(57)【要約】  ヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーを介してナノ粒子に共有結合された特異的結合部分を含むコンジュゲート組成物が開示される。１つの態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーにカップリングされた特異的結合部分および蛍光ナノ粒子を含むコンジュゲートが提供される。開示による蛍光コンジュゲートは、組織切片および細胞学的サンプルの免疫組織化学およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに一際強く、しかも安定なシグナルを提供することができ、そしてそのようなアッセイのマルチプレキシングを可能とする。
2008541015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーを介して共有結合された特異的結合部分およびナノ粒子を含んでなるコンジュゲート。
【請求項２】
リンカーのチオール反応性基が特異的結合部分に共有結合され、そしてリンカーのアミン反応性基がナノ粒子に共有結合されている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
リンカーのチオール反応性基が特異的結合部分のシステイン残基に共有結合されている、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
リンカーのチオール反応性基が、特異的結合部分に導入されたチオール基に共有結合されている、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
リンカーのアルデヒド反応性基が特異的結合部分に共有結合され、そしてリンカーのアミン反応性基がナノ粒子に共有結合されている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
リンカーのアルデヒド反応性基が、特異的結合部分のグリコシル化部分上に形成されたアルデヒドに共有結合されている、請求項５に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
リンカーのアルデヒド反応性基が特異的結合部分に共有結合され、そしてヘテロ二官能性リンカーのチオール反応性基がナノ粒子に結合されている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ヘテロ二官能性リンカーが、式：
【化１】
2008541015.tif 000023
式中、ｎ＝１〜５０である；あるいは
【化２】
2008541015.tif 000024
式中、ｍは１〜５０である、
を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーを含んでなる請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
コンジュゲートが式：
【化３】
2008541015.tif 000025
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０、そしてｏ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
コンジュゲートが式：
【化４】
2008541015.tif 000026
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０、そしてｐ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
コンジュゲートが式：
【化５】
2008541015.tif 000027
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０、そしてｑ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
コンジュゲートが式：
【化６】
2008541015.tif 000028
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、そしてｎ＝１〜５０、そしてｒ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
コンジュゲートが式：
【化７】
2008541015.tif 000029
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０、そしてｓ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
コンジュゲートが式：
【化８】
2008541015.tif 000030
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０、そしてｔ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
コンジュゲートが式：
【化９】
2008541015.tif 000031
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０、そしてｕ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
コンジュゲートが式：
【化１０】
2008541015.tif 000032
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０、そしてｖ＝１〜１０である、
を有する請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
ナノ粒子が量子ドットを含んでなる請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
特異的結合部分が抗体を含んでなる請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
特異的結合部分がアビジンを含んでなる請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲート組成物を調製する方法であって：
特異的結合部分からチオール化特異的結合部分を形成し；
ナノ粒子のアミン基をマレイミド／活性エステル二官能性ＰＥＧリンカーと反応させて、活性化ナノ粒子を形成し；そして
チオール化特異的結合部分を活性化ナノ粒子と反応させて、特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートを形成する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２１】
チオール化特異的結合部分を形成することが、特異的結合部分と還元剤を反応させてチオール化特異的結合部分を形成することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
特異的結合部分が抗体を含んでなり、そしてチオール化特異的結合部分を形成することが抗体を還元剤と反応させてチオール化抗体を形成することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
抗体と還元剤を反応させてチオール化抗体を形成することが、抗体あたり約１から約１０の間の平均チオール数をもつ抗体を形成することを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体を還元剤と反応させることが、抗体を２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、ＤＴＴ、ＤＴＥおよびＴＣＥＰおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤と反応させることを含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗体を還元剤と反応させることが、抗体をＤＴＴおよびＤＴＥおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤と反応させることを含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗体を還元剤と反応させることが、抗体を約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度の還元剤と反応させることを含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
チオール化特異的結合部分を形成することが、チオール基を特異的結合部分に導入することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
チオール基を特異的結合部分に導入することが、特異的結合部分を２−イミノチオラン、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、ＳＰＤＰ、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、ＳＡＭＳＡおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と反応させることを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
チオール基を特異的結合部分に導入することが、特異的結合部分をオキシダントと反応させて特異的結合部分の糖部分をアルデヒド基に変換し、そしてアルデヒド基をシスタミンと反応させることを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
