(57)【要約】  ある種の態様では、本発明は、試験細胞におけるＥｐｈＢ４遺伝子を検出するための組成物及び方法を提供する。ある種の態様では、本発明は、腫瘍を有する又は腫瘍を有することが疑われる被検体において腫瘍（癌）状態及び予後を評価するための方法及び組成物を提供する。
2008514925.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥｐｈＢ４の発現又は機能の阻害剤による治療に好適な腫瘍の同定方法であって、腫瘍において次の特性：
（ａ）ＥｐｈＢ４蛋白質の異常に高い発現、
（ｂ）ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡの異常に高い発現、及び
（ｃ）ＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅
のうち一つ以上を有する細胞を検出することを含み、
ここで、前記特性（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の一つ以上を有する細胞がＥｐｈＢ４の発現又は機能の阻害剤による治療に好適である、
腫瘍の同定方法。
【請求項２】
前記腫瘍が頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試験細胞におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅の評価方法であって、試験細胞内におけるＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を検出することを含み、ここで、該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数がコントロール細胞の当該コピー数に対して増加することが該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を示す方法。
【請求項４】
ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数をハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法で検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法がサザンブロット法、in situ ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）よりなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を増幅をベースとするアッセイ法で検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅をベースとするアッセイ法が定量ＰＣＲである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を、マイクロアレイベースのプラットホームを使用して検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記試験細胞がほ乳類細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記試験細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験細胞が腫瘍細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞よりなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験細胞が腫瘍を有することが疑われる被検体から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験細胞が腫瘍を有することが分かっている被検体から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験細胞が腫瘍組織から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験細胞が原発腫瘍から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験細胞が、原発腫瘍由来の転移性細胞が潜伏していることが疑われる組織から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験細胞がリンパ節又は骨髄から得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験細胞が血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液中に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記コントロール細胞が細胞当たり２コピーのＥｐｈＢ４遺伝子コピー数を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験細胞が試験細胞のプール中に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
被検体の癌状態の評価方法であって、
（ａ）腫瘍を有することが疑われる又は腫瘍を有することが分かっている被検体から試験細胞を得、
（ｂ）該試験細胞におけるＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を検出すること
を含み、
ここで、コントロール細胞に対する該試験細胞における該ＥｐｈＢ４遺伝子コピー数の増加が、該試験細胞が腫瘍細胞であることを示す、前記方法。
【請求項２３】
前記ＥｐｈＢ４遺伝子コピー数をハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法によって検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＥｐｈＢ４遺伝子コピー数を増幅をベースとするアッセイ法によって検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥｐｈＢ４遺伝子コピー数をマイクロアレイベースのプラットホームを使用することによって検出する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験細胞がほ乳類細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験細胞がヒト細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試験細胞が腫瘍細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞が頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞よりなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験細胞が原発腫瘍から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記試験細胞が、原発腫瘍由来の転移性細胞が潜伏していることが疑われる組織から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記試験細胞がリンパ節又は骨髄から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記試験細胞が血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液中に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験細胞が試験細胞のプール中に存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
被検体の予後の評価方法であって、
（ａ）腫瘍を有することが疑われる又は腫瘍を有することが分かっている被検体から試験細胞を得、
（ｂ）該試験細胞におけるＥｐｈＢ４活性上昇の指標を検出すること
を含み、
ここで、コントロール細胞に対する該試験細胞におけるＥｐｈＢ４活性の指標の増加が、該被検体が転移癌を有し又は転移癌を発症する危険性が高いことを示す、前記方法。
【請求項３６】
前記ＥｐｈＢ４活性の指標がＥｐｈＢ４ｍＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＥｐｈＢ４活性の指標がＥｐｈＢ４蛋白質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥｐｈＢ４活性の指標がＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡを、ＥｐｈＢ４ヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションベースのアッセイ法によって検出する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡを、ＥｐｈＢ４ヌクレオチドプライマーを使用した増幅ベースのアッセイ法によって検出する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレオチドプローブ又はヌクレオチドプライマーが標識されている、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＥｐｈＢ４蛋白質を、ＥｐｈＢ４抗体を使用した免疫アッセイ法によって検出する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＥｐｈＢ４抗体がＥｐｈＢ４抗体番号１、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１及び１３８よりなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が標識されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＥｐｈＢ４活性の指標を、マイクロアレイベースのプラットホームを使用して検出する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記試験細胞におけるＥｐｈＢ４活性の指標の増加が、コントロール細胞の前記指標に対して少なくとも３倍である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記試験細胞がほ乳類細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記試験細胞がヒト細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試験細胞が腫瘍細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍細胞が頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞よりなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記試験細胞が原発腫瘍組織から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記試験細胞が、原発腫瘍由来の転移性細胞が潜伏していることが疑われる組織から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
前記試験細胞がリンパ節又は骨髄から得られる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記試験細胞が血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液中に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記試験細胞が試験細胞のプール中に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
試験細胞におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を検出するためのキットであって、
（ａ）高ストリンジェントな条件下で該ＥｐｈＢ４遺伝子にハイブリダイズすることができる１種以上の核酸と、
（ｂ）規定の位置に１コピーのＥｐｈＢ４を有するヒトゲノムＤＮＡを有するコントロール核酸と
を備えるキット。
【請求項５７】
前記１種以上の核酸がハイブリダイゼーションベースのアッセイ法においてプローブとして使用される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記１種以上の核酸が増幅ベースのアッセイ法においてプライマーとして使用される、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
試験細胞におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を検出するためのキットであって、
（ａ）高ストリンジェントな条件下で該ＥｐｈＢ４遺伝子にハイブリダイズすることができる１種以上の核酸と、
（ｂ）平均約２コピーのＥｐｈＢ４遺伝子を有する少なくとも１種のコントロール細胞株と
を備えるキット。
【請求項６０】
平均約４コピーのＥｐｈＢ４遺伝子を有する少なくとも１種のコントロール細胞株をさらに備える、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
癌に罹患した患者の治療方法であって、
（ａ）該患者において、ＥｐｈＢ４遺伝子が遺伝子増幅した複数の腫瘍細胞を有する腫瘍を同定し、
（ｂ）該患者に、次の群：
（ｉ）生理学的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズし且つ細胞内でのＥｐｈＢ４発現を減少させる核酸化合物、及び
（ii）ＥｐｈＢ４の細胞機能を阻害するポリペプチド
よりなる群から選択されるＥｐｈＢ４選択的治療用化合物を投与すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００４年９月２３日に出願された米国仮出願第６０／６１２８６１号に基づく優先権を主張する。当該出願の全教示は、そのまま参照によって援用するものとする。
本発明は、腫瘍を検出し且つ治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、米国人の成人において重大な死亡原因である。しかしながら、多くの場合には、早期の癌は外科切除（切除術）によって治療できる。外科治療と化学療法剤とを組み合わせてある種の癌においてさらに高い生存率を達成することができる。ほとんどの癌において、生存率は、転移（末期）結腸癌患者では急激に低下する。
【０００３】
罹患した患者の効果的なスクリーニング及び早期発見と適切な治療的介入とを組み合わせることで、例えば、結腸癌における死亡者数が減少することが分かっている。さらに、治療及び癌の進行を監視するための診断テストが、治療計画を作成し、そしてこのような計画を患者の状態に適合させる際に非常に有用である。
【０００４】
最新の分子生物学によって、所定の生理学的状態と特に関連のある蛋白質及び核酸を同定することが可能になった。これらの分子マーカーは、妊娠からＨＩＶのようなウイルス感染までを範囲とする様々な健康状態の診断法に大変革をもたらした。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
腫瘍の発見及び腫瘍の治療のための薬剤及び方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概略
ある種の態様では、本発明は、ＥｐｈＢ４活性が高まるという指標が、癌状態、特に転移癌と関連があるという発見に関する。このような指標としては、ＥｐｈＢ４のｍＲＮＡ及び蛋白質レベルが挙げられる。驚くべきことに、ＥｐｈＢ４遺伝子は、多くの癌、特に転移癌で増幅される。ＥｐｈＢ４の増幅は、ＥｐｈＢ４蛋白質レベルとの相関を示す。従って、ＥｐｈＢ４遺伝子増幅（例えば、コピー数）を使用して癌状態を検出し且つ評価することもできる。
【０００７】
ある種の態様では、本発明は、ＥｐｈＢ４の発現又は機能の阻害剤による治療に適した腫瘍の同定方法を提供する。このような方法は、腫瘍内で、次の特徴の一つ以上：（ａ）ＥｐｈＢ４蛋白質の異常に高い発現；（ｂ）ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡの異常に高い発現；及び（ｃ）ＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を有する細胞を検出することを含むことができる。。（ａ）〜（ｃ）の特徴の一つ以上を有する細胞を含む腫瘍は、ＥｐｈＢ４の発現又は機能の阻害剤による治療に感受性がある可能性が高い。ＥｐｈＢ４を直接発現しない腫瘍もこれらの蛋白質をターゲットにした治療に感受性を有し得ることに留意すべきである。というのは、これらの蛋白質は、血管内皮で発現し且つ腫瘍の成長を助ける新たな毛細管の形成に関与することが知られているからである。ＥｐｈＢ４の発現又は機能の阻害剤は、例えば、（ｉ）ＥｐｈＢ４選択的化合物（例えば、生理学的条件下でＥｐｈＢ４転写物にハイブリダイズし且つ細胞内でのＥｐｈＢ４の発現を低減させる核酸化合物、又はＥｐｈＢ４の細胞機能を阻害するポリペプチド）であることができる。
【０００８】
ある種の態様では、本発明は、試験細胞内におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅の評価方法を提供する。このような方法は、試験細胞内におけるＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を検出することを含むことができ、ここで、該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数がコントロール細胞の当該コピー数に対して増加することが該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を示す。このＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法（例えば、サザンブロット法、in situ ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））又は増幅をベースとするアッセイ法（例えば、定量ＰＣＲ）によって検出できる。随意に、このＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、マイクロアレイをベースとするプラットホームを使用して検出される。好ましくは、これらの方法における試験細胞は、ヒト細胞のようなほ乳類細胞である。所定の場合には、該試験細胞は、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞（これらに限定されない）を含む腫瘍細胞である。試験細胞は、腫瘍を有する疑いのある被検体又は腫瘍を有することが分かっている被検体から得ることができる。後者の場合には、試験細胞は、腫瘍組織、原発腫瘍又は該原発腫瘍に由来する転移細胞が潜伏している疑いのある組織から得ることができる。具体例として、試験細胞は、リンパ節又は骨髄から得られる。別の具体例として、試験細胞は、血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液（中に存在する）から得られる。特定の具体例では、試験細胞は、試験細胞のプール中に存在する。従って、該方法は、複数の試験細胞内でのＥｐｈＢ４の遺伝子増幅を同定し又はスクリーニングするために使用できる。
【０００９】
ある種の態様では、本発明は、被検体における細胞の癌状態の評価方法を提供する。当該方法は、（ａ）腫瘍を有することが疑われる又は分かっている被検体から試験細胞を得；（ｂ）該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を検出することを含み、ここで、該試験細胞内でのＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数がコントロール細胞の当該コピー数に対して増加することが、該試験細胞が腫瘍細胞であることを示す。このＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法（例えば、サザンブロット法、in situ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ））又は増幅をベースとするアッセイ法（例えば、定量ＰＣＲ）によって検出できる。随意に、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、マイクロアレイをベースとするプラットホームを使用して検出される。好ましくは、これらの方法における試験細胞は、ヒト細胞のようなほ乳類細胞である。所定の場合には、該試験細胞は、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞（これらに限定されない）を含む腫瘍細胞である。例示すると、試験細胞は、腫瘍組織、原発腫瘍又は該原発腫瘍に由来する転移細胞が潜伏している疑いのある組織から得ることができる。具体例として、試験細胞は、リンパ節又は骨髄から得られる。別の具体例として、試験細胞は、血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液から得られ又はその中に存在する。特定の具体例では、試験細胞は、試験細胞のプール中に存在する。従って、該方法は、１以上の被検体における複数の細胞の癌状態を評価するために使用できる。
