(57)【要約】【課題】DESGLA-VII因子ポリペプチド構造の除去による、VII因子ポリペプチドの原体の精製【解決手段】本発明は、desGla-VII因子ポリペプチド構造の形態の不純物を有するVII因子ポリペプチドの原体の精製方法に関する。該方法は、陰イオン交換物質を利用し所定のｐＨのバッファーによる洗浄及び／又は溶出を含む。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えVII因子ポリペプチドの原体の精製のための方法であって、前記原体が少なくとも３％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含み、該方法が以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(a) 前記原体を陰イオン交換物質に、該原体の一部が前記陰イオン交換物質へ結合することを促進する条件下で接触させること；
(b) 前記陰イオン交換物質を洗浄バッファーで洗浄すること；
(c) 前記陰イオン交換物質を溶出バッファーで溶出し、VII因子ポリペプチドの精製された原体を溶出物として収集すること；
ここにおいて、ローディングバッファー及び／又は洗浄バッファー及び／又は溶出バッファーは、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。
【請求項２】
前記工程(a)のVII因子ポリペプチドの原体が、少なくとも４％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程(a)の原体が、液体形状であり、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する、請求項１〜２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記洗浄バッファーが、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶出バッファーが、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄バッファー並びに前記溶出バッファーが、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶出バッファーが多くても6.5のｐＨを有する、請求項５及び６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶出バッファーが、一以上の２価の陽イオンを含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記２価の陽イオンが、Ca2+、Sr2+、Mg2+、及びBa2+から成る群から選択される２価の陽イオンを少なくとも一つ含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記２価の陽イオンが、Ca2+を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶出バッファーが、5-100 mMの範囲のような、少なくとも5 mMの２価の陽イオンの濃度を有する、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶出バッファーが、前記２価の陽イオンに関して勾配バッファーである、請求項８〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記勾配バッファーの２価の陽イオンの初期濃度が0-20 mMの範囲であり、前記勾配バッファーの２価の陽イオンの最終濃度が15-100 mMの範囲である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶出工程(c)が、一以上の陰イオンによる前記原体の競合的な溶出によって行われる、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記陰イオンが、クロライド、アセテート、マロネート、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、及びニトレートから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶出バッファーが、100-800 mMの範囲のCl-の濃度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶出バッファーが、Cl-に関して勾配バッファーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記勾配バッファーのCl- の初期濃度が0-300 mMの範囲であり、前記勾配バッファーのCl- の最終濃度が300-1000 mMの範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出バッファーが、100-800 mMの範囲のマロネートの濃度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出バッファーが、マロネートに関して勾配バッファーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記勾配バッファーのマロネートの初期濃度が0-300 mMの範囲であり、前記勾配バッファーのマロネートの最終濃度が300-1000 mMの範囲である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶出バッファーが、100-1000 mMの範囲のアセテート濃度を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶出バッファーが、アセテートに関して勾配バッファーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記勾配バッファーのアセテートの初期濃度が、0-400 mMの範囲であり、前記勾配バッファーのアセテートの最終濃度が、400-1000 mMの範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶出バッファーが、ｐＨに関して勾配バッファーである、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記勾配バッファーの初期ｐＨが5.0-6.9の範囲であり、前記勾配バッファーの最終ｐＨが2.5-4.5の範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶出バッファーのイオン強度が100-1000 mMの範囲である、請求項１〜２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程(c)において収集されたVII因子ポリペプチドの精製された原体が、工程(a)における原体と比較して、少なくとも１％ポイント少ないdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む、請求項１〜２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
VII因子ポリペプチドの精製された原体が、多くても2.0％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
VII因子ポリペプチドの原体の精製のための方法であって、前記原体が少なくとも４％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含み、該方法が以下の工程を含むことを特徴とする方法：
(a) 前記原体を陰イオン交換物質に、該原体の一部が該陰イオン交換物質へ結合することを促進する条件下で接触させること、前記原体は液体形状であり2.0-6.9の範囲のｐＨを有する；
(b) 前記陰イオン交換物質を、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する洗浄バッファーで洗浄すること；
