(57)【要約】本発明は骨変性疾患を治療または予防するための方法を提供する。治療または予防される疾患は、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、オステオミエローマ（osteomyeloma）、骨異栄養症、骨ページェット病、骨形成不全症、ならびに慢性腎疾患、副甲状腺機能亢進症、内因性チロトロピンの高値、およびコルチコステロイドの長期使用に関連する骨変性疾患を含む。開示される治療方法は、哺乳動物に対してTSHRアゴニストを（1）骨変性疾患を治療または予防する；（2）骨劣化を遅延する；（3）喪失した骨を回復する；（4）新生骨形成を刺激する；ならびに／または（5）骨量および／もしくは骨質を維持するための有効量で投与する段階を含む。チロトロピンおよびその修飾型のようなTSHRアゴニストは、抗吸収剤および骨代謝剤などのその他の化合物と共に提供される。2008508294.tif 000003
2008508294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨変性疾患を治療または予防するために十分な量および時間で哺乳動物に対してチロトロピンを投与する段階を含む、哺乳動物における骨変性疾患の治療または予防の方法。
【請求項２】
骨変性疾患が骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、オステオミエローマ（osteomyeloma）、骨異栄養症、骨ページェット病、骨形成不全症、骨硬化症、無形成骨、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後の骨の菲薄化から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
疾患が骨粗鬆症である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
骨粗鬆症が閉経後、ステロイド誘発性、老人性、またはチロキシン使用誘発性である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の骨変性疾患が高カルシウム血症、慢性腎疾患、腎透析、原発性および二次性副甲状腺機能亢進症、ならびにコルチコステロイドの長期使用の一つまたは複数に関連する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
治療的有効量のチロトロピンを、骨劣化を遅延し、骨を維持し、喪失した骨を回復し、または新生骨形成を刺激するために十分な期間、哺乳動物に対して投与する段階を含む、哺乳動物における骨劣化の遅延、骨の維持、喪失した骨の回復、または新生骨形成の刺激の方法。
【請求項７】
骨劣化が骨量の減少によって特徴付けられる、請求項6記載の方法。
【請求項８】
骨量の減少が骨塩密度を測定することによって決定される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
骨劣化が骨質の変性によって特徴付けられる、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
骨質の変性が骨の微細構造の完全性を評価することによって決定される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ビスホスホネート、ビスホスホネートエステル、テストステロン、エストロゲン、フッ化ナトリウム、ビタミンDおよびその類似体、カルシトニン、カルシウムサプリメント、選択的エストロゲンレセプター調節物質、骨原性タンパク質、スタチン、ANGELS、ならびにPTHからなる群より選択される第二の治療用化合物を投与する段階をさらに含む、請求項1または6記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項1または6記載の方法。
【請求項１３】
チロトロピンが組換え型チロトロピンである、請求項1または6記載の方法。
【請求項１４】
組換え型チロトロピンがCHO細胞において産生される、請求項1または6記載の方法。
【請求項１５】
チロトロピンがヒト型である、請求項1または6記載の方法。
【請求項１６】
ヒトチロトロピンがチロトロピンαである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
チロトロピンが配列番号：3のアミノ酸1からアミノ酸112までに示される配列を含む、請求項1または6記載の方法。
【請求項１８】
チロトロピンが配列番号：3のアミノ酸1からアミノ酸118までに示される配列を含む、請求項1または6記載の方法。
【請求項１９】
チロトロピンが配列番号：1に示される配列をさらに含む、請求項1または6記載の方法。
【請求項２０】
チロトロピンが0.0001〜0.01、0.01〜0.1、または0.1〜10IU/kgの用量で投与される、請求項1または6記載の方法。
【請求項２１】
0.01〜100IU/mgの比活性を持つチロトロピンが10−8〜10−7、10−7〜10−6、10−6〜10−5、または10−5〜10−4g/kgの用量で全身性に投与される、請求項1または6記載の方法。
【請求項２２】
チロトロピンが全身性に投与される、請求項1または6記載の方法。
【請求項２３】
チロトロピンが少なくとも2週間の期間にわたって繰り返し投与される、請求項1または6記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明の技術分野は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症および骨異栄養症などの骨変性疾患の治療における甲状腺刺激ホルモン（TSH；チロトロピン）の治療的使用に関する。
【０００２】
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、2004年7月27日に出願された米国特許仮出願第60/591,464号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
甲状腺刺激ホルモン（TSH；チロトロピン）は視床下部からの信号に反応して下垂体前葉によって分泌される内分泌性ホルモンである。チロトロピンは甲状腺濾胞の発達および甲状腺ホルモンの産生を司る。この物質は甲状腺の上皮細胞上でGタンパク質共役レセプターであるTSHRに結合し、それによって甲状腺を刺激して甲状腺ホルモンを合成および放出する。TSHRは、骨髄細胞、リンパ球、胸腺、精巣、腎、脳、ならびに脂肪組織、リンパ組織および骨格組織を含む、甲状腺以外の複数の組織で発現する。チロトロピンの産生は古典的な負のフィードバックループメカニズムによって制御されて、甲状腺ホルモンの血中濃度が高くなるとチロトロピンの分泌が阻害される。
【０００４】
組換え技術によって産生されたヒトチロトロピンであるThyrogen（登録商標）（Genzyme Corp.）は、高分化型甲状腺癌の患者の経過観察において甲状腺スキャニングおよびチログロブリン値の検査に用いられている。提案されるさらなる臨床的用途は、チロトロピン刺激試験（例えば、甲状腺貯蔵を調べる）、ならびにチロトロピン刺激放射性ヨウ素除去による非甲状腺性疾患症候群、甲状腺癌、および大きな甲状腺機能正常性甲状腺腫の治療を含む。
【０００５】
甲状腺ホルモンと骨の関係は1890年代に最初に認識されて、甲状腺機能亢進症がより高い骨折率に関連することが最初に観察された（Bauer et al. (2001) Ann. Inter. Med., 134:561-568（非特許文献1））。
【０００６】
成人期を通して、骨は骨形成および吸収の対となるプロセスを介して絶えず代謝回転を行っている。骨吸収は、単核食細胞性前駆細胞によって形成される骨吸収細胞である破骨細胞によって介在される。喪失する骨に置き換わる新生骨は、間葉性間質細胞によって形成される骨形成細胞である骨芽細胞によって沈着される。リモデリングプロセスに関与するその他の様々な細胞タイプは、全身性の因子（例えば、ホルモン、リンホカイン、増殖因子、ビタミン）および局所性の因子（例えば、サイトカイン、接着分子、リンホカイン、および増殖因子）によって厳重に制御される。骨の量および完全性を維持するためには骨リモデリングプロセスの適切な時間的空間的連携が不可欠である。多くの骨変性疾患は、骨粗鬆症、骨形成不全（骨軟化症）、骨異栄養症、骨ページェット病、慢性腎不全、ならびに原発性および二次性副甲状腺機能亢進症のような代謝性骨疾患を含む骨量の異常減少（骨減少症）の原因となる骨リモデリングサイクルの不均衡に関連する。
【０００７】
甲状腺疾患は最も広く見られる内分泌異常の一つである。チロトロピンを抑制するために甲状腺ホルモンであるL-チロキシンの外因性投与は、乳頭様または濾胞性甲状腺癌およびその他の甲状腺機能亢進状態の進行または再発を阻害するために広く用いられる治療である。甲状腺機能亢進性の機能障害における骨に対する影響は甲状腺ホルモンの値に寄与しており、このホルモン値はカルシウムホメオスタシスの調節に直接関係する。甲状腺機能亢進患者は、骨の喪失に関連する低い（または検出不可能な）循環チロトロピン値を示す。さらに、チロキシンは患者によっては骨粗鬆症を誘発することが知られている。一方、甲状腺機能低下症は高い骨量および高いチロトロピン値に関連する。
