(57)【要約】  アセチルヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド、およびこのヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を記載する。本発明は、AHASSポリペプチドもしくはAHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現カセットおよび植物発現ベクターを提供する。また、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、または発現ベクターによって形質転換された、植物、種子、および宿主細胞が提供される。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを使用してAHAS活性を高め、除草剤に対する植物の耐性を向上させる方法を提供する。
2008508884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるポリヌクレオチド；
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(c)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(d)  配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
(e)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(f)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(g)  配列番号１０で定義されるポリヌクレオチド；ならびに
(h)  配列番号１１で定義されるポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０または配列番号１１で定義されるポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されたプロモーターを含む発現カセット内に存在する、請求項１の(a)-(f)のいずれか１つに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、植物発現ベクター内にある、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記発現カセットが、葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ポリヌクレオチドに機能しうるように連結してさらに含む、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーターが、細菌、真菌細胞、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される宿主細胞において、ポリヌクレオチドの発現を駆動する能力を有する、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記発現カセットが、細菌、真菌細胞、動物細胞および植物細胞からなる群から選択される宿主細胞内に存在する、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記発現カセットが植物内に存在する、請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記植物発現ベクターが、真核生物AHASLポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に機能しうるように連結された第２のプロモーターを含む第２のポリヌクレオチド構築物をさらに含み、２つのプロモーターがいずれも植物細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有する、請求項８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列；ならびに、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、からなる群から選択される、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記真核生物AHASLポリペプチドが植物AHASLポリペプチドである、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記真核生物AHASLポリペプチドが除草剤耐性AHASLポリペプチドである、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、植物細胞内に存在する、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、植物内に存在する、請求項１２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
(a)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチド；
(b)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有する、前記ポリペプチド；
(c)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
(d)   配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；ならびに
(e) 配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義される、請求項１９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
(a)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるポリヌクレオチド；
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(c)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(d)  配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
(e)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；ならびに
(f)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド構築物が、構成的プロモーターおよび組織選択的プロモーターからなる群から選択されるプロモーターに機能しうるように結合されている、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド構築物が、第１のヌクレオチド配列に機能しうるように結合した、葉緑体輸送ペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２４】
前記トランスジェニック植物細胞のAHAS活性が、野生型品種の植物細胞と比較して増加した、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２５】
前記トランスジェニック植物細胞の、少なくとも１つの除草剤に対する耐性が、野生型品種の植物細胞と比較して増加した、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２６】
前記トランスジェニック植物細胞が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ライコムギ、キビ、およびモロコシからなる群から選択される単子葉植物細胞である、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２７】
前記トランスジェニック植物細胞が、ダイズ、ワタ、アブラナ属エスピーピー、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、およびラッカセイからなる群から選択される双子葉植物細胞由来のものである、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２８】
前記トランスジェニック植物細胞が、植物中に存在する、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２９】
前記トランスジェニック植物細胞が、種子中に存在する、請求項２１に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３０】
ポリヌクレオチド構築物を植物細胞に導入すること、ならびに植物細胞から、植物の野生型品種と比較して増加したAHAS活性を有するトランスジェニック植物を生成することを含む、植物においてAHAS活性を高める方法であって、前記ポリヌクレオチド構築物が、
(a)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるポリヌクレオチド；
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(c)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(d)  配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
(e)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；ならびに
(f)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記方法。
【請求項３１】
前記トランスジェニック植物が、その植物の野生型品種と比較して増加した、除草剤に対する耐性を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記トランスジェニック植物が、その植物の野生型品種と比較して増加した、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記植物が、除草剤耐性植物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記植物が、イミダゾリノン耐性植物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記植物が、除草剤耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHASL）ポリペプチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチド構築物が、ヌクレオチド配列に機能しうるように結合したプロモーターをさらに含み、そのプロモーターが、構成的プロモーターおよび組織選択的プロモーターからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチド構築物が、除草剤耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット(AHASL)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
ポリヌクレオチド構築物を植物細胞に導入すること、ならびにその植物細胞からトランスジェニック植物を生成することを含む方法によって作出された、植物の野生型品種と比較して増加したAHAS活性を有するトランスジェニック植物であって、前記ポリヌクレオチド構築物が、
(a)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるポリヌクレオチド；
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(c)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(d)  配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列；
(e)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；ならびに
(f)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記トランスジェニック植物。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチド構築物が、配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチド構築物が、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４１】
イミダゾリノン除草剤を雑草および植物に施用することを含む、植物周辺の雑草を防除する方法であって、植物はその野生型品種と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する増加した耐性を有し、さらに植物は、
(a)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるポリヌクレオチド；
(b)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(c)  配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
(d)  配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列；
(e)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；ならびに
(f)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、そのポリヌクレオチドがAHASS活性を有するポリペプチドをコードする、前記ポリヌクレオチド；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を含む、前記方法。
【請求項４２】
アセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）ドメインと機能しうるように結合されたアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHASL）ドメインを含む融合ポリペプチドであって、該融合ポリペプチドはAHAS活性を有し、AHASLドメインは真核生物の成熟AHASLポリペプチドのアミノ酸配列を含み、さらにAHASSドメインは：
(a)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチド；
(b)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有する、前記ポリペプチド；
(c)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
(d)   配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；ならびに
(e) 配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
からなる群から選択されるAHASSポリペプチドのアミノ酸配列を含む、前記融合ポリペプチド。
【請求項４３】
真核生物AHASLポリペプチドが植物AHASLポリペプチドである、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４４】
AHASLドメインおよびAHASSドメインの間に機能しうるように連結されたリンカー領域をさらに含む、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４５】
AHASLポリペプチドおよびAHASSポリペプチドが異なる種に由来する、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４６】
アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHASL）-アセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、該AHASLは真核生物AHASLポリペプチドであり、さらに該AHASSは、
(a)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチド；
(b)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有する、前記ポリペプチド；
(c)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
(d)   配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；ならびに
(e) 配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記AHASSが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドが、リンカー領域をコードする、機能しうるように連結された第３のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドに機能しうるように結合した葉緑体ターゲティング配列をさらに含む、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５０】
真核生物AHASLポリペプチドが植物AHASLポリペプチドである、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
真核生物AHASLポリペプチドが除草剤耐性AHASLポリペプチドである、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが植物発現ベクター内に存在する、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドが植物細胞内に存在する、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドが種子に存在する、請求項４６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
植物細胞にヌクレオチド構築物を導入すること、ならびにそのトランスジェニック植物細胞から、植物の野生型品種と比較して、増加したAHAS活性を有するトランスジェニック植物を生成することを含む、増加したAHAS活性を有するトランスジェニック植物を作出する方法であって、該ポリヌクレオチド構築物は、アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHASL）-アセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）融合ポリペプチドをコードし、該AHASLは真核生物AHASLポリペプチドであり、さらに該AHASSは、
(a)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるポリペプチド；
(b)   配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも81%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）活性を有する、前記ポリペプチド；
(c)  配列番号５の連続したアミノ酸64-471と、少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
(d)   配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；ならびに
(e) 配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義されるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、そのポリペプチドがAHASS活性を有する、前記ポリペプチド；
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記AHASSポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471で定義される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
トランスジェニック植物が、その植物の野生型品種と比較して、イミダゾリノン除草剤に対して増加した耐性を有する、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセトヒドロキシ酸合成酵素の小サブユニットをコードし、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性、および作物植物の除草剤耐性を高めるために使用することができる、新規ポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
アセトヒドロキシ酸合成酵素（AHAS; EC 4.1.3.18、アセト乳酸合成酵素すなわちALSとしても知られている）は、分岐鎖アミノ酸、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの生化学合成を触媒する最初の酵素である（Singh, 1999, “Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine”、Plant Amino Acidsより、Singh編、Marcel Dekker Inc. New York, New York, 227-247頁）。AHASは、スルホニルウレア系（LaRossaおよびFalco, 1984, Trends Biotechnol. 2:158-161）、イミダゾリノン系（Shaverら、1984, Plant Physiol. 76:545-546）、トリアゾロピリミジン系（SubramanianおよびGerwick, 1989, “Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines”、Biocatalysis in Agricultural Biotechnologyより、WhitakerおよびSonnet編、ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., 277-288頁）、およびピリミジルオキシ安息香酸系（Subramanianら、1990, Plant Physiol. 94:239-244）を含む、構造的に異なる４系統の除草剤の作用点である。イミダゾリノン系およびスルホニルウレア系除草剤は、それらが非常に少ない散布量で有効であり、動物には比較的無毒であるため、近代農業において広く使用されている。AHAS活性を阻害することによって、上記系統の除草剤は、多くの雑草種を含む感受性植物の、それ以上の生長および発達を妨げる。市販のイミダゾリノン系除草剤の例をいくつか挙げると、PURSUIT（登録商標）（イマゼタピル）、SCEPTER（登録商標）（イマザキン）、およびARSENAL（登録商標）（イマザピル）がある。スルホニルウレア系除草剤の例としては、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フラザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロンがある。
