(57)【要約】  本発明は、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のためのプロセスであって、微生物においても、微生物におけるＮ−アセチルグルタミン酸形成の生来のレベルの活性と比較して、増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成が存在し、そして微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収される、プロセスに関する。本発明はまた、対応する増加したＯＤＣ活性および増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成を担持するベクター、プラスミドおよび宿主に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のための方法であって、
微生物においても、微生物におけるＮ−アセチルグルタミン酸形成の生来のレベルの活性と比較して、増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成が存在し、そして微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
増加したＯＤＣ活性は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、およびシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＦまたはｓｐｅＣ（それぞれＥ．Ｃ．４．１．１．１７に属する）の過剰発現によって達成される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来している、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するｓｐｅＦである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１に属する）および／またはＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．３５に属する）のいずれかの過剰発現によって達成される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびブフネラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡの過剰発現によって達成される、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、およびブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡの過剰発現によって達成される、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、オーシャノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．３５に属する）の過剰発現によって達成される、
請求項５に記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、オーシャノバチルス・イヘエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、ストレプトマイセス・コエリコル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｒ）、およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって達成される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、
（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）およびアグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する、アグマチンウレアヒドロラーゼをコードする遺伝子とも称される）、または
（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）、およびアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＡ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１２に属する、アグマチンデイミナーゼをコードする遺伝子とも称される）、およびＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５３に属する）、および場合によりまた、アグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する）
のいずれかの過剰発現によって、少なくとも２つの他の酵素についても増加した酵素活性が得られる、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アゾトバクター・フィネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
方法は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われる、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
方法は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われ、オルニチンデカルボキシラーゼおよびＮ−アセチルグルタミン酸形成の増加したレベルの活性とは別に、少なくともアグマチナーゼならびに／またはアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼと組み合わされたアルギニンデカルボキシラーゼの活性のレベルも増加する、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）、ならびに請求項１および５〜９のいずれか一項に記載の生来のレベルの活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成と比較して増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成を担持するベクター、プラスミドおよび宿主。
【請求項２０】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の１つもしくはそれ以上のさらなる酵素活性の増加したレベルの活性をさらに担持する請求項１９に記載のベクター、プラスミドおよび宿主。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する微生物における１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ番号１１０−６０−１；テトラメチレンジアミンとも称される化合物；生化学的文献では、プトレシンとも称されている）の生化学合成のための新規のプロセスに関する。以後、オルニチンデカルボキシラーゼはＯＤＣとも称される。一般に、ＯＤＣ活性を有するそのような微生物は、スペルミジンおよびスペルミン（それぞれ産物Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミンおよびＮ，Ｎ’−ビス−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミンの一般名である）のようなポリアミン類を産生することが可能であることが既知である。そのような化合物、ならびに例えば、１，４−ブタンジアミンおよび１，５−ペンタンジアミン（カダベリンとも称される）のような多様な短い直鎖ジアミン自体は、しばしば、生化学研究において、ポリアミン類と称されるが、ポリアミン類の厳密な化学的定義からでも、より多数のアミノ基が予想される。しかし、本特許出願の目的のために、ポリアミン類という用語は、その生化学的意味で使用されており、従って、１，４−ブタンジアミンを含む。
【０００２】
化合物１，４−ブタンジアミンは、主なエンジニアリングプラスチック：ホモポリマー、または例えば、約５重量％のポリアミド−６モノマー（カプロラクタム）とのコポリマー化されたいずれかの形態のポリアミド−４，６のいくつかの生成のための重要な原材料である。ホモポリマーのポリアミド−４，６（ナイロン−４，６）は、１９３８年と早くから記載されていた（米国特許第２，１３０，９４８号明細書、カラザーズ（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ））。それは、モノマーの１，４−ブタンジアミンとアジピン酸との重縮合産物である。現在、特に、ポリアミド−４，６の化合物が生産され、ＳＴＡＮＹＬ（登録商標）の商品名で蘭国においてＤＳＭより販売されている。
【０００３】
１，４−ブタンジアミンの合成のための多くの化学的経路が既知である。これらのすべての化学的経路は、出発物質が、再生不能と考えられている供給源から入手しなければならないという欠点を免れない。しかし、再生可能な炭素源から出発し、生細胞における生化学的プロセス（「生体内変化」とも称される）を使用する１，４−ブタンジアミンの合成のための新規かつ容易な経路を提供する実質的な必要性がある。一般に、ポリアミン類は、生化学的産生（ｏｄｕｃｔｉｏｎ）におけるいずれの細胞または微生物においても毒性であると考えられる。従って、しかしながら、現在まで、生化学合成によるそのような新規の経路は魅力がないと考えられていた。
【０００４】
これは、例えば、次の参考文献：フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻（１９９５年）、１８８３１−１８８３５頁；およびスズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻（１９９４年）、８９３０−８９３４頁から認めることができる。
【０００５】
フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ欠損細胞における（即ち、アセチルトランスフェラーゼＳｐｅＧを欠く細胞における）スペルミジンの蓄積による細胞生存能（およびほとんどすべての種類のタンパク質の合成）の減少について明確に記載している。リムスウム（Ｌｉｍｓｕｗｕｍ）ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１８２巻（２０００年）、５３７３−５３８０頁）が、低い温度で、特定の遺伝子ｓｐｅＧの過剰発現によってそのような問題を克服することができることを示していることに留意すべきである。スペルミジンは、中間体としての１，４−ブタンジアミンから細胞において産生されている産物である。従って、１，４−ブタンジアミンの生合成は、必然的に、スペルミジンの形成をももたらす。
【０００６】
一方、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）らもまた、（マウス細胞において）ＯＤＣの過剰発現がポリアミン類、具体的には、スペルミジンの蓄積を生じ、ｓｐｅＧ欠損でない細胞であっても、少量のスペルミジンの添加時に、常に細胞死が観察されることを実証している。スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）らは、低減された細胞生存能はアンチザイムによるＯＤＣの不十分なフィードバック阻害によるものであり、適切なアンチザイムの過剰産生によって克服することができることを示唆している。次いで、アンチザイムのそのような過剰産生もまた、細胞におけるポリアミン類の産生を低減し、従って、ＤＡＢ産生にはふさわしくない。
【０００７】
さらに、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７０巻（１９８８年）、３１３１−３１３５頁においてカシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）らが説明しているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるポリアミン類の含量は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、特に、構成性に発現されるｓｐｅＣの過剰発現によって調整することができる。それらの実験のために、ボイル（Ｂｏｙｌｅ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第９４巻（１９８３年）、１１７−１２１頁によって産生されるようなプラスミドｐＯＤＣがクローニングにおいて使用された。明らかに、オルニチンデカルボキシラーゼのそのような過剰産生は、強度に増加したレベルの１，４−ブタンジアミンの細胞中含量をもたらさなかった。７０倍のレベルのＯＤＣでは、細胞に添加されたオルニチンの量に依存せずに、１，４−ブタンジアミンの細胞中含量の２０％以下の増加しか観察されなかった。しかし、一方で、オルニチンの存在下で増殖する細胞は、１，４−ブタンジアミンの増加した分泌を呈することが示された。７０倍のレベルのＯＤＣでは、合計で約８．５倍高い１，４−ブタンジアミンの産生（産生される１，４−ブタンジアミンの力価は、内部および外部濃度について合計で約２０〜２５ｍｇ／ｌ、即ち、きわめて低い濃度であった）が見出された。著者らは、そのようなかなり低い効率の１，４−ブタンジアミン産生はオルニチンの不足によることを示唆し、オルニチンの外部供給によってこれを解決しようと試みたが、僅かな改善しか認められなかった。従って、３０ｍｇ／ｌより有意に高いレベルでの１，４−ブタンジアミンの産生のための生化学合成プロセスを提供することは不可能であるように考えられる。
【０００８】
さらに、上記のこれらの研究は、ポリアミン類（１，４−ブタンジアミンを含む）そのものの合成に関するものではないが、分子レベルでのポリアミン類の生理学的機能のさらなる見識を得ることがかなり試みられた。より高いレベルの細胞中オルニチンでは、おそらく、さらなるアルギニンもまた細胞に存在する。カシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）の教示に従えば、そのようなさらに高い量のアルギニンは、１，４−ブタンジアミン形成に対する実質的にネガティブな効果を有するはずである。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０７２６２４０号明細書は、現在までのところ、１，４−ブタンジアミンを含むポリアミン類の生化学合成に関する数少ない特許文献の１つである。しかし、それは、主な成分としてタンパク質を含有する天然産物の発酵によるとりわけ、１，４−ブタンジアミンの産生について、記載している。前記プロセスでは、天然産物は、まず、それらを部分または全分解に供することによって処置し、次いで、発酵工程の前に、任意の好ましくない成分（例えば、Ｈｇ、Ｃｒ、Ａｓ、Ｃｄ、ＳｅおよびＰｂ）、細胞増殖インヒビター、農薬、抗生物質、界面活性剤、石鹸、脂肪、油、シアン化物およびフェノール類を取り出す。そのような方法で産生されるプトレシンおよび他のジアミン類は、肥料および肥やしとして（再）利用されているが、非常に多量の他の物質を含有するため、それらは例えば、ポリアミド−４，６の産生のための原材料として不適切である。
【００１０】
従って、約３０ｍｇ／ｌよりも有意に高い力価で、好ましくは、（高価な）オルニチンの外部供給をも伴うことなく、１，４−ブタンジアミンの合成のための効率的な代替的生合成経路の必要性が依然としてある。このような１，４−ジアミノブタンの改善された利用可能性に対する必要性は、例えば、ポリアミド−４，６の産生のための出発物質としてのその意図される使用に基づく。一般に、今日までのところ既知である１，４−ブタンジアミンへの経路は、かなり労力を要し、面倒であり、さらなる精製を伴わなければナイロンの産生において使用が困難であるような前記産物の品質をもたらし得る。１，４−ブタンジアミンへの既知の化学経路は、相対的に高価な出発物質および反応物（取り扱いが困難な反応物を含む）、および多段階およびマルチリアクター設計における温度および圧力の相対的に厳密な反応条件、ならびに高価な触媒系の使用を必要とする。従って、好ましくは、はるかに安価な原材料からで、およびシアン化水素酸のような反応物を取り扱う問題を回避する１，４−ブタンジアミンへの代替的経路の必要性が依然としてある。天然において増殖し、従って、農業生産から再生可能な材料が、発酵において使用することができるグルコースのような炭素源（または他の適切な炭素源およびそれらの混合物）の基本であることは周知である。そのような再生可能な材料は、相対的に安価であり、豊富に利用可能である。一般に、再生可能な材料をすべての種類の化学材料の出発物質として使用することができれば、極めて有利であると考えられる。
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体内変化による１，４−ブタンジアミンの大規模産業生産のための改善された可能性を提供することである。
【００１２】
本発明者らは、意外なことに、この目的が、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のための新規のプロセスであって、微生物において、微生物におけるＮ−アセチルグルタミン酸形成の生来のレベルの活性と比較して、増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成がまた存在し、そして微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収される、プロセスによって達成されることを見出した。
【００１３】
本特許出願において意味するように、用語「生化学合成」（本特許出願において、「生体内変化」と代替的に称される用語）は、（多くの純粋な化学的反応工程の他に）適切な産生株の細胞全体を使用する１つもしくはそれ以上の成体触媒反応を伴うプロセスだけではなく、適切な産生株の細胞全体を使用する純粋な生化学的プロセスをも含む。そのような純粋な生化学的プロセスは、それぞれ、生化学合成が適切な炭素源から出発する場合は発酵と称され、または生合成が、合成しようとする標的分子を得ることができる炭素骨格を既に有する中間産物から出発する場合には、前駆体発酵と称される。プロセスは、好気的または嫌気的条件下で行われ得る。
【００１４】
本発明の生化学合成における生体触媒反応は、インビボまたはインビトロのいずれでも行うことができる。一般に、インビボプロセスは、生細胞（従って、用語「生細胞」は、いわゆる休止細胞も含む）を使用する場合に行われるプロセスであり；一方、インビトロプロセスは、通常、細胞溶解物または（部分的に）精製された酵素を使用して、行われている。本発明に従う生化学合成は、微生物において行われる。これは、適切な産生株の細胞全体を使用して行うことができるが、また、透過した細胞を使用して行ってもよく；しかし、インビボとインビトロとを区別することは、透過した細胞または固定化された宿主細胞で行われるプロセスに対してあまり意味を成さない。しかし、例えば、固定化された酵素などを使用することによって行う場合の本発明のプロセス由来の個々の生体触媒工程は、本出願において意味するとおりの生化学合成におけるそのような工程に等価であるとみなされることは明白である。
【００１５】
オルニチンデカルボキシラーゼ（即ち、オルニチン脱炭酸反応活性を有する酵素、またはＯＤＣ）は、クラスＥ．Ｃ．４．１．１．１７に分類される酵素である。過剰発現される場合、オルニチンデカルボキシラーゼの活性のレベルは、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ二酸化炭素検出キット（Ｓｉｇｍａ）；オステルマン，Ａ．Ｌ．（Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｌ．）ら１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３，１３６６２−１３６６７頁に記載のアッセイを使用して、無細胞抽出物内において標準的条件（オルニチンおよびＰＬＰの存在下３７℃）下で、生来の（即ち、過剰発現されていない）レベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と容易に比較することができる。従って、当業者であれば、タンパク質含量の決定、またはＲＮＡレベルを決定することによって、使用する微生物における生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して、使用するＯＤＣが増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する（ＯＤＣ活性を増加する）かどうかを容易に確立することができる。タンパク質含量の決定のための多様な標準的手順、例えば、比色定量的ならびに分光的方法については、ロットスパイヒ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）およびゾルバス（Ｚｏｒｂａｓ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｂｅｒｌｉｎ，ＩＳＢＮ３−８２７４−００４１−４（１９９８年）、第３、５、２１、２２および２４章に記載されている。タンパク質レベルならびにＲＮＡレベルの決定のための方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、および他の多くの方法については、Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６（１９８９年）において記載されている。しかし、他の多くの標準的な手順は、この分析分野における当業者に公知であり、ここで述べる必要はない。
