(57)【要約】核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび／または検出するシステムおよび方法、ならびに関連構成要素（例えば、基質、ソフトウェアなど）を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
核酸ポリマーの相補鎖を形成することおよび
粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖におけるヌクレオチドの配列を同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
核酸ポリマーがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
相補鎖がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を核酸ポリメラーゼ酵素により形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸ポリマーの相補鎖をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標識がヌクレオチド各種に特異的である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
標識が１または２以上の原子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
標識が３または２以下の原子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
標識が単一原子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
原子が単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
原子が単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
原子がハロゲン原子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび／または相補鎖中に取り込む、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレオチド特異的標識が、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させ、同定のステップの前に核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖のヌクレオチドを実質的に基質から除去し、標識ヌクレオチドの標識を基質に固着させたままにする、請求項６〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドの配列を同定するステップが、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によってヌクレオチドを同定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヌクレオチドを同定するステップが、粒子線への特徴的変化を検出することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
粒子線が軽粒子線である、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項２１】
軽粒子線が電子線である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の片端で基質に固着させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の両端で基質に固着させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖に沿った複数の位置で基質に固着させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、配列を同定する前に実質的に真っ直ぐにする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を流体により真っ直ぐにする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
流体が分子コーミングを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
流動体が１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップが、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ヌクレオチドが標識されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
粒子線の変化が、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
粒子線の変化が、空間パターンの変化である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
空間パターンが、一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
さらに相補鎖および／または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
付着が核酸配列特異的分子によるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
核酸配列特異的分子がオリゴヌクレオチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
基質を誘導体化し、配列非特異的である付着点を提供する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
基質が炭素薄膜を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ヌクレオチドの配列を同定するステップが、粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖の複数の走査を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１００のヌクレオチドが、各走査において同定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を合成すること、および
粒子線を使って核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定すること
を含み、
標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖に取り込まれたとき、粒子線を使って同定可能である、前記方法。
【請求項４５】
核酸ポリマーがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
核酸ポリマーの相補鎖がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を核酸ポリメラーゼ酵素によって合成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って合成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
標識が、各種のヌクレオチドに対して特異的である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
標識が１または２以上の原子を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
標識が３または２以下の原子を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
標識が単一原子を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
原子が単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
原子が単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
原子がハロゲン原子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の合成に使われるリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸に取り込む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖へのリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸の取り込み後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合させる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定するステップが、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によってリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを検出するステップが、粒子線への特徴的変化を検出することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
粒子線が軽粒子線である、請求項４４または５８に記載の方法。
【請求項６１】
軽粒子線が電子線である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
同定のステップの前に、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを実質的に基質から除去し、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドの標識を基質に固着させたままにする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の片端で基質に固着させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の両端で基質に固着させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の全長に沿った複数の位置で基質に固着させる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定する前に実質的に真っ直ぐにする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を流体により真っ直ぐにする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
流体が分子コーミングを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
流動体が１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を同定するステップが、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する、請求項４４に記載の方法。
【請求項７３】
粒子線の変化が、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
粒子線の変化が、空間パターンの変化である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
空間パターンが、一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
さらに相補鎖および／または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項７７】
付着が核酸配列特異的分子によるものである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
核酸配列特異的分子がオリゴヌクレオチドである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
基質を誘導体化し、配列非特異的である付着点を提供する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
基質が炭素薄膜を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を同定するステップが、粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖の複数の走査を行うことを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも１００のヌクレオチドが、各走査において同定される、請求項７２に記載の方法。
【請求項８４】
核酸ポリマーの配列を決定する方法であり、
標識リボヌクレオチド三リン酸および／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーの相補鎖を合成すること、
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させること、
分子コーミングを使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖を実質的に真っ直ぐにすること、
粒子線を発生させること、
基質上の相補鎖を通して核酸ポリマーおよび相補鎖を粒子線に曝露すること、および
相補鎖における標識ヌクレオチドを検出するための、ヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈し、それにより核酸ポリマーの配列を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項８５】
核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定する方法であり、
核酸ポリマーの相補鎖を形成すること、
相補鎖および、任意に、核酸ポリマーを基質に付着させること、および
粒子線を使って相補鎖および／または核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定すること
を含む、前記方法。
【請求項８６】
同定するステップが、相補鎖および／または核酸ポリマーの長さを測定することまたは少なくとも部分配列を決定することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を核酸ポリメラーゼ酵素により形成する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
核酸ポリメラーゼ酵素が、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾する、請求項８５に記載の方法。
【請求項９１】
標識が各種のヌクレオチドに対して特異的である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
標識が１または２以上の原子を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
標識が３または２以下の原子を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
標識が単一原子を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
原子が単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
原子が単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
原子がハロゲン原子である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび／または相補鎖に取り込む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合させる、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
粒子線を使って相補鎖および／または核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定するステップが、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によって相補鎖および／または核酸ポリマーのヌクレオチドを同定することを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０１】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ヌクレオチドを検出するステップが、粒子線への特徴的変化を検出することを含む、請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
粒子線が軽粒子線である、請求項８５または１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
軽粒子線が電子線である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、配列を検出する前に実質的に真っ直ぐにする、請求項８５に記載の方法。
【請求項１０６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、流体により真っ直ぐにする、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
流体が、分子コーミングを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
