(57)【要約】  フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン・アナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のために式（II）｛式中、１のＸはＮであり、そして他のＸはＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；ＺはＯ，Ｓ又はＮＲ3であり；Ｒ2とＲ3は各々、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ベンジル又はＢ−フェニルエチルであり；ｎは０〜６であり；Ａは、場合によりスペーサーによりトリアジンに連結された支持マトリックスであり；Ｒ7は中性ｐＨにおいて正電荷をもつ基であり；Ｗは任意的リンカーであり；Ｖは芳香族基であり；そしてＲ8とＲ9は各々、Ｈ，ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アミノ、ＮＨ2、アシルオキシ、アシルアミノ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル若しくはハロゲン又は環状構造、例えばモルフォリノ基であり、あるいはＲ8とＲ9は連結して前記環状構造を形成する。｝で表される化合物であるアフィニティー吸着剤が使用される。
2008541083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリノーゲン又はフィブリノーゲン・アナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のためのアフィニティー吸着剤の使用であって、当該アフィニティー吸着剤は、以下の式（II）：
【化１】
2008541083.tif 000011
｛式中、１のＸはＮであり、そして他のＸはＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮＲ3であり； 
Ｒ2とＲ3は各々、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ベンジル又はＢ−フェニルエチルであり；
ｎは０〜６であり；
Ａは、場合によりスペーサーによりトリアジンに連結された支持マトリックスであり；
Ｒ7は中性ｐＨにおいて正電荷をもつ基であり；
Ｗは任意的リンカーであり；
Ｖは芳香族基であり；そして
Ｒ8とＲ9は各々、Ｈ，ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アミノ、ＮＨ2、アシルオキシ、アシルアミノ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル若しくはハロゲン又は環状構造、例えばモルフォリノ基であり、あるいはＲ8とＲ9は連結して前記環状構造を形成する。｝で表される化合物である前記使用。
【請求項２】
ＶＲ8Ｒ9は環状構造であるか又は環状構造を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記環状構造はモルフォリンである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記吸着剤は式（III）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記吸着剤は式（IV）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記吸着剤は式（Ｖ）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記吸着剤は式（VI）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記吸着剤は式（VII）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記フィブリノーゲンが、血漿のサンプル中に存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ7はアミノではなく、そして／又はＲ8は環状構造である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の式（II）を有する新規化合物。
【請求項１１】
Ａが、トリアジン環に直接又は間接的に連結された官能基により置換された請求項１０に記載の化合物の前駆体である化合物であって、ここで、当該置換は、固体支持体上の前駆体の固定化を可能にする前記化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、化合物、及びアフィニティーリガンドとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
フィブリノーゲンは、その各々半分が、Ａα，Ｂβ、及びγといわれるジスルフィド結合ポリペプチド鎖から成る２量体タンパク質である。肝臓においては、Ａα−及びＢβ−鎖の遺伝子は、それぞれ、６１０と４６１個のアミノ酸残基の単一産物をコードする。これに反し、γ鎖遺伝子の転写物の他のスプライシングは、僅かに異なる長さ（４１１と４２７残基）のγ鎖バリアントを生成し、その内の短い方は、最終産物の約９０％を構成する。フィブリノーゲンの優勢な形態は、約３４０ｋＤａの分子質量をもって循環中に分泌される。肝臓からのその分泌の後、当該タンパク質は血漿中に存在するだけではなく、リンパ液及び間質液中にも存在する。健康な個体においては、血漿中のフィブリノーゲンの濃度は４〜１０μＭの間にある。重要なことには、この濃度は、生理学的ストレス時の間には、４００％程にも上昇しうる。
【０００３】
