(57)【要約】本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定に関連するＰＮＡプローブ、プローブセット、混合物、方法およびキットに関する。本発明は、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するためのプローブヌクレオ塩基配列を含む、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットのＰＮＡプローブを、提供する。本発明の１つの実施形態において、この１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである。
2008541703.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するためのプローブヌクレオ塩基配列を含む、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットのＰＮＡプローブ。
【請求項２】
前記１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項３】
前記プローブが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物および配列番号９の相補物から成る群より選択されるプローブヌクレオ塩基配列を含む、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項４】
前記ＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物である、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項５】
前記プローブが標識されていない、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項６】
前記プローブが少なくとも１つの検出可能部分で標識されている、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項７】
前記１または複数の検出可能部分が、デキストラン複合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルまたは化学発光化合物から成る群より選択される、請求項６に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項８】
前記プローブが支持体結合している、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項９】
前記プローブが自己指示性である、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項１０】
試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するのに適するＰＮＡプローブセット。
【請求項１１】
前記１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１２】
各々のＰＮＡプローブが１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットを含む、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１３】
前記セットの少なくとも１個のＰＮＡプローブが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物および配列番号９の相補物から成る群より選択されるプローブヌクレオ塩基配列を含む、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１４】
前記セットが、配列番号６をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブ、配列番号７をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブ、配列番号８をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブおよび／または配列番号９をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブを含む、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１５】
前記セットが、プローブヌクレオ塩基配列として配列番号６のＰＮＡプローブ、プローブヌクレオ塩基配列として配列番号７のＰＮＡプローブ、プローブヌクレオ塩基配列として配列番号８のＰＮＡプローブおよび／またはプローブヌクレオ塩基配列として配列番号９のＰＮＡプローブを含む、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１６】
前記セットのすべてのプローブが１またはそれ以上の検出可能部分で標識されている、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１７】
前記セットの少なくとも１個のプローブが自己指示性である、請求項１０に記載のプローブセット。
【請求項１８】
セットの少なくとも１個のプローブが支持体結合している、請求項１０に記載のプローブ前記セット。
【請求項１９】
ａ）各々が１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内のプライマー配列にハイブリダイズすることができる、１５−３０ヌクレオチド長の少なくとも２個の核酸プライマー；および
ｂ）１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内の標的配列にハイブリダイズすることができる、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの少なくとも１個のＰＮＡプローブ
を含む混合物。
【請求項２０】
前記１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２１】
ｃ）ＰＣＲ増幅反応を実施するために選択される他の試薬
をさらに含む、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２２】
内部陽性対照をさらに含む、請求項２１に記載の混合物。
【請求項２３】
ｃ）インサイチューハイブリダイゼーションアッセイを実施するために選択される他の試薬
をさらに含む、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２４】
前記少なくとも２個の核酸プライマーが各々独立して配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５である、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２５】
前記１または複数のＰＮＡプローブが、各々配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物および配列番号９の相補物から成る群より独立して選択されるプローブヌクレオ塩基配列を含む、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２６】
各々のプローブのプローブヌクレオ塩基配列が、独立して配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物である、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２７】
１または複数のＰＮＡプローブが自己指示性である、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２８】
ａ）配列番号１のプライマー；配列番号２のプライマー；配列番号３のプライマー；配列番号４のプライマー；および／または配列番号５のプライマー；および
ｂ）プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号６から成るＰＮＡプローブ；プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号７から成るＰＮＡプローブ；プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号８から成るＰＮＡプローブ；および／またはプローブヌクレオ塩基配列としての配列番号９から成るＰＮＡプローブ
を含む、請求項１９に記載の混合物。
【請求項２９】
ａ）試料を、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの１またはそれ以上のＰＮＡプローブと接触させること、ここで該１またはそれ以上のＰＮＡプローブの各々は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物および配列番号９の相補物から成る群より独立して選択されるプローブヌクレオ塩基配列を含む；および
ｂ）適切なハイブリダイゼーション条件または適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件下で、試料中の少なくとも１個の標的配列への１または複数の該ＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列のハイブリダイゼーションを測定し、その結果を試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅの存在、不在および／または量と相関させること
を含む方法。
【請求項３０】
前記１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ｃ）前記試料を、１５−３０ヌクレオチド長の少なくとも２個の核酸プライマーおよびＰＣＲ増幅反応を実施するために選択される他の試薬と接触させること；および
ｄ）１または複数の前記標的配列を含む１またはそれ以上のアンプリコンを生産するためにＰＣＲ増幅反応を実施すること
をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＣＲアッセイがエンドポイントＰＣＲアッセイまたはリアルタイムＰＣＲアッセイである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１または複数の前記ＰＮＡプローブが自己指示性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ｅ）試料を少なくとも１つの内部陽性対照と接触させること
をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）各々が１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内のプライマー配列にハイブリダイズすることができる、１５−３０ヌクレオチド長の少なくとも２個の核酸プライマー；および
ｂ）１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内の標的配列にハイブリダイズすることができる、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの少なくとも１個のＰＮＡプローブ
を含むキット。
【請求項３６】
前記１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓがＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａである、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ｃ）ＰＣＲ増幅反応を実施するために選択される他の試薬
をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
ｃ）少なくとも１つの内部陽性対照
をさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
少なくとも２個の核酸プライマーが、各々独立して、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５
である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
１または複数の前記ＰＮＡプローブが各々、
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物
から成る群より独立して選択されるプローブヌクレオ塩基配列を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
１または複数の前記ＰＮＡプローブが自己指示性である、請求項３５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年５月６日に出願された米国仮特許出願第６０／６７８，３３１号および２００６年５月４日に出願された米国特許第１１／４１８，３８７号（これらの全体が、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
ここで使用する章の標題は、構成のみを目的とするものであり、いかなる意味においても記述される対象を限定すると解釈されるべきではない。
【０００３】
１．技術分野
本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定のためなどの、微生物の検出、分析および／または定量の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．序論
Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱の成員は、最も小さく、最も単純な原核生物の１つである。この綱は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａおよびＵｒｅａｐｌａｓｍａ属からの種を含み、病原体であり得、および／または細胞培養中、あるいはある種の生成物および工程中に外因性汚染物質として存在し得る。それらの小さなサイズと堅い細胞壁が存在しないことにより、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱の成員（以下単に「Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ」と称する）は細菌汚染物質を除去するためのフィルターを容易に通り抜ける。小さなサイズのゆえに、これらの生物は限られた生合成能力を有しており、そのことがこれらを必須栄養素および補因子に関して外部供給源依存性にしている。Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの多くの種が、それゆえ、細胞内寄生生物になるように進化してきた。
【０００５】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａのすべての種が潜在的細胞培養夾雑物として危険物質とみなされる。汚染物質として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種は培養細胞に多種多様な負の作用を及ぼすことが示された。たとえばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種は、必須栄養素に関して培養細胞と競合するまたは細胞死を引き起こし得る毒素を生産することができ、それらのすべてが細胞培養の質と生産性に影響を及ぼし得る。これらの生物は、それゆえ、薬剤、ワクチンおよび他の「生物学的製剤」の生産のために連続細胞培養に依存する、生物医薬品産業にとって重大な懸念である。Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ属の成員、特にＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉも、外因性の細胞培養、生成物または工程汚染物質として実質的な懸念となっている。
【０００６】
Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの検出のための現在の培養方法は、これらの選好性生物の増殖のために必要な時間によって制限される。結果として、これらの方法を用いたＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの検出は２８日間またはそれ以上かかることがあり、今日の速いペースの医薬品製造および配給とは適合しない時間枠である。Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの検出のための迅速で単純且つ比較的安価な方法の開発は、常套的な試験および細胞培養、原材料、装置、設備等の事前対策的品質管理を可能にする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
当業者は、以下で述べる図面の説明が例示だけを目的とすることを了解する。図面の説明は、いかなる意味においても本発明の教示の範囲を限定することを意図しない。
【０００８】
特許、特許出願、記事、書物、論文およびインターネットウエブページを含むがこれらに限定されない、本明細書の中で引用するすべての参考文献および同様の資料は、そのような参考文献および同様の資料の形式に関わらず、ありとあらゆる目的のためにそれらの全体が明白に参照によりここに組み込まれる。
【０００９】
４．定義
本明細書の解釈のために、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数で使用される用語は複数も包含し、逆もまた同じである。以下で述べる何らかの定義が、参照によりここに組み込まれる書類を含む、他の何らかの書類におけるその語の用法と矛盾する場合は、以下で述べる定義に従うものとする。
【００１０】
ａ．ここで使用する、「ヌクレオ塩基」は、核酸技術を利用する、または核酸に配列特異的に結合することができるポリヌクレオ塩基鎖を生成するためにペプチド核酸技術を利用する人々に一般的に知られる、天然に生じるおよび非天然に生じる複素環式部分を指す。適切なヌクレオ塩基の非限定的な例は、以下を含む：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）。適切なヌクレオ塩基の他の非限定的な例は、図１Ａおよび１Ｂに例示されているヌクレオ塩基を含む（米国特許第６，３５７，１６３号も参照のこと）。
【００１１】
ｂ．ここで使用する、「ヌクレオ塩基配列」は、ポリヌクレオ塩基鎖の何らかのセグメント、あるいは２またはそれ以上のセグメントの集合体を指す。適切なポリヌクレオ塩基鎖の非限定的な例は、オリゴデオキシヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（たとえばＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、核酸類似体および／または核酸ミミックを含む。
【００１２】
ｃ．ここで使用する、「ヌクレオ塩基含有サブユニット」という語句は、ヌクレオ塩基を含むポリヌクレオ塩基鎖のサブユニットを指す。オリゴヌクレオチドについては、ヌクレオ塩基含有サブユニットはヌクレオチドである。ペプチドおよびタンパク質については、サブユニットはアミノ酸である。オリゴヌクレオチドおよびペプチドに関して、当業者は、他の種のポリヌクレオ塩基鎖に結合した形態のサブユニットを認識する。
【００１３】
ｄ．ここで使用する、「標的配列」は、決定しようとするポリヌクレオ塩基鎖のヌクレオ塩基配列を指す。標的配列は、ＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのｒＲＮＡのサブ配列であり得る。標的配列は、ＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのｒＤＮＡのサブ配列であり得る。標的配列は、ＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのｒＲＮＡのｃＤＮＡのサブ配列であり得る。標的配列は、ＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのゲノムＤＮＡのサブ配列であり得る。標的配列は、ＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのｍＲＮＡのサブ配列であり得る。標的配列は、核酸増幅反応から生産されるポリヌクレオ塩基鎖（アンプリコンのポリヌクレオ塩基鎖を含む）のサブ配列であり得る。核酸増幅反応の非限定的な例は、以下を含む：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、転写を介した増幅法（ＴＭＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、サイクリングプローブテクノロジー（ＣＰＴ）、ループを介した等温増幅法（ＬＡＭＰ）、線形標的等温多量体化および増幅法（ＬＩＭＡ）、およびＱβレプリカーゼ。
【００１４】
ｅ．ここで使用する、「ポリヌクレオ塩基鎖」は、ヌクレオ塩基含有サブユニットを含む完全な高分子一本鎖を指す。
【００１５】
ｆ．ここで使用する、「核酸」は、ヌクレオチドから形成される骨格を有する、ヌクレオ塩基配列含有高分子、またはポリヌクレオ塩基鎖、またはそれらの類似体を指す。好ましいヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、およびｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）である。疑わしさを避けるため、ＰＮＡは核酸ミミックであり、核酸または核酸類似体ではない。ＰＮＡはヌクレオチドから形成されないので、核酸ではない。
【００１６】
ｇ．ここで使用する、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号および同第６，３５７，１６３号においてペプチド核酸と称されるまたはペプチド核酸として特許請求されるポリヌクレオ塩基鎖またはポリヌクレオ塩基鎖のセグメントを含むが、これらに限定されない、２またはそれ以上のＰＮＡサブユニットを含むポリヌクレオ塩基鎖またはポリヌクレオ塩基鎖のセグメントを指す。
【００１７】
「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語はまた、以下の公表文献の中で述べられている核酸ミミックの２またはそれ以上のサブユニットを含むポリヌクレオ塩基鎖またはポリヌクレオ塩基鎖のセグメントにも適用されるものとする：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １：５  ５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：  １２６９−１２７２（２００１）；および国際公開番号第ＷＯ９６／０４０００号に開示されているＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．のｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭｓ）。
【００１８】
一部の実施形態では、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、式：
【００１９】
【化１】
2008541703.tif 000003
［式中、各々のＪは、同じかまたは異なり、Ｈ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから成る群より選択される。各々のＫは、同じかまたは異なり、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１から成る群より選択される。各々のＲ１は、同じかまたは異なり、場合によりヘテロ原子あるいは置換または非置換アリール基を含み得る、１−５個の炭素原子を有するアルキル基である。各々のＡは、単結合、式：−（ＣＪ２）ｓ−の基および式：−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−の基［式中、Ｊは上記で定義ｓタンパク質とおりであり、各々のｓは１−５の整数である］から成る群より選択される。各々のｔは１または２であり、および各々のｕは１または２である。各々のＬは、同じかまたは異なり、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、Ｎ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、他の天然に生じるヌクレオ塩基類似体および他の非天然に生じるヌクレオ塩基（たとえば図１Ａおよび１Ｂ）から独立して選択される。］
の２またはそれ以上の共有結合サブユニットを含むポリヌクレオ塩基鎖またはポリヌクレオ塩基鎖のセグメントである。
【００２０】
一部の実施形態では、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合を通してＮ−［２−（アミノエチル）グリシン骨格のＮ−α−グリシル窒素に結合した天然に生じるまたは非天然に生じるヌクレオ塩基であり得る；これは、現在最も一般的に使用される形態のペプチド核酸サブユニットである。
【００２１】
ｈ．ここで使用する、「標識」、「レポーター部分」または「検出可能部分」という用語は、交換可能であり、ポリヌクレオ塩基鎖または抗体を装置または方法によって検出可能にするために、ポリヌクレオ塩基鎖または抗体に結合することができる、またはさもなければレポーター系において使用できる部分を指す。たとえば標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを与える；（ｉｉ）第二標識と相互作用して、第一または第二標識によって与えられる検出可能なシグナルを修飾する；または（ｉｉｉ）捕獲機能（たとえば疎水親和性、抗体／抗原、イオン錯体形成）を付与する、何らかの成分であり得る。
【００２２】
ｉ．ここで使用する、「配列特異的に」は、水素結合を通した塩基対合によるハイブリダイゼーションを指す。標準塩基対合の非限定的な例は、チミンまたはウラシルとアデニンの塩基対合およびシトシンとグアニンの塩基対合を含む。塩基対合モチーフの他の非限定的な例は、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルまたは２−チオチミンのいずれかとアデニンの塩基対合；５−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシンのいずれかとグアニンの塩基対合；ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかとシトシンの塩基対合；２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）のいずれかとチミンまたはウラシルの塩基対合；および万能塩基であるＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）と、たとえばアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）またはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかのような、他の何らかのヌクレオ塩基との塩基対合を含むが、これらに限定されない（Ｓｅｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．：２８（１７）：３２２４−３２３２（２０００）参照）。
【００２３】
