(57)【要約】【解決手段】  被験者の代謝疾患を検出するための方法が提供される。本方法は、前記被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、前記被験者は代謝疾患を有するものとして検出される。【選択図】  図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の代謝疾患を検出するための方法であって、
前記被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、
前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、
前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、前記被験者は代謝疾患を有するものとして検出される、方法。
【請求項２】
代謝疾患を早期に検出するための方法であって、
被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、
前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、
前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、前記被験者は代謝疾患を発展させ易い性質を有するものとして検出される、方法。
【請求項３】
代謝疾患を監視するための方法であって、
前記被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、
前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の脂質体の定量的特徴の値が閾値と有意に異なっているか否かを評価することによって、前記白血球の脂質体の前記定量的特徴を分析し、これによって代謝疾患を監視する、各工程を備える、方法。
【請求項４】
前記閾値は、コントロール群から採取された血液サンプルの白血球の脂質体の定量的特徴の閾値である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記閾値は、施行処置の後に前記被験者から採取された血液サンプルの白血球の脂質体の定量的特徴の閾値である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記施行処置は、物理的活動、栄養補給、時間の経過、医科治療、ダイエット又は絶食である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記定量的特徴は、脂質体面積、総脂質体面積、平均脂質体面積、中間脂質体面積、少なくとも１つの白血球内の最大脂質体面積、少なくとも１つの白血球内の最小脂質体面積、脂質体含有量、平均脂質体含有量、中間脂質体含有量、少なくとも１つの白血球内の最大脂質体含有量、少なくとも１つの白血球内の最小脂質体含有量、脂質体の数、脂質体の総数、脂質体の平均数、脂質体の中間数、少なくとも１つの白血球内の脂質体の最大数、少なくとも１つの白血球内の脂質体の最小数、脂質体の重量、脂質体の体積、脂質体のサイズ、脂質体の直径、脂質体の半径、又は、上記したものの組み合わせである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析工程は、前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の脂質体の前記定量的特徴の値を計算し、該値を前記閾値と比較する、各工程を備える、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記有意に異なっているとは、少なくとも約３０％の差異を示す、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記有意に異なっているとは、少なくとも４の因子の差異を示す、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
代謝疾患の防止又は治療に関してリガンドの効き目を評価するための方法であって、
前記リガンドを被験者に投与した後に、代謝疾患を有する該被験者から白血球を含む血液サンプルを採取し、
前記血液サンプルを検査システム内に導入し、
前記血液サンプルの前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、
前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が代謝疾患を有する治療されていない被験者の血液サンプルの白血球の脂質体の定量的特徴の値よりも低い場合、前記リガンドは代謝疾患の治療又は防止に効き目が有るものとして検出される、方法。
【請求項１２】
前記血液サンプルを検査システム内に導入する工程は、前記サンプルをサンプルコンテナ内に挿入する工程を備える、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質体は、前記血液サンプルの、好中球細胞、エオシン好性白血球、好塩基性球、リンパ球、単核白血球又はマクロファージの各集団内にある、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者は人間の被験者である、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験者は動物である、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記代謝疾患は、代謝病、代謝障害、アテローム性動脈硬化、グルコース過敏症、タイプＩＩの糖尿病、メタボリックシンドローム、インシュリン抵抗、前糖尿病、脂肪毒性、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪症、肥満、発作、心臓血管病、高脂肪血症、代謝疾患合併症、糖尿病合併症、糖尿病性網膜症、又は、糖尿病性腎障害である、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検査システムはＳＥＭである、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検査システムは顕微鏡、ＦＡＣＳ又はＥＬＩＳＡである、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
被験者の代謝疾患を分析するためのキットであって、
白血球を含む血液サンプルを挿入するためのサンプルコンテナと、
前記代謝疾患の存在を検出するように前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析するためのデータと、
を備える、キット。
【請求項２０】
前記データは、ペーパー又は電子シートに構築されている、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記データは、前記脂質体の前記定量的特徴の閾値を含み、前記代謝疾患の分析は、前記閾値を脂質体の定量的特徴の値と比較することにより実行される、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記定量的特徴は、脂質体面積、総脂質体面積、平均脂質体面積、中間脂質体面積、少なくとも１つの白血球内の最大脂質体面積、少なくとも１つの白血球内の最小脂質体面積、脂質体含有量、平均脂質体含有量、中間脂質体含有量、少なくとも１つの白血球内の最大脂質体含有量、少なくとも１つの白血球内の最小脂質体含有量、脂質体の数、脂質体の総数、脂質体の平均数、脂質体の中間数、少なくとも１つの白血球内の脂質体の最大数、
少なくとも１つの白血球内の脂質体の最小数、脂質体の重量、脂質体の体積、脂質体のサイズ、脂質体の直径、脂質体の半径、又は、上記したものの組み合わせである、請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記脂質体は、前記血液サンプルの、好中球細胞、エオシン好性白血球、好塩基性球、リンパ球、単核白血球又はマクロファージの各群内にある、請求項１９乃至２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記代謝疾患は、代謝病、代謝障害、アテローム性動脈硬化、グルコース過敏症、タイプＩＩの糖尿病、メタボリックシンドローム、インシュリン抵抗、前糖尿病、脂肪毒性、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪症、肥満、発作、心臓血管病、高脂肪血症、代謝疾患合併症、糖尿病合併症、糖尿病性網膜症、又は、糖尿病性腎障害である、請求項１９乃至２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
検査システムを備える、請求項１９乃至２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