フィブリノーゲンは、トリプシン様セリン・プロティナーゼであるトロンビンによりフィブリンに変換される。トロンビンは、フィブリノーゲン内の少なくとも２つの特異的なＡｒｇ−Ｇｌｙ結合を加水分解する。このプロセスは、まずフィブリン・プロトフィブリルの形成を導き、これはその後会合して、より太いファイバーを形成し、これはその後会合してさらにより太く、かつ、分岐したフィブリン束を形成しうる。このような束は、隣接するフィブリン分子のα鎖内に位置するＬｙｓとＧｌｎ残基の間に形成された架橋によりさらに安定化されて、血流を防止し又は血流を制限することができる３Ｄ網様構造を形成する。この架橋プロセスは、酵素第ＸＩＩＩａ因子により触媒される。
【０００４】
フィブリノーゲンの先天異常の２つのタイプ、無フィブリノーゲン血症と異常フィブリノーゲン血症がある。無フィブリノーゲン血症は、出血素質をもたらす量的欠陥である。用語「低フィブリノーゲン血症」とは、軽度のフィブリノーゲン欠陥をいう。異常フィブリノーゲン血症は、出血又は血栓症のいずれかをもたらしうるフィブリノーゲンの機能的な異常を特徴とする。患者は、フィブリノーゲン濃縮物又は寒冷沈降物で処理されうる。フィブリノーゲンは、フィブリン接着剤の形態にる止血の付属物として外科手術中にも一般に使用される。これらは、適当な医薬組成物中に（例えば、フィブリノーゲン濃縮物の形態にある）フィブリノーゲンとトロンビンを含む典型的には２成分の系である。
【０００５】
フィブリノーゲンの上記の部分的に精製された形態の投与における関心は、汚染性タンパク質の存在である。フィブリノーゲンの単離のためのアフィニティー・ベースの特製方法は、それゆえ有用であろう。このような精製方法は、特別なやり方で、非瀉出血漿からフィブリノーゲンを単離して、さらなる操作のために他のタンパク質成分の全てを無傷のままにすることができる場合には、特に有用であろう。
【０００６】
ＷＯ９７／１０８８７は、アフィニティー吸着剤として有用な以下の式（Ｉ）：
【化１】
2008541083.tif 000003
｛式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロヘキシル、ＮＨ2、フェニル、ナフチル、１−フェニルピラゾール、インダゾール、ベンズチアゾール、ベンゾキサゾール又はベンズイミダゾールであり、この芳香族基の内のいずれかは、アルキル、アルコキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノ、ＮＨ2、ＯＨ，ＣＯ2Ｈ、スルフォニル、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル、及びハロゲンの内の１以上により置換されることができ；
１のＸはＮであり、そして他のＸはＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮＲ3であり； 
Ｒ2とＲ3は各々、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ベンジル又はＢ−フェニルエチルであり；
Ｑはベンゼン、ナフタレン、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール、１−フェニルピラゾール、インダゾール又はベンズイミダゾールであり；
Ｒ4、Ｒ5とＲ6は各々、Ｈ，ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アミノ、ＮＨ2、アシルオキシ、アシルアミノ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル又はハロゲンであり；
ｎは０〜６であり；
ｐは０〜２０であり；そして
Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスである｝で表されるトリアジン・ベースの化合物を開示している。
【０００７】
関連構造をもつ化合物は、ＷＯ００／６７９００とＷＯ０３／０９７１１２中に開示されている。それらは内毒素に対するアフィニティーをもつ。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
驚ろくべきことに、その内の多くが新規であるところの特定の化合物が、フィブリノーゲンのアフィニティー・ベースの単離に有用であることが発見された。これらの化合物は以下の式（II）：
【化２】
2008541083.tif 000004
｛式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｎ、及びＡは先に式（Ｉ）のために定義したものと同じであり；
Ｒ7は中性ｐＨにおいて正電荷をもつ基であり；
Ｗは任意的リンカーであり；
ＶはＱのために先に記載したものと同じであるが、節構造であってもよく；そして
Ｒ8とＲ9はＲ4，Ｒ5とＲ6のために定義したものと同じであるが、さらに環状構造を含むか、又はＲ8とＲ9は連結して当該環構造を形成する。｝を有する。
【０００９】
さらに、本発明の化合物は、式中、Ａが、メリアジン環に直接又は関節的に連結された官能基により置換され、支持体上に固定化されうる、対応のリガンドを含む。用語「リガンド」及び「吸着剤」は、以下、互換使用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の説明
ＷＯ９７／１０８８７，ＷＯ００／６７９００、及びＷＯ０３／０９７１１２は、リガンドのコンビナトリアル・ライブラリーが固体支持体上でどのようにして構築されうるかを開示する。本発明に共通する態様及び手順の例を含むそれらの開示は、本明細書中に援用する。供給原料としてのプールされたヒト血漿を用いたこれらのコンビナトリアル・ライブラリーのセットのスクリーニングの間、ヒト・フィブリノーゲンに選択的に結合し、かつ、これを溶離させうる多数のリガンドが固定された。
【００１１】
本発明に使用される式（II）の化合物は、当業者に知られた手順により調製されうる。これらの手順は、前記した３つのＰＣＴ公開中に記載されてより；それらは、新規化合物の調製のために容易に改作されうる。
【００１２】
