(57)【要約】  本発明は、気管支炎症性疾患、特に喘息の治療又は予防のための薬剤の製造のためのシクロデキストリン化合物の使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
気管支炎症性疾患の治療を必要とするホスト哺乳類における気管支炎症性疾患の治療のための薬剤の製造のためのシクロデキストリン化合物の使用。
【請求項２】
気管支炎症性疾患の治療を必要とするホスト哺乳類における気管支炎症性疾患の予防のための薬剤の製造のためのシクロデキストリン化合物の使用。
【請求項３】
前記シクロデキストリン化合物が少なくとも１．８５ｇ／１００ｍｌの水溶解度を有する、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記シクロデキストリン化合物がβシクロデキストリン化合物である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
前記シクロデキストリン化合物が、以下の：
β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−βシクロデキストリン、スルホブチルエーテル−βシクロデキストリン、ランダムメチル化−βシクロデキストリン、ジメチル−βシクロデキストリン、トリメチル−βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、ヒドロキシブチルβシクロデキストリン、グルコシル−βシクロデキストリン、マルトシル−βシクロデキストリン、２−Ｏ−メチル−βシクロデキストリン又はその組合せ及び医薬的に許容可能な塩
から成る群から選択される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項６】
前記シクロデキストリン化合物がヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンである、請求項１又は２記載の使用。
【請求項７】
前記シクロデキストリン化合物が２−Ｏ−メチル−シクロデキストリンである、請求項１又は２記載の使用。
【請求項８】
前記気管支炎症性疾患が喘息である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項９】
気管支炎症性疾患の予防方法であって、このような治療を必要とする患者への有効用量のシクロデキストリン化合物の投与を含む、気管支炎症性疾患の予防方法。
【請求項１０】
気管支炎症性疾患の治療方法であって、このような治療を必要とする患者への有効用量のシクロデキストリン化合物の治療を含む、気管支炎症性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、気管支炎症性疾患の治療及び予防のためのシクロデキストリン化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支炎症性疾患の治療及び予防のための化合物は、それらの薬力学的作用に基づいて、発作治療薬とも呼ばれる気管支拡張薬、又は長期管理薬と呼ばれる非気管支拡張薬抗炎症薬として当該技術分野で分類される。短期作用性気管支拡張薬、例えば吸入ベータアゴニスト又は抗コリン作動薬は、発作治療薬と考えられる。コルチコステロイド、クロモリンナトリウム、ネドクロミルナトリウム、徐放性テオフィリン及び長期作用性βアゴニストは、症候の制御をなし、保持するために用いられ、そして長期間毎日用いられるため、長期管理薬と考えられる。
【０００３】
発作治療薬の中で、吸入β２−アドレナリン作動性アゴニストは、急性気道閉塞のための症候の軽減のための薬剤である。それらは作用の迅速開始並びに活性の３〜６時間の持続を示す。残念ながら、それらは、長期投与中にしばしば消失(disapear)する頻拍、心悸亢進及び振顫といった副作用を有する。
【０００４】
抗コリン作動性薬は、気道平滑筋弛緩を誘起する。それらの活性は、喘息におけるβアゴニストほど有効というわけではないが、しかしより持続性である（６〜８時間）。
【０００５】
長期管理薬の中で、糖質副腎皮質ステロイドは抗炎症作用を有する有効な作用物質である。残念ながら、それらの副作用としては、副腎抑制、骨粗鬆症、成長抑制、体重増加、高血圧、糖尿病、皮膚菲薄化、白内障、筋疾患及び精神病性動作が挙げられる。これらの作用は用量関連性であり、そして通常は全身投与に伴って観察される。局所的副作用、例えば口腔カンジダ症及び発声困難は、低用量の吸入糖質コルチコイドで起こるおそれがある。
【０００６】
クロモリンナトリウム及びネドクロミルナトリウムも、それらの類似の臨床プロフィールのために、長期管理薬として分類される。それらは、神経媒介性事象により誘発される気管支収縮を抑制する。
【０００７】
テオフィリンは一般的に気管支拡張薬とみなされるが、しかし治療用量で弱気管支拡張薬活性を有する。それは抗炎症特性も有し得る。テオフィリンの用量関連副作用は、吐き気、神経過敏、不安及び頻拍である。
