(57)【要約】本発明は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための組成物および方法、ならびにより詳細には化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによるアポリポタンパク質Ｂの下方制御に関する。
2008514632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のセンス鎖配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなるｉＲＮＡ剤。
【請求項２】
薬剤番号１〜１９、２４〜２６、２９、３０および３２〜４２のｉＲＮＡ剤のセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜１９、２４〜２６、２９、３０および３２〜４２のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなるｉＲＮＡ剤であって、該ｉＲＮＡ剤が、同剤とのインキュベーション後に培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して６０％超減少させるか、あるいは細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を６０％超減少させるかのうち少なくともいずれかを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【請求項３】
薬剤番号１〜１２、１５、１７、２４、２９、３０および３２〜３５のｉＲＮＡ剤のセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜１２、１５、１７、２４、２９、３０および３２〜３５のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなるｉＲＮＡ剤であって、該ｉＲＮＡ剤が、同剤とのインキュベーション後に培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して７０％超減少させるか、あるいは細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を７０％超減少させるかのうち少なくともいずれかを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【請求項４】
薬剤番号１〜５、７、および１１のｉＲＮＡ剤のセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜５、７、および１１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなるｉＲＮＡ剤であって、該ｉＲＮＡ剤が、同剤とのインキュベーション後に培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して８０％超減少させるか、あるいは細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を８０％超減少させるかのうち少なくともいずれかを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【請求項５】
センス鎖およびアンチセンス鎖からなるｉＲＮＡ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々が、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤の配列のうちの１つとほぼ同一の少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列からなり、鎖当たりそれぞれ１、２または３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されている（例えばアデノシンがウラシルによって置換されている）が、培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力、ならびにＣ５７Ｂｌ／６マウスに体重１ｋｇあたり５０ｍｇまたは１００ｍｇの該ｉＲＮＡ剤を投与した後に該動物の肝臓細胞中に存在するａｐｏ−ＢのｍＲＮＡの量をｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも２０％減少させる能力を、ほぼ保持していることを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【請求項６】
薬剤番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４のｉＲＮＡ剤の群から選択されるｉＲＮＡ剤。
【請求項７】
前記ｉＲＮＡ剤が、該ｉＲＮＡ剤とのインキュベーション後に培養ヒトＨｅｐＧ２細胞
中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、同剤とともにインキュベーションしなかった細胞と比較して５０％超減少させるか、あるいは培養ヒトＨｅｐＧ２細胞によって細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を５０％超減少させるか、あるいは体重１ｋｇあたり５０ｍｇまたは１００ｍｇの投与後にＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓細胞中に存在するａｐｏ−ＢのｍＲＮＡの量を、ｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも２０％減少させるかのうち少なくともいずれかの特徴を有する、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項８】
前記アンチセンスＲＮＡ鎖の長さが３０ヌクレオチド以下であり、前記ｉＲＮＡ剤の２重鎖領域の長さが１５〜３０ヌクレオチド対である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項９】
前記ｉＲＮＡ剤が肝臓を起源とするマウス培養細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量をさらに減少させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１０】
前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を付与する修飾を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１１】
ホスホロチオエートまたは２’−修飾ヌクレオチドを含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１２】
ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；または５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドを含んでなる、請求項１１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１３】
存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであるか、あるいは
センス鎖中の全ピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつ存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’および５’−ＣＡ−３’の５’側のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであるか、あるいは
センス鎖中の全ピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつアンチセンス鎖中の存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドである、請求項１２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１４】
前記２’−修飾が、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１５】
１〜４個の対合していないヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部分を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド突出部分が２または３の対合していないヌクレオチドを有する、請求項１５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド突出部分がｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’端に存在する、請求項１５または１６に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１８】
コレステロール部分を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１９】
前記コレステロール部分がｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’端に結合している、請求項１８に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２０】
前記ｉＲＮＡ剤が肝臓の細胞により取り込まれるように標的化されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２１】
前記ｉＲＮＡ剤が消化管の細胞により取り込まれるように標的化されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項２２】
脂質障害を有するかあるいは発症する危険があるヒト対象を治療する方法であって、ｉＲＮＡ剤を投与することからなり、該ｉＲＮＡ剤が、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のセンス鎖配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記脂質障害が高コレステロール血症、高脂血症、冠状動脈疾患、冠状動脈心疾患、血栓症、またはアテローム性動脈硬化症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｉＲＮＡ剤を、前記対象の細胞または組織中のＡｐｏＢの発現を低下させるのに充分な量投与する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ剤、および
ｂ．医薬として許容可能な担体
からなる医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ剤と、医薬として許容可能な担体を配合することからなる、医薬組成物を調製する方法。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ剤と、細胞を接触させることからなる、細胞中のＡｐｏＢ  ＲＮＡの量を減少させる方法。
【請求項２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前記ｉＲＮＡ剤と前記細胞を接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象においてｉｎ  ｖｉｖｏで前記ｉＲＮＡ剤と前記細胞を接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、高コレステロール血症、高脂血症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、冠状動脈心疾患、血栓症、またはアテローム性動脈硬化症であると診断されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜２１に記載のｉＲＮＡ剤を製造する方法であって、前記ｉＲＮＡ剤を合成することからなり、センス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸分解に対してｉＲＮＡ剤を安定化する修飾を少なくとも１個含んでなることを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記対象が、脂質障害を有すると診断されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、高コレステロール血症、高脂血症、冠状動脈疾患、冠状動脈心疾患、血栓症、またはアテローム性動脈硬化症を有すると診断されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象がヒトである、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害すると考えられるｉＲＮＡ剤を評価する方法であって、
ａ．ｉＲＮＡ剤を提供する工程であって、第１鎖がＡｐｏＢのｍＲＮＡのヌクレオチド配列と充分相補的であり、第２鎖が第１鎖とハイブリダイズするのに充分な第１鎖との相補性を有することを特徴とする工程と、
ｂ．ＡｐｏＢ遺伝子を含む細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる工程と、
ｃ．細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる前の、または接触させていない対照細胞のＡｐｏＢ遺伝子の発現と、細胞とｉＲＮＡ剤を接触させた後のＡｐｏＢ遺伝子の発現とを比較する工程と、
ｄ．ｉＲＮＡ剤がＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害するのに有用であるかどうかを判定する工程であって、細胞中に存在するＡｐｏＢのＲＮＡまたは該細胞によって分泌されるタンパク質の量が、細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる前の量より少ない場合、該ｉＲＮＡは有用であることを特徴とする工程と
からなる方法。
【請求項３６】
工程ｂ〜ｄを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびヒト以外の実験動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏの両方で実施する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
末梢血単核細胞によるインターフェロン−α産生の活性化の際の前記ｉＲＮＡ剤の活性を測定することをさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための組成物および方法に関し、より詳細には、例えば化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによるアポリポタンパク質Ｂの下方制御に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がワームに導入されると遺伝子発現を阻害し得るという観察結果について述べるために、ファイヤー（Ｆｉｒｅ）および共同研究者によって最初に造られた用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物において遺伝子特異的な転写後発現抑制を誘導し、遺伝子機能を研究するための新たなツールをもたらした。
【０００３】
リポタンパク質は、タンパク質、リン脂質およびコレステロールの両親媒性コーティングによって囲まれた、アシルグリセロールおよびコレステリルエステルで構成されている。リポタンパク質のタンパク質成分はアポリポタンパク質として知られ、ヒトでは少なくとも９種のアポリポタンパク質が存在する。アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）は、さまざまなクラスのリポタンパク質、すなわちキロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に見出される。ＡｐｏＢは、ＡｐｏＢ／Ｅ受容体による細胞の結合およびＬＤＬ粒子の取り込みの認識シグナルとして働く。アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の蓄積または過多は、アテローム性動脈硬化症などの脂質関連障害をもたらす可能性がある。
【０００４】
ＡｐｏＢを減少させる療法の開発は、脂質関連障害を治療するのに有用である可能性がある。アンチセンス療法の形の１つのオリゴヌクレオチド系療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでマウスのＡｐｏＢレベルを低下させることが示されており、これらの治療は続いて血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルを低下させた（特許文献１）。これらの結果はＡｐｏＢの適度な下方制御、および脂質関連障害を治療する際の標的としてのＡｐｏＢの使用を実証した。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血清ＡｐｏＢレベルを低下させることが示されたｉＲＮＡ剤を提供することによって技術を進展させる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０２１５９４３号明細書
【非特許文献１】ファイヤーら（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、アポリポタンパク質Ｂの発現を調節するための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物中のアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）レベルを低下させるための組成物および方法を提供する。本発明の方法は、ＡｐｏＢ遺伝子を発現抑制（サイレンシング）するｉＲＮＡ剤を対象に投与することを含む。ｉＲＮＡ剤は本明細書に記載するｉＲＮＡ剤であってもよいし、あるいは活性を有する配列の１つに基づき、ＡｐｏＢ遺伝子、例えばヒトまたはマウス由来のＡｐｏＢ遺伝子などの哺乳動物ＡｐｏＢ遺伝子の同一領域を標的とするｄｓＲＮＡであってもよい。ｉＲＮＡ剤は鎖当たり３０個未満のヌクレオチド、例えば２１〜２３個のヌクレオチドを含む可能性があり、薬剤番号１〜７４として本明細書中に提示される薬剤の１つで構成されるか、同剤を含ん
でなるか、あるいは同剤に由来するものでよい。これらの好ましいｉＲＮＡ剤は、対象中の全ての非ＡｐｏＢ遺伝子配列に対し４ヌクレオチド以上のミスマッチを含む。
【０００７】
本発明は詳細には、薬剤番号１〜７４で本明細書中に提示されるｉＲＮＡ剤、例えばセンス鎖配列が５’−ｃｕｕｕａｃａａｇｃｃｕｕｇｇｕｕｃａｇｕ−３’（配列番号１５３）、アンチセンス鎖配列が５’−ａｃｕｇａａｃｃａａｇｇｃｕｕｇｕａａａｇｕｇ−３’（配列番号１５４）の薬剤番号１に対して、薬剤番号１のセンス鎖配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供する。
【０００８】
本明細書中に提示される幾つかのｉＲＮＡ剤は特定の好ましい修飾ヌクレオチドのパターン、例えば薬剤番号５４〜７４を含むが、薬剤番号１〜５３のｉＲＮＡ剤はブループリント（設計図）として与えられていることは理解されよう。該ｉＲＮＡ剤は、薬剤番号１〜５３のｉＲＮＡ剤と同等であることが当業者には明らかな、例えば以降にさらに述べるような修飾を含むことが意味されている。該修飾は例えば、２’−Ｏ−メチル修飾、当業者には該ｉＲＮＡ剤の性質、特にその相補的相当物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２本鎖の能力が変化するとは予測されないであろう一般的な塩基置換などである。
【０００９】
【表１】
2008514632.tif 000003
【００１０】
2008514632.tif 000004
【００１１】
本明細書の以下の実施例３に示すように、表１のｉＲＮＡ剤、薬剤番号１〜５３は、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションしなかった細胞と比較して５０％未満に減少させる、かつ／または培養ヒトＨｅｐＧ２細胞によって細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を５０％未満に減少させるという、有利かつ驚くべき能力を有する（表８参照）。
【００１２】
本発明はさらに、薬剤番号１〜１９、２４〜２６、２９、３０および３２〜４２のｉＲＮＡ剤のセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜１９、２４〜２６、２９、３０および３２〜４２のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供する。本明細書の以下の実施例３に示すように、薬剤番号１〜１９、２４〜２６、２９、３０および３２〜４２のｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションしなかった細胞と比較して６０％超減少させるか、または細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を６０％超減少させるかのうち少なくともいずれかの、有利かつ驚くべき能力を有する（表８参照）。
【００１３】
本発明はさらに、表１に提示される薬剤番号１〜１２、１５、１７、２４、２９、３０および３２〜３５の薬剤のセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、表１に提示される薬剤番号１〜１２、１５、１７、２４、２９、３０および３２〜３５の薬剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供する。本明細書の以下の実施例３に示すように、これらのｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションしなかった細胞と比較して７０％超減少させるか、または細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を７０％超減少させるかのうち少なくともいずれかの、有利か
つ驚くべき能力を有する（表８参照）。
【００１４】
本発明はさらに、薬剤番号１〜５、７、および１１のｉＲＮＡ剤のセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜５、７、および１１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含むｉＲＮＡ剤を提供する。本明細書の以下の実施例３に示すように、これらのｉＲＮＡ剤は、同剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションしなかった細胞と比較して８０％超減少させるか、または細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を８０％超減少させるかのうち少なくともいずれかの、有利かつ驚くべき能力を有する（表８参照）。
【００１５】
特に好ましい態様では、ｉＲＮＡ剤は、薬剤番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、または７４のｉＲＮＡ剤群から選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を、同剤と共にインキュベーションしなかった細胞と比較して５０％超減少させる、かつ／または培養ヒトＨｅｐＧ２細胞によって細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を５０％超減少させる、かつ／またはＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓細胞中に存在するａｐｏ−ＢのｍＲＮＡの量を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇまたは１００ｍｇ投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで少なくとも２０％減少させる。
【００１７】
本発明によってさらに提供されるのは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるｉＲＮＡ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々が、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤の配列のうちの１つと（以下で定義するように）ほぼ同一の少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列からなり、鎖当たりそれぞれ１、２または３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されている（例えばアデノシンがウラシルによって置換されている）が、以下で定義するように培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力をほぼ保持しているｉＲＮＡ剤である。
【００１８】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は少なくとも１５ヌクレオチド長であり、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含み、そのアンチセンスＲＮＡ鎖は長さが３０ヌクレオチド以下であり、ｉＲＮＡ剤の２重鎖領域は長さが１５〜３０ヌクレオチド対、好ましくは１８〜２５ヌクレオチド対である。ｉＲＮＡ剤は１〜４個、好ましくは２〜３個の非対（対合していない）ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部分をさらに含んでもよく、非対ヌクレオチドは少なくとも１個のホスホロチオエートジヌクレオチド結合を有し得る。ヌクレオチド突出部分は、例えばｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’端に存在してよい。
【００１９】
１実施形態ではｉＲＮＡ剤は、例えばヒトＨｅｐＧ２およびマウスＮｍｕＬｉ細胞中で、ヒトおよびマウスＡｐｏＢの発現を阻害する。
１実施形態では、本明細書で記載するように、疎水性部分、例えばコレステロール含有部分を、好ましくはｉＲＮＡ剤のセンス鎖、およびより好ましくはｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’端と結合させることによって、ｉＲＮＡ剤を修飾することが好ましい。
【００２０】
他の実施形態では、本明細書で記載するように、ｉＲＮＡ剤を修飾して安定性を改善することが好ましい。好ましい修飾は、ホスホロチオエート結合およびリボース単位への２’−置換基の導入、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル
（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換基の導入である。
【００２１】
好ましくは、これらの２’−置換は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖上、任意選択で同様にアンチセンス鎖上の、５’−ＵＡ−３’ジヌクレオチド、５’−ＵＧ−３’ジヌクレオチド、５’−ＣＡ−３’ジヌクレオチド、５’−ＵＵ−３’ジヌクレオチド、または５’−ＣＣ−３’ジヌクレオチドの５’ヌクレオチドに、あるいは全てのピリミジン塩基含有ヌクレオチドに施される。より好ましくは、存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’端のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドである。さらにより好ましくは、センス鎖中の全てのピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつ存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’および５’−ＣＡ−３’の５’端のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドである。最も好ましくは、センス鎖中の全てのピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつアンチセンス鎖中の存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’端のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドである。
【００２２】
他の実施形態では、本明細書で記載するように、（例えばセンス鎖の３’端上の）コレステロール部分、２’−修飾（例えば２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾）、および（例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端側の１個または２個のヌクレオチド上の）ホスホロチオエートが、同じｉＲＮＡ剤中に存在する。
【００２３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書で記載するｉＲＮＡ剤の投与は、対象に存在する、ＡｐｏＢの発現が役割を果たす疾患または障害を治療するためである。他の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤の投与はＡｐｏＢに仲介される障害の予防処置をするためである。
【００２４】
１態様では本発明は、ＡｐｏＢを調節する、例えば阻害するｉＲＮＡ剤の実質的に純粋な調製物または医薬として許容可能な調製物を含めた調製物を特徴とする。これらの調製物は、ＡｐｏＢをコードする核酸を標的とするｉＲＮＡ剤および医薬として許容可能な担体を含み得る。１実施形態ではｉＲＮＡ剤は、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを有する。
【００２５】
他の態様では本発明は、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１〜７４のｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とからなるｉＲＮＡ剤を、医薬として許容可能な担体とともに配合することからなる、医薬組成物を調製する方法を特徴とする。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、ＡｐｏＢのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を低下させるのに充分な量で投与することが可能である。１実施形態では、ＡｐｏＢタンパク質の発現を（例えば、少なくとも２％、４％、６％、１０％、１５％、２０％あるいはそれ以上）低下させるのに充分な量のｉＲＮＡ剤を投与する。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、ＡｐｏＢの高発現または他の望ましくない発現、高レベルまたは他の望ましくないレベルのコレステロール、脂質に仲介される血管障害、および／また
は脂質代謝の調節障害によって特徴付けられる障害の危険があるかあるいは該障害に罹患している対象に投与することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、該障害を有すると診断されているかまたは該障害を有する個体、あるいは該障害の危険がある個体に投与して、障害または障害の症状の発症を遅らせることが可能である。これらの障害には、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常；脂質代謝異常、例えば家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン耐性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）；血栓症；およびアテローム性動脈硬化症がある。１実施形態では、ＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤を、スタチン耐性高コレステロール血症に罹患している対象に投与する。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、対象中の血清ＬＤＬコレステロールおよび／またはＨＤＬコレステロールおよび／または総コレステロールのレベルを低下させるのに充分な量、投与することが可能である。例えばｉＲＮＡを、対象中の総コレステロールを少なくとも０．５％、１％、２．５％、５％、１０％あるいはそれ以上低下させるのに充分な量投与する。１実施形態では、本発明の医薬組成物を、対象の心筋梗塞の危険を低下させるのに充分な量投与する。好ましい実施形態では、医薬組成物を繰り返し投与する。
【００２９】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤の標的を肝臓とすることが可能であり、ＡｐｏＢ  ｉＲＮＡ剤の投与後、肝臓中のＡｐｏＢの発現レベルが低下する。例えばｉＲＮＡ剤を、肝臓を標的とする構成部分、例えば抗体または肝臓細胞上の受容体と結合するコレステロールなどのリガンドとともに複合体化することが可能である。以下の実施例７Ｇ）中に示すように、コレステロール含有部分の結合によってｓｉＲＮＡが肝臓組織に有効に取り込まれ、肝臓試料中のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを低下させた。これは、コレステロール含有部分との結合などの修飾により、肝臓中の遺伝子を標的とするためにｉＲＮＡ剤をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することが可能になることを示している。
【００３０】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤の標的を、腸などの消化管に、例えば腸の空腸などにすることが可能であり、ＡｐｏＢ  ｉＲＮＡ剤の投与後、消化管中のＡｐｏＢの発現レベルが低下する。予想外なことに、コレステロール部分と結合したｉＲＮＡ剤を使用して、ｉＲＮＡ剤を消化管に向けることが可能であることが分かった。以下の実施例７Ｇ）中に示すように、コレステロール含有部分の結合は腸組織によるｓｉＲＮＡの有効な摂取をもたらし、腸組織試料中のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを低下させた。このことは、コレステロール含有部分との結合などの修飾により、消化管組織中の遺伝子を標的とするためにｉＲＮＡ剤をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することが可能になることを示している。
【００３１】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は修飾されているか、あるいは送達物質、例えばリポソームなどの本明細書に記載する送達物質と結合させる。１実施形態では、修飾は、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン（ＳＡ）、またはその断片との結合を仲介する。
【００３２】
ＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害すると考えられるｉＲＮＡ剤を評価する方法であって、
ａ．ｉＲＮＡ剤を提供する工程であって、第１鎖がＡｐｏＢのｍＲＮＡのヌクレオチド配列と充分相補的であり、第２鎖が第１鎖とハイブリダイズするのに充分な第１鎖との相補性を有することを特徴とする工程と、
ｂ．ＡｐｏＢ遺伝子を含む細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる工程と、
ｃ．細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる前、または接触させていない対照細胞のＡｐｏＢ遺伝子の発現と、細胞とｉＲＮＡ剤を接触させた後のＡｐｏＢ遺伝子の発現とを比較する工程と、
ｄ．ｉＲＮＡ剤がＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害するのに有用であるかどうかを判定する工程であって、細胞中に存在するＡｐｏＢのＲＮＡまたは細胞によって分泌されるタンパ
ク質の量が、細胞とｉＲＮＡ剤を接触させる前の量より少ない場合、ｉＲＮＡが有用であることを特徴とする工程と
を含む方法。
【００３３】
１実施形態では、工程ｂ〜ｄをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびヒト以外の実験動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏの両方で実施する。他の実施形態では、この方法は、末梢血単核細胞によるインターフェロン−α産生の活性化の際のｉＲＮＡ剤の活性を測定することをさらに含む。
【００３４】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載する肝臓の疾患および障害を治療するための方法および組成物は、記載する任意のｉＲＮＡ剤と共に使用することが可能である。さらに、本発明の方法および組成物は、本明細書に記載する任意の疾患または障害を治療するため、および任意の対象、例えば任意の動物、任意の哺乳動物、任意のヒトなどを治療するために使用することが可能である。
【００３５】
本発明の方法および組成物、例えば本明細書に記載する脂質代謝障害を治療するための方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載する任意の用量および／または配合で、ならびに本明細書に記載する任意の投与経路で使用することが可能である。
【００３６】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細について、添付の図面および以下の記載において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は本記載、図面から、および特許請求の範囲から明らかであると思われる。本出願は、全ての引用文献、特許文献、および特許出願について、それらの全容をあらゆる目的で本願明細書に援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
説明を容易にするために、用語「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」を、本明細書中ではＲＮＡ剤の１つまたは複数のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書中での用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物の場合に、以下でさらに記載するように、１箇所または複数箇所の修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分を指す可能性もあることは理解されよう。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡ剤」は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代替物であり、これらは全て本明細書に記載されている。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代替物について記載するが、好ましい例としては非修飾ＲＮＡより高いヌクレアーゼ分解耐性を有するものが挙げられる。好ましい例は、２’糖修飾、１本鎖突出部分、好ましくは３’側の１本鎖突出部分中の修飾、あるいは特に１本鎖の場合、１つまたは複数のリン酸基あるいは１つまたは複数のリン酸基類似体を含む５’修飾を有するものを含む。
【００３９】
本明細書で使用する「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略語）は、標的遺伝子、例えばＡｐｏＢの発現を下方制御することが可能なＲＮＡ剤である。理論に拘泥することは望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野でＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、あるいは転写前または翻訳前機構を含めた１つまたは複数の幾つかの機構によって作用する可能性がある。ｉＲＮＡ剤は１本鎖を含むものでもよいし、あるいは２本以上の鎖を含んでもよく、例えばｉＲＮＡ剤は２本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤であってよい。ｉＲＮＡ剤が１本鎖である場合、同剤は１つまたは複数のリン酸基あるいは１つまたは複数のリン酸基類似体を含む５’修飾を含むことが特に好ましい。
【００４０】
本明細書で使用する「１本鎖ｉＲＮＡ剤」は、１分子で構成されるｉＲＮＡ剤である。１本鎖ｉＲＮＡ剤は、鎖内の対によって形成される２重鎖領域を含む可能性があり、例え
ば１本鎖ｉＲＮＡ剤はヘアピン構造またはパンハンドル構造であってもよいし、あるいは該構造を含んでいてもよい。１本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。