ＷＯ９７／１０８８７は、それを介してトリアジン環が固体支持体Ｍに連結されうるスペーサー又はリンカーＬを含むＡの例を与える。ＷＯ９７／１０８８７中に記載されるように、このような支持体は、アガロース、シリカ、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナン、合成ポリマー、ガラス及び金属酸化物を含む。このような材料は、本発明の吸着剤を形成するために、反応前に活性化されうる。
【００１３】
Ｌは、例えば、−Ｔ−（−Ｖ1−Ｖ2）ｍ−であることができ、
ここで、
ＴはＯ，Ｓ又は−ＮＲ7−であり；
ｍは０又は１であり；
Ｖ1は２〜２０Ｃの場合により置換された炭化水素基であり；そして
Ｖ2はＯ，Ｓ，−ＣＯＯ−，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−，−ＰＯ3Ｈ−，−ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−又は−ＮＲ8−であり；そしてＲ7とＲ8は各々独立にＨ又はＣ1-6アルキルである。
【００１４】
本発明の化合物中、Ｒ7は、中性ｐＨにおいて正電荷をもつ基である。このような基の例は、グアニジノ、アミジノ等であり、又はアラニン又はフェニルアラニンの如きアミノ酸から誘導される。
【００１５】
（存在する場合）Ｗは、（例えば、アルギニンその他中のカルボン酸で）場合により置換された、アルキル、シクロアルキル、オキシアルキル又は芳香族環構造でありうる任意的リンカーである。
【００１６】
ＶはＱのために先に記載したものと同じであるが、節構造であってもよい。このような構造の例は、単純な第三アミン又はメチン官能基を含み、例えば、モルフォリノ基の形成を可能にする。
【００１７】
Ｒ8とＲ9は、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6のために定義したものと同じであるが、さらに環構造を含み、又はＲ8とＲ9は連結して当該環構造を形成する。このような環構造の例は、典型的には４〜８個の環原子を含み、この内１，２又は３個は独立にＮ（又はＮＨ）、Ｏ又はＳから選択される、飽和、不飽和又は芳香族の、炭素環式又は複素環式環を含み；その１例はモルフォリンである。
【００１８】
本発明の好ましい態様においては、フィブリノーゲン結合性リガンド又は吸着剤は、（生理学的ｐＨにおいてプロトン化されるであろう）以下の式（III）：
【化３】
2008541083.tif 000005
を有する。
【００１９】
本発明の他の好ましい態様においては、フィブリノーゲン結合性リガンド又は吸着剤は、以下の式（IV）：
【化４】
2008541083.tif 000006
を有する。
【００２０】
本発明のさらに他の好ましい態様においては、フィブリノーゲン結合性リガンド又は吸着剤は、以下の構造（Ｖ）：
【化５】
2008541083.tif 000007
により表される。
【００２１】
本発明のさらに好ましい態様においては、フィブリノーゲン結合性リガンド又は吸着剤は、以下の構造（VI）：
【化６】
2008541083.tif 000008
により表される。
【００２２】
本発明の最も好ましい態様においては、フィブリノーゲン結合性リガンド又は吸着剤は、以下の構造（VII）：
【化７】
2008541083.tif 000009
により表される。
【００２３】
本明細書中に記載するフィブリノーゲン結合性リガンド及び吸着剤は、非制限的にヒト血漿及び組換え発酵上清を含む、複合混合物からのフィブリノーゲンの精製に有用である。この有用性は、ヒトのプールされた血漿を用いたクロマトグラフィー実験により、以下の実施例７において証明される。
【００２４】
用語「フィブリノーゲン」は、フィブリノーゲン自体、そしてまた、例えば本明細書中に記載す所定の化合物に対するアフィニティーの点で、フィブリノーゲンの機能特性を有するアナログを記載するために、本明細書中で使用される。したがって、アナライトは、フィブリノーゲンの機能的断片であるタンパク質、又は同一結合部位の全ての内の１以上をもつ構造アナログ、又は融合タンパク質であることができる。
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００２５】
実施例１−４−（４−モルフォリノ）アニソニルジクロロトリアジンの合成
塩化シアヌール酸（１６．１ｇ）をテトラヒドロフラン（１３０ｍＬ）に溶解し、そして氷／塩浴内で０℃に冷却した。ＴＨＦ（４００ｍＬ）中４−（４−モルフォリノ）アニリン（２９．６１ｇ）を、温度が０℃を上廻らない速度で、塩化シアヌール酸の溶液に添加した。添加完了後、混合物をさらに３０分間０℃で撹拌し、そしてその後、溶液を、氷（７００ｇ）と水（１．５Ｌ）の混合物に添加した。得られた固体を、癒別し、水（１Ｌ）で洗浄し、その後、真空オーブン内４５℃で一定重量（２８．５４ｇ）まで乾燥させた。
【００２６】
実施例２−吸着剤IIIの合成
６％架橋ｐｕｒａｂｅａｄアガロースゲル（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水中に沈殿した１０００ｇ）を、ＲＯ水（６６７ｍＬ）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（９０ｍＬ）、及びエピクロロヒドリン（１２７ｍＬ）でスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基についての分析は、ゲルが沈殿ゲル１ｇ当り１９．２μｍｏｌエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００２７】
ゲルを排水し、その後ＲＯ水（４００ｍＬ）と０．８８比重水性アンモニア溶液（１００ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、その後１６時間この温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×５００ｍＬ）で洗浄した。アミン基のためのＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿したゲル１ｇ当り２８．０μｍｏｌアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００２８】