流動体が、１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップが、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの存在、長さおよび／または配列を決定する、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１１】
ヌクレオチドが標識されている、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
粒子線の変化が、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
粒子線の変化が、空間パターンの変化である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
空間パターンが、一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
さらに相補鎖および任意に核酸ポリマーを基質に付着させることを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項１１６】
核酸ポリマーおよび／または相補鎖を核酸配列特異的分子によって固着させる、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
核酸配列特異的分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
核酸配列特異的分子を、核酸配列特異的分子の片端で基質に固着させる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
核酸配列特異的分子を、核酸配列特異的分子の両端で基質に固着させる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
核酸配列特異的分子を、核酸配列特異的分子全長に沿った複数の位置で基質に固着させる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
基質が炭素薄膜を含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
相補鎖および／または核酸ポリマーの量を定量化することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項１２４】
実質的に粒子線に透明である基質、および基質表面の核酸ポリマー結合部位を含むデバイス。
【請求項１２５】
基質が、実質的に電子線に透明である、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１２６】
基質が炭素薄膜を含む、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１２７】
実質的に粒子線に透明である支持体をさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１２８】
基質が５ｎｍ厚未満である、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１２９】
基質が２ｎｍ厚未満である、請求項１２８に記載のデバイス。
【請求項１３０】
基質が１．５ｎｍ厚未満である、請求項１２９に記載のデバイス。
【請求項１３１】
基質が１．１ｎｍ厚未満である、請求項１３０に記載のデバイス。
【請求項１３２】
核酸ポリマー結合部位が格子パターンである、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１３３】
核酸ポリマー結合部位が配列特異的である、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１３４】
配列特異的核酸ポリマー結合部位がオリゴヌクレオチドである、請求項１３３に記載のデバイス。
【請求項１３５】
核酸ポリマー結合部位が配列特異的ではない、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１３６】
核酸ポリマー結合部位に固着させた１または２以上の核酸ポリマーをさらに含む、請求項１２４に記載のデバイス。
【請求項１３７】
１または２以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する、請求項１３６に記載のデバイス。
【請求項１３８】
実質的に粒子線に透明である基質を得ること、および
基質表面に核酸ポリマー結合部位を形成すること
を含む、デバイスを作る方法。
【請求項１３９】
基質が実質的に電子線に透明である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
結合部位を基質表面の所定の位置に形成する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
基質が炭素薄膜を含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
実質的に粒子線に透明である支持体を基質に付着させることをさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
基質が５ｎｍ厚未満である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４４】
基質が２ｎｍ厚未満である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４５】
基質が１．５ｎｍ厚未満である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４６】
基質が１．１ｎｍ厚未満である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４７】
核酸ポリマー結合部位を格子パターンに形成する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４８】
核酸ポリマー結合部位が配列特異的である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４９】
配列特異的核酸ポリマー結合部位がオリゴヌクレオチドである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
核酸ポリマー結合部位が配列特異的ではない、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５１】
１または２以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることをさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５２】
１または２以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび／またはそれを同定するために設計されたシステムであり：
サンプルチャンバー；
チャンバーを伴う粒子線発生装置；
核酸ポリマーの標識相補鎖を含むサンプル、ここで該サンプルは、チャンバー内に置かれたとき、粒子線発生装置により発生した粒子線に曝露され、粒子線および相補鎖の間で相互作用をもたらす；および
相互作用後、粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器
を含む、前記システム。
【請求項１５４】
検出器からの信号を受信および分析するための作動可能なデータ解析モジュールをさらに含む、請求項１５３に記載のシステム。
【請求項１５５】
データ解析モジュールが、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向に関する信号を分析するのに作動可能である、請求項１５４に記載のシステム。
【請求項１５６】
データ解析モジュールが、信号を分析するためのパターン認識法を分析するのに作動可能である、請求項１５４に記載のシステム。
【請求項１５７】
データ解析モジュールにより受信されたおよび／または生み出された情報の表示を制御するのに作動可能なユーザーインターフェースをさらに含む、請求項１５４に記載のシステム。
【請求項１５８】
粒子線発生装置が電子線発生装置である、請求項１５３に記載のシステム。
【請求項１５９】
核酸ポリマーデータを基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュールをさらに含む、請求項１５３に記載のシステム。
【請求項１６０】
核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび／またはそれを同定するために設計されたシステムであり：
サンプルチャンバー；
チャンバーを伴う粒子線発生装置；
粒子線および核酸ポリマーおよび／または核酸ポリマーの相補鎖を含むサンプルの間の相互作用後、粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器；
核酸ポリマーに関する情報を決定するために粒子線種に関する信号を分析するよう設計されたデータ解析モジュール；および
情報を基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュール
を含む、前記システム。
【請求項１６１】
サンプルが、核酸ポリマーの標識相補鎖を含む、請求項１６０に記載のシステム。
【請求項１６２】
フィードバックモジュールが、核酸ポリマーの塩基−塩基間距離を基にシステムを較正するよう設計された、請求項１６０に記載のシステム。
【請求項１６３】
フィードバックモジュールが、核酸ポリマーの既知の形状を基にシステムを較正するよう設計された、請求項１６０に記載のシステム。
【請求項１６４】
粒子線機器を較正する方法であり、
核酸ポリマーに関するデータを入手すること；および
データを基に機器を較正すること
を含む、前記方法。
【請求項１６５】
データが、核酸ポリマーの塩基−塩基間距離に関する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
較正が、核酸ポリマーの既知の形状に基づき機器を較正することを含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
核酸ポリマーを検出器により検出される粒子線種を基に検出する、配列決定するおよび／または同定するシステムであり、粒子線種は核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線への曝露によるものであり：
検出器からの１または２以上の信号を受信し、１または２以上の信号は粒子線種を表し、および少なくとも一部は受信した１または２以上の信号に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を検出、配列決定および／または同定するのに作動可能なデータ解析モジュール
を含む、前記システム。
【請求項１６８】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖が標識されている、請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１６９】
粒子線種が１または２以上の以下の特性：吸収、反射、偏向、エネルギーおよび方向を有し、
データ解析モジュールは、１または２以上の特性の値を決定するために１または２以上の信号を分析するのに作動可能である、
請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１７０】
データ解析モジュールが核酸ポリマー情報を含むデータ資源にアクセスするのに作動可能であり、データ資源は複数のエントリーを有するデータ構造を含み、各エントリーがそれぞれの核酸ポリマー配列についての情報を特定する、請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１７１】
データ解析モジュールが、１または２以上の信号を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定するのに作動可能であり、該データ解析モジュールは：
部分配列をデータ資源からアクセスされた核酸ポリマーの配列情報と組み合わせるための結合モジュール
をさらに含む、請求項１７０に記載のシステム。
【請求項１７２】
データ解析モジュールが、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するのに作動可能な比較モジュールを含む、請求項１７０に記載のシステム。
【請求項１７３】
比較モジュールが、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するためのパターン認識法を使用するのに作動可能である、請求項１７２に記載のシステム。
【請求項１７４】
データ解析モジュールが、データ解析モジュールにより受信されたおよび／または生み出された情報をユーザーに表示するためのユーザーインターフェースモジュールを含む、請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１７５】
サンプルを曝露する粒子線を、粒子線発生装置により発生させ、
データ解析モジュールが、１または２以上のフィードバック信号を粒子線発生装置および／または検出器に提供するのに作動可能なフィードバックモジュールを含み、１または２以上のフィードバック信号が少なくとも一部は検出器から受信した１または２以上の信号から決定した情報を特定する、
請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１７６】
１または２以上のフィードバック信号が、粒子線発生装置を較正するための情報を含む、請求項１７５に記載のシステム。
【請求項１７７】
フィードバックモジュールが、少なくとも一部は核酸ポリマーの既知の形状に基づく１または２以上のフィードバック信号を発生させるのに作動可能である、請求項１７６に記載のシステム。
【請求項１７８】
データ解析モジュールが、コンピュータ可読の媒体におけるデータ解析モジュールにより受信および／または発生させる情報を記憶するのに作動可能な記憶モジュールを含む、請求項１７７に記載のシステム。
【請求項１７９】
サンプルが同じ核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖の分子を複数含み、複数の粒子線種が複数のサンプルの分子の粒子線への曝露によりもたらされ、１または２以上の信号は複数の粒子線種を表し、
データ解析モジュールが、第１の部分配列を作り出すために複数の分子の１番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定するのに、および第２の部分配列を作り出すために複数の分子の２番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定するのに作動可能であり、および
データ処理モジュールが、第１のおよび第２の部分配列を組み合わせるための結合モジュールをさらに含む、
請求項１６７に記載のシステム。
【請求項１８０】
コンピュータ可読の媒体であり、コンピュータにより実行された結果、核酸ポリマーを検出器により検出された粒子線種を基に検出する、配列決定するおよび／または同定するプロセスを行うためにコンピュータを制御する指示を定義するそこに記憶されるコンピュータ可読の信号を有し、該プロセスは：
検出器からの１または２以上の信号を受信し、１または２以上の信号は粒子線種を表すこと、および
少なくとも一部は受信した１または２以上の信号に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を検出する、配列決定するおよび／または同定すること
を含む、
前記コンピュータ可読の媒体。
【請求項１８１】
核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖が標識されている、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８２】
粒子線種が１または２以上の以下の特性：吸収、反射、偏向、エネルギーおよび方向を有し、
検出する、配列決定するおよび／または同定する行為が、１または２以上の特性の値を決定するために１または２以上の信号を分析することを含む、
請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８３】
検出、配列決定および／または同定する行為が、核酸ポリマー情報を含むデータ資源にアクセスすることを含み、該データ資源は、複数のエントリーを有するデータ構造を含み、各エントリーがそれぞれの核酸ポリマー配列についての情報を特定する、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８４】
検出、配列決定および／または同定する行為が、
部分配列を作り出すための１または２以上の信号を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；
データ資源からの核酸ポリマーの部分配列情報にアクセスすること；および
部分配列を部分配列情報と組み合わせること、
を含む、請求項１８３に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８５】
検出、配列決定および／または同定する行為が、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のエントリーから特定された情報と比較することを含む、請求項１８４に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８６】
検出、配列決定および／または同定する行為が、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するためのパターン認識法を使用することを含む、請求項１８５に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８７】
プロセスが、１または２以上の受信された信号から決定した情報をユーザーに表示することをさらに含む、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８８】
