(57)【要約】  以下の工程を含む、サンプル中の１本鎖標的ポリヌクレオチドの存在を同定する方法：（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも第１および第２のポリヌクレオチドプローブと接触させ、それぞれのプローブは標的ポリヌクレオチドのオーバーラップせずに隣接する領域に相補的である第１の領域を含み；（ii）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたそれらの第１および第２のポリヌクレオチドを互いにライゲートさせ；（iii）必要により、ライゲートしたポリヌクレオチドを増幅させ；および（iv）ライゲートしたポリヌクレオチドを検出することによって標的ポリヌクレオチドが元のサンプル中に存在するかどうかを判定し、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つは所定のポリヌクレオチド配列を有する第２の領域を含み、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域上の少なくとも２つのヌクレオチドで表され、ライゲートしたポリヌクレオチドは第１および第２のポリヌクレオチドプローブの少なくとも一方の第２の領域を決定することによって同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の１本鎖標的ポリヌクレオチドの存在を同定する方法であって、
（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも第１および第２のポリヌクレオチドプローブと接触させ、それぞれのプローブは標的ポリヌクレオチドのオーバーラップせずに隣接する領域に相補的である第１の領域を含み；
（ii）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたそれらの第１および第２のポリヌクレオチドを互いにライゲートさせ；
（iii）必要により、ライゲートしたポリヌクレオチドを増幅させ；そして
（iv）ライゲートしたポリヌクレオチドを検出することによって元のサンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在するかどうかを判定し、ここで第１および第２のポリヌクレオチドの少なくとも1つは所定のポリヌクレオチド配列を有する第２の領域を含み、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域上の少なくとも２つのヌクレオチドで表され、ライゲートしたポリヌクレオチドは第１および第２のポリヌクレオチドプローブの少なくとも一方の第２の領域を決定することにより同定される、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
第１および第２のポリヌクレオチドプローブがDNAである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１および第２のポリヌクレオチドプローブがRNAである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１の領域の塩基Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、およびＣのそれぞれが第２の領域中の２つの連続するユニットの組合せによって表され、各塩基が２つのユニットの異なる組合せによって表される、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１および第２のポリヌクレオチドプローブを蛍光成分で標識する、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ii）がリガーゼ活性に好適な条件下でリガーゼ酵素を添加することを含む、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ii）のライゲートしたポリヌクレオチドをポリメラーゼ反応で増幅する、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ポリメラーゼ反応が定量的であり、増幅したポリヌクレオチドの量をモニタリングする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
標的ポリヌクレオチドがRNAである、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
標的ポリヌクレオチドがDNAである、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
野生型配列と比較して１個以上のヌクレオチドが異なる標的ポリヌクレオチドを検出するための、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
欠失、挿入、または置換を検出するための、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
一塩基多型を検出するための、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
野生型標的配列を検出するための、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）が複数の同じまたは異なる第１および第２のポリヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドに結合させることを含む、請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標的ポリヌクレオチド上の少なくとも２つの標的配列の順序を同定する方法であって、
（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも第１および第２のポリヌクレオチドプローブと接触させ、それぞれのプローブは標的ポリヌクレオチドの隣接しない領域に相補的である第１の領域を含み；
（ii）ポリメラーゼ反応を行って少なくとも２つのプローブの間にヌクレオチドを導入し、それによって第３のポリヌクレオチドを形成し；そして