【０００３】
これらは有効性が高く毒性は低いため、イミダゾリノン系除草剤は、広範な植生域の上からの散布による施用が好まれる。広範な植生域の上から除草剤を散布することが可能であることは、農園の設立および維持に関わるコストを下げ、こうした薬品の使用に先だって敷地造成する必要性を減少させる。また、望ましい耐性種の上から散布すると、結果として、競合種がないことにより、望ましい種の最大生産力を達成することが可能となる。しかしながら、このような全面散布法を使用できるかどうかは、全面散布領域において望ましい植物のイミダゾリノン抵抗性種が存在するかどうかにかかっている。
【０００４】
主要農作物の中で、大豆のような一部のマメ科植物は、イミダゾリノン系除草剤化合物を速やかに代謝することが可能であるため、本来イミダゾリノン系除草剤に対して抵抗性である（ShanerおよびRobson, 1985, Weed Sci. 33:469-471）。トウモロコシ（Newhouseら、1992, Plant Physiol. 100:882886）およびイネ（Barretteら、1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, 195-220頁）といった他の作物は、イミダゾリノン系除草剤に対してやや感受性である。イミダゾリノン系除草剤に対する感受性の差異は、個別の除草剤の化学的性質、およびそれぞれの植物における有毒型から無毒型への化合物の代謝の相違に依存する（Shanerら、1984, Plant Physiol. 76:545-546; Brownら、1987, Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29）。吸収およびトランスロケーションといった他の植物生理学上の相違も、感受性に重要な役割を果たしている（ShanerおよびRobson, 1985, Weed Sci. 33:469-471）。
【０００５】
トウモロコシ（Zea mays）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ダイズ（Glycine max）およびタバコ（Nicotiana tabacum）において、種子、小胞子、花粉、およびカルスの変異誘発によって、イミダゾリノン系、スルホニルウレア系、およびトリアゾロピリミジン系に対して抵抗性の作物品種を作製することに成功している（Sebastianら、1989, Crop Sci. 29:1403-1408; Swansonら、1989, Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouseら、1991, Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivanら、1991, Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourandら、1993, J. Heredity 84:91-96）。いずれの場合も、単一の半優性核遺伝子が抵抗性を与えた。４つのイミダゾリノン抵抗性コムギも、以前、コムギ品種Fidel（Triticum aestivum L. cv. Fidel）の種子の変異誘発後に単離された（Newhouseら、1992, Plant Physiol. 100:882-886）。遺伝の研究から、単一の半優性遺伝子が抵抗性を付与することが確認された。対立遺伝子の研究に基づいて、著者らは、同定された４系統における変異が同一の遺伝子座にあると結論付けた。Fidel種の抵抗性遺伝子の１つが、FS-4と命名された（Newhouseら、1992, Plant Physiol. 100:882-886）。
【０００６】
イミダゾリノン系除草剤に対する植物の抵抗性は、数多くの特許でも報告されている。米国特許第4,761,373号、第5,331,107号、第5,304,732号、第6,211,438号、第6,211,439号および第6,222,100号は、植物において除草剤抵抗性を顕現させるために改変AHAS遺伝子を使用することを記載し、具体的には、ある種のイミダゾリノン抵抗性トウモロコシ系統を開示する。米国特許第5,013,659号は、少なくとも１つのアミノ酸、または１つもしくは複数の保存領域における変異に起因して除草剤抵抗性を示す植物を開示する。それに記載された変異は、イミダゾリノン系およびスルホニルウレア系に対する交差抵抗性(cross-resistance)、またはスルホニルウレア特異的抵抗性のいずれか一方をコードするが、イミダゾリノン特異的抵抗性は記載されていない。さらに、米国特許第5,731,180号および第5,767,361号は、野生型単子葉植物AHASアミノ酸配列中に単一のアミノ酸置換を有する、単離された遺伝子であって、イミダゾリノン特異的抵抗性を結果として生じる、前記遺伝子について検討している。加えて、アセトヒドロキシ酸合成酵素に干渉性である除草剤に対して抵抗性であるイネ植物が、突然変異育種によって、ならびに葯培養により作製されたイネ植物プールから除草剤抵抗性植物を選択することによっても、開発された（米国特許第5,545,822号、第5,736,629号、第5,773,703号、第5,773,704号、第5,952,553号および第6,274,796号を参照されたい）。
【０００７】
植物において、AHAS酵素は、２つのサブユニット、すなわち大サブユニット（触媒の役割）および小サブユニット（調節する役割）からなる（DugglebyおよびPang, 2000, J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36）。AHAS大サブユニットタンパク質（AHASLと称する）は、シロイヌナズナおよびイネの場合のように単一の遺伝子によって、またはトウモロコシ、アブラナ、およびワタの場合のように複数の遺伝子ファミリーメンバーによってコードされる可能性がある。AHASLの特定の一塩基置換は、酵素に、１つもしくは複数の除草剤系統に対するある程度の非感受性をもたらす（ChangおよびDuggleby, 1998, Biochem J. 333:765-777）。
【０００８】
除草剤抵抗性AHASL遺伝子はまた、合理的にデザインされてきた。国際公開第96/33270号、米国特許第5,853,973号および第5,928,937号は、イミダゾリノン系およびAHAS阻害性除草剤などの除草剤に対して、選択的抵抗性を示す変異体を含めて、AHAS変異体を調製するための、構造に基づくモデル化手法を記載する。AHAS阻害剤複合体の三次元高次構造のコンピューターによるモデル化は、誘導された変異がおそらくイミダゾリノン系に対する選択的抵抗性を与えると思われる部位として、提案される阻害剤結合ポケット内のいくつかのアミノ酸を予測している（Ottら、1996, J. Mol. Biol. 263:359-368）。これらの合理的にデザインされた、AHAS酵素の推定結合部位内の、ある種の変異によって作製されたコムギ植物は、実際に、単一系統の除草剤に対して特異的な抵抗性を示した（Ottら、1996, J. Mol. Biol. 263:359-368）。
【０００９】
原核細胞系での研究から、AHAS酵素の機能について多くのことが知られている。これらの研究は、AHAS小サブユニット（AHASS）タンパク質の役割を明らかにした。原核生物AHAS酵素は、２つの、別個であるが物理的に結合したタンパク質サブユニットとして存在する。原核生物において、２つのポリペプチド、「大サブユニット」および「小サブユニット」は、別々の遺伝子から発現される。腸内細菌では、I、IIおよびIIIと命名され、いずれも大および小サブユニットを有する、３つの主要なAHAS酵素が同定された。原核生物において、AHAS酵素は、分岐鎖アミノ酸生合成経路における調節酵素であることが明らかとなっており（Miflin, 1971, Arch. Biochm. Biophys. 146:542-550）、大サブユニットのみが触媒活性を有することが認められている。微生物系起源のAHAS酵素の研究から、小サブユニットについて２つの役割が報告されている。１つの役割は、イソロイシン、ロイシンもしくはバリン、またはそれらの組み合わせが存在する場合に、触媒作用のある大サブユニットをアロステリックフィードバック阻害することである。もう１つの役割は、イソロイシン、ロイシンもしくはバリンが存在しない場合に、大サブユニットの触媒活性を強めることである。小サブユニットはまた、大サブユニットの活性コンホメーションの安定性を高めることが明らかになっている（Weinstockら、1992, J. Bacteriol. 174:5560-5566）。大腸菌(E. coli)由来AHAS Iについて明らかなように、小サブユニットの発現は、大サブユニットの発現を増加させることもある（Weinstockら、1992, J. Bacteriol. 174:5560-5566）。
【００１０】
in vitroでの研究によって、原核生物の大サブユニットは、小サブユニット非存在下では、基底レベルのAHAS活性を示し、この活性はアミノ酸、イソロイシン、ロイシン、もしくはバリンによるフィードバック阻害を受けないことが証明された。大サブユニットを含有する同じ反応混合物に小サブユニットを添加すると、大サブユニットの比活性は増大する。
【００１１】
AHASの小サブユニットは植物にも存在することが知られているが、そのin vivoでの機能についてはあまり知られていない。国際公開第98/37206号は、Nicotiana plumbaginifolia 由来のAHASS cDNA配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに除草剤のスクリーニングにおいて前記配列を使用することを記載しているが、この除草剤はAHASホロ酵素の活性を阻害する。さらに、国際公開第98/37206号は、トウモロコシAHASSタンパク質の部分長cDNA配列を開示する。米国特許第6,348,643号は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の完全長AHASSタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を開示する。この特許はさらに、Arabidopsis AHASSタンパク質の添加による野生型および除草剤抵抗性型のArabidopsis AHASLタンパク質の活性化も明らかにする。活性化は、Arabidopsis AHASSタンパク質が野生型および除草剤抵抗性型のAHAS比活性をいずれも増加させることができることを、明らかにすることによって立証された。最近、米国特許公報第2001/0044939号は、天然の植物AHASSタンパク質を、種特異的でないAHASLタンパク質とともに再構成することの有益な効果を報告したが、それはN. plumbaginifolia AHASSタンパク質が別の双子葉植物、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のAHASLタンパク質の比活性を高めることができることから示されるとおりである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、トウモロコシ、イネ、およびコムギのアセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供するが、これらは本明細書においてそれぞれ、トウモロコシ（Zea mays）AHAS小サブユニットサブタイプ1パラログa（ZmAHASS1a）、イネ（Oryza sativa）AHAS小サブユニットサブタイプ１（OsAHASS1）、およびコムギ（Triticum aestivum）AHAS小サブユニットサブタイプ１（TaAHASS1X）と称される。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１および３に記載のヌクレオチド配列、ならびに配列番号２、４および５に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに、AHASS活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の断片および変異体からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565を含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列に対して、または配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、もしくは配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565に対して、少なくとも80%の配列同一性を有し、このポリヌクレオチドはAHASS活性を有するポリペプチドをコードする。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本発明のAHASSポリペプチドの成熟型をコードするポリヌクレオチドも包含する。こうした成熟型AHASSポリヌクレオチドは、N-末端に位置する葉緑体輸送ペプチドを欠いている。
【００１４】
本発明はまた、イネAHASSプロモーターを含むポリヌクレオチド配列を提供する。このポリヌクレオチドは、イネAHASS遺伝子の転写開始部位から上流のイネゲノム領域を含み、これを操作して、植物において依然として機能しうる最も短いプロモーターを生成することができることは、当業者に認識されるであろう。このプロモーターを含むイネゲノム断片を、配列番号１０に示す。
【００１５】
本発明はさらに、イネAHASSターミネーターを含むポリヌクレオチド配列を与える。このポリヌクレオチドは、イネAHASS遺伝子の転写終止コドンから下流のイネゲノムの領域を含み、これを操作して、植物において依然として機能しうる最も短いターミネーターを生成することができることは、当業者に認識されるであろう。このターミネーターを含むイネゲノム断片を、配列番号１１に示す。
【００１６】
本発明はまた、植物、植物細胞、および他の非ヒト宿主細胞において、本発明のポリヌクレオチドを発現するための発現カセットを提供するものであって、前記宿主細胞は細菌、真菌細胞、および動物細胞を含めるが、それらに限定されない。発現カセットは、目的とする植物、植物細胞、もしくは他の宿主細胞において発現可能なプロモーターを含むが、このプロモーターは、全長AHASSポリペプチド（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含む）または成熟AHASSポリヌクレオチド（すなわち、葉緑体輸送ペプチドなし）のいずれかをコードする本発明のポリヌクレオチドに、機能しうるように連結されている。植物もしくは植物細胞のプラスチド内で発現することが望ましい場合、発現カセットはさらに、機能しうるよう結合した、葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体ターゲティング配列を含むことができる。
【００１７】
本発明はさらに、目的の植物もしくは宿主細胞において、真核生物AHASLポリペプチドおよびAHASSポリペプチドをいずれも発現させるための、植物発現ベクターを与える。ある実施形態において、植物発現ベクターは、第１のポリヌクレオチド構築物および第２のポリヌクレオチド構築物を含み、この第１のポリヌクレオチド構築物は、真核生物AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、機能しうるように結合した第１のプロモーターを含み、第２のポリヌクレオチド構築物は、AHASSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、機能しうるように結合した第２のプロモーターを含むが、さらに、これらの第１および第２のプロモーターは、目的の植物もしくは宿主細胞において、遺伝子発現を駆動する能力を有する。ある実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチド構築物はさらに、機能しうるように連結された葉緑体ターゲティング配列を含む。別の実施形態において、上記真核細胞AHASLポリペプチドは植物AHASLポリペプチドであり、場合によっては、除草剤耐性AHASLポリペプチドである。
【００１８】
本発明は、AHASSポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドを与える。この単離されたポリペプチドは、配列番号２、４および５に示されるアミノ酸配列、配列番号１および３に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、ならびにAHASS活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列の断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。このような断片には、本発明のAHASSポリペプチドの成熟型、特に、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列、すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸77-483、配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸74-481、配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸64-471、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド275-1495によってコードされるアミノ酸配列、ならびに配列番号３に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド342-1565によってコードされるアミノ酸配列が含まれるが、それらに限定されない。本発明はまた、配列番号２、４および５に記載のアミノ酸配列と少なくとも81%の配列同一性を有し、配列番号５の連続するアミノ酸64-471と少なくとも77%の配列同一性を有するポリペプチドを提供するが、このポリペプチドはAHASS活性を有する。
【００１９】
本発明はさらに、本発明のAHASSポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物、種子、およびトランスジェニック植物細胞を提供する。ある実施形態において、AHASSポリヌクレオチドは、植物細胞においてその発現を駆動するプロモーターに、機能しうるように結合されている。別の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーター、もしくは組織選択的(tissue-preferred)プロモーターのいずれかである。もう一つの実施形態において、ポリヌクレオチド構築物はさらに、AHASSポリヌクレオチドに機能しうるように結合した葉緑体ターゲティング配列を含む。ある実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ライコムギ、キビ、およびモロコシからなる群から選択される単子葉植物である。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、ダイズ、ワタ、アブラナ属エスピーピー(spp)、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、およびラッカセイからなる群から選択される双子葉植物である。好ましくは、本発明のAHASSポリヌクレオチドを含むこれらのトランスジェニック植物、種子、および植物細胞は、その植物の野生型の種と比較して、増加したAHAS活性、および／または少なくとも１つの除草剤に対する抵抗性を有する。
【００２０】
本発明は、植物においてAHAS活性を高める方法を提供するが、その方法は本発明のAHASSポリヌクレオチドで植物を形質転換することを含む。ある実施形態において、AHASSポリヌクレオチドは、プロモーターを含む発現カセット内にあり、そのプロモーターはAHASSヌクレオチド配列に機能しうるように連結されており、植物細胞内で遺伝子発現を駆動することができる。別の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター、もしくは組織選択的プロモーターのいずれかである。さらに別の実施形態において、植物は、除草剤耐性アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHASL）ポリヌクレオチドを含む。本発明の方法を使用して、AHAS酵素の触媒活性に干渉する、少なくとも１つの除草剤に対する植物の抵抗性を高めまたは強めることができる。こうした方法によって作製されたトランスジェニック植物も与えられるが、このトランスジェニック植物におけるAHAS活性は、その植物の野生型の種と比べて増加している。
【００２１】
本発明はまた、本発明のAHASSポリヌクレオチドで植物を形質転換することを含む、除草剤耐性植物において除草剤耐性を高める方法を提供する。ある実施形態において、
AHASSポリヌクレオチドは、プロモーターを含む発現カセット内にあり、そのプロモーターはAHASSヌクレオチド配列に機能しうるように連結されており、植物細胞内で遺伝子発現を駆動することができる。別の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーター、もしくは組織選択的プロモーターのいずれかである。さらに別の実施形態において、AHASSポリヌクレオチド構築物はさらに、除草剤耐性AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。もう一つの実施形態において、除草剤耐性植物は、AHASLポリペプチドを含む。さらに別の実施形態において、除草剤耐性植物は、遺伝子操作され、または遺伝子操作を受けず、除草剤耐性AHASLポリペプチドを発現する。別の実施形態において、除草剤耐性植物はイミダゾリノン耐性植物である。この方法で作出されたトランスジェニック植物も与えられるが、こうしたトランスジェニック植物におけるAHAS活性は、その植物の野生型品種と比較して増加している。本発明はまた、植物の周辺の雑草を防除する方法も提供するが、その方法はイミダゾリノン系除草剤を雑草および植物に施用することを含むものであって、この植物はその野生型品種と比較してイミダゾリノン系除草剤に対する耐性が高められており、その植物は本発明のAHASSヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築物を包含する。ある実施形態において、AHASSヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号１の連続したヌクレオチド275-1495、または配列番号３の連続したヌクレオチド342-1565で定義される。別の実施形態において、AHASSヌクレオチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号２の連続したアミノ酸77-483、配列番号４の連続したアミノ酸74-481、または配列番号５の連続したアミノ酸64-471に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