オキシダントが過ヨウ素酸塩イオン、Ｉ２、Ｂｒ２およびそれらの組み合わせ、またはノイラミニダーゼ／ガラクトース  オキシダーゼを含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ナノ粒子のアミン基をマレイミド／活性エステル二官能性ＰＥＧリンカーと反応させて活性化ナノ粒子を形成することが、ナノ粒子を式：
【化１１】
2008541015.tif 000033
式中、ｎ＝１〜５０である、
を有するＰＥＧマレイミド／活性エステルとを反応させることを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
ｎ＝４〜１２である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ナノ粒子が量子ドットを含んでなる請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
抗体−ナノ粒子コンジュゲート組成物を調製する方法であって：
抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成し；
アルデヒドを持つ抗体をＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーと反応させて、チオール−反応性抗体を形成し；そして
チオール−反応性抗体を、チオール化ナノ粒子を反応させて、抗体−ナノ粒子コンジュゲートを形成する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項３５】
抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成することが、抗体のグリコシル化領域を酸化してアルデヒドを持つ抗体を形成することを含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗体のグリコシル化領域を酸化することが、抗体を過ヨウ素酸塩、Ｉ２、Ｂｒ２またはそれらの組み合わせ、あるいはノイラミニダーゼ／ガラクトース  オキシダーゼで処理することを含んでなる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらにチオール化ナノ粒子をナノ粒子から形成することを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
チオール化ナノ粒子を形成することが、チオール基をナノ粒子に導入することを含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
チオール基をナノ粒子に導入することが、ナノ粒子を２−イミノチオラン、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、ＳＰＤＰ、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、ＳＡＭＳＡおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と反応させることを含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アルデヒドを持つ抗体をＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーと反応させて、チオール−反応性抗体を形成することが、アルデヒドを持つ抗体を式：
【化１２】
2008541015.tif 000034
式中、ｎ＝１〜５０である、
を有するリンカーと反応させることを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
チオール化ナノ粒子が量子ドットを含んでなる請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
抗体をオキシダントと反応させて、アルデヒドを持つ抗体を形成することが、抗体あたり平均約１から約１０の間のアルデヒド基を導入することを含んでなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
生物学的サンプル中の目的分子の検出方法であって：
生物学的サンプルを、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーを介してナノ粒子に共有結合された特異的結合部分を含んでなる特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲート組成物と接触させ；そして
目的分子に結合したコンジュゲートにより生成されるシグナルを検出する、
ことを含んでなる上記検出方法。
【請求項４４】
生物学的サンプルが組織切片または細胞学サンプルを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
特異的コンジュゲート部分が抗体またはアビジンを含んでなり、そしてナノ粒子が量子ドットを含んでなる請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
特異的結合部分が抗体を含んでなる請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
コンジュゲートが抗−ハプテン抗体であり、そして目的分子がハプテン−標識化プローブ配列で検出可能な核酸配列である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が−抗体抗体を含んでなる請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ナノ粒子が量子ドットを含んでなり、そして検出が生物学的サンプルを量子ドットにより発する蛍光を刺激する波長の光で照射することを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
異なる特異的結合部分および別個に検出可能なナノ粒子を有する少なくとも２つのコンジュゲートがサンプルと接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
別個に検出可能なナノ粒子が異なる発光波長を有する量子ドットを含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は２００５年４月２８日に出願された特許文献１の利益、および２００５年６月２４日に出願された特許文献２の利益を主張し、両出願は引用により本明細書に編入する。
【発明の背景】
【０００２】
発明の背景
１．分野
本発明は、生物学的サンプル中の特定分子を検出するための試薬および方法に関する。より詳細には、本発明は特異的結合部分およびナノ粒子の共有コンジュゲート、ならびに組織切片のような生物学的サンプル中の特定分子を検出するためのそのようなコンジュゲートの使用法に関する。
２．背景
特異的結合部分およびシグナル生成部分のコンジュゲートは、生物学的サンプル中の特異的な標的分子を検出するためのアッセイに使用することができる。そのようなコンジュゲートの特異的結合部分は、サンプル中の標的に強固に結合し、そしてシグナル生成部分を利用して標的の存在／およびまたは場所を示す検出可能なシグナルを提供する。
【０００３】
１つの種類の検出可能なコンジュゲートは、抗体および発蛍光団の共有コンジュゲートである。コンジュゲートに発蛍光団により吸収される波長の光子を向けることは、検出され、そして抗体を定性し、定量し、かつ／または場所を見つけるために使用することができる蛍光を刺激する。発蛍光団として使用される蛍光部分の多くは、結合されたｐｉ−電子系を有する有機分子である。そのような有機発蛍光団は強力な蛍光シグナルを提供することができるが、それらの効力、特にマルチプレックスアッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ）、そして保管的（ａｒｃｈｉｖａｌ）試験結果が必要な場合における効力を限定する多くの特性を現す。
【０００４】
有機発蛍光団は、励起源による長期の照射により光退色する恐れがあり、これはサンプルから最大かつ／または検出可能なシグナル引き出すことができる期間を限定する。長期化した照射および／または長期化した酸素への暴露は、永久的に有機発蛍光団を非蛍光分子に転換し得る。このように蛍光検出は、保管的サンプルが必要な場合に日常的に使用されてこなかった。
【０００５】
有機発蛍光団を使用したマルチプレックスアッセイは、そのような発蛍光団が典型的には発蛍光団により吸収される光子よりもわずかに長いだけである波長（低エネルギー）の光子（すなわちそれらは小さいストークのシフトを有する）を発するので難しい。このように電磁気スペクトルの一部（可視部分のような）をわたる種々の波長の光の発する１組の発蛍光団の選択には、この部分をわって吸収する発蛍光団の選択を必要とする。このような状況で、１つの発蛍光団により発せられる光子は、その組の中のもう１つの発蛍光団により吸収される可能性があり、これによりアッセイの精密度および感受性が下がる。
【０００６】
幾つかの有機金属性発蛍光団（例えばランタニド錯体）は有機発蛍光団よりも光安定性が高いようであるが、それらの組も吸収の重複およびあるスペクトル領域をわたる蛍光という欠点を持つ。さらに有機および有機金属性発蛍光団が共有する欠点は、それらの蛍光スペクトルが広くなる傾向にあり（すなわち蛍光光子がある波長範囲にわたる）、さらにマルチプレックスアッセイにおける２以上の発蛍光団が同じ波長の光子を発するようにす
るらしい。ここでもこれがアッセイの正確さを限定する。たとえ半定量的および定性的アッセイでも、これら有機および有機金属性発蛍光団の限界が結果を歪める恐れがある。
【０００７】
