(57)【要約】本発明は、ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞からの樹状細胞の培養に関する。ヒトＥＳ細胞は、先ず、ストローマ細胞との同時培養により造血細胞に培養される。ここで造血系統に分化された細胞は、次にＧＭ−ＣＳＦと共に培養されて、骨髄球系前駆細胞の培養を作製する。サイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を伴う骨髄球系前駆細胞の培養により、機能性樹状細胞を生じさせる。樹状細胞は、細胞表面マーカーのそれらの組合せにより示されるような独自の表現型を有する。【選択図】図１Ａ
2008541762.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
（ａ）ヒト胚性幹細胞をマクロファージコロニー刺激因子を発現しないストローマ細胞と同時培養する工程であって、幹細胞が多能性リンパ・造血性始原細胞に分化するように誘導され、そして培養がサイトカインの存在下でない、同時培養する工程、
（ｂ）顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ）と共に始原細胞を培養する工程であって、それにより、骨髄球系前駆細胞の拡大を引き起こす、培養する工程、及び
（ｃ）未成熟樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程
を包含する、ヒト胚性幹細胞を樹状細胞に培養する方法。
【請求項２】
前記の樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程が少なくとも１つのサイトカインと共に前記骨髄球系前駆細胞を培養することを包含する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サイトカインがＩＬ−４、ＴＦＮ−α、ＩＦＮ−α及びＧＭ−ＣＳＦから成る群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ストローマ細胞がＯＰ９細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）の培養が非接着性条件下である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）間に、細胞培養から細胞の凝集塊及び死細胞を分離する工程をさらに包含する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＧＭ−ＳＣＦ及びＴＮＦα又はＧＭ−ＳＣＦ及びＩＮＦαと共に前記骨髄球系前駆細胞を培養し、そして調節性補助細胞を回収する工程を付加的に包含し、前記調節性補助細胞がマーカーＣＤ１ａlow、ＣＤ９、ＣＤ８０low及びＣＤ８６lowにより特性化される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄球系前駆細胞の拡大が無血清条件下である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記培養中の細胞の大多数がＣＤ１ａ＋、ＤＣ−ＳＩＧＮ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ９low、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４０low、ＣＤ８６＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＡＢＣ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋の表現型を有し、そしてＣＤ２０７及びＣＤ２０８に関して陰性である、ヒト樹状細胞の培養。
【請求項１０】
前記細胞の大多数が骨髄球系前駆体の表現型を有し、そして前記細胞の少なくとも９０％がＣＤ４５＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２３lowであり、ＨＬＡ−ＤＲに関して陰性であり、そしてＭＰＯ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５及びＣＤ１６を発現する細胞の亜集団を含む、骨髄球系前駆細胞の培養。
【請求項１１】
前記細胞の大多数がＣＤ１ａlow、ＣＤ８０low、ＣＤ８６low表現型を発現し、そしてナイーブＴ細胞の増殖を誘導する能力減少を示す、ヒト調節性ＤＣの培養。
【請求項１２】
以下の：
ａ．  マーカーＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＨＬＡ−ＤＲhighによって特徴付けられたヒト胚性幹細胞を樹状細胞の一集団に分化させること、
ｂ．  患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、且つ調製すること、及び
ｃ．  細胞性ワクチンが作製されるよう、胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合すること
を包含する、細胞性ワクチンを製造する方法。
【請求項１３】
癌を治療するための樹状細胞ワクチンを製造する方法であって、以下の：
ａ．  ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１６＋細胞の亜集団を含むＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＣＤ１２３low骨髄球系前駆体にヒト胚性幹細胞を分化させること、
ｂ．  免疫原性腫瘍タンパク質又はペプチドを発現するように骨髄球系前駆細胞を変更すること、及び
ｃ．  遺伝子修飾骨髄球系前駆体を免疫原性樹状細胞に分化させること、
を包含する、前記樹状細胞ワクチンを製造する方法。
【請求項１４】
変更骨髄球系前駆細胞がＭＡＧＥ３、ＰＡＰ及びＰＳＭＡから成る群から選択されるペプチドを発現する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
同一細胞株から得られるヒト胚性幹細胞由来組織の拒絶の治療のために用いられ得る寛容原特性を有する樹状細胞を作製する方法であって、以下の：
ａ．  骨髄球系前駆細胞にｈＥＳ細胞を分化させる工程、及び
ｂ．  調節性樹状細胞を獲得する工程であって、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦα又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαと共に骨髄球系前駆体を培養することにより、前記細胞はＣＤ１ａlow、ＣＤ９−、ＣＤ８０low、ＣＤ８６lowにより特性化される、調節性樹状細胞を獲得する工程
を包含する、前記樹状細胞を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／６８６，１４５号（２００５年６月１日提出）（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