沈殿したアミノ化ゲル（５００ｇ）を１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０（５００ｍＬ）中に懸濁させ、その後排水した。その後、このゲルに、１Ｍリン酸カリウムｐＨ７．０（１２５ｍＬ）とＲＯ水（１２５ｍＬ）を添加した。スラリーを激しく撹拌し、同時にアセトン（２５０ｍＬ）を添加した。３０分間にわたり氷／塩浴中で冷却した後、冷アセトン（１２５ｍＬ）中塩化シアヌール酸（１２．５ｇ）を１部で添加した。混合物を１時間にわたり０℃で撹拌し、その後、５０％水性アセトン（５×５００ｍＬ）、ＲＯ水（５×５００ｍＬ）、５０％水性アセトン（５×５００ｍＬ）、及びＲＯ水（１０×５００ｍＬ）で洗浄した。ゲルを動下で放置して沈殿させ、その後、サンプルを分析のために採取した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２６．１μｍｏｌの置換ジクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。
【００２９】
先のステージからの沈殿ゲル（２３８ｇ）を氷／塩冷却下ＲＯ水（１３８ｍＬ）でスラリー化し、その後冷（８℃）ＲＯ水（９５ｍＬ）中２−（４−モルフォリノ）エチルアミン（４．３９ｇ）を添加し、反応温度が８℃を上廻らないようにした。次いで、この混合物を１時間にわたり８℃で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１０×２５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物の放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２３．８μｍｏｌの置換モノクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。
【００３０】
２３８ｇ（沈殿）のゲルに、ＲＯ水（２００ｍＬ−ｐＨをｐＨ１０に調整、その後ＲＯ水で２３８ｍＬの最終体積に調製した）中に溶解した硫酸アグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）（１５．４２ｇ）を添加した。この混合物を一夜６０℃で撹拌し、同時にｐＨを１０に維持した。上清のサンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、ＲＯ水（１５×２５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１７．０μｍｏｌのアグマチンで誘導体化されていたことを示した。
【００３１】
ゲルを、４０℃で一夜、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ水性エタノールの最終濃度においてインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（５×２００ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水させ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（２５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を４０℃で一夜インキュベートした。次いで、ゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノール（５×２５０ｍＬ）で、その後ＲＯ水（１０×２５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、ゲルを、４０℃一夜０．５Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×２５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水した後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（２５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を一夜４０℃でインキュベートした。次いでゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×２５０ｍＬ）で洗浄し、その後ＲＯ水（１０×２５０ｍＬ）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．０（３×２５０ｍＬ）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×２５０ｍＬ）で洗浄し、その後２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００３２】
実施例３−吸着剤IVの合成
６％架橋ｐｕｒａｂｅａｄアガロースゲル（ＲＯ水中に沈殿した６５０ｇ）を、ＲＯ水（４３８ｍＬ）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（５９ｍＬ）、及びエピクロロヒドリン（８３ｍＬ）でスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基についての分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１６．５μｍｏｌエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００３３】
ゲルを排水し、その後ＲＯ水（５２０ｍＬ）と０．８８比重水性アンモニア溶液（１３０ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、その後１６時間この温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。アミン基のためのＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿したゲル１ｇ当り２２．９μｍｏｌアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００３４】
