(57)【要約】  チトクロムＰ−４５０（ＣＹＰ）２Ｃ９の活性及び、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する又はＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導する可能性を評価するための、迅速かつ高感度の放射分析アッセイを記載する。インキュベーション、生成物分離及び放射活性カウントを含むアッセイの段階は全て、好ましくはマルチウェル方式で行われ、これは自動化できる。
2008515426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウム標識されたトリチウム標識ジクロフェナック（［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック）、ＮＡＤＰＨ及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ２Ｃ９活性が４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）混合物からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロムＰ４５０アイソフォーム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項２】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー、シリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材並びに活性炭からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項３】
吸着剤がポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
４’位において標識されたジクロフェナックが、２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ４−ブロモアニリンの混合物を提供すること、前記混合物を銅触媒の存在下にインキュベートして、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を生成させること、及び２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸をパラジウム触媒存在下でトリチウムと共にインキュベートして、４’位において標識されたジクロフェナックを生成させることにより生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水性混合液が、ＮＡＤＰＨ再生系をさらに含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｅ）における混合液中のトリチウムが、ＣＹＰ２Ｃ９、フェニル環の４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナック及びＮＡＤＰＨを含有しており検体を含有していない対照混合液からの混合液中のトリチウム量と比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＹＰ２Ｃ９がミクロソーム中において提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ミクロソーム中がヒト肝臓ミクロソームである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ミクロソームが、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞（これらの細胞は、ＣＹＰ２Ｃ９を発現するベクターを含む。）から産生される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有するカラムプレート又はカラム（非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）を提供することと；
（ｂ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識ジクロフェナック及び検体を含有する混合物を添加することと；
（ｃ）段階（ｂ）のウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨを接触させ、ＣＹＰ２９が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；
（ｄ）マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の段階（ｃ）での水性混合液からＣＹＰ２Ｃ１９を分離することと；
（ｅ）カラムプレートの個々のミニカラムに段階（ｄ）での各水性混合液を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｅ）の水性混合液中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロムＰ４５０アイソフォーム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１１】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー、シリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材並びに活性炭からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ２Ｃ９がトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナックを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９の相対活性を決定する。）
を含む、肝細胞においてチトクロム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の相対的活性を決定するための方法。
【請求項１３】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー、シリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材並びに活性炭からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナックを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ２Ｃ９が４’位でトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと；
（ｄ）肝細胞の培養物から第二の培地を除去することと；
（ｅ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、第二の培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｆ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｅ）の第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導することを示す。）
を含む、チトクロム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）発現を誘導する検体を同定するための方法。
【請求項１５】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー、シリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材並びに活性炭からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）肝細胞の培養物を提供することと；
（ｂ）ＣＹＰ２Ｃ９がトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナック及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；
（ｃ）肝細胞の培養物から培地を除去することと；
（ｄ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｅ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｄ）の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性を阻害する検体を同定するための方法。
【請求項１７】
吸着剤が、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマー、シリカ基材に結合された非極性基を含有するシリカ基材並びに活性炭からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ４−ブロモアニリンの混合物を提供することと；
（ｂ）前記混合物を銅触媒の存在下にインキュベートして、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を生成させることと；及び
（ｃ）２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を、パラジウム触媒存在下にトリチウムと共インキュベートして、４’位において標識されたジクロフェナックを生成させることと
を含む、４’位において標識されたジクロフェナックを生成させるための請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
式：
【化１】
2008515426.tif 000015
（式中、Ｔはトリチウムである。）を有する、４’位において標識されたジクロフェナック。
【請求項２０】
式：
【化２】
2008515426.tif 000016
（式中、Ｂｒは臭素であり、Ｃｌは塩素である。）を有する、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸。
【請求項２１】
（ａ）ＣＹＰ２Ｃ９、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；
（ｂ）様々な時間、前記混合物をインキュベートすることと；
（ｃ）前記混合物を希釈し、次いで希釈混合物に４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナック及びＮＡＤＰＨを添加することと；
（ｄ）ＣＹＰ２Ｃ９が４’位においてトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、前記希釈混合物をインキュベートすることと；
（ｅ）混合物からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；
（ｆ）非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に前記混合物を添加して、前記混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及び
（ｇ）トリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）
を含む、チトクロム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（１）発明の分野
本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９の活性及び、例えばＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害剤又は誘導剤などの、検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を調節する可能性を評価するためのアッセイに関する。このアッセイは、基質としての４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナック及び、ＣＹＰ２Ｃ９による４’位における標識ジクロフェナックのヒドロキシル化の際に生じるトリチウム化水から標識ジクロフェナックを分離するための、ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いる、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ９を含むミクロソーム又は肝細胞において、ジクロフェナックの４’−ヒドロキシル化を測定することにより、ＣＹＰ２Ｃ９活性を調べる。このアッセイは、ＣＹＰ２Ｃ９酵素活性及び候補薬物のＣＹＰ２Ｃ９阻害又は誘導の可能性を評価して、さらなる開発から可能性のあるＣＹＰ阻害剤又は誘導剤を除外するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
（２）関連技術の説明
