(57)【要約】  本発明は、ジアリールウレア化合物、例えば４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤を含む、癌の処置用の医薬組成物および組合せに関する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３阻害剤｛セレコキシブ、ビリジン類、ワートマニン類など｝、ＡＫＴキナーゼ阻害剤｛ペリフォシン、トリシリビンなど｝およびｍＴＯＲ阻害剤｛ラパマイシン類、テムシロリムス類およびエベロリムス類など｝を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2008542214.tif 000009
の化合物、または、その医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物もしくはプロドラッグ、および、少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含む組合せ。
【請求項２】
該第２の化合物が、セレコキシブ、ＯＳＵ−０３０１２、ＯＳＵ−０３０１３、ＰＸ−３１６、２'−置換、３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール誘導体、３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体、Ｌｙ２９４００２、ＩＣ４８６０６８、３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体、ＰＸ−８６６、ペリフォシン、トリシリビン、ＦＫＢＰ１２エンハンサー、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、ワートマニンまたはラパマイシンまたはそれらの誘導体、または、それらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
該第２の化合物が、式Ｗ：
【化２】
2008542214.tif 000010
のワートマニン化合物、式Ｗのワートマニン化合物の誘導体もしくは類似体、式Ｗのワートマニン化合物の医薬的に許容し得る塩、または、式Ｗのワートマニン化合物の誘導体もしくは類似体の医薬的に許容し得る塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項４】
該式Ｗの誘導体または類似体が、
ａ）式Ｗ１
【化３】
2008542214.tif 000011
（式中、Ｒは、Ｈ（１１−デスアセトキシワートマニン）またはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
の化合物、
ｂ）式Ｗ２
【化４】
2008542214.tif 000012
（式中、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
のΔ９,１１−デヒドロデスアセトキシワートマニン化合物、
ｃ）式Ｗ３
【化５】
2008542214.tif 000013
（式中、Ｒは、Ｈまたはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルであり、そして、Ｒ''は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキルである）
の１７（α−ジヒドロ−ワートマニン化合物、
ｄ）式Ｗ４
【化６】
2008542214.tif 000014
（式中、Ｒ１は、Ｈ、メチルまたはエチルであり、Ｒ２はＨまたはメチルである）
のワートマニン化合物のＡ−環が開裂した酸またはエステル、または、
ｅ）式Ｗ５
【化７】
2008542214.tif 000015
（式中、Ｒ４は＝Ｏまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、Ｒ３は、＝Ｏ、−ＯＨまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、各Ｒ６は、独立して、フェニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ４が＝Ｏまたは−ＯＨである場合、Ｒ３は＝Ｏではない）
のワートマニンの１１−置換および１７−置換誘導体
から選択される、請求項３に記載の組合せ。
【請求項５】
該第２の化合物がＡｋｔ−キナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項６】
該第２の化合物が、Ａｋｔ−１−１、Ａｋｔ−１−１,２、ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ、１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル誘導体、インドール−３−カルビノールおよびその誘導体、ペリフォシン、ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体、トリシリビンまたはこれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項７】
該第２の化合物がｍＴＯＲ阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項８】
該第２の化合物が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３６７５、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３８４１、４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン、３２−デオキソラパマイシンもしくは１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシン、ＳＡＲ９４３またはそれらの医薬的に許容し得る塩である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物およびワートマニンを含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項１０】
式（Ｉ）の化合物およびラパマイシンを含む、請求項１に記載の組合せ。
【請求項１１】
該組合せの有効成分の量が相乗的である、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１２】
癌を処置するための請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の組合せ。
【請求項１３】
該癌が、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌である、請求項１２に記載の組合せ。
【請求項１４】
癌の処置を必要としている対象における癌の処置方法であって、有効量の式Ｉ
【化８】
2008542214.tif 000016
の化合物、または、その医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物もしくはプロドラッグ、および、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を投与することを含む、方法。
【請求項１５】
癌を処置するための請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の組合せの製造方法。
【請求項１６】
該癌が、黒色腫、肝細胞癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
ジアリールウレア化合物、例えば、例えばＵＳ２００５００３８０８０に記載されている４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドは、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ｒａｆ、ｐ３８および／またはｆｌｔ−３キナーゼシグナル伝達分子に対する阻害活性を含む様々な活性を有する強力な抗癌および抗血管新生剤である。ＲＡＳ／ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路は、細胞増殖、分化および形質変換に関与し、多くの癌に関係づけられている。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、細胞の別の重要な生理的経路である。それは、増殖因子、サイトカイン、細胞−細胞接着および細胞−細胞外マトリックスを含む、細胞外の刺激を媒介する（Vivanco and Sawyers, Nat Rev Cancer, 2: 489-501, 2002, Downward, Curr Opin Cell Biol, 10: 262-267, 1998)。ＡＫＴ経路は、多くのタイプのヒトの癌において活性であると思われる (Nicholson and Anderson, Cell Signal, 14: 381-395, 2002）。
【発明の開示】
【０００２】
発明の説明
本発明は、細胞増殖性障害（癌など）、炎症、免疫調節性障害および異常または望ましくない血管新生に伴う症状が含まれるがこれらに限定されない疾患および症状を処置するための薬物の組合せ、組成物および方法を提供する。薬物の組合せは、式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害剤である第２の化合物を含む。その方法は、例えば、下記のジアリールウレア化合物およびシグナル伝達経路阻害剤、医薬的に許容し得るそれらの塩およびそれらの誘導体などを投与することを含み得る。
【０００３】
ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡＫＴ（タンパク質キナーゼＢ）シグナル伝達経路は、細胞の生存、細胞の増殖、細胞の成長および細胞の運動を含む、様々な生物学的過程を調節する。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の異常は、細胞増殖性障害（癌など）、炎症および免疫調節性障害を含む数々の疾患および症状の発病に寄与する。
