(57)【要約】遷移金属化合物（Ｉ）（ここで、Ｍは窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；ＲおよびＲ′は窒素原子でＭに配位結合し；Ｌは結合リガンドであり；ｚは塩素または臭素であり；ｍは１〜６であり得；Ｘは、電荷ｍと等しいアニオンまたはアニオン組み合せである）を含むアナライトを電気化学的に検出するための組成物および方法。電気化学タグおよび検出法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008508268.tif 000007
の遷移金属化合物であって、上記式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、約３〜約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基およびＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を有する有機アミンを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである、遷移金属化合物。
【請求項２】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｍがオスミウムである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
結合リガンドが、３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合
物からなる群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｍがオスミウムである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項６に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｚが塩素または臭素である、請求項６に記載の化合物。
【請求項１１】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が、２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
式：
【化２】
2008508268.tif 000008
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
遷移金属化合物の製造法であって、
式：
【化３】
2008508268.tif 000009
（式中、Ｚ、Ｍ、Ｒ、Ｒ′、Ｘおよびｍは請求項１に定義の通りである）
の前駆化合物と、結合リガンドとを接触させて、請求項１に記載の遷移金属化合物を形成するステップを含んでなる方法。
【請求項１４】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｍがオスミウムである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｍがオスミウムである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が、２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前駆化合物が、式：
【化４】
2008508268.tif 000010
（式中、ＲおよびＲ′は２，２′−ビピリジルであって窒素原子でＯｓに配位結合し、Ｚは塩素であり、ｍは＋３であり、Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）の化合物であり；結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールであり；遷移金属化合物が、式：
【化５】
2008508268.tif 000011
の化合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
式：
【化６】
2008508268.tif 000012
の遷移金属化合物に結合したレドックス生体分子を含んでなる電気化学タグであって、上記式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、約３〜約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基およびＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を有する有機アミンを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである、電気化学タグ。
【請求項２６】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項２７】
Ｍがオスミウムである、請求項２６に記載の電気化学タグ。
【請求項２８】
レドックス生体分子がオキシドレダクターセを含んでなる、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項２９】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項２８に記載の電気化学タグ。
【請求項３０】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項３１】
Ｚが塩素または臭素である、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項３２】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項３３】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３２に記載の電気化学タグ。
【請求項３４】
Ｍがオスミウムである、請求項３３に記載の電気化学タグ。
【請求項３５】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項３２に記載の電気化学タグ。
【請求項３６】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項３５に記載の電気化学タグ。
【請求項３７】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項３２に記載の電気化学タグ。
【請求項３８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項３２に記載の電気化学タグ。
【請求項３９】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項４０】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項３９に記載の電気化学タグ。
【請求項４１】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項４０に記載の電気化学タグ。
【請求項４２】
式：
【化７】
2008508268.tif 000013
の遷移金属化合物に結合したレドックス生体分子を含んでなる、請求項２５に記載の電気化学タグ。
【請求項４３】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項４２に記載の電気化学タグ。
【請求項４４】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項４３に記載の電気化学タグ。
【請求項４５】
請求項２５に記載の電気化学タグの製造法であって、レドックス生体分子を、式：
【化８】
2008508268.tif 000014
（式中、
Ｍは窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、約３〜約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基およびＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を有する有機アミンを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）
の遷移金属化合物に結合させるステップを含んでなる方法。
【請求項４６】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム
、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｍがオスミウムである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
レドックス生体分子をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
Ｚが塩素または臭素である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｍがオスミウムである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
レドックス生体分子をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
Ｚが塩素または臭素である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
