(57)【要約】  ＣｐＧジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドを、少なくとも１個含んでいるアジュバントであって、該ＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチドは、１個又は多数個のＣｐＧジヌクレオチドを含有している。前記アジュバントは、狂犬病ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン又はそのほかのワクチンと組み合わせて使用される場合、ワクチンの免疫効果を顕著に増強させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個又は多数個のＣｐＧジヌクレオチドを含有している一本鎖デオキシヌクレオチド。
【請求項２】
以下の構造式中のいずれかによって示されることを特徴とする請求項１に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
（ｉ）（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ，但し、Ｘ１＝Ａ、Ｔ又はＧ；Ｘ２＝Ａ又はＴ；Ｙ１＝Ａ又はＴ；Ｙ２＝Ａ、Ｔ又はＣ；Ｌ、Ｍ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；ｎは０−６である；
（ｉｉ）（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（ＸＹ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ，但し、Ｘ＝Ａ又はＴ；Ｙ＝Ａ又はＴ；Ｌ、Ｍ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；ｎは０−６である；
（ｉｉｉ）（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ，但し、Ｌ、Ｍ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；ｎは０−６である；
（ｉｖ）（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧ（Ｍ）ｎ，但し、Ｘ１＝Ａ、Ｔ又はＧ；Ｘ２＝Ａ又はＴ；Ｌ、Ｍ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；ｎは０−６である；或いは
（ｖ）ＴＴＣＧＴＣＧを含む配列。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５の中のいずれかが示す配列を有していることを特徴とする請求項２に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、１５０、１６７、１６８の中のいずれかが示す配列を有していることを特徴とする請求項３に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
【請求項５】
前記一本鎖デオキシヌクレオチドに含まれている塩基が、以下の修飾方式中のいずれかによって修飾されていることを特徴とする請求項１に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド。
非チオ化修飾，チオ化修飾，部分的チオ化修飾，希有塩基修飾（ｄＩ，ｄＵなど），メチル基化修飾，メルカプト、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ  Ｃ６、Ｔｈｉｏｌ−Ｃ６  Ｓ−Ｓなどのほかの物質とのカップリング後に修飾を行う修飾方式。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の一本鎖デオキシヌクレオチドの、ワクチンのアジュバントとしての応用。
【請求項７】
前記一本鎖デオキシヌクレオチドを単独、或いはアルミニウムアジュバント、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント、ＭＰＬ又は乳剤の中の１種以上を含む非核酸アジュバントと組み合わせて使用されることを特徴とする請求項６に記載の応用。
【請求項８】
前記一本鎖デオキシヌクレオチドが、ワクチンと混合されるか又はワクチンと化学的にカップリングされるか、或いは前記一本鎖デオキシヌクレオチドがＤＮＡワクチン中にクローニングされることを特徴とする請求項６に記載の応用。
【請求項９】
前記ワクチンが、Ｂ型肝炎ウイルス血液源性ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスのウイルスベクターワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスの細菌ベクターワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、狂犬病ウイルス血液源性ワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、狂犬病ウイルスのウイルスベクターワクチン、狂犬病ウイルス細菌ベクターワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子導入植物ワクチンから選ばれ、前記ＤＮＡワクチンがＢ型肝炎ウイルスＤＮＡワクチン、狂犬病ウイルスＤＮＡワクチンから選ばれるものであることを特徴とする請求項８に記載の応用。
【請求項１０】
ワクチンを、請求項１〜５に記載の一本鎖デオキシヌクレオチド中の少なくとも１種と組み合わせて使用することを特徴とするワクチンの免疫原性を向上させる方法。
【請求項１１】
さらに非核酸類アジュバントと組み合わせて使用することも含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
使用対象が、すべての人間であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
使用対象が、すべての哺乳動物であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の一本鎖デオキシヌクレオチドの、ウイルスの感染予防及び関連疾病の治療に用いられる医薬物の製造における応用。
【請求項１５】
前記一本鎖デオキシヌクレオチドが、単独或いは、ウイルスの感染予防に用いられるワクチンと組み合わせて使用されることを特徴とする請求項１４に記載の応用。
【請求項１６】
前記使用が、筋肉、皮下、粘膜、胃腸、静脈、又は腹腔における使用を含むことを特徴とする請求項１５に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣｐＧジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に関しており、特に、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、狂犬病ウイルスワクチンのアジュバントとして用いられるＣｐＧジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドに関する。さらに、ＣｐＧジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドの配列にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、非メチル基化のシトシン−グアニンヌクレオチド（ＣｐＧ）を中心とするオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ＯＤＮ）であり、当該ＣｐＧの両端と隣接している塩基の配列は、大体５’ＰｕｒＰｕｒＣＧＰｙｒＰｙｒ３’との規律に沿っている。すなわち、５’末端が二つのプリンで、３’末端が二つのピリミジンである（非特許文献１）。研究結果によると、ＣｐＧ  ＯＤＮは複数種類の免疫効果細胞を活性化させることができ、非メチル基化のＣｐＧジヌクレオチドは、ＣｐＧ  ＯＤＮ配列が免疫学活性を具備する重要な条件である。細菌、ウイルス、無脊椎動物のＤＮＡは、非メチル基化のＣｐＧジヌクレオチドを有しているため免疫活性作用を具備しているが、脊椎動物のＤＮＡはその中に含まれているＣｐＧがメチル基化されているため、免疫活性作用を具備していない。免疫系はこれらの特定の非メチル基化のＣｐＧ配列を識別することによって、外来性ＤＮＡに対する免疫応答を誘発している（非特許文献２）。
【０００３】
狂犬病（ｒａｂｉｅｓ，恐水病（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉａ）とも言う）は、６０個を超える国において発生されたことのある疾病である（非特許文献３）が、その中で東南アジアにおける発病率は世界の他の国に比べて高く、中国内地における発病率は０．４／１０万〜１．５８／１０万に達している。最近、中国を含めて多くの国において狂犬病の発生率が高くなる傾向になっている（非特許文献４）。発病した患者の死亡率はほぼ１００％に達する。
【０００４】
ヒト狂犬病は、一般的に狂犬病ウイルスに感染した動物、例えば犬の咬傷によってヒトに伝染される。中国においては、８０〜９０％のヒト狂犬病が感染した犬の伝播によって発生する。ヒト狂犬病は中枢神経系を侵すことを特徴とする急性伝染病である（非特許文献５）。その臨床症状は、特有の怖水、怖風、強い不安感、咽喉頭筋の痙攣、進行性麻痺などである。
【０００５】