前記検査システムはＳＥＭである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記被験者の前記代謝疾患の分析は、代謝疾患の検出、代謝疾患の診断、代謝疾患の早期検出、代謝疾患の防止若しくは治療のためのリガンドの効き目の評価、被験者の代謝疾患の悪化の監視、又は、被験者の代謝疾患の改善の監視のために実行される、請求項１９乃至２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システムに導入し、
前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備える方法。
【請求項２９】
白血球サンプルの脂質体の定量的特徴を計測するための方法であって、
被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システムに導入し、
前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、代謝疾患又は他の異常を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝疾患又は異常は、最も一般的な人間の慢性の病気及び合併症のうちの一つである。代謝疾患として、例えば、代謝病、代謝障害、アテローム性動脈硬化、グルコース過敏症、タイプＩＩの糖尿病、メタボリックシンドローム、インシュリン抵抗、前糖尿病、脂肪毒性、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪症、肥満、発作、心臓血管病、高脂肪血症、又は、例えば、糖尿病性網膜症若しくは糖尿病性腎障害若しくは、代謝病又は代謝傷害に属する他の危険な因子等の代謝疾患合併症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代謝疾患の病因は、包括的で環境の効果を含む多数の因子であると考えられる。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、血管内の血液の移動のための通路を狭める、血管壁内に形成された肥満沈殿物によって引き起こされる冠状動脈病である。これは、冠状動脈の究極的な妨害物を生じさせ、心臓発作をもたらし、アメリカ合衆国における早死の指折りの原因となっている。
【０００４】
脂肪肝は、肝臓の大滴性肝脂肪沈着により歴史的に特徴付けられた臨床条件の範囲を包含する。脂肪肝疾患の組織病理学的範囲は、単純な脂肪肝（脂肪症）から脂肪性肝炎、変わり易い程度の繊維症を有する肝炎の異型まで及んでいる。脂肪性肝炎は、漸進性であり、肝硬変、肝疾患、及び、肝細胞性癌へと導きかねず、原因不明の肝硬変の主要な原因となり得る。脂肪性肝臓疾患に関する共通の危険因子は、肥満、タイプＩＩ糖尿病、及び、高脂肪血症である。
【０００５】
タイプＩＩ糖尿病は、非常に一般的な人間の慢性疾患のうちの一つであり、アメリカ合衆国における大人人口のほとんど８％及び６５歳を超えた人の１９％に影響を及ぼしている。
【０００６】
メタボリックシンドロームは、例えば、冠状動脈病及び糖尿病等、様々な疾患に関する危険因子の集中的な発生である。例えば、アメリカ合衆国で生活している大人の２５％は、メタボリックシンドロームと診断される。メタボリックシンドロームの異常生理学は、インシュリン抵抗に関連していると考えられている。危険因子は、一般に、次の要素の蓄積として定義することができる。即ち、男では１０２ｃｍ以上、女では８８ｃｍ以上の高いウェスト環境、例えば１５０ｍｇ／ｄＬ以上の高いトリグリセリド、男では４０ｍｇ未満、女では５０ｍｇ／ｄＬ未満等の減少した高密度リポプロテイン、例えば１３０／８５ｍｍＨｇ以上の高い血圧、並びに、例えば１００ｍｇ／ｄＬ以上の高い絶食時グルコースである。メタボリックシンドロームは、他の危険因子を含み得ることが認められる。更には、危険因子は、様々な集団においてばらつき得る。
【０００７】
代謝疾患の多くは、トリグリセリドの蓄積及びインシュリン抵抗によって特徴付けられる。
例えば筋肉、肝臓及び膵臓組織等の様々な身体組織におけるトリグリセリドの蓄積は、代謝疾患の増大へと導く、組織特有のインシュリン抵抗の重要な因子であると考えられている。更には、脂質体という用語と同義である脂質液滴の蓄積は、組織において、インシュリン抵抗の形成時に早期に生じ、その過酷さと相関している。多数の科学的な論文は、筋肉組織内の脂質含有量を測定することによってインシュリン抵抗に関連する疾患の診断
のための方法を記載している（ケーリーＤＥ、グッドペスターＢＨ、及び、ストルリーンＬによる筋肉トリグリセリド及びインシュリン抵抗、アンヌレビューNutr 22:325-346、２００２；グッドペスターＢ及びケーリーＤ．スケレータル筋肉トリグリセリド、タイプＩＩの糖尿病における肥満誘導のインシュリン抵抗のマーカー又は媒介物、現在の糖尿病報告２：２１６−２２２，２００２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の実施例は、代謝疾患の存在及び過酷さを診断し、検出し、予測し及び／又は監視するための方法、並びに、代謝疾患を治療又は防止するためリガンドの効き目及び／又は効能を選別するための方法を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かくして、本発明の一実施態様に係る方法が提供され、該方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備える。
【００１０】
本発明の一実施態様によれば、白血球サンプルの脂質体の定量的特徴を計測するための方法が提供され、該方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システムに導入し、前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備える。
【００１１】
かくして、本発明の一実施態様によれば、被験者の代謝疾患を検出するための方法が提供され、該方法は、前記被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、前記被験者は代謝疾患を有するものとして検出される。
【００１２】
本発明の一実施態様によれば、代謝疾患を早期に検出するための方法が提供され、該方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、前記被験者は代謝疾患を発展させ易い性質を有するものとして検出される。
【００１３】
本発明の一実施態様によれば、代謝疾患を監視するための方法が提供され、該方法は、前記被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、前記被験者から採取された前記血液サンプルの前記白血球内の脂質体の定量的特徴の値が閾値と有意に異なっているか否かを評価することによって、前記白血球の脂質体の前記定量的特徴を分析し、これによって代謝疾患を監視する、各工程を備える。
【００１４】
本発明の一実施態様によれば、代謝疾患の防止又は治療に関してリガンドの効き目を評価するための方法が提供され、該方法は、前記リガンドを被験者に投与した後に、代謝疾患を有する該被験者から白血球を含む血液サンプルを採取し、前記血液サンプルを検査システム内に導入し、  前記血液サンプルの前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、前記血液サンプルの前記白血球内の前記脂質体の前記定量的特徴の値が代謝疾患を有する治療されていない被験者の血液サンプルの白血球の脂質体の定量的特徴の値よりも低い場合、前記リガンドは代謝疾患の治療又は防止に効き目が有るものとして検出される。
【００１５】
かくして、本発明の一実施態様によれば、被験者の代謝疾患を分析するためのキットが
提供され、該キットは、白血球を含む血液サンプルを挿入するためのサンプルコンテナと、前記代謝疾患の存在を検出するように前記白血球の脂質体の定量的特徴を分析するためのデータと、を備える。
【実施例】
【００１６】
次の説明では、本発明の様々な態様が記載される。説明の目的のため、特定の構成及び詳細な事項が、本発明の徹底した理解を提供するため記載されている。しかし、本発明は、本明細書で与えられた特定の詳細な事項無しに、実施することができることが当業者には明らかであろう。更には、周知した特徴は、本発明を不明瞭にしないため省略されたり或いは簡単化され得る。
【００１７】
本発明の実施例は、人間の被験者又は動物における例えば単核白血球群、好中球細胞群、エオシン好性白血球群、好塩基性球群、リンパ球群、又は、マクロファージ群等内におけるのような、白血球サンプル中の脂質体の検査によって代謝疾患又は異常を診断し検出するための非侵入式方法を提供することができる。
【００１８】
