(57)【要約】本発明は、対象において疾患反応を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、ＭＤＡ決定因子及びカルジオリピンからなる群より選択される抗原を露出する対象の死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識し結合する抗体又は組換えタンパク質とを接触させ、それによって対象において病理的反応を抑制することを包含する方法に関する。一つの実施形態において、本発明は、対象の瀕死細胞及び死細胞に露出する抗原を認識し結合する可変抗体領域又は機能的に同等の作用物質を使用した処置により、自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患を改善する方法を対象とする。
2008530019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の病理的自己免疫反応を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を露出する該対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識し結合する結合タンパク質とを接触させ、それによって該対象の該病理的自己免疫反応を抑制することを包含する、方法。
【請求項２】
該病理的自己免疫反応が炎症反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該結合タンパク質が抗体又はそのフラグメント若しくは変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該抗体が、該死細胞又は瀕死細胞のホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を認識し結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該ＰＣ決定因子を認識し結合する抗体が、Ｔ１５抗体又はそのフラグメント若しくは変異体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該Ｔ１５抗体が未変性又は修飾された定常領域を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該定常領域がＩｇＧ定常領域である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該Ｔ１５抗体変異体が、少なくとも野生型Ｔ１５抗体の抗原結合領域を含むＴ１５組換え分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該Ｔ１５抗体フラグメントが、Ｔ１５  Ｆａｂ分子、Ｔ１５  Ｆ（ａｂ′）２分子、Ｔ１５  Ｆｖ分子又はＴ１５  ｓｃＦｖ分子である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
対象の病理的自己免疫反応を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を露出する該対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する複数個の抗原を認識し結合する複数個の結合タンパク質とを接触させ、これにより該死細胞又は瀕死細胞が該対象から排除されることで、該対象の該病理的自己免疫反応を抑制することを包含する、方法。
【請求項１１】
対象からの死細胞又は瀕死細胞の排除を増強する及び／又は該対象の炎症反応を抑制するのに有効な量の該結合タンパク質を使用して、請求項１又は１０に記載の方法により該対象の病理的自己免疫反応を抑制することにより、該対象の自己免疫系疾患を処置する方法。
【請求項１２】
該免疫系疾患が炎症性疾患又は障害である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該免疫系疾患が紅斑性狼瘡又はループス腎炎又は糸球体腎炎である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該免疫系疾患が、乾癬、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、関節炎、多発性筋炎及び強皮症からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
関節炎が乾癬性関節炎又は炎症性関節炎である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該炎症性疾患がアテローム硬化型疾患である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
該免疫系疾患が治療的移植の合併症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
治療的移植の該合併症が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
治療的移植の該合併症が移植片拒絶反応である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
該移植片拒絶反応が同種移植片拒絶反応である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該免疫系疾患が黄斑変性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択され、該死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原に特異的な結合タンパク質を対象に投与することで、該対象の循環自己抗体のレベルを低減することにより、自己免疫性反応の症状を低減するために該対象の循環自己抗体のレベルを低減する方法。
【請求項２３】
死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する又は炎症促進性可溶性因子若しくは細胞関連因子の産生に関連する自己免疫性疾患を改善する方法であって、該死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞を特異的に認識し結合する抗体とを接触させ、それによって該自己免疫性疾患を改善することからなり、該抗体が、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を認識する、方法。
【請求項２４】
炎症促進性可溶性因子又は細胞関連因子の産生に関連する疾患を改善する方法であって、死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞を特異的に認識し結合する抗体とを接触させ、それによって該疾患を改善することからなり、該抗体が、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を認識する、方法。
【請求項２５】
Ｔ１５抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質。
【請求項２６】
該タンパク質がヒト／マウスキメラ抗体である、請求項２５に記載の組換えタンパク質。
【請求項２７】
該抗原結合領域が未変性又は修飾ＩｇＧ尾部と連結する、請求項２５に記載の組換えタンパク質。
【請求項２８】
請求項２５に記載の組換えタンパク質のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２又はＦｖフラグメント。
【請求項２９】
２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体であって、該抗原の一方が、請求項２５に記載の組換えタンパク質が結合する抗原である、抗体。
【請求項３０】
該タンパク質が治療因子と結合して組換えタンパク質コンジュゲートを形成する、請求項２５に記載の組換えタンパク質。
【請求項３１】
該治療因子が、抗腫瘍薬、毒素、放射性作用物質、第２の抗体又は酵素である、請求項３０に記載の組換えタンパク質。
【請求項３２】
プロドラッグを細胞毒に変換できる酵素に結合する請求項２５に記載の組換えタンパク質を含む免疫コンジュゲートと、前記プロドラッグとの組み合わせ。
【請求項３３】
プロドラッグを細胞毒に変換できる酵素に結合する請求項２５に記載の組換えタンパク質を含む免疫コンジュゲートと、前記プロドラッグとの組み合わせを含む組成物。
【請求項３４】
化学療法に関連する症状を緩和する方法であって、請求項２５に記載の組換えタンパク質の薬学的有効量を患者に投与し、それによって炎症を抑制し、化学療法に関連する徴候及び症状、合併症を緩和することを包含する、方法。
【請求項３５】
対象の炎症反応を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を発現する対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識し結合する結合タンパク質とを接触させ、それによって該対象の該炎症反応を抑制することを包含する、方法。
【請求項３６】
該結合タンパク質が抗体又は組換えタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該抗体が、該死細胞又は瀕死細胞のホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を認識し結合する抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該ＰＣ決定因子を認識し結合する抗体が、Ｔ１５抗体又はその変異体若しくはフラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該Ｔ１５抗体変異体が、少なくとも野生型Ｔ１５抗体の抗原結合領域を含むＴ１５組換え分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該Ｔ１５抗体フラグメントが、Ｔ１５  Ｆａｂ分子、Ｔ１５  Ｆ（ａｂ′）２分子、Ｔ１５  Ｆｖ分子又はＴ１５  ｓｃＦｖ分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
対象の自己免疫反応を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原を露出する該対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識し結合する結合タンパク質とを接触させ、これにより該死細胞又は瀕死細胞を該対象から排除されることで、該対象の該自己免疫反応を抑制することを包含する、方法。
【請求項４２】
対象からの死細胞又は瀕死細胞の排除を増強する及び／又は該対象の炎症反応を抑制するのに有効な量の結合タンパク質を使用して、請求項３５又は４１に記載の方法により該対象の自己免疫反応を抑制することにより、該対象の免疫系疾患を処置する方法。
【請求項４３】
対象からの死細胞又は瀕死細胞の排除を増強する及び／又は該対象の炎症反応を抑制するのに有効な量の抗体を使用して、請求項３５又は４１に記載の方法により該対象の自己免疫反応を抑制することにより、該対象の炎症性疾患プロセスを処置する方法。
【請求項４４】
該免疫系疾患が炎症性疾患である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
該免疫系疾患が、紅斑性狼瘡又はループス腎炎又は糸球体腎炎である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
該免疫系疾患が、乾癬、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、関節炎、多発性筋炎及び強皮症からなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
関節炎が乾癬性関節炎又は炎症性関節炎である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該炎症性疾患がアテローム硬化型疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
該免疫系疾患が治療的移植の合併症である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
治療的移植の該合併症が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
治療的移植の該合併症が移植片拒絶反応である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
該移植片拒絶反応が同種移植片拒絶反応である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
該免疫系疾患が黄斑変性である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する又は炎症促進性可溶性因子若しくは細胞関連因子の産生に関連する自己免疫性疾患を改善する方法であって、該死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞のホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、若しくはカルジオリピンを有する抗原、又はそれらの代謝産物を認識し結合する結合タンパク質の有効量とを接触させ、それによって該自己免疫性疾患を改善することを包含する、方法。
【請求項５５】
死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する又は炎症促進性可溶性因子若しくは細胞関連因子の産生に関連する炎症性疾患を改善する方法であって、該死細胞又は瀕死細胞と、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、若しくはカルジオリピンを有する抗原、又はそれらの代謝産物、又はその他のリン脂質の代謝産物を認識し結合する結合タンパク質の有効量とを接触させることを包含する、方法。
【請求項５６】
該結合タンパク質が、該死細胞又は瀕死細胞のホスホリルコリン決定因子を認識し結合する抗体である、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
該結合タンパク質が、該死細胞又は瀕死細胞のホスホリルコリンを認識し結合する組換えタンパク質である、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５８】
ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原、又はその他のリン脂質部分の代謝産物を露出する対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する１つ以上の抗原を認識し結合する１つ以上の抗体とを接触させることで、該対象からの該死細胞又は瀕死細胞の排除を改善することにより、該死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する又は炎症促進性可溶性因子若しくは細胞関連因子の産生に関連する対象の自己免疫性疾患状態を改善する方法。