(c) 前記陰イオン交換物質を溶出バッファーで溶出すること、該溶出バッファーは2.0-6.9の範囲のｐＨを有し、２価の陽イオンを含み、並びに、VII因子ポリペプチドの精製された原体を溶出物として収集すること、該収集された精製原体は、多くとも2.0％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、desGla-VII因子ポリペプチド構造の形態にある不純物を有するVII因子ポリペプチの原体(drug substances)の精製方法に関する。該方法は、陰イオン交換物質を利用し、また、所定のｐＨのバッファーによる洗浄及び／又は溶出を含む。
【背景技術】
【０００２】
例えば、VII因子、VIII因子、IX因子、X因子、及びタンパク質Cを含む、凝固カスケードに関与するタンパク質は、多様な病理学的状態を治療するのに有用な治療薬剤であることが分かっている。従って、薬学的に許容され、一様に所定の臨床的効力を示すそれらのタンパク質を含む製剤への要求が高まっている。
【０００３】
VII因子ポリペプチドの原体の精製のための全体的な工業的規模の方法は、該原体がかなりの量の対応するdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含むという欠点を確実に被る。即ち、該原体はかなりの量の不純物を含むと考えられる。これは当然望ましくなく、許容されない場合がある。
【発明の開示】
【本発明の説明】
【０００４】
本発明者らは、最も決定的な工程においてｐＨが低く維持される、ある特定の陰イオン交換方法を続けることによって、原体中のdesGla-VII因子ポリペプチド構造の存在を減少させるか、又は、実質的に排除することが可能であることを発見した。
【０００５】
本発明は、VII因子ポリペプチドの原体の精製のための方法であって、前記原体が少なくとも３％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含み、該方法が以下の工程を含むことを特徴とする方法を提供する：
(a) 前記原体を陰イオン交換物質に、該原体の一部が前記陰イオン交換物質へ結合することを促進する条件下で接触させること；
(b) 前記陰イオン交換物質を洗浄バッファーで洗浄すること；
(c) 前記陰イオン交換物質を溶出バッファーで溶出し、VII因子ポリペプチドの精製された原体を溶出物として収集すること；
ここにおいて、前記ローディングバッファー及び／又は洗浄バッファー及び／又は溶出バッファーは、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。
【０００６】
本発明に従った方法は、このように、特にdesGla-VII因子ポリペプチド構造のかなりの不純物、即ち、少なくとも３％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を有する、VII因子ポリペプチドの原体に関する。ある場合において、工業的規模のVII因子ポリペプチドの原体が高い量のdesGla-VII因子ポリペプチド構造、例えば、少なくとも４％、少なくとも4.5％又は少なくとも５％のような、desGla-VII因子ポリペプチド構造を含み、そして、本発明の方法がそのような原体により関連していることが理解されるであろう。
【０００７】
VII因子ポリペプチドと組合せて用いられる場合、desGla-VII因子ポリペプチド構造のパーセンテージ（％）は重量パーセントとして述べられる。
【０００８】
「desGla-VII因子ポリペプチド構造」という表現は、Gla-ドメインがLys38の近傍においてVII因子ポリペプチド分子から切断されたVII因子ポリペプチド構造を意味するように意図される。
【０００９】
VII因子ポリペプチドの原体におけるdesGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量は、実施例１に記載されたようなSDS-PAGEによって定量することができる。
【００１０】
これらに限定されないが、本発明の方法は、特に「工業的規模」（又は「大規模」）のVII因子ポリペプチドの原体に適する。「工業的規模」という用語によって、典型的には、液体VII因子ポリペプチド組成物の容量が、少なくとも100 L、少なくとも500 Lのような、例えば少なくとも1000 L、又は少なくとも5000 Lのようであり、或いは、該組成物の重量が少なくとも100 kg、少なくとも500 kg、例えば少なくとも1000 kg、又は少なくとも5000 kgのようであり、或いは、該産物の重量が少なくとも1 g（乾燥物質）、少なくとも10 g、例えば少なくとも50 g、例えば1-1000 g又は1-500 g又は1-100 gのようである方法が意味される。
【００１１】
本明細書で用いられる「原体(drug substance)」という表現は、固体質量(solid mass) 並びに液体質量(liquid mass)、例えば、VII因子ポリペプチドを含有する溶液又は懸濁液を意味するように意図される。「原体」という表現は、特に、「大きい」容量又は質量に適用するように意図される、即ち、大規模及び工業的規模の方法で知られる容量及び質量に適用される。  
「VII因子ポリペプチド」という用語はさらに下記で定義される。
【００１２】
工程(a)−原体と陰イオン交換物質との接触
該方法の第一の工程において、VII因子ポリペプチドの原体が陰イオン交換物質と接触される。その目的は、前記VII因子ポリペプチドの原体の一部が前記陰イオン交換物質に結合するのを促進するためである。
【００１３】
工程(a)に関して「一部」という用語は、VII因子ポリペプチドの原体中に存在するVII因子ポリペプチドの質量の少なくとも30％（即ち30-100％）を意味する。ほとんどの場合に、VII因子ポリペプチドの質量の30％をはるかに超えて、例えば少なくとも50％又は少なくとも70％又は所定の一部が結合することが望ましいことは理解されるであろう。「所定の一部」という用語は、VII因子ポリペプチドの原体中に存在するVII因子ポリペプチドの質量の少なくとも90％を意味する。より大きい部分が陰イオン交換物質に結合することが好ましく、例えばVII因子ポリペプチドの原体中に存在するVII因子ポリペプチドの質量の少なくとも95％、又は該質量の少なくとも98％、又は該質量の少なくとも99％、又は該質量の実質的に全てが結合することが好ましい。
【００１４】
VII因子ポリペプチドの原体は典型的には、工業的な規模の生産方法の、例えば、細胞培養物、クローン化動物（例えば、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及び魚）又は昆虫などから、特に細胞培養物から生じる。
【００１５】
陰イオン交換物質は、強陰イオン交換物質が好ましく、例えば、四級アンモニウム基を有する陰イオン交換物質が好ましい。そのような物質の商業的な例は、DEAEセファロース、Blueセファロース、及びAmersham BiosciencesのQ-セファロース・ファスト・フロー、及び、PerSeptive Biosystems又はTosohaas のPOROS HQ 50である。
【００１６】
陰イオン交換物質の最も普通のアレンジメントはカラムの型式である。バッチ容器中でのアレンジメントももちろん可能である。
【００１７】
VII因子ポリペプチドの原体は典型的には、先行する精製工程から直接得られ、或いは、先行する精製工程に続いて、ｐＨ、イオン強度、２価金属イオンのキレート化など必要なものはいずれも調節して得られる。
【００１８】
陰イオン交換物質に適用する前及び適用中の該原体のｐＨが、desGla-VII因子ポリペプチド構造の形成に関連する役割を果たすようにみえる。よって、該原体は、液体形態であり、陰イオン交換物質への適用時に2.0-6.9の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.5又は3.5-6.9の範囲のｐＨを有することが好ましい。いくつかの興味深い態様において、該原体は、2.0-6.8の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.8又は3.5-6.8、或いは2.0-6.7の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.7又は3.5-6.7、或いは2.0-6.6の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.6又は3.5-6.6、或いは2.0-6.5の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.5又は3.5-6.5、或いは2.0-6.4の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.4又は3.5-6.4の範囲のｐＨを有する。