【０００８】
リポキシゲナーゼ阻害薬及びロイコトリエン受容体アゴニストも、長期管理薬である。それらは、アラキドン酸の５−リポ酸素添加由来のロイコトリエンの病理学的作用を変える。それらは、アレルゲン、運動、乾燥冷気及びアスピリンアレルギーの気管支痙攣作用を抑制し得る。ともに、中等度の喘息患者における４〜６週間の治療中に症候を緩和し、肺機能を改善するのに有効である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって気管支炎症性疾患の治療又は予防のために用いられ得る改善型化合物に対する必要性が存在する。
【００１０】
ここで意外にも、シクロデキストリンは気管支炎症性疾患の治療又は予防のための活性化合物として有用である、ということが判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって本発明は、このような治療を必要とするホスト(host)哺乳類における気管支炎症性疾患の治療又は予防のためのシクロデキストリン化合物の使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
シクロデキストリン化合物とは、シクロデキストリン、並びにそれらの医薬的に許容可能な塩、エナンチオマー形態、ジアステレオマー及びラセミ化合物を意味する。
【００１３】
シクロデキストリンとは、“Cyclodextrin Technology, J Szejtli, Kluwer Academic Publishers 1998, pp 1-78”に記載されているようなデンプンの酵素的分解により産生される環状オリゴ糖を意味し、そしてそれらは種々の数の、大部分は６、７又は８のグルコピラノース単位（ｎ）から成る。これらのシクロデキストリンは、それぞれα、β及びγシクロデキストリン（αＣＤ、βＣＤ、γＣＤ）と呼ばれる。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
ｎ＝６      α−シクロデキストリン
ｎ＝７      β−シクロデキストリン
ｎ＝８      γ−シクロデキストリン
【００１６】
シクロデキストリンは、本明細書中で以後、ＣＤとしても表わされる。
【００１７】
本発明によるシクロデキストリン化合物は、シクロデキストリン自体、アルキルシクロデキストリン（Ｒ−ＣＤ）（ここで、Ｒはメチル、エチル、プロピル、及びブチルである）、カルボキシアルキル−シクロデキストリン（ＣＲ−ＣＤ）、エーテル化シクロデキストリン（ＲＯ−ＣＤ）、スルホアルキル−シクロデキストリン（ＳＲ−ＣＤ）、ヒドロキシアルキル−シクロデキストリン（ＨＲ−ＣＤ）、グルコシル−シクロデキストリン、ジグリセリド−シクロデキストリン、トリグリセリド−シクロデキストリン、又はこれらの組み合わせ、及び２５℃で０．５ｇｒ／１００ｍｌの量で少なくとも水溶性であるこれらの医薬的に許容可能な塩である。
【００１８】
本発明で使用されることが好ましい水溶性シクロデキストリン化合物は、少なくともβ−シクロデキストリン（１．８５ｇ／１００ｍｌ）水溶解度を有するシクロデキストリンを示す。このような水溶性のシクロデキストリン化合物の例は、スルホブチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、及びこれらの塩である。特には、スルホブチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、及びこれらの塩である。
【００１９】
本発明による他の好ましいシクロデキストリン化合物は、２−Ｏ−メチルβ−シクロデキストリン、ジメチルシクロデキストリン（ＤＩＭＥＢ）（好ましくは、２位及び６位で置換される）、トリメチルシクロデキストリン（好ましくは、２位、３位、及び６位で置換される）、「ランダムにメチル化した」シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢ又はＲＭ）（好ましくは、２位、３位、及び６位でランダムに置換されるが、グルコピラノースユニット(unit glucopyrannose)によって１，７位〜１，９位に多くのメチルを有する）等のメチルシクロデキストリン（シクロデキストリンメチル化産物）；ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰＣＤ）（好ましくは、主に２位及び３位でランダムに置換されるヒドロキシプロピル化シクロデキストリン（ＨＰ−βＣＤ、ＨＰ−γＣＤ））；スルホブチルエーテルシクロデキストリン（ＳＢＥＣＤ）；ヒドロキシエチルシクロデキストリン；カルボキシメチルエチルシクロデキストリン；エチルシクロデキストリン；ヒドロキシル基における炭化水素鎖をグラフト化することによって得られ、ナノ粒子を形成することができるシクロデキストリン両親媒性化合物；コレステロールシクロデキストリン；及び「Critical Review in Therapeutic drug Carrier Systems」(Stephen D. Bruck編)、「Cyclodextrin-Enabling Excipient; their present and future use in Pharmaceuticals」(D. Thomson, Volume 14, Issue 1, p1-114(1997))に記載されているように（スペーサーアーム(spacer arm)で）モノアミノ化したシクロデキストリンをグラフト化することによって得られたトリグリセリド−シクロデキストリンである。