【００１０】
ある種の態様では、本発明は、被検体の予後の評価方法であって、（ａ）腫瘍を有することが疑われる又は分かっている被検体から試験細胞を得；（ｂ）該試験細胞におけるＥｐｈＢ４活性の上昇という指標を検出することを含み、ここで、該試験細胞におけるＥｐｈＢ４活性の指標がコントロール細胞の当該指標に対して増加することが、該被検体が転移癌を有する又は発症する危険性が高いことを示す被検体の予後の評価方法を提供する。ここで使用するときに、ＥｐｈＢ４活性の指標には、ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡ、ＥｐｈＢ４蛋白質及びＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数が含まれる。特定の具体例では、このＥｐｈＢ４ｍＲＮＡは、ＥｐｈＢ４ヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法又はＥｐｈＢ４ヌクレオチドプライマーを使用した増幅をベースとするアッセイ法によって検出できる。随意に、この方法で使用されるヌクレオチドプローブ又はプライマーは標識されている。別の特定の具体例では、ＥｐｈＢ４蛋白質は、ＥｐｈＢ４抗体番号１、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１又は１３８（これらに限定されない）を含むＥｐｈＢ４抗体を使用した免疫アッセイ法によって検出できる。随意に、この方法で使用される抗体は標識される。さらに別の特定の具体例では、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法又は増幅をベースとするアッセイ法によって検出できる。所定の場合には、ＥｐｈＢ４の指標は、マイクロアレイをベースとするプラットホームを使用して検出される。ある具体例では、試験細胞におけるＥｐｈＢ４の指標の増加は、コントロール細胞の指標に対して少なくとも３倍である。好ましくは、これらの方法における試験細胞は、ヒト細胞のようなほ乳類細胞である。所定の場合には、該試験細胞は、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸直腸細胞、肺腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞及び脳腫瘍細胞（これらに限定されない）を含む腫瘍細胞である。例示すると、試験細胞は、腫瘍組織（例えば、原発腫瘍）又該原発腫瘍に由来する転移細胞が潜伏している疑いのある組織から得ることができる。具体例として、試験細胞は、リンパ節又は骨髄から得られる。別の具体例として、試験細胞は、血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、胸膜液、大便、尿及び結腸流出液よりなる群から選択される体液から得られ又はその中に存在する。特定の具体例では、試験細胞は、試験細胞のプール中に存在する。従って、該方法は、２以上の被検体の予後を評価するために使用できる。
【００１１】
ある種の態様では、本発明は、癌に冒された患者の治療方法であって、（ａ）該患者において、ＥｐｈＢ４遺伝子が遺伝子増幅した複数の癌細胞を有する腫瘍を同定し；（ｂ）該患者にＥｐｈＢ４選択的治療化合物（例えば、ＥｐｈＢ４転写産物に生理的条件下でハイブリダイズし、且つ、細胞内でのＥｐｈＢ４の発現を減少させる核酸化合物又はＥｐｈＢ４の細胞機能を阻害するポリペプチド）を投与することを含む治療方法を提供する。このような方法は、診断の一部として、該患者において、ＥｐｈＢ４が遺伝子増幅した複数の癌細胞を有する腫瘍を同定することを包含し得る。遺伝子増幅は、ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法（例えば、in situ ハイブリダイゼーション）及び増幅をベースとするアッセイ法（例えば、定量ＰＣＲ）を含め、様々な方法で検出できる。
【００１２】
ある種の態様では、本発明は、試験細胞内におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を検出するためのキットを提供する。このようなキットは、（ａ）高度にストリンジェントな条件下でＥｐｈＢ４遺伝子にハイブリダイズできる１種以上の核酸と、（ｂ）正常な位置で１コピーのＥｐｈＢ４を有するヒトゲノムＤＮＡを含むコントロール核酸とを備えることができる。例えば、このキットの核酸は、ハイブリダイゼーションをベースとするアッセイ法においてプローブとして使用でき、又は増幅をベースとするアッセイ法においてプライマーとして使用できる。
【００１３】
ある種の態様では、本発明は、試験細胞内におけるＥｐｈＢ４遺伝子の遺伝子増幅を検出するためのキットを提供する。このようなキットは、（ａ）高度にストリンジェントな条件下でＥｐｈＢ４遺伝子にハイブリダイズできる１種以上の核酸と、（ｂ）平均約２コピーのＥｐｈＢ４遺伝子を有する少なくとも１種のコントロール細胞株とを備えることができる。随意に、該キットは、平均約４コピーのＥｐｈＢ４遺伝子を有する少なくとも１種のコントロール細胞株をさらに備えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、Ｂ４ＥＣｖ３蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）。
【００１５】
図２は、Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）。
【００１６】
図３は、Ｂ２ＥＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）。
【００１７】
図４は、Ｂ４ＥＣｖ３−ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）。
【００１８】
図５は、Ｂ２ＥＣ−ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）。
【００１９】
図６は、可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣ組換え蛋白質のドメイン構造を示す。これらのドメインの名称は次の通りである：Ｌ＝リーダーペプチド、Ｇ＝球状（リガンド結合ドメイン）、Ｃ＝Ｃｙｓリッチドメイン、Ｆｌ、Ｆ２＝フィブロネクチンIII型反復配列、Ｈ＝６×Ｈｉｓタグ。
【００２０】
図７は、ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４発現と遺伝子増幅を示す。（Ａ）上部：該方法に記載したようにＥｐｈＢ４モノクローナル抗体で染色し且つ腫瘍細胞に限局されたＤＡＢ（茶色）で視覚化された代表的なアーカイブ切片の免疫組織化学。下部：隣接切片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。濃い紫の染色は、腫瘍細胞の存在を示す。右手のカラムは、ＥｐｈＢ４ポリクローナル抗体（右上）で染色され且つＤＡＢで視覚化されたリンパ節転移の凍結切片である。コントロール（中央）は、ヤギ血清とのインキュベーションであり、そしてＨ＆Ｅ（下）から、染色されない間質で取り囲まれた転移中心の位置が明らかになる。（Ｂ）ランオフ転写によって生じたＥｐｈＢ４（左カラム）及びエフリンＢ２（右カラム）のＤＩＧ標識アンチセンス又はセンスプローブをプローブとしたＨＮＳＣＣ症例の連続凍結切片の in situ ハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーションシグナル（濃い青）を、アルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体を使用して検出し、そして切片をヌクレアーファーストレッドで対比染色した。Ｈ＆Ｅで染色した連続切片染色（左下）は、腫瘍構造を明らかにするために示している。（Ｃ）腫瘍（Ｔ）、腫瘍の浸潤のない正常な組織（Ｎ）及びリンパ節生検（ＬＮ）からなる患者試料の蛋白質抽出物のウェスタンブロット。試料を４〜２０％トリス−グリシンゲルでのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、その後ナイロン膜上に電気ブロットした。続いて、膜をＥｐｈＢ４モノクローナル抗体及びβ−アクチンモノクローナル抗体で精査した。化学ルミネッセンスシグナルをオートラジオグラフィーフィルム上で検出した。示されているのは、１２０ｋＤで移動するＥｐｈＢ４に特異的なバンド及び４０ｋＤで移動するβ−アクチンである。このβ−アクチンシグナルをそれぞれの試料のローディングと転写のためのコントロールに使用した。（Ｄ）ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数の増加によって示されるようなＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４遺伝子増幅の調査。
【００２１】
図８は、ＨＮＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４発現及び遺伝子増幅を示す。（Ａ）ＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４発現の調査。図７Ｃに記載したような、ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体を連続的にプローブとし、はぎ取り、そしてβ−アクチンモノクローナル抗体を再度プローブとした全細胞溶解物のウェスタンブロット。（Ｂ）ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数の増加によって示されるような、ＳＣＣ細胞株のいくつかにおけるＥｐｈＢ４遺伝子増幅の調査。
【００２２】
図９は、前立腺細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現。（Ａ）ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体をプローブとした様々な前立腺癌細胞株、正常の前立腺由来細胞株（ＭＬＣ）及び急性骨髄芽球リンパ腫細胞（ＡＭＬ）の全細胞溶解物のウェスタンブロット。（Ｂ）ウェスタンブロットによって決定されるＰＣ−３細胞におけるＥｐｈＢ４の燐酸化。
【００２３】
図１０は、前立腺癌組織でのＥｐｈＢ４の発現を示す。ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体（左上）又はアイソタイプ特異的コントロール（左下）で染色された代表的な前立腺癌凍結切片。ＥｐｈＢ４モノクローナル抗体で染色された隣接ＢＰＨ組織（右上）。陽性のシグナルは、腫瘍細胞内では褐色である。基質及び正常の上皮は陰性である。ＥｐｈＢ４の膜貫通の局在と一致する、腫瘍組織内における染色の膜局在に留意されたい。癌試料及び隣接するＢＰＨ組織（右下）から抽出されたＲＮＡの代表的なＱＲＴ−ＰＣＲ。
【００２４】
図１１は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）及びウェスタンブロット（Ｂ）によって示されるようにＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２が中皮腫細胞内で発現していることを示す。
【００２５】
図１２は、エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を中皮腫細胞内でのin situ ハイブリダイゼーションによって示している。アンチセンスプローブと共にエフリンＢ２又はＥｐｈＢ４（上列）にハイブリダイズさせた、チャンバースライド中で培養したＮＣＩ  Ｈ２８中皮腫細胞。それぞれのハイブリダイゼーションについてのコントロールはセンスプローブであった（下列）。陽性反応は、紺青色の細胞質染色である。
【００２６】
図１３は、中皮腫培養液中でのＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の細胞発現を示す。悪性中皮腫患者の胸水由来の一次細胞単離体並びに細胞株ＮＣＩ  Ｈ２８、ＮＣＩ  Ｈ２３７３及びＮＣＩ  Ｈ２０５２をエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４に対して免疫蛍光染色したもの。緑色はＦＩＴＣ標識二次抗体に対する陽性シグナルである。免疫蛍光染色の特異性を一次抗体なしでのシグナルの欠落によって実証した（最前列）。細胞核をＤＡＰＩ（青色）で対比染色して全ての細胞の位置を明らかにした。示されているのは、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ蛍光の組み合わせの画像である。原倍率は２００倍である。
【００２７】
図１４は、中皮腫におけるエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を示している。悪性中皮腫生検の免疫組織化学。腫瘍構造を明らかにするためのＨ＆Ｅ染色切片；左下のパネルは、一次抗体なしのバックグラウンドコントロールである。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２に特異的な染色は茶色である。原倍率は２００倍である。
【００２８】
図１５は、エフリンＢ２（ＥｐｈＢ４ではない）がＫＳ生検組織内で発現することを示している。（Ａ）エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４についてのアンチセンスプローブによる in situ ハイブリダイゼーションと、腫瘍構造を明らかにするためのＨ＆Ｅ染色切片。ＩＳＨにおける紺青色は、エフリンＢ２に対する陽性反応を示している。ＥｐｈＢ４についてのシグナルは、カポジ肉腫生検では全く検出されなかった。対照的に、ＥｐｈＢ４についてのＩＳＨシグナルは、扁平上皮癌腫瘍細胞で強い。また、ＫＳでも、エフリンＢ２がＥｐｈＢ４−ＡＰ融合蛋白質（左下）を使用して検出された。（Ｂ）ＥｐｈＢ４／Ｆｃ融合蛋白質によるエフリンＢ２の検出。隣接する切片をＨ＆Ｅで染色して（左）腫瘍構造を示した。長方形で囲った部分は、方法の部分で説明したようにＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出されたＥｐｈＢ４／Ｆｃ処理切片（中央）に示される領域を示す。コントロールとして、隣接する切片をヒトＦｃ断片（右）で処理した。ＥｐｈＢ４／Ｆｃの該切片への結合によって生じる特異的シグナルは、腫瘍細胞の領域にしか見られない。（Ｃ）エフリンＢ２とＨＨＶ８潜伏蛋白質ＬＡＮＡ１の同時発現。凍結ＫＳ生検材料のエフリンＢ２（赤）、ＬＡＮＡ１（緑）又はＥｐｈＢ４（赤）に対する抗体による二重標識共焦点免疫蛍光顕微鏡分析から、ＫＳ生検におけるＬＡＮＡ１とエフリンＢ２の同時発現を直接実証する。同時発現は、黄色として観察される。沃化プロピジウム核染色（赤）した細胞におけるＰＥＣＡＭ−１に対する抗体（緑）による生検の二重標識共焦点画像から、腫瘍の脈管性が実証される。
【００２９】
図１６は、ＨＨＶ−８がカポジ肉腫細胞内で動脈マーカーの発現を誘導することを示す。（Ａ）様々な細胞溶解物についてのエフリンＢ２に対するウェスタンブロット。ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲはＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲを発現するＳＬＫの安定クローンであり、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬは空の発現ベクターをトランスフェクトした対照の安定クローンである。ＬＡＮＡ又はＬＡＮＡΔ４４０をトランスフェクトしたＳＬＫ細胞は、それぞれ、ＳＬＫ−ＬＡＮＡ及びＳＬＫ−Δ４４０である。蛋白質負荷量及び転移量を、β−アクチンモノクローナル抗体によって再度膜を検査することによって決定した。（Ｂ）発現ベクターｐｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬによるＫＳ−ＳＬＫ細胞のトランジエントトランスフェクションによって、ＦＩＴＣによる免疫蛍光染色（緑）で示されるように、エフリンＢ２の発現が生じたが、コントロールベクターpＣＥＦＬはいかなる影響も及ぼさなかった。ＫＳ−ＳＬＫ細胞（０．８×１０5／ウェル）に０．８μｇのＤＮＡをリポフェクタミン２０００を使用してトランスフェクトした。２４時間後の細胞を固定し、そしてエフリンＢ２ポリクローナル抗体及びＦＩＴＣ結合二次抗体で染色した。（Ｃ）ｖＧＰＣＲによるＨＵＶＥＣのトランジエントトランスフェクションは、エフリンＢ２ルシフェラーゼ構築物からの転写を誘導する。２４ウェルプレート中８×１０3個のＨＵＶＥＣに、スーパーフェクトを使用して、翻訳開始部位に対して−２９４１〜−１１までの配列又は図のように２個の５'−欠失を含む０．８μｇ／ウェルのエフリンＢ２プロモーター構築物を８０ｎｇ／ウェルのpＣＥＦＬ又はｐｖＧＰＣＲ−ＣＥＦＬと共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼをトランスフェクション後４８時間で決定した。その誘導比をグラフの右に示している。ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃは、プロモーターを欠くルシフェラーゼコントロールベクターである。ルシフェラーゼは、ＧＰＣＲが同時トランスフェクトしたβ−ガラクトシダーゼの発現を誘導したため、蛋白質に基準化された。グラフは、６回の反復試験の平均＋ＳＥＭである。示されているのは、３つの類似の実験のうちの１つである。
【００３０】
図１７は、膀胱癌細胞株内でのＥｐｈＢ４の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル伝達経路によるＥｐｈＢ４発現の調節（Ｂ）を示す。
【００３１】
図１８は、ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す。
【００３２】
図１９は、ヒトＥｐｈＢ４のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【００３３】
図２０は、ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す。
【００３４】
図２１は、ヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す。
【００３５】
図２２は、ヒトＥｐｈＢ４のアミノ酸配列を示す。
【００３６】
図２３は、ヒトエフリンＢ２のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
図２４は、ＥｐｈＢ４抗体の例及びこれらの抗体のエピトープマッピングを示す。球状ドメイン（Ｇ）、システインリッチドメイン（Ｃ）及び２個のフィブロネクチン３型ドメイン（Ｆｌ及びＦ２）を含め、ＥｐｈＢ４細胞外ドメインのトポロジーを示している。
【００３８】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、一部、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４リガンド／受容体経路を介したシグナル伝達が腫瘍形成に寄与するという発見に基づく。本出願人は、腫瘍細胞内でのエフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の発現又は発現の増加を発見し、そしてエフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の発現又は活性のいずれかをブロックするための抗腫瘍治療剤を開発した。さらに、本出願人は、ＥｐｈＢ４遺伝子がいくつかの腫瘍、例えば、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌及び脳癌内で増幅されることを見いだした。従って、ある種の態様では、本発明は、試験細胞試料におけるＥｐｈＢ４の遺伝子増幅を評価することを含む検出方法及び診断方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、腫瘍におけるエフリンＢ２の遺伝子増幅を意図し、しかして試験細胞試料におけるエフリンＢ２の遺伝子増幅を評価することを含む検出方法及び診断方法を提供する。読みやすさのために、以下の開示は、主としてＥｐｈＢ４に関する方法及び組成物に言及する。しかしながら、当業者であれば、同様の方法及び組成物がエフリンＢ２を使用して導き出せることを容易に認識するであろう。
【００４０】
本明細書、特に実施例において説明する研究は、エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４に言及するものである。しかしながら、本発明は、腫瘍内で発現するエフリンリガンド及び／又はＥｐｈ受容体であってそれらの各ファミリーの中にあるもののいずれをも意図する。エフリン（リガンド）は、２種の構造型のものであり、これらは配列の関係に基づき、及び機能として、それらのものが示す２種の対応する受容体サブグループに対する選択的結合に基づき、さらに細分化できる。構造的には、２タイプのエフリンが存在する：グリセロホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって膜に固定されるもの及び膜貫通ドメインを介して固定されるもの。慣例的に、該リガンドは、ＥｐｈＡ受容体に優先的に結合するＧＰＩ結合蛋白質であるエフリン−Ａサブクラスと、一般にＥｐｈＢ受容体に優先的に結合する膜貫通蛋白質であるエフリン−Ｂサブクラスとに分類されている。
