(57)【要約】  本発明は、３つの区画Ａ、Ｂ及びＣを含み、前記区画の少なくとも１つは配列番号１、２又は３の配列の１つを含む、プロ−カルボキシペプチダーゼＢ（プロ−ＣＰＢ）をコードする核酸に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのセグメントＡ、Ｂ及びＣを含み、前記セグメントの少なくとも１つは配列番号１、２又は３に記載の配列の１つを有する、プロ−カルボキシペプチダーゼＢ（Ｐｒｏ−ＣＰＢ）をコードする核酸。
【請求項２】
セグメントＡが配列番号１に記載の配列を有し、セグメントＢが配列番号２の配列を有し、及び／又はセグメントＣが配列番号３に記載の配列を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
セグメントＡ、Ｂ及びＣの少なくとも２つが、配列番号１、２又は３に記載の配列の１つを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
残りのセグメントが配列番号４、５又は６の配列から選択されることを特徴とする、請求項１ないし３の少なくとも１項に記載の核酸。
【請求項５】
配列が、
−配列番号１−配列番号２−配列番号３
−配列番号１−配列番号５−配列番号６
−配列番号４−配列番号２−配列番号６
−配列番号４−配列番号５−配列番号３
−配列番号１−配列番号２−配列番号６
−配列番号１−配列番号５−配列番号３
−配列番号４−配列番号２−配列番号３
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１ないし４の少なくとも１項に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れかに記載の核酸を発現することによって取得可能なプロ−カルボキシペプチダーゼ。
【請求項７】
請求項６に記載のプロ−ＣＰＢのプロ配列を、トリプシンにより切除することによって取得可能なカルボキシペプチダーゼＢ。
【請求項８】
少なくとも２００Ｕ／ｍｇの酵素活性を有する、請求項７に記載のカルボキシペプチダーゼ。
【請求項９】
請求項１ないし５の何れかに記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターを含有する形質転換された生物。
【請求項１１】
請求項６に記載のプロ−ＣＰＢを発現する方法であり、
−請求項１０に記載の形質転換された生物を培養する工程と、
−発現を誘導する工程と、
−プロ−ＣＰＢを精製する工程と、
を含む前記方法。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載のカルボキシペプチダーゼＢを発現する方法であり、
−請求項１０に記載の形質転換された生物を培養する工程と、
−発現を誘導する工程と、
−プロ−ＣＰＢをＣＰＢへと切断することによる活性化工程と、
−ＣＰＢを精製する工程と、
を含む前記方法。
【請求項１３】
配列番号７に記載の配列を有するプロ−カルボキシペプチダーゼ。
【請求項１４】
最大３０個の変異、欠失又は挿入を有する、請求項１３に記載のプロ−カルボキシペプチダーゼ。
【請求項１５】
Ｄ２２Ｈ、Ｓ２４Ｎ、Ｅ２５Ｉ、Ｒ３３Ｔ、Ａ６３Ｔ、Ｅ６９Ｋ、Ｃ９４Ｖ、Ｅ１１５Ｑ、Ｋ１２０Ｅ、Ｄ１３５Ｅ、Ｄ１３７Ｒ、Ｎ１３８Ｔ、Ｑ１６８Ｐ、Ｄ１７７Ｅ、Ｙ１８４Ｒ、Ａ１８６Ｉ、Ｆ１９１Ｌ、Ｎ１９４Ｋ、Ｎ２４０Ｄ、Ｔ２４５Ｓ、Ｖ２４６Ｉ、Ｖ２５０Ｒ、Ｎ２５４Ｄ、Ｉ２９５Ｍ、Ｄ３０９Ｎ、Ｓ３１４Ａ、Ｇ３１８Ａ、Ａ３１９Ｔ、Ｙ３２７Ｈ、Ｓ３３０Ｋ、Ｓ３３７Ａ、Ｎ３５３Ｄ、Ｆ３７０Ｙ、Ａ３８１Ｐ、Ｑ３８４Ｅ、Ｖ３９０Ｉ、Ｎ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ｖの群から選択される少なくとも５つの変異を有する、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項１６】
