(57)【要約】  本発明は、内視鏡検査又は蛍光顕微鏡検査に使用するための、検体（10）のファイバ式マルチフォトン式イメージング装置に関する。この装置は：マルチフォトン励起レーザ輻射を生成するべくフェムト秒でパルスされるパルスレーザ（1、2）と、複数の光ファイバで構成され表面下の平面内での点から点への走査により検体を照射することの可能なイメージガイド（8）と、イメージガイド（8）内での励起パルスの分散効果を補償するための予備補償手段（4）と（前記手段はパルスレーザとイメージガイド（8）との間に配置されている）、励起レーザビームをイメージガイドのファイバ内へ交わる交わる差し向けるための走査手段と、特に、イメージガイドから出る励起レーザビームを検体（10）内へ集束させるための光学ヘッド（9）とを備えている。【選択図】      図１
2008517291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体のファイバ式マルチフォトン式イメージング装置であって、この装置はマルチフォトン励起レーザビームを生成するパルスレーザを備え、この装置は更に：
−複数の光ファイバで構成され、点から点への走査により検体を照射することの可能なイメージガイドと、
−前記パルスレーザとイメージガイドとの間に配置され、イメージガイド内の励起パルスの分散効果を補償するための補償手段と、
−励起レーザビームをイメージガイドのファイバ内へ交わる交わる差し向けるための走査手段、
とを備えていることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は少なくとも２つのプリズムを有する分散ラインを備えていることを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は少なくとも２つの回折格子を有する分散ラインを備えていることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は他のイメージガイド（即ち、第２のイメージガイド）を備え、この第２のイメージガイドは少なくとも２つのプリズムを有する分散ラインに連携してあって、この第２のイメージガイドと主イメージガイドとによって導入された位相ずれが前記分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されることを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は他のイメージガイド（即ち、第２のイメージガイド）を備え、この第２のイメージガイドは少なくとも２つの回折格子を有する分散ラインに連携してあって、この第２のイメージガイドと主イメージガイドとによって導入された位相ずれが前記分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は少なくとも２つのプリズムを有する分散ラインに連携された単一の光ファイバを備え、この単一の光ファイバと前記イメージガイドとによって導入された位相ずれが前記分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は少なくとも２つの回折格子を有する分散ラインに連携された単一の光ファイバを備え、この単一の光ファイバと前記イメージガイドとによって導入された位相ずれが前記分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項２から７のいづれかに基づく装置であって、前記分散ラインはミラーによって終っており、このミラーの上手に位相・振幅マスクが配置されていることを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項１に基づく装置であって、前記補償手段は異常分散型の光ファイバを備えていることを特徴とする装置。
【請求項１０】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記補償手段は前記走査手段内に組み込まれていることを特徴とする装置。
【請求項１１】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記パルスレーザおよび補償手段は波長において調節可能であることを特徴とする装置。
【請求項１２】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、イメージガイドの近位端側に配置され、励起レーザビームをイメージガイドの所与の光ファイバ内に交わる交わる集束させることの可能な注入手段を更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項１３】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体から来る蛍光信号を検出するための第１の検出手段を更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項１４】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体から来る第２高調波生成信号を検出するための第２の検出手段を更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項１５】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体から来る信号を検出手段の方へ差し向けることの可能な二色フィルターを更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項１６】
請求項１５に基づく装置であって、前記二色フィルターは走査手段とイメージガイドとの間に配置されていることを特徴とする装置。
【請求項１７】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体から来る第２高調波生成信号から蛍光信号を分離することの可能な調節可能な二色フィルターを更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項１８】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記走査手段はリアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査し、検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することを特徴とする装置。