（iii）第３のポリヌクレオチドを検出することによって、標的ポリヌクレオチド上の２つの標的配列の順序およびそれらの間の距離を判定し、ここで第１および第２のポリヌクレオチドは所定のポリヌクレオチド配列を有する第２の領域を含み、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域上の少なくとも２つのヌクレオチドで表され、第１および第２のポリヌクレオチドプローブの第２の領域を検出することによって第３のポリヌクレオチド中のプローブの順序およびそれらの間の距離を同定する、
の各工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的ポリヌクレオチドの検出およびその配列の決定、特に標的ポリヌクレオチド中に存在する変異の特性決定の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、多くの障害が被験体のゲノム中に存在する変異に起因することが認識されている。障害の症状が明らかでない場合でも、特定の変異の存在が将来のある時点で障害が起こるリスクが高いことを示しうる。従って、特定の疾病に関係する変異の同定、および疾病の発症の可能性を予測する助けとなる診断試験の開発のために多くの研究がなされている。
【０００３】
多くの疾病関連変異が特性決定されてきたが、特定の被験体において特定の標的配列（特に変異を含むもの）の存在を測定するための有効かつ信頼性のある方法が今なお必要とされている。一般に変異の同定は、患者から得たゲノムDNAをシーケンシングし、配列情報を対照と比較することによって行う。
【０００４】
一般に大規模DNAシーケンシングに使用される主な方法はチェーン・ターミネーション法である。この方法はSangerおよびCoulsonによって最初に開発され（Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467）、４つのヌクレオチドのジデオキシ誘導体を使用し、それらがポリメラーゼ反応において新生ポリヌクレオチド鎖に導入されることに基づくものである。導入の際、ジデオキシ誘導体によってポリメラーゼ反応が停止され、その後ゲル電気泳動法によって生成物を分離し、分析を行って、特定のジデオキシ誘導体がどの位置で鎖に導入されたかを明らかにする。
【０００５】
この方法は広く使用され、信頼度のある結果が得られるが、時間と手間と費用がかかることが認識されている。
【０００６】
米国特許第5302509号は、固相支持体に固定化したポリヌクレオチドのシーケンシングを行う方法を開示している。この方法は、DNAポリメラーゼの存在下で、固定化されたポリヌクレオチドに異なる蛍光標識を有する3’-ブロッキングした塩基A、G、C、およびTを導入することに基づくものである。ポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基が導入されるが、3’-ブロッキング基によって更なる添加は阻止される。その後、導入された塩基の標識を判定し、化学的切断によってブロッキング基を除去し、それによって更なる重合を行うことができるようになる。しかしながら、このようにブロッキング基を除去しなければならないことは時間がかかり、また、高効率で行わなければならない。
【０００７】
多くの既存の技術に伴う更なる難点は、１つのゲノムに存在しうる複数の変異の特性決定を行うことができないことである。従って、１つのアッセイ操作で複数の変異の特性決定をすることができ、１つの点変異から全体的な染色体再配置まで、あらゆる変異を検出することができる方法があれば有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチド分子の存在の検出を、標的ポリヌクレオチドに少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、その少なくとも１つは標的配列に関する情報をコードしており、それらのプローブを連結させて、情報を含む単一のポリヌクレオチドを生成し、連結された産物を検出することによって行うことができるという認識に基づく。標的ポリヌクレオチドの配列は、連結されたポリヌクレオチド中の情報を解読することによって決定できる。
【０００９】
本発明の第一の観点によれば、サンプル中の１本鎖標的ポリヌクレオチドの存在を同定する方法は以下の工程を含む：
（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも第１および第２のポリヌクレオチドプローブと接触させ、それぞれのプローブは標的ポリヌクレオチドのオーバーラップせずに隣接する領域に相補的である第１の領域を含み；
（ii）標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたそれらの第１および第２のポリヌクレオチドを互いにライゲートさせ；
（iii）必要により、ライゲートしたポリヌクレオチドを増幅させ；そして
（iv）ライゲートしたポリヌクレオチドを検出することによって元のサンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在するかどうかを判定し、ここで第１および第２のポリヌクレオチドの少なくとも１つは所定のポリヌクレオチド配列を有する第２の領域を含み、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域上の少なくとも２つのヌクレオチドで表され、ライゲートしたポリヌクレオチドは第１および第２のポリヌクレオチドプローブの少なくとも１つの第２の領域を決定することによって同定される。
【００１０】
本発明の第２の観点により、標的ポリヌクレオチド上の配列順序を決定できる。この観点によれば、標的ポリヌクレオチド上の少なくとも２つの標的配列の順序を同定する方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも第１および第２のポリヌクレオチドプローブと接触させ、それぞれのプローブは標的ポリヌクレオチドの隣接しない領域に相補的である第１の領域を含み；
（ii）ポリメラーゼ反応を行って、少なくとも２つのプローブの間にヌクレオチドを導入し、第３のポリヌクレオチドを形成し；そして