蛍光ナノ粒子、例えば蛍光Ｃｄ／Ｓｅナノ粒子は、マルチプレックスアッセイに大変有望な新たなクラスの発蛍光団である。特定の性質を現すナノ粒子を工作するためのより広い努力の一環として、大変狭い波長範囲で強い蛍光を発するための蛍光ナノ粒子が開発された。また蛍光ナノ粒子は高度に光安定性であり、そして特定の波長で蛍光を調整することができる。そのようなナノ粒子の吸収および蛍光特性により、広い全波長範囲にわたる蛍光ナノ粒子の組は、単一の波長または特定の波長範囲内の光子で同時に励起されることができ（ＵＶ源でのブロードバンド励起の場合ように）、そしてより長い波長で蛍光を発する他のナノ粒子により吸収される、任意の粒子により発せられる蛍光光子は大変少ないか、または無い。その結果、蛍光ナノ粒子は、シグナル安定性およびマルチプレックスアッセイに対する潜在能力に関してる有機および有機金属性発蛍光団の限界を克服する。
【０００８】
しかしながらナノ粒子は一般に、そして蛍光ナノ粒子は特異的に抗体のような特異的結合部分に結合される場合に幾つかの問題が生じる。表面の相互作用はナノ粒子の特性を改変する傾向がある。したがって、ナノ粒子の特異的結合部分への結合は、ナノ粒子の特性および安定性を、そして蛍光ナノ粒子の場合はそれらの蛍光特性を改変する可能性がある（蛍光波長および強度のような）。同様に、ナノ粒子と特異的結合部分との間の相互作用は、結合部分の特異性を減少させる恐れがある。このように蛍光ナノ粒子はそれらを従来の発蛍光団に代わる魅力的な選択とする多数の特性を提供するものの、コンジュゲート中の有用なシグナル生成部分としてそれらの能力は未だ完全に実現されなかった。
【０００９】
組織および細胞学サンプルの免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のようなｉｎ  ｓｉｔｕアッセイに関する応用、特にそのようなサンプルのマルチプレックスアッセイでは、特異的結合部分の特異性および蛍光ナノ粒子の蛍光特性を大きな程度まで保持する蛍光ナノ粒子のコンジュゲートを開発することが高度に望まれている。コンジュゲートにおけるこれら特性の保持は、アッセイが少量のタンパク質および低コピー数の核酸配列を検出することに向けられている場合、より一層重要となる。
【００１０】
１つの励起源により励起することができる、独特な狭い整調性（ＦＷＨＭ＜４０ｎｍ）の量子ドット蛍光は、造影に極めて魅力的である。このために、被検体としての量子ドットは多くの異なる構成物中で使用されてきた。静電的および共有結合の両方が個々の量子ドットのカプセル化に使用され、凝集を防止し、そして末端反応基を提供するために使用されてきた。例には静電的相互作用または共有結合のいずれかを介する架橋結合分子での生物結合のためのアミンおよびカルボキシル基の使用を含む。例えばＣｈａｎ  ａｎｄ  Ｎｉｅ「超高感度の非アイソトープ性検出のための量子ドット生物コンジュゲート（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」（非特許文献１）、およびＭ．Ｐ．Ｂｒｕｃｈｅｚ，ｅｔ  ａｌ．「検出可能な標識として半導体ナノクリスタルを使用したサンプル中の被検体の検出法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｅ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｓ  Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  Ｌａｂｅｌ）」（特許文献３）を参照にされたい。しかしほとんどの現在のコンジュゲートの作成法は、量子収率が下げられ、そして安定性および保管性の両方が可能ではない量子ドットを生じる、したがって特異的結合部分の特異性およびナノ量子の望ましい光物理学特性（光安定性および量子収率のような）の両方をより良く保持するコンジュゲートの存在が必要である。
【参考文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６７５，７５９号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／６９３，６４７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，６３０，３０７号明細書
【非特許文献１】Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｎｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８１，ｐ．２０１６〜２０１８，１９９８，
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
特異的結合部分およびナノ粒子のコンジュゲートが開示され、このコンジュゲートの作成および使用法も開示される。開示するコンジュゲートは、生物学的サンプル中の目的分子の検出、特に組織切片および細胞学サンプル中のそのような分子の検出に優れた性能を現す。特に開示する特異的結合部分と蛍光ナノ粒子のコンジュゲートは特異的結合部分の特異性およびナノ粒子の望ましい蛍光特性を保持し、これにより抗原および核酸の感度のあるマルチプレックスアッセイを可能とする。
【００１３】
１つの観点では、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーのようなヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーを介してナノ粒子に共有的に連結された特異的結合部分を含むコンジュゲートが開示される。１つの態様では、開示されるコンジュゲートは、抗体、およびヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーにより共有的に連結されたナノ粒子を含む。別の態様では、開示するコンジュゲートは、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーに共有的に連結されたアビシンおよびナノ粒子を含む。より詳細な態様では、開示するコンジュゲートは、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーにより量子ドットに共有的に連結された抗体またはアビジンを含む。
【００１４】
開示するコンジュゲートのＰＥＧリンカーは、カルボニル反応性基、アミン反応性基、チオール反応性基および光反応性基から選択される２つの異なる反応性基の組み合わせを含む。より詳細な態様では、ＰＥＧリンカーは、チオール反応性基およびアミン反応性基の組み合わせ、またはカルボニル反応性基およびチオール反応性基の組み合わせを含む。より詳細な態様では、チオール反応性基はマレイミド基を含み、アミン反応性基は活性エステルを含み、そしてカルボニル反応性基はヒドラジン誘導体を含む。
【００１５】
別の観点では、開示するコンジュゲートの作成法が提供される。１つの態様では、コンジュゲートの作成法はチオール化特異的結合部分を形成し；アミン基を有するナノ粒子をＰＥＧマレイミド／活性エステル二官能性リンカーと反応させて、活性化ナノ粒子を形成し；そしてチオール化特異的結合部分を活性化シグナル生成部分と反応させて、抗体およびシグナル生成部分のコンジュゲートを形成することを含む。チオール化特異的結合部分は、特異的結合部分に固有のシステイン架橋の還元剤による還元により形成され得るか、またはチオール化特異的結合部分は、抗体を、チオールを特異的結合部分に導入する試薬と反応させることにより形成され得る。
【００１６】
別の態様では、開示する抗体コンジュゲートの作成法には、特異的結合部分をオキシダントと反応させて、アルデヒドを持つ特異的結合部分を形成し；アルデヒドを持つ特異的結合部分をＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーと反応させてチオール反応性特異的結合部分を形成し；そしてチオール反応性特異的結合部分をチオール化ナノ粒子と反応させてコンジュゲートを形成することを含む。特定の態様では、特異的結合部分をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成することは、特異的結合部分のグリコシル化領域を酸化して（過ヨウ素酸塩、Ｉ２、Ｂｒ２およびそれらの組み合わせを用いるような）、アルデヒドを持つ特異的結合部分を形成することを含む。この方法はさらに、例えばナノ粒子を、チオール基をナノ粒子に導入する試薬と反応させることにより、ナノ粒子からチオール化ナノ粒子を形成することを含むことができる。
【００１７】
別の観点では、開示する方法に使用して、そして特に開示する蛍光ナノ粒子コンジュゲートを使用した目的分子のマルチプレックス検出において、生物学的サンプル中の目的分子を検出する方法が開示される。開示するこれらのおよびさらなる観点、態様および特徴は、以下の詳細な説明および実施例から明らかとなるだろう。
【００１８】
幾つかの具体的態様の詳細な説明
本発明のさらなる観点は、以下の非限定的例により具体的に説明され、これは以下に定義する略号および用語について始める。
Ｉ．略号
２−ＭＥ        ２−メルカプトエタノール
２−ＭＥＡ      ２−メルカプトエチルアミン
Ａｂ            抗体
ＢＳＡ          ウシ血清アルブミン
ＤＴＥ          ジチオエリスリトール（シス−２，３−ジヒドロキシ−１，４−
ジチオールブタン）
ＤＴＴ          ジチオスレイトール（トランス−２，３−ジヒドロキシ−１，４−ジチ
オールブタン）
ＦＷＨＭ        半値全幅
ＩＨＣ          免疫組織化学
ＩＳＨ          ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＭＡＬ          マレイミド
