(57)【要約】  本発明は、内皮前駆細胞（pre-endothelial cell）および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す、脂肪由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を包含する。本発明はまた、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す、脂肪由来成体間質細胞を作製するための組成物および方法をも包含する。血管移植、組織工学、血管新生・脈管形成の調節、および心疾患等の多数の疾患の治療における該細胞の使用方法も含まれる。【選択図】図１
2008528041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮前駆細胞（pre-endothelial cell）の少なくとも１つの性質を示すように誘導された、単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞。
【請求項２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化するように誘導される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ｉｎ ｖｉｖｏで分化するように誘導される、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
外来性の遺伝物質が導入されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
ヒト由来である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
ＣＤ３４およびＣＤ３１のうち少なくとも１つを発現している、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳ細胞からのＣＤ３４およびＣＤ３１それぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４およびＣＤ３１の少なくとも１つを発現している、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つを発現している、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳ細胞からのＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０およびＣＤ６３それぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つを発現している、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示す単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を分化させる方法であって、該細胞をＭＩＩ培地中でインキュベートし、続いて該細胞をＭＩＩＩ培地中でインキュベートすることを含む、上記方法。
【請求項１１】
前記細胞がヒト由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＩＩ培地が、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミンおよび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記グルタミンの濃度が約２．３ｍＭである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＦＧＦの濃度が約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＩＩＩ培地が、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミン、ニコチンアミドおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記グルタミンの濃度が約２．３ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニコチンアミドの濃度が約１０ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＢＳの濃度が約２％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示す細胞へと分化させるための分化用培地であって、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミンおよび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が添加され、ＭＩＩ培地と名付けられている、上記培地。
【請求項２０】
前記グルタミンの濃度が約２．３ｍＭである、請求項１９に記載の培地。
【請求項２１】
前記ＦＧＦの濃度が約１０ｎｇ／ｍＬである、請求項１９に記載の培地。
【請求項２２】
単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示す細胞へと分化させるための分化用培地であって、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミン、ニコチンアミドおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）が添加され、ＭＩＩＩ培地と名付けられている、上記培地。
【請求項２３】
前記グルタミンの濃度が約２．３ｍＭである、請求項２２に記載の培地。
【請求項２４】
前記ニコチンアミドの濃度が約１０ｍＭである、請求項２２に記載の培地。
【請求項２５】
前記ＦＢＳの濃度が約２％である、請求項２２に記載の培地。
【請求項２６】
動物体内で脈管形成を誘導する方法であって、以下のステップ：
（ａ）単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導するステップ；および
（ｂ）該細胞を動物に投与するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２７】
前記ＡＤＡＳ細胞が前記動物から単離されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＤＡＳ細胞が同種ドナーから単離されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＤＡＳ細胞が異種ドナーから単離されたものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＤＡＳがヒト由来である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞から内皮前駆細胞および／または内皮細胞への分化に影響する化合物の能力を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）ＡＤＡＳ細胞を間質細胞培地中で一定時間培養するステップ；
（ｂ）該間質細胞培地を化合物または対照ビヒクルを含んでなる分化用培地と交換するステップ；
（ｃ）該ＡＤＡＳ細胞を該化合物または該対照ビヒクルを含んでなる該分化用培地中で一定時間インキュベートするステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）から、該化合物を含んでなる該分化用培地を用いて分化した細胞の数またはパーセンテージを測定するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）から、該ビヒクルを単独で含有する該分化用培地を用いた細胞中の分化細胞のパーセンテージ数を測定するステップ；
（ｆ）ステップ（ｄ）および（ｅ）から得られた分化細胞の数またはパーセンテージを比較するステップ；
（ｇ）ステップ（ｄ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数がステップ（ｅ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数と比較して大きければ、該化合物がＡＤＡＳ細胞から内皮前駆細胞および／または内皮細胞への分化を誘導することが可能であることが示されるステップ
を含む、上記方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト由来である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内皮前駆細胞（pre-endothelial cell）および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す、脂肪由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞に関する。本発明はまた、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す、脂肪由来成体間質細胞を作製するための組成物および方法にも関する。血管移植、組織工学、血管新生・脈管形成の調節、および心疾患等の多数の疾患の治療における該細胞の使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの発生における新生児期は、複数の分化経路に沿って発達する潜在能力を有する「幹」細胞の存在を特徴とする。これらの細胞の最終分化は、器官形成と組織構造とを協調させるサイトカインおよびホルモンの合図によって決定される。マウス由来の胚幹（ＥＳ）細胞が単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて広範に研究されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏで外来性の刺激を用いて、研究者は複数の系列の経路に沿ったＥＳ細胞の分化を誘導している。これらの経路は、神経細胞系、Ｂリンパ細胞系、および脂肪細胞系を含む（Daniら、1997, J. Cell Sci. 110:1279; Remoncourtら、1998, Mech. Dev. 79:185; O’Shea, 1999, Anat. Rec. 257:32）。
【０００３】
多能性（multipotent）幹細胞はまた成体生物の組織にも存在する。成体幹細胞の最もよく特徴付けられている例は、骨髄および末梢血から単離される造血前駆細胞である。無処置では、致死的な放射線照射を受けたマウスは循環血液細胞を補充することができないため死亡したが、同系のドナー動物由来の骨髄細胞の移植は宿主動物を救った。ドナー細胞は循環血液細胞の再増殖に関与した。研究はその後、未分化の造血幹細胞が宿主動物において異なる血液細胞系列を再生できることを実証するために行われた。これらの研究は、癌および先天性代謝異常のために広く受け入れられている治療法である、骨髄移植の基礎を提供している。
【０００４】
骨髄由来細胞はまた、他の細胞タイプに分化できることも見いだされた。骨髄は少なくとも２種類の幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞または髄間質細胞（ＭＳＣ）または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）と様々に呼ばれる非造血組織の幹細胞を含む。これらの用語は本明細書を通じて同義的に用いられる。ＭＳＣは、骨髄穿刺液から簡単に単離され、容易に単一細胞由来のコロニーを形成するため興味深い。単一細胞由来のコロニーは約１０週間で５０回もの分裂を介して増殖でき、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞（Friedensteinら、1970, Cell Tissue Kinet. 3:393-403; Castro-Malaspinaら、1980, Blood 56:289-301; Beresfordら、1992, J. Cell Sci. 102:341-351; Prockop, 1997, Science 276:71-74）、筋細胞（Wakitaniら、1995, Muscle Nerve 18:1417-1426）、星状細胞、オリゴデンドロサイト、および神経細胞（Aziziら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913; Kopenら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10711-10716; Choppら、2000, Neuroreport II, 3001-3005; Woodburyら、2000, Neuroscience Res. 61:364-370）に分化することができる。
【０００５】