【請求項５９】
ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を有する抗原、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子を有する抗原、ＭＤＡ決定因子を有する抗原、及びカルジオリピンを有する抗原からなる群より選択される抗原、又はその他のリン脂質部分の代謝産物を露出する対象の死細胞又は瀕死細胞と、該死細胞又は瀕死細胞に露出する１つ以上の抗原を認識し結合する１つ以上の抗体とを有効量接触させることで、該対象の白血球活性又はサイトカイン産生を抑制又は調節することにより、該死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する又は炎症促進性可溶性因子若しくは細胞関連因子の産生に関連する対象の自己免疫性疾患状態を改善する方法。
【請求項６０】
該白血球活性が、リンパ球、樹状細胞、及び／又はマクロファージ、及び／又はその他の食細胞からなる群より選択される白血球の活性である、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、死細胞又は瀕死細胞の除去障害に関連する免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患）の症状を低減するための、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識する結合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの自己免疫性疾患は、死細胞又は瀕死細胞の除去障害に関連することが部分的に原因となって生じると考えられている。例えば、ループス患者は、アポトーシス細胞を排除する能力に欠陥があることが示されている１。毎日１０１０を超える細胞が代謝回転しており、これらの細胞の死骸を適切に除去できない場合に、これらの細胞成分が体内で炎症を誘導する可能性がある。これらの細胞から放出される自己抗体は、自己免疫性Ｂ細胞及びＴ細胞反応を誘導する可能性があり、この反応が病理的自己免疫性疾患の発症をもたらすか又はそれに寄与する可能性がある。
【０００３】
これまでのところ、ｉｎ  ｖｉｖｏアポトーシス排除を増強する能力に基づいて実用的な治療剤を開発できるという証拠は全く報告されていない。アポトーシス排除を増強する作用物質は又、細胞及び細胞分解産物、マクロファージの細胞及び樹状細胞、並びに潜在的なその他の細胞においてアポトーシス膜成分を有するこれらの錯体間で相互作用する能力に影響を及ぼし、これらの遭遇が、適応及び先天性免疫系の細胞に関わる免疫及び炎症反応の強度又は性質を減少、変更又は調節する。
【０００４】
死細胞又は瀕死細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ排除は、多数の表面リガンド、架橋分子、食細胞受容体及びシグナル伝達トランスデューサーを伴う複雑な多段階プロセスである（２で考察）。死亡プロセスは各細胞で異なるため、死の各段階に関連する膜変化、並びにアポトーシスの初期及び後期段階にある細胞の明確な経路を特定することができる３；４。このようなアポトーシスに関連する変化は、アポトーシス誘導事象（例えば、ミトコンドリア事象）による酵素的変化又は酸化剤損傷を反映する場合がある。
【０００５】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）で以前に示されているように５、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子は、リン脂質（ＰＬ）の酸化調節に関連するプロセスにより、酵素的又は非酵素的機序により、初期アポトーシス時に露出される６。アポトーシス細胞は、壊死細胞と異なる細胞反応を引き起こし、その反応が膜関連シグナルにおける差を生じる場合があると報告されているが、最近の報告では、これが壊死細胞からのＨＭＧＢｌのような炎症誘導性因子の放出に起因する可能性があることが示唆している７。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、マクロファージの特性がＰＳとの相互作用によって変わり得ることが示されているが８、ｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用の実用及び治療上の影響は、依然として不明なままである。
【０００６】
初期補体因子Ｃｌｑ、Ｃ２及びＣ４の欠失状態は、人をループス様症候群に罹患しやすくすることが長い間知られてきたが、これが死細胞又は瀕死細胞の排除の障害と関連付けられたのはつい最近のことである。重要なことに、最初の報告では、補体成分がアポトーシス細胞の変質表面に自然に沈着することが示されたものの９；１０、より最近の報告では、Ｃｌｑの効果的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ沈着には、成体マウス由来のポリクローナルＩｇＭの存在が実際に必要であることが示されている１１。Ｃｌｑの沈着は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（即ち、補体受容体３、ＣＲ３）及び量は少ないもののＣＤ１１ｃ（例えば、補体受容体４、ＣＲ４）のリガンドである、免疫コンジュゲート（ＩＣ）関連抗原におけるＣ３ｂｉ及びＣ４の共有結合をもたらす。意義深いことに、マクロファージ（Ｍφ）及び樹状細胞（ＤＣ）には高レベルのＣＲ３及びＣＲ４が存在しており、これらの補体受容体を媒介した相互作用により、細胞活性を調節する可能性がある活性化シグナルが変換される可能性がある。全てのＩｇＭ抗体がこれらの特性を有するかどうか、又はそのような機能活性が、特定の定義された結合特異性を有するＩｇＭ抗体のサブセットのみとの遭遇によってもたらされるかどうかの証拠は報告されていない。
【０００７】
循環ＩｇＭが全体の免疫恒常性に影響を及ぼす可能性があるという仮説の裏付けとして、循環ＩｇＭを欠失するマウスは、ループス様自己免疫性疾患を発症することが報告されている１２；１３。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では、ヒトポリクローナルＩｇＭ抗体とのインキュベーションが、補体成分の沈着を促進することによって、排除のために壊死細胞破壊片を標識する可能性があることが示されており１４、このことは、ポリクローナルＩｇＭが老化赤血球の排除を助ける可能性があるという過去の報告と一致している１５。ポリクローナルヒトＩｇＭ内の一部の抗体は、アポトーシス細胞に発現するＰＣ関連の決定因子も認識することが報告されているが１４、これらのヒトＩｇＭ抗体の受動伝達が、ｉｎ  ｖｉｖｏアポトーシス排除に影響を及ぼす可能性があるか、又は免疫特性を伝達若しくは変更するかどうかについては報告されていない。
【０００８】
天然又は野生型マウスＴ１５抗体は、形質細胞腫により産生されるＩｇＡ抗体であると当初報告されたが、後に天然ＩｇＭ抗体（即ち、前免疫処置のない又は証明できる意図的な免疫暴露のない多くのマウス株で産生される抗体の種類）であることが報告されており、アポトーシス細胞を含めた死細胞又は瀕死細胞に特異的であることが現在知られている決定因子をこの抗体が認識する６。マウスＴ１５抗体は、肺炎球菌のテイコ酸細胞壁多糖（Ｃ−ＰＳ）の免疫優性ＰＣ部分に特異的であることが最初に報告された１６。Ｔ１５抗体はハプテンとしてＰＣを結合するが、ホスファチジルコリン（ＰｔＣ）のような減少した天然リン脂質には、たとえこれらの天然リン脂質がＰＣ基を含有していたとしても、結合しない。しかし、（特定のＴ１５Ｈ：κ２２Ｌ対を発現する）プロトタイプＴ１５抗体の再配列は、スプライス部位における「Ｎ」（非鋳型）の挿入が欠けており、このことは、Ｎ挿入の原因となる末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を周産期肝臓Ｂ細胞が発現しないために１７、これらの再配列が発生の初期に起こり、後にＢ−１細胞区画に専ら現れることを示唆している。ほとんどの成体マウスにおいて、Ｔ１５クローン特異的マーカーを発現するＰＣ反応性Ｂ細胞は、肺炎球菌に対する反応を含めた全ての抗ＰＣ反応で優位を占める１８。全ての抗ＰＣ抗体の中でも、Ｔ１５抗体は１９〜２１、血液からの微生物の効果的な排除によって２３、実験株からの全身的肺炎球菌感染に対して最大の保護を提供する２２。
【０００９】
Ｔ１５抗体は、図１に示すように、リン脂質を含有する酸化修飾された低密度のリポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）に発現するＰＣを認識し結合することも示されている６；２４。マクロファージはＯｘＬＤＬを認識し、取り込み、排除することができるものの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用する試験では、Ｔ１５  ＩｇＭと同じ可変領域遺伝子によりコードされるＥＯ６抗体を添加することで、アポトーシス細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ取り込み及び排除が阻止されることが報告されている２５。このデータは、本明細書に記載される組成物と大きく異なる活性が、食細胞とＴ１５  ＩｇＭの抗ＰＣ抗体及び機能的に同等の抗体との相互作用により誘導されることの示唆となった。又、このデータは、食細胞の排除活性に影響を及ぼすことによって、治療ベネフィットがその他の炎症性又は自己免疫性疾患にどのように付与されるかを予測していない。
【００１０】
炎症性障害及び／又は自己免疫性疾患の現在の処置には、コルチコステロイドのような免疫抑制薬及び、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドのような薬剤を投与することが含まれる。これらの免疫抑制薬は、対象の免疫系の細胞に加えて、体の多くの細胞に影響を及ぼす。加えて、インフリキシマブ、エタネルセプト、キナレット又はその他のサイトカイン遮断薬若しくは拮抗薬のような特定のサイトカイン遮断物質といった治療法も開発されている。何れかの種類の作用物質の長期的な使用は、感染の危険性を高め、場合によっては癌を発症する危険性を高める可能性がある。更に、これらの薬剤は単に疾患の進行を遅延するだけであり、通常は処置が中断されると進行が再開する。加えて、これらの非特異性薬剤による長期の治療は、腎不全、骨髄抑圧、肺線維症、糖尿病及び肝機能障害を含めた有毒な副作用を生じることが多い。これらの薬剤は、数ヵ月から数年間にわたり使用していく内に徐々に効果が薄れていく場合もある。
【００１１】
或いは、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）並びにプレドニゾン及びメチルプレドニゾロンのようなコルチコステロイド化合物を含む抗炎症性薬である治療剤が使用されてきた。しかし、これらのステロイドは、長期的な使用に伴う著しく有毒な副作用も有する。
【００１２】
従って、炎症性障害及び／又は自己免疫性疾患の現行の処置は、著しく有毒な副作用を伴う限定的な効能を示すことが多く、多くの場合、長期間連続して使用することができない。
【００１３】
このため、このような自己免疫性疾患及び炎症性疾患を処置するのに効果的で、より強力な処置が求められており、主要な病原経路を中断する作用物質の投与によって大きなベネフィットがもたらされる可能性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、対象の自己免疫又は自己免疫性疾患を抑制する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）決定因子、リノール酸過酸化物、マロンジアルデヒド及び４−ヒドロキシノネナール、並びにカルジオリピンからなる群より選択される、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原との相互作用によって死細胞又は瀕死細胞を特異的に認識し結合する結合タンパク質（例えば、組換えタンパク質又は抗体又はそのフラグメント若しくは変異体）を対象に投与し、それによってアポトーシス排除の効果に影響を及ぼす、並びに／或いはマクロファージ及び／又は樹状細胞が疾患に関連する免疫及び／又は炎症反応状態を誘導又は調節する又は低下する能力に影響を及ぼすことを包含する方法を提供する。別の実施形態において、この方法は、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、ＭＤＡ決定因子及びカルジオリピンからなる群より選択される抗原を露出する死細胞又は瀕死細胞を、抗原の１つ以上を認識し結合する抗体のような結合タンパク質の１つ、数個又は複数個と対象において接触させ、これにより死細胞又は瀕死細胞が対象から効果的に排除されることで、対象の自己免疫、自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患を抑制することからなる。
【００１５】
本発明は、対象の瀕死細胞及び死細胞に露出する抗原を認識し結合する可変抗体領域又は機能的に同等の作用物質を使用した処置により、自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患を改善する方法を対象とする。
【００１６】
本発明は又、死細胞又は瀕死細胞におけるホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、マロンジアルデヒド、カルジオリピン、若しくはこれらの代謝産物、又はその他のリン脂質の代謝産物からなる群より選択される、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を認識し結合する組換えタンパク質又は抗体によって自己免疫性疾患又は炎症性疾患を改善する方法を対象とする。
【００１７】
本発明は更に、化学療法の処置に関連する（例えば、死細胞又は瀕死細胞の排除障害に関連する）徴候及び症状（例えば、望ましくない副作用）を緩和する方法であって、抗体（そのフラグメント若しくは変異体を含む）又は組換えタンパク質のようなＴ１５  ＰＣ結合タンパク質の薬学的有効量を患者に投与し、それにより炎症を抑制し、化学療法に関連する症状（例えば、望ましくない副作用）を緩和することを包含する方法を提供する。
【００１８】