（iii）第３のポリヌクレオチドを検出することによって、標的ポリヌクレオチド上の２つの標的配列の順序およびそれらの間の距離を判定し、ここで、第１および第２のポリヌクレオチドは所定のポリヌクレオチド配列を有する第２の領域を含み、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域上の少なくとも２つのヌクレオチドで表され、第１および第２のポリヌクレオチドプローブの第２の領域を検出することによって第３のポリヌクレオチド中のプローブの順序およびそれらの間の距離を同定する。
【００１１】
本発明は１つの反応で複数の標的分子の検出および複数の特定の変異の特性決定を行うことを可能とする。１つの点変異から全体的な染色体再配置まで、あらゆる変異を特性決定することができる。それぞれの変異に関する情報は、分析操作の最後に単離および特性決定することができる分子内にコードされている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明を使用して標的ポリヌクレオチドを検出し、標的ポリヌクレオチド内の変異を特性決定する。標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの別々の領域にハイブリダイズできる少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブと接触させる。ハイブリダイズしたプローブを共有結合させて標的ポリヌクレオチドに関する情報を含む単一のポリヌクレオチドを生成させ、その後これを検出および特性決定する。標的配列がサンプル中に存在しない場合、ハイブリダイゼーションは起こらず、プローブは検出されない。
【００１３】
多くの異なる標的配列にハイブリダイズするように設計された多数のポリヌクレオチドプローブを同時または逐次的にサンプルに添加することができる。好ましくはサンプルはゲノムDNAサンプルである。本発明の方法の実施によって、サンプルがプローブに相補的な標的配列を含むかどうかが同定される；２つ以上のプローブがハイブリダイズする標的配列ではそれぞれ、少なくとも２つのプローブを含む連結されたポリヌクレオチドが生成される。この方法により、１つのアッセイ操作で複数の変異を特性決定することができる。
【００１４】
“ポリヌクレオチド”という用語は当該分野で周知であり、一連の連結された核酸分子（例えばDNAまたはRNA）を表すのに用いられる。核酸模倣体、例えばPNA、LNA（ロックト核酸, locked nucleic acid）、および2’-O-methRNAも本発明の範囲内である。当業者に明白なように、最も一般的な標的ポリヌクレオチド源は被験体から採取したゲノムDNAである。オリゴヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせるためには、プローブおよび標的の両方ともハイブリダイゼーションの際に１本鎖でなければならない。
【００１５】
本明細書で使用する“塩基”という用語は、各核酸モノマー、Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、またはＣをいう。これらの略語はヌクレオチド塩基アデニン、チミン（ウラシル）、グアニン、およびシトシンを表す。ポリヌクレオチドがRNAの場合はチミンがウラシルで置き換えられるか、またはdUTPを用いてウラシルをDNAに導入でき、これも当該分野で周知である。
【００１６】
本明細書で使用する“変異体”という用語は、少なくとも１つのヌクレオチドが対照配列と異なる配列をいう。変異は１つ以上の特定の核酸塩基の置換、欠失、または挿入であってもよい。好ましくは本発明を用いてゲノムDNAフラグメント上に存在する１つ以上の一塩基多型（SNP）を同定する。本明細書で使用する“多型”という用語は、異なるゲノムまたは被験体間で２つ以上のゲノム配列または対立遺伝子が生ずることをいう。SNPは１つの塩基の変更である。一般にSNPは多型部位で１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されている。１つのヌクレオチドの欠失または１つのヌクレオチドの挿入も一塩基多型を生じさせる。
【００１７】
別の好ましい態様では、１塩基より広い範囲にわたる変異を検出する。
【００１８】
本発明は標的ポリヌクレオチドの別々のオーバーラップしない領域にハイブリダイズできるポリヌクレオチドプローブを必要とする。各プローブは同じサイズであってもよいし、あるいは異なるサイズであってもよい。好ましくは、プローブがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの領域は2から50塩基長、より好ましくは3から20塩基長である。
【００１９】
少なくとも２つのプローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。好ましくは2から10個のプローブ、最も好ましくは2、3、または4個のプローブがハイブリダイズする。ハイブリダイズした後に、プローブを互いに連結させて、プローブがハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドの配列に関する情報を含む単一のポリヌクレオチドを生成することができる。
【００２０】
各プローブは同じ標的配列に相補的であってもよい、すなわち、複数の単一プローブを標的配列に加えてもよいし、または異なる標的配列に相補的なプローブを加えてもよい。当業者に認識されるように、２つ以上の同じプローブを使用することによって標的配列ポリヌクレオチド中の配列反復の同定が可能となる。トリプレット反復がいくつかの遺伝病に関係しており、例えば脆弱性X症候群はＣＧＧトリプレット反復に関係し、筋強直性ジストロフィーはＣＴＧ反復に関係し、ハンチントン病はＣＡＧ反復に関係する。これらの疾病は一般に、罹患した個体における反復配列の数の増加を伴う。従って、反復配列にハイブリダイズするプローブを設計することが可能である。プローブは一つの反復（すなわちトリプレット反復の場合は３塩基）にハイブリダイズしてもよいし、あるいは複数の反復にハイブリダイズしてもよい。プローブのハイブリダイゼーションおよびその後の、プローブの連結によって生成される単一のポリヌクレオチドの特徴は、存在する反復の数を示し、従って反復配列の変化に関係する障害の診断に有用である。