沈殿したアミノ化ゲル５００ｇ部をＤＭＦ（５００ｍＬ）でスラリー化し、その後排水した。その後、このゲルをＤＭＦ（２５０ｍＬ）でスラリー化し、そしてジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１１．０ｍＬ）を撹拌しながら添加した。混合物を１０分間にわたり撹拌し、次いで、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中４−（４−モルフォリノ）アニリニルジクロロトリアジン（２０．６ｇ）を一部で添加した。この混合物を３時間にわたり室温で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、７０％ｖ／ｖ水性ＤＭＦ（４×１５０ｍＬ）、５０％ＤＭＦ（２×１５０ｍＬ）、及びＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２０．２μｍｏｌ置換モノクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。残存アミンは、誘導体化後のＴＮＢＳアッセイによっては検出限界以下であった。
【００３５】
１５０ｇ（沈殿）部のゲルを、１Ｍホウ酸ナトリウム・バッファー（１５０ｍＬ）中でスラリー化し、そしてｐＨを、１０Ｍ水酸化ナトリウムで１０に調整した。アルギニン（５．５０ｇ）を一部で添加した。混合物を一夜６０℃で撹拌し、同時に、ｐＨを１０に維持した。上清のサンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２２．４μｍｏｌのアルギニンで誘導体化されていたことを示した。
【００３６】
ゲルを、４０℃で一夜、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ水性エタノールの最終濃度においてインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水させ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を４０℃で一夜インキュベートした。次いで、ゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノール（５×１５０ｍＬ）で、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、ゲルを、４０℃一夜０．５Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水した後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を一夜４０℃でインキュベートした。次いでゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．０（３×１５０ｍＬ）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００３７】
実施例４−吸着剤Ｖの合成
６％架橋ｐｕｒａｂｅａｄアガロースゲル（ＲＯ水中に沈殿した６５０ｇ）を、ＲＯ水（４３８ｍＬ）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（５９ｍＬ）、及びエピクロロヒドリン（８３ｍＬ）でスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基についての分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１６．５μｍｏｌエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００３８】
ゲルを排水し、その後ＲＯ水（５２０ｍＬ）と０．８８比重水性アンモニア溶液（１３０ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、その後１６時間この温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。アミン基のためのＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿したゲル１ｇ当り２２．９μｍｏｌアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００３９】
沈殿したアミノ化ゲル５００ｇ部をＤＭＦ（５００ｍＬ）でスラリー化し、その後排水した。その後、このゲルをＤＭＦ（２５０ｍＬ）でスラリー化し、そしてＤＩＰＥＡ（１１．０ｍＬ）を撹拌しながら添加した。混合物を１０分間にわたり撹拌し、次いで、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）中４−（４−モルフォリノ）アニリニルジクロロトリアジン（２０．６ｇ）を一部で添加した。この混合物を３時間にわたり室温で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、７０％ｖ／ｖ水性ＤＭＦ（４×１５０ｍＬ）、５０％ＤＭＦ（２×１５０ｍＬ）、及びＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２０．２μｍｏｌ置換モノクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。残存アミンは、誘導体化後のＴＮＢＳアッセイによっては検出限界以下であった。
【００４０】