ＮＨＳ          Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド
ＮＰ            ナノ粒子
ＰＥＧ          ポリエチレングリコール
ＱＤ＃＃＃      量子ドット（蛍光最大の波長）
ＳＡＭＳＡ      Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
ＳＡＴＡ        Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート
ＳＡＴＰ        スクシンイミジル  アセチル−チオプロピオネート
ＳＢＭ          特異的結合部分
ＳＭＰＴ        スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル
ジチオ）トルエン
ＳＰＤＰ        Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＴＣＥＰ        トリス（カルボキシエチル）ホスフィン
【００１９】
ＩＩ．用語
用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に他を示さない限り、単数および複数の両方の指示対称を含む。
【００２０】
用語「抗体」は、集合的に免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、その組み合わせ、および任意の脊椎動物例えばヒト、ヤギ、ラット、ウサギおよびマウスのような哺乳動物における免疫応答中に生産される類似分子を含む）、および目的分子（または目的分子に高度に類似性の群）に、他の分子（例えば生物学的サンプル中の他の分子の結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１より大きい、１０４Ｍ−１より大きく、または１０５Ｍ−１より大きい目的分子への結合定数を有する抗体および抗体フラグメント）の結合を実質的に排除する程度まで、特異的に結合する抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントにはタンパク質分解抗体フラグメント［当該技術分野で知られているＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントおよびＦａｂフラグメントのような］、組換え抗体フラグメント（当該技術分野で知られているｓＦｖフラグメント、ｄｓＦｖフラグメント、二重特異性ｓＦｖフラグメント、二重特異性ｄｓＦｖフラグメント、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）およびトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）のような）、および特許請求されている抗体（例えば米国特許第６，０１５，６９５号；同第６，００５，０７９号−同第５，８７４，５４１号；同第５，８４０，５２６号；同第５，８００，９８８号；および同第５，７５９，８０８号明細書を参照にされたい）を含む。
【００２１】
用語「アビジン」は、生物学的サンプル中に存在するかもしれない他の低分子を実質的に排除するまで、ビオチンに特異的に結合する任意のタンパク質を指す。アビジンの例には、卵白、脂肪種子（例えばダイズ粉）、および穀物（例えばコーン／メイズ）に自然に存在するアビジン、および細菌起源のタンパク質であるストレプトアビジンを含む。
【００２２】
「目的分子」という句は、存在、場所および／または濃度が測定される分子を指す。目的分子の例には、ハプテンで標識されたタンパク質および核酸配列を含む。
【００２３】
用語「ナノ粒子」は、ナノメートルで測定されるサイズを有するナノスケールの粒子を指し、例えば少なくとも約１００ｎｍの少なくとも１つの寸法を有するナノスコピック粒子である。ナノ粒子の例には、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン−様物質、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合した金属錯体を含むような）、ナノファイバー、ナノホーン、ナノ−オニオン、ナノロッド、ナノロープおよび量子ドットを含む。ナノ粒子は検出可能なシグナルを、例えば光子の吸収および／または発光（ラジオ周波および可視光子を含む）、およびプラスモン共鳴を介して生産することができる。
【００２４】
用語「量子ドット」は、量子封じ込めによりサイズ依存性の電気的および光学的特性を現すナノスケールの粒子を指す。量子ドットは例えば半導体材料（例えばカドミウムセレニドおよび硫化鉛）から、および晶子（分子ビームエピタクシーを介して成長した）等から構成されてきた。種々の表面化学および蛍光特性を有する様々な量子ドットがインビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ユージーン、オレゴン州から市販されている（例えば、米国特許第６，８１５，０６４号，同第６，６８２，５９６号および同第６，６４９，１３８号明細書を参照にされたい。その各々の特許は引用により本明細書に編入する）。また量子ドットはエビデントテクノロジーズ（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（トロイ、ニューヨーク州）からも市販されている。他の量子ドットには、ＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓおよびＩｎＧａＮ量子ドットのような合金量子ドットがある（合金量子ドットおよびその作成法は、例えば米国特許出願第２００５／００１２１８２号明細書および国際公開第２００５／００１８８９号パンフレットに開示されている）。
【００２５】
用語「特異的結合分子」は、一般に特異的に結合する対のメンバーを指す。特異的に結合する対は、他の分子の結合を実質的に排除する程度まで、高いに結合することを特徴とする分子対である（例えば特異的に結合する対は、生物学的サンプル中の他の分子との結合対の２つのいずれか結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１より大きい、１０４Ｍ−１より大きく、または１０５Ｍ−１より大きい結合定数を有することができる）特異的結合部分の特定の例には、抗体、レクチン、アビジン（ストレプトアビジンのような）およびプロテインＡのような特異的結合タンパク質を含む。また特異的結合部分は、そのような特異的結合タンパク質に特異的に結合する分子（またはその部分）も含むことができる。
【００２６】
ＩＩＩ．概説
１つの観点では、以下に表す一般構造
【００２７】
【化１】
2008541015.tif 000003
【００２８】
式中、ＡおよびＢは異なる反応性基を含み、ｘは２〜１０の整数であり（２、３もしくは４のような）、そしてｙは３〜２０からの整数または４〜１２からの整数のような１〜５０の整数、例えば２〜３０の整数である、
を有するヘテロ二官能ポリアルキレングリコールリンカーを介してナノ粒子に共有結合された特異的結合部分を含む特異的結合部分／ナノ粒子コンジュゲートが開示される。
式中の１または複数の水素原子は、ヒドロキシル基、アルコキシ基（メトキシおよびエトキシのような）、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、スルファト基およびアミノ基（ジアルキルアミノ基のようなモノ−およびジ−置換アミノ基を含む）のような官能基に置換され得る。
【００２９】
ＡおよびＢは、独立してカルボニル反応性基、アミン反応性基、チオール反応性基、または光反応性基を含むことができるが、同じ反応性基を含まない。カルボニル反応性基の例にはヒドラジンおよびヒドラジド誘導体およびアミンのようなアルデヒドおよびケトン反応性基を含む。アミン反応性基の例には、ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロライド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、無水物等のような活性エステルを含む。チオール反応性基の例には、非重合性ミハエル受容体、ハロアセチル基（ヨードアセチルのような）、アルキルハライド、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、およびピリジルジスルフィド基のようなジスルフィド基およびエルマン試薬で活性化されるチオールがある。光活性基の例には、アリールアジドおよびハロゲン化アリールアジドを含む。このような各種類の基のさらなる例は、当業者には明らかである。反応条件および１つの種類の反応性基の別の反応性基への交換法に関するさらなる例および情報は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「生物コンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、１９９６に提供されており、これは引用により本明細書に編入する。特定の態様では、チオール反応性基はビニルスルホン以外である。
【００３０】
幾つかの態様では、ヘテロ二官能性リンカーのチオール反応性基は、特異的結合部分に共有結合され、そしてヘテロ二官能性リンカーのアミン反応性基がナノ粒子に共有的に連結されているか、またはその逆である。例えばヘテロ二官能性リンカーのチオール反応性基は、特異的結合部分のシステイン残基（システイン架橋の還元に従うような）に共有結合されることができ、あるいはヘテロ二官能性リンカーのチオール反応性基は、特異的結合部分に導入されたチオール基に共有結合されることができ、そしてアミン反応性基はナノ粒子に結合される。
【００３１】