未確定
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
胚性幹細胞は、細胞培養中での増殖並びに多能特性を示す種々の系統制限細胞集団への分化をともに可能にする多能性細胞である（Odorico  et  al.，（2001）Stem  Cells  19：193-204）。したがってヒト胚性幹（ＥＳ）細胞は、種々の系統限定経路への拘束及び分化を可能にして、独自の機能を実施する非常に特異的な細胞型を生じる。
【０００４】
一般にＥＳ細胞は高度に均質であり、自己複製のための能力を示し、そして身体中の任意の機能性細胞に分化する能力を有する。この自己複製特性は、適切な条件下で、細胞培養中での非限定性拡張に関する潜在性を伴う長期増殖能力をもたらし得る。さらにヒトＥＳ細胞が望ましくない様式で分化させられる場合、複数の異なる組織型に対するマーカーを発現する細胞の異質集団が得られる、と理解される（国際公開第０１／５１６１６号；Shamblott  et  al.，（2001）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．98：113）。これらの特徴は、これらの細胞を、治療的有用性を有する細胞の産生のための独自の均質出発集団にする。
【０００５】
ヒトＥＳ細胞から種々の子孫細胞型を培養するための方法を開発するために、当該技術分野の研究者により努力がなされてきた。例えば米国特許第６，２８０，７１８号は、ヒトＥＳ細胞をストローマ細胞と共に培養することによるヒトＥＳ細胞を造血細胞に培養する方法を記載する。ヒトＥＳ細胞から子孫細胞型を作製するためのいくつかの方法は、培養中のＥＳ細胞により形成され得る三次元構造である、また、種々の分化子孫系統へのＥＳ細胞の多様な分化を促す胚様体の作製を包含する。子孫系統を作製するための他の方法は、特定方向での分化を助長する因子にＥＳ細胞を曝露するために特定の培地、作用物質又は細胞型と共にヒトＥＳ細胞を培養することによっている。これらの方法はすべて、共通の目的を有しており、これは、科学的調査及び実験のための特定の細胞型に関する、また、いくつかの細胞型に関しては治療目的のためにヒト身体中への最終的移植のための供給源を提供することである。
【０００６】
樹状細胞は、哺乳類免疫系における重要な機能を果たす免疫細胞である。樹状細胞（ここではＤＣと呼ぶ場合もある）は、環境と接触する身体の組織、例えば皮膚、並びに鼻、肺、胃及び腸の内張りにおいて低頻度で存在する強力な抗原提示細胞である。樹状細胞は、抗原を取り込み、そして主要Ｔ細胞応答を誘導して、病原体に対する全身性免疫系応答を開始する。樹状細胞は、樹状細胞形態に特徴的である樹状突起と呼ばれるそれらの長い突起又は腕のために、そのように命名されている。
【０００７】
樹状細胞は、造血系統からの骨髄中で連続的に生成され、そして血中で成熟する。一個体の樹状細胞は、不均一な表現型及び機能を有する。樹状細胞はいくつかの方法で発達し、そして誘導のそれらの系統に応じて、樹状細胞間に差が存在し得る。２つの独立した経路に沿ってＣＤ３４＋造血性始原細胞から発達する樹状細胞は、ランゲルハンス島及び間質性樹状細胞になる。単球由来の又は形質細胞様Ｔ細胞由来の樹状細胞は、それぞれ単球由来ＤＣ又は形質細胞様ＤＣと呼ばれる。それらの細胞起源表現型に基づいて、樹状細胞は普通は広範に２つの主な区分、即ち骨髄球系又はリンパ球系に分類される。骨髄球系ＤＣは共通の骨髄球系前駆体から発達し、一方、リンパ球系ＤＣは共通のリンパ球系前駆体から発達すると考えられるが、しかし共通骨髄球系ＤＣ前駆体はすべての樹状細胞系統を生じる、ということも、目下提案されている。
【０００８】
ヒト未成熟樹状細胞の利用可能性は、抗原プロセシング及び提示の研究のために、並びに免疫及び寛容性の誘導のメカニズムを理解するために有用である。ヒト樹状細胞サブセットの機能的分析は、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び単球からの樹状細胞の分化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の開発により有意に促進された。しかしながらこれら既存プロトコルを用いて、多数のヒト樹状細胞始原細胞を獲得することは労力を要するプロセスであり、ドナーに対する潜在的危険と関連する。樹状細胞生物学の他の側面、例えば樹状細胞個体発生は、早期発生中に組織を獲得するのが困難であるため、ヒトにおいては研究されていない。ヒトＥＳ細胞の出現は、これらの制限を克服する機会を提示する。
【０００９】
機能性樹状細胞は、胚様体を用いて、また、マウスマクロファージコロニー刺激因子欠乏性骨髄ストローマ細胞株ＯＰ９との同時培養により、マウスＥＳ細胞から生成されてきた。ＯＰ９細胞は、ヒトＥＳ細胞から造血細胞を誘導するために用いられ得る、ということを本発明者らは以前に実証した。種々の系統の子孫を生じるそれらの造血細胞の十分な潜在能力は、以前に調査されなかった。
【発明の開示】
【００１０】
（発明の簡単な要約）
一実施態様において、本発明は、ヒト胚性幹細胞を樹状細胞に培養する方法であって、ヒト胚性幹細胞をマクロファージコロニー刺激因子を発現しないストローマ細胞と同時培養する工程であって、幹細胞が多能性リンパ−造血性始原細胞に分化するように誘導され、そして培養がサイトカインの存在下でない、同時培養する工程、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ）と共に始原細胞を培養する工程であって、それにより、骨髄球系前駆細胞の拡大を引き起こす、培養する工程、及び、未成熟樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程を包含する方法である。好ましくは、樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程は、ＩＬ−４、ＴＦＮ−α、ＩＦＮ−α及びＧＭ−ＣＳＦから成る群から選択される少なくとも１つのサイトカインと共に骨髄球系前駆細胞を培養することを包含する。好ましくは、ストローマ細胞はＯＰ９細胞であり、そして工程（ｂ）の培養は非接着性条件下である。
【００１１】
別の実施態様では、本発明はＧＭ−ＳＣＦ及びＴＮＦα又はＧＭ−ＳＣＦ及びＩＮＦαと共に骨髄球系前駆細胞を培養し、且つ調節性補助細胞を回収する工程を包含し、調節性補助細胞がマーカーＣＤ１ａlow、ＣＤ９、ＣＤ８０low及びＣＤ８６lowにより特性化される。
【００１２】