【００２０】
最も好ましいシクロデキストリン化合物は、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、スルホニルブチルエーテル−β−シクロデキストリン（ＳＢＥβＣＤ）、ランダムにメチル化したβ−シクロデキストリン（ＲＭβＣＤ）、ジメチル−β−シクロデキストリン（ＤＩＭＥβＣＤ）、トリメチル−β−シクロデキストリン（ＴＲＩＭＥβＣＤ）、ヒドロキシブチル−β−シクロデキストリン（ＨＢβＣＤ）、グルコシル−β−シクロデキストリン、マルトシル−β−シクロデキストリン、及び２−Ｏ−メチル−β−シクロデキストリン（Ｃｒｙｓｍｅｂ）等のグルコピラノースユニットでグラフト化した適宜官能基を有するβ−シクロデキストリン、又はこれらの組み合わせ、及びこれらの医薬的に許容可能な塩である。
【００２１】
本発明によるシクロデキストリン化合物は、”Cyclodextrin Technology, J Szejtli, Kluwer Academic Publishers 1998, pp 1-78”に記載されている方法のようなデンプンの既知の酵素的分解と、その後の適切な化学基のグラフト化により産生される。
【００２２】
本発明はさらに、気管支炎症性疾患の治療を必要とする患者に対する気管支炎症性疾患の治療又は予防のための薬剤の製造のためのこのようなシクロデキストリン化合物の使用を提供する。
【００２３】
本発明によれば、シクロデキストリン化合物は、数ヶ月又は数年に亘って（特に予防の場合）、患者に投与されなければならない。シクロデキストリン化合物は、好ましくはエーロゾルとして、ナノモル〜モル濃度の範囲の非毒性用量で投与される。
【００２４】
本発明は、医薬的有効量での本発明のシクロデキストリン化合物の利用によるこのような治療を必要とするホスト哺乳類、例えばこのような疾患に罹患している患者における気管支炎症性疾患、好ましくは喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療するために用いられる方法に関する。喘息は、アレルゲン曝露に関連するか又は関連しない気管支紋理の炎症性疾患である。この炎症は、収縮するよう気管支平滑筋を刺激し、粘液分布を増強し、そして疾患の経過に関する悪化因子であると考えられる気管支形態学的変化を誘導することにより、患者における症候を引き起こす。気道応答性亢進は疾患の特徴であり、大部分の症候に関与する。気管支樹は、多数の細胞型（例えば上皮細胞、平滑筋細胞、炎症細胞、神経、粘液産生細胞、繊維芽細胞）を有する非常に複雑な組織であり、そして多数の局面を含む気管支再構築事象は主に気管支壁における細胞外マトリックス構成成分の沈着、平滑筋過形成、並びに粘液産生細胞の過形成から成る。本発明によるシクロデキストリン化合物の使用は、気管支肺胞洗浄液及び気管支周囲組織の区画中の炎症細胞流入を抑制し、そしてメタコリンのような刺激薬に対する異常応答と定義される過剰応答性を抑制する。当該疾患及び最新治療は、例えばGINA Workshop Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention (NIH Publication No. 02-3659)及びFabbri, L.M., and Hurd, S.S., Eur. Respir. J. 22 (2003) 1-2で検討されている。
【００２５】
したがって本発明はさらに、治療的有効量で本発明のシクロデキストリン化合物を用いて、このような疾患に罹患している患者における気管支炎症性疾患を治療するための方法に関する。
【００２６】
本発明は好ましくはさらに、本発明のシクロデキストリン化合物を用いて、このような疾患に罹患している患者における気腫を治療するための方法に関する。このような疾患において、肺胞壁はタンパク質分解プロセスにより破壊され、そしてこの破壊は血液への酸素の移入を減損する。このような疾患においては、呼吸筋の機能不全を引き起こすことにより換気の異常を生じる誘導過膨張(derived hyperinflation)のため、そして進行段階における心不全をもたらす肺動脈の高血圧のため、生理学的問題も生じる。
【００２７】
