(57)【要約】  特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶを用いて、ワクチンおよび該ワクチンを含有する医薬組成物を調製する。該ワクチンを生産するために用いたサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対する防御細胞性免疫反応を個体に誘発することにより、該ワクチンを使用して、ＨＩＶに慢性的に感染した個体を治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶを含む組成物。
【請求項２】
医薬として許容される担体をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記不活化全粒子ＨＩＶサブタイプが非自己由来である請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが、グループＭのサブタイプ、ＨＩＶ−２グループおよびＨＩＶ  Ｏサブグループから選択される請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
グループＭのサブタイプがＡ、Ｂ、ＣまたはＥである請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記不活化全粒子ＨＩＶが化学的処理により不活化されている請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記不活化全粒子ＨＩＶがアルドリチオール−２（ＡＴ−２）処理により不活化されている請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
アジュバントをさらに含む請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記アジュバントが樹状細胞の成熟を刺激する請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ２プロフィールでの細胞分化を阻害するために樹状細胞を刺激できる請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ１プロフィールでの細胞分化を活性化するために樹状細胞を刺激できる請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記不活化全粒子ＨＩＶが抗原提示免疫細胞（ＡＰＣ）により提示されている請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＡＰＣがランゲルハンス細胞（ＬＣ）、成熟樹状細胞（ＤＣ）および未成熟樹状細胞（ＤＣ）のグループから選択される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶの含むＨＩＶ慢性的に感染した個体を治療するための医薬品であって、医薬品を生産するために使用したサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対し該個体に防御細胞性免疫反応を誘発する医薬品。
【請求項１５】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶがＨＩＶ慢性感染のために治療される前記個体の自己由来ではない請求項１４に記載の医薬品。
【請求項１６】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが化学的処理により不活化されている請求項１４に記載の医薬品。
【請求項１７】
前記不活化全粒子ＨＩＶがアルドリチオール−２（ＡＴ−２）処理により不活化されている請求項１６に記載の医薬品。
【請求項１８】
アジュバントをさらに含む請求項１４に記載の医薬品。
【請求項１９】
前記アジュバントが樹状細胞の成熟を刺激する請求項１８に記載の医薬品。
【請求項２０】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ２プロフィールでの細胞分化を阻害するために樹状細胞を刺激できる請求項１４に記載の医薬品。
【請求項２１】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ１プロフィールでの細胞分化を活性化するために樹状細胞を刺激できる請求項２０に記載の医薬品。
【請求項２２】
前記樹状細胞がランゲルハンス細胞である請求項１４に記載の医薬品。
【請求項２３】
皮内投与によりＨＩＶ慢性感染個体を治療するための請求項１４から２２のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項２４】
前記不活化全粒子ＨＩＶが抗原提示免疫細胞（ＡＰＣ）により提示されている請求項１４から１７のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項２５】
前記ＡＰＣがランゲルハンス細胞（ＬＣ）、成熟樹状細胞（ＤＣ）および未成熟樹状細胞（ＤＣ）のグループから選択される請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２６】
皮下投与によりＨＩＶ慢性感染個体を治療するための請求項２４または２５のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項２７】