【００１９】
これに限定されないが、その伝導率は典型的には5-30 mS/cmの範囲であり、例えば10-20 mS/cmの範囲である。該原体の温度は、これに限定されないが、典型的には0-15℃であり、例えばおよそ2-10℃である。
【００２０】
VII因子ポリペプチドと結合する陰イオン交換物質の温度は、これに限定されないが、典型的には0-15℃であり、例えばおよそ2-10℃であり、例えば、冷却ジャケット及び制御された温度の溶液を用いて特定の範囲に維持される。
【００２１】
VII因子ポリペプチドの原体の接触は、典型的には従来のプロトコールに従って行われる。即ち、該原体の濃度、温度、イオン強度などは通常であってよく、また、陰イオン交換物質は、通常のように適用の前に洗浄され平衡化されてよい。
【００２２】
VII因子ポリペプチドの添加（load）は典型的には、マトリクス（湿潤形態の陰イオン交換物質）１リットル当りのVII因子ポリペプチドが10-40 gの範囲であり、例えば、15-30 gの範囲であり、該原体は典型的には、１時間当り3-200のカラム容量（CV/h）、例えば少なくとも10 CV/h、例えば少なくとも20 CV/h又は少なくとも40 CV/h又は少なくとも80 CV/h、例えば、80-120 CV/hのようなフローで適用される。
【００２３】
工程 (b)−洗浄工程
VII因子ポリペプチドの原体の該陰イオン交換物質への結合の後、陰イオン交換物質からdesGla-VII因子ポリペプチド構造のかなりの割合を除去するために、洗浄工程 (b)が行われる。この工程によって、陰イオン交換物質上に残った（結合した）VII因子ポリペプチドの割合は、desGla-VII因子ポリペプチド構造のより低い存在量を有する。
【００２４】
この洗浄工程(b)は、2.0-6.9の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.5又は3.5-6.9の範囲のｐＨを有する洗浄バッファーによって行われることが好ましい。幾つかの興味深い態様において、該洗浄バッファーは、2.0-6.8の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.8又は3.5-6.8、又は2.0-6.7の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.7又は3.5-6.7、又は2.0-6.6の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.6又は3.5-6.6、又は2.0-6.5の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.5又は3.5-6.5、又は2.0-6.4の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.4又は3.5-6.4のｐＨを有する。
【００２５】
洗浄工程(b)は典型的には、１時間当り3-200カラム容量(CV/h)のフローで、例えば、少なくとも10 CV/h、例えば少なくとも20 CV/h又は少なくとも40 CV/h又は少なくとも80 CV/h、例えば80-120 CV/hのフローで行われる。
【００２６】
該洗浄バッファーは典型的には緩衝剤、典型的には、MES、PIPES、ACES、BES、TES、HEPES、TRIS、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、及びコハク酸の酸及び塩から成る群から選択される少なくとも一つの成分を含有する緩衝剤を含有する水溶液である。該緩衝剤が二以上の成分の混合物を含むことができ、ここで該混合物は特定の範囲のｐＨ値を提供することができることは理解されるであろう。例として、酢酸及び酢酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２７】
洗浄バッファーは、典型的にはカラムからのVII因子ポリペプチドの溶出を行うためには不足の陰イオン濃度の、塩等を含んでもよい。ｐＨ 6.0において、該洗浄バッファーは、100-250 mM NaCl、約10 mM ヒスチジン（緩衝剤）、ｐＨ 6.0の組成を有し得る。
【００２８】
該洗浄工程(b)は、一つ、二つ又は幾つかの異なる洗浄バッファーによって行われてよく、又は、勾配洗浄バッファーの適用によって行われてもよいことは理解されるであろう。
【００２９】
工程(c)−溶出工程
洗浄工程(c)の後、陰イオン交換物質は、溶出バッファーによって溶出され、VII因子ポリペプチドの精製された原体が溶出物として収集される。
【００３０】
溶出工程(c)では、かなりの変動性が起こり得る。溶出がかなり速く行われた場合は、溶出が6.9以上のｐＨで行われた場合でさえ、著しい量のdesGla-VII因子ポリペプチド構造の形成が抑制される。しかしながら、desGla-VII因子ポリペプチド構造の形成を避けるために、溶出バッファーは2.0-6.9の範囲のｐＨを有することも好ましく、例えば、3.0-6.5又は3.5-6.9の範囲のようなｐＨを有することが好ましい。幾つかの興味深い態様において、溶出バッファーは、2.0-6.8の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.8又は3.5-6.8、又は2.0-6.7の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.7又は3.5-6.7、又は2.0-6.6の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.6又は3.5-6.6、又は2.0-6.5の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.5又は3.5-6.5、又は2.0-6.4の範囲のｐＨ、例えば3.0-6.4又は3.5-6.4を有する。
【００３１】
溶出工程(b)は、典型的には、例えば少なくとも10 CV/h又は少なくとも20 CV/H、例えば20-60 CV/hのような、3-200カラム容量／時間(CV/h)のフローで行われる。
【００３２】
溶出のタイプは、特に重大な意味を持たないが、例えば、２価陽イオンを含む溶出バッファーで溶出すること、ある陰イオンの高濃度を利用する競合的溶出を行うこと、或いは、ｐＨ勾配を使用すること、又は前述の組み合わせを用いることが可能である。
【００３３】
一つの態様において、溶出は一以上の２価陽イオンを含む溶出バッファーによって行われる。２価陽イオンの濃度は、典型的には、少なくとも5 mMであり、例えば少なくとも10 mM、又はさらに少なくとも15 mMである。
【００３４】
２価の陽イオンは好ましくは、Ca2+、Sr2+、Mg2+、及びBa2+から成る群から選択される少なくとも一つの２価の陽イオンを含む。そのような２価の陽イオンは、VII因子ポリペプチドのGla-ドメインに結合する傾向を有し、それ故、陰イオン交換物質からのVII因子ポリペプチドの原体の遊離を促進する。一つの好ましい態様において、２価の陽イオンはCa2+を含む。
【００３５】
溶出バッファーは典型的には、5-100 mMの範囲、例えば10-40 mMの範囲のような、少なくとも5 mMの２価陽イオンの濃度を有する。
【００３６】
一つの変異形において、溶出バッファーは２価の陽イオン（例えばCa2+）に関する勾配バッファーであり、例えば２価の陽イオン（例えばCa2+）の初期濃度が0-20 mMの範囲であり、該勾配バッファーの２価の陽イオン（例えばCa2+）の最終濃度が15-100 mMの範囲である、勾配バッファーである。
【００３７】