狂犬病ウイルスは、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するウイルスであり、大きさが約７５×１８０ｎｍである一本鎖のマイナス鎖ＲＮＡである。狂犬病ウイルスの外表面はタンパク質外膜によって囲まれており、その表面にリポタンパク質皮膜を有し、その皮膜の上に、糖タンパク質からなるスパイクが形成されている。狂犬病ウイルスは免疫原性を有しており、中和抗体を生成させることができ、雛、ガチョウ等の動物の赤血球を凝集させる機能を発揮できる。狂犬病ウイルスは、紫外線、第４級アンモニウム化合物、ヨードチンキ、過マンガン酸カリウム、アルコール、ホルムアルデヒドなどによって、失活される。１００℃に２分間加熱しても狂犬病ウイルスを失活させることができる。狂犬病ウイルスは低温に耐えられ、−７０℃或いは−４℃（凍結乾燥状態）の条件下で何年間も存在できる。
【０００６】
現在、狂犬病に対して特に有効な治療法がなく、狂犬病予防用の主な対策になっているのは、狂犬病ウイルスワクチンを接種することと、抗狂犬病の血清を使用することである。中国において用いられている狂犬病ウイルスワクチンは、ハムスター腎臓細胞ワクチンであるが、その免疫プロセスとして、第０日、第３日、第７日、第１４日および第３０日にそれぞれ１回ずつ筋肉注射して、全部５回筋肉注射をしている。酷く咬傷された人間に対しては、狂犬病ウイルスワクチンの使用量を増加してもよい。例えば、咬傷された当日から第６日まで毎日１回ずつ注射した後、さらに、第１０日、第１４日、第３０日、第９０日にそれぞれ１回ずつ注射して、合わせて１０回注射するほうが良い。人間の病犬に咬傷された後の平均発病率は１５〜２０％である。狂犬病ウイルスワクチンを注射することにより、狂犬病の発生を有効に予防することができる。全コース注射後の発病率は０．１５％である。
【０００７】
Ｂ型ウイルス肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による肝臓炎症性損害であり、人類の健康を影響する重篤な疾病である。２００４年までに、世界的に４億人がＢ型肝炎ウイルスに感染されており（非特許文献６）、アジア人が感染者の中で高い比例を占めている。中国においてＢ型肝炎ウイルスの保菌者は人口総数の１０％以上に達している。アルミニウムをアジュバントとするＢ型ウイルス肝炎の表面抗原遺伝子工学ワクチン（ＨｂｓＡｇ）を接種することは、Ｂ型肝炎ウイルスの伝播を予防／制御するための主な措置となっている。ＷＴＯの報道によると、１９８２年以後、世界的に１０億投与量のＢ型肝炎ウイルスワクチンが消費され、Ｂ型肝炎ウイルスの伝播を予防／制御するに非常に重要な役割を発揮している。このようなワクチンがＢ型肝炎を予防する主要なメカニズムは、保護性抗体であるＩｇＧ１を生成・分泌するように生体を誘導することである。このような抗体は、細胞外のウイルスを中和できるが、感染した細胞内に潜伏しているＢ型肝炎ウイルスを徹底的に除去することは不可能である。したがって、患者体内におけるＢ型肝炎ウイルスの隠匿を招く場合が多い。且つ、約１０％の人間が該ワクチンに対して反応力が低いか又は反応しない。そこで、現有Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの免疫活性を如何に向上させるか、または、細胞内に隠匿しているＢ型肝炎ウイルスを消滅できるメカニズムを有効に活性化できるワクチンを開発することが、重要な課題になっている。現在、国内外の研究者は各方面から新規ＨＢＶ遺伝子工学ワクチンについて研究を進んでいるが、その研究の重要な内容になっているのは、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの有効な免疫アジュバントを探すことである。ＣｐＧ  ＯＤＮは近年に発見された新規免疫アジュバントである。
【０００８】
数多くの実験結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮはＢ型肝炎ウイルスワクチンと相乗して、マウス、人間、人間以外の霊長類動物体内の特異性抗体の生成及び細胞毒性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）反応を促進でき（非特許文献７）、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの安全且つ有効なアジュバントとして使用できる。
【０００９】
１９９８年、Ｄａｖｉｓらは、ＨｂｓＡｇとＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６（アジュバントとして）にてＢＡＬＢ／ｃマウスに対して免疫を行った。Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原抗体（ＨＢｓＡｂ）を測定した結果、ＨｂｓＡｇにアジュバントとしてＣｐＧ  ＯＤＮを使用した場合にマウス体内に生成されたＨｂｓＡｂは、ＨｂｓＡｇにアジュバントとしてアルミニウムをアジュバントとして使用した場合より５倍高い。なお、ＨｂｓＡｇにアジュバントとしてＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントを使用した場合にマウス体内に生成されたＨｂｓＡｂは、ＨｂｓＡｇにアジュバントとしてアルミニウムアジュバントを使用した場合に比べ３５倍高く、ＨｂｓＡｇにアジュバントとしてＣｐＧ  ＯＤＮを使用していなかった場合には、ＨｂｓＡｂを生成しないか、低レベルのＨｂｓＡｂしか生成していなかった。上記の結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＨｂｓＡｇのアジュバントとしてマウスを刺激してＨｂｓＡｂを生成させるに用いられる場合、その作用がアルミニウムアジュバントより優れており、ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの間には強い相乗効果を発生できることが分かれる。ＥＬＩＳＡと５１Ｃｒキラー試験結果から、ＣｐＧ  ＯＤＮとＨｂｓＡｇ又はＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとＨｂｓＡｇとの併用により、Ｔｈ１型免疫応答を生成するようにマウスを刺激でき、その表現としてはＩｇＧ２ａＨＢｓＡｂを生成し、ＨＢＶ特異性のＣＴＬ反応を伴うとのことである。なお、アルミニウムアジュバントとＨｂｓＡｇとの併用によっては、主にＴｈ２型免疫応答を生成するようにマウスを刺激でき、その表現としてＩｇＧ１ＨｂｓＡｂは生成するが、ＨＢＶ特異性のＣＴＬ反応は伴わない。インビトロで細胞表面分子抗体の染色結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮがＨｂｓＡｇの免疫効果を増強させるメカニズムは、ＣｐＧ  が抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を誘導して共刺激分子を表現させること、Ｂリンパ細胞から生成された抗体を相乗的に刺激してクラス転換を発生させることと密接な関係を持っている（非特許文献８）。
【００１０】
以上の研究結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮはＢ型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとしていろんな面でその応用が期待されている。
【００１１】
【非特許文献１】G. Mutwiri, R . Pontarollo, S . BaBIUK . Bological activity of immunostimulatory CpG ODN motif in domestic animals. Veterinary Immunopathology, 2003, 91: 89-103.
【非特許文献２】YiAK, Klinman DM, Martin TL, et al. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. Immunol, 1996, 157(12):5394-402.
【非特許文献３】Wolfgang Haupt. Rabies - risk of exposure and current trends in prevention of human cases. Vaccine 1999 (17): 1742-1749.
【非特許文献４】David W Dreesen. A global review of rabies vaccines for human use. Vaccine, 1997,15,suppl s2-s6. D. Zienius, J. Bagdonas, A. Dranseika. Epidemiological situation of rabies in Lithuania from 1990 to 2000. Veterinary Microbiology, 2003(93):91-100.
【非特許文献５】ALAN C. JACKSON, WILLIAM H. WUNNER. Detection of Rabies Virus Genomic RNA and mRNA in Mouse and Human Brains by Using In Situ Hybridization. JOURNAL OF VIROLOGY, 1991,65(6):2839-2844.
【非特許文献６】Lin KW, Kirchner JT. Hepatitis B.Am Fam Physician, 2004 Jan 1, 69(1):75-82.
【非特許文献７】Weeranta RD, McCluskie MJ, Xu Y, et al. CpG ODN is a novel non-toxic adjuvant which induces stronger immune responses than many conventional adjuvants. Vaccine, 2000, 18: 1755-62.
【非特許文献８】Hartmann G, Weeratna RD, Ballas ZK, et al. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. Immunol, 2000, 164:1617-24.
