(57)【要約】  ａ）ヌクレオシド三リン酸以外の試験化合物を提供し、ｂ）試験化合物を細胞中の野生型ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、ｃ）試験化合物を細胞中のＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、ｄ）試験化合物を反応動力学的逆転写酵素アッセイにかけ、そして該アッセイ中で取り込まれたヌクレオチドに対して競合的である試験化合物を識別し、工程ｂ）でも同様に活性であり、工程ｃ）で活性であり、そして工程ｄ）で取り込まれたヌクレオチドに対して競合的であると識別される試験化合物を選択する工程、を含んでなる新クラスのヌクレオチド競合ＲＴインヒビターを識別する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレオシド三リン酸以外の試験化合物を提供し、
ｂ）試験化合物を細胞中の野生型ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｃ）試験化合物を細胞中のＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｄ）試験化合物を反応動力学的逆転写酵素アッセイにかけ、そして該アッセイ中で取り込まれたヌクレオチドに対して競合的である試験化合物を識別し、
工程ｂ）でも同様に活性であり、工程ｃ）で活性であり、そして工程ｄ）で取り込まれたヌクレオチドに対して競合的であると識別される試験化合物を選択する工程、
を含んでなる新クラスのヌクレオチド競合ＲＴインヒビターを識別する方法。
【請求項２】
ａ）ヌクレオシド三リン酸以外である試験化合物を提供し、
ｂ）野生型ＨＩＶウイルスの複製を阻害する抗ＨＩＶ化合物を選択し、
ｃ）工程ｂ）で選択された化合物をＮＮＲＴＩ耐性ウイルス株に対して試験し、そして該ウイルス株の複製を阻害する化合物を選択し、
ｄ）ｃ）で選択された化合物を反応動力学的酵素アッセイにかけ、そして該アッセイで競合的である化合物を選択する工程、
を含んでなる請求項１記載の方法。
【請求項３】
ａ）ヌクレオシド三リン酸以外の試験化合物を提供し、
ｂ）試験化合物を細胞中の野生型ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｃ）試験化合物を細胞中のＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｄ）試験化合物を反応動力学的逆転写酵素アッセイにかけ、そして該アッセイで競合的な試験化合物を識別し、
ｅ）工程ｂ）でも同様に活性であり、工程ｃ）で活性であり、そして工程ｄ）で競合的であると識別される試験化合物を選択し、
ｆ）ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素（ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込む）、を含んでなる反応ウェルを提供し、そして
テンプレート中に取り込まれた検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｇ）ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸、
少なくとも１種のＲＴ酵素（ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込む）、を含んでなるもう１つの反応ウェルを提供し、そして
テンプレート中に取り込まれた検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｈ）工程ｆ）及び工程ｇ）で得られたＲＴ活性を比較し、
ｉ）工程ｅ）の基準を満たし、そしてｇ）で得られるＲＴ阻害活性がｆ）で得られるＲＴ阻害活性を超える試験化合物を選択する工程（ここで工程ｆ）及びｇ）におけるＨＩＶのＲＴインヒビターの量は同じで、ＲＴ活性の増加が測定可能であるようなものである）、を含んでなる、リボヌクレオチド又はピロリン酸感受性でそしてヌクレオチド競合的である、新クラスのＲＴインヒビターを識別する方法。
【請求項４】
工程ｂ）及びｃ）が連続的に実施される、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
工程ｂ）及びｃ）が平行に実施される、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項６】
工程ｂ）及びｃ）が工程ｆ）及びｇ）が工程ｆ）及びｇ）に先駆けて連続して実施される、請求項３〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
工程ｆ）及びｇ）が平行に実施される請求項６の方法。
【請求項８】
工程ｆ）及びｇ）で決定されるＲＴ活性が特定のパーセントの阻害濃度、とりわけＩＣ５０又はＩＣ９０値である請求項３〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
ヌクレオシドリン酸がＡＴＰ及びＧＴＰから選択される請求項３〜８のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は知られた逆転写酵素インヒビターと異なって作用する特別なクラスのＨＩＶ逆転写酵素の競合的インヒビターを識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶウイルス感染症を治療するために現在市場で販売されている又は開発中の薬剤は、逆転写酵素インヒビター（ＲＴＩ）、プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）及びより最近の融合インヒビターのようなクラスに属する。ＲＴＩは逆転写酵素機構を妨げることによりウイルスの複製を抑制し、他方、ＰＩはウイルスのアッセンブリーに介入する。ＲＴインヒビターはウイルスの複製がブロックされるようにその機能を阻害する多数の方法でＲＴ酵素と相互反応する。ＰＩはウイルスのプロテアーゼ酵素の活性部位に結合し、それにより感染性ヴィロンの構造的及び酵素の成分を生成するために必要な前駆体のポリタンパク質の切断を阻害する。
【０００３】
「ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）」は逆転写酵素による伸長するウイルスＤＮＡ中への取り込みのための天然のヌクレオシド三リン酸と競合するヌクレオシド三リン酸に細胞内で転化されるＲＴインヒビターのクラスである。これらの化合物を天然のヌクレオシドから区別する化学的修飾物がＤＮＡのチェインターミネーション事象をもたらす。現在入手できるＮＲＴＩはジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄｌ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エムトリシタビン（ＦＴＣ）及びテノフォビル及びテノフォビルジソプロキシルフマレート（ＴＤＦ）を包含し、後者はしばしば、「ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（ＮｔＲＴＩ）」と呼ばれる。
【０００４】
逆転写酵素の機能はＨＩＶのＲＮＡをＤＮＡに転化させることである。この過程で、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が増殖ＤＮＡに結合される。ＮＲＴＩのようなチェインストッパーが最初に細胞キナーゼにより三リン酸（ＴＰ）に転化される。例えば、識別された最初のＨＩＶのＲＴインヒビターの１つであったＡＺＴはＡＺＴ−ＴＰに転化され、次にＨＩＶ−１のＲＴがウイルスのＤＮＡの構築における有効な代替基質としてＡＺＴ−ＴＰを使用することができる。しかし、ＡＺＴ−ＴＰは更なるＤＮＡ伸長に必要な３’ＯＨを欠き、それにより、取り込み後の増殖ＤＮＡチェインのターミネーションを誘起する。逆の過程、すなわちチェインのヌクレオチドの除去又はＡＺＴのようなチェインターミネーション残基の除去が、ピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸により仲介され、同様にしかしずっと低い程度に起る。この逆の過程はＨＩＶ突然変異体において促進され、それが野生型ＲＴよりずっと高い効力を伴ってチェインターミネーション残基を除去する能力を増加する。この機序は例えば、非特許文献１中に記載のようなＡＺＴ又は他のいずれかのＮＲＴＩに対する突然変異ＨＩＶの耐性の原因と認められる（非特許文献１参照）。
【０００５】
この逆過程のために、インビトロのＲＴ試験モデルへのピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸の添加は、とりわけ突然変異ＲＴが使用される時、試験されるＮＲＴＩの阻害活性を減少させる。しかし、幾つかのＮＲＴＩはＲＴ活性の最少の減少のみを示すか、又は幾つかのＮＲＴＩによりＲＴ活性は同一レベルに留まることすらある。
【０００６】
現在入手できるＨＩＶ薬剤に対するＨＩＶウイルスの耐性が治療の失敗の主要な原因であり続ける。これが、通常、異なる活性プロファイルを有する２種以上の抗−ＨＩＶ剤の組み合わせ治療の導入をもたらした。「ＨＡＡＲＴ」治療（高度活性抗−レトロウイルス
治療）の導入により著しい進歩がもたらされ、それにより処置されたＨＩＶ患者人口における罹患率及び死亡率の著しい減少をもたらした。ＨＡＡＲＴはＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ及びＰＩの種々の組み合わせを伴う。抗レトロウイルス治療に対する最近の指針は初期の処置に、このような３種組み合わせ治療計画を推奨する。しかし、これらの多剤治療はＨＩＶを完全には排除せず、長期の処置が通常、多剤耐性をもたらす。とりわけ、抗−ＨＩＶ組み合わせ治療を受けている患者の半数は、主として、使用される１種以上の薬剤に対するウイルスの耐性のために処置に完全には応答しない。更に、耐性ウイルスは新規感染個体に継代され、それが、これらの薬剤に新規の患者に対して極めて限定された治療選択肢をもたらすことが示された。
【０００７】
その結果、ＨＩＶに対して有効な薬剤組み合わせ物中に使用のための新タイプの有効成分の継続的需要が存在する。従って、化学構造及び活性プロファイルの異なる、新タイプの抗−ＨＩＶの有効な活性成分を提供することは著しく望ましい、達成すべき目標である。逆転写酵素は興味深い標的であり続け、そしてこの酵素のインヒビターはＨＡＡＲＴ組み合わせ物の欠くべからざる部分である。新機序によりこの酵素の機能を阻害する物質を発見することは、近年使用されるＮＲＴＩ及びＮＮＲＴＩの代替物を提供することが期待される。とりわけ後者はこのクラス全体にわたり交差耐性を引き起こす突然変異体に悩む。しかし程度は小さいが、ＮＲＴＩもまた、突然変異体による耐性に直面する。ＮＲＴＩが比較的弱い交差耐性を示す事実は、ポケット中に構造的変化を引き起こす突然変異がすべてのＮＮＲＴＩを無効にさせるような同様な結合ポケットと明らかにすべて反応するＮＮＲＴＩに比較して、ＲＴとのより複雑な相互反応により説明される。従って、ＮＲＴＩ様動態を有するが化学的に異なる化合物を発見することは、交差耐性に感受性が低く、そして異なる突然変異体を選択する薬剤をもたらすことが期待される。このような化合物は薬剤カクテル中にＮＮＲＴＩ及び／又はＮＲＴＩの代替物としての使用を見出すことができると考えられる。
【０００８】
本発明は、それらが、現在知られているＮＲＴＩ又はＮＮＲＴＩに比較して逆転写酵素と異なって相互反応する、新クラスに属するＨＩＶのＲＴインヒビターを識別する方法を目的とする。この新クラスのＲＴインヒビターに属する化合物はＮＲＴＩ又はＮＮＲＴＩの現在のクラスのどちらにも属さず、従って、これらのクラスに属する薬剤の代替物としての使用を見出し、とりわけそれらは抗ＨＩＶ薬剤組み合わせ物中への使用を見出すかも知れない。
【０００９】
更に、インビトロ試験モデルにおいてピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸を添加されると、幾つかのＲＴインヒビターは予期されなかったことには、活性の増加を示すことが見いだされた。前記のように、これまでのところ、ＲＴ活性の減少又は同一レベルが認められただけである。その結果、このような活性増加を示す化合物はＲＴ酵素と異なって相互反応し、従って新クラスのＲＴインヒビターに属すると考えられる。本発明は更に、ピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸が添加される時に、取り込まれたヌクレオチドに対して競合的であるのみならずまた、増加した活性を示す化合物を検出することを目的とする。
【非特許文献１】Ｇｏｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，ｐｐ．３５７９−３５８５
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、
ａ）ヌクレオシド三リン酸以外の試験化合物を提供し、
