(57)【要約】  本発明は、融合タンパク質をコードする核酸配列を保有する組換えＭＶＡに関する。本発明は、さらに、前記組換えＭＶＡを含むキット、および、哺乳類のＴ細胞応答を促進する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記第１構成要素および第２構成要素を含み、前記第１構成要素および第２構成要素が、任意に、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、キット。
ａ）  １以上の外来タンパク質、もしくは、前記外来タンパク質をコードする核酸、または、それらの機能的部分を含む第１構成要素；および、
ｂ）  組換え修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）を含み、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、
前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分、および、１以上の外来タンパク質またはそれらの機能的部分を含む、
第２構成要素。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、さらに、ユビキチンと前記外来タンパク質との間にリンカーを含む請求項１記載のキット。
【請求項３】
前記外来タンパク質が、治療用ポリペプチド、病原性薬のポリペプチドおよびそれらの機能的部分からなる群に由来する異種タンパク質である請求項１または２記載のキット。
【請求項４】
前記治療用ポリペプチドが、分泌タンパク質からなる群に由来し、例えば、抗体、ケモカイン、サイトカインまたはインターフェロンのポリペプチドである請求項３記載のキット。
【請求項５】
前記病原性薬が、ウィルス、バクテリア、原生動物、および寄生生物、ならびに腫瘍細胞または腫瘍細胞関連抗原およびそれらの機能的部分からなる群に由来する請求項３記載のキット。
【請求項６】
前記ウィルスが、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、デングウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、またはパピローマウィルスからなる群から選択される請求項５記載のキット。
【請求項７】
前記原生動物が、熱帯性マラリア原虫（Plasmodium  falciparum）である請求項５記載のキット。
【請求項８】
前記バクテリアが、結核の原因となるマイコバクテリアである請求項５記載のキット。
【請求項９】
前記腫瘍細胞関連抗原が、
メラノーマ関連分化抗原、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、
癌精巣抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、およびＢＡＧＥ、
ならびに、
腫瘍において過剰発現された非変異型共有抗原、例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、およびｐ５３
からなる群から選択される請求項５記載のキット。
【請求項１０】
前記融合タンパク質および／または外来タンパク質のコード領域が、それぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須部位に隣接しているＤＮＡ配列に隣接する、請求項１から９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記非必須部位が、ＭＶＡゲノム内の欠失IIIの部位である請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
組換えＭＶＡ粒子の感染単位（ＩＵ）として測定された前記第１構成要素の量と前記第２構成要素の量との比が、１：５〜１：２０、好ましくは１：１０である請求項１から１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
抗癌治療または感染症予防に用いるための、請求項１ｂで定義した組換えＭＶＡまたは請求項１から１２のいずれか一項に記載したキット。
【請求項１４】
哺乳類のＴ細胞応答の促進方法に使用する医薬の製造のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載したキットの使用であって、
前記Ｔ細胞応答促進方法が下記ａ）〜ｃ）工程を含む使用。
ａ）  請求項１から１２のいずれか一項に記載のキットを準備する工程
ｂ）  一次免疫応答を与えるために有効な量の前記第１構成要素により、哺乳類を刺激する工程
ｃ）  二次免疫応答を与えるために有効な量の前記第２構成要素により、前記哺乳類を追加免疫する工程
【請求項１５】
癌治療用または感染症予防用の医薬を製造するための、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記追加免疫工程を、前記刺激工程の後２〜１２週間、好ましくは４〜８週間に行う、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
ワクチン投与方法に用いる請求項１４から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
処置される動物がヒトである請求項１４から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
組換えＭＶＡの使用であって、
前記組換えＭＶＡは、ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔワクチン投与における追加免疫薬として、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、
前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分、および、１以上の外来タンパク質またはその機能的部分を含む、
組換えＭＶＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）に関し、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を有する。本発明は、さらに、前記組換えＭＶＡを含むキット、および、哺乳類のＴ細胞応答を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウィルス（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ、ＶＶ）は、ポックスウィルス科オルソポックスウィルス属に属する。ワクシニアウィルスのうちのある株は、長年にわたって、天然痘に対して免疫を与えるための生ワクチンとして用いられており、例えば、英国（ＵＫ）リスター研究所（Ｌｉｓｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＥｌｓｔｒｅｅ株がある。ワクチン接種に由来する合併症のために(非特許文献１：Schar,  Zeitschr.  Fur  Praventivmedizin  18,  41-44  [1973])、また、ＷＨＯによる１９８０年の天然痘根絶宣言のために、今日では、天然痘に対するワクチン接種は、リスクの高い人にのみ行われている。
【０００３】
ワクシニアウィルスは、外来抗原の生産および送達のためのベクターとしても用いられてきた(非特許文献２：Smith  et  al.,  Biotechnology  and  Genetic  Engineering  Reviews  2,  383-407  [1984])。これには、ＤＮＡ組換え技術によってワクシニアウィルスのゲノム中に導入される、外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）が必要である。ウィルスのライフサイクルに必須でないウィルスＤＮＡのサイトに前記遺伝子が組み込まれた場合、新たに生産された組換えワクシニアウィルスを感染性とすることが可能である。すなわち、外来細胞を感染させ、それにより、組み込まれたＤＮＡ配列を発現させることができる（欧州特許出願番号第８３，２８６および第１１０，３８５号）。この方法によって調製された前記組換えワクシニアウィルスは、一方では、感染予防のための生ワクチンとして使用することができる。他方では、真核細胞における異種タンパク質の調製に用いることができる。
【０００４】
ワクシニアウィルスは、生ベクター（ｌｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ）の中で最も広範に評価されており、かつ、組換えワクチンとしての使用を支持する特性を有する。すなわち、ワクシニアウィルスは、安定性が高く、製造コストが安く、投与が容易であり、かつ、大量の外来ＤＮＡに適応可能である。ワクシニアウィルスは、抗体応答および細胞傷害性応答の両方の誘導に有利であり、より自然な方法で、免疫系への抗原の提示を可能にし、かつ、広範な動物モデルを感染症から保護するベクターワクチンとして有利に用いることができる。さらに、ワクシニアベクターは、組換えタンパク質の構造と機能との関係を解析するための、体液性のまたは細胞媒介による免疫応答の標的を特定するための、および、特定疾患に対する保護に必要な免疫防御の型を調査するための、非常に価値のある研究ツールである。
【０００５】
しかしながら、ワクシニアウィルスは、ヒトに対して感染性であり、研究室における発現ベクターとしての使用は、安全性の関係および制御の影響を受けてきた。さらに、将来可能性のある組換えワクシニアウィルスの応用、例えば、ヒトに対する新規な治療的または予防的アプローチのために組換え体タンパク質または組換え体ウィルス粒子を生成させることは、組換えワクシニアベクターの増殖的複製により障害を受けている。文献に記述されている多くの組換えワクシニアウィルスは、ワクシニアウィルスのウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ、ＷＲ）株に基づいている。一方、この株は、高い神経毒性を有するため、ヒトおよび動物への適用にはほとんど適さないことが知られている(非特許文献３：Morita  et  al.,  Vaccine  5,  65-70  [1987])。
【０００６】
ＶＶの標準株の安全性に関しては、高度に弱毒化されたウィルス株に由来するワクシニアベクターの開発により取り組まれてきた。これらのワクシニアベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、それらの制限された複製能力で特徴付けられ、ｉｎ  ｖｉｖｏではそれらの非病原性（弱毒性）で特徴付けられる。望ましくない副作用を避けるために特別に培養されたウィルス株は、長年にわたって知られていた。したがって、ＭＶＡを培養するために、ニワトリ胚繊維芽細胞でワクシニアウィルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を長期連続継代することが可能であった(例えば、非特許文献４：Mayr,  A.,  Hochstein-Mintzel,  V.  and  Stickl,  H.  (1975)  Infection  3,  6-14;  および特許文献１：スイス国特許第５６８３９２号明細書参照)。前記ＭＶＡウィルスは、微生物の寄託（ＣＮＣＭ）に関するブダペスト条約上の要請(Institut  Pasteur,  Collectione  Nationale  de  Cultures  de  Microorganisms,  25,  rue  de  Docteur  Roux,  75724  Paris  Cedex  15)に従って、１９８７年１２月１５日に寄託番号Ｉ−７２１で寄託された。