本発明はまた、ヒト樹状細胞の培養であって、当該培養中の細胞の大多数がＣＤ１ａ＋、ＤＣ−ＳＩＧＮ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ９low、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４０low、ＣＤ８６＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＡＢＣ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋の表現型を有し、そしてＣＤ２０７及びＣＤ２０８に関して陰性である培養である。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、当該骨髄球系前駆細胞の培養であって、細胞の大多数が骨髄球系前駆体の表現型を有し、そして当該細胞の少なくとも９０％がＣＤ４５＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１２３lowであり、ＨＬＡ−ＤＲに関して陰性であり、そしてＭＰＯ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５及びＣＤ１６を発現する細胞の亜集団を含む培養である。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、細胞性ワクチンを製造する方法であって、以下の：
マーカーＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＨＬＡ−ＤＲhighによって特徴付けられたヒト胚性幹細胞を樹状細胞の一集団に分化させること、患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、且つ調製すること、及び、細胞性ワクチンが作製されるように、胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合することを包含する方法である。
【００１５】
本発明の他の実施態様は、明細書、特許請求の範囲及び図面を再検討すれば、当業者に明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
樹状細胞はヒトＥＳ細胞から多数作製され得る、ということをここに本発明者らは報告する。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）欠乏性ストローマ細胞株、例えばネズミＯＰ９株との同時培養系は、造血細胞へのヒトＥＳ細胞の分化を促す。これらの造血細胞は樹状細胞を生成する能力を有し、その能力は造血細胞のＧＭ−ＣＳＦ培養により利用される。ヒトＥＳ細胞に由来する樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで自然に産生される間質性ヒト樹状細胞と形態学的、表現型的及び機能的に適合性である。
【００１７】
Slukvin，et  al.，J．Immunology，2006，176：2924-2932は、本発明を記載している本発明者らによる学術論文である。それは以下で詳細に記述されるように、参照により本明細書中で援用される。
【００１８】
全体的方法は、図１Ａ及び図Ｂに模式的に示されており、この場合、当該プロセスは３つの全体的工程に細分化され、以下の実施例における、並びに上記のSlukvin，2006におけるその好ましい形態で実証される。「多能性リンパ造血始原細胞」、「骨髄球系樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞」、「未成熟ＤＣ」、「成熟ＤＣ」及び「調節性ＤＣ」とは、図１Ｂに開示された細胞集団を本発明者らは意味する。
【００１９】
工程１では、ヒトＥＳ細胞は、ストローマ細胞、好ましくはＭ−ＣＳＦ欠乏性ストローマ細胞と同時培養されて、多能性リンパ造血性始原細胞への当該細胞の分化を誘導する。好ましくは、細胞はＯＰ９細胞である。
【００２０】
工程２では、その培養からの解離ＥＳ由来細胞は次に、骨髄球様細胞拡大が起こるように培養される。好ましくはこれは、好ましくは以下の実施例に記載されるように、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と共に細胞を培養することにより実行される。さらにまた好ましくは、この工程は、非接着性条件下で実施される。好ましい非接着性条件は、下記のようにポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ、Sigma）で組織培養フラスコを被覆することを要する。プラスチック容器を被覆するために非接着特性を有することが既知である物質を用いて、又は市販の非接着性組織フラスコを用いて、細胞振盪のような他の手段により、細胞接着を防止することも可能である。
【００２１】
この拡大工程の結果は、骨髄球系前駆体が豊富な培養であり、そしてその培養は次に、工程３に用いられて、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、又は樹状細胞への発達を調整するサイトカインの他の組合せ（下記）と共に無血清培地中で培養することにより、樹状細胞を作製する。
【００２２】
パーコール分離で実行され得る任意の分離手法は、工程２及び３の間で示され、そして樹状細胞生成を誘導する前に培養から細胞の凝集塊及び死細胞を共に除去するために用いられる。
【００２３】
下記の実施例では、サイトカイン付加を伴わずに、Ｍ−ＣＳＦ欠乏性ストローマ細胞と共にヒトＥＳ細胞を同時培養することにより得られる骨髄球系前駆細胞の選択的拡大により、ヒトＥＳ細胞から樹状細胞は生成される。同時培養工程に起因する造血細胞は、骨髄球系前駆細胞に分化するように、次に未成熟樹状細胞に分化するように誘導されるべき応答能を有する。
【００２４】
ＤＣを生成するための本発明者らのプロトコルにおいて重要な工程は、ヒトＥＳ細胞／ＯＰ９同時培養における造血性分化の効率であった。少数のＣＤ３４＋ＣＤ４３＋Ｌｉｎ−多能性リンパ造血性始原細胞（３％未満）は骨髄球系前駆細胞を拡大できず、その後、樹状細胞に分化できなかった。「Ｌｉｎ−」は、これらの始原細胞が、特定の造血系統に拘束されるより成熟した細胞上に存在するＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ及びＨＬＡ−ＤＲマーカーを発現しない、ということを示す。
【００２５】
樹状細胞に分化し得る骨髄球系前駆細胞の拡大を媒介するために顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が用いられる次の工程のために、単離リンパ造血性前駆細胞というよりむしろ、同時培養からの全細胞懸濁液を本発明者らは用いた。本発明者らの見方では骨髄球系前駆細胞にこの拡大を受けさせる最も有効な因子は、本発明者らの見方では骨髄球系樹状細胞前駆体の拡大にほとんど影響を及ぼさない他の因子、例えばＳＣＦ及びＦＬＴ３−Ｌと対比して、ＧＭ−ＣＳＦであった。
【００２６】
ヒトＥＳ細胞由来の、そしてＧＭ−ＣＳＦで拡大される骨髄球系前駆体は、骨髄球様コロニー形成細胞（ＣＦＣ）を、並びに樹状細胞表現型を有するより成熟した細胞の小集団を含有した。しかしながら細胞の大多数は骨髄単球性系統の芽細胞と形態学的に類似し、そしてＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ１２３low及び低レベルのＣＤ１４を発現した。これらの細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ陰性であった。これらの細胞は、ＭＰＯ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５及びＣＤ１６を発現する細胞の亜集団を包含することが判明した。