さらに、ＭＳＣは３種類の胚葉細胞のすべてを生じる（Kopenら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10711-10716; Liechtyら、2000, Nature Med. 6:1282-1286; Kottonetら、2001, Development 128:5181-5188; Tomaら、2002, Circulation 105:93-98; Jiangら、2002, Nature 418:41-49）。ｉｎ ｖｉｖｏでの知見は、非分画骨髄由来細胞ならびに純粋なＭＳＣ集団が肺のそれをはじめとする上皮細胞タイプを生じることを示し（Krauseら、2001, Cell 105:369-377; Petersenら、1999, Science 284:1168-1170）、いくつかの最近の研究は、ＭＳＣの生着が組織損傷によって促進されることを示した（Ferrariら、1998, Science 279:1528-1530; Okamotoら、2002, Nature Med. 8:1101-1017）。これらの理由から、ＭＳＣは多数のヒト疾患の細胞治療および遺伝子治療におけるそれらの潜在的な用途について現在検証されている（Horwitzら、1999, Nat. Med. 5:309-313; Caplanら、2000, Clin. Orthoped. 379:567-570）。
【０００６】
ＭＳＣは代替的な多能性（pluripotent）幹細胞供給源となる。生理的条件下で、それらはそれぞれ、異なる細胞接着分子およびサイトカインの分泌により、骨髄の構造を維持し、造血を調節する（Clarkら、1995, Ann. NY Acad. Sci. 770:70-78）。組織培養用プラスチックへのそれらの選択的付着によって骨髄の外で培養されるＭＳＣは、効率的に増殖させることができ（Aziziら、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913; Colterら、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3213-218）、遺伝子操作することができる（Schwarzら、1999, Hum. Gene Ther. 10:2539-2549）。
【０００７】
ＭＳＣはまた、骨（Beresfordら、1992, J. Cell Sci. 102:341-351）、軟骨（Lennonら、1995, Exp. Cell Res. 219:211-222）、脂肪（Beresfordら、1992, J. Cell Sci. 102:341-351）および筋肉（Wakitaniら、1995, Muscle Nerve 18:1417-1426）をはじめとする多数の中胚葉性組織に分化できるため、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）とも呼ばれる。加えて、神経細胞マーカーを発現する神経様細胞への分化が報告されており（Woodburyら、2000, J. Neurosci. Res. 61:364-370; Sanchez-Ramosら、2000, Exp. Neurol. 164:247-256; Dengら、2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:148-152）、ＭＳＣが胚葉の拘束を克服しうることを示唆している。これらの知見に基づき、骨髄は、骨、軟骨、筋肉、脂肪組織、肝臓、神経組織および他の組織の再生のための間質幹細胞源として提案されている。しかし、骨髄間質細胞の採取はドナーに対して高い危険性と苦痛を伴う。
【０００８】
対照的に、成人の髄外脂肪組織由来間質細胞（ＡＤＡＳ）は、患者に対して最低限の危険性または苦痛しか伴わずに定期的に採取され得る間質幹細胞源となる。病理学的な知見は、脂肪由来間質細胞が複数の系列の経路に沿って分化できることを示唆する。さらに、脂肪組織由来の間質細胞は多数の中胚葉性組織に分化できることが実証されている。
【０００９】
脈管形成（vasculogenesis）、すなわち、血管芽細胞として知られる未分化内皮前駆細胞が、内皮細胞（集合して第一次毛細血管網を形成する）へとｉｎ ｓｉｔｕで分化することは、胚発生の間の血管系の発達に関与する（Peichevら、2000, Blood 95:952-958）。一方、既存の血管からの出芽過程による新たな血管の形成と定義される血管新生（angiogenesis）は、発生中と出生後の両方で起こる（Peichevら、2000, Blood 95:952-958; Wattら、1995, Leuk. Lymphoma 17:229-235; Reyesら、2001, Blood 98:2615-2625）。最近まで、出生後の血管形成は既存の血管からの内皮細胞の出芽によって仲介されると考えられていた。しかし、最近の研究は、内皮幹細胞が成体期にも存続し、そこでそれらが新たな血管の形成に寄与しうることを示唆している（Nishikawaら、1998, Development 125:1747-1757; Gehlingら、2000, Blood 95:3106-3112; Rafiiら、1994, Blood 84:10-18; Asaharaら、1997, Science 275:964-967）。これは言い換えると、発生の間と同様に、成体における新血管形成が少なくとも部分的には脈管形成の過程に依存しうることを示唆する。内皮細胞の前駆体は骨髄および末梢血から単離されている（Peichevら、2000, Blood 95:952-958; Wattら、1995, Leuk. Lymphoma 17:229-235）。これらの内皮前駆細胞の個体発生論は未知である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、内皮細胞を生じ得る前駆細胞の容易に入手可能な供給源の単離方法および増殖方法が必要とされている。多くの内皮前駆細胞を培養し入手するための現在の方法は成功していない。多くの内皮前駆細胞の利用可能性は、血管移植、組織工学、血管新生・脈管形成の調節、および心疾患をはじめとする多数の障害の治療において非常に有用となるであろう。
【００１１】
このように、治療および実験目的に有用な多数のこのような細胞を得るために、内皮前駆細胞の増殖を最大にする培養条件の標準化のための方法および組成物が、長年必要とされている。本発明はこの必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す、脂肪由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を作製するための組成物および方法を包含する。
【００１３】
一態様では、ＡＤＡＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで分化するように誘導される。
【００１４】
別の態様では、ＡＤＡＳ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで分化するように誘導される。
【００１５】
さらなる態様では、ＡＤＡＳ細胞は外来性の遺伝物質を発現するように操作されている。
【００１６】
さらに別の態様では、ＡＤＡＳ細胞はヒト由来である。
【００１７】
本発明はまた、ＣＤ３４およびＣＤ３１のうち少なくとも１つを発現するように誘導されたＡＤＡＳ細胞をも包含する。
【００１８】
一態様では、ＡＤＡＳ細胞は、内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳ細胞からのＣＤ３４およびＣＤ３１それぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４およびＣＤ３１の少なくとも１つを発現している。
【００１９】
別の態様では、ＡＤＡＳ細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つを発現している。
【００２０】
さらに別の態様では、ＡＤＡＳ細胞は、内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳ細胞からのＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０およびＣＤ６３それぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つを発現している。
【００２１】
本発明はまた、ＡＤＡＳ細胞を内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように分化させる方法をも包含し、その方法は該細胞をＭＩＩ培地中でインキュベートし、続いて該細胞をＭＩＩＩ培地中でインキュベートすることを含む。
【００２２】
一態様では、その方法はヒト由来のＡＤＡＳ細胞の使用を含む。
【００２３】
別の態様では、ＭＩＩ培地は、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミンおよび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含有する。
【００２４】
さらに別の態様では、ＭＩＩ培地中のグルタミンの濃度は約２．３ｍＭである。
【００２５】
さらなる態様では、ＭＩＩ培地中のＦＧＦの濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。
【００２６】
一態様では、ＭＩＩＩ培地は、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミン、ニコチンアミドおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する。
【００２７】
別の態様では、ＭＩＩＩ培地中のグルタミンの濃度は約２．３ｍＭである。
【００２８】
さらに別の態様では、ＭＩＩＩ培地中のニコチンアミドの濃度は約１０ｍＭである。
【００２９】
さらなる態様では、ＭＩＩＩ培地中のＦＢＳの濃度は約２％である。
【００３０】
本発明はまた、動物体内で脈管形成を誘導する方法をも包含し、その方法は、
（ａ）単離された脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導するステップ；および
（ｂ）そのように誘導された該細胞を該動物に投与するステップ
を含む。
【００３１】
一態様では、ＡＤＡＳ細胞は前記動物の自己細胞である。
【００３２】
別の態様では、ＡＤＡＳ細胞は同種ドナーから単離される。
【００３３】
さらなる態様では、ＡＤＡＳ細胞は異種ドナーから単離される。
【００３４】
さらに別の態様では、ＡＤＡＳ細胞はヒト由来である。
【００３５】
本発明はまた、ＡＤＡＳ細胞の内皮前駆細胞および／または内皮細胞への分化に影響する化合物の能力を測定する方法をも包含し、その方法は、
（ａ）該ＡＤＡＳ細胞を間質細胞培地中で一定時間培養するステップ；
（ｂ）該間質細胞培地を化合物または対照ビヒクルを含有する分化用培地と交換するステップ；
（ｃ）該ＡＤＡＳ細胞を該化合物または該対照ビヒクルを含有する該分化用培地中で一定時間インキュベートするステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）から、該化合物を含有する該分化用培地を用いて分化した細胞の数またはパーセンテージを測定するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）から、該ビヒクルを単独で含有する該分化用培地を用いた細胞中の分化細胞のパーセンテージ数を測定するステップ；
（ｆ）ステップ（ｄ）および（ｅ）から得られた分化細胞の数またはパーセンテージを比較するステップ；
（ｇ）ステップ（ｄ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数がステップ（ｅ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数と比較して大きければ、該化合物が該ＡＤＡＳ細胞の内皮前駆細胞および／または内皮細胞への分化を誘導することが可能であることが示されるステップ
を含む。
【００３６】
一態様では、ＡＤＡＳ細胞はヒトに由来する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞を内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導する組成物ならびに方法を提供する。本発明の方法によって作製される細胞は、研究、移植、ならびに疾患の治療および組織修復のための組織工学製品の開発に使用され得る機能的な細胞の供給源を提供する。
【００３８】
定義
本明細書において用いられる場合、下記のそれぞれの用語は、この項においてそれと関連付けられている意味を有する。
【００３９】
冠詞の「a」および「an」は、本明細書においてその冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために用いられる。一例として、「an element」は１つのエレメントまたは１つ以上のエレメントを意味する。
【００４０】
「約」という用語は当業者によって理解され、それが用いられる文脈によってある程度異なるであろう。