本発明はさらに、AHASSドメインに機能しうるように結合したAHASLドメインを含む単離された融合ペプチドを与え、この融合ポリペプチドはAHAS活性を有する。AHASLドメインは、真核生物の成熟AHASLポリペプチドのアミノ酸配列を含む。AHASSドメインは、配列番号２、４および５に示すアミノ酸配列；配列番号１および３に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；ならびに、AHASS活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列の断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。こうした断片には、本発明のAHASSポリペプチドの成熟型、特に、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸77-483；配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸74-481；配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸64-471；配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド275-1495によってコードされるアミノ酸配列、ならびに配列番号３に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド342-1565によってコードされるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列が含まれるが、それらに限定されない。ある実施形態において、真核生物AHASLポリペプチドは植物AHASLポリペプチドである。別の実施形態において、真核生物AHASLポリペプチドは、除草剤耐性植物のAHASLポリペプチドである。さらに別の実施形態において、融合ポリペプチドはさらに、AHASLドメインとAHASSドメインの間に、機能しうるように連結されたリンカー領域を含む。好ましくは、AHASLポリペプチドおよびAHASSポリペプチドは、異なる種を起源とする。
【００２３】
本発明はまた、対象とする植物または宿主細胞において、AHASL-AHASS融合ポリペプチドを発現するための発現ベクターを提供する。発現ベクターは、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能しうるように結合したプロモーターを含む。このポリヌクレオチドは、第２のヌクレオチド配列に機能しうるように結合した第１のヌクレオチド配列を含むが、この第１のヌクレオチド配列は真核生物の成熟AHASLポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードしており、第２のヌクレオチド配列は本発明の成熟AHASSポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードする。ポリヌクレオチドはさらに、機能しうるように結合した、リンカー領域をコードする第３のヌクレオチド配列を含むことも可能であり、このリンカー領域は融合ポリペプチドのAHASLおよびAHASSドメインの間に配置される。ある実施形態において、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはさらに、機能しうるように連結された葉緑体ターゲティング配列を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドの真核生物AHASLドメインは植物AHASLポリペプチドである。さらに別の実施形態において、真核生物AHASLポリペプチドは除草剤耐性植物のAHASLポリペプチドである。
【００２４】
本発明はさらに、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物、種子、および植物細胞を提供する。除草剤耐性植物を作出する方法も与えられるが、その方法は、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能しうるように結合されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること、ならびにこのトランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を生成することを含み、このAHASL-AHASS融合ポリペプチドを含むトランスジェニック植物は、その植物の野生型品種と比較して、少なくとも１つの除草剤に対して耐性の増加を有していた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、アセトヒドロキシ酸合成酵素小サブユニット（AHASS）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。具体的には、本発明は、トウモロコシ（Zea mays）、イネ（Oryza sativa）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来の単子葉植物AHASSポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子に関するが、これらは本明細書においてそれぞれ、ZmAHASS1a、OsAHASS1、およびTaAHASS1Xと称される。さらに具体的には、本発明は、配列番号１もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、配列番号２、４および５に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびに機能性AHASSポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列の断片および変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子に関する。
【００２６】
加えて、本発明は、成熟ZmAHASS1a、OsAHASS1またはTaAHASS1Xポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の成熟AHASSポリペプチドは、ZmAHASS1a、OsAHASS1またはTaAHASS1XポリペプチドのそれぞれのN末端にある葉緑体輸送ペプチド(chloroplast transit peptide)を欠いているが、AHASS活性は保持する。詳細には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド275-1495、配列番号３に記載のヌクレオチド配列のヌクレオチド342-1565、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸77-483をコードするヌクレオチド配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列のアミノ酸64-471をコードするヌクレオチド配列、配列番号５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸74-481をコードするヌクレオチド配列、ならびにAHASS活性を有する成熟AHASSポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列の断片および変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、特に指示しない限り、「AHASS活性」は、AHASSポリペプチドの生物学的活性を表し、その活性によってAHASSポリペプチドは、AHASSポリペプチド非存在下でのAHASLポリペプチドのAHAS活性と比較して、AHASSおよびAHASLポリペプチドが共存するとき、少なくとも１つのAHASLポリペプチドのAHAS活性を増加させる。
【００２８】
本発明の単離されたAHASSポリヌクレオチド分子を使用して、作物植物を形質転換し、除草剤、特にAHAS活性を阻害することが知られている除草剤であって、より詳細にはイミダゾリノン系およびスルホニルウレア系除草剤、に対する作物の耐性を高めることができる。このようなAHASSポリヌクレオチド分子を、発現カセット、発現ベクター、形質転換ベクター、プラスミドなどに使用することができる。こうしたポリヌクレオチド構築物による形質転換の後に得られたトランスジェニック植物は、たとえば、イミダゾリノン系およびスルホニルウレア系除草剤といった、AHAS阻害除草剤に対する耐性の増加を示す。本明細書で使用される場合、「耐性」という用語は、植物が、通常ではその植物の野生型品種を枯死させる、もしくは生長を阻害するレベルの除草剤の効果に抵抗する能力と同等に使用され、そうした能力を指している。本明細書で使用される場合、植物の「野生型品種(wild-type variety)」は、対照植物として比較のために分析される植物群を指し、この植物の野生型品種は、それがAHASSポリヌクレオチドによる形質転換を受けていないこと、および／またはその野生型植物品種におけるAHASSポリヌクレオチドの発現が改変されていないことを除いて、被験植物（AHASSポリヌクレオチドで形質転換された植物、またはAHASSポリペプチドの発現が改変されている植物）と同一である。したがって、「野生型品種」の植物という用語の使用は、その植物のゲノム中に組換えDNAがないことを意味するものではない。
【００２９】
本発明の組成物は、AHASSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。より詳細には、本発明は、配列番号２、４および５に示すアミノ酸配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子（本明細書において「核酸分子」とも称する）を提供する。さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子、たとえば、配列番号１および３に記載のポリヌクレオチド分子、ならびにそれらの断片および変異体によってコードされる、アミノ酸配列を有するポリペプチドが与えられる。
【００３０】
本発明は、単離された、もしくは実質的に精製された、核酸もしくはポリペプチド組成物を包含する。「単離された」もしくは「精製された」ポリヌクレオチド分子もしくはポリペプチド、または生物学的に活性のあるその一部分は、実質的もしくは本質的に、天然環境において認められるような、前記ポリヌクレオチド分子もしくはポリペプチドに通常、付随する、もしくはこれと相互作用する成分を含まない。したがって、単離された、もしくは精製された、ポリヌクレオチド分子もしくはポリペプチドは、組換え技術によって作製される場合、実質的に他の細胞物質もしくは培地を含まず、化学合成される場合には、化学的な前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸の起源となる生物のゲノムDNAにおいて、その核酸にもともと隣接している配列（すなわち、核酸の5'および3'末端に位置する配列）（好ましくはポリペプチドをコードする配列）を含まない。たとえば、さまざまな実施形態において、単離されたポリヌクレオチド分子は、核酸の起源となる細胞のゲノムDNAにおいてポリヌクレオチド分子にもともと隣接している、約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kbもしくは0.1 kbに満たないヌクレオチド配列を含有することができる。実質的に細胞物質を含まないポリペプチドは、（乾重量で）約30%、20%、10%、5%、または1%未満の夾雑ポリペプチドを有する、ポリペプチドの標品を包含する。本発明のポリペプチド、もしくは生物学的に活性のあるその一部分が、組換えによって作製される場合、好ましくは、培地は（乾重量で）約30%、20%、10%、5%または1%未満の化学的前駆体もしくは問題のポリペプチドではない化学物質に相当する。
【００３１】
本発明は、AHASSポリペプチド、すなわちZmAHASS1a、OsAHASS1、およびTaAHASS1Xを含む、単離されたポリペプチドを提供する。本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、同等に使用され、ペプチド結合によって連結された少なくとも４つのアミノ酸からなる鎖を表す。この鎖は、直鎖、分岐鎖、環状、またはそれらの組み合わせとすることができる。単離されたポリペプチドは、配列番号２、４および５に示すアミノ酸配列；配列番号１および３に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列；ならびに、AHASS活性を有するAHASSポリペプチドをコードしたアミノ酸配列の機能性断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。「機能性断片および変異体」という用語は、AHASS活性を有する、例示されたポリペプチドの断片および変異体を表す。
【００３２】
さらに、本発明のAHASSポリペプチドの成熟型を含む、単離されたポリペプチドが提供される。この単離されたポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸77-483；配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸74-481；配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸64-471；配列番号１に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド275-1495によってコードされるアミノ酸配列、配列番号３に示すヌクレオチド配列のヌクレオチド342-1565によってコードされるアミノ酸配列、ならびにAHASS活性を有する成熟AHASSポリペプチドをコードしたアミノ酸配列の断片および変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明のある特定の実施形態において、方法は、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性植物の使用に関する。「除草剤耐性(herbicide-tolerant)」もしくは「除草剤抵抗性(herbicide-resistant)」植物は、その植物の普通の品種もしくは野生型品種を通常ならば枯死させ、またはその生長を阻害するレベルの少なくとも１つの除草剤に対して耐性であり、または抵抗性である植物を意味する。好ましくは、本発明の除草剤耐性植物は、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質を有する。「除草剤耐性AHASLタンパク質」もしくは「除草剤抵抗性AHASLタンパク質」という用語は、AHAS活性を阻害することが知られている除草剤の存在下で、しかも野生型AHASLタンパク質のAHAS活性を阻害することが知られている濃度もしくはレベルで、野生型AHASLタンパク質のAHASL活性より高いAHAS活性を示すAHASLタンパク質を表す。
【００３４】
さらに、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて、植物またはその原種を形質転換することによって、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質を植物に導入することができることが認識されている。このような除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質は、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLポリヌクレオチドによってコードされる。あるいはまた、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質は、植物もしくはその原種のゲノムに内在するAHASL遺伝子における、天然のもしくは誘導された突然変異の結果として、植物体内に生じることもある。
【００３５】
本発明は、少なくとも１つの除草剤に対する抵抗性もしくは耐性の増加を示す、形質転換された植物、形質転換された植物組織、形質転換された植物細胞、および形質転換された宿主細胞を提供する。除草剤の好ましい量もしくは濃度が、「有効な量」もしくは「有効な濃度」である。「有効な量」もしくは「有効な濃度」という用語は、類似の、形質転換されていない植物、植物組織、植物細胞もしくは宿主細胞を死滅させる、またはその生長（増殖）を阻害するのに十分であるが、その量が、形質転換された植物、形質転換された植物細胞もしくは形質転換された宿主細胞を死滅させることはなく、その生長（増殖）を同じようにひどく阻害することもない、量もしくは濃度を表す。「類似の、形質転換されていない植物、植物細胞もしくは宿主細胞」という用語は、本発明の形質転換された植物、形質転換された植物細胞、および形質転換された宿主細胞を作製するために使用された、本発明の特定のポリヌクレオチドを持たない、それぞれ植物、植物組織、植物細胞もしくは宿主細胞を表す。したがって、「形質転換されていない」という用語の使用は、植物、植物組織、植物細胞もしくは宿主細胞のゲノム中に組換えDNAがないことを意味するものではない。
【００３６】
本発明は、植物、植物組織、植物細胞もしくは宿主細胞の、AHAS酵素活性を阻害する少なくとも１つの除草剤に対する、耐性もしくは抵抗性を強める方法を提供する。好ましくは、こうした除草剤はイミダゾリノン系またはスルホニルウレア系除草剤である。本発明に関して、イミダゾリノン系除草剤には、PURSUIT（登録商標）（イマゼタピル）、CADRE（登録商標）（イマザピック）、RAPTOR （登録商標）（イマザモックス）、SCEPTER（登録商標）（イマザキン）、ASSERT（登録商標）（イマゼサベンツ）、ARSENAL（登録商標）（イマザピル）、前記除草剤のいずれかの誘導体、または前記除草剤の２つ以上からなる混合物、たとえば、イマザピル／イマザモックス（ODYSSEY（登録商標））が含まれるが、それらに限定されない。さらに具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミジアゾリン-2-イル)-ニコチン酸、[2-(4-イソプロピル)-4-] [メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-3-キノリンカルボン]酸、[5-エチル-2-(4-イソプロピル-] 4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-ニコチン酸、2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-5-(メトキシメチル)-ニコチン酸、[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-]イミダゾリン-2-イル)-5-メチルニコチン酸、ならびにメチル[6-(4-イソプロピル-4-]メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-m-トルアートおよびメチル[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-]オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-p-トルアートから選択することができるが、それに限定されない。5-エチル-2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ- 2-イミダゾリン-2-イル)-ニコチン酸、および[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-]イル)-5-(メトキシメチル)-ニコチン酸の使用が好ましい。[2-(4-イソプロピル-4-] メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-5-(メトキシメチル)-ニコチン酸の使用が特に好ましい。本発明に関して、スルホニルウレア除草剤には、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フラザスルフロン、イマザスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロンを含めるが、それらに限定されない。
【００３７】
本発明は、AHASSポリヌクレオチド構築物を用いて植物を形質転換することを含む、植物においてAHAS活性を高める方法を提供する。本明細書で使用される場合、「AHASSポリヌクレオチド構築物」という用語は、AHASSヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを表す。その方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、少なくとも１つの植物細胞に導入すること、ならびにその細胞から、形質転換された植物体を生成することを含む。ある実施形態において、AHASSポリヌクレオチド構築物は、AHASSヌクレオチド配列に機能しうるように結合したプロモーターを含み、このプロモーターは植物細胞において遺伝子発現を駆動することができる。好ましくは、こうしたプロモーターは、構成的プロモーター、もしくは組織選択的プロモーターである。この方法を用いて、AHAS酵素の触媒活性を阻害する、少なくとも１つの除草剤に対する植物の耐性を高める、または強めることができる。
【００３８】
本発明はまた、除草剤耐性植物において、除草剤耐性を強める方法を提供するが、その方法はAHASSポリヌクレオチド構築物で植物を形質転換することを含む。この方法は、本発明のAHASSポリヌクレオチド構築物を少なくとも１つの植物細胞に導入すること、ならびにその細胞から、形質転換された植物体を再生することを含む。ある実施形態において、除草剤耐性植物は、AHAS酵素活性を阻害することが知られている、少なくとも１つの除草剤に対する耐性をその植物に付与する、除草剤耐性AHASLタンパク質を含む。別の実施形態において、AHASSポリヌクレオチド構築物は、AHASSヌクレオチド配列に機能しうるように結合したプロモーターを含むが、このプロモーターは植物細胞において遺伝子発現を駆動することができる。この方法を用いて、AHAS酵素活性を阻害する少なくとも１つの除草剤に対する、除草剤耐性植物の耐性を強めることができる。したがって、この方法は、除草剤耐性植物を枯死させることも、有意に損傷することもなしに、除草剤耐性植物に対して高レベルの除草剤を適用することを可能にする。
【００３９】
本発明は、植物、植物組織、植物細胞もしくは他の宿主細胞において、本発明のAHASSポリヌクレオチドを発現させるための発現カセットを提供する。発現カセットは、目的とする植物、植物組織、植物細胞もしくは他の宿主細胞において発現可能なプロモーターを含むが、このプロモーターは、全長AHASSポリペプチド（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含む）もしくは成熟AHASSポリペプチド（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含まない）のいずれかをコードする本発明のポリヌクレオチドに機能しうるように連結される。植物もしくは植物細胞のプラスチドで発現することが望ましいならば、発現カセットは、機能しうるように連結された葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体ターゲティング配列を含むことができる。
【００４０】
本発明の発現カセットは、植物もしくは宿主細胞の除草剤耐性を高める方法に使用することができる。この方法は、本発明の発現カセットで植物もしくは宿主細胞を形質転換することを包含するが、この発現カセットは目的の植物もしくは宿主細胞において発現可能なプロモーターを含み、そのプロモーターは本発明のAHASSポリヌクレオチドに機能しうるように連結される。