【０００４】
多くの増殖および生存因子は、ＰＩ３Ｋファミリーの構成員を活性化して、１種の脂質シグナル伝達分子ＰＩＰ２を別のＰＩ（３,４,５）Ｐ３に特異的に変換する。リン酸化された生成物は、Ａｋｔファミリーの構成員を内側の細胞膜にリクルートし、それらのタンパク質キナーゼ活性を刺激する。今日までに、いくつかの生物学的過程に関与する多くのＡｋｔエフェクターが同定された。例えば、Ａｋｔキナーゼは、アポトーシス機構の成分のリン酸化および不活性化を介して、細胞の生存を媒介する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路には、このシグナル伝達カスケードに関与するいかなる構成員または成分も含まれる。これらには、例えば、ＰＩ３−キナーゼ、Ａｋｔ−キナーゼ、ＦＫＢＰ１２、ｍＴＯＲ（哺乳類のラパマイシンの標的；ＦＲＡＰ、ＲＡＦＴ１またはＲＡＰＴ１としても知られている）、ＲＡＰＴＯＲ（ｍＴＯＲの調節関連タンパク質）、ＴＳＣ（結節性硬化症複合体）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシン・ホモログ）およびそれらの下流のエフェクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組合せは、上述の活性のいずれに関連するいずれの症状および／または疾患を処置および／または予防するためにも使用できる。
【０００５】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害剤は、上述のシグナル伝達カスケードの１種またはそれ以上の構成員を阻害する化合物である。そのような化合物は、経路阻害剤と呼んでもよいが、作用メカニズムまたはどのようにして治療効果が達成されるかに拘わらず、本発明は、言及される疾患または症状のいずれかを処置するためのこれらの阻害剤の使用を含む。実際に、そのような化合物は１種以上の標的を有し得ると認識されており、ある化合物について最初に認識された活性は、対象に投与されたときにそれがインビボで有する活性またはその治療効力を達成する活性ではないことがある。従って、経路またはタンパク質標的（例えばＡｋｔまたはｍＴＯＲ）阻害剤としての化合物の説明は、化合物がそのような活性を有することを示すが、治療または予防剤として使用したときに化合物がその活性を有するとは決して限定しない。
【０００６】
ＡＫＴファミリーの構成員の例には、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２（一般的に腫瘍において過剰発現される; Bellacosa et al., Int. J. Cancer, 64:280-285, 1995）およびＡｋｔ３が含まれる。
【０００７】
ＰＩ３Ｋファミリーの構成員の例には、ｐ１１０−アルファ、ｐ１１０−ベータ、ｐ１１０−デルタおよびｐ１１０−ガンマ（触媒性）が含まれる。
【０００８】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤の例には、例えば、ＦＴＹ７２０（例えば、Lee et al., Carcinogenesis, 25(12):2397-2405, 2004）；
ＵＣＮ−０１（例えば、Amornphimoltham et al., Clin Cancer Res., 10(12 Pt 1):4029-37, 2004）
が含まれるが、これらに限定されない。
【０００９】
ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）阻害剤の例には、例えば、セレコキシブ並びにＯＳＵ−０３０１２およびＯＳＵ−０３０１３などのその類似体（例えば、Zhu et al., Cancer Res., 64(12): 4309-18, 2004）；
ＰＸ−３１６などの３−デオキシ−Ｄ−ミオ−イノシトール類似体（例えば、米国出願番号２００４０１９２７７０；Meuillet et al., Oncol. Res., 14:513-27, 2004);
２'−置換、３'−デオキシ−ホスファチジル−ミオ−イノシトール類似体（例えば、Tabellini et al., Br. J. Haematol., 126(4): 574-82, 2004)；
縮合ヘテロアリール誘導体（米国特許第６,６０８,０５６号）；
３−（イミダゾ［１,２−ａ］ピリジン−３−イル）誘導体（例えば、米国特許第６,４０３,５８８号および第６,６５３,３２０号）；
Ｌｙ２９４００２（例えば、Vlahos, et al., J. Biol., Chem., 269(7) 5241-5248, 1994)；
ＩＣ４８６０６８などのキナゾリン−４−オン誘導体（例えば、米国出願番号２００２０１６１０１４；Geng et al., Cancer Res., 64:4893-99, 2004)；
３−（ヘテロ）アリールオキシ置換ベンゾ（ｂ）チオフェン誘導体（例えば、ＷＯ０４１０８７１５；また、ＷＯ０４１０８７１３）；
ＰＸ−８６６（酢酸（１Ｓ,４Ｅ,１０Ｒ,１１Ｒ,１３Ｓ,１４Ｒ）−［４−ジアリールアミノメチレン−６−ヒドロキシ−１−メトキシメチル−１０,１３−ジメチル−３,７,１７−トリオキソ−１,３,４,７,１０,１１,１２,１３,１４,１５,１６,１７−ドデカヒドロ−２−オキサ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１１−イルエステル）などの半合成ビリジン（viridin）類を含むビリジン類（例えば、Ihle et al., Mol Cancer Ther., 3(7):763-72, 2004；米国出願番号２００２００３７２７６；米国特許第５,７２６,１６７号）；および
ワートマニンおよびその誘導体（例えば、米国特許第５,５０４,１０３号；第５,４８０,９０６号、第５,４６８,７７３号；第５,４４１,９４７号；第５,３７８,７２５号；第３,６６８,２２２号）
が含まれるが、これらに限定されない。
【００１０】
Ａｋｔ−キナーゼ（タンパク質キナーゼＢとしても知られている）阻害剤の例には、例えば、Ａｋｔ−１−１（Ａｋｔ１を阻害する）（Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005）；
Ａｋｔ−１−１,２（Ａｋ１および２を阻害する）（Barnett et al., Biochem. J., 385 (Pt.2):399-408, 2005）；
ＡＰＩ−５９ＣＪ−Ｏｍｅ（例えば、Jin et al., Br. J. Cancer., 91:1808-12, 2004）；
１−Ｈ−イミダゾ［４,５−ｃ］ピリジニル化合物（例えば、ＷＯ０５０１１７００）；
インドール−３−カルビノールおよびその誘導体（例えば、米国特許第６,６５６,９６３号；Sarkar and Li, J Nutr., 134(12 Suppl):3493S-3498S, 2004）；
ペリフォシン（perifosine）（例えば、Ａｋｔの膜局在を妨害する；Dasmahapatra et al., Clin. Cancer Res., 10(15):5242-52, 2004)；
ホスファチジルイノシトールエーテル脂質類似体（例えば、Gills and Dennis, Expert. Opin. Investig. Drugs, 13:787-97, 2004）；
トリシリビン（triciribine）（ＴＣＮまたはＡＰＩ−２またはＮＣＩ識別物質（identifier）：ＮＳＣ１５４０２０；Yang et al., Cancer Res., 64:4394-9, 2004）
が含まれるが、これらに限定されない。
【００１１】
ｍＴＯＲ阻害剤の例には、例えば、以下のものが含まれるが、これらに限定されない；
ＦＫＢＰ１２エンハンサー、
ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス）、ＲＡＤ００１（エベロリムス；ＷＯ９４０９０１０）、ＴＡＦＡ９３およびＡＰ２３５７３；ラパログ（rapalog）類、例えば、ＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７に開示のもの、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１；４０−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、４０−［３−ヒドロキシ（ヒドロキシメチル）メチルプロパノエート］−ラパマイシン（ＣＣ１７７９とも呼ばれる）、４０−エピ−（テトラゾリル）−ラパマイシン（ＡＢＴ５７８とも呼ばれる）、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンチニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロラパマイシンおよびＷＯ０５００５４３４に開示の他の誘導体；ＵＳＰ５,２５８,３８９、ＷＯ９４／０９０１０１、ＷＯ９２／０５１７９、ＵＳＰ５,１１８,６７７、ＵＳＰ５,１１８,６７８、ＵＳＰ５,１００,８８３、ＵＳＰ５,１５１,４１３、ＵＳＰ５,１２０,８４２、ＷＯ９３／１１１１３０、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９４／０２４８５、ＷＯ９５／１４０２３、ＷＯ９４／０２１３６、ＷＯ９５／１６６９１（例えばＳＡＲ９４３）、ＥＰ５０９７９５、ＷＯ９６／４１８０７、ＷＯ９６／４１８０７およびＵＳＰ５,２５６,７９０に開示の誘導体を含むラパマイシン類およびそれらの誘導体；
リン含有ラパマイシン誘導体（例えば、ＷＯ０５０１６２５２）；
４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体（例えば、米国仮出願番号６０／５２８,３４０）。
【００１２】
前臨床または臨床使用にある化合物の例には、例えば、ＡＰ２３５７３、ＡＰ２３８４１、ＣＣＩ−７７９およびＲＡＤ００１が含まれる。
【００１３】
