(57)【要約】  Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を作成する方法、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩の医薬組成物、血管新生および異常な脈管形成と関連している疾患を治療するためのAc-PHSCN-NH2の酸付加塩およびその医薬組成物を使用する方法および塩形成によってAc-PHSCN-NH2の劣化を防ぐ方法が本明細書中で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ac-PHSCN-NH2 (配列番号１)の酸付加塩。
【請求項２】
酸が、メタンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、硫酸、(+)カンファースルホン酸、マンデル酸、サリチル酸、コハク酸、臭化水素酸、硝酸およびリン酸からなる群から選択される、請求項１の酸付加塩。
【請求項３】
酸が塩酸である、請求項１の酸付加塩。
【請求項４】
請求項１の酸付加塩および製薬的に許容しうるビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項５】
患者における異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患または障害を治療または予防するための方法であって、そのような治療または予防を必要としている患者に治療有効量の請求項１の酸付加塩を投与する段階を含む方法。
【請求項６】
酸付加塩が精製されている、請求項５の方法。
【請求項７】
患者における異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患または障害を治療または予防するための方法であって、そのような治療または予防を必要としている患者に治療有効量の請求項４の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項８】
治療方法であって、そのような治療を必要としている患者に当該酸付加塩ではない治療有効量の抗血管新生剤を投与する段階をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項９】
治療方法であって、そのような治療を必要としている患者に当該酸付加塩ではない治療有効量の抗血管新生剤を投与する段階をさらに含む、請求項７の方法。
【請求項１０】
血管新生疾患が癌である、請求項５の方法。
【請求項１１】
癌が、乳癌、腎癌、脳癌、結腸癌、前立腺癌、軟骨肉腫または血管肉腫である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
血管新生疾患が癌である、請求項７の方法。
【請求項１３】
癌が、乳癌、腎癌、脳癌、結腸癌、前立腺癌、軟骨肉腫または血管肉腫である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
酸が塩酸である、請求項７の方法。
【請求項１５】
Ac-PHSCN-NH2を劣化に対して安定化する方法であって、Ac-PHSCN-NH2に酸を付加する段階を含む方法。
【請求項１６】
劣化が二量体化に起因する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
酸が、メタンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、硫酸、(+)カンファースルホン酸、マンデル酸、サリチル酸、コハク酸、臭化水素酸、硝酸およびリン酸からなる群から選択される、請求項１５の方法。
【請求項１８】
酸が塩酸である、請求項１５の方法。
【請求項１９】
請求項１の酸付加塩を含む溶液であって、23〜25℃で約600時間後に該塩のモノマーが85%を超えている溶液。
【請求項２０】
酸が塩酸である、請求項１９の溶液。
【請求項２１】
23〜25℃で800時間を超える時間後に本質的に純粋である、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩。
【請求項２２】
99%を超える純度である、請求項２１の酸付加塩。
【請求項２３】
酸が塩酸である、請求項２１の酸付加塩。
【請求項２４】
凍結乾燥されている、請求項１の酸付加塩。
【請求項２５】
酸が塩酸である、請求項２４の酸付加塩。
【請求項２６】
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を含有する第一の容器を含むキット。
【請求項２７】
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩が凍結乾燥されている、請求項２６のキット。
【請求項２８】
滅菌水性溶液を含有する第二の容器をさらに含む、請求項２７のキット。
【請求項２９】
シリンジをさらに含む、請求項２６のキット。
【請求項３０】
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩ではない抗血管新生剤を含有する第二の容器をさらに含む、請求項２６のキット。
【請求項３１】
薬物として使用するためのAc-PHSCN-NH2の酸付加塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2005年2月1日提出の米国仮出願第60/649,308号の利益を主張する。該仮出願の内容全体は参照により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
1.  発明の属する分野
本発明は、一般的に、抗血管新生ペプチドであるAc-PHSCN-NH2の酸付加塩、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を作成する方法、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を含む医薬組成物、血管新生(angiogenesis)および異常な脈管形成(vascularization)と関連している疾患を治療するためにAc-PHSCN-NH2の酸付加塩およびその医薬組成物を使用する方法および塩形成によってAc-PHSCN-NH2の劣化(degradation)を防ぐ方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
2.  発明の背景
ほとんどの形態の癌は固形腫瘍に由来し(Shockley et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1991, 617: 367-382)、それは治療、例えばモノクローナル抗体および免疫毒素の使用に耐性であることが臨床で証明されている。固形腫瘍が成長持続のために血管新生(すなわち、新規血管の形成)を必要とすることの認識から、癌を治療するための抗血管新生治療(Anti-angiogenic therapy)が開発された(Folkman, Ann. Surg. 1972, 175: 409-416; Folkman, Mol. Med. 1995, 1(2): 120-122; Folkman, Breast Cancer Res. Treat. 1995, 36(2): 109-118; Hanahan et al., Cell 1996, 86(3): 353-364)。抗血管新生治療の効力は動物モデルにおいて実証されている(Millauer et al., Cancer Res. 1996, 56:1615-1620; Borgstrom et al., Prostrate 1998, 35:1-10; Benjamin et al., J. Clin. Invest. 1999, 103: 159-165; Merajver et al., Proceedings of Special AACR Conference on Angiogenesis and Cancer 1998, Abstract #B-11, January 22-24)。血管新生の不存在下では、固形腫瘍の内部細胞層は栄養状態が悪い。さらに、血管新生(すわなち、異常な脈管形成)は、多数の他の疾患(例えば、眼球の血管新生疾患、黄斑変性、関節リウマチ、等)に関与している。
【０００４】
対照的に、正常組織は、特殊な状況(例えば、創傷修復、月経周期中の子宮内膜の増殖、等)下を除いて、血管新生を必要としない。したがって、血管新生に関する必要性は腫瘍細胞と正常組織間の顕著な相違点である。重要なことに、正常細胞と比較された場合の腫瘍細胞の血管新生への依存性は、癌治療において利用されることがよくある正常組織と腫瘍組織間での細胞複製および細胞死の差異より量的に大きい。
【０００５】
血管新生は、低酸素(hypoxic)条件下の腫瘍細胞において、サイトカイン、例えば血管内皮増殖因子および/または線維芽細胞成長因子によって開始されうる。それらは局所血管系の内皮細胞上の特異的受容体に結合する。活性化された内皮細胞は酵素を分泌し、該酵素は関連組織基質を再構築し、接着分子、例えばインテグリンの発現をモジュレートする。基質分解後、内皮細胞は増殖して低酸素の腫瘍へ遊走し、その結果、新規血管が生成および成熟する。
【０００６】
Ac-PHSCN-NH2は血管新生を効果的に阻害するペプチドである(Livant, United States Patent No. 6,001,965; Livant, United States Patent No. 6,472,369)。しかし、二量体化によって不活性型が生じる。それは、Ac-PHSCN-NH2が溶液に溶解するか、あるいは固形物として保存される場合に重大な問題である。したがって、必要とされるのは、液相および固相の両条件下でAc-PHSCN-NH2の劣化を防ぐ方法である。
【発明の開示】
【０００７】
3.  発明の要旨
本発明は、Ac-PHSCN-NH2 (配列番号１)の酸付加塩、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を作成する方法、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を含む医薬組成物、血管新生および異常な脈管形成と関連している疾患を治療するためにAc-PHSCN-NH2の酸付加塩およびその医薬組成物を使用する方法および塩形成によってAc-PHSCN-NH2の劣化を防ぐ方法を提供することによって、前記および他の必要性を満たすものである。
【０００８】
第1の態様では、抗血管新生ペプチドAc-PHSCN-NH2の酸付加塩を提供する。いくつかの実施形態では、該酸は、塩酸、メタンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、硫酸、(+)カンファースルホン酸、マンデル酸、サリチル酸(salicyclic acid)、コハク酸、臭化水素酸、硝酸およびリン酸からなる群から選択される。好ましい実施形態では、酸は塩酸である。特定の実施形態では、該Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は精製されている。他の実施形態では、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は凍結乾燥されている。
【０００９】
本発明は、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩溶液であって、23〜25℃で600時間後に、約85%を超える酸付加塩が単量体である溶液をさらに提供する。一実施形態では、該酸付加塩溶液は、23〜25℃で800時間を超える時間後に純粋であり、例えば99%を超える純度である。
【００１０】
第2の態様では、抗血管新生ペプチドAc-PHSCN-NH2の酸付加塩を含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、一般的に、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩および製薬的に許容しうるビヒクルを含み、該ビヒクルには、希釈剤、担体、または賦形剤が含まれる。希釈剤、担体、および賦形剤の選択は、他の要因の中でもとりわけ、所望の投与様式に依存する。
【００１１】
第3の態様では、本発明は、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患または障害を治療または予防するための方法を提供する。該方法は、一般的に、そのような治療または予防を必要としている患者に医薬組成物中に含まれていてよい治療有効量のAc-PHSCN-NH2の塩を投与する段階を含む。該方法は、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩ではない治療有効量の抗血管新生剤を投与する段階をさらに含んでよい。特定の実施形態では、治療対象の疾患または障害は、癌、例えば、乳癌、腎癌、脳癌、結腸癌、前立腺癌(prostrate cancer)、軟骨肉腫または血管肉腫である。別の実施形態では、治療対象の疾患はクローン病である。
【００１２】
第4の態様では、本発明は、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を含有する容器を含むキットを提供する。一実施形態では、該Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は凍結乾燥されている。特定の実施形態では、該キットは、滅菌水性溶液を含有する容器をさらに含む。他の実施形態では、該キットは、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩ではない抗血管新生の酸を含有する容器をさらに含む。該キットはシリンジおよび/または指示書を含んでもよい。
【００１３】
4.  図面の簡単な説明
図１は、Ac-PHSCN-NH2塩酸塩の合成の模式図である。  
図２は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基とAc-PHSCN-NH2の塩酸塩についての単量体対二量体の濃度の液相比較を時間の関数として示す。  
図３は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基とAc-PHSCN-NH2の塩酸塩についての単量体対二量体の濃度の固相比較を時間の関数として示す。  
図４は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基、Ac-PHSCN-NH2のメタンスルホン酸塩、およびAc-PHSCN-NH2の硝酸塩についての単量体対二量体の濃度の液相比較を時間の関数として示す。  
図５は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基、Ac-PHSCN-NH2のメタンスルホン酸塩、およびAc-PHSCN-NH2の硝酸塩についての単量体対二量体の濃度の固相比較を時間の関数として示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
