(57)【要約】本発明は、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチド、そのポリヌクレオチド、及びその用途を開示する。より具体的には、本発明は、リグニン生合成に関与するシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチド、前記ポリヌクレオチドを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、このような組み換えベクターで形質転換された形質転換体、植物の生長を抑制する方法、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法、及び前記スクリーニング方法により得られた物質を含む植物の生長抑制用組成物を開示する。【選択図】図１
2008505609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドであって、正反応基質のコニファーアルデヒド、及び逆反応基質のコニフェリルアルコールに対する基質特異性を有すると共に、コニファーアルデヒドに対する基質親和度が、コニフェリルアルコールに対する基質親和度よりも高い、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチド。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に記載されたアミノ酸配列またはそれに類似した配列からなるシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドの発現またはその機能を抑制する段階を含む、植物の生長を抑制する方法。
【請求項４】
前記段階が、請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを植物体内に導入する段階を含むことを特徴とする、請求項３に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項５】
前記段階が、請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターを植物体内に導入する段階を含むことを特徴とする、請求項３に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項６】
前記段階が、請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・トゥメファシエンスを植物体内に導入する段階を含むことを特徴とする、請求項３に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項７】
前記段階が、遺伝子除去、遺伝子挿入、Ｔ−ＤＮＡ導入、相同的組み換え、トランスポゾン標識、及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれたいずれか一つの方式により行われることを特徴とする、請求項３に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項８】
配列番号２に記載されたアミノ酸配列またはそれに類似した配列からなるシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドの発現またはその機能を抑制する物質を検出する段階を含む、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によりスクリーニングされた物質を含む、植物の生長抑制用組成物。
【請求項１０】
前記物質が、請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチド、請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクター、及び請求項２に記載のポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・トゥメファシエンスからなる群より選ばれたことを特徴とする、請求項９に記載の植物の生長抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグニン生合成に関与するシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチド、そのポリヌクレオチド、及びそれらの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リグニンは、植物体の機械的支持を担当する成分であり、生物学的にみると、植物体になくてはならない成分である。リグニンはまた、病原菌の侵入と増殖に対する物理的障壁として機能することにより、植物体の疾病抵抗性を高める作用を持っている。
【０００３】
リグニンが担っている上記した役割のために、全ての植物体には、ヒトや動物には存在しないリグニン生合成過程が必須に存在している。
【０００４】
このようなリグニンの生合成過程は、一連の過程を経て進行するが、先ず、前駆物質であるＬ−フェニルアラニンが、フェニルアラニン・アンモニア・リアーゼ、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ、４−ヒドロキシシンナメート３−ヒドロキシラーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、フェルレート５−ヒドロキシラーゼ、ヒドロキシシンナメートＣｏＡ−リガーゼ等の酵素によって、クマル酸、フェルラ酸、シナピン酸を形成する過程である。この過程がフェニルプロパノイド経路であるが、これは、一般の経路であり、リグニン生合成に特異的な経路ではない。
【０００５】
次に、これらの酸が、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）により、桂皮アルデヒド、すなわち、コニファーアルデヒド、シナプアルデヒドに還元され、その桂皮アルデヒドが、シンナミルアルコール脱水素化酵素（ＣＡＤ）により、モノリグノールのシンナミルアルコール、すなわち、コニフェリルアルコール、ｐ−クマリルアルコール、シナピルアルコールに転換される過程である。この過程は、リグニン生合成に特異的な経路である。前記シンナミルアルコールは、最終的に過酸化酵素、ラッカーゼ等によりリグニンに合成されるようになる。
【０００６】
このようなリグニンの生合成過程のために、前記リグニン生合成の特異的経路に関与しているシンナミルアルコール脱水素化酵素の機能が阻害されると、リグニン生合成が阻害される可能性がある。これは、リグニンは、植物体において、生物学的にその重要性が大きいので、リグニン生合成の阻害が植物の生長阻害につながることを示唆することである。
【０００７】
本発明者らは、このように、シンナミルアルコール脱水素化酵素が、リグニン生合成の特異的経路に関与する酵素であるということに着目し、シンナミルアルコール脱水素化酵素の機能が阻害される場合、結局として、植物の生長阻害につながるという期待を持って、シロイヌナズナから前記酵素の機能を有する関連ポリペプチドとポリヌクレオチドを分離し、アンチセンス技術を用いて、そのポリペプチドの発現を阻害させてみたところ、シロイヌナズナの生長が阻害されることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、植物の生長を抑制する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記スクリーニング方法により得られた物質を含む植物の生長抑制用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のその他の目的や具体的な態様は、以下において提示される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、一側面において、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを提供する。