サンプルを曝露する粒子線を、粒子線発生装置により発生させ、プロセスが、
１または２以上のフィードバック信号を粒子線発生装置および／または検出器に提供し、１または２以上のフィードバック信号が少なくとも一部は検出器から受信した１または２以上の信号から決定した情報を特定すること、
をさらに含む、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１８９】
提供する行為が、粒子線発生装置を較正するための情報を含む１または２以上のフィードバック信号を提供することを含む、請求項１８８に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１９０】
プロセスが、少なくとも一部は核酸ポリマーの既知の形状を基に１または２以上のフィードバック信号を発生させることをさらに含む、請求項１８９に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１９１】
プロセスが、コンピュータ可読の媒体において１または２以上の信号から決定した情報を記憶させることをさらに含む、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体。
【請求項１９２】
サンプルが同じ核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖の分子を複数含み、複数の粒子線種が複数のサンプルの分子の粒子線への曝露によりもたらされ、１または２以上の信号は複数の粒子線種を表す、請求項１８０に記載のコンピュータ可読の媒体であり、検出、配列決定および／または同定する行為が：
第１の部分配列を作り出すために複数の分子の１番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；
第２の部分配列を作り出すために複数の分子の２番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；
第１および第２の部分配列を組み合わせること
を含む、前記媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻(35 U.S.C.)第１１９条（ｅ）の規定に基づき、２００４年７月１４日に出願された米国仮特許出願第60/587,997号を基礎として優先権を主張し、また参照として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して核酸ポリマーの同定、配列決定および／または検出に関し、より具体的に、粒子（例えば、電子）線を使って核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび／または検出するシステムおよび方法、ならびに関連構成要素に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
核酸分子を配列決定する様々な方法がある。歴史的に、一般的な方法は、後に電気泳動法により分離する特異的切断核酸分子を作る化学的（例えば、マキサム・ギルバート(Maxam and Gilbert)配列決定）または酵素的（例えば、サンガー(Sanger)ジデオキシ配列決定およびエクソヌクレアーゼベースの配列決定）反応を基にしたものであり、それらの相対的な長さを決定するためのものである。より最近では、潜在的により高性能な手法が、ピロシーケンスおよびハイブリダイゼーションベースの配列決定方法を含め、開発されている。しかしながら、かかる方法における改善でさえも、核酸配列決定の費用および速度を、（例えば分子医学および薬理ゲノム学において有用な）幅広いゲノム配列決定および核酸配列の他の使用を容易にするために改善すべきである。
【０００４】
米国特許公開公報第2002/0086317号および同第2004/0038261号（ナガヤマ(Nagayama)）には、電子顕微鏡を介して画像化するために塩基特異的重原子標識を使用するＤＮＡシークエンサシステムが開示されている。ナガヤマ手法において、配列決定された核酸および標識塩基の間のワトソン−クリック(Watson-Crick)結合に依存する一本鎖ＤＮＡが使用される。また、ナガヤマ塩基はヌクレオチドではなく、むしろ核酸分子を作ることができる重合可能な単位のない塩基である。これにより、重原子の標識は、対象とする塩基に比較的弱く保持される。したがって、ナガヤマの方法において、標識塩基は、配列決定の取り組みに適用可能な意味のあるデータを減少させるまたは消去する画像化に使われる電子線により元の一本鎖からの置換に感受性がある。
【０００５】
ナガヤマの手法はまた、デジタルデータとして以外の方法で核酸を得ることにおけるその能力に限りがあり得る。ナガヤマの手法は、相対的な信号強度のみを基にした画像化を伴う。さらに、ナガヤマ手法において、解像度の高さは、標識の重原子間の距離、または重原子が標識塩基内に有する配置パターンを決定するのに十分ではないだろう。
したがって、現在利用できる方法およびシステムよりも核酸配列および量をより迅速におよび効果的に決定することができる改善された方法およびシステムの必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび／または検出するシステムおよび方法、ならびに関連構成要素（例えば、基質、ソフトウェアなど）を提供する。
本発明の一面により、核酸ポリマーの配列を決定する方法を提供する。該方法は、核酸ポリマーの相補鎖を形成することおよび粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖におけるヌクレオチドの配列を同定することを含む。
【０００７】
ある態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖はＤＮＡまたはＲＮＡである。他の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って核酸ポリメラーゼ酵素により形成する。
好ましい態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾する。好ましくは、標識は各種のヌクレオチドに対して特異的である。標識は１または２以上の原子、好ましくは３または２以下の原子、好ましくは単一原子を含むことができる。いくつかの好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有し、一方他の好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する。いくつかの態様において、原子はハロゲン原子である。
【０００８】
好ましくは、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび／または相補鎖中に取り込む。他の態様において、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合させる。
【０００９】
さらなる態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させ、同定のステップの前に核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖のヌクレオチドを実質的に基質から除去し、標識ヌクレオチドの標識を基質に固着させたままにする。
また他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を発生させ、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露し、粒子線への特徴的変化によってヌクレオチドを同定することを含む。好ましくは、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むように修飾し、より好ましくは、ヌクレオチドを同定するステップは、粒子線への特徴的変化を検出することを含む。ある態様において、粒子線は軽粒子線であり、より好ましくは、軽粒子線は電子線である。
【００１０】
他の態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させる。核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の片端で、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の両端で、および／または核酸ポリマーおよび／または相補鎖の全長に沿った複数の位置で基質に固着させることができる。
ある態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、配列を同定する前に実質的に真っ直ぐにする。好ましくは、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を流体により真っ直ぐにし、より好ましくは、流体は分子コーミングを含む。流動体は１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする。
【００１１】
追加の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップは、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する。好ましくは、ヌクレオチドが標識されている。粒子線の変化は、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化を含む。粒子線の変化はまた、空間パターン、例えば、一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンの変化であり得る。
【００１２】
さらなる態様において、方法はまた、相補鎖および／または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む。好ましくは、付着は核酸配列特異的分子、好ましくはオリゴヌクレオチドによるものである。他の好ましい態様において、基質を誘導体化し、配列非特異的である付着点を提供する。相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。
他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖の複数の走査を行うことを含む。好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドが、各走査において同定される。
【００１３】
本発明の別の側面により、核酸ポリマーの配列を決定する方法を提供する。該方法は、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を合成すること、および粒子線を使って核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖における標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定することを含み、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖に取り込まれたとき、粒子線を使って同定可能である。
ある態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖はＤＮＡまたはＲＮＡである。他の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って核酸ポリメラーゼ酵素により合成する。
【００１４】
好ましい態様において、標識は、各種のヌクレオチドに対して特異的である。標識は、１または２以上の原子、好ましくは３または２以下の原子、好ましくは単一原子を含むことができる。いくつかの好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有し、一方他の好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する。いくつかの態様において、原子はハロゲン原子である。
好ましくは、標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の合成に使われるリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸に取り込む。他の態様において、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖へのリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸の取り込み後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合させる。
【００１５】
さらなる態様において、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定するステップは、粒子線を発生させること、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露すること、および粒子線への特徴的変化によってヌクレオチドを同定することを含む。好ましくは、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを検出するステップは、粒子線への特徴的変化を検出することを含む。ある態様において、粒子線は軽粒子線であり、より好ましくは、軽粒子線は電子線である。
【００１６】
他の態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に固着させる。ある態様において、同定のステップの前に、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖のリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを実質的に基質から除去し、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドの標識を基質に固着させたままにする。核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の片端で、核酸ポリマーおよび／または相補鎖の両端で、および／または核酸ポリマーおよび／または相補鎖に沿った複数の位置で基質に固着させることができる。
【００１７】
ある態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを同定する前に実質的に真っ直ぐにする。好ましくは、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を流体により真っ直ぐにし、より好ましくは、流体は分子コーミングを含む。流動体は１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする。
【００１８】
追加の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップは、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドリン酸を検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定する。好ましくは、ヌクレオチドは標識されている。粒子線の変化は、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化を含む。粒子線の変化はまた、空間パターン、例えば、一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンの変化であり得る。
【００１９】
さらなる態様において、該方法はまた、相補鎖および／または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む。好ましくは、付着は核酸配列特異的分子、好ましくはオリゴヌクレオチドによるものである。他の好ましい態様において、基質を誘導体化し、配列非特異的である付着点を提供する。相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。
他の態様において、ヌクレオチドの配列を同定するステップは、粒子線を使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖の複数の走査を行うことを含む。好ましくは、少なくとも１００のヌクレオチドが、各走査において同定される。
【００２０】
本発明の別の側面により、核酸ポリマーの配列を決定する方法を提供する。該方法は、標識リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸を使って核酸ポリマーの相補鎖を合成すること、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させること、分子コーミングを使って核酸ポリマーおよび／または相補鎖を実質的に真っ直ぐにすること、粒子線を発生させること、基質上の相補鎖を通して核酸ポリマーおよび相補鎖を粒子線に曝露すること、および相補鎖における標識ヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの配列を決定することを含む。
【００２１】
本発明の別の側面により、核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定する方法を提供する。該方法は、核酸ポリマーの相補鎖を形成すること、相補鎖および、任意に、核酸ポリマーを基質に付着させること、および粒子線を使って相補鎖および／または核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定することを含む。
いくつかの態様において、同定するステップは、長さを測定することまたは少なくとも相補鎖および／または核酸ポリマーの部分配列を決定することを含む。
【００２２】
ある態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖はＤＮＡまたはＲＮＡである。他の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って核酸ポリメラーゼ酵素により形成し、好ましくは、核酸ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。