本発明は好ましくはさらに、本発明のシクロデキストリンを用いて、このような疾患に罹患している患者における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療するための方法に関する。このような疾患において、小気道の気管支壁は、タンパク質分解プロセスにより再構築され、そしてこの再構築及び繊維増多は、肺活量測定により測定され得る気道閉塞を誘発する。このような疾患においては、肺換気／血流比の異常を引き起こし、そして換気低下及び最終的にはＣＯ２蓄積を引き起こす誘導高度膨張のため、生理学的問題も生じる。
【００２８】
本発明によれば、シクロデキストリン化合物は、このような療法を必要とする患者に、数ヶ月又は数年に亘って投与されなければならない。シクロデキストリン化合物は、１ｋｇまた１日当たりマイクロ及びモル濃度の範囲の非毒性用量で、好ましくは液体又は粉末組成物のエーロゾル化により投与される。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい目的は、シクロデキストリン又はその塩そして好ましくは水溶性シクロデキストリン誘導体（水溶性は、２５℃で少なくとも０．５ｇ／水１００ｍｌの溶解度と定義される）を含有する、気管支炎症性疾患の治療のための本発明によるシクロデキストリン化合物の医薬組成物、並びにその使用である。
【００３０】
医薬組成物は、生理学的適合性を有する水性組成物である。組成物は、シクロデキストリン又はその塩のほかに、補助物質、緩衝剤、防腐剤、溶媒及び／又は粘度調節剤を含む。適切な緩衝系は、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム又はホウ酸ナトリウムを基礎にする。防腐剤は、使用中の医薬組成物の微生物汚染を防止するために必要とされる。適切な防腐剤は、例えば塩化ベンズアルコニウム、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ソルビン酸である。このような防腐剤は、典型的には０．０１〜１重量％／容量の量で用いられる。
【００３１】
本発明のシクロデキストリン化合物は、経口投与、非経口投与又は局所投与によりその作用を示し、そしてそれは、好ましくは非経口投与のための組成物、特に注射用組成物、又は局所投与のための組成物、特にエーロゾル組成物に成形される。このようなエーロゾル組成物は、例えば溶液、懸濁液、微粉化粉末混合物等である。組成物は、ネブライザー、計量吸入器又は乾燥粉末吸入器或いはこのような投与のために設計された任意の用具を用いて投与される。製剤（galenic)ガレヌス組成物の例としては、錠剤、カプセル、粉末、顆粒等が挙げられる。これらは、既知の技法により、そして典型的添加剤、例えば賦形剤、滑剤及び結合剤の使用を伴って製造され得る。適切な補助物質及び医薬組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.に記載されている。典型的には、組成物を等張にさせるために適量の医薬的に許容可能な塩が組成物中に用いられる。医薬的に許容可能な物質の例としては、生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、さらに好ましくは約７〜約７．５である。
【００３２】
霧状化のための好ましい医薬組成物は、シクロデキストリン（ＣＤ）、ＮａＣｌ及び水を含む。溶液は、精製水１００ｍｌ中にＣＤを溶解し、ＮａＣｌを付加して、それらを溶解するために撹拌することにより調製され、２００ｍｌの溶液を得るように水で満たされる。好ましくは、溶液が０．２２μｍのポリプロピレン膜を通した濾過により、又は蒸気滅菌プロセスにより、滅菌される。
【００３３】
特に好ましい組成物は、以下の組合せ（２００ｍｌ溶液用）である：１０〜５０ｇのＣＤ、好ましくは２０ｇのＣＤ、好ましくはＨＰβＣＤ；塩化ナトリウム  １．２〜１．５ｇ、好ましくは１．４２ｇ（等張性）、並びに水、好ましくは発熱物質無含有の滅菌性精製水で全体を２００ｍｌとする。このような組成物は、気管支炎症性疾患の治療のために有用である。
【００３４】
最も好ましい組成物は、２−Ｏ−メチルβＣＤと塩化ナトリウム１．２〜１．５ｇ、好ましくは１．４２ｇ（等張性）、並びに水、好ましくは発熱物質無含有の滅菌性精製水（全体で２００ｍｌとする量）の組合せである。
【００３５】
以下の実施例、参考文献及び図面は、本発明の理解を助けるために提示される。本発明を逸脱しない限り、記述された手法において変更がなされ得る、と理解される。
【実施例１】
【００３６】
喘息のマウスモデルにおけるアレルゲン誘導性気道炎症及び気管支過剰応答性の治療のためのＨＰ−β−シクロデキストリンを含有する組成物の使用
材料