１５０ｇ（沈殿）部のゲルを、１Ｍホウ酸ナトリウム・バッファー（１５０ｍＬ）中でスラリー化し、そしてｐＨを、１０Ｍ水酸化ナトリウムで１０に調整した。アルギニンアミドジヒドロクロリド（７．７５ｇ）を一部で添加した。混合物を一夜６０℃で撹拌し、同時に、ｐＨを１０に維持した。スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１５×１５０ｍＬ）で洗浄した。ゲルが、洗浄され、そして沈殿したゲルの残存塩化物の分析は、アルギニンアミドにより完全に誘導体化されていたことを示した。
【００４１】
ゲルを、４０℃で一夜、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ水性エタノールの最終濃度においてインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水させ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を４０℃で一夜インキュベートした。次いで、ゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノール（５×１５０ｍＬ）で、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、ゲルを、４０℃一夜０．５Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水した後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を一夜４０℃でインキュベートした。次いでゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．０（３×１５０ｍＬ）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００４２】
実施例５−吸着剤VIの合成
６％架橋Ｐｕｒａｂｅａｄ  アガロース・ゲル（ＲＯ水中沈殿６５０ｇ）をＲＯ水（４３８ｍＬ）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（５９ｍＬ）、及びエピクロロヒドリン（８３ｍＬ）でスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１６．５μｍｏｌのエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００４３】
ゲルを排水し、その後ＲＯ水（５２０ｍＬ）と０．８８比重アンモニア水（１３０ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、その後１６時間にわたりこの温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、１２×１ＬのＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。アミン基のＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２２．９μｍｏｌのアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００４４】
沈殿しアミノ化したゲル（７０ｇ）を１Ｍリン酸カリウム（７０ｍＬ）中でスラリー化し、そして放置して沈殿させた。次いで、１Ｍリン酸カリウム（２０ｍＬ）を添加し、混合物を激しく撹拌し、そしてアセトン（１０ｍＬ）を添加した。混合物を、氷塩浴内で０℃に冷却し、その後、冷アセトン（１７．５ｍＬ）中の塩化シアヌール酸（１．７５ｇ）を一部で添加した。このスラリーを０〜４℃で１時間にわたり撹拌し、その後排水し、そして５０％ｖ／ｖ水性アセトン（５×７０ｍＬ）、ＲＯ水（５×７０ｍＬ）、５０％ｖ／ｖ水性アセトン（５×７０ｍＬ）、及びＲＯ水（１０×７０ｍＬ）で洗浄した。分析は、沈殿ゲル１ｇ当り１８．０μｍｏｌのジクロロトリアジン基の付着を現した。
【００４５】
ジクロロトリアジニル・アガロース（５５ｇ）を５０％ｖ／ｖ水性ＤＭＦで洗浄し、次いで５０％ｖ／ｖ水性ＤＭＦ（５５ｍＬ）中でスラリー化した。４−（４−モルフォリノ）アニリン（１．２３ｇ）を７５％ｖ／ｖ水性ＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解し、そして氷上で冷却し、その後ジクロロトリアジニル・アガロースに添加した。この混合物を６０分間にわたり４℃に到達させた。この後、上清のサンプルを採取し、その後、ゲルを５０％ＤＭＦ（５×１００ｍＬ）とＲＯ水（１０×１００ｍＬ）で洗浄した。この反応で放出された塩化物イオンの分析は、沈殿ゲル１ｇ当り２０．６μｍｏｌのアミンのローディングを示した。
【００４６】
３７ｇ（沈殿）部のゲルを、１Ｍホウ酸ナトリウム・バッファー（３７ｍＬ）中にスラリー化し、そして１０Ｍ水酸化ナトリウムでそのｐＨを９に調整した。４−アミノベンズアミジンジヒドロクロリド（１．９３ｇ）を一部で添加した。この混合物を一夜６０℃で撹拌し、同時にｐＨを１０に維持した。このスラリーを濾過し、次いで、ＲＯ水（１５×１５０ｍＬ）で洗浄した。ゲルをＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後、２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００４７】
実施例６−吸着剤VIIの合成
６％架橋Ｐｕｒａｂｅａｄ  アガロース・ゲル（ＲＯ水中沈殿６５０ｇ）をＲＯ水（４３８ｍＬ）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（５９ｍＬ）、及びエピクロロヒドリン（８３ｍＬ）でスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１６．５μｍｏｌのエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００４８】