【００２７】
本発明者らの方法により得られるヒトＥＳ細胞由来の未成熟樹状細胞は、ＣＤ１ａ＋、ＤＣ−ＳＩＧＮ＋、ＣＤ４＋、ＣＤ９low、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４０low、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＨＬＡ−ＡＢＣ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ２０７−及びＣＤ２０８−の表現型（臍帯血又は骨髄ＣＤ３４＋造血性幹細胞から分化された間質性樹状細胞と比較可能な表現型）を有した。好ましくは、これらの未成熟樹状細胞は、この時点での培養細胞の少なくとも７０％を構成する。しかしながらヒトＥＳ由来の樹状細胞の異なる表現型特徴は、ＣＤ１４の同時発現であった。ＣＤ１４発現のレベルは、ＩＬ−４を用いて分化された細胞中で最低であったが、しかしＴＮＦ−αを用いて分化された細胞に関しては実質的により高かった。ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でヒトＣＤ３４＋造血性幹細胞から発達する樹状細胞は、それぞれＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋である表現型を有する中間体を介して、ランゲルハンス細胞並びに皮膚樹上細胞及び間質性樹状細胞に分化する。今までのところ、本発明者らの培養では、ＣＤ１ａ発現は常に、ＣＤ１４の少なくとも低レベルの発現に関連しており、そして本発明者らは、細胞培養中に異なるＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−又はＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋集団を観察していない。したがって、樹状細胞へのヒトＥＳ細胞の分化のために用いられる培養条件は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ４５＋造血性幹細胞からの分化の対応する経路の反復を必要とし得ない独特の経路を用いると思われる。
【００２８】
以下の実施例は、本発明の別の実施態様、少なくとも７０％が成熟ＤＣである細胞の一集団を記載する。
【００２９】
さらに、本発明の別の実施態様は、調節性ＤＣ細胞の一集団である。ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−α又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαと共に培養される骨髄球系ＤＣ前駆細胞は、低刺激活性を有するＣＤ１ａlow、ＣＤ９−、ＣＤ８０low、ＣＤ８６low補助細胞に発達する。これらの細胞は、調節性ＤＣを代表し得る。
【００３０】
Ｍ−ＣＳＦ欠乏性ストローマ細胞（ＯＰ９細胞）と共にここで用いられる同時培養系は、ネズミＥＳ細胞と共に用いられるＯＰ９細胞を基礎にした系と異なる。ここに記載される方法は、マウス系と違って、ＯＰ９細胞との二次同時培養を用いない。最大量の骨髄球系始原細胞が生成され、次に無支持細胞非接着条件でＧＭ−ＣＳＦを有するそれらの始原細胞を拡大すると、同時培養からのヒトＥＳ細胞誘導体を本発明者らは収集した。この技法は、樹状細胞発達のさらなる研究のために有用である樹状細胞前駆体の異なる集団を生じた。
【００３１】
胚体分化中、ＨＬＡ−ＤＲを発現し、そして成人リンパ球の増殖を誘発し得る細胞が生成された、ということが近年示されている（Zhan，et  al.，2004，Lancet  Jul  10；364（9429）：163-71）。しかしながら、この系で生成される細胞の抗原提示特性及び表現型は、実証されなかった。この報告に記載されたようにして得られた細胞はマクロファージであった、という可能性がある。ヒトＥＳ細胞が抗原提示樹状細胞の形態学、表現型及び機能的特性を有する細胞に直接分化され得る、という証拠を、本発明者らの結果は初めて提供する。さらにこのプロセスは、すでに相対的に効率的である。１０7の最初に平板培養されたヒトＥＳ細胞から同時に４×１０7個という多くの樹状細胞を増殖し得た。
【００３２】
樹状細胞は明白な科学的利益及び適用性を有するが、それらはヒト医療における潜在的用途も有する。ｉｎ  ｖｉｖｏで運搬されるペプチドパルス樹状細胞はマウスにおける抗腫瘍免疫応答を効率的に誘導し得た、ということを、いくつかの研究は実証している。これらの試験は、ヒトにおける癌免疫療法のための樹状細胞ベースのワクチンのその後の開発を助長した。これらの技法では、末梢血から単離される未成熟樹状細胞前駆体又は末梢血単核球及びＣＤ３４＋造血系始原細胞から生成される樹状細胞は、樹状細胞ベースのワクチンの臨床試験で用いられる。しかしながらこれらの技法は労力を要し、各ワクチンのための新規の樹状細胞の反復生成を必要とし、そして標準化するのが難しい。胚性幹細胞は、制限なしに拡大され得るし、そして多数の型の細胞に分化し、したがって樹状細胞ワクチンのための細胞の普遍的且つ秤量可能な供給源であり得る。潜在的には、主要ＨＬＡハプロタイプ組合せを有する樹状細胞は、ドナーＭＨＣハプロタイプを整合させるためにヒトＥＳ細胞から獲得され得る。臨床的設定では、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞は、慣用的供給源からの樹状細胞を上回るいくつかの利点を有する。大きな絶対数の樹状細胞は同一ドナー細胞株から生成され、そして同一系統の樹状細胞が多重ワクチン接種のために用いられ得る。ヒトＥＳ細胞からの樹状細胞の誘導は、バイオリアクター技術の履行を伴う標準化のためにあまり労力を要さず、そしてより改善可能であり得る。病原体汚染の低危険性並びに無危険ドナー収集は、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞の臨床的使用の別の重要な利点である。
【００３３】
別の実施態様では、本発明は、樹状細胞の一集団にヒト胚性幹細胞を分化させることを含む、細胞性ワクチンを製造する方法であって、樹状細胞がＣＤ１ａ+、ＣＤ８０+、ＣＤ８６+、ＤＣ−ＳＩＧＮ+、ＨＬＡ−ＤＲhighであり、患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、調製すること、及び胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合することを特徴とする方法である。Gong，et  al.，J．Immunology，2000，165：1705-1711及びParkhurst，et  al.，2003，J．Immunology，170：5317-5325（これらはともに参照により本明細書中で援用される）は、細胞融合のための一般的技法を記載する。
