(57)【要約】  修飾された骨形態形成蛋白質（骨形態形成蛋白質とも称するＢＭＰ）組成物が記載されている。骨形態形成蛋白質は、１つの態様では、例えばポリ（エチレングリコール）の如き親水性重合体で化学的に修飾されたＢＭＰ−７である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性重合体に共有結合された単離された骨形態形成蛋白質から構成される組成物。
【請求項２】
該骨形態形成蛋白質が骨形態形成蛋白質−７である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該骨形態形成蛋白質−７がヒト組み換え骨形態形成蛋白質−７である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
該ヒト骨形態形成蛋白質−７がここでＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として同定される配列を有する請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
該親水性重合体がポリ（エチレングリコール）である前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
該ポリ（エチレングリコール）が約１０〜５５ｋダルトンの間の分子量を有する請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
該骨形態形成蛋白質が２個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を介して該親水性重合体に共役結合される請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記請求項のいずれかに記載の組成物および製薬学的に許容可能な賦形剤から構成される製薬学的調剤。
【請求項９】
腎臓疾患の予防または処置用の注射のために調合された薬品の製造における使用のための請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
該骨形態形成蛋白質−７を活性化剤の存在下において官能化された親水性重合体と反応させる工程に従い製造される共役体の組成物である、共有結合された親水性重合体で修飾された骨形態形成蛋白質−７から構成される共役体の組成物。
【請求項１１】
該活性化剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびヒドロキシル−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）よりなる群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該官能化された親水性重合体がポリ（エチレングリコール）の活性化された誘導体である請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリ（エチレングリコール）の該活性化された誘導体がニトロフェニルカルボネート誘導化されたメトキシ−ポリエチレングリコールである請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
該骨形態形成蛋白質−７がヒト骨形態形成蛋白質−７である請求項１０−１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
該共役体が１：１、２：１および３：１のＰＥＧ：骨形態形成蛋白質−７の比を有する共役体の不均質組成物を形成する請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
該組成物が約５０％より多い１：１比のＰＥＧ：骨形態形成蛋白質−７を有する共役体を含んでなる請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
ここに記載されている主題は骨形態形成蛋白質の修飾に関する。より具体的には、主題は１つもしくはそれ以上の親水性重合体連鎖で修飾された修飾された骨形態形成蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞異化は、胚において開始しそして成体組織修復および再生機構における有機体の寿命全体にわたり種々の程度で持続する形態形成の中心的な特徴である。形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）上科における蛋白質は、成長中および／または成体寿命中の細胞異化に関与する高度に関係のある遺伝子の亜科を包含する。これらの亜科の１つは、骨形態形成蛋白質または骨形成蛋白質とも称する骨形態形成蛋白質である。これらの蛋白質は最初に骨マトリックスから単離されておりそして骨−誘発活性を有する。ヒトｃＤＮＡライブラリーからのこれらの蛋白質をコードする遺伝子のその後の単離が、ＢＭＰ−２〜ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７とも称する骨形成蛋白質−１（ＯＰ−１）を包含する蛋白質の科を同定した（非特許文献１）。
【０００３】
単離された骨形態形成蛋白質７（ＢＭＰ−７）はヒトに投与された時に軟骨および／または骨形成を誘発することを示した。それは外傷治癒および組織修復を助けることも信じられている。さらに最近では、ＢＭＰ−７は疾病状態または損傷された腎臓の処置における使用が提案されている。体外から供給されるＢＭＰ−７蛋白質は腎臓濾過速度を高める傾向があり、そして疾病状態の腎臓ではそれは腎臓機能の劣化速度を低下させる傾向がある（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。成熟蛋白質を用いる処置は、尿管閉塞症におけるように、虚血および／または再灌流損傷に関与する腎臓線維発生を減少させることも示された（非特許文献６）。
【０００４】
しかしながら、治療用蛋白質としてＢＭＰ−７の送達は多くの問題を被る。例えば、注射部位において骨を形成する蛋白質の性質は、外傷治癒、組織修復、および腎不全の処置におけるように、骨形成が望まれない場合には治療に関して問題となる。別の欠点は中性ｐＨにおけるその低い溶解度である。ＢＭＰ−７はｐＨ＜６．０において可溶性であるが、酸性溶液の注射は本質的には生理的ｐＨにある溶液より痛みが強く且つ患者にとって刺激性である。ＢＭＰ−７も比較的速いインビボ浄化速度
【０００５】
【数１】
2008542388.tif 000002
【０００６】
の注射により投与される時には多くの蛋白質に共通の問題を被る。
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｍｐａｔｈ  Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２８）：２０３５２（１９９２）
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１３：Ｓ１４−Ｓ２１（２００２）
【非特許文献３】Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｆ３８２−Ｆ３８９（１９９９）
【非特許文献４】Ｚｅｉｓｂｕｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８０（９）：８０９４（２００５）
【非特許文献５】Ｚｅｉｓｂｕｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９（７）：９６４（２００３）
【非特許文献６】Ｈｒｕｓｋａ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８０：Ｆ１３０（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それ故、治療剤としてＢＭＰ蛋白質を使用する際のこれらの欠点を処理するための修飾されたＢＭＰ蛋白質、そして特に、修飾されたＢＭＰ−７蛋白質が所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
関連技術の前記の例およびそれらに関連する限定は説明用でありそして排他的でない。関連技術の他の制限は明細書の読解および図面の検討で当業者に明らかになるであろう。
【００１０】
簡単な要旨
一面では、親水性重合体に共有結合された単離された骨形態形成蛋白質から構成される組成物が提供される。
【００１１】
１つの態様では、骨形態形成蛋白質は骨形態形成蛋白質−７である。別の態様では、骨形態形成蛋白質−７はヒト組み換え骨形態形成蛋白質−７である。ヒト骨形態形成蛋白質−７の例示アミノ酸配列はここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として示される。
【００１２】
別の態様では、蛋白質に結合される親水性重合体はポリ（エチレングリコール）である。ポリ（エチレングリコール）はいずれの分子量を有していてもよく、そして１つの態様では約１０〜５５ｋダルトンの間の分子量を有する。
【００１３】
さらに別の態様では、骨形態形成蛋白質は２個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を介して該親水性重合体に共役結合される。
【００１４】
別の面では、上記の組成物および製薬学的に許容可能な賦形剤から構成される製薬学的調剤が記載される。
【００１５】
別の面では、上記の製薬学的調剤または組成物が注射により対象に投与される処置方法が記載される。
【００１６】
別の面では、骨形態形成蛋白質−７を活性化剤の存在下において官能化された親水性重合体と反応させる工程に従い製造される共役体の組成物である、親水性重合体で修飾された骨形態形成蛋白質−７から構成される共役体の組成物が記載される。例示の活性化剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびヒドロキシル−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を包含する。
【００１７】
１つの態様では、官能化された親水性重合体はポリ（エチレングリコール）の活性化された誘導体である。例示のポリ（エチレングリコール）の活性化された誘導体は、ニトロフェニルカルボネート誘導化されたメトキシ−ポリエチレングリコールである。
【００１８】
ここに記載された方法により製造される組成物は、１つの態様では、１：１、２：１および３：１のＰＥＧ：骨形態形成蛋白質−７の比を有する共役体の不均質組成物を与える。１つの態様では、組成物約５０％より多いＰＥＧ：骨形態形成蛋白質−７の１：１比を有する共役体を含んでなる。
【００１９】
上記の例示面および態様の他に、別の面および態様は図面の参照および以下の記述の検討により明らかになるであろう。
【００２０】
図面の簡単な記述