【００２３】
他の態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾する。好ましい態様において、標識は、各種のヌクレオチドに対して特異的である。標識は１または２以上の原子、好ましくは３または２以下の原子、好ましくは単一原子を含むことができる。いくつかの好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５より大きい原子番号を有し、一方他の好ましい態様において、原子は、単独でまたは全体で５５以下の原子番号を有する。いくつかの態様において、原子はハロゲン原子である。
好ましくは、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成中、核酸ポリマーおよび／または相補鎖中に取り込む。他の態様において、ヌクレオチド特異的標識を、核酸ポリマーおよび／または相補鎖形成後、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドに結合させる。
【００２４】
さらなる態様において、粒子線を使って相補鎖および／または核酸ポリマーの存在を検出するおよび／または同定するステップは、粒子線を発生させること、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を粒子線に曝露すること、および粒子線への特徴的変化によって相補鎖および／または核酸ポリマーのヌクレオチドを同定することを含む。
いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖のヌクレオチドを、標識を含むよう修飾する。好ましくは、ヌクレオチドを検出するステップは、粒子線への特徴的変化を検出することを含む。ある態様において、粒子線は軽粒子線であり、より好ましくは、軽粒子線は電子線である。
【００２５】
ある態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、配列を検出する前に実質的に真っ直ぐにする。好ましくは、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を、流体により真っ直ぐにし、より好ましくは、流体は、分子コーミングを含む。流動体は、１または２以上の液体、気体、位相またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの態様において、核酸ポリマーおよび／または相補鎖を基質に付着させ、および基質に付着させたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより流体の中で真っ直ぐにする。
【００２６】
追加の態様において、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを同定するステップは、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖におけるヌクレオチドを検出するためのヌクレオチドとの相互作用による粒子線の変化を解釈することを含み、それにより核酸ポリマーの存在を決定するおよび／または核酸ポリマーを同定する。好ましくは、ヌクレオチドは標識されている。粒子線の変化は、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向の変化を含む。粒子線の変化はまた、空間パターン、例えば一次元パターン、二次元パターンまたは三次元パターンの変化であり得る。
【００２７】
さらなる態様において、方法はまた、相補鎖および／または核酸ポリマーを基質に付着させることを含む。好ましくは、付着は核酸配列特異的分子、好ましくはオリゴヌクレオチドによるものである。他の好ましい態様において、基質を誘導体化し、配列非特異的である付着点を提供する。相補鎖および任意に核酸ポリマーを格子パターンの基質に付着させる。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。
他の態様において、方法はまた、相補鎖および／または核酸ポリマーの量を定量化することを含む。
【００２８】
本発明の別の側面により、実質的に粒子線に透明である基質、および基質表面の核酸ポリマー結合部位を含むデバイスを提供する。
いくつかの態様において、基質は、実質的に電子線に透明である。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。
他の態様において、デバイスはまた、実質的に粒子線に透明である支持体を含む。
好ましくは、基質は５ｎｍ厚未満であり、より好ましくは２ｎｍ厚未満であり、さらにより好ましくは１．５ｎｍ厚未満、なおより好ましくは１．１ｎｍ厚未満である。
【００２９】
他の態様において、核酸ポリマー結合部位を、所定の位置基質表面で、好ましくは格子パターンに形成する。ある態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的であり、好ましくはオリゴヌクレオチドである。他の態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的ではない。
さらなる態様において、デバイスはまた、１または２以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることを含む。好ましくは、１または２以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する。
【００３０】
本発明の別の側面によると、デバイスを作る方法を提供する。該方法は、実質的に粒子線に透明である基質を得ること、および基質表面の核酸ポリマー結合部位を形成することを含む。
いくつかの態様において、基質は、実質的に電子線に透明である。好ましくは、基質は炭素薄膜を含む。いくつかの態様において、核酸ポリマー結合部位を、基質表面の所定の位置で、好ましくは格子パターンに形成する。
【００３１】
他の態様において、該方法はまた、実質的に粒子線に透明である支持体を基質に付着させることを含む。
好ましくは、基質は５ｎｍ厚未満であり、より好ましくは２ｎｍ厚未満であり、さらにより好ましくは１．５ｎｍ厚未満であり、なおより好ましくは１．１ｎｍ厚未満である。
ある態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的であり、好ましくはオリゴヌクレオチドである。他の態様において、核酸ポリマー結合部位は配列特異的ではない。
また他の態様において、該方法はまた、１または２以上の核酸ポリマーを核酸ポリマー結合部位に固着させることを含む。好ましくは、１または２以上の核酸ポリマーを標識を含むよう修飾する。
【００３２】
本発明の別の側面によると、核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび／またはそれを同定するために設計されたシステムを提供する。該システムは、サンプルチャンバー；チャンバーを伴う粒子線発生装置；核酸ポリマーの標識相補鎖を含むサンプル、ここで該サンプルは、チャンバー内に置かれたとき、粒子線発生装置により発生した粒子線に曝露され、粒子線および相補鎖の間で相互作用をもたらす；および相互作用後粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、システムはまた、検出器からの信号を受信および分析するのに作動可能なデータ解析モジュールを含む。好ましくは、データ解析モジュールは、吸収、反射、偏向、エネルギーまたは方向に関する信号を分析するのに作動可能である。他の態様において、データ解析モジュールは、信号を分析するためのパターン認識法を分析するのに作動可能である。
さらなる態様において、システムはまた、データ解析モジュールにより受信されたおよび／または生み出された情報の表示を制御するのに作動可能なユーザーインターフェースを含む。
好ましい態様において、粒子線発生装置は電子線発生装置である。
他の態様において、システムはまた、核酸ポリマーデータを基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュールを含む。
【００３４】
本発明の別の側面により、核酸ポリマーの存在を検出するために、その配列を決定するためにおよび／またはそれを同定するために設計されたシステムを提供する。該システムは、サンプルチャンバー；チャンバーを伴う粒子線発生装置；粒子線および核酸ポリマーおよび／または核酸ポリマーの相補鎖を含むサンプルの間の相互作用後粒子線種を収集するよう構成し、配置した検出器；核酸ポリマーに関する情報を決定するために粒子線種に関する信号を分析するよう設計されたデータ解析モジュール；および情報を基にシステムを較正するよう設計されたフィードバックモジュールを含む。
【００３５】
いくつかの態様において、サンプルは、核酸ポリマーの標識相補鎖を含む。
ある態様において、フィードバックモジュールは、核酸ポリマーの塩基−塩基間距離を基にシステムを較正するよう設計されている。他の態様において、フィードバックモジュールは、核酸ポリマーの既知の形状を基にシステムを較正するよう設計されている。
【００３６】
また、本発明の別の面により、粒子線機器を較正する方法を提供する。該方法は、核酸ポリマーに関するデータを入手すること；およびデータを基に機器を較正することを含む。好ましくは、データは、核酸ポリマーの塩基−塩基間距離に関する。いくつかの態様において、較正は、核酸ポリマーの既知の形状に基づき機器を較正することを含む。
【００３７】
本発明の別の側面により、核酸ポリマーを検出器により検出される粒子線種を基に検出する、配列決定するおよび／または同定するシステムを提供する。粒子線種は核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線への曝露によるものである。該システムは、検出器からの１または２以上の信号を受信し、１または２以上の信号は粒子線種を表し、および少なくとも一部は受信した１または２以上の信号に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を検出、配列決定および／または同定するのに作動可能なデータ解析モジュールを含む。好ましくは、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖は標識されている。
【００３８】
いくつかの態様において、粒子線種は１または２以上の以下の特性：吸収、反射、偏向、エネルギーおよび方向を有し、データ解析モジュールは、１または２以上の特性の値を決定するために１または２以上の信号を分析するのに作動可能である。
【００３９】
他の態様において、データ解析モジュールは核酸ポリマー情報を含むデータ資源にアクセスするのに作動可能であり、データ資源は複数のエントリーを有するデータ構造を含み、各エントリーがそれぞれの核酸ポリマー配列についての情報を特定する。好ましくは、データ解析モジュールは、１または２以上の信号を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定するのに作動可能であり、該データ解析モジュールは、部分配列をデータ資源からアクセスされた核酸ポリマーの配列情報と組み合わせるための結合モジュールをさらに含む。好ましい態様において、データ解析モジュールは、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するのに作動可能な比較モジュールを含む。好ましくは、比較モジュールは、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するためのパターン認識法を使用するのに作動可能である。
他の態様において、データ解析モジュールは、データ解析モジュールにより受信されたおよび／または生み出された情報をユーザーに表示するためのユーザーインターフェースを含む。
【００４０】
さらなる態様において、サンプルを曝露する粒子線を、粒子線発生装置により発生させ、データ解析モジュールが、１または２以上のフィードバック信号を粒子線発生装置および／または検出器に提供するのに作動可能なフィードバックモジュールを含み、１または２以上のフィードバック信号が少なくとも一部は検出器から受信した１または２以上の信号から決定した情報を特定する。好ましくは、１または２以上のフィードバック信号は、粒子線発生装置を較正するための情報を含む。好ましい態様において、フィードバックモジュールは、少なくとも一部は核酸ポリマーの既知の形状に基づき１または２以上のフィードバック信号を発生させるのに作動可能である。データ解析モジュールは好ましくは、コンピュータ可読の媒体におけるデータ解析モジュールにより受信および／または発生される情報を記憶するのに作動可能な記憶モジュールを含む。
【００４１】
いくつかの態様において、サンプルが同じ核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖の分子を複数含み、複数の粒子線種が複数のサンプルの分子の粒子線への曝露によりもたらされ、１または２以上の信号は複数の粒子線種を表し、データ解析モジュールが、第１の部分配列決定を作り出すために複数の分子の１番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定するのに、および第２の部分配列を作り出すために複数の分子の２番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列するのに作動可能であり、およびデータ処理モジュールが、第１のおよび第２の部分配列を組み合わせるための結合モジュールをさらに含む。
【００４２】
本発明の別の側面によりと、コンピュータ可読の媒体であり、コンピュータにより実行された結果、核酸ポリマーを検出器により検出される粒子線種を基に検出する、配列決定するおよび／または同定するプロセスを行うためにコンピュータを制御する指示を定義するそこに記憶されるコンピュータ可読の信号を有する媒体を提供する。粒子線種は核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線への曝露によるものである。該プロセスは、検出器からの１または２以上の信号を受信すること、１または２以上の信号は粒子線種を表すこと、および少なくとも一部は受信した１または２以上の信号に基づきサンプルに含まれる核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を検出する、配列決定するおよび／または同定することを含む。好ましくは、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖は標識されている。
いくつかの態様において、粒子線種は１または２以上の以下の特性：吸収、反射、偏向、エネルギーおよび方向を有し、検出、配列決定および／または同定する行為が、１または２以上の特性の値を決定するために１または２以上の信号を分析することを含む。
【００４３】
他の態様において、検出、配列決定および／または同定する行為は、核酸ポリマー情報を含むデータ資源にアクセスすることを含み、該データ資源は、複数のエントリーを有するデータ構造を含み、各エントリーがそれぞれの核酸ポリマー配列についての情報を特定する。好ましくは、検出、配列決定および／または同定する行為は、部分配列を作り出すための１または２以上の信号を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；データ資源からの核酸ポリマーの部分配列情報にアクセスすること；および部分配列を部分配列情報と組み合わせることを含む。好ましい態様において、検出、配列決定および／または同定する行為は、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のエントリーから特定された情報と比較することを含む。これらの態様のいくつかにおいて、検出、配列決定および／または同定する行為は好ましくは、１または２以上の信号から決定された情報を１または２以上のデータ構造エントリーから特定された情報と比較するためのパターン認識法を使用することを含む。
さらなる態様において、プロセスはさらに、１または２以上の受信された信号から決定した情報をユーザーに表示することを含む。
【００４４】
他の態様において、サンプルを曝露する粒子線を、粒子線発生装置により発生させ、プロセスはさらに、１または２以上のフィードバック信号を粒子線発生装置および／または検出器に提供し、１または２以上のフィードバック信号が少なくとも一部は検出器から受信した１または２以上の信号から決定した情報を特定することを含む。好ましくは、提供する行為は、粒子線発生装置を較正するための情報を含む１または２以上のフィードバック信号を提供することを含む。いくつかの態様において、プロセスはさらに、少なくとも一部は核酸ポリマーの既知の形状を基に１または２以上のフィードバック信号を発生させることを含む。
他の態様において、プロセスはさらに、コンピュータ可読の媒体において１または２以上の信号から決定した情報を記憶させることを含む。
【００４５】
さらなる態様において、サンプルは同じ核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖の分子を複数含み、複数の粒子線種が複数のサンプルの分子の粒子線への曝露によりもたらされ、１または２以上の信号は複数の粒子線種を表し、検出、配列決定および／または同定する行為は、第１の部分配列を作り出すために複数の分子の１番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；第２の部分配列を作り出すために複数の分子の２番目を基に核酸ポリマーを部分的に配列決定すること；第１および第２の部分配列を組み合わせることを含む。
【００４６】
本発明の他の面、態様および特長は、添付図面と併せて考慮するとき、以下の本発明の詳細な説明から明らかであろう。添付の図面は概略図であり、縮尺比に従ったものではない。図面において、様々な図面において説明されたそれぞれ同一の、または実質的に類似の構成要素を、単一の数字または表記によって表す（ただし、常にではない）。明確化の目的のために、すべての構成要素がそれぞれの図面中で標識されているわけではない。また、当業者が本発明を理解するのに説明が必要ではない場合は、本発明の各態様のすべての構成要素が示されているわけではない。本明細書中に参考文献として組み込まれたすべての特許出願および特許は、それら全体が参考文献として組み込まれる。不一致の場合、本明細書が、定義を含め、支配する。