5.  発明の詳細な説明
以下、本発明の実施形態を詳細に述べる。本発明はこれらの実施形態とともに記載されるが、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解される。それとは反対に、特許請求の範囲によって規定される本発明の思想および範囲内に含まれるであろう代替物、改変物、および等価物を含むことが意図される。
【００１５】
5.1  Ac-PHSCN-NH2の塩
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を形成させると、このペプチドが劣化から顕著に保護されることが発見された。したがって、本明細書中で提供されるのは、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を作成する方法、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩を含む医薬組成物、血管新生および異常な脈管形成と関連している疾患を治療するためのAc-PHSCN-NH2の酸付加塩およびその医薬組成物を使用する方法および塩形成によってAc-PHSCN-NH2の劣化を防ぐ方法である。
【００１６】
構築対象のペプチドは、好ましくは純粋であるか、あるいは本質的に純粋であり、望ましくは、本質的に均質である(すなわち、混入ペプチドまたはタンパク質、等を含まない)。「本質的に純粋な」とは、調製物の総重量に基づいて少なくとも90重量%、好ましくは少なくとも95重量%が該ペプチドであるペプチド調製物を意味する。「本質的に均質な」調製物とは、調製物中の該ペプチドの総重量に基づいて少なくとも99重量%のペプチドを含むペプチド調製物を意味する。
【００１７】
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は有機および無機の酸の両者から形成させてよい。典型的な有機酸には、一般的に、カルボン酸およびスルホン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、グリコール酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、3-(4-ヒドロキシベンゾイル)安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、1,2-エタン-ジスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、フマル酸、シュウ酸、乳酸、4-クロロベンゼンスルホン酸、2-ナフタレンスルホン酸、4-トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、4-メチルビシクロ[2.2.2]-オクタ-2-エン-1-カルボン酸、グルコヘプトン酸(glucoheptonic acid)、3-フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、t-ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸およびムコン酸が含まれる。他の有機酸も当業者に知られている。いくつかの実施形態では、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は、メタンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、(+)カンファースルホン酸、マンデル酸、サリチル酸、コハク酸またはその組み合わせから形成される。
【００１８】
典型的な無機酸には、フッ化水素酸、過塩素酸、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、ヨウ化水素酸、塩素酸、チオシアン酸、次亜リン酸、亜硝酸、シアン酸、クロム酸、亜硫酸、亜リン酸またはヒドラゾ酸が含まれる。他の無機酸は当業者に知られている。いくつかの実施形態では、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は、臭化水素酸、硝酸、塩酸、リン酸またはその組み合わせから形成される。他の実施形態では、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は塩酸から形成される。
【００１９】
一般に、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は、当業者に公知の任意の慣用の方法によって作成してよい。これらの方法は、Ac-PHSCN-NH2の溶液をガス状の酸で飽和させる段階、酸の溶液をAc-PHSCN-NH2の溶液に加える段階、等を含む。いくつかの実施形態では、蒸留水に溶解されたAc-PHSCN-NH2の溶液に1当量をわずかに超える(例えば1.05当量の)酸を加えることによってAc-PHSCN-NH2の酸付加塩を作成する。該酸付加塩は、典型的に、該水性混合物から固形物として単離される。
【００２０】
Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩は、固相および液相の両相においてその遊離塩基よりかなり安定性が高くなりうる。理論によって拘束されることを望まないが、該酸付加塩は、システインによって媒介されるAc-PHSCN-NH2の酸化的二量体化を防ぐと考えられる。Ac-PHSCN-NH2の劣化を防ぐ酸付加塩は、例えば、メタンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、硫酸、(+)カンファースルホン酸、マンデル酸、サリチル酸、コハク酸、臭化水素酸、硝酸およびリン酸から形成される。いくつかの実施形態では、該酸付加塩は塩酸から形成される。
【００２１】
Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基とAc-PHSCN-NH2の酸付加塩(例えばHCl)の間の安定性の差異は、液相および固相の両相においてかなり顕著でありうる。いくつかの実施形態では、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩(例えばHCl)は、室温で500時間を超える時間後に溶液中で単量体が約85%を超えている。対照的に、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基は同一期間中に他の産物(例えば二量体)に完全に変換されている。固相において同様に、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩(例えばHCl)は、室温、すなわち23〜25℃で800時間を超える時間後に約99%を超える純度であり、一方、遊離塩基は同一量の時間後に約82%を超える純度である。
【００２２】
5.2  アッセイ
当業者は、本明細書中に記載のAc-PHSCN-NH2の塩の抗血管新生活性を測定するために有用なin vitroおよびin vivoアッセイが、包括的ではなく例証的であることを認識し、さらに、使用可能な改変は当業者に自明である。
【００２３】
5.2.1  内皮細胞遊走に関するアッセイ
内皮細胞(EC)遊走に関して、１トランスウェルあたり200μLのコラーゲン溶液を加えた後、37℃で一晩インキュベートすることによって、トランスウェルをI型コラーゲン(50μg/mL)でコーティングする。該トランスウェルを24ウェルプレート中で組み立て、総容量0.8 mLの培地中で底部槽に化学誘引物質(例えば線維芽細胞成長因子-2 [FGF-2])を加える。トリプシンを使用して単層培養から分離されたEC、例えばヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、血清を含まない培地で約106細胞/mLの終濃度に希釈し、0.2 mLのこの細胞懸濁液を各トランスウェルの上部槽に加える。Ac-PHSCN-NH2の塩を上部および下部の両槽に加えてよく、加湿雰囲気中で37℃で5時間、遊走を進行させる。DIFFQUIK (登録商標)、ギムザ染色(Dade Behring, Deerfield, IL)を使用して染色された該プレートからトランスウェルを取り出す。遊走しない細胞を、綿棒でこすることによって上部槽から除去し、該メンブレンを分離し、スライドガラスにマウントし、高倍率視野(40Ox)下でカウントして、遊走細胞の数を決定する。
【００２４】
5.2.2  抗浸潤活性の生物学的アッセイ
細胞、例えばECまたは腫瘍 (例えばPC-3ヒト前立腺癌腫)細胞が再構成基底膜(MATRIGELTM, EHSマウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物, BD Biosciences, San Jose, CA)を通過して浸潤する能力は、MATRIGELTM浸潤アッセイ系として知られているアッセイにおいて、当技術分野で詳細に報告されている(Kleinman et al., Biochemistry 1986, 25: 312-318; Parish et al., 1992, Int. J. Cancer 52:378-383)。MATRIGELTMは、IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、例えば、bFGFに結合して局在化させるパーリカン、ビトロネクチンならびにトランスフォーミング成長因子-β(TGFβ)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ(uPA)、組織プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)および1型プラスミノーゲンアクチベータインヒビター(PAI-1)として知られているセルピンを含有する再構成基底膜である(Chambers et al., Canc. Res. 1995, 55:1578-1585)。細胞外受容体または酵素を標的にする化合物に関して、このアッセイにおいて取得された結果がin vivoでのこれらの化合物の効力の予測であることが当技術分野において容認される(Rabbani et al., Int. J. Cancer 1995, 63: 840-845)。
【００２５】
そのようなアッセイでは、トランスウェル組織培養挿入物を使用する。浸潤性細胞とは、MATRIGELTMおよびポリカーボナートメンブレン上面を超えて、該メンブレンの底面に接着することができる細胞として規定される。ポリカーボナートメンブレン(8.0μm孔サイズ)を含有するトランスウェル(COSTAR (登録商標), Corning Life Sciences, Corning, NY)を滅菌PBS中で終濃度75μg/mLに希釈済みのMATRIGELTM (１挿入物あたり60μLの希釈MATRIGELTM)でコーティングし、該トランスウェルを24ウェルプレートのウェル中に配置する。該メンブレンを生物学的に安全なキャビネット中で一晩乾燥した後、抗生物質を含有する100μLのDMEM (GlBCO(登録商標), Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を加えることによってシェーカーテーブル上で1時間再水和する。該DMEMを各挿入物から吸引によって除去し、0.8 mLのDMEM/10 % FBS/抗生物質を24ウェルプレートの各ウェルに加えて、それがトランスウェルの外側(「下部槽」)を取り囲むようにする。新鮮なDMEM/抗生物質(lOOμL)、ヒトGlu-プラスミノーゲン(5μg/mL)、および試験対象の任意のインヒビターを、トランスウェルの上部の内側(「上部槽」)に加える。試験対象の細胞をトリプシン処理し、DMEM/抗生物質に再懸濁した後、800,000細胞/mLの終濃度で該トランスウェルの上部槽に加える。上部槽の最終容量を200μLに調節する。組み立てたプレートを、次いで、加湿5% CO2雰囲気中で72時間インキュベートする。インキュベーション後、該細胞を固定し、DIFFQUIK (登録商標)を使用して染色し、次いで綿棒を使用して上部槽をこすり、Matrigel (登録商標)およびメンブレンを通過して浸潤しなかった任意の細胞を除去する。X-ACTO (登録商標)ブレードを使用して該メンブレンをトランスウェルから分離し、PERMOUNT (登録商標)、トルエンベースの合成樹脂マウント用媒体(Biomeda, Foster City, CA)、およびカバーガラスを使用してスライドガラスにマウントし、次いで高倍率(40Ox)視野下でカウントする。
【００２６】
5〜10視野をカウントして、浸潤した細胞の平均を決定し、Ac-PHSCN-NH2塩濃度の関数としてプロットする。
【００２７】
5.2.3  抗血管新生活性についての管形成アッセイ
調製または商業的に取得可能な内皮細胞、例えばヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)またはヒト微小血管内皮細胞(HMVEC)を、2 x 105細胞/mLの濃度でフィブリノーゲン(リン酸緩衝食塩水(PBS)中5mg/mL、比1:1 (v/v))と混合する。トロンビンを加え(5単位/ mL終濃度)、混合物をすぐに24ウェルプレートに移す(１ウェルあたり0.5 mL)。フィブリンゲルを形成させた後、VEGF (血管内皮増殖因子)およびbFGF (塩基性線維芽細胞成長因子)を(それぞれ5 ng/mL終濃度で)試験化合物とともにウェルに加える。細胞を37℃で5% CO2中で4日間インキュベートし、その時点で、各ウェル中の細胞をカウントし、丸い細胞、細長くて分枝なしの細胞、細長くて1分枝を有する細胞、または細長くて2以上の分枝を有する細胞として分類する。各濃度の化合物に関して5個の別個のウェルの平均として結果を表記する。典型的に、血管新生インヒビターの存在下では、細胞は丸いままであるか、あるいは未分化の管(例えば0または1分枝)を形成する。このアッセイはin vivoにおける血管新生(または抗血管新生)効力の予測として当技術分野で認められている(Min et al., Cancer Res. 1996, 56: 2428-2433)。
【００２８】
代替のアッセイでは、内皮細胞をMATRIGELTM上で培養した場合の内皮細胞管形成を観察する(Schnaper et al., J. Cell. Physiol. 1995, 165:107-118)。内皮細胞(1 x 104細胞/ウェル)をMATRlGELTMコーティング24ウェルプレート上に移し、48時間後に管形成を定量する。インヒビターを、内皮細胞と同時に、あるいはその後の諸時点で加えることによって試験する。管形成は、(a)血管新生成長因子、例えばbFGFまたはVEGF、(b)分化刺激剤(例えばPMA [ホルボール12-ミリスタート13-アセタート])または(c)これらの組み合わせを加えることによって刺激することもできる。
【００２９】