他の態様において、溶出工程(c)は、一以上の陰イオン、例えば、１価、２価又は３価の陰イオンによる原体の競合的溶出によって行われる。そのような陰イオンは典型的には、クロライド、アセテート、マロネート、ホスフェート、カーボネート、スルフェート、及びニトレートから成る群から選択され；特にクロライド (Cl-)、アセテート及びマロネートから選択される。
【００３８】
一つの変異形において、該溶出バッファーは100-800 mMの範囲、例えば200-500 mMの範囲のCl-濃度を有する。或いは、該溶出バッファーは、Cl-に関する勾配バッファーであり、例えばCl-の初期濃度が0-300 mMの範囲であり、Cl-の最終濃度が300-1000 mMの範囲である勾配バッファーである。
【００３９】
さらなる変異形において、該溶出バッファーは100-800 mMの範囲、例えば200-500 mMの範囲のマロネートの濃度を有する。或いは、該溶出バッファーは、マロネートに関する勾配バッファーであり、例えばマロネートの初期濃度が0-300 mMの範囲であり、マロネートの最終濃度が300-1000 mMの範囲である勾配バッファーである。
【００４０】
さらなる変異形において、該溶出バッファーは、100-1000 mMの範囲、例えば400-800 mMの範囲のアセテート濃度を有する。或いは、該溶出バッファーは、アセテートに関する勾配バッファーであり、例えばアセテートの初期濃度が0-400 mMの範囲であり、アセテートの最終濃度が400-1000 mMの範囲である勾配バッファーである。
【００４１】
さらなる変異形において、該溶出バッファーは、ｐＨに関して勾配バッファーである。その一つの変異形において、該勾配バッファーの初期ｐＨは、5.0-6.9の範囲であり、該勾配バッファーの最終ｐＨは、2.5-4.5の範囲である。
【００４２】
幾つかの態様において、ローディングバッファー、洗浄バッファー、及び溶出バッファーから成る群から選択される少なくとも一つのバッファーが、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。幾つかの特に好ましい態様において、洗浄バッファー並びに溶出バッファーは2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。他の態様において、ローディングバッファー並びに洗浄バッファーは2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。他の態様において、ローディングバッファー、洗浄バッファー及び溶出バッファーのそれぞれは、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。他の態様において、ローディングバッファー、洗浄バッファー及び溶出バッファーの一つのみが2.0-6.9の範囲のｐＨを有する。
【００４３】
溶出バッファーがｐＨ勾配であるとき、洗浄工程(b)と溶出工程(c)を合せることが可能であり、それ故、この場合、4.5-6.9の範囲の初期ｐＨ及び2.0-4.5の範囲の最終ｐＨであるｐＨ勾配が有用なプロフィールを与え、ここではフォアフロント（forefront）が棄却され、残存画分が収集される、
溶出工程(c)に関して、一般に、溶出バッファーのイオン強度が100-1000 mMの範囲、200-800 mMのような範囲にあることが好ましい。
【００４４】
「精製された原体」という用語は、得られた原体、即ち、工程(c)で収集された原体が、工程(a)で適用された原体よりもdesGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量が低いことを意味する。「精製」という用語は、精製された原体を得ることができる方法、即ち、本発明の方法を指す。
【００４５】
本発明の方法が、極めて効率良くVII因子ポリペプチドの原体からdesGla-VII因子ポリペプチド構造を除去することを可能とし、また、そのようなdesGla-VII因子ポリペプチド構造の形成を抑制することを可能にするということが発見されている。従って、好ましい態様において、工程(c)で収集されたVII因子ポリペプチドの精製された原体は、工程(a)の原体と比較して、少なくとも1％ポイント少ない（1%-point less）のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む。
【００４６】
さらに特には、VII因子ポリペプチドの精製された原体は、多くとも2.5％、多くとも2.0％のような、又は多くとも1.5％のような、desGla-VII因子ポリペプチド構造を含む。
【００４７】
通常、陰イオン交換物質は、後の使用のために一連の工程によって再生される。
【００４８】
好ましい態様
本発明の方法は、VII因子ポリペプチドの精製された原体を得るために特に有用であり、工程(a)-(c)のｐＨに関する条件が適切に選択された場合、desGla-VII因子ポリペプチド構造の形成を減少させ、それによって該方法の全体的な収率を上昇させることさえ可能である。
【００４９】
よって、本発明の好ましい態様は、VII因子ポリペプチドの原体の精製のための方法を提供し、前記原体は少なくとも4％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含み、前記方法は次の工程を含む：
(a) 前記原体を陰イオン交換物質に、該原体の一部が該陰イオン交換物質へ結合することを促進する条件下で接触させること、前記原体は液体形状であり2.0-6.9の範囲のｐＨを有する；
(b) 前記陰イオン交換物質を、2.0-6.9の範囲のｐＨを有する洗浄バッファーで洗浄すること；
(c) 前記陰イオン交換物質を溶出バッファーで溶出すること、該溶出バッファーは2.0-6.9の範囲のｐＨを有し、２価の陽イオンを含み、並びに、VII因子ポリペプチドの精製された原体を溶出物として収集すること、該収集された精製原体は、多くとも2.0％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む。
【００５０】
VII因子ポリペプチド
ここで用いられるように、「VII因子ポリペプチド」という用語は、野性型VII因子（即ち、米国特許第4,784,950に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド)、並びに、野性型VII因子に対して実質的に同じであるか又は改善された生物活性を示す、VII因子の変異体、誘導体及び接合体を包含する。「VII因子」という用語は、それらの未切断（チモーゲン）形態にあるVII因子ポリペプチド、並びにタンパク分解的に処理されてそれらのそれぞれの生理活性形態（VIIa因子と命名される）を産するものを包含するよう意図される。典型的には、VII因子は、残基152と153の間で切断されてVIIa因子を産する。「VII因子ポリペプチド」という用語はまた、そのVIIa因子生物活性が野性型のVIIa因子の活性と比較して実質的に改変されたか又は幾分減少された変異体を含む、ポリペプチドを包含する。それらのポリペプチドは、これらに限定されないが、該ポリペプチドの生理活性を改変するか又は乱す特異的なアミノ酸配列変化がその中に導入されたVII因子又はVIIa因子を含む。
【００５１】
血液凝固におけるVIIa因子の生物活性は、その(i)組織因子(TF)に結合する能力、及び(ii) IX因子又はX因子のタンパク分解的切断を触媒して活性化されたIX因子又はX（それぞれ、IXa因子又はXa因子）を生成する能力に由来する。
【００５２】
「改善された生物活性」という用語は、i) 組換え野性型ヒトVIIa因子と比較して実質的に同じであるか又は上昇したタンパク分解活性を有するFVII ポリペプチド、或いはii) 組換え野性型ヒトVIIa因子と比較して、実質的に同じであるか又は上昇したTF結合活性を有するFVIIポリペプチド、或いは iii) 組換え野性型ヒトVIIa因子と比較して、実質的に同じであるか又は上昇した血漿中の半減期を有するFVII ポリペプチドを称する。
【００５３】