【００４１】
本明細書において用いられる場合、「脂肪由来間質細胞」、「脂肪組織由来間質細胞」、または「脂肪組織由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞」は互換可能に用いられ、脂肪組織に由来する、骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞などの様々な異なる細胞型への幹細胞様前駆細胞として機能し得る間質細胞を指す。
【００４２】
「脂肪」とはいずれかの脂肪組織を指す。脂肪組織は褐色脂肪組織または白色脂肪組織でありうる。好ましくは、脂肪は皮下白色脂肪組織である。このような細胞は、初代培養細胞または不死化細胞株を含みうる。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来しうる。好ましくは、脂肪組織は哺乳動物由来であり、最も好ましくは、脂肪組織はヒト由来である。ヒト脂肪組織の都合の良い供給源は脂肪吸引手術からである。しかし、脂肪組織の供給源または脂肪組織の単離方法は、本発明にとって重要ではない。
【００４３】
「同種の」とは、同一種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【００４４】
本明細書において定義されるように、「同種の脂肪由来成体間質細胞」はレシピエントと同一種の異なる個体から得られる。
【００４５】
「同種抗原」は、レシピエントによって発現される抗原とは異なる抗原である。
【００４６】
「ドナー抗原」とは、レシピエントに移植されるドナー組織によって発現される抗原を指す。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「エフェクター細胞」とは、抗原に対する免疫反応を仲介する細胞を指す。移植物がレシピエントに導入される場合、エフェクター細胞はドナー移植物中に存在する抗原に対して免疫反応を誘導するレシピエント自身の細胞であり得る。別の状況では、エフェクター細胞は移植物の一部であり得、それによって、移植物のレシピエントへの導入は、移植物中に存在するエフェクター細胞に、レシピエントに対する移植物の免疫反応を生じさせる。
【００４８】
本明細書において用いられる場合、「自己の」とは同一個体に由来する任意の物質を指すことを意味し、それは後で個体に再導入される。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、「血管新生」という用語は、新たな血管が既存の血管系および組織から形成される過程を指す（Folkman, 1995, Nat. Med. 1:37-31）。「修復またはリモデリング」という語句は既存の血管系の再形成を指す。組織虚血の緩和は血管新生に大きく依存する。新たな血管の自発的成長は虚血領域およびその周囲に側副血行をもたらし、血流を改善し、虚血によって生じた症状を緩和する。
【００５０】
本明細書において用いられる場合、「血管新生因子」または「血管新生タンパク質」という用語は、既存の血管系からの新たな血管の成長（「血管新生」）を促進することができる任意の既知のタンパク質を指す。本発明での使用に適した血管新生因子は、胎盤成長因子、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ニューロピリン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、オステオポンチン、プレイオトロピン、アクチビン、エンドセリン−１およびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。血管新生因子は単独で、または互いに組み合わせて作用し得る。組み合わせた場合、血管新生因子は相乗的にも作用し得るため、それらの因子の複合効果は、別々に投与された個々の因子の効果の合計より大きい。「血管新生因子」または「血管新生タンパク質」という用語はまた、このような因子の機能的類似体をも包含する。機能的類似体は、例えば因子の機能部分を含む。機能的類似体はまた、それらの因子の受容体に結合し、そのためそれらの因子の血管新生および／または組織リモデリングを促進する活性を模倣する抗イディオタイプ抗体をも含む。このような抗イディオタイプ抗体を作製する方法は当技術分野においてよく知られており、例えば、ＷＯ ９７／２３５１０に記載される（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００５１】
「血管新生因子」は、本明細書において用いられる場合、任意の適切な供給源から産生または入手され得る。例えば、それらの因子はそれらの天然の供給源から精製することができ、または合成もしくは組換え発現によって産生され得る。それらの因子はタンパク質組成物として患者に投与され得る。それらの因子は、それらの因子をコードする発現プラスミドの形で投与され得る。適切な発現プラスミドの構築は当技術分野においてよく知られている。発現プラスミドを構築するための適切なベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＲＮＡベクター、リポソーム、カチオン性脂質、レンチウイルスベクターおよびトランスポゾンを含む。
【００５２】
本明細書において用いられる場合、「生体適合性格子」（biocompatible lattice）という用語は、組織発達を促す３次元構造の形成を促進することができる基材を指すことを意味する。従って、例えば、細胞は、細胞外マトリックス物質、合成ポリマー、サイトカイン、増殖因子等を含むものなどの、このような生体適合性格子上に培養または播種され得る。格子は、組織型の発達を促進するために望ましい形状に成形され得る。また、少なくとも細胞培養の初期段階で、培地および／または基材は、適切な組織型および構造の発達を促進する因子（例えば、増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックス物質等）を添加される。
【００５３】
「分化した」とは、本明細書では、成熟の最終段階に達して細胞が完全に発達し、生物学的特殊化および／または特定の環境への適応および／または機能を示す細胞を指すために用いられる。一般的に、分化した細胞は、特定の細胞における分化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現によって特徴付けられる。例えば、内皮細胞マーカーＣＤ３１およびフォン・ウィルブラント因子の発現ならびに「敷石状」形態の形成は、分化した成熟内皮細胞の典型的な例である。細胞が「分化した」と言われる時、その用語が本明細書において用いられる場合、その細胞は分化の過程にある。
【００５４】
「分化用培地」とは、本明細書では、培地中でインキュベートされる時完全には分化していない幹細胞、脂肪由来成体間質細胞または他のこのような前駆細胞が、分化した細胞の特性のいくつかもしくはすべてを有する細胞に発達することができるような、添加物を含有するあるいは添加物を含まない細胞増殖培地を指すために用いられる。
【００５５】
「内皮ＡＤＡＳ細胞」とは、本明細書では、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳ細胞を指すために用いられる。
【００５６】
「増殖性」とは、本明細書では、細胞の増殖する能力、例えば、数を増やす能力、または細胞集団の場合には分裂を行う能力を指すために用いられる。
【００５７】
「移植片」は、移植のための細胞、組織、器官または他の任意の生物学的適合格子を指す。
【００５８】
「増殖因子」は、ピコグラム／ｍＬ〜ミリグラム／ｍＬレベルの濃度での、以下の特定の因子、すなわち、成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテジェリンリガンド、インスリン、インスリン様成長因子、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および骨形態形成タンパク質をはじめとする因子を意味するがそれらに限定されない。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、「増殖培地」という用語は、細胞の増殖を促進する培地を指すことを意味する。増殖培地は通常、動物血清を含有するであろう。場合によっては、増殖培地は動物血清を含まなくてもよい。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、「多能性の」または「多能性」という用語は、中枢神経系の幹細胞が、１つ以上の種類の細胞に分化する能力を指す。
【００６１】
「増殖」とは、本明細書では、同様の形態、特に細胞の複製または増加を指すために用いられる。すなわち、増殖とはより多くの細胞の産生を包含し、特に、単に細胞数の計数、３Ｈ−チミジンの細胞内への取り込みの測定などによって測定され得る。
【００６２】
「前駆細胞」（precursor cell）、「始原細胞」（progenitor cell）および「幹細胞」という用語は、当技術分野および本明細書において同義的に用いられ、それ自身が新生するため、または、例えば、内皮細胞もしくは内皮様細胞に分化するであろう子孫細胞を生じるために潜在的に無制限の回数の有糸分裂ができる多能性（pluripotent）前駆細胞すなわち系列中立の前駆細胞；あるいは自己新生でき、かつ内皮細胞もしくは内皮様細胞に分化できる、系列の確定した前駆細胞およびその子孫細胞のいずれかを指す。多能性（pluripotent）幹細胞とは異なり、系列の確定した前駆細胞は通常、互いに表現型の異なる多数の細胞タイプを生じることはできないと考えられる。代わりに、前駆細胞は１つまたは場合によっては２つの系列の確定した細胞タイプを生じる。
【００６３】
「内皮前駆細胞」という用語は、それ自身を新生するため、または内皮細胞もしくは内皮様細胞に分化するであろう子孫細胞を生じるために潜在的に無制限の回数の有糸分裂ができる細胞を指す。
【００６４】
「間質細胞培地」という用語は、本明細書において用いられる場合、ＡＤＡＳ細胞の培養に有用な培地を指す。通常、間質細胞培地は基本培地、血清および抗生物質／抗真菌剤を含有している。しかし、ＡＤＡＳ細胞は抗生物質／抗真菌剤を含まず少なくとも１つの増殖因子を添加した間質細胞培地で培養することができる。好ましくは、その増殖因子はヒト内皮増殖因子（ｈＥＧＦ）である。ｈＥＧＦの好ましい濃度は約１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは、その濃度は約５ｎｇ／ｍＬである。好ましい基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）である。好ましい血清はウシ胎児血清（ＦＢＳ）であるが、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウマ血清またはヒト血清をはじめとする他の血清が使用されうる。間質細胞の増殖を支援するために、好ましくは最大２０％までのＦＢＳが上記培地に添加される。しかし、間質細胞の増殖に必要なＦＢＳ中の増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが同定され、適切な濃度で増殖培地に供給される場合、合成培地が使用されうる。さらに、付加的な成分を培地に添加しうることも認識される。そのような成分としては、抗生物質、抗真菌剤、アルブミン、増殖因子、アミノ酸、および細胞の培養のために当技術分野において既知の他の成分が挙げられるが、それらに限定されない。培地に添加され得る抗生物質は、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むがそれらに限定されない。培地中のペニシリンの濃度は約１０〜約２００ユニット／ｍＬである。培地中のストレプトマイシンの濃度は約１０〜約２００μｇ／ｍＬである。しかし、本発明は、決していずれか１つの間質細胞培養のための培地に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、組織培養において間質細胞を支援することができる任意の培地が使用されうる。
【００６５】
「ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメン」は、ＡＤＡＳ細胞のＭＩＩ培地でのインキュベーションとそれに続くその細胞のＭＩＩＩ培地でのインキュベーションを指す。
【００６６】
「移植物」は、移植される対象の生体適合性格子またはドナー組織、器官もしくは細胞を指す。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、「治療上有効な量」とは、細胞が投与される被験体に有益な効果をもたらすのに十分な、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳ細胞の量である。
【００６８】
「異種の」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、「内因性」とは、生物、細胞もしくは系の内部に由来する、または内部で産生される任意の物質を指す。
【００７０】