【００４１】
該Ｅｐｈファミリー受容体は、Ｅｐｈに関連する受容体蛋白質−チロシンキナーゼファミリーであり、エリトロポエチン産生ヒト肝細胞癌細胞株におけるその発現にちなんで名付けられた受容体である。これらは、それらの細胞外ドメイン配列の関係及びエフリン−Ａ蛋白質又はエフリン−Ｂ蛋白質に対する優先的結合能に基づき、２つのサブグループに分類される。エフリン−Ａ蛋白質と優先的に相互作用する受容体がＥｐｈＡ受容体であり、エフリン−Ｂ蛋白質と優先的に相互作用する受容体がＥｐｈＢ受容体である。
【００４２】
ＥｐｈＢ４は、膜結合リガンドであるエフリンＢ２に特異的である（Sakano, S.外,1996；Brambilla R.外,1995）。エフリンＢ２は、膜貫通ドメインと、５個の保存チロシン残基を有する細胞質領域と、ＰＤＺドメインとを有するＥｐｈリガンドのクラスに属する。Ｅｐｈ受容体は、クラスターを形成した膜結合エフリンの結合によって活性化される（Davis S外, 1994）が、これは、該受容体を発現する細胞と該リガンドを発現する細胞との接触がＥｐｈの活性化に必要であることを示す。リガンドが結合すると、Ｅｐｈ受容体は二量体化し、且つ、近傍の膜チロシン残基を自己燐酸化させて完全な活性化を獲得する（Kalo MS外, 1999, Binns KS, 2000）。該Ｅｐｈ受容体を介した順方向のシグナル伝達に加えて、逆方向のシグナル伝達がエフリンＢを介して生じ得る。エフリンのＥｐｈ結合によって、細胞内保存チロシンの迅速な燐酸化が生じ（Bruckner K, 1997）、そしてＰＤＺ結合蛋白質のやや緩やかな動員が生じる（Palmer A 2002）。近年、いくつかの研究から、Ｅｐｈ／エフリンの高発現が腫瘍成長、腫瘍形成及び転移についての高い可能性に関連している可能性があることが示された（Easty DJ, 1999；Kiyokawa E, 1994；Tang XX, 1999；Vogt T, 1998；Liu W, 2002；Stephenson SA, 2001；Steube KG 1999；Berclaz G, 1996）。
【００４３】
本発明の一態様は、腫瘍又は腫瘍予後の状態を評価するための検出方法を提供し、この場合に、腫瘍はエフリンＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現する。このような方法は、試験細胞試料におけるエフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の遺伝子増幅を評価することを含む。
【００４４】
本発明の別の態様は、エフリンＢ２及び／又はＥｐｈＢ４を発現する腫瘍の成長速度を低下させるための治療方法を提供する。このような方法は、エフリンＢ２、ＥｐｈＢ４又はその両方の発現又は活性を阻害する治療剤の所定量を投与することを含む。
【００４５】
II. 検出試薬及び検出方法
ある具体例では、本発明は、少なくとも部分的に、ＥｐｈＢ４遺伝子がいくつかの腫瘍、例えば、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌及び脳癌内で増幅されるという本出願人の発見に基づく。さらに、ＥｐｈＢ４の発現は、これらの腫瘍内でＥｐｈＢ４遺伝子の増幅と共にそれに対応して上昇することが分かった。従って、ＥｐｈＢ４遺伝子の増幅は、新形成又はその可能性の診断に役立ち得る。或いは、ヒトＥｐｈＢ４をコードする物質（例えば、ｍＲＮＡ及び蛋白質）の発現の上昇を検出することも新形成又は悪性形質転換の可能性の診断に役立つ。さらに、ＥｐｈＢ４発現の上昇に至る他の遺伝子変化、例えば、ＥｐｈＢ４遺伝子の調節領域における突然変異が腫瘍形成にも関与し得ることがさらに考えられる。
【００４６】
ある種の態様では、本発明は、被検体（個人又は患者）における腫瘍の状態、腫瘍予後及び生存可能性を評価する（判断する又は測定する）ための方法であって、ＥｐｈＢ４活性の指標を検出することを含むものを提供する。ここで使用するときに、ＥｐｈＢ４活性の指標としては、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数、ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡ及びＥｐｈＢ４蛋白質が挙げられる。また、ここでは、ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡ及びＥｐｈＢ４蛋白質は、ＥｐｈＢ４の遺伝子発現産物ともいう。
【００４７】
ある種の特定の具体例では、本発明は、ＥｐｈＢ４遺伝子増幅の検出方法を提供する。遺伝子増幅の検出は、標的遺伝子のコピー数を決定することによって評価できる。一般に、正常の二倍体細胞は、所定の常染色体遺伝子を２コピー有する。しかしながら、このコピー数は、例えば、癌細胞内での遺伝子の増幅又は重複によって増加し得る。特定の遺伝子のコピー数を評価する方法は斯界に周知であり、特に、ハイブリダイゼーションをベースとしたアッセイ法及び増幅をベースとしたアッセイ法が挙げられる。
【００４８】
例えば、多数のハイブリダイゼーションをベースとしたアッセイ法を使用して生物学的試料の細胞内における標的遺伝子のコピー数を検出することができる。このような方法の一つはサザンブロット法（Ausubel外又はSambrook外参照）であり、この方法では、ゲノムＤＮＡを典型的に断片化し、電気泳動によって分離し、膜に転写し、その後特異的なプローブにハイブリダイズさせる。試験細胞試料からのハイブリダイゼーションシグナルの強さと、増幅されていない正常のゲノムＤＮＡを含むコントロール細胞からのシグナルの強さとの比較によって、ＥｐｈＢ４遺伝子の相対的なコピー数を推定することができる。コントロールと比較して増大したシグナルが遺伝子増幅の存在を示す。
【００４９】
試料中における遺伝子のコピー数を決定するための別法は、in situ ハイブリダイゼーション、例えば、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である（Angerer, 1987 Meth. Enzymol, 152：649を参照）。一般に、in situ ハイブリダイゼーションは、次の主要な段階を含む：（１）分析すべき組織又は生物学的構造体の固定；（２）標的ＤＮＡの接近性を増大させ且つ非特異的な結合を減少させるための該生物学的構造体の予備ハイブリダイゼーション処理；（３）生物学的構造体又は組織内の核酸に対する核酸混合物のハイブリダイゼーション；（４）該ハイブリダイゼーション中に結合しなかった核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後洗浄及び（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出。このような用途において使用されるプローブは、典型的には、例えば、放射性同位体又は蛍光レポーターで標識されている。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で該標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションを可能にするほど十分に長い、例えば、約５０、１００又は２００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド以上である。
【００５０】
遺伝子のコピー数を決定するための他の別法は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）である。比較ゲノムハイブリダイゼーション方法では、核酸の「試験」採取物が第１標識で標識されると共に、第２採取物（例えば、正常の細胞又は組織由来の）が第２標識で標識される。該核酸のハイブリダイゼーションの比率は、所定の配列でそれぞれの線維に結合する第１標識と第２標識の比によって決定される。これら２種の標識とのシグナルの比の差（例えば、該試験採取物における遺伝子増幅による）を検出し、そしてこの比がＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数の基準となる。遺伝子コピー数偏差の細胞遺伝学的な図をＣＧＨによって作成することができるが、これは、区別がつくように標識された試験及び基準ゲノムＤＮＡからの染色体全長に沿った蛍光比を与える。
【００５１】
本発明の方法で使用するのに好適なハイブリダイゼーションプロトコールは、例えば、Albertson（1984）EMBO J. 3：1227−1234；Pinkel（1988）Proc. Natl. Acad. ScI USA, 85：9138−9142；EPO Pub. No. 430：402；Methods in Molecular Biology, Vol. 33：In Situ Hybridization Protocols, Choo,著, Humana Press, Totowa, NJ.（1994）に記載されている。
【００５２】
或いは、増幅をベースとするアッセイ法を使用して標的遺伝子（例えば、ＥｐｈＢ４）のコピー数を測定することもできる。このようなアッセイ法では、標的核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ）における鋳型として作用する。定量的な増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例する。好適なコントロールとの比較は、上で議論した原理に従い、該遺伝子のコピー数の基準を与える。ＴａｑＭａｎプローブを使用したリアルタイム定量ＰＣＲの方法が斯界に周知である。リアルタイム定量ＰＣＲついての詳細なプロトコールは、例えば、ＲＮＡについては、「Gibson外., 1996, A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res.,10：99５−1001」；及びＤＮＡについては、「Heid外., 1996, Real time quantitative PCR. Genome Res., 10：986−994」に与えられている。また、ＴａｑＭａｎをベースとしたアッセイ法を使用してＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を定量することもできる。ＴａｑＭａｎをベースとしたアッセイ法は、５'蛍光色素及び３' 消光剤を含有する蛍光原オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、所定のＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、３'末端の遮断剤のためそれ自体は延長できない。該ＰＣＲ産物がその後のサイクルで増幅されると、そのポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ）の５'ヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブが開裂する。この開裂によって５'蛍光色素と３'消光剤とが分離し、それによって増幅の関数として蛍光が増加する（例えば、http://www2.perkin−elmer.comを参照）。
【００５３】
ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を決定するための定量的な増幅反応に使用する好ましいプライマーの例を以下に与える：
ＥｐｈＢ４−順：5'−TCC TGC AAG GAG ACC TTC AC−3'
ＥｐｈＢ４−逆：5'−CAG AGG CCT CGC AAC TAC AT−3' 
ＰＣＲ産物の予想されるサイズ：１９５ｂｐ。
【００５４】
これらのプライマーは、好ましくは、コピー数の増加が予期されない所定の遺伝子に向けられる、以下のようなコントロールプライマーのセットで使用される：
ＧＡＰＤＨ−順：5'−GAG GGG TGA TGT GGG GAG TA−3'
ＧＡＰＤＨ−逆：5'−GAG CTT CCC GTT CAG CTC AG−3'
予想されるサイズ：２０６ｂｐ
プライマーの両セットについてのアニーリング温度：６４℃。
【００５５】
他の好適な増幅ベース方法としては、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu及びWallace, Genomics, 4：560, 1989；Landegren外., Science, 241 ：1077, 1988；並びにBarringer外., Gene, 89：117, 1990を参照）、転写増幅（Kwoh外., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86：1173, 1989）、自立配列複製（Guatelli外., Proc Nat Acad Sci, USA 87：1874, 1990）、ドットＰＣＲ及びリンカーアダプターＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
遺伝子のコピー数を決定するための別の強力な方法は、マイクロアレイベースのプラットホームを使用する。マイクロアレイ技術は、高い分解能を与えるため使用できる。例えば、従来のＣＧＨは、一般に、２０Ｍｂに制限されるマッピング分解能を有するが、マイクロアレイベースＣＧＨでは、区別的に標識された試験及び基準ゲノムＤＮＡの蛍光比によってＤＮＡコピー数の変化の位置毎の測定値が与えられ、それによってマッピング分解能の増加が達成される。様々なマイクロアレイ方法の詳細は、文献に見いだすことができる。例えば、米国特許第６,２３２,０６８号；Pollack外., Nat. Genet., 23（l）：41−6,（1999）などを参照されたい。
【００５７】
他の特定の具体例では、本発明は、遺伝子発現産物（例えば、ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡ又は蛋白質）の検出に関する。ｍＲＮＡへの転写は、ノーザンブロット法（Thomas（1980）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：5201−5205）、ドットブロット法及び in situ ハイブリダイゼーション法を含め、様々な技術によって測定できる。ウェスタンブロット法及び免役組織化学染色法を含め、遺伝子産物の発現を測定するための様々な方法が存在する。ウェスタンブロットは、ゲル（通常はＳＤＳゲル）上に蛋白質試料を展開し、該ゲルを硝酸セルロースフィルターにブロットし、そして該フィルターを標識抗体でプローブすることによって実施される。免役組織化学染色技術では、細胞試料を典型的には脱水及び固定し、次いで結合される遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させることによって調製されるが、ここで該標識は、通常、酵素標識、蛍光標識、発光標識などのような視覚によって検出できるものである。本発明で使用するのに好適な特に感度のよい染色技術は、Hsu外.（1980）Am. J. Clin. Path. 75：734−738に説明されている。
【００５８】
ある種の態様では、ＥｐｈＢ４活性の指標（例えば、遺伝子増幅）レベルの増加が腫瘍の侵襲性及び腫瘍が転移した又は転移するであろう可能性に直接関連する。例えば、ＥｐｈＢ４遺伝子の増幅について陽性と検査される患者は生存する見込みが少なく（予後が不十分）且つ通常はこのような遺伝子増幅がない患者よりも腫瘍の外科切除後に受ける再燃時間が短いであろう。別の例として、遺伝子増幅を示す患者は、それらの腫瘍の外科切除後に積極的な治療計画の恩恵を享受し得る。逆に、遺伝子増幅を示さない患者は、このような厳格な治療を必要とする可能性が低いかもしれない。
【００５９】
ある種の態様では、本発明は、充実性腫瘍及び造血癌の両方を含めて広く様々な腫瘍性疾患をスクリーニングするために有用である。代表的な腫瘍性疾患としては、腺癌及び黒色腫のような上皮性悪性腫瘍；神経芽腫及び網膜芽細胞腫のような中胚葉性腫瘍；骨肉腫、ユーイング肉腫及び様々な白血病のような肉腫；並びにリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。特に興味のあるものは、前立腺、頭部及び頸部、乳房、卵巣、結腸及び直腸、肺、胃、脳及び肝臓の上皮性悪性腫瘍である。
【００６０】
本発明の一形態によれば、ヒトにおける腫瘍性組織の診断方法を提供する。試験試料（例えば、組織又は体液）をヒトから単離し、そしてヒトＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数を決定する。或いは、ヒトＥｐｈＢ４遺伝子発現産物のレベルを決定することができる。これらは、蛋白質及びｍＲＮＡを包含する。
【００６１】
癌（腫瘍）の性質に応じて、適切な患者試料が得られる。例えば、充実性腫瘍の場合には、外科切除された腫瘍からの組織試料を得、そして従来技術によって試験のために調製する。リンパ腫及び白血病の場合には、リンパ球、白血病細胞又はリンパ組織を得、そして適切に調製する。所定の場合には、試験組織又は試験細胞は、腫瘍（例えば、原発腫瘍）又は腫瘍性であることが疑われる組織から得られる。通常、試験組織又は試験細胞は、望ましくは、分析のために正常な外見の組織から分離される。これは、斯界に知られているように、パラフィン又は凍結切片法又はフローサイトメトリーによって行うことができる。他の場合では、試験組織又は試験細胞は、原発腫瘍に由来する転移細胞を有することが疑われる組織、例えばリンパ節又は該原発腫瘍に近い組織から得られる。随意に、非腫瘍性組織又は任意の正常組織を使用して遺伝子発現又は遺伝子のコピー数の基準レベルを決定し、これとＥｐｈＢ４遺伝子の発現又は遺伝子増幅の量とを比較することができる。
【００６２】
別の特定の具体例では、体液のような試験試料も特定の腫瘍での使用に役立つであろう。例えば、体液をアッセイして遺伝子発現産物又は遺伝子増幅のレベル上昇を検出することができる。好適な体液としては、血液、血清、血漿、血液由来画分、リンパ液、唾液、痰、大便、尿、結腸流出液、乳房浸出液が挙げられ、また広く様々な有用な免疫アッセイ法は、特許文献及び科学文献に記載されている。例えば、米国特許第３,７９１,９３２号；同３,８１７,８３７号；同３,８３９,１５３号；同３,８５０,７５２号；同３,８５０,５７８号；同３,８５３,９８７号；同３,８６７,５１７号；同３,８７９,２６２号；同３,９０１,６５４号；同３,９３５,０７４号；同３,９８４,５３３号；同３,９９６,３４５号；同４,０３４,０７４号；及び同４,０９８,８７６を参照されたい。
【００６３】
ある種の具体例では、遺伝子増幅の測定は、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数が推定できるように定量的に実施されるであろう。病気の状態は、腫瘍細胞内に存在する遺伝子のコピー数と直接的に関係し得る。例えば、遺伝子増幅を示す患者（例えば、３コピーのＥｐｈＢ４遺伝子）は、遺伝子増幅を示さない患者（例えば、２コピーのＥｐｈＢ４遺伝子）よりも再発の危険性が高い。さらに、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数が増加するにつれて、侵襲性及び転移の可能性も増加するように思われる。随意に、ＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数は、従来の因子と共に、リンパ節状態、エストロゲン受容体状態、プロゲステロン受容体状態などを含めて腫瘍状態を評価する際の重要な因子となるだろう。この利用できる情報の全てを用いて、治療する医師は、腫瘍状態を評価し、そして患者の利益に最良な治療戦略を推奨することができる。
【００６４】
一般に、ヒトＥｐｈＢ４遺伝子は、細胞がゲノム当たりにこの遺伝子の正常のコピー数（２）以上を含む場合に、増幅したとみなされる。遺伝子増幅を検出するための様々な技術が斯界にはよく知られている。遺伝子増幅は、例えば、サザンブロット分析で決定でき、この場合には、ヒト組織からの細胞ＤＮＡを消化し、分離し、そしてフィルターに写し、このものに、相補的な核酸を含むプローブをハイブリダイズさせる。或いは、プライマーを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して遺伝子増幅を決定することもできる。好適なプライマーは、ヒトＥｐｈＢ４コード配列を一まとめにした配列に結合するであろう。斯界に知られている遺伝子のコピー数を決定するための他の技術を制限なく使用できる。
【００６５】
測定される遺伝子産物は、ｍＲＮＡか蛋白質かのいずれかであることができる。用語「発現の上昇」とは、ｍＲＮＡの産生又は蛋白質の産生が、非癌細胞によって正常に産生されるよりも増加することを意味する。増幅はヒトの腫瘍で観察されているが、これらの腫瘍又は他の腫瘍にはＥｐｈＢ４の発現の上昇に至る他の遺伝子変化も存在し得る。腫瘍の例としては、ＨＮＳＣＣ、肺、乳房、脳、結腸直腸、膀胱、前立腺、脳、肝臓、皮膚及び胃が挙げられるが、これらに限定されない。基準発現レベルを決定する際に使用される非癌細胞は、腫瘍周辺の組織、他のヒト又はヒト細胞株から得ることができる。いかなる増加も診断価値を有し得るが、一般に、ｍＲＮＡ又は蛋白質発現は、非癌細胞において見いだされるものよりも少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、場合によっては約５０倍まで上昇するであろう。ｍＲＮＡ又は蛋白質を検出するために使用される技術は周知であり、また斯界では日常的である。ｍＲＮＡ又は蛋白質産生の増加は、例えば、それぞれノーザンブロット分析又はウェスタンブロット分析を使用して、或いはＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、ＲＩＡなどのような他の既知の技術を使用して検出できる。これらの技術の全ては当業者に周知である。