ＨＰ−β−ＣＤ（置換度＝０．６４）は、Roquette (France)から入手した。α−及びＨＰ−γ−ＣＤは、Wacker Chemie Gmbh (Germany)から入手した。非発熱原性リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Bio-Wittaker (Verviers, Belgium)から購入した。メタコリンは、Sigma-Aldrich (Germany)からであった。他の材料はすべて、分析等級のものであった。注射用の滅菌水を、この試験を通して用いた。滅菌性、非発熱原性及び等張性ＣＤ溶液を、ＨＰ−β−ＣＤ及びα−ＣＤに関しては１、７．５及び５０ｍＭで、及びＨＰ−γ−ＣＤに関しては５０ｍＭで調製した。カブトガニ血球溶解物（ＬＡＬ）を用いて、ＵＳＰ  ＸＸＶＩに記載された細菌内毒素検定に従って、シクロデキストリンを試験した。Ｋｎａｕｅｒ自動半微量浸透圧計により、すべての溶液のモル浸透圧濃度を測定し、そして適量のＮａＣｌの付加により３００ｍＯｓｍ／ｋｇの値に調整した。蒸気滅菌プロセスにより、溶液の最終滅菌を実施した。
【００３７】
方法
超音波ネブライザーＳＹＳＴＡＭを用いてエーロゾルを製造したが、この振動周波数は２．４ＭＨｚであり、可変性振動強度及び換気レベルを有する。振動強度は位置６に固定され、そして換気レベルは２５（ｔ1/2）ｌ／分であった。
【００３８】
霧状化エーロゾルの特性化
ＣＤ溶液から揮散されるエーロゾルサイズ分布を、レーザーサイズ分析器マスターサイザー（Malvern, Orsay, France）を用いて確定した。１０ミリリットルの各溶液を、レーザー光線中で直接霧状にした。マウスピースをレーザー光線の中心から１ｃｍに保持した。その結果生じたエーロゾルを、光線の反対側に吸引した。環境温度及び相対湿度を一定に、即ち２０℃及び４０〜４５％に維持した。各測定の三重反復実験を実施して、ＰＢＳの対照と比較した。結果を、０．５〜５．７９μｍの範囲に含まれる小滴のパーセンテージ及び中央径として表わす。レーザー光線の不明瞭化パーセンテージにより評価される空気中の小滴の濃度は、各実験に関して同じ範囲であった（１５〜２５％）。ＭＭＡＤ、ＧＳＤ及びすべてのＣＤ溶液の０．５〜５．７９μｍの範囲に含まれる小滴のパーセンテージと、ＰＢＳに関する対応する値との比較は、溶液中のＣＤの存在がエーロゾル中の小滴サイズ分布に影響を及ぼさないことを実証した。６５％に近い０．５〜５．７９μｍの範囲に含まれる小滴の分画を各実験で得た。
【００３９】
感作、アレルゲン曝露及び治療プロトコール
気道炎症の調節を試験するために、１と８日目に水酸化アルミニウム(AlumInjet; Perbio, Erembodegem, Belgium)中に乳化したオバルブミン（ＯＶＡ）（Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany）１０μｇの腹腔内注射により、６〜８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスを感作した。その後、２１〜２７日目に、超音波ネブライザー（Devilbiss 2000）により発生される３０分間の１％ＯＶＡのエーロゾルの毎日の吸入により、マウスをアレルゲンに曝露した。マウスにα−ＣＤ、ＨＰ−β−ＣＤ１、７．５、５０ｍＭ及びＨＰ−γ−ＣＤ５０ｍＭの３０分間の吸入を施した後、ＯＶＡ吸入を施した。Cataldo他(Am. J. Pathol 2002; 161 (2): 491-498)により、以前に報告されたように、２８日目にマウスの屠殺を実施した。
【００４０】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）
気道応答性の評価直後、及び最終アレルゲン曝露後２４時間
マウスを屠殺し、Cataldo DD, Tournoy KG, Vermaelen K他(Am J Pathol 2002;161(2): 491-498)により以前に記載されているように、４×１ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ０．０５ｍＭ（Calbiochem, Darmstadt, Germany）を用いて気管支肺胞洗浄を実施した。静かに手動で吸引することにより、細胞を回収した。気管支肺胞液（ＢＡＬＦ）の遠心分離（１，２００ｒｐｍで４℃で１０分間）後、タンパク質評価のために上清を−８０℃で凍結し、細胞ペレットを１ｍｌのＰＢＳ−ＥＤＴＡ０．０５ｍＭ中に再懸濁した。ディフ・クイック（Dade, Belgium）で染色後、細胞遠心分離調製物（Cytospin）で差次的細胞計数を実施した。
【００４１】
肺組織学検査及び組織プロセシング