【００１６】
本発明のプロセスにおいて使用することができる適切なオルニチンデカルボキシラーゼは、オルニチンを脱炭酸化することが可能であるすべての酵素およびその変異体である。そのようないずれの酵素も、増加したレベルの活性で、即ち、過剰産生される形態で、本発明のプロセスにおいて使用することができる。そのような増加したレベルの活性は、当業者に公知の任意の方法、例えば、遺伝子コピー数を増加すること、または変異による酵素の内因性活性もしくは構造を増加すること、または脱調節された酵素を使用することによって、達成することができる。しかし、そして最も好ましくは、それはまた、増加した転写および／または翻訳効率でオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させることによって、達成することができる。さらに、任意の具体的に命名された酵素活性について本明細書において使用される用語「増加したレベルの活性」もまた、そのような酵素活性、例えば、オルニチンデカルボキシラーゼの活性が微生物の天然の供給源において全く存在しないような状況を包含することが意図され、ここで、反応は生じているが、そこで、遺伝子修飾により意図的に誘導されることに留意すべきである。
【００１７】
本発明に従うプロセスでは、微生物におけるＮ−アセチルグルタミン酸形成の生来のレベルの活性と比較して、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加したレベルの活性（添付の従属する特許請求の範囲の考察が提示される場合に以下においてさらに規定される）が認められる必要がある。増加したおよび生来の活性レベルのＮ−アセチルグルタミン酸形成の比較は、Ｌ−［１４Ｃ］グルタミン酸およびアセチル−ＣｏＡを基質として使用するラジオアッセイによる無細胞抽出物内における標準的な条件（アバドジエバ，Ａ．（Ａｂａｄｊｉｅｖａ，Ａ．）、２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４２８６９−４２８８０頁に記載のアッセイ）下での適切な試験反応によるＯＤＣのそのような決定と同様に容易に行うことができる。
【００１８】
１，４−ブタンジアミンは、本発明に従い、生体内変化による増加したＯＤＣおよびＮ−アセチルグルタミン酸形成活性を伴う微生物において産生され、微生物の周囲の発酵ブロスに分泌される。１，４−ブタンジアミンは発酵ブロスに分泌され、そこから回収される。
【００１９】
本発明に従えば、１，４−ブタンジアミンの合成のための改善された生化学的プロセスが提供され、得られた１，４−ブタンジアミンは、例えば、ポリアミド−４，６の産生のための原材料として極めて適切である。
【００２０】
本発明に従って産生される多量の１，４−ブタンジアミンの形成は、細胞の生存能に対するポリアミン形成のネガティブな影響を回避するための何らかの手段を講じなければ、増加したレベルのＯＤＣ活性は（Ｎ−アセチルグルタミン酸の形成の増加した活性と共に）、細胞の死を生じることが予想される。
【００２１】
上記のように、いずれのＯＤＣ酵素も、本発明のプロセスにおいて、増加したレベルの活性で、即ち、過剰産生される形態で、使用することができる。
【００２２】
本発明に従えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のＯＤＣと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、および最も好ましくは少なくとも６５％同一性を有し、オルニチン脱炭酸反応を触媒することが可能であるすべてのオルニチンデカルボキシラーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのＯＤＣが公知である。
【００２３】
対照酵素との同一性百分率を決定することは、当業者に既知の方法によって、例えば、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために、公的なデータベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」としての参照酵素のタンパク質配列を使用することによって、実施することができる。そのような検索は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．２）を使用して、実施することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００２４】
好ましくは、増加したＯＤＣ活性は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、およびシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＦまたはｓｐｅＣ（それぞれＥ．Ｃ．４．１．１．１７に属する）の過剰発現によって達成される。オルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦは誘導性オルニチンデカルボキシラーゼであり；オルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＣは構成性オルニチンデカルボキシラーゼである。
【００２５】
より好ましくは、オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来している。これまでのところ、文献的には、ｓｐｅＣがｓｐｅＦよりもはるかによく調べられている。しかし、最も意外なことに、そして最も好ましくは、本発明に従う最も良好な結果は、オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子がｓｐｅＦであり、より詳細には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するｓｐｅＦである場合に達成される。構成性オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣの過剰発現による結果と比較すると、これまでのところ、本発明に従う最も良好な結果は、実際に、ｓｐｅＦを使用する場合に達成されている。
【００２６】
本出願において、上記のオルニチンデカルボキシラーゼのいずれかと相同であり、示されるオルニチンデカルボキシラーゼに十分匹敵するオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする任意の遺伝子は、本発明のプロセスに適切である。そのような等価な遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニングストラテジー、例えば、本明細書の実験の部に記載の方法によって、適切に得ることができる。あるいは、そのような等価なオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子はまた、意図的な構築によって得ることもできる。
【００２７】
Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の活性という用語は、本特許出願において、単一の酵素または酵素の組み合わせによるかにかかわらず、Ｎ−アセチルグルタミン酸の細胞内形成をもたらすことが可能な任意の酵素活性を表す。
【００２８】
詳細には、本発明に従えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、および最も好ましくは少なくとも７５％同一性を有し、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成反応を触媒することが可能であるすべてのＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼが公知である。
【００２９】
好ましくは、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１に属する）および／またはＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．３５に属する）のいずれかの過剰発現によって達成される。酵素または本明細書において記載の酵素のうちの１つの同じ機能性を有するその変異体をコードする任意の遺伝子が、クラスＥ．Ｃ．２．３．１．１または２．３．１．３５のうちの１つにおけるそのような酵素と等価とみなされるのは明白である。
【００３０】
本発明の好適な実施形態の１つでは、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、およびブフネラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１に属する）の過剰発現によって達成される。これらのＡｒｇＡ酵素は、それらのＮ−アセチルグルタミン酸形成において活性であるための補酵素Ａの存在（または供給）を必要とする。
【００３１】
本実施形態では、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、およびブフネラ・アフィディコラ（Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡの過剰発現によって達成される。
【００３２】