【００６６】
本発明の別の形態によれば、ヒトＥｐｈＢ４遺伝子の増幅又はｍＲＮＡ発現の上昇の決定用の核酸プローブ又はプライマーを提供する。このプローブは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸を含むことができ、且つ、全ヒトＥｐｈＢ４コードヌクレオチド配列、それに相補的な配列又はそれらの断片を含むことができる。プローブは、例えば、図１８及び１９に示したようなヌクレオチドを含むことができる。一般に、プローブ又はプライマーは、該ヒト配列の少なくとも約１４個の隣接ヌクレオチドを含むが、望ましくは約４０、５０又は１００個のヌクレオチドを含む。プローブは、典型的には、蛍光タグ、放射性同位体又はこれらのものを容易に検出できる同様のものを含むことができる。好ましくは、該プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするであろう。本発明のプローブは、ヒトＥｐｈＢ４遺伝子に相補的である。これは、これらのものがヒトＥｐｈＢ４との高い配列同一性（例えば、９５％、９８％、９９％又は１００％）を共有することを意味する。
【００６７】
本発明によれば、ＥｐｈＢ４蛋白質を、他のヒト蛋白質を実質的に含むことなく産生させることができる。ＥｐｈＢ４のＤＮＡ配列を与えるにあたって、当業者であれば、非ヒト細胞内でそのｃＤＮＡを発現させることができる。このような細胞の溶解物は、他のヒト蛋白質を実質的に含まない蛋白質を与える。この溶解物は、例えば免疫沈降法又は親和性クロマトグラフィーによってさらに精製できる。
【００６８】
本発明の抗体は、ＥｐｈＢ４蛋白質と特異的に反応する。好ましくは、これらのものは、他の種からのＥｐｈＢ４とは交差反応しない。これらのものはポリクローナル又はモノクローナルであることができ、しかも天然ＥｐｈＢ４又はＥｐｈＢ４融合蛋白質又は合成ペプチドに対するものとして得られ得る。該抗体は、他のヒト蛋白質上には存在しないＥｐｈＢ４エピトープと特異的に免疫反応する。随意に、いくつかの抗体は、ヒトＥｐｈＢ４にユニークで且つマウスホモログ上には存在しないエピトープと反応性がある。該抗体は、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法及び蛋白質検出用の他の免疫アッセイ法のような従来の分析に有用である。ポリクローナル抗体を作製及び精製するための技術は、モノクローナル抗体を調製するための技術と同様に、周知である。抗体の結合は、酵素標識二次抗体、ブドウ球菌蛋白質Ａなどの使用のような、斯界に知られている方法によって決定できる。
【００６９】
ＥｐｈＢ４遺伝子に特異的なプローブ又はプライマーのような遺伝子のコピー数を決定するために必要な試薬並びに取扱説明書を収容したキットを提供する。この説明書は、決定された値と比較するための検量線を提供することができる。また、キットは、ｍＲＮＡ（例えば、プローブを含む）又はＥｐｈＢ４蛋白質（例えば、抗体を含む）の発現の上昇を決定するためにも提供される。説明書は、ＥｐｈＢ４の発現レベルが上昇するかどうかを決定させることを可能にするでろう。また、反応容器及びクロモゲン、緩衝液及び酵素のような補助試薬もこのキットに含まれ得る。
【００７０】
III. 治療剤
ある具体例では、本発明は、ＥｐｈＢ４及び／又はエフリンＢ２の発現又は活性を妨げるための治療方法を提供する。この方法は、生体内、試験管内又は生体外で適用でき、しかもＥｐｈＢ４活性の上昇の１以上の指標を有する癌に特に有用であろう。治療剤としては、核酸、ポリペプチド、抗体及び小分子化合物が挙げられる。これらの治療剤の例は、米国特許出願公開第１０／８００,０７７及び同１０／８００,３５０並びに国際公開第ＵＳ０４／０７４９１号及びＵＳ０４／０７７５５号パンフレットに記載されている。
【００７１】
例えば、本発明は、一本鎖、二重鎖又は多重鎖であることができる核酸治療剤を提供し、またこれは、修飾若しくは非修飾ヌクレオチド若しくは非ヌクレオチド又は様々な混合物及びそれらの組合せを含むことができる。核酸治療剤の例としては、アンチセンス核酸、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及び酵素的核酸化合物（例えば、リボザイム又はＤＮＡ酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。随意に、この開示は、エフリンＢ２蛋白質をコードするエフリンＢ２遺伝子（例えば、Genbank Accession No.：NP_304084）又はＥｐｈＢ４蛋白質をコードするＥｐｈＢ４受容体遺伝子（例えば、Genbank Accession No.：NP_004435）の発現を独立に又は組み合わせて調節する１種以上の核酸治療剤を特徴とする。
【００７２】
特定の具体例では、代表的なＥｐｈＢ４アンチセンス核酸を以下の表１に与えており、代表的なＥｐｈＢ４ｓｉＲＮＡを以下の表２に与えている。別の特定の具体例では、代表的なエフリンＢ２アンチセンス核酸を以下の表３に与えており、代表的なエフリンＢ２ｓｉＲＮＡを以下の表２に与えている。
【００７３】
【表１−１】
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【００７４】
【表１−２】
2008514925.tif 000004
【００７５】
【表１−３】
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【００７６】
【表１−４】
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【００７７】
【表２−１】
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【００７８】
【表２−２】
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【００７９】
【表２−３】
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【００８０】
【表３−１】
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【００８１】
【表３−２】
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【００８２】
【表４−１】
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【００８３】
【表４−２】
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【００８４】
他の具体例では、本発明は、可溶性ポリペプチドと、抗体と、抗体の抗原結合部分とを含むポリペプチド治療剤を提供する。ある種の態様では、本発明は、ＥｐｈＢ４蛋白質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドを提供する。該可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２ポリペプチドに特異的に結合する。用語「可溶性」は、単に、これらのペプチドが、該ポリペプチドの生理学的塩溶液への溶解性を損なうのに十分な膜貫通ドメイン又は膜貫通ドメインの一部分を含有しないことを示すために使用するに過ぎない。好適なポリペプチドは、好ましくは、エフリンＢ２のようなリガンドへの結合についてＥｐｈＢ４と競合し且つＥｐｈＢ４の活性化によって生じるシグナル伝達を阻害する単量体として調製される。随意に、可溶性ポリペプチドは、多重結合の形態で、例えば、Ｆｃ融合蛋白質又は別の多重結合ドメインとの融合体として発現することによって調製できる。このような多重結合形態は、複合的な活性を有することができ、状況によってはアゴニスト又はアンタゴニスト効果を有することができる。所定の具体例では、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４蛋白質の球状ドメインを含む。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、図２２で定義されるアミノ酸配列の１〜５２２残基に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むことができる。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、図２２で定義されるアミノ酸配列の１〜４１２残基に少なくとも９０％等しい配列を含むことができる。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、図２２で定義されるアミノ酸配列の１〜３１２残基に少なくとも９０％等しい配列を含むことができる。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、球状（Ｇ）ドメインを含む配列（図２２のアミノ酸２９〜１９７）と、随意に追加のドメイン、例えば、システインリッチドメイン（図２２のアミノ酸２３９〜３２１）、第１フィブロネクチン３型ドメイン（図２２のアミノ酸３２４〜４２９）及び第２フィブロネクチン３型ドメイン（図２２のアミノ酸４３４〜５２６）とを含むことができる。ここで説明し且つリガンド結合活性を有するものとして実証した好ましいポリペプチドとしては、図２２に示したアミノ酸配列のそれぞれ１〜５３７、１〜４２７及び１〜３２６に相当するポリペプチドが挙げられる。可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、図１又は２に示したような配列を含むことができる。斯界には周知であるように、このようなＥｐｈＢ４ポリペプチドが好適な細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞株内で発現すると、リーダーペプチドの開裂が生じるであろう。このような開裂は、単一部位では常に完全とは限らず又は完全に一貫するとは限らないものの、ＥｐｈＢ４は、図２２に示される配列の最初の１５個のアミノ酸を除去するように開裂する傾向がある。従って、特定の例として、本発明は、エフリンＢ２に結合し且つ次の群（番号付けは図２２の配列に関するものである）：１〜１９７、２９〜１９７、１〜３１２、２９〜１３２、１〜３２１、２９〜３２１、１〜３２６、２９〜３２６、１〜４１２、２９〜４１２、１〜４２７、２９〜４２７、１〜４２９、２９〜４２９、１〜５２６、２９〜５２６、１〜５３７及び２９〜５３７から選択されるアミノ酸配列を含むプロセシングを受けていない可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、プロセシングを受けた形態で使用でき、このような形態は、次の群（番号付けは図２２の配列に関するものである）：１６〜１９７、１６〜３１２、１６〜３２１、１６〜３２６、１６〜４１２、１６〜４２７、１６〜４２９、１６〜５２６及び１６〜５３７から選択される予想アミノ酸配列を有する。さらに、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、先のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも９０％、随意に９５％又は９９％等しいアミノ酸配列を含むと共に、エフリンＢ２結合活性を保持するものであることができる。好ましくは、図２１に示した配列からのアミノ酸配列の任意の変異体は、特に表面ループ領域内でのわずか１、２、３、４又は５個のアミノ酸の保存的変換又は欠失である。ある具体例では、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４との相互作用を阻害することができる。該可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４のクラスター形成又は燐酸化を阻害することができる。エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の燐酸化は、一般に、これらの蛋白質によって調節される細胞内シグナル伝達経路を誘発する際の初期の事象の一つであるとみなされている。上記のように、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単量体又は多重結合融合蛋白質として調製できる。該可溶性ポリペプチドは、１種以上の修飾アミノ酸を含むことができる。このようなアミノ酸は、プロテアーゼ消化に対する抵抗性の増大のような所望の特性に寄与することができる。
【００８５】
本発明は、血中半減期の増大を与えつつ、なおエフリンＢ２結合活性を保持する追加成分を有する可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドを提供する。所定の具体例では、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、単量体であり、且つ、１個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に共有結合する。この１個以上のＰＥＧは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａを範囲とする分子量を有し、好ましくは、約１０〜約６０ｋＤａ又は約２０〜約４０ｋＤａを範囲とする分子量を有するであろう。好ましい具体例では、この可溶性の単量体ＥｐｈＢ４結合体は、好ましくはＥｐｈＢ４リシンのε−アミノ基又はＮ末端アミノ基を介して、約２０〜約４０ｋＤａの１個のＰＥＧ基に共有結合したＥｐｈＢ４ポリペプチド（モノＰＥＧ化ＥｐｈＢ４）を含む。最も好ましくは、ＥｐｈＢ４は、ＥｐｈＢ４リシンのε−アミノ基及びＮ末端アミノ基よりなる群とは別の１個のアミノ基でランダムにＰＥＧ化される。驚くべきことに、本発明に従うモノＰＥＧ化ＥｐｈＢ４は、非修飾可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチド及びポリＰＥＧ化ＥｐｈＢ４の治療適用性に関して優れた特性を有する。それでもなお、本発明は、１カ所以上の位置にＰＥＧを有するポリＰＥＧ化ＥｐｈＢ４も提供する。このようなポリＰＥＧ化形態は、非修飾形態に対して改善された血中半減期を与える。ある具体例では、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、エフリンＢ２結合を実質的に減ずることなく半減期の改善を与える第２の安定化ポリペプチドと安定して会合する。安定化ポリペプチドは、好ましくは、ヒト患者（又は患畜。この場合には、獣医学的用途を意図する。）と免疫適合性があり、且つ、ほとんど又は全く有意な生物活性を有しないであろう。好ましい具体例では、安定化ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン又はその部分である。ヒト血清アルブミンは、ＥｐｈＢ４ポリペプチドと安定して共有又は非共有結合できる。共有結合は、ヒト血清アルブミンとの同時翻訳融合体としてのＥｐｈＢ４ポリペプチドの発現によって達成できる。該アルブミン配列は、可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチド内のＮ末端、Ｃ末端又は非破壊的内部位置で融合できる。ＥｐｈＢ４の露出したループがアルブミン配列の挿入のための好適な位置であろう。また、アルブミンは、例えば化学的架橋によって翻訳後にＥｐｈＢ４ポリペプチドに結合することもできる。また、ＥｐｈＢ４ポリペプチドは、１種以上のアルブミンポリペプチドとも安定して会合できる。
【００８６】
可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドの例を以下の例で与える。ある種の態様では、本発明は、エフリンＢ２蛋白質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む可溶性エフリンＢ２ポリペプチドを提供する。該可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、ＥｐｈＢ４ポリペプチドに特異的に結合する。用語「可溶性」は、単に、これらのポリペプチドが該ポリペプチドの生理学的塩溶液への溶解性を損なうのに十分な膜貫通ドメイン又は膜貫通ドメインの一部分を含まないことを示すために使用するに過ぎない。可溶性ポリペプチドは、好ましくは、ＥｐｈＢ４のようなリガンドへの結合についてエフリンＢ２と競合し且つエフリンＢ２活性によって生じるシグナル伝達を阻害する単量体として調製できる。随意に、可溶性ポリペプチドは、多重結合の形態で、例えば、Ｆｃ融合蛋白質又は別の多重結合ドメインとの融合体として発現することによって調製できる。このような多重結合形態は複合的な活性を有することができ、状況によってはアゴニスト又はアンタゴニストの効果を有することができる。可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、図２２で定義されるアミノ酸配列の１〜２２５残基を含むことができる。可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、図３によって定義される配列を含むことができる。斯界には周知のように、このようなエフリンＢ２ペプチドが好適な細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞株内で発現すると、リーダーペプチドの開裂が生じるであろう。このような開裂は、単一部位では常に完全とは限らず又は完全に一貫するわけではないが、エフリンＢ２は、図２２に示される配列の最初の２６個のアミノ酸を除去するように開裂する傾向にあることが分かっている。従って、特定の例として、本発明は、ＥｐｈＢ４に結合し且つ図２２のアミノ酸１〜２２５に相当するアミノ酸配列を含むプロセシングを受けていない可溶性エフリンＢ２ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、プロセシングを受けた形態で使用でき、このような形態は、次の群（番号付けは図２２の配列に関するものである）：２６〜２２５から選択される予想アミノ酸配列を有する。ある具体例では、該可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、エフリンＢ２とＥｐｈＢ４との相互作用を阻害することができる。該可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４のクラスター形成又は燐酸化を阻害することができる。上記のように、該可溶性エフリンＢ２ポリペプチドは、単量体又は多重結合融合蛋白質として調製できる。該可溶性ポリペプチドは、１種以上の修飾アミノ酸を含むことができる。このようなアミノ酸は、プロテアーゼ消化に対する抵抗性の増大のような所望の特性に寄与することができる。
【００８７】
別の特定の具体例では、本発明は、エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４に対する抗体を提供する。ここに記載するときに、用語「アンタゴニスト抗体」とは、エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の機能を阻害する抗体をいう。好ましくは、該アンタゴニスト抗体は、エフリンＢ２又はＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに結合する。本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル；そのままのもの又は短縮されたもの、例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆｖ；異種、同種、同系又はそれらの修飾された形態、例えば、ヒト化、キメラなどであることができるものとする。これらの抗体の例としては、図２４に示されるようなＥｐｈＢ４抗体番号１、２３、３５、４７、５７、７９、８５Ｌ、８５Ｈ、９１、９８、１２１、１３１及び１３８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
抗体番号２３（アミノ酸１６〜１９８内のエピトープ）、抗体番号９１（キナーゼ活性化抗体；アミノ酸３２４〜４２９内のエピトープ）、抗体番号９８（アミノ酸４３０〜５３７内のエピトープ）、抗体番号１３１（アミノ酸３２４〜４２９内のエピトープ）及び抗体番号１３８（アミノ酸４３０〜５３７内のエピトープ）を産生するハイブリドーマをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），米国バージニア州マサチューセッツ１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，２０１１０−２２０９に寄託した。ＡＴＣＣ寄託番号は、抗体番号２３、９１、９８、１３１及び１３８については、それぞれ、ＰＴＡ−６２０８、ＰＴＡ−６２０９、ＰＴＡ−６２１０、ＰＴＡ−６２１４及びＰＴＡ−６２１１である。従って、本発明の所定の特定の態様は、ＰＴＡ−６２０８、ＰＴＡ−６２０９、ＰＴＡ−６２１０、ＰＴＡ−６２１４及びＰＴＡ−６２１１よりなる群から選択されるＡＴＣＣ寄託番号を有するハイブリドーマ細胞に関するものである. 