【０００８】
骨のホメオスタシスにおけるチロトロピンの正確な役割は解明されていない。遺伝的に甲状腺ホルモンまたはα1/β甲状腺ホルモンレセプター（TR）を欠くマウスは、骨格の形態形成および板の成長の異常に関わらず正常なリモデリング表現型を示す（Gother et al. (1999) Genes and Devel., 13:1329-1341（非特許文献2））。さらに、TSHR欠損ヘテロ接合およびホモ接合マウスは高い代謝回転の骨リモデリングを示し、その結果、骨量の減少および限局性の骨硬化症を惹起する（Abe et al. (2003) Cell, 115:151-162（非特許文献3））。TSHR欠損マウスに由来する骨細胞を用いたインビトロにおける試験に基づいて、チロトロピンは骨リモデリングプロセスの同化および異化部分の双方に対して直接的な負の調節作用を示すことが示唆されている。具体的には、チロトロピンは破骨細胞の形成および骨芽細胞の分化の双方を抑制することが報告されている（Abe、前記（非特許文献3））。
【０００９】
骨変性疾患の治療のための慣例的な治療には、カルシウムサプリメント、エストロゲン、カルシトニンおよびビスホスホネートが含まれる。カルシウムおよびリン酸の吸収を促進することが知られているビタミンD3およびその代謝物も試みられている。しかし、これらの治療に新生骨組織の形成を刺激するものはない。さらに、これらの物質は骨リモデリングに対しては一過性の影響しか及ぼさない。従って、一部の症例では疾患の進行が停止または遅延する場合があるが、重度の骨劣化患者はリスクを抱えたままである。これは、しばしば診断時に既に骨の構造的劣化が発症し始めている閉経後骨粗鬆症のような疾患において特に広く見られる。
【００１０】
従って、骨疾患の治療および予防のための新しい治療方法を開発する必要がある。
【００１１】
【非特許文献１】Bauer et al. (2001) Ann. Inter. Med., 134:561-568
【非特許文献２】Gother et al. (1999) Genes and Devel., 13:1329-1341
【非特許文献３】Abe et al. (2003) Cell, 115:151-162
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、卵巣切除ラットに対する手術直後のチロトロピンの全身投与がエストロゲン欠乏症後に発現する骨の喪失の遅延に有効であるという発見および実証に、一部、基づく。卵巣切除に誘発される骨減少症は早期閉経後骨粗鬆症の十分にバリデートされたモデルである。従って、本開示はチロトロピンが骨に対して治療的効果を持つことを初めて実証する。
【００１３】
従って、本発明は骨変性疾患を治療または予防するための方法を提供する。治療または予防される疾患には、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、オステオミエローマ（osteomyeloma）、骨異栄養症、骨ページェット病、骨形成不全症、骨硬化症、無形成骨、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫、および転移後の骨の菲薄化が含まれる。治療または予防される疾患には、さらに、高カルシウム血症、慢性腎疾患（末期腎疾患を含む）、腎臓透析、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、およびコルチコステロイドの長期使用に関連する骨変性疾患が含まれる。
【００１４】
開示される方法は、哺乳動物に対してTSHRアゴニストを以下のための有効量で投与する段階を含む：
（1）骨変性疾患の治療または予防；
（2）骨劣化の遅延；
（3）喪失した骨の回復；
（4）新生骨形成の刺激；および／または
（5）骨（骨量および／または骨質）の維持。
【００１５】
一部の態様において、TSHRアゴニストはチロトロピンまたは生物学的に活性なその類似体である。例示的態様において、チロトロピンは組換え技術によって産生されるヒトチロトロピン、例えばチロトロピンαである。本発明は、骨変性疾患の治療におけるTSHRアゴニストの有効性を調べるためのアッセイをさらに提供する。本発明の方法で用いられる投与の方法、組成物および装置も提供される。
【００１６】
本発明は以下の記載に示されており、その記載から理解されるか、または本発明の実践によって習得され得る。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の方法で用いられる組成物はTSHRアゴニストを含む。
【００１８】
「TSHRアゴニスト」という用語は、チロトロピンシグナリング経路を促進する化合物または組成物（ソースまたは産生様式に関わらない）を示す。TSHRアゴニストは単独でTSHR介在性シグナリングを刺激し得、かつ／または内因性チロトロピンもしくは投与された（即ち、外因性の）もう一つのTSHRアゴニストの生物活性を増強することによってTSHR介在性シグナリングを刺激し得る。TSHRアゴニストは、チロトロピン下流シグナリングに特異的な遺伝子を活性化または不活化することもできる。一部のTSHRアゴニストはチロトロピンレセプターに特異的に結合して、次に向甲状腺細胞またはTSHRを天然に発現するその他の細胞もしくはTSHRを発現するように改変された細胞においてTSHR介在性の細胞内シグナリングを伝達する。「特異的結合」という用語およびその同義語は、適切な条件下で測定された、少なくとも、例えば、105、0.5×106、106、0.5×107、107、0.5×107、0.5×108、108、0.5×109、109M−1またはより高い親和性定数Kaを伴う相互作用を示す。
【００１９】
例えば、TSHRアゴニストはチロトロピンおよびチロトロピン類似体、抗TSHR抗体、ならびに以下に記載されるような小分子を含む。チロトロピン類似体は、修飾チロトロピン、ならびにチロトロピンおよび修飾チロトロピンの生物学的に活性な非天然型断片などのタンパク質性チロトロピン類似体を含む。
【００２０】
TSHRアゴニストの生物活性を測定するためのアッセイは当技術分野において公知である。例えば、生物活性は実施例に記載されるような細胞をベースとするアッセイで測定され得る。このようなアッセイにおいて、TSHR介在性シグナリング活性は細胞内3',5'-サイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）の量に基づいて測定される。被験物質のcAMP量に対する影響は、機能性TSHRおよび任意でcAMP反応性レポーター遺伝子構築物を発現する細胞において測定される。機能性TSHRの発現は、既に、例えば、Akamizu et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:5677-5681; Frazier et al. (1990) Mol. Endocrinol., 4:1264-1276; Libert et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 165:1250-1255; Libert et al. (1990) Mol. Cell. Endocrinol., 68:R15-R17; Misrahi et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun., 166: 394-403; Nagayama et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1184-1190; Parmentier et al. (1989) Science, 246: 1620-1622; Perret et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun., 28:171(3): 1044-50; および米国特許第6,361,992号（例えば、特にCHO細胞およびCHO-J09クローンを用いたアッセイを参照されたい）に記載されるように実施されている。
【００２１】
チロトロピンαの生物活性は細胞をベースとするアッセイによって調べられる。このアッセイでは、機能性チロトロピンレセプター、および例えばルシフェラーゼのようなヘテロレポーター遺伝子に共役するcAMP-反応性エレメントを発現する細胞が使用される。報告された遺伝子発現の測定はチロトロピン活性の指標を提供する。チロトロピンαの比活性は、チロトロピンαに反応してウシ甲状腺ミクロソーム調製物によって産生されるcAMPの量を測定するインビトロアッセイを用いて、世界保健機構（WHO）ヒト下垂体由来チロトロピン参照標準であるNIBSC 84/703に対して検量された参照物質を基準として測定される。チロトロピンαの比活性は、典型的には、細胞をベースとするアッセイにおいて測定される通り4〜12IU/mgの範囲である。
【００２２】
TSHRアゴニストはチロトロピンおよびチロトロピン類似体を含む。
【００２３】
