(57)【要約】  本発明は、樹状細胞における標的としてのＧＰＲ９１の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞における標的としてのＧＰＲ９１の使用。
【請求項２】
ＧＰＲ９１活性が仲介する樹状細胞障害の診断のための、ＧＰＲ９１の使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用のためのバイオマーカーとしてのＧＰＲ９１の使用。
【請求項４】
樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベルをＧＰＲ９１特異的抗体の使用により測定する、ＧＰＲ９１が仲介する障害または疾患の診断法。
【請求項５】
個体のサンプル中のＧＰＲ９１が仲介する障害または疾患の診断のためのキットであって、
ａ)  ＧＰＲ９１を認識する、所望により標識された形の分子、
ｂ)  樹状細胞においてどのように該キットを使用するかの指示書、
ｃ)  所望により検出手段、
ｄ)  所望により固相
を含む、キット。
【請求項６】
ＧＰＲ９１活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ法であって、
ａ)  個体のサンプルの樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベルを、ＧＰＲ９１のレベルを調節することが予測される候補化合物の非存在下および存在下で測定し、
ｂ)  工程ａ)において測定したＧＰＲ９１のレベルを調節する候補化合物を、例えば薬剤として同定し、そして
ｃ)  このような薬剤をＧＰＲ９１が仲介する障害または疾患の処置における医薬として使用する
ことを含む、アッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は樹状細胞における標的としてのＧＰＲ９１に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体(ＧＰＲ)は、細胞内のシグナル伝達を担うタンパク質の主要なクラスを構成し、そしてヒトゲノムにおいて３５０を超える報告されている遺伝子があるタンパク質の最大のファミリーの一つである。
【０００３】
ＧＰＲは３個の構造ドメイン：アミノ末端細胞外ドメイン、７個の膜貫通セグメント、３個の細胞外ループおよび３個の細胞内ループを含む膜貫通ドメインならびにカルボキシ末端細胞内ドメインを有する。リガンドのＧＰＲの細胞外部分への結合により、シグナルが細胞内で伝達され、それが該細胞の生物学的または生理学的特性の変化をもたらす。ＧＰＲは、Ｇタンパク質ならびに例えばＧタンパク質により調節される細胞内酵素およびチャネルのようなエフェクターと共に、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外インプットと接続するモジュラー・シグナル伝達系の要素である。
【０００４】
故に、ＧＰＲは薬剤作用および開発の主要な標的である。新規ＧＰＲとして、Ｇタンパク質共役受容体ＧＰＲ９１が同定された(例えばWittenberger T. et al., J.Mol.Biol. 2001, 307, 799-813参照)。ＧＰＲ９１の機能についてはほとんど知られていない。
【０００５】
驚くべきことに、我々は、今回ＧＰＲ９１が主に樹状細胞で、そして仮にあったとしても少ない程度でのみ、単球、Ｔ細胞またはＢ細胞でも、発現されることを発見した。
【発明の開示】
【０００６】
いくつかの局面において、本発明は
１.  以下に使用するためのＧＰＲ９１、例えば、または以下のためのＧＰＲ９１の使用
１.１  樹状細胞における標的として；
１.２  ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される、樹状細胞障害の診断のため。
【０００７】
ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される、例えば疾患を含む障害は、自己免疫性のような免疫障害、炎症性障害、アレルギー性障害、感染症、心血管障害、癌、移植と関連する障害、神経変性障害；より具体的に