関心のあるホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）阻害剤の例は、ワートマニンおよびその誘導体またはその類似体並びにワートマニンおよびその誘導体および類似体の医薬的に許容し得る塩である。従って、本発明の方法には、式Ｗ：
【化１】
2008542214.tif 000002
のＰＩ３−キナーゼ阻害剤、式Ｗの化合物の誘導体または類似体、式Ｗの化合物の医薬的に許容し得る塩、および、式Ｗの化合物の誘導体または類似体の医薬的に許容し得る塩の使用が含まれる。
【００１４】
本明細書では、ワートマニンまたは「式Ｗ」の化合物の誘導体および類似体への言及には、米国特許第５,５０４,１０３号；第５,４８０,９０６号、第５,４６８,７７３号；第５,４４１,９４７号；第５,３７８,７２５号；第３,６６８,２２２号で同定される誘導体および類似体が含まれると企図する。適する式Ｗの化合物の誘導体および類似体には以下のものが含まれる：
ａ）式Ｗ１
【化２】
2008542214.tif 000003
（ここで、Ｒは、Ｈ（１１−デスアセトキシワートマニン）またはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
の化合物、
【００１５】
ｂ）式Ｗ２
【化３】
2008542214.tif 000004
（ここで、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルである）
のΔ９,１１−デヒドロデスアセトキシワートマニン化合物、
【００１６】
ｃ）式Ｗ３
【化４】
2008542214.tif 000005
（ここで、Ｒは、Ｈまたはアセトキシであり、Ｒ'はＣ１−Ｃ６アルキルであり、そして、Ｒ''は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキルである）
の１７（α−ジヒドロ−ワートマニン化合物、
【００１７】
ｄ）式Ｗ４
【化５】
2008542214.tif 000006
（ここで、Ｒ１は、Ｈ、メチルまたはエチルであり、Ｒ２はＨまたはメチルである）
のワートマニン化合物のＡ−環が開裂した酸またはエステル、または、
【００１８】
ｅ）式Ｗ５
【化６】
2008542214.tif 000007
（ここで、Ｒ４は＝Ｏまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、Ｒ３は、＝Ｏ、−ＯＨまたは−Ｏ（ＣＯ）Ｒ６であり、各Ｒ６は、独立して、フェニル、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、ここで、Ｒ４が＝Ｏまたは−ＯＨである場合、Ｒ３は＝Ｏではない）のワートマニンの１１−置換および１７−置換誘導体。
【００１９】
４｛４−［３−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）−ウレイド］−３−フルオロフェノキシ｝−ピリジン−２−カルボン酸メチルアミドに相当する式（Ｉ）の構造を有する化合物、その医薬的に許容し得る塩、多形、溶媒和物、水和物、代謝物およびプロドラッグは、本明細書では集合的に「式Ｉの化合物」と呼ばれる。式（Ｉ）は、以下の通りである：
【化７】
2008542214.tif 000008
【００２０】
本明細書で化合物、塩などの単語の複数形が使用される場合、これは、単数の化合物、塩なども意味すると解釈される。
【００２１】
用語Ｃ１−６アルキルは、断りの無い限り、環状、直鎖または分枝鎖（単数または複数の分枝を有する）であってよい、１個ないし６個の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基を意味する。そのような基には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチルなどが含まれる。本発明はまた、医薬的に許容し得る塩および代謝物などの、本明細書で開示される化合物の有用な形態にも関する。用語「医薬的に許容し得る塩」は、本発明の化合物の、相対的に非毒性な無機または有機酸付加塩を表す。例えば、S. M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19 参照。医薬的に許容し得る塩には、塩基として機能する主要な化合物を、無機または有機酸と反応させて、塩、例えば塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸の塩を形成させることにより得られるものが含まれる。医薬的に許容し得る塩には、また、主要な化合物が酸として機能し、適切な塩基と反応して、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびコリン塩を形成するものも含まれる。当業者は、さらに、特許請求される化合物の酸付加塩は、数々の既知方法のいずれかを介する、化合物と適切な無機または有機酸との反応により製造し得ることを認識するであろう。あるいは、アルカリおよびアルカリ土類金属塩は、本発明の化合物を様々な既知方法を介して適切な塩基と反応させることにより製造される。
【００２２】
本発明の化合物の代表的な塩には、常套の非毒性の塩および四級アンモニウム塩、例えば無機または有機の酸または塩基から当分野で周知の手段により形成されるものが含まれる。例えば、かかる酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、桂皮酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタン硫酸塩、フマル酸塩、グルコへプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、イタコン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、スルホン酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が含まれる。
【００２３】
塩基塩には、カリウムおよびナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミンおよびＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩基とのアンモニウム塩が含まれる。加えて、塩基性窒素含有基は、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチルなどの低級アルキルハロゲン化物；硫酸ジメチル、ジエチルおよびジブチルなどのジアルキル硫酸塩；および硫酸ジアミル、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルなどの長鎖ハロゲン化物、臭化ベンジルおよびフェネチルおよび他の一置換ハロゲン化アラルキルまたは多置換ハロゲン化アラルキルなどのアリールまたはアラルキルハロゲン化物などの物質で、四級化し得る。
【００２４】
本発明の目的上、溶媒和物は、溶媒分子が固体状態で複合体を形成している化合物の形態であり、例えば、エタノールおよびメタノールが含まれるがこれらに限定されない。水和物は、溶媒分子が水である、溶媒和物の特別な形態である。
【００２５】
ある種の医薬的に活性な物質は、不安定な官能基でさらに修飾でき、それは、インビボ投与後に切り離され、親の活性物質および薬理的に不活性な誘導体化基をもたらす。これらの誘導体は一般的にプロドラッグと呼ばれ、例えば、活性物質の物理化学的特性を変更し、活性物質を特定の組織に標的化し、活性物質の薬物動態および薬力学的特性を変更し、望ましくない副作用を低減するために使用できる。本発明のプロドラッグには、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはペンチルエステルを含むアルキルエステルなどの、良好に耐容される医薬的に許容し得るエステルである適切な本発明の化合物のエステルが含まれる。フェニル−Ｃ１−Ｃ５アルキルなどのさらなるエステルを使用し得るが、メチルエステルが好ましい。
【００２６】
他のプロドラッグを合成するのに使用できる方法は、その主題に関する以下の概説に記載されている。これらの合成方法の説明を、出典明示により本明細書の一部とする：
・Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975).
・Roche, E. B. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs. American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977).
・Sinkula, A. A.; Yalkowsky, S. H. J Pharm Sci. 1975, 64, 181-210.
・Stella, V. J.; Charman, W. N. Naringrekar, V. H. Drugs 1985, 29, 455-473.
・Bundgaard, H., ed. Design of Prodrugs. Elsevier: New York (1985).
・Stella, V. J.; Himmelstein, K. J. J. Med. Chem. 1980, 23, 1275-1282.
・Han, H-K; Amidon, G. L. AAPS Pharmsci 2000, 2, 1- 11.
・Denny, W. A. Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 577-595.
・Wermuth, C. G. in Wermuth, C. G. ed. The Practice of Medicinal Chemistry Academic Press: San Diego (1996), 697-715.
・Balant, L. P.; Doelker, E. in Wolff, M. E. ed. Burgers Medicinal Chemistry And Drug Discovery John Wiley & Sons: New York (1997), 949-982.