「外来性」とは、生物、細胞、もしくは系の外部から導入される、または外部で産生される任意の物質を指す。
【００７１】
「コードする」とは、生物学的過程において、所定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）もしくは所定のアミノ酸配列とその結果生じる生物学的特性のいずれかを有する他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の遺伝的特性を指す。従って、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を生成する場合、遺伝子はタンパク質をコードしている。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表において提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子もしくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖との両方は、タンパク質もしくはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードすると見なすことができる。
【００７２】
他に特に規定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であり、同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含みうる。
【００７３】
「単離された核酸」とは、天然の状態でそれと隣接する配列から分離された核酸部分または断片、例えば、本来はその断片と隣接している配列、例えば、それが自然に存在するゲノム内でその断片と隣接している配列から取り出されたＤＮＡ断片を指す。その用語はまた、天然では核酸とともにある他の成分、例えば、天然では細胞内でそれとともにあるＲＮＡもしくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。その用語は、従って、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドもしくはウイルス内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれている組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した別の分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生じたゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００７４】
本発明の状況において、通常存在する核酸塩基に対して下記の略語が用いられる。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００７５】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る合成物である。多数のベクターが当技術分野において知られており、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン化合物または両親媒性化合物を伴うポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが挙げられるがそれらに限定されない。従って、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。その用語はまた、核酸の細胞内への輸送を促進する非プラスミド性および非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどをも包含すると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、それらに限定されない。
【００７６】
「発現ベクター」は、発現される対象のヌクレオチド配列に機能しうる形で連結された発現制御配列を有する組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを有し、発現のための他のエレメントは宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系によって提供され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込んでいる（例えば、裸の、またはリポソームに含まれた）コスミド、プラスミドおよびウイルスなど、当技術分野において既知のすべてのものを含む。
【００７７】
説明
脂肪組織は、幹細胞供給源として骨髄の代替物を提供する。脂肪組織は容易に入手可能であり、多くの個体に豊富に存在する。脂肪組織に由来する幹細胞は、比較的非侵襲性の方法である脂肪吸引によって採取でき、大量の脂肪由来成体間質（ＡＤＡＳ）細胞をもたらし得る。
【００７８】
本発明は、ＡＤＡＳ細胞が合成培地によって内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように処理され得るという発見に関する。これらの細胞は、本明細書において「内皮ＡＤＡＳ細胞」と呼ばれる。従って、本明細書における開示に基づき、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す内皮ＡＤＡＳ細胞の大集団を作製することができ、成熟内皮細胞に分化するそれらの能力を維持しながら増殖させることができる。このように、本発明は、実験／治療目的のために有用な多数の内皮ＡＤＡＳ細胞を作製する組成物および方法を包含する。
【００７９】
I. ＡＤＡＳの単離および培養
本発明の方法に有用なＡＤＡＳ細胞は、当業者に知られている様々な方法によって単離されうる。例えば、このような方法は米国特許第６，１５３，４３２号に記載され、該文献はその全体が本明細書に組み入れられる。好ましい方法では、ＡＤＡＳ細胞は哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験者から単離される。ヒトでは、ＡＤＡＳ細胞は通常、脂肪吸引物から単離される。本発明の細胞がヒト被験者に移植される場合、ＡＤＡＳ細胞は、自己移植を行うために同一被験者のそれから単離されることが好ましい。
【００８０】
本発明の別の態様では、投与されるＡＤＡＳ細胞はレシピエントに対して同種でありうる。同種ＡＤＡＳ細胞は、レシピエントと同一種の別個体であるドナーから単離される。単離後、同種産物を作製するために、細胞は本明細書において開示される方法を用いて培養される。本発明はまた、レシピエントに対して異種のＡＤＡＳ細胞をも包含する。
【００８１】
本発明をいかようにも限定することなく、脂肪組織由来の間質細胞は本明細書において開示される方法を用いて単離され得る。簡潔には、皮下貯蔵脂肪由来のヒト脂肪組織を脂肪吸引手術によって摘出する。その後、脂肪組織を脂肪吸引カップから５００ｍＬの滅菌ビーカーに移し、約１０分間静置しておく。沈殿した血液を吸引によって除去する。約１２５ｍＬの量（またはそれ以下）の組織を２５０ｍＬの遠心管に移し、その後、遠心管をクレブス・リンガーバッファーで満たす。組織とバッファーを約３分間、またははっきりと分離するまで静置し、その後、バッファーを吸引によって除去する。組織をクレブス・リンガーバッファーでさらに４〜５回、または組織が橙黄色になりバッファーが淡褐色になるまで洗浄することができる。
【００８２】
脂肪組織の間質細胞はコラゲナーゼ処理を用いて分散され得る。簡潔には、バッファーを組織から除去し、１ｍＬ組織あたり１ｍＬコラゲナーゼ溶液の比率で、約２ｍｇコラゲナーゼ／ｍＬクレブスバッファー（Worthington, ME）溶液に置換する。チューブを３７℃の水浴で断続的に振とうしながら約３０〜３５分間インキュベートする。
【００８３】
間質細胞は、５分間５００×ｇで室温での遠心分離によって脂肪組織の他の成分から単離される。油および脂肪細胞の層は吸引によって除去される。残りの画分を強く回転させることにより約１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、５０ｍＬチューブに分け、５分間５００×ｇで遠心分離することができる。間質細胞を残してバッファーを吸引により除去する。その後、間質細胞を間質細胞培地に再懸濁し、適切な細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２中で一晩インキュベートする。一旦、組織培養皿またはフラスコに付着したら、培養間質細胞は直ちに使用することができ、または、目的とする細胞、例えば、実施例の項に記載されるような内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す細胞に分化させるために誘導する前に、一定時間もしくは何回かの継代の間、培養を維持することもできる。しかし、本発明は、決して間質細胞を単離するいずれか１つの方法に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、ＡＤＡＳ細胞を単離する任意の方法が本発明に包含されるべきである。
【００８４】
細胞培養において線維芽細胞を支援することができる任意の培地を、ＡＤＡＳを培養するために使用することができる。線維芽細胞の増殖を支援する培地組成は、イーグル最小必須培地、ＡＤＣ−１、ＬＰＭ（ウシ血清アルブミンを含まない）、Ｆ１０（ＨＡＭ）、Ｆ１２（ＨＡＭ）、ＤＣＣＭ１、ＤＣＣＭ２、ＲＰＭＩ １６４０、ＢＧＪ培地（Fitton-Jacksonの改変を伴うかまたは伴わない）、イーグル基礎培地（Earle's salt baseの添加を伴うＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地（血清を含まないＤＭＥＭ）、Yamane、ＩＭＥＭ−２０、グラスゴー改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）、ライボビッツＬ−１５培地、マッコイ５Ａ培地、Ｍ１９９培地（Earle's salt baseを含むＭ１９９Ｅ）、Ｍ１９９培地（Hank's salt baseを含むＭ１９９Ｈ）、イーグル最小必須培地（Earle's salt baseを含むＭＥＭ−Ｅ）、イーグル最小必須培地（Hank's salt baseを含むＭＥＭ−Ｈ）およびイーグル最小必須培地（非必須アミノ酸を含むＭＥＭ−ＮＡＡ）などを含むが、それらに限定されない。ＡＤＡＳの培養のために好ましい培地はＤＭＥＭであり、より好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）である。
【００８５】
本発明の方法において有用な培地のさらなる非限定的な例は、ウシまたは他の動物種の胎児血清を少なくとも１％〜約３０％、好ましくは少なくとも約５％〜１５％、最も好ましくは約１０％の濃度で含有し得る。ニワトリまたは他の動物種の胎児抽出液は、約１％〜３０％、好ましくは少なくとも約５％〜１５％、最も好ましくは約１０％の濃度で存在し得る。
【００８６】
単離後、ＡＤＡＳ細胞は、培養器具中の間質細胞培地中で一定時間、または細胞が別の培養器具に細胞を継代する前の密集度に達するまでインキュベートされる。培養器具は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に一般的に使用される任意の培養器具であり得る。好ましい培養器具は培養フラスコであり、より好ましい培養器具はＴ−２２５培養フラスコである。ＡＤＡＳ細胞は、抗生物質／抗真菌剤を含まず少なくとも１つの増殖因子を添加された間質細胞培地で培養され得る。好ましくは、その増殖因子はヒト内皮増殖因子（ｈＥＧＦ）である。ｈＥＧＦの好ましい濃度は、約１〜５０ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくはその濃度は約５ｎｇ／ｍＬである。
【００８７】
ＡＤＡＳ細胞は、抗生物質／抗真菌剤の非存在下でｈＥＧＦを添加した間質細胞培地中で、一定時間または細胞があるレベルの密集度に達するまで培養され得る。好ましくは、その密集度のレベルは７０％以上である。より好ましくは、密集度のレベルは９０％以上である。一定時間とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に適した任意の時間であり得る。間質細胞培地は、ＡＤＡＳ細胞の培養の間、任意の時点で交換されうる。好ましくは、間質細胞培地は３〜４日毎に交換される。その後、ＡＤＡＳ細胞は培養器具から回収され、そこでＡＤＡＳ細胞は直ちに使用することができ、または後で使用するために保存すべく凍結保存され得る。ＡＤＡＳ細胞は、トリプシン処理、ＥＤＴＡ処理、または細胞を培養器具から回収するために用いられる任意の他の方法によって回収されうる。
【００８８】
II. ＡＤＡＳ細胞の処理