本発明の目的のために、VII因子ポリペプチドの生物活性（「VII因子生物活性」）は、血液凝固を促進する製剤の能力を測定することによって定量され得る。本明細書に記載されたアッセイ４を参照されたい。このアッセイにおいて、生物活性は、対照サンプルに対する凝固時間の減少として表され、1 unit/mLのVII因子活性を含有するプールされたヒト血清標準と比較することによって「VII因子ユニット」に変換される。或いは、VIIa因子生物活性は、(i) VIIa因子又はVII因子関連ポリペプチドが、脂質膜に包埋されたTF及びX因子を含有する系において、活性化されたX因子（Xa因子）を生成する能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii) 水性の系においてX因子の加水分解を測定すること（「インビトロタンパク分解アッセイ」、下記アッセイ２を参照）；(iii) VIIa因子又はVII因子関連ポリペプチドのTFへの物理的な結合を、表面プラスモン共鳴に基づく機器を用いて測定すること(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(iv) VIIa因子及び／又はVII因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解を測定すること（「インビトロ加水分解アッセイ」、下記アッセイ１を参照）；又は(v) インビトロ系におけるTF非依存性のトロンビンの産生を測定すること（下記アッセイ３を参照）によって定量され得る。
【００５４】
野性型のVIIa因子に対して実質的に同じであるか又は改善した生物活性を有するVII因子変異体は、上記の凝固アッセイ（アッセイ４）、タンパク分解アッセイ（アッセイ２）、又はTF結合アッセイの一以上で試験されたとき、同じ細胞タイプで生産されたVIIa因子の比活性の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％及び最も好ましくは少なくとも約90％を示すものを包含する。野性型VIIa因子に対して実質的に減少した生物活性を有するVII因子変異体は、上記の凝固アッセイ（アッセイ４）、タンパク分解アッセイ（アッセイ２）、又はTF結合アッセイの一以上で試験されたとき、同じ細胞タイプで生産された野性型VIIa因子の比活性の約25％未満、好ましくは約10％未満、より好ましくは約5％未満、及び最も好ましくは約1％未満を示すものである。野性型VII因子に対して実質的に改変された生物活性を有するVII因子変異体は、これらに限定されないが、TF-非依存性X因子タンパク分解活性を示すVII因子変異体、及び、TFに結合するがX因子を切断しないものを含む。
【００５５】
VII因子の変異体は、野性型VII因子と実質的に同じであるか又はそれより良い生理活性を示すか、或いは、野性型VII因子に対して実質的に改変されたか又は減少された生理活性を示すかに関わらず、これらに限定されないが、一以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって、野性型のVII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００５６】
野性型VII因子と実質的に同じ生物活性を有するVII因子変異体の非限定的な例には、S52A-FVIIa、S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. BioｐＨys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示されたような、上昇したタンパク分解安定性を示すFVIIa変異体；残基290と291の間又は残基315と316の間でタンパク分解的に切断されたVIIa因子（Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995）；酸化型のVIIa因子(Kornfelt et al., Arch. Biochem. BioｐＨys. 363:43-54, 1999)；PCT/DK02/00189に開示されたようなFVII変異体；及びWO 02/38162 (Scripps Research Institute)に開示されたような、上昇したタンパク分解安定性を示すFVII変異体；WO 99/20767 (University of Minnesota)に開示されたような、改変されたGla-ドメインを有し、増強された膜結合を示すFVII変異体；及びWO 01/58935 (Maxygen ApS)に開示されたようなVII因子変異体が含まれる。
【００５７】
野性型のFVIIaと比較して上昇した生物活性を有するVII因子変異体の非限定的な例は、WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO 03/27147、WO 03/37932；WO 02/38162 (Scripps Research Institute)に開示されたようなFVII変異体；及びJP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示されたような増強された活性を有するFVIIa変異体を含む。
【００５８】
野性型VII因子に対して実質的に減少したか又は改変された生物活性を有するVII因子変異体の非限定的な例は、R152E-FVIIa（Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990）、S344A-FVIIa（Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995）、FFR-FVIIa（Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998）、及びGlaドメイン欠損VIIa因子（Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993）を含む。
【００５９】
VII因子ポリペプチドの例は、これらに限定されないが、野性型のVII因子、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、及びS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-VII因子、S60A-VII因子；R152E-VII因子、S344A-VII因子、Glaドメイン欠損VIIa因子；及びP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；及び233Thr〜240Asnのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するFVII、304Arg〜329Cysのアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するFVII、及び、Ile153〜Arg223のアミノ酸配列中に置換、付加、又は欠失を有するFVIIを含む。
【００６０】
「VII因子誘導体」という用語は、ここで用いられるように、親ペプチドのアミノ酸の一以上が、例えばアルキル化、グリコシル化、PEG化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって、遺伝的に及び／又は化学的に及び／又は酵素的に改変された、野性型VII因子に対して実質的に同じであるか又は改善した生物活性を示すFVIIポリペプチドを示すように意図される。これは、PEG化ヒトVIIa因子、システイン-PEG化ヒトVIIa因子及びそれらの変異体を含むがこれらに限定されない。VII因子誘導体の非限定的な例は、WO 03/31464及び米国特許出願US 20040043446、US 20040063911、US 20040142856、US 20040137557、及びUS 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)に開示されたような、グリコPEG化（GlycoPegylated）FVII誘導体；WO 01/04287、米国特許出願20030165996、WO 01/58935、WO 03/93465 (Maxygen ApS) 及びWO 02/02764、米国特許出願20030211094 (University of Minnesota)に開示されたようなFVII接合体を含む。
【００６１】