特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶを含むワクチンをＨＩＶ慢性感染個体に投与することを含む、該個体を治療する方法であって、該ワクチンを生産するために使用したサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対し該個体に防御細胞性免疫反応を誘発する方法。
【請求項２８】
前記個体にアジュバントを投与することをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アジュバントが樹状細胞の成熟を刺激する請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記樹状細胞がランゲルハンス細胞である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ２プロフィールでの細胞分化を阻害するために樹状細胞を刺激できる請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記アジュバントがＣＤ４−Ｔｈ１プロフィールでの細胞分化を活性化するために樹状細胞を刺激できる請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが、グループＭのサブタイプ、ＨＩＶ−２グループおよびＨＩＶ  Ｏサブグループから選択される請求項２７から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記グループＭのサブタイプがＡ、Ｂ、ＣまたはＥである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが化学的処理により不活化されている請求項２７から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記不活化全粒子ＨＩＶがアルドリチオール−２（ＡＴ−２）処理により不活化されている請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記不活化全粒子ＨＩＶが皮内送達により投与される請求項２７から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記皮内送達が無針による直接送達である請求項２７から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが、ＨＩＶ慢性感染のために治療される個体の自己由来ではない請求項２７から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
治療される個体が感染しているＨＩＶのサブタイプを判定する第一の工程を含む請求項２７から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
投与される前記不活化ＨＩＶと治療される個体が感染しているＨＩＶとが同一のサブタイプを有する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＩＶ慢性感染個体を治療する方法であって、
１）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶを抗原提示細胞に負荷することと、
２）負荷された抗原提示細胞を該個体に投与し、これにより、該ワクチンを生産するために使用したサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対し防御細胞性免疫反応を誘発することと、を含む方法。
【請求項４３】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
特定のサブタイプの前記不活化全粒子ＨＩＶが、グループＭのサブタイプ、ＨＩＶ−２グループおよびＨＩＶ  Ｏサブグループから選択される請求項４２または４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記グループＭのサブタイプがＡ、Ｂ、ＣまたはＥである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記不活化全粒子ＨＩＶを皮下送達により投与する請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
治療される個体が感染しているＨＩＶのサブタイプを判定する第一の工程を含む請求項４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
投与される前記不活化ＨＩＶと治療される個体が感染しているＨＩＶとが同一のサブタイプを有する請求項４１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染の治療、特にヒトにおけるＨＩＶ感染の治療のためのワクチンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の発見から２０年が経過したが、これまでのところ有効な予防または治療ワクチンは利用可能となっていない。世界保健機関および国連合同エイズ計画の最近の予測では、現在の速度で世界的流行が進行すれば、２０１０年までに新たな感染者が４５００万人に達するという1。抗レトロウイルス療法により、ＨＩＶ感染
