(57)【要約】  本発明は、治療用品質の組換え抗体の製造に関する。特に、本発明は培養した宿主細胞試料に非溶解処理を受けさせて大規模な発酵からの機能性抗体の収率を高める方法に関する。
2008520225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え抗体分子をコード化している発現ベクターで形質転換させた宿主細胞試料を培養すること、及び当該試料を非溶解処理段階にかけることを含む組換え抗体分子の製造方法。
【請求項２】
当該発現ベクターが少なくとも抗体軽鎖の一部及び少なくとも抗体重鎖の一部をコード化しており、少なくとも軽鎖と重鎖抗体分子の幾つかが分泌され、結合して機能性抗体を形成する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該非溶解処理段階は当該試料について圧力処理を受けさせることを含む、請求項１又は請求項２記載の方法
【請求項４】
当該圧力処理は７５０ｐｓｉと５０００ｐｓｉの間で実施される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
当該圧力処理は１０００ｐｓｉと４０００ｐｓｉの間で実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
当該圧力処理は２０００ｐｓｉで実施される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
当該非溶解処理段階は当該試料に予備調整の攪拌を受けさせる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
更に当該試料に３０℃から７０℃の範囲内の温度上昇を最長２４時間受けさせることを含む、請求項１から７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの精製段階を更に含み、前記精製段階は前記方法の後に実施される、先行する請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
当該組換え抗体分子はモノクローナル、ヒト化又はキメラ抗体或いはそれらの断片である、先行する請求項いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性組換え抗体、特に治療用抗体の生産及び単離における収率を増加させる方法に関する。当該方法は特に治療用抗体の大規模工業的製造に適している。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ手法はこれまで急速に発展しており、抗体の生産、特に治療用抗体では特に有効である。組換え遺伝子の発現に関する系は問題となっている当分野の当事者には良く知られている。これらには哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌及びトランスジェニック動物や植物における発現が含まれる。発現系の選択はコード化タンパク質、例えば翻訳後修飾の特徴に依存する。他の考慮すべき事柄には時間及び特に必要とされる品質の材料の望まれる量の生産で発生する費用である。これら後者の考慮すべき事柄は監督官庁の承認に必要とされる品質の治療用抗体の生産及び多数の患者の治療に必要とされる量に関して特に重要である。
【０００３】
組換えタンパク質の生産に関する系で最も広く使用される系はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に基づいている。Ｅ．Ｃｏｌｉ使用に関し直面する具体的な問題は、治療において必要とされる量の物質を要求される品質で生産する困難さである。特に、必要とされる時間と費用が非常にかかる。１つの注目される具体的な問題はＥ．ｃｏｌｉから抗体の抽出する際の抗体の収率で被る損失である。後者の問題について部分的に述べ、治療の使用基準に適した抗体の生産を可能とする方法は米国特許第５，６５５，８６６号に記載されている。本方法は熱処理を使用して非機能性抗体から抗体のＦａｂ’断片の次なる単離を容易にすることに関与し、当該熱処理は当該発酵又は培養においていつでも、又は当該抗体の抽出及び精製においてはいずれの段階でも実施される。室温より上に高めた温度では、機能性抗体は極めて安定である一方、宿主細胞タンパク質及び遊離の軽鎖と重鎖種及び抗体の非機能性断片を含んでいる多くの他のタンパク質は沈殿及び／又は凝集物を形成し、それらはろ過又は遠心分離又は流動床クロマトグラフィーのような基本的な精製手順において簡単に機能性抗体から分離される。比例的には当該精製の経費は機能性抗体生成物の全経費の一部であるが、当該精製経費割合は上流の生産費用が安くなるに従って更に上昇する。そこで、抗体の回収及び精製における改善は生産の手段にかかわらず更に生産費用を低下させることになる（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＆  Ｇｌｏｖｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１，４：１７２−１８５）。そこで治療用抗体生産、特に精製において、例えば生成物回収を増加させ及び／又は当該生成物の流れの品質を向上させることにより、時間及び／又は経費節約を取り入れる方法が必要とされる。