加えて、本発明は、抗体又は組換えタンパク質、例えばＴ１５抗体の抗原結合領域の全て又は一部を含有する抗体又は組換えタンパク質のような結合タンパク質を提供する。一実施形態において、組換えタンパク質は、ヒト／マウス組換え抗体であり、その抗原結合領域は、Ｔ１５抗体のその標的抗原への免疫特異的結合を競合的に阻害するか、又は死細胞及び／若しくは瀕死細胞に発現する抗原に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合特異性及び活性を有する。又、医薬組成物及びキットも提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本出願の全体を通して、種々の文献が参照されている。これらの文献の開示内容は、本発明が関連する技術の状態をより詳細に説明するため、その全体が参考として本出願に組み入れられている。
【００２０】
本発明の方法及び組成物
方法
本発明は、抗原を認識する結合タンパク質又は小型分子を使用する、抗原を露出する死細胞又は瀕死細胞に関連する、対象の免疫反応（例えば、自己免疫反応）及び／又は免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患、病理的自己免疫性疾患若しくは状態、及び／又は炎症性疾患）を抑制する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、死細胞又は瀕死細胞に露出する、リン脂質であるか若しくはそれを含む抗原を、又はリン脂質誘導抗原を認識し結合する結合タンパク質（例えば、抗体）を接触させ、対象において免疫反応（例えば、自己免疫、又は炎症性疾患、又は自己免疫性疾患を含む反応）の抑制をもたらすことからなる。別の実施形態において、この方法は、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、ＭＤＡ決定因子及び／又はカルジオリピンの何れかを含む抗原を露出する死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞に露出する複数個の抗原を認識し結合する複数個の結合タンパク質（例えば、抗体）とを接触させ、これにより死細胞又は瀕死細胞が対象からより急速及び／又は効果的に排除されることで、対象の自己免疫、又は自己免疫性疾患、又は炎症性疾患を抑制することからなる。
【００２１】
本明細書で使用される「病理的自己免疫性反応」には、対象のリンパ球が、炎症並びに
／又は組織傷害及び損傷の設定において、体の成分（例えば、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の自己活性）を認識する臨床状態が含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される「結合タンパク質」は、死細胞又は瀕死細胞において露出する抗体を認識する分子を意味する。結合タンパク質には、露出抗原を認識する領域を含有する任意の物質が含まれ、又、本発明の抗体（抗体のフラグメント又は変異体を含む）、その組換えタンパク質、及びその小型分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書で使用されるこの「抑制」とは、当該技術分野で認められる試験により検出される炎症反応（例えば、コラーゲン誘導関節炎モデルで誘導される、関節腫脹及び関節への白血球浸潤）に必須の受容体、シグナル伝達経路又は分子の活性化を妨害することを意味する。抑制は部分的である場合もあれば、全体的である場合もある。別の例では、炎症反応の抑制は、ＩＦＮ  Ｉ型及びＩＩ型、並びにＩＬ−２のような関連するサイトカインといった炎症因子及びメディエーターの低減を測定することによって検出することができる。抑制は部分的である場合もあれば、全体的である場合もある。
【００２４】
本明細書で使用される、自己免疫又は炎症反応の症状の低減とは、例えば、自己免疫又は炎症反応が生じる上で必須となる抗原を露出する死細胞又は瀕死細胞の排除を増強することによって、自己免疫又は炎症反応の症状を改善することを意味する。症状には、関節腫脹及び関節への白血球浸潤（関節炎）、自己免疫又は炎症反応に関連する因子及びメディエーター、例えばＩＦＮ  Ｉ型及びＩＩ型、並びにＩＬ−２を含めたサイトカイン、並びにインターフェロンγの減少が含まれるが、過剰発現する特定のサイトカインは疾患によって異なる。加えて、何れの理論にも束縛されるものではないが、本発明の方法及び組成物は、対象の死細胞又は瀕死細胞と相互作用することができる白血球の反応を変更することによって、対象の自己免疫又は炎症性疾患の症状を抑制又は低減する。
【００２５】
本発明の実施によると、「死細胞又は瀕死細胞」には、プログラム細胞死（例えば、アポトーシスによる）、自食又は非プログラム細胞死（例えば、壊死又は傷害による）を含めた任意の経路による細胞死又は瀕死が含まれる。
【００２６】
本発明の実施によると、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原とは、新たに露出する、即ち細胞が死亡又は瀕死している場合にのみ露出する抗原である。健康な細胞において、この抗原は細胞膜に存在する場合もあるが、抗体（例えばＴ１５抗体）はこれらの細胞に結合せず、これらの細胞への結合を低減する作用を示すため、これは不可解であり、除外する。
【００２７】
これらの死細胞又は瀕死細胞における抗原は、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子６、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子２６、ＭＤＡ決定因子２５及びカルジオリピン２７；２８の何れかを含む場合がある。死細胞及び瀕死細胞に発現するその他の機能的に同等の抗原又は決定因子は、抗原又は決定因子の素生が不明であっても、本発明により産生される抗体又は組換えタンパク質によりターゲティングされる場合がある。
【００２８】
本発明の実施によると、死細胞又は瀕死細胞に露出する、露出脂質である抗原、又はリン脂質誘導抗原には、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、ＭＤＡ決定因子及びカルジオリピンの何れかを含む抗原が含まれるが、これに限定されない。
【００２９】
方法の一実施形態において、抗体は、死細胞又は瀕死細胞に露出するホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子を認識し結合する抗体である。例えば、ＰＣ決定因子を認識し結合する抗体は、Ｔ１５抗体又はその変異体若しくはフラグメント、又は機能的に同等のタンパク質である場合がある。本発明の方法における使用に好適な抗体又はその変異体若しくはフラグメントの更なる例については、上記の表題「組成物」を参照されたい。
【００３０】
本明細書で使用される「Ｔ１５抗体又はその変異体若しくはフラグメント」は、Ｔ１５抗体、又はＳｈａｗ，  ｅｔ  ａｌ．６に記載のＴ１５抗体の同一又は密接に関連する可変領域を含む任意の抗体又はその変異体若しくはフラグメントを意味する。変異体は、親分子の配列類似性及び活性を共有する分子である。例えば、Ｔ１５抗体の変異体には、Ｓ１０７．１重鎖可変領域遺伝子でコードされ、ＰＣ及び／又はその他のリン脂質誘導決定因子を認識し結合する、Ｔ１５抗体の可変ドメインに少なくとも８０％類似しているアミノ酸配列を有する分子が含まれる。変異体とは、Ｔ１５配列によりコードされるものからの、アミノ酸の配列及び／又は化学性質の任意の変化、例えばアミノ酸類似体を意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ又はヒト化抗体であってもよい。
【００３１】
一実施形態において、Ｔ１５抗体フラグメントはＴ１５  Ｆａｂ分子であってもよい。別の実施形態において、Ｔ１５抗体フラグメントはＴ１５  Ｆ（ａｂ′）２分子であってもよい。尚更に、Ｔ１５抗体フラグメントはＴ１５  Ｆｖ分子であってもよい。加えて、別の例において、Ｔ１５抗体フラグメントはＴ１５単鎖Ｆｖ分子である。
【００３２】
本発明は、対象においてホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、ＭＤＡ決定因子及びカルジオリピンの何れかを含む露出抗原を有する死細胞又は瀕死細胞と接触させる結合タンパク質（例えば、抗体又は組換えタンパク質）により、対象の炎症反応を抑制する（例えば、炎症反応を低減する）方法を更に提供する。更なる実施形態において、この方法は、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン（ＰＳ）決定因子、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）決定因子及びカルジオリピンの何れかを含む１つ以上の露出抗原を有する死細胞又は瀕死細胞と、死細胞又は瀕死細胞に露出する１つ以上の抗原を認識し結合する抗体（そのフラグメント又は変異体を含む）とを接触させ、それによって対象の炎症反応を抑制することからなる。
【００３３】
本明細書で使用される「炎症反応」は、特定の種類のサイトカイン、ヒスタミン、ケモカイン、プロスタグランジン等が含まれてもよいが、これらに限定されない炎症メディエーターの放出を伴う、対象の傷害又は免疫化又は免疫反応の部位への細胞の動員を意味する。炎症は、組織破壊、破壊性サイトカイン及びケモカインの放出、並びに先天性及び適応免疫系の細胞の異常な組織蓄積の存在により定義される。
【００３４】
加えて、本発明は、癌を有する及び／又は化学療法を受けている対象に結合タンパク質（本発明の抗体又は組換えタンパク質）の薬学的有効量を投与し、それにより炎症を抑制し、化学療法に関連する徴候、症状及び／又は合併症を緩和することによって、癌又は化学療法に関連する徴候、症状及び／又は合併症を緩和する方法を提供する。
【００３５】
本明細書で使用される、本発明の組成物（例えば、結合タンパク質）の「有効量」は、炎症を抑制又は低減する（例えば、炎症の症状を低減する）、並びに／又は組織損傷及び破壊を抑制又は低減する量として定義される。例えば、Ｔ１５抗体の有効量は、死細胞又は瀕死細胞に結合した時に、体の傷害領域又はその他からの死細胞又は瀕死細胞の除去を促進する結合タンパク質（例えば、抗体）の量として定義される場合がある。これらの結合タンパク質は、マクロファージ若しくは樹状細胞、又はその他の白血球を誘導して、炎症誘導表面分子を発現するか、又はサイトカイン若しくはその他の可溶性因子を放出する場合もある。
【００３６】
本発明の組成物（例えば、抗体又は組換えタンパク質のような結合タンパク質）の投与及び用量レジメンの最も効果的な様式は、処置する疾患の位置、程度又は種類、医学障害の重篤度及び経過、対象の健康及び処置に対する反応、並びに処置する医師の判断により異なる。従って、本発明の組成物の用量は、個別の対象及び／又は特定の医療状態若しくは疾患に滴定する必要がある。
【００３７】
一例として、表面積ｍｇ／ｍ２に基づく、種々の大きさ及び種類の動物並びにヒトの用量の相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，  Ｅ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．２９に記載されている。用量レジメンの調整は、疾患の原因である免疫反応、又は移植後の移植片拒絶反応を最適に抑制又は調節するために行われる場合があり、例えば、用量を分けて、毎日又は毎週又は隔週又は毎月投与される場合もあれば、状況に応じてそれに合うように用量が低減される場合もある（例えば、数回に分けた用量が毎日投与される場合もあれば、特定の治療状態に応じてそれに合うように用量が低減される場合もある）。
【００３８】
適切な臨床結果を達成するのに必要な本発明の組成物の用量は、スケジュールの最適化によって更に低減される場合があることは明白なはずである。
【００３９】
本発明は、死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原を特異的に認識し結合する、抗体のような結合タンパク質により、免疫系疾患（例えば、自己免疫性疾患又は炎症性疾患）の症状を低減する方法を更に提供する。
【００４０】
本発明は、自己免疫性疾患状態を改善する（例えば、その症状を低減する）方法であって、死細胞又は瀕死細胞を特異的に認識し結合する結合タンパク質（例えば、抗体又は組換えタンパク質）を対象に投与することを包含する方法を更に提供する。この方法の実施によると、組換えタンパク質は、抗体可変領域又はその部分を含んでもよい。この方法によると、抗体は、死細胞又は瀕死細胞に露出する、ホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、マロンジアルデヒド、カルジオリピン、若しくはこれらの代謝産物、又はその他のリン脂質の代謝産物を認識し結合する、可変抗体領域又はその部分を含む。
【００４１】
本明細書で使用される、疾患を「改善する」とは、例えば、薬剤又はその他の療法によって疾患を管理することにより改善を得ることを意味する。
【００４２】
疾患の「処置」は、疾患の症状を改善する、疾患の重篤度を低減する、疾患の進行の経過を変更する、及び／又は疾患の基本的な問題を改善又は治癒する場合がある。例えば、自己免疫性疾患を処置することは、免疫反応を制御、調節又は抑制することにより達成される場合がある。或いは、自己免疫性疾患を処置することは、本明細書に記載される本発明の組成物のような薬剤の使用を通じて疾患の発症又は進行を防止することにより達成される場合がある。
【００４３】
一実施形態において、炎症性疾患を改善する（例えば、その症状を低減する）方法は、死細胞又は瀕死細胞を認識し結合する結合タンパク質（例えば、抗体、又は本発明の抗体、又は組換えタンパク質）を対象に投与することからなる。この方法の実施によると、組換えタンパク質は、リン脂質抗原を認識する抗体可変領域又はその部分を含む。更に、この方法の実施によると、抗体は、新たに露出する抗原（これには、ホスホリルコリン、ホスファチジルセリン、マロンジアルデヒド、カルジオリピン、若しくはこれらの代謝産物、又はその他のリン脂質の代謝産物が含まれるが、これらに限定されない）のために、死細胞又は瀕死細胞を認識し結合する。好ましい実施形態において、抗体は、死細胞又は瀕死細胞に露出するホスホリルコリン決定因子を認識し結合する抗体である。
【００４４】
本発明は又、ホスホリルコリン決定因子、ホスファチジルセリン、マロンジアルデヒド、カルジオリピン、若しくはこれらの代謝産物、及び／又はその他のリン脂質部分の何れかを含む抗原を露出する死細胞又は瀕死細胞を接触させる結合タンパク質によって、死細胞若しくは瀕死細胞、又はその分解産物（例えば、アポトーシス小疱）の排除障害に関連する場合がある自己免疫性疾患状態を対象において改善する方法も包含する。一実施形態において、結合タンパク質は、死細胞又は瀕死細胞に露出する１つ以上の抗原を認識し結合し、それによって対象からの死細胞若しくは瀕死細胞の排除が改善されるか、又は対象において白血球の活性化若しくはサイトカインの産生が抑制若しくは調節されるようにする、１つ以上の抗体である。白血球には、リンパ球、樹状細胞、及び／若しくはマクロファージ、並びに／又はその他の食細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の方法及び組成物を使用することで、例えば、対象における死細胞又は瀕死細胞の排除の低減に関連する自己免疫又は炎症反応によって生じる、免疫系疾患を抑制してもよければ、又は免疫系疾患の症状を低減してもよい。免疫系疾患の例には、紅斑性狼瘡又は自己免疫性腎炎がある。別の例において、免疫系疾患は、乾癬、リンパ性血管炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、真性糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、炎症性関節炎、多発性筋炎及び強皮症からなる群より選択される自己免疫性疾患である。関節炎には、乾癬性関節炎又はリウマチ性関節炎又はライター症候群が含まれてもよい。加えて、炎症性疾患は、アテローム硬化性血管疾患であってもよい。別の実施形態において、免疫系疾患又は炎症性疾患は、黄斑変性である。