本発明の方法において用いられるチロトロピンは、天然チロトロピンまたは組換え技術もしくは合成によって産生されたチロトロピンの精製物である。例示的態様において、チロトロピンは「チロトロピンα」（Thyrogen（登録商標）として販売）である。
【００２４】
チロトロピンは、2つの非共有結合したサブユニットであるαおよびβから構成される。遊離のαおよびβサブユニットは本質的に生物活性を持たない。αサブユニットはその他の2つの下垂体糖タンパク質ホルモンである卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンにも含まれ、霊長類では胎盤ホルモンである絨毛性ゴナドトロピンにも含まれる。固有のβサブユニットは二量体にレセプター特異性を付与する。チロトロピンαおよびβサブユニットの配列は、魚類から哺乳動物まで高度に保存されている。例えば、ヒトおよびウシのチロトロピンはβサブユニットでは70％の相同性、αサブユニットでは89％を共有する。
【００２５】
ヒトチロトロピンα（配列番号：1）およびβ（配列番号：3）のサブユニットのアミノ酸配列を、それぞれ、図1Aおよび1Bに示す。それぞれのコードする核酸は、配列番号：2（ヌクレオチド残基73〜351が配列番号：1をコードする）および配列番号：4（ヌクレオチド残基61〜417が配列番号：3をコードする）として与えられる。（5'末端のさらなるヌクレオチド配列はシグナルペプチドをコードする。）
【００２６】
システインノット構造のジスルフィド架橋を形成するシステインは、図1Aおよび1Bにおいて黒で強調されている。システインノットモチーフはCys34-Cys88、Cys9-Cys57、Cys38-Cys90および Cys23-Cys72、Cys94-Cys100、Cys26-Cys100によって形成される。システインノットは、細胞内安定性にとっては重要であるがレセプターの結合または生物活性にとっては必須ではないと認識されている。
【００２７】
様々な種に由来する全長αサブユニット配列のデータベースアクセッション番号および配列表の配列に対する参照は次の通りである：ヒト（P01215；配列番号：45）；アカゲザル（P22762；配列番号：46）；マーモセット（P51499；配列番号：47）；ウシ（P01217；配列番号：48）；ヒツジ（P01218；配列番号：49）；ブタ（P01219；配列番号：50）；ウマ（P01220；配列番号：51）；ロバ（Q28365；配列番号：52）；ウサギ（P07474；配列番号：53）；ラット（P11963；配列番号：54）；マウス（P01216；配列番号：55）；カンガルー（O46687；配列番号：56）。従って、一部の態様においてチロトロピンは配列番号：45〜56の任意の配列を含む。
【００２８】
様々な種に由来する全長βサブユニット配列のデータベースアクセッション番号および配列表の配列に対する参照は次の通りである：ヒト（P01222；配列番号：58）；ウシ（P01223；配列番号：59）；ブタ（P01224；配列番号：60）；ラマ（P79357；配列番号：61）；イヌ（P54828；配列番号：62）；ウマ（Q28376；配列番号：63）；ラット（P04652；配列番号：64）；マウス（P12656；配列番号：65）；ニワトリ（O57340；配列番号：66）；ハムスター（Q62590）；および魚類（P37240；O73824；Q08127）。従って、一部の態様においてチロトロピンは配列番号：57〜66ならびにQ62590、P37240、O73824、およびQ08127の任意の配列を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、チロトロピンは組換え技術によって産生される。Thyrogen（登録商標）（注射用「チロトロピンα」）は、組換えDNA技術によって産生される糖タンパク質であるヒトチロトロピンの高度に精製された組換え型を含む。
【００３０】
チロトロピンαおよび天然ヒト下垂体甲状腺刺激ホルモンはいずれもグリコシル化変異体の混合物として合成される。図3A〜3Cは、チロトロピン上のN結合型糖の代替構造を示す。CHO細胞で産生される組換え型チロトロピンは、これらの細胞がGalNAcトランスフェラーゼおよびスルホトランスフェラーゼを欠くため、硫酸化されずシアル酸化される。組換え技術によって産生されるチロトロピンのグリコシル化は天然型チロトロピンとは全く同一ではないが、その生物活性は下垂体チロトロピンのそれとほぼ等しい。従って、本発明のチロトロピンおよびその類似体はオリゴ糖構造のヘテロ混合物を含んでもよい。
【００３１】
本発明の方法において有用なTSHRアゴニストはタンパク質性チロトロピン類似体を含む。タンパク質性チロトロピン類似体は、修飾チロトロピンならびにチロトロピンおよび修飾チロトロピンの生物学的に活性な非天然型断片を含む。タンパク質性チロトロピン類似体のスクリーニングのための例示的手順は実施例に記載される。修飾チロトロピンは、天然型チロトロピンに比して、（1）αサブユニット内で少なくとも1つであるが3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40よりも少ないアミノ酸が置換または欠失するチロトロピン、および／または（2）βサブユニット内で少なくとも1つであるが3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40よりも少ないアミノ酸が置換または欠失しているチロトロピンの非天然の変種を含む。例えば、ヒトチロトロピンにおいて一つまたは複数のアミノ酸がもう一つの種に由来する対応する残基によって置換されてもよい。「対応する」という用語またはその同義語は、第二のアミノ酸配列に対する第一のアミノ酸配列のアミノ酸の位置に関して用いられる場合、双方の配列を至適に整列させた（即ち、双方の配列中のアミノ酸の最大可能な数が一致する）際に第一の配列における位置と整列する第二の配列におけるアミノ酸残基を示す。特記する場合を除いて、アミノ酸の位置はすべて、ヒトの配列ならびにその他の種および修飾型チロトロピンにおける対応するアミノ酸を示す。
【００３２】
図5は、チロトロピンα（図4A）およびβ（図4B）サブユニットに関する複数の種由来のアミノ酸配列のアライメントを示す。可変アミノ酸は、例えば、図4A、4Bおよび5に示すようにその他の種の対応するアミノ酸から由来することができるが、由来する必要はない。
【００３３】
従って、いくつかの態様において、チロトロピン類似体は配列番号：44および／または配列番号：57を含む。
【００３４】
図5は、ヒト配列のアミノ酸10〜28に相当するαサブユニット由来の整列された多くのアミノ酸配列を含む。αL1のこの領域は、生物活性にとって重要な領域の一つとして認識されている。とりわけ、ウシチロトロピンは、この領域におけるアミノ酸の違いが原因と思われるが、ヒトのチロトロピンよりも著しく強い活性を示す。アライメントに基づいて、修飾チロトロピンは、X11がT、Q、K、Rまたはもう一つのアミノ酸であり、X12がL、Pまたはもう一つのアミノ酸であり、X13がQ、H、R、K、Gまたはもう一つのアミノ酸であり、X14がE、V、K、Q、Dまたはもう一つのアミノ酸であり、X16がP、Q、K、R、N、S、Tまたはもう一つのアミノ酸であり、X17がF、Y、L、I、Vまたはもう一つのアミノ酸であり、X20がQ、K、R、M、Nまたはもう一つのアミノ酸であり、X21がP、L、G、Dまたはもう一つのアミノ酸であり、X22がG、D、R、Sまたはもう一つのアミノ酸であり、X23がA、S、Vまたはもう一つのアミノ酸であり、X25がI、Vまたはもう一つのアミノ酸であり、X26がL、Y、Fまたはもう一つのアミノ酸であり、すべてが独立して可変性である、配列番号：6に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
修飾チロトロピンのさらなる例には、米国特許第6,361,992号に記載される「TSHスーパーアゴニスト」が含まれる。このような修飾チロトロピンは、αサブユニットの11、13、14、16、17、20L1の残基（αL1領域）、ならびにβサブユニットの13、20、58、63および69のアミノ酸残基に一つまたは複数のアミノ酸の変異を含み得る。ヒトチロトロピンのこれらの残基が塩基性残基で置換されると、生物活性が増強される（「機能獲得型」類似体としても公知である）。図2は、三次構造ヒトチロトロピンにおける、ある「機能獲得型」変異の位置を示す（即ち、αL1におけるアミノ酸残基α13、α14、α16およびα20；αL3におけるα64、α66、α73およびα81；βL3におけるβ58、β63およびβ69）。例えば、αサブユニットに4つの置換（Q13K、E14K、P16K、Q20K）およびβサブユニットにさらにもう一つの置換（L69R）があるヒトチロトロピンは、野生型チロトロピンに比べて95倍の強い生物活性を示す。αサブユニットにおける同一の4つの置換およびβサブユニットにおける3つの置換（I58K、E63、L69T）により、生物活性は100倍増強される。
【００３６】
