(57)【要約】本発明は、V、A、X、Z、W、U、およびR5が置換基である、一般式：（1）または（2）を有するキノベンゾキサジン類似体、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグに関する。本発明はまた、スクリーニングおよびアポトーシスを誘導するためのような、そのような化合物を用いるための方法にも関する。2008508311.tif 000243
2008508311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（1）を有する化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグを含む、薬学的組成物であって、
緩衝液においてポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールをさらに含み、かつ化学療法剤を含んでもよい該薬学的組成物：
2008508311.tif 000237
式中、
VがH、ハロ、またはNR1R2であり；
Aが、H、フルオロ、またはNR12であり；
Zが、O、S、NR1、またはCH2であり；
Uが、OR2、NR1R2、またはNR1-(CR12)n-NR3R4であり；
Xが、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4、ハロ、アジド、またはSR2であり；
mが1〜3であり；
nが1〜6であり；
R1およびR3が独立してHまたはC1-6アルキルであり；
R2が、Hであるか、またはN、O、およびSから選択される一つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を含んでもよく、および炭素環もしくは複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；またはR2が、置換されてもよい複素環、アリールもしくはヘテロアリールであり；
R4が、Hであるか、またはN、O、およびSから選択される一つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を含んでもよく、および炭素環もしくは複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；
式中、NR1R2において、R1およびR2が、Nと共にイミンまたは置換されてもよい環を形成してもよく；
式中、NR3R4において、R3およびR4が、Nと共にグアニジニルまたは置換されてもよい環を形成してもよく；
R5が、W上の任意の位置の置換基であり；およびそれぞれがハロ、=O、または一つもしくは複数のヘテロ原子によって置換されてもよいH、OR2、C1-6アルキル、C2-6アルケニルであり；またはR5が、無機置換基であり；または二つの隣接するR5がWと共に連結して環を形成し；および
Wが、単環であってもよく、または単環もしくは多環と縮合してもよく、およびヘテロ原子を含んでもよい、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであり；
または式（2）を有する化合物であり；
2008508311.tif 000238
式中、V、A、X、ZおよびUが先に定義したとおりであり、Wが以下からなる群より選択され：
2008508311.tif 000239
式中、
Q、Q1、Q2、およびQ3が独立してCHまたはNであり；
Yが独立してO、CH、=O、またはNR1であり；ならびに
R5が式（1）において定義されたとおりである。
【請求項２】
2008508311.tif 000240
である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ポリエチレングリコールがPEG300を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの濃度が5％（w/w）〜10％（w/w）である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項５】
プロピレングリコールの濃度が6％（w/w）〜12％（w/w）である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
緩衝液がリン酸緩衝液を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
糖、糖アルコール、またはその双方をさらに含み、および化学療法剤を含んでもよい、請求項1において定義された式（1）もしくは式（2）を有する化合物、または以下の式（1A）を有する化合物を含む薬学的組成物：
2008508311.tif 000241
。
【請求項８】
式（1）、式（2）、または式（1A）の2％w/w化合物を含む、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
マンニトールである4％w/w糖アルコールを含む、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
蔗糖である0.5％糖を含む、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
製剤が水溶性である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
製剤がpH約3.5を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
製剤が注射、経口、非経口、静脈内、筋肉内、局所、または局所下投与に適している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
それぞれのAがフルオロであり、それぞれのXがハロである、式（1）または式（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
AおよびXのそれぞれがフルオロである、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
それぞれのVがHである、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
UおよびXが独立してNR1R2である、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物：
式中、R1がHであり；
R2が、一つもしくは複数のヘテロ原子を含んでもよく、C3-6シクロアルキル、アリール、または一つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環の複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルであり；または
R2が、それぞれがアミノもしくはもう一つの複素環によって置換されてもよい、アリールまたは一つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環の複素環であり；
R1およびR2がNと共に、一つまたは複数のN、O、またはSを含む置換されてもよい5〜14員環を形成してもよい。
【請求項１８】
5〜14員環複素環が、独立してテトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソキサゾール、4,5-ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンズイミダゾル-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン1,1-ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-βカルボリンである、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
R1およびR2がNと共にモルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、またはジアゼピンを形成する、請求項17記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
UおよびXが独立して、R3およびR4がNと共に置換されてもよい環を形成してもよい式NR1-(CR12)n-NR3R4を有する、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
nが2〜3である、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
NR3R4が、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンである、請求項20記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
XがNR1R2であり；およびUがNR1-(CR12)n-NR3R4である、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物：
式中、
NR1R2において、R1およびR2がNと共に、置換されてもよい環を形成してもよく；
NR3R4において、R3およびR4がNと共に、置換されてもよい環を形成してもよく；ならびに
Xがアミノ、カルバメート、一つもしくは複数の非隣接N、O、もしくはSを含むC1-10アルキルによって置換されてもよく、および複素環によって置換されてもよく；そのそれぞれが置換されてもよいアリールまたは飽和もしくは不飽和複素環によって置換されてもよい。
【請求項２４】
Xが、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソキサゾール、4,5-ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンズイミダゾル-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン1,1-ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、および2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-βカルボリンからなる群より選択される複素環によって置換される、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
NR1R2およびNR3R4が独立して、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンである、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
Wが、ベンゼン、ピリジン、ビフェニル、ナフタレン、フェナントレン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、シノリン、フタラジン、キノキサリン、インドール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンゾフラン、アントロン、キサントン、アクリドン、フルオレノン、カルバゾイル、ピリミド[4,3-b]フラン、ピリド[4,3-b]インドール、ピリド[2,3-b]インドール、ジベンゾフラン、アクリジン、またはアクリジジンである、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
UがOR2であり、およびR2が炭素環または複素環によって置換されてもよいC1-6アルキルである、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
それぞれの置換されてもよい部分が、それぞれハロ、=O、アリール、または一つもしくは複数のヘテロ原子によって置換されてもよい、一つまたは複数のハロ、OR2、NR1R2、カルバメート、C1-10アルキル、C2-10アルケニルによって置換され；無機置換基、アリール、炭素環、または複素環によって置換されえる、式（1）または（2）を有する化合物を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
それを必要とする被験者または系において、細胞増殖障害を処置もしくは改善するために用いられる、または細胞死を誘導するための、請求項1〜28のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
細胞増殖障害が癌である、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
被験者がヒトまたは動物であり、系が細胞または組織である、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
それを必要とする被験者または系において、アポトーシスを誘導するために用いられる、請求項1〜28のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
被験者がヒトまたは動物であり、系が細胞または組織である、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
式（1A）を有する化合物ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグ：
2008508311.tif 000242
。
【請求項３５】
それを必要とする被験者または系において、細胞増殖障害を処置もしくは改善するための、または細胞死を誘導するための、任意で化学療法剤と共に請求項34記載の化合物またはその薬学的組成物の使用。
【請求項３６】
細胞増殖障害が癌である、請求項35記載の使用。
【請求項３７】
それを必要とする被験者または系において、アポトーシスを誘導するための、任意で化学療法剤と共に請求項34記載の化合物またはその薬学的組成物の使用。
【請求項３８】
それを必要とする系または被験者において、微生物力価を低減させるため、および／または微生物感染症を改善するための、請求項34記載の化合物またはその薬学的組成物の使用。
【請求項３９】
微生物力価または微生物感染症が、ウイルス、細菌、または真菌の力価または感染症である、請求項38記載の化合物の使用。
【請求項４０】
それを必要とする系または被験者において、c-Myc過剰発現によって媒介される障害を処置または改善するための、任意で化学療法剤と共に請求項38記載の化合物またはその薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、置換キノベンゾキサジン類似体、およびそのような化合物を用いる方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年4月15日に出願された米国特許出願第11/106,909号；2004年7月30日に出願された米国特許出願第10/903,975号；2004年4月7日に出願された米国特許出願第10/821,243号；2003年4月7日に出願された米国特許仮出願第60/461,271号；2003年4月15日に出願された米国特許仮出願第60/463,171号；2003年11月12日に出願された米国特許仮出願第60/519,535号；および2003年12月23日に出願された米国特許仮出願第60/532,727号に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
四重鎖は、核酸の特定のプリンに富む鎖において形成することができる。二本鎖核酸において、特定のプリンに富む鎖は、典型的な二重らせん構造と、らせんを形成していない非B型領域とのあいだの緩やかな平衡に関係しうる。これらの巻かれていない非B型は、「平行らせん構造」と呼ばれうる。いくつかの型は「ヌクレアーゼ過敏性要素」または「NHE」と呼ばれうるS1ヌクレアーゼ消化に対する感受性に関連している。四重鎖は、一つのタイプの平行らせん構造であり、特定のNHEは四重鎖構造をとりうる。四重鎖構造が、染色体のテロメア末端および腫瘍遺伝子調節領域を含む、ゲノムの特異的領域にインビボで存在しうることは、かなりの状況証拠から示唆されている（Han, et al., Trends Pharm. Sci. (2000)21:136〜142（非特許文献１））。このように、DNAの四重鎖形成領域は、抗癌剤の分子標的として用いられる可能性がある。
【０００４】
【非特許文献１】Han, et al., Trends Pharm. Sci. (2000)21:136〜142
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、式1、式1A、または式2を有する化合物、およびそれらを用いる方法に関する。本発明はまた、置換基が表1（表1A、1B、1Cおよび1D）における化合物から独立して選択される、式1、式1A、または式2を有する化合物の誘導体、ならびにこれらを用いる方法を含む。
【０００６】
一つの局面において、本発明は、以下を含む、四重鎖構造を形成することができる核酸と分子とのあいだの相互作用選択性を決定する方法を提供する：a）それぞれの核酸がテロメア核酸ではない、四重鎖構造を形成することができる三つまたはそれより多い核酸に、競合体分子の非存在下で分子を接触させる段階；b）分子と該三つまたはそれより多い核酸との直接の相互作用を測定する段階；およびc）相互作用測定の比較から相互作用選択性を決定する段階。一つの例において、三つまたはそれより多い核酸は、腫瘍遺伝子ヌクレオチド配列の5'に存在するヌクレオチド配列を含む。腫瘍遺伝子は、MYC、HIF、VEGF、ABL、TGF、PDGFα、MYB、SPARC、HER、VAV、RET、H-RAS、EGF、SRC、BCL-1、BCL-2、DHFR、またはHMGAであってもよい。
【０００７】
上記の方法において、分子は、異なる容器において三つまたはそれより多い核酸と個別に接触させてもよい。相互作用選択性は、IC50値の比較から決定してもよい。一つの例において、分子は、プロペラ四重鎖に結合してもよくおよび／またはそれを安定化してもよい。プロペラ四重鎖の例には、H-RAS、RET、BCL-1、DHFR、TGF-β、HIF-1α、VEGF、c-Myc、またはPDGFαが含まれるがそれらに限定されるわけではない。もう一つの例において、分子は、いす-エラ（eller）型またはかご型四重鎖に結合してもよくおよび／またはそれを安定化してもよい。例えば、分子はBCL-2に結合および／または安定化してもよい。
【０００８】
一つの態様において、分子は核酸または抗体を含む。核酸は、例えばアンチセンス核酸、リボザイム、RNAiまたはsiRNAであってもよい。
【０００９】
もう一つの態様において、分子は、以下の式（1）を有する化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグを含む。
2008508311.tif 000003
式中、
VはH、ハロ、またはNR1R2であり；
Aは、H、フルオロ、またはNR12であり；
Zは、O、S、NR1、またはCH2であり；
Uは、OR2、NR1R2、またはNR1-(CR12)n-NR3R4であり；
Xは、OR2、NR1R2、NR1-(CR12)n-NR3R4、ハロ、アジド、またはSR2であり；
mは1〜3であり；
nは1〜6であり；
R1およびR3は独立してHまたはC1-6アルキルであり；
R2は、Hであるか、またはN、O、およびSから選択される一つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を含んでもよく、および炭素環もしくは複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；またはR2は、置換されてもよい複素環、アリールもしくはヘテロアリールであり；
R4は、Hであるか、またはN、O、およびSから選択される一つもしくは複数の非隣接ヘテロ原子を含んでもよく、および炭素環もしくは複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルもしくはC2-10アルケニルであり；
式中、NR1R2において、R1およびR2はNと共に、イミンまたは置換されてもよい環を形成してもよく；
式中、NR3R4において、R3およびR4はNと共に、グアニジニルまたは置換されてもよい環を形成してもよく；
R5は、W上の任意の位置の置換基であり；およびそれぞれがハロ、=O、または一つもしくは複数のヘテロ原子によって置換されてもよいH、OR2、C1-6アルキル、C2-6アルケニルであり；またはR5は、無機置換基であり；または二つの隣接するR5がWと共に連結して環を形成し；および
Wは、単環であってもよく、または単環もしくは多環と縮合してもよく、およびヘテロ原子を含んでもよい、置換されてもよいアリールまたはヘテロアリールであり；
または式（2）を有する化合物であり；
2008508311.tif 000004
式中、V、A、X、ZおよびUは先に定義したとおりであり、Wは以下からなる群より選択され：
2008508311.tif 000005
式中、
Q、Q1、Q2、およびQ3は独立してCHまたはNであり；
Yは独立してO、CH、=O、またはNR1であり；ならびに
R5は式（1）において定義されたとおりである。
【００１０】
さらにもう一つの態様において、分子は以下の式（1A）を有する化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグを含む。
2008508311.tif 000006
【００１１】
本発明はまた、先に定義したとおりである式（1）、（1A）、または（2A）の化合物を含む薬学的組成物を提供する。一つの態様において、薬学的組成物は、先に定義したとおりである式（1）、（1A）、または（2A）の化合物を含み、緩衝液においてポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールをさらに含み、化学療法剤を含んでもよい。ポリエチレングリコールは、例えば5％（w/w）〜10％（w/w）の濃度のPEG300を含んでもよい。プロピレングリコールの濃度は、6％（w/w）〜12％（w/w）であってもよい。特定の例において、緩衝液はリン酸緩衝液を含む。
【００１２】
もう一つの態様において、薬学的組成物は、先に定義したとおりである式（1）、（1A）、または（2A）の化合物を含み、糖、糖アルコール、またはその双方をさらに含み、化学療法剤を含んでもよい。薬学的組成物は、式（1）、（2）、または（1A）の化合物の2％w/wを含んでもよい。一つの例において、薬学的組成物は、マンニトールである、4％w/w糖アルコールを含む。もう一つの例において、薬学的組成物は、蔗糖である、0.5％糖を含む。
【００１３】
本発明の薬学的製剤は水溶性であってもよく、pH約3.5を有してもよい。薬学的組成物は注射、経口、非経口、静脈内、筋肉内、局所、または局所下投与にとって適していてもよい。
【００１４】
一つの態様において、薬学的組成物は、それぞれのAがフルオロであり、それぞれのXがハロであってもよい、式（1）または（2）を有する化合物を含む。特定の例において、それぞれのAおよびXはフルオロである。
【００１５】
もう一つの態様において、薬学的製剤は、それぞれのVがHであってもよい、式（1）または（2）を有する化合物を含む。
【００１６】
さらにもう一つの態様において、薬学的製剤は、UおよびXがNR1R2であってもよい、式（1）または（2）を有する化合物を含む。
式中、
R1はHであり；
R2は、一つもしくは複数のヘテロ原子を含んでもよく、C3-6シクロアルキル、アリール、または一つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環の複素環によって置換されてもよいC1-10アルキルであり；または
R2は、それぞれがアミノもしくはもう一つの複素環によって置換されてもよい、アリールまたは一つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む5〜14員環の複素環である。
【００１７】
UおよびXがNR1R2である態様において、R1およびR2はNと共に、一つもしくは複数のN、O、もしくはSを含む、置換されてもよい5〜14員環を形成してもよい。例えば、R1およびR2はNと共に、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジン、またはジアゼピンを形成してもよい。
【００１８】
さらにもう一つの態様において、薬学的製剤は、UおよびXが独立して、式NR1-(CR12)n-NR3R4であってもよく、式中、R3およびR4がNと共に、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンのような置換されてもよい環を形成してもよい、式（1）または（2）を有する化合物を含む。一つの例において、nは2〜3である。
【００１９】
さらにもう一つの態様において、薬学的製剤は、XがNR1R2であり；およびUがNR1-(CR12)n-NR3R4である、式（1）または（2）を有する化合物を含み；
式中、
NR1R2において、R1およびR2はNと共に、置換されてもよい環を形成してもよく；
NR3R4において、R3およびR4はNと共に、置換されてもよい環を形成してもよく；ならびに
Xはアミノ、カルバメート、一つもしくは複数の非隣接N、O、もしくはSを含むC1-10アルキルによって置換されてもよく、複素環によって置換されてもよく；そのそれぞれが置換されてもよいアリールまたは飽和もしくは不飽和複素環によって置換されてもよい。
【００２０】
XおよびUが独立して、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジン、またはピペリジンである態様において。
【００２１】
さらにもう一つの態様において、薬学的製剤は、Wが、ベンゼン、ピリジン、ビフェニル、ナフタレン、フェナントレン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、シノリン、フタラジン、キノキサリン、インドール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンゾフラン、アントロン、キサントン、アクリドン、フルオレノン、カルバゾイル、ピリミド[4,3-b]フラン、ピリド[4,3-b]インドール、ピリド[2,3-b]インドール、ジベンゾフラン、アクリジン、またはアクリジジンである、式（1）または（2）を有する化合物を含む。
【００２２】
さらにもう一つの態様において、薬学的製剤は、UがOR2であり、R2が炭素環または複素環によって置換されてもよいC1-6アルキルである、式（1）または（2）を有する化合物を含む。
【００２３】
式（1）または（2）を有する化合物における置換基として用いてもよい複素環の例は、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソキサゾール、4,5-ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンズイミダゾル-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン1,1-ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、または2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-βカルボリンが含まれるがそれらに限定されるわけではない5〜14員環の複素環である。
【００２４】
さらに、式（1）または（2）を有する上記の化合物において、それぞれの置換されてもよい部分は、それぞれが、ハロ、=O、アリール、または一つもしくは複数のヘテロ原子によって置換されてもよい、一つまたは複数のハロ、OR2、NR1R2、カルバメート、C1-10アルキル、C2-10アルケニルによって置換されてもよく；無機置換基、アリール、炭素環、または複素環によって置換されてもよい。
【００２５】
本発明の化合物および薬学的組成物は、それを必要とする被験者もしくは系において、細胞増殖障害を処置もしくは改善するために、または細胞死を誘導するために有用である。例えば、細胞増殖障害は癌であってもよい。本発明の化合物および薬学的組成物はまた、それを必要とする被験者または系においてアポトーシスを誘導するために有用である。被験者はヒトまたは動物であってもよく、系は細胞または組織であってもよい。本発明はまた、細胞増殖障害を処置するため、または細胞死を誘導するための薬剤を製造するために、本発明の化合物または薬学的組成物を用いることを提供する。
【００２６】
もう一つの態様において、本発明は、それを必要とする系または被験者において、微生物力価を低減させるために、および／または微生物感染症を改善するために、本発明の化合物、またはその薬学的組成物を任意で化学療法剤と共に用いることを提供する。微生物力価または微生物感染症は、ウイルス、細菌、または真菌の力価または感染症であってもよい。もう一つの態様において、本発明は、それを必要とする系または被験者において、c-Myc過剰発現によって媒介される障害を処置または改善するために、本発明の化合物、またはその薬学的組成物を任意で化学療法剤と共に用いることを提供する。さらに、本発明は、式（1）、式（2）または式（1A）を有する化合物の有効量を、任意で化学療法剤と共にそれを必要とする系または被験者に投与して、それによってアポトーシスを誘導する段階を含む、アポトーシスを誘導する方法を提供する。被験者はヒトまたは動物であってもよく、系は細胞または組織であってもよい。特定の態様において、本発明は、先に示されたように、式（1A）を有する化合物、またはその薬学的組成物を用いることを提供する。
【００２７】
定義
本明細書において用いられるように、「アルキル」という用語は、炭素を含む化合物を指し、一つまたは複数のヘテロ原子を含む化合物を含む。「アルキル」という用語はまた、OR1、アミノ、アミド、ハロ、=O、アリール、複素環基、または無機置換基が含まれるがそれらに限定されるわけではない一つまたは複数の置換基によって置換されたアルキルを含む。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「炭素環」という用語は、環において炭素原子のみを含む環状化合物を指し、「複素環」は、ヘテロ原子を含む環状化合物を指す。炭素環および複素環構造は、単環、二環、または多環系を有する化合物を含む。
【００２９】
本明細書において用いられるように、「アリール」という用語は、多価不飽和、典型的に芳香族炭化水素置換基を指すのに対し、「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、ヘテロ原子を含む芳香環を指す。アリールおよびヘテロアリール構造は、単環、二環、または多環系を有する化合物を含む。
【００３０】
本明細書において用いられるように、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、または硫黄のような、炭素または水素でない任意の原子を指す。
【００３１】