レドックス生体分子をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
レドックス生体分子を、式：
【化９】
2008508268.tif 000015
の遷移金属化合物に結合させるステップを含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
レドックス生体分子をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
サンプル中のアナライトの電気化学的検出法であって、
電極表面に、アナライトと電気化学タグとを含んでなる電気化学的に活性なレドックス複合体を形成するステップと、
電極で電子移動を検出するステップと
を含んでなり、電気化学タグが、式：
【化１０】
2008508268.tif 000016
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ
１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、約３〜約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基およびＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を有する有機アミンを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）
の遷移金属化合物に結合したレドックス生体分子を含んでなる、方法。
【請求項７０】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
Ｍがオスミウムである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
アナライトがレドックス生体分子の酸化基質である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
Ｚが塩素または臭素である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７７】
電極表面にプローブを固定化するステップと、
アナライトを認識対の第１メンバーで標識するステップと、
電気化学タグを認識対の第２メンバーで標識するステップと、
標識された構成要素とレドックス生体分子の酸化基質とを、電極と接触している溶液中で混合するステップであって、プローブとアナライトは互いに特異的に結合またはハイブリダイズする、ステップと
をさらに含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７８】
認識対がビオチンとアビジンを含んでなる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
アナライトが核酸を含んでなる、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
電極表面を認識対の第１メンバーで標識するステップと、
電気化学タグを認識対の第２メンバーで標識するステップと、
標識された構成要素とレドックス生体分子の酸化基質とを、電極と接触している溶液中で混合するステップであって、電気化学タグは電極表面に結合する、ステップと
をさらに含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
認識対がビオチンとアビジンを含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
アナライトがレドックス生体分子の基質を含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
遷移金属化合物が、構造：
【化１１】
2008508268.tif 000017
を有する＋３カチオンを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項８４】
レドックス生体分子がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（０００１）本願は一般的にはバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
（０００２）レドックス生体分子は、可逆的還元酸化を受けて、電子を効率的に天然の電子受容体に移動させる。レドックス生体分子は、一般に、酸化還元経路を仲介し該経路に関与する活性部位補欠分子族または補酵素を含む。通常、補欠分子族は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などのジヌクレオチドをベースとしている。レドックス生体分子は、基質を酸化して基質から電子を受けとり、次いで、補欠分子族の可逆的酸化還元により電子を電子受容体に移動させる。
【０００３】
（０００３）バイオセンサーは、サンプル中のアナライト（分析対象物）を検出するための高感度、高速かつ低コストのアッセイを提供し得る。バイオセンサーは、基本的には、標的アナライトを認識するレドックス生体分子と、認識事象を測定可能なシグナルに変換するトランスデューサとからなる。バイオセンサーは、ある意味では、天然の電子受容体へと向かう電子の流れを「阻止する」ことで機能する。電子の流れは、生体分子に近接する電極を含む電気回路によって電流または電圧として検出される。したがって、レドックス生体分子の活性部位補欠分子族と電極表面との間の電子の移動は、バイオセンサーの効率的な稼動における重要な要素である。
【０００４】
（０００４）一般に、バイオセンサーのレドックス生体分子から電極表面への電子移動の効率は、天然の電子受容体による高効率な還元より低いと言われている。いくつかのグループは、レドックスメディエータの共有結合によるレドックス生体分子の修飾について調べたが、その電子移動速度定数は、酵素とその天然電子受容体との間の電子移動速度定数よりはるかに低いことを発見した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、サンプル中のアナライトを検出するための新規バイオセンサーおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の要約］
（０００５）本発明により、本出願人らは、バイオセンサーでサンプル中のアナライトを検出する新規方法を首尾良く発明した。この新規方法は、種々の実験条件下に電子を得失し得る新規レドックスメディエータの合成に基づいている。そのようなレドックスメディエータは、例えばオキシドレダクターゼなど他の酸化還元分子からの非拡散性の電子移動を可能にする電子リレー基の機能を果たすと考えられる。
【０００７】
（０００６）種々の実施形態において、本発明は、式Ｉ：
【０００８】
【化１】
2008508268.tif 000002
【０００９】
に一致する構造を有する遷移金属化合物を提供し、上記式中、Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素である。ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり得る。Ｌは、約３〜約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基およびＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を有する有機アミンを含む結合リガンドであり得る。Ｚはハロゲン原子であり、ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり得る。Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである。
【００１０】
（０００７）種々の他の実施形態において、本発明はさらに、式Ｉに一致する上記構造を有する遷移金属化合物の製造法を提供する。該方法は、式ＩＩ：
【００１１】
【化２】
2008508268.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｚ、Ｍ、Ｒ、Ｒ′、Ｘおよびｍは上記の通りである）の前駆化合物を結合リガンドと接触させて、リガンド交換反応を介して式Ｉの遷移金属化合物を形成する方法を提供する。
【００１３】
（０００８）さらなる実施形態において、本発明は、式Ｉ（式中、Ｚ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｒ′、Ｘおよびｍは上記の通り）の遷移金属化合物に結合したレドックス生体分子を含む電気化学タグを提供する。１つの好ましい実施形態において、Ｍはオスミウム、Ｌは３−アミノプロピルイミダゾールである。遷移金属化合物はレドックス生体分子に共有結合していることが好ましく、レドックス生体分子はグルコースオキシダーゼを含むのが好ましい。
【００１４】
（０００９）種々のさらなる実施形態において、本発明はさらに、上記電気化学タグの製造法を提供する。この方法は、レドックス生体分子を、式Ｉ（式中、Ｚ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、
Ｒ′、Ｘおよびｍは上記の通り）の遷移金属化合物に結合させるステップを含む。１つの好ましい実施形態において、Ｚは塩素であり、Ｌは３−アミノプロピルイミダゾールであり、遷移金属化合物は、グルコースオキシダーゼカルボキシレートとＬ上に存在する脂肪族第１級アミノ基とがアミド結合を形成することによりグルコースオキシダーゼに共有結合される。
【００１５】
