(57)【要約】本発明は、患者由来のサンプルが、このサンプルをＣＤ２８と接触させることにより抗ＣＤ２８自己抗体の存在について分析されることに従って、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患を診断するための方法に関する。自己抗体がＣＤ２８二結合する場合、このことは、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示す。本発明はまた、これらの疾患を診断するためのＣＤ２８の使用、ならびに、ＣＤ２８および標識化免疫グロブリン抗体を含むこの目的のために設計されたキットにも関する。
2008530522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の診断のための、ＣＤ２８の使用。
【請求項２】
患者由来のサンプルが、該サンプルをＣＤ２８と接触させることによって抗ＣＤ２８自己抗体の存在について分析されることを特徴とし、該自己抗体のＣＤ２８に対する結合が、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示すことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の診断のための方法であって、該方法は、患者由来のサンプルが、該サンプルをＣＤ２８と接触させることによって抗ＣＤ２８自己抗体の存在について分析されることを特徴とし、該自己抗体のＣＤ２８に対する結合が、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示すことを特徴とする、方法。
【請求項４】
ＣＤ２８は、全長ＣＤ２８分子もしくはその細胞外フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法もしくは使用。
【請求項５】
前記細胞外フラグメントは、配列番号２に記載の配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の方法もしくは使用。
【請求項６】
前記全長ＣＤ２８分子もしくはその細胞外フラグメントは、融合タンパク質の一部分であることを特徴とする、請求項４および請求項５に記載の方法もしくは使用。
【請求項７】
前記融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法もしくは使用。
【請求項８】
前記サンプルは、血液サンプルもしくは血清サンプルであることを特徴とする、請求項２〜７に記載の方法もしくは使用。
【請求項９】
ＣＤ２８は、支持体に結合していることを特徴とする、請求項１〜８に記載の方法もしくは使用。
【請求項１０】
抗ＣＤ２８自己抗体のＣＤ２８に対する結合は、前記支持体を、前記患者の属する種の抗体に対する標識化抗免疫グロブリン抗体と接触させること、および前記標識化抗体を検出することによって分析されることを特徴とする、請求項９に記載の方法もしくは使用。
【請求項１１】
前記患者はヒトであり、そして前記抗免疫グロブリン抗体は抗ヒト免疫グロブリン抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法もしくは使用。
【請求項１２】
前記抗免疫グロブリン抗体は、酵素、ビオチン、放射性同位体もしくは蛍光色素によって標識されることを特徴とする、請求項１０および請求項１１に記載の方法もしくは使用。
【請求項１３】
前記分析は、ブロット分析、ＥＬＩＳＡ分析、ＲＩＡ分析、ＦＡＣＳ分析もしくは液相検出系において実施されることを特徴とする、請求項１０〜１２に記載の方法もしくは使用。
【請求項１４】
前記アレルギー性疾患は、アレルギー性鼻結膜炎もしくはアレルギー性気管支喘息であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法もしくは使用。
【請求項１５】
前記アトピー性疾患は、アトピー性皮膚炎であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法もしくは使用。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患は、強皮症、紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、皮膚筋炎、もしくは水疱性自己免疫疾患であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法もしくは使用。
【請求項１７】
さらに、前記サンプル中の総ＩｇＥ濃度が決定され、ここで、１００ＩＵ／ｍｌ以上の総ＩｇＥ濃度は、アレルギー性疾患および／もしくはアトピー性疾患を示すことを特徴とする、請求項１〜１５に記載の方法もしくは使用。
【請求項１８】
高濃度の、ＣＤ２８に対する自己抗体は、特別な危険性、特に重篤な疾患、もしくは特に激しい疾患を示すことを特徴とする、請求項１〜１７に記載の方法もしくは使用。
【請求項１９】
アレルギー性疾患および／またはアトピー性疾患の診断のためのキットであって、該キットは、ＣＤ２８および標識化抗免疫グロブリン抗体を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２０】
ＣＤ２８は、全長ＣＤ２８分子もしくはその細胞外フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記細胞外フラグメントは、配列番号２に記載の配列を有することを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記全長ＣＤ２８分子もしくはその細胞外フラグメントは、融合タンパク質の一部分であることを特徴とする、請求項２０および請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記融合タンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
標識化抗ＩｇＥ抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項１９〜２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記標識化抗体は、酵素、ビオチン、放射性同位体もしくは蛍光色素によって標識されることを特徴とする、請求項１９〜２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の診断のための方法に関し、この方法において、患者由来のサンプルは、このサンプルをＣＤ２８と接触させることによって、抗ＣＤ２８自己抗体の存在について分析され、ここで、自己抗体のＣＤ２８に対する結合は、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示す。本発明は、上記疾患の診断のためのＣＤ２８の使用、ならびにＣＤ２８および標識化抗免疫グロブリン抗体を含むこの目的のために設計されたキットにさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫応答は、感染に対する防御のための、したがって、健康の維持のために不可欠である、身体系の重要な構成要素である。
【０００３】
しかし、適応免疫応答はまた、時々、感染性生物と関係のない抗原によって引き起こされる。このような不適当な免疫応答は、深刻な疾患をもたらし得、これらの疾患としては、アレルギー、アトピー性疾患もしくは自己免疫が挙げられる。
【０００４】
自己免疫疾患は、内因性抗原に対する特異的適応免疫応答である。本発明者らは、何が自己免疫応答を引き起こすのかを知らないが、環境要因および遺伝的要因の両方が役割を果たしている可能性が非常に高い。自己免疫疾患は、通常、免疫系によって認識される自己抗原を発現する細胞が破壊される際に、長期間の組織損傷をもたらす。これは、おそらく、主に細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの過剰な活性化に関係する。有害な抗体応答もまた、役割を果たし得る。
【０００５】
アレルギーは、通常無害である外来性物質に対する免疫系媒介型応答である。アレルギー性応答は、アレルゲンと接触した最も最初の時には起こらない。第１の適応免疫応答は、時間がかかり、そして一般に気付かれない。しかし、抗原に対して指向される抗体もしくはＴ細胞が誘導されるとすぐに、この抗原との新しい接触の各々は、症状をもたらす。
