(57)【要約】  マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を参照溶液と並行して流れている試料溶液内でおこる生体分子結合イベント及び／または動力学を検出するために用いられるセンサを自己参照するためのシステム及び方法が説明される。
2008521005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロメートルサイズ深さフローチャネルに付帯するセンサを自己参照するための方法において、前記方法が、
前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を互いに並行して流れる試料溶液及び参照溶液内に検知領域を有する前記センサに光ビームを向ける工程、
前記センサから出力光応答を受け取る工程、
前記出力光ビームを検出及び分析して、前記センサの前記検知領域の検出領域内を流れている前記試料溶液に関係付けられる検出信号を決定し、かつ前記センサの前記検知領域の参照領域内を流れている前記参照溶液に関係付けられる参照信号を決定する工程、及び
前記検出信号から前記参照信号を差し引いて補正検出信号を生成する工程、
を有してなり、
環境条件及び呼掛けシステムのコンポーネントによって生成される雑音による前記検出信号の不確定性が前記補正検出信号において低められていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記補正検出信号が前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を流れている前記試料溶液内で生体分子結合イベントがおこったか否かを示すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記センサが回折格子結合導波路センサまたは表面プラズモン共鳴センサであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネルが前記試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができ、コンピュータが前記出力光ビームを分析して前記試料溶液内の前記複数の濃度勾配に対応する複数の検出信号を決定できることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
システムにおいて、
センサ、
試料溶液及び参照溶液が前記センサの検知領域内を互いに並行して流れるマイクロメートルサイズ深さフローチャネル、
前記センサに入力光ビームを向け、前記センサから出力光ビームを受け取るための、出力像を表す電気信号に前記光ビームを変換するためのカメラを有する、呼掛けシステム、
前記センサの前記検知領域の検出領域内を流れている前記試料溶液に関係付けられる検出信号を決定するため及び前記センサの前記検知領域の参照領域内を流れている前記参照溶液に関係付けられる参照信号を決定するために前記出力像を分析するための、前記検出信号から前記参照信号を差し引いて補正検出信号を生成する、コンピュータ、
を備え、
環境条件による前記検出信号の不確定性が前記補正検出信号において低められていることを特徴とするシステム。
【請求項６】
前記補正検出信号が前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を流れている前記試料溶液内で生体分子結合イベントがおこったか否かを示すことを特徴とする請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記センサが回折格子結合導波路センサまたは表面プラズモン共鳴センサであることを特徴とする請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネルが前記試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができ、前記コンピュータが前記出力光ビームを分析して前記試料溶液内の前記複数の濃度勾配に対応する複数の検出信号を決定できることを特徴とする請求項５に記載のシステム。
【請求項９】
呼掛けシステムにおいて、
マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を互いに並行して流れる試料溶液及び参照溶液内に検知領域を有するセンサに光ビームを向ける工程、
前記センサから出力光ビームを受け取る工程、
を実施することができ、
前記出力光ビームが検出／分析されて、前記センサの前記検知領域の検出領域内を流れている前記試料溶液に関係付けられる検出信号を決定し、かつ前記センサの前記検知領域の参照領域内を流れている前記参照溶液に関係付けられる参照信号を決定し、
前記参照信号が前記検出信号から差し引かれて補正検出信号が生成され、
前記補正検出信号が前記マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を流れている前記試料溶液内で生体分子結合イベントがおこったか否かを示す、
ことを特徴とする呼掛けシステム。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスにおいて、
試料溶液及び参照溶液がセンサの検知領域内を互いに並行して流れる、呼掛けシステムが入力光ビームを前記センサに向け、出力光ビームを前記センサから受け取るような、マイクロメートルサイズ深さフローチャネル、
を備え、
前記出力光ビームがコンピュータまたは検出器システムによって分析されて、前記センサの前記検知領域の検出領域内を流れている前記試料溶液に関係付けられる検出信号及び前記センサの前記検知領域の参照領域内を流れている前記参照溶液に関係付けられる参照信号が決定される、