【００４７】
詳細な説明
ＤＮＡなどの核酸ポリマーを配列決定する、同定するおよび／または検出するシステムおよび方法を提供する。該方法は、電子線などの粒子線を使って、核酸ポリマーに関する情報を得ることを伴い得る。例えば、ＤＮＡのサンプルを粒子線に曝露することができ、サンプルとの相互作用によるビームにおける変化は、情報を提供すると解釈することができるパターンを形成し得る。いくつかの態様において、粒子線機器（例えば、電子顕微鏡）を、ＤＮＡのサンプルを直接見るのに使うことができる。サンプルに、サンプルのヌクレオチドの検出および同定を容易にするために（例えば、ＤＮＡ鎖に付着した原子または分子を使って）標識してもよい。さらに以下に説明するように、該方法により、利点の中でとりわけ、高速で、安価で、および高精度で核酸の配列決定する、同定するおよび／または検出することが可能になる。
【００４８】
図１は、本発明の一態様による核酸ポリマーを同定する、配列決定するおよび／または検出するためのシステム１０を示す。該システムは、サンプル１４を置くチャンバー１２を含む。この態様において、真空ポンプ２２は、使用中十分低い真空（例えば、約１０−５ｔｏｒｒ未満）を維持するため、チャンバーに付随する。粒子線発生装置１６は、粒子線１８を発生させるために設計されている。示すように、１または２以上のレンズ配置２０（一つのレンズまたは複数のレンズを含んでもよい）を、サンプルに粒子線を導くおよび／または焦点を合わせるために使う。検出器２４をチャンバー内に置き、粒子線およびサンプルの間の相互作用後、粒子線種２６を収集する。１または２以上のレンズ配置２０をサンプルまたは基質および検出器２４の間に置き、検出器２４の上で粒子線種２６を拡大することができる。示すように、検出器をサンプルの下に置き、サンプルを通して伝わるビーム種を収集してもよい。検出器は、収集したビーム種を代表する電気信号をデータ解析モジュール２８に伝える。さらに以下に説明するように、データ解析モジュールを、核酸ポリマーを検出する、配列決定するおよび／または同定するために、データを解釈する（例えば、核酸を検出する、配列決定するおよび／または同定するために）および／またはそれをデータパターンの既知のライブラリと比較するよう構成してもよい。
【００４９】
本発明のシステムは、図１の態様に示したものと異なる様々な構成を有していてもよいことを、理解すべきである。
一般的に、サンプル１４は、核酸ポリマーの配列および／または存在を決定するために分析してもよい好適な形状である。ある態様において、サンプルを、核酸ポリマーの１または２以上の相補鎖で形成することが好ましい。他の態様において、サンプルを、相補鎖に沿ってまたは離れて核酸ポリマーの１または２以上の鎖で形成してもよい。
【００５０】
従来の手法を、核酸ポリマーおよび／またはポリマー自体の相補鎖を形成するのに使ってもよい。典型的に、相補鎖を形成する第１のステップは、核酸ポリマーの一本鎖を得ることである。あらゆる好適な手法を、一本鎖を得るのに使ってもよい。いくつかの態様において、図２に示すように、一本鎖を、二本鎖構造４２の第２の鎖４０Ｂから第１の鎖４０Ａを分離することにより得てもよい。鎖間の水素結合を切断する標準の変性処理（例えば、熱、酵素）を使ってもよい。他の態様において、一本鎖を、それをテンプレートから合成することにより作ることができる。例えば、当該技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写酵素処理を使ってもよい。他の態様において、一本鎖を、１回に１つのヌクレオチドを、例えば、オリゴヌクレオチド合成処理において、化学的に合成してもよい。かかる合成処理は、当該技術分野で周知であり、自動化することができる。また、一本鎖を、それを天然源から精製することにより、例えば細胞から一本鎖ＲＮＡを得ることが可能である。前述のもの（そして当業者に既知の他の方法）の組み合わせもまた、使うことができる。図３は、核酸を含む分離後の鎖４０Ａを示す。
【００５１】
核酸ポリマーの相補鎖を、あらゆる好適な従来の手法を使って一本鎖から作ることができる。例えば、標準の重合手法を使ってもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、標準のＰＣＲ、ロングＰＣＲプロトコル）を含む。該手法は一般的に、適切な反応条件下で、一本鎖を過剰なヌクレオチドに曝露することを伴う。本明細書中のさらに以下に説明するようにおよび図４に図式的に示したように、ヌクレオチドを標識してもよい。いくつかの態様において、一つのまたは複数のポリメラーゼ酵素を、反応を容易にするのに使用する。ポリメラーゼ酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定酵素を含む）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む。他の態様において、酵素を使う必要はない（例えば、in vitro化学合成）。他の好適な構成要素（例えば、ヌクレオチドプライマー、プライマーゼなどの他の酵素など）が存在していてもよい。図５は、さらに以下に説明するように、第１の鎖４０Ａに結合した、標識した相補鎖４４を含む構造４６を示す。
【００５２】
構造４６は、図２において、相補鎖４４を含むよう修飾し、他の構成要素がさもなければＤＮＡ鎖に存在しないよう、構造４２と異なってもよいことを理解すべきである。例えば、相補鎖を、本発明の方法においてヌクレオチドの検出および同定を容易にする標識を含むよう修飾してもよい（例えば、形成中または後）。標識（例えば、原子または分子）は、粒子線に曝露するとき、本発明のシステムおよび方法を使って検出および同定することができる特徴のある粒子線種を作る。代表的な態様において、標識ヌクレオチドを、アスタリスク（例えば、Ａ＊、Ｔ＊、Ｃ＊、Ｇ＊）で表示する。同様に、核酸ポリマーをまた、標識を含むよう修飾することができる。これは、例えば、典型的に両方の鎖（すなわち、核酸ポリマーおよびその相補鎖）の合成をもたらすＰＣＲを使って、核酸の合成中に有利に行われる。しかしながら、本発明のある態様において、標識は利用されない。
【００５３】
標識は存在するとき、標識を相補鎖のヌクレオチドのみに（例えば、図５に示すように）、または核酸の両方の鎖に（例えば、合成後化学標識ステップを使って）付着させるか、または相補鎖のみ（例えば、ＰＣＲ１ラウンドを使って）または核酸の両方の鎖（例えば、ＰＣＲ２ラウンドまたは３ラウンド以上を使っておよび図６に示すように）に標識を取り込むことが好ましいだろう。
【００５４】
ある態様において、特定の型の標識をそれぞれ、各種のヌクレオチド（例えば、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミン三リン酸（ＴＴＰ）、ウラシル三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）；通常、核酸分子内に取り込むこれらのヌクレオチドを、１文字で、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵで表す）に付着させる。例えば、ＤＮＡに標識するために、第１の型の標識を、第１のヌクレオチド型（例えば、ＣＴＰ）に付着させ；第２の型の標識を、第２のヌクレオチド型（例えば、ＡＴＰ）に付着させ；第３のの型の標識を、第３のヌクレオチド型（例えば、ＴＴＰ）に付着させ；および第４の型の標識を、第４のヌクレオチド型（例えば、ＧＴＰ）に付着させる。したがって、さらに以下に説明するように、ヌクレオチド型を、特定の標識を同定することにより同定してもよい。修飾（非天然の）または異型の天然ヌクレオチドをまた使ってもよく、ここで、塩基、糖またはリン酸部分は、典型的な天然に発生するヌクレオチドに（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵに）存在するものと異なり得る。この一例は、「ロックされた(locked)」核酸であり、例えば、リボヌクレオシドを、２’−酸素原子および４’−炭素原子の間をメチレン単位を用いて連結させる、二環式核酸であり得る。前述の混合物を、本発明において用いることができる。
【００５５】
本明細書中で使われる「ヌクレオチド」は、窒素含有塩基、糖分子（例えば、ＤＮＡのデオキシリボース、ＲＮＡのリボース）および１または２以上の（典型的に１〜３）連結基（例えば、リン酸、ペプチド）を含むことを理解すべきである。典型的なヌクレオチドは、上に示したように、シトシン三リン酸などのヌクレオチド三リン酸である。本明細書中で使われる「ヌクレオシド」は、窒素含有塩基および糖分子を含むが、上に説明したように、連結基は含まない。本明細書中で使われる「塩基」は、窒素含有塩基を含むが、糖分子または連結基は含まない。これらの組成物の違いにより、ヌクレオチドを核酸ポリマーに重合することができるが、ヌクレオシドまたは塩基はできない。さらに以下に説明するように、本発明のある態様の１つの利点は、標識はヌクレオチドに付着してもよく、それは、核酸塩基とは反対に、核酸ポリマーに重合してもよいことである。しかしながら、注意すべきは、「塩基対」は通常、配列特異的な形で結合するヌクレオチド対、例えば、二本鎖核酸ポリマーにおけるＡ−ＴおよびＣ−Ｇなどのワトソン−クリック対合、を表すのに使われる。しかしながら、この用語はまた、定義により、核酸ポリマーの一部ではない、ヌクレオシドまたは塩基の対合を示すことができる。
【００５６】
独特の標識を持つ各ヌクレオチド型を有する利点の１つは、１回の「データ読み込み」のみが配列を直接得るのに必要なことである。あるヌクレオチドのどの鎖があるかについて、いくつかの解釈が必要であろう。各塩基対を２回同定することから、各種のヌクレオチドに独特の標識することにより、データ解釈にいくらかの柔軟性を持たせるようになり、各ヌクレオチドを直接同定し、塩基対あたり２つのヌクレオチドがあり、データ読み込みおよび配列の正確性のために内部制御を提供する。
【００５７】
他の態様において、ある鎖において各ヌクレオチド型（例えば、Ｃ、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｇ）が独特の標識を持つが、他の鎖の標識は異なる。これは、連続ＰＣＲサイクル、または他の合成方法において、異なる組の標識ヌクレオチドを使って達成することができ、ヌクレオチドが属する鎖を追跡するのがいともたやすくなる。
【００５８】
ある態様において、すべてのヌクレオチド型に標識する必要はない。例えば、３つのヌクレオチド型（例えば、Ｃ、Ａ、Ｔ）が標識されて、４番目（例えば、Ｇ）が標識されていない場合、各「非標識」型は、４番目のヌクレオチド型（例えば、Ｇ）として直ちに同定されるだろう。核酸ポリマーにおけるヌクレオチドの高度に規則正しい間隔を考えると、非標識ヌクレオチドの位置を、標識ヌクレオチド間の距離の観察から推察することができる。他の態様において、ヌクレオチド型の２つのみを標識してもよい。例えば、第１組の配列データを２つの標識したヌクレオチド型（例えば、Ｃ、Ａ）で作成してもよく、第２組の配列データを他の２つの標識したヌクレオチド型（例えば、Ｔ、Ｇ）で作成してもよい。両方の組のデータを、全体の配列に関する情報を提供するために処理してもよい。
【００５９】
代わりに、核酸ポリマーの両方の鎖の２つのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ）のみを標識することにより、一方の鎖の配列を、他の鎖の配列から推察することができる。例えば、二本鎖核酸ポリマーの一本鎖のすべての標識アデニンは、ワトソン−クリックのヌクレオチド結合規則に従って反対の鎖のチミンに結合するであろう。したがって、一本鎖のアデニンの観察により、二本鎖核酸の他の鎖の対応する位置のチミンの存在を推察することができる。他のヌクレオチドの位置も同様に、２つのヌクレオチド特異的標識のみを取り込む二本鎖核酸を観察することから直接読むまたは推察することができる。
【００６０】
標識は、ヌクレオチドの様々な異なる位置に付着してもよい。いくつかの態様において、標識を、窒素含有塩基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）の、または中のヌクレオチドに付着させる。例えば、これらの態様において、標識を塩基の炭素／窒素環に付着させてもよく、または塩基の炭素または窒素原子と置き換えてもよい。他の態様において、標識を、糖分子（例えば、ＲＮＡのリボース、またはＤＮＡのデオキシリボース）の、またはその中のヌクレオチドに付着させる。他の態様において、標識を、ヌクレオチドの連結基に、またはその中に付着させる。例えば、標識を、リン酸連結基に、またはその中に付着させてもよい。標識を、リン（例えば、アルファ置換リン酸、αＳ）などの酸素置換物に付着させてもよく、またはある部位のリン原子を置き換えてもよい。
【００６１】
ある態様において、標識を共有結合によりヌクレオチドに付着させる。さらに以下に説明するように、共有結合は、標識サンプルを核酸の検出および／または同定に重要であるであろう比較的高い粒子線エネルギー（例えば、電子線について約５０ｋＶより大きい、例えば約８０〜１２０ｋＶ）への曝露に耐えることを可能にし得る、標識およびヌクレオチドの間の強力な付着を提供する。これに対し、ナガヤマにより記された手法は、一般的に共有結合より著しく弱いワトソン−クリック結合を使って標識を付着することを伴い、したがって、かかる高い電子線エネルギーに耐えることができないだろう。
【００６２】
ある態様において、標識を、ヌクレオチドが相補鎖(および／または核酸ポリマーの第１の鎖のコピー)を形成する前にヌクレオチドに付着させることが好ましい。これらの態様において、標識を、さらに以下に説明するように、相補鎖(および／または核酸ポリマーの第１の鎖のコピー)を形成するポリメラーゼ反応を妨げない型から選択してもよい。したがって、これらの場合、相補鎖をその形成中に標識する。
【００６３】
しかしながら、他の態様において、相補鎖（および／または核酸ポリマーの第１の鎖のコピー）形成後、標識をヌクレオチドに付着させるのが望ましいだろう。これらの場合、ヌクレオチドを所望の標識型に好ましくは共有結合し得る好適な付着部位を含むように修飾してもよい（相補鎖の形成および／または核酸ポリマーの第１の鎖のコピー前）。形成後、核酸鎖を、部位に付着する標識に曝露する。
【００６４】
本発明の方法において、あらゆる好適な標識を使ってもよい。一般的に、標識を、粒子線を利用する本発明の方法を使ってヌクレオチド、それら自体より簡単に検出可能および同定可能である型から選択すべきである。いくつかの態様において、標識は、基（例えば、トリフルオロメチル）を形成する同じ型でもよくまたは異なる型でもよい原子の組み合わせを含む。いくつかの場合、標識は、３または２以下の原子を、いくつかの場合、単一原子を含むのが好ましいだろう。標識するのに好適な原子は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｕ、Ｏｓ、Ｐｂ、Ａｕ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｐｔ、Ｅｕ、Ｐｄ、Ｃｏ、Ｈｇ、Ｇｄ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ａｃ、Ｗ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｒａ、Ｂａ、およびＳｒを含むが、これらに限定されない。ある場合、ハロゲン原子が好ましいだろう。すべてではないがいくつかの態様において、標識は、本発明の方法において（単独でまたは全体で）５５より大きい原子番号を有してもよい。だが、他の態様において、標識は、（単独でまたは全体で）５５以下、例えば、１７〜５５の原子番号を有するのが好ましいだろう。
【００６５】
本発明のある方法において、相補鎖を第１の鎖から分離し、示すように、サンプルとして使われる単一相補鎖を形成する。相補鎖を、従来の変性手法（例えば、熱、酵素）を使って第１の鎖から分離してもよい。分離後、第１の鎖は廃棄してもよく、またそのまましても、あるいはそうでなければ使ってもよい。
【００６６】
いくつかの場合、相補鎖の分離および使用により、次の方法のステップにおける検出および／または同定を簡素化することができる。いくつかの態様において、相補鎖および第１の鎖を分離せず、二重鎖構造を、検出および／または同定ステップにおいてサンプルとして使う。
ある態様において、相補鎖を第１の鎖から分離するとき、相補鎖を、標識してもよい別の鎖を作るためにテンプレートとして使用する。これは、図６に示すように、２本の標識鎖（すなわち、相補鎖および相補鎖から作られた新しい鎖）を含む二重鎖構造を作ることができる。ある方法において、この二重鎖構造を、検出および／または同定ステップにおいてサンプルとして使う。
【００６７】
本発明の方法は、１つのサンプル（例えば、相補鎖、相補鎖および第１の鎖、相補鎖および新しい鎖）、または２以上のサンプルを基質へ付着させることを伴ってもよい。２以上のサンプルを付着させるとき、サンプルは同じ（すなわち、同じ配列に基づいて）または異なってもよい。一般的に、基質は粒子線への曝露に好適であるべきである。サンプルを通じて伝わる粒子線種を検出する態様において、基質は粒子線の十分な透過を可能にすべきである。
【００６８】
基質は一般的に、十分な粒子線がそれを透過できるよう薄い。例えば、基質は、５ナノメートル（ｎｍ）未満；いくつかの場合、２ｎｍ未満；または、１．５または１．１ｎｍ未満でさえあってもよい。基質は、単層または複数層を形成してもよい。ある場合、層は架橋してもよい。従来の手法を基質を形成するのに使うことができ、他の中でとりわけ、蒸着およびＦＩＢミリングを含む。
【００６９】
好適な基質材料は当業者に既知であり、炭素（例えば、純粋な炭素、黒鉛、ダイヤモンド）、窒化ホウ素（例えば、立体構造を有するもの）、アルミニウムおよびある高分子樹脂（例えば、FORMVAR（登録商標）（ポリビニルホルマール））を含むことができる。他の態様において、基質を、脂質、天然たんぱく質または合成たんぱく質など有機材料で形成する。基質材料は、例えば、架橋層にまたはさらに以下に説明するように、サンプルの付着を容易にするために化学物質によりドープしてもよい。
【００７０】
