(57)【要約】  式Ｉの化合物：[式中、Ｒ1は、モルホリノ環の２位又は３位において８〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐のアルキル基であり、そしてＲ2はα位以外において水酸基で置換される２〜１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキルであり、Ｒ1基及びＲ2基における炭素原子の合計が、少なくとも１０であり、そして好ましくは１０〜２０である]は、表面上でバイオフィルムの形成を妨げるように使用される。当該化合物は、医療機器、例えばステント、カテーテル、及びワイヤーガイドを含む医療機器の被膜又は処理として特に有用である。
2008528160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上でのバイオフィルムの形成の防止又は低減のため、又は表面上での生きた微生物の増殖を防止又は低減するための、以下の式(Ｉ)：
【化１】
2008528160.tif 000007
[式中、
Ｒ1は、モルホリノ環の２位又は３位において８〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分枝アルキル基であり、そして
Ｒ2は、α位を除いて水酸基で置換される２〜１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、Ｒ1基及びＲ2基における炭素原子の合計が少なくとも１０であり、そして好ましくは１０〜２０である]
を有する化合物又はその塩の使用。
【請求項２】
前記化合物がデルモピノールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記表面が医療機器であるか、又は医療機器の一部を形成する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記医療機器が、外科用インプラントである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記表面がコンタクトレンズであるか、又はコンタクトレンズの一部を形成する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記表面が、液体貯蔵又はデリバリー器具である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
前記表面が、フィルター又は水デリバリーパイプである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記表面に前記化合物を染み込ませるか又は当該表面が当該化合物で被膜される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記化合物が、放出制御製剤中に存在するか、又は当該化合物の放出制御を可能にする装置内に含められる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
表面上のバイオフィルムの防止のための、式(Ｉ)を有する化合物又はその塩を含む物質の使用。
【請求項１１】
前記物質が織られている、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
手術の前に手術用器具を処理するための、請求項１に定義される化合物の使用。
【請求項１３】
請求項１に定義される化合物を染み込ませたスワブ。
【請求項１４】
請求項１に定義される化合物で被膜される、医療機器。
【請求項１５】
前記化合物がデルモピノールである、請求項１４に記載の医療機器。
【請求項１６】
前記医療機器が外科用インプラントである、請求項１４又は１５に記載の医療機器。
【請求項１７】
前記機器がコンタクトレンズである、請求項１４又は１５に記載の医療機器。
【請求項１８】
前記機器が歯科インプラント、カテーテル、ステント、ガイドワイヤー、又は整形外科用人工装具である、請求項１４又は１５に記載の医療機器。
【請求項１９】
請求項１で定義される化合物で被膜されたフィルター又は水デリバリーパイプ。
【請求項２０】
請求項１で定義される化合物で被膜された液体貯蔵又は液体デリバリー機器。
【請求項２１】