理論によって拘束されることを望まないが、このアッセイは、特定のタイプの基底膜、すなわち遊走および分化している内皮細胞が最初に遭遇すると予測される基質の層を内皮細胞に提示することに基づく血管新生のモデルである。結合している成長因子に加えて、MATRIGELTM (およびin situの基底膜)において認められる基質成分またはそのタンパク質分解による産物もまた、内皮細胞管形成に関して刺激性である可能性があり、それによって、このモデルは、以前に報告されているフィブリンゲル血管新生モデルを補完するモデルになる(Blood et al., Biochim. Biophys. Acta 1990, 1032:89-118; Odedrat al., Pharmac. Ther. 1991, 49:111-124,)。
【００３０】
5.2.4  増殖の阻害に関するアッセイ
本発明の化合物がECの増殖を阻害する能力を96ウェル形式で測定できる。I型コラーゲン(ゼラチン)を使用して、プレートのウェルをコーティングする(PBS中0.1〜1 mg/mL、ウェルあたり0.1 mLで室温で30分間)。プレートを洗浄(3x w/PBS)後、１ウェルあたり3〜6,000細胞をプレートし、内皮増殖培地(EGM; Clonetics, Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ)またはM199培地、0.1〜2% FBS含有物中で4時間付着させる(37℃/5% CO2)。4時間の終了時点で培地および任意の未付着細胞を除去し、bFGF (1〜10 ng/mL)またはVEGF (1〜10 ng/mL)を含有する新鮮な培地を各ウェルに加える。試験対象の化合物を最後に加え、プレートを24〜48時間インキュベートする(37℃/5% CO2)。MTS (Promega, Madison, WI)を各ウェルに加え、1〜4時間インキュベートする。次いで、細胞数に比例する490nmでの吸光度を測定して、コントロールウェルと試験化合物含有ウェルの間の増殖の差異を決定する。同様のアッセイ系を培養済み接着性腫瘍細胞を用いてセットアップすることができる。しかし、この形式ではコラーゲンは省略してもよい。腫瘍細胞(例えば3,000〜10,000/ウェル)をプレートし、一晩付着させる。次いで、血清を含まない培地をウェルに加え、該細胞を24時間同調させる。次いで、10% FBSを含有する培地を各ウェルに加えて増殖を刺激する。試験対象の化合物をいくつかのウェルに含ませる。24時間後、MTSをプレートに加え、上記のようにアッセイを展開し、読み取りを行う。
【００３１】
5.2.5  カスパーゼ-3活性
カスパーゼ-3の活性化を測定することによって、本発明の化合物がECのアポトーシスを促進する能力を決定してよい。I型コラーゲン(ゼラチン)を使用してPlOOプレートをコーティングし、10% FBSを含有するEGM中に5x105 ECを播種する。24時間(5% CO2中で37℃で)後、培地を、2% FBS、10 ng/ml bFGFおよび所望の試験化合物を含有するEGMに取り替える。細胞を6時間後に回収し、1% Triton中で細胞ライセートを調製し、EnzChek (登録商標) Caspase-3 Assay Kit #1 (Molecular Probes, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を使用してアッセイする。該キットは製造元の指示書にしたがって使用する。
【００３２】
5.2.6  角膜血管新生モデル
使用されるプロトコルは、Volpert et al., J. Clin. Invest. 1996, 98:671-679に記載のプロトコルと本質的に同一である。簡潔に言えば、雌性Fischerラット(120〜140グラム)を麻酔し、Hydronペレット(Kenyon et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 1996, 37:1625-1632のように、既知の量のCpGオリゴデオキシヌクレオチド、スクラルファート(10 mg, Bulch Meditec, Vaerlose, Denmark)、およびhydronポリマーをエタノール中で混合し(120 mg/1 mlエタノール; Interferon Sciences, New Brunswick, NJ)、該混合物を15 x 15 mm2片の網目状合成織物(synthetic mesh) (Sefar America, Inc., Kansas City, MO)に適用することによって作成された角膜内挿入用のペレット)、bFGF (150 nM)、および試験対象の化合物からなるペレット(5μl)を、縁から1.0〜1.5 mmの角膜に施された小さい切開内に移植する。移植後5および7日の時点で血管新生を評価する。7日目に、動物を麻酔し、色素、例えばコロイド状炭素を注入して、血管を染色する。次いで動物を安楽死させ、角膜をホルマリンで固定し、その角膜を平らにし、写真撮影して、血管新生の程度を評価する。総血管領域のイメージングまたは長さまたは単に血管をカウントすることによって新規血管を定量してよい。
【００３３】
5.2.7  MATRIGELTMプラグアッセイ
このアッセイは、本質的にPassaniti et al., 1992, Lab 15 Invest. 67:519-528に記載のように実施する。氷冷MATRIGELTM (例えば500μL) (Collaborative Biomedical Products, Inc., Bedford, MA)を、ヘパリン(例えば50μg/ml)、FGF-2 (例えば400 ng/ml)および試験対象の化合物と混合する。いくつかのアッセイでは、血管新生刺激として、bFGFを腫瘍細胞で置き換えてもよい。MATRIGELTM混合物を4〜8週齢胸腺欠損ヌードマウスの腹部正中付近の部位に皮下注射し、好ましくはマウス１匹につき3回注射する。注射されたMATRIGELTMは触診可能な固形ゲルを形成する。注射部位は、各動物がポジティブコントロールプラグ(例えばFGF-2 +ヘパリン)、ネガティブコントロールプラグ(例えばバッファー+ヘパリン)および、血管新生に対するその効果に関する試験対象の化合物を含むプラグ、例えば(FGF-2 +ヘパリン+化合物)を受けるように選択される。すべての治療を好ましくは3回実行する。注射後約7日目、または血管新生の観察に最適な別の時点で、動物を頸椎脱臼によって殺す。マウス皮膚を腹部正中に沿って分離し、MATRIGELTMプラグを回収し、すぐに高分解能でスキャンする。次いでプラグを水に分散させ、37℃で一晩インキュベートする。Drabkin溶液(例えばSigmaから入手)を製造元の指示書にしたがって使用してヘモグロビン(Hb)レベルを決定する。プラグ中のHbの量は血管新生の間接的な尺度である。それがサンプル中の血液の量を反映するからである。さらに、またはあるいは、動物を殺す前に、フルオロフォアがコンジュゲートされている高分子量デキストランを含有する0.1 mlバッファー(好ましくはPBS)を注射してよい。分散されたプラグ中の蛍光の量を蛍光定量によって決定すると、それもまた、プラグ中の血管新生の尺度として役立つ。mAb抗CD31 (CD31は「血小板-内皮細胞接着分子またはPECAM」である)を用いる染色を使用して、プラグ中の新規血管形成および微小血管密度を確認してもよい。
【００３４】
5.2.8  ニワトリ絨毛尿膜(CAM)血管新生アッセイ
このアッセイは、本質的にNguyen et al., Microvascular Res. 1994, 47:31-40に記載のように実施する。血管新生因子(bFGF)または腫瘍細胞に加えてインヒビターを含有するメッシュを8日齢のニワトリ胚のCAM上に配置し、サンプルの移植後3〜9日間、該CAMを観察する。血管を含有するメッシュの目のパーセンテージを決定することによって血管新生を定量する。
【００３５】
5.2.9  腫瘍細胞を用いるMatrigel(登録商標)プラグアッセイを使用する血管新生阻害および抗腫瘍効果のin vivo評価
このアッセイでは、腫瘍細胞、例えば1〜5 x 106細胞の3LLルイス肺癌腫またはラット前立腺セルラインMatLyLuをMatrigelTMと混合した後、マウスの側腹部に注射する。それは上記セクション5.2.7に記載のプロトコルにしたがって行う。約5〜7日後にプラグにおいて腫瘍細胞の質量および強力な血管新生応答を観察することができる。実際の腫瘍環境における化合物の抗腫瘍および抗血管新生作用は、それをプラグ中に含ませることによって評価することができる。その後の測定は、腫瘍重量、Hbレベルまたは(殺す前に注射されたデキストラン-フルオロフォアコンジュゲートの)蛍光レベルから構成される。Hbまたは蛍光を測定するために、まず組織ホモジナイザーを用いてプラグをホモジナイズする。
【００３６】
5.2.10  皮下(s.c.)腫瘍成長の異種移植モデル
ヌードマウスに対して、動物の右側腹部にMDA-MB-231細胞(ヒト乳癌)およびMatrigelTM (0.2mL中1 x 106細胞)をs.c.接種する。腫瘍を200 mm3に成長させた後、試験組成物での治療を開始する(1OOμg/動物/日でq.d. i.p. [腹腔内]投与)。腫瘍容量を1日おきに取得し、2週の治療の後に動物を殺す。腫瘍を切り出し、重量を測定し、パラフィンに包埋する。腫瘍の組織学的切片をHおよびE [ヘマトキシリン-および-エオシン]、抗CD31、Ki-67、TUNEL、およびCD68染色によって分析する。
【００３７】
5.2.11  転移の異種移植モデル
さらに、実験的転移モデルを使用して、本発明の化合物を後期転移の阻害に関して試験する(Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90:5021-5025)。後期転移には、腫瘍細胞の付着および血管外遊出、局所浸潤、播種、増殖および血管新生の段階が関与する。レポーター遺伝子、好ましくは緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、代替物としては酵素クロラムフェニコールアセチル-トランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼまたはLacZをコードする遺伝子でトランスフェクトされたヒト前立腺癌腫細胞(PC-3)をヌードマウス内に接種する。このアプローチにより、これらのマーカーを利用(GFPの蛍光検出または酵素活性の組織化学的比色検出)して、これらの細胞の運命を追跡することが可能になる。好ましくはi.v.で細胞を注射し、特に肺においてであるが、リンパ節、大腿および脳の領域においても約14日後に転移が確認される。これは、ヒト前立腺癌において天然に存在する転移の器官向性を模倣する。例えば、GFP発現PC-3細胞(マウス１匹あたり1 x 106細胞)をヌード(nu/nu)マウスの尾静脈内にi.v.注射する。100μg/動物/日の試験組成物をq.d. i.p.投与して動物を治療する。単一転移細胞および病巣を、蛍光顕微鏡観察または光学顕微鏡による組織化学または組織の粉砕および検出可能な標識の定量的比色アッセイによって、視覚化し定量する。
【００３８】
5.2.12  PHSCNおよび機能的誘導体によるin vivo自然転移の阻害
ラット同系(syngeneic)乳癌系ではMat BIIIラット乳癌細胞を使用する(Xing et al., Int. J. Cancer 1996, 67:423-429)。腫瘍細胞、例えば0.1 mL PBS中に懸濁された約106を、雌性Fisherラットの乳房脂肪体内に接種する。接種の時点で、試験化合物を分配するための14-day Alza浸透ミニポンプ(osmotic mini-pump) (Mountain View, CA)を腹腔内に移植する。化合物をPBSに溶解し(例えば200 mMストック)、滅菌ろ過し、ミニポンプ中に配置し、約4 mg/kg/日の放出速度を達成する。コントロール動物はミニポンプ中のビヒクル(PBS)単独またはビヒクルコントロールペプチドを受ける。約14日目に動物を殺す。本発明の化合物で治療されたラットでは、原発腫瘍のサイズおよび、脾臓、肺、肝臓、腎臓およびリンパ節(これらは別個の病巣として列挙される)における転移の数の顕著な減少が観察されるであろう。組織学的および免疫組織化学的分析では、治療された動物の腫瘍における壊死の増加およびアポトーシスの徴候が示される。血管新生を欠いている腫瘍領域に大規模な壊死領域が見られる。131Iがコンジュゲート(ペプチド１分子あたり1または2個のI原子)されているヒトまたはウサギPHSCNおよびそれらの誘導体は有効な放射線療法薬であり、非コンジュゲート型ポリペプチドより少なくとも2倍強力であることが見出されている。対照的に、コントロールペプチドでの治療は腫瘍サイズまたは転移の大きな変化を生じさせない。
【００３９】
5.2.13  LL ルイス肺癌腫: 原発腫瘍成長
この腫瘍系統はC57BL/6マウスにおいて肺の癌腫として自然に生じたものである(Malave et al., J. Nat'l. Canc. Inst. 1979, 62:83-88)。それを皮下(s.c.)接種によりC57BL/6マウスにおいて継代することによって増殖させ、半同種(semiallogeneic) C57BL/6 x DBA/2 F1マウスまたは同種(allogeneic) C3Hマウスにおいて試験する。典型的に、皮下(s.c.)移植に関して１群あたり6動物、または筋肉内(i.m.)移植に関して10動物を使用する。腫瘍は、2〜4 mm断片としてsc移植するか、あるいは約0.5〜2 x 106細胞の懸濁細胞の種菌としてi.m.またはs.c.移植してよい。治療は移植24時間後に開始するか、あるいは指定サイズ(通常約400 mg)の腫瘍が触診できるまで遅らせる。11日間毎日、試験化合物をi.p.投与する。動物は、重量測定、触診、および腫瘍サイズの測定を受ける。無治療コントロールレシピエントにおけるi.m.接種後12日目の典型的な腫瘍重量は500〜2500 mgである。典型的な生存期間の中央値は18〜28日である。ポジティブコントロール化合物、例えばシクロフォスファミドを1日あたり20 mg/kg/injectionで、1〜11日目に使用する。算入される結果には、平均動物体重、腫瘍サイズ、腫瘍重量、生存期間が含まれる。治療活性の確認に関して、該試験組成物を2複数用量アッセイ(two multi-dose assays)において試験すべきであろう。
【００４０】
5.2.14  3LLルイス肺癌腫: 原発腫瘍成長および転移モデル
このアッセイは当技術分野において周知である(Gorelik et al., J. Nat 'l. Canc. Inst. 1980, 65:1257-1264; Gorelik et al., Rec. Results Canc. Res. 1980, 75:20-28; Isakov et al., Invasion Metas. 2:12-32 (1982); Talmadge et al., J. Nat'l. Canc. Inst. 1982,69:975-980; Hilgard et al., Br. J. Cancer 1977, 35:78-86)。試験マウスは雄性C57BL/6マウス、2〜3月齢である。s.c.、i.m.、または足蹠内移植後、この腫瘍は、選択的に肺において、転移を生じる。この腫瘍のいくつかの系統では、原発腫瘍が抗転移効果を発揮し、転移相を研究する前にまず切り出す必要がある(U.S. Patent No. 5,639,725をさらに参照のこと)。