アレルギー性および非アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー、アレルギー性消化器疾患、アトピー性皮膚炎、リウマチ性関節炎、乾癬および他のアレルギー性、自己免疫性および炎症性疾患のような肥満細胞仲介疾患を含む障害；関節炎、喘息、ＡＩＤＳのような免疫不全疾患、腎血管性高血圧、アテローム性動脈硬化症、糖尿病および腎不全に密接に関連する疾患、肉芽腫性疾患、炎症性腸疾患、敗血症、アクネ、好中球減少症、好中球増多症、乾癬、Ｔ細胞仲介細胞毒性のような過敏症を含む免疫学的障害；宿主対移植片および移植片対宿主病のような移植臓器および組織に対する免疫応答、自己免疫性不妊症、水晶体組織傷害、脱髄、全身性エリテマトーデス、薬剤誘発溶血性貧血、シェーグレン病、および強皮症のような自己免疫障害、心血管障害、皮膚科学的障害、代謝疾患、癌障害、例えば白血病、消化器および肝臓疾患、血液学的障害、生殖障害、内分泌系の疾患、炎症性疾患、筋肉−骨格障害、神経学的障害、泌尿器科学的障害、呼吸器疾患、細菌、真菌、原虫、およびウイルス感染のような感染に関連する障害、特にＨＩＶウイルスが原因の障害、急性心不全を含む心血管疾患、低血圧、高血圧、狭心症、心筋梗塞、血液学的疾患、尿失禁および良性前立腺肥大を含む尿生殖器疾患、骨粗鬆症、疼痛、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む末梢および中枢神経系障害のような神経変性障害、代謝疾患、胃腸病学的疾患、筋肉または骨格の疾患、免疫学的疾患、発育疾患または生殖器系の疾患、例えば腎臓、脳、心臓または肺障害と関連する疾患を含むと考えられる。
【０００８】
本発明に従いＧＲＰＲ９１を使用し得る障害および疾患は、特に乾癬、リウマチ性関節炎、移植と関連する障害または疾患、癌と関連する障害または疾患、狼瘡、例えば全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、喘息、心血管障害、例えば乾癬および乾癬を有する患者で起こる状態、例えば乾癬性関節炎を含む。
【０００９】
乾癬は、Ｔｈ１細胞活性化と関連し、そして、皮膚細胞が非常に速い速度で増幅する炎症性皮膚疾患と関連する自己免疫性障害である。新しい皮膚細胞が正常よりも約８倍速く  −  １ヶ月のかわりに数日間で  −  産生されるが、古い細胞が剥がれる速度は変わらないままである。これは、皮膚表面上での細胞の増殖をもたらし、薄片状の、帯銀色−白色の死亡皮膚細胞(鱗)で覆われた、赤い斑点(red scores)(病巣)の厚いパッチ、またはプラークを形成する。
【００１０】
生命を脅かすことは稀であり、最も軽度では、乾癬は痒く、ひりひりし得る。最も重度では、痛く、外見を損ない、消耗させる。乾癬を有するヒトの約２／３がこの疾患の軽い形である。約１／３が中程度から重度の乾癬を有する。乾癬は全ての年齢の人々に影響し得るが、最も頻繁に１５歳から３５歳の人々を襲う。
【００１１】
５つの形態の乾癬がある。プラーク乾癬は最も一般的である  −  乾癬を有する人々の５名中４名に影響する。プラーク乾癬は小さな赤い(reed)隆起物から始まり、大きい病巣へと進行する。
【００１２】
乾癬のプラークは最も頻繁には肘、膝、脚の他の部位、頭皮、背中、顔、掌および足裏に発生する。乾癬はまた手の爪および足の爪にも影響し得、爪の周囲の組織の穴、脱色または隆起の原因となる。
【００１３】
National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseasesによると、乾癬を有するヒトの約１５％がまた乾癬性関節炎を発症し、これは処置しないと進行性に身体障害となる。
【００１４】
Ｔリンパ球(Ｔ細胞)は乾癬において重要な役割を有すると考えられており、Ｔｈ１細胞活性化が主要な役割を有することが発見された。乾癬はまた遺伝要素である：感染症例の約１／３において、該疾患の家族歴がある。
【００１５】
Ｔ細胞は体中を循環し、細菌またはウイルスのような外来異物に対する免疫系の応答を組織化する。乾癬のヒトでは、欠損したＴ細胞が過剰活動し、創傷を治癒するまたは感染を撃退するかのように皮膚に移動する。この過程は皮膚細胞の急速な増殖をもたらし、炎症および病巣の発症の引き金を引く。
【００１６】
現在まで、乾癬を診断するための単独の試験は存在しないが、皮膚科医は、皮膚の見かけならびに個人および家族の病歴の考察(locking at)から通常決定できる。
【００１７】
皮膚科医は、皮膚の見かけならびに個人および家族の病歴の考察から通常乾癬を決定できるが、現在まで乾癬を診断するための単独の試験は存在しない。
請求項１または２に記載の使用のためのバイオマーカーとしてのＧＰＲ９１の使用。
【００１８】
いくつかの他の局面において、本発明は
２.  上記１.１または１.２に示す使用のための、バイオマーカーとしての、
例えば個体のサンプル中の、
例えば個体の体液サンプルまたは組織サンプル中の、
例えば個体の生検サンプル中の、
例えば個体の皮膚生検サンプル中の、
ＧＰＲ９１、または例えばＧＰＲ９１の使用を提供する。
【００１９】
上記１.または２.のいずれかの下に示すＧＰＲ９１は、樹状細胞における全ての形態、例えば下記の形態のＧＰＲ９１を含む：