【００２１】
あるいは、プローブは異なる標的配列に相補的であってもよい。これらは約１つの変異の領域にわたってもよく、またはそれぞれ異なる変異に相補的であって単一の連結されたポリヌクレオチドから複数の変異を同定することが可能であってもよい。標的ポリヌクレオチド中の変異の位置は既知であるかまたは予想されるが、変異の詳細が未知の場合、推測される変異部位にわたり、異なる配列を含む多くのプローブを添加してもよい。例えば特定のSNPについて、４つの異なるプローブ（それぞれが推測される変異部位に異なる塩基を含有する）を使用できる。標的に相補的なプローブだけがハイブリダイズし、ライゲートされる。したがって、ライゲートしたポリヌクレオチドの検出によって、推測される変異部位の配列が同定される。
【００２２】
標的ポリヌクレオチド中の変異の疑いがあるヌクレオチドがプローブ中の末端塩基と相補的であるのが好ましい。例えばプローブはSNPを含む領域にハイブリダイズし、プローブの末端塩基が標的中のSNPで変更されているヌクレオチド位置にハイブリダイズしてもよい。より好ましくは、SNP部位に結合するプローブの末端塩基を別のプローブと共有結合させる。プローブ間のライゲーションは、ライゲートすべき各プローブの末端塩基が標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合にだけ起こるので、これによってプローブの特異性が確実に最大となる。変異が標的ポリヌクレオチド中の１塩基より多くにわたる場合、相補的な塩基は１つのプローブに含まれるか、または２つ以上のプローブにわたっていてもよい。例えば変異が標的中の２つの隣接する塩基を含む場合、相補的な塩基の一方もしくは両方が１つのプローブの末端にあるように、あるいは、第１の変異塩基が上流プローブの最後の塩基に相補的であり、第２の変異塩基が下流プローブの最初の塩基に相補的であるように設計できる。
【００２３】
本明細書では標的ポリヌクレオチドに相補的な各プローブの領域を“第１の領域”と記載する。“相補的な”とは、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的にハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に明白であり、そのような条件の一例では、50%ホルムアミド、5x SSC（150mM NaCl、15mMクエン酸３ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハルト溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/ml変性断片化サケ精子DNAを含有する溶液中、42℃で一晩インキュベートし、その後0.1 x SSC中、約65℃で洗浄する。プローブの第１の領域はハイブリダイズするのに十分相補的であれば標的配列に完全に相補的である必要はないということは明白である。しかしながら、ライゲーション反応に関与する各プローブの末端ヌクレオチドは、プローブと別のプローブまたは他のポリヌクレオチド（標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするもの）間のライゲーションが起こるために、標的ポリヌクレオチドに相補的でなければならない。最も好ましくは各プローブの第１の領域は標的ポリヌクレオチド中の領域に100%相補的である。
【００２４】
標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブの第１の領域に加え、標的にハイブリダイズする少なくとも１つのプローブは、第１の領域、つまりプローブがハイブリダイズする配列に関する情報をコードする第２の領域を含有する。標的ポリヌクレオチドに関する情報をコードするのはこの第２の領域である。プローブを含む連結されたポリヌクレオチドの特性決定を行う際、標的ポリヌクレオチドの配列を示すのは第２の領域または一連の第２の領域である。従って連結されたポリヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも１つのプローブの第２の領域を含まなければならない。
【００２５】
第２の領域は所定のポリヌクレオチド配列を有し、第１の領域の個々のヌクレオチドはそれぞれ第２の領域中の少なくとも２つのヌクレオチドで表される。好ましくは第２の領域は識別可能な(distinct)核酸配列の“ユニット”を含有する。第１の領域中の各ヌクレオチドは識別可能な既定のユニット、または第２の領域中のユニットの固有の組合せで表される。各ユニットは好ましくは２個以上のヌクレオチド塩基、好ましくは２から５０塩基、より好ましくは２から２０塩基、そして最も好ましくは４から１０塩基、例えば６塩基を含む。好ましくは各ユニットに少なくとも２つの異なる塩基が含まれる。好ましい態様では、各ユニットに３つの異なる塩基が含まれる。第２の領域中のユニットは国際特許公開WO-A-00/39333（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）の開示に従って設計することができる。
【００２６】
ユニットの設計は“読み取り（read-out）”段階で異なるユニットを識別できるように行い、重合化反応における検出可能な標識がなされたヌクレオチドの導入または相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを伴う。例えば第１の領域の各塩基はユニット中の一連の塩基で表され、１つの塩基は読み取り段階で導入された標識されたヌクレオチドに相補的であり、１つの塩基は“スペーサー”として機能して導入された標識間を分離し、１つの塩基は停止シグナルとして作用する。
【００２７】
好ましい態様では、識別可能な配列の２つのユニットを用いてプローブの第１の領域上の４つの可能な塩基全てを表す。この態様によれば、２つのユニットを２進法として用いることができ、一方のユニットが“０”、他方が“１”を表す。プローブの第１の領域中の各塩基は第２の領域中の２つのユニットの組合せで特性決定する。例えば図１に示すように、アデニンは“０”＋“０”、シトシンは“０”＋“１”、グアニンは“１”＋“０”、チミンは“１”＋“１”で表される。ユニット間の識別が必要であるため、各ユニットに“停止”シグナルを導入することができる。第１の領域中の塩基が奇数番号の位置にあるか偶数番号の位置にあるかによって、異なるユニットを用いて“１”および“０”を表すことも好ましい。