最大３０個のさらなる変異、欠失又は挿入を有する、請求項１５に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロ−カルボキシペプチダーゼＢ及びカルボキシペプチダーゼＢ並びにこれらを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）は、ペプチド結合をリジン、アルギニン及びオルニチンなどの塩基性アミノ酸において加水分解することによって切断する膵臓のエキソペプチダーゼである。この切断は、ポリペプチドのＣ末端において行われる。カルボキシペプチダーゼＢは、亜鉛含有ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．２）である。
【０００３】
カルボキシペプチダーゼＢは、酵素的に不活性であるプレ−プロ−カルボキシペプチダーゼＢから形成される。プレ−プロ−カルボキシペプチダーゼＢから、シグナルペプチドが切除されて、同じく酵素的に不活性であるプロ−カルボキシペプチダーゼＢが得られる。後者から、別のペプチドが切除されて、活性なカルボキシペプチダーゼが得られる。
【０００４】
カルボキシペプチダーゼＢの分子量は約３５ｋＤである。カルボキシペプチダーゼＢは、様々な目的のために、特に、インシュリンなどのペプチドの調製のために、及びタンパク質配列分析において使用されている。カルボキシペプチダーゼＢは、通常、ウシの膵臓から精製される。
【０００５】
ヒトカルボキシペプチダーゼＢのｃＤＮＡ配列は公知である。
【０００６】
ＷＯ９６／２３０６４号は、組み換えラットカルボキシペプチダーゼＢの調製方法を記載している。記載されているプラスミドを発現するための試みには、成功しなかった。
【０００７】
市販のカルボキシペプチダーゼ（天然源から精製される。）は、典型的には、約５０ないし１７０Ｕ／ｍｇの活性を有する。１ユニット（１Ｕ）は、２５℃及び７．６５のｐＨでヒププリル−Ｌ−Ａｒｇ１ｍｍｏｌ／分の加水分解に対応する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
天然源から精製されたカルボキシペプチダーゼＢには、常に、他のプロテアーゼの少量が混入している。従って、可能な限り高い活性を有する高度に純粋なカルボキシペプチダーゼに対する必要がなお存在する。
【０００９】
この目的は、添付の特許請求の範囲に記載されている、新規プロ−カルボキシペプチダーゼＢ（プロ−ＣＰＢ）及び新規カルボキシペプチダーゼＢ（ＣＰＢ）を提供することによって達成される。本発明のカルボキシペプチダーゼは、少なくとも２００Ｕ／ｍｇ、好ましくは２５０Ｕ／ｍｇ超、より好ましくは２７０Ｕ／ｍｇの酵素活性を有する。
【００１０】
本発明のカルボキシペプチダーゼは、より容易に精製される。ブタ膵臓から得られたカルボキシペプチダーゼＢｈａ、逆相ＨＰＬＣ中で８１．６％の純度を有するのに対して、本発明のＣＰＢは、９７．４％の純度を有する。ゲル浸透クロマトグラフィーでは、本発明のカルボキシペプチダーゼは９９．１％の純度を有するのに対して、ブタ膵臓から精製されるカルボキシペプチダーゼは７７．２％の純度を有する。驚くべきことに、変化した構造は、４０℃で、より高い温度安定性を達成する。さらに、ｐＨ８で、液体形態で保存されると、より高い長期安定性を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明は、一方では、３つのセグメントＡ、Ｂ及びＣを含み、前記セグメントの少なくとも１つが配列番号１、２又は３に記載の配列の１つを有する、プロ−カルボキシペプチダーゼＢ（Ｐｒｏ−ＣＰＢ）をコードする核酸に関する。
【００１２】
好ましい実施形態において、セグメントＡは配列番号１に記載の配列を有し、セグメントＢは配列番号２の配列を有し、及び／又はセグメントＣは配列番号３の配列を有する。
【００１３】
さらに好ましい実施形態において、セグメントＡ、Ｂ及びＣの少なくとも２つは、それぞれ、配列番号１、２又は３を有する配列の１つに対応する。
【００１４】
１つの実施形態において、配列１、２又は３の何れも含有しない残りのセグメントは、配列４ないし６又は９ないし１１から選択される。本発明の１つの実施形態において、セグメントの少なくとも１つは、配列番号１、２又は３に記載の配列の１つを有し、この配列は、セグメントＡについて配列１、４及び９から、セグメントＢについて２、５及び１０から、並びにセグメントＣについて３、６及び１１から選択される。
【００１５】
プロカルボキシペプチダーゼＢをコードする核酸に対する特に好ましい配列は、
−配列番号１−配列番号２−配列番号３
−配列番号１−配列番号５−配列番号６
−配列番号４−配列番号２−配列番号６
−配列番号４−配列番号５−配列番号３