ｊ．ここで使用する、「キメラ」または「キメラオリゴマー」という用語は、異なるクラスのサブユニットから選択される２またはそれ以上の結合サブユニットを含むポリヌクレオ塩基鎖を指す。たとえばＰＮＡ／ＤＮＡキメラは、少なくとも１個の２’−デオキシリボ核酸サブユニットに結合した少なくとも１個のＰＮＡサブユニットを含み得る（ＰＮＡ／ＤＮＡキメラの作製に関する例示的な方法および組成物については、国際公開番号第ＷＯ９６／４０７０９号参照）。キメラの例示的な成分サブユニットは、ＰＮＡサブユニット、天然に生じるアミノ酸サブユニット、ＤＮＡサブユニット、ＲＮＡサブユニットおよび核酸の類似体またはミミックのサブユニットから成る群より選択され得る。
【００２４】
ｋ．ここで使用する、「連結高分子」という用語は、リンカーによって連結されている２またはそれ以上のポリマーセグメントを含むポリヌクレオ塩基鎖を指す。連結高分子を形成するように連結され得るポリマーセグメントは、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド、ポリアミド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびキメラから成る群より選択され得る。
【００２５】
ｌ．ここで使用する、「ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ」または「Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ」という用語は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａ属の１またはそれ以上の種を指す。
【００２６】
ｍ．ここで使用する「固体支持体」または「固体担体」は、その上でポリヌクレオ塩基を合成する、結合する、連結するまたはさもなければ固定化することができる何らかの固相材料を指す。固体支持体は、「樹脂」、「固相」、「表面」および「支持体」などの用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミ供与体どの有機ポリマー、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトで構成され得る。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、または逆相シリカなどの無機物であり得る。固体支持体の形状は、ビーズ、スフェア、粒子、顆粒、ゲルまたは表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウエル、くぼみまたは他の入れ物、容器、特徴または位置の形態で構成され得る。複数の固体支持体を、ロボットによる試薬の送達のためにまたはレーザー照射による走査および共焦点または偏向集光（ｄｅｆｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｇａｔｈｅｒｉｎｇ）を含む検出手段によって指定可能な、様々な位置のアレイに構成することができる。
【００２７】
ｎ．ここで使用する、「支持体結合」は、固体支持体上でのまたは固体支持体への固定化を指す。固定化は、たとえば供給結合による、静電固定化による、リガンド／リガンド相互作用を通した結合による、接触によるまたは表面への沈着によるものを含む、何らかの手段によって起こり得ることは了解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
５．詳細な説明
Ｉ．全般：
この「全般」の章で以下に述べる考察は、ここで述べる本発明の様々な実施形態の一部または全部に関係し得ることが了解されるべきである。「または」の使用は、異なる記載がない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（包含する）」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，ｉｎｃｌｕｄｅ，ｉｎｃｌｕｄｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）は交換可能であり、限定を意図しない。様々な実施形態の説明が「含む」という用語を使用する場合、当業者が、一部の特定の場合、実施形態が「基本的に〜から成る」または「から成る」という言語を使用して選択的に表わされ得ることを理解することはさらに了解される。
【００２９】
ＰＮＡ合成
ＰＮＡの化学的構築のための方法は周知である（たとえば米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号および同第６，１０７，４７０号参照）。ＰＮＡ合成方法についての一般的な参考文献として、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）参照。
【００３０】
ペプチド核酸の支持体結合自動化学的構築のための化学物質および装置は入手可能である。標識および非標識ＰＮＡオリゴマーも同様に、注文に従って作製されるＰＮＡオリゴマーの商業的販売者から入手可能である。ＰＮＡの化学的構築は固相ペプチド合成に類似しており、構築の各々のサイクルで、オリゴマーは、伸長するポリマーに付加される次のシントンと縮合することができる反応性アルキルアミノ末端を有する。標準ペプチド化学を利用するので、天然および非天然アミノ酸はＰＮＡオリゴマーに常套的に組み込むことができる。ＰＮＡはポリアミドであるので、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。標的配列への逆方向結合（好ましい方向）に適するハイブリダイゼーションプローブの設計のために、ＰＮＡプローブのプローブするヌクレオ塩基配列のＮ末端は、等価ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端の等価物である。しかし、ＰＮＡオリゴマーはまた、核酸および他のＰＮＡオリゴマーの両方に平行方向で結合することが知られているので、ハイブリダイゼーションの方向は限定ではない。
【００３１】
ＰＮＡ標識：
ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，３５５，４２１号、同第６，３６１，９４２号および同第６，４８５，９０１号に述べられているか、またはさもなければＰＮＡ合成の技術分野において周知である。ＰＮＡオリゴマーを標識するための他の非限定的な方法はまた、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）においても論じられている。ＰＮＡオリゴマーおよびオリゴヌクレオチドはまた、米国特許第６，１９７，５１３号に述べられているようにタンパク質（たとえば酵素）およびペプチドで標識することもできる。それゆえ、様々な標識ＰＮＡオリゴマーを作製するまたは市販の販売者から購入することができる。
【００３２】
核酸合成および修飾
核酸オリゴマー（オリゴヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド）の合成は常套的となってきた。核酸合成の詳細な説明については、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ参照。当業者は、標識および非標識オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの合成類似体）の両方が容易に入手可能であることを認識する。それらは、市販の装置と試薬を用いて合成できるかまたは注文に応じて生産されるオリゴヌクレオチドの商業的販売者から購入することができる。
【００３３】
キメラ合成および修飾
ＰＮＡキメラは、核酸とペプチド核酸サブユニットの組合せである。ＰＮＡキメラの合成、標識および修飾のための適切な参考文献は、米国特許第６，０６３，５６９号に認められる。さらに、ＰＮＡ合成および標識に関して上述した方法は、しばしばＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を修飾するために利用できる。加えて、核酸の合成および標識のための周知の方法が、しばしばＰＮＡキメラの核酸部分を修飾するために利用できる。それゆえ、ＰＮＡキメラの合成、標識および修飾は、当業者に公知の方法ならびに上記で述べたまたは参照した方法を利用することができる。
【００３４】
標識
本発明の実施形態において使用されるポリヌクレオ塩基鎖（たとえばＰＮＡプローブ）または抗体を標識するために使用できる検出可能部分（標識）の非限定的な例は、デキストラン複合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルまたは化学発光化合物を含み得る。他の適切な標識試薬および結合の好ましい方法は、ＰＮＡ、ペプチドまたは核酸合成の当業者に認識される。
【００３５】
ハプテンの非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニンおよびビオチンを含む。
【００３６】
蛍光色素（発蛍光団）の非限定的な例は、５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）染料、シアニン３（Ｃｙ３）染料、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）染料、シアニン５（Ｃｙ５）染料、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）染料、シアニン７（Ｃｙ７）染料、シアニン９（Ｃｙ９）染料（シアニン染料、２、３、３．５、５および５．５はＡｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬからＮＨＳエステルとして入手可能である）またはＡｌｅｘａ染料シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。
【００３７】
酵素の非限定的な例は、ポリメラーゼ（たとえばＴａｑポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、シークエナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼを含む。
【００３８】
エネルギー転移
一部の実施形態では、ポリヌクレオ塩基鎖をエネルギー転移セットで標識することができる。エネルギー転移がハイブリダイゼーションを測定する上で有用であるためには、少なくとも１個のエネルギー転移供与体と少なくとも１個のエネルギー転移受容体部分を含むエネルギー転移セットが存在すべきである。しばしばエネルギー転移セットは１個の供与体部分と１個の受容体部分を含むが、これは限定ではない。エネルギー転移セットは、２個以上の供与体部分および／または２個以上の受容体部分を含み得る。供与体と受容体部分は、１またはそれ以上の受容体部分が１またはそれ以上の供与体部分から転移されたエネルギーを受容するようにまたはさもなければ供与体部分からのシグナルを消光するように作動する。それゆえ一部の実施形態では、供与体部分と受容体部分の両方が発蛍光団である。先に列挙した発蛍光団（適切なスペクトル特性を有する）もエネルギー転移受容体として機能し得るが、受容体部分はまた、４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ））などの非蛍光消光剤部分であり得る。エネルギー転移セットの標識は、ポリヌクレオ塩基鎖の末端で連結され得るかまたはポリヌクレオ塩基鎖内の部位で連結され得る。たとえばエネルギー転移セットの２つの標識の各々は、ポリヌクレオ塩基鎖の最も遠位の末端で連結され得る。
【００３９】
供与体と受容体部分の間のエネルギーの転移は、エネルギー転移セットの密接に会合する部分の衝突、または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などの無放射工程のような、何らかのエネルギー転移工程を通して起こり得る。ＦＲＥＴが起こるために、エネルギー転移セットの供与体と受容体部分の間でのエネルギーの移動は、２つの部分が空間的に近接することおよび供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと実質的な重複を有することを必要とする（Ｙａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特にｐａｇｅ  ２３２，ｃｏｌ．  １  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｇｅ  ２３４，ｃｏｌ．１参照）。あるいは、衝突を介した（無放射）エネルギー転移は、供与体部分の発光スペクトルが受容体部分の吸収スペクトルと実質的な重複を有するか否かに関わらず、極めて密接に会合する供与体と受容体部分の間で起こり得る（Ｙａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特にｐａｇｅ  ２２９，  ｃｏｌ．  １  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｇｅ  ２３２，ｃｏｌ．１参照）。この工程は、消光が供与体と受容体部分の直接接触によって引き起こされると考えられるので、分子内衝突と称される（Ｙａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．参照）。エネルギー転移はまた、作用機構がまだ記述されていない工程を通して起こり得る。本出願におけるエネルギー転移への言及はこれらの機構的に異なる現象のすべてを包含することが了解されるべきである。また、エネルギー転移が同時に２つ以上のエネルギー転移工程を通して起こり得ること、および検出可能なシグナルの変化が２またはそれ以上のエネルギー転移工程の同時および／または連続作用の測定であり得ることも了解されるべきである。従って、エネルギー転移の機構は本発明の実施形態への限定ではない。
【００４０】
自己指示性ポリヌクレオチド鎖におけるエネルギー転移の検出
