(57)【要約】  本発明は、治療用品質の組換え抗体の製造に関係する。特に、本発明は、培養宿主細胞検体に凍結‐解凍処理ステップを受けさせて、大規模醗酵からの機能性抗体の収量を増加させる方法に関係する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換した宿主細胞検体を培養し、該検体を凍結‐解凍処理に供することを含む、組換え抗体の製造方法。
【請求項２】
前記発現ベクターが、少なくとも抗体軽鎖の一部と、少なくとも抗体重鎖の一部とをコードし、該軽鎖及び重鎖抗体分子の少なくとも一部が分泌され、結合して、機能性抗体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結‐解凍処理ステップが、前記検体を、緩徐凍結及び／又は緩徐解凍に供することからなる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記凍結検体が、マイナス２０℃からマイナス７０℃の間で保存される、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記凍結検体がマイナス２０℃の温度に置かれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結検体がマイナス７０℃の温度に置かれる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
さらに少なくとも一つの精製ステップを含み、該精製ステップが前記方法の後に行われる、上記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記組換え抗体分子が、天然、ヒト化又はキメラ抗体、又はそれらのフラグメントである、上記請求項のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性組換え抗体、特に治療用抗体の生産及び単離における収量(yield)を増加させる方法に関する。この方法は、特に治療用抗体の大規模な工業的製造に適する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術は、急速に発展しており、抗体、特に治療用抗体の製造に有用である。組換え遺伝子を発現系は当業者には良く知られている。これは、哺乳動物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、細菌細胞及び形質転換動物及び植物での発現を含む。発現系の選択は、コードされたタンパク質の特徴、例えば翻訳後修飾に依存する。その他に考慮することとして、必要な品質の物質の必要な量の生産に必要な時間、及び、特に、コストが含まれる。この後者を考慮することは、当局の承認を得るために必要な品質及び非常に多数の患者を治療するのに必要な量の治療用抗体を製造する場合に特に重要である。
【０００３】
組換えタンパク質の製造に最も広く使用されているシステムは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に基づいている。Ｅ．ｃｏｌｉを使用することにより遭遇する特別な問題は、治療に必要な品質及び数量の物質の製造が困難であることである。特に、必要な時間と費用が法外になることがある。注目すべき一つの特別な問題は、Ｅ．ｃｏｌｉから抗体を抽出する際に受ける抗体の収量の損失である。この後者の問題の一部を取り扱い、治療的な使用に受け入れられる抗体の生産を可能にする方法は、ＵＳ  ５，６５５，８６６に記述されている。この方法は、非機能性抗体から抗体の機能的Ｆａｂ’フラグメントの後の単離を促進するために熱処理を使用することを含んでおり、この熱処理は醗酵又は培養の間のいつでも、又は抗体の抽出及び精製のいずれの段階においても行われる。室温より高い温度において、機能性抗体は著しく安定であるが、一方、宿主細胞タンパク質、及び遊離の軽鎖及び重鎖、及び抗体の非機能フラグメントを含む他の多数のタンパク質は、沈殿及び／又は凝集を形成し、これは濾過又は遠心分離又は流動床クロマトグラフィーのような主要な精製操作の間に機能性抗体から容易に分離される。比例してではあるが、精製コストは治療用抗体の製造総コストの一部であり、精製コストの比率は、上流の製造コストが低下するにしたがって一層増加するであろう。したがって、抗体の回収及び精製における改良は、製造の手段と関係なく、製造コストを一層低下させるであろう（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＆  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００１，４：１７２−１８５）。したがって、治療用抗体製造、特に精製に、例えば収量の増加により時間及び／又はコストの節約をもたらす方法に対するニーズがある。
【０００４】
醗酵又は培養当たりの低収量は、しばしば主要な抽出段階において注目される特別な問題である；抗体の発現は細胞内では高いが、主要な抽出段階における高いパーセンテージの回収は達成するのが著しく困難である。ＵＳ  ５，６６５，８６６は、熱処理ステップを含めることによる、主要な精製の収量の増加を記述しており、このステップは、非機能性抗体を除去することにより精製操作を補助するものである。
【０００５】
ＷＯ２００５０１９４６６（本出願の優先日の後に公開された）は、醗酵の後、下流の操作の前に中断ステップ(interruption step)を含めることによる、組換えタンパク質の収量の増加を記述している。
【０００６】