本発明は、ＡＤＡＳ細胞を内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導する（これらの細胞は内皮ＡＤＡＳ細胞と呼ばれる）ためのＡＤＡＳ細胞の処理を包含する。特定の理論に拘束されることを意図しないが、２次元もしくは３次元の生体適合性格子における、血清、胎児抽出液、好ましくは非ヒト胎児抽出液、精製もしくは組換え増殖因子、サイトカイン、ホルモン、および／または化学物質の組合せを含有する合成培地によるＡＤＡＳ細胞の処理は、ＡＤＡＳ細胞を分化誘導すると考えられる。
【００８９】
ＭＩＩ培地：
ＡＤＡＳ細胞を内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導するために、新たに単離された、または凍結保存されたＡＤＡＳ細胞は、分化用培地による以下の処理に使用され得る。無処理のＡＤＡＳ細胞は、その他の点では同一のＡＤＡＳ細胞の分化用培地での処理の効果を比較するために、任意の増殖培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、１０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦおよび１ｎｇ／ｍＬ ｈＦＧＦを含有する培地中で培養される。例えば、処理群のＡＤＡＳ細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミンおよびＦＧＦを含有するＭＩＩ培地で培養され得る。本発明の一実施形態では、ＭＩＩ培地は血清を含まない。
【００９０】
好ましくは、ＭＩＩ培地中のグルタミンの濃度は、少なくとも０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、好ましくは少なくとも約１ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１．５ｍＭ〜１５ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも約１．５ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは少なくとも約２ｍＭ〜５ｍＭである。本発明の一態様では、グルタミンの濃度は約２．３ｍＭである。
【００９１】
ＭＩＩ培地中のｈＦＧＦの濃度は、少なくとも０．５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ〜７５ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも約１．５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも約２ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも約３ｎｇ／ｍＬ〜１５ｎｇ／ｍＬである。本発明の一態様では、ＭＩＩ培地中のｈＦＧＦの濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。
【００９２】
ＡＤＡＳ細胞は、ＡＤＡＳの表現型／形態が内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように変化するのに十分な時間、ＭＩＩ培地で処理され得る。好ましくは、ＡＤＡＳ細胞には段階的な処理レジメンが行われ、それは、最初の播種後１、３および５日目でのＭＩＩ培地の培地交換を伴う約６日間のＭＩＩ培地の初期処理から始まる。本開示に基づき、当業者は、ＡＤＡＳ細胞がＭＩＩ培地で６日間より長く処理され得ること、例えば、ＡＤＡＳ細胞は約１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または６ヶ月間でも処理され得ること；およびＭＩＩ培地は処理期間のいつでも交換できることを認識するであろう。
【００９３】
ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ培地中で一定時間または細胞があるレベルの密集度に達するまでインキュベートされる。好ましくは、その密集度のレベルは７０％より大きい。より好ましくは、密集度のレベルは９０％より大きい。細胞がＭＩＩ培地中で培養される一定時間とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に適した任意の時間であり得る。
【００９４】
特定の理論に拘束されることを意図せずに、ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理は、ＡＤＡＳ細胞の表現型および形態を変化させると考えられる。例えば、無処理または処理前のＡＤＡＳ細胞と比較した場合、ＭＩＩ培地で処理したＡＤＡＳ細胞はあまり線維芽細胞様の形態を示さず、細胞間結合のネットワークを形成してより丸い形態を示す。
【００９５】
ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理後、ＡＤＡＳ細胞は実験／治療での使用のために直ちに回収され得、または後で使用するために凍結保存され得る。本発明の一態様では、ＭＩＩ培地処理されたＡＤＡＳ細胞は、下記でさらに完全に記載されるＭＩＩＩ培地でさらに処理される。
【００９６】
ＭＩＩＩ培地：
ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理後、その細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、グルタミン、ニコチンアミド、ＦＢＳを含有するＭＩＩＩ培地でさらに処理され得る。ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理とそれに続くＭＩＩＩ培地での処理はまた、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地とも呼ばれる。特定の理論に拘束されることを意図せずに、ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳの処理に続くＭＩＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理は、細胞を内皮細胞系列に向けてさらに分化させると考えられる。ＭＩＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理は通常、ＭＩＩ処理およびＰＢＳを用いた洗浄ステップに続いて行われる。ＰＢＳを用いた洗浄ステップは、ＭＩＩＩ培地でＡＤＡＳ細胞を培養する前にＭＩＩ培地の成分を細胞培養物から除去する働きをする。しかし、本発明は、ＭＩＩ培地によるＡＤＡＳの処理後のＭＩＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理に限定されるべきではない。本発明は、ＡＤＡＳ細胞を内皮細胞系列に向けて分化させるために、任意の時点でのＭＩＩＩ培地の使用を包含すべきである。
【００９７】
好ましくは、ＭＩＩＩ培地中のグルタミンの濃度は、少なくとも０．５ｍＭ〜約２５ｍＭ、好ましくは少なくとも約１ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１．５ｍＭ〜１５ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも約１．５ｍＭ〜１０ｍＭ、最も好ましくは少なくとも約２ｍＭ〜５ｍＭである。本発明の一態様では、グルタミンの濃度は約２．３ｍＭである。
【００９８】
ＭＩＩＩ培地中のニコチンアミドの濃度は、少なくとも０．５ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは少なくとも約１ｍＭ〜７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１．５ｍＭ〜５０ｍＭ、さらに好ましくは少なくとも約２ｍＭ〜２５ｍＭ、最も好ましくは少なくとも約３ｍＭ〜１５ｍＭである。本発明の一態様では、ＭＩＩＩ培地中のニコチンアミドの濃度は約１０ｍＭである。
【００９９】
ＭＩＩＩ培地中のＦＢＳの濃度は、少なくとも０．５％〜約２０％、好ましくは少なくとも約０．７５％〜１５％、より好ましくは少なくとも約１％〜１０％、さらに好ましくは少なくとも約１．５％〜７．５％、最も好ましくは少なくとも約１．７５％〜５％である。本発明の一態様では、ＭＩＩＩ培地中のＦＢＳの濃度は約２％である。
【０１００】
ＡＤＡＳ細胞は、各細胞タイプの表現型が内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように変化するのに十分な時間、ＭＩＩＩ培地で処理され得る。好ましくは、ＡＤＡＳ細胞はＭＩＩＩ培地で約４日間処理される。本開示に基づき、当業者は、細胞がＭＩＩＩ培地で任意の期間処理され得ることを認識するであろう。例えば、細胞はＭＩＩＩ培地で４日間より長く処理され得る（すなわち、細胞は約１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または６ヶ月間でも処理され得る）。さらに、細胞はＭＩＩＩ培地で４日間より短く処理され得る（すなわち、細胞は約１日、２日、または３日間でも処理され得る）。ＭＩＩＩ培地は処理期間の任意の時点で交換され得る。
【０１０１】
ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩＩ培地中で一定時間または細胞があるレベルの密集度に達するまでインキュベートされる。好ましくは、その密集度のレベルは７０％より大きい。より好ましくは、密集度のレベルは９０％より大きい。ＭＩＩＩ培地中での一定時間とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に適した任意の時間であり得る。
【０１０２】
ＭＩＩＩ培地によるＡＤＡＳ細胞の処理は、内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように細胞の表現型および形態をさらに変化させる。無処理／処理前のＡＤＡＳ細胞と比較した場合、ＭＩＩ培地に続いてＭＩＩＩ培地で処理されたＡＤＡＳ細胞は、培養細胞の全体的な形態に変化を示し、例えば、培養内皮細胞に類似した「敷石」状の領域を形成している細胞に加えて、ＭＩＩ処理の間に観察されるものに類似した細胞の不均一な混合物を生じる。
【０１０３】
解析：
本発明の細胞は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンによる細胞処理の間の任意の時点で、トリプシン処理によって回収され、即時の実験／治療使用のために集められるか、または後で使用するために凍結保存され得る。本明細書の別項に記載されたように、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンは、ＡＤＡＳ細胞のＭＩＩ培地でのインキュベーションに続くその細胞のＭＩＩＩ培地でのインキュベーションを指す。本発明の一態様では、細胞は、ＡＤＡＳ細胞の培養または処理レジメンの間の任意のステップで凍結保存される。凍結保存は当技術分野において一般的な方法であり、本明細書において用いられる場合、将来の解析および使用のために細胞を凍結保存するための現在使用されるすべての方法を包含する。別の態様では、細胞は回収され、処理レジメンを考慮して細胞の表現型の変化を判断するために細胞表面マーカーを評価するフローサイトメトリーの対象となり得る。
【０１０４】
ＡＤＡＳ細胞および／または内皮ＡＤＡＳ細胞は、当技術分野の多数の方法および本明細書に開示される方法の任意の１つで解析されうる。細胞は、内皮前駆細胞および／もしくは内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す細胞の分化の指標となる、表面および細胞内タンパク質、遺伝子、ならびに／または他のマーカーの同定によって解析されうる。これらの方法は、
（ａ）ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６３、ＣＤ１６６、ＭＨＣクラスＩ；ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ５４；ＣＤ３１、ＣＤ１３、ＣＤ４０；ＣＤ２９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ１１、ＣＤ４４、ＣＤ１４６などの細胞表面タンパク質のフローサイトメトリーまたはｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色などの免疫蛍光アッセイによる細胞表面タンパク質の検出；
（ｂ）特異的モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーまたはｉｎ ｓｉｔｕ免疫染色などの免疫蛍光法による細胞内タンパク質の検出；
（ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および／または他のブロット解析などの方法による発現ｍＲＮＡの検出
を含むがそれらに限定されない。
【０１０５】
目的とする細胞の表現型マーカーは当業者によく知られている。さらなる表現型マーカーは発表され続けており、過度の実験をすることなく同定され得る。これらの任意のマーカーは、ＡＤＡＳ細胞が内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すことを確認するために使用され得る。系列特異的な表現型特性は、細胞表面タンパク質、細胞骨格タンパク質、細胞形態、および分泌産物を含み得る。