【００１５】
本発明者らは、以下の過程を経て、前記ポリペプチドの機能を確認した。先ず、シロイヌナズナのシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有する蛋白質を暗号化すると推定される遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ  １２１９４９）の塩基配列を基礎としてプライマーを作製し、シロイヌナズナから全長のｃＤＮＡを得た。次に、そのｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、転写読み取り枠（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）を分析したところ、前記ｃＤＮＡがコードするポリペプチドの分子量を推定することができ、その推定された分子量のポリペプチドが前記ｃＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで形質転換された大腸菌から得られることが確認された。さらには、このような大腸菌から得られたポリペプチドは、コニファーアルデヒドからコニフェニルアルコールへの転換過程に関与することが確認された。
【００１６】
したがって、本発明において、シンナミルアルコール脱水素化酵素は、三つのモノリグノールであるシンナミルアルコール、すなわち、コニフェリルアルコール、ｐ−クマリルアルコール、シナピルアルコールのうち、コニフェリルアルコールの生合成に関与する酵素であり、コニファーアルデヒドに対する基質特異性を有する酵素として定義されることが好ましい。より好ましくは、コニファーアルデヒド及び逆反応基質であるコニフェリルアルコールに対する基質特異性を有する酵素として定義され得る。より好ましくは、コニファーアルデヒドに対する基質親和度が、コニフェリルアルコールに対する基質親和度よりも高い酵素として定義され得る。
【００１７】
本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドは、下記のポリペプチドのいずれか一つである。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド。
【００１８】
上記、また請求の範囲を含めた以下において、「配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較すると、未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を保有するとみなすのに充分な程度の配列番号２のアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドと定義される。未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を保有すればよいので、前記ポリペプチドの長さ、またそのポリペプチドが有する活性の程度は問題とならない。すなわち、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて活性が低くても、未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を保有するポリペプチドであれば、その長さに拘わらず、前記「配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」に含まれるものである。通常の当業者であれば、すなわち、本出願当時を基準として公知された関連先行技術を平均的に熟知している者であれば、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて一部分が欠失しても、これらのポリペプチドは、未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有しているものと期待することである。このようなポリペプチドとして、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、Ｎ−末端部分またはＣ−末端部分が欠失したポリペプチドが挙げられる。これは、一般に、Ｎ−末端部分またはＣ−末端部分が欠失しても、そのポリペプチドは、本来のポリペプチドが有する機能を保有すると当業界に公知されているからである。もちろん、場合によっては、Ｎ−末端部分またはＣ−末端部分が、酵素の機能に必須なモチーフに関与することにより、Ｎ−末端部分またはＣ−末端部分が欠失したポリペプチドが、前記酵素の機能を示さないこともあり得るが、それにもかかわらず、そのような不活性のポリペプチドを活性のポリペプチドと区分して検出することは、当業者の通常の能力範囲内に属する。さらには、Ｎ−末端部分またはＣ−末端部分のみならず、その他の部分が欠失しても、本来のポリペプチドが有する機能を未だに有していることもある。ここでも、当業者であれば、その通常の能力範囲内において、このような欠失したポリペプチドが、未だに本来のポリペプチドが有する機能を有しているかを充分に確認することができる。特に、本明細書が、配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列を開示しており、さらには、配列番号１の塩基配列により暗号化され、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するかを明らかに確認した実施例を開示していることから、配列番号２のアミノ酸配列において一部の配列が欠失したポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する機能を未だに保有するかを、当業者は、彼の通常の能力範囲内で充分に確認することができたことが極めて自明となる。したがって、本発明における「配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」については、上記定義の通り、本明細書の開示内容に基づいて、当業者が、彼の通常の能力範囲内で製造可能なシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有する欠失した形態の全てのポリペプチドを含む意味として理解されるべきである。
【００１９】