ゲルを排水し、その後ＲＯ水（５２０ｍＬ）と０．８８比重アンモニア水（１３０ｍＬ）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、その後１６時間にわたりこの温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、１２×１ＬのＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。アミン基のＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２２．９μｍｏｌのアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００４９】
沈殿しアミノ化したゲル１５０ｇ部をＤＭＦ（１５０ｍＬ）でスラリー化し、その後、排水した。次いで、このゲルに、ＤＭＦ（７５ｍＬ）でスラリー化し、そしてＤＩＰＥＡ（１．３８ｍＬ）を撹拌しながら添加した。混合物を１０分間にわたり撹拌し、次いで、ＤＭＦ（７５ｍＬ）中４−（４−モルフォリノ）アニリニルジクロロトリアジン（２．５８ｇ）を一部で添加した。この混合物を３時間にわたり室温で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、７０％ｖ／ｖ水性ＤＭＦ（４×１５０ｍＬ）、５０％ＤＭＦ（２×１５０ｍＬ）、及びＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２１．４μｍｏｌ置換モノクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。残存アミンの分析は、誘導体化後、沈殿ゲル１ｇ当り０．８μｍｏｌのアミン基が残存していたことを示した。
【００５０】
１３２ｇ（沈殿）部のゲルを、１Ｍホウ酸ナトリウム・バッファー（１３２ｍＬ）中でスラリー化し、そしてｐＨを、１０Ｍ水酸化ナトリウムで１０に調整した。硫酸アグマチン（３．７３ｇ）を一部で添加した。混合物を一夜６０℃で撹拌し、同時に、ｐＨを１０に維持した。上清のサンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後ＲＯ水（１５×１５０ｍＬ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１９．９μｍｏｌのアグマチンで誘導体化されていたことを示した。
【００５１】
ゲルを、４０℃で一夜、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ水性エタノールの最終濃度においてインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水させ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％  ｖ／ｖ  水性エタノール（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を４０℃で一夜インキュベートした。次いで、ゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノール（５×１５０ｍＬ）で、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。次いで、ゲルを、４０℃一夜０．５Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でインキュベートし、その後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄した。最終洗浄液を放置して動下で排水した後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１５０ｍＬ）を添加し、そして混合物を一夜４０℃でインキュベートした。次いでゲルを、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後ＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  ｐＨ７．０（３×１５０ｍＬ）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×１５０ｍＬ）で洗浄し、その後２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００５２】
実施例７−ヒト血漿に対するクロマトグラフィー
クロマトグラフィー実験を、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ＬＰ  クロマトグラフィーシステムを用いて１ｃｍ直径１０ｍＬカラム容量オムニフィット・カラムを用いて吸着剤III，IV，Ｖ，VI、及びVIIの各々を用いて実施した。このカラムを、１００ｃｍ／時間で１３ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０の５カラム容量で平衡化した。次いで、ヒト血漿（０．４５μｍ濾過、１００ｍＬ）を５０ｃｍ／時間でロードした。ロード後洗浄を、１３ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０で行ってベースライン吸光にした。次いで、カラムを０．３Ｍグリシン．０．５Ｍ塩化ナトリウム、及び１％ｗ／ｖコール酸ナトリウムｐＨ９．０で溶出させ、そして２Ｍ塩酸グアニジンｐＨ７．０で殺菌した。溶出フラクションを直ちに０．４ＭＨＣｌで中和し、その後分析した。ロード、非結合、及び溶出フラクションを、比濁計により分析して、結合及び溶出能力を測定した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを実施して純度を測定した。
【００５３】
各溶出液中のフィブリノーゲンの純度は８５％よりも高かった。結合及び溶出能力を以下の表１に示す。
【００５４】
【表１】
2008541083.tif 000010
【国際調査報告】
2008541083.tif 000012
2008541083.tif 000013
2008541083.tif 000014