ｂ）該試験化合物を細胞中の野生型ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｃ）試験化合物を細胞中のＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｄ）試験化合物を反応動力学的逆転写酵素アッセイ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓａｙ）にかけ、そして該アッセイ中で取り込まれたヌクレオチドに対して競合的である試験化合物を識別し、
工程ｂ）でも同様に活性であり、工程ｃ）で活性であり、そして工程ｄ）で競合的であると識別される試験化合物を選択する工程、
を含んでなる新クラスのヌクレオチド競合ＲＴインヒビターを識別する方法を提供する。
【００１１】
更なるアスペクトにおいて、本発明は、
ａ）ヌクレオシド三リン酸以外の試験化合物を提供し、
ｂ）該試験化合物を細胞中の野生型ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｃ）試験化合物を細胞中のＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶウイルス複製試験にかけ、
ｄ）試験化合物を反応動力学的逆転写酵素アッセイにかけ、そして該アッセイで競合的な試験化合物を識別し、
ｅ）工程ｂ）でも同様に活性であり、工程ｃ）で活性であり、そして工程ｄ）で競合的であると識別される試験化合物を選択し、
ｆ）ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素（ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込む）、を含んでなる反応ウェルを提供し、そして
テンプレート中に取り込まれた検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｇ）ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸、
少なくとも１種のＲＴ酵素（ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込む）、を含んでなるもう１つの反応ウェルを提供し、そして
テンプレート中に取り込まれた検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｈ）工程ｆ）及び工程ｇ）で得られたＲＴ活性を比較し、
ｉ）工程ｅ）の基準を満たし、そしてｇ）で得られたＲＴ阻害活性がｆ）で得られたＲＴ阻害活性を超える試験化合物を選択する工程（ここで工程ｆ）及びｇ）中のＨＩＶのＲＴインヒビターの量は同等で、ＲＴ活性の増加が測定可能であるようなものである）、
を含んでなる、リボヌクレオチド又はピロリン酸感受性で、且つヌクレオチド競合的な、新クラスのＲＴインヒビターを識別する方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に、本明細書及び請求の範囲内に開示されたいずれかの特徴物の種々の組み合わせ物又は準組み合わせ物に関する。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の方法の工程ｂ）におけるような抗ＨＩＶ化合物の選択は野生型ＨＩＶウイルスによるインビボアッセイを使用して実施することができる。ウイルスの複製の阻害は、特定の百分率の細胞がＨＩＶウイルスで感染されることを防御するために必要な試験化合物の濃度であるＥＣ値を測定することにより決定することができる。それぞれ５０％又は９０％の細胞がＨＩＶウイルスで感染することを防御するために必要な試験化合物の濃度であるＥＣ５０又はＥＣ９０値を決定することができる。他の百分率のＥＣ値を決定することはできるが、通常は、ＥＣ９０、そしてとりわけＥＣ５０値が好ましい。これらの値は知られた方法を使用して測定することができる。
【００１４】
１つのこのような方法は、ＨＩＶで感染した時に検出可能な信号を送ることができる細胞に基づく。この方法に使用される細胞は好ましくは、ＨＩＶ感染に高度に感受性で、許容性である。検出可能な信号は放射性標識、蛍光、発光又は吸収分光分析のような生化学又は生物学的試験で使用されるあらゆる信号であってもよい。検出可能な信号はまた、細胞壊死のような細胞内の特定の事象又は細胞のＨＩＶ感染に伴うあらゆる他の信号を包含する。検出可能な信号は直接に又は間接的に測定することができる。特定の態様において、細胞はＨＩＶに感染されると検出可能な信号を送るように操作されている。
【００１５】
１つの態様において、細胞はＧＦＰ及びＨＩＶ特異的プロモーターで操作されており、進行中のＨＩＶ感染を蛍光光度測定することができる。細胞毒性は同様な細胞中で測定されるが、構成的プロモーター下のＧＦＰで操作されている。ＨＩＶ感染細胞の感染（又はその阻害）及び擬似感染細胞の蛍光は２種の前記のタイプの細胞により発生される蛍光ＧＦＰ信号により測定される。使用することができる細胞は、標的細胞株として働く、ＨＩＶ感染に著しく感受性で、許容性であることが以前に示された（Ｋｏｙａｎａｇｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３６，４４５−４５１，１９８５）、ＨＩＶ−１形質転換Ｔ４−細胞、ＭＴ−４を包含する。ＧＦＰ（及びＨＩＶ特異的プロモーター）で操作されたこれらの細胞中で、進行中のＨＩＶ感染は蛍光光度法により測定される。この態様は抗ＨＩＶ剤のインビトロの評価のために使用することができる、早急な、感受性のそして自動化されたアッセイ法を提供する。
【００１６】
５０％有効濃度（ＥＣ５０）のような有効濃度値を決定することができ、通常μＭで表わされる。その場合、ＥＣ５０値は５０％だけＨＩＶ感染細胞の蛍光を減少する試験化合物の濃度と定義される。５０％細胞毒性濃度（μＭにおけるＣＣ５０）は５０％だけ擬似感染細胞の蛍光を減少させる試験化合物の濃度と定義される。ＥＣ５０に対するＣＣ５０の比率は選択性指数（ＳＩ）と定義される。測定は、感染の約５日後に通常起る細胞の壊死前に実施され、とりわけ測定は感染の３日後に実施される。
【００１７】
もう１つの態様において、測定はＨＩＶウイルスの細胞変性効果に基づく。５０％有効濃度（ＥＣ５０）又は９０％有効濃度（ＥＣ９０）のような有効濃度値は５０％又は９０％のような特定の百分率の細胞をウイルスの細胞変性効果から防御するために必要な試験化合物の量を表わす。好ましくは、ＥＣ５０値が使用される。
【００１８】