ＢＡＬ後、胸郭を開け、左主気管支をクランプした。左肺を切除し、タンパク質及びｍＲＮＡ抽出のために−８０℃で直ちに凍結した。４％パラホルムアルデヒド４ｍｌを右肺に注入し、パラフィン中に包埋して、組織学的検査のために用いた。５μｍ厚の切片をパラフィンから切断し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。Cataldo DD, Tournoy KG, Vermaelen K他(Am J Pathol 2002;161(2): 491-498)により以前に記載されているように、気管支周囲炎症細胞の定量により算定されるスコアにより、気管支周囲炎症の程度を概算した。炎症が検出可能でなかった場合は値を０と判定し、時々炎症細胞が存在する場合は値を１、ほとんどの気管支が炎症細胞の薄層（１〜５細胞）により取り囲まれる場合は値を２、そしてほとんどの気管支が炎症細胞の厚い層（＞５細胞）に取り囲まれる場合は値を３と判定した。１匹のマウス当たり５〜７個の無作為選択組織区分がスコアされたため、炎症スコアは平均値として表わされ、群間で比較され得る。コンゴ・レッド染色後、気道壁中の好酸球浸潤を手動計数により定量し、好酸性炎症性スコアを明らかにする上皮基底膜の周辺視野計に送った。
【００４２】
Ｍｉｋｒｏ−Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Braun Biotech International, Gmbh Melsungen, Germany）を用いて、左肺を粉砕した。タンパク質抽出のため、２Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）を含有する溶液中で４℃で一晩、粉砕肺組織をインキュベートし、その後、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を−８０℃で保存した。
【００４３】
気管支応答性測定
Hamelmann, E.他(Am. J Respir. Crit. Care Med. 156 (1997) 766-775)により提唱されているように、気圧プレチスモグラフ（Emka technologies, Paris）を用いてＰｅｎｈ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐａｕｓｅ）を測定することにより、最終アレルゲン曝露後２４時間で、気管支過剰応答性を確定した。基線で、そして漸増用量（２５、５０、７５及び１００ｍＭ）のメタコリン（Ｍｃｈ）の吸入の５分後に、Ｐｅｎｈを測定した。
【００４４】
ＥＬＩＳＡによるサイトカインの測定
市販のＥＬＩＳＡ（R & D systems, Abingdon, UK）を用いて、エオタキシン及びＩＬ−１３レベルを評価した。タンパク質の認識に特異的に向けられる一次抗体で被覆されたホイール中でインキュベートすることでエオタキシンを測定し、そしてすすいだ後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたエオタキシンに対する二次抗体を用いて、溶液中のエオタキシンの量を定量した。
【００４５】
アレルゲン特異的血清ＩｇＥの測定
実験終了時に、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＥの測定のために心臓から血液を採取した。マイクロタイタープレートをＯＶＡで被覆した。血清を付加し、その後、ビオチニル化ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＥ（S. Florquin, ULB, Brussels, Belgium）を付加した。ＯＶＡ感作動物からの血清プールを、内部実験室標準として用いた；適宜、１単位をこのプールの１／１００希釈と定義した。
【００４６】
Ｂａｌ及び肺タンパク質抽出物中のエオタキシン及びＩＬ−１３の測定
タンパク質の認識に特異的に向けられる一次抗体で被覆されたホイール中でインキュベートすることでＩＬ−１３を測定し、そしてすすいだ後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたＩＬ−１３に対する二次抗体を用いて、溶液中のエオタキシンの量を定量した。
【００４７】
統計学的分析
ＢＡＬ細胞計数、肺組織検査、サイトカイン及びｍＲＮＡレベルの結果を、平均＋／−ＳＥＭとして表わし、そして群間の比較をマン・ホイットニー検定を用いて実施した。ウインドウ９５用ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＩＮＳＴＡＴバージョン３．００（GRAPHPAD SOFTWARE, San Diego, CA, USA, WWW.GRAPHPAD.Com.）を用いて、マン・ホイットニー検定を実施した。Ｐ値＜０．０５で有意であるとみなされた。
【００４８】
薬理学的結果
ＢＡＬ中の炎症細胞
アレルゲン曝露後、好酸球数は、５０ｍＭの用量でのＨＰ−β−ＣＤ及びＨＰ−γ−ＣＤの吸入後に有意に低減された。１、７．５及び５０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤ吸入に関して、ＢＡＬ好酸球の用量依存性の低減が認められた。プラセボと比較して、ＨＰ−β−ＣＤ吸入後のＢＡＬ中に異なる量では他の炎症細胞は存在しなかった。これに対して、α−ＣＤ吸入は、アレルゲン曝露後のＢＡＬ中の好酸球の数を増大する傾向をもたらした（図１）。
