(57)【要約】  慢性疼痛を治療及び／又は予防するための医薬の製造のための、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる、特にTrkAの生物活性を遮断することができる抗TrkA抗体の使用。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性疼痛を治療及び／又は予防するための医薬の製造のための、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用。
【請求項２】
前記抗体がTrkAの生物活性を遮断することができる、請求項1記載の使用。
【請求項３】
前記抗体軽鎖の可変領域が、配列番号1のアミノ酸24〜アミノ酸33；配列番号1のアミノ酸49〜アミノ酸55；配列番号1のアミノ酸88〜アミノ酸96；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つを含む、請求項1又は2記載の使用。
【請求項４】
前記抗体軽鎖の前記可変領域が、配列番号1のアミノ酸24〜アミノ酸33；配列番号1のアミノ酸49〜アミノ酸55；配列番号1のアミノ酸88〜アミノ酸96；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも2つを含む、請求項1又は2記載の使用。
【請求項５】
前記抗体軽鎖の前記可変領域が、配列番号1のアミノ酸24〜アミノ酸33；配列番号1のアミノ酸49〜アミノ酸55;配列番号1のアミノ酸88〜アミノ酸96；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の3つ全てを含む、請求項1又は2記載の使用。
【請求項６】
前記抗体軽鎖の前記可変領域が本質的に配列番号1の配列を含む、請求項1又は2記載の使用。
【請求項７】
前記抗体重鎖の前記可変領域が、配列番号2のアミノ酸26〜アミノ酸35；配列番号2のアミノ酸50〜アミノ酸66；配列番号2のアミノ酸99〜アミノ酸112；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つを含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
【請求項８】
前記抗体重鎖の前記可変領域が、配列番号2のアミノ酸26〜アミノ酸35；配列番号2のアミノ酸50〜アミノ酸66；配列番号2のアミノ酸99〜アミノ酸112；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも2つを含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
【請求項９】
前記抗体重鎖の前記可変領域が、配列番号2のアミノ酸26〜アミノ酸35；配列番号2のアミノ酸50〜アミノ酸66；配列番号2のアミノ酸99〜アミノ酸112；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の3つ全てを含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体重鎖の前記可変領域が、本質的に配列番号2の配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体が単鎖形態であり、かつリンカーによって連結された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体が2つの軽鎖及び2つの重鎖を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の使用。
【請求項１３】
前記抗TrkA抗体がヒト又はヒト化抗体である、請求項1〜12のいずれか1項記載の使用。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体軽鎖の前記可変領域が本質的に配列番号3のアミノ酸1〜アミノ酸106からの配列を含む、請求項13記載の使用。
【請求項１５】
前記ヒト化抗体重鎖の前記可変領域が本質的に配列番号4のアミノ酸1〜アミノ酸123配列を含む請求項13又は請求項14記載の使用。
【請求項１６】
前記ヒト化抗体軽鎖が本質的に配列番号3の配列を有する、請求項13〜15のいずれか1項記載の使用。
【請求項１７】
前記ヒト化抗体重鎖が、本質的に配列番号4、配列番号5、配列番号6；から選択される配列を有する、請求項13〜16のいずれか1項記載の使用。
【請求項１８】
前記疼痛が慢性炎症性型である、前述の請求項のいずれか1項記載の使用。
【請求項１９】
