(57)【要約】  局所適用のための医薬組成物が開示され、該組成物が、治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む。賦形剤は、４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含みかつ該組成物が３〜５の範囲内のｐＨを有するように調合される。組成物は、コロイド懸濁液の形態で投与され、使用時に適切な酸性化手段を、核酸および組成物の長期保存にとってより適切でありうる賦形剤からなる実質的に中性の懸濁液に添加することにより、より低いｐＨに緩衝化されうる。あるいは、組成物は、後続の再構成のために、例えば実質的に緩衝化されていない水または生理食塩水などの適切な水性媒体での使用の直前に、より低いｐＨで凍結乾燥されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物であって、
前記賦形剤が４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含みかつ前記組成物が３〜５の範囲内のｐＨを有するように調合されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物が４〜５の範囲内のｐＨを有するように調合されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記両性リポソームが両性脂質または両性の特性を有する脂質成分の混合物および中性リン脂質を含有する脂質相から形成されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記中性リン脂質がホスファチジルコリンを含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ホスファチジルコリンがＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣからなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣまたは非水素化卵ＰＣを含むことを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記中性リン脂質が、ホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含むことを特徴とする、請求項４、請求項５または請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ホスファチジルエタノールアミンがＤＯＰＥまたはＤＭＰＥおよびＤＰＰＥからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ホスファチジルコリンが、ＰＯＰＣ、大豆ＰＣまたは卵ＰＣを含み、かつ前記ホスファチジルエタノールアミンがＤＯＰＥを含むことを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記中性リン脂質が前記脂質相の少なくとも２０モル％を構成することを特徴とする、請求項４〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記両性脂質が、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣｈｏｌからなる群から選択される単一の脂質を含むことを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記両性脂質がＨｉｓｔＣｈｏｌであることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
両性の特性を有する前記脂質成分が２種以上のアニオンおよびカチオン脂質の混合物を含み、前記１種またはそれ以上のカチオン脂質が、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＰ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣからなる群から選択され、かつ前記１種またはそれ以上のアニオン脂質が、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記カチオン脂質が、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌのうちの１種またはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記アニオン脂質が、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐのうちの１種またはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項１３または請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記脂質相が、ＰＯＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳを含有し、前記脂質相がＤＯＴＡＰよりも大きいモル量のＣＨＥＭＳを含有することを特徴とする、請求項１３、請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記脂質相が、２０〜６０モル％のＰＯＰＣ、１０〜４０モル％のＤＯＴＡＰおよび２０〜７０モル％のＣＨＥＭＳを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記脂質相が、約６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記脂質相が、ＰＯＰＣ、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳを含有することを特徴とする、請求項１３、請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記脂質相中のＭｏＣｈｏｌのモル量が実質的にＣＨＥＭＳのモル量に等しいかまたはそれより大きいことを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記脂質相が約３０モル％のＰＯＰＣ、約３５モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３５モル％のＣＨＥＭＳを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記脂質相がＤＯＰＥをさらに含有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記脂質相がＣＨＥＭＳよりも大きいかまたはそれと実質的に等しいモル量のＭｏＣｈｏｌを含有し、かつＣＨＥＭＳおよびＭｏＣＨＯＬの全モル量が脂質相の約３０〜約８０モル％であることを特徴とする、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記脂質相が、約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記脂質相が、約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４６モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記脂質相が、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃを含有することを特徴とする、請求項１３、請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記脂質相が、ＤＭＧＳｕｃｃよりも大きいかまたはそれと実質的に等しいモル量のＭｏＣｈｏｌを含有し、かつＤＭＧ−ＳｕｃｃおよびＭｏＣＨＯＬの全モル量が脂質相の３０〜８０モル％であることを特徴とする、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記脂質相が、約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＤＭＧ−Ｓｕｃｃを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記脂質相が、約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４６モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＤＭＧＳｕｃｃを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記脂質相がコレステロールをさらに含有することを特徴とする、請求項３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記脂質相が、約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌを含有し、全体が１００モル％であることを特徴とする、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記両性リポソームが５０〜１０００ｎｍの範囲内の大きさを有することを特徴とする、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記核酸が脊椎動物細胞内で１種またはそれ以上のＲＮＡへの転写能を有し、前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムであり、前記ｍＲＮＡが１種またはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記核酸が環状ＤＮＡプラスミド、線形ＤＮＡコンストラクトまたはｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記核酸がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜５０塩基対の長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドがホスホチオエート結合を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが２’ＭＯＥ修飾核酸塩基を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドがＬＮＡ核酸塩基を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記オリゴヌクレオチドがＦＡＮＡ核酸塩基を含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドが天然のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対の長さのｓｉＫＮＡを含むことを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドが１５〜３０塩基対の長さのデコイオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記核酸の一部が前記リポソーム内に配置されることを特徴とする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記核酸の少なくとも５０モル％が前記リポソーム内に配置されることを特徴とする、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記核酸の少なくとも８０モル％が前記リポソーム内に配置されることを特徴とする、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記組成物が非カプセル封入核酸を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記組成物が、後続の注射用水を用いた再構成のために酸性ｐＨで凍結乾燥される、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
局所適用のための薬剤の製造における、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５０】
前記組成物が粘膜、移植に先立つ移植片または眼への局所適用を目的とすることを特徴とする、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記組成物が、鼻、気道、口、腸または膣における粘膜への局所適用を目的とすることを特徴とする、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
炎症性、免疫または自己免疫疾患の治療あるいは予防における使用を目的とした薬剤の製造における、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項５３】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療的量または予防的量を、それを必要とするヒトまたは非ヒト動物患者に投与するステップを含む、炎症性、免疫または自己免疫疾患の治療あるいは予防の方法。
【請求項５４】
移植に先立ち移植片を処理する方法であって、前記移植片にエクスビボで請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５５】
ヒトまたは非ヒト動物に遺伝子ワクチンをワクチン接種する方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を前記ヒトまたは動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項５６】
前記組成物が使用時に３〜５の範囲内のｐＨに酸化されることを特徴とする、請求項５３、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
医薬組成物およびその使用のための使用説明書を含むキットであって、前記組成物が、治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む、キットにおいて、
前記賦形剤が４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含み、かつ前記組成物が実質的に中性ｐＨの懸濁液の形態で提供され、前記使用説明書が約３〜約５の範囲内のｐＨへの使用に先立ち前記懸濁液の酸性化を指示することを特徴とする、キット。
【請求項５８】
前記組成物の前記低いｐＨへの緩衝化のための使用時に懸濁液への混和を目的とした別個の酸性化手段をさらに含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記酸性化手段が、酢酸、クエン酸またはグリシンを含むことを特徴とする、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
医薬組成物およびその使用のための使用説明書を含むキットであって、前記組成物が、治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む、キットにおいて、
前記賦形剤が４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含み、かつ前記組成物が水性媒体を用いた再構成時に前記再構成された組成物のｐＨが約３〜約５の範囲内であるように凍結乾燥された形態で提供され、前記使用説明書が使用時に前記凍結乾燥された組成物の再構成を指示することを特徴とする、キット。
【請求項６１】
使用時に前記組成物の再構成のための別個の水性媒体をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記水性媒体が実質的に緩衝化されていない水または生理食塩水を含むことを特徴とする、請求項６１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは非ヒト動物または移植用移植片への局所投与のための医薬組成物に関し、特に治療物質としての核酸を含むかかる組成物に言及する。本発明は、局所投与のための薬剤の製造におけるかかる組成物の使用についても包含する。本発明は、本発明に記載の組成物を使用時に調合することを意図した核酸治療薬およびキットを使用した炎症性、免疫または自己免疫疾患の治療あるいは予防の方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
核酸治療薬は、全身または局所投与のための新たな薬剤のクラスを提示する。かかる治療の大部分は、ＣｐＧ−オリゴまたはアプタマーを除き、細胞内作用部位を有し、かつ１種またはそれ以上の特異的なタンパク質、ポリペプチドをコードする核酸あるいはタンパク質の発現を特異的に下方制御可能なＲＮＡ配列およびオリゴヌクレオチドに分類されうる。
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、様々な化学物質のアンチセンス、固定化核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（モルホリノ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびデコイを含む。異なる機構に関する詳細な説明については、文献（例えば、非特許文献１、非特許文献２または非特許文献３）中に認められうる。
【０００４】
種々の疾患の治療において核酸治療薬が提案されている。全身適用に加え、かかる薬剤の粘膜、エクスビボでの移植片および眼への局所適用を扱う、特に炎症性または免疫媒介性疾患および障害の領域ならびに遺伝子ワクチン接種の分野における多数の前臨床および臨床試験がある（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１および非特許文献１２）。
【０００５】
核酸治療薬では、その実際の化学的原因（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｒｉｇｉｎ）とは無関係に、体液中でのその不安定性または細胞への効率の悪い取り込みまたはそれら双方が理由で、治療有効性が不十分でありうることは当該技術では既知である。上記のものならびにリガンドまたはポリマーとの抱合体を含む、かかるオリゴヌクレオチドの化学修飾は、かかる実用上の制限を克服するための１つの戦略を示す。
【０００６】
第２のアプローチは、核酸の保護、ターゲティングまたは細胞への取り込み促進を目的とした、例えばリポソームなどの担体系の使用を包含する。リポソームは、かかる担体系として使用される場合、望ましくは高いカプセル封入効率を示しかつ作製が経済的である必要があり、優れたコロイド安定性を有しかつ薬剤の細胞への取り込み促進をもたらす必要があり、さらにその毒性も免疫原性も低い必要がある。
【０００７】
担体と環境の間に凝集が実質的に生じないことから、アニオンまたは中性リポソームは優れたコロイド安定性を有することが多い。その結果、それらの生体内分布は優れ、かつそれらの炎症および細胞毒性に対する潜在性は低い。しかし、かかる担体はカプセル封入効率を低下させることが多く、細胞へのさらなる取り込みを促進しうるエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）シグナルをもたらすことがない（非特許文献１３）。
【０００８】
非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６を例とする極めて多数の出版物がカチオン性リポソーム系を扱っている。
【０００９】
カチオン系は、高い帯電効率をもたらす可能性があるが、特に体液との接触後にはコロイド安定性が不足する場合が多い。タンパク質または他の生体高分子とのイオン相互作用により、原位置で細胞外マトリックスまたは細胞表面との凝集体形成が起こりうる。例えば、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９によって示されるように、カチオン脂質が有毒であると認められることも多かった。
【００１０】
担体の立体的安定化をもたらす成分の添加により、かかる制限は克服されうる。例えば、様々な鎖長のポリエチレングリコールは体液中でのカチオン成分の使用に関連した凝集問題を低減することが知られており、ＰＥＧ化したカチオン性リポソームがインビボで循環時間の増大を示す（非特許文献２０）。しかし、ＰＥＧを使用してもカチオン脂質に関連した特有の毒性問題を解決することはない。ＰＥＧがかかるリポソームの細胞への積極的侵入（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｅｎｔｒｙ）または細胞内送達を実質的に阻害しうることも知られている（非特許文献２１）。