この方法において、ＨＩＶ又は擬似感染ＭＴ４細胞を種々の濃度の試験化合物の存在下で数日間、通常５日間インキュベートする。インキュベート期間後、すべてのＨＩＶ感染細胞をあらゆる阻害試験化合物の不在下で対照培養物中でウイルスを複製することにより殺す。細胞の生存率を例えば、生存細胞のみのミトコンドリア中の、紫の非水溶性フォルマザンに転化される黄色の水溶性テトラゾリウム染料、ＭＴＴの濃度を測定することにより、標準法により測定する。生成されるフォルマザン結晶をイソプロパノールで可溶化すると、溶液の吸収を５４０ｎｍでモニターする。値は５日間のインキュベートの終結時に培養物中に残留する生存細胞数に正比例する。化合物の阻害活性はウイルス感染細胞上でモニターされ、ＥＣ５０又はＥＣ９０値として表わされた。これらの値は５０％及び９０％それぞれの細胞をウイルスの細胞変性効果から防御するために必要な化合物の量を表わす。試験化合物の毒性は擬似感染細胞上で測定され、５０％だけ細胞の増殖を阻害するために必要な試験化合物の濃度を表わすＣＣ５０として表わされる。選択性指数（ＳＩ）（ＣＣ５０／ＥＣ５０の比率）もまた決定され、それは試験化合物の抗ＨＩＶ活性の選択性の指標である。結果はまた、例えばＥＣ５０又はＥＣ９０それぞれとして表わされる結果の負の対数のｐＥＣ５０又はｐＣＣ５０値として報告することができる。
【００１９】
工程ｂ）で得られる試験結果は、試験化合物が野生型ＨＩＶウイルスの複製を阻害する
のに有効であるか否かを見るために評価される。野生型ＨＩＶウイルス複製阻害における試験化合物の有効度は、有効度の閾値であると考えられる一定のＥＣ５０値より小さい一定の試験化合物のＥＣ５０値を決定することにより評価することができる。この閾値は約１００μＭに配置することができ（ｐＥＣ５０は約４である）、好ましくは、それは約３２μＭに配置することができる（ｐＥＣ５０は約４．５である）。
【００２０】
野生型ウイルスは種々の源、例えば、ＬＡＩ株又はＨＸＢ２株であることができる。
【００２１】
本発明の方法の工程ｃ）におけるような抗ＨＩＶ化合物の選択は、工程ｂ）におけるものと同様なタイプのアッセイを使用して、しかしＮＮＲＴＩに対して耐性である突然変異ＨＩＶウイルスを使用して実施される。工程ｂ）におけるようにウイルスの複製の阻害は、特定の百分率の細胞がＨＩＶウイルスで感染されることを防御するために必要な試験化合物の濃度であるＥＣ値を測定することにより決定することができる。それぞれ５０％又は９０％の細胞がＨＩＶウイルスで感染することを防御するために必要な試験化合物の濃度であるＥＣ５０又はＥＣ９０値を決定することができる。他の百分率のＥＣ値を決定することはできるが、通常は、ＥＣ９０、そしてとりわけＥＣ５０値が好ましい。これらの値は知られた方法、とりわけ工程ｂ）に関して説明されたような方法を使用して測定することができる。
【００２２】
使用することができる突然変異ＨＩＶ株はＮＮＲＴＩに耐性のＨＩＶ株である。概括的にこれは、突然変異ＨＩＶ感染細胞中でＨＩＶ阻害効果を試験する時に、野生型感染細胞による同様な試験に比較すると、ＮＮＲＴＩである試験化合物の有効濃度が増加されるにちがいないことを意味する。好ましくは、突然変異ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶ阻害効果を試験する時に、野生型感染細胞による同様な試験における同様な試験の有効濃度に対する、ＮＮＲＴＩである試験化合物の有効濃度の比率は１より大きい、とりわけ約４以上であり、好ましくは、約１０以上である。該有効濃度又はＥＣ値は特定の百分率におけるＥＣ値として、とりわけＥＣ５０又はＥＣ９０値として表わすことができる。好ましいものはＥＣ５０値である。
【００２３】
本明細書で使用される用語「ＮＮＲＴＩ」はそれらに限定はされないが、ネビラピン、デラビルジン、エファヴィレンズ、８及び９−Ｃｌ  ＴＩＢＯ（チヴィラピン）、ロビリド、ＴＭＣ−１２５、４−［［４−［［４−（２−シアノエテニル）−２，６−ジフェニル］アミノ］−２−ピリミジニル］アミノ］−ベンゾニトリル（ＴＭＣ２７８）、ダピビリン（Ｒ１４７６８１又はＴＭＣ１２０）、ＭＫＣ−４４２、ＵＣ７８１，ＵＣ７８２、カプラヴィリン、ＱＭ９６５２１、ＧＷ４２０８６７Ｘ、ＤＰＣ９６１、ＤＰＣ９６３、ＤＰＣ０８２、ＤＰＣ０８３、カラノリドＡ、ＳＪ−３３６６、ＴＳＡＯ、４”−脱アミノ化ＴＳＡＯ、ＭＶ１５０、ＭＶ０２６０４８、ＰＮＵ−１４２７２１を含んでなる当該技術分野で知られた非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターの群を表わす。
【００２４】
ＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶ株の例は、それらに限定はされないが、表１に挙げた１種又は複数の突然変異体を担持するＨＩＶ株を含んでなる。これらの突然変異体はＮＮ−逆転写酵素インヒビターに対する耐性を伴い、現在知られているＮＮＲＴＩに耐性を示すウイルスをもたらす。
【００２５】
表２は表１で挙げたもの以外に存在する可能性がある突然変異体を挙げる。これらの変異体自体はＮＮＲＴＩに耐性を引き起こさないが、表１の突然変異体の効果を強化することが知られている。
【００２６】
表３はＨＩＶ中に存在すると強力な耐性をもたらす多数の突然変異体を挙げる。変異株は臨床的に単離されたウイルス株又はサイトで変異したウイルス株（すなわち１種又は複
数の突然変異体が誘導された野生型株）であることができる。
【００２７】
【表１】
2008528047.tif 000002
【００２８】
【表２】
2008528047.tif 000003
【００２９】
【表３】
2008528047.tif 000004
【００３０】
本発明の方法の工程ｃ）に使用のために好ましいものは表３に挙げた突然変異体をもつウイルス株である。特に興味深いものは、Ｋ１０３Ｎ及びＹ１８１Ｃ突然変異体を含有する株である。
【００３１】
工程ｄ）におけるような反応動力学的酵素アッセイは試験化合物が競合的ＲＴインヒビターであるか否かを決定するために使用され、ＨＩＶのＲＴインヒビターの阻害機序が野生型ＨＩＶのＲＴ又は突然変異ＲＴタンパク質を使用する動力学から決定される酵素の反応動力学的アッセイである。例えば、ミカエリス定数、Ｋｍ、酵素インヒビター複合物の解離定数、Ｋｉ及び阻害の機序は基質、ＲＴインヒビター及び／又は他の試薬の種々の濃度におけるデータを、ミカエリス−メンテンの競合阻害式、ミカエリス−メンテンの非競
合阻害式及びミカエリス−メンテンの不競合阻害式に当てはめることにより決定することができる。ミカエリス−メンテンの競合阻害式を使用して最良の適合が得られる場合は、該インヒビターはヌクレオチド競合ＲＴインヒビターである。考えられる適用に応じて、当該技術分野で知られた他のあらゆる反応動力学的分析を本発明の方法とともに使用することができる。