ことを特徴とするマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月１８日に出願された、名称を「マイクロメートルサイズ深さフローチャンバ内のセンサを自己参照するためのシステム及び方法（System and Method For Self-Referencing A sensor In A Micron-Sized Deep Flow Chamber）」とする、米国特許出願第１０/９９３５６５号の恩典を主張する。この特許出願の明細書は本明細書に参照として含まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は全般的には、マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を参照溶液と並行して流れている試料溶液内で生体分子結合イベントがおこったか否かを検出するために用いられるセンサを自己参照するためのシステム及び方法に関する。一実施形態において、センサ及びマイクロメートルサイズ深さフローチャネルはマイクロプレートの壁体内に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、導波路回折格子ベース表面センシング及び表面散乱またはバルク散乱などの光検出技術に基づくセンサの性能は一般に、センサ及び光学系の設計及び特性により、また環境変動により、影響を受ける。温度変化、機械的振動及び（とりわけ）光源ドリフトを含む環境変動への不要な感受性は、センサの性能に影響する最も一般的な問題である。スエーデン国ウプサラ（Uppsala）のBiacore ABによって製造販売されるＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｓ５１のような既存の計測器は、センサの性能への温度変動の影響を最小限に抑えるに役立つ温度制御機能を備えている。しかし、そのようなタイプの計測器は高価であり、温度制御だけで全ての環境要因を補正することはできない。
【０００４】
他に、自己参照法及び／またはいかなる環境変動も参照除去され得るように参照領域及び検出領域に対する共通環境を与えることによる環境変動の影響の軽減が試みられている計測器もある。３つのそのような計測器がマルムクィヴィスト（Malmqvist）等の特許文献１及び２、及びルース（Roos）等の特許文献３に説明されている。マルムクィヴィスト等は、離散検知領域の選択的増感が可能になり、離散検知領域の試料流体フローとの選択的接触が与えられるように、フローセル内の検知面にかかる流体フローを制御するための方法及びデバイスを開示している。また、ルース等は、流体の相対流量を制御することによってフローセルの縦方向における流体間の界面の位置を調節するための方法を開示している。
【０００５】
これらの計測器の一欠点は、それぞれの表面センサがフローセルの全幅をカバーすることはなく、この結果、いくつかの実施形態においてはフローセルの全幅をカバーするために１つより多くの表面センサが必要になることである。したがって、いかなる環境変動または非特性的生体分子結合も参照除去するためには、１つは参照のため、１つは検出のための、少なくとも２つの表面センサがフローセル内に必要である。１つより多くの空間的に離して置かれたセンサを用いることにより、付加されたセンサの数だけ検出に必要な光学系が多くなる。この結果、センサをどれだけ互いに近接させて配置できるか、及びフローセル内で用いることができるセンサの数について物理的限界があり得る。また、センサが異なればセンサが受ける環境変動も異なり得るし、特性及び性能も異なり得る。これらの差異の全てが足し合されて不確定性が高まり、したがって生体分子結合イベントの検出の確度に悪影響が及ぼされ得る。
【０００６】
これらの計測器の別の欠点は、複数の層流間の動的干渉に依存し、したがってそれぞれの参照手法の重要要素として流体インターフェースの移動を用いることである。試料流体及び参照流体のいずれもがフローセル内にあるが、２つの流体の間の界面は試料流体フローを排他的にセンサ上に配するように調節され、次いで流体界面はさらに、参照流体を同じ検知領域上に配し、よって参照信号を与えるように（流量等により）修正される。この方法では試料流体及び参照流体のいずれについても単一の検知領域が有効に利用されるが、流体界面の移動は、層流の崩壊を生じさせ、流れの混合を促進し、よって信号を劣化させ得る。さらに、流体界面の正確な移動には、流体チャネルの寸法、流量等にわたる完璧な制御が必要である。さらに、流体界面の移動により、試料信号及び参照信号は同時に測定されず、これは自己参照法の確度を低下させることになろう。
【特許文献１】米国特許第６２００８１４Ｂ１号明細書
【特許文献２】欧州特許第１０２１７０３Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３/００２２３８８Ａ１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、従来の計測器の上述した欠点及びその他の欠点に対処する、センサを自己参照するためのシステム及び方法が必要とされている。この要求及びその他の要求は本発明のシステム及び方法によって満たされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を参照溶液と並行して流れている試料溶液内でおこった生体分子結合イベントを検出するために用いられるセンサを自己参照するためのシステム及び方法を含む。一実施形態において、本システムは、マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を互いに並行して流れる試料溶液及び参照溶液内に検知領域を有するセンサに入力光ビームを向ける呼掛けシステムを備える。