エネルギー転移セットで標識したとき、我々はポリヌクレオ塩基鎖を自己指示性（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ”と称する）。自己指示性核酸オリゴマーの非限定的な例は、米国特許第６，１０３，４７６号、同第６，１５０，０９７号および同第６，３６５，７２９号に述べられている。自己指示性ＰＮＡオリゴマーの非限定的な例は、米国特許第６，３５５，４２１号、同第６，４８５，９０１号、同第６，５２８，２６７号および同第６，６４９，３４９号に述べられている。一部の場合には、自己指示性オリゴマーは核酸増幅反応におけるプライマーとして使用できる（たとえば米国特許第５，８６６，３６６号、同第６，０９０，５５２号、同第６，１１７，６３５号および同第６，３６５，７２９号）。
【００４１】
自己指示性オリゴマーと標的配列の間での雑種形成は、オリゴマーがハイブリダイズしていない状態で存在するときと比較して、ハイブリダイゼーション複合体が形成されたとき検出可能に異なるエネルギー転移セットの少なくとも１つの成員の少なくとも１つの物理的性質を測定することによって観測できる。我々はこの現象をポリヌクレオ塩基鎖の自己指示特性と称する。検出可能シグナルのこの変化は、標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーションによって引き起こされる供与体と受容体部分の間でのエネルギー転移の効率の変化から生じる。
【００４２】
たとえば検出手段は、エネルギー転移セットの供与体の蛍光または受容体発蛍光団を測定することを含み得る。一部の実施形態では、エネルギー転移セットは、供与体発蛍光団の蛍光の測定が、標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定または定量するために使用できるように、少なくとも１個の供与体発蛍光団と少なくとも１個の受容体（蛍光または非蛍光）消光剤を含み得る。たとえば標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーション後に供与体発蛍光団の蛍光の測定可能な上昇が存在し得る（図２参照）。
【００４３】
一部の実施形態では、エネルギー転移セットは、少なくとも１個の供与体部分または１個の受容体部分のいずれかまたは両方の蛍光の測定が、標的配列への自己指示性オリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定または定量するために使用できるように、少なくとも１個の供与体発蛍光団と少なくとも１個の受容体発蛍光団を含み得る。
【００４４】
自己指示性ＰＮＡオリゴマーはインサイチューハイブリダイゼーションにおいて使用できる。自己指示性ＰＮＡオリゴマーはまた、リアルタイムまたは終点での核酸増幅反応の分析のために有用である。
【００４５】
検出可能なおよび独立して検出可能な部分／マルチプレックス（多重）分析
マルチプレックスハイブリダイゼーションアッセイが本発明の実施形態に従って実施できる。マルチプレックスアッセイでは、多数の対象条件を同時に検討することができる。マルチプレックスアッセイは、アッセイの間またはアッセイが完了した後に、試料成分またはそれに関連するデータを分類する能力に基づく。本発明の様々な実施形態では、１またはそれ以上の異なる独立して検出可能な部分が、アッセイで使用される２またはそれ以上の異なるプローブを標識するために使用できる。独立して検出可能な部分の各々を識別するおよび／または定量する能力は、異なって（独立して）標識されたプローブの各々の特定標的配列へのハイブリダイゼーションと相関するデータを、試料中で検出しようとする各々の生物（たとえばｍｏｌｌｉｃｕｔｅ）の存在、不在および／または量と相関させることができるので、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段を提供する。その結果として、本発明のマルチプレックスアッセイは、同じ試料および同じアッセイにおいて２またはそれ以上の異なる生物（たとえばｍｏｌｌｉｃｕｔｅ）の存在、不在および／または量を同時に検出するために使用できる。たとえばマルチプレックスアッセイは、各々が独立して検出可能な発蛍光団、または独立して検出可能な発蛍光団のセットで標識されている、２またはそれ以上のＰＮＡプローブを使用することができる。
【００４６】
スペーサー／リンカー部分
一般に、スペーサーは、かさの高い標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に及ぼし得る有害作用を最小限に抑えるために使用される。リンカーは、典型的にはポリヌクレオ塩基鎖に柔軟性とランダム性を誘導するまたはさもなければポリヌクレオ塩基鎖の２またはそれ以上のヌクレオ塩基配列を連結する。ここで述べるポリヌクレオ塩基鎖のための好ましいスペーサー／リンカー部分は、１またはそれ以上のアミノアルキルカルボン酸（たとえばアミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（たとえばリシンまたはオルニチンの側鎖）、天然アミノ酸（たとえばグリシン）、アミノオキシアルキル酸（たとえば８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（たとえばコハク酸）、アルキルオキシ二酸（たとえばジグリコール酸）またはアルキルジアミン（たとえば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）を含み得る。スペーサー／リンカー部分はまた、付随的にまたは意図的に、ポリヌクレオ塩基鎖の水溶解度を改善するように構築され得る（たとえばＧｉｌｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）および米国特許第６，３２６，４７９号および同第６，７７０，４４２号参照）。
【００４７】
たとえばスペーサー／リンカー部分は、式：−Ｙ−（Ｏｍ−（ＣＷ２）ｎ）ｏ−Ｚ−を有する１またはそれ以上の連結化合物を含み得る。Ｙ基は、単結合、−（ＣＷ２）ｐ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＷ２）ｐ−、−Ｃ（Ｓ）（ＣＷ２）ｐ−および−Ｓ（Ｏ２）（ＣＷ２）ｐから成る群より選択され得る。Ｚ基は、式ＮＨ、ＮＲ２、ＳまたはＯを有し得る。各々のＷは、独立してＨ、Ｒ２、−ＯＲ２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得る［式中、各々のＲ２は、−ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ２ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ（ＣＸ３）２および−Ｃ（ＣＸ３）３
から成る群より独立して選択され得る。各々のＸは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得る］。各々のｍは、独立して０または１であり得る。各々のｎ、ｏおよびｐは、独立して０−１０の整数であり得る。
【００４８】
ハイブリダイゼーション条件／ストリンジェンシー
核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを課するまたは制御するために一般的に使用される因子が、ホルムアミド濃度（または他の化学的変性試薬）、塩濃度（すなわちイオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、洗浄剤濃度、ｐＨおよびカオトロッピック剤の存在または不在を含むことを認識する。プローブ／標的の組合せのための最適ストリンジェンシーは、しばしば上記ストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、次に１個のストリンジェンシー因子を変化させることの影響を測定する周知の手法によって見出され得る。ＰＮＡのハイブリダイゼーションがイオン強度と全く無関係であることを除き、同じストリンジェンシー因子を、ＰＮＡの核酸へのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御するように調節することができる。アッセイのための最適ストリンジェンシーは、所望識別度が達成されるまで各々のストリンジェンシー因子を検討することによって実験的に決定され得る。
【００４９】
適切なハイブリダイゼーション条件
一般に、核酸汚染物質を生じさせるバックグラウンドが標的配列とより密接に関連するほど、ストリンジェンシーをより慎重に制御しなければならない。ブロッキングプローブも、単なるストリンジェンシー因子の最適化によって可能な限界を超えて識別を改善するための手段として使用できる。適切なハイブリダイゼーション条件は、それゆえ、アッセイが正確で（アッセイに関して所望する許容範囲内で）再現性のある結果を生じるように、所望識別度が達成される条件を含む。常套的な実験とここで提供する開示だけを助けとして、当業者は、ここで開示する方法、キットおよび組成物を使用してアッセイを実施するための適切なハイブリダイゼーション条件を容易に決定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件は、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションならびにリアルタイムＰＣＲ反応におけるようなプライマー部位へのプライマーのハイブリダイゼーションの両方に適用できる。適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件は、インサイチューハイブリダイゼーション手順を実施するために適切な条件を含む。それゆえ、適切なハイブリダイゼーションまたは適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件は生物学的技術分野において周知であり、所望識別レベルを達成するための特定条件は、付加的な常套的実験を伴ってまたは伴わずに、ここで提供する開示を用いて達成することができる。
【００５０】
ブロッキングプローブ
ブロッキングプローブは、プローブポリマーのプローブヌクレオ塩基配列の非標的配列への結合を抑制するために使用できる核酸または非核酸プローブ（たとえばＰＮＡプローブ）である。ＰＮＡオリゴマーはブロッキングプローブであり得る（Ｃｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，１１０，６７６号参照）。典型的には、ブロッキングプローブはプローブヌクレオ塩基配列と密接に関連し、好ましくはプローブヌクレオ塩基配列と比較して点突然変異を含む。ブロッキングプローブは、非標的配列へのハイブリダイゼーションによって機能し、それにより、プローブヌクレオ塩基配列と非標的配列の間のハイブリダイゼーションによって形成されるよりも熱力学的に安定な複合体を形成すると考えられる。より安定で好ましい複合体の形成は、プローブヌクレオ塩基配列と非標的配列の間のより不安定で好ましくない複合体の形成をブロックする。それゆえ、ブロッキングプローブは、存在し得るおよびアッセイの成績に干渉し得る非標的配列へのＰＮＡプローブの結合を抑制するために本発明の様々な実施形態に関して使用できる。ブロッキングプローブは単一点突然変異の識別に適用することができる。
【００５１】
プローブヌクレオ塩基配列
ポリヌクレオ塩基鎖のプローブヌクレオ塩基配列は、構築物の特異的配列認識部分である。たとえばＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列は、標的配列の存在、不在および／または量が試料中の生物（たとえばｍｏｌｌｉｃｕｔｅ）の存在、不在および／または量を測定するために使用できる、標的配列に配列特異的にハイブリダイズするように設計されたヌクレオ塩基の配列である。それゆえ、選択アッセイ様式のためのＰＮＡプローブの必要条件を十分に考慮して、プローブのプローブヌクレオ塩基配列の長さは、一般に、適切なハイブリダイゼーション条件または適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件下でＰＮＡプローブと標的配列の間に安定な複合体が形成されるように選択される。
【００５２】
プローブ複合体
一部の実施形態では、２個のプローブが一緒になって標的配列にハイブリダイズするように設計することができ、それにより、各々のプローブのヌクレオ塩基配列は、アッセイにおいて検出しようとする生物の完全な標的配列へのハイブリダイゼーションのために必要なプローブヌクレオ塩基配列の半分または約半分を含む。非限定的な例として、２個のプローブのプローブヌクレオ塩基配列は、参照によりここに組み込まれる、Ｈ．Ｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，による、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｊａｃｅｎｔｌｙ  ａｎｎｅａｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ”と題する米国特許第６，０２７，８９３号に述べられているように設計し得る。この方法を使用して、標的配列にハイブリダイズするプローブを標識してもよくまたは標識しなくてもよい。しかし、検出されるのは、隣接プローブのアニーリングによって形成されるプローブ複合体である。ＰＮＡプローブだけから成る同様の組成物が米国特許第６，２８７，７７２号に述べられている。
【００５３】
連結高分子
一部の実施形態では、連結高分子をプローブとして使用することができる。先に定義したように、連結高分子は、リンカーによって連結された２またはそれ以上の高分子セグメントを含むポリヌクレオ塩基鎖を指す。従って、一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは２個のヌクレオ塩基配列を含むように設計することができ、それにより２個のヌクレオ塩基配列の各々は、アッセイにおいて検出しようとする生物の完全な標的配列へのハイブリダイゼーションのために必要なプローブヌクレオ塩基配列の半分または約半分を含む。３個以上の高分子セグメントを使用する場合は、連結高分子セグメントの２またはそれ以上を、様々なセグメントの集合体ヌクレオ塩基配列がアッセイにおいて検出しようとする生物の標的配列へのハイブリダイゼーションのために必要なプローブヌクレオ塩基配列を含むように組み合わせることができる。