【００４６】
更に、免疫系疾患又は炎症性疾患は、臓器又は脊髄移植（例えば、細胞、組織又は臓器）に関連する疾患又は病理的状態であってもよい。一実施形態において、移植関連疾患は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。別の例において、移植疾患は、腎臓、心臓、肺又は肝臓の同種移植片拒絶反応のような移植片拒絶反応である。
【００４７】
本発明には更に、癌を処置するか又は癌に関連する徴候若しくは症状を緩和する方法であって、結合タンパク質（例えば、ＰＣに対する抗体（例えばＴ１５抗体）又はその他のリン脂質関連決定因子）の薬学的有効量を対象に投与し、それにより死細胞若しくは瀕死細胞の排除障害に関連する炎症を抑制するか、又は白血球の反応に影響を及ぼすことによって、癌を処置するか、又は癌に関連する徴候若しくは症状を緩和する方法も含まれる。
【００４８】
加えて、本発明は、対象の循環自己抗体のレベルを低減する方法であって、ホスホリルコリン（ＰＣ）決定因子、ホスファチジルセリン決定因子、ＭＤＡ決定因子、リノール酸過酸化物決定因子、４−ヒドロキシノネナール決定因子及びカルジオリピン決定因子の何れかを含み、死細胞若しくは瀕死細胞に露出する抗原又はその分解産物を対象とする抗体を対象に投与し、それによって対象の循環自己抗体又は炎症のレベルを低減することを包含する方法も提供する。
【００４９】
本発明の実施によると、本発明の方法は更に、上述の１つ以上の結合タンパク質（例えば、抗体）を投与することに加えて、免疫系疾患（例えば、自己免疫及び／又は炎症反応）を更に抑制するため、癌を処置するため、又は化学療法に伴う望ましくない症状を低減するために１つ以上の治療因子を投与することからなってもよい。これらの作用物質には、ステロイド、グルココルチコイド、薬物毒素、アルキル化剤、抗腫瘍薬、酵素、抗体、コンジュゲート、コルチコステロイドのような免疫抑制剤、及びメトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドのような薬剤が含まれるが、これらに限定されない。免疫抑制剤は、対象の免疫系の細胞に加えて、体内の多くの細胞に影響を及ぼす。加えて、インフリキシマブ、エタネルセプト、キナレット又はその他のサイトカイン遮断薬若しくは拮抗薬のような特定のサイトカイン遮断物質、ＴＮＦ受容体を遮断する分子（例えば、ペグスネルセプト）、サイトカイン機能を阻止する分子（例えば、ＡＭＧ７１９）、ＬＦＡ−１機能を阻止する分子（例えば、エファリズマブ）といった治療法も開発されている。又、アセチルサリチル酸、コリンマグネシウムサリチレート、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、その他の非特異性ＣＯＸ阻害薬及びＣｏｘ−２特異性阻害薬、メロキシカムのような抗炎症剤、並びにリン酸コデイン、プロポキシフェンナプシレート、塩酸オキシコドン、重酒石酸オキシコドン、トラマドールのようなその他の鎮痛剤も開発されている。
【００５０】
これらの治療因子の用量は使用される特定の治療因子によって異なることは、当業者には明白なはずである。治療因子に応じた適切な用量の具体例を以下に記載する。
【００５１】
本発明の組成物の有効量は、約０．１ｍｇ／週〜４０ｍｇ／週；０．１ｍｇ／週〜５ｍｇ／週；５ｍｇ／週〜１０ｍｇ／週；１０ｍｇ／週〜３０ｍｇ／週；３０ｍｇ／週〜３５ｍｇ／週；０．１ｍｇ／週〜１００ｍｇ／週；又は３０ｍｇ／週〜５０ｍｇ／週の範囲であってもよい。別の実施形態において、本発明の組成物は、約５０ｍｇ／週、又は２５ｍｇの量を週に２回投与することができる。用量範囲は処置する疾患及び使用する併用治療因子によって異なることは、当業者には明白なはずである。
【００５２】
メトトレキサートは、ＤＮＡ合成、プリン代謝、修復及び細胞複製を妨害する抗代謝剤分子である。メトトレキサートは、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害薬、即ち葉酸拮抗薬として機能する。メトトレキサートは、一般的に約０．１〜４０ｍｇ／週の量で投与され、一般的な用量は約５〜３０ｍｇ／週の範囲である。メトトレキサートは、種々の加量、即ち、約０．１〜５ｍｇ／週、約５〜１０ｍｇ／週、約１０〜１５ｍｇ／週、約１５〜２０ｍｇ／週、約２０〜２５ｍｇ／週、約２５〜３０ｍｇ／週、約３０〜３５ｍｇ／週、又は約３５〜４０ｍｇ／週で対象に投与される場合がある。一実施形態において、本発明の組成物及びメトトレキサートのような併用治療因子の有効量は、約１０〜３０ｍｇ／週の量である。
【００５３】
アルキル化剤であるシクロホスファミドは、約１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲の用量で投与される場合がある。
【００５４】
シクロスポリンＡとしても知られるシクロスポリン（例えば、ＮＥＯＲＡＬＲ）は、一般的に約１〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲の用量で投与される。約２．５〜４ｍｇ体重ｋｇ／日の範囲の用量が一般的に使用される。
【００５５】
クロロキン又はヒドロキシクロロキン（例えば、ＰＬＡＱＵＥＮＩＬＲ）は、一般的に約１００〜１０００ｍｇ／日の範囲の用量で投与される。１日に投与される好ましい用量は、約２００〜６００ｍｇの範囲である。
【００５６】
スルファサラジン（例えば、ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ  ＥＮ−ｔａｂｓＲ）は、一般的に約５０〜５０００ｍｇ／日の範囲の量で投与され、成人の一般的な用量は約２０００〜３０００ｍｇ／日である。子供の用量は、一般的に約５〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日であり、１日に最高２ｇまでとする。
【００５７】
金塩は、２種類の投与、即ち注入又は経口用に配合される。注入用金塩は、一般的に２〜４週間当たり約５〜１００ｍｇの用量で処方される。経口用金塩は、一般的に約１〜１０ｍｇ／日の範囲の用量で処方される。
【００５８】
Ｄ−ペニシラミン又はペニシラミン（ＣＵＰＲＩＭＩＮＥＲ）は、一般的に約５０〜２０００ｍｇ／日の用量で投与され、好ましい用量は約１２５〜１５００ｍｇ／日である。
【００５９】
アザチオプリンは、一般的に約１０〜２５０ｍｇ／日の用量で投与される。好ましい用量は約２５〜２００ｍｇ／日の範囲である。
【００６０】
アナキンラ（例えば、ＫＩＮＥＲＥＴＲ）は、インターロイキン−１受容体拮抗薬である。アナキンラの一般的な用量は約１０〜２５０ｍｇ／日の範囲であり、推奨される用量は約１００ｍｇ／日である。
【００６１】
インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥＲ）は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合し、ＴＮＦαの活性を阻害するキメラモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、一般的に４〜８週間当たり約１〜２０ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与される。対象に応じて、約３〜１０ｇ／体重ｋｇの用量が４〜８週間毎に投与される場合がある。
【００６２】
エタネルセプト（例えば、ＥＮＢＲＥＬＲ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合し、ＴＮＦ受容体との相互作用を阻止する二量体融合タンパク質である。エタネルセプトの一般的に投与される用量は、成人の場合約１０〜１００ｍｇ／週であり、好ましい用量は約５０ｍｇ／週である。若年対象の用量は、約０．１〜５０ｍｇ／体重ｋｇ／週の範囲であり、最高約５０ｍｇ／週までとする。成人患者の場合、エタネルセプトは、一般的に週に２回、例えば７２〜９６時間を空けて、２５ｍｇの用量で投与（例えば、注入）される。
【００６３】
レフルノミド（ＡＲＡＶＡＲ）は、一般的に約１〜１００ｍｇ／日の用量で投与される。一般的な１日の用量は、約１０〜２０ｍｇ／日である。
【００６４】
組成物
本発明の結合タンパク質及び小型分子
本発明は更に、死細胞若しくは瀕死細胞又はその分解産物（例えば、アポトーシス小疱）に露出するリン脂質関連決定因子を含む抗原に結合する、結合タンパク質及び小型分子を提供する。これらの決定因子には、ホスホリルコリン決定因子、ホスファチジルセリン決定因子、ＭＤＡ決定因子、リノール酸過酸化物決定因子、４−ヒドロキシノネナール決定因子及びカルジオリピン決定因子、又は中性リン脂質部分のその他の代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
結合タンパク質には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化及び／又はその他の形態の組換え抗体のような抗体が含まれてもよい。抗体は、何れの供給源、例えばラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス又はヒトに由来してもよい。更に、本発明の抗体は、次のアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＤの免疫グロブリン定常領域を有する場合がある。
【００６６】
死細胞又は瀕死細胞に露出する抗原は、ホスホリルコリン決定因子、ホスファチジルセリン決定因子、ＭＤＡ決定因子、リノール酸過酸化物決定因子、４−ヒドロキシノネナール決定因子及びカルジオリピン決定因子、又は中性リン脂質部分のその他の代謝産物の何れかを含む。ホスホリルコリン決定因子を有する抗原の好ましい例には、Ｔ１５抗体により認識される抗原がある。
【００６７】
本発明には、免疫認識のために多くの一般的な微生物病原体を装飾することが長い間知られる分子エピトープであるＰＣの予想外の機能的役割、即ち、死細胞又は瀕死細胞を標識し、アテローム硬化症の主要なメディエーターである酸化修飾された低密度リポタンパク質（ＯｘＬＤＬ）２４を標識する役割の発見が含まれる。アテローム硬化症は、酸化修飾されたリン脂質壊死組織片の異常な排除により生じると考えられ、アポトーシス認識及び排除の同じ経路の多くも、アテローム硬化病変の発症に関わる。アテローム発生の動物モデルと臨床疾患は何れもＯｘＬＤＬに対する限られた自己免疫反応に関連することが、幅広く考証されている。抗ＯｘＬＤＬ抗体の潜在的な機能的役割を調査するため、ＯｘＬＤＬに特異的な脾臓Ｂ細胞株のパネルが、アテローム硬化傾向高脂肪血症アポリポタンパク質Ｅ欠失マウスから単離された。Ｅ０６と呼ばれるこの群のプロトタイプは、この独立して単離されたＯｘＬＤＬ特異的クローンにより発現された抗体遺伝子を有し、正準抗体遺伝子再配列が全く同じで、体細胞過剰突然変異のないＩｇＭであり、最初は何十年も前に古典的なＴ１５抗ＰＣ  Ｂ細胞クローンについて記載された２４。
【００６８】
好ましい抗体は、上記の抗原（例えば、ＰＣ抗原）に選択的に結合し、健康な細胞の表面に到達できる決定因子には結合しない（又は弱く結合する）。最も好ましい抗体は、ＰＣ及び機能的に同等の抗原を特異的に結合する。「特異的に結合する」という用語は、抗体が上記のリン脂質抗原（例えば、ＰＣ抗原）を優位に結合することを意味する。具体的に考慮される抗体（例えば、Ｔ１５抗体）には、これらの抗体の抗原結合ドメイン及び／又は１つ以上の相補性決定領域を含有する、モノクローナル及びポリクローナル抗体、並びにそのフラグメント（例えば、組換えタンパク質）が含まれる。これらの抗体は、何れの供給源、例えばラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、マウス又はヒトに由来してもよい。
【００６９】
一実施形態において、Ｔ１５抗体は、例えば死細胞又は瀕死細胞の細胞表面に露出するリン脂質決定因子の細胞外表面に特異的に結合する。「細胞外表面」という用語は、細胞膜の外側にあるリン脂質又はリン脂質コンジュゲートの任意の部分を意味するものとして意図される。当業者に理解されるように、抗体が対象とするこのリン脂質又は機能的に同等の決定因子の領域又はエピトープは、種々の抗体及び所期の用途により異なる場合がある。例えば、死細胞又は瀕死細胞の膜結合リン脂質決定因子を検出する免疫測定法での使用が意図される抗体は、膜結合リン脂質又はリン脂質コンジュゲートの接触可能なエピトープを対象としなければならない。このような抗体については、以下の実施例で説明する。
【００７０】
本発明の結合タンパク質は、炭水化物又はタンパク質に関連するリン脂質決定因子（例えば、ＰＣ抗原）を特異的に認識する抗体フラグメントも包含する。本明細書で使用される抗体フラグメントは、標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域、即ち抗原結合領域の少なくとも一部分として定義される。免疫グロブリンの定常領域の一部が含まれる場合もある。本発明の実施によると、免疫グロブリンの定常領域は、次のアイソタイプ、即ちＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ、又はこれらの一部の何れかである場合がある。中でもＩｇＭ及びＩｇＧ定常領域が好ましい。
【００７１】
抗体変異体（例えば、Ｔ１５抗体変異体）も本発明により考慮される。抗体の抗原（Ａｇ）結合特異性は、Ｆａｂ部分の可変領域の寄与により定義されるが、定常領域は、４つの主要なエフェクター機能：即ち、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；及び半減期／排除率を誘導する。ＡＤＣＣ及び食作用は、ＦｃγＲと相互作用する抗体と結合する細胞又は細胞産物の錯体により媒介されるのに対し、ＣＤＣは、Ｃｌｑの沈着により始まる補体カスケードとの相互作用により媒介される。ＩｇＧのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、遊離抗体と新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合により媒介される。
【００７２】