また、上記、また請求の範囲を含めた以下において、「前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」とは、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する機能、すなわち、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を未だに保有するポリペプチドのことをいう。ここでも、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドがシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を未だに保有しておりさえすれば、このようなポリペプチドが有する活性の程度やアミノ酸が置換された程度は、問題とならない。換言すると、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて、その活性がいくら低くても、また多数の置換されたアミノ酸を含んでいるとしても、そのポリペプチドがシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を保有しておりさえすれば、本発明に含まれるものである。一つ以上のアミノ酸が置換されても、置換される前のアミノ酸が置換されたアミノ酸と化学的に等価であれば、その置換されたアミノ酸を含むポリペプチドは、未だに本来のポリペプチドの機能を保有しているものである。例えば、疎水性アミノ酸であるアラニンが、他の疎水性のアミノ酸、例えば、グリシン、または、より疎水性であるアミノ酸、例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンに置換されても、その置換されたアミノ酸（等）を有するポリペプチドは、活性は低くても、本来のポリペプチドが有する機能を未だに保有するものである。同様に、負に荷電されたアミノ酸、例えば、グルタミン酸が、他の負に荷電されたアミノ酸、例えば、アスパラギン酸に置換されても、その置換されたアミノ酸（等）を有するポリペプチドも、活性は低くても、本来のポリペプチドが有する機能を未だに保有するものであり、また、正に荷電されたアミノ酸、例えば、アルギニンが他の正に荷電されたアミノ酸、例えば、リシンに置換されても、その置換されたアミノ酸（等）を有するポリペプチドもまた、活性は低くても、本来のポリペプチドが有する機能を未だに保有するものである。また、ポリペプチドのＮ−末端部分またはＣ−末端部分において置換されたアミノ酸（等）を含むポリペプチドも、本来のポリペプチドが有する機能を未だに保有するものである。当業者であれば、前述したような一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有するシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を未だに保有するポリペプチドを製造することができる。また、当業者であれば、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドが、未だに上記した機能を有するかを確認することができる。さらに、本明細書が、配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列を開示しており、また、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有することを確認した実施例を開示しているので、本発明の「前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」は、当業者にとって容易に実施可能なものであることが明らかである。したがって、「前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」は、一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有する全てのポリペプチドを含む意味として理解されるべきである。
【００２０】
このように「前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」は、一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、未だにシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有する全てのポリペプチドを含む意味であるが、それにもかかわらず、活性の程度という観点からみると、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列との配列相同性が高いほど好ましい。前記ポリペプチドは、配列相同性の下限において、６０％以上の配列相同性を有することが好ましいのに対して、配列相同性の上限においては、当然、１００％の配列相同性を有することが好ましい。
【００２１】
より具体的に、前記配列相同性は、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び９９．６％の順に高くなるほど好ましい。ここで、９９．６％の配列相同性は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、一つのアミノ酸が置換された場合である。
【００２２】
また、本発明の「前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」は、「配列番号２のアミノ酸配列の全体を含むポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」のみならず、「配列番号２のアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」を含むので、前述した全ての説明は、「配列番号２のアミノ酸配列の全体を含むポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」についてのみならず、「配列番号２のアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドと実質的に類似したポリペプチド」についても適用される。
【００２３】
本発明は、他の側面において、前述したポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドに関するものである。ここで、「前述したポリペプチド」とは、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有すると共に、配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体を含むポリペプチド、配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、及び前記ポリペプチドと実質的に類似したポリペプチドを含むのみならず、前述した好適な態様の全てのポリペプチドを含む意味である。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有すると共に、配列番号２に記載されたアミノ酸配列の全体またはその実質的な部分を含むポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチド、及びこのポリペプチドと実質的に類似したポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドを含み、さらには、好適な態様として、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有すると共に、前述した配列相同性の順に、その配列相同性を有する全てのポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドを含む。アミノ酸配列が明らかになったとき、そのアミノ酸配列に基づき、そのアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを、当業者であれば、容易に製造することができる。
【００２４】