呼掛けシステムはセンサから出力光ビームを受け取る、システムは、出力光ビームを分析し、センサの検知領域の検出領域内を流れている試料溶液に関係付けられる検出信号を決定するため及びセンサの検知領域の参照領域内を流れている参照溶液に関係付けられる参照信号を決定するための、コンピュータまたはその他の電気ハードウエアも備える。コンピュータ（または等価な電気回路）は次いで、マイクロメートルサイズ深さフローチャネル内を流れている試料溶液内で生体分子結合イベントがおこったか否かを示す補正検出信号を生成するために、検出信号から参照信号を差し引く。このようにすれば、システムは、センサを自己参照し、環境条件による検出信号の不確定性を低めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
添付図面とともになされる以下の詳細な説明を参照することによって、本発明のさらに完全な理解を得ることができる。
【００１０】
図１〜３を参照すれば、マイクロ流体デバイス１０１内またはその下に配置されるセンサ１０２（例えば、回折格子結合導波路センサ１０２，表面プラズモン共鳴センサ１０２）を自己参照するためのシステム１００及び方法２００の好ましい実施形態のいくつかの図が示されている。センサ１０２は、マイクロ流体デバイス１０１のマイクロメートルサイズ深さフローチャネル１０１内で参照溶液１０６の隣を流れている試料溶液１０４内で生体分子結合イベントがおこったか否かを検出するために用いられる。詳しくは、センサ１０２は、センサ１０２の検知領域１１６上を試料溶液１０４及び参照溶液１０６が互いに並行して流れるマイクロメートルサイズ深さフローチャネル１０８内またはその下に配置される（図１内の拡大図を見よ）。図１内の拡大図に見られるように、例示的マイクロ流体デバイス１０１は、センサ１０２の検知領域１１６に重ねられる共通マイクロメートルサイズ深さフローチャネル１０８を共有する複数のフローチャネル１０７ａ，１０７ｂ，１０７ｃ及び１０７ｄを有する。マイクロ流体デバイス１０１は２つの流入口１０９ａ及び１０９ｂ並びに２つの流出口１１１ａ及び１１１ｂも有する（マイクロ流体デバイス１０１には流出口１１１ａまたは１１１ｂを１つだけとすることも可能である）。図示されるように、２つの流体１０４及び１０６は２つの流入口１０９ａ及び１０９ｂを開くことによって同時にフローチャネル１０８に流入させることができる。また、いかなる与えられた時点においても、１つの流体１０４または１０６だけが共通フローチャネル１０８を流過できるように１つの流入口１０９ａまたは１０９ｂを閉じることができる。
【００１１】
システム１００は、センサ１０２に光ビーム１１２を向け（工程２０２）、センサ１０２から光ビーム１１４を受け取る（工程２０４）、呼掛けシステム１１０を備える。システム１００は、光ビーム１１４にともなう情報を分析／分波し（工程２０６）、センサ１０２の検知領域１１６の検出領域１１６ａ内を流れている試料溶液１０４に関係付けられる検出信号１２０（図３Ａを見よ）を生成する、コンピュータ／プロセッサ（または等価な電気ハードウエア）１１８をさらに備える。コンピュータ（または電気ハードウエア）１１８は、光ビーム１１４にともなう情報の分析／分波（工程２０６）、及びセンサ１０２の検知領域１１６の検出領域１１６ｂ内を流れている参照溶液１０６に関係付けられる参照信号１２２（図３Ａを見よ）の生成も行う。コンピュータ（または電気ハードウエア）１１８は次いで、検出信号１２０から参照信号１２２を差し引いて（工程２０８）、補正検出信号１２４（図３Ｂを見よ）を生成する。補正検出信号１２４は、試料溶液１０４内で生体分子結合イベントがおこったか否かを有効に示すと同時に、望ましくない環境の効果を軽減する。
【００１２】
システム１００及び方法２００は同時検出／参照に対して１つのセンサ１０２しか必要とせず、これにより、光学系の複雑さが軽減され、計測器、必要なセンサの数が低減されるという点で、従来技術に優る顕著な改善である。上述したように、本発明においては検出のために用いられるセンサと同一のセンサ１０２から参照信号１２２が生成される。さらに、従来技術と異なり、試料流体１０４と参照流体１０６の間の流体界面を一定に保つことができ、移動流体界面システムに本質的な、乱流混合、ヒステリシス及び再現性の問題を防止することができる。さらに、試料信号及び参照信号は同時に測定されるから、いかなる急激な短時間の環境変動も参照除去でき、自己参照法２００はさらに正確かつ頑健になり得る。また、試料溶液１０４及び参照溶液１０６はマイクロメートルサイズ深さフローチャネル１０８内を互いに隣り合って流れるから、両者は同じ環境変動を受け、参照信号１２２及び検出信号１２０も同じ環境変動を受ける。参照信号１２２を検出信号１２０から差し引いて補正検出信号１２４を生成することによってシステム１００による望ましくない環境効果の軽減を可能にするのはこの事実である。
【００１３】
２つの流体１０４及び１０６の流れがマイクロメートルサイズ深チャネル１０８内を並行して流れている場合、２つの流体１０４及び１０６を混合する手段は分子拡散によるしかないから、これらの全て可能である。チャネル１０８の長さ及び高さのスケールが小さいことから、２つの流体１０４及び１０６の間の乱流及び剪断層不安定性により渦拡散率が生じるいかなる可能性も排除される。このマイクロメートル高さ流体チャネル内では、薬物探索研究に一般に用いられる２つの流体１０４及び１０６の分子エンティティの質量拡散率は、２つの流体１０４及び１０６の熱拡散率より数桁以上小さい。これにより、チャネル１０８内の熱拡散長及び質量拡散長のスケールは全く異なることになる。質量拡散率が小さいことから、２つの流れ１０４及び１０６は、２つの流体１０４及び１０６は接触している時間長に応じて成長する、非常に薄い拡散層によって十分に隔てられる。拡散界面の大きさは式：