−  例えばＧＰＲ９１の誘導体をコードする核酸を含む、ＧＰＲ９１をコードする核酸、
−  例えばＧＰＲ９１誘導体であるタンパク質を含むＧＰＲ９１タンパク質、または
−  ＧＰＲ９１分泌細胞、例えばまたはＧＰＲ９１分泌細胞の派生物。
【００２０】
本発明に従う、例えば分泌細胞におけるＧＰＲ９１核酸またはタンパク質の“誘導体”は、ＧＰＲ９１の生物学的機能を、例えば本質的に保持する、例えば、樹状細胞におけるＧＰＲ９１の生物学的機能を、例えば本質的に保持する、ＧＰＲ９１タンパク質のまたはＧＰＲ９１をコードする核酸のフラグメント、突然変異体、変異体、相同体または一時変異(modification)を含む。
【００２１】
例えばＧＰＲ９１産生細胞を含むＧＰＲ９１分泌細胞は、樹状細胞(ＤＣ)のような抗原提示細胞(ＡＰＣ)を含む。
【００２２】
故に、本発明により提供される通りの使用のためのＧＰＲ９１は、一次転写産物の別のスプライシングにより産生されたｍＲＮＡによりコードされるスプライス変異体、アミノ酸突然変異体、グリコシル化およびリン酸化変異体のような翻訳後一時変異、およびＧＰＲ９１の共有結合的誘導体である一時変異を含み、それらは樹状細胞におけるＧＰＲ９１の生物学的機能を保持する。ＧＰＲ９１誘導体の例は、ＧＰＲ９１タンパク質が、ＧＰＲ９１タンパク質内の部分により置換、例えば適当な手段、例えば化学的または酵素的手段に由来する置換により、共有結合的に修飾されている、一時変異を含む。このような部分は、例えば１個以上のアミノ酸、例えば天然に存在するアミノ酸および天然に存在する以外のアミノ酸、および／または検出可能な部分を含む。検出可能な部分は酵素、放射性同位体、タグ、毒素ならびに癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子のような遺伝子を含む。ＧＰＲ９１誘導体は、さらに、例えば特定の種内で提供されるような、ＧＰＲ９１の天然に存在する変異体を含む。このような変異体は同じ遺伝子ファミリーの関連遺伝子により、特定の遺伝子のアレル変異体によりコードされ得るか、またはＧＰＲ９１遺伝子の別のスプライシング変異体を意味する。
【００２３】
ここで使用するＧＰＲ９１誘導体はまたＧＰＲ９１をコードする核酸の、またはＧＰＲ９１タンパク質のフラグメントも含み、そして個々のＧＰＲ９１ドメインおよびＧＰＲ９１ドメインに由来するより小さなポリペプチドを含む。好ましくは、本発明に従うＧＰＲ９１に由来するより小さなポリペプチドは、ＧＰＲ９１の特徴である一つの機能的活性を規定する。フラグメントは、それがＧＰＲ９１の生物学的特徴を保持する限り、理論的にはほとんど全てのサイズのものであり得る。好ましくは、フラグメントは各々１２乃至２１０核酸長または４乃至７０アミノ酸長である。より長いフラグメントは完全長ＧＰＲ９１の短縮形(truncation)と見なされる。
【００２４】
ここで使用するＧＰＲ９１の誘導体はまた樹状細胞におけるＧＰＲ９１の生物学的機能の保持の要求に従っている、アミノ酸欠失、付加または置換を含み得るその突然変異体も含む。保存的アミノ酸置換を、例えば５'または３'末端からの切断により、ＧＰＲ９１の性質を変えることなく成し得る。欠失および置換もまた、ＧＰＲ９１のフラグメントにおける欠失および置換を含む。ＧＰＲ９１突然変異体は、例えばＧＰＲ９１における１個以上のアミノ酸の付加、交換および／または欠損をもたらす、インビトロ突然変異誘発に付されているＧＰＲ９１をコードするＤＮＡから製造できる。例えば、ＧＰＲ９１の置換、欠損または挿入変異体を、組み換え法により調製し、未変性形態のＧＰＲ９１との機能的類似性に関してスクリーニングできる。
【００２５】
ここで使用するＧＰＲ９１の誘導体はまたＧＰＲ９１相同体、好ましくはＧＰＲ９１と実質的な相同性を保持するＧＰＲ９１相同体も含む。ここで使用する“相同性”は、ＧＰＲ９１とＧＰＲ９１相同体が、樹状細胞におけるＧＰＲ９１の生物学的機能を保持するために十分な特徴を共有することを意味する。好ましくは、相同性は配列同一性を言及するために使用する。故に、ＧＰＲ９１の誘導体は、好ましくは示す核酸配列と実質的な配列同一性を保持する。
【００２６】
相同性が配列同一性を意味するときの“実施的な相同性”は、５０％を超える配列同一性、好ましくは７５％を超える配列同一性およびさらに好ましくは８０％またはそれを超える、例えば９０％以上、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を意味する。
好ましくはＧＰＲ９１は哺乳動物の樹状細胞に由来する。
【００２７】