【０１０６】
内皮細胞の特性は、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ１０５、ＣＤ１４４、ＣＤ１８４／ＣＸＣ４、ＣＤ２０２ｂ、およびＭａｄ−ＣＡＭ−１などの内皮マーカーの発現を含む。当業者は、本開示において、既知の熱量測定法、蛍光法、免疫化学法、ポリメラーゼ連鎖反応、化学的または放射化学的方法により内皮前駆細胞もしくは内皮細胞特異的マーカーの有無を容易に確認し得ることを認識するであろう。
【０１０７】
本発明は、本明細書において開示されるレジメンに従ったＡＤＡＳ細胞のインキュベーションから生じる細胞集団を包含する。例えば、本発明は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンに従って培養された内皮ＡＤＡＳ細胞を含む細胞集団を包含する。
【０１０８】
本発明の一態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、本明細書において開示される方法を用いて測定されるように、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地中での培養後、少なくともＣＤ３４に対して陽性である。別の態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンに従って培養されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳからのＣＤ３４の発現レベルと比較して、より高いレベルで少なくともＣＤ３４を発現している。
【０１０９】
本発明の別の態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地中での培養後、ＣＤ３４およびＣＤ３１のうち少なくとも１つに対して陽性である。さらなる態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンに従って培養されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳからのＣＤ３４およびＣＤ３１それぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４およびＣＤ３１の少なくとも１つを発現している。
【０１１０】
本発明の一態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つに対して陽性である。別の態様では、内皮ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンに従って培養されていないこと以外は同じであるＡＤＡＳからのＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せそれぞれの発現レベルと比較して、より高いレベルでＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３、またはこれらの組合せのうち少なくとも１つを発現している。
【０１１１】
本発明はまた、ＡＤＡＳ細胞から内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示す細胞への分化を促進する化合物の同定方法ならびに研究方法をも提供する。それにより、ＡＤＡＳ細胞から内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳへの分化に影響する化合物の能力を測定する方法が提供され、その方法は、
（ａ）ＡＤＡＳ細胞を間質細胞培地中で一定時間培養するステップ；
（ｂ）間質細胞培地を化合物または対照ビヒクルを含有する分化用培地と交換するステップ；
（ｃ）ＡＤＡＳ細胞を化合物または対照ビヒクルを含有する分化用培地中で一定時間インキュベートするステップ；
（ｄ）ステップ（ｃ）から、該化合物を含有する該分化用培地を用いて分化した細胞の数またはパーセンテージを測定するステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）から、該ビヒクルを単独で含有する該分化用培地を用いた細胞中の分化細胞のパーセンテージ数を測定するステップ；
（ｆ）ステップ（ｄ）および（ｅ）から得られた分化細胞の数またはパーセンテージを比較するステップ；
（ｇ）ステップ（ｄ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数がステップ（ｅ）から得られた分化細胞のパーセンテージ数と比較して大きければ、該化合物が該ＡＤＡＳ細胞から内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳ細胞への分化を誘導することが可能であることが示されるステップ
を含む。
【０１１２】
ＡＤＡＳ細胞の使用方法
ＡＤＡＳ細胞をＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地レジメンに従ってインキュベートし、ＡＤＡＳ細胞を内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように誘導した後、内皮ＡＤＡＳ細胞は、脈管形成および／もしくは血管新生の障害に関連した障害または疾患を患っている患者の治療のために使用されうる。本発明は、それを必要とする患者における脈管形成および／または血管新生を改善する細胞治療のために、内皮ＡＤＡＳ細胞を使用する組成物および方法を包含する。本明細書の方法に従って作製された内皮ＡＤＡＳ細胞は、損傷を受けた／破壊された内皮組織を修復または置換するため、既存の内皮組織を補強するため、新たなもしくは改変した組織を導入するため、人工器官を修飾するため、あるいは生体組織もしくは構造を連結するために使用され得る。例えば、その細胞は心臓弁の細胞を置換するために使用され得る。加えて、その細胞は心筋梗塞後の虚血心筋を治療するために使用され得る。特定の理論に拘束されることを意図せずに、内皮ＡＤＡＳ細胞は、血管新生および筋形成、心筋細胞アポトーシス、ならびに虚血心臓組織におけるリモデリングを調節することにより、虚血心筋の再生に寄与すると考えられる。
【０１１３】
本発明の細胞はさらに、心臓血管疾患および心臓血管障害を治療するために使用され得る。本発明の方法によって得られる細胞は、損傷の減少および／または最小化、ならびに損傷後の心筋もしくは心臓血管の修復および再生の促進に寄与することができるいくつかの特性を有する。これらは、新たな血管形成を促進する増殖因子を合成、分泌する能力、血管新生因子を合成、分泌する能力、細胞の生存および増殖を促進する増殖因子を合成、分泌する能力、増殖して新たな血管形成に直接参加する細胞に分化する能力、ならびに損傷した心筋に生着して瘢痕形成（コラーゲン沈着およびコラーゲン架橋結合）を阻害する能力を含むが、それらに限定されない。
【０１１４】
本発明の細胞は、胎盤成長因子（ＰＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むがそれらに限定されない多数の血管新生増殖因子を発現することができ、それらは、血管形成および血管の発達において機能し、虚血組織の生存を支援し、後肢の閉塞／再還流傷害後の再還流を誘導し、心臓損傷後の動物に注射した場合心臓に向かい、また脈管形成および血管新生に関与する細胞への分化と合致するマーカーを発現する細胞に分化する。当業者は、本発明の細胞が組織虚血後の血管新生部位、例えば、肢、網膜、および心筋に取り込まれ得ることを認識するであろう。
【０１１５】
本発明はまた、本発明に従って作製された内皮ＡＤＡＳ細胞を用いて様々な疾患を治療する方法をも包含する。当業者は、本明細書において提供される開示に基づき、アテローム硬化、冠動脈疾患、閉塞性動脈疾患、心筋虚血、末梢血管閉塞性疾患などをはじめとする虚血、心疾患を含むがそれらに限定されない多くの疾患の治療における再生医療の重要性と可能性を認識するであろう。本発明は、新たな損傷を受けていない細胞の導入が何らかの形の治療的救済をもたらす疾患を治療するために、ヒトを含む動物に内皮ＡＤＡＳ細胞を投与する方法を包含する。
【０１１６】
当業者は、内皮ＡＤＡＳ細胞が動物に投与され、それによって、周囲の環境からのシグナルおよび合図を受け、細胞がｉｎ ｖｉｖｏにおいて隣接した細胞環境によって決定づけられる成熟内皮細胞にさらに分化し得ることを容易に理解するであろう。ＡＤＡＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すように分化させる方法は本明細書において開示され、内皮ＡＤＡＳ細胞は本明細書に記載される方法で動物に投与され得る。あるいは、内皮ＡＤＡＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてより成熟した内皮細胞にさらに分化し、その成熟内皮細胞がそれを必要とする動物に投与され得る。
【０１１７】
内皮ＡＤＡＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境での長期間の生存を保証するような移植のために調製され得る。例えば、細胞を、細胞の増殖および維持に適した培地中で増殖させ、コンフルエントまで増殖させる。例えば、０．０５％トリプシンを含有し、１ｍｇ／ｍＬのグルコース；０．１ｍｇ／ｍＬのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのＣａＣｌ２を添加し（完全ＰＢＳ）、トリプシンを不活性化するために５％血清を加えたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝溶液を用いて、細胞を培養基質から剥離する。遠心分離を用いて細胞をＰＢＳで洗浄することができ、その後、トリプシンを含まない完全ＰＢＳ中に、注射のために選択された密度で再懸濁する。
【０１１８】
ＰＢＳに加えて、宿主被験体に生理的に適合する任意の浸透圧平衡溶液が、ドナー細胞を懸濁して宿主に注射するために使用されうる。非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張食塩水などの製薬上許容されうる担体と混合された細胞を含む。このような製剤は、ボーラス投与または持続投与に適した形で調製、包装、または販売されうる。注射製剤は、アンプルのような単位投与剤形もしくは保存料を含有する複数回投与容器で調製、包装、または販売されうる。
【０１１９】
本発明はまた、ＣＮＳ、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、膵臓などを含む身体の疾患または外傷を治療するための、他の治療方法と組み合わせた内皮ＡＤＡＳ細胞の移植をも包含する。従って、本発明の内皮ＡＤＡＳ細胞は、患者に有益な効果を及ぼす遺伝子改変細胞と非遺伝子改変細胞の両方の他の細胞とともに移植されうる。従って、本明細書において提供される教示内容によってすぐに当業者に理解されるとおり、本明細書において開示される方法は、他の治療方法と併用され得る。
【０１２０】
本発明の内皮ＡＤＡＳ細胞は、当技術分野において既知の技術、すなわち、米国特許第５，０８２，６７０号および同第５，６１８，５３１号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）に記載される技術を用いて、患者に、または身体の任意の他の適切な部位に、内皮ＡＤＡＳ細胞それ自体として移植され得る。
【０１２１】
本発明の細胞の移植は、当技術分野においてよく知られている技術、ならびに本明細書に記載される技術または将来開発される技術を用いて達成され得る。本発明は、細胞を哺乳動物、好ましくはヒトに移植（transplanting）、移植（grafting）、注入、または他の方法で導入する方法を包含する。本明細書において例示されるのは細胞を様々な哺乳動物の心臓血管組織に移植する方法であるが、本発明はこのような解剖学的部位またはそれらの哺乳動物に限定されない。また、骨移植に関する方法も当技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許第４，６７８，４７０号に記載され、膵臓細胞移植は米国特許第６，３４２，４７９号に記載され、米国特許第５，５７１，０８３号は細胞を身体の任意の解剖学的位置に移植する方法を教示する。
【０１２２】
細胞はまた、マイクロカプセル化（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号を参照）またはマクロカプセル化（例えば、それらすべてが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，９７６，８５９号；および同第４，９６８，７３３号；ならびに国際公開ＷＯ ９２／１９１９５；ＷＯ ９５／０５４５２を参照）をはじめとする既知のカプセル化技術に従ってカプセル化され、生物活性分子を送達するために使用されうる。マクロカプセル化のため、装置中の細胞数は様々であり得るが、好ましくは、各装置は１０３〜１０９細胞を含有し、最も好ましくは、約１０５〜１０７細胞を含有する。いくつかのマクロカプセル化装置が患者に移植されうる。細胞のマクロカプセル化および移植のための方法は当技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許第６，４９８，０１８号に記載される。