【０００７】
ＭＶＡウィルスは、野生型ＣＶＡ株と比較して、ゲノムの変化を特定するために解析されてきた。６つの主要な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、Ｖ、およびVI）が確認されている(非特許文献５：Meyer,  H.,  Sutter,  G.  and  Mayr  A.  (1991)  J.  Gen.  Virol.  72,  1031-1038)。この修飾ワクシニアウィルスアンカラは、低い病原性しか有さず、すなわち、ワクチン投与に用いたときに副作用を示さない。したがって、この修飾ワクシニアウィルスアンカラは、免疫不全患者の初期ワクチン投与に特に好適である。前記ＭＶＡ株の優れた特性は、多数の臨床試験で示されてきた(非特許文献６：Mayr  et  al.,  Zbl.  Bakt.  Hyg.  I,  Abt.  Org.  B  167,  375-390  [1987],および非特許文献７：Stickl  et  al.,  Dtsch.  med.  Wschr.  99,  2386-2392  [1974])。
【０００８】
修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）は、組換え遺伝子発現のための安全なウィルスベクターとして有用なツールであり、修飾ワクシニアウィルスアンカラは、タンパク質機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究または抗原特異性細胞性若しくは体液性免疫応答のｉｎ  ｖｉｖｏ誘発のような、様々な目的に使用できる。ＭＶＡの主要な利点は、ヒトおよび多くの哺乳類細胞において複製欠損であるにも関わらず、高レベルな遺伝子発現を許容可能なことである。ワクチンとしてのＭＶＡは、優れた安全性実績を有し、バイオセーフティレベル１の条件下で取り扱うことができ、そして、動物の異種抗原を送達する際に免疫原性および保護性であることが証明されており（１−８）、かつ、臨床試験において、第１のヒト候補ワクチンとして推進されてきた。
【０００９】
多くの哺乳類セルラインにおいて増殖不可能であるために、ＭＶＡは、ウィルス性および異種性遺伝子の未障害発現を保持する(Sutter  and  Moss,  1992)。ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化ストラテジー（prime-boost  immunization  strategies）(Meseda  et  al.,  2002;  Amara  et  al.,  2002)および進行中の臨床試験(McConkey  et  al.,  2003;  Cosma  et  al.,  2003;  Hanke  et  al.,  2002)における広い使用が示している通り、ヒトに対する病原性の欠落、免疫不全の宿主においてさえも本質的に非病原性（弱毒性）であること、外来抗原の高レベル発現および免疫応答における免疫賦活作用が、組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）を、予防的および治療的ワクチン投与の両方に対して理想的なベクターとしている。
【００１０】
事実、組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）に基づくワクチンは、体液性および細胞媒介順応性の両方の免疫応答を誘発し(Ramirez  et  al.,  2000)、いくつかの感染症の動物モデルにおいて(Hanke  et  al.,  1999;  Barouch  et  al.,  2001;  Weidinger  et  al.,  2001;  Schneider  et  al.,  1998;  Sutter  et  al.,  1994b;  Hirsch  et  al.,  1996;  Wyatt  et  al.,  1996)、また、いくつかの腫瘍モデルにおいてさえも(Carroll  et  al.,  1997;  Rosales  et  al.,  2000;  Drexler  et  al.,  1999)、保護性であることが証明されている。
【００１１】
ｒＶＶを生成する標準的な方法は、詳細に述べられており(Earl  et  al.,  1998)、アクセプターＶＶ  ＤＮＡと形質移入された伝達プラスミドとの間におけるｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換えに依存し、外来遺伝子は、ＶＶ配列に隣接することとなる。組換えＭＶＡ生成のためのさらなるアプローチは、例えば、ＷＯ  ０４／０７４４９３、ＷＯ  ０３／０２３０４０およびＷＯ  ９７／０２３５５（特許文献２〜４）に開示されている。
【００１２】
WANG  et  al.,  Blood,  August  2004,  Vol.  104,  No.  3（非特許文献８）は、造血幹細胞移植（hematopoietic  stem  cell  transplants）後のサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）罹患率および死亡率を制限する免疫療法アプローチを開示する。一つのアプローチは、ワクシニアウィルス（ＶＶ）の病原性（毒性）Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株および高度に弱毒化された株である修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）に、ユビキチン修飾ＣＭＶ抗原を挿入する試みを含む。ユビキチン修飾ＣＭＶ抗原は、ホスホプロテイン６５（ｐｐ６５）、ホスホプロテイン１５０（ｐｐ１５０）および最初期タンパク質１(ＩＥ１）免疫優性抗原であった。
【００１３】
しかしながら、WANGらは、抗原のユビキチン化は、ｒＭＶＡが有するＣＭＶ抗原に対する一次免疫には、影響が全くないか、ごくわずかであったことを示している。
【００１４】
修飾ワクシニアウィルスアンカラは、組換え遺伝子の発現のための有用かつ安全なウィルスベクターであると考えられているが、哺乳類、特にヒトに対するＭＶＡ投与には上限があることが広く受け入れられている。例えば、ヒトに対する組換え体ＭＶＡの投与は、現在では、一回の投与につき５×１０８ＩＵ(infectious  units、感染単位)に制限されている。しかしながら、このケースにおいて、それはｒＭＶＡにより引き起こされる免疫応答が、所望の治療効果の達成に不十分であるという理由により、不利となりうる。したがって、哺乳類において、ある特定の免疫応答の達成に必要な感染単位数を減少させることが、極めて望ましい。
【００１５】
【特許文献１】スイス国特許第５６８３９２号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ  ０４／０７４４９３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ  ０３／０２３０４０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ  ９７／０２３５５号パンフレット
【非特許文献１】Schar,  Zeitschr.  Fur  Praventivmedizin  18,  41-44  [1973]
【非特許文献２】Smith  et  al.,  Biotechnology  and  Genetic  Engineering  Reviews  2,  383-407  [1984]
【非特許文献３】Morita  et  al.,  Vaccine  5,  65-70  [1987]
【非特許文献４】Mayr,  A.,  Hochstein-Mintzel,  V.  and  Stickl,  H.  (1975)  Infection  3,  6-14;
【非特許文献５】Meyer,  H.,  Sutter,  G.  and  Mayr  A.  (1991)  J.  Gen.  Virol.  72,  1031-1038
【非特許文献６】Mayr  et  al.,  Zbl.  Bakt.  Hyg.  I,  Abt.  Org.  B  167,  375-390  [1987]
【非特許文献７】Stickl  et  al.,  Dtsch.  med.  Wschr.  99,  2386-2392  [1974]
【非特許文献８】WANG  et  al.,  Blood,  August  2004,  Vol.  104,  No.  3
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の根底にある目的は、哺乳類、特にヒトにおいて、十分に高い免疫応答を達成するとともに、感染単位数が比較的低いかまたは低減されている、ＭＶＡに基づくワクチン投与システムを提供することである。本発明の根底にあるさらなる目的は、ＭＶＡに基づくワクチン投与プロトコールのために改善され、選択した抗原に対する二次免疫応答の促進につながる追加免疫剤（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらの課題は、独立請求項に記載されている対象により解決される。好ましい実施形態は、従属請求項で述べている。
【発明の効果】
【００１８】
要約すると、本発明は、以下の利点および結果をもたらす。
【００１９】
予期せぬことに、ワクチン投与プロトコール、すなわちｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔワクチン投与プロトコールにおいて、異なる種類の組換えＭＶＡ粒子を組み合わせることで、従来技術のアプローチと比較して促進された細胞免疫応答を示すことが判明した。言い換えれば、刺激（プライミング）のための外来タンパク質と、ユビキチン化外来タンパク質を産生する組換えＭＶＡとの組み合わせが、免疫応答の促進につながり、そして、哺乳類に投与するｒＭＶＡにおいて、より少ない感染単位で十分な免疫応答を達成できることが判明した。これらの結果は、他の科学者、例えばWANGらが前述の刊行物Blood,  Volume  104,  No.  3において、抗原のユビキチン化がｒＭＶＡの免疫原性に影響しなかったと示していることからみて、驚くべきことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明において、ユビキチン化外来タンパク質を保有するｒＭＶＡの一次免疫応答は比較的低いが、前記ｒＭＶＡを追加免疫剤として用いると、大規模な免疫応答が見られることが確認されている。本発明者等は、本発明のワクチン投与システムを用いることにより、ワクチン投与に用いるｒＭＶＡの感染単位の全量を劇的に減少可能であることを見出した。
【００２１】