本発明の一実施例では、代謝疾患又は異常として、例えば、代謝病、代謝傷害、アテローム性動脈硬化、グルコース過敏症、タイプＩＩの糖尿病、メタボリックシンドローム、インシュリン抵抗、前糖尿病、脂肪毒性、脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪症、肥満、発作、心臓血管病、高脂肪血症、又は、例えば、糖尿病性網膜症若しくは糖尿病性腎障害若しくは、代謝病又は代謝傷害に属する他の危険な因子等の代謝疾患合併症が挙げられるが、これらの限定されるものではない。他の代謝疾患又は異常を検出及び／又は診断することもできる。
【００１９】
代謝疾患は、最も一般的な人間の慢性の病気のうちの一つである。この代謝疾患の病因は、包括的で環境の効果を含む多数の因子であると考えられる。
例えば筋肉、肝臓又は膵臓組織等の身体の様々な組織において脂質体という用語と同義である、トリグリセリド蓄積等の脂肪液滴の蓄積は、代謝疾患の増大へと導く、組織特有のインシュリン抵抗の重要な因子であると考えられている。新たなる証拠は、代謝疾患における病因事象として炎症の役割を示唆している。
【００２０】
かくして、炎症を起こした白血球における脂質体蓄積並びに代謝疾患の発展における炎症の役割を考慮すると、周囲の白血球及び単核好中球細胞等のマクロファージ内のトリグリセリド又はエイコサノイド等の蓄積などの脂質蓄積の定量的且つ形態学的特徴は、白血球サンプル中の１又は複数の脂質体の検査及び／又は計測により代謝疾患を分析するための非侵入式方法を提供することができるという仮説が成り立つ。
【００２１】
ここで、代謝障害又は異常を検出するための方法の一実施例の簡単化されたフローチャートである図１Ａを参照する。図１Ａに示されるように、ブロック１０では、白血球を含む血液サンプルを、検査システム内に挿入することができる。白血球中の脂質体の定量的特徴の分析を、ブロック１２に示されるように、実行することができる。ブロック１４に示されるように、定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、ブロック１６に示されるように代謝疾患を検出することができる。定量的特徴の値が閾値と大して異なっていない場合には、ブロック１８に示されるように、代謝疾患は、検出されないとすることができる。
【００２２】
図１Ａに記載された方法の実施例は、任意の適切な態様及び任意の適切な順序で実行することができることが認められる。他の作業を使用することもできる。
被験者において代謝疾患又は異常を検出し及び／又は診断するための本発明の一実施例に係る方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入
し、白血球中の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、被験者から採取された血液サンプル中の白血球内の脂質体の定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合、被験者は代謝疾患を有するものとして診断及び／又は検出される。
【００２３】
本発明の一実施例に係る方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、白血球中の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備えている。
【００２４】
本発明の一実施例に係る白血球中の脂質体の定量的特徴の計測のための方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、白血球中の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備えている。
【００２５】
本発明の一実施例に係る方法は、任意の適切な方法、典型的には静脈穿刺によって人間又は動物の被験者から全血サンプルを取得する工程を備えている。全血は、任意の適切な方法によって、例えば全血サンプルを保温し、かくして白血球部分を赤血球部分から概略分離させることによって、白血球を得るため分離される。取り出された白血球部分は、その後、遠心分離機にかけられる。白血球は、例えば、尿等の任意の適切な身体部分から採取されてもよいことが理解されよう。
【００２６】
例えば、フォルムアルデヒド、グルタラルデヒド等のアルデヒドの添加、メタノールの添加、三酸化オスミウム、又は、それらの組み合わせ等の任意の従来の固定方法を使用した分析のために、画像形成前に白血球を準備することができる。代替例として、事前の固定無しに、白血球のサンプルが分析され、画像形成することができる。
【００２７】
例えば、計測システム等の検査システム内のサンプルの検査によるなどの任意の適切な方法によって、分析を実行することができる。計測システムは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）等の電子顕微鏡、例えば、典型的にはナイルレッド染色、蛍光活動細胞分類手段（ＦＡＣＳ）又は酵素架橋免疫吸着剤分析評価（ＥＬＩＳＡ）を使用した共焦光顕微鏡、蛍光顕微鏡等の光顕微鏡などの、サンプルを測定するためのシステムであるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２８】
代替例として、分析は、例えば画像形成システム等の検査システムでサンプルを画像形成し、その後、人間の視覚化の間にサンプルを測定すること等によって任意の適切な方法を用いてサンプルを測定する、各工程を備えることができる。
【００２９】
脂質体の分析は、本発明の一実施例では、白血球サンプル中の脂質体の定量的特徴を測定する工程を備えている。
定量的特徴の測定の１つ又は複数の値を生じさせることは、被験者において、代謝疾患の存在又は過酷さを診断、検出又は予測するためのデータとして使用することができる。定量的特徴の値は、閾値と比較して有意に異なっている場合、被験者は、代謝疾患を有するか又は該代謝疾患を発展させることに影響を及ぼすものとして診断され及び／又は検出される。
【００３０】
「定量的特徴」という用語は、１つ又は複数の細胞内の脂質体の平均、中間又は総合した、脂質含有量、面積、体積、重量若しくは数等、１つ又は複数の細胞当たりの脂質体の最大若しくは最小である、脂質体含有量、面積、重量若しくは体積、及び／又は、１つ又は複数の細胞当たりの脂質体の最大若しくは最小数、或いは、直径若しくは半径等の任意の脂質体のサイズ、形態的な特徴、又は、それらの組み合わせ等の脂質体の任意の測定可能な特徴を表すことができるが、これらの例に限定されるものではないことが理解されよう。
【００３１】
脂質体含有量は、単一の脂質体若しくは複数の脂質体における総合した脂質体面積である。
本発明の一実施例では、測定された脂質体面積は、脂質体を画定する球状形状の大円内に拘束された表面の面積である。大円は、球の直径を備える球の区分として、通例、定義される。更には、測定された脂質体面積は、脂質体の断面積等、任意の適切な測定値であってもよい。
【００３２】
「有意に異なる」又は「有意な相違」という用語は、被験者から導出された血液サンプルの脂質体の定量的特徴と、コントロール群から導出された血液サンプルの脂質体の定量的特徴との間の任意の測定可能な差異を表すことができる。一実施例では、この差異は、約３０％以下であってもよい。代替例として、当該差異は、３０％、４０％、５０％、７０％、１００％以上の差異を表すことができる。加えて、当該差異は、コントロール群から導出された血液サンプルの脂質体の定量的特徴と比較した、被験者から導出された血液サンプルの脂質体の定量的特徴のうち約１．５、２、３、４、５又は６以上の因子の増大とすることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
有意な差異は、実質的な差異又はかなりの差異のいずれであってもよい。
例えば、人間又は動物の被験者からの白血球サンプル内の脂質体面積が、コントロール群から導出された白血球サンプル内の脂質体面積よりもかなり高い場合には、当該被験者は、代謝疾患を有するものとして診断及び／又は検出される。
【００３４】
なお、「コントロール群」という用語は、当該用途において、健康な被験者か、又は、１人以上の健康な被験者から導出され、計算されたデータへ参照される。被験者は、動物であっても人間であってもよい。
【００３５】
分析工程は、本発明の任意の実施例において、被験者から導出された血液サンプルにおける脂質体の定量的特徴を計算し、被験者からの血液サンプルの定量的特徴の結果値をコントロール群からの血液サンプルの定量的特徴の値と比較する、各工程を備える。
【００３６】
閾値は一定値であってもよく、例えば、被験者の脂質体面積が一定閾値より高い場合、被験者は、代謝疾患を有するものとして診断され及び／又は検出される。当該閾値は、様々に異なる集団及び／又は様々な異なる環境状況でばらつき得ると認められる。
【００３７】
加えて、例えば、コントロール群の被験者の統計的分布とは異なる、脂質体面積当たりの脂質体の数の統計的分布は、被験者が代謝疾患を持っていることを示すことができる。他の示唆的な統計的分布を、被験者における代謝疾患を診断し及び／又は検出するために使用することができる。
【００３８】