請求項１又は２で定義される化合物を含む容器であって、表面上でのバイオフィルム形成を防止又は低減するために表面を処理する際に使用するための、又は表面上での生微生物増殖を防止又は低減するための容器。
【請求項２２】
複数の密封されたパッケージを含む容器であって、各パッケージが、請求項１又は２に定義される化合物の単位用量形態を液体形態で含む、前記容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療機器及び液体を含有する貯蔵製品上でのバイオフィルム形成の防止に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、単に「有機ポリマーマトリクスに埋め込まれ、表面に付着する微生物の群生」として記載することができる(Carpentier, 1993. J. Appl. Bacteriol. 75: 499-511)。全てのバイオフィルムは、３種の基本的な成分：微生物、グリコカリックス、及び表面を含む。これらの成分のうちの一つが除かれる場合、バイオフィルムは発達しないであろう。
【０００３】
バイオフィルムは、一の細菌種により形成されうるが、バイオフィルムは、真菌、藻類、プロトゾア、破砕物、及び腐食生成物を伴う多くの種の細菌からなることが多い。バイオフィルムは、細菌及びある程度の量の水に晒されたほぼ全ての表面上で形成することができる。
【０００４】
利用可能な表面(生物又は非生物)への細菌の付着過程、及びそれに続くバイオフィルムの発達は、W. Michael Dunne Jr, Clin Microbiol Rev. 2002 Apr; 15(2): 155-66により総説される。細菌の付着は、細菌種、表面組成、環境因子、及び必須遺伝子産物などの多くの変数により影響される。
【０００５】
簡単に述べると、細菌が水性環境に付着し、そして粘性のある接着剤様の物質を分泌し始める際にバイオフィルムが形成する。当該粘性のある粘着剤様の物質は、細菌をある範囲の物質、例えば金属、プラスチック、土壌粒子、医療インプラント機器、及び組織、に固定することができる。
【０００６】
条件のあった表面とプランクトン微生物との偶然の接触を通して、一次付着が生じる。過度に単純化すると、細菌と非生物表面との間の一次付着は、非特異的(例えば、疎水性)相互作用により媒介され、一方、生きた又は失活組織(living or devitalized tissue)への付着は、特異的分子(レクチン、リガンド、又は接着)ドッキングメカニズムを介して達成される。当該段階は可逆的であり、そして細菌細胞表面と対象である条件付表面との間での相互作用を規定する生化学的変数により影響される。
【０００７】
一次付着後アンカー相が生じ、当該アンカー相において、緩く結合された生物が表面と複合体形成するエキソ多糖類を産生することにより付着を強固にし、当該表面への不可逆的付着がもたらされる。
【０００８】
細菌が不可逆的に接着されると、バイオフィルムの成熟が始まる。表面に結合された生物が活発に複製され(そして死亡し)、そして(付着細菌により生成される)細胞外成分が直近環境の有機及び無機分子と相互作用して、グリコカリックスを生成するので、バイオフィルムの全体密度及び複雑度が増加する。エキソ多糖類がグリコカリックスの(水を除いた)主要成分を形成する。グリコカリックスは、多くの種において、主に陰イオン性であり、そして外界からの攻撃から細菌を保護する一方、栄養を捕捉する。感染された生物医学インプラントの場合、グリコカリックスは、インプラントに付着された宿主誘導性炎症反応タンパク質、又は補体、フィブリノーゲン、及びグリコサミノグリカンなどのマトリックスタンパク質を含む。
【０００９】
バイオフィルムの成長能力は、直近環境における栄養の利用性、バイオフィルム内の細胞への栄養の染み込み、及び老廃物の除去により制限される。バイオフィルムを通した最適な流体力学的流れは、最外層の崩壊よりは、成長及び浸透を促進する。バイオフィルムの成熟を制御する他の因子は、内部ｐＨ、酸素浸透、炭素源、及び浸透圧を含む。限界質量において動的平衡が達成され、当該平衡状態では増殖の最外層(表面から最も遠い部分)はプランクトン生物を生じさせる。これらの生物は、バイオフィルムから自由に逃れ、そして他の表面でコロニー形成する。表面に最も近い細胞は、栄養又は浸透の欠乏、ｐＨ、ｐＯ2の低下、又は毒性代謝副産物の増加のため、不活発になるか又は死んでしまう。