最初に、本発明者等は、ハイブリダイゼーションＰＣＲ法により、ユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子(Ｕｂ−Ｔｙｒ)を構築した（図１ｂ）。次に、相同組換えおよび引き続いての宿主細胞選択を通じて、組換えＭＶＡウィルスを産生することに成功した。この組換えウィルスは、前記融合遺伝子がウィルスゲノム中に安定に組み込まれており、Ｕｂ−Ｔｙｒが、ユビキチン化融合タンパク質として生産された（図１ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ユビキチン化は、前記ユビキチン化融合タンパク質の半減期の有意な減少を導く急速かつほぼ完全なプロテアソーム依存性分解により、標的タンパク質の細胞質不安定性を導いた（図２）。前述の通り、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性試験により、驚くべきことに、前記ユビキチン化抗原を含むＭＶＡワクチンは、前記ユビキチン化抗原を含まないＭＶＡと比較して弱い一次応答を示したにもかかわらず、有意に促進された二次免疫応答を示すことが判明した（図４および５参照）。
【００２２】
本出願では、ＭＨＣクラスＩ特異的提示のためのペプチドプロセシングを促進する、急速なプロテアソーム分解のためにデザインされた抗原の生産により、ｒＭＶＡベクターを用いてＣＴＬ生成を最適化するための新規なアプローチを請求する。ユビキチン／外来タンパク質融合タンパク質を発現するＭＶＡワクチンは、ウェスタンブロット法、放射性免疫沈降法およびクロム放出法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築され、特徴付けられた。
【００２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ワクチン投与研究は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−形質転換マウスを用いて行い、ＣＴＬ応答は、細胞内サイトカイン合成およびテトラマー結合アッセイにより解析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＭＶＡにより生産されたユビキチン化チロシナーゼ(Ｕｂ−Ｔｙｒ)は、プロテアソーム阻害剤の存在下で特異的に阻害される急速分解にかけた。さらに、ユビキチン化は、ウィルス感染の初期の時点においてさえもペプチドプロセシングの増加および細胞表面における高いＭＨＣクラスＩペプチド密度の有効性を示す感染した標的細胞において、外来タンパク質特異的ＣＴＬ認識の有意な促進という結果を生じた。ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔワクチン投与研究においては、ＭＶＡ−Ｕｂ−外来タンパク質は、重要なことにワクチン容量が低い場合においても、Ｔｙｒ−特異的ＣＴＬリコール応答を最も効果的に促進することが可能であった。
【００２４】
ここで提示するデータは、抗原の特徴的な製剤形態を送達するＭＶＡワクチンが、選択的に、刺激（プライミング）または追加免疫（boosting）に使用できることを示す。ＭＶＡに基づくワクチン投与プロトコールであって、改善された免疫原性を有し、最適化されたプロトコールの開発のために、前記ＭＶＡワクチンは、極めて重要である。
【００２５】
第１の側面によれば、本発明は、下記第１構成要素および第２構成要素を含み、それら第１構成要素および第２構成要素が、任意に、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、キットに関する。
ａ）  １以上の外来タンパク質、もしくは、前記外来タンパク質をコードする核酸、または、それらの機能的部分を含む第１構成要素；および、
ｂ）  組換え修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）を含み、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、
前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分、および、１以上の外来タンパク質またはそれらの機能的部分を含む、
第２構成要素。
【００２６】
なお、前記外来タンパク質は、通常、前記２つの構成要素において同じものを用いるが、異なっていてもよい。
【００２７】
ここで使用する「外来タンパク質」という用語は、１つの組換えＭＶＡ粒子中に、１つだけでなく、２つ以上の特徴的な外来タンパク質を含む代替物（alternative）をも包含する。したがって、いくつかの疾患に対する免疫原性を、１つのみのワクチン投与により達成することができる。２つ以上の外来タンパク質を用いることは、あるウィルス性疾患および腫瘍性疾患の回避機構を避けるかまたは打破を補助し得る。
【００２８】
さらに、「外来タンパク質」という用語は、天然にＭＶＡの一部として存在しないタンパク質、すなわち異種タンパク質（およびそれをコードする核酸）をも示す。
【００２９】
ユビキチンは、小サイズの細胞質タンパク質であり、高度に保存されている。ユビキチンは、組織中で、細胞内におけるコントロールされたタンパク質分解の制御における基本的な役割を担う。
【００３０】
ユビキチンのポリペプチド鎖は、７６個のアミノ酸からなる。しかしながら、本発明で使用する「ユビキチン」という用語は、この特定のタンパク質のみに制限されない。この用語は、「ユビキチン様タンパク質」と呼ばれるタンパク質スーパーファミリーをも含む。それは、すなわち、ユビキチン様の折りたたみモチーフを示すタンパク質、ならびにそれらのフラグメントおよび融合タンパク質である。したがって、本発明は、ユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーにおけるタンパク質から選択されるユビキチンタンパク質をも含む。それらのタンパク質は、置換、挿入、欠失、およびその他の全ての化学修飾により修飾されているが、それらの特異的な折りたたみモチーフを保持しているか、または、細胞分解機構に関係するタンパク質の導入という結果をもたらす。
【００３１】
この観点において、使用可能なさらなるタンパク質の例は、小サイズのユビキチン様修飾因子(SUMO;  Yun-Cai  Liu,  Annu.  Rev.  Immunol.  2004.  22:81-127参照)、ＰＥＳＴ配列 (Duane  A.  Sewell  et  al.,  CANCER  RESEARCH  64,  8821-8825,  December  15,  2004)である。さらなる情報については、Chien-Fu  Hung  et  al.,  CANCER  RESEARCH  63,  2393-2398,  May  15,  2003も参照のこと。
【００３２】
前述の通り、本明細書中で使用する「機能的部分」という用語は、そのようなタンパク質またはそれをコードする核酸を意味し、野生型タンパク質／核酸と比較すると、その機能を変えることなく、１以上の置換、挿入および／または欠失を含む。それらは、好ましくは１つの、若しくは２、３、４若しくはそれ以上のヌクレオチドを、５’若しくは３’若しくは核酸配列中において欠いているか、または、それらのヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている。外来タンパク質の「機能的部分」は、その生理学的機能を満たす限り、切断型タンパク質であっても良く、その生理学的機能とは、すなわち、特定疾患の治療および／または保護に有効な免疫原性を提供することである。したがって、本発明で用いる外来タンパク質は、それが、関連技術分野において共通であるという意味で、「抗原」であると考えることもできる。本明細書中における抗原は、免疫系により外来あるいは毒性と認識され、免疫応答を誘発する物質として定義する。
【００３３】
工程ａ）で使用する前記外来タンパク質または抗原は、宿主中において前記外来タンパク質自体を発現する核酸の形態で、前記外来タンパク質を発現する組換えバクテリアの形態で、タンパク質形態の外来タンパク質として、および／または、ウィルスベクターにより保因される外来タンパク質の形態として存在する。
【００３４】
好ましい実施形態においては、前記ウィルスベクターは、修飾ワクシニアウィルスアンカラ(ＭＶＡ)である。
【００３５】
好ましい実施形態によれば、前記融合タンパク質は、ユビキチンと前記外来タンパク質との間にリンカーをさらに含む。前記リンカーは、ユビキチン／タンパク質融合の安定性を強化するアミノ酸（例えば、前記融合タンパク質のユビキチン部分における第７６位のアラニン）、または、ユビキチン部分の好ましい開裂を導くアミノ酸（例えば、前記融合タンパク質のユビキチン部分における第７６位のグリシン）を含むことが好ましい。これによって、リンカーは、前記タンパク質のこの部分の開裂促進を導く、融合タンパク質内に含まれるアミノ酸（例えば、前記融合タンパク質の残部の第１位のアルギニン）、および／または、細胞内のさらなるユビキチン分子によりターゲットとされ、認識シグナルとして機能することにより開裂の促進を導くアミノ酸に含まれるアミノ酸を明らかにする。
【００３６】
本明細書中において用いる「組換えＭＶＡ」という用語は、例えば、ＤＮＡ組換え技術により遺伝子改変されたＭＶＡや、例えば、ワクチンまたは発現ベクターとしての使用に供されるＭＶＡを意味する。
【００３７】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウィルスは、いくつかの周知技術、例えば、Ｋ１Ｌ−遺伝子に基づく選択プロトコールにより調製できる。一例として、ワクシニアウィルス（ＶＶ）Ｋ１Ｌタンパク質またはＫ１Ｌ誘導ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、外来タンパク質（またはユビキチン／外来タンパク質の融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列とを含み、両者がＭＶＡゲノムの非必須部位（例えば、自然に起こる欠失、例えば欠失III）に隣接しているＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡ構築物を、細胞中に、好ましくは真核細胞に導入する。好ましくは、トリ、哺乳類およびヒトの細胞を用いる。好ましい真核細胞は、Ｋ１Ｌ遺伝子配列およびＭＶＡゲノムのプロモーター配列または前記配列の機能的部分が不活性化されて相同組換えが可能である、変異ＭＶＡに生産的に感染したＢＨＫ−２１(ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０)、ＢＳＣ−１(ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２６)、ＣＶ−１(ＥＣＡＣＣ  ８７０３２６０５)またはＭＡ１０４(ＥＣＡＣＣ  ８５１０２９１８)細胞である。さらなる好ましい宿主細胞は、ニワトリ繊維芽細胞、ウズラ繊維芽細胞、ＱＴ−９細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｂ細胞、またはヒト一次細胞（例えば、一次繊維芽細胞、樹状細胞）である。さらに詳細な情報は、ＷＯ  ０４／０７４４９３号公報を参照することにより、本明細書中に完全に組み込まれる。
【００３８】