一方、前記「単離されたポリヌクレオチド」は、請求の範囲を含む以下において、化学的に合成されたポリヌクレオチド、生物体、特に、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）から分離されたポリヌクレオチド、及び変形されたヌクレオチドを含有したポリヌクレオチドを全て含み、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの重合体を全て含むものと定義する。したがって、前記「単離されたポリヌクレオチド」とは、ｃＤＮＡを含めてヌクレオチドを化学的に重合させたポリヌクレオチドのみならず、さらには、生物体、特に、シロイヌナズナから分離されるｇＤＮＡを含む。ここで、本明細書が開示している配列番号２のアミノ酸配列、これをコードする配列番号１の塩基配列、及び当業界に公知された技術に基づく限り、ｃＤＮＡを含めて前記化学的に合成されるポリヌクレオチドの製造及び前記ｇＤＮＡの分離は、当業者の通常の能力範囲内に属するものである。
【００２５】
本発明は、また他の側面において、前述したポリヌクレオチドに相補的に結合可能なアンチセンスヌクレオチドに関するものである。
【００２６】
前記アンチセンスヌクレオチドは、前述したポリヌクレオチドに相補的に結合し、転写（ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合）または翻訳（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合）を阻害可能な全てのポリ（またはオリゴ）ヌクレオチドを含む。このようなアンチセンスヌクレオチドは、前述したシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的に結合し、転写（ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合）または翻訳（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合）を阻害可能であれば、その長さやその相補的な配列相同性は、問題とならない。短い長さ、例えば、３０個ヌクレオチド程度のポリヌクレオチドとしても、その当該遺伝子（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）に対して１００％の相補的な配列相同性を有し、その他の条件、例えば、濃度やｐＨ等が適宜調節されれば、アンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。また、配列においても、その当該遺伝子と１００％の相補的な配列相同性を有していなくても、適当な大きさの長さを有すれば、同様に、アンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。したがって、アンチセンスヌクレオチドの長さ、相補的な配列相同性の程度に拘わらず、アンチセンスヌクレオチドとして作用することができれば、すなわち、当該遺伝子の転写または翻訳を阻害可能な能力があれば、いずれも、本発明のアンチセンスヌクレオチドに含まれるものとみなされるべきである。ここで、アンチセンスヌクレオチドとして必要な長さの決定、当該遺伝子と相補的な配列相同性の程度、また、そのアンチセンスヌクレオチドの製造方法については、本明細書が開示している配列番号１の塩基配列、配列番号２のアミノ酸配列、及び当業界に公知された技術に基づく限り、いずれも、当業者の通常の能力範囲内に属するものである。
【００２７】
一方、前記アンチセンスヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドが好ましい。ここで、「配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分」とは、前述した内容を考えると、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡまたはそれから転写されたＲＮＡと相補的に結合し、その転写または翻訳を妨害するのに充分な長さを含むものと理解され得る。
【００２８】
本発明は、また他の側面において、前述したポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、及びその組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関するものである。
【００２９】
後述する本発明の実施例では、配列番号１に記載された塩基配列からなるシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｐＣＡＬ−ｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に挿入して作製された組み換えベクターをｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈと命名し、そのｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターを大腸菌に形質転換させた後、前記ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを分離し、その分子量を確認した結果、配列番号１の塩基配列の転写読み取り枠（ＯＲＦ）から推定された分子量と同一であることを確認することができた。
【００３０】
このような本発明の好適な実施の態様を考えると、前記組み換えベクターは、ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈであることが好ましく、また、本発明の形質転換体は、前記組み換えベクターで形質転換された大腸菌であることが好ましい。
【００３１】
本発明は、また他の側面において、植物の生長を抑制する方法を提供する。具代的に、本発明の植物の生長を抑制する方法は、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに類似した配列からなるシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドの発現または機能を抑制する段階を含むことを特徴とする。
【００３２】
前述したが、シンナミルアルコール脱水素化酵素は、リグニンの生合成に特異的な反応を媒介する酵素である。また、リグニンは、植物にとって必須な成分である。したがって、シンナミルアルコール脱水素化酵素が発現されず、または、その機能が抑制されると、リグニンの生合成が阻害され、結局として、植物の生長の抑制となるものである。本発明の実施例に示すように、実際、配列番号１の塩基配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドをシロイヌナズナに形質転換させたとき、形質転換されたシロイヌナズナにおいて生長が遅滞する等の現象が発見された。したがって、本発明の植物の生長を抑制する方法は、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドの発現を抑制し、または、その機能を抑制することにより、可能となるものである。
【００３３】