【００２７】
本発明の化合物の代謝物には、１個またはそれ以上の窒素がヒドロキシ基で置換されている式Ｉの化合物の酸化誘導体が含まれる；それは、ピリジン基の窒素原子がオキシド形である（当分野で１−オキソ−ピリジンと呼ばれる）か、または、ヒドロキシ置換基を有する（当分野で１−ヒドロキシ−ピリジンと呼ばれる）誘導体を含む。
【００２８】
一般的製造方法
本発明の化合物は、既知の化学反応、および、以下の公開された国際出願ＷＯ２００５／００９９６１に記載の方法を使用することにより製造し得る。
【００２９】
式Ｉの化合物は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ｒａｆキナーゼ、ｐ３８キナーゼ、ＶＥＧＦＲキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼの阻害を含む様々な活性を有すると過去に特徴解析された。これらの活性および様々な疾患および症状の処置におけるそれらの使用は、例えば、ＷＯ２００５／００９９６１に開示されており、それらを全体的に出典明示により本明細書の一部とする。
【００３０】
適応症
本発明の薬物の組合せは、これらの組合せを構成する化合物により調節される細胞の経路に関するか、またはそれに媒介されるいかなる疾患または症状の処置にも利用できる。これらの経路には、例えば、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、Ｒａｆ／Ｍｅｋ／Ｅｒｋ、Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋ、ＭＴＯＲ、ＰＴＥＮなどを含むシグナル伝達経路が含まれるがこれらに限定されない（上記も参照）。これらの薬物の組合せは、ＰＴＥＮ、ｒａｓ、Ｒａｆ、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋなどの癌関連突然変異を含む、これらの経路に存在する１種またはそれ以上の遺伝子の突然変異に関連するか、またはそれにより媒介される疾患の処置に有用であり得る。
【００３１】
上述の通り、これらの化合物は特異的阻害剤として知られているかもしれないが、本発明は、作用メカニズムまたはそれがいかにして達成されるかに拘わらず、いかなる改善または治療効果も含む。
【００３２】
この薬物の組合せは、抗増殖；抗腫瘍；抗血管新生；内皮または腫瘍細胞の増殖阻害；抗新生物；免疫抑制；免疫調節；アポトーシス促進などを含む活性の１つまたはそれ以上を有し得る。
【００３３】
本発明に従い処置できる症状または疾患には、増殖性障害（癌など）、炎症性障害、免疫調節性障害、アレルギー、自己免疫疾患（リウマチ性関節炎または多発性硬化症など）、異常または過剰な血管新生などが含まれる。
【００３４】
いかなる腫瘍または癌も処置でき、ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲ−ベータ、Ｆｌｔ−３、ｒａｓ、ＰＴＥＮ、Ａｋｔ、ＰＩ３Ｋ、ｍＴＯＲ並びにそれらが一部をなすシグナル伝達経路の上流または下流の任意の構成員に１個またはそれ以上の突然変異を有する癌が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍または癌は、その原因であるメカニズムに拘わらず、本発明の薬物の組合せにより処置できる。いかなる器官の癌も処置でき、例えば、結腸、膵臓、乳房、前立腺、骨、肝臓、腎臓、肺、精巣、皮膚、膵臓、胃、前立腺、卵巣、子宮、頭部および頸部、血液細胞、リンパなどの癌が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
本発明に従い処置できる癌には、特に、脳腫瘍、乳癌、骨肉腫（例えば、骨肉腫およびユーイング肉腫）、気管支の前癌状態（bronchial premalignancy）、子宮内膜癌、神経膠芽腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、ホジキン病、腎臓新生物、白血病、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ腫、レルミット・ダクロス病（Lhermitte-Duclose disease）、悪性神経膠腫、黒色腫、悪性黒色腫、転移、多発性骨髄腫、骨髄化生、骨髄芽細胞性症候群（myeloplastic syndromes）、非小細胞肺癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌（例えば、進行型、進行型難治性）、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、皮膚の扁平上皮癌、ＰＴＥＮ機能の喪失；活性化Ａｋｔに関連する癌（例えばＰＴＥＮヌル腫瘍およびｒａｓ突然変異を有する腫瘍）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３６】
乳癌の例には、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性乳管癌および非浸潤性小葉癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
呼吸管の癌の例には、小細胞、非小細胞肺癌、気管支腺腫および胸膜肺芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
脳の癌の例には、脳幹および視床下部の（hypophtalmic）神経膠腫、小脳および大脳の星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、並びに、神経外胚葉および松果体の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
雄性生殖器官の腫瘍には、前立腺癌および精巣癌が含まれるが、これらに限定されない。雌性生殖器官の腫瘍には、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、膣および外陰部の癌、並びに子宮肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
消化管の腫瘍には、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
泌尿器の腫瘍には、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
眼の癌には、眼球内黒色腫および網膜芽腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
肝臓の癌の例には、肝細胞癌腫（線維層板変異を伴うか、または伴わない肝細胞の癌腫）、胆管癌（肝内胆管癌）および混合性肝細胞性胆管癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
皮膚の癌には、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚癌および非黒色腫皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
頭頸部の癌には、喉頭、下咽頭、鼻咽頭および／または口咽頭の癌、並びに口唇および口腔の癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
リンパ腫には、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
肉腫には、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
白血病には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および有毛細胞白血病が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
腫瘍細胞の増殖の阻害に加えて、本発明の薬物の組合せは、腫瘍の退行、例えば、腫瘍のサイズまたは体内の癌の程度の低下も引き起こすことができる。
【００５０】
好ましいのは、黒色腫、腎臓癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌または膵臓癌の処置である。
【００５１】
血管新生に関連する症状および障害も、本発明の薬物の組合せで処置できる。血管新生の不適当な異所性の発現は、生物にとって有害であり得る。数々の病状が、異質な血管の成長を伴う。これらには、例えば、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、水晶体後線維増殖症、血管線維腫、炎症、再狭窄などが含まれる。加えて、癌性および新生物性組織に伴う血液供給の増加は、成長を促進し、急速な腫瘍の拡大および転移を導く。さらに、腫瘍における新しい血管の成長は、反乱細胞に脱出路を提供し、転移および結果的な癌の拡散を促進する。
【００５２】