【請求項１９】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記走査手段は表面下の平面内のライン上で検体を走査することを特徴とする装置。
【請求項２０】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記走査手段は緩慢な収集に適した周波数を有する検流式ミラーを備え、この装置は緩慢な収集速度に適したパスバンドを有するフォトセンサーを更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項２１】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記パルスレーザはフェムト秒レーザであることを特徴とする装置。
【請求項２２】
請求項１から２０のいづれかに基づく装置であって、前記パルスレーザはピコ秒レーザであることを特徴とする装置。
【請求項２３】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、前記イメージガイドは複数の整頓されたモノモード光ファイバで構成されていることを特徴とする装置。
【請求項２４】
請求項１から２２のいづれかに基づく装置であって、前記イメージガイドは複数のマルチモード光ファイバで構成されていることを特徴とする装置。
【請求項２５】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、イメージガイドから出た励起レーザビームを検体内に集束させるための光学ヘッドを備えていることを特徴とする装置。
【請求項２６】
請求項１から２４のいづれかに基づく装置であって、前記イメージガイドは数千の光ファイバで構成されており、これらの光ファイバの遠位端は裸で検体の表面に直接接触して配置されるようになっていることを特徴とする装置。
【請求項２７】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体内に存在しかつ励起レーザビームによって励起された複数の蛍光体から発射された複数の蛍光信号を夫々解離しかつ検出するためのフィルター手段および検出手段を備えていることを特徴とする装置。
【請求項２８】
請求項２７に基づく装置であって、蛍光体の蛍光信号に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げるための処理手段を備えていることを特徴とする装置。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に基づく装置であって、フィルター手段は異なる蛍光信号を１つの共通のセンサーの方へ逐次通過させるパスバンド調節可能なフィルターを備えていることを特徴とする装置。
【請求項３０】
請求項２７又は２８に基づく装置であって、フィルター手段は、また、波長に応じて夫々の蛍光信号を異なるセンサーの方へ送ることの可能なセパレータを有することができることを特徴とする装置。
【請求項３１】
前記請求項のいづれかに基づく装置であって、検体から来る信号の一部を用いてスペクトルを作り上げることの可能な分光器を更に備えていることを特徴とする装置。
【請求項３２】
請求項３１に基づく装置であって、前記分光器は、励起信号が興味のある領域を走査する瞬間に対応する所定の瞬間に検体から来る信号の一部を分光器の方へ指向させるシャッターに連携されていることを特徴とする装置。
【請求項３３】
検体のファイバ式マルチフォトン式イメージング方法であって、この方法においてはマルチフォトン励起レーザビームが生成され、この方法は更に以下のステップを包含することを特徴とする：
−分散効果を補償することの可能な補償手段を通って励起レーザビームを通過させ、
−複数の光ファイバからなるイメージガイドのファイバ内に励起レーザビームを交わる交わる差し向けることにより検体を走査し、
−イメージガイドから来る励起レーザビームを用いて点から点へと走査することにより検体を照射し、
−検体から発射された蛍光信号を検出すること。
【請求項３４】
請求項３３に基づく方法であって、更に、検体から発射された第２高調波生成信号を検出することを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に基づく方法であって、形態学的研究を行うために第２高調波生成信号を使用することを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３３から３５のいづれかに基づく方法であって、リアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査し、かつ、ファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出することを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３３から３６のいづれかに基づく方法であって、イメージガイドから出る蛍光信号全体を検出することを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内視鏡検査又は蛍光顕微鏡検査に使用するための、検体のファイバ式マルチフォトン式顕微鏡画像を形成するための装置および方法に関する。目的とする応用分野は、より詳しくは、生体内式（in-vivo）かつその場式（in-situ）イメージングの分野である。
【背景技術】
【０００２】
従来の共焦点式蛍光イメージングにおいては、１つの光子は１つの分子を励起する。この分子の励起解除は１つの蛍光光子の輻射を惹起する。励起光子のエネルギは分子を所与の励起状態に持ち来すに必要なエネルギ量に正確に対応する。使用する光源は可視領域（約400ｎｍ〜650ｎｍ）における励起光子を発射するレーザである。マルチフォトン（多光子）式顕微鏡検査においては、換言すれば蛍光の非線形顕微鏡検査においては、より詳しくは二光子式顕微鏡検査においては、遷移に必要なエネルギ量は、１つの励起光子によってではなく、２つ（或いは、マルチフォトン・イメージングにおいてはそれ以上）の光子によってもたらされるのであり、夫々の光子は従来の励起光子のエネルギよりも二倍（或いはそれ以上）小さなエネルギを有する。即ち、従来の場合における励起光子よりもエネルギの小さな近赤外領域（700ｎｍ〜1000ｎｍ）の励起光子が使用される。しかしながら、分子によって発射される蛍光光子は従来の場合に発射されるものと同一である。