（００１０）本発明はさらに、上記電気化学タグを用いたサンプル中のアナライトの電気化学的検出法を提供する。種々の実施形態において、アナライトと電気化学タグとを含んでなる電気化学的に活性なレドックス複合体が電極表面で形成され、該電気化学タグは、式Ｉ（式中、Ｚ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｒ′、Ｘおよびｍは上記の通り）の遷移金属化合物に結合したレドックス生体分子を含む。本発明の実用性、機能または構成を制限するものではないが、何度も酸化還元を受ける電気化学タグと電極との間の電子の行き来を検出することが可能であり、この電子の行き来がサンプル中のアナライトの有無の指標となる。検出すべきアナライトは、例えば、核酸またはタンパク質であり得る。１つの好ましい実施形態において、アナライトは、多様なガンに関連する遺伝子であるｐ５３遺伝子に相当する配列である。他の実施形態において、検出すべきアナライトは、レドックス生体分子の酸化基質でもあり得る。
【００１６】
（００１１）さらに他の実施形態において、本発明はさらに、上記電気化学タグを含むキット、ならびに、アナライトを電気化学的に検出するためにそのような電気化学タグを利用するバイオセンサーにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（００１２）当業者には当然のことであるが、以下に記載する図面はもっぱら説明のためのものである。図面は、本教示の範囲をどのようにも限定するものではない。
［発明の詳細な説明］
（００１７）本発明により、本出願人らは、サンプル中のアナライトを検出するための新規バイオセンサーおよび方法を発明した。本発明は、種々の実験条件下に電子を得失し得る新規酸化還元メディエータの合成に基づいている。特定の理論に拘泥するわけではないが、そのようなレドックスメディエータは、例えばオキシドレダクターゼなど他の酸化還元分子からの非拡散性の電子移動を可能にする電子リレー基の機能を果たすと考えられる。
【００１８】
（００１８）種々の実施形態において、本発明は、レドックスメディエータの機能を果たすことができ、上記式Ｉ（式中、Ｍは窒素への配位結合を形成し得る金属元素である）に一致する構造を有する遷移金属化合物を提供する。Ｍとしての使用に適した金属元素は、例えば、オスミウム（Ｏｓ）、ルテニウム（Ｒｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ロジウム（Ｒｈ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、カドミウム（Ｃｄ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）およびイリジウム（Ｉｒ）およびそれらの混合物であり得る。１つの好ましい実施形態において、金属元素Ｍは遷移金属オスミウム（Ｏｓ）である。
【００１９】
（００１９）ＲとＲ′は同一でも異なっていてもよく、窒素原子でＭに配位結合する。ＲとＲ′の一方または両方は、例えば、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル、ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−
フェナントロリニルであり得る。ＲおよびＲ′の少なくとも一方は２，２′−ビピリジルであるのが好ましい。
【００２０】
（００２０）Ｌは結合リガンドである。種々の実施形態において、Ｌは、３〜２０個の非水素原子を有し、脂肪族アミノ基を含み、さらにＭへの金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を含む有機アミンである。１つの好ましい実施形態において、窒素部分は、少なくとも１個の窒素原子を含む複素環である。非限定的な例としては、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピロール、ピラゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジンおよびトリアジンが挙げられる。複素環窒素の１つは金属Ｍへの配位結合を形成する。１つの好ましい窒素部分はイミダゾールである。窒素部分が複素環のとき、脂肪族アミノ基は、該複素環に結合したアルキル基上に保持されているのが好ましい。アルキル基は、直鎖でも分岐鎖でもよく、一般に１〜約２０個、好ましくは２〜１２個、より好ましくは３〜６個の炭素原子を含む。１つの好ましい結合リガンドＬは３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００２１】
（００２１）Ｚはハロゲン原子である。１つの好ましい実施形態において、Ｚは塩素または臭素であるが、塩素の方が好ましい。上付き文字ｍは、金属Ｍの酸化状態に応じて、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５または＋６であり得る。１つの好ましい実施形態において、例えば、金属Ｍが＋４酸化状態のオスミウムのとき、Ｚは塩素でｍは＋３である。Ｘは、カチオンの形式電荷ｍと均衡するアニオンまたはアニオン組み合わせである。例えば、Ｘは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、テトラフルオロホウ酸塩、過塩素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、炭酸塩または亜硫酸塩であり得るが、それらには限定されない。
【００２２】
（００２２）他の実施形態において、リガンド基ＲおよびＲ′の少なくとも一方、好ましくは両方が、２，２′−ビピリジルまたは１，１０−フェナントロリニルであり、どちらも場合により置換され得る。ビピリジルまたはフェナントロリニルが置換されるとき、置換基は、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、フェニル基、ならびに、Ｃ１−Ｃ４アルキル、特にＣ１−Ｃ２アルキル基でさらに置換されたフェニル基から選択するのが好ましい。置換ビピリジルおよびフェナントロリニルリガンド基は、モノ置換でも、ジ置換でも、またはそれ以上置換されてもよい。種々の実施形態において、ジ置換リガンド基を用い得る。非限定的例としては、４，４′−ジ置換−２，２′−ビピリジル、５，５′−ジ置換−２，２′−ビピリジル、１，１０−フェナントロリニル、４，７−ジ置換−１，１０−フェナントロリニル、および５，６−ジ置換−１，１０−フェナントロリニルが挙げられる。
【００２３】
（００２３）ＲおよびＲ′の一方のみがビピリジルもしくはフェナントロリニルまたは上記の任意選択で置換された基の１つであるとき、他方は、金属Ｍとの配位結合を形成し得る２個の窒素原子を含む脂肪族リガンドから選択するのが好ましい。非限定的例としては、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミンおよびそれらの誘導体があり、誘導体は、任意選択でアルキル、アリール、または金属Ｍへの窒素の配位結合や複合体の電気化学活性に干渉しない他の基で置換された１，３−プロパンジアミンまたは１，４−ブタンジアミン骨格をベースとする。
【００２４】
（００２４）好ましい実施形態において、遷移金属化合物は、以下の特性を１つ以上有する。本発明のバイオセンサーにおける電子シャトルとして機能するのに適したレドックス電位（該電位は一般に生体分子の補欠分子族の電位とバイオセンサーの電極電位との中間である）；電極との間で電子を高速で交換する能力（酵素または別の電気化学的に活性なレドックス複合体触媒の存在下に、電子を酵素に高速で移動させるか、酵素から電子を高速で受容して基質の電解酸化または電解還元の速度を促進する能力）。
【００２５】
（００２５）１つの好ましい実施形態において、遷移金属化合物は、構造：
【００２６】
【化３】
2008508268.tif 000004
【００２７】
を有する形式電荷＋３のカチオンを含む。
（００２６）本発明はさらに、上記式Ｉに一致する構造を有するレドックスメディエータとして機能し得る遷移金属化合物の製造法を提供する。この方法の１つの好ましい実施形態において、遷移金属化合物は、上記一般式ＩＩの前駆化合物を結合リガンドでリガンド交換することにより形成される。本明細書に記載の遷移金属化合物は、金属との安定な錯体形成を促進するとともにリガンド交換条件下に結合リガンドで置換可能であるフィラーリガンド（ｆｉｌｌｅｒ  ｌｉｇａｎｄ）Ｚを含む。好ましい結合リガンドは、金属への金属窒素配位結合をもたらす窒素部分を含む。１つの好ましい実施形態において、金属はオスミウム、Ｚは塩素、結合リガンドは３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００２８】
（００２７）別の実施形態において、遷移金属化合物は、電気化学タグの一部としてのレドックスメディエータとして用いられる。電気化学タグは、結合リガンドを介して遷移金属化合物をレドックス生体分子に結合させたときに得られる。種々の実施形態において、電気化学タグを形成するために遷移金属化合物をレドックス生体分子のアミノ酸に共有結合させる。遷移金属化合物は、レドックス生体分子の活性部位の補欠分子族に比較的近接したレドックス生体分子のアミノ酸残基に結合させるのが好ましい。１つの好ましい実施形態において、遷移金属化合物はグルコースオキシダーゼのアスパラギン酸およびグルタミン酸残基に結合される。コンピュータグラフィック分析から、少なくとも２つのグルタミン酸残基と８つのアスパラギン酸残基が、１６０キロダルトンのグルコースオキシダーゼホモダイマー内のＦＡＤ／ＦＡＤＨ補欠分子族のフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）Ｎ５原子から少なくとも１６オングストローム内にあることが示されている。