【非特許文献９】厳家新、李承平、朱家鴻ら、狂犬病ウイルス中和抗体を測定する快速蛍光巣抑制試験方法の設立、中国生物製品雑誌、1998，11（2）：93-96；中華人民共和国衛生部. 中国生物製品規定（一部），北京：中国人口出版社，1996，201.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ワクチンのアジュバントとして使用可能のＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係るＣｐＧ  ＯＤＮの構造は以下の式１〜５で表すことができる。
【００１４】
１．（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｘ１＝Ａ，Ｔ，Ｇ；Ｘ２＝Ａ，Ｔ；Ｙ１＝Ａ，Ｔ；Ｙ２＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。Ｘ１はアデニン、チミン、グアニンでよい；Ｘ２はアデニン又はチミンでよい；Ｙ１はアデニン又はチミンでよい；Ｙ２はアデニン、チミン、シトシンでよい；Ｌ，Ｍはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
【００１５】
２．（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（ＸＹ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｘ＝Ａ，Ｔ；Ｙ＝  Ａ，Ｔ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。Ｘはアデニン又はチミンでよい；Ｙはアデニン又はチミンでよい；Ｌ，Ｍはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
【００１６】
３．（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。Ｌ，Ｍはアデニン、チミン、グアニン、シトシンでよい。
【００１７】
４．（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧ（Ｍ）ｎ、但し、Ｘ１＝Ａ，Ｔ，Ｇ；Ｘ２＝Ａ，Ｔ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。Ｘ１はアデニン、チミン、グアニンでよい；Ｘ２はアデニン又はチミンでよい；Ｌ，Ｍはアデニン、チミン、シトシンでよい。
【００１８】
５．ＴＴＣＧＴＣＧを含む配列。
【００１９】
本発明の詳細な説明に基づいて、当業者であれば、一本鎖デオキシヌクレオチドの塩基に対して修飾を行うことができることが分かるはずである。その修飾の方式としては、非チオ化修飾，チオ化修飾，部分的チオ化修飾，希有塩基修飾（ｄＩ，ｄＵなど），メチル化修飾，メルカプト、Ａｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒ  Ｃ６、Ｔｈｉｏｌ−Ｃ６  Ｓ−Ｓ等のほかの物質とのカップリングの後に修飾を行う修飾方式などが挙げられる。同様に、二つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含む一本鎖デオキシヌクレオチドであっても、その中におけるＣｐＧジヌクレオチドの作用は、ＣｐＧジヌクレオチドを一つのみ含む一本鎖デオキシヌクレオチドと同じく、本発明の目的を実現できる。
【００２０】
本発明のＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチドは、ワクチンの免疫効果を向上させるために、他の非核酸アジュバントと組み合わせて使用してもよい。前記非核酸アジュバントとしては、アルミニウムアジュバント、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント、ＭＰＬ、乳剤などが挙げられる。
【００２１】
本発明は、さらに、ワクチンの免疫原性を向上させる方法を提供している。前記方法は、ワクチンを本発明のアジュバントと組み合わせて使用することを特徴としている。前記アジュバントは、本発明のＣｐＧジヌクレオチド含有一本鎖デオキシヌクレオチドを少なくとも一つ含んでおり、該ＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチドは一つ又は二つ以上のＣｐＧジヌクレオチドを含んでいる。前記ワクチンとして、狂犬病ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチンが挙げられるが、これらに限られることではない。前記Ｂ型肝炎ウイルスワクチンとして、Ｂ型肝炎ウイルス血液源性ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスのウイルスベクターワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスの細菌ベクターワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡワクチンなどが挙げられるが、これらに限られることではない。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨｂｓＡｇ）が上記のワクチン中の主要な抗原成分であってもよい。前記狂犬病ワクチンとしては、狂犬病ウイルス血液源性ワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子工学タンパク質類ワクチン、狂犬病ウイルスのウイルスベクターワクチン、狂犬病ウイルス細菌ベクターワクチン、狂犬病ウイルス遺伝子導入植物ワクチン、狂犬病ウイルスＤＮＡワクチンが挙げられるが、これらに限られることではない。なお、本発明のアジュバントは非核酸類のアジュバントと組み合わせて使ってもよい。
【００２２】
本発明のアジュバントは、狂犬病ウイルスワクチンと組み合わせて使われる場合、生体の狂犬病ウイルスに対する反応を顕著に向上させることができ、狂犬病ワクチンの注射回数を減少できる。又、ＨｂｓＡｇと組み合わせて使われる場合、ＣｐＧ  ＯＤＮはＢ型肝炎ウイルスワクチンの免疫原性を増強させることができ、速やかに免疫反応を行うように生体を刺激して、Ｔｈ１免疫応答を誘導し、免疫反応時限を延長して、免疫回数を減少できる。かつ、未成熟又は老衰個体の免疫活性を向上させることができる。このように、ＣｐＧ  ＯＤＮはＢ型肝炎ウイルスワクチンのアジュバントとして使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、実施例にて、当業者が理解できるように本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の目的を説明するための例に過ぎなく、本発明を制限できるものではない。
【００２４】
（実施例１：ＣｐＧ一本鎖デオキシヌクレオチドの設計）
配列を以下のように設計することができる。
【００２５】
（１）（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｘ１＝Ａ，Ｔ，Ｇ；Ｘ２＝Ａ，Ｔ；Ｙ１＝Ａ，Ｔ；Ｙ２＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。（表１）
【００２６】
【表１】
2008521385.tif 000002
【００２７】
（２）（Ｇ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（ＸＹ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｘ＝Ａ，Ｔ；  Ｙ＝Ａ，Ｔ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。（表２-１、表２-２）
【００２８】
【表２−１】
2008521385.tif 000003
【００２９】
【表２−２】
2008521385.tif 000004
【００３０】
（３）（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＣＧ（Ｍ）ｎ（Ｇ）ｎ、但し、Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。（表３-１、表３-２）
【００３１】
【表３−１】
2008521385.tif 000005
【００３２】
【表３−２】
2008521385.tif 000006
【００３３】
（４）（ＴＣＧ）ｎ（Ｌ）ｎＸ１Ｘ２ＣＧ（Ｍ）ｎ、但し、Ｘ１＝Ａ，Ｔ，Ｇ；Ｘ２＝Ａ，Ｔ；Ｌ，Ｍ＝Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ；ｎは０−６である。配列を以下のように設計することができる。（表４-１、表４-２、表４-３）
【００３４】
【表４−１】
2008521385.tif 000007
【００３５】
【表４−２】
2008521385.tif 000008
【００３６】
【表４−３】
2008521385.tif 000009
【００３７】
（５）ＴＴＣＧＴＣＧを含んでいる配列（表５）
【００３８】
【表５】
2008521385.tif 000010
【００３９】
本発明ＣｐＧ  ＯＤＮは、以下の表６の配列を有することが好ましい。
【００４０】
【表６】
2008521385.tif 000011
【００４１】
以下の実施例において、使われたＣｐＧ  ＯＤＮは、［  ］中の数字にて表す。
【００４２】
（実施例２：ＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチドの合成）
固相亜リン酸トリエステル法にてＤＮＡ断片を合成した。該方法は高効率、快速などのメリットを具備しており、ＤＮＡの化学合成においてよく使われている。
【００４３】
ＤＮＡの化学合成は、酵素触媒のＤＮＡ合成とは異なっている。即ち、酵素触媒のＤＮＡ合成では、５’末端から３’末端へ延伸するが、ＤＮＡの化学合成は３’末端から始まった。具体的な反応ステップは以下の通りである。
【００４４】
１．脱保護基化：トリクロロ酢酸を用いてＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）に連結されているヌクレオチドの保護基であるＤＭＴ（ジメトキシトリチル）を脱離させて、遊離状態の５’−ヒドロキシ基末端を形成して、次の縮合反応に供する。
【００４５】
２．活性化：亜燐酸アミドによって保護されているヌクレオチド単体をテトラゾールと混合してから、合成カラムに投入して、亜燐酸アミドテトラゾール活性中間体（３’末端は活性化されているが、５’末端はＤＭＴによって保護されている）を形成する。該中間体をＣＰＧの上の脱保護基化されたヌクレオチドと縮合反応させる。
【００４６】
３．連結：亜燐酸アミドテトラゾール活性中間体は、ＣＰＧの上の脱保護基化されたヌクレオチドと反応するに際して、その中の５’―ヒドロキシ基と親和反応を行い、縮合によりテトラゾールが脱離される。この場合、合成されたオリゴヌクレオチド鎖は、前に向かって一つの塩基の長さで延長される。
【００４７】
４．ブロッキング：縮合反応が終わった後、ＣＰＧの上の反応に参加しなかった５’−ヒドロキシ基が次の循環反応において延伸されることを防止するために、通常、アセチル化によって該末端のヒドロキシ基をブロッキングする。一般的に、アセチル化剤は無水酢酸とＮ−メチルイミダゾール等との混合反応によって生成されたものである。
【００４８】
５．酸化：縮合反応を行う時、ヌクレオチド単体は亜燐酸エステル結合を介してＣＰＧの上のオリゴヌクレオチドに連結されるが、亜燐酸エステル結合が酸、アルカリによって加水分解されやすくて不安定であるため、通常、ヨードのテトラヒドロフラン溶液にて亜燐酸エステルをリン酸トリエステルに転換させて、安定したオリゴヌクレオチドを形成する。
【００４９】
以上の五つのステップを通じて、一つのデオキシヌクレオチドがＣＰＧの上のヌクレオチドに連結される。同様に、さらにトリクロロ酢酸にて新たに連結されたデオキシヌクレオチドの５’―ヒドロキシ基の保護基ＤＭＴを脱離させて、上記の活性化、連結、ブロッキング、酸化のステップを繰り返すと、一つのＤＮＡ断片粗品が得られる。最後に、切断、脱保護基化（一般的に、Ａ、Ｃ塩基に対してはベンゾイル基保護、Ｇ塩基に対してはイソブチリル基保護を行い、Ｔ塩基は保護する必要がなく、亜リン酸はニトリルエチルにて保護する）、精製（通常使われているのは、ＨＡＰ、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、Ｃ１８、ＯＰＣなどの方法である）、定量化などの合成後処理を行うことにより、実験レベルのオリゴヌクレオチド断片が得られる。
