(57)【要約】  本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野に関連する。とりわけ本発明は、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、該抗原がそれぞれＶＬＰに結合されたＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片である組成物を提供する。また、本発明は、前述の組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、特に肥満の治療及び／又は予防と特に有効な免疫応答、特に抗体応答を誘導することによる肥満の治療及び／又は予防のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、示した範囲内の自己特異的な免疫応答を効率よく誘発するために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している、組成物。
【請求項２】
前記ＧＩＰタンパク質が、
(a) 配列番号２２；
(b) 配列番号２３；
(c) 配列番号２４；
(d) 配列番号２５；
(e) 配列番号２６；
(f) 配列番号６３；
(g) 任意の他の動物からのＧＩＰ相当オルソログ；及び
(h) (a)から(f)の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＧＩＰ断片が、配列番号２２のアミノ酸残基７−１０(配列番号６４)に相同なアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＧＩＰ断片が、
(a) 配列番号２７；
(b) 配列番号２９；
(c) 配列番号３２；
(d) 配列番号４５；及び
(e) 配列番号２７、２９、３２及び４５の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＧＩＰ断片が、
(a) 配列番号２８；
(b) 配列番号３１；
(c) 配列番号４３；
(d) 配列番号４４；
(e) 配列番号６８；及び
(f) 配列番号２８、３１、４３、４４及び６８の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＶＬＰがＲＮＡファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有してなる、請求項１ないし５の何れか一に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＲＮＡファージがＲＮＡファージ Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第一付着部位が、少なくとも一の共有結合を介して前記第二付着部位に結合しており、好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項１ないし７の何れか一に記載の組成物。
【請求項９】
前記第一付着部位が、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含有する、請求項１ないし８の何れか一に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二付着部位がスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含有する、請求項１ないし９の何れか一に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片が、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体ないしはその断片のＮ末端又はＣ末端に融合する、請求項１ないし８の何れか一に記載の組成物。
【請求項１２】
さらにリンカーを含有する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の組成物。
【請求項１３】
(a) それぞれ少なくとも一の第一付着部位を有する少なくとも一の第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)及び少なくとも一の第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と
(b) それぞれ少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の第一抗原及び少なくとも一の第二抗原、
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、該少なくとも一の第二抗原が、(i) グレリンないしはグレリンペプチド；(ii) ニコチン、コチニンないしはノルニコチン；及び(iii) 第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片からなる群から選択される分子であるかその分子を含み、該第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片が第一ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なるものであって；
該少なくとも一の第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と該少なくとも一の第一抗原が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しており、該少なくとも一の第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と該少なくとも一の第二抗原が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している、組成物。
【請求項１４】
前記第一ウイルス様粒子及び／又は前記第二ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有してなり、好ましくは該ＲＮＡファージがＱβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第二のＧＩＰ断片が、
(a) 配列番号２７；
(b) 配列番号２９；
(c) 配列番号３２；
(d) 配列番号４５；
(e) 配列番号２８；
(f) 配列番号３１；
(g) 配列番号４４；
(h) 配列番号６８；及び
(i) 配列番号２７−２９、３１、３２、４４、６８及び４５の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記グレリンないしはグレリンペプチドが、
(a) 配列番号３３；
(b) 配列番号３５；
(c) 配列番号４０；
(d) 配列番号３６；
(e) 配列番号３７；
(f) 配列番号３８；
(g) 配列番号４６ (GSSFLSPEHQKLQ)；及び
(h) 配列番号４７ (GSSFLSPEHQKVQ)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第二抗原がＯ-スクシニル-３'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物を具備してなるキットであって、
該第一組成物が、
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有する第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の第一抗原；
を含んでなり、該少なくとも一の第一抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものであり；
該第二組成物が、
(c) 少なくとも一の第一付着部位を有する第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；
(d) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の第二抗原；
を含んでなり、該少なくとも一の第二抗原が、(i) グレリンないしはグレリンペプチド；(ii) ニコチン、コチニンないしはノルニコチン；及び(iii) 第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片からなる群から選択される分子であるかその分子を含み、該第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片が第一組成物に含有される第一ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なり；(c)と(d)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものである、キット。
【請求項１９】
前記第一ウイルス様粒子及び／又は前記第二ウイルス様粒子が、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有してなり、好ましくは該ＲＮＡファージがＱβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第二のＧＩＰ断片が、
(a) 配列番号２７；
(b) 配列番号２９；
(c) 配列番号３２；
(d) 配列番号４５；
(e) 配列番号２８；
(f) 配列番号３１；
(g) 配列番号４４；
(h) 配列番号６８；及び
(i) 配列番号２７−２９、３１、３２、４４、６８及び４５の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記グレリンないしはグレリンペプチドが、
(i) 配列番号３３；
(j) 配列番号３５；
(k) 配列番号４０；
(l) 配列番号３６
(m) 配列番号３７；
(n) 配列番号３８；
(o) 配列番号４６ (GSSFLSPEHQKLQ)；
(p) 配列番号４７ (GSSFLSPEHQKVQ)；及び
(q) 配列番号３３、３５−３８、４０、４６又は４７に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又はより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記第二抗原がＯ-スクシニル-３'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２３】
請求項１ないし１２の何れか一に記載の組成物又は請求項１３ないし１７の何れか一に記載の組成物を含有してなるワクチン組成物。
【請求項２４】
動物、好ましくはイヌ、又はネコ、好ましくは愛玩用ネコ、又はヒトに請求項２３に記載のワクチン組成物が投与されることを含む、免疫化方法。
【請求項２５】
(a) 請求項１ないし１２の何れか一に記載の組成物又は請求項１３ないし１７の何れか一に記載の組成物、と
(b) 受容可能な薬剤的担体
を含んでなる薬剤組成物。
【請求項２６】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給し
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片である、少なくとも一の抗原を供給し、
(c) 該ＶＬＰを該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原に結合して該組成物を産生させる
ことを含む、請求項１ないし１２の何れか一に記載の組成物の産生方法。
【請求項２７】
肥満の治療及び／又は予防のための医薬の製造方法における、請求項１ないし１２の何れか一に記載の組成物又は請求項１３ないし１７の何れか一に記載の組成物の使用。
【請求項２８】
動物、好ましくは愛玩用ネコないしはイヌ、又はヒトに請求項２３に記載のワクチン組成物が投与されることを含む、肥満の治療又は予防の方法。
【請求項２９】
請求項１８ないし２２の何れか一に記載のキットの少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物が動物、好ましくは愛玩用ネコないしはイヌ、又はヒトに投与されることを含む、動物の肥満の治療及び／又は予防の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも一の第一組成物と前記少なくとも一の第二組成物が同時に投与される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の背景)
発明の分野
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野に関連する。とりわけ本発明は、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、該抗原がそれぞれＶＬＰに結合されたＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片である組成物を提供する。
また、本発明は、前述の組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、特に肥満の治療及び／又は予防と特に有効な免疫応答、特に抗体応答を誘導することによる肥満の治療及び／又は予防のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、示した範囲内の自己特異的な免疫応答を効率よく誘発するために特に有用である。
【０００２】
関連技術
グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド(ＧＩＰ、別名胃酸分泌抑制ポリペプチド)は、胃壁に並ぶ内分泌性Ｋ細胞から食事の間に放出される胃腸ホルモンである。血液に放出されるＧＩＰの量は、主に食事内容物に依存していて、主に摂取された脂肪、グルコース又はアミノ酸の吸収により誘導される(Elliott, R.M: 等, (1993), J. Endocrinol. 138, 159-166、Lardinois, C.K. 等, (1988), J Am Coll Nutr. 7(3), 241-7)。ＧＩＰは急速に膵臓β細胞に作用して、インスリンの放出を刺激し、それによって、組織へのグルコースのインスリン媒介性の取り込みが促される(Dupre J. 等, (1973) J. Clin. Endocrinol. Metab. 37, 826-828)。ＧＩＰは、β細胞上に発現される７膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターに結合することによって、この効果を達成する。ＧＩＰが一度結合すると、これらのレセプターはアデニリルシクラーゼおよび他のシグナル伝達経路を活性化し、最終的に細胞内Ｃａ２＋濃度およびインスリンエキソサイトーシスが亢進する(Lu, M. 等, (1993), Encocrinology 133, 2861-2870)。脂肪及びグルコース取り込みに加えて、炭水化物の取り込みもＧＩＰ放出を刺激する(Elliott, R.M: 等, (1993), J. Endocrinol. 138, 159-166)。
ＧＩＰは、エンテロインスラーアクシスのインクレチン因子の一つであると考えられる。抗ＧＩＰ抗体はグルコース誘導性インスリン分泌に対するＧＩＰの作用をブロックすることが示されている(Ebert 等, Endocrinology (1982) 111: 1601)。さらに、ＧＩＰはまた、脂肪細胞に直接作用するとみなされており、それはＧＩＰレセプターを発現する(Yip 等, Endocrinology (1998) 139: 4004)。
【０００３】
そのインスリン分泌性活性のために、２型糖尿病の潜在的な治療法としてホルモンを利用することは注目すべき関心事となっている(EP171465,、国際公開公報03/030946)。さらに、ＧＩＰレセプターノックアウトマウス(ＧＩＰＲ-/-)が、グルコース経口負荷の後に、より高い血中グルコースレベルを有し、初めのインスリン応答が障害されていることが最近示された。インスリン分泌が代償的に高くなるために、ＧＩＰＲ+/+マウスにおいて、摂取後の血中グルコースレベルは高脂肪食によって、増加しないが、ＧＩＰＲ-/-マウスでは、このような促進が起こらないために血中グルコースレベルは顕著に増加する。したがって、このエンテロインスラーアクシスの欠損により、糖尿病の病理が発症しうる(Miyawaki K. 等, (1999) PNAS 96:26, 14843-14847)。
同じ研究グループは後に、高脂肪食を与えられる野生型マウスがインスリン耐性を有する極端な内臓及び皮下脂肪の堆積とＧＩＰの分泌過多を表すことを示した。対照的に、高脂肪食を与えられるＧＩＰレセプターを欠いているマウス(ＧＩＰＲ-/-)は、インスリン耐性及び肥満の発達が起こらなかった(Miyawaki K. 等, (2002) Nature Medicine 8: 7, 738-742)。しかしながら、いくつかの研究グループは、ＧＩＰ作用がＧＩＰレセプターアンタゴニストによって、実際に破壊される場合、栄養摂取後に齧歯動物において、高血糖及び障害されたインスリン分泌が生じることを明らかにしている(Lewis, J.T. 等 (2000), Endocrinology 141, 3710-3716、Tseng, C.C. 等 (1996) J. Clin. Invest. 98, 2440-2445)。これにより、ＧＩＰレセプターアンタゴニストを用いた慢性的な治療によりグルコース不耐性、又はさらに糖尿病を生じうることが示唆される(Kieffer, T. J. (2003), Trends in Pharmacological Sciences Vol. 24 No.3, 110-112)。
【０００４】
(発明の概要)
我々は、驚くべきことに、ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片を含有してなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、免疫応答、特に抗体応答を強力に誘導し、自己抗原ＧＩＰに対する抗体力価を高めることができることを発見した。さらに、我々は、驚くべきことに、ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片を含有してなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、予防及び治療のための高脂肪食肥育肥満マウスにおいて、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することができることを発見した。本発明の組成物及びワクチンのそれぞれを摂取した肥満マウスの体重増加は、本発明の組成物及びワクチンのそれぞれを摂取していないマウスと比較して顕著に低減した。このことから、免疫応答、特に本発明の組成物及びワクチンのそれぞれによって精製される抗体は、インビボでＧＩＰを特異的に認識して、その機能を阻害することができることが示される。さらに、抗体は固形組織、特に脂肪組織に効率よく浸透しないくらい分子が大きいので、本発明の組成物及びワクチンが脂肪蓄積の増加を阻害するのに有効であることは非常に驚くべきことである。
【０００５】
さらに我々は、驚くべきことに、本発明の組成物及びワクチンが、インビボでのＧＩＰ機能を阻害する、特にレシピエント動物に体重増加をさせない際に有効である一方で、血中グルコース、血漿トリグリセリド及びフルクトサミンレベルを阻害しないことから、本発明の組成物が糖尿病を引き起こさないことが示唆されることを発見した。したがって、本発明の組成物及びワクチンは、肥満を予防するか治療するための使用が安全であることが証明される。
したがって、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一のＧＩＰタンパク質ないしは少なくとも一のＧＩＰ断片；を含んでなり、(a)と(b)が該第一付着部位と該第二付着部位を介して結合して、好ましくは規則的に反復した抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な実施態様では、本発明の使用に好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有する。
【０００６】
ある好適な実施態様では、本発明の組成物はＧＩＰ断片を含有する。強力で保護的な免疫応答、特に抗体応答が確保される一方で、本発明のＧＩＰ断片の使用により、自己特異的な細胞障害性Ｔ細胞応答が誘導される可能性が減少し、本発明の組成物及びワクチンそれぞれの産生コストが減少しうる。
他の態様では、本発明はワクチン組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒト又は動物、好ましくは哺乳動物へのワクチン組成物の投与方法を提供する。本発明のワクチンは、任意のアジュバントなしで免疫応答、特に抗体応答を強く誘導することができる。したがって、ある好適な実施態様では、ワクチンは何れのアジュバントも欠いている。アジュバントの使用を避けることによって、望ましくない炎症性Ｔ細胞応答が生じる可能性が減少しうる。
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な薬剤的担体を含有してなる薬剤組成物を提供する。
【０００７】
より更なる態様では、本発明は、特に肥満を効果的に治療する、予防する、又は寛解する方法を提供する。