あるいはヘテロ二官能性リンカーのアルデヒド反応性基は、ナノ粒子に共有結合されることができ、そしてヘテロ二官能性リンカーのアミン反応性基は、ナノ粒子に共有結合されることができ、あるいはその逆であることもできる。特定の態様では、ヘテロ二官能性リンカーのアルデヒド反応性基は、特異的結合部分のグリコシル化部分上に形成されたアルデヒドに共有結合されることができ、そしてアミン反応性基はナノ粒子に共有結合される。
【００３２】
さらに別の態様では、ヘテロ二官能性リンカーのアルデヒド反応性基は特異的結合部分に共有結合され、そしてヘテロ二官能性リンカーのチオール反応性基はナノ粒子に共有結合されるか、あるいはその逆である。
【００３３】
幾つかの態様では、ヘテロ二官能性リンカーは式：
【００３４】
【化２】
2008541015.tif 000004
【００３５】
を有し、
式中、ＡおよびＢは前のような異なる反応性基であり；ｘおよびｙは前の通りであり、そしてＸおよびＹはスペーサー基、例えば１と６との間の炭素、または１と４との間の炭素のような１と１０との間の炭素を有するスペーサー基であり、そして場合により１もしくは複数のアミド連結、エーテル連結、エステル連結等を含んでよい。スペーサーＸおよびＹは同じか、または異なることができ、そして直鎖、分岐または環式（例えば脂肪族もしくは芳香族環式構造）であることができ、そして非置換または置換されることができる。スペーサー上の置換基であることができる官能基には、カルボニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）原子、アルコキシ基（メトキシおよびエトキシのような）、ニトロ基およびスルファト基がある。
【００３６】
別の特定の態様では、ヘテロ二官能性リンカーは式：
【００３７】
【化３】
2008541015.tif 000005
【００３８】
式中、ｎ＝１〜５０、例えばｎ＝３〜２０またはｎ＝４〜１２のようなｎ＝２〜３０である、
を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーを含んでなる。さらに幾つかの特定の態様では、このリンカーのスクシンイミド基のカルボニルはナノ粒子上のアミン基に共有結合され、そしてリンカーのマレイミド基は特異的結合部分のチオール基に共有結合されるか、あるいはその逆である。さらに他の特定の態様では、平均約１から約１０の間の特異的結合部分がナノ粒子に共有結合している。ナノ粒子の例には半導体ナノクリスタル（例えばインビトロジェン社、ユージーン、オレゴン種から得られる量子ドットのような；例えば米国特許第６，８１５，０６４号、同第６，６８２，５９６号および同第６，６４９，１３８号明細書を参照にされたい。各特許は引用により本明細書に編入する）、常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子および超常磁性ナノ粒子がある。
【００３９】
別の特定の態様では、ヘテロ二官能性リンカーは式：
【００４０】
【化４】
2008541015.tif 000006
【００４１】
式中、ｍ＝１〜５０、例えばｍ＝３〜２０または４〜１２のようなｍ＝２〜３０である、
を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーを含んでなる。さらに詳細な態様では、このリンカーのヒドラジド基は特異的結合部分のアルデヒド基に共有的に連結され、そしてリンカーのマレイミド基はナノ粒子のチオール基に共有的に連結されるか、あるいはその逆である。さらに一層詳細な態様では、特異的結合部分のアルデヒド基は、抗体のＦｃ部分のグリコシル化領域の酸化により抗体のＦｃ部分に形成されたアルデヒド基である。他のさらに一層詳細な態様では、平均約１から約１０の間の特異的結合部分がナノ粒子に共有的に連結される。簡単に説明すると、上記式のマレイミド／ヒドラジドＰＥＧ−リンカーは、保護されたヒドラジン誘導体（Ｂｏｃ−保護ヒドラジン）で処理し、続いて酸で処理することにより、対応するマレイミド／活性エステルＰＥＧリンカー（これは例えばクォンタ  バイオデザイン、ポーウェル、オハイオ州から入手可能である）から合成することができる。
【００４２】
他の特定の態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧ−連結特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートは、式：
【００４３】
【化５】
2008541015.tif 000007
【００４４】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０（ｎ＝２〜３０、ｎ＝３〜２０またはｎ＝４〜１２のような）、そしてｏ＝１〜１０（ｏ＝２〜６またはｏ＝３〜４のような）である、
あるいは
【００４５】
【化６】
2008541015.tif 000008
【００４６】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０（ｎ＝２〜３０、ｎ＝３〜２０またはｎ＝４〜１２のような）、そしてｐ＝１〜１０（ｐ＝２〜６
またはｐ＝３〜４のような）である、
を有するコンジュゲートを含んでなる。
【００４７】
さらに別の特定の態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧ−連結特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートは、式：
【００４８】
【化７】
2008541015.tif 000009
【００４９】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｎ＝１〜５０（ｎ＝２〜３０、ｎ＝３〜２０またはｎ＝４〜１２のような）、そしてｑ＝１〜１０（ｑ＝２〜６またはｑ＝３〜４のような）である、
あるいは
【００５０】
【化８】
2008541015.tif 000010
【００５１】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、そしてｎ＝１〜５０（ｎ＝２〜３０、ｎ＝２〜２０またはｎ＝４〜１２のような）、そしてｒ＝１〜１０（ｒ＝２〜６またはｒ＝３〜４のような）である、
を有するコンジュゲートを含んでなる。
【００５２】
さらに別の特定の態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧ−連結特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートは、式：
【００５３】
【化９】
2008541015.tif 000011
【００５４】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０（ｍ＝２〜３０、ｍ＝３〜２０またはｍ＝４〜１２のような）、そしてｓ＝１〜１０（ｓ＝２〜６またはｓ＝３〜４のような）である、
あるいは
【００５５】
【化１０】
2008541015.tif 000012
【００５６】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、そしてｍ＝１〜５０（ｍ＝２〜３０、３〜２０または４〜１２のような）、そしてｔ＝１〜１０（ｔ＝２〜６またはｔ＝３〜４のような）である、
を有するコンジュゲートを含んでなる。
【００５７】
さらに別の特定の態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧ−連結特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートは、式：
【００５８】
【化１１】
2008541015.tif 000013
【００５９】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０（ｍ＝２〜３０、ｍ＝３〜２０またはｍ＝４〜１２のような）、そしてｕ＝１〜１０（ｕ＝２〜６またはｕ＝３〜４のような）である、
あるいは
【００６０】
【化１２】
2008541015.tif 000014
【００６１】
式中、ＳＢＭは特異的結合部分であり、ＮＰはナノ粒子であり、ｍ＝１〜５０（ｍ＝２〜３０、ｍ＝２〜２０またはｍ＝４〜１２のような）、そしてｖ＝１〜１０（ｖ＝２〜６またはｖ＝３〜４のような）である、
を有するコンジュゲートを含んでなる。
【００６２】
これらコンジュゲート中のＳＭＢには、例えば抗体、核酸、レクチンまたはストレプトアビジンのようなアビジンを含むことができる。ＳＭＢが抗体を含む場合、抗体は任意の特定の分子または高度に類似の分子の特定の基に特異的に結合することができ、そして特定の態様では、抗体は抗−ハプテン抗体（これは例えば目的の核酸配列に向けられたハプテン−標識化プローブ配列を検出するために使用され得る）、またはサンプル中に存在し得る特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を含んでなる。ハプテンは、抗体により特異的に結合される低有機分子であるが、それら自体では動物に免疫応答を誘導せず、そして免疫応答を刺激するためにはタンパク質のような大きいキャリアー分子に最初に結合されなければならない。ハプテンの例には、ジ−ニトロフェノール、ビオチンおよびジゴキシゲニンがある。さらに別の特定の態様では、抗体はイムノアッセイで２次抗体として使用することができる抗−抗体抗体を含んでなる。例えば抗体は、抗−マウスＩｇＧ抗体、
抗−ウサギＩｇＧ抗体または抗−ヤギＩｇＧ抗体のような抗−ＩｇＧ抗体を含んでなることができる。
【００６３】