一方、上記、また請求の範囲を含めた以下において、「配列番号２のアミノ酸配列と類似した配列からなるポリペプチド」とは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの同族体として、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有すると共に、植物体の種類による進化的経路の相違により、配列番号２のアミノ酸配列と異なる配列からなる全てのポリペプチドを含む意味である。したがって、前記本発明の植物の生長を抑制する方法において、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、たとえシロイヌナズナから分離されたものであっても、前記植物の範囲には、シロイヌナズナのみならず、その他の全ての植物が含まれるものと理解されるべきである。ただし、ここで、配列番号２のアミノ酸配列と類似した配列からなるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と配列相同性が高いほど好ましく、最も好ましくは、当然、１００％の配列相同性を有するときである。一方、配列相同性の下限においては、前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の配列相同性を有する場合が好ましい。より具体的には、前記配列相同性が、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、及び９９．６％の順に高くなるほど好ましい。
【００３４】
一方、上記において、ポリペプチドの発現抑制は、当業界に公知の方法で充分可能である。すなわち、アンチセンスヌクレオチド導入、遺伝子除去、遺伝子挿入、Ｔ−ＤＮＡ導入、相同的組み換え、または、トランスポゾン標識、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等の方法が用いられる。
【００３５】
後述する本発明の実施例では、アンチセンスヌクレオチドを植物体内に導入する方法を用いているが、具体的には、先ず、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドを製造した後、それを含む組み換えベクター（ｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＣＡＤ−Ｈベクター）を作製し、その組み換えベクターをアグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に形質転換させた後、この形質転換体をシロイヌナズナに形質転換させる過程を経た。この形質転換されたシロイヌナズナに種子を育種した結果、いずれも、生長が顕著に低化する現象が確認された（下記実施例４参照）。
【００３６】
したがって、本発明の植物の生長を抑制する方法において、前記段階は、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドを、当該植物体内に導入する段階を含むことが好ましく、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体を植物体内に導入する段階を含むことがより好ましく、特に、前記形質転換体は、前記組み換えベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・トゥメファシエンスであることがさらに好ましい。ここで、「配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分」とは、前記本発明のアンチセンスヌクレオチドと関連して説明したものと同様である。
【００３７】
一般に、アンチセンスヌクレオチドは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）内の標的ヌクレオチド配列と結合し、前記核酸の機能または合成を抑制する役割をすると知られている。すなわち、ある特定の遺伝子に相応するアンチセンスヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両者にハイブリダイズする能力を有することにより、転写または翻訳過程において特定の遺伝子の発現を阻害するものである。
【００３８】
したがって、配列番号２のアミノ酸配列またはそれに類似したアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現抑制やその機能抑制を通じて、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能が阻害されると、結果として、リグニンの生合成が阻害され、植物の生長が抑制され得る。
【００３９】
本発明の植物の生長を抑制する方法は、植物にのみ存在するリグニンの生合成過程を阻害させる機序を用いるということから、リグニン生合成過程が存在しないヒトや動物には、特に害を与えない方法となり得る。
【００４０】
本発明は、また他の側面において、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法に関するものである。前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列及びそれに類似した配列からなるシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドの発現またはその機能を抑制する物質を検出する段階を含むことを特徴とする。
【００４１】
上記、また請求の範囲を含めた以下において、配列番号２のアミノ酸配列と類似した配列からなるポリペプチドとは、前記本発明の植物の生長を抑制する方法において説明したことがそのまま適用され、前記ポリペプチドの発現を抑制する物質としては、既述したようなシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスヌクレオチドが挙げられる。
【００４２】
一方、前記ポリペプチドの発現を抑制する物質は、本発明の植物の生長を抑制する方法と関連して前述した理由から、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドであることが好ましく、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体であることがより好ましく、特に、前記組み換えベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・トゥメファシエンスであることがさらに好ましい。ここでも、「配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分」とは、前記本発明のアンチセンスヌクレオチドと関連して説明したものと同様である。
【００４３】
本発明のまた他の目的は、前記スクリーニング方法により得られた物質を含む植物の生長抑制用組成物に関するものである。
【００４４】
このような植物の生長抑制用組成物は、ヒト及び動物に害を与えないと共に、植物の生長を抑制する効果を有するものと期待される。これは、本発明の植物の生長抑制用組成物がヒトに無害であり、環境親和的な除草剤として用いられ得ることを示唆することである。
【００４５】
一方、上記において前記スクリーニング方法によって得られた物質としては、前述したようなアンチセンスヌクレオチドであることが好ましく、特に、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドであることが好ましい。また、前記物質は、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体であることがより好ましく、さらに、その形質転換体は、前記組み換えベクトルで形質転換されたアグロバクテリウム・トゥメファシエンスであることが好ましい。ここでも、「配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分」とは、前記本発明のアンチセンスヌクレオチドと関連して説明したようである。
【発明の効果】
【００４６】