【００４１】
本明細書で使用する「ｄｓ  ｉＲＮＡ剤」（「２本鎖ＲＮＡ剤」の略語）は、２本以上、好ましくは２本の鎖を含むｉＲＮＡ剤であり、鎖間ハイブリダイゼーションによって２重鎖構造の領域が形成されうる。
【００４２】
哺乳動物細胞中では、長いｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、有害であることの多いインターフェロン応答を誘導する可能性があるが、短いｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、少なくとも細胞および宿主に有害である程度まではインターフェロン応答を誘導しない。本発明のｉＲＮＡ剤は、哺乳動物細胞中でインターフェロン応答を誘導しない程度に充分短い分子を含む。したがって、（例えば本明細書に記載するように配合した）ｉＲＮＡ剤組成物の哺乳動物細胞への投与を使用して、インターフェロン応答を回避しながらＡｐｏＢ遺伝子の発現を抑制することが可能である。インターフェロン応答を誘導しない程度に充分短い分子を、本明細書ではｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡと呼ぶ。本明細書で使用する「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、ヒト細胞中で有害なインターフェロン応答を誘導しない程度に充分短いｉＲＮＡ剤、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ剤または１本鎖ｉＲＮＡ剤を指し、例えば該ｉＲＮＡ剤は６０ヌクレオチド対未満、ただし好ましくは５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の２重鎖領域を有する。
【００４３】
さらに１実施形態では、インターフェロン応答の要素、例えばｄｓＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼＰＫＲを妨害するｉＲＮＡ剤で哺乳動物細胞を処理する。
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含めた本明細書に記載する単離ｉＲＮＡ剤は、例えばＲＮＡの分解によってＡｐｏＢ遺伝子の発現抑制を仲介し得る。便宜上、このようなＲＮＡを本明細書では発現抑制しようとするＲＮＡとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。発現抑制しようとするＲＮＡは、内在性ＡｐｏＢ遺伝子の遺伝子産物であることが好ましい。
【００４４】
本明細書で使用する語句「ＲＮＡｉを仲介する」とは、配列特異的な方法で標的遺伝子を発現抑制する薬剤の能力を指す。「標的遺伝子を発現抑制（サイレンシング）する」とは、薬剤と接触していないときにその標的遺伝子の特定の産物を含む、かつ／または同産物を分泌する細胞が、その薬剤と接触しているときに、その薬剤と接触しなかった同じ細胞と比較して前記遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含む、かつ／または分泌するようになるプロセスを意味する。このような標的遺伝子の産物は、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または制御要素であってよい。理論によって縛られることは望まないが、本明細書に記載の薬剤による発現抑制は、ＲＮＡｉ機構またはプロセス、ならびにガイドＲＮＡ、例えば１５〜３０ヌクレオチド対のｓｉＲＮＡ剤を使用すると考えられる。
【００４５】
本明細書で使用するように、用語「相補的」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子、例えばＡｐｏＢのｍＲＮＡ分子との間に安定した特異的な結合が生じるような、充分な相補性の度合いを示すために使用される。特異的な結合には、特異的な結合が望まれる条件下、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処理の場合の生理条件下、あるいはｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイの場合は該アッセイを実施する条件下において、オリゴマー化合物と非標的配列との非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性が必要である。非標的配列は一般に、少なくとも４ヌクレオチド異なっている。
【００４６】
本明細書で使用するように、ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が細胞中で標的ＲＮＡにコードされるタンパク質の産生を低下させる場合、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば
標的ＡｐｏＢのｍＲＮＡ）と「充分に相補的」である。ｉＲＮＡ剤は、（ＳＲＭＳ含有サブユニットは除いて）標的ＲＮＡと「正確に相補的」であってもよく、例えば標的ＲＮＡとｉＲＮＡ剤がアニーリングして、正確に相補的な領域中のワトソン−クリック塩基対のみで構成されるハイブリッドを形成することが好ましい。「充分に相補的な」ｉＲＮＡ剤は、標的のＡｐｏＢ  ＲＮＡと正確に相補的な（例えば少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は１ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。この場合、１ヌクレオチドの違いがある（例えば７ヌクレオチド以内の）領域に正確な相補性が見られる場合にのみｉＲＮＡ剤はＲＮＡｉを仲介する。好ましいｉＲＮＡ剤は、表１に提示するセンス配列およびアンチセンス配列に基づくものであるか、あるいは同配列のみで構成されるか、あるいは同配列を含むことになる。
【００４７】
本明細書で使用するように、「ほぼ同一である」は、第１ヌクレオチド配列に関して第２ヌクレオチド配列と比較して使用する場合、第１ヌクレオチド配列が最大１、２または３個までのヌクレオチド置換（例えばウラシルによるアデノシンの置換）以外は第２ヌクレオチド配列と同一であることを意味する。表１のｉＲＮＡ剤と同一ではないがヌクレオチドの欠失、付加または置換によって該ｉＲＮＡ剤の１つから誘導されたｉＲＮＡ剤に関し本明細書で使用する「培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力をほぼ保持する」は、その誘導ｉＲＮＡ剤が、同剤を誘導した元の表１のｉＲＮＡ剤と比較して低下が２０％阻害以内の阻害活性を有することを意味する。例えば、培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を７０％減少させる表１のｉＲＮＡ剤から誘導されたあるｉＲＮＡ剤は、それ自体は培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量を少なくとも５０％減少させ、培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力をほぼ保持していると考えることが可能である。場合によっては、本発明のｉＲＮＡ剤は、培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡの量、または細胞培養上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を、少なくとも５０％減少させることが可能である。
【００４８】
典型的な実施形態では、対象はウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギまたは霊長類などの哺乳動物である。より好ましい実施形態では、対象はヒト、例えば正常個体、または疾患もしくは障害を有する個体、疾患もしくは障害であると診断された個体、または疾患もしくは障害を有すると予想される個体である。
【００４９】
ｉＲＮＡ剤仲介型の発現抑制はｉＲＮＡ剤組成物の投与後数日間続く可能性があるので、多くの場合、１日当たり１回未満の頻度で、あるいは場合により治療計画全体の中で１回だけ、組成物を投与することが可能である。
【００５０】
ＡｐｏＢの誤発現との関連を有する障害
ＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤、例えば本明細書に記載するｉＲＮＡ剤を使用して、対象、例えば異常なＡｐｏＢ遺伝子発現または望ましくないＡｐｏＢ遺伝子発現、例えばＡｐｏＢの過剰発現と関連のある疾患または障害を有するか、あるいは該疾患または障害を発症する危険があるヒトを治療することが可能である。
【００５１】
例えば、ＡｐｏＢのｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤を使用して、高コレステロール血症、例えば末梢血管疾患を伴う原発性高コレステロール血症などの脂質関連障害を治療することが可能である。他の脂質関連障害には、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、心筋梗塞；ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロール平衡異常；脂質代謝異常（例えば家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）および後天性高脂血症）；高コレステロール血症；スタチン耐性高コレステロール血症；冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）；血栓症；およびアテローム性動脈硬化症がある。１実施形態では、ＡｐｏＢのｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡを、スタチン耐性障害、例えばスタチン耐性高コレステロール血症に罹患している対象に投与する。対象は現在スタチン治
療を受けている対象でもよいし、過去にスタチン治療を受けた対象でもよいし、スタチン治療には適さない対象であってもよい。
【００５２】
ＡｐｏＢのｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤を使用して、ＡｐｏＢ遺伝子またはＬＤＬ受容体の遺伝子突然変異または遺伝子多型を有するヒトを治療することが可能である。例えばｉＲＮＡ剤を使用して、高コレステロール血症およびＣＡＤの多発をもたらす優性遺伝性のリポタンパク質代謝障害である家族性リガンド欠損アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＦＤＢ）を有すると診断されているヒトを治療することが可能である。これらの対象においては、ＡｐｏＢ／Ｅ受容体の欠損によるＬＤＬ粒子のクリアランス不全のため、血漿コレステロールレベルは劇的に上昇する。
【００５３】
ｉＲＮＡ剤の設計および選択
本明細書の以下の実施例２は、配列予測に基づく遺伝子歩行法を使用して、ヒトおよびマウスＡｐｏＢのｍＲＮＡを標的とする８１個のｉＲＮＡ剤候補を評価したことを示す。与えられた結果に基づいて、表１にＡｐｏＢを標的とする活性ｉＲＮＡ剤を提示する。活性配列の少なくとも一部分がｉＲＮＡ剤中に含まれるように、本明細書で提示された活性配列の１つに基づく、該配列を含む、あるいは該配列のみで構成される他のｉＲＮＡ剤を、容易に設計および作製することが可能である。
【００５４】
本明細書の以下の実施例２に示すｉＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド長のセンス鎖、および２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖から構成される。しかしながら、これらの長さがおそらく最適であるかもしれないものの、ｉＲＮＡ剤がこれらの長さに制限されることを意味するわけではない。ある長さの範囲内では、有効性は鎖の長さではなくヌクレオチド配列の関数であるので、より短いｉＲＮＡ剤もより長いｉＲＮＡ剤も同様に有効であり得ることは、当業者には充分理解されている。例えば、ヤング、ディーら（Ｙａｎｇ、Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．）、ＰＮＡＳ  ２００２、第９９巻、ｐ．９９４２〜９９４７ページには、２１〜３０塩基対の長さのｉＲＮＡ剤に関して有効性が同じであることが実証されている。他の研究者は、約１５塩基対の長さのｉＲＮＡ剤による遺伝子の有効な発現抑制を示している（バイロム、ダブリュー、エムら（Ｂｙｒｏｍ、Ｗ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）、「Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｗｉｔｈ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＮａｓｅＩＩＩ；テクニカルノート１０（１）、米国テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）所在のアンビオンインコーポレイティド社（Ａｍｂｉｏｎ、Ｉｎｃ．））。
【００５５】
したがって、本発明によって可能であり企図されるのは、表１に記載の配列の１つに由来するｉＲＮＡ剤を作製するための１５〜２２ヌクレオチドの部分配列を、表１に提示する配列から選択することである。あるいは、表１に提示する配列の１つに１個または複数個のヌクレオチドを加え、その加えたヌクレオチドが、必須ではないが好ましくは、標的遺伝子、例えばＡｐｏＢの各配列と相補的であるようにすることが可能である。全てのこのような誘導型ｉＲＮＡ剤は、同剤が培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力をほぼ保持するという条件で、本発明のｉＲＮＡ剤に含まれる。
【００５６】
一般に、本発明のｉＲＮＡ剤はＡｐｏＢ遺伝子と充分に相補的な領域を含み、ヌクレオチド長さとしても充分なので、本発明のｉＲＮＡ剤またはその断片は、ＡｐｏＢ遺伝子の下方制御を仲介し得る。表１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖はマウスＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿１３７９５５）およびヒトＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８４）のｍＲＮＡ配列と完全に相補的であり、同剤のセンス鎖はアンチセンス鎖上の２個の３’末端ヌクレオチドを除きアンチセンス鎖と完全に相補的である。しかしながら、ｉＲＮＡ剤と標的の間に完全な相補性が存在することは必須ではない。ただし、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えばＡｐｏＢのｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断によっ
て配列特異的な発現抑制を誘導し得るように、対応性は充分でなければならない。
【００５７】
したがって本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる薬剤を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列を含み、該配列は、鎖当たりそれぞれ１、２または３個以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されている（例えばウラシルによって置換されたアデノシン）以外は、表１の配列の１つと以下で定義するようにほぼ同一であり、以下で定義するように培養ヒトＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢの発現を阻害する能力をほぼ保持している。したがってこれらの薬剤は、表１の配列の１つと同一な少なくとも１５個のヌクレオチドを有するが、標的のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ配列に対して、あるいはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１、２または３個の塩基のミスマッチが導入されることになる。特にアンチセンス鎖中の標的ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ配列とのミスマッチは、末端領域中では大部分が許容され、ミスマッチが存在する場合には一端または両端の領域中、例えば５’および／または３’末端から６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端から６、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが最も好ましい。センス鎖は、分子の全体的な２本鎖特性を保つ程度に充分にアンチセンス鎖と相補的でありさえすればよい。
【００５８】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるか、あるいはそれ以上の長さでなければならない。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００５９】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるか、あるいはそれ以上の長さでなければならない。ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００６０】
ｉＲＮＡ剤の２本鎖部分の長さは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド対であるか、あるいはそれ以上でなければならない。ｉＲＮＡ剤の２本鎖部分の長さは、６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド対以下でなければならない。長さの好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。
【００６１】
ｉＲＮＡ剤が該分子の一端または両端に１本鎖または非対領域を含むように、センス鎖およびアンチセンス鎖を選択することが好ましい。したがってｉＲＮＡ剤は、突出部分、例えば１個または２個の５’または３’突出部分であるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分を含むように対合したセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことが好ましい。大部分の実施形態は３’突出部分を有すると思われる。好ましいｓｉＲＮＡ剤は、それぞれの端に１本鎖突出部分、好ましくは１〜４ヌクレオチド長もしくは好ましくは２〜３ヌクレオチド長の３’突出部分を有すると思われる。これらの突出部分は、一方の鎖が他方の鎖より長い結果であってもよいし、または同じ長さの２本の鎖をずらして配置した結果であってもよい。５’端はリン酸化されていることが好ましい。
【００６２】
２重鎖領域の好ましい長さは、例えば上述のｓｉＲＮＡ剤の範囲内で、１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ剤は、長いｄｓＲＮＡ由来の天然のダイサー（Ｄｉｃｅｒ）プロセシング産物と長さおよび構造が似ている可能性がある。ｓｉＲＮＡ剤の２本の鎖が結合している
、例えば共有結合している実施形態も含まれる。必要とされる２本鎖領域と、好ましくは３’突出部分とを与えるヘアピンまたは他の１本鎖構造も、本発明の範疇にある。
【００６３】
以下の考察の大部分は、１本鎖分子について述べるものである。本発明の多くの実施形態では、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤、例えば部分的にｄｓであるｉＲＮＡ剤が必要であるか、あるいは好ましい。したがって、以下に記載する１本鎖構造で構成される２本鎖構造（例えば、２つの別個の分子が接触して２本鎖領域を形成する２本鎖構造、または分子内対形成によって２本鎖領域が形成される２本鎖構造（例えばヘアピン構造））は、本発明の範疇にあることが理解される。好ましい長さについては、本発明の他の箇所に記載する。
【００６４】
候補ｉＲＮＡ剤の評価
候補ｉＲＮＡ剤を、標的遺伝子の発現を下方制御する同剤の能力に関して評価することが可能である。例えば、候補ｉＲＮＡ剤を提供し、該ｉＲＮＡ剤を、内因的に標的遺伝子、例えばＡｐｏＢ遺伝子を発現している細胞、あるいはＡｐｏＢを発現させることが可能な構築物でトランスフェクトされている細胞、例えばＨｅｐＧ２細胞に接触させることが可能である。候補ｉＲＮＡ剤との接触前後の標的遺伝子の発現レベルを、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで比較することが可能である。標的遺伝子から発現されるＲＮＡまたはタンパク質の量が、ｉＲＮＡ剤との接触後では低いと判定される場合、該ｉＲＮＡ剤が標的遺伝子の発現を下方制御すると結論付けることが可能である。細胞中の標的のＡｐｏＢ  ＲＮＡまたはＡｐｏＢタンパク質のレベルは、任意の望ましい方法によって測定することが可能である。例えば標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡｓｅプロテクションアッセイによって測定することが可能である。タンパク質のレベルは、例えばウエスタンブロット分析によって測定することが可能である。
【００６５】
ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾、および再試験
候補ｉＲＮＡ剤を、安定性に関して、例えばｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入されたときのエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断の受けやすさに関して評価することが可能である。幾つかの方法を使用して、修飾、特に切断、例えば対象の体内に見られる成分による切断を受けやすい部位を同定することが可能である。
【００６６】
切断を受けやすい部位が同定されたら、例えばその切断部位に２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル基を導入することによって、切断される可能性のある部位を切断耐性にするように、さらなるｉＲＮＡ剤を設計および／または合成することが可能である。このさらなるｉＲＮＡ剤を安定性に関して再試験することが可能であり、望ましい安定性を示すｉＲＮＡ剤が見出されるまでこの方法を繰り返すことが可能である。
【００６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害することが可能であるとして同定されたｉＲＮＡ剤を、動物モデルにおいて（例えばマウスまたはラットなどの哺乳動物において）ｉｎ  ｖｉｖｏでの機能に関して試験することが可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤を動物に投与することが可能であり、該ｉＲＮＡ剤の生体内分布、安定性、およびＡｐｏＢ遺伝子の発現を阻害する同剤の能力に関して評価することが可能である。
【００６８】
ｉＲＮＡ剤は注射などによって標的組織に直接投与されてもよいし、あるいはｉＲＮＡ剤は、同剤をヒトに投与される場合と同じ方法で動物モデルに投与されてもよい。
ｉＲＮＡ剤を、その細胞内分布に関して評価することも可能である。該評価は、ｉＲＮＡ剤が細胞中に取り込まれたかどうか決定することを含み得る。該評価は、ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば半減期）を決定することも含み得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでのｉＲＮＡ剤の評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー；３５Ｓ、３２
Ｐ、３３Ｐ、または３Ｈなどの放射活性標識；金粒子；または免疫組織化学用の抗原粒子）と結合したｉＲＮＡ剤の使用によって容易にすることが可能である。
【００６９】
生体内分布を調べるのに有用なｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現抑制活性を欠いていてもよい。例えば、ｉＲＮＡ剤がその動物中に存在しない遺伝子を標的としていてもよいし（例えば、マウスに注射されるｉＲＮＡ剤がルシフェラーゼを標的としてもよい）、あるいはｉＲＮＡ剤が、いかなる遺伝子も、例えばいかなる内在遺伝子も標的としない無意味な配列を有していてもよい。ｉＲＮＡの局在／生体内分布は、例えばｉＲＮＡ剤と結合した追跡可能な標識（前述の追跡可能な物質など）によって調べることが可能である。
【００７０】
ｉＲＮＡ剤は、ＡｐｏＢ遺伝子の発現を下方制御する同剤の能力に関して評価することが可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｐｏＢ遺伝子発現のレベルは、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、あるいはｉＲＮＡ剤への曝露前後に組織からＲＮＡを単離することによって、測定することが可能である。組織を採取するためには動物を屠殺する必要がある場合、未処理の対照動物が比較用に役立つと思われる。標的ＡｐｏＢのｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分岐ＤＮＡアッセイ、またはＲＮＡａｓｅプロテクションアッセイだけには限られないが、これらを含めた任意の望ましい方法によって検出することが可能である。別例として、あるいは追加として、ＡｐｏＢ遺伝子の発現を、ｉＲＮＡ剤で処理した組織抽出物のウエスタンブロット分析の実施によって調べることが可能である。
【００７１】
ｉＲＮＡの化学的性質
本明細書に記載するのは、ＲＮＡｉを仲介してＡｐｏＢの発現を阻害する単離ｉＲＮＡ剤、例えばＲＮＡ分子（２本鎖；１本鎖）である。
【００７２】
本明細書で論じるＲＮＡ物質には、他の非修飾ＲＮＡ、および例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代替物のポリマーがある。非修飾ＲＮＡは、該核酸の構成要素、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在する、好ましくはヒト体内に本来存在する構成要素と同じあるいはほぼ同じである分子を指す。当技術分野では、希少であるかまたは通常とは異なるが天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと呼んでいる。例えばリンバッハら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６ページを参照されたい。このような希少または通常と異なるＲＮＡは、（おそらく典型的には転写後修飾の結果であるために）修飾ＲＮＡと呼ばれることが多いが、本明細書で使用する場合、用語「非修飾ＲＮＡ」の範疇にある。本明細書で使用する修飾ＲＮＡは、１つまたは複数の核酸構成要素、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在する構成要素とは異なる、好ましくはヒト体内に存在する構成要素とは異なる分子を指す。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然ながらその修飾のために、ＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代替物は、リボースリン酸（ｒｉｂｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）骨格が、ハイブリダイゼーションがリボースリン酸骨格で見られるのとほぼ同等であるように、正しい空間的位置関係で塩基を存在させることを可能にする非リボースリン酸構築物、例えば非荷電のリボースリン酸骨格模倣体で置換されている分子である。前述の事項の全ての例について、本明細書で論じる。
【００７３】
本明細書に記載する修飾は、本明細書に記載する任意の２本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤中に組み込むことが可能である。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい可能性がある。核酸はサブユニットまたはモノマーの重合体なので、以下に記載する修飾の多くは、核酸中で反復される部位に存在する。例えば塩基もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の結合に関与していな
いＯの修飾である。幾つかの場合については、修飾は核酸中の対象部位の全てに存在するが、多くの場合、実際ほとんどの場合はそうではない。例えば、修飾は３’または５’末端部位のみに存在してもよいし、末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチド上あるいは鎖の最後の２、３、４、５、または１０ヌクレオチド中の部位にのみ存在していてもよい。修飾は２本鎖領域内、１本鎖領域内、あるいは両方に存在しうる。例えば、結合に関与していないＯの位置におけるホスホロチオエート修飾が、鎖の一端または両端のみに存在していてもよいし、末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチド上あるいは鎖の最後の２、３、４、５、または１０ヌクレオチド中の部位にのみ存在していてもよいし、あるいは２本鎖領域および１本鎖領域中、特に末端に存在していてもよい。同様に修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、あるいは両方に存在しうる。幾つかの場合、センス鎖とアンチセンス鎖は同じ修飾または同じ種類の修飾を有することになるが、他の場合、センス鎖とアンチセンス鎖は異なる修飾を有することになり、例えば幾つかの場合、１つの鎖、例えばセンス鎖だけを修飾することが望ましい場合がある。
【００７４】
ｉＲＮＡ剤に修飾を導入する２つの主な目的は、以下でさらに論じるように、生物環境中での分解に対しｉＲＮＡ剤を安定化すること、ならびに薬理学的性質、例えば薬力学的性質を改善することである。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基、または骨格に対する他の適切な修飾は、２００４年１月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３に記載されている。ｉＲＮＡ剤は、２００４年４月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２に記載された塩基などの、非天然塩基を含み得る。ｉＲＮＡ剤は、非炭水化物環状担体分子などの非天然糖を含み得る。ｉＲＮＡ剤中に使用するための非天然糖の例示的な特徴は、２００３年４月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９に記載されている。
【００７５】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を増大させるのに有用なヌクレオチド間結合（例えば、キラルホスホロチオエート結合）を含み得る。加えて、あるいは別例として、ｉＲＮＡ剤はヌクレアーゼ耐性を増大させるためにリボース模倣体を含み得る。ヌクレアーゼ耐性を増大させるための例示的なヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００７６】
ｉＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチド合成用の、リガンドに結合したモノマーサブユニットおよびモノマーを含み得る。例示的なモノマーは、２００４年８月１０日に出願された共願の米国特許出願第１０／９１６，１８５明細書に記載されている。
【００７７】
ｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載の通りのＺＸＹ構造を有し得る。
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分とともに複合体を形成する可能性がある。ｉＲＮＡ剤と共に使用するための例示的な両親媒性部分は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００７８】
ｉＲＮＡ剤のセンス配列およびアンチセンス配列は、パリンドロームであってよい。パリンドロームｉＲＮＡ剤の例示的な特徴は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００７９】
他の実施形態ではｉＲＮＡ剤は、モジュラー複合体を特徴とする送達物質と複合体を形成する可能性がある。該モジュラー複合体は、（ａ）縮合剤（例えばイオン的または静電気的相互作用によって、核酸を誘引する、例えば核酸と結合することが可能である物質など）；（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜を介して融合かつ／または輸送可能な物質）；および（ｃ）標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパ
ク質、脂質またはタンパク質、例えば特定の種類の細胞と結合する抗体；のうち１または複数（好ましくは２以上、より好ましくは３つ全て）と結合した担体物質を含み得る。送達物質と複合体形成したｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８０】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ２重鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、標準的ではない対合を有し得る。標準的ではないｉＲＮＡ剤の例示的な特徴は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８１】
ヌクレアーゼ耐性の増強
ｉＲＮＡ剤、例えばＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤は、増強されたヌクレアーゼ耐性を有していてもよい。耐性を増大させるための１つの方法は、切断部位を同定し、その部位を修飾して切断を阻害することである。例えばジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、または５’−ＣＣ−３’は、共願かつ同時係属の米国特許出願第６０／５７４，７４４号およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１に記載されているように、切断部位として働き得る。
【００８２】
ヌクレアーゼ耐性および／または標的との結合親和性の増大のために、ｉＲＮＡ剤、例えばｉＲＮＡ剤のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、例えば２’修飾リボース単位および／またはホスホロチオエート結合を含み得る。例えば２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、幾つかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することが可能である。
【００８３】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素と結合した「ロック型」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）がある。メトキシエチル基（ＭＯＥ）のみを含むオリゴヌクレオチド、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）が、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目すべきことである。
【００８４】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、部分的にｄｓであるＲＮＡの突出部分と非常に関係があるデオキシリボース糖）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ；（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびに、例えばアミノ官能基により任意選択で置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルがある。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【００８５】
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、２’修飾を１個または複数個のリン酸結合修飾（例えばホスホロチオエート）と組み合わせて使用することが可能である。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２個以上の異なる修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
【００８６】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の全てのピリミジンが２’修飾を有しており、したがって該ｉＲＮＡ剤はエンドヌクレアーゼに対する高い耐性を有する。ヌクレアーゼ耐性の増強は、例えばウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド；または５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである少なくとも１個の５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドを生成する５’ヌクレオチドの修飾によって得ることも可能である。ｉＲＮＡ剤は少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個のこのようなジヌクレオチドを含み得る。存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンは２’−修飾ヌクレオチドであることが好ましい。センス鎖中の全ピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつ存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’および５’−ＣＡ−３’の５’側のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであることがより好ましい。センス鎖中の全ピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであり、かつアンチセンス鎖中に存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンが２’−修飾ヌクレオチドであることが最も好ましい。本発明者らによって、後者のパターンの修飾が、所望の安定性に必要とされる修飾の総数を最少にしながら、ヌクレアーゼ分解に対する分子全体の安定化に対するヌクレオチド修飾の貢献を最大にすることが示されている。その全容を本願明細書に援用する、共願かつ同時係属のＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１を参照のこと。
【００８７】
オリゴヌクレオチド骨格にフラノース糖を含めることによっても、エンドヌクレアーゼによる切断が減少する可能性がある。３’カチオン基を含めることによって、あるいは３’−３’結合を用いて３’末端のヌクレオシドを逆向きにすることによって、ｉＲＮＡ剤をさらに修飾することが可能である。他の代替例では、３’末端をアミノアルキル基で、例えば３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴでブロックすることが可能である。その他の３’結合体は、３’−５’エクソヌクレアーゼによる切断を阻害し得る。理論によって縛られるものではないが、３’結合体、例えばナプロキセンまたはイブプロフェンは、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’端と結合するのを立体的に阻害することによって、エクソヌクレアーゼによる切断を阻害するのかもしれない。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環の結合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）さえも、３’−５’エクソヌクレアーゼを阻害し得る。
【００８８】
同様に、５’結合体も５’−３’エクソヌクレアーゼによる切断を阻害し得る。理論によって縛られるものではないが、５’結合体、例えばナプロキセンまたはイブプロフェンは、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’端と結合するのを立体的に阻害することによって、エクソヌクレアーゼによる切断を阻害するのかもしれない。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環の結合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でも、３’−５’エクソヌクレアーゼを阻害し得る。
【００８９】
２重鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一端に１本鎖ヌクレオチド突出部分を含むとき、ｉＲＮ