複素環の説明的な例には、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソキサゾール、4,5-ジヒドロイソキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、1,3-ジヒドロベンズイミダゾル-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン1,1-ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-βカルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタムが含まれるがそれらに限定されるわけではなく、同様にヘテロアリールを含んでもよい。ヘテロアリールの他の説明的な例には、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、およびトリアゾールが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００３２】
本明細書において用いられるように、「二環化合物」という用語は、橋頭炭素原子の対を共有する二つの環を有する化合物を指す。二環化合物の例には、デカリン、ノルボルナン、カンフル、およびジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタンが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００３３】
本明細書において用いられる「処置する」、「処置」および「治療効果」という用語は、細胞増殖速度を低減もしくは停止させる（例えば、腫瘍の成長を遅らせるまたは休止させる）ことまたは増殖する癌細胞の数を低減させる（例えば、腫瘍の一部または全てを除去する）ことを指す。これらの用語はまた、微生物に感染した系（すなわち、細胞、組織、または被験者）における微生物の力価を低減させるため、微生物の伝幡速度を低減させるため、微生物感染症に関連した症状の数または症状の効果を低減させるため、および／または系からの微生物の検出可能な量を除去するためにも応用可能である。微生物の例には、ウイルス、細菌、および真菌が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００３４】
本明細書において用いられるように、「化学療法剤」という用語は、腫瘍または癌のような細胞増殖障害を処置または改善するために用いてもよい治療物質を指す。化学療法剤の例には、抗新生物剤、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗菌剤、スルホンアミド、抗ウイルス剤、白金物質、および当技術分野で公知の他の抗癌剤が含まれるがそれらに限定されるわけではない。化学療法剤の特定の例には、シスプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、メソトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メファラン（mephalan）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、パクリタキセル、ゲンシタビン、および当技術分野で公知の他の物質が含まれるがそれらに限定されるわけではない（例えば、GoodmanおよびGilman, 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」(9th ed）(Goodman, et al., eds.)(McGraw-Hill)(1996)；および1999 Physician's Desk Reference(1998)を参照されたい）。
【００３５】
本明細書において用いられるように、「アポトーシス」という用語は、内因性の細胞の自己破壊または自殺プログラムを指す。誘発刺激に反応して、細胞は、細胞の収縮、細胞膜の気泡形成、および染色質の凝縮および断片化を含む一連のカスケードを受ける。これらの事象は、細胞において最後には膜結合粒子（アポトーシス体）の集団への変換で終わり、その後、これらはマクロファージによって包み込まれる。
【００３６】
発明の説明
本発明は、式1、1A、および2を有する化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグに関する。本発明はまた、スクリーニングにおいて、およびアポトーシスを誘導するためのように、本明細書において記述された化合物を用いる方法にも関する。化合物は、四重鎖を形成することができるDNAの領域と相互作用してもよく、同様に細胞増殖障害を処置するために用いてもよい。
【００３７】
一つの局面において、本発明の方法は、A、Z、V、X、W、およびUが既に記述されたとおりである、式1または2を有する化合物、ならびにその薬学的に許容される塩、エステル、およびプロドラッグを用いることに関する。
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【００３８】
上の式1または2で、AおよびXは、独立的にハロとすることができる。一例において、AおよびXは独立的にフルオロとすることができる。
【００３９】
上の式1または2で、VはHとすることができる。別の方法として、VはNH2または式NR1-(CR12)n-NR3R4を持つ化合物とすることができる。
式中、R1およびR3は、独立的にHまたはC1-6アルキルで、
nは、1〜6で、また
R4は、H、炭素環式もしくは複素環式の環により任意に置換されるC1-6アルキル、またはアリールで、またここにおいて、NR3R4では、R3およびR4は任意に置換された環を形成するものであってもよい。
【００４０】
上の式1または2で、UおよびXは、独立的にNR1R2とすることができる。一例において、R1はHで、R2は、任意に1個または複数個のヘテロ原子を含みうるC1-10アルキルで、C3-6シクロアルキル、アリール、または1個または複数のN、OまたはSを含む5〜14員複素環で任意に置換される。別の例において、R1はHで、R2はアリールまたは1個または複数個のN、OまたはSを含み、それぞれアミノまたは別の複素環と任意に置換されうる5〜14員複素環である。さらに別の例において、NR1R2のR1とR2は、1個または複数個のN、OまたはSを含む任意に置換される5〜14員環を形成する。例えば、NR1R2は、ピロリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、ピペリジンまたはジアゼピンを形成するものとすることができる。
【００４１】
上の式1または2で、UおよびXは、独立的に次の式を有するものとすることができる。
NR1-(CR12)n-NR3R4                      (3)
式中、R1およびR3は、独立的にHまたはC1-6アルキルで、
nは、1〜6で、また
R4はH、またはN、O、Sの中から選択される1個または複数個の非隣接ヘテロ原子を任意に含み、炭素環式もしくは複素環式の環で任意に置換されるC1-10アルキルまたはC2-10アルケニルである。
ここにおいて、NR3R4では、R3およびR4は任意に置換された環を形成するものとすることができる。
【００４２】
上の式3において、nは2〜3とすることができ、かつNR3R4は非環式アミン、またはグアニジニルまたはその互変異性体であるか、またはR3およびR4は任意に1個または複数個のN、OまたはSを含む置換された環を形成する。特定の例において、NR3R4は、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジンまたはピペリジンである。
【００４３】
上の式1または2で、XはNR1R2とすることができ、Uは次の式を有する。
NR1-(CR12)n-NR3R4                      (3)
式中、R1およびR2は、請求項1で定義したとおりである。
R3は、HまたはC1-6アルキルで、
nは、1〜6で、また
R4はH、またはN、O、Sの中から選択される1個または複数個の非隣接ヘテロ原子を任意に含み、炭素環式もしくは複素環式の環で任意に置換されるC1-10アルキルまたはC2-10アルケニルである。
ここにおいて、NR1R2およびNR3R4、R1およびR2、ならびにR3およびR4ではそれぞれ独立的に置換環を形成することができる。
【００４４】
上の式1または2で、XはNR1R2で、Uは式NR1-(CR12)n-NR3R4(2)となり、NR1R2のR1とR2、およびNR3R4のR3とR4は、それぞれ1個または複数個のN、OまたはSを含む置換された環を独立的に形成してもよい。例えば、Xは、アミノ、カルバメート、1個または複数個の非隣接N、OまたはSを含み複素環で任意に置換されるC1-10アルキル、アリール、または飽和複素環または不飽和複素環（どれも任意に置換される）により任意に置換される。一例において、XおよびNR3R4は、独立的にモルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、ピロリジン、ピペラジン、ピリジンまたはピペリジンなどである。一例において、XおよびNR3R4は、独立的にピロリジンである。別の例において、Xはピロリジンで、ピラジンで置換される。この例において、VはH、Aはフルオロ、Wはナフタレニルである。
【００４５】
複素環の例には、テトラヒドロフラン、1,3-ジオキソラン、2,3-ジヒドロフラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、1,3-ジヒドロ-イソベンゾフラン、イソオキサゾール、4,5-ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン-2-オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロ-ピロロ[3,4-b]ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン-2,4-ジオン、ベンズイミダゾール、1,3-ジヒドロベンゾイミダゾール-2-オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロ-チオフェン 1,1-二酸化物、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン、および2,3,4,4a,9,9a-ヘキサヒドロ-1H-J-カルボリンなどがあるが、これに限定されない。
【００４６】
上の式1または2で、Wは、ベンゼン、ピリジン、ビフェニル、ナフタレン、フェナントレン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、シンノリン、フタラジン、キノキサリン、インドール、ベンズイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンゾフラン、アントロン、キサントン、アクリドン、フルオレノン、カルバゾリル、ピリミド[4,3-b]フラン、ピリド[4,3-b]インドール、ピリド[2,3-b]インドール、ジベンゾフラン、アクリジン、またはアクリジジンのいずれかとすることができる。
【００４７】
上の式1または2で、Uは、OR2とすることができ、またR2は炭素環式もしくは複素環式の環と任意に置換されるC1-6アルキルである。
【００４８】
上の式1または2で、それぞれの任意に置換される部分は、1個または複数個のハロ、OR2、NR1R2、カルバメート、C1-10アルキル、C2-10アルケニル、（それぞれハロ、=O、アリールまたは1個または複数個のヘテロ原子で任意に置換）、無機置換基、アリール、炭素環式もしくは複素環式の環で置換される。
【００４９】
もう1つの局面において、本発明の方法は、式1Aを有する化合物の使用に関する。
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式はまた化合物CX-3543とも呼ばれる。
【００５０】
化合物はキラルまたはアキラルとすることができる。本明細書で使用する場合、キラル化合物とは、その鏡像と異なり、エナンチオマーを有する化合物である。キラル化合物の合成方法およびエナンチオマーのラセミ混合物の分解方法は、当業者にはよく知られている。例として、March, 「Advanced Organic Chemistry」, John Wiley and Sons, Inc., New York, (1985)があるが、これは参照により本明細書に組み込まれる。さらに本発明は、式1、式1A、または式2を有する化合物を含む薬学的組成物を提供する。本発明の方法において使用するための化合物の例示を表1（1A、1B、1Cおよび1D）に示す。
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【００５１】
本明細書に記載の化合物は、四重鎖を形成しうるDNAの領域と相互に作用する。四重鎖を形成しうるDNAの領域は、発癌遺伝子転写などの生物学的処置を調節する役目をするため、四重鎖生物活性の修飾因子は、癌治療に用いることができる。四重鎖を形成しうるDNAの領域と相互に作用する分子は、一定の細胞増殖性疾患やそれに関連する状態に療法効果を及ぼしうる。特に、発癌遺伝子発現が異常に増加すると、細胞増殖性疾患の原因となることがあり、一般に四重鎖構造により発癌遺伝子発現が下方制御される。発癌遺伝子の例としては、MYC、HIF、VEGF、ABL、TGF、PDGFA、MYB、SPARC、HER、VAV、RET、H-RAS、EGF、SRC、BCL1、BCL2、DHFR、HMGAおよび当技術分野で知られているその他の発癌遺伝子などが含まれるがそれに限定されない。
【００５２】
四重鎖を形成しうるDNAの領域に結合する分子は、異なる機序に従い生物学的効果を及ぼしうるが、この機序には例えば、天然四重鎖構造の安定化、鎖の切断を阻止することによる天然四重鎖の二本鎖DNAへの転換の抑制、四重鎖不安定化ヌクレオチド置換およびその他の配列特異的相互作用のある天然四重鎖構造の安定化などが含まれる。こうして、本明細書で説明した四重鎖を形成しうるDNAの領域に結合する化合物は、発癌遺伝子転写を下方制御し、それにより細胞増殖性疾患を治療する目的で、細胞、組織、または生物体に投与することができる。
【００５３】
四重鎖を形成しうる天然DNAの生物活性が、細胞内、組織内、または生物体内で調整されるかどうかの判断は、四重鎖生物活性のモニタリングにより達成できる。DNAの四重鎖を形成する領域の生物活性は、細胞内、組織内、または生物体内でモニタリングすることができ、例えば、四重鎖を形成するDNAと分子との接触に応答した遺伝子転写の増減を検出する方法がある。転写は、RNA転写物を直接観察するか、転写物により翻訳されたポリペプチドを観察することにより、検出が可能であり、これらは当技術分野では周知の方法である。
【００５４】
四重鎖を形成するDNAおよび四重鎖を形成する核酸と相互に作用する分子は、数多くの細胞増殖性疾患の治療に用いることができる。細胞増殖性疾患には、例えば、結腸直腸癌および造血器腫瘍性疾患（例えば、骨髄性、リンパ系または赤血球系列、またはその前駆細胞に起因するものなど造血系の過形成／腫瘍細胞の関与する疾患）などがある。この疾患は、低分化型の急性白血病（赤芽球系白血病や急性巨核芽球性白血病など）に起因することもある。その他の骨髄性疾患には、急性プロミエロイド白血病（APML）、急性骨髄性白血病（AML）および慢性骨髄性白血病（CML）（Vaickus, Crit. Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297 (1991)）があるが、これに限定されない。リンパ系悪性腫瘍には、急性リンパ性白血病（ALL）（これにはＢ細胞系急性リンパ性白血病とT細胞系急性リンパ性白血病がある）、慢性リンパ性白血病（CLL）、前リンパ球性の白血病（PLL）、毛細胞白血病（HLL）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（WM）があるが、これに限定されない。悪性リンパ腫のその他の形態には、非ホジキンリンパ腫とその変異体、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病／リンパ腫（ATL）、皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、大顆粒リンパ球性白血病（LGF）、ホジキン病およびリード‐シュテルンベルク病があるが、これに限定されない。また、細胞増殖性疾患には、結腸直腸、胸部、肺、肝臓、膵臓、リンパ節、結腸、前立腺、脳、頭と首、皮膚、肝臓、腎臓、および心臓の癌などがある。四重鎖を形成しうるDNAの領域と相互に作用する化合物は、被験体における血管新生を抑制することにより、血管新生の増大など、癌に関連した過程や状態を標的とするために用いることもできる。
【００５５】
本発明により、細胞増殖を低減する方法、または細胞増殖性疾患を治療もしくは軽減する方法が提供されるが、これは、式1、式1A、または式2を有する化合物と四重鎖を形成する能力のあるDNAを持ったシステムに接触することを含む。このシステムは細胞群または1個または複数個の組織とすることができる。一態様において、このシステムは細胞増殖性疾患の治療を必要とする被験体（マウス、ラット、サル、またはヒトなどの哺乳動物）である。
【００５６】
また、本発明は、c-Myc過剰発現に関連する癌の治療または改善の方法も提供し、これはc-MYC四重鎖を形成する領域と相互に作用する化合物をそれを必要とする被験体に投与することによる。c-Myc過剰発現に関連する癌の例は、結腸直腸癌、前立腺癌、および膵臓癌が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、血管新生を抑制する方法、および任意に血管新生と関連性のある癌の治療方法も提供するが、これは血管内皮の成長因子（VEGF）四重鎖を形成する領域と相互に反応する化合物をそれを必要とする被験体に投与し、それにより血管新生を低減し、また血管新生と関連性のある癌を任意に治療することを含む。
【００５７】
DNAの四重鎖を形成する領域と相互に作用する化合物は、ウイルス感染などの微生物感染の低減にも使用できる。レトロウイルスは、G-四重鎖を標的とした治療学のための潜在的標的を豊富に提供するものである。G-四重鎖構造は、HIV、二量体リンカー構造（DLS）およびセントラルDNAフラップ（CDF）のウイルスRNAまたはDNAのいずれかにより形成される少なくとも2個の二次構造における機能的要素としてかかわり合ってきた。さらに、分子間または分子内四重鎖構造のいずれかを適用しうるDNAアプタマーにより、ウイルス複製が抑制されうる。一例において、DNAアプタマーは、エンベロープタンパク質（推定的）を標的とすることで、ウイルス複製の抑制が可能である。別の例において、DNAアプタマーは、それぞれHIV-インテグラーゼを標的とし、インテグラーゼ酵素との相互作用における天然四重鎖構造の関与を示すことで、ウイルス複製を抑制する。
【００５８】
すべてのレトロウイルスに共通の二量体リンカー構造は、2つのウイルスRNA配列の2つの5’端の間で非共有結合の相互作用をすることで、ウイルス性ゲノムの複製物2つを結合する役目をする。ゲノム二量体は、成熟ウイルス粒子内のGagタンパク質と安定した関係を有している。HIVの場合には、この非共有結合の起源は、少なくとも2つの連続したグアニン（インビトロでのRNAダイマーの生成用の3’など）の複数列を含む98の塩基対の配列にたどることができる。アンチセンス配列が効果的に二量体化するされることに失敗したことに加え、インビトロでの二量体の生成と安定性には陽イオン（カリウム）への依存が観察されたことで、最も可能性の高い結合構造は分子間G-四重鎖であることが明らかになった。
【００５９】
宿主ゲノムへの組み込みの前に、逆転写されたウイルスDNAは、少なくとも2つの主なウイルスタンパク質、インテグラーゼおよび逆転写酵素のあるプレインテグレーション複合体（PIC）を形成し、その後これが核に運ばれる。セントラルDNAフラップ（CDF）とは、+鎖の99塩基長の一本鎖の尾を意味し、ウイルス性二本鎖DNAの中心付近で発生し、PICの核の取り込みにおける役割を果たすことで知られている。CDFのオリゴヌクレオチド模倣体は、細胞のないシステムにおいて分子間G-四重鎖構造を形成することが示されている。
【００６０】
こうして、四重鎖を形成する領域を認識する化合物は、二量体リンカー構造を安定させるために使用でき、こうして2つのRNA鎖のデカップリングが阻止される。また、CDFにより形成された四重鎖構造への結合により、PICの核転移のためのタンパク質認識および/または結合現象が混乱することがある。いずれの場合においても、抗ウイルス療法に対してかなりの有利な面があることが考えられる。現在の高活性抗レトロウイルス剤療法（HAART）といった療法は、HIVプロテアーゼやHIVインテグラーゼを標的とした薬物を組み合わせたものの使用に依存している。多剤併用療法の要件は、耐性の出現を最小限に抑えることであるが、これは普通は薬剤が孤立的に使用された場合に急速に進行する。こうした急速な耐性の出現の原因は、逆転写酵素の不忠実さであり、10,000塩基対あたり約1回の突然変異を起こす。ウイルスの四重鎖構造を標的にすることがタンパク質を標的にすることより優れている点は、耐性の進行が遅いか、または不可能なことである。標的の四重鎖の点突然変異は、四重鎖構造の完全性を損い、ウイルスの非機能的な複製を招くことがある。この考え方をもとに、単一の治療薬は現在採用されている多剤併用療法に取って代わるものとなることが考えられ、同時にコストの低減や有害な薬物／薬剤相互作用の除去といった利点がある。
【００６１】
本発明は、システム内の微生物力価を減少させる方法を提供し、これは、式1、式1A、または式2を有する化合物のある領域を形成する天然DNA四重鎖を持ったシステムと接触することを含む。このシステムとしては、1個または複数個の細胞や組織などが考えられる。微生物力価の例としては、ウイルス性、細菌性または真菌性の力価などがあるが、これに限定されない。特定の態様において、このシステムはウイルス感染の治療を必要とする被験体（例えば、マウス、ラット、サル、またはヒトなどの哺乳動物）である。ウイルス感染の例としては、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎またはC型肝炎など）、エイズウイルス（HIV）、ライノウイルス、帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV-1またはHSV-2など）、サイトメガロウイルス（CMV）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、脳炎ウイルス、ハンタウイルス、アルボウイルス、西ナイルウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、エプスタイン・バールウイルス、および呼吸器合胞体ウイルスなどによる感染がある。また、本発明は、式1を有する化合物をそれを必要とする被験体に投与することでHIV感染を低減させ、HIV感染を治療する方法を提供する。
【００６２】
DNAの四重鎖を形成する領域に結合可能な化合物を識別する
本明細書で説明されている化合物は、DNAの四重鎖を形成する領域に結合可能な化合物として識別され、これにおいて、その化合物を含むシステムの中で生成されるこの領域の生物活性（しばしば「信号」と表現される）は、その化合物が含まれていないシステムの中で生成される信号とは異なる。このアッセイ法で新しい分子が探索される度に背景信号が評価されうる一方で、新しい分子が評価される度に背景信号を検出する必要はない。
【００６３】
四重鎖を形成する核酸配列の例は、次の表2に記載したとおりである。
【００６４】
（表２）
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【００６５】
試験分子や試験核酸によって異なる信号が引き起こされるかどうかの判断に加え、核酸とその化合物との間の相互作用の親和性を数量化することもできる。IC50、Kd、またはKiのしきい値をそれぞれの相互作用について測定したIC50またはKdの値と比較することができ、それにより試験分子を四重鎖と相互作用する分子として、または試験核酸を四重鎖を形成する核酸として識別することができる。例えば、10μM以下、1μM以下、または100nM以下といったIC50またはKdのしきい値がよく用いられる。別の例において、四重鎖と相互作用する分子および四重鎖を形成する核酸を識別するために、10nM以下、1nM以下、100pM以下、および10pM以下のしきい値が用いられることがある。
【００６６】
DNAの四重鎖を形成する領域の親和性を持つ化合物を識別するために、数多くのアッセイ法を使用できる。これらのアッセイ法のうち一部において、生物活性は、化合物に結合する四重鎖酸で、結合は信号として測定される。その他のアッセイ法において、生物活性は、四重鎖の機能を阻止するポリメラーゼで、阻止の度合いは信号の減少として測定される。一定のアッセイ法において、生物活性は転写で、転写レベルを信号として数量化できる。別のアッセイ法において、生物活性は細胞死で、細胞死にいたる細胞数が数量化される。別のアッセイ法では、癌細胞の増殖率が監視される。アッセイ法の例としては、蛍光色素結合アッセイ法、ゲル移動度シフト分析（例えば、JinおよびPike, Mol. Endocrinol. (1996) 10:196-205を参照）、ポリメラーゼアレストアッセイ法、転写レポーターアッセイ法、癌細胞増殖アッセイ法、およびアポトーシス検出法（例えば、Amersham Biosciences 社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）を参照）などがあるが、それらのアッセイ法の実施例については下記に説明する。また、トポイソメラーゼアッセイ法を、四重鎖と相互作用する分子がトポイソメラーゼ経路活性をもつかどうかの判定に使用できる（例えば、TopoGEN, Inc. （オハイオ州コロンバス）を参照）。
【００６７】
ゲル電気泳動移動度シフト解析（EMSA）
EMSAは、核酸で四重鎖が形成されるか、およびヌクレオチド配列が四重鎖不安定であるかを判定するために有用である。EMSAは、前述（JinおよびPike, Mol. Endocrinol. 10: 196-205 (1996)）を多少修正したもとのして実施される。一般に、合成の一本鎖オリゴヌクレオチドは、[K-32P]ATP（1,000 mCi/mmol, Amersham Life Science）の存在下でT4-キナーゼのある5'-末端で標識化され、セファデックスカラムにより精製される。次に、32P標識化されたオリゴヌクレオチド（〜30,000cpm）を、10mMのトリスpH7.5、100mMのKCl、5mMのジチオスレイトール、0.1mMのEDTA、5mMのMgCl2、10%のグリセロール、0.05%のNonedit P-40、および0.1mg/mlのポリ(ジ-dC)が含まれる緩衝液20μl（Pharmacia）に、さまざまな濃度の試験化合物を溶解したものと共にまたはその化合物なしで培養する。室温で20分間培養した後、結合反応を0.25xトリス ボレート-EDTA緩衝液（0.25 xTBE、1xTBEは89mM トリス-ボレート、pH 8.0、1mM EDTA）に溶かした5%ポリアクリルアミドゲル上に載せる。ゲルが乾燥したら、それぞれのバンドをホスフォイメージャー（phosphoimager）を使用して数量化する。
【００６８】
DMSメチル化プロテクションアッセイ法
化学フットプリント分析は、四重鎖構造の評価に有用である。四重鎖構造は、核酸中のどのヌクレオチドが、変性試薬にそれぞれ到達不能または到達可能である結果としての化学修飾に対して、保護されているかまた保護されていないかを判定することにより評価される。DMSメチル化アッセイ法は、化学フットプリント分析の一例である。こうしたアッセイ法において、EMSAによるバンドは単離され、DMS誘発による鎖の切断の対象となる。対象となる各バンドは、電気泳動移動度シフトゲルから切除され、4℃の100mM KCl溶液（300μl）に6時間浸す。この溶液をろ過し（マイクロ遠心機）、30,000cpm（反応あたり）のDNA溶液をさらに100mM KClを0.1X TEに溶かしたもので希釈し、合計量を70μl（反応あたり）にする。1μlのサケ精液DNA（0.1μg/μl）を加えた後、反応混合物を1μlのDMS溶液（DMS:エタノール；4:1；v:v）で一定時間だけ培養する。各反応を、18μlの停止バッファー（b-メルカプトアタノール:水:NaOAc (3M)；1:6:7；v:v:v）で停止させる。エタノール沈殿（2回）とピペリジン切断の後、反応は分離ゲル（16%）上で分離し、ホスフォイメージャーで画像表示させる。
【００６９】
ポリメラーゼアレストアッセイ法
アレストアッセイ法には、テンプレート核酸（四重鎖を形成する配列から構成されることもある）、および四重鎖を形成する配列のテンプレート核酸5’に対してハイブリッド形成されるプライマー核酸が含まれる。プライマーは、テンプレート核酸に沿ってプライマーから発達したポリメラーゼ（Taqポリメラーゼなど）により延長される。このアッセイ法において、四重鎖構造によって酵素の発達が遮断または阻止されることがあり、転写断片が短くなることになる。また、アレストアッセイ法は、45℃および60℃を含めたさまざまな温度で、またさまざまなイオン濃度で実施できる。
【００７０】
Taqポリメラーゼ停止試験の一例がHan, et al., Nucl. Acids Res. (1999) 27:537-542に説明されており、これはWeitzmann, et al., J.Biol.Chem. (1996) 271:20958-20964で使用されているものを修正したものである。手短かに説明すれば、テンプレートDNA（50nM）、Tris HCl（50mM）、MgCl2（10mM）、DTT（0.5mM）、EDTA（0.1mM）、BSA（60ng）、および5’端で標識化された四重鎖核酸（〜18nM）の反応混合物を5分間90℃まで加熱し、30分かけて周囲温度まで冷却させる。Taqポリメラーゼ（1μl）を反応混合物に加え、反応は30分間一定温度に保持される。10μlの停止バッファー（ホルムアミド（20ml）、1M NaOH（200μl）、0.5M EDTA（400μl）、および10mgのブロモフェノールブルー）を加えた後、反応は分離ゲル（12%）上で分離され、ホスフォイメージャーで画像表示させる。アデニン配列決定（ゲルの最上部で「A」で表示）は、二本鎖DNAサイクルシーケンス方式（Life Technologiesによる）を使用て実施される。鋳型鎖の一般的配列は、
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で、ここで「INSERT」は、四重鎖を形成する配列を含む核酸配列を意味する（表2などを参照）。ゲル上のバンドの移動度が遅くなるが、これは四重鎖の生成を示すものである。
【００７１】
高度処理能力のあるポリメラーゼアレストアッセイ法
高度処理能力のあるポリメラーゼアレストアッセイ法が開発された。このアッセイ法は、テンプレート核酸（多くの場合DNA）をプライマー（これも多くの場合DNA）と接触させる手順、プライマー／テンプレート合成を本明細書で説明した化合物（「試験化合物」ともいう）と接触させる手順、プライマー／テンプレート合成をポリメラーゼと接触させる手順、および反応生成物を分離する手順を含む。このアッセイ法では、多くの場合、プライマー／テンプレート合成混合物を変性させた後、その複合体を再生させる手順が含まれ、これは多くの場合、試験分子をシステムに追加する前に実施される。多くの場合、例えばIC50値が得られるように、異なる濃度の試験化合物を用いて複数の試験が実施される。反応性生物には、長さの異なる延長されたプライマーが含まれていることが多い。試験化合物と鋳型中の四重鎖構造との間で有意な相互作用がない場合には、プライマーは、その鋳型の端部まで伸びることが多い。
【００７２】
