(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）（式中、Ｒ１〜Ｒ７は明細書に定義されたとおりである）のスルホンアミド誘導体に関する。化合物（Ｉ）は１０バニロイド受容体に拮抗し、炎症状態の処置用医薬の調製に使用することができる。
2008517884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008517884.tif 000043
（式中、
Ｒ１は、水素であり；
Ｒ２は、ベンジル又は２−フェニルエチルであり、ここで、芳香環は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ及びメトキシから選択される一つ又はそれ以上の基で置換されており；
Ｒ３は、水素、ハロゲン又はアルコキシ基であり；
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−基であり、ここで、ｎは、０〜３の範囲にあり；
Ｒ５は、Ｓ又はＯであり；
Ｒ６は、−ＮＨＣＨ２−であり；
Ｒ７は、ｔ−ブチル又はトリフルオロメチルである）で示される化合物。
【請求項２】
Ｒ５がＳを表し、Ｒ６が−ＮＨＣＨ２−基を表す、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ３が水素であり、Ｒ７が４−ｔ−ブチル及び４−トリフルオロメチルから選択される、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ４基において、ｎが０である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ４基において、ｎが２である、請求項３記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２がベンジル又は２−フェニルエチルであり、ここで、芳香環が、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ及びメトキシから選択される一つ又はそれ以上の基で置換されている、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１が水素であり、Ｒ２２−がヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
医薬としての使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に定義の式（Ｉ）の化合物。
【請求項９】
炎症状態の治療用の医薬組成物を調製するための、請求項１〜７のいずれか一項に定義の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１０】
炎症状態が、慢性疼痛又は炎症性痛覚過敏である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に定義の式（Ｉ）の化合物を、適切な賦形剤及び／又はビヒクルとの混合物で含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バニロイド受容体の拮抗薬に関し、特に、ＴＲＰＶ１受容体に拮抗するスルホンアミド誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の実験的証拠により、炎症状態においては、バニロイドＴＲＰＶ１受容体（一過性受容体電位チャネル）の発現が上昇することが示された。それにより、炎症過程、例えば慢性疼痛又は炎症性痛覚過敏の治療に、ＴＲＰＶ１拮抗薬が有用であり得ることが仮定された。
【０００３】
多数のバニロイド受容体拮抗薬が公知であり、その数種はカプサイシンから誘導され、カプサイシノイド拮抗薬と称されている。特に、Wrigglesworth, R.ら（J. Med. Chem. 1996, 39, 4941-4951）は、式（ＩＩ）：
【０００４】
【化２】
2008517884.tif 000003
【０００５】
で示されるチオ尿素を開示した。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
2008517884.tif 000004
【０００８】
（式中、
Ｒ１は、水素であり；
Ｒ２は、ベンジル又は２−フェニルエチルであり、ここで、芳香環は、場合により、ハロゲン、ヒドロキシ及びメトキシから選択される一つ又はそれ以上の基で置換されており;
Ｒ３は、水素、ハロゲン又はアルコキシ基であり;
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−基であり、ここで、ｎは、０〜３の範囲にあり;
Ｒ５は、Ｓ又はＯであり；
Ｒ６は、−ＮＨＣＨ２−であり；
Ｒ７は、ｔ−ブチル又はトリフルオロメチルである）で示される化合物に関する。
【０００９】