【００４１】
本発明はまた、目的とする植物もしくは宿主細胞において、真核生物AHASLポリペプチドおよび本発明のAHASSポリペプチドを発現する、発現ベクターを提供する。ある実施形態において、植物発現ベクターは、第１のポリヌクレオチド構築物および第２のポリヌクレオチド構築物を含むが、この第１のポリヌクレオチド構築物は、真核生物AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能しうるように結合した第１のプロモーターを含み、第２のポリヌクレオチド構築物は、AHASSタンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能しうるように結合した第２のプロモーターを含み、さらに第１および第２のプロモーターは、目的とする植物もしくは宿主細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有する。ある実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチド構築物はさらに、機能しうるように結合した葉緑体ターゲティング配列を含む。別の実施形態において、真核生物AHASLタンパク質は植物AHASLタンパク質であり、場合によっては、除草剤耐性AHASLタンパク質である。植物および植物細胞における発現のための発現ベクターは、本明細書では、植物発現ベクターと称する。植物発現ベクターの第１および第２のプロモーターは、植物細胞において遺伝子発現を駆動することができる。
【００４２】
本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」という用語の使用は、本発明を、DNAを含むポリヌクレオチド構築物に限定するものではない。当業者は、リボヌクレオチド、ならびにリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせからなる、ポリヌクレオチド構築物、特にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた、本明細書に記載の方法に使用することができることに気付くであろう。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、本発明の、植物を形質転換する方法に使用することができる、あらゆるポリヌクレオチド構築物を包含し、こうした構築物にはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる構築物が含まれるが、それらに限定されない。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然に存在する分子も、合成アナログもいずれも包含する。本発明のポリヌクレオチド構築物はまた、あらゆる形のポリヌクレオチド構築物を包含し、それには一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン型、ステム-ループ構造などを含めるがそれらに限定されない。さらに、当業者には当然のことであるが、本明細書に記載の各ヌクレオチド配列は、例示されたヌクレオチド配列の相補体も包含する。
【００４３】
さらに、当然のことながら、本発明の方法は、形質転換された植物において、少なくとも１つのタンパク質の発現、または少なくとも１つのRNA、たとえば、mRNAの少なくとも一部に相補的であるアンチセンスRNA、の発現を指令する能力を有するポリヌクレオチド構築物を使用することができる。典型的には、こうしたポリヌクレオチド構築物は、タンパク質のコード配列、または5'および3'転写調節領域に機能しうるように結合したRNAからなる。あるいはまた、やはり当然のことながら、本発明の方法は、形質転換された植物において、タンパク質もしくはRNAの発現を指令する能力を有するポリヌクレオチド構築物を使用することができる。
【００４４】
本発明は、AHASSドメインに機能しうるように結合した真核生物AHASLドメインを含む融合タンパク質を提供するが、このAHASLドメインは成熟AHASLタンパク質のアミノ酸配列を含み、AHASSドメインは本発明のAHASSタンパク質のアミノ酸配列を含む。このAHASLドメインは、AHASSドメインのAHASSタンパク質のアミノ酸配列と同じ、または異なる、真核生物種を起源とする、真核生物の成熟AHASLタンパク質のアミノ酸配列を含むことができる。したがって、AHASLドメインは、任意の真核生物に由来する真核生物成熟AHASLタンパク質の、任意の既知アミノ酸配列を含み、任意の真核生物には、単子葉植物、双子葉植物、藻類、動物、または真菌を含めるが、それらに限定されない。本発明はまた、こうした融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。
【００４５】
本発明は、目的とする植物もしくは宿主細胞においてAHASL-AHASS融合ポリペプチドを発現するための、発現ベクターを提供する。発現ベクターは、目的とする植物もしくは宿主細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有するプロモーターを、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能しうるように連結して含む。このポリヌクレオチドは第１のヌクレオチド配列を含み、この配列は、真核生物成熟AHASLポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするものであって、第２のヌクレオチド配列に機能しうるように結合しているが、この第２の配列は、本発明の成熟AHASSポリペプチドを含むアミノ酸配列をコードするものである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはさらに、第１および第２のヌクレオチド配列の間に位置するリンカー領域をコードする、機能しうるように連結された第３のヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
植物もしくは宿主細胞において発現される場合、本発明のAHASL-AHASS融合ポリペプチドはAHAS活性を有する。好ましくは、AHASL-AHASS融合ポリペプチドは、対応するAHASSポリペプチドが存在しない場合の、対応するAHASLポリペプチドの活性より高いレベルのAHAS活性を有する。
【００４７】
本発明は、プロモーターを、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能しうるように連結して含む植物発現ベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること、ならびにそのトランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を生成することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法を提供する。この方法を用いて、AHAS活性を阻害する少なくとも１つの除草剤に対する耐性の増加した作物を作り出すことができる。
【００４８】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を包含するものであって、こうしたポリヌクレオチドには、AHASSヌクレオチド配列、AHASL-AHASS融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド構築物、発現カセット、および発現ベクターを含めるが、それらに限定されない。本発明の宿主細胞は、原核細胞および真核細胞をいずれも包含し、植物細胞、動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、および他の真菌細胞が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の宿主細胞は、非ヒト宿主細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、植物細胞、細菌細胞、および酵母細胞である。もっとも好ましくは、宿主細胞は植物細胞である。
【００４９】
さらに、当然のことながら、目的とする宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現するために、ポリヌクレオチドを、当該宿主細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有するプロモーターに機能しうるように結合することができる。宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現する本発明の方法は、特定のプロモーターに依存しない。この方法は、当技術分野で知られており、目的とする宿主細胞において遺伝子発現を駆動することができる任意のプロモーターの使用を包含する。
【００５０】
本発明は、AHASSポリヌクレオチド分子、ならびにその断片および変異体を包含する。上記ヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチド分子も本発明に含まれる。「断片」という用語は、本発明のAHASSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部分を指す。本発明のAHASSヌクレオチド配列の断片は、AHASSポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードしていてもよく、または下記の方法を用いてハイブリダイゼーションプローブもしくはPCRプライマーとして使用できる断片であってもよい。AHASSポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本発明のAHASSヌクレオチド配列のうち１つの一部分を単離し、AHASSポリペプチドのコードされた部分を発現させ（たとえば、in vitro組換え発現によって）、AHASSポリペプチドのコードされた部分の活性を評価することによって、調製することができる。AHASSヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチド分子は、使用目的に応じて、ヌクレオチドを、少なくとも約15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, もしくは1800個、または本明細書に記載の全長ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドの数まで（たとえば、配列番号１および３について、それぞれ1726および1861ヌクレオチド）含む。
【００５１】
当然のことながら、単離された断片は、実質的に同一であって未発表の配列のみならず、本発明以前に公表されていないいかなる連続した配列も包含する。したがって、もし単離された断片が本発明以前に公表されているならば、その断片は、本発明に含まれるものではない。配列が本発明以前に公表されていない場合、単離された核酸断片は、少なくとも約12, 15, 20, 25, または30個の連続したヌクレオチドである。ヌクレオチド配列の他の領域は、すでに公表された配列との潜在的な相同性に応じて、さまざまな大きさの断片を含むことができる。
【００５２】
本発明のAHASSポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする、AHASSヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, もしくは450個の、または本発明の全長AHASSポリペプチド中に存在するアミノ酸総数（たとえば、配列番号２、４および５について、それぞれ483、481および471個のアミノ酸）までの、連続したアミノ酸をコードすると考えられる。PCRプライマーのためのハイブリダイゼーションプローブとして有用な、AHASSヌクレオチド配列の断片は、一般に、AHASSポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードしている必要はない。
【００５３】
本明細書に記載のヌクレオチド配列の変異体であるポリヌクレオチド分子もまた、本発明に含まれる。本発明のAHASSヌクレオチド配列の「変異体」には、本明細書に記載のAHASSポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のために保存的に異なっている配列が含まれる。こうした天然の対立遺伝子変異体は、下記に概要を説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイゼーション法といった、よく知られている分子生物学の技術を用いて、同定することができる。変異型ヌクレオチド配列はまた、合成によって誘導されたヌクレオチド配列を包含し、これはたとえば、部位特異的突然変異誘発によって生成されるが、依然として、下記のとおり本発明に記載のAHASSポリペプチドをコードするものである。概して、本発明のヌクレオチド配列変異体は、本明細書に記載の特定のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の同一性を有する。変異型AHASSヌクレオチド配列は、それぞれAHASSポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、本明細書に記載のAHASSポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, または99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するものである。
【００５４】
さらに、当業者には当然のことながら、突然変異によって本発明のヌクレオチド配列内に変化を導入することができ、それによってAHASSポリペプチドの生物学的活性を変化させることなく、コードされたAHASSポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。したがって、配列番号２、４および５とはそれぞれ異なる配列を有するAHASSポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子は、１つもしくは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を、本明細書に記載の対応するヌクレオチド配列に導入することによって作り出され、その結果、１つもしくは複数のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失が、コードされたポリペプチド内に導入される。部位特異的変異誘発、およびPCRによる変異誘発といった、標準的な技法によって変異を導入することができる。このような変異型ヌクレオチド配列もまた本発明に含まれる。
【００５５】
たとえば、好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つもしくは複数の、予想される、好ましくは非必須のアミノ酸残基で行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく、AHASSポリペプチドの野生型配列（たとえば、それぞれ、配列番号２、４および５の配列）から変更することができる残基であって、これに対して「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸ファミリーが当技術分野で定義されている。こうしたファミリーには、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。こうした置換は、保存されているアミノ酸残基、または保存されているモチーフ内のアミノ酸残基に対して行われることはない。
【００５６】
本発明のタンパク質を、アミノ酸置換、欠失、末端切断および挿入を含めた、さまざまな方法で改変することができる。このような操作の方法は、当技術分野では広く知られている。たとえば、AHASSポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、DNAに変異を起こすことによって調製することができる。突然変異誘発、およびヌクレオチド配列変異の方法は、当技術分野においてよく知られている。たとえば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkelら、1987, Methods in Enzymol. 154:367-382; 米国特許第4,873,192号; WalkerおよびGaastra編、1983, Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, New York、ならびにそれらに記載の参考文献を参照されたい。目的とするタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない、適当なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoffら、1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.、のモデルに見出すことができ、これは参考として本明細書に含めるものとする。アミノ酸を、類似した特性を有する別のアミノ酸で置換するという、保存的置換が好ましいと思われる。
【００５７】
あるいはまた、AHASSコード配列の全体もしくは一部にランダムに変異を導入すること、たとえば飽和突然変異誘発、によって、変異型AHASSヌクレオチド配列を作製することが可能であり、その結果得られた変異体をAHASSの生物学的活性でスクリーニングして、活性を保持している変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされたポリペプチドを組換え技術によって発現させ、ポリペプチドの活性を標準的なアッセイ法によって測定することができる。
【００５８】
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、本明細書に記載の配列、ならびにその断片および変異体を包含する。本発明のAHASSヌクレオチド配列、ならびにその断片および変異体をプローブおよび／またはプライマーとして使用して、他の植物においてAHASSホモログを同定、および／またはクローニングすることができる。こうしたプローブを用いて、同じ、もしくはまったく同じポリペプチドをコードする転写物、またはゲノム配列を検出することができる。
【００５９】
このように、PCR、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本発明の配列とほぼ同一の配列を同定することができる。たとえば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY、ならびにInnisら、1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NYを参照されたい。本明細書に記載のAHASSヌクレオチド配列、またはその断片および変異体に対する配列同一性に基づいて単離されたAHASSヌクレオチド配列は、本発明に含まれる。
【００６０】
ハイブリダイゼーション法において、既知のAHASSヌクレオチド配列の全体もしくは一部を用いて、cDNAまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることができる。こうしたcDNAおよびゲノムライブラリを構築する方法は、当技術分野で広く知られており、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYに記載されている。いわゆるハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムDNA断片、cDNA断片、RNA断片、または他のオリゴヌクレオチドとすすることができ、32Pのような検出可能な基、または他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素コファクターといった、他の任意の検出可能なマーカーで標識することができる。ハイブリダイゼーション用プローブは、本明細書に記載の既知のAHASSヌクレオチド配列に基づく合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製することができる。既知のAHASSヌクレオチド配列もしくはコードされるアミノ酸配列において、保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基に基づいてデザインされた縮重プライマーを、追加的に使用することができる。プローブは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、本発明のAHASSヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体の、少なくとも約12、好ましくは約25、さらに好ましくは約50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, もしくは1800個の連続したヌクレオチドに対してハイブリッド形成する、ヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリダイゼーション用プローブを調製する方法は、当技術分野において広く知られており、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYに記載されているが、これは参考として本明細書に含めるものとする。
【００６１】
たとえば、本明細書に示す全AHASS配列、またはその一部分もしくは複数の部分を、対応するAHASS配列およびメッセンジャーRNAと特異的にハイブリッド形成することができるプローブとして、使用することができる。ハイブリダイゼーション法は、平板上のDNAライブラリのハイブリダイゼーションスクリーニングを包含する（プラークもしくはコロニーのいずれか；たとえば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYを参照されたい）。
【００６２】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行うことができる。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に対してハイブリダイズする程度が、他の配列に対するよりも検出可能なほど大きくなるような（たとえば、バックグラウンドの少なくとも２倍）条件を表す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況が異なれば、違ってくる。
【００６３】
典型的には、ストリンジェントな条件は、pH7.0から8.3で、塩濃度が約1.5 M Naイオン、典型的には約0.01から1.0 M Naイオン濃度（もしくは他の塩）より低く、温度は短いプローブ（たとえば、10から50ヌクレオチド）については最低30℃程度で、長いプローブ（たとえば、50ヌクレオチドより大）については最低60℃ほどであるような条件となる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化試薬を添加することによって達成されることもある。ストリンジェンシーの低い条件の例としては、37℃にて30-35%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）からなるバッファー溶液によるハイブリダイゼーション、ならびに、50-55℃にて1X-2X SSC（20X SSC = 3.0 Mクエン酸三ナトリウム）による洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェンシー条件の例を挙げると、37℃にて40-45%ホルムアミド、1.0 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーション、ならびに、55-60℃にて0.5X-1X SSCによる洗浄である。高ストリンジェンシー条件の例は、37℃にて50% ホルムアミド、1.0 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーション、ならびに、60-65℃にて0.1X SSCによる洗浄である。状況に応じて、洗浄バッファーは約0.1%から約1%のSDSを含んでいてもよい。ハイブリダイゼーションの時間は、一般に約24時間未満であるが、通常4-12時間程度である。