【０００６】
免疫応答によって引き起こされる種々の型の組織障害が、存在する。アレルギーの場合、ＩｇＥ抗体によって媒介される急速なアレルギー反応である、いわゆる即時型過敏症、アトピー性アレルギーもしくはアトピーが、決定的な役割を果たす。遅延型過敏症の場合、Ｔ細胞応答が原因であり、そしてこれらは、１日もしくは２日後まで最大に達しない。
【０００７】
アレルギー性疾患およびアトピー性疾患の有病率は、ここ１０年間の間に非常に上昇している。２０％を超える人口が、即時型のアレルギーに罹患している。
【０００８】
例えばアトピー性皮膚炎における上昇について可能な説明は、いわゆる衛生説（アトピー性疾患が、幼少期の感染によって予防され得ると考える）である。この理論は、アトピー性疾患の発症についての公知の危険要因（たとえば、小家族もしくは集団の中心での生活）によって支持される。免疫学的同定もまた、衛生説を支持する。
【０００９】
アトピーの現在の病理学的概念は、特定のサイトカイン（主にインターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））を分泌するＴｈ２型のアレルゲン特異的Ｔリンパ球が免疫応答を支配し、一方で、例えばインターロイキン−γを産生するＴｈ１リンパ球は、活性が低い（非特許文献１）。サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）は、主に、アトピー性障害を有する患者における好酸球増加症およびＩｇＥイソ型の抗体の産生の増大を担う（非特許文献２）。したがって、アトピー性障害を有する患者において、Ｔｈ１応答からＴｈ２応答への免疫系の平衡の一般的なシフトが、見出される。一般的に、Ｔｈ１応答は、感染（例えば、細菌感染）によってより誘導されやすく、一方で、Ｔｈ２応答は、例えば、（例えば寄生虫による）攻撃に対する反応として、引き起こされる。
【００１０】
多くのアレルギー性疾患において、原因となるアレルゲンは、公知であるか、またはアレルギー試験によって決定され得る。このために、特に即時型アレルギーの場合に、いわゆる皮膚プリック試験（ｓｋｉｎ  ｐｒｉｃｋ  ｔｅｓｔ）が、主に使用される（非特許文献３）。これらの試験により、例えば、枯草熱の原因物質について、短時間で非常な正確性で決定することが可能である。この場合、アレルゲンの同定は、しばしば、アレルゲンへの曝露を避けるかまたは低減することを可能にし、そして時々免疫治療もまた可能であり、患者の脱感作をもたらし得る。
【００１１】
このことは、特異的ＩｇＥの濃度の低下および特異的ＩｇＧ４の濃度の上昇を伴い（非特許文献４）、そして肥満細胞および好酸球の数の減少およびメディエータの分泌の低減を伴う（非特許文献５）。Ｔ細胞のアネルギーの誘導およびサイトカインスペクトルのＩＬ−１０産生およびＴｈ１−サイトカイン産生へのシフトもまた、役割を果たすと考えられる（非特許文献６および非特許文献７）。
【００１２】
しかし、多くの疾患について、アレルギー分類において原因物質を確立することは容易ではない。例えば、アトピー性皮膚炎もしくは喘息において、診断は、一般に、主に症状に基づき、個々の原因物質を同定することは困難である。処置はまた、一般に、症状の緩和にも向けられる。
【００１３】
しかし、初期治療は、長期にわたる状態の増悪に対して反作用するために決定的である。例えば、アトピー性皮膚炎に感作した小児における現代の抗ヒスタミンの投与は、増悪を予防し得るか、またはステロイド吸入による初期抗炎症治療は、気管支喘息を有する小児の生活の質を大いに改善し得る。
【００１４】
アトピーはまた、以下のアトピー性疾患の１つ以上に罹患する遺伝的傾向を示す：アトピー性気管支喘息、アレルギー性鼻結膜炎（枯草熱）またはアトピー性皮膚炎（アトピー性湿疹）。アトピーの診断について、一つの臨床的徴候もしくは特定の実験室診断結果は存在しない。診断は、一般に、臨床特徴と患者の記録および家族医学歴の組み合わせに基づく。
【００１５】
医学歴を考慮する場合、湿疹、アレルギー性喘息およびアレルギー性鼻結膜炎に対して、そして例えば新生児頭部皮膚炎、発汗によって強められる掻痒、金属不適合性もしくは光恐怖症の以前の発症に対して、特定の注意が払われる。例えば、膝もしくは肘の屈曲部における、または顔領域の特定の部位における乾燥皮膚、炎症のような臨床的徴候は、アトピーの重要な指標である。
【００１６】
特定の挑戦は、（例えば、乳児気管支喘息の場合の）診断の困難さである。多くの場合、臨床的状態は、非常に長い間の再発性閉塞性気管支炎として分類され、そして気管支喘息の診断が確立されるのは遅すぎる。医学歴および初期感作の検出ならびに／もしくは継続的なアトピー性皮膚炎に加えて、近年、好酸球カチオン性蛋白（ＥＣＰ）が、乳児気管支喘息の危険性のある児童（ＥＣＰ＞１６μｇ／ｌ）を同定するために使用されている。
【００１７】
さらに、ＥＣＰの確定はまた、抗炎症処置の有効性をモニタリングするためにも役立つ。ＥＣＰの確定とは別に、メタコリン刺激による乳児の肺機能の測定は、非常に小さな子供においてすら、疑わしい症例における気管支喘息の診断を確認するためのよい手段である。ＥＣＰと気管支過剰反応性との間に相関性はないので、これらの２つの方法は、気管支喘息の異なる病理学的機構を検出する。慢性気管支喘息の発症を避けるために、閉塞性症状（ぜん鳴）を有する全ての小さな子供について、初期に明確な診断が得られるべきである。
【００１８】
実験室試験に関して、アトピー性分類の全ての疾患について、血液中の総ＩｇＥ抗体濃度が測定される。濃度の上昇は、アトピーもしくはアレルギーの指標である。
【００１９】
実験室において、種々の免疫学的方法が、総ＩｇＥを測定するために使用される。この結果は、ＩＵ／ｍｌ（国際単位）もしくはＫＵ／ｌで表される。
【００２０】
総ＩｇＥの濃度は、例えば、多くの場合ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）によって測定される。このために、例えば、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、支持体は、ポリクローナル起源の抗ヒトＩｇＥ抗体でコーティングされ、そして非特異的結合部位は、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によってブロックされる。患者の血清（例えば、１：１０希釈である）は、この支持体に接触され、洗浄され、そして結合したＩｇＥは二次抗体、すなわち（ヒト患者の場合）抗ヒトＩｇＥ抗体で検出される。これらの抗体は、一般に、例えば酵素（例えばアルカリペルオキシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識され、この酵素は、検出および定量が容易な呈色反応を触媒する。総ＩｇＥ濃度はまた、ブロッティング（ウェスタンブロットもしくはドットブロット）、ＲＩＡ（ラジオイムノソルベントアッセイ）もしくは支持体としての磁気ビーズ手段および蛍光標識二次抗体によっても測定され得る。
【００２１】
アレルギー患者において、総ＩｇＥは、多くの場合、非アレルギー性被験体と比較して高いが、ＩｇＥの分布における重複が存在する。指針としては、以下である：
・２０ＩＵ／ｍｌ（もしくはＫＵ／ｌ）未満の値を有する場合、アレルギーである可能性は低い。
・１００ＩＵ／ｍｌを超える値を有する場合、アレルギーである可能性が高い。
・２０〜１００ＩＵ／ｍｌの値を有する場合、総ＩｇＥ値に基づいて明確な決定を行うことはできない。
【００２２】
これらの限界の点において、この試験は、上記の指針のように考慮される。
【００２３】
しかし、１００ＩＵ／ｍｌを超える値は、例えば医学歴が不確定である場合、患者の病訴はおそらくアレルギーもしくはアトピーに起因し得る。
【非特許文献１】Ｊｕｊｏら，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９２年，第９０巻，ｐ．３２３−３３１
【非特許文献２】Ｐｕｎｎｏｎｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，１９９３年，第９０巻，ｐ．３７３０−３７３４
【非特許文献３】Ｄｒｅｂｏｒｇ，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９年，第２１巻，ｐ．８２０−８２１