【００５４】
プローブ
様々な実施形態において、ポリヌクレオ塩基鎖は核酸増幅反応におけるプライマーとして使用することができる。プライマーはオリゴヌクレオチドであり得る。プライマーはＰＮＡ／ＤＮＡキメラであり得る。一部の実施形態では、プライマーは標識することができる。一部の実施形態では、プライマーは非標識であり得る。プライマーは、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応において使用できる。
【００５５】
非対称および非同調（Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）ＰＣＲ
一部の実施形態では、非対称または非同調ＰＣＲはアッセイにおいて使用することができる。非対称ＰＣＲは、米国特許第５，０６６，５８４号の中でＧｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によって述べられており、米国特許第６，４８５，９０１号および６，６４９，３４９号では自己指示性プローブと組み合わせて使用されている。非同調ＰＣＲは、国際公開番号第ＷＯ０１／９４６３８号の中でＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．によって記述されている。どちらの場合も、増幅反応は二本鎖鋳型のポリヌクレオ塩基一本鎖を他方の鎖よりも多く生産し、過剰に生産されるポリヌクレオ塩基鎖が標的配列を含む。
【００５６】
内部陽性対照
一部の実施形態では、内部陽性対照（ＩＰＣ）を増幅アッセイに含め得る。ＩＰＣはプライマー、プローブおよび標的ＤＮＡの独立したセットで構成され得る。ＩＰＣは、アッセイにおいて増幅が起こったことを確認するために含めることができる。反応において増幅が起こったことを確認することにより、陰性結果が得られた場合に増幅の失敗を除外することが可能である。ＩＰＣの増幅は、別個のチューブまたはウエルにおいてあるいはＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出するプローブおよびプライマーの１またはそれ以上と一緒に実施し得る。標的ＤＮＡは、プラスミドにクローニングし得るかまたはオリゴヌクレオチドであり得る。内部陽性対照は市販のものが入手可能である。
【００５７】
ＩＩ．本発明の様々な実施形態
ａ．ＰＮＡプローブ：
一部の実施形態では、本発明は１またはそれ以上のＰＮＡプローブを対象とする。１またはそれ以上のＰＮＡプローブは、試料中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａおよび／またはＵｒｅａｐｌａｓｍａなど）を測定するために選択できる。測定は、試料中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａおよび／またはＵｒｅａｐｌａｓｍａ種を検出する、同定するおよび／または定量することを含み得る。１またはそれ以上のＰＮＡプローブは、対象生物内に存在するか否かに関わらず、核酸の分析のために使用することができる。従って、本発明は、生物の分析（たとえばインサイチュー分析）のためならびに対象生物からのまたは対象生物に由来する核酸抽出物の分析（たとえばＰＣＲ分析）のために使用することができる。それゆえ、標的配列の供給源は限定ではない。
【００５８】
【表１】
2008541703.tif 000004
注：
１）ヌクレオ塩基配列は、核酸については５’−３’方向、およびＰＮＡについてはＮ末端からＣ末端方向に示している。
２）ＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよびＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱の関連種の検出のための公表されている既存のＰＣＲプライマー配列と本発明の核酸プライマー配列の類似性を決定するため、データベースの検索を実施した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）より入手可能な「２個の配列の整列」機能を使用して、配列番号１−９を５０個以上の公開Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ標的プライマーのセット（Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔ  ａｎｄ  Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ，１９９４；Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｕｐｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｄｒｅｘｌｅｒ，１９９９；ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４）と比較した。配列番号２、３、５および６−９は、スクリーニングしたプライマーのいずれとも重複しなかったが、配列番号１および４は公知のプライマーといくぶんかの相同性を示した。
【００５９】
一般に、本発明はＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定のために有用であり得る。ＰＮＡプローブは、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの種の１またはそれ以上の属の特異的測定のために有用であるプローブヌクレオ塩基配列を含み得る。１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓにおいて標的配列を検出するのに適する様々なＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列を表１の配列番号６−９に列挙する。そこで、一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物を含み得る。配列番号１−５として同定するプライマーと組み合わせて、表２に列挙する生物を測定するために１またはそれ以上のＰＣＲ増幅反応を実施することができる。表２は、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ綱に属する１００以上の種の生物を特定する。
【００６０】
一部の実施形態では、１またはそれ以上のＰＮＡプローブは、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの長さを有し得る。一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは、１３−１８ヌクレオ塩基含有サブユニットの長さを有し得る。一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは、１５−１７ヌクレオ塩基含有サブユニットの長さを有し得る。一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは、表１に列挙する正確なヌクレオ塩基配列を有するように選択できる。従って、一部の実施形態では、ＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物である。表１の配列番号６−９として列挙するプローブヌクレオ塩基配列の相補物は、標的配列のコピーを作製するまたは増幅することが可能であり、コピーは標的配列の相補物であって、それゆえ表１に列挙するヌクレオ塩基配列の相補物と結合するので、適切なＰＮＡプローブの製造において潜在的に有用である。
【００６１】
【表２】
2008541703.tif 000005
ＰＮＡプローブは、標的配列に相補的なプローブヌクレオ塩基配列を有し得る。あるいは、プローブと標的配列の間に１またはそれ以上の点突然変異（塩基ミスマッチ）が存在するプローブを使用するとき、より大きな配列識別が得られることが明らかにされているので、実質的に相補的なプローブヌクレオ塩基配列が使用できる（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：３３１−３３５（１９９７）参照）。
【００６２】
本発明は、表１に列挙するプローブヌクレオ塩基配列内の変異が、表２に列挙する生物の特異的検出に適したＰＮＡプローブを提供し得ることを考慮する。一般的な変異は、欠失、挿入およびフレームシフトを含む。ここで述べるパラメータ内でのプローブヌクレオ塩基配列の変異は、本発明の実施形態であるとみなされる。
【００６３】
１またはそれ以上のＰＮＡプローブは、プローブヌクレオ塩基配列だけを含み得るか（ここで先に述べたように）または付加的な部分を含み得る。付加的な部分の非限定的な例は、検出可能部分（標識）、リンカー、スペーサー、天然または非天然アミノ酸、ペプチド、酵素および／またはＰＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡの他のサブユニットを含む。付加的な部分は、アッセイにおいて機能性または非機能性であり得る。一般に、しかしながら、付加的な部分は、ＰＮＡプローブが使用できるアッセイの設計の範囲内で機能性であるように選択される。たとえばＰＮＡプローブは、１またはそれ以上の検出可能部分で標識できる、あるいは２またはそれ以上の独立して検出可能な部分で標識することができる。独立して検出可能な部分は、独立して検出可能な発蛍光団であり得る。検出可能または独立して検出可能のいずれの場合も、ＰＮＡプローブは自己指示性であり得る。標識の非限定的な例はここで先に述べられている。
【００６４】
ＰＮＡプローブは、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）において使用することができる（たとえば米国特許第６，２８０，９４６号、同第６，６４９，３４９号、同第６，６５６，６８７号および同第６，６６４，０４５号参照）。ＰＮＡプローブは核酸増幅反応において使用できる（たとえば米国特許第６，３５５，４２１号、同第６，３６１，９４２号、同第６，４４１，１５２号、同第６，４８５，９０１号および同第６，６４９，３４９号参照）。
【００６５】
過剰のプローブは、時として、特異的にハイブリダイズしたプローブの検出可能部分が、まだ存在するがハイブリダイズしていないプローブから生じるバックグラウンドシグナルを上回って検出できるようにアッセイから除去される。しかし、ある種の自己指示性プローブはほとんどまたは全くバックグラウンドを生じないので、過剰のプローブが試料から完全に除去される（洗い流される）という必要条件を排除するために使用できる。
【００６６】
非標識非核酸プローブ
本発明のプローブは、作動性であるために検出可能部分で標識される必要はない。ＰＮＡプローブを使用するとき、標的配列へのプローブのプローブヌクレオ塩基配列のハイブリダイゼーションによって形成されるＰＮＡプローブ／標的配列複合体を検出することが可能である。たとえば標的配列へのＰＮＡプローブヌクレオ塩基配列のハイブリダイゼーションによって形成されるＰＮＡ／核酸複合体は、抗体結合条件下で複合体と特異的に相互作用する抗体を用いて検出できる。ＰＮＡ／核酸複合体に対する適切な抗体およびそれらの作製と使用のための方法は、たとえば米国特許第５，６１２，４５８号に述べられている。
【００６７】
ＰＮＡ／核酸複合体とα−ＰＮＡ／核酸抗体の相互作用によって形成される抗体／ＰＮＡ／核酸複合体は、いくつかの方法で検出することができる。たとえばα−ＰＮＡ／核酸抗体を検出可能部分で標識することができる。適切な検出可能部分はここで先に述べられている。それゆえ、検出可能部分の存在、不在および／または量を、抗体／ＰＮＡ／核酸複合体および同定しようとする１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの存在、不在および／または量と相関させることができる。あるいは、検出可能部分で標識した二次抗体を用いて抗体／ＰＮＡ／核酸複合体を検出できる。典型的には、二次抗体は、抗体結合条件下でα−ＰＮＡ核酸抗体に特異的に結合する。それゆえ、検出可能部分の存在、不在および／または量を、抗体／抗体／ＰＮＡ／核酸複合体および同定しようとする１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの存在、不在および／または量と相関させることができる。ここで使用する、抗体という用語は、他の抗体または他の抗体フラグメントに特異的に結合する抗体フラグメントを包含する。
【００６８】
表面へのプローブの固定化
一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは溶液中で使用することができる。一部の実施形態では、ＰＮＡプローブは支持体上に固定化することができる。従って、ＰＮＡプローブの１またはそれ以上を、場合により、対象標的生物の標的配列の検出のために表面に固定化することができる。
【００６９】
ＰＮＡプローブは、紫外線架橋の周知の工程を用いて表面に固定化できる。ＰＮＡプローブは、脱保護には適するが合成支持体からの切断には適さない方法で、表面上で合成することができる（Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （ＰＮＡ）  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｒｒａｙｓ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，  １４：２７９２−２７９９（Ｊｕｌｙ  １９９７）参照）。さらにもう１つの実施形態では、ＰＮＡプローブは、表面の官能基とプローブ上の適切な官能基の反応によって表面に共有結合することができる（米国特許第６，４７５，７２１合参照）。