【００８９】
VI. 治療方法
ある具体例では、本発明は、腫瘍成長を阻害し又は低減させる方法及び癌に罹患した個体の治療方法を提供する。随意に、これらの治療方法の一つ以上は、遺伝子増幅（ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２）を上記のような方法で検出した後に適用される。これらの方法は、該個体に、上記のような１種以上の治療剤若しくは以下に説明する慣用の抗腫瘍化合物又はその両方の治療上有効な量を投与することを伴う。これらの方法は、特に、動物、特にヒトの治療又は予防的治療を目的とする。
【００９０】
ここに記載するときに、腫瘍には、所定の個体内部にある腫瘍、腫瘍異種移植片又は試験管内でクラスター形成した腫瘍が含まれる。特に、本発明の核酸治療剤は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、脳癌、胃癌、ＨＮＳＣＣ、カポジ肉腫及び白血病（これらに限定されない）を含めた癌（腫瘍）を治療し又は予防するのに有用である。
【００９１】
このような方法の所定の具体例では、１種以上の治療剤を共に（同時に）又は異なる時点で（連続的に）投与できる。さらに、治療剤は、癌治療用の２タイプ以上の化合物と共に投与できる。例えば、本発明の治療剤は、従来の抗腫瘍治療手段の一つと併用できる。このような方法は、癌の予防、術後の癌の再発及び転移の予防に並びに従来の他の癌治療のアジュバントとして使用できる。本発明は、従来の癌療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法及び外科手術）の有効性を主題の核酸治療剤の使用によって向上させることができるものであると認められる。
【００９２】
多数の従来の化合物が抗腫瘍活性を有することが示されている。これらの化合物は、充実性腫瘍を縮小させ、転移及びさらなる成長を防ぎ又は白血病や悪性骨髄内における悪性細胞の数を減少させるための化学療法において医薬品として使用されてきた。化学療法は、様々なタイプの悪性腫瘍を治療する際に効果的であったが、多くの抗腫瘍性化合物は望ましくない副作用を誘発する。２つ以上の異なる治療を組み合わせると、これらの治療は、相乗効果的に作用し、且つ、これらの治療のそれぞれの投与量を減少させ、それによってさらに高い投与量のそれぞれの化合物によってもたらされる有害な副作用を低減させることを可能にすることが示されている。他の場合には、難治性の悪性腫瘍は、２種以上の異なる治療の併用療法に好ましい反応を示す。
【００９３】
本発明の治療剤を別の慣用の抗癌（抗腫瘍又は化学療法）剤と共に付随的に又は連続的に投与するときに、このような治療剤は、抗腫瘍剤の治療効果を向上させることや、このような抗腫瘍剤に対する細胞耐性を克服することが示される。これは、抗腫瘍剤の投与量を減少させ、それによって望ましくない副作用を低減させ又は耐性細胞における抗癌剤の有効性を回復させることを可能にする。
【００９４】
慣用の抗腫瘍化合物としては、単なる例示であるが、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルチシン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチソン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィメル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンが挙げられる。
【００９５】
これらの化学療法用抗腫瘍化合物は、それらの作用機序によって、例えば、次の群：抗代謝剤／抗癌剤、例えば、ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロキシウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）及びプリンアナログ、葉酸アンタゴニスト並びに関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；天然物質を含めた増殖抑制剤／有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン）、微小管破壊剤、例えばタキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン及びナベルビン、エピジポドフィルロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラシクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレフタミン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミド及びエトポシド（ＶＰ１６））；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラシクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びミトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身で代謝し、且つ、アスパラギンを合成する能力を有しない所定の細胞を奪うＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；増殖抑制剤／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド及びアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）及びアナログ、ストレプトゾシン）、トラゼン−ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）；増殖抑制剤／抗有糸分裂抗代謝剤、例えば、葉酸アナログ（メトトレキセート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及びその他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（例えば、組織プラスミノゲン活性剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗転移剤；分泌抑制剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル）；抗血管形成化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチソン、デキサメタソン、ヒドロコルチソン、メチルペドニソロン、プレドニソン及びプレニソロン）；成長因子シグナルトランスダクションキナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤及びカスパーゼ活性剤；並びにクロマチン破壊剤に分類できる。
【００９６】
併用療法の性質によっては、治療剤の投与を続行すると同時に及び／又はその後に、その他の治療を実施する。治療剤の投与は、単回投与又は複数回投与でなし得る。場合によっては、治療剤の投与は、慣用の治療の少なくとも数日前に実施される。他の場合には、投与は、慣用の治療の実施直前又は実施時に開始される。
【００９７】
VII 投与方法及び医薬組成物
ある具体例では、本発明の治療剤（化合物）は、薬学的に許容できるキャリヤーと共に処方される。このような治療剤は、単独で又は医薬処方物（組成物）の成分として投与できる。これらの薬剤は、ヒトの薬又は動物薬に使用するための任意の便利な方法での投与のために処方できる。また、湿潤剤、乳化剤及び滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、被覆剤、甘味剤、香料及び香味剤、保存料及び酸化防止剤も該組成物に存在することができる。
【００９８】
この主題の薬剤の処方物としては、経口／ 経鼻、局所、非経口、直腸及び／又は膣内投与に好適なものが挙げられる。該処方物は、単位剤形で与えることが便利であり、また調剤分野に周知の任意の方法によって調製できる。キャリアー材料と組み合わせて単一剤形を生じさせることができる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与形式に応じて変化するであろう。キャリアー材料と組み合わせて単一剤形を生じさせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じさせる該化合物の量であろう。
【００９９】
ある具体例では、これらの処方物又は組成物を製造する方法は、別のタイプの抗腫瘍治療剤と、キャリヤーと、随意に１種以上の副成分とを組み合わせることを含む。一般に、該処方物は、液体キャリヤー若しくは微粉化された固体キャリヤー又はその両方で製造でき、続いて、必要ならば、該製品を成形する。
【０１００】
経口投与用の処方物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（香り付けされた基材、通常はスクロース及びアラビアガム又はトラガカントを使用する）、粉剤、顆粒剤の形態、又は水性若しくは非水性液体の溶液若しくは懸濁液の状態、又は水中油型若しくは油中水型液体エマルジョンの状態、又はエリキシル若しくはシロップの状態、又は口内錠（不活性基材、例えば、ゼラチンとグリセリン又はスクロースとアラビアガムを使用する）及び／又は洗口剤などの状態にあることができ、それぞれのものは、活性成分として所定量の主題治療剤を含有する。
【０１０１】
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒剤など）では、１種以上の治療剤と、クエン酸ナトリウム又は燐酸二カルシウムのような１種以上の薬学的に許容できるキャリヤー及び／又は次のもののいずれか：（１）充填剤又増量剤、例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニット及び／又は珪酸；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアラビアガムのような結合剤；（３）グリセリンのような湿潤剤；（４）崩壊剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉又はタピオカ澱粉、アルギン酸、所定のシリケート及び炭酸ナトリウム；（５）溶液緩染剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四アンモニウム化合物；（７）例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートのような湿潤剤；（８）吸着剤、例えば、カオリン及びベントナイトクレー；（９）滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物；並びに（１０）着色剤とを混合させることができる。カプセル剤、錠剤及び丸剤の場合には、該医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。また、類似するタイプの固体組成物を、ラクトース、すなわち乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して軟及び硬ゼラチンカプセル剤への充填剤として使用することもできる。
【０１０２】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容できるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。該活性成分の他に、該液体剤形は、斯界で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水その他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、オイル（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル並びにそれらの混合物を含有できる。不活性希釈剤のほかに、該経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、香味剤、着色料、香料及び保存料のようなアジュバントも含むことができる。
【０１０３】
懸濁液は、活性化合物のほかに、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビット及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカント並びにそれらの混合物のような懸濁剤を含有することができる。
【０１０４】
特に、本発明の方法は、皮膚又は子宮頚部若しくは膣上にあるような粘膜のいずれかに局所的に投与できる。これは、副作用を誘発させる最も低い確率で、腫瘍への直接送達にとって最大の機会を与える。この局所処方物は、皮膚又は角質層浸透向上剤として有効であることが知られている様々な薬剤のうち１種以上をさらに含むことができる。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ポリプロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド及びアゾンである。美容上許容できる処方物を作るために、追加の薬剤をさらに含めることができる。これらの例は、脂肪、ワックス、オイル、染料、フレグランス、防腐剤、安定剤及び界面活性剤である。また、斯界に知られているような角質溶解剤も含めることができる。例は、サリチル酸及び硫黄である。
【０１０５】
局所又は経皮投与用の剤形としては、粉剤、スプレー剤、軟膏、泥膏、乳剤性軟膏、ローション剤、ゲル剤、溶剤、パッチ及び吸入剤が挙げられる。主題の治療剤は、無菌条件下で薬剤として許容できるキャリヤー及び必要かもしれない任意の防腐剤、緩衝剤又は推進剤と混合できる。軟膏、泥膏、乳剤性軟膏及びゲル剤は、主題の核酸分子のほかに、動物性及び植物性の脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク及び酸化亜鉛又はそれらの混合物のような賦形剤を含有することができる。
【０１０６】
粉剤及びスプレー剤は、治療剤のほかに、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム及びポリアミド粉末又はこれらの物質の混合物のような賦形剤を含有することができる。スプレー剤は、クロルフルオル炭化水素及び揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタン及びプロパンのような従来の促進剤をさらに含有することができる。
【０１０７】
非経口投与に好適な医薬組成物は、１種以上の治療剤を１種以上の薬学的に許容できる滅菌等張水溶液若しくは滅菌等張非水溶液、分散液、懸濁液若しくはエマルジョン又は使用直前に滅菌注射用溶液若しくは分散液に再構成できる滅菌粉末と共に含むことができ、ここで、これらのものは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、対象とする賦形剤又は懸濁剤若しくは増粘剤の溶質であって該処方物を血液と等張にするものを含むことができる。本発明の医薬組成物に使用できる好適な水性及び非水性キャリヤーの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物性油及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。例えば、レシチンのような被覆用物質を使用すること、分散体の場合には必要な粒度を維持すること及び界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。
【０１０８】
また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のようなアジュバントも含有することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロルブタノール、フェノールソルビン酸などの包含によって保証できる。また、糖質、塩化ナトリウムなどのような等張剤を組成物に包含させることが望ましいかもしれない。さらに、注射用製剤の持続的吸収を、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらすことができる。
【０１０９】
注射用のデポー製剤は、ポリラクチド−ポリグルコリドのような生分解性重合体中に１種以上の治療剤の微小被包化マトリックスを形成させることによって作られる。薬剤対重合体の比率及び使用される特定の重合体の性質によって、薬物の放出速度が制御できる。他の生分解性重合体の例としては、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。また、注射用デポー製剤は、生体組織と適合性のあるリポソーム又はミクロエマルジョン中に薬剤を閉じ込めることによっても製造される。
【０１１０】
膣内又は直腸内投与用の処方物は、座薬として与えることができるが、これは、本発明の１種以上の化合物と、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、座剤ワックス又はサリチレートを含む１種以上の好適な刺激性のない賦形剤又はキャリヤーとを混合させることによって調製でき、しかもこのものは室温では固体である一方で体温では液体であるため、直腸又は膣腔内で溶け、そして活性化合物を放出するであろう。
【０１１１】
ある具体例では、１種以上の治療剤は、それらの望ましい活性にとって最も好適な身体部位内で該治療剤が効果的に分布することを可能にする薬学的に許容できる薬剤と共に処方される。このような薬学的に許容できる薬剤の例としては、ＰＥＧ、リン脂質、ホスホロチオエート、薬剤が様々な組織に入るのを向上させ得るＰ−糖蛋白質阻害剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５）、移植後の徐放性送達用の生体分解性重合体、例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）微小球（Emerich, DF外, 1999, Cell Transplant, 8, 47−58）及び血液脳関門を横切って薬剤を送達することができ且つニューロンへの取り込み機構を変化させることができる、ポリブチルシアノアクリレートから作られるもののような充填ナノ粒子（Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941−949, 1999）が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１１２】
本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、次の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。この実施例は、単に本発明のある種の態様及び具体例を例示する目的のために含めており、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１１３】
例１．ＥｐｈＢ４は、頭部及び頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）内で発現する
Ａ．ＨＮＳＣＣ腫瘍はＥｐｈＢ４を発現する
本発明者は、ヒト腫瘍組織内でのＥｐｈＢ４の発現を免疫組織化学、in situ ハイブリダイゼーション及びウェスタンブロットで検討した。ＩＲＢの認可に従って予め採取しておいた２０個の腫瘍組織を、ＥｐｈＢ及びＥｐｈＡファミリーの他のものとは反応しない特定のＥｐｈＢ４モノクローナル抗体で評価した。全てのケースにおいて、ＥｐｈＢ４発現が様々な染色強度で観察される。図７Ａ（左上）は、代表的なケースを例示するものであり、これは、ＥｐｈＢ４がＨ＆Ｅ腫瘍構造によって明らかなように腫瘍領域のみで発現することを示している（図７Ａ左下）。間質ではＥｐｈＢ４についての染色が存在しないことに注意されたい。次に、リンパ節内の転移腫瘍部位は、陽性の染色を示しているが、該リンパ節の残りは陰性である（図７Ａ右上）。
in situ ハイブリダイゼーションを実施して腫瘍組織内でのＥｐｈＢ４転写産物の存在及び位置を決定した。ＥｐｈＢ４特異的アンチセンスプローブに対する強いシグナルが検出されたが、これは転写物の存在を示している（図７Ｂ左上）。腫瘍構造を示すためのＨ＆Ｅ染色との比較（図７Ｂ左下）から、該シグナルは該腫瘍細胞に局在した一方で、間質領域には存在しなかったことが明らかになる。また、エフリンＢ２転写物は、腫瘍試料でも検出され、またＥｐｈＢ４と同様に、該シグナルは腫瘍細胞に局在していた（図７Ｂ右上）。ＥｐｈＢ４又はエフリンＢ２センスプローブのいずれも該切片にはハイブリダイズしなかったが、これは該シグナルの特異性を証明するものである。
【０１１４】
Ｂ．ＨＮＳＣＣの原発部位及び転移部位内でのＥｐｈＢ４発現と遺伝子コピー数の増加
原発腫瘍、リンパ節転移及び関与しない組織からの組織のウェスタンブロットを実施してこれらの部位におけるＥｐｈＢ４発現の相対的レベルを決定した。腫瘍及び正常の隣接組織を２０ケース集めると共に、腫瘍に対して陽性のリンパ節をこれら２０ケースのうち９ケースで採取した。代表的なケースを図７Ｃに示す。ＥｐｈＢ４発現が該腫瘍試料のそれぞれで観察される。同様に、腫瘍陽性リンパ節の全てが、原発腫瘍に等しいか又はそれよりも大きいＥｐｈＢ４発現を示している。正常の隣接組織では、発現は全く又はほとんど観察されない。さらに、高いＥｐｈＢ４発現は、ＨＮＳＣＣの一次組織及び転移組織における遺伝子のコピー数の増加と相関関係があった（図７Ｄ）が、これは、ＥｐｈＢ４遺伝子の増幅を腫瘍状態（特に、腫瘍転移）のための診断用マーカーとして使用することができることを示唆するものである。
【０１１５】
Ｃ．ＨＮＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現と遺伝子コピー数の増加
腫瘍細胞に限定してＥｐｈＢ４の発現を実証したが、次に、本発明者は、ＨＮＳＣＣにおけるＥｐｈＢ４発現の試験管内モデルが存在するかどうかを決定することを試みた。６種のＨＮＳＣＣ細胞株について、ＥｐｈＢ４蛋白質発現をウェスタンブロットで調査した（図８Ａ）。これらの大部分が強いＥｐｈＢ４発現を示したため、その後の研究の基礎とした。また、高いＥｐｈＢ４発現とＥｐｈＢ４遺伝子のコピー数の増加との間の強い相関関係がＨＮＳＣＣ細胞株で見いだされた（図８Ｂ）。この結果は、ＥｐｈＢ４遺伝子の増幅を腫瘍状態（特に、腫瘍転移）のための診断用マーカーとして使用することができることをさらに裏付けるものである。