ある更なる態様では、本発明は、動物、好ましくは愛玩用ネコないしはイヌ、又はヒトの肥満の治療方法であって、該動物又はヒトに本発明のワクチンとＶＬＰ-グレリンのワクチンを投与することを含む方法を提供する。本発明のある好適な実施態様では、本発明のワクチンとＶＬＰ-グレリンのワクチンは、前記の動物又はヒトに同時に投与される。ある更なる態様では、本発明は、肥満を予防及び治療する、好ましくはヒトの肥満を予防するための方法であって、該ヒトに本発明のワクチンとＶＬＰ-ニコチンのワクチンを投与することを含む方法を提供する。好ましくは、これは、喫煙停止後の体重増加の埋め合わせをするためのものである。さらに好ましくは、これは喫煙停止中及び停止後の食物摂取の増加を埋め合わせるためのものである。前記動物又はヒトへの２つのワクチンの投与により、別々に投与される場合の各々のワクチンの有効性を付加的に、あるいは好ましくは相乗的に増加しうる。
【０００８】
(発明の詳細な説明)
定義：
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(ＢおよびＴエピトープ)を有しうる。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【０００９】
抗原性部位：本明細書中において相互に交換可能に用いられる「抗原性部位」なる用語及び「抗原性エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。免疫特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応が除外されない。典型的に、抗原性部位は、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含有する。
結合(会合) (associated)：本明細書中で用いられる「結合(会合) (associated)」なる用語は、２つの分子がともに結合するすべての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有的相互作用及び非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有的相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。
【００１０】
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、リジンなどのアミノ酸のアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＶＬＰと会合(結合)する。
【００１１】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、本発明のＧＩＰに天然に生じる又は本発明のＧＩＰに人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。本発明のＧＩＰの第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第二付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一の第二付着部位を有するＧＩＰタンパク質」、「少なくとも一の第二付着部位を有するＧＩＰ断片」又は「少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＧＩＰ」なる用語は、本発明のＧＩＰと少なくとも一の第二付着部位を含むコンストラクトを指す。しかしながら、特に、ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に天然に生じない第二付着部位の場合、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介して本発明のＧＩＰと会合(結合)する。さらに他の好適な実施態様では、第二付着部位は、タンパク質融合により好ましくはシステインを含むアミノ酸リンカーを介して本発明のＧＩＰに人工的に付加される。
【００１２】
結合(bound)：本明細書中で用いられる「結合(bound)」なる用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などによるものである結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。また、この用語には物質の封入または部分的な封入も含まれる。「結合(bound)」なる用語はより広義であり、「カップル(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、「パッケージ化(packaged)」及び「付着(attached)」などの用語も含む。例えば、ポリグルタミン酸などのポリ陰イオン性高分子は、典型的かつ好ましくは、実際には共有結合しないで、典型的かつ好ましくは、ＶＬＰに封入されるかパッケージ化される。
コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質を指す。典型的かつ好ましくは、「コートタンパク質」なる用語は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのゲノム、又はウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を指す。より好ましくは、例として、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号１４又は、第一メチオニンが配列番号１４から切断されているアミノ酸配列を指す。より好ましくは、例として、「Ｑβのコートタンパク質」はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらず、配列番号１(「Ｑβ ＣＰ」)と配列番号２(Ａ１)を指す。バクテリオファージＱβのキャプシドは主にＱβ ＣＰと少量のＡ１タンパク質からなる。
【００１３】
本発明のＧＩＰ：本明細書中で用いる「本発明のＧＩＰ」なる用語は、本明細書中で定義する少なくとも一のＧＩＰタンパク質ないしは少なくとも一のＧＩＰ断片を指す。
ＧＩＰタンパク質：本明細書中で用いる「ＧＩＰタンパク質」なる用語は、配列番号：２２のヒトＧＩＰ、配列番号：２３のマウスＧＩＰ、配列番号：２４のラットＧＩＰ、配列番号：２５のウシＧＩＰ、配列番号：２６のブタＧＩＰ、配列番号：６３のネコないしイヌのＧＩＰ、又は任意の他の動物由来の任意のオルソログの対応するＧＩＰ配列を含む、あるいは好ましくはそれからなるポリペプチドを包含する。「オルソログ」なる用語は、異なる種由来のポリペプチドの機能的な相対物であるある種から得られるポリペプチドを意味する。オルソログの中での配列の相違は種分化の結果である。さらにまた、本明細書中で用いる「ＧＩＰタンパク質」なる用語は、配列番号：２２のヒトＧＩＰ、配列番号：２３のマウスＧＩＰ、配列番号：２４のラットＧＩＰ、配列番号：２５のウシＧＩＰ、配列番号：２６のブタＧＩＰ、配列番号：６３のネコないしイヌのＧＩＰ、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上および最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意の遺伝的に操作した変異体又は天然の変異体を含むか、ないしは好ましくはそれからなる任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で用いる「ＧＩＰタンパク質」なる用語は、限定するものではないが、上記に定義するＧＩＰタンパク質のリン酸化、アセチル化、グリコシル化を含む翻訳後修飾をさらに包含する。好ましくは、本明細書中で定義するＧＩＰタンパク質は、最大２００アミノ酸長、さらにより好ましくは最大１００アミノ酸、さらにより好ましくは最大５０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＶＬＰに結合するＧＩＰタンパク質は、例えばＥＬＩＳＡにより検査されるような、ＧＩＰに特異的に結合できる抗体のインビボでの産生を誘導できる。
【００１４】
ＧＩＰ断片：本明細書中で用いる「ＧＩＰ断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＧＩＰタンパク質の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して６５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上およびさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＧＩＰ断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＧＩＰタンパク質の少なくとも６の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上およびさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。ＧＩＰ断片の好適な実施態様は、ＧＩＰタンパク質の内部欠損型又は切断型である。典型的かつ好ましくは、ＶＬＰに結合したＧＩＰ断片は、ＧＩＰに特異的に結合できる抗体のインビボでの産生を誘導できる。
【００１５】
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性があるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
結合(linked)：ここで用いられる場合、「結合(連結)」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位の直接結合を包含するだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接的な結合も包含する。
【００１６】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位と本発明のＧＩＰを結合させるか、第二付着部位を既に含むか、基本的に第二付着部位からなるか第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも一のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含有する分子は本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含有する分子である。さらに好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。本発明のＧＩＰとリンカーの間の会合(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００１７】
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある、抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージのＶＬＰなどの本発明の特定の実施態様では、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ、好適に規則的で反復性の抗原の典型的かつ好ましい例である。
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。また、この用語にはポリ陰イオン性高分子の封入ないしは部分的な封入が含まれる。したがって、ポリ陰イオン性高分子を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。
【００１８】
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
【００１９】
ここで用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指し、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに類似する非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入できないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは物理的又は科学的に不活性化されている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の相等物のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。
【００２０】
ＲＮＡファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡファージの構造に類似するＲＮＡファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が包含される。本開示の範囲内で、「サブユニット」及び「単量体」なる用語は、この文脈において、相互に交換可能に、同等に用いられる。本出願では、「ＲＮＡファージ」なる用語及び「ＲＮＡ-バクテリオファージ」なる用語は、相互に交換可能に使われる。
【００２１】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
この出願において、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性(Ｋａ)で、抗原と結合するならば、特異的に結合するものと定義される。抗体の親和性は、(例えばスキャッチャード分析により)通常の当業者によって容易に測定され得る。
【００２２】
この発明は、動物又はヒトにおいてＧＩＰに対する免疫応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を含んでなり、該少なくとも一の抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものである。好ましくは、ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片はＶＬＰに結合しており、規則的で反復性の抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好適な実施態様では、本発明の少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも１２０及びさらにより好ましくは少なくとも１８０の本発明のＧＩＰがＶＬＰに結合する。
規則的で反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はキャプシドタンパク質は、国際公開公報2004/009124の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。
【００２３】
ウイルスないしウイルス様粒子は産生され、ウイルス感染細胞培養物から精製することができる。ワクチンのためには、結果として生じるウイルスないしウイルス様粒子は病原性を欠失させる必要がある。病原性のウイルスないしウイルス様粒子は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理等の物理的又は化学的な不活性化によって生成してもよい。あるいは、ウイルスが複製できなくなるように、ウイルスのゲノムを変異ないしは欠損によって遺伝的に操作してもよい。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは組み換えＶＬＰである。本明細書中で開示する組み換えＶＬＰは、少なくとも一のＤＮＡ組み換え技術の工程を含む方法によって調整されるＶＬＰを指す。ほとんどすべての一般的に公知のウイルスは配列決定されており、容易に入手可能である。コートタンパク質をコードする遺伝子は当業者に容易に同定されうる。典型的には、コートタンパク質遺伝子は、標準的な方法によって発現ベクターにクローニングされ、ベクターに好適な宿主内で発現させることができる。発現されたコートタンパク質の自己集合化(アセンブリ、構築)の結果生じるＶＬＰは回収され、さらに当分野で一般的な方法によって精製されうる。例えば、国際公開公報02/056905に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ウイルス様粒子産生のための好適な宿主細胞については２９頁３７行目から３０頁１２行目、宿主細胞内へのポリヌクレオチドベクターの導入方法については３０頁１３−２７行目、ウイルス様粒子の産生のための組み換え宿主細胞としての哺乳動物細胞については３０頁２８−３５行目。
【００２４】
好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、a) ＲＮＡファージ；b) バクテリオファージ；c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのキャプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開公報92/11291)；d) はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))；e) シンドビスウイルス；f) ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)；g) 口蹄疫ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))；h) ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；i) アルファウイルス属；j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；m) ポリオーマウイルス；n) タバコモザイク病ウイルス；及びo) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、あるいはこれからなる。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは、その組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、これらからなる。一以上のアミノ酸配列を含むかそれらからなるＶＬＰを、本出願ではモザイクＶＬＰと称する。
【００２５】
ここで使用される「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一の内部欠失、少なくとも一の切断、又はそれらの少なくとも一の組合せから得られる。「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドをさらに包含する。
本発明で交換可能に使用される「変異体組み換えタンパク質」なる用語又は「組み換えタンパク質の変異体」なる用語、本発明で交換可能に使用される「変異体コートタンパク質」なる用語又は「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持している。
【００２６】
ＶＬＰ内へのコートタンパク質又は組み換えタンパク質の変異体又は断片の集合化(アセンブリ)は、当業者には理解されるように、大腸菌中でタンパク質を発現させ、場合によっては細胞可溶化物をゲル濾過することによりキャプシドを精製し、免疫拡散アッセイ(オークタロニーテスト)又は電子顕微鏡法(ＥＭ)(Kozlovska, T. M.ら, Gene 137：133-37(1993))によりキャプシド形成を分析することにより、試験してもよい。免疫拡散アッセイ及びＥＭは、細胞可溶化物で直接実施してもよい。
好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開公報00/32227、同01/85208及び同01/056905に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報01/056905の３４−３９頁に開示されている。
【００２７】
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、本発明のＧＩＰのＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整される。このアミノ酸は修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Glyのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号２０から配列番号２１に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２１の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。
本発明の他の実施態様では、ウイルス様粒子は、組み換えアルファウイルス、より具体的には組み換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、ＤＮＡ中間生成物のない感染細胞の細胞質で完全にゲノムＲＮＡを複製する陽性の鎖ＲＮＡウイルスである(Strauss, J.及びStrauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994))。アルファウイルスファミリのメンバーである、シンドビス(Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993))、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991))およびその他(Davis, N.L. 等, Virology 171:189-204 (1989))は、ワクチン開発の候補として、及び様々な異なるタンパク質のウイルスベースの発現ベクター(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997))としての使用についてかなり注目されている。