【００３４】
別の実施態様では、本発明は、ヒト胚性幹細胞から分化する樹状細胞を含む癌を治療するための樹状細胞ワクチンの生成方法であって、樹状細胞が同種異系癌細胞と融合されている、方法である。腫瘍ワクチンを作製する種々の方法を、当業者は理解及び認識し得る。例えば米国特許出願公開ＵＳ２００２／０１３１９６２Ａ１号及び同第ＵＳ２００６／００６３２５５Ａ１号は、いくつかの方法を開示する。
【００３５】
別の実施態様では、本発明は、癌を治療するための樹状細胞ワクチンを製造する方法であって、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１６を発現する細胞の亜集団を含むＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＣＤ１２３low骨髄球系前駆体にヒト胚性幹細胞を分化させること、免疫原性腫瘍タンパク質／ペプチドを発現するよう骨髄球系前駆細胞を遺伝子的に変更すること、及び遺伝子修飾骨髄球系前駆体を免疫原性樹状細胞に分化させることを包含する方法である。例えば、免疫応答の標的である腫瘍細胞で細胞をトランスフェクトすることが望まれ得る。例えば、黒色腫抗原−３（ＭＡＧＥ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）で細胞をトランスフェクトすることが望まれ得る。
【００３６】
別の実施態様では、本発明は、同一細胞株から得られるヒト胚性幹細胞由来組織の拒絶の治療のために用いられ得る寛容原特性を有する樹状細胞を作製する方法である。「寛容原特性」とは、細胞が宿主免疫系により移植片の拒絶を抑制することを意味する。細胞は、移植組織に対する宿主の有害免疫応答を下向き調節する。この目的のために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−α又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＦＮαと共に培養することにより、ｈＥＳ細胞由来の骨髄球系前駆体は調節性ＤＣに分化するよう誘導される。
【実施例】
【００３７】
実験プロトコル及び結果
ＧＭ−ＣＳＦを伴うヒトＥＳ細胞由来の骨髄球系始原細胞の拡大
近年、本発明では、フィーダー細胞としてマウスＭ−ＣＳＦ欠乏性骨髄ストローマ細胞株ＯＰ９の細胞を用いて、ヒトＥＳ細胞からの造血性分化のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系（ここで記載されるプロトコルを開始するために用いられる工程）を開発した。ヒトＥＳ細胞をＯＰ９細胞と同時培養し、コロニー形成細胞で高度に濃化され、そして赤血球、骨髄球並びにリンパ球系始原細胞を含有するＣＤ３４＋細胞に分化し、そしてＣＤ３４＋ＣＤ４３＋Ｌｉｎ−多能性造血性始原細胞の一集団を包含するようにした。この工程は、サイトカイン付加を必要としない。分化の９〜１０日目に、ＯＰ９同時培養系中の骨髄球系コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の最大拡大を観察した。骨髄球系始原細胞の選択的拡大を誘導するために、ヒトＥＳ細胞／ＯＰ９同時培養の９又は１０日目から生じる細胞を収穫し、そしてＧＭ−ＣＳＦの存在下で非接着性条件下で細胞を培養した。培養開始時に、大型細胞の集合体が形成された。ＧＭ−ＣＳＦ培養の開始後約３日目に、個々の細胞が出現し、迅速に拡大した。ＧＭ−ＣＳＦを伴う培養の９〜１０日後に、且つパーコール分離による凝集塊及び死細胞の除去後に、９０％がＣＤ４５陽性である細胞の一集団を得た。これらのＣＤ４５＋細胞の９０％より多くが、細胞内ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ、骨髄性細胞のマーカー）を含有したが、しかしＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、リンパ球系細胞のマーカー）を含有せず、そして骨髄球系始原細胞のマーカーＣＤ３３を発現した。さらに、これらのヒトＥＳ細胞由来の骨髄球系細胞はＣＤ４陽性であり、そしてＩＬ−３受容体α鎖ＣＤ１２３を弱く発現した。これらの細胞の５０％より多くが、ＣＤ１６、ＣＤ１５、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃを発現した（表２）。形態学的には、ＧＭ−ＣＳＦ拡大細胞は、多裂片化又は円形核、並びに骨髄骨髄性単球系前駆細胞（bone  marrow  myelomonocytic  precursors）に類似する可視的粒子を伴わない中等度量の灰色がかった、時折空胞化した細胞質（図２Ｂ）を有した。ＧＭ−ＣＳＦ拡大細胞のいくつかは骨髄球系ＣＦＣ能力を保有したが、しかし赤血球系又は多系統ＣＦＣ能力は検出されなかった（図２Ｃ）。さらに、中等度レベルのＣＤ１４、低レベルのＣＤ１ａ並びにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６同時刺激分子を発現する成熟の進行段階で、細胞の相対的小集団が存在した（表２）。
【００３８】
末梢血ＣＤ３４＋細胞上の皮膚リンパ球関連抗原（ＣＬＡ）発現はランゲルハンス細胞にさらに分化する始原細胞を明らかにするが、一方、ＣＤ３４＋ＣＬＡ−細胞は間質性ＤＣ様細胞を生じる。ＯＰ９同時培養又は単離されたヒトＥＳ細胞由来ＣＤ３４＋細胞から得られる全体的細胞集団では、有意のＣＬＡ発現は検出されなかった。しかしながらＣＬＡ発現は、ＧＭ−ＣＳＦを用いて生成される骨髄球系始原細胞の小サブセットで見出された。
【００３９】
ＧＭ−ＳＣＦは、骨髄球系前駆細胞の拡大において最も重要な因子であると思われた。別個に、ＧＭ−ＳＣＦ補足培養へのＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ又はＳＣＦ＋ＦＬＴ３Ｌの付加は、１０日間の培養中の総細胞産出量及び骨髄球系ＣＦＣ数にほとんど影響を及ぼさなかった（表１）。これらのデータは、ＧＭ−ＣＳＦを有するＯＰ９系で生成される分化されたヒトＥＳ細胞の培養は主に、ＭＰＯ、Ｍ−ＣＳＦＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１５及びＣＤ１６を発現する細胞の亜集団を含むＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＣＤ１２３low骨髄球系前駆細胞の独特の集団に拡大する、ということを実証する。
【００４０】
ヒトＥＳ細胞由来の骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化
骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化を誘導するために、ＧＭ−ＣＳＦを有する前駆細胞並びにＩＬ−４、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−αの種々の組合せの培養を培養した。典型的実験では、ＧＭ−ＳＣＦ及びＩＬ−４を伴う７〜１０日の培養後、細胞のほとんどは凝集塊に見えた。さらに、明瞭な樹状突起を有する個々の遊走細胞が培養中に出現した。形態学的には、これらの細胞は大型であり、高い核細胞質比を有し、そして卵形又は腎臓形の核並びに非常に細い細胞質突起を有する非空胞化の、時として粒状の細胞質を有した（図３Ａ及び図Ｃ）。サイズ及び粒状度のフローサイトメトリー分析に基づいて、２つの細胞集団が観察された（図３Ｄ）：Ｒ１（高散乱プロファイル及び樹状細胞表現型を有する細胞）；並びにＲ２（低散乱プロファイルを有し、樹状細胞マーカーを欠き、そして第２工程で生成される骨髄球系始原細胞と表現型的により類似する細胞）。Ｒ１依存性細胞(R1  gated  cell)として同定される樹状細胞は、ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０及びＣＤ８６を発現した。さらにこれらの細胞は、低レベルのＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２３及びＣＤ４０を発現した。ＣＤ１４発現は非常に弱かったが、しかし検出可能であり、ＣＤ１４陽性細胞のほとんどがＣＤ１ａを同時発現した。しかしながらすべての細胞は、ＣＤ８３発現を欠いていた。
【００４１】
ＩＬ−４のほかに、骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化は、他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−α及びＩＦＮ−α又はそれらの組合せを用いることにより達成された。しかしながらＴＮＦ−αを有する培養中の細胞のほとんどは、低レベルのＣＤ１ａ、高レベルのＣＤ１４を同時発現し、ＣＤ９の発現を欠いていた。さらに、ＴＮＦ−αを有する培養中では、細胞は同時刺激性分子の発現を下向き調節した。予測どおり、これらの細胞培養へのＩＦＮ−αの付加は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現増大を生じた。しかしながらＩＦＮ−α培養は、ＣＤ１ａ＋細胞の数の低減を、ＣＤ１４発現の低減と同様に生じた。単球−ＤＣ分化経路と同様に、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞上でのＤＣ−ＳＩＧＮの発現は、主にＩＬ−４に依存した。細胞収率、表現型及び機能特性（表１及び表２）に基づいて、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の組合せはヒトＥＳ細胞からの機能性樹状細胞の生成のための最良の条件を提供すると結論づけた。
【００４２】
免疫細胞化学により、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞はＣＤ６８に関して陽性であったが、しかしそれほど強くはなく、非常に低レベルの細胞質内ＣＤ８３（しかし膜ＣＤ８３ではない）を発現した。成熟樹状細胞の高度選択的マーカーであることが示されているアクチン結合タンパク質であるファシンは、検出されなかった。このことから、今までに記載されたプロセスにより生成される樹状細胞は未成熟であると結論づけた。これらの未成熟樹状細胞がさらに成熟され得るか否かを調べるために、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７で上記プロトコルから生成される細胞を処理した。この処理は、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＤＲ発現の上向き調節を生じた。細胞質内ＣＤ６８染色の強度は実質的に増大し、そしてＣＤ６８の核周囲濃縮はそのように産生された細胞中で明白であった。さらに、いくつかの細胞はファシン陽性になった。ＬＰＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ２及びＩＬ−６は、ｈＥＳ細胞由来ＤＣの成熟の誘導において効率的ではなかった。合わせて考えると、これらのデータは、典型的樹状細胞形態及び表現型を有する細胞がヒトＥＳ細胞から生成され得る、ということを実証する。
【００４３】
樹状細胞は同種異系Ｔ細胞応答を誘導し、抗原プロセシング及び提示を可能にし得る
次に、本発明のヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞が樹状細胞として十分に機能性であるか否かを確定するために、研究した。ＤＱ卵白アルブミン検定により確定した場合、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞は抗原を取り込み、プロセシングすることができた。ＧＭ−ＳＣＦ及びＩＬ−４で処理された培養中で得られる細胞は抗原プロセシングにおいて最も効率的であったが、一方、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを用いて分化された樹状細胞は低効率であった。
【００４４】
樹状細胞の機能性のホールマークは、ナイーブ細胞を刺激するそれらの能力である。本発明の試験によれば、ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞は、完全にナイーブである臍帯血Ｔ細胞を誘発することができた。付加されたＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を有する培養中で生成された未成熟樹状細胞は最も強力な刺激細胞であったが、一方、細胞培養へのＴＮＦ−αの付加は、ナイーブＴリンパ球を刺激する細胞の能力を有意に減少した。さらに、樹状細胞は成人ドナーＴ細胞を刺激することができた。
【００４５】
ＭＨＣクラスＩ経路により抗原を提示する樹状細胞の能力を評価するために、ＨＬＡ−Ａ０２  Ｈ１細胞株由来の樹状細胞を不活性化ＣＭＶウイルスでパルス標識して、ＣＭＶｐｐ６５ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドに対する特異性を有するＨＬＡ−Ａ０２０１制限ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローンＨＬＡを刺激する細胞の能力を評価した。Ｔ細胞への樹状細胞の付加は同種異系応答を誘導するが、Ｔ細胞による応答の有意の増大は、細胞がＣＭＶパルス化Ｈ１由来の樹状細胞で刺激された場合に得られた（表３）。全体的に見て、これらのデータは、樹状細胞に特徴的な表現型、形態学及び独特の抗原提示特性を有する細胞の生成を本発明の培養系が可能にする、ということを実証する。
【００４６】
方法及び材料
細胞株、サイトカイン及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）