【０１２３】
本発明の一態様では、ＡＤＡＳ細胞はドナーの脂肪組織から採取され、本明細書において開示される方法を用いて培養され、患者の損傷もしくは変性した心筋または他の心臓血管組織に対して治療効果をもたらすために、それを必要とする患者に投与される。加えて、個体に導入される細胞は、異なるドナーに由来してもよく（同種）、またはそれらは治療される個体から得られた細胞であってもよい（自己）。さらに、個体に導入される細胞は、全く異なる動物種から得ることもできる（異種）。好ましい実施形態では、細胞はそれらが移植される人の脂肪組織から採取され、その結果、移植物に対する抗原反応および／または免疫原反応に関連した予測される合併症は減少する。
【０１２４】
内皮ＡＤＡＳ細胞の投与量は広い範囲で変化し、それぞれの具体的な事例における個々の必要条件に応じて調整されうる。使用される細胞数は、レシピエントの体重および状態、投与回数および／または頻度、ならびに当業者にとって既知の他の変数に依存する。
【０１２５】
患者に投与される内皮ＡＤＡＳ細胞の数は、例えば、脂肪組織処理後の細胞収率に関連しうる。全細胞数の一部は後の使用のために維持され、または凍結保存されうる。加えて、送達される用量は、細胞の患者への送達経路にも依存する。心外膜または心内膜送達系を用いる場合、これらの系および方法は心臓血管症状の治療のために最も直接的な経路を提供できるため、より少ない細胞しか必要としない場合がある。本発明の一実施形態では、患者に送達されるべき細胞数は約５．５×１０４細胞であると見込まれる。しかし、この数は、望ましい治療効果を達成するために数桁程度は調整され得る。
【０１２６】
１００ｋｇ体重あたり約１０５〜約１０１３個の内皮ＡＤＡＳ細胞が個体に投与され得る。一部の実施形態では、１００ｋｇ体重あたり約１．５×１０６〜約１．５×１０１２個の細胞が投与される。一部の実施形態では、１００ｋｇ体重あたり約１×１０９〜約５×１０１１個の細胞が投与される。一部の実施形態では、１００ｋｇ体重あたり約４×１０９〜約２×１０１１個の細胞が投与される。一部の実施形態では、１００ｋｇ体重あたり約５×１０９〜約１×１０１１個の細胞が投与される。
【０１２７】
内皮ＡＤＡＳ細胞は、心筋機能が損なわれる任意の状況において患者に投与されうる。このような状況の例としては、急性心筋梗塞（心臓発作）、うっ血性心不全（治療としてまたは移植の仲立ちとしてのいずれか）、および冠動脈バイパス移植手術の補足が挙げられるがそれらに限定されない。細胞は事前に採取され凍結保存されてもよく、または必要と確定した時もしくはその前後に採取されてもよい。本明細書において開示されるように、細胞は、さらなる処理なしに、またはさらに精製、改変、刺激する、もしくは別の方法で細胞を変化させる付加的な処理の後に、患者に投与されてもよく、あるいは直接損傷組織にまたは損傷組織の近傍に与えられてもよい。例えば、細胞は、それを必要とする患者への投与の前に、本明細書において開示される方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。
【０１２８】
本発明の細胞の患者への投与方法は、治療されている疾患の種類、哺乳動物の年齢、細胞が分化しているか否か、細胞がその中に導入された異種ＤＮＡを有するかなどを含むいくつかの要因に応じて変化しうる。細胞は、直接注入によって、または心臓血管疾患もしくは心臓血管障害を患っている患者に投与される化合物の導入のために当技術分野において用いられる他の任意の方法によって、目的とする部位に導入されうる。
【０１２９】
内皮ＡＤＡＳ細胞は様々な方法で宿主に投与され得る。好ましい投与方法は、血管内、脳内、非経口、腹腔内、静脈内、硬膜外、髄腔内、骨髄内（intrastemal）、関節内、滑膜内、くも膜下、動脈内、心臓内、または筋内投与である。一部の実施形態では、内皮ＡＤＡＳ細胞は心臓血管組織に直接移植によって投与される。他の実施形態では、内皮ＡＤＡＳ細胞は心臓血管組織、すなわち血管系に単純な注射によって投与される。
【０１３０】
内皮ＡＤＡＳ細胞はまた、目的とする治療効果を増強、制御、または他の方法で方向づけるために、添加剤とともに与えられうる。例えば、一実施形態では、抗体を介した陽性および／または陰性細胞選択の使用によって細胞をさらに精製し、有効性の増大、疾病率の低下、もしくは手順の簡便性の促進のために細胞集団を濃縮してもよい。同様に、細胞は、移植される細胞の支持および／または運命決定によってｉｎ ｖｉｖｏでの組織工学を容易にする生体適合性マトリックスとともに与えられうる。
【０１３１】
内皮ＡＤＡＳ細胞の患者への投与に先立ち、細胞は、プラスミド、ウイルスもしくは代替的なベクター方法を用いて、目的とする核酸で安定にもしくは一過的にトランスフェクトまたは形質導入されうる。細胞は、細胞によってもたらされる治療応答を促進することを目的とした遺伝子産物を発現できるように、遺伝子操作された後に投与されうる。操作の例は、血管新生もしくは脈管形成を促進する因子（すなわち、ＶＥＧＦ）の発現、特定の細胞系列への分化を促進する発生遺伝子（すなわち、ＭｙｏＤ）または細胞の成長および増殖を促進するもの（すなわち、ｂＦＧＦ−１）の発現を制御（増加または減少）するような操作を含む。
【０１３２】
内皮ＡＤＡＳ細胞はまた、移植に先立って足場材料上での細胞培養を受けてもよい。従って、組織工学によって作製された弁、心室パッチ、心膜、血管、および他の構造は、レシピエントへの挿入もしくは移植に先立ち、細胞を用いて天然もしくは合成のマトリックスまたは足場上に合成されうる。
【０１３３】
本発明の細胞はまた、被験体における新たな毛細血管もしくは血管の形成を誘導または促進する血管新生因子とともに投与され得る。内皮前駆細胞および／または内皮細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳは、血管新生因子の注射の前、同時、または後に投与され得る。加えて、本発明の細胞は、血管新生因子の投与部位に直接隣接した部位、同じ部位、または離れた部位に投与されうる。
【０１３４】
加えて、本発明の細胞は、例えば、内皮前駆細胞および／または内皮細胞に対する化合物、アレルゲン、増殖／調節因子、医薬品などの有効性および／または細胞毒性についてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてスクリーニングするため；その細胞の生物活性（例えば、増殖能力、接着性、血管新生因子の産生）の変化を測定することによって特定の疾患の機構を解明するため；薬物および／または増殖因子が内皮細胞の生物活性を調節するために作用する機構を研究するため；遺伝子治療、遺伝子送達もしくはタンパク質送達のために患者の疾患を診断およびモニタリングするため；ならびに生物活性産物を産生するために使用され得る。内皮前駆細胞および／または内皮細胞に対する増殖／調節因子の影響は、例えば、総細胞の計数、および分化細胞の計数によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの生細胞数の分析によって評価され得る。これは、細胞タイプ特異的細胞抗原を特定する抗体を用いた免疫細胞化学法の使用をはじめとする、標準的な細胞学的および／または組織学的方法を用いて達成され得る。本発明の細胞に対する様々な薬物の影響は、懸濁培養または３次元システムのいずれかにおいて評価され得る。
【０１３５】
本発明の細胞はまた、内皮細胞の分化および成熟に関与する因子の単離ならびに評価にも使用され得る。従って、内皮前駆細胞の少なくとも１つの性質を示すＡＤＡＳ細胞は、馴化培地などの培地の活性を測定するため、細胞増殖活性について液体を評価するため、特定の系列に特化させることへの関与などを評価するためのアッセイに使用されうる。様々な系が適用でき、様々な生理的ストレスに基づいて内皮前駆細胞の分化を誘導するように設計され得る。
【０１３６】
心臓血管系に影響を及ぼす疾患、障害、または症状の治療のための内皮ＡＤＡＳ細胞の使用は、内皮ＡＤＡＳ細胞が免疫抑制剤の必要なしにレシピエントに導入され得るというさらなる利点をもたらす。細胞移植の成功は、レシピエントによって生じる移植片拒絶免疫反応の誘導を伴わないドナー細胞の永続的な生着を必要とすると考えられる。一般的に、宿主拒絶反応を予防するために、シクロスポリン、メトトレキサート、ステロイドおよびＦＫ５０６などの非特異的免疫抑制剤が使用される。これらの薬剤は日常的に投与され、投与を停止した場合、通常は移植片の拒絶反応が起こる。しかし、非特異的免疫抑制剤の使用における望ましくない結果は、それらが免疫反応のすべての側面を抑制すること（全般的な免疫抑制）によって作用するため、レシピエントの感染症および他の疾患への感受性が著しく増加することである。
【０１３７】
本発明は、内皮ＡＤＡＳ細胞を免疫抑制剤の必要なしにレシピエントに導入することによって、心臓血管系に影響を及ぼす疾患、障害、または症状を治療する方法を提供する。本発明は、レシピエントに利益をもたらすような、同種もしくは異種の内皮ＡＤＡＳ細胞、またはレシピエントとは遺伝的にかけ離れた他の内皮ＡＤＡＳ細胞のレシピエントへの投与を含む。本発明は、内皮ＡＤＡＳ細胞をレシピエントに投与する際、免疫抑制剤の使用の必要なしに疾患、障害、または症状を治療するための内皮ＡＤＡＳ細胞の使用方法を提供する。従って、移植される内皮ＡＤＡＳ細胞のレシピエントに対して、感染および、免疫抑制治療に関連する癌関連症状を含む他の疾患を招くような感受性は減少する。
【０１３８】
遺伝子改変
本発明の細胞はまた、治療目的のため、または患者の組織でのそれらの取り込みおよび分化を追跡する方法のため、外来タンパク質もしくは外来分子を発現するために使用され得る。従って、本発明は、発現ベクターならびに、例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、およびAusubelら(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されるもののような外来性ＤＮＡの細胞での発現を伴う外来性ＤＮＡの細胞内への導入方法を包含する。
【０１３９】
単離された核酸は、一旦それらが患者に導入された後に、細胞の移動、取り込み、および生存を追跡するために使用される分子をコードすることができ、またはそれらは患者において突然変異、欠損もしくは別の形で機能しないタンパク質を発現するために使用され得る。追跡のためのタンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、任意の他の蛍光タンパク質（例えば、強化緑色、シアン、黄色、青色および赤色蛍光タンパク質；Clontech, Palo Alto, CA）、または本明細書の別項に開示される他のタグタンパク質（例えば、ＬａｃＺ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ、Ｈｉｓ６など）が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、細胞に導入される単離された核酸としては、ＣＦＴＲ、ヘキソサミニダーゼ、および当技術分野において周知のまたは将来開発される他の遺伝子治療法が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４０】
本発明の細胞の移動、分化および取り込みの追跡は、ベクターまたはウイルスから発現される検出可能な分子の使用に限定されない。細胞の移動、取り込み、および分化は、移植された内皮ＡＤＡＳ細胞の局在化決定を可能にするであろう一連のプローブを用いて解明され得る。このようなプローブは、５０００塩基対に約１つ存在する豊富な転移エレメントであり、従って当業者が移植された細胞のその後を追跡することを可能にする、ヒト特異的Ａｌｕに対するものを含む。移植された細胞の追跡はさらに、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ６３などであるがそれらに限定されない、本明細書の別項に詳述される細胞特異的マーカーに対する抗体または核酸プローブを用いることによって達成されうる。
【０１４１】
本発明はまた、単離された核酸がその中に導入され、目的とする核酸によってコードされるタンパク質がそこから発現される際、それが以前にはその細胞に存在しないかもしくは発現されていなかった場合、またはそれが単離された核酸を導入する前とは異なるレベルもしくは異なる状況下で発現される場合に、利点が得られるような、内皮ＡＤＡＳ細胞を含む。このような利点は、目的とする核酸の発現を検査室でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてまたはその細胞が存在する哺乳動物において調べ得る系、導入された核酸を有する細胞が研究、診断および治療手段として使用され得る系、ならびに哺乳動物における選択された病状のための新たな診断および治療手段の開発に有用な哺乳動物モデルを作製する系が提供されているという事実を含みうる。