図１はここでは「ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７」と称するポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体の製造用の合成反応スキームを示し、ここでＢＭＰ−７はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）の存在下でニトロフェニルカルボネート誘導化されたメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）に共有結合されており、
図２Ａ−２Ｂは図１に示された反応に従い製造された精製前のＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（図２Ａ）および成熟ＢＭＰ−７（図２Ｂ）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録であり、
図３は図１に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録を示し、
図４Ａ−４Ｂは蛋白質検出用にクーマッシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーで（図４Ａ）そしてＰＥＧ検出用にヨウ素で（図４Ｂ）染色された図１に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、レーン：１、成熟ＢＭＰ−７；２、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体；３、純粋な１：１ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７を含有する画分；４、左側のゲル上の蛋白質分子量標準および右側にあるＰＥＧ標準；５、６、および７はチオール分解後の１、２、および３と同じ試料を含有し、
図５はここでは「ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７」と称するポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体の製造用の合成反応スキームを示し、ここでＢＭＰ−７の糖部分は酸化されそして次にｍＰＥＧ−ヒドラジドと反応し、
図６Ａ−６ＣはｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体（図６Ａ）、酸化されたＢＭＰ−７（図６Ｂ）、および成熟ＢＭＰ−７（図６Ｃ）に関するＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録であり、
図７は図５に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録を示し、
図８は種々の濃度、ｎｇ／ｍＬ、のＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体に対する露呈時のインビトロでのラットの骨芽（ＲＯＳ）細胞中へのアルカリ性ホスファターゼの導入を示すプロットであり、
図９Ａ−９Ｃは、ヒト腎臓細胞がインビトロで成熟ＢＭＰ−７（四角形）、ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７（逆三角形）またはＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（三角形）に露呈された時のＢＭＰ−７濃度、ｎｇ／ｍＬ、の関数としてのインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度、ｎｇ／ｍＬ、のプロットであり、ＢＭＰ−７の濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、
図１０Ａ−１０Ｃは、ヒト腎臓細胞がインビトロで成熟ＢＭＰ−７（四角形、対照）、ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７（逆三角形）またはＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（三角形）に露呈された時の、ＢＭＰ−７濃度、ｎｇ／ｍＬ、の関数としてのインターロイキン−８（ＩＬ−８）濃度、ｎｇ／ｍＬ、のプロットであり、ＢＭＰ−７の濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲であり、
図１１は、成熟ＢＭＰ−７（三角形）、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（逆三角形）、または食塩水賦形剤（四角形）の静脈注射後の、時間数、時間、の関数としてのＢＭＰ−７血清濃度、ｎｇ／ｍＬ、のグラフであり、そして
図１２Ａ−１２Ｂは、片側性尿管閉塞症および成熟ＢＭＰ−７（点のある棒）、可溶性ＢＭＰ−７（斜行平行線のある棒）、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（点のある棒）を用いる処置後の、マウスにおけるアルファ−平滑筋アクチン（図１２Ａ）およびコラーゲンアルファ１（１）（図１２Ｂ）の対照標準化レベルを示す棒グラフである。
【００２１】
詳細な記述
１．定義
「ＢＭＰ−７」は骨形態形成蛋白質−７をさす。ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＧ４３５０８；ＮＰ ００１７１０）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ３４７５８）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（イヌ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３４８１９およびＡＡＦ８９７５２）、ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）（ブタ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ３８１１１）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）（ウサギ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＬ２４５００）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ ３４２５９２）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（イエネズミ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２３３５９およびＮＰ ０３１５８３）、並びにヒツジ（Ｏｖａｒｉｓ  ａｒｉｅｓ）（ヒツジ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＭ４６９２３）を包含するがそれらに限定されない種々の種に関するアミノ酸配列は既知である。それ故、用語「ＢＭＰ−７」はいずれかの種からのＢＭＰ−７のアミノ酸配列並びに成熟蛋白質の所望する治療活性を保有するこれらの蛋白質の断片および変種をさす。当業者は、選択されたアミノ酸残基の省略および／または選択されたアミノ酸残基の置換を可能にする蛋白質のある部分が治療活性のために要求されていることを認識している。蛋白質内の個々のアミノ酸残基を酸化、還元、または他の誘導化により修飾することができ、そして蛋白質を分解して活性を保有する断片が得られることも認識されるであろう。生物学的活性を損なわないそのような変更は定義からの蛋白質配列を除かない。より一般的には、用語ＢＭＰ−７は上記のＧｅｎＢａｎｋ配列の少なくとも１つまたは下記の他の配列との少なくとも約７０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、そしてさらにより好ましくは９５％の配列同一性を有するいずれかの蛋白質配列も意図する。配列「同一性」は、整列時にポリペプチド類のアミノ酸配列を比べて配列隙間を最少にしながら重複および同一性を最大にすることにより、測定される。２種のアミノ酸または２種の核酸配列の同一率は視覚的観察および／もしくは数学的計算により測定することができ、またはより好ましくは、コンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することにより比較が行われる。例示の好ましい配列プログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；マジソン、ウィスコンシン州）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０  ｐｒｏｇｒａｍ，‘ＧＡＰ’（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４））である。配列比較技術者により使用される他のプログラム、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを介する使用が利用可能なＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）およびＢＬＡＳＴＩＮプログラムを使用することもできる。好ましい態様では、視覚的検査からまたは上記のコンピュータープ���グラムの１つから測定した時に、それらのアミノ酸配列が少なくとも約６０％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも８０％の同一性である場合に同族性または同一性であると考えられる。
【００２２】
ここで使用される「親水性重合体」は、室温において重合体をある程度の水溶性にさせる水中に可溶性である部分を有する重合体をさす。例示の親水性重合体は、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチル−アクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミド、上記重合体の共重合体、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド共重合体を包含する。これらの重合体の多くに関する性質および反応は米国特許第５，３９５，６１９号明細書および第５，６３１，０１８号明細書に記載されている。
【００２３】
「ＰＥＧ処理」は、骨形態形成蛋白質、例えばＢＭＰ−７に対する１つもしくはそれ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）置換基または誘導体の結合をさす。好ましい態様では、この用語は生理的条件下で逆転可能または不安定でない結合による１つもしくはそれ以上のＰＥＧ置換基または誘導体の共有結合をさす。それ故、「共有」結合された重合体は、生理的条件下で逆転可能または不安定であると一般的に考えられていない結合をさす。
【００２４】
ＩＩ．組成物