【００６４】
一般に、特異的であることがハイブリダイゼーション後の洗浄の役割であって、重要な要素は、最終洗浄液のイオン強度および温度である。DNA-DNAハイブリッドについては、Tmは、MeinkothおよびWahlの式：Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L（MeinkothおよびWahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284）から概算することができる；式中Mは、一価カチオンのモル濃度、%GCはDNA中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、ならびにLは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Tmは、相補的標的配列の50%が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（一定のイオン強度およびpH条件下）である。Tmは、ミスマッチ1%につき約1℃ずつ減少する；したがって、Tm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄条件を調整して、望ましい同一性を有する配列とハイブリダイズすることができる。たとえば、≧90%同一性を有する配列を探す場合、Tmを10℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件を選択し、一定のイオン強度およびpHで、特定の配列およびその相補物について、融点（Tm）より約5℃低くなるようにする。しかしながら、非常にストリンジェントな条件は、融点（Tm）より1, 2, 3 もしくは4℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができる；中程度にストリンジェントな条件は、融点Tmより6, 7, 8, 9または10℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができる；ストリンジェンシーの低い条件は、融点（Tm）より11, 12, 13, 14, 15または20℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を用いることができる。上記の式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件、ならびに望ましいTmを用いて、当業者には当然のことであるが、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化が本質的に説明される。望ましいミスマッチの程度が、結果として45℃（水溶液）もしくは32℃（ホルムアミド
溶液）より低いTmをもたらす場合、SSC濃度を上げて、もっと高い温度を使用できるようにすることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する全般的な指針は、Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY; ならびにAusubelら編、1995, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NYに記載されている。また、Sambrookら、1989, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYも参照されたい。
【００６５】
当然のことながら、本発明のポリヌクレオチド分子およびポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号２、４もしくは５のアミノ酸配列と十分に同一である核酸もしくはアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド分子およびポリペプチドを包含する。「十分に同一」という用語は、本明細書において、第１および第２のアミノ酸、もしくはヌクレオチド配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列と同一の、または等価な（たとえば、類似した側鎖を持つ）、十分な数もしくは最小限の数の、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを含有する、第１のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を表すために使用される。たとえば、少なくとも約45%, 55%, もしくは65%の同一性、好ましくは75%同一性、より好ましくは77%, 80%, 81%, 85%, 95%, もしくは98%の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を、本明細書では十分に同一であると定義する。
【００６６】
２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸の、同一性パーセントを決定するため、最適な比較を目的としてこれらの配列をアラインメントする。２つの配列間の％同一性は、それらの配列に共有される同一ポジションの数の関数である（すなわち％同一性 = 同一ポジションの数／ポジションの総数（たとえば、重複ポジション） x 100）。ある実施形態において、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容して、または許容せずに、下記と同様の手法を用いて測定することができる。％同一性の計算に際して、典型的には正確なマッチを数える。本発明については、配列同一性／類似性の値は、好ましくは、本発明の全長ヌクレオチドもしくは全長アミノ酸配列の、第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に対する、ギャップなしのアラインメントから得られる。
【００６７】
２つの配列間の％同一性の測定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。２つの配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの、好ましい、限定的でない例は、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムであって、これはKarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改良されている。こうしたアルゴリズムは、Altschulら、1990, J. Mol. Biol. 215:403の、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラムを用いてスコア＝100、ワード長＝12で実行し、本発明のポリヌクレオチド分子に対するヌクレオチド配列同一性を得ることができる。BLASTタンパク質サーチは、XBLASTプログラムを用いて、スコア＝50、ワード長＝3で実施し、本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列同一性を得ることができる。比較目的でギャップを入れたアラインメントを得るために、Altschulら、1997, Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいはまた、PSI-Blastを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復サーチを行うことができる。Altschulら、1997を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム（たとえば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。もう一つの好ましい、限定的でない例であって、配列比較のために使用される数学アルゴリズムの例は、MyersおよびMiller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれ、このプログラムはGCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、PAM120重み残基表、ギャップ長のペナルティ12、およびギャップのペナルティ4を使用することができる。アラインメントはまた、検査によって手動で実施することもできる。
【００６８】
本明細書において特に明記しない限り、ペアワイズ％配列同一性は、単純なp distanceモデルによって、ClustalXバージョン1.81およびMEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) バージョン2.1を用いて、２つのヌクレオチドもしくは２つのアミノ酸配列のアラインメントから得られる。「同等のプログラム」という用語は、問題となっている任意の２つの配列について、単純なp distanceモデルを用いて、ClustalXバージョン1.81がもたらす対応するアラインメント、ならびにMEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) バージョン2.1によって算出されるパーセント同一性と比較したとき、同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基マッチを有するアラインメント、ならびに同じパーセント配列同一性をもたらす、任意の配列比較プログラムを表す。
【００６９】
本発明のAHASSヌクレオチド配列は、天然に存在する配列ならびに変異型をいずれも包含する。同様に、本発明のポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、ならびにその変異型および修飾型をいずれも包含する。こうした変異体は、望ましいAHASS活性を保持し続ける。明らかに、変異体をコードするDNAに生じる変異は、その配列を読み枠の外に置くべきではなく、二次的なmRNA構造を生じる可能性のある相補的な領域を生じないことが好ましい（たとえば、欧州特許出願第75,444号を参照されたい）。
【００７０】
本明細書に含まれるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、タンパク質の性質の極端な変化を生じないと思われる。しかしながら、置換、欠失、または挿入の正確な影響を、事前に予測することが困難である場合、当業者は十分理解していることであるが、その影響を通常のスクリーニングアッセイによって評価することができる。すなわち、活性はAHAS活性アッセイによって評価することができる。たとえば、Singhら、1988, Anal. Biochem. 171:173-179（参考として本明細書に含めるものとする）を参照されたい。
【００７１】
変異型ヌクレオチド配列およびタンパク質はまた、DNAシャフリングのような、変異誘発法および組換え誘導法から導かれた配列およびタンパク質を包含する。このような方法を用いて、１つもしくは複数の異なるAHASSコード配列を操作して、望ましい特性を有する新たなAHASSタンパク質を作り出すことができる。このようにして、実質的な配列同一性を有し、in vitroもしくはin vivoで相同組み換えすることができる、配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチド集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリが作製される。たとえば、この方法を用いて、目的とするドメインをコードする配列モチーフを、本発明のAHASS遺伝子と、他の既知のAHASS遺伝子の間でシャッフルし、たとえば、酵素の場合にはKmの増加といった、目的とする改善された特性を有する新規遺伝子を得ることができる。こうしたDNAシャフリングのための方策は当技術分野において知られている。たとえば、Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; Crameriら、1997, Nature Biotech. 15:436-438; Mooreら、1997, J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhangら、1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameriら、1998, Nature 391:288-291; ならびに米国特許第5,605,793号および第5,837,458号を参照されたい。
【００７２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、他の生物、特に他の植物から、さらに詳細には他の単子葉植物から、対応する配列を単離することができる。このように、PCR、ハイブリダイゼーションなどといった方法を用いて、本明細書に示す配列に対する配列同一性に基づいて、こうした配列を同定することができる。本明細書に記載の完全なAHASS配列もしくはその断片に対する配列同一性に基づいて単離された配列は、本発明に含まれる。したがって、AHASSタンパク質をコードしており、本明細書に記載の配列もしくはその断片と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された配列は、本発明に包含される。
【００７３】
PCR法において、PCR反応に使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、cDNA、または目的とする任意の植物から抽出されたゲノムDNAから、対応するDNA配列を増幅することができる。PCRプライマーをデザインし、PCRクローニングする方法は、当技術分野で広く知られており、Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NYに記載されている。また、 Innisら編、1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY; InnisおよびGelfand編、1995, PCR Strategies, Academic Press, NY; ならびにInnis およびGelfand編、1999, PCR Methods Manual, Academic Press, NYも参照されたい。PCRの既知の方法には、ペアプライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを使用する方法があるがそれらに限定されない。
【００７４】
本発明のAHASS配列はまた、目的とする植物で発現するための発現カセット内に与えられる。このカセットは、本発明のAHASSヌクレオチド配列に機能しうるように結合した、5'および3'制御配列を包含することができる。「機能しうるように結合した」という用語は、本明細書で用いられる場合、プロモーターともう一つの配列の間の機能的な連鎖を表すが、このプロモーター配列は、もう一つの配列に相当するDNA配列の転写を開始および調節する。一般に、「機能しうるように結合した」は、２つの配列がいずれも、使用された配列に起因する機能もしくは活性を実現するように、核酸もしくはアミノ酸配列が連結されていることを意味する。ある実施形態において、「機能しうるように結合した」は、連結されている核酸配列が切れ目なく連続しており、さらに２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、連続的であって同じ読み枠にあることを意味する。カセットはこれに加えて、生物内に同時形質転換されるべき少なくとも１つの追加の遺伝子を含有することができる。あるいはまた、追加の遺伝子は、複数の発現カセット上に与えられることもある。
【００７５】
AHASS配列を挿入するための複数個の制限酵素部位が制御領域の転写制御下にある発現カセットが与えられる。この発現カセットはさらに、選択可能なマーカーを含有することができる。
【００７６】
発現カセットは、5'-3'転写方向に、植物において作動する転写および翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、本発明のAHASS配列、ならびに転写および翻訳終結領域（すなわち終結領域）を包含することができる。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のAHASS配列に対して、天然型もしくは類似物であってよく、または外来もしくは異種とすることができる。加えて、プロモーターは、天然の配列であっても、あるいはまた合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主にとって「外来」もしくは「異種」である場合、そのプロモーターが導入される天然の植物中に存在しないプロモーターを意味する。プロモーターが、本発明のAHASS配列に対して「外来」もしくは「異種」である場合、そのプロモーターは、機能しうるように結合した本発明のAHASS配列に関して、天然型プロモーターでも、天然に存在するプロモーターでもないプロモーターを表す。本明細書で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域に機能しうるように結合したコード配列を含む。
【００７７】
異種プロモーターを用いて配列を発現させることが好ましいと考えられるが、天然型AHASSもしくはAHASLプロモーター配列を使用することもできる。こうした構築物は、植物もしくは植物細胞においてAHASSタンパク質の発現レベルを変化させると思われる。したがって、植物もしくは植物細胞の表現型が変化する。
【００７８】
終結領域は、転写開始領域と同じ天然型、機能しうるように連結された当該AHASS配列と同じ天然型、植物宿主と同じ天然型、または他の起源に由来するものでもよい（すなわち、プロモーター、当該AHASS配列、植物宿主もしくはそれらの任意の組み合わせに対して外来もしくは異種）。使いやすい終結領域は、たとえばオクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終結領域のように、A. tumefaciensのTiプラスミドから得ることができる（Guerineauら、1991, Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, 1991, Cell 64:671-674; Sanfaconら、1991, Genes Dev. 5:141-149; Mogenら、1990, Plant Cell 2:1261-1272; Munroeら、1990, Gene 91:151-158; Ballasら、1989, Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; ならびにJoshiら、1987, Nucleic Acid Res. 15:9627-9639も参照されたい）。
【００７９】
適切な場合には、遺伝子は、形質転換された植物内で発現が増加するように最適化することができる。すなわち、発現を改善するために植物優先コドンを用いて遺伝子を合成することができる（たとえば、宿主優先コドン使用頻度の検討については、CampbellおよびGowri, 1990, Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい）。当技術分野において植物優先遺伝子を合成するために方法を利用することができる（たとえば、米国特許第5,380,831号および第5,436,391号、ならびにMurrayら、1989, Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。これらは参考として本明細書に含められる）。
【００８０】
追加的な配列の改変が、細胞性宿主における遺伝子発現を高めることが知られている。これには、不要なポリアデニル化シグナル、エクソン-イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピート、ならびに遺伝子発現に有害となる可能性のある、十分特性の明らかな他の配列をコードする配列の除去が含まれる。配列のG-C含量を、宿主細胞で発現される既知遺伝子と比較して計算された、所定の細胞性宿主に関する平均的なレベルに、調整することができる。可能ならば配列は、予測されるmRNAのヘアピン二次構造を避けるように改変される。
【００８１】
遺伝子発現を高めるヌクレオチド配列を、植物発現ベクター中に使用することもできる。これには、トウモロコシのイントロンAdhI、イントロン1遺伝子（Callisら、1987, Genes and Development 1:1183-1200）、ならびにタバコモザイクウイルス（TMV）、トウモロコシChlorotic Mottle Virus、およびアルファルファモザイクウイルス（Gallieら、1987, Nucleic Acid Res. 15:8693-8711 ならびにSkuzeskiら、1990, Plant Molec. Biol. 15:65-79）由来のリーダー配列（W配列）が含まれる。トウモロコシのshrunkent-1遺伝子座由来の第１のイントロンは、キメラ遺伝子構築物において遺伝子の発現を増加させることが明らかになった。米国特許第5,424,412号および第5,593,874号は、遺伝子発現構築物における特定のイントロンの使用を明らかにし、Gallieら、1994, Plant Physiol. 106:929-939は、遺伝子発現を組織特異的に制御するために、イントロンが有用であることも明らかにした。AHASS小サブユニット遺伝子発現をさらに高め、または最適化するために、本発明の植物発現ベクターはまた、マトリクス結合領域（MAR）を含むDNA配列を含有することができる。このように改変された発現系で形質転換された植物細胞は、その後、本発明のヌクレオチド配列の、過剰発現もしくは構成的発現を示す可能性がある。
【００８２】
発現カセットはさらに、発現カセット構築物中に5'リーダー配列を含有することができる。このようなリーダー配列は、翻訳を促進するよう作用することができる。翻訳リーダーは当技術分野において知られており、次のようなものがある：ピコルナウイルスリーダー、たとえば、EMCVリーダー(脳心筋炎ウイルス5'非コード領域) (Elroy Steinら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126 6130); ポティウイルスリーダー、たとえば、TEVリーダー(タバコエッチウイルス) (Gallieら、1995, Gene 165(2):233-238)、MDMVリーダー(トウモロコシ萎縮モザイクウイルス) (Virology 154:9 20)、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP) (Macejakら、1991, Nature 353:90 94); アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質mRNA由来の非翻訳リーダー (AMV RNA 4) (Joblingら、1987, Nature 325:622 625); タバコモザイクウイルスリーダー (TMV) (Gallieら、1989, in Molecular Biology of RNA, Cech編、Liss, New York, pp. 237-256); ならびにトウモロコシクロロティックモトルウイルス リーダー(MCMV) (Lommelら、1991, Virology 81:382 385)。Della Cioppaら、1987, Plant Physiol. 84:965 968も参照されたい。翻訳を促進することが知られている他の方法、たとえばイントロンなど、を使用することもできる。
