(57)【要約】本発明は、磁気共鳴に基づくセンサおよび関連する方法に関する。より詳細には、本発明は、試料溶液中の分析物の存在の検出するための磁気共鳴に基づくセンサに関する。センサは、分析物が可逆的に結合することができる部分に結び付けられた磁気ナノ粒子を備え、同ナノ粒子は、ナノ粒子に対して不透過であるが分析物を透過させる半透性の壁を備えたチャンバに閉じ込められている。分析物をナノ粒子に結合する際、ナノ粒子は凝集し、これがチャンバ内の試料溶液のＴ２緩和時間の変化により検出される（磁気緩和スイッチ）。分析物は、グルコース等の炭水化物、抗体、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、治療薬、ペプチド、タンパク質、等であり得る。センサはアッセイとして使用されてもよく、ハイスループット分析のためのウェルプレート等のＭＲＳまたはＭＲＩを使用して読み取られ得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物の存在を検出するための水の緩和に基づくセンサであって、
（ｉ）チャンバを包囲し、分析物をチャンバの内外に通過させる開口部を備えた囲い壁と；
（ｉｉ）各ナノ粒子が該ナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられた少なくとも１つの部分を有する、チャンバ内にある複数の磁気ナノ粒子と；
任意選択で、
（ｉｉｉ）チャンバ内にある少なくとも１つの結合剤と；
を備え、
開口部はナノ粒子よりサイズが小さいが分析物よりサイズが大きく；かつ
前記部分および前記分析物は各々結合剤（存在する場合）に可逆的に結合するか、または、前記分析物が前記部分に可逆的に結合する；
センサ。
【請求項２】
開口部は結合剤よりサイズが小さい請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記壁は分析物をチャンバの内外に通過させる複数の開口部を備え、各開口部はナノ粒子と結合剤よりもサイズが小さく、各開口部は分析物よりもサイズが大きい請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記部分は炭水化物、抗体、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、治療薬またはそれ代謝物質、ペプチド、またはタンパク質を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記部分は検出される分析物の分子断片、または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項６】
前記部分は−ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）、−（Ｏ）ＣＮＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、または−ＳＳ−を含む官能基によりナノ粒子に結び付けられ、ｎは０〜２０である請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記官能基は−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−である請求項６に記載のセンサ。
【請求項８】
ｎは２である請求項７に記載のセンサ。
【請求項９】
結合剤が存在しない請求項１に記載のセンサ。
【請求項１０】
前記部分がタンパク質を含む請求項９に記載のセンサ。
【請求項１１】
（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、チャンバは前記部分によって外来分析物に結合されたナノ粒子を備えたナノ粒子凝集物を含む請求項９に記載のセンサ。
【請求項１２】
結合剤が存在する請求項１に記載のセンサ。
【請求項１３】
結合剤がタンパク質またはモノクローナル抗体を含む請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１４】
前記部分は検出される分析物の分子断片、または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片を含む請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１５】
（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは部分によって結合剤に結合されたナノ粒子を備えたナノ粒子凝集物を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、ナノ粒子は結合剤から分析物により置換され、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含む請求項１２に記載のセンサ。
【請求項１６】
前記開口部が約１ｋＤａから約３ｋＤａまでのサイズを有する請求項１に記載のセンサ。
【請求項１７】
ナノ粒子の各々は約３０ｎｍから約６０ｎｍまでの全体のサイズを有する請求項１に記載のセンサ。
【請求項１８】
ナノ粒子凝集物は少なくとも約１００ｎｍの全体のサイズを有する請求項１１または１５に記載のセンサ。
【請求項１９】
（ａ）と（ｂ）の間のナノ粒子凝集の変化でチャンバ内部の水のプロトン緩和は変更されるが、チャンバ外部の水のプロトン緩和は実質的に変更されない請求項１１または１５に記載のセンサ。
【請求項２０】
（ａ）と（ｂ）の間のナノ粒子凝集の変化でチャンバ内部の水のＴ２緩和時間の測定可能な変化が生じる請求項１９に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記部分はキラル化合物を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項２２】
前記部分は炭水化物を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項２３】
前記部分は以下の構造を含む請求項１に記載のセンサ。
【化１】
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【請求項２４】
前記結合剤は少なくとも２つの結合部位を含むタンパク質である請求項１に記載のセンサ。
【請求項２５】
前記結合剤は少なくとも４つの結合部位を含むタンパク質である請求項１に記載のセンサ。
【請求項２６】
前記結合剤は炭水化物に結合するタンパク質である請求項１に記載のセンサ。
【請求項２７】
前記炭水化物はグルコースである請求項２６に記載のセンサ。
【請求項２８】
前記タンパク質はコンカナバリンＡである請求項２７に記載のセンサ。
【請求項２９】
前記結合剤はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはオリゴヌクレオチドを含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項３０】
各磁気ナノ粒子が磁気金属酸化物を含む請求項１に記載のセンサ。
【請求項３１】
前記磁気金属酸化物は超常磁性金属酸化物を含む請求項３０に記載のセンサ。
【請求項３２】
金属酸化物は酸化鉄を含む請求項３０に記載のセンサ。
【請求項３３】
各磁気ナノ粒子は、アミノ誘導体化された架橋酸化鉄ナノ粒子である請求項３２に記載のセンサ。
【請求項３４】
ナノ粒子が実質的に凝集している請求項１に記載のセンサ。
【請求項３５】
水性試料中の分析物を検出する方法であって、
（ｉ）請求項１に記載のセンサを提供すること；
（ｉｉ）分析物が存在しないかまたは分析物の不存在を模倣した条件でセンサのチャンバ内部の水の緩和時間を測定すること；
（ｉｉｉ）センサを試料と接触させること；
（ｉｖ）センサのチャンバ内部の水の緩和時間を測定すること；
および
（ｖ）  工程（ｉｉ）と工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間を比較すること；
からなり、工程（ｉｉ）で測定されたＴ２緩和時間に対する工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間の変化が分析物の存在を示す、方法。
【請求項３６】
前記分析物が１価の分析物である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析物は多価の分析物である請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔ２緩和時間の変化が磁気共鳴映像法を使用して測定される請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｔ２緩和時間の変化が磁気共鳴非映像法を使用して測定される請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記分析物が炭水化物である請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記分析物がグルコースである請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記分析物がキラルである請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記キラル分析物が試料中の１または複数の光学活性部分と共に存在する請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記キラル分析物が試料中のキラル分析物の立体異性体と共に存在する請求項４３に記載
の方法。
【請求項４５】
前記キラル分析物が試料中のキラル分析物の対掌体と共に存在する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記キラル分析物はアミノ酸である請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記分析物は核酸またはオリゴヌクレオチドである請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記分析物は治療薬または治療薬の代謝物質である請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記分析物はペプチドまたはタンパク質である請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｉｉ）および（ｉｖ）がＴ２緩和時間を測定することを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ｉｉ）で測定されたＴ２緩和時間に対する工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間の増加が分析物の存在を示す請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は磁気共鳴に基づくセンサおよび関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）等の磁気共鳴（ＭＲ）に基づくレポート法は、非侵襲的方法として既知の利点を有している。例えばＭＲＩは、組織による光の散乱および吸収により光学的レポート法が複雑になる組織深さ（例えば約２５０μｍよりも大きな組織深さ）で使用することができる。
【０００３】
医学におけるナノテクノロジーの１つの応用例は、環境に対して高い感度なセンサおよび分子イメージング剤としての生体適合ナノ物質の開発である。分離と抽出のために設計された磁性粒子の調製物は、弱い印加磁場による操作が容易な粒子を使用する。これらの材料は通常マイクロメートルのサイズであり、一粒子当たりの磁気モーメントが高い。しかしながら、ナノ粒子は手持ち形磁石の弱い磁場には応答しない。
（発明の開示）
本発明は、一般に磁気共鳴に基づくセンサ（例えば水緩和および平衡に基づくセンサ）およびその関連方法に関し、半透性の囲いの中に磁気ナノ粒子が封入されたセンサを水性試料（例えば含水試料）中の種々の分析物の検出用の遠隔センサとして使用することができ、また、分析物のレベルの変化を連続的にモニタするために使用することができるという知見に一部基づいている。
【０００４】
その最も広い態様では、発明は、試料中の分析物の存在を検出するための水の緩和に基づくセンサを提供する。センサは、分析物（例えば半透膜）への入口の開口部を画成する囲いと、その囲いの中に閉じ込められた複数のナノ粒子とを備えている。ナノ粒子は水性液相に懸濁されているかまたは懸濁可能であり、磁気モーメントを有しており（例えば結晶性の酸化鉄または他の磁性体を含む）、囲いの中の分析物の存在または濃度の関数としてナノ粒子の凝集状態を変更するよう選択された１または複数の部分に共有結合または非共有結合で結び付けられるか、または別な方法で同部分に固定される。
【０００５】
１態様では、本発明は、試料中の分析物（例えば外来分析物）の存在を検出するための水の緩和に基づくセンサをその特徴とする。センサは、（ｉ）チャンバを包囲し、分析物をチャンバの内外に通過させる１または複数の開口部（例えば一つの開口部または複数の開口部）を備えた囲い壁と；（ｉｉ）各々がナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられた（固定される）少なくとも１つの部分を有する、チャンバ内にある複数の磁気ナノ粒子と；任意選択で、（ｉｉｉ）チャンバ内にある少なくとも１つの結合剤と：を備え、開口部はナノ粒子および結合剤よりサイズが小さいが分析物よりサイズが大きく；かつ、上記部分および分析物は各々結合剤（存在する場合）に可逆的に結合するか、または、分析物は上記部分に可逆的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子に結び付けられた時に結合剤がチャンバ内に残る限り、開口部は結合剤より大きい。
【０００６】
実施形態は以下の１または複数の特徴を含み得る。
ナノ粒子は水性液相に懸濁されるかまたは懸濁可能である。ナノ粒子は、通常または特定条件下で、磁気モーメントを有し得る。
【０００７】