【０００４】
発酵又は培養当たりの低生成物収率はしばしば最初の抽出段階において目立つ特定の問題である；抗体の発現が細胞内で高いものの、最初の抽出段階で高い率での回収を達成するのは非常に難しい。米国特許第５，６６５，８６６号は非機能抗体を除去することにより精製工程を助ける熱処理段階を含めることによる初期精製収率の向上を記載している。
【０００５】
ＷＯ２００５０１９４６６（本出願の優先日の後に公表）は発酵の後であって下流処理に先立つ中断段階を入れることによる組換えタンパク質の収率の向上を記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書に記述した本発明は熱処理と組合せた非溶解処理が、初期抽出段階で機能性抗体の収率を最高５０％にまで向上させるという驚くべきかつ予想されない所見に基づいている；即ちこの機能性抗体の収率は熱処理のみによる収率を上回る。これは治療用品質の機能性抗体の生産に関する時間と費用の大きな節約をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、提供されるものは組換え抗体分子の製造する方法で、それは組換え抗体分子をコード化している発現ベクターで形質転換した宿主細胞試料を培養すること、及び前記試料を非溶解処理段階にかけることを含んでいる。
【０００８】
好ましい試料においては、当該組換え抗体分子は少なくとも抗体軽鎖の一部及び少なくとも抗体重鎖の一部であるので、少なくとも発現した軽鎖及び重鎖抗体分子の幾つかは結合することができて機能性抗体を形成する。
【０００９】
非常に好ましい実施形態では、当該方法は更に当該試料を最大２４時間の期間３０℃から７０℃の範囲の温度上昇に曝すことを含む。そして、本発明は機能性抗体分子と非機能性抗体分子を含む試料から単離した機能性抗体分子の収率を向上させる方法も提供するが、方法には最大２４時間３０℃から７０℃の範囲内の温度上昇に試料を曝すことを含み、その際当該試料を温度上昇に曝す前に非溶解処理段階を受けさせる。こうして本発明の方法を用いれば、単離又は得られた機能性抗体の収率の向上が達成される。
【００１０】
特に、当該方法は単離した機能性抗体の収率を、産生される機能性抗体及び使用される発現系の具体的な特徴を考慮して必要に応じて変化させることができ、当技術分野の当事者が理解できる温度及び処理条件の範囲で増加させることができる。
【００１１】
本明細書で使用される“機能性抗体”には当該抗原（同種抗原）を特異的に認識する或いは結合する能力を保持している抗体分子が含まれる。機能性抗体の産生は当該抗原の予想分子量に相当する非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける単一バンドの存在又はＢＬＡｃｏｒｅを用いる直接結合アッセイ又は当技術分野の当事者が知っている他の方法、例えばこれだけに限らないがＥＬＩＳＡによる直接結合分析により示される。非機能的抗体にはそれらの同種抗体を認識しない断片が含まれ、不正確に折り畳まれた又は不正確に組み立てられた抗体、遊離の重鎖と軽鎖及びそれらの同類抗原を認識又は結合しない抗体の部分的に分解した断片を含むそれらの断片が含まれる。
【００１２】
本発明の方法では、試料は例えばこれだけに限らないが細菌、特にグラム陰性細菌又は酵母を含む発酵物、例えばこれに限らないが哺乳類又は昆虫細胞培養である細胞培養などの発酵（又は培養）の生産物でありうる。最も好ましくは、当該試料は組換え抗体を発現するＥ．Ｃｏｌｉを含む発酵の生産物で、当該抗体は機能性と非機能性抗体でありうる。望ましくは、当該宿主細胞は当該発酵培地より集められ、例えば宿主細胞は遠心分離、ろ過又は濃縮により試料より集められる。特に、本発明の方法は治療用品質の抗体の大規模工業的生産に適している。
【００１３】
本発明の方法にて非溶解処理を用いる更なる利点は、得られる機能性抗体の収量の驚くべき増加に加えて大規模な試料の扱いが容易であることである。溶解は粘度の増加を起こし、それは機能性抗体の後処理及び精製において課題を生ずる。特に宿主細胞群の溶解は宿主細胞タンパク質の放出を起こし、必要な純度を達成するにはより多くの精製段階が必要とされ、そして／又はクロマトグラフィー材料がより多く必要となるので精製に経費と時間がかかるようになる。宿主細胞のＤＮＡの大量放出がろ過及び遠心分離の困難性を生じる試料粘度の増加を起こし、清澄化におけるタンパク質損失の主な原因となる。溶解した試料（即ち、宿主細胞のタンパク質及びＤＮＡを含有している）はクロマトグラフィー材料の目詰まりも起こしてしまう。
【００１４】
本明細書で説明した本発明では、非溶解処理には例えばＥ．ｃｏｌｉのような組換え抗体発現に使用する細菌、哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞又は他の生物の相当な割合に溶解を起こさないいずれの処理も含まれる。大層好ましい実施形態では、当該非溶解処理は圧力処理を含む。それに代わるものとして、当該非溶解処理は攪拌又はかき混ぜの前調整段階を含む。“相当な部分”には元のままで存在する発酵又は培養における当該生物の８０％以上の部分、より好ましくは８５％、更に好ましくは９０％、そして大層好ましくは９５％以上の部分がそのままであることが含まれる。