血管新生の調節に有用なシステムには、例えば、腫瘍転移片（explants）の血管新生（例えば、米国特許第５,１９２,７４４号；第６,０２４,６８８号）、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えば、Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998）、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば、米国特許第６,０２４,６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991）、遊走アッセイおよびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）成長阻害アッセイ（例えば、米国特許第６,０６０,４４９号）が含まれる。加えて、リンパ脈管新生の調節に有用なシステムには、例えば、ウサギ耳モデル（例えば、Szuba et al., FASEB J., 16(14):1985-7, 2002）が含まれる。
【００５３】
血管新生の調節は、任意の適当な方法により測定できる。例えば、組織血管増生の程度は、典型的には、所定のサンプル中に存在する血管の数と密度を評価することにより決定する。例えば、微小血管密度（ＭＶＤ）は、強力な顕微鏡の視野中の内皮のクラスターの数を計数することにより、または、微小血管内皮に特異的なマーカーもしくは他の成長中または確立された血管のマーカー、例えばＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子またはＰＥＣＡＭとしても知られている）を検出することにより、見積もることができる。例えば、Penfold et al., Br. J. Oral and Maxill. Surg., 34: 37-41；米国特許第６,０１７,９４９号；Dellas et al., Gyn. Oncol., 67:27-33, 1997 などに記載の通り、ＣＤ３１抗体を常套の免疫組織化学的方法で用いて、組織切片を免疫染色できる。他の血管新生のマーカーには、例えば、Ｖｅｚｆ１（例えば、Xiang et al., Dev. Bio., 206:123-141, 1999）、アンジオポエチン、Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２（例えば、Sato et al., Nature, 376:70-74, 1995）が含まれる。
【００５４】
本発明の薬物の組合せは、炎症症状、冠動脈再狭窄、腫瘍関連血管新生、アテローム性動脈硬化症、自己免疫疾患、炎症、糸球体または糸球体間質細胞の増殖と関連するある種の腎臓疾患、および網膜血管増殖と関連する眼疾患、乾癬、肝硬変、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血管移植後再狭窄、ステント内狭窄、血管新生、眼疾患、肺線維症、閉塞性細気管支炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎などの広範な疾患の進行を処置または予防する幅広い治療活性も有する。
【００５５】
本発明はまた、ヒトおよび／または他の哺乳動物における以下の症状の１つまたはそれ以上の処置、予防、調節なども提供する：糖尿病性網膜症を含む網膜症、虚血性網膜静脈閉塞、早産児の網膜症および加齢関連黄斑変性；リウマチ性関節炎、乾癬、または水疱性類天疱瘡、多形性紅もしくはヘルペス状皮膚炎を含む、表皮下水疱形成を伴う水疱性障害、リウマチ熱、骨吸収、閉経後骨粗鬆症、敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症ショック、内毒素ショック、毒素性ショック症候群、全身性炎症反応症候群、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、ヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応、喘息、成人呼吸促迫症候群、急性肺線維性疾患、肺サルコイドーシス、アレルギー性呼吸器疾患、ケイ肺症、炭坑夫塵肺、肺胞傷害、肝不全、急性炎症における肝臓疾患、重篤なアルコール性肝炎、マラリア（熱帯熱マラリアおよび脳性マラリア）、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、うっ血性心不全、心臓病後の損傷、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、急性脳炎、脳傷害、多発性硬化症（多発性硬化症における脱髄（demyelation）および乏突起膠細胞の損失）、進行癌、リンパ性腫瘍、膵炎、感染、炎症および癌における創傷治癒の悪化、骨髄異形成症候群、全身性エリテマトーデス、胆汁性肝硬変、腸壊死、放射線損傷／モノクローナル抗体投与後の毒性、宿主対移植片反応（虚血性再灌流傷害、並びに、腎臓、肝臓、心臓および皮膚の同種移植片拒絶）、肺同種移植片拒絶（閉塞性気管支炎）または人工股関節全置換に起因する合併症、および、結核、消化性潰瘍疾患におけるヘリコバクターピロリ感染、クルーズ・トリパノソーマ感染に起因するシャーガス病、大腸菌感染に起因する志賀様毒素の効果、ブドウ球菌感染に起因するエンテロトキシンＡの効果、髄膜炎菌感染、並びに、ライム病菌、梅毒トレポネーマ、サイトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの感染、乳頭腫、ブラストグリオーマ（blastoglioma）、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星状細胞腫、頭部の癌、頸部の癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、血管新生、再狭窄、ステント内再狭窄、血管移植後再狭窄、肺線維症、肝硬変、アテローム性動脈硬化症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、血栓性微小血管障害症候群、移植片拒絶、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症、および、神経変性疾患、過免疫障害、血管腫、心筋血管新生、冠血管および脳の側副血管新生、虚血、角膜疾患、虹彩炎、血管新生緑内障、早産児の黄斑変性網膜症、創傷治癒、潰瘍性ヘリコバクター関連疾患、骨折、子宮内膜症、糖尿病性症状、猫ひっかき熱、甲状腺過形成、火傷後の喘息または浮腫、外傷、慢性肺疾患、卒中、ポリープ、嚢胞、滑膜炎、慢性およびアレルギー性炎症、卵巣過刺激症候群、肺および脳浮腫、ケロイド、線維症、硬変、手根管症候群、成人呼吸促迫症候群、腹水症、眼の症状、心血管症状、クロウ・深瀬（ＰＯＥＭＳ）病、クローン病、糸球体腎炎、骨関節炎、多発性硬化症、移植片拒絶、ライム病、敗血症���フォンヒッペル・リンダウ病、類天疱瘡、パジェット病、多発性嚢胞腎、サルコイドーシス、甲状腺炎、過粘稠度症候群、オスラー・ウェーバー・ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、照射、低酸素症、子癇前症、機能性子宮出血、子宮内膜症、単純ヘルペスによる感染、虚血性網膜症、角膜の血管新生、帯状疱疹、ヒト免疫不全ウイルス、パラポックスウイルス、原生動物、トキソプラズマ症、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、ベヒテレフ病、例えば血清型Ｈ５Ｎ１を含む鳥インフルエンザ、並びに腫瘍関連滲出および浮腫。
【００５６】
本発明は、式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の阻害剤である第２の化合物（例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンの誘導体もしくは類似体、または、ワートマニンまたはワートマニンの誘導体もしくは類似体）の有効量を投与することを含む、上述の疾患および／または症状（参照文献のいずれかで言及されたものを含む）のいずれを処置する方法も提供する。「有効量」は、所望の結果、例えば、疾患または症状の処置を達成するのに有用な化合物の量である。
【００５７】
本発明はまた、細胞を含む系において血管新生を阻害する方法に関し、それは、本明細書に記載の化合物の有効量の組合せをその系に投与することを含む。細胞を含む系は、患者中の腫瘍、単離された器官、組織または細胞などのインビボの系、インビトロアッセイ系（ＣＡＭ、ＢＣＥなど）、動物モデル（例えば、インビボの皮下癌モデル）、処置を必要としている宿主（例えば、血管新生成分を有する疾患、例えば癌を患っている；再狭窄を経験している宿主）などであり得る。
【００５８】
加えて、薬物の組合せを投与して、１つまたはそれ以上の以下の過程、細胞の成長（例えば、増殖）、腫瘍細胞の成長（例えば、分化、細胞の生存および／または増殖を含む）、腫瘍の退縮、内皮細胞の成長（例えば、分化、細胞の生存および／または増殖を含む）、血管新生（血管の成長）、血管新生および／または血球新生（例えば、増殖、Ｔ細胞の発達など）を調節できる。
【００５９】
本発明の化合物または薬物の組合せは、任意の形態で、例えば、経口で、非経腸で、経腸で、静脈内に、腹腔内に、局所で、経皮で（例えば、任意の標準的パッチを使用する）、眼に、鼻腔に、局所に、非経口で、例えばエアゾールで、吸入で、皮下に、筋肉内に、頬側に、舌下に、直腸に、膣に、動脈内に、および、くも膜下腔内になどを含む任意の有効な経路により投与できる。それらは、単独で、または、任意の活性または非活性成分と組み合わせて投与できる。それらは、任意の有効投与量で、例えば、約０.１ないし約２００ｍｇ／体重ｋｇで投与できる。