【００７０】
表面へのＰＮＡプローブの化学結合のための方法は、一般に、修飾する支持体上の求電子基と固定化するプローブの求核基（たとえばアミンまたはチオール）の反応を含む。あるいは、求核基が支持体上に存在し、求電子基（たとえば活性化カルボン酸）がプローブ上に存在してもよい。天然ＰＮＡはアミノ末端を有するので、ＰＮＡは、表面に固定化するための修飾を必ずしも必要としない（米国特許第６，４７５，７２１合参照）。
【００７１】
表面へのＰＮＡプローブの固定化に適する条件は、一般に高分子の標識に適する条件と同様である。固定化反応は基本的に標識化と等価であり、標識が、高分子を連結しようとする表面に置き換わる。
【００７２】
アミノ基、カルボン酸基、イソシアネート、イソチオシアネートおよびマレイミド基で誘導体化される数多くの種類の表面が市販されている。適切な表面の非限定的な例は、膜、チップ（たとえばシリコンチップ）、ガラス、細孔性ガラス、ポリスチレン粒子（ビーズ）、シリカおよび金ナノ粒子を含む。
【００７３】
ＰＮＡプローブのアレイ
アレイは、２またはそれ以上のプローブが各々規定された位置に固定化されている表面である。ＰＮＡプローブのアレイは、たとえば米国特許第６，４７５，７２１号ならびに  Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｒｒａｙｓ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１４：２７９２−２７９９（Ｊｕｌｙ  １９９７）に述べられている。固定化プローブのプローブヌクレオ塩基配列は、１またはそれ以上の標的生物からの核酸を含み得る試料を調べるために賢明に選択し得る。各々の固定化プローブの位置と組成物が既知であるので、アレイは、試料中に存在し得る２またはそれ以上の標的生物（たとえば１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）からの核酸の同時検出、同定および／または定量のために有用であり得る。さらに、ＰＮＡプローブのアレイは、各々のアッセイ後にハイブリダイズした核酸のいずれかを取り除くことによって再生させることができ、それにより、同じアレイを用いて多数の試料を繰り返し分析するための手段を提供する。そこで、ＰＮＡプローブまたはＰＮＡプローブセットのアレイは、対象標的生物に関する試料の反復スクリーニングのために有用であり得る。あるいは、少なくとも１個のＰＮＡプローブまたは２個以上のＰＮＡプローブを含み得る。表１で特定するプローブヌクレオ塩基配列を含むＰＮＡプローブは、表２に列挙する１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するのに適し得る。
【００７４】
ｂ．ＰＮＡプローブセット
一部の実施形態では、本発明はまた、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するのに適したプローブセットを対象とする。１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定に適するＰＮＡプローブの一般的なおよび好ましい特徴は、ここで先に述べられている。そのようなプローブにおける使用に適する例示的なプローブヌクレオ塩基配列は、表１の配列番号６−９として列挙されている。そのようなＰＮＡプローブの１またはそれ以上を、プローブセットを形成するために１またはそれ以上の他のプローブと組み合わせることができる。
【００７５】
従って、一部の実施形態では、セットの少なくとも１個のＰＮＡプローブは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物をプローブヌクレオ塩基配列として含み得る。一部の実施形態では、プローブセットは、配列番号６をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブ、配列番号７をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブ、配列番号８をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブおよび／または配列番号９をプローブヌクレオ塩基配列として含むＰＮＡプローブを含み得る。一部の実施形態では、ＰＮＡプローブセットは、配列番号６のＰＮＡプローブ、配列番号７のＰＮＡプローブ、配列番号８のＰＮＡプローブおよび／または配列番号９のＰＮＡプローブを含み得る。
【００７６】
１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの特異的測定のために特性決定されたセット内のＰＮＡプローブの分類は、本発明の非常に強力な実施形態であり得る。プローブセットは、少なくとも１個のＰＮＡプローブを含み得るが、ＰＮＡプローブだけを含む必要はない。たとえばプローブセットは、ＰＮＡプローブおよび核酸プローブおよび／または核酸プライマーの混合物を含み得るが、ただし、セットがここで述べる少なくとも１個のＰＮＡプローブを含むことを条件とする。１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するために有用なＰＮＡプローブは、他の生物についてのプローブと組み合わせることができる。プローブセットは、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイなどのアッセイを実施するために選択されるプライマーおよび／または他の試薬と組み合わせることができる。一部の実施形態では、セットのプローブの一部は、ＰＮＡまたは核酸から成るブロッキングプローブであり得る。
【００７７】
表１は、１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定に適する２またはそれ以上のプローブヌクレオ塩基配列を列挙する。選択的なプローブヌクレオ塩基配列が存在する場合は、アッセイにおける検出可能シグナルを上昇させるために２またはそれ以上のＰＮＡプローブを含むプローブセットを使用できる。単一アッセイにおいて測定できる種の数を増加させるために２またはそれ以上のＰＮＡプローブをセット内で組み合わせることができる。
【００７８】
一部の実施形態では、プローブセットは、各々独立して検出可能なプローブが試料中の異なるＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓまたはＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓのセットを測定するのに適する、２またはそれ以上の独立して検出可能なＰＮＡプローブを含み得る。そのようなアッセイは、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの２またはそれ以上の属またはＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの種の各々が、試料中に存在するかどうかが独立して測定される、マルチプレックスアッセイであり得る。一部のマルチプレックスアッセイでは、同定、検出および／または定量しようとする様々な種の各々を測定するために、適切な独立して検出可能なプローブを使用することができる。
【００７９】
ｃ．混合物
一部の実施形態では、本発明はまた、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するのに適した混合物を対象とする。混合物は、ここで述べる１またはそれ以上のＰＮＡプローブを含み得る。Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定に適するＰＮＡプローブの一般的なおよび好ましい特徴は、ここで先に述べられている。そのようなプローブにおける使用に適する例示的なプローブヌクレオ塩基配列は、表１の配列番号６−９として列挙されている。
【００８０】
Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの特異的測定のためにプローブを混合物に組み合わせることは、本発明の非常に強力な実施形態であり得る。そのような混合物は、少なくとも１個のＰＮＡプローブを含み得るが、ＰＮＡプローブだけを含む必要はない。そのような混合物は、ＰＮＡプローブ、核酸プローブおよび／または核酸プライマーを組み合わせることができる。そのような混合物は、１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するために有用なＰＮＡプローブを、他の生物の測定のためのプローブと組み合わせることができる。ＰＮＡプローブをプライマーおよび／または他の試薬と組み合わせた混合物は、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイまたはＰＣＲアッセイなどのアッセイを実施するために選択することができる。一部の実施形態では、混合物のプローブは、ＰＮＡまたは核酸から成るブロッキングプローブを含み得る。
【００８１】
一部の実施形態では、混合物を形成するために組み合わせる成分は、アッセイを実施するために選択できる。たとえば混合物の成分は、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを検出する、同定するおよび／または定量するために使用されるアッセイの一部として核酸増幅反応を実施するために選択できる。そのような混合物は、各々がＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内のプライマー部位にハイブリダイズすることができる、１５−３０ヌクレオチド長の少なくとも２個の核酸プライマー、およびＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの核酸内の標的配列にハイブリダイズすることができる、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの少なくとも１個のＰＮＡプローブを含み得る。
【００８２】
たとえば少なくとも２個の核酸プライマーは、各々、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を含み得るかまたは前記で構成され得る。同様に、１またはそれ以上のＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列は、各々、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号６の相補物、配列番号７の相補物、配列番号８の相補物または配列番号９の相補物を含み得るかまたは前記で構成され得る。１つのそのような混合物は、ａ）配列番号１のプライマー；配列番号２のプライマー；配列番号３のプライマー；配列番号４のプライマー；および／または配列番号５のプライマー；ならびにｂ）プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号６から成るＰＮＡプローブ；プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号７から成るＰＮＡプローブ；プローブヌクレオ塩基配列としての配列番号８から成るＰＮＡプローブ；および／またはプローブヌクレオ塩基配列としての配列番号９から成るＰＮＡプローブを含み得る。
【００８３】
一部の実施形態では、混合物は、ＰＣＲ増幅反応を実施するために選択される他の試薬をさらに含み得る。一部の実施形態では、混合物は内部陽性対照をさらに含み得る。そのような試薬および対照は、市販のものを入手し得るか、またはさもなければ当業者に周知である。
【００８４】
一部の実施形態では、混合物の成分はインサイチューハイブリダイゼーションアッセイを実施するために選択される。ＰＮＡプローブを使用したインサイチューアッセイは周知である（米国特許第６，２８０，９４６号、同第６，６４９，３４９号、同第６，６５６，６８７号および同第６，６６４，０４５号参照）。従って、常套的な実験とここで開示する情報だけで、１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するのに適した混合物の成分を選択することが可能である。
【００８５】
一部の実施形態では、混合物の成分は、２以上の生物を測定する、マルチプレックスアッセイを実施するために選択できる。一部の場合、マルチプレックスアッセイはＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの２またはそれ以上の種を測定するように設計することができる。一部の場合、マルチプレックスアッセイはＭｙｃｏｐｌａｓｍａの３以上の種を測定するように設計することができる。
【００８６】
混合物の各々の成分の量は、アッセイの必要条件に基づいて選択される。従って、プローブおよびプライマーの量はアッセイの特定設計によって決定され得る。様々な種のアッセイにおいてＰＮＡプローブおよびプライマーを使用することについては多くが知られているので、ここで述べる開示と組み合わせた常套的な実験だけが、そのようなアッセイを実施するのに適した混合物を製剤するために必要な成分の量を決定することに関与する。
【００８７】
ｄ．方法
一部の実施形態では、本発明はまた、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するのに適した方法を対象とする。Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定に適するＰＮＡプローブの一般的なおよび好ましい特徴は、ここで先に述べられている。例示的なプローブヌクレオ塩基配列は、表１の配列番号６−９として列挙されている。
【００８８】