【００１１】
両性リポソームは、ｐＨ７．４のアニオンまたは中性電荷およびｐＨ４のカチオン電荷を有する、最近記載されたリポソーム類であることを示す。ここでは特許文献１、特許文献２および特許文献３（いずれもパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）ら）に対して参照がなされ、それらは特定の両性リポソームに関する詳細な説明を示し、参照により本明細書中に援用される。特許文献４および特許文献３（同様にパンツナー（Ｐａｎｚｎｅｒ）らにおいて開示がなされ、それらは参照により本明細書中に援用され、両性リポソームの作製におけるｐＨに感受性を示す脂質についてさらに記載している。両性リポソームは優れた生体内分布を有し、動物において十分な耐容性を示すことが認められており、それらは核酸分子を高効率にカプセル封入することが可能である。
【特許文献１】国際公開第０２／０６６４９０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０７０７３５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０７０２２０号パンフレット
【非特許文献１】クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）、ＢＢＡ（１９９９年）、１４８９（１）、３１−４４頁
【非特許文献２】ティジュスターマン（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ（２００４年）、１１７（１）、１−３頁
【非特許文献３】マン（Ｍａｎｎ）ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、（２０００年）、１０６（９）、１０７１−５頁
【非特許文献４】シャナハン（Ｓｈａｎａｈａｎ）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ、（１９９９年）、８（９）、１４１７−１４２９頁
【非特許文献５】ボール（Ｂａｌｌ）ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ、（２００３年）、３（２）、９７−１０６頁
【非特許文献６】フィノット（Ｆｉｎｏｔｔｏ）ら、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（２００２年）、１０７（２）、２７９−２８６頁
【非特許文献７】ネドバル（Ｎｅｄｂａｌ）ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、（２００２年）、１２（２）、７１−７８頁
【非特許文献８】ボコット（Ｂｏｃｈｏｔ）ら、Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．、（２０００年）、１９（２）、１３１−１４７頁
【非特許文献９】ロジ（Ｒｏｇｙ）ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、（２０００年）、１１（１２）、１７３１−１７４１頁
【非特許文献１０】クラヴィンスキス（Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）、１６２、２５４−２６２頁
【非特許文献１１】ホプソン（Ｈｏｐｓｏｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００３年）、３１（３）、２１７−２２４頁
【非特許文献１２】バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２０００年）、２（１）、８７−９３頁
【非特許文献１３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （２０００年）、２９２、４８０−４８８頁、クリムク（Ｋｌｉｍｕｋ）ら
【非特許文献１４】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）、１６、１２９−１４０頁、マウラー（Ｍａｕｒｅｒ）ら
【非特許文献１５】ＢＢＡ（２０００年）１４６４、２５１−２６１頁、メイダン（Ｍｅｉｄａｎ）ら
【非特許文献１６】Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１年）、１（２）、２７−３３頁、フィゼ（Ｆｉｓｅｔ）およびガウニ（Ｇｏｕｎｎｉ）
【非特許文献１７】フィリオン（Ｆｉｌｉｏｎ）ら、ＢＢＡ（１９９７年）、１３２９（２）、３４５−３５６頁
【非特許文献１８】ダス（Ｄａｓｓ）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００２年）、５４（５）、５９３−６０１頁
【非特許文献１９】ヒルコ（Ｈｉｒｋｏ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１０（１４）、１１８５−１１９３頁
【非特許文献２０】ＢＢＡ（２００１年）１５１０、１５２−１６６頁、センプル（Ｓｅｍｐｌｅ）ら
【非特許文献２１】ソン（Ｓｏｎｇ）ら、ＢＢＡ（２００２年）、１５５８（１）、１−１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、粘膜、エクスビボでの移植前の移植片または眼への局所適用にとって治療的な核酸を含む医薬組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、本発明に記載の医薬組成物の局所投与により、炎症性もしくは免疫媒介性疾患または障害を治療あるいは予防するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の一態様によると、治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む、局所投与用の医薬組成物であって、該賦形剤が約４〜約７．４の等電点を有する両性リポソームを含みかつ該組成物が約３〜約５の範囲内のｐＨを有するように調合されることを特徴とする、医薬組成物が提供される。
【００１５】
一部の実施形態では、賦形剤は７未満の等電点を有しうる。組成物は４〜６の範囲内のｐＨ、好ましくはｐＨ４〜５を有するように調合されうる。
【００１６】
該組成物は懸濁液、特にコロイド懸濁液の形態で投与されうることから、使用時に適切な酸性化手段を、核酸および組成物の長期保存にとってより適切でありうる賦形剤からなる実質的に中性の懸濁液に添加することにより、より低いｐＨに緩衝化されうる。あるいは、本発明に記載の組成物は、後続の再構成のために、例えば実質的に緩衝化されていない水または生理食塩水などの適切な水性媒体での使用の直前に、より低いｐＨで凍結乾燥されうる。
【００１７】
したがって、本発明の別の態様では、医薬組成物およびその使用のための使用説明書を含むキットであって、該組成物が治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む、キットにおいて、該賦形剤が４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含み、かつ該組成物が実質的に中性ｐＨの懸濁液の形態で提供され、該使用説明書が約３〜約５の範囲内のｐＨへの使用に先立ち該懸濁液の酸性化を指示することを特徴とする、キットが提供され、ならびに本発明の別の態様では、医薬組成物およびその使用のための使用説明書を含むキットであって、該組成物が治療物質としての核酸、リポソームを含む賦形剤およびそれらのための医薬的に許容できる担体を含む、キットにおいて、該賦形剤が４〜７．４の等電点を有する両性リポソームを含み、かつ該組成物が水性媒体による再構成時に再構成された組成物のｐＨが約３〜約５の範囲内であるように凍結乾燥された形態で提供され、該使用説明書が使用時に前記凍結乾燥された組成物の再構成を指示することを特徴とする、キットが提供される。
【００１８】
本発明の異なる態様では、治療的量または予防的量の本発明に記載の医薬組成物を治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物患者に投与するステップを含む、炎症性、免疫または自己免疫疾患の治療あるいは予防の方法が提供され、ここで該治療物質は、該炎症性、免疫または自己免疫疾患の重症度を緩和するか、予防するかまたは低減するのに適合される。一部の実施形態では、組成物は、例えば、鼻、気道、口、腸もしくは膣における膜などの粘膜、または眼に対して局所投与されうる。組成物は局所適用されうる。
【００１９】
適切には、該核酸がＣＤ４０をコードする核酸を標的にするように適合されるオリゴヌクレオチドを含むことにより、哺乳類細胞内でのＣＤ４０の発現が調節されうる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドはヒトＣＤ４０に特異的である。２００５年１１月４日に出願された同時係属の出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０５／ｎｎｎｎｎ（代理人整理番号３３８４１−５０１−ＷＯ１）に記載のように、その内容は参照により本明細書中に援用され、ＣＤ４０は、例えばアンチセンスもしくはｓｉＲＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド阻害剤を使用して緩和される可能性を秘めている炎症性または免疫障害の治療における好ましい標的を示す。
【００２０】
さらに本発明の別の態様では、エクスビボで本発明に記載の医薬組成物を該移植片に投与するステップを含む、移植に先立ち移植片を処理するための方法が提供される。一部の実施形態では、該組成物は、移植片拒絶または対宿主移植片病の徴候の重症度を予防するかまたは低減するのに適合される核酸治療薬を含みうる。
【００２１】
さらに本発明の別の態様では、本発明に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む、ヒトまたは非ヒト動物に遺伝子ワクチンをワクチン接種する方法が提供される。
【００２２】