壁は１つよりも多くの開口部を備えてもよい。壁が１つよりも多い開口部（例えば複数の開口部）を備える場合、その開口部の少なくとも１つはナノ粒子および任意選択で結合剤よりもサイズが小さく、分析物よりサイズが大きい。特定の実施形態では、壁は複数の
開口部を備え、各開口部はナノ粒子と結合剤よりサイズが小さく、各開口部は分析物よりサイズが大きい。
【０００８】
上記部分は、囲いの中の分析物の存在または濃度の関数としてナノ粒子の凝集状態を変更するために選択することができる。
そのいくつかの代替実施形態では、センサは種々の検出形式を利用することが可能である。例えば、上記部分は、分析物に結合して囲いの中の分析物の存在または濃度の関数として複数の結び付けられたナノ粒子凝集物を生成するよう選択され得る。センサは複数の結び付けられたナノ粒子の凝集物を含んでもよく、それらは囲いの中の分析物の存在または濃度の関数としてばらばらに分離される。上記部分は分析物の基準試料の断片であってもよいし、またはその構造模倣体であってもよいし、その場合センサはさらに、分析物および模倣体（使用された場合）に結合して複数の結び付けられたナノ粒子からなる複数の凝集物を生成する多価結合剤を備える。センサはさらに、上記部分に結合して凝集物を生成する多価結合剤を備えてもよい。センサはまた、分析物の存在下で部分に結合して凝集物を分離させる結合剤をさらに備えてもよい。さらに別の形式では、センサは、分析物の存在下で部分に結合して凝集物を生成する結合剤を備えてもよい。１実施形態では、センサは囲いの中に閉じ込められた複数の凝集物をさらに備える。別の実施形態では、センサは、囲いの内部と連通する試料の流路を有する。したがって、試料は囲いの中へまたは囲いの内外に流れ、分析物の周期的なサンプリングを可能にする。
【０００９】
いくつかの実施形態では、センサは上記の特徴（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を有し、上記部分は、検出される分析物の分子断片または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片であるか、またはその化学構造の一部として同分子断片を含み；結合剤はタンパク質を含み得る。分析物が存在しない場合、チャンバは１または複数のナノ粒子凝集物を含んでもよい。ナノ粒子凝集物の各々は、１または複数のナノ粒子と、結合剤とを含むことができる。ナノ粒子凝集物の形成は、ナノ粒子上の部分の結合剤（例えば結合剤は、同部分による結合のために認識される１または複数の結合部位を含み得る）への結合を通じて起こり得る。
【００１０】
分析物が存在する場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含んでよい。分析物は、存在する場合、ナノ粒子共役体からナノ粒子を置換させることができ、それにより実質的にばらばらに分離されたナノ粒子（例えば分析物と上記部分は、分析物とナノ粒子が結合剤と結合するよう競争し、分析物（存在する場合）が凝集物中の結合剤からナノ粒子を置換させてばらばらに分離されたナノ粒子を提供するよう、選択することが可能である）を提供することができる。
【００１１】
特定の実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバはナノ粒子凝集物を含み、ナノ粒子凝集物は上記部分によって結合剤に結合されたナノ粒子凝集物を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、ナノ粒子は分析物によって結合剤から置換され、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含む。含水液体媒体の存在下、ナノ粒子凝集の変化（ナノ粒子凝集物から実質的にばらばらに分離されたナノ粒子への変化ならびにその逆の変化。例えば上記の（ａ）と（ｂ）の間の差）は、チャンバ内の水のプロトン緩和を変化させるが、チャンバ外の水のプロトン緩和を実質的に変化させない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、センサは上記の特徴（ｉ）および（ｉｉ）を有するが、特徴（ｉｉｉ）は有さず、上記部分はタンパク質であるか、またはその化学構造の一部としてタンパク質を含み得る。分析物が存在しない場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含み得る。分析物が存在する場合、チャンバは１または複数のナノ粒子凝集物を含み得る。ナノ粒子凝集物の各々は１または複数のナノ粒子および分析物を含んでよい。ナノ粒子凝集物の形成は、ナノ粒子上の部分への（例えば部分は、分析物による結
合のために認識される１または複数の結合部位を含み得る）分析物の結合を通じて起こり得る。
【００１３】
特定の実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、チャンバは前記部分によって分析物に結合されるナノ粒子を含むナノ粒子凝集物を含む。含水液体媒体の存在下で、ナノ粒子凝集の変化（ナノ粒子凝集物から実質的にばらばらに分離されたナノ粒子への変化およびその逆の変化。例えば（ａ）と（ｂ）の間の差）は、チャンバ内の水のプロトン緩和を変化させるが、チャンバ外の水のプロトン緩和を実質的に変化させない。
【００１４】
１態様では、本発明は、水性試料中の分析物を検出する（例えば試料流れの中の分析物の存在または濃度をモニタする）方法をその特徴とし、方法は、（ｉ）本明細書に記載のセンサを提供すること；（ｉｉ）分析物が存在しないかまたは分析物の不存在を模倣した条件でセンサのチャンバ内部の水の緩和時間（例えばＴ２またはＴ１緩和時間）を測定すること；（ｉｉｉ）センサを試料と接触させること（例えばナノ粒子は水性液相に懸濁されているか懸濁可能であり、磁気モーメントをも有し得る）；（ｉｖ）センサのチャンバ内部の水の緩和時間（例えばＴ２またはＴ１緩和時間）を測定すること；および（ｖ）工程（ｉｉ）と工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間を比較すること；からなり、工程（ｉｉ）で測定されたＴ２緩和時間に対する工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間の変化（例えば増加または減少）が分析物の存在を示す。
【００１５】
例えば、囲いへ試料流れを流入させ、試料中の分析物によってナノ粒子（例えば懸濁されたナノ粒子）の凝集状態を変化させ、ナノ粒子に隣接して位置する水プロトンの磁気共鳴緩和能の摂動を測定することが可能である。これらの工程を繰り返し、流れ中の分析物の濃度の一時的プロフィールを得ることができる。
【００１６】
実施形態は以下の１または複数の特徴を含み得る。
ナノ粒子は水性液相に懸濁されるかまたは懸濁可能である。ナノ粒子は、磁気モーメントを有し得る。
【００１７】
壁は１つよりも多くの開口部を備えてもよい。壁が１つよりも多い開口部（例えば複数の開口部）を備える場合、その開口部の少なくとも１つはナノ粒子と結合剤よりもサイズが小さく、分析物よりサイズが大きい。特定の実施形態では、壁は複数の開口部を備え、各開口部はナノ粒子と結合剤よりサイズが小さく、各開口部は分析物よりサイズが大きい。
【００１８】
上記部分は、囲いの中の分析物の存在または濃度の関数としてナノ粒子の凝集状態を変更するために選択することができる。上記部分と分析物は、各々結合剤（存在する場合）に可逆的に結合してもよいし、または分析物が部分に可逆的に結合してもよい。分析物は一価分析物であっても多価分析物であってもよい。
【００１９】
上記部分は、炭水化物、抗体、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、治療薬もしくはその代謝物質、ペプチド、またはタンパク質であるか、またはその構造の一部としてそれらの物質を含み得る。上記部分は、共有結合または非共有結合で結び付けられた分析物（例えば結びつけられた分析物または結びつけられた結合タンパク質と称されることもある検出される分析物）、共有結合または非共有結合で結び付けられた分析物誘導体、または共有結合または非共有結合で結び付けられた分析物アイソスターもしくは模倣体（例えば検出される分析物の誘導体、アイソスター、または模倣体）であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、上記部分は、検出される分析物の分子断片または検出される
分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片であるか、またはその化学構造の一部として同分子断片を含み得る。
【００２１】
本明細書に使用する場合、「検出される分析物の分子断片」を含む部分（または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片を含む部分）は、検出される分析物（またはその誘導体、アイソスター、もしくは模倣体）の化学構造の一部分（例えば本質的部分）が、同部分の化学構造に組み込まれたものである。これらの実施形態では、ナノ粒子は一般式（Ａ）：（Ａ）Z−ＮＰcを有し、「Ａ」は分析物Ａ−Ｘの分子断片であり、Ｘは分析物中に存在するが式（Ａ）のナノ粒子に組み込まれない水素原子または官能基であり；「ＮＰc」はナノ粒子のコアであり、「−」は分子断片の任意の原子を
ナノ粒子に接続する共有結合（例えば化学結合またはリンキング官能基）であり；ｚは１−５０（例えば１−４０、１−３０、１−２５、１−２０、２−２０）である。また、上式の「Ａ」は検出される分析物の誘導体、アイソスター、または模倣分子の分子断片であってもよい。
【００２２】
上記部分はタンパク質または核酸であってもよい。
結合剤はなくてもよい。上記部分は、タンパク質であるか、その構造の一部としてタンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、チャンバは１または複数のナノ粒子凝集物を含み得る。ナノ粒子凝集物の各々は、１または複数のナノ粒子と、分析物とを含み得る。ナノ粒子凝集物の形成は、ナノ粒子上の部分（例えば同部分は、分析物による結合のために認識される１または複数の結合部位を含み得る）への分析物の結合を通じて起こり得る。
【００２３】
いくつかの実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、チャンバは同部分によって分析物に結合されたナノ粒子を備えたナノ粒子凝集物を含む。
【００２４】
結合剤は存在してもよく、それは例えばタンパク質またはモノクローナル抗体であり得る。部分は、検出される分析物の分子断片または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片であるか、またはその化学構造の一部として同分子断片を含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバは１または複数のナノ粒子凝集物を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含む。ナノ粒子凝集物の各々は、１または複数のナノ粒子と、結合剤とを含み得る。ナノ粒子凝集物の形成は、ナノ粒子上の部分の結合剤（例えば結合剤は、同部分の化学構造の全部または一部として存在する化学基による結合のために認識される１または複数の結合部位を含み得る）への結合を通じて起こり得る。分析物、存在する場合、ナノ粒子共役体からナノ粒子を置換させることができ、それにより実質的にばらばらに分離されたナノ粒子（例えば分析物とナノ粒子の置換基は、分析物とナノ粒子部分が結合剤と結合するよう競争し、分析物（存在する場合）が凝集物中の結合剤からナノ粒子を置換させてばらばらに分離されたナノ粒子を提供するよう、選択することが可能である）を提供することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、（ａ）分析物が存在しない場合、チャンバはナノ粒子凝集物を含み、ナノ粒子凝集物は上記部分によって結合剤に結合されたナノ粒子凝集物を含み、（ｂ）分析物が存在する場合、ナノ粒子は分析物によって結合剤から置換され、チャンバは実質的にばらばらに分離されたナノ粒子を含む。（ａ）と（ｂ）の間のナノ粒子凝集の変化は、チャンバ内の水のプロトン緩和を変化させるが、チャンバ外の水のプロトン緩和
を実質的に変化させない。
【００２７】
（ａ）と（ｂ）の間のナノ粒子凝集の変化は、チャンバ内部の水のＴ２緩和時間の測定可能な変化を生じさせ、このＴ２緩和時間の変化は磁気共鳴映像法または非映像法を使用して、測定可能である。
【００２８】
上記部分は、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−（Ｏ）ＣＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）、−（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、または−ＳＳ−等の官能基によりナノ粒子にリンクさせることができる。ｎは０−２０であってよく、例えば２、５、１０、または１５である。各開口部はサイズ（孔径）を有し、約１ｋＤａから約１μｍ（例えば約１ｋＤａから約３００，０００ｋＤａまで；約１ｋＤａから約１００，０００ｋＤａまで；約１ｋＤａから約５ｋＤａまで；約１ｋＤａから約３ｋＤａまで；約１ｋＤａから約１μｍまで）である。
【００２９】
各ナノ粒子は約１０ｎｍから約５００ｎｍ（例えば約１０ｎｍから約６０ｎｍまで、約３０ｎｍから約６０ｎｍまで）の粒径または全体サイズを有する。全体サイズは粒子の最大の寸法である。ナノ粒子凝集物は、少なくとも約１００ｎｍの全体サイズ（粒径）を有し得る。ナノ粒子は実質的に凝集されていてもよいし（例えば１または複数のナノ粒子凝集物を含む）、実質的にばらばらに分離されていてもよい。分析物は炭水化物（例えばグルコース）であってよい。
【００３０】
分析物はキラルであってよい。キラル分析物は、試料中の１または複数の光学活性部分と共に存在し得る。キラル分析物は、試料中のキラル分析物の立体異性体と共に存在することができる。キラル分析物は、試料中のキラル分析物の対掌体と共に存在することができる。キラルの外来分析物はアミノ酸であってよい。
【００３１】
分析物は核酸またはオリゴヌクレオチドであってもよい。