【００２８】
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡ-ファージは、ａ)バクテリオファージＱβ；ｂ)バクテリオファージＲ１７；ｃ)バクテリオファージｆｒ；ｄ)バクテリオファージＧＡ；ｅ)バクテリオファージＳＰ；ｆ)バクテリオファージＭＳ２；ｇ)バクテリオファージＭ１１；ｈ)バクテリオファージＭＸ１；ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；ｋ)バクテリオファージｆ２；ｌ)バクテリオファージＰＰ７、及びｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有し、該コートタンパク質は、(a) 配列番号：１(Ｑβ ＣＰを指す)；(b) 配列番号：１と配列番号：２の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質を指す)；(c) 配列番号：３；(d) 配列番号：４；(e) 配列番号：５；(f) 配列番号：６、(g) 配列番号：６と配列番号：７の混合物；(h) 配列番号：８；(i) 配列番号：９；(j) 配列番号：１０；(k) 配列番号：１１；(l) 配列番号：１２；(m) 配列番号：１３；及び(n) 配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一般的に、上記のコートタンパク質はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらずＶＬＰ内に集合化することができる。
【００２９】
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
とても好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質は配列番号１と配列番号２、又は配列番号６と配列番号７のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡファージＱβである。Ｑβのキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, Rら, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβキャプシドとなる、コートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に対し、普通ではない耐性を示す。驚くべきことに、我々は、１Ｍの高さの濃度のグアニジウム、３０％の高さの濃度のアセトニトリル及びＤＭＳＯがキャプシドの安定性に影響しないことを発見した。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰの高い安定性は、本発明の哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種における使用に特に有用な性質である。
【００３０】
さらに好適な本発明のＲＮＡファージ、特にＱβ及びｆｒのウイルス様粒子は国際公開公報02/056905に開示されており、この開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。特に、国際公開公報02/056905の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調整について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰである。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体コンピテント変異体型を本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰの入手方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開公報2004/007538は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高い免疫原性があり、本発明のＧＩＰと結合して、典型的かつ好ましくは、反復様式で配位する本発明のＧＩＰを表出するワクチンコンストラクトを生成することができる。表出された本発明のＧＩＰに対して高い抗体力価が誘発されることから、結合した本発明のＧＩＰが抗体分子との相互作用のためにアクセス可能であり、免疫原性であることが示される。
【００３１】
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は欠失によって少なくとも一のリジン残基が除去されて修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は挿入によって少なくとも一のリジン残基が付加されて修飾されている。あるとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は欠失によって除去されている。またとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβのものであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は挿入によって付加されている。更なる好適な一実施態様では、ＲＮＡファージＱβの変異体コートタンパク質は、配列番号１５−１９の何れか一から選択されるアミノ酸配列を有する。特にワクチンの必要性に合わせて調整するために、少なくとも一のリジン残基の欠失、置換又は付加によって、カップリングの程度、すなわち、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット当たりの本発明のＧＩＰの量を変えることができる。
【００３２】
好適な一実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．５〜４．０の抗原密度を有する。ここで使用される「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、好ましくはＶＬＰのコートタンパク質当たり、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合する本発明のＧＩＰの平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのモノマー又はサブユニット全体の平均として算出される。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの変異体コートタンパク質、又はその変異体ないしはその断片、及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列 配列番号１５、１６、１７、１８又は１９を有する変異体コートタンパク質及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
本発明の更なる他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージＱβ、ＡＰ２０５、ｆｒ又はＧＡの組み換えコートタンパク質ないしはその断片と、ＲＮＡファージＱβ、ＡＰ２０５、ｆｒ又はＧＡの組み換え変異体コートタンパク質ないしはその断片の混合物を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００３３】
また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに、アミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化コンピテント変異体型を本発明の実施に用いてもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。ＡＰ２０５Ｐｒｏ-５-ＴｈｒのクローニングとＶＬＰの精製は国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
さらにまた、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K 等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及び、ｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L 等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。そのような情報を用いて、表面に曝された残基を同定して、ＲＮＡファージコートタンパク質を修飾して、一又は複数の反応性のアミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができる。ＲＮＡファージ由来のＶＬＰの他の利点は、安価で大量の物質を産生することが可能となる細菌での発現回収率が高いことである。
【００３４】
好適な一実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一の抗原を含有するものであり、該少なくとも一の抗原はＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片である。好適な一実施態様では、ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、(a) ヒトＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(b) ウシＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(c) ヒツジＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(d) イヌＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(e) ネコＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(f) マウスＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(g) ブタＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(h) ニワトリＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；(i) ウマＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片；及び(g) ラットＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片からなる群から選択される。
好適な一実施態様では、少なくとも一の抗原はＧＩＰタンパク質である。更なる好適な実施態様では、ＧＩＰタンパク質は、(a) 配列番号22；(b) 配列番号23；(c) 配列番号24；(d) 配列番号25；(e) 配列番号26；(f) 配列番号63；(g) 任意の他の動物のＧＩＰ対応オルソログ；及び(h) 配列番号２２−２６及び配列番号６３の何れかと少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００３５】
好適な一実施態様では、ＧＩＰタンパク質は、アミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなるものであり、最大７、好ましくは６、５、４、より好ましくは最大３、２又は１のアミノ酸が、(a) 配列番号22；(b) 配列番号23；(c) 配列番号24；(d) 配列番号25；(e) 配列番号26の群から選択されるアミノ酸配列と比較して、好ましくは保存的置換によって置換、挿入又は欠失されるものである。
好適な一実施態様では、少なくとも一の抗原がＧＩＰ断片であり、該ＧＩＰ断片が少なくとも一の抗原性部位を含むか、あるいはそれらからなるものである。
タンパク質の抗原性部位を決定する方法は当分野の技術者に公知である。PCT/EP2005/004980の26頁の第1段落から27頁の第4段落に、これらのうちのいくつかの方法について詳述されている。この具体的な開示内容は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。一般的に、これらの方法は他のポリペプチド抗原に応用できるものであり、PCT/EP2005/004980に開示されるＩＬ-２３ ｐ１９に限定するものではないことを注記する。
本発明の好適な実施態様では、ＧＩＰ断片は、本明細書中で定義されるＧＩＰタンパク質の少なくとも５から１２の連続したアミノ酸を含むか、あるいは好ましくはそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ＧＩＰ断片はＧＩＰのアミノ部分から選択される。本明細書中で用いられるＧＩＰのアミノ部分は、配列番号２２のＧＩＰの初めの１８、好ましくは１５アミノ酸配列、又は任意の他の動物の対応するオルソログを指す。
【００３６】
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号 22のアミノ酸配列7-10 (配列番号64)、好ましくは4-10 (配列番号67)、好ましくは4-13 (配列番号32)、好ましくは1-10 (配列番号29)、好ましくは4-11 (配列番号45)、好ましくは7-15 (配列番号65)、より好ましくは4-15 (配列番号66)、さらにより好ましくは1-15 (配列番号27)、又は任意の他の動物のＧＩＰ対応オルソログを含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号 22のアミノ酸配列7-10 (配列番号64)、好ましくは4-10 (配列番号67)、好ましくは4-13 (配列番号32)、好ましくは1-10 (配列番号29)、好ましくは4-11 (配列番号45)、好ましくは7-15 (配列番号65)、より好ましくは4-15 (配列番号66)、さらにより好ましくは1-15 (配列番号27)、又は任意の他の動物のＧＩＰ対応オルソログを含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなるものであり、7-10配列の1アミノ酸、又は4-10、4-13、1-10、4-11、4-15、7-15及び1-15アミノ酸配列の3、好ましくは2、さらにより好ましくは1アミノ酸が、好ましくは欠失、挿入及び／又は置換によって、より好ましくは保存的置換によって変異されている。当分野の技術者に理解される、保存的置換には、アイソステリックな置換、アミノ酸の荷電、極性、芳香族、脂肪族又は疎水性の性質が維持される置換が含まれる。典型的な保存的置換は、以下の一グループ内のアミノ酸間の置換である；Gly, Ala；Val, Ile, Leu；Asp, Glu；Asn, Gln；Ser, Thr, Cys；Lys, Arg；及びPhe, Tyr。
【００３７】
更なる好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、(a) 配列番号27；(b) 配列番号29；(c) 配列番号32；(d) 配列番号45；及び(e) 配列番号27、29、32又は45と少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号22-26又は配列番号63のアミノ酸20-23、好ましくは19-25、より好ましくは16-30、又は任意の動物の対応するオルソログのＧＩＰ配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ＧＩＰ断片は、(a) 配列番号31；(b) 配列番号43；及び(e) 配列番号31又は43と少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号22-26又は配列番号63のアミノ酸20-23、好ましくは19-25、より好ましくは16-30、又は任意の他の動物の対応するオルソログのＧＩＰ配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなるものであり、20-23アミノ酸配列の1アミノ酸、又は19-25、好ましくは16-30アミノ酸配列の3、好ましくは2、さらにより好ましくは1アミノ酸が、好ましくは欠失、挿入及び／又は置換によって、より好ましくは保存的置換によって変異されている。
【００３８】
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号22-26又は配列番号63のアミノ酸31-34、好ましくは30-34、より好ましくは28-34、より好ましくは30-37、より好ましくは28-37、より好ましくは31-42、より好ましくは28-42又は任意の動物の対応するオルソログのＧＩＰ配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ＧＩＰ断片は、(a) 配列番号28；(b) 配列番号44；(c) 配列番号68；及び(d) 配列番号28、44又は68と少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、配列番号22-26又は配列番号63のアミノ酸31-34、好ましくは30-34、より好ましくは28-34、より好ましくは26-34、より好ましくは30-37、より好ましくは28-37、より好ましくは26-37、より好ましくは31-42、より好ましくは28-42、より好ましくは26-42又は任意の他の動物の対応するオルソログのＧＩＰ配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなるものであり、31-34又は30-34配列の1アミノ酸、又は28-34、30-37、28-37、31-42又は28-42配列の3、好ましくは2、さらにより好ましくは1アミノ酸が、好ましくは欠失、挿入及び／又は置換によって、より好ましくは保存的置換によって変異されている。
【００３９】
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片ないしはＧＩＰタンパク質は、上記のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に融合したひと続きの親水性のアミノ酸をさらに含有する。本明細書中で用いるひと続きの親水性のアミノ酸は、その配列の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸が親水性アミノ酸である、ひと続きのアミノ酸を指す。好適な実施態様では、ひと続きのアミノ酸は、最大７、好ましくは６、５、４、より好ましくは３、より好ましくは２又は１のアミノ酸からなる。親水性アミノ酸の付加により、ＧＩＰ断片ないしはＧＩＰタンパク質の溶解性が増す。更なる好適な一実施態様では、親水性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン及び荷電性アミノ酸である。更なる好適な一実施態様では、荷電性アミノ酸は、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸である。好適な一実施態様では、ひと続きのアミノ酸は、アミノ酸配列DD、KK、RR、DE、ED；EE、KR、RKを含むか、ないしはこれらからなる。
好適な一実施態様では、ＧＩＰ断片は、(a) Ｃ末端にDD又はKKが付加された配列番号22のアミノ酸1-12；(b) Ｃ末端にDD又はKKが付加された配列番号22のアミノ酸1-13；(c) Ｃ末端にDD又はKKが付加された配列番号22のアミノ酸1-14(配列番号69 及び70)；(d) Ｃ末端にDD又はKKが付加された配列番号22のアミノ酸1-15(配列番号71及び72)及び(e) Ｃ末端にDD又はKKが付加された配列番号22のアミノ酸1-11からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００４０】
一実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原は、少なくとも２つのＧＩＰ断片、好ましくは２つのＧＩＰ断片を含有する。好適な実施態様では、２つのＧＩＰ断片は２つの異なるＧＩＰ断片である。好適な一実施態様では、２つのＧＩＰ断片は一ポリペプチド内に融合される。一実施態様では、２つのＧＩＰ断片は直接融合する。他の実施態様では、２つのＧＩＰ断片はスペーサー配列を介して融合する。
本発明の好適な一実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも一のペプチド結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＧＩＰに結合する。本発明のＧＩＰ、好ましくはＧＩＰ断片、より好ましくは５０アミノ酸以下、さらにより好ましくは３０アミノ酸よりも少ない断片をコードする遺伝子が、ＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子の内部に又は好ましくはＮないしＣ末端の何れかにインフレーム結合する。ウイルス、好ましくはＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片へ本発明の抗原を融合する実施態様は、国際公開公報2004/009124の62頁20行目から68頁17行目に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。好ましくは、融合タンパク質は発現の際にＶＬＰ内に集合体化する能力を保持しており、その集合体化は電子顕微鏡で調べることができる。