【００２９】
（００２８）１つの好ましい実施形態において、本発明は、一般式Ｉの遷移金属化合物であるレドックスメディエータと、レドックス生体分子、例えばオキシドレダクターゼとを含む電気化学タグを提供する。１つの特に好ましい実施形態において、遷移金属化合物の金属はオスミウムであり、結合リガンドは３−アミノプロピルイミダゾールである。１つの好ましい実施形態において、電気化学タグは、グルコースオキシダーゼに共有結合した式Ｉの遷移金属化合物であるレドックスメディエータを含む。
【００３０】
（００２９）さらなる実施形態において、本発明は、遷移金属化合物をレドックス生体分子に共有結合させて電気化学タグを形成する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、例えば、当業者には周知の１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いたカルボジイミドカップリングにより、遷移金属化合物をレドックス生体分子に結合させる。理論に拘泥するわけではないが、カルボジイミドは、カルボキシルまたはリン酸を活性化してＯ−尿素誘導体を形成することによりカルボン酸またはリン酸とアミンとのアミド結合形成を触媒する。この誘導体は求核試薬と容易に反応し得る。この試薬
は、アルコール基からのエーテル結合、酸とアルコールまたはフェノールからのエステル結合および酸とアミンからのペプチド結合の形成に用い得る。カルボジイミドは、水溶性誘導体ＥＤＣまたは有機溶解性誘導体Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）としてペプチド合成に用いられることが多い。ＮＨＳは、ＥＤＣ存在下のカルボジイミドカップリングの促進にしばしば用いられている。この反応は、活性エステル中間体（カルボン酸基とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの縮合産物）を形成し、さらにアミン官能基と反応して最終的にアミド結合を生成する反応を含み得る。
【００３１】
（００３０）本発明はさらに、種々の実施形態において、サンプル中のアナライトを電気化学的に測定するための電気化学タグの使用法を提供する。本発明の機構、機能または有用性を制限するものではないが、そのような方法は、本発明の電気化学タグからバイオセンサー電極への電子の高効率の移動を利用すると考えられる。本発明の方法は、広範なサンプル中の多様なアナライトの測定に適用し得る。
【００３２】
（００３１）非限定的例において、電気化学タグを含む電気化学的に活性なレドックス複合体は例えば電極などの固体担体の表面で形成され、電子の移動が検出される。１つの実施形態において、レドックス複合体は、電極表面上に固定されているかまたは電極表面に結合可能であるプローブに、アナライトが誘引されるかまたは結合することにより、電極表面で形成される。アナライトとプローブの結合は検出すべきアナライト（「標的」）によって異なる。例えば、アナライトが核酸の場合、適当なプローブは、アナライトの特定配列に相補的な一本鎖領域を含む核酸である。検出すべきアナライトは、指定どおりに、１本鎖でも２本鎖でもよく、あるいは２本鎖配列部分と１本鎖配列部分の両方を有するものでもよい核酸を含み得る。アナライトが２本鎖核酸のみを有する場合、アナライトを相補的プローブとハイブリダイズさせる前に、鎖の分離が必要なことは当然である。アナライトは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはハイブリッドでもよく、該核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合せ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの塩基の任意の組み合せを含む。検出すべきアナライトが抗原を含む場合、適当なプローブは、その抗原を特異的に認識する抗体である。あるいは、標的アナライトが抗体である場合、プローブは、その抗体によって認識される抗原を含み得る。アナライトとプローブとの結合は、１つの非限定的例として、ハイブリダイゼーション、アニーリング、２電荷間相互作用、疎水性相互作用、または共有結合によるものでよい。一般に、プローブは、オリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、抗原、抗体、リガンドまたは受容体を含み得る。
【００３３】
（００３２）電気化学タグとアナライトとの相互作用は、当業者には周知の多様な認識対を利用して達成される。非限定的例として、認識対はビオチンとアビジンとで構成される。認識対を利用するために、認識対の各メンバーをアナライトと電気化学タグに共有結合させる。認識対の２つのメンバーの特異的相互作用により、前記２種類の化学物質と共有結合した認識対とを含む複合体が形成される。
【００３４】
（００３３）このように、１つの実施形態において、電極表面に固定化されたプローブと、認識対の第１メンバーで標識されたアナライトと、認識対の第２メンバーで標識された電気化学タグとの相互作用により、電極表面に複合体が形成される。標識された構成要素は、レドックス生体分子の酸化基質と溶液中で混合され、該溶液が電極に接触して配置される。電極は、上述のレドックス生体分子に共有結合した金属化合物を介して酸化基質から電子を効率的に受容するのに適した電位で操作される。プローブとアナライトは、上述のように、互いに特異的に結合またはハイブリダイズする。プローブは電極表面に固定化されているので、アナライトがプローブにハイブリダイズすると電気化学タグが電極に
近接し、そこで電子移動が生じ得る。
【００３５】
（００３４）好ましい実施形態において、本発明の方法は遺伝子診断に用いられる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、多様ながんに関与する遺伝子であるｐ５３遺伝子などの標的アナライト配列を測定することができる。他の非限定的例としては、非腺腫性大腸がんの遺伝子、ＢＲＣＡ１乳がん遺伝子、患者の発症前簡易スクリーニングを容易にするアルツハイマー病のリスク増大を示すＡｐｏＥ４遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子の変異、または当技術分野では周知の他のものが挙げられる。
【００３６】
（００３５）１つの好ましい実施形態において、標的ｐ５３遺伝子の電流測定（アンペロメトリー）による直接検出は、遷移金属化合物に共有結合したアビジン‐グルコースオキシダーゼコンジュゲートを含む電気化学タグを用いて、ラット肝臓から抽出されたｍＲＮＡを利用して実施される。任意選択で、当技術分野では周知の技術を利用して、ｍＲＮＡをさらにｃＤＮＡに変換し、次いで、これをビオチン標識する。電気化学的に活性なレドックス複合体は電極表面で形成されるが、電極表面ではそれぞれ、プローブが電極に結合し、アナライトが核酸ハイブリダイゼーションを介してプローブに結合し、電気化学タグが、アビジンとビオチンの認識対の結合を介してアナライトに結合する。別途説明したように、当業者には当然のことであるが、これはビオチン／アビジン認識対の利用に限定されるものではなく、本発明に従って利用し得る多様な認識対が存在する。このように、電気化学タグは標的アナライトのハイブリダイゼーション後に電極表面に運ばれる。基質（この場合はグルコース）の存在下、レドックス生体分子（この場合はグルコースオキシダーゼ）を含む電気化学タグは基質の酸化を触媒し、レドックス生体分子骨格に結合した遷移金属化合物によって、電子が電極表面との間を行き来する。アナライトの測定または検出は、電気化学的に活性なレドックス複合体と電極との間の電子の移動を検出することによって決定される。往復する電子が電極で捕集されたときに電流が検出される。
【００３７】
（００３６）１つのさらなる実施形態において、検出すべきアナライトは、レドックス生体分子の酸化基質でもある。非限定的例において、電気化学タグのレドックス生体分子成分はグルコースオキシダーゼを含み、アナライトはグルコースである。酸化基質の存在は、電極における電子移動活性として検出され（電流または電圧の検出）、電気化学タグは、当技術分野では周知の技術を利用して電極表面に保持または形成される。非限定的例において、電極表面は認識対の第１メンバーで標識され、電気化学タグは第２メンバーで標識される。標識された構成要素は、溶液中で、レドックス生体分子の酸化基質でもある検出すべきアナライト（この場合は、例えばグルコース）を含むサンプルと混合することができる。認識対のメンバーが相互に結合すると、電気化学タグは電極近くに運ばれ、そこで電子の移動が生じ得る。グルコースオキシダーゼを含む電気化学タグはサンプル中に存在するグルコースの酸化を触媒し、電子はグルコースオキシダーゼ骨格に結合した遷移金属化合物によって電極表面との間を行き来する。グルコースの測定または検出は、電気化学タグと電極との間の電子の移動を検出することによって決定される。往復する電子が電極で捕集されたときに電流が検出される。
【００３８】
（００３７）１つの好ましい実施形態において、プローブは金電極に結合される。しかしながら、当技術分野では周知の多くの技術を用いてプローブを電極に固定し得ることは当業者が知るところである。例えば、プローブと電極との結合に認識対を用いることができる。これに関して、プローブを認識対の第１メンバーを含むように修飾し、電極表面を認識対の第２メンバーでコーティングすることができるが、この認識対は、アナライトと電気化学タグとの結合に用いた認識対とは異なるものである。さらなる実施例において、本発明のプローブは、薄膜酸化表面に共有結合させることができる。文献の手順を用いれば、本発明に用いる電極の表面にプローブを固定化するための多様な技術が利用可能であり、それらの技術は当業者には周知である。