分析物は、本明細書に使用する場合に生理活性部分と称する、被験者（例えばヒトまたは動物被験者）に投与された時に被験者に治療上の、生物学的、または薬学的結果を与える（例えば１または複数の疾病、障害、または症状もしくはそれらの徴候を治療、制御、軽減、予防、発症遅延、進展の危険性を減らす）治療薬であるか、またはその代謝物質であってよい。分析物は例えば葉酸であってもよい。
【００３２】
分析物はペプチドまたはタンパク質（例えばインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）であってもよい。
上記部分は、キラル部分であってもよいし、その構造の一部としてキラル部分を含んでもよい。上記部分は、アミノ酸、核酸、オリゴヌクレオチド、治療薬、治療薬の代謝物質、ペプチドまたはタンパク質であってもよいし、その構造の一部としてそれらを含んでもよい。上記部分は、炭水化物（例えば以下の構造を有する）であってもよいし、その構造の一部として炭水化物を含んでもよい。
【００３３】
【化１】
2008541089.tif 000003
【００３４】
結合剤は、少なくとも２つの結合部位または少なくとも４つの結合部位を有するタンパク質であってよい。結合剤は組み換えのタンパク質か、または結合部位を各々が備えた複数のタンパク質の複合体であってもよい。このタンパク質の複合体は架橋によって組み立てられ得る。結合剤は炭水化物（例えばグルコース）に結合するタンパク質であってよい。タンパク質はコンカナバリンＡであってよい。結合剤はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはオリゴヌクレオチドであってよい。結合剤は例えば葉酸の抗体またはインフルエンザ赤血球凝集素ペプチドの抗体であってよい。分析物とナノ粒子は、結合剤に可逆的に結合することが可能である。
【００３５】
磁気ナノ粒子は各々磁気金属酸化物（例えば超常磁性金属酸化物）を含んでもよい。金属酸化物は酸化鉄であってよい。磁気ナノ粒子の各々はアミノ誘導体化された架橋酸化鉄ナノ粒子であってよい。
【００３６】
センサは埋設可能なセンサであるように構成することができる。例えば、センサは皮下に埋設することができる。特定の実施形態では、センサは、被験者（例えばヒトまたは動物）の四肢に埋設することができる。
【００３７】
工程（ｉｉ）および（ｉｖ）はＴ２緩和時間またはＴ１緩和時間の測定を含み得る。工程（ｉｉ）で測定されたＴ２緩和時間に対する工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間の増加は、分析物の存在を示し得る。工程（ｉｉ）で測定されたＴ２緩和時間に対する工程（ｉｖ）で測定されたＴ２緩和時間の減少は、分析物の存在を示し得る。
【００３８】
用語「分析物」または「外来分析物」とは、本明細書に記載のセンサを使用して分析（例えば検出および定量）およびモニタすることが可能な試料（例えば体液または工業流体）中の物質または化学成分（例えばグルコース、葉酸またはインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）を指す。
【００３９】
用語「被験者」はマウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ、霊長類の動物、イヌ、ネコおよびヒトを含む。
ナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられた本明細書に記載の少なくとも一つの部分を有し、凝集状態と分離状態とので切り替え可能なナノ粒子を、本明細書では「磁気ナノスイッチ」または「ナノスイッチ」と称する場合がある。
【００４０】
実施形態は以下の１または複数の特徴を含み得る。
理論に束縛されることを望まないが、ナノ粒子の凝集（ナノ粒子凝集物（例えばマイクロ微小凝集物）の形成）および分離（微小凝集物またはナノ粒子凝集物からの分離ナノ粒子または分散ナノ粒子の形成）は平衡に制御されたプロセスであると考えられており、この平衡の位置は分析物の濃度によって決まる（したがって分析物の濃度により維持される）。分析物の濃度が変わると、少なくともいくつかの要因に依存する一連の感度の範囲で、平衡の位置が変化する。この平衡の位置の変化は、センサのチャンバ内部の水のプロトン緩和の変化によって表され、これは測定可能である。そのためセンサは、検出中に何も生成または生産されないため大半の進行中の（例えば長期の）測定中にセンサの条件を再度調整したりセンサを取り替えたりする必要が通常なく、このため分析物のレベルの変化を連続的にモニタするのに有効であり、また、凝集物と分離されたナノ粒子の間の平衡を分析物によって移動できるという利点を有する。センサチャンバ内部で起こる上述の平衡の変化を（例えばチャンバ内部の水のＴ２緩和時間を周期的または連続的にモニタすることにより）連続的にモニタすることができる限り、分析物のレベルの変化が生じた時にその変化を連続的にモニタすることができる。
【００４１】
センサは、炭水化物（例えばグルコース）、ペプチド（例えばインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）および治療薬（例えば葉酸）を含むがこれらに限定されない化学的に異なる分析物のアレイを検出するために使用することができる。
【００４２】
センサは、可動部分、電子機器、および試料採取管またはワイヤ等の外部記録装置への接続の無い比較的単純な装置である。代わりに、センサは、Ｔ２および外来分析物（例えばグルコース）濃度として解釈可能な水プロトンのラムール（Ｌａｒｍｏｕｒ）差周波数で放射線を吸収および放射することにより作動する。使用放射線（例えば１．５Ｔ  ＭＲＩで６０ＭＨｚ）は、組織による光の散乱および吸収により光学レポート法が複雑になることもある深さ（例えば約２５０μｍより大きな組織深さ）で生物系を貫通する。したがって、センサは、外部記録装置または動力源と接続されることなく水緩和測定によってその局所環境についてレポートする遠隔センサであり得る。
【００４３】
分析物の検出は、センサの表面の化学構造を開発および最適化する必要性を避けるために、表面ではなく溶液中で起こり得る。これにより、分析の特徴（感度、特異性、動力学）を、センサ水をバルク水から識別するために必要とされる半浸透性装置または手段とは無関係に、チューブ形式で独立して決定することができる。結合剤（例えばタンパク質および抗体）およびナノ粒子は、新しい水緩和分析用の試薬として容易に試験することができ、これは異なる分析物に対する緩和に基づくセンサのパネルにつながる。
【００４４】
ナノ粒子凝集／分散の可逆平衡の位置を感知することにより、不可逆反応（例えば一回で使い捨ての分析）を含む分析と比較して、分子の生産または消費は回避される。したがって、繰り返しになるが、動作を継続するのに基板によりセンサを「充電する」必要がない。センサは、例えば分析物がない状態で、または分析物がない状態（例えば比較的低濃度の分析物）を模倣するよう選択された条件で、平衡にすることにより再使用のために調製することができる。
【００４５】
水緩和センサと共に使用される高周波放射線は、ナノ粒子や生体分子ではなく、水プロトンと相互作用し、そのために、放射線により引き起こされる損害の可能性を最小にする。
【００４６】
センサは、２つ以上の分析物（例えば、各々が異なる結合剤と部分を有する異なるセンサのパネルを、多数の分析物を検出するために同じスクリーニングまたは試験環境に使用することができる）の検出に使用される。
【００４７】
別段明確に定義されない場合、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。不一致がある場合には、定義を含め本願が優先する。すべての刊行物、特許出願、特許、および本明細書に記載の他の文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書に記載した方法および材料と同様または等価な方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、好ましい方法と材料を以下に説明する。材料、方法および実施例は単なる例示であって、限定を意図しない。本発明の他の特徴および利点が以下の説明および特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
図１Ａは、一価分析物を検出するための水の緩和に基づくセンサの一実施形態の断面図である。分析物がない状態と存在する状態とでセンサチャンバで起こる平衡制御されたプロセスと、凝集または分散されたナノ粒子の水緩和特性の要約とが示されている。
【００５０】
図１Ｂは、一価分析物を検出するための水の緩和に基づくセンサの一実施形態の断面図である。分析物がない状態と存在する状態とでセンサチャンバで起こる平衡制御されたプロセスと、凝集または分散されたナノ粒子の水緩和特性の要約とが示されている。
【００５１】
図１Ｃは、ナノ粒子が互いに直接結合でき、分析物が凝集／分離を媒介できるセンサ形態の実施形態の略図である。このナノ粒子の表面（反応式の左側）は分析物に結合することができ、分析物への結合は表面の物性（例えば電荷または疎水性）を変化させ、これによって凝集／分離が生ずる（反応式の右側）。ここで、凝集／分離はｐＨ（Ｈ＋）の変化により媒介される。
【００５２】
図１Ｄは、核酸断片上の塩基配列の検出がナノ粒子の自己集合を媒介し得るセンサ形態の実施形態の略図である。２種類のナノ粒子が混合されると、それらは、オリゴヌクレオチドの塩基間に生じるハイブリダイゼーションにより自分集合することができる（反応式の左側）。２種類の粒子のうちの１つに結合可能な分析物は、凝集物の解離を引き起こすことができる（反応式の右側）。
【００５３】
図２は、グルコースにリンクされた架橋酸化鉄ナノ粒子（ＧＩｕ−ＣＬＩＯ）の合成を示す反応スキームである。
図３Ａは、Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ／ＣｏｎＡ配置を使用した、グルコースに対するチューブに基づく水緩和分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフである。ＣｏｎＡ追加後の安定したＴ２緩和時間で示されるように、アミノ−ＣＬＩＯはＣｏｎＡ結合タンパク質と反応しない。２−アミノのグルコース（Ｇ）の取り付けにより、官能化ナノ粒子（ＧＩｕ−ＣＬＩＯ）が生じ、これはグルコース結合タンパク質（ＣｏｎＡ）追加時のＴ２低下を示す。Ｔ２低下はグルコースの添加によって逆転される。データはナノ粒子の凝集および分離を示す。Ｔ２測定については、０．５ｍＬのＧｌｕ−ＣＬｉＯ（１０μｇ  Ｆｅ／ｍＬ）、８００μｇ／ｍＬのＣｏｎＡ（１ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2のＰＢＳ溶液）が使用された。
【００５４】
図３Ｂは分析装置の写真である。写真の鉄濃度は対比を良くするために１００μｇ  Ｆｅ／ｍＬに増加された。
図４Ａは、ＧＩｕ−ＣＬＩＯ  ナノスイッチ／ＣｏｎＡ配置を使用した、グルコースに対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフである。Ｇｌｕ−ＣＬＩＯに対するＣｏｎＡの添加は最初のＴ２低下を引き起こし、これは増大濃度のグルコース添加により逆転された。図４Ｂは、種々のグルコース濃度で得られたＴ２値（プラト
ーでの）の変化のグラフである。図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは、光散乱実験により得られた粒径分布のグラフである。図４Ｃは分散されたＧＩｕ−ＣＬＩＯナノ粒子の粒径分布を示す。４ＤはＣｏｎＡ添加時の分散ナノ粒子（濃い棒線）から微小凝集物の状態（薄い棒線）への切り替えを示す。図４Ｅはグルコース添加時のＧＩｕ−ＣＬＩＯナノ粒子から分散状態へ戻り切り替えを示す。
【００５５】
図５Ａは、水緩和センサを種々の外部グルコース濃度の溶液と接触させることにより得られたＴ２緩和時間の変化のグラフである。センサは最初に０．１ｍｇ／ｍＬグルコースのＰＢＳ溶液中に入れ、次に１．０ｍｇ／ｍＬグルコース緩衝液に入れ、０．１ｍｇ／ｍＬグルコース溶液に戻る。条件は、図３Ａおよび３Ｂに関して説明したのと実質的に同じであった。
【００５６】
図５Ｂは、含グルコース試料媒体を含むセンサおよび装置の写真である。
図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、ＭＲＩによって視覚化されたグルコースに対する水緩和センサの反応に対応する画像である。図５Ａは、５０ｍＬチューブにＣｏｎＡおよびＧｌｕ−ＣＬＩＯが配置されたセンサを示す。図５Ｂは、０．５ｍｇ／ｍＬの外部グルコースが備えられた５０ｍＬチューブのＭＲイメージを示す。図５Ｃは１．４ｍｇ／ｍＬの外部グルコース濃度のＭＲイメージを示す。条件は、図３Ａおよび３Ｂに関して説明したのと実質的に同じであった。
【００５７】
図７は、グルコース濃度を増加または減少させた時のＴ２の時間依存性の変化を示すグラフである。図４Ａ−４Ｅに説明した実験に使用されたＧＩｕ−ＣＬＩＯナノスイッチ／ＣｏｎＡシステムを半透性装置に配置し、グルコースが低濃度と高濃度の間で循環し、センサ中のナノ粒子が低Ｔ２状態と高Ｔ２状態との間で前後に移動できるようにした。
【００５８】
図８Ａは、ＨＡ（抗ＨＡ）配置へのＨＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ／抗体を使用する、インフルエンザ赤血球凝集素ペプチド（ＨＡ）に対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフである。ＨＡ−ＣＬＩＯに対する抗ＨＡの添加は最初のＴ２低下を引き起こし、これは増大濃度のＨＡ添加により逆転された。図８Ｂは、種々のＨＡ濃度で得られたＴ２値の変化のグラフである。図８Ｃ、８Ｄおよび８Ｅは、光散乱実験により得られた粒径分布のグラフである。図８Ｃは、分散ＨＡ−ＣＬＩＯナノ粒子の粒径分布を示す。図８Ｄは、抗ＨＡ添加時の分散したナノ粒子（濃い棒線）から微小凝集物状態（薄い棒線）への切り替えを示す。図８ＥはＨＡ添加時のＨＡ−ＣＬＩＯナノ粒子から分散状態への戻り切り替えを示す。
【００５９】