本明細書で記述する本発明は、熱処理と組み合わせた凍結‐解凍処理が、主要な抽出段階における機能性抗体の収量の50％に及ぶ増加をもたらす、すなわち、機能性抗体の収量は熱処理のみの収量を超えて増加したという驚くべき、予想されなかった観察結果に基づいている。これにより、治療用品質の機能性抗体の大量生産の時間及びコストを非常に有効に節約することができる。またそれは、必要な量を製造するためにわずかなバッチ数を要求するので、醗酵のバッチ間の変動の影響を少なくする。
【０００７】
したがって、組換え抗体分子をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞検体を培養し、この検体を、凍結‐解凍処理ステップに供することを含む組換え抗体分子の製造方法が提供される。
【０００８】
好ましい実施例において、組換え抗体分子は、少なくとも抗体軽鎖の一部と、少なくとも抗体重鎖の一部とからなり、その結果、発現された軽鎖及び重鎖の少なくとも一部が結合して機能性抗体を形成することができる。
【０００９】
最も好ましい態様において、この方法はさらに、検体を２４時間までの間３０℃から７０℃の範囲内に上昇させた温度に供することを含む。したがって、本発明はまた、検体から単離された機能性抗体分子の収量を増加させる方法であって、検体が、可溶性、機能性抗体分子、及び非機能性抗体分子を含有し、検体を２４時間までの間３０℃から７０℃の範囲内の上昇させた温度に供することを含み、検体を、この温度上昇に供する前に、凍結‐解凍処理ステップに供することを特徴とする、方法を提供する。
【００１０】
特に、この方法は、生産される機能性抗体及び使用される発現系の特別な特徴を考慮して、要求に応じて変更することができ、当業者により理解される温度範囲及び処理条件において単離された機能性抗体の収量を増加させる。
【００１１】
本明細書で使用される際、「機能性抗体」とは、それを生じさせた抗原（コグネイト抗原）を特異的に認識し、それと結合する能力を維持している抗体分子を含む。機能性抗体の製造は、抗体の予想される分子量に相当する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の単一バンドの存在、又はＢＩＡＣｏｒｅを使用する直接結合アッセイ又は当業者に知られている他の方法、例えば、限定はしないが、ＥＬＩＳＡにより示される。非機能性抗体は、コグネイト抗原を認識しないフラグメントを含み、また正しくフォールドされていない又は正しく組み立てられていない抗体、遊離の重鎖及び軽鎖、及びそれらのフラグメントを含み、これには、コグネイト抗原を認識しない又はそれに結合しない抗体の部分的に分解したフラグメントが含まれる。
【００１２】
本発明の方法において、検体は、醗酵の生産物、例えば、限定せずに、細菌、又はイーストを含む醗酵、細胞培養、例えば、限定せずに、哺乳動物又は昆虫細胞培養であり得る。最も好ましいのは、検体が組換え抗体を発現するＥ．ｃｏｌｉを含む醗酵の生産物であり、該抗体は機能及び非機能性抗体であり得る。必要があれば、宿主細胞は醗酵培地から採集することができ、例えば、宿主細胞は遠心分離、濾過又は濃縮により検体から採集することができる。特に、本発明の方法は、治療用品質の抗体の大規模工業生産に適している。
【００１３】
好ましくは、宿主細胞は醗酵又は培養から、例えば、遠心分離により採集され、そして細胞検体が凍結されるのに充分な低温に置かれる。一態様において、液状の細胞検体は−２０℃から−７０℃のフリーザーの中に置かれる。好ましくは、検体は−２０℃で凍結保存される。その他には、検体を−７０℃で凍結し、保存する。最も好ましくは、凍結は徐々に行う。本明細書で使用される際「徐々に凍結」とは、低い温度、例えばフリーザーの中に置かれ、フリーザーに入れられる前に瞬間凍結、例えば、ドライアイス上に置くとか、液体窒素中に入れるなどをしない検体を含む。一態様において、細胞検体は保存される前に、例えばフリーザー中で、瞬間凍結される。
【００１４】
その他に、採取された宿主細胞は、緩衝塩、例えば、限定せずに、Ｔｒｉｓ、酢酸塩又はリン酸塩などを使用する緩衝液に懸濁される。この溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ２とｐＨ１０の間、最も好ましいのはｐＨ６とｐＨ８の間である。最も好ましい緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４であり、これは凍結‐解凍処理ステップを受ける前に、さらに任意にＥＤＴＡを含むことができ、例えば、限定せずに、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４である。
【００１５】
本発明の方法において、凍結検体は、適する期間、例えば、１又は２時間から１又は２週間まで凍結保存することができる。一態様において、検体は室温に解凍される前の２から４時間凍結保存される。別の態様において、検体は室温に解凍される前の２、３又は４日凍結保存される。さらに別の態様において、検体は室温に補助なしで解凍される前の終夜、例えば１２から１８時間凍結保存される。その他に、解凍を、例えば水浴又は加温オーブンを使用して補助することができる。
【００１６】
したがって、組換え抗体遺伝子をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞検体を培養し、この検体を、緩徐な凍結ステップ及び／又は緩徐な解凍ステップからなる凍結‐解凍ステップに供することを含む、組換え抗体分子の製造法が提供される。したがって、本発明の方法の一態様において、機能性抗体分子及び非機能性抗体分子を含む検体から単離される機能性抗体分子の収量を増加させる方法であって、この検体を、２４時間までの間３０℃から７０℃の範囲内の温度上昇に供することを含む方法において、この検体を、緩徐な凍結ステップ及び／又は緩徐な解凍ステップからなる凍結‐解凍ステップに供することを特徴とする、方法が提供される。