【００５０】
固相におけるオリゴヌクレオチド合成はＤＮＡ合成装置中で行われる。上記の方法によってオリゴヌクレオチドを合成する場合、保護基が脱離された後、目的オリゴヌクレオチドの純度は極めて低く、多くの不純物を含んでいる。その中の主な不純物としては、脱離された保護基とアンモニアから生成された安息香酸アンモニア、イソ酪酸アンモニア、ニトリルホスフェート基（ｎｉｔｒｉｌｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）から脱離されたニトリルエチル基、及び合成する時に生成された短鎖などが挙げられる。したがって、粗生成品中のオリゴヌクレオチドの含有量は、１５％左右のみである。合成するときのステップごとの効率がいずれも９７％〜９８％になっているにもかかわらず、累積の効率は高くない。故に、粗生成品中のオリゴヌクレオチドの含有量がとても低く、１０％未満になる場合もある。これらの不純物、特に粗生成品中に存在している多くの塩と短鎖は定量化の精度を低下させるだけでなく、次の反応にも影響をもたらすので、オリゴヌクレオチドについて精製を行う必要がある。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）を採用して精製するほうが好ましい。該方法によって精製された製品は純度が高く、且つ該方法はほとんどの分子生物学実験に使用可能であり、多くの予測できない迷惑も避けることができるからである。コストの面から考慮すると、精度に対する要求が低い実験、例えばＰＣＲ反応などに対しては脱塩精製法を採用してもよい。
【００５１】
オリゴヌクレオチドはＯＤ２６０値により計量される。１ｍｌの１ｃｍ光路程の標準石英比色皿の中で、２６０ｎｍの波長下で吸光度が１であるオリゴヌクレオチドを、１ＯＤ２６０と定義した。オリゴヌクレオチドの種類によって塩基の組成が全く一致しているのではないが、１ＯＤ２６０のオリゴヌクレオチド重量は大体３３μｇである。
【００５２】
（実施例３：狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較）
【００５３】
１．実験動物：マウス２００匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【００５４】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【００５５】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【００５６】
４．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けているが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表７）
【００５７】
【表７】
2008521385.tif 000012
【００５８】
５．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させて、対応する濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ溶液を調製した。
【００５９】
６．マウスの免疫：第０日、第３日、第７日、第１４日、第２８日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、実験の組み分け項目に記載の狂犬病ワクチン又は狂犬病ワクチン＋ＣｐＧ  ＯＤＮを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。
【００６０】
７．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けているが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。０．５ｍｌの体積で接種する。
【００６１】
８．狂犬病ワクチン抗体の測定：第３５日に、マウスの尾部静脈から採血して、快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法（非特許文献９）を利用して、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体の存在を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
【００６２】
９．結果：ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量の増加に従って、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体のレベルが高くなった。その結果を図１に示した。
【００６３】
１０．結論：ＣｐＧ  ＯＤＮは、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、刺激効果を顕著に向上させることができる。これにより、ＣｐＧ  ＯＤＮが狂犬病ワクチンの有効なアジュバントであることが明らかになった。
【００６４】
（実施例４：狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較）
【００６５】
１．実験動物：マウス２００匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【００６６】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【００６７】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【００６８】
４．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表８）
【００６９】
【表８】
2008521385.tif 000013
【００７０】
５．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させて、対応する濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ溶液を調製した。
【００７１】
６．マウスの免疫：第０日、第３日、第７日、第１４日、第２８日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、実験の組み分け項目に記載の狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント又は狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント＋ＣｐＧ  ＯＤＮを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。Ａｌアジュバントの終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌである。
【００７２】
７．狂犬病ワクチン抗体の測定：第３５日に、マウスの尾部静脈から採血して、快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
【００７３】
８．結果：ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量の増加に従って、マウス血清中の狂犬病ウイルス特異性抗体のレベルが高くなった。狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較結果を図２に示した。
【００７４】
９．結論：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントは、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、刺激効果を顕著に向上させることができる。これにより、ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの組み合わせが、狂犬病ワクチンの強効なアジュバントであることが明らかになった。
【００７５】
（実施例５：狂犬病ワクチンで生体を刺激して特異性抗体を生成させる場合の、抗体生成速度に対するＣｐＧ  ＯＤＮの影響）
【００７６】
１．実験動物：マウス８０匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【００７７】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【００７８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【００７９】
４．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表９）
【００８０】
【表９】
2008521385.tif 000014
【００８１】
５．マウスの免疫方式：第０日、第３日、第７日、第１４日、第２８日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、狂犬病ワクチンまたは狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント又は狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント＋ＣｐＧ  ＯＤＮを注射して免疫を行った。ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。アジュバントの終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌである。
【００８２】
６．狂犬病ワクチン抗体の測定：第０日、第５日、第７日、第１４日、第２８日、第３５日、第４９日、第６３日、第７７日に、各マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
【００８３】
７．結果：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、抗体の力価はどの時点においても、狂犬病ワクチンを単独使用する場合の力価と、アルミニウムアジュバントを単独使用する場合の力価と、ＣｐＧ  ＯＤＮを単独使用する場合の力価との中のいずれかより高い。その結果を図３に示した。
【００８４】
８．結論：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用すると、狂犬病ワクチンでマウスを刺激して狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させる場合の、抗体の出現速度を高めることができる。
【００８５】
（実施例６：狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのＣｐＧ  ＯＤＮが、狂犬病ワクチンの免疫回数を減少できるか否かに係る実験）
【００８６】
１．実験動物：マウス８０匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【００８７】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【００８８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【００８９】
４．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組にして、１０組に分けるが、１組中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表１０）
【００９０】
【表１０】
2008521385.tif 000015
【００９１】