【００６０】
本発明の組合せは、任意の時間に、任意の有効な形態で投与できる。例えば、これらの化合物は、同時に、例えば、単一の組成物または投薬単位（例えば、両組成物を含有する丸剤または液剤）として投与できるか、または、それらは、分離した組成物として、しかし同時に投与できる（例えば、一方の薬物を静脈内投与し、他方を経口または筋肉内投与する）。これらの薬物を異なる時間に連続的に投与することもできる。作用物質は、延長された期間、例えば１２時間、２４時間にわたって所望の放出速度を達成するために、従来通りに製剤化できる。これは、適する代謝半減期を有する作用物質および／またはそれらの誘導体を使用することにより、かつ／または、制御放出製剤を使用することにより、達成できる。
【００６１】
薬物の組合せは、例えば、薬物の連合作用が、組み合わされた効果がそれらの個々の効果の代数的合計よりも大きいようなものである場合、相乗的であり得る。従って、低減された量の薬物を投与して、例えば、毒性または他の有害または望ましくない効果を低減し、かつ／または、それらの物質が単独で投与される場合と同じ量を使用するが、より大きい効力（例えば、より強力な抗増殖およびアポトーシス促進作用を有する）を達成することができる。
【００６２】
本発明の化合物または薬物の組合せは、さらに、他の適する添加物または医薬的に許容し得る担体と組み合わせることができる。そのような添加物には、既に述べた任意の物質、並びに、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro and Gennaro, eds, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2000); Theory and Practice of Industrial Pharmacy (Lachman et al., eds., 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins, 1986); Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Swarbrick and Boylan, eds., 2nd edition, Marcel Dekker, 2002）に記載のもののような、任意の常套に使用されるものが含まれる。これらは、本明細書では、それらが活性な薬物と組み合わされ、治療目的で対象に安全に投与できることを示すために、「医薬的に許容し得る担体」と呼ぶことができる。
【００６３】
加えて、本発明の化合物または薬物の組合せは、上述の疾患および／または症状のいずれかを処置するために利用される他の活性物質または療法（例えば、放射線照射）と共に投与できる。
【００６４】
本発明は、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種の疾患または障害の処置に有用なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の組合せを提供する。「組合せ」は、本発明の目的上、以下のものを含む：
−少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含有する、単一の組成物または投与形；
−少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含有する、同時または連続的に投与するための組合せパック；
−投薬単位または独立した投薬単位として相互に分離されて包装されている少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含み、それらが同時または連続的に投与されるという指示書を含むか、または含まない、キット；および、
−同時または連続的に投与されると、協同して同じ疾患の予防または処置などの治療効果を達成する、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の分離した独立の投与形。
【００６５】
組合せの各物質の投与量は、所望の治療活性を提供するために、他方並びに／または疾患のタイプおよび／もしくは病状に照らして選択できる。例えば、組合せ中の活性物質は、固定された組合せで存在および投与できる。「固定された組合せ」は、本明細書では、各成分が所望の効力を提供する固定された比率で存在する医薬形を意味することを企図する。これらの量は、特定の患者のために日常的に決定できる（この場合、様々なパラメーター（例えば、癌のタイプ、患者の年齢、病状、患者の健康状態、体重など）を利用して適切な投与量を選択する）か、または、これらの量は比較的標準的であり得る。
【００６６】
この組合せは、いずれかの化合物を単独で使用する場合よりも大きい治療効力を達成する、少なくとも１種の式Ｉの化合物および少なくとも１種のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を含むことができる。この組合せは、物質が単独で使用されると治療効果が観察されない場合、または、この組合せを投与すると効果の増強が観察される場合に、腫瘍の退縮をもたらすのに、疾患の安定性をもたらすのに、転移を防止または低減するのに、または、他の治療的エンドポイントのために、有用であり得る。
【００６７】
この組合せ中の各化合物の相対比は、それらの各々の作用メカニズムおよび疾患の生物学に基づいて選択することもできる。例えば、Ｂ−ＲＡＦ遺伝子の活性化突然変異がヒトの黒色腫の６０％以上で観察され、黒色腫の処置用の組成物は、有利には、式Ｉの化合物を、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である化合物よりも効力の高い量で含み得る。比較して、癌がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の突然変異を伴う場合（例えば、卵巣癌および乳癌）、このシグナル伝達経路において活性を有する物質は、Ｒｅｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に対してより効力の高い量で存在できる。各化合物の相対比は、幅広く多様であることができ、本発明は、式Ｉの化合物および第２の活性物質の量をいずれかがより多い量で存在するように日常的に調節できる、癌の処置用の組合せを含む。
【００６８】
必要に応じて、単一の投薬形、組合せパック、キットの場合に、または分離した独立の投薬形の場合に、組合せの１種またはそれ以上の物質の放出を制御して、所望の治療効果を提供することもできる。
【００６９】
アッセイ
本発明の組合せの活性は、任意の有効なインビトロまたはインビボの方法に従い決定できる。
【００７０】
キナーゼ活性
キナーゼ活性は、常套のアッセイ方法を使用して日常的に決定できる。キナーゼアッセイは、典型的には、キナーゼ酵素、基質、バッファーおよび検出システムの成分を含む。典型的なキナーゼアッセイは、タンパク質キナーゼのペプチド基質およびＡＴＰ、例えば３２Ｐ−ＡＴＰとの反応を含み、リン酸化された最終生成物（例えば、ペプチド基質を使用する場合、リン酸化タンパク質）を産生する。得られる最終生成物を、任意の適する方法を使用して検出できる。放射性ＡＴＰを利用する場合、アフィニティーメンブレンまたはゲル電気泳動を使用して、未反応のガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰから放射性標識リン酸化タンパク質を分離でき、次いで、オートラジオグラフィを使用してゲル上で可視化できるか、または、シンチレーションカウンターで検出できる。非放射性の方法も使用できる。方法は、リン酸化された基質を認識する抗体、例えば、抗リン酸化チロシン抗体を利用できる。例えば、キナーゼ酵素を、基質と共に、ＡＴＰおよびキナーゼバッファーの存在下、その酵素がその基質をリン酸化するのに有効な条件下でインキュベートできる。反応混合物を、例えば電気泳動的に分離でき、次いで、例えば、抗リン酸化チロシン抗体を使用するウエスタンブロットにより、基質のリン酸化を測定できる。この抗体は、例えば、ＨＲＰなどの酵素、アビジンまたはビオチン、化学発光試薬などの検出可能な標識で標識できる。他の方法は、ＥＬＩＳＡ様式、アフィニティーメンブレン分離、蛍光偏光アッセイ、発光アッセイなどを利用できる。
【００７１】
放射性様式の代替法は、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）である。この方法は、基質、例えばビオチン化ポリ（ＧｌｕＴｙｒ）を、ＡＴＰの存在下でタンパク質キナーゼによりリン酸化する、標準的なキナーゼ反応に従う。次いで、最終生成物を、ユーロピウムキレート化リン酸化型特異的抗体（抗−リン酸化チロシンまたはリン酸化セリン／スレオニン）およびビオチン化基質に結合するストレプトアビジン−ＡＰＣで検出できる。これらの２種の成分は結合すると空間的に一緒になり、リン酸化型特異的抗体からアクセプター（ＳＡ−ＡＰＣ）へのエネルギー転移が均一な様式で蛍光の読み取りをもたらす。
【００７２】
Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ活性
ｃ−Ｒａｆキナーゼアッセイは、Ｌｃｋキナーゼにより活性化（リン酸化）されたｃ−Ｒａｆ酵素を用いて実施できる。Ｌｃｋ−活性化ｃ−Ｒａｆ（Ｌｃｋ／ｃ−Ｒａｆ）を、ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ（アミノ酸３０２からアミノ酸６４８まで）およびＬｃｋ（全長）を発現するバキュロウイルスで細胞を共感染させることにより、Ｓｆ９昆虫細胞で産生する。両バキュロウイルスは、感染効率２.５で使用し、細胞を感染の４８時間後に回収する。
【００７３】
ＭＥＫ−１タンパク質は、ＧＳＴ−ＭＥＫ−１（全長）融合タンパク質を発現するバキュロウイルスにより、感染効率５で細胞を感染させ、細胞を感染の４８時間後に回収することにより、Ｓｆ９昆虫細胞で産生する。ＧＳＴ−ｃ−Ｒａｆ３０２−６４８およびＧＳＴ−ＭＥＫ−１に、同様の精製方法を使用する。
【００７４】
形質移入された細胞を、湿った細胞の生物量１００ｍｇ／ｍＬで、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７.３、０.５％ Triton X-100 およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するバッファーに懸濁する。細胞を Polytron ホモジナイザーで破砕し、３０,０００ｇで３０分間遠心分離する。３０,０００ｇの上清を GSH-Sepharose にアプライする。この樹脂を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０.０１％ Triton X-100 を含有するバッファーで洗浄する。ＧＳＴタグ付きタンパク質を、１００ｍＭグルタチオン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０.０１％ Triton X-100 を含有する溶液で溶出する。精製したタンパク質を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％グリセロールを含有するバッファーに透析する。
【００７５】
試験化合物を、原液の濃度に対して三倍希釈を使用して、典型的には、５０μＭないし２０ｎＭの範囲に、ＤＭＳＯに連続希釈する（例えば、アッセイにおける最終濃度は、１μＭないし０.４ｎＭの範囲にあり得る）。ｃ−Ｒａｆ生化学アッセイは、放射性フィルターマットアッセイとして、９６ウェルの Costar ポリプロピレンプレート (Costar 3365) 中で実施する。プレートに、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、７０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｌｃｋ／ｃ−Ｒａｆ８０ｎｇおよびＭＥＫ−１ １μｇを含有する溶液７５μＬを負荷する。続いて、連続希釈した個々の化合物２μＬを、ＡＴＰの添加に先立ち、この反応に添加する。５μＭ ＡＴＰおよび０.３μＣｉ［３３Ｐ］−ＡＴＰを含有するＡＴＰ溶液２５μＬで反応を開始する。プレートを密閉し、３２℃で１時間インキュベートした。４％リン酸５０μｌの添加により反応をクエンチし、Wallac Tomtec Harvester を使用してＰ３０フィルターマット (PerkinElmer) に回収する。フィルターマットを最初に１％リン酸で、２番目に脱イオンＨ２Ｏで洗浄する。フィルターをマイクロ波中で乾燥し、シンチレーション液に浸し、Wallac 1205 Betaplate Counter (Wallac Inc., Atlanta, GA, U.S.A.) で読む。結果をパーセント阻害として表す。
％阻害＝［１００−（Ｔｉｂ／Ｔｉ）］ｘ１００、式中、
Ｔｉｂ＝（阻害剤ありのカウント毎分）−（バックグラウンド）
Ｔｉ＝（阻害剤なしのカウント毎分）−（バックグラウンド）
【００７６】
Ｒａｆ活性は、ＥＲＫリン酸化（即ち、ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ）に至るカスケードを開始させ、リン酸化−ＥＲＫをもたらす能力により監視することもできる。Bio-Plex Phospho-ERK1/2 免疫アッセイは、以下の通りに実施できる：
【００７７】
レーザーフローサイトメトリーの基盤を使用する９６ウェルのリン酸化−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）免疫アッセイは、細胞株の基底ｐＥＲＫの阻害を測定するために確立された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、細胞５０,０００個／ウェルで９６ウェルのマイクロタイタープレートに完全増殖培地中で播く。基底ｐＥＲＫ１／２の阻害に対する試験化合物の効果について、播種の翌日、０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭにＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を移し、最終濃度３ｍＭないし１２ｎＭまで０.１％ＤＭＳＯ中で１：３希釈した試験化合物とインキュベートする。細胞を試験化合物と２時間インキュベートし、洗浄し、Bio-Plex 全細胞溶解バッファーＡに溶解する。サンプルをバッファーＢで１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、直接アッセイプレートに移すか、または、加工するまで−８０℃で冷凍する。希釈したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解液５０ｍＬを、抗−ＥＲＫ１／２抗体を結合させた約２０００個の５ミクロン Bio-Plex ビーズと、終夜、シェーカー上、室温でインキュベートする。翌日、ビオチン化リン酸化−ＥＲＫ１／２サンドイッチ免疫アッセイを実施し、各インキュベーションの間にビーズを３回洗浄し、次いで、ＰＥ−ストレプトアビジン５０ｍＬを現像剤（a developing agent）として使用する。Bio-Plex フロー細胞（プローブ）を用いて高感度で２５個のビーズを計測することにより、ｐＥＲＫ１／２の相対的蛍光単位を検出する。非処理細胞を最大値とし、細胞無し（ビーズのみ）をバックグラウンドとして、ＩＣ５０を算出する。
【００７８】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ活性
ＰＫＩ３活性は、例えば、購入できるキット（例えば、Perkin-Elmer, FlashPlate Platform), Frew et al., Anticancer Res., 14(6B):2425-8, 1994 を使用して、日常的に決定できる。ＰＫＩ３阻害剤で列挙した刊行物も参照。
【００７９】
Ａｋｔ活性
ＡＫＴは、Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を発現している昆虫細胞から、ＷＯ０５０１１７００に記載の通りに単離できる。発現している細胞を、ポリトロンを使用して、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール；ｐＨ７.５に溶解する（溶解バッファー５ｍｌ／細胞ｇ）。細胞のデブリを、２８,０００ｘｇで３０分間、遠心分離により除去する。上清を４.５ミクロンのフィルターを通して濾過し、次いで、溶解バッファーで予め平衡化したニッケルキレート化カラムに負荷する。カラムを５カラム体積（ＣＶ）の溶解バッファーで、次いで、５ＣＶの２０％バッファーＢ（ここで、バッファーＢは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール；ｐＨ７である）で洗浄する。Ｈｉｓ−タグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を、１０ＣＶを超える２０−１００％直線グラジエントのバッファーＢで溶出する。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴＩ（１３６−４８０）溶出画分を集め、バッファーＣで３倍に希釈する（ここで、バッファーＣは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７である）。次いで、サンプルを、バッファーＣで予め平衡化した Q-Sepharose HP カラムでクロマトグラフィーする。カラムを５ＣＶのバッファーＣで洗浄し、次いで、５ＣＶ１０％Ｄ、５ＣＶ２０％Ｄ、５ＣＶ３０％Ｄ、５ＣＶ５０％Ｄおよび５ＣＶの１００％Ｄで段階溶出する；ここで、バッファーＤは、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０００ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７.５である。
【００８０】