マウス胚性繊維芽細胞での毎週の継代により、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１（３２〜５１継代）及びＨ９（４０〜４４継代）を、非分化状態に保持した。マウス骨髄ストローマ細胞株ＯＰ９は、Toru  Nakano博士（Research  Institute  for  Microbial  Diseases，Osaka  University，Japan）から入手した。この細胞株を、２０％限定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；HyClone  Laboratories，Logan，UT）を補足したα−ＭＥＭ（Invitrogen，Carlsbad，CA）から成るＯＰ９増殖培地中で、ゼラチン化１０ｃｍ皿（BD  Bioscience，Bedford，MA）上で保持した。滅菌組換え内毒素及び無発熱物質ＳＣＦ、ＦＬＴ３−Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４は、Peprotech（Rocky  Hill，NJ）から、ＧＭ−ＳＣＦはBerlex  Laboratories（Richmond，CA）から、そしてＩＦＮ−αはSchering  Corporation（Kenilworth，NJ）から入手した。ネズミ細胞との検出可能な交差反応性を有さない以下のマウス抗ヒトｍＡｂは、フローサイトメトリー分析のために用いられている：ＣＤ１ａ−ＰＥ、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６−ＰＥ、ＣＤ３３−ＦＩＴＣ、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ８６−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）−ＦＩＴＣ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）−ＦＩＴＣ（Caltag，Burlingame，CA）；ＣＤ９−ＰＥ、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ、ＣＤ４０−ＰＥ、ＣＤ４３−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）−ＦＩＴＣ、ＣＬＡ−ＦＩＴＣ（BD  Pharmingen）；ＣＤ１１ｃ−ＰＥ、ＣＤ３４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Becton  Dickinson  Immunocytometry  Systems［BDIS］，San  Jose，CA）；ＣＤ８３−ＦＩＴＣ、ＣＤ２０８（ＤＣ−ＬＡＭＰ；Beckman  Coulter，Miami，FL）；ＣＤ１２３−ＦＩＴＣ（Miltenyi  Biotech，Aubum，CA）；ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＦＩＴＣ（Sigma，St．Louis，MO）；ＣＤ２０７（Vector  Laboratories）。
【００４７】
ＯＰ９細胞との同時培養におけるヒトＥＳ細胞の造血系分化
造血細胞へのヒトＥＳ細胞分化の誘導を、上述されたように実行した（Vodyanik，et  al．2005．Blood  105：617）（参照により本明細書中で援用される）。要するに、非分化ヒトＥＳ細胞を、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Invitrogen）で処理することにより収穫し、１０％ＦＢＳ（HyClone）及び１００μＭのメチルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＭＴＧ）（Sigma，St．Louis，MO）を補足したα−ＭＥＭ中の１０ｃｍ皿当たりの１．５×１０6／２０ｍｌのおよその密度でＯＰ９培養に付加した。サイトカインを付加せずに４、６及び８日目に培地を半分交換しながら、ヒトＥＳ細胞／ＯＰ９同時培養を９〜１０日間インキュベートした。ヒトＥＳ細胞はその後、造血細胞に分化した。
【００４８】
ヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞の生成
ヒトＥＳ細胞からの樹状細胞の生成のために用いられるプロトコルの模式図を、図１に示す。ヒトＥＳ細胞／ＯＰ９同時培養の９〜１０日目に、コラゲナーゼＩＶ（Invitrogen；α−ＭＥＭ中１ｍｇ／ｍｌ）で３７℃で２０分間処理し、その後、０．０５％トリプシン−０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Invitrogen）で３７℃で１５分間処理することにより、ヒトＥＳ細胞の分化誘導体を収穫した。ＦＢＳによるトリプシン不活性化後、これらの細胞を、１０％ＦＢＳ（HyClone）及び１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補足したα−ＭＥＭ中に再懸濁し、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ、Sigma）で被覆した組織培養フラスコ（BD  Bioscience）中に移して、細胞接着を防止した。次に細胞を８〜１０日間培養して、４日ごとに培地を半分取り替えながら、樹状細胞前駆体を拡大した。これらのヒトＥＳ細胞由来の樹状細胞前駆体の拡大に及ぼすＳＣＦ及びＦＬＴ３−Ｌの影響を評価するために、（１）１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ；（２）１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＳＣＦ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３−Ｌ；又は（３）１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＳＣＦ＋２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３−Ｌの存在下で、細胞を培養した。その後、細胞を２０％パーコール（Sigma）上で回転させて、死細胞及び細胞集合体を除去した。第３工程として、脂質混合物１（Sigma）及び１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補足したＳｔｅｍＳｐａｎ登録商標無血清拡大培地（ＳＦＥＭ；Stem  Cell  Technologies，Vancouver，Canada）においてＨＥＭＡ被覆フラスコ中で、以下のサイトカイン：（１）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４；（２）２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α；（３）１０4Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−α；及び（４）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４＋２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを付加して、パーコール単離細胞を、７〜９日間培養した。細胞は４日ごとに半量の培地を取り替えながら７〜９日間培養した。樹状細胞をさらに成熟させるために、４００ｎｇ／ｍｌのＡ２３１８７カルシウムイオノフォア（Sigma）を含有するＳＦＥＭ培地中で工程３で得られた細胞を４８時間培養した。