ＧＰＲ９１をコードする核酸は、好ましくはWittenberger T. et al., J.Mol.Biol. 2001, 307, 799-813)に記載の核酸配列を有する。ＧＰＲ９１タンパク質は、好ましくは上記の核酸の翻訳されたタンパク質配列に対応する。
【００２８】
ここで使用するバイオマーカーは、個体のサンプルの樹状細胞におけるＧＰＲ９１分子の測定(＝検出および／または定量)が、それ自体障害または疾患の指標であり、および／またはＧＰＲ９１活性と関連する障害または疾患の状態のモニタリングに有用であることを意味する。
【００２９】
他の局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の診断法であって、
ａ)  個体のサンプルを提供し、
ｂ)  該サンプル中の樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベルを測定し、
ｃ)  工程ｂ)で測定したＧＰＲ９１のレベルと、健常対照個体のサンプルからの樹状細胞における参照レベルを比較し、そして
ｄ)  工程ｂ)で測定したＧＰＲ９１のレベルが、例えば該参照レベルと有意に異なるか否かの決定により、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患を診断する
ことを含む、方法を提供する。
【００３０】
他の局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の軽減または治癒に効果があることが予測される物質での、個体の治療における治療効果のモニタリング法であって、該個体のサンプルの樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベルを測定し、該物質投与前のＧＰＲ９１のレベルと比較することを含む、方法を提供する。
【００３１】
本発明の使用または方法に従う個体のサンプルは、体液または組織サンプルのサンプルを含む。体液は、例えば単離された単核細胞を含む、例えば血液に、または、例えば血漿または血清、好ましくは血清を含む血液分画に由来し得る。組織サンプルは、例えば皮膚生検サンプルのような生検サンプルであり得る。
【００３２】
他の局面において、本発明は、サンプルが個体の体液または組織サンプルである、例えば体液が血液に、例えば単離された樹状細胞に、または血液分画に、例えば血漿または血清、例えば血清に由来する；例えば組織サンプルが、例えば皮膚生検サンプルのような生検サンプルであり得る、本発明の使用または方法を提供する。
【００３３】
個体のサンプル由来の樹状細胞は、適当に、慣用法に例えば従って、例えば準じて単離できる。
【００３４】
ＧＰＲ９１のレベルを測定するための樹状細胞における検出手段は、慣用の、例えば免疫診断法、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)のような免疫アッセイ；解離促進ランタニドフルオロ免疫アッセイ(ＤＥＬＦＩＡ)のような蛍光に基づくアッセイ、放射測定アッセイまたはＧＰＲ９１特異的ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の実施による手段を含み；特異的検出手段はＧＰＲ９１を特異的に認識する、例えば直接的または間接的に検出可能な分子、好ましくは抗体誘導体またはそれらのフラグメントを含む抗体、例えばＧＰＲ９１を認識する抗体、例えば標識を担持するＧＰＲ９１認識抗体を含む分子を含む。
【００３５】
このような標識は慣用の標識、例えばビオチンまたは、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)もしくはペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)のような酵素、または蛍光分子、例えば例えばフルオレッセインイソチオシアネートのような蛍光染料であり得る。好ましくは本標識はビオチンである。標識担持分子、例えば標識担持抗体は慣用法により、例えば蛍光測定または酵素検出法を介して検出できる。
【００３６】
抗体フラグメントまたは抗体誘導体は、ＧＰＲ９１をまだ認識できる、抗体の、例えば化学的にまたは酵素的に修飾されたフラグメントまたは誘導体を含む。
【００３７】
個体の体液のサンプル、例えば血中のＧＰＲ９１分泌細胞は慣用の方法により、例えば下記の方法により、測定できる：
樹状細胞を、サンプル、例えば血液から、精製し、例えば、密度勾配遠心により単離し、得られた精製細胞を染色する。抗ＧＰＲ９１抗体、例えば蛍光標識した抗ＧＰＲ９１抗体を、所望により細胞を例えばインターロイキン−４で刺激した後、染色細胞調製物に添加し、ＧＰＲ９１分泌細胞のレベルを測定する。
【００３８】