本発明のＴ１５抗体変異体は、アポトーシス細胞に対する結合活性、並びにアポトーシス排除及び寛容化特性に必須の補体を活性化する能力を保持する。一実施形態において、Ｔ１５抗体変異体は、ＩｇＭアイソタイプを有するＴ１５抗体である。別の実施形態において、Ｔ１５抗体変異体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長するトランサイトーシスされた抗体の再循環の原因となるＦｃＲｎと相互作用する能力を保持するＩｇＧアイソタイプ（Ｔ１５  ＩｇＧ変異体）を有するＴ１５抗体である。
【００７３】
例えば、死細胞及び瀕死細胞の両方に新たに露出する（即ち、死亡時又は臨死時に露出する）ＰＣ抗原の発現、並びにＰＣの細胞表面位置が、スクリーニング、診断、予後及び追跡アッセイ及び画像化法に好ましいマーカーの特徴を表す。加えて、これらの特徴は、ＰＣ抗原が、標的抗体療法、免疫療法及び遺伝子療法のような治療法の標的となる場合があることを示している。例えば、本発明の抗体は、フローサイトメトリーアッセイにおいてアポトーシス細胞を特異的に認識する６；３０。一実施形態において、可変領域は同一であるがγ定常領域は異なるＩｇＧ  Ｔ１５抗体のパネルを使用して、異なるＦｃγ媒介エフェクター特性を伝達することができる。これらの抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで更に試験を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏ自己免疫性病原に対する影響を試験することができる。
【００７４】
ｐＩＧＧ発現ベクターにより、一連のＴ１５発現組換えＩｇＧ抗体を生成した。ｐＩＧＧベクターは、ヒトＩｇＧ１抗体のクローン遺伝子によりもたらされたため３１、マウスＬ鎖遺伝子のベクター（Ｔ１５  ＶＬマウスＣκ）及びＴ１５  ＶＨ領域をｐＩＧＧベクターにサブクローニングし、トランスフェクション試験によって、相当なＴ１５ヒトキメラＩｇＧ１レベル（約２ｕｇ／ｍｌ）が産生され、認識にＴ１５ＶＨ−Ｔ１５ＶＬ領域を必要とするＡＢ１−２抗イディオタイプにより認識されるＴ１５可変領域を発現した３２。この発現されたＴ１５  ＩｇＧ抗体は、ＰＣ結合のレベルを定量的に測定するＥＬＩＳＡ法により判定されたように、親Ｔ１５マウスＩｇＭと同等の、効果的なＰＣ結合活性を保持した。加えて、重鎖定常領域をコードするＤＮＡ領域をγ鎖に交換することで、ＰＣ結合反応性を保持することがＥＬＩＳＡにより示され、且つ死細胞及び瀕死細胞を認識するが健康な細胞は認識しないことがフローサイトメトリーにより示される、Ｔ１５マウス（ｍａ）ＩｇＧ２ａを産生することができる（図９及び１０を参照）。置換突然変異を定常領域に導入することによって、Ｔ１５マウスＩｇＧ２ａ  Ｄ２６５Ａ突然変異体が作製されたが、これは、ＰＣ結合活性を完全に保持するものの、組換えヘキサヒスチジン標識ＦｃγＲＩＩＩによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合系で示されるように、ＦｃγＲＩＩＩ結合を有する免疫錯体の予想通りの大きな欠陥があった３３。
【００７５】
本発明の結合タンパク質（例えば、Ｔ１５抗体、又はその他の抗ＰＣ抗体、又は変異体若しくはフラグメント）は、自己免疫性疾患、炎症性疾患又は自己免疫性疾患状態の管理における診断アッセイ、画像化法及び治療法に特に有用である場合がある。このようなアッセイは、ＰＣ抗原を認識し結合することができる１つ以上のＴ１５抗体若しくはその他の抗体、又は死細胞及び瀕死細胞の機能的に同等の決定因子を使用することができ、これらのアッセイには、種々の沈殿、凝集反応、補体結合、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）、免疫組織化学分析等を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で周知の種々の免疫学的アッセイ形式が含まれる。加えて、標識Ｔ１５抗体又は同等の抗体を使用するラジオシンチグラフィー画像化法を含むがこれに限定されない免疫学的画像化法も、本発明により提供される。このようなアッセイは、瀕死細胞又は死細胞の除去障害に関連する炎症性疾患、自己免疫性疾患又は炎症性疾患の検出、モニタリング及び予後において臨床的に有用である場合がある。
【００７６】
Ｔ１５抗体は、ＰＣ及びリン脂質決定因子を精製する方法、並びに抗原相同体及び関連する分子を単離する方法にも使用される場合がある。例えば、一実施形態において、ＰＣ抗原タンパク質決定因子又はＰＣ糖脂質コンジュゲートを精製する方法は、固体マトリックスに結合しているＴ１５抗体を、死細胞又は瀕死細胞の成分を含有する溶解質又はその他の溶液と共に、Ｔ１５抗体又は機能的に同等の抗体が名目上の抗原を結合できる条件下でインキュベートし；固体マトリックスを洗浄して不純物を取り除き；結合した抗体から結合タンパク質を溶離することからなる。加えて、Ｔ１５抗体又は抗ＰＣ抗体は、細胞選別及び精製技法を使用して、Ｔ１５陽性の死細胞又は瀕死細胞を単離するために使用される場合がある。
【００７７】
本発明の結合タンパク質（例えば、Ｔ１５抗体）のその他の使用には、選択した抗原又は決定因子を模倣する抗イディオタイプ抗体、例えば本発明のモノクローナル抗体の何れかのイディオタイプとの反応性を持つモノクローナル抗イディオタイプ抗体を生成することが含まれる。
【００７８】
抗体を調製する種々の方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、抗体は、（３４に記載の通り）所望の細胞、抽出物、又は精製タンパク質若しくはリン脂質含有化合物、ペプチドコンジュゲート、又はフラグメントを、単離した又は免疫コンジュゲートの形態で使用して、好適な哺乳類宿主を免疫化することにより調製される場合がある。所望の抗原を発現又は過剰発現する細胞が免疫化にも使用される場合がある。同様に、所望の抗原を発現するように操作された任意の細胞が使用される場合もある。この戦略は、死細胞又は瀕死細胞の内在性抗原（例えば、ＰＣ抗原又は機能的に同等の決定因子）を認識する能力が増強されたモノクローナル抗体の生成をもたらす場合がある。
【００７９】
例えば、標準的な技法及び標準的なハイブリドーマプロトコールを使用して３４、定義された任意のリン脂質決定因子に対するＴ１５モノクローナル抗体、モノクローナル抗ＰＣ抗体又はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが生成される場合がある。良好な特異性を有する分子結合の予備知識がなくても、アポトーシスに特異的であるが健康な細胞には特異的ではないモノクローナル抗体が生成される場合もある。
【００８０】
本発明のキメラ抗体は、ヒト及び非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。一実施形態において、キメラ抗体の抗原結合領域（例えば、可変領域）は、非ヒト供給源（例えばマウス）から誘導することができ、生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに付与するキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源から誘導することができる。従って、キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性、及びヒト抗体分子により付与されるエフェクター機能を有する必要がある。
【００８１】
一般的に、キメラ抗体を産生するのに使用される手順は、以下の手順を含んでもよい：
ａ）抗体分子の抗原結合部分をコードする正確な遺伝子セグメントを同定し、クローニングする手順；この遺伝子セグメント（重鎖のＶＤＪ（多様な可変連結領域）、又は軽鎖のＶＪ（可変連結領域）、又は単にＶ（可変領域）として知られる）は、ｃＤＮＡ又はゲノムの何れかの形態である場合がある；
ｂ）定常領域又はその所望の部分をコードする遺伝子セグメントをクローニングする手順；
ｃ）転写及び翻訳できる形態で完全なキメラ抗体がコードされるように、可変領域を定常領域と結合させる手順；
ｄ）この作成物を、選択マーカー、並びにプロモーター、エンハンサー及びポリ（Ａ）シグナルのような遺伝子調節領域を含有するベクターと結合させる手順；
ｅ）細菌中でこの作成物を増幅させる手順（適宜必要に応じて行う）；
ｆ）このＤＮＡを真核細胞に、即ちほとんどの場合、哺乳類の真核細胞又はその他の細胞型（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞又はＴ２９３細胞）に導入（トランスフェクション）する手順；
ｇ）選択マーカーを発現する細胞を選択するか、又は組換えタンパク質の発現に基づいて細胞を選択する手順；
ｈ）所望のキメラ抗体を発現する細胞をスクリーニングする手順；及び
ｉ）抗体を適切な結合特異性及びエフェクター機能について試験する手順。
【００８２】
幾つかの明確は抗原結合特異性を持つ抗体は、これらのプロトコールによって操作されて、キメラタンパク質を産生している。同様に、新しい配列を、抗原結合領域をコードする配列と結合させることによって、幾つかの異なるエフェクター機能が達成されている。これらの機能の一部には、酵素３５、別の種の免疫グロブリン定常領域、及び別の免疫グロブリン鎖の又は所定の突然変異を有する定常領域３６；３７が含まれる。定常領域の突然変異又は変化は、そのエフェクター機能に影響を及ぼす可能性もある。加えて、遺伝子修飾を標的にするため相同性組換えを使用して抗体分子を修飾する及びキメラ抗体分子を産生する手順も解説されている３８。
【００８３】
ポリクローナル抗血清は一部の用途では満足のいく場合があるが、医薬組成物では、モノクローナル抗体調合剤が好ましい。一般的に知られる通り、リンパ球又は脾臓細胞の不死化をもたらすＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの標準法又はその変形を使用して、所望のモノクローナル抗体を分泌する永久増殖細胞株が調製される場合がある。或いは、抗体可変領域及び定常領域遺伝子を含有するベクターで、細胞株がトランスフェクトされる。所望の抗体を分泌する永久増殖細胞株は、抗原がＰＣ又は機能的に同等の決定因子である免疫測定法によりスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な永久増殖細胞培養を同定すると、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、又は腹水若しくはトランスジェニック動物での産生により培養することができる。
【００８４】
次に所望のモノクローナル抗体を、培養上澄みから、又は腹水上澄みから、又はその他の流体から回収する。免疫学的に有意な部分（即ち、ＰＣ決定因子を認識し結合する部分）を含有する、本発明のモノクローナル抗体のフラグメント又はポリクローナル抗血清のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖフラグメント、融合タンパク質）は、拮抗薬として、並びに無処置の抗体として使用することができる。ＰＣ決定因子を対象とするヒト化抗体も有用である。本明細書で使用されるヒト化Ｔ１５抗体は免疫グロブリン分子であり、これは、死細胞又は瀕死細胞のＰＣを結合することができ、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する可変領域フレームワーク（ＦＲ）領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列又はＰＣ決定因子を結合するように操作された配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。非ヒト抗体ＣＤＲの１つ以上を対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス及びその他の非ヒト抗体をヒト化する方法は、周知である（例えば、３９−４１を参照。又、４２；４３も参照）。
【００８５】
Ｆａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）２フラグメントのような免疫反応性フラグメントの使用は、これらのフラグメントが一般的に免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いため、特に治療上の文脈において好ましい時がある。更に、２つ以上のエピトープの特異的であり且つ反応性がある二重特異性抗体は、当該技術分野で一般的に知られる方法を使用して生成される場合がある。
【００８６】
更に、抗体エフェクター機能が、本発明の抗体（例えば、Ｔ１５抗体及び抗ＰＣ抗体及びリン脂質修飾決定因子に関連する抗体）の治療効果を増強するように修飾される場合もある。例えば、システイン残基を操作してＦｃ領域に作り変え、内在化、ＡＤＣＣ及び／又は補体媒介細胞致死の能力を増強する場合がある、鎖間ジスルフィド結合の形成及びホモ二量体の生成を可能にする（例えば４４；４５を参照）。定常領域の突然変異は、補体活性化活性を増強し、望ましくないことにＦｃγＲとの相互作用を損なう場合があり、突然変異は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を改善する場合がある。ホモ二量体抗体も又、当該技術分野で既知の架橋技法により生成される場合もある（例えば、４６）。本発明は又、本発明のモノクローナル抗体又は抗イディオタイプモノクローナル抗体を有する医薬組成物も提供する。
【００８７】
抗体又は抗体のフラグメントのような結合タンパク質も又、現行の技術を使用して組換え手段により産生される場合がある。例えば、ＰＣ決定因子の所望の領域に特異的に結合する領域も又、多種由来のキメラ又はＣＤＲ移植抗体の文脈で産生される場合がある。本発明には、抗体、例えば本発明のモノクローナル抗体の何れかと死細胞又は瀕死細胞のＰＣ決定因子との免疫特異的結合を競合的に阻害するモノクローナル抗体、及び健康な細胞ではなく死細胞又は瀕死細胞におけるその他の決定因子の認識及び結合を介して、死細胞又は瀕死細胞への免疫特異的結合を示す抗体が含まれる。
【００８８】
或いは、完全ヒトモノクローナル抗体を産生する方法は、ファージディスプレイ及び遺伝子導入法を含み、既知の方法で、ヒトモノクローナル抗体の生成に使用される場合がある（概説については、４７を参照）。ＰＣ決定因子又はその他のリン脂質決定因子に特異的な、完全ヒト抗ＰＣモノクローナル抗体又は機能的に同等の抗体は、大規模なヒトＩｇ遺伝子結合ライブラリーを使用するクローニング技術（即ち、ファージディスプレイ）４８；４９を使用して生成される場合がある。完全ヒト抗ＰＣモノクローナル抗体も又、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニックマウスを使用して、産生される場合がある５０。
【００８９】
標的抗原に対する抗ＰＣ抗体の反応性は、適宜ＰＣ決定因子、ＰＣ含有リン脂質、ＰＣ発現死細胞又は瀕死細胞を使用する、ウエスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析をはじめとする幾つかの周知の方法により確立される場合がある。抗ＰＣ抗体が又、補体媒介腫瘍細胞溶解質、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性マクロファージ媒介細胞傷害（ＡＤＭＭＣ）、腫瘍細胞繁殖等をはじめとする種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにて特徴付けられる場合がある。