【００３２】
工程ｂ）、ｃ）及びｄ）は任意の一定の配列で実施することができ、それらは連続して、又は平行に実施することができる。連続的に実施される時は工程ｂ）を最初に、次に工程ｃ）、そして次に工程ｄ）又はその反対に実施することができる。他の工程を双方の工程の実施の前又は後に実施しながら、工程の２種又は３種すべてを平行に実施することができる。好ましい実施において、最初に工程ｂ）を実施し、次に工程ｃ）、そして次に工程ｄ）を実施する。
【００３３】
試験を簡素化するために、工程ｂ）で活性な化合物を選択して試験ｃ）を実施し、その後、試験ｃ）で活性である化合物のみを試験ｄ）にかける。従って本発明の好ましい態様はａ）ヌクレオシド三リン酸以外である試験化合物を提供し、
ｂ）野生型ＨＩＶウイルスの複製を阻害する抗ＨＩＶ化合物を選択し、
ｃ）ＮＮＲＴＩ耐性ウイルス株に対して工程ａ）で選択された化合物を試験し、そして該ウイルス株の複製を阻害する化合物を選択し、
ｄ）ｂ）で選択された化合物を反応動力学的酵素アッセイにかけ、そして該アッセイで競合的である化合物を選択する工程：を含んでなる、新クラスのヌクレオチド競合ＲＴインヒビターを識別する方法である。
【００３４】
ヌクレオシド三リン酸である化合物は本発明の方法の工程ａ）に明記されたように廃棄しなければならない。これらは天然のヌクレオシドの三リン酸又は、ＮＲＴＩ三リン酸のようなそれらの誘導体のいずれかを含んでなり、とりわけこれらは逆転写酵素により伸長しているウイルスＤＮＡ中への取り込みのための天然のヌクレオシド三リン酸と競合するあらゆる三リン酸を含んでなる。１つの態様において、天然のヌクレオシド又は一、二又は三リン酸を包含するそれらの誘導体のいずれかの、あらゆるヌクレオシドリン酸（ヌクレオチド）は本発明の方法中の工程ａ）で排除される。
【００３５】
本発明は新クラスに属するＨＩＶのＲＴインヒビターを検出するための、早急で、直接的でそして安価な方法である、インビトロ試験を提供する。
【００３６】
更なるアスペクトにおいて、本発明は「リボヌクレオチド又はピロリン酸感受性でそしてヌクレオチド競合的」ＲＴインヒビターとして指定することができる、また更なるクラスのＲＴインヒビターを識別する方法を提供し、ここで該方法は前記の工程ａ）〜ｉ）を含んでなる。
【００３７】
本方法においてヌクレオシドリン酸はリボヌクレオシドリン酸、リボヌクレオシド二リン酸及びリボヌクレオシド一リン酸を包含し、そして更にデオキシリボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド二リン酸ト及びデオキシリボヌクレオシド一リン酸並びにリボヌクレオシドチオ又はイミノ誘導体のリン酸エステルのようなそれらの誘導体を包含することができる。リボヌクレオシド三リン酸はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰから選択することができ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰから選択することができる。リボヌクレオシド一又は二リン酸はＡＭＰ、ＡＤＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰから選択することができる。デオキシリボヌクレオシド一又は二リン酸はｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＭＰ、ｄＧＤＰ、ｄＵＭＰ、ｄＵＤＰ、ＴＤＰ、ＴＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＣＤＰから選択することができる。リボヌクレオシドチオ又はイミノ誘導体のリン酸エステルは例えば、ＡＴＰｂｇＮ
Ｈ（アデノシン５’（ベータ、ガンマ、イミド）三リン酸）、ＡＴＰｇＳ（アデノシン５’［ガンマ−チオ］三リン酸）を包含する。特に興味深いものは、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＡＴＰｂｇＮＨ、ＡＴＰｇＳ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰである。
【００３８】
ヌクレオシドリン酸がデオキシリボヌクレオシド三リン酸である場合、検出可能なｄＮＴＰ基質は好ましくは、もう１つの核酸から誘導される。本発明における使用に好ましいものはＡＴＰ又はＧＴＰであり、もっとも好ましいものはＡＴＰである。ピロリン酸又はＰＰｉはアルカリ金属ピロリン酸のようなピロリン酸塩、とりわけピロリン酸ナトリウムであることができる。
【００３９】
本発明の方法において、工程ｂ）及び工程ｃ）の成分は任意の一定の順序で試験ウェルに添加することができる。それらは１種ずつ又は混合物中に合わせてグループとして添加することができる。とりわけＲＴ酵素は最初に反応ウェルに添加することができ、次に他の成分を添加するか又は他の成分を最初に添加することができ、その後ＲＴ酵素を反応ウェルに添加する。更に１種又は複数の成分を添加し、次にＲＴ酵素、次に残りの成分を添加することもできる。
【００４０】
このように、１つの態様において、アッセイはＨＩＶのＲＴ酵素のテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び試験化合物を含んでなる反応ウェルを提供する。次にＨＩＶのＲＴ酵素を反応ウェルに添加し、そこでＨＩＶのＲＴ酵素が検出可能なｄＮＴＰ基質をテンプレートに取り込む。試験化合物のＲＴ阻害活性を測定する。試験化合物はもう１つの試験を受け、そこでＨＩＶのＲＴ酵素のテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質、試験化合物及び、ＡＴＰ及びＧＴＰのようなヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含んでなるもう１つの反応ウェルが提供される。次に野生型ＨＩＶのＲＴ酵素を反応ウェルに添加し、そこでＨＩＶのＲＴ酵素が検出可能なｄＮＴＰ基質をテンプレート中に取り込む。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下での試験化合物のＲＴ阻害活性を測定し、ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含まない試験で得られた結果と比較する。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下での試験化合物のＲＴ阻害活性が、ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の不在下での試験で得られたＲＴ阻害活性を超える化合物が選択される。