【００１５】
溶解は当技術分野で知られているいずれの方法でも判定でき、顕微鏡による観察、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析及び全タンパク質に対する上澄み液及び／又は生物（細胞）沈殿物におけるタンパク質の分析が含まれる。１つの実施形態では、溶解は非溶解処理後に処理前後の試料における全タンパク質を比較することで判定できる。処理が溶解を起こせば、当該処理試料の上澄み液に存在する全タンパク質は当該非処理試料中に存在する全タンパク質に比べて、例えばＢｒａｄｆｏｒｄ検定法を用いて測定すると増加している。好ましい実施形態では、ＦＡＣＳ分析は当該試料を蛍光色素で標識した後、非溶解処理しＦＡＣＳ分析で行う。大層好ましくは、ＦＡＣＳ分析は処理前に比較用のベースライン値を求めておく。
【００１６】
ここで、非溶解処理には一定時間緩やかな再懸濁、例えば攪拌又はかき混ぜ或いは例えば緩衝液へのピペッチングのような手動による再懸濁による予備調整を含むことができる。１つの実施形態では、予備調整は１時間と２４時間の間、好ましくは１時間と２０時間の間、より好ましくは２時間と１８時間、４時間と１６時間、６時間と１６時間の間、そして大層好ましくは１２，１４又は１６時間の間実施される。そこで予備調整についての最短時間は１，２又は４時間で、最長時間は１６，１８又は２４時間である。予備調整は５０から２５０ｒｐｍの回転、好ましくは６０ｒｐｍから１００ｒｐｍ、そして大層好ましくは１４又は１６時間で実施できる。予備調整の間、当該細胞群は４℃から３０℃の範囲の間、好ましくは４℃から２０℃の間、そして大層好ましくは室温で維持する。
【００１７】
好ましい実施形態では、非溶解処理は当該宿主細胞群を、例えばフレンチプレス（加圧型細胞破砕装置）又は窒素減圧を用いて加圧に曝すことを含む。具体的な例では、試料はＥ．Ｃｏｌｉ発酵の生成物で、そのＥ．ｃｏｌｉは組換え抗体を発現し、これをフレンチプレスにて加圧処理にかける。圧力は７５０ｐｓｉから凡そ５０００ｐｓｉの範囲の程度である。１つの実施形態では、当該圧力処理は１０００ｐｓｉ又は１２５０ｐｓｉ、１５００ｐｓｉ、１７５０ｐｓｉ、２０００ｐｓｉ、２２５０ｐｓｉ、２５００ｐｓｉ、２７５０ｐｓｉ、３０００ｐｓｉ、３２５０ｐｓｉ、３５００ｐｓｉ、４０００ｐｓｉ、４２５０ｐｓｉ、４５００ｐｓｉ、又は４７５０ｐｓｉで実施される。より好ましくは、当該圧力処理は１０００ｐｓｉと３０００ｐｓｉの間、大層好ましくは２０００ｐｓｉで実施される。実質的に非溶解（即ち２０％未満の溶解を起こす）である圧力処理は当該試料を含む緩衝液と細胞型及び当該圧力に依存する簡単な実験で測定できる。
【００１８】
従って、提供されるのは組換え抗体分子をコード化した発現ベクターで形質転換した宿主試料を培養すること及び当該試料を圧力処理にかけることを含む組換え抗体分子の製造方法である。同時に、提供されるのは試料から単離された機能性抗体分子の収率を向上させる方法で、前記試料は可溶性で機能性抗体分子及び非機能性抗体分子を含んでおり、その方法には当該試料を最長２４時間の期間３０℃から７０℃の範囲内の温度上昇に曝することを含み、その際当該試料は温度上昇に曝す前に当該試料を加圧に曝すことを含んでいる非溶解処理段階を受けさせる。
【００１９】
更に提供されるのは組換え抗体分子をコード化した発現ベクターで形質転換した宿主細胞試料の培養及び前記試料を予備調整の攪拌に曝すことを含む、組換え抗体分子の製造方法である。本発明は同時に試料から単離した機能性抗体分子を増加させる方法も提供するが、前記試料は溶解性で機能性抗体分子及び非機能性抗体分子を含んでおり、方法は当該試料を最長２４時間の期間３０℃から７０℃の範囲の温度にて上昇する温度に曝すことが含まれ、前記方法は温度上昇に当該試料を曝す前に当該試料を予備調整することを含む非溶解処理段階に試料を曝すことを特徴とする。好ましくは、当該非溶解処理は１４又は１６時間の間の予備調整用攪拌を含んでいる。
【００２０】
好ましくは、当該宿主細胞群は発酵又は培養物から、例えば遠心分離により収集され、例えばこれだけに限らないがトリス、酢酸塩又はリン酸塩のような緩衝塩を用いる緩衝液中に懸濁させる。当該溶液のｐＨは、例えばｐＨ２とｐＨ１０の間であり、大層好ましくはｐＨ６とｐＨ８の間であろう。１つの実施形態では、当該ｐＨは６．８又はｐＨ６．８の０．１範囲内である。大層好ましい緩衝液はトリス緩衝液ｐＨ７．４で、これは場合により更にＥＤＴＡを含み、例としてはこれだけに限らないが１０ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ｍＭトリス、ｐＨ７．４である。宿主細胞群は好ましくは後者の緩衝液に懸濁してから非溶解処理段階を受けさせる。当該非溶解処理は、例えば生育ブロス中での予備調整のような精製される抗体に依存する発酵に関しては生育ブロス又は培地中で行うことができる。そこで、１つの例では生育ブロスでの予備調整による収率の向上は当該宿主細胞により発現される抗体により変動する。熟練した人であれば生育ブロスでの予備調整がある種の抗体に適しているかは実験的に測定できる。大層好ましくは、当該非溶解処理は上記のような緩衝液中で実施される。