【００４１】
細かく刻んだ腫瘍組織を0.3%トリプシンの溶液で処理することによって、固形腫瘍から単一細胞懸濁液を調製する。細胞をPBS (pH 7.4)で3回洗浄し、PBS中に懸濁する。このように調製された3LL細胞の生存度は一般に約95〜99%である(トリパンブルー色素排除に基づく)。0.05 ml PBS中に懸濁された生存腫瘍細胞(3 x 104〜5 x 106)を、C57BL/6マウスの背側領域に、または一方の後ろの足蹠内に皮下注射する。106細胞の背側s.c.注射の3〜4日後に可視の腫瘍が出現する。腫瘍が出現した日および確立された腫瘍の直径を2日おきにカリパスによって測定する。この治療を、１週あたり1〜5用量のペプチドまたは誘導体として施す。別の実施形態では、浸透ミニポンプによってペプチドを送達する。
【００４２】
背側腫瘍の腫瘍切除を含む実験では、腫瘍のサイズが約1500 mm3に達した時点で、マウスを無作為に以下の2群に分ける: (1) 原発腫瘍が完全に切除されている群; または(2) 偽手術を実施し、腫瘍が無傷のままである群。500〜3000 mm3の腫瘍は転移の成長を阻害するが、1500 mm3は、高い生存性を有し、局所的な再成長を伴わずに安全に切除できる最大サイズの原発腫瘍である。21日後、すべてのマウスを殺して剖検する。
【００４３】
肺を取り出して重量を測定する。肺をBouin溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中で固定し、可視の転移の数を記録する。さらに、マイクロメータ含有接眼レンズを装備した双眼ステレオスコープを8X拡大率下で使用して、転移の直径を測定する。記録された直径に基づいて、各転移の容量を計算することが可能である。肺あたりの転移の総容量を決定するために、可視の転移の平均数に転移の平均容量を乗じる。転移成長をさらに決定するために、肺細胞内への125IdUrd (ヨードデオキシウリジン)の取り込みを測定することが可能である(Thakur et al., J. Lab. Clin. Med. 1977, 89:217 228)。腫瘍切断の10日後、25μgのフルオロデオキシウリジンを担癌動物(および、使用するならば、腫瘍切除マウス)の腹膜内に接種する。30分後、マウスに1μCiの125IdUrdを投与する。1日後、肺および脾臓を取り出して重量を測定し、ガンマカウンターを使用して125IdUrd取り込みの程度を測定する。
【００４４】
足蹠腫瘍を有するマウスでは、腫瘍の直径が約8〜10 mmに達した時点で、マウスを無作為に以下の2群に分ける: (1) 膝関節の上を結紮した後、腫瘍を有する脚を切断する群; または(2) マウスを非切断担癌動物コントロールとして無傷のままにする群。(担癌マウスの腫瘍を有さない脚の切断は、以後の転移に関して既知の影響を有さないので、麻酔、ストレスまたは外科手術の影響の可能性が排除される)。切断の10〜14日後にマウスを殺す。上記のように転移を評価する。
【００４５】
統計学: 担癌マウスの肺における転移の発生率およびそれらの成長を示す値は正規分布しない。したがって、ノンパラメトリック統計学、例えばマン-ホイットニーU検定を分析に使用してよい。Gorelik et al. (1980, 上記)によるこのモデルの研究では、腫瘍細胞種菌のサイズが転移成長の程度を決定することが示された。術後マウスの肺における転移の割合は原発腫瘍を有するマウスと異なっていた。ゆえに、大量の3LL細胞(1〜5 x 106)の接種によって原発腫瘍が誘発され、その後、それが外科手術により除去されたマウスの肺では、未手術の担癌マウスにおいてより転移の数が少なく、一方、転移の容量は未手術のコントロールにおいてより大きい。125IdUrd取り込みを肺転移の尺度として使用すると、元々106 3LL細胞が接種された腫瘍切除マウスおよび担癌マウスの肺の間で有意差は見出されなかった。105腫瘍細胞の接種後に腫瘍の切断を施すと転移成長が劇的に促進された。これらの結果は局所腫瘍の切除後のマウスの生存と一致した。局所腫瘍の切除後に転移成長が促進される現象は繰り返し観察されている(例えばU. S. Patent No. 5,639,725を参照のこと)。これらの観察は、癌の外科手術を受ける患者の予後に関して影響を有する。
【００４６】
5.3  Ac-PHSCN-NH2塩の治療上の使用
本発明では、Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物を、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患または障害を患う患者、好ましくは動物に投与し、該動物には、非限定的に、ヒト、哺乳類、または非ヒト動物、例えばウシ(cow)、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ(fowl)、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、等が含まれ、より好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトである。異常な脈管形成または異常な血管新生には、異常血管新生(abnormal neovascularization)、例えば新規血管、大きい血管、分枝が多い血管の形成および、不適当であるか、あるいは血管新生が疾患または障害の存在または進行を支援するか、あるいはそれに必要である患部組織または部位への血液運搬能を増加させる任意の他の機構が含まれる。Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物を使用して、異常な脈管形成または異常な血管新生を治療してよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患には、癌(例えば、任意の脈管形成腫瘍、好ましくは固形腫瘍、例えば非限定的に、肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管(bilary tract)、結腸、直腸、（子宮）頸部、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺の癌腫、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌腫、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫(例えば血管肉腫、軟骨肉腫))、関節炎、糖尿病、動脈硬化、動静脈の、形成異常、角膜移植片血管新生、創傷治癒の遅延、糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性、肉芽、やけど、血友病関節、関節リウマチ、肥厚性瘢痕、血管新生緑内障、骨癒合不全骨折、Osier Weber症候群、乾癬、化膿性、肉芽腫、水晶体後線維増殖、翼状片、強皮症、トラコーマ、血管癒着(vascular adhesions)、眼球血管新生、寄生虫症、外科手術後の肥大、毛髪の成長阻害、黄斑変性(滲出型および萎縮型の両者を含む)、関節リウマチおよび骨関節炎が含まれる。他の実施形態では、異常な脈管形成および異常な血管新生によって特徴付けられる疾患には、癌、黄斑変性、クローン病および関節リウマチが含まれる。
【００４８】
さらに、特定の実施形態では、Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物を、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる種々の疾患または障害に対する予防措置として、患者、好ましくはヒトに投与する。ゆえに、Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物は、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患にかかりやすい患者に対する予防措置として投与してよい。したがって、Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物は、ある疾患または障害の予防および同時に別の疾患または障害の治療に使用してよい(例えば、癌の治療中に関節炎を予防する)。
【００４９】
5.4  治療/予防的投与
Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物は、ヒト医学または獣医学において好都合に使用してよい。上記セクション5.3ですでに記載されているように、Ac-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物は、異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる種々の疾患または障害の治療または予防に有用である。
【００５０】
上記疾患または障害を治療または予防するために使用される場合、医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を、単独で、または他の物質と組み合わせて、投与または適用してよい。医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩は、単独で、1種以上の他の医薬活性物質(例えば他の抗癌剤、他の抗血管新生剤、例えばキレート剤、例えば亜鉛、ペニシラミン、チオモリブダート等)と組み合わせて、投与または適用してもよい。他の医薬活性物質には、本明細書中に記載の他の酸付加塩が含まれる。
【００５１】
1種以上のAc-PHSCN-NH2塩を含む医薬組成物中に場合により含まれているAc-PHSCN-NH2塩を経口投与してよい。医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩は、任意の他の好都合な経路、例えば、注入またはボーラス注入、上皮または粘膜皮膚の内膜(例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜、等)を通過する吸収によって投与してもよい。投与は全身性または局所性でありうる。種々の送達系(例えばリポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、カプセル、等)を使用して、本発明の化合物および/または医薬組成物を投与してよい。投与方法には、非限定的に、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、経直腸、吸入による投与、または、特に耳、鼻、眼、または皮膚への、局所投与が含まれる。好ましい投与様式は開業医の裁量に委ねられ、部分的には医学的症状の部位に依存する。ほとんどの場合、投与によって、本発明の化合物および/または医薬組成物が血流内へ放出される。
【００５２】
特定の実施形態では、1種以上のAc-PHSCN-NH2塩および/またはその医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、非限定的に、外科手術中の局所注入、局所適用、例えば外科手術後の創傷包帯と併用の局所適用、注射、カテーテル方式、坐剤方式、またはインプラント方式によって達成してよく、該インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン質の材料のインプラントであり、それには、メンブレン、例えばsialasticメンブレン、またはファイバーが含まれる。一実施形態では、癌または関節炎の部位(または以前の部位)での直接注射によって投与を行うことができる。
【００５３】
特定の実施形態では、場合により医薬組成物中に含まれている1種以上のAc-PHSCN-NH2塩を、任意の好適な経路、例えば脳室内、くも膜下腔内および硬膜外注射によって中枢神経系内に導入することが望ましいことがある。脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバ等のリザーバに取り付けられている脳室内カテーテルによって促進できる
。
【００５４】
場合により医薬組成物中に含まれているAc-PHSCN-NH2塩は、吸入によって肺に直接投与してもよい。吸入による投与では、塩および/またはその医薬組成物を、好都合に、いくつかの種々の装置によって肺に送達してよい。例えば、好適な低沸点噴射剤(例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または任意の他の好適なガス)を含有するカニスターを利用する定量吸入器(「MDI」)を使用して、本発明の化合物を肺に直接送達してよい。
【００５５】
別法では、乾燥粉末吸入器(「DPI」)装置を使用して、場合により医薬組成物中に含まれているAc-PHSCN-NH2塩を肺に投与してよい。DPI装置では、ガスのバースト等の機構を典型的に使用して、容器の内側で乾燥粉末の煙(cloud)を生じさせる。そして患者はそれを吸入してよい。DPI装置はまた、当技術分野において周知である。よく知られているバリエーションは複数用量DPI (「MDDPI」)系であり、それによって2以上の治療用量の送達が可能になる。MDDPI装置は、AstraZeneca、Glaxo Wellcome、IVAX、Schering Plough、SkyePharmaおよびVectura等の企業から入手可能である。例えば、Ac-PHSCN-NH2塩およびこれらの系に好適な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有する、吸入器または空気吸入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化してよい。
【００５６】
医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を肺へ送達するために使用しうる別のタイプの装置は、例えばAradigm Corporation (Hayward, CA)によって供給される液体スプレー装置である。液体スプレー系では、極めて小さいノズルホールを使用して液状薬物製剤をエアロゾル化する。そして該エアロゾルは肺内に直接吸入してよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、噴霧器を使用して、医薬組成物中に含まれていてよい本発明の化合物を肺に送達する。噴霧器では、例えば超音波エネルギーを使用して、容易に吸入される微粒子を形成させることによって、液状薬物製剤からエアロゾルが作成される(例えばVerschoyle et al., British J. Cancer, 1999, 80, Suppl. 2, 96 (該文献は参照により本明細書中に組入れられる)を参照のこと)。噴霧器の例には、Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd. (Armer et al., United States Patent No. 5,954,047; van der Linden et al., United States Patent No. 5,950,619; van der Linden et al., United States Patent No. 5,970,974を参照のこと)およびBatelle Pulmonary Therapeutics (Columbus, Ohio)によって供給される装置が含まれる。