一旦前記ＤＮＡ構築物が真核細胞中に導入され、前記Ｋ１ＬコードＤＮＡおよび外来ＤＮＡが前記ウィルスＤＮＡと組換えられると、ウィルス成長を助けるためにＫ１Ｌ機能が必要な細胞（例えば、ＲＫ−１３細胞）の継代により、所望の組換えワクシニアウィルスＭＶＡを単離できる。組換えウィルスのクローン化は、プラーク精製として知られる公知の方法により可能である(Nakano  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  79,  1593-1596  [1982],  Franke  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.  1918-1924  [1985],  Chakrabarti  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.  3403-3409  [1985],  Fathi  et  al.,  Virology  97-105  [1986]を比較されたい)。
【００３９】
挿入されるＤＮＡ構築物は、線状でも環状でもよい。好ましくは、環状ＤＮＡを用いる。特に、プラスミドを用いることが好ましい。
【００４０】
前記ＤＮＡ構築物は、ＭＶＡゲノムの非必須部位（例えば、欠失III部位、Sutter,  G.  and  Moss,  B.  (1992)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89,  10847-10851)、ＭＶＡゲノムにおいて設計したＫ１Ｌ欠失部位、または、本発明の変異ＭＶＡゲノムにおける任意の非必須部位に対し、右側および左側に隣接する配列を含む。
【００４１】
前記外来ＤＮＡ配列は、前記非必須部位（例えば、自然に起こる欠失）に隣接する配列の間に挿入してもよい。
【００４２】
前記外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチド、または、病原性薬由来のポリペプチドをコードする遺伝子であっても良く、好ましくは、ワクチン投与目的、または、治療用若しくは科学的に有用なポリペプチドの生産のために用いることができる。前記治療用ポリペプチドとしては、例えば、分泌タンパク質、例えば、抗体、ケモカイン、サイトカイン若しくはインターフェロンのポリペプチドである。病原性薬は、疾患を引き起こすウィルス、バクテリアおよび寄生生物、ならびに、生体において無制限に増殖し、それにより病理成長を導く腫瘍細胞であると理解することができる。そのような病原性薬の例は、Davis,  B.D.  et  al.,により記述されている(Microbiology,  3rd  ed.,  Harper  International  Edition)。病原性薬の好ましい遺伝子は、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳウィルス）、デングウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ、例えばＨＩＶ  ＩおよびＨＩＶ  II）、ヒト肝炎ウィルス（例えば、ＨＣＶおよびＨＢＶ）、ヘルペスウィルス、パピローマウィルス、マラリア寄生生物の熱帯性マラリア原虫および結核の原因となるマイコバクテリアの遺伝子である。
【００４３】
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、メラノーマ関連分化抗原（例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２）、癌精巣抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、およびＢＡＧＥ）、および、腫瘍において過剰発現された非変異型共有抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、およびｐ５３）をコードする遺伝子である。
【００４４】
本発明の使用におけるさらなる外来配列は、人工的なエピトープに含まれるポリペプチド配列、または、エピトープを含む配列であり、例えば、ミニ遺伝子、ポリトープ等である。
【００４５】
前記ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションにより細胞に導入してもよく、例えば、リン酸カルシウム沈降法 (Graham  et  al.,  Virol.  52,  456-467  [1973];  Wigler  et  al.,  Cell  777-785  [1979])、エレクトロポレーション (Neumann  et  al.,  EMBO  J.  1,  841-845  [1982])、マイクロインジェクション法 (Graessmann  et  al.,  Meth.  Enzymology  101,  482-492  [1983])、リポソーム (Straubinger  et  al.,  Methods  in  Enzymology  101,  512-527  [1983])、スフェロプラスト (Schaffner,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  77,  2163-2167  [1980])、または、当業者に公知の他の方法により、導入してもよい。リン酸カルシウム沈降法によるトランスフェクションを好ましく用いることができる。
【００４６】
ワクチンを調製するために、本発明の前記組換えＭＶＡを、生理学的に許容可能な形態に変換させ、続いて、キットに組み込む。このことは、天然痘に対するワクチン投与に使用するためのワクチンの調製における長年の経験に基づいて行うことができる(Kaplan,  Br.  Med.  Bull.  25,  131-135  [1969])。典型的には、組換えＭＶＡ粒子１０６〜１０８個を、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で凍結乾燥する。前記凍結乾燥は、アンプル中で行い、好ましくはガラスアンプル中で行う。投与するＭＶＡの用量に関するさらなる情報を、以下に示す。前記凍結乾燥物は、非経口投与に好適な増量剤（例えば、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドン）または他の助剤（例えば、抗酸化剤、安定剤等）を含んでいてもよい。続いて、前記ガラスアンプルを密封し、保存してもよい。好ましくは、マイナス２０℃以下で数ヶ月保存可能である。
【００４７】
ワクチン投与のために、前記凍結乾燥物を、０．１〜０．２ｍｌの水溶液、好ましくは生理食塩水に溶かし、そして、非経口的に、例えば、皮内接種により投与してもよい。本発明のワクチンは、皮内に注入することが好ましい。注射部位には、腫脹および発赤、ならびに時として掻痒が見られることがある(Stickl  et  al.,  supra)。投与方法、用量および投与回数は、当業者により、公知の方法で最適化することができる。外来抗原に対する高レベルな免疫応答を得るために、前記ワクチンを、長期間にわたり、数回、適切に投与することが好ましい。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、本発明のキットは、前記第１構成要素の量と前記第２構成要素の量との比が、組換えＭＶＡ粒子の感染単位（ＩＵ）による測定で、１：５から１：２０、好ましくは１：１０である。刺激（プライミング）工程に用いる組換えＭＶＡ（ユビキチンを含まない）のＩＵは、例えば、マウス１匹当たり１０５〜１０６である。これは、従来技術のアプローチと比較すると比較的に少量の粒子である。動物への追加免疫に用いる組換えＭＶＡ（ユビキチンを含む）の用量は、約１０６〜１０７で、ユビキチンを含まない組換え粒子（従来技術における追加免疫工程）１０７〜１０８ＩＵの場合と同等のＴ細胞応答が達成できる。このように、前記追加免疫工程に用いるＩＵ数は、従来技術と比較して約９０％低減させることが可能である。
【００４９】
ヒトに対する組換えＭＶＡ投与量の上限は、約５×１０８ＩＵであり、この上限値よりも有意に低い量の組換えＭＶＡを用いるのみで、促進された免疫応答を達成できる。
【００５０】
第２の側面によれば、本明細書中で定義する前記組換えＭＶＡまたは前記キットは、抗癌治療または感染症予防に用いることを目的とする。
【００５１】
第３の側面によれば、本発明は、哺乳類のＴ細胞応答の促進方法に使用する医薬の製造のための、本明細書中で定義するキットの使用を目的とする。前記Ｔ細胞応答促進方法は、下記ａ）〜ｃ）工程を含む。
ａ）  本明細書で定義するキットを準備する工程
ｂ）  一次免疫応答を与えるために有効な量の前記第１構成要素により、哺乳類を刺激する工程
ｃ）  二次免疫応答を与えるために有効な量の前記第２構成要素により、前記哺乳類を追加免疫する工程
【００５２】
前記キットは、癌治療用または感染症予防用の医薬の製造に用いることが好ましい。
【００５３】
さらに好ましい実施形態によれば、前記追加免疫工程を、前記刺激工程の後２〜１２週間、好ましくは４〜８週間に行う。前述の通り、本明細書中に開示するキットは、ワクチン投与方法に使用する。
【００５４】
好ましくは、処置される動物は、ヒトである。
【００５５】
本発明は、さらに、下記ａ）〜ｃ）工程を含む哺乳類のＴ細胞応答促進方法を提供する。
ａ）  本明細書中で定義するキットを準備する工程
ｂ）  一次免疫応答を与えるために有効な量の前記第１構成要素により、哺乳類を刺激する工程
ｃ）  二次免疫応答を与えるために有効な量の前記第２構成要素により、前記哺乳類を追加免疫する工程
【００５６】
その他の方法では、樹状細胞(ＤＣ)を、患者から単離するか、または生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で生成させ、続いて、本発明に従い、ユビキチン化抗原を発現するｒＭＶＡに感染させる。続いて、これら感染ＤＣをワクチンとして患者に養子性に転移させる。これにより、未処理のＴ細胞を直接刺激するか、または、それぞれの抗原に特異的なすでに存在するＴ細胞を拡大させる。これら感染ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を刺激または拡大するために用いることもでき、これにより、これらｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したＴ細胞を、レシピエントに対し養子性に転移させることができる。
【００５７】
さらにその他の側面によれば、本発明は、組換えＭＶＡを含み、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を保有し、前記融合タンパク質は、前述の通り定義した、
ａ）  ユビキチンまたはその機能的部分、および、
ｂ)  外来タンパク質またはそれらの機能的部分
を含む。ただし、サイトメガロウィルス由来抗原とユビキチンとの融合タンパク質を含む組換えＭＶＡは除く。
【００５８】
さらにその他の側面によれば、本発明は、組換えＭＶＡの使用であって、前記組換えＭＶＡは、ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔワクチン投与の追加免疫薬として、融合タンパク質をコードする核酸配列を保有し、前記融合タンパク質は、
ユビキチンまたはその機能的部分、および
１以上の外来タンパク質またはその機能的部分