【数１】
2008521005.tif 000003
【００１４】
を用いて得ることができ、ここでＤは質量拡散係数、ｔは時間である（ｔ＝Ｌ/Ｕ，ここでＬは流入口からの検知領域の距離であり、Ｕは平均流速である）。Ｄの値が小さい（例えば、分子が小さい、フルオレセインブオチン及びタンパク質のウシ血清アルブミンについてのＤはそれぞれ、３.４×１０−６ｃｍ２ｓ−１及び６.５×１０−７ｃｍ２ｓ−１である）ことにより、流れ１０４及び１０６のそれぞれの化学的／組成的完全性が中心近くの非常に薄い層内を除いて維持されることが保証される。他方で、熱境界層は：
【数２】
2008521005.tif 000004
【００１５】
にしたがって成長するから、熱拡散率の値が大きいことによってチャネル１０８内の横方向温度分布は一様であることが保証される。ここでαは熱拡散率である（例えば，水についてはα＝１.４×１０−３ｃｍ２ｓ−１）。熱と質量の全く異なる混合長スケールを活用することにより、自己参照システム１００及び方法２００は１つのセンサ１０２を用いて検知領域１１６における生体分子間の相互作用を調べることができる。このタイプの自己参照は、センサ１０２が有する、角度、位置、温度、光源波長、計装の熱膨張における動揺に対する、また試料溶液１０４内の生体分子の非特性的結合にさえも対する、感度を有効に低減または除去する。
【００１６】
センサ１０２に呼び掛けるために一般に用いられる呼掛けシステム１１０は、光ビーム１１２が検知表面で反射されるときに角成分または波長成分が検体の存在によって変えられるような、適切なスペクトル成分または角成分を有する光ビーム１１２を利用する。これには、測定される量が入力ビームからの一組の角または波長の吸収であって共鳴反射ではない、表面プラズモン共鳴の使用の可能性が含まれる。呼掛けシステム１１０は多くの形態をとることができ、２つの一般的な実施形態が本明細書に説明される。一実施形態において、呼掛けシステム１１０は、単一波長−高角成分光ビーム１１２をセンサ１０２に送り、出力ビーム１１４はセンサ１０２からの何らかの角応答情報を保持する。このタイプの呼掛けシステム１１０は、出力ビーム１１４内の優勢角の位置を突き止めるために角検出が用いられるから、一般に角度呼掛けシステム１１０ａと称される（図４〜６を見よ）。呼掛けシステム１１０の別の実施形態は複数の波長（帯）を含むコリメータされた光ビーム１１２のセンサ１０２への送出を含み、出力ビーム１１４がセンサ１０２の波長応答に関する何らかの情報を与える。このタイプの呼掛けシステム１１０は、波長空間における共鳴の位置を突き止めるために出力ビーム１１４のスペクトルが分析されるから、一般にスペクトル呼掛けシステム１１０ｂと称される（図７〜８を見よ）。
【００１７】
角度呼掛けシステム１１０ａ（図４）とスペクトル呼掛けシステム１１０ｂ（図７）の間の違いは、エバネッセント場タイプの多くのセンサについては角と波長の間の関係が線形であるから、ある程度明白である。この理由のため、２つの手法の間の主要な違いは出力ビームの波長スペクトルを測定するスペクトル検出における余分な工程に関係する。これは、２つのシステムに対する検出システムが、検出器／カメラの前面にある波長弁別素子を除いて、理論的に同等であり得ることを意味する。
【００１８】
計測器システムにおけるより大きな違いは送光形態の選択に基づく。入力／出力光は、（例えば図４の角システムに示される）自由空間または（図７のスペクトルシステムにおける光ファイバで例示される）光導波路を介して、センサに／センサから送ることができる。角実施形態またはスペクトル実施形態は、（入力ビーム及び出力ビームの）多くの様々な組合せにおいて、自由空間送光手法または導波路送光手法で実施することができる。入力光の自由空間送光と導波路送光の間の違いは、補正検出信号１２４を生成するためにはコンピュータ１１８が受け取った光ビーム１１４を異なる手法で分析／分波する必要があるから、本発明に関して重要になる。角度呼掛けシステム１１０ａにともなう自由空間送光において、センサ１０２の応答方向に沿う出力ビーム１１４は検知領域１１６から生じる遠視野応答である。検知領域の幅にかけて入力ビーム１１２で適切に走査またはサンプリングし、それぞれの検知領域の像を検出器上に結像させることによって、センサ１０２の幅にわたる出力応答プロファイル１１４を検出システムにおいて解像し、コンピュータ１１８によって分析することができる。この態様においては、センサ１０２上の任意のフローゾーンを同時に、かつ互いに独立に測定し、次いで比較または照合することができる。スペクトル呼掛けシステム１１０ｂの導波路送光の場合、空間情報は一般にファイバ内の伝搬中に失われ、よって、光ビーム１１４を分波してセンサ１０２上の異なるフローゾーンを弁別するためには異なる処理手法が必要である。これらの手法はいずれも以下で図４〜８を参照してさらに詳細に論じられる。
【００１９】