前記慢性疼痛が、膵炎、腎結石、頭痛、月経困難症、筋骨格疼痛、挫傷、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は創傷による疼痛、外傷と関連した疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患と関連した疼痛、リウマチ様関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、関節周囲の病態、腫瘍学的疼痛、骨転移による疼痛、HIVによる疼痛によって生じる、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
前記疼痛が神経障害性疼痛である、請求項1〜17のいずれか1項記載の使用。
【請求項２１】
前記疼痛が腫瘍学的疼痛である、請求項1〜17のいずれか1項記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体が長期間作用する、前述の請求項の記載の使用。
【請求項２３】
前記慢性疼痛の治療に使用するための、請求項1〜17のいずれか1項に開示したとおりの抗TrkA抗体。
【請求項２４】
被験体の慢性疼痛を治療及び／又は予防するための方法であって、請求項1〜17のいずれか1項に開示したとおりの抗TrkA抗体の有効量を被験体に投与することを含み、これにより被験体の慢性疼痛を治療及び／又は予防する、前記方法。
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか1項に開示したとおりの抗TrkA抗体を含む組成物を、慢性疼痛の治療及び／又は予防を必要とする被験体に前記組成物の投与を指示する説明書と共に含み、これにより前記被験体の慢性疼痛を治療及び／又は予防する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の背景）
本発明は、NGFとその受容体のTrkAとの間の結合を阻害することができる分子の使用に関する。特に、NGFの生物活性を遮断することにより、鎮痛効果が延長された抗体に関する。その永続的な鎮痛効果のために、これらは、神経障害性又は腫瘍性の疼痛などの（しかし、限定されない）慢性疼痛としても知られる疼痛の持続的形態を伴った病態のための有利な療法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（技術水準）
脊髄に対して求心性の侵害受容性シグナルは、線維Aδ及びCによって運ばれ、その細胞体（一次感受性ニューロン）は、脊髄の背側の神経節（DRG）に位置する。一次感受性ニューロンは、興奮神経伝達物質としてATPと共にグルタミン酸を、並びにサブスタンスP及びCGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）などの種々のその他の物質を放出する（Hunt及びMantyhの論文, 2001）。これらの興奮神経伝達物質の放出は、カプサイシンに感受性のもの（バニロイド受容体、VR1）、GABAによって活性化されるもの、ATP自体によって活性化されるもの、及びカンナビノイド（CB1）によって活性化されるものを含む、求心性末端に存在する種々のクラスの受容体によって制御される（Sivilotti及びNistrihの論文, 1991; Hunt及びMantyhhの論文, 2001; Khakhhの論文, 2001; Morissetらの論文, 2001）。慢性疼痛が生じる生理病理学的所見の一つは、異痛症、すなわち通常痛みを伴わない刺激が痛みを伴う感覚に変質することである。この現象には、種々のイオン電流が関与しており、それゆえ、カプサイシン、VR1に対する受容体及びATPに対する向イオン性受容体を含む、「リガンド開口」型の種々のチャンネルが関与している（Khakhの論文, 2001）。脊髄の侵害受容性の介在ニューロン上のVR1に対する受容体の、及びATPに対する受容体の同時活性化により、痛みを伴う刺激伝達の補強を伴った興奮性シナプスシグナルのかなりの蓄積が発生する（Nakatsukaらの論文, 2002）。従って、これらの観察から、ATP受容体（特にP2X3クラスに属するもの）が疼痛経路において基本的役割を果たすことは、明らかである（Bumstockの論文、2001）。これらの受容体は、痛覚発生刺激によって活性化される末梢神経終末に、DRGにおけるニューロンの細胞体に、並びに脊髄におけるシナプス前末端に、及びシナプス後末端に存在している（Khakhの論文、2001）。主な種類の「持続的」疼痛の根底にある分子過程において、神経成長因子（NGF）及びその高親和性受容体TrkAの関与を示すかなりの証拠があり（Levi-Montalciniの論文、1987；Levi-Montalciniらの論文, 1996；Frade及びBardeの論文（1998）；Kaplanの論文, 1998）、NGF／TrkA系を遮断する抗体（Levineの論文、1998）の主要な治療領域（特に「持続性」形態に関連した疼痛のもの）を示している。