【００５８】
他の実施形態では、エレクトロハイドロダイナミック(「EHD」)エアロゾル装置を使用して、医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を肺に送達してよい。EHDエアロゾル装置は電気エネルギーを使用して液状薬物溶液または懸濁液をエアロゾル化する(例えばNoakes et al., United States Patent No. 4,765,539を参照のこと)。EHDエアロゾル装置は、既存の肺送達テクノロジーより高い効率で薬物を肺に送達する可能性がある。
【００５９】
他の実施形態では、医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を小胞、特にリポソーム中で送達することができる(Langer, 1990, Science, 249:1527-1533; Treat et al., in "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer," Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989)を参照のこと; 一般には"Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer," Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989)を参照のこと)。
【００６０】
さらに他の実施形態では、医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を持続放出系、好ましくは経口持続放出系によって送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してよい(Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit Ref Biomed Eng. 14:201; Saudek et al., 1989, N. Engl. J Med. 321:574を参照のこと)。
【００６１】
さらに他の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる("Medical Applications of Controlled Release," Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); "Controlled Drug Bioavailability," Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J Macromol. Sci. Rev. Macromol Chem. 23:61を参照のこと; さらにLevy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照のこと)。さらに他の実施形態では、ポリマー材料を経口持続放出送達に使用する。好ましいポリマーには、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース(最も好ましくはヒドロキシプロピルメチルセルロース)が含まれる。他の好ましいセルロースエーテルが報告されている(Alderman, Int. J. Pharm. Tech. & Prod. Mfr., 1984, 5(3) 1-9)。薬物放出に影響する要因は当業者に周知であり、当技術分野において報告されている(Bamba et al., Int. J. Pharm., 1979, 2:307)。
【００６２】
さらに他の実施形態では、腸溶コーティング調製物を経口持続放出投与に使用することができる。好ましいコーティング材料には、pH依存的溶解性を有するポリマー(すなわちpH制御放出)、緩徐な割合またはpH依存的割合の膨張、溶解または侵食を伴うポリマー(すなわち時間制御放出)、酵素によって分解されるポリマー(すなわち酵素制御放出)および圧力の増加によって破壊される硬い層を形成するポリマー(すなわち圧力制御放出)が含まれる。
【００６３】
さらに他の実施形態では、浸透送達系(osmotic delivery systems)が経口持続放出投与に使用される(Verma et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 2000, 26:695-708)。さらに他の実施形態では、OROS(登録商標) (ALZA Corp., Mountain View, CA)浸透装置が経口持続放出送達装置に使用される(Theeuwes et al., United States Patent No. 3,845,770; Theeuwes et al., United States Patent No. 3,916,899)。
【００６４】
さらに他の実施形態では、本発明の化合物および/または医薬組成物の標的付近に制御放出系を配置することができ、ゆえに全身性用量の一部分しか必要とされない(例えばGoodson, in "Medical Applications of Controlled Release," supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照のこと)。Langer, 1990, Science 249:1527-1533で考察されている他の制御放出系を使用してもよい。
【００６５】
5.5  医薬組成物
本医薬組成物は、治療有効量の1種以上の、好ましくは精製型の、Ac-PHSCN-NH2塩を、好適な量の製薬的に許容しうるビヒクルとともに含有する。該ビヒクルは患者に対する適正な投与のための剤形を提供するために含まれる。患者に投与される場合、Ac-PHSCN-NH2塩および製薬的に許容しうるビヒクルは好ましくは滅菌されている。本発明の化合物が静脈内投与される場合、水は好ましいビヒクルである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液を液状ビヒクルとして使用することもでき、それは特に注射溶液に関する。好適な医薬用ビヒクルには、賦形剤、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉(flour)、胡粉(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等も含まれる。本医薬組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することもできる。さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤を使用してよい。
【００６６】
Ac-PHSCN-NH2塩を含む医薬組成物は、慣用の混合、溶解、造粒、糖衣錠作成(dragee-making)、粉末化(levigating)、乳化、カプセル化、包括化(entrapping)または凍結乾燥プロセスを用いて製造できる。医薬組成物は、本発明の化合物を医薬的に使用可能な調製物に加工することを容易にする1種以上の生理学的に許容しうる担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して、慣用の様式で製剤化してよい。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【００６７】
本医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉末、持続放出製剤、坐剤、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液の剤形、または使用に好適な任意の他の剤形をとりうる。いくつかの実施形態では、製薬的に許容しうるビヒクルはカプセルである(例えばGrosswald et al., United States Patent No. 5,698,155を参照のこと)。好適な医薬用ビヒクルの他の例は当技術分野において報告されている(Remington's Pharmaceutical Sciences, Philadelphia College of Pharmacy and Science, 17th Edition, 1985を参照のこと)。
【００６８】
局所投与用には、当技術分野において周知であるように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液、等としてAc-PHSCN-NH2塩を製剤化してよい。全身性製剤には、注射、例えば皮内、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内または腹腔内注射による投与のために設計された製剤、ならびに経皮、経粘膜、経口または肺投与のために設計された製剤が含まれる。気道粘液の粘液線毛クリアランスを改善するか、あるいは粘膜の粘性を低減する追加の活性物質と組み合わせて全身性製剤を作成してよい。これらの活性物質には、非限定的に、ナトリウムチャネルブロッカー、抗生物質、N-アセチルシステイン、ホモシステインおよびリン脂質が含まれる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、通常の手順にしたがって、ヒトに対する静脈内投与に合わせた医薬組成物としてAc-PHSCN-NH2塩を製剤化する。典型的に、静脈内投与用のAc-PHSCN-NH2塩は滅菌等張水性バッファー中の溶液である。注射用には、水性溶液、好ましくは生理適合性バッファー、例えばハンクス液、リンガー液、または生理食塩水バッファー中でAc-PHSCN-NH2塩を製剤化してよい。該溶液には、製剤化物質(formulatory agents)、例えば懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤を含有させてよい。必要な場合、該医薬組成物に可溶化剤を含ませてもよい。静脈内投与用の医薬組成物には、場合により、注射部位の痛みを緩和するために局所麻酔薬、例えばリグノカインを含ませてよい。一般に、該成分は、別個に供給されるか、あるいは、例えば活性物質の量を表示するアンプルまたは小袋(sachette)等の密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、単位投与剤形中で一緒に混合される。Ac-PHSCN-NH2塩が注入によって投与される場合、例えば滅菌医薬品等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いてそれを分配することができる。Ac-PHSCN-NH2塩が注射によって投与される場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供して、投与前に前記成分を混合してよいようにすることができる。
【００７０】
経粘膜投与用には、透過対象の障壁に適切な浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知である。
【００７１】
経口送達用の医薬組成物は、例えば錠剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、顆粒、粉末、エマルジョン、カプセル、シロップ、またはエリキシルの剤形であってよい。経口投与される医薬組成物には、1種以上の選択物質、例えば甘味剤、例えばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリン; 香味物質、例えばペパーミント、冬緑油、またはサクランボ着色剤および保存剤を含有させて、製薬的に美味な調製物を提供してよい。さらに、錠剤または丸剤の剤形中では、組成物をコーティングして消化管における崩壊および吸収を遅延させることができ、それによって長期間にわたる持続作用を提供しうる。また、浸透活性推進化合物(osmotically active driving compound)を包む選択透過膜は本発明の経口投与化合物に好適である。これらの後者のプラットフォームでは、カプセル周囲の環境から該推進化合物によって液体が吸収され、それは膨張して、孔を通して該物質または物質組成物を移動させる。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤の急増プロファイルとは対照的に、本質的にゼロ次の送達プロファイルを提供することができる。時間遅延材料、例えばグリセロールモノステアラートまたはグリセロールステアラートを使用してもよい。経口組成物には、標準的ビヒクル、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、等を含ませることができる。そのようなビヒクルは好ましくは医薬品等級である。
【００７２】
経口液状調製物、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液に関して、適切な担体、賦形剤または希釈剤には、水、生理食塩水、アルキレングリコール(例えばプロピレングリコール)、ポリアルキレングリコール(例えばポリエチレングリコール) 油、アルコール、pH 4〜pH 6の範囲のわずかに酸性のバッファー(例えば約5.0 mM〜約50.0 mMの範囲の酢酸バッファー、クエン酸バッファー、アスコルビン酸バッファー)等が含まれる。さらに、香味物質、保存剤、着色剤、胆汁酸塩、アシルカルニチン等を加えてよい。
【００７３】
バッカル投与用には、本医薬組成物は、慣用の様式で製剤化される錠剤、ロゼンジ、等の剤形をとってよい。
【００７４】
噴霧器および液体スプレー装置およびEHDエアロゾル装置を用いる使用に好適な液状薬物製剤には、典型的に、本発明の化合物が製薬的に許容しうるビヒクルとともに含まれる。好ましくは、該製薬的に許容しうるビヒクルは、液状物、例えばアルコール、水、ポリエチレングリコールまたはパーフルオロカーボンである。場合により、別の材料を加えて、本発明の化合物の溶液または懸濁液のエアロゾル特性を変化させてよい。好ましくは、この材料は、液状物、例えばアルコール、グリコール、ポリグリコールまたは脂肪酸である。エアロゾル装置における使用に好適な液状薬物溶液または懸濁液を製剤化する他の方法は当業者に公知である(例えばBiesalski, United States Patent No. 5,112,598; Biesalski, United States Patent No. 5,556,611を参照のこと)。