本発明の別の好適な実施形態では、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、オーシャノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．３５に属する）の過剰発現によって達成される。
【００３３】
本発明に従うプロセスにおいて使用することができる適切なＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）参照種由来のＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼと十分な、即ち、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、および最も好ましくは少なくとも４０％同一性を有し、Ｎ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチル転移反応を触媒することが可能であるＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼである。対応するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）参照酵素とそのようなレベルの同一性を有する多くのＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼが既知である。
【００３４】
ＡｒｇＡ酵素とは対照的に、ＡｒｇＪ酵素は、それらのＮ−アセチルグルタミン酸形成において活性であるための補酵素Ａの存在（または供給）を必要としない。従って、産業用途における使用には、ＡｒｇＡ酵素よりも明らかにこれらのＡｒｇＪ酵素が好適である。
【００３５】
本発明のこのような他の好適な実施形態では、Ｎ−アセチルグルタミン酸形成の増加した活性は、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、オーシャノバチルス・イヘエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、ストレプトマイセス・コエリコル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｒ）、およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ａｒｇＪの過剰発現によって達成される。
【００３６】
本出願において、上記のＮ−アセチルグルタミン酸形成活性のいずれかと相同であり、示されるＮ−アセチルグルタミン酸形成酵素に十分匹敵するＮ−アセチルグルタミン酸形成活性を有する酵素をコードする任意の遺伝子は、本発明のプロセスに適切である。そのような等価な遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニングストラテジー、例えば、本明細書の実験の部に記載の方法によって、適切に得ることができる。あるいは、そのような等価なＮ−アセチルグルタミン酸形成遺伝子はまた、意図的な構築によって得ることもできる。
【００３７】
本発明のさらなる好適な実施形態では、１，４−ブタンジアミンの生化学合成のためのプロセスは微生物において行われ、ここで、さらに、以下のいずれかの過剰発現によって、少なくとも２つの他の酵素についても増加した酵素活性が得られる：
（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）およびアグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する；アグマチンウレアヒドロラーゼをコードする遺伝子とも称される）；または
（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）、およびアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＡ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１２に属する；アグマチンデイミナーゼをコードする遺伝子とも称される）、およびＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５３に属する）、および場合によりまた、アグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する）。
【００３８】
このようなさらなる好適な実施形態の利点は、さらに高い量で１，４−ジアミノブタンが形成されることである。
【００３９】
本明細書において意味する過剰発現は、当業者に既知の任意の方法によって；例えば、それぞれの遺伝子の翻訳および／または転写効率を増加することによって、但しまた、遺伝子コピー数を増加するような他の任意の既知の方法によって、または変異による酵素の内因性活性もしくは構造を増加することによって、あるいは脱調節された酵素を使用することによって、達成することができる。これに関して上記のさらなる好適な実施形態の部（ｉ）において意味するように、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢの組み合わせは、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢの任意の機能的な組み合わせ（組み合わされた融合タンパク質としてか、または個別の酵素活性としてかにかかわらず）を表すことが意図される。事実、この組み合わせはまた、ＳｐｅＡＢとも呼ばれる。それらの部（ｉｉ）は、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢのそのような組み合わせで、ＳｐｅＢ部分自体が、ＡｇｕＡおよびＡｇｕＢの任意の機能的組み合わせ（組み合わされた融合タンパク質としてか、または個別の酵素活性としてかにかかわらず）によって置き換えられ得ることを表す。
【００４０】
ヤノウィッツ（Ｊａｎｏｗｉｔｚ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ５４４（２００３年）、２５８−２６１は、アグマチンデイミナーゼＡｇｕＡが高等植物のアルギニンデカルボキシラーゼ経路に関与することを記載している。ＳｐｅＢによって触媒される変換もまた、植物において生じる酵素によって、即ち、アグマチンデイミナーゼＡｇｕＡとＮ−カルバモイル−プトレシンアミノヒドロラーゼＡｇｕＢとの組み合わされた作用によって触媒され得ることが、ナカダ（Ｎａｋａｄａ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９（２００３年）、７０７−７１４よりさらに公知である。従って、本発明においては、ＳｐｅＢの代わりに、またはさらにそれとの組み合わせで、ＡｇｕＡおよびＡｇｕＢを使用することもできる。そのようなａｇｕＡおよびａｇｕＢ遺伝子の供給源は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）およびトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）であり得るが、しかし、匹敵する遺伝子は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）の変異体においても見出され得る。
【００４１】
本出願において、上記のアルギニンデカルボキシラーゼ、それぞれアグマチナーゼ、またはアグマチンイミノヒドロラーゼもしくはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼのいずれかと相同であり、それぞれの酵素に十分匹敵するアルギニンデカルボキシラーゼ（それぞれ、アグマチナーゼ、またはアグマチンイミノヒドロラーゼもしくはＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ）活性を有するそのようなそれぞれの酵素をコードする任意の遺伝子は、場合により、それらの等価物であり、このような本発明のプロセスのさらなる好適な実施形態に適切である。そのような等価な遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニングストラテジー、例えば、本明細書の実験の部に記載の方法によって、適切に得ることができる。あるいは、そのような等価な遺伝子はまた、意図的な構築によって得ることもできる。
【００４２】
従って、本発明のプロセスの好適な実施形態では、過剰発現される遺伝子のさらなる組み合わせ、即ち、（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼおよびアグマチナーゼ、または（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼならびにアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ、ならびに場合により、アグマチナーゼをコードする遺伝子もまた、使用されている。
【００４３】
詳細には、本発明に従うプロセスのこのような好適な実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のアルギニンデカルボキシラーゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％同一性、および最も好ましくは少なくとも６５％同一性を有し、アルギニン脱炭酸反応を触媒することが可能であるすべてのアルギニンデカルボキシラーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアルギニンデカルボキシラーゼが公知である。
【００４４】
さらに、詳細には、前記実施形態において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のアグマチナーゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、および最も好ましくは少なくとも６０％同一性を有し、アグマチナーゼ反応を触媒することが可能であるすべてのアグマチナーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアグマチナーゼが公知である。
【００４５】