図９Ａは、ＦＡ（抗ＦＡ）配置へのＦＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ／抗体を使用する、葉酸（ＦＡ）に対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフである。ＦＡ−ＣＬＩＯに対する抗ＦＡの添加は最初のＴ２低下を引き起こし、これは増大濃度のＦＡ添加により逆転された。図９Ｂは、種々のＦＡ濃度で得られたＴ２値の変化のグラフである。図９Ｃ、９Ｄおよび９Ｅは、光散乱実験により得られた粒径分布のグラフである。図９Ｃは、分散ＦＡ−ＣＬＩＯナノ粒子の粒径分布を示す。図９Ｄは、抗ＦＡ添加時の分散したナノ粒子（濃い棒線）から微小凝集物状態（薄い棒線）への切り替えを示す。図９ＥはＦＡ添加時のＦＡ−ＣＬＩＯナノ粒子から分散状態への戻り切り替えを示す。
【００６０】
種々の図面中の参照符号は同様な要素を示す。
詳細な説明
本発明は一般に、含水媒体（例えばインビトロまたはインビボ媒体）中の種々の分析物（例えば外来分析物）を検出するための磁気共鳴に基づくセンサ（例えば水緩和に基づくセンサ）および方法に関する。
【００６１】
センサ
一般に、本明細書で説明するセンサは磁気ナノ粒子、つまり、半透性の（例えばナノ粒子を保持するが分析物のセンサチャンバの領域内外への通過を許容する）囲い壁に封入された、特定条件下で磁気モーメントを備えたナノ粒子、を備えている。囲い壁は、分析物は通過させるがナノ粒子（および存在する場合に結合剤）を通過させない１または複数の開口部を備えてよい。各ナノ粒子は、ナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられた少なくとも１つの部分（例えば検出される分析物の分子断片、または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片）を有する。センサは、半透性の囲いの中にやはり封入された結合剤（例えばタンパク質またはモノクローナル抗体）をさらに備えてよい。結合剤は、存在する場合、分析物および部分に結合することができ、部分は分析物または結合剤に結合することができる。一般に、部分および分析物の各々は結合剤（存在する場合）に可逆的に結合することができるか、または分析物は部分に可逆的に結合することができる。本発明の実施に使用される現時点で好ましい化学構造をここで説明する。一般に、分析物、部分および結合剤の化学構造は、別段示さない限り、それ自体従来のものであってもよく、通常は従来のものであり、本明細書で開示された新規なセンサおよび方法に使用される他の技術から適合可能である。
【００６２】
図１Ａを参照すると、いくつかの実施形態では、一価分析物（図１ＡのＡex）を検出するための水緩和に基づくセンサ１０は、囲い壁１２、複数のナノ粒子２０および少なくとも１つの結合剤（例えばタンパク質）１８を含んでいる。囲い壁はチャンバ１６を封入し、複数の開口部１４が穿孔されている。ナノ粒子２０および結合剤１８はいずれもチャンバ１６の閉じ込め範囲内にある。ナノ粒子２０の各々は、ナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられ、検出される分析物の分子断片を含む少なくとも１つの部分（図１ＡのＡb）を有する。結合剤１８は分析物および部分Ａbに結合（例えば可逆結合）することができる。すべての実施形態で、分析物のサイズはナノ粒子２０または結合剤１８のいずれかより小さい。すべての実施形態で、開口部１４は、（ｉ）分析物がチャンバ１６の内外を自由に通過するよう（矢印１７）分析物よりサイズが大きく、（ｉｉ）チャンバ１６内にナノ粒子２０および結合剤１８を保持するようナノ粒子２０または結合剤１８のいずれよりもサイズが小さい。
【００６３】
分析物が存在しない場合、ナノ粒子２０は結合剤１８に結合して、センサチャンバ１６内でナノ粒子凝集物２２を形成する。ナノ粒子２０の結合剤１８への結合は、部分Ａb（
図１Ａを参照）を通じて起こると考えられる。一般に、ナノ粒子凝集物２２の生成は平衡制御されたプロセス（矢印２３）である。
【００６４】
外来分析物が存在し、開口部１４を通ってチャンバ１６に入ると、凝集物２２の結合剤に結合している（例えば、結合タンパク質に結合している）ナノ粒子は、分析物（図１ＡのＡex）により結合剤から置換され、そのためナノ粒子−結合剤（結合タンパク質）の平衡（矢印２３）が変化する。その結果、分析物、分析物結合剤（タンパク質複合体２４）および（再生成）ナノ粒子２０の間に第２の平衡がチャンバ１６にて確立される（矢印２５）。  第２の平衡制御プロセス（矢印２５）で生じた再生成ナノ粒子は、第１の平衡制御プロセス（矢印２３）で形成された凝集物２２の結合ナノ粒子に比べて実質的に分離されている。
【００６５】
図１Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、多価分析物（図１Ｂの≡Ａex）を検出するための水緩和に基づくセンサ１０は、囲い壁１２および複数のナノ粒子２６を含んでいる。ナノ粒子はチャンバの閉じ込め範囲内にあり、各ナノ粒子はナノ粒子に結び付けられた少なくとも１つの部分（例えば少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つのタンパク質）を有している（図１Ｂの中空のくさび部分）。すべての実施形態で、外来分析物はナノ粒子２６よりサイズが小さい。すべての実施形態で、開口部
１４は、（ｉ）外来分析物がチャンバ１６の内外を自由に通過するよう（矢印１７）分析物よりサイズが大きく、（ｉｉ）チャンバ１６内にナノ粒子２６を保持するようナノ粒子２６よりもサイズが小さい。
【００６６】
分析物が存在しない場合、ナノ粒子２６はセンサチャンバ１６内で実質的に分離されている。
分析物が存在し、開口部１４を通ってチャンバ１６に入ると、ナノ粒子２６は多価分析物（図１Ｂの≡Ａex）に結合し、チャンバ内でナノ粒子凝集物２８を形成する（矢印２７）。凝集物２８の一部を形成するナノ粒子はナノ粒子２６よりも凝集している。分析物へのナノ粒子２６の結合は、部分（例えばタンパク質）を通じて起こると考えられる。通常、ナノ粒子凝集物２８の形成は平衡制御プロセス（矢印２７）である。
【００６７】
図１Ｃを参照すると、いくつかの実施形態では、分析物（例えばプロトンＨ＋）が自己集合（ナノ粒子の凝集および分離）を直接媒介できるようにセンサを形成することができる。図１Ｃに示した構成を有するセンサは、１または複数の以下の特性を有する：（ｉ）ナノ粒子が互いに直接結合可能である（つまり図１Ａおよび１Ｂに示されるようにナノ粒子間の「架橋」として機能する分子がない）；（ｉｉ）一種類のナノ粒子を使用することができる；および（ｉｉｉ）分析物はナノ粒子の表面に結合することにより自己集合を制御することができる。これらの実施形態、ナノ粒子の表面は分析物と結合することができる。分析物の結合によって表面の物性（例えば電荷または疎水性）が変化し得る。理論に束縛されることを望まないが、表面特性の変化によってナノ粒子間の引力が変化し、ナノ粒子の自己集合（または分離）が起こると考えられる。特定の実施形態では、ｐＨがある対象範囲にわたって変化するため、ナノ粒子の表面を荷電または非荷電の表面を有するように設計することができる。例えばＡｃ−ＬＬＬＬＬＬ−ＫＨＨＨＥ−Ｇ−Ｋ−（ＦＩＴＣ）−Ｃ−ＮＨ2（ｐＩ＝６．４８）のようなペプチドは、ＳＰＤＰまたはＳＩＡ等の二
官能基架橋剤を使用してナノ粒子に取り付けることができる（Koch et al. "Uptake and metabolism of a dual fluorochrome Tat-nanoparticle in HeLa cells." Bioconjug Chem. 2003;74(6):l 115)）。約６．４８およびそれより高いｐＨでは、ヒスチジンが実質的に非プロトン化され、疎水性のロイシン側鎖間の自己会合により凝集が生じる。約６．４８より低いｐＨでは、ヒスチジンは実質的にプロトン化され、ナノ粒子は陽電荷を帯び、分散される。
【００６８】
図１Ｄを参照すると、いくつかの実施形態では、核酸断片上の延期配列の検出がナノ粒子の自己集合を媒介するようにセンサを形成することができる。図１Ｄに示した構成を有するセンサは、１または複数の以下の特性を有する：（ｉ）互いに親和性を有する２種類のナノ粒子を調製することができる；および（ｉｉ）２種類のナノ粒子のうちの１つは分析物に結合することができる。これらの実施形態では、各々にオリゴヌクレオチドの特定配列が取り付けられた２種類のナノ粒子が合成される。２種類のナノ粒子が混合されると、それらはオリゴヌクレオチドの塩基間に生じるハイブリダイゼーションによって自己集合する。そのような二重らせん構造のオリゴヌクレオチドを媒介としたナノ粒子凝集物の例がPerez et; al., "DNA-based magnetic nanoparticle assembly acts as a magnetic relaxation nanoswitch allowing screening of DNA-cleaving agents." J Am Chem Soc.
2002;124:2856に記載されている。その後、分析物（例えば核酸断片上に存在する塩基配列）は、センサに入り、２種類のナノのうちの１つに結合することにより凝集物の解離を引き起こすことができる。
【００６９】
分析物のナノ粒子凝集物との濃度依存的反応が、ナノ粒子の凝集物状態を変化させるため、州、外来分析物の存在および量を、例えばセンサチャンバ内部の水のＴ２緩和時間の変化として感知することができる。水Ｔ２緩和時間は、先に分散された（例えばモノ分散、多分散された）磁気ナノ粒子が凝集またはクラスタ化すると短くなることが知られてい
る。理論に束縛されることを望まないが、より高次のナノ集合物へのナノ粒子の自己集合中に、各々のナノ粒子の超常磁性酸化鉄コアは、周囲の水プロトンの回転位相をずらして（つまりスピン−スピン緩和時間（例えばＴ２緩和時間）を増強して）より効率的になると考えられる。
【００７０】
したがって、いくつかの実施形態では、センサチャンバ１６内に存在する水の緩和特性をモニタすることにより（例えばセンサチャンバ内に存在する水のＴ２緩和時間の変化（例えば増加および減少）を測定することにより）、サンプリング媒体中の分析物を検出し定量化することができる。例えば、図１Ａを参照すると、分析物がないと（ナノ粒子凝集物２２の形成により）センサチャンバ１６の内部の水のＴ２緩和時間が減少すると予想され、分析物が存在すると（凝集物２２の結合されたナノ粒子の置換と後の分離により）水のＴ２緩和時間はそのような低い値に対して増加すると予想される。代わりに図１Ｂを参照と、センサチャンバ１６の内部の水のＴ２緩和時間は多価分析物が存在しないと増加すると予想され、多価分析物が存在すると水のＴ２緩和時間はそのような値に対して減少すると予想される。結合剤および／またはナノ粒子はチャンバ１６内に閉じ込められているので、一般にセンサチャンバ１６内で起こるナノ粒子凝集の変化はチャンバの外の水（つまりバルク水）のプロトン緩和を実質的に変化させない。
【００７１】
Ｔ２の測定はナノ粒子の凝集を決定する望ましい方法ではあるが、ナノ粒子または名の粒子の凝集状態の変化に関連する水緩和現象であれば、いかなるものも使用することができる。Ｔ２は通常、比較的迅速かつ容易に決定することができる。しかしながら、ナノ粒子の凝集の測定は、Ｔ２をＴ１等の他の緩和プロセスと共に使用することができる。Ｔ１とＴ２の測定値は、チャンバの小さな拡張または収縮によるセンサ内のナノ粒子の凝集状態の小さな変化を修正するために使用することができる。従って、本明細書で使用する場合、緩和減少または磁気緩和能の測定と言えば、Ｔ１の測定を含めたそのような緩和関連プロセスをすべて含むものとする。
【００７２】
センサの構成要素および仕様
一般に、センサ１０のサイズおよび形状は希望通りに選択することができる。
いくつかの実施形態では、センサの形状は例えば管状、球状、円筒状、または卵形である。本明細書に記載のセンサは同様に他の形状を有してもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、センサのサイズおよび形状は所望のまたは都合の良い試料ホルダサイズおよび／サンプル体積を収容するように選択することができる（例えばインビトロの感知用途で）。通常センサの体積は、チャンバ内部の水の緩和特性とチャンバ外部の水の緩和特性とをセンサが識別できるように選択される。例えば、センサのサイズは、約０．１マイクロリットル（μＬ）から約１０００ミリリットル（ｍＬ）まで（例えば約１μＬ（例えば動物画像装置）、１０μＬ（例えば臨床ＭＲＩ装置）または０．５ｍＬ）の試料体積を収容するように選択される。特定の実施形態では、センサは、チューブの開口端が約１ミリメートル（ｍｍ）から約１０ｍｍまでの直径（例えば５ｍｍおよび７．５ｍｍ）を有する管状の形を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、センサのサイズおよび形状は、従来の磁気共鳴技術（例えばインビトロの感知用途で）の空間の解像能に基づいて選択することができる。特定の実施形態では、センサの最長の寸法は約０．０１ｍｍから約２ｍｍ（例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１）である。特定の実施形態では、印加磁場が例えば約０．４７テスラ（Ｔ）、１．５Ｔ、３Ｔ、または９．４Ｔである（一般に動物の分析用）。
【００７５】
囲い壁１２は、チャンバ１６をバルク試料媒体から分離し、バルク試料媒体から外来分
析物（存在する場合）を入れるための１または複数の通路（例えば開口部１４）を提供する。一般に、囲い壁１２は、外来分析物および水を通過させるがナノ粒子と結合剤を実質的に通過させない任意の半透性材料（例えば生物適合性半透性材料）である。いくつかの実施形態では、半透性材料は限外ろ過または透析膜である。いくつかの実施形態では、半透性材料はポリマー物質（例えば移植された細胞を封入するために使用されるポリマー物質、M.S. Lesney, Modern Drug Discovery 2001, 4, 45を参照）である。いくつかの実施形態では、半透性材料は、小型の埋設可能な徐放性装置（例えば埋設可能な徐放性産児制限装置、例えばDepo-Provera, Norplant, Progestasert; C. I. Thompson et al, Can J Physiol Pharmacol 80, 180-92 (Mar, 2002) またはD. C. Stoller, S. R. Thornton, F.