試験化合物が、鋳型中の四重鎖構造と有意に相互作用する場合、多くの場合にプライマーは、鋳型中の四重鎖構造までは伸びるが、それ以上は伸びない。こうして、多くの場合に反応混合物には、試験化合物が鋳型中の四重鎖構造と相互作用する場合、少なくとも2つの反応生成物が含まれ、その1つは、完全に伸びたプライマーのあるもので、1つは不完全に伸びたプライマーのあるもので、これらの2つの反応生成物は分離される。これらの生成物は、質量分析法、および1つの態様ではキャピラリー電気泳動法など、都合のよい任意の分離方法を使用して分離できる。
【００７３】
反応性生物は、多くの場合、プライマーに連結された検出可能ラベルを検出することで識別される。検出可能ラベルは、プライマーの5’末端に非共有結合されていることもある（例えば、プライマーの5’末端に共有結合されたビオチン分子で、これが検出可能ラベルと結合したアビジン分子に非共有結合されているもの）。検出可能ラベルは、時にはプライマーをシステムに追加する前、プライマーを延長させた後、または生成物を分離した後など、アッセイ法のどの段階でもプライマーと結合することができる。検出可能ラベルは、多くの場合、検出可能ラベルの化学基の性質に応じて選択される手順を用いて、プライマーに共有結合されている。
【００７４】
検出可能ラベルを核酸に共有結合するための数多くの方法が使用できるが、これにはアリルアミン由来のヌクレオチドを、検出可能ラベルのスクシンイミジルエステル誘導体に化学的に共役結合させた後、標識ヌクレオチドを用いてプライマーを生成するなどがある（Nature Biotech (2000) 18:345-348およびインターネット（http）アドレスのinfo.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/n_coupling.htmlを参照）。時には、スペーサー（多くの場合、長さは5〜16の炭素原子分）が検出可能ラベルとヌクレオチドの間に組み込まれる。都合のよい任意の検出可能ラベルを使用することができる。放射性同位元素（例えば、125I、131I、35S、32P、14Cまたは3H）、光散乱標識（例えば、gold or silver label（球状の金または銀の標識）；カリフォルニア州サンディエゴGenicon Sciences Corporationおよび米国特許第6,214,560号）、酵素またはタンパク質標識（例えば、GFPやペルオキシダーゼ）、またはその他の色素標識や染料などが時には使用されるが、これに限定されない。多くの場合、蛍光標識が使用される（例えば、アミノメチルクマリン（AMCA）、ジエチルアミノメチルクマリン（DEAC）、カスケード・ブルー（CB）、フルオレッセインイソチオシアネート（FITC）、オレゴングリーン（OG）、Alexa 488（A488）、ローダミングリーン（RGr）、ランタニド キレート（例えば、ユーロピウム）、カルボキシローダミン6G（R6G）、テトラメチルローダミン（TAMRA）、テキサスレッド（TxR）、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびカルボキシナフトフルオレセイン（CNF）、ジゴキシゲニン（DIG）、ならびに2,4-ジニトロフェニル（DNP）など）。その他の発蛍光団や付随物の励起波長や発光波長については、Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37:2709-2714 and QuおよびChaires, Methods Enzymol (2000) 321:353-369)に説明がある。
【００７５】
1つの態様において、蛍光標識に共有結合されたプライマーオリゴヌクレオチドをテンプレートDNAに接触させる。結果として生じる複合体が試験分子と接触し、その後、プライマーを延長させる能力のあるポリメラーゼと接触する。次に、反応生成物は、キャピラリー電気泳動法により分離・検出される。プライマーが共有結合された発蛍光団を含まない場合、またはキャピラリー電気泳動法が分離に使用されていない場合の態様と比較して、この態様には長めのプライマー配列が使用された。デオキシヌクレオチドが、分離前に、多くの場合プライマーをテンプレートDNAに接触させる時点で、アッセイ法の任意の段階で追加される。多くの場合にはテンプレートDNA／プライマー合成を変性させ（例えば、系の温度を高くすることで）、試験化合物を追加する前に復元させる（組織を冷却するなど）。
【００７６】
四重鎖結合アッセイ法
一般的に、5'-蛍光標識（FAM）プライマー（P45、15 nM）を、10 mM MgCl2、0.1 mM EDTA、および0.1 mM混合デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を含むトリス-HCl緩衝液（15 mMトリス、pH 7.5）において、鋳型DNA（15 nM）と共に混合した。一つの例において、FAM-P45プライマー
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およびc-Myc鋳型DNA
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を合成して、Applied BiosystemsによってHPLC精製した。混合物を95℃で5分間変性させた後、室温まで冷却した後、37℃で15分間インキュベートした。
【００７７】
室温まで冷却した後、1 mM KClおよび試験化合物（様々な濃度）を加えて、混合物を室温で15分間インキュベートした。プライマーの伸長は、10 mM KClおよびTaq DNAポリメラーゼ（2.5 U/反応、Promega）を加える段階、および70℃で30分間インキュベートする段階によって行った。反応混合物1μlをHi-Diホルムアミド混合10μlおよびLIZ120サイズ標準物質0.25μlに加えることによって反応を停止させた。Hi-DiホルムアミドおよびLIZ120サイズ標準物質をApplied Biosystemsから購入した。第一の段階で、プライマーおよび鋳型配列と共に競合核酸の様々な濃度を加えることによって、方法を繰り返す。G-四重鎖結合リガンドを、停止産物対完全長の産物を1：1の比で生じるように予め確立された濃度で加える。それぞれの核酸競合物質のCC50は、停止産物対完全長産物の比率を1：1から1：2に変化させるために必要な競合物質の濃度として定義される。
【００７８】
部分的に伸長した四重鎖停止産物は、長さが61塩基または62塩基のあいだであり、完全長の伸長産物は長さが99塩基であった。産物を分離して、キャピラリー電気泳動を用いて分析した。キャピラリー電気泳動は、ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyserを用いて行った。アッセイ法は、先に記述した化合物を用いて行い、結果を表1に示す。表1において報告したμM濃度は、DNAの50％がアッセイ法において停止する濃度である（すなわち、より短い部分的に伸長したDNA（停止DNA）対完全長の伸長したDNAの比率は1：1である）。
【００７９】
転写レポーターアッセイ法
転写レポーターアッセイ法において、試験四重鎖DNAは、レポーターシステムと共役結合し、四重鎖構造の生成や安定化によってレポーターシグナルが調整できるようになっている。こうしたシステムの一例は、レポーター発現システムであり、ここで、ルシフェラーゼまたは緑蛍光タンパク質（GFP）などのポリペプチドは、潜在的な四重鎖を形成する核酸に作動可能に連結され、ポリペプチドの発現が検出可能な遺伝子により発現される。本明細書で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、潜在的な四重鎖を形成する核酸を含む配列により調節されたヌクレオチド配列を意味する。配列は、四重鎖DNAと同一の核酸上にある場合も、別の核酸上にある場合にも、作動可能に連結された状態となりうる。模範的なルシフェラーゼのレポーターシステムについてここで説明する。
【００８０】
He, et al., Science (1998) 281:1509-1512で説明されているルシフェラーゼプロモーターアッセイ法が、四重鎖生成の研究で使用されることがよくある。具体的には、このアッセイ法で使用するベクターについては、He, et al.文献の引用文献11に記載している。このアッセイ法において、HeLa細胞は、リポフェクタミン2000をベースにしたシステム（Invitrogen社）を使用して、その製造業者の手順書に従い、0.1μgのpRL-TK（Renillaルシフェラーゼ レポータープラスミド）および0.9μgの四重鎖を形成するプラスミドを用いて形質移入される。96ウェルプレート形式のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega社）を用い、製造業者の手順書に従い、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を評価する。
【００８１】
円二色性分析法
円二色性（CD）は、別の分子が四重鎖核酸と相互作用するかどうかの判定に使用される。特に、CDは、PNAまたはPNA-ペプチド共役体がインビトロで四重鎖核酸とハイブリッド形成されるかどうかの判定に有用である。10mMリン酸カリウム（pH7.2）および10mMまたは250mM KClを含む緩衝液に溶かした四重鎖DNAにPNAプローブ（各5μM）を37℃で加え、同一温度で5分間そのままにした後、スペクトルの記録をする。CDのスペクトルは、熱電学的に制御される単一細胞ホルダーが装備されたJ-715分光偏光計で記録する。普通はCD強度は220nm〜320nmで検出され、相互作用の存在または不在を確認するために、四重鎖DNAのみ、PNAのみ、および四重鎖DNAとPNAについての比較スペクトルが生成される（Datta, et al., JACS (2001) 123:9612-9619などを参照）。スペクトルは、100nm/分で記録された8回のスキャンの平均を示すものとしてまとめられる。
【００８２】
蛍光性結合アッセイ法
蛍光性結合アッセイ法の一例は、四重鎖核酸、信号分子、および試験分子が含まれるシステムである。信号分子により、四重鎖核酸（N-メチルメソポルフィリンIX（NMM）など）と結合した場合に蛍光信号が生成され、その信号は、試験化合物が四重鎖核酸との結合について信号分子と競争する場合に変化する。試験化合物が存在しない場合と比較した試験分子が存在する場合の信号の変化により、試験化合物は四重鎖と相互作用する化合物として識別される。
【００８３】
50μlの四重鎖核酸または四重鎖を形成する能力をもたない核酸を96ウェル式プレートに追加する。試験化合物も異なる濃度で追加する。一般的なアッセイ法は、100μlの20mM HEPES緩衝液、pH7.0、140mM NaCl、および100mM KCl中で実施される。次に50μlの信号分子NMMを最終濃度3TMとなるように追加する。NMMは、ユタ州ローガンのFrontier Scientific社から入手する。蛍光性は、FluroStar 2000蛍光測定器（ノースカロライナ州ダーハムのBMG Labtechnologies社）を使用して、励起波長420nmおよび発光波長660nmで測定する。蛍光性は、試験化合物または四重鎖を標的とした核酸の濃度の関数とした曲線で表示されることが多く、またNMMの最大蛍光信号は、これらの分子が不在の場合に評価される。
【００８４】
細胞増殖アッセイ法
癌細胞増殖アッセイ法において、細胞増殖率は細胞培養液に加える試験化合物の異なる濃度の関数として評価される。任意の癌細胞の種類がこのアッセイ法で使用できる。1つの態様において、大腸癌細胞をインビトロで培養し、試験化合物を培地に異なる濃度で加える。有用な大腸癌細胞株はcolo320で、これはアメリカ国立衛生研究所に受入番号JCRB0225として預け入れられた結腸腺癌株細胞である。こうした細胞を使用するためのパラメータは、インターネット（http）アドレスのcellbank.nihs.go.jp/cell/data/jcrb0225.htmで入手できる。
【００８５】
複合物の製剤化
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩、エステルおよびアミド」という用語には、カルボン酸塩、その化合物のアミノ酸添加の塩、エステルおよびアミドのほか、その両性イオンの形態も含まれるが、これに限定されず、また当業者には、これらはヒトおよび動物での使用に適していることが知られている。（Gerge,?S.M., et al.,「Pharmaceutical Salts」, J.Pharm.Sci. (1977) 66:1-19を参照。これは参照により本明細書に組み込まれる。）
【００８６】
本明細書に説明した化合物は任意の適切な製剤を調製できる。安定した無毒性の酸塩または塩基塩を形成するために、化合物の塩基性または酸性が十分である場合には、塩としての化合物の投与が適切であると考えられる。薬学的に許容される塩の例としては、生理学的に許容可能なアニオンを形成する酸とともに形成される有機酸を添加した塩などがあり、これには例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α-ケトグルタル酸塩、およびα-グリセロリン酸塩がある。適した無機塩も形成しうるが、これには塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭素塩などが含まれる。薬学的に許容される塩は、当技術分野でよく知られている標準的手順を用いて得ることができる。例えば、薬学的に許容される塩は、アミンなどの十分な塩基化合物を、生理学的に許容される陰イオンを生成する適切な酸と反応させることによって得ることができる。アルカリ金属（ナトリウム、カリウムまたはリチウムなど）またはアルカリ土類金属（カルシウムなど）のカルボン酸塩も生成できる。
【００８７】
化合物は、薬学的組成物として製剤化でき、そうした治療を必要とする哺乳類の宿主に投与することができる。1つの態様において、哺乳類の宿主はヒトである。経口的、非経口的、静脈内、筋肉内、局所的および皮下の各経路などを含むがこれに限定されず、適切な任意の投与経路を使用することができる。
【００８８】
1つの態様において、化合物は、不活性希釈剤または同化性可食性の担体など、医薬品として許容される賦形剤との組み合わせで、全身的に（例えば、経口的に）投与される。硬質または軟質のシェル型ゼラチンカプセルに包む、錠剤に圧縮する、または患者の規定食の食品に直接組み込むこともできる。治療上の経口投与では、活性のある化合物は、1個または複数個の添加剤と組み合わせることもでき、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、特効薬、懸濁液、シロップ、ウェハースのほか、これに類似した形態で使用することができる。こうした組成および調製品には、少なくとも0.1%の活性のある化合物が含まれるべきである。組成および調製品の割合はさまざまな値をとることができ、都合のよいことに、所定の単位投与形態で重量で約2%〜約60%とすることができる。こうした治療的に有用な組成における活性のある化合物の量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
【００８９】
錠剤、トローチ、ピル、カプセル、およびこれに類似する形態にも以下が含まれることが考えられる。すなわち、トラガカント、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの添加剤、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸およびこれに類似するものなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑油、ならびに蔗糖、果糖、ラクトースもしくはアスパルテームなどの甘味剤などで、またハッカ、ウィンターグリーンのオイル、もしくはサクランボ味などの香味剤を添加することもできる。単位投与形態がカプセルの場合には、上述の種類の材料に加え、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含めることもできる。コーティング、またはその他の方法で固体単位投与形態の物理的形態を変化させるためのさまざまな材料が他にも存在しうる。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖、およびこれに類似するものでコーティングすることができる。シロップまたは特効薬には、活性のある化合物、甘味剤として蔗糖または果糖、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、チェリーやオレンジ風味などの染料および香味剤などが含まれうる。任意の単位投与形態の調製に使用されるすべての材料は、薬学的に許容されるものであり、採用する量において実質的に無毒性である。さらに、活性のある化合物は、徐放性の製剤や道具に組み込むことができる。
【００９０】
また、活性のある化合物は、注入または注射により、静脈内または腹腔内に投与することもできる。活性のある化合物またはその塩の溶液は、緩衝液、多くの場合はリン酸緩衝食塩水内で調製でき、任意に無毒性界面活性剤と混合することができる。分散も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびその混合物中、ならびに油中に準備することができる。通常の保管・使用条件下では、これらの製剤には、微生物の増殖を阻止するための防腐剤が含まれる。時には、化合物は、ポリマトリクス（polymatrix）を含む製剤形態としてそうした投与用に準備される（例えば、リポソームまたは小胞体）。リポソームについては、例えば、米国特許第5,703,055号（Felgner、et al.）およびGregoriadis、Liposome Technology vol.I〜III(2nd ed.1993)に説明がある。
【００９１】
注射または注入用に適切な医薬剤形には、滅菌の注射用もしくは注入用の溶液や分散剤の即席的な製剤用に採用された有効成分を含み、任意にリポソームでカプセルで包んだ、滅菌水溶液や分散剤または滅菌パウダーなどが含まれうる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および保管の条件下で無菌、流動体、安定であるべきである。液体担体または媒体は、溶剤または液体分散媒が考えられ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびこれに類似したもの）、植物油、非中毒性グリセリルエステル、およびその適切な混合物などを含む。適切な流動性は、例えば、リポソームの生成により、分散剤の場合に粒子サイズの維持により、または界面活性剤の使用により維持が可能である。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌性抗真菌性の薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、およびこれに類似するものにより対処できる。多くの場合、例えば、糖類、緩衝液またはナトリウム塩化物などの等張剤を含めることが好ましい。注射用の組成の長期的な吸収は、組成に、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を使用することで対処できる。
【００９２】
滅菌注射用溶液は、必要とされる量の活性のある化合物を、必要に応じて、上記に列挙したさまざまなその他の成分と共に、該当する溶剤に組み込んだあと、フィルター滅菌をして準備される。滅菌注射用溶液の調製用の、滅菌パウダーの場合において、好ましい調製の方法は、真空乾燥およびフリーズドライ技術で、これにより、有効成分の粉末に加え、あらかじめ滅菌・ろ過済の溶液に存在する希望するその他の成分が生成される。
【００９３】
局所的投与の場合には、本化合物は、液体の形態に適用されうる。化合物は、皮膚科学的に許容可能な担体との組み合せで、組成または製剤形態として投与されることがよくあるが、これは固体でも液体でもよい。化合物を皮膚に到達させるために使用される有用な皮膚科学的組成の例が知られている（例えば、Jacquet, et al.（米国特許第4,608,392号）、Geria（米国特許第4,992,478号）、Smith, et al.（米国特許第4,559,157号）およびWortzman（米国特許第4,820,508号）などを参照）。
【００９４】
化合物は、固体の担体と共に製剤化することもでき、これにはタルク、粘土、微結晶性のセルロース、シリカ、アルミナ、およびこれに類似するものなど細かく分割した固体などがある。有用な液体担体には、水、アルコール類またはグリコール、または水-アルコール／グリコールの混合物などがあり、ここで、本化合物は有効レベルに溶解または分散でき、任意に無毒性の界面活性剤の助けを借りる。芳香剤や他の抗菌剤などのアジュバント（免疫増強）を添加して、所定の用途について特性を最適化することもできる。結果としてできる液体の組成は、吸水パッドで塗布する、包帯ほかの包帯剤にしみ込ませて使用する、または患部にポンプ型またはエアロゾル噴霧器を用いて吹き付けるなどができる。合成的ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、変性セルロースや変性鉱物材などの増粘剤を、液体キャリアと一緒に採用して、使用者の皮膚に直接塗布するために、薄く塗ることのできるのり、ゲル、軟膏、石鹸、およびそれに類似したものを形成できる。
【００９５】
一般に、液体の組成中の化合物の濃度は、約0.1wt%〜約25wt%であることが多く、約0.5wt%〜約10wt%であることも時にはある。ゲルまたは粉末などの半固体または固体の組成中の濃度は、約0.1wt%〜約5wt%であることが多く、約0.5wt%〜約2.5wt%である場合もある。化合物の組成は、単位投与形態として調製でき、これは製薬産業で知られている従来的な技術に従い調製される。一般的にいえば、そうした技術には、液体の形態または細かく分割した固体の形態、またはその両方で、化合物を薬学的担体や添加剤と関連性をもたせる技術、ならびに必要に応じて製品の形状を整える技術が含まれる。
【００９６】
表3は、本明細書に記述の化合物の用途に関する様々な製剤を示す。例えば、本明細書に記述の処方を用いて、10 mg/ml〜20 mg/ml溶液の用量を有する化合物CX-3543を調製してもよい。表3において、「D5W」という名称は、5％デキストロースを含む脱イオン水を指す。それぞれの処方におけるそれぞれの成分を、化合物の活性に影響を及ぼさずに、変化させてもよい。一つの例において、化合物は、リン酸緩衝液のような緩衝液においてポリエチレングリコールおよびピロピレングリコールを含む溶液において調製される。ポリエチレングリコールの濃度は5％（w/w）〜10％（w/w）であってもよく、プロピレングリコールの濃度は6％（w/w）〜12％（w/w）であってもよい。
【００９７】
（表３）
2008508311.tif 000145
【００９８】
化合物の組成は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、および浣腸など、いかなる剤形にも製剤化することができる。また、組成は、水溶性、非水溶性、または混合した培養液の懸濁液として製剤化できる。水溶性懸濁液には、さらに、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなどの粘性を増大させる物質が含まれうる。また、懸濁液には1種または複数個の安定剤が含まれうる。
【００９９】
治療での使用に要求される化合物またはその活性塩類や誘導体の量は、選択した特定の塩類だけでなく、投与経路、治療する状態の本質、および患者の年齢や病状などによっても変化し、最終的には担当医師・臨床医の判断となる。
【０１００】
用量
有用な化合物の用量は、細胞または組織系のインビトロでの活性および/または動物系のインビボでの活性を評価することで判断することがよくある。例えば、マウスおよびその他の動物での有効な用量からヒトの用量を推定する方法が、当技術分野で知られている（米国特許第4,938,949号などを参照）。こうしたシステムは、化合物のLD50（50%の母集団にとって危険な用量）の決定、およびED50（50%の母集団において治療的に有効な用量）の決定に使用できる。毒性と療法効果の用量比が治療係数であり、比率ED50/LD50として表現しうる。化合物の用量は、ED50が毒性とはほんのわずかまたは全く関係のない濃度の循環範囲内に収まることが多い。用量は、採用する剤形と用いる投与経路にもよるが、この範囲内で変化しうる。本明細書で説明した方法で使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、初期的には細胞培養アッセイ法から推定しうる。用量は、時にはインビトロでのアッセイ法により決定されるIC50（例えば、最大半減の症状の抑制が達成される試験化合物の濃度）を含めた、プラズマ濃縮幅の循環を達成するために製剤化されることもあるが、この情報はヒトへ有用な用量をより正確に決定するために使用されることがよくある。プラズマのレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０１０１】
被験体のための有効な用量の決定のもう1つの例は、被験体の血清中の「遊離」および「結合」の化合物レベルを直接検定する能力である。こうしたアッセイ法では、抗体模倣体や分子インプリント技術で生成された「バイオセンサー」を活用しうる。化合物は、触媒試薬による重合の前に、重合可能な単量体を空間的に組織化するためのテンプレート、つまり「インプリンティング分子」として使用される。その後のインプリント分子の除去により、化合物の繰り返し「陰性イメージ（negative image）」が含まれているポリマー基質が残り、生物学的検定法の条件下で選択的に分子を再結合できる（例えば、Ansell, et al., Current Opinion in Biotechnology (1996) 7:89-94、およびShea, Trends in Polymer Science (1994) 2:166-173を参照）。こうした「インプリント」親和マトリックスは、リガンド-結合アッセイ法の影響を受けやすく、それによって、固定化された単クローン抗体コンポーネントが、適切にインプリントされた基質によって置き換えられる（例えば、Vlatakis, et al., Nature (1993) 361:645-647を参照）。同位体-標識化の使用によって、化合物の「遊離」濃度は、簡単に監視でき、IC50の算出に使用できる。また、この「インプリント」親和マトリックスは、局部的および選択的な化合物の結合に応じてその光子発光特性がはっきりと変化する蛍光基を含めて設計することもできる。これらの変化は、適切とされる光ファイバー機器を用いてリアルタイムで簡単に検定でき、それによって被験体への用量を個別のIC50をもとに迅速に最適化することができる。この「バイオセンサー」の一例がKriz, et al., Analytical Chemistry (1995) 67:2142-2144に説明されている。
【０１０２】
模範的な用量には、被験体のキログラム数またはサンプル重量に対してミリグラムまたはマイクログラムの化合物量が含まれる。例えば、1キログラムあたり約1マイクログラムから、1キログラムあたり約500ミリグラム、1キログラムあたり約100ミリグラムから1キログラムあたり5ミリグラム、または1キログラムあたり1マイクログラムから1キログラムあたり約50マイクログラムなどである。小さな分子の適切な用量は、調整される発現または活性に関連しての小さな分子の効力に依存することが理解できる。本明細書で説明したポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調整するために、1個または複数個のこれらの小さな分子が動物（ヒトなど）に投与される場合、医師、獣医、または研究者は、例えば、比較的低い容量をまず処方し、その後で適切な応答が得られるまで用量を増やすこともできる。さらに、特定の被験動物についての具体的な用量レベルは、採用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、健康全般、性別、および被験体の規定食、投与時刻、投与経路、排泄率、なんらかの複合薬、および調整する発現または活性の程度など、さまざまな要因に依存することは理解される。
【０１０３】
抗腫瘍活性
一つの態様において、本発明の化合物は、多くの十分に特徴が調べられた腫瘍遺伝子のプロモーター領域において、G-四重鎖DNAモチーフをターゲティングするためにDNA認識特性を有するフルオロキノロンコアを使用する。化合物は、望ましい分子認識およびADMET特性を得るために、ならびに細菌および真核細胞酵素に対する望ましくない活性を除去するために、様々な薬物様部分によって改変してもよい。
【０１０４】
一つの例において、式1Aを有する化合物は、他のタイプの四重鎖コンフォメーションまたは他の型のDNAと比較して有意な分子選択性で並行型四重鎖に結合するように設計された。CX-3543は、VEGF、pDGF-A、HIF-1α、H-Ras、c-MYCおよびその他を含むいくつかの主要な腫瘍遺伝子のプロモーター領域において形成する四重鎖構造に選択的に結合する。CX-3543は、肝臓CYP450酵素の有意な阻害を示さず、ヒト肝細胞による代謝的安定性を示し、エームズ遺伝子毒性試験において非変異誘発性である。その上、CX-3543は、マウス、ラット、およびイヌにおいて都合のよい薬物動態特性を示し、抗腫瘍効果を示すために必要な用量より実質的に高い用量でマウス異種移植片モデルにおいて良好に容認される。インビボ試験において、CX-3543は、膵臓癌（MiaPaCa）、難治性前立腺癌（PC-3）、および結腸直腸癌（HCT-116）異種移植片モデルにおいて腫瘍の成長を阻害する。p53、カスパーゼ-3、アネキシンおよび細胞周期実験に関するプロトコールを用いて、CX-3543はまたアポトーシスを誘導することも示された。このように、本明細書に記述の化合物は、癌に対して、特に特定のリンパ腫、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、および乳癌を含む、関連する腫瘍遺伝子によって促進される腫瘍において用いてもよい。
【０１０５】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、限定するためではない。
【０１０６】
実施例
以下は、置換キノベンゾオキサジン類似体の合成のための模範的な手順である。
【０１０７】
実施例1
置換キノベンゾオキサジン類似体の調製
置換キノベンゾオキサジン類似体の調製の一般的合成法をスキーム1に示す。
スキーム1
2008508311.tif 000146
【０１０８】
エチル-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル)-エタン酸
2008508311.tif 000147
エチルマロン酸カリウム（3.66g、21.5mmol）、MgCl2（2.44g、25.7mmol）およびTEA（2.05g、20.3mmol）をアセトニトリル（70ml）中で10〜15℃で2.5時間混合した。アセトニトリル（10ml）に溶かした2,3,4,5-塩化テトラフルオロベンゾイル（2.00g、10.3mmol）を、0℃で15分間かけて加えた後、TEA（0.23g、2.3mmol）の2度目の追加を行った。室温まで暖まるようにした後、混合物を16時間攪拌した。揮発物を真空内で除去した後、トルエン（30ml）を加え、真空内で除去した。トルエン（60ml）を加えた後、温度が25℃を超えないようにHCl1.5 M（40ml）を注意深く加えた。有機物部分をHCl1.5M（2×25ml）および水（2×25ml）で洗い流し、MgSO4上で乾燥させ、真空内で明るいオレンジ色の油になるまで減少させた（[M+1]+265、98%）。