【非特許文献４】Ｒｅｉｄら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６年，７８巻，ｐ．５９０−６００
【非特許文献５】Ｖａｒｎｅｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９３年，第９２巻，ｐ．６４４−６５１
【非特許文献６】ＡｋｄｉｓおよびＢｌａｓｅｒ，Ａｌｌｅｒｇｙ，２０００年，第５５巻，ｐ．５２２−５３０
【非特許文献７】Ａｋｄｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９８年，第１０２巻，ｐ．９８−１０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
この背景に対し、したがって、当業者は、アトピー性疾患およびアレルギー性疾患の診断ならびに自己免疫疾患の診断のための補助的方法であって、診断の信頼性を高めるか、または診断を行うことすら可能にする方法を発明する課題に直面している。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
この課題は、特許請求の範囲の内容によって、特に、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の診断のためのＣＤ２８の使用によって、解決される。ＣＤ２８は、患者由来のサンプルを、このサンプルとＣＤ２８とを接触されることによって、抗ＣＤ２８自己抗体の存在を試験するために使用され得、ここで、自己抗体のＣＤ２８への結合は、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示す。
【００２６】
この文脈において、本発明はまた、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の診断のための方法を提供し、ここで、患者由来のサンプルが、このサンプルをＣＤ２８と接触させることにより、抗ＣＤ２８自己抗体の存在について試験され、ここで、ＣＤ２８に対する自己抗体の結合は、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および／または自己免疫疾患の存在を示す。
【００２７】
ＣＤ２８は、休止Ｔ細胞および活性型Ｔ細胞によって、４４ｋＤＡ膜タンパク質として発現される。ＣＤ２８は、Ｔ細胞媒介型免疫応答の誘導において、不可欠な役割を果たす。ナイーブなＴ細胞の活性化は、少なくとも２つのレセプター媒介型シグナルを必要とし、これらのシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって媒介される。
【００２８】
第１のシグナルは、抗原特異的であり、かつ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）とＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）との間の相互作用によって媒介される。しかし、このシグナルは、ナイーブなＴ細胞をそれ自身の活性化のためには不十分である。さらに、Ｔリンパ球上のＣＤ２８とＡＰＣ上の対応するリガンド（すなわち、ＣＤ８０（Ｂ７−１）もしくはＣＤ８６（Ｂ７−２））との間の結合が存在しなければならない（Ａｐｐｌｅｍａｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ２００３，１９２：１６１−１８０；Ｓｈａｒｐｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  ２００２，２：１１６−１２６）。次いで、この細胞は、増殖を開始し、そしてエフェクター細胞への分化を開始する。分子ＣＴＬＡ−４もまた、Ｔリンパ球上で発現され、そしてＣＤ８０およびＣＤ８６に対して結合し得る。ＣＤ２８とは対照的に、ＣＴＬＡ−４は、活性型Ｔリンパ球のエフェクター応答を阻害する。例えば、Ｔ細胞の調節が、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４によって妨害される場合、自己反応性Ｔ細胞が刺激され得、そしてとりわけ自己免疫疾患において中心的な病理生理学的役割を果たす。
【００２９】
Ｔリンパ球の表面分子に対する自己抗体は、種々の自己免疫疾患および感染において、ならびに輸血の間に見出されている（Ｏｓｍａｎら，Ｃｌｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９９４，１３：２１−２７；Ｓｗａａｋ，Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，ＰｅｔｅｒＪ．Ｂ．，Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ編，Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６：４７８）。これらの抗体の出現は、いくつかの疾患において、疾患の活性（Ｗｉｎｆｉｅｌｄら，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９２；６３：１３−１６）および白血球の機能妨害（Ｗｉｎｆｉｅｌｄら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９７５，１８：５８７−５９４；Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９８７，７９：７６２−７６８；Ｔａｎａｋａら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，１９８９，３２：３９８−４０５；Ｓａｋａｎｅら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９７９，６３：９５４−９６５；Ｗｅｒｎｅｔら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７３，１３８：１０２１−１０２６；Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８２，１６：３６９−３７７）と相関している。
【００３０】
現在、ヒトにおいて、ＣＤ４５，β２−ミクログロブリンおよびａｎｄｔｏＨＬＡ−Ｉ型分子に対する自己抗体（Ｍｉｍｕｒａら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９０，１７２：６５３−６５６；ＣｚｙｚｙｋらＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９６，３９：５９２−５９９；Ｒｅｖｉｌｌａｒｄら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７９，１２２：６１４−６１８；Ｐｒｏｐｅｒら，Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）１９９１，８０：８７−９３）が、そして動物においてＣＴＬＡ−４に対する自己抗体（Ｋｈａｔｌａｎｉら，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２００３，２６：１２−２０）が見出されている。現在、ＣＤ２８に対する自己抗体は、記載されていない（Ｋｈａｔｌａｎｉら；Ｍａｔｓｕｉら，ＪＩｍｍｕｎｏｌ  １９９９，１６２：４３２８−４３３５）。
【００３１】
本発明の範囲において、驚くべきことに、ＣＤ２８の出現は、アレルギー性疾患、アトピー性疾患および自己免疫疾患（例えば、アトピー性皮膚炎（オッズ比２５．３１［９５％  ＣＩ（信頼区間）、５．５２−１１６．１１］；（ｐ＜０．０００１）、アレルギー性喘息およびアレルギー性鼻結膜炎（オッズ比１０．７８［９５％  ＣＩ、５．３９−２１．５５］；ｐ＜０．０００１）ならびに強皮症のような自己免疫疾患）と有意に関連していることが見出された。血清が分析された患者において診断された全ての他の疾患は、ＣＤ２８自己抗体の出現と相関していなかった（図４、表２）。
【００３２】
基本的に、ＣＤ２８自己抗体の存在は、より若年の者および女性と相関している傾向があることが見出された。他の影響（例えば、血清ＩｇＥ）を除外するため、さらに、多変ロジスティック回帰分析を行った。この方法において、年齢、性別もしくは血清ＩｇＥの影響の可能性は、余因子として統計的に除外された。