【００１７】
最も好ましくは、熱処理ステップは３０℃から７０℃の範囲内で行われる。温度は必要に応じて選択することができ、精製に対する抗体の安定性によるであろう。別の態様において、温度は４０℃から６５℃、又は好ましくは４０℃から６０℃の範囲内、より好ましくは４５℃から６０℃の範囲内、さらにより好ましくは５０℃から６０℃の範囲内、そして最も好ましくは５５℃から６０℃である。したがって、最低温度は３０℃，３５℃又は４０℃であり、そして最高温度は６０℃，６５℃又は７０℃である。加熱処理の長さは、好ましくは１から２４時間の間、より好ましくは４から１８時間の間、さらにより好ましくは６から１６時間の間、そして最も好ましくは１０から１４時間、例えば１２時間である。したがって、加熱の最短時間は１，２又は３時間であり、そして最長時間は２０，２２又は２４時間である。
【００１８】
特別な態様において、熱処理は５０℃から６０℃において１２から１６時間、そしてより好ましくは５０℃で１４時間行われる。温度及び時間は対象となる検体及び製造される抗体の性質に適するように選択することができることを当業者は理解するであろう。
【００１９】
本明細書で使用さる際「抗体」とは、機能的に活性なフラグメント、誘導体又は類似物を含み、限定せずに、ポリクロナール、モノクロナール、２価‐、３価‐又は４価‐抗体、ヒト化又はキメラ抗体、一本鎖のＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’及びＦａｂ’２フラグメントのような一本鎖抗体、抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体及び上記のいずれかの抗原決定基結合フラグメントであり得る。これらの抗体及びそのフラグメントは天然に存在する、ヒト化、キメラ又はＣＤＲ移植の抗体であり得、そして必要に応じて修飾、アミノ酸又はドメインの追加又は削除をするために標準的分子生物学の技術を使用することができる。ヒト化抗体は、１以上の非ヒト種の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する非ヒト種の抗体分子である（例えば、ＵＳ  ５，５８５，０８９を参照）。本発明の方法を使用して精製される抗体分子は、いずれかのクラス（例えば、ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＤ及びＩｇＡ）又は免疫グロブリン分子のサブクラスの抗体であり得る。
【００２０】
これらの抗体分子の製造法は当業者に良く知られている（例えば、Ｓｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４；Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：３２３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＵＳ  ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ，ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ，１０：１−１４２；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６：１６５−１８１参照）
【００２１】
モノクロナール抗体は、当業者に知られているいずれかの方法、例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７），トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）により製造される。
【００２２】
キメラ抗体は、軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によりコードされた抗体である。これらのキメラ抗体は、抗原性が少ないようである。２価抗体は当業者に知られている方法により作ることができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９）。２価‐、３価‐及び４価‐抗体は多重特異性を含むこともあり、また単一特異性のこともある（例えば、ＷＯ９２／２２８５３参照）。
【００２３】
また抗体配列は、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８及びＷＯ９２／０２５５１により記述されているように、特異抗体の生産のために選択された単一リンパ球から作られた免疫グロブリン可変領域の分子クローニング及び発現に基づく単一リンパ球抗体法を使用して造ることもできる。この後者の方法は、個別の抗体生産細胞を単離し、次いでこのクローンを拡大し、次いで同族抗原を認識する抗体を生産するクローンをスクリーニングし、そして、必要があれば、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）の遺伝子配列を同定することによる。その他には、同族抗原を認識する抗体を生産する細胞を培養し、次いでスクリーニングすることもできる。
【００２４】