Ａ剤は高いヌクレアーゼ耐性を有し得る。好ましい実施形態では、該ヌクレオチド突出部分は１〜４、好ましくは２〜３の非対合ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、１本鎖ヌクレオチド突出部分の非対合ヌクレオチドであって一番端のヌクレオチド対と直接隣接するヌクレオチドはプリン塩基を含み、前記一番端のヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であるか、あるいは端の４つの相補的ヌクレオチド対のうち少なくとも２個がＧ−Ｃ対である。他の実施形態では、ヌクレオチド突出部分は１個または２個の非対合ヌクレオチドを有してもよく、例示的な実施形態ではヌクレオチド突出部分は５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、ヌクレオチド突出部分はアンチセンス鎖の３’端上に存在する。１実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２ヌクレオチドの突出部分５’−ＧＣ−３’が形成されるように、アンチセンス鎖の３’端上にモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を含む。
【００９０】
したがってｉＲＮＡ剤は、例えば対象の体内に見られるヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾されたモノマーを含み得る。これらのモノマーを、本明細書ではＮＲＭ、すなわちヌクレアーゼ耐性促進モノマーまたは修飾（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ぶ。多くの場合これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の性質、例えば、タンパク質（例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン）、またはＲＩＳＣの構成要素と相互作用する能力、あるいは互いに２重鎖を形成するかまたは他の配列（例えば標的分子）と２重鎖を形成する第１配列および第２配列の能力も調節すると思われる。
【００９１】
理論によって縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤中の糖、塩基、および／またはリン酸骨格の修飾は、エンドヌクレアーゼ耐性およびエクソヌクレアーゼ耐性を高める可能性があり、かつ輸送タンパク質およびＲＩＳＣ複合体を構成する１または複数の機能要素との相互作用を高める可能性があると考えられる。好ましい修飾は、エクソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレアーゼ耐性を増大させ、したがってＲＩＳＣ複合体と相互作用する前のｉＲＮＡ剤の半減期を延長させるが、同時に、標的ｍＲＮＡの切断を誘導する薬剤としてのｉＲＮＡ剤の目的の活性に関して不活化しない修飾である。再度、如何なる理論によっても縛られることも望まないが、アンチセンス鎖の３’および／または５’端あるいはその近辺に修飾を配置することは、前述の好ましいヌクレアーゼ耐性の基準に見合うｉＲＮＡ剤をもたらす可能性があると考えられる。再度、さらに如何なる理論によっても縛られることも望まないが、例えばセンス鎖の中央への修飾の配置は、的外れな効果（オフターゲット効果）を示す可能性が比較的低いｉＲＮＡ剤をもたらす可能性があると考えられる。
【００９２】
前述の好ましいヌクレアーゼ耐性基準に見合うｉＲＮＡ剤を生成するのに有用な可能性がある修飾は、以下の、糖、塩基、および／またはリン酸骨格の化学修飾および／または立体化学修飾のうち１つまたは複数を含み得る。
【００９３】
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオエート。したがって、好ましいＮＲＭは、通常は酸素が占める位置Ｘに、非架橋位置にヘテロ原子を含む修飾リン酸基の特定のキラル型、例えばＳｐまたはＲｐを豊富に含むかまたは前記キラル型のみを含むヌクレオチド二量体を含む。Ｘ位の原子はＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３であってもよい。ＸがＳならば、豊富な、またはキラル型について純粋なＳｐ結合が好ましい。豊富とは好ましい型が少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％であることを意味する。そのようなＮＲＭについては以下により詳細に記載する。
【００９４】
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好ましいＮＲＭは、カチオン基で誘導体化された末端位置のモノマーを含む。アンチセンス配列の５’
末端は、末端に−ＯＨまたはリン酸基を有する必要があるので、前記のＮＲＭは、アンチセンス配列の５’末端では使用されないことが好ましい。このカチオン基は、水素結合形成およびハイブリッド形成への干渉を最少化する塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置（例えばピリミジンの５’位またはプリンの７位）に結合しなければならない。これらについては以下により詳細に述べる。
【００９５】
（ｉｉｉ）末端での非リン酸結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えばリン酸結合よりも大きい切断耐性を付与する４原子の結合などの、非リン酸結合を含む。例として、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ２−５’が挙げられる。
【００９６】
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸。したがって、好ましいＮＲＭは前記の構造を含むことが可能である。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド。したがって、他の好ましいＮＲＭに含まれるものは、ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシド由来のヌクレオチド二量体；２’−５’リン酸結合、非リン酸結合および修飾リン酸結合、例えばチオリン酸、ホスホルアミデートおよびホウ素化リン酸；逆向きの結合、例えば３’−３’または５’−５’結合を有する二量体；糖の１’位にα結合を有するモノマー、例えば本明細書に記載のα結合を有する構造が挙げられる。
【００９７】
（ｖｉ）結合基。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば標的化部分、または、例えば糖、塩基もしくはバックボーンを介してモノマーと結合した本明細書に記載の結合リガンドを含むことが可能である。
【００９８】
（ｖｉ）脱塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば本明細書に記載されるような脱塩基モノマー（例えば核酸塩基のないモノマー）、本明細書に記載されるような芳香族モノマーまたは複素環式もしくは多複素環式芳香族モノマーを含むことが可能である。
【００９９】
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’−ホスフェート型プロドラッグ。したがって、好ましいＮＲＭは、好ましくは末端部位（例えば５’位）に、リン酸基の１つまたは複数の原子が保護基により誘導体化されているモノマーを含み、この１つまたは複数の保護基は、対象の体内成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在する酵素の作用により除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護分子を切断する結果チオエートアニオンが生じ、チオエートアニオンがリン酸のＯに隣接する炭素を攻撃する結果として保護されていないリン酸が生じるリン酸プロドラッグ。
【０１００】
１つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列中に導入することが可能である。ＮＲＭ修飾は、配列またはｉＲＮＡ剤に２回以上使用することが可能である。一部のＮＲＭはハイブリッド形成を妨げるので、取り込む総数は、許容可能なレベルのｉＲＮＡ剤の二本鎖形成が維持されるものでなければならない。
【０１０１】
一部の実施形態において、ＮＲＭ修飾は、対象の所望の配列または遺伝子を標的としない配列（センス鎖またはセンス配列）の末端切断部位または切断領域へ導入される。このことによりオフターゲットの発現抑制を低減しうる。
【０１０２】
ヌクレアーゼ耐性修飾に含まれる修飾は、あるものは末端のみに配置することが可能であり、他の修飾は任意の位置に配置可能である。一般に修飾はハイブリダイゼーションを阻害する可能性があるので、末端領域のみに修飾を使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列の切断部位または切断領域中には修飾を使用しないことが
好ましい。ｉＲＮＡ剤の２配列間の充分なハイブリダイゼーションが保たれるという条件で、修飾はセンス配列中の任意の場所において使用することが可能である。幾つかの実施形態では、対象の配列または遺伝子を標的としない配列の切断部位または切断領域中にＮＲＭを置くことが望ましい。というのは、オフターゲットの発現抑制を最少にする可能性があるからである。
【０１０３】
さらに、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤の他方の配列と２重鎖構造を形成しない突出部分を有し得る。これは突出部分であるが、それ自体と、あるいは該ｉＲＮＡ剤の他方の配列以外の他の核酸と、ハイブリダイズする。
【０１０４】
大抵の場合、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、その配列が対象中の配列を標的とする（アンチセンス配列と呼ばれることが多い）か、あるいは対象中の配列を標的としない（センス配列と呼ばれることが多い）かに応じて分布が異なると思われる。配列が対象中の配列を標的とする場合、エンドヌクレアーゼによる切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ仲介性の切断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域中に挿入すべきではない。（本願明細書に援用する、エルバシャーら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５：１８８に記載されるとおりである。）標的の切断は２０または２１ヌクレオチドの誘導ＲＮＡのほぼ中央、あるいはこの誘導配列と相補的な第１ヌクレオチドの約１０または１１ヌクレオチド上流で起こる。本明細書で使用するように、切断部位とは、標的上または標的にハイブリダイズするｉＲＮＡ剤の鎖上の、切断される部位のいずれかの側のヌクレオチドを指す。切断領域とは、切断される部位のヌクレオチドおよびいずれかの方向に１、２、または３個のヌクレオチドを意味する。
【０１０５】
このような修飾は末端領域、例えば対象中の配列を標的とする配列または対象中の配列を標的としない配列の、末端位置または末端の２、３、４、または５つの位置を加えた位置に導入することが可能である。
【０１０６】
係留リガンド
ｉＲＮＡ剤の薬理学的性質を含めたｉＲＮＡ剤の性質は、例えば、リガンド、例えば係留リガンドを導入することによって影響され調節され得る。
【０１０７】
多種多様な物、例えばリガンドをｉＲＮＡ剤に、例えばリガンド結合モノマーサブユニットの担体に結合させることが可能である。これらの例はリガンド結合モノマーサブユニットに関して以下に記載するが、それは単に好ましいものにすぎず、他の地点でｉＲＮＡ剤に物を結合させることが可能である。
【０１０８】
好ましい構成部分は、介在係留部を介して直接的または間接的に担体と結合、好ましくは共有結合したリガンドである。好ましい実施形態では、リガンドは介在係留部によって担体に取り付けられる。リガンドまたは係留リガンドは、リガンド結合モノマーが伸長している鎖に取り込まれるときに、リガンド結合モノマー上に存在していてもよい。幾つかの実施形態では、「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットを伸長している鎖に取り込ませた後に、リガンドを「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットに取り込ませることが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端結合を有するモノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を、伸長しているセンス鎖またはアンチセンス鎖中に取り込ませることが可能である。後の操作において、すなわち前駆体モノマーサブユニットの鎖中への取り込みの後、求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、続いて前駆体リガンド結合モノマーと結合させることが可能である。該結合は、リガンドの求電子基と前駆体リガンド結合モノマーサブユニットの係留部の末端求核基とを結合させることによって可能である。
【０１０９】
好ましい実施形態では、リガンドは、それが取り込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばそのようなリガンドを含まないものと比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞種、区画（例えば細胞区画または臓器区画）、身体の組織、臓器または領域に対する高い親和性を与える。
【０１１０】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を改善することが可能であり、生成する天然もしくは修飾オリゴヌクレオチド、または本明細書に記載するモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を改善する可能性もある。
【０１１１】
リガンドは一般に、例えば摂取を増大させるための治療用修飾物質；例えば分布を調べるための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性を付与する部分；ならびに天然または通常と異なる核酸塩基を含み得る。一般例には、親油性物質、脂質、ステロイド（例えばウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えばトリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合物質、インテグリン標的分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
【０１１２】
リガンドは、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；アミノ酸、または脂質を含み得る。リガンドは組換え分子でもよいし、合成ポリマーなど、例えば合成ポリアミノ酸などの合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであるポリアミノ酸を含む。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性成分、例えばカチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、αヘリカルペプチドがある。
【０１１３】
リガンドは、標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば肝臓細胞もしくは空腸の細胞などの特定の細胞種と結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸（塩）、ポリアスパラギン酸（塩）、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であってよい。
【０１１４】
リガンドの他の例には色素、インターカレート剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンド
ヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えばそのエステルおよびエーテル、例えばＣ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、またはＣ２０アルキル；例えば１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレイン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター化合物、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰがある。
【０１１５】
リガンドはタンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば共通リガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えばがん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞種と結合する抗体であってよい。リガンドはホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。リガンドは脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド性のものも含み得る。リガンドは例えばリポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化物質、またはＮＦ−κＢの活性化物質であってよい。
【０１１６】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能である物質、例えば薬剤であってよい。該薬剤は例えばタクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スビンホライドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであってよい。
【０１１７】
リガンドは、例えば炎症応答を活性化することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガンドには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンがある。
【０１１８】
１態様ではリガンドは、脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば肝実質細胞などの肝臓組織への該複合体の分布を可能にする。ＨＳＡと結合し得る他の分子をリガンドとして使用することも可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）該複合体の分解に対する耐性を増大させることが可能であり、（ｂ）標的指向性または標的細胞もしくは細胞膜への輸送を増大させることが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用することが可能である。
【０１１９】
脂質系リガンドを使用して、複合体と標的組織の結合を調節する、例えば制御することが可能である。例えば、ＨＳＡと比較的強く結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓へ向かう可能性が低いと思われ、したがって身体から除去されにくいと思われる。ＨＳＡ
とあまり強く結合しない脂質または脂質系リガンドを使用して、複合体を腎臓に向けることが可能である。
【０１２０】
好ましい実施形態では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。脂質系リガンドは、複合体が腎臓以外の組織に優先的に分布するように、充分な親和性でＨＳＡと結合することが好ましい。しかしながら、親和性は、ＨＳＡとリガンドとの結合が解消し得ないほどは強くないことが好ましい。
【０１２１】
他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖している細胞によって取り込まれる成分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性または非悪性の細胞種、例えばがん細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示的なビタミンは、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、またはがん細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素である。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１２２】
他の態様では、リガンドは、細胞浸透性物質、好ましくはヘリカル構造の細胞浸透性物質である。この物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテノペディアなどのペプチドである。物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または擬似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、該ペプチドを修飾することが可能である。ヘリカル構造の物質はα−ヘリカル構造物質であることが好ましく、同物質は親油性相および疎油性相を有することが好ましい。
【０１２３】
増殖している細胞中に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することが可能である。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、がん細胞、特にαｖβ３インテグリンを発現する細胞を標的とすることが可能である。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することが可能であると思われる。ＲＧＤ以外に、αｖ−β３インテグリンリガンドを標的とする他の成分を使用することが可能である。一般に、このようなリガンドを使用して、増殖している細胞および血管新生を制御することが可能である。この種の好ましい複合体には、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子、例えば本明細書に記載するがん遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤がある。
【０１２４】
糖、例えばガラクトースおよび／またはその類似体を取り込む標的化物質は特に有用である。これらの物質は特に、肝実質細胞を標的とする。例えば、標的化部分は、互いに約１５オングストローム間隔で配置された２個以上または好ましくは２〜３個のガラクトース部分を含み得る。あるいは標的化部分は、ガラクトースと結合したグルコースであるラクトース（例えば、３個のラクトース部分）であってよい。標的化部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンであってもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、マクロファージを標的とするのに使用することが可能である。
【０１２５】
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）は、天然ペプチドと同じ決まった三次元構造にフォールディングし得る分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体とｉＲＮＡ剤の結合は、細胞の認識および吸収を増大させることなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を与える可能性がある。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であってよい。
【０１２６】
ｉＲＮＡ複合体
ｉＲＮＡ剤は、第２の物質と結合、例えば共有結合させることが可能である。例えば、脂質障害などの特定の障害を治療するために使用されるｉＲＮＡ剤は、例えばｉＲＮＡ剤以外の薬剤などの第２の治療剤と結合させることが可能である。第２の治療剤は、同じ障害の治療を対象とする薬剤であってよい。
【０１２７】
５’−リン酸修飾
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は５’リン酸化されているか、５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ仲介性の遺伝子発現抑制と適合性がある修飾が挙げられる。適切な修飾には、５’−１リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−２リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−３リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化体または非メチル化体）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／イオウで置換された１リン酸、２リン酸および３リン酸の任意の他の組合せ（例えば５’−α−チオトリホスフェート、５’−γ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）がある。
【０１２８】
センス鎖を不活性化して活性ＲＩＳＣの形成を妨げるためにセンス鎖を修飾することによって、おそらくオフターゲット効果を低下させることが可能である。これは、センス鎖の５’−リン酸化を妨げる修飾によって、例えば５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いた修飾によって実施することが可能である（ニッカネンら（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、（２００１）「ＡＴＰ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ」、Ｃｅｌｌ  第１０７巻、ｐ．３０９〜３２１を参照）。リン酸化を妨げる他の修飾、例えばＯ−ＭｅではなくＨによって５’−ＯＨを単に置換することも使用することが可能である。あるいは、大きく嵩高い基を５’−リン酸に付加し、ホスホジエステル結合にすることが可能である。
【０１２９】
組織および細胞へのｉＲＮＡ剤の送達
肝臓に対する標的化
ＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば会合によって、例えばｉＲＮＡ剤と親油性成分、例えば脂質、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基との結合によって、肝臓に向けることが可能である。コレステロールとの結合が好ましい。ｉＲＮＡ剤と会合、例えば結合させることが可能な他の親油性成分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレイン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンがある。別例として、ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤と低密度リポタンパ
ク質（ＬＤＬ）、例えばラクトシル化ＬＤＬとの会合（例えば結合）によって肝臓に向けることが可能であり、あるいはｉＲＮＡ剤は、糖残基を有するポリマー担体複合体とｉＲＮＡ剤の会合、例えば結合によって肝臓に向けることが可能である。
【０１３０】
ｉＲＮＡ剤は、糖残基と複合体形成したリポソームと該ｉＲＮＡ剤との会合、例えば結合によって肝臓に向けることが可能である。糖、例えばガラクトースおよび／またはその類似体を取り込んだ標的化物質は特に有用である。これらの物質は、特に肝臓の実質細胞を標的とする。標的化部分は２以上のガラクトース部分を含むことが好ましく、２個または３個含むことがより好ましい。標的化部分は、例えば互いに約１５オングストローム間隔で配置された、３個のガラクトース部分を含むことが最も好ましい。標的化部分はラクトースであってよい。ラクトースは、ガラクトースと結合したグルコースである。標的化部分は、３個のラクトースを含むことが好ましい。標的化部分は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンであってもよい。マンノース、またはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、標的をマクロファージに設定するために使用することが可能である。
【０１３１】
ラクトシル化ＬＤＬなどの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）との会合によって、ｉＲＮＡ剤を肝臓に向けることも可能である。糖残基と複合体形成したポリマー担体も、ｉＲＮＡ剤を肝臓に向けるために機能し得る。
【０１３２】
標的化物質は、例えば共有結合または非共有結合によって、ｉＲＮＡ剤や他の送達様式または配合様式、例えばリポソームと、直接結合させることが可能である。例えば、標的化部分を含むｉＲＮＡ剤または含まないｉＲＮＡ剤を、標的化部分を含む送達物質または含まない送達物質、例えばリポソームに取り込ませることが可能である。
【０１３３】
ＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤は、例えばｉＲＮＡ剤と血清アルブミン（ＳＡ）分子、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）分子、またはその断片との会合、例えば結合によって、肝臓に向けることが可能である。ｉＲＮＡ剤またはその組成物は、肝臓内の該ｉＲＮＡ剤またはその組成物のレベルがＳＡ、例えばＨＳＡの存在下で少なくとも１０、２０、３０、５０、または１００％高くなるように、あるいは外来ＳＡの添加により肝臓への送達が増大するように、充分に高いＳＡ親和性、例えばＨＳＡ親和性を有し得る。上記の基準は、例えば外来のマウスまたはヒトＳＡの存在下または不在下において、マウス中での分布を試験することによって測定することが可能である。
【０１３４】
ＳＡ、例えばＨＳＡを標的とする物質は、例えば共有結合または非共有結合によって、ｉＲＮＡ剤や他の送達様式または配合様式、例えばリポソームと直接結合させることが可能である。例えば、標的化部分を含むｉＲＮＡ剤または含まないｉＲＮＡ剤を、標的化部分を含む送達様式または含まない送達様式、例えばリポソームに取り込ませることが可能である。
【０１３５】
細胞内へのｉＲＮＡ剤の輸送
如何なる理論によって縛られることも望まないが、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤と、リポタンパク質を構成する幾つかの要素（例えばコレステロール、コレステリルエステル、リン脂質）との間の化学的類似性は、ｉＲＮＡ剤と血中リポタンパク質（例えばＬＤＬ、ＨＤＬ）との会合、および／またはｉＲＮＡ剤とコレステロールに対する親和性を有する細胞内成分、例えばコレステロール輸送経路の成分との相互作用をもたらす可能性がある。リポタンパク質およびその構成要素は、さまざまな能動的および受動的輸送機構、例えば（限定するものではないが）ＬＤＬ−受容体に結合したＬＤＬのエンドサイトーシス、スカベンジャー受容体Ａとの相互作用による酸化ＬＤＬあるいは修飾ＬＤＬのエンドサイトーシス、肝臓中のスカベンジャー受容体Ｂ１仲介型のＨＤＬコレステロールの取り込
み、ピノサイトーシス、あるいはＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）輸送タンパク質、例えばＡＢＣ−Ａ１、ＡＢＣ−Ｇ１またはＡＢＣ−Ｇ４による膜を介したコレステロール輸送によって、細胞によって取り込まれ処理される。したがって、コレステロール結合ｉＲＮＡ剤は、このような輸送機構を有する細胞、例えば肝臓の細胞による容易な取り込みを享受するであろうと思われる。このように本発明は、ｉＲＮＡ剤の標的を、ある種の細胞表面要素、例えば受容体を発現している細胞に設定することに関する証拠および一般的方法を提供する。この方法は、前記細胞表面要素の天然リガンド（例えばコレステロール）をｉＲＮＡ剤に結合させることによって、あるいは前記要素の天然リガンド（例えばＬＤＬ、ＨＤＬ）と会合または結合する化学基部分（例えばコレステロール）をｉＲＮＡ剤に結合させることによって行われる。
【０１３６】
他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞に送達された外来ＤＮＡの鋳型から、細胞中ｉｎ  ｖｉｖｏで生成されうる。例えば、該ＤＮＡ鋳型をベクター中に挿入して遺伝子療法用ベクターとして使用することが可能である。遺伝子療法用ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号明細書）によって、あるいは定位注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４〜３０５７、１９９４を参照）によって、対象に送達することが可能である。遺伝子療法用ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子療法用ベクターを含んでいてもよいし、あるいは遺伝子送達用媒体が埋め込まれた徐放性マトリクスを含んでなるものでもよい。例えば、ＤＮＡの鋳型が２つの転写単位を含み、転写単位の一方がｉＲＮＡ剤の上部鎖を含む転写産物を生成し、一方がｉＲＮＡ剤の底部鎖を含む転写産物を生成するものであってもよい。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が生成され、遺伝子発現抑制を仲介するｓｉＲＮＡ剤の断片へとプロセシングされる。
【０１３７】
生理学的影響
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤とヒトおよび非ヒト動物の配列との相補性によって、治療毒性の決定が容易になされるように設計することが可能である。これらの方法によって、ｉＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列ならびに少なくとも１種の非ヒト動物、例えばげっ歯類、反芻動物または霊長類などの非ヒト哺乳動物由来の核酸配列と完全に相補的な配列で構成されうる。例えば、非ヒト哺乳動物はマウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ボノボ（Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ）、またはカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）であってよい。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳動物およびヒトの相同遺伝子、例えばがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子内の配列と相補的であることも考えられる。非ヒト哺乳動物におけるｉＲＮＡ剤の毒性を測定することによって、ヒトにおける該ｉＲＮＡ剤の毒性を推定することが可能である。より困難な毒性試験用に、ｉＲＮＡ剤は、ヒトならびに２種以上、例えば２種または３種あるいはそれ以上の非ヒト動物と相補的であってよい。
【０１３８】
本明細書に記載する方法を使用して、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的影響、例えば毒性作用などの任意の望ましくない影響、あるいは任意のポジティブまたは望ましい影響を関連付けることが可能である。
【０１３９】
ｉＲＮＡの生産
さまざまな方法によって、ｉＲＮＡを例えば大量に生産することが可能である。例示的な方法には、有機合成およびＲＮＡ切断、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断がある。
【０１４０】
有機合成。２本鎖ＲＮＡ分子のそれぞれの各鎖を別々に合成することによって、ｉＲＮＡを製造することが可能である。次いで要素鎖をアニーリングすればよい。
大型のバイオリアクタ、例えばファルマシアバイオテックＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＡＢ）［スウェーデン国ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在］のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩを使用して、所与のｉＲＮＡのための大量の特定のＲＮＡ鎖を生産することが可能である。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩリアクタは、わずか１．５モル濃度過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドを使用して、ヌクレオチドを効率良く結合させることが可能である。ＲＮＡ鎖を作製するために、リボヌクレオチドアミダイトを使用する。モノマー付加の標準サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用のオリゴヌクレオチド鎖を合成することが可能である。典型的には、２本の相補鎖を別々に生産した後、例えば、固相担体からの切り離しおよび脱保護の後にアニーリングさせる。
【０１４１】
有機合成を使用して、別個の種類のｉＲＮＡを生産することが可能である。該ｉＲＮＡ種のＡｐｏＢ遺伝子との相補性を、正確に特定することが可能である。例えば、ｉＲＮＡ種は、多型、例えば１ヌクレオチド多型を含む領域と相補的であってもよい。さらに、多型の位置を正確に定義することが可能である。幾つかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば一方または両方の末端から少なくとも４、５、７、または９ヌクレオチドに位置する。
【０１４２】
ｄｓＲＮＡ切断。ｉＲＮＡは、大きなｄｓ  ｉＲＮＡを切断することによって作製することも可能である。切断はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われてもｉｎ  ｖｉｖｏで行われてもよい。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断によってｉＲＮＡを生成するために、以下の方法を使用することが可能である。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写。両方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写することによってｄｓＲＮＡを生産する。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、ベクターと、該ベクターのＴ７プロモーターのいずれかの側に隣接する位置にクローニングされた核酸セグメントについてｄｓＲＮＡを生産する方法を提供する。ｄｓＲＮＡの２本の相補鎖のＴ７転写用に別々の鋳型を作製する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを加えることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで鋳型を転写し、ｄｓＲＮＡを生成させる。ＰＣＲおよび／または他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３またはＳＰ６ポリメラーゼ）を使用する同様の方法も使用することが可能である。１実施形態では、この方法によって作製したＲＮＡを注意深く精製して、組換え酵素調製物を汚染している可能性のあるエンドトキシンを除去する。
【０１４４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断。例えばＤｉｃｅｒまたは匹敵するＲＮＡｓｅＩＩＩ系活性を使用することによって、ｄｓＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＲＮＡに切断する。例えば、ショウジョウバエ由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出物中で、あるいは精製成分、例えば精製ＲＮＡｓｅまたはＲＩＳＣ複合体を使用してｄｓＲＮＡをインキュベートすることが可能である。例えば、ケッティングら（Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００１年１０月１５日、第１５巻、第２０号、ｐ．２６５４〜９．およびハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１年８月１０日、第２９３巻、第５５３２号、ｐ．１１４６〜５０を参照のこと。
【０１４５】
ｄｓＲＮＡの切断は一般に、それぞれが供給源のｄｓＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ヌクレオチド断片である複数のｉＲＮＡ種を生成する。例えば、供給源のｄｓＲＮＡ分子の重複領域および隣接領域と相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在する可能性がある。
【０１４６】
合成の方法とは無関係に、配合に適した溶液（例えば、水溶液および／または有機溶液）中で、ｉＲＮＡ調製物を調製することが可能である。