【０００３】
二光子（又は多光子）式顕微鏡検査においては、２つ（又は、それ以上）の光子が関与するメカニズムは励起光源の瞬間強度の二乗（又は、それ以上）に比例する効率を有する。大きな励起効率は強い空間的かつ時間的制約によってしか達成することができない。空間的制約は、励起ビームが組織内に正確に集束すること、即ち、照射焦点容積内における光子の空間的密度が大きいことを意味する。検出されたすべての蛍光は深いところで励起された単位的容積からしか来ないので、従って、二光子式顕微鏡検査はその自然の共焦点性という主要な利点を有する。発射された蛍光は検体の表面と励起された単位的容積との間に含まれる容積の積分ではない；これは、特に、表面と集束面との間に位置する蛍光体の光漂白の問題をすべて制限するのを可能にする。時間的制約は、超短かつ非常に強力なパルスを生成するレーザ源、即ち、照射焦点容積内における光子の時間的密度が大きいことを意味する。
【０００４】
更に、近赤外は光子−物質相互作用を生じることが少ないので、照射規格の点で二光子式顕微鏡検査は評価することができると共に、超短パルスでパルスされる励起は光毒性に伴う問題をかなり低減する。
【０００５】
蛍光のファイバ式線形顕微鏡検査の難点は、検体中への励起ビームの貫入距離が小さく、百マイクロメートル以下であるということである。貫入距離を向上させる目的でビームのパワーを増加させれば、特に一般に操作がほぼ連続的に行われることから、確実に生理的な損傷を生じるであろう。従って、検体内のより深いところにある器官にはアクセスすることができない。二光子式顕微鏡検査は、理論的な貫入距離が400マイクロメートルより大きいので、これらの不都合を解消するのを可能にする。即ち、近赤外に位置する励起光子は個別的にはエネルギがより小さく、基本的には水からなる組織によって吸収されることが少ないので、線形蛍光に使用するものに比較してより破壊的でない。
【０００６】
今日使用されている二光子式顕微鏡検査装置は、例えば画像を形成するための走査装置および検出装置を担持した高い光学盤からなる直立顕微鏡のような卓上顕微鏡である。このような画像収集装置は特に生体内式その場式の内視鏡に適用することはできない。即ち、卓上顕微鏡は往々にして嵩張っており、照射および信号回収用に従来型の対物レンズを使用しており、対物レンズの下に動物を保持する必要があり、長い積分時間を必要とする（これは大きな感度を意味する）。
【０００７】
二光子式顕微鏡検査装置を提案した文献GB 2,338,568（Optiscan）「二光子内視鏡又は顕微鏡検査方法および装置」が知られている。この装置はレーザから検体に向かってパルスを伝送するために唯一本の光ファイバを使用している。光ファイバ内におけるパルスの線形および非線形の分散現象を制限するため、特にプリズムによる補償手段が開示してある。
【０００８】
文献US 6,369,928（Optical Biopsy Technologies）には顕微鏡画像を収集するための二光子式蛍光走査顕微鏡が記載されている。この顕微鏡は少なくとも２本の光ファイバを備えている：夫々の光ファイバは光源として使用されると共に、他方の光ファイバの照射によって得られた蛍光ビームの受信部としても使用される。特に、この装置の次の２つの特徴は小型化の制約となる：１）走査はファイバの遠位端側から（即ち、ファイバと検体との間で）行われる；２）２つの入射ビームは検体内への入射角（従って、ファイバ間の距り）を維持する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、特に内視鏡検査に応用するための、小型化された新規なマルチフォトン（多光子）式顕微鏡検査装置を提供することにある。本発明の他の目的は、検体の深所の画像を収集することの可能な新規なマルチフォトン式顕微鏡検査装置を提供することにある。
【００１０】
前記目的の少なくとも１つは、特に内視鏡検査又は蛍光顕微鏡検査に使用するための、検体のファイバ式マルチフォトン式イメージング装置によって達成されるもので、この装置はマルチフォトン励起レーザビームを生成するパルスレーザを備えている。本発明によれば、この装置は更に：
−複数の光ファイバで構成され、特に表面下の平面内での点から点への走査により検体を照射することの可能なイメージガイドと、
−前記パルスレーザとイメージガイドとの間に配置され、イメージガイド内の励起パルスの分散効果を補償するための補償手段と、
−励起レーザビームをイメージガイドのファイバ内へ交わる交わる差し向けるための走査手段、
とを備えている。
【００１１】
好ましくは、大きな深度に到達するため、この装置は、イメージガイドから出た励起レーザビームを検体内に集束させるための光学ヘッドを備えている。
【００１２】
好ましくは、光学ヘッドおよびイメージガイドのサイズはそれらが容易に操作チャンネル内で摺動できるようなものである。
【００１３】
本発明の装置は、顕微鏡的解像度を有する、生体内式、その場式の、オフセットされた蛍光画像を形成するのを可能にする。イメージガイド或いは“ファイバ・バンドル（束）”は可撓性を呈すると共に、特に操作チャンネル内に挿入することにより内視鏡への用途を可能にするサイズを有する。
【００１４】
本発明の有利な特徴によれば、例えば次のような異なる補償手段を採用することができる：
−少なくとも２つのプリズムを有する分散ライン；
−少なくとも２つの回折格子を有する分散ライン；
−パルスの位相とスペクトル振幅を変調する手段を有する分散ライン；
−他のイメージガイド、即ち、第２のイメージガイド（これは、この第２のイメージガイドと主イメージガイドとによって導入された位相ずれが分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されるように、少なくとも２つのプリズム又は回折格子を有する分散ラインに連携されている）；
−イメージガイドの応答を最適化するのを可能にする単一の光ファイバ（この単一の光ファイバは、この単一の光ファイバとイメージガイドとによって導入された位相ずれが分散ラインによって導入された位相ずれによって補償されるように、少なくとも２つのプリズム又は回折格子を有する分散ラインに連携されている）；および、