被験者から導出された白血球を含むサンプルの定量的特徴の分析と、施行処置後に被験者から導出された白血球を含むサンプルとの比較とからデータがもたらされ、施行処置に続いて被験者から導出された白血球を含むサンプルの脂質体の定量的特徴は、処置の施行前における被験者からの白血球サンプルの脂質体の定量的特徴と比較して、施行処置に従って、かなり高くなったり、低くなったりし得ることが更に理解されよう。
【００３９】
典型的には、「施行処置」という用語は、絶食、物理的な活動、栄養素補給、医療治療、又は、日から週若しくは月までの時間の差異等の時間の経過、又は、上記したものの組み合わせを指すことができる。
【００４０】
医療治療には、代謝疾患のための処置が含まれているが、これに限定されるものではな
い。任意の適切な施行処置を用いることができると認められる。
様々な施行処置は、脂質体の定量的特徴において様々に異なる反応を引き起こすことができると認められる。例えば、医療処置に続く人間又は動物の被験者からの白血球サンプルにおける脂質体の定量的特徴は、医療処置前に被験者から採取された白血球サンプルにおける脂質体の定量的特徴よりもかなり低くなり得ることが認められよう。
【００４１】
代替例として、例えば、処置の施行により引き起こされる被験者の脂質体の定量的特徴の値の増加は、処置の施行により引き起こされるコントロール群の脂質体の定量的特徴の値の増加よりもかなり高い場合、当該被験者は、代謝疾患を有するものとして診断及び／又は検出される。
【００４２】
一実施例に係る方法は、適切に施行された処置又は介入との被験者の適合性に従って被験者を階層化するため使用することができると認められる。
例えば、製剤の投与又はダイエット等のように施行された処置に続いて被験者群から導出された白血球サンプルの脂質体の定量的特徴を、被験者群のための代謝疾患の防止及び／又は治療における施行処置の適合性及び／又は効果を評価するように分析することができる。例えば、製剤の投与又はダイエットによって治療された人間被験者群から導出された血液サンプルの脂質液滴の数が、製剤の投与又はダイエットの前に人間被験者群から導出された血液サンプルの脂質液滴の数よりも小さい場合には、人間被験者の群は、適合可能であり及び／又は製剤又はダイエットにより治療されたものとして人間被験者群を階層化することができる。
【００４３】
更に加えて、１人又は複数人の被験者から導出された白血球サンプルの脂質体の定量的特徴の分析結果を、１人又は複数人の被験者にとって適切な治療のコースを決定するため１人又は複数人の被験者を階層化するように使用することができる。例えば、１人又は複数人の人間被験者から導出された血液サンプルの脂質液滴の数が閾値と有意に異なっている場合、１人又は複数人の被験者を、例えば、製剤又は特定のダイエットによる治療等の特定の治療コースに追従することができる１人又は複数人の被験者として階層化することができる。
【００４４】
分析工程は、本発明の任意の実施例において、被験者から導出された血液サンプルにおける脂質体の定量的特徴を計算し、被験者から導出された血液サンプルにおける脂質体の定量的特徴の結果としての値を、施行処置後に被験者から導出された血液サンプルにおける脂質体の定量的特徴の値と比較する、各工程を備えている。
【００４５】
白血球の成分を含む任意の脂質で分析を実行することができると認められる。
一実施例に係る方法は、被験体における代謝疾患又は異常の早期の検出及び／又は診断のために使用することができる。当該被験体は、次の例に限定するものではないが、肥満であるか又は代謝疾患の家族履歴を有して代謝疾患を発展させるリスクをかかえた人間被験者、又は代謝疾患を発展させる他の任意のリスクを有する人間被験者であり得る。本発明の一実施例では、被験体は、例えば、代謝疾患を発展させる傾向性を有するように遺伝的に治療された動物、又は、これに限定されるものではないが高肥満ダイエット食事を供給されることによって、代謝疾患を発展させる傾向性を誘導された動物等の動物であってもよい。
【００４６】
ここで、代謝疾患又は異常の早期検出のための方法の一実施例の簡単化されたフローチャートである図１Ｂを参照する。図１Ｂに示されるように、ブロック２０では、白血球を含む血液サンプルを検査システム内に挿入することができる。反応物における脂質体の定量的特徴の分析を、ブロック２２に示されるように実行することができる。ブロック２４に示されるように、定量的特徴の値が、閾値と有意に異なっている場合には、ブロック２
６に示されるように、代謝疾患を発展させ易い性質を検出することができる。定量的特徴の値が、閾値と大して異なっていない場合には、ブロック２８に示されるように、代謝疾患を発展させ易い性質が検出されないこととなる。
【００４７】
図１Ｂに記載された方法の実施例は、任意の適切な態様及び任意の適切な順序で実行することができることが理解されよう。他の作業を使用することができる。
代謝疾患又は異常の早期検出及び／又は診断のための本発明の一実施例に係る方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、白血球内の脂質体の定量的特徴を分析し、被験者から採取された該白血球内の脂質体の定量的特徴の値が閾値と有意に異なっている場合には、被験者が代謝疾患を発展させ易い性質を有するものとして検出される。
【００４８】
早期の検出及び／又は診断を、例えば、白血球サンプル内の脂質体の任意の定量的特徴を測定することによって実行することができる。
測定結果の１つ以上の値を、代謝疾患の早期検出及び／又は診断のためのデータとして使用することができる。
【００４９】
例えば、人間又は動物の被験者からの白血球サンプルにおける脂質体含有量が、コントロール群から導出された白血球サンプル内の脂質体含有量よりも高い場合、当該被験者は、代謝疾患を発展させやすい性質を有するものと検出される。
【００５０】
例えば、上述された差異及び閾値等の、有意な差異又は閾値の任意の適切な値を用いることができることが理解されよう。更に加えて、定量的特徴の任意の適切な表現を、上述のように用いることができる。
【００５１】
上述したように、被験者から導出された白血球含有サンプルの定量的特徴の値を、施行処置の後の被験者から導出された白血球含有サンプルの定量的特徴の値と比較することによりデータを生じさせることができることが更に理解されよう。
【００５２】
ここで、代謝疾患又は異常の防止又は治療のためのリガンドの効き目及び／又は効能を評価するための方法の実施例の簡単なフローチャートである図１Ｃを参照する。図１Ｃに示されるように、ブロック３０では、リガンドが被験者に投与される。ブロック３２では、白血球を含む血液サンプルが被験者から採取される。ブロック３４では、血液サンプルを検査システム内に挿入することができる。ブロック３６に示されるように、白血球内の脂質体の定量的特徴の分析を実行することができる。ブロック３８に示されるように、定量的特徴の値が治療していない被験者から導出された定量的特徴の値よりも低い場合、ブロック４０に示されるように、リガンドは、代謝疾患治療に効き目有り即ち有効であるとされる。定量的特徴の値が治療していない被験者から導出された定量的特徴の値よりも大して低くない場合、ブロック４２に示されるように、リガンドは、代謝疾患治療に効き目無し即ち無効果であるとされる。
【００５３】
図１Ｃに記載された方法の実施例は、任意の適切な態様及び任意の適切な順序で実行することができることが理解されよう。他の作業も使用することができる。
一実施例に係る方法は、代謝疾患又は異常の防止又は治療のためのリガンドの効果及び／又は効能を評価するために使用することができ、該方法は、被験者へのリガンドの投与の後で代謝疾患を持つ被験者から白血球を含む血液サンプルを採取し、該血液サンプルを検査システム内に導入し、血液サンプルの白血球内の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、当該血液サンプルの白血球内の脂質体の定量的特徴の値が、代謝疾患を持ち、治療していない被験者の血液サンプルの白血球内の脂質体の定量的特徴の値よりも低い場合、当該リガンドは、代謝疾患の防止又は治療のためのリガンドに効能有りと検出され
る。
【００５４】
リガンドは、例えば、化学試薬、核酸、薬剤、核酸、リボゾーム、ＲＮＡ、抗体、ププチド、又は、化合物であってもよい。リガンドは、例えば、代謝疾患を治療するための可能な薬剤候補又は先導成分若しくは分子とすることができる。
【００５５】
リガンドの評価は、例えば、白血球サンプル内の脂質体の定量的特徴を測定することによって、実行することができる。白血球サンプルは、人間の被験者又は動物から導出されたサンプルであってもよい。
【００５６】
測定結果の１つ以上の値を、代謝疾患の防止又は治療のためのリガンドの効き目及び／又は効能を評価するためのデータとして使用することができる。
例えば、代謝疾患を持つ治療していない被験者又は代謝疾患を持つ動物モデルからの白血球サンプルの脂質体面積が、リガンドを投与された代謝疾患を持つ被験者から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積よりも大きい場合、当該リガンドは、代謝疾患の治療又は防止にとって効き目があり及び／又は有効であると検出される。