５．マウスの免疫方式：組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に、狂犬病ワクチンまたは狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント又は狂犬病ワクチン＋Ａｌアジュバント＋ＣｐＧ  ＯＤＮを注射して免疫を行った。狂犬病ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。Ａｌアジュバントの終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌである。免疫の回数をそれぞれ、５回、４回、３回に設定した。５回免疫の場合、免疫の時間はそれぞれ、第０日、第３日、第７日、第１４日、第２８日であり、４回免疫の場合は、第０日、第７日、第１４日、第２８日であり、３回免疫の場合には、第０日、第７日、第２１日である。
【００９２】
６．狂犬病ワクチン抗体の測定：最後の免疫を行ってから７日間過ごした後、各マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
【００９３】
７．結果：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、免疫を３回、４回、５回行ったマウスはいずれも高いレベルの狂犬病ウイルス特異性抗体を生成することができた。その結果を図４に示した。
【００９４】
８．結論：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合、狂犬病ワクチンにて免疫を３回行ったマウスであっても、高いレベルの抗体を生成することができる。
【００９５】
（実施例７：狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのＣｐＧ  ＯＤＮが、狂犬病ワクチンの使用量を減少できるか否かに係る実験）
【００９６】
１．実験動物：マウス１２８匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【００９７】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【００９８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【００９９】
４．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表１１）
【０１００】
【表１１】
2008521385.tif 000016
【０１０１】
５．マウスの免疫方式：第０日、第３日、第７日、第１４日、第２１日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に注射して免疫を行った。ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。アジュバントの終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌである。
【０１０２】
６．狂犬病ワクチン抗体の測定：第２８日に、マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を陰性対照とした。
【０１０３】
７．結果：狂犬病ワクチンの使用量を減少した場合であっても、ＣｐＧ  ＯＤＮと組み合わせて使用したら、依然としてマウスを刺激して高レベルの狂犬病ウイルス特異性抗体を生成させることができた。これから分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮは狂犬病ワクチンの使用量を減少することができる。その結果を図５に示した。
【０１０４】
８．結論：ＣｐＧ  ＯＤＮは狂犬病ワクチンの使用量を減少することができる。
【０１０５】
（実施例８：狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの種類によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較）
【０１０６】
１．実験動物：マウス１１２匹。雄と雌がそれぞれ半分である。体重は１８〜２２ｇであり、６〜８週齢である。北京維通利華実験動物有限公司から購入した。
【０１０７】
２．狂犬病ワクチン：１ｍｌ／枝（２．５ＩＵを含む）、長春生物製品所から購入した。
【０１０８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製である。
【０１０９】
４．対照配列：５’−ＴＣｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴｃｇＴＴ−３’［２００６］
【０１１０】
５．実験の組分け：８匹のマウスを一つの組に分けるが、その中で、雄と雌がそれぞれ半分である。（表１２）
【０１１１】
【表１２】
2008521385.tif 000017
【０１１２】
６．マウスの免疫方式：第０日、第３日、第７日、第１４日、第２８日に、組み分けに基づいてそれぞれ、マウスの腹腔に注射して免疫を行った。ワクチンの用量は０．５ｍｌ／マウスである。アジュバントの用量は０．５ｍｇ／ｍｌである。
【０１１３】
７．狂犬病ワクチン抗体の測定：第３５日に、マウスの尾部静脈から採血して、血清を分離させた。快速狂犬病ワクチン蛍光巣抑制実験（ＲＦＦＩＴ）方法を利用して、マウス血清中の狂犬病ワクチン抗体の力価を測定した。免疫する二日間前にマウスの尾部静脈から採血して、得られた血清を、陰性対照とした。
【０１１４】
８．結果：狂犬病ワクチン＋ＣｐＧ６６７と、狂犬病ワクチン＋ＣｐＧ３０９との、抗体生成を刺激する効果は、狂犬病ワクチン＋ＣｐＧ２００６に比べて顕著に優れている。その結果を図６に示した。
【０１１５】
９．結論：ＣｐＧＯＤＮ６６７とＣｐＧＯＤＮ３０９は、狂犬病ワクチンの免疫効果を顕著に増強させることができる。
【０１１６】
（実施例９：ＥＬＩＳＡ法によるＢ型肝炎ウイルス抗体の測定）
【０１１７】
Ｉ．試薬
１．ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製）ワクチンの調製：  １ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて、応用液を調製した（１ｍｇ／１ｍｌ）。
【０１１８】
２．ＨＲＰ−ｈｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、北京鼎国生物技術有限公司製。
【０１１９】
３．ＰＢＳ：１０００ｍｌ；ＮａＣｌ…８ｇ（北京化工場製）、ＫＣｌ…０．２ｇ（北京化工場製）、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ…２．９ｇ（北京化工場製）、ＫＨ２ＰＯ４…０．２ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、ＨＣｌ又はＮａＯＨにてＰＨ７．２−７．４になるまでＰＨ値を調整してから、１０００ｍｌに定容した。
【０１２０】
４．コーティング液：１００ｍｌ；ＰＢＳ…８０ｍｌ、５０％グルタルアルデヒド…１．６ｍｌ（北京化工場製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで１００ｍｌに定容した。
【０１２１】
５．洗浄液：５００ｍｌ；ＰＢＳ…４００ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０…０．５ｍｌ（北京化工場製）、ＮａＣｌ…１４．６２５ｇ（北京化工場製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで５００ｍｌに定容した。
【０１２２】
６．ブロッキング液：１００ｍｌ；ＰＢＳ…８０ｍｌ、脱脂ミルク…５ｇ（北京鼎国生物技術有限公司製）、ＢＳＡ…１ｇ（北京鼎国生物技術有限公司製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで１００ｍｌに定容して、０．０５ｇのアジ化ナトリウムを添加した。
【０１２３】
７．サンプル希釈液：１０００ｍｌ；Ｔｒｉｓ…２．４２ｇ（北京化工場製）、ＮａＣｌ…８．７７ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて溶解させた後、ＨＣｌでＰＨ７．１になるまでＰＨ値を調整してから、以下の物質を添加した後、超純水にて１０００ｍｌに定容した。ＢＳＡ…１ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０…０．５ｍｌ。
【０１２４】
８．基質液
甲液：クエン酸…１９．２ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で１０００ｍｌに定容した。  
乙液：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ…７１．７ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で１０００ｍｌに定容した。  
基質液：甲液…４７．２７６ｍｌ、乙液…５０ｍｌ。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、０．２２μｍのろ過膜で濾過・除菌した。
【０１２５】
９．終止液：１００ｍｌ；濃硫酸…２０ｍｌ（北京化工場製）。８０ｍｌの超純水中に攪拌しながら緩やかに添加した。
【０１２６】
II．方法
１．コーティング：１０ｍｌのコーティング液を取り、その中にＨＢｓＡｇ（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加した。即ち、コーティング液でその終濃度が１０μｇ／ｍｌになるまでＨｂｓＡｇを希釈した。酵素標識プレートのウェル毎に１００μｌの希釈されたＨｂｓＡｇを添加した。酵素標識プレートを４℃の雰囲気中で１晩放置した。
【０１２７】
２．洗浄：翌日に酵素標識プレートを取り出して、その中の液体を除去した。ウェル毎に３００μｌの洗浄液を添加した。室温で３分間放置してから、その中の液体を振り捨てた後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。同様にして３回洗浄した。
【０１２８】
３．ブロッキング：酵素標識プレートのウェル毎に３００μｌのブロッキング液を添加した後、室温で２時間放置した。
【０１２９】
４．被測定サンプルの添加：上記方法２と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液により異なる希釈度に希釈された被測定サンプルをウェル毎に３００μｌ添加した。各希釈度について二重ウェルで試験を行った。室温で２時間放置した。
【０１３０】
５．ＨＲＰ−ｈｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙの添加：上記方法２と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液でＨＲＰ−ｈｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを希釈した（１：１０００）。ウェル毎に１００μｌの希釈されたＨＲＰ−ｈｏｕｓｅ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙを添加した。室温、遮光条件下で、２時間放置した。
【０１３１】
６．基質液の添加：上記方法２と同じにして洗浄した後、ウェル毎に１００μｌの新たに調製した基質液を添加した。室温、遮光条件下で、２０分間放置した。
【０１３２】
７．終止液の添加：酵素標識プレートで２０分間孵化させてから、直接に酵素標識プレート中に５０μｌの終止液を添加した。
【０１３３】
８．酵素標識機による測定（Ａ４９２ｎｍ）：終止液を添加してから５分間以内に酵素標識機による測定を行った（Ａ４９２ｎｍ）。
【０１３４】
９．陽性値の判断：サンプルのＯＤ値／陰性対照のＯＤ値≧２である場合、陽性値であると判断した。
【０１３５】
（実施例１０：ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの種類によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較）