隣接するアミノ酸残基を付加して、コートタンパク質と外来性のエピトープの間の間隙を増やしてもよい。隣接配列に用いるためにはグリシン残基及びセリン残基が特に好ましい。このような隣接配列によってフレキシビリティが付加される。このフレキシビリティの付加により、ＶＬＰサブユニットの配列内へ外来性の配列を融合する際に生じうる不安定性作用が軽減され、外来性のエピトープの存在による集合体化の阻害が軽減される。
【００４１】
他の好適な実施態様では、本発明のＧＩＰ、好ましくはＧＩＰ断片、さらにより好ましくはアミノ酸配列 配列番号27-32、配列番号43-45、配列番号66又は68を有するＧＩＰ断片を、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体ないしはその断片のＮ末端又はＣ末端に融合する。更なる好適な一実施態様では、融合タンパク質は、スペーサーをさらに含有するものであり、該スペーサーはＡＰ２０５のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体と本発明のＧＩＰの間に位置する。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも一の共有結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の本発明のＧＩＰに結合した少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、該共有結合は非ペプチド結合である。本発明の好適な実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の抗原と結合する、好ましくは共有結合的に結合するマレイミド基を含むか、好ましくはそのものである。
【００４２】
本発明のとても好ましい実施態様では、少なくとも一の第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものであり、少なくとも一の第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のＧＩＰは、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基(一又は複数)のアミノ基を有する好ましい第一付着部位と反応可能な官能基と、好ましい第二付着部位、すなわち本発明のＧＩＰに元もとある、ないしは人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくはシステイン(一又は複数)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時に本発明のＧＩＰとＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。
【００４３】
好ましい実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。本発明のＧＩＰにおける第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、好ましくは第二の付着部位として適切な少なくとも一のアミノ酸を含むリンカーとの結合により達成される。よって、本発明の好ましい実施態様では、リンカーは少なくとも一の共有結合、好ましくは典型的には少なくとも一のペプチド結合により、本発明のＧＩＰに結合している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含む又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、リンカーは好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
リンカーの選択は、本発明のＧＩＰの性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。リンカーの好ましい実施態様は：(a) CGG又はCG/GC；(b)Ｎ-末端ガンマ１-リンカー(例えばCGDKTHTSPP、配列番号48)；(c)Ｎ-末端ガンマ３-リンカー(例えばCGGPKPSTPPGSSGGAP、配列番号59)；(d)Ｉｇヒンジ領域；(e)Ｎ-末端グリシンリンカー(例えばGCGGGG、配列番号49)；(f)n=0-12、k=0-5である(G)kC(G)n；(g)Ｎ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するｎ＝1-3の(GGGGS)n(例えば配列番号50、n=1の実施態様に相当))；(h)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2である(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n(例えば配列番号51、n=1、k=1、l=1及びm=1の実施態様に相当)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)Ｃ-末端ガンマ１-リンカー(例えばDKTHTSPPCG、配列番号52)；(m)Ｃ-末端ガンマ３-リンカー(例えばPKPSTPPGSSGGAPGGCG、配列番号53)；(n)Ｃ-末端グリシンリンカー(GGGGCG、配列番号54)；(o)n=0-12及びk=0-5である(G)nC(G)k；(p)Ｃ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するn=1-3の(SGGGG)n(例えば配列番号55、n=1の実施態様に相当))；(q)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2及びo=0-8である(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k(例えば配列番号56、n=1、k=1、l=1、o=1及びm=1の実施態様に相当)からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＧＩＰのＮ-末端に融合している。本発明の他の好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＧＩＰのＣ-末端に融合している。
【００４４】
この発明に係る好ましいリンカーは、第２付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号57)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号58)、ペプチドのＣ-末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ又はＧＧＣ-ＮＨ２(「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端のＣＧＧのリンカーである。一般的に、グリシン残基は、第２付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。
好適な一実施態様では、リンカー配列はGCであり、好ましくはGCはＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片のＣ末端、好ましくは配列番号22-27、29、31-32、43又は45に結合する。他の好適な実施態様では、リンカー配列はCGであり、好ましくはCGはＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片のＮ末端、好ましくは配列番号28、44又は68に融合される。
本発明のＧＩＰに本来備わっているかないしは付加された、第二付着部位として働くシステイン残基は還元状態にあって、活性化担体上のヘテロ二官能性架橋剤、と反応するものである。すなわち、遊離スルフヒドリル基を有する遊離システインないしはシステイン残基は有用であるといえる。
【００４５】
上記の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いることによるＶＬＰへの本発明のＧＩＰの結合により、正方向の様式でＶＬＰに本発明のＧＩＰをカップリングさせることができる。ＶＬＰに本発明のＧＩＰを連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、本発明のＧＩＰをＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。本発明のＧＩＰは、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。次いで、必要であれば脱保護化した後に本発明のＧＩＰを以下のようにＶＬＰにカップリングしてもよい。過剰なチオラート化剤を分離した後、本発明のＧＩＰを、システイン反応基を含有し、システイン残基に対して反応可能な少なくとも一又はいくつかの官能基を表出するヘテロ二官能性架橋剤にて予め活性化させた、ＶＬＰと反応させる。このとき本発明のチオラート化ＧＩＰは上記に記載のように反応することができる。場合によっては、少量の還元剤が反応混合物中に含まれる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(Pierce)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、本発明のＧＩＰをＶＬＰに結合させる。
【００４６】
好ましい一実施態様では、第一の付着部位は、スルフヒドリル基、さらに好ましくは、ＶＬＰを構成するか又はそれにより本質的になるコートタンパク質に天然に又は人工的に付加されるスルフヒドリル基を含むか又は好ましくは該基である。第二の付着部位は、抗原に化学的に結合し、好ましくは抗原に共有的に結合し、より好ましくは抗原のアミノ基に共有的に結合し、さらに好ましくは抗原のＮ-末端アミノ酸のアミノ基と、リンカーのＮＨＳ-エステル基により共有的に結合する、ＳＭＰＨ(スクシンイミジル-６-[β-マレイミドプロピオンアミド]ヘキサノアート)又はＭＢＳ(ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル)等の、リンカーのマレイミド基である。好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原、好ましくは５０以下、さらにより好ましくは３０以下のアミノ酸、さらにより好ましくは配列番号22-27、29、31-32、43又は45のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、好ましくは化学的に合成され、マレイミド基は、好ましくはＮ-末端アミノ酸のアミノ基に結合している。第一の付着部位及び第二の付着部位は、チオ-エーテル結合を介して結合している。
選択的な好ましい一実施態様では、第一の付着部位は、アミノ基、好ましくはＶＬＰに含まれるまたは本質的になるコートタンパク質に天然に生じるないしは人工的に付加されたリジンのアミノ基を含むか、又は好ましくは該基である。第二の付着部位は、上の段落で詳述されたようなリンカーのマレイミド基である。ＶＬＰのアミノ基は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えばＮ-スクシンイミジル-Ｓ-アセチルチオアセタート(ＳＡＴＡ)又は２-イミノチオランにより、スルフヒドリル基に誘導体化され、これがついでリンカーのマレイミド基と反応する。
【００４７】
少なくとも一のマレイミド基を有する好ましいリンカーは、例えばＳＭＰＨ、スルホ-ＭＢＳである。さらに好ましいリンカーは、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤で、スルフヒドリル基と反応性のある一の官能基と、アミノ基と反応性のある一の官能基を有するものである。
本発明の他の実施態様では、組成物は、化学的な相互作用を介して本発明のＧＩＰに結合したウイルス様粒子を含むか、ないしは本質的にそれからなるものであり、この相互作用の少なくとも一は共有結合ではない。例えば、ＶＬＰをビオチン化してストレプトアビジン-融合タンパク質として本発明のＧＩＰを発現することによって本発明のＧＩＰへのＶＬＰの結合が起こる。また、他の結合対、例えばリガンド-レセプター、抗原-抗体も、ビオチン-アビジンと同様の形で、カップリング試薬として使用することができる。
米国特許第5698424号には、キャプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。ついで、挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原性タンパク質等として提示される。
【００４８】
しかしながら、キャプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、キャプシドのオリゴマー化に至りうることを我々は記す。さらに、ジスルフィド結合によるキャプシドと抗原性タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、ジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一の第二の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらにまた本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、硫黄-硫黄結合を含まない。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、システインのスルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、スルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まないか、該ＶＬＰは宿主ＤＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。好適な一実施態様では、ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。
【００４９】
更なる好適な一実施態様では、組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含有する。更なる好適な実施態様では、ポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのものである。宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を少なくするないしは排除することにより、ＧＩＰに特異的な強力な抗体応答を維持しながら、望ましくないＴ細胞応答、例えば炎症性Ｔ細胞応答や障害性Ｔ細胞応答、及び他の望ましくない発熱などの副作用が最小限化ないしは低減される。
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的に好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味する。ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的で好適な方法は、同じ指定代理人により2005年10月5日に出願したPCT/EP2005/055009の実施例１７に記載される。典型的に好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。
【００５０】
本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性荷電の反復基を含有する相対的に高分子量の分子を指し、その構造は、実際ないしは概念的には、相対的に低分子量の分子に由来するユニットの複合的な反復物を本質的に含有する。
一態様では、本発明は、本発明の組成物を含有するワクチン組成物を提供する。好適な一実施態様では、ワクチン組成物内のＶＬＰに結合した本発明のＧＩＰは、動物、好ましくは哺乳動物ないしはヒト起源のものである。更なる好適な実施態様では、本発明のＧＩＰはヒト、ウシ、ニワトリ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマ起源である。
好適な一実施態様では、ワクチン組成物はさらに少なくとも一のアジュバントを含有する。少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチンおよび薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。様々なアジュバントが用いられうる。例として、完全および不完全なフロイントアジュバント、アルミニウム水酸化物および修飾ムラミルジペプチドなどがある。更なるアジュバントは、ミネラルゲル、例えば酸化アルミニウム三水和物、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよび潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)およびコリネバクテリウムパルバムである。このようなアジュバントも当分野で公知である。本発明の組成物とともに投与されうる更なるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類(ミョウバン)、ＭＦ-５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術が含まれるが、これらに限定するものではない。また、アジュバントは、これらの物質の混合物を含んでもよい。
【００５１】
他の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを欠く。本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。さらにアジュバントを含んでいないので、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する所望されない炎症性Ｔ細胞反応の発生が最小となる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。
更なる態様では、本発明は、ヒトのＧＩＰ関連疾患、特に肥満の治療のための医薬の製造における、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の非ヒト、好ましくは非ヒト脊椎動物の本発明のＧＩＰ；を含んでなる組成物であって、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している、組成物の使用を提供する。少なくとも一の非ヒトの本発明のＧＩＰ、例えばネコ、イヌ、ウシ、ラット又はマウスの本発明のＧＩＰを含有する好適な実施態様は、ヒトＧＩＰを認識する交差抗体応答を誘導することができる。
【００５２】
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物、特にイヌ又はネコ、好ましくは愛玩用ネコである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって動物又はヒトに投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶溶及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。
投与される個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「製薬的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。以下のメカニズムの説明によって本発明が限定されるものではなく、本発明のワクチンは、ＧＩＰに結合する抗体であり、その濃度を抑え、及び／又は生理学的及び病理学的な働きを阻害する抗体を誘導しうる。
【００５３】
他の態様では、本発明は、本発明で述べられる組成物と受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファー又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。
更なる一態様では、本発明は、本発明の組成物、又は本発明のワクチン組成物、又は本発明の薬剤組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給し；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片である、少なくとも一の抗原を供給し；そして(c) 該ＶＬＰを該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原に結合して該組成物を産生させる、ことを含む産生方法を提供する。
【００５４】