−レーザ波長に対し異常分散型の光ファイバ。
これらの補償装置は、また、この装置の他のすべての部材（光学ヘッド、レンズ、ミラー、等々）によって導入された分散を補償するために使用することもできる。
【００１５】
本発明によれば、イメージガイドの近位端側に配置された、励起レーザビームをイメージガイドの所与の光ファイバ内に交わる交わる集束させることの可能な、注入手段が設けられる。また、検体から来る蛍光信号を検出するための第１の検出手段が設けられる。本発明の有利な特徴によれば、更に、検体から来る第２高調波生成信号（SGH。Second Harmonic Generation）を検出するための第２の検出手段が設けられる。二光子式蛍光特性と第２高調波生成特性との間の相補性は、特に分子秩序（対称、組織）およびそれらの近接環境との相関作用に関する局部的情報にアクセスするのを可能にする。
【００１６】
検体から来る信号がこれらの検出手段に到達するようにするため、この装置は、蛍光信号および第２高調信号をセンサーの方へしか通過させないようになった二色フィルターを更に有する。特に、この二色フィルターは走査手段とイメージガイドとの間に配置されている。従って、検体から来る信号は走査手段を再び通過することはない。同様に、各センサーの前に濾過用穴を配置する必要はない。この場合、マルチフォトン式顕微鏡検査は自然の共焦点性を有するという利点が享受される。
【００１７】
本発明の装置は、また、検体から来る第２高調波生成信号から蛍光信号を分離することの可能な調節可能な二色フィルターを有することができる。
【００１８】
一般的に、この装置は構成要素全体（特に励起手段と検出手段との間の同期）を管理する処理ユニットを有する。このユニットは画像処理を行うもので、この画像処理は例えば文献WO 2004/008952（マウナ  ケア  テクノロジーズ）に記載された画像処理に基づくことができる。例えば、多数の光子を長時間にわたり積分することにより高品質の画像を形成するべく検体の緩慢な走査を指令することができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば、走査手段はリアルタイムで使用するに充分な毎秒画像数の収集に対応する速度で検体を走査する。相補的に、検出手段はファイバを１本づつサンプリングする最小限サンプリング周波数に対応する検出周波数で蛍光信号を検出する。より正確には、ファイバ・サンプリングの尊重（シャノン基準による）は各ファイバに良く対応する点から点への画像を得るのを可能にする。これは、平均最小限毎秒画像数（即ち、実際には896×640ピクセルの最大限モードの場合に最小限毎秒１２画像）を尊重しながらすべてのファイバを１本づつサンプリングすることによって情報を失わないことを可能にする。この最小限サンプリングに応じて検出周波数（検出センサーのパスバンド）を選定すれば、可能な最大数の蛍光光子を各ファイバ毎に検出することが可能になる。従って、約30,000の可撓性光ファイバからなるイメージガイドを用いた可能な実施例によれば、検出装置（アバランシュ型フォトダイオード又は同等物）のサンプリング周波数とパスバンドはほぼ１.５MHzに設定され（ファイバ当たり約12ピクセルに対応）、896×640ピクセルの最大限モードで最小限１２画像／秒を得るのを可能にする。実用的には、ビームの偏向は、共鳴式“ライン”ミラーの高速の走査周波数と検流式“フレーム”ミラーの遅い走査周波数を決定することにより制御される。これは、リアルタイムの画像を得るのに適切な高速でファイバを走査するのを可能にする。
【００１９】
検流式ミラーは、また、緩慢な収集に適合した走査周波数を有することができる；この場合、フォトセンサーは緩慢な収集速度に適合したパスバンドを呈する。
【００２０】
本発明によれば、走査手段は、また、線形走査（ライン・スキャニング）を実現するべく、表面下の平面内においてライン上で検体を走査することができる。従って、観察中のある種の元素（element）の強度又は速度を測定することができる。
【００２１】
パルスレーザはフェムト秒レーザ又はピコ秒レーザであり得る。レーザのタイプの選択は目標とする蛍光のタイプ（特に感度で換算）に依存する。例えば、ピコ秒レーザはより長いパルスを有し、従って高効率の蛍光体にとって先験的に有用なレーザである。実際には、例えば１０ピコ秒〜１０フェムト秒のパルス幅を使用することができる。
【００２２】
更に、本発明によれば、パルスレーザおよび補償手段は波長において調節可能である。そうすれば、700ｎｍ〜1000ｎｍ（好ましくは800ｎｍ〜870ｎｍ）の波長を有するレーザを使用することができ、これは既に多数の蛍光体を検出するのを可能にする。レーザの各波長毎に補償を調節する。
【００２３】
本発明の他の観点によれば、本発明は、特に内視鏡検査又は蛍光顕微鏡検査に使用するための、検体のファイバ式マルチフォトン式イメージング方法を提供するもので、この方法においてはマルチフォトン励起レーザビームが生成される。本発明によれば：
−分散効果を補償することの可能な補償手段を通って励起レーザビームを通過させ、
−複数の光ファイバからなるイメージガイドのファイバ内に励起レーザビームを交わる交わる差し向けることにより検体を走査し、
−イメージガイドから来る励起レーザビームを用いて点から点へと走査することにより検体を照射し、かつ、
−検体から発射された蛍光信号を検出する。
【００２４】
好ましくは、検体から出た蛍光信号の全体が検出される。従って、脱走査（デスキャン）は行われないし、フォトセンサーによる検出の前に蛍光信号は濾過されない。
【００２５】
光学ヘッドのない本発明の変化形においては、イメージガイドは数千の光ファイバで構成されており、これらの光ファイバの遠位端は裸で検体の表面に直接接触して配置されるようになっており、夫々のファイバは表面から光ファイバのコアの直径に特に依存する最大深度までの間に位置する検体のマイクロボリュームを励起することの可能な拡散ビームを生成するようになっている。例えば最初の拾マイクロメートルにわたっては、ビームはなお光ファイバのコアの直径とほぼ同一の直径を有する。プローブ“Ｓ”と呼ばれるイメージガイドについては、使用されている光ファイバの直径はマルチフォトン現象が現れるべく充分に小さく、例えば１マイクロメートルである。
【００２６】