本発明によれば、シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチド、そのポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、このような組み換えベクターで形質転換された形質転換体、植物の生長を抑制する方法、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法、及び前記スクリーニング方法により得られた物質を含む植物の生長抑制用組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下、本発明を実施例を参照して説明する。しかしながら、これらの実施例が本発明の範囲を制限するものではない。
【００４８】
＜実施例１＞シロイヌナズナからシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子の分離
【００４９】
シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子をシロイヌナズナから分離するためのスクリーニングを行った。
【００５０】
＜１−１＞シロイヌナズナの栽培及び培養
シロイヌナズナは、土壌を入れた植木鉢で栽培し、または、２％スクロース（ｐＨ５．７）と０．８％寒天が含まれたＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ ｓａｌｔｓ，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）培地を入れたペトリ皿で栽培した。植木鉢で栽培するときは、２２℃の温度で１６／８時間、明暗周期で調節される栽培箱中で栽培した。
【００５１】
＜１−２＞ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡライブラリーの製造
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーを作るために、数個の分化段階のシロイヌナズナの葉からＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出し、抽出された全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ分離キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）のプロトコールに従って、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分離した。プライマーとしてＮｏｔＩ−（ｄＴ）18を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとｃＤＮＡ合成キット（Ｔｉｍｅ Ｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）で二本鎖のｃＤＮＡを製造した。
【００５２】
＜１−３＞シンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子の分離
シロイヌナズナのシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有する蛋白質を暗号化すると推定される蛋白質（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ  １２１９４９）の塩基配列を基礎として、配列番号３と表示され、制限酵素ＢｇｍＨＩの配列が含まれた正方向プライマーと、配列番号４と表示され、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの配列が含まれた逆方向プライマーを合成した。前記両プライマーを用いて、前記実施例１−２において製造されたシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて、全長ｃＤＮＡを増幅し分離した。
【００５３】
前記分離されたｃＤＮＡの分析の結果、約３５．６ｋＤａの分子量を有し、３２６個のアミノ酸を暗号化する９８１ｂｐサイズの転写読み取り枠（ＯＲＦ）を有しており、６個のエクソンと５個のイントロンで構成されていることが確認され、これをＡｔＣＡＤ−Ｈ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｉｎｎａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｖｄｒｏｇｅｎａｓｅ−Ｈ）と命名した。前記遺伝子が暗号化するＡｔＣＡＤ−Ｈ蛋白質の等電点は７．１５であった（以下、遺伝子は、イタリック体を用いて「ＡｔＣＡＤ−Ｈ」または「ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子」とし、蛋白質は、「ＡｔＣＡＤ−Ｈ」または「ＡｔＣＡＤ−Ｈ蛋白質」とする）。
【００５４】
＜実施例２＞大腸菌においてＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子から発現される蛋白質の精製
【００５５】
＜２−１＞蛋白質の発現誘導
前記実施例１−３において分離したＡｔＣＡＤ−Ｈ ｃＤＮＡ全長部位を含む増幅されたＤＮＡ断片をＢｇｍＨＩ制限酵素とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断し、ｐＣＡＬ−ｎベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ制限酵素とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位にクローニングし、ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターを作製した。ここで、前記ｐＣＡＬ−ｎベクターは、カルモデュリン結合ペプチド標識配列を含んでいるので、前記ベクターから発現される蛋白質は、カルモデュリンレジンにより容易に分離されるという利点がある。
【００５６】
前記ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターを大腸菌に形質変換させて増幅した後、これを大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に形質転換させた。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｂｒｏｔｈ，ＵＳＢ，ＵＳＡ）培地において、Ｏ．Ｄ．600値が０．７となるまで、３７℃で１５０ｒｐｍで撹拌培養した。目標蛋白質の大腸菌細胞内発現を誘導するために、前記懸濁液にＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を最終濃度１ｍＭとなるように加えた後、２時間さらに培養した。培養された細胞を５０ｍＭ ＭｇＳＯ4と０．４Ｍ ＮａＣｌが溶存された５０ｍＭ−リン酸カリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）で洗浄した後、さらに、４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、沈殿物を集めて−２０℃で保管した。
【００５７】
＜２−２＞蛋白質の精製
