(57)【要約】  本発明は、アミリンファミリーポリペプチド−６（ＡＦＰ−６）アナログに関するもので、本発明には、誘導体および断片、関連する核酸、発現構築体、宿主細胞、ならびに組換えＡＦＰ−６アナログの製法が含まれる。本発明のＡＦＰ−６アナログには、１個または複数のアミノ酸配列の改変が含まれる。加えて、代謝および心血管の障害、例えば、肥満、糖尿病、代謝異常症候群および心筋虚血、ならびに心血管のリスクの増加のごとき状態を治療および予防する方法および組成物が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−ＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−ＳＡＰＶ−Ｘ３３−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号４１）
［式中、Ｘ１は、不存在、ＴＱＡＱＬＬＲＶＧ（配列番号４２）、配列番号４２の１個または複数の連続したアミノ酸のいずれか、Ｎ−アリール、またはＣ１〜Ｃ１８アルキル、置換されているアルキルもしくはヘテロアリール基から選択される置換基を有するＮ−アシルであり；
Ｘ２は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、側鎖がアミド結合を介して連結することができる、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ８と結合を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ４は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴであり；
Ｘ５は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、Ｓまたは不存在であり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、ホモセリン、（Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（Ａｂ）、または（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸（Ａｐ）であり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ２と結合を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ２１は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２２は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２６は、Ｒまたは不存在であり、ただしＸ２６が不存在の場合、Ｘ２７は不存在であり；
Ｘ２７は、Ｑまたは不存在であり、ただしＸ２７が不存在の場合、Ｘ２６は不存在であり；
Ｘ２８は、ＤまたはＥであり；かつ
Ｘ３３は、ＤまたはＥであり、該アミノ酸配列は、配列番号１でも配列番号２でもない、アミリンファミリーポリペプチド−６（ＡＦＰ−６）アナログ］、または該アミノ酸配列の生物学的に活性な断片を有するアミリンファミリーポリペプチド−６（ＡＦＰ−６）アナログ。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号１０〜１２、１６〜３３、および３５〜４０よりなる群から選択される、請求項１に記載のＡＦＰ−６アナログ。
【請求項３】
アミノ酸配列：Ｘ１−Ｘ２−ＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−ＳＡＰＶ−Ｘ２５−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号５６）
［式中、Ｘ１は、Ｑまたは不存在であり；
Ｘ２は、Ｖまたは不存在であり；
Ｘ１３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１６は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１７は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１８は、Ｒまたは不存在であり、ただしＸ１８が不存在の場合、Ｘ１９は不存在であり；
Ｘ１９は、Ｑまたは不存在であり、ただしＸ１９が不存在の場合、Ｘ１８は不存在であり；
Ｘ２０は、ＤまたはＥであり；かつ
Ｘ２５は、ＤまたはＥであり、該アミノ酸配列は、配列番号１３でも配列番号１４でもない］、または該アミノ酸配列の生物学的に活性な断片を有するＡＦＰ−６アナログ。
【請求項４】
Ｃ−末端がアミド化されている、請求項１〜３のいずれか１記載のＡＦＰ−６アナログ。
【請求項５】
アナログが、ＡＦＰ−６アゴニスト活性を有する、請求項１〜４のいずれか１記載のＡＦＰ−６アナログ。
【請求項６】
アナログが、ＡＦＰ−６アンタゴニスト活性を有する、請求項１〜４のいずれか１記載のＡＦＰ−６アナログ。
【請求項７】
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＦＰ−６アナログ。
【請求項８】
請求項１〜３に記載のＡＦＰ−６アナログを含む化合物。
【請求項９】
請求項１〜３に記載のＡＦＰ−６アナログを含むポリペプチド。
【請求項１０】
医薬上許容される担体中に、請求項１〜４のいずれか１記載のＡＦＰ−６アナログの少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１１】
治療または予防を必要とする対象において、カロリーもしくは栄養の摂取量または利用能を減少させることによって緩和することができる状態または疾患を治療または予防する方法であって、カロリーまたは栄養の摂取量または利用能を減少させるのに治療上有効な量で請求項５に記載のＡＦＰ−６アナログを該対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
状態または疾患が、肥満、インスリン抵抗性、代謝異常症候群または真性糖尿病である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
状態または疾患が、心血管の状態または疾患である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
治療または予防を必要とする対象において、消耗性の状態または疾患を治療または予防する方法であって、消耗性の状態または疾患を治療または予防する治療上有効な量で請求項６に記載のＡＦＰ−６アナログを該対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
消耗性の状態または疾患が、摂食障害、悪液質または過食症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
消耗性の状態または疾患の特徴が、食欲の減少、食物摂取量の減少、体重の減少、胃の低運動性、または低血圧である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１または３に記載のＡＦＰ−６アナログをコードする単離された核酸。
【請求項１８】
核酸が、ＤＮＡ分子である、請求項１７に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項２０】
発現制御配列と作動可能に結合する、請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞が、細菌、酵母、藻類、鳥類細胞、哺乳類細胞、植物細胞および昆虫細胞よりなる群から選択される、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
宿主細胞が、代謝障害の治療に使用するためのＡＦＰ−６アナログを産生する、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
ＡＦＰ−６アナログの発現を供する条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養し、次いで、発現したＡＦＰ−６アナログを単離することを特徴とするＡＦＰ−６アナログの製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられ、２００４年１０月８日付で出願した米国仮特許出願第６０／６１７４６８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、アミリンファミリーペプチドのメンバーの活性を有する新規の化合物に関する。これらの化合物は、代謝障害、血管障害、腎障害および／または胃腸障害のごとき状態を治療または予防するのに有用である。例示的な状態として、肥満、ＩＩ型糖尿病、摂食障害、代謝異常症候群およびインスリン抵抗性症候群等のカロリー摂取量の低減が重要である状態があげられる。
【背景技術】
【０００３】
アミリンファミリーポリペプチド−６（ＡＦＰ−６）は、アミリンファミリーのメンバーである。アミリンファミリーには、アミリン、アドレノメデュリン（ＡＤＭ）、カルシトニン（ＣＴ）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）が含まれる。ヒトＡＦＰ−６遺伝子は、インターメジンとしても知られ、１４８個のアミノ酸のオープンリーディングフレームをコードし、このアミノ酸は、Ｎ−末端に、分泌に関わる２４個のアミノ酸のシグナルペプチドならびに以下のアミノ酸配列を有する成熟したアミド化ペプチドを持つ：
TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号１）。
【０００４】
他のＡＦＰ−６ポリペプチドには、VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号２）、PHAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLVRPAGRRDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号３）、およびVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLVRPAGRRDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号４）が含まれる。さらに他のアミリンファミリーポリペプチドには、KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY-NH2  （配列番号５）、CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-NH2  （配列番号６）、ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAF-NH2  （配列番号７）、ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2  （配列番号８）、およびYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2  （配列番号９）が含まれる。
【０００５】
表１には、上記の配列番号に対応するポリペプチドを示す。配列番号１〜４は、ヒトおよびマウスのＡＦＰ−６の形態に関する。配列番号５〜９は、ヒトアミリンファミリーポリペプチドに属するアミリン、カルシトニン、ＣＧＲＰα、ＣＧＲＰβおよびアドレノメデュリンに関する。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
これらのアミリンファミリーポリペプチドの生物学的作用は、２種の密接に関連するＩＩ型のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、カルシトニン受容体（ＣＴＲ）およびカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）に結合することによって媒介されると報告されている。クローン化および機能的緩急により、ＣＧＰＲ、ＡＤＭおよびアミリンは、ＣＴＲまたはＣＲＬＲと受容体活性修飾タンパク質（ＲＡＭＰ）との種々の組合せと相互作用することが示されている。多数の細胞は、複数のＲＡＭＰを発現する。カルシトニン、ＣＧＲＰ、ＡＤＭおよびアミリンの機能性受容体を生成するためには、ＲＡＭＰとＣＴＲまたはＣＲＬＲのいずれかとが共発現することが必要であると考えられている。ＲＡＭＰファミリーには、３種のメンバー（ＲＡＭＰ１、ＲＡＭＰ２およびＲＡＭＰ３）が含まれ、それらは３０％未満の配列同一性を共有するが、共通した形態的な構造を有する。ＣＲＬＲとＲＡＭＰ１との共発現は、ＣＧＲＰの受容体の形成に導く。ＣＲＬＲとＲＡＭＰ２とが共発現すると、ＡＤＭの受容体が形成されるようになる。ＣＲＬＲとＲＡＭＰ３との共発現は、ＡＤＭおよびＣＧＲＰの受容体の形成に導く。ｈＣＴＲ２とＲＡＭＰ１との共発現は、アミリンおよびＣＧＲＰの受容体の形成に導く。ｈＣＴＲ２とＲＡＭＰ３との共発現は、アミリンの受容体の形成に導く。
【０００８】
アミリンは、胃内容排出を調節し、グルカゴンの分泌および食物摂取を抑制し、従って、循環におけるグルコース出現の速度を調節する。アミリンは、グルコースの循環からの消失速度および末梢組織による取り込み速度を調節するインスリンの作用を補完するようである。これらの作用は、アミリンが、いずれもグルコース出現の速度に影響する、少なくとも３種の独立した機構によって、食後のグルコース調節に対するインスリンの効果を補完することを示す、げっ歯類およびヒトにおける実験的知見によって支持されている。第１に、アミリンは、食後のグルカゴン分泌を抑制する。健常な成人と比較し、Ｉ型糖尿病の患者は、循環しているアミリン認められず、ＩＩ型糖尿病の患者では、食後のアミリン濃度を低下させている。さらに、循環しているアミリンに結合するアミリン特異的モノクローナル抗体の注入は、再度、対照に比べ、グルカゴン濃度が大幅に上昇した。これらの結果はともに、食後のグルカゴン分泌の調節において、内因性アミリンが生理的な役割を担っていることを示す。第２に、アミリンは、胃腸運動および胃内容排出を遅らせる。最後に、ラットアミリンの視床下部の注射は、ラットにおける摂食量が減少し、視床下部における神経伝達物質の代謝が変化したことを示した。ある研究において、視床下部のラットアミリンおよびラットＣＧＲＰの注射後８時間まで、食物摂取量が顕著に減少した。ヒト臨床治験では、アミリンアナログのプラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）が、体重または体重増加を低下させることが示された。また、アミリンは、糖尿病および肥満等の代謝状態の治療に有用であり得る。アミリンを用いて、痛み、骨障害、胃炎を治療でき、脂質、特にトリグリセリドを調節でき、または優先的な脂肪の減少および除脂肪組織の容認のごとき体組成に影響できる。
【０００９】
ホルモンであるカルシトニン（ＣＴ）は、高カルシウム血症の誘発に応じたその分泌ならびに迅速な血中カルシウム低下効果から、名づけられた。カルシトニンは、それ故にＣ細胞と呼ばれている甲状腺の神経内分泌細胞で産生され、そこから分泌される。ＣＴ（１〜３２）の最も研究されたのは、その破骨細胞に対する効果である。ＣＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果には、波状縁の急速な減少およびリソソームでの酵素の放出低下が含まれる。最終的には、ＣＴによる破骨細胞機能の阻害の結果、骨再吸収が低下する。しかしながら、甲状腺摘除の場合における血清ＣＴの慢性的な低下も、髄様甲状腺癌で判明した血清中ＣＴの上昇も、血清カルシウム量および骨量の変化とは関連がないようである。従って、ＣＴ（１〜３２）の主たる機能は、緊急事態における急性高カルシウム血症に対処することおよび／または成長、妊娠および授乳のごとき「カルシウムストレス」の期間に骨格を保護することである可能性が高い。例えば、Ｂｅｃｋｅｒ（２００４）ＪＣＥＭ  ８９（４）：１５１２−１５２５、およびＳｅｘｔｏｎ（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：１０６７−１０９３を参照されたい。これは、カルシトニンおよびＣＧＲＰ−Ｉペプチドの両方を除去したカルシトニン遺伝子ノックアウトマウスから得られた最近のデータと一致する。それは、マウスが正常なレベルのカルシウムに関連する基底値を示すが、血漿カルシウム応答は上昇することが示された（Ｋｕｒｉｈａｒａら、（２００３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ．２６  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ  １０５−１０８）。
【００１０】
ＣＴは、血漿カルシウムレベルに対する効果を有し、破骨細胞の機能を阻害するので、骨粗鬆症の治療に広く使用されている。治療的には、サケＣＴは、最小の有害作用で、骨密度を増加させ、骨折の発生率を低下させるようである。また、ＣＴは、骨パジェット病の治療法として、過去２５年以上成功裡に使用されている。この疾患は、骨格の１または複数の領域で骨が肥大または変形を生じ得る慢性骨格障害である。また、ＣＴは、骨粗鬆症の間の骨の痛みに対する鎮痛効果のために、広く用いられている。しかしながら、この効果についての機構は、明確には理解されていない。
【００１１】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、その受容体が、神経系および心血管系を含めた体内に広く分布する神経ペプチドである。このペプチドは、知覚神経伝達を調節し、今日までに発見されている最も強力な内因性の血管拡張性ペプチドの１つである。ＣＧＲＰについて報告された生物学的効果は、炎症におけるサブスタンスＰの調節、神経筋接合部におけるニコチン受容体活性、膵臓酵素分泌の刺激、胃酸分泌の低下、末梢血管拡張、心悸亢進、神経調節、カルシウム代謝の調節、骨形成刺激、インスリン分泌、体温上昇および食物摂取量の減少を含む。Ｗｉｍａｌａｗａｎｓａ（１９９７）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１１（２−３）：１６７−２３９。ＣＧＲＰの重要な役割は、α−ＣＧＲＰの静脈投与後の平均動脈圧の低下により証明される、その強力な血管拡張作用による、種々の臓器への血流の制御である。また、この血管拡張作用は、ホモ接合体ノックアウトＣＧＲＰマウスの最近の解析によって支持され、この解析は、末梢の交感神経の活動の増大により引き起こされた末梢血管の抵抗および、血圧の上昇を実証した（Ｋｕｒｉｈａｒａ（２００３）、前出）。従って、ＣＧＲＰは、とりわけ、血管拡張効果、血圧低下効果およびを心拍数の増加を誘発するようである。
【００１２】
うっ血性心不全の患者へのＣＧＲＰの長時間注入は、有害作用なくして、血行力学的な機能に対する持続した有益な効果を示し、心不全への使用が示唆される。ＣＧＲＰの使用の他の適応症は、腎不全、急性および慢性の冠状動脈虚血、心不整脈の治療、レイノー現象のごとき他の末梢血管疾患、クモ膜下出血、高血圧症ならびに肺高血圧症を含む。また、妊娠中の前子癇性の毒素血症および早産が潜在的に治療可能である（Ｗｉｍａｌａｗａｎｓａ（１９９７）、前出）。最近の治療上の使用例は、偏頭痛の治療のためのＣＧＲＰアンタゴニストの使用を含む。
【００１３】
アドレノメデュリンは、ほとんど一様に発現しており、このペプチドを含有する組織の方が、そうでない組織よりはるかに多い。ＡＤＭの公表された総説は、心血管系、細胞増殖、中枢心神経系および内分泌系に対するＡＤＭの効果を詳述し、血管拡張、細胞増殖、ホルモン分泌の調節およびナトリウム利尿を含めた広範な生物学的作用をもたらすとしている（Ｈｉｎｓｏｎら、（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１（２）：１３８−１６７）。ラット、ネコ、ヒツジおよびヒトにおける研究は、ＡＤＭの静脈内注射が、ＣＧＲＰと同等の強力で持続性の血圧降下作用を生じることを確認している。しかしながら、麻酔ラットの平均動脈圧に対するＡＤＭの血圧降下効果は、ＣＧＲＰアンタゴニストＣＧＲＰ８−３７によって阻害されないことから、この効果はＣＧＲＰ受容体を介して媒介されていないことが示唆されている。麻酔ラット、覚醒ラットまたは高血圧性のラットにおける、ヒトＡＤＭを急性または慢性に投与した結果、血圧の降下に伴って、全末梢抵抗が顕著に低下し、同時に心拍数、心拍出量および１回拍出量は増加した。
【００１４】
また、ＡＤＭは、胚形成および分化における重要な因子としてならびにラット内皮細胞のアポトーシス生存因子として提案されている。これは、最近のＡＤＭノックアウトマウス研究によって支持され、この研究では、ＡＤＭ遺伝子欠損にホモ接合性のマウスが、胚形成中に不完全な血管形成を呈し、かくして妊娠中期に死亡した。ＡＤＭ  ＋／−ヘテロ接合性マウスは、組織の損傷も受けやすいと共に、高血圧性を有することが報告されている（Ｋｕｒｉｈａｒａ（２００３）、前出）。
【００１５】
ＡＤＭは、脳下垂体、副腎、生殖器および膵臓のごとき内分泌臓器に影響する。このペプチドは、脳下垂体からのＡＣＴＨの放出を阻害する役割を有するようである。副腎においては、ＡＤＭは、ラットおよびヒトの両方において副腎皮質の分泌活性に影響するようであり、さらに、無処置ラットの副腎血管床では血管拡張剤として作用して副腎の血流を増加させる。ＡＤＭは、女性の生殖器系全体に存在し、正常な妊娠では血漿濃度が上昇することが示されている。子癇前症のラットモデルにおける研究では、妊娠後期のラットに投与すると、ＡＤＭは、高血圧を改善し、子の死亡率を低下できることが示されている。子癇前症のモデルの妊娠早期または妊娠していないラットにおいては、動物において同様の効果が認めらなかったため、これは、ＡＤＭが子宮胎盤循環器系において重要な調節機能を担い得ることを示唆している。膵臓では、ＡＤＭは、阻害的な役割を担っている可能性が高い。というのは、経口グルコース負荷に対するインスリン応答を減弱および遅延させ、そのため、初期のグルコース濃度は上昇するからである。また、ＡＤＭは、腎機能に影響できる。末梢ボーラス投与は、かなり平均動脈圧を低下させ、腎血流、糸球体ろ過率および尿流量を増加できる。いくらかの場合には、Ｎａ＋排泄が増加する。