【００７５】
Ac-PHSCN-NH2塩は、例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤を含有する坐剤または貯留浣腸(retention enemas)等の経直腸または経膣医薬組成物中で製剤化してもよい。以前に記載の製剤に加えて、Ac-PHSCN-NH2塩をデポー調製物として製剤化してもよい。そのような長時間作用性製剤は、(例えば皮下または筋肉内)移植または筋肉内注射によって投与してよい。ゆえに、例えば、好適なポリマー材料または疎水性材料(例えば許容しうる油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂とともに、あるいはやや難溶の誘導体、例えばやや難溶の塩としてAc-PHSCN-NH2塩を製剤化してよい。
【００７６】
最後に、Ac-PHSCN-NH2塩は、Mazar et al., 表題"Improved Formulations of Anti-Angiogenic Peptides", United States Provisional Application Serial No. 60/648,391, February 1, 2005提出, およびInternational Application No. 未定, February 1, 2006提出(Attorney Docket No. 28932.0013)の両同時係属出願に記載のように製剤化してよい。該各文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。使用可能な製剤は、自発的な直列二量体化または高次オリゴマー形成に対してAc-PHSCN-NH2塩を安定化する追加の化合物を含む。ゆえに、本出願に記載の任意の医薬組成物には、1種以上のそのような追加の化合物をさらに含ませてよい。好ましくは、該追加の化合物は、pK約5を有する生体適合性酸バッファーであり、例えばクエン酸バッファー、酢酸バッファーまたは2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)である。該酸バッファーは、好ましくは約25 mMまたは50 mMの濃度のクエン酸バッファーである。該バッファーには、賦形剤および増量剤として、好ましくは約50 mg/mlの濃度でグリシンを補充してよい。該製剤には1種以上の還元剤、例えばジチオスレイトール β-メルカプトエタノール、またはグルタチオンをさらに含ませてよい。該製剤には、溶解保護量、例えば約50〜600モル溶解保護剤: 1モルペプチドで存在する溶解保護剤(lyoprotectant)を含ませてもよい。該溶解保護剤は、1種以上の糖(例えばショ糖またはトレハロース)、1種以上のアミノ酸(例えばグルタミン酸1ナトリウムまたはヒスチジン)、1種以上のメチルアミン(例えばベタイン)、1種以上の離液性の塩(例えば硫酸マグネシウム)、および/または1種以上のポリオール(例えばグリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、およびプロピレングリコール)である。
【００７７】
5.6  用量
Ac-PHSCN-NH2塩、またはその医薬組成物は、一般的に、意図される目的を達成するために有効な量で使用される。異常な脈管形成または異常な血管新生によって特徴付けられる疾患または障害を治療または予防するための使用に関して、医薬組成物中に含まれていてよい該Ac-PHSCN-NH2塩は治療有効量で投与または適用される。
【００７８】
本明細書中で開示される特定の障害または症状の治療において有効なAc-PHSCN-NH2塩の量は、該障害または症状の性質に依存し、前記のような当技術分野において公知の標準的臨床技術によって決定することができる。さらに、in vitroまたはin vivoアッセイを場合により使用して、最適な用量範囲の特定を支援してよい。Ac-PHSCN-NH2塩の投与量は、当然、他の要因の中でもとりわけ、治療対象の被験者、被験者の体重、苦痛の重症度、投与様式および処方する医師の判断に依存する。
【００７９】
例えば、該用量は医薬組成物中で単一投与、複数回適用または制御放出によって送達してよい。投薬は断続的に繰り返してよく、単独であるいは他の薬物と組み合わせて提供してよく、疾患状態または障害の有効な治療に必要とされる期間、継続してよい。
【００８０】
経口投与に好適な用量範囲は該薬物の効力に依存するが、一般には、体重1キログラムあたり0.001 mg〜200 mg、好ましくは0.01 mg〜50 mg、より好ましくは0.1〜50 mgの範囲の本発明の化合物である。用量範囲は、通常の当業者に公知の方法によって容易に決定されよう。
【００８１】
静脈内(i.v.)投与に好適な用量範囲は、体重1キログラムあたり約0.01 mg〜約100 mgである。鼻腔内投与に好適な用量範囲は、一般的に0.01 mg/体重1 kg〜50 mg/体重1 kgまたは0.10 mg/体重1 kg〜10 mg/体重1 kgである。坐剤は、一般的に、体重1キログラムあたり約0.01ミリグラム〜約50ミリグラムの範囲の本発明の化合物を含有し、約0.5重量%〜約10重量%の範囲の活性成分を含む。皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下または脳内投与の推奨用量は、体重1 kgあたり約0.001 mg〜約200 mgの範囲である。有効量は、in vitroまたは動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿してよい。そのような動物モデルおよび系は当技術分野において周知である。
【００８２】
特定の実施形態では、投与用量は体重に基づかず、例えば1服あたり1〜1000 mgの範囲の絶対量である。特定の実施形態では、該用量は1服あたり10〜750 mg、例えば1服あたり20 mg、100 mg、または600 mgである。特定の実施形態では、該用量が週に1〜数(例えば2、3、4、または7)回投与される。
【００８３】
Ac-PHSCN-NH2塩は、好ましくは、所望の治療または予防活性に関して上記のようにin vitroおよびin vivoでアッセイされた後に、ヒトにおいて使用される。例えば、in vitroアッセイを使用して、異常な脈管形成によって特徴付けられる疾患の治療にAc-PHSCN-NH2塩またはAc-PHSCN-NH2塩群の組み合わせの投与が好ましいかどうかを決定することができる。動物モデル系を使用して、該Ac-PHSCN-NH2塩が有効および安全であることを実証してもよい。
【００８４】
好ましくは、本明細書中に記載の治療有効量のAc-PHSCN-NH2塩は、実質的な毒性を生じさせることなく治療上の利益をもたらす。
【００８５】
Ac-PHSCN-NH2塩の毒性は標準的製薬手順を使用して決定でき、それは当業者によって容易に確かめられよう。毒作用および治療効果の間の用量比は治療係数である。Ac-PHSCN-NH2塩は、好ましくは、疾患および障害の治療において特に高い治療係数を示す。本明細書中に記載のAc-PHSCN-NH2塩の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全く有さない有効量を含む循環濃度の範囲内である。
【００８６】
5.7  併用療法
特定の実施形態では、医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩を、Ac-PHSCN-NH2の酸付加塩ではない少なくとも1種の他の治療物質との併用療法において使用することができる。該他の治療物質は、例えば、併用される該酸付加塩ではない。医薬組成物中に含まれていてよいAc-PHSCN-NH2塩、および該治療物質は、相加的または、より好ましくは相乗的に作用しうる。いくつかの実施形態では、場合により医薬組成物中に含まれているAc-PHSCN-NH2塩を、別の治療物質の投与と同時に投与する。他の実施形態では、Ac-PHSCN-NH2塩またはその医薬組成物を、別の治療物質の投与前またはその投与後に投与する。該2種の物質は別々に投与しても、あるいは同一組成物中で一緒に投与してもよい。特定の実施形態では、該他の治療物質は抗血管新生剤または化学療法剤である。
【００８７】
特定の実施形態では、医薬組成物中に含まれていてよい該Ac-PHSCN-NH2塩は、他の化学療法剤(例えば、アルキル化剤(例えばナイトロジェンマスタード(例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファレン(melphalen)、クロランブシル、ヘキサメチルメラミン(hexamethylmelamine)、チオテパ)、アルキルスルホナート(例えばブスルファン)、ニトロソ尿素、トリアジン) 代謝拮抗剤(例えば葉酸アナログ、ピリミジンアナログ(例えばフルオロウラシル、フロクスウリジン、シトシンアラビノシド、等)、プリンアナログ(例えばメルカプトプリン、チオグアニン(thiogunaine)、ペントスタチン、等)、天然物(例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ターティポシド(tertiposide)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン(mithrmycin)、マイトマイシンC、L-アスパラギナーゼ、インターフェロンアルファ)、白金配位錯体(例えばシス-白金、カルボプラチン、等)、ミトキサントロン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ホルモンおよびアンタゴニスト(例えばプレドニゾン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、フルタミド、ロイプロリド、等)、抗血管新生物質またはインヒビター(例えばアンギオスタチン、レチノイン酸およびパクリタキセル、エストラジオール誘導体、チアゾロピリミジン(thiazolopyrimidine)誘導体、等)、アポトーシス誘発物質(例えばアポトーシスを阻害する癌遺伝子をブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチド、腫瘍抑制因子、TRAIL、TRAILポリペプチド、Fas関連因子1、インターロイキン-1β-変換酵素、ホスホチロシンインヒビター、RXRレチノイド受容体アゴニスト、カルボスチリル誘導体、等)およびキレート剤(ペニシラミン、亜鉛、トリエンチン、等))との併用療法において使用することができる。
【００８８】
5.8  治療用キット
本発明は、Ac-PHSCN-NH2塩またはその医薬組成物を容器中に含む治療用キットを提供する。該治療用キットには、1種以上の他の化合物(例えば化学療法剤、天然物、ホルモンまたはアンタゴニスト、抗血管新生物質またはインヒビター、アポトーシス誘発物質またはキレート剤)またはこれらの他の化合物の医薬組成物を同一または別個の容器中で含有させてもよい。
【００８９】
治療用キットは、Ac-PHSCN-NH2塩またはその医薬組成物を、他の成分(例えば他の化合物またはこれらの他の化合物の医薬組成物)を伴って、あるいは伴わずに含有する単一の容器を有してよく、あるいは各成分ごとに別個の容器を有してよい。好ましくは、本発明の治療用キットは、第二の化合物(好ましくは化学療法剤、天然物、ホルモンまたはアンタゴニスト、抗血管新生物質またはインヒビター、アポトーシス誘発物質またはキレート剤)またはその医薬組成物の同時投与と組み合わせて使用するためにパッケージされたAc-PHSCN-NH2塩またはその医薬組成物を含む。該キットの成分はあらかじめ混合してよく、あるいは各成分は患者に投与するまで別個の容器中であってよい。
【００９０】
該キットの成分は、1種以上の液状溶液、好ましくは水性溶液、より好ましくは滅菌水性溶液中で提供してよい。該キットの成分は固形物として提供してもよく、該固形物は好適な溶媒の添加によって液状物に変換してよく、該溶媒は好ましくはさらに別個の容器中で提供される。
【００９１】
治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ビン、シリンジ、または固形物または液状物を封入する任意の他の手段であってよい。通常、2種以上の成分が存在する場合、該キットは第二のバイアルまたは他の容器を含有し、それによって別々の投薬が可能になる。該キットは製薬的に許容しうる液状物用の別の容器を含有してもよい。
【００９２】
好ましくは、治療用キットは装置(例えば1種以上の針、シリンジ、点眼器、ピペット、等)を含有し、それによって該キットの他の成分の投与が可能になる。
【実施例】
【００９３】
6.  実施例
以下の実施例を参照して、本発明をさらに規定する。該実施例では、Ac-PHSCN-NH2塩の調製および、安定性を測定するための方法を詳細に説明する。当業者には明らかであるように、本発明の範囲から逸脱することなく、材料および方法の両者に対して多数の改変を施すことができる。
【００９４】
6.1  実施例１: Ac-PHSCN-NH2塩酸塩の調製
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2, TFA塩の調製
Rink Amide AM樹脂(Novabiochem, EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA)をDMF (ジメチルホルムアミド; 樹脂100 mgあたり1 mL)中の20%ピペリジンで窒素撹拌しながら3分間処理し、その反応混合物をろ過し、DMFで1回洗浄した。この段階をさらに2回繰り返した。その樹脂をDMFで3回洗浄し、ジクロロメタンで3回洗浄した。Fmoc-Asn(trt)-OH (3 eq)、HBTU (3 eq)、およびHOBt (3 eq)をDMF (樹脂100 mgあたり1 mL)に溶解し、上記樹脂に加え、次いでN-メチルモルホリン(NMM) (6 eq)を加え、その混合物を1時間撹拌した。その反応混合物をろ過し、その樹脂をDMFで3回洗浄し、ジクロロメタンで3回洗浄した。このカップリング段階を繰り返した。Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(trt)-OHおよびFmoc-His(trt)-OHを用いて、Fmoc脱保護および上記カップリング段階を連続して使用し、該樹脂に結合しているFmoc-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)を得た。この樹脂をDMF (樹脂100 mgあたり1 mL)中の20%ピペリジンで窒素撹拌しながら3分間処理し、その反応混合物をろ過し、DMFで1回洗浄した。この段階をさらに2回繰り返した。その樹脂をDMFで3回洗浄し、ジクロロメタンで3回洗浄した。Ac-Pro-OH (3 eq)、HBTU (3 eq)、およびHOBt (3 eq)をDMF (樹脂100 mgあたり1 mL)に溶解し、上記樹脂に加え、次いでN-メチルモルホリン(NMM) (6 eq)を加え、その混合物を1時間撹拌した。その反応混合物をろ過し、樹脂をDMFで3回洗浄し、ジクロロメタンで3回洗浄して、Rink Amide AM樹脂に結合しているAc-Pro-His(trt)-Ser(trt)-Cys(trt)-Asn(trt)を得た。その樹脂をTFA/TIS/水(95:2.5:2.5、樹脂100 mgあたり1 mL)で処理し、窒素で2時間撹拌した。その反応混合物をろ過し、樹脂をTFA/TIS/水で1回洗浄し、ジクロロメタンで3回洗浄した。真空中で溶媒を除去し、得られた残留物をエーテルで3回トリチュレートして、粗製のAc-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2, TFA塩を得た。