図４を参照すれば、例示的角度呼掛けシステム１１０ａを利用する、図１に示されるシステム１００の第１の実施形態がブロック図で示されている。例示的角度呼掛けシステム１１０ａは、偏光子４０４（例えば４５°偏光子４０４）、円筒対物レンズ４０６（例えばｆ〜１０ｃｍ円筒対物レンズ４０６）及びピックオフミラーまたはビームスプリッタ４０８を通過してからセンサ１０２及びマイクロ流体デバイス１０１に到達する光ビーム１１２ａを放射するレーザ４０２を備える。センサ１０２における照明は、照明光がセンサの幅にかけて広がる線を形成するように、アナモルフィックになされる（すなわち、入射ビーム１１２ａはセンサ応答方向に沿って集束され、直交方向には集束されない）。センサ１０２は、ピックオフミラーまたはビームスプリッタ４０８によって偏向され、偏光子４０４に対して９０°に配向された分析器（偏光子）４１０を通過してからＣＣＤカメラ４１２に到達する、センサ１０２の幅にわたる光応答１１４ａを放射する。あるいは、検出素子として光検出器４１４（例えば、センサ１０２の検出領域及び参照領域のそれぞれについて１つの、検出器対）でカメラ４１２を置き換えることができる。光検出器４１４は、共鳴の位置を示すことができる電圧を出力するから、ＣＣＤカメラ４１２より効率が高くなり、データはＣＣＤカメラ４１２からのデータより分析が容易であり得る。対照的に、ＣＣＤカメラ４１２は測定された応答を決定するためにさらに分析されなければならない像を出力する。
【００２０】
図示されるように、レーザ／光源４０２はセンサ１０２と相互作用する多くの角を有する光ビーム１１２ａを放射する。センサ１０２は、センサ領域１１６の遠視野応答像を生成する、光ビーム１１４ａをＣＣＤカメラ４１２に放射することによって応答する。明るいストリークは、例えば、センサ１０２の幅全体からの共鳴応答角を示す（図５Ａ及び５Ｂの写真を見よ）。写真において、水平方向はセンサ１０２の幅全体から反射された応答１１２ａの大きさを表し、この応答幅はセンサ１０２の空間的広がりによって制限される。したがって、垂直方向は角応答軸を表し、水平方向はセンサの幅にわたって生じる応答の位置を表す。縦方向における明るい帯の移動は共鳴応答の変化を表し、水平軸に沿う像の差は２つの異なるフロー１０４及び１０６を利用するときに期待されるような、異なるセンサ領域の応答を示す。生体分子結合イベントがあったか否かを示すために用いられるのはこの垂直方向の共鳴応答変化である。図４に示されるシステム１００は明解さのために１つのセンサ１０２とインターフェースする１本の光ビームだけを有するとして示されていることは認識されるべきである。もちろん、システム１００は、複数のセンサ１０２に複数の光ビームを放射し、複数のセンサ１０２から複数の光ビームを受け取ることを可能にするハードウエア（例えば、光学系４０４，４０６，４１０及び多重化光検出器４１４）を有することができる。
【００２１】
本発明の能力を実証するための実験において、発明者等は、幅が４ｍｍで深さが２００μｍのフローチャネル１０８をもつ「Ｈ字形」フローチャンバ、３ｍｍ×３ｍｍ導波路回折格子表面センサ１０２及び図４に示されるシステムに類似の角度呼掛けシステム１１０ａを用いた。このセンサ１０２は共鳴応答の角位置またはスペクトル最大値の変化による回折格子近傍の表面における屈折率変化に応答した。センサ１０２の応答像は、コンピュータ１１８によって参照領域１１６ａ及び検出領域１１６ｂを含む２つの領域に分割された（図６Ａを見よ）。コンピュータ１１８は次いで像を分析して２つの独立な角応答プロット６０６及び６０８を生成した（図６Ｂを見よ）。一方の応答プロット６０６はフローチャネル１０８の検出側半分１１６ａに関係付けられ、他方の応答プロット６０８はフローチャネル１０８の参照側半分１１６ｂに関係付けられる。センサ１０２の検知領域上の１つの流れ（図３Ａのマイクロ流体デバイス１０１の中央部を見よ）内で低屈折率バッファ溶液（例えば水）と並行して高屈折率試料溶液１０４（例えば０.５％グリセロール）を流すことによって、照合が可能になった。溶液１０４及び１０６のいずれもが混合することなく同じセンサ１０２にかけて流れたから、単一のセンサ１０２がそれぞれのフロー流に対する応答を独立に与えた。試料溶液１０４及び参照（バッファ）溶液１１６は流体フロー１０２と１０４の間に物理的な分離無しに同じセンサ１０２の上を流れたから、センサ１０２の２つの検知領域１１６ａ及び１１６ｂはそれぞれ、試料流体１０４及び参照流体１０２に対する応答を示した（図３Ａの検出信号１２０及び参照信号１２２を見よ）。流体フロー１０４と１０６は物理的に接していたから、それぞれのフローの温度及び圧力はほぼ同じであり、データは同じ光ビーム１１４及び単一の物理センサ１０２から生じたから、角度、機械的雑音、レーザ雑音等もほぼ同じである。補正検出信号１２４に関係付けられる差分トレースは優れた平坦性及び応答を示した（図３Ｂを見よ）。
【００２２】
図７を参照すれば、例示的スペクトル呼掛けシステム１１０ｂを利用する、図１に示されるシステム１００の第２の実施形態がブロック図で示されている。例示的スペクトル呼掛けシステム１１０ｂは、レンズ７０４，光ファイバ７０６及びコリメータ７０８を通過してからセンサ１０２に単一角で到達してセンサ１０２と相互作用する、光ビーム１１２ｂを放射する広帯域光源７０２を備える。センサ１０２は、光ファイバ７１０（回収ファイバ７１０）への入力であり、レンズ７１２を通過して分光写真器７１４に入る光ビーム１１４ｂを放射する。光ビーム１１４ｂは共鳴位置に対応するスペクトルピークをもつ。
【００２３】
上述したように、センサ１０２に関する空間情報はスペクトル呼掛けシステム１１０ｂ内の導波路伝搬中に失われるから、光ビーム１１４ｂ内の流体フロー１０４及び１０６からの応答を分波するためには別の手段が用いられなければならない。１つの解決策は、流体フロー１０４及び１０６の数に対応して同じ導波路送光／受光系７０２，７０４，７０６，７０８，７１０及び７１２を配置することであり、本例では、２つのファイバ投光／受光系７０２，７０４，７０６，７０８，７１０及び７１２がセンサ１０２の上を流れる２つの流体１０４及び１０６の下に並べて配置されることになろう。この実施形態では当然複雑さもコストも高くなり、導波路の機械系及び光学系がセンサ１０２の下に物理的に適合し、正確に位置合せされなければならない。別の解決策には、それぞれのフロー１０４及び１０６からの測定が望まれる場合に、単一の光ファイバ投光／受光系７０２，７０４，７０６，７０８，７１０及び７１２を精確に一方のフロー領域１１６ａから他方のフロー領域１１６ｂに機械的に移動または振動させることを含めることができよう。