【００３９】
（００３８）種々の他の実施形態において、本発明の複合体を用いてウイルスおよび細菌の検出を行い得る。このような実施形態においては、さまざまな細菌やウイルスから標的配列を検出するようにプローブが設計される。本明細書に開示する方法により、例えばＨＩＶ核酸配列を検出するための臨床サンプルの直接スクリーニングが可能になる。さらに、これによって、抗ウイルス療法の有効性についての改良評価法として、患者の体内を循環するウイルスの直接モニタリングが可能になる。同様に、白血病関連ウイルスであるＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−ＩＩもこの方法で検出し得る。例えば結核などの細菌感染も検出可能である。
【００４０】
（００３９）他の実施形態においては、例えば、水や食品サンプルのスクリーニングにおける毒性細菌用のプローブとして核酸が用いられる。例えば、細菌を溶菌して核酸を遊離させるようにサンプルを処理し、次いで、細菌の菌株、例えば、限定するものではないが、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌のエンテロトキシン株およびレジオネラ症細菌などの病原菌株を認識するようにプローブを設計し得る。同様に、本発明の組成物を用いてバイオレメディエーション法を評価し得る。
【００４１】
（００４０）他の実施形態において、本発明のプローブは、犯罪現場に残っているＤＮＡなどのアナライトと被害者や容疑者から採取したサンプルとを照合するＤＮＡフィンガープリント法が用いられる科学捜査に用いることが可能である。
【００４２】
（００４１）アナライト源としては、例えば、ヒト、動物、植物または環境が挙げられる。
（００４２）他の実施形態において、本発明はさらに、電気化学タグを含むキットに関する。該キットは、検出すべきアナライトを認識して結合し得る、本明細書に記載のプローブなどのプローブをさらに含み得る。
【００４３】
（００４３）種々の他の実施形態において、本発明はさらに、本明細書に記載の電気化学タグを利用するバイオセンサーに関する。このバイオセンサーは、１つ以上の電気化学タグが生成するシグナルの検出・測定に必要な構成要素を含む装置を備えるか、そのような構成要素を含むシステムで用い得る。装置は、電源および検出器と組み合されたバイオセンサーアレイを含む集積回路を具備し得る。そのような集積回路は当業者には周知である。バイオセンサーアレイを含むシステムは、さらに、作用電極に電位を印加した後で電気化学的シグナルを測定する手段を含み得る。電位の印加および電気化学的シグナルの測定は、プログラム化されたプロセッサを用いて達成し得る。検出すべきシグナルは、例えば、パルスアンペロメトリー、インターミッテントパルスアンペロメトリー、または微分パルスアンペロメトリーで測定し得る。あるいは、本発明のバイオセンサーは、単一の作用電極と、単一の参照電極を有していてもよい。アレイか単一作用電極かにかかわらず、バイオセンサーは、任意選択で１つ以上の対電極を有し得る。
【００４４】
（００４４）本明細書に記載の方法および装置は当業者には周知の実験技術を利用するが、これらの実験技術は、例えば、サムブルック、ジェイ．ら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、２００１年；スペクター、ディー．エル．ら（Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ）、「Ｃｅｌｌｓ；Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９８年；およびハーロー、イー．
（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．）、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９９年などの実験マニュアルで見られる。
【００４５】
（００４５）本明細書で用いる（例えば、［発明の背景］および［発明の要約］などの）表題は、本発明の開示内容の一般的なテーマ構成にすぎず、発明の開示または発明の態様を制限するものではない。具体的に言えば、［発明の背景］に開示する主題は、本発明の範囲内の技術の諸相を含んでいるが、従来技術をすべて列挙しているとは限らない。［発明の要約］で開示する主題は、本発明またはその実施形態の全範囲の包括的開示でも完全な開示でもない。
【００４６】
（００４６）本明細書における参照文献の引用は、これらの文献が、従来技術であることや、本明細書に開示する本発明の特許性に何らかの関連性があることを認めるものではない。本明細書に引用するすべての参照文献はそのまま本明細書に文献援用される。
【００４７】
（００４７）本発明の実施形態を示す、説明および特定の実施例は、単なる例示を目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。さらに、提示した特徴を有する多くの実施形態の列挙は、追加の特徴を有する他の実施形態、または提示した特徴の異なる組み合せを組み込んだ他の実施形態を排除するものではない。特定の実施例は、本発明の組成物および方法の、製造法、使用法および実施法を例示する目的で提供されており、別途特段の定めがない限り、本発明の所与の実施形態が作製または試験されたかどうかを示すものではない。
【００４８】
（００４８）本明細書において、用語「好ましい」（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」および「好ましくは（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」は、一定条件下に一定の利点をもたらす本発明の実施形態を示す。しかし、同一または他の条件下において他の実施形態が好ましいこともある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを暗示するものでもないし、本発明の範囲から他の実施形態を排除するものでもない。
【００４９】
（００４９）本明細書において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」およびその変形は、非限定的であることを意味し、したがって、リスト中の項目列挙は、本発明の材料、組成物、デバイスおよび方法に有用であり得る他の同様な項目を排除するものではない。
【００５０】
（００５０）以下の説明において、用語「測定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」または「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、アナライトの定性的および定量的な測定または検出を示すのに用いられる。例えば、以下に定義する方法およびシステムが液体媒質中のアナライトの測定または検出に用いられる場合、この用語は、媒質中のアナライトの存在および任意選択でその濃度の測定を示すものと定義される。
【００５１】
（００５１）本明細書で用い、さらに以下で用いる用語「アナライト（ａｎａｌｙｔｅ）」は、液体サンプル中で測定される物質を示すものと定義される。アナライトはレドックス生体分子の基質である場合もそうでない場合もある。
【００５２】
（００５２）本明細書で用い、さらに以下で用いられる用語「レドックス生体分子」は、例えば、基質または基質群の酸化または還元を触媒する酵素など本質的に電子移動の能力がある天然または修飾もしくは改変された生体分子を示すものと定義される。ある種のレドックス生体分子は、例えばフラビンまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）などの補欠分子族を利用する。補欠分子族は、レドックス生体分子に結合して該分子が酸化または還元を触媒するのを可能にする、レドックス生体分子の非タンパク質成分である。補欠分子族が存在しない最も単純なレドックス生体分子は、チオレドキシンに
おけるような２つのシステイン残基間の可逆的ジスルフィド結合形成を利用するものである。多くは、鉄または銅イオンの２つの異なるレドックス状態で存在する能力を利用する。
【００５３】
（００５３）本明細書で使用され、さらに以下で使用される用語「基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」または「酸化基質（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」は、レドックス生体分子の活性部位に結合して、酸化または還元などの反応を受ける分子を示すものと定義される。
【００５４】
（００５４）本明細書で使用され、さらに以下で使用される用語「レドックスメディエータ（ｒｅｄｏｘ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）」は、レドックス生体分子と電極との間の電子輸送に用いられる分子を示すものと定義される。
【００５５】
（００５５）本明細書で使用され、さらに以下で使用される用語「電気化学タグ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔａｇ）」は、レドックスメディエータに共有結合したレドックス生体分子を示すものと定義される。
【００５６】
（００５６）本明細書で使用され、さらに以下で使用される用語「電気化学的に活性なレドックス複合体（ｅｌｅｃｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｄｏｘ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、電気化学タグを含む、電極表面で形成された複合体を示すものと定義される。