一面では、親水性重合体に対する共有結合により修飾されたＢＭＰ−７から構成される組成物が提供される。好ましい態様では、ＢＭＰ−７はヒトＢＭＰ−７であり、それはチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で組み換え製造されうる。上記のように、ヒトＢＭＰ−７はインビボで骨形成を誘発しそしてインビトロで骨芽細胞の細胞増殖およびコラーゲン合成を増加させる（Ｓａｍｐａｔｈ  Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（２８）：２０３５２（１９９２））。組み換えヒトＢＭＰ−７はここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として同定される３４−３８ｋＤａ二硫化物結合されたホモ二量体よりなる。還元で、ホモ二量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸残基２９３−４３１を含有する２３、１９、または２７ｋＤａ単量体として泳動し、ここではプレ−プロＢＭＰ−７のアミノ末端Ｍｅｔ基は基１として定義される（Ｏｚｋａｙｎａｋ，Ｅ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：２０８５（１９９０））。基２９−２９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はプロ−領域（ｐｒｏ−ｄｏｍａｉｎ）と称する（Ｊｏｈｅｓ，Ｗ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，１１：２１５（１９９４））。Ｎ−グリカナーゼを用いる単量体の温浸（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）が２３、１９、および１７ｋＤａ単量体を単一の１４ｋＤａ種に還元し、明らかな分子量の差は特異的なグリコシル化によることを示している（Ｊｏｎｅｓ，同上）。精製されたＢＭＰ−７ホモ二量体は生理的緩衝液、例えば燐酸塩緩衝食塩水または細胞培養培地、の中に微溶性であり、そして溶液を保持するためには変性剤を必要とする。組み換えＢＭＰ−７の成熟領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の基２９３−４３１に相当しそしてここでは「成熟」ＢＭＰ−７と称しそしてここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として同定される。
【００２５】
好ましい態様では、ここではＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と同定された配列を有するヒトＢＭＰ−７が組成物中で使用される。１つの態様では、組成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対する少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＢＭＰ−７を包含し、ここで配列同一性は上記の通りにして測定される。他の態様では、組成物はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として同定された蛋白質配列に対する少なくとも８０％の、好ましくは８５％の、より好ましくは９０％の、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有するヒトＢＭＰ−７を包含する。
【００２６】
ＢＭＰ−７は１つもしくはそれ以上の親水性重合体連鎖で化学的に修飾される。蛋白質に対する親水性重合体の化学的結合、すなわち共役結合、は当該技術では親水性重合体であるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で例示されるが、例えば以上で挙げられたもののような他の親水性重合体も同等に適することは認識されるであろう。蛋白質、例えばＢＭＰ−７、に対するＰＥＧ連鎖の共役結合は、典型的にはＰＥＧの「活性化された誘導体」、すなわち、例えば蛋白質上のアミノ基との反応のための１個もしくはそれ以上の末端に官能基を有するＰＥＧを用いるものである。ピリジルジチオプロピオニル−ＰＥＧ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−ＨＮ−ＰＥＧ、スクシンイミジルカーボネート−ＰＥＧ、ニトロフェニルカーボネート−ＰＥＧ、およびＺａｌｉｓｐｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３８７：５０（２００４）に示された他のものを包含するＰＥＧの多くの活性化された誘導体が当該技術で既知である。蛋白質のアミノ基に結合するＰＥＧ上の官能部分、または蛋白質のグリカン部分、または蛋白
質のＮ−末端が適しており、アミノ基のアシル化が普遍的な方法である。
【００２７】
ＢＭＰ−７およびＰＥＧの共役体は補助試験において実施例１および２に詳細記述されている２つの例示反応スキームにより製造された。実施例１に関すると、ヒト成熟ＢＭＰ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）により例示される活性化剤の存在下でニトロフェニルカーボネート誘導化されたメトキシ−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）と混合した。ＢＭＰ−７のアミン−指向ＰＥＧ処理を示す図１に見られるように、６−７．５の範囲内の中性ｐＨにおけるＢＭＰ−７とアシル化剤ｍＰＥＧ−ＮＰＣとの反応はゆっくり進行する。ＰＥＧ−ＮＰＣは塩基性条件下で反応性がより大きいため、ＰＥＧ−ＮＰＣを用いる蛋白質のＰＥＧ処理は７．５より高いｐＨにおいてより急速に進行する。上記のように、ＢＭＰ−７は中性および塩基性ｐＨにおいて水中に微溶性であり、ｍＰＥＧ−ＮＰＣを用いて蛋白質を効果的に化学的に修飾することを難しくする。しかしながら、１つの態様では、これも図１で説明されているように、ＢＭＰ−７を活性化剤の存在下でｍＰＥＧ−ＮＰＣのようなアシル化剤と反応させることによりＰＥＧで化学的に修飾されたＢＭＰ−７の共役体が製造される。反応混合物に対する活性化剤の添加が反応効率を高めそして中性ｐＨ値（例えば６−７．５の間）および７．０より低いｐＨ値における蛋白質修飾を容易にする。
【００２８】
図１および実施例１における活性化剤はＨＯＳｕにより例示される。しかしながら、ＰＥＧ処理剤にＮ−またはＯ−結合されたプロトンを供与する性質を有する中酸性度のいずれの水溶性の非−カルボン酸性のブロンステッド酸でも活性化剤としての使用に適することは認識されよう。一般例は、酸性アルコール類、フェノール類、イミダゾール類、トリアゾール類およびテトラゾール類をとりわけ包含する。使用に適する酸性酸類の例はＮ−ヒドロキシジカルボキシイミド類、特に芳香族環上にニトロおよび他の電子吸引置換基を有するＮ−ヒドロキシフタルイミド類、Ｎ−ヒドロキシテトラヒドロフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシグルタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、およびＮ−ヒドロキシ−７−オキサビシクロ［２．２１］ヘプト−５−エン−２，３−ジカルボキシイミドを包含するが、それらに限定されない。１−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび芳香族環上に電子吸引基を有する誘導体、例えばニトロ、クロロ、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩は水中に非常に可溶性であり、そのことはそれが水性緩衝液中ではＨＯＳｕより高い濃度でも使用できることを意味する。例示のヒドロキシアミン類は、ＨＯＳｕの他に、ＨＯＳｕのスルホネート誘導体、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、およびヒドロキシル−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を包含する。これらの化合物は約４〜約７．５のｐＨ範囲において、それらのｐＫａを基準として、有効な緩衝液成分として作用する。例えば、ｐＫａ＝６の弱酸であるＨＯＳｕは約５〜約７のｐＨ範囲において有効な緩衝液成分として作用する。活性化剤を緩衝液に加えることができ、または緩衝液を他の塩類を用いてまたは用いずに含んでなることができる。さらに、ＨＯＳｕは水溶液中で非常に可溶性であるため、それを緩衝液に比較的高い濃度で加えてＰＥＧ処理反応をさらに増強することができる。
【００２９】
活性化剤として適する他の化合物はフェノール類、例えばジニトロフェノール、トリニトロフェノール、トリフルオロフェノール、ペンタフルオロフェノール、およびペンタクロロフェノールを包含し、４−もしくは２−ヒドロキシピリジンおよび誘導体、例えばヒドロキシ−２−ニトロピリジン、並びに酸性Ｎ−Ｈ官能性を有する化合物、例えば電子吸引基を有するイミダゾール誘導体（イミダゾール、ｐＫａ＝７）、例えば４−もしくは２−ニトロイミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、およびある種の誘導体、例えば２−ニトロ−１，２，４−トリアゾールも適する。
【００３０】
実施例１に記載されるように、成熟蛋白質を活性化剤としてのＨＯＳｕの存在下で官能
化されたＰＥＧであるｍＰＥＧ−ＮＰＣ（３０ｋＤのｍＰＥＧ分子量）と反応させることによりＰＥＧ−修飾されたＢＭＰ−７が製造された。ここではｍＰＥＧ３０ｋＤａ−ＢＭＰ−７と称する生じたＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体は精製前にＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより同定された。図２Ａで見られるように、ＢＭＰ−７の約５８％がＰＥＧ処理され、モノ−およびジ−ＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７の生成が好ましい。約３５分で溶離する成熟ＢＭＰ−７（図２Ｂ）は合計ピーク面積の４２％であった。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７組成物は１：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体（３８％）、２：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体（１６％）、および３：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体（４％）から構成された。
【００３１】
組成物を透析およびイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製して未反応の蛋白質を除去しそしてＨＰＬＣ−ＳＥＣおよびゲル電気泳動により再び同定した。図３は精製後のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７を示す。精製後に、共役体組成物の６１％は１：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体であった。２：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体および３：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体は組成物の３３％および５％を構成した。