開示するコンジュゲートは、免疫組織化学的結合アッセイを含め任意の種類の結合イムノアッセイで、および核酸プローブの免疫化学的検出を使用するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で目的分子を検出するために利用することができる。１つの態様では、開示するコンジュゲートはイムノアッセイにおける標識化１次抗体、例えば特定分子またはハプテン標識化分子に向けられた１次抗体として使用される。あるいは目的分子がマルチエピトープ性である場合、複数のエピトープに向けられたコンジュゲートの混合物を使用することができる。別の態様では、開示するコンジュゲートはイムノアッセイにおける２次抗体として使用される（例えば目的の分子に結合する１次抗体に向けられる；目的分子はマルチエピトープ性である場合、サンドイッチ型のアッセイにおいて２つの１次抗体により結合され得る）。さらに別の態様では、１次抗体により結合された目的分子によるシグナルのさらなる増幅を提供するために、開示するコンジュゲートの混合物が使用される（目的分子はサンドイッチ型のアッセイで２つの１次抗体により結合され得る）。例えば混合物中の第１コンジュゲートは、目的分子に結合する１次抗体に向けられ、そして第２コンジュゲートは第１コンジュゲートの抗体部分に向けられ、これにより目的分子の部位に、より多くのシグナル生成部分が局在する。開示するコンジュゲートを使用することができる他の型のアッセイは、当業者には直ちに明白である。
【００６４】
さらに別の観点では、特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートを調製する方法が開示され、この方法は特異的結合部分からチオール化特異的結合部分を形成し；アミン基を有するナノ粒子をＰＥＧマレイミド／活性エステル二官能性リンカーと反応させて、活性化ナノ粒子を形成し；そしてチオール化特異的結合部分を活性化ナノ粒子と反応させて、特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートを形成することを含む。
【００６５】
チオール化特異的結合部分は、特異的結合部分を還元剤と反応させてチオール化特異的結合部分を形成することにより形成することができ、例えば特異的結合部分を還元剤と反応させて、特異的結合部分あたり約１から約１０の間の平均チオール数を有するチオール化特異的結合部分を形成する。特異的結合部分あたりのチオールの平均数は滴定により決定することができる。還元剤の例には２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、ＤＴＴ、ＤＴＥおよびＴＣＥＰおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される還元剤を含む。特定の態様では、還元剤はＤＴＴおよびＤＴＥおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、そして約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度で使用される。
【００６６】
あるいはチオール化特異的結合部分を形成することは、チオール基を特異的結合部分に導入することを含む。例えばチオール基は、２−イミノチオラン、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、ＳＰＤＰ、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、ＳＡＭＳＡおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬を用いた反応により特異的結合部分に導入することができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「生物コンジュゲート技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９６を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）。さらに詳細な態様では、チオール基を特異的結合部分に導入することは、特異的結合部分をオキシダント（過ヨウ素酸塩）と反応させて特異的結合部分の糖部分（抗体のグリコシル化部分のような）をアルデヒド基に変換し、そして次にアルデヒド基をシスタミンと反応させることを含む。別のより詳細な態様では、特異的結合部分はストレプトアビジンを含み、そしてチオール基を導入することはストレプトアビジンを２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）と反応させることを含んでなる。
【００６７】
別の詳細な態様では、ナノ粒子をＰＥＧマレイミド／活性エステル二官能性リンカーと
反応させて、活性化ナノ粒子を形成することは、ナノ粒子を式：
【００６８】
【化１３】
2008541015.tif 000015
【００６９】
式中、ｎ＝１〜５０、例えばｎ＝３〜２０またはｎ＝４〜１２のようなｎ＝２〜３０である、
を有するＰＥＧマレイミド／活性エステルと反応させることを含む。
【００７０】
さらなる観点では、特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲート組成物を調製する方法が開示され、この方法は特異的結合部分をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ特異的結合部分を形成し；アルデヒドを持つ特異的結合部分をＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーとを反応させて、チオール反応性の特異的結合部分を形成し；そしてチオール反応性の特異的結合部分を、チオール化ナノ粒子と反応させて、特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートを形成することを含む。特定の態様では、特異的結合部分は抗体であり、そして特異的結合部分をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ特異的結合部分を形成することは、抗体のグリコシル化領域を酸化して（例えば過ヨウ素酸塩、Ｉ２、Ｂｒ２またはそれらの組み合わせ、あるいはノイラミニダーゼ／ガラクトースオキシダーゼを用いるような）アルデヒドを持つ抗体を形成することを含む。さらに詳細な態様では、抗体をオキシダントと反応させてアルデヒドを持つ抗体を形成することは、抗体あたり平均約１から約１０の間のアルデヒド基を導入することを含む。
【００７１】
またチオール化ナノ粒子は、チオール基をナノ粒子に導入すること（例えばナノ粒子を、２−イミノチオラン、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ、ＳＰＤＰ、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、ＳＡＭＳＡおよびシスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される試薬と反応させることによる）により形成することができる。
【００７２】
特定の態様では、ＰＥＧマレイミド／ヒドラジド二官能性リンカーは、式：
【００７３】
【化１４】
2008541015.tif 000016
【００７４】
式中、ｍ＝１〜５０、例えばｍ＝３〜２０またはｍ＝４〜１２のようなｍ＝２〜３０である、
を有する。
【００７５】
さらに別の観点では、生物学的サンプル中の目的分子を検出する方法が開示され、この方法は生物学的サンプルを、ヘテロ二官能性ＰＥＧ−連結特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートと接触させ、そして特異的−部分コンジュゲート−ナノ粒子コンジュゲートにより生成されるシグナルを検出することを含む。生物学的サンプルは生体分子（タンパク質、核酸、脂質、ホルモン等）を含有する任意のサンプルであることができるが、特定の態様では、生物学的サンプルは組織切片（生検から得られるような）、または細胞学サン
プル（Ｐａｐスミアまたは血液スミアのような）を含む。特定の態様では、ヘテロ二官能性ＰＥＧ連結特異的−部分−ナノ粒子コンジュゲートは、量子ドットに共有的に連結された特異的結合部分を含む。
【実施例】
【００７６】
ＩＶ．実施例
以下の非限定的な実施例は、本発明の特定の観点をさらに具体的に説明するために提供される。
【００７７】
Ａ．マレイミドＰＥＧ活性エステルを使用した特異的結合部分−ナノ粒子コンジュゲートの調製
１つの態様では、開示する特異的結合部分ナノ粒子コンジュゲートは以下のスキーム１〜３に記載する方法に従い調製され、ここでヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、アミン−反応性基（活性エステル）およびチオール反応性基（マレイミド）を有するポリエチレングリコールリンカーである。スキーム１に示すように、１もしくは複数の利用可能なアミン基を有するナノ粒子（量子ドットのような）を、過剰なリンカーと反応させて活性化ナノ粒子を形成する。
【００７８】
【化１５】
2008541015.tif 000017
【００７９】
チオール基は、スキーム２に示すように抗体をＤＴＴのような還元剤で処理することにより抗体に導入される。ＤＴＥまたはＤＴＴのような穏やかな還元剤については、限定された数のチオール（約２から約６の間のような）を抗体に導入すると同時に、抗体を完全なまま維持するために（これはサイズ排除クロマトグラフィーにより測定することができる）、約１ｍＭから約４０ｍＭの間の濃度、例えば約１５ｍＭから約２５ｍＭの間のような約５ｍＭから約３０ｍＭの間の濃度が使用される。特定濃度の溶液との反応のために、適切な時間は、所定の時間で生産されるチオールの数を滴定することにより容易に決定できるが、反応は典型的には１０分から約１日、例えば約１５分から約２時間の間、例えば約２０分から約６０分の間進められる。
【００８０】
【化１６】