を含む、
組換えＭＶＡの使用を提供する。前述の通り、この組換えＭＶＡは、驚くべきことに、関与する外来タンパク質とは独立に、促進された二次免疫応答を示すことが明らかになっている。
【００５９】
本明細書中に記述する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照により、それらの全てが本明細書中に組み込まれる。抵触が生じる場合には、本明細書は、定義を含め、調整することができる。さらに、物質、方法および実施例は、単なる例示であり、本発明を制限することを意図しない。
【００６０】
以下、本発明を、添付の図面を用いてさらに説明する。
【００６１】
図１
ワクシニアウィルス特異的プロモーターＰ７．５の制御下で、ユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子を発現する組換えＭＶＡ（ｒｅｃＭＶＡ）構築物。（Ａ）は、ウィルスゲノムへの挿入部位（欠失III）と、相同組換え後に得られたウィルス性中間体および最終構築物とを示す模式的マップである。(Ｂ)は、ハイブリダイゼーションＰＣＲ法（アガロースゲル）後に得られた組換えユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子を示す。対照として、ユビキチンまたはチロシナーゼの一本鎖ＤＮＡフラグメントをも併せて示す。
【００６２】
図２
真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染したＢＨＫ細胞におけるヒトチロシナーゼ遺伝子発現のウェスタンブロット解析。細胞は、図示した感染後経過時間（ｈ.ｐ.ｉ.）において回収した。細胞可溶化物は、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。このゲルから得られたブロットは、抗チロシナーゼｍＡｂ  Ｔ３１１およびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体でブロットし、そして、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）により可視化した。
【００６３】
図３
ワクシニアウィルスに特異的なプロモーターＰ７．５(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５(●))またはそのユビキチン化形態(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５（n))の制御下で、ヒトチロシナーゼを発現するｒｅｃＭＶＡに感染した標的細胞の抗原提示能力。ヒトチロシナーゼペプチドエピトープ３６９−３７７に対して反応するＡ＊０２０１拘束性マウスＣＴＬによる特異的溶解は、６時間の［５１Ｃｒ］放出法により測定した。
【００６４】
図４
真正またはユビキチン化チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡウィルスでの単一免疫化により誘導される、急性期のチロシナーゼ特異的一次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答。ＨＨＤマウスは、ｉ.ｐ.を、１０７ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５(灰色のバー)、ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５(黒色のバー)またはＭＶＡ−ｗｔ(白色のバー)で刺激した。ＭＶＡ特異的Ｔ細胞応答およびチロシナーゼ特異的Ｔ細胞応答は、８日目に解析した。（Ａ）脾細胞は、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＶＰ３５＃１または対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５に対して特異的なキメラＡ２Ｋｂ−テトラマーで染色した。(Ｂ）脾細胞は、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＶＰ３５＃１または対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５でそれぞれペプチド刺激した。そして、その脾細胞を、続いて、細胞内インターフェロンγ産生（ＩＣＳ）によりスクリーニングした。全ての結果は、４匹のマウスの平均値±標準偏差で表している。
【００６５】
図５
非相同的ＤＮＡ−ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化により誘導される急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答。Ａ２Ｋｂマウスは、ｉ.ｍ.を、ＤＮＡワクチンコード化チロシナーゼ（DNA-vaccine  encoding  tyrosinase）で二回刺激し、ｉ.ｐ.を、真正チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ) １０７ＩＵまたはユビキチン化チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ)１０７ＩＵで一回追加免疫した。脾細胞は、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７に対する特異性を、最終のワクチン投与から５日後に解析した。（Ａ）は、キメラのＡ２Ｋｂテトラマー染色による解析結果であり、(Ｂ）は、ＩＣＳによる解析結果である。結果は、少なくとも３回の独立した実験により表している。
【００６６】
図６
非相同的ＭＶＡ−ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化により誘導される急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答。ＨＨＤマウスは、ｉ.ｐ．を、真正チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ)１０７ＩＵで刺激し、そして、ｉ．ｐ．を、真正チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ)またはユビキチン化チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ)１０８ＩＵで追加免疫した。脾細胞は、最終のワクチン投与から５日後に回収し、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＢ２２Ｒまたは対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５でそれぞれペプチド刺激した。そして、その脾細胞を、続いて、細胞内インターフェロンγ産生（ＩＣＳ）によりスクリーニングした。
【００６７】
図７
真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染したＲＭＡ細胞のパルスチェイス実験。感染から５時間後の細胞を２０分間飢餓状態にし、続いて、５０μＣｉの３５Ｓ標識化メチオニンおよびシステインで４５分間パルスし、さらに続いて、ＲＰＭＩ培地で追跡した。免疫沈降は、図示した時点において、抗チロシナーゼｍＡｂ  Ｃ−１９により行った。沈殿物は、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）で可視化した。ユビキチン化チロシナーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、有意に減少し、３０分未満であると評価することができた。一方、真正チロシナーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、１０時間を越えると評価された（Jimenez  et  al.,  1988）。
【００６８】
図８
感染したＲＭＡおよびＨｅＬａ細胞中でｒｅｃＭＶＡにより発現されるユビキチン化ヒトチロシナーゼの免疫沈降。
【００６９】
図９
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒの免疫原性。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性チロシナーゼエピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ＨＨＤマウスのＭＶＡ／ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ／ｂｏｏｓｔワクチン投与（リコール）後に測定した。全てのマウスは、１０ｅ５  ＩＵ（Ａ）または１０ｅ７  ＩＵ(Ｂ)のＭＶＡ−ｈＴＹＲにより刺激し、１０ｅ７  ＩＵのＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒまたはＭＶＡ−ｈＴｙｒで追加免疫した。脾細胞は、追加免疫から５日後に、細胞内インターフェロンγ産生によりスクリーニングした。
【００７０】
図１０
比較的低用量の一次ワクチン投与後に、ＭＶＡ−ｈＴｙｒ追加免疫した動物と比較した、ＭＶＡ−Ｕｂ／ｈＴｙｒの高効率なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性。ＨＤＤマウスは、１０７（Ａ）または１０６（Ｂ）ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒで刺激し、続いて、刺激後３０日目に、１０７ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒまたはＭＶＡ−Ｕｂ／ｈＴｙｒで追加免疫した。ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、または、対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５−４４３で標識したｉ．ｖ．注入自己脾細胞の急速ｉｎ  ｖｉｖｏ死滅を、追加免疫後５日目に評価した。図示の通り、血液または脾臓における標的細胞の５時間での特異的なｉｎ  ｖｉｖｏ溶解を、異なる刺激用量（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｄｏｓｅｓ）において比較した。
【００７１】
図１１
免疫化に先立ちｒｅｃＭＶＡを形質導入した細胞の免疫化により追加免疫した、急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答。ＨＨＤマウスは、ｉ．ｐ．を、真正チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ（ＭＶＡ−ｈＴｙｒ)１０７ＩＵで刺激し、そして、ｉ．ｐ．を、真正チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ)またはユビキチン化チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ)１０  ＩＵ／細胞に感染したＲＭＡ−ＨＨＤ細胞１０６個で追加免疫した。脾細胞は、最終のワクチン投与から５日後に回収し、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、または対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５でそれぞれペプチド刺激した。そして、その脾細胞を、細胞内インターフェロンγ産生（ＩＣＳ）によりスクリーニングした。