したがって、本発明は、両性リポソームおよび核酸治療薬を含む医薬組成物に関し、組成物を粘膜、眼またはエクスビボで移植片に対して局所投与することが可能である。核酸治療薬の実質的割合またはすべては物理的に両性リポソーム内に捕捉されうる。好ましくは、両性リポソームは弱酸性ｐＨで安定である。本発明の医薬組成物は、動物もしくは動物の一部、特にヒトもしくはその器官における症状または疾患の他の局所治療を目的としても使用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の医薬組成物における賦形剤として含有される両性リポソームは、両性脂質または両性の特性を有する脂質成分の混合物および中性リン脂質を含有する脂質相から形成されうる。
【００２４】
本明細書における「両性」とは、リポソームがアニオンとカチオンの双方の性質を有する電荷群を含むことを意味し、
（ｉ）電荷群の少なくとも一方が４〜７．４のｐＫを有し、
（ｉｉ）カチオン電荷はｐＨ４で広がり、かつ
（ｉｉｉ）アニオン電荷はｐＨ７．４で広がり、
それによってリポソームはｐＨ４〜ｐＨ７．４でゼロ正味電荷の等電点を有する。この定義により、両性イオンは上記の範囲内のｐＫを有しないことから、両性の性質は両性イオンの性質とは異なる。結果として、両性イオンはｐＨ値の範囲を超えて本質的に中性である。
【００２５】
該中性リン脂質は、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物を含みうる。ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンは、両性イオンの性質を有する中性脂質である。
【００２６】
該中性のホスファチジルコリンまたはホスファチジルコリンとホスファチジルエタノールアミンの混合物は、少なくとも２０モル％、好ましくは少なくとも２５モル％または３０モル％、およびより好ましくは４０モル％超に至るまで脂質相中に存在しうる。
【００２７】
一部の実施形態では、該ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、天然もしくは水素化大豆ＰＣ、天然もしくは水素化卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣからなる群から選択されうる。（本明細書中で用いられる脂質の参照を容易にするために、かかる略式名称の用語集が下記に含められる。一部の場合には、かかる略語は当業者によって共通に用いられるものである）。
【００２８】
ここで好ましいホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣ、非水素化大豆ＰＣおよび非水素化卵ＰＣである。
【００２９】
ホスファチジルエタノールアミンは、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥからなる群から選択されうる。
【００３０】
最も好ましくは、該中性脂質は、ＤＯＰＥおよびＰＯＰＣ、大豆ＰＣまたは卵ＰＣを含む。
【００３１】
脂質相は両性脂質を含有しうる。適切な両性脂質が、国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０７３５号パンフレットの中で開示される（これら双方の内容は参照により本明細書中に援用される）。好ましくは、該両性脂質は、ＨｉｓｔＣｈｏｌ、ＨｉｓｔＤＧ、ｉｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ、アシルカルノシンおよびＨＣＣＨｏｌからなる群から選択される。
【００３２】
最も好ましくは、両性脂質はＨｉｓｔＣｈｏｌである。
【００３３】
両性脂質の含量は５モル％〜３０モル％、好ましくは１０〜２５モル％でありうる。
【００３４】
あるいは、脂質相は、国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット中に開示されるように（その内容は参照により本明細書中に援用される）、ｐＨに感受性を示すアニオンおよび／またはカチオン成分を使用して調合されうる。ｐＨに感受性を示すカチオン脂質は、国際公開第０２／０６６４８９号パンフレットおよび国際公開第０３／０７０２２０号パンフレット（これら双方の内容は参照により本明細書中に援用される）ならびにそれらの中でなされた参考文献、特にブドカー（Ｂｕｄｋｅｒ）ら、１９９６年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（６）：７６０−４頁において開示されており、構成的に帯電されたアニオン脂質またはｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせて使用されうる。逆にカチオン電荷は、ｐＨに感受性を示すアニオン脂質と組み合わせた、当業者には既知の構成的に帯電された脂質からも導入されうる。
【００３５】
好ましいカチオン成分は、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰおよびＤＯＥＰＣである。
【００３６】
特に好ましいカチオン脂質は、ＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌである。
【００３７】
両性混合物は、ｐＨに応答して構成的にまたは条件付きで帯電したアニオン脂質をさらに含み、かかる脂質も当業者に既知である。本発明での使用にとって好ましい脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐである。
【００３８】
特に好ましいアニオン脂質は、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐである。
【００３９】
一部の実施形態では、該カチオン脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌのうちの１種またはそれ以上を含みうる。該アニオン脂質は、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＯＧＳｕｃｃ、ＤＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔｙｌ−Ｐのうちの１種またはそれ以上を含みうる。
【００４０】
局所適用時の粘膜への両性リポソームの生体接着を証明するため、本発明によるとリポソームがカチオン表面電荷を有することが有利であることが認められている。両性リポソームは、弱酸性ｐＨ、より正確にはリポソームの等電点未満のｐＨではカチオン性である。両性リポソームは、かかるｐＨで投与される場合、望ましくは凝集または融合しないことが求められる。酸性ｐＨでの両性リポソームのかかる凝集または融合は、リポソームの脂質組成物およびカーゴの存在に依存しうる。例えば、特定の空でかつ薬剤が負荷された両性リポソームが４〜５へのｐＨシフト時に安定であることが認められている。
【００４１】
本発明に記載の両性リポソームがｐＨ７．５およびｐＨ４〜５の双方で安定でありうることと、ｐＨ４〜５でのアンチセンスを負荷された両性リポソームの局所投与が炎症性疾患または免疫関連疾患の治療において特に有効でありうることが認められている。
【００４２】
核酸を負荷された両性リポソームをｐＨ４〜５で凍結乾燥可能であることも認められている。したがって、両性リポソームは、安定な保存形態をもたらしかつ有効な薬剤適用を促進するための手段を提供しうる。
【００４３】
例えば、荷電脂質ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳを含有する両性リポソームは、中性脂質ＰＯＰＣが二層内にも存在する場合、酸性ｐＨで安定であることが認められている。ここで「安定な」とは、リポソームが酸性化時に凝集しないことを意味する。それに対し、ＰＯＰＣをＤＯＰＥと置き換えると、低いｐＨで膜の不安定化が生じる可能性がある。混合物中でのカチオン：アニオン比の範囲においてもかかる不安定化が認められている。
【００４４】
したがって、有利にも、該脂質相は、ＰＯＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳを含有し、ＤＯＴＡＰよりも大きいモル量のＣＨＥＭＳを含有しうる。本発明の一部の実施形態では、脂質相は、全体が１００モル％として、２０〜６０モル％のＰＯＰＣ、１０〜４０モル％のＤＯＴＡＰおよび２０〜７０モル％のＣＨＥＭＳを含有しうる。
【００４５】
好ましい一実施形態では、脂質相は、全体が１００モル％として、約６０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰおよび約３０モル％のＣＨＥＭＳを含有しうる。
【００４６】
ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳは、ＰＯＰＣと安定な二層も形成しうる。脂質相中のＭｏＣｈｏｌの量は、ＣＨＥＭＳのモル量に実質的に等しいかまたはそれよりも多い可能性がある。ＣＨＥＭＳおよびＭｏＣＨＯＬの全モル量は脂質相の約３０〜約８０モル％でありうる。
【００４７】
したがって好ましい一実施形態では、脂質相は、全体が１００モル％として、約３０モル％のＰＯＰＣ、約３５モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約３５モル％のＣＨＥＭＳを含有しうる。
【００４８】
有利には、該脂質相はＤＯＰＥをさらに含有する。
【００４９】
したがって別の好ましい実施形態では、該脂質相は、全体が１００モル％として、約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＣＨＥＭＳを含有する。
【００５０】
さらにここでの別の好ましい実施形態では、該脂質相は、全体が１００モル％として、約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４６モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＣＨＥＭＳを含有する。
【００５１】
一部の実施形態では、該脂質相は、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌおよびＤＭＧＳｕｃｃを含有しうる。脂質相は、ＤＭＧ−Ｓｕｃｃよりも多いかまたはそれに実質的に等しいモル量のＭｏＣｈｏｌを含有し、ＤＭＧ−ＳｕｃｃおよびＭｏＣｈＯＬの全モル量は脂質相の３０〜８０モル％でありうる。
【００５２】