感受性のある侵害受容性ニューロンの発達は、NGFに非常に依存しており、成人侵害受容体の反応も同じ因子によって調整される（Julius及びBasbaumの論文, 2001）。特に、NGFは、カプサイシン痛覚発生刺激に対して急性の感作を発揮する（Shu及びMendellの論文, 1999）。基本的観点から、侵害受容性ニューロンは、慢性炎症に続いて、これらの活動電位の頻度及び期間に変化を起こす。これらの現象は、内因性NGFを遮断することによって退行し、慢性疼痛状態の典型である過剰興奮性の有意な減弱を引き起こす（Djouhriらの論文, 2001）。成人侵害受容体において疼痛閾値を定義するNGF作用は、TrkA受容体によって媒介され、侵害受容性末端に存在するVR1受容体によって媒介される反応の調整も介する。VR1反応のTrkA依存的増強は、ホスホリパーゼCγ（PLCγ、Chuangらの論文, 2001）の細胞内伝達経路を介して生じると考えられている。末梢NGFレベルは、炎症過程で増加するが、一方で、外来性NGFの投与は、ラットに対する痛覚過敏効果を有し、ヒトでは筋肉痛を生じる。更に、NGFは、一般的にヒト及���哺乳類において熱刺激に対する過敏化を生じさせる。NGFは、炎症性過程が生じる末梢部位において、肥満細胞、線維芽細胞及びその他の細胞タイプによって放出される。特に、肥満細胞は、基本的役割を果たすようである（Woolfらの論文, 1996）。これらは、NGFを産生し、それと同時に、これらの表面上に機能的なTrkA受容体を発現するので（Nilssonらの論文, 1997）、これらは、リゾホスファチジルセリンの存在下において、NGF自体に反応することができる（Horigomeらの論文, 1993；Kawamotoらの論文, 2002）。その結果、NGF／TrkA系は、自己分泌ポジティブ・フィードバック機構を介して肥満細胞活性化を媒介し、痛覚発生炎症性シグナルの局部的増幅を可能にするようである。
【０００３】
高レベルのNGFは、ニューロンにおいても見いだされ、そこでは、このニューロトロフィンが疼痛と関連した神経線維の修飾の役割を担っている（Harpfらの論文, 2002）。ある形態の癌において、過剰のNGFは、腫瘍による疼痛の誘導と共に神経線維の成長及び浸潤を容易にさせる（Zhuらの論文, 1999）。最近の実験研究では、NGFを遮断することにより、どのように障害を受けたニューロンの細胞体に損傷を与えることなく、神経障害性の疼痛の原因である神経腫の形成を有意に減少させることができるかを証明している（Krygerらの論文, 2001）。これらの結果により、慢性疼痛の治療のためのNGF効果の減少に基づいた治療アプローチに、かなりの興味が生じた（Saragovi及びGehringの論文, 2000）。近年、疼痛伝達の分子過程におけるNGF／TrkA系の関与が、また遺伝学的に証明された。特に、TrkA遺伝子（染色体1q21-q22に局在する）の突然変異は、再発性の偶発性発熱、無汗症、侵害受容性刺激に対する無反応、精神遅滞及び自傷傾向によって特徴づけられるCIPA（「先天性無痛無汗症」）として公知の遺伝性の常染色体劣性症候群の原因となる（Indoらの論文, 1996；Saragovi及びGehringの論文, 2000）；Indoの論文, 2001；Indoらの論文, 2001）。侵害反応におけるNGFの関与の更なる確認は、抗NGFトランスジェニックマウス表現型（AD11）の特徴づけにより、発明者によって最近得られた。これらの動物では、抗NGF抗体αDl1の局所的な発現により、成人年齢におけるNGFの機能的遮断が生じる。このような遮断は、一貫して有害な熱刺激に対する反応の潜時の増大へと翻訳される（Capsoniらの論文, 2000；Rubertiらの論文, 2000）。多数の証拠により、疼痛療法のための可能性ある標的として、神経成長因子（NGF）及びその高親和性受容体TrkAによって構成される系が示されている。このため、TrkA受容体を遮断することによってNGF／TrkA系の生物活性を中和することができる抗体は、疼痛療法のための、特に持続痛のための重要な資源を表すであろう。
【０００４】
本発明の著者は、TrkAによって媒介されるNGFの生物学的効果を遮断することができる（TrkA受容体に向けられた）抗体を利用する。試薬MNAC13は、特に興味深い。