それぞれのセンサ領域１１６ａ及び１１６ｂの適切な弁別により、また別の実施形態が可能になり得るであろう。例えば、フローチャネル１０８内の流体１０４及び１０６がかなり異なっているか、あるいはそれぞれの個別フローにより異なる表面化学特性が与えられれば、結果として共鳴応答にスペクトル分離を生じさせるような導波路の差により、それぞれの共鳴信号に相互に十分に大きなシフトが生じ得る。言い換えれば、空間情報の必要は２つのフロー領域１１６ａ及び１１６ｂの大きな（明確であることが必須な）スペクトル分離によって無効にされる。この状況が、広帯域光源スペクトル内に２つの連立ピーク９０２及び９０４を見ることができる、図８に示されるグラフに簡略に示される。これらのピークは２つの異なるフロー領域１１６ａ及び１１６ｂに対応することができ、ピーク９０２及び９０４のそれぞれのトラッキングは所望の検出信号１２０及び参照信号１２２を表す。これらの状況のいずれにおいても、コンピュータ１１８は参照信号１２２を検出信号１２０から差し引き、補正検出信号１２４を生成する。ここでも、補正検出信号１２４は試料溶液１０４内で生体分子結合イベントがおこったか否かを有効に示し、望ましくない環境効果を軽減する。
【００２４】
図９Ａ〜９Ｃを参照すれば、呼掛けシステム１１０（図示せず）及びコンピュータ１１８（図示せず）とインターフェースする複数のマイクロ流体デバイス１０１及びセンサ１０２が組み込まれた、例示的９６-Ｈウエルプレート９００の上面図、底面図及び側断面図がそれぞれ示されている。図９Ａに示される９６-Ｈウエルプレート９００の上面図からわかるように、それぞれの「ウエル」は２つの流入口９０２及び２つの流出口９０４を含む４つの孔を有する。また、図９Ｂに示される底面図においては、それぞれの「ウエル」について（２つが流入口９０２で２つが流出口９０４の）４つの孔をもつ、Ｈ字形（Ｈの高さはマイクロメートル寸法である）の「ウエル」しか見ることができない。最後に、図９Ｃに示される側面図においては、流入口９０２，流出口９０４，センサ１０２及びマイクロメートルサイズ深さ「Ｈ」字形チャネル９０６を見ることができる。
【００２５】
９６-Ｈウエルプレート９００に呼びかけるために用いられる場合、呼掛けシステム１１０は、それぞれのデバイス１０１のそれぞれのセンサ１０２に光ビーム１１２を放射し、それぞれのデバイス１０１のそれぞれのセンサ１０２から光ビーム１１４を受け取るように設計される。このようにすれば、複数のセンサ１０２に同時に呼びかけることができる。例えば、ＣＣＤカメラ４１２または多重化光検出器システム４１４がセンサアレイ１０２から複数の光ビーム１１４を受け取ることができる。多重化検出器システム４１４が用いられる場合、個々の検出器に入射することによって複数のビームが分波される。先に説明したように、それぞれの光検出器（例えば、センサの検出領域及び参照領域のそれぞれについて１つの、検出器対）が次いで個々のセンサの異なる領域からの検出信号１２０と参照信号１２２を分波することができる。ＣＣＤカメラ４１２が用いられる場合には、コンピュータ／プロセッサ１１８がセンサアレイからの複数の光ビーム１１４を分析／分波し、一方から他方が差し引かれて補正検出信号１２４が決定される、検出信号１２０及び参照信号１２２を生成するためにそれぞれの光ビーム１１４の分析／分波も行う。それぞれの補正検出信号１２４は対応するデバイス１０１内におかれた試料溶液１０４内で生体分子結合イベントがおこったか否かを有効に示す。図１０Ａ及び１０Ｂは、システム１００及び図９Ａ〜９Ｃに示される９６−Ｈウエルプレート９００の能力を実証するために実施された実験中に得られた、検出信号１２０，参照信号１２２及び補正検出信号１２４を示す、２つの時間推移グラフである。この実験の実施中に得られた、２つの流体１０４及び１０６の区分化を示す２枚の写真が示されている、図５Ａ及び５Ｂも見よ。
【００２６】
図１１を参照すれば、システム１００の第３の実施形態に関連するいくつかの図が示されている。この実施形態において、呼掛けシステム１１０は光ビーム１１２をセンサ１０２に出力して光応答１１４をセンサ１０２から受取り、光応答１１４は次いでコンピュータ１１８によってフローチャンバ１１０２内の試料流体１０４及び参照流体１０６のそれぞれの濃度に対応する独立の信号に分割される。詳しくは、マイクロ流体デバイス１１００がマイクロメートルサイズ深さフローチャンバ１１０２内を流れる試料溶液１０４内に複数の濃度勾配を生成し、コンピュータ１１８が出力光ビーム１１４を分析して試料溶液１０４内の複数の濃度勾配に対応する複数の補正検出信号１２４を決定する。図示されるように、並列フローチャンバをもつマイクロメートルサイズ深さフローチャンバ１１０２は、センサ１０２の検知領域１１６と一致するようにつくられる。この実施形態の利点は、勾配分析のための並列測定を行うために単一のセンサ１０２を使用できることである。また、この実施形態の別の利点は、１つの実験を実施することによって、様々な濃度の試料流体１０４を同時に生成し、測定に使用できることである。試料を分析して平衡解離定数（例えばＳｋａｔｃｈａｒｄプロット）を決定するためにこの構成を用いることもできよう。この構成は、試料流体を分析して生体分子結合動力学を測定するために用いることもできよう。システム１００のこの実施形態は、物理的に分離されたセンサ、複数の流体取扱コンポーネント及び／または別々に作成された濃度を用いて、順次にまたは平行して多くの実験を実施する必要がある従来の方法に優る顕著な改善である。
【００２７】
マイクロ流体デバイスに入れられた試料に濃度勾配を生成するための様々な方法が既に開示されていることに注意すべきである。方法のいくつかは、その内容が本明細書に参照として含まれる、以下の文献に開示されている：