例えば、ｉＲＮＡ調製物を純粋な再蒸留水中に沈殿および再溶解させ、凍結乾燥させることが可能である。次いで乾燥ｉＲＮＡを、目的とする配合工程に適した溶液中に再懸濁
させることが可能である。
【０１４７】
修飾ｉＲＮＡ剤およびヌクレオチド代替物ｉＲＮＡ剤の合成については以降に論じる。
配合
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、対象に投与するために配合することが可能である。
【０１４８】
説明を容易にするために、本項中の配合（物）、組成（物）、および方法は主に非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論じる。しかしながら、これらの配合（物）、組成（物）、および方法は他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤に関して実践することが可能であり、このような実践は本発明の範疇にあることは理解されるはずである。
【０１４９】
配合ｉＲＮＡ組成物は、さまざまな状態をとり得る。幾つかの例では、組成物は少なくとも部分的に結晶であるか、均一に結晶であるか、あるいは無水状態（例えば水分が８０、５０、３０、２０、または１０％未満）であるかのうち少なくともいずれかである。他の例では、ｉＲＮＡは水相中、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０１５０】
水相組成物または結晶組成物は例えば、送達媒体、例えばリポソーム中に（特に水相に関して）取り込ませてもよいし、あるいは粒子（例えば、結晶組成物に適している可能性があるミクロ粒子）中に取り込ませてもよい。一般に、目的とする投与法との適合性があるような形式でｉＲＮＡ組成物を配合する。
【０１５１】
特定の実施形態では、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技法の組合せ；または脂質を用いた超音波処理、凍結−乾燥、凝縮および他の自己凝集のうち少なくとも１つによって組成物を調製する。
【０１５２】
ｉＲＮＡ調製物は、他の物質、例えば他の治療剤、またはｉＲＮＡを安定化させる物質、例えばｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合することが可能である。さらに他の物質には、キレート剤、例えばＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの２価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広い特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤）などがある。
【０１５３】
１実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、第２の遺伝子または同じ遺伝子に関するＲＮＡｉを仲介し得る第２のｉＲＮＡ剤を含む。さらに他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００あるいはそれ以上の異なるｉＲＮＡ種を含み得る。このようなｉＲＮＡは、同じ数の異なる遺伝子に関するＲＮＡｉを仲介し得る。
【０１５４】
１実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも１つの第２の治療剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤にプロセシングすることが可能である大きなｉＲＮＡ剤、または、ｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を、特定の細胞を標的とするように配合する。例えば、ｉＲＮＡを含むリポソームまたは粒子または他の構造体も、標的細胞上の特定分子を認識する標的化部分を含み得る。標的化部分は、標的細胞に対する特異的親和性を有する分子であってよい。標的化部分は、標的細胞の表面上に見られるタンパク質を対象とする抗体、あるいは標的細胞の表面上に見られる分子のリガンドまたはリガンドの受容体結合部分を含み得る。
【０１５５】
１実施形態では、標的化部分をリポソームと結合させる。例えば米国特許第６，２４５
，４２７号明細書には、タンパク質またはペプチドを使用してリポソームを標的化するための方法が記載されている。他の例では、リポソームのカチオン性脂質成分を、標的化部分を用いて誘導体化する。例えば国際公開公報第９６／３７１９４号パンフレットには、Ｎ−グルタリルジオレイルホスファチジルエタノールアミンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルへの転換が記載されている。該生成物は次いでＲＧＤペプチドと結合された。他の標的化法は、本明細書の他の箇所に記載する。
【０１５６】
治療法および送達経路
ｉＲＮＡ剤、例えばＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、さまざまな経路によって対象に送達することが可能である。例示的な経路には、クモ膜下、実質、静脈内、鼻腔、口腔、および眼内への送達がある。ｉＲＮＡ剤は、投与に適した医薬組成物に組み込むことが可能である。例えば組成物は、１種または複数種のｉＲＮＡ剤および医薬として許容可能な担体を含み得る。本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な担体」は、医薬の投与と適合性がある、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。医薬活性物質用のためのこのような媒体および物質の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または物質が本発明の活性化合物と不適合でない限り、本組成物における使用が企図される。補助活性化合物を組成物中に組み込むことも可能である。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに応じて、および治療する領域に応じて、幾つかの方法で投与することが可能である。投与は（眼内、鼻腔内、経皮を含めた）局所投与、経口または非経口投与であってよい。非経口投与には、点滴静脈注射、皮下、腹膜内もしくは筋肉内注射、またはクモ膜下もしくは心室内投与がある。
【０１５８】
送達の経路は、患者の障害に応じて変更可能である。
一般にｉＲＮＡ剤は、任意の適切な方法によって投与することが可能である。本明細書で使用するように、局所送達とは、眼、粘膜、体腔表面を含めた身体の任意の表面、あるいは任意の内部表面へのｉＲＮＡ剤の直接的施用を意味しうる。局所投与用の配合物は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、スプレー、および液体を含み得る。従来の医薬担体、水性ベース、粉末ベースまたは油状ベース、増粘剤などが必要であるか、あるいは望ましい可能性がある。対象の表皮または真皮、またはその特定層、または下層組織にｉＲＮＡ剤を選択的に送達するための手段として、局所投与を使用することも可能である。
【０１５９】
クモ膜下または心室内投与用の組成物は滅菌水溶液を含むことが可能であり、滅菌水溶液は緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含み得る。
非経口投与用の配合物は滅菌水溶液を含むことが可能であり、滅菌水溶液は緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含み得る。例えばリザーバと連結させた心室内カテーテルによって、心室内注射を容易にすることが可能である。静脈内で使用するためには、溶質の総濃度を調節して調製物を等張にしなければならない。
【０１６０】
ｉＲＮＡ剤は、肺送達によって対象に投与することが可能である。肺送達用組成物は、分散物を患者に吸入させて、該分散物中の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺に達し、肺で肺胞領域を介して直接血液循環中に容易に吸収され得るように送達することが可能である。肺の疾患を治療するために、肺送達は全身送達および局所送達のいずれにも有効である可能性がある。
【０１６１】
霧状、エアロゾル状、ミセル状および乾燥粉末系の配合物の使用を含めた様々な手法によって、肺送達を実施することが可能である。液体噴霧器、エアロゾル系吸入器、および
乾燥粉末分散装置を用いて送達を実施することが可能である。定量装置が好ましい。噴霧装置または吸入器を使用する利点の１つは、装置内蔵式なので汚染の可能性が最少になることである。例えば乾燥粉末分散装置は、簡単に乾燥粉末として配合可能な薬剤を送達する。単独あるいは適切な粉末担体と組み合わせた凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として、ｉＲＮＡ組成物を安定して保存することが可能である。吸入用組成物の送達は、タイマー、容量測定器、計時デバイス、もしくは時間表示器を含み得る計量計時要素であって、装置に組み込むとエアロゾル薬剤投与中の投与量追跡、コンプライアンス調査、および／または患者への投与誘導が可能な計量計時要素によって仲介することが可能である。
【０１６２】
ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が血液脳関門を通ることが可能なように修飾することもできる。例えばｉＲＮＡ剤を、同剤が関門を通るのを可能にする分子と結合させることが可能である。このような修飾ｉＲＮＡ剤は、心室内または筋肉内注射などの任意の望ましい方法によって、あるいは例えば肺送達によって投与することが可能である。
【０１６３】
ｉＲＮＡ剤は、網膜の障害、例えば網膜症を治療するために眼内に投与することが可能である。例えば医薬組成物を、眼の表面または周辺組織、例えば瞼の内側に施用することが可能である。医薬組成物は、例えば噴霧によって、滴剤で、目薬または軟膏として、局所施用することが可能である。軟膏または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器などの、当技術分野で知られている眼内送達システムによって送達することが可能である。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）などの粘液類似物質、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロムなどの防腐剤、ならびに通常量の希釈剤および／または担体を含み得る。医薬組成物は眼の内部に投与することも可能であり、医薬組成物を選択した領域または構造に導入することが可能な、注射針または他の送達デバイスによって導入することが可能である。ｉＲＮＡ剤を含む組成物は、眼帯によって施用することも可能である。
【０１６４】
ｉＲＮＡ剤は、口腔または鼻腔送達によって投与することが可能である。例えば、これらの膜を介して投与される薬物は作用開始が早く、治療的血漿レベルをもたらし、肝臓代謝の初回通過効果を回避し、敵対的胃腸（ＧＩ）環境への薬剤の曝露を回避する。他の利点は、膜部位へのアクセスが容易であるため薬物が容易に適用、局在化および除去されうることである。
【０１６５】
投与は、対象者が行ってもよいし他の人間、例えば介護者が行ってもよい。介護者は、ヒトの介護に関与する任意の存在：例えば病院、ホスピス、医院、外来クリニック；医師、看護師、または他の従業者などの医療従事者；あるいは配偶者または親などの保護者であってよい。投薬は正確に測定した量で、あるいは一定量を送達するディスペンサーで提供することが可能である。
【０１６６】
疾患症状の改善または安定化に関して、対象を調べることも可能である。
用語「治療有効量」は、治療を受ける対象において望ましい薬物レベルをもたらして期待の生理学的応答を得るために必要とされる組成物中に存在する量である。
【０１６７】
用語「生理学的有効量」は、望ましい緩和または治癒効果を得るために対象に送達される量である。
用語「医薬として許容可能な担体」は、該担体が、肺に対する顕著で有害な毒性作用を伴わずに、肺に取り込まれうることを意味する。
【０１６８】
担体として有用である医薬賦形剤の種類には、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調整剤または
緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩がある。これらの担体は結晶形でも無定形でもよいし、あるいはこの２つの混合物であってよい。
【０１６９】
特に有用である充填剤には、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはこれらの組合せがある。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、トレハロースなどの二糖；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；ならびにラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールがある。炭水化物の好ましい群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、およびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドにはアスパルテームがある。アミノ酸にはアラニンおよびグリシンがあり、グリシンが好ましい。
【０１７０】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、有機酸および塩基から調製した有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどがあり、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０１７１】
１実施形態では、ｉＲＮＡを含む単位用量または測定用量の組成物を、インプラントデバイスによって投薬する。デバイスは、対象内のパラメータを調べるセンサーを含み得る。例えばデバイスは、浸透ポンプ、および場合によっては電子機器と連結したポンプなどのポンプを含み得る。
【０１７２】
天然のウイルスカプシド中、あるいは化学的に生成または酵素により生成した人工カプシドまたは該カプシド由来の構造体中に、ｉＲＮＡ剤をパッケージ化することが可能である。
【０１７３】
用量。ｉＲＮＡ剤は、体重１ｋｇあたり約７５ｍｇ未満／、または体重１ｋｇあたり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５ｍｇ未満の単位用量で、および体重１ｋｇあたり２００ナノモル（ｎｍｏｌｅ）（例えば、約４．４×１０１６コピー）未満のＲＮＡ剤、または体重１ｋｇあたり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌｅ未満のＲＮＡ剤の単位用量で投与することが可能である。単位用量を、例えば、注射（例えば、静脈内または筋肉内注射、クモ膜下注射、あるいは臓器への直接注射）、吸入投与、または局所施用によって投与することが可能である。
【０１７４】
臓器への直接の（例えば、直接肝臓への）ｉＲＮＡ剤の送達は、およそ約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ／臓器、あるいは好ましくは約０．０００１〜０．００１ｍｇ／臓器、約０．０３〜３．０ｍｇ／臓器、約０．１〜３．０ｍｇ／眼あるいは約０．３〜３．０ｍｇ／臓器の用量であってよい。
【０１７５】
用量は、疾患あるいは障害を治療あるいは予防するのに有効な量であってよい。
１実施形態では、１日１回より少ない頻度、例えば２、４、８または３０日毎よりも少ない頻度で、単位用量を投与する。他の実施形態では、単位用量は一定頻度では投与しない（例えば、規則的な頻度で投与しない）。例えば、単位用量を１回で投与することが可能である。
【０１７６】
１実施形態では、他の伝統的な治療形式で有効量を投与する。
１実施形態では、初回量、および１または複数の維持量のｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤へとプロセシングさ
れうる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を対象に投与する。１または複数の維持量は一般に初回量より低く、例えば初回量の半分である。維持治療法は１日に体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜７５ｍｇの範囲、例えば１日に体重１ｋｇあたり７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００５ｍｇの１または複数の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は５、１０、または３０日毎に１回を超えずに投与することが好ましい。さらに、該治療法は一定期間続けることが可能であり、該期間は個々の疾患の性質、重篤度、および患者の全体的な状態に応じて変わると思われる。好ましい実施形態では、１日当たり１回を超えずに、例えば、２４時間、３６時間、４８時間、あるいはさらに長い時間当たり１回を超えずに、例えば、５日または８日毎に１回を超えずに前記用量を送達することが可能である。治療後、患者の状態の変化に関して、および疾患状態の症状の緩和に関して、患者を調べることが可能である。化合物の用量は、患者が現行の用量レベルには有意に応答しない場合増大させてもよいし、あるいは疾患状態の症状の緩和が観察された場合、疾患状態が消散している場合、または望ましくない副作用が観察される場合は用量を減らすことも可能である。
【０１７７】
特定の状況下で望ましいかあるいは適切であると考えられるように、有効量を単回で投与してもよいし、あるいは２回以上の量で投与してもよい。反復注入または頻回注入を容易にすることが望ましい場合、送達デバイス、例えばポンプ、半透明ステント（例えば静脈内、腹腔内、脳槽内または嚢内ステント）、またはリザーバなどが妥当である。
【０１７８】
１実施形態では、ｉＲＮＡ剤医薬組成物は複数種のｉＲＮＡ剤を含む。これらのｉＲＮＡ剤は、天然に存在する標的配列、例えばＡｐｏＢ遺伝子の標的配列に関して重複せず隣接していない配列を有し得る。他の実施形態では、複数種のｉＲＮＡ剤が、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。例えば、ＡｐｏＢを標的とするｉＲＮＡ剤が、異なる遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と同じ医薬組成物中に存在していてもよい。他の実施形態では、複数のｉＲＮＡ剤は異なる対立遺伝子に特異的である。
【０１７９】
治療成功の後、患者に維持療法を施して疾患状態の再発を防止することが望ましい場合があり、この場合、本発明の化合物を体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持量で投与する（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照）。
【０１８０】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療または予防する際に、あるいはヒトの生理学的状態を制御するのに充分有効な量である。投与するｉＲＮＡ剤の濃度または量は、該ｉＲＮＡ剤および投与方法、例えば鼻腔、頬、または肺への投与に関して測定されたパラメータに依存すると思われる。例えば鼻腔用配合物は、鼻腔通路の炎症または火傷を回避するために、一部の成分の濃度がより低い必要がある傾向にある。経口配合物を１０〜１００倍まで希釈して、適切な鼻腔用配合物を提供することが望ましい場合もある。
【０１８１】
ある種の要因が対象を効果的に治療するのに必要とされる用量に影響を与える可能性があり、その要因には疾患または障害の重篤度、事前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患があるが、これらだけには限られない。さらに、治療上有効量のｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤へとプロセシングされうる大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば２本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を用いる対象の治療は単回治療を含むことが可能であり、あるいは好ましくは一連の治療を含むことが可能である。治療のために使用するｓｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤の有効用量が、個々の治療過程で増大または低下し得ることも理解されよう。用量の変更が、本明細書に記載するように診断アッセイの結果から実施され、かつ明らかとなる可能性が
ある。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後に対象を調査することが可能である。該調査からの情報に基づいて、さらなる量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することが可能である。
【０１８２】
投薬は、数日間〜数カ月間、あるいは治癒するかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで続く治療過程の間、治療する疾患状態の重篤度および応答性に応じて変わる。最適な投与スケジュールは、患者体内の薬物蓄積の測定値から計算することが可能である。当業者は、最適な用量、投与法および反復率を容易に決定することが可能である。最適用量は個々の化合物の相対的効能に応じて変わる可能性があり、一般にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが分かっているＥＣ５０値に基づいて推定することが可能である。幾つかの実施形態では、動物モデルは、ヒト遺伝子、例えば標的ＡｐｏＢのＲＮＡを生成する遺伝子を発現するトランスジェニック動物を含む。トランスジェニック動物は、対応する内在ＲＮＡが欠損していてもよい。他の実施形態では、試験用の組成物は、動物モデル中の標的ＡｐｏＢ  ＲＮＡとヒトの標的ＡｐｏＢ  ＲＮＡとの間で保存されている配列と、少なくとも内部領域において相補的であるｉＲＮＡ剤を含む。
【０１８３】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、該実施例はさらに限定を加えるものとして解釈すべきではない。
〔実施例〕
【０１８４】
実施例１．固相合成によりｓｉＲＮＡを生産した
試薬供給元
試薬供給元を本明細書に具体的に記載していない場合、かかる試薬は、分子生物学に適用するための標準的な品質／純度として、任意の分子生物学用試薬の供給元から入手可能である。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡの合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９合成機（アプライドバイオシステムズ、アプレラドイツ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在）および固体担体として微細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ、５００Å、グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、米国バージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）所在）を用いて、１μｍｏｌスケールで固相合成により１本鎖ＲＮＡを作製した。ＲＮＡおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを、それぞれ対応するホスホロアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイト（プロリゴバイオケミー社（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）所在）を用いて固相合成により作製した。これらのホスホロアミダイトを、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ボーケージ、エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）ら編、（ジョンワイリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在）に記載されている標準的なヌクレオシドホスホロアミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された位置に組み込んだ。ヨード酸化剤溶液をＢｅａｕｃａｇｅ試薬（クルアケム社（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ．）、英国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）所在）のアセトニトリル（１％）溶液で置き換えることにより、ホスホロチオエート結合を導入した。さらに補助試薬はマリンクロットベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ）（ドイツ国グリースハイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）所在）より得た。
【０１８６】
粗製オリゴリボヌクレオチドのアニオン交換ＨＰＬＣによる脱保護および精製を、確立された手順に従い行った。収率および濃度は、スペクトル光度計（ＤＵ６４０Ｂ、ベック
マンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ウンターシュレイフハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ）所在）を用いて２６０ｎｍの波長での各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収により決定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１００ｍＭ塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、水浴中８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却することにより、２本鎖ＲＮＡを生成させた。精製したＲＮＡ溶液を使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０１８７】
図１に示したように、コレステロールをｓｉＲＮＡに結合させた。これらの３’−コレステロール結合型ｓｉＲＮＡを合成するため、適切な修飾固体担体をＲＮＡ合成に使用した。修飾固体担体は以下の通りに調製した。
【０１８８】
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート  ＡＡ
【０１８９】
【化１】
2008514632.tif 000005
【０１９０】
４．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、氷冷攪拌したグリシン酸エチル塩酸（３２．１９ｇ、０．２３ｍｏｌ）の水（５０ｍＬ）溶液中に加えた。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３ｍｏｌ）を加え、ＴＬＣにより反応の完了を確かめるまで（１９時間）混合物を室温で攪拌した。１９時間後、該混合物をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配させた。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留すると、ＡＡが得られた（２８．８ｇ、６１％）。
【０１９１】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル  ＡＢ
【０１９２】
【化２】
2008514632.tif 000006
【０１９３】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に加えた。次いでジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温にし、さらに６時間攪拌した。反応の完結をＴＬＣにより確かめた。反応混合物を真空下に濃縮し、酢酸エチルを加えるとジイソプロピル尿素が沈殿した。懸濁液を濾過した。濾液を５％塩酸水溶液、５％炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮すると、粗製の生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡ
Ｃ／ヘキサン）により精製すると、ＡＢが１１．８７ｇ（８８％）得られた。
【０１９４】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル  ＡＣ
【０１９５】
【化３】
2008514632.tif 000007
【０１９６】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンに０℃で溶解した。溶液を１時間攪拌し続けた。反応混合物を真空下に濃縮し、残渣に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗製の生成物を塩酸塩に変換することにより精製した。
【０１９７】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル  ＡＤ
【０１９８】
【化４】
2008514632.tif 000008
【０１９９】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解した。懸濁液を氷上０℃に冷却した。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にコレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を終夜攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【０２００】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘ
キサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル  ＡＥ
【０２０１】
【化５】
2008514632.tif 000009
【０２０２】
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン３０ｍＬにスラリー化した。混合物を氷上０℃に冷却し、ジエステルＡＤ（５ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を２０分内で攪拌しながらゆっくり加えた。添加する間、温度を５℃未満に維持した。０℃で３０分間攪拌し続け、氷酢酸１ｍＬを加え、直ちに水４０ｍＬ中のＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（４ｇ）を加えた。得られた混合物をジクロロメタン各１００ｍＬで２回抽出し、合わせた有機抽出物をリン酸緩衝液各１０ｍＬで２回洗浄し、脱水し蒸発乾固した。残渣をトルエン６０ｍＬに溶解し、０℃に冷却し、ｐＨ９．５の冷炭酸塩緩衝液各５０ｍＬで３回抽出した。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に合わせ、クロロホルム各４０ｍＬで５回抽出し、抽出物を合わせ、脱水し、蒸発させて残渣を得た。２５％酢酸エチル／ヘキサンを用いるカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製すると、ｂ−ケトエステル１．９ｇ（３９％）が得られた。
【０２０３】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＦ
【０２０４】
【化６】
2008514632.tif 000010
【０２０５】
ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の還流混合物に、１時間かけてメタノール（２ｍＬ）を滴下添加した。還流温度で１時間攪拌し続けた。室温に
冷却後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混合物を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空下に濃縮すると生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）により精製した（８９％）。
【０２０６】
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＧ
【０２０７】
【化７】
2008514632.tif 000011
【０２０８】
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）を真空下にピリジン（２×５ｍＬ）と共に蒸発させることにより乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を攪拌しながら加えた。反応を室温で終夜行った。メタノールを加えることにより反応をクエンチした。反応混合物を真空下に濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残留しているピリジンをトルエンとともに蒸発させることにより除去した。粗製の生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０．５）により精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０２０９】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル  ＡＨ
【０２１０】
【化８】
2008514632.tif 000012
【０２１１】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空下４０℃で終夜乾燥させた。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴン雰囲気下室温で１６時間攪拌した。次いでジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷したクエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮乾固した。残渣はそのまま次のステップに使用した。
【０２１２】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ  ＡＩ
【０２１３】
【化９】
2008514632.tif 000013
【０２１４】
コハク酸塩ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解した。この溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍＬ）中トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は鮮やかなオレンジ色に変色した。Ｗｒｉｓｔ−Ａｃｔｉｏｎ（登録商標）振盪機を用いて溶液を短時間攪拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍｍ／ｇ）を加えた。懸濁液を２時間攪拌した。焼結漏斗を通してＣＰＧを濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタンおよびエーテルで順次洗浄した。未反応のアミノ基を無水酢酸／ピリジンを用いてマスクした。ＵＶ測定を行うことにより、ＣＰＧの装填能力を測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０２１５】
コレステロール結合型ＲＮＡ鎖の合成および構造を図１に示した。
実施例２．ｓｉＲＮＡをヒトおよびマウスＡｐｏＢ遺伝子中の標的領域に対して設計した
核酸配列を、標準命名法と、特に表２の略語を用いて以下に示す。
【０２１６】
【表２】
2008514632.tif 000014
【０２１７】
本明細書に記載した特定のオリゴヌクレオチドを、同オリゴヌクレオチドの３’末端にコレステロール部分を結合させるように修飾した（図１参照）。これらを５’−（ｎ）ｎ（Ｃｈｏｌ）−３’と表す。
【０２１８】
本明細書において、あるヌクレオチド配列内の「ｎ位」（ｎは整数）に言及するとき、該ヌクレオチド配列中のｎ番目のヌクレオチドに言及することを意味しており、その場合５’末端ヌクレオチドを第１番目のヌクレオチドとみなして３’方向に数え続ける。
【０２１９】
ヒトに使用するための治療薬は通常は最初に動物で試験されるため、動物モデル系ならびにヒトのいずれにおいても効果を有する可能性があるように、ｓｉＲＮＡを設計した。選択された動物モデル系はマウスで、ハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）であった。それゆえ、ｓｉＲＮＡ標的化のための配列を選択する第１の基準は、マウスおよびヒトのＡｐｏＢ間の交差反応性であった。
【０２２０】
ヒトと同様マウスにおいてもＡｐｏＢ遺伝子発現を潜在的に抑制すると思われるｓｉＲＮＡを選択するために、マウスＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿１３７９５５）およびヒトＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８４）のオープンリーディングフレームをコードする配列を、ペアワイズＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてアラインメントした。ＢＬＡＳＴプログラムに使用されている数学的アルゴリズムは、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）らの文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２、１９９７年）に記載されている。２３またはそれ以上の連続したヌクレオチドにおいて同一性を有する領域（マウスのオープンリーディングフレームにおけるヌクレオチドとして：４６３〜４９４、６２２〜６４７、６５８〜６８０、７０１〜７２５、１２１６〜１２４０、１２８２〜１３２０、１２９９〜１３２８、１３３９〜１３６２、２１２４〜２１５５、２８０７〜２８３０、２８０９〜２８３７、２８６０〜２９０１、３０３５〜３０５７、３１０３〜３１２５、３４４４〜３４６７、３６０８〜３６３５、４１３０〜４１６７、４３７４〜４４０２、４５０３〜４５２５、５９６２〜５９８５、６６９６〜６７２４、９２３２〜９２５７、９３４９〜９３７２、１０１７７〜１０２１３、１０４７７〜１０５０５、１０７９１〜１０８１４、１１０２０〜１１０４５、１２２２７〜１２２５１、１３５３９〜１３５７２）を同定した。
【０２２１】
長さが２３ヌクレオチドの全ての可能なヌクレオチド配列を決定した。このセットは、１７０のｓｉＲＮＡ標的領域候補となった。これらの配列を、ヒトおよびマウスのゲノムデータベースおよびｍＲＮＡデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索（ワードサイズ７、ミスマッチペナルティ−１、期待値１０００）により比較した。マウスｍＲＮＡデータベースおよびマウスゲノムデータベースにおけるあらゆる非ＡｐｏＢ配列に対して配列ミスマッチが３以下の全ての２３ヌクレオチド長標的領域候補を、最初のセットから除外した。残った８４個の標的領域候補を、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を得るための鋳型として利用した。それぞれのｓｉＲＮＡのセンス鎖は、前記標的領域候補のヌクレオチド３〜２３（５’→３’）と一致させた。アンチセンス鎖は、標的領域２３ヌクレオチド全長に対する逆向きの相補体と定義した。得られたｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端の２ヌクレオチド突出部分と、２１ヌクレオチドの塩基対合領域とを有していた。これら８４種のｓｉＲＮＡ候補のうち８１種を合成し、培養ヒトＨｅｐＧ２細胞におけるＡｐｏＢ発現の阻害について有効性を測定した。未処理の対照細胞におけるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルの５０％未満までＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡについて、ヒトおよび／またはマウス血清中での安定性も測定した。
【０２２２】
８４種の合成ｓｉＲＮＡ２重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を表３に示す。センス鎖は、全２３ヌクレオチドの領域のヌクレオチド３〜２３に相当し、該領域は、（ａ）マウスＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿１３７９５５）およびヒトＡｐｏＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００３８４）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）間で相同であり、（ｂ）ヒトおよびマウスのゲノムデータベースおよびｍＲＮＡデータベースにおける全ての他のエントリー配列と比較した場合に４以上のミスマッチを