本発明の目的において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００１０】
式（Ｉ）の好ましい化合物は、Ｒ５がＳであり、Ｒ６が−ＮＨＣＨ２−基である化合物であり、特に、Ｒ３が水素であり、Ｒ７が４−ｔ−ブチル及び４−トリフルオロメチルから選択される化合物である。
【００１１】
中でも、好ましい化合物の第一の群は、Ｒ４においてｎが０である化合物である。
【００１２】
好ましい化合物の第二の群は、Ｒ４基において、ｎが２である化合物であり；中でも、特に好ましくは、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が、場合により上述したように置換された、ベンジル又は２−フェニルエチルである化合物である。
【００１３】
Ｒ２がベンジル又は２−フェニルエチルであり、ここで、芳香環が置換されている式（Ｉ）の化合物において、Ｒ２が、２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジルである化合物が好ましい。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物は、バニロイドＴＲＰＶｌ受容体の阻害剤として活性であることが証明されており、したがって、炎症状態、例えば慢性疼痛及び炎症性痛覚過敏の治療のための医薬組成物の調製に使用され得る。これらの製剤は、従来の方法及び賦形剤、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII Ed. Mack Pub., N.Y., U.S.A.に開示されているようなものを用いて調製されるであろう。
【００１５】
式（Ｉ）の化合物は、従来公知の方法、例えば式（ＩＩＩ）：
【００１６】
【化４】
2008517884.tif 000005
【００１７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｎは、上記に定義したとおりである）で示されるスルホンアミドを、式（ＩＶ）
【００１８】
【化５】
2008517884.tif 000006
【００１９】
で示されるイソシアナート又はイソチオシアナートと反応させることにより、都合よく調製され得る。
【００２０】
式（Ｉ）の数種の化合物の合成を、スキーム１〜３に示し、以下の実施例にてより詳細に説明する。
【００２１】
【化６】
2008517884.tif 000007
【００２２】
試薬：（ｉ）ジオキサン、ＴＥＡ、８０℃；（ｉｉ）２０％ＨＣｌ水溶液、ジオキサン；（ｉｉｉ）４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルイソチオシアナート又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート、エタノール、還流。
Ｒ３＝Ｈ、Ｆ、ＯＣＨ３；Ｘ＝Ｉ、Ｃｌ、Ｂｒ；Ｒ７＝ｔ−ブチル、トリフルオロメチル。
【００２３】
【化７】
2008517884.tif 000008
【００２４】
試薬：（ｉ）４−アセトアミドベンゼンスルホニルクロリド、ジオキサン；（ｉｉ）２０％ＮａＯＨ水溶液；（ｉｉｉ）４−ｔ−ブチルベンジルイソチオシアナート又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート。
Ｒ７＝ｔ−ブチル、トリフルオロメチル。
【００２５】
【化８】
2008517884.tif 000009
【００２６】
試薬：（ｉ）無水酢酸、（ｉｉ）クロロスルホン酸、０℃；（ｉｉｉ）塩酸２−ヨード（クロロ、ブロモ）−５−メトキシ−４−ヒドロキシベンジルアミン、ジオキサン；（ｉｖ）２０％ＮａＯＨ水溶液；（ｖ）４−ｔｅｒｔ−ブチルベンジルイソチオシアナート又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート、エタノール、還流。
Ｒ７＝ｔ−ブチル、トリフルオロメチル。
【００２７】
１  実施例
反応を、シリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（プレコートされたF245 Merckプレート）により定期的に監視し、生成物は、ヨウ素又は過マンガン酸カリウム溶液で視覚化した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３、ＣＦ３ＣＯＯＤ、又はＤＭＳＯ−ｄ６中で、Varian VXR 200分光計を用いて記録した。ピーク位置は、内部基準としてのテトラメチルシランから低磁場への百万分の一（δ）にて提供し、Ｊ値はＨｚにて提供する。ＩＲスペクトルは、KBr Wafer法を使用して、Pye Unicam SP 300分光計上で記録した。質量スペクトルは、Shimadzu QP5050 DI 50分光計により獲得した。表現「軽油エーテル」は、４０〜６０℃で沸騰する石油留分を指す。融点（Ｍ．ｐ．）は、Buchi-Tottoli機器上で測定され、未修正である。クロマトグラフィーは、Merckの６０〜２００メッシュのシリカゲルを使用して行なった。合成した化合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、割り当て構造と一致した。元素分析は、Ｃ、Ｈ及びＮの理論値の±０．４%以内であった。