【００５７】
代替例として、代謝疾患が誘発される前にリガンドが投与された被験動物からの白血球サンプルの脂質体面積の値が、代謝疾患の誘発後に被験動物から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積の値にほぼ等しい場合、リガンドは、代謝疾患の治療又は防止にとって効き目があり及び／又は有効であると検出される。被験者から導出された白血球含有サンプルの定量的特徴を、被験者にリガンドを投与した後の被験者から導出された白血球含有サンプルの定量的特徴の値とを比較することによりデータをもたらすことができることが更に認められる。
【００５８】
上述した差異即ち閾値等のような、有意な差即ち閾値の任意の適切な値を用いることができることが理解されよう。加えて、定量的特徴の任意の適切な表現を、上述されたように用いることができる。
【００５９】
一実施例に係る方法は、代謝疾患を監視するため使用することができる。被験者は、代謝疾患を有する人間の被験者又は被験動物のいずれであってもよい。
ここで、被験者の代謝疾患又は異常を監視するための方法の一実施例の簡単なフローチャートである図１Ｄを参照する。図１Ｄに示されるように、ブロック５０では、被験者から導出された白血球を含む血液サンプルが検査システムに挿入される。ブロック５２に示されるように、白血球内の脂質体の定量的特徴の分析を実行することができる。ブロック５４に示されるように、定量的特徴の値が閾値よりも有意に高い場合、ブロック５６に示されるように、被験者の代謝疾患が劣化した可能性がある。定量的特徴の値が閾値よりも大して高くない場合、ブロック５８に示されるように、被験者の代謝疾患は改善されたか又は変化していない可能性がある。
【００６０】
図１Ｄに記載された方法の実施例は、任意の適切な態様及び任意の適切な順序で実行することができることが理解されよう。他の作業も使用することができる。
代謝疾患又は異常を監視するための一実施例に係る方法は、被験者から採取された白血球を含む血液サンプルを検査システム内に導入し、被験者から採取された血液サンプルの白血球内の脂質体の定量的特徴の値が閾値と有意に異なっているか否かを評価することによって、血液サンプルの白血球内の脂質体の定量的特徴を分析する、各工程を備え、これによって代謝疾患を監視する。
【００６１】
監視工程は、例えば、白血球サンプル内の脂質体の定量的特徴を測定することによって実行することができる。
定量的特徴の測定結果の１つ以上の値を、例えば代謝疾患を監視するためのデータとして使用することができる。定量的特徴の値は、代謝疾患を監視するため所定の閾値と比較することができる。
【００６２】
例えば、被験者への施行処置の前に被験者から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積の値が、被験者への施行処置の後に被験者から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積の値よりも有意に高い場合、代謝疾患を有する被験者における改善が監視される。
【００６３】
施行処置は、例えば、数日、数週間又は数ヶ月の経過等の時間の進行を含む、上述されたような任意の適切な処置であってもよい。時間の進行前に、被験者から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積の値が、時間の経過の後に被験者から導出された白血球サンプルにおける脂質体面積の値よりも有意に異なり、例えば高い場合、代謝疾患を有する被験者における改善が検出される。
【００６４】
上述した差異即ち閾値等のような、有意な差即ち閾値の任意の適切な値を用いることができることが理解されよう。加えて、定量的特徴の任意の適切な表現を、上述されたように用いることができる。
【００６５】
なお、他の従来方法を用いて得られたデータは、代謝疾患分析のため上述された実施例における定量的特徴の値を含むデータと連結して使用することができる。例えば、脂質体の数及び絶食時のグルコースのレベルを、代謝疾患の早期検出及び／又は診断のため一緒に使用することができる。
【００６６】
後述される例では、脂質体は、サンプルコンテナを使用し、ピペットを使って該サンプルコンテナの膜に白血球サンプルを取り付ける走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で画像形成された。
【００６７】
サンプルコンテナは、例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００３／００１０５４号に記載され、ＷＯ／２００４／０７５２０９号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５７号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４８号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５４号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４６号として公開された実施例に開示されたＳＥＭ互換性サンプルコンテナ等のサンプルコンテナであってもよい。これらの特許文献の全体的な内容は、ここで参照したことにより本願に組み込まれる。膜は、例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００３／００１０５４号に記載され、ＷＯ／２００４／０７５２０９号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５７号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４８号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５４号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４６号として公開された実施例に開示されたＳＥＭ互換性サンプルコンテナの膜等の膜であってもよい。これらの特許文献の全体的な内容は、ここで参照したことにより本願に組み込まれる。ピペットは、例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ２００３／００１０５４号に記載され、ＷＯ／２００４／０７５２０９号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５７号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４８号として公開され、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００４５４号に記載され、ＷＯ０３／１０４８４６号として公開された実施例に開示されたピペット等のピペットであってもよい。これらの特許文献の全体的な内容は、ここで参照したことにより本願に組み込まれる。他の適切な膜、コンテナ及びピペットを使用することもできる。
【００６８】
ＳＥＭのサンプルコンテナ内の白血球サンプルの検査は、サンプルの異なる領域の間の材料組成における相違を暴露することができる。例えば、電子後方散乱の効率は、構成原
子の原子番号（Ｚ）に依存している。かくして、ほとんど炭素から構成されたサンプルの脂質の豊富な領域は、ほとんど酸素から構成された水性領域から区別することができる。別の実施例では、重原子を含む物質を、従来の方法を使用してサンプルを染色し、サンプルの構成要素の間の追加のコントラストを提供するために使用することができる。
【００６９】
かくして、本方法の実施例は、代謝疾患のための分析ツールを提供することができる。該分析ツールは、複数の目的、例えば、代謝疾患又は異常の早期検出及び／又は診断、代謝疾患のための診断生体マーカー、例えば、臨床研究及び患者における前臨床研究での体重損失ダイエットの薬剤治療又は投与などの治療監視、代謝疾患の進行の監視、代謝疾患を持つ被験者の悪化状態の監視、ターゲットの同定、ターゲット認可のため分析ツールを提供することによる薬剤開発の援助、最適化へと導くように見つけられるインヒビタ及びモデュレータ等の薬剤のスクリーニング、並びに、動物研究と患者の階層化及び分類化など、複数の目的のために用いることができる。
【００７０】
分析ツールは、例えば、白血球含有血液サンプルを挿入するためのサンプルコンテナと、被験者の代謝疾患を分析するように脂質体の定量的特徴の分析のためのデータと、を備える人間被験者又は被験動物の代謝疾患分析のためのキットの形態で提供されてもよい。当該データは、脂質体の定量的特徴の閾値であってもよく、代謝疾患分析は、閾値を脂質体の定量的特徴の値と比較することによって実行される。
【００７１】