【実施例】
【００７２】
［物質および方法］
［プラスミド構築］
ユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子は、ＭＶＡトランスファーベクターｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５にクローン化して構築した。ここで、本発明者等は、他の非Ｕｂまたは非ｈＴｙｒ  ＤＮＡ配列が挿入されることのなく、ユビキチン(Ｕｂ)遺伝子がチロシナーゼ(ｈＴｙｒ)ｃＤＮＡと融合するハイブリダイゼーションＰＣＲ法を確立した。タンパク質への融合体として発現されたユビキチンは、そのＧ７６残基が、細胞質プロテアーゼにより切断されるため、本発明者等は、Ｇ７６を、プラスミドベクターにより発現された際に、細胞質切断を回避することが知られているＡ７６に変異させることを目的とした(Rodriguez  F  et  al,  J  Virol,  1997)。
【００７３】
第１の工程において、ユビキチンは、標準的な逆転写ＰＣＲ(Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）、Ｒｏｃｈｅ社)を用い、製品マニュアルにしたがって、マウスＢ１６メラノーマ細胞のＲＮＡ標品から増幅させた。生成するフラグメントの５’−末端においてＢａｍＨＩ制限部位（下線部）を作成するため、３’−末端においてｈＴｙｒとの１５ｂｐのオーバーラップを作成するため、さらに、ユビキチン残基Ｇ７６をＡ７６（下線および全角で示した残基）に変異させるために、プライマーとして、5´-GGG  CGG  ATC  CGA  CCA  TGC  AGA  TCT  TCG  TGA  AGA  CCC  TGAC-3´  および  5´-CAA  AAC  AGC  CAG  GAG  CAT  ＣＧＣ  ACC  TCT  CAG  GCG  AAG  GAC  CAG-3´を選択した。
【００７４】
第２工程において、ヒトチロシナーゼを、標準的なＰＣＲを用いて、プラスミドｐｃＤＮＡＩ−ｈＴｙｒから増幅させた(Drexler  et  al.  Cancer  Res,  1999)。プライマー5´-CGC  CTG  AGA  GGT  ＧＣＧ  ATG  CTC  CTG  GCT  GTT  TTG  TAC  TGC  CTG-  3´  および  5´-GGG  CGT  TTA  AAC  TTA  TAA  ATG  GCT  CTG  ATA  CAA  GCT  GTG  GT-  3´は、５’−末端におけるユビキチンとの１８ｂｐオーバーラップおよび３’−末端におけるＰｍｅＩ制限部位（下線部）を有するｈＴｙｒ  ｃＤＮＡを伸長させた。
【００７５】
得られたフラグメントを精製し（商品名ＰＣＲ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）、これを鋳型として、プライマー5´-GGG  CGG  ATC  CGA  CCA  TGC  AGA  TCT  TCG  TGA  AGA  CCC  TGAC-3´  および  5´-GGG  CGT  TTA  AAC  TTA  TAA  ATG  GCT  CTG  ATA  CAA  GCT  GTG  GT-  3´とともにハイブリダイゼーションＰＣＲ法に用いた。ＭＶＡトランスファーベクターｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５−Ｕｂ−ｈＴｙｒを産生するために、融合ユビキチン／チロシナーゼ遺伝子(Ｕｂ−ｈＴｙｒ)を、ｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５の特有のＢａｍＨＩ／ＰｍｅＩ制限部位にクローン化した。ｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５は、Ｐ７．５  ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅプロモーター、ｌａｃＺ遺伝子配列、Ｋ１Ｌ宿主範囲選択遺伝子、および、ＭＶＡゲノムの欠失IIIに組み込まれるフランキングＭＶＡ−ＤＮＡ配列を含む。
【００７６】
それから、ベクターｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５−Ｕｂ−ｈＴｙｒをエレクトロポレーション法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ(Ｇｉｂｃｏ社)に導入し、アンピシリン耐性により選択した。プラスミドＤＮＡを増幅させ、調製した(商品名Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社)。
【００７７】
［組換え体ウィルスの産生］
組換え体ウィルスは、公知(Staib  et  al.  2004)である、相同組換えおよびその後の一過性な宿主範囲選択により得た。簡潔に述べると、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）の単層を、６ウェル組織培養プレートで８０％コンフルエンスまで増殖させ、続いて、１細胞当たり０．０１の感染効率（ＭＯＩ）でＭＶＡ−ｗｔを感染させた。感染から１時間後の細胞に対し、形質移入剤(商品名ＦｕＧＥＮＥ６、Ｒｏｃｈｅ社)を用い、プラスミドｐIIIｄＨＲ−Ｐ７．５−Ｕｂ−ｈＴｙｒをトランスフェクションした。そして、その細胞を無血清ＲＰＭＩ培地中で８時間インキュベートした。続いて、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中における４８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、凍結および解凍を３回繰り返し、カップソニケーター（ｃｕｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で超音波処理した。遊離したウィルスは、連続的に希釈し、そして、宿主範囲選択のため、ウサギ腎臓細胞(ＲＫ−１３)の感染に用いた。ＤＮＡ抽出およびＰＣＲにより、ＲＫ１３細胞における２〜３回のプラーク継代の後、微視的に典型的なプラークを、組換え遺伝子およびｗｔ−ＤＮＡについてスクリーニングした。組換えＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒを産生するＭＶＡ−ｗｔフリーなプラークを、ＣＥＦ細胞におけるプラーク精製を進めるために用い、これによりＫ１Ｌ宿主範囲遺伝子を除去し、続いて増幅させた。ウィルスのストックを精製し、滴定し、ＭＶＡ−ｗｔの非存在およびＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒの存在下、ＰＣＲにより解析した。
【００７８】
［ウェスタンブロット解析］
ユビキチン化チロシナーゼの発現および分解を、ウェスタンブロット解析により確認した。ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ)、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３)、マウスＴリンパ腫細胞(ＲＭＡ)およびヒト子宮頚部癌細胞(ＨｅＬａ)を、図示した特異的プロテアソーム阻害剤の存在下、ＭＯＩ＝１０の、真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染させた。細胞を図示した時点で回収し、凍結および解凍し、超音波処理した。免疫沈降を、図示したとおり行った（図８参照）。細胞可溶化物は、ＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法により分離し、そして、２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノールを含む緩衝液(ｐＨ８．６)中で、１時間、ニトロセルロース上に電気ブロットした。ブロットは、１％ＢＳＡおよび０．１％ＮＰ４０を含むＰＢＳブロッキング緩衝液中、室温で１時間ブロッキングし、続いて、ブロッキング緩衝液で１００倍希釈したｍＡｂ  Ｔ３１１(Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社)を用いて室温で終夜インキュベートした。そのブロットを０．１％ＮＰ４０を含むＰＢＳで洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体(Ｄｉａｎｏｖａ社)を用いて室温で１時間インキュベートし、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）により可視化した。
【００７９】
［結果］
ＭＶＡ−Ｕｂ−Ｔｙｒにより発現したユビキチン化チロシナーゼは、ＭＶＡ−Ｔｙｒにより発現した真正チロシナーゼよりわずかに大きいサイズであり、８ｋＤのモノユビキチンとの融合を反映した。ＭＶＡ−Ｕｂ−Ｔｙｒにより発現したユビキチン化チロシナーゼは、真正チロシナーゼの発現または検出に影響しない特異的なプロテアソーム阻害剤の存在下でのみ検出可能であった。プロテアソームが効果的に阻害された場合は、前記２つの構築物間において、発現したタンパク質の全量に差はなかった。プロテアソーム阻害がない場合、ユビキチン化チロシナーゼのタンパク質量は、ウェスタンブロット解析における検出レベル未満であり、このことは、チロシナーゼのユビキチン化が急速なプロテアソーム依存性分解につながることを示す。
【００８０】
［免疫沈降］
細胞可溶化物は、ウェスタンブロット解析において前述した通りに調製し、ロッキングデバイスを用いて、０．２μｇのｍＡｂ  Ｃ−１９(商品名、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ハイデルベルク)と４℃で１時間インキュベートした。続いて、注意深く振盪させた２０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇ−Ａｇａｒｏｓｅ(商品名、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ハイデルベルク)を加え、プローブを、ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）を用いて４℃で終夜インキュベートした。
【００８１】
［パルスチェイス実験および放射性免疫沈降法］
パルスチェイス実験は、真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染したＲＭＡ細胞について行った。感染から５時間後の細胞を、ウルトラグルタミン（ultraglutamin）およびピルビン酸を各１％ずつ含むメチオニン／システインフリーダルベッコ（Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ）培地で２０分間飢餓状態にし、続いて、５０μＣｉの３５Ｓ標識化メチオニンおよびシステインで４５分間パルスし、さらに、ＲＰＭＩ培地で追跡した。免疫沈降は、図示した時点において、抗チロシナーゼｍＡｂ  Ｃ−１９により行った。沈殿物は、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして、ホスホイメージャー（商品名）で可視化した。