有することが見出された領域である。表３に示したアンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドのセンス鎖領域のヌクレオチド１〜２３に相補的である。マウスＡｐｏＢのＯＲＦにおける対応する２３ヌクレオチドの領域の最も５’−側のヌクレオチドの位置も提示されている。
【０２２３】
【表３】
2008514632.tif 000015
【０２２４】
2008514632.tif 000016
【０２２５】
別例として、同じ８４種の標的領域候補について、ｓｉＲＮＡは１９の塩基対と２ヌクレオチドｄＴｄＴの突出部分とを備えて作製されてもよい。次いでセンス鎖は標的領域のヌクレオチド１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２、または５〜２３と一致し、２つのｄＴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチドの３’−末端に付加される。次いでこのように選択されたセンス鎖の逆向きの相補体を、アンチセンス鎖の鋳型として利用するということになり、また２つのｄＴヌクレオチドをその３’−末端に付加することになる。
【０２２６】
実施例３．ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルならびにタンパク質レベルのいずれにおいても細胞培養物においてＡｐｏＢ発現を阻害した
上記のｓｉＲＮＡの活性を、ＨｅｐＧ２細胞中で試験した。
【０２２７】
ＨｅｐＧ２培養細胞を使用して、分岐ＤＮＡアッセイにより、ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡと共にインキュベートした細胞から単離した全ｍＲＮＡ中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡを定量し、かつ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡと共にインキュベートした細胞の上清中のＡｐｏＢ１００タンパク質を定量した。ＨｅｐＧ２細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在、カタログ番号ＨＢ−８０６５）より入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（バイオクロム  アーゲー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ）、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｓ０１１５）、２ｍＭのＬ−グルタミン（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｋ０２３８）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ａ２２１３）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡ）（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｋ０２９３）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｌ０４７３）を含むように添加されたＭＥＭ（ギブコインビトロジェン、インビトロジェン社（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号２１０９０−０２２）中、加湿インキュベータ（ヘレウス  ヘラセル（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＨＥＲＡｃｅｌｌ）、ケンドロラボラトリープロダクツ社（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ドイツ国ランゲンゼルボルト（Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ）所在）にて５％ＣＯ２の雰囲気下３７℃で培養した。
【０２２８】
ｓｉＲＮＡでトランスフェクションするために、ＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルプレート中１ウェル当たり１．５×１０４個の細胞密度で播種し、２４時間培養した。ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号１２２５２−０１１）を用いて、製造業者の説明どおりにｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ２重鎖のスクリーニング用には１００ｎＭの濃度で、用量反応／５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を評価する際は１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、０．１４、および０．０５ｎＭの濃度で、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で培地を交換し、さらに２４時間細胞をインキュベートした。下記に記載するように、酵素結合免疫吸着アッセイによりＡｐｏＢ１００タンパク質濃度を評価するために、上清を採取して分析まで−８０℃で保存した。下記に記載するように、分岐ＤＮＡアッセイによりＡｐｏＢ  ｍＲＮＡを測定するために、細胞を採取し、ｍＲＮＡのｂＤＮＡ定量のためにＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅキット（ゲノスペクトラ社（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）、米国カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）所在、カタログ番号ＱＧ−０００−０２）の製造業者の推奨手順に従って細胞を溶解した。ただし、５０μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ原液（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在、カタログ番号ＭＰＲＫ０９２）２μｌを、組織および細胞溶解溶液（Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）６００μｌに加えた。溶解液は分岐ＤＮＡアッセイによる分析まで−８０℃で保存した。
【０２２９】
ＮｍｕＬｉ培養細胞を用いて、分岐ＤＮＡアッセイ（ｂＤＮＡアッセイ）によりマウスＡｐｏＢ  ｍＲＮＡを定量した。ＮｍｕＬｉ細胞（正常マウス肝臓、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６３８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｓ０１１５）および２ｍＭのＬ−グルタミン（バイオクロム
アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｋ０２３８）を含むように添加されたＤＭＥＭ（バイオクロム  アーゲー、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｆ０４３５）
中で、加湿インキュベータ（ヘレウス  ヘラセル（Ｈｅｒａｅｕｓ  ＨＥＲＡｃｅｌｌ）、ケンドロラボラトリープロダクツ社（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ドイツ国ランゲンゼルボルト（Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ）所在）で５％ＣＯ２を含む雰囲気下３７℃で培養した。
【０２３０】
トランスフェクションの１日前に、ウェル当たり４×１０３個の細胞を９６ウェルプレート上に播種した。ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を用いて、製造業者のプロトコル（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号１２２５２−０１１）に従い、３連としてｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション中の培地中のｓｉＲＮＡ濃度は、１５種の未修飾または修飾ｓｉＲＮＡ２重鎖のスクリーニング用には２００ｎＭとした。トランスフェクション後に細胞を２４時間培養し、その後増殖培地を、ｓｉＲＮＡを含まない新鮮な培地に交換した。ＨｅｐＧ２細胞について上記した通りに細胞溶解物を得て保存した。
【０２３１】
非コレステロール結合型対照として使用したｓｉＲＮＡ２重鎖の配列は以下の
【０２３２】
【化１０】
2008514632.tif 000017
【０２３３】
である。
ＡＬ−ＤＵＰ  ＨＣＶのセンス鎖は、Ｃ型肝炎ウイルス（受託番号：Ｄ８９８１５）の３’−非翻訳領域の９４７２位〜９４９３位に対応する。
【０２３４】
コレステロール結合型対照として使用したｓｉＲＮＡ２重鎖の配列は以下の
【０２３５】
【化１１】
2008514632.tif 000018
【０２３６】
である。
センス鎖のヌクレオチド１〜２１は、増強緑色蛍光タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｕ５７６０７）を有するクローニングベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ３中の８４３位〜８６４位に対応する。
【０２３７】
細胞上清中のＡｐｏＢ１００タンパク質レベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。透明平底ポリスチレン高結合マイクロプレート（Ｃｌｅａｒ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  
Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）（コーニングビーブイ  ライフサイエンス社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｂ．Ｖ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オランダ国スキポールライク（Ｓｃｈｉｐｈｏｌ−Ｒｉｊｋ）所在、カタログ番号９０１８）をアッセイに使用した。抗ヒトアポリポタンパク質Ｂヤギポリクローナル抗体（ケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ホーフハイム（Ｈｏｆｈｅｉｍ）所在、カタログ番号ＡＢ７４２）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、バイオクロム  アーゲー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ）、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｌ１８２−０５）中で１：１０００に希釈し、この希釈物１００μｌにて９６ウェルプレートを４℃で終夜コーティングした。ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号８０７６．２）３００μｌでブロッキングした後、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。
【０２３８】
細胞培養上清を解凍し、０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ
ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号９１２７．１）および０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１に希釈した。この希釈液１００μｌをそれぞれのウェルに加えた。室温で２時間インキュベーションした後、プレートを０．１％トゥイーン２０含有ＰＢＳで５回洗浄し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。０．１％トゥイーン２０および３％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトアポリポタンパク質Ｂ−１００ヤギポリクローナル抗体（アカデミィバイオメディカル社（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国テキサス州ヒューストン所在、カタログ番号２０Ｈ−Ｇ１−ｂ）１００μｌを、それぞれのウェルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。０．１％トゥイーン２０を含むＰＢＳで５回、ＰＢＳで３回プレートを洗浄した後、０．０３％過酸化水素（メルクバイオサイエンスゲーエムベーハー（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国バートゾーデン（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ）所在、カタログ番号３８６７９０）を含む２４ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（シグマ−アルドリッチ社、ドイツ国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在、カタログ番号Ｃ１９０９−１ＫＧ）（ｐＨ５．０）中０．９ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩、メルクバイオサイエンスゲーエムベーハー、カタログ番号５２３１２１）とともにウェルをインキュベートした。０．５ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４（メルクＫｇａＡ社、ドイツ国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在、カタログ番号１００７３１）を加えることにより酵素反応を停止し、４９０ｎｍでの吸光度を分光光度計（パーキンエルマーワラックビクトル３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３）１４２０マルチラベルリーダー、パーキンエルマー  エルエーエス  ゲーエムベーハー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ロドゴウ（Ｒｏｄｇａｕ）所在）で測定した。どのマウス遺伝子とも関連のないｓｉＲＮＡ２重鎖を対照として使用し、所与のＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖の活性を、処理した細胞の上清中のＡｐｏＢタンパク質濃度の、対照ｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した細胞の上清中のＡｐｏＢタンパク質濃度に対する百分率として表現した。ｓｉＲＮＡ２重鎖のセンス鎖へのコレステロール部分の結合は、培養ＨｅｐＧ２細胞中でのＡｐｏＢ分泌誘発効果を高めた。従って、１つのｓｉＲＮＡ２重鎖対照には、結合コレステロール部分を含めた（ＡＬ−ＤＵＰ  ５１２９）。
【０２３９】
分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイによりＡｐｏＢ１００のｍＲＮＡレベルを測定した。Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅキット（ゲノスペクトラ社（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）、米国カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）所在、カタログ番号ＱＧ−０００−０２）を用いてアッセイを行った。冷凍された細胞溶解物を室温で解凍し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅキットを用いて製造業者の指示
書に従いＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを定量した。捕捉伸長プローブ（ＣＥ）、標識伸長プローブ（ＬＥ）およびブロッキングプローブ（ＢＬ）のための核酸配列は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ（商標）ソフトウェア２．０（ゲノスペクトラ社（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）、米国カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）所在、カタログ番号ＱＧ−００２−０２）の助けを借りてＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨの核酸配列から選択した。マウスおよびヒトのＡｐｏＢの定量に使用したプローブヌクレオチド配列をそれぞれ表４および表５に示す。マウスおよびヒトのＧＡＰＤＨの定量に使用したプローブヌクレオチド配列をそれぞれ表６および表７に示す。
【０２４０】
【表４】
2008514632.tif 000019
【０２４１】
【表５】
2008514632.tif 000020
【０２４２】
【表６】
2008514632.tif 000021
【０２４３】
【表７】
2008514632.tif 000022
【０２４４】
ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、試料中に存在するＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの比を比較することにより、異なる試料間で正規化した。どのマウス遺伝子も標的としないＡＬ−ＤＵＰ  ＨＣＶ、およびコレステロール結合型のＡＬ−ＤＵＰ  ５１２９を対照として使用した。所与のＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖の活性を、処理した細胞中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ（ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）の、対照ｓｉＲＮＡで処置した細胞に対する百分率として表した。
【０２４５】
ＨｅｐＧ２細胞培養物中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルおよびＮｍｕＬｉ細胞の培養上清中のＡｐｏＢタンパク質レベルを減少させる活性について、８１種のｓｉＲＮＡ２重鎖をスクリーニングした結果を表８に示す。
【０２４６】
【表８】
2008514632.tif 000023
【０２４７】
2008514632.tif 000024
【０２４８】
2008514632.tif 000025
【０２４９】
表８の中で最も活性の高い２７種のｓｉＲＮＡ２重鎖を、残存ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが対照の＜３１％であるか、または残存ＡｐｏＢタンパク質レベルが対照の＜３５％である２重鎖として決定した。これらのｓｉＲＮＡ２重鎖を、更なる分析およびＩＣ５０値の決定のために選択した。これらのｓｉＲＮＡ２重鎖は、ＡＬ−ＤＵＰ
５０００、ＡＬ−ＤＵＰ  ５００２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０１３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３６、ＡＬ−ＤＵＰ
５０３８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０６０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８８、ＡＬ−ＤＵＰ
５０８９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１００、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１０１であった。
【０２５０】
上記２７種のｓｉＲＮＡ２重鎖を用いて用量漸増実験を行った。該実験では、各ｓｉＲＮＡ２重鎖の１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、０．１４、または０．０５ｎＭ溶液とともにインキュベーションした後に、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡをＮｍｕＬｉ細胞中で定量し、ＡｐｏＢタンパク質をＨｅｐＧ２細胞の培養上清中で定量した。最小の残存ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡおよびＡｐｏＢタンパク質レベルを決定した。上記２７種のｓｉＲＮＡのうち、最小の残存ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡおよびＡｐｏＢタンパク質レベルを併せて最も低い１５種に関して、用量漸増実験を３度繰り返し、得られたデータを、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出するために使用し、３つの測定値から平均値を算定した。ＩＣ５０は、用量漸増実験のデータを、コンピュータソフトウェアＸｌｆｉｔ４（アイディ  ビジネスソリューション社（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．）、英国ギルフォード（Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ）所在）で所定のカーブフィッティング法に供すること
により算出した。以下のパラメータを用いる線形フィッティングから得られたパラメータ化された式を用いて、ＩＣ５０値を算定した：用量反応１サイト（Ｄｏｓｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ）、４パラメータロジスティックモデル、ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（（１０＾Ｃ）／ｘ）＾Ｄ））））、ｉｎｖ＝（（１０＾Ｃ）／（（（（Ｂ−Ａ）／（ｙ−Ａ））−１）＾（１／Ｄ）））、ｒｅｓ＝（ｙ−ｆｉｔ）  （例として、図２参照）。
【０２５１】
ＮｍｕＬｉ細胞においてｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方を７０％以上（＞７０％）減少させた５つのＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡに関する平均ＩＣ５０値を表９に示す。対照実験から、培養したＮｍｕＬｉ細胞中の最小残存ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを未処理対照の百分率として、およびＨｅｐＧ２細胞上清中の最小残存ＡｐｏＢタンパク質を未処理対照の百分率として測定した。
【０２５２】
【表９】
2008514632.tif 000026
【０２５３】
更なる検討のためにＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８を選択した。
実施例６．ｓｉＲＮＡ２重鎖を修飾すると、ヌクレアーゼ耐性の改善を示した
例えば血清および細胞内媒質などの生体液中に存在するヌクレアーゼによる分解に対しオリゴヌクレオチド鎖の耐性を高めるために、ｓｉＲＮＡ２重鎖ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８を種々の化学修飾で変化させた。具体的には、ホスホロチオエート結合を、アンチセンス鎖の２１位と２２位の間および２２位と２３位の間に、および／またはセンス鎖の２０位と２１位の間に導入（表１０参照）することにより、エクソヌクレアーゼ分解に対するｓｉＲＮＡの安定性を増大させた。
【０２５４】
【表１０】
2008514632.tif 000027
【０２５５】
以前に、本研究室では、エンドヌクレアーゼによる分解攻撃を特に受けやすいｓｉＲＮＡ２重鎖中の特定の配列モチーフを同定した（共願かつ同時係属の米国特許出願第６０／５７４，７４４号明細書参照）。具体的には、これらのモチーフは、５’−ＵＡ−３’、５’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＣＣ−３’である。これらの配列モチーフを含むｓｉＲＮＡは、これらのジヌクレオチドモチーフ中の５’側ヌクレオチドのリボースサブユニットの２’−ＯＨを２’−Ｏ−ＣＨ３（本明細書では２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−Ｍｅとも呼ばれる）に置換することにより、エンドヌクレアーゼによる分解攻撃に対して安定化できる。それゆえに、センス鎖上もしくはアンチセンス鎖上のいずれか、または両方の鎖上に、５’−ＣＣ−３’を除き、存在する上記ジヌクレオチドモチーフ全てにおいて各ヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｍｅ基を有するように、ｓｉＲＮＡを合成した。
【０２５６】
次に試験した修飾は、ｓｉＲＮＡセンス鎖の３’−末端へのコレステロール部分の結合であった（図１参照）。この修飾は、細胞内へのＲＮＡの取り込みを容易にすると考えられる（マノハラン、エムら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）、「アンチセンスおよび核酸薬剤の開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１２巻、１０３〜１２８ページ）。
【０２５７】
表１０に示したｓｉＲＮＡ２重鎖を合成し、培養ＮｍｕＬｉ細胞により上清中に分泌されるＡｐｏＢタンパク質の量を減少させる活性について試験するとともに、血清インキュベーションアッセイにて核酸分解に対する安定性について試験した。
【０２５８】
次のｓｉＲＮＡ、すなわちＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８０、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８１のヌクレオチド配列は、以下の点を除いて同一である。
【０２５９】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４は、完全に非修飾ヌクレオチドのみで構成されている。
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３は、アンチセンス鎖の２１位と２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を、
ならびに２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６０】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６４は、センス鎖の４位、６位、８位、１２位、１４位、および２０位、ならびにアンチセンス鎖の１位、６位、７位、１３位、１５位、および１７位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６１】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５は、アンチセンス鎖の１位、６位、７位、１３位、１５位、および１７位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６２】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６は、そのセンス鎖の４位、６位、８位、１２位、１４位、および２０位に、ならびにそのアンチセンス鎖の２１位および２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６３】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８０は、そのセンス鎖の４位、６位、８位、１２位、１４位、および２０位に、ならびにそのアンチセンス鎖の２１位および２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間、ならびにセンス鎖の２０位と２１位の間にホスホロチオエート結合を有する。
【０２６４】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８１は、そのセンス鎖の４位、６位、８位、１２位、１４位、および２０位、ならびにそのアンチセンス鎖の１位、６位、７位、１３位、１５位、および１７位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間、ならびにセンス鎖の２０位と２１位の間にホスホロチオエート結合を有する。
【０２６５】
ｓｉＲＮＡ２重鎖ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１７０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８２、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８３のヌクレオチド配列は、以下の点を除いて同一である。
【０２６６】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８は、完全に非修飾ヌクレオチドのみで構成されている。
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、アンチセンス鎖の２１位と２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を、ならびに２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６７】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６８は、そのセンス鎖の３位、６位、８位、１１位、１５位、および１８位、ならびにそのアンチセンス鎖の２位、３位、６位、８位、１０位、１３位、１５位、１８位、および２１位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６８】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６９は、そのアンチセンス鎖の２位、３位、６位、８位、１０位、１３位、１５位、１８位、および２１位に２’−Ｏ−Ｍｅ基を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２６９】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１７０は、そのセンス鎖の３位、６位、８位、１１位、１５位、およ
び１８位、ならびにそのアンチセンス鎖の２１位および２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有し、かつセンス鎖の３’−末端にコレステロール部分が結合している。
【０２７０】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８２は、そのセンス鎖の３位、６位、８位、１１位、１５位、および１８位、ならびにそのアンチセンス鎖の２１位および２２位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間、ならびにセンス鎖の２０位と２１位の間にホスホロチオエート結合を有する。
【０２７１】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８３は、そのセンス鎖の３位、６位、８位、１１位、１５位、および１８位、ならびにそのアンチセンス鎖の２位、３位、６位、８位、１０位、１３位、１５位、１８位、および２１位に２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有し、アンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間、ならびにセンス鎖の２０位と２１位の間にホスホロチオエート結合を有する。
【０２７２】
表１０に示したｓｉＲＮＡの安定性を、マウス血清および９５％ヒト血清中で試験した。マウス血清は、シグマ（シグマ−アルドリッチケミー  ゲーエムベーハー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在、カタログ番号Ｍ５９０５）またはチャールスリバー（チャールスリバーラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ドイツ国ズルツフェルト（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）所在、カタログ番号ＭＡＳＥＲ）から入手した。本明細書に報告したアッセイ結果は、試験した異なる血清供給源の間で一貫していた。ヒト血清中での修飾ｓｉＲＮＡの安定性を試験するために、８名のヒトボランティアの血液（２７０ｍＬ）を採取し、室温で３時間保持した。次いで該血液プールを、Ｍｅｇａｆｕｇｅ（登録商標）１．０（ヘレウスインスツルメンツ、ケンドロラボラトリープロダクツゲーエムベーハー（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ランゲンゼルボルト（Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ）所在）を用いて２０℃および３０００ｒｃｆで遠心分離して、細胞画分から血清を分離した。上清を等分注して−２０℃で保存し、必要に応じて使用した。シグマ（シグマ−アルドリッチケミー  ゲーエムベーハー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在）から入手したヒト血清（カタログ番号Ｈ１５１３）を対照アッセイに使用した。
【０２７３】
６μｌのＰＢＳに溶解した２本鎖ＲＮＡ（３００ｐｍｏｌ、約４．２μｇ）をヒト血清６０μｌに加え、該混合物を、例えば０、１５、もしくは３０分、または１、２、４、８、１６、もしくは２４時間の様々な長さの時間、３７℃にてインキュベートした。その後、ＲＮＡ／血清溶液を含むチューブごと液体窒素中で冷凍して−８０℃で保存した。
【０２７４】
非コレステロール結合型ｓｉＲＮＡを分析するために、冷凍試料を氷上に置き、０．５ＭのＮａＣｌ（４５０μｌ）を加えた。完全に解凍した後、溶液をＰｈａｓｅ−Ｌｏｃｋ
Ｇｅｌ（登録商標）チューブ（エッペンドルフ社（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ドイツ国ハンブルク所在、カタログ番号００３２００５．１５２）に移液し、５００μｌの５０％フェノール、４８％クロロホルム、２％イソアミルアルコール（カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号Ａ１５６．２）と混合し、さらにクロロホルム３００μｌを加えた。チューブを３０秒間激しくボルテックスし、続いて４℃で１６，２００ｒｃｆにて１５分間遠心分離した。水性上清を新しいチューブに移液し、３ＭのＮａ−アセテートｐＨ５．２（４０μｌ）、ＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（商標）１μｌ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）、米国テキサス州所在、カタログ番号９５１６）および９５％エタノール１ｍｌと混合した。ＲＮＡを−２０℃で終夜沈殿させた。
【０２７５】
コレステロール結合型ｓｉＲＮＡを、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下での熱フェノール抽出により単離した。血清試料（６６μｌ）を、２００μｌのＲＮＡ緩衝液（０．５％ＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスｐＨ７．５）および２００μｌの水飽和フェノール（カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー、ドイツ国カールスルーエ所在、カタログ番号Ａ９８０．１）と混合した。反応チューブを６５℃で２０分間インキュベートした。相分離させるために、チューブを５分間氷上に置き、続いて４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。水相を新しいチューブに移液した。残ったフェノール相を、ＲＮＡ試薬１５０μｌを用いて１０秒間激しくボルテックスして２度目の抽出を行った。チューブを２分間氷上に置き、次いで４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。２度目の抽出の水相を移液し、最初の抽出の上清と合わせた。２μｌのＧｌｙｃｏＢｌｕｅ（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）、米国テキサス州オースチン所在、カタログ番号９５１６）および１ｍｌの９５％エタノールを加えることによりＲＮＡを沈殿させた。−２０℃で終夜にてＲＮＡの沈殿を完結させた。
【０２７６】
変性ゲル電気泳動により、単離したＲＮＡを分析した。沈殿したＲＮＡの入ったチューブを４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。上清を除去し廃棄した。ＲＮＡペレットを７０％エタノール４００μｌで洗浄し、４℃で１６，２００ｒｃｆにて５分間遠心分離することにより再度ペレット化した。全ての液体を除去し、ペレットをＳＴＯＰ緩衝液（９５％ホルムアミド、５％ＥＤＴＡ０．５Ｍ、０．０２％キシレンシアノール）２０μｌに溶解した。試料を９２℃で３分間煮沸し、素早く氷上で冷却した。変性１４％ポリアクリルアミドゲル（６Ｍ尿素、２０％ホルムアミド、カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー、ドイツ国カールスルーエ所在）に１０μｌを載せた。４５ｍＡで約２時間ＲＮＡを分離した。「ステインオール（ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ）」試薬（シグマ−アルドリッチケミー  ゲーエムベーハー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）所在、カタログ番号Ｅ９３７９）を用いて製造業者の指示書に従って染色することにより、ＲＮＡバンドを可視化した。
【０２７７】
非修飾型のＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４は、マウスおよびヒトの血清とともにインキュベーションした１時間後にはほぼ完全に分解したが、修飾ｓｉＲＮＡは分解に対してより耐性であった（図３参照）。電気泳動分離した後、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３に関しては最大でインキュベーション時間３時間まで、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８０、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８１に関しては最大６時間まで、ステインオール試薬で完全長ＲＮＡが染色された。最も大きな安定化効果はＡＬ−ＤＵＰ  ５１６４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８１において見られ、センス鎖中の分解しやすい部位を修飾することが最も効果的であることが示された。アンチセンス鎖をさらに修飾しても、ごく小さな安定化効果しか得られなかった（図３参照）。
【０２７８】
同様に、非修飾型のＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８は、マウス血清とともにインキュベーションした１時間後にはほぼ完全に分解したが、修飾ｄｓＲＮＡは分解に対する感受性が低かった。電気泳動分離した後、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１７０、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８２に関しては最大３時間、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６９に関しては最大６時間まで、ならびにＡＬ−ＤＵＰ  ５１６８およびＡＬ＝ＤＵＰ５１８３に関しては最大２４時間まで、ステインオール試薬により完全長ＲＮＡが染色された（図３参照）。
【０２７９】
インビボでさらに試験するための最も活性の高い２重鎖を選択するために、培養ＨｅｐＧ２細胞による上清中へのＡｐｏＢタンパク質分泌を減少させる効果について、表１０に示したｓｉＲＮＡ２重鎖を試験した。
【０２８０】
ＨｅｐＧ２細胞でのインビトロアッセイにおけるＡｐｏＢに特異的なコレステロール修飾ｓｉＲＮＡの発現抑制活性は、ＡｐｏＢ特異的な非修飾型ｓｉＲＮＡの活性に匹敵していた。コレステロールが結合していない２つのｓｉＲＮＡ、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８は、２００ｎＭの濃度でマウスＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルをそれぞれ８４±９％および７２±９％減少させたが、対応するコレステロール結合型かつ修飾型ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３は、それぞれ６１±８％および６８±９％の阻害活性を有していた。