【０１０９】
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸
2008508311.tif 000148
アルゴン中で、ジメチル アセタール ジメチル ホルムアミド （0.61g、5.1mmol）を、無水酢酸（2ml）に溶かしたエチル-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル)-エタン酸（0.9g、3.41mmol）に滴下して加えた。30分後、溶剤を真空内で除去し、オレンジ色のオイルとして定量的収率（[M+1+]320）の生成物が残った。
【０１１０】
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサジン-5-カルボキシレート
2008508311.tif 000149
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（3.4g、8.0mmol）および2-アミノ-4-フェニル-フェノール（1.5g、8.0mmol）を20DMSO（20ml）に溶かしたものを、真空内で60℃で30分間攪拌した。K2CO3（5g）およびMeCN（20ml）を加え、その懸濁液を80℃で1時間加熱した。室温まで冷ました後、その混合物を少し多めの希硫酸に注ぎ、ろ過した。生成物が黄褐色の固体として収集された（[M+1]+420、65%）。
【０１１１】
実施例2
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000150
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサジン-5-カルボンキシレート（2.2g、5.3mmol）を、濃塩酸と酢酸（それぞれ20ml）の混合物中で2時間還流させた。室温まで冷ました後、冷水（40ml）を反応混合物に加え、その結果生じる沈殿物を、ろ過しエーテルで洗浄して、生成物が黄褐色の固体90%として得られた（[M+1]+392）。
【０１１２】
実施例3
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ナフチル-2’’、3’’-ジアミノ)-プロプ-2-エン酸の調製
2008508311.tif 000151
アセトニトリル（50ml）に溶かしたエチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（10.53g、33mmol）を、アセトニトリル（150ml）に溶かした溶液2,3-ジアミノナプタレン（5.22g、33mmol）に加え、アルゴン中で50℃に保持した。3時間後、揮発物を真空内で除去し、残基についてシリカ（15% EtOAc/ヘキサン）上でクロマトグラフィーを実施し、黄色の固体として生成物を得た（[M+1]+433）（55%）。
【０１１３】
実施例4
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェンジアジン-5-カルボンキシレート
2008508311.tif 000152
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ナフチル-2’’、3’’ジアミノ)-プロプ-2-エン酸（600mg 1.4mmol）を、DMF（500ml）中のK2CO3のスラリーに溶かした。混合物を100℃で1時間勢いよく攪拌した後、室温まで冷ました。K2CO3をろ過により除去し、DMFを真空内で除去して、定量的収率で黄褐色の固体が得られた。（[M+1]+393）。
【０１１４】
実施例5
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェンジアジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000153
KOH溶液（1N、2.54ml、2.56mmol）を、エタノール（400ml）に溶かしたエチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェンジアジン-5-カルボキシレート（500mg、1.28mmol）に加え、還流状態で加熱した。2時間後、反応混合物を室温まで冷ました後、HCl溶液（1N）で中和した。生成物はろ過により黄色の固体89%として収集された。（[M+1]+365）。
【０１１５】
実施例6
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-フェンチアジン-5-カルボキシレートの調製
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(N-アミノベンジルジスルフィド)-プロプ-2-エン酸
2008508311.tif 000154
アセトニトリル（10ml）に溶かしたエチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（17.7g、55.3mmol）を、アセトニトリル（100ml）に溶かした1,2-アミノチオフェノール ダイマー（5.22g、33mmol）溶液に加えた。3時間後、揮発物を真空内で除去し、残基についてシリカ（1%MeOH/DCM）上でクロマトグラフィーを実施し生成物を黄色の固体として得た（[M+1]+523）（50%）。
【０１１６】
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-フェンチアジン-5-カルボンキシレート
2008508311.tif 000155
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(N-アミノベンジルジスルフィド)-プロプ-2-エン酸（2.5g 3.2mmol）をDMF（120ml）に溶かし、還流状態で6時間加熱した。DMFを真空内で除去して、生成物が黄色の固体90%として得られた（[M+1]+360）。
【０１１７】
実施例7
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-フェンチアジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000156
KOH溶液（1N、3.0、3.0mmol）を、エタノール（400ml）に溶かしたエチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-フェンチアジン-5-カルボキシレート（1000mg、2.5mmol）に加え、還流状態で加熱した。2時間後、反応混合物を室温まで冷ました後、HCl溶液（1N）で中和した。生成物はろ過により黄色の固体として収集された（[M+1]+332、95%）。
【０１１８】
実施例8
5,6-ジフルオロ-9-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]ピリミド[g]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
7-ニトロキナゾリン-4,6-ジオール
2008508311.tif 000157
20mlの48%水溶性HBrおよび20mlのAcOHを含む溶液に、6-メトキシ-7-ニトロ-3,4-ジヒドロキナゾリン-4-オン（1.4g、6.3mmol）を加え、その混合物を一晩還流させた。結果として生じる溶液を蒸発させ、粗フェノールを残基として得たが、これをそれ以上精製することなく使用した（1.2g、5.8mmol）（M+1、208）。
【０１１９】
7-アミノキナゾリン-4,6-ジオール
2008508311.tif 000158
上述の粗生成物（1.0g、5.8mmol）を40mlの水で希釈し、3gのスズII塩化二水和物を加え、この反応物を室温で攪拌した。1時間後、反応物をK2CO3で中和させ、EtOAcで抽出した（3×50mL）。組み合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶剤を真空内で除去し、粗アミノアルコールを得た（1.0g、5.6mmol）（M+1、178）。
【０１２０】
エチル；  5,6-ジフルオロ-9-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]ピリミド[g]フェノキサジン-2-カルボキシレート
2008508311.tif 000159
テトラフロロエチレン（2.2g、6.9mmol）をDMSO（3mL）に溶かした溶液に、アミノフェノール（1.0g、5.6mmol）を加え、反応混合物を真空下で（回転蒸発器）60℃で20分間攪拌した。反応混合物を室温まで冷まし、アセトニトリル（200mL）で希釈し、炭酸カリウムを加えた。混合物を還流するように5時間加熱し、希釈したHOAc/水に注いだ。減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロエステルを黄褐色の固体として得た（1.3g、3.2mmol）（M+1、412）。
【０１２１】
5,6-ジフルオロ-9-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]ピリミド[g]フェノキサジン-2-カルボン酸
2008508311.tif 000160
ジフルオロエステル（1.3g、3.2mmol）を、氷酢酸と12M HCl（20mL）の1:1混合物に溶かし、30分間還流させた。次にその混合物を室温まで冷まし、水に注いだ。すると、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を黄褐色の固体として得た（0.98g、2.5mmol）（[M+1]+392）。
【０１２２】
実施例9
2-(2-(エトキシカルボニル)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-9-イルオキシ)酢酸の調製
エチル 5,6-ジフルオロ-9-ヒドロキシ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボンキシレート
2008508311.tif 000161
DMSO（12mL）に溶かしたテトラフロロエチレン（5.8g、18.2mmol）溶液に、2,4-ジヒドロキシアニリン ヒドロクロリド（2.5g、15.5mmol）を加え、その混合物を60℃まで真空下（回転蒸発器）で20分間加熱した。次に、反応混合物をアセトニトリル（100mL）で希釈し、炭酸カリウム（3g）を加え、混合物を一晩還流させた。混合物を室温まで冷まし、溶剤を真空内で除去した。過剰の2 M HClを加え、炭素塩を急速に溶かし、その固体沈殿物をろ過し、乾燥させてジフルオロエステルを黄褐色の固体として得た（5.0g、13.9mmol）（M+1、360）。
【０１２３】
2-(2-(エトキシカルボニル)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-9-イルオキシ)酢酸
2008508311.tif 000162
ジフルオロエステル（2.1g、5.8mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（2.0g、10.3mmol）をDMF（30mL）に溶かした溶液に、炭酸カリウム（2.0g）を加え、その混合物を60℃まで1時間加熱した。反応物を冷まし、水（500mL）に注ぎ、酢酸エチル（3×100mL）で抽出し、鹹水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、シリカゲル（30×50mm）パッド上でろ過し、酢酸エチルで溶出させた。溶剤を真空内で除去し、結果としてできる物質をヘキサンで倍散させ、乾燥させて、tert-ブチルエステルを黄褐色の固体として得た（2.8g、5.8mmol）。この物質をトリフルオロ酢酸（40mL）に溶かし、室温で30分間攪拌した。溶剤を真空内で除去し、黄褐色の固体として酸を得た（2.4g、5.7mmol）（M+1、418）。
【０１２４】
実施例10
9-(カルボキシメトキシ)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000163
ジフルオロエステル（2.4g、5.7mmol）を、氷酢酸と12M HCl（40mL）の1:1混合物に溶かし、1時間還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注いだ。すると、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を黄褐色の固体として得た（2.0g、5.1mmol）（M+1、390）。
【０１２５】
実施例11
エチル 1,2,3-トリフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000164
テトラフロロエチレンをDMSO（12mL）に溶かすのと類似した手順により調製したペンタフルオロエンアミン（8g、23.7mmol）に、3-アミノ-2-ナフトール（3.5g、21.9mmol）を加え、その混合物を60℃まで真空下（回転蒸発器）で2時間加熱した。次に、反応混合物をアセトニトリル（200mL）で希釈し、炭酸カリウム（8.0g）を加え、混合物を一晩還流させた。混合物を室温まで冷まし、溶剤を真空内で除去した。少し多めの2M HClを加え、炭素塩を急速に溶かし、その固体沈殿物をろ過し、乾燥させてジフルオロエステルを黄褐色の固体として得た（1.3g、3.2mmol）（M+1、412）。
【０１２６】
実施例12
1,2,3-トリフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000165
トリフルオロエタノール（1.3g、3.2mmol）を酢酸（5mL）に溶かし、12M HClを加え（5mL）、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてトリフルオロ酢酸を淡色固体として得た（1.0g、2.6mmol）（M+1、384）。
【０１２７】
実施例13
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボキシレート
2008508311.tif 000166
酢酸エチル（100mL）にエナミン（30g、94mmol）を溶かした溶液に、3-アミノ-2-ナフトール（10g、63mmol）を室温で加え、その混合物を直ちに回転蒸発器に載せて、溶剤を2時間かけて0℃より低い温度（フラスコに氷が付着）で除去し、黄色の固体が生成された。この固体にエーテル（200mL）を加え、スラリーをろ過し、黄色の固体を得た。次に、この固体をDMF（200mL）に溶かし、炭酸カリウム（16.5g、120mmol）を加え、その混合物を90℃まで1時間加熱した。混合物を室温まで冷まし、水（500mL）を加え、結果として生じる固体をろ過し、水で洗浄し、これを乾燥させて、黄褐色の固体としてジフルオロエステルを得た（12.2g、30.8mmol）（M+1、394）。
【０１２８】
実施例14
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000167
ジフルオロエステル（5g、12.7mmol）をメタノール（50mL）に溶かし、濃塩酸（20mL）を加え、その混合物を12時間還流させた。混合物を室温まで冷まし、固体を減圧濾過により収集し、メタノールで洗浄して、明るい黄褐色の粉としてジフルオロ酸を得た（3.6g、9.9mmol）（M+1、366）。
【０１２９】
実施例15
エチル 1-フルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000168
酢酸エチル（100mL）中のテトラフロロエチレン（14g、46.3mmol）と類似した方法で調製したエナミンの溶液に、3-アミノ-2-ナフトール（5.0g、31.2mmol）を室温で加え、その混合物を直ちに回転蒸発器に載せて、溶剤を2時間かけて0℃より低い温度（フラスコに氷が付着）で除去し、黄色の固体が生成された。この固体にメタノール（200mL）を加え、スラリーをろ過し、黄色の固体を得た。次に、この固体をアセトニトリル（200mL）に溶かし、炭酸カリウム（10.0g、72.5mmol）を加え、その混合物を80℃まで1時間加熱した。混合物を室温まで冷まし、水（500mL）を加え、結果として生じる固体をろ過し、水で洗浄し、これを乾燥させて、黄褐色の固体としてフルオロエステルを得た（6.0g、16.0mmol）（M+1、376）。
【０１３０】
実施例16
1-フルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[g]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000169
フルオロエステル（6.0g、16.0mmol）を酢酸（10mL）に溶かし、12M HClを加え（10mL）、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてフルオロ酸を淡色固体として得た（4.8g、13.8mmol）（M+1、348）。
【０１３１】
実施例17
エチル 9-クロロ-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000170
エナミン（14.4g、45.3mmol）を酢酸エチル（200mL）に溶かした溶液に、5-クロロ-2-アミノフェノール（5.0g、34.8mmol）を加え、溶剤を真空内で回転蒸発器を用い2時間かけて加熱することなく除去した。メタノールを加え、結果として生じるフェノール酸エナミンを減圧濾過で単離した。結果として生じる固体（7.0g）をアセトニトリルに溶かし、炭酸カリウムを加え、結果として生じる混合物を加熱し2時間還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、希HCIに注いだ。結果として生じる固体を減圧濾過で収集し、これを乾燥させて、淡黄色の固体としてジフルオロエステルを得た（5.0g、13.3mmol）（M+1、378）。
【０１３２】
実施例18
9-クロロ-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000171
ジフルオロエステル（5.0g、13.3mmol）を酢酸（45mL）に溶かし、12M HCl（30mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（4.0g、10.6mmol）（M+1、350）。
【０１３３】
実施例19
エチル 10-クロロ-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000172
エナミン（14.4g、45.3mmol）を酢酸エチル（200mL）に溶かした溶液に、4-クロロ-2-アミノフェノール（5.0g、34.8mmol）を加え、溶剤を真空内で回転蒸発器を用い2時間かけて加熱することなく除去した。メタノールを加え、結果として生じるフェノール酸エナミンを減圧濾過で単離した。結果として生じる固体（7.5g）をアセトニトリルに溶かし、炭酸カリウムを加え、結果として生じる混合物を加熱し2時間還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、希HCIに注いだ。結果として生じる固体を減圧濾過で収集し、これを乾燥させて、淡黄色の固体としてジフルオロエステルを得た（5.0g、13.3mmol）（M+1、378）。
【０１３４】
実施例20
10-クロロ-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000173
ジフルオロエステル（2.5g）を酢酸（25mL）に溶かし、12M HCl（20mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（2.0g、5.3mmol）（M+1、350）。
【０１３５】
実施例21
エチル 5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000174
酢酸エチル（50mL）にエナミン（5.7g、17.9mmol）を溶かした溶液に、2-アミノフェノール（1.9g、17.43mmol）を室温で加え、その混合物を直ちに回転蒸発器に載せて、溶剤を2時間かけて0℃より低い温度（フラスコに氷が付着）で除去し、黄色の固体が生成された。この固体にエーテル（25mL）を加え、スラリーをろ過し、黄色の固体を得た。次に、この固体をDMF（20mL）に溶かし、炭酸カリウム（2.9g、21mmol）を加え、その混合物を90℃まで1時間加熱した。混合物を室温まで冷まし、水（200mL）を加え、結果として生じる固体をろ過し、水で洗浄したが、これを乾燥させて、黄褐色の固体としてフェノキサジンを得た（2.9g、8.45mmol）（M+1、344）。
【０１３６】
実施例22
5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000175
ジフルオロエステル（5.0g、14mmol）をメタノール（50mL）に溶かし、濃塩酸（20mL）を加え、その混合物を2時間還流させた。混合物を室温まで冷まし、固体を減圧濾過により収集し、メタノールで洗浄して、明るい黄褐色の粉としてジフルオロ酸を得た（4.2g、13.3mmol、91%）（M+1,316）。
【０１３７】
実施例23
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[h]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000176
エナミン（14.0g、45.3mmol）を酢酸エチル（200mL）に溶かした溶液に、1-アミノ-2-ナフトール（5.0g、31.3mmol）を加え、溶剤を真空内で回転蒸発器を用い2時間かけて加熱することなく除去した。メタノールを加え、結果として生じるフェノール酸エナミンを減圧濾過で単離した。固体をアセトニトリルに溶かし、炭酸カリウム（10g）を加え、混合物を加熱し2時間還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、希HCIに注いだ。結果として生じる固体を減圧濾過で収集し、これを乾燥させて、淡黄色の固体としてジフルオロエステルを得た（5.0g、13.3mmol）（M+1、376）。
【０１３８】
実施例24
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[h]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000177
ジフルオロエステル（5.5g）を酢酸（25mL）に溶かし、12M HCl（20mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（5.0g、14.4mmol）（M+1、348）。
【０１３９】
実施例25
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[f]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000178
エナミン（45g、141mmol）を酢酸エチル（500mL）に溶かした溶液に、2-アミノ-1-ナフトール（15.0g、93.8mmol）を加え、溶剤を真空内で回転蒸発器を用い、加熱することなく2時間かけて除去した。メタノールを加え、フェノール酸エナミンを減圧濾過で単離した。結果として生じる固体をアセトニトリル（400mL）に溶かし、炭酸カリウム（25g）を加え、混合物を加熱し2.5時間還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、希HCIに注いだ。結果として生じる固体を減圧濾過で収集し、これを乾燥させて、淡黄色の固体としてジフルオロエステルを得た（19.69g、50.1mmol）（M+1、394）。
【０１４０】
実施例26
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[f]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000179
ジフルオロエステル（15.0g、38.1mmol）を酢酸（60mL）に溶かし、12M HCl（60mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（11.7g、32mmol）（M+1、366）。
【０１４１】
実施例27
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[b]フラン[2,3-g]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
3-アミノジベンゾフラン-2-オール
2008508311.tif 000180
塩化メチレン（500mL）に0℃で溶かしたジベンゾフラン（15g、70.4mmol）の溶液にBBr3（200mL、CH2Cl2中1M）を滴下漏斗で加えた。添加が完了した後、混合物を1時間かけて室温になるようにし、その後、水、炭酸カリウム（40g）の順に急冷した。結果として生じる固体を減圧濾過により収集し、これを乾燥させて、白色の固体としてヒドロキシル ジベンゾフランを得た（13.2g、199mmol）（M+1、200）。
【０１４２】
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[b]フラン[2,3-g]-フェノキサジン-5-カルボキシレート
2008508311.tif 000181
DMSO（30mL）に溶かしたテトラフロロエチレン（15.0g、47mmol）溶液に、ヒドロキシル ジベンゾフラン（12.0g、60mmol）を加え、その混合物をその混合物を60℃まで真空下（回転蒸発器）で20分間加熱した。次に、反応混合物をアセトニトリル（200mL）で希釈し、炭酸カリウム（17g）を加え、混合物を2.5時間還流させた。混合物を室温まで冷まし、溶剤を真空内で除去した。少し多めの2M HClを加え、炭素塩を急速に溶かし、その固体沈殿物をろ過し、乾燥させてジフルオロエステルを黄褐色の固体として得た（15.0g、34.6mmol）（M+1、434）。
【０１４３】
実施例28
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[b]フラン[2,3-g]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000182
ジフルオロエステル（15.0g、34.6mmol）を酢酸（60mL）に溶かし、12M HCl（60mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（13.7g、34mmol）（M+1、406）。
【０１４４】
実施例29
エチル 2-(エトキシカルボニル)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-10-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000183
DMSO（25mL）に溶かしたテトラフロロエチレン（7.0g、21.9mmol）溶液に、4-ヒドロキシ-3-アミノ安息香酸（3.0g、19.6mmol）を加え、その混合物を60℃まで真空下（回転蒸発器）で2時間加熱した。次に、反応混合物をアセトニトリル（200mL）で希釈し、炭酸カリウム（8.0g）を加え、混合物を一晩還流させた。混合物を室温まで冷まし、溶剤を真空内で除去した。少し多めの2 M HClを加え、炭素塩を急速に溶かし、その固体沈殿物をろ過し、乾燥させてジフルオロエステルを黄褐色の固体として得た（6.2g、16.0mmol）（M+1、388）。
【０１４５】
実施例30
2-(エトキシカルボニル)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-10-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000184
ジフルオロエステル（6.2g、16.0mmol）を酢酸（25mL）に溶かし、12M HCl（20mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（5.3g、14.8mmol）（M+1、360）。
【０１４６】
実施例31
エチル 5,6-ジフルオロ-10-ニトロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボンキシレートの調製
2008508311.tif 000185
エナミン（6.0g、18.7mmol）および2-アミノ-4-ニトロフェノール（3.5g、23.3mmol）をアセトニトリルに溶かした溶液を80℃まで15分間加熱した。次に、炭酸カリウム（8.0g）を加え、その混合物を加熱し一晩還流させた。次に、反応混合物を熱いうちにろ過し、溶剤を真空内で除去し、粗ニトロエステルを得た（5.0g、12.8mmol）（M+1、389）。
【０１４７】
実施例32
5,6-ジフルオロ-10-ニトロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000186
粗ジフルオロエステル（5.0g、12.8mmol）を酢酸（25mL）に溶かし、12M HCl（20mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（2.0g、5.5mmol）（M+1、361）。
【０１４８】
実施例33
エチル 5,6-ジフルオロ-3-オキソ-10-フェニル-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000187
エナミン（5.4g、16.9mmol）および3-アミノ-4-ヒドロキシビフェニル（3.5g、18.9mmol）をアセトニトリルに溶かした溶液を80℃まで90分間加熱した。次に、炭酸カリウム（8.0g）を加え、その混合物を加熱し一晩還流させた。次に、反応混合物を熱いうちにろ過し、溶剤を真空内で除去し、粗ジフルオロエステルを得た（3.9g、9.3mmol）（M+1、420）。
【０１４９】
実施例34
5,6-ジフルオロ-3-オキソ-10-フェニル-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000188
粗ジフルオロエステル（3.6g、8.6mmol）を酢酸（10mL）に溶かし、12M HCl（10mL）を加え、反応混合物を2時間加熱して還流させた。次に、混合物を室温まで冷まし、水に注ぎ、減圧濾過により、固体の生成物が収集されたが、それを乾燥させてジフルオロ酸を淡色固体として得た（2.6g、6.6mmol）（M+1、392）。
【０１５０】
実施例35
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-11-スルホン酸-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[h]-フェノキサジン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000189