【００３２】
図４Ａ−４Ｂは蛋白質の検出用にクーマッシブルーで（図４Ａ）そしてＰＥＧの検出用にヨウ素で（図４Ｂ）染色された電子泳動ゲルの写真である。両方のゲルにおいて、レーン１は成熟ＢＭＰ−７であり；レーン２は、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７の精製された調剤であり、レーン３は純粋なＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７の１：１共役体である。レーン４は、パネルＡでは蛋白質に関する分子量（ＭＮ）マーカーでありそしてパネルＢではＰＥＧに関するマーカーである。レーン５、６、および７は、メルカプトエタノールを用いる還元後の、それぞれ、レーン１、２、および３の蛋白質に相当する。ゲルはＨＰＬＣ−ＳＥＣからの結果を確認して、１：１ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体の生成が好ましいことを示した。
【００３３】
実施例２に記載されそして図５で説明されているように、炭水化物−指向結合反応を用いて修飾されたＢＭＰ−７が製造される他の試験を行った。この方式では、ＢＭＰ−７を過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化しそして次に２０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧであるｍＰＥＧ−ヒドラジド（ｍＰＥＧ−Ｈｚ）と反応させた。図６Ａ−６Ｂに示されているように、生じた組成物を精製前に同定した。成熟ＢＭＰ−７に関する記録は図６Ｃに示され、蛋白質は約３６分で溶離する。酸化された蛋白質は図６Ｂに示され、そして約３５分で溶離する。ｍＰＥＧ−Ｈｚとの反応後に、少量（８％）の成熟蛋白質が保持され、残りの９２％は１つもしくはそれ以上のＰＥＧ連鎖で修飾された。共役体の大部分は３：１ＰＥＧ−蛋白質（５１％）であり、２：１および１：１ＰＥＧ−蛋白質共役体は合計の２３％および１８％を含んでなった。
【００３４】
ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７組成物を透析およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製しそしてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより再び分析した。精製後の組成物の記録は図７に示されている。精製された調剤は９５％のＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７および約５％の遊離蛋白質を含有しており、ＰＥＧ処理された蛋白質画分は図面で示された通りである。
【００３５】
ＰＥＧ−修飾されたＢＭＰ−７は成熟蛋白質と比べて改良された水溶性を示した。成熟ＢＭＰ−７は酸性ｐＨ（ｐＨ＜５．０）において水溶性であるが、中和で蛋白質が沈殿する。対照的に、ＰＥＧ−ＢＭＰ−７はｐＨ７以上でも水中に可溶性のままでありそして一般的な緩衝塩を用いる中和で沈殿しない。
【００３６】
修飾されたＢＭＰ−７であるＰＥＧ３０ｋＤａ−ＢＭＰ−７をインビトロで試験して共役体が生物学的活性を保有しているかどうかを測定した。実施例３に記載されているように、共役体がラットの骨芽（ＲＯＳ）細胞内でのアルカリ性ホスファターゼ特異的活性を誘発する能力を評価した。ＲＯＳ細胞を種々の濃度の成熟ＢＭＰ−７およびＰＥＧ３０ｋ
Ｄａ−ＢＭＰ−７と共に４０−５６時間にわたりインキュベートした。細胞を分解しそしてアルカリ性ホスファターゼの存在に関して吸光度により分析することによりアルカリ性ホスファターゼの誘発を評価した。結果は図８に示されている。
【００３７】
図８は、ＢＭＰ−７濃度、ｎｇ／ｍＬ、の関数としての成熟ＢＭＰ−７（四角形）およびＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（三角形）の吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍ）を示す。ＰＥＧ３０Ｋ−ＢＭＰ−７共役体は成熟ＢＭＰ−７と同様な活性を示した。蛋白質、そして特に受容体−結合蛋白質、はそれらのインビトロ生物学的活性の実質的な部分をＰＥＧ処理で失うため、この結果は予測されていなかった。
【００３８】
ＰＥＧ−修飾されたＢＭＰ−７共役体の生物学的活性はヒト腎臓（ＨＫ−２）細胞系統を用いてインビトロでも試験された。成熟（ｐｅｇ処理されていない）ＢＭＰ−７はサイトカイン類であるインターロイキン−６（ＩＬ−６）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の生成を示した。実施例１および２に記載されている通りにして製造された共役体であるＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７およびＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７を実施例４に記載されている工程に従い試験して、ＰＥＧを用いる化学的修飾後に蛋白質がＨＫ−細胞内でＩＬ−６およびＩＬ−８生成を示すその能力を保持したかどうかを測定した。
【００３９】
図９Ａ−９Ｃは、ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体がＩＬ−６生成を阻害する能力により証明される生物学的活性を保有することを示している。図９Ａは、共役結合された蛋白質が、５０ｎｇ／ｍＬ〜１．７５ｎｇ／ｍＬの蛋白質濃度範囲にわたり、本質的に同じ阻害活性を有する成熟、成熟ＢＭＰ−７（対照、四角形）およびＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（三角形）では阻害することを示している。図９Ｂおよび９Ｃはより広い蛋白質濃度範囲にわたる同様なプロットであり、そしてＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体がより高い蛋白質濃度において幾らか減じられた活性を有するＰＥＧ−２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体では成熟、成熟蛋白質のものとほぼ近い活性を保有することを示している。
【００４０】
図１０Ａ−１０Ｃはインターロイキン−８（ＩＬ−８）に関する結果を示しており、ここで成熟ＢＭＰ−７（四角形）およびＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体（三角形）は低濃度においてＩＬ−８の生成を阻害する（図１０Ａ）。蛋白質のより高い濃度においては（図１０Ｂ、１０Ｃ）、ＰＥＧ−２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体は成熟ＢＭＰ−７と比べて幾らか減じられた活性（逆三角形）を有するが、依然としてＩＬ−８生成を阻害する能力を示した。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（三角形）は成熟蛋白質と本質的に同等なＩＬ−８阻害活性を保有した。
【００４１】
上記のように、腎不全および骨形成異常症の処置のための成熟ＢＭＰ−７の全身投与に関係する問題は注射部位における骨形成である。３種の試験をインビボで行って共役体ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７の送達後の注射部位における骨形成を評価した。これらの試験は実施例５−７に記載されている。実施例５に詳細記述された試験では、ラットを成熟ＢＭＰ−７またはＰＥＧ処理された蛋白質で皮下または筋肉内注射により処置した。注射後約２週間にわたり、注射部位をＸ−線により分析した。各動物の右腹からの組織を回収しそして骨小節の可視的徴候に関して評価した。組織を定量的３ＤミクロＣＴ分析用にも処理した。成熟ＢＭＰ−７の筋肉内注射を受けた動物の約９５％の筋肉組織内で骨小節が生成した。対照的に、ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体で処置した動物の筋肉内注射部位では骨は観察されなかった。
【００４２】
実施例６および７に記載された試験は実施例５の試験で観察された結果のさらなる確認を与える。ＢＭＰ−７のｐｅｇ処理は筋肉および皮膚内で注射部位の骨形成を防止し、この共役体は骨形成性がより少なく、すなわち、より可溶性であり、そして注射後の急速な分散が可能であることを示した。実施例５および６に記載された試験の結果は表１にまと
められている。
【００４３】
【表１】
2008542388.tif 000003
【００４４】
実施例８に記載されているように、蛋白質をラット内に静脈内注射することにより、ＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７の薬物動力学を評価した。この共役体および成熟ＢＭＰ−７の血液循環寿命が図１１に示されている。成熟ＢＭＰ−７（三角形）と比べて増加したＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（逆三角形）の血液循環寿命は明らかである。
【００４５】
ＩＩＩ．使用方法
別の面では、親水性重合体、例えばポリ（エチレングリコール）、に共有結合されたＢＭＰ−７から構成される共役体を投与することを含んでなる処置方法が提供される。例えば、ＢＭＰ−７は急性もしくは慢性の腎臓損傷に罹っている患者における腎臓構造および機能に対する有益な効果を有する。ＰＥＧ処理された共役体の形態でのＢＭＰ−７の投与は糸球体濾過速度および腎臓血液流を高めることができ、血清クレアチンおよび血液ウレア窒素における低下を伴う。ＢＭＰ−７は血管平滑筋細胞の一体性の保有およびアルファ−平滑細胞におけるアクチン発現の維持においても有益な効果を有する。それ故、この共役体は腎臓線維症、腎臓虚血および／または再灌流損傷並びに当業者に明白な他の症状を包含するがそれらに限定されない腎臓症状の予防および処置における特別な用途を見出す。
【００４６】
ＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体を用いる例示処置は実施例９に示されている。この試験では、マウスの片側性尿管閉塞症（ＵＵＯ）モデルを使用してＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体の効果を評価した。マウスの尿管を結紮して尿管流を遮断した。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７が尿管閉塞の４日間の期間中に腎臓線維症の進行を抑制する能力を評価した。実時間逆トランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、α−平滑筋アクチン発現の相対的レベルを測定した。賦形剤処置動物における発現のレベルを簡便な比較のために１単位に設定した。結果は図１２Ａに示されている。４日間の閉塞された腎臓内でのα−平滑筋アクチンの相対的レベルは、成熟ＢＭＰ−７で処置された４匹のマウスの中の３匹で、可溶性ＢＭＰ−７で処置された４匹のマウスの中の２匹で、そしてＰＥＧ  ＢＭＰ−７で処置された３匹のマウスの中の２匹で低下した。