【００３３】
本発明の範囲内で、全長ＣＤ２８分子もしくは抗ＣＤ２８自己抗体によって認識され得るそのフラグメントは、ＣＤ２８と呼ばれる。好ましくは、細胞外フラグメントである。特に、ＣＤ２８の細胞外フラグメントは、細胞内部分および膜貫通領域を除き、全長ＣＤ２８中に出現するアミノ酸を含む。好ましくは、細胞外フラグメントは、配列番号２の配列を有する。配列番号２は、ヒト細胞外フラグメントの配列を示す。
【００３４】
全長ヒトＣＤ２８の配列は、配列番号１において示される。しかし、ヒトＣＤ２８分子もしくはそのフラグメントに加えて、他の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウマもしくはウシ）由来のＣＤ２８タンパク質もしくはそのフラグメントもまた、本発明の範囲内にある。
【００３５】
上記の全長ＣＤ２８分子もしくはその細胞外フラグメントは、融合タンパク質の一部分であり得る。このましくは、この融合タンパク質は、さらに、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼもしくはヒスチジンタグ（これは、組換えタンパク質の精製のために特に有用である）を含む。基本的に、ＣＤ２８は、細胞から精製され得るか、または組換え技術によって産生され得る。この融合タンパク質は、Ｉｇ（免疫グロブリン）部分を含み得るが、免疫グロブリンが融合タンパク質中に含まれないことが、患者の血清中に存在するＩｇ部分に対する自己抗体の交差反応の可能性による困難を避けるために好ましい。しかし、ＣＤ２８は、ＣＤ２８−Ｉｇ融合分子から、例えばトリプシンによって切断され得る。
【００３６】
患者のサンプルは、好ましくは血液サンプルもしくは血清サンプルである。本発明に従う方法は、一般に、インビトロで実施される。
【００３７】
ＣＤ２８は、支持体に結合されることが好ましい。この固体支持体は、例えば、ＥＬＩＳＡプレート、磁気ビーズもしくはブロットフィルム（例えば、ニトロセルロースフィルム）であり得る。本発明の範囲内において、支持体はまた、天然にまたは組換え技術によって、ＣＤ２８をその表面上に発現する細胞である。ＣＤ２８は、支持体に直接的に結合され得るか、または、抗体（特に、ＣＤ２８に連結したタグに対する抗体、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を介して支持体に結合され得る。これらの抗体は、二次抗体との交差反応を避けるため、ヒト抗体ではない。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、抗ＣＤ２８自己抗体のＣＤ２８への結合は、上記支持体を、患者の属する種の抗体に対する標識化抗免疫グロブリン抗体と接触させ、そして標識化抗体を検出することによって検査される。この患者は、例えば、ヒトであり得る。この場合、好ましくは、ヒトＣＤ２８が使用され、そして抗免疫グロブリン抗体は、抗ヒト免疫グロブリン抗体である。
【００３９】
好ましくは、この抗免疫グロブリン抗体は、ＩｇＧイソ型の抗体に特異的であるが、これらはまた、ＩｇＧならびにＩｇＭおよび／またはＩｇＥと反応性であり得る。
【００４０】
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、酵素（例えば、アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ビオチン、放射性同位体もしくは蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）もしくはフィコエリトリン（ＰＥ））で標識されている。
【００４１】
検査は、ブロット（例えば、ドットブロットもしくはウェスタンブロット）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＦＡＣＳ（蛍光活性型細胞選別）分析または液相検出系において実施され得る。この支持体が細胞である場合、後の結合の検査は、好ましくは、ＦＡＣＳもしくは蛍光顕微鏡分析によって実施される。
【００４２】
特に、本発明に従う方法もしくは本発明に従うＣＤ２８の使用は、アレルギー性鼻結膜炎（枯草熱）もしくはアレルギー性気管支喘息の診断のために使用され得る。ＣＤ２８自己抗体と疾患との間の非常に高い相関性はまた、アトピー性皮膚炎においても見出される。自己免疫疾患の分類において、抗ＣＤ２８自己抗体の手段により、特に、強皮症もしくは紅斑性狼瘡を検出可能であり、しかしまた慢性関節リウマチおよび皮膚筋炎をも検出可能である。
【００４３】
抗ＣＤ２８自己抗体はまた、皮膚の水疱性自己免疫疾患（尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡）において出現する。
【００４４】
抗ＣＤ２８抗体の検出は、特に実験室試験において、上記の疾患のうちの１つの診断のために補助的診断技術なしで使用され得る。しかし、他の基準との組み合わせが、好ましい。特に、患者の医学的記録および家族医学歴、ならびに臨床症状は、無論、診断において重要な役割を果たし続ける。
【００４５】
アトピーおよびアレルギーの分類におけるさらなる実験室試験の場合において、患者由来のサンプル（例えば血液サンプルもしくは血漿サンプル）中の総ＩｇＥの濃度の測定は、特に重要である。したがって、１００ＩＵ／ｍｌ以上の総ＩｇＥ濃度は、アレルギー性疾患および／またはアトピー性疾患の存在を示す。２０〜１００ＩＵ／ｍｌの総ＩｇＥ濃度は、このような疾患の存在の正確な指標を提供しない（Ｓａｎｚ  ＭＬ，Ｐｒｉｅｔｏ  Ｉ，Ｇａｒｃｉａ  ＢＥ，Ｏｅｈｌｉｎｇ  Ａ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ａｌｌｅｒｇｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６年５月〜６月；６（３）：１５２−６１）。特にこの場合、ＣＤ２８のの補助による補助的診断は、感度が高い。
【００４６】
喘息が疑われる場合、本発明に従う診断の方法と（例えば、メタコリンによる）刺激試験との組み合わせは、感度が高い。他の試験、例えば好酸球カチオン性蛋白についての試験（Ｗｏｌｔｈｅｒｓ  ＯＤ．Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ａｓｔｈｍａ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３年８月；１４（４）：２４８−５４．）は、本発明に従う方法と組み合わされ得る。
【００４７】
本発明の範囲内で、ＣＤ２８に対する自己抗体の濃度との陽性の相関性があることが確立されたので、特定の危険性、特に重度の疾患もしくは特定の強度の疾患の診断のために、方法がさらに作製され得る。アトピー性疾患の重傷度の重要なパラメータは、血清ＩｇＥである。検査される患者について、血清ＩｇＥのレベルと抗ＣＤ２８自己抗体の力価のレベルとの間の相関性が見出された。
【００４８】
本発明の方法に従う方法を実施するために、キットもまた、提供される。好ましくは、このキットは、アレルギー性疾患および／またはアトピー性疾患の診断のために適しており、そしてＣＤ２８および標識化抗免疫グロブリン抗体を含む。
【００４９】
好ましくは、このキットは、ヒトＣＤ２８抗体および標識化抗免疫グロブリン抗体（特に抗ヒトＩｇＧ抗体）を含む。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明に従うキットは、標識化抗ＩｇＥ抗体をさらに含み、したがって、総ＩｇＥ濃度とＣＤ２８自己抗体の検出との両方に基づいて、アレルギー性疾患もしくはアトピー性疾患の確認のための診断試験を実施するために適する。このキットは、未標識抗ＩｇＥ抗体をさらに含み得る。何故なら、総ＩｇＥについての試験は、サンドイッチＥＬＩＳＡとして実施され得るからである。未標識抗体は、ポリクローナル抗ＩｇＥであり得、そして標識化抗ＩｇＥ抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。あるいは、この標識化抗ＩｇＥ抗体および未標識抗ＩｇＥ抗体は、各々、モノクローナル抗体であってもよいが、しかしこれらは、ことなるエピトープを指向しなければならない。
【００５１】