【０２８１】
図５Ａ〜５Ｌは、ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖を１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、０．１４、または０．０５ｎＭ含む培地とともにインキュベートした培養ヒトＨｅｐＧ２細胞の上清中へのＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応曲線を示す。反応は、非特異的な対照ｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した細胞の上清中のＡｐｏＢ濃度に対する、ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した細胞の上清中のＡｐｏＢタンパク質濃度の比として表されている。これらの結果を基に、マウスで試験するために、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を選択した。
【０２８２】
実施例７．修飾ｓｉＲＮＡ２重鎖は、肝臓および空腸の組織切片中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ量、およびオスのＣ５７Ｂ１／６マウスの血清中のＡｐｏＢタンパク質のコレステロールレベルを減少させた
２７Ｇ針を用いて、尾静脈注射によりマウスにｓｉＲＮＡをボーラス投与した。ｓｉＲＮＡをＰＢＳに溶解して、体重１ｇ当たり８μｌの目的用量を送達可能な濃度とした。注射しやすいように、マウスを投薬前におよそ３分間赤外線ランプ下に置いた。
【０２８３】
投薬前の数日間、尾静脈から４〜７滴を採取することにより、処理前の血液試料を採取した。ＣＯ２窒息により屠殺し、約０．７ｍｌの血液を心臓穿刺により採取し、肝臓および空腸を採取し、２０〜４０ｍｇの組織分割物を液体窒素中で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。
【０２８４】
上述した通りに分岐ＤＮＡアッセイによりＡｐｏＢ１００ｍＲＮＡレベルを測定した。それぞれ約１０〜３０ｍｇの凍結組織切片（肝臓および空腸）の３連の試料を、８４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在、カタログ番号ＭＰＲＫ０９２）を含む組織および細胞溶解液（Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）１ｍｌ中で、約１５０μｍの振幅でそれぞれ０．９秒の３〜９パルスを用いて、超音波処理（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  Ｓｏｎｏｐｕｌｓ（商標）ＨＤ２０７０、バンデリンエレクトロニック  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー（ＢＡＮＤＥＬＩＮ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ）、ドイツ国ベルリン所在）することにより均一化した。溶解物を分析前に少なくとも１２時間（終夜）−８０℃に置いた。
【０２８５】
凍結した溶解物を室温で解凍し、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｐｌｏｒｅキットを用いて、製造業者の指示書に従いＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを定量化した。捕捉伸長プローブ（ＣＥ）、標識伸長プローブ（ＬＥ）およびブロッキングプローブ（ＢＬ）のための核酸配列は、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ（登録商標）ＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ（商標）ソフトウェア２．０（ゲノスペクトラ社（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）、米国カリフォルニア州フレモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）所在、カタログ番号ＱＧ−００２−０２）の助けを借りてＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨの核酸配列から選択した。ＡｐｏＢの定量
に使用したプローブヌクレオチド配列を表４に示す。ＧＡＰＤＨの定量に使用したプローブヌクレオチド配列を表６に示す。
【０２８６】
組織試料中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに対するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの比を各処理群で平均化し、未処理の対照群または無関係のｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した対照群と比較した。
マウス血清中のＡｐｏＢ１００タンパク質量を定量するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。アッセイを行うために、９６ウェルプレートをマウスＡｐｏＢ１００特異的モノクローナル抗体ＬＦ３（２５μｇ／ｍｌ；ズロット  シーエッチら（Ｚｌｏｔ，Ｃ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．）、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．１９９９年、第４０巻、７６〜８４ページ）１００μｌでコーティングし、同プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＳダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）、バイオクロム  アーゲー（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ）、ドイツ国ベルリン所在、カタログ番号Ｌ１８２−０５）で３回洗浄し、次いでそれぞれのウェルに３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号８０７６．２）を含むＰＢＳ（３００μｌ）を加えることにより、残った結合部位をブロッキングした。プレートを室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳで５回洗浄した。０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号９１２７．１）および３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（１００μｌ）で希釈したマウス血清０．２μｌをそれぞれのウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳで５回洗浄した。抗マウスアポリポタンパク質Ｂ４８／１００ウサギポリクローナル抗体（アクリスアンチボディーズ  ゲーエムベーハー（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ヒデンハイム（Ｈｉｄｄｅｎｈｅｉｍ）所在、カタログ番号ＢＰ２０５０）の１：５００希釈液１００μｌをウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した抗ウサギＩｇＧロバ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国カリフォルニア州サンタクルーズ所在、カタログ番号ｓｃ２００４）１００μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄し、０．０３％過酸化水素（メルクバイオサイエンスゲーエムベーハー（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国バートゾーデン（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ）所在、カタログ番号３８６７９０）を含む２４ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（シグマ−アルドリッチ社、ドイツ国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在、カタログ番号Ｃ１９０９−１ＫＧ）ｐＨ５．０中０．９ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩、メルクバイオサイエンスゲーエムベーハー（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国バートゾーデン（Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ）所在、カタログ番号５２３１２１）とともにウェルをインキュベートした。０．５ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４（メルクＫｇａＡ社、ドイツ国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在、カタログ番号１００７３１）を加えることにより酵素反応を停止し、４９０ｎｍでの吸光度を分光光度計（パーキンエルマーワラックビクトル３（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ３）１４２０マルチラベルリーダー、パーキンエルマーＬＡＳゲーエムベーハー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ロドゴウ（Ｒｏｄｇａｕ）所在）で測定した。
【０２８７】
コレステロールＦＳ試薬キット（ダイアシスダイアグノスティックシステムズゲーエムベーハー（ＤｉａＳｙｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ホルツハイム（Ｈｏｌｚｈｅｉｍ）所在）を用いて、製造業者の指示書に従いマウス血清中の血清総コレステロールを測定した。分光光度計（ＤＵ６４０Ｂ、ベックマンコールターゲーエムベーハー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ウンタ
ーシュレイフハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ）所在）で測定を行った。
【０２８８】
注射後の肝臓および空腸組織ならびに血清中のｓｉＲＮＡを検出するために、Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイを使用した。分岐ＤＮＡアッセイ用に、動物組織の小断片（１０〜３０ｍｇ）を上述した通りに均一化した。これらの溶解物は、直ちに処理するか、または−８０℃で保存してアッセイを行う前に室温で解凍した。溶解物１００μｌを新しい反応チューブに移し、２００μｌのＳＴＥ（塩化ナトリウム−トリス−ＥＤＴＡ緩衝液；５００ｍＭのＮａＣｌ、９ｍＭのトリスｐＨ７．５、０．９ｍＭのＥＤＴＡ）および２００μｌのフェノール（トリス−ＥＤＴＡ飽和フェノール、ロティフェノール（Ｒｏｔｉ−ｐｈｅｎｏｌ）、カールロス  エムベーハー  ウント  コー  カーゲー（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ
ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号００３８．１）と混合した。該チューブを、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（登録商標）２（サイエンティフィックインダストリーズ社（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ボヘミア（Ｂｏｈｅｍｉａ）所在、カタログ番号ＳＩ−０２５６）で３０秒間最大速度にて激しく混合し、続いて４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。約３１０μｌの水性上清を注意深く吸引して新しい反応チューブに移液し、５０μｇの大腸菌ｔＲＮＡ（ロシュダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ドイツ国ペンツバーグ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ）所在、カタログ番号１０９  ５４１）および９５％エタノール９００μｌと混合した。−２０℃で終夜、ＲＮＡを沈殿させた。
【０２８９】
Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイに使用するＤＮＡプローブを放射標識した。２５〜２７ヌクレオチド長のプローブは、ｓｉＲＮＡ分子の２１ヌクレオチドのセンス鎖配列に相当するが、３’−末端にさらに４〜６ヌクレオチドの非相補的な伸長部分を含むものとした。該ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをγ−３２Ｐ  ＡＴＰでリン酸化して、５’−末端に放射活性リン酸基を導入した。それぞれのプローブ１５ｐｍｏｌを、γ−３２Ｐ  ＡＴＰ（アマシャムジーイー−ヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在、カタログ番号ＡＡ００１８）５０μＣｉと混合し、１０Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ドイツ国フランクフルト所在、Ｍ０２０１Ｓ）を、ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ドイツ国フランクフルト所在、カタログ番号Ｍ０２０１Ｓ）中で全量が５０μｌとなるように混合した。この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。該反応混合物をＭｉｃｒｏｓｐｉｎ（商標）Ｇ−２５脱塩カラムに製造業者（アマシャムジーイー−ヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在、カタログ番号２７−５３２５−０１）の指示書に従って通すことにより、標識反応を停止させた。得られたプローブ溶液は１〜３日以内に使用した。
【０２９０】
マウス組織溶解物からｓｉＲＮＡを検出するために、溶解物から沈殿させた全ＲＮＡを、４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。核酸ペレットを保持しながら、上清を注意深く除去し廃棄した。最初にこのペレットを５０μｌのＳ１−ハイブリダイゼーション緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３８ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、０．１％のトリトンＸ−１００）に再懸濁させ、次いで放射性ＤＮＡプローブ溶液１μｌを加えた。ハイブリダイゼーション反応混合物を９２℃に２分間加熱した。反応チューブを直ちに３７℃のヒートブロックに移し、さらに３０分間インキュベートした。室温でさらに２時間ハイブリダイゼーションを続けた。
【０２９１】
血清中のｓｉＲＮＡ濃度を決定するためには、血清１μｌを、Ｓ１−ハイブリダイゼーション緩衝液５０μｌおよび放射性ＤＮＡプローブ１μｌと混合し、上記のようにハイブ
リダイゼーションを続けた。
【０２９２】
以下のプローブを使用した：
【０２９３】
【化１２】
2008514632.tif 000028
【０２９４】
加えて、肝臓および空腸で内在的に発現しているマイクロＲＮＡ（肝臓；ｍｉＲＮＡ１２２、空腸；ｍｉＲＮＡ１４３）とハイブリダイズする２つのプローブを、装荷量の対照として使用した。
【０２９５】
【化１３】
2008514632.tif 000029
【０２９６】
ハイブリダイゼーション後、Ｓ１ヌクレアーゼ消化混合物４５０μｌを各チューブに加え（４５０μｌのＳ１反応混合物：３３３ｍＭのＮａＣｌ、２．２ｍＭのＺｎ−アセテート、６６．７ｍＭのＮａ−アセテートｐＨ４．５、０．０２％トリトンＸ−１００および１００ＵのＳ１ヌクレアーゼ；アマシャムジーイー−ヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在、カタログ番号Ｅ２４１０Ｙ）、ハイブリダイズしていないプローブを分解した。消化反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。５００ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）７μｌ中のｔＲＮＡ（ロシュダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ドイツ国ペンツバーグ（Ｐｅｎｚｂｅｒｇ）所在、カタログ番号１０９  ５４１）３０μｇおよび９５％エタノール９００μｌを加えることにより、消化反応を停止させた。この保護されたプローブを−２０℃で終夜または−８０℃で９０分間沈殿させた。
【０２９７】
沈殿後、前記の保護化プローブを変性ゲル電気泳動により分析した。沈殿した２重鎖ＲＮＡを４℃で１６，２００ｒｃｆにて１０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し廃棄した。ペレットをＳＴＯＰ緩衝液（９５％ホルムアミド、５％ＥＤＴＡ０．５Ｍ、０．０２％キシレンシアノール）１２μｌに溶解した。チューブを９２℃に２分間加熱し、次いで直ちに氷上で冷却した。該溶液を変性シークエンシングゲルの各レーンあたり４μｌ装荷した（変性シークエンシングゲル：１２．５％アクリルアミド、１×標準ＴＢＥ緩衝液、１９ｃｍ×２０ｃｍ×０．４ｍｍ（長さ×幅×奥行き）、Ｒｏｔｉｐｈｏｒｅｓｅ（登録商標）ＤＮＡシークエンシングシステム、カールロス  ゲーエムベーハー  ウント  コー  カーゲー（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧ）、ドイツ国カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）所在、カタログ番号Ａ４３１．１）。およそ３０Ｖ／ｃｍの電圧勾配に相当する６００Ｖで４５分間ゲルを泳動した（ＥＰＳ３５０１ＸＬ、アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、スウェーデン国ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在、カタログ番号１８−１１３０−０５）。ゲルを紙の上で乾燥させ、汎用性の蛍光スクリーンイメージャ（アマシャムジーイー−ヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在、カタログ番号６３−００３４−８８）に終夜曝露した。翌日、放射性バンドをＴｙｐｈｏｏｎ（登録商標）９２００高性能イメージャ（アマシャムジーイー−ヘルスケア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ドイツ国フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）所在、カタログ番号６３−００３８−４９）で可視化した。放射性バンド強度の定量は、ゲル上に装荷した６０、２０、６．６、および２．２ｆｍｏｌの希釈系列の各放射性プローブと比較することにより、Ｔｙｐｈｏｏｎ（登録商標）９２００イメージャ付属のＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ＴＬソフトウェアバージョン２００３．０１を用いて実施した。
【０２９８】
以下に記載したヒトＡｐｏＢを発現するトランスジェニック動物を用いる実験以外は、全ての動物実験を、実験その他科学的目的に使用される脊椎動物の保護のための欧州協定
（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｒｐｏｓｅ）の規制に準拠して行った。オスのＣ５７Ｂｌ／６マウスはチャールスリバーラボラトリーズ社（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ドイツ国ズルツフェルト（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）所在）から入手し、使用する前の少なくとも５日間環境に馴化させた。動物を２２±２℃および５５±１０％相対湿度で飼育した。昼／夜リズムは、６：００ａｍ（点灯）および６：００ｐｍ（消灯）で切り換える１２時間とした。以下に別途特記しない限り、動物にはＳｓｎｉｆｆ（登録商標）Ｒ／Ｍ−Ｈ飼料（スニフ  スペツィアルディアーテン  ゲーエムベーハー（Ｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｅｔｅｎ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ゾースト（Ｓｏｅｓｔ）所在、カタログ番号Ｖ１５３１）を自由摂取として与えた。
【０２９９】
以下の実験プロトコルを行った。
Ａ）それぞれ３．５月齢の７匹の動物からなる３群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６（配列は表１０参照）を３日間連続で１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ用量として、または等量の担体を与え、４日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清中ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【０３００】
センス鎖の４位、６位、８位、１２位、１４位、および２０位のヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾されているＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６は、その他の点で同一のＡＬ−ＤＵＰ
５１６３と比較して、血清中での分解に関して高い安定性を有していた（図３参照）。この実験は、マウスＡｐｏＢに特異的なｓｉＲＮＡについて、マウスの肝臓および空腸におけるＡｐｏＢ遺伝子の発現を下方制御し、血清中のＡｐｏＢタンパク質レベルおよびコレステロールレベルを低下させる能力について試験するために設計された。この実験はまた、センス鎖に生体血清中での安定性を増加させる２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有するｓｉＲＮＡが、センス鎖の２’ＯＭｅ修飾を行っていないｓｉＲＮＡよりも、ＡｐｏＢ発現を下方制御する能力が高いかどうかをも試験した。
【０３０１】
肝臓および空腸組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイにより調べた。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３は、肝臓組織試料中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、対照動物の肝臓組織中に存在するレベルの５０±１３％に低下させることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの４０±６％に低下した。
【０３０２】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６は、肝臓組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、対照動物の組織中のｍＲＮＡレベルの５９±９％に低下させることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの１４±３％に低下した。
【０３０３】
Ｂ）それぞれ３．５月齢の７匹の動物からなる２つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７（配列は表１０参照）を３日間連続で１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ用量として、または等量の担体を用いて処理した。マウスを４日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清中ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【０３０４】
ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを分岐ＤＮＡアッセイにより決定した。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、対照動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの４１±６％に低下させることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの２９±９％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、対照レベルの１０１±９％でほとんど変化がなかった。血清コレステロールは、担体対照の６０±２２％に低下した。
【０３０５】
Ｃ）それぞれ２．５月齢の７匹の動物からなる３つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５を３日間連続で１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ用量として、または等量の担体を与え、４日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清中ＡｐｏＢ１００濃度、および肝臓のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【０３０６】
アンチセンス鎖の１位、６位、７位、１３位、１５位、および１７位のヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を有するＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５は、その他の点で同一のＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３（配列は表１０参照）と比較して、血清中での分解に関して安定性は増加した（図３参照）が、その安定化効果はＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６において見られた効果ほどは強くなかった。この実験では、マウスＡｐｏＢに特異的であり、かつアンチセンス鎖に安定化修飾を有するｓｉＲＮＡの、マウスの肝臓および空腸におけるＡｐｏＢ遺伝子の発現を下方制御し、血清ＡｐｏＢおよびコレステロールレベルを低下させる能力について比較した。この実験はまた、血清中での安定性が増大するように修飾されたｓｉＲＮＡが、ＡｐｏＢ発現を下方制御する能力が高いかどうかについても試験した。
【０３０７】
ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを測定するために、分岐ＤＮＡアッセイを使用した。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５は、処理群マウスの肝臓組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、担体のみを与えた対照動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの６８±１２％に低下させることが見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、対照レベルの６３±６％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの９９±２６％であり変化が見られなかった。
【０３０８】
Ｄ）それぞれ２．５月齢の６匹の動物からなる４つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１を３日間連続で１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ用量として、または等量の担体を与え、４日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清中ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【０３０９】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のヌクレオチド配列は表１０に示されている。ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１およびＡＬ−ＤＵＰ  ３００１の配列は以下の通りである。
【０３１０】
【化１４】
2008514632.tif 000030
【０３１１】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１は、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７に対して４、１０、１４、および
１９位の４箇所にＧ／Ｃスイッチを作製した、マウスＡｐｏＢ  ｍＲＮＡミスマッチｓｉＲＮＡを表す。このｓｉＲＮＡは、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７と比較するための陰性対照とした。
【０３１２】
ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１は関連のない対照ｓｉＲＮＡを表す。ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１のセンス鎖の１〜２１位の配列は、クローニングベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ  ゲーエムベーハー（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在、カタログ番号Ｅ１７５１）、受託番号Ｕ４７２９５のヌクレオチド１２５２〜１２７２に相当し、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼをコードする配列の一部である。ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１は、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７に対する別の陰性対照として機能するものとした。
【０３１３】
この実験は、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で得られた初期の結果を確かめ、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で見られた効果が配列特異的であることをさらに示すことを意図したものである。
【０３１４】
分岐ＤＮＡアッセイによりＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、処理群マウスの肝臓組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを、対照動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの３６±１１％に低下させることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの２７±８％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのおよそ２９±１６％に低下した。血清コレステロールレベルは、７３±３５％でほぼ不変であった。
【０３１５】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１では、処理群マウスの肝臓組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、担体を注射した対照動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの９５±１６％でありほぼ不変であることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの１２０±１９％でありほぼ不変であることが見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０９±７６％でありほぼ不変であった。血清コレステロールレベルは、担体対照の７７±４３％でありほぼ不変であることが見出された。
【０３１６】
ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１では、処理群マウスの肝臓組織中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルが、担体のみを与えた対照動物の肝臓組織中のｍＲＮＡレベルの７９±２２％であり、ほとんど不変であることが見出された。空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは、対照動物中のレベルの１３０±３３％でありほとんど変化がないことが見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０４±５５％でありほとんど変化がないことが見出された。血清コレステロールレベルは、担体対照レベルの１０８±４６％でありほとんど変化がないことが見出された。
【０３１７】
Ｅ）それぞれ２．５月齢の６匹の動物からなる７つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１を３日間連続で１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ用量として、または等量の担体を与えるか、あるいは３日間連続でＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を１日あたり１０ｍｇ／ｋｇ用量として与えるか、または３日間連続でＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を１日あたり２ｍｇ／ｋｇ用量として与えるか、または１日目に５０ｍｇ／ｋｇ用量を１回与えるかのいずれかの処理を行った。マウスを４日目に屠殺した。別の動物６匹の群には、１日目に、背部の肩甲骨よりもわずかに後方に、浸透圧ポンプインプラント（Ａｌｚｅｔ（登録商標）１００７Ｄ、アルゼット浸透圧ポンプデュレクト社（ＡＬＺＥＴ  Ｏｓｍｏｔｉｃ  Ｐｕｍｐｓ  ＤＵＲＥＣＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国カリフォルニア州クパチーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ）所在）を皮下に埋め込んだ。このポンプを、０．３３ｍｇ／μｌのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７溶液が０．５μｌ／時で７日間供
給されるように設定し、動物１匹あたり１日に体重１ｋｇあたりおよそ４ｍｇの１日用量となるようにした。この群の動物は８日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清中ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルを決定した。
【０３１８】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１およびＡＬ−ＤＵＰ  ３００１のヌクレオチド配列は上記に記載されている。
この実験は、対照として担体、ミスマッチｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１）、および関連のないｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１）を用いて、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で得られた初期の結果を確かめ、かつ３日間連続の体重１ｋｇあたり２または１０ｍｇのボーラス静脈注射投与が、または１日目に体重１ｋｇあたり５０ｍｇの単回投与が、上記（Ｃ）および（Ｄ）において３日間連続で体重１ｋｇあたり５０ｍｇを静脈内投与する際に見られた効果を導き出すに充分であるかどうかをさらに決定することを意図したものである。さらにこの実験は、上記投薬計画を、浸透圧ポンプから７日間にわたって１日当たり体重１ｋｇにつき４ｍｇの低用量を連続的に送達する場合と比較するように設定された。
【０３１９】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、体重１ｋｇにつき５０ｍｇの用量で、３日間連続で静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの６９±１７％に低下することが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物のレベルの２４±８％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は担体対照レベルの６９±９％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの９５±２９％でありほとんど不変であることが見出された。
【０３２０】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、体重１ｋｇにつき１０ｍｇの用量で、３日間連続で静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの８１±３２％でありほとんど不変のままであることが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの６２±１３％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０１±１９％でほとんど変化がなかった。血清コレステロールは担体対照レベルの１０１±２９％で、ほとんど変化がないことが見出された。
【０３２１】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、体重１ｋｇにつき２ｍｇの用量で、３日間連続で静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの１０９±３８％でありほとんど不変のままであることが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの９７±２１％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は担体対照レベルの１１５±１３％であり、ほとんど変化がなかった。血清コレステロールは担体対照レベルの１１４±２６％であり、ほとんど変化がないことが見出された。
【０３２２】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇの用量で、１日目に１回静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの４１±２０％に低下することが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの６２±２３％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５２±１１％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの９５±２５％でほとんど変化がないことが
見出された。
【０３２３】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇの用量で、３日間連続で静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの１００±１６％でありほとんど不変のままであることが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの１００±２０％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの９７±１１％でほとんど変化がなかった。血清コレステロールは、担体対照レベルの１２９±３７％でほとんど変化がないことが見出された。
【０３２４】
ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１を、体重１ｋｇあたり５０ｍｇの用量で、３日間連続で静脈内投与し、続いて４日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの９７±２８％でほとんど不変のままであることが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの１０１±１６％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０６±６％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの１２９±４３％でほとんど変化がないことが見出された。