以下のアミノ酸は、TSHRの結合および／またはチロトロピンの生物活性において重要な役割を担うことが認識されている。αサブユニットでは、α10〜28；α33〜38；αヘリックス（α40〜46）；αK51；N結合型糖を持つαN52およびαN78；C末端（α88〜92）。βサブユニットでは、N結合型糖を持つβN23；カウトマン（Kautmann）ループ」（β31〜52）、および特に「シートベルト」領域（β88〜105）。（構造機能試験のレビューについては、例えば、Szkudlinski et al. (2002) Physiol. Rev., 82:473-502を参照されたい。）
【００３７】
3つの公知のN結合型グリコシル化位置を図1Aおよび1Bにおいてアステリスクで示す。この分子上のN結合型グリコシル化はその生物活性のレベルを決定する。ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびウシチロトロピンの脱グリコシル化によって、レセプターの結合は増強するがレセプターシグナル伝達は低下する。さらに、βサブユニットC末端の6つのアミノ酸の切断を惹起するタンパク質分解性切断部位によって、図1Bにおいて矢印で示される112アミノ酸産物が生じる。この切断は精製ヒト下垂体チロトロピンで見られており、このホルモンの活性には影響しないと思われる。
【００３８】
タンパク質性TSHRアンタゴニストは、チロトロピンおよびその修飾型の生物学的に活性な断片を含む。
【００３９】
従って、いくつかの態様において、チロトロピン類似体は以下を含む：
（1）アミノ酸残基αN52、αN78およびβN23に対応する3つのアスパラギンの任意の1つもしくは任意の2つ、または任意で3つ全てのアスパラギン；
（2）配列番号：1のアミノ酸（aa）10〜28、配列番号：1のaa 33〜38、配列番号：1のaa 40〜46、配列番号：1のaa 88〜92、配列番号：2の31〜52、配列番号：2の88〜105から選択される1つまたは複数のアミノ酸（aa）配列、ならびに配列番号：45〜56および配列番号：58〜66に対応するアミノ酸配列；
（3）配列番号：6〜43のアミノ酸配列の任意の1つ；
（4）配列番号：44；
（5）配列番号：57；
（6）配列番号：44および配列番号：57；
（7）配列番号：45〜56のアミノ酸配列の任意の1つ；
（8）配列番号：58〜66のアミノ酸配列の任意の1つ；
（7）配列番号：3のaa 1〜112、または配列番号：57〜66の任意の1つにおける対応するアミノ酸；または
（8）ヒトチロトロピンのαサブユニットまたはβサブユニットのいずれかに対応する、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90アミノ酸を含む（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）および（7）の任意の1つ。
【００４０】
タンパク質性チロトロピン類似体は、アゴニスト性抗TSHR抗体をさらに含む。「抗体」という用語は、TSHRに特異的に結合する免疫グロブリン（Ig）を示す。この用語は、TSHRに関する特異性を保持する限り、このような免疫グロブリンの一部または断片も示す。本発明において有用な抗体は、ソースまたは産生方法に関して限定されない。最も典型的には、モノクローナル抗体が用いられる。最も一般的には、IgタイプG（IgG）が用いられる。抗体は、完全ヒト型、完全マウス型、CDR移植（例えば、ヒト化）、キメラ（例えば、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む）、合成、組換え、ハイブリッド、または変異型であり得る。抗体産生は当業者にとって十分対応可能である（例えば、Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 2nd ed., Oxford University Press, 1995を参照されたい）。アゴニスト性抗TSHR抗体の例には、ヒトモノクローナル甲状腺刺激自己抗体（例えば、Sanders et al. (2003) Lancet, 362(9378):126-128、およびKin-Saijo et al. (2003) Eur. J. Immunol., 33:2531-2538を参照されたい）、刺激活性を持つマウスモノクローナル抗TSHR抗体（例えば、Costagliola et al. (2000) BBRC, 299(5): 891-896を参照されたい）が含まれる。
【００４１】
チロトロピン類似体の作成方法は当技術分野において公知である。この類似体は化学的または組換え的に合成することができる。組換え型チロトロピンは、例えば、Cole et al. (1993) Bio/Technology, 11:1014-1024によって述べられるように組換え的に産生することができる。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母、およびバキュロウイルスの系が含まれる。ヘテロポリペプチドの発現のために当技術分野において利用可能な哺乳動物の細胞株には、CHO細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、NSOマウス黒色腫細胞、および多くのその他の細胞が含まれる。TSHRアゴニストの作成に適したその他の細胞については、例えば、Gene Expression Systems, eds. Fernandez et al., Academic Press, 1999; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., 2nd ed., John Wiley & Sons, 1992を参照されたい。
【００４２】
本発明の方法において有用なTSHRアゴニストは小分子を含む。小分子には、合成および精製された天然のTSHRアゴニストが含まれる。小分子は模倣剤または分泌促進物質であり得る。このような分子の例には、非遺伝子向性エストロゲン様シグナル伝達活性化物質（ANGELS）および関連化合物が含まれる（例えば、米国特許出願第2003/0119800号を参照されたい）。
【００４３】
本発明の方法において有用なTSHRアゴニストは、甲状腺ホルモンの合成および／または放出の阻害物質（例えば、プロピルチオウラシル（PTU）およびメチマゾールなどの小分子）をさらに含む。
【００４４】
本発明の方法において有用なTSHRアゴニストは、例えば、チロトロピン放出ホルモン（TRH；L-ピログルタミル-L-ヒスチジル-L-プロリンアミド）のようなTSH分泌促進物質をさらに含む。
【００４５】
投与および使用の方法
本発明は、特に、ヒト、サル、げっ歯類、ヒツジ、ウサギ、イヌ、モルモット、ウマ、ウシおよびネコを含む哺乳動物における骨変性疾患を治療または予防するための方法を提供する。
【００４６】
治療または予防される疾患には、例えば、骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症（例えば、閉経後、ステロイド誘発性、老人性、またはチロキシン使用誘発性）、オステオミエローマ、骨異栄養症、骨ページェット病、骨形成不全症、体液性高カルシウム血症性ミエローマ、多発性骨髄腫および転移後の骨の菲薄化が含まれる。治療または予防される疾患には、高カルシウム血症、慢性腎疾患、原発性または二次性副甲状腺機能亢進症、およびコルチコステロイドの長期使用に関連する骨変性疾患がさらに含まれる。
【００４７】
開示される方法は、哺乳動物に対してTSHRアゴニストを以下のための有効量投与する段階を含む：
（1）骨変性疾患の治療または予防；
（2）骨劣化の遅延；
（3）喪失した骨の回復；
（4）新生骨形成の刺激；および／または
（5）骨（骨量および／または骨質）の維持。
本発明の方法は、骨梁および皮質骨における微小欠損を治療するために用いることができる。骨質は、例えば、骨の微細構造の完全性を評価することによって調べることができる。
【００４８】
一般に、TSHRアゴニストは、少なくとも2、4、6、8、10、12、20、もしくは40週間、または少なくとも1、1.5もしくは2年間、または被験体の寿命まで繰り返し投与される。
【００４９】
一般に、チロトロピンおよびチロトロピン類似体を含むTSHRアゴニストは、0.0001〜0.001；0.001〜0.01；0.01〜0.1；または0.1〜10IU/kgの用量で投与することができる。代替的な態様において、0.01〜100IU/mgの比活性を持つチロトロピンは、（i）10−8〜10−7；10−7〜10−6；10−6〜10−5；または10−5〜10−4g/kgの用量で投与される。一部の態様において、用量は7.2IU/kg、0.52IU/kgまたは0.143IU/kgではなく、または投与はヒト被験体当たり45mgまでの単回注射ではない。実施例に示す通り、チロトロピンαは、例えば、2〜8週間の期間にわたって静脈内に注射することができ、チロトロピンの用量は0.7〜70μg（それぞれ、0.005および0.5IUに対応する）まで変化する。一つの動物モデルにおいて達成される治療的有効投与量は、当技術分野において公知の換算係数を用いて、ヒトを含むもう一つの動物での使用のために換算することができる（例えば、Freireich et al. (1966) Cancer Chemother. Reports, 50(4):219-244を参照されたい）。
【００５０】