上記キット中に含まれる標識化抗体は、酵素（例えば、アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ビオチン、放射性同位体もしくは蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣもしくはＰＥ）で標識され得る。
【実施例】
【００５２】
（実施例１：トリプシンによる組換えＣＤ２９−Ｉｇ融合タンパク質の酵素切断およびイムノブロットにおけるＣＤ２８に対する自己抗体の検出）
組換えＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を、ＰＢＳ緩衝液（２．７Ｍ  ＮａＣｌ、５４ｍＭ  ＫＣｌ、８７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ  ＫＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、そして１００μｌのこの溶液を、５０μｌのトリプシン（１０ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間消化した。このインキュベーション時間の最後に、１．５μｌのアプロチニン（１０ｍｇ／ｍｌ）および２．５μｌのＴＬＣＫ（Ｎα−ｐ−トシル−Ｌ−リジン−クロロメチルケトン、２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、トリプシンの酵素活性を阻害した。この溶液を、さらなる使用まで−２０℃で保存し得る。
【００５３】
タンパク質のゲル電気泳動による分離（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、Ｌｕｇｈｔｅｎｂｅｒｇら（Ｌｕｇｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．（１９７５），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８，２５４）の方法に従って実施する。上記の切断産物を、４％スタッキングゲルを用いたＳＤＳ−ゲル電気泳動（１０％ゲル）（１１０Ｖ、１５０分間）によって、非還元条件下で分離した。次に、この切断産物を、５０ｍＡの電流で３時間にわたってＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）膜（Ｓｅｇｉｎ−Ｂｌｏｔ，Ｂｉｏｒａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に移動させた。次いで、この膜を、５％スキムミルク粉末によって６０分間室温でブロックし、そしてＰＢＳで３回洗浄した。
【００５４】
イムノブロットの感度および特異性を、以下の抗体でモニタリングした：モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）（ＰＢＳ中１：５０００希釈）、ビオチン化ポリクローナルマウス抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）（ＰＢＳ中１：５０００希釈）、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＰＢＳ中１：１００００希釈）、およびポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＰＢＳ中１：３５００希釈）。
【００５５】
図１は、ＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質の切断産物は、抗ＣＤ２８抗体によってのみ明瞭に認識されるが、ＩｇＧもしくはＦｃに対する抗体によっては明瞭には認識されないことを示す。
【００５６】
血清中のＣＤ２８に対する自己抗体を検出するために、細長く切断した上記ＰＶＤＦ膜を、１：１０希釈したヒト血清中で１時間、旋回テーブル上で室温でインキュベートした。ヒトＦｃ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ）およびヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）に対する特異的抗血清を、コントロールとして用いた。次いで、このブロットを、再び３回洗浄し、次いで、ヒトＩｇＧに対するＡＰ結合体化二次抗体（Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇより）と共に室温で１時間インキュベートした。この結合を、酵素呈色反応（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）によって可視化した。
【００５７】
図２は、例として、ＣＤ２８に対する自己抗体を含む血清についての結果または陰性の結果を示す。イムノブロットにより、ＣＤ２８に対する特異的ＩｇＧ抗体が、血清中で検出される。
【００５８】
（実施例２：ＣＤ２８に対する自己抗体の種々の疾患との関連）
本方法を用いて、計２６８の血清を試験し、ＣＤ２８に対する自己抗体の存在について評価した。この群において、７２の血清を、健康な試験被験体から得、そして１９６の血清を、種々の疾患の患者から得た。学術目的で血液サンプルを採取するための書面による同意を、各患者から得た。
【００５９】
健康な試験被験体の群において、ＣＤ２８自己抗体を、８／７２（１１．１％）の血清中で検出した。患者群において、５３／１９６（２７．０４％）の血清が陽性であった。表１は、ＣＤ２８自己抗体の存在が、より若年の者および女性と相関している傾向があることを示す。
【００６０】
（表１：抗ＣＤ２８自己抗体に対する年齢および性別の関係）
【００６１】
【表１】
2008530522.tif 000003
単変量分析は、ＣＤ２８自己抗体の出現が、アトピー性湿疹（オッズ比、２５．３１［９５％  ＣＩ、５．５２−１１６．１１］；ｐ＜０．０００１）、アレルギー性喘息およびアレルギー性鼻結膜炎（ＯＲ  １０．７８［９５％  ＣＩ、５．３９−２１．５５］；ｐ＜０．０００１）と、ならびに強皮症、紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、皮膚筋炎もしくは水疱性自己免疫疾患のような自己免疫疾患と、有意に関連していることを示す（表２）。患者群において診断された全ての他の疾患は、ＣＤ２８自己抗体の出現と相関していなかった。
【００６２】
他の要因（例えば血清ＩｇＥ）を除外するため、さらに、多変ロジスティック回帰分析を行った。これに基づき、年齢、性別もしくは血清ＩｇＥの影響の可能性は、余因子として統計的に除外された（表３）。
【００６３】
（表２：診断と抗ＣＤ２８自己抗体との間の関係）
【００６４】
【表２】
2008530522.tif 000004
９５％−ＣＩ：９５％の信頼区間；ｎ．ｓ．：有意でない；ｐ＊：フィッシャーの直接確率検定によるＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正ｐ−値；ＯＲ：オッズ比。
【００６５】
（表３：抗ＣＤ２８自己抗体の出現に影響を有する要因のロジスティック回帰分析）
【００６６】
【表３】
2008530522.tif 000005
（実施例３：ＣＤ２８に対する自己抗体の機能的有意性）
ＣＤ２８に対する自己抗体の機能的有意性を、いわゆる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって検査した。
【００６７】
まず、プロテインＧ−バンド（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ）を、指示書に従い、ＣＤ２８融合タンパク質とともにローディングした。このタンパク質は、架橋によって不可逆的にビーズに結合した。そして結合を、フローサイトメトリーによって測定した。次いで、血清プールを、（１）アトピー性湿疹を有する患者由来の抗ＣＤ２８自己抗体を含有する３つの血清（ＡＥ＋）、（２）アトピー性湿疹を有する患者由来の抗ＣＤ２８自己抗体を含有しない２つの血清（ＡＥΦ）、（３）アトピー性湿疹を有さない患者由来の抗ＣＤ２８自己抗体を含有する２つの血清（Ｇ＋）、（３）アトピー性湿疹を有さない患者由来の抗ＣＤ２８自己抗体を含有しない７つの血清（ＧΦ）から調製した。
【００６８】