さらに、詳細には、前記実施形態において、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）対照酵素由来のアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼと十分な、即ち、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、および最も好ましくは少なくとも４０％同一性を有し、アグマチンイミノヒドロラーゼ、それぞれＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ反応を触媒することが可能であるすべてのアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼを使用することができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼが公知である。
【００４６】
本発明の上記の好適な実施形態における過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである。より好ましくは、過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである。
【００４７】
本発明のこのような好適な実施形態では、過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである。より好ましくは、過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである。
【００４８】
本発明のこのようなさらなる好適な実施形態では、さらに、過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである。より好ましくは、過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アゾトバクター・フィネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである。
【００４９】
本発明のプロセスは、任意の適切な宿主生物体において行われ得る。宿主は、生合成において当業者に一般に公知の産生生物体（または細胞）の群から選択され得る。そのような生物体は、真核生物由来であっても、またはより好適には、原核生物由来であってもよい。真核細胞は、例えば、植物および真菌、ならびに他の多様な群（該他の群は集合的に「原生生物界」と称される）由来の細胞であり得る。
【００５０】
本発明に従うプロセスは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われることが特に好ましい。
【００５１】
本発明のプロセスでは、宿主として使用すべき微生物は、アミノ酸、オルニチンおよび／またはアルギニンを産生することが可能であることが特に好ましい。ほとんどの天然の微生物について、アルギニンは必須アミノ酸であることから、通常、そのような能力はすべての野生型株において利用可能であるため、この要件は満たされる。
【００５２】
これらの種のうち、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．は、それらが、所望の過剰発現される酵素活性を伴う株を提供するために、遺伝子操作によって取り扱うことが容易であるため、好適である。さらに、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．は、天然において既に、ほとんどの上記の酵素活性のそれぞれ（即ち、植物由来のａｇｕ遺伝子は別として）を含有し、そのため、過剰発現される遺伝子のほとんどを相同遺伝子として使用することができる。また、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．（但し、天然のオルニチンデカルボキシラーゼを欠く）は、発酵プロセスにおいて容易に取り扱うことができる適切なグルタミン酸産生株であるため、特に好ましい。
【００５３】
本発明のプロセスでは、グルタミン酸は極めて適切な前駆体である。従って、プロセスは、好ましくは、グルタミン酸の発酵が可能な宿主株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））において行われている。
【００５４】
本発明に従うプロセスが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われ、オルニチンデカルボキシラーゼおよびＮ−アセチルグルタミン酸形成の増加したレベルの活性とは別に、少なくともアグマチナーゼならびに／またはアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミノヒドロラーゼと組み合わされたアルギニンデカルボキシラーゼの活性のレベルも増加する場合、最も良好な結果が達成されている。本明細書において意味するように、記載の酵素のそれぞれについて、増加したレベルの活性は、宿主生物体におけるそれぞれの前記酵素活性の生来のレベルの活性と比較される。
【００５５】
本発明のプロセスは、好ましくは、発酵条件として通常的でもある反応条件下で行われることが明らかである。従って、プロセスは、バッチ式、但しまた、所望であれば、流加培養で行うことができる。宿主生物体として使用される生物体が、形成される１，４−ジアミノブタンに適切な輸送系を有するかまたは備えることを確実にすることは好都合であり得る。好ましくは、そのような輸送系は生来のものである。
【００５６】
もちろん、本発明はまた、最終的に、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）、および生来のレベルの活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成と比較して増加した活性のＮ−アセチルグルタミン酸形成を担持するベクター、プラスミドならびに宿主に関する。詳細には、好適な実施形態では、本発明はまた、添付の特許請求の範囲に従う増加したレベルの活性の１つもしくはそれ以上の他の上記の酵素活性をさらに担持するすべてのベクター、プラスミドおよび宿主に関する。
【００５７】
以下、いくつかの実験結果によって本発明を説明するが、本発明の範囲を限定する意図は全くない。
【００５８】
実験の部
一般的手順
すべてのＤＮＡ操作については、標準的な手順を適用した（サンブルック，Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）。ＤＮＡは、他に示さない場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら（２０００年）、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，４４４３−４４５２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０７８３、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２の染色体ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造のプロトコルに従い、プルーフリーディング酵素ＳＡＷＡＤＹ  Ｐｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｐｅｑｌａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ、独国）またはＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）を使用して実施する一方、構築された株の確認は、ＴａｑポリメラーゼＲＥＡＤＹＭＩＸ（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、独国）を利用するコロニーＰＣＲによって行った。その後のクローニングならびにさらなる操作のための制限部位は、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、独国）から購入したオリゴヌクレオチドにより導入した。ＤＮＡフラグメントは、製造のプロトコルに従い、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で精製した。プラスミドＤＮＡの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐスピンＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ、独国）の利用によって達成した。構築されたプラスミドの確認は、制限解析および以後の配列決定（Ａｇｏｗａ，Ｂｅｒｌｉｎ、独国）によって行った。
【００５９】
遺伝子の高レベル発現について、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃｌＱ）に基づくＩＰＴＧ誘導性タンパク質産生に適切なベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）を使用した。
【００６０】
プラスミドの構築
（ｉ）プラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（誘導性、生分解性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＦを、発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングした。このベクターは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃｌＱ）下で、クローニングされた遺伝子の転写制御に基づく高レベルタンパク質産生を可能にする。発現プラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ）の構築のために、コーディング遺伝子を、本来のＲＢＳ（リボソーム結合部位）、開始および終止コドンと共にクローニングした。
【００６１】
２２４７ｂｐのｓｐｅＦ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００１７２；ヌクレオチド１０２４２−１２４６８）：
５’−ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡ−３’  ［配列番号１］