更なる好適な実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを提供する工程は、(a) 該ウイルス様粒子を該ウイルス、好ましくは該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に分解して；(b) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製して；(c) 該精製された該ウイルス、好ましくは該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再集合体化させる工程をさらに含むものであり、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである。より更なる好適な実施態様では、前記の精製したコートタンパク質の再集合体化は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子、好ましくはポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸の存在下にてなされる。
さらに一態様では、本発明は、ＧＩＰが重要な病理学的作用を及ぼす疾患又は症状、特に肥満を予防する、治療する及び／又は軽減するために用いられうる組成物を提供する。
【００５５】
更なる態様では、本発明は、少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物を具備してなるキットであって、該第一組成物が、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有する第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の第一抗原；を含んでなり、該少なくとも一の第一抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものであり；該第二組成物が、(c) 少なくとも一の第一付着部位を有する第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；(d) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の第二抗原；を含んでなり、該少なくとも一の第二抗原が、(i) グレリンないしはグレリンペプチド；(ii) ニコチン、コチニンないしはノルニコチン；及び(iii) 第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片からなる群から選択される分子であるかその分子を含み、該第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片が第一組成物に含有される第一ＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なり；(c)と(d)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものである、キットを提供する。
好適な実施態様では、第一組成物は本発明の組成物であり、第一ウイルス様粒子は本発明のウイルス様粒子であり、第一抗原は本発明のＧＩＰである。同様に、第二ウイルス様粒子は本発明のウイルス様粒子である。したがって、この特徴、好適な実施態様、第一組成物の準備と使用、第一ウイルス様粒子及び第一抗原はすべて記載されており、本発明において定義される。
好適な一実施態様では、第一ＶＬＰと第二ＶＬＰは異なる。好適な一実施態様では、第一ＶＬＰと第二ＶＬＰは同じである。本発明の好適な一実施態様では、第一及び／又は第二ウイルス様粒子はＲＮＡファージのものであり、好ましくは該ＲＮＡファージはＲＮＡファージＱβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である。好適な一実施態様では、第一ウイルス様粒子及び／又は第二ウイルス様粒子は、ＲＮＡファージの組み換えタンパク質、その変異体又はその断片を含むか、それらからなる。更なる好適な一実施態様では、第一及び第二のＶＬＰは何れもＲＮＡファージ、好ましくはＲＮＡファージＱβのものである。好適な一実施態様では、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの第一及び／又は第二のＶＬＰは、宿主内で組み換えて産生されるものであり、該第一及び／又は該第二のＶＬＰは本質的に宿主ＲＮＡを含まない、好ましくは宿主の核酸を含まない。
【００５６】
好適な一実施態様では、グレリンないしグレリンペプチドは、(a) ヒトグレリンないしグレリンペプチド；(b) イヌグレリンないしグレリンペプチド；(c) ネコグレリンないしグレリンペプチド；(d) ウシグレリンないしグレリンペプチド；(e) ブタグレリンないしグレリンペプチド；(f) ヒツジグレリンないしグレリンペプチド；及び(g) マウスグレリンないしグレリンペプチドからなる群から選択される。更なる好適な実施態様では、グレリンないしグレリンペプチドは、(a) 配列番号３３；(b) 配列番号３５；(c) 配列番号４０；(d) 配列番号３６；(e) 配列番号３７；(f) 配列番号３８；(g) 配列番号４６ (GSSFLSPEHQKLQ)；及び(h) 配列番号４７ (GSSFLSPEHQKVQ)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
少なくとも一の第二抗原がグレリンないしグレリンペプチドである、第二組成物の好適な実施態様の調整及び使用は、特許出願国際公開公報2004/009124及び国際公開公報2005/068639に開示されており、この２つは出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明の第二組成物の更なる好適な実施態様は、国際公開公報2004/009124の特に請求項１ないし３１、並びに国際公開公報2005/068639の特に請求項１ないし２９にはっきりと定義されており、出典明記により本明細書中に組み込まれる。
少なくとも一の第二抗原がニコチン、コチニンないしノルニコチンである、第二組成物の好適な実施態様の調整及び使用は、同じ指定代理人により出願された特許出願国際公開公報2004/009116に開示されている。この開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。本発明の第二組成物の更なる好適な実施態様は、国際公開公報2004/009116の特に請求項１ないし５０にはっきりと定義されており、出典明記により本明細書中に組み込まれる。
【００５７】
好適な一実施態様では、少なくとも一の第二抗原は、(a) 6-(カルボキシメチルウレイド)-(±)-ニコチン (CMUNic)；(b) トランス-3’-アミノメチルニコチン コハク酸；(c) O-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチン；(d)トランス-4’-カルボキシコチニン；(e) N-[1-オキソ-6-[(2S)-2-(3-ピリジル)-1-ピロリジニル] ヘキシル]-β-アラニン；(f) 4-オキソ-4-[[6-[(5S)-2-オキソ-5-(3-ピリジニル)-1-ピロリジニル]]ヘキシル] アミノ]-ブタン酸；(g) (2S)-2-(3-ピリジニル)-1-ピロリジンブタン酸 フェニルメチル エステル；(h) (2R)-2-(3-ピリジニル)-1-ピロリジンブタン酸 フェニルメチル エステル；(i) コチニン 4'-カルボン酸, N-スクシニル-6-アミノ-(±)-ニコチン；(j) 6-(.シグマ.-アミノカプラミド)-( ±)-ニコチン；(k) 6-(.シグマ.-アミノカプラミド)-(±)-ニコチン；(l) 3’ アミノメチルニコチン；(m) 4’アミノメチルニコチン；(n) 5’ アミノメチルニコチン；(o) 5 アミノニコチン；(p) 6 アミノニコチン；(q) S-1-(b-アミノエチル) ニコチニウムクロライド；(r) S-1-(b-アミノエチル) コチニウムクロライド；及び(s) N-スクシニル-6-アミノ-(±)-ニコチン、からなる群から選択される物質から形成される。
更なる好適な一実施態様では、第二組成物は、O-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する。更なる好適な一実施態様では、第二組成物はO-スクシニル-トランス-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する。更なる好適な一実施態様では、第二組成物は、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、好ましくはＱβウイルス様粒子、さらに好ましくはＲＮＡファージＱβのコートタンパク質を含むか好ましくはこれからなるＱβウイルス様粒子にコンジュゲートしたO-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する。
【００５８】
好適な一実施態様では、少なくとも一の第二抗原は、O-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有する。更なる好適な一実施態様では、第二抗原はO-スクシニル-トランス-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有するか、好ましくはそのものである。好適な一実施態様では、第二抗原はトランス-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンを含有するか、好ましくはそのものである。
好適な一実施態様では、第二組成物に含有される第二付着部位は、(a) アミン；(b) アミド；(c) カルボキシ；(d) カルボニル；(e) スルフヒドリル；(f) ヒドロキシル；(g) アルデヒド；(h) ジアゾニウム；(i) アルシルハロゲニド(Alcylhalogenid)；(j) ヒドラジン；(k) ビニル；(l) マレイミド；(m) スクシンイミド；及び(n) ヒドラジンからなる群から選択された反応基を含有するか、好ましくはそのものである。好適な一実施態様では、少なくとも一、好ましくは一の共有結合を介する第一付着部位と第二付着部位との結合は、第一付着部位を有する前記のO-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンのO-スクシニル部分の反応によって形成される。更なる好適な一実施態様では、少なくとも一、好ましくは一の共有結合を介する第一付着部位と第二付着部位との前記の結合は、アミド結合によって形成される。更なる好適な一実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基である。更なる好適な一実施態様では、第二付着部位はカルボキシル基を含むか、好ましくはそのものである。更なる好適な一実施態様では、少なくとも一、好ましくは一の共有結合を介する第一付着部位と第二付着部位との結合は、第一付着部位であるリジン残基のアミノ基を有する、O-スクシニル-3'-ヒドロキシメチル-ニコチンのO-スクシニル部分の反応によって形成される。
【００５９】
好ましくは、第二組成物は、ＲＮＡファージのアミン基、好ましくはＲＮＡファージのリジンのアミン基を有するコハク酸のカルボキシル基を反応させることによって、コハク酸モノ-(1-メチル-2-ピリジン-3-イル-ピロリジン-3-イルメチル)エステルから形成される。
反応を行うための好適な方法は、カルボジイミド、好ましくはＥＣＤ、さらにより好ましくはＤＣＣによってカルボキシル基を活性化させることである。活性化させたカルボキシル基はＲＮＡファージに直接共有結合させるか、N-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)エステルの付加によるN-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)エステルに変換させる。ＮＨＳエステルは、活性化したカルボキシル基による反応後に直接用いるか、単離した後にＲＮＡファージと反応させる。
活性なカルボキシル基への選択的な試薬は、ウロニウム塩(uronium salts) 、例えばＨＡＴＵ(2-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸)又はＨＢＴＵ(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸)である。コハク酸モノ-(1-メチル-2-ピリジン-3-イル-ピロリジン-3-イルメチル)エステルは、ＨＡＴＵないしＨＢＴＡによって活性化され、対応する活性化カルボキシル基がアミンと直接反応する。
【００６０】
好適な一実施態様では、少なくとも一の第二抗原はＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、該第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、第一組成物に含有される第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なる。好適な一実施態様では、第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に含有されるか又はそれらからなる同じアミノ酸配列と比べて、異なる化学的修飾を含有するアミノ酸配列を含有するか、これらからなる。好適な一実施態様では、第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に含有されるか又はそれらからなる同じアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含有するか、これらからなる。好適な一実施態様では、第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に含有されるか又はそれらからなる抗原性部位と比べて、少なくとも一の異なる抗原性部位を含有するか、これらからなる。好適な一実施態様では、第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は、第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片に含有されるか又はそれらからなる抗原性部位と比べて、異なる抗原性部位を含有するか、これらからなる。さらに好適な一実施態様では、第一のＧＩＰ断片はＧＩＰのアミノ部分の少なくとも一の抗原性部位を含有するか、これらからなり、第二のＧＩＰ断片はＧＩＰのカルボキシル部分の少なくとも一の抗原性部位を含有するか、これらからなる。ＧＩＰ断片のカルボキシル部分は、配列番号22-26及び配列番号63の何れか一の少なくとも１８、好ましくは１５アミノ酸を指す。好適な一実施態様では、第一のＧＩＰ断片は、配列番号27のアミノ酸配列を含有するか、これらからなり、第二のＧＩＰ断片は配列番号28のアミノ酸配列を含有するか、これらからなる。この特徴、好適な実施態様、異なるＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片の準備と使用はすべて記載されており、本発明において定義される。
【００６１】
好適な一実施態様では、第二のＧＩＰ断片は、(a) 配列番号27；(b) 配列番号29；(c) 配列番号32；(d) 配列番号45；(e) 配列番号28；(f) 配列番号31；(g) 配列番号44；(h) 配列番号68；及び(i) 配列番号27-29、31、32、44、68又は45と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
第一組成物及び第二組成物に含有する抗原の違いを除いて、この特徴、好適な実施態様、第二組成物の準備と使用は、本発明において第一組成物について記載され、定義されるものと実質的に同じである。
【００６２】
更なる他の態様では、本発明は、動物、好ましくは愛玩用ネコないしはイヌ、又はヒトに、キットの少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物が投与されることを含む、動物又はヒトの肥満の治療及び／又は予防の方法を提供する。好ましくは、動物又はヒトへの第二組成物の投与は、第一組成物の同動物又はヒトへの投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後に行う。好適な一実施態様では、２つの組成物は、２週間未満空けて、好ましくは１週間未満空けて、より好ましくは３日空けて、さらにより好ましくは２４時間空けて同じ患者に投与されるのが好ましい。更なる好適な一実施態様では、２つの組成物は同じ動物又はヒトに同時に投与される。本明細書中で用いる「同時」とは、２つの組成物がある動物又はヒトへ注入される前に混合される、又は２つの組成物が同じ動物又はヒトに連続して投与されることを意味する。本明細書中で用いる「連続して」とは、２つの組成物が同じ動物又はヒトに別々に投与されるが、４時間以下、好ましくは２時間以下、さらにより好ましくは１時間以下、さらにより好ましくは３０分以下、より好ましくは１０分以下の間隔であることを意味する。
さらに好適な実施態様では、前記の第一組成物と前記の第二組成物は同じ方法で投与され、好ましくはその方法は皮下投与である。好適な一実施態様では、第一組成物と第二組成物は同時に投与される。
【００６３】
他の態様では、本発明は、動物又はヒトの肥満を予防する及び／又は治療する方法であって、同動物又はヒトに本発明のワクチンとＶＬＰ-グレリンのワクチン、ＶＬＰ-ニコチンのワクチン、又はＶＬＰ-第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片のワクチンが投与されることを含む方法を提供する。「ＶＬＰ-グレリンのワクチン」は本発明の第二組成物を含有し、この少なくとも一の抗原はグレリンないしグレリンペプチドである。好適な一実施態様では、「ＶＬＰ-グレリンのワクチン」はさらに少なくとも一のアジュバントを含有する。さらに、「ＶＬＰ-ニコチンのワクチン」は本発明の第二組成物を含有し、この少なくとも一の抗原はニコチン、コチニンないしノルニコチンを含有する。好適な一実施態様では、「ＶＬＰ-第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片のワクチン」は本発明の第二組成物を含有し、この少なくとも一の抗原は第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片を含むか、そのものであり、第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片は第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なる。
便宜上、本発明のワクチンとＶＬＰ-グレリン又はＶＬＰ-ニコチン又はＶＬＰ-第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片のワクチンを、以降「２つのワクチン」と称する。
【００６４】
ＶＬＰ-グレリンのワクチン、ＶＬＰ-ニコチンのワクチン、又はＶＬＰ-異なるＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片のワクチンの投与は、本発明のワクチンの同動物又はヒトへの投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後に行うのが好ましい。同動物又はヒトへの２つのワクチンの投与は、一つのワクチンのみを投与する場合と比べて、付加的又は好ましくは相乗的に効果が増す。
好適な一実施態様では、少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物はキットの中で別々に収容される。
【００６５】
他の実施態様では、少なくとも一の第一組成物と少なくとも一の第二組成物は混合されて、キットの中で混合物として収容される。したがって、更なる態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位をそれぞれ有する少なくとも一の第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)；及び(b) 少なくとも一の第二付着部位をそれぞれ有する少なくとも一の第一抗原と少なくとも一の第二抗原；を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の第一抗原がＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片であり、該少なくとも一の第二抗原が、(i) グレリンないしはグレリンペプチド；(ii) ニコチン、コチニンないしはノルニコチン；及び(iii) 第二ＧＩＰタンパク質ないしは第二ＧＩＰ断片からなる群から選択される分子であるかその分子を含み、該第二のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片が第一のＧＩＰタンパク質ないしはＧＩＰ断片と異なり；該少なくとも一の第一ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と該少なくとも一の第一抗原が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しており、該少なくとも一の第二ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と該少なくとも一の第二抗原が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している組成物を提供する。したがって、本発明は、前記組成物を含んでなるワクチン組成物を提供する。さらに、ワクチン組成物は少なくとも一のアジュバントを含有する。好ましくは、ワクチン組成物は任意のアジュバントを欠いている。さらに、本発明は、動物、好ましくはイヌないしネコ、好ましくは愛玩用ネコ、又はヒトに前記のワクチン組成物が投与されることを含む免疫化方法を提供する。さらに、本発明は、動物、好ましくは愛玩用ネコないしイヌ、又はヒトにワクチン組成物が投与されることを含む、肥満の治療及び／又は予防の方法を提供する。さらに、本発明は、前記の組成物と受容可能な薬剤的担体を含有してなる薬剤組成物を提供する。