【０１３６】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、６〜８週齢（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１３７】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいない，北京生物製品研究所から購入。
【０１３８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０１３９】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させて応用液を調製した。
【０１４０】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。
【０１４１】
６．対照ＣｐＧ  ＯＤＮの配列：５’−ＴＣｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴＣｇＴＴＴＴｇＴｃｇＴＴ−３’［２００６］
【０１４２】
II．方法
１．マウスの組み分け：１０匹／組（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）（表１３）
【０１４３】
【表１３】
2008521385.tif 000018
【０１４４】
２．ＨＢｓＡｇで刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの種類によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較：ＨｂｓＡｇ応用液と異なる配列のＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の３日前（陰性血清）及び免疫の４週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、１０μｌ毎の血液に２μｌのヘパリンナトリウム（上海至▲きん▼化工有限公司，０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）に溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌する）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、配列の異なるＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして添加した場合、マウス体内で生成されたＨｂｓＡｇのタイターを異なる程度で向上させることができる。ＨｂｓＡｇワクチンを単独に使用する場合に比べ、ＨｂｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮを使用すると、マウスを有効に刺激して高レベルのＨｂｓＡｇを生成させることができる。分散解析を行い、有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。各組の抗体タイターの比較結果を図７に示した。
【０１４５】
（実施例１１：ＨＢｓＡｇで刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較）
【０１４６】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、６〜８週齢（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１４７】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
【０１４８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０１４９】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させて対応する濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ溶液を調製した。
【０１５０】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ溶液と、１μｌのＨｂｓＡｇ応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０１５１】
II．方法
１．マウスの組み分け：１０匹／組（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）（表１４）
【０１５２】
【表１４】
2008521385.tif 000019
【０１５３】
２．ＨＢｓＡｇで刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較：ＨｂｓＡｇと、異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮとを用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の３日前（陰性血清）及び免疫の４週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、１０μｌ毎の血液に２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、投与量の異なるＣｐＧ  ＯＤＮを添加した場合、マウス体内で生成されたＨｂｓＡｇのタイターを異なる程度で向上させることができる（図８を参照）。ＣｐＧ  ＯＤＮアジュバントの投与量≧１０μｇである時、ＨｂｓＡｇワクチンを単独使用する場合に比べ、いずれもマウス体内に生成されるＨｂｓＡｇのタイターを顕著に向上させることができる（Ｐ＜０．０５）。各組の抗体のタイター比較結果を図８に示した。
【０１５４】
（実施例１２：ＨＢｓＡｇで刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較）
【０１５５】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、６〜８週齢（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１５６】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいる（２５  ｍｇ  Ａ１３＋／ｍｇ  ＨＢｓＡｇ）。北京生物製品研究所から購入。
【０１５７】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０１５８】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させて、対応する濃度のＣｐＧ  ＯＤＮ溶液を調製した。
【０１５９】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ溶液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０１６０】
II．方法
１．マウスの組み分け：１０匹／組（表１５）
【０１６１】
【表１５】
2008521385.tif 000020
【０１６２】
２．ＨＢｓＡｇで刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較：ＨｂｓＡｇと、異なる投与量のＣｐＧ  ＯＤＮとを用いて、それぞれマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の３日前（陰性血清）及び免疫の４週後、それぞれマウスの尾部静脈から採血して、１０μｌ毎の血液に２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、投与量の異なるＣｐＧ  ＯＤＮを添加した場合、マウス体内で生成されたＨｂｓＡｇのタイターを異なる程度で向上させることができる。ＣｐＧ  ＯＤＮアジュバントの投与量≧１０μｇである時、ＨｂｓＡｇとアルミニウムアジュバントとの併用（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）に比べ、ＣｐＧ  ＯＤＮとＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいない）との併用が、マウス体内に生成されるＨｂｓＡｇのタイターを顕著に向上させることができる（Ｐ＜０．０５）。各組の抗体のタイター比較結果を図９に示した。
【０１６３】
（実施例１３：ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用が、ＨＢｓＡｇの免疫効果の対する増強作用）
【０１６４】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、６〜８週齢（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１６５】
２．ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいる）、ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいない）。北京生物製品研究所から購入。
【０１６６】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０１６７】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させてＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を調製した。
【０１６８】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０１６９】
II．方法
１．マウスの組み分け：１０匹／組（表１６）
【０１７０】
【表１６】
2008521385.tif 000021
【０１７１】
２．ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用が、ＨＢｓＡｇの免疫効果の対する増強作用：実験マウスを、ＨＢｓＡｇ  組と、ＨＢｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいる）（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）組と、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ組と、ＨＢｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいる）（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）＋ＣｐＧ  ＯＤＮ組との４組に分けて、それぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の３日前（陰性血清）に、マウスの尾部静脈から採血して、１０μｌ毎の血液サンプルに２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。０ｗ免疫後、４ｗ目に免疫を増強させた。免疫してからそれぞれ、１ｗ（週）後、２ｗ後、４ｗ後、６ｗ後、８ｗ後、１０ｗ後、１２ｗ後にマウスの尾部静脈から採血して、血漿を分離させ、ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれもＨｂｓＡｇのタイターを向上させることができる。ＨＢｓＡｇ組、ＨＢｓＡｇ（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）組に比べ、分散解析を行い全て有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとを組み合わせて使用する場合のＨｂｓＡｇのタイターが一番高かった。各組の抗体のタイター比較結果を図１０に示した。
【０１７２】
（実施例１４：ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体サブタイプを生成させる場合の、アジュバントの種類によるアジュバントの刺激増強効果の比較）