「PEG化(PEGylated)されたヒトVIIa因子」という用語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに接合したPEG分子を有するヒトVIIa因子を意味する。PEG分子が、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖部分を含む、VIIa因子ポリペプチドの任意の部分に結合し得ることは理解されるであろう。「システイン-PEG化(cysteine-PEGylated)ヒトVIIa因子」という用語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に接合したPEG分子を有するVIIa因子を意味する。
【００６２】
一つの好ましい態様において、VII因子ポリペプチドは、DNA組換え技術によって作製される（組換えVII因子ポリペプチド）。
【００６３】
幾つかの態様において、VII因子ポリペプチドは、ヒトVIIa因子(hFVIIa)であり、好ましくは組換え的に作製されたヒトVIIa因子(rhVIIa)である。幾つかの態様において、VII因子ポリペプチドは、PEG化VII因子ポリペプチドであり、好ましくはPEG化された組換え的に作製されたヒトVIIa因子である。
【００６４】
他の態様において、VII因子ポリペプチドはVII因子配列変異体である。
【００６５】
幾つかの態様において、VII因子ポリペプチドは、野性型ヒトVII因子と異なるグリコシル化を有する。
【００６６】
例えばVII因子ポリペプチドがVII因子関連ポリペプチド又はVII因子配列変異体であるような種々の態様において、本明細書に記載されたような「インビトロタンパク分解アッセイ」（アッセイ２）において試験されたとき、前記VII因子ポリペプチドの活性と、天然ヒトVIIa因子(野性型FVIIa)の活性との間の比は、少なくとも約1.25、好ましくは少なくとも約2.0、又は4.0、最も好ましくは少なくとも約8.0である。
【００６７】
幾つかの態様において、VII因子ポリペプチドはVII因子関連ポリペプチドであり、特に変異体であり、ここにおいて、該VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒトVIIa因子(野性型FVIIa)の活性の間の比は、「インビトロ加水分解アッセイ」（下記アッセイ１）で試験されたとき、少なくとも約1.25であり；他の態様において、該比は少なくとも約2.0であり；さらなる態様において、該比は少なくとも約4.0である。
【００６８】
VII因子ポリペプチドの精製された原体の使用
VII因子ポリペプチドの精製された原体に対応する画分を収集した後、溶液に処方されてよく、これはバイアル及び凍結乾燥に分配され得る。商業的に入手可能な、組換え的に製造されたFVIIポリペプチド組成物NovoSeven(R)(Novo Nordisk A/S, Denmark)に相当する最終産物の説明例として、1.2 mgの組換えヒトVIIa因子、5.84 mg NaCl、2.94 mg CaCl2、2 H2O、2.64 mg GlyGly、0.14 mg ポリソルベート80、及び60.0 mg マンニトールを含有するバイアル(1.2 mg)を挙げることができる。この産物は、使用の前に注射(WFI)のために、2.0 mLの水でｐＨ 5.5に再構成される。再構成されたとき、該タンパク質溶液は、使用のために２４時間は安定である。
【００６９】
組換え活性化VII因子(rFVIIa)の全体的な製造は、Jurlanderらによる「Seminars in Thrombosis and Hemostasis, Vol. 27, No. 4, 2001」に開示されている。
【実施例】
【００７０】
VII因子ポリペプチドの生物活性の定量に適するアッセイ
本発明に従う有用なVII因子ポリペプチドは、インビトロ試験において簡単に予備的に行うことができる適切なアッセイによって選択され得る。例として、本明細書では、VII因子ポリペプチドの活性のための簡単な試験（「インビトロ加水分解アッセイ」と表題される）を記載する。
【００７１】
インビトロ加水分解アッセイ（アッセイ１）
天然の（野性型）VIIa因子及びVII因子ポリペプチド（いずれも以降「VIIa因子」と称する）は比活性をアッセイされることができる。それらは、それらの比活性を直接比較するために同時にアッセイされ得る。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)上で行われる。色素生産性基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド（S-2288, Chromogenix, Sweden）、最終濃度1 mMが、0.1 M NaCl、5 mM CaCl2及び1 mg/mLウシ血清アルブミンを含有する50 mM HEPES、ｐＨ 7.4中のVIIa因子（最終濃度100 nM）に加えられる。405 nmでの吸光度が、スペクトロマックスTM 340プレートリーダー (Molecular Devices, USA)で連続的に測定される。20分のインキュベーションの間に発達した吸光度が、酵素を含まないブランクウェルでの吸光度を減算した後、VII因子ポリペプチド及び野性型VIIa因子の活性の間の比の算出に用いられる：
比＝（A405 nm VII因子ポリペプチド）/（A405 nm VIIa因子野性型）
それに基づいて、天然のVIIa因子と比較してより低い活性又はより高い活性を有するVII因子ポリペプチドを同定することができ、例えば該VII因子ポリペプチドの活性と天然のVII因子（野性型FVII）の活性との間の比が約1.0対1.0以上であるようなものを同定することができる。
【００７２】
VII因子ポリペプチドの活性は、X因子（「インビトロタンパク分解アッセイ」）のような生理学的基質を適切には100-1000 nMの濃度で用いて測定されることもでき、ここで、Xa因子の発生は、適切な色素生産性基質（例えばS-2765）の添加の後に測定される。加えて、該活性アッセイは、生理学的温度で行われ得る。
【００７３】
インビトロタンパク分解アッセイ（アッセイ２）
天然（野性型）VIIa因子及びVII因子ポリペプチド（いずれも以降「VIIa因子」と称する）は、それらの比活性を直接比較するために同時にアッセイされる。該アッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)中で行われる。0.1 M NaCl、5 mM CaCl2 及び1 mg/mLウシ血清アルブミンを含有する、100 μLの50 mM HEPES、ｐＨ 7.4中のVIIa因子(10 nM)及びX因子 (0.8 マイクロM)は、１５分間インキュベートされる。次いで、0.1 M NaCl、20 mM EDTA及び1 mg/mLウシ血清アルブミンを含有する50 μLの50 mM HEPES、ｐＨ 7.4を添加して、X因子の切断が停止される。発生したXa因子の量は、色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765, Chromogenix, Sweden)を最終濃度0.5 mMで添加して測定される。405 nmでの吸光度が、スペクトロマックスTM340プレートリーダー(Molecular Devices, USA)を用いて連続的に測定される。１０分間で発達した吸光度が、FVIIaを含まないブランクウェルの吸光度を減算した後、VII因子ポリペプチドと野性型のVIIa因子のタンパク分解活性の比を算出するために用いられる：
比＝（A405 nm VII因子ポリペプチド）/（A405 nm VIIa因子野性型）。
【００７４】
それに基づいて、天然のVIIa因子と比較してより低い活性又はより高い活性を有するVII因子ポリペプチドが同定され、例えばVII因子ポリペプチドの活性と、天然のVII因子（野性型FVII）の活性との間の比が約1.0対1.0以上であるようなものVII因子ポリペプチドが同定される。
【００７５】
トロンビン生成アッセイ（アッセイ３）
VIIa因子又はVII因子ポリペプチドのトロンビンを生成する能力は、全ての関連する凝固因子及び阻害剤を生理学的濃度で含有し（マイナスVIII因子、擬態性血友病A状態の場合)、また、活性化された血小板（「Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547」の543頁に開示されているように、これは参照によって本明細書に援用される）を含有する、アッセイ（アッセイ３）において測定することができる。