DMSO（30mL）に溶かしたテトラフロロエチレン（5.4g、16.9mmol）溶液に、1-アミノ-2-ヒドロキシ-4-ナフタレンスルホン酸（4.8g、20mmol）を加え、そのその混合物を60℃まで真空下（回転蒸発器）で2時間加熱した。反応混合物に、炭酸カリウム（10.0g）を加え、その混合物を60℃まで1時間加熱した。混合物を室温まで冷まし、多少多めの2M HClを加え、炭素塩を急速に溶かした。水層を静かに注ぎ、残りの有機残留物をメタノール（100mL）に溶かし、酢酸エチル（200mL）で沈殿させ、固体の沈殿物をろ過したが、これを乾燥させて、茶色の固体としてスルホン酸を得た（3.1g、6.5mmol）（M+1、474）。
【０１５１】
実施例36
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-11-スルホン-ピリド[3,2,1-kl]ベンゾ[h]-フェノキサジン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000190
粗ジフルオロエステル（1.5g、3.2mmol）を酢酸（10mL）に溶かし、12M HCl（10mL）を加え、反応混合物を30分加熱して還流させた。溶剤を真空内で除去し、茶色の固体としてスルホン酸を得た（1.1g、2.5mmol）（M+1、446）。
【０１５２】
実施例37
2-(エトキシカルボニル)-5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-9-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000191
ジフルオロエンアミン（5.2g、16.3mmol）および4-アミノ-3-ヒドロキシ安息香酸（4.0g、26.1mmol）をDMSOに溶かした溶液を室温で1.5時間攪拌した。炭酸カリウム（8g）を加え、反応混合物を真空下（回転蒸発器）で1時間攪拌した。次に、この混合物を100℃まで1時間加熱した後、室温まで冷ました。次に、反応混合物を、1M H2SO4（500mL）に注ぎ、減圧濾過により固体を収集した。結果として生じる固体を乾燥させて、黄褐色の固体として粗ジフルオロ酸を得た（5.0g、12.9mmol）（M+1、388）。
【０１５３】
実施例38
5,6-ジフルオロ-3-オキソ-3H-ピリド[3,2,1-kl]フェノキサジン-2,9-ジカルボン酸の調製
2008508311.tif 000192
粗ジフルオロエステル（5.0g、12.9mmol）を酢酸（20mL）に溶かし、12M HCl（20mL）を加え、反応混合物を1時間加熱して還流させた。反応物を室温まで冷まし、水を加えた。結果として生じる固体が減圧濾過により収集されたが、それを一晩かけて乾燥させて、黄褐色の固体としてジ-酸を得た（1.9g、5.3mmol）（M+1、360）。
【０１５４】
実施例39
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フルオレノン-5-カルボキシレートの調製
3-ニトロ-2-ヒドロキシフルオレノン
2008508311.tif 000193
NO2BF4（3.52g、25.5mmol）をアセトニトリル（100ml）に溶かした溶液を、2-ヒドロキシフルオレノン（5g、25.5mmol）をアセトニトリル（400ml）に溶かした溶液に周囲温度で滴下して加えた。次に、反応混合物を0℃に冷却し、水（100ml）を加えて、不純物を沈殿させた。ろ過した後、水（200ml）を加えて、沈殿物を赤い固体としてろ過した（68%）（M+1、242）。
【０１５５】
3-アミノ-2-ヒドロキシフルオレノン
2008508311.tif 000194
3-ニトロ-2-ヒドロキシフルオレノン（1.6g、6.6mmol）およびSnCl2（3g、6.6mmol）の混合物を、酢酸：濃塩酸（1:1）100ml中で1時間還流させた。混合物を室温まで冷まし、水酸化アンモニウムで中和させた。EtOAc（3×100ml）で抽出した後、混合した有機物断片を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させると茶色の固体として生成物が残った（65%）（M+1、212）。
【０１５６】
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フルオレノン-5-カルボキシレート
2008508311.tif 000195
3-アミノ-2-ヒドロキシフルオレノン（0.9g、4.26mmol）およびエチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（1.36g、4.26mmol）の混合物を、DMSO（50ml）中で真空下で18時間加熱した。EtOAc／鹹水を使用して生成物を抽出し、有機層が結合・乾燥して赤い固体として生成物が得られた。この固体を過剰なK2CO3を含むDMSO（40ml）に溶かし、100℃で30分間加熱した。室温まで冷ました後、鹹水(30ml)を加え、沈殿した生成物を黄色の固体として収集した（2ステップで60%）（M+1、446）。
【０１５７】
実施例40
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フルオレノン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000196
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フルオレノン-5-カルボキシレートを酢酸：濃塩酸（1:1）（それぞれ50ml）に溶かした混合物を、還流状態で2時間加熱した。室温まで冷ました後、水（50ml）を加え、黄色の固体として生成物が得られた（94%）（M+1、418）。
【０１５８】
実施例41
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-アントラキノン-5-カルボキシレートの調製
2008508311.tif 000197
3-アミノ-2-ヒドロキシアントラキノン（5.54g、23.2mmol）およびエチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（8.7g、34.8mmol）の混合物を、ごく少量のDMSO（〜10ml）中で真空下で24時間加熱した。水（50ml）を加えることで生成物が沈殿した。真空オーブン内で固体を一晩かけて乾燥させ、かなり余分なK2CO3を含むDMSO（40ml）で溶かし、100℃で30分間加熱した。室温まで冷ました後、鹹水（30ml）を加え、沈殿生成物を黄色の固体として収集した（2ステップで60%）（M+1、474）。
【０１５９】
実施例42
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-アントラキノン-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000198
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-アントラキノネノン-5-カルボキシレート（3.5g、6.8mmol）を酢酸：濃塩酸（1:1）（それぞれ50ml）に溶かした混合物を、還流状態で2時間加熱した。室温まで冷ました後、水（50ml）を加え、黄色の固体として生成物が得られた（94%）（M+1、446）。
【０１６０】
実施例43
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサゾール-5-カルボキシレートの調製
2-アミノ(t-ブトキシ カルボニル)-5-アミノヒドロキノン
2008508311.tif 000199
Boc無水物（7.17g、33mmol）およびDIEA（17ml、99mmol）をDMSO（20ml）に溶かした溶液を、1,4-ジヒドロキシ-2,5-ジアミノベンゼン（7g、33mmol）の攪拌溶液に室温で滴下して加えた。18時間攪拌した後、生成物をEtOAcと鹹水に分離し、有機層をMgSO4上で結合・乾燥させた。溶剤を除去した後、残基に対してシリカ上で、ヘキサンに25〜50%のEtOAcを溶かしたものを溶出剤として、カラム クロマトグラフィーを実施したところ、純粋な生成物が得られた（45%）（M+1、239）。
【０１６１】
4-ヒドロキシ-3-アミノ(t-ブトキシ カルボニル)-フェノキサゾール
2008508311.tif 000200
アセトニトリル/水（1:1；20ml）に溶かした2-アミノ(t-ブトキシ カルボニル)-5-アミノヒドロキノン（4.69g、23.3mmol）の溶液に、ナトリウムヒドロスルフィット（過剰量）を加え、その混合物を室温で15分間攪拌した。アセトニトリルを真空内で除去し、水溶性の混合物をEtOAc（3×20ml）で抽出した。混合有機質層をMgSO4上で乾燥させ、溶剤を真空内で除去した。残基は、純粋なオルトギ酸トリエチル（100ml）に大量に含まれ、16時間そのまま攪拌を続けた後、10分間加熱して還流させた。室温に冷ました後で水を加えると、生成物が沈殿した（83%）（M+1、251）。
【０１６２】
4-ヒドロキシ-2-アミノ フェノキサゾール
2008508311.tif 000201
4-ヒドロキシ-3-アミノ(t-ブトキシカルボニル)-フェノキサゾール（3g、12mmol）を純粋なTFA（100ml）に溶かし、室温で1時間攪拌した。TFAを真空内で除去すると、トリフルオロ酢酸塩として最終生成物が残った（定量的）（M-1、149）。
【０１６３】
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(N-(4-ヒドロキシ-2-アミノ フェノキサゾール))-プロプ-2-エン酸
2008508311.tif 000202
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(ジメチルアミノ)-プロプ-2-エン酸（7.34g、23mmol）および2-アミノ-4-フェニル-フェノール（3.45g、23mmol）を、トリエチルアミン（10ml）を含むEtOAc（20ml）に溶かした溶液を、真空下で回転蒸発器で3時間攪拌した。EtOAcを真空内で除去し、残基に対して、ヘキサンに50%EtOAcを溶かしたものを溶出液として、シリカ上でカラムクロマトグラフィーを実施したところ、純粋な生成物が得られた（72%）（M+1、425）。
【０１６４】
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサゾール-5-カルボキシレート
2008508311.tif 000203
エチル-2-(2’,3’,4’,5'-テトラフルオロベンゾイル-)-3-(N-(4-ヒドロキシ-2-アミノ  フェノキサゾール))-プロプ-2-エン酸（3.5g、8.25mmol）を、K2CO3（過剰量）を含むDMSO（50m）に溶かした溶液を80℃で10分間加熱した。室温まで冷ました後、水を加え、黄色の固体としての生成物を沈殿させた（82%）（M+1、385）。
【０１６５】
実施例44
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(3’-ヒドロキシ-4’-アミノフェニル)-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000204
エチル 1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-フェニル-フェノキサゾール-5-カルボキシレート（2.3g、6mmol）を酢酸：濃塩酸（1:1、100ml）に溶かした混合物を、30分間加熱し還流させた。室温まで冷ました後、揮発物を真空内で除去すると、茶色の固体として生成物が残った（82%）（M+1、347）。
【０１６６】
実施例45
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(ニトロ-フェノキサジン)-5-カルボン酸の調製
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(3’-ヒドロキシ-4’-アミノ-(N-2’’-フルオロ-4’’-ニトロフェニル)-フェニル))-5-カルボン酸
2008508311.tif 000205
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(3’-ヒドロキシ-4’-アミノ フェニル)-5-カルボン酸（0.5g、1.44mmol）、3,4-ジフルオロ-ニトロベンゼン（0.5ml、4.3mmol）およびDIEA（1ml）の溶液を、90℃でNMP（50ml）中で30分間加熱した。室温まで冷ました後、水を加えて生成物を沈殿させてろ過した（63%）（M+1、486）。
【０１６７】
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(ニトロ-フェノキサジン)-5-カルボン酸
2008508311.tif 000206
2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(3’-ヒドロキシ-4’-アミノ フェニル)-5-カルボン酸（0.3g、0.6mmol）を余分なK2CO3を含むDMSO（50ml）に溶かした溶液を、110℃まで1時間攪拌し加熱した。室温まで冷ました後、3M HClを加えて生成物を沈殿させ、ろ過した（71%）（M+1、465）。
【０１６８】
実施例46
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(アミノ-フェノキサジン)-5-カルボン酸の調製
2008508311.tif 000207
1,2-ジフルオロ-4-オキソ-4H-ピリド[3,2,1-kl]-8-(ニトロ-フェノキサジン)-5-カルボン酸（0.1g、0.2mmol）およびスズ（II）塩化物（0.15g、0.6mmol）を、酢酸：濃塩酸（1:1、50ml）に溶かした混合物を、4時間加熱し還流させた。室温まで冷ました後、水を加えて生成物を沈殿させ、ろ過した（72%）（M+1、435）。
【０１６９】
実施例47
置換キノベンゾオキサジン類似体のアミド誘導体の調製
2008508311.tif 000208
フルオロ酸（0.5mmol）をNMP（3.6mL）に溶かした一連の溶液に、アミンNHR1R2（0.5〜2.0mmol）を室温で加えた。容器は密封し、90℃のホットプレート上で加熱し、HPLC/MS分析により反応が完了したと確定されるまで1〜2時間絶え間なく攪拌した。反応物を室温まで冷まし、水（20mL）を加えた。その結果生じる沈殿物を減圧濾過により収集し、真空下で乾燥させた。1.0当量のアミンを使用した場合は、結果として生じる反応混合物は、次のステップで「そのまま」使用した。結果として生じる固体または溶液を、HBTU（2.5eq.）およびDIEAを3.6mL NMPに溶かしたもので処理し、不活性環境下で30分間室温で攪拌した。これらの溶液を、96ウェルフォーマット（Whatman社ユニプレート、2mL）に入れた一連のアミンNHR3R4（2.5当量）に加え、2時間反応させた。次に、メタノール（50〜100mL）を加え、プレートをろ過した（Whatman社ユニフィルター、ポリプロピレン製）。結果として生じる液体に対して、逆相HPLC（Waters製Xterra19x50mm）で、マス検出器（Micromass社ZQ、Waters社FCII）を用いて、直接的にクロマトグラフィーを実施した。純度（MS TIC、UV）について断片を分析し、真空蒸着（Savant社）で乾燥させたが、平均収量は5〜10mgであった。置換キノベンゾオキサジン類似体を表1に記載する。
【０１７０】
実施例48
CX-3092およびCX-3543の合成
CX-3543を合成する一つの方法を下記に示す。スキーム2において示すように、CX-3543は収束法で合成され、小構造1、1Aおよび2Aを最終的な二つの合成段階において組み立てて（スキーム2）、RSおよびSS異性体を50：50の比率で有するCX-3543を形成する。CX-3092は、1Aの非キラル型を用いて同様に合成してもよい。
2008508311.tif 000209
【０１７１】
より詳しくは、ピラジノピロリジン1Aを、[3+2]付加環化化学によって合成する。L-プロリン7のシアノ-1-アミノピロリジン8への変換の後に還元すると、立体化学を喪失することなく、キラル2-アミノエチル-1-メチルピロリジン2Aが高い収率で提供される。CX-3543は、約20 mg/mlの処方溶解度を有することが見いだされた。
【０１７２】
実施例49
細胞増殖および／または細胞毒性試験
細胞培養
ヒトの子宮頚管上皮細胞（HeLa細胞）は、American Type Culture Collection（米国菌培養収集所）（バージニア州マナサス）から入手した。細胞は、イーグル最小必須培地（MEM、ユタ州Hyclone社）で培養されたもので、湿った環境（5%CO2、37℃）において、2mMグルタミン、0.1mM非必須アミノ酸、1mM ビルビン酸ナトリウム、1.5g/L NaHCO3、50mg/Lゲンタマイシン、および10%ウシ胎児血清（米国Hyclone社）が補充された。
【０１７３】
MTSアッセイ法
化合物の高増殖性の効果をCellTiter 96AQueousアッセイ法（ウィスコンシン州Promega社）により試験したが、これは、生菌細胞数の決定用の色彩分析評価である。（Wang,L., et al., Methods Cell Sci (1996) 18:249-255などを参照）。1つの実施例において、細胞（4,500細胞／ウェル）を、96ウェルのフラットボトムプレート（ニューヨーク州Corning社）100μl培地に播種し、0日目には抗癌薬を一切用いず、1日目に抗癌薬をさまざまな濃度で含む培地と交換した。正常な成長条件で3日間培養した後（4日目）、単層をPBSで一回洗い流し、媒体をそれぞれ96ウェルのプレートの100μlPBSに切り替えた。MTSとPMSを20:1の割合で混合した後、20μlのMTS/PMS溶液を96ウェルプレートのそれぞれに加え、4時間湿った環境（5%CO2、37℃）で培養した。FLUOstar Galaxy 96ウェルプレート リーダー（ドイツBMG Labtechnologies社）を使用して、吸光度を490nmで読み取った。表1で報告したμM濃度（MTSデータ）は、50%の抗増殖性の細胞応答がみられた濃度である。IC50値が5μMを超える化合物は、報告されていない。
【０１７４】
実施例50
細胞アッセイ法におけるmRNA値の測定
標的のc-mycおよび同じチューブ内にある細胞膜内で成長する基準GAPDH遺伝子の複製数の変化を検出するために、リアルタイム定量的PCR（QPCR）法を使用した。細胞（15,000細胞／ウェル）を、96ウェル式フラットボトムプレート（ニューヨーク州Corning社）に播種し、正常な成長条件下で一晩培養した。翌日、培地を抗癌薬をさまざまな濃度で含むものと交換し、湿った環境（5%CO2、37℃）で4時間培養した。RNeasy 96 Kit（カリフォルニア州QIAGEN社）を使用して、Total RNA（tRNA）を抽出した。tRNAの濃度は、RiboGreen RNA定量化試薬（オレゴン州Molecular Probes社）により決定された。
【０１７５】
1xTaqMan RT緩衝液、2.5uMランダムヘキサマー、5.5mM MgCl2、それぞれ0.5mMのデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）、30U MultiScribe 逆転写酵素、および10 U RNase 阻害剤を含む25μl反応の各ウェルからとった50ngのtRNAを使用して逆転写（RT）反応を起こした。RT反応を25℃で10分間保温し、48℃で30分間逆転写させ、95℃で5分間不活性化し、4℃で配置した。すべてのRT試薬は、カリフォルニア州Applied Biosystems社から購入した。
【０１７６】
リアルタイムQPCR反応は、5μlのcDNA、1xUniversal PCR Master Mix、1x c-myc Pre-Developed Primers and Probeセット、および0.8×GAPDH Pre-Developed Primers and Probeセットを含む50μl反応で実施した。HelaでのGAPDH遺伝子の存在量は相対的であるために、GAPDHのプライマーとプローブの濃度は、同一のチューブ内にある両方の遺伝子の正確なスレッショルドサイクル（CT）を得るために調整した。スレッショルドサイクル（CT）は、増幅された標的の量が固定域値に達する断片的なサイクル数を示す。そうすることで、GAPDH増幅は停止されて、c-mycの増幅に使用できる共通の反応物質を制限できるようになり、これにより、GAPDHのΔRn値が減少するが、そのCT値には影響はなく、またどちらの遺伝子にとっても等しい増幅効果となる。ΔRn値は、正規化されたレポーターシグナルからベースライン信号を差し引いた値を表す。ΔRnは、PCR時に増幅産物（amplicon）の複製数が増加する場合、反応が平坦域に近づくまで増加する。
【０１７７】
c-mycプローブは、6FAM（商標）染料-MGBで標識化し、GAPDHプローブは、VIC（商標）染料-MGBで標識化した。前保温は、AmpErase UNG 酵素を活性化させるために50℃で2分間実施した後、AmpliTaq DNAポリメラーゼを活性化するために95℃で10分実施した。DNAは、95℃で15秒間および60℃で1分間、40サイクルに増幅した。ヒトc-mycおよびGAPDH cDNAは、ABI Prism 7000 配列検出システム（カリフォルニア州Applied Biosystems社）を使用して、リアルタイムで増幅、検出、および数量化したが、このシステムは、6-FAMとVICの両方のレポーター染料を同時進行的に検出するように設定した。
【０１７８】
データはABI PRISM配列検出システムおよびMicrosoft Excelを使用して分析した。相対的定量化は、標準曲線および比較CT法を同時に使用して行ったが、どちらの方法も等価な結果が得られた。増幅プロットがCTと交差するサイクルは、相対mRNA値を正確に反映することが知られている。(Heid, et al., Genome Res.(1996) 6:986-994； Gibson, et al., Genome Res.(1996) 6:995-1001).  QPCR反応は、各cDNAサンプルで3つを設定し、3つのCT値の平均をとった。Pre-Developed Primers and Probeセットを含めてすべての試薬は、カリフォルニア州Applied Biosystems社から購入した。表1に報告したμM濃度（STOPデータ）は、50 %のc-myc mRNAレベルの抑制がみられた濃度である。IC50値が5μMを超える化合物は、報告されていない。
【０１７９】
実施例51
インビトロ特徴づけ
本発明の化合物のインビトロ特徴付けのために、以下が含まれるがそれらに限定されるわけではない様々な方法を用いた：i）停止アッセイ法；ii）4重鎖／二本鎖競合アッセイ法；iii）クアドローム（quadrome）フットプリント；iv）競合体分子の非存在下での直接アッセイ法。
【０１８０】
停止アッセイ法
図1は、標的G-四重鎖に結合してこれを安定化させる薬物を検出するためのハイスループットファーストパススクリーニングである停止アッセイ法を表す。図1に示すように、それに対する薬物スクリーニングが望ましい「標的」四重鎖のヌクレオチド配列を含むDNA鋳型オリゴヌクレオチドを作製する。次に、蛍光標識プライマーDNAを鋳型DNAの3'末端にアニールする。TaqポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを、蛍光標識プライマーから伸長させることによって、DNAの相補鎖を合成するために導入する。Taqポリメラーゼの進行が妨害されなければ、これは鋳型の完全長のコピーを合成する。単に二本鎖DNAに結合するのみであり、四重鎖領域に選択的に結合しない試験薬を加えると、完全長の産物の合成の減少が起こり、多様な長さのDNAコピーが同時に増加する。しかし、試験薬が四重鎖に選択的に結合してこれを安定化すると、ポリメラーゼの進行は四重鎖のみで停止して、特徴的な「停止産物」が合成される。
【０１８１】
一つの局面において、本発明は、c-mycのような四重鎖のプロペラ／椅子型によって調節される腫瘍遺伝子を選択的に標的とすると考えられる化合物を提供する。化合物は当初、一つの濃度でスクリーニングされ、「合格した化合物」を、IC50値（すなわち、停止産物／完全長の産物比1：1を生じるために必要な薬物濃度）を決定するために広範囲の用量で再度アッセイする。これらの産物をキャピラリー電気泳動によって可視化する。
【０１８２】
図2は、トポ-II毒物m-AMSA；抗生物質ジスタマイシン、アクチノマイシンD（非特異的転写阻害剤）、およびミスラマイシン；ならびに抗生物質フルオロキノロンシプロフロキサシンのようなDNA相互作用薬を含む、他のタイプの薬物と共にCX-3543の電気泳動図を示す。CX-3543は、停止アッセイ法においてIC50値1.0μMを示したが、他のDNA相互作用薬はいずれも100μMまでの濃度で四重鎖に結合しなかった。このように、ファーストパススクリーニングは、プロペラ／椅子型四重鎖に対して少なくとも100倍の選択性を有する物質を有効に同定した。
【０１８３】
四重鎖／二本鎖競合アッセイ法
二本鎖DNAと比較して標的四重鎖配列に対する化合物の選択性は、競合アッセイ法（すなわち、「選択的スクリーニング」）を用いて測定してもよい。この選択性スクリーニングは、外から加えられたDNA配列の、薬物を結合するためにDNA鋳型において形成された標的四重鎖構造との相対的競合能を測定するために、リポーター系として停止アッセイ法を使用する。例えば、競合体は、鋳型DNAに存在する四重鎖配列と同一であるc-myc四重鎖配列、または複雑なゲノム二本鎖DNAを模倣するプラスミドDNAである。それぞれの競合体が溶液中の薬物を首尾よく「吸収する」程度は、停止産物の合成における定量的減少によって反映される。このようにして、標的四重鎖および二本鎖DNAの双方に対する薬物の相対的結合親和性を決定する。
【０１８４】
図3は、CX-3543の四重鎖対二本鎖DNA結合選択性を示す選択性アッセイ法である。競合体のIC50値の比は、四重鎖または二本鎖DNAに対する化合物の相対的結合親和性を示す。図3に示すように、CX-3543は、pUC18プラスミドDNAと比較してc-myc四重鎖に関してほぼ400倍の選択性を示す。
【０１８５】
クアドロームフットプリント
化合物を、広範な異なる腫瘍遺伝子を調節する四重鎖制御要素を含む、生物学的に関連する他の天然の四重鎖構造との結合能に関して評価した。図4は、腫瘍遺伝子によるCX-3543に関する選択性フットプリント（上のパネル、右）および停止アッセイ法（下のパネル、右）を示す。図4に示すように、CX-3543は、椅子型／プロペラ型コンフォメーションをとることができるそれらの四重鎖に選択的に結合する。
【０１８６】
直接相互作用アッセイ法
化合物を、テロメア核酸ではない、四重鎖構造を形成することができる核酸との直接相互作用能に関して評価してもよい。アッセイ法は、同じまたは異なる容器において行ってもよい。例えば、化合物を同じ容器でそれぞれの核酸に接触させてもよい。または化合物を異なる容器において試験した核酸のそれぞれに個別に接触させてもよい。本明細書において用いられるように、テロメア核酸は、染色体の末端で非常に反復性の高い核酸の領域を表す。本明細書において用いられるように、競合体核酸が存在しなくとも、直接の相互作用が測定される。
【０１８７】
化合物と核酸との相互作用は、例えば、結合および／または四重鎖安定化を示すIC50値を測定することによって決定してもよい。相互作用の選択性は、例えば測定されたIC50値を比較することによって決定してもよい。例えば、最低のIC50値を用いて、化合物と核酸とのあいだの強い相互作用を示してもよく、最高のIC50値は相互作用が不良であることを示し、このように相互作用の選択性を示す。反応産物を、キャピラリー電気泳動によって特徴を調べた。
【０１８８】
実施例52
直接相互作用アッセイ法
直接相互作用アッセイ法を用いて、CX-3543を異なるタイプの四重鎖に対する結合能および／または安定化能に関してスクリーニングした。本実施例において、10 mM MgCl2、0.1 mM EDTAおよび0.1 mM混合デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）を含むトリス-HCl緩衝液（15 mMトリス、pH 7.5）において、5'-蛍光標識（FAM）プライマー（P45、15 nM）を鋳型DNA（15 nM）と混合する。混合物を95℃で5分間変性させて室温まで冷却後、37℃で15分間インキュベートする。室温まで冷却後、1 mM KClおよび様々な濃度の試験化合物を加えて、混合物を室温で15分間インキュベートする。プライマーの伸長は、13 mM KClおよびTaq DNAポリメラーゼ（2.5 U/反応、Promega）を加える段階、および70℃で20分間インキュベートする段階によって行う。試験した四重鎖の核酸配列を表4に記載する。
【０１８９】
（表４）停止鋳型
2008508311.tif 000210
【０１９０】
表5に示したCX-3543のIC50値は、CX-3543が、調べたプロペラ型の四重鎖（すなわち、c-myc、TGF-β、およびH-RAS）と強く相互作用すること、および調べた椅子-エラ型およびかご型四重鎖（すなわち、BCl-2およびHum Tel）との相互作用はあまり強くないことを示している。CX-3543は、調べた7価-4価（SRCおよびHMGA-2）およびi-モチーフ四重鎖と弱く相互作用する。これらの結果は、図4に示される競合アッセイ法において得られた結果と同様である。
【０１９１】
（表５）
2008508311.tif 000211
【０１９２】
実施例53
CX-3092およびCX-1535抗腫瘍活性
化合物CX-3092（化合物1204）およびCX-1535（化合物494）の抗腫瘍活性をそれぞれ、Ramos小児白血病モデル（図5）およびHCT-116結腸直腸癌モデル（図6）において示し、有効性（遅い腫瘍重量の増加）および毒性の欠如（体重変化がほとんどない）を示している。接種のための二つの異種移植片モデルを得て、濃度50×106個/mlまたは100×106個/mlに希釈した。4〜6週齢のヌードマウスに5×106〜10×106個を含む細胞浮遊液0.1 mlを注射した。腫瘍が適当な大きさに達した後、化合物の投与を開始する。腫瘍の大きさを処置期間中、キャリパーを用いて測定し、体重も同様に測定した。
【０１９３】
実施例54
腫瘍細胞株に対するCX-3543インビトロ活性
CX-3543の作用の抗腫瘍範囲を、癌細胞株のパネルを用いてインビトロで試験し、MTS細胞生存アッセイ法を用いて評価した。細胞を様々な濃度のCX3543に4日間曝露して、IC50値を計算した。一般的に、96ウェルプレートの各ウェルにおいて細胞2,000〜5,000個を播種して、終夜インキュベートした。試験化合物の連続希釈液を細胞に加えて、5％CO2湿潤インキュベーターにおいて37℃で4日間さらにインキュベートした。製造元のプロトコール（Promega）に記述されているように、生存細胞数をMTS法によって評価した。IC50値（すなわち、50％細胞死を誘導するために必要な試験薬の濃度）は、化合物を含まない対照群の細胞数と比較して細胞数を505減少させる試験化合物の濃度として計算した。特定の例において、IC50値をAlamar Blueによって測定した。
【０１９４】