2008541015.tif 000018
【００８１】
スキーム１および２に従い生成された成分は、次いで合わせてスキーム３に示すコンジュゲートを与える。
【００８２】
【化１７】
2008541015.tif 000019
【００８３】
スキーム１〜３はマレイミドＰＥＧ活性エステルに関する最適な方法を具体的に説明するが（ここでナノ粒子は、アミン基（１もしくは複数）をリンカーの活性エステルと反応させて、活性化ナノ粒子を形成することにより最初に活性化される）、抗体上のアミン（１もしくは複数）もしくはチオール（１もしくは複数）のいずれかをリンカーと反応させることにより最初に抗体を活性化し、次いで活性化抗体をナノ粒子と反応させすることも可能である［チオール（１もしくは複数）もしくはアミン（１もしくは複数）を適切なリンカー上の残る反応性基と反応させる］。
【００８４】
このように別の態様では、抗体が結合のために活性化され、次いで以下のスキーム４および５に示すようにナノ粒子に結合される。スキーム４では、抗体がスキーム１に示すようなナノ粒子の代わりに活性化される。スキーム４の特定の態様では、糖部分（抗体のＦｃ部分のグリコシル化領域に位置するような）が最初に酸化されてアルデヒド基を提供し、次いでこれをリンカーのアルデヒド反応性基（具体的に説明するマレイミド／ヒドラジドＰＥＧリンカーのヒドラジド基のような）と反応させる。
【００８５】
【化１８】
2008541015.tif 000020
【００８６】
次いでスキーム５に示すように、活性化された抗体のリンカー部分のチオール反応性基（具体的に説明するようなマレイミド基のような）を、ナノ粒子のチオール基と反応させる。ここでも方法を逆転することができ、ここでリンカーは最初にナノ粒子上のアルデヒド基（例えば糖部分の酸化により形成された）と反応させて、活性化ナノ粒子を形成し、次いで活性化ナノ粒子を抗体上のチオール基と反応させることができる。
【００８７】
【化１９】
2008541015.tif 000021
【００８８】
上記スキーム１〜５および以下の６は、具体的に説明するための特定のコンジュゲートの例を示すが、開示するコンジュゲート中のナノ粒子に対する特異的結合部分（この場合、抗体）の比率は、ナノ粒子あたり複数の（５、１０、２０以上のような）特異的に結合する部分から、特異的結合部分あたり複数の（５、１０、２０以上のような）ナノ粒子へと変動することができると考えられる。
【００８９】
実施例Ｂ：チオールの抗体への導入
結合用の抗体、例えば抗−マウスＩｇＧまたは抗−ウサギＩｇＧ抗体を活性化するために、抗体を２５ミリモルのＤＴＴと周囲温度（２３〜２５℃）で２５分間インキュベーションすることができる。ＰＤ−１０ＳＥカラムを通す精製後、ＤＴＴを含まない抗体、典型的には２〜６個の遊離チオールを持つ抗体を得る（スキーム２）。ヤギ抗−マウスＩｇＧチオールを調製するために概略した例示の手順は、一般に他の抗体にも応用可能である。抗体あたりのチオール数は、例えば２００５年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／６７５７５９号明細書（引用により本明細書に編入する）に記載するチオールアッセイを使用することにより測定することができる。
【００９０】
実施例Ｃ：組織サンプルで超高感度（およびマルチプレックス）な免疫組織化学的およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出のための、免疫グロブリンおよびストレプトアビジンとＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドットとのコンジュゲート
しばしば量子ドットと呼ばれる半導体ナノクリスタルは、それらのサイズ依存的光学特性のために生物学的検出アッセイに使用することができる。量子ドットは、典型的には有機フルオロフォアに比べて高い吸収性および高い量子収率の結果、明るい蛍光を現す能力を提供する。さらに発光は調整でき、そして光退色に対して安定であり、保管性を可能にする。検出およびアッセイ目的のために、これらの強固なフルオロフォアは、マルチプレックスアッセイで利点を提供する。例えばこれら可視／ＮＩＲの励起は１つの供給源で可能である。しかし生物学的画像における限定要因は、生物コンジュゲートの感受性および安定性である。多色アッセイで量子ドットを効果的に利用するために、各ドットは望ましくは特異的かつ感受性である。
【００９１】
免疫グロブリンを量子ドットの殻に導入する方法は、この実施例に記載される。この方法は１）アミン−末端化量子ドットキャッピング基の、安定なＮＨＳエステル−（ＰＥＧ）ｘ−マレイミドでの官能化、（ｘ＝４，８，１２）ヘテロ二官能性２）ジチオスレイトールを用いて、時間依存的処置を介する免疫グロブリン全体の自然なジスルフィド結合の還元３）マレイミド−末端化量子ドットをこれらのチオール化免疫グロブリンで誘導化４）コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィーによる精製に依る。この工程をスキーム６に表す。
【００９２】
【化２０】
2008541015.tif 000022
【００９３】
ストレプトアビジンコンジュゲートは、この工程においてチオール化ストレプトアビジンにチオール化免疫グロブリンを代えることにより作成することができる。例えば２−イミノチオランで処理したストレプトアビジン分子。
【００９４】
この実施例で使用する量子ドットは、静電的に結合したトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）の殻および水溶性を誘導するために挿入する両親媒性ポリマーにより保護された。このポリマーは約３０個の末端アミン基をさらなる官能化のために有する。Ｅ．Ｗ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．「水性媒質中で強化された分散性を有する表面修飾半導体および金属ナノ粒子（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ）」、米国特許第６，６４９，１３８号明細書（引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。高度に感受性の量子ドットコンジュゲートを形成するために、抗体を量子ドットに比率を変えて結合させた。化学は２００５年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／６７５７５９号明細書（引用により本明細書に編入する）に記載されているものに類似する。
【００９５】
この方法論は、自然なジスルフィドを使用するので試薬の必要性がほとんど無い点で有利である。さらに抗体は個別なままで、しかも断片を形成しない。これにより各々の繋がれた抗体から２つの結合部位が可能となる。さらに高度に安定でしかも明るいコンジュゲートが生成される。同じ組織に関して、明るさは市販のストレプトアビジン−ＱＤコンジュゲート（インビトロジェン  コーポレーション、ユージーン、オレゴン州）をしのぐ。異なる発光波長の量子ドットへのヤギ抗−ビオチンおよびウサギ抗−ＤＮＰ抗体コンジュゲートを生成し、これによりマルチプレックスアッセイを可能とした。ＦＩＳＨを介するＨＰＶ検出が、開示する量子ドットコンジュゲートを用いて証明された。
【００９６】
材料
ＤＴＴはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入し、そして量子ドットはクォンタム
ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ）社から購入し、そして受け取った時に使用した。ＮＨＳ−ｄＰＥＧ１２−ＭＡＬおよびＮＨＳ−ｄＰＥＧ４−ＭＡＬはクォンタナ  バイオデザインから購入した。ヤギ抗−ビオチンは凍結乾燥でシグマから得、そしてウサギ抗−ＤＮＰはバーファー、ｐＨ＝７．２中、２ｍｇ／ｍＬでモレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）から得た。抗体濃度はε２８０＝１．４ｍｌｍｇ−１ｃｍ−１を使用して算出した。イムノピュア（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ）なストレプトアビジンはピアスから得た。ストレプトアビジン濃度はε２８０＝３．４ｍｌｍｇ−１ｃｍ−１を使用して決定した。量子ドット濃度は、６０５ｎｍで発光する量子ドット（ＱＤ６０５）についてはε６０１（±３）＝６５００００Ｍ−１ｃｍ−１を、そしてＱＤ６５５についてはε６４５（±３）＝７０００００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して決定した。脱イオン水はＭｉｌｌｉ−ＱＢｉｏｃｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍを通して１８．２ＭΩの抵抗に達した。バーファー交換はＰＤ−１０カラム（ＧＥバイオサイエンス）で行った。サイズ−排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、Ａｋｔａ  ピュアリファイヤー（ｐｕｒｉｆｉｅｒ）（ＧＥバイオサイエンス）で行い、これを既知の分子量のタンパク質標準に対してキャリブレーションした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＧＬ１０／３００（ＧＥバイオサイエンス）での流速は０．９ｍｌ／分であった。
【００９７】
抗体の鎖間ジスルフィドの還元