【００１６】
また、ＡＤＭは、骨および肺に対して、他の末梢性の効果を有する。骨に対しては、研究は、心血管系および体液のホメオスタシスを超える役割もすることを支持し、ＡＤＭが胎性および成体げっ歯類の破骨細胞に作用して、形質転換増殖因子βのごとき既知の破骨細胞成長因子による細胞増殖と同じ程度まで、細胞増殖を増加させることが実証されている。これは、臨床的に重要である。というのは、骨粗鬆症の研究における主な課題の１つが、破骨細胞を刺激することによって骨量を増加させる治療法を開発することであるからである。肺においては、ＡＤＭは、肺血管拡張を引き起こすだけでなく、ヒスタミンまたはアセチルコリンにより誘発された気管支収縮を阻害する。ラットモデルにおける肺高血圧症を治療するためにエアロゾル化したＡＤＭを使用した最近の研究では、この状態の吸入治療が有効であることが示されている。これは、セーラインを与えたラットよりもＡＤＭで処置したラットにおいて、平均肺動脈圧および全肺抵抗が顕著に低下したという事実によって証明されている。全身動脈圧および心拍数を変化させることなく、この結果が得られた（Ｎａｇａｙａら、（２００３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５：Ｈ２１２５−２１３１）。
【００１７】
Ｎｉｃｈｏｌｌｓら（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２００１）２２：１７４５−１７５２）により公表された総説は、ＡＤＭの注入による効果が概説されている。健常ボランティアにおいて、静脈注射は、動脈圧を低下させ、心拍数、心拍出量、ｃＡＭＰ、プロラクチン、ノルエピネフリンおよびレンニンの血漿レベルを刺激した。これらの患者では、尿量またはナトリウムの排泄量の増加がほとんどあるいは全く認められなかった。心不全または慢性腎不全の患者では、ＡＤＭの静脈内注射は、正常な対象で認められた効果と同様の効果を有し、投与した用量に依存して、利尿およびナトリウム利尿も誘発した。また、実験的なＡＤＭ処置は、動脈および肺高血圧症、敗血症ショックならびに虚血／再灌流障害に有益であることも示された（Ｂｅｌｔｏｗｓｋｉ（２００４）Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：５−２７）。ＡＤＭ処置の他の適応症には、末梢血管疾患、クモ膜下出血、高血圧症、妊娠中の前子癇性の毒素血症および早産ならびに骨粗鬆症が含まれる。
【００１８】
アミリンファミリーペプチドの最新のメンバーとしてのＡＦＰ−６の生物学的機能は、上記のメンバーより余り特徴付けされていない。しかしながら、ヒトおよびマウスの組織のノーザンブロットから得られた発現データは、以下の実施例の項の表４に示され、このデータは発現が主に脳下垂体および消化管内にあることを示す報告済みのデータと一致する。ＡＦＰ−６に特異的な受容体は報告されていないが、結合研究は、ＡＦＰ−６が、アミリンファミリーの既知の受容体全てに結合することを示す。ＡＦＰ−６は、内因性ＣＧＲＰ受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびＬ６細胞においてｃＡＭＰの産生を増加させ、これらの細胞内で、それらの受容体への結合につきラベル化ＣＧＲＰと競合することが示されている。公表されているｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、ＡＦＰ−６投与は、おそらくＣＲＬＲ／ＲＡＭＰ受容体との相互作用を介して行われている可能性が高い正常ラットおよび自然発生高血圧症ラットの双方の血圧低下に導く。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、胃内容排出および食物摂取の抑制に導く（Ｒｏｈら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：７２６４−７２７４）。
【００１９】
ＣＧＲＰ、ＡＤＭまたはアミリンを欠く変異マウスを用いた研究は、種々の系で、ＣＲＬＲは、心血管系の形態形成、知覚神経伝達、免疫反応、侵害受容挙動およびグルコースホメオスタシスにつき重要な役割を担うことができることが示されている。かくして、このファミリーのポリペプチドにおける生理的機能は、受容体結合特異性および個々のリガンドの組織発現プロフィールによって決定される。ＡＦＰ−６は、アミリンファミリーの全受容体に結合するという点ではユニークであるようである。例えば、アミリンは、アミリン、カルシトニンおよびＣＧＲＰ受容体に、０．０５〜２０ｎＭの親和性で結合するが、アドレノメデュリン受容体にはそれほど高い親和性では結合しない（数百ｎＭの親和性）。ウシ研究では、ＡＦＰ−６は、アドレノメデュリン受容体に結合（約１〜５ｎＭ）し、さらにそれ以外の３種の受容体に対しては３〜３０ｎＭの親和性を有し、このことから、ＡＦＰ−６にはアミリン、ＣＴ、ＣＧＲＰおよび／またはＡＤＭの特性が与えられる。受容体結合データについては、本明細書の表３も参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
アミリンファミリータンパク質全般、特に、ＡＦＰ−６ポリペプチドは、様々な疾患、状態および障害の治療または予防に有用である広範な生物学的活性を有する。かかるポリペプチド、ならびにその誘導体およびアナログを、上記の疾患、状態および障害の治療および／または予防に使用するために開発する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ある一般的な態様において、本発明は、新規のＡＦＰ−６アナログに関する。ＡＦＰ−６ポリペプチドのある領域が結合性および／または活性につき望ましいことが発見された。ある具体例において、新規のＡＦＰ−６アナログは、以下の式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−ＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−ＳＡＰＶ−Ｘ３３−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号４１）
［式中、Ｘ１は、不存在、ＴＱＡＱＬＬＲＶＧ（配列番号４２）、配列番号４２の１個または複数の連続したアミノ酸のいずれか、Ｎ−アリール、またはＣ１〜Ｃ１８アルキル、置換されているアルキルもしくはヘテロアリール基から選択される置換基を有するＮ−アシルであり；
Ｘ２は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、側鎖がアミド結合を介して連結できる、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ８と結合、例えばジスルフィドもしくはアミド結合、を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ４は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴであり；
Ｘ５は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、Ｓまたは不存在であり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、ホモセリン、（Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（Ａｂ）、または（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸（Ａｐ）であり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ２と結合、例えばジスルフィドもしくはアミド結合、を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ２１は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２２は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２６は、Ｒまたは不存在であり、但しＸ２６が不存在の場合、Ｘ２７は不存在であり；
Ｘ２７は、Ｑまたは不存在であり、但しＸ２７が不存在の場合、Ｘ２６は不存在であり；
Ｘ２８は、ＤまたはＥであり；
Ｘ３３は、ＤまたはＥである］
で表されるアミノ酸配列およびその生物学的に活性な断片を含む化合物であるが、この属のＡＦＰ−６アナログには、配列番号１または２を含まないものとする。
【００２２】
他の具体例において、新規のＡＦＰ−６アナログは、以下の式（ＩＩ）：
Ｘ１−Ｘ２−ＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−ＳＡＰＶ−Ｘ２５−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号５６）
［式中、Ｘ１は、Ｑまたは不存在であり；
Ｘ２は、Ｖまたは不存在であり；
Ｘ１３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１６は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１７は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１８は、Ｒまたは不存在であり、但しＸ１８が不存在の場合、Ｘ１９は不存在であり；
Ｘ１９は、Ｑまたは不存在であり、但しＸ１９が不存在の場合、Ｘ１８は不存在であり；
Ｘ２０は、ＤまたはＥであり；
Ｘ２５は、ＤまたはＥである］
で表されるアミノ酸配列およびその生物学的に活性な断片を含む、またはその活性な領域が、以下の式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列およびその生物学的に活性な断片からなるが、当該アミノ酸配列は、配列番号１３または１４ではない。
【００２３】
さらに他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、配列番号１０〜１２、１６〜３３および３５〜４０のアミノ酸配列を含む。さらに他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログが配列番号１５または３４のアミノ酸配列を含む、あるいはその活性な領域が配列番号１５または３４のアミノ酸配列からなる。
【００２４】
ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、２５、３０、３５、４０または４５個以下のアミノ酸を有することにより特徴づけることができる。他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、２３〜４９個のアミノ酸を有し得る。ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、配列番号１〜４、１０〜１２、１６〜３３および３５〜４０と、少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７または９８％のアミノ酸配列同一性を備え、少なくとも１種のアミリンファミリー活性を有するが、当該化合物は、配列番号１〜４ではない。他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、配列番号１５および３４の配列と、少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７または９８％のアミノ酸配列同一性を備え、アミリンファミリーポリペプチドのアンタゴニスト活性を有する、あるいはその活性な領域が、配列番号１５および３４の配列と、少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７または９８％のアミノ酸配列同一性を備え、アミリンファミリーポリペプチドに対するアンタゴニスト活性を有するが、当該化合物は、配列番号１３および１４ではない。
【００２５】
もう一つの一般的な態様では、本発明は、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログの使用方法を提供する。ある具体例において、本発明は、対象におけるカロリーまたは栄養の摂取量または利用能を減少させることによって、緩和できる状態または疾患を治療または予防する方法を意図する。本発明方法には、限定されるものではないが、肥満、インスリン抵抗性、代謝異常症候群および真性糖尿病の状態および疾患を含むことができる。他の具体例において、本発明は、対象における心血管の状態または疾患を治療または予防する方法を意図する。心血管の状態または疾患の例は、高血圧症、心筋虚血および心筋再灌流障害であるが、これらに限定されない。
【００２６】
さらに他の具体例において、本発明方法は、アンタゴニスト活性を有するＡＦＰ−６アナログの使用を意図する。従って、例示的な使用には、対象における摂食障害、悪液質、過食症、および食欲の減少、食物摂取量の減少、体重の減少、胃の低運動性または低血圧症により特徴付けられる他の消耗性疾患の治療または予防を含む。
【００２７】
さらなる具体的態様には、本発明の化合物を、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で、注射、注入、吸収（例えば粘膜、経粘膜、経皮）および吸入のごときデリバリー方法で投与すること、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、当該ヌクレオチドを含有するベクター、ヌクレオチドを増殖し、および／または当該ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する宿主細胞、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログに指向される抗体、ならびに対象におけるスクリーニングまたは検出／診断におけるそれらの使用が含まれる。もう一つの具体例において、本発明は、ＡＦＰ−６アナログの発現を供する条件下で、ＡＦＰ−６アナログをコードする発現ベクターを含有する宿主細胞を培養し、次いで、発現したＡＦＰ−６アナログを単離することを含む方法を含めたＡＦＰ−６アナログを製法を提供する。
【００２８】
本明細書に記載した全ての文献は、参照によってその全体が組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（図面の簡単な記載）
図１Ａおよび１Ｂは、アドレノメデュリンペプチドクエリ配列と仮想タンパク質ＸＰ＿１４７９１６とのＢＬＡＳＴ配列比較、およびヒトアドレノメデュリン前駆体と全長の仮想マウスタンパク質ＸＰ＿１４７９１６とのＢＬＡＳＴ配列比較を示す。同一の残基を濃灰色で、類似する化学的性質を有する残基を淡灰色で示す。
図２は、今回マウスＡＦＰ−６と新たに名づけられたタンパク質ＸＰ＿１４７９１６のＦＡＳＴＡフォーマットの全配列を示す。
図３は、ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により実施し、シェーディングのためにＢＯＸＳＨＡＤＥにエクスポートしたマウスおよびヒトＡＦＰ−６前駆体タンパク質の配列比較を示す。同一の残基を濃灰色で、類似する化学的性質を有する残基を灰色で示す。
図４は、ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により実施し、シェーディングのためにＢＯＸＳＨＡＤＥにエクスポートしたヒトアドレノメデュリンおよびヒトＡＦＰ−６前駆体タンパク質の配列比較を示す。同一の残基を濃灰色で、類似する化学的性質を有する残基を淡灰色で示す。
図５は、ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）による、アミリンファミリーポリペプチドであるｈＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリン、ヒトアミリン、ｈＣＧＲＰ１およびヒトカルシトニンの配列比較を示す。同一の残基を濃灰色で、類似する化学的性質を有する残基を淡灰色で示す。
図６は、アドレノメデュリンとの相同性に基づいたヒトおよびマウスのＡＦＰ−６前駆体からの予測される成熟した生理活性ペプチドを示す。
図７は、データベース配列ＮＭ０２４８６６と整列したヒト前立腺ＡＦＰ−６のｃＤＮＡの５’ＵＴＲの配列比較を示す。
図８Ａ〜８Ｉは、膵臓、前立腺および唾液腺から選択されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのデータを示す。
図９は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを用いて測定した、ＨＵＶＥＣおよびＣＨＯ細胞における２種の濃度のＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリンおよびｈＣＧＲＰ１によるサイクリックＡＭＰの上昇のデータを示す。
図１０は、アミリンの放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示す。グラフは、アミリン受容体における放射標識されたアミリンの結合の置換を、ＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリン、ｈＣＧＲＰ１、ヒトカルシトニンおよびｒアミリンの阻害濃度（ＩＣ５０）の計算値とともに示す。
図１１は、ＣＧＲＰの放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示す。グラフは、ＣＧＲＰ受容体における放射標識されたＣＧＲＰの結合の置換を、ＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリン、ｈＣＧＲＰ１、ヒトカルシトニンおよびｒアミリンのＩＣ５０の計算値とともに示す。
図１２は、ＡＦＰ−６のマウスにおける短期の食物摂取に対する効果を示す。
図１３は、ＡＦＰ−６のマウスにおける短期の食物摂取に対する及ぼす投与量−応答を示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ラットにおける胃内容排出速度に対する、各々、ＡＦＰ−６およびｒアミリンの効果を示す。
図１５Ａおよび１５Ｂは、ラットにおけるイオン化カルシウムレベルに対する、各々、ＡＦＰ−６およびｒアミリンの効果を示す。
図１６Ａ〜１６Ｃは、雄性ラットにおいて、いくつかの心臓パラメーター、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）およびｄＰ／ｄｔに対する、ｒアミリン、ＡＦＰ−６およびラットアドレノメデュリンの効果を示す。
図１７Ａおよび１７Ｂは、高脂肪食を与えられたラットにおける食物摂取および体重増加に対する、配列番号１のＡＦＰ−６または配列番号３２の例示的なＡＦＰ−６アナログの１週間連続皮下注入の効果を示す。
【００３０】
本発明は、新規のＡＦＰ−６アナログの発見に関する。ＡＦＰ−６以外のアミリンファミリーポリペプチドの理解と組み合わせた、ＡＦＰ−６の構造および機能を理解するように設計された研究の努力を介して、新規の化合物およびそれらの使用を本明細書に記載する。ＡＦＰ−６アナログと呼ばれるこれらの化合物は、とりわけ、代謝の状態および障害の治療および予防に有用である。ＡＦＰ−６アナログの１つの望ましい特徴は、ＡＦＰ−６アナログが、特定のアミリンファミリー受容体をそれ以外の受容体よりも好む（例えば、ある結合プロフィールを所有させる）ように設計することができるということである。これによって、より効果的な治療、副作用の低減、安定性または溶解性の増加、活性の増大、あるいは当該ペプチドの製造または使用の簡便性の増加、例えば、当該ペプチドの製造をより経済的とすることもできる。従って、ペプチドアナログは、臨床での使用ならびに、限定されるものではないが、高血圧症および心血管系のホメオスタシスの維持；肺疾患、妊娠（または不妊症）および授乳；胃腸；グルコース調節、肥満、代謝異常症候群、ならびに他の代謝障害を含む生理学に関与する状態の治療法の開発につき、非常に注目される。
【００３１】
ある具体例において、高血圧および心血管の状態；妊娠（または不妊症）および授乳；肺障害；ならびに胃腸の状態および高または低血糖と関与する状態の治療および／または予防において、本発明のＡＦＰ−６アナログは、ネイティブなＡＦＰ−６ポリペプチドに比べ、同等または高い効力を有し得る。他の具体例において、本発明のＡＦＰ−６アナログは、上記の状態の治療および／または予防において、依然として有効であるか弱い効力を有するが、ネイティブなＡＦＰ−６を上回る他の望ましい特徴、安定性または溶解性の増大、少ない副作用、あるいは生物学的活性の組合せおよび／または製造、製剤化もしくは使用の簡便化を所有し得る。さらに他の具体例において、本発明のＡＦＰ−６アナログは、ＡＦＰ−６の活性を遮断または減少させるアンタゴニスト活性を有する。従って、本発明のＡＦＰ−６アンタゴニストアナログは、例えば、消耗性の疾患または障害の予防または治療に有用である。
【００３２】
本明細書においては、項目は構成上の便宜のために使用されているに過ぎず、記載された主題をいかなる場合であっても限定するものではない。
【００３３】
ＡＦＰ−６アナログ