−配列番号１−配列番号２−配列番号６
−配列番号１−配列番号５−配列番号３
−配列番号４−配列番号２−配列番号３
からなる群から選択される配列である。
【００１６】
本発明は、さらに、本発明の核酸を発現することによって取得可能なプロ−カルボキシペプチダーゼ、及び本発明のプロ−カルボキシペプチダーゼＢのプロ配列を切除することによって取得可能なカルボキシペプチダーゼＢに関する。
【００１７】
本発明は、さらに、本発明の核酸を含有する発現ベクター、及び本発明の発現ベクターを含有する形質転換された生物に関する。
【００１８】
本発明は、さらに、Ｄ２２Ｈ、Ｓ２４Ｎ、Ｅ２５Ｉ、Ｒ３３Ｔ、Ａ６３Ｔ、Ｅ６９Ｋ、Ｃ９４Ｖ、Ｅ１１５Ｑ、Ｋ１２０Ｅ、Ｄ１３５Ｅ、Ｄ１３７Ｒ、Ｎ１３８Ｔ、Ｑ１６８Ｐ、Ｄ１７７Ｅ、Ｙ１８４Ｒ、Ａ１８６Ｉ、Ｆ１９１Ｌ、Ｎ１９４Ｋ、Ｎ２４０Ｄ、Ｔ２４５Ｓ、Ｖ２４６Ｉ、Ｖ２５０Ｒ、Ｎ２５４Ｄ、Ｉ２９５Ｍ、Ｄ３０９Ｎ、Ｓ３１４Ａ、Ｇ３１８Ａ、Ａ３１９Ｔ、Ｙ３２７Ｈ、Ｓ３３０Ｋ、Ｓ３３７Ａ、Ｎ３５３Ｄ、Ｆ３７０Ｙ、Ａ３８１Ｐ、Ｑ３８４Ｅ、Ｖ３９０Ｉ、Ｎ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ｖの群から選択される少なくとも５つの変異を有する配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質に関する。
【００１９】
１つの実施形態において、Ｙが、アミノ酸４０２として付加される。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、上記変異の少なくとも７個、より好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１５個が含む。本タンパク質は、最大３０個の他の変異、欠失又は挿入をさらに有し得る。
【００２１】
組み換えタンパク質であるので、本発明のタンパク質は、他の天然プロテアーゼによる混入が存在しない。さらに、本発明のタンパク質は、特に高い純度、特に、１７０Ｕ／ｍｇ超、好ましくは２００Ｕ／ｍｇ超、より好ましくは２５０Ｕ／ｍｇ超、最も好ましくは２８０Ｕ／ｍｇの純度で製造され得る。
【００２２】
本発明は、さらに、プロ−ＣＰＢを発現する方法であり、
−形質転換された生物を培養する工程と、
−発現を誘導する工程と、
−プロ−ＣＰＢを精製する工程と、を含む前記方法に関し、並びに
カルボキシペプチダーゼＢを発現する方法であり、
−請求項１０に記載の形質転換された生物を培養する工程と、
−発現を誘導する工程と、
−プロ−ＣＰＢをＣＰＢへと切断することによる活性化工程と、
−ＣＰＢを精製する工程と、を含む前記方法に関する。
【００２３】
本発明は、さらに、好ましくは最大３０個の変異、欠失又は挿入を有する、配列番号７に記載の配列を有するカルボキシペプチダーゼに関する。
【００２４】
「変異」とは、あるアミノ酸の別のアミノ酸への交換を意味し、「挿入」とは、さらなるアミノ酸の追加的導入を意味し、「欠失」とは、アミノ酸の除去を意味する。
【００２５】
特に好ましい発現系は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。しかしながら、原理的には、昆虫細胞中でのバキュロウイルス系、又は哺乳類細胞中での発現など、その他の通常の発現系も使用し得る。ピチア発現系は、例えば、米国５，１０２，７８９号（参照により、本明細書に含まれる。）に記載されている。
【００２６】
本発明の核酸は、例えば、断片中での化学合成によって合成することが可能であり、続いて断片は連結される。次いで、対応する核酸を発現させることによって、本発明のタンパク質を取得することが可能である。この核酸は、ＣＢＰの公知のｃＤＮＡ配列から、部位特異的変異誘発法によって取得してもよい。この方法は、例えば、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １７４  （１９９９），  １９９２５  −  １９９３３」（参照により、本明細書中に含まれる。）に記載されている。
【００２７】
本発明は、以下のさらなる実施例によって、さらに例示される。
【００２８】
以下のベクター中に遺伝子をクローニングした。
【００２９】
ピチア・パストリス：ｐＫＩＮＴＥＸ、ｐＫＥＸＴＥＸ、ｐＰｉｃｚα