MNAC13抗体はヒトTrkA受容体に対して向けられたマウスモノクローナル抗体であり（Cattaneoらの論文, 1999；Pesaventoらの論文, 2000）、インビトロ及びインビボの両方において、NGFによるTrkAの活性化及びその下流の生物学的機能の阻害に特に有効である（Cattaneoらの論文, 1999；Pesaventoらの論文, 2000）。NGFによるTrkAの機能的活性化を防げるアンタゴニスト活性を有するMNAC13抗体を含む抗TrkA抗体は、EP 1.181.318に開示されている。また、このような抗体の誘導体は、W02005／061540に開示されている。しかし、慢性疼痛におけるこのような分子の治療的又は予防的効果は、開示されていない。
【０００５】
該抗体は、構造の観点から（Covaceuszachらの論文, 2001）、及びTrkA受容体との分子相互作用から（Covaceuszachらの論文, 2005）詳細に特徴づけられた。このような詳細な構造的知識に基づいて、革新的な方法によって、元の抗体と同じ抗原結合における特色を有するMNAC13のヒト化型（Hu-MNAC13）が産生された（特許出願WO2005／061540）。
【０００６】
一次病巣によって、又は神経系の機能障害によって生じる、神経障害性の疼痛のための、腫瘍による疼痛のための、及び多数のその他の形態の持続痛（炎症性の性質のものも）のための治療の現在利用可能な療法は、有効性が限られていることが見いだされた。副作用に関連した問題を解決するために、現在療法に使用される薬物と比べて異なる作用機序をもつ、鎮痛作用をもつ新たな分子を同定及び開発することには、明白な需要がある。国際特許出願WO02/20479は、TrkA受容体を阻害することによって潜在性鎮痛作用を有する小さな合成分子を開示する。それにもかかわらず、いくつかの疼痛モデルに対するこれらの分子の効果は、証明されていなかった。更に、抗体と比較したときに、小分子は、血液脳関門を通過しやすく、重大な副作用の可能性を伴うという欠点を有している。実際に、アルツハイマー病を含む種々の形態の進行性の神経変性によって影響を受けるニューロン集団である前脳基底核のコリン作動性ニューロン（Saperらの論文, 1985）は、TrkA受容体を発現し、正しく機能するためにNGFに依存している（Holtzmanらの論文, 1992）。国際特許出願WO01/78698は、慢性的な内臓痛を予防し、又は治療するためのNGFアンタゴニストの使用を提唱しているが、神経障害性疼痛又は腫瘍による疼痛ではない。該出願は、アンタゴニストがNGF及びTrkA受容体の両方に結合することができると述べているにもかかわらず、アンタゴニストのTrkAへの結合によって、受容体が機能的に遮断されることは証明されていない。
【０００７】
神経障害性の性質の慢性疼痛の評価のために、MNAC13抗体がNGF／TrkAの生物活性を遮断する能力に基づいて、抗体及びそのヒト化型を持続痛の種々の動物モデル、特に「慢性収縮傷害」モデル（CCI、坐骨神経の慢性収縮傷害）において試験した（Bennett及びXieの論文, 1988）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の目的は、慢性疼痛の治療のための医薬の製剤のための、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
適切には、抗体は、TrkAの生物活性を遮断する抗体、すなわちアンタゴニスト抗体である。
TrkAの生物活性を遮断する分子は、TrkA受容体に対するNGF結合に関して、アンタゴニストとして作用する分子をいい、これは、
i）TrkAに結合し；かつ、
ii）生細胞の表面上に発現された「ネイティブな」TrkA受容体へのNGFの結合を阻害し；かつ、
iii）同じTrkA受容体へのNGFの結合に由来する生物活性を遮断する、
合成分子若しくはモノクローナル抗体又はその生物学的／合成誘導体として定義され得る。
【００１０】
「生物活性を遮断する」という用語は、受容体自体の「活性な」状態への変換過程を遮断することとして定義される、受容体の活性化を遮断することを単に意味するだけでなく、活性化過程の下流の生物学的結果：二次メッセンジャー、新たな遺伝子発現、細胞及び系レベルの両方での表現型の修飾並びに機能的修飾の機能的中和を意味する。本発明の分子は、古典的なインビトロ試験（PC12細胞における神経突起伸長の試験）においてTrkAを遮断することができるだけでなく、インビボでも遮断できる（前脳基底核のコリン作動性ニューロンの機能的遮断及び古典的な「熱板」試験における痛覚の遮断）。
【００１１】
上記の如く、アンタゴニスト作用をもつTrkA抗体は、EP 1181318及びWO2005/061540に開示されている。
従って、慢性疼痛を治療及び／又は予防するための医薬の製造のための、NGFとTrkAとの間の結合を阻害することができる抗TrkA抗体の使用が、本発明の目的である。適切には、抗体は、TrkAの生物活性を遮断することができる。