L. Smith, Pharmacology 66, 11-8 (Sep, 2002)に記載）。
【００７６】
いくつかの実施形態では、囲い壁は、サンプリング条件下で汚れやコーティングに対して比較的耐性があり、そのため囲い壁が開口部１４の特定の孔径を維持する可能性が増大する（例えば開口部１４が感知中に実質的に妨害されない可能性が増大する）。汚れは孔を塞ぐタンパク質の吸着による孔（例えば開口部１４）の閉鎖である。汚れは、体液（例えば血液）中に材料を入れ、当該技術分野で周知の生体適合試験法を使用して同材料の性能を評価することにより確認することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、囲い壁１２は本質的に非免疫原であってもよく、そのため被験者（例えばヒト）の望ましくない免疫性のまたは有毒な副作用を引き起こす可能性が最小限となる。
【００７８】
生体適合性の半透性材料の例には、多糖に基づく材料（セルロース）、修飾れた炭水化物（セルロースエステル）またはポリビニルピロリドンが含まれる。
いくつかの実施形態では、囲い壁１２は、比較的可撓性のない半透性材料で作られ、これは、封入されたチャンバ１６は流体試料媒体との接触時に体積が実質的に変化しない真のスペースまたは空隙であることを意味している。別の実施形態では、囲い壁は比較的可撓性のある半透性材料で作られ、これは流体試料媒体との接触時に（例えば流体試料媒体の摂取量により）封入されたチャンバの体積が拡大することができることを意味する。
【００７９】
一般に、囲い壁１２は外来分析物のレベルの変化に対して迅速にセンサが平衡状態となるよう十分に薄い。いくつかの実施形態では、壁を形成する薄膜は約１から約５００００μｍの厚さを有し得る。
【００８０】
一般に、開口部１４の孔径は本明細書で記載した分子の排除基準を満たすように選択される（つまり、外来分析物および水を通過させるがナノ粒子と結合剤を実質的に通過させない）。
【００８１】
いくつかの実施形態では、分子の排除は分子量による排除である。特定の実施形態では、各開口部は約１ＫＤａから約５００，０００ｋＤａの孔径（例えば特定の分子量を有する分子の通過を許容する孔径）を有する。各開口部は、約１ｋＤａから約１μｍ（例えば約１ｋＤａから約３００，０００ｋＤａ、約１ｋＤａから約１００，０００ｋＤａ、約１ｋＤａから約５ｋＤａ、約１ｋＤａから約３ｋＤａ、約１ｋＤａから約１μｍ）のサイズ（孔径）を有する。特定の実施形態では、開口部は約１ｋＤａまたは約３ｋＤａの孔径を有する。
【００８２】
特定の実施形態では、半透性材料はＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）チューブ、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）マイクロカセットまたは透析ファイバである。このような材料は、埋設に関与しない用途に一般に好適である。一般に、半透性材料は、チャンバの内外への分析物の通過を許容するよう分析物よりサイズが大きいが、磁気ナノ粒
子や結合剤（例えば結合タンパク質）等の他の試薬をチャンバの閉じ込め範囲内に保持するのに十分に小さい孔径を有している。半透性材料は、測定される分析物を含有する流体（例えばヒトまたは動物被験者の血漿、間質液、脳脊髄液）で安定性（長期機能）に関して選択することができる。半透性材料はさらに、センサが埋設されるか、または分析される流体が被験者の体外（例えばバイオリアクタ、チューブまたはパイプ）の導管内に含まれているかどうかに基づいても選択可能である。
【００８３】
仮に粒子が実質的に懸濁されたままの状態である（つまり粒子が沈殿しない）とすれば、磁気粒子はナノ粒子（例えば約１０ｎｍから約２００ｎｍまでの粒径を有する）または粒子（例えば約２００ｎｍから約５０００ｎｍまでの粒径を有する）であってよい。本明細書に使用する場合、用語「磁気ナノ粒子」は、常に磁性を帯びているすべての粒子ならびに特定の条件（例えば印加電場中で）で磁気モーメントを有するすべての粒子を指す。粒子の沈降は、比較的小さな粒子（例えばナノ粒子）を用いるか、または密度が水の密度より匹敵する比較的大きな粒子を用いることにより一般に回避することができる。粒子の密度は、合成時に種々の密度のポリマーを使用することにより変更することができる。すべての実施形態で、ナノ粒子または粒子は、生体分子の付着を許容する表面を有する。いくつかの実施形態では、磁気粒子は約１０から約５００ｎｍ（例えば約１５から約２００ｎｍまで、約２０ｎｍから約１００ｎｍ、約１０ｎｍから約６０ｎｍ、約２０ｎｍから約４０ｎｍ、約３０ｎｍから約６０ｎｍ、約４０ｎｍから約６０ｎｍ、または約５０ｎｍ）まで走った。官能化していない金属酸化物は一般に直径約１−２５ｎｍ（例えば約３−１０ｎｍまたは約５ｎｍ）の結晶である。
【００８４】
ナノ粒子（粒子）より大きな磁性材料を使用してもよい。一般に、そのような粒子は１または複数の以下の特性の有し得る：（ｉ）粒子は比較的高いＲ２を有する、つまり水緩和を変化させることが望ましい、（ｉｉ）粒子は分析中に重力によって大いに沈殿されるような高い感受性を有しないことが望ましい、（ｉｉｉ）粒子は、生体分子、好ましくはアミノ基またはカルボキシル基の付着のための表面を有することが望ましい。例としては、直径約１−５ミクロンからのミクロスフェアを含む。そのような粒子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州カールスバッド所在）のＤｙｎｂｅａｄ磁気ミクロスフェア、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（インディアナ州フィッシャー所在）のミクロスフェア、およびＭｅｒｃｋ社やＥＭＤ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（イリノイ州ネイバーピル所在）のＥｓｔａｐｏｒ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓを含めて例えば市販業者から得ることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、粒子（例えばナノ粒子２０または２６）は、超常磁性酸化鉄等の官能化していない磁気金属酸化物であってよい。磁気金属酸化物には、コバルト、マグネシウム、亜鉛またはこれらの金属の鉄との混合物も含まれる。本明細書に使用する場合、用語「磁気」とは、常磁性化合物または超常磁性化合物および磁鉄鉱、γ酸化鉄または金属鉄等の磁化率の高い材料を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子２０は、比較的高い緩和能（つまり水緩和に対する強い作用）を有するものが含まれる。
【００８６】
通常、粒子は、その鉄または金属酸化物の超常磁性に起因して、比較的高い緩和能を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば２０または２６）は、約５〜３０ｍＭ-1秒-1の間（例えば１０、１５、２０、または２５ｍＭ-1秒-1）のＲ１緩和能を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば２０または２６）は、約１５〜１００ｍＭ-1秒-1の間（例えば２５、５０、７５、または９０ｍＭ-1秒-1）のＲ２緩和能を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば２０または２６）は１．５〜４の間（例えば２、２．５、または３）のＲ２／Ｒ１の比を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば２０または２６）は、１５、２０、２５ま
たは３０パーセント（例えば）を越える粒子の質量の合計の約１０％より大きな酸化鉄含有量を有している。
【００８８】
いくつかの実施形態では、磁気ナノ粒子が酸化鉄に基づくナノ粒子である場合、鉄（Ｆｅ）の濃度は約２μｇ／ｍＬから約５０μｇ／ｍＬ  Ｆｅまでである。一般に鉄の濃度は、水の緩和特性を変化させるのに十分に高いよう選択される。比較的高い緩和能を有する粒子では、より低い鉄濃度を使用し得る。比較的低い緩和能を有する粒子では、より高い鉄の濃度は使用し得る。
【００８９】
ナノ粒子（例えば２０または２６）の各々は、ナノ粒子に共有結合または非共有結合で結び付けられた少なくとも１つの部分（例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４）を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、上記部分は官能基によってナノ粒子にリンクさせることができる。官能基は、主として合成のし易さ、立体障害がないこと、および生分解性等の要因に基づいて選択または設計される。適切な官能基には、−Ｏ、−Ｓ、−ＳＳ、−ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）、−（Ｏ）ＣＮＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）、−（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）、−ＮＨＮＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｓ、−ＳＣ（Ｏ）、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ2）n（Ｏ）、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）Ｏ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−ＮＨ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2
）nＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＯ−、−Ｓ（ＣＨ2）nＣ
（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）nＳ−、−ＮＨ（ＣＨ2）n、−（ＣＨ2）nＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＯ−、−Ｓ（ＣＨ2）n−、または−（ＣＨ2）nＳ−であり、各々においてｎは１−１００（例えばｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９）である。線形で完全に飽和のアルキレンリンカー部分（ＣＨ2）nの代わりに環状基、不飽和基、または環状不飽和基を有する官能基もナノ粒子に同部分を取り付けるために使用することができる。特定の実施形態では、官能基は、ナノ粒子をチャンバの範囲内の保持するために、チャンバ壁の開口部よりサイズが大きいナノ粒子を与えるように選択される（例えばリポタンパク質のような比較的大きな分析物が検出される場合）。
【００９１】
特定の実施形態では、官能基は−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ2）nＣ（Ｏ）ＮＨ−であり、ｎは０−２０である。特定の実施形態では、ｎは２、３、４、５、または６（好ましくは２）である。
【００９２】
官能基は、ナノ粒子の一部またはナノ粒子（例えば２０または２６）の上記部分の一部のいずれかに関連する出発物質または合成中間物上に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子に基づく出発物質は、１または複数の部分に取り付けるための１または複数の官能基（例えば２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個の官能基）を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子はアミノ誘導体化された架橋酸化鉄ナノ粒子（例えばＮＨ2−ＣＬＩＯ）である。ナノ粒
子に最終的に結び付けられた部分（例えば、検出される分析物の分子断片または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片；もしくはタンパク質）の数は、ナノ粒子への上記部分の取り付けに利用できる官能基の数と等しいかそれより少ない。いかなる場合でも、１つのナノ粒子当たりの部分の数が、所与のナノ粒子の集団（例えば２０および／または２６の集団）の中で変化することが許容される。
【００９３】
一般に、１つのナノ粒子当たりの部分の数は、所望に応じて（例えば結合剤（例えばタ
ンパク質）上の結合部位の数および位置に依存して、および／または、１つより多い結合剤が存在する場合にナノ粒子を結合剤（例えばタンパク質）と架橋させることが望ましいか否かに基づいて）選択することができる。いくつかの実施形態では、磁気粒子は、一価材料の複数のコピーが同じ粒子に取り付けられる多価粒子である。一般的、原子価は、一つのナノ粒子当たり約２．５から約２０の結合部分のコピーである（つまり一つのナノ粒子当たりのコピー平均数、したがって一般に多価粒子の所与集団内のいくつかの粒子は一価であり得る）。機能するために、より高いレベルは必ずしも必要ないと考えられている。多価ナノ粒子は、一つのナノ粒子当たり２つ以上の官能基を取り付けることにより調製することができる。多価ナノ粒子は、一価結合材または多価結合剤（例えばタンパク質）のいずれかを取り付けることによっても調製することができる。
【００９４】
一般に、部分には、炭水化物（例えばグルコース、多糖）、抗体（例えばモノクローナル抗体、ビオチン化抗ＧＦＰポリクローナル抗体）、アミノ酸およびその誘導体ならびに立体異性体（例えばＤ−フェニルアラニン）、キラル部分、脂質、ステロール、リポ多糖、リポタンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、治療薬（例えば葉酸）、治療薬の代謝産物、ペプチド（例えばインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）、またはタンパク質が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、部分は、検出される分析物の分子断片、または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片であるか、またはその化学構造の一部として同分子断片を含む。
【００９６】
一般に、そのような部分は、（ｉ）結合剤（例えばタンパク質、例：結合タンパク質）により認識され、（ｉｉ）分析物により結合剤から置換可能（つまり分析物は結合剤（例えばタンパク質）との結合に関して同部分と競争することができる）なものである。したがって、いくつかの実施形態では、部分と検出される分析物とは、互いに構造が実質的に類似しており、結合剤に対して実質的に類似の結合力を有する。別の実施形態では（例えば部分が検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片であるか、またはその化学構造の一部として同分子断片を含む場合）、部分と検出される分析物とは、構造が必ずしも実質的に類似していなくてもよいが、結合剤に対して実質的に類似の結合力を有する。
【００９７】
検出される分析物の分子断片または検出される分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片である少なくとも１つの部分を有するナノ粒子は、以下の一般式（Ａ）を有する：
（Ａ）2−ＮＰc      （Ａ）
式中、「Ａ」は分析物（またはその誘導体、アイソスター、または模倣体）Ａ−Ｘの分子断片であり、Ｘは遊離の分析物（またはその誘導体、アイソスター、または模倣体）中に存在するが式（Ａ）のナノ粒子に組み込まれない水素原子または官能基であり；
「ＮＰc」はナノ粒子のコアであり；
「−」は分子断片の任意の原子をナノ粒子に接続する共有結合（例えば化学結合またはリンキング官能基）であり；
ｚは１−５０（例えば１−４０、１−３０、１−２５、１−２０、２−２０、２、４、６、８、１０および１５）である。また、上式の「Ａ」は検出される分析物の誘導体、アイソスター、または模倣分子の分子断片であってもよい。
【００９８】
特定の実施形態では、Ｘは分析物中に存在するアミノ基または水酸基の一部を形成する水素原子であるか、またはＸはアミノ基または水酸基等の官能基である。例として、所与
の分析物Ａ−ＯＨ（Ｘ＝ＯＨ＝水酸基）の場合、対応するナノ粒子は、例えば（Ａ−Ｏ）2−ＮＰcまたは（Ａ−ＮＨ）2−ＮＰcの構造を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、部分はその化学構造（例えばグリコシル）の一部として炭水化物を含む。特定の実施形態では、部分は、検出される炭水化物分析物の分子断片または検出される炭水化物分析物の誘導体、アイソスター、もしくは模倣体の分子断片を含む。例えば部分は以下の式（Ｉ）を有する。
【０１００】
【化２】
2008541089.tif 000004
【０１０１】
ここで、波線はナノ粒子への同部分の接続箇所を示す。式（Ｉ）の同部分は、グルコースを検出および定量化すべくセンサと共に使用することができる。
部分は、一価または多価タンパク質（例えば、少なくとも２、例えば３、４、５、または６を有する）の結合部位であってよい。
【０１０２】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、チャンバ壁の開口部よりサイズが大きいナノ粒子をチャンバの範囲内に保持するように機能する置換基をさらに備える（例えばリポタンパク質等の比較的大きな分析物が検出される場合）。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、結合剤が存在しなくてもよい（例えば、共有結合または非共有結合で結び付けられた部分が例えばタンパク質であるナノ粒子で多価分析物を検出する場合、図１Ｂに示された分析形態を参照）。したがって、分析により、ナノ粒子を保持しつつ分析物がチャンバに出入りできるほど十分に大きい孔径（つまり図１Ａおよび図１Ｂの孔径）を備えたセンサを使用して、多価分析物タンパク質を測定することができる。種々の分析形態が本明細書に記載される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、結合剤は存在する（例えば、検出される分析物の分子断片または検出される分析物の誘導体、アイソスター、または模倣分子の分子断片を有するナノ粒子で一価分析物を検出する場合、図１Ａに描かれた分析形態を参照））。結合剤は例えばタンパク質、抗体、レクチン、受容器結合タンパク質、タンパク質の結合ドメイン、合成物質または非タンパク質材料である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、結合剤はタンパク質である。特定の実施形態では、結合タン
パク質は少なくとも２つの（例えば３、４、５、または６個の）結合部位を有する多価結合タンパク質である。
【０１０６】