インビトロにおいて、CX-3543は、広範囲の腫瘍タイプに対して抗腫瘍活性を示した（IC50は、表5に示すように、MTSアッセイ法においてマイクロモル下から一桁のマイクロモルレベルまでに及ぶ）。
【０１９５】
（表５Ａ）
2008508311.tif 000212
【０１９６】
さらに、CX-3543を、トポイソメラーゼIおよびトポイソメラーゼII酵素に対して可能性がある阻害活性に関して評価したところ、いずれの酵素の阻害剤または毒物でもないことが決定された。図7は、対照トポイソメラーゼ-II毒物としてVP-16（エトポシド）を用いるトポイソメラーゼ-II毒物アッセイ法からのデータを示す。1μM VP-16の存在下で、トポイソメラーゼIIは、スーパーコイルDNAにおいて二本鎖切断の形成を媒介し、直線状のDNA産物を生じる。CX-3543は、100μMもの高濃度でもトポイソメラーゼ依存的鎖切断を誘導しなかった。
【０１９７】
実施例55
CX-3543の薬物代謝
チトクロームP450（CYP450）阻害アッセイ法
CX-3543を、CYP450イソ酵素6個：CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4によるインビトロ阻害アッセイ法を用いて、チトクロームP450イソ酵素に対する可能性がある阻害活性に関して評価した。一般的に50 mMリン酸カリウム、pH 7.4、2.6 mM NADP+、6.6 mMグルコース-6-リン酸、0.8 U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、および試験化合物の1：6倍希釈液を含む溶液100μlを加えた反応試験管6本を、適した陽性対照阻害剤の1：6連続希釈液の試験管6本と共に調製した。予め加温した酵素／基質溶液100 μlを反応試験管に加えることによって反応を開始させた。ゼロ時点での対照反応は、酵素を不活化するために共因子溶液100μlにアセトニトリル50μlを加えた後、酵素／基質溶液100μlを加えることによって調製した。阻害剤を加えない対照反応も同様に調製した。37℃で適切にインキュベートした後、アセトニトリル50μlを加えることによって反応を終了させた。LC/MS/MSを用いてプローブ基質の代謝型に関して反応物を分析した。それぞれのアッセイ法は2回通り行った。表6は、IC50値の要約を示す。
【０１９８】
（表６）
2008508311.tif 000213
【０１９９】
イソ酵素5個中4個：CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、およびCYP2D6については有意な阻害を認めなかった。CYP3A4の場合、1〜3μMの範囲で軽微で部分的な阻害のみが明白であった。これらの結果は、薬物曝露の臨床レベルで、同時投与した薬物の肝代謝による薬物-薬物相互作用の可能性が低いことを示唆している。本実施例が示すように、CX3543は、CYP450イソ酵素系によって主に代謝される抗癌薬（例えば、ドセタキセル）と同時投与してもよい。
【０２００】
実施例56
CX-3543の代謝安定性
代謝安定性アッセイ法および代謝物のプロファイリング
代謝物のプロファイルを調べるためのヒト肝細胞アッセイ法を市販のキットを用いて、標準的な方法に従って行った。ヒト肝細胞によるCX-3543の代謝安定性を、1 μMおよび20 μMで0分間、30分間、60分間、および120分間インキュベートした後に評価した。親化合物の消費および代謝物の出現を注意深くモニターして、代謝物の断片化パターンを定義するために、可能性がある代謝物ピークに関して質量分析プロダクトイオンスキャンを実行した。
【０２０１】
CX-3543は、約12〜20μMの濃度で中等度から急速に消費されるが、12μM（残っている当初の薬物の約60％）またはそれより低い濃度ではよりゆっくり、および1μMではかなりゆっくり消費される。これらの知見は、CX-3543が肝細胞によって、20μMより高い見かけのKmで消費されることを示唆している。本発明を実践するためにメカニズムは必要ではないが、高いKmは、二相性の動態を説明すると考えられる（すなわち、低いKmを有する第二の酵素成分が関係する可能性がある）。
【０２０２】
ゼロ時点を120分の時点と比較することによって、およびゼロ点には存在しなかった120分の時点でのピークを探すことによって、m/z 303、347、348、および391で可能性がある代謝物4個が同定された。これらの種のプロダクトイオンスペクトルを採取する試みを行ったところ、m/z 348のスペクトルのみが得られたが、感度は非常に低かった。m/z 348でのプロダクトイオンスペクトルを親イオンと比較しても、如何なる明白な分子類似性も明らかにされず、このことは四つの代謝物のいずれもCX-3543に関連しないことを示唆するが、この知見はそれらが代謝物であることを除外しない。
【０２０３】
可能性がある代謝物のピーク高さは比較的小さいが、大きさの有意性は親と代謝物とのあいだのイオン化電位の起こりうる差のために決定することができなかった。この知見は、CX-3543との肝細胞インキュベーション培地において単一の主要な代謝物が存在せず、むしろいくつかの小さい代謝物が存在することを示唆している。肝臓による消失の役割が軽微であることは、肝酵素の誘導物質または阻害物質である同時投与された化合物との薬物-薬物相互作用の可能性を最小限にする。
【０２０４】
実施例57
CX-3543インビボ活性
CX-3543を、インビボ有効性を決定するために多数の癌異種移植片モデルに対して試験した。HCT-116、およびPC-3担癌nu/nuまたはMiaPaCa担癌SCIDマウスに、図の説明文に示されたスケジュールに従って参照および試験化合物を投与した。腫瘍の測定はキャリパーを用いて投与開始日から1日おきに、または週に2回行い、体重を同じ時点で測定した。腫瘍の容積は、標準的な式、W2×L/2から計算した。c-MYC mRNA発現を、最終投与後全ての腫瘍試料からQPCRによって測定した。18SリボソームRNAをハウスキーパーとして用いて、同様にQPCRによって定量した。
【０２０５】
インビボにおいて、CX-3543は、その全てが高レベルのc-Mycを発現する難治性の前立腺癌（PC-3）、結腸直腸癌（HCT-16）、および膵臓癌（MiaPaCa）異種移植片モデルにおいて有意な腫瘍の成長阻害を誘導した。HCT-116結腸直腸腫瘍モデルにおける有効性は、10 mg/kg、15 mg/kg、および20 mg/kgの用量で認められ（図8）、処置動物群から単離した腫瘍組織において、対照（18S rRNA）と比較して、c-Myc mRNA発現の用量依存的な低下が観察され、20 mg/kg群では85％低下した。有意な腫瘍成長の阻害はまた、PC-3（図9）およびMiaPaCa（図10）モデルにおいてもq.o.dスケジュールでi.p.投与した5 mg/kg、10 mg/kg、および15 mg/kgで観察された。
【０２０６】
実施例58
腫瘍抑制における化合物有効性の評価
ヒト癌の無胸腺ヌードマウスモデルにおける本発明の化合物の有効性を評価するための実験を以下のように設計する。5〜6週齢で、体重が20 gより多い雄性または雌性動物（マウス、Sim）（NCR、nu/nu）を用いる。動物は目的を持って飼育され、試験開始時、実験的に未処置である。腫瘍は、注射した細胞から、または腫瘍断片の継代から繁殖すると考えられる。用いた細胞株には、MiaPaCa、PC3、HCT116、HT29およびBT474が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０２０７】
細胞の埋め込み
培地0.1 mlに浮遊させた1〜1000万個の細胞を、Matrigel（Collaborative Biomedical Products, Inc, Bedford, MA）と共に、または含まずに動物60匹の右脇腹に皮下接種する。動物あたりの注射は1回限りである。注射の7〜14日以内に、腫瘍は約1.0 cm3の試験に用いる大きさまで発達すると考えられる。小さいサブセット（＜10/60）の動物をドナーと見なし、連続移植に用いるために、腫瘍を大きさ1.5 cm3となるまで10〜28日間成長させる。エストロゲン依存的腫瘍株（すなわち、BT474）の場合、雌性マウスに、10ゲージ套管針によって肩甲骨のあいだにエストロゲンペレットを皮下に埋め込んだ3日後、細胞または腫瘍の断片を注射／埋め込む。
【０２０８】
断片の移植
ドナー動物を安楽死させて、腫瘍を外科的に切除して、無菌的技術を用いて2 mm3の大きさの断片に切断する。埋め込むべき動物をイソフルランによって軽く麻酔する。埋め込まれる領域を70％エタノールおよびベタジンによって清浄する。次に、断片1個を套管針を用いて皮下に埋め込む。
【０２０９】
有効性試験
担癌動物50〜60匹の群を、表7に記述するように、各動物7匹を含む3〜8群に無作為に分ける。
【０２１０】
（表７）
2008508311.tif 000214
*賦形剤／希釈剤
**タキソール、CPT11、およびゲンシタビンが含まれるがそれらに限定されるわけではない市販の抗癌化合物を陽性対照として用いる。
【０２１１】
投与法
化合物をIP、IV（側方尾静脈）、またはPOによってQD、QOD、Q3D、または週に1回投与する。動物を全ての群に関して類似になるように投与時間を配分する規則正しい順序で投与する。ボーラスIPおよびPO投与の場合、動物を手で抑える。IVボーラス投与または短時間のIV注入（1分間）の場合、動物を機械によって拘束するが鎮静させない。使い捨ての滅菌シリンジを各動物／用量に関して用いる。
【０２１２】
図8に示すように、10 mg/kg、15 mg/kg、および20 mg/kgの用量でHCT-116結腸直腸モデルにおいて有効性が観察された。有効性はまた、PC-3（図9）およびMiaPaCa（図10）モデルにおいても5 mg/kg、10 mg/kg、および15 mg/kgの用量で観察された。
【０２１３】
実施例59
最大認容量の評価
本発明の化合物の最大認容量（MTD）を評価するための実験を以下のように設計する。動物モデルの選択は、実施例58において既に記述されたとおりである。
【０２１４】
急性毒性試験
1回投与後のMTDを決定するために、未処置の動物60匹を、動物10匹（雄性5匹および雌性5匹）を含む群に無作為に分けて、二つの投与経路によって一つの化合物を、または一つの投与経路によって二つの化合物を投与する。50 mg/kg IVの1回投与は、認容されることが示されており、予備的な低用量レベルとして用いる。経口試験の低用量は、予測された認容性に基づき、必要に応じて下方調節されると考えられる。設計された用量レベル、投与容量、および投与溶液濃度を表8に記述する。
【０２１５】
（表８）
2008508311.tif 000215
【０２１６】
亜慢性試験
反復投与後の用量反応関係の特徴を調べるために、未処置の動物25匹を、表9に記載したように動物各5匹を含む群に無作為に分ける。それぞれの2週間の試験は、これまでの急性毒性試験において収集されたデータに由来する最適な用量での1回投与によって一つのみの化合物を試験する。
【０２１７】
（表９）
2008508311.tif 000216
【０２１８】
投与法
化合物を、IV（側方尾静脈）、またはPOによってQD、QOD、Q3D、またはQ7Dで投与する。動物を全ての群に関して投与時間を類似となるように配分する規則正しい順序で投与する。PO投与の場合、動物を手で抑える。IVボーラス投与または短時間のIV注入（1分間）の場合、動物を機械によって拘束するが鎮静させない。使い捨ての滅菌シリンジを各動物／用量に関して用いる。
【０２１９】
実施例60
薬物動態特性の評価
化合物の薬物動態特性を評価するための薬物動態試験を以下のように設計する。5〜6週齢の雄性動物（マウス、Balb-cまたはラット、SD）または体重200 gより多いラットを試験のために用いる。動物20匹を図10に示すように無作為に4群に分ける。一群を無処置とし、ベースラインとして用いるために試料を採取する。他の三群に処置を行い、静脈内注射によって化合物を1回投与する。
【０２２０】
（表１０）
2008508311.tif 000217
【０２２１】
投与法
化合物をIV（側方尾静脈）、IPまたはPOによって投与する。動物を全ての群に関して投与時間を類似となるように配分する規則正しい順序で投与する。IPおよびPO投与の場合、動物を手で抑える。IVボーラス投与または短時間のIV注入（1分間）の場合、動物を機械によって拘束するが鎮静させない。使い捨ての滅菌シリンジを各動物／用量に関して用いる。
【０２２２】
初回投与前に、血液約0.5 mlを心穿刺によって未処置動物から採取する。最終血液試料（0.5 ml）は、上記の図に従う時点で1群あたり動物2匹から心穿刺によって採取する。試料は全て、抗凝固剤としてヘパリンリチウムを含む試験管に入れて、上下逆さまにして直ちに混合する。それらを遠心して、血漿を液体窒素において急速に凍結して、-70℃またはそれより低い温度で保存して、薬物レベルに関して分析する。
【０２２３】
CX-3543組織分布の経時的変化を決定するための薬物動態試験を、25 mg/kg CX-3543の静脈内投与後のマウスにおいて行った。IV用量の投与後24時間を通して定期的に採取を行い、重要な由来する薬物動態パラメーターを誘導した。図11は、CX-3543の薬物動態プロファイルのグラフ表示を提供し、そこから重要なパラメータ（表11）を得た。
【０２２４】
図11において、Cmaxは、達成された最高CX-3543血漿濃度（ng/mlで表記）である。AUC0-infは、ゼロ時間から無限大まで外挿したCX-3543血漿濃度対時間曲線下面積である（ng.hr/mlで表記）。T1/2は、CX-3543の終末相半減期（hrで表記）である。Vdssは、定常状態でのCX-3543の分布容積である（L/kgで表す）。およびClsは、CX-3543の全身クリアランスである（L/hr/kgで表記）。図11に示すように、CX-3543は、Cmax約5353 ng/mlを有する。AUC0-infは約20332.5 ng.hr/mlであり；およびT1/2は約4.6時間である。
【０２２５】
（表１１）
2008508311.tif 000218
【０２２６】
実施例61
肝細胞におけるインビトロ代謝安定性の決定
インビトロインキュベーションにおいて、肝細胞（ヒト、ラット、イヌ、サル）の存在下で新しい化学実体の安定性を決定するプロトコールを設計する。試験物質を肝細胞および適した培地と共に37℃で様々な時間インキュベートする。反応混合物を抽出して、親化合物および予想される代謝物に関してLC/MS/MSによって分析する。応用可能である場合、試験物質の消費に関する半減期を計算する。試験物質に関して得られた半減期の値を比較するために、代謝物対照を分析する。代謝対照は、トルブタミド、デシプラミン、およびナロキソンであり、これらの化合物はそれぞれ、低い、中等度、および高いインビボクリアランス値に対応する定義された薬物動態を有する。
【０２２７】
代謝安定性試験
一般的に、試験化合物の溶液を、酵素活性に関する参照を提供することが意図される代謝対照のカクテル溶液と共に調製する。これらの予め加温した溶液を肝細胞浮遊液および培地対照溶液と組み合わせることによって、反応を開始する。開始直後に、対照ゼロ試料をこれらの反応から採取する。さらなる試料を適当な時点で採取する。それぞれの試料は、反応を停止させるために終止溶液（内部標準を含む酸性化アセトニトリル）に直ちに入れる。肝細胞ブランク浮遊液および試験化合物標準溶液を調製する。
【０２２８】
試験化合物の試料および標準物質と共に適当なブランクを、注文の試料調製方法に供して、タンデム質量分析と共役させた高速液体クロマトグラフィーを用いて、試験化合物の親および／または代謝物型に関して分析する。試料および代謝物対照に関する標準物質を、本明細書に記述の分析法に供する。クレブス-ヘンゼライト緩衝液を加える場合、緩衝液に室温で5％CO2含有空気を5〜10分間通気してからBSAを最終濃度0.2％w/vで加える。終止溶液の容積および試料調製法は、方法開発の際に試験物質に関して決定される。
【０２２９】
試験物質／培地溶液
5％CO2含有空気によって平衡にしたクレブス-ヘンゼライト緩衝液において、保存液の適当な容量を0.2％BSAに加えることによって、試験物質溶液を調製する。最終濃度は20μMであり、反応開始時の最終的なアッセイ濃度は10μMと考えられる。
【０２３０】
代謝対照／培地溶液
トルブタミド、デシプラミン、およびナロキソン溶液を、5％CO2含有空気によって平衡にしたクレブス-ヘンゼライト緩衝液において、各10 mM保存液の適当量を0.2％BSAに加えることによって調製する。最終濃度は各代謝対照に関して20μMであり、最終的なアッセイ濃度は反応開始時10μMと考えられる。
【０２３１】
肝細胞浮遊液
肝細胞を、販売元（Invitrotech, Inc.）の説明書に従って解凍して単離した。方法の最終段階において、細胞生存率を、トリパンブルー排除法を用いて決定する。次に、肝細胞を5％CO2含有空気によって平衡にしたクレブス-ヘンゼライト緩衝液において、0.2％BSAと共に浮遊させて、最終濃度を生存細胞50万個/mlとする。反応開始時の濃度は、生存細胞25万個/mlであると考えられる。
【０２３２】
試験物質インキュベーションの開始
調製した試験物質溶液の等量をポリプロピレンシンチレーションバイアル4個に分配する。バイアルを95％湿度および5％CO2において37℃で5〜10分間予め加温する。5％CO2含有空気によって平衡にしたクレブス-ヘンゼライト緩衝液において、0.2％BSAの等量をバイアルの二つに加えて十分に混合する。反応開始直後、タイマーを開始させて、試料100μlを各バイアルから採取して、終止溶液の適当量を含む1.7 ml遠心管に入れる。これらの試料は、非酵素的分解および容器に対する非特異的結合をチェックするために培地対照として役立つと考えられる。
【０２３３】
調製した肝細胞浮遊液の等量をバイアルの二つに加えて十分に混合する。反応開始直後、タイマーを開始させて、試料100μlを各バイアルから採取して、終止溶液の適当量を含む1.7 ml遠心管に入れる。バイアルは全て37℃、95％湿度、および5％CO2で維持されたインキュベーターに入れる。
【０２３４】
代謝対照インキュベーションの開始
調製した代謝対照溶液の等量をポリプロピレンシンチレーションバイアル2個に分配する。バイアルを95％湿度および5％CO2において37℃で5〜10分間予め加温する。調製した肝細胞浮遊液の等量をバイアルの二つにそれぞれ加えて十分に混合する。反応開始直後、タイマーを開始させて、試料100μlを各バイアルから採取して、終止溶液の適当量を含む1.7 ml遠心管に入れる。バイアルは全て37℃、95％湿度、および5％CO2で維持されたインキュベーターに入れる。
【０２３５】
試料の採取
バイアルを軽く振とうさせて、試料（100μl）を採取して、以下のスケジュールに従って終止溶液の適当量を含む1.7 ml遠心管に入れる。試験物質試料を、5分後、10分後、15分後、30分後、60分後、90分後、および120分後に採取する。代謝対照試料を30分後、60分後、90分後、および120分後に採取する。最後の試料を採取するまで、試料採取直後、バイアルをインキュベーターに戻す。
【０２３６】
ブランクの調製
肝細胞浮遊液試料（100μl）を0.2％BSAクレブス-ヘンゼライト緩衝液溶液の等量に加えて十分に混合する。この溶液の100μl試料を採取して、試験物質反応のために用いた終止溶液の同じ量を含む1.7 ml遠心管に入れる。インキュベーション培地（0.2％BSAのクレブス-ヘンゼライト緩衝溶液）の試料を、試験物質反応のために用いた終止溶液の同じ量を含む1.7 ml遠心管に入れる。
【０２３７】
試料の調製および分析
バイアルは全て16,000 gで3分間遠心する。上清をポリプロピレンオートサンプラーバイアルに入れて、分析するまで4℃（＜1日）、または-70℃（＞1日）で保存する。試験物質溶液は、標準的な方法に従ってHPLC/MS/MS条件を用いて分析する。一つの例において、以下のHPLC条件を用いてもよい：カラム（Phenomenex Synergi Hydro-RP、100.0×2.0 mm、5μm）；ガードカラム（Phenomenex C18、4.0×2.0 mm、5μm）；流速（0.3 ml/分）；カラム温度45℃；注入容積10μl；および室温のオートサンプラー。
【０２３８】
実施例62
ミクロソームにおけるインビトロ代謝安定性の決定
インビトロインキュベーションにおいて肝ミクロソーム（ヒト、ラット、イヌ、サル）の存在下での新しい化学実体の安定性を決定するためのプロトコールを設計する。試験物質を、ミクロソームおよび適した培地と共に37℃で様々な時間インキュベートする。反応混合物を抽出して、親化合物および予想される代謝物に関してLC/MS/MSによって分析する。応用可能である場合、試験物質の消費に関する半減期を計算する。試験物質に関して得られた半減期の値を比較するために、代謝物対照を分析する。代謝対照は、トルブタミド、デシプラミン、およびテストステロンであり、これらの化合物はそれぞれ、低い、中等度、および高いインビボクリアランス値に対応する定義された薬物動態を有する。
【０２３９】
代謝安定性試験
一般的に、50 mMリン酸カリウム、pH 7.4、2.6 mM NADP+、6.6 mMグルコース-6-リン酸、0.8 U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、および1μM、10μM、または50μM試験化合物含む溶液100μlを加えた予め加温した反応バイアル6個を調製した。低い（トルブタミド）、中等度（デシプラミン）、および高い（テストステロン）クリアランスの化合物を表す代謝対照による類似の反応を同じ酵素溶液によって同時に行った。予め加温した酵素溶液100μlを加えることによって反応を開始して、37℃でインキュベートした。酵素溶液を加える前に、アセトニトリル（内部標準を含む）50μlを試験化合物／共因子溶液に加えることによって、ゼロ時点の反応を調製した。15分後、30分後、60分後、90分後、および120分後、反応試験管を水浴から除去して、内部標準を含むアセトニトリル50μlによって反応を終了させた。反応物を抽出して、MS/MS検出を備えたC18カラムを用いて、試料を試験化合物の親化合物型および一つの代謝物に関して分析した。各アッセイ法は2回通り行った。
【０２４０】
共因子／試験化合物溶液濃度
10 mM NCE保存液を10％DMSO（v/v）において調製する。全てのアッセイ法に関して、試験物質の2μM、20μM、または100μM溶液を、50 mMリン酸カリウム、pH 7.4、2.6 mM NADP+、6.6 mMグルコース-6-リン酸および0.8 U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（共因子溶液）において調製する。
【０２４１】
共因子／代謝対照液濃度
代謝対照（トルブタミド、デシプラミン、およびテストステロン）の保存液を用いて、共因子溶液において6μM代謝対照溶液を調製する。
【０２４２】
酵素溶液濃度
50 mMリン酸カリウム、pH 7.4に肝ミクロソームを加えて、最終濃度1 mg/mlの酵素溶液を調製する。ミクロソームは全て、XenoTechまたはInvitroTech, Inc.から購入した。
【０２４３】
反応の開始
反応試験管は全て37℃の水浴において3〜5分間予め加温する。酵素を不活化するために、15.9μMネブラリン（内部標準）を含むアセトニトリル50μlを共因子溶液100μlに加えて、ボルテックスミキサーによって混合することによって、ゼロ時点の対照反応を各反応物に関して調製する。反応は、酵素溶液100μlを各試験管に加えて、ボルテックスミキサーによって混合することによって開始する。ゼロ時点の対照を含む試験管は全て、37℃の水浴においてインキュベートする。反応開始後の試験管における全ての成分の最終濃度は、50 mMリン酸カリウム、pH 7.4、1.3 mM NADP+、3.3 mMグルコース-6-リン酸、0.4 U/mlグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、0.5 mg/ml肝ミクロソームおよび1μM、10μM、または50μM試験物質である。
【０２４４】
反応の終了および抽出
37℃で15分後、30分後、60分後、90分後、および120分後、15.9μMネブラリン（内部標準）を含むアセトニトリル150μlを加えることによって反応を終了する。120分後にゼロ時点の対照を水浴から除去した。バイアルは全て、16,000 gで3分間遠心する。上清をポリプロピレンオートサンプラーバイアルに入れて、分析するまで4℃（＜1日）または-70℃（＞1日）で保存する。
【０２４５】
試験物質溶液の分析
実施例60に記述する方法のような標準的な方法に従って、試験物質溶液をHPLC/MS/MS条件を用いて分析する。
【０２４６】
実施例63
細菌変異原性試験
この変異原性評価（エームスアッセイ法）は、試験物質抽出物の、試験生物のゲノムにおける塩基変化またはフレームシフト変異によって引き起こされた、ネズミチフス菌（S. typhimurium）におけるヒスチジン（his）復帰変異（his-からhis+）、または大腸菌（E. coli）におけるトリプトファン（trp）復帰変異（trp-からtrp+）の誘導能を評価した。
【０２４７】
このプレート取り込みアッセイ法は、外因性の哺乳類活性化系（S9）の存在下および非存在下で、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）5株（TA97a、TA98、TA100、TA102、およびTA1535）および大腸菌（Escherichia coli）1株（WP2-uvrA-）によって行った。試験物質を5％デキストロースに溶解した。次に、試験直前に、生理食塩液において連続希釈液を調製した。明確な変異原性評価にとって適当な用量を決定するために、用量設定試験をこのアッセイ法のために実施した。
【０２４８】
陰性対照は全て、正常範囲内またはわずかに低い範囲内であり、陽性対照は全て適度に増加した復帰変異率を示し、有効なアッセイ法であることを示している。したがって、本アッセイ法は、可能性がある変異誘発物質および非変異誘発物質を正確に同定することができた。本アッセイ法において、試験物質は、変異誘発に関連するタイプの復帰変異率の実質的な増加を誘導しなかった。いくつかの試験物質の毒性が認められたが、中等度のレベルであった。しかし、復帰変異体のコロニー数は正常であるように思われたことから、毒性は干渉を引き起こさなかった。試験物質によって処置した試験株のいずれも、復帰変異率の増加を示さなかったことから、試験物質は、点突然変異、交換、または欠失の増加を引き起こさないと決定される。これらのアッセイ条件に基づいて、CX-3543は、このアッセイ法において非変異誘発性であると見なされる。
【０２４９】
試験材料の調製
試験物質の保存液を以下のように20.0 mg/mlで調製した。試験物質1.0 gを0.1 N HCl 15.0 mlに1分間加えた。試験物質を室温で15分間攪拌した。次に、脱イオン水33.0 mlを加えて30分間攪拌した。次に、pHを3.53に調節した。使用直前にこの保存液から5％デキストロースにおいて希釈することによって、低用量を調製した。分解に関する如何なる変化も最小限にするために、試験物質溶液を調製後、投与方法の直前まで氷中で保存した。試験物質を、試験系と適合性の溶媒によってインビトロで投与した。
【０２５０】
試験株の遺伝子型の特徴付け
試験株の作業保存液を遺伝子型マーカーおよび許容される自然復帰変異率に関して確認する。作業保存液は全て、ヒスチジンまたはトリプトファン（大腸菌のみ）に関する必要性を示さなければならない。さらに、適当であれば、以下のコンフォメーションを各アッセイ法に関して作製する：rfa壁変異によるクリスタルバイオレットに対する感受性（株：TA100、TA98、TA97a、TA102、TA1535、およびWP2-uvrA-）；uvrB遺伝子の欠失による紫外光に対する感受性（大腸菌におけるuvrA）（株：TA97a、TA98、TA100、TA1535、およびWP2-uvrA-）；pKM101プラスミドの存在によるアンピシリンに対する耐性（株：TA97a、TA98、TA100、TA102）；pAQ1プラスミドの存在によるテトラサイクリンに対する耐性（株：TA102）；および株に関する自然復帰変異率を陰性対照を用いて決定する。
【０２５１】
水溶性である試験物質は等張生理食塩液に溶解する。非水溶性である試験物質は、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解する。DMSOが試験物質と有害な反応を引き起こすと予想される場合、試験物質をカルボキシメチルセルロースに懸濁する。溶解を助けるために、加熱、激しい攪拌、または代わりの溶媒を用いてもよい。
【０２５２】
試験系
本試験は、Ames（Ames et al., Mutation Research(1975)31:347〜364）によって最初に記述され、Maron and Ames（Maron et al., Mutation Research(1983)113:173〜215）によって更新されたプレート取り込み方法論に従って実施した。本アッセイ法は、ヒスチジン非要求株を産生するためにヒスチジン要求株の遺伝子における変異を検出するために、またはそれに一致してトリプトファン非要求株を産生するためにトリプトファン要求株の遺伝子における変異を検出するために、歴史的に用いられてきた。さらに、これは、有害な効果に関連するタイプの遺伝可能なDNA変異を産生する多様なクラスの化学変異誘発物質を検出することが示されている。
【０２５３】
このアッセイ法において用いたネズミチフス菌株、TA97a、TA98、TA100、およびTA102（Maron and Ames、前記；Green（Green et al., Mutation Research(1976)38:33〜42）；およびBrusick（Brusick et al., Mutation Research（1980）76:169〜190）によって記述されるように）は、Ames Laboratory, Department of Biochemistry, University of California, Berkeley, CA 94720から受領した。ネズミチフス菌株TA1535および大腸菌株Wp2-uvrA-は、American Type Culture Collection, Manassas, VA（ATCC番号：それぞれ、29629および49979）から受領した。試験株の作業保存液は全て遺伝子型マーカーおよび許容される復帰変異率に関して確認する。作業保存液は、ヒスチジンまたはトリプトファン（大腸菌のみ）に対する要求を示さなければならない。
【０２５４】
実験法
試験株のマスタープレートを凍結作業保存液から調製した。このアッセイ法において用いた各細菌株の作業培養物を作製するために、単一のコロニーをマスタープレートからオキソイド栄養ブロスに移して、振とうさせながら37±2℃で吸光度（650 nm）が0.6〜1.6に達するまでインキュベートした。この終夜培養物を、変異原性試験および遺伝子型確認のために用いた。遺伝子型試験を行った。
【０２５５】
用量範囲および変異原性試験の双方に関して、0.6％Difco寒天の0.5％NaCl溶液からなる上部寒天を融解して、0.5 mM L-ヒスチジン／0.5 mMビオチンまたは0.5 mM L-トリプトファン溶液を、必要に応じて10 ml／寒天100 mlの比率で融解した上部寒天に加えた。添加した寒天を、試験管あたり2 mlの少量に分けて、45〜47℃に維持した。処置のための上部寒天を調製するために、試験物質または対照0.1 ml、細菌培養物0.1 ml、およびリン酸緩衝生理食塩液0.5 mlを、融解した寒天に加えた。混合物を手短にボルテックスミキサーによって攪拌して、室温の最小グルコース寒天プレート（Vogel-Bonner培地E中に1.5％Difco寒天、2％グルコース）に注いだ。代謝活性化は、PBSの代わりにS9混合物0.5 mlを加えることによって提供された。プレートを固化させた後、37±2℃で48〜72時間インキュベートした。プレートは全て、自動画像分析システムを用いて計数した。陰性対照および試験物質処置プレートはまた、芝状の細菌の存在に関して試験した。