【００９０】
本発明の抗体又はそのフラグメントは、検出可能なマーカーによって標識される場合もあれば、治療因子（例えば、細胞傷害剤）のような第２の分子に結合して免疫コンジュゲートをもたらす場合もある。例えば、治療因子には、抗腫瘍薬、毒素、放射性作用物質、サイトカイン、第２抗体又は酵素が含まれるが、これらに限定されない。更に、本発明は、プロドラッグを細胞毒に変換する酵素に本発明の抗体が結合する実施形態を提供する。
【００９１】
細胞傷害剤の例には、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリチアマイシン、サパオナリアオフィシナリス阻害薬、マイタンシノイド、グルココルチコイド、及びその他の化学治療剤、並びに２１２Ｂｉ、１３１Ｌ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅのような放射性同位体が含まれるが、これらに限定されない。適切な検出可能なマーカーには、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素が含まれるが、これらに限定されない。抗体は又、プロドラッグをその活性形態に変換できる抗癌プロドラッグ活性化酵素に結合する場合もある。
【００９２】
治療因子を抗体に結合又は連結する技術は周知である（例えば、５１〜５４を参照）。
【００９３】
加えて、本発明の結合タンパク質には組換えタンパク質が含まれる。一実施形態において、本発明の組換えタンパク質は、本発明の抗体の何れかの抗原結合領域を有し、死細胞又は瀕死細胞の除去障害に関連する炎症性疾患、自己免疫性疾患又は自己免疫性疾患状態の処置に、又はそれらの症状の低減に使用することができる。
【００９４】
本発明は又、本発明の種々の抗体を組換えタンパク質の形態で提供する。一実施形態において、組換えタンパク質は、Ｔ１５抗体の抗原結合領域を含む。別の実施形態において、組換えタンパク質は、ヒト／マウスキメラ抗体である。更に別の実施形態において、組換えタンパク質は、ＩｇＧ尾部に連結する抗原結合領域を含む。組換えタンパク質のＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２又はＦｖフラグメントが本発明に包含される。別の実施形態において、上述の種々の形態で生成されるものは、ＰＣに特異的な任意の抗体である。又、死細胞及び瀕死細胞に優先的に発現するが、健康な細胞には発現しないものも、任意の抗原決定因子に特異的な抗体である場合がある。
【００９５】
加えて、本発明には、２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体も包含される。一実施形態において、抗原の内の一つはＰＣ抗原である。
【００９６】
加えて、本発明では、抗原結合領域がＴ１５抗体とその標的抗原との免疫特異的結合を競合的に阻害するモノクローナル抗体が考慮される。
【００９７】
一実施形態において、抗原の内の一つはＰＣ抗原である。加えて、本発明には、Ｔ１５抗体又はその他の抗ＰＣ抗体により示されるものと機能的に同等の活性を示すアッセイにおいて、死細胞及び瀕死細胞に特異的であるが、健康な細胞には特異的でない結合を有する抗体が包含される。
【００９８】
更に、本発明は、抗原結合領域がＴ１５抗体とその標的抗原との免疫特異的結合を競合的に阻害するヒト／マウス組換え抗体を提供する。
【００９９】
本発明の一実施形態において、アポトーシス細胞に特異的な組換えタンパク質は、治療因子と結合して、組換えタンパク質コンジュゲートを形成する。そのような治療因子の例には、抗腫瘍薬、毒素、放射性作用物質、第２の抗体又は酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明は更に、プロドラッグを細胞毒に変換できる酵素に結合する組換えタンパク質を含む免疫コンジュゲートと、前記プロドラッグとの組み合わせを提供する。
【０１０１】
更に、本発明には、プロドラッグを細胞毒に変換できる酵素に結合する本発明の組換えタンパク質を含む免疫コンジュゲートと、前記プロドラッグとの組み合わせを含む組成物が含まれる。
【０１０２】
場合により瀕死細胞又は死細胞の除去障害に関連することがある自己免疫、又は自己免疫性疾患、又は炎症性疾患の処置に有用な医薬組成物は、本発明の組換えタンパク質の薬学的有効量と許容される担体とを含む。一実施形態において、抗体は、放射能標識、酵素、発色団及び蛍光色素からなる群より選択される標識により標識される。
【０１０３】
キット
本発明の更なる実施形態において、本発明は、自己免疫性疾患若しくは炎症性疾患状態を処置する又はその症状を低減するのに有用な本発明の分子を含有するキット（即ち、試薬と説明書とを組み合わせたパッケージ）を提供する。
【０１０４】
キットは、本発明の１つ以上の結合タンパク質、例えば本発明の可溶性抗体（例えば、一般的なＰＣ抗原を認識する抗体）を単独で含むか、又は本発明のそのような抗体（例えば、複数個のＰＣ抗原、若しくはその他のリン脂質抗原、若しくはその他のアポトーシス関連抗原）の組み合わせを含むか、又は第２の作用物質、及び許容される担体若しくはアジュバント（例えばリン酸緩衝剤、リンゲル液及びブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝剤）を共に含む医薬組成物を含有してもよい。更にキットには、その他の緩衝剤、稀釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明書の医療用医薬品添付文書を含めた、販売及び利用者の観点から望ましいその他の材料も含まれる場合がある。作用物質は、溶解すると適切な濃度の試薬溶液をもたらす賦形剤を含めた、通常凍結乾燥される乾燥粉末として提供される場合がある。
【０１０５】
第２の作用物質には、ステロイド、グルココルチコイド、薬物毒、アルキル化剤、抗腫瘍薬（例えば、シクロホスファミド）、酵素、抗体、コンジュゲート、免疫抑制剤、シクロスポリン、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾプリイン））、金塩、ＤＭＡＲＤ、レフルノミド、アザチオプリン、メトトレキサート又はＤ−ペニシラミン、ＴＮＦα遮断薬又は拮抗薬（例えば、インフリキシマブ又はエタルネルセプト）、或いは炎症性サイトカインを標的にする任意の生物学的作用物質（例えば、アナキンラ、ＴＮＦ受容体を遮断する分子（例えば、ペグスネルセプト）、サイトカイン機能を阻止する分子（例えば、ＡＭＧ７１９）、ＬＦＡ−１機能を阻止する分子（例えば、エファリズマブ））が含まれてもよい。或いはジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナム酸、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、その他のＣＯＸ阻害薬及びＣｏｘ−２特異性阻害薬、メロキシカム、若しくはリン酸コデイン、又はアセチルサリチル酸、コリンマグネシウムサリチレート、又はその他の鎮痛剤（例えば、プロポキシフェンナプシレート、塩酸オキシコドン、重酒石酸オキシコドン、トラマドール）、又はジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬若しくはその他の代謝阻害薬のような非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれてもよい。
【０１０６】
キットは、ラベル及び／又は説明書の付いた容器を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル及び試験管が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような種々の材料から形成されてもよい。容器は、滅菌された注入口を有してもよい（例えば、容器は、静脈用溶液バッグであってもよければ、皮下注射針のような針で穴を空ける栓を有するバイアルであってもよい）。容器は本発明の医薬組成物を保持してもよい。
【０１０７】
キットは、本明細書に記載の１つ以上の第２の作用物質、及び／又はリン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液のような薬学的に許容される緩衝剤を含む第２の容器を含んでもよい。更にキットには、その他の緩衝剤、稀釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明書の医療用医薬品添付文書を含めた、販売及び利用者の観点から望ましいその他の材料も含まれる場合がある。
【０１０８】
キットは又、容器上に又は容器に関連して、ラベル及び／又は説明書を適切に含む場合もある。ラベルは、例えば乾燥粉末の溶解といった結合タンパク質の調製、及び／又は特定の自己免疫性疾患若しくは疾患状態の処置を実施する指示を提供することができる。
【０１０９】
ラベル及び／又は説明書には、医薬組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ何れかの使用に関する指示が記載されてもよい。ラベル及び／又は説明書には、医薬組成物が単独で使用されるか、又は第２の作用物質と組み合わせて使用されるかについて記載されてもよい。
【０１１０】
ラベルには、本発明の結合タンパク質に適切な用量が記載されてもよい。例えば、ラベルには、死細胞又は瀕死細胞の排除を増強するのに有効な結合タンパク質の用量が、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１〜１００ｍｇであることが記載されてもよい。
【０１１１】
ラベル及び／又は説明書には又、第２の作用物質の用量が約１〜約５，０００ｍｇ／日であることが記載されてもよい。
【０１１２】
ラベル及び／又は説明書には又、医薬組成物を単独で又は第２の作用物質と組み合わせて使用することで、免疫系疾患、自己免疫性疾患、免疫増生病、移植片関連傷害、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば、骨髄移植、幹細胞移植若しくは実質臓器移植から生じる場合があるような疾患、又は免疫寛容を誘導する治療的試みの後遺症のような疾患）、移植片拒絶反応に関連する免疫障害、慢性拒絶反応に関連する免疫障害、組織又は細胞の同種若しくは異種移植片に関連する免疫障害（例えば、肝臓、皮膚、小島、筋肉、肝細胞、神経細胞、実質臓器等）、乾癬、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、睾丸血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ性血管炎、その他の形態の血管炎、又はループスのような自己免疫性疾患（例えば、紅斑性狼瘡若しくは皮膚ループス）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ぶどう膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎の合併症、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、炎症性関節炎（例えば、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎又はライター症候群）、多発性筋炎、強皮症、混合性結合組織疾患等の症状を低減できることが記載されてもよい。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態において、キットは、薬学的に許容される担体及び有効量の第１の作用物質を含む医薬組成物を含み、ここで第１の結合タンパク質は、本発明の抗体である。
【０１１４】
以下の実施例は、本発明を説明するため、並びに当業者が本発明を実施及び使用するのを助けるために提示される。これらの実施例は、本発明の範囲をどのようにも制限するものとして意図されない。
【実施例】
【０１１５】
実施例１
Ｔ１５  ＩｇＭ抗体の保護特性を試験するｉｎ  ｖｉｖｏ自己免疫性疾患モデル系の開発
自己免疫性病原に対するＴ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ  Ａｂ注入の効果を試験するため、ループスマウスモデル（ＮＺＷｘＢＸＳＢ）Ｆ１（ＷＸＦ１）を使用した。これは民間の供給先（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）から購入した雌ＮＺＷマウスから生まれた雄ＢＸＳＢマウスの子孫であり、抗リン脂質症候群、自己免疫性血小板減少症を発症し、糸球体腎炎による死亡を加速される。これらのマウスは又、抗未変性（ｄｓ）ＤＮＡに対する古典的なＩｇＧ抗細胞核抗体及び抗カルジオリピン抗体も発生し、加速化アテローム硬化症を発症する傾向もある。この調査のため、民間の供給業者（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ［米国ミネソタ州ミネアポリス］）との契約によって、ＩｇＭ抗体のＢ細胞ハイブリドーマを、中空繊維バイオリアクターにより血清のない条件下で増殖し、高度に精製されたエンドドキシンの少ない又はこれを含まない抗体を産生して濃縮した。
【０１１６】
Ｔ１５  ＩｇＭで処置された（ＮＺＷｘＢＸＳＢ）Ｆ１マウスの生存期間の延長（図３）
Ｔ１５  ＩｇＭによる処置が自己免疫性疾患の経過に影響を及ぼす可能性があるかを試験するため、生後８週目より種々のＷＸＦ１マウス群は、１．５ｍｇのＴ１５  ＩｇＭ（Ｎ＝３０）若しくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｎ＝４４）、又は食塩水中の１．５ｍｇの無関係な特異性を持つＩｇＭアイソタイプ対照（ＮＣ１７−Ｄ８）（Ｎ＝１０）による腹腔内（ｉ．ｐ．）処置を２週毎に受けた。処置マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフを示す。ループスマウスのこれらの処置試験では、ＰＢＳ処置（ログランク検定ｐ＝０．０００３）に比べてＴ１５  ＩｇＭ処置後の生存期間が、並びにＮＣ１７−Ｄ８処置（ログランク検定ｐ＜０．０１）に比べてＴ１５  ＩｇＭ処置後の生存期間が統計的に有意に改善されたことが示されている。食塩水を摂取したループス発症傾向にあるＷＸＦ１マウス群又はＩｇＭアイソタイプ対照（ＮＣ１７−Ｄ８）処置群の間で生存期間に統計的有意差はなかった。
【０１１７】
Ｔ１５  ＩｇＭによる処置によってＷＸＦ１マウスの生存期間が有意に改善されたことを示すこれらの結果は、早期の死亡をもたらす自己免疫性炎症性病原に対する治療介入の作用を実証する決定的手段を表す。
【０１１８】