【００２８】
これは以下のように表される：
奇数番号のテンプレート配列：
“０”：ＴＴＴＴＴＴＡ（ＣＣＣ）
“１”：ＴＴＴＴＴＴＧ（ＣＣＣ）
偶数番号のテンプレート配列：
“０”：ＣＣＣＣＣＣＡ（ＴＴＴ）
“１”：ＣＣＣＣＣＣＧ（ＴＴＴ）
【００２９】
この例では、下線を付した塩基はポリメラーゼ反応における標識されたヌクレオチドの標的であり、括弧内の塩基は停止シグナルとして使用され、それ以外の塩基は標識間を分離するためのものである。
【００３０】
奇数番号位置（例えば1、3、5など）では、ポリメラーゼ反応の際に導入されるヌクレオチド混合物は蛍光X-dUTP、蛍光Y-dCTP、およびdATPからなる（dGTPは混合物に含有されない）。“０”では蛍光Yの相補的塩基が含まれず、“１”では蛍光Xの相補的塩基が含まれない。従って、ポリメラーゼ反応の際、ユニット“０”が存在すれば蛍光Ｘをモニタリングすることによって、“１”が存在する場合は蛍光Yをモニタリングすることによってこれを検出できる。
【００３１】
全ての偶数番号位置（2，4、6など）ではヌクレオチド混合物は同じ２つの蛍光標識ヌクレオチドからなるが、dATPではなくdGTPが用いられ、１つ以上のT塩基が停止シグナルを規定する。
【００３２】
各ユニットの“読み取り”が行われた後、含有されていない相補的ヌクレオチド（例えばdGTPまたはdATPのいずれか）を導入して停止配列での取り込みを可能とすることによって工程を再開することができる。取り込まれなかったヌクレオチドを洗浄除去した後、次の読み取り段階を行う。
【００３３】
当該分野で知られる方法を用いて各ポリヌクレオチドの第１の領域をポリヌクレオチドプローブの第２の領域に変換することができる。好ましくはこの変換を本発明におけるプローブの使用前に行い、そのためプローブは標的に添加される時には、第２の領域を含有している。国際特許公開WO-A-00/39333（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される制限酵素を用いる方法を採用してもよい。例えば挿入位置近くにクラスIIS制限部位を有するベクターに第１の領域をライゲートするか、またはそれらの部位を含有するように第１の領域を設計してもよい。その後好適なクラスIIS制限酵素を用いて制限部位を切断し、第１の領域にオーバーハングを生じさせる。
【００３４】
次に、１つ以上のユニットを含有する好適なアダプターを用いてオーバーハングの１つ以上の塩基に結合させる。アダプターのオーバーハングと切断したベクターがハイブリダイズすれば、これらの分子はライゲートすることができる。これはオーバーハングが全長にわたって完全に相補的である場合にのみ起こる。その後、平滑末端のライゲーションを行い、アダプターの他の末端をベクターに結合させてもよい。更なるクラスII制限酵素部位、または他の好適な制限酵素部位（これは前に使用した酵素と同じでも異なってもよい）を好適に配置することによって、標的配列中の、第１のアダプターが標的とする配列の下流にオーバーハングを生成させるように切断を行うことができる。このようにして、隣接またはオーバーラップしている配列を、所定の配列のユニットを有する配列に連続的に変換させてもよい。
【００３５】
好ましくはこの変換システムを使用し、２進法（２つの連続するユニットを用いて第１の領域中の特定の塩基を定義する）を用いて各ポリヌクレオチドプローブの第２の領域を生成する。
【００３６】
少なくとも２つのプローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせた後、それらを互いにライゲートさせる。プローブは本発明の第１の観点に従って直接ライゲートさせてもよいし、本発明の第２の観点に従って介在ポリヌクレオチドを介して間接的にライゲートさせてもよい（各観点の更なる記述については以下参照）。ライゲーションに好適な条件は当業者に明白である；好ましい条件はリガーゼ活性に好適な条件下でのリガーゼ酵素の添加である。２つのプローブをライゲートさせる際、２つの第１の領域を互いにライゲートさせるのが好ましい。連結させたポリヌクレオチドは２つの第１の領域を含有し、それらは２つの第２の領域に挟まれている。この態様では、プローブの第２の領域は第１および第２のプローブの反対の末端、すなわち第１のプローブの３’末端と第２のプローブの５’末端にある。
【００３７】
必要により、共有結合したプローブを含有する単一のポリヌクレオチドを増幅してもよい。好ましい増幅法はポリメラーゼ反応である。ポリメラーゼ反応の実施に好適な条件は当業者に明らかである。一般的な条件は、ポリメラーゼ活性に好適な条件下でポリメラーゼ酵素、オリゴヌクレオチドプライマー、および遊離のヌクレオチドを標的（テンプレート）配列（すなわちライゲートさせたプローブ分子）に加えるものである。好ましい態様では、ポリメラーゼ反応は定量的である。定量的ポリメラーゼ反応は当該分野で周知であり、各サイクル後に増幅された産物の量をモニタリングできる。概要を記載すると、増幅された産物への蛍光シグナルの取り込みをモニタリングし、増幅産物の量が多いほど高い蛍光シグナルを生じる。定量的かつリアルタイムのＰＣＲのためのキットが市販されており、一般的に用いられるものの例としてTaqMan（Applied Biosystems社）およびSYBR Green（Molecular Probes社）がある。
【００３８】
連結されたプローブを含有する単一の分子の検出は、“読み取り”段階でプローブの第２の領域を検出することによって行い、ここで各プローブの第２の領域により表される情報、すなわちプローブがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの配列が決定される。プローブが変異標的配列にハイブリダイズすれば、標的ポリヌクレオチド上に存在する変異が明らかになる。読み取り段階は任意の好適な方法を用いて行うことができる。好ましい態様は国際特許公開WO 00/39333に記載されている。
【００３９】