【００７６】
一段階凝固アッセイ（アッセイ４）
VII因子ポリペプチドの生物活性は、一段階凝固アッセイ（アッセイ４）を用いて測定できる。この目的のために、試験されるサンプルは50 mM PIPES-バッファー(ｐＨ 7.5) に希釈され、0.1％ BSA及び40 μlが、40 μlのVII因子欠損血漿及び10 mM Ca2+ 及び合成リン脂質を含有する80 μlのヒト組換え組織因子と共にインキュベートされる。凝固時間が測定され、平行線アッセイにおける参照標準を用いた標準曲線と比較される。
【００７７】
VII因子ポリペプチドの調製及び精製
本発明において用いるのに適したヒトの精製されたVIIa因子は、好ましくは、DNA組換え技術、例えばHagenら「Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986」によって開示されたような技術、或いは、欧州特許第0 200 421 (ZymoGenetics, Inc.)に開示されたような技術によって作製される。
【００７８】
VII因子もまた、「Broze and Majerus, J.Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980」及び「Hedner and Kisiel, J.Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983」に開示されたような方法によって生産され得る。それらの方法は、他の血液凝固因子の検出可能な量を含むことなくVII因子を産出する。さらに精製されたVII因子の製剤でさえ、最終精製工程としてさらなるゲル濾過を含むことによって得られる。次いで、VII因子は、既知の方法、例えば、XIIa因子、IXa因子又はXa因子のような、幾つかの異なる血漿タンパク質による方法によって、活性化されたVIIa因子に転換される。或いは、Bjoernらによって開示されたように(Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)、VII因子は、それをMono Q(R)（Ｐharmacia fine Chemicals）などのようなイオン交換クロマトグラフィーカラムを通過することによって、又は溶液中での自己活性化によって、完全に活性化され得る。
【００７９】
VII因子関連ポリペプチドは、野性型VII因子の改変又は組換え技術によって生成され得る。野性型VII因子と比較したとき変化したアミノ酸配列を有するVII因子関連ポリペプチドは、既知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発によって、天然のVII因子をコードする核酸においてアミノ酸コドンを変化させるか又はアミノ酸コドンのいくつかを除去するかの何れかによって、野性型VII因子をコードする核酸配列を改変することによって生成されうる。
【００８０】
置換が、VIIa因子分子の機能に重大な意味を持つ領域の外側でなされ、その結果なお活性なポリペプチドであることが可能であるということは、当業者には明らかであろう。VII因子ポリペプチドの活性に必須であるアミノ酸残基であり、それ故に置換の対象ではないことが好ましいものは、部位特異的な突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発のような当該分野で既知の方法に従って同定することができる（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照されたい）。後者の技術において、突然変異誘発は、分子中の正に帯電した残基の全てに導入され、得られた突然変異分子は、分子の活性に重大な意味を持つアミノ酸を同定するために凝固性、それぞれに架橋結合活性を試験される。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性ラベリング（例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312；Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904；Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照されたい）のような技術によって決定されるような三次元構造の分析によって決定されることもできる。
【００８１】
一つのヌクレオチドを他のヌクレオチドに交換するための、核酸配列への突然変異の導入は、当該分野で既知の任意の方法を用いて、部位特異的突然変異誘発によって行うことができる。所望の挿入断片を備えるスーパーコイルした二重鎖ＤＮＡベクター及び所望の突然変異を含んだ二つの合成プライマーの利用が、特に有用な方法である。ベクターの逆鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Pfu DNAポリメラーゼによって、温度サイクルの間に伸張する。プライマーの取込みによって、ねじれ型のニックを含有する突然変異プラスミドが発生する。温度サイクルに続いて、該産物は、メチル化及びヘミメチル化されたＤＮＡに特異的なDpnIで処理して、親ＤＮＡテンプレートを消化し、突然変異を含有する合成されたＤＮＡを選択する。変異体を創造し、確認し、単離するために当該分野で知られる他の方法は、例えば、遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術のようなものが用いられ得る。
【００８２】
起源の細胞からのポリペプチドの分離は、限定されないが、接着細胞培養物からの、所望の産物を含む細胞培養培地の取出し；非接着細胞の除去のための遠心分離又は濾過；などを含む、当該分野で既知の任意の方法によって達成され得る。
【００８３】
任意に、VII因子ポリペプチドはさらに精製され得る。精製は、限定されないが、親和性クロマトグラフィー、例えば、抗-VII因子抗体カラム(例えば、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986；及びThim et al., Biochem. 27:7785, 1988を参照)でのようなもの；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動的方法（例えば、調製用の等電点電気泳動(IEF)、溶解度差（differential solubility）（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出などを含む、当該分野で既知の任意の方法を用いて行われることができる。一般には、「Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982」；及び「Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989」を参照されたい。精製後は、該製剤は、宿主細胞に由来する非VII因子ポリペプチドの、10重量％未満、より好ましくは5％未満、最も好ましくは1％未満を含むことが好ましい。
【００８４】
本発明の内容において、該精製は、少なくとも一つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程を含む。
【００８５】
本発明の方法によっては完全に活性化されない場合、VII因子ポリペプチドは、XIIa因子又は例えば、IXa因子、カリクレイン、Xa因子、及びトロンビンのような、トリプシン用特異性を有する他のプロテアーゼを用いてタンパク分解的に切断されて活性化され得る。例えば、「Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972)」；Thomas、米国特許第4,456,591；及び「Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)」を参照されたい。或いは、VII因子ポリペプチドは、それをMono Q(R)(ＰＨarmacia)などのようなイオン交換クロマトグラフィーカラムに通すことによって、或いは、溶液中での自己活性化によって、活性化され得る。得られた活性化VII因子ポリペプチドは、次いで処方され、本願に開示されたように投与される。
【００８６】