【００５７】
（００５７）本明細書で使用され、さらに以下で使用される用語「バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）」は、酸化還元反応中に生じた電子の移動により生成されたシグナルの検出または測定（例えば、電流測定（アンペロメトリー）による検出）に必要な構成要素を含む装置またはシステムを示すものと定義される。用語「バイオセンサー」には、生物系が直接利用されない場合でも、基質濃度や、生物学的に興味深いその他のパラメータを測定するデバイスが含まれる。
【００５８】
［実施例］
（００５８）以下の実施例は本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５９】
（００５９）この実施例では、レドックスメディエータ、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌの合成を説明する。
（００６０）例えば、レイ、ピー．エイ．ら（Ｌａｙ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）、１９８６年、Ｉｎｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．、第２４巻：ｐ．２９１−２９６に提示されているような手順に従って、Ｋ２ＯｓＣｌ６（９９％、ステム・ケミカルズ社（Ｓｔｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））からＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２を合成する。Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌは以下のように合成する：蒸留したばかりのエチレングリコール６．０ｍｌにＯｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（０．１０ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、３−アミノプロピルイミダゾール（０．１２ｍｍｏｌ）を１度に加え、得られた混合物を９０〜１２０分還流させる。３−アミノプロピルイミダゾールは、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国ミズーリ州セントルイス所在）から購入した。リガンド交換反応の完了は、サイクリックボルタンメトリーでモニターする。次いで、紫色の反応混合物を急速攪拌エーテル２００ｍｌに徐々に注ぐ。沈殿物を、微細な焼結濾過器を介して吸引濾過して回収する。粗生成物をエーテルで洗い、３．０〜５．０ｍｌのエタノールに溶解し、再度エーテルから沈殿させる。さらに沈殿物をエタノールから結晶化して精製し、収率７５％で純粋生成物を得る。
【００６０】
（００６１）この生成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、金電極で０．１９ＶのＥ１／２の単一ペアの可逆的レドックス波を示す。完全なリガンド交換を確実にするためには、わずかに過剰な３−アミノプロピルイミダゾール（１０〜２０％）が必要である。
【００６１】
（００６２）リガンド交換反応の進行はサイクリックボルタンメトリーでモニターする。精製生成物を質量分析および電気化学により特性決定すると、
【００６２】
【化４】
2008508268.tif 000005
【００６３】
の構造と一致する。
【実施例２】
【００６４】
（００６３）この実施例では、レドックスメディエータとカップリングすることによる、レドックス生体分子、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）の修飾について説明する。
（００６４）グルコースオキシダーゼ−アビジンＤコンジュゲート（ＧＯｘ−Ａ）（固体１ｍｇあたり１３１単位）は、ベクター・ラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在）から購入した。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ、ＥＣ１．１．３．４、Ｘ−Ｓ型、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来、固体１ｍｇあたり２１３単位）は、シグマ・アルドリッチ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）から購入した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および透析キット（ＭＷＣＯ  １０，０００）は、ピアース社（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手した。
【００６５】
（００６５）カップリング剤としてＥＤＣ／ＮＨＳを用い、ＧＯｘカルボキシレートと、レドックスメディエータ（例えば、遷移金属化合物）上に存在する脂肪族第１級アミノ基とのアミド結合を形成することにより、ＧＯｘをＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌで共有結合的に修飾する。タンパク質の自己架橋を回避するために過剰量のレドックスメディエータを用いる。
【００６６】
（００６６）４．５ｍｌの、ＤＩ水中１．０ｍＭのＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌおよび１．０μＭのアビジン−グルコースオキシダーゼコンジュゲート（ＧＯｘ−Ａ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加えて、最終濃度が４．０ｍＭのＥＤＣおよび１．６ｍＭのスルホ−ＮＨＳを得る。混合物を室温下に２時間攪拌する。次いで、該溶液をＰＢＳ緩衝液に対し２４時間透析して精製する。対照実験では、カップリング剤を加えずに、同量のＧＯｘ−ＡをＯｓ錯体と混合する。
【実施例３】
【００６７】
（００６７）この実施例では、遷移金属化合物Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌを共有結合させて修飾したＧＯｘの電気化学タグが電気化学的に活性であることを示す。
【００６８】
（００６８）電気化学実験は、低電流モジュールを備えたシー・エイチ・インスツルメンツ６６０Ａ型電気化学ワークステーション（シー・エイチ・インスツルメンツ社（ＣＨ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）所在）を用いて実施する。この３電極システムは、直径２ｍｍの金の作用電極と、小型のＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極（サイプレス・システムズ社（Ｃｙｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カンザス州ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）所在）と、白金線の対電極とからなる。電位はＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を参照する。電気化学タグのサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）は、０．１９Ｖを中心とした１対の明確なボルタンメトリー電流ピークを示し、これは、電気化学的活性を示している。酵素が、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌとの単純な静電結合ではなく、確かに共有結合的に修飾されたことを証明するために、実施例２に従って、但し、ＥＤＣおよびＮＨＳカップリング剤の不在下に、対照実験を実施する。この対照実験により、透析後に、生物学的に活性ではあるが検出可能なメディエータを有していない酵素を得るが、これは、メディエータがＧＯｘに共有結合していないことを示している（図１の曲線ｂ）。
【実施例４】
【００６９】
（００６９）この実施例では、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌで修飾したＧＯｘのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを用いた特性解析について説明する。
【００７０】
（００７０）出発物質および修飾ＧＯｘのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを図２に示す。Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）ＣｌのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルはＯｓ（ｂｐｙ）２化合物のものと類似している。これは、リガンド内（ＩＬ）σ→σ＊（ｂｐｙ）遷移による紫外域内の濃いバンドと、スピン許容Ｏｓ（ｄπ）→ｂｐｙ（π＊）金属リガンド間電荷移動（ＭＬＣＴ）遷移による可視域（４００〜６００ｎｍ）内の広域バンドを示す。さらに、修飾ＧＯｘのスペクトルは、ＧＯｘとＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）錯体の両方に由来する吸収スペクトルの複合物である。Ｏｓ（ｂｐｙ）２Ｃｌ（３−アミノプロピルイミダゾール）とＧＯｘを単純に重ね合わせると、活性化ＧＯｘと類似したスペクトルが生じ、これは、活性化ＧＯｘの形成を裏付けている。