【０１１６】
例２．ＥｐｈＢ４は前立腺癌において上方調節され且つグロース・アドバンテージを与える
Ａ．前立腺癌細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現
まず、本発明者は、様々な前立腺癌細胞株におけるＥｐｈＢ４発現蛋白質をウェスタンブロットで試験した。本発明者は、前立腺癌細胞株が１２０ｋＤのＥｐｈＢ４の存在量の著しい変化を示すことを見いだした。このレベルは、ＰＣ３では比較的高く、しかもＰＣ３の転移クローンであるＰＣ３Ｍではさらに高かったが、正常の前立腺由来細胞株（ＭＬＣ）は、低いＥｐｈＢ４発現を示すか又はその発現を全く示さなかった（図９Ａ）。次に、本発明者は、ＰＣ３細胞におけるＥｐｈＢ４の活性化状態を燐酸化研究によってチェックした。本発明者は、正常の培養条件下であっても、ＥｐｈＢ４が燐酸化されることを見出したが、これは、そのリガンドであるエフリンＢ２によってさらに誘導され得ると考えられる（図９Ｂ）。
【０１１７】
Ｂ．臨床前立腺癌試料におけるＥｐｈＢ４の発現
ＥｐｈＢ４が臨床前立腺試料で発現するかどうかを決定するために、前立腺癌外科的試料からの腫瘍組織及び隣接する正常組織を試験した。該前立腺試料におけるＥｐｈＢ４の組織学的分布を免疫組織化学によって決定した。明らかに、ＥｐｈＢ４発現は腫瘍性上皮組織に限られ（図１０左上）、しかも間質と正常の前立腺上皮組織には存在していない（図１０右上）。前立腺組織系列では、試験した３２種の前立腺癌のうち２４種が陽性であった。本発明者は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＥｐｈＢ４のｍＲＮＡが臨床試料の正常組織及び腫瘍組織の両方で発現することを見いだした。しかしながら、この場合において、腫瘍ＥｐｈＢ４ｍＲＮＡレベルは、正常のものよりも少なくとも３倍高かった（図１０右下）。
【０１１８】
例３．中皮腫におけるＥｐｈＢ４の発現
Ａ．ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２は中皮腫細胞株で発現する
悪性中皮腫細胞内でのエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を様々な方法によってＲＮＡ及び蛋白質レベルで決定した。ＲＴ−ＰＣＲから、４種の細胞株の全てがエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４を発現することが示された（図１１Ａ）。これらの細胞株において、蛋白質発現をウェスタンブロットで決定した。ＥｐｈＢ４に特異的なバンドが１２０ｋＤで見られた。さらに、エフリンＢ２は、試験した全ての細胞株において、ウェスタンブロット上で３７ｋＤのバンドとして検出された（図１１Ｂ）。エフリンＢ２に非特異的なバンドが、ネガティブコントロールとして包含された２９３個のヒト胚腎臓細胞で観察された。
中皮腫細胞内にＥｐｈＢ４転写産物が存在することを確認するために、in situ ハイブリダイゼーションを、チャンバースライド上で培養したＮＣｌ  Ｈ２８細胞株で実施した。ＥｐｈＢ４に特異的なシグナルを、アンチセンスプローブを使用して検出し、また、エフリンＢ２転写物も同一の細胞株で検出された。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２についてのセンスプローブはネガティブコントロールとしての役割を果たし、しかも該細胞にはハイブリダイズしなかった（図１２）。ＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２蛋白質の発現を該細胞株内で免疫蛍光分析によって確認した（図１３）。３種の細胞株が強いＥｐｈＢ４の発現を示すと共に、エフリンＢ２の発現がＨ２８とＨ２０５２に存在し且つＨ２３７３では弱く検出できた。
【０１１９】
Ｂ． 臨床試料におけるＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の発現の根拠
胸膜悪性中皮腫と診断された患者の胸水から培養された腫瘍細胞が単離され、そしてこれは、第１継代でＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の両方に対して陽性の染色を示した（図１３下列）。これらの結果は、中皮腫細胞株内でのＥｐｈＢ４とエフリンＢ２との同時発現を確認するものである。腫瘍細胞株で見られるこれらの結果が病状の発現を実際に反映しているのかどうかを判断するために、腫瘍生検試料をＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２に対して免役組織化学染色法に付した。両方の蛋白質に対する抗体は、染色腫瘍細胞内で陽性染色であることが明らかになった。代表的なデータを図１４に示す。
【０１２０】
例４．カポジ肉腫（ＫＳ）内でのエフリンＢ２の発現はヒトヘルペスウイルス８型によって誘導される
Ａ．ＫＳ腫瘍はエフリンＢ２を発現するが、ＥｐｈＢ４を発現しない
ＫＳ障害の高度に脈管性の性質及びこれらの腫瘍細胞の推定される内皮細胞起源は、それぞれ静脈内皮細胞及び動脈内皮細胞についてのマーカであるＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の発現の調査のきっかけになった。エフリンＢ２（ＥｐｈＢ４ではない）の転写産物をＫＳ生検の腫瘍細胞で in situ ハイブリダイゼーションによって検出した（図１５Ａ）。Ｈ＆Ｅ染色によって示されるようなエフリンＢ２アンチセンスプローブ及び腫瘍細胞による陽性シグナルの比較から、エフリンＢ２の発現は、腫瘍細胞を含む生検材料の領域に限定されることが示される。ＥｐｈＢ４アンチセンスプローブによるＫＳでのシグナルの欠落は、該プローブの欠陥によるものではない（扁平上皮癌で転写物が検出されたからである。本発明者は、この蛋白質を発現することを示した。）。ＫＳ腫瘍組織でのエフリンＢ２の発現についてのさらなる根拠は、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＦｃ抗体によって検出された、腫瘍細胞に対するＥｐｈＢ４／Ｆｃシグナルの局在によって与えられる。エフリンＢ２は、ＥｐｈＢ４に対する唯一のリガンドであるため、この試薬は、エフリンＢ２の発現に特異的である（図１５Ｂ左）。この二次試薬のみで処理された隣接切片は、特異的なシグナルを全く示さない。２色共焦点顕微鏡法によって、エフリンＢ２陽性細胞内にＨＨＶ−８潜伏蛋白質ＬＡＮＡ１が存在することが実証された（図１５Ｃ左）が、これはこのものが腫瘍細胞であり、この動脈マーカーを発現している腫瘍血管ではないことを示している。ＰＥＣＡＭ−１抗体による腫瘍生検材料の染色によって、この腫瘍の高度に脈管性の性質が明らかになった（図１５Ｃ右）。ＫＳ生検材料についてこのエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４発現パターンが一般的かどうかに関する試験的研究をＲＴ−ＰＣＲ分析によって実行した。６個の試料の全てがエフリンＢ２に対して陽性であったが、２個のみがＥｐｈＢ４に対してわずかに陽性であった（データは示さない）。
【０１２１】
Ｂ．ＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲは、エフリンＢ２発現を誘導する
個々のウイルス蛋白質が全ウイルスで見られるエフリンＢ２の発現を誘導できたかどうかを試験するために、ＫＳ−ＳＬＫ細胞にＨＨＶ−８ＬＡＮＡ又はＬＡＮＡΔ４４０又はｖＧＰＣＲを安定にトランスフェクトした。安定なクローンのウェスタンブロットから、ｖＧＰＣＲをトランスフェクトしたＫＳ−ＳＬＫ内では、ＳＬＫ−ＬＡＮＡ又はＳＬＫ−ＬＡＮＡΔ４４０と比較して、エフリンＢ２を５倍誘導したことが明らかになった（図１６Ａ）。ベクター単独（pＣＥＦＬ）をトランスフェクトしたＳＬＫをコントロールとして使用した。また、ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞及びＳＬＫ−ｐＣＥＦＬ細胞も、エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現について、一時的にトランスフェクトしたＫＳ−ＳＬＫ細胞内での免疫蛍光によって試験した。図１６Ｂは、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬと比較して、ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞内でエフリンＢ２がさらに高発現していることを示している。ＥｐｈＢ４の変化は、ＳＬＫ−ｐＣＥＦＬと比較してＳＬＫ−ｖＧＰＣＲでは全く観察されなかった。これは、ＳＬＫ−ｖＧＰＣＲ細胞がＳＬＫ−ｐＣＥＦＬ細胞と比較して高レベルのエフリンＢ２を発現したこと実証していることは明らかである。これは、ＨＨＶ−８のｖＧＰＣＲがＫＳにおけるエフリンＢ２の発現及び動脈表現型の変換の誘導に直接関与していることを示唆するものである。本発明者は、ＨＨＶ−８がＨＵＶＥＣでのエフリンＢ２の発現を誘導したことを示したため、続いて、本発明者は、これが転写効果によって仲介できたかどうかを試験した。エフリンＢ２の５'−フランキングＤＮＡ−ルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、そしてこれをＨＵＶＥＣに一時的にトランスフェクトした。エフリンＢ２の５'−フランキングＤＮＡ配列−２４９１／−１１は、ＨＵＶＥＣ細胞内で最小の活性を有する（図１６Ｃ）。これは、動脈（静脈ではない）マーカーであるエフリンＢ２と一致する。しかしながら、本発明者は、培養状態のＨＵＶＥＣがＲＮＡレベルでいくつかのエフリンＢ２を発現することに気づいた。ＨＨＶ−８ｖＧＰＣＲの同時トランスフェクションによって、コントロールの発現ベクターｐＣＥＦＬと比較して約１０倍のエフリンＢ２転写が誘導される。おおむね等しい誘導がエフリンＢ２配列−２４９１／−１１、−１２４２／−１１又は−５７７／−1 1で見られたが、これは−５７７から−１１の間の要素がｖＧＰＣＲに対する応答を仲介するのに十分であることを示すものの、最大の活性は−１２４２／−１１ルシフェラーゼ構築物で見られる。
【０１２２】
例５．膀胱癌におけるＥｐｈＢ４の発現
図１７は、膀胱癌細胞株でのＥｐｈＢ４の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル伝達経路によるＥｐｈＢ４発現の調節（Ｂ）を示している。
【０１２３】
例６．可溶性ＥｐｈＢ４ポリペプチドの作製
（１）エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の組換え可溶性誘導体産生用の哺乳動物発現ベクター
全長ＯＲＦを有するヒトＥｐｈＢ４（ｈＢ４）ｃＤＮＡを含むベクターをＰＣＲによってプライマー：GGATCCgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCT（５Ｂａｍ−ｈＢ４）及びGCGGCCGCTCAGTACTGCGGGGCCGGT（３Ｎｏｔｌ−Ｂ４）で増幅させ、そしてＢａｍＨＩ−Ｎｏｔｌで切断したｐＲＫ５ベクターにクローン化した。
ｈＢ４の全長ＯＲＦを有するＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ−１断片の配列
ggatccgccatggagctccgggtgctgctctgctgggcttcgttggccgcagctttggaagagaccctgctgaacacaaaattggaaactgctgatctgaagtgggtgacattccctcaggtggacgggcagtgggaggaactgagcggcctggatgaggaacagcacagcgtgcgcacctacgaagtgtgtgaagtgcagcgtgccccgggccaggcccactggcttcgcacaggttgggtcccacggcggggcgccgtccacgtgtacgccacgctgcgcttcaccatgctcgagtgcctgtccctgcctcgggctgggcgctcctgcaaggagaccttcaccgtcttctactatgagagcgatgcggacacggccacggccctcacgccagcctggatggagaacccctacatcaaggtggacacggtggccgcggagcatctcacccggaagcgccctggggccgaggccaccgggaaggtgaatgtcaagacgctgcgtctgggaccgctcagcaaggctggcttctacctggccttccaggaccagggtgcctgcatggccctgctatccctgcacctcttctacaaaaagtgcgcccagctgactgtgaacctgactcgattcccggagactgtgcctcgggagctggttgtgcccgtggccggtagctgcgtggtggatgccgtccccgcccctggccccagccccagcctctactgccgtgaggatggccagtgggccgaacagccggtcacgggctgcagctgtgctccggggttcgaggcagctgaggggaacaccaagtgccgagcctgtgcccagggcaccttcaagcccctgtcaggagaagggtcctgccagccatgcccagccaatagccactctaacaccattggatcagccgtctgccagtgccgcgtcgggtacttccgggcacgcacagacccccggggtgcaccctgcaccacccctccttcggctccgcggagcgtggtttcccgcctgaacggctcctccctgcacctggaatggagtgcccccctggagtctggtggccgagaggacctcacctacgccctccgctgccgggagtgccgacccggaggctcctgtgcgccctgcgggggagacctgacttttgaccccggcccccgggacctggtggagccctgggtggtggttcgagggctacgtccggacttcacctatacctttgaggtcactgcattgaacggggtatcctccttagccacggggcccgtcccatttgagcctgtcaatgtcaccactgaccgagaggtacctcctgcagtgtctgacatccgggtgacgcggtcctcacccagcagcttgagcctggcctgggctgttccccgggcacccagtggggcgtggctggactacgaggtcaaataccatgagaagggcgccgagggtcccagcagcgtgcggttcctgaagacgtcagaaaaccgggcagagctgcgggggctgaagcggggagccagctacctggtgcaggtacgggcgcgctctgaggccggctacgggcccttcggccaggaacatcacagccagacccaactggatgagagcgagggctggcgggagcagctggccctgattgcgggcacggcagtcgtgggtgtggtcctggtcctggtggtcattgtggtcgcagttctctgcctcaggaagcagagcaatgggagagaagcagaatattcggacaaacacggacagtatctcatcggacatggtactaaggtctacatcgaccccttcacttatgaagaccctaatgaggctgtgagggaatttgcaaaagagatcgatgtctcctacgtcaagattgaagaggtgattggtgcaggtgagtttggcgaggtgtgccgggggcggctcaaggccccagggaagaaggagagctgtgtggcaatcaagaccctgaagggtggctacacggagcggcagcggcgtgagtttctgagcgaggcctccatcatgggccagttcgagcaccccaatatcatccgcctggagggcgtggtcaccaacagcatgcccgtcatgattctcacagagttcatggagaacggcgccctggactccttcctgcggctaaacgacggacagttcacagtcatccagctcgtgggcatgctgcggggcatcgcctcgggcatgcggtaccttgccgagatgagctacgtccaccgagacctggctgctcgcaacatcctagtcaacagcaacctcgtctgcaaagtgtctgactttggcctttcccgattcctggaggagaactcttccgatcccacctacacgagctccctgggaggaaagattcccatccgatggactgccccggaggccattgccttccggaagttcacttccgccagtgatgcctggagttacgggattgtgatgtgggaggtgatgtcatttggggagaggccgtactgggacatgagcaatcaggacgtgatcaatgccattgaacaggactaccggctgcccccgcccccagactgtcccacctccctccaccagctcatgctggactgttggcagaaagaccggaatgcccggccccgcttcccccaggtggtcagcgccctggacaagatgatccggaaccccgccagcctcaaaatcgtggcccgggagaatggcggggcctcacaccctctcctggaccagcggcagcctcactactcagcttttggctctgtgggcgagtggcttcgggccatcaaaatgggaagatacgaagaaagtttcgcagccgctggctttggctccttcgagctggtcagccagatctctgctgaggacctgctccgaatcggagtcactctggcgggacaccagaagaaaatcttggccagtgtccagcacatgaagtcccaggccaagccgggaaccccgggtgggacaggaggaccggccccgcagtactgagcggccgc。
【０１２４】
また、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ全長（ＦＬ）ヒトＥｐｈＢ４の別バージョンもクローン化した。相違点は、クローニングのために使用した３'−末端ＰＣＲオリゴプライマー：
３Ｎｏｔｌ−Ｂ４  GCGGCCGCTCAGTACTGCGGGGCCGGT 
３Ｎｏｔ２−Ｂ４  GCGGCCGCAGTTCCTGCAGGTCAAGTACT
である。
【０１２５】
エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の組換え可溶性誘導体発現用のプラスミドベクターは、ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）、ｐＩＧ（ノバジェン社）又はｐＲＫ５を基礎とする。ｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯは、ヒト伸長因子ｌαエンハンサー／プロモーターとブラストサイジン耐性マーカーを含む。ｐＩＧベクターは、ＣＭＶプロモーター調節下でヒトＩｇＧ１のＦｃ部分との蛋白質融合を高レベルで発現させるためにデザインされており、ｐＲＫ５は、多目的ＣＭＶプロモーター含有ほ乳類発現ベクターである。プラスミド構築物ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴを作製するために、ヒトＥｐｈＢ４のｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲによってオリゴプライマー５'−GGATCCGCC ATGGAGCTC CGGGTGCTGCT−３'及び５'−TGGATCCCT GCTCCCGC CAGCCCTCG CTCTCATCCA−３'を使用して増幅させ、そしてｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターにＴＯＰＯクローニングした。ｐＥＦ６−ｈＢ４ＥＣｖ３を、ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣＮＴから、該プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶ及びＢｓｔＢＩで消化し、それらの末端をクレノウ酵素でフィルインし、そして該ベクターに再度連結することによって得た。ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴによってコードされる組換えＥｐｈＢ４誘導体は、エピトープタグ又は精製タグを含まないが、ｐＥＦ６−ｈＢ４ＥＣｖ３によってコードされる類似のＢ４ＥＣｖ３蛋白質は、状態調整された培地からの精製を容易にするためにそのＣ末端上にＶ５エピトープタグ及び６ｘＨｉｓタグを含む。プラスミド構築物ｐＥＦ６−ｈＢ２ＥＣを、オリゴプライマー５'−TGGATCCAC CATGGCTGT GAGAAGGGAC−３'と共に５'−ATTAATGGTGATGGT GAT GATGACTAC CCACTTCGG AACCGAGGAT GTTGTTC−３'を使用したエフリンＢ２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅及びｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクターへのＴＯＰＯクローニングによって作製した。プラスミド構築物ｐＩＧ−ｈＢ２ＥＣ−ＦＣを、オリゴプライマー５'−TAAAGCTTCCGCCATGG CTGTGAGAAGGGAC−３'及び５'−TAGGATCCACTTCGGA ACCGAGGATGTTGTT CCC−３'を使用してエフリンＢ２ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、続いてＴＯＰＯクローニングし、そして得られたＰＣＲ断片の配列を決定し、その後ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで切断したｐＩＧ  ｈｌｇＧｌ Ｆｃ融合体発現ベクターにサブクローニングすることによって作製した。同様に、ｐＩＧ−ｈＢ２ＥＣ及びｐＩＧ−ｈＢ４ＥＣｖ３を、オリゴプライマー５'−ATAAGCTTCC GCCATGGAGC TCCGGGTGCTG−３'と共に５'−TTGGATCCTGCTCCCG CCAGCCCTCGC TCTCATC−３'を使用してＥｐｈＢ４  ＥＣＤ ｃＤＮＡの部分をＰＣＲ増幅し、その後ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで切断したｐＩＧ  ｈｌｇＧｌ Ｆｃ融合体発現ベクターにサブクローニングすることによって作製した。これらのベクターによってコードされる蛋白質の予想配列は上記した。