所望により、サンプルに含まれるＧＰＲ９１または検出手段に含まれるＧＰＲ９１を認識する、例えば検出可能な分子を、固相に固定する。適当な固相は、例えば固定化に使用される慣用の固相、例えばポリスチレンまたはポリビニルプレートのようなプラスチックプレート、とりわけマイクロタイタープレートを含む。またマイクロビーズ、例えば被覆されたマイクロビーズも、固相として使用できる。本固相は、コーティング材により被覆でき、その性質は、例えば検出手段に含まれる標識に依存する。コーティング材は標識と結合できなければならず、例えば標識がビオチンであるとき、コーティング材は、例えば固相に共有結合的に結合したストレプトアビジンを含む。
【００３９】
好ましくは樹状細胞におけるＧＰＲ９１の測定は、ＧＰＲ９１を特異的に認識する分子、例えば抗ＧＰＲ９１抗体、例えば市販のＧＰＲ９１特異的抗体のような抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントを使用して行う。ＧＰＲ９１−抗体形成の検出は、好ましくは免疫診断アッセイ法により行う。
【００４０】
他の局面において、本発明は、樹状細胞におけるＧＰＲ９１をＧＰＲ９１特異的抗体の使用により測定する、本発明に従うＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の診断法を提供する。
【００４１】
他の局面において、本発明は個体のサンプルにおけるＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患を診断するためのキットであって、
ａ)  ＧＰＲ９１を認識する、所望により標識された形の分子、
ｂ)  樹状細胞においてどのように該キットを使用するかの指示書、
ｃ)  所望により検出手段、
ｄ)  所望により固相
を含む、キットを提供する。
【００４２】
このようなキットは、例えば試験すべきサンプルの適当な環境、および、例えば試験すべきサンプル中のＧＰＲ９１を測定するための適当な手段を含む、実質的な要素をさらに含み得る。
【００４３】
さらなる局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性を調節する薬剤を同定するためのアッセイ法であって、
ａ)  個体のサンプルの樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベルを、ＧＰＲ９１のレベルを調節することが予測される候補化合物の非存在下および存在下で測定し、
ｂ)  工程ａ)において測定したＧＰＲ９１のレベルを調節する候補化合物を、例えば薬剤として同定し、そして
ｃ)  このような薬剤をＧＰＲ９１により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の処置における医薬として使用する
ことを含む、アッセイ法を提供する。
【００４４】
ＧＰＲ９１のレベルは適当に、例えばここに記載の通り測定する。
【００４５】
ここで記載する候補化合物は、ＧＰＲ９１のレベル、またはＧＰＲ９１活性またはＧＰＲ９１分泌細胞を調節することが予測され得る化合物であり、ＧＰＲ９１に対するその影響を測定できる、化合物(ライブラリー)を含む。化合物(ライブラリー)は、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、摸倣体、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ'ｓ)を含む。
【００４６】
薬剤は、例えば患者のサンプル、例えば血清のような血液サンプル、または皮膚生検サンプルからの樹状細胞におけるＧＰＲ９１のレベル、またはＧＰＲ９１活性またはＧＰＲ９１分泌細胞のレベルを調節する候補化合物である。薬剤は、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、摸倣体、小分子、例えば低分子量化合物(ＬＭＷ'ｓ)を含む。
【００４７】
他の局面において、本発明は本発明のアッセイ法また方法により同定された薬剤を提供する。
【００４８】
本発明の薬剤は薬理学的活性を示し得て、故に医薬として有用である。本発明の薬剤は、例えばＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患において、治療活性を示し得る。
【００４９】
他の局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害における、医薬としての本発明の薬剤の使用を提供する。
【００５０】
医薬的使用のために、処置のための本発明薬剤は、１個以上の、好ましくは１個の本発明の薬剤を含み、例えば、２個の以上の本発明の薬剤の組み合わせを含む。