慣例的なシーケンシング操作を読み取り段階として用いてプローブの第２の領域の同定、ひいては変異の同定を行うことができる。あるいはまた、異なるプローブの間を識別するような方法で第２の領域に検出可能な標識をしてもよい。読み取り段階で標識を検出し、意図するポリマーを同定することができる。好ましい標識は蛍光体であり、慣例的な方法を用いてこれを各プローブの第２の領域に結合させることができる。
【００４０】
読み取り段階は、上記のようにポリメラーゼ反応を用い、選択された検出可能な標識がなされたヌクレオチド、またはその後の間接標識のための群を導入したヌクレオチドを用いて、各プローブの第２の領域上の塩基に相補的な塩基を取り込ませ、取り込み事象をモニタリングすることにより行うことができる。
【００４１】
好ましくは読み取りポリメラーゼ反応は、相補的ヌクレオチドを一度に１ユニットずつ制御して取り込むことができる条件下で実施する。これによって、取り込まれた標識の検出によって各ユニットを分類することが可能となる。上記のように、好ましくは各ユニットは“停止”配列を含むため、第１のユニットへの取り込みに必要なヌクレオチドのみを供給することによって取り込みを制御することが可能である。各ユニットは特定の標識で認識されるので、各サイクルで２つの異なるユニット（0および1）を識別できる。これによって取り込まれた標識の検出が可能となり、ユニットの識別表示および位置を判定することが可能となる。
【００４２】
この方法は以下のように実施することができる：
（i）重合化反応が進行しうる条件下で所定のユニットを含むプローブの第２の領域をヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP、およびdCTPの少なくとも１つと接触させ（ここで、少なくとも１つのヌクレオチドはそのヌクレオチドに特有の検出可能な標識を含む）；
（ii）取り込まれていないヌクレオチドを除去して取り込み事象を検出し；
（iii）取り込まれたヌクレオチドから標識を除去し；そして
（iv）工程（ii）から（iv）を反復して異なるユニットを同定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
【００４３】
各サイクルの工程（i）で必要とされる異なるヌクレオチドの数は、ユニットの設計によって異なる。各ユニットが１つの塩基型だけを含む場合は、（検出可能な標識がなされた）１つのヌクレオチドのみが必要である。しかしながら２つの塩基が使用される場合は（１つは検出可能な標識がなされたヌクレオチドの標的として、１つは異なる標的塩基間を隔てるため）、２つのヌクレオチドが必要である（１つは標的塩基に結合させるため、１つは標的塩基間の塩基を充填するため）。
【００４４】
塩基を停止シグナルとして使用することにより、ポリメラーゼ反応中の制御不能な取り込みを防止するためのブロックされたヌクレオチドを必要とすることなく、検出段階を実施することができる。ポリメラーゼ混合物に“停止”塩基の相補体が含まれないため、停止シグナルが有効である。従って、各ユニットを特性決定した後、欠失したヌクレオチドを用いて“充填”段階を行って、停止塩基に相補体を取り込ませ、それによって次のユニットの特性決定が可能となる。これは検出段階後に実施する。あるユニットの“停止”塩基は、それに続くユニットの第１塩基と同じ型のものではない。これによって“充填”操作が次のユニットにまで進行しないことが確実となる。その後“充填”操作で使用された取り込まれなかったヌクレオチドを除去し、次のユニットを特性決定できる。
【００４５】
ポリメラーゼおよび検出可能な標識の選択は当業者に明白である。以下は単に手引きとして用いるものである：
ａ）クレノウおよびクレノウ（エキソ−）はテトラメチルローダミン-4-dUTPおよびローダミン-110-dCTP（Amersham Pharmacia Biotech）を効率的に取り込むことができる（BrakmannおよびNieckchen, 2001、BrakmannおよびLobermann, 2000）
ｂ）Vent、Taq、およびTgo DNAポリメラーゼは間隔をあけずに少なくともいくつかの位置にジオキシゲニン（dioxigenin）および蛍光体、例えばAMCA、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、およびCy5を効率的に取り込むことができる（Augustinら, J. Biotechnol. 2001, Apr. 13; 86(3): 289-301）
ｃ）T4 DNAポリメラーゼは蛍光体で標識されたヌクレオチドを効率的に充填する
【００４６】
好ましいポリメラーゼはクレノウラージフラグメント（エキソ−）およびT4 DNAポリメラーゼである。
【００４７】
ポリメラーゼ反応を実施するためには通常、まず連結されたポリヌクレオチドにプライマー配列をアニールさせることが必要であり、このプライマー配列はポリメラーゼ酵素によって認識され、続く相補鎖の伸長の開始位置として作用する。プライマーのアニールを可能にする相補配列を含むプライマー配列を、連結されたポリヌクレオチドとは別の成分として添加してもよい。
【００４８】
ポリメラーゼ反応の実施に必要な他の条件、例えば、温度、pH、バッファー成分などは当業者に明白である。重合化段階は塩基を第１のユニットに取り込むのに十分な時間行うのが適切である。その後取り込まれなかったヌクレオチドを、例えばアレイを洗浄することによって除去し、次いで取り込まれた標識の検出を行うことができる。
【００４９】
別の読み取り法では、短い検出可能な標識がなされたオリゴヌクレオチドを用いて、ポリヌクレオチド上のユニットにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション事象を検出する。
【００５０】
短いオリゴヌクレオチドはプローブの第２の領域の特定のユニットに相補的な配列を有する。例えば２進法を用いて、それぞれの特性をユニットの異なる組み合わせ（一方は“０”、一方は“１”を表す）で定義する場合、本発明は“１”ユニットに特異的なオリゴヌクレオチドを必要とする。この態様では、他のユニットとは異なるポリヌクレオチド配列となるように各ユニットを設計することによって、オリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーションを行うことができる。これによって、特定のユニットが存在する場合にのみハイブリダイゼーション事象が起きることが確実となり、ハイブリダイゼーション事象の検出によって標的分子の特性が同定される。