本発明のＡＦＰ−６アナログには、限定されるものではないが、配列番号１のアミノ酸１８〜２７および４１〜４７を少なくとも有する化合物；配列番号１のアミノ酸１８〜２７および３３〜４７を少なくとも有し、３５位および４０位のアミノ酸はＤもしくはＥのいずれかである化合物；配列番号１のアミノ酸１８〜２７、３６〜３９および４１〜４７を少なくとも有する化合物；または前記の化合物のいずれかであって、Ｎ−末端にジスルフィドまたはアミドのループのごときループをさらに有する前記化合物のいずれかを含み、但し、ＡＦＰ−６アナログは配列番号１〜４ならびに配列番号１のアミノ酸１６〜４７および１７〜４７ではない。ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６個以下のアミノ酸を有することにより特徴付けできる。他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、４７、４８、４９個またはそれ以上のアミノ酸を有し得る。いくつかの具体例において、ＡＦＰ−６アナログが、本明細書に記載されたもののようなアミリン、カルシトニン、ＣＧＲＰ、アドレノメデュリンまたはＡＦＰ−６の活性のごときアミリンファミリー活性を有する。いくつかの具体例において、ＡＦＰ−６アナログが、アミリンファミリーアンタゴニスト活性を有する。かくして、「ＡＦＰ−６アナログ」とは、アゴニストまたはアンタゴニスト活性のいずれかを有するペプチドをいう。ＡＦＰ−６アナログがアゴニストまたはアンタゴニストのいずれであるかは、本明細書に記載された生物学的アッセイのいずれかを用いて決定できる。
【００３４】
本発明のＡＦＰ−６アナログは、少なくとも以下の式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−ＱＶＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｘ２８−ＳＡＰＶ−Ｘ３３−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号４１）
［式中、Ｘ１は、不存在、ＴＱＡＱＬＬＲＶＧ（配列番号４２）、配列番号４２の１個または複数の連続したアミノ酸のいずれか、Ｎ−アリール、またはＣ１〜Ｃ１８アルキル、置換されているアルキルもしくはヘテロアリール基から選択される置換基を有するＮ−アシルであり；
Ｘ２は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、側鎖がアミド結合を介して連結することができる、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ８と結合、例えばジスルフィドもしくはアミド結合、を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ４は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、ＳまたはＴであり；
Ｘ５は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、ＡまたはＳであり；
Ｘ６は、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｇ、Ｎ、Ａ、Ｓまたは不存在であり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｓ、ホモセリン、（Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（Ａｂ）、または（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸（Ａｐ）であり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｓ、Ｃ、置換されているＬ、Ｋ、ＤもしくはＥ、またはＸ２との結合、例えばジスルフィドもしくはアミド結合、を形成できるいずれかのアミノ酸であり；
Ｘ２１は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２２は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ２６は、Ｒまたは不存在であり、但しＸ２６が不存在の場合、Ｘ２７は不存在であり；
Ｘ２７は、Ｑまたは不存在であり、但しＸ２７が不存在の場合、Ｘ２６は不存在であり；
Ｘ２８は、ＤまたはＥであり；
Ｘ３３は、ＤまたはＥである］
を有する化合物を含み得るが、当該ＡＦＰ−６アナログは、配列番号１および２ではない。
【００３５】
他の具体例において、新規のＡＦＰ−６アナログは、以下の式（ＩＩ）： 
Ｘ１−Ｘ２−ＱＮＬＳＨＲＬＷＱＬ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−ＳＡＰＶ−Ｘ２５−ＰＳＳＰＨＳＹ（配列番号５６）
［式中、Ｘ１は、Ｑまたは不存在であり；
Ｘ２は、Ｖまたは不存在であり；
Ｘ１３は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１４は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１５は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１６は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１７は、Ｍ、Ｇ、Ｐ、Ａまたは不存在であり；
Ｘ１８は、Ｒまたは不存在であり、但しＸ１８が不存在の場合、Ｘ１９は不存在であり；
Ｘ１９は、Ｑまたは不存在であり、但しＸ１９が不存在の場合、Ｘ１８は不存在であり；
Ｘ２０は、ＤまたはＥであり；
Ｘ２５は、ＤまたはＥである］
で表されるアミノ酸配列およびそれらの生物学的に活性な断片を含む、またはその活性な領域が、式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列およびそれらの生物学的に活性な断片からなるが、当該アミノ酸配列は、配列番号１３および１４ではない。
【００３６】
ＡＦＰ−６アナログは、Ｃ−末端がアミド化されていてもまたはされていなくてもよい。さらに、式（Ｉ）のある変形により規定されるＡＦＰ−６アナログも意図されている。例えば、ある具体例において、Ｘ１は、不存在である。他の具体例において、Ｘ１は、ＲＶＧである。さらに他の具体例において、Ｘ１は、ＶＧである。さらに他の具体例において、Ｘ１は、Ｇｌｙである。さらに他の具体例において、Ｘ１は、Ｖａｌである。ある具体例において、Ｘ２およびＸ８は、Ｃｙｓである。他の具体例において、Ｘ２およびＸ８は、置換されているＬｅｕ、ＬｙｓまたはＡｓｐである。さらに他の具体例において、Ｘ２およびＸ８は、Ｍｅｔである。さらに他の具体例において、Ｘ２および／またはＸ８は、Ｇｌｕである。さらに他の具体例において、Ｘ２およびＸ８は、化学的に相互に結合して分子内結合を形成できる側鎖を有するアミノ酸である。Ｘ２およびＸ８についてのかかる側鎖には、ジスルフィド結合を形成し得るアルキルスルフヒドリル；環状のラクタムを形成し得るアルキル酸およびアルキルアミン；縮合および還元されてアルキルアミンの橋を形成し得るアルキルアルデヒドもしくはアルキルハライドおよびアルキルアミン、または結合してアルキル、アルケニル、アルキニル、エーテルもしくはチオエーテル結合を形成し得る側鎖から誘導された基が含まれる。
【００３７】
式（Ｉ）に包含されるＡＦＰ−６アナログのある具体例において、Ｘ３は、Ｖａｌである。他の具体例において、Ｘ３は、Ａｓｎである。さらに他の具体例において、Ｘ３は、Ｇｌｙである。ある具体例において、Ｘ４は、Ｌｅｕである。他の具体例において、Ｘ４は、Ｔｈｒである。さらに他の具体例において、Ｘ４は、Ａｓｎである。ある具体例において、Ｘ５は、Ｇｌｙである。他の具体例において、Ｘ５は、Ａｌａである。さらに他の具体例において、Ｘ５は、Ｌｅｕである。ある具体例において、Ｘ６は、不存在である。他の具体例において、Ｘ６は、Ｓｅｒである。ある具体例において、Ｘ３はＶａｌであり、Ｘ４はＬｅｕであり、Ｘ５はＧｌｙであり、かつＸ６は不存在である。他の具体例において、Ｘ３はＡｓｎであり、Ｘ４はＴｈｒであり、Ｘ５はＡｌａであり、かつＸ６は不存在である。さらに他の具体例において、Ｘ３はＧｌｙであり、Ｘ４はＡｓｎであり、Ｘ５はＬｅｕであり、かつＸ６はＳｅｒである。
【００３８】
式（Ｉ）に含まれるＡＦＰ−６アナログのある具体例において、Ｘ７は、Ｔｈｒである。ある具体例において、Ｘ２１〜Ｘ２５は、不存在である。他の具体例において、Ｘ２１は、Ｍｅｔである。他の具体例において、Ｘ２２は、Ｇｌｙである。他の具体例において、Ｘ２３は、Ｐｒｏである。他の具体例において、Ｘ２４は、Ａｌａである。他の具体例において、Ｘ２５は、Ｇｌｙである。ある具体例において、Ｘ２６はＲであり、かつＸ２７はＱである。他の具体例において、Ｘ２６およびＸ２７は、不存在である。ある具体例において、Ｘ２８および／またはＸ３３は、Ａｓｐである。他の具体例において、Ｘ２８および／またはＸ３３は、Ｇｌｕである。
【００３９】
さらに、式（ＩＩ）のある変形により包含されるＡＦＰ−６アナログも意図されている。ある具体例において、Ｘ１３〜Ｘ１７は、不存在である。他の具体例において、Ｘ１３は、Ｍｅｔである。他の具体例において、Ｘ１４は、Ｇｌｙである。他の具体例において、Ｘ１５は、Ｐｒｏである。他の具体例において、Ｘ１６は、Ａｌａである。他の具体例において、Ｘ１７は、Ｇｌｙである。ある具体例において、Ｘ１８はＲであり、かつＸ１９はＱである。他の具体例において、Ｘ１８およびＸ１９は、不存在である。ある具体例において、Ｘ２０および／またはＸ２５は、Ａｓｐである。他の具体例において、Ｘ２０および／またはＸ２５は、Ｇｌｕである。
【００４０】
ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、長さが３０または３１個のアミノ酸である。他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、長さが３２個のアミノ酸である。さらに他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、長さが３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６個のアミノ酸である。さらに他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、長さが４７または４８個またはそれ以上のアミノ酸である。ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログの長さが、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９個のアミノ酸である。
【００４１】
アンタゴニスト活性を有するＡＦＰ−６アナログは、例えば、Ｘ１〜Ｘ５が欠失している式（Ｉ）の化合物を含み得る。アンタゴニスト活性を有する他のＡＦＰ−６アナログは、ＡＦＰ−６アナログアンタゴニストが配列番号１３および１４（配列番号１のアミノ酸１６〜４７および１７〜４７）ではない式（ＩＩ）の化合物を含み得る。アンタゴニスト活性を有する他のＡＦＰ−６アナログは、Ｘ１および／またはＸ２が欠失している式（ＩＩ）の化合物を含むことができ、但し、ＡＦＰ−６アナログアンタゴニストは配列番号１３および１４ではない。例示的なＡＦＰ−６アナログアンタゴニストとして、配列番号１３、１４および３４があげられる。さらに、ＡＦＰ−６アナログアンタゴニストは、内部の置換または欠失を含み得る。例えば、配列番号１４の９位のＴｒｐが欠失すると、配列番号１５のペプチドが生成される。例示的なＡＦＰ−６アナログアンタゴニストは、配列番号１５である。
【００４２】
本発明の例示的なＡＦＰ−６アナログには、以下が含まれる。
RVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１０）
GCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１１）
CVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１２）
QVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１３）
VQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１４）
VQNLSHRL-QLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１５）
TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１６）
TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQL-------DSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１７）
VGCVLGTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：１８）
CVLGTCQVQNLSHRLWQL-----RQESAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：１９）
TQAQLLRVGCSNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２０）
TQAQLLRVGCNTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２１）
RVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２２）
TQAQLLRVGCDTATCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２３）
TQAQLLRVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２４）
TQAQLLRVGMVLGT MQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２５）
GMVLGTMQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２６）
VGMVLGTMQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２７）
RVGCGNLSTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２８）
VGCGNLSTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：２９）
V-CNTA-TCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：３０）
GCNTATCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVDPSSPHSY-NH2  （配列番号：３１）
TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQESAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３２）
TQAQLLRVGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３３）
GTMQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３４）
VGCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３５）
VGCVLGTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３６）
GCNTATCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３７）
GCSNLSTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３８）
GCGNLSTCQVQNLSHRLWQL-----RQDSAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：３９）
GCVLGTCQVQNLSHRLWQL-----RQESAPVEPSSPHSY-NH2  （配列番号：４０）。
【００４３】
また、ＡＦＰ−６アナログには、配列番号１〜４および１０〜４０のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７または９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ１）配列番号１〜４０のいずれか１つに類似する活性またはアミリンファミリー活性、あるいは２）前記の活性のアンタゴニスト活性を有するポリペプチドも含むことができ、ここに、当該ＡＦＰ−６アナログは、配列番号１〜９、その既知の変異体、ならびに配列番号１３および１４ではない。パーセント同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）におけるＡｌｉｇｎＸ（登録商標）モジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製；Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いた分析によって決定される。
【００４４】
本発明の化合物は、ペプチドの生物学的活性または機能に影響しないが、精製（例えば、ヒスチジンタグ）、検出（例えば、ビオチン）または発現（例えば、発現カセット／ベクターおよびプロモーター）を補助する等、他の機能を果たすことができるさらなるアミノ酸、化学薬品または成分をさらに含むことができる。
【００４５】
また、本発明のＡＦＰ−６アナログは、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化のごとき化学的変化によって、さらに誘導体化し得る。かかる化学的変化は、化学的または生化学的な方法、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ手法を介して、あるいはそれらのいずれかの組合せによって得ることができる。また、本発明のアナログポリペプチドの誘導体には、１種もしくは複数のポリマー、または低分子物質にチア売るコンジュゲーションを含み得る。ポリマーコンジュゲーションの一種は、ＡＦＰ−６アナログのＮ−もしくはＣ−末端またはアミノ酸残基の側鎖に、種々の長さのポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）ポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ｐｏｌｙ−ｈｉｓ、ｐｏｌｙ−ａｒｇ、ｐｏｌｙ−ｌｙｓ等）および／または脂肪酸鎖を連結または結合である。低分子の置換基は、短いアルキルおよび制約されたアルキル（例えば、分岐アルキル、環状アルキル、縮合アルキル、アダマンチルアルキル）、ならびに芳香族基を含む。加えて、ＲおよびＫのごとき塩基性残基を、ホモＲおよびホモＫ、シトルリンまたはオルニチンで置換してペプチドの代謝安定性を改善し得る。また、ＡＦＰ−６アナログには、ペプチドの酸およびアミドの形態も含まれる。
【００４６】
また、ＡＦＰ−６アナログには、本明細書に記載の大きなペプチドの生物学的に活性な断片も含まれる。望ましい活性の例として、（１）食物摂取、胃内容排出、膵臓分泌、血圧、心拍数または体重減少のアッセイにおける、ＡＦＰ−６ポリペプチドまたは本発明のアミリンファミリーポリペプチドに類似する活性を有すること、および／あるいは（２）アミリンファミリー受容体（例えば、アミリン受容体、カルシトニン受容体）に対する受容体結合アッセイにおける結合を含む。アミリンファミリー受容体の例示的な結合アッセイは、本明細書および、参照によってその全体が本明細書に組み入れられている米国出願第５２６４３７２号に記載されている。
【００４７】
ある具体例では、かかるアッセイにおいて、ＡＦＰ−６アナログは、１μＭを超える親和性で結合し、他の具体例において、ＡＦＰ−６アナログが１〜１０ｎＭを超える親和性で結合する。また、ＡＦＰ−６アナログが、アミリンファミリー受容体（例えば、アミリン、カルシトニン、ＣＧＲＰまたはアドレノメデュリン）と間接的に相互作用することによって、望ましい活性を所有し得ること、あるいはＡＦＰ−６アナログが、ＡＦＰ−６ポリペプチド自体が相互作用して生物学的応答を誘発できる他の１種または複数の受容体に結合できることも意図されている。
【００４８】
本発明のアゴニストポリペプチドは、通常、ＡＦＰ−６活性のごとき生物学的アミリンファミリー活性の少なくとも一部を保持する。すなわち、アミリンファミリー活性には、アミリン活性、カルシトニン活性、アドレノメデュリン活性、ＣＧＲＰ活性またはＡＦＰ−６活性が含まれる。表２は、Ｗｉｍａｌａｗａｎｓａ（１９９７）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１１：１６７−２３９に発表されたアミリンファミリーの生物学的効果の概要を提供する。
【００４９】
【表２】
2008515443.tif 000004
【００５０】
「アミリン活性」を有するポリペプチドとは、当該ポリペプチドが、当技術分野で公知の特徴、および本明細書に記載の特徴、例えば食物摂取量を減少させることのごときアミリンに類似する生理的特徴を示すことを意味する。本発明のポリペプチドは、アミリン受容体、またはアミリン自体が相互作用して生物学的応答を誘発する、例えば、食物摂取量を減少させることができる他の１種もしくは複数の受容体に結合する、または結合しない場合にはそれらと直接もしくは間接的に相互作用することができる。
【００５１】
「カルシトニン活性」を有するポリペプチドとは、当該ポリペプチドが、当技術分野で公知の特徴、および本明細書に記載の特徴、例えば破骨細胞の機能を阻害すること、等のカルシトニンに類似する生理的特徴を示すこと意味する。本発明のポリペプチドは、ＣＴ受容体、またはカルシトニン自体が相互作用して生物学的応答を誘発する、例えば、破骨細胞の機能を阻害することができる他の１もしくは複数の受容体に結合する、または結合しない場合にはそれらと直接もしくは間接的に相互作用することができる。