【０３２５】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、１日当たり体重１ｋｇにつき４ｍｇの用量で、浸透圧ポンプから７日間かけて送達し、続いて８日目に屠殺した場合、分岐ＤＮＡアッセイにより決定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのレベルは、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するｍＲＮＡレベルの７９±２４％でほとんど不変のままであることが見出され、空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡレベルは対照動物中のレベルの７０±１９％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０６±６％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの１２９±４３％でほとんど変化がないことが見出された。
【０３２６】
Ｆ）それぞれ２．５月齢の６匹の動物からなる７つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７を、１日目に体重１ｋｇあたり５０ｍｇの単回ボーラス注射として与えた。対照群の６匹の動物には、等量の担体を与えた。ｓｉＲＮＡを与えた動物群は、投与の１２、２４、３６、６０、８４および１０８時間後に屠殺した。担体を与えた対照群は投与後８４時間で屠殺した。肝臓および空腸のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを測定した。
【０３２７】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のヌクレオチド配列は上記の通りである。
この実験は、肝臓および空腸におけるＡｐｏＢのｍＲＮＡレベル、ならびに血清中のＡｐｏＢおよびコレステロール濃度に対する、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の影響の経時変化を得るために設計した。
【０３２８】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１２時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの１００±３２％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの１４５±７８％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１２４±１４％であると測定された。
【０３２９】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後２４時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８５±２１％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８４±３２％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢ
タンパク質濃度は、担体対照レベルの９２±５２％であると測定された。
【０３３０】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後３６時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの６４±２０％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８８±１９％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５５±１２％に低下した。
【０３３１】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後６０時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの７３±１０％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの４１±１３％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの４３±１６％に低下した。
【０３３２】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後８４時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの７２±１３％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの６８±２２％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５４±１５％に低下した。
【０３３３】
５０ｍｇ／ｋｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１０８時間で屠殺した動物では、肝臓中に、担体のみを与えた動物の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの６８±１５％が見出され、空腸においては、担体のみを与えた動物の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８５±１５％が見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５１±８％に低下した。
【０３３４】
Ｇ）それぞれ２．５月齢の１０匹の動物からなる５つの群に、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６のいずれかを３日間連続で静脈内に１日当たり体重１ｋｇにつき５０ｍｇの用量として、あるいは等量の担体を与え、１群の７匹の動物には同じ投与法によってＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３を与え、全ての動物を４日目に屠殺した。血清総コレステロール、血清ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを測定した。さらに、肝臓および空腸の試料中に存在するｓｉＲＮＡの量を、Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって概算した（図６参照）。
【０３３５】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１のヌクレオチド配列は上記の通りである。ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５およびＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６のヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【０３３６】
【化１５】
2008514632.tif 000031
【０３３７】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５は、センス鎖の３’端にコレステロール部分がなく、センス鎖の２０位と２１位の間にホスホロチオエート結合を有すること以外、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７と同一である。このホスホロチオエート基は、ホスホロチオエート含有コレステロール修飾と同様にエクソヌクレアーゼ分解に対する保護を付与することを意図したものである（図１参照）。
【０３３８】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６は、アンチセンス鎖の２３位の２’−Ｏ−メチル修飾を除去し、２１位に２’−Ｏ−メチル修飾を加えたこと以外、ＡＬ−ＤＵＰ  ３００１と同一である。これは、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６にＡＬ−ＤＵＰ  ３００１よりも優れた分解に対する安定性を付与すると考えられた。
【０３３９】
この実験は、上記の（Ｅ）で得た結果を確認し、コレステロール結合型のＡＬ−ＤＵＰ
５１６７の活性とコレステロール非結合型であるがその他は同一のＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５の活性とをさらに比較し、かつＡＬ−ＤＵＰ  ３００１に関して見られたＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ発現阻害活性の欠如が、処理群マウス血清中のＡＬ−ＤＵＰ  ３００１の急速な分解によるものではなかったことを確認するために設計した。
【０３４０】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの４３±６％に低下させたことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの２７±１０％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの３２±１４％に低下した。マウス血清中の血清コレステロール濃度は、担体対照レベルの６３±１１％に低下した。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって、組織１ｇ当たり約１００〜２００ｎｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７が肝臓および空腸組織試料中で検出された（図６Ａ）。
【０３４１】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの６４±８％に低下させたことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの４９±１３％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの６６±２０％に低下した。マ
ウス血清中の血清コレステロール濃度は、担体対照レベルの９４±１０％でほぼ不変であった。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって、組織１ｇ当たり約５０〜１５０ｎｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３が肝臓および空腸組織試料中で検出された。
【０３４２】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの８４±１２％としてほぼ不変に保ったことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの１１５±２５％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０１±２４％で不変であることが見出された。マウス血清中の血清コレステロール濃度は、担体対照レベルの９７±１０％でほぼ変わらなかった。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイにおいて、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５は肝臓および空腸組織試料中で検出不能な状態であった（図６Ａ）。
【０３４３】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの９６±１６％としてほぼ不変に保ったことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの９６±２８％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０２±３２％で不変であることが見出された。マウス血清中の血清コレステロール濃度は、担体対照レベルの１０４±１０％でほぼ変わらなかった。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって、組織１ｇ当たり約５０〜２００ｎｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１が肝臓および空腸組織試料中で検出された（図６Ａ）。
【０３４４】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの８９±１１％としてほぼ不変に保ったことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの８５±１４％になった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの９４±３１％で不変であることが見出された。マウス血清中の血清コレステロール濃度は、担体対照レベルの１０４±１０％でほぼ変わらなかった。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって、組織１ｇ当たり約５０〜２００ｎｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６が肝臓および空腸組織試料中で検出された（図６Ａ）。
【０３４５】
Ｈ）それぞれ２．５月齢の６匹の動物からなる６つの群に、体重１ｋｇあたり１００、５０、２５または１２．５ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、または等量の担体の単回静脈内ボーラス投与を実施した。動物は投与後７２時間で屠殺した。血清総コレステロール、血清ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを測定した。
【０３４６】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のヌクレオチド配列は表１０において上記した通りである。
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７に関する用量反応を評価するために、この実験を実施した。
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの投与量では、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの４８±１３％に低下させたことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの３７±３％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５７±１４％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの７１±１４％に低下した。
【０３４７】
体重１ｋｇあたり５０ｍｇの投与量では、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの７９±１５％に低下させたことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの６７±１５％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの６９±１７％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの９０±２８％でほぼ不変であることが見出された。
【０３４８】
体重１ｋｇあたり２５ｍｇの投与量では、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの９６±７％としてほぼ不変に保ったことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの５６±１１％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの６８±２６％と測定された。血清コレステロールは、担体対照レベルの９３±８％でありほぼ不変であることが見出された。
【０３４９】
体重１ｋｇあたり１２．５ｍｇの投与量では、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたとおり、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの９０±１４％としてほぼ不変に保ったことが見出され、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの７７±２２％であり不変であった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの９５±５％であると測定された。血清コレステロールは、担体対照レベルの９１±１４％でほぼ不変であることが見出された。
【０３５０】
Ｉ）それぞれ２．５月齢の６匹の動物からなる８つの群に、体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７（配列に関しては、表１０を参照）、または等量の担体の単回静脈内ボーラス投与を実施した。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で治療した動物群を、投与後１８時間、６６時間、９６時間、１６８時間、および３３６時間で屠殺し、担体で治療した動物群は、投与後１８時間、６６時間、および２４０時間で屠殺した。２４０時間後に屠殺した群を対照として使用し、全ての値はこの群で見られた平均に対する割合（％）として表す。血清総コレステロール、血清ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを測定した。Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、肝臓組織中に存在するＡＬ−ＤＵＰ−５１６７の量を測定した。
【０３５１】
この実験は、肝臓および空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベル、ならびに血清ＡｐｏＢおよびコレステロール濃度に対するＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の影響の経時変化を確認し、かつ観察時間を延長するために設計した。
【０３５２】
投与後１８時間で、組織１ｇあたり３．３μｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７が肝臓試料中で回収され、６６時間後では組織１ｇあたり２２ｎｇに低下し、その後は検出限界未満に低下した。
【０３５３】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１８時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの３７±１６％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８７±２９％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのＸＸ±Ｘ％に低下した。
【０３５４】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後６６時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベ
ルの４７±７％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの４３±８％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのＸＸ±Ｘ％に低下した。
【０３５５】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後９６時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの３８±９％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの７８±１４％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのＸＸ±Ｘ％に低下した。
【０３５６】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１６８時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの５７±５％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８７±２７％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのＸＸ±Ｘ％に低下した。
【０３５７】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後３３６時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの９４±１０％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの１０９±１２％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルのＸＸ±Ｘ％に低下した。
【０３５８】
生理食塩水対照ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１８時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの８３±２１％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの１０９±２６％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５１±８％に低下した。
【０３５９】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７の静脈内投与後１８時間で屠殺した動物では、２４０時間の担体対照群の肝臓組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの１０４±１９％相当が肝臓において見出され、２４０時間の担体対照群の空腸組織中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルの９７±２１％相当が空腸において見出された。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５１±８％に低下した。
【０３６０】
この実験は、コレステロール結合型ｓｉＲＮＡの作用は肝臓中で７日以上、消化管中で３日以上持続しうることを示すものである。後者は腸管細胞の平均寿命と一致する。
実験Ａ）〜Ｉ）からの結論：ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子発現の阻害について重視すべきことは、観察された作用が特異的であるか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｓｉＲＮＡおよび他のオリゴヌクレオチド系手法に関して報告された「オフターゲット」効果および起こりうるインターフェロン応答によるものではないかということである。我々の実験では、ＡｐｏＢ特異的なコレステロール結合型ｓｉＲＮＡの作用は、ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの個別の配列領域を標的とする幾つかの別個のｓｉＲＮＡに関して見られた。さらに、非特異的ｓｉＲＮＡもミスマッチな対照ｓｉＲＮＡも、ＡｐｏＢのｍＲＮＡ、血漿ＡｐｏＢタンパク質レベル、または総コレステロールの有意な低下を仲介しなかったように、ＡｐｏＢのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現抑制は特異的であった。コレステロール結合型ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡは生物学的活性を示し、非結合型ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡは示さなかったことから、全身性のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を達成するためのコレステロール結合の重要な役割が実証され、化学的結合戦略による全身投与に基づいて活性をさらに最適化する可能性が示唆された。
【０３６１】
実施例８．コレステロールはｓｉＲＮＡ活性を安定化させる
ｉｎ  ｖｉｖｏで内在標的遺伝子を発現抑制する合成ｓｉＲＮＡの可能性を調べる際に、本発明者らは、化学的に安定化されたコレステロール結合型ｓｉＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで著しく改善された薬理学的性質を有することを見出した。センス鎖およびアンチセンス鎖上に部分的ホスホロチオエート骨格および２’−Ｏ−メチル修飾を有する、化学的に安定化されたｓｉＲＮＡは、血清および組織ホモジェネート中でのエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解に対して有意に高い耐性を示した。ピロリジンリンカーによるｓｉＲＮＡセンス鎖の３’端でのコレステロールの結合（それによってコレステロール結合型ｓｉＲＮＡが生じる）が、細胞培養物中の遺伝子発現抑制活性の有意な消失をもたらすことはなかった。トランスフェクトしたプラスミドからルシフェラーゼを一時的に発現するＨｅＬａ細胞において、かつトランスフェクション試薬またはエレクトロポレーションの不在下において、コレステロール結合型ｓｉＲＮＡのみがルシフェラーゼ発現を阻害し（ＩＣ５０２００ｎＭ）、非結合型ｓｉＲＮＡは不活性であった。コレステロール結合型ｓｉＲＮＡとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合は表面プラズモン共鳴測定によって測定されたが、非結合型ｓｉＲＮＡはＨＳＡとの測定可能な結合を示さず、コレステロール結合型ｓｉＲＮＡは推定ＫＤ＝１μＭでＨＳＡと結合することが分かった。血清タンパク質との高い結合性により、ＩＶ注射によりラットに投与されたコレステロール結合型ｓｉＲＮＡは、非結合型ｓｉＲＮＡと比較して改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態を示した。５０ｍｇ／ｋｇでラットにＩＶ注射すると、放射活性標識コレステロール結合型ｓｉＲＮＡは血漿中でｔ１／２＝９５±１３分を有し、一方非結合型ｓｉＲＮＡは血漿中でｔ１／２＝６．２±０．６分を有していた。これらの値は、２コンパートメントモデル、一次排出速度と仮定し、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）４．１（ファルサイトコーポレーション（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）所在）を使用してカーブフィッティングシミュレーションにより測定した。ＲＮａｓｅ保護アッセイにより測定されたように、コレステロール結合型ｓｉＲＮＡはマウスへの５０ｍｇ／ｋｇの単回ＩＶボーラス注射後２４時間で広範囲の組織生体内分布を示した。非結合型ｓｉＲＮＡは組織試料中で検出可能な量が観察されず、コレステロール結合型ｓｉＲＮＡは組織１ｇあたり約２００ｎｇの有意なレベルで肝臓、心臓、腎臓、および肺試料中で検出した。全体として、これらの試験から、コレステロールの結合によりｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態が有意に改善されることが実証された。
【０３６２】
実施例９．ヒトＡｐｏＢ−１００トランスジェニックマウスにおけるＡｐｏＢ発現は、ヒトおよびマウスＡｐｏＢに特異的なｓｉＲＮＡによって低下する
この実験手順はＡｌｎｙｌａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたものであり、マサチューセッツ州ケンブリッジ市の動物福祉に関する規制に従って実施した。
【０３６３】
ヘミ接合のオスのヒトＡｐｏＢ−１００トランスジェニックマウス（系統名：Ｂ６．ＳＳＪＬ−Ｔｇ（ＡＰＯＢ１００）Ｎ２０）を、タコニック社（Ｔａｃｏｎｉｃ）（Ｔａｃｏｎｉｃ、米国ニューヨーク州ジャーマンタウン所在（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）、カタログ番号１００４−Ｔ）から入手し、１２時間の明／暗サイクル（６：３０ＡＭ／６：３０ＰＭ）で一定温度および一定湿度において飼育した。動物には放射線照射した標準的なげっ歯類用飼料（ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ２０、ピュリナミルズエルエルシー（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ、ＬＬＣ）、米国ミズーリ州セントルイス所在、カタログ番号５０５３）を与えた。
【０３６４】
３０〜３２週齢の動物を、治療用に８匹の３群に分けた。１群には、リン酸緩衝生理食塩水（体重１グラムあたり１０μｌ）を、１日１回として３回尾部静脈内注射した（投与
間隔２４時間）。第２群には、投与用量を体重１グラムあたり１０μｌとして体重１キログラムあたり５０ｍｇのｓｉＲＮＡ  ＡＬ−ＤＵＰ５１６７を、１日１回として３回尾部静脈内注射した（投与間隔２４時間）。第３群には、投与用量を体重１グラムあたり１０μｌとして体重１キログラムあたり５０ｍｇのｓｉＲＮＡ  ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１を、１日１回として３回尾部静脈内注射した（投与間隔２４時間）。ｓｉＲＮＡ２重鎖はリン酸緩衝生理食塩水中に配合した。
【０３６５】
最後の注射後２４時間で、ＣＯ２窒息により動物を屠殺した。肝臓全体、および空腸に相当する小腸のセグメントを各動物から採取し、液体窒素中で急速に凍結させた。凍結組織は乳鉢と乳棒を使用してすり潰し、微粉とした。
【０３６６】
各組織の粉末約１０ｍｇを氷冷１．５ｍｌエッペンドルフチューブに加え、３．３μｌ（１０μｌ／３ｍｌ）の５０μｇ／μｌプロテイナーゼＫストック溶液（エピセントレ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マディソン所在、カタログ番号ＭＰＲＫ０９２）を含む１ｍｌの組織および細胞溶解溶液（エピセントレ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、米国ウィスコンシン州マディソン所在、カタログ番号ＭＴＣ０９６Ｈ）を加えた。チューブを渦流攪拌し、５分毎に攪拌しながら１５分間６５℃でインキュベートした。細胞残骸は室温で１０分間５０００ｒｃｆにてペレット状にし、８００μｌの上清を新たなチューブに移した。溶解物は、直ぐに（前に記載した）分岐ＤＮＡアッセイに使用し、ＡｐｏＢとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの相対レベルを測定するか、あるいは後で使用するために−８０℃で保存した。
【０３６７】
ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ  ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７はマウスＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを低下させることが見出された（ｐ＜０．０１で有意差あり）。ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で処理した動物では、担体で処理した動物におけるマウスＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルに対し、肝臓中では４３±１０％、空腸中では５８±１２％であることが見出された。肝臓中のヒトＡｐｏＢのｍＲＮＡは、対照動物の肝臓中のレベルの４０±１０％に低下した。ミスマッチな対照ｓｉＲＮＡ  ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１は、ＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルをほぼ不変に保つことが見出され、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７で治療した動物では、担体で処理した動物におけるマウスＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルに対し、肝臓中では９３±２０％、空腸中では１０４±１３％が見出された。肝臓中のヒトＡｐｏＢのｍＲＮＡは、対照動物の肝臓中のレベルの９２±２４％であることが測定された。
【０３６８】
実施例１０．特異的ＡｐｏＢ切断部位は５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって同定することが可能である
プライマーはオペロンバイオテクノロジーインコーポレイティド（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（米国カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ）所在）から購入した。
【０３６９】
前述の実験（Ｇ．）（実施例７）の処理群のそれぞれから集めた肝臓および空腸中のＡｐｏＢ  ｍＲＮＡの、ｓｉＲＮＡ誘導型特異的切断産物を、エルラベら（Ｌｌａｖｅ、ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２年）、２９７：２０５３〜６、およびイェクタら（Ｙｅｋｔａ、ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４年）、３０４：５９４〜６に記載の通りに５’−ＲＡＣＥによって同定し、該同定には以下の修飾および以下に記載のプライマーを用いた。この実験では、ＲＮＡ試料中に存在する５’−リン酸含有ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ複合ＲＩＳＣによるｍＲＮＡ切断の３’−産物などとアダプタを反応させる。ヌクレアーゼによって触媒される核酸分解反応の、全てではないにせよ大部分の産物は５’−リン酸基を含まず、したがってアダプタとは反応しないと思われる。その後のＰＣＲ反応では、アダプタ配列と標的遺伝子配列の両方を含む分子のみが、適切に選択したプライマーによって増幅される。
【０３７０】
ＲＡＣＥアダプタ（「ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）」アダプタ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をライゲーションした後、遺伝子特異的プライマー５１６７ＧＳＰを使用してｃＤＮＡ合成を実施して、「５１６７」ｃＤＮＡを生成した。ＡｐｏＢに対応する配列を、以下のプライマー対：
ＰＣＲ反応１：ＧＲ５’−ＸｂａＩ（順方向）＋５１６７ＡｐｏＢ  Ｒｅｖ２−ＳａｌＩ（逆方向）
ＰＣＲ反応２：ＧＳ５’ＮｅｓｔＦ−ＸｂａＩ（順方向）＋５１６７ＡｐｏＢ  Ｒｅｖ３−ＳａｌＩ（逆方向）
を用いた逐次ＰＣＲ反応により増幅させた。
【０３７１】
ＰＣＲ反応１の５０倍希釈物をＰＣＲ反応２において使用した。それぞれのＰＣＲ反応の産物はアガロースゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。ｓｉＲＮＡ誘導型切断に対応する予想された大きさの特異的バンドが、ＡＬ−ＤＵＰ
５１６７を与えた動物の肝臓中および空腸中、ならびに程度は少ないがＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５を与えた動物の空腸中で見られた（図７参照）。
【０３７２】
ＰＣＲ反応１からの特異的バンドを切り出し、塩基配列を決定して（塩基配列決定用プライマー：５１６７ＡｐｏＢ  Ｒｅｖ３−ＳａｌＩ）、ＲＡＣＥアダプタとマウスＡｐｏＢ（受託番号：ＸＭ１３７９５５）のヌクレオチド１０２２６との間の接合部の存在を確認した。
【０３７３】
予想されるｓｉＲＮＡ切断部位に対応する断片を特異的に増幅させるために、ＰＣＲ反応混合物１を５０倍希釈し、以下のプライマー対：
ＰＣＲ反応３：ｉＡｐｏＢ５１６７−ＸｂａＩ（順方向）＋５１６７ＡｐｏＢ  Ｒｅｖ３−ＳａｌＩ（逆方向）
を用いて増幅させた。
【０３７４】
ＲＡＣＥアダプタと、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７に仲介されたＲＮＡ干渉によって予想されるＡｐｏＢ  ｍＲＮＡのＲＩＳＣ切断産物とを組み合わせるＰＣＲ反応混合物１の中に、反応産物が存在する場合、かつ反応産物が存在する場合のみ、ＰＣＲ反応３においてＰＣＲ産物が形成される。このＰＣＲ反応の産物を、前述のようにして視覚化した（図７）。増幅させたバンドを確認する塩基配列決定を前述のように実施した。
【０３７５】
プライマーの配列は：
【０３７６】
【化１６】
2008514632.tif 000032
【０３７７】
である。
実施例１１．修飾ｓｉＲＮＡに関するその他の試験
他の修飾ｓｉＲＮＡの設計
ＡＬ−ＤＵＰ  ５００２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９７、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０９８の修飾型に相当する他のｓｉＲＮＡについて、ＡｐｏＢ発現の阻害に向けて安定性および活性に関して試験した。ピロリジンリンカーを介してセンス鎖の３’端にコレステロール部分が結合した、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８の修飾型を合成した。非修飾型ｉＲＮＡ剤であるＡＬ−ＤＵＰ  ５００２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９７、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０９８のそれぞれについて、２１ヌクレオチドのセンス鎖と、２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを有し、２ヌクレオチドの３’突出部分が形成され、センス鎖の３’端にはホスホロチオエート含有リンカーを介してコレステロール部分が結合しており、アンチセンス鎖の２１位および２２位に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有し、かつアンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有する、１つのｉＲＮＡ剤を合成した。この構造はＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７において既に使用した修飾パターンに相当するものであり、エクソヌクレアーゼの分解活性からｉＲＮＡ剤が保護されることを意味する。
【０３７８】
さらに、ＡＬ−ＤＵＰ  ５００２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０３５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０８９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０９７、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５０９８の修飾型に相当し、ホスホロチオエート含有リンカーを介してセンス鎖の３’端にコレステロール部分が結合し、存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、およ
び５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンの位置に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有し、かつアンチセンス鎖の２１位と２２位、および２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を有する、第２のｉＲＮＡ剤を合成した。これらの追加の修飾を施して、エンドヌクレアーゼの分解活性からこれらのｓｉＲＮＡ剤を保護した。対応する配列を表１１中に列挙する。
【０３７９】
【表１１】
2008514632.tif 000033
【０３８０】
ｓｉＲＮＡ安定性試験
上記ｓｉＲＮＡ（配列を表１１に示す）について、ヒト血清（シグマ‐アルドリッチケミー  ゲーエムベーハー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）所在、カタログ番号Ｈ１５１３）中でインキュベーションした後にＨＰＬＣで分離断片を単離することによって、安定性に関して試験した。各ｓｉＲＮＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマ‐アルドリッチケミー  ゲーエムベーハー、ドイツ国タウフキルヒェン所在）に溶かした５０μＭ溶液を、血清と共に、血清：ｓｉＲＮＡ溶液の比を１０：１として３０分、１、２、４、８、１６および２４時間インキュベートし、試料を以下に記載したように分析した。