【００４７】
実時間ＲＴ−ＰＣＲにより、動物におけるコラーゲンα１（１）発現の相対的レベルも測定された。結果は図１２Ｂに示されている。賦形剤処置された動物における発現のレベルを１単位に設定した。４日間の閉塞された腎臓内でのコラーゲンα１（１）の相対的レベルは、成熟ＢＭＰ−７で処置された４匹のマウスの中の３匹で、可溶性ＢＭＰ−７で処
置された４匹のマウスの中の３匹で、そしてＰＥＧ  ＢＭＰ−７で処置された３匹のマウスの中の２匹で低下した。
【００４８】
そのような処置方法における使用のためには、上記の共役体組成物を当該技術で既知である方法に従い非経口的送達用に調合することができる。典型的には、蛋白質を適当な担体賦形剤、例えば食塩水または製薬学的に認可されている他の賦形剤と調合する。
【００４９】
ＰＥＧ−ＢＭＰ−７共役体を他の治療剤と組み合わせて投与できることも認識されるであろう。具体例はＰＥＧ−ＢＭＰ−７とエナラプリル（ｅｎａｌａｐｒｉｌ）との同時処置を包含する。
【実施例】
【００５０】
ＩＶ．実施例
以下の実施例はここに記載された主題をさらに説明するものでありそしてその範囲を何ら制限する意図はない。
【００５１】
実施例１
ポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体（ｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７）の製造
この反応スキームは図１に示されている。
【００５２】
Ａ．共役結合反応および精製
組み換えヒト骨形態形成蛋白質−７（ＢＭＰ−７；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は凍結乾燥粉末として得られそして−７０℃に保たれた。１．４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ７貯蔵溶液を２５ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ｐＨ６、の中で製造した。
【００５３】
３０，０００ダルトンの分子量のニトロフェニルカーボネート誘導されたメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣ）はＮＯＦ・コーポレーション（ＮＯＦ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（東京、日本）から購入した。ｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣの１０ｍＭ貯蔵溶液をアセトニトリルの中で製造した。
【００５４】
１２．８６ｍＬのＢＭＰ−７（１８ｍｇ）を４．２４ｍＬのＨＯＳｕ緩衝液、ｐＨ６、に混合することにより、反応（図１）を開始した。その後に、０．９ｍＬのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣを混合物に、静かに撹拌しながら、滴下した。反応を１６時間にわたり室温（２１−２２℃）においてロッキング・ミキサー上でそのまま進めた。最終的な反応容量は、１ｍｇ／ｍＬ（０．０２８ｍＭ）のＢＭＰ−７、０．５ｍＭのｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣ、５％のアセトニトリル、および１８のモル比のＰＥＧ／ＢＭＰ−７を含有する１８ｍＬであった。最終的なＨＯＳｕ濃度は２４ｍＭであり、それはｍＰＥＧ３０ｋ−ＮＰＣに対して約４８モル過剰である。反応を１０ｍＭのグリシンを用いて１時間にわたり室温においてクエンチした。
【００５５】
共役結合反応からの生成物を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬ，１ｘ３０ｃｍカラム（ＧＥ・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、および２５ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、３００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍのウレア、ｐＨ６．５、移動相を用いるＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。試料を移動相の中で１／２０に希釈し、そして５０μＬをカラムに注入した。流速を０．５ｍＬ／分に設定し、そしてカラムからの溶離を２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯幅１５ｎｍ）に設定された蛍光検知器により監視した。共役体およびＢＭＰ−７対照に関する結果は、それぞれ、図２Ａ−２Ｂに示されている。
【００５６】
精製のために、共役結合反応試料を１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５の中で、６
０００−８０００の分子量カットオフを有するＳＰＥＣＴＲＳ／ＰＯＲ１膜管（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ・インコーポレーテッド（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ロスアンジェルス、カリフォルニア州）を用いて透析した。透析は４℃において行われた。透析の終了時に、試料を０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜注射器フィルター（パル・ライフ・サイエンセス（ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アン・アルボル、ミネソタ州）を通して濾過した。
【００５７】
次に、１．７ｍＬの合計容量のスルホプロピルカチオン交換体カラムであるＳｏｕｒｃｅ  １５Ｓ  ＰＥ  ４．６ｘ１００ｍｍ（ＧＥ・ヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を２０カラム容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液で平衡化した。次に、２０ｍＬの透析された共役結合試料をカラム上に充填した。溶離は、１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含有するｐＨ５の移動相Ａ、１ＭのＮａＣｌを１０ｍＭの酢酸Ｎａ中に含有するｐＨ５の移動相Ｂ１、および６Ｍのウレア、１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの酢酸Ｎａを含有するｐＨ５の移動相Ｂ２を用いる、１ｍｌ／分の流速における、勾配溶離により行われた。カラムに結合されなかった物質は４０ｍＬの移動相Ａで洗浄除去された。移動相Ｂ１を５０分間にわたり１０％から６０％へ、次に１０分間にわたり１００％Ｂ２（１ＭのＮａＣｌ、６Ｍのウレア）へ、２ｍＬ／分で増加させることにより、勾配溶離を開始した。画分は溶離段階全体にわたり１ｍＬ／画分で集められた。未反応のＰＥＧはカラムに結合せずそしてフロー−スルー物質と共に出ていった。ＰＥＧ処理されたＢＭＰ７は約１５０ｍＭのＮａＣｌで溶離を開始しそして約４００ｍＭのＮａＣｌで溶離を終了した。遊離ＢＭＰ７を最後に６Ｍのウレアを含有する１ＭのＮａＣｌで溶離した。
【００５８】
イオン交換分離中に集められた画分の含有量を同定するために、画分からのアリコートを上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬ，１ｘ３０ｃｍカラムを用いるＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した（結果は示されていない）。ＰＥＧ処理された蛋白質を含有するイオン交換分離からの画分を貯蔵し、濃縮し、そして２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５％のマンニトール、ｐＨ４．５の緩衝液の中で、窒素下で２０ｐｓｉにおいて、１０ｍＬのＡｍｉｃｏｎ限外濾過撹拌セル（ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、ビレリカ、マサチュセッツ州）の中で、３０００の分子量カットオフを有するＯＭＥＧＡ限外濾過膜ディスクフィルター（パル・ライフ・サイエンセス、アン・アルボル、ミネソタ州）を用いて透析した。試料を約３．５ｍＬの最終容量にした。
【００５９】
濃縮した試料を０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜注射器フィルターを通して殺菌濾過し、そしてオートクレーブ処理したガラス瓶に殺菌充填した。全ての瓶は４℃で貯蔵された。下記の蛋白質検定により測定して、合計で約１．２ｍｇのＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７が精製から得られた。
【００６０】
Ｂ．蛋白質測定検定
蛋白質測定検定は蛋白質の固有トリプトファンの蛍光同定に基づいた。ＢＭＰ−７が標準として使用され、そして２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５％のマンニトール、ｐＨ４．５緩衝液の中で順次希釈が６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００μｇ／ｍＬで行われた。ｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７試料を同じ緩衝液の中で１：１０および１：２０に希釈した。標準および試験試料を黒色マイクロタイタープレートに、２００μＬ／ウエルで、三回重複で移した。プレートを２９５ｎｍの励起波長（２ｎｍスリット）および３６０ｎｍの発光波長（１０ｎｍスリット）に設定された蛍光計の中で読み取った。結果は表Ａに示されている。
【００６１】
【表２】
2008542388.tif 000004
【００６２】
Ｂ．同定
Ｂ１．ＨＰＬＣ−ＳＥＣ分析
精製されたｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７試料を上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。試料を移動相の中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μＬをカラムに注入した。流速は０．５ｍＬ／分に設定され、そしてカラムからの溶離を２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯幅１５ｎｍ）に設定された蛍光検知器により監視した。成熟蛋白質および共役体に関する結果は図３に示されている。
【００６３】