【実施例】
【００６６】
実施例の項目で用いる「従来のＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「従来のＱβ ＶＬＰ」、「従来のＡＰ２０５ ＶＬＰ」などは、国際公開公報02/056905、国際公開公報04/007538に記載のように、大腸菌から組み換えて発現させ、その後精製して得たＶＬＰを指す。
【００６７】
実施例１  ＧＩＰ断片1-15、1-10、4-13、16-30、28-42、31-42及びＧＩＰタンパク質1-42の化学的な合成
ＧＩＰ断片のＮ末端又はＣ末端に融合したGC又はCGリンカー配列を含有するマウスＧＩＰ断片1-15、1-10、4-13、16-30及び31-42(配列番号27、29、32、43、44)を標準的な手法によって化学的に合成した。
Ｃ末端に融合したGCリンカー配列を含有するＧＩＰタンパク質1-42(配列番号30)及びＮ末端に融合したCGリンカー配列を含有するＧＩＰ断片28-42を標準的な手法によって化学的に合成した。
従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたＮ末端ＧＩＰ断片の可溶性を改善するために、特定のＧＩＰ断片内の疎水性アミノ酸残基を置換した。リジン(ｌｙｓ)およびアスパラギン酸(ａｓｐ)などの極性の、親水性荷電アミノ酸を付加するか用いて、天然のＧＩＰ残基を置換した。
ＧＩＰ断片のＣ末端に融合したKKCリンカー配列を含有するＧＩＰ断片1-14又はDDCリンカー配列を含有するＧＩＰ断片1-14を標準的な手法によって化学的に合成した。
【００６８】
実施例２  GIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC及びCG-GIP-31-42の従来のＱβ、ｆｒ又はＨＢｃＡｇ ＶＬＰへのカップリング
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に２．０ｍｇ／ｍｌの従来のＱβ ＶＬＰを含有する２ｍｌの溶液を、１１４．４μｌのＳＭＰＨ(Pierce)溶液(ＤＭＳＯに溶解した５０ｍＭの貯蔵溶液)と２５℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。
その後、透析して誘導体化したＱβ ＶＬＰをマウスGIP 1-15-GC (配列番号60)、GIP 1-10-GC (配列番号61)、GIP 4-13-GC (配列番号62)又はマウスCG-GIP 31-42ペプチドの何れかにカップリングするために用いた。簡潔に言えば、１ｍｌの誘導体化されたＱβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、２８６μｌの１０ｍＭ ペプチド溶液と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中で、２０℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
Ｑβ ＶＬＰに対するＧＩＰペプチド1-15および31-42の共有結合性カップリングを、１２％Ｎｕ-ＰＡＧＥゲル(Invitrogen)を用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥにて評価した。カップリング反応液のゲルをクーマシーブルー染色すると、Ｑβに共有結合したＧＩＰペプチドについて予測されるものに対応する分子量のバンドが示された(図１)。サブユニット当たりのカップリングされた１、２、３又は４のペプチドに対応するカップリングバンドを矢印で示す。誘導体化されたＱβ ＶＬＰ単独と比較して、これらの付加的なバンドの出現から、GIP CG-1-15およびGIP 31-42-GCはＱβ ＶＬＰに共有的にカップリングしたことが示された。カップリング効率[すなわちモルＱβ-ＧＩＰ／モルＱβ単量体(総量)]をクーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥによる濃度測定によって推定すると、Ｑβ単量体当たり１．８−２．３のＧＩＰ断片であった。同様なカップリング効率はGIP CG-1-10についてみられ、GIP 4-13-GCはＱβ ＶＬＰに共有結合的にカップリングした(データは示さない)。
【００６９】
ＧＩＰ断片のｆｒ ＶＬＰへのカップリング
１ｍｌの誘導体化されたｆｒ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、２８６μｌの１０ｍＭ GIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC又はCG-GIP-31-42と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中で、２０℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
ＧＩＰ断片のＨＢｃＡｇ1-185-Ｌｙｓへのカップリング
ＨＢｃＡｇ1-185-Ｌｙｓの構築、発現及び精製については国際公開公報03/040164の実施例２−５に実質的に記載されている。１ｍｌの誘導体化されたＨＢｃＡｇ1-185-Ｌｙｓ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、２８６μｌの１０ｍＭ GIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC又はCG-GIP-31-42と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中で、２０℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
【００７０】
実施例３  GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIP 1-42-GCの従来のＱβ ＶＬＰへのカップリング
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に２．０ｍｇ／ｍｌのＱβ ＶＬＰを含有する２ｍｌの溶液を、１１４．４μｌのＳＭＰＨ(Pierce)溶液(ＤＭＳＯに溶解した５０ｍＭの貯蔵溶液)と２５℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。
その後、透析して誘導体化したＱβ ＶＬＰをマウスGIPタンパク質(配列番号30)、マウスCG-GIP 28-42、マウスGIP 16-30-GC、GIP 1-14-KKC又はGIP 1-14-DDCの何れかにカップリングするために用いた。簡潔に言えば、１ｍｌの誘導体化されたＱβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、２８６μｌの１０ｍＭ ペプチド溶液と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中で、２０℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
次いで、カップリング産生物を１２％Ｎｕ-ＰＡＧＥ(Invitrogen)ゲルを用いたＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。次いで、カップリング産生物はゲルをクーマシーブリリアントブルー染色することによって可視化した。
【００７１】
実施例４  従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC又はCG-GIP 31-42を用いたマウスの免疫化
成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループにつき５匹)を、従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、マウスGIP 1-10-GC、マウスGIP 4-13-GC又はマウスCG-GIP 31-42(実施例２で得たもの)の何れかにてワクチン接種した。各試料から透析したワクチン１００μｇをＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０、１４、２８及び４２日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。コントロールとして、１グループのマウスに、ＰＢＳ又はＶＬＰ Ｑβを投与した。第０、１５、２８、４３、５６、７１、９１および１０５日目にマウスの後眼窩から採血し、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡにてその血清を分析した。表１は、GIP 1-15-特異的抗体、GIP 1-10-特異的抗体又はCG-GIP 31-42-特異的抗体の平均力価を示す。示された結果はグループ当たりの１０匹のマウスの平均である。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、最大半量のＯＤを引き起こす血清希釈物として表される。GIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ又はCG-GIP 31-42にて免疫化したマウスでは、第５６日目までにそれぞれおよそ1:300000、1:330000及び1:82000の平均力価に達した(表１)。GIP 4-13-GC-Qβにて免疫化したマウスのＧＩＰ-特異的力価は、GIP 1-15-特異的力価のおよそ１０分の１であった(データは示さない)。免疫化前の血清又はＰＢＳないしＱβ ＶＬＰを接種したマウスの血清は何れのＧＩＰペプチドに対しても反応を示さなかった。最大半量ＯＤ力価は１００よりも小さく、アッセイのカットオフ以下であると考えられた。これより、ＧＩＰ-ＶＬＰコンジュゲートは、自己タンパク質ではあるが、ＧＩＰ断片に対して高い抗体力価を誘導することができることが明確に示された。ＲＮアーゼにカップリングしたＧＩＰ断片に対して測定した抗体力価は、ＧＩＰタンパク質に対して測定された抗体力価と同様であった(データは示さない)。これより、ＧＩＰ断片にて生じた抗体がＧＩＰタンパク質を認識することができることが示唆された。
【００７２】
表１  第０、１４、２８及び４２日目にGIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ又は Qβ-CG-GIP 31-42それぞれにて免疫化したマウスの平均的抗体ＧＩＰ特異的ＩｇＧ抗体力価(希釈で表す)
2008517975.tif 000002
【００７３】
実施例５  ＥＬＩＳＡにおけるＧＩＰ特異的抗体及びグレリン特異的抗体の検出
まず、以下の段落に記載のように、マウスGIP 1-15-GC又はマウスGC-GIP 31-42をＲＮアーゼ(SIGMA)-SPDP (SIGMA)にカップリングさせた。５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼと０．２ｍＭ ＳＰＤＰ(終濃度)を室温で１時間インキュベートした。ＲＮアーゼ-ＳＰＤＰ溶液をＰＤ１０カラム(Amersham)にて精製した。精製後、１０ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ペプチドをＲＮアーゼ-ＳＰＤＰ溶液に添加した。カップリング効率を３４３ｎｍのＯＤを測定することによって決定した。
ＥＬＩＳＡプレート(９６ウェルMAXIsorp)を、１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼ-カップリングマウスGIP 1-15-GC又はマウスGC-GIP 31-42を含むコーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３, ｐＨ９．６)にて４℃で終夜をかけてコートした。代わりに、ＥＬＩＳＡプレートを、２．５μｇ／ｍｌのブタＧＩＰタンパク質(Bachem)にてコートした。洗浄バッファ(ＰＢＳ-０．０５％ Ｔｗｅｅｎ)にてプレートを洗浄した後、ブロックバッファ(２％ＢＳＡ-ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ２０溶液)にて３７℃で２時間ブロックして、次いで、再び洗浄して、段階的に希釈したマウス血清にてインキュベートした。コントロールとして、同じマウスの免疫化前の血清も試験した。プレートを室温で２時間インキュベートした。さらに洗浄した後、結合した抗体を、ＨＲＰＯ-標識、Ｆｃ特異的、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Jackson Immunoresearch)にて検出して、室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、プレートをＯＰＤ溶液(１ＯＰＤ錠剤、２５μｌ ＯＰＤバッファ及び８μｌ Ｈ２Ｏ２)と６分間反応させ、反応を５% Ｈ２ＳＯ４溶液にて停止させた。プレートはＥＬＩＳＡ読み取り機(Biorad Benchmark)にて４５０ｎｍを読み取った。ＥＬＩＳＡ力価をＥＬＩＳＡアッセイにて最大半量ＯＤとなる血清希釈液として表した。
Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたグレリン24-31GCにて免疫化したマウスの血清からグレリン特異的抗体を測定するために、上記の方法に類似の方法を用いた。ＥＬＩＳＡプレートを２０μｇ／ｍｌのグレリンタンパク質(Bachem)にてコートした点のみが異なる。
【００７４】
実施例６  食餌誘導肥満動物モデルにおける従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ又はQβ-CG-GIP 31-42を用いた有効性実験
開始体重がほぼ同じ(２２．７−２３．１ｇ)成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)に、実施例２で得た従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC又はマウスCG-GIP 31-42の何れかをワクチン接種した。コントロールとして、Ｑβ ＶＬＰをマウスに注射した。初回投与後、すべてのマウスに高脂肪食(３５重量％の脂肪、６０％エネルギー)を与え、食餌誘発性の肥満を生じやすくした。食餌と水は適宜与えた。初回投与後およそ４か月間、一定の間隔で個々の体重をモニターした。
図２Ａに示すように、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC又はCG-GIP 31-42にて免疫化したマウスは、Ｑβ ＶＬＰを投与されたコントロール動物よりも実験の過程において体重が減少した。実際、初回免疫化の１１２日後、コントロール動物はおよそ１１０％まで体重が増加したのに対して、GIP 1-15-GC-Qβ及びGC-GIP 31-42-Qβ VLP免疫化マウスはそれぞれ８０％及び８２％までの体重増加にとどまった。ゆえに、両ワクチン化グループは、コントロールグループと比較して、顕著な体重増加の減少を示した。GIP 1-15-GC-Qβ VLPによって得られた結果と類似の結果が、GIP 1-10-GC-Qβによって得られた(データは示さない)。
【００７５】
さらにＧＩＰに対するワクチン接種の効果を評価するために、体脂肪量の変化を、二重エネルギーＸ線吸光光度スキャン(ＤＥＸＡ)で測定した。ＤＥＸＡ分析は、超高分解能PIXIMUSシリーズ濃度計(0.18×0.18mmのピクセル、GE Medical Systems)にて行った。初回投与から１４２日後、ＤＥＸＡ分析を行った。Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はCG-GIP 31-42にて免疫化したマウスは、Ｑβ ＶＬＰコントロール動物と比較して、それぞれおよそ２６％及び２２％、の体脂肪量の減少を示した(図２Ｂ)。Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-10-GCによっても同じような結果が得られた(データは示さない)。ワクチン接種グループとコントロールグループとの間で除脂肪体重の違いが見られなかったことから、体重の減少は体脂肪の減少によるものであることが明らかに示された。
まとめると、これらの結果から、ＧＩＰ-ＶＬＰコンジュゲートが体重増加及び体脂肪蓄積を軽減することができることが明らかに示された。
【００７６】
実施例７  食餌誘導肥満動物モデルにおける従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ又はQβ-CG-GIP 31-42を用いた安全性実験
ＧＩＰに対するワクチン接種の起こりうる副作用を評価するために、血中グルコース、フルクトサミン及びトリグリセリドレベルをワクチン接種した動物において測定した。簡単に言うと、成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)に、実施例２で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はマウスCG-GIP 31-42を実施例４に記載のようにワクチン接種した。コントロールとして、ＰＢＳ又はＱβ ＶＬＰをマウスに注射した。
初回免疫化後９１日と１０２日の間、２日に分けて４日間にわたって、午前に２回(９時)と午後に２回(１５時)にマウスから採血して、Glucotrend血中グルコース計(Roche)を用いて、血中グルコースレベルを測定した。この期間、マウスに自由に食物と水を与えた。午後及び午前の測定値のそれぞれの平均を表４に示す。ワクチン接種した動物とＰＢＳ投与動物の血中グルコースレベルに有意差はなかった。GIP 1-10-GC-Qβをワクチン接種したマウスにも同様な結果が観察された(データは示さない)。
同じ動物において、初回投与の１２０日後に血漿トリグリセリドレベルを測定した。簡単に言うと、１２時間の空腹時期間の後、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はマウスCG-GIP 31-42免疫化マウス及びＰＢＳ投与コントロールマウスから血液試料を採取した。次いで、オリンパスＡＵ４００自動laboratory work stationにて血漿試料からトリグリセリドレベルを測定した。各グループの平均値と標準偏差(ｎ＝５)を表４に示す。ワクチン接種した動物とコントロール動物との間に有意差は観察されなかった。
【００７７】
さらに、免疫化後、様々な時間的間隔で同じ動物のフルクトサミンレベルを測定した。フルクトサミンレベルは循環中のグリコシル化タンパク質の総量を表し、フルクトサミンレベルが上昇する場合、増加した糖血を示す。循環フルクトサミンは３週間の寿命を有するので、フルクトサミン測定値により遡及的な血糖状態が示される。簡単に言うと、１２時間の空腹期間の後、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はCG-GIP 31-42免疫化マウスと、ＰＢＳ又はＱβ ＶＬＰ投与コントロールマウスから様々な時間的間隔で血液試料を採取した。次いで、血漿試料からフルクトサミンレベルを測定した。各グループの平均値と標準偏差(ｎ＝５)を表５に示す。概して、ワクチン接種動物とコントロール動物との間に有意な差異は観察されなかった。にもかかわらず、GIP 1-15-GC-Qβ又はCG-GIP 31-42-Qβワクチン接種グループに対する２つの明らかに異なる時点(それぞれ第５５及び６９日、第２７及び６９日)では、全体の値がおよそ２００−４００μｍｏｌ／Ｌの正常なフルクトサミン範囲に下がった。４００μｍｏｌ／Ｌを超えるフルクトサミンレベルは、糖尿病発症のリスクが考えられる。したがって、ＧＩＰに対するワクチン接種により、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はCG-GIP 31-42による免疫化マウスでは高血糖状態が誘導されない。
結論として、ワクチン接種マウスにおいて抗ＧＩＰ抗体が存在するにもかかわらず、ワクチン接種グループ(Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC又はCG-GIP 31-42)と、コントロールグループ(ＰＢＳ又はＱβ ＶＬＰ投与動物)との間で、血液グルコースレベル、空腹時トリグリセリド及びフルクトサミンレベルに有意差は観察されなかった(表２及び表３)。
【００７８】
表２  GIP 1-15-GC-Qβ又はQβ-CG-GIP 31-42にて免疫化した５匹のグループにおける平均午前及び午後の血中グルコースレベルと空腹時トリグリセリドレベル
2008517975.tif 000003
表３  GIP 1-15-GC-Qβ又はQβ-CG-GIP 31-42にて免疫化した５匹のグループにおける平均空腹時フルクトサミンレベル
2008517975.tif 000004
【００７９】
実施例８  従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42-GCによるマウスの免疫化