TSHRアゴニストの正確な投与量は、所望の転帰に基づいて経験的に決定される。例示的な転帰には以下が含まれる：（a）骨変性疾患が治療または予防される、（b）骨の劣化が遅延する；（c）喪失した骨が回復する；（d）新生骨成長が形成される；ならびに／または（e）骨量および／もしくは骨質が維持される。例えば、TSHRアゴニストは骨劣化（例えば、骨量および／または骨塩密度の減少）を少なくとも20、30、40、50、100、200、300、400または500％遅延するための有効量が投与される。
【００５１】
骨劣化に関連する転帰は、骨梁の減少（骨梁プレートの穿孔）；（骨幹端の）皮質骨の喪失；海綿質骨の喪失；骨塩密度の減少；骨塩質の低下；骨リモデリングの減少；血清中アルカリホスファターゼおよび酸ホスファターゼ値の上昇；骨脆弱性（骨折率の増加）、骨折治癒の減少に関するTSHRアゴニストの特異的効果によっても評価され得る。骨量および骨質を評価するための方法は当技術分野において公知であり、X線回折；DXA；DEQCT；pQCT、化学的分析、密度分画法、ヒストフォトメトリー（histophotometry）、ならびに例えばLane et al. (2003) J. Bone Min. Res., 18(12):2105-2115および実施例に記載される組織化学的分析が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、医薬品の投与に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌物質および抗真菌物質、等張剤および吸収遅延剤などを示す。薬学的に活性な物質においてこのような媒質および物質を用いることは当技術分野において周知である。この組成物は、補助的、付加的または強化された治療的機能を示すその他の活性化合物をさらに含んでもよい。薬学的組成物は、投与説明書と共に容器、パックまたはディスペンサーに収容されてもよい。
【００５３】
薬学的組成物は意図する投与経路と適合するように製剤化される。例えば、Thyrogen（登録商標）は、注射用滅菌水USPで再溶解した後に筋肉内（IM）投与用の無菌、非発熱性の白色ないし類白色の凍結乾燥製剤として供給される。Thyrogen（登録商標）の各バイアルは、1.1mgチロトロピンα（4〜12IU/mg）、36mgマンニトール、5.1mgリン酸ナトリウム、および2.4mg塩化ナトリウムを含有する。注射用滅菌水USP 1.2mlで再溶解後のチロトロピンαの濃度は0.9mg/mlである。再溶解液のpHは約7.0である。
【００５４】
または、TSHRアゴニストは、例えば、Basu et al. (2004) Expert Opin. Biol. Ther., 4(3):301-317およびPechenov et al. (2004) J. Control. Release, 96:149-158に記載される通りに提供されることもある。このような組成物の例には、裸で、または生分解性高分子（例えば、PEG、PLGA）と組み合わせて提供される結晶性タンパク質製剤が含まれる。
【００５５】
投与の方法は当技術分野において公知である。「投与」は任意の特定の送達系に限定されず、非経口的投与（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、直腸投与、局所投与、経皮投与、または経口投与（例えば、カプセル、懸濁剤、またはタブレット）を含み得るが、それらに限定されるわけではない。個体に対する投与は、様々な生理学的に許容される任意の塩の形で、ならびに／または薬学的組成物の一部として許容可能な薬学的担体および／もしくは添加物と共に（前記）、単回投与または継続投与もしくは間欠的反復投与として行うことができる。生理学的に許容される塩の形ならびに標準的な薬学的製剤化技術および賦形剤は当業者に周知である（例えば、Physicians' Desk Reference (PDR) 2003, 57th ed., Medical Economics Company, 2002；およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, eds. Gennado et al., 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000を参照されたい）。
【００５６】
TSHRアゴニストは、誘導骨再生および／または骨置換において用いられる担体ゲルおよびマトリックスまたはその他の組成物と組み合わせた薬学的組成物として投与してもよい。このようなマトリックスの例には、合成ポリエチレングリコール（PEG）-、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、およびフィブリンをベースとするマトリックスであるtisseelフィブリン接着剤などが含まれる。
【００５７】
TSHRアゴニストは、例えば、ビスホスホネート（窒素含有および窒素非含有）、アポミン、テストステロン、エストロゲン、フッ化ナトリウム、ビタミンDおよびその類似体、カルシトニン、カルシウムサプリメント、選択的エストロゲンレセプター調節物質（SERM、例えば、ラロキシフェン）、骨原性タンパク質（例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-11、GDF-8）、スタチン、非遺伝子向性エストロゲン様シグナル伝達活性化物質（ANGELS）、および副甲状腺ホルモン（PTH）などのその他の治療的化合物と組み合わせてまたは同時に投与してよい。Apomineは新規の1,1-ビスホスホネートエステルであり、ファルネイオンX活性化レセプターを活性化してHMG(3-ヒドロキシ-3-メチルグリタリル-コエンザイムA）レダクターゼの分解を促進する（例えば、米国特許出願第2003/0036537号および本明細書に引用される参考文献を参照されたい）。
【００５８】
個体への治療薬の投与は、アンタゴニストをコードする核酸配列をインビボにおいて患者に投与するか、またはインビトロにおいて細胞に投与した後に患者に導入する遺伝子療法を使って行ってもよい。具体的な遺伝子療法のプロトコールに関しては、Morgan, Gene Therapy Protocols, 2nd ed., Humana Press, 2000を参照されたい。
【００５９】
本発明のさらなる出願は、オステオインテグレーション（osteointegration）を促進するために、骨インプラント、マトリックスおよびデポー系をコーティングするかまたはこれらに組み込むためのTSHRアゴニストの使用を含む。このようなインプラントの例には、歯科インプラントおよび関節置換インプラントが含まれる。
【００６０】
本発明は、骨変性疾患の治療におけるTSHRアゴニストの有効性の評価をさらに含む。
【００６１】
このようなアッセイは以下の段階を含む：
（1）哺乳動物（例えば、OVXラット）に対して少なくとも2、4、6または8週間の期間にわたってTSHRアゴニストを反復投与する段階；および
（2）TSHRアゴニストの骨に対する影響を決定する段階であって、ここでTSHRアゴニストに帰因する骨の劣化（例えば、骨量および／または骨質）の遅延は、TSHRアゴニストが骨変性疾患の治療に有効であることを示す。
【００６２】
TSHRアゴニストは骨変性疾患に関する一つもしくは複数の動物モデルおよび／またはヒトにおいて評価され得ることが理解されるであろう。骨減少症は、例えば、不動化、低カルシウム食、高リン食、コルチコステロイドの長期使用、卵巣機能の停止、老化によって惹起され得る。例えば、卵巣切除（OVX）誘発性骨減少症は、ヒト閉経後骨粗鬆症の十分に確立された動物モデルである。もう一つの十分にバリデートされたモデルはコルチコステロイドの投与を伴う。このようなモデルには、カニクイザル、イヌ、マウス、ウサギ、フェレット、モルモット、ミニブタおよびヒツジが含まれる。骨減少症の様々な動物モデルに関するレビューについては、例えば、Turner (2001) Eur. Cells and Materials, 1:66-81を参照されたい。
【００６３】
さらなるインビトロにおける試験は、コラーゲンおよびオステオカルシン合成に対する影響またはアルカリホスファターゼおよびcAMPの誘導レベルに対する影響などの、培養骨芽細胞に対する影響の評価を含み得る。適切なインビボおよびインビトロの試験は、例えば、米国特許第6,333,312号に記載されている。
【００６４】
以下の実施例は本発明の例示的態様を示す。当業者は、本発明の精神または範囲を変更することなく実施することができる多くの改変および変更を認識するであろう。このような改変および変更は本発明の範囲に含まれる。実施例は、いかなる点においても本発明を限定するものではない。
【００６５】
実施例
実施例1：TSHRアゴニストの活性を測定するためのアッセイ
甲状腺膜調製物-