【実施例５】
【００７１】
（００７１）この実施例では、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌで修飾したＧＯｘの生物活性を、ＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを用いて説明する。
（００７２）酵素が共有結合修飾後にも生物学的に活性であるかどうかを測定するために、１滴の修飾酵素溶液をスクリーン印刷炭素電極に塗布する。５〜１０分吸着させた後、電極をＰＢＳ緩衝液で徹底的にすすぐ。ＰＢＳ中４０ｍＭのグルコース溶液の存在下に０．３Ｖで電流を計測して、触媒電流をモニターする。電気的に活性な固定化酵素の電流測定（アンペロメトリー）結果は、ＧＯｘがグルコースの酸化に対するその触媒活性を保持していることを示している（図３）。触媒電流は、最も溶けやすいメディエータ存在下での同濃度の天然ＧＯｘと同等またはそれ以上である。電流測定結果はさらに、ＧＯｘに共有結合したＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌが溶液にメディエータを追加する必要なしに酵素のＦＡＤ中心の直接還元を促進し得ることを証明している。同様に、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌで修飾したＧＯｘ−アビジンコンジュゲートは、活性化ＧＯｘと同様の電気化学特性を示す。
【実施例６】
【００７２】
（００７３）この実施例では、Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌで修飾したＧＯｘ−Ａの、核酸検出における電気化学タグとしての使用について説明する。
【００７３】
（００７４）核酸を電流測定により直接検出する際の電気化学タグとして、電気化学的に活性化されたＧＯｘ−Ａを用いる。図４は、ラット肝臓から抽出したｍＲＮＡ（２０ｐｇ／μｌ）（ｍＲＮＡはｃＤＮＡに変換され、次いでビオチン標識される）中のｐ５３遺伝子を検出するための典型的な電流測定曲線である。核酸の調製、捕捉プローブの固定化および計測は、基本的に、例えば、サイ、エイチ．ら（Ｘｉｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅｒｃｈ、第３２巻：ｅ１５に記載のとおりであった。相補的プローブを電極表面に固定化すると、酵素は、標的遺伝子のハイブリダイゼーション後に、ＧＯｘ−Ａのアビジン部分が標的のビオチン部分に結合するために、電極表面へと運ばれる。グルコースの存在下、酵素はグルコースの酸化を触媒する。次いで、ＧＯｘ−Ａ骨格に結合したＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌにより電子が電極表面との間を行き来し、電極によって捕集される。電極表面に非相補的な捕捉プローブを用いる対照実験では、標的ｐ５３遺伝子は捕捉プローブにハイブリダイズすることができないので、酵素は電極表面に結合できない。検出される微小電流は、主として酵素の非特異的結合による。表１は３回の重複試験の結果を示している。
【００７４】
【表１】
2008508268.tif 000006
【００７５】
（００７５）上記方法および組成物には、本発明教示の範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことが可能であるので、上記説明に含まれるすべての事項は例示であって、限定的に解釈してはならない。例示および実施例は、本発明の教示の所定の実施形態が実施されたかどうかを示すものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＰＢＳ緩衝液中の、スクリーン印刷炭素電極上に吸着したＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌ修飾グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）のサイクリックボルタンメトリーを示すデータの図。（ａ）はＥＤＣ／ＮＨＳカップリング剤の存在下、（ｂ）はＥＤＣ／ＮＨＳカップリング剤の不在下。走査速度：１００ｍＶ／秒。
【図２】（ａ）ＧＯｘ、（ｂ）Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌおよび（ｃ）Ｏｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌ修飾ＧＯｘのＵＶ−ｖｉｓスペクトルの図。
【図３】スクリーン印刷炭素電極上に吸着したＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌ修飾ＧＯｘの電流応答の図。（ａ）はＥＤＣ／ＮＨＳカップリング剤の存在下、（ｂ）はＥＤＣ／ＮＨＳカップリング剤の不在下。平衡電位：０．３０Ｖ、グルコース濃度：４０ｍＭ。
【図４】電気化学タグとしてＯｓ（ｂｐｙ）２（３−アミノプロピルイミダゾール）Ｃｌ修飾酵素を用いたＤＮＡアッセイ（ｍＲＮＡ中のｐ５３遺伝子、２０ｐｇ／μｌ）の電流応答の図。（ａ）ｐ５３遺伝子に相補的な捕捉プローブを使用、（ｂ）ｐ５３遺伝子に非相補的な捕捉プローブを使用。条件は図３に記載のものと同じである。
【図１】
2008508268.tif 000018
【図２】
2008508268.tif 000019
【図３】
2008508268.tif 000020
【図４】
2008508268.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月29日(2006.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008508268.tif 000022
の遷移金属化合物であって、上記式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、Ｍへの金属窒素配位結合をもたらす３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである、遷移金属化合物。
【請求項２】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｍがオスミウムである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｍがオスミウムである、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が、２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
式：
【化２】
2008508268.tif 000023
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
遷移金属化合物の製造法であって、
式：
【化３】
2008508268.tif 000024
（式中、Ｚ、Ｍ、Ｒ、Ｒ′、Ｘおよびｍは請求項１に定義の通りである）
の前駆化合物と、３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる結合リガンドとを接触させて、請求項１に記載の遷移金属化合物を形成するステップを含んでなる方法。
【請求項１２】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｍがオスミウムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｍがオスミウムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が、２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前駆化合物が、式：
【化４】
2008508268.tif 000025
（式中、ＲおよびＲ′は２，２′−ビピリジルであって窒素原子でＯｓに配位結合し、Ｚは塩素であり、ｍは＋３であり、Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）の化合物であり；結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールであり；遷移金属化合物が、式：
【化５】
2008508268.tif 000026
の化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
式：
【化６】
2008508268.tif 000027
の遷移金属化合物に結合したレドックス酵素を含んでなる電気化学タグであって、上記式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、Ｍへの金属窒素配位結合をもたらす３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである、電気化学タグ。
【請求項２２】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項２３】
Ｍがオスミウムである、請求項２２に記載の電気化学タグ。
【請求項２４】
レドックス酵素がオキシドレダクターセを含んでなる、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項２５】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項２４に記載の電気化学タグ。