【０１２６】
球状（Ｇ）ドメイン及びシステイン−リッチドメイン（Ｃ）を有する短縮ヒトＥｐｈＢ４ポリペプチド（「ＧＣ」ポリペプチド）をコードする構築物を、オリゴヌクレオチド：
５ＳｐｅＢ４  TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT
３ＮｏｔＢ４ＧＣ  gcggccgcttaatggtgatggtgatgatgAGCCGAAGGAGGGGTGGTGCA
を使用したＰＣＲ増幅によって調製した。
増幅した部分をｐＥＦ６へのＴＡクローニングによってクローン化した。該クローン化断片（Ｓｐｅｌ−Ｎｏｔｌ断片）の配列は次の通りである：
actagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGAAGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTcatcatcaccatcaccattaagcggccgc。
【０１２７】
球状ドメイン＋システインリッチドメイン（Ｂ４ＥＣ−ＧＣ）前駆体蛋白質の配列は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAHHHHHH。
【０１２８】
治療用途を含めた多くの用途のためには、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、しかしてプロセシングを受けた形態はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ...から始まる）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを除去し又は省略することができる。
【０１２９】
ＧＣ蛋白質用のプラスミドは次の配列を有する：
AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGCCTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTGCCCTTtactagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGACGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTcatcatcaccatcaccattaagcggccgcAAGGGCAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGTCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCGATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAAGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATAC GAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG AGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTC。
【０１３０】
球状ドメインと、Ｃｙｓリッチドメインと、第１ＦＮIIIドメイン（ＧＣＦ）とを有する短縮ヒトＥｐｈＢ４蛋白質をコードする核酸を、次のオリゴヌクレオチド：
５ＳｐｅＢ４  TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT
３ＮｏｔＢ４ＧＣＦｌ  AGCGGCCGCTTAATGGTGATGGTGATGATGGACATTGACAGGCTCAAATGGGA
を使用してＰＣＲで調製した。
【０１３１】
ｐＥＦ６にＴＡクローニングした。このクローン化断片（ＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ断片）の配列は次の通りである：
tactagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGAAGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCGGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCCATCATCACCATCACCATTAAgcggccgct。
【０１３２】
ＧＣＦ前駆体蛋白質の配列は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWWVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVHHHHHH。
【０１３３】
治療用途を含めて多くの用途のためには、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、しかしてプロセシングを受けた形態はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ...から始まる。）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを除去し又は省略することができる。
【０１３４】
プラスミドＤＮＡ配列は次の通りである：
AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGCCTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTGCCCTTtactagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGACGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGCCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGTCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCTGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCCATCATCACCATCACCATTAAgcggccgctAAGGGCAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACG CGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGG CAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGTCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCGATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAAGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTC。
【０１３５】
球状ドメインと、Ｃｙｓリッチドメインと、Ｃ末端タグＧＣＦ２（ｖ．３）を有する２個のＦＮIIIドメインとを有する短縮ヒトＥｐｈＢ４蛋白質をコードするベクターを、ｐＥＦ６−ＦＬ− ｈＢ４ＥＣから、ＥｃｏＲＶ及びＢｓｔＢＩで消化し、クレノウで処理し、そして再度連結反応させることによって得た。
【０１３６】
コードＦＬ−ｈＢ４ＥＣ前駆体（Ｈｉｓタグ付き）のアミノ酸配列は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDE EQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAG RSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVWRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQGSKRAILQIEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH。
【０１３７】
治療用を含めて多くの用途のためには、リーダー配列（最初の１５アミノ酸、しかしてプロセシングを受けた形態は、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ...から開始する。）及びＣ末端ヘキサヒスチジンタグを除去し又は省略することができる。
【０１３８】
プラスミドＤＮＡ配列は次の通りである：
aatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctaca acaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaattagcttggtactaatacgactcactatagggagacccaagctggctaggtaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttATAAGCTTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGG ATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGAAGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGG TGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCGGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGCAGTGTCTGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGGCTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCGTGGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAGAAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGGCAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCGCTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGGATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGGGATCCAAaagggcaattctgcagatcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcggggcatccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttggggatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccaggcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagcctttgtctcaagaagaatccaccctcattgaaagagcaacggctacaatcaacagcatccccatctctgaagactacagcgtcgccagcgcagctctctctagcgacggccgcatcttcactggtgtcaatgtatatcattttactgggggaccttgtgcagaactcgtggtgctgggcactgctgctgctgcggcagctggcaacctgacttgtatcgtcgcgatcggaaatgagaacaggggcatcttgagcccctgcggacggtgtcgacaggtgcttctcgatctgcatcctgggatcaaagcgatagtgaaggacagtgatggacagccgacggcagttgggattcgtgaattg ctgccctctggttatgtgtgggagggctaagcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactg cattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttc。
【０１３９】
正常のリーダー配列、続いてＣｙｓリッチ及び２個のＦＮIIIドメイン（ＣＦ２）を有する短縮ヒトＥｐｈＢ４蛋白質をコードするベクターを、該球状ドメインを欠失させることによって調製した。重複ＰＣＲを、Ｇを欠失させるようにデザインされたオリゴヌクレオチドで実行した：
断片１：５'−プライマー−５ＳｐｅＢ４
TACTAGTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCT
３'−プライマー−３ＲｅｖＢ４ 
CAGCTGagtttccaattttgtgttc
断片２：
５ｏｖｅｒＢ４−gaacacaaaattggaaactCAGCTGACTGTGAACCTGAC
３ＮｏｔＢ４ＧＣＦ２−GCGGCCGCCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCT
（第２フィブロネクチン反復配列の後にあるＣ末端Ｂ４ＥＣ  ＦＬ  配列の後にＮｏｔＩ部位を付加してｐＥＦ６内でＶ５及びＨｉｓタグへのフレーム単位の融合を可能する ）。ｐＥＦ６にＴＡクローニングし、次いでＮｏｔｌで消化し、ゲル精製し、そして自己連結させた。
【０１４０】
該クローン化断片（ＳｐｅＩ−ＮｏｔＩ断片）の配列は次の通りである：
tactagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCGGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGCAGTGTCTGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGGCTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCGTGGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAGAAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGGCAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCGCTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGGATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGGgcggccgc。
【０１４１】
ＣＦ２前駆体は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCWDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSWSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVWRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQGGRSSLEGPRFEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH。
【０１４２】
プラスミドＤＮＡ配列は次の通りである：
AATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGCCTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTAGCTTGGTACTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTGCCCTTtactagtccgccATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGTCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCTGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGCAGTGTCTGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGGCTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCTGTGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAGAAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGGCAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCGCTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGGATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGGgcggccgcTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACGCGTACCGGTCATCATCACCATCACCATTGAGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAGAATCCACCCTCATTGAAAGAGCAACGGCTACAATCAACAGCATCCCCATCTCTGAAGACTACAGCGTCGCCAGCGCAGCTCTCTCTAGCGACGGCCGCATCTTCACTGGTGTCAATGTATATCATTTTACTGGGGGACCTTGTGCAGAACTCGTGGTGCTGGGCACTGCTGCTGCTGCGGCAGCTGGCAACCTGACTTGTATCGTCGCGATCGGAAATGAGAACAGGGGCATCTTGAGCCCCTGCGGACGGTGTCGACAGGTGCTTCTCGATCTGCATCCTGGGATCAAAGCGATAGTGAAGGACAGTGATGGACAGCCGACGGCAGTTGGGATTCGTGAATTGCTGCCCTCTGGTTATGTGTGGGAGGGCTAAGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTC。
【０１４３】
ヘキサヒスチジンタグのような任意のＣ末端タグを欠失した好ましいＧＣＦ２短縮蛋白質をコードするベクターを、ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣｖ３−Ｖ５−Ｈｉｓから、Ｂ４ＥＣｖ３の３'（Ｃ末端）部分を再増幅してＶ５及びＨｉｓタグを除去し、そして再度ｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣｖ３−Ｖ５−Ｈｉｓにサブクローニングすることによって得た。
使用したＰＣＲプライマー：ＩｎｔＢ４−３：CATTGGATCAGCCGTCTGCC及び
Ｂ４ＥＣｖ３ＦＩＮ（tgtttaaacTTACTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCATCCAGTT）。
【０１４４】
Ｂ４ＥＣｖ３の正確なＮ末端部分を有する断片をｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣｖ３−Ｖ５−Ｈｉｓから切り出し、そしてＫｐｎＩ切断したｐＥＦ６−Ｉｎｔ３−Ｂ４ＥＣｖ３ＦＩＮ中間構築物にサブクローニングした。
全Ｈｉｎｄlll−ＰｍｅＩ断片の配列は次の通りである：
AAGCTTCCGCCATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGAAGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCGGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGCAGTGTCTGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGGCTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCGTGGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAGAAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGGCAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCGCTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGGATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGTAAgtttaaac。
【０１４５】
好ましいＧＣＦ２蛋白質（ここでは、ＧＣＦ２Ｆともいう）の前駆体配列は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCWDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVVWGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQ。
【０１４６】
プロセシングを受けた配列は次の通りである：
LEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCEVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELWPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVWRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAWLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQ。