従って、この変化形は、各ファイバの出口で集束する信号を走査しないが、各ファイバの出口で拡散する信号を走査する点において、光学ヘッドを有する変化形とは異なる。ファイバの出口で信号が集束しないことは、組織の表面の直ぐ下に位置するボリュームの画像（これらは活用可能で特に医学的見地から興味がある）を得るのを可能にする。これらの画像は点から点へと走査された表面下の切断面に由来するものではないので“共焦点的”ではないが、表面の直ぐ下に位置するマイクロボリュームを交わる交わる走査することに由来するので“高解像度”と呼ぶことができる画像である。
【００２７】
このような変化形の利点の一は、内視鏡の用途においては、内視鏡プローブの直径はイメージガイドの直径（従って、その光ファイバの数）のみに依存して非常に小さいということにある。これは、集束用光学ヘッドの小型化に固有の問題を解消することにより、例えば神経学の分野のような、内視鏡プローブのサイズが決定的な要因であるような用途に用いるのを可能にする。
【００２８】
本発明の他の有利な特徴によれば、この装置は、検体内に存在しかつ励起レーザビームによって励起された複数の蛍光体から発射された複数の蛍光信号を夫々解離しかつ検出するためのフィルター手段および検出手段を備えている。即ち、理想的には、所与の或る蛍光体を励起するように定められた波長を有するパルスレーザビームが生成される。しかしながら、他の蛍光体がこの波長に対して敏感であることがあり、そしてやはり蛍光信号を発することがある。また、故意に複数の蛍光体を導入することができ、これらの蛍光体を同時に励起することの可能なレーザビーム波長を使用することができる。好ましくは、濾過によって解離できるように蛍光信号は互いに充分に隔てられた波長を有する。この装置は、蛍光体の蛍光信号に応じて着色された領域を有する最終画像を作り上げるための処理手段を有することができる。本発明は、従って、検出路によって多重マーキングを実施するようになっている。フィルター手段は異なる蛍光信号を１つの共通のセンサーの方へ逐次通過させるパスバンド調節可能なフィルターを有することができる。フィルター手段は、また、波長に応じて夫々の蛍光信号を異なるセンサーの方へ送ることの可能なセパレータを有することができる。
【００２９】
本発明の更に他の有利な特徴によれば、この装置は、検体から来る信号の一部を用いてスペクトルを作り上げることの可能な分光器を更に備えている。この分光器は、励起信号が興味のある領域を走査する瞬間に対応する所定の瞬間に検体から来る信号の一部を分光器の方へ指向させるシャッターに連携することができる。或いは、興味のある領域だけが照射されるようにパルスレーザを操作することも可能である。生成されたスペクトルは次いで処理手段内で処理される。好ましくは、分光器の方へ偏向せられる信号の部分は有効信号の１０％より少ない。
【００３０】
本発明の他の利点や特徴は非限定的な実施例の詳細な説明と添付図面から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１には検体１０が示してあり、この検体は生物組織又は細胞培養物であり得る。一般に、観察される蛍光は外因性の化合物（典型的には投薬されたマーカー）又は内因性の化合物に由来することができ、後者は生物組織の細胞によって製造されるか（トランスジーニック型のマーカー）、細胞内に自然に存在する（自動蛍光）。
【００３２】
二光子式の非線形吸収は、減少された容積内へ非常に大きなエネルギ密度を持ち来すことを必要とする。このため、100fsのパルス幅をもってフェムト秒レートでパルスされるパルスレーザ２を使用する。これは１〜532ｎｍ固体レーザによってポンピングされるチタン−サファイア・レーザである。レーザ２の反復周期は約80MHzであり、平均出力は１ワットのオーダーである。レーザ２から出る励起ビームの波長は700〜1000ｎｍ（近赤外）、好ましくは800〜870ｎｍに調節することができる。実際、この装置の性能は基本的に光源の特性に依存している：即ち、特にイメージガイドの出口における所望のピーク出力とパルス幅である。
【００３３】
レーザ２の出口には、ノイズ反射がレーザ２のキャビティの方へ戻るのを防止するためのファラデー・アイソレータ２１が配置してある。場合によりアイソレータ２１には、必要に応じ、励起レーザビームを波形成形しかつ注入するための装置３が続く。この装置３は１とは異なる倍率の無焦点光学装置からなり、レーザビームの直径を調節することの可能なレンズで構成されている。倍率は、レーザビームの直径がこのレーザビームを補償手段４内へ差し向けるために設けた注入手段に適合するように計算される。この補償手段の位置と角度は励起ビームの波長に応じて調節される。
【００３４】
一般的に、補償手段４はイメージガイド８の光ファイバ内における励起パルスの拡幅を予備補償する機能を有する。この時間的拡幅は光ファイバの線形有彩色分散および非線形効果（スペクトルの拡幅を惹起する自動位相変調）に因る。この装置はイメージガイド８の出口において数十ミリワットの平均出力で数百フェムト秒のパルス幅を得るのを可能にする。
【００３５】
走査手段５は、次いで、斯く予備補償された励起パルスを回収する。図１に示した選ばれた実施例においては、この走査手段は、ビームを水平に偏向し、従って画像のラインを実現するための、４kHzで共鳴するミラーM1と、ビームを垂直に偏向し、従って画像のフレームを形成するための15Hz型（一般には10〜40Hz）の検流式ミラーM2と；統一された倍率の２つの無焦点系（２つのミラーの間に位置するAF1と、ミラーM2の後に位置するAF2）とを備え、これらの無焦点系は２つのミラーM1およびM2の回転面を１本のファイバへの注入面に共役させるために使用される。本発明によれば、走査速度は組織の生体内式（in-vivo）その場式（in-situ）の観察を可能にするべく決定される。このためには、走査は、最も遅いモードに対応する896×640ピクセルの表示モードで少なくとも１２画像／秒がスクリーンに表示されるように、充分速くなければならない。従って、より少ないピクセルを有する表示モードの場合には、毎秒当たりの収集画像数は常に１２画像／秒より大きいであろう。変化形として、走査手段は特に回転ミラー、MEMs型の集積デバイス（XY走査ミラー）、又は音響光学システムを有することができる。
【００３６】