定量的特徴は、上述されたように、例えば、脂質体領域、総脂質体面積、平均脂質体面積、中間の脂質体面積、少なくとも１つの白血球における最大脂質体面積、少なくとも１つの白血球における最小脂質体面積、脂質体含有量、平均脂質体含有量、中間の脂質体含有量、少なくとも１つの白血球における最大脂質体含有量、少なくとも１つの白血球における最小脂質体含有量、脂質体の数、脂質体の総数、脂質体の平均数、脂質体の中間数、少なくとも１つの白血球における最大脂質体数、少なくとも１つの白血球における最小脂質体数、脂質体の重量、脂質体の体積、脂質体のサイズ、脂質体の直径、脂質体の半径、又は、前述したものの組み合わせのいずれであってもよい。
【００７２】
更に加えて、コントロール群被験者の統計的分布とは異なっている脂質体当たりの脂質体の数の統計的分布は、代謝疾患分析のために用いることができる。更には、施行処置の後に続く、被験者の統計的分布とは異なっている脂質体当たりの脂質体の数の統計的分布は、上述されたように、代謝疾患分析のために用いることができる。他の任意に示される統計的分布も、被験者の代謝疾患を分析するため使用することができる。
【００７３】
上述されたように、分析は、例えば、形態システムにおける画像形成により任意の適切な態様で実行することができる。例えば、画像分析ソフトウェア等の画像分析機能を提供することができる。
【００７４】
当該キットは、例えば上述されたように、代謝疾患防止又は治療に関するリガンドの効き目を評価するか又は代謝疾患に関する被験者の悪化状態を監視する、代謝疾患の検出及び／又は診断、代謝疾患の早期検出及び／又は診断等の任意の適切な目的のために使用することができる。
【００７５】
ここで、一実施例に従って構成され、作動するキット１００の簡単な図である図２Ａを参照する。図２Ａに示されるように、キット１００は、白血球を含む血液サンプルを挿入するためのサンプルコンテナ１０４を備えている。ペーパー１１０には、代謝疾患の存在を検出するように、脂質体の定量的特徴の分析のためのデータ１２０を有する使用説明指令が記載されていてもよい。
【００７６】
ここで、一実施例に従って構成され、作動するキット２００の簡単な図である図２Ｂを参照する。図２Ｂに示されるように、キット２００は、白血球を含む血液サンプルを挿入するためのサンプルコンテナ２０４を備えている。サンプルコンテナ２０４は、図２Ａのサンプルコンテナ１０４と同一であってもよい。指令は、コンピュータ２１４のディスプレイ２１２の電子シート２１０に表示されてもよく、又は、例えばハードディスク若しくは電子メモリ（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ等）等のメモリデバイスに記憶されてもよい。電子シート２１０は、代謝疾患の存在を検出するように、脂質体の定量的特徴の分析のためのデータ２２０を表示することができる。
【００７７】
データは、例えば電話を介したデータの送信による等、任意の適切な態様で与えられ、提供されてもよいことが理解されよう。図２Ａ及び図２Ｂのデータ１２０及び２２０は、例えば上述されたような、脂質体の定量的特徴の値、閾値、グラフ及び統計的分析などの、脂質体の定量的特徴の分析のための任意の適切なデータを備えていてもよい。
【００７８】
データは、例えば定量的特徴の値のリストとして、任意の適切な形態で提供されてもよい。
図２Ａ及び図２Ｂのキット１００及び２００は、上述されたような、任意の適切なサンプルコンテナを備えていてもよい。
【００７９】
健康な人間の被験者（Ａ）及び代表的なメタボリックシンドローム患者（Ｂ）の好中球含有サンプルの各々の顕微鏡写真である、図３（Ａ及びＢ）で理解することができるように、メタボリックシンドローム患者から採取されたサンプル中の脂質含有量は、健康な被験者から採取されたサンプルの脂質含有量よりも有意に大きい。図３Ｂ（メタボリックシンドローム患者）で理解することができるように、おおよそ２つの脂質体（明るいスポット）を見ることができる図３Ａ（健康な人間の被験者）と比較して、明るいスポットとして細胞の周囲から区別された、有意により大きい数の脂質体、約１３もの脂質体が存在している。更には、図３Ｂ（メタボリックシンドローム患者）における脂質体面積の平均サイズは、平均の脂質体面積が約０．５μｍ２である図３Ａ（健康な人間の被験者）と比較して、有意に大きい約１．５μｍ２となっていることを理解することができる。
【００８０】
同様に、健康な人間の被験者（Ａ）及び代表的なメタボリックシンドローム患者（Ｂ）の単核白血球含有サンプルの各々の顕微鏡写真である、図４（Ａ及びＢ）において、メタボリックシンドローム患者から採取されたサンプル中の脂質含有量は、健康な被験者から採取されたサンプルの脂質含有量よりも有意に大きいことを理解することができる。図４Ｂ（メタボリックシンドローム患者）で理解することができるように、脂質体が見られない図４Ａ（健康な人間の被験者）と比較して、有意により大きい数の脂質体（明るいスポット）、約８もの脂質体が存在している。
（例１）
全血サンプルは、２人の健康な人間の被験者群と２人のメタボリックシンドローム患者群とから採取された。全血サンプルは、１２時間絶食した後に、各人間の被験者から採取された。
（実験処置）
全血サンプルは、クエン酸ナトリウムの溶液を含む管内に収集された。各人間の被験者から全血サンプルを引き抜いた後の４時間で、約１ミリリットルの全血が、３３５マイクロリットルのデキストラン溶液と混合され、約３０分間に亘って約３７℃の温度で保温された。デキストラン溶液は、６％のデキストランと、３％のグルコースと、０．９％のＮａＣｌと、を含み、全血サンプルとの混合前に約−２０℃の温度で格納された。
【００８１】
保温後に、全血サンプルは、赤血球部分と白血球部分とに分離された。約３３５マイクロリットルの白血球部分が赤血球部分から取り出され、０．８９ｍＭのカルシウムと０．
４９ｍＭのマグネシウムを含む約１ミリリットルのリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）が該白血球部分に添加された。その結果生成された白血球サンプルは、約１０分間に亘って約１５００ｒｐｍの速度で遠心分離機にかけられた。その後、その結果として生成された浮遊物が白血球サンプルから除去された。０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約１５０マイクロリットルのＰＢＳが該白血球サンプルに添加された。その結果生成された溶液から約５０マイクロリットルが取り出され、０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約７５０マイクロリットルのＰＢＳで希釈された。
【００８２】
１５マイクロリットルの白血球サンプルを含む、生成された溶液の一部分が、ピペットを使用してサンプルコンテナの膜に付着され、次に約１５分間に亘って室温で保温された。
【００８３】
その後、白血球サンプルが、室温で約３０分間に亘って、ＰＢＳ溶液で希釈された、２％のパラフォルムアルデヒドと０．１％のグルタアルデヒドとの溶液と混合された。次に、白血球サンプルは、ＰＢＳ溶液で４回洗浄され、再蒸留水で４回洗浄された。
【００８４】
サンプルコンテナ内の白血球サンプルの画像形成前に、白血球サンプルは、室温で約３０分間に亘って０．５％のＯｓＯ４を含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。白血球サンプルは、室温で約５分間に亘って０．５％のウラニルアセテートを含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。
（実験結果）
図５で理解することができるように、健康な人間被験者群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、０．４５７の標準偏差で約５．６６である。メタボリックシンドロームの患者群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、０．９６の標準偏差で約８．８８である。好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、健康な人間被験者群よりもメタボリックシンドロームの患者群の方が有意に高いことを理解することができる。これに対応して、健康な人間被験者群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．８４μｍ２の標準偏差で約０．７４μｍ２であり、メタボリックシンドロームの患者群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０１６μｍ２の標準偏差で約１．９７３μｍ２である。好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、健康な人間被験者群よりもメタボリックシンドロームの患者群の方が有意に高いことを理解することができる（図６）。
【００８５】