（変異は太字、ＫｐｎＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＣ−３’  ［配列番号２］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）。
【００６２】
フラグメントを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩおよびＸｂａＩで末端修飾し、同じ様式で切断した発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ、７５０２ｂｐ）を、制限解析および以後の配列決定によって確認した。
【００６３】
（ｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ４（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（構成性、生合成性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、（ｉ）を参照のこと）にクローニングし、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃプロモーターおよびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃｌＱ）下の転写制御に基づく強力な遺伝子発現を可能にした。従って、コーディング遺伝子を、本来の開始および終止コドンと共にクローニングした。インシリコ研究を利用してｓｐｅＣに対する保存されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を決定することができなかったため、変異誘発により、最適化されたＲＢＳをｓｐｅＣ開始コドンの７ｂｐ上流に導入した。
【００６４】
２２３５ｂｐのｓｐｅＣ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７９；ヌクレオチド２６５０−４８６７）：
５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  Ｔ−３’  ［配列番号３］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’  ［配列番号４］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）。
【００６５】
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＰＣＲ産物を、同じ様式で切断したプラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ４（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣ、７４９１ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００６６】
（ｉｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ１（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼをコードする遺伝子ａｒｇＡを、発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、（ｉ）を参照のこと）にクローニングした。遺伝子を、本来のＲＢＳ（リボソーム結合部位）および終止コドンと共にクローニングした。しかし、翻訳開始をＧＴＧからＡＴＧに変更した。
【００６７】
１３６５ｂｐのａｒｇＡ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３６５；ヌクレオチド３３１２−４６４３）：
５’−ＡＴＡ  ＡＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧ−３’  ［配列番号５］
（変異は太字、ＥｃｏＲＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  Ｔ−３’  ［配列番号６］
（変異は太字、ＫｐｎＩ制限部位は斜字体）。
【００６８】
フラグメントを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを使用して末端修飾し、続いて、同じ様式で切断した発現プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ１（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ、６６２７ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００６９】
（ｉｖ）プラスミドｐＤＡＢ５（ｐＪＦ１１９ＱＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＦ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦおよびＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼＡｒｇＡの同時産生を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のｓｐｅＦをコードする遺伝子を、ａｒｇＡ発現ベクターｐＤＡＢ１（ｉｉｉを参照のこと））にクローニングした。
【００７０】
ｓｐｅＦ含有ＤＮＡフラグメント（２２２５ｂｐ）を、エンドヌクレアーゼＫｐｎＩおよびＸｂａＩによる消化によって、構築したプラスミドｐＤＡＢ２（Ａ．１を参照のこと）から切断し、同様に切断されたａｒｇＡ含有プラスミドｐＤＡＢ１（（ｉｉｉ）を参照のこと）に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、ＳｐｅＦおよびＡｒｇＡの同時産生のために、得られたプラスミドｐＤＡＢ５（ｐＪＨ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＦ、８８４１ｂｐ）を、制限解析によって確認した。
【００７１】
（ｖ）プラスミドｐＤＡＢ６（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＣ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＣおよびＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼＡｒｇＡの同時産生を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のｓｐｅＣをコードする遺伝子を、ａｒｇＡ発現ベクターｐＤＡＢ１（（ｉｉｉ）１を参照のこと））にクローニングした。
【００７２】
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる構築したプラスミドｐＤＡＢ４（（ｉｉ）を参照のこと）の消化によって、最適化されたＲＢＳを伴うｓｐｅＣ遺伝子を含有する２２２５ｂｐのＤＮＡフラグメントを分離した。続いて、フラグメントを、同じ様式で切断したａｒｇＡ含有プラスミドｐＤＡＢ１（（ｉ）を参照のこと）に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、ｓｐｅＣおよびａｒｇＡの同時発現を可能にする得られたプラスミドｐＤＡＢ６（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＣ、８８３０ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００７３】
（ｖｉ）プラスミドｐＤＡＢ７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＡＢ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡならびにアグマチナーゼをコードするｓｐｅＢを、発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、（ｉ）を参照のこと）にクローニングした。このように、遺伝子の本来のオペロン構造ならびにＲＢＳ、開始および終止コドンを維持した。
【００７４】
３０７９ｂｐのｓｐＡＢ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７７；ヌクレオチド１１９０−４２４７）：
５’−ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＴＧ−３’  ［配列番号７］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  Ｇ−３’  ［配列番号８］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）
【００７５】
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＤＮＡフラグメントを、同様に切断した発現プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＡＢ、８３３９ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００７６】
（ｖｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ８（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ−ｓｐｅＡＢ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦ、アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡおよびアグマチナーゼＳｐｅＢの同時産生を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のｓｐｅＡＢ遺伝子を、ｓｐｅＦ発現ベクターｐＤＡＢ２（（ｉ）を参照のこと））にクローニングした。
【００７７】