【００２１】
大層好ましい実施形態では、本発明の方法は組換え抗体を発現するＥ．ｃｏｌｉの発酵試料を用いて実施される。ｐＨ６とｐＨ８の間、好ましくはｐＨ７．４，より好ましくはｐＨ６．８のトリス／ＥＤＴＡ緩衝液当該試料を含む試料を、フレンチプレス中にて２０００ｐｓｉで圧力処理を受けさせる。
【００２２】
大層好ましくは、熱処理段階は３０℃から７０℃の範囲内で実施される。当該温度は望みに応じて選ぶことができ、精製における抗体の安定度に依存するであろう。他の実施形態では当該温度は４０℃から６５℃内、又は好ましくは４０℃から６０℃内、より好ましくは４５℃から６０℃内、更により好ましくは５０℃から６０℃、大層好ましくは５５℃から６０℃の範囲内である。そこで、最低温度は３０℃、３５℃又は４０℃であり、最高温度は６０℃、６５℃又は７０℃である。熱処理の長さは好ましくは１と２４時間、より好ましくは４と１８時間、更により好ましくは６と１６時間、そして大層好ましくは１０と１４時間、例えば１２時間である。そこで、熱処理についての最短時間は１，２又は３時間で、最長時間は２０、２２又は２４時間である。
【００２３】
１つの特定な実施形態では、当該熱処理は１２から１６時間の間５０℃から６０℃、より好ましくは１４時間の間５０℃で実施される。当技術分野の当事者であれば、温度と時間は対象とする試料及び産生される抗体の特徴に適するように選ぶことができることは理解するであろう。
【００２４】
抗体の製造には更にろ過及び／又は遠心分離のような基礎的な精製手順を含むことができる。同様に流動床クロマトグラフィーも含まれる。好ましい下流の精製手順にはイオン交換クロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、ダイアフィルトレーション及び固定床捕集と膨張床捕集、及びそれらいずれかの組合せが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用するとき、“抗体群”には機能性活性断片、誘導体又は類似体が含まれ、これだけに限らないがポリクローナル、モノクローナル、二価、三価又は四価の抗体、ヒト化又はキメラ抗体と単鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’とＦａｂ’２断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体のような単鎖抗体及び上記のいずれのエピトープ結合断片でありうる。これらの抗体群及びそれらの断片群は自然発生、ヒト化、キメラ又はＣＤＲグラフト化抗体群でありえて、標準の分子生物学手法を使用して望みに応じてアミノ酸又は領域を修飾、付加又は除去する。ヒト化した抗体群はヒト以外の種から得た１種類以上の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）及びヒト免疫グロブリン分子（例えば米国第５，５８５，０８９号参照）から得た骨格領域を有するヒト以外の種から得た抗体分子である。本発明の方法を用いて精製した抗体分子は免疫グロブリン分子のいずれかのクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスでありうる。
【００２６】
これらの抗体分子を作り出す方法は当分野技術で知られている（参照、例えばＳｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３；Ｒｉｅｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：３２３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ，ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０：１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６：１６５−１８１）。
【００２７】
モノクローナル抗体群はハイドリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイドリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ−ハイドリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）のような当分野技術でよく知られている方法で調製できる。
【００２８】
キメラ抗体は遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子でコード化された抗体群なので、軽鎖と重鎖遺伝子群は異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されている。これらのキメラ抗体群はより抗原性が少ないようである。二価抗体は当技術分野で知られている技術により作成することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９）。二価、三価及び四価抗体は多様な特異性を含むか単一特異性でありうる（参照、例えばＷＯ９２／２２８５３）。