者の生存期間の延長とＨＩＶ母子感染の減少に大きな進歩が達成されてきてはいるが、長期にわたる抗レトロウイルス療法下で薬剤耐性および／または重度の薬剤関連有害作用を発現する患者が増加している。このため、ＨＩＶ感染個体を疾患の進行から守る別の代替治療戦略が緊急に必要とされている。
【０００３】
大規模ヒト第３相試験において、ＨＩＶを中和する体液性免疫の誘発を目的とした１つのワクチン候補が、最近、その有効性の立証に失敗した2。こうした予防策の欠如は、現
行のワクチンデザインではＨＩＶに対しｉｎ  ｖｉｖｏで有効な中和抗体（Ｎａｂ）を誘発できないことが周知であることと一致している3。このように効果的なＮａｂを誘発で
きないことはおそらく、感染因子の性質によって決定されていると考えられる。たとえば、結核、癩（らい）病、およびＣ型肝炎ウイルス感染などの慢性感染症には有効な予防ワクチンが今のところ存在しない。対照的に、ポリオ、麻疹、ジフテリア、破傷風または天然痘などの急性伝染病は、Ｎａｂの誘発を介してワクチンで効果的に予防され、ワクチンは経胎盤的に、または母乳を介して移行し、胎児または新生児を感染から防御することもできる。
【０００４】
結核、癩病、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス、およびＨＩＶによる慢性感染症などのように、感染因子が根絶されない状況では、長期にわたる細胞性免疫によって疾患を制御できる可能性がある。これに関して、活発なウイルス特異的ＣＤ４＋１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞およびエフェクター（パーフォリン＋）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の反応が、慢性ＨＩＶ−１感染個体におけるウイルス血症のコントロールと長期にわたる非進行に関連していることが示された4-10。さらに、急性感染期に、または急性感染後まもなくの時期に実施した抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）による早期介入は、ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞の反応増強と関連していた11-12。対照的に、後期に実施したＨＡ
ＡＲＴでは、ＨＩＶ−１特異的ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞およびＣＴＬの反応が低下したことから5，13，14、ＨＩＶ−１を捕捉する抗原提示細胞（ＡＰＣ）（免疫反応の誘発に必要な
細胞）の機能的能力が感染の経過に伴って徐々に失われることが示唆された15-18。これ
に関連して、長期間持続するＨＩＶ−１特異的細胞性免疫反応の誘発を目的とした治療ワクチンは、２つの必須条件下で実行可能となると考えられる。すなわち、１）強力で幅広く持続する防御細胞性免疫を誘発できる適切な免疫原を発見すること、２）ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化したＡＰＣの養子移入（すなわち、補充戦略）により、あるいは免疫原および適切なサイトカインまたはアジュバントを同時併用して障害の少ないＤＣ（ランゲルハンス細胞など）をｉｎ  ｖｉｖｏで直接活性化することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで損なわれたＡＰＣ機能を再構築することの２つである。成功する治療ワクチンの最終目標は、ＨＩＶ−１感染患者のウイルス負荷量を可能な限り低レベルに持続的に低下させることにある。これが可能になれば、疾患の進行から患者を守ることができ、有害で高価な抗レトロウイルス薬の必要が少なくなると考えられる。さらに、ＨＩＶウイルス負荷量を持続可能に
低下させることができれば、健康な人にウイルスを性感染させるリスクを最小限に抑えられる可能性がある19。
【０００５】
ワクチンにより誘発される防御免疫反応は、免疫原の性質によって大きく異なりうる。弱毒化生ワクチンは体液性免疫反応と細胞性免疫反応の両方を誘発するが、不活化ワクチンおよび精製した合成タンパク質は体液性（抗体）反応を優先的に誘発する。免疫系の細胞性部分を誘発することを目的とした多施設臨床試験において、ＨＩＶ遺伝子を含有する細菌ＤＮＡから作製した実験的ワクチンで志願者２０５例を免疫したところ、顕著なＨＩＶ特異的細胞性免疫反応を示した志願者は２０％に過ぎず（該ＤＮＡプライムはマウスの実験では良好に作用しているのだが）、研究者らを失望させた20。これに関連して、本願発明者（および他の研究者）は、エンベロープタンパク質ｇｐ１２０の立体構造が保存されている（たとえば、該ウイルスがアルドリチオール−２［ＡＴ−２］で処理された場合など）不活化全粒子ＨＩＶ−１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力なＨＬＡ−Ｉ制限性ＣＴＬ反応を誘発するため、樹状細胞（ＤＣ、最も強力なＡＰＣ）により処理されて提示されうることを最近発見した21，22。