本発明の方法を使用して製造された抗体は、最も好ましくは、患者に投与された場合に抗体の半減期を延長するトキシン、薬物、細胞毒化合物又はポリマー又は他の化合物と結合することができるヒト化抗体である。
【００２５】
組換えタンパク質を発現する方法は当業者に良く知られている。例えば、上記のように作られた抗体を発現させるための宿主細胞の適する例は、グラム陽性又はグラム陰性細菌のような細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，又はイースト細胞、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，又は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞及び骨髄腫又はハイブリドーマ細胞系、例えばＮＳＯ細胞を含む。最も好ましくは、本発明の方法において、組換え抗体は、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで生産される（Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１６：１６５−１８１；Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６３：１３３−１４７参照）。
【００２６】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿虫細胞は天然に存在するＥ．ｃｏｌｉ又は組換えタンパク質を生産することができる突然変異株であり得る。特定の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株の例は、ＭＣ４１００，ＴＧ１，ＴＧ２，ＤＨＢ４，ＤＨ５α，ＤＨ１，ＢＬ２１，ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９を含む。また例には、修飾Ｅ．ｃｏｌｉ，例えば、代謝変位株及びプロテアーゼ欠乏株も含まれる。一つの好ましいＥ．ｃｏｌｉ宿主は、組換えタンパク質醗酵のために多く使用されているホスト株であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）である。本発明の方法を使用して生産された組換え抗体は、タンパク質の性質及び生産規模によって、典型的にＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞の周辺腔又は宿主細胞の培養上清のいずれかの中に発現される。これらのコンパートメントを標的としたタンパク質のための方法は当業者には良く知られており、総説としてＭａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６，６０，５１２−５３８．を参照。タンパク質をＥ．ｃｏｌｉの周辺腔に指向させるのに適するシグナル配列の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｈｏＡ，ＯｍｐＡ，ＯｍｐＴ，ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列を含む。タンパク質の分泌を生じさせるために自然の分泌経路により又は外側の膜の限定された漏出の誘導によりタンパク質は上清を指向することができ、その例としては、pelBリーダー、タンパク質Ａリーダー、バクテリオシン放出タンパク質、培養培地へグリシンの添加をともなうマイトマイシン誘導バクテリオシン放出タンパク質そして膜透過性のためにkil遺伝子の共発現がある。最も好ましいのは、本発明の方法において、組換えタンパク質が宿主Ｅ．ｃｏｌｉの周辺腔に発現されることである。
【００２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中の組換えタンパク質の発現は、誘導可能なシステムの調節の下に行うことができ、それによりＥ．ｃｏｌｉ中の組換え抗体の発現は誘導可能なプロモーターにより調節されている。Ｅ．ｃｏｌｉ中で使用するのに適した多数の誘導可能なプロモーターが当業者にはよく知られており、そしてプロモーターによって、組換えタンパク質の発現は、例えば、温度又は増殖培地中の特別な物質の濃度のような種々の因子により誘発され得る（Ｂａｎｅｙｘ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１０:４１１−４２１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｄｏｉ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ，１０５−１２８）。誘導しうるプロモーターの例には、ラクトース又は非加水分解ラクトース類似体、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導することができるＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃ，ｔａｃ及びｔｒｃプロモーター，及びリン酸塩、トリプトファン及びＬ−アラビノースでそれぞれ誘導されるｐｈｏA，ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターが含まれる。発現は、例えば、誘発物質の添加又は誘導が温度依存性の場合には温度の変化により誘導することができる。組換えタンパク質の誘導の場合には、発現は培地へ誘発物質を添加することにより行われ、誘発物質は醗酵システム及び誘導物質により適する方法、例えば、誘発物質の１回または複数回添加、または徐々に供給することにより添加することができる。この誘導物質の添加と実際のタンパク質発現の間には遅れがあり得る、例えば、誘発物質がラクトースである場合に、ラクトースの前に予め存在する炭素源が利用されているが、タンパク質発現の誘導が生じるまでに遅れがあり得る。