【００１０】
ひとたび表面に固定されると、周囲環境条件に依存して、バイオフィルム微生物は、(ヒトを基準として)有害又は有益な様々な反応を行う。表面上の微生物バイオフィルムには、装置の損傷、製品汚染、エネルギーロス、及び医療感染の点で毎年数十億ドルの費用がかかる。従来の殺菌方法(例えば、抗生物質及び消毒)は、一つにはグリコカリックスの保護性質のためにバイオフィルム細菌に効果的でないことが多い。システムからバイオフィルム細菌を取り除くために必要とされる大量の抗菌剤は環境面で不所望であり(そして環境規制により許されていないこともあり)、そして医学上も行われていない(バイオフィルム細菌を殺菌するために必要とされる量は患者に悪影響を与えるからである)。
【００１１】
細菌の付着を遅延させる表面又は表面被膜が記載されてきたが(例えば、Shengら、Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 38:1-5)、細菌の接着を防止するものは開発されてこなかった(p1-11 , Lappin-Scott and Costerton, Microbial Biofilms 1995. Cambridge University Press)。従って、新たな戦略がバイオフィルムの形成を管理するために必要とされる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
本発明は、デルモピノール(delmopinol)、及びその誘導体が、バイオフィルム形成を防止又は低減するために使用できるか、又は非病原性(非生存性)バイオフィルム状態を保証するために使用することができるという認識に基づいている。デルモピノールは、手術器具、又は水の貯蔵若しくはデリバリー機器上でのバイオフィルムの形成を防止することを含む。
【００１３】
本発明の第一態様では、以下の式(Ｉ)：
【化１】
2008528160.tif 000003
[式中、
Ｒ1は、モルホリノ環の２又は３位において８〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、そして
Ｒ2は、α位以外で水酸基で置換される、２〜１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、Ｒ1及びＲ2基における炭素原子の合計は、少なくとも１０であり、そして好ましくは１０〜２０である]
を有する化合物、又はその塩は、表面上へのバイオフィルム形成の防止又は低減に使用されるか、又は表面上での生きた微生物増殖を防止又は低減するために使用される。
【００１４】
本発明の第二態様では、上で定義される化合物を、手術前に外科器具の処理のために使用することに関する。
【００１５】
本発明の第三態様では、上で定義される化合物を染み込ませたスワブ(swab)に関する。
【００１６】
本発明の第四態様では、上で定義される化合物で被膜された医療機器に関する。
【００１７】
本発明の第五態様では、フィルター、水デリバリーパイプ又は液体貯蔵タンクは、上で定義される化合物で被膜される。
【００１８】
本発明の第六態様では、上で定義される化合物を含む容器は、表面上でバイオフィルム形成を防止又は低減させるため、或いは表面上での生きた微生物の増殖を防止又は低減させるために表面を処理するために使用される。
【００１９】
本発明の第七態様では、容器は、複数の個別の密閉パッケージを含み、各パッケージは、上で定義される化合物の液体形態の単位投与形態を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、デルモピノール及びその誘導体が、バイオフィルム形成を防止又は低減することができ、及び/又は全ての細菌バイオフィルムが不活性である、つまり、非生存状態である、ということを保証できるという驚くべき発見に基づいている。「バイオフィルム」という用語は、本明細書に使用されるとき、当該技術分野において当該用語について認識された意味、つまり、表面に付着される微生物の群生及び関連するグリコカリックス、を指す。多くの定義が、当該技術分野に存在し、その各々が本発明の範囲内である。例えば、(上記)Carpentierは、バイオフィルムを「有機ポリマーマトリックス中に埋め込まれ、表面に付着している微生物の群生」として記載し；Costerton(1999 Science 284: 1318-1322)は、バイオフィルムを「自己生産性ポリマーマトリックス内に閉じ込められ、そして不活性の又は生きた表面に付着するする細菌細胞の構造化された群生」として定義する。Elderは(1995、Eye ９：102-109)は、「大規模エキソポリマーマトリックス(extensive exopolymer matrix)内に配置された微生物の機能共同体(function consortium)」としてより共同的な用語で記載する。