医薬品の薬物動態及び毒物動態特性は、大部分、薬物代謝酵素によるそれらの生体内変化に依存する。哺乳動物における主要な薬物代謝系はチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）であり、これは、肝臓に主に存在するミクロソーム酵素のファミリーである。複数のＣＹＰアイソフォームが、薬物、ステロイド、プロスタノイド、エイコサノイド、脂肪酸及び環境毒素を含む、内在性及び外来性の化学物質の酸化を触媒する（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ．（１９９６））。特定のＣＹＰアイソザイムにより代謝される薬物がその同じ酵素の阻害剤と同時投与されると、その薬物動態が変化し得、悪影響が生じ得る（Ｂｅｒｔｚ及びＧｒａｎｎｅｍａｎ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３２：２１０−２５８（１９９７）；Ｌｉｎ及びＬｕ，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．３５：３６１−３９０（１９９８）；Ｔｈｕｍｍｅｌ及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３８：３８９−４３０（１９９８）；ｖｏｎ  Ｍｏｌｔｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１１３−１２２（１９９８））。したがって、代謝阻害のためにクリアランスの変化が起きることを予想し回避できることは重要である。薬物探索プロセス中に、さらなる開発から可能性のある阻害剤を除外するために、候補薬物のＣＹＰ阻害の可能性を評価することは、製薬工業における通常業務である（Ｌｉｎ及びＬｕ，前出（１９９８）；Ｃｒｅｓｐｉ及びＳｔｒｅｓｓｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４４：３２５−３３１（２０００）；Ｂａｃｈｍａｎｎ及びＧｈｏｓｈ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．２：２９９−３１４（２００１）；Ｒｉｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．４：４５−５４（２００１））。
【０００３】
多様な形態で発現されるＣＹＰ２Ｃ９は、ヒトにおける最も重要な薬物代謝酵素の１つである。これはヒト肝臓ＣＹＰ総含量の約２０％を構成し、治療上重要な薬物の約１０％を代謝する（Ｍｉｎｅｒｓ及びＢｉｒｋｅｔｔ、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：５２５−５３８（１９９８）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２：３４９−３５５（２００１）；Ｘｉｅら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：１２５７−１２７０（２００２）；Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３３：２３−３０（２００３））。ＣＹＰ２Ｃ９の阻害による多くの臨床的に関連する薬物相互作用が述べられている。（Ｍｉｎｅｒｓ及びＢｉｒｋｅｔｔ、前出；Ｉｔｏら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：４７３−４８６（２００４））。候補薬物がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する可能性を調べるために、いくつかのアッセイ法が現在使用されおり、これらの方法のそれぞれが様々な長所及び短所を示す。最も広く使用されているマーカー反応は、ジクロフェナック４’−ヒドロキシル化、トルブタミン４’−ヒドロキシル化及びＳ−ワーファリン７’−ヒドロキシル化である。インキュベーションアッセイは通常、酵素源としてヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）を用い、ヒドロキシル化基質を定量するために紫外線（ＵＶ）又は質量分析（ＭＳ）検出を伴う高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行われる。
【０００４】
ヒドロキシル化基質を単離し検出するためにＨＰＬＣを使用する必要があるため、ＣＹＰ２Ｃ９の阻害剤を検出するための現在のアッセイはハイスループットスクリーニングに適していない。ハイスループットスクリーニングに適切なアッセイを創出するための試みにおいて、多くの蛍光性基質プローブが開発されてきた。これらのプローブを用いると、蛍光を測定することによりヒドロキシル化基質を検出することが可能となる。このアッセイの他の成分から生成物を分離する必要はない。ＨＰＬＣにより生成物を単離することなく生成物を検出できることから、ハイスループットスクリーニング形式での使用に対してこのアッセイは実用的となる。しかし、蛍光プローブを用いることにはいくつかの欠点がある。第一に、蛍光プローブは１以上のＣＹＰアイソフォームにより代謝されることが多く、したがって、このアッセイは、ＨＬＭの代わりに１種類のＣＹＰアイソフォーム（組み換えＤＮＡ技術により産生される。）を用いて行わなければない。第二に、蛍光プローブ及び組み換えＣＹＰアイソフォームを用いるアッセイの結果は、ＨＬＭにおいて従来のプローブを用いて得られる結果とあまりよく相関しない（Ｃｏｈｅｎら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１，１００５（２００３））。相関がない理由としては、ＨＬＭに存在するが組み換えＣＹＰアイソフォームを使用するアッセイには存在しない試験阻害剤の代謝及び複数の基質結合部位の存在が挙げられ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、基質としてジクロフェナックを使用することに基づき、少なくとも従来のアッセイと同じ程度に高感度で特異的であり、高スループットスクリーニング形式に容易に適合させることができる、ＣＹＰ調節因子を同定するためのアッセイが依然として要求されている。肝細胞においてＣＹＰ２Ｃ９活性を評価するためのアッセイもまた必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、チトクロムＰ−４５０アイソフォーム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性及び、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する可能性を評価するための、迅速かつ高感度の放射分析アッセイを提供する。このアッセイは、検体存在下での、４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナック（［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック）のＣＹＰ２Ｃ９介在性ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］Ｈ２Ｏとしてのトリチウムの放出の検出に基づくものであり、ここで、検体存在下での肝細胞における時間経過によるトリチウム放出の増加又は検体存在下でのＣＹＰ２Ｃ９を含有する反応での時間経過によるトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の調節因子であることを示す。この方法により、さらに、肝細胞標本におけるＣＹＰ２Ｃ９の活性を調べることができる。従来のジクロフェナック４’−ヒドロキシル化アッセイとは異なり、本明細書中のアッセイは、ＨＰＬＣ分離及び質量分析を必要としない。代わりに、ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を用いた固相抽出プロセスにおいて、トリチウム化ジクロフェナックから、トリチウム化水生成物を分離する。インキュベーション、生成物の分離及び放射活性測定を含む本アッセイの全段階が好ましくはマルチウェル形式で行われ、これは自動化できる。
【０００７】
したがって、ある実施形態において、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウム標識されたトリチウム標識ジクロフェナック、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する水性混合液を提供することと；ＣＹＰ２Ｃ９が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、水性混合液をインキュベートすることと（トリチウム標識水が生成する。）；場合によっては水性混合液からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に水性混合液を添加して、水性混合液からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された水性混合液中のトリチウム標識水の量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【０００８】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【０００９】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含有する。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００１０】
さらなる実施形態において、吸着剤は活性炭を含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてのみトリチウム標識されたトリチウム標識ジクロフェナック、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；ＣＹＰ２Ｃ９活性が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、混合物をインキュベートし、場合によっては混合物からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに混合物を添加して、水性混合液からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された混合物中のトリチウムの量を測定することと（検体存在下でのトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１２】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００１３】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。
【００１４】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウム標識されたトリチウム標識ジクロフェナック、ＮＡＤＰＨ、場合によってはＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；ＣＹＰ２Ｃ９活性が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、混合物をインキュベートすることと；場合によっては混合物からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるような、Ｎ−ビニルピロリジンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリジンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーに混合物を添加して、混合物中のトリチウム標識水からヒト肝臓ミクロソーム及びトリチウム標識ジクロフェナックを分離することと；トリチウム標識ジクロフェナックが除去された水性混合液中のトリチウム量を測定することと（検体存在下でのトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１６】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００１７】
上記のさらなる実施形態において、加湿性ポリマーは、固相抽出カートリッジ又はカラムの内側に充てんされる。上記の何れか１つの特に好ましい実施形態において、本方法は、インキュベーションを行うための第一のマルチウェルプレート、インキュベーション後にトリチウム化水から標識ジクロフェナックを分離するための、マルチウェルプレートと同じ配列であるマルチカラムプレート及びトリチウムを測定するためにマルチカラムからカラム空隙容量及び洗浄液を回収するための第二のマルチウェルプレート、を含むマルチウェルプレート形式で行われる。
【００１８】
本発明はさらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤をその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてのみトリチウムにより標識されたトリチウム標識ジクロフェナック及び検体を含有する混合物を添加することと；上記のウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ２Ｃ９が４’位でトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の混合物からＣＹＰ２Ｃ９を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各混合物を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された混合物中のトリチウム量を測定することと（検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００１９】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２０】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００２１】
本発明は、さらに、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識ジクロフェナック及び検体を含有する混合物を添加することと；上記ウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ２Ｃ９が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の混合物からＣＹＰ２Ｃ９を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各水性混合液を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；トリチウム標識ジクロフェナックが除去された混合物中のトリチウム量を測定することと（検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２２】