・  名称を「マイクロ流体システムにおける材料のその場濃縮及び／または希釈のための方法及び装置（Methods and Apparatus for In Situ Concentration and/or Dilution of Materials in Microfluidic Systems）」とする、米国特許第５８６９００４号明細書；
・  エス・ケイ・ダブリュー・ダーティンジャー（S. K. W. Dertinger）等，「マイクロ流体網を用いる複雑な形状を有する勾配の生成（Generation of Gradients having Complex Shapes using Microfluidic Networks）」，Anal. Chem.，２００１年，第７３巻，ｐ.１２４０〜１２４６；
・  名称を「勾配生成のための方法及び装置（Method and Apparatus for Gradient Generation）」とする、米国特許出願公開第２００２／０１１３０９Ａ１号明細書；
マイクロ流体デバイス内に入れられた試料に濃度勾配を生成するためのこれらの方法のいずれも、本発明のこの実施形態において実施することができる。
【００２８】
図１２Ａ〜１２Ｃはシステム１００の第４の実施形態のいくつかの図を示す。この実施形態において、呼掛けシステム１１０は光ビーム１１２をセンサ１０２に出力して光応答１１４をセンサ１０２全体から受取り、光応答１１４は次いでコンピュータ１１８によってフローチャンバ１２０２内の試料流体１０４及び参照流体１０６のそれぞれの濃度に対応する独立の信号に分割される。詳しくは、マイクロ流体デバイス／混合器１２００はマイクロメートルサイズ深さフローチャネル１２０２内を流れる試料溶液１０４内に複数の濃度勾配を生成する。また、コンピュータ１１８は出力光ビーム１１４を分析して試料溶液１０４内の複数の濃度勾配に相当する複数の補正検出信号１２４を決定する。
【００２９】
図１２Ａ〜１２Ｃは、本発明の一実施形態によって表面センサ１０２を用いる多重検出がどのようにして可能になるかを示す、一連の図である。実証実験において、水１０６及び０.５％グリセロール溶液１０４の２つの入り流体試料を混合器１２０４によって３つ，４つ及び５つの流れに順次に分割した。それぞれの流れはグリセロール溶液１０４の様々な濃度に対応する（図１２Ａを見よ）。これらの流れを合せて単一のマイクロメートル深さ−広幅チャネル１２０２に入れた後、グリセロール溶液１０４の濃度勾配を、流れの方向に直交して、マイクロメートル深さチャネル１２０２にわたって形成した（図１２Ａを見よ）。３ｍｍ×３ｍｍ導波路回折格子表面センサ１０２の上面にマイクロメートル深さ−広幅チャネル１２０２を重ねた。図４に示されるＣＣＤカメラ４１２を備える光検出システム１００を用いてセンサ応答の像を得た。センサ応答像を５つの領域に分割して５つの別々の角共鳴プロット（図１２Ａ内の写真を見よ）を作成した。流れは混合することなく同じセンサ１０２にかけて流れたから、単一のセンサ１０２でそれぞれのフロー流に対する応答が独立に得られ、センサの５つの「ゾーン」がそれぞれのゾーンの上に局在する流体だけに対する応答を示した（図１２Ａ内の写真を見よ）。また、図１２Ｂ及び１２Ｃのグラフに示される差引き後すなわち参照後のトレースは、測定雑音及びドリフトが大きく低減され、より滑らかな（雑音が少ない）応答が得られることを示す。
【００３０】
上述から、当業者には、本発明によってマイクロメートル深さフローチャンバ内のセンサに対する簡単で非常にフレキシブルな自己参照法が可能になることが容易に理解できる。従来技術と異なり、検出及び参照を同時に行うために１つのセンサしか必要ではなく、このため光学系及び計測器の複雑さが軽減される。参照信号は検出に用いられるセンサと同一のセンサから生成される。したがって、参照信号は検出信号と同じ環境変動を受ける。これにより、参照の確度が高められ、環境条件による不確定性が低められる。図４に示されるシステム１００の好ましい実施形態を用いれば、いかなるセンサもさらに付け加えることなくフローチャンバ内の参照領域に呼びかけることができ、活センサ領域をソフトウエアで調節して新しいセンサ及び検出光学系の付加を回避することができる。さらに、従来技術と異なり、検出流体と参照流体の間の流体界面が一定に保たれ、移動流体界面システムに本質的な、乱流混合、ヒステリシス及び再現性問題が防止される。
【００３１】
本発明に用いられる好ましいセンサ１０２は回折格子結合導波路センサ１０２または表面プラズモン共鳴センサ１０２であることに注意すべきである。以下の文献は本発明に用いることができる例示的センサ１０２の構造及び機能に関する詳細を開示している：
・  名称を「光検定：方法及び装置（Optical Assay: Method and Apparatus）」とする、欧州特許出願公開第０２０２０２１Ａ２号明細書；
・  名称を「気体、液体、固体及び多孔質の試料における物質の選択的検出のため及び／または屈折率変化の検出のための光センサ（Optical Sensor for selective Detection of Substances and/or for the Detection of Refractive Index Change in Gaseous, Liquid, Solid and Porous Samples）」とする、米国特許第４８１５８４３号明細書；
これらの文献の内容は本明細書に参照として含まれる。
【００３２】