図７で理解することができるように、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．４１の標準偏差で約２．０９である。メタボリックシンドロームの患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．３７の標準偏差で約４．５６である。単核細胞当たりの脂質体の平均数は、健康な人間被験者群よりもメタボリックシンドロームの患者群の方が有意に高いことを理解することができる。これに対応して、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０６４μｍ２の標準偏差で約０．１６１μｍ２であり、メタボリックシンドロームの患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０７１μｍ２の標準偏差で約０．４４４μｍ２である。単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、健康な人間被験者群よりもメタボリックシンドロームの患者群の方が有意に高いことを理解することができる（図８）。
（例２）
全血サンプルは、２人の健康な人間の被験者群と２人のタイプＩＩ糖尿病患者群とから、１２時間絶食後、該１２時間絶食後に７５グラムのデキストロースを含む高いグルコースの食事を取った後、１時間、１．５時間、２時間及び２．５時間経過してから採取された。
（実験処置）
全血サンプルは、クエン酸ナトリウムの溶液を含む管内に収集された。各人間の被験者から全血サンプルを引き抜いた後の４時間で、約１ミリリットルの全血が、３３５マイクロリットルのデキストラン溶液と混合され、約３０分間に亘って約３７℃の温度で保温された。デキストラン溶液は、６％のデキストランと、３％のグルコースと、０．９％のＮａＣｌと、を含み、全血サンプルとの混合前に約−２０℃の温度で格納された。
【００８６】
保温後に、全血サンプルは、赤血球部分と白血球部分とに分離された。約３３５マイクロリットルの白血球部分が赤血球部分から取り出され、０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約１ミリリットルのリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）が該白血球部分に添加された。その結果生成された白血球サンプルは、約１０分間に亘って約１５００ｒｐｍの速度で遠心分離機にかけられた。その後、その結果として生成された浮遊物が白血球サンプルから除去された。０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約１５０マイクロリットルのＰＢＳが該白血球サンプルに添加された。その結果生成された溶液から約５０マイクロリットルが取り出され、０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約７５０マイクロリットルのＰＢＳで希釈された。
【００８７】
１５マイクロリットルの白血球サンプルを含む、生成された溶液の一部分が、ピペットを使用してサンプルコンテナの膜に付着され、次に約１５分間に亘って室温で保温された。
【００８８】
その後、白血球サンプルが、室温で約３０分間に亘って、ＰＢＳ溶液で希釈された、２％のパラフォルムアルデヒドと０．１％のグルタアルデヒドとの溶液と混合された。次に、白血球サンプルは、ＰＢＳ溶液で４回洗浄され、再蒸留水で４回洗浄された。
【００８９】
サンプルコンテナ内の白血球サンプルの画像形成前に、白血球サンプルは、室温で約３０分間に亘って０．５％のＯｓＯ４を含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。白血球サンプルは、室温で約５分間に亘って０．５％のウラニルアセテートを含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。
（実験結果）
図９で理解することができるように、１２時間絶食した後の健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．０１６５の標準偏差で約２．６２０２である。１２時間絶食した後の糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１５０７の標準偏差で約５．４４である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後１時間において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１６９８の標準偏差で約２．０４である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１６９８の標準偏差で約２．０４である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１３４１の標準偏差で約４．５３である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１．５時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１０８４の標準偏差で約１．５４である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１．５時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．６４１４の標準偏差で約２．３６である。
【００９０】
１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１１
４９の標準偏差で約１．６３である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．３８９の標準偏差で約３．３９である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２．５時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１７８８の標準偏差で約１．１７である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２．５時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均数は、０．１４の標準偏差で約３．８１である。単核細胞当たりの脂質体の平均数は、健康な人間被験者群よりも糖尿病の患者群の方が有意に高いことを理解することができる。脂質体の数の揺らぎは、高いグルコースの食事を取った後の様々な時間で示されており、糖尿病患者群における脂質体数の範囲に関わらず、糖尿病患者群における脂質体数は、健康な被験者群の脂質体数よりも有意に高くなっている。
【００９１】
上記に対応して、１２時間絶食した後の健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０４μｍ２の標準偏差で約０．２３μｍ２である。１２時間絶食した後の糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０２２７μｍ２の標準偏差で約０．５２μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０６１５μｍ２の標準偏差で約０．２μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０１２１μｍ２の標準偏差で約０．４８μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１．５時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０２０４μｍ２の標準偏差で約０．１３μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の１．５時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０８０５μｍ２の標準偏差で約０．２μｍ２である。
【００９２】
１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０２２８μｍ２の標準偏差で約０．１３μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．１１８μｍ２の標準偏差で約０．３３μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２．５時間経過後において、健康な人間被験者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０１１４μｍ２の標準偏差で約０．１１μｍ２である。１２時間絶食した後に高いグルコースの食事を取った後の２．５時間経過後において、糖尿病患者群における白血球サンプルの単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．０６９７μｍ２の標準偏差で約０．３７μｍ２である。単核細胞当たりの脂質体の平均面積は、健康な人間被験者群よりも糖尿病の患者群の方が有意に高いことを理解することができる。脂質体の面積の揺らぎは、高いグルコースの食事を取った後の様々な時間で示されており、糖尿病患者群における脂質体面積の値の範囲に関わらず、糖尿病患者群における脂質体面積は、健康な被験者群の脂質体面積よりも有意に高くなっている（図１０）。