いくつかの研究からも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで不活化全粒子ＨＩＶ−１を負荷した自己由来ＤＣの養子移入がｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスに防御抗ウイルス免疫を誘発したことが立証されている。23，24。本願発明者は以前に、不活化全粒子サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）株ｍａｃ２５１（ＳＩＶｍａｃ２５１）を負荷したＤＣで作製した治療ワクチンが、ＳＩＶｍａｃ２５１で２カ月間感染させて免疫感作したＣｈｉｎｅｓｅアカゲザルにおいて、他の抗ウイルス治療をまったく併用せずに、ウイルスを劇的に抑制したことを示した25。以上の所見を統合すれば、ＡＴ不活化全粒子ウイルスは、慢性ＨＩＶ−１感染を有する人に防御ＨＩＶ−１特異的ＣＴＬ反応を誘発するための有効なワクチン免疫原として使用できる可能性があることが示唆される。しかし、世界的規模のＨＩＶ−１の可変性のため、ＧＭＰグレードの不活化全粒子ウイルス製剤をＨＩＶ−１に対する世界共通の治療ワクチンとして使用するという考えに反対する議論がある。（発明の開示）
本発明は、特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶと、任意でアジュバントとを含むワクチンを提供する。該ワクチンは、該ワクチンを生産するために用いたサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対する防御細胞性免疫反応を誘発することにより、ＨＩＶに慢性的に感染した個体を治療するために使用することができる。
【０００６】
本発明はまた、特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶを含むワクチンと医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
本発明はさらに、ＨＩＶ慢性感染個体の治療用の医薬品を生産するための特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶの使用方法も提供する。該医薬品は、該ワクチンを生産するために用いたサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対する防御細胞性免疫反応を誘発することにより、ＨＩＶ慢性感染個体を治療するために使用することができる。
【０００７】
本発明はまたさらに、該個体の特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶと任意でアジュバントとを含有するワクチンを投与することを含み、その結果該ワクチンを生産するために用いたサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対する防御細胞性免疫反応が該個体に誘発される、ＨＩＶ慢性感染個体の治療方法を提供する。１つの実施形態では、不活化ＨＩＶをｅｘ  ｖｉｖｏで抗原提示免疫細胞（ＡＰＣ）に負荷し、続いて該細胞を該個体に投与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ＨＩＶには２つの主要グループ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）と多数のサブグループが存在するが、これはＨＩＶゲノムが絶えず変異しているためである。グループとサブグループとの間の主な違いはウイルスのエンベロープに存在する。ＨＩＶ−１は主要サブグループ（Ｍ）と１０番目のアウトライヤーサブグループ（Ｏ）に分類され、サブグループ
ＭはＡからＪまで設定された９つのサブタイプ（クレード）に分けられる28，29。ＨＩＶゲノムに見られる遺伝的変異は、突然変異、組換え、挿入および欠失の結果である29。
【０００９】
ＨＩＶに対する、好ましくはサブタイプＡ、Ｂ、ＣまたはＥのようなＨＩＶ−１サブタイプに対する本発明によるワクチンは、サブタイプを一致させたウイルス株では高いＣＴＬ殺活性を示し、一方、交差サブタイプ殺活性は低いことが観察された。個々の症例に交差サブタイプ殺活性が観察されたが、サブタイプを一致させなかったウイルス株では一致させたウイルス株に比べ、ＣＴＬ殺効率が大きくばらついていた（下記の実施例１および図１を参照）。したがって、本発明は、特定のサブタイプの不活化全粒子ＨＩＶ調製物で作製した、ＨＩＶに対するサブタイプ特異的治療ワクチンを提供する。このような本発明のワクチンはＨＩＶ慢性感染個体を治療するために使用することができ、ワクチンは、ワクチンを生産するために用いたサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプに対する防御細胞性免疫反応を誘発する。
【００１０】
本明細書に使用している用語「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を形成させる、または免疫を人為的に増強させるために投与される組成物を指す。
好ましくは、該ワクチンは、治療される個体の自己由来ではないＨＩＶサブタイプで生産される。実際に本願発明者は、治療される個体の自己由来ではないＨＩＶサブタイプで作製したワクチンが、意外にも該個体のウイルス負荷量を有意に減少させうることを示した。
【００１１】