【０２５６】
外因性の代謝活性化
本アッセイ法において用いたインビトロ代謝活性化系は、スプラーグドーリー（Sprague-Dawley）系ラット肝酵素と共因子プールとを含んだ。酵素は、化学物質をより活性な型に変換することができる酵素の産生を誘導するために、アロクロルを処置したラットからの肝ミクロソーム（S9画分）の調製物に含まれた。使用直前にS9を解凍して、pH 7.4の200 mMリン酸緩衝液において5％S9、5 mMグルコース-6-リン酸、4 mMβ-ニコチン-アデニンジヌクレオチドリン酸、8 mM MgCl2、および33 mM KClを含むように共因子プールと混合した。S9は、Moltox（Boone, NC）から購入して、-70℃より低い温度で凍結維持した。
【０２５７】
投与レベルと複製物
試験物質を、用量範囲アッセイ法において、五つの用量レベル（20.0、10.0、5.0、2.5、および1.25 mg/ml）で適当な溶媒（5％デキストロース）および陽性対照と共に3回通り試験した。これは2.0 mg/プレート、1.0 mg/プレート、0.5 mg/プレート、0.25 mg/プレート、および0.125 mg/プレートと同等であった。
【０２５８】
最終的なアッセイ法において、三つの用量レベルを選択した（10.0、10.0、および5.0 mg/ml）。これは2.0 mg/プレート、1.0 mg/プレート、および0.5 mg/プレートと同等であった。陰性および陽性対照を含む全ての処置を、代謝活性化の存在下および非存在下で、試験株TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535、およびWP2-uvrA-に対して3回通り播種した。これらの用量は、広範な試験物質の毒性の誘導および適用した用量の最大化に基づいて選択した。用量範囲アッセイ法の過程において試験物質を処置したプレートのバックグラウンドの芝状細菌において干渉性の低減を認めず、これらのプレートにおいて自然発生変異の数の顕著な低減も認めなかった。いずれのエンドポイントも、本アッセイ法において毒性の指標として役立つ。
【０２５９】
対照物質
対照物質を調製して、表12に記述するように変異原性アッセイ法において用いた。
【０２６０】
（表１２）
2008508311.tif 000219
【０２６１】
陰性（賦形剤）対照
試験株を、対応する最大濃度（0.1 ml）でS9の存在下および非存在下で無処置デキストロース溶液と共に播種した。これらのプレートは陰性対照として役立ち、バックグラウンドの芝状細菌および復帰変異体コロニー形成に関する情報を提供した。
【０２６２】
用量範囲アッセイ法
初回用量範囲アッセイ法は、最高濃度2.0 mg/プレートで開始した。試験したより低い四つの用量を1：2倍連続希釈した。如何なる用量においても、または代謝活性化の結果として毒性の干渉レベルを認めなかった。株TA100はまた、特徴的な遺伝子型性質の全てが一致した。これは陽性対照に対するその特徴的な感受性を保持して、アンピシリンに対して耐性であり、クリスタルバイオレット、テトラサイクリン、および紫外線照射に対して感受性を示した。この用量範囲試験からの情報に基づいて、最終的なアッセイ法に関して三つの用量（2.0 mg/プレート、1.0 mg/プレート、および0.5 mg/プレート）を選択した。結果を表13に示す。
【０２６３】
（表１３）TA100コロニー数データ（用量範囲）
2008508311.tif 000220
【０２６４】
復帰変異アッセイ法
S9の存在下および非存在下でそれぞれの異なる細菌株は、その自身の同時陽性および賦形剤対照によって異なる実験と見なされた。プレートは全て、自動コロニーカウンターによって採点し、データの印刷を行った。陽性対照は、直接作用型の変異誘発物質および代謝的変換を必要とする変異誘発物質からなった。復帰変異率の二倍またはそれよる大きい増加を、適当な陽性対照と共に全ての株に関して観察した。それぞれの株に関する陰性対照物質の復帰変異率は、従来からの実験データからの予想範囲内であったか、またはわずかに低かった。したがって、本アッセイ法は有効なアッセイ法に関する基準を満たした。
【０２６５】
如何なる株に関しても誘導された陽性結果は、陰性対照値に対してプレートあたりの復帰変異体コロニー数の少なくとも2倍増加によって示される。試験物質は、如何なる株の復帰変異体コロニーにおいてもこのタイプの増加を引き起こさなかった。一般的に、バックグラウンドの芝状細菌の低減によって認められるように、最高用量は、中等度の毒性レベルを引き起こした。
【０２６６】
試験株の遺伝子型特徴付け
各試験株を、株が、変異誘発活性に対してそれらを感受性にする特徴を確実に維持するように、遺伝子型マーカーおよび許容される自発的復帰変異率に関して確認した。株は、TA102を例外として全て、クリスタルバイオレット（rfa壁変異による）およびテトラサイクリン（pAQ1プラスミドの非存在による）に対する感受性の許容されるレベルを示した。株TA102は、テトラサイクリンに対して耐性（pAQ1プラスミドの存在により）であることが示され、この遺伝子型試験において適切に成長した（この試験に関して対照として役立つ）。株TA97a、TA100、TA98、TA1535、およびWP2-uvrA-は、紫外線に対する適当な感受性を示した（uvrB/uvrA遺伝子の欠失による）。再度、試験の対照としてTA102を播種したところ。紫外線照射に対する曝露にもかかわらず、適切に成長した。株TA97a、TA98、およびTA100は、アンピシリンに対する適当な耐性（pKM101プラスミドの存在による）を示した。株WP2-uvrA-は、アンピシリンに対する感受性を示した。自然発生復帰変異率は、これまでの施設内データの範囲内であるか、またはわずかに低く、作業保存液が、ヒスチジンに対する特徴的な要求を保持することを提供した。
【０２６７】
実施例64
CHO細胞におけるインビトロ染色体異常アッセイ法
染色体異常アッセイ法は、その可能性がある遺伝子毒性に関して材料をスクリーニングするために用いることができるいくつかのインビトロ試験の一つである。染色体異常は、発癌性に関連している変異である。したがって、染色体異常アッセイ法は、可能性がある変異誘発物質および発癌物質を試験するために適切である（Galloway et al., Environ. Mut.(1985)7:1〜51；Galloway et al., Environ. Mut.(1987)10:1〜175）。この染色体異常アッセイ法は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞において試験物質抽出物が損傷を誘導する可能性を評価した。この試験は、三つの処置器官にわたって、外因性の哺乳動物活性化系（S9）の存在下および非存在下で実施した。
【０２６８】
陰性対照処置調製物は全て、自然発生異常の正常レベルを示したが、陽性対照処置培養は、異常な染色体の劇的な用量依存的増加を示した。三つの最高用量処置レベルにおいて実質的なレベルの細胞障害性が認められた。最高用量レベルを処置した培養物では、試験物質沈殿物が認められた。異常な染色体レベルは、正常な陰性範囲外ではなかった。これらの試験条件に基づき、試験物質は、本試験系において非変異誘発性であると見なされる。
【０２６９】
本アッセイ法は、試験材料が染色体異常誘発性であるか否か、すなわち染色体の切断能を有するか否かを決定するために設計される。染色体異常誘発性は、それが、特定の腫瘍遺伝子（例えば、myc）を活性化して、特定の腫瘍抑制遺伝子（例えば、網膜芽腫を抑制する遺伝子）を不活化することができる、染色体の切断および不適当な再結合を通して起こることから、重要なエンドポイントである。本試験において、哺乳動物のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を試験材料に曝露して、紡錘子毒物を用いて分裂中期で遮断する。処置したCHO細胞の低張性の膨張、固定および染色後に、染色体の可視化を顕微鏡によって行う。染色体切断を誘導することができることが判明した物質は、発癌物質である可能性が高く、遺伝性の染色体欠損を誘導する可能性を有する。
【０２７０】
CHO-K1細胞株（ATCC番号：CCL-61）は、形態上の染色体数が20であり、集団倍加時間が10〜14時間であるプロリン栄養要求体である。この系は、多様な化学物質の染色体異常誘発活性に対して感受性であることが示されている（Preston et al., Mutation Res. (1981)87:143〜188）。CHO細胞を成長させて、10％仔ウシ胎児血清、1％L-グルタミン（2 mM）、ペニシリン（100単位/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を添加したMcCoy's 5A培地において維持した。培養物に緩く蓋をして、37±2℃の湿潤インキュベーターにおいて、5〜7％CO2でインキュベートする。
【０２７１】
試験物質の調製
保存液を50 mg/mlで調製した。低用量は、使用直前にこの保存液から5％デキストロースにおいて希釈することによって調製した。分解の如何なる機会も最小限にするために、試験物質溶液は調製後、投与方法の直前まで氷中で保存した。
【０２７２】
試験法
細胞を、処置の前日に10 mlの新鮮な培地において、約1〜1.5×106個/75 cm2組織培養フラスコで播種した。処置にあたって、浪費された培地を新鮮な増殖培地と交換して、試験物質抽出物、陰性または陽性対照をそれぞれのフラスコに加えた。陽性対照は賦形剤の毒性を最小限にするために容量0.1 mlで投与した。試験物質の希釈液および陰性対照は容量1 mlで投与した。新鮮な培地を加えて総処置容積を10 mlとした。代謝活性化を行う試験の部分に関して、S9活性化混合物を無血清培地に最終濃度1.5％（v/v）となるように加えた。処置は全て2回通り行った。細胞を試験物質抽出物、S9反応混合物（試験の代謝活性化部分のみ）および増殖培地の存在下で37±2℃でインキュベートした。アッセイ法を三つの処置期間に分けた：3時間、S9活性化と共に3時間、および20時間。
【０２７３】
処置期間の後、全てのフラスコを、毒性の肉眼的発現（すなわち、細胞の形態学的変化、または有意な細胞の剥離）に関して顕微鏡によって評価した。フラスコを全て、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって2回洗浄した。10％ウシ胎児血清（FBS）を含む通常の増殖培地を洗浄したばかりの細胞に加えて、フラスコをさらに14.5〜15.5時間インキュベーターに戻した。20時間処置したフラスコは回収する前に洗浄しなかった。顕微鏡評価は回収の直後に行った。回収の2時間前、コルセミド1μgを全てのフラスコに加えて（最終濃度0.1μg/ml）分裂細胞を蓄積させた。
【０２７４】
代謝活性化系
いくつかの化合物は前変異誘発状態のみに存在することから、代謝活性化系を用いることは、試験物質の評価のための重要な局面である。すなわち、それらは外部の代謝源によって作用された後に限って変異誘発性となる。インビトロ試験系は、S9のような外部の系を加えなければ化合物のこの代謝能を欠損する。
【０２７５】
本アッセイ法において用いたインビトロ代謝活性化系は、スプラーグドーリー系ラット肝酵素と、その機能にとって必要なエネルギー産生系（NADPおよびイソクエン酸；中心反応混合物）とを含んだ。酵素は、化学物質をより活性型に変換することができる酵素を誘導するためにアロクロル1254によって処置したラットの肝ミクロソーム（S9画分）の調製物に含まれる。S9は、Moltox（Boone, NC）から購入して、使用するまで-70℃で凍結して保持した。このS9画分は使用直前に解凍して、中心反応混合物に加える。
【０２７６】
投与レベル
試験物質抽出物を六つの用量レベル（培養における最終濃度0.5 ml/ml、0.16 ml/ml、0.05 ml/ml、0.016 ml/ml、0.005 ml/ml、および0.0016 ml/ml）で、適当な賦形剤対照および陽性対照と共に、2回通り試験した。
【０２７７】
細胞の固定
分裂中期細胞を、分裂細胞を振り落とすことによって回収して75 mM KClによって膨張させ、メタノール：氷酢酸（3：1v/v）において固定した。細胞を新しい固定液に浮遊させた後、ガラススライドガラス上にピペットで滴下して空気乾燥させた。スライドガラスに盲検コードのラベルを貼った。各処置フラスコからスライドガラス3枚を調製した。
【０２７８】
細胞の染色および採点
スライドガラスをギムザによって染色して、永続的に封入した。スライドガラスは、異常の頻度が適切であることを確保するために最初に評価される高用量の陽性対照を例外として全て、盲検コード下で読み取った。1用量あたり細胞200個（2回通りのフラスコからそれぞれ100個ずつ）を、それぞれの用量から読み取った。以下の定義に従って、高用量の陽性対照のそれぞれから細胞100個を読み取ってそのように採点した。
【０２７９】
染色分体のタイプ
TG（染色分体のギャップ）：
「Tid Gap」。一つの染色分体における無色の（非染色性の）領域であり、その大きさは染色分体の幅に等しい、またはそれより小さい。これらは全てが真の切断ではない可能性があることから、観察されても、通常、最終的な異常総数には含まれない。
【０２８０】
IG（同位染色分体ギャップ）：
「染色体ギャップ」。ギャップは双方の姉妹染色分体において同じ座に存在する。これらは全てが真の切断ではない可能性があることから、観察されても最終的な異常総数には含まれない。
【０２８１】
TB（染色分体切断）：
染色分体の幅より大きい、一つの染色分体における無色の領域。関連する断片は部分的もしくは完全に置換されている、または欠失している可能性がある。
【０２８２】
ID（染色分体欠失）：
染色分体の中央領域からの染色分体の長さの「切断」、それによって短くなった染色分体または染色分体のギャップの横に小さい断片または環が存在する。
【０２８３】
TR（三射体（Triradial））：
二つの染色体間の交換、それによって腕が三本ある形状が得られる。関連する無動原体断片を有することがある。
【０２８４】
QR（四射体（Quadriradial））：
三射体と同じであるが、それによって腕が四本ある構造が得られる。
【０２８５】
CR（複雑な染色体再配列）：
いくつかの切断および交換の結果である、二つより多い染色体における交換。
【０２８６】
TI（染色分体相互転座）：
一つまたは両方の腕を含む染色体内の交換。
【０２８７】
染色体のタイプ
SB（染色体切断）：
端部欠失。染色体は明らかな切断を有し、位置が移動して、細胞において会合したままであるか、または細胞のどこかに出現する可能性がある、無動原体断片を有する異常な（欠失した）染色体を形成する。
【０２８８】
DM（二重微細断片）：
染色体の中間部欠失。これらは小さい二重の「点」のように見えるか、または対を形成した環である可能性がある。いくつかの場合において、それらは、交換または端部欠失に起因する無動原体断片と区別することができない。
【０２８９】
D（二動原体）：
二つの動原体を有する染色体が起こる、二つの染色体間の交換。これはしばしば、断片を有する二動原体（DF）として分類される無動原体断片に関連する。
【０２９０】
MC（多動原体染色体）：
二つより多い動原体を有する染色体が得られる、染色体における交換。
【０２９１】
R（環）：
動原体を含む円を形成する染色体。これはしばしば無動原体断片に関連し、この場合、これは断片を有する環（RF）として分類される。無動原体環も同様にこの範疇に含まれる。
【０２９２】
Ab（異常な一動原体染色体）：
これは、その形態が核型に関して異常である染色体であり、しばしば転座または挟動原体逆位のような事象の結果である。異常を例えば相互転座に帰することができなければ、この分類を用いる。
【０２９３】
T（転座）：
二つの染色体間での材料の明白な移動であり、それによって二つの異常な染色体が起こる。同定可能である場合、「T」と判定して、「2Ab」とはしない。
【０２９４】
その他
SD（重度損傷細胞）：
任意のタイプの異常を10個またはそれより多く有する細胞。重度損傷細胞は、異常のタイプを同定するために分析しなければならず、例えば三動原体に関連して見いだされる断片のような多数の断片のために、10個またはそれより多くを有してもよい。
【０２９５】
PU（染色体粉砕）：
らせん解体または断片化された染色体。これは、単に染色体凝縮の異なる段階である可能性がある。
【０２９６】
P（+粉砕細胞）：
核全体までに及ぶ複数の染色体が「粉砕」されている。
【０２９７】
PP（多倍体細胞）：
染色体の半数体の多数のコピーを含む細胞。多倍体細胞は、時に正常な骨髄または細胞培養において観察される。これらは記録されるが、最終的な構造異常の総数には含まれない。
【０２９８】
対照物質
刊行された報告において記述されるように、対照物質を調製して、本アッセイ法において用いた。陽性対照：シクロホスファミド−高用量15μg/ml；シクロホスファミド−低用量5μg/ml；マイトマイシンC−高用量1.0μg/ml；およびマイトマイシンC−低用量0.25μg/ml。
【０２９９】
陰性（賦形剤）対照
CHO細胞を、S9活性化の存在下および非存在下で5％デキストロース陰性対照によって処置した。これらの処置は、バックグラウンドの異常な細胞数に関する情報を提供した。
【０３００】
アッセイ法の信頼性の評価
溶媒対照培養の異常総数（％CA）は1〜4％の範囲に入らなければならない。高用量陽性対照は、統計分析によって決定した場合に95％信頼レベル（p＜0.05）で異常数の統計学的に有意な増加を生じなければならない
【０３０１】
統計分析およびデータ表示
分散分析（ANOVA）を用いて、陽性と陰性対照群、または試験物質と陰性対照群とのあいだの有意差を同定した。得られたp値が0.05より小さい場合、差は有意であると見なされた。見いだされた異常のタイプ、異常の発生率、および異常を有する細胞の百分率を表14に表す。歴史的な対照値を表15に表す。染色分体および同位染色分体ギャップは観察されたが、それらは真の切断を表していない可能性があることから、異常の評価の総数に含めなかった。
【０３０２】
自然発生異常率（バックグラウンド）を決定するために、陰性対照を本アッセイ法において分析した。自然発生異常が過剰に高い比率に達する場合、本アッセイ法は感度を失う。表14に示されるように、陰性対照における自然発生異常率は、正常範囲（5％デキストロースで3時間：3.0％、5％デキストロースで3時間＋S9：3.0％、5％デキストロースで20時間：3.0％）内である。
【０３０３】
高用量陽性対照用量は、39％より大きいまたはそれに等しい異常率を誘導し；低用量は全て少なくとも20％の異常率を誘導した。数値の増加および明白な用量反応（表14および16）は、陰性対照と比較した場合に全ての期間において統計学的に有意差によって支持される。陽性対照処置調製物において観察されたこれらの強い増加は、アッセイ法がその特徴的感度を保持したことを示している。バリデーション基準を、陽性対照および陰性対照の結果と共に考慮した場合、本アッセイ法は有効であると決定された。
【０３０４】
（表１４）
2008508311.tif 000221
％CA＝（ギャップを除く異常を有する細胞総数／採点された伸展染色体総数）*100
FI＝試験群を同時の陰性対照群と比較した増加倍率
NA＝有効なデータが得られなかった
*全体で伸展染色体6個が、この群に関して見いだされ、採点された。細胞一つが実際に損傷の証拠を示した。しかし、標本の大きさが極めて小さいことにより、損傷の推定を正確に行うことができない。
【０３０５】
（表１５）歴史的な異常発生率
2008508311.tif 000222
*2001〜2002年の試験からプールしたデータ
【０３０６】
試験物質のデータ
見いだされた異常のタイプと共に、異常の発生率および異常を有する細胞の百分率を表14に要約する。染色分体および同位染色分体ギャップが認められたが、それらは真の切断ではない可能性があることから、異常の評価の総数に含めなかった。核内倍加および多倍体は正常なバックグラウンドレベルで起こった。
【０３０７】
本アッセイ法において試験物質誘発毒性の程度を決定するために、いくつかのエンドポイントが存在する。本アッセイ法において、処置直後に、培養物を顕微鏡によって肉眼的な形態の変化の証拠に関して評価した。全ての場合において、0.5 mg/ml用量は単層を混濁させるかなりのレベルの沈殿物を誘導した。3時間の処置のあいだ、用量0.16 mg/ml、0.05 mg/ml、および0.016 mg/mlは、中等度から重度のレベルの細胞障害性を示した。低い〜バックグラウンドレベルの毒性が0.005 mg/mlおよび0.0016 mg/ml処置において認められた。20時間の処置のあいだに、細胞障害性はより顕著であった。0.16 mg/ml用量は非常に細胞障害性であった。軽度のレベルの細胞障害性は0.005 mg/ml用量まで認められなかった。細胞障害性および可能性がある細胞周期遅延のさらなるマーカーとして、採点した各スライドガラスに関して分裂指数を計算した（表16）。
【０３０８】
（表１６）平均分裂指数
2008508311.tif 000223
【０３０９】
高レベルの細胞障害性により、分裂中期伸展染色体は、三つの高用量では使用できなかった。0.016 mg/ml用量では、分裂中期を認めたが採点するために十分な質ではなかった。伸展染色体は密に密集して、染色体は実質的に伸長していなかった。0.005 用量および0.016 用量では、十分な品質の分裂中期伸展染色体が認められ、採点された。陰性対照と比較すると、これらの試験物質処置群はいずれも、異常の発生率において有意な増加を示さない。実際に、異常の発生率は、正常な陰性の範囲内であった。異常の発生率において関連する用量反応傾向を認めなかった。
【０３１０】
分析および結論
染色体異常アッセイ法は、S9外因性哺乳動物活性化の存在下および非存在下で、CHO-K1細胞株において試験物質の染色体異常誘導能を評価する。損傷によって腫瘍抑制遺伝子の不活化または腫瘍遺伝子の活性化が起こりうることから、異常の誘導は、発癌性と連結している。いくつかの化合物は前変異誘発物質として存在して、変異誘発物質となるには完全または部分的に代謝されなければならないことから、代謝活性化系を用いることは、試験物質の評価に対する重要な成分である。S9代謝活性化系は、体の代謝系を模倣すると意図される。
【０３１１】
試験物質の変異誘発能を十分に評価するために、三つの処置期間を用いた。より短い3時間の処置を代謝活性化の存在下および非存在下で行った。反応の遅れまたはより遅い変異誘発メカニズムのために、長期間の処置後に、試験物質が変異誘発物質であるか否かを決定するために、20時間の処置も同様に評価した。代謝活性化系は、細胞と長期間接触させると毒性となるため、細胞は、20時間の処置では代謝活性化の非存在下に限って処置した。さらに、試験物質によって引き起こされた如何なる細胞周期の遅れも考慮するために、および罹患細胞を分裂中期に到達させるために、細胞に長期間の発現期間（約15細胞周期、OECD 1995）を与えた。
【０３１２】
陰性対照は全て正常なパラメータで異常発生率を示し、高用量陽性対照は全て異常発生率の統計学的有意な増加を誘導したことから、本アッセイ法は、有効なアッセイ法としての基準を満たした。統計分析は、陰性対照と比較して試験物質希釈液によって処置した細胞における異常な発生率の有意な増加を示さなかった。試験物質処置調製物において異常の有意な増加がなかったことは、この試験系においてCX-3543が変異誘発性ではないことを示している。
【０３１３】
実施例65
イヌにおいて静脈内投与したCX-3543の亜急性試験
本試験は、ビーグル犬に1日1回、5日間連続して静脈内投与した三つの用量レベルでのCX-3543の安全性および認容性を決定する。安全性パラメーターを観察、臨床病理学、および顕微鏡組織病理学評価を通してモニターした。選択された動物にはまた、薬物動態／毒性動態評価のために血液試料の採取を行った。動物は全て、心リズムおよび／または伝導異常を検出するために、ECG評価によっても評価した。
【０３１４】
実験の設計
表17は、試験設計を要約する。試験は試験物質群3群および対照物質群1群を用いて実施した。対照物質は、投与前に試験物質を希釈するために用いた溶液（5％デキストロース水溶液）であり、これを高用量と同じ容量で投与した。本試験に関する試験物質の用量レベルは、約12 mg/kg、3.8 mg/kg、および1.2 mg/kgであった。試験物質および対照物質は約1時間の期間での静脈内注入（IV）による1回投与を5日間連続行った。試験物質の血中レベル分析のための血液試料は、以下のように採取した（すなわち、pk/tk試料採取）。低用量群の雄性のイヌ3匹および雌性のイヌ3匹から、血液約1 mlを注入開始から約20分目および40分目に採取した後、注入終了時（0時間）および5分目、10分目、15分目、および30分目に、ならびに初回および5回目の投与後の注入終了時から1時間目、2時間目、4時間目、8時間目、12時間目、および24時間目に採取した。同様に、全ての動物に関して投与1の直前および直後、ならびに投与5の後に、および回復した動物に関しては剖検の前に、リードII形状において約5〜10秒間のECGトレーシングを得た。動物を最後の投与後1日目または15日目に終了した。血液学および臨床化学分析のための血液を、投与前および終了時に安楽死前に採取した。安楽死後、顕微鏡評価のために主要な臓器の収集を含めるために、剖検を行った。
【０３１５】
（表１７）
2008508311.tif 000224
*約1時間の注入として送達する。
【０３１６】
試験法
動物を以下のような群に規則正しく割付した。その性別内で最も体重の重いイヌを1群に割付して、その性別の次に体重の重いイヌを2群に割付して、次に重いイヌを3群、次に重いイヌを4群に割付した後、2群、3群、4群および1群の順で継続し、次に3群、4群、1群、および2群の順で継続し、各群が動物の全数に達するまでこのパターンを継続した。試験および対照物質を各投与時に、腕頭静脈または伏在静脈への約1時間の静脈内注入として投与した。
【０３１７】
動物の体重を、投与前および剖検前に毎日測定した。動物は全て、投与直前および投与1時間後に、薬理活性、行動の変化、および毒性の徴候に関して観察した。回復した動物も同様に回復期間のあいだ、1日1回観察した。全ての動物に関して投与1と投与5の前および直後に、ならびに回復した動物に関しては剖検の前に、リードII形状において約5秒間のECGトレーシングを得た。これらのトレーシングは、QRS複合体およびT波のリズムおよび振幅の変化を解釈するためのデータを提供するために、およびトレーシングあたりの多数のセグメントにおけるQT時間（約5〜10）を測定するために用いた。
【０３１８】
血液の採取
PK/TK：
試験物質血液レベルの分析のための血液試料を採取した。低用量群の雄性のイヌ3匹および雌性のイヌ3匹から、血液約1 mlを注入開始から約20分および40分目に採取した後、注入終了時（0時間）および5、10、15、および30分、ならびに初回および5回目の投与後の注入終了時から1、2、4、8、12、および24時間目に採取した。血漿（ヘパリンリチウム抗凝固剤）試料を調製して、分析した。
【０３１９】
臨床病理学：
終夜絶食して初回投与前に（ベースライン；全ての動物）および各剖検前に、血液試料を血液学および臨床化学のために採取する。血液学アッセイ法に関して、ベースラインおよび剖検前（絶食）に採取した血液を赤血球数、ヘマトクリット、MCH、白血球数、白血球百分率、差示的WC、MCHC、ヘモグロビン、MCV、血小板数、PT、およびAPTTに関して分析する。臨床化学アッセイ法の場合、ベースラインおよび剖検前（絶食）時に採取した血液を以下に関して試験する：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASP）、グロブリンおよびA/G比、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、ナトリウム、アルカリホスファターゼ、カリウム、γグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、塩素、グルコース、カルシウム、血中尿素窒素（BUN）、総ビリルビン、クレアチニン、無機燐、総タンパク質、コレステロール、アルブミン、およびトリグリセリド。
【０３２０】
終了：
主たる処置および回復群の動物を、そのそれぞれの剖検時に麻酔下での瀉血によって安楽死させた。
【０３２１】
剖検
血液試料の採取後、主たる処置および回復群の動物をそれぞれの終了時に屠殺して剖検した。主要な臓器を採取して、重量を測定し、顕微鏡評価のために保存した。剖検には頭蓋、胸腔、腹腔、および骨盤腔、その内臓、組織、器官、および胴体の検査が含まれた。
【０３２２】
血液試料の採取後、主たる処置および回復群の動物をそれぞれの終了時に屠殺して剖検する。主要な臓器を採取して、重量を測定し、顕微鏡評価のために保存する。剖検には頭蓋、胸腔、腹腔、および骨盤腔、その内臓、組織、器官、および胴体の検査が含まれた。
【０３２３】
主たる処置および回復群の動物から、以下の組織を採取して、重量を測定した：脳、胸腺、肝臓、腎臓（2個）、副腎（2個）、脾臓、および性腺（2個）。主たる処置および回復群の動物に関して、以下の組織を10％中性緩衝ホルマリンにおいて固定した（ヴアン固定液を用いた精巣を除く）：全ての肉眼的病変、注射部位静脈、胸腺、脳、下大静脈、膵臓、腎臓、脾臓、リンパノート（note）−腸間膜、リンパ節−前肩甲部、肝臓、性腺、肺、心臓、および副腎。最初に、対照群および高用量動物のみからの組織を評価した。他の処置群からの標的組織も同様に、知見をさらに調べるために評価した。
【０３２４】
統計学的方法
臨床化学および血液学の値ならびに臓器および体重のデータの統計分析を行って、試験群を対照群と比較する。データのために用いた統計学的方法は、適当に選択される。パラメトリックデータは、一元配置分散分析を用いて分析し、非パラメトリックデータはクルスカイ（kurskai）-ウォリス検定を用いて分析する。対応のあるt-検定も同様に用いて、各動物のベースラインおよび処置後の臨床化学および血液学の値を比較する。0.05またはそれより小さい確率（p）値は、全ての統計学的検定に関して有意であると見なされると考えられる。
【０３２５】
結果
表18は、1.2 mg/kg CX-3543を1日1回5日間静脈内投与後のイヌにおけるCX-3543薬物動態パラメータの要約を提供する。図12は、1.2 mg/kg CX-3543を1日1回5日間静脈内投与後のイヌにおけるCX-3543血漿濃度を記述した。投与1のCX-3543を静脈内投与した後、最高血漿濃度は一般的に1時間注入の終了時またはその付近で得られた。注入後、血漿濃度は多指数的に低下して、平均終末半減期は雄性および雌性のイヌに関してそれぞれ、3.2時間および3.8時間であった。投与1の平均Cmax値は、雄性および雌性に関してそれぞれ、108.3 ng/mlおよび138.9 ng/mlであった。投与1の平均AUC（0〜24）およびAUC（0〜無限大）値は、雄性のイヌにおいて313.6 ng・h/mlおよび316.9 ng・h/mlならびに雌性のイヌにおいて381.4 ng・h/mlおよび386.3 ng・h/mlであった。
【０３２６】