【００２９】
抗体配列は、分子クローニング及びＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１５）：７８４３−７８４８及びＷＯ９２／０２５５１に記載されているような特異抗体の産生に関して選ばれる単一白血球群から生成する免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡｓの発現に基づいた単一白血球抗体法を用いて産生することもできる。後者の方法は、そののちクローン的に広がる個々の抗体産生細胞群の単離に依存しており、次いで同種抗原及び望めばそれらの可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）遺伝子の配列の次なる認識をする抗体を産生しているそれらのクローンを選別する。これに代わるものとして、その同種抗原を認識する抗体を産生する細胞群は同時に培養され、そののち選別にかけられる。
【００３０】
本発明の方法を用いて調製された抗体群は大層好ましくは、毒素、薬物、細胞毒化合物又は高分子に結合するであろうヒト化抗体群、或いは患者に投与すると抗体の半減期を長引かせる他の化合物である。
【００３１】
組換えタンパク質の発現する方法は当技術分野では良く知られている。組換え抗体分子の発現に関して適した宿主細胞群の例には、例えばグラム陽性又はＥ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性細菌又は、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞、又は例えばＣＨＯ細胞やミエローマのような哺乳類細胞或いはＮＳＯ細胞のようなハイブリドーマ細胞株が含まれる。大層好ましくは、本発明の方法では組換え抗体は、例えばＥ．ｃｏｌｉ（参照、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１６：１６５−１８１；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３−１４７）のような細菌中で産生される。
【００３２】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞群は組換えタンパク質を産生できる天然発生のＥ．ｃｏｌｉ株又は変異株でありうる。特異な宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株の例にはＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ２１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９が含まれる。例には、例えば代謝突然変異株及びプロテアーゼ欠損株である修飾Ｅ．ｃｏｌｉ株も含まれる。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉ宿主はＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）で、組換えタンパク質発酵によく使用される宿主株である。本発明の方法を用いて産生される組換え抗体は一般的にタンパク質の性質及び産生の規模により当該Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の周辺質或いは当該宿主細胞培養上澄み液のどちらかに発現される。タンパク質をこれらの区画に狙いをつける方法は当該技術分野では良く知られていて、概説はＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗａ，１９９６，６０，５１２−５３８を参照。Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質にタンパク質を導くのに適したシグナル配列の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ，ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ，ＯｍｐＴ，ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列が含まれる。タンパク質は天然の分泌経路により、又はタンパク質分泌を起こさせる外膜の限定された濾出の誘導により上澄み液へ導けるが、その例には膜透過性上昇のためのｐｅｌＢリーダー、タンパク質Ａリーダー、バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、培養液へのグリシン添加に加えてのマイトマイシン誘導バクテリオシン放出タンパク質、及びｋｉｌ遺伝子の同時発現などの利用がある。大層好ましくは、本発明の方法では当該組換えタンパク質は当該宿主Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質中に発現される。
【００３３】