本発明によれば、いかなるサブタイプのＨＩＶによる慢性感染も治療することができ、たとえば、ＨＩＶウイルスによる慢性感染はグループＭのＡ、Ｂ、ＣまたはＥ（およびその他の）サブタイプの１つや、ＨＩＶ−２グループおよびＨＩＶ  Ｏサブグループから選択される。
【００１２】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、たとえば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の異なる不活化ＨＩＶサブタイプなど、いくつかの不活化ＨＩＶサブタイプを含むことができる。
【００１３】
本明細書に使用する場合、ＨＩＶ慢性感染を有する個体を「治療する」とは、ＨＩＶ感染の症状を予防、軽減または抑制すること、ワクチンの投与後にウイルス負荷量（特に血漿ウイルス負荷量）が減少すること、および／または個体に抗ＨＩＶ  ＣＴＬ反応が誘発されることを意味する。個体のＨＩＶ慢性感染を「治療する」ことは、個体からＨＩＶが完全に根絶されることを求めてはいない。
【００１４】
本明細書に使用する場合、「ＨＩＶ慢性感染個体」とは、ＨＩＶに感染したと診断されうる個体を意味する。
本明細書に使用する場合、「不活化全粒子ＨＩＶ」とは、不活化され、もはや感染性のない完全なＨＩＶ粒子を意味する。
【００１５】
本発明を実施するに際し、紫外線照射、加熱、またはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、プロピオラクトンもしくはＡＴ−２処理のような化学的処理など、当業者に周知の適切な手法により、特定のサブタイプのＨＩＶを不活化することができる。
【００１６】
好ましくは、ＨＩＶを化学的処理に曝すことにより、より好ましくはＡＴ−２処理に曝すことにより、特定のサブタイプのＨＩＶが不活化される。意外にも、このようなＡＴ−２不活化はＨＩＶタンパク質の立体構造を維持することが可能であり、非自己由来による実に強力なＣＴＬ反応を誘発することができる。
【００１７】
サブタイプ特異的不活化全粒子ウイルス免疫原は、成熟もしくは未成熟の樹状細胞（ＤＣ）またはランゲルハンス細胞（ＬＣ）などの抗原提示免疫細胞（ＡＰＣ）のｅｘ  ｖｉｖｏ負荷（「パルシング」とも呼ばれる）のためや、ＡＰＣをベースとした治療ワクチンを製造するため、あるいは無細胞ワクチンを製造するためＬＣのｉｎ  ｖｉｖｏ負荷を可能にする直接皮内ｉｎ  ｖｉｖｏ注射のために使用することができる。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明の無細胞ワクチンは、たとえば、サブタイプを特定した不活化ＨＩＶを当該技術分野の範囲内の方法で患者の皮膚に直接（好ましくは無針で）送達することにより（たとえば、皮内注射器により）、投与することができる。皮内ワクチン投与のための無針の器具は当業者には周知であり、一例として米国特許第６，９３３，３１９号および国際特許出願第ＷＯ  ２００４／１０１０２５号に記載されている器具が挙げられ、当該器具は参照により本明細書に組み込まれる。表皮には多数のＬＣが存在するため、皮膚を通じたワクチン接種（皮内投与）は特に好都合である。ＬＣはＤＣの未成熟形であることが知られており、皮膚の最表面層である角質層に近接した位置に存在する。ＬＣは、皮膚表面積の２５％に相当する面積に存在し26、慢性ＨＩＶ／ＳＩＶ感染の早期または無症候期には機能的に無傷のままである27。本願発明者は、本発明の無細胞ワクチンを上記のように皮内投与すればＳＩＶウイルス負荷量を顕著に減少させることが可能であることを示した。
【００１９】
別の実施形態では、ＡＰＣをベースとした本発明のワクチンは、たとえば、サブタイプを特定した不活化ＨＩＶを負荷したＡＰＣを、当該技術分野の範囲内の方法で患者に直接送達することにより（たとえば、皮下注射器により）、投与することができる。
【００２０】
１つの実施形態では、該方法は、本発明の組成物を投与する前に、治療される患者が感染しているＨＩＶのサブタイプを判定する前工程を包含する。このような判定は、上記患者の血液試料に存在するＨＩＶを分析することにより特定の領域のＨＩＶ配列の遺伝子型特定を行うなど、当該技術分野で周知の方法により行なうことができる。好ましくは、当該ＨＩＶサブタイプ判定工程の後に、治療される患者が感染したサブタイプと同一のＨＩＶサブタイプからなる本発明のＡＰＣベースのワクチンまたは無細胞ワクチンを投与する。
【００２１】
別の実施形態では、特定のサブタイプの不活化ＨＩＶを負荷したＡＰＣで個体を治療する。まずＡＰＣにｅｘ  ｖｉｖｏで不活化ＨＩＶを負荷し、続いて負荷したＡＰＣを任意の適切な手法により患者に投与する。好ましくは、負荷したＡＰＣを個体の皮下、皮内または筋肉内に注射し、好適には皮下注射により投与する。より好ましくは、治療される個体から単球（ＣＤ１４＋）を単離するために先に行なったＰＢＭＣサンプリングによりＡＰＣを入手し、続いて、未成熟樹状細胞と次に成熟樹状細胞において既知のサイトカインでＡＰＣを形質転換させる。このような方法は当業者には周知であり、一例として実施例１に記述する方法がある。
【００２２】
ＤＣは成熟すると所属リンパ節へ効果的に遊走して免疫刺激機能を果たすが、不活化全粒子ＨＩＶは、細菌産物とは異なり単独ではＤＣの成熟を誘発するほどの効力がない25。このため、アジュバントとして知られている強力な分子種を不活化全粒子ＨＩＶと併用して、ＬＣなどの免疫細胞の最適な成熟を誘発することが好ましく、これによりＨＩＶ−１に対する効果的な細胞性免疫反応が生み出される。