ウシ甲状腺膜を調製するための技術は、Pekonen et al. (1980) J. Biol. Chem., 255:8121-8127に述べられる方法に基づく。ウシ甲状腺を20mM Tris HCl、1mM EDTA、pH 7.4で細切する。細切した組織を単一速度VWRブレンダーで1分間ホモジナイズして、続いて、チーズクロスに通して濾過する。次に、ホモジネートを1000×gにて4℃で10分間遠心分離して、ペレットを廃棄する。上清を回収して、10000×gにて4℃で30分間、遠心分離する。得られたペレットを20mM Tris HCl、1mM EDTA、pH 7.4に再懸濁して、続いて10000×gで30分間、再度遠心分離する。ペレットを再懸濁して、18000×gにて30分間、遠心分離する。これをもう1回反復実施してもよく、製造業者の説明書に従ってBioRad Protein Assayを用いて定量した後、ペレットを0.25Mショ糖、20mM Tris HCl、1mM EDTA、pH 7.4において1.25mg/mlの最終濃度まで再懸濁する。この甲状腺調製物をブレンダーに短時間かけ、等分割した後、−70℃よりも低い温度で保存する。
【００６６】
膜をベースとするTSH比活性アッセイ-
参照試料および被験試料を3段階のレベルで分析する。1.25mM EDTA、0.125mM BSA、25μl テオフィリン、62.5μM 5'-グアニリル-イミドジホスフェート中にTSHの20ng、60ng、または180ngを含む試料80μlにウシ甲状腺膜調製物（前記）の20μlを加える。17.4mM クレアチンホスフェート、12.5mM クレアチンホスホキナーゼ、2.5mM ATP、6.25mM塩化マグネシウム、25mM Tris HCl、pH 7.8。試料をボルテックスして、30℃にて20分間インキュベートし、5分間煮沸した後、15分間、氷冷水で冷却する。製造業者の推奨（NEN）に従ってRIAによりサイクリックAMPを定量する。
【００６７】
TSH反応性細胞株の増殖および維持-
TSHレセプターおよびcAMP反応性ルシフェラーゼレポーターを安定的にトランスフェクトされたCHO細胞株をInterthyr Corporation（Athens, OH, U.S.A.）から入手する。細胞は、1ml当たり10％FBS、2mM L-グルタミン、100単位ペニシリンおよび100pgストレプトマイシンを含むHam's F12培地で培養した。培養物は、5％COの大気下にて加湿細胞インキュベーター内で増殖させる。細胞は、90〜100％集密に達した時点で継代する。
【００６８】
細胞をベースとするTSH力価アッセイ-
96ウェル組織培養プレート（Costar）（外側のウェルを除いて）中の成長培地に、ウェル当たり30000個の細胞を播種して、培地を加える。プレートを加湿5％COインキュベーターで17〜19時間、インキュベートした。成長培地を、0〜60pg/ml rhTSHを含むHanks液（HBSS）中0.4％BSAと交換する。前記の膜をベースとする比活性アッセイを用いて、ヒトTSH参照標準（WHO 841703, National Institute for Biological Standards and Controls, Potters Bar, U.K.）に対して試験された、この参照物質に対して公称比活性5.3IU/mgを付与した。陽性対照（60μg/ml rhTSH）および陰性対照（0μg/ml rhTSH）は6つのウェルで試験し、参照物質および試料の曲線は20μg/ml〜0.0012μg/ml rhTSHの範囲に及ぶ。参照物質および試料の各レベルは3つ組のウェルにて試験する。プレートは加湿5％CO2インキュベーター内で6時間、インキュベートする。細胞内ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイ試薬キット（Promega, Madison, WI, U.S.A.）を用いて製造業者の推奨に従って測定する。発光は、Wallac Microlumat Plus LB 96 Vルミノメーターで測定した。
【００６９】
実施例2A：ラットにおける骨減少症の治療
体重約300g、4カ月齢の72匹の雌性Sprague-Dawleyラットをこの試験に使用した。実験中、ラットは20×32×20cmのケージで標準的条件（24℃、12時間/12時間、明/暗周期）にて飼育した。すべての動物に、飲水、ならびに1kg当たり1.00％カルシウム、0.65％リン、および2.40KIU ビタミンD3を含有する市販の固形飼料（Harlan Teklad）を自由に与えた。-14日および-4日に動物にカルセイングリーン標識投与計画（15mg/kg i.p.）を行った結果、活性な骨形成表面に二重蛍光色素標識が沈着した。
【００７０】
12匹の動物に偽手術を行い、60匹には腹部アプローチにより両側性に卵巣を切除した（OVX）。処置は、卵巣切除後直ちに次の通り開始した：（1）SHAM（偽手術）；（2）OVX+ビヒクルを毎日；（3）OVX+0.7μgチロトロピンを毎日；（4）OVX+7μgチロトロピン；（5）OVX+70μgチロトロピンを毎日；（6）OVX+17βエストラジオールを週3回。動物は（DEXA分析前に）8週間処置された。この試験で用いたThyrogen（登録商標）の比活性は7IU/mgであった。
【００７１】
動物は、治療開始前およびその後は8週間の治療中2週間毎に、小動物ソフトウェアを備えた二重エネルギー吸収測定法（DXA, HOLOGIC QDR-4000）を用いてスキャンした。スキャン前に動物をチオペンタール（Nycomed）で麻酔した。
【００７２】
全身スキャンを行って、腰椎、後肢、全身、および頭部を除く全身の骨塩密度（BMD）、骨塩量（BMC）を測定した。
【００７３】
採尿のため、動物を代謝ケージに収容して、18時間の一晩、飼料を除去した。血液は眼窩静脈叢から採取した。血液および尿は、治療開始時およびその後は8週間の治療期間中2週間毎に採取した。
【００７４】
屠殺は、治療開始8週後にエーテル麻酔下にて開始した。組織診断のために骨を採取した。
【００７５】
屠殺後、大腿骨、脛骨および腰椎を回収してスキャンし、骨全体およびその一部のBMDおよびBMCを測定した。
【００７６】
図6〜8は、それぞれ、全身、後肢および腰椎の2、4、6および8週時のBMD分析の結果を示す。後肢（股関節を含む）のBMD分析の結果、低用量（0.7μg/ラット）のThyrogen（登録商標）はOVXの2週および4週に比較して6週および8週にBMDを増加させ、6週には統計学的に有意なレベルに達した。Thyrogen（登録商標）は、6週の時点で椎骨のBMDにもはっきりと影響することができる。より高い用量（70μg/ラット）において、Thyrogen（登録商標）は同化作用性よりもより吸収性であると思われる。副甲状腺ホルモン（PTH）と同様に、Thyrogen（登録商標）は骨リモデリングに対して二相性の作用を示し得る可能性が高い。図9〜12は、骨のエクスビボにおけるDEXA測定の結果を示す。結果は、OVX動物に比較して、ヒトチロトロピンの0.7および7μgを投与した動物では近位および遠位大腿骨のBMDの統計学的に有意な増加を実証する。脛骨および腰椎のBMDは一定の傾向を示したが、チロトロピン治療群およびOVX動物の間に統計学的な差はなかった。エクスビボにおけるDEXA測定値から、ヒトチロトロピンの0.7および7μgを投与した動物では近位大腿骨のBMDが偽手術の値に達することが示された。実験群間に体重における顕著な差はなく、副作用は認められなかった。
【００７７】
実施例2B：ラットTSHを用いたラットにおける骨減少症の治療
本質的に同一の投与計画に従った同様の試験がOVXラットにおいて天然のラットTSHを用いて実施された。ラットTSHは、ラット体内での甲状腺による甲状腺ホルモン産生刺激において、ヒト組換え型TSHに比べて極めて効果的（10〜20倍）であるため、ラット当たり0.01、0.1、0.3μgの用量を用いた。比活性約90IU/mgのラットTSHをScripps Instituteから入手した。インビボにおける骨塩のモニタリングならびに血清および尿の生化学的分析は本質的に実施例3Aに記載する通りに実施された。この試験の結果から、インビボにおける全身、後肢および腰椎BMDの分析、ならびにエクスビボにおける近位大腿骨および近位脛骨のBMDの分析、ならびにマイクロCT解析によって調べられる骨梁体積、骨梁数、骨梁幅、皮質幅および骨塩量によって調べられる卵巣切除に伴う骨喪失の予防において天然のラットTSHが有効であることが示された。さらに、血清コラーゲンC-テロペプチド分析の減少は、TSHが抗吸収活性を持つことを示唆した。予想通り、ラットTSHはヒトTSHよりも低い濃度において有効であった。
【００７８】
実施例3A：インビボにおける治療効果の特徴付け
生化学アッセイ-
デオキシピリジノリン架橋結合およびクレアチニン（それぞれ、DPDおよびCr）の尿中濃度は、Metrobiosystems（Mountain View, CA, USA）のラットELISAキットを用いて2つ組にて分析する。オステオカルシン（OSC）の血清中濃度は、Biomedical Technologies（Stroughton, MA, USA）のラットサンドイッチELISAキットを用いて測定する。製造業者のプロトコールに従い、すべての試料は2つ組にて分析する。各キットから標準曲線を作成して、この標準曲線から絶対濃度を求める。
【００７９】