一般に、結合剤（例えばタンパク質または抗体）と、ナノ粒子（部分を介する）および分析物との間の結合は可逆的であり、部分と分析物との間の結合は可逆的である。そのため、分析物は消費しない方法で検出および定量化することができる（つまり結合剤または部分は可逆的に分析物に結合するが、分析物を消費しない）。この可逆性は、定量かされる結合および未結合の分析物に定常状態の条件を与える。その後、分析物濃度は慣用法を使用して数学的に計算することができる。当業者には、例えば、分析物の結合および解離に関連する反応速度論が結合剤として選択されるタンパク質毎に異なり得ることが理解される。
【０１０７】
特定の実施形態では、タンパク質結合剤が治療薬またはその代謝物質；炭水化物（例：グルコース）、タンパク質（例：コンカナバリンＡで）、またはアミノ酸（例えば結合タンパク質は、ある対掌体に対して別の対掌体よりも選択的に結合する、例：Ｄ−アラニン対Ｌ−アラニン）に結合する。特定の実施形態では、タンパク質は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【０１０８】
特定の実施形態では、タンパク質結合剤はモノマーである。別の実施形態では、タンパク質結合剤は、多量体の結合剤である（例えば、１つのタンパク質の数個のコピーか、多価結合部分を形成する架橋された複数のモノマーを含む融合タンパク質を製造することにより調製される）。さらに別の実施形態では、結合剤は基質に結合できるが反応を触媒しないように修飾された酵素である。
【０１０９】
特定の実施形態では、結合剤は脂質、ステロール、リポ多糖またはリポタンパク質に結合する。例えば、結合剤はステロールに結合するタンパク質である（コレステロールに結合するａｐｏＳＡＡｐ、例えばLiang and Sipe, 1995, "Recombinant human serum amyloid A (apoSAAp) binds cholesterol and modulates cholesterol flux", J. Lipid Res, 36(1): 37参照）。別の例として、結合剤はリポタンパク質に結合する受容体である（例
えば可溶性低密度リポタンパク質および／またはその変異型、例えばBajari et al, 2005, "LDL receptor family: isolation, production, and ligand binding analysis", Methods, 36: 109-116またはYamamoto et al., 2005, "Characterization of low density lipoproteinreceptor ligand interactions by fluorescence resonance energy transfer", J. Lipid Research, 47:1091参照）。さらなる例として、結合剤は脂肪酸に結合する
タンパク質である（例えばヒト血清アルブミン、Fang et al, 2006, "Structural changes accompanying human serum albumin's binding of fatty acids are concerted", 1764(2):285-91. Epub 2005 Dec 27参照）。
【０１１０】
別の実施形態では、結合剤はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはオリゴヌクレオチドである。結合剤は、例えば葉酸の抗体またはインフルエンザ赤血球凝集素ペプチドの抗体である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、分析物はキラルである。キラル分析物は試料中の１または複数の光学活性部分と共に存在してもよい（例えば試料中のキラル分析物の立体異性体、例えば試料中のキラル分析物の対掌体）。特定の実施形態では、キラル分析物はアミノ酸である。
【０１１２】
本明細書に記載のセンサは、イオン、小分子、タンパク質、ウイルスおよびリポタンパク質を含むがそれらに限定されない分析物（表１を参照）を検出、モニタ、および定量化するために使用することができる。
【０１１３】
【表１】
2008541089.tif 000005
【０１１４】
特定の実施形態では、分析物は炭水化物（例えばグルコース）；脂質、ステロール、リポ多糖、リポタンパク質、核酸またはオリゴヌクレオチド；治療薬（例えば葉酸）、治療薬の代謝物質、ペプチド（例えばインフルエンザ赤血球凝集素ペプチド）またはタンパク質である。
【０１１５】
センサの製造および使用
いくつかの実施形態では、反応性官能基（例えばカルボキシ基等の求電子基およびアミノ基等の求核基）を有するナノ粒子を、センサと共に使用されるナノ粒子のための出発物質として使用することができる。
【０１１６】
カルボキシ官能化したナノ粒子は、例えばＧｏｒｍａｎの方法に従って製造することができる（ＷＯ００／６１１９１を参照）。この方法では、市販のデキストランから還元されたカルボキシメチル（ＣＭ）デキストランをする。ＣＭデキストランと鉄の塩を混合し、次に、水酸化アンモニウムで中和する。得られたカルボキシ官能化ナノ粒子は、アミノ官能基（例えばかかる官能基または基質部分のさらなるセグメント）の結合のために使用することができる。
【０１１７】
カルボキシ官能化ナノ粒子は、多糖でコーティングされたナノ粒子からでも、同ナノ粒子を強塩基下でブロモまたはクロロ酢酸と反応させてカルボキシ基を取り付けることにより、製造することができる。さらに、カルボキシ官能化粒子は、アミノ官能化ナノ粒子からでも、無水コハク酸または無水マレイン酸等の試薬を用いてアミノ基をカルボキシ基に変換することにより製造することができる。
【０１１８】
ナノ粒子サイズは、米国特許第５，２６２，１７６号に記載されているように例えば塩基での鉄の塩の中和中に低温を使用することにより、反応条件を調節することにより制御することができる。米国特許第５，４９２，８１４号に記載されているような遠心分離、限外ろ過、またはゲルろ過を使用して粒子を細分化することにより、一様な粒径の材料を得ることもできる。
【０１１９】
ナノ粒子はＭｏｌｄａｙの方法（Molday, R. S. and D. MacKenzie, "Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents or the labeling and magnetic separation of cells, " J. Immunol. Methods, 1982, 52(3):353-67）によっても合成可能であり、過ヨ
ウ素酸塩と反応してアルデヒド基を形成する。アルデヒドを含有するナノ粒子をジアミン（例えばエチレンジアミンまたはヘキサンジアミン）と反応させてシッフ塩基を形成し、その後水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノホウ化水素で還元する。
【０１２０】
デキストランでコーティングされたナノ粒子を製造して、エピクロロヒドリンと架橋させてもよい。アンモニアを添加するとエポキシ基と反応し、アミン基を生成する。例えばJosephson et al., Angewandte Chemie, International Edition 40, 3204-3206 (2001)
、 Hogemann et al., Bioconjug. Chem., 2000, ll(6):941-6、およびJosephson et al.,
"High- efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-Tat peptide conjugates," Bioconjug. Chem. , 1999, 10(2):186-91を参照。この材料は架橋酸化鉄または「ＣＬＩＯ」（cross-linked iron oxid）として知られ、アミンで官能化された場合はアミン−ＣＬＩＯまたはＮＨ2−ＣＬＩＯと称される。
【０１２１】
カルボキシ官能化ナノ粒子は、水溶性カルボジイミドやエチレンジアミンまたはヘキサンジアミン等のジアミンを用いてアミノ官能化磁気粒子に変換することができる。
式（Ｉ）に相当する部分を有するナノ粒子２０は、アミノ−ＣＬＩＯ（ＮＨ2−ＣＬＩ
Ｏ）を無水コハク酸（ｐＨ８．５）と接触させ、その後カルボジイミド（例えば水溶性カルボジイミド、例：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミ
ド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ｐＨ６．０）の存在下で２−アミノグルコースと接触させることにより調製することができる（図２を参照）。そのようなナノ粒子は「Ｇ−ＣＬＩＯ」「Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ」、「またはＧｌｕ−ＣＬＩＯナノスイッチ」と称される。
【０１２２】
葉酸（ＦＡ）は、可溶カルボジイミド（例えばＥＤＣ／ＮＨＳ、ｐＨ６．０）を用いてＮＨ2−ＣＬＩＯと共役され、ナノ粒子にリンクされた葉酸含有部分を有するナノ粒子２
０を提供する。そのようなナノ粒子は本明細書では「ＦＡ−ＣＬＩＯ」または「ＦＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ」と称される。
【０１２３】
インフルエンザ赤血球凝集素ペプチド（ＨＡ）は例えばＮ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）（ＰＢＳバッファ、ｐＨ７．４）を用いてＮＨ2−ＣＬＩＯと共役され、ナノ粒子にリンクされたＨＡ含有部分を有するナノ粒子２０
を提供する。そのようなナノ粒子は本明細書では「ＨＡ−ＣＬＩＯ」または「ＨＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ」と称される。
【０１２４】
本明細書に記載のセンサで使用されるナノ粒子は、例えば参照により本明細書に組み込まれるSun, E.Y., Josephson, L., Kelly, K., Weissleder, R. Bioconjugate Chemistry
2006, 17, 109-113に記載された共役化学を使用しても調製することができる。本明細書に記載のセンサで使用されるナノ粒子はさらに、例えばKoIb et al, Angew Chem IntEd Engl., 2001, 40:2004-2021に記載された「クリック化学」法を使用しても調製することができる。
【０１２５】
本明細書に記載のセンサで使用されるナノ粒子２０、分析物、およびタンパク質結合剤１８の組み合わせは、所望に応じて選択することができる。
いくつかの実施形態では、センサで使用されるナノ粒子、分析物、および結合剤の組み合わせは、例えば各々参照により本明細書に組み込まれるJosephson, et al., Angewandte Chetnie, International Edition 40, 3204-3206 (2001)、Perez et al., Nat Biotechnol 20, 816-20 (2002)、J. M. Perez et al. JAm Chem Soc 124, 2856-7 (2002)、およ
びTsourkas et al. Angew Chem Int Ed Engl 43, 2395-9 (2004)に記載された分析形態に基づいてもよい（グルコースではない薬または代謝物質のレベルを測定するＭＲに基づく分析法の能力を示す対掌体の不純物を検出する、抗体と表面官能化ナノ粒子を用いた水緩和分析）。
【０１２６】
例として、表２は代表的な分析形態を示す。
【０１２７】
【表２】
2008541089.tif 000006
2008541089.tif 000007
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のセンサを、グルコースの生理学的濃度をモニタするために使用することができる（実施例のセクション参照）。
一般に、センサチャンバ内における水Ｔ２緩和時間をセンサチャンバの外部の水Ｔ２緩和時間と識別できる任意のＭＲに基づく方法を、センサをモニタするために使用することができる。そのような方法はＭＲ映像法またはＭＲ非映像法である。
【０１２９】
例えば、単一の水緩和センサが使用され、非センサのＴ２、バルク水が一様である応用例では、センサ水の緩和特性を決定するには必ずしもＭＲ映像装置または水緩和データの二次元マトリックスは必要でない。センサ内部から発せられるＭＲ信号の特性をバルク水の特性から区別することが可能な任意の非映像法を使用することが可能である。したがって、臨床ＭＲＩ機器よりはるかに簡単で高価でないタイプの手段によって緩和特性センサ水をバルク水から区別することができる。第１に、センサは流体の流動チューブのチューブ内に埋設することができ、必要とされる均質な磁場の体積を最小限にしているが、なおＭＲＩ機器の空間符号化法を使用している。第２に、印加磁場は均質でなくてもよく、ＭＲ映像を生成するのに磁石が必要である。初期のＭＲ映像装置の設計では選択的な励起磁石が考慮されていた（例えばZ. Abe, K. Tanaka, Y. Yamada, Radiat Med 2, 1-23参照)
。市販の装置の磁石の数ミリメートル以内の試料の緩和特性を分析するのに、磁場強度可変の携帯型磁石および励起／レシーバコイルが使用される（例えば http://www.minispec.com/products/ProFiler.htm参照）。これらの装置は新しいセンサと共に使用することができる。
【０１３０】
溶媒（例えば水）のスピン−スピン緩和時間（Ｔ２）は、核磁気共鳴ベンチトップ緩和測定装置を用いた緩和測定により決定することができる。一般に、Ｔ２緩和時間の測定は、１０μｇ  Ｆｅ／ｍＬの総鉄含有量を含む溶液を用いて０．４７Ｔおよび４０℃で行われる（Ｂｒｕｋｅｒ  ＮＭＲ  Ｍｉｎｉｓｐｅｃ、マサチューセッツ州ビルリカ所在）。
【０１３１】
代わりに、Ｔ２緩和時間を、３８４穴ウェルプレート（５０μＬ試料量）の磁気共鳴映像により決定してもよく、この場合高い処理能力での並行測定が可能である。一般に、磁気共鳴映像は、１．５Ｔの超伝導磁石（Ｓｉｇｍａ５．０、ＧＥ  ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ワイオミング州ミルウォーキー所在）を使用して、Ｔ２期待値のスペクトルをカバーするために可変エコー時間（ＴＥ＝２５−１０００ミリ秒）と３，０００ｍｓの反復時間（ＴＲ）でＴ２重み付けされたスピンエコーを使用して、実行することができる。この技術については例えばPerez, J. M., et al. Nat Biotechnol 2002, 20, 816- 820; and Hogemann, D., et al. Bioconjug Chem 2002, 13, 116-121に記載されている。
【０１３２】
理論に束縛されることを望まないが、ナノ粒子の凝集はナノ粒子のＲ２緩和能の増加に関連するがＲ１緩和能には必ずしも関連しないと考えられている。例えばJosephson, L.,
Perez, J. M., and Weissleder, R. (2001). "Magnetic nanosensors for the detection of oligonucleotide sequences." Angewandte Chemie International Edition :3204-3206の表１を参照されたい。緩和能Ｒは、１ｍＭぶんの濃度変化当たりの緩和速度（１／
Ｔ）の変化である。ナノ粒子の凝集に関連してＲ１には実質的に変化がないか、比較的少しの変化しかないため、ナノ粒子濃度を決定するにはＴ１の測定を使用することができ、ナノ粒子の凝集を決定するにはＴ２の測定を使用することができる。この方法は例えば以下の式（１）−（３）を使用することができる。式中、ＮＰ＝ナノ粒子であり、Ｔ１0お
よびＴ２0はナノ粒子がない状態でのセンサ水の緩和時間である。［Ａ］（分析物の濃度
）はＲ２の単関数または複合関数であり、粒子の凝集状態を反映する。
【０１３３】
（１）  ［ＮＰ］＝（１／Ｔ１0−1／Ｔ1NP）／Ｒ１
（２）  （１／Ｔ２0−１／Ｔ２NP）＝Ｒ２
（３）  ［Ａ］＝ｋＲ２または［Ａ］＝ｆ（Ｒ２）
以下の例が示すように、ナノ粒子凝集は、Ｔ２を測定せずに決定することもできる。
【０１３４】
１．Ｔ２ではなくＴ２＊すなわち自由誘導減衰の測定。
２．ラムール差周波数で正確でない放射線である非共鳴放射線を用いた試料中の特定の
クラスの水プロトンの緩和特性量の測定。この測定では、ラムール差周波数で正確でない入射放射線の周波数が使用される。
【０１３５】
３．完全なエコートレインではなくパルス列を測定するＴ２で得られた一つのエコーの高さの測定。標準Ｔ２測定は、Ｔ２を決定するために多くのエコー低下高さを利用する。
４．印加電場の周波数または強度のシフトおよびプロトン吸収ピーク幅の測定。ピークとエネルギー吸収の幅が広いほど、より高値のＴ２のと相関する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、機器が専らセンサ水プロトンの緩和を容積水プロトンから識別するために設計されており、緩和に基づくセンサを、種々の工業用途におけるバイオリアクタまたは流体を含む任意の囲まれた水性システムで外来分析物をモニタするために使用することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、センサは、皮下に埋設される埋設センサである（例えばセンサは磁場により被験者の全身が囲まれるのを回避するために被験者の四肢に埋設することができる）。
【０１３８】
実施例
本発明は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例は単なる例示の目的で与えられているのであって、いかようにも本発明の範囲または内容を限定するものとして解釈されない。
【０１３９】
概論
表面官能化ナノ粒子の合成：ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド）、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホスクシニミジルエステル）はＰｉｅｒｃｅ社から購入した。ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。他のすべての化学物質はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、受け取った状態で使用した。アミノ−ＣＬＩＯナノ粒子はデキストランコーティングをエピクロルヒドリンで架橋し、これをアンモニアと反応させ、第一アミン基を与えることにより合成した（例えばJosephson, L.; Tung, C. H.; Moore, A.; Weissleder, R. Bioconjug Chem. 1999, 10, (2), 186-91.および Josephson, L.; Perez, J. M.; Weissleder, R.