【００１２】
また、本発明の態様として、被検体の慢性疼痛を治療及び／又は予防し、抗TrkA抗体の有効量を被験体に投与することを含み、これにより前記被験体における慢性疼痛を治療及び／又は予防する方法を提供する。また、TrkA抗体を含む組成物を、慢性疼痛の治療及び／又は予防を必要とする被験体に前記組成物の投与を指示する説明書を共に含み、これにより前記被験体の慢性疼痛を治療及び／又は予防するキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の態様において、抗体軽鎖の可変領域は、配列番号1のアミノ酸24〜アミノ酸33；配列番号1のアミノ酸49〜アミノ酸55；配列番号1のアミノ酸88〜アミノ酸96；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つ、より好ましくは上記CDRのうち2つを含み、最も好ましくは上記のCDRのうちの3つを含む。抗体軽鎖の可変領域は、例えば本質的に配列番号1の配列を含んでいてもよい。
【００１４】
【化１】
2008542440.tif 000002
。
【００１５】
本発明の態様において、抗体重鎖の可変領域は、配列番号2のアミノ酸26〜アミノ酸35；配列番号2のアミノ酸50〜アミノ酸66；配列番号2のアミノ酸99〜アミノ酸112；から選択される配列を有する相補性決定領域（CDR）の少なくとも1つ、より好ましくは上記CDRのうち2つ、最も好ましくは上記のCDRのうちの3つを含む。抗体軽鎖の可変領域は、例えば本質的に配列番号2の配列を含んでいてもよい。
【００１６】
【化２】
2008542440.tif 000003
。
【００１７】
抗体は、単鎖の形態であり、リンカーによって連結された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含んでいてもよい。
或いは、抗体は、2つの軽鎖及び2つの重鎖を含んでいてもよい。
本発明の好ましい態様において、抗TrkA抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。当業者であれば、抗体をデザインするために適当なヒト化法を選択するはずであり、好ましい方法は、WO2005/061540に開示された方法である。例示的なヒト化抗体は、配列番号1（マウス起源配列）のヒト化誘導体である軽鎖可変領域を含む。例示的なヒト化抗体は、配列番号2（マウス起源の配列）のヒト化誘導体である重鎖可変領域を含む。
【００１８】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体軽鎖の可変領域は、配列番号3のアミノ酸1〜アミノ酸106の配列を本質的に含む。
より好ましい態様において、ヒト化抗体軽鎖は、本質的に配列番号3の配列を有する。
【００１９】
【化３】
2008542440.tif 000004
。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、ヒト化抗体重鎖の可変領域は、配列番号4のアミノ酸1〜アミノ酸123の配列を本質的に含む。
より好ましい態様において、ヒト化抗体重鎖は、本質的に配列番号4、配列番号5、配列番号6；から選択される配列を有する。
【００２１】
【化４】
2008542440.tif 000005
。
【００２２】
【化５】
2008542440.tif 000006
。
【００２３】
【化６】
2008542440.tif 000007
。
【００２４】
イタリック：可変領域、太字：ヒト化過程におけるマウス配列の突然変異、下線：CDR。
【００２５】
なおさらなる本発明の目的は、炎症性の慢性疼痛の治療のための治療薬を調製するための、NGFとTrkAとの間の結合を阻害し、後者の生物活性を遮断することができる分子の使用である。より好ましくは、疼痛は、膵炎、腎結石、頭痛、月経困難症、筋骨格疼痛、挫傷、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、術後疼痛、片頭痛、三叉神経痛、火傷及び／又は創傷による疼痛、外傷と関連した疼痛、神経障害性疼痛、筋骨格疾患と関連した疼痛、リウマチ様関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、関節周囲の病態、腫瘍学的疼痛、骨転移による疼痛、HIVによる疼痛によって生じる。疼痛研究の国際協会（IASP, www.iasp-pain.org ＜http：//www.iasp-pain.org/＞）によると、疼痛は、「実際の、若しくは潜在的組織損傷と関連するか、又はこのような損傷若しくは両方に関して記述された、不快な感覚及び感情的経験」として一般に定義される。全ての形態の疼痛に必須の要素は、生体に対して潜在的組織損傷を警告するための特殊化した高閾値の受容体及び神経線維の活性化である。炎症細胞及び過程の関与は、多くの疼痛状態における共通の要素である。「急性疼痛」という用語は、切断、圧挫、火傷などの傷害によって、又は化学的刺激によってもたらされる即座の、一般に高閾値の疼痛を意味する。本明細書で使用される「慢性疼痛」という用語は、急性疼痛以外の疼痛を意味する。慢性疼痛は、例えば何月も又は何年もの比較的長い期間であり、連続的又は断続的であることができることが理解される。