Ｈｉｓタグ付きＡＫＴＩ（ａａ１３６−４８０）を含有する分画を集め、１０−ｋＤａ分子量のカットオフの濃縮器で濃縮する。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ；ｐＨ７.５で予め平衡化した Superdex 75 ゲル濾過カラムでクロマトグラフィーする。Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ１（ａａ１３６−４８０）画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析を使用して調査する。タンパク質を集め、濃縮し、８０℃で保存する。
【００８１】
Ｈｉｓタグ付きＡＫＴ２（ａａ１３８−４８１）およびＨｉｓタグ付きＡＫＴ３（ａａ１３５−４７９）は、同様に単離および精製できる。
【００８２】
ＡＫＴ酵素アッセイ化合物を、ＡＫＴタンパク質セリンキナーゼ阻害活性について、基質リン酸化アッセイで試験できる。このアッセイは、低分子有機化合物の、ペプチド基質のセリンリン酸化を阻害する能力を調べるものである。基質リン酸化アッセイは、ＡＫＴ１、２または３の触媒ドメインを使用する。ＡＫＴ１７２および３も、Upstate USA, Inc. から購入できる。この方法は、単離された酵素がＡＴＰからビオチン化合成ペプチド（ビオチン−ａｈｘ−ＡＲＫＲＥＲＡＹＳＦＧＨＨＡ−アミド）のセリン−７２残渣へのガンマ−ホスフェートの移動を触媒する能力を測定する。基質のリン酸化は、ＷＯ０５０１１７００に記載されている以下の方法により検出できる。
【００８３】
アッセイは、３８４ウェルのＵ底白色プレートで実施する。１０ｎＭの活性化ＡＫＴ酵素を、４０分間室温で、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｕＭ ＡＴＰ、８ｕＭペプチド、０.０４ｕＣｉ［ｇ−３３Ｐ］ＡＴＰ／ウェル、１ｍＭ ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ ＤＴＴおよび１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物１μｌを含有するアッセイ量２０ｕｌ中でインキュベートする。ＳＰＡビーズミックス（ダルベッコのＭｇ２＋およびＣａ２＋を含まないＰＢＳ、０.１％ Triton X-100、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μＭ ＡＴＰ、２.５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン−被覆ＳＰＡビーズ）５０μｌの添加により反応を停止する。プレートを密閉し、ビーズを終夜かけて沈殿させ、次いでプレートを Packard Topcount Microplate Scintillation Counter (Packard Instrument Co., Meriden, CT) でカウントした。
【００８４】
用量応答についてのデータを、データ換算式１００＊（Ｕ１−Ｃ２）／（Ｃ１−Ｃ２）で算出される％対照対化合物濃度（式中、Ｕは未詳値であり、Ｃ１は、ＤＩＶＩＳＯについて得られる平均対照値であり、Ｃ２は、０.１Ｍ ＥＤＴＡについて得られる平均対照値である）として、プロットできる。データを、ｙ＝（（Ｖｍａｘ＊ｘ）Ｋ＋ｘ））（式中、Ｖｍａｘは、上側の漸近線であり、ＫはＩＣ５０である）により表される曲線にフィットさせる。
【００８５】
細胞増殖
細胞増殖アッセイの例を下記の実施例に記載する。しかしながら、増殖アッセイは、任意の適する方法により実施できる。例えば、乳癌細胞増殖アッセイは、以下の通りに実施できる。他の細胞タイプを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株と置き換えることができる。
【００８６】
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ ＭＢ−２３１、ＮＣＩ）を、１０％熱非動化ＦＢＳを添加した標準的増殖培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中、加湿インキュベーター内で培養する。細胞を、細胞３０００個／ウェルの密度で、増殖培地９０μＬ中、９６ウェル培養ディッシュに播く。Ｔ０時間ＣＴＧ値を決定するために、播種の２４時間後、CellTiter-Glo Luminescent Reagent (Promega) １００μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートする。Wallac Victor II 装置で発光を記録する。CellTiter-Glo 試薬は細胞の溶解およびＡＴＰ存在量に比例する発光シグナルの生成をもたらし、それは、今度は、存在する細胞の数に直接比例する。
【００８７】
試験化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ原液を調製する。原液をさらに増殖培地中で１：４００に希釈し、０.２５％ＤＭＳＯ中の２５μＭ試験化合物の作業原液を得る。試験化合物を、全ウェルで一定のＤＭＳＯ濃度を維持するために、０.２５％ＤＭＳＯを含有する増殖培地で連続希釈する。希釈した試験化合物６０μＬを各培養ウェルに添加し、最終体積１８０μＬとする。個々の試験化合物を含む細胞および含まない細胞を７２時間インキュベートし、以前に記載した通りにその時間でＡＴＰ依存的発光を測定し、Ｔ７２時間値を得る。場合により、ＩＣ５０値は、化合物濃度対パーセント阻害を使用して、最小二乗解析プログラムで決定できる。
％阻害＝［１−（Ｔ７２時間試験−Ｔ０時間）／（Ｔ７２時間対照−Ｔ０時間）］ｘ１００、式中、
Ｔ７２時間試験＝試験化合物存在下、７２時間でのＡＴＰ依存的発光
Ｔ７２時間対照＝試験化合物非存在下、７２時間でのＡＴＰ依存的発光
Ｔ０時間＝時間ゼロでのＡＴＰ依存的発光
【００８８】
血管新生
血管新生を研究するための１つの有用なモデルは、増殖因子（例えばＦＧＦ−１）を添加した Matrigel などの再構成された基底膜マトリックスを宿主動物に皮下注射すると、内皮細胞がマトリックスにリクルートされ、数日間で新しい血管を形成するという観察を基礎とする。例えば、Passaniti et al., Lab. Invest., 67:519-528, 1992 参照。抽出物のサンプルを様々な時間で取ることにより、血管新生を時間的に分析でき、例えば、内皮細胞のマトリックスへの遊走、内皮細胞の血管新生経路への参入、細胞の伸長および袋状空間の形成および赤血球細胞を含有する連結した線状の構造を含む機能的毛細血管の確立を含む、血管新生の全段階に関与する遺伝子の同定を可能にする。増殖因子を安定化する、かつ／または、マトリックスからのその放出を遅延させるために、増殖因子をヘパリンまたは他の安定化剤に結合させることができる。血管新生過程を増強および延長するために、マトリックスに定期的に増殖因子を再注入することもできる。
【００８９】
血管新生を研究するための他の有用なシステムには、例えば、腫瘍外植片の新血管新生（例えば、米国特許第５,１９２,７４４号；第６,０２４,６８８号）、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ（例えば、Taylor and Folkman, Nature, 297:307-312, 1982; Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140, 1255-1263, 1998）、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞アッセイ（例えば、米国特許第６,０２４,６８８号；Polverini, P. J. et al., Methods Enzymol., 198: 440-450, 1991）、遊走アッセイ、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）増殖阻害アッセイ（例えば、米国特許第６,０６０,４４９号）が含まれる。
【００９０】
本発明は、以下の特徴の１つまたはそれ以上を提供する：
式Ｉの化合物およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を投与することを含む、上述の疾患および／または症状のいずれかの処置方法。
式Ｉの化合物およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物の有効量を投与することを含む、１つまたはそれ以上の上述の活性の調節（例えば阻害）方法。
式Ｉの化合物およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤である第２の化合物を含む組合せ。
【００９１】
さらなる詳述がなくとも、当業者は先行する記載を使用して、本発明をその最大限まで利用できると考えられる。従って、以下の好ましい特別な実施態様は、単なる例示説明と解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を何ら限定するものでは決してない。上記および下記で引用する全ての特許および刊行物の全開示を、出典明示により全体的に本明細書の一部とする。
【国際調査報告】
2008542214.tif 000017
2008542214.tif 000018
2008542214.tif 000019