凍結乾燥で得、そして３．０ｍｇ／ｍｌに０．１Ｍ  リン酸Ｎａ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．５バッファーで再構成したポリクローナル抗ビオチンの溶液に、ＤＴＴを２５ｍＭの最終濃度で加えた。これは０．６７ｍｌ〜２．７ｍｌの規模で行った。この混合物を正確に２５分間回転した後、ＰＤ−１０で０．１Ｍ  リン酸Ｎａ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０バッファーで溶出した。同じ手順を抗−ＤＮＰについても繰り返したが、これはバーファー中、２ｍｇ／ｍＬとして得た。取り込まれた抗体の数は、およそ等しかった。
【００９８】
ストレプトアビジンのチオール化
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５０ｍＭ  トリエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ＝８．０バーファー中、０．２７５ｍｇ／ｍＬの２−イミノチオランからなるＴｒａｕｔの溶液を調製した。０．１Ｍ  リン酸Ｎａ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０バーファー中、０．５ｍＬのストレプトアビジン溶液（４．１ｍｇ／ｍＬ）に、０．２５ｍＬのＴｒａｕｔ溶液を加え、そして４５分間回転した。
【００９９】
ＱＤ−ｄＰＥＧｘ−ＭＡＬの合成
ホウ酸塩バーファー、ｐＨ＝８．０中の量子ドットの溶液（８〜９μＭ）に、６０倍過剰のＮＨＳ−ｄＰＥＧｘ−ＭＡＬ（ｘ＝４，１２）を加え、そして２時間回転した。量子ドットはＰＤ−１０クロマトグラフィーを介して０．１Ｍ  リン酸Ｎａ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．０バッファーで精製した。
【０１００】
ＱＤ−ＭＡＬ−抗体コンジュゲートの合成
精製したＱＤ−マレイミドは、精製したチオール化抗体と、２：１、５：１および１０：１の抗体／ＱＤのモル比で合わせ、そして１６時間回転した。ＳＥＣは１ＸＰＢＳバッファー、ｐＨ７．５中で行った。
【０１０１】
ＱＤ−ＭＡＬ−ストレプトアビジンコンジュゲートの合成
精製したＱＤ−マレイミドをチオール化ストレプトアビジンと、５：１のタンパク質／ＱＤのモル比で合わせ、そして１６時間回転した。ＳＥＣは１ＸＰＢＳバッファー、ｐＨ＝７．５で行った。
【０１０２】
ビオチン化マイクロタイタープレートを使用したＱＤ−ＭＡＬコンジュゲートの評価  
ビオチン化プレートは、ピアスバイオテクノロジーから購入した。染色は４０ｎＭで３連にて、または順次滴定を用いて行った。これらはＰＢＳｐＨ＝７．５のバッファー中で行った。
【０１０３】
組織染色の詳細
ＩＨＣ−染色は、カゼイン中の量子ドットコンジュゲートの４０ｎＭおよび２０ｎＭ溶液で行った。これはベンタナ  ベックマーク  インスツルメント（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｃｈｍａｒｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（ＶＭＳＩ、タスコン、アリゾナ州）で行った。組織サンプルを脱パラフィン化し、そしてエピトープ−特異的抗体を適用した。３２分間インキュベーションした後、汎用的な２次抗体（ビオチン化）を加えた。再度インキュベーションを３２分間行った。次いで抗−ビオチン量子ドットコンジュゲート（１００μＬ）を手で適用し、そしてまた３２分間、インキュベーションした。使用する時、ＤＡＰＩカウンター染色を適用し、続いて８分間インキュベーションした。スライドは界面活性剤での洗浄、エタノールおよびキシレンでの脱水で処理し、そして蛍光顕微鏡で見る前にカバースリップを乗せた。
【０１０４】
ＩＳＨ−染色は、カゼイン中４０ｎＭの量子ドット溶液で行った。ここでもこれはベンタナ  ベックマーク  インスツルメントで行った。パラフィンで覆った組織を７５℃に暖め、４分間インキュベーションし、そしてＥＺＰｒｅｐ（商標）容量調整（ＶＭＳＩ）で２回処理した。２回目の処理に続いて液体のカバースリップをかけ、７６℃で４分間インキュベーションし、そして組織を脱パラフィンするためにすすぐ工程を行った。細胞コンディショナー＃２（ＶＭＳＩ）を加え、そしてスライドを９０℃に８分間暖めた。細胞コンディショナー＃２を再度加え、そしてさらに９０℃で１２分間暖めた。スライドを反応バッファー（ＶＭＳＩ）ですすぎ、３７℃に冷却し、そしてＩＳＨ−Ｐｒｏｔｅａｓｅ３（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を加えた。４分後、ｉＶｉｅｗ（商標）＋ＨｙｂＲｅａｄｙ（商標）（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、そして４分間インキュベーションした。ＨＰＶ  ＨＲプローブ（２００μＬ、ＶＭＳＩ）を加え、そして３７℃で４分間インキュベーションし、続いて９５℃で１２分間、そして５２℃で１２４分間インキュベーションした。このスライドをすすぎ、そして再度７２℃に８分間、２回の別個の時間で暖めた。
【０１０５】
抗−ビオチン量子ドットコンジュゲート
３７℃で、１次抗体、ｉＶｉｅｗ＋ウサギ抗−ＤＮＰ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、そして２０分間インキュベーションした。増幅のために、ｉＶｉｅｗ＋Ａｍｐ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、そして８分間インキュベーションした。ヤギ抗−マウスビオチンである２次抗体、ｉＶｉｅｗ＋Ｂｉｏｔｉｎ−Ｉｇ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、そして１２分間インキュベーションした。最後に１００μＬの量子ドット／抗体コンジュゲートを適用し、２８分間インキュベーションし、そしてすすいだ。スライドを反応バッファーですすぎ、エタノールおよびキシレンで脱水し、続いてカバースリップを乗せた。
【０１０６】
抗−ＤＮＰ量子ドット
３７℃で、ＱＤ／抗−ＤＮＰコンジュゲートを適用し（１００μＬ）、２８分間インキュベーションし、そしてすすいだ。再度スライドをすすぎ、そしてカバースリップを乗せた。
【０１０７】
蛍光顕微鏡
画像は、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）蛍光スコープで行った。非混合蛍光スペクトルは、ＣＲｉカメラを使用して達成した。ＤＡＰＩは、マルチプレッキシングのカウンター染色に使用した。
【０１０８】
ＱＤ−ＳＡコンジュゲートに対する比較
図１は、ＣＤ２０での染色における抗−ビオチン／ＱＤ６０５コンジュゲート  対  対照として市販されているストレプトアビジン／ＱＤ６０５コンジュゲートを比較する。図１Ａ〜１Ｄはそれぞれ、市販されているストレプトアビジン／ＱＤ６０５、２：１ＡＢ／ＱＤ６０５、５：１ＡＢ／ＱＤ６０５、１０：１  ＡＢ／ＱＤ６０５の４０ｍＭ溶液を用いた染色を表す。同様に、図１Ｅ〜１Ｈは、市販されているストレプトアビジン／ＱＤ６０５、２：１ＡＢ／ＱＤ６０５、５：１ＡＢ／ＱＤ６０５、１０：１  ＡＢ／ＱＤ６０５の２０ｎＭ溶液を用いた染色を表す。
【０１０９】
図２は、開示するコンジュゲートのマルチプレックス使用を示す。具体的にはＱＤ６０５コンジュゲート、ＱＤ６５５コンジュゲートおよびＤＡＰＩカウンター染色（青）でのマルチプレキシング。図２Ａは、ニューロフィラメントのＱＤ６０５（緑）コンジュゲートでの染色、およびＧＦＡＰのＱＤ６５５（赤）コンジュゲートでの染色を表す。図２ＢはカドヘリンのＱＤ６５５（赤）コンジュゲートでの染色、およびＣＤ２０のＱＤ６０５（緑）コンジュゲートでの染色を表す。
【０１１０】
図３は、開示されたコンジュゲートの安定性を示し、これにより開示されたコンジュゲートで染色されたサンプルの保管性も示す。ＱＤ６０５コンジュゲートおよびＱＤ６５５コンジュゲートの４５℃での安定性は、扁桃組織切片でＣＤ２０を染色することにより調査した。
【０１１１】
図４は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に関して、ＨＰＶプローブおよび１：５ＱＤ／Ａｂコンジュゲートを使用したＩＳＨアッセイについて、開示するコンジュゲートの使用を示す。図４Ａ〜４Ｃはそれぞれ、ＱＤ６５５／抗ビオチン−Ａｂコンジュゲート、ＱＤ６０５／抗ビオチン−Ａｂコンジュゲート、およびＱＤ６０５／抗ＤＮＰコンジュゲートでの染色を表す。
【０１１２】
図５は、開示に従いストレプトアビジン−ＱＤコンジュゲートのＩＨＣアッセイでの使用を示す。特に図５Ａ〜５Ｄは、胎盤組織中のＣＤ３４を、それぞれ５、１０、２０および４０ｎＭ濃度のストレプトアビジン／ＱＤ６０５コンジュゲートを使用した染色を示す。
【０１１３】
本発明の原理を幾つかの態様を参考にして記載するが、当業者には態様の詳細がそのような原理から逸脱することなく修飾できることが明らかなはずである。特許請求の範囲および精神に入るので、本発明はすべてのその修飾、変更および等価物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ＣＤ２０での染色について、対照として市販されているストレプトアビジン／ＱＤ６０５コンジュゲートに対して、開示する抗−ビオチン／ＱＤ６０５コンジュゲートを使用した蛍光染色を比較する一連の画像である。
【図２】ＩＨＣアッセイにおいて、開示するコンジュゲートを使用したマルチプレックス検出を示す一対の画像である。
【図３】開示するコンジュゲートの高温での高い経時的安定性を表す一連の画像である。
【図４】開示するコンジュゲートを用いたＩＳＨアッセイの結果を表す一連の画像である。
【図５】開示するコンジュゲートを用いたＩＨＣアッセイの結果を表す一連の画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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