【００２６】
本発明の抗TrkA抗体は、適切には全身投与される。全身投与は、注射、例えば連続静脈内注入、大量瞬時静脈内注入、皮下又は筋肉内注入によって行うことができる。或いは、その他の投与形態（例えば、経口、粘膜、吸入法を介して、舌下など）を使用してもよい。抗体の局部的送達は、局所投与、例えば患部組織の近くの関節内投与又は皮下、筋肉内の注射によって行うことができる。
【００２７】
抗TrkA抗体は、意図された投与経路に適した医薬組成物と共に適切に製剤化される。注射のための溶液には、適切な緩衝液及びモル濃度変更剤、例えばリン酸、塩及び／又はデキストロースを適切なように含む水性媒体（例えば、注射用水）中に溶解又は分散している抗体を適切に含む。
【００２８】
治療計画、すなわち用量、時期及び反復は、選ばれた投与経路により、製品の一回又は繰り返しの投与（例えば、注射）によって表すことができる。用量投与の間隔は、臨床効果の範囲及び期間、並びに特定の個体及び個体の臨床歴に応じて変更させることができる。適切には、抗TrkA抗体は、長い作用期間を有する。特に、投与後に及ぶ抗体の臨床効果は、動物試験から決定すると21日間程度の長さであろう。更に、予備的データは、抗TrkA抗体が、その投与後に血清又は血漿などの関連した生体マトリックスにおいて検出することができる期間よりも長い期間の臨床的利益を明示し得ることを暗示する。意図された長い作用期間（すなわち、適切には、少なくとも1週、又は好ましくは少なくとも2週、例えば少なくとも3週又は少なくとも4週長続きする効果）を考慮して、適切には、抗体は、被検体に1週間に1回以下の頻度で、また例えば、2週間に1回、又は3週間に1回、又は4週間に1回以下の頻度で投与される。
抗TrkA抗体の適切な用量は、典型的には0.1〜10 mg/kg体重の範囲である。
本明細書に開示した新規抗体及びそれらを含む組成物は、本発明の態様として主張される。
【実施例】
【００２９】
（方法）
（モノクローナル抗体の産生）
モノクローナル抗体MNAC13（可変領域軽鎖  配列番号1；可変領域重鎖  配列番号2）は、先に開示した標準的方法（Gaifre及びMilsteinの論文, 1981；Cattaneoらの論文, 1988；Caftaneoらの論文, 1999）に従って、ハイブリドーマ上清から産生してもよい。それぞれの抗体を含む上清を、沈澱（29%の硫酸アンモニウム）、続いて1倍濃度のPBSに対する透析（Spectra-Por 12／14K膜、Spectrum社）、及びセファロースプロテインGカラム（4-Fast Flow、Amersham Biosciences社）によるアフィニティークロマトグラフィーに供した。溶出は、低pH（5 mM HCl）溶液によって行い、これを回収時に中和した。最終的な溶出液を濃縮して、1〜5 mg／mlの間の濃度の精製抗体の標品を得た（Amicon Ultra-15, 50K, Millipore社）。ヒト化型（ヒトIgG1）の抗体（Hu-MNAC13）が濃縮される限り、それぞれの抗体の重鎖（pVH／CMVexpress）及び軽鎖（pVL／CMVexpress）の両者のための安定な両形質移入体である安定に形質移入されたCHO細胞株の上清から開始して、上に開示したとおりにこれらを更に精製した。ベクターは、当該技術分野において公知であり、例えばWO02/09645 8に開示されているものである。安定な両形質移入体クローンは、G418及びミコフェノール酸による二重選別を介して得られた。
【００３０】
（ネズミ疼痛モデルにおける実験）
研究における動物の使用では、IASP倫理委員会及びイタリア国内法令（DL116/92、欧州方針86/609/EECの適用）に従って、動物を処理し、扱った。動物の苦しみを最小にするために、及び信頼できる科学的データを産生するために必要な動物の最少量を使用するために、あらゆる必要な努力がなされた。
【００３１】
（坐骨神経手術）