【００２８】
１  塩酸２−（置換）−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジルアミン１〜３の調製
１．１  ４−アセチルオキシ−３−メトキシ−Ｎ−アセチル−ベンジルアミンの合成
無水酢酸（１mL、１０．５mmol）を、塩酸４−ヒドロキシ−３−メトキシ−ベンジルアミン（０．５ｇ、２．６３mmol）のピリジン（５mL）溶液に加え、混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残留物を水（１００mL）中に懸濁させた。水性層を酢酸エチル（３×２０mL）で抽出し、一緒にした有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発させて、表題の化合物を白色固体（０．４５ｇ、収率７５％）として得た。
【００２９】
【表１】
2008517884.tif 000010
【００３０】
１．２  ２−ヨード−４−アセチルオキシ−５−メトキシ−Ｎ−アセチルベンジルアミンの合成
実施例１．１のジアセチル誘導体と、触媒量のトリフルオロメタンスルホン酸（５〜６滴）を、ＩＰｙ２ＢＦ４１，２（０．６９ｇ、６．９mmol）のＣＨ２Ｃｌ２（４０mL）溶液に加えた。得られた混合物を室温で５時間撹拌した後、混合物が完全に透明になるまで、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えた。水性層をＣＨ２Ｃｌ２（３×２５mL）で抽出し、有機相を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空下で蒸発させた。残留物をＣＨ２Ｃｌ２／Ｅｔ２Ｏの混合物から再結晶させて、表題の化合物を淡黄色固体（０．３８ｇ、収率６５％）として得た。
【００３１】
【表２】
2008517884.tif 000011
【００３２】
二次元ＮＯＥＳＹ（ＣＤＣｌ３）：７．４４ppmの一重項と、２．３３ppmの一重項との間のカップリングは、ヨウ素が、芳香環の２位に存在することを裏付ける。
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３６４（Ｍ＋Ｃ１２Ｈ１４ＩＮＯ４）。
【００３３】
１．３  ２−クロロ−４−アセチルオキシ−５−メトキシ−Ｎ−アセチルベンジルアミンの合成
Ｎ−クロロスクシンイミド（３．１５mmol、０．４２g）を、実施例１．１の４−アセチルオキシ−３−メトキシ−Ｎ−アセチル−ベンジルアミン（０．５ｇ、２．１mmol）の乾燥ＤＭＦ（６mL）溶液に加え、混合物を０℃で３０分間撹拌した後、室温で１６時間撹拌した。
反応物（４０mL）に水を加えた際に、白色沈殿の形成が観察された。
固体を濾過により分離し、冷水（２×２０mL）で２回洗浄した後、Ｐ２Ｏ５上で乾燥して、表題の化合物を白色固体（０．４５ｇ、収率８３％）として得た。
【００３４】
【表３】
2008517884.tif 000012
【００３５】
二次元ＮＯＥＳＹ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．２４ppmの一重項と、７．２５ppmの一重項との間のカップリングは、塩素が、芳香環の２位に存在することを裏付ける。
ＭＳ：ｍ／ｚ  ２７２．１（Ｍ＋Ｃ１２Ｈ１４ＩＮＯ４）。
【００３６】
１．４  ２−ブロモ−４−アセチルオキシ−５−メトキシ−Ｎ−アセチルべンジルアミンの合成
Ｎ−ブロモスクシンイミド（３．１５mmol、０．４２ｇ）を、実施例１．１の４−アセチルオキシ−３−メトキシ−Ｎ−アセチル−ベンジルアミン（０．５ｇ、２．１mmol）の乾燥ＤＭＦ（６mL)溶液に加え、混合物を０℃で３０分間撹拌した後、室温で１６時間撹拌した。
反応物（４０mL）に水を加えた際に、白色沈殿の形成が観察された。
固体を濾過により分離し、冷水（２×２０mL）で２回洗浄した後、Ｐ２Ｏ５上で乾燥して、表題の化合物を白色固体（０．４６ｇ、収率８１％）として得た。
【００３７】
【表４】
2008517884.tif 000013
【００３８】
二次元ＮＯＥＳＹ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．４９ppmの一重項と、７．３９ppmの一重項との間のカップリングは、臭素が、芳香環の２位に存在することを裏付ける。
ＭＳ：ｍ／ｚ  ３１５．１（Ｍ＋Ｃ１２Ｈ１４ＢｒＮＯ４）。
【００３９】