【００５１】
他の局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の処置用薬剤の製造のための、本発明の薬剤の使用を提供する。
【００５２】
他の局面において、本発明は、本発明の薬剤と、それ以外に少なくとも１種の医薬賦形剤、例えば増量剤、結合剤、崩壊剤、流動調節剤、滑剤、糖および甘味剤、香料、防腐剤、安定化剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および／または緩衝剤を含む、例えば適当な担体および／または希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００５３】
他の局面において、本発明は、ＧＰＲ９１活性により仲介される、例えば関連する、例えば誘発される障害または疾患の処置法であって、有効量の本発明の薬剤をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００５４】
このような処置のために、適当な投与量は、もちろん、例えば、用いる本発明の化合物の化学的性質および薬物動力学データ、個々の宿主、投与形態ならびに処置する状態の性質および重症度に依存して変化する。しかしながら、一般に、大型哺乳動物、例えばヒトにおいて、満足行く結果のために、指示される１日量は、
−  約０.００１ｇから約１.５ｇ、例えば０.００１ｇから１.５ｇ；
−  約０.０１mg／体重kgから約２０mg／体重kg、例えば０.０１mg／体重kgから２０mg／体重kg、
の範囲であり、例えば１日４回までの分割量で投与する。
【００５５】
本発明の薬剤は任意の慣用の経路で、例えば経鼻、口腔、直腸、経口投与を含む、例えば経腸投与で；例えば、静脈内、筋肉内、皮下を含む非経腸投与で；または例えば皮膚上、鼻腔内、気管内を含む局所投与で；局所送達のための医療デバイス、例えばステントを介して、
例えばコーティングまたは非コーティング錠剤、カプセル、(注射可能)溶液、固溶体、懸濁液、分散剤、固体分散剤の形で；例えばアンプル、バイアルの形で、クリーム、ゲル、ペースト、吸入粉末、泡状物、チンキ、リップスティック、液滴、スプレーの形で、または坐薬の形で投与できる。
【００５６】
例えば眼への投与を含む局所使用について、０.５−１０％、例えば１−３％濃度の活性物質の１日数回、例えば１日２から５回の局所投与により、満足行く結果を得ることができる。
【００５７】
本発明の薬剤は薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩または金属塩の形で；または遊離形で；所望により溶媒和物の形で使用できる。塩の形の本発明の薬剤は遊離形の；所望により溶媒和物の形の本発明の薬剤と同程度の活性を有する。
【００５８】
本発明の薬剤は、本発明に従う医薬処置のために単独で、または１種以上の他の薬学的活性剤と組み合わせて使用できる。
【００５９】
組み合わせは、２種以上の薬学的活性剤が同じ製剤中に存在する固定された組み合わせ剤；別々の製剤中の薬学的活性剤が、例えば併用投与の指示書と共に同じ包装内で販売されるキット；および複数の薬学的活性剤が別々に包装されているが、同時のまたは連続的な投与のための指示が与えられる、自由な組み合わせを含む。
【００６０】
図面の説明
図１は、種々の免疫細胞におけるＧＰＲ９１の発現を示す。図１から、ＧＰＲ９１が主に樹状細胞で、そして、例えあるとしても非常に限定された量で単球、Ｔ細胞またはＢ細胞でも、発現されることが直ちに明白となる。
図２は、種々の組織におけるＧＰＲ９１の発現を示す。
【００６１】
下記略語を使用する：
【表１】
2008541026.tif 000002
【実施例】
【００６２】
定量的実時間ＰＣＲによるＧＰＲ９１の遺伝子発現
ａ)ＲＴ−ＰＣＲプロトコール
プライマーを、PrimerExpress program(Applied Biosystems)を使用して、ＧＰＲ９１配列および内部対照としてのハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αのために設計する。
増幅法は、定量的実時間ＰＣＲ(TaqMan)のための最先端プロトコールに従う。各反応混合物は２５μLの最終容量に、１  Taqman Universal Master Mix(Applied Biosystems)、０.２５単位Platinium Taq DNAポリメラーゼ(Gibco)、５０ng  ｃＤＮＡ、および４５０nMのプライマー(前向きおよび後ろ向きプライマー)および２００nM(TaqManプローブ)濃度を含む。サイクリングを、９６ウェル光学反応プレート(Applied Biosystems)中、ABI7700 PCR装置を使用して行う。サイクリング条件は下記の通りである：５０°で２分の前活性化、９４°で１０分、１サイクル、次いで９５°で１５秒で４５サイクルの変性、１分、６０°でアニーリングおよび伸長。本反応の動態を、４８８nm励起および５１８nm放出波長で記録する。