このプール血清を、順次ビーズによって精製することにより、ＣＤ２８に対する抗体およびヒトＦｃに対する抗体を有する画分を得た。次いで、溶出物を、ＣＤ２８に対する抗体の存在について、ウェスタンブロットによって試験した。
【００６９】
次に、溶出物およびプール血清について、ＭＬＲの範囲内で増殖試験を実施した。細胞株を、ＲＰＭＩ１６４０培地＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で培養した。ＭＬＲのために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０４個の細胞／ｍｌ）を、放射線照射した（用量：３０ｇｙ）Ｒａｊｉ細胞（１０４／ｍｌ）と共に培養した。溶出物（５０μｌ）を、種々の培地に添加した。いくつかの培地において、４μｇのＣＴＬＡ−４−Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を、アネルギーの誘導のために添加した。２日後、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、培養物に添加し、そして５時間インキュベートした（Ｎｅｕｂｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００３，１０９：２４−３１）。次いで、細胞の増殖を、呈色反応によって測定した。
【００７０】
この実験（図３）は、ＣＤ２８に対する自己抗体を含む血清からの溶出物は、細胞増殖を大いに刺激したが、一方、自己抗体を含まない血清は、増殖を阻害したことを示した。
【００７１】
Ｔリンパ球上のＣＴＬＡ−４レセプターの刺激は、刺激シグナルの阻害を介して、細胞をアネルギー状態でシフトした（Ｓｈａｒｐｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  ２００２，２：１１６−１２６）。したがって、このＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合タンパク質を、増殖実験におけるコントロールとして使用し得る（Ｌｉｎｓｌｅｙら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９１，１７４：５６１−５６９）。ＣＤ２８に対する自己抗体を含む血清は、アネルギー状態を突破し、そしてＴ細胞は再び増殖し得ることを見出した。
【００７２】
（実施例４：ＣＤ２８−ＧＳＴ融合タンパク質の産生）
（ヒト全血からのＲＮＡ調製）
まず、ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ，カタログ番号：５２３０４）からのＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔを用いてヒト全血から調製した。
【００７３】
（ｃＤＮＡの産生のためのＲＴ−ＰＣＲ）
５μｇの調製ＲＮＡを、ランダムへキサマープライマーを用いＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いて血液ｃＤＮＡに転写した。
【００７４】
（ＣＤ２８  ｃＤＮＡのクローニング）
次いで、上記タンパク質の細胞外領域（ＩｇＧ−様ドメイン、膜貫通領域およびシグナルペプチドを含まない）をコードするｃＤＮＡ領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。使用した参照は、配列ＮＭ＿００６１３９（配列番号３）であり、ＮＣＢＩからインターネット上で利用可能である。
【００７５】
増幅したｃＤＮＡは、以下のアミノ酸配列をコードする：
ＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦ（配列番号２）。
【００７６】
使用したプライマーは、以下であった：
センス      ５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣ−３’  （配列番号４）
アンチセンス      ５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＴＡＧＧＧＧＡＣＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧ−３’  （配列番号５）
このｃＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩの切断部位（これらは、既に増幅に用いたプライマー５’内に組み込まれている（プライマー配列中の下線部位））を介してベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，カタログ番号：２７−４５８０−０１）のマルチクローニングサイトに組み込んだ。このために、ＰＣＲ増幅産物およびベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１の両方を、反応緩衝液ＮＥＢ４中で、２０℃もしくは３７℃で、各々２時間にわたって、まずＳｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  Ａ．Ｍ．，カタログ番号：＃Ｒ０１４１Ｓ）と共にインキュベートし、次いで、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号＃Ｒ０１０１Ｓ）と共にインキュベートした。この後、切断したＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅ社からのアガロースゲルＤＮＡ抽出キット（Ｂａｓｅｌ，カタログ番号：１６９６５０５）によって精製した。次いで、この線状化ベクターを、脱リン酸化するために、この溶出したＤＮＡを、適切な緩衝液の添加後、３７℃で１０Ｕのアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：７１３０２３）と共にインキュベートした。次いで、この制限調製物を、１％アガロースゲル中で１００Ｖで分離した。臭化エチジウム染色の後、約４００ｂｐのバンドを、ＵＶトランスイルミネーター上で可視化し、そして切り出した。次いで、切断したｃＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅアガロースゲル溶出キットを用いて、５０μｌ  Ｈ２Ｏ中で溶出した。次に、ライゲーションチャージを、Ｔ４−リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号：Ｅ１１１−０１）、１００ｎｇのベクターおよび２００ｎｇのｃＤＮＡフラグメントで調製し、そして１２℃で数時間インキュベートした。これにより、リーディングフレーム中に存在するＣＤ２８から５’方向にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼが配置されている構築物を得た。
【００７７】
次に、コンピテントな細菌（ＸＬ１  Ｂｌｕｅ，ＨＢ  １０１）を、５分の１のライゲーションチャージで形質転換した。このために、５分の１のライゲーションチャージもしくは０．５μｇのＤＮＡ調製物を、氷上で融解した５０μｌのコンピテント細菌にピペットで添加し、そして氷上で３０分間インキュベートした。
【００７８】
次いで、細菌調製物を、３７℃で５分間加熱した。次いで、９５０μｌのＳＯＣ培地を添加し、そして５０μｌ〜１ｍｌのチャージを、１５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ−アガープレート上に均一にピペットで画線し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
（細菌からのプラスミドの少量調製（ｍｉｎｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ））