サンプルを、少なくともサンプルの一部を基質に化学結合により基質に付着させてもよい。好適な手法は、当業者に既知である。例えば、基質表面に存在する分子（例えば、基質の一部として既存するまたは基質の誘導体化に続く）を、サンプルに結合させるのに使ってもよい。分子は、核酸配列特異的分子（例えば、オリゴヌクレオチド）であってもよい。他の場合では、基質表面を、配列非特異的である付着点を提供するために誘導体化してもよい。他の場合では、電荷を、サンプルを基質表面に結合させるのに使ってもよい。サンプルのための付着点は、格子またはマイクロアレイなど所定のパターンで、間隔を空けることができる。
【００７１】
サンプルの単数または複数部分を基質に付着させてもよい。いくつかの場合、サンプルの両端（例えば、相補鎖、相補鎖および第１の鎖、相補鎖および新しい鎖）に付着してもよく；他の場合では、サンプルの片端のみに付着してもよく；いくつかの場合、サンプル全長に沿った１または２以上の非末端部分に付着してもよい。核酸分子の末端またはそれに沿った付着を、所望の場合、基質との結合を形成することができるヌクレオチド合成中に核酸に含ませることにより、容易にすることができる。
【００７２】
図７は、示すように、ループ状でもおよび曲線状でもよい標識二本鎖４８のらせん構造を説明する。本発明のある方法は、基質への付着前、中または後でさえもサンプル（例えば、標識二本鎖）を実質的に真っ直ぐにすることを伴う。これにより、検出および／または同定を容易にすることができる。図８Ａおよび８Ｂは、実質的に真っ直ぐになり、基質５０に付着した標識二本鎖４８を示す。標識二本鎖は、例えば、さらに以下に説明するように連結結合を介して結合部位に、基質に付着してもよい。従来の手法を、サンプルを真っ直ぐにするのに使ってもよい。例えば、サンプルを、流体（例えば、分子コーミング）を使って真っ直ぐにしてもよい。流動体は、１または２以上の液体、気体、またはそれらの組合せを含んでもよい。ある態様において、サンプルを、ハイブリダイゼーションにより流体の中で基質表面上に存在するオリゴヌクレオチドに付着させ、真っ直ぐにする。いくつかの場合、電界を、サンプルを真っ直ぐにするのを促進するために使ってもよい（流体の存在下で、または単独で）。２以上のサンプルを基質に付着させる態様において、ビームへの曝露を容易にするために、各サンプルが実質的に互いに平行に並んでいるのが好ましいだろう。例えば、「分子コーミング」手法を、オリゴヌクレオチドを基質表面に並べるのに使ってもよい。好適な「分子コーミング」手法は、例えば、米国特許第6,303,296号または国際特許公報第WO 95/21939号に記載されており、それらを参考文献として本明細書に組み込む。
【００７３】
ある態様において、基質の表面（または基質表面積の大部分）は均質である。これらの態様において、実質的に基質の表面全体（または基質表面の大部分）は、サンプルに結合可能である。他の態様において、基質はサンプルに結合可能なそれぞれの局所的な表面部位を含む。例えば、局所的な結合部位５２を、図９Ａおよび９Ｂに示すように基質５０上の格子パターンに配置してもよい。
核酸鎖の基質への付着プロセスを、既に含まれた、部分的に含まれた、またはまだ含まれていない標識のいずれかと行うことができる。後者２つの場合、続いて１または２以上の型の標識を基質上の鎖に標識するのに加える。
【００７４】
鎖の付着の後に、過剰な溶液を除去する。基質を、任意に洗浄し、不純物を除去することができる。
いくつかの方法において、核酸材料をサンプルから除去してもよく、一方標識を基質に結合させたままにしてもよい。例えば、核酸材料を、溶解、酵素消化、蒸発（例えば、減圧および／または加温により）またはエッチング（例えば、化学物質または粒子線により）により除去してもよい。核酸をエッチングするとき、標識を保護するために、マスクを任意に使ってもよい。
【００７５】
本発明のある態様において、サンプルを基質上にさらに安定化させるのが好ましいだろう。例えば、材料の安定化層をサンプル一面に提供してもよい。安定化層を、粒子線に十分透明であるべきあらゆる好適な材料で形成することができる。好適な材料は、上記の基質材料を含む。安定化層を、機械的位置決めまたは沈殿により（例えば、化学的にまたはリソグラフにより）サンプル一面に提供してもよい。図１０は、サンプル一面に（例えば、標識二本鎖４８）形成されたかかる保護層５６を示す。安定化層は、同定する、配列決定するおよび／または検出するのに重要であり得る次の処理ステップにおいて高電子エネルギーを使うことを可能にするだろう。安定化層はまた、保存および／または次の解析のために核酸分子または（核酸分子の除去後は標識）を保管するのにより安定な材料を提供してもよい。
【００７６】
本発明の方法は、サンプルを粒子線に曝露することを伴う。ある態様において、粒子線は、電子線などの軽粒子線であることが好ましい。他の場合では、粒子線は、Ｘ線であってもよい。電子線を使うとき、ビーム発生装置１６は、電子顕微鏡（例えば、透過電子顕微鏡）において使われるものと同様であり得る。発生装置１６は、所望の電圧を有するビームを発生させてもよく、例えば、５０ｋＶより大きく、例えば、８０〜３００ｋＶ、好ましくは８０〜１２０ｋＶであり得る。ビームエネルギーは、電圧および電流両方の関数である。ビーム電流は典型的に、５〜２５μＡ、好ましくは８〜１５μＡの範囲である。特異的ビームエネルギーは一部、行われる特異的解析に依存する。
【００７７】
方法は、当業者に既知なようにレンズ配置を使って、サンプル上で正しくビームの焦点を合わせることを含み得る。方法はまた、較正ステップを含んでもよい。ある場合、システムを、フィードバックループを使ってサンプルにおける核酸分子からの既知の情報（既知の分子形状および構造など）に基づき自動的に較正してもよい。例えば、電子線を使って核酸サンプルから得たデータは、ヌクレオチド間（例えば、標識間）距離を含んでもよい。本明細書中で使われているように、ヌクレオチド間距離は、１つの鎖における１つのヌクレオチド塩基から同じ鎖の隣接したヌクレオチド塩基への距離である。例えば、ＤＮＡ分子のヌクレオチド間距離は一般的に知られている一方、あるサンプルのヌクレオチド間距離は、一般的に既知の距離に対応しないかもしれないが、典型的には、基質に固着させたサンプル、特に、例えば、分子コーミングまたは同様の方法を使った処置によって真っ直ぐにしたサンプル内で、実質的に一定である。したがって、あるサンプルについてデータ読み込みを得た後、システムの様々な側面を、フィードバック制御システムを使って較正または調整することができる。例えば、ヌクレオチド間距離を知ることにより、粒子線の焦点を合わせることおよび粒子線に相対的なサンプルの動きに関するフィードバックが可能になる。
【００７８】
本発明のシステムは、従来の透過電子顕微鏡と似たいくつかの構成要素（例えば、ビーム発生装置、レンズなど）を含むかもしれないが、本発明のあるシステムは、典型的な従来のＴＥＭよりも単純である。例えば、いくつかの態様において、システムを、他の性質の中でとりわけ倍率の範囲、加速電圧、プローブ径、ビーム電流、およびサンプルの柔軟性を制限することにより単純化する。また、システムに典型的な作動条件に予めセットしたレンズ配置を使って、従来のＴＥＭにおける球面収差に関する問題を制限、または排除することができる。
【００７９】
粒子線の特徴は、サンプルと相互作用するときに変化する。例えば、１または２以上の粒子線の以下の特徴が変化してもよい:エネルギー、方向、吸収、反射および偏向。かかる変化は、上に説明したように粒子線およびヌクレオチドに付着した標識の相互作用によるものであってもよい。特定の型の標識は、特異的または特徴的変化を作り出してもよい。したがって、標識(および、それが付着する特異的ヌクレオチド)を、特異的または特徴的なビームの変化を認識することにより同定してもよい。
【００８０】
検出器２４は、粒子線およびサンプルの相互作用後、粒子線種２６を収集する。検出器は典型的に、サンプルを通して伝わるビーム種を収集するが、反射するおよび／または散乱するビーム種も収集することができる。検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）を含んでもよい。ＣＣＤは、ビーム種をデジタル情報に直接変換してもよい。ＣＣＤ技術以外の技術を、ビーム種をデジタル情報に変換するのに使ってもよく、それは本発明の範囲内であることを意図する。
典型的に、ビームをサンプルにわたって走査し、それはサンプルに相対的なビームの動きによって、ビームに相対的なサンプルの動きによって、あるいは両方によって生じる。ある方法は、複数回サンプルにわたってビームを走査することを伴う。
【００８１】
フィードバックループを、性能を最適化するのに使ってもよい。ヌクレオチド間距離に関する上記のフィードバックループに加えて、追加のフィードバックループのために、電子線読み込みデバイスによりサンプルを走査して集めたサンプル情報を統合することができる。
【００８２】
フィードバックループを、基質上の分子の経路をたどるのに使うことができ、関連のある分子付近でデータ収集しているもののみに読み込む必要があるＣＣＤにおける画素数を減らすのに使うことができ、それにより実質的により速いデータ解析のために１秒あたりのデータ読み込み数を増加させる。この型のフィードバックループをまた、データを再サンプリングまたはオーバーサンプリングする必要性を決定するのに、および／またはいつ特定のサンプルの解析が終了するのかをおよび／またはいつ装置が次のサンプル／分子へと動いてもいいのかを決定するのに使うことができる。
【００８３】
本発明のいくつかの態様において、核酸ポリマーを、検出器（例えば、上記の検出器）により検出した粒子線種を基に検出および／または配列決定および／または同定してもよい。粒子線種は、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線（例えば、電子線などの軽粒子線）への曝露によるものでもよい。核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を、本明細書中に記載の手法を使って標識してもよい。かかる方法は、システム６０を使って実行してもよく、図１１に関連して今記述するデータ解析モジュール７１を含む。
【００８４】
図１１は、検出器により検出される粒子線種を基に核酸ポリマーを検出するおよび／または配列決定するおよび／または同定するためのシステム６０の一例を説明するブロック図であり、粒子線種は、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの粒子線への曝露によるものである。システム６０は単に、検出器により検出された粒子線種を基に核酸ポリマーを検出する、および／または配列決定するおよび／または同定するためのシステムの説明的な態様であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。例えば、システム６０の変化型などのかかるシステムの他の実施は可能であり、それは本発明の範囲内であることを意図する。
【００８５】
サンプルを曝露するのに使われる粒子線を、粒子線発生装置により、例えば、上に説明したように発生させてもよい。さらに、上に説明したように、この粒子線は、例えば、電子線などの軽粒子線でもよく、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を、標識してもよい。
データ解析モジュール７１を、例えば、Cognex Corporation（Natick, Massachusetts）より入手可能なシステムなどの既知のマシン視覚システム（例えば、「見ること」ができる機械）に用いられる手法と同様の、または同じ手法を用いてもよい。
システム６０は、以下のいずれも含んでもよい：粒子線機器６４；検出器６８；ソフトウェア解析モジュール７１；ネットワーク６９；ネットワーク８５；データ資源８６；他の構成要素；または前述のあらゆる好適な組合せ。粒子線機器６４および検出器６８は、本明細書中に記載のあらゆる型であってもよい。
【００８６】
データ解析モジュール７１を、検出器６８からの１または２以上の信号７０を受信するよう構成してもよい。１または２以上の信号により、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖を含むサンプルの曝露による粒子線種を表してもよい。本発明のいくつかの態様において、データ解析モジュール７１および検出器６８を同じデバイスに備え、１または２以上の信号７の通信を、内部バスおよび他の接続を通して達成してもよい。他の態様において、モジュール７１および検出器６８は、１または２以上の信号７０をネットワーク６９にわたって伝わるよう、異なるデバイスに互いから遠隔に位置させてもよい。
【００８７】
データ解析モジュール７１は、１または２以上の信号７０を受信するようデータ収集モジュール７４を含んでもよい。データ収集モジュールを、１または２以上の受信信号を増幅させるようおよび／または他の既知の信号処理法を適用するよう構成してもよい。１または２以上のこれらの信号処理法をまた、検出器６８が用いてもよいことを認識すべきである。
【００８８】
データ解析モジュール７１を、少なくとも一部は受信した１または２以上の信号７０を基にしたサンプルを含む核酸ポリマーを検出するおよび／または配列決定するおよび／または同定するよう構成してもよい。例えば、モジュール７１を、異なる機能を異なる時に行うよう構成してもよい。すなわち、あるサンプルについて核酸ポリマーを検出するよう構成し、そして別の（または同じ）あるサンプルについて核酸ポリマーを配列決定するよう異なって構成し、およびまた別の（または同じ）あるサンプルを同定するよう異なって構成してもよい。さらに、データ解析モジュール７１を、異なる時に検出、配列決定および／または同定の異なる組合せを行うよう構成してもよい。モジュール７１を構成することを、モジュール７１のソフトウェア素子をハードコードすること；構成可能なパラメータについて手動でまたはソフトウェアを通して値を設定すること；モジュール７１のファームウェア要素を電気的にプログラムすること；他の既知のプログラミング手法を用いることまたは前述のもののあらゆる好適な組合せにより、行ってもよい。さらに、データ解析モジュール７１を、１または２以上の信号７０により表された粒子線種の１または２以上の特性を同定し、同定した特性を基に１または２以上の検出、配列決定および同定を行うよう構成してもよい。すなわち、モジュール７１の動作は、データに依存的であってもよい。
【００８９】
１または２以上の信号で表される粒子線種は、以下の特性のいずれを有してもよい：吸収；反射；偏向；エネルギー；方向；他の特性；または前述のもののあらゆる好適な組合せ。データ解析モジュール７１を、１または２以上の特性のうち少なくとも１つ（例えば、すべて）の値を決定するために、１または２以上の受信信号７０を分析するよう構成してもよい。さらに、上述のように、データを、分子（または分子内の原子）の有無、存在する分子の数、核酸分子におけるヌクレオチドまたは塩基対の配列、核酸分子の長さおよび核酸分子の形を決定して評価してもよい。
【００９０】
本発明のいくつかの態様において、データ解析モジュール７１は、核酸ポリマー情報８８を含むデータ資源８６にアクセスするのに作動可能である。核酸ポリマー情報８８および／またはデータ資源８６の１または２以上の部分を、図１１に示すように、モジュール７１から、分離したデバイスにネットワーク８５を通じて遠隔に処置してもよい。例えば、データ資源の少なくとも一部は、本出願日に公的にアクセス可能なNational Center for Biotechnology Information (NCBI)よりインターネットでアクセス可能なGenBankデータベースであろう（http://www.ncbi.gov）。したがって、情報８８の１または２以上の部分は、GenBankデータベースからアクセスしてもよい。さらに、情報８８および／またはデータ資源８６の１または２以上の部分を、同じデバイスにモジュール７１として備えてもよい。
核酸ポリマー情報８８を、複数のエントリーを含むデータ構造として配置してもおよび／または含んでもよく、ここで各エントリーは、それぞれの核酸ポリマーについての情報を特定する。例えば、各エントリーは、GenBankデータベースからのエントリーおよび／または記録であってもよい。
【００９１】
データ解析モジュール７１は、核酸ポリマーおよび／またはその相補鎖について１または２以上の信号７０から決定した情報を、データ資源８６の情報８８からアクセスした１または２以上の情報と比較するのに作動可能であってもよい。例えば、モジュール７１は、かかる比較をするよう構成した比較モジュール７８を含んでもよい。本発明のいくつかの態様において、比較モジュール７８を、１または２以上の信号から決定した情報を核酸ポリマー８８の１または２以上のエントリーにより特定された情報と比較するためのパターン認識法を使うよう構成してもよい。例えば、モジュール７８を、１または２以上の信号から少しずつ集めた情報を特異的標識を有する個々のヌクレオチド、標識ヌクレオチドの個々の塩基対、固有の対立遺伝子、および固有の突然変異（例えば、脱落、反復、異常配列の包含など）に対応する既知のデータパターンと比較するよう構成してもよい。コンピュータモジュール７８を、パターンを比較すための既存の市販の又は無料のソフトウェアを使って構成してもよく、および実施する特定のデータ比較のために最適化してもよい。
【００９２】
既述のように、本発明のいくつかの態様において、フィードバックループを、例えば、既知の核酸分子形状および核酸分子の構造および複合体を基に、粒子線機器６４を較正するために用いる。例えば、データ解析モジュール７１は、フィードバック情報６２を粒子線機器６４に提供するフィードバックモジュール７２を含んでもよい。フィードバックモジュール７２をまた、フィードバック情報６６を検出器６８および／または本明細書中に記載のシステムの他の構成要素に提供するよう構成してもよい。フィードバック情報６２を、データモジュール７１の１または２以上の構成要素により発生させたかもしれず、少なくとも一部は１または２以上の信号７０および／または１または２以上の核酸ポリマー情報８８を基に決定したかもしれない。例えば、フィードバック情報６２を、核酸ポリマー情報８８から得られた既知の核酸ポリマーの形状を使って発生させてもよい。
【００９３】