上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。
【００２３】
上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーは、Ｎ−ビニルピロリドンである。
【００２４】
上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、マルチウェルプレート及び、固相抽出カートリッジの一連を有しているカラムプレート又はカラム（形成されるポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるような、Ｎ−ビニルピロリジンに対するジビニルベンゼンの割合で、ジビニルベンゼン及びＮ−ビニルピロリジンをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーをその中に有する。）を提供することと；マルチウェルプレートのウェルのそれぞれに、ＣＹＰ２Ｃ９、４’位においてトリチウムにより標識されたトリチウム標識ジクロフェナック及び検体を含有する混合物を添加することと；ウェルのそれぞれの中の混合物にＮＡＤＰＨ及び場合によってはＮＡＤＰＨ再生系を接触させ、ＣＹＰ２Ｃ９が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、インキュベートすることと；場合によっては、マルチウェルプレートのウェルのそれぞれの中の混合物からＣＹＰ２Ｃ９を分離することと；カラムプレートの個々のミニカラムに各混合物を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された混合物中のトリチウム標識水の量を測定することと（検体非存在下でのトリチウム標識水の量に対する検体存在下でのトリチウム標識水の量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００２６】
上記の実施形態のさらなる態様において、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンは、１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含み、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００２７】
上記の実施形態及び態様の何れか１つのさらなる態様において、カラムプレートのミニカラムのそれぞれは、ポリマーを保持するための多孔性保持手段をさらに含む。好ましい実施形態において、マルチウェルプレート及びカラムプレートのウェルはそれぞれ、９６ウェル組織培養プレートの形式を有する。
【００２８】
上記の実施形態の何れか１つのさらなる実施形態において、２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ４−ブロモアニリンの混合物を提供すること；銅触媒の存在下に混合物をインキュベートして、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を生成させること；パラジウム触媒存在下にトリチウムとともに２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸をインキュベートして、４’位において標識されたジクロフェナックを生成させることにより、ジクロフェナックを４’位において標識する。
【００２９】
本発明は、さらに、ＣＹＰ２Ｃ９、ＮＡＤＰＨ再生系及び検体を含有する混合物を提供することと；様々な時間、混合物をインキュベートすることと；混合物を希釈し、次いで希釈混合物に４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナック及びＮＡＤＰＨを添加することと；ＣＹＰ２Ｃ９が４’位においてトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、希釈混合物をインキュベートすることと；混合物からＣＹＰ２Ｃ９を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に混合物を添加して、混合物からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された段階（ｄ）の混合物中のトリチウム量を測定することと（トリチウム量の減少は、検体が不可逆的にＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害することを示す。）、を含む、チトクロム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）の活性を不可逆的に阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３０】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３１】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００３２】
上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、ＣＹＰ２Ｃ９はミクロソームにおいて提供される。ミクロソームは、哺乳動物及び昆虫細胞からなる群から選択される細胞から生成され得、この細胞は、ＣＹＰ２Ｃ９を発現するベクター（例えば、ウイルス又はプラスミドベクター）を含むか、又はミクロソームは、腎臓、肝臓、脳、筋肉などの細胞由来であり得る。好ましくは、ミクロソームは、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）である。ＣＹＰ２Ｃ９源としてＨＬＭを使用する上記の実施形態及び態様の何れか１つの特定の実施形態において、酸性化及び／又は遠心分離により水性混合液からＨＬＭが除去される。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ２Ｃ９がトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナックを含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された培地中のトリチウム量を測定することと（これは、肝細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９の活性を決定する。）、を含む、肝細胞においてＣＹＰ２Ｃ９の活性を決定するための方法を提供する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；４’位においてトリチウムにより標識されたジクロフェナックを含有する第二の培地で検体を含有する培地を置き換え、ＣＹＰ２Ｃ９が４’位におけるトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、肝細胞をインキュベートすることと；肝細胞の培養物から第二のメディウムを除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に第二の培地を添加して、培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された第二の培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識ジクロフェナックを含み検体不含の状態でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の増加は、検体がＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導する検体を同定するための方法を提供する。好ましくは、検体を含有する培地中で約２４時間から７８時間、肝細胞をインキュベートする。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、肝細胞の培養物を提供することと；ＣＹＰ２Ｃ９がトリチウム標識ジクロフェナックをヒドロキシル化するのに十分な時間、４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナック及び検体を含有する培地中で肝細胞をインキュベートすることと；肝細胞の培養物から培地を除去することと；非極性化合物に選択的に結合する吸着剤に培地を添加して、培地からトリチウム標識ジクロフェナックを除去することと；及びトリチウム標識ジクロフェナックが除去された培地中のトリチウム量を測定することと（トリチウム標識ジクロフェナックを含み検体不含の状態でインキュベートした肝細胞の対照培養物に対するトリチウム量の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害することを示す。）、を含む、ＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する検体を同定するための方法を提供する。
【００３６】
上記の実施形態のさらなる態様において、肝細胞の培養物はマルチウェルプレートの１以上のウェルにおいて提供され、吸着剤は、カラムプレートを構成する、１以上の固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされて提供される。
【００３７】
上記の実施形態のさらなる態様において、吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される加湿性ポリマーを含む。上記の実施形態のさらなる態様において、脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン、エーテル又はＣ２−Ｃ１８アルキル基を含む。さらなる態様において、脂溶性モノマーはジビニルベンゼンである。上記の実施形態のさらなる態様において、親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基を含む。さらなる態様において、親水性モノマーはＮ−ビニルピロリドンである。上記の実施形態のさらなる態様において、加湿性ポリマーはポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン、好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含むポリマー、より好ましくは、ポリ（ビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドンが約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含むポリマーである。
【００３８】
上記の実施形態の別の態様において、吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。さらなる態様において、吸着剤は、フェニルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン及びオクタデシルシランからなる群から選択される１以上のシランを含む。さらなる態様において、シリカ基材は、シリカ粒子及びシリカゲルからなる群から選択される。
【００３９】
上記の実施形態のさらなる態様において、２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ４−ブロモアニリンの混合物を提供すること；銅触媒の存在下に混合物をインキュベートして、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を生成させること；及びパラジウム触媒存在下にトリチウムとともに２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸をインキュベートして、４’位における標識されたジクロフェナックを生成させることにより、ジクロフェナックを４’位で標識する。
【００４０】
本発明はさらに、２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ４−ブロモアニリンの混合物を提供することと；２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸を生成させるために銅触媒存在下に混合物をインキュベートすることと；及びパラジウム触媒存在下に２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸をトリチウムと共にインキュベートして、４’位において標識されたジクロフェナックを生成させることと；を含む、４’位でトリチウムにより標識されたジクロフェナックを生成させるための方法を提供する。好ましくは、［４−３Ｈ］−ジクロフェナックを生成させるためにトリチウムガスを使用する。
【００４１】