形質転換した細胞の個々のコロニーを、対応する抗生物質添加物と共に２．５ｍｌの培地中に植菌し、そして一晩培養した。この細菌を、次いで、２４００ｇで遠心分離し、上清を除去して、ペレットを、シェーカー上で、２００μｌの１μｇ／ｍｌのリゾチーム含有ＳＴＥＴ（８％スクロース、５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。このチャージを、次いで２分間９５℃で加熱し、次いで、１０分間１６０００ｇで遠心分離した。沈殿をつまようじで除去し、廃棄した。１０μｌの５％  ＣＴＡＢ溶液（セチル−トリメチル−アンモニウムブロミド）を上清に添加し、少し振とうし、ペレットを１６０００ｇで沈殿させた。上清を除去し、そしてペレットを、シェーカー上で、３００μｌの１．２Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解した。次いで、７５０μｌの１００％エタノールを添加し、このチャージを激しく振とうして、そして１０分間１６０００ｇで遠心分離した。この上清を除去し、そしてペレットを１ｍｌの７０％エタノール中で洗浄し、５分間１６０００ｇで遠心分離し、そして再び上清を廃棄した。このＤＮＡペレットを、乾燥させ、そして３０μｌ  Ｈ２Ｏ中に入れた。
【００８０】
挿入された領域の配列の正確性を、配列決定法によって決定した。
【００８１】
（組換えＣＤ２８−ＧＳＴ融合タンパク質の調製）
コンピテントＢＬ２１−ＲＩＬｓｕｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉａ（プロテアーゼ欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、上記のｃＤＮＡ構築物で形質転換させ、その後、ＳＯＣ培地中３７℃で３０分間プレインキュベーションし、１５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有のＬＢ−アガープレート上に画線した。１４時間のインキュベーション後、３０ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に、コロニーを植菌した。
【００８２】
この予備培養物を、シェーカー内で、一晩３７℃でインキュベートした。次いで、これをアンピシリン含有５００ｍｌ  ＬＢ培地に移し、そして３７℃で、連続的に振とうしながら、６００ｎｍで０．６〜０．８の最適密度までインキュベートした（約１．５時間）。
【００８３】
この密度に達するとすぐに、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルｂＤ−チオガラクトピラノシド，Ｂｉｏｍｏｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，カタログ番号：０５６８４−１）によってタンパク質発現を誘導した。約４時間後、細菌を４０００ｇ、４℃で１０分間沈殿させ、培養上清を捨て、そしてペレットを５〜１０ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に再懸濁した。この上清を、５回、各回１０秒間にわたって超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０、第６段階）、次いで、２０分間３００００ｇで遠心分離した。次いで、親和性精製を、ＧＳＴ−タグを介して行った。グルタチオン−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号：２７−４５７４−０１）を、ベッド容量１ｍｌの重力駆動ポリプロピレンカラムにローディングし、そして５倍の容量のＰＢＳで平衡化した。
【００８４】
細菌溶解物をローディングし、そしてカラムへの流れを再び開始した。第２の通過物を捨て、そしてカラムをベッド容量の５倍の容量のＰＢＳで洗浄した。溶出を、１０ｍＭ還元グルタチオン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール中で実施した。次いで、溶出したタンパク質のアリコートを、−８０℃で保存した。
【００８５】
（使用した材料）
ＰＢＳ                        １３７ｍＭ  ＮａＣｌ
２．７ｍＭ  ＫＣｌ
７．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４
１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４
ＳＴＥＴ                      ８％スクロース
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ
５０ｍＭ  ＥＤＴＡ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８
ＴＡＥ×５０                  ２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基
５．７１％氷酢酸
５０ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＴＥ                          ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５
１ｍＭＥＤＴＡ
適用緩衝液×５（核酸用）      ４０％スクロース
０．２５％ブロモフェノールブルー
０．２５％  ＴＥ中キシレンＸ
ＳＯＣ培地                    ２％  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ
０．５％  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
２．５ｍＭ  ＫＣｌ
５Ｎ  ＮａＯＨ（ｐＨ７．０まで）
オートクレーブの後、６０℃まで冷ます
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭグルコース
Ｄｙｔ培地                    １．６％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ
１％Ｂａｃｔｏ酵母抽出物
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
ＬＢ培地                      １％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ
０．５％  Ｂａｃｔｏ酵母抽出物
２００ｍＭ  ＮａＣｌ
ＮａＯＨでｐＨ７．５まで調整する
Ｙ−ブロス                    ＬＢ培地
４ｍＭ  ＭｇＳＯ４
５ｍＭ  ＫＣｌ
ＴＦＢ  １                    １５％グリセロール
１０ｍＭ  ＣａＣｌ２
３０ｍＭ  酢酸カリウム
酢酸でｐＨ５．８まで調整する
１００ｍＭＲｂＣｌ
５０ｍＭＭｎＣｌ２
ＴＦＢ  ２                    １５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ
７５ｍＭ  ＣａＣｌ２
１０ｍＭ  ＲｂＣｌ
ＬＢ培地                        １％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ
０．５％Ｂａｃｔｏ酵母抽出物
２００ｍＭ  ＮａＣｌ
ＮａＯＨでｐＨ７．５まで調整する
（コンピテント細菌の産生）
ＸＬ１ｂｌｕｅ細菌を、ＬＢプレート上に画線し、そして３７℃で一晩インキュベートした。朝に、数個のコロニーを、各々２ｍｌのＹ−ブロスに植菌し、そしてシェーカー内で２時間３７℃でインキュベートした。次いで、これらの予備培養物を、５００ｍｌ  Ｙ−ブロスに入れ、そして６００ｎｍでのＯＤが０．３〜０．３５になるまでインキュベートした。次いで、この培養物を、２つの５０ｍｌポリプロピレンチューブに分配し、氷上に短時間置き、そして４℃、２０００ｇで沈殿させた。上清を捨て、ペレットを各々１５ｍｌのＴＦＢ  １（１５％グリセロール、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３０ｍＭ酢酸カリウム、酢酸でｐＨ５．８に調整、１００ｍＭ  ＲｂＣｌ、５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）中に再懸濁し、そして氷上に６０〜９０分間置いた。
【００８６】