【００４９】
気管支周囲炎症
アレルゲン曝露後、プラセボで処置したマウスは、気管支周囲炎症スコアにより定量されるように、気管支周囲炎症の有意の増大を示した。１、７．５及び５０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤ及び５０ｍＭのＨＰ−γ−ＣＤで処置したマウスは、プラセボ処置マウスと比較して、炎症スコアが低減していることが示された。α−ＣＤ吸入は、気管支周囲炎症スコアを低減しなかった（図２）。
【００５０】
気管支周囲好酸球浸潤
これまでに実証されたように、アレルゲン曝露は、気管支周囲域で検出可能な好酸球の数の有意な増大を誘導しなかった。試験したＣＤはすべて、この浸潤の低減を誘導し、そしてこの低減は、α−ＣＤ、ＨＰ−β−ＣＤ１、７．５、及びＨＰ−γ−ＣＤ５０ｍＭに関して統計学的に有意になった（図３）。
【００５１】
気管支応答性
５０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤの吸入は、メタコリン誘導性Ｐｅｎｈ増大を低減した（図４）。異なるＣＤに関してメタコリン用量応答曲線の下の面積（Ａ．Ｕ．Ｃ）を測定した場合、５０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤは、有意な低減を示す唯一のものであった（図５）。
【００５２】
ＢＡＬ及び肺タンパク質抽出物中のサイトカイン測定
プラセボ曝露マウスと比較して、試験した全用量のＨＰ−β−ＣＤは、肺タンパク質抽出物中のＥＬＩＳＡにより測定されるエオタキシンのレベルの低減を誘導した（図７ａ）。ＩＬ−１３レベルはＨＰ−β−ＣＤ曝露後のＢＡＬ中で低減されたが、これに対して、α−ＣＤ曝露後は増大された（図７ｂ）。
【００５３】
血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの測定
血清中でＥＬＩＳＡにより測定される同様のレベルのＯＶＡ特異的ＩｇＥにより評価されるように、アレルゲン感作に関して群間の有意差は認められなかった（図６）。
【実施例２】
【００５４】
喘息のマウスモデルにおけるアレルゲン誘導性気道炎症及び気管支過剰応答性の治療のための２−Ｏ−メチル−シクロデキストリンを含む組成物の使用
材料
材料は実施例１と同一であるが、但し、シクロデキストリン化合物は、実施例２では２−Ｏ−メチル−シクロデキストリン、ＫＬＥＰＴＯＳＥ  ＣＲＹＳＭＥＢ（登録商標）（Roquette製）である。それは、平均で、１個のネイティブシクロデキストリン分子当たり４個のメチル基を有し、そして平均分子量１，１３５及び平均モル置換度０．５７により特性化される。
【００５５】
滅菌性、非発熱原性及び等張性ＣＤ溶液を、２−Ｏ−メチル−シクロデキストリンに関しては１０、２０、５０及び７５ｍＭで調製した。カブトガニ血球溶解物（ＬＡＬ）を用いて、ＵＳＰ  ＸＸＶＩに記載された細菌内毒素検定に従って、シクロデキストリンを試験した。Ｋｎａｕｅｒ自動半微量浸透圧計により、すべての溶液のモル浸透圧濃度を測定し、そして適量のＮａＣｌの付加により２８０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの値に調整した。蒸気滅菌プロセスにより、溶液の最終滅菌を実施した。
【００５６】
方法
実施例１と同様の方法を用いるが、本実施例では、７日間、３０分／日、標準曝露ボックス（２０×３０×１５ｃｍ）中でエーロゾル化ＣＲＹＳＭＥＢ（１０、２０、５０、１００又は２００ｍＭ）にマウスを曝露した。
【００５７】
薬理学的結果
ＢＡＬ中の炎症細胞
気管支肺胞洗浄液の細胞組成は、ＣＲＹＳＭＥＢへの曝露によっては有意に変化しなかった。特に、好酸球数及び好中球数に関する差は認められなかった（表１を参照のこと）。気管支肺胞洗浄液好酸球増多症は、ＣＲＹＳＭＥＢにより処置された群において有意に低減された。洗浄液好酸球増多症の低減は、異なる濃度のＨＰ−β−シクロデキストリン又はフルチカゾン（参照療法として用いられる一般的に使用される吸入ステロイド）を用いて得られるものに匹敵した（表２）。
【００５８】
気管支周囲炎症
アレルゲン曝露後、プラセボで処置したマウスは、気管支周囲炎症スコアにより定量されて、気管支周囲炎症の有意の増大を示した。２０ｍＭのＣＲＹＳＭＥＢで処置したマウスは、プラセボ処置マウスと比較して、炎症スコアが低減していることが示された（図９Ａ）。気管支周囲炎症スコアを測定すると、プラセボと比較して、すべての治療群において有意に低減した（図９Ｂ）。
【００５９】
気管支応答性
１０ｍＭのＣＲＹＳＭＥＢの吸入は、メタコリン誘導性Ｐｅｎｈ増大を低減した（図１０）。メタコリンに対する応答性はアレルゲン曝露及びプラセボ後に増大され、そしてＣＲＹＳＭＥＢによる処置により、フルチカゾン療法で得られるものに匹敵する程度で有意に低減された（図１０）。
【００６０】
ＢＡＬ及び肺タンパク質抽出物中のサイトカイン測定