【請求項２６】
Ｚが塩素または臭素である、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項２７】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項２８】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２７に記載の電気化学タグ。
【請求項２９】
Ｍがオスミウムである、請求項２８に記載の電気化学タグ。
【請求項３０】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項２７に記載の電気化学タグ。
【請求項３１】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項３０に記載の電気化学タグ。
【請求項３２】
Ｚが塩素または臭素である、請求項２７に記載の電気化学タグ。
【請求項３３】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項３４】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項３３に記載の電気化学タグ。
【請求項３５】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項３４に記載の電気化学タグ。
【請求項３６】
式：
【化７】
2008508268.tif 000028
の遷移金属化合物に結合したレドックス酵素を含んでなる、請求項２１に記載の電気化学タグ。
【請求項３７】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項３６に記載の電気化学タグ。
【請求項３８】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項３７に記載の電気化学タグ。
【請求項３９】
遷移金属化合物が結合リガンドを介してレドックス生体分子に結合している、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の電気化学タグ。
【請求項４０】
請求項２１に記載の電気化学タグの製造法であって、レドックス酵素を、式：
【化８】
2008508268.tif 000029
（式中、
Ｍは窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、Ｍへの金属窒素配位結合をもたらす３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）
の遷移金属化合物に結合させるステップを含んでなる方法。
【請求項４１】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｍがオスミウムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
レドックス酵素をアミド結合により遷移金属化合物に共有結合させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
Ｚが塩素または臭素である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
ＲおよびＲ′が、独立に、２，２′−ビピリジル、４，４′−メチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−エチル−２，２′−ビピリジル、４，４′−フェニル−２，２′−ビピリジル、５，５′−メチル−２，２′−ビピリジル、５，５′−エチル−２，２′−ビピリジルおよび５，５′−フェニル−２，２′−ビピリジルからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｍがオスミウムである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
レドックス酵素をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
Ｚが塩素または臭素である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
ＲおよびＲ′の少なくとも一方が２，２′−ビピリジルであり、Ｍがオスミウムであり、Ｚが塩素であり、結合リガンドが３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
レドックス酵素をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
レドックス酵素を、式：
【化９】
2008508268.tif 000030
の遷移金属化合物に結合させるステップを含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５９】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
レドックス酵素をアミド結合により遷移金属化合物に結合させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
サンプル中のアナライトの電気化学的検出法であって、
電極表面に、アナライトと電気化学タグとを含んでなる電気化学的に活性なレドックス複合体を形成するステップと、
電極で電子移動を検出するステップと
を含んでなり、電気化学タグが、式：
【化１０】
2008508268.tif 000031
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成し得る金属元素であり；
ＲおよびＲ′は、窒素原子でＭに配位結合した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ′は、独立に、２，２′−ビピリジル；Ｃ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された２，２′−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１−Ｃ４アルキル、フェニルおよび１つ以上のＣ１−Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から選択され；
Ｌは、Ｍへの金属窒素配位結合をもたらす３−アミノプロピルイミダゾールを含んでなる結合リガンドであり；
Ｚはハロゲン原子であり；
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり；
Ｘは、ｍと均衡するアニオンまたはアニオンの組み合せである）
の遷移金属化合物に結合したレドックス酵素を含んでなる、方法。
【請求項６３】
Ｍが、オスミウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステンおよびイリジウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｍがオスミウムである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
アナライトがレドックス酵素の酸化基質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
電極表面にプローブを固定化するステップと、
アナライトを認識対の第１メンバーで標識するステップと、
電気化学タグを認識対の第２メンバーで標識するステップと、
標識された構成要素とレドックス酵素の酸化基質とを、電極と接触している溶液中で混合するステップであって、プローブとアナライトは互いに特異的に結合またはハイブリダイズする、ステップと
をさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
認識対がビオチンとアビジンを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
アナライトが核酸を含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
電極表面を認識対の第１メンバーで標識するステップと、
電気化学タグを認識対の第２メンバーで標識するステップと、
標識された構成要素とレドックス酵素の酸化基質とを、電極と接触している溶液中で混合するステップであって、電気化学タグは電極表面に結合する、ステップと
をさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
認識対がビオチンとアビジンを含んでなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
アナライトがレドックス酵素の基質を含んでなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
遷移金属化合物が、構造：
【化１１】
2008508268.tif 000032
を有する＋３カチオンを含んでなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項７６】
レドックス酵素がオキシドレダクターゼを含んでなる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
オキシドレダクターゼがグルコースオキシダーゼを含んでなる、請求項７５に記載の方法。
【国際調査報告】
2008508268.tif 000033
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