１．５  塩酸２−ヨード（クロロ、ブロモ）−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジルアミン  １〜３の合成
３７％塩酸（０．２mL）を、２−ヨード（クロロ、ブロモ）−４−アセチルオキシ−５−メトキシ−Ｎ−アセチル−ベンジルアミン（０．１ｇ、０．２７mmol）の絶対エタノール（５mL）溶液に加え、混合物を１２時間還流した。冷却した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を乾燥アセトンから再結晶させて、表題の化合物を淡黄色固体として、定量的収率で得た。
【００４０】
２  Ν−［（２−置換−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−３−Ｒ３−４−アセトアミド  ４〜８の調製
３−（置換）−スルホニルクロリド（２．１mmol）のジオキサン（５０mL）溶液に、ＴＥＡ（２mol等量）及び塩酸２−置換−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジルアミン（２mol等量）を加えた。混合物を３時間加熱還流し、溶媒を減圧除去し、残留物に水（５０mL）を加えた。形成された固体を濾過により分離し、乾燥し、エタノールから再結晶させて、所望の生成物を白色固体として得た。
【００４１】
２．１  Ｎ−［（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−４−アセトアミド  ４
【００４２】
【表５】
2008517884.tif 000014
【００４３】
２．２  Ｎ−［（２−クロロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−４−アセトアミド  ５
【００４４】
【表６】
2008517884.tif 000015
【００４５】
２．３  Ｎ−［（２−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−４−アセトアミド  ６
【００４６】
【表７】
2008517884.tif 000016
【００４７】
２．４  Ｎ−［（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−３−フルオロ−４−アセトアミド  ７
【００４８】
【表８】
2008517884.tif 000017
【００４９】
２．５  Ｎ−［（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニルベンゼン−３−メトキシ−４−アセトアミド  ８
【００５０】
【表９】
2008517884.tif 000018
【００５１】
３  実施例２のＮ−アセチル官能基の加水分解のための一般的手順
実施例２のアセチル誘導体（１ｇ）のジオキサン（１５mL）溶液に、２０％ＨＣｌ（２０mL）水溶液を加え、混合物を１時間加熱還流した。溶媒を減圧除去し、残留物に水を加えた。得られた溶液を、２０％ＮａＯＨ水溶液で中和し、形成された固体を濾過により分離し、冷水（３０mL）で洗浄した。沈殿を乾燥し、絶対エタノールから再結晶させて、遊離アミノ化合物を固体として、定量的収率で得た。
【００５２】
３．１  Ｎ−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−４−アミノベンゼンスルホンアミド  ９
【００５３】
【表１０】
2008517884.tif 000019
【００５４】
３．２  Ｎ−（２−クロロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−４−アミノベンゼンスルホンアミド  １０
【００５５】
【表１１】
2008517884.tif 000020
【００５６】
３．３  Ｎ−（２−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−４−アミノベンゼンスルホンアミド  １１
【００５７】
【表１２】
2008517884.tif 000021
【００５８】
３．４  Ｎ−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−３−フルオロ−４−アミノベンゼンスルホンアミド  １２
【００５９】
【表１３】
2008517884.tif 000022
【００６０】
３．５  Ｎ−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−３−メトキシ−４−アミノベンゼンスルホンアミド  １３
【００６１】
【表１４】
2008517884.tif 000023
【００６２】
４  Ｎ−（４−Ｒ７−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−置換）−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）−３−Ｒ３−アミノスルホニル］フェニルチオ尿素誘導体  １４〜２１の合成のための一般的手順