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによるプラスミドｐＤＡＢ７（（ｖｉ）を参照のこと）の消化によって、ｓｐｅＡＢ遺伝子オペロンを含んでなる３０６７ｂｐを分離し、同じ様式で切断したｓｐｅＦ含有プラスミドｐＤＡＢ２（（ｉ）を参照のこと）に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、ＳｐｅＦＡＢの同時産生を可能にする、得られたプラスミドｐＤＡＢ８（ｐＪＨ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦＡＢ、１０５４７ｂｐ）を、制限解析によって確認した。
【００７８】
（ｖｉｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ１０（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＦ−ｓｐｅＡＢ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦ、アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡ、アグマチナーゼＳｐｅＢおよびＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼＡｒｇＡの同時産生を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のｓｐｅＡＢ遺伝子を、ａｒｇＡ−ｓｐｅＦ発現ベクターｐＤＡＢ５（（ｉｖ）を参照のこと）にクローニングした。
【００７９】
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによるプラスミドｐＤＡＢ７（（ｖｉ）を参照のこと）の消化によって、ｓｐｅＡＢ遺伝子オペロンを含んでなる３０６７ｂｐを分離し、同じ様式で切断したｓｐｅＦ含有プラスミドｐＤＡＢ５（（ｉｖ）を参照のこと）に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、ＡｒｇＡおよびＳｐｅＦＡＢの同時産生を可能にする、得られたプラスミドｐＤＡＢ１０（ｐＪＨ１１９ＥＨ−ａｒｇＡ−ｓｐｅＦＡＢ、１１８８６ｂｐ）を、制限解析によって確認した。
【００８０】
（ｉｘ）プラスミドｐＤＡＢ３７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＪＢｓ−ｓｐｅＦ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０７８３由来のＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡｒｇＪの同時産生を可能にするために、本ａｒｇＡ遺伝子を置き換えることによって、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｒｇＪをコードする遺伝子をｓｐｅＦ発現ベクターｐＤＡＢ５（（ｉｖ）を参照のこと）にクローニングした。遺伝子を、本来のＲＢＳおよび終止コドンと共にクローニングした。
【００８１】
１２７９ｂｐのａｒｇＪ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０７８３の染色体ＤＮＡ（受託番号Ｚ９９１０９（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８、完全ゲノム（２１のうちのセクション６））；ヌクレオチド１８４３２１−１８５６００）から増幅した：
５’−ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＡＧＡ  ＡＣＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ−３’  ［配列番号９］
（変異は太字、ＥｃｏＲＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＴＣ−３’  ［配列番号１０］
（変異は太字、ＫｐｎＩ制限部位は斜字体）。オリゴヌクレオチドを、株枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８のゲノムに存在するａｒｇＪの配列に従って構築した。
【００８２】
増幅したＤＮＡフラグメントおよびプラスミドｐＤＡＢ５を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで制限切断した。ｐＤＡＢ５の場合、１３５５ｂｐおよび７４８６ｂｐの２つのフラグメントが得られた。ベクターｐＪＦ１１９ＥＨおよび遺伝子ｓｐｅＦを含んでなる７４８６ｂｐフラグメントを単離し、増幅したＤＮＡフラグメントと連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ３７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＪＢｓ−ｓｐｅＣ、８７４９ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。配列解析より、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ  １０７８３からクローニングされたａｒｇＪ遺伝子は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８について報告されたａｒｇＪ遺伝子とは異なることが示された。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｔｒ．１６８（受託番号ＣＡＢ１２９６１）のタンパク質ＡｒｇＪと比較して、プラスミドｐＤＡＢ３７上に存在するａｒｇＪ遺伝子からコードされるタンパク質ＡｒｇＪは、次の入れ換えを示す：Ｈ７２Ｑ、Ｐ７４Ａ、Ｔ７５Ａ、Ｌ９５Ｉ、Ｆ１０５Ｌ、Ｇ１１０Ｄ、Ｈ１３４Ｑ、Ｅ１４２Ｑ、Ａ１６９Ｔ、Ｒ１８１Ａ、Ｔ２１６Ｉ、Ａ２４２Ｇ、Ｄ２５５Ｅ、Ｎ３５３Ｈ、Ｉ３６３Ｌ、Ａ３８０Ｄ、Ｄ３８３Ｅ。
【００８３】
（ｘ）プラスミドｐＤＡＢ３８（ｐＪＦ１１９ＱＥＨ−ａｒｇＪＣｇ−ｓｐｅＦ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦおよびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡｒｇＪの同時産生を可能にするために、本ａｒｇＡ遺伝子を置き換えることによって、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２のａｒｇＪをコードする遺伝子をｓｐｅＦ発現ベクターｐＤＡＢ５（（ｉｖ）を参照のこと）にクローニングした。遺伝子を、本来のＲＢＳおよび終止コドンと共にクローニングした。
【００８４】
１２１９ｂｐのａｒｇＪ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２の染色体ＤＮＡ（受託番号ＮＣ００６９５８（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２、完全ゲノム）；ヌクレオチド１４６６６５０−１４６７８６９）から増幅した：
５’−ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＡＴＧ  Ｇ−３’  ［配列番号１１］
（変異は太字、ＥｃｏＲＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＧＣ  ３’  ［配列番号１２］
（変異は太字、ＫｐｎＩ制限部位は斜字体）。
【００８５】
増幅されたＤＮＡフラグメントおよびプラスミドｐＤＡＢ５を、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで制限切断した。ｐＤＡＢ５の場合、１３５５ｂｐおよび７４８６ｂｐの２つのフラグメントが得られた。ベクターｐＪＦ１１９ＥＨおよび遺伝子ｓｐｅＦを含んでなる７４８６ｂｐフラグメントを単離し、増幅したＤＮＡフラグメントと連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ３８（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ａｒｇＪＣｇ−ｓｐｅＦ、８６７９ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００８６】
（ｘｉ）プラスミドｐＤＡＢ３（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣｎＲＢＳ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（構成性、生合成性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングし、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃプロモーターおよびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃｌＱ）下の転写制御に基づく強力な遺伝子発現を可能にした。従って、本来のＲＢＳ、開始および終止コドンを伴うコーディング遺伝子ｓｐｅＣをクローニングした。
【００８７】
２２３５ｂｐのｓｐｅＣｎＲＢＳ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７９；ヌクレオチド２６５０−４８６７）：
５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  Ｔ−３’  ［配列番号１３］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’  ［配列番号１４］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）。
【００８８】
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＰＣＲ産物を、同じ様式で切断したプラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ３（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣｎＲＢＳ、７４９１ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００８９】
比較実験Ａ：
ＩＰＴＧによって誘導される遺伝子発現によるオルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＣの唯一の過剰発現を介する１，４−ブタンジアミンの産生（フラスコ振盪法）