ＣＲＹＳＭＥＢの薬理学的作用に関与するメカニズムを明らかにするために、本発明者等は気道過剰応答性及び炎症に関与する主要Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−１３を測定した。全肺タンパク質抽出物中でＥＬＩＳＡにより測定されるＩＬ−１３のレベルは、ＣＲＹＳＭＥＢ、並びにフルチカゾン及び５０ｍＭのＨＰ−β−ＣＤへの曝露により有意に低減されることを本発明者等は見出した（図１１を参照のこと）。
【実施例３】
【００６１】
気管支炎症性疾患のための治療を必要とする患者にエーロゾル中で投与される医薬組成物
７５ｍＭのＨＰ−β−ＣＤ
溶液モル浸透圧濃度は３０８ｍＯｓ／ｋｇである。ｐＨは７．２である。ＣＤ化合物の濃度は、要求の機能において変更され得る。ＮａＣｌの付加により張性を調整するのが好ましい。霧状化のための好ましい組成を以下に示す。
２００ｍｌ溶液用：
発熱原物質を含有しないＨＰ−β−ＣＤ                ２０．１５ｇ（７５ｍＭ）
塩化ナトリウム                                      １．４２ｇ（等張性）
発熱原無含有の滅菌性精製水                          全体を２００ｍｌとする量
【００６２】
ａ）発熱原物質を含有しないＨＰ−β−ＣＤ２０．１５ｇを計量（３．２％Ｈ２Ｏ、ROQUETTE製）し、それらを精製水１００ｍｌ中に溶解する。
ｂ）塩化ナトリウム１．４２ｇを計量し溶液（ａ）にそれらを付加し、それらを溶解するために激しく撹拌する。
ｃ）２００ｍｌの溶液を得るように水で満たされる。０．２２μｍのポリプロピレン膜を通した濾過により滅菌する。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＢＡＬ好酸球パーセンテージに及ぼすシクロデキストリン化合物の吸入の作用を示す図である。対照は、吸入によりＯＶＡに、そして吸入によりプラセボに曝露されるマウスである（ＯＶＡ）。
【図２】気管支周囲炎症スコアに及ぼすシクロデキストリン化合物の吸入の作用を示す図である。対照は、吸入によりＯＶＡに、そして吸入によりプラセボに曝露されるマウスである（ＯＶＡ）。
【図３】上皮基底膜の数／ｍｍとして本明細書で報告される気管支周囲好酸球に及ぼすシクロデキストリン化合物の吸入の作用を示す図である。
【図４】気道応答性測定を示す図である。シクロデキストリン又はプラセボの２分吸入後５分間のＯＶＡ（ＯＶＡ）及び漸増用量のメタコリン（Ｍｃｈ）の曝露マウスにおいて、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐａｕｓｅ（Ｐｅｎｈ）を測定した。
【図５】ＥＬＩＳＡによるサイトカインの測定を示す図である。タンパク質の認識に特異的に向けられる一次抗体で被覆されたホイール中でインキュベートすることでエオタキシンを測定し、そしてすすいだ後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたエオタキシンに対する二次抗体を用いて、溶液中のエオタキシンの量を定量した。
【図６】血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥレベルの測定を示す図である。
【図７】Ｂａｌ及び肺タンパク質抽出物中のエオタキシン及びＩＬ−１３の測定を示す図である。タンパク質の認識に特異的に向けられる一次抗体で被覆されたホイール中でインキュベートすることでＩＬ−１３を測定し、そしてすすいだ後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたＩＬ−１３に対する二次抗体を用いて、溶液中のエオタキシンの量を定量した。
【図８】気道応答性測定を示す図である。ＣＲＹＳＭＥＢ又はプラセボ処置を受けた後のマウスにおいて、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｏｎｓｅ（Ｐｅｎｈ）を測定した。
【図９】種々のＣＲＹＳＭＥＢ濃度で処置された場合の組織学検査で測定された気管支周囲炎症スコアと、プラセボとの比較を示す図（９Ａ）、および他のシクロデキストリン及びフルチカゾンの比較を示す図である（９Ｂ）。
【図１０】気道応答性測定：シクロデキストリン化合物とプラセボ及びフルチカゾンとの比較を示す図である。アレルゲンに７日曝露された、そしてアレルゲン曝露前に３０分間吸入療法を受けているマウスにおけるメタコリン誘導性気道応答を測定した。
【図１１】肺タンパク質抽出物中のＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−１３のレベルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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