したがって、さらに別の好ましい実施形態では、該脂質相は、全体が１００モル％として、約１５モル％のＰＯＰＣ、約４５モル％のＤＯＰＥ、約２０モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２０モル％のＤＭＧ−Ｓｕｃｃを含有する。
【００５３】
さらに別の好ましい実施形態では、該脂質相は、全体が１００モル％として、約６モル％のＰＯＰＣ、約２４モル％のＤＯＰＥ、約４６モル％のＭｏＣｈｏｌおよび約２３モル％のＤＭＧＳｕｃｃを含有する。
【００５４】
一部の実施形態では、脂質相はコレステロールをさらに含有する。一部の実施形態では、該脂質相は１０〜４０モル％、好ましくは１５〜２５モル％のコレステロールを含有しうる。一実施形態では、該脂質相は、全体が１００モル％として、約３０モル％のＰＯＰＣ、約１０モル％のＤＯＴＡＰ、約２０モル％のＣＨＥＭＳおよび約４０モル％のＣｈｏｌを含有しうる。
【００５５】
下記の実施例は、本発明の実施に適する両性リポソームのさらなる混合物を提供する。本発明が実施例に限定されないように、他の両性リポソームを同定しかつ試験するためのアッセイについても記載される。
【００５６】
本発明の活性薬剤は核酸に基づいている。上記のように、これらはタンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡにおける１つもしくは複数の特異的な配列をコードする核酸およびタンパク質の発現を特異的に下方制御しうるオリゴヌクレオチドに分類される。
【００５７】
したがって、本発明の一部の実施形態では、核酸に基づく治療は、脊椎動物細胞内でｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはリボザイムでありうる１種またはそれ以上のＲＮＡへの転写能を有する核酸を含みうる。ここでかかるｍＲＮＡは１種またはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする。かかる核酸治療薬は、環状ＤＮＡプラスミド、線形ＤＮＡコンストラクト、国際公開第９８／２１３２２号パンフレットもしくはＤＥ１９７５３１８２号明細書に開示されたＭＩＤＧＥ（Ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクター類または翻訳可能な状態のｍＲＮＡ（例えばＥＰ１３９２３４１号明細書）でありうる。
【００５８】
本発明の別の実施形態では、特異的なタンパク質をコードする既存の細胞内核酸を標的にしうるオリゴヌクレオチドが使用されることにより、タンパク質の発現が弱まる可能性がある。「標的核酸」という用語は、特異的なタンパク質をコードするＤＮＡ、ならびにかかるＤＮＡ由来のプレ−ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡといったすべてのＲＮＡを包含する。標的核酸とかかる配列に特異的な１種またはそれ以上のオリゴヌクレオチドの間の特異的なハイブリダイゼーションを行う結果、タンパク質の発現が阻害されうる。かかる特異的なターゲティングを行うため、オリゴヌクレオチドは、適切には標的核酸の配列に相補的なヌクレオチドの連続ストレッチを含む必要がある。
【００５９】
上記の基準を満たすオリゴヌクレオチドは、多数の異なる化学物質またはトポロジーを包含しうる。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖でありうる。一本鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして周知であるＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド、固定化核酸、２’−修飾オリゴヌクレオチドおよびその他を含むがこれらに限定されない。骨格または塩基修飾は、ホスホチオエートＤＮＡ（ＰＴＯ）、２’Ｏ−メチルＲＮＡ（２’Ｏｍｅ）、２’Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート（ＮＰ）、２’フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、固定化核酸（ＬＮＡ）、モルホリンホスホアミデート（モルホリノ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）およびその他を含みうるがこれらに限定されない。さらに、混合化学物質は当該技術では既知であり、共重合体、ブロック共重合体またはギャップマーとして、あるいは他の配列において単一のヌクレオチドよりも多くの種から構成される。
【００６０】
上記オリゴヌクレオチドに加え、タンパク質の発現は、相補配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を用いても阻害されうる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術ではｓｉＲＮＡ分子として知られている（例えば、国際公開第９９／３２６１９号パンフレットおよび国際公開第０２／０５５６９３号パンフレット）。この場合にも様々な化学物質がこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合される。さらにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当該技術では既知である。
【００６１】
本発明の別の実施形態では、デコイオリゴヌクレオチドが使用されうる。これらの二本鎖ＤＮＡ分子は核酸ではなく転写因子を標的にする。これは、デコイオリゴヌクレオチドが配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質に結合しかつ転写に干渉するように適合されることを意味する（例えば、チョ・チュン（Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ）ら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１９９９年）。
【００６２】
あらゆる上記のオリゴヌクレオチドは、１０程度、好ましくは１５、およびより好ましくは１８ヌクレオチドから５０、好ましくは３０、およびより好ましくは２５ヌクレオチドの間で長さが変化しうる。オリゴヌクレオチドと標的配列の間の適合性は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの各塩基が上記オリゴヌクレオチド数の連続ストレッチを上回る標的核酸上のその相補的塩基と塩基対を形成することによって完全である。しかしあまり好ましいことではないが、配列対は、塩基対の該連続ストレッチ内に１個もしくは数個のミスマッチを含みうる。
【００６３】
治療物質は、治療または予防がなされるべき疾患症状または疾患に応じて選択されうる。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物がＣＤ４０をコードする核酸を標的にするオリゴヌクレオチドを含むことにより、哺乳類細胞内でのかかるＣＤ４０の発現が弱まる可能性がある。上記のように、本明細書では「ＣＤ４０をコードする核酸」とは、ＣＤ４０をコードするＤＮＡおよびかかるＤＮＡ由来のプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡといったＲＮＡを意味する。
【００６４】
上記オリゴヌクレオチドに加え、ＣＤ４０の発現は、相補配列モチーフを含む二本鎖ＲＮＡ分子を用いても阻害されうる。かかるＲＮＡ分子は、当該技術ではｓｉＲＮＡ分子として知られている。この場合にも様々な化学物質がこのクラスのオリゴヌクレオチドに適合される。さらにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド系が当該技術では既知である。
【００６５】
より詳細には、本明細書では、かかるオリゴヌクレオチドに有用な配列および化学物質について述べた米国特許第６，１９７，５８４号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（いずれもベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ））が参照される。ＣＤ４０の阻害のためのｓｉＲＮＡ配列モチーフについて述べたプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年もまた参照される。さらに、ｓｉＲＮＡモチーフは公開されており、例えばサンタクルース・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（サンタクルース（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、米国）から入手してもよい。
【００６６】
リポソームの作製のための方法は当業者にとっては既知である。それらには、所定の孔径の膜を介した押し出し、エタノール中の脂質溶媒のカーゴを含有する水相への注入、または高圧均一化が含まれる。
【００６７】
さらに、核酸治療薬を実質的に中性ｐＨで賦形剤と接触させることにより、核酸を含有する溶液のうちの特定の百分率を占める大量の封入体が生成されうることは当該技術では既知である。薬剤の実質上のカプセル封入を促進するためには、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲の高濃度の賦形剤が好ましい。
【００６８】
かかる標準的方法に対し、両性リポソームは、それらの等電点またはその近傍でオリゴ核酸と結合することによって薬剤をリポソーム表面に集結させるという確かな利点をもたらす。かかるプロセスは、参照により本明細書中に援用される国際公開第０２／０６６０１２号パンフレット中により詳細に記載されている。
【００６９】
実際の作製プロセスとは無関係に、リポソームが密度の高い容器として形成される初期作製ステップの後に、任意の非カプセル封入活性薬剤がリポソームから除去されうる。この場合も、技術文献および本明細書中に含められる参考文献ではかかる方法について詳細に記載され、かつ適切なプロセスステップには、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降、透析、限界濾過またはダイアフィルトレーションなどが含まれうるがこれらに限定されない。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも５０重量％および好ましくは８０重量％超の薬剤がリポソーム内部に配置される。