化合物９〜１３（０．２３mmol）の無水エタノール（１０mL）溶液に、４−ｔ−ブチルベンジルイソチオシアナート又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート（１．２mol等量、Wrigglesworth, R.et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 4942-4951)を加え、混合物を１６時間加熱還流した。溶媒を減圧除去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル（etere petrolio）１：１）で精製して、誘導体１４〜２１を固体として与えた。
【００６３】
４．１  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １４
【００６４】
【表１５】
2008517884.tif 000024
【００６５】
４．２  Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １５
【００６６】
【表１６】
2008517884.tif 000025
【００６７】
４．３  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）−３−フルオロ−アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １６
【００６８】
【表１７】
2008517884.tif 000026
【００６９】
４．４  Ｎ−（４−ｔ−ブチルベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）−３−メトキシ−アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １７
【００７０】
【表１８】
2008517884.tif 000027
【００７１】
４．５  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−クロロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １８
【００７２】
【表１９】
2008517884.tif 000028
【００７３】
４．６  Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−クロロ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  １９
【００７４】
【表２０】
2008517884.tif 000029
【００７５】
４．７  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  ２０
【００７６】
【表２１】
2008517884.tif 000030
【００７７】
４．８  Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ブロモ−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル］フェニルチオ尿素  ２１
【００７８】
【表２２】
2008517884.tif 000031
【００７９】
５  Ｎ−（２−フェニルエチル）−４−アセトアミドベンゼンスルホンアミド  ２３の合成
塩化スルホニル（０．５ｇ）の無水ジオキサン（３０mL）溶液に、２−フェニルエチル−アミン（１．６等量、０．４３mL）を加え、混合物を約１時間還流する。溶媒を減圧除去し、残留物を水（３５mL）と一緒にする。得られた固体を減圧濾過し、乾燥し、エタノールから結晶化させて、化合物２３の白色固体（０．６１ｇ、収率８４％）を得る。
【００８０】
【表２３】
2008517884.tif 000032
【００８１】
６  Ｎ−（２−フェニルエチル）−４−アミノベンゼンスルホンアミド  ２４の合成
２３（０．６ｇ、１．７mmoｌ）のジオキサン（８mL）溶液に、２０％ＮａＯＨ（１３mL）を加え、混合物を１．５時間還流する。溶媒を減圧濃縮し、水性相に２０％ＮａＯＨを加えて、ｐＨ＝７とする。得られた固体を減圧濾過し、水で洗浄し、乾燥して、化合物２４を白色固体（０．４３ｇ、収率８３％）として与える。
【００８２】
【表２４】
2008517884.tif 000033
【００８３】
７  Ｎ−（４−Ｒ７−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−フェニルエチル−アミノ）スルホニル］フェニルチオ尿素  ２５、２６の合成のための一般的手順