CX-3543を1日1回5日間投与後、雄性および雌性においてそれぞれ、平均Cmax値は126.4 ng/mlおよび145.1 ng/mlで最小の蓄積を認めた。投与5の平均AUC（0〜24）値は362.9 ng・h/mlおよび443.7 ng・h/mlであった。AUC（0〜24）に関する投与5対投与1の比は雄性および雌性に関してそれぞれ、1.2および1.1であった。投与5に関する雄性および雌性の平均終末半減期はいずれも5.2時間であった。
【０３２７】
5日間の処置のあいだに、死亡は認められず、雄性および雌性のイヌはその体重にわずかな変動を示したに過ぎなかった。雄性および雌性のイヌの臨床所見は用量依存的であり、投与期間中、投与直後、および投与1時間後に主に認められた。主な知見は、膨疹、顔面の腫脹、不安または興奮、嗜眠、および既に投与された腕頭／伏在領域での腫脹／紅斑であり、高用量群に限って時に嘔吐および頻呼吸が認められた。唯一の注目すべき剖検時の知見は、注射部位またはその近傍での血管および血管周囲病変に関連した知見に限定され、これは回復動物において消散しているように思われた。投与1および5の前後でのECGモニタリングには異常は検出されなかった。処置群を対照と比較した場合に、臨床病理学的パラメータにおける毒性学的に有意な変化は観察されなかったが、例外は、高用量群における上昇した白血球数であり、これはおそらく局所炎症反応に関連した。ベースラインでの血液学および臨床化学パラメータと処置後の結果との対応のある比較から、毒性学的に関連する知見は明らかにされなかった。
【０３２８】
組織の組織学的評価は、試験物質が用量依存的な（すなわち高用量では中等度および低用量群より顕著である）局所炎症を引き起こし、注射部位での壊死および出血、ならびに排液リンパ節における関連する炎症反応を引き起こすことを示した。これらの変化は全て、回復した動物では消散していることが認められた。脾臓および胸腺におけるリンパ球の軽度の減少は高用量群において明白であったが、中等度の用量の動物の脾臓および胸腺を対照群と比較しても差は明白ではなかった。
【０３２９】
本試験の条件において、静脈内1時間注入としてそれぞれ投与したCX-3543（ロット番号12591）の12 mg/kg、3.8 mg/kg、または1.2 mg/kgでの5日間連続投与は、一過性の用量依存的な血管および血管周囲炎症、ならびに注射部位の壊死を除き、毒性学的に良好に認容されるように思われた。投与の際、投与直後および投与1時間後に主に認められた他の用量依存的な臨床知見には、膨疹、顔面の腫脹、不安または興奮、嗜眠、および先に投与した腕頭／伏在領域での腫脹／紅斑が含まれ、高用量群に限って時に嘔吐および頻呼吸が認められた。
【０３３０】
（表１８）1.2 mg/kg CX-3543を1日1回5日間静脈内投与した後のイヌにおけるCX-3543薬物動態パラメータ
2008508311.tif 000225
a  中央値および範囲として表記する。
b  ジャックナイフ分散に基づく調和平均および偽SDとして表記する。
【０３３１】
実施例66
ラットにおける静脈内投与したCX-3543の亜急性試験
本試験は、ラットに三つの用量レベルで1日1回5日間毎日静脈内投与したCX-3543の安全性および認容性を決定する。安全性パラメーターを、観察、臨床病理学、および顕微鏡による組織病理学評価によってモニターする。選択した動物はまた、薬物動態／毒性動態評価のための血液試料採取を受けると考えられる。
【０３３２】
実験法
表19は試験設計を要約する。試験は試験物質群3群および対照物質群1群を用いて実施した。高用量および低用量試験物質群ならびに対照群はそれぞれ動物28匹からなり、これを用いて認容性を評価した。中等度の試験物質群は、動物64匹からなり、そのうち動物28匹を認容性の評価のために用い、動物36匹を試験のPK/TK部分における初回および5回目の投与後の様々な時点で血液中の試験物質のレベルを決定するために用いた。対照物質は、投与前に試験物質を希釈するために用いた溶液（5％デキストロース水溶液；D5W）であり、これを高用量試験物質群と同じ容量で投与した。本試験に関する試験物質の用量レベルは、24 mg/kg、7.6 mg/kg、および2.4 mg/kgであった。試験および対照物質は、尾静脈への1分間の静脈内注射（IV）によって連続5日間投与した。
【０３３３】
試験物質血中レベル分析のための血液試料を以下のように採取した。投与前および注射終了時（0時間）、ならびに1回目および5回目の投与後注射終了から約0.08時間目、0.25時間目、0.5時間目、1時間目、2時間目、4時間目、8時間目、12時間目、および24時間目でのそれぞれの試料採取時点で、血液約0.3〜0.5 mlを麻酔下で雄性ラット3匹および雌性ラット3匹から採取した。認容性を評価するために用いた動物は、最後の投与の1日後（主たる処置群）または15日後（回復群）に終了した。認容性試験動物の終了時、血液学および臨床化学分析のための血液を安楽死の前後に採取した。顕微鏡評価のために主要な臓器の回収を含めるために、剖検を行った。試験物質のレベルを決定するために限ってpk/tk血液採取のために用いた動物は、如何なるさらなる試料採取または観察も行わずに、最終的な血液試料を採取した後に安楽死させた。
【０３３４】
（表１９）
2008508311.tif 000226
a  約1時間の注入として送達
【０３３５】
試験法
試験および対照物質を、毎回の投与時に尾静脈への約1分間の静脈内注入として投与した。動物を投与前および剖検前に毎日体重を測定した。動物は全て、投与直後および1時間後に、薬理活性、行動の変化、および毒性の徴候に関して観察した。回復動物も同様に回復期間のあいだ毎日観察した。
【０３３６】
血液の採取
PK/TK：
試験物質血中レベル分析のための血液試料を採取した。雄性18匹および雌性18匹の中等度用量動物を用いて、投与前および注射終了時（0時間）、ならびに初回および5回目の投与後の注射終了時から約0.08時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、および24時間でのそれぞれの試料採取時点で、麻酔下で雄性ラット3匹および雌性ラット3匹から、血液約0.3〜0.5 mlを採取した。血液試料を、動物の最終試料のために後眼窩出血または心穿刺出血によって採取した。血漿（ヘパリンリチウム抗凝固剤）試料を調製して分析した。化学的病理学、剖検、および組織病理学、ならびに例えば実施例65に記述される統計学的方法に関する一般的な方法を行った。
【０３３７】
用量の投与
対照動物に約6 ml/kg D5Wを投与した。高用量、中等度、および低用量試験物質群に約24 mg/kg、7.6 mg/kg、および2.4 mg/kgの用量をそれぞれ投与した。対照または試験物質を5日間連続して首尾よく投与した群あたり雄性14匹および雌性14匹を得るために、性別毎の試験群あたりに投与した動物総数は、対照：雄性14匹および雌性14匹、高用量：雄性44匹および雌性34匹、中等度用量：雄性17匹および雌性16匹、低用量：雄性16匹および雌性15匹であった。
【０３３８】
結果
表20は、CX-3543を1日1回5日間静脈内投与した後のラットにおけるCX-3543薬物動態パラメーターの要約を提供する。図13は、CX-3543を1日1回5日間静脈内投与後のラットにおけるCX-3543血漿濃度を記述する。投与1のCX-3543の静脈内投与後、血漿濃度は、多重指数的に低下して、終末半減期は雄性および雌性ラットにおいてそれぞれ、6.8時間および6.6時間であった。投与1のCmax値は雄性および雌性に関してそれぞれ、513.8 ng/mlおよび598.2 ng/mlであった。投与1のAUC（0〜24）およびAUC（0〜無限大）値は、雄性において778.7 ng・h/mlおよび833.3 ng・h/ml、ならびに雌性において784.3お ng・h/mlよび860.8 ng・h/mlであった。
【０３３９】
CX-3543を1日1回5日間毎日投与した後、中等度の蓄積が認められ、Cmax値は雄性および雌性においてそれぞれ、485.3 ng/mlおよび1050.0 ng/mlであった。対応する投与5のAUC（0〜24）値は、1008.6 ng・h/mlおよび1204.1 ng・h/mlであった。AUC（0〜24）に関する投与5対投与1の比は、雄性および雌性に関してそれぞれ、1.3および1.5であった。投与5における雄性および雌性に関する終末半減期はそれぞれ、8.8時間および4.8時間であった。
【０３４０】
対照動物は全て、試験期間中正常であるように思われた。処置の5日間にわたって、約5％の死亡率が高用量動物において起こり、これらの動物は最初の投与を受けた数分以内に死亡した。雄性および雌性に関する臨床知見は用量依存的であり、主に高用量動物においてであった。高用量群のほとんどの動物が、初回投与の直後に以下の知見の一つまたは複数を示した：唾液分泌、呼吸困難、頭振、速い呼吸、不安定歩行、後足で立ち上がる、攣縮、咀嚼、嗜眠、背を丸めた姿勢、立毛、赤い鼻、または眼の周囲の赤い物質。高用量動物におけるこれらの知見は毎回の投与後1時間以内にほとんどが消散して、その後の用量の投与によって発生率および重症度は減少した。しかし、重度の尾の刺激がほぼ全ての高用量動物において認められ、これによって約60〜70％の自然減（すなわち、計画に従って5回投与の残りの投与を継続することができない）が起こった。中等度の用量群における知見は、雌性動物1匹における重い呼吸、眼の周囲の赤い物質（動物の40％）、雄性動物5匹における立毛、および尾の知見（動物の約50％）に主に限定された。低用量群の動物に関する知見は、時折の立毛（雄性動物4匹）、眼の周囲の赤い物質（動物の約30％）、および尾の知見（動物の約30％）に限定された。
【０３４１】
全体として、試験物質を処置した動物における体重の変化は最小であったが、高用量動物において主に認められ、血液学または臨床化学における毒性学的に関連する変化は認められなかった。剖検の知見は、主に高用量群からであり、肺、腸骨リンパ節、頭蓋内容物、および尾における知見が含まれた。組織病理学的知見には以下が含まれた：1）中等度および高用量での、局所炎症、壊死、血管壊死、血栓症、浮腫、および注射部位での出血、2）高用量での排液リンパ節における炎症および壊死、3）高用量での肺における組織球性炎症（組織球性肺炎）、および4）高用量での胸腺におけるリンパ球の減少。
【０３４２】
試験の条件下で、CX-3543を24 mg/kg、7.6 mg/kg、または2.4 mg/kgで1時間の静脈内注射によって5日間毎日投与することは、中等度および低用量レベル（すなわちそれぞれ、7.6 mg/kgおよび2.4 mg/kg）で毒性学的に十分に認容されるように思われた。高用量動物において、重度の尾の刺激、ならびに主に尾静脈、肺、排液リンパノート、および胸腺における組織病理学的変化と共に低い死亡発生率が認められた。
【０３４３】
（表２０）CX-3543の5日間毎日静脈内投与後のラットにおけるCX-3543薬物動態パラメータ
2008508311.tif 000227
【０３４４】
実施例67
リン酸化および総p53に及ぼすCX-3543の効果
図14Aおよび14Bは、リン酸化および総p53に及ぼすCX-3543（2〜5μM）の効果を示す。アポトーシス細胞死の公知の調節物質であるタンパク質p53およびリン酸化p53の集団は、1〜5μM CX-3543の用量範囲を用いてHCT-116細胞の24時間の処置によって増強されることが示される。
【０３４５】
本アッセイ法のプロトコールは、以下のように記述される。1日目、細胞を2×106個/10 cm培養皿／10 ml培地で播種する。2日目、細胞を以下のように処置する：対照＝0.05％DMSO（DMSO保存液5μl／培地10 ml）；1μM CX3543（保存液（10 mM）1μl／培地10 ml）；2μM CX3543（保存液（10 mM）2μl／培地10 ml）；3μM CX3543（保存液（10 mM）3μl／培地10 ml）；4μM CX3543（保存液（10 mM）4μl／培地10 ml）；および5μM CX3543（保存液（10 mM）5μl／培地10 ml）。
【０３４６】
3日目に、細胞を回収して、接着および浮遊細胞を回収した。細胞をPBSによって2回洗浄して、計数し4×106個/試料で回収した。細胞の沈降物を、さらに使用するまで-80℃で凍結した。同じ日または4日目に、細胞抽出緩衝液（細胞抽出緩衝液3 ml、プロテアーゼ阻害剤300μlおよび0.3 M PMSF 10μl）を用いて抽出した。それぞれの試料に緩衝液200μlを加え、溶液をボルテックスミキサーによって攪拌して氷中に30分入れ、その後10分ごとにボルテックスミキサーによって攪拌した。次に、溶液を13,000 rpmで10分間遠心して、試験管あたり上清100μlをとり、-80℃で保存した。
【０３４７】
アッセイ法の調製（5日目）
各8ウェル列に関して、100×濃縮液10μlをHRP希釈液1 mlによって希釈することによって抗ウサギIgG HRP溶液を調製した。蒸留水を用いて当初のバイアル（×25）を希釈して、1×溶液を作製することによって洗浄緩衝液を調製した。p53標準物質溶液またはp53総溶液の希釈液を表21に記述するように調製した。完全な溶解を得るために、標準物質1を軽く攪拌して、室温で10分間放置した。
【０３４８】
（表２１）
2008508311.tif 000228
【０３４９】
試験法
全ての溶液をRTに到達させて、使用前に軽く攪拌する。8ウェル列を採取して挿入する。標準物質希釈緩衝液100μlを標準的な8ウェルに加える（0 ng/ml/ウェルまたは0単位/ウェル）。色素原のブランクウェルには何も加えない。標準物質または希釈試料100μlを適当なマイクロタイターウェルに加える。一般的に、試料は標準希釈緩衝液によって少なくとも1：10またはそれより多く希釈すべきである。各試料は2回通り行う。プレートの側面を軽くたたいて十分に混合する。プレートカバーでプレートを覆い、RTで2時間または4℃で一晩インキュベートする。ウェルを作業洗浄緩衝液400μlによって4回洗浄する。15〜30秒間すすいだ後、液体を吸引する。洗浄後、プレートを上下逆さにして、吸光度用ティッシュ上で水分を吸わせて乾燥させる。抗p53[pS15]または抗p53（総）（検出抗体）100μlを、色素原ブランクを除く各ウェルに加える。軽くたたいて混合させ、プレートの蓋をしてRTで1時間インキュベートする。溶液をウェルから十分に吸引する。
【０３５０】
ウェルを作業洗浄緩衝液400μlによって4回洗浄する。15〜30秒間すすいだ後、液体を吸引する。洗浄後、プレートを上下逆さにして、吸光度用ティッシュ上で軽くたたく。色素原ブランクを除く各ウェルに、抗ウサギIgG HRP作業溶液100μlを加える。プレートの蓋をしてRTで30分間インキュベートする。ウェルを作業洗浄緩衝液400μlによって4回洗浄する。15〜30秒間すすいだ後、液体を吸引する。洗浄後、プレートを上下逆さにして、吸光度用ティッシュ上で水分を吸わせて乾燥させる。TMB（安定化色素原基質）100 μlを各ウェルに加えて、RTの暗所で30分間インキュベートする。色は青色に変化する。停止溶液100μlを加える。プレートを軽くたたいて混合する。色は黄色に変化するはずである。色素原ブランク（＝TMB 100μl＋停止溶液100 μl）をブランクとして設定することによってプレートをA450 nmで読み取る。アッセイ終了の2時間以内に吸光度を読み取る。
【０３５１】
実施例68
カスパーゼ-3/7アッセイプロトコール
図15は、HCT-116におけるカスパーゼ-3活性化に及ぼすCX-3543の効果を示す。用量範囲1μM、3μM、および5μMのCX-3543を用いて、HCT-116細胞を24時間処置すると、カスパーゼ-3レベルに用量反応性の増加を生じる。カスパーゼ-3は、アポトーシス誘導における主要なエフェクターカスパーゼであり、このデータは、アポトーシスの誘導と一貫している。
【０３５２】
以下のプロトコールに従った（24時間）。1日目、HCT-116細胞0.015×106個/50μl/ウェルを播種する。37℃CO2インキュベーターにおいてインキュベートする。2日目、培地25μlをウェルから採取する。HCT-116細胞を1μM、3μM、5μM CX-3543によって処置する。陽性対照群を0.01μM、0.1μM、1μMスタウロスポリンによって処置する。陰性対照の6ウェルを培地のみによって処置する（希釈した試料25μlを適当なウェルに加える）。CO2インキュベーターにおいて37℃で24時間インキュベートする。3日目、Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7アッセイ試薬（Promega）を試薬10μl／緩衝液1 mlで調製する。希釈した試薬50μlを加える。室温で1時間インキュベートする。485/520で蛍光を測定する。
【０３５３】
実施例68
アネキシンV-Alexa 488染色プロトコール
アポトーシス反応の広く用いられているマーカーであるアネキシンVのエクスターナリゼーションを用いて、本試験は、CX-3543のアポトーシス誘導能を証明する。HCT-116細胞を2μMおよび4μM CX-3543によって24時間処置すると、アネキシンVエクスターナリゼーションに関して陽性の色素による染色の有意な増加を生じる（X軸）。カンプトテシン（CPT）をアネキシンV実験の対照として用いた。0.5μM CPTでは、混合アポトーシス／壊死反応が認められた（アネキシンVに対して特異的な色素−x軸；二本鎖DNA結合に特異的な色素−y軸）。
【０３５４】
本実施例に関して以下のプロトコールに従う。HCT-116細胞1.5〜2.0×106個／10 cm培養皿／培地10 mlを播種する。CO2インキュベーターにおいて37℃で24時間または24時間までインキュベートする。翌日、細胞を1μM、2μM、3μM、4μM、および5μM CX-3543によって処置する。無処置プレート1枚または2枚（培地のみ）を対照プレートとして維持する。以下の対照を用いる：無処置試料（Alexa、またはヨウ化プロピジウムなし）、ヨウ化プロピジウムまたはAlexa 488のみによって処置した対照、ならびにAlexa488およびヨウ化プロピジウムの双方によって処置した対照。細胞を採取する（接着細胞のみならず浮遊細胞を採取する）。細胞を冷PBSによって2回洗浄する。細胞を1×アネキシン結合緩衝液に浮遊させる。
【０３５５】
細胞を計数して1×アネキシン結合緩衝液において〜1×106個/0.1 mlとなるように希釈して、アッセイあたり100μlを有するように十分な容量を調整する。アネキシンV結合物5μlを細胞浮遊液各100μlに加える。ヨウ化プロピジウム溶液（保存液＝1 mg/ml）4μlを細胞浮遊液各100μlに加える。試料をRTで15分間インキュベートする。アネキシン結合緩衝液400μlを加えて、軽く混合して試料を氷中で維持する。染色した細胞をフローサイトメトリーによって直ちに分析する。
【０３５６】
実施例69
DNA細胞周期分析プロトコール
図16は、DNA細胞周期分析に従って24時間後の細胞周期に及ぼすCX-3543の効果を示す。HCT-116細胞（最初に、細胞周期内で細胞を同期させるために血清を枯渇する）を1〜5μm CX-3543によって24時間処置しても、細胞周期を通しての細胞の分布に観察可能な効果を有しなかった。
【０３５７】
本実施例において以下のプロトコールに従った。細胞1.5〜2.0×106個/10 cm培養皿を播種する（非染色細胞のために余分にさらに1枚播種する）。細胞を37℃の湿潤5％CO2インキュベーターにおいて24時間インキュベートする。細胞を休止期にするために低成長状態で細胞を同期させるために、培地を除去して無血清培地において1回すすぎ、無血清培地10mlを各培養皿に加える。細胞を37℃の湿潤5％CO2インキュベーターにおいて24時間インキュベートする。培地を除去して処置（血清を含む培地において希釈する、10 ml）を加える。1〜5μM CX-3543＋対照。細胞を37℃の湿潤5％CO2インキュベーターにおいて24時間インキュベートする。
【０３５８】
細胞をトリプシン処理／単離するために、トリプシン／EDTA溶液3 mlを加える。浮遊細胞を維持して接着細胞と合わせる。37℃の湿潤5％CO2インキュベーターにおいて5分間インキュベートする。培地（FBSを含む）3 mlをウェルに加えて、遠心管にピペットで移す。1000 rpmで5分間遠心する。上清をデカントして捨て、沈殿物をPBS 2〜3 mlに浮遊させる。細胞を計数して2×106個／試験管に入れることによって1回洗浄し、PBS 2 mlを加えて1000 rpmで5分間遠心する。沈降した細胞を冷PBS 0.3 mlに浮遊させる。
【０３５９】
細胞を固定するために、氷冷70％エタノール0.7 mlを、PBSにおける細胞浮遊液0.3 mlを含む試験管に滴下してボルテックスミキサーによって攪拌しながらゆっくり加える。氷中で1時間（または4℃で数日まで）放置する。1000 rpmで5分間遠心する。冷PBS（1〜2 ml）によって1回洗浄する。1000 rpmで5分間遠心する。細胞沈降物を冷PBS 0.25 mlに浮遊させて、10 mg/ml RNアーゼA（最終濃度は0.2〜0.5 mg/ml）5μlを加える。37℃で1時間インキュベートする。1 mg/mlヨウ化プロピジウムの脱イオン水溶液10μlを加えて（最終濃度は10μl/ml）、分析するまで4℃の暗所で維持する。488 nmでのサイトメーター上で読み取ることによってFACSにおいて分析する。細胞は、分析当日にヨウ化プロピジウムによって染色してもよい。
【０３６０】
実施例70
本実施例は、対応するエステルとアミンおよび塩化アルミニウムとの反応から置換ベンゾキサジン類似体を調製する方法を記述する。
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【０３６１】
2,3,4,5-テトラフルオロ安息香酸（100 g、510 mmol）の溶液に、塩化メチレン（0.5 L）において塩化オキサリル（68 mg、540 mmol）およびDMF（約3滴）を加えて、反応混合物を室温で終夜攪拌して、生成された気体を放出させた。溶媒を真空下で除去して、反応容器を高真空（約0.5 mmHg）に2時間置くと、塩酸が粘性の油（105 g）として得られ、これをその後精製せずにその後の反応に用いた。
2008508311.tif 000230
【０３６２】
マロン酸エチルカリウム（97 g、570 mmol）および塩化マグネシウム（55 g、570 mmol）のアセトニトリルにおける懸濁液に、懸濁液を0℃に冷却した。この懸濁液に粗2,3,4,5-塩化ベンゾイル（105 g、520 mmol）を5分間かけて加えた。反応温度を10℃未満に維持するために十分な速度でトリエチルアミンをゆっくり加えて、混合物を室温まで加温して終夜攪拌した。溶媒を真空下で除去して、トルエン（300 ml）に置換し、1N HCl（500 ml）を加えて、混合物を1時間攪拌した。有機層を分離して、1N HCl（100 ml）および塩水（100 ml）によって洗浄して硫酸ナトリウム上で乾燥させて、シリカゲルパッド（50×100 mm）上で濾過して、酢酸エチルによって溶出した。溶媒を真空下で除去して、得られた油をエタノール／水（9：1）に溶解して、終夜結晶化させた。得られた結晶を濾過によって単離して、エタノール／水（8 ：2）によって洗浄すると、ケトエステル（43.75 g、166 mmol）が白色結晶固体として得られた。
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【０３６３】
250 ml丸底フラスコに、テトラフルオロケトエステル（10.0 g、37.9 mmol）、オルトギ酸トリエチル（8.6 ml、56.8 mmol）および無水酢酸（7.15 ml、75.8 mmol）を加えて、反応混合物を145℃まで2時間加熱した。反応物を室温まで冷却して、高真空下（約0.5 mmHg）に1時間置いた。得られた油をエタノール（100 ml）に溶解して、2-アミノ-1-ナフトール（6.02 g、37.9 mmol）を室温で加えると、溶液は一時的に透明になり、産物が沈殿し始めた。反応物を2時間攪拌した後濾過して、エタノール（100 ml）によって洗浄すると、エナミンが黄色の固体（12.5 g、28.9 mmol）として得られた。
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【０３６４】
エナミン（12.13 g、27.95 mmol）の無水DMF（50 ml）溶液に、炭酸カリウム（4.24 g、1.1等量）を加えて、混合物を絶えず攪拌しながら90℃まで2時間加熱した。混合物を攪拌せずに室温まで冷却して、室温でさらに1時間維持した。結晶固体を濾過によって回収して、水によって洗浄した。THFによる再結晶により、ジフルオロエステルが白色固体（9.3 g、23.6 mmol）として得られた。
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【０３６５】
ジフルオロエステル（1.0 g、2.5 mmol）のNMP（10 ml）溶液に、N-Boc-3(2-ピラジノ)ピロリジン（870 mg、3.5 mmol）を加えて、混合物を3時間加熱環流した。反応混合物を室温まで冷却させて、産物を濾過によって回収した。THFから結晶化させると、ピラジンエステルが黄色の固体（910 mg、1.74 mmol）として得られた。
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【０３６６】
ピラジンエステル（250 mg、0.48 mmol）および2-(2-アミノエチル)-1-メチルピロリジン（80 mg、0.63 mmol）の塩化メチレン溶液に、室温で塩化アルミニウム（83 mg、0.63 mmol）を加えて、反応混合物を2時間攪拌した。溶媒を真空下で除去して、飽和L-酒石酸（5 ml）を加えて、混合物を1時間攪拌した。塩化メチレン（10 ml）を加えて、混合物を1N NaOHによって塩基性にした。有機層を分離して、ロシェル塩の飽和溶液、塩水によって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、得られた固体をTHFに溶解して濾過し、溶媒を再度除去した。粗固体を酢酸エチルにおいて再結晶させると、アミドが黄色の固体（225 mg、0.37 mmol、98.5％純粋）として得られた。
【０３６７】
実施例71
本実施例は、対応するカルボン酸と、アミンおよび塩化アルミニウムとの反応から置換ベンゾキサジン類似体を調製する方法を記述する。
2008508311.tif 000235
【０３６８】
ピラジノエステル（2.0 g、3.8 mmol）をエタノール（100 ml）に溶解して、濃塩酸（20 ml）を加えて、混合物を終夜還流した。混合物を室温まで冷却して、固体を真空濾過によって回収して、エタノールによって洗浄すると、ピラジノ酸がうすい黄褐色の粉末（1.6 g、3.2 mmol）として得られた。
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【０３６９】
フルオロアミノ酸（1.6 g、3.2 mmol）およびHBTU（2.0 g、5.3 mmol）のNMP（20 ml）溶液に、N,N-ジイソプロピル-N-エチルアミン（1.0 ml、6 mmol）を加えて、混合物をアルゴン下で室温で1時間攪拌した（溶液は透明になった）。(S)-2-(2-アミノエチル)-1-メチルピロリジン（Mizuno, A.；Hamada, Y.；Shioiri, T., Synthesis, 1980, 12 1007）（1.0 ml、6.9 mmol）を加えて、混合物を30分間攪拌した。水（200 ml）を加えて、得られた固体を真空濾過によって回収して、水によって洗浄して乾燥させると、ピラジンが黄色の固体として得られた。黄色の固体をシリカゲル（10％MeOH/CH2Cl2、最初に不純物を溶出した後、5％NH4OH/15％MeOH/CH2Cl2によって溶出する）において精製した。合わせた画分を蒸発させると、化合物が黄色の固体（1.2 g、2.0 mmol、85％純粋）として得られた。
【０３７０】
上記の詳しい記述および添付の実施例は単なる例に過ぎず、本発明の範囲に対する限定であるととるべきではないと理解すべきである。開示の態様に対する様々な変化および改変が当業者に明らかであると思われる。そのような変化および改変は、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、製剤、および／または本発明の使用法に関連する変化および改変が含まれるがそれらに限定されるわけではなく、本発明の趣旨および範囲に含まれると思われる。本明細書において参照し米国特許および刊行物は参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０３７１】
【図１】腫瘍遺伝子阻害剤のファーストパススクリーニングとしての停止アッセイ法を示す。
【図２】CX-3543、mAMSA、ジスタマイシン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、およびシプロフロキサシンの電気泳動図を示す。
【図３】CX-3543の結合選択性を示す。
【図４】腫瘍遺伝子によるCX-3543の選択性フットプリント（上のパネル、右）および停止アッセイ法（下のパネル、右）を示す。
【図５】RamosおよびHCT-116異種移植片モデルに対する式1を有する化合物の活性をそれぞれ示す。
【図６】RamosおよびHCT-116異種移植片モデルに対する式1を有する化合物の活性をそれぞれ示す。
【図７】CX-3543のトポイソメラーゼIIアッセイ法を示す。
【図８】HCT-116結腸直腸癌異種移植片モデルにおけるCX-3543の抗腫瘍活性を示す。
【図９】PC3前立腺癌およびMiaPaCa異種移植片モデルにおけるCX-3543の抗腫瘍活性をそれぞれ示す。
【図１０】PC3前立腺癌およびMiaPaCa異種移植片モデルにおけるCX-3543の抗腫瘍活性をそれぞれ示す。
【図１１】マウスにおけるCX-3543の薬物動態プロファイルを示す。
【図１２】CX-3543の静脈内投与後のイヌおよびラットにおけるCX-3543血漿中濃度をそれぞれ示す。
【図１３】CX-3543の静脈内投与後のイヌおよびラットにおけるCX-3543血漿中濃度をそれぞれ示す。
【図１４】AおよびBは、p53状態に及ぼすCX-3543の効果を示す。
【図１５】HCT-116におけるカスパーゼ-3活性化に及ぼすCX-3543の効果を示す。
【図１６】細胞周期に及ぼすCX-3543の効果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
2008508311.tif 000249
【図４Ｂ】
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【図５】
2008508311.tif 000251
【図６】
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【図７】
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【図８】
2008508311.tif 000254
【図９】
2008508311.tif 000255
【図１０】
2008508311.tif 000256
【図１１】
2008508311.tif 000257
【図１２】
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【図１３】
2008508311.tif 000259
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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