次いで、これを２０００ｇで再び沈殿させ、上清を捨て、そしてペレットを各２ｍｌ  ＴＦＢ２（１５％グリセロール、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、７５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＲｂＣｌ）中に再懸濁した。次いで、細菌を、２００μｌのアリコートに分配し、そして直ちに液体窒素中で急速凍結させ、次いで−８０℃で保存した。
【００８７】
（実施例５：ヒトＣＤ２８の細胞外ドメインに特異的な抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ）
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）のウェルを、１００μｌモノクローナルマウス抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）抗体（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来のＧＳＴに特異的、ＰＢＳ中１：２０００の事前希釈物）でコーティングした。室温で１時間のインキュベーション時間後、このウェルを、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。
【００８８】
次いで、２５０μｌの１％スキムミルク粉末含有ＰＢＳ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で室温で１時間ブロッキングを実施し、その後、再びＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。
【００８９】
各１００μｌのＣＤ２８−ＧＳＴ抗原１：２事前希釈物（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）を、カラム１および２のウェル内にピペットで入れ、第３および第４のカラムのウェルに、各々、１００μｌ  ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０のみを入れた。このマイクロタイタープレートの他のカラムを、同様に調製した。
【００９０】
室温で１時間の後、３回以上の洗浄工程を行った。次いで、患者由来の血清およびポジティブコントロール血清、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）（濃度１μｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中で１：２００に事前希釈した。
【００９１】
ブランク値は、抗原を含むがコントロール血清を含まず、ネガティブコントロールはコントロール血清を含むが抗原を含まず、そしてブランクは、コントロール血清も抗原も含まなかった。各患者血清を、抗原および（非特異的反応を除外するために）ＰＢＳ＋０．１％  ／Ｔｗｅｅｎ  ２０に対して、２重決定で測定した。
【００９２】
次いで、このマイクロタイタープレートを、室温で１時間インキュベートし、次いで、３回洗浄した。次の工程において、二次抗体を添加した。コントロール血清を含むウェル（Ｂ１〜４）中で各１００μｌの抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｆｃ特異的；Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ）を使用し、そして患者血清について、各１００μｌの抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｆｃ特異的；Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ）を使用した。両抗体を、１：５０００に事前希釈し、そしてアルカリホスファターゼで標識した。インキュベーション時間は、室温で６０分間であった。
【００９３】
５回完全に洗浄した後、１００μｌのｐ−ニトロフェニル基質溶液（ｐＮＰＰ基質錠剤セット，Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ）を、各ウェルに添加し、そして暗所で６０分間、室温でインキュベートした。発色を、４０５ｎｍで０分後および６０分後に測定した。
【００９４】
各血清についての結果を、以下の式から計算した：
【００９５】
【数１】
2008530522.tif 000006
商を、試験した全ての血清について計算した。限界値を、健康な試験被験体由来の７２の血清で計算した。健康な試験被験体の全ての計算した商の９５％は、９未満であり、したがって、１０を超える値が陽性であると評価され、すなわち、これらは自己抗体を含むことが見出された。
【００９６】
さらに、ＣＤ２８に対する自己抗体を全く含まない血清およびＣＤ２８自己抗体を絶対に含む血清を、希釈系列中で試験した。ＣＤ２８自己抗体を含む血清はまた、１：７００の希釈における陰性の血清よりはっきりと高いＯＤを示した（図４）。
【００９７】
患者血清中のＧＳＴに対して交差反応する抗体を、除外した。この目的で、３２の血清を試験し、そしてこのＥＬＩＳＡに用いたＧＳＴに対する抗体を含む血清は見出されなかった。
【００９８】
アトピー性疾患を有する全ての患者について、血清中のＩｇＥ値が、示された。ＩｇＥの濃度は、アトピー性疾患の重症度の程度についてのパラメータである。これらの患者について、ＣＤ２８に対する自己抗体についての力かは、血清ＩｇＥ力価のレベルと有意に相関している。したがって、抗ＣＤ２８自己抗体力価のレベルが、アトピーの重症度と相関することを結論し得る。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】トリプシンによる酵素消化後のＣＤ２８−Ｉｇ融合タンパク質の切断産物。カラム１：マウス抗ヒトＣＤ２８  ｍｏＡｂで標識したＣＤ２８。カラム２：ビオチン化ポリクローナルマウス抗ヒトＣＤ２８  Ａｂで標識したＣＤ２８。ＣＤ２８融合タンパク質のいくつかのより小さいフラグメントは、このポリクローナルＡｂで検出されるが、モノクローナル抗体で検出されない。カラム３〜５：ウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを有するＩｇ部分の分割産物（カラム３）、ならびにヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ａｂを有するＩｇ部分の分割産物（カラム４）およびマウス抗ヒトＦｃ  Ａｂを有するＩｇ部分の分割産物（カラム５）。
【図２】アトピー性湿疹（ＡＤ）およびＣＤ２８に対する自己抗体を有する４人の患者、ならびに自己抗体を有さない１人の患者のイムノブロット。自己免疫疾患（ＡＩ）のＣＤ２８抗体についての例として、強皮症を有する患者の血清による結果を示す。ここで、後天性表皮水疱症（ＡＩ）および尋常性乾癬（ＰＳ）を有する患者において、ＣＤ２８に対する自己抗体は検出されなかった。
【図３】放射線照射Ｒａｊｉ細胞および生Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＭＬＲ。増殖を、培養の２日後にＢｒｄＵの組み込みによって測定した。結果は、自発的増殖（コントロール）の刺激の割合（％）で示される。ＣＴＬＡ４−Ｉｇが増殖を阻害する一方で、ＣＤ２８自己抗体（ＣＤ２８  ａｕｔｏ−Ａｂ）を含む溶出物は、Ｔ細胞増殖を有意に刺激した。ＣＴＬＡ４−ＩｇおよびＣＤ２８に対する自己抗体による同時刺激は、Ｊｕｒｋａｔ細胞増殖の阻害の有意な低下を示した。＊＊Ｐ＜０．０１は、コントロールに対する比較において有意である。
【図４】ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ２８自己抗体についての血清の分析。絶対に抗ＣＤ２８自己抗体を含む血清のＯＤは、高い希釈においてさえも、抗ＣＤ２８自己抗体について明瞭に陰性である血清よりもなお有意に高い。
【図５】それぞれ、抗ＣＤ２８自己抗体とアトピーもしくはアトピー性湿疹を有する患者における血清ＩｇＥとの相関の提示。相関係数は０．２０６であり、そして有意性のレベルは、０．０１２である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月15日(2008.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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