本発明のいくつかの態様において、サンプルに含まれた核酸ポリマーを検出する、および／または配列決定するおよび／または同定するために、核酸ポリマーについての既知の情報（例えば、その分子形状）を１または２以上の信号７０から決定された情報と組み合わせることができる。例えば、データ解析モジュール７１の１または２以上の構成要素は、１または２以上の信号７０を基にサンプルの核酸ポリマーを部分的に配列決定する。さらに、核酸ポリマー配列の他の部分を、核酸ポリマー情報８８から（例えば、GenBankデータベースから）配列決定してもよい。結合モジュール７６を、核酸ポリマーを検出、および／または配列決定および／または同定してもよい１または２以上の信号７０から決定した部分配列および核酸ポリマー情報８８から決定した部分配列を組み合わせる（すなわち、組み立てる）よう構成してもよい。１または２以上の信号７０から決定した部分配列の「ギャップを埋める」ための核酸ポリマー情報８８を使うことは、利点であり得る。例えば、サンプルの曝露の数を減少させ、サンプル内の核酸ポリマーを検出する、および／または配列決定するおよび／または同定するのに必要なデータ読み込み（例えば、１または２以上の信号７０の受信）をもたらすだろう。
【００９４】
本発明の他の態様において、データ解析モジュール（例えば、フィードバックモジュール７２からフィードバック情報６２を通じて）を、１または２以上の核酸ポリマーの存在、配列および／または同定について得られた情報を使い、個々の核酸分子および／または基質に関して（例えば、異なる格子位置などの基質上の異なる位置から情報を読み込むために基質を再配置するかどうか）粒子線機器６４を制御するよう構成してもよい。この方法で粒子線機器を制御する、例えば、機器の使用から得ることを望む情報を得るために必要なデータおよび／または時間を減少させることが望ましいだろう。
【００９５】
個々の分子に相対的な粒子線機器６４を制御をし、例えば、決定した配列の量を減少させることを行うことができる。いくつかの態様において、モジュール７１を、その一部がすべての核酸ポリマーの配列の特徴である場合など、配列の一部のみを決定した後、配列決定作業を中止するよう構成してもよい。これを、後に配列の同定を部分配列を基に決定してもよい核酸ポリマー情報８８にクエリすることにより決定してもよい。
【００９６】
任意に、機器６４を、（例えば、フィードバック情報６２に含まれる指示を通じて）核酸ポリマーの末端部に移動するために、例えば、核酸ポリマーの一部を配列決定することを省略して、制御することができる。粒子線機器６４に、配列決定された核酸ポリマーの特定の位置に移動することを指示してもよい。これは、例えばビームの物理的移動によりまたは選択的データ解析により行ってもよい。データ解析モジュール７１を、確認するのが望ましい配列部分および現在配列決定されている部分からの物理的距離についての情報についての情報を統合することにより、例えばヌクレオチド間距離を基に距離を計算することにより、移動指示を決定してもよい。例えば、核酸ポリマーの最初の１００のヌクレオチドを配列決定した後、データ解析モジュール７１は、ポリマーがその全長に対して特定の配列を有する可能性を、例えば、データ資源８６から（例えば、核酸ポリマー情報８８から）アクセスした情報に類似のまたは同一の配列を認識することによって、決定してもよい。
【００９７】
そしてフィードバックモジュール７２は、フィードバック情報６２を粒子線機器６４に送ってもよく、これは、機器６４が配列の確認をするために核酸ポリマーの別の部分を省略し得ることを示す。これは、対立遺伝子の核酸配列間で識別するのに特に有用であり得る。前述の方法で粒子線機器６４を制御を、データ解析モジュール７２によって独立して（例えば、自動的に）行ってもよく（例えば、モジュール７２を、人間の介在なくそうするよう構成してもよい）、または任意にユーザーの入力に応答して行ってもよい。例えば、ユーザーインターフェースモジュール８２を、ユーザー出力８０としてユーザーに情報を報告し、ユーザー入力８０としてユーザーから指示を受けるよう構成してもよい。
【００９８】
決定された配列の量および／またはシステム６０により行われた検出および／または同定の量を減少させるために、基質に相対的な機器の制御を行うことができる。いくつかの態様において、基質に存在する核酸ポリマーの一部のみを試験することが望まれるかもしれない。例えば、複数の遺伝子プローブが基質に格子パターンで存在する場合（例えば、マイクロアレイ）、遺伝子プローブの一部のみに対応する基質の位置を試験してもよい。これを、例えば、特定の疾患または一連の疾患を示すある遺伝子の存在を試験するために行ってもよい。基質がある状態を有する疑いがある対象（例えば、患者）からの核酸ポリマーを含有する場合、基質を、診断目的のため、状態と相関がある遺伝子配列の発現に対応する核酸ポリマーの存在および量について試験することができる（他の状態を除外するために）。状態について疑いがない場合、対象がある状態を有することを示唆するために十分なデータを収集するまで、遺伝子プローブの基質格子の部分のみを試験することが望まれ、その後に基質の他の選択された部分を確認のために試験する（例えば、他の遺伝子の発現がその状態であることが予想される場合）。
【００９９】
いくつかの態様において、データ解析モジュール７１に関する本明細書中に記載の機能性の少なくともいくつかの側面を、粒子線機器６４、検出器６８および／またはシステム６０他の構成要素において実施してもよいことを認識すべきである。
本発明のいくつかの態様において、粒子線機器に曝露するサンプルは、複数の同じ型の核酸ポリマーを含んでもよい。したがって、サンプルの曝露による粒子線種は、１または２以上の分子を示す情報を含有してもよい。その結果、１または２以上の信号７０は、複数の分子についての情報を表してもよい。かかる態様において、データ解析モジュールを、１または２以上の信号７０から複数の分子についての情報を決定するよう、およびサンプル内に含有される核酸ポリマーを検出する、および／または配列決定するおよび／または同定するためにこの情報を使うよう構成してもよい。例えば、データ解析モジュールは、２または３以上の複数の分子を部分的に配列決定することにより、複数の部分配列を作り出してもよい。結合モジュール７６を、分子を検出する、および／または配列決定するおよび／または同定するために部分配列を組み合わせるよう構成してもよい。
【０１００】
異なる分子から決定した部分配列を組み合わせる際、分子を、解釈にもっとも好適な形状を基に評価してもよい。例えば、いくつかの分子は、ある塩基対に対して好都合であって他に対してはそうではない形状を有するだろう。例として、核酸二重らせんにおけるヌクレオチドの位置をサンプルの基質の平面または粒子線の位置に相対的に、好都合にまたは不都合に並べてもよい。別の例として、分析した複数の同じ型の核酸分子はそれぞれ、サンプルの基質の平面または粒子線の位置に相対的に、好都合に位置するヌクレオチドおよび／または標識のある部分を有してもよい。これらの複数の分子の配列情報は、核酸分子のそれぞれに好都合な位置を基に得ることができ、そして核酸分子の複合配列を提供するのに組み合わせることができる。
【０１０１】
上述のように、データ解析モジュール７１、および１または２以上のその構成要素を、上記のいずれかの手法を使って、分子（または分子内の原子）の有無、存在する分子の数、核酸分子におけるヌクレオチドまたは塩基対の配列、核酸分子長および核酸分子の形を決定するために評価するよう構成してもよい。さらに、１または２以上の信号７０内に含まれたまたはデータ解析モジュール７１の構成要素のいずれかから発生させた情報のいずれかを、データ資源８６に、例えば、核酸ポリマー情報８８の一部として記憶させてもよい。記憶モジュール８４を、この目的のために構成してもよい。さらに、１または２以上の信号７０内に含まれたまたはデータ解析モジュール７１のモジュールのいずれかにより決定された情報のいずれかを、１または２以上のユーザーに、ユーザー入力／出力８０の一部として、表示してもよく、そうでなければ、通信してもよい。ユーザーインターフェースモジュール８２を、この目的のために構成してもよい。
【０１０２】
システム６０およびその構成要素を、ソフトウェア（例えば、Ｃ、Ｃ＃、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ(登録商標）、またはそれらの組合せ）、ハードウェア（例えば、１または２以上のアプリケーション特異的集積回路）、ファームウェア（例えば、電気的にプログラムしたメモリ）またはあらゆるそれらの組合せを含む様々な技術のいずれかを使って実施してもよい。１または２以上のシステム６０の構成要素を、単一デバイス（例えば、コンピュータ）に備えてもよく、あるいか１または２以上の構成要素を、分離した、別個のデバイスに備えてもよい。さらに、各構成要素を、複数のデバイスにわたって分布させてもよく、１または２以上のデバイスを、相互接続させてもよい。
【０１０３】
さらに、１または２以上のシステム６０の構成要素を含む１または２以上のデバイスのそれぞれにて、構成要素のそれぞれを、システム上の１または２以上の位置に備えてもよい。例えば、これらのシステムの構成要素の異なる部分を、デバイス上のメモリ（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ディスクなど）の異なる領域に備えてもよい。かかる１または２以上のデバイスのそれぞれは、他の構成要素のうち、１または２以上のプロセッサ、メモリシステム、ディスク記憶システム、１または２以上のネットワークインターフェース、および１または２以上のバスまたは様々な構成要素を相互接続する他の内部通信リンクなど複数の既知の構成要素を含んでもよい。システム６０およびその構成要素を、図１２および１３に関して以下に記載したようなコンピュータシステムを使って実施してもよい。
【０１０４】
システム６０に関して上に記載した１または２以上の機能、方法、およびそれらの作用、ならびにこれらの機能、方法およびこれらの作用の様々な態様および変形型を、個々にまたは組合せて、１または２以上のコンピュータ可読の媒体、例えば、非揮発性記録媒体、集積回路メモリ素子、またはそれらの組合せにおいて明白に具体化されたコンピュータ可読の信号により定義してもよい。コンピュータ可読の媒体は、コンピュータによってアクセスすることができるあらゆる利用可能な媒体であり得る。一例として、限定することなく、コンピュータ可読の媒体は、コンピュータ記憶媒体および通信媒体を含んでもよい。コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読の指示、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータなどの情報の記憶のためのあらゆる方法または技術において実施される揮発性および非揮発性、除去可能なおよび除去不可能な媒体を含む。コンピュータ記憶媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または他の光学的記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶または他の磁気記憶デバイス、他の型の揮発性および非揮発性メモリ、所望の情報を記憶させるのに使うことができ、コンピュータによりアクセスすることができるあらゆる他の媒体、ならびに前記の好適な組合せを含むが、それらに限定されない。
【０１０５】
通信媒体は典型的に、搬送波または他の輸送機構などの変調されたデータ信号においてコンピュータ可読の指示、データ構造、プログラムモジュールまたは他のデータを具体化し、あらゆる情報送達媒体を含む。用語「変調されたデータ信号」は、信号の情報をエンコードするような方法に設定または変更された１または２以上のその特徴を有する信号を意味する。一例として、限定することなく、通信媒体は、有線ネットワークまたは直接有線接続などの有線媒体、音響、ＲＦ、赤外線および他の無線媒体などの無線媒体、他の型の通信媒体、および前述のもののあらゆる好適な組合せを含む。
【０１０６】
１または２以上のコンピュータ可読の媒体において具体化されたコンピュータ可読の信号は、例えば、１または２以上のプログラムの一部としての指示を定義してもよく、コンピュータにより実行された結果、１または２以上の本明細書中に記載の機能（例えば、システム６０に関する）、および／または様々な態様、変形型およびそれらの組合せを行うようコンピュータに指示する。かかる指示を、複数のプログラム言語のいずれか、例えば、Ｊａｖａ(登録商標）、Ｊ＃、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｃ、Ｃ＃、またはＣ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｐａｓｃａｌ、Ｅｉｆｆｅｌ、Ｂａｓｉｃ、ＣＯＢＯＬなど、あるいは様々なそれらの組合せのいずれかによって書いてもよい。かかる指示が具体化されたコンピュータ可読の媒体は、本明細書中に記載のシステム６０または９０のいずれかの１または２以上の構成要素を備えてもよく、１または２以上のかかる構成要素にわたって分布してもよく、それらの間を推移中でもよい。
【０１０７】
コンピュータ可読の媒体は、そこに記憶された指示をあらゆるコンピュータシステム資源にロードし、本明細書中に説明した本発明の側面を実施することができるよう、可搬型であってもよい。加えて、上記のコンピュータ可読の媒体に記憶した指示は、ホストコンピュータにて動かしているアプリケーションプログラムの一部として具体化された指示に限定されないことを認識すべきである。むしろ、指示を、上に説明した本発明の側面を実施するためにプロセッサをプログラムするのに用いることができるあらゆる型のコンピュータコード(例えば、ソフトウェアまたはマイクロコード)として具体化してもよい。
【０１０８】
本明細書中に記載の機能を行う、コンピュータシステムのあらゆる単一構成要素または複数の構成要素の集合、例えば、図１１〜１３に関して説明したコンピュータシステムを、かかる機能を制御する１または２以上のコントローラとして一般的に考慮することができることを認識すべきである。１または２以上のコントローラを、多くの方法により、例えば専用のハードウェアおよび／またはファームウェアにより、上に列挙した機能または前述のもののあらゆる好適な組合せを行うためのマイクロコードまたはソフトウェアを使ってプログラムしたプロセッサを使って、使用することができる。
【０１０９】
本発明による様々な態様を、１または２以上のコンピュータシステムにおいて実施してもよい。これらのコンピュータシステムは、例えば、Intel PENTIUM(登録商標）型プロセッサ、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISCプロセッサ、Advanced Micro Devices (AMD)から入手可能なプロセッサの変形型のいずれかまたはあらゆる他の型のプロセッサなどを基にした汎用コンピュータであってもよい。１または２以上のあらゆる型のコンピュータシステムを、本発明の様々な態様を実施するために使ってもよいことを認識すべきである。
【０１１０】
本発明の一態様による汎用コンピュータシステムを、１または２以上の上記の機能を行うよう構成する。システムは、他の機能を行ってもよく、本発明は、あらゆる特定の機能または機能一式を有することに限定されないことを認識すべきである。
【０１１１】
例えば、本発明の様々な側面を、図１２に示すように汎用コンピュータシステム９０において専門のソフトウェアを実行して実施してもよい。コンピュータシステム９０を、ディスクドライブ、メモリ、データを記憶するための他のデバイスなどの１または２以上のメモリデバイス９８に接続したプロセッサ９４を含んでもよい。メモリ９８は典型的に、コンピュータシステム９０の動作中にプログラムおよびデータを記憶するのに使われる。コンピュータシステム９０の構成要素は、相互接続機構９６により連結され、１または２以上のバス（例えば、同じ機械内に統合した構成要素間）および／またはネットワーク（例えば、分離した、別個の機械を備えた構成要素間）を含んでもよい。相互接続機構９６は、通信（例えば、データ、指示）を、システム９０のシステム構成要素間で交換することを可能にする。コンピュータシステム９０はまた、１または２以上の入力デバイス９２、例えば、マイクロコード、マウス、トラックボール、マイクロホン、タッチスクリーン、および１または２以上の出力デバイス１０２、例えば、印刷デバイス、ディスプレイスクリーン、スピーカーを含む。加えて、コンピュータシステム９０は、コンピュータシステム９０を通信ネットワーク（相互接続機構９６に加えてまたはその代わりに）に接続する１または２以上のインターフェース（図示せず）を含有してもよい。
【０１１２】
図１３に詳細に示された記憶システム１００は典型的に、コンピュータ可読なおよび書き込み可能な非揮発性記録媒体１０４を含み、プロセッサにより実行するプログラムを定義する信号を記憶し、または媒体１０４にまたはその中に記憶された情報をプログラムにより処理する。媒体は、例えば、ディスクまたはフラッシュメモリであってもよい。典型的に、作業中に、プロセッサはデータを非揮発性記録媒体１０４から別のメモリ１０６に読み込ませ、媒体１０４よりもプロセッサによる情報へのより速いアクセスを可能にする。このメモリ１０６は典型的に、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）またはスタティックメモリ（ＳＲＡＭ）などの、揮発性の、ランダムアクセスメモリである。それは、示すように、記憶システム１００に、または図示していないがメモリシステム９８に位置してもよい。プロセッサ９４は一般的に、集積回路メモリ９８、１０６内で走査し、そして処理完了後、データを媒体１０４にコピーする。様々な機構が、媒体１０４および集積回路メモリ素子９８、１０６の間でデータ移動を管理するのに知られているが、本発明は、それらに限定されない。本発明は、特定のメモリシステム９８または記憶システム１００に限定されない。
【０１１３】
コンピュータシステムは、特別にプログラムされた、特殊目的のハードウェア、例えば、アプリケーション特異的集積回路（ＡＳＩＣ）を含んでもよい。本発明の側面を、ソフトウェア、ハードウェアまたはファームウェア、またはそれらのあらゆる組合せにおいて実施してもよい。さらに、かかる方法、作用、システム、システム素子およびそれらの構成要素を、上記のコンピュータシステムの一部としてまたは独立した構成要素として実施してもよい。
【０１１４】
コンピュータシステム９０を、一例として、本発明の様々な側面が実行されてもよいコンピュータシステムの１種として示しているが、本発明の側面は、図１２に示すようにコンピュータシステムにて実施することに限定されないことを認識すべきである。本発明の様々な側面を、図１２に示すように異なるアーキテクチャまたは構成要素を有する１または２以上のコンピュータにおいて実行してもよい。
【０１１５】