【００８３】
発現カセットの調製に際して、適正な方向性、ならびに、必要に応じて適正な読み枠で、DNA配列を提供できるように、さまざまなDNA断片を操作することができる。このような目的で、アダプターもしくはリンカーを用いて、DNA断片を連結することができるが、または、他の操作を関与させて、便利な制限酵素部位、不必要なDNAの除去、制限酵素部位の除去などをもたらすことができる。こうした目的のために、in vitro変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、および置換、たとえば、塩基転移および塩基転換を関与させることができる。
【００８４】
本発明の実施に際して、いくつかのプロモーターを使用することができる。プロモーターは、望ましい結果を踏まえて選択することができる。核酸は、植物で発現する構成的プロモーター、組織選択的プロモーター、または他のプロモーターと組み合わせることができる。
【００８５】
こうした構成的プロモーターとしては、たとえば、国際公開第99/43838号および米国特許第6,072,050号に記載の、Rsyn7プロモーターのコアプロモーター、および他の構成的プロモーター；コアCaMV 35Sプロモーター（Odellら、1985, Nature 313:810-812）；イネ アクチン（McElroyら、1990, Plant Cell 2:163-171）；ユビキチン（Christensenら、1989, Plant Mol. Biol. 12:619-632 およびChristensenら、1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689）；pEMU（Lastら、1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；MAS（Veltenら、1984, EMBO J. 3:2723-2730）；ALSプロモーター（米国特許第5,659,026号）などがある。他の構成的プロモーターには、たとえば、米国特許第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号および第6,177,611号が挙げられる。
【００８６】
組織選択的プロモーターを使用して、特定の植物組織内で強化されたAHASS発現を目指すことができる。このような組織選択的プロモーターには、葉選択的プロモーター、根選択的プロモーター、種子選択的プロモーター、および茎選択的プロモーターがあるが、それらに限定されない。組織選択的プロモーターは、Yamamotoら、1997, Plant J. 12(2):255-265; Kawamataら、1997, Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansenら、1997, Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russellら、1997, Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehartら、1996, Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Campら、1996, Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevasciniら、1996, Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamotoら、1994, Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam, 1994, Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozcoら、1993, Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuokaら、1993, Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; ならびにGuevara-Garciaら、1993, Plant J. 4(3):495-505を包含する。このようなプロモーターは、必要に応じて、弱い発現を求めて改変することができる。
【００８７】
ある実施形態において、目的とする核酸は発現のために葉緑体を標的とする。このように、当該核酸が直接、葉緑体内に挿入されない場合、発現カセットは、目的の遺伝子産物を葉緑体に向けて方向付けることができる、葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、葉緑体ターゲティング配列を追加して含有することができる。こうした輸送ペプチドは当技術分野で知られている。たとえば、Von Heijneら、1991, Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clarkら、1989, J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppaら、1987, Plant Physiol. 84:965-968; Romerら、1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; ならびにShahら、1986, Science 233:478-481を参照されたい。本発明のAHASSポリペプチドは天然の葉緑体輸送ペプチドを包含するが、葉緑体ターゲティング配列を、本発明の成熟AHASSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'末端に、機能しうるように連結することによって、当技術分野で知られている任意の葉緑体輸送ペプチドを、本発明の成熟AHASSポリペプチドのアミノ酸配列と融合させることができる。
【００８８】
葉緑体ターゲティング配列は当技術分野において知られており、それには、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ（Rubisco）の葉緑体小サブユニット (de Castro Silva Filhoら、1996, Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnellら、1991, J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(エノールピルビル)シキミ酸-3-リン酸合成酵素(EPSPS) (Archerら、1990, J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); トリプトファン合成酵素 (Zhaoら、1995, J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); プラストシアニン (Lawrenceら、1997, J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); コリスミ酸合成酵素 (Schmidtら、1993, J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); ならびに集光性クロロフィルa/b結合タンパク質(LHBP) (Lamppaら、1988, J. Biol. Chem. 263:14996-14999) が含まれる。Von Heijneら、1991, Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clarkら、1989, J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppaら、1987, Plant Physiol. 84:965-968; Romerら、1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; ならびにShahら、1986, Science 233:478-481も参照されたい。
【００８９】
葉緑体の形質転換法は、当技術分野で知られている（たとえば、Svabら、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; SvabおよびMaliga, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; SvabおよびMaliga, 1993, EMBO J. 12:601-606を参照されたい）。その方法は、選択可能なマーカーを含有するDNAのパーティクルガンデリバリー、ならびに、相同的組み換えによる、DNAのプラスミドゲノムへのターゲティングに依存するものである。それに加えて、プラスミドの形質転換は、核にコードされ、プラスチドに向けられたRNAポリメラーゼの組織選択的発現による、サイレントなプラスチド導入遺伝子のトランス活性化によって、達成することができる。こうした系は、McBrideら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告されている。
【００９０】
葉緑体を標的とする目的の核酸を、葉緑体で発現するために最適化し、植物の核とこの小器官との間のコドン使用頻度の相違を明らかにすることができる。このように、当該核酸を、葉緑体で優先されるコドンを用いて合成することができる（たとえば、米国特許第5,380,831号を参照されたい。これは参考として本明細書に含めるものとする）。
【００９１】
本明細書に記載されるように、本発明のAHASSヌクレオチド配列を用いて、除草剤耐性AHASLポリペプチドをコードする遺伝子を有する植物の除草剤耐性を高めることができる。このようなAHASL遺伝子は、植物のゲノムに組み込んでもよいが、内在性遺伝子もしくは導入遺伝子に組み込むこともできる。さらに、特定の実施形態において、望ましい表現型を有する植物を作製するために、本発明の核酸配列を、所定のヌクレオチド配列の任意の組み合わせに、スタッキングすることができる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドは、農薬活性および／または殺虫活性を有するポリペプチド、たとえば、Bacillus thuringiensis毒性タンパク質をコードする、他の任意のポリヌクレオチドとスタッキングすることができる（米国特許第5,366,892号; 第5,747,450号; 第5,737,514号; 第5,723,756号; 第5,593,881号; およびGeiserら、1986, Gene 48:109に記載されている）。生成した組み合わせは、目的のポリヌクレオチドのうち任意の１つの複数コピーを含むこともできる。
【００９２】
当然のことながら、これらのヌクレオチド配列とともに、AHASS配列のメッセンジャーRNA(mRNA)の少なくとも一部分に相補的なアンチセンス構築物を構築することができる。アンチセンスヌクレオチドを、対応するmRNAとハイブリダイズするように構築する。アンチセンス鎖の改変は、その配列が対応するmRNAとハイブリダイズし、その発現を阻害する限り、行うことができる。このようにして、対応するアンチセンス配列に対して70%、好ましくは80%、さらに好ましくは85%の配列同一性を有するアンチセンス構築物を使用することができる。さらに、アンチセンスヌクレオチドの一部を用いて、標的遺伝子の発現を妨害することができる。一般に、少なくとも50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、またはそれより大きな配列を使用することができる。
【００９３】
本発明のヌクレオチド配列をセンス方向に使用して、植物の内在性遺伝子の発現を抑制することもできる。センス方向のヌクレオチド配列を使用して、植物において遺伝子発現を抑制する方法は、当技術分野で知られている。その方法は一般に、植物において発現を駆動するプロモーターを、内在性遺伝子の転写物に相当するヌクレオチド配列の少なくとも一部に機能しうるように連結して含む、DNA構築物を用いて植物を形質転換することを包含する。典型的には、このようなヌクレオチド配列は、内在性遺伝子の転写物の配列に対して、実質的な配列同一性、好ましくは約65%を超える配列同一性、さらに好ましくは約85%を超える配列同一性、もっとも好ましくは約95%を超える配列同一性を有する（米国特許第5,283,184号および第5,034,323号を参照されたい；参考として本明細書に含めるものとする）。
【００９４】
一般に、発現カセットは、形質転換された細胞の選択のために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞もしくは組織を選択するために使用される。マーカー遺伝子には、抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子、たとえば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NEO）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）をコードする遺伝子、ならびにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）といった除草性化合物に対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子がある。一般的には、下記を参照されたい：Yarranton, 1992, Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christophersonら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yaoら、1992, Cell 71:63-72; Reznikoff, 1992, Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkleyら、1980, The Operonより、177-220頁; Huら、1987, Cell 48:555-566; Brownら、1987, Cell 49:603-612; Figgeら、1988, Cell 52:713-722; Deuschleら、1989, Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerstら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschleら、1990, Science 248:480-483; Gossen, 1993, Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reinesら、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labowら、1990, Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambrettiら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baimら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborskiら、1991, Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, 1989, Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolbら、1991, Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidtら、1988, Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, 1993, Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossenら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Olivaら、1992, Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavkaら、1985, Handbook of Experimental Pharmacology, 第78巻, Springer-Verlag, Berlin; Gillら、1988, Nature 334:721-724。これらの開示文書は参考として本明細書に含めるものとする。
【００９５】
選択可能なマーカー遺伝子の上記リストは、限定することを意図するものではない。いかなる選択可能なマーカー遺伝子も、本発明において使用することができる。
【００９６】
AHASSポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子をベクター中で使用して、植物を形質転換することができるが、その結果生成した植物は、除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤に対する耐性が高まっていた。AHASSポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を、単独で、または植物において除草剤抵抗性を付与するAHAS酵素の大サブユニットをコードする、ヌクレオチド配列と組み合わせて、ベクター中で使用することができる（米国特許第6,348,643号を参照されたい；これは参考として全体を本明細書に含めるものとする）。
【００９７】
本発明のAHASSヌクレオチド配列は、形質転換された植物細胞、植物組織、および植物体を選択するためのマーカーとして、AHASLヌクレオチド配列と組み合わせて使用することもできる。目的とする任意の遺伝子を、AHASSおよびAHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに、組み込むことができる。ベクターを、AHAS阻害除草剤に感受性の植物細胞もしくは組織に導入することができる。このようなベクターを含有する、形質転換された植物、植物組織および植物細胞を、当技術分野で知られている標準的な技術によって、除草剤の存在下で選択することができる。
【００９８】
本発明はまた、本発明の単離されたAHASSポリヌクレオチド分子に機能しうるように連結された、植物において発現を駆動するプロモーターを含む、植物発現ベクターを提供する。単離されたポリヌクレオチド分子は、単子葉植物AHASSポリペプチド、特に配列番号２、４もしくは５に示すアミノ酸配列を含むAHASSポリペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の植物発現ベクターは、特定のプロモーターに依存しないが、ただ、そうしたプロモーターは植物細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有している。好ましいプロモーターには構成的プロモーターおよび組織選択的プロモーターがあるが、それに限定されない。
【００９９】
別の実施形態において、植物発現ベクターは、AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能しうるように結合した、真核生物AHASL遺伝子のプロモーター、ならびに本発明のAHASSヌクレオチド配列に機能しうるように連結された、植物細胞において発現を駆動する能力を有するプロモーターを含むが、このAHASSヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号３に記載のヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号４、および配列番号５に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびにAHASS活性を有する成熟AHASSポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の断片および変異体からなる群から選択される。
【０１００】
このような成熟AHASSポリペプチドは、こうしたAHASSおよびAHASLポリペプチドが共存するとき、AHASSポリペプチド非存在下でのAHASLポリペプチドのAHAS活性と比較して、少なくとも１つのAHASLポリペプチドの活性を増加させることができる。
【０１０１】
さらに別の実施形態において、異種AHAS遺伝子を植物で発現させるための植物発現ベクターは、AHASSポリペプチドのアミノ酸配列と融合した成熟AHASLポリペプチドのアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能しうるように連結された、植物プロモーターを含む。こうしたポリヌクレオチド構築物は、本発明のAHASSヌクレオチド配列に機能しうるように連結された、成熟AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、融合ポリペプチドをコードする上記のようなポリヌクレオチドとの関連において「機能しうるように結合した」という用語は、融合ヌクレオチド配列によってコードされる融合アミノ酸配列が、第１および第２のアミノ酸配列を含むのと同様に、第２のアミノ酸配列をコードする第２のヌクレオチド配列に連結もしくは融合した、第１のアミノ酸配列をコードする第１のヌクレオチド配列を表す。当然のことながら、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物は、追加のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、そうした追加のヌクレオチド配列は第１のコード配列の5'側、第２のコード配列の3'側、または第１と第２のコード配列の間に配置することができる。さらに、本発明の特定の実施形態において、融合ポリペプチドをコードするこのような融合ヌクレオチド配列に、リンカーアミノ酸配列をコードする追加のヌクレオチド配列を含めることは望ましいと認識されている。結果として得られた融合ポリペプチドにおいて、リンカーアミノ酸配列は第１と第２のアミノ酸配列の間に位置づけることができる。このようなリンカーアミノ酸配列が、第１および第２のアミノ酸配列に相当する融合タンパク質部分の間で、最適な相互作用を可能にすることが望ましいと認識されている。このようなリンカーアミノ酸配列は、1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100個、またはそれより多くのアミノ酸を含むことができる。
【０１０３】