【００９３】
脂質体数及び脂質体面積の値は、２人の健康な人間の被験者群及び２人の糖尿病患者群の絶食グルコーステストの結果に対応している。２人の健康な人間の被験者群及び２人の糖尿病患者群の絶食グルコースの各々の値は、９０ｍｇ／Ｌ、９１ｍｇ／Ｌ、１４７ｍｇ／Ｌ及び１８２ｍｇ／Ｌであり、人間被験者を糖尿病として診断するための閾値は、約１００ｍｇ／ｄＬである。
（例３）
全血サンプルは、３匹のコントロールマウス群と３匹のアテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ欠損マウス群とから採取された。
（実験処置）
全血サンプルは、エチレンジアミン四酢酸の溶液を含む管内に収集された。全血を引き抜いた後の１時間で、約３００ミリリットルの全血が、９００マイクロリットルの赤血球分解溶液と時折攪拌して混合された。
【００９４】
赤血球分解溶液は、ＵＳＡ、ＭＮ５５４４１、ミネソタポリス、シュート１２０、アベニューＮ、１０番地１３３５５で、ジェントラ入ステムから商品名ＰＵＲＧＥＮＥで市販されている。
【００９５】
保温後に、全血サンプルは、約５分間に亘って約１２００ｒｐｍの速度で遠心分離機にかけられた。その後、その結果として生成された浮遊物がサンプルから除去され、よって白血球を含む部分が残り、白血球サンプルを形成した。０．８９ｍＭのカルシウムと０．４９ｍＭのマグネシウムを含む約１００マイクロリットルのＰＢＳが該白血球サンプルに添加された。
【００９６】
１５マイクロリットルの白血球サンプルを含む、溶液の一部分が、ピペットを使用してサンプルコンテナの膜に付着され、次に約６０分間に亘って室温で保温された。
その後、白血球サンプルが、室温で約３０分間に亘って、ＰＢＳ溶液で希釈された、２％のパラフォルムアルデヒドと０．１％のグルタアルデヒドとの溶液と混合された。次に、白血球サンプルは、ＰＢＳ溶液で４回洗浄され、再蒸留水で４回洗浄された。
【００９７】
サンプルコンテナ内の白血球サンプルの画像形成前に、白血球サンプルは、室温で約３０分間に亘って０．５％のＯｓＯ４を含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。白血球サンプルは、室温で約５分間に亘って０．５％のウラニルアセテートを含む溶液で染色された。次に、白血球サンプルは再蒸留水で４回洗浄された。
（実験結果）
図１１で理解することができるように、コントロールマウス群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、０．０３１４の標準偏差で約０．８３であり、ＡｐｏＥ欠損マウス群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、１．７０１の標準偏差で約６．６８である。好中球細胞当たりの脂質体の平均数は、コントロールマウス群よりもＡｐｏＥ欠損マウス群の方が有意に高いことを理解することができる。これに対応して、コントロールマウス群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．００４３μｍ２の標準偏差で約０．０６μｍ２であり、ＡｐｏＥ欠損マウス群における白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、０．２５５μｍ２の標準偏差で約０．６７１μｍ２である。好中球細胞当たりの脂質体の平均面積は、コントロールマウス群よりもＡｐｏＥ欠損マウス群の方が有意に高いことを理解することができる（図１２）。
【００９８】
コントロールマウス群とアテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ欠損マウス群とから採取された白血球サンプルの、好中球細胞当たりの脂質体の平均数対好中球細胞当たりの脂質体の平均面積の統計的分布である図１３を参照すると、ＡｐｏＥ欠損マウス群の統計的分布はコントロールマウス群統計的分布とは異なっていることを理解することができる。
【００９９】
上述された例１乃至３において、測定された脂質体面積は、脂質体を画定する球状形状の大円内に拘束された表面の面積である。
本発明は、特別に図示され、上述されたように説明されたものによって限定されるもの
ではないことが当業者には認められよう。本発明の範囲は、上述された様々な特徴並びに本明細書を読むとき当業者に想到される従来技術内にはない変形及び変更の組み合わせ及び副次的な組み合わせの両方を網羅する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一実施例に係る方法の簡単化されたフローチャートを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の一実施例に係る方法の簡単化されたフローチャートを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の一実施例に係る方法の簡単化されたフローチャートを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の一実施例に係る方法の簡単化されたフローチャートを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の一実施例に従って構成され、動作するキットの簡単な図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の一実施例に従って構成され、動作するキットの簡単な図である。
【図３】図３（Ａ及びＢ）は、代表的な健康な人の被験者（Ａ）及び代表的なメタボリックシンドロームの患者（Ｂ）の好中性球含有サンプルの顕微鏡写真である。
【図４】図４（Ａ及びＢ）は、代表的な健康な人間の被験者（Ａ）及び代表的なメタボリックシンドロームの患者（Ｂ）の単核白血球含有サンプルの顕微鏡写真である。
【図５】図５は、１２時間絶食した後の、２人の健康な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数のグラフである。
【図６】図６は、１２時間絶食した後の、２人の健康的な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面線のグラフである。
【図７】図７は、１２時間絶食した後の、２人の健康的な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された単核白血球細胞当たりの脂質体の平均数のグラフである。
【図８】図８は、１２時間絶食した後の、２人の健康的な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された単核白血球細胞当たりの脂質体の平均面積のグラフである。
【図９】図９は、１２時間絶食したとき、並びに、１２時間絶食した後に高いグルコースの食事に続いて１、１．５時間、２時間及び２．５時間経過した後における、２人の健康的な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された単核白血球細胞当たりの脂質体の平均数のグラフである。
【図１０】図１０は、１２時間絶食したとき、並びに、１２時間絶食した後に高いグルコースの食事に続いて１、１．５時間、２時間及び２．５時間経過した後における、２人の健康的な人間の被験者及び２人のメタボリックシンドロームの患者から採取された単核白血球細胞当たりの脂質体の平均面積のグラフである。
【図１１】図１１は、３匹のコントロールマウス群及び３匹のアテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ欠損マウスから採取された白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数のグラフである。
【図１２】図１２は、３匹のコントロールマウス群及び３匹のアテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ欠損マウスから採取された白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均面積のグラフである。
【図１３】図１３は、３匹のコントロールマウス群及び３匹のアテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ欠損マウスから採取された白血球サンプルの好中球細胞当たりの脂質体の平均数対好中球細胞当たりの脂質体の平均面積の統計的な分布のグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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