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC又はGIPタンパク質1-42-GCの何れかをワクチン接種した。簡単に言うと、各試料から透析した１００μｇのワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量に希釈し、第０、１４、２８及び４２日目とその後は必要なときに皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンはアジュバントあり又はなしで投与した。コントロールとして、１グループのマウスに、アジュバントあり又はなしで、Ｑβ ＶＬＰによる免疫化をするか、ＰＢＳを投与した。第０、１４、２８、４２日目と一定間隔でその後もマウスの後眼窩から採血した。次いで、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡにてＧＩＰ特異的抗体を定量した。
【００８０】
実施例９  食餌誘導肥満動物モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42-GCを用いた有効性実験
開始体重がほぼ同じ成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例３で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC又はGIPタンパク質1-42-GCの何れかを、実施例８に記載のようにワクチン接種した。コントロールとして、Ｑβ ＶＬＰ単独でマウスを免疫化するか、ＰＢＳをマウスに注射した。実験中、ＧＩＰ特異的抗体力価が有意に減退したら、マウスを追加免疫した。すべてのマウスに高脂肪食(３５重量％の脂肪、６０％エネルギー)を与え、食餌誘発性の肥満を生じやすくした。食餌と水は適宜与えた。一定間隔で体重をモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベル及びフルクトサミンレベルを測定した。
【００８１】
実施例１０  遺伝的肥満動物モデルにおける従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42-GCを用いた有効性実験
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６ ob/obマウスに、実施例２又は３で得た従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC又はGIPタンパク質1-42-GCの何れかを、実施例８に記載のようにワクチン接種した。コントロールとして、Ｑβ ＶＬＰでマウスを免疫化するか、ＰＢＳをマウスに注射した。実験の期間中、ＧＩＰ特異的抗体力価が有意に減退したら、マウスを追加免疫した。マウスには普通食(４−１０重量％の脂肪を含む)を与え、水は適宜与えた。一定間隔で体重をモニターした。体脂肪量に加え、(実施例７に記載のように)異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベル及びフルクトサミンレベルを測定した。
【００８２】
実施例１１  治療的食餌誘導性肥満動物モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC及びCG-GIP 31-42を用いた有効性実験
成体雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり１０匹)におよそ１４週間、肥満になるまで(体重＞４２ｇ)適宜高脂肪食餌を与えた。次いで、平均開始体重が２つのグループで同じになるように２つに分けた。２つのグループの平均の差は実験開始時には０．１ｇより小さかった。
グループに分けた後、実施例２で得た従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC又はCG-GIP 31-42の何れかを用いて、実施例４に記載のようにマウスにワクチン接種した。コントロールとして、マウスにＱβ ＶＬＰで免疫化した。さらに、実験中、ＧＩＰ特異的抗体力価が減退したらマウスを追加免疫した。
第０、１４、２８、４２、５６日目及びその後は１か月間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のようにＧＩＰ特異的ＥＬＩＳＡによって血清のＧＩＰ特異的抗体を定量した。従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC又はCG-GIP 31-42によるワクチン接種によって誘導されたＧＩＰ特異的抗体力価の比較を表１に示す。体重は一定間隔でモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベルを測定した。
【００８３】
表４に示すように、実験の期間中に、従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC、GIP 1-10-GC又はCG-GIP 31-42によって免疫化したマウスは、Ｑβ ＶＬＰを投与したコントロール動物よりも体重が減少した。初回免疫の９８日後、コントロール動物はおよそ８．６ｇ(２０％)分体重が増加していたのに対して、GIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ及びGC-GIP 31-42-Qβ VLP免疫化マウスはそれぞれ０．５ｇ(３．０％)、０．６ｇ(−３．０％)及び０．２ｇ(−０．５％)分体重が減少していた。ゆえに、すべてのワクチン接種グループは、治療的条件において、コントロールグループと比較して体重増加の減少を明らかに示した。
表４  GIP 1-15-GC-Qβ、GIP 1-10-GC-Qβ又はQβ-CG-GIP 31-42にて免疫化した１０匹のグループの９８日間にわたる平均体重変化(％で表す)
2008517975.tif 000005
【００８４】
実施例１２  治療的食餌誘導性肥満動物モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42-GCを用いた有効性実験
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおよそ１７〜２４週間、又は肥満になるまで(体重＞４５ｇ)適宜高脂肪食餌を与えた。次いで、開始体重及び平均開始体重の分布がすべてのグループについて小さくなるようにグループ分けした。
実施例３で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42-GCの何れかを用いて、実施例８に記載のようにマウスにワクチン接種した。コントロールとして、マウスにＱβ ＶＬＰで免疫化するか、ＰＢＳをマウスに投与した。さらに、ＧＩＰ特異的抗体力価が減退し始めたらマウスを追加免疫した。第０、１４、２８、４２、５６、７０日目及びその後は１か月間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡによって血清のＧＩＰ特異的抗体を定量した。体重は一定間隔でモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベル及びフルクトサミンレベルを測定した。
【００８５】
実施例１３  結果として再集合体化したＱβ ＶＬＰが生じる、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下における分解／再集合体化による本発明のＱβ ＶＬＰの調整
(A) 従来のＱβ ＶＬＰの分解
大腸菌溶解物から精製した４５ｍｇの従来のＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、Bradford分析によって測定)を含むＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を１０ｍＭ ＤＴＴにて還元して、撹拌しながら室温に１５分間置いた。次いで、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度まで添加し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートを続け、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡを沈殿させた。溶液から沈殿されたＲＮＡを取り除くために、溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した(Eppendorf 5810 R、以下のすべての工程で固定角ローターA-4-62を用いた)。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含有する上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
【００８６】
(B) 陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質および残渣の宿主細胞ＲＮＡを含有する分解反応の上清を水で１：１５に希釈し、１０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を調整し、ＳＰ-セファロースＦＦカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に流した。カラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７にて予め平衡化した。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムの勾配法により溶出させ、タンパク質は約２５ｍｌの分画容量に回収した。室温で５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をモニターした。
第二工程では、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)をセファクリルＳ-１００ＨＲカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に流し(２列)、２０ｍｍ リン酸ナトリウム／２５０ｍｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．５にて平衡化した。室温で２．５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
【００８７】
(C1) 透析によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に２．２ｍｇ／ｍｌ)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)及びＤＴＴ(Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、それぞれ終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ)を、３．５ｋＤａのカットオフのメンブランを用いて２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りであった：ポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、硫酸デキストラン(MW 5000及び10000, Sigma)、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸(MW 11000及び33400, Sigma)、ポリ-Ｌ-グルタミン酸(MW 3000、13600及び84600, Sigma)、及びパン酵母と小麦麦芽由来のｔＲＮＡ。
(C2) 透析濾過(ダイアフィルトレーション)によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
３３ｍｌの精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１．５ｍｇ／ｍｌ)を、Ｈ２Ｏ及び尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)、ＮａＣｌ(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)及びポリ-Ｌ-グルタミン酸(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 84600)と混合した。混合物の容量は５０ｍｌであり、成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．０Ｍ 尿素及び０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ-Ｌ-グルタミン酸であった。次いで、混合物を室温で、５００ｍｌの２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析濾過した。この透析濾過は、１０ｍｌ／分の交差流速と２．５ｍｌ／分の透過流速で、Pellicon XL薄膜カートリッジ(Biomax 5K, Millipore)を用いた正接流量濾過装置(tangential flow filtration apparatus)にて行った。
【００８８】
実施例１４  ＡＰ２０５ ＶＬＰのインビトロ集合体化(アセンブリ)
(A) ＡＰ２０５コートタンパク質の精製
分解：２０ｍｌのＡＰ２０５ ＶＬＰ溶液(ＰＢＳ中に１．６ｍｇ／ｍｌ、大腸菌抽出物から精製)を、０．２ｍｌの０．５Ｍ ＤＴＴと混合し、室温で３０分間インキュベートした。５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加して、次いで混合物を６０℃で１５分間インキュベートし、ＤＴＴ還元コートタンパク質を沈殿させた。混濁した混合物を遠心分離し(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)、上清を廃棄し、ペレットを、２０ｍｌの１Ｍ 尿素／２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ３．２に播種した。室温で３０分間撹拌した後、１．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を加えることによって、ｐＨ６．５にばらつきを調整し、その後二量体コートタンパク質を含む上清を得るために遠心分離した(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)。
陽イオン交換クロマトグラフィ：上清(上記参照)を２０ｍｌの水で希釈して、約５ｍＳ／ｃｍの伝導率を調整した。結果として生じた溶液を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５バッファにて予め平衡化した６ｍｌのＳＰセファロースＦＦ (Amersham Bioscience)のカラムに流した。流した後、カラムを４８ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５のバッファにて洗浄し、その後、２０倍のカラム容量の１Ｍ ＮａＣｌへの比例勾配により結合したコートタンパク質を溶出した。メインピークの分画をプールし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびＵＶ分光法にて分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによると、単離されたコートタンパク質は本質的に他のタンパク質混入がなく純粋であった。ＵＶ分光法によると、タンパク質濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ(総量１２ｍｇ)であり、１Ａ２８０単位はＡＰ２０５コートタンパク質の１．０１ｍｇ／ｍｌを表す。さらに、Ａ２６０(０．２９１)の値に対してＡ２８０(０．５９９９)の値は２であることから、調製物は本質的に核酸を欠いていることが示唆される。
【００８９】
(B) ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化
任意のポリ陰イオン性高分子のない条件下における集合体化：上記で溶出されたタンパク質分画を透析濾過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５にて１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にまでＴＦＦによって、濃縮した。その溶液の５００μｌを、５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、室温で４８時間インキュベートした。混合物中での再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて平衡化したTSKgel G5000 PWXLカラム(Tosoh Bioscience)をＨＰＬＣ分析に用いた。
ポリグルタミン酸存在下における集合体化：３７５μｌの精製したＡＰ２０５コートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に１ｍｇ／ｍｌ)を、５０μｌのＮａＣｌ貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)、５０μｌのポリグルタミン酸貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 86400, Sigma)及び２５μｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を室温にて４８時間インキュベートした。混合物中における再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。混合物中のコートタンパク質がＶＬＰ内にほぼ完全に組み込まれたことから、任意のポリ陰イオン性高分子がない条件下で集合体化したＡＰ２０５コートタンパク質より効率よく、多く集合体化されたことが示された。
【００９０】
実施例１５  再集合化Ｑβないしは再集合化ＡＰ２０５ ＶＬＰへのＧＩＰ断片1-10、4-13、1-15、31-42、16-30、28-42、1-14-KKC、GIP 1-14-DDC及びGIPタンパク質1-42のカップリング
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に２．０ｍｇ／ｍｌの再集合化Ｑβ ＶＬＰ(実施例１３で得たもの)を含有する２ｍｌの溶液を、１１４．４μｌのＳＭＰＨ(Pierce)溶液(ＤＭＳＯに溶解した５０ｍＭの貯蔵溶液)と２５℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。
その後、透析して誘導体化した再集合化Ｑβ ＶＬＰをマウスGIP 1-15-GC 、マウスCG-GIP 31-42ペプチド、マウスGIP 1-10-GC、マウスGIP 4-13 GC、マウスGIP 16-30-GC、マウスCG-GIP 28-42、マウスGIP 1-14-KKC、マウスGIP 1-14-DDC又はマウスGIPタンパク質1-42-GCの何れかにカップリングするために用いた。簡潔に言えば、１ｍｌの誘導体化された再集合化Ｑβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、２８６μｌの１０ｍＭ ペプチド溶液と、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中で、２０℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
まず、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に２．０ｍｇ／ｍｌの再集合化ＡＰ２０５ ＶＬＰ(実施例１４で得たもの)を含有する２ｍｌの溶液を、再集合化Ｑβ ＶＬＰと同一ないしは類似の条件下でＳＭＰＨにて誘導体化した。次いで、誘導体化した再集合化ＡＰ２０５ ＶＬＰを同一ないしは類似の条件下にて、前段落に記載のＧＩＰ断片と反応させた。
【００９１】
実施例１６  治療的食餌誘導性肥満動物モデルにおける再集合化Ｑβ ＶＬＰないしは再集合化ＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-10-GC、GIP 1-15-GC、GIP 4-13-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC CG-GIP 31-42及びGIPタンパク質1-42-GCを用いた有効性実験と免疫化
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおよそ１７〜２４週間、又は肥満になるまで(体重＞４５ｇ)適宜高脂肪食餌を与えた。次いで、開始体重及び平均開始体重の分布がすべてのグループについて小さくなるようにグループ分けした。