【０３８１】
血清試料のプロテイナーゼＫ処理後のＨＰＬＣによるｓｉＲＮＡ分解経時変化の測定
プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）をｐｅＱＬａｂ（ドイツ国エルランゲン（Ｅｒｌａｎｇｅｎ）所在、カタログ番号０４−１０７５）から入手し、脱イオン水（１８、２ｍΩ）で１：１に希釈して、終濃度１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとした。プロテイナーゼＫバッファー（４．０ｍｌのＴＲＩＳ−ＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ７．５、１．０ｍｌのＥＤＴＡ  ０．５Ｍ、１．２ｍｌのＮａＣｌ  ５Ｍ、４．０ｍｌのＳＤＳ  １０％）を新たに調製し、使用するまで５０℃に保ち沈殿を回避した。
【０３８２】
４０ｍｅｒのポリ（Ｌ−ｄＴ）である（Ｌ−ｄＴ）４０を、ノクソンファーマアーゲー（Ｎｏｘｘｏｎ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ）（ドイツ国ベルリン所在）から入手し、内部標準として使用した。核酸のＬ−エナンチオマーのポリマーは、Ｒ−エナンチオマーのみで構成される天然の核酸と比較すると、核酸分解に対して驚くべき安定性を示すが（クラスマン、エスら（Ｋｌｕｓｓｍａｎ  Ｓ、ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１９９６年、１４：１１１２）、その他の点では非常に類似した性質を示す。
【０３８３】
ｓｉＲＮＡ分解を終了させるために、２５μｌのプロテイナーゼＫバッファーを、各インキュベーション時間の終了直後に血清インキュベーション試料に加え、該混合物を最高速度で５秒間攪拌し（Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ（登録商標）２、サイエンティフィックインダストリーズインコーポレイテッド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ボヘミア（Ｂｏｈｅｍｉａ）所在、カタログ番号ＳＩ０２５６）、８μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えてから５秒間攪拌し、最後に混合物を４２℃および１０５０ｒｐｍにおいてサーモミキサー中で２０分間インキュベートした。
【０３８４】
（Ｌ−ｄＴ）４０の５０μＭ溶液５μｌ（２５０ｐｍｏｌｅ）を内部標準としてそれぞれのウェルに加え、溶液を５秒間攪拌し、チューブを卓上遠心分離機中で１分間遠心分離して、ウェルの内側表面に付着した全ての小滴を底部に集めた。溶液を９６ウェルのＣａｐｔｉｖａ（商標）０．２ｕｍフィルタプレート（バリアン（Ｖａｒｉａｎ）、ドイツ国所在、カタログ番号Ａ５９６０００２）に移し、２１９００ｒｃｆで４５分間の遠心分離によって濾過した。
【０３８５】
インキュベーションウェルを４７．５μｌの脱イオン水（１８．２ｍΩ）で洗浄し、洗浄液をＣａｐｔｉｖａ（商標）フィルタユニットで２１９００ｒｃｆにて１５分間濾過し、この洗浄工程を繰り返した。理論上の合計体積２００μｌのうち平均して約１８０μｌが、第２の洗浄工程後に回収される。
【０３８６】
イオン交換クロマトグラフィーによる、ｓｉＲＮＡ１本鎖相互および分解産物からのｓｉＲＮＡ１本鎖の分離：
インライン脱気装置、オートサンプラー、カラムオーブンおよび固定波長のＵＶ検出器を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＢｉｏＬＣ  ＨＰＬＣシステム（ダイオネクス  ゲーエムベーハー（Ｄｉｏｎｅｘ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国イドシュタイン（Ｉｄｓｔｅｉｎ）所在）を、変性条件下で使用した。標準実施パラメータは：
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡ−Ｐａｃ１００；４×２５０ｍｍ
温度：７５℃
溶出液Ａ：１０ｍＭのＮａＣｌＯ４、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％アセトニトリル、ｐＨ＝８．０
溶出液Ｂ：８００ｍＭのＮａＣｌＯ４、２０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％アセトニトリル、ｐＨ＝８．０
検出：２６０ｎｍ
勾配：０〜１分：１０％Ｂ
１〜１１分：１０％→３５％Ｂ
１１〜１２分：３５％Ｂ→１００％Ｂ
１２〜１４分：１００％Ｂ→１０％Ｂ
１４〜１６分：カラムの再平衡化のために１０％Ｂ
注入体積：２０μｌ
とした。
【０３８７】
ｓｉＲＮＡの２本の鎖の分離が十分ではなかったか、あるいは分解断片が一方の鎖と共に溶出した場合、温度、ｐＨ、ＮａＢｒによるＮａＣｌＯ４の置換、アセトニトリルの濃度を変えることによって、かつ／あるいはセンス鎖およびアンチセンス鎖からのピークの個別定量を可能にする分離が達成されるまで溶出勾配の程度を調整することによって、クロマトグラフィーのパラメータを調整した。
【０３８８】
ＵＶ検出器（Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（登録商標）６．６；ダイオネクス  ゲーエムベーハー、ドイツ国イドシュタイン（Ｉｄｓｔｅｉｎ）所在）の製造業者によって供給された
ソフトウェアを使用して、ＵＶ検出器のシグナルを積分することにより完全長の鎖のピーク面積を得た。
【０３８９】
データ分析：
センス鎖、アンチセンス鎖、および内部標準の積分したピーク面積を、全ての試料および標準化対照に関して得た。
【０３９０】
濾過工程および洗浄工程中の液体の消失を示す補正係数ＣＦを、内部標準の実験上のピーク面積と理論上のピーク面積との比を計算することにより各試料に関して決定した。内部標準の理論上のピーク面積は、例えば（Ｌ−ｄＴ）４０の５０μＭ溶液の連続希釈液各５０μｌをＨＰＬＣカラムに注入することによって得た内部標準の検量線、ならびに該連続希釈系列からのピーク面積に線形最少二乗法をフィッティングして得た等式を用いて、２５ｐｍｏｌｅの（Ｌ−ｄＴ）４０に対応する理論上のピーク面積を計算することから得る。センス鎖およびアンチセンス鎖のピーク面積に適用すべき補正係数ＣＦは、以下の：
ＣＦ＝ピーク面積内部標準（理論上）／ピーク面積内部標準（試料）
として得られる。
【０３９１】
この処理では、フィルタを２回洗浄することによって、合わせた濾液中にほぼ完全な回収が達成されると想定し、フィルタに残った洗浄水の種々の体積を補正して、異なる試料由来のピーク面積を比較できるようにする。
【０３９２】
次いで、各時点でセンス鎖およびアンチセンス鎖のピークに関して得たピーク面積を、補正係数ＣＦと掛け合わせて、標準化ピーク面積（ＮＰＡセンス、ｔ、ＮＰＡアンチセンス、ｔ）：
ＮＰＡセンスまたはアンチセンス、ｔ＝（ピーク面積センスまたはアンチセンス、ｔ）×ＣＦ
を得る。
【０３９３】
時間ｔでのセンス鎖およびアンチセンス鎖について残存している完全長生成物の相対量（％ＦＬＰ）を得るために、時間ｔ＝０分での各鎖の標準化ピーク面積（ＮＰＡセンス、ｔ＝０、ＮＰＡアンチセンス、ｔ＝０）を１００％と設定し、他の時点でのＮＰＡをこれらの値で割る。
【０３９４】
％ＦＬＰｔ＝１，２，３．．．ｎ＝（ＮＰＡｔ＝１，２，３．．．ｎ／ＮＰＡｔ＝０）×１００
ｓｉＲＮＡをアニーリングバッファーのみとインキュベートした対照試料から得た値は、方法の精度の対照値として役立てることができる。いずれの鎖の％ＦＬＰも、インキュベーション時間とは無関係に誤差範囲内で１００％付近になるはずである。
【０３９５】
したがって分解半減期ｔ１／２を、一次反応速度と仮定して、時間に対するｌｎ（％ＦＬＰ）のプロットへフィッティングした線形最少二乗法の傾きから：
ｔ１／２＝ｌｎ（０，５）／傾き
として、各鎖に関して計算することが可能である。
【０３９６】
表１１に配列で記載したｓｉＲＮＡの血清中半減期
表１１に示す配列によって表されるｓｉＲＮＡの完全長産物の分解半減期を、表１２に示す。ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４６のアンチセンス鎖の半減期が、そのセンス鎖またはＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のアンチセンス鎖の半減期と比較して異なることから明らかなように、３’の最後から２番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル基およびホスホロチオエート結合による鎖の３’端の保護は、分解半減期の約６〜７倍の増大をもたらす。さらに、エン
ドヌクレアーゼ分解を特に受けやすい部位で２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド置換を行うことによって、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３以外は半減期が約３〜４倍さらに改善し、平均して２０倍改善した。
【０３９７】
【表１２】
2008514632.tif 000034
【０３９８】
エンドヌクレアーゼ分解耐性を有するように修飾したｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
表１１のｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、本明細書中で実施例３において上述したようにして試験した。結果は表１３中に示す。
【０３９９】
【表１３】
2008514632.tif 000035
【０４００】
表１３のＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７およびＡＬ−ＤＵＰ  ５５４６のＩＣ５０の比較から明らかなように、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７においてアンチセンス鎖の２１位と２２位、お
よび２２位と２３位の間にホスホロチオエート結合を、かつアンチセンス鎖の２１位および２２位の２’−Ｏ−メチル基を導入することにより、このｓｉＲＮＡの活性に悪影響を与えることはなかった。さらに、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６とＡＬ−ＤＵＰ  ５５３７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３８とＡＬ−ＤＵＰ  ５５３９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４０とＡＬ−ＤＵＰ  ５５４１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２とＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３、ならびにＡＬ−ＤＵＰ  ５５４４とＡＬ−ＤＵＰ  ５５４５のＩＣ５０の比較からわかるように、存在する全ての配列モチーフ５’−ＵＡ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’、および５’−ＵＧ−３’の５’側のピリミジンの位置への２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの導入は、多くの場合これらのいずれの分子の活性に対しても悪影響はなかった。
【０４０１】
エンドヌクレアーゼ分解耐性を有するように修飾したｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
以下の実験は、上記実施例７に記載したのと同様の通常作業および手順を使用して実施した。
【０４０２】
それぞれ２．５月齢の５匹の動物からなる１３の群に、体重１ｋｇあたり１００ｍｇのＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４５、または等量の担体を、単回で静脈内ボーラス投与した。動物は投与後７２時間で屠殺した。血清総コレステロール、血清ＡｐｏＢ１００濃度、ならびに肝臓および空腸のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを測定した。さらに、実施例７に記載したのと同様にＳ１ヌクレアーゼ保護アッセイによって各群から３匹の動物の肝臓、空腸、および血清試料においてｓｉＲＮＡの濃度を測定した。ただし、放射活性バンドの強度の定量はバンドを希釈系列と目視で比較することによって行い、標準偏差は計算しなかった。
【０４０３】
ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のヌクレオチド配列は上記の表１０の通りである。ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４１、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４４、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５５４５のヌクレオチド配列は表１１に上記した通りである。
【０４０４】
この実験は、生物媒体中でのｓｉＲＮＡの安定性を改善するために同ｓｉＲＮＡ中に導入した修飾による、ｉｎ  ｖｉｖｏでの該ｓｉＲＮＡの遺伝子発現阻害活性に対する影響を評価するために行った。
【０４０５】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの４２±１２％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの４５±８％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの４４±２３％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの７５±２０％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で７０ｎｇ／ｇ、空腸で１４ｎｇ／ｇ、血清で１４ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４０６】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４６は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの９５±９％としてほぼ不変に保ったことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの１０２±１６％であった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１１３±３９％でほぼ不変のままであった。血清コレステロー
ルは、担体対照レベルの１３２±１０％に上昇した。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で１ｎｇ／ｇ、空腸では検出不能、血清では検出不能であることがわかった。
【０４０７】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの５６±８％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの２８±８％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの４６±６％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの７４±３３％に低下した。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で２ｎｇ／ｇ、空腸で６ｎｇ／ｇ、血清で６ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４０８】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３７は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの７２±１１％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの９４±９％でほぼ不変であった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの７５±２５％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの１１８±９％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で検出不能、空腸で検出不能、血清で１ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４０９】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３８は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの５６±１６％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの７５±１％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０２±２７％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの１１７±１８％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で３５ｎｇ／ｇ、空腸で７ｎｇ／ｇ、血清で１８ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４１０】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３９は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの７６±１８％としてほぼ不変に保ったことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、担体対照レベルの６２±１２％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの１０８±２３％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの１０２±１８％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で７ｎｇ／ｇ、空腸で４ｎｇ／ｇ、血清で２ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４１１】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４０は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの５４±１２％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの５４±１２％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの７２±３０％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの９１±１０％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で１３０ｎｇ／ｇ、空腸で２８ｎｇ／ｇ、血清で２５ｎｇ／ｇであることが
わかった。
【０４１２】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４１は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの７３±１０％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの６８±５％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの９０±８％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの９９±８％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で７２ｎｇ／ｇ、空腸で１０ｎｇ／ｇ、血清で７ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４１３】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの５８±９％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの２８±４％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５５±９％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの６１±２７％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で８ｎｇ／ｇ、空腸で１７ｎｇ／ｇ、血清で２２ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４１４】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの７７±５％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの９１±１４％でほぼ不変であった。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの９７±１６％でほぼ不変のままであった。血清コレステロールは、担体対照レベルの１２８±２４％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で検出不能、空腸で検出不能、血清で検出不能であることがわかった。
【０４１５】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４４は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの６３±６％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの２０±３％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの４６±５％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの５５±５％に低下した。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で＞９００ｎｇ／ｇ、空腸で６０ｎｇ／ｇ、血清で４０ｎｇ／ｇであることがわかった。
【０４１６】
体重１ｋｇあたり１００ｍｇの用量において、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４５は、分岐ＤＮＡアッセイにより測定されたように、処理群マウスの肝臓組織試料中に存在するＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルを、担体のみを与えた動物の肝臓組織に存在するｍＲＮＡレベルの５８±１１％に低下させたことが分かり、空腸中のＡｐｏＢのｍＲＮＡのレベルは、対照動物中のレベルの３７±１１％に低下した。マウス血清中の血清ＡｐｏＢタンパク質濃度は、担体対照レベルの５０±６％に低下した。血清コレステロールは、担体対照レベルの７５±２８％でほぼ不変のままであった。３匹の動物の平均ｉＲＮＡ濃度はおよそ、肝臓で７０ｎｇ／ｇ、空腸で７ｎｇ／ｇ、血清では検出不能であることがわかった。
実施例１２．
【０４１７】
免疫学的能力に関するｓｉＲＮＡの試験
近年、ｓｉＲＮＡ剤は潜在的に有害な免疫応答を誘導する可能性があると主張する、幾つかの報告が発表されてきている（例えば、ホルヌングら（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００５、１１：２６３〜２７０を参照のこと）。例えば、ｓｉＲＮＡによって引き起こされる可能性のあるヒトでの一時的なインターフェロンα（ＩＦＮ−α）の増大の、生物学的影響については、ほとんど知られていない。不必要な、危険な副作用を回避するために、検出可能な免疫賦活活性がほとんどあるいは全くない強力な抗ウイルスｓｉＲＮＡを有することが望ましい。しかしながら、ヒトでの正確なプロセスを忠実にシミュレーションするのは不可能なので、本発明者らは、記載した実験が、オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡによる免疫賦活を予想するのに適していると考える。
【０４１８】
本発明者らは、ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４４、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５５４５による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＩＦＮ−αの誘導を測定することによって、表１１に列挙したｓｉＲＮＡの免疫原性を試験した。ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１を、無関係な配列対照として含めた。ＩＦＮ−αの強力な誘導剤であるＯＤＮ２２１６（ホルヌングら（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００５、１１：２６３〜２７０）を陽性対照として使用し、ＰＢＳを陰性対照として使用した。ＯＤＮ２２１６のヌクレオチド配列は、
【０４１９】
【化１７】
2008514632.tif 000036
【０４２０】
である。
チャン、エイチ、エス（Ｃｈａｎｇ、Ｈ．Ｓ．）およびサック、ディー、エー（Ｓａｃｋ、Ｄ．Ａ．）、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１、８：４８２〜４８８に記載の通りＦｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配遠心分離によってＰＢＭＣを単離した。ただし、ドイツ国ズール（Ｓｕｈｌ）所在のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｇＧｍｂＨ、から入手した１人のドナー由来の無濾過で赤血球を含まない白血球濃縮物（Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔ）を、ＰＢＳで１：１に希釈して、出発材料として使用し、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ１６４０完全培地；１０％ＦＣＳ；１％Ｌ−Ｇｌｕ）中の最終懸濁液を細胞１０６個／ｍｌに調節した。
【０４２１】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）またはＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋トランスフェクション試薬ＧｅｎＰｏｒｔｅｒ（商標）２（ＧＰ２；ペクラブ  バイオテクノロギー  ゲーエムベーハー（Ｐｅｑｌａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国エルランゲン（Ｅｒｌａｎｇｅｎ）所在）中で、ＯＤＮ２２１６またはｓｉＲＮＡと共に細胞をインキュベートした。９６ウェルプレートのウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液（１００，０００個の細胞）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭにオリゴヌクレオチドを溶かした１．５μＭ溶液５０μｌ（最終オリゴヌクレオチド濃度５００ｎＭ）、あるいはａ）６μｌのＧＰ２試薬と１１９μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭの混合物、およびｂ）ＰＢＳにオリゴヌクレオチドを溶かした１００μＭ溶液１μｌとＧＰ２キットの希釈液Ｂ１２４μｌの混合物の、１：１混合物５０μｌ（最終オリゴヌクレオチド濃度１３３ｎＭ）と組み合わせた。インキュベーションを３７℃で２４時間続け、５０μｌの上清をウェルの上部から注意深く取り出した。該上清を、ｈｕＩＦＮ−αインスタントＥＬＩＳＡ（ベンダーメドシステムズ（Ｂｅｎｄ
ｅｒＭｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、オーストリア国ウィーン所在、カタログ番号ＢＭＳ２１６ＩＮＳＴ）を用いたＩＦＮ−α測定用に使用した。表１４はその結果を要約したものである。
【０４２２】
【表１４】
2008514632.tif 000037
【０４２３】
実施例１１および１２からの結論：
ａ）幾つかの特に分解を受けやすい部位に修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、生物媒体中ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの半減期の点で利点を有し、一方ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現阻害活性は大部分が影響を受けない。
【０４２４】
ｂ）ｓｉＲＮＡはその配列によっては、全般的にではないが、免疫賦活物質である可能性がある。
ｃ）ＡＬ−ＤＵＰ  ５５３６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５５４０およびＡＬ−ＤＵＰ  ５５４２は、ａｐｏＢ発現を阻害するためのｉＲＮＡ剤として、したがってａｐｏＢの異常発現と関係がある障害の治療剤として、特に有望な候補である。
【０４２５】
表１５は、上述のｉＲＮＡ剤を表すために本明細書で使用される場合のある薬剤番号を列挙するものである。
【０４２６】
【表１５】
2008514632.tif 000038
【０４２７】
その他の実施形態
本発明の幾つかの実施形態について記載してきた。しかしながら、本発明の思想および範囲から逸脱せずにさまざまな変更形態を作製しうることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０４２８】
【図１】コレステロール結合型ＲＮＡ鎖の合成および構造を示す概略図。球体は固相（微細孔性ガラス、ＣＰＧ）を表す。
【図２】ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＵＰ５０２４の濃度を増大させて細胞を処理した後の、比［ＡｐｏＢ  ｍＲＮＡ］／［対照のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ］を示すグラフ。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の測定値は、以下のパラメータ、すなわち用量反応１サイト（Ｄｏｓｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｏｎｅ  Ｓｉｔｅ）、４パラメータロジスティックモデル、ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（（１０＾Ｃ）／ｘ）＾Ｄ））））、ｉｎｖ＝（（１０＾Ｃ）／（（（（Ｂ−Ａ）／（ｙ−Ａ））−１）＾（ｌ／Ｄ）））、ｒｅｓ＝（ｙ−ｆｉｔ）を使用するコンピュータソフトウェアＸｌｆｉｔ（商標）を使用したカーブフィッティングによって決定した。
【図３】マウス血清ヌクレアーゼによるｓｉＲＮＡ２重鎖ＡＬ−ＤＵＰ  ５０２４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６４、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６５、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６６、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８０、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８１の分解を示すポリアクリルアミドゲルのパネル図。ｓｉＲＮＡ２重鎖をマウス血清中で０、１、３、６または２４時間（ｈ）インキュベートした。「ｕｎｂ」で示すレーンは未処理対照を表す。
【図４】マウス血清ヌクレアーゼによるｓｉＲＮＡ２重鎖ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５０４８、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６９、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１７０、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１８２、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１８３の分解を示すポリアクリルアミドゲルのパネル図。ｓｉＲＮＡ２重鎖をマウス血清中で０、１、３、６または２４時間（ｈ）インキュベートした。「ｕｎｂ」で示すレーンは未処理対照を表す。
【図５Ａ】１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４、０．１４、または０．０５ｎＭのＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３を含んだ培地と共にインキュベートした培養ヒトＨｅｐＧ２細胞による、上清中へのＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。反応は、ＡｐｏＢ特異的ｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した細胞の上清中のＡｐｏＢタンパク質濃度と、コレステロール結合を有する（ＡＬ−ＤＵＰ  ５１２９、菱形）あるいは有していない（ＡＬ−ＤＵＰ  ＨＣＶ、四角）非特異的対照ｓｉＲＮＡ２重鎖で処理した細胞の上清中のＡｐｏＢ濃度との比として表わされている。
【図５Ｂ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６４と共にインキュベートした。
【図５Ｃ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６５と共にインキュベートした。
【図５Ｄ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６６と共にインキュベートした。
【図５Ｅ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１８０と共にインキュベートした。
【図５Ｆ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１８１と共にインキュベートした。
【図５Ｇ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６７と共にインキュベートした。
【図５Ｈ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６８と共にインキュベートした。
【図５Ｉ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１６９と共にインキュベートした。
【図５Ｊ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１７０と共にインキュベートした。
【図５Ｋ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１８２と共にインキュベートした。
【図５Ｌ】図５Ａについて記載した方法による、ＡｐｏＢタンパク質分泌の用量反応プロットの図。ＨｅｐＧ２細胞を、図５Ａについて記載した濃度範囲でｓｉＲＮＡ２重鎖５１８３と共にインキュベートした。
【図６Ａ】例として本明細書の実施例７（Ｈ）に記載の実験で得た結果を示す、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な放射標識プローブを用いたＳ１ヌクレアーゼ保護アッセイの図。このアッセイを使用して、生理食塩水（「−」）、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６（「Ａ」）、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１（「Ｂ」）、ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５（「Ｃ２」）、およびＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７（「Ｃ１」）を注射した動物から集めた肝臓および空腸組織溶解物中のｓｉＲＮＡを検出した。３種のコレステロール結合型ｓｉＲＮＡは、肝臓および空腸中において比較可能なレベルで検出されたが、コレステロール非結合型ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５は、いずれの組織においても検出レベル未満に留まった。内在性ｍｉＲＮＡのＳ１ヌクレアーゼ保護アッセイを、空腸（ｍｉＲＮＡ１４３、配列５’−ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣＡ−３’、配列番号２７０）および肝臓（ｍｉＲＮＡ１２２、配列５’−ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ−３’、配列番号２６９）の装荷量対照として実施した。
【図６Ｂ】例として本明細書の実施例７（Ｈ）に記載の実験で得た結果を示す、ｓｉＲＮＡ処理後のマウス肝臓および空腸組織中のＡｐｏＢのｍＲＮＡレベルを検出する分岐ＤＮＡアッセイ結果を示すグラフ。組織溶解物を用いてＡｐｏＢおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを定量し、ＡｐｏＢとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの比を計算し、群の平均として生理食塩水対照群と比較して表した。棒グラフは群の平均値を表す。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。棒グラフ中の棒上の星印は、ｐ＜０．０１で生理食塩水対照動物と比較して有意に異なる群であることを示す。
【図６Ｃ】例として本明細書の実施例７（Ｈ）に記載の実験で得た結果を示す、ｓｉＲＮＡ処理後の血漿中ＡｐｏＢタンパク質レベルを測定するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ。個々の動物の血漿試料由来のＡｐｏＢ−１００を、マウスＡｐｏＢ−１００に対する一次抗体ＬＦ３を使用して検出した。ＡｐｏＢタンパク質レベルの群平均の値を、生理食塩水対照の平均に対して表している。棒グラフは群平均の値を表す。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。棒グラフ中の棒上の星印は、ｐ＜０．０１で生理食塩水対照の動物と比較して有意に異なる群であることを示す。
【図６Ｄ】例として本明細書の実施例７（Ｈ）に記載の実験で得た結果を示す、ｓｉＲＮＡ処理後の血漿中総ＡｐｏＢタンパク質レベルを示すグラフ。コレステロール検出キット（Ｄｉａｓｙｓ）を使用して測定した血漿中総コレステロールレベルである。棒グラフは群平均の値を表す。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。棒グラフ中の棒上の星印は、ｐ＜０．０１で生理食塩水対照動物と比較して有意に異なる群であることを示す。
【図７Ａ】ＡｐｏＢのｍＲＮＡおよび５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲに使用したアダプタ連結型ＡｐｏＢ  ｃＤＮＡの概略図。この図は、ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７  ｓｉＲＮＡおよびＰＣＲプライマーの相対的な標的部位、ならびにＰＣＲ反応産物の大きさを示している。
【図７Ｂ】ＲＡＣＥ−ＰＣＲ増幅３のアガロースゲルの図。この電気泳動分析では、ＡｐｏＢ特異的ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７のみで処理したマウスの肝臓および空腸において特異的切断産物が示されている。ゲルのレーンは、処理群および対照群を示す大文字によって表されている。レーンの表示は、Ａ：ＰＢＳ、Ｂ：ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８６、Ｃ：ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６７、Ｄ：ＡＬ−ＤＵＰ  ５１６３、Ｅ：ＡＬ−ＤＵＰ  ５３８５、Ｆ：ＡＬ−ＤＵＰ  ５３１１、Ｆｃ：対照（Ｃ群のｃＤＮＡを使用して順方向プライマーのみ）、ＲＣ：対照（Ｃ群のｃＤＮＡを使用して逆方向プライマーのみ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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