【００６３】
ｂ)細胞の調製、ＲＮＡおよび最初のｃＤＮＡ合成
本分析に使用する細胞は、ＬＰＳ、ＩＬ−１０または両方の組み合わせで活性化した初代、ヒト単球(ｈＰＢＭ)、ＰＨＡで活性化した初代ヒトＴ細胞(ｈＰＢＴＣ)、抗ＣＤ４０リガンドにより活性化したヒトＢ細胞(ｈＰＢＣ)、ＬＰＳ、ＩＬ−１０または両方の組み合わせで活性化したヒト単球由来樹状細胞(ＤＣ)である。
初代ヒト単球は標準プロトコールに従い、水簸(elutriation)により単離する。
ＴおよびＢ細胞を末梢血から製造者のプロトコールに従い、ＭＡＣＳビーズ(Milteny)により単離する。ヒトＤＣを、ｈＰＢＭを標準プロトコールに従いＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養することによりインビトロで産生する。
ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従い、ＳＮＡＰＴＭ抽出キット(InVitrogen)を使用して細胞から調製する。
第一鎖ｃＤＮＡを、全細胞ＲＮＡから、Applied Biosystemsの、ランダム・ヘキサマー・プライマーを含むTaqMan逆転写キットを使用して調製する。
【００６４】
ｃ)遺伝子発現プロファイル
上記の通りに提供されるプライマーにより表されるＧＰＲ９１配列を、市販の組織由来のｃＤＮＡ(Clontech panel IおよびII)中で、および種々の細胞型において、により上記の通りの定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、Applied Biosystemsから供給された試薬を使用し、そして製造者のプロトコールに従い増幅させる。対照反応を、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αに特異的なプライマーで行う。
【００６５】
より詳細には：
選択した配列を、上記の通りの組織および種々の細胞型由来のｃＤＮＡに、製造者のプロトコールに従った定量的ＲＴ−ＰＣＲまたは半定量的ＰＣＲにより、プロファイルする。対照反応を、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αに特異的なプライマーで行う。ＲＴ−ＰＣＲプロファイリングに使用するための組織ｃＤＮＡはClontechから購入する。半定量的ＰＣＲにおいて、各反応混合物は２５μlの総容量中に０.２mM  ｄＮＴＰ、１.５mM  ＭｇＣｌ２を含む１×ＰＣＲ緩衝液、０.５単位Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、５０pmolの各プライマーおよび脱イオンＨ２Ｏを含む。
使用したｃＤＮＡ鋳型は、Clontech panel IおよびIIの組織サンプル由来の市販のｃＤＮＡ(２.５μl)または上記の細胞型から調製したｃＤＮＡ(１μl)のいずれか由来である。サイクリングを０.２ml試験管中、最適に決定されたアニーリング温度でBiometra Trio PCR機を使用して行う。サイクリング条件は下記の通りである：９４°で１分、４５秒で１サイクルの変性、次いで９４°で１５秒の３５サイクルの変性、１５秒のアニーリングおよび７２°で３０秒の伸長。反応を１.５％アガロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドで染色する。対照ＲＴ−ＰＣＲ反応をハウスキーピング遺伝子ＥＦ１αに特異的なプライマーで行う。
ＧＰＲ９１の発現値は、ＥＦ１αの発現に対して、下記に従い標準化する：
相対的発現Ｎ＝１０００×２(ＣＴ＿ＰＳＩ−ＣＴ＿ＥＦ１α)
【００６６】
結果は図１および２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】種々の免疫細胞におけるＧＰＲ９１の発現を示す。図１から、ＧＰＲ９１が主に樹状細胞で、そして、例えあるとしても非常に限定された量で単球、Ｔ細胞またはＢ細胞でも、発現されることが直ちに明白となる。
【図２】種々の組織におけるＧＰＲ９１の発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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