ミラーM1およびM2は、また、毎秒１０画像以下（例えば、毎秒１〜３画像）を使用するような走査周波数をもった２つの検流式ミラーであることができる。この場合、対応するフォトセンサのパスバンドは検流式ミラーによって課される収集速度に合わせる。積分時間はこの装置の感度を増加させるように長くすることができる。
【００３７】
走査手段５の出口で偏向された励起ビームは、イメージガイド８のいづれか１本のファイバ内へ注入されるべく光学手段７の方へ差し向けられる。走査手段５と注入手段７との間に配置された二色フィルター６は励起ビームに対して透明にとどまる。注入手段７はここでは２つの光学アッセンブリE1およびE2で構成されている。第１の光学アッセンブリE1は走査手段５の視野の縁における光学収差を部分的に補正するのを可能にするもので、従って、注入は光学視野の全体について、即ち中央においても縁においても、最適化される。第２の光学アッセンブリE2はいわゆる注入を行うことを目的としている。その焦点距離と開口係数はガイド８の光ファイバへの注入率を最適化するように選ばれる。色消し性基準を得るのを可能にする実施例によれば、第１のアッセンブリE1は１つの二枚玉レンズからなり、第２のアッセンブリE2は２つの二枚玉レンズからなり、後者の後にはイメージガイドの近くに位置するレンズがある。変化形として、この注入用光学系は、例えば２つの三枚玉レンズのような他の任意のタイプの標準型光学系や、屈折率分布レンズ（回折性光学素子による色収差補正付き）や、或いは顕微鏡の対物レンズで構成することができる。
【００３８】
イメージガイド８は非常に多数の可撓性光ファイバ（例えば、夫々がモノモード、直径２μｍ、開口係数0.23、隣り合うファイバに対して3.8μｍ離間された、ゲルマニウム・ドープド・シリカからなる、30,000本のファイバ）で構成されている。イメージガイドの横断方向断面は0.8ｍｍのオーダーである。実際には、イメージガイドのファイバの全てを使用するか、或いは、これらのファイバの選ばれたサブアッセンブリ（例えば中央のもの）を使用することができる。変化形として、イメージガイドは、ガイドの横断方向断面が0.65ｍｍ程度の場合について、直径1.9μｍ、開口係数0.42、3.3μｍ離間された、マルチモードのファイバで構成することができる。
【００３９】
光ファイバの遠位端は光学ヘッド９に接続されており、この光学ヘッドは励起用レーザビームを検体１０内において単位的容積に集束させる。この単位的容積ないし点は検体の表面（光学ヘッド９はこの表面に当接せられるようになっている）から数百μｍのところにある所与の深さに位置している。この深度は例えば200μｍである。従って、光学ヘッド９はイメージガイドから出た光束を検体内に集束させることを可能にするが、検体から戻って来る蛍光光束を収集することをも可能にする。光学ヘッド９は２.４の倍率と、検体に対する０.５の開口係数を有する。二光子式顕微鏡検査は当然に共焦点特性を有するので、フォトセンサーが捕集した蛍光信号を濾過する必要はない：即ち、この信号のうちの異なる光束はすべてフォトセンサーに送られ、これはこの装置の感度を向上させる。倍率と開口係数をこのような数値にすれば、軸方向解像度は１５μｍ程度となり、横方向解像度は２μｍ程度となる。開口係数は、また、回収される光子の数（これは出来るだけ大きくしなければならない）を最適化するように選ばれる。光学ヘッドは、従来型の光学系（二枚玉レンズ、三枚玉レンズ、非球面レンズ）及び／又は屈折率分布レンズ（GRIN）で構成することができる。作動時には、光学ヘッドは特に検体１０に接触して配置される。最適には、光学ヘッドは倍率４で開口係数１の屈折光学系からなる。この光学ヘッドは水浸漬型であり、色消しではない。
【００４０】
従って、蛍光信号はイメージガイド８、注入手段７２を通過し、次いで二色フィルター６で反射され、後者はこの蛍光信号を着色された拒絶フィルター１１と集束レンズE3を介して蛍光センサー１２の方へ指向させる。
【００４１】
二色フィルターは励起波長に対して98〜99％の透過効率を有し、従って他の波長を反射する。光学ヘッドとイメージガイドとを介して検体から来る蛍光信号はこうして検出路の方へ送られる。拒絶フィルター１１は励起波長におけるノイズ反射の１〜２％を完全に除去するのを可能にし、それらはやはり検出路の方へ通過する。
【００４２】
センサー１２は検査中の蛍光の波長に対して最大の感度を呈する。例えばアバランシュ型フォトダイオード（APD）やフォトマルチプリケータを使用することができる。更に、本発明によれば、パスバンドは蛍光信号の積分時間を最適化するように選ばれる。それはリアルタイムで１.５MHzであり、これは積分時間が各ピクセル毎に最適化された場合のイメージガイドの最小限サンプリング周波数に対応する。
【００４３】
本発明の装置は、第２高調波生成顕微鏡検査をマルチフォトン式顕微鏡検査に結合することを可能にする点で特に特徴的である。それは蛍光信号と同時に検体から発射された第２高調波生成信号を検出することである。このため、二色フィルター６と拒絶フィルター１１との間に、第２高調波生成信号を蛍光信号から分離することの可能な、同調可能な二色フィルター１３又はあらゆる他の装置を設ける。 SHGセンサー１４はこの第２高調波生成信号を受け取る。
【００４４】
検出された信号を制御し、分析し、ディジタル処理し、表示するための電子情報処理手段１６（例えば、マイクロコンピュータ）は以下のボードを有する：
−次の機能を有する同期ボード１７：
−走査（即ち、ラインミラー M1とフレームミラーM2の動き）を同期して制御すること；
− SHGセンサー１４から来るデータの分析を蛍光画像と同期して制御すること；
−このように走査されるレーザスポットの位置をあらゆる瞬間において知ること；および、
−それ自身も制御され得るマイクロコンピュータを介して他のすべてのボードを管理すること；および、
−この装置の波長同調性を管理するべく予備補正手段を制御すること；
−特にインピーダンス適合を行うアナログ回路と、増幅器と、アナログ・ディジタル変換器と、次いで、信号を成形するプログラム可能な論理デバイス（例えば、FPGA回路）とを各検出路毎に有する検出ボード１５。
【００４５】
マイクロコンピュータ１６は、また、可変周波数のデジタルデータの流れを処理してそれをグラフィックボード（図示せず）を用いてスクリーンに表示するためのデジタル収集ボード（図示せず）を有する。
【００４６】
非限定的な例として、本発明で使用される画像処理は、特に文献WO 2004/008952及び／又はWO 2004/010377に記載されているような画像処理の簡単な修正でもよい。