【００９５】
この一般的手順を使用して、2グラムのRink Amide AM樹脂(積載: 0.63 mmol/g)から708 mgの粗製のAc-PHSCN-NH2, TFA塩を調製した。
【００９６】
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2, TFA塩の精製
最小量のメタノールおよび水に溶解された前記粗製のペプチドを、Phenomenex Synergi hydro-RP C18カラム(250mm x 21.2 mm)を用いる調製用逆相HPLC (Beckman)によって精製した。3〜100% Bの勾配を使用して、30分にわたって20 mL/分の流速で該ペプチドを溶出させ、その場合、溶媒Aは0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水であり、溶媒Bは0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルであった。検出は220 nmで行った。3〜100% Bの勾配を使用する分析用HPLC分析, Phenomenex hydro RP (250mm x 4.6mm) (Waters)に基づいて95%を超える純度のフラクションをまとめ、ロータリーエバポレーター処理によって約2〜4 mlの容量に濃縮し、凍結乾燥した。サンプルを水に再溶解し、タール化(tared)された2ドラムのバイアルに移し、2回目の凍結乾燥を行った。
【００９７】
本方法を使用して、338 mgの粗製材料から140 mgの純粋なAc-PHSCN-NH2, TFA塩を得た: ES MS m/z (M+H)+ 598.2; HPLC: 99%純粋。
【００９８】
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2, TFA塩(140 mg, 0.197 mmol)を2 mLの蒸留水に溶解し、Amberlyst A-26 (OH)樹脂(4.2 meq/g, 273 mg, 5.8 eq)を加えた。その反応混合物を室温で5分間撹拌した。水性溶液をデカントし、樹脂を蒸留水で2回洗浄し、水層をまとめ、凍結乾燥して、81 mg (69%)のAc-PHSCN-NH2を飛散性の白色固形物として得た: ES MS m/z (M+H)+ 598.2; HPLC: 94%単量体, 6%二量体。
【００９９】
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2, 塩酸塩
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2 (77 mg, 0.13 mmol)を3 mLの蒸留水に室温で溶解し、すぐに1 M塩酸(0.13 mL, 0.13 mmol)を加えた。その混合物を1回回旋させた後、凍結および凍結乾燥して、Ac-PHSCN-NH2, 塩酸塩を飛散性の白色固形物として得た: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ9.00 (s, 1H), 8.57-8.26 (m, 2H), 8.21-8.03 (m, 2H), 7.45-7.36 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 4.79-4.59 (m, 1H), 4.50-4.25 (m, 4H), 3.74-3.56 (m, 3H, 水ピークとオーバーラップ), 3.25-3.15 (m, 2H, 水ピークとオーバーラップ), 3.11-2.98 (m, 1H), 2.88-2.72 (m, 2H), 2.57-2.38 (m, 2H, DMSOピークとオーバーラップ), 2.02 (s, 3H), 1.92-1.65 (m, 4H); HPLC: 93%単量体, 7%二量体。  
Ac-PHSCN-NH2の合成手順は図１に示される通りである。
【０１００】
6.2  実施例２: Ac-PHSCN-NH2遊離塩基の調製
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2塩酸塩(301 mg, 0.475 mmol)を4.7 mLの蒸留水に溶解し、Amberlyst A-26 (OH)樹脂(4.2 meq/g, 623 mg, 5.5 eq)を加えた。その反応混合物を室温で5分間撹拌した。水性溶液をデカントし、樹脂を蒸留水で2回洗浄し、水層をまとめ、凍結乾燥して、139 mg (49%)の標題化合物を飛散性の白色固形物として得た: 1H NMR (300 MHz, DMSO d6)δ8.56 (br s, 1H), 8.23-7.84 (m, 3H), 7.59-7.52 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.07-7.00 (m, 1H), 6.97-6.77 (m, 2H), 5.19-4.98 (m, 1H), 4.62-4.16 (m, 5H), 3.70-3.51 (m, 3H), 3.03-2.72 (m, 4H), 2.53-2.36 (m, 2H, DMSOピークとオーバーラップ), 2.00 (s, 3H), 1.90-1.75 (m, 2H), 1.74-1.63 (m, 2H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析(Anal), C23H35N9O8Sとしての計算値: N, 21.09. 実測値: 19.66 (ペプチド含量, 93%). 塩素含量(IC): 0.01 %。
【０１０１】
6.3  実施例３: Ac-PHSCN-NH2遊離塩基の種々の塩形態の調製
Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2を蒸留水(ペプチド20 mgあたり1 mL)に室温で溶解し、すぐに適切な酸(1.05 eq)を加えた。その混合物を1回回旋させた後、凍結および凍結乾燥して、飛散性の白色固形物を得た。
【０１０２】
6.4  実施例４: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2メタンスルホン酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(51 mg, 0.073 mmol)およびメタンスルホン酸(5μL, 0.077 mmol)から飛散性の白色固形物(49 mg, 98%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.98 (s, 1H), 8.57-8.22 (m, 2H), 8.18-7.91 (m, 2H), 7.42-7.34 (m, 2H), 7.18-7.06 (m, 2H), 6.95 (s, 1H), 4.79-4.58 (m, 1H), 4.57-4.22 (m, 4H), 3.23-3.12 (m, 3H), 3.06-2.71 (m, 4H), 2.34 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.90-1.64 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析, C24H39N9O11S2としての計算値: N, 21.09; S, 9.24. 実測値: N, 15.88 (ペプチド含量, 87%); S, 8.40. 塩素含量(IC): 0.0002%。
【０１０３】
6.5  実施例５: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2酢酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(22 mg, 0.034 mmol)および酢酸(2.1μL, 0.036 mmol)から飛散性の白色固形物(20 mg, 87%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.61-8.48 (m, 1H), 8.26-7.86 (m, 3H), 7.73-7.60 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.06-6.97 (m, 1H), 6.95-6.82 (m, 2H), 4.63-4.22 (m, 5H), 3.70-3.57 (m, 4H, 水シグナルとオーバーラップ), 2.99-2.88 (m, 3H), 2.85-2.72 (m, 2H), 2.63-2.34 (m, 2H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.00 (s, 3H), 1.91 (s, 3H), 1.86-1.64 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 30 塩素含量(IC): 0.09%。
【０１０４】
6.6  実施例６: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2グリコール酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(23 mg, 0.036 mmol)およびグリコール酸(2.9 mg, 0.038 mmol)から飛散性の白色固形物(24 mg, 99%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.60-8.48 (m, 1H), 8.25-7.85 (m, 3H), 7.69-7.58 (m, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.08-6.98 (m, 1H), 6.95-6.81 (m, 2H), 4.63-4.22 (m, 6H), 3.90 (s, 2H), 3.57-3.12 (m, 8H, 水シグナルとオーバーラップ), 3.04-2.87 (m, 3H), 2.84-2.72 (m, 2H), 2.65-2.37 (m, 2H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.00 (s, 3H), 1.89-1.64 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 塩素含量(IC): 0.09%。
【０１０５】
6.7  実施例７: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2硫酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(23 mg, 0.036 mmol)および1.8 M硫酸(21μL, 0.038 mmol)から飛散性の白色固形物(23 mg, 92%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.84-8.67 (m, 1H), 8.43-8.24 (m, 2H), 8.16-7.93 (m, 2H), 7.38-7.22 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.94 (s, IH), 4.77-4.57 (m, IH), 4.49-4.24 (m, 4H), 3.70-3.41 (m, 6H, 水ピークとオーバーラップ), 3.18-3.06 (m, 3H, 水ピークとオーバーラップ), 3.04-2.90 (m, 2H), 2.87-2.71 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 1.91-1.65 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析, C23H37N9O12S2としての計算値: N, 18.12; S, 9.22. 実測値: N, 16.88 (ペプチド含量, 93%); S, 7.76. 塩素含量(IC): 0.09%。
【０１０６】
6.8  実施例８: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2 D-(+)-カンファースルホン酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(23 mg, 0.036 mmol)およびD-(+)-カンファースルホン酸(8.7 mg, 0.037 mmol)から飛散性の白色固形物(29 mg, 100%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSOd6)δ8.92-8.83 (m, 1H), 8.45-8.23 (m, 2H), 8.17-7.88 (m, 2H), 7.38-7.27 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 5.13 (br s, 1H), 4.78-4.57 (m, 1H), 4.49-4.23 (m, 4H), 3.72-3.48 (m, 5H, 水ピークとオーバーラップ), 3.20-3.09 (m, 2H, 水シグナルとオーバーラップ), 3.05-2.62 (m, 6H), 2.53-2.34 (m, 3H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.30-2.18 (m, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.95-1.66 (m, 7H), 1.33-1.22 (m, 2H), 1.05 (s, 3H), 0.74 (s, 3H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 塩素含量(IC): 0.09%。
【０１０７】