【００５１】
好ましい態様では、標識は蛍光成分である。使用できる蛍光体の多くの例が従来技術で知られており、それらには以下がある：
Alexa色素（Molecular Probes）
BODIPY色素（Molecular Probes）
シアニン色素（Amersham Biosciences社）
テトラメチルローダミン（Perkin Elmer、Molecular Probes 、Roche Diagnostics）
クマリン（Perkin Elmer）
テキサスレッド（Molecular Probes）
フルオレセイン（Perkin Elmer、Molecular Probes 、Roche Diagnostics）
【００５２】
好適な蛍光体のヌクレオチドへの結合は慣例的な方法で実施できる。また、好適に標識されたヌクレオチドは市販されている。標識の結合は、検出段階後に除去することが可能なように行う。これは任意の慣例的な方法で行うことができ、それらには以下がある：
Ｉ．シグナル自体の攻撃
ａ）退色
ｉ）光退色
ii）化学退色
ａ）蛍光のクエンチング
ｉ）蛍光に対する抗体による（例えば抗フルオレセイン、抗オレゴングリーン）
ii）ＦＲＥＴによる（シグナルの隣に消光体を導入することによってシグナルのクエンチングができる。例えばタックマン法）
ｃ）シグナルの切断
ｉ）化学切断（例えば塩基およびシグナル間のジスルフィド架橋の還元）
ii）光切断（例えばニトロベンジルまたはtert-ブチルケトン基の導入）
iii）酵素（例えばペプチドリンカーのα-キモトリプシン消化）
II．シグナルを有するヌクレオチド：
ｃ）エキソヌクレアーゼ分解除去
ｉ）充填されたヌクレオチドの3’-5’エキソヌクレアーゼ消化（例えばエキソヌクレアーゼIII、または一定のヌクレオチドが存在しない場合はDNAポリメラーゼの3’-5’エキソヌクレアーゼ分解活性の活性化による）
ｄ）制限酵素消化
ｉ）２本鎖DNAを有するシグナルの消化（例えば停止シグナルに導入できるApal、Dral、Smal部位）
【００５３】
除去が可能な標識を使用する代わりに、生化学過程の際に再活性化される、不活性な標識を使用してもよい。
【００５４】
好ましい方法は光または化学切断である。
【００５５】
標識が蛍光体の場合、取り込み時に生成する蛍光シグナルを光学的方法、例えば共焦点顕微鏡によって測定することができる。あるいはまた、高感度2-D検出器、例えば電荷結合素子検出器（ＣＣＤ）を用いて、生じた個々のシグナルを可視化することができる。
光検出の一般的な設定は以下の通りである：
顕微鏡：エピ・フルオレセンス
対物レンズ：油浸（100x、1.3NA）
光源：レーザーまたはランプ
フィルター：バンドパス
ミラー：ダイクロイック（Dichroic）ミラーおよびダイクロイックウェッジ
検出器：フォトマルチプライヤー（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラ
【００５６】
以下のような改良型を使用することもできる：
Ａ．全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）
光源：１つ以上のレーザー
バックグラウンド制御：ピンホール不要
検出：ＣＣＤカメラ（ビデオおよびデジタルイメージングシステム）
Ｂ．共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）
光源：１つ以上のレーザー
バックグラウンド低減：１つまたは数個のピンホール開口
検出：ａ）１個のピンホール：種々の蛍光波長のためのフォトマルチプライヤー管（ＰＭＴ）検出器［最終画像はコンピューターによって一定時間にわたる一点一点から構築される］
ｂ）数千個のピンホール（ニポウ回転盤）：画像のＣＣＤカメラ検出［最終画像をカメラで直接記録できる］
Ｃ．二光子（ＴＰＬＳＭ）および多光子走査型レーザー顕微鏡
光源：１つ以上のレーザー
バックグランド制御：ピンホール不要
検出：ＣＣＤカメラ（ビデオおよびデジタルイメージングシステム）
好ましい方法はＴＩＲＦＭおよび共焦点顕微鏡である。
【００５７】
本発明の第１の観点によれば、標的ポリヌクレオチドのオーバーラップせずに隣接する配列に相補的な少なくとも２つのプローブと標的ポリヌクレオチドを接触させる。本明細書において用いる場合、“隣接する”という用語は単一のポリヌクレオチド中で隣り合う２つの配列を意味し、好ましくはそれらを分離する塩基がない。ライゲーション反応は１または２個の塩基で分離された異なるポリヌクレオチド間で起こりうるため、これも本発明の範囲内であり、従って“隣接する”とは１または２個の塩基による分離を含むものと解釈すべきである。プローブを添加してハイブリダイゼーション条件下に施与した後、ライゲーション段階を実施する。ポリヌクレオチドのライゲーションに好適な条件は当業者に明白である。少なくとも２つのプローブが標的ポリヌクレオチド上の隣接する配列にハイブリダイズすれば、ライゲーション段階でこれらのプローブが連結され、隣接する末端ヌクレオチド間にホスホジエステル結合が形成されることによって単一のポリヌクレオチドが生成する。その後、標的ポリヌクレオチドに関する情報を含有するこのライゲート産物を検出および特性決定することができる。
【００５８】
この観点の非制限的な例として、２つのプローブを使用することができる。両プローブが標的にハイブリダイズすると、それらは互いにライゲートして単一の分子を形成する。このライゲーション段階は両方のプローブがハイブリダイズする場合にだけ起こる。従って認識されるように、オリゴヌクレオチドプローブの一方または両方が標的分子に相補的でない場合はハイブリダイゼーションおよびライゲーションは起こらず、２つのプローブを含む単一の分子は生成されない。
【００５９】
この観点の最も単純な態様によれば、この方法を用いて標的配列がサンプル中に存在するかしないかを検出することができる。好ましい態様では、サンプルは種々のDNA配列、例えばゲノムDNAを含む。標的分子中の２つの隣接する配列に相補的な少なくとも２つのプローブを用いる。標的がサンプル中に存在する場合には、プローブはハイブリダイズおよびライゲートし、単一のプローブ分子が生成され、次にこれを検出することができる。標的がサンプル中に存在しない場合には、単一のライゲートしたプローブ分子が生成されず、従って検出されない。