【００７１】
しかし、非カプセル封入物質のかかる除去は必須ではなく、本発明の一部の実施形態では、組成物は遊離薬剤および捕捉薬剤を含みうる。
【００７２】
組成物の粒径は５０〜１０００ｎｍ、好ましくは１００〜５００ｎｍでありうる。
【００７３】
作製プロセス後に、組成物の凍結乾燥は安定化のためのさらなる手段を提供しうる。本発明の好ましい一実施形態では、組成物は、使用に先立ち上記の酸性ｐＨで凍結乾燥され、次いで注射用水で再構成されうる。凍結乾燥の間の酸性ｐＨおよびそれに続く再構成は、薬剤とリポソーム膜との相互作用によるカプセル封入核酸物質の損失を阻止する。もし凍結乾燥が作製手順の一部である場合、糖、アミノ酸またはポリマーなどの保護剤が担体中に存在しうる。
【００７４】
低いｐＨで特に有利な場合に医薬組成物の適用がなされるが、当然ながら本発明の実施はそれに限定されない。本発明の一部の実施形態では、組成物は約７〜約８の生理的ｐＨで適用されうる。
【００７５】
本発明の好ましい一実施形態では、組成物は弱酸性ｐＨ、特に賦形剤の等電点未満のｐＨで適用されうる。より好ましくは、組成物のｐＨは約ｐＨ３．５以上の場合があり、最も好ましくは、組成物は適用される場合に４〜５のｐＨを有する。
【００７６】
かかる適用における医薬的に許容できる担体は当業者には既知であり、所望のｐＨを有する組成物のために酢酸、クエン酸またはグリシンなどを含むがこれらに限定されない。より一般的には、担体は、水、緩衝液物質、塩、糖、ポリマーなどを含む任意の適切な医薬的に許容できる担体を含有しうる。
【００７７】
低いｐＨが核酸または脂質の長期安定性に対して有害でありうることから、ｐＨは使用前に優先的により低い値に調節される。医薬的に許容できる標準状態下でこれを達成するための手段は、当業者には既知であり、保存が安定的なコロイドを、優先的により低いｐＨに緩衝化された、より好ましくはｐＨ２〜ｐＨ４の緩衝液である、適量の酢酸、クエン酸またはグリシンと混合させるステップを含むがこれに限定されない。
【００７８】
以下は、本発明の異なる実施形態に記載の医薬組成物を調製するために有利に使用されうるプロセスステップの特定の組み合わせである。
（Ａ）
Ｉ．中性ｐＨでの核酸のカプセル封入
ＩＩ．担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった薬剤が除去される
Ｖ．保存形態：懸濁液
ＶＩ．ｐＨが賦形剤の等電点未満に調節される
ＶＩＩ．酸性ｐＨでの投与
（Ｂ）
Ｉ．中性ｐＨでの核酸のカプセル封入
ＩＩ．担体は水、生理食塩水または緩衝化生理食塩水でありうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．捕捉されなかった薬剤が除去される
Ｖ．保護剤の添加によってｐＨがリポソーム賦形剤の等電点未満に調節される
ＶＩ．凍結乾燥
ＶＩＩ．保存形態：粉末
ＶＩＩＩ．酸性ｐＨでの再構成および投与
（Ｃ）
Ｉ．０．５〜２０、好ましくは１〜１０である薬剤のアニオン電荷に対する賦形剤のカチオン電荷のモル比を用いた、賦形剤の等電点未満のｐＨでの核酸のカプセル封入
ＩＩ．担体は酢酸、クエン酸などによって緩衝化されかつ塩化ナトリウムまたはスクロースをさらに含有しうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．抗凍結剤の添加および凍結乾燥
Ｖ．保存形態：粉末
ＶＩ．酸性ｐＨでの再構成および投与
（Ｄ）
Ｉ．０．５〜２０およびより好ましくは１〜１０である薬剤のアニオン電荷に対する賦形剤のカチオン電荷のモル比を用いた、賦形剤の等電点未満のｐＨでの核酸のカプセル封入
ＩＩ．担体は酢酸、クエン酸などによって緩衝化されかつ塩化ナトリウムまたはスクロースをさらに含有しうる
ＩＩＩ．実際のリポソーム形成およびサイジングステップ
ＩＶ．ｐＨを中性に上昇させる
Ｖ．捕捉されなかった薬剤が除去される
ＶＩ．（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）からさらなるプロセスステップの組み合わせを選択する
【００７９】
したがって、本発明は、粘膜、エクスビボでの移植に先立つ移植片または眼への局所適用のための核酸を含む医薬組成物を包含する。かかる組成物は、本明細書で提供される実施例に限定されることなく、炎症性腸疾患の治療において治療的活性を示しうる。一般に、本発明の組成物は、動物における異なる症状または疾患の予防あるいは治療にとって有用である。１つの特定のタスクは、移植片拒絶、対宿主移植片病、炎症性腸疾患、クローン病（Ｍｏｒｂｕｓ  Ｃｒｏｈｎ）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息およびＣＯＰＤを含む炎症、免疫または自己免疫疾患の予防あるいは治療における組成物の局所適用である。
【００８０】
本発明の組成物の投与は、当業者の通常の技能の範囲内にある。投与は、治療されるべき疾患の重症度および／または応答性、数日から数か月にかけて持続する治療の治療単位、あるいは治療が有効となっているかまたは疾患の徴候の減少が得られているまでの時間に依存しうる。至適な投与計画は、患者体内の薬剤蓄積の測定値から算出されうる。当業者であれば、至適用量、投与方法および反復率を容易に判定できる。至適用量は組成物における個々の薬剤の相対効力に依存して変化する場合があり、かつ一般に、動物モデルにおいて有効であることが認められたＥＣ５０値に基づいて評価されうる。用量は、毎日、週１回、月１回または年１回与えられるかあるいはより不規則に与えられる場合さえある。当業者であれば、体液中または組織内での薬剤の測定された滞留時間および濃度に基づく投与における反復率を容易に評価することができる。治療が成功した後、患者に維持療法を受けさせることで疾患状態の再発を予防することが望ましい場合があり、ここでは調合物が維持用量で１日に１回もしくは複数回ないし１年に１回投与されうる。
【００８１】
以下は、本発明の実施形態の添付図面についてあくまで例として記載するものである。
【実施例】
【００８２】
実施例１：両性リポソームの調製
【００８３】
【表１】
2008520600.tif 000002
【００８４】
脂質混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。脂質膜をＰＢＳ、ｐＨ７．５で水和した。得られた脂質濃度は５０ｍＭであった。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径２００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。
【００８５】
実施例２：空の両性リポソームによるｐＨシフト実験
実施例１のリポソーム１０μｌを１００ｍＭクエン酸塩／リン酸塩緩衝液  ｐＨ４〜８で１：１００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。次いで、０．９％生理食塩水７．５ｍｌを添加し、リポソームの大きさを動的光散乱によって特徴づけた。
【００８６】
結果を図１に示す。１：３の比で荷電脂質ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳからなる両性リポソームは、中性脂質ＰＯＰＣも二層で少なくとも４０％で存在する場合の酸性ｐＨ時に限って安定である。
【００８７】
実施例３：カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を負荷したリポソームの調製
【００８８】
【表２】
2008520600.tif 000003
【００８９】
【表３】
2008520600.tif 000004
【００９０】
脂質混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。脂質膜を１０ｍＭヘペス中１０μＭ  ＣＦ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で水和した。得られた脂質濃度は１０ｍＭであった。懸濁液を水槽内、室温で４５分間水和させ、５分間超音波処理してから、−７０℃で凍結／解凍サイクルを３回行った。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径２００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。サイズ排除クロマトグラフィーによって非カプセル封入ＣＦを取り出す一方、リポソームを６倍に希釈した。
【００９１】
実施例４：実施例３の両性リポソームによるｐＨシフト実験
実施例３のリポソーム１５０μｌ、０．９％生理食塩水７．５ｍｌおよび０．５Ｍクエン酸塩／リン酸塩緩衝液１５０μｌの混合物をｐＨ４〜８で調製し、リポソームの大きさを動的光散乱によって特徴づけた。
【００９２】
結果を図２および図３に示す。異なる比で荷電脂質ＤＯＴＡＰおよびＣＨＥＭＳからなる両性リポソームはＤＯＰＥではなくＰＯＰＣの存在によって安定化されうる。
【００９３】
実施例５：空の両性リポソームの調製
【００９４】
【表４】
2008520600.tif 000005
【００９５】
脂質混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。脂質膜をＰＢＳ、ｐＨ７．５で水和した。得られた脂質濃度は１００ｍＭであった。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。
【００９６】
実施例６：プラスミドを負荷した両性リポソームの調製
【００９７】
【表５】
2008520600.tif 000006
【００９８】
１０容量％のエタノール脂質溶液を、ルシフェラーゼをコードする１６μｇ／ｍｌの７０００ｂｐプラスミドを含有する１０ｍＭのＮａＡｃ  １５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ４．５または１０ｍＭのＮａＡｃ  ｐＨ４．５に注入することにより、リポソームを作製した。得られた脂質濃度は２ｍＭであった。この溶液のｐＨは１／１０容量の１Ｍヘペス  ｐＨ８を用いて直ちにシフトした。希釈したリポソームを濃縮するため、懸濁液をＴＬＡ１００．４ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）  Ｏｐｔｉｍａ−ＭＡＸ）内、８０，０００ｒｐｍで１時間沈降させた。非カプセル封入プラスミドを取り出すため、濃縮したリポソーム懸濁液をスクロースストック溶液で希釈し、０．８Ｍスクロースにした。ＰＢＳ中０．５Ｍスクロースおよび純粋なＰＢＳを上部に層状化し、粒子外部のプラスミドを取り出すために勾配を形成した。スクロース勾配をＭＬＳ−５０ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）  Ｏｐｔｉｍａ−ＭＡＸ）内、４０，０００ｒｐｍで４５分間回転させ、リポソームを上部相間から取り出した。