この初期用量処置レジメンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態試験に基づいているが、投与後約７日までＴ１５  ＩｇＭが検出できなかったため、ＷＸＦ１マウスの方がＴ１５  ＩｇＭの循環半減期（即ち、ｔ１／２）が遥かに短いと判定された。これらの所見では、より一貫したレベルの治療抗体を提供することでより頻繁な用量レジメンになるにつれて、臨床ベネフィットが向上するはずであるということが示唆されている。ベネフィットの向上は、ＩｇＭ抗ＰＣ抗体のような、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期がより長い抗ＰＣ抗体の形態の使用によっても、もたらされるはずである。
【０１１９】
実施例２
Ｔ１５  ＩｇＭが瀕死細胞への補体沈着を促進し、アポトーシス排除を増強
ｉｎ  ｖｉｖｏ保護特性の潜在性について抗体の特性を最も効果的に試験し、定量的に測定するため、強力且つ関連性のある実験系を開発して、特定のモノクローナル抗体ＩｇＭが、アポトーシス排除の原因となる分子及び細胞機構にどのように影響を及ぼすかについて評価した。ｍｕＭＴ−／−マウスは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ｍｕ重鎖遺伝子の定常領域におけるエキソンの同型接合ノックアウトにより予め作製された遺伝子操作マウスである５５。この標的突然変異は、Ｂ細胞前駆体の段階でＢ細胞の発生を阻止するため、ｍｕＭＴ−／−マウスは成熟Ｂ細胞及び循環Ｉｇを有さないが、これらの免疫系の他の面は直接影響を受けない（４７）。従って、アッセイに影響を及ぼす内在性循環免疫グロブリン（Ｉｇ）が存在しないため、所定のＩｇ試料をｍｕＭＴ−／−マウスに導入して、関連する生物学的特性を直接アッセイすることができる。
【０１２０】
図４：Ｔ１５  ＩｇＭがアポトーシス胸腺細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体沈着を誘導
無関係な結合特異性を持つＩｇＭではなくＴ１５  ＩｇＭとの特異的相互作用を評価するため、以下の試験を実施した。（エピトープ誘導後の）アポトーシス胸腺細胞を、ＩｇＭ  ２０μｇ／ｍｌ又はＰＢＳを有する２０％Ｉｇ欠失（ｍｕＭＴ）血漿と共に３７℃でインキュベートした。そして培養物中で１５分後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより試験を行った。すると、Ｔ１５  ＩｇＭ処置のみが、初期補体因子の沈着を同定する検出試薬である、蛍光色素標識ヤギ抗マウスＣ３により、アポトーシス細胞の染色をもたらした。代わりにＴ１５  ＩｇＭとのインキュベーションが、補体欠失血漿の存在下で、又はＣａ＋＋のない培地で実施された場合には、染色が検出されなかった。インキュベーションが無関係な結合特異性を持つＩｇＭアイソタイプ対照を代わりに使用する場合は、補体の沈着が検出されなかった。まとめると、これらの所見では、補体活性化及び細胞沈着を媒介するＴ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体の活性が実証されており、この活性には、補体含有血漿、並びにカルシウム（Ｃａ＋＋）の十分な局所濃度が必要であることが知られている。
【０１２１】
他の抗ＰＣ抗体と同じく、Ｔ１５  ＩｇＭは、死細胞又は瀕死細胞（及びアポトーシス体）を特異的に認識する６。これらの試験では、Ｔ１５  ＩｇＭとアポトーシス／壊死細胞の相互作用によって、これらの死細胞又は瀕死細胞への特異的な補体沈着がもたらされる（図４を参照）ことが明確に示されると共に、この補完が、（図５及び６）に示す通り、死細胞及び瀕死細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ排除の増強と相関し、且つＴＬＲ媒介細胞活性化を弱める（図７を参照）及び炎症誘導因子のレベルを弱める（図１１を参照）能力とも相関するオプソニン作用の一形態であることが明確に示されている。
【０１２２】
図５：Ｔ１５  ＩｇＭが腹膜Ｍφによるアポトーシス胸腺細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ食作用を増強
死細胞及び瀕死細胞の排除に対するＴ１５  ＩｇＭの影響を評価するため、ｍｕＭＴ−／−マウスを、標識胸腺細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ点滴注入の約１６時間前に、食塩水又は１ｇのＩｇＭで処置し、後に殺処理した（図５）。この時、胸腺細胞は最初にＳＮＡＲＦ−１蛍光色素（赤色）で標識した。腹膜細胞を採取した後、サイトスピンを実施し、重要な種類の食細胞であるマクロファージを同定するＦ４／８０  ＦＩＴＣ（緑色）検出試薬で染色した。マウスは、（エトポシドによる培養によって生成された）アポトーシス細胞、又はさもなければ免疫学的に適合する同系細胞である健康な細胞の何れかを摂取した。処置ｍｕＭＴ−／−マウスの腹膜腔から回収した細胞については、Ｔ１５  ＩｇＭによる前処置によって、アポトーシス胸腺細胞の鎖のクラスター化及び形成がもたらされ、食細胞Ｍφによるこれらの死細胞又は瀕死細胞の飲み込みを増強した（左側のパネル）。これらの所見は、アポトーシス細胞を摂取し、無関係な接続特異性を持つＩｇＭ対照（ＮＣ１７−Ｄ８  ＩｇＭ）の注入を受けたマウスでは見られなかった。又、Ｔ１５  ＩｇＭを摂取した後、健康な（新たに単離された）胸腺細胞を与えられたマウスでもこれらの所見は見出されなかった（右側のパネル）。これらの試験でも又、Ｔ１５  ＩｇＭとのインキュベーションの後に、アポトーシス細胞（新たに単離された胸腺細胞ではない）がクラスター／鎖に凝集し、Ｍφに関連するようになったことが実証されている。これらのパネルにおいて、矢印はＭφ中の食菌されたアポトーシス胸腺細胞を示している。従って、Ｔ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体のみが、Ｍφによる死細胞又は瀕死細胞の取り込み及び食作用を増強することが示されている。
【０１２３】
これらの試験では、（Ｉｇ欠失）ｍｕＭＴ−／−マウスを使用して、死細胞又は瀕死細胞を結合しないＮＣ１７−Ｃ８  ＩｇＭと比べた、死細胞又は瀕死細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合するＴ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体の活性を評価した。まとめると、これらの試験では、アポトーシス死を被る胸腺細胞を（Ｉｇ欠失）ｍｕＭＴ−／−マウス由来の（補体因子含有）血漿と共にインキュベートすると、死細胞又は瀕死細胞を特徴的な膜変化で同定するアネキシンＶによる染色で示されるように、Ｔ１５  ＩｇＭの添加によってアポトーシス細胞への補体沈着が誘導されることが示されている。事実、比較的健康な（アネキシンＶに未反応の）胸腺細胞は補体により被覆されなかった。デキサメタゾン誘導アポトーシスを被る細胞は、Ｔ１５  ＩｇＭにより媒介される補体沈着と同じ所見をもたらした。
【０１２４】
従って、Ｔ１５  ＩｇＭ処置の治療ベネフィットは、マクロファージ及び樹状細胞のような食細胞による認識、相互作用及び取り込みを増強する、死細胞及び瀕死細胞への初期補体成分の沈着を増強するｉｎ  ｖｉｖｏ能力と相関する。死細胞及び瀕死細胞、並びにアポトーシス小疱のようなそれらの分解産物に沈着する補体因子により誘導されるシグナル伝達も又、誘導される活性化レベルの性質及び同族信号を提供する能力を変更する、及び／又はそのようなマクロファージ若しくは樹状細胞により放出若しくは誘導されるサイトカインの種類を変更する可能性がある。従って、これらのアッセイは、十分なレベルで注入された場合に治療ベネフィットを予測する場合がある抗体又は組換えタンパク質の特性を評価する方法を提供する。
【０１２５】
図６：Ｔ１５  ＩｇＭが腹膜Ｍφによるアポトーシス胸腺細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ食作用を増強
Ｔ１５  ＩｇＭが死細胞及び瀕死細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ排除にも影響を及ぼすかどうかを評価するため、最終アッセイの４日前に、腹膜Ｍφを活性化する腹腔内（ｉ．ｐ．）チオグリコレート処置をｍｕＭＴ−／−マウスが受ける実験系を使用した。次にマウスは、免疫学的に適合するマウス由来の新鮮な（即ち、健康な）又はエトポシド誘導アポトーシス胸腺細胞のｉ．ｐ．点滴注入の１６時間前に、１ｍｇのモノクローナルＩｇＭ又は食塩水を静脈内（ｉ．ｖ．）摂取した。これらの胸腺細胞のｉ．ｐ．点滴注入の１０分後に、氷冷ＨＢＳＳ／ＥＤＴＡを使用した洗浄により全ての腹膜細胞を回収した。そして、移動した胸腺細胞及びその他のＴ細胞を同定するために抗ＣＤ３蛍光色素染色を使用して、フローサイトメトリー分析を実施し、アポトーシスの初期段階にある細胞を、７ＡＡＤ非染色及びアネキシンＶ反応性に基づいて同定した（図６）。Ｔ１５  ＩｇＭにより処置したマウスでは、食塩水により処置したマウスに比べて（ｐ＝０．００２）、又は無関係な結合特異性を持つ対照ＩｇＭ（ＮＣ１７−Ｄ８）により処置したマウスに比べて（ｐ＝０．００４）、これらの瀕死／死細胞の排除が著しく増強される（即ち、腹膜腔内に存在しない）ことが見出された。Ｔ１５  ＩｇＭによる処置は又、壊死細胞も含まれる場合がある死の後期段階（即ち、７ＡＡＤ反応性、アネキシンＶ反応性）にある細胞の排除も増強した。従って、これらの試験では、まとめると、Ｔ１５  ＩｇＭ処置によって、腹膜Ｍφのような食細胞による結合、取り込み及び飲み込みが増強されることが示されている。
【０１２６】
図７：Ｔ１５  ＩｇＭ処置がＭφ、ＤＣ及び一部のＢリンパ球においてＴＬＲシグナル伝達を下方制御
又、限られた持続期間（即ち、２週間）のＴ１５  ＩｇＭ処置が、炎症反応を引き起こし、炎症性疾患、並びに全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような炎症性自己免疫性疾患の病原に関与する、明確なトール様受容体（ＴＬＲ）の精製された作動薬の投与に対する細胞反応に影響を及ぼす可能性があるかどうかを判定するためにも、試験を実施した。これらの試験では、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス群が、１．５ｍｇのＴ１５  ＩｇＭ又は無関係な特異性を持つＩｇＭアイソタイプ対照のｉ．ｐ．注入を３回（０、７及び１４日目）受けた。１７日目に殺処理する１２時間前に、種々の群のマウスは、食塩水を摂取するか、又はＴＬＲ３作動薬（ポリＩ：Ｃ、１００ｕｇ）、若しくはＴＬＲ４作動薬（エンドトキシン、１００ｕｇ）、若しくはＴＬＲ７作動薬（ＳＭ−３６０３２０、３００ｕｇ）５６、若しくはＴＬＲ９作動薬（ホスホロチオエートＣｐＧオリゴ１０１８、２００ｕｇ５７）の投与を受けた。図７のパネルに示す通り、種々の平均蛍光指数（ＭＦＩ）が示されている：上段は対照の灰色斜線部；中段はＴＬＲ作動薬投与後のアイソタイプ対照ＩｇＭ、太実線；下段は同じＴＬＲ作動薬に続くＴ１５処置、赤色破線。ここで、ＭＦＩは、ＴＬＲの誘因により誘導される可能性がある、細胞活性化のこれらのマーカーの発現レベルの数値によるフローサイトメトリー指標である。
【０１２７】
これらの結果では、ｉｎ  ｖｉｖｏリガンド投与により誘導される細胞膜関連の活性化マーカーの発現レベルの鈍化（即ち、低下）によって示される通り、２週間のＴ１５  ＩｇＭによる処置によって、明確なトール様受容体（ＴＬＲ）の精製作動薬の投与に対する細胞反応が弱められることが示されている。微生物病原体及び一部の自己リガンド由来の特定の産物に類似すると考えられるこれらのＴＬＲ作動薬は、先天性及び適応免疫系の両細胞が免疫反応を増幅し、炎症を誘導する重要な誘因として作用することが知られている。従って、図７に示す通り、これらの結果は、ＩｇＭ抗ＰＣ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏレベルを増大することにより、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ（Ｍφ）及び特定の種類の成熟Ｂ細胞が特定の細胞受容体を介して活性になる能力を大幅に阻害できるという、直接の証拠を提供する。これらの細胞の種類の内、Ｍφのみがアポトーシス細胞の排除に対する重要な定量的寄与であるが、これらの種類の細胞は全てＴＬＲ及び補体受容体を発現する。従って、Ｔ１５  ＩｇＭによる処置は、アポトーシス細胞関連成分及び決定因子への補体沈着と補体受容体を発現する細胞との相互作用を変えることによりベネフィットをもたらす場合があり、これは、炎症反応に寄与するように誘導される可能性もあれば、炎症反応を低下する可能性もある。
【０１２８】
図７に示す通り、アイソタイプ対照ではなくＴ１５  ＩｇＭによる前処置によって、共刺激分子、ＣＤ８６及びＭＨＣクラスＩＩの発現の例が示される、ＴＬＲ作動薬の投与による膜関連活性化マーカーのその後の誘導の能力が弱められることが示されている。二次誘導変化の可能性を制限するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＬＲ作動薬投与と直後のｅｘ  ｖｉｖｏ分析の間の間隔は最小限（即ち、１２時間）とした。Ｔ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体の処置では、種々のＴＬＲ作動薬それぞれに対する反応におけるマクロファージ（Ｍφ）及び樹状細胞（ＤＣ）の機能的な阻止が誘導されたが、これらの予備試験において、Ｔ１５により誘導される阻害は、ＴＬＲ７リガンドよりもＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬及びＴＬＲ９作動薬の方がより完全であった。これらの試験では、ＴＬＲ７作動薬にＳＭ−３６０３２０を使用し、その活性はレシキモドの１００倍であった５６。加えて、マクロファージ（Ｍφ）のマーカーであるＦ４／８０＋細胞では、Ｔ１５  ＩｇＭ処置によるＴＬＲ反応性及び／又は保護の程度がサブセットによって異なることが、輪郭によって示されている。従って、全てのＭφ及びＤＣサブセットが等しく影響を受けるわけではないこともあり、Ｔ１５  ＩｇＭ処置によって、一部のＴＬＲ作動薬に対する反応が弱められ、且つ一部のＤＣ及びＭφの組については他に影響を及ぼすことなく反応が弱められる場合もある。従って、Ｔ１５  ＩｇＭは、病原に影響を及ぼし、炎症反応及び／又は病理的自己免疫反応を弱める場合がある一方で、全身性免疫抑制を生じない場合がある。これらのＴＬＲ作動薬に対する反応性の減少に加えて、この同じＴ１５  ＩｇＭのレジメンは、脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣの発現も増加させ、予備試験により、この処置が、他の種類のＤＣにも影響を及ぼすものの、脾臓ＣＤ８α＋及び形質細胞性ＤＣの両発現に影響を及ぼすことが示された。
【０１２９】