【００６０】
また、標的ポリヌクレオチド中の変異の存在を検出することができる。標的中の変異配列または野生型配列に相補的になるようにプローブを設計することができる。変異配列に相補的になるようにプローブを設計する場合、ライゲーション段階後に単一のライゲートしたプローブ分子が存在すれば、これは元のサンプル中に変異配列が存在したことを示し、存在しなければ元のサンプル中に標的変異配列が存在しなかったことを示す。単一のライゲートしたプローブが生成されれば、読み取り段階で配列を特性決定できる。当業者に明白なように、逆の状況、すなわちプローブが野生型配列に相補的である状況も十分同様に作用する。この場合、ライゲーション段階後に単一のライゲートしたプローブ分子が存在すれば、これは元のサンプル中に野生型配列が存在したことを示し、存在しなければ標的野生型配列が元のサンプル中に存在しなかったことを示す。
【００６１】
野生型および変異型相補的プローブを併用して、野生型および変異型配列の両方が元のサンプル中に存在するか否かを同定することができる。例えば１つの対立遺伝子が野生型配列、第２の対立遺伝子が変異配列を含み、両対立遺伝子がゲノムDNAサンプル中に存在してもよい。
【００６２】
本発明の第２の観点は、標的ポリヌクレオチド内の少なくとも２つの標的配列の順序の同定を伴う。これを使用して、例えば全体的な再配列を調査したり、標的配列上のマーカーの順序を決定することができる。標的配列間の距離を測定することもできる。好ましい態様ではストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドを少なくとも２つのポリヌクレオチドプローブと接触させ、その両者ともプローブがハイブリダイズする配列に関する情報をコードする第２の領域を含有する。プローブは標的ポリヌクレオチド上の隣接する配列にハイブリダイズする必要はない。好ましい態様では、プローブは標的ポリヌクレオチドの非隣接領域に相補的である。プローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした後、ポリメラーゼ反応を実施して２つのプローブ間にヌクレオチドを取り込ませ、このときハイブリダイズしたプローブの一方は重合化のプライマーとして作用する。好ましくはポリメラーゼ反応は前記のように定量的である。
【００６３】
ポリメラーゼ反応がプローブ間にヌクレオチドを充填するだけでプローブ自体は置換しないためには、非置換（non-displacing）ポリメラーゼを使用しなければならない。非鎖置換ポリメラーゼは当該分野で周知であり、例えば、制限されるわけではないが、Taqポリメラーゼ、E. coli DNAポリメラーゼI、およびT4 DNAポリメラーゼがある。
【００６４】
次に、ライゲーション反応を行い、ポリメラーゼで生成したポリヌクレオチドにプローブを共有結合させ、プローブを含有する単一のポリヌクレオチドを生成させる。次いで、プローブを含む単一のポリヌクレオチドを特性決定し、各プローブの第２の領域の順序およびその間の距離を検出することによって、標的配列の順序およびそれらの距離を検出することができる。
【実施例】
【００６５】
本発明の方法を以下に例証する：
ゲノムDNAサンプル内の標的DNAポリマーが特定の位置にSNPを含有する疑いがある。第１のポリヌクレオチドプローブは、SNP部位のすぐ上流にあるがSNP部位を含まない10塩基に相補的な第１の領域、および10連の3塩基ユニットを含む第２の領域を含み、各ユニットは第１の領域中の１個の塩基を表す。各ユニットは停止シグナルとして作用する塩基１個、１塩基のスペーサー、および読み取り段階での同定に好適な塩基１個を含む。第２の領域は第１の領域の上流にある。
【００６６】
4個の異なる第２ポリヌクレオチドプローブを使用する。これらはそれぞれ、SNP部位に相補的な塩基だけが異なる10塩基の第１の領域を含む。すなわち4個の異なる第２プローブのそれぞれの第１塩基はＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。各プローブ中の残りの9塩基は同一であり、変異部位のすぐ下流にある9塩基と相補的である。これらの第２のポリヌクレオチドプローブは10連の3塩基ユニットを含む第２の領域も含み、各ユニットは第１の領域の1つの塩基を表す。それぞれの第２ポリヌクレオチドにおいて、第２の領域は第１の領域の下流にある。
【００６７】
ゲノムDNAサンプルを融解して1本鎖標的配列を得、ハイブリダイゼーション条件下で第１ポリヌクレオチドプローブを4つの第２ポリヌクレオチドプローブのそれぞれと共にサンプルに添加する。第１プローブの第１の領域はSNP部位のすぐ上流の10塩基にハイブリダイズする。4つの第２ポリヌクレオチドのうち、1つの第１の領域はSNP部位および下流の9塩基と100%の相補性でハイブリダイズする。SNP部位に相補的でない残りの3つの第２ポリヌクレオチドは、SNP部位の下流の9塩基とのみハイブリダイズする。次いで、リガーゼ活性に好適な条件下でリガーゼ酵素を添加し、ライゲーション反応を実施する。このライゲーションは、第２プローブが標的配列に100%相補的である、すなわちSNPに相補的である場合にだけ第１のポリヌクレオチドプローブを第２のポリヌクレオチドプローブと連結させる。SNP部位が相補的でない残り3個の第２プローブは第１プローブにライゲートされない。ライゲーションによって、第１ポリヌクレオチドプローブおよびSNP部位に相補的な第２ポリヌクレオチドプローブを含む単一のライゲートしたプローブ分子が生成される。ライゲートしたプローブは２つの第２の領域に挟まれた２つの第１の領域を含む。
【００６８】
単一のライゲートしたプローブ分子をポリメラーゼ反応で増幅する。増幅されたポリヌクレオチドはSNPに及ぶ20塩基（SNP部位の配列を含む）上の第１および第２のポリヌクレオチドプローブの第２の領域にコードされる配列情報を含む。任意の好適な読み取り段階でこの配列を決定することができる。
【国際調査報告】
2008515452.tif 000002
2008515452.tif 000003
2008515452.tif 000004