【００２１】
本発明において使用するための化合物は、上で示される一般式(Ｉ)、式中、Ｒ1は、モルホリノ環の２位又は３位で８〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、そしてＲ2は、α位以外の水酸基で置換された２〜１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、Ｒ1基及びＲ2基の炭素原子の合計が少なくとも１０であり、そして好ましくは１０〜２０である、を有する。好ましい実施態様では、当該化合物は、既知の化合物であるデルモピノール、つまり、３-(４-プロピル-ヘプチル)-４-(２-ヒドロキシエチル)モルフォリンである。
【００２２】
本発明において使用される化合物の調製は、US4894221において記載されており、当該文献の内容は本明細書に援用される。
【００２３】
以下の記載において、「バイオフィルム形成の防止又は低減」について言及される。しかしながら、本発明はまた、「活性」バイオフィルムの形成を防止又は低減するために表面を処理することを包含する。活性バイオフィルムは、生きた微生物により特徴付けられるバイオフィルムである。従って、バイオフィルム形成の防止についての言及は、生きた微生物複合体又はコロニーの形成の防止又は低減、或いはその様な複合体又はコロニーの形成の低減を含む。「低減」は、未処理の表面と比べることにより計測される。
【００２４】
当該化合物は、あらゆる表面を処理するために使用されてもよい。実際、任意の表面-動物、鉱物、又は植物(つまり、生物性又は非生物性)の表面-は、細菌のコロニー化及びバイオフィルム形成に適していることがある。例えば、コンタクトレンズ、船殻、乳製品及び石油のパイプライン、並びに様々な生物医学インプラント及び経皮投与装置の全てが挙げられる。その結果、当該化合物は、これらの任意の表面上にバイオフィルムの形成を妨げるために使用されてもよい。
【００２５】
当該化合物は、医療機器、例えば、腰などの人工関節を含む外科的インプラント、ピン、プレート、及びワイヤーなどの整形外科ハードウェア、人工/人工装具肢、心臓弁、ステント、コンタクトレンズ、及び液体、栄養、及び医薬をデリバリーするための装置、又は液体及び老廃物を取り除くための装置、例えばカテーテル上でのバイオフィルムの防止において特に有用である。誤解を避けるために、本明細書で使用される「医療機器」という用語は、美容治療において使用される装置及びインプラントを含む。当該化合物は、対象の中にインプラントされる同定及び情報タグ、又は電気チップ上にバイオフィルムが形成することを妨げるために使用されてもよい。
【００２６】
本発明の化合物は、手術器具、例えば、手術用ナイフ、手術用鋸、外科用メス、鉗子など、又は侵襲的外科手術において使用される任意の他の器具を処理するために使用されてもよい。
【００２７】
医療機器は、インプラント、つまり、対象の体内に挿入される機器であってもよい。好ましい実施態様では、当該機器は、インプラントを可能にするために体内への切開を必要とする外科的インプラントである。特に好ましい実施態様では、処理される機器は、歯科インプラント、例えば歯保持歯科用ピン又はネジである。或いは、医療機器は、体に接触するが、体内に入っていないもの、例えば、人工肢、ギブス、コンタクトレンズ、又は補聴器である。
【００２８】
コンタクトレンズの文脈では、本発明の化合物は、コンタクトレンズの表面上に染み込ませてもよい。或いは、ヒドロゲルコンタクトレンズの文脈では、当該化合物は、ヒドロゲルマトリクス中に染み込ませてもよい。或いは、当該化合物は、コンタクトレンズを貯蔵又は洗浄するために使用される溶液中に存在してもよい。
【００２９】