本発明はさらに、トリチウムにより４’位で標識されたジクロフェナック（［４−３Ｈ］−ジクロフェナック）及び２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸（４’−ブロモジクロフェナック）を提供する。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「検体」という用語は、分子、化合物、化学物質、組成物、薬物などを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明は、チトクロムＰ４５０アイソフォーム２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）活性を評価するための、及びＣＹＰ２Ｃ９活性の調節因子を同定するための、迅速かつ高感度のジクロフェナック４’−ヒドロキシル化アッセイを提供する。とりわけ、本発明は、ＣＹＰ２Ｃ９を含有する混合物中のＣＹＰ２Ｃ９の活性を評価するためのアッセイを提供する。本アッセイは、可逆的阻害アッセイ及び機能ベース又は時間依存的阻害アッセイの両方を含む。このような混合物の例として、ヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）などの様々な組織からのミクロソーム；組み換えＣＹＰ２Ｃ９を発現する発現ベクターを含有する哺乳動物又は昆虫細胞からのミクロソーム；又は肝細胞、上記混合物の何れかの中で検体がＣＹＰ２Ｃ９の活性を阻害する可能性及び肝細胞において検体がＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導する可能性が含まれる。好ましくは、ＣＹＰ２Ｃ９は、ヒトＣＹＰ２Ｃ９である。本アッセイは、検体存在下での、ＣＹＰ２Ｃ９が介在する、４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナックの４’−ヒドロキシル化において生じる［３Ｈ］−Ｈ２Ｏとしてのトリチウムの放出を検出することに基づき、本アッセイにおいて、時間経過による放出の増減は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の調節因子であることを示す。例えば、検体存在下でのＨＬＭ中のトリチウム放出の減少は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害剤であることを示し、一方、検体での肝細胞処理後の肝細胞におけるトリチウム放出の増加は、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の誘導剤であることを示す。ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する基材を含む吸着剤を用いて固相抽出プロセスにおいてトリチウム化ジクロフェナックからトリチウム化水生成物を分離する。インキュベーション、生成物分離及び放射活性カウントを含むアッセイの全段階がマルチウェル形式で行われ、これは自動化することができる。
【００４４】
ある態様において肝細胞を用いてＣＹＰ２Ｃ９の活性を誘導又は阻害する検体を同定するための実施形態により、ＣＹＰ２Ｃ９をコードする遺伝子の発現を阻害又は誘導する検体、即ち、ＣＹＰ２Ｃ９をコードする遺伝子の転写に影響を与える検体が同定される。別の態様における実施形態によって、ＣＹＰ２Ｃ９をコードするｍＲＮＡの転写後プロセシングに影響を与えることによりＣＹＰ２Ｃ９活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ２Ｃ９をコードするｍＲＮＡの翻訳に影響を与えることによりＣＹＰ２Ｃ９活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。さらなる態様における実施形態によって、ＣＹＰ２Ｃ９と直接又は間接的に相互作用することによりＣＹＰ２Ｃ９活性において阻害又は誘導効果を示す検体が同定される。
【００４５】
ＣＹＰ２Ｃ９の活性を評価するための実施形態は、例えば新しい化学物質を用いて代謝安定性試験を行うための肝細胞を使用する前など、市販のバッチの肝細胞の活性又は研究室内で単離された肝細胞の質を調整するために有用である。ＣＹＰ２Ｃ９調節因子を同定するための実施形態は、さらなる開発から強力な阻害剤又は誘導剤である候補薬物を排除するために、候補薬物のＣＹＰ２Ｃ９阻害又は誘導の可能性を評価するのに有用である。何れかの実施形態において、本発明は、検体のＣＹＰ２Ｃ９阻害又は誘導の可能性を評価するためにＨＰＬＣ分離及び質量分析に依存する先行技術アッセイにおける改良法である。
【００４６】
本アッセイは本明細書中でＨＬＭ又は肝細胞を用いて説明されるが、本アッセイは、精製組み換えＣＹＰ２Ｃ９又は、例えば腎臓、腸、肺などの他の組織から調製されたミクロソーム又はミクロソームを含有するその他の細胞内分画を使用し得る。ＣＹＰ２Ｃ９、好ましくはヒトＣＹＰ２Ｃ９を発現する、プラスミド又はウイルスベクターを含有する哺乳動物細胞からミクロソームを調製することができる。ミクロソームは、ＣＹＰ２Ｃ９及びｐ４５０レダクターゼを発現する組み換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞由来であり得る。組み換えＣＹＰ２Ｃ９を発現する細胞の長所は、ＣＹＰ２Ｃ９が、これらのミクロソームにおいて存在する唯一のチトクロムＰ４５０であり、通常は比活性がより高いことである。組み換えＣＹＰ２Ｃ９を用いたアッセイに対する濃度範囲は約１から１００ｐｍｏｌ／ｍＬであり、好ましい濃度は、約５から５０ｐｍｏｌ／ｍＬの間である。時間依存的アッセイの場合、酵素は５から１０倍高いものであるべきである（第二のインキュベーションにおける最終希釈のため。）。
【００４７】
ＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害について検体を試験するために、ＣＹＰ２Ｃ９活性における阻害効果について試験すべき検体、基質プローブとしての４’位においてトリチウム標識されたジクロフェナック、適切な基質濃度を与えるための非標識ジクロフェナック、プールされたＨＬＭ及び生理的ｐＨの緩衝液を含む水性混合液を含有する第一の容器を提供する。通常、トリチウム標識ジクロフェナックの約１０，０００から１，０００，０００ｄｐｍの間を使用し、好ましくは、標識ジクロフェナックは約１００，０００ｄｐｍである。非標識ジクロフェナックの量は、約１から１００μＭの間、通常は約１０μＭである。プールされたＨＬＭは、一般に約０．０５から１ｍｇ／ｍＬ、通常約０．１ｍｇ／ｍＬである。適切な緩衝液の例は、０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．６である。最終体積は、好ましくは約１００μＬの間である。好ましくは、検体に対して使用されるビヒクルの当量を含有する対照を提供する。
【００４８】
３７℃にて数分間緩衝液中でミクロソームの好ましいインキュベーション段階を行った後、約５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、約３ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び約１ユニット／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系あり又は無しで、約１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを水性混合液に添加して反応混合物を形成し、次いでこれをジクロフェナックの４’ヒドロキシル化が可能となるのに十分な時間、３７℃でインキュベートする。好ましい実施形態において、ＮＡＤＰＨは再生系とともに添加される。通常、約１０分間という時間は、ＣＹＰ２Ｃ９の活性を検出するのに一般に十分である。場合によっては、様々な時間の長さで複数のアッセイを行う。次に、約０．１Ｎの濃度のＨＣｌなどの酸を添加することにより、反応混合物を反応停止させる。好ましくは、トリチウム化ジクロフェナックからトリチウム化水を分離するための抽出カートリッジ又はカラムに反応混合物を移す前に、水性混合液からＨＬＭを除去する。ろ過、遠心分離などにより、水層からＨＬＭを除去することができる。好ましい実施形態において、遠心分離によりＨＬＭを除去する。反応の酸性化によりＨＬＭ中のタンパク質が沈殿するので、低速遠心分離を用いてＨＬＭのタンパク質を除去することができる。
【００４９】
ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに、ＨＬＭが除去された水性混合液又はＨＬＭを含有する反応混合物を移す。カラムからの、空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ２Ｃ９によりトリチウム化ジクロフェナックから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンタにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がないか、又は陽性対照においてトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害剤であることを示す。
【００５０】
肝細胞の調製物のＣＹＰ２Ｃ９活性を次のように調べる。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。培地中、又は肝細胞を培養するのに適切な水性混合液中で、５％ＣＯ２及び９５％空気又は酸素の加湿環境中で３７℃において肝細胞を維持する（例えば、Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｎｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９８９））を参照のこと。）。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、通常、約１ｘ１０５個の細胞／ｍＬから約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度、好ましくは約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度で肝細胞をインキュベートする。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、肝細胞培地（ＨＣＭ）１ｍＬ（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）、非標識ジクロフェナック及びトリチウム標識ジクロフェナックを含有する。通常、約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍの間のトリチウム標識ジクロフェナックを使用する。非標識トリチウムの量は、約１から５０μＭの間、通常は約１０μＭである。プレーティングされた細胞においてアッセイを行う場合、組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で肝細胞をプレーティングする。
【００５１】
インキュベーション後、例えば遠心分離によりインキュベーション液を細胞から除去し、ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ２Ｃ９によりトリチウム化ジクロフェナックから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンタにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。生成したトリチウム化水の量により、肝細胞の相対的ＣＹＰ２Ｃ９活性が決定される。
【００５２】
検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を阻害する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。懸濁液中又は細胞培養プレートに接着した培養細胞においての何れかの細胞を用いてアッセイを行うことができる。懸濁液アッセイの場合、上記のように肝細胞を培養するのに適切な培地中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて肝細胞を維持する。通常、肝細胞は、約１ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度でインキュベートする。懸濁液ではないアッセイの場合、組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくはコラーゲン被覆した組織培養プレート）、肝細胞を培養するのに適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境中で３７℃にて維持する。したがって、各培養ウェルは、約１ｘ１０６個の細胞、ＨＣＭ  １ｍＬ、ＣＹＰ２Ｃ９の活性における阻害効果について試験すべき検体、非標識ジクロフェナック及びトリチウム標識ジクロフェナックを含有する。通常、トリチウム標識ジクロフェナック約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍを使用し、好ましくは、約５００，０００ｄｐｍ／ｍＬである。非標識ジクロフェナックの量は、約１から５０μＭ、通常は約１０μＭである。好ましくは、検体に対するビヒクル又はスルファフェナゾールなどのＣＹＰ２Ｃ９阻害剤を含む対照を提供する。
【００５３】
インキュベーション後、細胞からインキュベーション液を除去し、ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で数回洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ２Ｃ９によりトリチウム化ジクロフェナックから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンタにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水がない、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が減少していることは、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害剤であることを示す。
【００５４】
検体がＣＹＰ２Ｃ９活性を誘導する能力を調べるためのアッセイは次の通りである。新しく肝臓組織から単離された肝細胞を含み得る、又は既に単離され、冷凍保存され、アッセイのために凍結融解された肝細胞の初代培養を提供する。組織培養プレートに肝細胞をプレーティングし（好ましくは、培養プレートはコラーゲン被覆した２４又は９６ウェル組織培養プレートである。）、新鮮な肝細胞の培養に適切な培地（例えばＨＣＭ）中で５％ＣＯ２の加湿環境において３７℃にて維持する。好ましくは、培地にＩＴＳを添加する。通常、肝細胞を約１５０，０００から２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングする。２４時間から７８時間後、培地を除去し、新鮮な培地及び、誘導の可能性についての試験を行う検体を肝細胞に添加する。好ましくは、検体に対するビヒクル又はリファムピシン又はフェノバルビトールなどの公知の誘導剤の何れかを含有する対照を提供する。上記のようにＣＹＰ２Ｃ９の誘導に十分な時間（通常は約２４時間から７８時間で十分である。）肝細胞をインキュベートした後、ＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を調べる。