【００４７】
光学ヘッドのないイメージガイドの場合に関しては、この装置の作動は、以下の点を除けば、前述したものと同様である：イメージガイドの出口では、注入されたファイバから出る発散光は検体内で拡散し、蛍光信号は表面と数μｍ（ファイバのコアの直径とその開口係数による）の深さとの間に位置するマイクロボリューム内で回収される。走査により、検体はマイクロボリュームからマイクロボリュームへと照射される。各瞬間毎に、組織内の励起されたマイクロボリュームは蛍光信号を発射し、この蛍光信号はより短い波長の方へずれようとする特性を有する。この蛍光信号はイメージガイドによって捕集され、それから励起ビームとは逆の光路を経て二色フィルター６に達し、後者は蛍光信号を検出路の方へ送るであろう。検出された信号は、次々と、図１を参照しながら前述したのと同じ画像処理によって特にリアルタイムで処理され、リアルタイムで画像を再構成して画面に表示するのを可能にする。
【００４８】
図２から図１４は予備補償装置の幾つかの実施例を示す。予備補償は、超短レーザパルスを準備して、それにスペクトル幅と位相変調を与えることからなり、これらはイメージガイド８の出口においてその最適な時間的圧縮をもたらすであろう。用いる技術は、装置全体のグループ速度分散を補償すると共に、光パルスがイメージガイド内を伝播する時に光パルスが受ける不可避的な非線形効果をも補償することを目的としている。目的とする予備補償の原理は、S.W. Clark、F.O. Ildlay、F.W. Wiseが「チタン：サファイア・レーザからのフェムト秒パルスのファイバ供給」（Optics Letters、vol. 26, No. 17, 2001年9月1日）に発表したものと同一である。
【００４９】
典型的には、予備補償は２つの部分からなる：即ち、光ファイバの切断片と、それに続く回折格子式の分散ライン。
−  単一の光ファイバ又は１つのイメージガイドからなる光ファイバ切断片：用いる単一の光ファイバはレーザ波長に対してはモノモードである。切断片の長さはマルチコア・イメージガイド８の長さに近い。この長さは、例えばイメージガイドの長さやレーザビームの波長やイメージガイドの入口および出口における出力とパルス幅等々のような装置の他のパラメータに応じて最適化される。このファイバのモード直径は、予備補償の２つの部分内で遭遇する非線形効果を均衡するため、イメージガイドのコアのモード直径より大きい。従って、大モード面積（large mode area (LMA)）の光ファイバ、又はエア−シリカ構造化クラッド型の新世代光ファイバに属する光ファイバを使用する。このモノモードファイバの切断片は、正常グループ速度分散がある程度のレート（主として２と３のオーダー）であることと、モード直径を介して制御される（特に切断片の最初の数ミリメートルにわたる）スペクトル拡幅の非線形効果が発現することとを特徴としている。単一の光ファイバ又は１つの第２のイメージガイドからなるこの切断片は励起レーザパルスに位相ずれをもたらす。この位相ずれは主イメージガイド８内の分散を予備補償するべく作用するが、例えば光学ヘッドのようなこの装置の残部によって導入される他のあらゆる分散を補償するべく作用をすることもできる。
【００５０】
−  回折格子式の分散ライン：この部分は、反射で作動し、平面的で、効率の大きな、完全に反射性の中間平面ミラーに連結された、２つの回折格子からなる。回折格子は互いに向かい合って数センチメートルのところに平行に配置されている。レーザビームは、光をほぼ自らの方へ送り返す平面ミラーに到達する前に、斜めの入射角でこれら２つの格子に順次に入射する。従って、レーザビームは分散ラインから再び出て行く前に４回これらの格子に入射する。この分散ラインの目的は、この装置内に大きなレートの異常グループ速度分散を導入することである。これはレーザスペクトルの最も赤い光子を遅延させることになり、これは前述したモノモードファイバの切断片内においてだけでなくイメージガイド内においても同時に起こることとは逆の挙動に対応する。“トリーシィ（Treacy）ライン”の名称で知られるこの装置は、フェムト秒レーザチェーン周波数偏移式の増幅装置（ここではこの装置はチェーン末端のパルスコンプレッサの役割を果たす）において広く使用されている。この分散ラインは、格子のピッチ、格子間距離、およびこれらの格子に対する入射角に応じて、異常グループ速度分散がある程度のレート（主として２および３のオーダー）であることを特徴としている。
【００５１】
図２から図１４は本発明の装置の簡素化模式図であり、これらの図には予備補償装置４が詳細に示してある。明瞭化のため、装置３は示してない。図１のものと同じ構成要素は図２から図１４には同じ参照符号で示してある。レーザ２、走査装置５、二色フィルター６（これは励起ビームを検体の方へ送ると共に蛍光信号をセンサー１２の方へ送る）が示してある。図２から図７は第１切断片を備えていない基本的補償装置を示す。ファラデー・アイソレータ２１から出たビームは直接に回折格子式又はプリズム式の分散ラインの方へ進む。図２では、このラインは２つの回折格子２３、２４と１つのミラー２５からなる。分散ライン内におけるレーザビームの進路は次の通りである：第１回折格子２３上で第２回折格子２４に向かって反射、第２回折格子２４上でミラー２５に向かって反射（ミラー２５ではレーザビームは第２格子２４に向かって、次いで第１格子２３に向かって完全に反射される）。分散ラインから出たパルス１９はレーザ２から出たパルス１８より長い。回折格子２３から来るビームは次いでミラー２２上で走査装置５の方へ反射し、次いでイメージガイド８の方へ反射する。図２から図１４は上面図である；特に、図２、３、６〜９においては、レーザ２から出て格子２３へ向かうレーザビームはミラー２２を横切ることなくその上方を通過する。反対に、格子２３から走査装置へ向かうレーザビームはミラー２２で反射する。このミラー２２は、レーザからの励起ビームを分散ラインの方へ通過させると共に分散ラインからの励起ビームを走査装置の方へ反射するセパレータで置換することができる（この場合、２つのビームは整列せられる）。しかし、後者の場合には、セパレータによって生じる損失が大きい（入射信号の２５％のみが使用される）。
【００５２】