当該Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換えタンパク質の発現は誘導系の制御下でもあるので、Ｅ．ｃｏｌｉ中の組換え抗体の発現は誘導性プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉで使用するのに適した多くの誘導性プロモーターは当技術分野にて良く知られており、当該プロモーターにより当該組換えタンパク質の発現は温度又は生育培地における特定の物質濃度のように変動する因子で誘導することができる（Ｂａｎｅｙｘ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１０：４１１−４２１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｄｏｉ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ，１０５−１２８）。誘導性プロモーターの例にはＥ．ｃｏｌｏ  ｌａｃ，ｔａｃ及びｔｒｃプロモーターが含まれ、それらはラクトースか非加水分解性ラクトース類似体、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及びリン酸、トリプトファン及びＬ−アラビノースによりそれぞれ誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーター群で誘導することができる。発現は、例えば誘導因子の添加又は誘導が温度依存性であれば温度変化により誘導される。組換えタンパク質発現の誘導を誘導因子の培養液への添加で行う場合、当該誘導因子は発酵系により適した方法で添加でき、当該誘導因子は例えば単回又は複数回ショットでの添加或いは供給物に入れて徐々なる添加で行う。当該誘導因子の添加とタンパク質発現の実際の誘導との間には遅延がありうること、例えば当該誘導因子がラクトースである場合、タンパク質発現の誘導は遅延がある一方でラクトース投入以前に存在するいずれの炭素源も利用されることは理解されるであろう。
【００３４】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞培養（発酵）は、Ｅ．ｃｏｌｉの生育及び組換えタンパク質の発現を助長するいずれの培地でも培養できる。当該培地は、Ｐｉｒｔ  Ｓ．Ｊ．（１９７５）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓにて提供されたような化学的に明確な培地のいずれかに本明細書で説明したような生育速度を制御するのに適した修正を加えたものでありうる。適した培地の例はＨｕｍｐｈｒｅｙｓ等が２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６：３０９−３２０で記述したような‘ＳＭ６Ｅ’がある。
【００３５】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞群の培養は必要な産生の規模により振盪フラスコ又は発酵槽のような適した容器で行うことができる。種々な大規模発酵槽で１，０００リットルより大きく最大１００，０００リットルの容量が使用できる。好ましくは１，０００から５０，０００リットル、より好ましくは１，０００から１０，０００か１２，０００リットルの発酵槽が使用される。より小さな規模の発酵槽は０．５と１，０００リットルの容量のものも使用される。
【００３６】
Ｅ．ｃｏｌｉの発酵は必要とされるタンパク質及び収率に応じて、例えば連続式、バッチ式又は流加培養式（Ｔｈｉｒｙ  ＆  Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１０３−１０５）など、いずれの適した系で行われる。バッチ式は必要である栄養又は誘導因子のショット添加で使用される。この代わりとして流加培養法が使用でき、最大比増殖速度にてバッチ式前誘導で生育する当該培養液は、当初培養槽に存在した栄養分及び発酵が完了するまで当該生育速度を制御するために１回以上の栄養分供給を用いて維持することができる。流加培養法もＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞群の代謝を制御し、より細胞密度を高めさせるために前誘導を使用する。
【００３７】
本発明の各実施形態の好ましい特徴は他の実施形態の各々に関して必要な変更を加えたものである。本明細書で引用した特許及び特許公報だけに限らない全ての出版物は、あたかも全てを説明したように本明細書に参照で組入れるように各特定の出版物を本明細書で具体的にそして一つ一つ示したように、参照で本明細書に組み込まれている。
【００３８】
本発明は以下の実施例を参照してここで説明されるが、それは単に例示であって決して本発明の目的を制限するものとして理解されるべきものではない。
【実施例１】
【００３９】
実施例１：非溶解処理（予備調整）の効果