【００４１】
本発明のもう１つの態様において、アッセイはＨＩＶのＲＴ酵素が反応ウェル中に存在し、そしてテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質、ＨＩＶのＲＴインヒビター及びアッセイの第２の部分におけるヌクレオシドリン酸又はピロリン酸がＨＩＶのＲＴ酵素に添加されるように実施される。
【００４２】
工程ｆ）、ｇ）、ｈ）及びｉ）を包含する方法において、工程ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｆ）及びｇ）を平行に又は連続して実施することができ、それは平行する又は連続的の実行のどんな組み合わせも実施することができることを意味する。例えば、５工程すべてを平行して実施することができるか又は５工程すべてを任意の一定の順列で連続して実施することができる、すなわちある工程は平行して、そして他は連続して、例えば、工程ｂ）、ｃ）及びｄ）は連続して、次に又はその前に工程ｆ）及びｇ）を平行して等、のように実施することができる。
【００４３】
工程ｆ）、ｇ）、ｈ）及びｉ）を包含する方法は特定の試験化合物に対するＲＴ酵素活性の感受性の変化に基づく。感受性は概括的にＡＴＰ又はＧＴＰのようなヌクレオシドリン酸あるいはピロリン酸の存在下及び不在下におけるＲＴ酵素活性のＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率として表わすことができる。他のＩＣ百分率の比率も可能である。感受性は概括的にＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率として表わされる。
【００４４】
ＩＣ５０又はＩＣ９０値はそれぞれ５０％又は９０％の酵素活性が阻害される試験化合物濃度である。これらの値は標準法を使用して決定される。
【００４５】
例えばＡＴＰ及びＧＴＰから選択されるヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下で測定されるＲＴ酵素活性のＩＣ値に対する、ヌクレオシドリン酸、例えばＡＴＰ及びＧＴＰ又はピロリン酸の存在下で測定されるＲＴ酵素活性のＩＣ値の比率は１を超えなければならず、好ましくは該比率が３を超えなければならず、より好ましくはそれは５を超えなければならない。とりわけ該比率はＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率である。
【００４６】
本発明は新クラスに属するＨＩＶのＲＴインヒビターを検出するためのインビトロの、早急なそして安価な方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法は特に、高い処理量の試験又は評価装置に適用できる。しかし、各反応物が相互から単離されたままで留まるようなサンプルラック又は多数の反応ウェルから形成された固形支持体を調製することは本発明の実施の範疇内にある。次に１種又は複数の試薬の反応ウェルへの同時の移動は高い処理量の分析の当該技術分野で使用される多数の技術の１つにより実施することができる。
【００４８】
工程ｅ）、ｆ）、ｇ）及びｈ）を包含する方法において、各反応ウェルの１種又は複数の内容物は変更することができる。例えば、１つの態様において、各反応ウェルはＨＩＶのＲＴインヒビターのためのテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び、野生型ＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素であることができるＨＩＶのＲＴ酵素を含有する。例えば、ピロリン酸のＡＴＰ又はＧＴＰから選択されるヌクレオシドリン酸は各反応ウェルに添加されるか又は添加されない。反応ウェルはアレーを形成しても又は各コンパートメントを識別又は処置するもう１つの手段を使用してもよい。次に各反応ウェルのＲＴ活性を各反応ウェルのテンプレート中に取り込まれた検出可能なｄＮＴＰ基質の量から決定し、記録することができる。その他の態様は、それらに限定はされないが、１種又は複数の成分の濃度、ＲＴ酵素を変更すること、及びヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を変更することを包含する。
【００４９】
高い処理量を操作する、すなわち比較的短期間に多数のサンプルを分析する多数の方法が存在する。利用できるあらゆる高い処理量の分析法を本発明の方法に適用することができる。例は、それらに限定はされないが、「官能ピペットサンプルを有する分析装置」と題するＳａｋａｚｕｍｅ等の米国特許第５，９８５，２１５号明細書、「微量規模の流動装置中の高処理スクリーニングアッセイシステム」と題するＰａｒｃｅ等の米国特許第６，０４６，０５６号明細書、「検体の急速スクリーニングの方法」と題するＰａｕｗｅｌｓ等の国際公開第００／１４５４０号パンフレット、「連続フォーマット高処理スクリーニング」と題するＢｅｕｔｅｌ等の国際公開第９９／３０１５４号パンフレット及び「細胞に基づくスクリーニングアッセイを実施するための高処理法、システム及び装置」と題するＷａｄａ等の国際公開第９９／６７６３９号パンフレット、を包含する。
【００５０】
本発明の実施において、ＨＩＶのＲＴ酵素に対して有効なテンプレートとして役立つと考えられるあらゆるテンプレートを使用することができる。テンプレートは反応ウェルに結合してもしなくてもよいが、好ましい態様においては、反応ウェルに結合される。更なる好ましい態様において、テンプレートはポリ−ｒＡ又はヘテロポリマーＲＮＡ又はＤＮＡから選択される。選択されるテンプレートに相補的な任意のプライマーを使用することができる。１つの態様において、プライマーはオリゴ−ｄＴ又はヘテロポリマーテンプレートに相補的なプライマーから選択される。
【００５１】
本発明の実施に有用な検出可能なｄＮＴＰ基質は任意のｄＮＴＰ基質、そして好ましい
態様においてはテンプレート中への取り込み前及び／又はその後に検出可能な、任意のｄＴＴＰ基質（デオキシチミジン三リン酸）を包含する。検出可能なｄＮＴＰ基質は、それらに限定はされないが、放射性標識ｄＴＴＰ又は任意の放射性標識ｄＮＴＰ及び蛍光、発光又は吸収分光分析により検出可能なｄＮＴＰ基質を包含する。検出可能なｄＮＴＰ基質はそれ自体で検出可能であるか又は、次に検出されることができるトレーサーに結合させることができる。トレーサーは蛍光、発光又は吸収分光分析により検出することができるトレーサーのような光学的トレーサーであるか、あるいはトレーサーが放射性標識トレーサーであることができる。１つの態様において、検出可能なｄＮＴＰ基質はブロモ−デオキシウリジン−三リン酸であり、光学的トレーサーはｄＮＴＰ基質に結合するアルカリホスファターゼに共役結合された、抗体又は、モノクローナル抗−ＢｒｄＵ抗体のようなモノクローナル抗体である。