【０１７３】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、６〜８週齢（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１７４】
２．ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいる）、ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいない）。北京生物製品研究所から購入。
【０１７５】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０１７６】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させてＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を調製した。
【０１７７】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、マウスの筋肉に注射した。  
ＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいない、北京生物製品研究所製）の調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。
【０１７８】
６．ＨＲＰ標識のｓｈｅｅｐ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅのＩｇＧ２ａとＩｇＧ１：Ｓｅｒｏｔｅｃ会社製。
【０１７９】
７．試薬の調製：
ＰＢＳ：１０００ｍｌ；ＮａＣｌ…８ｇ（北京化工場製）、ＫＣｌ…０．２ｇ（北京化工場製）、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ…２．９ｇ（北京化工場製）、ＫＨ２ＰＯ４…０．２ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、ＨＣｌ又はＮａＯＨにてＰＨ７．２−７．４になるまでＰＨ値を調整してから、１０００ｍｌに定容した。  
コーティング液：１００ｍｌ；ＰＢＳ…８０ｍｌ、５０％グルタルアルデヒド…１．６ｍｌ（北京化工場製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで１００ｍｌに定容した。  
洗浄液：５００ｍｌ；ＰＢＳ…４００ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ２０…０．５ｍｌ（北京化工場製）、ＮａＣｌ…１４．６２５ｇ（北京化工場製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで５００ｍｌに定容した。  
ブロッキング液：１００ｍｌ；ＰＢＳ…８０ｍｌ、脱脂ミルク…５ｇ（北京鼎国生物技術有限公司製）、ＢＳＡ…１ｇ（北京鼎国生物技術有限公司製）。充分に溶解させた後、ＰＢＳで１００ｍｌに定容して、０．０５ｇのアジ化ナトリウムを添加した。  
サンプル希釈液：１０００ｍｌ；Ｔｒｉｓ…２．４２ｇ（北京化工場製）、ＮａＣｌ…８．７７ｇ（北京化工場製）。８００ｍｌの超純水にて溶解させた後、ＨＣｌでＰＨ７．１になるまでＰＨ値を調整してから、以下の物質を添加した後、超純水にて１０００ｍｌに定容した。ＢＳＡ…１ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０…０．５ｍｌ。  
基質液：甲液：クエン酸…１９．２ｇ（北京化工場製）、８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で１０００ｍｌに定容した。乙液：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ…７１．７ｇ（北京化工場製）、８００ｍｌの超純水にて充分に溶解させた後、超純水で１０００ｍｌに定容した。  
基質液：甲液…４７．２７６ｍｌ、乙液…５０ｍｌ。上記の体積の甲、乙液をそれぞれ量り、混合した後、０．２２μｍのろ過膜で濾過・除菌した。  
終止液：１００ｍｌ；濃硫酸…２０ｍｌ（北京化工場製）。８０ｍｌの超純水中に攪拌しながら緩やかに添加した。
【０１８０】
二）マウスの免疫
１．マウスの組み分け（表１７）：
【０１８１】
【表１７】
2008521385.tif 000022
【０１８２】
２．マウスの免疫：組み分けに基づいて、それぞれ第０週と、第４週にマウスに対して免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。免疫の３日前（陰性血清）に、マウスの尾部静脈から採血して、１０μｌ毎の血液サンプルに２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０１８３】
II．方法
１．コーティング：１０ｍｌのコーティング液を取り、その中にＨＢｓＡｇ（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加した。酵素標識プレートのウェル毎に希釈されたＨｂｓＡｇを添加して、４℃の雰囲気中で１晩放置した。
【０１８４】
２．洗浄：翌日に酵素標識プレートを取り出して、その中の液体を除去した後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。ウェル毎に３００μｌの洗浄液を添加した。室温で３分間放置してから、その中の液体を振り捨てた後、吸水紙の上で叩いて乾燥させた。同様にして３回洗浄した。
【０１８５】
３．ブロッキング：酵素標識プレートのウェル毎に３００μｌのブロッキング液を添加した後、室温で２時間放置した。
【０１８６】
４．被測定サンプルの添加：上記方法と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液により異なる希釈度に希釈された被測定サンプルを酵素標識プレートのウェル毎に１００μｌ添加した。各希釈度について二重ウェルで試験を行った。室温で２時間放置した。
【０１８７】
５．ＨＲＰ標識のｓｈｅｅｐ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅのＩｇＧ２ａとＩｇＧ１の添加：上記方法と同じにして洗浄した後、サンプル希釈液でＨＲＰ標識のｓｈｅｅｐ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅのＩｇＧ２ａとＩｇＧ１を希釈した（１：１０００）。酵素標識プレートのウェル毎に１００μｌの希釈されたＨＲＰ標識のｓｈｅｅｐ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅのＩｇＧ２ａとＩｇＧ１を添加した。室温、遮光条件下で、２時間放置した。
【０１８８】
６．基質液の添加：上記方法と同じにして洗浄した後、酵素標識プレートのウェル毎に１００μｌの新たに調製した基質液を添加した。室温、遮光条件下で、２０分間放置した。
【０１８９】
７．終止液の添加：酵素標識プレートで２０分間孵化させてから、直接に酵素標識プレート中に５０μｌの終止液を添加した。
【０１９０】
８．酵素標識機による測定（Ａ４９２ｎｍ）：終止液を添加してから５分間以内に酵素標識機による測定を行った（Ａ４９２ｎｍ）。
【０１９１】
９．陽性値の判断：サンプルのＯＤ値／陰性対照のＯＤ値≧２である場合、陽性値であると判断した。測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして使用する場合、ＩｇＧ２ａの生成比率が高く、アルミニウムアジュバント組のＩｇＧ２ａ抗体に比べ、分散解析を行い、有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。その結果を図１１に示した。
【０１９２】
ＣＴＬ特異性殺傷結果の測定
（１）効果細胞の調製：マウスを免疫してから１２週間経た後、無菌条件下でマウスの脾臓を分離して、１０％子牛血清含有ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏｌ会社製）平皿の上に置かせた。すりガラス板でマウスの脾臓を軽く研磨した。２００メッシュのメンブランフィルターでマウスの脾臓の研磨液を濾過した後、ろ液中に赤血球分解液（１３９．６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ，１６．９６ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ，  １ｍｏｌ／ＨＣｌでｐＨを７．２に調節した）を３−５ｍｌ添加して、１０分間放置した。その後、生理食塩水にて脾臓細胞を２回洗浄して、脾臓細胞の数を計数した。１０％子牛血清含有ＩＭＤＭにて、脾臓細胞の数を３×１０７／ｍｌに調節した。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子をトランスフェクションされたＰ８１５細胞（ＡＴＣＣ）に、マイトマイシン（Ｓｉｇｍａ、無血清ＩＭＤＭで５００μｇ／ｍｌに調製した）を終濃度が５０μｇ／ｍｌになるまで添加した。３７℃で２時間孵化してから、生理塩水にて３回洗浄した。１×１０６個のＰ８１５細胞を採集して、脾臓細胞内に添加して、３７℃、５％ＣＯ２で５日間孵化させた。５日間後、脾臓リンパ細胞を採集して効果細胞とした。
【０１９３】
（２）５１Ｃｒ標識ターゲット細胞：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子をトランスフェクションされたＰ８１５細胞を１×１０６個採集して、１００μｌの５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。３７℃で１時間孵化させた。５〜１０分間毎に、Ｐ８１５細胞を軽く均一に１回揺り、１０％子牛血清含有ＩＭＤＭ  にて、Ｐ８１５細胞を３回洗浄して、ターゲット細胞とした。
【０１９４】
（３）ＣＴＬの殺傷：１０％子牛血清含有ＩＭＤＭにて、効果細胞を異なる濃度に希釈した後、５１Ｃｒ標識ターゲット細胞を添加して、効果細胞：ターゲット細胞の比率を１００：１〜１２．５：１に調節した。３７℃で４時間孵化させた後、上澄み液を収集してｃ．ｐ．ｍ値を測定した。
【０１９５】
（４）測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮはアジュバントとして使用される場合、ＨｂｓＡｇにてマウスを刺激しＨＢＶ特異性ＣＴＬを生成させる作用を顕著に増強させることができ、ＣｐＧＯＤＮ＋ＨｂｓＡｇとアルミニウムアジュバント＋ＨｂｓＡｇを比較する場合、ＣｐＧＯＤＮ＋ＨｂｓＡｇの方がＨＢＶ特異性ＣＴＬの生成に対して、もっと強い作用を発揮できることが明らかになった（Ｐ＜０．０５）。その結果を図１２に示した。
【０１９６】
（実施例１５：若齢マウスのＢ型肝炎ウィルスワクチンに対する反応性を増強させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用）
【０１９７】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃ若齢マウス、雌、６〜８日（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０１９８】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいるか（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨｂｓＡｇ）、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
【０１９９】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０２００】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：１０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させてＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を調製した。