【００２３】
用語「アジュバント」は、免疫反応を改善するためにワクチンに加えられる物質を指す。
適切なアジュバントには、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物
質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性もしくは炭化水素系乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、通例の細菌産物（コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、弱毒化もしくは不活化ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびコリネバクテリウムパルブムまたはＢＣＧ由来タンパク質など）、生化学的分子（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１−β、ＩＬ−６、ＰＧＥ２もしくはＣＤ４０Ｌなど）、あるいはＣｐＧモチーフを有するオリゴデオキシヌクレオチドなどが挙げられる。ワクチン組成物に使用するのに適した材料の例は、たとえば、Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980), pp. 1324-1341に開示されており、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２４】
樹状細胞は、単球の分化の調節、特にＣＤ４−Ｔｈ１プロフィール対ＣＤ４−Ｔｈ２プロフィールの分化の調節に中心的な役割を果たしている。好適には、本発明の無細胞ワクチン組成物は、慢性感染において誘発されることが多いＣＤ４−Ｔｈ２プロフィールでの細胞分化を阻害するために樹状細胞を刺激でき、かつ同時に、ＣＤ４−Ｔｈ１プロフィールでの細胞分化を活性化するために樹状細胞を刺激できるアジュバントを含む。そのようなアジュバントは、当業者には周知であり、細菌産物（Ａｇ８５ＢのようなＢＣＧ由来タンパク質など）、または抗ＣＯＸ活性、特に抗ＣＯＸ２活性を有する化合物のような化合物（ＶＩＯＸ（登録商標）、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）またはＲＩＢＡＶＥＲＩＮ（登録商標）など）が含まれる。
【００２５】
本発明のワクチンは、ＨＩＶに慢性的に感染した個体を治療するため、医薬組成物（「医薬品」とも呼ばれる）に配合することができる。本発明の医薬組成物は、無菌で、発熱物質を含まないことが好ましく、かつ医薬として許容される担体をも含有する。医薬として許容される適切な担体には、水、食塩溶液（たとえば生理食塩水）、粘度調整剤および他の通例の医薬賦形剤、および／またはヒトに使用する医薬組成物の配合に使用される添加物が挙げられる。適切な医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液、およびｐＨ調整剤が挙げられる。適切な添加物には、生体適合性緩衝液（たとえばトロメタミン塩酸塩など）、キレート化合物（たとえばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（たとえばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）が挙げられ、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩（たとえば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウムなど）を加えてもよい。本発明の医薬組成物の配合は当該技術分野の範囲内にあり、たとえばRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されており、当該開示内容はすべて、参照により本明細書に組み込まれ
る。
【００２６】
積極療法による細胞性免疫反応により緩和することができる、ＨＩＶ慢性感染個体を治療するための典型的投薬計画は、上記のようなワクチン組成物の有効量を、１週間から約２４カ月を含む期間にわたって、単回治療として投与するか、または増量もしくは追加量として反復投与することを包含する。
【００２７】
本発明によれば、ワクチン組成物の「有効量」とは望ましい生物学的効果を達成するに足る量であり、この場合は、ＨＩＶに対する少なくとも１つの細胞性または体液性免疫反応、好適には１つの細胞性免疫反応が生物学的効果となる。当然のことながら、有効量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療の頻度、望む効果の性質によって異なる。下に提供する有効量の範囲は、本発明を限定することを意図したものではなく、好ましい投与量範囲を表している。しかし、当業者には当然のことであり、かつ決定可能であるように、最も好ましい投与量は、過度の実験を伴うことなく、個々の対象者に合わせて調整される。たとえば、下記のＢｅｒｋｏｗ（１９８７年）、下記のＧｏｏｄｍａｎ（１９９０年）、下記のＡｖｅｒｙ（１９８７年）、Ebad
i, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, Mass. (1985)および下記のＫａｔｓｕｎｇ（１９９２年）を参照されたいが、これらの文献とそこに引用された文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２８】
一般的には、成人投与量は投与１回あたり不活化全粒子ＨＩＶ約１０6〜１０14個であ
り、１０8〜１０12個が好ましい。どのような投与量が用いられるとしても、本明細書に
も記述するように、周知の方法で測定した安全かつ有効な量でなければならない。
【００２９】
以下に記述する非限定的な実施例により、本発明を説明する。
実施例
（実施例１）
方法
ウイルスおよび細胞試料
ＨＩＶ−１サブタイプＡ（ｎ＝１０）、Ｂ（ｎ＝１０）、Ｃ（ｎ＝１０）またはＥ（ｎ＝１０）に感染した患者のＣＤ８枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養により、ＨＩＶ−１株を得た。続いて、参照により開示内容がすべて本明細書に組み込まれる文献21に記載されているように、ＨＩＶ−１サブタイプ（Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ）株をＡＴ−２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で不活化した。標準化した７日間培養25により、ＧＭＰ条件下で各患者から単球由来のＤＣを調製した。簡単に述べると、新たに採取したＰＢＭＣに、０．５％臨床用ヒト血清アルブミン（ＬＦＢ，Ｌｅｓ  ＵＨｓ，フランス）の存在下で１０6細胞／ｃｍ2の密度でプラスチック付着法を行なった。３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートした後、滅菌ＰＢＳ緩衝液ですすいで非付着細胞を除
去した。次に、ＧＭ−ＣＳＦ  ２０００Ｕ／ｍｌ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｂｒｉｎｎｙ，アイルランド）および臨床グレードのＩＬ−４  ５０ｎｇ／ｍｌ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ドイツ）を補った臨床グレードのＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含有する完全培地中で、付着細胞を５日間培養した。５日目に、ＤＣをＡＴ−２不活化自己由来ウイルス（１０9ウイルス粒子／ｍｌ）に３７℃で
２時間曝した。２回洗浄して非結合不活化ウイルスを除去した後、臨床グレードのサイトカインＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＮＦ−α（５０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を補った完全培地中でさらに２日間細胞を培養した。７日目に、参照により開示内容がすべて本明細書に組み込まれるフローサイトメトリー25により、ＤＣの品質管理（ＱＣ）を行なった。続いて、ＱＣに合格した生存能力のあるＤＣを用い、上記文献21に記載されているように混合培養プロトコルにより、自己由来ウイルスに特異的なＣＴＬを拡大させた。
細胞傷害性測定
ＤＣをＡＴ−ＨＩＶ−１（１０9／ｍｌ）で９０分間パルスし、続いてＣＦＳＥ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＰｏｏｒｔＧｅｂｏｕｗ，オランダ）（１０ｎＭ）で１５分間標識し、２回洗浄した。非パルスＤＣをＣＦＳＥで標識して特異性の対照とした。ＨＩＶ−１サブタイプ株に特異的なＣＴＬを、ＣＦＳＥで標識したサブタイプを一致させるかまたは一致させていないＡＴ−２−ＨＩＶ−１パルス樹状細胞（ＤＣ）の存在下で、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｕｂｅｓ−Ｂｕｌｋ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中においてＥ：Ｔ比１０：１で３７℃で４時間平板培養した。インキュベーションの終わりに、１０μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ）（２０μｇ／ｍｌ）を各チューブに加えた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で標的細胞溶解を分析した。非パルスＤＣの非特異的ＣＦＳＥ／ＰＩ染色を差し引いた後、ＣＦＳＥ／ＰＩ染色ＤＣの割合を算出することにより、ウイルス特異的細胞溶解活性を判定した。
統計解析
ＨＩＶ−１サブタイプを一致させた場合と一致させていない場合の細胞殺活性の障害デ
ータをＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較した。
結果
ＨＩＶ−１サブタイプＡ、Ｂ、ＣまたはＥに特定した本発明によるワクチンは、サブタイプを一致させたウイルス株（ｎ＝１０）では高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＴＬ殺活性（２８〜３７％）を示したが、交差サブタイプ殺活性は低い（５〜１７％）ことが観察された（Ｐ＜０．００１）。個々の症例に交差サブタイプ殺活性が観察されたが、サブタイプを一致させなかったウイルス株（ＳＤ／平均値＞５０％）では一致させたウイルス株（ＳＤ／平均値＜２０％）に比べ、ＣＴＬ殺効率が大きくばらついていた（Ｐ＜０．００１）（図１）。これらの所見は、サブタイプを特定したＨＩＶ−１用の医薬治療ワクチンが、ＧＭＰグレードの不活化全粒子ウイルス製剤により作製できることを示している。