融合タンパク質を形成する２つのアミノ酸配列の組み合わせに関して「機能しうるように結合する」が使用される場合、その用語は、２つのアミノ酸配列が単一の連続したアミノ酸配列を形成するように融合し、または連結されており、その結果２つの配列が、使用された配列に起因する機能もしくは活性を実現することを意味する。ある実施形態において、こうした融合タンパク質は、第２のヌクレオチド配列に機能しうるように結合した第１のヌクレオチド配列を含む、単一の連続したヌクレオチド配列の翻訳産物である。第１のヌクレオチド配列は第１のアミノ酸配列をコードし、第２のヌクレオチド配列は第２のアミノ酸配列をコードする。そこで融合ポリペプチドは、単一の連続したヌクレオチド配列の翻訳産物として生成する。
【０１０４】
もう一つの実施形態において、植物発現ベクターは、成熟AHASLポリペプチドのアミノ酸配列、および本発明の成熟AHASSポリペプチドのアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能しうるように結合した、植物細胞において遺伝子発現を駆動する能力を有するプロモーターを含む。したがって、融合ポリペプチドは、２つのドメイン、AHASLドメインおよびAHASSドメイン、から構成される。こうした融合ポリペプチドは、N末端から、AHASLドメイン、続いてAHASSドメイン、あるいはまたAHASSドメイン、次にAHASLドメインを含むことができる。加えて、融合ポリペプチドは、リンカー領域のアミノ酸配列をさらに含むことができる。こうした融合ポリペプチドにおいて、リンカー領域は、AHASLおよびAHASSドメインの間に位置する。必要ならば、葉緑体発現のために、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはさらに、葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体ターゲティング配列を含む。この葉緑体輸送ペプチドは、融合ポリペプチドの天然型AHASSもしくはAHASLポリペプチド由来の葉緑体輸送ペプチド、または当技術分野で知られている他の任意の葉緑体輸送ペプチドからなる群から選択することができる。こうした葉緑体輸送ペプチドは典型的にはタンパク質のN末端側にあることが認識されている。
【０１０５】
本発明のAHASSヌクレオチド配列を使用して、連結されたAHAS酵素を作製することができるが、この酵素は本発明のAHASL-AHASS融合ポリペプチドを含む。たとえば、本発明のある実施形態において、本発明のAHASSポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド分子は、真核生物AHASLタンパク質のアミノ酸配列をコードする第２のポリヌクレオチド分子と、ポリグリシン（polyGly）のようなリンカー領域（もしくはリンカーポリペプチド）をコードするリンカーヌクレオチド配列を介して、翻訳によって連結される。すなわち、AHASSポリペプチドのアミノ酸配列、リンカー領域のアミノ酸配列、ならびにAHASLポリペプチドのアミノ酸配列を連続して含む１つのポリペプチドをコードすることができるように、リンカーヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列の3'末端および第２のヌクレオチド配列の5'末端に、機能しうるように連結される。別のポジショニングは、小サブユニット輸送配列によって、リンカー領域転写物について、大サブユニットおよび小サブユニットの成熟コード配列を入れ替えることを伴う。本発明は、特定の数のアミノ酸を有するリンカー領域に依存しないが、ただ、融合ポリペプチドは、対応するAHASSポリペプチド非存在下で、AHAS活性、好ましくは対応するAHASLポリペプチドより高レベルのAHAS活性を有する。
【０１０６】
連結されたAHAS酵素を使用して、AHASの大および小サブユニットドメインを相互に近接した近傍に維持することによって、除草剤耐性を高めることができることが認められている。大腸菌（E. coli）AHAS酵素について、大小サブユニット間のつながりがゆるいことが明らかになった。大腸菌では、各サブユニットについて10-7 Mの濃度で、大サブユニットは、わずかに半分しかα2β2活性ホロ酵素として会合しないと推定された（Sellaら、1993, J. Bacteriology 175:5339-5343）。
【０１０７】
AHASLタンパク質のモル濃度に対してモル過剰のAHASSタンパク質が存在するときに最高活性が達成されることが認められている。双方のサブユニットが会合したときにAHAS酵素がもっとも安定であり、活性であることがわかっているので（Weinstockら、1992, J. Bacteriology, 174:5560-5566, Sellaら、1993, J. Bacteriology 175:5339-5343）、２つのサブユニットを融合させて、単一ポリペプチドにすることによって、活性および安定性の高い酵素を作り出すことができる。連結されたポリペプチドは、適正に機能することが明らかになった。Gilbertらは、２つの連結されたオリゴ糖合成酵素を大腸菌において発現させて、機能を有し、in vitroで安定な、可溶性酵素を作製した（Gilbertら、1998, Nature Biotechnology 16: 769-772）。
【０１０８】
単一ヌクレオチド構築物に由来する単一ポリペプチドとしての、AHASの大および小サブユニット両者の発現は、遺伝子導入除草剤耐性作物を作製するために利点がある。植物を形質転換および育種して、優良な作物系統にするために単一遺伝子を使用することは、２つ以上の遺伝子を使用する場合よりも、容易で有利である。
【０１０９】
一方はAHASLポリペプチドをコードし、他方はAHASSポリペプチドをコードする、２つのポリヌクレオチド構築物を含有する植物発現ベクターを構築することができる。このように、２つの遺伝子は単一遺伝子座として分離され、除草剤耐性作物の育種をいっそう容易にする。あるいはまた、大および小サブユニットを融合させて、単一のプロモーターから発現される単一の遺伝子とすることができる。融合ポリペプチドは、AHAS活性レベルおよび除草剤耐性を向上させたと思われる。AHASの大サブユニットは、（単独の、または融合された、小サブユニットの存在下で抵抗性が付与されるならば）野生型配列とすることができるが、それ自体ある程度の除草剤抵抗性を有する、変異型大サブユニットであってもよい。小サブユニットの存在は、大サブユニットの活性を高め、大サブユニットの除草剤耐性を向上させ、in vivo発現時に酵素の安定性を高め、および／または分解に対する大サブユニットの抵抗性を高めることができる。小サブユニットは、このように、植物／作物のイミダゾリノンもしくは他の除草剤に対する耐性を高めると思われる。耐性の向上は、形質転換された植物に対する植物毒性なしに、散布を可能にし、および／または除草剤の雑草防除率の安全性を高めると考えられる。理想的には、付与される耐性は、AHASを阻害することが知られている除草剤、たとえば、イミダゾリノンおよびスルホニルウレア除草剤に対する耐性を高めると思われる。
【０１１０】
大および小サブユニットの会合は、原核生物では非常に特異的であると思われる。たとえば、大腸菌は、３つのAHASLアイソザイムおよび３つのAHASSアイソザイムを有する。それぞれのAHASLアイソザイムは、たとえすべてのサブユニットが同一の生物において発現していても、ただ１つのAHASSアイソザイムと特異的に会合する（Weinstockら、1992, J. Bacteriology, 174:5560-5566）。しかしながら、同一種もしくは異なる種に由来する、または同一種の異なるアイソザイム対に由来する、真核生物AHASLおよびAHASSタンパク質の間の相互作用の特異性についてはほとんど知られていない。
【０１１１】
本発明のAHASSポリペプチドは、たとえば、トウモロコシ、イネ、およびコムギ植物から精製することができ、組成物に使用することができる。また、本発明のAHASSタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド分子を用いて、本発明のAHASSポリペプチドを、大腸菌のような微生物において発現させることができる。発現されたAHASSポリペプチドは、当業者に知られているいかなる方法によっても、大腸菌の抽出物から精製することができる。
【０１１２】
本発明はまた、除草剤に抵抗性であるトランスジェニック植物を作製する方法に関する。この方法は、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子に機能しうるように連結された、植物において発現を駆動するプロモーターを含む植物発現ベクターで、植物を形質転換することを含む。単離されたポリヌクレオチド分子は、単子葉植物AHASSポリペプチド、特に、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むAHASSポリペプチド、をコードするヌクレオチド配列を含む：配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号５に示すアミノ酸配列；配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸77-483、配列番号４に示すアミノ酸配列のアミノ酸64-471、および配列番号５に示すアミノ酸配列のアミノ酸74-481；またはその機能性断片もしくは変異体。
【０１１３】
本発明はまた、植物細胞に除草剤耐性を付与する方法に関する。その方法は、AHASLポリペプチドをコードする核酸配列に機能しうるように結合した、第１の植物の発現可能なプロモーターを含む第１の植物発現ベクター、ならびに本発明のAHASSポリペプチドをコードする核酸配列に機能しうるように結合した、第２の植物の発現可能なプロモーターを含む第２の植物発現ベクターを用いて、植物細胞を同時形質転換することを含む。好ましくは、AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、真核生物AHASLポリペプチドをコードする。ある実施形態において、AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、植物AHASLポリペプチドをコードする。別の実施形態において、AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物AHASLポリペプチドをコードする。さらに別の実施形態において、AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、AHASLポリペプチドをコードするが、このAHASLポリペプチドについてAHAS活性が本発明のAHASSポリペプチドによって高められることが知られている。
【０１１４】
本発明はさらに、AHASLポリペプチドをコードする遺伝子、またはその変異体、ミュータントもしくはバリアントを発現する、トランスジェニック植物の除草剤耐性を高める方法に関する。この方法は、トランスジェニック植物を、本発明のAHASSポリヌクレオチド分子で形質転換することを含む。好ましくは、このポリヌクレオチド分子は、植物において、または植物の少なくとも１つの細胞において、遺伝子発現を駆動する能力を有するプロモーターに、機能しうるように結合している。
【０１１５】
本発明はまた、除草剤抵抗性植物の後代植物において、除草剤抵抗性を高める方法を提供する。その方法は、遺伝的相補体が除草剤抵抗性真核生物AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むような植物を、本発明のAHASSポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換された植物と、体細胞もしくは生殖細胞により交雑すること、ならびに除草剤抵抗性の向上を示す後代植物について選択することを含む。ある実施形態において、選択された子孫は、本発明のAHASSポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を、安定にゲノムに組み込んで包含する。このような後代植物は、植物の野生型品種の除草剤抵抗性と比較すると、少なくとも１つの除草剤に対して向上した抵抗性を有する。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の方法によって作製されたトランスジェニック植物および後代植物を提供するが、その植物はAHAS酵素を阻害する除草剤に対する抵抗性の向上を示す。本発明の組成物および方法を用いて、任意のAHAS阻害剤群に対する、植物もしくは宿主細胞の抵抗性を高めることができる。このAHAS阻害剤群としては、イミダゾリノン系およびスルホニルウレア系：トリアゾロピリミジン系（クロランスラム-メチル、フロラスラム、ジクロスラム、メトスラム、フルメトスラム）；ピリミジニル（チオ）安息香酸系（ピリミノバック-メチル、ピリチオバック-Na、ピリフタリド、ピリベンゾキシム（pyribezoxim）、ビスピリバック-Na）；ならびに、スルホニルアミノ-カルボニルトリアゾリノン系（フルカルバゾン-Na、プロポキシカルバゾン-Na）が含まれるが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の除草剤は、イミダゾリノン系、スルホニルウレア系、クロランスラム-メチル、およびフロラスラムといった、農業で使用される除草剤である。本発明のある実施形態において、除草剤は、イミダゾリノン除草剤を含む市販の除草剤製品であり、Backdraft（商標名）、Beyond（商標名）Herbicide、Cadre（登録商標）、Extreme（登録商標）、Lightning（登録商標）Herbicide、Pursuit（登録商標）、Raptor（登録商標）、およびSceptor（登録商標）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１７】
本発明のある実施形態は、AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の使用に関する。このようなヌクレオチド配列は当技術分野で知られている。本発明は、特定のAHASLポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列に依存しないが、ただそうしたAHASLポリペプチドの活性は、本発明のAHASSポリペプチドによって強められ、高められる能力を有している。好ましくは、このヌクレオチド配列は、真核生物AHASLポリペプチドをコードする。さらに好ましくは、このヌクレオチド配列は、植物AHASLポリペプチドをコードする。AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列には、受託番号AAR06607.1（ヒメアマナズナ(Camelina microcarpa)）、AAK68759.1（シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、AAK50821.1（イガホビユ(Amaranthus powellii)）、CAA87083.1 （リクチワタ (Gossypium hirsutum)）、CAA87084.1 （リクチワタ(Gossypium hirsutum)）、CAA18088.1（ヒナゲシ(Papaver rhoeas)）、BAB20812.1（イネ(Oryza sativa)）、AAG40279.1（アメリカイヌホオズキ(Solanum ptycanthum)）、AAG53548.1（コムギ(Triticum aestivum)）、AAG53550.1（コムギ(Triticum aestivum)）、AAM03119.1（ウマノチャヒキ(Bromus tectorum)）、およびAAC14572.1（オオムギ(Hordeum vulgare)）に記載の配列が含まれる。
【０１１８】
本発明のAHASSポリヌクレオチドを、除草剤耐性植物の耐性を高める方法に使用することができる。詳細には、このような除草剤耐性植物は、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLポリペプチドを含む。こうした除草剤耐性植物には、除草剤耐性AHASLヌクレオチド配列で形質転換された植物、ならびに、除草剤耐性AHASLポリペプチドをコードする内在性遺伝子をゲノム内に含む植物が、ともに含まれる。除草剤耐性AHASLポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびに除草剤耐性AHASLポリペプチドをコードする内在性遺伝子を含む除草剤耐性植物は、当技術分野で知られている。たとえば、米国特許第5,013,659号、第5,731,180号、第5,767,361号、第5,545,822号、第5,736,629号、第5,773,703号、第5,773,704号、第5,952,553号、および第6,274,796号を参照されたい；これらはいずれも参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【０１１９】
多数の植物形質転換ベクター、および植物を形質転換する方法が利用可能である。たとえば、Anら、1986, Plant Pysiol., 81:301-305; Fryら、1987, Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, 1988, Theor. AppL Genet.76:767-774; Hincheeら、1990, Stadler. Genet. Symp. 203-212; Cousinsら、1991, Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; CheeおよびSlightom, 1992, Gene.118:255-260; Christouら、1992, Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluinら、1992, Bio/Technol. 10:309-314; Dhirら、1992, Plant Physiol. 99:81-88; Casasら、1993, Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, 1993, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Daviesら、1993, Plant Cell Rep. 12:180-183; DongおよびMchughen, 1993, Plant Sci. 91:139-148; FranklinおよびTrieu, 1993, Plant. Physiol. 102:167; Golovkinら、1993, Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asanoら、1994, Plant Cell Rep. 13; AyeresおよびPark, 1994, Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barceloら、1994, Plant. J. 5:583-592; Beckerら、1994, Plant. J. 5:299-307; Borkowskaら、1994, Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, 1994, Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapenら、(1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartmanら、(1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritalaら、1994, Plant. Mol. Biol. 24:317-325; ならびにWanおよびLemaux, 1994, Plant Physiol. 104:3748を参照されたい。
【０１２０】
本発明のある方法は、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入することに関する。本明細書で使用される場合、「導入」という用語は、植物にポリヌクレオチド構築物を付与することであって、その構築物が植物の細胞内部にアクセスするように付与することを意味する。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入する特定の方法に依存しないが、ただ、そのポリヌクレオチド構築物は植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスする。ポリヌクレオチド構築物を植物に導入する方法は、当技術分野で知られており、安定な形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルスによる方法を包含するがそれらに限定されない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「安定な形質転換」という用語は、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれうる形質転換法を表す。本明細書で使用される場合、「一過性形質転換」という用語は、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれない、形質転換法を表す。
【０１２２】
植物および植物細胞の形質転換のために、本発明のヌクレオチド配列は、標準的な技法によって、植物もしくは植物細胞におけるヌクレオチド配列の発現に適している、当技術分野で知られている任意のベクターに挿入される。ベクターの選択は、好ましい形質転換法、および形質転換されるべき標的植物の種類によって決まる。好ましい実施形態において、AHASSヌクレオチド配列は、植物細胞における高レベル発現で知られている植物プロモーターに、機能しうるように連結されており、この構築物はその後、ゲノム内に除草剤抵抗性AHASL対立遺伝子を含む植物に導入される。このような除草剤抵抗性AHASL対立遺伝子は、植物ゲノムにもともと備わっている、もしくは内在するものとすることができるが、当技術分野で知られている何らかの植物形質転換法によって植物ゲノムに導入されることもある。このように、除草剤抵抗性遺伝子（AHASL）の有効性は、この大サブユニットタンパク質の安定化もしくは活性化によって向上させることができる。この方法を、いかなる植物種にも適用することができる；しかしながら、作物、特に除草剤の存在下で通常は生長する作物に適用すると、もっとも有効である。
【０１２３】
植物発現カセットを構築し、外来核酸を植物に導入する方法は、当技術分野で広く知られており、すでに記述されている。たとえば、外来DNAは、腫瘍誘発（Ti）プラスミドベクターを用いて植物に導入することができる。外来DNAデリバリーに使用される他の方法は、PEGによるプロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、顕微注入ウィスカー、ならびにDNAの直接取り込みのための遺伝子銃もしくは微粒子銃の使用を包含する（たとえば、米国特許第5,405,765号、Vasilら; Bilangら、1991, Gene 100: 247-250; Scheid ら、1991, Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guercheら、1987, Plant Science 52: 111-116; Neuhauseら、1987, Theor. AppL Genet. 75: 30-36; Kleinら、1987, Nature 327: 70-73; Howellら、1980, Science 208:1265; Horschら、1985, Science 227: 1229-1231; DeBlockら、1989, Plant Physiology 91: 694-701; WeissbachおよびWeissbach編、1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc.；ならびにSchulerおよびZielinski編、1989, Methods in Plant Molecular Biology, Academic Press, Inc.を参照されたい）。形質転換の方法は、形質転換されるべき植物細胞、使用するベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベル、および他のパラメーターによって決まる。