化合物２４（１５０mg）の無水エタノール（１２mL）溶液に、ｔ−ブチル−ベンジルイソチオシアナート（Wrigglesworth, R. et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 4942-4951）又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート（１．２等量）を加え、溶液を約１６時間還流する。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー（ＡｃＯＥｔ：石油エーテル１：１）により精製して、化合物２５、２６を固体として与える。
【００８４】
７．１  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−フェニルエチル−アミノ）−スルホニル］フェニルチオ尿素  ２５
【００８５】
【表２５】
2008517884.tif 000034
【００８６】
７．２  Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−フェニルエチル−アミノ）スルホスルホニル］フェニルチオ尿素  ２６
【００８７】
【表２６】
2008517884.tif 000035
【００８８】
８  Ｎ−アセチル−２−フェニルエチルアミン  ２８の合成
市販されている２−フェニルエチルアミン（２mL、１５．８mmol）のピリジン（5mL）溶液に、無水酢酸（２等量、３mL）を加え、溶液を室温で１２時間撹拌する。溶媒を減圧除去し、残留物を水（４０mL）と一緒にし、水性相をＥｔＯＡｃ（４×２５mL）で抽出する。有機抽出物を貯め、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で蒸発させる。残留物を石油エーテルから結晶化させて、化合物２８を白色固体（２．５６ｇ、定量的収率）として与える。
【００８９】
【表２７】
2008517884.tif 000036
【００９０】
９  ４−アセトアミドエチルベンゼンスルホニルクロリド  ２９の合成
化合物２８（０．５ｇ、３mmol）に、ＨＳＯ３Ｃｌ（１．１mL）を１滴ずつ加え、温度を０℃に保持する。添加の終わりに、反応混合物を１００°で約１時間加熱し、次いで冷却し、破砕氷上に注ぐ。得られた沈殿を濾過し、水で洗浄して、化合物２９を白色固体（０．５１ｇ、収率６５％）として与える。
【００９１】
【表２８】
2008517884.tif 000037
【００９２】
１０  Ｎ−［（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］アミノスルホニル−ベンゼン−Ｎ−エチル−４−アセトアミド  ３０の合成
２９（２５０mg、０．９mmol）の無水ジオキサン（２０mL）溶液に、塩酸２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシベンジルアミン（１．６等量、４８０mg)及びＴＥＡ（１．８等量、０．２４mL）を加え、混合物を約１時間還流する。添加の終わりに、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を水（４０mL）と一緒にする。得られた沈殿を吸引濾過し、水で洗浄し、乾燥して、化合物３０を淡黄色固体（３８０mg、収率８４％）として与える。粗化合物を、以下の脱保護反応に使用する。
【００９３】
１１  Ｎ−［（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ）−ベンジル］−４−（２−エチルアミノ）ベンゼンスルホンアミド  ３１の合成
化合物３０（１１０mg、０．２２mmol）のジオキサン（５mL）溶液に、２０％ＮａＯＨ（６mL）を加え、混合物を８０℃まで約３時間かけて加熱する。添加の終わりに、溶媒を減圧除去し、２０％ＨＣｌにより残留物のｐＨを７に調整する。得られた沈殿を減圧濾過し、乾燥し、エチルエーテルから結晶化させて、化合物３１を淡黄色固体（９０mg、収率８８％）として与える。
【００９４】
【表２９】
2008517884.tif 000038
【００９５】
１２  Ｎ−（４−Ｒ７−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル−２−フェニルエチル］チオ尿素誘導体  ３２及び３３の合成のための一般的手順
化合物３１（１００mg、０．２mmol）の無水エタノール（１２mL）溶液に、４−ｔ−ブチル−ベンジルイソチオシアナート（Wrigglesworth, R. et al. J. Med. Chem. 1996, 39, 4942-4951）又は４−トリフルオロメチルベンジルイソチオシアナート（１．２等量）を加え、溶液を約１６時間還流する。その後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル１：１）により精製して、化合物３２及び３３を固体として与える。
【００９６】