一部の実施形態では、方法は、ａ）試料を、１２−２０ヌクレオ塩基含有サブユニットの１またはそれ以上のＰＮＡプローブと接触させること、ただし１またはそれ以上のＰＮＡプローブの各々は、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号９を含むまたは前記から成るプローブヌクレオ塩基配列を含む；およびｂ）適切なハイブリダイゼーション条件または適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件下で、試料中の少なくとも１個の標的配列へのＰＮＡプローブのプローブヌクレオ塩基配列のハイブリダイゼーションを測定し、その結果を試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅの存在、不在および／または量と相関させることを含み得る。この相関は、プローブ／標的配列複合体の直接または間接測定によって可能である。
【００８９】
一部の実施形態では、前記方法はインサイチューハイブリダイゼーションアッセイとして実施される。インサイチュー法によって分析する生物は、様々な方法によって分析のために調製できる。細胞をスライドガラスに固定し、フィルム、カメラ、スライドスキャナーまたは顕微鏡で視覚化することができる。あるいは、細胞を固定し、その後フローサイトメーターで分析することができる。スライドスキャナーおよびフローサイトメーターは、対象試料中に存在する標的生物の数を迅速に定量するために特に有用である。
【００９０】
生物からの核酸も分析することができる。典型的には、これらの分析のために、しばしば生物の細胞を溶解した後核酸を採集することを通して、生物の核酸を収集する。
【００９１】
核酸を採集する場合、核酸増幅反応が実施できる。それゆえ一部の実施形態では、前記方法は、ｃ）試料を、１５−３０ヌクレオチド長の少なくとも２個の核酸プライマーおよびＰＣＲ増幅反応を実施するために選択される他の試薬と接触させること；およびｄ）標的配列を含む１またはそれ以上のアンプリコンを生産するためにＰＣＲ増幅反応を実施することをさらに含み得る。一部の実施形態では、核酸プライマーは、各々、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を含み得るかまたは前記で構成され得る。一部の実施形態では、ＰＣＲアッセイは、エンドポイントＰＣＲアッセイまたはリアルタイムＰＣＲアッセイである。一部の実施形態では、前記の１またはそれ以上のＰＮＡプローブは自己指示性である（たとえば実施例１）。
【００９２】
ｅ．キット
一部の実施形態では、本発明は、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するアッセイを実施するのに適したキットを対象とする。１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの検出、同定および／または定量に適するＰＮＡプローブの一般的なおよび好ましい特徴は、ここで先に述べられている。
【００９３】
本発明のキットは、１またはそれ以上のＰＮＡプローブ、およびアッセイを実施するためまたはさもなければアッセイの実施を単純化するために選択される他の試薬または組成物を含み得る。キットは、たとえばＰＮＡ−ＩＳＨまたはＰＮＡ−ＦＩＳＨアッセイを実施するために選択される緩衝液および／または他の試薬を含み得る。他の実施形態では、緩衝液および／または他の試薬は、ＰＣＲ反応などの核酸増幅反応を実施するために選択することができる。当業者は、ＰＮＡ−ＩＳＨ、ＰＮＡ−ＦＩＳＨアッセイまたはＰＣＲアッセイを実施するために使用されるキットにおいてどのような種類の試薬が典型的に存在するかを認識する。
【００９４】
ｆ．本発明の実施形態を使用するための例示的な適用
ここで述べるＰＮＡプローブ、プローブセット、混合物、方法およびキットは、１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓを測定するために有用であることが明らかになった。測定するとは、試料中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの存在、不在および／または量を確立することを意味する。さらに、ここで述べるアッセイは迅速に（一部の実施形態、たとえば図６では、わずか３５分間）実施することができる。アッセイは、感受性が高く、信頼でき、単一アッセイにおいて、  表２に列挙する生物を検出および／または枚挙することができる。
【００９５】
支持体結合しているか溶液中であるかに関わらず、ここで述べるＰＮＡプローブ、プローブセット、混合物、方法および／またはキットは、哺乳動物、昆虫または植物起源の細胞培養物において、完成医薬品、ワクチンまたは他の細胞培養由来の生物学的製剤またはパーソナルケア製品でのそれらの生産のために使用される原材料において、乳製品またはボトル入り飲料水において、１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの迅速で感受性があり、信頼できる検出のために、あるいは環境試料の分析のために使用することができる。これらは、食品、水、医薬品、パーソナルケア製品、乳製品を製造または保存するために使用される原材料、装置、製品または工程の分析のため、あるいは環境試料の分析のために特に有用であり得る。
【００９６】
支持体結合しているか溶液中であるかに関わらず、ここで述べるＰＮＡプローブ、プローブセット、混合物、方法および／またはキットは、臨床または動物試料中および環境中の１またはそれ以上のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの測定のために有用であり得る。臨床試料の非限定的な例は、痰（ｓｐｕｔｕｍ）、喉頭スワブ、胃洗浄液、気管支洗浄液、生検、吸引液、痰（ｅｘｐｅｃｔｏｒａｔｅｓ）、体液（たとえば脊髄液、胸膜液、心膜液、滑液、血液、膿、羊水および尿）、骨髄および組織切片を含む。適切なＰＮＡプローブ、プローブセット、混合物、方法およびキットはまた、ヒトまたは動物を治療するために使用される臨床標本、装置、備品または製品の分析のために特に有用であり得る。
【００９７】
６．実施例
本発明の教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、これらの実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【００９８】
すべてのＰＮＡオリゴマーは従来の合成および精製手順を用いて調製した。すべての核酸プライマーは商業的供給源より購入した。［Ｊｅｎｓ／Ｂｙｒｏｎ−これは正しいのか？］。
【実施例】
【００９９】
実施例１
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連する属の検出
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種および関連するＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの属の検出のために多くのポリメラーゼ連鎖反応アッセイが考案されたが（Ｄｕｓｓｕｒｇｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、この大きくて系統発生的に多様な生物の群に属する配列を選択に増幅するプライマーを特定することの困難さは、これらのプライマーセットのうちで意図する標的に対して完全に特異的であることが示されたものはないという事実に反映されている（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連する属の検出のためのここで述べるＤＮＡプライマーとＰＮＡプローブの併用は、２つの層の特異性を含むので、これらのこれまでのアッセイよりも特異的である。最初の層の特異性は、標的生物のこの幅広い群の配列多様性を包含するように選択された、ここで述べる５個のＤＮＡプライマー（配列番号１−５）の組合せにある。この実施例で述べるアッセイにおいて使用される条件下で、これらのプライマーは、ＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａおよびＵｒｅａｐｌａｓｍａ種などの、多くのＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種および関連するＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの属についてのアンプリコンを生成すると予想された。
【０１００】
【表３】
2008541703.tif 000006
注：１）ｇｌｕ＝グルタミン酸；ｌｙｓ＝リシン；２）ヌクレオ塩基配列は、核酸プライマーについては５’−３’方向、およびＰＮＡプローブについてはＮ末端からＣ末端方向に示している；３）プライマーの一部とプローブの一部の間にはヌクレオ塩基配列の部分的な重複がある。そのような重複は太字で示している。
これらのプライマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍなどの、最も密接に関連する属の非標的細菌からのＤＮＡの増幅を避けるように設計されたが、他の非標的細菌との不慮の交差反応が起こり得ることは可能であった（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。２番目の層の特異性は、ここで述べる４個のＰＮＡ（配列番号６−９）の使用にある。アッセイによって標的されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよび他のＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓから予想される４個のアンプリコンの存在を報告するためにこれらのＰＮＡプローブの配列特異的ハイブリダイゼーションを使用した。アッセイに設計されたこれら２層の特異性により、非標的生物に属するゲノムＤＮＡとの不慮のプライマー交差反応または人工産物から生じるアンプリコンおよびプライマー二量体形成などの副反応がアッセイ結果の解釈を混乱させることはなかった。
【０１０１】
表３の要点：
プライマー配列：
配列番号１＝広く反応性の正方向プライマー
配列番号２＝Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｄｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓおよび関連種を標的する逆方向プライマー
配列番号３＝Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよび関連種を標的する逆方向プライマー
配列番号４＝Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉおよび関連種を標的する逆方向プライマー
配列番号５＝Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｉｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍおよび関連種を標的する逆方向プライマー。
【０１０２】
プローブ配列：
配列番号６＝配列番号１（正方向プライマー）と配列番号２（逆方向プライマー）の組合せを使用して生成されるアンプリコンの検出のための自己指示性ＰＮＡプローブ
配列番号７＝配列番号１（正方向プライマー）と配列番号３（逆方向プライマー）の組合せを使用して生成されるアンプリコンの検出のための自己指示性ＰＮＡプローブ
配列番号８＝配列番号１（正方向プライマー）と配列番号４（逆方向プライマー）の組合せを使用して生成されるアンプリコンの検出のための自己指示性ＰＮＡプローブ
配列番号９＝配列番号１（正方向プライマー）と配列番号５（逆方向プライマー）の組合せを使用して生成されるアンプリコンの検出のための自己指示性ＰＮＡプローブ。
【０１０３】
アッセイの説明：
このアッセイは、４個のＰＮＡプローブ、１個の正方向ＰＣＲプライマーおよび４個の逆方向ＰＣＲプライマーを含んだ。このプローブセットは、細胞系汚染の９５％を生じさせることが報告された８つの「問題」種を含む、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａのほぼすべての公知の種を同定するために選択した。このプローブセットはまた、同じ細胞培養汚染物質として重大な懸念である、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉの同定も可能にする。このアッセイを用いて測定できる付加的な標的生物は表２に列挙されている。このアッセイは、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａ、Ｍｅｓｏｐｌａｓｍａ（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）ならびに非Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ属のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは標的しなかった。
【０１０４】
ＰＣＲ条件：
リアルタイムＰＣＲ反応については、以下の条件を使用した：ＰＣＲチューブに、ＰＣＲ  Ｍｉｘ  ４０μＬおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａまたはＡｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａゲノムＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）またはそれらの適切な混合物１０μＬを添加した。ＰＣＲ  Ｍｉｘは、１×緩衝液Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＭｇＣｌ２  ３．０ｍＭ、４個のｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）の各々０．２５ｍＭ、ＰＮＡプローブ５００ｎＭ、正方向プライマー１００ｎＭ、逆方向プライマー１００ｎＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）  Ｇｏｌｄポリメラーゼ２単位（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含んだ。ＰＣＲサイクリング条件を、以下のサイクルプロトコールを用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した：