Ｂ２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ｍＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ７試料を、ＮｕＰＡＧＥ(R)Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ４−１２％勾配ゲルおよびＭＯＰＳ−ＳＤＳ流動緩衝液（インビトロゲン・ライフ・テクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いる変性条件下でのゲル電気泳動により、分析した。試料および対照を１．５〜５μｇの蛋白質を含有する２つのゲル上に１０μＬ／ウエルで充填した。ゲルを２００ボルトの一定電圧で５５分間にわたり流した。それぞれ、図４Ａ−４Ｂに示されているように、１つのゲルは蛋白質検定用にクーマッシーブルーでそしてＰＥＧ検出用にヨウ素で染色された。
【００６４】
実施例２
ポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体（ｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７）の製造
この反応スキームは図５に示されている。
【００６５】
Ａ．共役結合反応
酸化および共役結合の二段階反応は組み換えヒトＢＭＰ−７を用いて行われた。２．８ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ７貯蔵溶液を２５ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液の中で製造した（合計１５．６ｍｇのＢＭＰ−７）。ＢＭＰ−７酸化反応は１ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムの中で２０分間にわたり４℃において行われ、次に２ｍＭのＮ−アセチル−メチオニンでクエンチされた。
【００６６】
次に、メトキシ−ポリエチレングリコール２００００−ヒドラジド（ｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ）の５ｍＭ貯蔵溶液を２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５の中で製造した。酸化したＢＭＰ−７（１４ｍｇ）をｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚと１．４ｍｇ／ｍＬのＢＭＰ−７（０．０３９ｍＭ）および２．９ｍＭのｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚと１６時間にわたり室温（２１−２２℃）においてロッキング・ミキサー上で反応させて、７５／１のＰＥＧ対蛋白質のモル比を生じた。
【００６７】
共役結合反応からの生成物を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬ，１ｘ３０ｃｍカラム（ＧＥ・ヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、および２５ｍＭのトリス、３００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍのウレア、ｐＨ６．５、移動相を用いるＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。試料を移動相の中で１／２０に希釈し、そして５０μＬをカラムに注入した。流速を０．５ｍＬ／分に設定し、そしてカラムの溶離を２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯幅１５ｎｍ）に設定された蛍光検知器により監視した。ｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体、酸化されたＢＭＰ−７、および成熟ＢＭＰ−７に関するＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録は、それぞれ、図６Ａ−６Ｃに示されている。
【００６８】
精製のために、共役体を５ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７の中で、６０００−８０００の分子量カットオフを有するＳＰＥＣＴＲＳ／ＰＯＲ１膜管（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ・インコーポレーテッド、ロスアンジェルス、カリフォルニア州）を用いて透析した。透析は４℃において行われた。透析の終了時に、試料を０．４５μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜注射器フィルター（パル・ライフ・サイエンセス、アン・アルボル、ミネソタ州）を通して濾過した。
【００６９】
次に、２つのスルホプロピルカチオン交換体カラムであるそれぞれ５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ・ヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を順次連結して１０ｍＬの合計床容量にした。カラムを５カラム容量の５ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ７緩衝液で平衡化した。次に、２５ｍＬの透析された共役結合試料をカラムの上に１ｍＬ／分の流速で５ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７の下で充填した。カラムに結合されなかった物質を集めそして上記と同じ条件下でカラムに２回再充填した。３つの移動相を溶離工程で使用した：５ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７緩衝液を含有する移動相Ａ、１ＭのＮａＣｌを２０ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７中に含有する移動相Ｂ１、および６Ｍのウレア、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７を含有する移動相Ｂ２。移動相Ｂ１を３０分間にわたり２ｍＬ／分で３０％へ、次に４分間にわたり４ｍＬ／分で１００％Ｂ２に増加させることにより、勾配溶離が開始した。画分が溶離段階全体にわたり５ｍＬ／画分で集められた。未反応のＰＥＧはカラムに結合せず、そしてフロー−スルー物質と共に出ていった。しかしながら、ＰＥＧ処理されたＢＭＰ７および共役結合されなかったＢＭＰ７は両方とも３０％の移動相Ｂ１（３０ｍＭのＮａＣｌ）で溶離した。
【００７０】
イオン交換クロマトグラフィー分離からのＰＥＧ処理されたＢＭＰ７および共役結合されなかったＢＭＰ７を含有する画分を貯蔵しそしてＰＥＧ処理されたＢＭＰ７を共役結合されなかったＢＭＰ７から分離するために疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる精製にかけた。３つのフェニル疎水性相互作用カラムであるそれぞれ５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ・ヘルスケア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を順次連結しそして１Ｍの硫酸アンモニウム、６Ｍのウレア、および２０ｍＭの燐酸ナトリウムｐＨ７緩衝液を含有する１００ｍＬの結合移動相Ａで平衡化した。貯蔵試料を次にカラムに１ｍＬ／分の流速で注入した。ピークを通る流れを５ｍＬ画分で集めそしてカラムに対する最大結合を得るために再注入した。勾配を次に７０％Ａおよび３０％Ｂ（６Ｍのウレア、２０ｍＭの燐酸Ｎａ、ｐＨ７）に変え、そして７０分間にわたり１００％Ｂに増加させ、引き続き１００％Ｂにおける２０分間とした。画分を溶離段階全体にわたり１ｍＬ／画分で集めた。疎水性相互作用クロマトグラフィー分離中に集められた画分の含有量を同定するために、画分からのアリコートを上記のＳｕｐｅｒｏｓ６  １０／３００  ＧＬカラムを用いるＨＰＬＣ−ＳＥＣにより分析した。
【００７１】
ＰＥＧ処理された蛋白質を含有する疎水性相互作用分離からの画分を濃縮貯蔵しそしてＰＢＳｐＨ７．２の中で窒素下で２０ｐｓｉにおいて１０ｍＬのＡｍｉｃｏｎ限外濾過撹拌セル（ミリポア・コーポレーション、ビレリカ、マサチュセッツ州）の中で、３０００の分子量カットオフを有するＯＭＥＧＡ限外濾過膜ディスクフィルター（パル・ライフ・
サイエンセス、アン・アルボル、ミネソタ州）を用いて透析した。試料を約４ｍＬの最終容量にした。
【００７２】
濃縮した試料を０．２２μｍのＡｃｒｏｄｉｓｃ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜注射器フィルターを通して殺菌濾過し、そしてオートクレーブ処理したガラス瓶に殺菌充填した。全ての瓶は４℃で貯蔵された。以上の実施例１に記載された蛋白質検定により測定して、約３．４ｍｇのＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７が精製から得られ、それはＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７試料内の蛋白質濃度が０．９５ｍｇ／ｍＬであったことを判定した。
【００７３】
Ｂ．同定
精製されたｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７試料を上記のＳｕｐｅｒｏｓｅ６  １０／３００ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。試料を移動相の中で１／１０に希釈し、そして５０μＬをカラムに注入した。流速は０．５ｍＬ／分に設定され、そしてカラムからの溶離を２９５ｎｍの励起波長および３６０ｎｍの発光波長（帯幅１５ｎｍ）に設定された蛍光検知器により監視した。
【００７４】
実施例３
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のインビトロ活性
活性の定量化はラットの骨芽（ＲＯＳ）細胞の中へのアルカリ性ホスファターゼ特異的活性の導入に基づく。３０，０００個の細胞／ウエル（２００μＬ）を平底プレートに加えそして一晩にわたり３７℃においてインキュベートした。ＢＭＰ−７をアセテート／マンニトール緩衝液ｐＨ４．５の中で０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（実施例１に記載されている通りにして製造された）および成熟ＢＭＰ−７の両者の４μｇ／ｍＬの反応貯蔵溶液をアセテート／マンニトール緩衝液の中で製造した。両者の順次希釈はＦ１２培地の中で２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを用いて行われた。
【００７５】
５０μＬの共役体または成熟蛋白質の試料をプレートに三回重複で加えた。試料の最終濃度は以下の通りである：８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎｇ／ｍＬ。プレートを４０〜５６時間にわたりインキュベートした。
【００７６】
次に、１５０μＬのならし培地を除去しそして廃棄した。１００μＬの暖めた２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液を各ウエルに加えた。プレートをインキュベーターの中に６０分間にわたり戻して細胞を分解しそしてアルカリ性ホスファターゼ分子を放出させた。プレートを４℃において一晩にわたりインキュベートして抽出工程を確実に完了させた。