【００５２】
本発明の方法に使用のための試験化合物は任意の天然の、天然に誘導された又は人工の物質であることができる。本範疇内に使用される用語「試験化合物」は単一の化合物又は化合物の混合物を表わす。
【００５３】
工程ｅ）、ｆ）、ｇ）及びｈ）を包含する方法において、本発明の方法に使用のための反応ウェルは、例えばＡＴＰ及びＧＴＰから選択される少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸を含有してもしなくてもよい。リボヌクレオチド又はピロリン酸の濃度は考慮される適用に応じて変動することができる。例えば、インビボのピロリン酸（ＡＴＰと一緒の）の影響は明らかに細胞内濃度に左右される。好ましい態様において、ＡＴＰに対しては３．２±１．５ｍＭ、ＧＴＰに対しては０．５±０．２ｍＭ、そしてピロリン酸に対しては１３０μＭにおいて、十分に確立されている細胞内濃度が使用される。
【００５４】
本発明の方法は野生型ＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素を使用することにより開始することができる。テンプレート中に検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込むことができる任意のＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素は本発明の実施に有用であることができる。
【００５５】
本発明はまた、キットを提供する。キットは本明細書に記載のいずれかの方法に使用することができ、とりわけキットはヌクレオチド競合ＲＴインヒビターを選択するために使用することができる。本発明のキットはＨＩＶのＲＴ酵素のテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び、例えば、ＡＴＰ及びＧＴＰから選択されるリボヌクレオシド三リン酸又はピロリン酸を含んでなることができる。キットは更に突然変異体ＲＴ酵素及び／又は野生型ＲＴ酵素を含んでなることができる。
【００５６】
工程ｅ）、ｆ）、ｇ）及びｈ）を包含する方法において、本発明の方法は野生型ＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素を使用して実施することができる。テンプレート中に検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込むことができる任意のＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素は本発明の実施に有用であることができる。
【００５７】
本発明の方法は高処理量の試験又は評価装置中への使用を見いだすことができる。しかし、各反応物が相互から単離されたまま留まるようなサンプルラック又は、多数の反応ウェルから形成された固形の支持体を調製することは本発明の実施の範疇内にある。次に１種又は複数の試薬の反応ウェルへの同時の移動を高処理量の分析の当該技術分野に使用される多数の技術の１つにより達成することができる。
【００５８】
本発明の方法に使用のための試験化合物は任意の天然の、天然誘導の又は人工の物質であってもよい。本範疇内に使用される用語「試験化合物」は単一の化合物又は化合物の混合物を表わす。
【００５９】
本発明に従う方法はＮＲＴＩにもＮＮＲＴＩのクラスにも属さない「ヌクレオチド競合ＲＴインヒビター（ＮＣＲＴＩ）」と呼ばれる新クラスに属するＲＴインヒビターである化合物の検出を許す。後者の用語はＲＴ酵素中のいわゆるＮＮＲＴＩ「ポケット」と相互反応する化合物を含んでなるために当該技術分野で使用される。すべての現在のＮＮＲＴＩは、このクラスのＨＩＶインヒビター全体に対する交差耐性のみならずまた、不活性化突然変異体の比較的早急な出現を引き起こすと考えられる同様な疎水性ポケット中で結合することが見いだされた。しかし、程度は少ないが、ＮＲＴＩも突然変異体による耐性に直面する。ＮＲＴＩが弱い交差耐性を示す事実は、ＮＮＲＴＩに比較してＲＴとの更に複雑な相互反応により説明される。
【００６０】
この新クラスの化合物はそれらが、ＮＲＴＩのクラスと構造的に異なるが、それらが天然のヌクレオシド三リン酸と競合する点でＮＲＴＩ様動態を示す点でユニークである。それらはＮＲＴＩ及びＮＮＲＴＩを免れるＨＩＶ突然変異体で感染した患者における代替処置として使用することができるか又は抗ＨＩＶ剤組み合わせ物中への使用を見いだすことができる。
【００６１】
工程ｈ）、ｇ）ｈ）及びｉ）を包含する方法は、もう１つのクラス、すなわちＮＲＴＩにもＮＮＲＴＩのクラスにも属さず、そして更にヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下で増加したＲＴ阻害活性を示すヌクレオチド競合ＲＴインヒビターに属するＨＩＶインヒビターを検出するために使用することができる。以下の説に限定されることは望まないが、ヌクレオシドリン酸（ＡＴＰのような）又はピロリン酸はまた、酵素の機能が阻害されるようにＲＴ酵素に結合するが、このような化合物はＲＴ酵素中でＮＲＴＩと同様な位置で相互反応することが推定される。これが酵素の二重のブロックをもたらすので、本発明の方法により検出される化合物はＨＩＶのＲＴ酵素の非常に有効なブロッカーであると考えられる。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の同時投与を伴わなくとも、ＡＴＰのようなヌクレオシドリン酸は細胞血漿（ｃｅｌｌ  ｐｌａｓｍａ）中に存在するので、この効果は役割を果たすことができる。
【００６２】
本発明は更に本明細書に記載の新クラスのＨＩＶのＲＴインヒビターに属する化合物を識別するための、化合物のスクリーニング法を提供する。
【００６３】
本明細書に引用されるすべての参考文献、特許及び特許出願物はそれら全体を引用することにより取り込まれている。
【００６４】
以下の実施例は具体的表示により提供され、本発明を限定する意図はもたれない。
【００６５】
実施例
【実施例１】
【００６６】
試験化合物を以下の方法に従って実施される細胞アッセイにおいて抗ウイルス活性につき試験する。
【００６７】