予熱；９５℃、１０分間
以下の５０サイクル：
９５℃、１５秒間
６０℃、１分間。
【０１０５】
迅速エンドポイントＰＣＲ反応については、以下の条件を使用した：ＰＣＲチューブに、ＰＣＲ  Ｍｉｘ  ２０μＬおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）５μＬを添加した。添加した各々のＤＮＡの最終濃度は１４０ｆｇであった。ＰＣＲ  Ｍｉｘは、１×ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＭｇＣｌ２  ２．０ｍＭ、４個のｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド三リン酸）の各々０．２５ｍＭ、ＰＮＡプローブ（配列番号６）５００ｎＭ、正方向プライマー（配列番号１）１００ｎＭ、逆方向プライマー（配列番号２）１０００ｎＭ、１×ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および１×（５０ｎＭ）ＲＯＸ内部標準染料の最終濃度を含んだ。ＰＣＲサイクリング条件を、以下のサイクルプロトコールを用いてＡＢＩ  ９８００  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍで実施した。
【０１０６】
以下の５０サイクル：
９５℃、２秒間
６０℃、５秒間。
【０１０７】
ＰＣＲの完了後、スペクトルの収集とデータの数量化のためにＦａｓｔ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍプレートをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに移した。蛍光も、紫外線トランスイルミネーターを使用して容易に視覚化された。
【０１０８】
内部陽性対照：
以下は、ＰＣＲアッセイにおいて使用した内部陽性対照の成分の説明である：
【０１０９】
【化２】
2008541703.tif 000007
太字部分はＩＰＣ内のプライマー部位を示し、下線部分はＰＮＡプローブの結合部位を示す。Ｖｉｃ標識ＰＮＡプローブはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。
【０１１０】
結果：
図３Ａは、ＰＮＡに基づくＭｙｃｏｐｌａｓｍａリアルタイムＰＣＲアッセイの広い動的範囲を示す。この実験では、様々な量のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｉｒｕｍゲノムＤＮＡを反応のための鋳型として使用した。各々の曲線を作成するために使用したＭ．ｐｉｒｕｍゲノムＤＮＡの量をナノグラム、ピコグラムまたはフェムトグラムで示す。添加したＤＮＡの量およびＭ．ｐｉｒｕｍのゲノムサイズの両方に基づいて算定した、対応する標的コピー数をカッコ内に示す。この図は、アッセイが６対数範囲以上のＤＮＡ標的濃度で十分に機能したことを明らかにする。図３Ｂは配列番号９についてのＣｔプロットである。このプロットは、反応系に添加した既知濃度の標的ＤＮＡと生じたＣｔ値−増幅曲線が検出閾値と交差する点−の間の関係を示す。この直線関係は、未知の試料中に最初に存在する標的ＤＮＡの濃度を算定するために使用できる。加えて、この直線の勾配はＰＣＲ反応の効率を算定するために使用し得る。
【０１１１】
図４は、配列番号６に対応するＰＮＡプローブの、その予想標的群（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｄｉｔｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｒａｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍおよび関連種）に対する特異性を示す。非標的Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｉｒｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、これらの種のゲノムＤＮＡからアンプリコンを生産することができるプライマーの反応に存在したにもかかわらず、シグナルを生じなかった。
【０１１２】
図５は、配列番号８に対応するＰＮＡプローブの、その予想標的群（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉおよび関連種）に対する特異性を示す。非標的Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｉｒｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、これらの種のゲノムＤＮＡからアンプリコンを生産することができるプライマーの反応に存在したにもかかわらず、シグナルを生じなかった。
【０１１３】
図６は、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａリアルタイムＰＣＲアッセイによるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種の選択的同定を示す。配列番号１−５に対応するＤＮＡプライマーおよび配列番号６−９に対応するＰＮＡプローブを含むマルチプレックスアッセイを、単一チューブにおいて、標的および非標的細菌からのゲノムＤＮＡと組み合わせた。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａの４つの標的群と関連Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓの代表からのＤＮＡがこのアッセイによって容易に検出された。代表非標的細菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）からのＤＮＡは検出されなかった。
【０１１４】
図７は、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、この場合はＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉの迅速で選択的な終点検出のためにＦａｓｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍと組み合わせた、ここで述べるＤＮＡプライマーとＰＮＡプローブの有用性を示す。標的生物（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｎｉｎｉ、〜１．７２のΔＲｎ）と非標的生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、〜０．５９のΔＲｎ）の間の５３０ｎｍでの最終蛍光値の大きな差は反応の特異性を強調する。〜６０５ｎｍでの二次蛍光最大値は内部標準に属し、診断値ではない。
【０１１５】
考察：
非対称ＰＣＲは、もう１本の鎖に比べて１本の鎖の選択的増幅を可能にする。これは、過剰生産を所望する鎖の合成を指令するプライマーを大量に添加することによって達成される。過剰に存在するプライマーは、反応チューブ内で使用可能な限られた資源（ヌクレオチド、マグネシウム等）のより大きな割合を消費し、特に反応の対数期の間に、生成物形成の偏りを導く。この実施例で述べるＰＮＡプローブを用いたＰＣＲアッセイでは、過剰生産を所望する生成物は、標的配列を含むポリヌクレオ塩基鎖（すなわちＰＮＡプローブに相補的なヌクレオ塩基配列を含むアンプリコンの鎖）である。この実施例で述べるアッセイでは、正方向プライマー（配列番号１）は０．１μＭのレベルで存在し、一方逆方向プライマー（配列番号２−５）は各々１μＭの濃度で存在した。ＰＮＡプローブは０．５μＭの濃度で使用した。
【０１１６】
製薬材料または工程におけるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ汚染を検出する上での使用を別にして、この実施例で述べるプライマーとプローブの独自の組合せはまた、インシリコでの特異性試験が、それらがヒトにおける非淋菌性尿道炎および他の尿生殖器感染などの状態に関連するＭｙｃｏｐｌａｓｍａまたはＵｒｅａｐｌａｓｍａ種の大部分を検出できることを示唆するので、医学的に関係するＭｙｃｏｐｌａｓｍａの存在／不在検出のために有用であると考えられる（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これらのプライマーおよびプローブはまた、それらが経済的に重要な動物疾患に関与するＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種を検出すると期待されるので、動物診断適用においても有用であると考えられる（Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１１７】
このアッセイの目標は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａおよび関連するＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓの属に属する最大数の種を検出することであった。標的群の大きさと系統発生的多様性を考慮して、実験前には、選択プライマー配列がアッセイによって求められる機能的特異性を有するかどうかは不明であった。それゆえ、標的生物であるＭ．ａｒｇｉｎｉｎｉとＭ．  ｏｒａｌｅは配列番号２によって表わされる逆方向プライマーに１個のミスマッチを示すが、これらの種が使用した最終的ＰＣＲ条件下で容易に検出できたことは幾分意外であった。同様に、この配列に２個のミスマッチを示すＭ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍも、最終アッセイにおいて容易に検出された。
【０１１８】
本発明の教示を様々な実施形態に関連して説明しているが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図しない。逆に、本教示は、当業者に認識されるように、様々な代替、変更および等価物を包含する。
【０１１９】
【化３】
2008541703.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、本発明の様々な実施形態において使用される核酸プライマーおよび／またはＰＮＡプローブに組み込むことができるいくつかのヌクレオ塩基の例示である。
【図２】図２は、ハイブリダイズしていない（ａ）およびハイブリダイズした（ｂ）状態の自己指示性ＰＮＡプローブの例示である。そのハイブリダイズしていない状態（ａ）では、蛍光が実質的に消光しており、ハイブリダイズした状態（ｂ）では、検出可能な蛍光の実質的な上昇が存在する。
【図３Ａ】図３Ａは、少なくとも２個の核酸プライマーと少なくとも１個のここで述べるＰＮＡプローブを使用した、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓについてのアッセイのリアルタイム感受性および特異性試験に関するＡＢＩ７７００からの出力データである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示したデータのＣｔプロット分析である。
【図４】図４は、少なくとも２個の核酸プライマーと少なくとも１個のここで述べるＰＮＡプローブを使用した、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓについてのアッセイのリアルタイム感受性および特異性試験に関するＡＢＩ７７００からの出力データである。
【図５】図５は、少なくとも２個の核酸プライマーと少なくとも１個のここで述べるＰＮＡプローブを使用した、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓについてのアッセイのリアルタイム感受性および特異性試験に関するＡＢＩ７７００からの出力データである。
【図６】図６は、少なくとも２個の核酸プライマーと少なくとも１個のここで述べるＰＮＡプローブを使用した、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓについてのアッセイのリアルタイム感受性および特異性試験に関するＡＢＩ７７００からの出力データである。
【図７】図７は、核酸プライマーと少なくとも１個のここで述べるＰＮＡプローブを使用したＭｏｌｌｉｃｕｔｅｓについての高速エンドポイントアッセイに関するＡＢＩ９８００からの出力データである。
【図８】図８は、染料１の化学構造の例示である。
【図１Ａ】
2008541703.tif 000009
【図１Ｂ】
2008541703.tif 000010
【図２】
2008541703.tif 000011
【図３Ａ】
2008541703.tif 000012
【図３Ｂ】
2008541703.tif 000013
【図４】
2008541703.tif 000014
【図５】
2008541703.tif 000015
【図６】
2008541703.tif 000016
【図７】
2008541703.tif 000017
【図８】
2008541703.tif 000018
【配列表】
2008541703000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月18日(2008.2.18)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008541703000001.app
【国際調査報告】
2008541703.tif 000022