【００７７】
次に、１個の４０ｍｇのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）錠剤を４０ｍＬの０．１Ｍグリシン、ｐＨ９．６に加え、そして溶液を３０分間にわたり水浴の中で温めた。プレートを４℃から除去しそして１０分間にわたり２６００ｒｐｍで遠心した。各ウエルからの２０μＬの上澄み液を空のＤｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２プレートの各ウエルに移した。１００μＬのＰＮＰＰ溶液をＩｍｍｕｌｏｎ  ２プレートの各ウエルに加え、プレートを密封し、そして２０分間にわたりインキュベートした。７５μＬの０．２Ｎ  ＮａＯＨを各ウエルに加えることにより反応を停止した。プレートを次にプレートリーダー上で４０５ｎｍにおいて読み取った。結果は図８に示されている。
【００７８】
実施例４
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のインビトロ分析
成熟ＢＭＰ−７は入手されそしてＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体は実施例１に記載された通りにして３０，０００ダルトンのＰＥＧ分子量で製造された。
【００７９】
ヒト腎臓（ＨＫ−２細胞系統）細胞を、５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒト表皮政調因子（ｒＨｕＥＧＦ）および０．０５ｍｇ／ｍＬのウシ下垂体抽出物（完全Ｋ−ＳＦＭ）が補充された角化細胞無血清培地の中で〜８０％集密度となるまでＴ２５または１５０ｍｍ皿の中で培養した。細胞を補充物質なしのＫ−ＳＦＫですすぎそして次に６時間にわたりＫ−ＳＦＫ（補充物質なし）だけでまたは１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、または１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７および２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを添加して処理した。ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて単離しそしてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＢＭＰ−７の存在下ではＩＬ−６レベルは減じられた。
【００８０】
細胞を完全Ｋ−ＳＦＭの中で１個のウエル当たり１００，０００個の細胞で２４ウエルプレート内で一晩にわたり培養した。培地を除去しそしてＢＭＰ−７（０、２５、５０、１００、２００、４００ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β１（０、０．３１、０．６２５、１．２５、２．５もしくは５ｎｇ／ｍＬ）またはＴＮＦ−α（２ｎｇ／ｍＬ）およびＢＭＰ−７もしくはＴＧＦ−β１を含有する補充物質なしのＫ−ＳＦＭで２４時間にわたり交換した。上澄み液を無菌的に殺菌性ミクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管の中に集め、２０００ｒｐｍでミクロ遠心機の中で回転させて細胞屑を除去し、そして新しい管に移した。上澄み液をＥＬＩＳＡによる分析まで凍結（−２０℃）貯蔵した。ＩＬ−６およびＩＬ−８を製造業者の指示によりＥＬＩＳＡ検査（Ｒ＆Ｄ・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により定量化した。
【００８１】
結果は図９Ａ−９Ｃおよび１０Ａ−１０Ｃに示されている。
【００８２】
実施例５
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体の注射後の注射部位のインビボ評価
成熟ＢＭＰ−７は入手されそしてＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体は実施例１に記載された通りにして３０，０００ダルトンのＰＥＧ分子量で製造された。
【００８３】
２０匹の雄のラットが入手されそして処置用に４群に無作為分割された。各動物はそれ自体の対照として成熟蛋白質またはＰＥＧ処理された蛋白質を左腹にそして対照賦形剤を右腹に送達することにより処置された。処置群は以下の通りであった：
【００８４】
【表３】
2008542388.tif 000005
【００８５】
１００μｇ／ｋｇの服用量でのそして酢酸マンニトール緩衝液担体賦形剤中の蛋白質の注射が左腹になされた。各動物の右腹には右腹に与えられた蛋白質と同じ送達方式により酢酸マンニトール緩衝液賦形剤が注射された。１回の注射がなされそして動物は注射後２週間にわたり観察された。この２週間の観察期間中に明白なまたは触診可能な小節の徴候は形成されなかった。
【００８６】
注射後１５日に、ラットを安楽死させそしてｘ−線検査した。全ての群からのｘ−線では目に見える明白な骨小節はなかった。しかしながら、解剖では、ｉ．ｍ投与された成熟ＢＭＰ−７で処置された群３では４／５の動物の筋肉内で骨小節が見られた。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（ｉ．ｍおよびｓ．ｃ）でまたは対照賦形剤で処置された動物（群２、４）では骨小節は観察されなかった。
【００８７】
組織試料を動物から取り出しそして５％ＰＶＡの中に入れた。それらをヘキサン冷凍浴を用いて冷凍しそして−８０℃の冷凍機の中に入れた。これらの塊の大部分をその後に７０％アルコール中で解凍しそしてミクロＣＴ分析のために処理した。骨はｉ．ｍ．ＢＭＰ−７を摂取した動物（群３）の４／５の筋肉内でそしてｓ．ｃ．ＢＭＰ−７を摂取した動物（群１）の５／５の筋肉内で観察された。結果は表Ｂにまとめられている。
【００８８】
【表４】
2008542388.tif 000006
【００８９】
実施例６
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のＩ．Ｍ．注射後の注射部位のインビボ評価
成熟ＢＭＰ−７は商業的に入手されそしてＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体は実施例１に記載された通りにして３０，０００ダルトンのＰＥＧ分子量で製造された。
【００９０】
１０匹の雄のラットが入手されそして処置用に２群に無作為分割された。各動物はそれ自体の対照として成熟蛋白質またはＰＥＧ処理された蛋白質を左腹にそして対照賦形剤を右腹に送達することにより処理された。処置群は以下の通りであった：
【００９１】
【表５】
2008542388.tif 000007
【００９２】
１００μｇ／ｋｇの服用量でのそして酢酸マンニトール緩衝液担体賦形剤中の蛋白質の注射が左腹に筋肉内になされた。各動物の右腹には右腹に与えられた蛋白質と同じ送達方式により酢酸マンニトール緩衝液賦形剤が注射された。注射がなされた時に、ラットにＣＯ２／Ｏ２の７０／３０混合物で麻酔をかけた。動物の骨が針により衝突しないことまたは骨が注射部位に近すぎないことを確保するために注意を払った。１回の注射がなされそして動物を注射後２週間で安楽死させた。
【００９３】
注射部位のｘ−線分析は、成熟ＢＭＰ−７で処置された動物の全てにおいて骨小節を示した。ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７で処置された動物（群２）は骨小節を発現させなかった。解剖時に、成熟ＢＭＰ−７で処置された群１動物における小節は触診可能でありそして
解剖では骨小節がこの群における動物の筋肉内で目に見えた。群２における動物の解剖では、骨小節は見られなかった。このデータはミクロＣＴ分析により確認された（５匹の中の４匹で骨あり）。各動物の右腹になされた賦形剤注射は骨形成を生じなかった。結果は表Ｃにまとめられている。
【００９４】
【表６】
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【００９５】
実施例７
ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体の注射後の注射部位のインビボ評価
成熟ＢＭＰ−７は入手されそしてＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体は実施例２に記載された通りにして２０，０００ダルトンのＰＥＧ分子量で製造された。
【００９６】
１０匹の雄のラットが入手されそして処置用に２群に無作為分割された。各動物はそれ自体の対照として成熟蛋白質またはＰＥＧ処理された蛋白質を左腹にそして対照賦形剤を右腹に送達することにより処置された。処置群は以下の通りであった：
【００９７】
【表７】
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【００９８】
１００μｇ／ｋｇの服用量でのそして酢酸マンニトール緩衝液担体賦形剤中の蛋白質の注射が左腹に筋肉内になされた。各動物の右腹には右腹に与えられた蛋白質と同じ送達方式により酢酸マンニトール緩衝液賦形剤が注射された。１回の注射がなされそして動物を注射後２週間で安楽死させた。
【００９９】
注射部位のｘ−線分析はいずれの動物においても骨小節を示さなかったが、動物の解剖は成熟ＢＭＰ−７で処置されたラットにおいて骨小節を示した。解剖はＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７で処置した動物に関してはいずれの注射部位にも存在する小節を示さなかった。賦形剤注射部位のいずれも骨形成を生じなかった。
【０１００】
実施例８
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体の薬物動力学
雄のスプラーク−ダウレイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットに２５０μｇ／ｋｇのＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７、２５０μｇ／ｋｇの成熟ＢＭＰ−７、または食塩水を注射した。血清を眼窩採血により時間０並びに投薬後１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、および６時間に集めた。血清中のＢＭＰ−７の濃度を以下の処方に従いＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１０１】
プレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅ  ＩＩ  Ｆ９６  ＭＡＸＩＳＯＲＰ）をＢＭＰ−７モノクローン抗体１Ｂ１２でコーティングした。ＢＭＰ−７対照標準を５０ｍＭのトリス−緩衝された食塩水（ＴＢＳ）＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の中で１０μｇ／ｋｇの濃度に希釈することにより標準を製造した。標準をアリコートにしそして−８０℃において貯蔵した。