図１，４，７及び１１に示されるシステム１００は明解さのため１つのセンサとインターフェースする１本の光ビームだけを有するとして描かれていることにも注意すべきである。もちろん、システム１００は、複数の光ビームを複数のセンサ１０２に放射し、複数の光ビームを複数のセンサ１０２から受け取ることを可能にする、ハードウエア（例えば、光学系、多重化光検出器４１４，分光写真器７１４，ＣＣＤカメラ４１２）を有することができる。複数のセンサ１０２を複数のセンサプレートに組み込むことができる。
【００３３】
本発明の複数の実施形態を添付図面に示し、上記の詳細な説明で述べたが、本発明が開示された実施形態に限定されず、添付される特許請求の範囲に述べられ、定められるような本発明の精神を逸脱することのない、数多くの再構成、改変及び置換が可能であることは当然である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明にしたがうシステムの基本コンポーネントを示すブロック図である
【図２】本発明にしたがう図１に示されるシステムのマイクロ流体デバイス内に配置されたセンサを自己参照するための好ましい方法の基本工程を示すフローチャートである
【図３Ａ】図１に示されるマイクロ流体デバイス及びセンサの構造をさらに詳細に示す図である
【図３Ｂ】図１に示されるマイクロ流体デバイス及びセンサの構造をさらに詳細に示す図である
【図４】本発明にしたがう角度呼掛けシステムを利用する、図１に示されるシステムの第１の実施形態を示すブロック図である
【図５Ａ】図４に示されるシステムによって測定された共鳴像におけるシフトを示す時間推移写真である
【図５Ｂ】図４に示されるシステムによって測定された共鳴像におけるシフトを示す時間推移写真である
【図６Ａ】図４に示されるシステムの能力を実証するために実施された実験中のセンサからの応答像を示す図である
【図６Ｂ】図４に示されるシステムの能力を実証するために実施された実験中の応答像から得られた別々の２つの角共鳴プロット像を示す図である
【図７】本発明にしたがうスペクトル呼掛けシステムを利用する、図１に示されるシステムの第２の実施形態を示すブロック図である
【図８】図７に示されるスペクトル呼掛けシステムによって受け取られた出力ビームにおける多重共鳴応答の例を示すグラフである
【図９Ａ】図１に示される呼掛けシステム及びコンピュータとインターフェースする複数のマイクロ流体デバイス及びセンサが組み込まれた例示的な９６-Ｈウエルプレートの上面図を示す
【図９Ｂ】図１に示される呼掛けシステム及びコンピュータとインターフェースする複数のマイクロ流体デバイス及びセンサが組み込まれた例示的な９６-Ｈウエルプレートの底面図を示す
【図９Ｃ】図１に示される呼掛けシステム及びコンピュータとインターフェースする複数のマイクロ流体デバイス及びセンサが組み込まれた例示的な９６-Ｈウエルプレートの側断面図を示す
【図１０Ａ】図９Ａ及び９Ｂに示されるシステムの能力を実証するために実施された実験中に得られた検出信号及び参照信号を示す時間プロットである
【図１０Ｂ】図９Ａ及び９Ｂに示されるシステムの能力を実証するために実施された実験中に得られた補正検出信号を示す時間プロットである
【図１１】本発明にしたがう試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができるマイクロ流体デバイスを分析する図１に示されるシステムの第３の実施形態のいくつかの図を示す
【図１２Ａ】本発明にしたがう試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができるマイクロ流体デバイスを分析する図１に示されるシステムの第４の実施形態のいくつかの図を示す
【図１２Ｂ】本発明にしたがう試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができるマイクロ流体デバイスを分析する、図１に示されるシステムの第４の実施形態で得られた結果の１つを示す
【図１２Ｃ】本発明にしたがう試料溶液内に複数の濃度勾配を生成することができるマイクロ流体デバイスを分析する、図１に示されるシステムの第４の実施形態で得られた結果の１つを示す
【符号の説明】
【００３５】
１００    自己参照システム
１０１    マイクロ流体デバイス
１０２    センサ
１０４    試料溶液
１０６    参照溶液
１０７ａ，１０７ｂ，１０７ｃ，１０７ｄ    フローチャネル
１０８    マイクロメートルサイズ深さフローチャネル
１０９ａ，１０９ｂ    流入口
１１０    呼掛けシステム
１１１ａ，１１１ｂ    流出口
１１２    入力光ビーム
１１４    出力光ビーム
１１６    検知領域
１１６ａ      検出領域
１１６ｂ    参照領域
１１８    コンピュータ／ハードウエア
【図１】
2008521005.tif 000005
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2008521005.tif 000016
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2008521005.tif 000018
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
2008521005.tif 000020
【図１１】
2008521005.tif 000021
【図１２Ａ】
2008521005.tif 000022
【図１２Ｂ】
2008521005.tif 000023
【図１２Ｃ】
2008521005.tif 000024
【国際調査報告】
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2008521005.tif 000026
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