ＤＡＢ産生に対するオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣの過剰発現の影響を、プラスミドｐＤＡＢ３（（ｉｘ）を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）内において調べた。
【００９０】
この株を、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３００ｍｇ／ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１５ｍｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１２ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ／ｌ）、クエン酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（７５ｍｇ／ｌ）、チアミン・ＨＣｌ（ビタミンＢ１）（５ｍｇ／ｌ）ならびに微量元素Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．０５ｍｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（３．７５ｍｇ／ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．７５ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（３０ｍｇ／ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（４．５ｍｇ／ｌ）、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）およびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２２．５ｍｇ／ｌ）からなる最小培地を利用するフラスコ振盪実験において試験した。グルコースのストック溶液（５００ｇ／ｌ）を個別にオートクレーブし、滅菌した培地に１０ｇ／ｌの最終濃度まで添加した。
【００９１】
１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２のＯＤ６２０まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、１０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。
【００９２】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、希釈した上清をＨＰＬＣによって分析した。ここで、含有するアミン類を、オルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体として、５０％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．２；緩衝液Ｂ  メタノール）で平衡化したＣ１８逆相カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５Ｃ１８，Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ、独国）を使用するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １１００Ｓｅｒｉｅｓ装置上、２３０ｎｍで検出した。分離のため、次の勾配を適用した：１〜７分：０．５ｍｌ／分の流速での５０％〜７５％緩衝液Ｂにおける直線勾配、７〜１３分：０．５ｍｌ／分の流速での７５％〜８５％緩衝液Ｂ、１３〜１４．５分：１ｍｌ／分の低速（ｌｏｗ  ｒａｔｅ）での８５％〜５０％緩衝液Ｂ、１４．５〜１７分：１ｍｌ／分の流速での５０％緩衝液Ｂ、および１７〜２０分：０．５ｍｌ／分の流速での５０％緩衝液Ｂ。
【００９３】
較正のための標準物質の利用によって、ＮＭＲ分光学により以下のＤＡＢ濃度を決定し（表１を参照のこと）、確認することができた。
【００９４】
【表１】
2008505651.tif 000002
【００９５】
実施例：増加したＮ−アセチルグルタミン酸形成活性と組み合わされた増加したオルニチン脱炭酸活性による１，４−ブタンジアミン産生の改善
実施例１．ＯＤＣならびにＡｒｇＡ過剰産生を利用する１，４−ブタンジアミンの産生（フラスコ振盪法）
ＤＡＢ産生に対するグルタミン酸から出発するオルニチン生合成における第１の工程を触媒するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼＡｒｇＡおよびオルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦまたはＳｐｅＣの同時産生の影響について、プラスミドｐＤＡＢ５（（ｉｖ）を参照のこと）またはｐＤＡＢ６（（ｖ）を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）内において調べた。
【００９６】
これらの株を、最小培地におけるフラスコ振盪実験（比較実験Ａを参照のこと）において試験した。従って、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２の６２０ｎｍでの光学密度まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、１０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。
【００９７】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、上清をＨＰＬＣによって分析した（比較実験Ａを参照のこと）。較正のための標準物質の利用によって、以下のＤＡＢ濃度を決定することができた（表２を参照のこと）。
【００９８】
【表２】
2008505651.tif 000003
【００９９】
実施例２．ＯＤＣならびにＡｒｇＪ過剰産生を利用する１，４−ブタンジアミンの産生（フラスコ振盪法）
ＤＡＢ産生に対するＬ−グルタミン酸およびＮ−アセチルオルニチンから、Ｎ−アセチルグルタミン酸およびオルニチンの形成を触媒するＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のいずれか一方由来のＮ２−アセチル−Ｌ−オルニチン：Ｌ−グルタミン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡｒｇＪならびにオルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦまたはＳｐｅＣの同時産生の影響を、プラスミドｐＤＡＢ３７（（ｉｘ）を参照のこと）またはｐＤＡＢ３８（（ｘ）を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）内において調べた。
【０１００】
これらの株を、最小培地におけるフラスコ振盪実験（比較実験Ａを参照のこと）において試験した。従って、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２の６２０ｎｍでの光学密度まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。
【０１０１】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、上清をＮＭＲによって分析した。培養上清のサンプルをｐＨ５．８に調整し、凍結乾燥し、Ｄ２Ｏに再溶解した。３２３Ｋでの６００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲは、予想された共鳴スペクトルおよび少量のＤＡＢのスパイクにより、ＤＡＢの存在が確認された。較正のための標準物質の利用によって、以下のＤＡＢ濃度を決定することができた（表３を参照のこと）。
【０１０２】
【表３】
2008505651.tif 000004
【０１０３】
実施例３．オルニチンならびに  アルギニンから出発するバッチ内の１，４−ブタンジアミン産生の改善（フラスコ振盪法）
オルニチンならびにアルギニンから出発するＤＡＢ形成のさらなる改善を実証するために、オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦ、アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡおよびアグマチナーゼＳｐｅＢの組み合わされた過剰産生の影響について調べた。さらに、適切な前駆体供給を確実にするために、これらの試験を、さらなる実験において、グルタミン酸から出発するオルニチン生合成の最初の段階を触媒するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼＡｒｇＡの過剰産生と組み合わせた。
【０１０４】
従って、それぞれプラスミドｐＤＡＢ８およびｐＤＡＢ１０（（２．２および２．３を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の利用によって、最小培地（Ａ．３を参照のこと）においてフラスコ振盪培養を行った。従って、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２の６２０ｎｍでの光学密度まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、１０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。
【０１０５】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、上清をＨＰＬＣによって分析した（比較実験Ａを参照のこと）。較正のための標準物質の利用によって、以下のＤＡＢ濃度を決定することができた（表４を参照のこと）。
【０１０６】
【表４】
2008505651.tif 000005
【配列表】
2008505651000001.app
【国際調査報告】
2008505651.tif 000006
2008505651.tif 000007
2008505651.tif 000008
2008505651.tif 000009
2008505651.tif 000010