【０１０２】
血清、血漿、または検定洗剤希釈剤／試料緩衝液（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、１％のＮＰ−４０、０．５％のＤＯＣ、ｐＨ８．０）の中の１０μｇ／ｍＬ対照標準の８００ｎｇ／ｍＬの第一希釈物を製造した。
【０１０３】
次に、血清、血漿、または検定洗剤希釈剤／試料緩衝液中での一連の１：２希釈を行うことにより標準曲線を決定した。標準濃度（最終）は、８００、４００、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９５、０．０９７、０．０４８、および０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０４】
５０μＬの標準対照および試験試料を割り当てられたウエルに加えた。５０μＬの検定洗剤希釈剤／試料緩衝液を全てのウエルに加えた。プレートをプレートシーラーで保護被覆しそして２時間にわたり室温（２０−２５℃）においてシェーカー（速度４）上でインキュベートした。
【０１０５】
プレートをＢＭＰ−７洗浄緩衝液（１×ホウ酸塩緩衝食塩水、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ８．０）を用いて２サイクルにわたり洗浄しそしてプレートを乾燥除去した。Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｒａｂｂｉｔ  ５０８６（ＢＭＰ−７ポリクローン抗体）をＢＭＰ−７共役体希釈剤（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）の中で１：２５００に希釈しそして５０μＬを全てのウエルに加えた。プレートをプレートシーラーで保護被覆しそして１時間にわたり室温（２０−２５℃）においてシェーカー上でインキュベートした。次に、プレートをプレート洗浄機の上で上記のように２サイクルで洗浄した。プレートを乾燥除去しそして次に１個のウエル当たり５０μＬのヤギ−抗−ウサギＨＲＰ共役体（Ｚｙｍｅｄ  Ｃａｔ  ＃  ８１−６１２０）の１：２５，０００希釈物（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４中）を加えた。プレートを再び被覆しそして室温（２０−２５℃）においてシェーカー上でインキュベートしそして次に再び洗浄した。
【０１０６】
１個のウエル当たり１００μＬのＴＭＢ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｚｙｍｅｄ  Ｃａｔ  ＃  ００−２０２３）を５−１０分間にわたり室温において加えた。１個のウエル当たり１００μＬの停止溶液（０．１８ＭのＨ２ＳＯ４）を加えることにより反応を停止させた。４５０ｎｍにおいて吸光度を読み取った。結果は図１１に示されている。
【０１０７】
実施例９
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のインビボ効果
片側性尿管閉塞症（ＵＵＯ）モデルを使用してＰＥＧ処理されたＢＭＰ−７共役体の効果を評価した。マウスの尿管を結紮して尿管流を遮断した。成熟ＢＭＰ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、可溶性ＢＭＰ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の基３０−４３１；成熟ＢＭＰ−７と非共有的に会合した蛋白質のアミノ末端プロ領域（ｐｒｏｄｏｍａｉｎ）を有する成熟領域）、およびＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（上記の通りにして製造された）が腎臓線維症のマーカーの発現を抑制する能力を、腎臓線維症の進行を抑制する能力として、４日間の尿管閉塞期間の間に測定した。
【０１０８】
マウスを、賦形剤単独（ｎ＝３）、成熟ＢＭＰ−７（ｎ＝４）、可溶性ＢＭＰ−７（ｎ
＝４）、またはＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（ｎ＝４）を用いる処置のために４つの処置群に無作為分割した。全ての形態のＢＭＰ−７を１日１回１ｋｇの齧歯動物体重当たり３００μｇの濃度で投与した。
【０１０９】
ベータアクチン、アルファ平滑筋、およびコラーゲンのレベルを各動物から採取された腎臓組織試料から４日間の期間の終了時に実時間ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。ベータアクチンｃＤＮＡを対照として棘波することによりベータアクチンを測定した。賦形剤処置した動物内での発現のレベルを簡便な比較のために１単位に設定した。結果は図１２Ａ−１２Ｂに示されている。
【０１１０】
実施例１０
ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体の免疫原性
雄のＢａｌｂ／ＣマウスにＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７または成熟ＢＭＰ−７を注射した。１４日後に、マウスは同じ試験化合物の第二回目の注射を受けた。血液試料を０日から３５日まで毎週採取し、血清を分離しそして抗−ＰＥＧ−ＢＭＰ−７抗体の存在をＥＬＩＳＡを用いて検査する。
【０１１１】
多くの例示面および態様は以上で論じられたが、当業者はそれらのある種の改変、置換、追加および細分−組み合わせを認識するであろう。従って、添付された請求の範囲およびその後に導入される請求項は全ての改変、置換、追加および副組み合わせをそれらの真の精神および範囲内にある如く包含すると解釈されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１はここでは「ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７」と称するポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体の製造用の合成反応スキームを示し、ここでＢＭＰ−７はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）の存在下でニトロフェニルカルボネート誘導化されたメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＮＰＣ）に共有結合されている。
【図２】図２Ａ−２Ｂは図１に示された反応に従い製造された精製前のＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体（図２Ａ）および成熟ＢＭＰ−７（図２Ｂ）のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録である。
【図３】図３は図１に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録を示す。
【図４】図４Ａ−４Ｂは蛋白質検出用にクーマッシーブルーで（図４Ａ）そしてＰＥＧ検出用にヨウ素で（図４Ｂ）染色された図１に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、レーン：１、成熟ＢＭＰ−７；２、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体；３、純粋な１：１ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７を含有する画分；４、左側のゲル上の蛋白質分子量標準および右側にあるＰＥＧ標準；５、６、および７はチオール分解後の１、２、および３と同じ試料を含有する。
【図５】図５はここでは「ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７」と称するポリ（エチレングリコール）−ＢＭＰ−７共役体の製造用の合成反応スキームを示し、ここでＢＭＰ−７の糖部分は酸化されそして次にｍＰＥＧ−ヒドラジドと反応する。
【図６】図６Ａ−６ＣはｍＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体（図６Ａ）、酸化されたＢＭＰ−７（図６Ｂ）、および成熟ＢＭＰ−７（図６Ｃ）に関するＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録である。
【図７】図７は図５に示された反応に従い製造された精製されたＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７共役体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ記録を示す。
【図８】図８は種々の濃度、ｎｇ／ｍＬ、のＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７共役体に対する露呈時のインビトロでのラットの骨芽（ＲＯＳ）細胞中へのアルカリ性ホスファターゼの導入を示すプロットである。
【図９】図９Ａ−９Ｃは、ヒト腎臓細胞がインビトロで成熟ＢＭＰ−７（四角形）、ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７（逆三角形）またはＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（三角形）に露呈された時のＢＭＰ−７濃度、ｎｇ／ｍＬ、の関数としてのインターロイキン−６（ＩＬ−６）濃度、ｎｇ／ｍＬ、のプロットであり、ＢＭＰ−７の濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、ヒト腎臓細胞がインビトロで成熟ＢＭＰ−７（四角形、対照）、ＰＥＧ２０ｋ−Ｈｚ−ＢＭＰ−７（逆三角形）またはＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（三角形）に露呈された時の、ＢＭＰ−７濃度、ｎｇ／ｍＬ、の関数としてのインターロイキン−８（ＩＬ−８）濃度、ｎｇ／ｍＬ、のプロットであり、ＢＭＰ−７の濃度は５０ｎｇ／ｍＬ〜４００ｎｇ／ｍＬの範囲である。
【図１１】図１１は、成熟ＢＭＰ−７（三角形）、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（逆三角形）、または食塩水賦形剤（四角形）の静脈注射後の、時間数、時間、の関数としてのＢＭＰ−７血清濃度、ｎｇ／ｍＬ、のグラフである。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂは、片側性尿管閉塞症および成熟ＢＭＰ−７（点のある棒）、可溶性ＢＭＰ−７（斜行平行線のある棒）、ＰＥＧ３０ｋ−ＢＭＰ−７（点のある棒）を用いる処置後の、マウスにおけるアルファ−平滑筋アクチン（図１２Ａ）およびコラーゲンアルファ１（１）（図１２Ｂ）の対照標準化レベルを示す棒グラフである。
【図１】
2008542388.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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