【００５２】
「ＣＧＲＰ活性」を有するポリペプチドとは、当該ポリペプチドが、当技術分野で公知の特徴、および本明細書に記載の特徴、例えば血管拡張効果を誘発することのごときＣＧＲＰに類似する生理的特徴を示すこと意味する。本発明のポリペプチドは、ＣＧＲＰ受容体、またはＣＧＲＰ自体が相互作用して生物学的応答を誘発する、例えば、血管拡張効果を誘発することができる他の１種もしくは複数の受容体に結合する、または結合しない場合にはそれらと直接もしくは間接的に相互作用することができる。
【００５３】
「アドレノメデュリン活性」を有するポリペプチドとは、当該ポリペプチドが、当技術分野で公知の特徴、および本明細書に記載の特徴、例えば血圧降下効果を誘発すること、等のＡＤＭに類似する生理的特徴を示すこと意味する。本発明のポリペプチドは、ＡＤＭ受容体、またはＡＤＭ自体が相互作用して生物学的応答を誘発する、例えば、血圧降下効果を誘発することができる他の１種もしくは複数の受容体に結合する、または結合しない場合にはそれらと直接もしくは間接的に相互作用することができる。
【００５４】
「ＡＦＰ−６活性」を有するポリペプチドとは、当該ポリペプチドが、当技術分野で公知の特徴、および本明細書に記載の特徴、例えば血圧降下効果を誘発することのごときＡＦＰ−６に類似する生理的特徴を示すことを意味する。本発明のポリペプチドは、ＡＦＰ−６自体が相互作用して生物学的応答を誘発する、例えば、血圧降下効果を誘発することができる１種もしくは複数の受容体に結合する、または結合しない場合にはそれらと直接もしくは間接的に相互作用することができる。
【００５５】
本発明のもう一つの態様では、アンタゴニスト活性を持つＡＦＰ−６アナログは、通常、ＡＦＰ−６活性のごとき生物学的アミリンファミリー活性の少なくとも一部を阻害するまたは減弱させる。すなわち、アミリン活性、カルシトニン活性、ＣＧＲＰ活性、アドレノメデュリン活性および／またはＡＦＰ−６活性が、アンタゴニストアナログによって遮断される。
【００５６】
表３に、アミリンファミリーポリペプチドの食物摂取アッセイおよび種々のアミリンファミリー受容体結合アッセイの結果の概要を示す。実施例の項の表６および表７には、いくつかのＡＦＰ−６アナログの食物摂取アッセイおよび結合アッセイの結果の概要をそれぞれ示す。
【００５７】
【表３】
2008515443.tif 000005
【００５８】
本明細書に記載されている生物学的活性および／または受容体結合活性をもとに、本発明は、治療を必要とする対象の疾患または障害の治療に用いる医薬品に使用するための、ＡＦＰ−６アナログおよびＡＦＰ−６アナログ組成物を提供する。また、本発明は、対象の疾患または障害の治療において、ＡＦＰ−６アナログおよびＡＦＰ−６アナログ組成物の使用方法も提供する。
【００５９】
従って、ある態様では、本発明は、ＡＦＰ−６アゴニストアナログ組成物、さらにそれらを用いて、対象における体重を減少させる方法；体組成に影響させる方法；ＩＩ型もしくはインスリン非依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病および妊娠性糖尿病を含めた糖尿病を治療する方法；ならびに摂食障害、痛み、インスリン抵抗性症候群、代謝異常症候群、心血管疾患、肺疾患、不妊症または骨に影響する状態を治療する方法を提供する。
【００６０】
さらにもう一つの様態では、本発明は、ＡＦＰ−６アンタゴニストアナログの組成物と、アミリン、カルシトニン、ＣＧＲＰ、アドレノメデュリンまたはＡＦＰ−６の効果を遮断するそれらの能力によって、対象において、例えば、摂食障害、悪液質、過食症、および食欲の減少、食物摂取量の減少、体重の減少、または低血圧症を特徴とする他の消耗性疾患を効果的に治療できるようなそれらの使用方法を提供する。
【００６１】
「ＡＦＰ−６」とは、いずれかの種から得られた、または誘導されたＡＦＰ−６ポリペプチドを意味する。従って、「ＡＦＰ−６」という用語には、ヒトの全長アミノ酸ペプチド、ならびに、例えば、マウス、ハムスター、ニワトリ、ウシ、ラットおよびイヌのＡＦＰ−６ポリペプチドを含めた多様な種のＡＦＰ−６を含む。この意味では、「ＡＦＰ−６ポリペプチド」および「野生型ＡＦＰ−６ポリペプチド」または「ネイティブなＡＦＰ−６ポリペプチド」、すなわち未改変のＡＦＰ−６ポリペプチドは、互換性に用いられる。
【００６２】
「ＡＦＰ−６アゴニスト」とは、ペプチド、ペプチド様化合物および低分子を含めた、ＡＦＰ−６に類似する生物学的活性を誘発するいずれかの化合物を意味する。
【００６３】
「アミノ酸」および「アミノ酸残基」とは、構造的に立体異性の形態をとることができるならば、それらのＤおよびＬ立体異性体での、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および修飾アミノ酸を意味する。天然アミノ酸には、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）が含まれる。非天然アミノ酸には、限定されるものではないが、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノピメリン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモリジン、ホモプロリン、ホモセリン、ヒドロキシルセリン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｉｎｅ）、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、およびチオプロリン、ホモリジン、ホモアルギニン、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、Ｎ−ホルミルリジンが含まれる。修飾アミノ酸には、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ（カルボアミノ基または側鎖の官能基が、もう一つの官能基に化学的に体系化されている）のごとく、可逆的もしくは非可逆的にブロックされている、またはＮ−末端のアミノ基もしくは側鎖の基において修飾されている天然アミノ酸および非天然アミノ酸が含まれる。例えば、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）は、アスパラギン酸の修飾アミノ酸であり；Ｎ−エチルグリシンは、グリシンの修飾アミノ酸であり；またはアラニンカルボキサミドは、アラニンの修飾アミノ酸である。組み入れることができる他の残基は、Ｓａｎｄｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：２４８１−２４９１に記載されている。
【００６４】
ある具体例において、本発明のＡＦＰ−６アゴニストアナログは、ＡＦＰ−６ポリペプチドまたはアミリンファミリーのもう一つのポリペプチドの生物学的活性を、少なくとも約２５％、または約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％保持する、あるいは影響する。もう一つの具体例において、本発明のアゴニストアナログポリペプチドじゃ、他のアミリンファミリーポリペプチドの少なくとも１つに比べ、改善された活性を示す。例えば、本発明のアゴニストアナログポリペプチドが、ＡＦＰポリペプチドまたはアミリンファミリーのもう一つのポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約１１０％、１２５％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％または２００％超を示す。ＡＦＰ−６の例示的な機能として、食物摂取量の減少または血圧の低下がある。
【００６５】
例示的なＡＦＰ−６アナログは、本明細書に記載されているアッセイ（例えば、受容体結合アッセイ、食物摂取および／または体重減少アッセイ）の１つにおいて、同一アッセイにおけるヒトＡＦＰ−６ポリペプチドの効力を上回るまたはそれと同等の効力を有するものである。例えば、ＡＦＰ−６アナログは、少なくとも１つの受容体に、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭまたはそれを超える親和性で、あるいはネイティブなアドレノメデュリンまたは他のアミリンファミリーポリペプチドの１つの親和性より大きい親和性で、結合することができる。しかしながら、本発明のＡＦＰ−６アナログが、アッセイにおいてより弱い効力を有していてもよいことも意図されている。ＡＦＰ−６アナログは、特異的な結合プロフィール、安定性、溶解性または製造もしくは製剤化の簡便性のごとき望ましい特徴をさらに有し得る。
【００６６】
ある実施例において、本発明のポリペプチドは、食物摂取アッセイにおいて活性を示し得る。かかるポリペプチドは、累積食物摂取量を、ビヒクルに比べ、５％超、１５％超、２５％超、３５％超、または５０超減少させる能力を示す。ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログは、食物摂取量を７５％超または９０％超をも減少させる。
【００６７】
もう一つの一般的な態様では、本発明は、本明細書に記載されているＡＦＰ−６アナログをコードできる核酸を含む。かかる核酸を、当技術分野でよく知られた標準的なコード表を用いて、本明細書に提供されているアミノ酸配列から決定できる。
【００６８】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログの使用
本明細書に記載されている生物学的活性および／または受容体結合活性をもとに、本発明は、治療を必要とする対象の疾患または障害の治療に用いる医薬品に使用するための、ＡＦＰ−６アナログおよびＡＦＰ−６アナログ組成物を提供する。また、本発明は、対象の疾患または障害の治療において、ＡＦＰ−６アナログおよびＡＦＰ−６アナログの組成物を使用する方法も提供する。
【００６９】
本明細書で用い、当技術分野でよく理解されている「治療」とは、臨床結果を含めた、有用な、または望ましい結果を得るためのアプローチを意味する。疾患、障害または状態を「治療する」とは、障害を治療しない場合に比べ、状態、障害もしくは疾患の状況の程度および／または望ましくない臨床的徴候が軽減される、かつ／あるいは時間的な進行が緩慢になる、または延長されることを意味する。例えば、肥満の治療において、体重の減少、例えば、５％の体重減少は、望ましい治療結果の例である。本発明の目的について、有用な、または望ましい臨床結果には、限定されるものではないが、１種または複数の症状の軽減または改善、疾患の程度の低下、疾患の状況の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の拡散の予防、疾患の進行の遅延または緩慢、疾患の状況の改善または緩和、および検出可能または不可能な（部分的または完全な）緩解が含まれる。また、「治療」とは、治療を受けない場合に想定される生存期間に比べ、延長された生存期間を意味することもできる。さらに、治療とは、単回投与によって生じるとは限らず、しばしば多回投与によって生じる。かくして、治療上有効な量、または疾患、障害もしくは状態を治療するのに十分な量を、単回または多回投与できる。
【００７０】
従って、ある態様では、本発明は、ＡＦＰ−６アゴニストアナログの組成物、ならびにそれらを用いて、対象の体重を減少させる方法、体組成に影響する方法、ＩＩ型糖尿病すなわちインスリン非依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病および妊娠性糖尿病を含めた糖尿病を治療する方法、摂食障害、痛み、インスリン抵抗性症候群、代謝異常症候群、心血管疾患、肺疾患、不妊症ならびに／または骨に影響する状態を治療する方法を提供する。
【００７１】
さらにもう一つの様態では、本発明は、ＡＦＰ−６アンタゴニストアナログの組成物、ならびにアミリン、カルシトニン、ＣＧＲＰ、アドレノメデュリンまたはＡＦＰ−６の効果を遮断するそれらの能力によって、対象において、例えば、摂食障害、悪液質、過食症、および／または食欲の減少、食物摂取量の減少、体重の減少または低血圧症を特徴とする他の消耗性疾患の治療上有効であり得る、それらを使用する方法を提供する。
【００７２】
本明細書に記載されている薬理学的な活性に基づいて、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、（真性糖尿病および血糖代謝異常の様々な徴候、インスリン抵抗性およびインスリン抵抗性症候群、肥満、脂質代謝異常を含む）代謝疾患の治療に；胃炎、バレット食道炎および他の食道炎、膵臓炎ならびに過敏性大腸症候群を含む胃腸障害の治療に；胃内容排出に関係する、または胃内容排出の速度を調節することによって改善することができる障害の治療（例えば、ダンピング症候群、食後のグルコースレベルの緩和および胃の低運動性）に；高血圧症、腎不全、（虚血／再灌流障害および脳卒中を含む）血管閉塞障害を含めた心血管および腎臓の障害の治療に；うっ血性心不全および他の心室機能不全ならびに不整脈の治療に、さらに、特に心筋梗塞と関聨した心保護薬および／または筋保護薬として；肺高血圧症、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患および換気灌流ミスマッチの障害を含めた肺の障害の治療に；骨痛、偏頭痛およびアヘン剤の節約が望まれる他の状態を含めた痛みの治療に；骨形成および骨折修復の促進のための骨軟化症またはミネラル化の障害を含めた骨の障害の治療に；相対的な成長ホルモンおよび／またはＩＧＦ１の過剰を含めたグレリン関連障害の治療に；グルカゴン関連障害の治療に；ならびに、子宮および妊娠に影響するプロラクチンの放出に対して、成長ホルモンの放出において、ならびに卵胞の生存および成長において、有用で有り得る。
【００７３】
特に、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アゴニストアナログを用いて、カロリー（または栄養）の摂取量または利用能を減少させることによって緩和可能な状態または障害を治療し得る。これには、比較的高い栄養摂取量もしくは利用能によって生じる、比較的高い栄養摂取量もしくは利用能が絡んでいる、または比較的高い栄養摂取量もしくは利用能によって悪化する対象における状態または障害、あるいは栄養の摂取量もしくは利用能を減少させる、例えば、食物摂取量を減らすことによって緩和可能な対象の状態または障害のいずれをも含むであろう。かかる状態または障害には、限定されるものではないが、肥満、ＩＩ型糖尿病を含めた真性糖尿病、摂食障害およびインスリン抵抗性症候群が含まれる。
【００７４】
肥満およびそれに関連する障害は、米国および世界中で、共通しており、非常に深刻な公衆衛生上の問題になっている。上体部の肥満は、ＩＩ型真性糖尿病の既知の最も高い危険因子であり、心血管疾患の高い危険因子である。肥満は、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、脳卒中、胆のう疾患、骨関節炎、睡眠無呼吸症、多のう胞性卵巣症候群等の生殖器の障害、乳癌、前立腺癌および大腸癌、ならびに全身麻酔の合併症発生率の増加についての危険因子として知られている（例えば、Ｋｏｐｅｌｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３５−４３（２０００）を参照）。肥満は、寿命を短縮させ、上記の疾患に加え、感染症、静脈瘤、黒色表皮症、湿疹、運動不耐性、インスリン抵抗性、高血圧症高コレステロール血症、胆石症、整形外科的な外傷および血栓塞栓性の疾患のごとき障害を併発させる重大な危険性を有する（Ｒｉｓｓａｎｅｎら、ＢＭＪ  ３０１：８３５−７（１９９０））。
【００７５】
また、肥満は、インスリン抵抗性症候群または「シンドロームＸ」と呼ばれる一群の状態の危険因子でもある。肥満およびそれに関連する障害の医療費を最近の見積りは、世界全体で１，５００億ドルであった。肥満の発症には、種々の因子が絡むと考えられているが、基本的な問題は、肥満の対象において、過剰な脂肪組織が存在するまで、栄養の利用能とエネルギーの消費とのバランスが崩れていることである。現在、肥満は、満足な治療法がない、慢性の、実質的に難治性の代謝障害である。
【００７６】
今や、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アゴニストアナログを投与して、肥満およびそれに関連する状態を治療する、または本明細書に記載された他の疾患の状態を予防／それらの危険を低下できることを開示する。関連する状態には、限定されるものではないが、インスリン抵抗性、真性糖尿病、高血圧症、心血管の疾患、偽脳腫瘍、高脂血症、睡眠無呼吸症、癌、肺高血圧症、心血管疾患、胆石症および骨関節炎が含まれる。
【００７７】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アゴニストアナログは、胃内容排出を調節するのに有用である。胃内容排出を遅らせるこれらの化合物を、放射線検査または磁気共鳴画像法に使用できる。あるいは、これらの化合物を用いて、胃腸の疾患、例えば、急性の憩室炎に関連し得る痙攣、胆管の障害またはオディ括約筋の障害に苦しむ対象における胃の運動性を低下し得る。また、本発明の化合物を用いて、食後のダンピング症候群または食後の高血糖を治療し得る。
【００７８】
活性をブロックするＡＦＰ−６アンタゴニストは、限定されるものではないが、摂食障害、悪液質、過食症、ならびに低血圧症および胃の低運動性に加え、食欲の減少、食物摂取量の減少または体重の減少により特徴付けられる他の消耗性疾患に有用であろう。従って、ＡＦＰ−６のごときアミリンファミリーポリペプチドの活性に対してアンタゴニスト活性を有するＡＦＰ−６アナログおよびそれらの使用も、本発明の一部として意図されている。
【００７９】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログを用いて、体組成を改変する、例えば、除脂肪体組織を低下させないが、体脂肪を減らす、または良好な（大きな）除脂肪体−対−脂肪率を創製し得る。体組成の変化は、重量（例えば、増減をグラムで表す）、またはパーセント体脂肪率およびパーセント除脂肪量もしくはタンパク質で表すことができる。いかなる特定の説に縛られるつもりはないが、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、体脂肪を減らし、さらに除脂肪体重を維持するまたは除脂肪体重の減少を最小化する代謝効果を有し得る、
【００８０】
「肥満」は、通常、体格指数が３０以上と定義されるが、本開示のためには、体格指数が３０未満の対象を含め、体重を減らす必要がある、または体重を減らすことを望むいずれの対象も、「肥満」の範囲に含まれる。すなわち、本発明の化合物は、望ましい効果が達成される限りは、体格指数に関係なく、全ての対象において用いることが意図されている。例えば、これらの方法を注目し得る対象には、過体重または肥満の個人だけではなく、除脂肪体組成を有する者、例えば、ボディビルダーおよび他の運動選手が含まれる。このような個人にとって、体重を減らす、または維持すること、例えば、ある一定の体重の範囲に留まる、さらに、より優れた強度、スタミナ、耐久性および／またはいっそうの筋肉の出現のために除脂肪組織を維持する、または増加させることが望まれる場合がある。従って、ある具体例において、本発明方法には、体脂肪を減らす、または体脂肪の増加を防止することが含まれる。他の具体例において、除脂肪体組織を維持、または増加させることが含まれる。依然として他の具体例は、体重を制御する、かつ／または体形を整えることが含まれる。また、かかる方法は、高い除脂肪体量−対−脂肪率が望ましいいずれの動物に対しても使用できる。かかる使用の例として、限定されるものではないが、優れたショー用イヌ、より優れた競走馬、またはより肉の多い、脂肪の少ない家畜を作ることが含まれる。これらの概念は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられている、２００４年５月２０日付で出願された米国特許出願第１０／８５１５７４号に、より詳細に記載されている。
【００８１】
もう一つの状態の全身性高血圧症は、治療しないならば、アテローム硬化性の心血管疾患に至る可能性の高い疾患である。アメリカ人は、成人４人に１人という高率で、高血圧症であると見積もられている。高血圧症は、通常、平均拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上、または平均収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上の場合に、高血圧症と診断される。高血圧症は、糖尿病患者の場合、そうでない場合に比べ、発生率が約２倍である。血圧の変動が大きく、収縮期高血圧の可能性がはるかに高いので、糖尿病患者の高血圧症の診断には、特に注意を要する。高血圧症の罹患率は、加齢ともに増加する。ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アゴニストアナログを投与して、動脈血圧を低下させ、それによって、浮腫および炎症性の浸出液量も減少し得る。肺循環における高血圧症は、それほど一般的ではないが、重度の状態である結果、死亡率は高い。ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アゴニストアナログは、肺高血圧症の治療に有用であり得る。
【００８２】
肺血管における局所的な低酸素症は、生理的に血管収縮性の応答を誘発し、血液をより良好に換気される肺部分へ短絡する。しかしながら、慢性閉塞性肺疾患において、この機構は、圧倒されることがあり、その結果、肺高血圧症を起こし、かつ換気と灌流との整合が最適以下（いわゆる換気灌流ミスマッチ）、酸素負荷が最適以下、ならびに慢性の呼吸困難および運動不耐性となる。一般に、最適のガス交換を得るためには、局所の肺領域内で、ガス（換気）が血流（灌流）に整合することが重要である。換気されない肺領域への血流は、灌流されない領域の換気と同様、かかる領域では、空気と血液との間でガス交換が生じないので、無駄な努力である。換気灌流ミスマッチは、ガス交換器官としての肺の有効性が、正常時の１０分の１にまで低下しかねないことが報告されている。