実施例１５で得た再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-10-GC、GIP 4-13-GC、GIP 1-15-GC、GIP 16-30-GC、CG-GIP 28-42、GIP 1-14-KKC、GIP 1-14-DDC CG-GIP 31-42又はGIPタンパク質1-42-GCの何れかを用いて、実施例８に記載のようにマウスにワクチン接種した。コントロールマウスは再集合化Ｑβ ＶＬＰ(実施例１３で得たもの)で免疫化するか、ＰＢＳを投与した。１００μｇの透析したワクチンないしはコントロールタンパク質をＰＢＳにて２００μｌ容量に希釈し、アジュバントあり又はなしで、第０日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。第１４、２８及び４２日目に同一の製剤にてマウスを追加免役した。さらに、ＧＩＰ特異的抗体力価が減退し始めたらマウスを追加免疫した。
第０、１４、２８、４２、５６、７０日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡによって血清のＧＩＰ特異的抗体を定量した。体重は一定間隔でモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベル及びフルクトサミンレベルを測定した。
マウスの治療的食餌誘導性肥満モデルにおいて、ＧＩＰ断片ないしはＧＩＰタンパク質にカップリングした再集合化ＡＰ２０５ ＶＬＰの有効性を試験するために、同様、類似又は同一の条件を適応した。
【００９２】
実施例１７  従来のＱβ ＶＬＰへのグレリン24-31GCのカップリング
ＶＬＰにカップリングするための付加されたＣ末端システイン残基を含有する、グレリン-ペプチド Ghrel24-31GC (GSSFLSPEGC 配列番号39)を化学的に合成し、以下に記載のようにＱβに化学的にカップリングするために用いた。
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４に１４０μＭの従来のＱβ ＶＬＰを含有する５ｍｌの溶液を、１０８μｌのＨ２Ｏに溶解した６５ｍＭ ＳＭＰＨ(Pierce)溶液と２５℃で３０分間、振とう器上で反応させた。その後、反応溶液を５Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。その後、１００μｌの透析した反応混合液を、グレリン-ペプチド(１：１０ ペプチド／Ｑβキャプシドタンパク質比)の２８．６μｌの１０ｍＭ 貯蔵溶液(ＤＭＳＯ中)の何れかと反応させた。カップリング反応は１５℃のウォーターバス中で２時間行った。次いで、反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、２×５Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
カップリング反応物を還元条件下の１６％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにて分析した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーにて染色した。
【００９３】
実施例１８  Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたGhrel24-31-GCを用いたマウスの同時免疫化
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GC(実施例２で得たもの)とＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGhrel24-31-GC(実施例１７で得たもの)を同時にワクチン接種した。１００μｇの各々の透析したワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量に希釈し、第０、１４、２８及び４２日目とその後は必要に応じて皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。２つのワクチン混合物はアジュバントあり又はなしで投与した。コントロールとして、アジュバントあり又はなしで、１グループのマウスをＱβ ＶＬＰ単独で免疫化するか、ＰＢＳを投与した。第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡによって血清の抗ＧＩＰ抗体及び抗グレリン抗体について分析した。
再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCと再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGhrel24-31-GCにて同時に成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化するために、同様、類似又は同一の条件を適応した。第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取し、実施例５に記載のように、それぞれＧＩＰ特異的又はグレリン特異的ＥＬＩＳＡを用いて血清の抗ＧＩＰ抗体及び抗グレリン抗体について分析した。
【００９４】
実施例１９  食餌誘発性肥満モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたGhrel24-31-GCの同時免疫化による有効性試験
開始体重がほぼ同じ成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例１８に記載の従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCと従来のＱβ ＶＬＰにカップリングした再集合化マウスGhrel24-31-GCの両方を、ワクチン接種した。コントロールとして、従来のＱβ ＶＬＰ又は再集合化Ｑβ ＶＬＰ単独でマウスを免疫化するか、ＰＢＳをマウスに注射した。実験中、ＧＩＰ特異的ないしはグレリン特異的な抗体力価が有意に減退したら、マウスを追加免疫した。すべてのマウスに高脂肪食(３５重量％の脂肪、６０％エネルギー)を与え、食餌誘発性の肥満を生じやすくした。第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のように、ＥＬＩＳＡにより血清の抗ＧＩＰ抗体及び抗グレリン抗体について分析した。
食餌と水は適宜与えた。一定間隔で体重をモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベルを測定した。
【００９５】
実施例２０  遺伝的肥満動物モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたGhrel24-31-GCの同時免疫化による有効性試験
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６ ob/obマウスに、実施例１８に記載の従来のＱβ ＶＬＰないしは再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCと、従来のＱβ ＶＬＰないしは再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGhrel24-31-GCを、同時にワクチン接種した。コントロールとして、従来のＱβ ＶＬＰ単独ないし再集合化Ｑβ ＶＬＰ単独でマウスを免疫化するか、ＰＢＳをマウスに注射した。その後、実験期間中、ＧＩＰ特異的ないしはグレリン特異的な抗体力価が有意に減退したら、マウスを追加免疫した。マウスには標準的な食餌を与えた。
第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のように、ＥＬＩＳＡにより血清の抗ＧＩＰ抗体及び抗グレリン抗体について分析した。一定間隔で体重をモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベルを測定した。
【００９６】
実施例２１  治療的食餌誘導性肥満動物モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたGhrel24-31-GCの同時免疫化による有効性実験
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにおよそ１７〜２４週間、又は肥満になるまで(体重＞４５ｇ)適宜高脂肪食餌を与えた。次いで、開始体重及び平均開始体重の分布がすべてのグループについて小さくなるようにグループ分けした。
実施例１８に記載の従来のＱβ ＶＬＰないしは再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCと、従来のＱβ ＶＬＰないしは再集合化Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスグレリン24-31-GCの両方をマウスに同時にワクチン接種した。コントロールマウスは従来のＱβ ＶＬＰないし再集合化Ｑβ ＶＬＰで免疫化するか、ＰＢＳを投与した。その後、実験中に、ＧＩＰ特異的ないしグレリン特異的な抗体力価が減退したらマウスを追加免疫した。
第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡによって血清の抗ＧＩＰ抗体及び抗グレリン抗体について分析した。免疫後、個々のマウスの体重と体脂肪成分をモニターした。さらに、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルとトリグリセリドレベルを測定した。
【００９７】
実施例２２  Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたCG-GIP 31-42によるマウスの同時免疫化
成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスにＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスCG-GIP 31-42(両方とも実施例２で得たもの)を同時にワクチン接種した。１００μｇの各々の透析したワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量に希釈し、第０、１４、２８及び４２日目とその後は必要に応じて皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。２つのワクチン混合物はアジュバントなしで投与した。コントロールとして、マウスをＱβ ＶＬＰ単独で免疫化するか、マウスにＰＢＳを投与した。第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のように、完全長マウスＧＩＰタンパク質をプレートにコートすることによるＥＬＩＳＡによって血清の抗ＧＩＰ特異的抗体について分析した。ＧＩＰ特異的抗体力価の比較を表１に示す。
【００９８】
実施例２３  食餌誘発性肥満モデルにおけるＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたCG-GIP 31-42の同時免疫化による有効性試験
開始体重がほぼ同じ成体雄又は雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、実施例２２に記載のＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスGIP 1-15-GCとＱβ ＶＬＰにカップリングしたCG-GIP 31-42の両方を、ワクチン接種した。コントロールとして、従来のＱβ ＶＬＰでマウスを免疫化するか、ＰＢＳをマウスに注射した。その後、実験中、ＧＩＰ特異的抗体力価が有意に減退したら、マウスを追加免疫した。すべてのマウスに高脂肪食(３５重量％の脂肪、６０％エネルギー)を与え、食餌誘発性の肥満を生じやすくした。第０、１４、２８、４２日目及びその後は一定間隔でマウスの後眼窩から血液を採取した。実施例５に記載のように、ＥＬＩＳＡにより血清の抗ＧＩＰ抗体について分析した。ＧＩＰ特異的抗体力価の比較を表１に示す。
食餌と水は適宜与えた。一定間隔で体重をモニターした。体脂肪量に加え、実施例７に記載のように、異なる間隔で、血中グルコースレベルと血漿トリグリセリドレベル及びフルクトサミンレベルを測定した。表２に示すように、同時免疫化マウスにおける平均体重増加を単剤免疫化で観察されるものと比較した。
【００９９】
実施例２４  GIP 1-15ペプチドとＣ末端で融合したＡＰ２０５によるマウスの免疫化
ＧＩＰペプチド(YAEGTFISDYSIAMD、配列番号27)をコードするＤＮＡ断片を、３つの連続したＰＣＲ反応において作製した。第一の反応では、プラスミドｐＡＰ４０５を鋳型として用いて、ＸｂａＩ部位を含有するオリゴp1.45 (5’- AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG -3’、配列番号73)とオリゴp4.175 (5’- AATGAACGTGCCCTCTGCGTATCCGGAACCGCCTCCTGC -3’、配列番号74)を用いてＡＰ２０５コートタンパク質の遺伝子を増幅し、プラスミドｐＡＰ４０５内のＡＰ２０５コートタンパク質の遺伝子の３'領域内のGTAGGGSGをコードするヌクレオチド配列の３'にアミノ酸配列YAEGTFIをコードするヌクレオチド配列を付加した。次に、オリゴp1.45及びp4.176 (5’- CATCGCGATCGAGTAATCGGAAATGAACGTGCCCTCTGCGTA -3’、配列番号75)を用いて、第一反応のＰＣＲ生成物を増幅し、第一反応の生成物の３'末端にアミノ酸配列SDYSIAMをコードするヌクレオチド配列を付加した。第三の反応では、オリゴp1.45及びp4.177 (5’- ACATGCATTAATCCATCGCGATCGAGTAATC-3’、配列番号76)を用いて、第二反応の生成物を増幅して、第二ＰＣＲ生成物の３'末端に停止コドンとＭｐｈ１１０３Ｉ制限酵素部位を含有する残存するＡｓｐをコードするヌクレオチド配列を付加した。得られた断片をＸｂａＩとＭｐｈ１１０３Ｉで消化して、ベクターｐＡＰ２８３(ＡＰ２０５パテント)内の大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下の同じ制限酵素部位内にクローニングした。結果として生じたコンストラクトは以下の通りである：
515    AP205コートタンパク質- GTAGGGSG - YAEGTFISDYSIAMD
発現した融合タンパク質の精製方法はPCT/EP2005/054721の実施例２に記載のものと実質的に同じである。ＰＡＰ４０５及びｐＡＰ２８３の配列と構築はそれぞれPCT/EP2005/054721及びWO2004/007538A2に記載される。
【０１００】
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループにつき５匹)を、GIP 1-15ペプチドとＣ末端で融合したＡＰ２０５にてワクチン接種した。５０μｇの透析したワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０、１４、２８及び４２日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。コントロールとして、１グループのマウスに、ＰＢＳないしＡＰ２０５ ＶＬＰ単独を投与した。第０、１４、２８、４２、５６および７０日目にマウスの後眼窩から採血し、実施例５に記載のようにＥＬＩＳＡにてその血清を分析した。表５は、ＧＩＰ-特異的抗体の平均力価を示す。示された結果はグループ当たりの５匹のマウスの平均である。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、最大半量のＯＤを引き起こす血清希釈物として表される。GIP 1-15ペプチドとＣ末端で融合したＡＰ２０５で免疫化したマウスでは、第４２日目までに平均力価がおよそ１：１８４０００に達した(表５)。免疫前の血清又はＰＢＳないし  Ｑβ ＶＬＰを投与したマウスの血清はＧＩＰペプチドに対するいかなる反応も示さなかった。最大半量ＯＤ力価は１００より小さく、アッセイのカットオフ以下であると考えられる。これより、ＧＩＰ-ＶＬＰ融合は、自己タンパク質ではあるが、ＧＩＰ断片に対して高い抗体力価を誘導することができることが明らかに示された。
表５  第０、１４、２８及び４２日目にGIP 1-15ペプチドとＣ末端で融合したＡＰ２０５で免疫化したマウスにおける平均抗ＧＩＰ特異的ＩｇＧ抗体力価(希釈として表す)
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【０１０１】
実施例２５  食餌誘導性肥満動物モデルにおける従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC-Qβによるグルコース耐性に対する効果
グルコース耐性に対して起こりうる効果を評価するために、ワクチン接種した動物において経口グルコース耐性試験(ＯＧＴＴ)を行った。簡単に言うと、成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり５匹)に、実施例２で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCを実施例４に記載のようにワクチン接種した。コントロールとして、Ｑβ ＶＬＰをマウスに注射した。さらに、ＯＧＴＴの２０日前である、第１２２日目に追加免疫した。試験期間中、すべてのマウスに高脂肪食を与えた。
第１４２日目と１６時間空腹時の後に、経口経管栄養法により２ｇ／ｋｇのＤ-グルコース溶液をマウスに投与した。経口グルコース投与の０、１５、３０、４５、６０、１２０及び１８０分後に、マウスの尾静脈より採血した。Accu-checkグルコース計測器(Roche)を用いて血中グルコースレベルを測定した。この期間の間、マウスは空腹時のままとした。血中グルコース応答の動態を表６に示す。ワクチン接種した動物とコントロール動物の間で、グルコース応答の動態において有意な差異は観察されなかった。
ゆえに、ＧＩＰに対するワクチン接種により、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCにて免疫化されたマウスのグルコース耐性は障害されなかった。
表６  GIP 1-15-GC-Qβで免疫化した５匹のマウスグループにおける血中グルコースレベル
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【０１０２】
実施例２６  食餌誘導性肥満動物モデルにおける従来のＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GC-Qβによるインスリン応答性に対する効果
インスリン応答性に対して起こりうる効果を評価するために、ワクチン接種した動物においてインスリン感受性試験(ＩＳＴ)を行った。簡単に言うと、成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループ当たり４−５匹)に、実施例２で得たＱβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCを実施例４に記載のようにワクチン接種した。コントロールとして、Ｑβ ＶＬＰをマウスに注射した。さらに、ＩＳＴの２１日前である、第１２２日目に追加免疫した。試験期間中、すべてのマウスに高脂肪食を与えた。
第１４３日目と１６時間空腹時の後に、０．５Ｕ／ｋｇのブタインスリンをマウスに腹腔内投与(ＩＰ)した。インスリン投与の０、１５、３０、４５、６０及び９０分後に、マウスの尾静脈より採血した。Accu-checkグルコース計測器(Roche)を用いて血中グルコースレベルを測定した。この期間の間、マウスは空腹時のままとした。ＩＰＩＳＴ後の血中グルコース応答の動態を表９に示す。GIP 1-15-GC-Qβワクチン接種したマウスは、Ｑβ ＶＬＰワクチン接種コントロール動物と比較してインスリン感受性の改善を示した。インスリン投与の０、３０、４５及び６０分後では有意な差異はなかった。
ゆえに、ＧＩＰに対するワクチン接種により、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたGIP 1-15-GCにて免疫化されたマウスのインスリン応答性が改善された。
表７  GIP 1-15-GC-Qβで免疫化した４−５匹のマウスグループにおけるＩＰＩＳＴの血中グルコースレベル
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＧＩＰ断片のＱβ ＶＬＰへのカップリングを示す還元型ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル。レーンＭ：分子マーカー；レーン１：誘導体化Ｑβ単量体；レーン２：Ｑβ単量体にカップリングしたＧＩＰ断片1-15GC；レーン３：Ｑβ単量体にカップリングしたＧＩＰ断片31-42GC。サブユニット当たりのカップリングした１、２、３又は４のペプチドに対応するカップリングバンドを矢印で示す。
【図２】GIP 1-15-GC-Ｑβワクチン又はＱβ-CG-GIP 31-42ワクチンの有効性を示す。実施例６に詳述されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウスGIP 1-15-GC、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたマウスCG-GIP 31-42、又はＱβ ＶＬＰのみの何れかをワクチン接種した。図２Ａはｘ軸に示すように時間に対するマウスの体重増加を示し、図２Ｂは初回免疫化から１４２日後のマウスの脂肪組成を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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