およそ35gの重さの雄のCD1マウスに麻酔をかけ（500 mg/kgの抱水クロラールを腹腔注射）、右後足の坐骨神経を露出させて、Bennett及びXieの論文（1988）によって開示された坐骨神経の慢性収縮病変モデル（CC1）に従って、糸縫いによるゆるい結紮に供した。坐骨神経のゆるい結紮は、腿上部の内部で、熱/機械的異痛症及び痛覚過敏によって特徴づけられる末梢単神経障害を誘導した。異なるが近い３地点での神経の結紮によって、神経傷害は、病変に続いて3日で完全に発病し、2〜3月間持続した。
【００３２】
（薬理学的治療）
病変に続いて3日から、抗TrkA（MNAC13）抗体を、表Iで示したように生理食塩水（媒体）に希釈した完全な形態（Mab）で投与した。対照として、マウス免疫グロブリン（IgG）を遮断抗体（2種の用量が使用される場合、より多い用量で）又は生理食塩水と同量で使用した。
【００３３】
表I：投与プロトコル及び機械的な異痛症の測定
【表１】
2008542440.tif 000008
。
【００３４】
機械的異痛症は、表Iに示したように、足底の動的触覚計（Ugo Basile）によって測定した。3日目をベースラインと見なした。
同じプロトコルを使用して、抗体MNAC13のヒト化型の鎮痛作用を評価した。
【００３５】
（統計解析）
結果は、2つの異なる方法で、動物が病変と同側の後足を収縮するのに十分な閾値の力の値（グラム）の絶対値か、又は後足（同側の／反対側の）の絶対値の間の比率としての両方で表した。値は、繰り返し測定の分散解析（ANOVA）による統計解析に供し、そこでは、「治療」因子及び繰り返し測定（日）は、p＜0.01で有意であった。
【００３６】
（慢性炎症性疼痛のモデル）
アジュバントで誘導される関節炎は、雄ルイスラット（l75〜200 g、7〜8週）において、ミネラルオイル中の0.1mlの結核菌（mycobacterium butyricum）を尾部の付け根に注射することによって誘発した（Taurogらの論文, 1988；Devesaらの論文, 2005）。14日目に、関節炎ラットを、これらが発赤の存在、両後足の浮腫の増大及び足首の屈曲後の啼鳴の増加として測定される疾患の症候を示すかどうかの研究のための対照とした。
【００３７】
関節炎の誘導の14及び20日後にて、MNAC13抗体（無菌の生理食塩水媒体中の2 mg/kg）を静脈内に2回投与した。インドメタシン（3 mg/kg）を参照化合物として使用し、疾患誘導の14日後から開始して20日まで毎日経口投与した。対照動物は、いずれの処理も受けていない。統計的有意性のレベルは、繰り返し測定に対する分散解析（ANOVA）、続いてダネットt検定によって決定した。p＜0.05（*）又はp＜0.01（**）のP値を、有意なものとした。データは、平均±S.E.M.（n=7）を表す。対照群と比較して*p＜0.05；**p＜0.01（関節炎ラット）。
【００３８】
（結果）
（神経障害性疼痛）
CCIモデルでの結果は、遮断抗体MNAC 13（図1及び図2）が有意な鎮痛効果を有したことを示した。特に、同様の結果が、1.4 mg/kgの用量にて2つの抗体について観察された。図3及び図4に示したように、これらは、投与の2日目（4日）から鎮痛効果を有し始め、6日ごろ最大効果に到達し、14日目までの観察全期間で実質的に同じ鎮痛効力を保持していた。図4のように、割合期間での結果を表すと（病変と同側の後足についての閾値の力と対照側後足のものとの間の比率）、2つの遮断抗体のそれぞれについて、最大の割合値は、60%程度であり、対照群（IgG及び生理食塩水）については40%程度であったということができる。
【００３９】
動物を4週間、すなわち31日まで観察すると、抗体MNAC13の投与（図5及び図6）は、二段階の効果を示した。鎮痛効力の第一段階（3〜17日、すなわち最後の注射の1週後まで）は、11〜12日（図5）ごろの最大効果によって特徴づけられた。この効果は、使用した両方の用量（0.9及び2 mg/kg）で明白であったが、より少ない用量での鎮痛効力は、常により多い用量のものよりも低いままであった。17日目の効果の減少の後（それにもかかわらず、まだ統計学的に対照から識別可能）、第2の鎮痛段階が31日までの効果の増大と共に観察された。最終的な割合（31日目）は、40%程度の対照群の割合値と比べて、それぞれ2及び0.9 mg/kgの用量について、約70%及び65%に近かった（図6）。従って、MNAC13の鎮痛作用における二段階は、区別することができる：第一段階（「薬理学的」効果）、処理期間及び抗体の最後の注射の1週後 を含む（効果が減弱し、抗体の血液濃度に匹敵する週）；第二段階、これは、長期効果が確認でき、恐らく新たな遺伝子転写、遺伝子発現を必要とし、これは、この治療状況において現在使用される産物と異なる「疾患を変更する」有効成分である、すなわち疾患の経過を徹底的に変更することができるというMNAC13に独特の特色（神経障害性疼痛の分野における）を与える効果であり、これは症候における単純な薬理効果を証明する。上で示したものと実質的に同じ結果が、抗体MNAC13の代わりにいくつかのヒト化型が使用された時に得られ（使用した用量：それぞれの抗体で2 mg/kg）、後者が元の型と同じ鎮痛薬特性を有することが確認される。抗体は、軽鎖可変領域（配列番号3）及び重鎖可変領域（配列番号4）の両方において、W02005／061540の方法でヒト型化した。全ヒト型化抗体を構築するために、上に記述したように、異なる定常領域を利用された（配列番号3〜6）。