【００８３】
換気灌流ミスマッチは、肺障害の主な原因であり、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、肺胞性疾患および肺血管の疾患のごとき状態で存在し得る。換気灌流ミスマッチが特徴である肺障害において、（１）局部の肺の換気の増加に導く気管支拡張、（２）局所の肺の灌流の増加に導く血管拡張、および／または（３）ＣＯ２のより迅速な排気（炭酸水素塩として血液中へ移動）に導く炭酸脱水素酵素の活性化の組合せが有用であることが理論化されている。
【００８４】
従って、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、急性呼吸促迫症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、肺胞性疾患および肺血管の疾患のごとき状態ならびに換気灌流ミスマッチに関連した状態を治療するのに有用であり得ると考えられている。さらに、これらの化合物は、吸入によって送達できるとも考えられている。本発明のペプチドは、肺胞に向かう空気の流れに続くことができる。本発明のペプチドのかかるデリバリーは、「ホイッフルボール」のごとき低または超低密度の粒子としてのデリバリー、例えば、米国出願第２００４／０１７０５６８号および米国特許第６６３０１６９号（参照によってその全体が本明細書に組み入れられている）、またはＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥＳ（商標）（ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製；Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、ニューヨーク州）を含む。これらのペプチドは、（例えば、肺の血管拡張を介して）肺の比較的換気の良好な部分への血流を増加でき、気管支痙攣の抑制を介して換気を増大させることができる。さらに、ＡＤＭまたはＣＧＲＰ、それらのアゴニストおよびアナログも、単独またはＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログと組み合わせて用いて、急性呼吸促迫症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、肺胞性疾患および肺血管の疾患のごとき状態または換気灌流ミスマッチに関連する状態を治療できるとも考えられている。また、かかる状態において、本願の医薬組成物の項の教示は、ＡＤＭおよびＣＧＲＰ、それらのアゴニストおよびアナログに適用される。
【００８５】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰ分解酵素を刺激して、虚血発作および脱分極後に、興奮性の組織（心筋を含めた筋肉および神経）において、イオン性の環境を修復したり、リズム障害のごとき異常な電気的な現象の頻度および重症度を低下し得る。
【００８６】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、心保護薬として用いて、例えば、虚血性の損傷を改善する、心筋虚血の結果として起こる心筋梗塞の大きさを縮小する、またはそれ以外の場合、心筋の損傷の範囲を制限することができる。血栓溶解療法に併用して、または単独で投与できる、さらなる心筋保護を提供できる治療法に関する関心。というのは、遡及的疫学的研究は、梗塞後数年間の死亡率が元々の梗塞の大きさと関係すると思われることが示されているからである。
【００８７】
心筋虚血は、心筋の酸素の供給と需要との結果であり、労作性および血管攣縮性の心筋機能不全を含む。労作性虚血は、通常、大きな冠状動脈が関与する重症のアテローム硬化性狭窄の存在が原因であり、心内膜下血流の減少を生じる。血管攣縮性虚血は、局所性の変化の痙攣が関連し、その発生は労作またはストレスとは関係しない。痙攣は、より的確には、血管緊張の突然の増加と定義される。
【００８８】
うっ血性心不全とは、末梢組織に十分な酸素を送達するには不十分であるポンプ機能を示す。これは、時には、血液中の酸素運搬能力の低下（例えば、重篤な貧血症）の結果であることがある。最も一般的には、うっ血性心不全は、（例えば、心筋の損傷に続く）心機能の低下の結果、または心筋に要求される仕事量の増加（例えば、全身性高血圧症にともない末梢抵抗が増加した場合）の結果である。有毒な血液量増加症は、充填圧の増加により、心不全を悪化させる結果、心拡大および最適以下の心収縮力を生じかなない。ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、心後負荷の軽減（本明細書に示されている血管拡張）、心収縮力増加（例えば、本明細書に示されているｄＰ／ｄｔの増加）、有毒な血液量増加症の改善、およびイオンの不均衡の改善を含む様々な機構を通して、うっ血性心不全の治療に有用であり得る。
【００８９】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、浮腫の軽減、例えば、リウマチ性関節炎における浮腫、脳腫瘍または癌への照射に対する二次的な浮腫、脳卒中、頭部外傷または脊髄損傷が原因の浮腫、手術後の浮腫、喘息および他の呼吸器疾患の浮腫、ならびに眼ののう胞様横斑浮腫に使用することができる。
【００９０】
さらに、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、腎不全および腎障害の治療にも、腎臓の栄養因子としても有用であり得る。
【００９１】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、痛みの治療に有用であり得、アヘン剤の必要性を減らし得る。これらは、特に、偏頭痛を含めた血管運動性の障害に関連する痛み、および炎症の治療に有用であり得る。ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、特定の胃腸障害、特に、分泌抑制によって改善が可能な障害の治療に有用であり得る。かかる障害は、胃炎、（胆汁および胃酸の逆流をともなうバレット食道炎を含む）食道炎、ならびに膵臓炎を含む。加えて、これらは、かかる障害に関連する痛みの治療にも有用であり得る。
【００９２】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、骨粗鬆症、糖尿病性および他の骨減少症を含めた骨の脱ミネラル化の障害の治療に有用であり得る。加えて、これらは、骨形成を促進することもでき、骨折修復の促進に有用であり得る。
【００９３】
また、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログの投与の結果、プロラクチンを放出し、成長ホルモンの放出を調節し得る。プロラクチンは、脳下垂体前葉の特化された細胞である乳腺刺激ホルモン分泌細胞において合成され、そこから分泌されるポリペプチドホルモンである。プロラクチンは、生殖において複数の役割を担っており、生物体のホメオスタシスにおいても複数の役割を担っている。プロラクチンの合成および分泌は、脳下垂体前葉に限定されておらず、体内の他の臓器および組織にもこの能力は備わっている。乳腺に対するプロラクチンの種々の効果には、乳腺の増殖および発達、乳汁の合成、および乳汁分泌の維持が含まれる。妊娠中の下垂体切除が、その後の乳汁分泌を抑制するので、乳産生は、下垂体のプロラクチンを明らかに必要とする。
【００９４】
黄体の機能に対するプロラクチンの作用は、種および性周期の時期に依存する。プロラクチンは、黄体の構造および機能の整合性を維持することによって、黄体様のホルモンとして作用する。プロラクチンのこの「黄体様の」作用は、プロゲステロンの分泌の増強により特徴付けられる。プロラクチンは、２つの経路：黄体形成ホルモン（ＬＨ）のステロイド産生効果を顆粒膜黄体細胞において増強する、およびプロゲステロンを不活性化する水酸化ステロイド脱水素酵素を阻害するにおいて、プロゲステロンの分泌を増強する。ヒトにおいて、高濃度のプロラクチンは、顆粒膜細胞の黄体形成およびステロイド産生を抑制する。プロラクチンは、プロゲステロン生合成および妊娠中の黄体細胞の肥大化に不可欠である。黄体の機能に加え、プロラクチン−Ｒは、顆粒膜細胞中および卵母細胞においても多数の機能を媒介する。
【００９５】
生殖の過程に対する作用以外に、プロラクチンは、免疫系、浸透圧の平衡および血管新生の調節によって、内部環境の定常性の維持に役割を担っている。プロラクチンは、神経系、内分泌系および免疫系が、互いに連絡し合う免疫神経内分泌ネットワークの共有するメディエーターである。プロラクチンの主な特徴は、サイトカインおよびヘモポイエチン（ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）との協同作用であり、それは調節不全の状態下で、造血性のホメオスタシスを修復するように機能する「ストレスホルモン」として関係している。プロラクチンは、生理的、ならびに自己免疫疾患のごとき病的な状況下の液性および細胞性免疫の調節に重要な役割を担っている。Ｔ細胞の増殖および有糸分裂誘発；樹状細胞の成熟等を含めたｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫応答が、プロラクチンによって増強される。プロラクチンは、多数の自己免疫疾患において上昇し、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の約２０％が高プロラクチン血症である。また、プロラクチンは、哺乳類の細胞膜を介した溶質および水の輸送も調節する。例えば、プロラクチンは、哺乳類の上皮細胞膜を介する溶質の輸送に関する多数の活性を有する。プロラクチンは、哺乳類の上皮細胞内へのナトリウムの輸送を減少させ、カリウムの輸送を増加させる。プロラクチンは、腸管上皮細胞膜を介するクロリドおよびカルシウムの輸送にも影響する。プロラクチンは、血管新生活性を有するが；血管新生は、ネイティブなプロラクチンのタンパク質分解フラグメントによって阻害される。前記のようなプロラクチンの生理的な役割、例えば、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログによるプロラクチンの役割を調節する方法の理解は、本明細書で意図されているような不均衡を調節する新しい治療法に導く。
【００９６】
ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、グレリンの分泌の抑制を含めた、他のホルモンの応答を二次的に媒介できる。これらは、網膜症の治療を含めた、グレリン関連障害、およびグレリン−成長ホルモン−ＩＧＦ軸の障害の治療に有用であり得る。
【００９７】
さらに、膵島新生の機能は不明な点が多い（総説として、Ｂｏｕｗｅｎ（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ、４０（３  Ｓｕｐｐｌ）：８１−８８を参照）が、脱分化した、または異形成の外分泌（腺房および管）細胞が、多分化能の状態を獲得し、膵島前駆体として働くことができるという仮説がある。ＡＦＰ−６のｍＲＮＡが、腺房細胞に存在することおよび、ＳＡＧＥ解析法によって、膵臓上皮腺管癌においてＡＦＰ−６のｍＲＮＡが見出されたことから、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、膵島新生に有用である可能性がある。
【００９８】
さらに、分泌性上皮にＡＦＰ−６ｍＲＮＡが発現することから、ＡＦＰ−６は、前立腺の正常な機能に関与し得、従って、ＡＦＰ−６のアゴニストおよびアナログが、種々の前立腺の障害の治療に有用である可能性がある。
【００９９】
さらに、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログは、本明細書に記載されているＡＦＰ−６アナログの特性を有する他の化合物のスクリーニングにも使用し得る。例示的なスクリーニングの方法が、参照によってその内容の全体が組み入れられているＰＣＴ出願第ＷＯ２００４／０４８５４７号に記載されている。本発明は、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログに特異的な抗体を提供する。さらに、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストおよびＡＦＰ−６アナログおよび／またはそれらの抗体を、本明細書に記載されているような状態または障害、あるいはそれらを生じさせる傾向を決定する診断の場において使用することもできる。また、抗体をアンタゴニストとして使用できるとも考えられる。
【０１００】
ＡＦＰ−６アナログの製造
本明細書に記載されているＡＦＰ−６アナログは、当技術分野で知られた標準的な組換え技術またはペプチドの化学合成法、例えば、自動および半自動ペプチド合成機のいずれか、または両方を使用する方法、を用いて調製できる。同様に、本発明のポリペプチドの誘導体は、標準的な化学的、生化学的またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける方法を用いて調製し得る。
【０１０１】
本発明のＡＦＰ−６アナログは、従来技術に従って溶液中または固体の担体上で合成できる。種々の自動合成機が市販されており、既知のプロトコールに従って、使用することができる。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｄ．ｅｄ．、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）；Ｔａｒｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−７（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１−２８４（１９７９）を参照。
【０１０２】
別法として、本発明のＡＦＰ−６アナログは、当技術分野でよく知られた組換え技術によって調製できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  （１９８９）を参照。組換え技術によって調製されるこれらのポリペプチドは、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から発現し得る。これらのポリヌクレオチド配列には、宿主細胞におけるｍＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを組み入れることもできる。かかる製造のための配列は、当技術分野で周知の方法に従って、容易に構築し得る。例えば、第ＷＯ８３／０４０５３号を参照。多様な発現ベクター／宿主の系を利用して、ＡＦＰ−６アナログをコードする配列を含有および発現し得る。
【０１０３】
従って、ＡＦＰ−６アナログのアミノ酸配列は、新しい有用なウイルスまたはプラスミドＤＮＡベクターを調製するのに、新しい有用な、形質転換および形質移入した真核および原核細胞（細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、鳥類および哺乳類の培養細胞を含めた）を調製するのに、および本発明のポリペプチドを発現できるかかる宿主細胞を培養して増殖させる新しい有用な方法に、有用なポリヌクレオチド配列が決定する。また、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであるＡＦＰ−６アナログをコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子治療に有用であり得る。
【０１０４】
ＡＦＰ−６アナログをコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲによる増幅または部位特異的変異誘発法のごときよく知られた分子生物学的（または組換え）技術を用いて、適切なベクター、例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）にクローニングして創製し得る。
【０１０５】
また、本発明は、本発明のＡＦＰ−６アナログの製法も提供する。かかるＡＦＰ−６アナログをコードする核酸を含有する宿主細胞からポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）ＡＦＰ−６アナログをコードするポリヌクレオチドを含有する当該宿主細胞を、かかるＤＮＡ分子の発現を促進する条件下で培養し、次いで（ｂ）かかるＡＦＰ−６アナログを得ることを含む方法を提供する。宿主細胞は、細菌、酵母、藻類、植物、昆虫、鳥類および哺乳類の細胞等の真核または原核細胞であり得る。哺乳類の宿主細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたヒト細胞を含む。また、無細胞系を用いてポリペプチドを調製する方法も意図されている。無細胞タンパク質発現系の例は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によるＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）である。
【０１０６】
多様な発現ベクター／宿主の系を利用して、ＡＦＰ−６アナログをコードする配列を含有および発現し得る。これらには、限定されるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のごとき微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス）で形質移入した、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは哺乳類細胞系が含まれる。  組換えタンパク質の調製に有用な哺乳類細胞には、限定されるものではないが、ベロ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、（ＣＯＳ−７等の）ＣＯＳ細胞、ＷＩ  ３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２ならびにＫ５６２および２９３細胞が含まれる。これらの発現／宿主系の全て、ならびに他の発現／宿主系におけるタンパク質の組換え発現の例示的な手順は、当技術分野ではよく知られている。
【０１０７】
本発明によって調製したＡＦＰ−６アナログを精製するのが望ましいことがある。ペプチドの精製方法は、当業者にはよく知られている。これらの手法は、細胞環境を、ポリペプチドと非ポリペプチドとの分画への粗分画を含む。注目するポリペプチドを、クロマトグラフィーおよび電気泳動によってさらに精製して、部分的または完全に精製（または均一になるまで精製）を達成し得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点分離法である。特に効率がよく、好ましいペプチドの精製方法は、逆相ＨＰＬＣ後の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析による精製物の特徴付けである。アミノ酸分析を決定することによって、さらなる純度の確認が得られる。
【０１０８】
本明細書で用いた「精製ペプチド」という用語は、それ以外の構成要素から単離可能な組成をいい、該ペプチドは、天然に得ることができる状態に対して、どのような精製の程度でも精製される。従って、精製ペプチドとは、天然に生じ得る環境には拘束されないペプチドをいう。「実質的に精製された」という用語は、その中で、ペプチドが組成物の主たる構成要素を形成し、例えば、当該組成物中、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９５％超が当該ペプチドで構成されている組成物をいうように使用される。ポリペプチドの精製方法は、例えば、参照によってその全体が組み入れられている米国特許第５８４９８８３号に見い出すことができる。
【０１０９】
ペプチドの精製に使用するのに適した種々の手法が、当技術分野ではよく知られている。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等との沈殿法；熱変性後の遠心分離；イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーのごときクロマトグラフィー工程；等電点分離法；ゲル電気泳動；ならびにかかるおよび他の方法の組合せが含まれる。当技術分野で通常知られているように、種々の精製工程の実施の順序を変更でき、または特定の工程を省くことができると考えられており、それでも、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製する適切な方法が得られる。
【０１１０】
ペプチドを最も精製された状態で常に供給されるという一般的な要求は存在しない。ある具体的様態では、実質的に精製の低い生成物が有用であると考えられる。組み合わせてより少ない精製の工程を用いて、または異なった形態の同一の一般的な精製の体系を利用することによって、部分的精製が達成できる。例えば、ＨＰＬＣの装置を利用して行った、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーの結果、通常、低圧クロマトグラフィーの系を利用する同じ方法よりも精製度が「数倍」向上すると理解されている。相対的に低い度合の精製は、タンパク質の生成物の総回収量および発現タンパク質の活性を維持するのｎい有利であり得る。また、陰イオン交換クロマトグラフィーとイムノアフィニティークロマトグラフィーとを組み合わせて使用して、本発明の精製ペプチド組成物を調製し得ると考えられる。
【０１１１】
医薬組成物