当該機器が埋め込まれる(又は接触される)対象は、ヒト又は動物であってもよい。つまり、獣医学での適用も本発明の範囲内である。
【００３０】
当該化合物は、通常、被処理表面又は機器上に被膜されよう。化合物を適切な物質上に被膜することができる多くの方法が存在し、スプレー被膜、照射、及び紫外線硬化が挙げられる。医療機器を生体物質で被膜するための技術は現在進んでおり、そしてこれらの技術は、本発明に適用されうる。従って、本発明は、被膜された物質、特に式Ｉの化合物で被膜された医療機器を包含する。式Ｉの化合物で被膜されたフィルター又は水デリバリーパイプは、被膜液体貯蔵機器又は液体デリバリー機器と同様に、本発明の範囲内である。 被膜される物質は、金属、プラスチック、セラミック、ポリスチレン、又はガラスであってもよい。好ましくは被膜される物質は金属、例えばステンレス鋼である。
【００３１】
本発明の化合物は、共有結合又は非共有結合で処理表面に結合されてもよい。共有結合された場合、リンカー分子は、化合物を表面へと結合させるために使用してもよい。例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は、本発明において使用されうる有用なリンカー基質である。アミノ化は、有用なリンカー分子を提供するために使用されてもよい。
【００３２】
或いは、化合物は、マトリクス、例えばポリマーマトリクス中に染み込ませてもよい。慣用される生物適合性ポリマーマトリクスは、表面上に化合物を保持するために使用されてもよい。例えば、ポリ(オルガノ)ホファゼン(poly(organo)phophazene)、親水性ヒドロゲル(例えば、２-ヒドロキシエチルメタクリレート；ＨＥＭＡ)又はシリコンベースの被膜(例えば、フルオロシリコン)は全て、医療機器上に従来の被膜として使用され、そして本発明の化合物を保持するために使用されてもよい。適切な被膜方法は、US2005/0187611に開示される。当該文献の内容は、本明細書に援用される。
【００３３】
好ましい実施態様では、医療機器は、インプラントが配置される対象に挿入又は(接触)させる前又は間に、式Ｉの化合物と接触される。より好ましくは、当該機器は、対象と接触させる前又は間にすすがれる。最も好ましくは、すすぎは、対象と接触させる直前に行われ、続いて乾燥させて当該装置上に化合物を被膜する。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様は、医療機器又は他の表面に一回適用するのに適した量の式Ｉの化合物を容器内に含む。好ましくは、容器の内表面、その内環境、及び容量(例えば、デルモピノール)は、無菌状態であり、つまり滅菌状態であり、そして実質的に病原体を含まず、その結果、手術などの医療(又は美容)手術における使用に適している。より好ましくは、外表面もまた滅菌状態である。液体を保持するために適した任意の容器が使用されてもよく、容器を密封できることが好ましい。好ましい容器は、サチェット、又はポーチであって、製造の際に無菌的に密封でき、そして必要とされる場合に切られるか又は開くことができるものである。好ましくは、サチェットは、軟質プラスチック又は金属物質から作成され、適切なサチェットは当該技術分野に知られている。別の適切な容器は、任意の物質、好ましくは硝子又はプラスチック製のボトル、ジャー、及びチューブを含む。好ましい実施態様では、容器は、コンタクトレンズの貯蔵又は洗浄用のホルダーである。異なる適用に適した容器の大きさ(その結果、所定の容量の化合物がその中に貯蔵される)は、当業者に明らかであろう。例えば、腰へのインプラントは、(標準的な)カテーテルよりも大量のデルモピノールを必要とするであろう。各容器は、「一回用」である。つまりひとたび開かれ、そして内容物が使用されると、内容物の全てが使用されたかに関わらず捨てられる。一回用は、汚染の可能性を最小限にする利点を有する。
【００３５】
本発明の化合物は、任意の適切な濃度で容器内に存在してもよい。典型的に、化合物は、０.０１％(ｗ/ｖ)〜１０％(ｗ/ｖ)、好ましくは０.１％(ｗ/ｖ)〜５％(ｗ/ｖ)及び最も好ましくは１％(ｗ/ｖ)〜３％(ｗ/ｖ)の任意の適切な濃度で容器内に存在してもよく、例えば２％(ｗ/ｖ)である。化合物は、典型的に水溶液中に存在するであろうが、他の適切な任意の溶媒、例えばアルコールが使用されてもよい。
【００３６】