前記実施例２−１で得た細胞沈殿物をＣａＣｌ2結合バッファ（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，１．０ｍＭ ｍａｇｎｅｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ，１．０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，２ｍＭ ＣａＣｌ2）に懸濁した。前記細胞懸濁液にリゾチームを最終の濃度が２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、１５分間回転させた後、３０秒間超音波粉砕を行った。粉砕された試料を５分間氷で冷却させ、このような過程（超音波粉砕後、冷却）を３回繰り返して行った。前記試料を１０，０００ｘｇで５分間遠心分離し、上澄み液を集めてカルモデュリンアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。すなわち、平衡化したカルモデュリンアフィニティーレジンに前記上澄み液（粗抽出物）を適用し、４℃で２４時間の間反応させた。レジンに付着しない蛋白質及び他の物質を除去するために、ＣａＣｌ2結合バッファでカラムを洗浄し、カルモデュリンが結合された蛋白質を溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いて、カラムマトリクスから分離した。対照群としては、ｐＣＡＬ−ｎベクターで形質転換された大腸菌の粗抽出物から分離された蛋白質を用いた。
【００５８】
前記蛋白質の精製を確認するために、ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターで形質転換された大腸菌懸濁液と、これから分離された大腸菌溶出液のクロマト分画の１番目の分画から１３番目の分画を対象としてＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析を行った。その結果、図１に示すように、ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターで形質転換された大腸菌から分離した分画の４番目の分画から９番目の分画において、蛋白質の量が最も高く示されたことが認められ、ｐＣＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターで形質転換された大腸菌から分離した溶出液が、３９．６ｋＤａサイズの融合蛋白質（ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子から発現される蛋白質の分子量３５．６ｋＤａ＋カルモデュリン結合ペプチドの分子量４ｋＤａ）を含んでいることが確認された。これに対して、対照群大腸菌の溶出液では、前記サイズの蛋白質を含んでいないことが確認された（データは示されていない）。
【００５９】
一方、図１において、Ｍは、マーカーを示し、矢印（←）は、３９．６ｋＤａサイズの融合蛋白質を示すためのものである。また、レーンＳは、ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子が含まれた組み換えベクターで形質転換された大腸菌から得られた上澄み液に対するものであり、レーンＰは、ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子が含まれた組み換えベクターで形質転換された大腸菌から得られた不溶性蛋白質に対するものであり、レーンＢは、カルモデュリンアフィニティークロマトグラフィーにおいて、溶出緩衝液で溶出する直前の状態の分画に対するものである。また、レーン１乃至１３は、それぞれＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子が含まれた組み換えベクターで形質転換された大腸菌溶出液の１乃至１３番目の分画に対するものである。
【００６０】
＜実施例３＞蛋白質の酵素活性度の分析
前記分離された蛋白質が、リグニン生合成に関与するシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有しているかを確認するために、コニファーアルデヒドを基質として、酵素活性度を測定し、本酵素が可逆反応に対しても機能を有しているかを確認するために、コニフェリルアルコールを基質として、逆反応に対する酵素活性度を測定した。
【００６１】
前記蛋白質の酵素活性度は、３７℃に調節されるマイクロプレートリーダ（Ｂｉｏｒａｄ Ｂｅｎｃｈｍａｋ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、４０５ｎｍでミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔａ，２０８：３１−４７，１９９９）等の方法により測定した。酵素の正反応活性測定のための反応液２００ｍｌには、１００ｍＭトリス緩衝液溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．３）、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨ、前記実施例２−２において精製された蛋白質２〜３μｇが含まれており、酵素の逆反応活性測定のための反応液２００ｍｌには、１００ｍＭ ＮＡＤＰＨを除き、１００ｍＭ ＮＡＤＰ+を含ませ、その他の条件は正反応と同じである。正反応の場合、基質濃度別のコニファーアルデヒドを、また逆反応の場合、基質濃度別のコニフェリルアルコールを、それぞれ反応溶液に添加して酵素活性を測定した。酵素活性測定のための対照群としては、前記精製された蛋白質を除いた他の成分が含有されたウエルを用いた。
【００６２】
前記精製された蛋白質の酵素活性度は、基質１００ｍＭコニファーアルデヒドに対するミカエリス−メンテン型反応速度論に適合しており、基質のそれぞれの温度変化に応じた反応速度を測定し、ラインウィーバー−バークプロットで示した結果（図２ａ参照）、Ｋm値及びＶmax値が１．９８×１０-5Ｍ及び０．２３８で表われた。このような結果は、ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子から発現される蛋白質が桂皮アルデヒドのうちコニファーアルデヒドに対する基質特異性を有するシンナミルアルコール脱水素化酵素であることを示した。
【００６３】
また、前記精製された蛋白質の酵素活性度は、逆反応基質１００ｍＭコニフェリルアルコールに対しても、ミカエリス−メンテン型反応速度論に適合しており、気質のそれぞれの濃度変化に応じた反応速度を測定し、ラインウィーバー−バークプロットで示した結果（図２ｂ参照）、Ｋm値及びＶmax値がそれぞれ３．７×１０-4Ｍ及び０．１０２で表われた。このような結果は、正反応における基質親和度が逆反応のそれよりも高いことを意味し、このような事実は、ＡｔＣＡＤ−Ｈ蛋白質がリグニン生合成において、シンナミルアルコールの適正濃度の維持のための自己調節能力を有するという可能性を提示し、したがって、本蛋白質がリグニン生合成において極めて重要な役割を担っていると逆説することができる。一方、本蛋白質の最適ｐＨの研究に際して、正反応と逆反応における最適ｐＨの範囲には大きな差がなかった（データは示されていない）。このような事実は、本蛋白質の正・逆反応の基質に対する作用が、生体内ｐＨの変化に対して、大きな影響を受けないということを示唆する。
【００６４】
＜実施例４＞ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子に対するアンチセンス構成体が導入された形質転換シロイヌナズナの製造及び特性分析
【００６５】
＜４−１＞ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子に対するアンチセンス構成体が導入された形質転換シロイヌナズナの製造