１２．１  Ｎ−（４−ｔ−ブチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル−２−フェニルエチル］チオ尿素  ３２
【００９７】
【表３０】
2008517884.tif 000039
【００９８】
１２．２  Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−Ｎ′−［４−（２−ヨード−４−ヒドロキシ−５−メトキシ−ベンジル）アミノスルホニル−２−フェニルエチル］チオ尿素  ３３
【００９９】
【表３１】
2008517884.tif 000040
【０１００】
２  薬理学
材料及び方法
動物及び組織
新生及び成熟Sprague-Dawleyラット（〜２５０ｇ）を使用した（Harlam, イタリア）。全実験は、国のガイドラインに従い、また地方の倫理委員会により承認された。
【０１０１】
放射性リガンド結合アッセイ
試験時の体重２５０〜３５０ｇの雄のSprague-Dawleyラットを使用した。結合アッセイのために、ラットを麻酔下で、断頭により犠牲に供し、脊髄を取り出し、ポリトロン組織ホモジナイザーを用いて、５mM  ＫＣｌ、５．８mM  ＮａＣｌ、０．７５mM  ＣａＣｌ２、２mM  ＭｇＣｌ２、３２０mMスクロース、１０mM  ヘペスを含有するｐＨ８．６（Szallasi and Blunberg, 1992; 1993)の氷冷緩衝液中で破壊した。ホモジナイズした組織を、１０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離し、上清を再度、３５０００×ｇで３０分間、４℃にて遠心分離した（Beckman Avanti J25)。ペレットを、上記と同一の緩衝液中に再懸濁し、結合実験にて使用した。飽和実験において、膜懸濁液からの１５０μgタンパク質／サンプルを、［３Ｈ］−ＲＴＸ（［３Ｈ］−レシニフェラトキシン、Perkin Elmer, Boston, MA)（０．００３〜３nM）と共に、０．２５mg/mL脂肪酸フリーウシ血清アルブミンを含有するアッセイ緩衝液中で、３７℃にて６０分間インキュベートした。競合実験において、膜を［３Ｈ］ＲＴＸ（０．４nM）及び濃度を０．１nM〜３μMの範囲内で増大させた試験化合物と共に、３７℃で６０分間インキュベートした。１μM  ＲＴＸの存在下で、非特異的結合を規定した。インキュベーションの後、反応混合物を０℃に冷却し、ウシαｌ−酸糖タンパク質（２００μg／管）と共に１５分間インキュベートして、非特異的ＲＴＸ結合を減少させた。膜結合ＲＴＸを、１８５００×gで１５分間のサンプルの遠心分離により、遊離ＲＴＸから分離した。ペレットを含むミクロ遠心分離管の先端を切り取り、シンチレーション計数（Packard 2500 TR）により放射能を測定した。ウシ血清アルブミンを標準参照（Bradford, 1976）として、Bio-Rad法にしたがってタンパク質濃度を決定した。飽和及び競合試験を、プログラムLigand(Munson and Rodbard, 1980)により解析した。
【０１０２】
培養ラット三叉神経節ニューロン内のＣａ２＋蛍光測定
新生ラット（２日齢）に致命的な麻酔をかけ、断頭した。三叉神経節を取り出して、素早く冷リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に配置してから、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（１mg/mL、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋フリーＰＢＳ中に溶解した）に移して、３７℃で３５分間保った(Rigoni et al, 2003)。酵素処理後、節をＣａ２＋−Ｍｇ２＋フリーＰＢＳで３回濯ぎ、次いで１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、熱不活性化）、２mM  Ｌ−グルタミン、１００u/mLペニシリン及び１００mg/mLストレプトマイシンを補充した冷ＤＭＥＭ２mL中に配置した。次いで、節を一連のシリンジ針（２３Ｇから２５Ｇ）に数回通過させて、個々の細胞に分離した。最後に、培地と節細胞の複合物を、４０mmフィルターで篩いにかけて破片を除去し、ＤＭＥＭ培地８mLをいっぱいに満たし、遠心分離にかけた（２００×ｇで５分間）。最終的な細胞ペレットをＤＭＥＭ培地（１００ng/mLマウス神経成長因子（マウス−ＮＧＦ−７Ｓ）及びサイトシン−β−Ｄ−アラビノ−フラノシドフリー塩基（ＡＲＡ−Ｃ）２．５mMを補充した）中に再懸濁した。細胞をポリ−Ｌ−リシン（８．３mM）及びラミニン（５mM）を被覆した２５mmガラス製カバースリップ上に配置して、５％ＣＯ２及び空気で満たした加湿インキュベーター内にて、３７℃で２〜５日間保持した。プレートした神経細胞に、以下の組成（mM）：ＣａＣｌ２  １．４、ＫＣｌ  ５．４、ＭｇＳＯ４  ０．