【００８２】
［結果］
パルスチェイス実験は、ＭＶＡ−ＴｙｒおよびＭＶＡ−Ｕｂ−Ｔｙrにより発現した放射標識タンパク質が等しい量であることを示した。ユビキチン化チロシナーゼは、再度、予期したとおりの増大したサイズを示した。ＭＶＡ−Ｔｙｒにより発現した真正チロシナーゼは、４時間を越える観測期間において安定であった。一方、ＭＶＡ−Ｕｂ−Ｔｙｒにより発現したユビキチン化チロシナーゼは、急速に分解した。ユビキチン化チロシナーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、有意に減少し、３０分未満であると評価することができた。一方、真正チロシナーゼのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、１０時間を越えると評価された（Jimenez  et  al.,  1988）。
【００８３】
［クロム放出法］
ヒトチロシナーゼペプチドエピトープ３６９−３７７に対し反応するＡ＊０２０１拘束性マウスＣＴＬによる特異的溶解は、６時間の［５１Ｃｒ］放出法により測定した。簡潔に述べると、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性Ａ３７５細胞を、ＭＶＡ−ｗｔ、ＭＶＡ−ｈＴｙｒまたはＭＶＡ−Ｕｂ−ＴｙｒによりＭＯＩ＝５で３時間感染させ、１回洗浄し、１００μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４により３７℃で１時間標識し、続いて４回洗浄した。標識した標的細胞は、Ｕ字底９６ウェルプレートに１×１０４個細胞／ウェルで接種し、３７℃で８時間インキュベートした。感染から１５時間後、エフェクター細胞を、標的細胞と、種々のＥ：Ｔ比でインキュベートした。６時間後、１ウェル当たり１００μＬの上清を採取し、特異的な５１Ｃｒ放出を測定した。
【００８４】
［結果］
チロシナーゼのユビキチン化は、ウィルス感染初期の時点においてさえも、ペプチドプロセシングおよび細胞表面における高ＭＨＣクラスＩペプチド密度の有効性の増加を示す、感染した標的細胞のＴｙｒ特異的ＣＴＬ認識の有意な促進をもたらした。
【００８５】
［マウスおよびワクチン投与スケジュール］
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−トランスジェニック、ＨＨＤ−、またはＡ２Ｋｂ−マウスは、病原体のない特別な環境下での室内繁殖により得た。マウスは、指示用量のｒｅｃＭＶＡ（ｉ．ｐ．）またはＤＮＡ（ｉ．ｍ．）によりワクチン投与した。単一免疫化マウスにより誘導される、急性期のチロシナーゼ特異的一次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、ワクチン投与後８日目に解析した。ＭＶＡ−ＭＶＡまたはＤＮＡ−ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化により誘導される急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答のために、マウスを１回刺激し（ｒｅｃＭＶＡ）、刺激から３０日後に追加免疫するか、または、マウスを一週間間隔で２回刺激し（ＤＮＡ）、最初の刺激から３０日後に追加免疫し、そして最終の免疫化から５日後に解析した。マウスを殺し、脾臓を採取し、ＩＣＳまたはテトラマー結合アッセイにより解析した。
【００８６】
［細胞内サイトカイン染色］
ワクチン投与したマウス由来の脾細胞を、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＶＰ３５＃１、Ｂ２２Ｒ、または、対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５でそれぞれ５時間ペプチド刺激した。最後の３時間、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加えた。ＩＦＮγ産生のための細胞内サイトカイン染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（商品名、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用い、製品マニュアルにしたがって行った。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商品名、いずれもＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により取得した。取得データは、ＦＬＯＷＪＯ（商品名、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）ソフトウェアを用いてさらに解析した。
【００８７】
［ＭＨＣテトラマー染色による表現型Ｔ細胞の解析］
キメラＡ２Ｋｂテトラマー試薬は、公知の方法（Busch  et  al.  1998)で調製した。細胞を、生死判別のためにエチジウムモノアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）と、また、表面マーカーＡｂｓの非特異的結合を回避するために抗マウスＦｃ−Ａｂとインキュベートし、３回洗浄し、その後、ｍＡｂｓ抗ＣＤ８α（クローン５３−５．８）および抗ＣＤ６２Ｌ（クローンＭＥＬ−１４）（いずれもＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により、４５分間、ＭＨＣテトラマーおよび表面マーカー染色し、そして、再度３回洗浄した。全ての工程は、４℃で行った。データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商品名、いずれもＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により取得した。取得データは、ＦＬＯＷＪＯ（商品名、Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）ソフトウェアを用いてさらに解析した。
【００８８】
［結果］
ＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒによる追加免疫を通じて誘発させたＴｙｒ−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答は、ＭＶＡ−ｈＴｙｒと比較して、インターフェロンγ産生細胞中では２倍に増加し、テトラマー結合細胞中では３倍まで増加した。ＤＮＡ−またはＭＶＡ−ｈＴｙｒで刺激したマウスにおけるＴｙｒ特異的ＣＴＬリコール応答を最も効果的に促進するＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒの能力は、Ａ２Ｋｂ−およびＨＨＤ−マウスの両方において見られた。注目すべき点として、ＭＶＡ−Ｕｂ−ｈＴｙｒは、わずか１０ｅ５  ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒによる刺激ワクチン投与後でも、強いリコール応答を誘発することが可能であったのに対して、ＭＶＡ−ｈＴｙｒで追加免疫する際に、匹敵する量のインターフェロンγ産生エピトープ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘発するためには、１０ｅ７  ＩＵが必要であった（図９）。本実施例において、ユビキチン化抗原を発現するｒｅｃＭＶＡを二次免疫応答誘発に使用することで、一次免疫のためのウィルス用量を１００分の１まで低減することができる。このデータは、ユビキチン化抗原を発現するｒｅｃＭＶＡを二次免疫応答の追加免疫に使用することで、より強力な標的抗原特異的細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を、有意に低減されたウィルス用量で誘発できることを示す。重要なことに、このことから、刺激における必要用量の低減は、例えば、ＶＶエピトープＢ２２Ｒに対する二次応答において、ＶＶ−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞をも減少させることがさらに示された。
【００８９】
［Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬアッセイ］
未処理マウスの自己脾細胞を調製し、２つのグループに分けた。１つのグループは、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７（１μＭ）でパルスし、続いて、高濃度（５μＭ）の５，６−カルボキシ−フルオレセインスクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で標識した。他のグループは、対照としてＨＥＲ−２エピトープ４３５−４４３（１μＭ）でパルスし、低濃度のＣＦＳＥ（０．５μＭ）で標識した。ＣＦＳＥ標識のために、ＰＢＳ１ｍＬ当たり、ペプチドでパルスした細胞１０７個を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０分間、ＣＦＳＥとインキュベートした。標識反応を停止するために、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを２０ｍＬ加えた。フリーのＣＦＳＥを除くためにＰＢＳで３回洗浄した後、１匹のレシピエントマウス当たり、各グループについて１×１０７個の細胞を、２００μＬのＰＢＳ中において１：１で混合し、尾静脈経由で静脈内注射した。５時間後、前記レシピエントマウスの脾臓および血液を回収し、標的細胞に対する特異的溶解を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析した。少なくとも５，０００個の、ＣＦＳＥで「低度に（ｌｏｗ）」標識された細胞が得られた。特異的ｉｎ  ｖｉｖｏ溶解は、以下の通り計算した。
１００−（［（％  ワクチン投与レスポンダー中におけるＣＦＳＥ「Ｈｉｇｈ」／ワクチン投与レスポンダー中におけるＣＦＳＥ「ｌｏｗ」）／（％  未処理レスポンダー中におけるＣＦＳＥ「ｈｉｇｈ」／未処理レスポンダー中におけるＣＦＳＥ「ｌｏｗ」）］×１００）。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、ワクシニアウィルス特異的プロモーターＰ７．５の制御下で、ユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子を発現する組換えＭＶＡ（ｒｅｃＭＶＡ）構築物を示す。（Ａ）は、ウィルスゲノムへの挿入部位（欠失III）と、相同組換え後に得られたウィルス性中間体および最終構築物とを示す模式的マップである。(Ｂ)は、ハイブリダイゼーションＰＣＲ法（アガロースゲル）後に得られた組換えユビキチン／チロシナーゼ融合遺伝子を示す。対照として、ユビキチンまたはチロシナーゼの一本鎖ＤＮＡフラグメントをも併せて示す。