【０１４２】
目的とする単離された核酸を発現している細胞は、別の細胞、組織または哺乳動物の全身に単離された核酸の産物を供給するために使用され得、その場合、高レベルの遺伝子産物が異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害もしくは症状を治療または軽減するために有用であり得る。従って、本発明は、目的とする単離された核酸を発現している内皮ＡＤＡＳ細胞を包含し、その場合、目的とするタンパク質の発現、タンパク質レベル、ならびに／または活性の増加が脈管形成および／もしくは血管新生に関与する疾患、障害または症状を治療あるいは軽減するために有用であり得る。
【０１４３】
内皮ＡＤＡＳ細胞は、操作されたＡＤＡＳ細胞をレシピエントに投与する前に、血管新生因子、例えば、ＶＥＧＦを発現するように遺伝子操作され得る。操作されたＡＤＡＳ細胞は、このような因子を発現するように遺伝子改変されていないＡＤＡＳ細胞と比較してより多くのＶＥＧＦを発現および分泌する。遺伝子改変された内皮ＡＤＡＳ細胞を脈管形成および／もしくは血管新生に影響を及ぼす疾患、障害または症状の治療に使用する利点は、レシピエント体内に存在する内皮ＡＤＡＳ細胞が有する治療効果を増加させることである。治療効果の増加は、操作された内皮ＡＤＡＳ細胞に由来するＶＥＧＦの分泌の増加に起因する。操作された内皮ＡＤＡＳ細胞に由来するＶＥＧＦの分泌の増加に伴い、より多くのＶＥＧＦが近接した細胞または遠位の細胞に存在し、ＶＥＧＦからの利益を受ける。加えて、レシピエント体内に存在するＶＥＧＦ量の増加は、患者が治療を受ける期間の短縮を可能にする。
【０１４４】
本明細書に記載される方法は、多数の様式で、当技術分野において周知の様々なその改良および置換を伴って実施されうることが理解されるべきである。また、細胞タイプ間の作用または相互作用の様式について説明するいずれの理論も、いかなる方法によっても本発明を限定するものとして解釈されるべきではないが、本発明の方法をより十分に理解できるように示されていることが認識されうる。
【０１４５】
以下の実施例は、本発明の態様をさらに説明する。しかし、それらは決して本明細書に記載される本発明の教示または開示を限定するものではない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１
ＡＤＡＳ初代培養の確立
脂肪吸引によって得られた白色脂肪組織由来の間質血管画分（ＳＶＦ）を、０．５％ＢＳＡおよび１２５μｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩ（最終濃度）を含有するクレブス・リンガー重炭酸バッファー中で、１０分間隔で強く振とうしながら、３７℃で８０分間消化した。消化後、懸濁液を１，２００ｒｐｍで５分間室温で遠心分離し、強く振とうし、その後１，２００ｒｐｍで５分間室温で再度遠心分離した。ＳＶＦペレットを崩さずに、脂質／脂肪細胞層を吸引して廃棄した。そのペレットを間質細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、１０％ＦＢＳ、１×抗生物質／抗真菌剤）中で懸濁／洗浄し、全量４０ｍＬの間質細胞培地に再懸濁した。１０ｍＬのこの懸濁液を４０ｍＬの間質培地の入ったＴ−２２５フラスコに入れた。非接着細胞を播種１〜３日後に洗い流し、培地を５ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを添加した抗生物質／抗真菌剤を含まない間質細胞培地に交換した。この培地を３〜４日毎に交換した。コンフルエント培養物を播種１４日後に回収し凍結保存した。これらの細胞をＡＤＡＳ継代０代（Ｐ０）と表す。
【０１４７】
実施例２
ＡＤＡＳ細胞の処理
２回の独立した実験において、単独のドナー由来のＡＤＡＳ（Ｐ０）細胞を約６×１０３細胞／ｃｍ２の密度でＴ−８３フラスコに播種した（継代１代）。対照ＡＤＡＳ細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、１０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦおよび１ｎｇ／ｍＬ ｈＦＧＦを含有する増殖培地中で２〜４日毎に培地交換しながら培養された。処理群のＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２添加物、Ｂ２７添加物、２．３ｍＭグルタミン、１０ｎｇ／ｍＬ ｈＦＧＦ）中での６日間（播種後１、３および５日目で培地交換）から始まる段階的な処理レジメンを受けた。７日目に、培養物をＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、その後ＡＤＡＳ細胞は、ＭＩＩＩ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２添加物（Invitrogen, Carlsbad, CA）、Ｂ２７添加物（Invitrogen, Carlsbad, CA）、２．３ｍＭグルタミン、１０ｍＭニコチンアミド、２％ＦＢＳ）中で４日間インキュベートされた。ＭＩＩＩを１０日目に交換し、対照および処理ＡＤＡＳ細胞の両方を１１日目にトリプシン処理によって回収し、フローサイトメトリーに供した。
【０１４８】
フローサイトメトリー
表現型解析のため、およびＭＩＩ／ＭＩＩＩ培地処理レジメンに対する考えられる細胞応答を明らかにするために、対照およびＭＩＩ／ＭＩＩＩ処理細胞に対してフローサイトメトリーを実施した。コンジュゲートモノクローナル抗体のために、細胞を１ｍＬのフロー洗浄バッファー（１×ＤＰＢＳ、０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム）で１回洗浄し、約６０００×ｇで２０秒間遠心分離した。細胞を１．３ｍＬのブロッキングバッファー（２５μｇ／ｍＬマウスＩｇを含む洗浄バッファー）に懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、その後１００μＬアリコートに分けた。適切なモノクローナル抗体をそれらのそれぞれのアリコートに添加した。実験に用いられたモノクローナルアイソタイプの組合せと一致する適切なアイソタイプ対照の組合せが含まれた。１チューブあたり３つのモノクローナル抗体を含有した。実験に用いられた抗体の濃度は製造供給メーカーが推奨する濃度であった。ＡＤＡＳ細胞の表現型に使用される抗体は、ＣＤ８０（Caltag, Burlingame, CA）、ＣＤ８６（Caltag）、ＣＤ１４；ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１３３（Miltenyi Biotech, Auburn, CA）；ＣＤ９０、ＣＤ１０５（Caltag）、ＨＬＡ−ＤＲ；ＣＤ６３、ＣＤ１６６、ＭＨＣクラスＩ；ＣＤ４４（Cell Sciences, Canton, MA）、ＣＤ７３、ＣＤ５４；ＣＤ３１、ＣＤ１３、ＣＤ４０；ＣＤ２９（Caltag）、ＣＤ４９ａ、ＣＤ１１ａを含む（すべての抗体は、他に示されない限りBD-Pharmingen, San Jose, CAから入手された）。すべてのチューブを遮光して３０分間氷上でインキュベートした。細胞を２ｍＬの洗浄バッファーで１回洗浄し（約６５０×ｇ５分間）、その後２００μＬの１％パラホルムアルデヒド中で固定した。
【０１４９】
非コンジュゲートモノクローナル抗体のために、ＡＤＡＳ細胞を、本明細書の別項に記載されるように回収、洗浄、およびブロッキングした。一次抗体（ＶＥＧＦＲ２［ＫＤＲ］およびフォン・ウィルブラント因子）を添加し（１０μｇ／ｍＬ）、細胞を約３０分間氷上でインキュベートした。細胞を２ｍＬの洗浄バッファー（約６５０×ｇ５分間）で１回洗浄し、１００μＬの洗浄バッファーに再懸濁した。ヤギ抗マウスＰＥコンジュゲート二次抗体を０．５μｇ／ｍＬの濃度で、一次抗体を含有する懸濁物ならびに「二次抗体のみ」の対照に添加し、細胞を遮光して１５分間氷上でインキュベートした。２ｍＬのフロー洗浄バッファーで最後の洗浄を行い（約６５０×ｇ５分間）、細胞を上述のように固定した。
【０１５０】
Becton Dickinson ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターを使用し、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ取得ソフトウェア（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いて、抗体あたり１０，０００事象（細胞）を取得し、そのデータをＦｌｏｗ Ｊｏ解析ソフトウェア（Tree Star, Ashland, OR）によって解析した。
【０１５１】
形態
図１は、無処理およびＭＩＩ／ＭＩＩＩ処理ＡＤＡＳ培養物の代表的な顕微鏡写真を示す。処理前および無処理の対照培養物においては紡錘形の線維芽細胞様形態が観察された（図１Ａおよび図１Ｂ）が、一方、処理開始４日後、ＭＩＩで処理された培養物においては形態変化が観察された（図１Ｃおよび図１Ｄ）。ＭＩＩで処理された細胞は、あまり線維芽細胞様ではなく、接着性と非接着性の両方で丸く明位相差像を示す細胞が相当数見られた。さらに、この段階の細胞は細胞間結合の「ネットワーク」を形成するように見えた。ＭＩＩＩによる細胞のさらなる処理はまた培養物の形態を全体的に変化させ、培養内皮細胞に類似した「敷石」状の領域を形成している細胞に加えて、ＭＩＩ処理の間に見られるものに類似した細胞の不均一な混合物を生じた（図１Ｅおよび図１Ｆ）。
【０１５２】
表現型解析
間質系、造血系、または内皮細胞系列の細胞によって通常発現される様々な分子に対する抗体を用いて、対照およびＭＩＩ／ＭＩＩＩ処理ＡＤＡＳ細胞を表面マーカーの発現について表現型解析した。表１はこの解析の結果を示す（数値は表に記載された表面マーカーについての陽性染色細胞のパーセントである）。培養１１日後、無処理の継代１代のＡＤＡＳ細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＭＨＣクラスＩ、およびＶＥＧＦ受容体２（ｆｌｋ−１）を発現していた。ＭＩＩ／ＭＩＩＩレジメンで処理した場合、表面マーカーＣＤ３１（＋５６．５％）、ＣＤ３４（＋６７．９％）、ＣＤ４０（＋２７．４％）、ＣＤ６３（＋３８．０％）、ＣＤ１０５（−２５．３％）、およびＣＤ１６６（−３６．１％）を発現している細胞の平均パーセンテージに有意な変化（＞２０％）が認められた。
【表１】
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【０１５３】
本明細書における開示は、未分化ＡＤＡＳ細胞を処理して内皮ＡＤＡＳ細胞の集団に達するための培地処理スキームを使用する新規方法を実証する。本明細書に示された細胞の表現型解析はすべての考えられる内皮細胞表面マーカーを含むものではないが、本明細書において開示される方法によって作製される細胞集団はＣＤ３４（内皮前駆細胞および造血幹細胞のマーカー）ならびにＣＤ３１（成熟内皮細胞）に関して強度に陽性であり、同様にＣＤ４０およびＣＤ６３に関して陽性であることが観察され、それは内皮細胞タイプに対する表現型解析と一致する。本明細書に示されたデータは、本明細書において開示された方法を使用して、臨床での使用のための、容易に増殖される内皮ＡＤＡＳ細胞から多数のＣＤ３４＋、ＣＤ３１＋内皮前駆細胞を作製する可能性を実証した。加えて、本発見は、本明細書に記載されるような処理を用いて大規模な環境で内皮ＡＤＡＳ細胞を増殖させ、内皮細胞マーカー陽性の表現型を誘導するため、および内皮前駆細胞を製造するための魅力的なアプローチを可能にする。さらに、処理されたＡＤＡＳ細胞におけるＣＤ４０ならびにＣＤ８０（より低い程度だが）と合わせたＣＤ３４の発現は、造血前駆細胞をも誘導しうることを示唆する。
【０１５４】
本明細書において引用されたすべての特許、特許出願、および出版物の開示は、参照により本明細書にその全体が組み入れられる。
【０１５５】
本発明は特定の実施形態に関して開示されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形形態が当業者によって考案されうることは明白である。添付の特許請求の範囲は、このようなすべての実施形態および同等の変形形態を包含すると解釈されるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１Ａから図１Ｆを含む図１は、無処理およびＭＩＩ／ＭＩＩＩで処理されたＡＤＡＳ培養物を示す一連の画像である。図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、処理前および無処理の対照ＡＤＡＳ培養物を示す。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＭＩＩで処理されたＡＤＡＳ培養物を示す。図１Ｅおよび図１Ｆは、ＭＩＩＩで処理されたＡＤＡＳ培養物を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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