6.9  実施例９: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2マンデル酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(23 mg, 0.036 mmol)およびマンデル酸(5.8 mg, 0.038 mmol)から飛散性の白色固形物(30 mg, 112%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.61-8.49 (m, 1H), 8.25-7.86 (m, 3H), 7.68-7.57 (m, 1H), 7.44-7.25 (m, 6H), 7.13 (s, 1H), 7.07-7.00 (m, 1H), 6.96-6.81 (m, 2H), 4.99 (s, 2H), 4.63-4.20 (m, 5H), 3.54-3.10 (m, 10H, 水ピークとオーバーラップ), 3.04-2.88 (m, 3H), 2.83-2.72 (m, 2H), 2.65-2.37 (m, 2H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.00 (s, 3H), 1.90-1.63 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 塩素含量(IC): 0.01%。
【０１０８】
6.10  実施例１０: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2サリチル酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(23 mg, 0.036 mmol)およびサリチル酸(5.4 mg, 0.039 mmol)から飛散性の白色固形物としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.50-8.29 (m, 2H), 8.27-7.92 (m, 3H), 7.73 (dd, J= 7.7, 1.7 Hz, 1H), 7.37-7.28 (m, 2H), 7.18-7.02 (m, 3H), 6.94 (s, 1H), 6.80-6.72 (m, 2H), 4.70-4.24 (m, 6H), 3.58-3.24 (m, 8H, 水ピークとオーバーラップ), 3.12-2.89 (m, 5H), 2.84-2.71 (m, 2H), 2.66-2.37 (m, 2H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.00 (s, 3H), 1.92-1.63 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 塩素含量(IC): 0.01%。
【０１０９】
6.11  実施例１１: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2コハク酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(21 mg, 0.032 mmol)およびコハク酸(4.1 mg, 0.035 mmol)から飛散性の白色固形物(25 mg, 108%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.61-8.50 (m, 1H), 8.25-7.85 (m, 3H), 7.66-7.56 (m, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.07-7.00 (m, 1H), 6.96-6.79 (m, 2H), 4.63-4.20 (m, 5H), 3.69-3.57 (m, 3H, 水ピークとオーバーラップ), 3.04-2.71 (m, 5H), 2.65-2.38 (m, 2H, DMSOシグナルとオーバーラップ), 2.41 (s, 4H), 2.00 (s, 3H), 1.90-1.63 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 塩素含量(IC): 0.01%。
【０１１０】
6.12  実施例１２: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2臭化水素酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(21 mg, 0.032 mmol)および4.8%臭化水素酸(38.1μL, 0.034 mmol)から飛散性の白色固形物(23 mg, 105%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO d6)δ9.00 (s, 1H), 8.50-8.22 (m, 2H), 8.14-7.90 (m, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.80-4.58 (m, 1H), 4.49-4.24 (m, 4H), 3.72-3.56 (m, 3H, 水ピークとオーバーラップ), 3.23-2.93 (m, 5H), 2.88-2.71 (m, 2H), 2.65-2.36 (m, 2H, DMSOピークとオーバーラップ), 2.01 (s, 3H), 1.91-1.66 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析, C23H36N9O8Sとしての計算値: N, 18.58; Br, 11.78. 実測値: N, 16.85 (ペプチド含量, 91%); Br, 10.80. 塩素含量(IC): 0.01%。
【０１１１】
6.13  実施例１３: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2硝酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(21 mg, 0.032 mmol)および4.8%臭化水素酸(38.1μL, 0.034 mmol)から飛散性の白色固形物(23 mg, 109%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSOd6)δ8.95-8.83 (m, 1H), 8.60-8.23 (m, 2H), 8.19-7.89 (m, 2H), 7.40-7.29 (m, 2H), 7.14 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 5.16 (br s, 1H), 4.79-4.58 (m, 1H), 4.57-4.24 (m, 4H), 3.72-3.49 (m, 5H, 水ピークとオーバーラップ), 3.21-3.08 (m, 3H, 水ピークとオーバーラップ), 3.05-2.88 (m, 2H), 2.86-2.71 (m, 2H), 2.64-2.37 (m, 2H, DMSOピークとオーバーラップ), 2.01 (s, 3H), 1.93-1.57 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析, C23H36N10O11Sとしての計算値: C, 41.81; N, 21.20. 実測値: C, 40.20; N, 19.82 (ペプチド含量, 93%). 塩素含量(IC): 0.06%。
【０１１２】
6.14  実施例１４: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2リン酸塩
実施例３の手順にしたがって、遊離塩基(20 mg, 0.031 mmol)および8.5%リン酸(22.1μL, 0.032 mmol)から飛散性の白色固形物(22 mg, 105%)としてこの化合物を調製した: 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ8.53-8.41 (m, 1H), 8.35-7.98 (m, 3H), 7.95-7.76 (m, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.08-6.88 (m, 3H), 4.67-4.57 (m, 1H), 4.52-4.21 (m, 5H), 3.71-3.25 (m, 5H), 3.19-2.72 (m, 5H), 2.63-2.35 (m, 2H, DMSOピークとオーバーラップ), 2.01 (s, 3H), 1.90-1.64 (m, 4H); ES MS m/z (M+H)+ 598.3; 化学分析, C23H36N10O11Sとしての計算値: N, 18.12; P, 4.45. 実測値: N, 16.69 (ペプチド含量, 92%); P, 3.94. 塩素含量(IC): 0.06%。
【０１１３】
6.15  実施例１５: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2遊離塩基および塩酸塩の液相安定性の比較
蒸留水中のAc-PHSCN-NH2の1.657 mM溶液および蒸留水中のAc-PHSCN-NH2の塩酸塩の1.653 mM溶液を25±1℃の水浴中に置いた。アリコート(800μL)を定期的に取り出し、HPLCによって二量体化の量を決定した。
【０１１４】
すべてのHPLCスペクトルをWaters HPLCで取得した。Waters HPLCには、Breezeソフトウェア, Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector, Waters 1525 Binary HPLC Pump, およびWaters 717 plus Autosamplerが含まれていた。カラムはPhenomenex Synergi 4μ Hydro-RP 80A, 250 x 4.60 mm 4μミクロンであった。使用した40分の勾配を以下の表に記載する。
【化１】
2008528635.tif 000002
【０１１５】
約9.2分のAc-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2単量体に関するHPLCピーク、および約10.0分のATN-161二量体に関するピークを積分した。その目的は、各サンプル中のこれらの2種のパーセンテージを決定するためである。
【０１１６】
この研究についての表形式の結果は以下の通りである。図２は該結果をグラフで示す。
【化２】
2008528635.tif 000003
【０１１７】
6.16  実施例１６: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2遊離塩基および塩酸塩の固相安定性の比較
0.8〜1.2 mgのAc-PHSCN-NH2およびAc-PHSCN-NH2塩酸塩のサンプルをHPLCサンプルバイアル中に量り取り、25±1℃で保存した。0時間の時点をとった。サンプルを定期的に取り出し、蒸留水で希釈して、1 mg/mL溶液を得た。実施例１５に示されるようにHPLCによって二量体化の量を決定した。この研究についての表形式の結果は以下の通りである。その結果を図３にグラフで示す。
【化３】
2008528635.tif 000004
【０１１８】
6.17  実施例１７: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2遊離塩基、メタンスルホン酸塩、および硝酸塩の液相安定性の比較
25 mLメスフラスコ中でAc-PHSCN-NH2メタンスルホン酸塩(31.0 mg, 93.5%単量体, 0.0418 mmol)を蒸留水に溶解し、1.67 mM溶液を得た。第二の25 mLメスフラスコ中で、Ac-PHSCN-NH2硝酸塩(29.0 mg, 93.5%単量体, 0.0410 mmol)を蒸留水に溶解し、1.64 mM溶液を得、第三の25 mLメスフラスコ中で、Ac-PHSCN-NH2遊離塩基(26.3 mg, 94.5%単量体, 0.0416 mmol)を蒸留水に溶解し、1.66 mM溶液を得た。各溶液に関してt= 0時間の時点をとった。メスフラスコを25+0.5℃の水浴中に置き、定期的に、0.7 mLのアリコートを取り出し、実施例１５に記載のようにその溶液をHPLCによって分析した。この研究についての表形式の結果は以下の通りである。その結果を図４にグラフで示す。
【化４】
2008528635.tif 000005
【０１１９】
6.18  実施例１８: Ac-Pro-His-Ser-Cys-Asn-NH2遊離塩基、メタンスルホン酸塩、および硝酸塩の固相安定性の比較
11サンプルのAc-PHSCN-NH2メタンスルホン酸塩(サンプルあたり0.7〜1.0 mg)、12サンプルのAc-PHSCN-NH2硝酸塩(サンプルあたり0.7〜1.0 mg)、および12サンプルのAc-PHSCN-NH2遊離塩基(サンプルあたり0.7〜1.0 mg)をHPLCサンプルバイアルに量り取り、そのバイアルを25±0.5℃のインキュベーター中で保存した。定期的に各ペプチドのサンプルバイアルを取り出し、その材料を十分な蒸留水に溶解して1 mg/mL溶液を取得し、実施例１５に記載のようにHPLCによって分析した。この研究についての表形式の結果は以下の通りである。その結果を図５にグラフで示す。
【化５】
2008528635.tif 000006
【０１２０】
最後に、留意すべきことは、本発明を実施する代替の方法が存在することである。したがって、本実施形態は例示的であり、制限的ではないとみなされるべきであろう。本発明は、本明細書中で提供される詳細に限定されないものとし、特許請求の範囲およびそれと等価な範囲内で改変してよい。本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、Ac-PHSCN-NH2塩酸塩の合成についての模式図である。
【図２】図２は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基とAc-PHSCN-NH2の塩酸塩についての単量体対二量体の濃度の液相比較を時間の関数として示す。
【図３】図３は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基とAc-PHSCN-NH2の塩酸塩についての単量体対二量体の濃度の固相比較を時間の関数として示す。
【図４】図４は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基、Ac-PHSCN-NH2のメタンスルホン酸塩、およびAc-PHSCN-NH2の硝酸塩についての単量体対二量体の濃度の液相比較を時間の関数として示す。
【図５】図５は、Ac-PHSCN-NH2の遊離塩基、Ac-PHSCN-NH2のメタンスルホン酸塩、およびAc-PHSCN-NH2の硝酸塩についての単量体対二量体の濃度の固相比較を時間の関数として示す。
【図１】
2008528635.tif 000007
【図２】
2008528635.tif 000008
【図３】
2008528635.tif 000009
【図４】
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【図５】
2008528635.tif 000011
【配列表】
2008528635000001.app
【国際調査報告】
2008528635.tif 000012
2008528635.tif 000013
2008528635.tif 000014