【００４９】
フローサイトメトリー分析
２％正常マウス血清（Sigma）を補足したＰＢＳ−ＦＢＳ（０．０５％アジ化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ及び２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中で細胞を調製し、ｍＡｂの組合せで標識した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（BDIS）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔ獲得ソフトウエア（BDIS）と共に用いて、試料を分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Tree  Star，Inc.，Ashland，OR）により、リスト・モード・ファイルを分析した。適切なアイソタイプ整合対照ｍＡｂ（BD  Pharmingen）を用いた対照染色が、陽性染色及びバックグラウンド線形スケール平均蛍光強度（ＭＦＩ）値に関する閾値を確立するように含まれた。陽性細胞のパーセンテージ（％）は、（特定ｍＡｂで染色された陽性細胞の％）−（対応するアイソタイプ対照によるバックグラウンド染色の％）として算定された。ΔＭＦＩは、（特定ｍＡｂで染色された細胞のＭＦＩ）−（対応するアイソタイプ対照で染色された細胞のＭＦＩ）として算定された。線形スケールＭＦＩは、所定の細胞に関する相対抗原密度の指標として用いられた。
【００５０】
抗原プロセシング検定
タンパク質分解時に明緑色蛍光を示す卵白アルブミンの自己消光型接合体（ＤＱ−ＯＶＡ；Molecular  Probes，Eugene，OR）を用いて、卵白アルブミン（ＯＡ）プロセシング検定を実施した。図１の工程３で得られた樹状細胞を、２％ＦＢＳ及び１％の非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Invitrogen）中で、１００μｇ／ｍｌのＤＱ−ＯＶＡと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。４℃でインキュベートした細胞を、バックグラウンド蛍光に関する対照として用いた。フローサイトメトリーにより、ＯＶＡタンパク質分解を評価した。
【００５１】
クローン原性始原細胞検定
１ｍｌ／皿のＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦを、１％メチルセルロース、３０％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）及び３単位／ｍｌのエリスロポイエチンを含有するＨ４４３５半固体培地（Stem  Cell  Technologies）と共に用いて、３５ｍｍ低接着性プラスチック皿（Stem  Cell  Technologies）中で、造血コロニー原性検定を実施した。全コロニー原性始原細胞検定を二重反復実験で実施し、そして、赤血球系（Ｅ−ＣＦＣ）、顆粒球、マクロファージ、巨核球（ＧＥＭＭ−ＣＦＣ）、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ−ＣＦＣ）、顆粒球（Ｇ−ＣＦＣ）及びマクロファージ（Ｍ−ＣＦＣ）としてそれらのコロニー形態により、１４〜２１日のインキュベーション後に、ＣＦＣをスコアした。１０6総細胞当たりで、ＣＦＣの頻度を算定した。
【００５２】
同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７での密度勾配遠心分離により、健常な実験室有志から得た末梢血試料から、成人単核細胞を単離した。臍帯血単核細胞もまた、Cambrex  Bio  Science（Walkersville，MD）から購入した。単核細胞をプラスチック接着により単球から除去し、そして応答細胞として用いた。５％ヒトＡＢ血清（Sigma）を含有するＲＰＰＭＩ  １６４０中の９６ウエル平底プレート（Corning）中で６日間、段階的数（１×１０3〜３×１０4／ウエル）の照射（３５Ｇｙ）刺激細胞を１×１０5応答細胞と同時培養した。インキュベートの最後の１６時間で［３Ｈ］チミジン（Sigma）を加えた（１μＣｉ／ウエル）細胞をガラス繊維フィルター上に収穫し、［３Ｈ］チミジンの取り込みをシンチレーション計数により測定した。
【００５３】
理解を容易にする目的のために図解及び実施例により本発明を上記で多少詳細に記載してきたが、本発明の或る種の適応は当業者にとって慣例的な最適化の問題であり、そして本発明の精神又は添付の特許請求の範囲を逸脱しない限り実行され得る、と理解される。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
【表２】
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【００５６】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】本発明の全体的方法の模式図である。
【図１Ｂ】本発明の全体的方法の模式図である。
【図２】図１の工程２で生成される骨髄球系前駆細胞の形態学及び表現型特徴を示す。図２Ａは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で増殖中の分化ヒトＥＳ細胞の位相差顕微鏡写真である。図２Ｂは、その培養から得られた細胞のライト染色サイトスピンである。図２Ｃは、拡大細胞のコロニー形成細胞（ＣＦＣ）潜在能を図示する（数値は５つの実験の平均である）。図２Ｄは、ＧＭ−ＣＳＦ拡大ヒトＥＳ細胞における表面及び細胞内骨髄球系マーカーの発現を実証する代表的実験からのデータのグラフである。
【図３】ｈＥＳ細胞由来ＤＳの形態学及び光散乱特性を示す。（Ａ）培養の位相差顕微鏡写真及び（Ｃ）分化Ｈ１細胞のライト染色塗抹は、多数の細長い細胞質突起（「ベール（veils）」）を実証する；（Ａ）バーは１５μｍであり、そして（Ｃ）バーは４０μｍである。（Ｂ）平底超低接着プレート上で培養される場合、細胞は長い樹状突起を形成する；バーは２５μｍである。（Ｄ）ｈＥＳ細胞由来の骨髄球系始原細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に９日間培養後に工程３で得られた細胞の光散乱特性及び表現型。Ｈ１細胞株を用いた代表的実験からの表現型分析は、高散乱プロファイルを有するＲ１依存性細胞はＣＤ１ａ及び弱ＣＤ１４を発現する、ということを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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