また、本発明は、治療または予防に有効な量の少なくとも本発明のＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストもしくはＡＦＰ−６アナログ、またはそれらの医薬上許容される塩を、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログのデリバリーに有用な医薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体とともに含む医薬組成物に関する。かかる組成物には、種々の緩衝内容物（例えば、トリス−ＨＣ１、酢酸、リン酸）ならびにｐＨおよびイオン強度を含む希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、ツイーン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール）のごとき添加剤；あるいは材料を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸のごときポリマー化合物の粒状の調製物中に組み入れたもの、またはリポソームに取り込んだものを含み得る。かかる組成物は、本発明のＡＦＰ−６アナログの物性、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける放出速度およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクリアランス速度に影響するであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １４３５−７１２、１８ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９０）を参照。医薬組成物の例示的な処方方法を、参照によってその内容全体が組みれられている第ＷＯ２００４／０４８５４７号を見い出すことができる。
【０１１２】
本明細書で用いた「医薬上許容される」という成句は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げず、連邦政府または州政府の規制機関によって認められているか、あるいは米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に、動物用および特にヒト用として収載されている剤をいう。従って、適切な医薬上許容される担体には、動物またはヒトに投与しても、医薬組成物の有効性を妨げることがない、有害な、アレルギー性の、または都合の悪い反応を起こさない剤が含まれる。
【０１１３】
本明細書で用いた「医薬上許容される塩」という成句は、限定されるものではないが、硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、亜硫酸水素、リン酸、酸性リン酸、イソニコチン酸、酢酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、酸性クエン酸、酒石酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、酸性酒石酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、ゲンチシン酸、フマル酸、グルコン酸、グルクロン酸、サッカリン酸、ギ酸、安息香酸、グルタミン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびパモ酸（すなわち、１，１’−メチレン−ビス（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸）の塩のごとき医薬上許容される、好ましくは無毒性の、酸および塩基、例えば無機および有機の酸および塩基から調製された塩をいう。医薬上許容される塩には、限定されるものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸および酒石酸由来の塩のごとき遊離のアミノ基から形成される塩が含まれる。医薬上許容される塩には、限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、ナトリウムリチウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカイン由来の塩のごとき遊離のカルボキシル基から形成される塩も含まれる。
【０１１４】
本発明のＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログを、末梢投与のために製剤化でき、それらには、注射、経口投与、経鼻投与、肺投与、局所投与、または当業者に認識されている他の種類の投与のための製剤が含まれる。より詳しくは、本発明による医薬組成物の投与は、当該経路を介して標的組織に到達することができる限りは、一般的な経路のいずれを介してもよい。より好ましい具体例において、医薬組成物を、対象に、従来の末梢からの方法のいずれか、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、延髄後、肺内（例えば、期間放出）により、あるいは経口、舌下、経鼻、経肛門、経膣もしくは経皮デリバーまたは特定の部位に外科的に埋込みによって導入し得る。例として、静脈内もしくは皮下注射、経鼻投与、経口投与または粘膜投与、および鼻もしくは口による肺吸入があげられる。処置は、単回投与であってもよいし、一定期間にわたる多回投与であってもよい。本発明の組成物を制御された継続的な放出も意図されている。
【０１１５】
注射用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液または分散系、および注射用の無菌の水溶液または分散系を用事調製するための無菌の粉末が含まれる。いずれも場合も、その形態は、無菌であり、容易に注射可能である程度の流動性を有する必要がある。また、本発明のポリペプチドが、製造および保管条件下で安定であることが望ましく、細菌および真菌のごとき微生物の汚染作用に対して保護される必要もある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールならびにその他）、ジメチルアセトアミド、クレモルホルＥＬ（Ｃｒｅｍｏｒｐｈｏｒ  ＥＬ）、およびそれらの適切な混合物、ならびに油（例えば、大豆油、ゴマ油、ヒマシ油、綿実油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、グリコフロールおよびトウモロコシ油）を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性を、例えば、レシチンのごとき被覆を施すことによって、分散系の場合には、必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤を使用することによって、維持できる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、メタ−クレゾール、ベンジルアルコール、（メチル、プロピルまたはブチル）パラベン、クロロブタノール、フェノール、フェニル水銀（酢酸、ホウ酸または硝酸）塩、ソルビン酸、チメロサール等により引き起こすことができる。多数の場合、等張化剤（例えば、糖および塩化ナトリウム）が組成物中に含まれるであろう。注射用組成物の持続性の吸収は、組成物中に吸収を遅らせる剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって達成することができる。
【０１１６】
ある具体例において、本発明の医薬組成物を製剤化して、非経口投与、例えば、注射または注入に適したものとする。ある具体例において、ＡＦＰ−６アナログを、水性の担体、例えば、ｐＨが約３．０〜約８．０、さらに他の具体例において、ｐＨが約３．５〜約７．４、３．５〜６．０または３．５〜約５．０の等張化緩衝溶液中に懸濁させる。有用な緩衝液として、クエン酸ナトリウム−クエン酸、リン酸ナトリウム−リン酸および酢酸ナトリウム−酢酸の緩衝液があげられる。貯蔵または「デポー」徐放性製剤の形態を用いて、経皮の注射またはデリバリー後に、治療上有効な量の製剤を血流中に長期の時間または日にわたって送達し得る。
【０１１７】
一般に、本発明のＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストもしくはＡＦＰ−６アナログの治療または予防に有効な量は、処置を受ける者の年齢、体重、および疾患、代謝状態または障害の状態または重症度によって決定されるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６９７−７７３を参照。また、ＷａｎｇおよびＨａｎｓｏｎ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０、Ｓｕｐｐ．４２：２Ｓ（１９８８）も参照。典型的には、約０．００１〜約１０００μｇ／ｋｇ体重の間の投与量を使用できるが、経験のある医師であれば理解できようが、それより多い量または少ない量を使用することもできる。投与は、１日１回または複数回でも、あるいはそれより低頻度でもよく、本明細書に記載されているように、他の組成物と併用してもよい。本発明は、本明細書に記載された投与量に限定されないことに留意されたい。
【０１１８】
適切な投与量は、代謝の状態または障害のレベルを決定するための確立されたアッセイ方法の使用を介して、関連する投与量−応答データと併用して確認できる。最終的な投与計画は、担当医が、薬物の作用を変調する要因、例えば、薬物の特定の活性、患者の損傷の重症度および応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、いずれかの感染症の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因を考慮して決定される。研究がなされるにつれ、特定の疾患および状態に対する適切な投与量のレベルおよび治療期間に関するさらなる情報が明らかになるであろう。
【０１１９】
有効な投与量は、典型的には、５０ｋｇの患者の場合、１日あたり、約１〜３０μｇから約５ｍｇ、または約１０〜３０μｇから約２ｍｇ、さらなる具体例において、１日あたり、約５〜１００μｇから約１ｍｇ、または約５μｇから約５００μｇの範囲であり、単回または多回投与あるいは制御して、継続的に放出させる。例示的な投与量は、１回に、約０．０１から約１００μｇ／ｋｇの範囲である。投与は、栄養の利用能、食物摂取もしくは体重の抑制、血中グルコースもしくは血漿中の脂質低下、または血圧低下もしくは上昇が望まれる限り、例えば、肥満、真性糖尿病、インスリン抵抗性症候群、高血圧症または低血圧症の最初の徴候が認められる、あるいはそれらと診断された直後に、投与を開始する必要がある。投与経路はいずれであってもよく、例えば、注射（皮下または筋肉内を含む）、経口、経鼻、経皮等があげられる。特定の経路、例えば、経口投与の場合の投与量は、生物学的利用能の低下を考慮して、例えば、約５〜１００倍に増やすこともできる。
【０１２０】
医薬配合物を非経口的に投与するある具体例において、組成物を、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログを、１日あたり０．０１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または１回あたり、約０．０１μｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ〜約２５０μｇ／ｋｇもしくは約５０μｇ／ｋｇを下回る範囲の投与量で送達するように製剤化することがきる。もう一つの例示的な投与量範囲は、１日あたり０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。これらの範囲で投与量は、それぞれのアナログまたは誘導体の効力によって変動させ、もちろん、当業者が決定し得る。投与計画に意図される例示的な体重は、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｋｇまたは１００ｋｇ超であり得る。非経口投与によって、初回にボーラスで投与した後、継続して注入して、薬物生成物の治療上の循環しているレベルを維持し得る。当業者であれば、良好な医療慣行および個々の患者の臨床状態により決定されるように、有効な投与量および投与計画を容易に最適化することができる。
【０１２１】
本発明方法では、本発明のポリペプチドを、単独で投与してもよいし、あるいは長期もしくは短期の作用または相補的な作用を示す、１種または複数の他の化合物および組成物とともに投与する、すなわち併用療法としてもよい。例えば、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログに、栄養の利用能を低下させる別の化合物を加えることができ、かかる化合物として、限定されるものではないが、アミリンもしくはアミリンアナログアゴニスト、サケカルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）もしくはＣＣＫアゴニスト、レプチン（ＯＢプロテイン）もしくはレプチンアゴニスト、エキセンディン、エキセンディンアゴニストもしくはエキセンディンアナログアゴニスト、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１アゴニストもしくはＧＬＰ−１アナログアゴニスト、ＰＹＹ、ＰＹＹアゴニストもしくはＰＹＹアナログ、またはＰＹＹ関連ポリペプチドがあげられる。適切なアミリンアゴニストは、例えば、［２５，２８，２９Ｐｒｏ］−ヒトアミリン（「プラムリンチド」としても知られ、米国特許第５６８６５１１号および第５９９８３６７号に記載されている）を含む。使用されたＣＣＫは、例えば、ＣＣＫオクタペプチド（ＣＣＫ−８）である。レプチンは、例えば、Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４０−５４３；Ｈａｌａａｓら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４３−５４６；およびＣａｍｐｆｉｅｌｄら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４６−５４９で言及されている。適切なエキセンディンとして、エキセンディン−３およびエキセンディン−４、ならびに例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／０７４０４号、第ＷＯ９９／２５７２７号および第ＷＯ９９／２５７２８号に記載されているものを含めたエキセンディンアゴニスト化合物があげられる。適切なＰＹＹポリペプチドおよびアナログとして、米国出願第６０／５４３４０６号および第６０／５４３４０７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０２６５９１号および第ＷＯ０３／０５７２３５号に記載されているものがあげられる。
【０１２２】
本発明の医薬組成物および治療方法は、ヒトの医療および動物の医療の分野において有用であることが理解されよう。従って、治療の対象は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは他の動物であり得る。動物の目的では、対象として、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびヤギを含めた家畜、イヌおよびネコのごとき伴侶動物、ならびに展示および／または動物園用の動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含めた実験動物、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウのごとき家禽があげられる。
【０１２３】
加えて、本発明は、ＡＦＰ−６、ＡＦＰ−６アゴニストまたはＡＦＰ−６アナログと、医薬適用のために当該化合物を調製するのに適した成分と、医薬適用のための当該化合物および当該成分を使用するための説明書とを含むキットも意図している。
【０１２４】
本発明の理解を助けるために、以下に、実施例が含まれる。本発明に関する実験は、本発明を特に限定するものではなく、かつ当業者の理解の範囲内にある本発明の変形例、現在知られているものまたは今後開発されるものは本明細書および特許請求の範囲に記載されている発明の範囲に属するものである。
【実施例】
【０１２５】
本発明を、以下の非限定的の実施例を参照して、さらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより完全に説明するために提示されており、本発明の範囲を限定するためのものではない。実施例によって、ＡＦＰ−６アナログ（誘導体を含む）の調製方法、ならびにこれらＡＦＰ−６アナログのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験方法を示す。当業者であれば、これらの実施例に記載されている技術は、本発明の実施において機能する、本発明者らによって記載されている代表的な技術に過ぎないことが理解されよう。当業者には、本発明の開示に照らし、開示されている特定の方法を、多様に変形させても、発明の精神および範囲から逸脱することなく、同一または類似する結果が依然として得られることを理解されたい。
【０１２６】
実施例１．ＡＦＰ−６の核酸分子およびポリペプチド
１Ａ．マウスおよびヒトにおけるＡＦＰ−６の同定
ヒトアドレノメデュリン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受入番号：Ｐ３５３１８）を用いて、マウスのタンパク質の検索に限定し、他のパラメーターは全てデフォルトに設定して、ヒトアドレノメデュリンに対するマウスの相同体を見い出すために、ＢｌａｓｔＰを実施した。ＢｌａｓｔＰ検索によって得られた上位の２つの配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔのマウスアドレノメデュリンで、第４番目の配列は、ＣＧＲＰＩＩ（ＣＧＲＰＩは、ヒットリスト上第８番目であった）であった。予期せぬことに、リスト上の第３番目の配列は、仮想タンパク質ＸＰ＿１４７９１６であった。クエリ配列であるアドレノメデュリン（配列番号４３）にマッチする配列は、アドレノメデュリン成熟ペプチド（配列番号４４）の領域にほとんど一致して広がっており、これを図１Ａに示す。
【０１２７】
図１Ｂに示すように、マッチ領域の相同性は４４％で、同一性３２％を有する。マウスの配列（配列番号４５）のヒトアドレノメデュリン前駆体（配列番号４６）との配列比較は、タンパク質全体の相同性は２５％であることを示した（同一性１５％；配列比較は全て、ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）プログラム（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅ  ｓｕｉｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州より購入）を用いて実施した。
【０１２８】
２つのシグナル配列検出プログラムのＳｉｇｎａｌＰおよびＰＳｏｒｔを用いて、この仮想タンパク質が切断可能なシグナルを含有するか否かを決定した。両方のプログラムが、残基２５と２６の間で、シグナルペプチドが切断されると予測した。Ｒｅｆｓｅｑの実体ＸＰ＿１４７９１６を支持するために使用したＥＳＴは、ＢＧ９１８２１０．１であり、未交尾のマウスの乳腺、浸潤性乳管癌からクローン化されていた。ＦＡＳＴＡフォーマットのタンパク質ＸＰ＿１４７９１６の全配列（これ以降、マウスアミリンファミリーポリペプチド−６またはｍＡＦＰ−６の前駆体と呼ぶ）を図２に示し、これを配列番号４５とする。
【０１２９】
ＮＣＢＩのＢＬｉｎｋは、他のタンパク質との類似関係を示す大部分のＧｅｎＢａｎｋに入ることができる自動的に生成されたＢｌａｓｔである。ｍＡＦＰ−６前駆体にマッチするものは、１つもなかった。しかしながら、ｍＡＦＰ−６前駆体を用いて行った（後生動物に限定した）ＢｌａｓｔＰ検索は、ｍＡＦＰ−６前駆体自体に対して相同性を示すとともに、はるかに低いスコアで、多様な種（この群に期待される最良スコアは、ｅ＝０．５９であった）のアドレノメデュリンに相同性を示した。従って、明らかなパラログであるアドレノメデュリン自体は、多様な種から検出されたが、このＢｌａｓｔＰは、ヒトのオルソログには全くヒットしなかった。
【０１３０】
ＸＭ１４７９１６の転写物が、もう一つのタンパク質により近い相同性を有するもう一つのＯＲＦをコードしている可能性を調べるために、ＢｌａｓｔＸを実施した。ＢｌａｓｔＸは、クエリ配列を６つのフレームで翻訳し、クエリ配列をタンパク質データベースと比較する。ヒトの仮想タンパク質ＦＬＪ２１１３５には対応するが、アミリンファミリーポリペプチド−６配列をコードするマウスの転写物のフレームにはないマッチを検出した。
【０１３１】
しかしながら、仮想タンパク質ＦＬＪ２１１３５をコードする転写物ＡＫ０２４７８８およびＮＭ＿０２４８６６をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで翻訳すると、それらは、ＸＰ＿１４７９１６とマッチする上流のＯＲＦも含有していることが示された。より長い転写物であるＡＫ０９０６３５もまた、ＸＰ＿１４７９１６とマッチする上流のＯＲＦを含有している。上流のＯＲＦのコドンの付近の配列は、アノテートされた開始Ｍｅｔの周囲の配列よりも、コザックコンセンサスによりマッチしている。ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  Ｇ（配列番号４７）を、ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  Ｇ（配列番号４８）と比較されたい（古典的なコザックは、ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＰｕＣＣ  ＡＴＧ  Ｇ（配列番号４９）（Ｋｏｚａｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７；およびＫｏｚａｋ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５である）。ＡＫ０２４７８８のこのアドレノメデュリン様ＯＲＦは、ｍＡＦＰ−６前駆体に対して、全体的に、６７％の類似性および６２％同一性を示す。これ以後、ヒト仮想タンパク質を、ｈＡＦＰ−６前駆体と呼ぶことにする。本明細書では、転写物ＡＫ０２４７８８およびＮＭ＿０２４８６６のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける翻訳産物を、ｈＡＦＰ−６  ｓｈｏｒｔ前駆体（配列番号：５１）と呼び、挿入部分を含有する、ＡＫ０９０６３５のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおける翻訳産物を、ｈＡＦＰ−６  ｌｏｎｇ（配列番号：５０）と呼ぶ。マウスおよびヒトのＡＦＰ−６前駆体の配列比較を、図３に示す。