【図２】図２は、真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染したＢＨＫ細胞におけるヒトチロシナーゼ遺伝子発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図３】図３は、ワクシニアウィルスに特異的なプロモーターＰ７．５(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５(●))またはそのユビキチン化形態(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５（n))の制御下で、ヒトチロシナーゼを発現するｒｅｃＭＶＡに感染した標的細胞の抗原提示能力を示す。
【図４】図４は、真正またはユビキチン化チロシナーゼを産生するｒｅｃＭＶＡウィルスでの単一免疫化により誘導される、急性期のチロシナーゼ特異的一次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示す。（Ａ）脾細胞は、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＶＰ３５＃１または対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５に対して特異的なキメラＡ２Ｋｂ−テトラマーで染色した。(Ｂ）脾細胞は、ヒトチロシナーゼエピトープ３６９−３７７、ＶＶエピトープＶＰ３５＃１または対照としてのＨＥＲ−２エピトープ４３５でそれぞれペプチド刺激した。そして、その脾細胞を、続いて、細胞内インターフェロンγ産生（ＩＣＳ）によりスクリーニングした。
【図５】図５は、非相同的ＤＮＡ−ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化により誘導される急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示す。（Ａ）は、キメラのＡ２Ｋｂテトラマー染色による解析結果であり、(Ｂ）は、ＩＣＳによる解析結果である。
【図６】図６は、非相同的ＭＶＡ−ＭＶＡ  ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ免疫化により誘導される急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示す。
【図７】図７は、真正チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)、ユビキチン化チロシナーゼをコードするｒｅｃＭＶＡ(ＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒ  Ｐ７．５)または親ＭＶＡ(ＭＶＡ−ｗｔ)に感染したＲＭＡ細胞のパルスチェイス実験を示す。
【図８】図８は、感染したＲＭＡおよびＨｅＬａ細胞中でｒｅｃＭＶＡにより発現されるユビキチン化ヒトチロシナーゼの免疫沈降を示す。
【図９】図９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＶＡ−ｕｂｉ／ｈＴｙｒの免疫原性を示す。
【図１０】図１０は、比較的低用量の一次ワクチン投与後に、ＭＶＡ−ｈＴｙｒ追加免疫した動物と比較した、ＭＶＡ−Ｕｂ／ｈＴｙｒの高効率なｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性を示す。ＨＤＤマウスは、１０７（Ａ）または１０６（Ｂ）ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒで刺激し、続いて、刺激後３０日目に、１０７ＩＵのＭＶＡ−ｈＴｙｒまたはＭＶＡ−Ｕｂ／ｈＴｙｒで追加免疫した。
【図１１】図１１は、免疫化に先立ちｒｅｃＭＶＡを形質導入した細胞の免疫化により追加免疫した、急性期のチロシナーゼ特異的二次ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示す。
【図３】
2008528457.tif 000002
【図５】
2008528457.tif 000003
【図６】
2008528457.tif 000004
【図１１】
2008528457.tif 000005
【図１】
2008528457.tif 000006
【図２】
2008528457.tif 000007
【図４】
2008528457.tif 000008
【図７】
2008528457.tif 000009
【図８】
2008528457.tif 000010
【図９】
2008528457.tif 000011
【図１０Ａ】
2008528457.tif 000012
【図１０Ｂ】
2008528457.tif 000013
【配列表】
2008528457000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月14日(2007.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記第１構成要素および第２構成要素を含み、前記第１構成要素および第２構成要素が、任意に、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、キット。
ａ）  １以上の外来タンパク質、もしくは、前記外来タンパク質をコードする核酸、または、それらの機能的部分を含み、前記機能的部分が、野生型タンパク質と同じ機能を有したまま、野生型タンパク質と比較して１以上の置換、挿入および／または欠失を含む第１構成要素；および、
ｂ）  組換え修飾ワクシニアウィルスアンカラ（ＭＶＡ）を含み、前記ＭＶＡは、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、
前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分を含み、前記機能的部分が、野生型タンパク質と同じ機能を有したまま、野生型タンパク質と比較して１以上の置換、挿入および／または欠失を含み、および、１以上の外来タンパク質すなわち天然にＭＶＡの一部として存在しない１以上のタンパク質、またはそれらの機能的部分を含み、前記機能的部分が、野生型タンパク質と同じ機能を有したまま、野生型タンパク質と比較して１以上の置換、挿入および／または欠失を含む、
第２構成要素。
【請求項２】
前記融合タンパク質が、さらに、ユビキチンと前記外来タンパク質との間にリンカーを含む請求項１記載のキット。
【請求項３】
前記外来タンパク質が、治療用ポリペプチド、病原性薬のポリペプチドおよびそれらの機能的部分からなる群に由来する異種タンパク質である請求項１または２記載のキット。
【請求項４】
前記治療用ポリペプチドが、分泌タンパク質からなる群に由来し、例えば、抗体、ケモカイン、サイトカインまたはインターフェロンのポリペプチドである請求項３記載のキット。
【請求項５】
前記病原性薬が、ウィルス、バクテリア、原生動物、および寄生生物、ならびに腫瘍細胞または腫瘍細胞関連抗原およびそれらの機能的部分からなる群に由来する請求項３記載のキット。
【請求項６】
前記ウィルスが、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、デングウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、またはパピローマウィルスからなる群から選択される請求項５記載のキット。
【請求項７】
前記原生動物が、熱帯性マラリア原虫（Plasmodium  falciparum）である請求項５記載のキット。
【請求項８】
前記バクテリアが、結核の原因となるマイコバクテリアである請求項５記載のキット。
【請求項９】
前記腫瘍細胞関連抗原が、
メラノーマ関連分化抗原、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、
癌精巣抗原、例えば、ＭＡＧＥ−１、−２、−３、およびＢＡＧＥ、
ならびに、
腫瘍において過剰発現された非変異型共有抗原、例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、およびｐ５３
からなる群から選択される請求項５記載のキット。
【請求項１０】
前記融合タンパク質および／または外来タンパク質のコード領域が、それぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須部位に隣接しているＤＮＡ配列に隣接する、請求項１から９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記非必須部位が、ＭＶＡゲノム内の欠失IIIの部位である請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
組換えＭＶＡ粒子の感染単位（ＩＵ）として測定された前記第１構成要素の量と前記第２構成要素の量との比が、１：５〜１：２０、好ましくは１：１０である請求項１から１１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
抗癌治療または感染症予防に用いるための、請求項１から１２のいずれか一項に記載したキット。
【請求項１４】
哺乳類のＴ細胞応答の促進方法に使用する医薬の製造のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載したキットの使用であって、
前記Ｔ細胞応答促進方法が下記ａ）〜ｃ）工程を含む使用。
ａ）  請求項１から１２のいずれか一項に記載のキットを準備する工程
ｂ）  一次免疫応答を与えるために有効な量の前記第１構成要素により、哺乳類を刺激する工程
ｃ）  二次免疫応答を与えるために有効な量の前記第２構成要素により、前記哺乳類を追加免疫する工程
【請求項１５】
癌治療用または感染症予防用の医薬を製造するための、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記追加免疫工程を、前記刺激工程の後２〜１２週間、好ましくは４〜８週間に行う、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】
ワクチン投与方法に用いる請求項１４から１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
処置される動物がヒトである請求項１４から１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
組換えＭＶＡの使用であって、
前記組換えＭＶＡは、抗癌治療用または感染症予防用の医薬製造のために、ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔワクチン投与における追加免疫薬として、融合タンパク質をコードする核酸配列を有し、
前記融合タンパク質は、ユビキチンまたはその機能的部分、および、１以上の外来タンパク質すなわち天然にＭＶＡの一部として存在しない１以上のタンパク質、またはその機能的部分を含み、
前記ユビキチンの機能的部分が、野生型タンパク質と同じ機能を有したまま、野生型タンパク質と比較して１以上の置換、挿入および／または欠失を含み、前記異質タンパク質の機能的部分が、野生型タンパク質と同じ機能を有したまま、野生型タンパク質と比較して１以上の置換、挿入および／または欠失を含む、
組換えＭＶＡの使用。
【国際調査報告】
2008528457.tif 000014
2008528457.tif 000015
2008528457.tif 000016
2008528457.tif 000017