【００５５】
生理的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）の緩衝液を含有する平衡塩類溶液を含有するインキュベーション液中で肝細胞をインキュベートする。平衡塩類溶液の例は、Ｈａｎｋ’平衡塩類溶液であり、適切な緩衝液の例は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳである。次に、非標識ジクロフェナック及びトリチウム標識ジクロフェナックを含有する混合液を添加し、ＣＹＰ２Ｃ９の活性を評価するのに適切な時間、上述のように肝細胞をインキュベートするが、一般に約１時間で十分である。通常、トリチウム標識ジクロフェナック約１００，０００から２，０００，０００ｄｐｍ／ｍＬを使用し、好ましくは、標識ジクロフェナックは約５００，０００ｄｐｍ／ｍＬである。非標識ジクロフェナックの量は約１から５０μＭの間であり、通常約１０μＭである。場合によっては、平行したインキュベーションを行うが、これは、検出された酵素活性が特異的にＣＹＰ２Ｃ９により媒介されることを確認するために、ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤スルファフェナゾールを含有する。
【００５６】
インキュベーション後、インキュベーション液を細胞から除去し、ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤を含有する、抽出カートリッジ又はカラムに移す。カラムからの空隙容積又はフロースルーを第二の容器で回収する。カラム中の吸着剤を水で洗浄し、洗浄液を第二の容器に移す。シンチレーション液を第二の容器に添加し、ＣＹＰ２Ｃ９によりトリチウム化ジクロフェナックから放出されたトリチウムを測定する。あるいは、空隙容積又はフロースルー及び洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンタにおいてトリチウムを測定するためにシンチレーション液と混合する。トリチウム化水が存在すること、又はビヒクルのみを含有する対照におけるトリチウム化水の量と比較してトリチウム化水が増加していることは、検体がＣＹＰ２Ｃ９活性の誘導剤であることを示す。
【００５７】
下記で考察し、本アッセイの好ましい態様において実施例１で示すように、マルチウェル形式で、好ましくは９６ウェル形式で本アッセイを行う。マルチウェル形式により複数の検体を同時に試験できるようになる。マルチウェル形式において、マルチウェルプレートのウェル（第一の容器）中で各反応を行う。反応終了時及びＨＬＭを除去する任意の段階後のトリチウム化ジクロフェナックからのトリチウム化水の分離は、複数の小型カラム（それぞれが本明細書中で開示する吸着剤を含有する。）を含む精密ろ過／抽出カラムプレートの個々のカラムに各反応液を添加することにより行う。好ましくは、精密ろ過／抽出カラムプレートのカラムはマルチウェルプレートに対する形式と同じ形式に配置する。精密ろ過／抽出カラムプレートと同じ形式である第二のマルチウェルプレートで空隙容積及び洗浄液を回収し、シンチレーション液と混合し、マルチウェル形式中の試料をカウントするために適合させたシンチレーションカウンタにおいてカウントする。
【００５８】
吸着剤はジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する、すなわち、吸着剤は標識ジクロフェナックに吸着又は結合することができるが、ヒドロキシル化により生成した標識水には吸着又は結合しない。ジクロフェナックなどの非極性化合物に選択的に結合する吸着剤としては、以下に限定されないが、ポリスチレン−ジビニルベンゼン又はポリ（ジビニル−ベンゼン−ビニルピロリドン）などの疎水性又は脂溶性ポリマーを含有する吸着剤、吸着剤が標識ジクロフェナックに結合するがトリチウム化水に結合しないことを可能にするような割合で脂溶性及び親水性モノマーを含有する加湿性ポリマー及びＣ２−Ｃ１８シランなどのシリコンベースの吸着剤が挙げられる。
【００５９】
加湿性ポリマーを含有する吸着剤は、ポリマーが加湿性となり及び有機溶質保持において有効となるように十分な割合で、少なくとも１個の親水性モノマー及び少なくとも１個の脂溶性モノマーをコポリマー化することにより形成される。脂溶性モノマーは、フェニル、フェニレン及びＣ２−Ｃ１８−アルキル基などの脂溶性部分を含み得る。特に有用な脂溶性モノマーとしては、ジビニルベンゼン及びスチレンが挙げられる。親水性モノマーは、飽和、不飽和又は芳香族複素環基（例えば、ピロリドニル基又はピリジル基）などの親水性部分を含み得る。あるいは、親水性基はエーテル基であり得る。特に有用なモノマーとしては、Ｎ−ビニルピロリドン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン及びエチレンオキシドが挙げられる。加湿性ポリマーのある実施形態において、ポリマーは、約１２モル％を超えるＮ−ビニルピロリドンを含む、好ましくは、約１５モル％から約３０モル％のＮ−ビニルピロリドンを含む、ポリ（ジビニルベンゼン−コ−Ｎ−ビニルピロリドン）コポリマーである。好ましい加湿性ポリマーの例は、ＷＯ９７３８７７４及び米国特許第６，７２６，８４２号（両方ともＢｏｕｖｉｅｒらに対するものである。）で開示されている。好ましい吸着剤の例はＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ吸着剤であり、これは、Ｎ−ビニルピロリドンとジビニルベンゼンモノマーとの調和の取れた割合を含み、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）から市販されている。
【００６０】
シリコンベースの基材又はマトリクスを含有する吸着剤は、シリカ基材に結合された非極性基を含む。吸着剤は、非極性化合物を抽出することについて当技術分野で周知の１以上のシランを含み得る。このような吸着剤としては、以下に限定されないが、フェニルシラン、ブチルジメチルシラン、ジメチルシラン、トリメチルシラン、エチルシラン、ブチルシラン、ヘキシルシラン、オクチルシラン又はオクタデシルシランが挙げられる。シランは、単官能性又は三官能性であり得る。シリカ基材又はマトリクスとしては、以下に限定されないが、固体もしくは多孔性シリカ又はセラミック粒子又は微粒子又はシリカゲルが挙げられる。
【００６１】
本方法の好ましい実施形態において、吸着剤は、固相抽出カートリッジ又はカラムを形成するように開口容器中に充てんされた、吸着剤の、粒子、ビーズなどとして提供される。本発明の特定の実施形態において、吸着剤は、多孔性膜に捕捉された、固相抽出カートリッジ又はカラムに充てんされる。他の実施形態において、固相抽出カートリッジ又はカラムはさらに、吸着剤に隣接した固相抽出カートリッジ又はカラムの片端もしくは両端で、又はその付近で、フィルター成分などの多孔性の保持手段又はガラス原料を含む。多孔性保持手段は、固相抽出カートリッジ又はカラム内に吸着剤を保持するためである。さらなる実施形態において、一対の多孔性保持手段の間に吸着剤を配置するが、第一の多孔性保持手段は固相抽出カートリッジ又はカラム内で吸着剤を保持し、第二の保持手段はまた、カラム中の吸着剤の保持を補助し、ＨＬＭなどの固体材料が吸着剤と混合されるのを防ぐ。フィルター又は硝子材料は、例えば、フリット硝子又は多孔性ポリマー、例えば高密度ポリエチレン、ＴＥＦＬＯＮ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＤＥ）又はポリカーボネートなどである。
【００６２】
図１は、本発明の方法の実施に適切な固相抽出カートリッジ又はカラム１０の例の横断面図を示す。カラム１０は、壁１４を有する伸長体１２（これは、軸方向の空洞部１６を規定する。）、水性混合液を受容するための、カラム１０の遠位端２０のインレット１８及び、水性混合液を排出するための、カラム１０の近位端２４のアウトレット２２から構成される。図１でさらに示されるように、近位端２４に多孔性保持手段２６が隣接し、これは面２８を有する。多孔性保持手段２６は、面２８がカラム１０の壁１４に垂直であるように、カラム１０において近位端２４に隣接して位置する。多孔性保持手段２６の面２８には吸着剤３０が配置される。場合によっては、示されるように、第二の多孔性保持手段３２が、遠位端２０に隣接して、もしくはその付近に位置し得、吸着剤３０はそれらの間に配置され得る。カラム１０は、水性混合液がインレット１８を介して容器に入り、カラム１０内で吸着剤３０に接触し、アウトレット２２を介してカラム１０から排出されることを可能にする。好ましくは、吸着剤３０は、好ましくは直径が約３０から６０μｍであるビーズなどの小粒子としてカラム１０中に充てんされる。
【００６３】
好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニングに特に適切な形式を与えるために、複数のカラム１０を配置する。例えば、固相抽出カートリッジ又はカラム（好ましくは、小型固相抽出カートリッジ又はカラム、つまり、ミニカラム）を与えるために、複数のウェルを含む、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートを適合させた。好ましいマルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート形式では、マルチウェル組織培養プレートに対して使用される形式に対応する形式でミニカラムが配置される。例えば、精密ろ過／抽出カラムプレートのミニカラムは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル又は３８４ウェル形式で配置することができる。好ましい実施形態において、マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレートでは、９６ウェル形式でミニカラムが配置される。例として、図２は、水性混合液を受容するための開口部１４と水性混合液を排出するためのアウトレット１０６とを有する複数のミニカラム１０２を含むマルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００を示し、ここで、ミニカラム１０２のそれぞれは、９６−ミニカラム形式で並べられた図２のカラム１０に対して示されるものと同様の内部配置を含む。遠心分離又は減圧により、このカラムを介して、９６ウェル形式で配置されたウェルを含有する回収プレートへの水性混合液の移動が達成され得る。マルチカラム精密ろ過／抽出カラムプレート及び、このプレートを使用するための方法ならびに装置は、多くの米国特許、例えば、米国特許第６，５０６，３４３号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）、同第６，４９１，８７３号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＷｏｅｌｋに対する。）及び同第６，３３８，８０２号（Ｂｏｄｎｅｒらに対する。）及び米国公開特許出願第２００３０１４３１２４号（Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＧｒｅｎｚに対する。）で開示されている。
【００６４】
ＣＹＰの可逆的阻害に加えて、ある種の検体又はそれらのＣＹＰにより生成された代謝産物による不可逆的又は見かけ上不可逆的な不活性化が起こり得る。このタイプの阻害、作用機序に基づく又は時間依存的阻害（ＭＢＩ）と呼ばれるもの、は、阻害剤存在下で酵素活性が進行性に時間依存的低下を示すことを特徴とする。ＣＹＰの３種類の作用機序に基づく（時間依存的）不活性化が報告されている：（ｉ）阻害剤が酵素アポタンパク質に共有結合する；（ｉｉ）阻害剤が合成ヘムに共有結合する；（ｉｉｉ）阻害剤がきつく（見かけ上不可逆的に）ヘム又はアポタンパク質に結合する。ＣＹＰ３Ａ４／５、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｅ１を含む殆どのヒト肝臓薬物代謝ＣＹＰは、作用機序に基づく阻害（ＭＢＩ）にさらされる（Ｚｈａｎｇ及びＷｏｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．６：２４１−２５７（２００５）；Ｖｅｎｋａｔａｋｒｉｓｈｎａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．４：４２３−４５９（２００３）；Ｚｈｏｕら、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．５：４１５−４４２（２００４）；Ｚｈｏｕら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４：２７９−３０４（２００５））。
【００６５】
インビボでの影響が必ずしも明らかではない可逆的ＣＹＰ阻害に対して、ＭＢＩは殆ど常に、臨床的に関心のある薬物−薬物相互作用を導く。実際に、ＭＢＩは、臨床的な薬物−薬物相互作用に対する主要な原因の１つと現在では考えられていおり、過去においては潜在的に見過ごされてきた。
【００６６】
ＭＢＩが活性酵素の時間依存的喪失を導くので、同じＣＹＰにより代謝される薬物の薬物動態における時間依存的ＣＹＰ阻害剤の臨床的影響は次の通りである。
・ＭＢＩは、連続投与において非定常のＰＫを引き起こす。
・薬物−薬物相互作用の程度は発現及び消失において時間依存的である。
・腸管腔で阻害剤が高濃度であると、基質において顕著な影響が生じ、腸代謝によりその経口でのバイオアベイラビリティーが制限される。
【００６７】