【００２８】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞培養（醗酵）はＥ．ｃｏｌｉの増殖及び組換えタンパク質の発現を支持するいずれかの培地中で培養することができる。培地は、Ｐｉｒｔ  Ｓ．Ｊ．（１９７５）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに示されているような、そしてこの中に記述されている増殖速度に適する改良がなされた、化学的に規定されたいずれかの培地であり得る。適する培地の例は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２６：３０９−３２０に記述されている「ＳＭ６Ｅ」である。
【００２９】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の培養は、必要な生産スケールにより振とうフラスコのような適当な容器又は醗酵装置の中のいずれかで行うことができる。１，０００リットルより大きく、約１００，０００リットルまでの容積の種々の大規模な醗酵装置を使用することができる。好ましくは１，０００から５０，０００リットル、より好ましくは１，０００から１０，０００リットルの醗酵装置が使用される。０．５から１，０００リットルの容積を持つ小規模な醗酵装置も使用することができる。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉの醗酵は、求めるタンパク質と収量によっていずれかの適当なシステム、例えば、連続式、バッチ式又はバッチ投入モードで行うことができる（Ｔｈｉｒｙ  ＆  Ｃｉｎｇｏｌａｎｉ，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１０３−１０５）。バッチ式モードでは、必要な場合に、栄養素又は誘発物質を一度にまとめて添加することができる。その他には、バッチ投入式培養を使用することができ、誘導前のバッチ式において最大比増殖速度で増殖した培養を、最初に醗酵装置の中に存在した栄養素及び１回以上栄養素の追加法を使用して維持し、醗酵が完了するまで増殖速度を調節することができる。バッチ投入モードを誘発前に使用することができ、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の代謝を調節し、そして高い細胞密度にすることができる（Ｌｅｅ，１９９６，Ｔｉｂｔｅｃｈ，１４：９８−１０５）。
【００３１】
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えればそれぞれ他の態様である。特許及び特許出願に限らず本明細書に言及されている出版物は全て、完全に記述されていたものとしてここに引用により取り入れられるべく個別の出版物が特別にそして個別に示されていたものとして引用によりここに取り入れられている。
【００３２】
本発明は、以下の実施例を参照して記述されるが、これは単に説明のためのものであり、いずれにしても本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
【実施例】
【００３３】
実施例１：抗体Ａの収量に対する凍結‐解凍の効果
抗体ＡをコードするＤＮＡを挿入したベクターｐＴＴ０Ｄを使用して、抗体Ａ（Ｆａｂ’）をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０細胞中で発現した。醗酵（ＤＤ５３中）を２５℃で、ＯＤ６００が１１１．６になり、回収ができる状態まで行った。室温で回収培養分割液５０ｍｌを遠心分離した：一つの細胞ペレットを−２０℃に４時間置き、第２のペレットを培養上清５ｍｌプラスＨ２Ｏ  ２９ｍｌ及び１００ｍＭＥＤＴＡを含有する１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４  ５ｍｌの中に懸濁し、次いで１７０ｒｐｍで１４時間攪拌しつつ５０℃の熱処理を行った。熱処理の後、再懸濁した細胞ペレットをＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ．６遠心分離機中４２００ｒｐｍで３０分間４℃において遠心分離して澄明にした。機能性抗体Ａを含有する上清を、２０ｍＭリン酸緩衝液中プロテインＧ  ＨＰＬＣ分析を使用して、Ｆａｂ’についてアッセイした。注入時のｐＨ７．４からｐＨ２．５へ減少するｐＨグラジエントを使用して抗体Ａを溶出した。機能性抗体の収量は、標準Ｆａｂ’濃度と比較することにより算出した。
【００３４】
凍結‐解凍を行わなかった検体に比較して、凍結‐解凍検体において機能性抗体の収量の増加を認めることができる（図１）。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、機能的抗体Ａの収量に対する凍結‐解凍処理の影響を示す棒グラフである。それぞれのバーの上の数字は、機能的抗体Ａの収量をｍｇ／澄明化再懸濁のリットルで示す。バー１は、凍結しない対照再懸濁のＦａｂ’収量を示し、そしてバー２は凍結‐解凍を行った再懸濁のＦａｂ’収量を示す。
【図１】
2008520226.tif 000003
【国際調査報告】
2008520226.tif 000004
2008520226.tif 000005
2008520226.tif 000006