【０１３２】
ヒトアドレノメデュリン前駆体のｈＡＦＰ−６であるＮＭ＿０２４８６６  ＯＲＦとの配列比較は、全体的に、２６％の類似性および１６％の同一性を示す。しかしながら、これらは、ＡＦＰ−６の仮想ペプチドの領域にわたって、より高い相同性：３９％の類似性および３２％の同一性を有する。ヒトアドレノメデュリン前駆体（配列番号４６）とｈＡＦＰ−６  ｓｈｏｒｔ体（ＮＭ２４８６６／ＦＬＪ２１１３５）（配列番号：５１）との配列比較を、図４に示す。
【０１３３】
国際ヒトゲノムシーケンス決定コンソーシアム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＵＣＳＣゲノムバイオインフォマティクスウエブサイトによって集められたヒトゲノムに対するこれらの配列のＢＬＡＴ（ＢＬＡＴ−Ｔｈｅ  ＢＬＡＳＴ−Ｌｉｋｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ．Ｋｅｎｔ（２００２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：６５６−６６４）分析は、ｈＡＦＰ−６前駆体が、ヒト第２２番染色体の２２ｑｌ３に位置することを示す。ｈＡＦＰ−６前駆体にマッチする登録がＵｎｉｇｅｎｅに存在し、興味深いことに、ＵｎｉｇｅｎｅコンティグであるＨｓ．１９６９８５のＳＡＧＥデータは、最高の仮想スコアが、ＳＡＧＥ  Ｐａｎｅ  ９１  １６１１３である膵臓上皮腺管癌の非正規化バルクＥＳＴに対するものであることを示す。
【０１３４】
アドレノメデュリンは、アミリン／カルシトニン／ＣＧＲＰペプチドファミリーの一部である。この広範なペプチドのファミリーの他のメンバーとの比較を、図５に示す。ヒトＡＦＰ−６は、ヒトアミリンペプチドに対して２７％の同一性、ヒトＣＧＲＰペプチドに対して２５％の同一性、およびヒトカルシトニンペプチドに対して２４％の同一性を有する。
【０１３５】
ＡＦＰ−６前駆体は、真実のペプチドホルモンをコードしている可能性が高く、少なくともマウスとヒトに相同体が存在する。成熟ペプチドの切断に使用されると思われる二塩基性および一塩基性の部位およびアドレノメデュリンとの相同性から推し量って予測される成熟した生理活性ペプチドを、図６に示す。
【０１３６】
１Ｂ．マウスおよびヒトのＡＦＰ−６のｃＤＮＡのクローン化
上記のデータベース配列ＸＭ１４７９１６に対してオリゴヌクレオチドを設計することによって、関連する翻訳領域を含有する、マウスＡＦＰ−６のｃＤＮＡの６４６ｂｐの部分をクローン化した。プライマーとしてオリゴｄＴを用いてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したＲＮＡから４２℃で逆転写したマウスの肺ｃＤＮＡおよび７日齢の胚のｃＤＮＡの両方から、これらのオリゴヌクレオチド（順方向オリゴ５’−ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＴ−３’（配列番号５２）および逆方向オリゴ５’−ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＧ−３’（配列番号５３））を用いて、この配列を増幅した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒのサイクルシークエンシングを行い、配列を確認し、マウスの胚および肺にこの転写物が存在することを実証した。次いで、この配列をプローブとして使用して、マウスの他のどの組織にこの転写物が含有されるかをノーザン解析法によって決定した（以下に記載）。
【０１３７】
上記のデータベース配列ＮＭ０２４８６６に対してオリゴヌクレオチド（順方向オリゴ５’−ＣＣＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  Ｔ−３’（配列番号５４）および逆方向オリゴ５’−ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号５５））を設計することによって、関連する翻訳領域の３’末端のみを含有する、ヒトＡＦＰ−６のｃＤＮＡの８８６ｂｐの部分をクローン化した。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから得たＲＮＡから作成したヒト膵臓ｃＤＮＡから、この配列を増幅した。ヒト膵臓ｃＤＮＡは、プライマーとしてオリゴｄＴを用い、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製；Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）を用いて、６５℃で逆転写したものである。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒのサイクルシークエンシングを行い、ｈＡＦＰ−６配列を確認した。本実験で得られたクローンは、対象の全読み枠を含有していなかったが、この配列をプローブとしてノーザンブロットに使用して、ヒトの他のどの組織がこの転写物を含有しているかを決定した。また、（１５名からなる男女の提供者の）膵臓ｃＤＮＡから得た４つのクローン全てが、（図３の配列比較に示す）ＡＦＰ−６  ｌｏｎｇ体のタンパク質に翻訳される配列に対応することも発見された。
【０１３８】
大きな３’非翻訳配列が加わった、対象の全翻訳領域を含有するヒトＡＦＰ−６のｃＤＮＡの約１．６ｋｂの部分が、高温逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、ヒト前立腺のｃＤＮＡからクローン化された。この操作は、この遺伝子の５’末端のＣｐＧアイランドのために必要であった。二次構造のために増幅が困難なことが多いＧＣが豊富な配列の回収を増強するために、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて増幅を行った。本実験で回収された３つのクローンの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）には、ＮＭ＿０２４８６６と比較し、代わりにスプライスされるイントロンまたはＮＭ＿０２４８６６のクローン中に不適切に保持されたイントロンを示すと思われる７２ｂｐ長の配列の欠失が存在する（図７中、スクレオチド２０９と２８１の間）。５’末端供与部位の可能性があるＧＴおよび３’末端受容部位の可能性があるＡＧを、図７中、灰色で示した。
【０１３９】
１Ｃ．発現解析
マウスおよびヒトのノーザン解析：６４６ｂｐのマウスのインサートおよび８８６ｂｐの部分的なヒトのｃＤＮＡクローンのインサートを単離し、３２ＰｄＣＴＰで標識し、ノーザンブロットをプローブするのに使用して、どの組織がＡＦＰ−６のｍＲＮＡを発現するかを決定した。データの概要を、表４に示す。
【０１４０】
【表４】
2008515443.tif 000006
ｎ．ｄ．＝未測定
＋＝非常に弱い発現（発現までに３週間超の暴露）
＋＋＝弱い発現（暴露３〜５日後に最もよく認められる）
＋＋＋＝中等度の発現
＋＋＋＋＝強い発現
＊小腸においては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈブロット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）上では、シグナルが全く認められなかったが、小腸の一部（回腸および空腸）は、ＢｉｏＣｈａｉｎブロット（ＢｉｏＣｈａｉｎ製；Ｈａｙｗａｒｄ、カリフォルニア州）上で、陽性を示した。これは、ブロット上のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡの量によると思われる（ＢｉｏＣｈａｉｎ、３μｇに対して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、２μｇ）。＊＊マウスの肺ではＡＦＰ−６に対するシグナルは検出されなかったが、この組織からｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲすることができる。
【０１４１】
ヒトの組織においては、前立腺、唾液腺、膵臓、甲状腺、胃、回腸、空腸および結腸で発現した主たるバンドが、予測より大きい（ＡＫ０９０６３５の２．６ｋｂではなく、約４．７ｋｂであり、これは、公開されているデータベースの中で最大のｃＤＮＡである）。Ｃｌｏｎｔｅｃｈブロット上の甲状腺のレーンで認められる、小さい方のバンドを計算したところ、約１．８ｋｂであり、約１．７ｋｂであるＮＭ＿０２４８６６に大きさが類似する。従って、ＡＦＰ−６転写物の２つの形態が存在すると思われる。長時間の暴露を必要とする、ＡＦＰ−６を弱く発現する組織は、脳、肺、直腸、胎盤および腎臓であった。この解析方法ではＡＦＰ−６を発現しなかった組織は、脾臓、子宮頚部、子宮、副腎髄質、副腎皮質、精巣および甲状腺であった。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ内分泌ブロット上では、小腸からはシグナルが全く認められなかったが、ＢｉｏＣｈａｉｎブロット上では、空腸および回腸の両方に対して、シグナルが認められた。これは、上記で議論したように、ブロット上のＲＮＡの量の差による可能性が高い。
【０１４２】
マウスから得た組織においては、胚のノーザン解析（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）をすると、７日齢で１．６４ｋｂ転写物が発現し、１７日齢で１．２８ｋｂ転写物が出現した。いずれの形態も、１１日齢および１３日齢では存在しなかった。ＧｅｎＢａｎｋ配列（ＸＭ＿１４７９１６）が７６５ｋｂであることから、１．２８ｋｂのバンドは、予測より若干大きかった。この大きさの違いは、拡張した５’もしくは３’ＵＴＲまたは非常に長いｐｏｌｙＡの尾部等、いくつかの要因によると思われる。使用したハイブリダイゼーションの条件から、このプローブで同定される少なくとも２つの大きさの異なる転写物が明らかになった。大きい方の転写物は、別のスプライスの可能性を示していると思われる。
【０１４３】
成体マウスのブロット上で最も強い発現を示した組織は、前立腺および唾液腺で、ヒトのブロットからは、前立腺、唾液腺、膵臓、甲状腺、胃および腸が最も強かった。成体マウスのブロット上での弱い発現は、甲状腺および胃であった。マウスの組織中、膵臓は、ノーザン解析法では解析しなかったが、マウスの組織のドットブロット法では、ＡＦＰ−６に対する陽性のシグナルを示したが、このことからは、どの形態が膵臓に存在するかは不明である。この成体マウスのノーザンブロット上でＡＦＰ−６を発現しなかった組織は、大腸、甲状腺および子宮であった。
【０１４４】
第２のマウスのノーザンブロットを、マウスのＡＦＰ−６プローブとハイブリダイズさせた。ＡＦＰ−６は、腎臓、および恐らく非常に低レベルで肝臓に存在するようである。このブロット上では、ＡＦＰ−６は、心臓、脳、脾臓、肺、骨格筋および精巣では検出されなかった。腎臓では、マウスにおいて同定されたＡＦＰ−６の両方の形態（上記）が、発現した。前回は、大きい方の形態のみが、初期の胚形成（７日齢）で認められた。大きさを解析すると、腎臓で認められた２つのバンドは、上記で議論された大きい方の胚の形態と小さい方の成体の形態に対応した。ヒトにおいても２つの形態のＡＦＰ−６が存在すると思われたが、この２つの形態の大きさの違いは、マウスで認められるより、はるかに大きい。
【０１４５】
マウスの組織のｉｎ  ｓｉｔｕにおける解析：ノーザン解析で記載したマウスのＡＦＰ−６プローブと同じものを、マウスの組織切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用して、これらの組織中のどの細胞がＡＦＰ−６のｍＲＮＡを発現しているのかを決定した。組織を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで、一晩、固定後、脱水し、パラフィンに包埋した。５〜７ミクロンの連続切片をゼラチンスライド上に載せた。スライド１枚あたり、１〜３個の切片を載せ、キシレン中で脱パラフィン後、再水和し、後固定した。切片を、プロテイナーゼＫで消化し、後固定し、トリエタノールアミン／無水酢酸で処理後、洗浄し、脱水した。ｃＲＮＡ転写物を、メーカー（Ｍａｘｉｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ（Ｔ７）、Ａｍｂｉｏｎ社製；Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）の条件に従って合成し、３５Ｓ−ＵＴＰ（＞１０００  Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージ州）で標識した。２００ヌクレオチド超の大きさのｃＲＮＡ転写物を、アルカリ加水分解して、ハイブリダイゼーションを効率よく行える、７０塩基の平均サイズを得た。切片を、５０％脱イオン化ホルムアルデヒド、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１０％デキストラン硫酸、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍｌ酵母トータルＲＮＡ、および５０〜７５，０００ｃｐｍ／μｌ３５Ｓ−標識ｃＲＮＡプローブ中で、５２℃において、一晩、ハイブリダイズさせた。組織を、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、および１０ｍＭ  ＤＴＴ中で、６５℃において、ストリンジェントに洗浄した後、ＰＢＳ中で洗浄し、２０μｇ／ｍｌＲＮＡ分解酵素を用いて、３７℃において、３０分間処理した。２×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣ中で、３７℃において、１０分間洗浄した後、スライドを脱水し、Ｋｏｄａｋ  ＮＴＢ−２核軌道乳剤に浸漬し、乾燥剤を有する光を遮断した箱の中で、４℃において、１週間露光した。写真の現像は、Ｋｏｄａｋ  Ｄ−１９中で行った。スライドを、トルイジンブルーで軽く対比染色し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡の明視野および暗視野用の部品の両方を用いて解析した。センスコントロールｃＲＮＡプローブ（ｍＲＮＡと同一）から、ハイブリダイゼーションのシグナルのバックグラウンドレベルを常時得た。
【０１４６】
結果が示すところによれば、Ｅ９．５およびＥ１２．５、胎生９．５日および１２．５日、の段階のマウスの胚において、ｍＲＮＡは、広範に認められ、全ての構造で均一に発現していた。Ｅ１７．５時でさえも、ｍＲＮＡは、広範に発現していたが、発現レベルが、唾液腺、腎臓および腸で、わずかに高かった。成体では、小腸のリーベルキューン腺の陰窩のパネート細胞、胃の上皮の胃腺、膵臓の腺房細胞、唾液腺の腺節、前立腺の上皮、および腎皮質の曲尿細管で、ＡＦＰ−６のｍＲＮＡを検出した。これらの細胞は、いずれも、分泌性である。膵臓、前立腺および唾液腺の代表的な写真を、図８Ａ〜８Ｉに示す。真中の列の暗視野のアンチセンスの画像に、特異的なＡＦＰ−６のｍＲＮＡシグナルが認められる。
【０１４７】
これらの実験で解析した組織から、ペプチド前駆体に対するＡＦＰ−６のｍＲＮＡは、分泌性または外分泌性の機能に一致する組織分布を有することが示されている。
【０１４８】
１Ｄ．ＡＦＰ−６ポリペプチドの合成
以下のポリペプチドは、標準的なポリペプチドの合成方法を用いて合成することができる。かかる方法を、以下に記載する。さらに、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられている、米国特許第６６１０８２４号および第５６８６４１１号ならびに特許出願第４５４５３３号（１９９９年１２月６日出願）にも記載されている。
【０１４９】
初期量を０．２ｍｍｏｌ／ｇ（０．２５ｍｍｏｌ規模）とし、Ｐｉｏｎｅｅｒ連続ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）上で、ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、ポリペプチドを合成した。Ｆｍｏｃアミノ酸（４．０当量、１．０ｍｍｏｌ）残基を、４．０当量のＨＢＴＵ、４．０当量のＨＯＢＴおよび８．０当量のＤＩＥＡを用いて活性化した後、１時間、樹脂に結合させた。Ｆｍｏｃ基を、ジメチルホルムアミド中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理することによって、除去した。最後に、ペプチドの脱保護および固相からの切断を、試薬Ｂ（９３％ＴＦＡ、３％フェノール、３％水および１％トリイソプロピルシラン）で、樹脂を、２〜３時間処理することによって行った。切断したペプチドを、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離してペレット化した後、凍結乾燥した。ペレットを水（１０〜１５ｍｌ）に再溶解し、ろ過後、Ｃ−１８カラムおよび０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水の濃度勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにて精製した。精製生成物を凍結乾燥後、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよび分析ＨＰＬＣによって分析したところ、純粋（＞９８％）であることが示された。質量分析値は全て、計算値と一致した。
【０１５０】
別法として、初期量を０．０５０〜０．１００ｍｍｏｌで、０．４３〜０．４９ｍｍｏｌ／ｇとし、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製；Ｗｏｂｕｒｎ、マサチューセッツ州）上で、Ｒｉｎｋアミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用いて、ペプチドを組み立てた。Ｆｍｏｃアミノ酸（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製；５．０当量、０．２５０〜０．５００ｍｍｏｌ）残基を、１−メチル−２−ピロリジノンに溶解し、０．１０Ｍの濃度とした。他の試薬（ＨＢＴＵ、ＨＯＢＴおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を、０．５５Ｍジメチルホルムアミド溶液として調製した。次いで、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＨＢＴＵ（２．０当量、０．１００〜０．２００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１．８当量、０．０９０〜０．１８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．４当量、０．１２０〜０．２４０ｍｍｏｌ）を用いて樹脂結合アミノ酸に、２時間結合させた。最後のアミノ酸結合の後、ペプチドを、ジメチルホルムアミド中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて、１時間脱保護した。ペプチド配列が完成したら、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成機をプログラムして、樹脂を切断する。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によるペプチドの樹脂からの切断を、９３％ＴＦＡ、３％フェノール、３％水および１％トリイソプロピルシランからなる試薬の混合液を用いて行った。切断したペプチドを、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離してペレット化した後、凍結乾燥した。ペレットを酢酸に溶解し、凍結乾燥後、水に溶解し、ろ過後、Ｃ−１８カラムおよび０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水の濃度勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにて精製した。分析ＨＰＬＣを用いて、ペプチドの純度を測定し、ＬＣ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによって、同定した。
【０１５１】
実施例２．受容体生理活性の解析
２Ａ．ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるｃＡＭＰ生成量によって測定するＡＦＰ−６のアドレノメデュリン様活性
ＡＦＰ−６が、アドレノメデュリンに対して最も近い相同性を有することから、アドレノメデュリン受容体を含有するＨＵＶＥＣ（Ｋａｔｏら、（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８９：３８３−３８５）におけるＡＦＰ−６の生理活性を試験した。試験は、最適２５〜３０，０００細胞／ウエルを使用するサイクリックＡＭＰ用ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを使用した。試験したペプチドは、アドレノメデュリン、ＣＧＲＰαおよびＡＦＰ−６であった。ＣＨＯ細胞に比べ、ＨＵＶＥＣでは、ｃＡＭＰレベルの上昇は大きくなかった。ＣＨＯ細胞は、アドレノメデュリン受容体を発現しないことから、ネガティブコントロールとして選ばれた。