したがって、本発明はまた、上述の、可逆的又は見かけ上可逆的なアッセイに加えて、作用機序に基づくアッセイ又は時間依存的アッセイも提供する。化合物が時間依存的ＣＹＰ阻害剤として作用する可能性を評価するために、一連の様々な長さの時間（通常、０分から６０分間）、ＮＡＤＰＨ再生系存在下で、検体をＣＹＰ２Ｃ９とともにプレインキュベートする。一般に、可逆的阻害アッセイにおいて使用される量よりも約５から１０倍多い量でＣＹＰ２Ｃ９を提供する。温度不安定性による酵素活性の喪失を監視するために、阻害剤非存在下で対照インキュベーションを行う。プレインキュベーション終了時に、時間０のプレインキュベーション時間対照に対する、酵素的に活性なＣＹＰの量の変化を調べる。プレインキュベーションが約１０倍希釈され、基質が添加される第二のインキュベーションを行うことにより、これを遂行する。特定の時間間隔の間に形成される生成物の量を測定することにより、酵素活性を求める。時間依存的ＣＹＰ阻害アッセイに使用される通常の基質は、上記可逆的阻害アッセイに対して使用されるものと同じである。例えば、ジクロフェナックに対するＣＹＰ２Ｃ９についてのＫｍは約６μＭであり、ジクロフェナックの好ましい濃度は、約３０から１００μＭの間である。実施例６は、ＨＬＭを用いた時間依存的アッセイの例を提供する。
【００６８】
第二のインキュベーションにおいて試験検体により生じるあらゆる可逆的ＣＹＰ阻害効果を最小限に抑えるために、プレインキュベーション混合液を数倍希釈（通常、５−２０倍）し、半最大活性に必要とされる濃度より数倍（通常、５−１０倍）高い濃度でＣＹＰ基質を添加し（試験化合物による競合的阻害を最小限に抑えるために。）、インキュベーション時間を短くする（通常１０分間）。検体が時間依存的阻害剤として作用する場合、ＣＹＰとのプレインキュベーションは、擬一次反応速度式による酵素活性の喪失を引き起こす。各阻害剤濃度に対して、残存酵素活性の％（阻害剤なしの対照に対して。）は、次の式に従い時間とともに変化する。
【００６９】
【数１】
2008515426.tif 000003
（式中、ｋは、実測の擬一次不活性化速度定数であり、これは、次の関係に従いプレインキュベーション中の阻害剤濃度に関連する。
【００７０】
【数２】
2008515426.tif 000004
（式中、Ｉは阻害剤濃度であり、ｋｉｎａｃｔは最大不活性化速度定数であり、Ｋ０．５は、５０％ｋｉｎａｃｔでの阻害剤濃度であり、ｎはＨｉｌｌ係数である。））ｋｉｎａｃｔ及びＫ０．５を求めるために、非線形回帰分析を用い、Ｉに対するｋの曲線を数式２にフィットさせる。
【００７１】
実施例１に示されるように、本発明は、４’位でトリチウムにより標識されたジクロフェナック（［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック）及び［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを調製するための方法も提供する。本発明は、さらに、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを調製するための中間体である２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸（４’−ブロモジクロフェナック）を提供し、及び４’−ブロモジクロフェナックを調製するための方法もさらに提供する。
【００７２】
Ｕｌｌｍａｎ反応を用いたジクロフェナックの合成が記載されている（Ｍｏｓｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：２３５８−２３６４（１９９０）；Ｓａｔｏｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３５８０−３５９４（１９９３）；Ｏｚａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，３２１−３３２（２００２）及びそれらの参考文献）。トリチウムにより４’位において標識されたジクロフェナック（［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック）を調製するために、Ｕｌｌｍａｎ反応を改変して、２−［（２，６−ジクロロ，４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸（４’−ブロモジクロフェナック（Ｉ））を生成させ、次に、トリチウム及びパラジウム触媒存在下でこれを４’位において標識されたジクロフェナックに変換した。
【００７３】
一般に、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックの合成は、スキーム１で示されるプロセスによる。２−ヨードフェニル酢酸及び２，６−ジクロロ，４−ブロモアニリンの混合物を活性化銅触媒存在下でインキュベートし、４’−ブロモジフェナック（１）を生成させる。次に、パラジウム触媒存在下で、４’−ブロモジクロフェナック（１）をトリチウムとともにインキュベートし、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを生成させる。
【００７４】
【化３】
2008515426.tif 000005
【００７５】
４’−ブロモジクロフェナックを調製するための反応は、好ましくは、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）などの有機溶媒中で行われる。高温で、好ましくは約１３５℃の温度で、４’−ブロモジクロフェナックを調製するのに十分な時間（混合物の色が褐色−黒色に変化する時間（通常約２０時間））、混合物をインキュベートする。好ましくはクロマトグラフィー法により反応物及び溶媒から４’−ブロモジクロフェナックを分離する。
【００７６】
次に、他の反応物から分離した４’−ブロモジクロフェナックをトリチウムガス及びパラジウム触媒とともに、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒中でインキュベートする。好ましい実施形態において、パラジウム触媒は、炭素触媒担持パラジウム（Ｐｄ／Ｃ）であり、好ましくは、パラジウムの割合は約１０％である。好ましい実施形態において、Ｔ２ガスとしてトリチウムを与える。ジクロフェナックを４’位でトリチウムにより標識するのに十分な時間の後、通常１時間後、置換性のトリチウムを除去し、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを反応のその他の成分から、好ましくはクロマトグラフィー法により分離する。
【００７７】
次の実施例は、本発明のさらなる理解を促すものである。
【実施例１】
【００７８】
スキーム１で示すような４’位でトリチウムにより標識されたジクロフェナックの合成は次のとおりであった。
【００７９】
４’−ブロモジクロフェナック（１）の合成は次のとおりであった。２−ヨードフェニル酢酸（２１．３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を、Ｎ−メチルピロリドン（０．５ｍＬ）中の、２，６−ジクロロ，４−ブロモアニリン（７８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム無水物（３３．６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）及び活性化銅粉末触媒（２．２５ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の混合物に添加した。下降コンデンサーを介して水を蒸留して除去すると同時に、反応混合物を１３５℃にて２２時間、撹拌しながら加熱した。反応混合物の色が褐色−黒色に変化した。熱い反応混合物を熱水で処理し、ＣＥＬＩＴＥ（Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，ＮＪより入手可能）に通してろ過した。逆相ＨＰＬＣ（ＬＵＮＡ  フェニルヘキシル２５０ｘ１０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡより入手可能）、０．１％ＴＦＡ含有の水：アセトニトリル、５０：５０、流速４ｍＬ／分、ＵＶ＝２５４ｎｍ、Ｒｔ＝２３−２４分）を用いることにより、４’−ブロモジクロフェナック（１）を含有する粗製生成物を精製した。求める分画を回収し、Ｓｅｐ−Ｐａｋ−Ｃ−１８（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に通し、次いで１０ｍＬエタノールで溶出して、２−［（２，６−ジクロロ−４−ブロモフェニル）アミノ］フェニル酢酸（１）５ｍｇを得た。
【００８０】
４’−ブロモジクロフェナック（１）からの［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックの合成は次のとおりであった。ＤＭＦ（１ｍＬ）中で１時間、触媒１０％Ｐｄ／Ｃ（５ｍｇ）を用いて、４’−ブロモジクロフェナック（１）（５ｍｇ）をトリチウムガス（Ｔ２又は３Ｈ２）とともに撹拌した。反応混合物をろ過し、置換性トリチウムを全て除去するために、エタノール（２ｘ１０ｍＬ）とともに同時蒸発させた。準分取ＨＰＬＣカラム（（ＬＵＮＡ  フェニルヘキシル、２５０ｘ１０ｍｍカラム）、０．１％ＴＦＡ含有の水：アセトニトリル、５５：４５、流速４ｍＬ／分、ＵＶは２５４ｎｍ、Ｒｔ＝２０−２１分）を用いることにより、粗製生成物を精製し、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック（ＬＣ／ＭＳにより決定した場合、１０ｍＣｉ、ＳＡ＝２２．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣ／ＭＳ：２９６（Ｍ）＋，２９８（Ｍ＋２）＋。
【実施例２】
【００８１】
この実施例は、本発明のアッセイの開発及び、ＣＹＰ２Ｃ９活性の阻害剤を同定するためのその使用を説明する。
【００８２】
［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを用いた放射分析ＣＹＰ２Ｃ９アッセイ。１００μＬの最終体積中に、実施例１のように調製され、さらなる精製なしで使用される標識ジクロフェナックトレーサー（１０，０００から１，０００，０００ｄｐｍ、通常１００，０００ｄｐｍ）、非標識ジクロフェナック（１０μＭ、別段の指示がある場合を除く。）、プールしたヒト肝臓ミクロソーム（ＨＬＭ）（０．１から１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１２５ｍｇ／ｍＬ）及び０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．６を含有する９６ウェルコニカルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡより入手可能）中で反応を行った。プールされたＨＬＭは、Ｇｅｎｔｅｓｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から入手した。ＤＭＳＯ／アセトニトリル／水（３５：２５：４０、ｖ／ｖ）中の保存溶液から阻害剤を反応混合物に添加し、最終溶媒濃度を０．７％ＤＭＳＯ及び０．５％アセトニトリルとした。阻害剤なしの対照はビヒクル当量を含有した。３７℃にて１０分間のプレインキュベーション後、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ及び、５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有するＮＡＤＰＨ再生系を添加することにより、反応を開始させた。３７℃にて１０分間アッセイを行い、０．１Ｎの最終濃度になるようにＨＣｌを添加することにより反応停止させた。次に、マイクロプレートローターにおいてプレートを１０分間遠心分離し、前もって調整した１０ｍｇＯＡＳＩＳ９６ウェルＨＬＢプレートのウェルに上清を載せた。ＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ９６ウェル抽出プレート及び真空マニホールドはＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＤＥから入手可能である。真空にして、空隙容積を回収プレートで回収した。次に、水７５μＬを添加し、再び真空にして、同じプレートで洗浄液を回収した。プールした空隙容積及び水洗浄液をシンチレーションバイアルに移し、β−シンチレーションカウンタ中でカウントした。あるいは、ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて２４ウェル又は９６ウェルシンチレーションプレート中で一定分量に対してカウントした。酵素活性の計算のために、ＮＡＤＰＨ再生系なしで行った対照インキュベーションで得られたカウントを差し引くことにより、生成物カウントを補正した。
【００８３】
４’ヒドロキシジクロフェナックの定量。ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＰＡＬ自動サンプラー（ＨＴＳ  ＰＡＬ；ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＨＰＬＣにより、アッセイ反応混合物の一定分量及び代謝産物の一定分量の標準曲線を分析した。ＸＴＥＲＲＡ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（４．６ｍＭｘ５ｃｍ；５μｍ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）において、２ｍＬ／分の流速で、水中０．１％ギ酸（Ａ）及びアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｂ）（直線的勾配０から０．５分  １０％Ｂ；３．０分  ９０％Ｂ、３．５分  ９０％Ｂ；３．６分  １０％Ｂ；次の注入前に１０％Ｂで１．４分間、システムを平衡化した。）からなる移動相を用いてクロマトグラフィーを行った。最初の１分間、溶離液を捨て、次いで、陽イオンモードで操作されるＴｕｒｂｏ  Ｉｏｎｓｐｒａｙイオン化ソースを備えたＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ−３０００トリプレット四極子質量分析装置（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡより入手可能）に送った。４’ヒドロキシジクロフェナックを検出し、遷移ｍ／ｚ３０５．０から２６９．１を用いて同定した。Ａｎａｌｙｓｔ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｗｉｚａｒｄソフトウェアバージョン１．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、加重線形最小二乗回帰分析により、代謝産物濃度を調べた。