【０２０１】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。若齢マウスの筋肉に注射するとき、１０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、若齢マウスの筋肉に注射した。
【０２０２】
II．方法
１．若齢マウスの組み分け：１０匹／組（表１８）
【０２０３】
【表１８】
2008521385.tif 000023
【０２０４】
２．若齢マウスのＢ型肝炎ウイルスワクチンに対する反応性を増強させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用の測定：若齢マウスをＨＢｓＡｇ組と、ＨｂｓＡｇ＋アルミニウムアジュバント組と、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ組と、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ＋アルミニウムアジュバント組との４組に分けて、０ｗにそれぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。４週後、増強免疫をした。免疫後、１ｗ（週）、４ｗ、６ｗ、８ｗ、１０ｗ経過した時に採血して、１０μｌ毎の血液サンプルに２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。血漿を分離させ、ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも若齢マウス体内におけるＨｂｓＡｇのタイターを向上させることができる。且つ、ＨＢｓＡｇ  組、ＨＢｓＡｇ（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）組に比べ、有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。ＣｐＧ  ＯＤＮをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、若齢マウス体内におけるＨｂｓＡｇのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図１３に示した。本発明の実施例から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮは、弱反応の個体がＨｂｓＡｇに対して強い体液免疫応答を起こるようにすることができる。
【０２０５】
（実施例１６：老齢マウスのＨｂｓＡｇに対する反応性を増強させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用）
【０２０６】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：ＢＡＬＢ／ｃマウス、雌、２０〜２４個月（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０２０７】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいるか（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨｂｓＡｇ）、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
【０２０８】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０２０９】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させてＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を調製した。
【０２１０】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。マウスの筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、若齢マウスの筋肉に注射した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０２１１】
II．方法
１．マウスの組み分け：１０匹／組（表１９）
【０２１２】
【表１９】
2008521385.tif 000024
【０２１３】
２．抗体の測定：「老齢」マウスをＨＢｓＡｇ組と、ＨｂｓＡｇ＋アルミニウムアジュバント組と、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ組と、ＨＢｓＡｇ＋ＣｐＧ  ＯＤＮ＋アルミニウムアジュバント組との４組に分けて、０ｗにそれぞれ免疫を行った。免疫部位はマウスの前脛骨筋である。４週後、増強免疫をした。免疫の３日間前に採血（陰性血清）して、１０μｌ毎の血液サンプルに２μｌのヘパリンナトリウム（０．２ｇを量り、１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏに溶解させて得る。濃度が０．２％で、１５ポンド２０分間にて滅菌した）を添加して凝固を防止した。血液サンプルを４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、２０分間遠心処理した後、上層の血漿を採集して−２０℃で保存した。免疫を行ってから、２ｗ（週）、４ｗ、６ｗ、８ｗ、１０ｗ、１２ｗ経た後にそれぞれ採血し、血漿を分離して、ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した（実施例３に記載の方法を参照）。測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも老齢マウス体内におけるＨｂｓＡｇのタイターを向上させることができる。且つ、ＨＢｓＡｇ組、ＨＢｓＡｇ（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨＢｓＡｇ）組に比べ、有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。ＣｐＧ  ＯＤＮをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、老齢マウス体内におけるＨｂｓＡｇのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図１４に示した。本発明の実施例から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮは、弱反応の個体がＨｂｓＡｇに対して強い体液免疫応答を起こるようにすることができる。
【０２１４】
（実施例１７：赤毛猿のＢ型肝炎ウイルスワクチンに対する反応性を増強させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用）
【０２１５】
Ｉ．動物と試薬
１．動物：赤毛猿、雌、２〜４ｋｇ（北京維通利華実験動物有限公司から購入）。
【０２１６】
２．ＨｂｓＡｇ：アルミニウムアジュバントを含んでいるか（２５ｍｇＡ１３＋／ｍｇＨｂｓＡｇ）、或いはアルミニウムアジュバントを含んでいない。北京生物製品研究所から購入。
【０２１７】
３．ＣｐＧ  ＯＤＮ：上海生工生物工程技術服務有限公司製。
【０２１８】
４．ＣｐＧ  ＯＤＮの調製：５０μｌのＰＢＳで１００μｇのＣｐＧ  ＯＤＮを溶解させてＣｐＧ  ＯＤＮ応用液を調製した。
【０２１９】
５．ＨｂｓＡｇの調製：１ｍｌのＰＢＳで１ｍｇのＨｂｓＡｇタンパク質凍結乾燥粉末を溶解させて応用液を調製した。赤毛猿の筋肉に注射するとき、５０μｌのＣｐＧ  ＯＤＮ応用液と、１μｌのＨｂｓＡｇ（アルミニウムアジュバントを含んでいるか又は含んでいない）応用液を量り、均一に混合して氷の上に１０分間放置してから、赤毛猿の筋肉に注射した。（Ｂ型肝炎ワクチンの用量は１μｇ／マウスであり、アルミニウムアジュバントの含有量は２５μｇ／ｍｌである。）
【０２２０】
II．方法
１．赤毛猿の組み分け（表２０）
【０２２１】
【表２０】
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【０２２２】
２．抗体の測定：免疫する前に赤毛猿から採血して、陰性血漿を分離した。０ｗに組み分けに基づいてそれぞれ免疫を行った。免疫部位は三角筋であった。第４週に、増強免疫をした。免疫を行ってから、２ｗ（週）、４ｗ、６ｗ、８ｗ、１０ｗ、１２ｗ経た後にそれぞれ採血し、血漿を分離して、ＥＬＩＳＡ法にてＨｂｓＡｇのタイターを測定した。測定結果から分かるように、ＣｐＧ  ＯＤＮをアジュバントとして使用する場合、単独或いはアルミニウムアジュバントとの併用のいずれも赤毛猿体内におけるＨｂｓＡｇのタイターを向上させることができる。且つ、ＨＢｓＡｇ  組、ＨＢｓＡｇ（２５  ｍｇ  Ａ１３＋／ｍｇ  ＨＢｓＡｇ）組に比べ、有意差ありとした（Ｐ＜０．０５）。ＣｐＧ  ＯＤＮをアルミニウムアジュバントと組み合わせてアジュバントとして使用する場合、赤毛猿体内におけるＨｂｓＡｇのタイターが一番高かった。各組における抗体のタイターの比較結果を図１５に示した。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図２】狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図３】狂犬病ワクチンで生体を刺激して特異性抗体を生成させる場合の、抗体生成速度に対するＣｐＧ  ＯＤＮの影響を示す図である。
【図４】狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのＣｐＧ  ＯＤＮが狂犬病ワクチンの免疫回数を減少できるか否かに係る実験の結果を示す図である。
【図５】狂犬病ワクチンのアジュバントとしてのＣｐＧ  ＯＤＮが狂犬病ウイルスワクチンの使用量を減少できるか否かに係る実験の結果を示す図である。
【図６】狂犬病ワクチンで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの種類によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図７】ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの種類によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図８】ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮの刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図９】ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体を生成させる場合の、ＣｐＧ  ＯＤＮの投与量によるＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用の刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図１０】ＣｐＧ  ＯＤＮとアルミニウムアジュバントとの併用が、ＨＢｓＡｇの免疫効果に対する影響を示す図である。
【図１１】ＨＢｓＡｇで生体を刺激して抗体サブタイプを生成させる場合の、アジュバントの種類による刺激増強効果の比較結果を示す図である。
【図１２】ＨｂｓＡｇにてＨＢＶ特異性ＣＴＬを生成させる場合のＣｐＧ  ＯＤＮの作用を示す図である。
【図１３】若齢マウスのＨｂｓＡｇに対する反応性を増加させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用を示す図である。
【図１４】老齢マウスのＨｂｓＡｇに対する反応性を増加させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用を示す図である。
【図１５】赤毛猿のＨｂｓＡｇに対する反応性を増加させるＣｐＧ  ＯＤＮの作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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