イメージガイド８内における線形分散および非線形効果は励起パルスの時間的かつスペクトル的なプロフィルを修正し、このプロフィルは再びレーザ２から出るパルスのプロフィル１８とほぼ同じになる。分散ラインはイメージガイド８によってもたらされた＋Δφの位相ずれをほぼ補償するべく−Δφの位相ずれをもたらす。図３では、２つの回折格子は２つのプリズム２６および２７によって置換されており、励起レーザビームの進路は同じである。
【００５３】
図４および図５では、分散ラインとミラー２２は、夫々、４つの回折格子（図４の場合）および４つのプリズム（図５の場合）によって置換してある。励起レーザビームは順次に４つの回折格子２８、２９、３０、３１（プリズム３２、３３、３４、３５）で反射する。
【００５４】
図６および図７は図２および図３に対応するもので、位相・振幅マスク３６はミラー２５の上手に導入してある。このマスクはイメージガイドの分散に対してパルスの形を精密に調整することにより予備補償性能を向上させることを可能にする。このマスクは、スペクトル位相に対して作用する異なるガラスプレートと、横断方向に可変でスペクトル振幅に対して作用するフィルターとを組み合わせることにより構成することができる。
【００５５】
図８〜１１は夫々図２〜５に対応するが、ミラー２２（図２および３）の上手、或いは４つの回折格子（図４）の上手、或いは４つのプリズム（図５）の上手に配置された切断片を更に備えている。
【００５６】
この切断片は、単一の光ファイバ、又はイメージガイドを構成する各光ファイバの特性が主イメージガイドの特性とほぼ同一であるような１つのイメージガイドで構成することができる。
【００５７】
この単一の光ファイバ又は第２のイメージガイドは正の位相ずれ＋Δφ１をもたらす。イメージガイド８はまた正の位相ずれ＋Δφ２をもたらす。従って、分散ライン（図８〜１１）は負の位相ずれ−（Δφ１＋Δφ２）をもたらす。
【００５８】
図１２に示したように、予備補償ステップはレーザ波長に対して異常分散型の単一の光ファイバ切断片３８を用いても得ることができる。この特殊なファイバはレーザ波長より短い波長においてゼロの分散を呈する。これは次のいづれかの構造を有する最適化された長さの新世代ファイバの切断片を用いることにより得ることができる：−同心的デュアルコアファイバ、エア−シリカ構造化クラッド型ファイバ、中空コア型エア−シリカ構造化クラッド型光子ファイバ、中空コア型ブラッグクラッド型光子ファイバ。この予備補償用ファイバ切断片は、また、このウエーブガイド内における伝播に関連する非線形効果を考慮するべくモード直径が最適化されていることを特徴としている。
【００５９】
前述したものの変化形として、予備補償は図１３および図１４に示したように走査装置内に組み込むことができる。即ち、図２〜１１に示した補償装置のいづれかを走査装置５の光路に挿入することができる。
【００６０】
本発明は、従って、コンパクト性とフレキシビリティーが利点であるイメージガイドをベースとする顕微鏡に関するもので、これは組織内にイメージガイドを挿入することにより内視鏡への用途を可能にする。最後に、マルチフォトン式顕微鏡検査とイメージガイドによるファイバ式顕微鏡検査との組み合わせは、観察すべき検体の深いところに位置する器官の蛍光画像の収集を可能にする。実際には、この装置は順応可能型であることができ、即ち、レーザ源なしで設計され、従って研究所内の既存のレーザ源とインターフェース可能である。
【００６１】
本発明は多数の用途を有するもので、特に非侵襲性の或いは少ししか侵襲性でない方法を必要とする用途に利用することができる。
これらの用途は、例えば、１ｍｍより小さな直径の光学プローブを例えば膀胱内に挿入する場合の尿道内視鏡；小動物の結腸鏡検査；角膜および網膜の可視化；筋肉繊維および神経繊維の可視化；白血球および血流の微小循環；血管構造および腎臓構造；肝細胞隔膜；および例えば生きている小動物の、又はヒトのための潜在的臨床的用途の、深層脳構造を可視化するためのその場式の神経生物学である。
【００６２】
勿論、本発明は前記実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は本発明の収集装置の模式図である。
【図２】図２は回折格子をベースとする補償部を備えた本発明の装置を上から見た模式図である。
【図３】図３はプリズムをベースとする補償部を備えた本発明の装置を上から見た模式図である。
【図４】図４は４つの回折格子をベースとする補償部を備えた本発明の装置を上から見た模式図である。
【図５】図５は４つのプリズムをベースとする補償部を備えた本発明の装置を上から見た模式図である。
【図６】図６は図２に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、位相および振幅においてパルス波形に作用する位相マスクおよび振幅マスクを備えている。
【図７】図７は図３に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、位相および振幅においてパルス波形に作用する位相マスクおよび振幅マスクを備えている。
【図８】図８は図２に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、光ファイバ又はイメージガイドの分散性切断片を備えている。
【図９】図９は図３に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、光ファイバ又はイメージガイドの分散性切断片を備えている。
【図１０】図１０は図４に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、光ファイバ又はイメージガイドの分散性切断片を備えている。
【図１１】図１１は図５に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、光ファイバ又はイメージガイドの分散性切断片を備えている。
【図１２】図１２は異常分散型の光ファイバをベースとする補償部を備えた本発明の装置を上から見た模式図である。
【図１３】図１３は走査装置と補償装置とを組合せてなる本発明の装置を上から見た模式図である。
【図１４】図１４は図１３に示した装置と等価的な装置を示すもので、この装置は、更に、光ファイバ又はイメージガイドの分散性切断片を備えている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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