【００９９】
調合物ＰＯＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳを以下のプロセスによって６０：１０：３０で作製した。
【０１００】
脂質混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。脂質膜を１００μｇ／ｍｌのプラスミドＰＢＳを含有する１０ｍＭのＮａＡｃ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４．５で水和した。得られた脂質濃度は１０ｍＭであった。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径８００／２００／８００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。非カプセル封入プラスミドを取り出すため、濃縮したリポソーム懸濁液をスクロースストック溶液で希釈し、０．８Ｍスクロースにした。ＰＢＳ中０．５Ｍスクロースおよび純粋なＰＢＳを上部に層状化し、粒子外部のプラスミドを取り出すための勾配を形成した。スクロース勾配をＭＬＳ−５０ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）  Ｏｐｔｉｍａ−ＭＡＸ）内、４０，０００ｒｐｍで４５分間回転させ、リポソームを上部相間から取り出した。
【０１０１】
実施例７：ｐＨ４．５で安定な両性リポソーム
リポソームをまずＰＢＳ  ｐＨ７．５中で１：１０に希釈し、その後で１／１０の容量の１Ｍ酢酸塩、ｐＨ４．５を極めて速やかに添加した。試料をシフトバッファ（ｓｈｉｆｔ  ｂｕｆｆｅｒ）の添加直後に撹拌混合した。リポソームを動的光散乱によって特徴づけた。
【０１０２】
【表６】
2008520600.tif 000007
【０１０３】
実施例８：ＣＤ４０−ＯＤＮを含有するリポソームの調製
８５μモルのＰＯＰＣ、４２μモルのＣＨＥＭＳおよび１４μモルのＤＯＴＡＰの混合物をクロロホルムに溶解し、丸底フラスコ内で蒸発させ真空下で乾燥させた。
【０１０４】
アスタリスクがヌクレオチド間のホスホロチオエート連結を示す場合の配列Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＡＧＡＴＧＧＡＣＣＧＣＴ＊Ｇ＊Ｔを有するＯＤＮを用いた（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ  ２００３年、ｒＡＳ３を参照）。
【０１０５】
脂質膜を緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ４．５）１ｍＬ中の１ｍｇのＯＤＮで水和した。懸濁液を水槽内、室温で２５分間水和させ、５分間超音波処理し、最終的に−７０℃で冷凍した。解凍後、リポソーム懸濁液を孔径４００ｎｍのポリカーボネート膜を介して１５回押し出した。リポソーム懸濁液を１Ｍヘペス緩衝液を使用してｐＨ７．５にし、ストック溶液を使用して０．８Ｍスクロースにした。非カプセル封入ＯＤＮを１０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で重層させた０．５Ｍスクロースを介した浮遊により押し出した試料から除去し、リポソーム懸濁液を４℃で保存した。得られたリポソームを動的光散乱によって特徴づけると、大きさが２２０〜２５０ｎｍであることがわかった。
【０１０６】
実施例９：大腸炎の誘発
２０ｍｇのＴＮＢＳを１５０ｍＭのＮａＣｌ中３５％エタノール１３５μｌに添加することによって調製した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の単一の結腸内部への適用を用いることにより、大腸炎を誘発した。光エーテル麻酔下で雄ウィスターラット（２００〜２５０ｇ）を置いて、肛門管を通して下行結腸に挿入された８ｃｍ長のカテーテルを使用して混合物を投与した。カテーテルを取り出した後、ラットを頭を下にした姿勢に３０秒間保って腸からの流出を回避し、以後はラットを通常の状態で保持した。
【０１０７】
実施例１０：治療および分析
大腸炎誘発の４時間前または３日後に、ラットを実施例１から得たＣＤ４０アンチセンスで治療した。実施例１から得たアンチセンス懸濁液を１Ｍ緩衝酢酸／酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０を使用してｐＨ４．５にし、２．７μｇのＣＤ４０アンチセンスを含有する全体で１００μｌの懸濁液を実施例２に記載の結腸に適用した。
【０１０８】
大腸炎の誘発の７日後、動物を殺した。結腸を摘出し、縦方向に開いた。４％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に結腸試料を固定した。パラフィン包埋切片（５μｍ）をヘマトキシリン／エオシンで染色してから顕微鏡検査した。
【０１０９】
結腸障害を以下の基準によってスコアリングした。
【０１１０】
【表７】
2008520600.tif 000008
【０１１１】
結果を図４から図５Ａ〜５Ｄに示し、それはスクランブルした対照アンチセンスではなくＣＤ４０に特異的なアンチセンスで治療した場合に実験大腸炎が極めて顕著に減少することを示している。かなり意外なことに、３日目で完全に発症した大腸炎に対してたとえ単回治療であっても、炎症が著しくほぼ完全に減少するに至った。それに対する確認として、疾患の開始前に調合物を予防的様式で適用した場合、大腸炎の予防も実現した。
【０１１２】
実施例１１：別の調合物
６０モル％のＰＯＰＣ、２０モル％のＨｉｓｔＣｈｏｌおよび２０モル％のコレステロールの混合物を賦形剤として使用した場合でも実験大腸炎の治療が奏功するに至った。
【０１１３】
実施例１２：ノンリムーバル（ｎｏｎ−ｒｅｍｏｖａｌ）の外部アンチセンス
ノンリムーバルの非カプセル封入アンチセンスを調合物として使用した場合でも安定なコロイド状の担体系が生成した。
【０１１４】
実施例１３：材料
この実施例は、ＣＤ４０の発現を調節しかつ本発明に記載の組成物における使用に適するオリゴヌクレオチドによって標的にされうるＣＤ４０ヌクレオチド配列の限定されない例を提供する。
【０１１５】
ヒトＣＤ４０  ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｘ６０５９２）
本発明における標的対象のヒトＣＤ４０  ｍＲＮＡ配列は配列番号１内に存在する。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号８５）、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許第６，１９７，５８４号明細書（すなわち配列番号８５）およびプルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁の中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号１）：
【化１】
2008520600.tif 000009
【０１１６】
ハツカネズミＣＤ４０  ｍＲＮＡ
本発明における標的対象のマウスＣＤ４０  ｍＲＮＡ配列は配列番号２内に存在する。関連配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書（すなわち配列番号１３２）中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
（配列番号２）：
【化２】
2008520600.tif 000010
【０１１７】
ラットＣＤ４０  ｍＲＮＡ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＦ２４１２３１）
本発明における標的対象のラットＣＤ４０  ｍＲＮＡ配列は配列番号３内に存在する（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ  ２００３年を参照）。
（配列番号３）：
【化３】
2008520600.tif 000011
【０１１８】
ブタＣＤ４０  ｃＤＮＡ
本発明における標的対象のブタＣＤ４０  ｃＤＮＡ配列は配列番号４内に存在する（図１１）。関連配列情報が、ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁の中に認められ、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１１９】
さらに以下に、本発明における使用に適する、アンチセンスＣＤ４０核酸配列を例とする抗−ＣＤ４０オリゴヌクレオチドの限定されない例を提供する。
【０１２０】
ヒトＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ヒトアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中および米国特許第６，１９７，５８４号明細書中に認められ、それらの内容は参照により本明細書中に提供される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
【化４】
2008520600.tif 000012
【０１２１】
以下のｓｉＲＮＡ配列は本発明における使用に適し（例えば、プルビネ（Ｐｌｕｖｉｎｅｔ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年、１０４（１２）、３６４２−３６４６頁を参照）、その内容は参照により本明細書中に援用される。
【化５】
2008520600.tif 000013
【０１２２】
すべてのｓｉＲＮＡは３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
【０１２３】
マウスＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
マウスのアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。さらに、配列情報が、ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７１号明細書中に認められ、これによってその内容は参照により本明細書中に援用される。ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）らによって示された配列番号を右側に示す。
マウス
【化６】
2008520600.tif 000014
【０１２４】
ラットＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ラットアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す（ガオ（Ｇａｏ）、博士論文、２００３年、ゲッチンゲン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツを参照）。
【化７】
2008520600.tif 000015
【０１２５】
ブタＣＤ４０に対するオリゴヌクレオチド
ブタアンチセンスＣＤ４０オリゴヌクレオチドの例を下記に示す。ラッシュワース（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ）ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２００２年、７３（４）、６３５−６４２頁を参照のこと。その内容は参照により本明細書中に援用される。
【化８】
2008520600.tif 000016
【０１２６】
脂質における略称の用語集
脂質における略語は主に文献における標準使用を示し、有用な参照として本明細書内に含められる。
ＤＭＰＣ  ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ  ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ  ジステアロイルホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ  パルミトイル−オレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＣ  ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＥ  ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＭＰＥ  ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＥ  ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＧ  ジオレオイルホスファチジルグリセロール
ＰＯＰＧ  パルミトイル−オレオイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＧ  ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＧ  ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ＤＭＰＳ  ジミリストイルホスファチジルセリン
ＤＰＰＳ  ジパルミトイルホスファチジルセリン
ＤＯＰＳ  ジオレオイルホスファチジルセリン
ＰＯＰＳ  パルミトイル−オレオイルホスファチジルセリン
ＤＭＰＡ  ジミリストイルホスファチジン酸
ＤＰＰＡ  ジパルミトイルホスファチジン酸
ＤＯＰＡ  ジオレオイルホスファチジン酸
ＰＯＰＡ  パルミトイル−オレオイルホスファチジン酸
ＣＨＥＭＳ  コレステロールヘミサクシネート
ＤＣ−Ｃｈｏｌ  ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
Ｃｅｔｙｌ−Ｐ  セチルリン酸
ＤＯＤＡＰ  （ｌ，２）−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ−塩化ジメチルアンモニウム
ＤＯＥＰＣ  １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン
ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ  ３−β−［Ｎ−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタン）カルバモイル］コレステロール
ＴＣ−Ｃｈｏｌ  ３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール
ＤＯＴＭＡ  （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））
ＤＯＧＳ  （（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシル−スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））
ＣＴＡＢ  セチル−トリメチルアンモニウムブロマイド
ＣＰｙＣ  セチル−ピリジニウムクロライド
ＤＯＴＡＰ  （ｌ，２−ジオレオイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＭＴＡＰ  （１，２−ジミリストイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＰＴＡＰ  （１，２−ジパルミトイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩
ＤＯＴＭＡ  （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）
ＤＯＲＩＥ  （ｌ，２−ジオレイルオキシプロピル）−３ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）
ＤＤＡＢ  ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド
ＤＰＩＭ  ４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−ｌ−メチル−ｌＨ−イミダゾール
ＣＨＩＭ  コレステロール−（３−イミダゾール−ｌ−ｙｌプロピル）カルバメート
ＭｏＣｈｏｌ  ４−（２−アミノエチル）−モルホリノ−コレステロールヘミサクシネート
ＨｉｓＣｈｏｌ  ヒスタミニル−コレステロールヘミサクシネート
ＨＣＣｈｏｌ  Ｎα−ヒスチジニル−コレステロールカルバメート
ＨｉｓｔＣｈｏｌ  Ｎα−ヒスチジニル−コレステロール−ヘミサクシネート
ＡＣ  アシルカルノシン、ステアリル−＆パルミトイルカルノシン
ＨｉｓｔＤＧ  １，２−ジパルミトイルグリセロール−ヘミサクシネート−Ｎα−ヒスチジニル−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＩｓｏＨｉｓｔＳｕｃｃＤＧ  １，２−ジパルミトイルグリセロール−Ｏａ−ヒスチジニル−Ｎα−ヘミサクシネート、＆ジステアロイル−、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
ＤＧＳｕｃｃ  １，２−ジパルミトイルグリセロール−３−ヘミサクシネート＆ジステアロイル−、ジミリストイル−ジオレオイルまたはパルミトイル−オレオイル誘導体
【化９】
2008520600.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳ混合物内でＰＯＰＣ含量が増大した。低いｐＨでの粒子の成長を完全に阻止するのに少なくとも４０％のＰＯＰＣが必要とされる。
【図２】リポソームがｐＨ７．５で作製され、凝集を促進するために酸性状態に調節された。２０モル％のＰＯＰＣの添加により融合傾向が大幅に減少する。
【図３】（図２）中と同一であるがＤＯＰＥにおける安定化が試験された。ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳ  ２５／７５とＤＯＰＥ／ＤＯＴＡＰ／ＣＨＥＭＳ  ２０／２０／６０が比較される場合、粒子の成長がより低いｐＨで開始する。さらに試験対象の全混合物が強い凝集および融合を受ける。
【図４】結腸障害に関する顕微鏡スコアリング（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇ）              対照  対照動物、ＰＢＳで処理              ＣＤ４０／０  誘発の０日目、４時間前に治療              ＣＤ４０／０＿３  誘発の０日目、４時間前に治療および３日目に治療              ＳＣＲ／０  スクランブルした対照で誘発の４時間前に治療              ＣＤ４０／３  ３日目のみ治療              ＳＣＲ／３  ３日目にスクランブルした対照で治療
【図５Ａ】治療後の結腸切片（正常、非罹患腸壁）
【図５Ｂ】治療後の結腸切片（炎症性を示すが治療されていない腸壁）
【図５Ｃ】治療後の結腸切片（スクランブルした対照を用いた大腸炎誘発前の治療）
【図５Ｄ】治療後の結腸切片（特異的なＣＤ４０アンチセンスを用いた大腸炎誘発前の治療）
【図６】本発明に記載のターゲティングを目的としたブタＣＤ４０  ｃＤＮＡ配列（配列番号４）。
【図１】
2008520600.tif 000018
【図２】
2008520600.tif 000019
【図３】
2008520600.tif 000020
【図４】
2008520600.tif 000021
【図５】
2008520600.tif 000022
【図６】
2008520600.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月25日(2007.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008520600000001.app
【国際調査報告】
2008520600.tif 000024
2008520600.tif 000025
2008520600.tif 000026
2008520600.tif 000027