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）：Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）ｐＥＴ２２−ＯＭＰＡ
アルクスラ・アデニノビランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｏｖｉｒａｎｓ）：ｐＡＬ−ＡＬＥＵ２ｍ−ＧＡＡ  １。
【００３０】
最高の発現率は、ピチア・パストリス：ｐＫＥＸＴＥＸ−ｎｐｐｒｏＣＰＢ中で達成された。
【００３１】
培養方法
フェドバッチ法及び連続法を開発した。これらの方法では、ｎｐｐｒｏＣＰＢ約２００ｍｇ／Ｌを、培地中に分離した。
【００３２】
フェドバッチ培養
発酵培地（１Ｌに対して）：
ヘキサリン酸培地
ヘキサメタリン酸ナトリウム２５ｇ
硫酸アンモニウム９ｇ
グリセロール塩培地
グリセロール４５．６ｇ（８６％）
硫酸カリウム１８．２ｇ
硫酸マグネシウム７水和物１４．９ｇ
硫酸カルシウム２水和物０．９ｇ
ＰＴＭ１（微量）１ｍＬ／Ｌ
【００３３】
【表１】
2008514194.tif 000002
【００３４】
【表２】
2008514194.tif 000003
【００３５】
【表３】
2008514194.tif 000004
【００３６】
【表４】
2008514194.tif 000005
【００３７】
【表５】
2008514194.tif 000006
【００３８】
処理方法
第一段階：トリプシン切断によるｎｐｐｒｏＣＰＢの活性化
第二段階：陰イオン交換クロマトグラフィー−ＤＥＡＥセファセル
第三段階：疎水性相互作用クロマトグラフィー−ブチルセファロース
この方法によって、純粋なｎｐＣＰＢが得られる。
【００３９】
トリプシン切断によるｐｒｏｎｐＣＰＢの活性化
【００４０】
【表６】
2008514194.tif 000007
【００４１】
【表７】
2008514194.tif 000008
【００４２】
【表８】
2008514194.tif 000009
【００４３】
酵素活性
組換えカルボキシペプチダーゼＢ（ｎｐＣＰＢ）およびブタ膵臓由来のカルボキシペプチダーゼＢ（ブタＣＰＢ）の比活性を定量するため、以下の手段を採用する。まず、ＣＰＢの容積活性を定量する。基質溶液として、ヒププリルアルギニン（ｈｉｐｐｕｒｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ社）の０．０１５モルを０．０５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８に溶解する。さらに、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．８を要する。反応溶液は、Ｔｒｉｓ緩衝液の０．５ｍｌ、基質溶液の０．１ｍｌ、蒸留水の０．３８５ｍｌからなる。反応は、ＣＰＢ酵素溶液の１７μｌで開始する。光度測定（ΔＥ）は、０．５ｃｍの層の厚さ、２５℃の温度、λ＝２５４ｎｍの波長でシリカガラスキュベットにおいて１分間実施する。ＣＰＢ活性を次式に従って算出する。
【００４４】
【数１】
2008514194.tif 000010
【００４５】
前記酵素溶液の関連するタンパク質濃度を、１ｃｍの層の厚さを有するシリカガラスキュベットにおいて２８０ｎｍの波長で、２０ないし２５℃の温度で、測光法によって定量する。まず、試料緩衝液の吸光度（Ｅ（ブランク））のみを測定することによって、ブランクを確立する。試料緩衝液は、０．０３３ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０からなる。次に、ＣＰＢ溶液の０．０５ｍｌを試料緩衝液の３ｍｌ中に希釈し、吸光度（Ｅ（試料））も定量する。タンパク質濃度を次式から算出する。
【００４６】
【数２】
2008514194.tif 000011
ΔＥ（試料）＝Ｅ（試料）−Ｅ（ブランク）
【００４７】
【表９】
2008514194.tif 000012
【国際調査報告】
2008514194.tif 000013
2008514194.tif 000014
2008514194.tif 000015
2008514194.tif 000016
2008514194.tif 000017
2008514194.tif 000018
2008514194.tif 000019