式Ｉの化合物は、バイオフィルムの形成が妨げられる表面と接触させるために使用される物質上に染み込ませてもよい。当該物質は、織られていてもよいし織られていなくともよい。織布(woven material)は、典型的に表面を拭きとるために使用されよう；適切な織布の非限定的な例は、スワブ、クロス、ワイプ、又はモップを含む。織布は、天然(例えば綿)又は合成のファイバー(例えば、ナイロン)を含んでもよく、或いはその両者の組み合わせを含んでもよい。好ましい実施態様では、含侵された物質は、無菌/滅菌の「一回用」物質であり、医療環境における使用、例えば包帯、に適している。最も好ましくは、上に記載される様に物質は容器内に供給され；当該溶液は、含侵された物質のみを含んでもよく、又は(当該物質を含侵物質と接触させることに加えて、又は接触させることの代わりに)含侵された物質及び表面を洗浄するのに適した過剰量の化合物を含んでもよい。
【００３７】
式Ｉの化合物は、液体、例えば水が表面と接触される他の工業適用においても有用である。好ましい実施態様では、水又は液体デリバリー又は貯蔵システムにおいてバイオフィルムの形成を防止するように使用され、例えば水精製又は輸送システムを含み、水パイプ及び水貯蔵タンクを含む。
【００３８】
別の好ましい実施態様では、表面自体は、本発明に記載の化合物で被膜されるか、又は染み込ませられる。この実施態様は、長期間in situに留められる表面、例えば、医療機器及び上記の水又は液体デリバリーシステムに特に適切である。
【００３９】
化合物は、従来の方法で被処理表面と接触されてもよい。例えば、化合物は、溶液内で調製されてもよく、そして当該溶液は表面と接触される。
【００４０】
化合物は、上で記載されるように表面を洗浄又は拭きとるために使用されてもよい。さらに好ましい実施態様では、化合物は表面にスプレーされる。当該実施態様では、化合物は、エアロゾル缶(aerosol canister)、噴霧器スプレーボトル(atomiser spray bottle)又は他の同様の機器であって、当該化合物を含む液的に基づく霧を生成するために適した機器で調製されてもよい。これは、広い表面積を当該化合物と接触させる効果的な方法である。これはまた、複雑な形の表面、又はコンタクトレンズなどのデリケートな表面を接触させるために特に有効である。
【００４１】
化合物は、所望の効果を達成する任意の適切な形態でデリバリーされうる。化合物は、放出制御製剤中に含まれてもよく、又は当該化合物の放出制御を許容する機器内に貯蔵されてもよい。放出制御製剤は、本明細書に記載される他の任意の実施態様と組み合わせて使用されてもよく、例えば放出制御製剤は、表面に染み込まされてもよいし、又はスプレーを用いてデリバリーされてもよい。
【００４２】
本発明の化合物は、その任意の塩形態で使用されてもよい。特に、当該化合物は、その酸塩形態(例えばデルモピノールＨＣｌ)又は水溶液中に低溶解度であってもよい。その結果、化合物は、洗浄後でさえ、被処理装置の表面に保持されるであろう。
【００４３】
バイオフィルム形成を妨げるために有効な量は、当業者に容易に明らかであり、そして被処理表面に基づいて決定されてもよい。
本発明は、さらに、以下の非限定的な例で記載される。
【実施例】
【００４４】
実施例
試験表面
以下の試験材料を試験に含めた：
・外科用ステンレス鋼３１６(例えば、心臓弁)
・チタン(例えば、腰インプラント)
異なる材料を、適切な直径３０ｍｍと厚さ１ｍｍを備えるディスクとして得た。当該ディスクを次にペトリ皿の底に置いた。
【００４５】
試験化合物
デルモピノール塩酸を、２０ｍｇ/ｍｌ(２％ｗ/ｖ)の濃度になるようにＵＨＱ品質の水に溶解した。溶液を使用するまで室温で暗所に貯蔵した。
【００４６】
試験表面のデルモピノール処理
方法Ａ：試験表面を２ｍｌのデルモピノールＨＣｌの２％水溶液で処理し、そして室温で１５分間攪拌せずにおいた。全てのデルモピノール溶液をピペットを用いて取り除いた。次にウェルを、４ｍｌのリン酸カリウム緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ７.２で３回完全に洗浄した。デルモピノールのｐＫａは７.１であるので、化合物のかなりの部分は、その塩基へと変換され、当該塩基は水溶液中にかなり低い溶解度しか有さず、そして、洗浄過程の間に完全に洗浄されることはない。