右近位脛骨骨幹端は、さらなる試料調製物を使用せずに、デスクトップ型μCT（μCT20；Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland）を用いて3つの空間的次元全てにおいて26μmの分解能で画像化する（Laib et al. (2001) Osteoporos. Int., 12:936-941）。スキャンは成長板から遠位方向に26μm刻みで開始して、1回のスキャンで合計120枚のスライスとする。この領域から、成長板の下方端の遠位1mmの距離から始まって長さ1.56mmの部分を含むスライス60枚を評価のために選択する。骨梁および皮質域は、半自動的に描かれる輪郭で分離される。
【００８０】
近位脛骨の完全な二次的海綿骨を評価して、それによって、単一切片の確率差異によって生じる試料採取誤差が完全に避けられる。ノイズを除去するために低域フィルターを用いて得られるグレースケールの画像を分割して、石灰化した骨相を抽出するために固定閾値を使用する。バイナリ化した画像から、骨梁のための三次元（3D）技術を用いて構造的指標を評価する。
【００８１】
相対的骨体積、骨梁数、骨梁幅、および骨梁間隔は、骨梁組織網において3Dの距離を直接測定し全ボクセルを通しての平均値を取ることによって算出する。
【００８２】
骨表面積は四面体メッシング技術から算出する。微少量の構造表面積を置換することによって、構造モデル指数（SMI）を算出する。SMIは骨梁のプレート-柱特性を量的に示して、この場合、SMI 0は純粋にプレート形の骨を示し、SMI 3は純粋に柱様の骨を示し、中間の値はプレートと柱の混合体を示す。さらに、オイラー数に基づく結合性を求める。加えて、骨の3D正六面体ボクセルモデルを構築して、皮質幅を測定する。
【００８３】
骨形態計測法-
右近位脛骨をエタノール中で脱水処理して、メタクリル酸メチルに脱灰せずに包埋して、Leica/Jung 2065ミクロトームを用いて長軸方向に4および8μmの厚さで薄切する。4μmの切片は光学顕微鏡による骨量および構造データの採取のためにフォン・コッサ（von Kossa）およびトルイジンブルーで染色して、8μmの切片は蛍光色素をベースとする指標の測定のために未染色のままとする。静的および動的な組織形態計測は、透過光および蛍光を備えた顕微鏡に接続した半自動画像解析装置であるOsteoMeasure System（OsteoMetrics Inc., Decatur, GA, USA）を用いて、またはSkeletech（Seattle, WA, USA）により実施される。
【００８４】
8mm2を測定して海綿質骨および骨髄のみを含む計測ウィンドウを組織形態計測分析のために作成する。静的測定には、総組織面積、骨面積および骨周囲長が含まれる。動的測定には、一重および二重標識周囲長、類骨周囲長、および標識間幅が含まれる。これらの指標は、骨体積、骨梁数、骨梁幅および骨梁間隔、類骨表面積、石灰化表面積、および石灰沈着速度（MAR）を算出するために用いられる。類骨体積は別に測定され、海綿質骨の体積には含められない。石灰化遅延日数（MLT）は類骨幅/MARとして算出される。最後に、面をベースとする骨形成速度（BFRBS）は、石灰化表面（一重標識表面/2+二重標識表面）にMARを掛けて算出される。
【００８５】
機械的性質検査-
個々の骨梁の組織分布的画像化および別個の機械的性質の測定のため、修正原子間力顕微鏡（AFM; Nanoscope IIIa；Digital Instruments, Santa Barbara, CA, USA）が用いられる。修正は、顕微鏡のカンチレバー／チップ部の、顕微鏡を画像化および圧入装置の双方として操作できるようにするトランスデューサー方式のヘッドおよびチップ（Triboscope; Hysitron, Minneapolis, MN, USA）との交換からなる。この分離圧入の詳細な変更は他で詳細に記載されている。圧入はすべて、三角負荷プロファイル時間0.3mm/s、最大負荷300μNにて実施する。弾性係数および硬度は、最大負荷時の無負荷力/変位勾配およびこの負荷時の投影接触面積から算出される。次に、この装置は、接触モードにおいてAFMチップに小さな正弦の力を適用して、得られる変位振幅およびその位相のズレを力に関して測定することによって表面トポグラフィーならびに貯蔵弾性率（storage modulus）および損失弾性率（loss modulus）双方の同時測定を可能とする動的剛性画像化を実施するようにさらに改良される。これらの量は、チップによって骨の表面全体がスキャンされたことから、粘弾性特性をピクセル単位で求めるために用いられる。この試験において、損失弾性率は貯蔵弾性率の5％よりも小さいことが認められ、従って、本発明者らは、貯蔵弾性率は弾性係数と概ね等しいと考えた（小粘弾性効果）。
【００８６】
骨形態計測法に使用したメチルメタアクリレートに包埋した右近位脛骨の骨幹端試料（厚さ約3mm）を、滑らかな骨表面が露出するまで（おおよそナノメーターの粗さ）まで漸進性に細かくなるグレードのダイアモンドペースト（0.1μmまで）を用いて、片面をさらに研磨する。各標本の異なる骨梁について長軸方向および横軸方向の双方でAFM計測を実施する。4処置群（偽手術、OVX、およびTSH）の各群から3つの右近位脛骨骨幹端試料について試験する（骨標本当たり約20の骨梁）。弾性係数および硬度は、試料の末端に交差する線に沿って2mmの間隔で、測定する各骨梁について少なくとも30mmの長さににわたって、圧入することによって得られる。
【００８７】
実施例3B：ラットにおける骨回復試験
TSHが骨に対して同化作用を持つことを確認するために、回復試験が実施された。TSHの投与が16週まで延長された点を除いて、本質的に実施例2Bにおいて記載された同様の用量および投与計画に従って、卵巣切除後7カ月、天然ラットTSHを投与した。
【００８８】
12匹の動物に偽手術を行い、48匹は腹部アプローチにより両側性に卵巣を切除した（OVX）。処置は、卵巣切除6週後に次の通り開始した：（1）SHAM（n=12）；（2）OVX+ビヒクル（n=12）；OVX+0.01μg（n=12）；（3）OVX+0.1μg（n=12）；および（4）OVX+0.3μg（n=12）。
【００８９】
インビボおよびエクスビボにおける骨塩密度のモニタリングならびに血清および尿の生化学的分析は本質的に実施例3Aに記載する通りに実施された。骨を喪失させるため、8カ月齢のラットを卵巣切除した後、7カ月間、放置した。その後、治療を開始して16週間継続し、BMDをインビボおよびエクスビボの双方で測定して、マイクロCTおよび血清生化学検査を実施した。
【００９０】
結果は以下を示した：
（1）TSHは0.1および0.3μg/ラットの濃度でインビボにおいて後肢のBMD値を増加させ、一方、最低試験用量である0.01μg/ラットは12および16週の時点で測定可能な効果を惹起しなかった（図14）；
（2）DEXAにより測定される通り、エクスビボにおける近位大腿骨BMDは0.3μgの用量で増加し、遠位および総大腿骨BMD値は若干増加した（図13および15）；
（3）エクスビボにおける脛骨および腰椎BMD値も増加し、特に0.1および0.3μg/ラットの用量で増加した（図16および17）；
（4）エクスビボにおける骨梁のマイクロCT分析の結果、長骨および脊椎の骨体積は試験した3用量すべてで処置した動物において増加した（図18）；
（4）骨梁幅（マイクロCTによって測定される）は偽手術および卵巣切除ラットの値を上回って有意に増加した（図19）；
（5）骨梁数もマイクロCTによって測定されるように増加したが、加齢動物であったために程度は骨梁幅よりも軽度であった（図20）；
（6）0.1および0.3μg/ラットの双方の用量とも皮質幅を増加させ、0.1μg/ラットの用量は偽手術動物の値を10％近く、また卵巣切除ラットを14％上回った（図21）；ならびに
（7）T3およびT4の血清中濃度の測定可能な増加はなかった（図示せず）。
【００９１】
これらの結果は実施されたもう一つの試験と一致し、この試験ではラットTSHが0.1μg/ラットで卵巣切除ラットにおいて使用された。
【００９２】
実施例4：TSHRアゴニストを用いたヒトの治療
この実施例は、ヒトにおけるTSHRアゴニストを用いた骨粗鬆症の治療に関する有望な治験について記載する。被験者は、甲状腺機能正常、または脊椎骨折歴（一つより多い）があり既にFosomax（登録商標）（アレンドロネート）またはSERM（ラロキシフェン）を投与されて循環チロトロピンの低い甲状腺機能異常の閉経後女性から選択される。TSHRアゴニスト、例えば、チロトロピンまたはその類似体は全身性（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経口、または経皮経路）に投与される（例えば、毎日、週1回、2週に1回）。被験者はTSHRアンタゴニストまたはプラセボの用量I（低用量）または用量II（高用量）を投与され、それらは全身性に有効となるであろう。
【００９３】
ベースラインおよび試験終了までに（観察期間中央値、24カ月）椎骨X線写真を撮影する。6カ月毎の二重エネルギーX線吸収測定法による骨量（BMD）の連続的測定が実施されるであろう。骨形成および骨吸収に関する生化学マーカーは3〜6カ月毎に血液および尿において測定される。被験者は、試験の完了期間中、もしあれば、その後の骨折（椎骨および椎骨以外の双方）についてモニターされる。
【００９４】