Angewandte Chemie, International Edition 2001, 40, (17), 3204-3206参照。）アミ
ンの数はＳＰＤＰと反応させ、ジチオトレイトールで処理してピリジン−２−チオン（Ｐ２Ｔ）を放出することにより決定した（例えばZh ao, M.; Kircher, M. F.; Josephson, L.; Weissleder, R. Bioconjug Chem 2002, 13, (4), 840-4参照）。タンパク質結合剤ＣｏｎＡ、抗葉酸抗体（抗ＦＡ）および抗ＨＡ抗体（抗ＨＡ）はＳｉｇｍａ社から購入した。
【０１４０】
Ｔ２測定に関しては、０．４７Ｔ緩和測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用した。測定は０．５ｍＬのＰＢＳ中で４０°Ｃで行った。表面官能化ナノ粒子の濃度は８〜１５μｇ／ｍｌ  Ｆｅであり、約１５０ミリ秒の開始Ｔ２を与えるよう調節した。結合タンパク質の濃度は１ｍｇ／ｍＬ（ＣｏｎＡ）、０．１ｍｇ／ｍＬ（抗ＨＡ）および０．１ｍｇ／ｍＬ（抗ＦＡ）とした。各量の分析物の添加後、安定した値に達するまでＴ２を数回記録した。
【０１４１】
ナノ粒子のサイズはレーザ光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）により１ｍＬのＰＢＳ中で２３℃で測定し、体積に基づくサイズである。表面官能化ナノ粒子の濃度は２５〜３５μｇ／ｍｌ  Ｆｅであり、この値はこの装置でナノスイッチ粒度分布を得るのに最適であると考えられる。結合タンパク質の濃度は１ｍ
ｇ／ｍＬ（ＣｏｎＡ）、０．５ｍｇ／ｍＬ（抗ＨＡ）および０．５ｍｇ／ｍＬ（抗ＦＡ）とした。結合タンパク質または分析物の添加後４０−８０分で繰り返しサイズを測定し、測定値はその期間を超えると本質的に一定だった。示された結果は典型的な粒度分布である。分散した状態（図４Ｅ、８Ｅおよび９Ｅ）へ逆転するには、６００ｍｇ／ｄｌ  グルコース、５００ｎＭ  ＨＡおよび３０ｎＭ  ＦＡを使用した。
【０１４２】
半透性装置内にナノスイッチを包囲する実験のいくつかに関し、０．２５ｍｌのＧｌｕ−ＣＬＩＯ（１０μｇ／ｍＬ  Ｆｅ）およびＣｏｎＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｋＤａカットオフ値のメンブレン（Ｆｉｓｃｈｅｒ社のＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）に配置した。装置を２０ｍｇ／ｄｌおよび２００ｍｇ／ｄｌのグルコース濃度で溶液間を前後に移動させた。装置を種々の時間に取り外し、ＮＭＲチューブに入れた。Ｔ２値は３０秒未満に得られ、装置を異なる濃度のグルコース溶液からオリジナルのグルコース溶液に入れた。
【０１４３】
データ処理：Ｔ２の周期的変化を描いた線が、以下の方程式を用いて得られた：Ｔ２＝Ａ＊ｓｉｎ（Ｂ＊時間＋Ｃ）＋Ｙ、Ａ＝１５．５８、Ｂ＝０．０２５３８３６、Ｃ＝５０．２８３およびＹ＝８３．８０９９。
【０１４４】
実施例１．Ｇｌｕ−ＣＬＩＯナノスイッチ
要旨
水緩和センサを実証するために、グルコースの生理学的濃度をモニタするための試作品を設計した。結合タンパク質としてコンカナバリンＡを使用し、グルコース官能化磁気ナノ粒子（Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ）をを合成した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）はグルコースと反応することが知られている四価のレクチンである。センサのうちのいくつかは、３ｋＤａの孔径を備えた囲い壁を有するように調製した。一般に、センサの囲い壁はＧｌｕ−ＣＬＩＯナノ粒子とＣｏｎＡを保持しつつ、グルコースがセンサを自由に出入りするのを許容する。
【０１４５】
実施例１Ａ．ＧＩｕ−ＣＬＩＯの調製
別記のようにＭＩＯＮ−４７およびアミノＣＬＩＯ（２５−３５ｎｍ）を調製した。（Ｄ）−グルコース、Ｄ−（＋）−塩酸グルコサミン、無水コハク酸、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびセファデックスＧ−２５を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）はＰｉｅｒｃｅ社から購入した（イリノイ州ロックフォード所在）。グルコース官能化ナノ粒子（Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ）を合成するために、ＮＨ2−ＣＬＩＯをまずカルボキシ官能化ナノ粒子に変換し、そ
の後水溶性カルボジイミドを使用して２−アミノのグルコースを結合させた。カルボキシ基官能化ＣＬＩＯを得るために、２．０ｍｇの無水コハク酸を、２００ｕＬ  ＮＨ2−Ｃ
ＬＩＯ（１０ｍｇＦｅ／ｍＬ、２０６４Ｆｅ当たり４２ＮＨ2）  ３００ｕＬ（０．１Ｍ
）ＮａＨＣＯ3緩衝液（ｐＨ８．５）に加えた。混合物を室温で２時間インキュベートし
、ＭＥＳ緩衝液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  ＭＥＳ）（ｐＨ６．０）で溶出したセファデックスＧ−２５カラムを使用してコハク酸を除去した。２−アミノグルコースをカルボキシ官能化ＣＬＩＯ（ＣＬＩＯ−ＣＯＯＨ）と共役するために、２ｍｇ  ＥＤＣおよび２ｍｇ  スルホ−ＮＨＳを５００ｕＬ  ＣＬＩＯ−ＣＯＯＨ（ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に加えた。混合物を室温で２時間反応させ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出したセファデックスＧ−２５カラムにより精製した。続いて２ｍｇ  グルコサミンを上記溶液に加え、混合物を室温で１時間反応させた。未反応のグルコサミンはＰＢＳでセファデックスＧ−２５を用いて除去した。
【０１４６】
実施例１Ｂ．Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡ−グルコースチューブ分析
Ｍｉｎｉｓｐｅｃ緩和測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用して０．４７Ｔ、４０℃にお
おける緩和時間を得た。
【０１４７】
Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ、ＣｏｎＡおよびグルコースの間の相互作用を実証するために、実験をＮＭＲチューブ（半透性の囲い壁なし）で１０μｇ  Ｆｅ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ  ＣｏｎＡにて直接行った。実験はすべて、１ｍＭ  ＣａＣｌ2および１ｍＭ  ＭｇＣｌ2をのＰＢＳで行なった。横方向の緩和時間（Ｔ２）を緩和測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ社のＭｉｎｉｓｐｅｃ（登録商標）１２０）で０．４７Ｔおよび４０℃にて測定した。上記の緩衝液に２０μｇ  Ｆｅ／ｍＬ  ＧＩｕ−ＣＬＩＯを加え、その後１ｍｇ／ｍＬまでのＣｏｎＡと１．５ｍｇ／ｍＬ  グルコースを添加して、サイズをＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ＨＳ  １０００（登録商標）（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、マサチューセッツ州マールボロ所在）で決定した。すべての実験でこれらのイオン、緩衝液、ＣｏｎＡおよびＧＩｕ−ＣＬＩＯの濃度を使用した。
【０１４８】
図３Ａに示されるように、Ｇｌｕ−ＣＬＩＯへＣｏｎＡを添加するとＴ２が低下し、約５０分後に平坦な状態であるプラトーに達したが、アミノ−ＣＬＩＯでは変化が得られなかった。ＣｏｎＡによって引き起こされたＴ２の変化に関連して、レーザ光散乱によるとＧｌｕ−ＣＬＩＯナノ粒子のサイズが３０ｎｍから３０１ｎｍまで増加したが、これはナノ粒子のクラスタリングがＣｏｎＡ添加およびＴ２増加に関連し、システムが磁気緩和スイッチのように作用したことを示している。その後、グルコースの添加により、Ｔ２低下の部分的逆転が起こり、Ｔ２は再び約１００分、１５０分、および２００分後にプラトーに達した。この種の応答は、０．４、０．８および１．８ｍｇ／ｍＬのグルコースの濃度を生成する添加で見られた。センサはヒトの血漿グルコースの生理学的範囲である０．２〜１．８ｍｇ／ｍＬのグルコースに応答した。装置は図３Ｂに示される。
【０１４９】
実施例１Ｃ．Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡ−グルコースチューブ分析
Ｇｌｕ−ＣＬＩＯナノスイッチを１５３ミリ秒のＴ２を得るためにチューブ内で希釈した。ＣｏｎＡを添加するとＴ２は減少し、６５ミリ秒のプラトー値に達した（図４Ａ参照）。
【０１５０】
増大する濃度のグルコースを添加するとこの結果が逆転し、各グルコース濃度で一定のＴ２値が観察された（図４Ｂ参照）。グルコース濃度の生理学的範囲にわたってプラトーなＴ２値が線形の様式で生じた（図４Ｂ参照）。
【０１５１】
さらに、最初の分散されたナノ粒子状態と微小凝集された状態との間の相互切り替え（スイッチ）を調べるために、光散乱値を得た（図４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅ参照）。分散されたナノスイッチは２６ｎｍの平均直径を有し（図４Ｃ参照）、これはＣｏｎＡを添加すると２３０ｎｍの平均直径まで増加し（図４Ｄ参照）、グルコース（４００ｍｇ／ｄｌ）を添加するとその元の粒度分布まで戻った（図４Ｅ参照）。１５３ミリ秒という最初のＴ２の値（図４Ａ参照）はグルコースを添加しても達成されなかった。最初のＴ値と最後のＴ２値の間のこの不一致は、グルコースの濃縮溶液の添加に伴う鉄のわずかな稀釈によると考えられる。ナノスイッチのその元の粒度分布への戻りに基づいて（図４Ｅ参照）、分散されたナノスイッチの状態と微小凝集されたナノスイッチ状態との間の完全な相互変換がグルコース添加により達成された。
【０１５２】
実施例１Ｄ．Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡ−グルコースセンサ分析
次に、チューブに基づく緩和分析の構成成分（図３Ａおよび３Ｂに使用されるＣｏｎＡおよびＧｌｕ−ＣＬＩＯ）を、図５Ｂに示された半浸透性装置に入れ、水緩和に基づくセンサ（体積０．５ｍＬ以下、３  ｋＤａ孔）を得た。センサを０．１ｍｇ／ｍＬ  グルコースで一晩平衡化し、ＭＲ緩和測定装置と共に使用されるガラス管内に入れることにより、９８ミリ秒の安定したＴ２を得た（図５Ａ参照）。その後、センサを第２のチューブ（
１ｍｇ／ｍＬ  グルコース）に入れ、Ｔ２値をモニタした（図５Ａ参照）。１００分後に新たな７０ミリ秒のプラトーが達成されたが、これはＧｌｕ−ＣＬＩＯナノ粒子がグルコースにより分散されたことを示す。その後、センサを０．１ｍｇ／ｍＬ  グルコースで第３のチューブに入れた。Ｔ２は増大し、再び９８ミリ秒のＴ２のプラトーに戻った（図５Ａ参照）。このように、水緩和に基づくグルコースセンサは、可逆的な様式で外部グルコースを感知するために、ＣｏｎＡとＧｌｕ−ＣＬＩＯの間のＴ２依存性平衡を使用する。
【０１５３】
５００ｕＬの上述のＧｌｕ−ＣｏｎＡとＣｏｎＡを１ｋＤａのカットオフ値で直径が７．５ｍｍのセルロースエステル膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）に入れて、外部センサ環境（図５Ｂ）でグルコースと相互作用させるためにＧｌｕ−ＣＬＩＯとＣｏｎＡを半透性センサ内に包囲すると、同様な結果が得られた。センサを混合のためにチューブの底に磁気撹拌装置がある状態で５０ｍＬチューブ内に配置した。種々の時間で、グルコースの外部濃度を変化させ、センサを除去してＮＭＲチューブに入れ、上述のようにＴ２を測定した（結果は図示しない）。
【０１５４】
実施例１Ｅ．ＭＲＩ映像法によるＧｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡ−グルコースセンサ分析
一方は２ｍｇ／ｍＬのグルコースを含みもう一方はグルコースを含まない２つの試験チューブにＧｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡセンサを配置し、臨床ＭＲ映像装置を用いてチューブを撮像した（図６Ａ参照）。Ｇｌｕ−ＣＬＩＯとＣｏｎＡの間の相互作用のＭＲＩによる検出能力を実証するために、半透膜、Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ（１０μｇ  Ｆｅ／ｍＬ）およびＣｏｎＡ（８００μｇ／ｍＬ）を１ｋＤａのカットオフ値で直径５ｍｍの半浸透性チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｄｉｓｐｏｄｉａｌｙｚｅｒ、Ｆｉｓｈｅｒ社）に入れ、センサを上述のように５０ｍＬ  チューブに入れた。２時間後、撹拌棒を除去し、臨床ＧＥ  Ｓｉｇｎａ  １．５Ｔユニットで画像を得た（画像サイズ、２５６×１９２、視界７×１４Ｃｍ、スライス厚さ１．５ｍｍ、ターボスピンエコーパルスシーケンスＴＲ２５００、ＴＥ６５を使用）。