【０１２４】
植物細胞にヌクレオチド配列を導入し、続いて植物ゲノムに挿入する、他の適当な方法には、マイクロインジェクション、Crosswayら(1986, Biotechniques 4:320 334)に記載；エレクトロポレーション、Riggsら(1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 5606,)に記載；アグロバクテリウム（Agrobacterium）による形質転換、Townsendら(米国特許第5,563,055号)およびZhaoら(米国特許第5,981,840号)に記載；遺伝子直接導入、Paszkowskiら(1984, EMBO J. 3:2717 2722)に記載；弾道粒子加速、たとえば、Sanfordら(米国特許第4,945,050号)、Tomesら(米国特許第5,879,918号)、Tomesら(米国特許第5,886,244号)、Bidneyら(米国特許第5,932,782号)、Tomesら(1995, “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, GamborgおよびPhillips編、Springer-Verlag, Berlin; McCabeら、1988, Biotechnology 6:923 926)に記載；ならびに、Lec1形質転換(国際公開第00/28058号)がある。またWeissingerら、1988, Ann. Rev. Genet. 22:421 477; Sanfordら、1987, Particulate Science and Technology 5:27 37 (タマネギ); Christou ら、1988, Plant Physiol. 87:671 674 (ダイズ); McCabeら、1988, Bio/Technology 6:923 926 (ダイズ); FinerおよびMcMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (ダイズ); Singhら、1998, Theor. Appl. Ge
net. 96:319-324 (ダイズ); Dattaら、1990, Biotechnology 8:736 740 (イネ); Kleinら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 4309 (トウモロコシ); Kleinら、1988, Biotechnology 6:559 563 (トウモロコシ); Tomes, 米国特許第5,240,855号; Buisingら、米国特許第5,322,783号および第5,324,646号; Tomesら、1995, “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Gamborg編、Springer-Verlag, Berlin, (トウモロコシ); Kleinら、1988, Plant Physiol. 91:440 444 (トウモロコシ); Frommら、1990, Biotechnology 8:833 839 (トウモロコシ); Hooykaas-Van Slogterenら、1984, Nature (London) 311:763-764; Bowenら、米国特許第 5,736,369号(穀物); Bytebierら、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (ユリ科); De Wetら、1985, The Experimental Manipulation of Ovule Tissuesより、Chapmanら編、Longman, NY, pp. 197-209 (花粉); Kaepplerら、1990, Plant Cell Reports 9:415-418 およびKaepplerら、1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (ウィスカーによる形質転換); D'Halluinら、1992, Plant Cell 4:1495-1505 (エレクトロポレーション); Liら、1993, Plant Cell Reports 12:250-255、ならびに、ChristouおよびFord, 1995, Annals of Botany 75:407-413 (イネ); Osjodaら、1996, Nature Biotechnology 14:745-750 (トウモロコシ、Agrobacterium tumefaciensによる)も参照されたい; これらはすべて参考として本明細書に含めるものとする。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、植物をウイルスもしくはウイルス核酸と接触させることによって植物に導入することもできる。一般に、こうした方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物をウイルスDNAもしくはRNA分子内に組み込むことを包含する。本発明のAHASSポリペプチドを最初にウイルスポリタンパク質の一部として合成し、後に、in vivoもしくはin vitroでタンパク質加水分解によって処理して、望ましい組換えAHASSポリペプチドを作製することができることが認められている。ポリヌクレオチド構築物を植物に導入して、それにコードされたタンパク質を発現させる方法であって、ウイルスDNAもしくはRNA分子の関与する方法は、当技術分野で知られている（たとえば、米国特許第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号および第5,316,931号を参照されたい；参考として本明細書に含めるものとする）。
【０１２６】
AHASSポリヌクレオチドが導入されている本発明の細胞を、従来の方法にしたがって、植物体に生長させることができる（たとえば、McCormickら、1986, Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい）。その後これらの植物を生長させて、同一の形質転換株、もしくは異なる株と受粉させ、その結果得られた、望ましい表現形質の構成的発現を示す雑種を同定することができる。２世代以上生育させて、望ましい表現形質の発現が安定して維持され、受け継がれることを確認することができるが、さらにその後、種子を収穫して、望ましい表現形質の発現が達成されたことを確認することができる。このように、本発明は、本発明のAHASSポリヌクレオチド構築物を有する、形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。ある実施形態において、本発明のAHASSポリヌクレオチドは、植物ゲノムに安定して組み込まれる。
【０１２７】
本発明は、単子葉植物および双子葉植物を含めて、いかなる種類の植物の形質転換にも使用することができるが、それらに限定されない。対象となる植物種の例としては、コーンもしくはトウモロコシ（Zea mays）、アブラナ属エスピー(sp.)（たとえば、セイヨウアブラナ（B. napus）、アブラナ（B. rapa）、カラシナ（B. juncea））、特に種子油の起源として有用なアブラナ属植物、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor, Sorghum vulgare）、雑穀（たとえば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana））、ヒマワリ（Helianthus annuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、コムギ（Triticum aestivum, T. turgidum ssp. durum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒーノキ（Coffea spp.）、ココナツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、柑橘類（Citrus spp.）、カカオノキ（Theobroma cacao）、チャノキ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、バンジロウ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum spp.）、エンバク、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の植物は作物（たとえば、トウモロコシ、イネ、コムギ、テンサイ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、モロコシ、雑穀、タバコなど）、好ましくは穀物植物（たとえば、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、モロコシ、ライムギ、ライコムギなど）、さらに好ましくはトウモロコシ、イネ、およびコムギ植物である。
【０１２８】
やはり当然のことながら、前記は、本発明の好ましい実施形態に関するものであって、本発明の範囲から逸脱することなく、その中で多くの変更を行うことができる。本発明は下記の実施例によってさらに説明されるが、実施例は決して、その範囲に限定を課すものと解釈されるべきではない。それとは反対に、明らかに当然のことであるが、さまざまな他の実施形態、変形、およびそれと均等のことを手段として用いることができるが、それは、本明細書の記述を読んだ後に、本発明の思想および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者に示唆されるべきものである。
【実施例】
【０１２９】
＜実施例１＞
トウモロコシ、イネ、およびコムギ由来の全長AHASSヌクレオチド配列の同定
トウモロコシの葉組織（品種3394）から、Concert（登録商標）植物RNA抽出溶液（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA）を用いて全RNAを抽出した。この全RNAプールは、InvitrogenのGene Racer (RLM-RACE)キットにより第１のストランドcDNAライブラリを作製するためのRNA源となった。RACE(rapid amplification of cDNA ends)法に使用されるプライマーは、全長に満たないパブリックドメインcDNA配列（ZmAHASS1a: 受託番号AY105043）の5'領域を標的としてデザインされた。この部分配列は、cDNAのORFを破壊する配列エラーを有する。翻訳されたAHASS1 cDNAと、ZmAHASS1a cDNA部分配列との配列比較は、フレームシフトを引き起こす可能性のある塩基を示唆した。しかしながら、実験によって生成された全長cDNAが得られるまで、フレームシフトを起こす塩基の特定は確実ではなかった。ZmAHASS1aの5' RACE法に使用したプライマーは下記のとおりである：
TTCACAAGGATGGAGAGAAGTATGCGAGCGA        gjb 17 (配列番号6)
ACATCACCCCCAGCATTGGATGGTTGA            gjb 18 (配列番号7)
AAGCAGCAGAAAATCGCCAGAAACGGG            gjb 42 (配列番号8)
AACGCCTCTATCAGGTCTGGGTAAG              gjb 43 (配列番号9).
5' RACE産物を、Promega製 pGem T-Easyクローニングキットを用いて、TAクローニングした。４つの別個のプラスミドクローンを配列決定し、決定されたヌクレオチド配列は、cDNA ZmAHASS1aの実験上の開始コドンを決定した。実験的に生成した開始コドンを、終止コドンを指定する公開の部分配列と併せて使用して、全長cDNA増幅のためのプライマーをデザインした。PCRを行って、上記植物組織に由来する第１のストランドcDNAライブラリからZmAHASS1a cDNAを増幅した。4回の別個のcDNA反応のプールから得られた23個の独立したクローンを配列決定し、解析して、ZmAHAS1aの実験上のcDNA配列を確認し、公表されたcDNA部分配列AY105043におけるフレームシフトシークエンシングエラーの所在を確認した。
【０１３０】
それぞれ配列番号１および３の、トウモロコシおよびコムギAHASヌクレオチド配列に対応する発現遺伝子配列断片（EST）を、既知のAHASSヌクレオチド配列に対する同一性に基づく、独自のESTデータベースで同定した。次に、RACE法、特に5'-RACE法を用いて、トウモロコシの全長cDNAクローンが得られた（Frohmanら、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002）。その結果得られたcDNAを配列決定し、配列番号１に示すヌクレオチド配列がもたらされた。
【０１３１】
コムギのアミノ酸配列（配列番号５）は、いくつかの重複した縮重EST（ヌクレオチド配列は示さない）のヌクレオチド配列の推定アミノ酸配列から導かれた。コンティグc5532171を、６つの独自のコムギEST、およびGenBank寄託の２つの部分配列（gi2139744およびgi21319X）からアセンブルした。Contig Express (Informax, Inc., North Bethesda, MD, USA)を使用して、元の独自のESTから上記のアセンブリーを反復した。得られたアセンブリーは遺伝子全体に及ぶものであったが、多数の多型を含有した。これは、おそらくコムギの３つの相同遺伝子間の差異を表す。したがって、重複部分に100%の同一性は存在しなかった。次に、推定アミノ酸配列（コンセンサスを示す）をZmAHASS1aおよびOsAHASS1から得られた配列、ならびに他の公開された配列とアラインして、コンセンサス配列について、使用された元のヌクレオチド配列を調べることによって、「予想外の」配列をそれぞれチェックした。
【０１３２】
２つの公開されたEST（受託番号：AU064546およびAU166867）、ならびに１つの独自コンティグから、イネ全長AHASS cDNAをアセンブルした。イネAHASSのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。本発明のイネAHASSヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、TIGR (The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850; online at www.tigr.org)から入手できるOsAHASS1ゲノムDNAのアノテーションと比較した。OsAHASS1ゲノムDNAのアノテーションに対するTIGRレファレンス番号は、TIGR遺伝子temp id: 8351.t03738および8351.t03738である。しかしながら、このアノテーションは、本発明のイネ全長AHASSヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）配列と同一ではなかった。ヌクレオチドレベルでは、アノテーションと配列番号３の間には２つのエクソンの相違がある。アミノ酸レベルでの相違は、図５で与えられるアラインメントに示す。
【０１３３】
＜実施例２＞
トウモロコシ、イネおよびコムギのAHASSタンパク質
本発明の、トウモロコシ、イネ、およびコムギAHASSタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４および５に示す。本発明のアミノ酸配列と、他の既知の植物AHASSアミノ酸配列との比較から、葉緑体輸送ペプチドの位置が、本発明のアミノ酸配列のそれぞれについて決定された。トウモロコシAHASSタンパク質については、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号２のアミノ酸1-76に相当し、成熟タンパク質はアミノ酸77-483に相当する。イネAHASSタンパク質については、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号４のアミノ酸1-73に相当し、成熟タンパク質はアミノ酸74-481に相当する。コムギAHASSタンパク質については、葉緑体輸送ペプチドは、配列番号５のアミノ酸1-63に相当し、成熟タンパク質はアミノ酸64-471に相当する。
【０１３４】
本発明の成熟AHASSタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントは、図１に与えられる。本発明の３つのAHASSタンパク質はそれぞれ、ドメイン１およびドメイン２と称される２つの保存ドメインを含有するが、これらは可変リンカー領域で隔てられている。
【０１３５】
本発明のアミノ酸配列を、他の既知の植物AHASSアミノ酸配列と比較した。図２は、本発明の成熟AHASSタンパク質と、既知の植物由来成熟AHASSタンパク質の、ペアワイズ比較から得られたアミノ酸配列同一性を示す。図３および４は、それぞれドメイン１および２の同様の比較結果を示す。
【０１３６】
本明細書で言及された刊行物および特許出願はいずれも、本発明の属する技術分野の当業者の水準を示す。刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物および特許出願が参考として含められることが具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参考として本明細書に含められるものとする。上記発明は、明確な理解のために、説明および例示の目的である程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で一定の変更および変形を行うことができることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、本発明の成熟AHASSポリペプチドのアミノ酸配列アラインメントである：ZmAHASS1a (配列番号２の残基77-483)、OsAHASS1 (配列番号４の残基74-481)、およびTaAHASS1X (配列番号５の残基64-471)。上記の推定アミノ酸配列（推定される可変葉緑体輸送ペプチドをマイナスした）を、Clustal X バージョン1.81、Multiple Alignment Modeを用いてアラインした。デフォルトパラメーターを用いて、完全なアラインメントを繰り返し行った（少なくとも３回）。“*”は、すべての配列でアミノ酸が同一であることを示す。“:”および“.”は、保存性の減少する置換である。保存されたドメイン１およびドメイン２領域は太字で示す。ドメイン１はN末端側、ドメイン２はC末端側である。介在する可変リンカー領域があり、ドメイン１と２の間に位置している。
【図２】図２は、成熟AHASSポリペプチドのペアワイズ比較による、アミノ酸同一性パーセントを示す。比較は、公に知られている植物AHASS配列のすべて、ならびに、ZmAHASS1a (配列番号２)、OsAHASS1 (配列番号４)、およびTaAHASS1X (配列番号５)に対する本発明のアミノ酸配列を含む。すべての公表された遺伝子コード配列から推定されるアミノ酸配列、および他の推定全長配列を、ClustalWアルゴリズムを用いてアラインした。対ごとの相違を、このアラインメントに基づいて計算した。データは、２つの配列間のパーセント配列同一性の形式で与えられる。命名法：“GmAHASS1”は、ダイズ（Glycine max）AHAS小サブユニットサブタイプ１（米国特許出願公開第2001/00044039A1号の配列番号18）を表す；“NpAHASS1”は、Nicotiana plumbaginifolia AHAS小サブユニットサブタイプ１（受託番号AJ234901.1）を表す；“ZmAHASS2”は、トウモロコシ（Zea mays）AHAS小サブユニットサブタイプ２（米国特許出願公開第2001/00044039A1号の配列番号10）を表す；“OsAHASS2”は、イネ（Oryza sativa）AHAS小サブユニットサブタイプ２（米国特許出願公開第2001/00044039A1号の配列番号16）を表す；“AtAHASS1”は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）AHAS小サブユニットサブタイプ１（NM_179843.1）を表す；ならびに、“AtAHASS2”は、シロイヌナズナAHAS小サブユニットサブタイプ２（NM_121634.2）を表す
【図３】図３は、AHASSポリペプチドのドメイン１のペアワイズ比較による、アミノ酸同一性のパーセントを示す。比較は、公に知られている植物AHASS配列のすべて、ならびに、ZmAHASS1a (配列番号２)、OsAHASS1 (配列番号４)、およびTaAHASS1X (配列番号５)に対する本発明のアミノ酸配列に由来するドメイン１を包含する。アミノ酸配列の命名法、およびアミノ酸同一性パーセントは、配列同一性パーセントを決定する際にドメイン１に相当するアミノ酸配列のみを使用した以外は、図２について上記で説明したとおりである。
【図４】図４は、AHASSポリペプチドのドメイン２のペアワイズ比較による、アミノ酸同一性のパーセントを示す。比較は、公に知られている植物AHASS配列のすべて、ならびに、ZmAHASS1a (配列番号２)、OsAHASS1 (配列番号４)、およびTaAHASS1X (配列番号５)に対する本発明のアミノ酸配列に由来するドメイン２を包含する。アミノ酸配列の命名法、およびアミノ酸同一性パーセントは、配列同一性パーセントを決定する際にドメイン２に相当するアミノ酸配列のみを使用した以外は、図２について上記で説明したとおりである。ドメイン１および２は、既知のAHASSポリペプチドのアミノ酸配列から、経験的に決定された。各ドメインはACTドメインを含有する。既知の植物AHASSポリペプチドは、細菌様AHASSポリペプチドの２つのリピートを有する。太古の重複の結果である可能性にもかかわらず、「リピート」は現在、互いに完全に異なるものであり、本明細書ではドメイン１および２と称される。
【図５】図５は、OsAHASS1（SEQ ID NO(配列番号)４）のアミノ酸配列、およびThe Institute for Genomic Research (TIGR)から入手できるOsAHASS1ゲノムDNAのアノテーションの翻訳（配列番号１２）のアラインメントを与える。２つのアミノ酸配列の対応する位置で、同一であるアミノ酸を影付きで示す。コンセンサス配列も与えられる。
【図６】図６は、全長OsAHASS1ヌクレオチド配列（配列番号３）の構築に使用した、２つのESTおよび１つの独自コンティグ(contig)のアラインメント、ならびに重複領域を表す。
【図１】
2008508884.tif 000003
【図２】
2008508884.tif 000004
【図３】
2008508884.tif 000005
【図４】
2008508884.tif 000006
【図５】
2008508884.tif 000007
【図６】
2008508884.tif 000008
【配列表】
2008508884000001.app
【国際調査報告】
2008508884.tif 000009
2008508884.tif 000010
2008508884.tif 000011
2008508884.tif 000012