方法Ｂ：試験表面を、２ｍｌのデルモピノールＨＣｌの２％水溶液で処理し、そして一晩乾燥させた。
【００４７】
微生物
新鮮な細菌菌株スタフィロコッカス・エピデルミジス(Staphylococcus epidermidis)を皮膚から単離し、そして粉乳中に-８０℃で貯蔵した。実験で使用する前日に、細菌を血液寒天培地に移し、そして９５％Ｈ2及び５％ＣＯ2にて３７℃の雰囲気下で一晩インキュベートした。コロニー形成ユニットを、血液寒天培地から回収し、そして１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７.２に懸濁して、およそ１０8細胞/ｍｌに相当する６００ｎｍで０.４の光学密度にした。
【００４８】
生存率により示される細菌懸濁液における細菌生存度は、生/死細菌生存度法(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, USA)を用いて、製品説明書に従って蛍光顕微鏡により評価された。こうして、ＳＹＴＯ９(１.５ｍｌ)及びプロピジウム・ヨージド(１.５ｍｌ)を１ｍｌの１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.２と混合した。１０μｌの一定量を、１０μｌの細胞懸濁液に加え、そして蛍光顕微鏡(ハロゲン光源及び４７０〜４９０ｎｍの励起フィルターを備えるLeitz Aristoplan 顕微鏡)において１０００×で緑/生細胞及び赤/死細胞について分析した。
全ての場合において、細胞培養の生存度は、９５％超であった。
【００４９】
付着アッセイ法
４ｍｌの細菌懸濁液を、ペトリ皿中に置かれた被膜及び非被膜試験表面の上に、４ｍｌの細菌懸濁液を加えた。細胞を６０分間３７℃で接着させた。４ｍｌの緩衝溶液で表面を３回すすぐことにより、非接着細胞を取り除いた。表面上の全ての液体を取り除き、そして接着細菌を上記のようにＳＹＴＯ９染色及びプロピジウム・ヨージド染色を用いて可視化した。１０μｌの量の混合液を表面に加えて、暗所で１０分のインキュベート後に分析した。接着細胞の顕微鏡画像を、各ディスクの１０の視野から分析した。当該画像を、顕微鏡につながれたデジタルカメラでキャプチャーし、そして別々の視野における接着細胞の数を平均化するために使用した。接着細胞の数、並びに生細胞の割合を、数学的プログラムＭＡＴＬＡＢを用いて見積もった。
【００５０】
剥離アッセイ法
接着細胞集合を、上記のようにデルモピノール被膜表面上で調製した。デルモピノールを用いて細胞が表面から取り除かれるかを試験するために、表面を３回、水中の２％デルモピノールですすぎ、続いて蛍光顕微鏡で分析した。
【００５１】
Ｉ.接着の際のデルモピノール被膜の効果
当該試験株の３回の培養を用い、そして異なる試行の平均値を表す。接着細胞の総数(生細胞及び死細胞)を表１に表す。
【００５２】
デルモピノールで被膜された表面又は非膜されていない表面への接着を比較した。数字は、デルモピノールＨＣｌの２％溶液で予め処理された又は未処理の所定の表面上における１ｍｍ2あたりの細胞数を表す。
【００５３】
【表１】
2008528160.tif 000004
【００５４】
ＩＩ.細菌生存度についてのデルモピノール被膜の効果
細菌株の３回の培養は、上で記載される様に処理され、そして異なる試行の平均値を表２に示す。
デルモピノールで被膜されるか又は被膜されない表面上の細菌の生存率の比較した。数字は、所定の試験表面上への生細胞の割合を示す。
【００５５】
【表２】
2008528160.tif 000005
【００５６】
ＩＩＩ.被処理及び未処理表面上への接着細菌の増殖
被膜された及び被膜されていない表面上で細菌が成長する能力は、各ウェルへとトリプシン酵母抽出物培地４ｍｌを加え、そして３７℃でインキュベートすることにより測定した。当該結果により、固体表面上での増殖が、デルモピノール被膜により阻害されることが示される(表３)。
【００５７】
【表３】
2008528160.tif 000006
【００５８】
結果として、デルモピノール被膜表面は、接着細胞の生存度の有意な減少を示し、そしてデルモピノールが表面に付着する細菌の成長を有意に阻害したことを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月1日(2006.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上でのバイオフィルムの形成の防止又は低減のため、又は表面上での生きた微生物の増殖を防止又は低減するための、以下の式(Ｉ)：