（ａ）抗体Ａ（ａＦａｂ’）は、挿入された抗体Ａをコード化しているＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０細胞中に発現された。発酵（ＤＤ５３中）は２５℃でＯＤ６００が１１１．６になり、集菌ができるまで実施された。室温で５０ｍｌの集菌用培養液を遠心分離し、当該細胞沈殿物を２９ｍｌのＨ２Ｏと５ｍｌの１Ｍトリスを加え、１００ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の５ｍｌの培養上澄み液中に再懸濁させた。再懸濁させた細胞沈殿物は図１で示したような時間、６０ｒｐｍで予備調整の攪拌を受けさせた。予備調整に次いで、当該再懸濁した細胞沈殿物を５０℃で１７０ｒｐｍの攪拌を１４時間受けさせた。熱処理後、当該再懸濁した細胞沈殿物は４℃にてＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ．６遠心分離機で４２００ｒｐｍの遠心分離を３０分間行い、清澄とした。機能性抗体Ａを含む上澄み液につき２０ｍＭリン酸緩衝液でのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰＬＣ分析を用いて分析した。抗体Ａは注入時ｐＨ７．４からｐＨ２．５までのｐＨ勾配を用いて溶出させた。機能性抗体収率は標準Ｆａｂ’濃度との比較で計算した。
【００４０】
機能性抗体の収率の向上が予備調整攪拌の全ての時間において非予備調整攪拌との比較で認めることができた（図１）。約３０％の機能性抗体の収率向上は、本非溶解処理を使用することで全ての時間で達成した。
【００４１】
（ｂ）抗体Ｂ（Ｆａｂ’）を上記のように挿入した抗体Ｂをコード化したＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中に発現させた。室温で５０ｍｌの集菌用培養液を遠心分離し、当該細胞沈殿物は１００ｍＭのＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４の２９ｍｌのＨ２Ｏと５ｍｌの１Ｍトリスを加えた５ｍｌの培養上澄み液に再懸濁させ、室温又は４℃において６０ｒｐｍでの予備調整攪拌を２４時間行った（参照、図３ａ及びｂ）。熱処理及び清澄化は上記のように実施したが、温度は図３ａ及び図３ｂの説明文で示した温度である。
【００４２】
機能性抗体の収率の向上はトリス／ＥＤＴＡへの再懸濁物については室温及び４℃で見られる。
【実施例２】
【００４３】
実施例２：非溶解処理の効果（圧力）
（ａ）抗体Ａは実施例１で説明したようにＥ．ｃｏｌｉで発現させた。再懸濁細胞沈殿物は実施例１のように培養上澄み液、Ｈ２Ｏ及びトリス／ＥＤＴＡ中で調製して、フレンチプレスを用いて種々の圧力で圧力処理を行った。熱処理を実施し、実施例１で説明したように機能性抗体収率を計算した。
【００４４】
機能性抗体の収率の向上は圧力処理無しに比べると、５００ｐｓｉを除く全ての圧力で見られた（図２）。機能性抗体Ａの収率の向上はこの非溶解処理の使用、特に１０００ｐｓｉ及び２０００ｐｓｉで成し遂げられた。４０００ｐｓｉでは、幾らかの溶解が明らかであるが、顕著ではなかった（即ち、２０％未満）。
【００４５】
（ｂ）抗体Ｂ（Ｆａｂ’）は、挿入した抗体Ｂをコード化したＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中で発現させた。発酵を行い、実施例１で説明したように培養上澄み液、Ｈ２Ｏ及びトリス／ＥＤＴＡ中で再懸濁細胞沈殿物を調製し、そののちにフレンチプレスを用いて種々な圧力で圧力処理を行った。熱処理は１７０ｒｐｍの攪拌を伴い（ｉ）３０℃（図３ａ）又は（ｉｉ）６０℃（図３ｂ）で１４時間行った。熱処理後、当該細胞再懸濁は遠心分離で清澄化し、機能性抗体の収率は実施例１で説明したように計算した。
【００４６】
機能性抗体Ｂの収率向上は、この非溶解処理の使用、特に５００ｐｓｉではなく１０００ｐｓｉ及び２０００ｐｓｉで達成された（図３ａと３ｂ）。４０００ｐｓｉでは、幾らかの細胞溶解が見られたが顕著ではなかった。
【００４７】
（ｃ）抗体Ｃ（Ｆａｂ’）は、挿入された抗体Ｃをコード化したＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中で発現させた。発酵を実施し、再懸濁沈殿物は実施例１で説明したように培養上澄み液、Ｈ２Ｏ及びトリス／ＥＤＴＡ中で調製し、そののちフレンチプレスを用いて種々な圧力で圧力処理を行った。熱処理は１７０ｒｐｍの攪拌しながら６０℃で（図４）１４時間実施した。熱処理後、当該細胞の再懸濁物は遠心分離で清澄化し、機能性抗体収率は実施例１で説明したように計算した。
【００４８】
機能性抗体の収率向上は圧力無しと比較して、１０００ｐｓｉと４０００ｐｓｉの間の穏やかな圧力で見られ、一方Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析で測定するとき全タンパク質の非常に僅かな増加（Ｆａｂ’に全宿主細胞タンパク質を加える）が得られた（図４ｂ）。この結果は当該清澄化抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認された（示してない）。これらの結果は１０００から４０００ｐｓｉの間の穏やかな圧力では宿主細胞群の顕著な溶解が生じていないことを示している。そこで６０℃での熱処理後の機能性抗体Ｃの収率向上はこの非溶解処理の使用により達成された。