【００８４】
曲線のフィッティング。ＸＬＦＩＴ４．０（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、非線形回帰により、Ｈｉｌｌの式又は４パラメーターロジスティック阻害モデル（Ｒｏｄｂａｒｄ及びＦｒａｚｉｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７：３−２２（１９７５））への曲線のフィッティングを行った。
【００８５】
結果
９６ウェル固相抽出プレートを用いた［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック及び［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの分離。１０ｍｇＯＡＳＩＳ吸着剤を含有する９６ウェル抽出プレートに、標識ジクロフェナック（１０４から１０７ｄｐｍ）を含有するアッセイ緩衝液の溶液及び停止溶液を載せた場合、９９．８％を超える放射活性がプレートに保持された。標識ジクロフェナックは、メタノールで溶出することにより回収することができた。標識ジクロフェナックとは異なり、［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ（１０２から１０５ｄｐｍ）は同じ条件下で保持されなかった。１０ｍｇ及び３０ｍｇプレートの両方において、１００μＬ又は４００μＬの水による洗浄後の、合わせた空隙容積中で溶出される［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの回収は定量的であった（９４±６％、平均±ＳＤ、ｎ＝６）。
【００８６】
ＨＬＭにおける［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏの形成。ＮＡＤＰＨ再生系存在下で［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックをＨＬＭとともにインキュベートした場合、時間依存的な様式で［３Ｈ］−Ｈ２Ｏが形成された。１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで、ミクロソーム濃度とともに、生成物形成は直線的に増加した（図３参照）。トリチウム化水の形成はＮＡＤＰＨに依存したが、このことから、この反応にチトクロムＰ４５０が介在したことが示される。特異的ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤であるスルファフェナゾールは、［３Ｈ］−Ｈ２ＯのＮＡＰＨ−依存的形成を阻害し、このことから、本反応に主にＣＹＰ２Ｃ９が介在したことが示される（図４参照）。ノイズ比に対するシグナルは、ＮＡＤＰＨ非存在に対するＮＡＤＰＨ存在において得られる生成物カウント間の比として定義される。分画変換速度は、単位時間あたり及びミクロソームタンパク質１ｍｇあたりのトリチウム化水に変換された総放射性標識基質の％として表される。ノイズ比に対するシグナルは、ＨＬＭ０．１２５から０．２５ｍｇ／ｍＬを用いて１０分間アッセイを行った場合、３０から５０の間であった。分画変換速度は約５０から８０％／分／ｍｇであった。
【００８７】
ＣＹＰ阻害剤及び抗ＣＹＰ抗体の影響。ＣＹＰ２Ｃ９が生成物形成に介在することを確認するために、一連のアイソフォーム選択的化学阻害剤（Ｂｏｕｒｒｉｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２７：３２１−３２（１９９６）；Ｅａｇｌｉｎｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：１０７−１４（１９９８））もしくはモノクローナル抗体（Ｍｅｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：７４９−５９（１９９９）；Ｓｈｏｕら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９４：１９９−２０９（２０００））の存在下又は非存在下で反応を行った。使用した化学阻害剤はフラフィリン（ＣＹＰ１Ａ２阻害剤）であり、モノクローナル抗体は、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４／５の阻害剤である。図５で示されるように、これらの薬剤の中で、抗ＣＹＰ２Ｃ９及び抗ＣＹＰ２Ｃ１９モノクローナル抗体を除き、ＨＬＭ中からのトリチウム化水の形成に顕著な影響を与えたものはなかった。ＣＹＰ２Ｃ９に対して向けられた抗体は、８０％を超える反応を阻害した。この反応はまた、ＣＹＰ２Ｃ９と交差反応することが知られているＣＹＰ２Ｃ１９に対するモノクローナル抗体によっても阻害された。これらの結果から、本アッセイがＣＹＰ２Ｃ９活性の検出に特異的であったことが示された。
【００８８】
ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤による阻害のカイネティクス。ＨＬＭにおける、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２ＯのＮＡＤＰＨ−依存的形成に対するＣＹＰ２Ｃ９阻害剤スルファフェナゾールの影響を図６で示す。スルファフェナゾールは、従来のジクロフェナック４’−ヒドロキシル化アッセイにおけるそのＩＣ５０値（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又はＨＰＬＣ−ＵＶ）と同様に、０．２から０．３μＭのＩＣ５０値でこの反応を阻害した（表１参照。）。
【００８９】
放射分析アッセイにおいて得られたいくつかの既知のＣＹＰ２Ｃ９阻害剤のＩＣ５０値を従来のＨＰＬＣ−質量分析アッセイにより得られた値と比較するために、様々な濃度の既知の阻害剤の存在下又は非存在下で反応を行った。同じ反応混合物中で、トリチウム化水形成及び非標識反応生成物４’ＯＨ−ジクロフェナックの形成を調べた。トリプル四重極質量分析と組み合わせたＨＰＬＣにより、４’−ＯＨ−ジクロフェナックを定量した。［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２ＯのＮＡＤＰＨ−依存的形成におけるいくつかのＣＹＰ阻害剤（ミコナゾール、ニフェジピン、プロゲステロン、α−ナフトフラボン、ジクマロール及びケトコナゾール）の影響を図７Ａから図７Ｆで示す。１８種類の化合物に対するＩＣ５０値を表１にまとめる。放射性標識及び非放射性標識生成物の形成の阻害に対するＩＣ５０値は非常に近かった。全ケースにおいて、ＩＣ５０値の差は２倍未満であった。１８種類の試験化合物のうち、放射分析アッセイの結果に基づき、強い又は弱い阻害剤の何れかとして間違って分類されたものがないといことは、最も重要なことである。ＩＣ５０値が３０μＭ未満である２種類の化合物を除き、線形回帰分析を行った結果、勾配が１．０９及び相関係数ｒ２が０．９３８である直線が得られた（図８）。これらの結果から、本アッセイにより、ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤の強度（ＩＣ５０）の信頼できる測定を提供することが分かる。
【００９０】
ジクロフェナックに対する、蛍光性ＣＹＰ２Ｃ９プローブを用いて得られたＩＣ５０値の多数の化合物に関する詳細な比較から、これらのアッセイ間の相関が完璧ではないことが分かった（Ｃｏｈｅｎら、前掲書中）。例えば、ワーファリンは、ジクロフェナックを用いて調べた場合は（ＩＣ５０２２μＭ）ＣＹＰ２Ｃ９の阻害剤であったが、蛍光性基質ＭＦＣを用いて調べた場合は阻害剤ではなかった。予想されるように、ワーファリンは、本放射分析アッセイでのトリチウム化水形成を阻害し、そのＩＣ５０値は１５μＭであった。蛍光性アッセイと従来のアッセイとの間の相関が乏しいことから、Ｃｏｈｅｎ及び共同研究者らは、蛍光性プローブを用いたスクリーニングの後、従来の基質を用いた試験を行うべきであることを推奨した。このように、スピード、ハイスループット及び従来の基質の使用の長所を組み合わせた本発明のアッセイは、この問題を回避する。
【００９１】
【表１】
2008515426.tif 000006
【実施例３】
【００９２】
動的トリチウム同位体効果の決定。次の式（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８７：６０７−６２５（１９８２））に従い、Ｖ／Ｋ比に対する、ＴＶ／Ｋ、動的同位体効果を調べた：
【００９３】
【数３】
2008515426.tif 000007
（式中、ｆは生成物に対する基質の分画変換であり、ＳＡ０は標識基質の最初の比放射能であり、ＳＡＰは生成物の比放射能である。）。本実験において観察されるもののようなｆ（＜５％）の低値において、この式は、次の式に変形される（Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、前出）：
【００９４】
【数４】
2008515426.tif 000008
【００９５】
トレーサー競合実験からの非標識生成物の見かけの形成速度の計算。［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックの固定量及び非標識ジクロフェナックの様々な濃度を用いてアッセイを行う場合、非標識生成物の形成速度ｖは、次式により与えられる：
【００９６】
【数５】
2008515426.tif 000009
（式中、ｖ＊はトリチウム化水の形成速度である。）。式２から差し引くことにより、
【００９７】
【数６】
2008515426.tif 000010
を得て、動的同位体効果で割った非標識生成物の形成速度としてｖ’を定義し、つまり、
【００９８】
【数７】
2008515426.tif 000011
であり、次式：
【００９９】
【数８】
2008515426.tif 000012
を得る。
【０１００】
既知のＴＶ／Ｋ比（これは、ＳＡｐ由来であったため、同語を繰り返すことになる。）を用いずに、ｖ’、非標識生成物の見かけの形成速度を計算できる。基質濃度Ｓに対してプロットし、Ｈｉｌｌの式へフィットさせた場合（式７）、Ｖ’ｍａｘ、Ｓ５０、５０％での基質濃度及びｎ、Ｈｉｌｌ係数を導き出すことができる。
【０１０１】
【数９】
2008515426.tif 000013
式中、
【０１０２】
【数１０】
2008515426.tif 000014
つまり、生成物形成の見かけの最大速度である。
【０１０３】
結果
放射性標識ジクロフェナックと非標識ジクロフェナックとの間の競合。ＨＬＭにおけるトリチウム化水の形成に対する非標識ジクロフェナックの影響を図９で示す。曲線から、「低用量フック」、すなわち、生成物形成速度が非標識基質の濃度上昇とともに上昇し、〜３μＭのジクロフェナック濃度でピークに到達し、次に低下することが示される。この影響は、正の方向に協同するリガンド置換相互作用にとって特徴的である（Ｄｅ  Ｌｅａｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、Ｒｅｃｅｐｔ：Ｃｏｍｐｒ．Ｔｒｅａｔｉｓｅ  １：１４３−１９２（１９７９））。トリチウム化生成物の形成が増加する理由は、低基質濃度で、正の方向に協同する酵素の反応速度が、基質濃度が上昇するにつれて用量に比例した上昇よりも大きく上昇するからである。ＣＹＰ２Ｃ９介在性のジクロフェナック４’−ヒドロキシル化が協同的カイネティクスを示すことは以前には報告されていなかったことに留意されたい。これはおそらく、協同性が、本放射分析アッセイの感受性の高い性質により明らかにされ、非常に低い基質濃度でのみ見られ、一方で従来のアッセイは通常、より高い基質濃度で行われることによるものと思われる。しかし、正方向の協同作用及びヘテロ活性化が、ダプソンなどの他のＣＹＰ２Ｃ９基質に対して報告されいている（Ｋｏｒｚｅｋｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：４１３７（１９９８）；Ｈｕｔｚｌｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４１０：１６（２００３）；Ｈｕｍｍｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：７２０７（２００４）；Ｅｇｎｅｌｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０７：８７８（２００３））。
【０１０４】
［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックを同位体トレーサーとして使用するので、トリチウム化水の形成速度（ｖ＊）は、非標識生成物、つまりジクロフェナックの４’−ヒドロキシル化由来の水の形成速度を代表している（これは、４’−ヒドロキシジクロフェナックとともに化学量論的に形成される。）。基質濃度（Ｓ）に対するｖ＊の依存性を使用して、非標識生成物の基質濃度への依存性ついての情報を得ることができる（後者が直接測定されないとしても。）。発明者らは、ｖ＊、非標識生成物の見かけの形成速度を、動的同位体効果により割った非標識生成物の形成速度（ｖ）として定義する（上記の実験セクションを参照のこと。）。図１０で示すように、Ｓに対するｖ’の曲線をＨｉｌｌの式にフィットさせることができ、Ｓ５０＝６．８±１．０μＭ、ｎ＝１．１５±０．０５及びＶ’ｍａｘ＝１．５±０．１ｎｍｏｌ／分／ｍｇ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝２）であった。Ｈｉｌｌ係数は１よりもわずかに大きく、このことから、弱い正の協同作用が示唆される。実際、低基質濃度において、図１０の差込図において示されるように、ｖ’とＳとの間でシグモイド型の関係が見られた。
【０１０５】