【０１５２】
図９に示すスクリーニングの結果から、ＡＦＰ−６には、１μＭおよび１０ｎＭの濃度でｃＡＭＰレベルを上昇させる活性があるが、ＨＵＶＥＣに対しては、アドレノメデュリンほど強力ではないことが示された。驚くことに、ＡＦＰ−６は、アドレノメデュリン受容体を含有するＨＵＶＥＣ細胞に比べ、アドレノメデュリン受容体を含有しないＣＨＯ細胞に対してより強力な活性を示した。このＨＵＶＥＣにおける効力の順位は、アドレノメデュリン＞ＡＦＰ−６≫ＣＧＲＰαであった。ＣＨＯ細胞における効力の順位は、ＡＦＰ−６＞アドレノメデュリン＝ＣＧＲＰαであった。
【０１５３】
従って、ＡＦＰ−６は、アドレノメデュリン受容体と相互作用するが、アドレノメデュリン自体よりは親和性が低い。ＡＦＰ−６は、アドレノメデュリンよりも、ＣＨＯ細胞においては、ｃＡＭＰレベルを強力に上昇させることから、この相互作用は、別の受容体、例えば、カルシトニン受容体を介している可能性が高い（Ｄ’Ｓａｎｔｏｓら、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８９４−８９９）。
【０１５４】
２Ｂ．ＣＨＯ細胞におけるｃＡＭＰ生成量によって測定するＡＦＰ−６ペプチドのカルシトニン受容体に対する機能的相互作用
ＡＦＰ−６がカルシトニン受容体と相互作用するか否かを試験するために、関連するペプチドのパネルをＣＨＯ細胞内、およびこれもカルシトニン受容体を発現するＴ４７Ｄ細胞内（Ｍｕｆｆら、（１９９２）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６５７：１０６−１１６およびＫｕｅｓｔｎｅｒら、（１９９４）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：２４６−２５５）で再度試験した。ＣＨＯ細胞の実験では、ＡＦＰ−６は、アミリンと同様の効力を示し、アドレノメデュリンより強力であり、効力の順位は、カルシトニン＞ＡＦＰ−６＞アミリン＞ｈＣＧＲＰα＞アドレノメデュリンであった。ＣＨＯ細胞における化合物のＥＣ５０値を、以下の表７Ａに示す。この表は、カルシトニン受容体を含有する培養細胞株であるＣＨＯ細胞（Ａ）およびＴ４７Ｄ細胞（Ｂ）のそれぞれにおける、１ｐＭ〜１μＭの範囲のアミリンファミリーペプチドの投与量−応答曲線から計算したＥＣ５０値の概要を示す。これらの例示的な独立αスクリーニングアッセイから得たデータの概要を、ＰＲＩＳＭで計算したＥＣ５０値とともに示す。
【０１５５】
【表５】
2008515443.tif 000007
【０１５６】
【表６】
2008515443.tif 000008
【０１５７】
ＡＦＰ−６は、Ｔ４７Ｄ細胞においてもｃＡＭＰの生成量を増加させた。Ｔ４７Ｄ細胞における化合物のＥＣ５０値を上記の表７Ｂに示し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に認められた効力の順位に類似する効力の順位：カルシトニン＞アミリン＞ＡＦＰ−６＝ｈＣＧＲＰα＞アドレノメデュリンを確立した。これらのデータから、ＡＦＰ−６は、カルシトニン受容体と相互作用するが、カルシトニン自体よりは弱く、アミリンの親和性と同等の親和性およびアドレノメデュリンの親和性よりはるかに高い親和性を有することが示されている。
【０１５８】
２Ｃ．放射性リガンドの結合能によって測定するＡＦＰ−６のアミリンおよびＣＧＲＰの受容体に対する相互作用
いくつかの例示的な本発明の化合物のアミリン受容体に対する結合能を、ラットの脳から調製した中隔側坐核の膜中で以下に示すように評価した。１２５Ｉ−ラットアミリンをＡｍｅｒｓｈａｍ社製（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、イリノイ州）のボルトンハンター試薬で標識した。標識されていないペプチドは、ＢＡＣＨＥＭ社（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、カリフォルニア州）から入手した。
【０１５９】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系（登録商標）ラット、雄、２００〜２５０ｇを、斬首により屠殺した。脳を取り出し、冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に保存した。腹側表面から、視床下部の頭側に向けて嗅索の外側まで切開し、これらの索から４５°の角度で内側に切開部分を伸ばした。中隔側坐核および周囲の領域を含有するこの前脳基底核の組織を計量後、氷冷した２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ酸、２３℃においてＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）中でホモジナイズした。膜を新鮮な緩衝液中で、４８，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、３回洗浄した。最終的に得られた膜のペレットを、０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁した。
【０１６０】
１２５Ｉ−アミリンの結合能を測定する（Ｂｅａｕｍｏｎｔら、（１９９５）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７３（７）：１０２５−１０２９を参照）ために、もともとの湿潤重量が４ｍｇの組織から得た膜を、０．５ｍｇ／ｍｌのバシトラシン、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の１２〜１６ｐＭの１２５Ｉ−アミリンとともに、インキュベートした。溶液を、２℃において、６０分間インキュベートした。放射標識ペプチドの非特異的結合を減少させるために、０．３％ポリエチレンイミン中に４時間あらかじめ浸漬したＧＦ／Ｂガラス繊維製のフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製；Ｃｌｉｆｔｏｎ、ニュージャージ州）でろ過することによって、インキュベートを停止した。フィルターを、ろ過の直前には５ｍｌの冷ＰＢＳ、およびろ過の直後には１５ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した。フィルターを取り外して、ガンマカウンターで７７％のカウント効率で、放射能を測定した。１０−１２〜１０−６Ｍの未標識の試験化合物の存在下で結合を測定することによって、競合曲線を作成し、４−パラメーターロジスティク方程式を使用する非線形回帰（ＩＮＰＬＯＴプログラム、ＧＲＡＰＨＰＡＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ製；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）によって分析した。
【０１６１】
本発明の化合物のＣＧＲＰ受容体に対する結合能の評価方法は、ＣＧＲＰ受容体を発現するとして知られているＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞（Ｍｕｆｆ，Ｒ．ら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２：６５７、１０６−１６）から調製した膜を使用する以外は、アミリンについて記載されている場合に準じる。結合アッセイを、１３，５００ｃｐｍ  １２５１−ｈＣＧＲＰ／ウエルまたは２１．７ｐＭ／ウエル（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）を使用する以外は、アミリンについての記載に準じて行った。
【０１６２】
図１０に示す結合アミリンの置換のＩＣ５０から、効力の順位：アミリン＞ＣＧＲＰ＞ＡＦＰ−６≫アドレノメデュリン＞カルシトニンを確立した。これは、ＡＦＰ−６は、アミリン受容体における強力なリガンドで、アドレノメデュリンよりはるかに強力であるが、アミリン自体ほどには強力ではないことを示している。
【０１６３】
同様に、図１１は、ＣＧＰＲの置換のＩＣ５０を示し、順位は、ＣＧＰＲ＞アドレノメデュリン＞ＡＦＰ−６＞アミリン≫カルシトニンであり、ＡＦＰ−６は、ＣＧＲＰ受容体における強力なリガンドであるが、ＣＧＲＰ自体およびアドレノメデュリンほどには強力ではないことを示している。
【０１６４】
アミリンファミリーポリペプチドの相対的な結合強度を表４に示す。ＡＦＰ−６は、複数の受容体において高い効力を有する雑然としたリガンドである。
【０１６５】
実施例３．カロリー摂取に対する効果
ＡＦＰ−６の食物摂取に対する効果を、急性食物摂取アッセイを用いて調べた。このアッセイでは、やせ型、集団飼育、一晩絶食のＮＩＨ／Ｓｗｉｓｓマウスにおける食物消費量を測定した。１２匹のマウスを、３匹ずつ集団で飼育した。検体化合物、この場合はＡＦＰ−６、をマウスに腹腔内注射した後、食物摂取量を２時間にわたり測定した。食物摂取の減少量および増加量を測定することができる。化合物を種々の投与量で試験し、ＥＤ５０を求めた。アッセイの手順を以下に示す。１．実験の前日の５：００ｐｍに、食物を取り除いた（水は自由に与える）。２．飼料ペレットを計量する（３ペレット／ケージ）。３．マウスに、２００μｌの適切な溶液を腹腔内注射する、ｔ＝０．４。直ちに、各ケージに、あらかじめ計量した飼料を（水の入ったボトルの飲み口から離して）供給し、マウスに自由に摂取させる。５．３０、６０および１２０分後に、試料を採取、計量する。６．データを分析する。データポイントは、ｎ＝１２の平均±標準偏差を表す。
【０１６６】
図１２に、ＡＦＰ−６が、ｌｍｇ／ｋｇの投与量で、食物摂取量を９１％抑制することを示す。ラットカルシトニンは、０．６３ｍｇ／ｋｇの投与量で、食物摂取を有意に抑制することはなかった（１６％）。それとは対照的に、ラットアミリンは、わずか０．１ｍｇ／ｋｇで、食物摂取量を３０〜４０％抑制した。アドレノメデュリンは、食物摂取量を７１％まで抑制し、この効果のＥＤ５０は、１３ｎｍｏｌ／ｋｇであった。アドレノメデュリンは、脳室内に投与した場合には、ラットの食物摂取を抑制することはないが、ＣＧＲＰ受容体の活性化を介するとの報告がある（Ｔａｙｌｏｒら、（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７：３２６０−３２６４）。
【０１６７】
従って、ＡＦＰ−６は、カルシトニン受容体と相互作用するが、食物摂取に対するＡＦＰ−６の効果を媒介するのは、この薬理学的な相互作用ではないようである。というのは、カルシトニン自体は、食物摂取には効果を及ぼさないからである。アミリンファミリーポリペプチドの相対強度を、表４に示す。カルシトニンは、食物摂取量の減少に効果を示さないが、ＡＦＰ−６は、アミリン、ＣＧＲＰおよびアドレノメデュリンと同等の効果を示している。
【０１６８】
上記の手順にしたがった、ＡＦＰ−６の短期食物摂取に対する投与量−応答を、図１３に示す。ＡＦＰ−６（Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を、０．３、１、３、１０、３０、１００または３００ｎｍｏｌ／ｋｇの各投与量で、１２匹のマウスに腹腔内注射した（ｎ＝１２／群）。注射後、直ちに、食物を与え、消費量を、ｔ＝３０、６０および１２０分の時点で計量した。非線形回帰分析から、６０分の時点で、ＥＤ５０＝１９ｎｍｏｌ／ｋｇであった。
【０１６９】
実施例４．ＡＦＰ−６の胃内容排出速度に対する活性
Ｈａｒｌａｎ  ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ系（登録商標）ラット、雄、２３７〜３１７ｇを、１２：１２の明暗サイクルで飼育した。実験は、明サイクル中に行った。時間＝０で、試験ペプチド（アミリンまたはＡＦＰ−６）を、６．３、２０、６３、２００、６３２および１１２２μｇ／ｋｇで、または媒体を、意識のあるラットに（皮下）注射した（ｎ＝６）。ｔ＝５分で、５μＣｉのＤ−［３−３Ｈ］グルコースを含有する無菌水１ｍｌを、意識のあるラットに、口咽頭チューブから胃管栄養した。胃管栄養後３０分で、血液試料を採取して、血漿中のカウント毎分（ＣＰＭ）を測定した。２０％ベンゾカイン液体局所麻酔薬を用いて、採血中の痛みを除いた（Ｇｅｄｕｌｉｎら、（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０８：Ａ６０４）。血漿に認められるカウント数は、胃内容排出速度を反映するものである。有意差（ｐ＜０．０５）を、分散分析によって求めた。図１４Ａに見られるように、ＡＦＰ−６は、胃内容排出を抑制しており、ＥＤ５０は、４９μｇ／ｋｇである。図１４Ｂは、アミリンでも、血漿中のカウント数の減少が認められ、胃内容排出を抑制し、ＥＤ５０は、４μｇ／ｋｇであることを示している。
【０１７０】
実施例５．ＡＦＰ−６の全血漿カルシウムに対する活性
実施例４で得られた試料を用いて、上記の胃内容排出実験で得た血漿試料中のイオン化カルシウム量を、イオン選択電極、Ｃｉｂａ／Ｃｏｒｎｉｎｇ  ６３４  Ｃａ／ｐＨ分析器（Ｃｉｂａ／Ｃｏｒｎｉｎｇ社製；Ｍｅｄｆｉｅｌｄ、マサチューセッツ州）を用いて測定した。図１５Ａおよび１５Ｂは、アミリンと同様、ＡＦＰ−６も、血漿イオン化カルシウムを減少させ、ＥＤ５０は、２５μｇ／ｋｇであることを示している。
【０１７１】
実施例６．いくつかのＡＦＰ−６アナログの化学的特徴および活性
６Ａ．いくつかの例示的なＡＦＰ−６アナログの化学的特徴
実施例１Ｄで記載した方法に従って合成した、精製アナログを、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよび分析ＨＰＬＣによって分析したところ、純粋（＞９８％）であることが示された。質量分析の結果は全て、計算値と一致し、それを表５に示す。
【０１７２】
６Ｂ．いくつかの例示的なＡＦＰ−６アナログの受容体結合活性および食物摂取に対する効果
いくつかの例示的なＡＦＰ−６アナログを、実施例２および３の記載に準じて、受容体生理活性および食物摂取について試験した。食物摂取および受容体結合の結果を、それぞれ表５および表６に示す。
【０１７３】
【表７】
2008515443.tif 000009
【表８】
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【０１７４】
【表９】
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【表１０】
2008515443.tif 000012
【０１７５】
実施例７．ＡＦＰ−６アナログの心血管系に対する効果
遠隔測定によって、意識のある、非麻酔、無拘束のラットに埋め込んだ無線送信機を介して、動脈圧、心拍数、動脈ｄＰ／ｄｔ、ＥＣＧ（波形間隔とともに）および深部体温を含めた血行動態の読みがリアルタイムで可能となる。ラットに、遠隔静脈投与によって、食塩水、ラットアミリン１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、ラットアドレノメデュリン１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、またはＡＦＰ−６  １０ｎｍｏｌ／ｋｇのいずれかを注射した。遠隔静脈投与は、留置している静脈アクセス口から行う。
【０１７６】
図１６Ａ〜１６Ｃに示すように、アミリンは、平均動脈圧（ＭＡＰ）を急激に上昇させ、次いで、はじめの３０分の間に、ＭＡＰを低下させることができる。一方、アドレノメデュリンは、１時間の間に、ＭＡＰを低下させている。心拍数については、３種のペプチドは全て、１時間にわたり、１分あたりの心拍数を増加させている。最後に、アミリンは、ｄＰ／ｄｔについても、急激に上昇させる効果があるが、この効果は、時間とともに消失する。一方、アドレノメデュリンは、１時間にわたり、持続してｄＰ／ｄｔを上昇させている。３つの心血管パラメーターの全てについて、ＡＦＰ−６は、アドレノメデュリンよりもアミリンに近い特性を示すようである。
【０１７７】
実施例８．ＡＦＰ−６のラットにおける食物摂取量および体重に対する効果
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系（登録商標）ラット（実験開始時の体重＝３１０ｇ、各１２時間明暗サイクル）を、個別に、高脂肪（ＨＦ）の飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ；脂肪から５８％ｋｃａｌ）で飼育した。ラット、を３４日間かけて太らせた。この期間の終わりに、麻酔下で、７日用浸透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ社製）を、肩甲骨間に埋め込んだ（埋め込み時の体重＝４０３ｇ）。ラットは、化合物またはビヒクル（５０％ＤＭＳＯ）を送達するポンプを与えられた。以下の化合物を、７５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日の投与量で、試験した：ＡＦＰ−６および配列番号３２のＡＦＰ−６アナログ。第２日目と第７日目に、食物摂取量および体重を測定した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＦｉｓｈｅｒの最小有意差法を用いて、群間の差を分析した。
【０１７８】
図１７Ａおよび１７Ｂから、ＡＦＰ−６および例示的なＡＦＰ−６アナログの両方が、ビヒクル群に比べ、処置２日後に、食物摂取量を有意に減少させていることが示される。第７日までには、両群の食物摂取量は、ビヒクル処置群と同等になった。第７日で、いずれのペプチドも、ビヒクルよりも、体重増加の程度が有意に少なく、第７日の体重減少率は、ＡＦＰ−６およびＡＦＰ−６アナログ（ビヒクル補正）について、それぞれ３．２％および２．１％であった。
【０１７９】
本発明を、より好ましい実施例および具体的態様によって説明してきたが、当業者であれば、変形例および改変例を思いつくことが理解されよう。従って、添付の特許請求の範囲には、請求されている本発明の範囲内である、かかる同等の変形例は全て包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ−１Ｂ】それぞれアドレノメデュリンペプチドクエリ配列と仮想タンパク質ＸＰ＿１４７９１６とのＢｌａｓｔ配列比較、およびヒトアドレノメデュリン前駆体と全長の仮想マウスタンパク質ＸＰ＿１４７９１６とのＢｌａｓｔ配列比較を示す図である。
【図２】マウスＡＦＰ−６と名づけられたタンパク質ＸＰ＿１４７９１６のＦＡＳＴＡフォーマットの全配列を示す図である。
【図３】ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）により実施した、マウスおよびヒトＡＦＰ−６前駆体タンパク質の配列比較を示す図である。
【図４】ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）による、ヒトアドレノメデュリンおよびヒトＡＦＰ−６前駆体タンパク質の配列比較を示す図である。
【図５】ＡｌｉｇｎＸ（登録商標）により実施した、アミリンファミリーポリペプチドであるｈＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリン、ヒトアミリン、ｈＣＧＲＰ１およびヒトカルシトニンの配列比較を示す図である。
【図６】アドレノメデュリンとの相同性に基づいたヒトおよびマウスのＡＦＰ−６前駆体のからの予測される成熟した生理活性ペプチドを示す図である。
【図７】データベース配列ＮＭ０２４８６６と整列したヒト前立腺ＡＦＰ−６のｃＤＮＡの５’ＵＴＲとの配列比較を示す図である。
【図８Ａ−８Ｉ】膵臓、前立腺および唾液腺からの選択されたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのデータを示す写真である。
【図９】ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイを用いて測定した、ＨＵＶＥＣおよびＣＨＯ細胞における２種の濃度のＡＦＰ−６、ヒトアドレノメデュリンおよびｈＣＧＲＰ１によるサイクリックＡＭＰの上昇のデータを示す図である。
【図１０】アミリンの放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示す図である。
【図１１】ＣＧＲＰの放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）の結果を示す図である。
【図１２】ＡＦＰ−６のマウスにおける短期の食物摂取に対する効果を示す図である。
【図１３】ＡＦＰ−６のマウスにおける短期の食物摂取に対する投与量−応答を示す図である。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ラットにおける胃内容排出速度に対する、各々、ＡＦＰ−６およびｒアミリンの効果を示す図である。
【図１５Ａ−１５Ｂ】ラットにおけるイオン化カルシウムレベルに対する、各々、ＡＦＰ−６およびｒアミリンの効果を示す図である。
【図１６Ａ−１６Ｃ】雄性ラットにおいて、いくつかの心臓パラメーター、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）およびｄＰ／ｄｔに対する、ｒアミリン、ＡＦＰ−６およびラットアドレノメデュリンの効果を示す図である。
【図１７Ａ−１７Ｂ】高脂肪食を与えられたラットにおける食物摂取および体重増加に対する、配列番号１のＡＦＰ−６または配列番号３２の例示的なＡＦＰ−６アナログの１週間連続皮下注入の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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