【０１５５】
図６Ｂおよび６Ｃに示されるように、高グルコース環境のセンサは高い信号強度を有志（画像がより明るい）、ナノ粒子の解離と高い（長い）Ｔ２を反映していた。したがって、外部グルコースの濃度はセンサ内の水の信号強度を変化させ、これはＭＲイメージで明らかとなった。
【０１５６】
実施例１Ｆ．ＭＲＩ映像法によるＧｌｕ−ＣＬＩＯ−ＣｏｎＡ−グルコースセンサ分析
ナノスイッチと結合タンパク質が半透性装置内に包囲され、分析物の進入は許容するがナノ粒子と結合タンパク質を保持する孔を備えている場合に、ナノスイッチ／結合タンパク質の平衡が維持されるかどうかをさらに検討した。これにより、センサ環境（透析物）に依存して、分析物濃度は上昇または低下するだろう。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒチューブ材料、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒマイクロカセット、および透析ファイバを含めてできるかぎり多くの異なる装置について調べた。Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒチューブは１００ｍＬビーカーからのセンサの迅速かつ繰り返しの移動を可能にし、ここでグルコース濃度は２０ｍｇ／ｄｌと４００ｍｇ／ｄｌの間でＭＲ緩和測定装置に循環され、Ｔ２測定は１分未満になされた。グルコースの濃度変化に応答して、センサ水のＴ２は約６８〜１００ミリ秒間で循環して変化した（図７参照）。グルコース濃度の増加および減少はいずれも、Ｔ２の変化により明らかなようにナノスイッチの平衡状態を変化させ、ナノスイッチの平衡性がさらに証明された。
【０１５７】
実施例２．ＨＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ
実施例２Ａ．ＨＡ−ＣＬＩＯの調製
赤血球凝集素ペプチド−ＣＬＩＯを合成するために、Ｃ末端システイン（ＹＰＹＤＶＰＤＶＡＧＧＣ）でチオール化したインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドを、Ｒｉ
ｎｋアミド樹脂でのＦｍｏｃ化学（Ｆｍｏｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｎ  Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社）を使用して合成し、逆相ＨＰＬＣにより精製した。ＨＡの分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより確認した。ナノ粒子にＨＡを取り付けるために、アミノ−ＣＬＩＯをまずＳＰＤＰと反応させた。精製後に、２００μＬ  ＳＰＤＰで修飾したＣＬＩＯ（５．０ｍｇ／ｍＬのＦｅ）のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μＬ  ＨＡ（５０ｍＭ）のＤＭＳＯ溶液と混合した。反応は室温で２時間進行した。ＣＬＩＯ共役体をセファデックスＧ−２５カラムにより分離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。一つのナノ粒子当たりのペプチドの数をＳＰＤＰ法により決定した。ナノ粒子は、２０００Ｆｅ当たり２５のＨＡと、図３に示される粒度分布を有していた。
【０１５８】
実施例２Ｂ．ＨＡ−ＣＬＩＯ−抗ＨＡ−ＨＡチューブ分析
Ｍｉｎｉｓｐｅｃ緩和測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用して０．４７Ｔ、４０℃における緩和時間を得た。
【０１５９】
ＨＡ−ＣＬＩＯをＧｌｕ−ＣＬＩＯと置換し、ＨＡ（抗ＨＡ）の抗体をＣｏｎＡと置換した時、図８Ａ−８Ｅで示されるようにナノスイッチは同様の特性を有した。図８Ａに示されるように、Ｔ２は抗ＨＡを添加すると１６２ミリ秒から１４１ミリ秒まで減少した。Ｔ２のプラトー値は５０〜４００ｎＭの間の範囲に亘って変化し（図８Ｂ）、これはＴ２（２．５μＭ−２０μＭ、図４Ｂ）を変更するために必要とされるグルコースの濃度よりも約８０倍低かった。ここでも光散乱データは、分析物（ＨＡ）が微小凝集物の形成を本質的に完全に逆転できることを示した（図８Ｃ、８Ｄおよび８Ｅ参照）。
【０１６０】
実施例３．ＦＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ
実施例３Ａ。ＦＡ−ＣＬＩＯの調製
ＦＡ−ＣＬＩＯを合成するために、アミノ−ＣＬＩＯのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を、まずＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ水和物、０．１ＭＮａＣｌ）（ｐＨ６．０）と交換し、溶液を５．０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。その後、１００μＬ（５０ｍＭ）葉酸のＤＭＳＯ溶液を２００μＬのアミノ−ＣＬＩＯ（５．０ｍｇ／ｍＬ  Ｆｅ）のＭＥＳ溶液（ｐＨ６．０）に加えた。その後、過剰量のＥＤＣ（０．９６ｍｇ、５μｍｏｌ）とスルホ−ＮＨＳ（１．１ｍｇ、５μｍｏｌ）の１００μＬ  ＤＭＳＯ溶液を加えた。反応は２時間室温で進行し、生成物をセファデックスＧ−２５カラムにより精製し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。ＦＡの取り付けを上述のようにＳＰＤＰを用いてアミン基の損失により定量化し、２０００Ｆｅ当たり３３ＦＡで、図９Ｃに示されるような粒度分布を有していた。
【０１６１】
実施例３Ｂ．ＦＡ−ＣＬＩＯ−抗ＦＡ−ＦＡチューブ分析
Ｍｉｎｉｓｐｅｃ緩和測定装置（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用して０．４７Ｔ、４０℃におおける緩和時間を得た。
【０１６２】
ナノスイッチシステムの特性をＦＡ−ＣＬＩＯナノ粒子および結合タンパク質として抗ＦＡに関して検討した。図９Ａに示されるように、抗ＦＡを添加するとＴ２は１５５ミリ秒から１１３ミリ秒まで減少した。Ｔ２値の変化に関連するＦＡの範囲または濃度が図９Ｂに示されており（５−２０ｎＭ）、それは測定されたグルコースの濃度（２．５μＭ−２０μＭ、図４Ｂ）よりも約１０００倍低かった。ここでも光散乱データは、分析物（ＨＡ）が微小凝集物の形成を本質的に完全に逆転できることを示した（図９Ｃ、９Ｄおよび９Ｅ参照）。
【０１６３】
結論として、表面官能化ナノ粒子と結合タンパク質は、外来分析物の濃度に依存して、分散（分離）された低Ｔ２状態（２０−４０ｎｍ）と微小凝集した高Ｔ２状態（２００−
２５０ｎｍ）との間で平衡かつ連続的なスイッチングを維持する。光散乱データに基づくと、高濃度の外来分析物は微小凝集物の構成を完全に逆転させ、システムを平衡プロセスに期待される元の分散状態に戻した。ナノスイッチと、グルコース、ＦＡおよびＨＡに対する結合タンパク質の使用によって示されるように、ナノスイッチは比較的広範囲の濃度にわたって化学的に多様な分析物を検出することができた。
【０１６４】
発明の他の実施形態
本発明の多くの実施形態について説明したが、本発明の趣旨および範囲から外れずに種々の改変をなし得ることが理解されるだろう。例えば、２つ以上のキレート化部分を、一つのモノマー基質分子に組み入れることができる。従って、他の実施形態も特許請求の範囲にある。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１Ａ】一価の分析物を検出するための水の緩和に基づくセンサの一実施形態の断面図。
【図１Ｂ】一価の分析物を検出するための水の緩和に基づくセンサの一実施形態の断面図。
【図１Ｃ】ナノ粒子が互いに直接結合でき、分析物が凝集／分離を媒介できるセンサ形態の実施形態の略図。
【図１Ｄ】核酸断片上の塩基配列の検出がナノ粒子の自己集合を媒介し得るセンサ形態の実施形態の略図。
【図２】グルコースにリンクされた架橋酸化鉄ナノ粒子（Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ）の合成を示す反応スキーム。
【図３Ａ】Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ／ＣｏｎＡ配置を使用した、グルコースに対するチューブに基づく水緩和分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフ。
【図３Ｂ】分析装置の写真
【図４Ａ】Ｇｌｕ−ＣＬＩＯ  ナノスイッチ／ＣｏｎＡ配置を使用した、グルコースに対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフ。
【図４Ｂ】種々のグルコース濃度で得られたＴ２値（プラトーでの）の変化のグラフ。
【図４Ｃ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図４Ｄ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図４Ｅ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図５Ａ】水緩和センサを種々の外部グルコース濃度の溶液と接触させることにより得られたＴ２緩和時間の変化のグラフ。
【図５Ｂ】含グルコース試料媒体を含むセンサおよび装置の写真。
【図６Ａ】ＭＲＩによって視覚化されたグルコースに対する水緩和センサの反応に対応する画像。
【図６Ｂ】ＭＲＩによって視覚化されたグルコースに対する水緩和センサの反応に対応する画像。
【図６Ｃ】ＭＲＩによって視覚化されたグルコースに対する水緩和センサの反応に対応する画像。
【図７】グルコース濃度を増加または減少させた時のＴ２の時間依存性の変化を示すグラフ。
【図８Ａ】ＨＡ（抗ＨＡ）配置へのＨＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ／抗体を使用する、インフルエンザ赤血球凝集素ペプチド（ＨＡ）に対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフ。
【図８Ｂ】種々のＨＡ濃度で得られたＴ２値の変化のグラフ。
【図８Ｃ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図８Ｄ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図８Ｅ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図９Ａ】ＦＡ（抗ＦＡ）配置へのＦＡ−ＣＬＩＯナノスイッチ／抗体を使用する、葉酸（ＦＡ）に対するチューブに基づく分析で得られたＴ２緩和時間の変化のグラフ
【図９Ｂ】種々のＦＡ濃度で得られたＴ２値の変化のグラフ。
【図９Ｃ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図９Ｄ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図９Ｅ】光散乱実験により得られた粒径分布のグラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
2008541089.tif 000021
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2008541089.tif 000023
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2008541089.tif 000025
【図７】
2008541089.tif 000026
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2008541089.tif 000031
【図９Ａ】
2008541089.tif 000032
【図９Ｂ】
2008541089.tif 000033
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【国際調査報告】
2008541089.tif 000037
2008541089.tif 000038
2008541089.tif 000039