４’−ヒドロキシジクロフェナック形成のカイネティクスを図１１で示す。この反応は、Ｓ５０が６．２±０．９μＭ、Ｖｍａｘが１．３±０．３ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質であり、Ｈｉｌｌ係数が１．１±０．１であった（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。Ｖ’ｍａｘとＶｍａｘとの間の比が０．９であり、これは、顕著な動的同位体効果がないことを示すことに留意されたい。
【実施例４】
【０１０６】
この実施例は、インタクトな肝細胞において酵素活性及びＣＹＰ２Ｃ９阻害剤の影響を調べ、定量するための本発明の使用を説明する。
【０１０７】
確立されたプロトコールに従い、新鮮なヒト肝臓から肝細胞を単離し、液体窒素中で凍結保存した（例えば、Ｈｅｎｇｓｔｌｅｒら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．３２：８１−１１８（２０００）；Ｆｅｒｒｉｎｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：３４１−５２（１９９８）を参照。）。細胞を凍結融解し、１５０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度でコラーゲン被覆２４ウェル又は９６ウェル培養プレートにプレーティングし、ＩＴＳ＋（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加した肝細胞培養液（ＨＣＭ）（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５：Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｏｌｌａｒｄ及びＷａｌｋｅｒ編）ｐｐ．１６１−１７６、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．（１９８９））中で５％ＣＯ２の加湿環境下で３７℃にて１時間維持した。ＣＹＰ２Ｃ９阻害剤スルファフェナゾール（１０μＭ）の非存在下又は存在下で、１０μＭ非標識ジクロフェナック、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック  ５００，０００ｄｐｍ／ｍＬとともに細胞をインキュベートした。様々な時間後、前もって調整した３０ｍｇ  ＯＡＳＩＳプレートの個々のウェルにインキュベーション液の一定分量を載せ、水２００μＬで２回洗浄した。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンタにおいてカウントした。
【０１０８】
図１２で示されるように、ヒト肝細胞中で［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックから時間依存的にトリチウム化水が形成され、この反応は殆ど完全にＣＹＰ２Ｃ９阻害剤スルファフェナゾールにより阻害された。これらの結果から、本アッセイを使用して、ＣＹＰ２Ｃ９の活性及びインタクトな肝細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９阻害剤の効果を調べることができることが示される。
【実施例５】
【０１０９】
この実施例は、ＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導する検体を同定するための本発明の使用を説明する。
【０１１０】
２名の異なるドナーからの凍結保存ヒト肝細胞を得る。細胞（およそ３２０，０００個）を２４ウェルコラーゲン被覆培養プレートにプレーティングし、ＩＴＳ＋（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を添加した肝細胞培養液（ＨＣＭ）（Ｄｉｃｈ及びＧｒｕｎｎｅｔ、前出）中で５％ＣＯ２、９５％酸素の加湿環境下で３７℃にて維持した。２４時間後、細胞の各ウェルに対する培養液を除去し、ＩＴＳを含有する新鮮なＨＣＭを添加し、ビヒクル（対照）、リフラムピシン、デキサメタゾンもしくはフェノバルビタール（陽性対照）などのＣＹＰ２Ｃ９発現の誘導剤又はＣＹＰ２Ｃ９活性誘導能について試験する検体の何れかで４８時間、細胞を処理した。次いでＣＹＰ２Ｃ９酵素活性を次のように求めた。
【０１１１】
各ウェルに対して、培地を除去し、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、６０μＭ非標識ジクロフェナック及び［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック２００，０００ｄｐｍを含有するＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）０．５ｍＬ中で３７℃にて１時間細胞をインキュベートする。それぞれに対して、酵素活性がＣＹＰ２Ｃ９により特異的に介在したことを確認するために、スルファフェナゾールなどの阻害剤存在下にて平行インキュベーションを行う。前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートの個々のウェルにインキュベーション液を添加する（これは、水２００μＬで２回洗浄した。）。各ウェルに対して、フロースルーを水洗浄液と合わせ、シンチレーション液添加後にβ−カウンタにおいてカウントする。ＣＹＰ２Ｃ９発現の誘導剤を含有しない対照と比較したトリチウム化水の存在から、検体がＣＹＰ２Ｃ９発現の誘導剤であることが示される。
【０１１２】
検体がＣＹＰ２Ｃ９発現を誘導することを確認するために、メタノール１ｍＬを用いて４’−ヒドロキシジクロフェナックをＯＡＳＩＳプレートから溶出し、Ｎ２下で乾燥させ、ギ酸０．１％を含有する５０％アセトニトリル／水（５０：５０）２００μＬ中で再構成する。４’−ヒドロキシジクロフェナックの定量のために、一定分量をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ系に注入する。定量は、ピーク領域と、未知の試料のように正確に処理し抽出した標準曲線のそれとの比較に基づく。
【実施例６】
【０１１３】
この実施例は、ＨＬＭを用いて時間依存的ＣＹＰ２Ｃ９アッセイを行う方法の例を示す。
【０１１４】
次のようにプレインキュベーション段階を行う。約３０μＬ  ＨＬＭ（タンパク質３．３ｍｇ／ｍＬ、好ましい最終濃度２ｍｇ／ｍＬ；０．１から５ｍｇ／ｍＬの範囲。）、試験検体１μＬ（３５％ＤＭＳＯ、６５％メタノール中に溶解）、アッセイ緩衝液９μＬ（０．１Ｍ  リン酸カリウム、ｐＨ７．６）を含有するプレインキュベーション混合液。ＮＡＤＰＨ再生系１０μＬ（アッセイ緩衝液中、５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、２５ｍＭグルコース−６−ホスフェート、１７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５Ｕ／ｍＬグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を添加することによりプレインキュベーションを開始する。逆順で様々な時間でプレインキュベーションを開始する（最長のプレインキュベーションを最初に開始し、最短のプレインキュベーションを最後に開始した。）。振盪水浴中で３７℃にて０から３０分間、混合液をプレインキュベートする。
【０１１５】
残存活性の測定は次のとおりである。［４’−３Ｈ］−ジクロフェナック）（約８００，０００ｄｐｍ）、３０から１００μＭ非標識ジクロフェナック及び１ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含有するアッセイ緩衝液４５０μＬでプレインキュベーション混合液を約１０倍希釈することにより第二のインキュベーションを開始する。振盪水浴中で３７℃にて１０分間インキュベーションを行う。１Ｎ  ＨＣｌ約５０μＬを添加することにより、反応を停止させる。室温にて２８００ｒｐｍで１５分間、プレートを遠心分離する。前もって調整した３０ｍｇＯＡＳＩＳプレートに上清約３００μＬを入れる。フロースルーを回収し、１２０μＬの一定分量を９６ウェルシンチレーションカウンティングプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）に移す。ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ４０シンチレーション液１８０μＬを添加し、プレートを密封し、振盪して、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴＯＰＣＯＵＮＴシンチレーションカウンタでカウントする。
【０１１６】
例としての実施形態を参照して本明細書中で本発明を説明してきたが、本発明がこれに限定されないことを理解されたい。当業者及び本明細書中での教示を入手した者は、この範囲内のさらなる修飾及び実施形態を認識する。したがって、本発明は、本明細書に添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】抽出カートリッジ又はカラム１０の横断面を示す。
【図２】マルチカラム精密ろ過／抽出プレート１００の透視図を示す。
【図３】ＨＬＭでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水のＮＡＤＰＨ依存性様式における、インキュベーション時間及びミクロソームタンパク質濃度の影響を示す。このアッセイでは、ウェルあたり１０μＭジクロフェナック及び標識ジクロフェナック６５０，０００ｄｐｍを使用した。ＨＬＭ濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬであった。
【図４】ＨＬＭでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水の形成における、ＮＡＤＰＨ及びスルファフェナゾールの影響を示す。このアッセイでは、ウェルあたり１０μＭジクロフェナック及び標識ジクロフェナック６５０，０００ｄｐｍを使用した。ＨＬＭ濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。
【図５】ＨＬＭでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水のＮＡＤＰＨ依存性の形成における、様々なＣＹＰ阻害剤の影響を示す。
【図６】ＨＬＭでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水形成のスルファフェナゾールによる濃度依存性阻害を示す。このアッセイでは、ウェルあたり１０μＭジクロフェナック及び標識ジクロフェナック１３４，０００ｄｐｍを使用した。ＨＬＭ濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。
【図７Ａ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるミコナゾールの影響を示す。
【図７Ｂ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるニフェジピンの影響を示す。
【図７Ｃ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるプロゲステロンの影響を示す。
【図７Ｄ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるα−ナフトフラボンの影響を示す。
【図７Ｅ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるジクマロールの影響を示す。
【図７Ｆ】ヒト肝臓ミクロソームでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからの［３Ｈ］−Ｈ２Ｏ形成におけるケトコナゾールの影響を示す。
【図８】線形回帰分析による、放射分析とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の１６種類の薬物に対するＩＣ５０値の比較を示す。データは表１からのものであった。
【図９】ＨＬＭでの、［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水形成における、非標識ジクロフェナックの濃度上昇の影響を示す。
【図１０】総基質濃度に対するｖ’の依存性を示す。用語ｖ’は実施例３で述べたとおり定義され、これは、図８で示される生成物カウントから計算した。非線形回帰分析により、データをＨｉｌｌの式にフィットさせた。
【図１１】総基質濃度に対する４’−ヒドロキシジクロフェナックの形成速度の依存性を示す。非線形回帰分析により、データをＨｉｌｌの式にフィットさせた。
【図１２】１０μＭスルファフェナゾール存在下又は非存在下での、ヒト肝細胞における［４’−３Ｈ］−ジクロフェナックからのトリチウム化水の形成を示す。
【図１】
2008515426.tif 000017
【図２】
2008515426.tif 000018
【図３】
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【図４】
2008515426.tif 000020
【図５】
2008515426.tif 000021
【図６】
2008515426.tif 000022
【図７Ａ】
2008515426.tif 000023
【図７Ｂ】
2008515426.tif 000024
【図７Ｃ】
2008515426.tif 000025
【図７Ｄ】
2008515426.tif 000026
【図７Ｅ】
2008515426.tif 000027
【図７Ｆ】
2008515426.tif 000028
【図８】
2008515426.tif 000029
【図９】
2008515426.tif 000030
【図１０】
2008515426.tif 000031
【図１１】
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【図１２】
2008515426.tif 000033
【国際調査報告】
2008515426.tif 000034