前記実施例２−２において精製した蛋白質の生理学的特性を確認するために、ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子がアンチセンス方向に導入された形質転換シロイヌナズナを製造し、ＡｔＣＡＤ−Ｈ転写体の発現を抑制した。
【００６６】
配列番号５と表示され、制限酵素ＢｇｌＩＩの配列が含まれた正方向プライマー、及び配列番号６と表示され、制限酵素ＸｂａＩの配列が含まれた逆方向プライマーを用いて、シロイヌナズナのｃＤＮＡからＰＣＲを用いて、ＡｔＣＡＤ−Ｈ ｃＤＮＡをアンチセンス方向に増幅した。前記ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切断し、発芽時期に植物体の致死を避けるために、ストレスまたは老化関連遺伝子であるｓｅｎ１プロモータの調節を受けるように作製したｐＳＥＮベクターにクローニングし、ＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子に対するアンチセンス構成体であるｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターを作製した。上記において、ｓｅｎ１プロモータは、植物の生長段階により発現される遺伝子に対して特異性を有する。
【００６７】
一方、図３にｐＳＥＮベクターとｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターの構成が示されている。図３ａに示すものはｐＳＥＮベクターの構成であり、図３ｂに示すものはｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターの構成である。図３におけるＢＡＲは、バスタ除草剤に対する抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）を指し、ＲＢは右縁、ＬＢは左縁、Ｐ３５ＳはＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡのプロモータ、３５Ｓ ｐｏｌｙ ＡはＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ａ，ＰＳＥＮはｓｅｎ１プロモータ、Ｎｏｓ ｐｏｌｙ Ａはノパリンシンターゼ遺伝子のｐｏｌｙ Ａを指す。
【００６８】
前記ｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＣＡＤ−Ｈ組み換えベクターをアグロバクテリウム・トゥメファシエンスにエレクトロポレーション法を用いて導入させた。形質転換されたアグロバクテリウム培養液を２８℃でＯ．Ｄ．600値が１．０となるまで培養し、２５℃で５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞を得た。得られた細胞を最終のＯ．Ｄ．600値が２．０となるまで、ＩＭ（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ；１Ｘ ＭＳ ＳＡＬＴＳ，１Ｘ Ｂ５ ｖｉｔａｍｉｎ，５％ｓｕｃｒｏｓｅ，０．００５％ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７，Ｌｅｈｌｅ Ｓｅｅｄ，ＵＳＡ）培地に懸濁した。４週令シロイヌナズナを真空室にあるアグロバクテリウム懸濁液に浸漬させ、１０分間１０4Ｐａの真空下に放置した。浸漬後、シロイヌナズナを２４時間の間ポリエチレン袋に入れた。以降、形質転換されたシロイヌナズナを続けて生長させて種子（Ｔ１）を収穫した。対照群としては、形質転換されなかった野生のシロイヌナズナ、及びアンチセンスＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子が含まれていないベクター（ｐＳＥＮベクター）のみで形質転換されたシロイヌナズナを用いた。
【００６９】
＜４−２＞Ｔ１形質転換シロイヌナズナの特性分析
前記実施例４−１におけるように、形質転換したシロイヌナズナから収穫した種子は、０．１％バスタ（Ｂａｓｔａ）除草剤（耕農、韓国）溶液に３０分間浸漬させて培養することにより、選別した。形質転換されたシロイヌナズナは、対照群（ｐＳＥＮベクターで形質転換されたシロイヌナズナ）と比較すると、アンチセンス方向にＡｔＣＡＤ−Ｈ遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナの種子から育った苗木であるＡｔｃａｄ−Ｈ１は、深刻に生長が遅滞し、濃緑色に着色現象が生じ（図４ａ参照）、Ａｔｃａｄ−Ｈ６は、上述したように、深刻に生長が遅滞し、しかも、葉の形態的変化（枯れ現象）が引き起こされた（図４ｂ参照）。このように、表現型変化において、両ラインに若干の差があることは、本遺伝子に対する変異体のアンチセンス効果の差によるものである。以降、このような形質転換シロイヌナズナは、開花及び種子の生産において、致命的な損傷を被った。また、本研究者らは、本遺伝子の遺伝子サイレンシングが発生したＴ−ＤＮＡ標識、ノックアウト突然変異体でも、このような表現型の変化を観察することができた（データは示されていない）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが含まれた組み換えベクターで形質転換された大腸菌溶出液の各分画に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析結果を示すものである。
【図２ａ】基質であるコニファーアルデヒドに対する精製された蛋白質の基質特異酵素活性度を測定するために、基質の濃度変化に応じた反応速度を測定し、ラインウィーバー−バークプロットで示したものである。
【図２ｂ】逆反応に対する基質であるコニフェリルアルコールに対する精製された蛋白質の基質特異酵素活性度を測定するために、基質の濃度変化に応じた反応速度を測定し、ラインウィーバー−バークプロットで示したものである。
【図３ａ】本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入されるベクターの構造（模式図）を示すものである。
【図３ｂ】本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入されたベクターの構造（模式図）を示すものである。
【図４ａ】本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入された形質転換シロイヌナズナの種子から育った幼苗であるＡｔｃａｄ−Ｈ１の写真である。
【図４ｂ】本発明のシンナミルアルコール脱水素化酵素機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入された形質転換シロイヌナズナの種子から育った幼苗であるＡｔｃａｄ−Ｈ６の写真である。
【図１】
2008505609.tif 000003
【図２ａ】
2008505609.tif 000004
【図３Ａ】
2008505609.tif 000005
【図３Ｂ】
2008505609.tif 000006
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2008505609.tif 000008
【図２ｂ】
2008505609.tif 000009
【配列表】
2008505609000001.app
【国際調査報告】
2008505609.tif 000010
2008505609.tif 000011