【０１４７】
（２）ほ乳類細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎臓系統）細胞を、１０％透析ウシ胎仔血清及びｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質を有するＤＭＥＭ中で保持した。細胞を５％ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃に保持した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン社）を使用して、製造業者のプロトコールに従って実行した。トラスフェクションの１日前に、２９３Ｔ細胞をトランスフェクション時に８０％の集合に達するように高密度で接種した。１：３の比のプラスミドＤＮＡ及びリポフェクタミン試薬を血清使用量低減培地（インビトロジェン社）で５分間にわたって希釈し、そして互いに混合してＤＮＡ：リポフェクタミン複合体を形成させた。それぞれ１０ｃｍの培養皿に対して、１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。２０分後に、上記複合体を培養液中の細胞に直接添加した。トランスフェクションの１６時間後に、培地を吸引し、血清フリーのＤＭＥＭで１回洗浄し、そして血清フリーのＤＭＥＭと交換した。分泌された蛋白質を、条件培地を集めることによって４８時間後に採取した。条件培地を１０００００ｇで２０分間にわたる遠心分離によって浄化し、０．２μｍフィルターでろ過し、そして精製のために使用した。
【０１４８】
（３）安定な細胞株の作製
ＥｐｈＢ４ＥＣｖ３及びＥｐｈＢ４ＥＣｎｔを産生する安定な細胞株を作製するために、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に上記のようなｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣｖ３又はｐＥＦ６−Ｂ４ＥＣ−ＮＴプラスミド構築物をトランスフェクトし、そして抗生物質のブラストサイジンを使用して選択した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を低密度で接種した。翌日、細胞を１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンで処理した。薬剤選択の２週間後に、生存細胞をプールし、単細胞クローン増殖に対してさらに選択した。安定な細胞を確立した後に、これらのものを４μｇ／ｍＬのブラストサイジンで保持した。培養上清を試験してそれぞれの組換え蛋白質の発現と分泌を確認した。発現の特異性を、抗Ｂ４モノクローナル又はポリクローナル抗体によるウェスタンブロットと、Ｂ２ＥＣ−ＡＰ試薬結合アッセイ及び競合アッセイによって確認した。
【０１４９】
（４）蛋白質精製
ＨＥＫ２９３細胞にＥｐｈＢ４外部ドメイン（Ｂ４ＥＣｖ３）の分泌型をコードするプラスミドを一過性導入した。条件培地を集め、そして１０ｍＭのイミダゾール、０．３Ｍ のＮａＣｌを加え、２０,０００ｇで３０分間遠心分離して細胞片及び不溶性粒子を除去した。得られた上澄み液の８０ｍＬを１ｍＬのＮｉ−ＮＴアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）で予備平衡化されたカラム上に１０ ｍＬ／時間の流量でアプライした。該カラムを１０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．３Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８で洗浄し、残りの蛋白質を３ｍＬの０．２５Ｍイミダゾールで溶出させた。溶出した蛋白質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ８に対して一晩透析した。Ｂ４ＥＣｖ３の精製と同定をＰＡＧＥ／クマシーＧ−２５０及び抗ＥｐｈＢ４抗体によるウェスタンブロットによって確認した。最後に、Ｂ４ＥＣｖ３の濃度を測定し、そして蛋白質を分取し、−７０℃で保存した。
【０１５０】
Ｂ４ＥＣ−ＦＣ蛋白質及びＢ２ＥＣ−ＦＣ蛋白質を同様に精製した。
【０１５１】
ＥｐｈＢ４−血清アルブミン融合蛋白質の作製：
ＸｂａＩ−ＮｏｔＩとしてのヒト血清アルブミン断片を、ＧＣＦ２との融合体を作製してＧＣＦ２半減期を延長させるためにＰＣＲを行い、そしてｐＥＦ６にＴＡクローニングした。次の段階で、得られたベクターをＸｂａＩで切断し（部分消化）、そしてＨＳＡ断片（１．８ｋｂ）をｐＥＦ６−ＧＣＦ２−ＸｂａのＸｂａＩ部位にクローニングして融合体発現ベクターを作製した。得られたベクターは、成熟蛋白質の４位でＴｈｒからＩｌｅへの置換に至るＣからＴへの点突然変異を有していた。これをｐＥＦ６−ＧＣＦ２−ＨＳＡｍｕｔと呼んだ。次のクローニング段階で、この突然変異を、該変異体をｐＥＦ６−ＧＣＦ２−ＩＦからの野生型ＫｐｎＩ断片（ベクターの断片及びＧＣＦ２のＮ末端を含有する）で置換することによって除去し、この最終的なベクターをｐＥＦ６−ＧＣＦ２と呼んだ。Ｎ末端の接合部位は、この新たなＫｐｎ断片が異なるＧＣＦ２発現ベクターに由来するため、結果として変更された。ｐＥＦ６−ＧＣＦ２のＤＮＡ配列を確認した。
【０１５２】
ＨＳＡ−ＥｐｈＢ４前駆体蛋白質のアミノ酸は次の通りである：
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCDVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCWDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAVLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQSRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFKQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL。
【０１５３】
ＨＳＡ−ＥｐｈＢ４蛋白質の成熟型は次の通りである：
LEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCDVQRAPGQAHWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDTVAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCWDAVPAPGPSPS LYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESGGREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVWRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPVPFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAVLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSENRAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQSRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFKQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL。
【０１５４】
ｐＥＦ６−ＧＣＦ２のＤＮＡ配列は次の通りである：
aatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtcgactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatg cgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaattagcttggtactaatacgactcactatagggagacccaagctggctaggtaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattgcccttCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGACGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGCCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAG 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【０１５５】
Ａ．細胞培養及びトランスフェクション：
ヒト胚腎臓細胞株（２９３Ｔ細胞）を、１０％透析ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン抗生物質を有するＤＭＥＭ中で保持した。細胞を５％ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気中で３７℃に保持した。
【０１５６】
ＥｐｈＢ４外部ドメイン、それらの断片及びＥｐｈＢ４−ＨＳＡ融合体をコードするプラスミドのトランスフェクションを、リポフェクタミン２０００試薬（インビトロジェン社）を使用して示唆されたプロトコールに従って実行した。トラスフェクションの１日前に、２９３Ｔ細胞をトランスフェクション時に８０％の集合に達するように高密度で接種した。１：３の比のプラスミドＤＮＡ及びリポフェクタミン試薬を血清使用量低減培地（インビトロジェン社）で５分間にわたって希釈し、そして互いに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を形成させた。それぞれ１０ｃｍの培養皿に対して、１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。２０分後に、上記複合体を培養液中の細胞に直接添加した。トランスフェクションの１６時間後に、培地を吸引し、血清フリーのＤＭＥＭで１回洗浄し、そして血清フリーのＤＭＥＭと交換した。分泌された蛋白質を、条件培地を集めることによって４８時間後に採取した。条件培地を１０００００ｇで２０分間にわたる遠心分離によって浄化し、０．２μフィルターで濾過し、そして精製のために使用した。
【０１５７】
Ｂ．ＥｐｈＢ４外部ドメインとＥｐｈＢ４外部ドメイン−ＨＳＡ融合蛋白質とのクロマトグラフィーによる分離
ＨＳＡに融合したＥｐｈＢ４外部ドメインを次の通りに精製した：７００ｍＬの培地を血清フリーの培地中で成長した一過性導入２９３細胞から採取し、そして１２０ｍＬの最終容量にまで濃縮した。膜：（オメガ社、７６ｍｍ）、５０ｋＤa Ｃ／Ｏ。濃縮後に、該試料のｐＨを、６ｍＬのＩＭ ＮａＡｃ，ｐＨ５．５を添加することによって調整した。次いで、試料を出発緩衝液（ＳＢ）：２０ｍＭのＮａＡｃ，２０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ５．５に対してＯ／Ｎにわたり透析した。５ｍＬのＳＰ−セファロースをＳＢで平衡化し、そして試料を充填した。洗浄：１００ｍＬのＳＢ。ＮａＣｌによる溶出：１２ｍＬ／画分及び２０ｍＭの増分。エフリンＢ２結合活性のほとんどが１００ｍＭ及び１２０ｍＭ画分で溶出した。
【０１５８】
エフリンＢ２結合アッセイ法で活性な画分（ＳＰクロマトグラフィーの画分番号１００−１２０ｍＭを参照）をＱカラムでの精製の第２段階で使用した。採取した画分を出発緩衝液第２（ＳＢ２）：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ８に対してＯ／Ｎにわたり透析し、そして２ｍＬのＱ−セファロース上に充填した。２０ｍＬのＳＢ２で洗浄後に、吸着した蛋白質をＮａＣｌ：３ｍＬ／画分によって２５ｍＭの濃度増分で溶出させた。得られた画分をＰＡＧＥ及びエフリン−Ｂ２結合アッセイ法で分析した。２００ｍＭ及び２２５ｍＭの画分が大部分の蛋白質及び大部分のＢ２結合活性を含んでいたことが分かった。
【０１５９】
可溶性ＥｐｈＢ４外部ドメイン蛋白質を次の通りに精製した：３００ｍＬの条件培地（細胞培養及びトランスフェクション参照）を、３０ｋＤaＣ／Ｏの限外ろ過膜を使用して、１００ｍＬの最終容量にまで濃縮した。濃縮後に、該試料のｐＨを、５ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．５を添加することによって調整した。次いで、試料を、出発緩衝液（ＳｔＢ）：２０ｍＭの酢酸ナトリウム，２０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ５．５に対してＯ／Ｎにわたり透析した。５ｍＬのＳＰ−セファロースをＳｔＢで平衡化し、試料を充填した。このカラムを２０ｍＬのＳｔＢで洗浄した後、吸着した蛋白質をＮａＣｌの直線勾配で溶出させた（２０〜２５０ｍＭ及び２０カラムの容量の全溶出容量）。蛋白質の純度をＰＡＧＥで分析した。
【０１６０】
参照による援用
本明細書において言及した全ての文献及び特許文献は、あたかもそれぞれ個々の文献又は特許文献が具体的かつ個別的に参照によって援用されていることが示されるように、それらの全体における参照によって援用するものとする。
【０１６１】
主題の発明の特定の具体例を議論してきたが、上記の明細書は例示であって限定ではない。当業者であれば、本明細書及び特許請求の範囲の再検討に基づき、本発明の多くの変形例が明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの均等の全範囲とともに、及び本明細書をこのような変形例と共に参照することによって決定すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】Ｂ４ＥＣｖ３蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）図である。
【図２】Ｂ４ＥＣｖ３ＮＴ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）図である。
【図３】Ｂ２ＥＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）図である。
【図４】Ｂ４ＥＣｖ３−ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂ＥｐｈＢ４リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）図である。
【図５】Ｂ２ＥＣ−ＦＣ蛋白質のアミノ酸配列を示す（非開裂エフリンＢ２リーダーペプチドを含む前駆体の予想される配列を示す）図である。
【図６】可溶性ＥｐｈＢ４ＥＣ組換え蛋白質のドメイン構造を示す図である。
【図７Ａ】ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４発現と遺伝子増幅を示す図である。
【図７Ｂ】ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４発現と遺伝子増幅を示す図である。
【図７Ｃ】ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４発現と遺伝子増幅を示す図である。
【図７Ｄ】ＨＮＳＣＣ一次組織及び転移組織におけるＥｐｈＢ４発現と遺伝子増幅を示す図である。
【図８】ＨＮＳＣＣ細胞株におけるＥｐｈＢ４発現及び遺伝子増幅を示す図である。
【図９】前立腺細胞株におけるＥｐｈＢ４の発現を示す図である。
【図１０】前立腺癌組織でのＥｐｈＢ４の発現を示す図である。
【図１１】ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）及びウェスタンブロット（Ｂ）によって示されるようにＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２が中皮腫細胞内で発現していることを示す図である。
【図１２】エフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を中皮腫細胞内でのin situ ハイブリダイゼーションによって示す図である。
【図１３】中皮腫培養液中でのＥｐｈＢ４及びエフリンＢ２の細胞発現を示す図である。
【図１４】中皮腫におけるエフリンＢ２及びＥｐｈＢ４の発現を示す図である。
【図１５Ａ】エフリンＢ２（ＥｐｈＢ４ではない）がＫＳ生検組織内で発現することを示す図である。
【図１５Ｂ】エフリンＢ２（ＥｐｈＢ４ではない）がＫＳ生検組織内で発現することを示す図である。
【図１５Ｃ】エフリンＢ２（ＥｐｈＢ４ではない）がＫＳ生検組織内で発現することを示す図である。
【図１６】ＨＨＶ−８がカポジ肉腫細胞内で動脈マーカーの発現を誘導することを示す図である。
【図１７】膀胱癌細胞株内でのＥｐｈＢ４の発現（Ａ）及びＥＧＦＲシグナル伝達経路によるＥｐｈＢ４発現の調節（Ｂ）を示す図である。
【図１８Ａ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｂ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｃ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｄ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｅ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｆ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｇ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｈ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｉ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１８Ｊ】ヒトＥｐｈＢ４のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図１９】ヒトＥｐｈＢ４のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ａ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｂ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｃ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｄ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｅ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｆ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｇ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｈ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｉ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｊ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｋ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｌ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｍ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｎ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｏ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｐ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２０Ｑ】ヒトエフリンＢ２のゲノムヌクレオチド配列を示す図である。
【図２１】ヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡヌクレオチド配列を示す図である。
【図２２】ヒトＥｐｈＢ４のアミノ酸配列を示す図である。
【図２３】ヒトエフリンＢ２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２４】ＥｐｈＢ４抗体の例及びこれらの抗体のエピトープマッピングを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１８Ｊ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
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【図２０Ｋ】
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【図２０Ｌ】
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【図２０Ｍ】
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【図２０Ｎ】
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【図２０Ｏ】
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【図２０Ｐ】
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【図２０Ｑ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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