４、ＮａＣｌ  １３５、Ｄ−グルコース  ５、ＨＥＰＥＳ  １０、及びＢＳＡ０．１％のＣａ２＋緩衝溶液中のＦｕｒａ−２−ＡＭ−エステル（３μM）を、ｐＨ７．４にて３７℃で４０分間負荷し、Ｃａ２＋緩衝溶液で２回洗浄し、Nikon eclipse TE300顕微鏡のステージ上のチャンバに移した。染料を３４０及び３８０nmで励起させて、動的画像分析システム（Laboratory Automation 2.0,RCS, Florence, イタリア）で記録したＦ３４０／Ｆ３８０比によって、相対的な〔Ｃａ２＋〕ｉ変化を示した。カプサイシン（０．１μM）及びイオノマイシン（５μM）を、チャンバに加えた。Ｆｕｒａ−２−ＡＭ−エステルと決定濃度の遊離Ｃａ２＋（Kudo et al., 1986）を含有する緩衝液を用いた較正曲線を使用して、Ｆ３４０／Ｆ３８０比から得られたデータを、〔Ｃａ２＋〕ｉ（nM）に変換した。
【０１０３】
全化合物の効果を、カプサイシン誘導によるカルシウム動員に対して試験した。拮抗化合物を１０分間インキュベートしてから、カプサイシンのチャレンジを行った。ＴＲＰＶ１拮抗薬、カプサゼピンの阻害効果も試験した。
【０１０４】
ラットの拭い試験
ラットの結膜上にカプサイシン３μg／眼（１０μL）を適用して、適用後６０秒間、拭いの動作の回数を記録することにより、カプサイシンの刺激効果（拭い動作の誘導）を評価した。別の実験の組では、ラットを様々な投与量の１４で腹腔内処置して、カプサイシン誘導による拭いを試験した。
【０１０５】
薬物及び溶解度
薬物及び試薬を、以下に示す会社より得た：カプサイシン、イオノマイシン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リシン及びカプサゼピン（シグマ, イタリア）；マウスＮＧＦ−７Ｓ及びコラゲナーゼ／ディスパーゼ(Roche Diagnostics, イタリア)；Dulbeccoの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（２００mM）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００IU/mL±１０，０００UG/mL）、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋フリーリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ギブコ, イタリア）；Ｆｕｒａ−２−ＡＭ−エステル（Societa’, Italiana Chimici, イタリア）。カプサイシン（１０mM）の保存液は、１００％エタノール中で調製した。全てのPharmEste化合物（１００mM）、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ−エステル（１００mM）及びイオノマイシン（１００mM）の母液は、ＤＭＳＯ中で調製した。次いで、クレブス緩衝溶液で適切な希釈を行った。
【０１０６】
結果
総括
化合物１４、１９及び２０は、ＴＲＰＶｌ受容体に結合し及び該受容体を活性化する能力を示した。
【０１０７】
結合アッセイ
［３Ｈ］−ＲＴＸの競合結合実験では、３種の化合物が、ラット脊髄に発現したＴＲＰＶｌ受容体に対して高い親和性を有することを示した（表１）。特に、１４は、１００nM未満の親和性の値が明らかとなった。これらの化合物の作用強度の順は、１４＞２０＞１９であった。
【０１０８】
Ｃａ２＋蛍光
大部分（８７％）のラット三叉神経細胞において、カプサイシン（０．１μM）は、〔Ｃａ２＋〕ｉを増大させ、したがってこれらは、ＴＲＰＶ１発現神経細胞として同定された。全化合物のＩＣ５０値については、表１を参照されたい。データは、平均及び９５％信頼限界として表される。
【０１０９】
【表３２】
2008517884.tif 000041
【０１１０】
親和性（Ｋｉ）及び作用強度（ＩＣ５０）値は、［３Ｈ］−ＲＴＸ競合結合アッセイ及び培養したラット三叉神経ニューロン内での細胞内カルシウムアッセイにより獲得した。ＮＴ：試験せず。
【０１１１】
ラットの拭い試験
カプサイシンチャレンジの６０分前の腹腔内の化合物１４は、ラットのカプサイシン誘導による拭いの挙動を、用量依存的に低下させた（用量１mg/kgは、２４％阻害を生じた）。
【０１１２】
結論
インビトロ及びインビボ試験において、１４は、古典的なＴＲＰＶｌ受容体拮抗薬であるカプサゼピンの親和性よりも有意に高い親和性で、ＴＲＰＶｌ依存的な応答を阻害することができた。更に、化合物１９及び２０は、インビトロで、ＴＲＰＶｌ受容体に対する高い親和性を示した。上述した全化合物は、疼痛及び神経性炎症モデルにおける今後の研究において、重要な手段であり得る。
【０１１３】
【表３３】
2008517884.tif 000042
【国際調査報告】
2008517884.tif 000044
2008517884.tif 000045