【化１】
2008528160.tif 000008
[式中、
Ｒ1は、モルホリノ環の２位又は３位において８〜１６個の炭素原子を含む直鎖又は分枝アルキル基であり、そして
Ｒ2は、α位を除いて水酸基で置換される２〜１０個の炭素原子を含む直鎖又は分岐アルキル基であり、Ｒ1基及びＲ2基における炭素原子の合計が少なくとも１０であり、そして好ましくは１０〜２０である]
を有する化合物又はその塩の使用。
【請求項２】
前記化合物がデルモピノールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記表面が医療機器であるか、又は医療機器の一部を形成する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記医療機器が、外科用インプラントである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記表面がコンタクトレンズであるか、又はコンタクトレンズの一部を形成する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
前記表面が、液体貯蔵又はデリバリー器具である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
前記表面が、フィルター又は水デリバリーパイプである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記表面に前記化合物を染み込ませるか又は当該表面が当該化合物で被膜される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記表面が金属、プラスチック、セラミック、ポリスチレン、又はガラスである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記表面が金属である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記化合物が、放出制御製剤中に存在するか、又は当該化合物の放出制御を可能にする装置内に含められる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
表面上のバイオフィルムの防止のための、式(Ｉ)を有する化合物又はその塩を含む物質の使用。
【請求項１３】
前記物質が織られている、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
手術の前に手術用器具を処理するための、請求項１に定義される化合物の使用。
【請求項１５】
請求項１に定義される化合物を染み込ませたスワブ。
【請求項１６】
請求項１に定義される化合物で被膜される、医療機器。
【請求項１７】
前記化合物がデルモピノールである、請求項１６に記載の医療機器。
【請求項１８】
前記医療機器が外科用インプラントである、請求項１６又は１７に記載の医療機器。
【請求項１９】
前記機器がコンタクトレンズである、請求項１６又は１７に記載の医療機器。
【請求項２０】
前記機器が歯科インプラント、カテーテル、ステント、ガイドワイヤー、又は整形外科用人工装具である、請求項１６又は１７に記載の医療機器。
【請求項２１】
請求項１で定義される化合物で被膜されたフィルター又は水デリバリーパイプ。
【請求項２２】
請求項１で定義される化合物で被膜された液体貯蔵又は液体デリバリー機器。
【請求項２３】
請求項１又は２で定義される化合物を含む容器であって、表面上でのバイオフィルム形成を防止又は低減するため又は当該表面上での生微生物増殖を防止又は低減するために当該表面の処理に使用するための前記容器。
【請求項２４】
複数の密封されたパッケージを含む容器であって、各パッケージが、請求項１又は２に定義される化合物の単位用量形態を液体形態で含む、前記容器。
【国際調査報告】
2008528160.tif 000009
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