【００４９】
（ｄ）抗体Ｄ（Ｆａｂ’）を挿入された抗体Ｄをコード化したＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中で発現させた。発酵を実施し、遠心分離で集菌した。再懸濁細胞スラリーを抽出緩衝液（１００ｍＭトリス／１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にて元の容積にして調製し、ＭＧホモジナイザー（一回通過）を通過させ、種々の圧力で圧力処理を行った。熱処理は６０℃にて１４時間１７０ｒｐｍで攪拌して行った。熱処理後、当該細胞再懸濁物を遠心分離で清澄化し、機能性抗体の収率は実施例１で説明したように計算した。
【００５０】
機能性抗体の収率の向上は１０００ｐｓｉと４０００ｐｓｉの間の穏やかな圧力で、加圧無しと比べて見ることができる一方で、Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析法により測定するとき、全タンパク質（Ｆａｂ’に宿主細胞タンパク質を加える）の増加は非常に少ない（表１）。
【００５１】
【表１】
2008520225.tif 000003
【実施例３】
【００５２】
実施例３：ＦＡＣＳ分析法を用いた細胞溶解の測定
抗体Ａ（Ｆａｂ’）を、挿入した抗体Ａをコード化したＤＮＡを伴うベクターｐＴＴ０Ｄを用いてＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中に発現させた。当該細胞スラリーを実施例１で説明したようにトリス／ＥＤＴＡ抽出緩衝液に再懸濁して元の容量とし、ＭＧホモジナイザーを種々な圧力で（参照、図５）通過させた（一回通過）。
【００５３】
当該ホモジナイザーからの供給流を集め、リン酸緩衝食塩水中でのＯＤ６００が０．２になるように希釈した。蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（２００μｇ／ｍｌ）を各試料（５００μｌ）に添加した（２μｌ）。ヨウ化プロピジウムはＤＮＡに結合するが、無傷の細胞膜を通過できない。各反応をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて分析し、溶解及び非溶解細胞を測定した。集菌物及び０ｐｓｉ対照を含め、圧力処理前の全無傷細胞を示す。図５で示すデータは、無細胞溶解についての４０００ｐｓｉまでの圧力処理は集菌物及び０ｐｓｉ対照と比較して細胞溶解がないことを示している。これに対して、当該圧力を８０００ｐｓｉに上げると、ヨウ化プロピジウムの取り込みの上昇が起こり、幾分かの細胞溶解が生じる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は予備調整処理（攪拌）の機能性抗体の収率に対する効果を示すヒストグラムである。予備調整の期間は時間で示してある。各棒グラフの上の数字は清澄にした再懸濁液リットル当たりのｍｇで機能性抗体Ａの収率を示している。
【図２】図２は機能性抗体Ａの収率に対する圧力の効果を示しているヒストグラムである。棒グラフ１は圧力処理無しの対照；棒グラフ２，３，４及び５はそれぞれ５００ｐｓｉ、１０００ｐｓｉ、２０００ｏｓｉ及び４０００ｐｓｉにおける処理を示す。
【図３ａ】図３ａ）は６０℃（パネル３ａ）における機能性抗体の収率に対する圧力処理と予備調整の効果を示しているヒストグラムである：各々の場合において棒グラフ１は非溶解処理での対照；棒グラフ２，３及び４はそれぞれ１０００ｐｓｉ、２０００ｐｓｉ及び４０００ｐｓｉにおける処理を示す。棒グラフ５及び６は室温（棒グラフ５）又は４℃（棒グラフ６）におけるトリス／ＥＤＴＡ中での２４時間の予備調整処理を表す。各棒グラフ上の数字は、清澄にした再懸濁液のリットル当たりのｍｇで機能性抗体Ｂの収量を示している。
【図３ｂ】図３ｂ）は３０℃（パネル３ｂ）における機能性抗体の収率に対する圧力処理と予備調整の効果を示しているヒストグラムである：各々の場合において棒グラフ１は非溶解処理での対照；棒グラフ２，３及び４はそれぞれ１０００ｐｓｉ、２０００ｐｓｉ及び４０００ｐｓｉにおける処理を示す。棒グラフ５及び６は室温（棒グラフ５）又は４℃（棒グラフ６）におけるトリス／ＥＤＴＡ中での２４時間の予備調整処理を表す。各棒グラフ上の数字は、清澄にした再懸濁液のリットル当たりのｍｇで機能性抗体Ｂの収量を示している。
【図４ａ】図４ａ）で、パネルａ）は６０℃で抽出した機能性抗体Ｃの収率に対する圧力処理の効果を示し、リットルあたりのＦａｂ’のグラムで表し、パネルａ）において、各棒グラフ上の数字は清澄にした再懸濁液リットル当たりのグラムで機能性抗体Ｃの収率を示している。
【図４ｂ】図４ｂ）で、パネルｂ）は熱処理後の清澄にした抽出物中に存在する全タンパク質を示しているヒストグラムである。
【図５】図５はヨウ化プロピジウムの存在下でＥ．ｃｏｌｉのＦＡＣＳ分析を用いたときの細胞溶解に対する圧力処理の効果を示しているヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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