（実施例２）
ＨＩＶ慢性感染個体を特定し、個体が感染しているＨＩＶのサブタイプを判定する。本発明のワクチンで治療を行う前に、各個体の血漿ウイルス負荷量を測定する。個体が感染しているサブタイプと同一のサブタイプのＨＩＶを入手し、上記の実施例１に記述したように、培養してＡＴ−２で不活化する。
【００３０】
不活化ＨＩＶサブタイプを１つの慢性感染個体群に無針皮内送達により投与し、血漿ウイルス負荷量を測定する。慢性感染個体の血漿ウイルス負荷量は、本ワクチンの投与により有意に減少すると期待される。
【００３１】
別の慢性感染個体群に、上記の実施例１に記述したようなＡＴ−２で不活化したＨＩＶを負荷した樹状細胞を投与する。ＨＩＶを負荷した該樹状細胞を個体群に投与する。当該慢性感染個体の血漿ウイルス負荷量は、負荷した樹状細胞の投与により有意に減少すると期待される。
（実施例３）
ＳＩＶｍａｃ２５１に慢性的に（＞１年）感染させ、血漿ウイルス負荷量が１０００コピー／ｍｌを超えるマカクザル４０匹を、自動注入ピストル（ＡＫＲＡＤＥＲＭＯ  ＪＥＴ，Ｐａｕ，フランス）を用いた５カ月間にわたるＳＩＶａｃ  ＬＡ２．１（１０10のＡＴ−２不活化ＳＩＶｍａｃ２５１を含有する０．９％ＮａＣｌ溶液２．５ｍｌ）の月１回皮内注射（１００μｌ／ｃｍ2／注射）（背部２５ｃｍ2）（ｎ＝２０）、または５カ月間にわたるプラセボ（０．９％ＮａＣｌ溶液のみ２．５ｍｌ）の月１回皮内注射（ｎ＝２０）のいずれかに無作為化した。ベースライン時とその後６カ月まで毎月、血漿試料を採取し、使用時まで−８０℃で保存した。最後に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定法（ＭＵＰＲＯＶＡＭＡ）により、血漿ＳＩＶ  ＲＮＡ負荷量を測定した。
結果
本発明によるサブタイプを特定したＳＩＶ無細胞ワクチンは、３カ月時点（Ｐ＝０．０３７）および６カ月時点（Ｐ＝０．０１３）において血中ウイルス量をほぼ３０％減少させている。これらの所見は、サブタイプを特定したＳＩＶ用の医薬治療ワクチンがＧＭＰグレードの不活化全粒子ウイルス製剤により作製できることを示している。
（実施例４）
ＳＩＶｍａｃ２５１に慢性的に（＞１年）感染させ、血漿ウイルス負荷量が１０００コピー／ｍｌを超えるマカクザル１４０匹を、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）２００ｍｇの１日１回４週間経口投与を併用した場合と併用しない場合において、自動注入ピストル（ＡＫＲＡＤＥＲＭＯ  ＪＥＴ，Ｐａｕ，フランス）を用い、異なるアジュバント（弱毒化または加熱不活化ＢＣＧの１０5ＵＦＣ、ＢＣＧ由来組換え型Ａｇ８５Ｂ）を使用したＳ
ＩＶａｃ  ＬＡ２．１（１０10のＡＴ−２不活化ＳＩＶｍａｃ２５１を含有する０．９％ＮａＣｌ溶液２．５ｍｌ）を投与する月１回５カ月間皮内注射（背部２５ｃｍ2）（１０
０μｌ／ｃｍ2／注射）（各群ｎ＝２０）、またはプラセボ（０．９％ＮａＣｌ溶液のみ
２．５ｍｌ）の月１回５カ月間皮内注射（ｎ＝２０）のいずれかに無作為化した。ベースライン時とその後６カ月まで毎月、血漿試料を採取し、使用時まで−８０℃で保存した。
最後に、定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定法（ＭＵＰＲＯＶＡＭＡ）により、血漿ＳＩＶ  ＲＮＡ負荷量を測定した。
【００３２】
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上に列記した参考文献を含め、本出願で引用した文書はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上に記述した実施形態に対して種々の変更を加え得ることは、本明細書で提供した開示内容から当業者には明らかである。したがって本発明は、その趣旨または本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のワクチンの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）殺活性を示す図。
【図２】ＳＩＶｍａｃ２５１慢性感染マカクザルの血漿ウイルス負荷量に対する、ＡＴ−２不活化ＳＩＶｍａｃ２５１による皮内免疫感作の効果を示す図。データは、免疫感作前後の血漿１ミリリットルあたりのＳＩＶ  ＲＮＡコピー数の幾何平均を示す。Ｐ値は、免疫感作の前および免疫感作から３または６カ月後における対のあるデータのＷｉｌｃｏｘｏｎ検定による統計解析結果を示す。
【図１】
2008515795.tif 000002
【図２】
2008515795.tif 000003
【国際調査報告】
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2008515795.tif 000005
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2008515795.tif 000007
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