Thyrogen（登録商標）を用いた閉経後骨粗鬆症の治療は、椎骨および椎骨以外の骨折のリスクを減少させ、椎骨、大腿骨および全身の骨塩密度を増加させ、さらに良好な耐容性が期待される。
【００９５】
データは、登録後に少なくとも1回の経過観察を受けたすべての女性について分析される。3試験群における副作用の率および骨折の見られる女性の割合を、ピアソンのカイ二乗検定を用いて比較する。すべての検査データおよび骨塩測定値は分散分析によって評価され、治療割付および国に関する項目が含められる。統計学的検定は両側検定とする。
【００９６】
本明細書は、本明細書内に引用される参考文献の教示に照らして最大限十分に理解される。本明細書の態様は本発明の態様の例証を提供するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。当業者は、多くのその他の態様が本発明によって包含されることを容易に認識する。本開示に引用されるすべての刊行物、特許および生物学的配列は参照によってそれらの全体が組み入れられる。参照によって組み入れられる資料が本明細書と矛盾するまたは一致しない限り、本明細書はこのような任意の資料に取って代わるであろう。本明細書における任意の参照の引用は、このような参照が本発明の先行技術であることの承認ではない。
【００９７】
特記する場合を除いて、特許請求の範囲を含めて本明細書で用いられる成分、細胞培養、投与条件等の量を表すすべての数値は、「約」という用語によってすべての場合において修正されることが理解されるべきである。従って、そうでないことが示される場合を除いて、数的パラメータは概算値であり、本発明によって得ようとされる所望の特性に応じて変化し得る。特記する場合を除いて、一連の要素の前にある「少なくとも」という用語は一連のものの中のすべての要素を示すことが理解されるべきである。当業者は、ごく定型の実験を用いて、多くが本明細書に記載される本発明の具体的態様と同等であることを認識し、または確認することができるであろう。このような同等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図1Aおよび1Bは、ヒトチロトロピンα（図1A）およびβ（図1B）のサブユニットのアミノ酸配列を示す。3つの公知のN結合型グリコシル化部位をアステリスクで示す。システインノット構造のジスルフィド架橋を形成するシステインは黒で強調されている。112アミノ酸産物を生じるβサブユニットにおけるC末端の6つのアミノ酸の切断を生じるタンパク質分解性切断部位は矢印で示される。βヘアピンループには一本線の下線が引かれている；αヘリックスには二重下線が引かれている；βC88〜βC105の「シートベルト」構造には点線の下線が引かれている。
【図２】生物活性に関連している複数のドメインおよび点変異を示すチロトロピンの三次構造を示す。（図は、Leitolf et al. (2000) J. Biol. Chem., 275:27457-65に示される通りである。）αサブユニットの骨格は灰色の線で示し、βサブユニット鎖は黒い線で示す。機能的に重要なドメインは次のように表示される：末端のβヘアピンループはαサブユニットではαL1、αL3として表示され、βサブユニットではβL1、βL3として表示される；2つの長いループはαヘリックス構造を持つαL2、およびβL2である。丸はアミノ酸残基の位置を示し（αL1のα13、α14、α16およびα20；αL3のα64、α66、α73およびα81；βL3のβ58、β63およびβ69）、ヒトチロトロピンでは塩基性残基との置換によって生物活性が亢進する。βヘアピンループには一本線の下線が引かれている；αヘリックスには二重下線が引かれている；βC88〜βC105の「シートベルト」構造には点線の下線が引かれている。
【図３】図3A、3Bおよび3Cは、チロトロピン上のN結合型糖の代替構造を示す。黒いダイヤ印はN-アセチルグルコサミンを示す；黒丸はマンノースを示す；黒い四角はフコースを示す；斜線のある丸印はN-アセチルガラクトサミンを示す；斜線のダイヤ印はガラクトースを示す；SO4は硫酸化した糖を示し、NeuAcはシアル酸化した糖を示す。図3Aはウシチロトロピンの代表的なオリゴ糖構造を示す。図3Bは、下垂体由来ヒトチロトロピンの代表的なオリゴ糖構造を示す。図3Cは、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた組換え型チロトロピンの代表的なオリゴ糖構造を示す。
【図４】図4Aおよび4Bは、チロトロピンα（図4A）およびβ（図4B）サブユニットに関する複数の種由来のアミノ酸配列のアライメントを示す。
【図５】様々な種に由来する多くの整列されたアミノ酸配列を示す。整列された領域は、ヒトチロトロピンαサブユニットのアミノ酸10〜28に相当する。
【図６】生体における全身の骨塩密度（BMD）分析の結果を示す。ラットを卵巣切除（OVX）し、手術後最長8週間の期間、ラット当たりThyrogen（登録商標）の0.7、7または70μgまたはエストロゲンで処置した。BMD分析は2週毎に実施した。アステリスクはOVX群に対する統計学的有意差を示す。
【図７】後肢のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図８】腰椎のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図９】エクスビボで実施された大腿骨近位領域のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図１０】エクスビボで実施された大腿骨遠位領域のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図１１】エクスビボで実施された脛骨全体のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図１２】エクスビボで実施された腰椎のBMD分析の結果を示す。動物は図6に示す通り処置した。
【図１３】骨修復試験からのインビボにおける全身BMDの二重エネルギーX線吸収測定法（DEXA）の結果を示す。ラットは卵巣切除して、手術7カ月後から開始して16週間継続してラットTSHの0.01、0.1または0.3μg（記載の通り）を処置した。
【図１４】インビボにおける後肢BMDのDEXA分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図１５】エクスビボにおける近位大腿骨BMDのDEXA分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図１６】エクスビボにおける遠位脛骨BMDのDEXA分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図１７】エクスビボにおける腰椎BMD分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図１８】骨体積/骨梁体積（BV/TV)分析のマイクロCT分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図１９】骨梁幅のマイクロCT分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図２０】骨梁数のマイクロCT分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【図２１】皮質幅のマイクロCT分析の結果を示す。動物は図13に示す通り処置した。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列に関する簡単な説明
配列番号：1は、図1Aに示す通り、ヒトチロトロピンのαサブユニットのアミノ酸配列である。配列番号：2はヒトチロトロピン前駆体のαサブユニットをコードするヌクレオチド配列である。73〜351のヌクレオチド残基は配列番号：1をコードする。配列番号：3は、図1Bに示す通り、ヒトチロトロピンのβサブユニットのアミノ酸配列である。配列番号：4はヒトチロトロピン前駆体のβサブユニットをコードするヌクレオチド配列である。61〜417のヌクレオチド残基は配列番号：3をコードする。配列番号：5は、ヒトチロトロピンのアミノ酸10〜28に対応するαサブユニットのL1ループにおける一般的アミノ酸配列である（図5を参照されたい）。配列番号：6〜43は、ヒトチロトロピンのアミノ酸10〜28に対応するαサブユニットのL1ループにおける、様々な種に由来するアミノ酸配列である（図5を参照されたい）。配列番号：44は、図4Aに示されるアラインメントに基づく全長チロトロピンαサブユニットの一般的配列である。配列番号：45〜56は、様々な種に由来するαサブユニットチロトロピンのアミノ酸配列である。配列番号：57は、図4Bに示されるアラインメントに基づく全長チロトロピンβサブユニットの一般的配列である。配列番号：58〜66は、様々な種に由来するβサブユニットチロトロピンのアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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