コンピュータシステム９０は、高度なコンピュータプログラム言語を使ってプログラム可能な汎用コンピュータシステムであってもよい。コンピュータシステム９０をまた、特別にプログラムされた、特殊目的のハードウェアを使って実施してもよい。コンピュータシステム９０において、プロセッサ９４は典型的に、Intel Corporationから入手可能な周知のPentium(登録商標）クラスプロセッサなどの市販のプロセッサである。他の多くのプロセッサが利用可能である。かかるプロセッサは通常、例えば、Microsoft Corporationから入手可能なWindows（登録商標） 95、Windows（登録商標） 98、Windows(登録商標） NT（登録商標）、Windows（登録商標） 2000 (Windows（登録商標） ME)またはWindows（登録商標） XPオペレーティングシステム、Apple Computerから入手可能なMAC OS システムX、Sun Microsystemsから入手可能なSolaris Operating System、様々な供給元から入手可能なLinuxまたは様々な供給元から入手可能なＵＮＩＸ(登録商標）などのオペレーティングシステムで実行する。様々な他のオペレーティングシステムのいずれも使ってもよい。
【０１１６】
プロセッサおよびオペレーティングシステムは共に、アプリケーションプログラムが高度なプログラム言語で書かれたコンピュータプラットフォームを定義する。本発明は、特定のコンピュータシステムプラットフォーム、プロセッサ、オペレーティングシステム、またはネットワークに限定されないことを理解すべきである。また、当業者には、本発明は、特異的プログラム言語またはコンピュータシステムに限定されず、他の適当なプログラム言語および他の適当なコンピュータシステムもまた使うことができることが明らかである。
【０１１７】
コンピュータシステム１または２以上の部分を、通信ネットワークに接続された１または２以上のコンピュータシステム（図示せず）にわたって分散させてもよい。これらのコンピュータシステムはまた、汎用コンピュータシステムであってもよい。例えば、様々な本発明の側面を、サービス（例えば、サーバ）を１または２以上のクライアントコンピュータに提供するよう、または分布システムの一部として総体的なタスクを行うよう構成された１または２以上のコンピュータシステムの間に分布させてもよい。例えば、本発明の様々な側面を、本発明の様々な態様により様々な機能を行う１または２以上のサーバシステムの間で分配される構成要素を含むクライアント−サーバシステム上で行ってもよい。これらの構成要素は、通信プロトコル（例えば、ＴＣＰ／ＩＰ）を使って通信ネットワーク（例えば、インターネット）で通信する、実行可能な、中間（例えば、ＩＬ）または解釈（例えば、Ｊａｖａ(登録商標））コードであってもよい。
【０１１８】
本発明は、いかなる特定のシステムまたはシステム群において実行することにも限定されず、本発明は、いかなる特定の分散アーキテクチャ、ネットワーク、または通信プロトコルにも限定されないことを認識すべきである。
【０１１９】
本発明の様々な態様を、ＳｍａｌｌＴａｌｋ、Ｊａｖａ(登録商標）、Ｊ＃（Ｊ−Ｓｈａｒｐ）、Ｃ＋＋、Ａｄａ、またはＣ＃（Ｃ−Ｓｈａｒｐ）などオブジェクト指向プログラム言語を使ってプログラミングしてもよい。他のオブジェクト指向プログラム言語もまた使うことができる。代わりに、機能的、スクリプト的、および／または論理的プログラム言語を使ってもよい。本発明の様々な側面を、プログラムによらない環境において実施してもよい（例えば、ＨＴＭＬ、ＸＭＬまたは他のフォーマットで作った文書は、ブラウザプログラムのウィンドウで見るとき、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）または他の機能を行う面をレンダリングする）。本発明の様々な面を、プログラム化したまたはプログラムによらない素子、またはそれらのあらゆる組合せとして実施してもよい。さらに、本発明の様々な態様を、Microsoft Corporationから入手可能なMicrosoft（登録商標） NET技術を使って実施してもよい。
【０１２０】
本発明のあるシステムおよび方法により提供される１つの利点は、核酸配列の検出および／または同定を、非常に高速で行うことができることである。高速および本発明の他の特長、例えばサンプル操作の減少およびサンプルにおいて化学反応を行う必要性の減少などもまた、かかる解析の著しい費用削減に至らしめることができる。したがって、本発明のシステムおよび方法により、臨床用途（例えば、薬理研究、生物過程の研究、および疾患の生物学的プロセスの研究）および研究用途（例えば、薬理ゲノム学、罹病性または疾患の予後などの診断）のために個人のゲノムの完全なまたは十分な部分を実用的に獲得させてもよい。また、本発明の態様を使って、核酸アッセイを行うことが可能であり、核酸を同定するのみならず、それら定量化を、高精度で、生物の個々の細胞内で行う。これにより、どのように固有の細胞が異なって機能するのかについての詳細な理解が得られる。
【０１２１】
前述したものの一例は、遺伝子発現のマイクロアレイ型解析を行うときの本明細書中に記載の方法の使用である。従来のマイクロアレイと同様に、オリゴヌクレオチドの格子（すなわち、特異的遺伝子または対立遺伝子用のプローブ）を、上に説明したように基質上に提供する。本明細書中に記載のように標識した核酸を調製し、オリゴヌクレオチド格子と接触させ、特異的配列を有する標識核酸分子を捕らえる。これらの態様において、それぞれの異なるヌクレオチドを独特の標識で標識する必要性は低減し、または排除される。それは、データ読み込みが、（オリゴヌクレオチドから特定された）配列を考慮する必要がなく、単純に特異的オリゴヌクレオチドプローブに結合した分子数を決定すること（すなわち、核酸ポリマーを検出すること）、および／または核酸ポリマーを同定するための核酸ポリマーの長さを決定することを考慮すればよいからである。本発明の方法の遺伝子発現のマイクロアレイ型解析および定量化への適用は、速度の改善および定量化をもたらす。また、基質に結合した個々の核酸分子を計算する能力により、該方法は、増幅せずより少ないサンプルの使用が可能であり、それにより、遺伝子発現レベルのより正確な実態を提供する。
【０１２２】
本発明のシステムおよび方法はまた、非常に信頼でき、再現可能なデータを提供してもよい。
本発明のシステムおよび方法はまた、将来の参照および照合のための遺伝子データの保存を可能にする、大量の可読の核酸配列データを物理的に保管してもよい。
本発明のシステムおよび方法はまた、非常に少量のサンプルを有利に使ってもよく、例えば、単一分子から配列データを決定することが可能である。
以下の例は、説明目的のために示したものであり、限定することを意図しているものではない。
【０１２３】
例１
この例は、標識ＤＮＡを作るためのステップおよび試薬を説明する。
規則正しいＤＮＡにより標識ＤＮＡを並べる模範的手順：
【０１２４】
１．所望のテンプレートを、ｄＮＴＰのスタンダード混合物と３０サイクル、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。
試薬：
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs (NEB), Beverly, MA、カタログ番号 MO267）
ｄＮＴＰ：５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０ｍＭの総ＮＴＰ濃度（NEB、カタログ番号N0447）
ＮＥＢ供給の緩衝液、超純水。
ＰＣＲプライマー、ZSDp200F (TTATCAATTCACGAAACTGC；配列番号：１）およびZSDp200R（AATGCACCTTCTAATAATAC；配列番号：２）、５０μＭ貯蔵濃度。プライマーは、Operon Biotechnologies, Huntsville ALにより生産された［ZSDp200F（52-336-000）およびZSDp200R（52-336-000）］。
注意：異なる実験において、別の組のＰＣＲプライマーを使った。ＺＳＤｐ２００ＦおよびＺＳＤｐ２００Ｒの組合せから、アルドラーゼ遺伝子配列から増幅させた２００ｂｐ以下の生成物（配列番号：３）を得た。別のプライマー対から、約１０００ｂｐの生成物を得た。
【０１２５】
プライマー「ZSDp200F」および「ZSDp200R」用のＰＣＲ条件
【表１】
2008508865.tif 000002
上記ミックスはより多量のＤＮＡ得るために１０倍に増やしてあるが、ＰＣＲ量を個別の試験管に反応あたり５０μｌに設定した。
【０１２６】
MJ Research（Waltham, MA、後にBio-Rad Laboratories (Hercules, CA)により買収された）のＰＴＣ−２００熱循環器を、以下のサイクル条件を行うために使った。アニーリング温度を、オリゴヌクレオチドプライマーにおける差異を基に最適化する必要がある。これらの条件を、これらのプライマーに対して最適化した。
１ｘ  −  ５分／９５℃
３０ｘ  −  ［４０秒／９５℃、４０秒／５５℃、１分／７２℃］
１ｘ  −  ７分／７２℃
【０１２７】
２．ＰＣＲ生成物を、緩衝液およびヌクレオチドを除去するためにスピンカラムを通過させた；ＰＣＲ生成物ＤＮＡが通過した。
試薬：
以下の２つの方法を使った。
Ａ：手製のスピンカラムを、Sephadex G75-50 Superfine (GE Healthcare、旧Amersham Biosciences/Pharmacia Biotech）を使って作った。ＰＣＲ混合物を樹脂に５秒間吸収させ、そして５，０００ｒｐｍの微小遠心で、室温で６０秒間回転させた。流れを収集した。おそらく、塩、プライマーおよび核酸以外種が樹脂に残った。
Ｂ：Qiagenカラムを、キット付属品（QIAquick Gel Extraction Kit #28704）と共に含まれるプロトコルの後にＰＣＲ生成物からヌクレオチドおよび緩衝剤を除去するのに使った。
【０１２８】
１．標識ＤＮＡおよび「スタンダード」ＤＮＡを比較するために、この時点のサンプルを２つの新しいＰＣＲ反応に分けた。サンプル１を基本的に上記のように設定したが、しかしながらテンプレートはより高い濃度だった。サンプル２について、ＰＣＲの１サイクルのみを、ヨウ素原子を有する一本鎖のみに標識されたＤＮＡを得るために行った（以下の試験管２）。
【表２】
2008508865.tif 000003
【０１２９】
代替のｄＮＴＰミックス：（ｄＣＴＰ＋ｄＵＴＰでの例）
貯蔵ｄＣＴＰ＋ｄＵＴＰミックスを、ストックｄＣＴＰは２０ｍＭ濃度であるため、それぞれ５ｍＭに設定した。代替のミックスは、スタンダードｄＡＴＰおよびｄＧＴＰの組合せを、ｄＴＴＰを交換した５−Ｉｏｄｏ  ｄＵＴＰおよびスタンダードｄＣＴＰを交換した５−Ｉｏｄｏ  ｄＣＴＰと一緒にしたものである。これらのヌクレオシド三リン酸類似体は市販されている。
５−Ｉｏｄｏ−ｄＣＴＰ
生産者：Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
製品番号：I-8361
５−Ｉｏｄｏ−ｄＵＴＰ
生産者：Trilink BioTechnologies, San Diego, CA
製品名：DUTP Iodinated
【０１３０】
４．増幅後、ＰＣＲ生成物を、新しいスピンカラムを通過させ、上記ステップ２のように、塩、取り込まれていないヌクレオチド、プライマーを除去した。カラムを通過するサンプルは解析できる状態にあった。
【０１３１】
注意：多数の他の重原子ｄＮＴＰ類似体が利用可能であり、それらはＤＮＡポリメラーゼと適合し、ＰＣＲ生成物に取り込むことができる。これらはｄＡＴＰのアルファ硫黄バージョン（例えば、ｄＡＴＰαＳ）を含む。上記手順における別の変形型は、両方の鎖を標識することである。図１０に示すようにＰＣＲの全３０サイクルにおいてヌクレオシド三リン酸類似体を含むことが可能であり、これは、ｄＡＴＰαＳおよび２−Ｉｏｄｏ−ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰの組合せにより行われた
【０１３２】
例２
この例は、基質の調製および核酸サンプルの調製した基質への付着を示す。
非晶質炭素で被覆した銅格子（製品番号01822または01822-F、供給元：Ted Pella, Inc.(Redding, CA)）を最初に、「無水」アセトン溶液に浸して２Åの分子ふるいに２４時間放置すことにより洗浄し、水の大部分を除去する。同じアセトン溶液を、全洗浄ステップにおいて使う。
そして格子を空気乾燥し、３分間プラズマ処理する。プラズマを、高出力ＲＦパルスを空気に真空下１〜４ｔｏｒｒで適用することにより発生させ、出力および時間を、その下の格子を破壊することなく親水性の表面を作るのに最適化した。プラズマ処理した格子は、著しい親水性の特徴を示した。
【０１３３】
これらの種類をシラン前駆体と直ぐに反応することができるヒドロキシ基に還元するために、格子をエタノール中５質量％のＮａＢＨ４の希釈液に５分間浸した。格子を３ＭのＨＣｌ酸性溶液上に浮かばせ、格子からのボラン中間体の解離を完了し、あらゆる残りの反応物質を中性化し、ヒドロキシ（−ＯＨ）末端の非晶質炭素薄膜を残した。
格子を、無水アセトンに１０〜１５間浸すことにより再び洗浄し、そして２％のビニルトリエトキシシラン（ＶＴＳ）のアセトン溶液に浮かばせた。おそらく、ＶＴＳは−ＯＨ末端と反応し、Ｓｉ−Ｏ−Ｃ結合を介して格子の表面にビニルシランを付着させたままにした。
【０１３４】
未反応のＶＴＳを別のアセトンに浸して除去した後、（濃縮の）原子的に標識した水中ＤＮＡの液滴を格子に落とし、蒸発させ、ビニル基との反応によりおよびその後の液滴の中心に向かってＤＮＡを並べる液滴の端の後退により原子的に標識したＤＮＡの格子への付着を通してコーミングをもたらす。
【０１３５】
例３
サンプル調製および電子線機器を使っての核酸分子の解析
１．原子的に標識したＤＮＡを、以下のように合成する：
・原子的に標識したｄＮＴＰを最後のサイクルのみで使って、一本鎖のみが原子的標識を有する二本鎖ＤＮＡを作る；
・原子的に標識したｄＮＴＰを全サイクルで使って、両方の鎖が標識原子を含有する二本鎖ＤＮＡを作る；および
・原子的に標識したｄＮＴＰを最後の２サイクルで使って、分子の半分が両方の鎖で標識され、半分が一本鎖で標識された二本鎖ＤＮＡ混合物を作る。
【０１３６】
２．分子を計数および測定するのに十分な解像度およびコントラストがある原子的に標識したＤＮＡ分子の画像を、電子線機器（ＴＥＭ）を使って以下のものから得た：
・両方の鎖が標識されている分子から；および
・一本鎖のみが標識されている分子から。
原子的に標識したＤＮＡ分子の代表的な画像を図１４に示す。画像において、原子的に標識したＤＮＡ分子は一般的に円形である。
【０１３７】
前述のものを以下の機器を用いて行った：
機器：
製造者：JEOL
本社所在地：日本国、196-8558  東京都昭島市武蔵野３丁目１−２
モデル：100S
設定：
加速電圧：80kV
直接倍率：40,000倍
総倍率（スコープおよびカメラ）：482,000倍
カメラシステムおよびソフトウェア：AMTカメラシステム
【０１３８】
アライメント手順：
Lab Manualからの標準アライメントプロトコルを使った。２のコンデンサ絞りを選択した；２の対物絞りを選択した；H.V. Wobblerを使わずむしろ手動で焦点を合わせた。
最終的な非点補正(stigmation)をＡＭＴカメラシステムで捉えたある画像に示された画像のＦＦＴ（高速フーリエ変換）を用いて手動で行った。
方法ステップ:
サンプルを、２０１ｂｐのＰＣＲ増幅生成物の原液から調製した。
サンプルは、およそ５０ｎｇ／μＬの標識ＤＮＡであった。ＰＣＲ合成を５−ｉｏｄｏ−ｄＣＴＰおよび５−ｉｏｄｏ−ｄＵＴＰ両方により行い、上に説明したように、塩基対あたり単一標識原子を提供した（すべてのピリミジンが標識されている）。
基質を、既述のように親水性を誘導するために、低圧プラズマに曝露した。０．８〜１．０μＬの液滴を処理した基質に落とし、上に説明したように室温でおよび室内圧力で蒸発させた。
【０１３９】
本発明の少なくとも一態様の数面について説明したことから、様々な交代、変更、および改善を当業者が想起することが認識される。かかる交代、変更，および改善は、この開示の一部であることを意図し、本発明の精神および範囲内であることを意図する。したがって、前述の説明および図面は一例としてのみである。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本発明の一態様による核酸ポリマーの同定、配列決定および／または検出システムを示す図である。
【図２】核酸分子の二本鎖部分を示す図である。
【図３】不対ヌクレオチドを示す詳細のある核酸分子の一本鎖部分を示す図である。
【図４】一本鎖への重合前の標識ｄＮＴＰの同不順の混合物を示す図である。
【図５】元の一本鎖核酸分子および標識相補鎖後重合を示す図である（明確化のために、結果として生じるらせん構造は省略）。
【図６】既に標識された鎖上に標識ｄＮＴＰを重合させることにより得られた二本鎖を示す図である（明確化のために、結果として生じるらせん構造は省略）。
【図７】片方または両方の鎖が標識されている、標識二本鎖から得られたらせん構造であり、ループおよび曲線になる可能性を示す図である。
【０１４１】
【図８Ａ】実質的に真っ直ぐになりおよびに基質付着した鎖の上面図である。
【図８Ｂ】実質的に真っ直ぐになりおよびに基質付着した鎖の断面図である。
【図９Ａ】格子パターンの基質に配置した局所的な結合部位の上面図である。
【図９Ｂ】格子パターンの基質に配置した局所的な結合部位の断面図である。
【図１０】基質状のサンプル一面に形成したかかる保護層を示す図である。
【図１１】検出する、および／または配列決定するおよび／または核酸ポリマーを同定するためのシステム一例を説明するブロック図である。
【図１２】汎用コンピュータシステムを説明するブロック図である。
【図１３】図１２の汎用コンピュータシステムの記憶システムを示す図である。
【図１４】例３に記したように標識ＤＮＡ鎖を示す顕微鏡写真のコピーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
2008508865.tif 000011
【図８Ｂ】
2008508865.tif 000012
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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