以下の実施例は、本発明の方法の実行を説明するものである。それらの例は、説明の目的のために含まれるものであって、本発明の範囲を如何なる意味においても限定するよう意図されるものではない。
【００８７】
実施例１：desGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量の定量
全長VII因子ポリペプチド構造に対するdesGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量は、SDS-PAGEによって定量される。150 μlのサンプルを50 μlのサンプルバッファー（non reducing, NuPAGE）に加え、５分間煮沸する。10 μlのサンプルを、12％ BisTris NuPAGE Gel (Invitrogen)にロードする。ゲルに200ボルト、120 mAを55 分間流す。ゲルをクーマシーブリリアントブルー溶液で染色し、脱染して乾燥する。相対的なdesGla-VII因子ポリペプチド含有量を、約45 kDa でのdesGla-VII因子ポリペプチドバンドのエリアを、約50 kDaでのVII因子ポリペプチドバンドのエリアで割って算出する。
【００８８】
実施例Ａ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ファルマシアQ-セファロース・ファスト・フローを充填し、5 mM EDTA、10 mM ヒスチジン、ｐＨ 6.0を含有する5 CVの溶液で平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行われる。ロードは12％ desGla-VII因子ポリペプチド構造を含む1 mg/ml FVIIa 類似体を含有する濾過した溶液 40 CVsであり、続いて、50 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、ｐＨ 6.0を用いて5 CV洗浄される。溶出は、10 mM ヒスチジンでｐＨ 6.0に緩衝された、25 mM NaClから50 mM CaCl2、25 mM NaClの勾配を10 CV用いて行われる。全体の精製は、流速20 CV/h及び温度５℃で行われる。
【００８９】
該産物のピークは、おおよそ12 mM CaCl2で溶出する。溶出物は、SDS-PAGEで分析され、これは２％より少ないdesGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量（検出限界以下）を示す。
【００９０】
実施例Ｂ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ファルマシアQ-セファロース・ファスト・フローを充填され、5 mM クエン酸三ナトリウム(tri sodium citrate)、10 mMトリスを含有する、ｐＨ8.0の溶液5 CVで平衡化されたカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行われる。ロードは、12％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む、1 mg/mlのFVIIa類似体を含有する濾過された溶液40 CVであり、続いて、50 mM NaCl、10 mM トリス、ｐＨ 8.0を用いて5 CV洗浄される。溶出は、10 mM ヒスチジンによってｐＨ 6.0で緩衝された、50 mM NaClから750 mM NaClの勾配を20 CV用いて行われる。全体の精製は、流速10 CV/h及び温度５℃で行われる。
【００９１】
産物のピークは、おおよそ350 mM NaClで溶出する。溶出物は、SDS-PAGEによって分析され、これは、２％より低いdesGla-VII因子ポリペプチド構造の含有量（検出限界以下）を示す。
【００９２】
実施例Ｃ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ファルマシアQ-セファロース・ファスト・フローを充填され、5 mM EDTA、10 mMヒスチジンを含有する、ｐＨ6.0の溶液5 CVで平衡化されたカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行われる。ロードは、10％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む、1 mg/mlのFVIIa類似体を含有する濾過された溶液40 CVであり、続いて、50 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、ｐＨ6.0を用いて5 CV洗浄される。溶出は、25 mM NaCl、25 mMクエン酸、25 mM ヒスチジン、ｐＨ 6から、25 mM NaCl、25 mM クエン酸、25 mM ヒスチジン、ｐＨ 3までの勾配25 CVを用いて行われる。全体の精製は、流速20 CV/h及び温度５℃で行われる。
【００９３】
実施例Ｄ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ファルマシアQ-セファロース・ファスト・フローを充填し、5 mMクエン酸塩、10 mMトリスを含有するｐＨ 8.0の溶液5 CVで平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行われる。ロードは、（10％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む）1 mg/mlのFVIIa類似体を含有する濾過された溶液40 CVであり、続いて、150 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、ｐＨ 6.0を用いて5 CV洗浄される。溶出は、10 mM ヒスチジンでｐＨ 6.0で緩衝された、0 mM NaClから750 mM NaClまでの勾配20 CVを用いて行われる。全体の精製は、流速10 CV/h及び温度５℃で行われる。
【００９４】
実施例Ｅ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、POROS 50 HQを充填し、5 mM EDTA、10 mM ヒスチジンを含有するｐＨ 6.0の溶液5 CVで平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行った。ロードは、（10％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む）1 mg/mlのFVIIa類似体を含有する濾過された溶液40 CVであり、続いて、175 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、ｐＨ 6.0を用いて5 CV洗浄した。溶出は、10 mM ヒスチジンでｐＨ 6.0で緩衝された、50 mM NaClから30 mM CaCl2、50 mM NaClまでの勾配25 CVを用いて行った。全体の精製は、流速80 CV/h及び温度５℃で行った。
【００９５】
参考例Ｆ
陰イオン交換クロマトグラフィーは、QセファロースFFを充填し、10 mM Glyglyを含有するｐＨ 8.6の溶液5 CVで平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長さ＝7.85 ml カラム容量(CV))で行った。ロードは、（10％のdesGla-VII因子ポリペプチド構造を含む）1 mg/mlのFVIIaを含有する濾過された溶液20 CVであり、続いて、175 mM NaCl、10 mM Glygly、ｐＨ 8.6を用いて5 CV洗浄した。溶出は、10 mM GlyglyでｐＨ 8.6で緩衝された、50 mM NaClから30 mM CaCl2、50 mM NaClまでの勾配25 CVを用いて行った。全体の精製は、流速40 CV/h及び温度５℃で行った。  
SDS-PAGEは、desGla-VII因子ポリペプチドの含有量5-10 ％を示した。RP-HPLCによる質量バランスは、工程収率80％、即ち約20％の損失を示した。
【国際調査報告】
2008514216.tif 000002
2008514216.tif 000003
2008514216.tif 000004