【００４０】
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【図面の簡単な説明】
【００４１】
本発明の非制限的実施態様は、ここで特に以下の図に関して開示される。
【図１】神経障害性疼痛に対する抗TrkAモノクローナル抗体MNAC13（1.4 mg/kg）の効果：足底の動的触覚計によって測定される機械的異痛症；坐骨神経の慢性収縮に供したCD1マウス；抗体は、坐骨神経の傷害の3、4、5、6日後に腹腔注射した。観察期間：3日〜14日。ネガティブ対照として、生理食塩水（sal）及びマウス免疫グロブリン（IgG、1.4 mg/kg）の両方を使用した。結果は、病変と同側の後足の閾値の力の絶対値（グラム）によって表した。値は、繰り返し測定についての分散解析（ANOVA）による統計解析に供して、そこでは、「治療」因子及び繰り返し測定（日）は、両方ともp＜0.01（少なくとも）で有意であった。抗TrkA又は抗NGFで処理された動物は、4日〜14日までで対照とは有意に異なっている。
【００４２】
【図２】神経障害性疼痛に対する抗TrkAモノクローナル抗体MNAC13（1.4 mg/kg）の効果：足底の動的触覚計によって測定される機械的異痛症；坐骨神経の慢性収縮に供したCD1マウス；抗体は、坐骨神経の傷害の3、4、5、6日後に腹腔注射した。観察期間：3日〜14日。対照として、生理食塩水（sal）及びマウス免疫グロブリン（IgG、1.4 mg/kg）の両方を使用した。結果は、割合%として表した（病変と同側の後足と反対側の後足に対応する閾値の力との間の比率）。対応する絶対値は、繰り返し測定の分散解析（ANOVA）による統計解析に供して、そこでは、「治療」因子及び繰り返し測定（日）は、p＜0.01（少なくとも）で有意であった。抗TrkAで処理された動物は、4日〜14日までで対照とは有意に異なっていた。
【００４３】
【図３】神経障害性疼痛に対する抗TrkAモノクローナル抗体MNAC13の効果（2つの用量：0. 9及び2 mg/kg）：足底の動的触覚計によって測定される機械的異痛症；坐骨神経の慢性収縮に供したCD1マウス；抗体は、坐骨神経の傷害の3、4、5、6、7、8、9、10日後に腹腔注射した。観察期間：3日から〜31日。ネガティブ対照として、マウス免疫グロブリン（IgG、2 mg/kg）を使用した。結果は、病変と同側の後足の閾値の力の絶対値（グラム）として表した。値は、繰り返し測定の分散解析（ANOVA）によって、統計解析に供して、そこでは、「治療」因子及び繰り返し測定（日）は、p＜0.01（少なくとも）で有意であった。MNAC13で処理された動物は、5日（より多い抗体量の場合）又は7日（より少ない量の場合）〜観察の最終日（31日）までで対照とは有意に異なっていた。
【００４４】
【図４】神経障害性疼痛に対する抗TrkAモノクローナル抗体MNAC13の効果（2つの用量：0.9 及び2 mg/kg）：足底の動的触覚計によって測定される機械的異痛症；坐骨神経の慢性収縮に供したCD1マウス；抗体は、坐骨神経の傷害の3、4、5、6、7、8、9、10日後に腹腔注射した。観察期間：3日から〜31日。対照として、マウス免疫グロブリン（IgG、2 mg/kg）を使用した。結果は、割合%として表した（病変と同側の後足と反対側の後足に対応する閾値の力との間の比率）。対応する絶対値は、繰り返し測定の分散解析（ANOVA）による統計解析に供して、そこでは、「治療」因子及び繰り返しの測定（日）は、p＜0.01（少なくとも）で有意であった。MNAC13で処理された動物は、5日（より多い抗体量の場合）又は7日（より少ない量の場合）〜観察の最終日（31日）までで対照とは有意に異なっていた。
【図１】
2008542440.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月4日(2008.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008542440000001.app
【国際調査報告】
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