ＨＩＶ−又は擬似感染ＭＴ−４細胞を種々の濃度の試験化合物の存在下で５日間インキュベートした。インキュベート期間の最後に、対照培養物中の複製ウイルスはあらゆるインヒビターの不在下ですべてのＨＩＶ−感染細胞を殺した。細胞生存率を、生存細胞のみのミトコンドリア中の紫の水不溶性フォルマザンに転化される黄色の水溶性テトラゾリウム染料、ＭＴＴの濃度を測定することにより決定した。生成されるフォルマザン結晶をイソプロパノールで可溶化して、溶液の吸収を５４０ｎｍでモニターする。値は５日間のインキュベートの終結時に培養物中に残留する生存細胞数に正比例する。化合物の阻害活性はウイルス感染細胞上でモニターされ、ＥＣ５０及びＥＣ９０値として表わされた。これらの値はそれぞれ５０％及び９０％の細胞をウイルスの細胞変性効果から防御するために必要な化合物の量を表わす。化合物の毒性は擬似感染細胞上で測定され、５０％だけ細胞の増殖を阻害するために必要な試験化合物の濃度を表わすＣＣ５０として表わされた。選択性指数（ＳＩ）（ＣＣ５０／ＥＣ５０の比率）は、インヒビターの抗ＨＩＶ活性の選択性の指標である。結果が例えば、ｐＥＣ５０又はｐＣＣ５０値として報告される場合はいつも、結果は、ＥＣ５０又はＥＣ９０それぞれとして表わされる結果の負の対数として表わされる。
【００６８】
化合物１は４５ｎＭの野生型ＨＩＶ−１（ＬＡＩ株）上のＥＣ５０を有する。
【００６９】
化合物１は国際公開第０４／０４６１４３号パンフレットに記載され、構造
【００７０】
【化１】
2008528047.tif 000005
【００７１】
を有する化合物である。
【実施例２】
【００７２】
試験化合物を更にＮＮＲＴＩインヒビターに対する耐性をもたらす幾つかの突然変異体を担持するＨＩＶ株に対するそれらの効力につき試験した（表１及び７）。試験化合物を実施例１に示したものと同様な試験法にかけたが、野生型ウイルスをＮＮＲＴＩインヒビターに耐性の突然変異ウイルスにより置き換えた。
【００７３】
化合物１はＫ１０３Ｎ及びＹ１８１Ｃ変異体を含有する野生型ＨＩＶ−１（ＨＸＢ２）の部位特異的突然変異体上で９８ｎＭのＥＣ５０を有する。
【実施例３】
【００７４】
酵素反応動力学的研究
酵素反応動力学的研究を４×５マトリックスの変動する基質及び４０〜３μＭの範囲のｄＴＴＰに対するインヒビター濃度及び２〜０μＭの化合物１を伴うプロトコールを使用して実施した。
【００７５】
反応混合物（５０μｌ）は更に５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭのジチオスレイトール、３００ｍＭのグルタチオン、５００μＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭのテンプレート／プライマー・ポリ（ｒＡ）オリゴ（ｄＴ）及び０．０６％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有した。反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、その時点で、１００μｌのコウシ胸腺ＤＮＡ（１５０ｐｇ／ｍｌ）、２ｍｌのＮａ４Ｐ２Ｏ７（１ＭのＨＣｌ中０．１Ｍ）及び２ｍｌのトリクロロ酢酸（１０％ｖ／ｖ）を添加した。溶液を氷上に３０分間維持し、その後、酸不溶性物質を洗浄し、放射能を分析した。反応速度の逆数（１／ｖ）を化合物１の異なる濃度の存在下で基質濃度の逆数（１／［ｄＴＴＰ］）に対してプロットし、グラフ（図１参照）を得る。
【００７６】
すべての線がＹ−軸との切片において交わるので、この化合物がＨＩＶのＲＴ阻害の競合モードを有することは明白である。
【実施例４】
【００７７】
ＡＴＰ存在下及び不在下におけるＨＩＶ逆転写酵素のインビトロの阻害
僅かな修飾を伴い製造業者の指示に従いキットＴＲＫ１０２２ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してアッセイを実施した。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中に１／４に次第に希釈し、次に培地Ａ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％コウシ胎仔血清、２０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン）中に１／５０に希釈した。
【００７８】
各実験において、３種の条件を試験した：２５μｌの前記の化合物溶液を満たしたウェル、２５μｌの培地Ａ（Ｒ０）中２％ＤＭＳＯで満たしたウェル及び培地Ａ（Ｒ１）中１００μｌのＳｔｏｐｓｏｌｕｔｉｏｎ及び２５μｌのＤＭＳＯを満たしたウェル。各ウェルに２５．５μｌのマスターミックッス（５μｌのプライマー／テンプレートビード、１０μｌのアッセイバッファー、０．５μｌのトレーサー（５０μＭ［３Ｈ］−ｄＴＴＰ）、５μｌのＨＩＶのＲＴ酵素溶液（１５ｍＵ／μｌ）、５μｌ培地Ａ）を添加した。プレートをシールし、３７℃で４時間インキュベートした。次に１００μｌの停止溶液を各ウェル（Ｒ１を除く）に添加した。放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭ中で計測した。
【００７９】
ＡＴＰの存在下での試験化合物阻害に対しては前記と同様なプロトコールを使用したがマスターミックス中の培地Ａを３２０ｍＭのＡＴＰを含有する培地Ａと置き換えた。
【００８０】
前記のアッセイを使用してＡＴＰ不在下の化合物１のＩＣ５０は０．３μＭであり、他方ＡＴＰ存在下の化合物１のＩＣ５０は０．０１６μＭである。
【実施例５】
【００８１】
実施例１の方法を繰り返したが、ＡＴＰを多数の他のヌクレオシドリン酸により変更した。以下の表は試験されたヌクレオシドリン酸及び関与したヌクレオシドリン酸の存在下で得られた化合物１のμＭのＩＣ５０値を示す。
【００８２】
ＡＴＰｇＳはアデノシン５’［ガンマ−チオ］三リン酸［ＣＡＳ９３８３９−８９−５］であり、そしてＡＴＰｂｇＮＨはアデノシン５’［ベータ、ガンマ、イミド］三リン酸［ＣＡＳ７２９５７−４２−７］である。
【００８３】
【表４】
2008528047.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】反応速度の逆数（１／ｖ）を、化合物１の異なる濃度の下で、基質濃度の逆数（１／［ｄＴＴＰ］）に対してプロットしたものである。
【図１】
2008528047.tif 000007
【国際調査報告】
2008528047.tif 000008
2008528047.tif 000009
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