これらの試験では、Ｂ細胞区画内の反応も評価した。脾臓周縁帯（ＭＺ）のＢ細胞は有意なＴＬＲリガンド反応を有したが、これらの反応も又Ｔ１５  ＩｇＭ処置によって弱められたのに対して、小胞Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ２３ｈｉＣＤ２１ｌｏ）はそれほど影響を受けなかった。腹膜腔では、ＴＬＲ作動薬のｉｎ  ｖｉｖｏ投与に対するＢ−１ａ細胞の反応も又、Ｔ１５  ＩｇＭ処置により、対照処置を代わりに受けたマウスの反応に比べて弱められた。これらの試験では、一般的に、リンパ球よりもＭφ及びＤＣの方が、抗ＰＣ抗体による処置の影響を受けた。
【０１３０】
まとめると、これらの試験では、ｉｎ  ｖｉｖｏで死細胞又は瀕死細胞を選択的に認識できるモノクローナルＩｇＭ抗ＰＣ抗体が、腹膜Ｍφのような食細胞によるこれらの細胞の結合、取り込み及び飲み込みを増強することが示されている。これらの処置は又、さもなければ炎症を誘導する因子により引き起こされる食細胞及び非食細胞の能力を弱める作用も持つ。これらの試験では又、最高レベルの補体受容体を有する種々の単核細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、周縁帯のＢ細胞及びＢ−１ａ細胞）もｉｎ  ｖｉｖｏ処置により最も影響を受けるため、補体がこれらの活性において中心的な役割を果たすことも示唆されている。
【０１３１】
これらの結果では、本発明の適用によって、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の病原に関わる経路を遮断する潜在能力を有する、包括的な免疫調節効果をもたらすことができることが示されている。
【０１３２】
図８：Ｔ１５  ＩｇＭ処置が脾臓周縁帯のＢ細胞及び移行性Ｂ細胞前駆体を枯渇
適応免疫系のＢ細胞区画内における細胞発現に対するＴ１５  ＩｇＭ処置の効果を評価するため、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの個々の群が、０、７及び１４日目に与えられた１．５ｍｇのＴ１５  ＩｇＭ又は無関係な特異性を持つＩｇＭ（ＮＣ１７−Ｄ８）又は食塩水を摂取し、１７日目に殺処理される、２つの独立した実験のデータをまとめた。各群に合計６〜７匹のマウスが存在した。脾臓の単核細胞による調査では、２週間のＴ１５  ＩｇＭ処置により、Ｂ２２０＋ＣＤ２１ｈｉＣＤ２３ｌｏの表面表現型に基づきフローサイトメトリーにより定義される（両側ｔ検定ｐ＜０．０１５）、脾臓周縁帯（ＭＺ）のＢ細胞の発現に有意な減少が誘導されることを示された。又、Ｂ２２０＋ＡＡ４．１ｈｉＣＤ２４ｈｉＣＤ２１ｌｏに基づき定義される（両側ｔ検定ｐ＜０．００７）５８；５９脾臓（即ち、Ｔ１）中の初期移行性Ｂ細胞前駆体も有意に枯渇する（図８）。
【０１３３】
成熟した小胞Ｂ細胞は、Ｔ１５  ＩｇＭの注入による影響をあまり受けなかった。多くの点で、これらのＴ１５  ＩｇＭにより誘導される変化は、ポリクローナルＩｇＭにより分泌ＩｇＭ失欠マウス中に誘導されることが報告されている変化と似ているが６０、このような機序については本報告中では考察されていない。
【０１３４】
同様の観察がＴ１５  ＩｇＭによる試験で行われたが、Ｔ１５  ＩｇＭ処置によって、さもなければ正常なＢ細胞を有するマウス系であるＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＺ  Ｂ細胞の発現が減少したことから、脾臓内の成熟Ｂ細胞の発現の変化に寄与する異なる機序が示唆されており、このことは以前に報告されている試験とは異なっている６０。ＭＺ  Ｂ細胞は、病理的自己免疫性疾患に寄与することあることが報告されているため、モノクローナル抗ＰＣ抗体の処置が、ＭＺ  Ｂリンパ球の疾患関連反応への動員を妨害することにより治療ベネフィットを提供する場合があるという更なる証拠を、これらの実験の所見が提供している。
【０１３５】
Ｔ１５  ＩｇＭ処置後に脾臓中のＢ細胞前駆体の発現が減少するというこの証拠に基づき、これらの処置は、中央区画である脊髄（ＢＭ）内のＢ細胞前駆体からの末梢Ｂ細胞の補充を減少することにより、この末梢リンパ区画に影響を及ぼす場合があるという仮説を立てた。
【０１３６】
Ｔ１５  ＩｇＭ処置により食塩水又はＩｇＭアイソタイプ対照処置群（Ｎ＝６／群、両側ｔ試験ｐ＜０．００６）に比べてプレＢ／未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｌｏ／＋ｓＩｇＭｌｏ／＋ｓＩｇＤｌｏ／−）の有意な枯渇も誘導されることがフローサイトメトリー分析により実証されたことから、これらの同じマウスでの中央区画の実験によりこの仮説は確認された。対照的に、これらのＴ１５  ＩｇＭ処置は、末梢から再循環したため、この部位に存在する、骨髄中の再循環小胞（ＩｇＭ＋ＩｇＤｈｉ）Ｂ細胞のレベルに影響を及ぼすことはなかった。
【０１３７】
Ｂ系細胞の損失の原因である機構を更に特徴付けるため、細胞生成／代謝回転の割合を決定するＤＮＡ標識（即ち、ブロモデオキシウリジン、ＢｒＤｕ）試験を実施した。Ｔ１５  ＩｇＭ処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、食塩水又はアイソタイプ対照処置群に比べて、脾臓Ｂ細胞におけるＢｒＤｕ標識のレベルが有意に低かった。これらの試験により、図１１に示す通り、おそらくはこれらのＢ系亜集団の生成又は生存の欠乏に起因して、又推定するにＢＡＦＦのようなＢ細胞特異性生存因子のレベルが低いことに起因して、脾臓中のＭＺ  Ｂ細胞及びＴ１細胞区画の、並びに骨髄中のＢ細胞前駆体の補充レベルの低下をＴ１５  ＩｇＭ処置が誘導できるという証拠が提供されている。
【０１３８】
実施例３
ｐＩＧＧベクター由来のＩｇＧ抗体が、高親和性ＰＣに対する結合を示し（図９）、フローサイトメトリーにより死細胞及び瀕死細胞を認識（図１０）
クローンＴ１５可変領域とクローン抗体定常領域とを含有するｐＩＧＧ発現ベクターを使用して産生された組換えＴ１５  ＩｇＧ抗体の結合特性を評価するため、固相免疫測定法を最初に実施した。ここでＥＬＩＳＡウエルを、ウシ血清アルブミンと結合したＰＣ（ＰＣ−ＢＳＡ）で被覆し、次にそれをブロックして、目的のＩｇ試料を、一連の稀釈を使用して繰り返し添加した。全ての組換えＩｇＧがマウスκ軽鎖を含有したことから、これらのアッセイにおける結合レベルは、抗マウス（ｍｓ）κ軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）特異性検出試薬によるその後の発現により測定した。陽性ＩｇＧ対照は、ＰＣ−ＫＬＨによる免疫化から生成された細胞株由来のマウスＩｇＧ抗体であるＰＣＧ１−１４であった。陰性対照では、ＭＯＰＣ２１が、ＰＣを認識しない無関係な結合特異性を持つＩｇＧである。図９に示すその他全ての抗体は、ｐＩＧＧベクターを使用して産生された、異なるＨ定常領域を有するＴ１５  Ｖ領域を発現する組換えＩｇＧタンパク質である。Ｔ１５−ヒト（ｈｕ）ＩｇＧ１は、マウスＴ１５  Ｖ領域及びヒトＩｇＧ１定常領域を発現するヒトキメラ抗体である。このアッセイにより、全ての組換えＴ１５系ＩｇＧ抗体が同等のＰＣ結合活性を発現することが示されている。特に、結合曲線に基づき、Ｔ１５親クローンの可変領域を発現する組換えＩｇＧ抗体（例えば、Ｔ１５−ＩｇＧ２ａ及びＴ１５  ＩｇＧ２ａ  Ｄ２６５Ａ）は、ＰＣタンパク質コンジュゲートＰＣ−ＢＳＡの認識及び結合に対して高い結合活性を有することが示されている（図９）。これらの活性も又、アポトーシス細胞は認識しこれに結合するものの、健康な細胞は認識又は結合しないその他の抗ＰＣ抗体について以前に説明した活性と同等のものである６。
【０１３９】
ｐＩＧＧベクターから生成される組換えＴ１５−ＩｇＧ２ａの活性も又、フローサイトメトリーアッセイで評価し、このＴ１５  ＩｇＧ抗体が死胸腺細胞及び瀕死胸腺細胞の決定因子を認識することが示された。図１０に示す通り、上段のパネルでは、Ｔ１５  ＩｇＧ抗ＰＣ抗体特異性が、エトポシド誘導アポトーシスを被る全ての胸腺細胞で示されている。一方下段のパネルでは、Ｔ１５  ＩｇＧ２ａ抗体が、初期アポトーシス細胞（即ち、アネキシンＶ−陽性、７ＡＡＤ陰性）も認識しており、この抗体はＰＣによって阻害されている（図示なし）。反応性は、標識ＩｇＧγ重鎖特異性試薬を使用して実証した（図１０）。結合を実証するのに比較的高い結合反応性を必要とするこのアッセイでは又、Ｔ１５  ＩｇＧがアポトーシス死の初期段階（即ち、７ＡＡＤ非反応性、アネキシンＶ反応性）にある細胞を認識し結合することも示されている。アポトーシス死の初期段階にある細胞のＴ１５  ＩｇＧ抗体によるこの実証された認識は、死の初期段階にあるそのような細胞及び分解産物の排除を促進することが、代わりに炎症性の宿主反応を支持する可能性がある後期段階及び／又は壊死への細胞の進行を防ぐ上で最も望ましいと考えられることから、特に重要である。
【０１４０】
実施例４
Ｔ１５  ＩｇＭ処置が炎症関連サイトカイン及び因子のＲＮＡ転写物のレベルを低減
２週間のＴ１５  ＩｇＭ処置がサイトカインレベルに影響を及ぼす可能性があるかどうかを判定するため、Ｔａｑｍａｎ系を使用する定量転写アッセイを使用した。図７でのフローサイトメトリー試験にて示す試験で使用した、同じ２週間のＩｇＭ又は対照処置レジメンを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを処置し、１７日目に殺処理した。これらのマウスは、ＴＬＲ作動薬の投与を受けなかった。各群２匹の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓全体におけるサイトカインレベルを、市販のプライマーセットを使用するＴａｑｍａｎ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｘｙｘｔｅｍｓ）により測定し、ＨＰＲＴ転写レベルを基準化した後に図示した（図１１）。特定の転写レベルはそれぞれ個別のマウスでいくらか異なっているものの、Ｔ１５  ＩｇＭ処置は、主要なＢ細胞生存因子である、ＢＡＦＦ転写及びＡＰＲＩＬ転写のベースラインにおける（即ち、恒常設定点に関連する）低減をもたらした。これらの予備試験でも又、Ｔ１５  ＩｇＭが、炎症誘導性サイトカインであるベースラインの炎症誘導性ＩＬ−６及びＩＬ−１２αを低減したという証拠が提供されている（図１１）。図示の通り、Ｔ１５  ＩｇＭ処置は、脾臓における一連のサイトカインのベースライン発現レベルに影響を及ぼすことが示されている。これらの試験では、ｉｎ  ｖｉｖｏＴ１５  ＩｇＭ処置が、脾臓における炎症誘導性及びＢ細胞生存促進性サイトカイン転写物の恒常レベルを下方制御することが示されている（図１１）。
【０１４１】
予備試験では又、対照処置を受け、ポリＩＣ（ＴＬＲ３作動薬）又はＣｐＧ（ＴＬＲ９）投与を受ける成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の１２時間後にアッセイした時に、脾臓ＩＬ−６及びＩＬ−１２α転写レベルの増加を誘導したが、そのような反応は、Ｔ１５  ＩｇＭによる２週間の処置レジメンを受けたマウスでは弱められたことも示されている（図示なし）。まとめると、これらの試験では、Ｔ１５  ＩｇＭ処置が、炎症性疾患に関与する一部のサイトカインのベースラインレベルを下方制御することができ、ＴＬＲ作動薬が炎症誘導性サイトカイン反応を引き起こす能力を弱めることもできることが示されている。
【０１４２】
炎症性サイトカインのベースラインレベルを下げ、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬのレベルを下げる抗ＰＣ抗体による処置の能力も又、図８に示す通り、２週間のＴ１５  ＩｇＭ処置の後に続く特定のＢ系細胞の発現の減少に寄与する場合がある。これらの減少したサイトカイン転写レベルは、これらの因子の一部又は全ての供給源となる可能性があるマクロファージ及び／又は樹状細胞に対するＴ１５  ＩｇＭ抗ＰＣｉｎ  ｖｉｖｏ処置の直接的又は間接的な効果を反映する場合がある。
【０１４３】
【表１】
2008530019.tif 000003
【０１４４】
【表２】
2008530019.tif 000004
【０１４５】
【表３】
2008530019.tif 000005
【０１４６】
【表４】
2008530019.tif 000006
【０１４７】
【表５】
2008530019.tif 000007
【０１４８】
【表６】
2008530019.tif 000008
【０１４９】
【表７】
2008530019.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ホスホリルコリン（ＰＣ）抗原の三構造を示す。ＰＣは、微生物病原体、アテローム硬化症関連血小板及び酸化修飾ＬＤＬ、並びに死細胞及び瀕死細胞に示されるため、これらの物質は細胞受容体、Ｂ細胞抗原受容体及び抗体により認識することができる。
【図２】Ｔ１５  ＩｇＭがアポトーシス関連ネオエピトープを認識して、死細胞及び瀕死細胞、アポトーシス小疱及び細胞破壊片の包み込み及びそれらへの補体因子の沈着を促進する機序を示す。
【図３】実施例１以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体による処置後の（ＮＺＷｘＢＸＳＢ）Ｆ１マウスの生存期間の延長を示す。
【図４】実施例２以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５  ＩｇＭ抗ＰＣ抗体が、代表的な瀕死細胞の一例であるアポトーシス胸腺細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体沈着を誘導することを示す、フローサイトメトリーアッセイを示す。
【図５】実施例２以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５抗ＰＣ抗体が、アポトーシス胸腺細胞の腹膜マクロファージ（Ｍφ）によるｉｎ  ｖｉｖｏ食作用を増強することを示す。
【図６】実施例２以下に詳細に記載する通り、無関係な結合特異性を持つＩｇＭアイソタイプ対照ＮＣ１７−Ｄ８ではなく、Ｔ１５  ＩｇＭによる処置が、アポトーシス胸腺細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ排除を増強するという、Ｂ細胞及び抗体失欠マウスであるｍｕＭＴ−／−マウスの処置結果を示す。
【図７】実施例２以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５  ＩｇＭ処置がトール様受容体（ＴＬＲ）の作動薬に対する反応を弱めることを示す。
【図８】実施例２以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５  ＩｇＭ処置が脾臓周縁帯（ＭＺ）のＢ細胞及び移行性Ｂ細胞前駆体を枯渇することを示す。
【図９】実施例３以下に詳細に記載する通り、ｐＩＧＧ発現ベクターを使用したＴ１５抗体遺伝子の発現により生成されるＩｇＧ抗ＰＣ抗体が、固相免疫測定法により高親和性ＰＣに対する結合活性を示すことを示す。
【図１０】実施例３以下に詳細に記載する通り、ｐＩＧＧ発現ベクターからの発現により生成されるＩｇＧ抗ＰＣ抗体が、フローサイトメトリーアッセイで示されるように、高親和性の死細胞及び瀕死細胞を結合することを示す。
【図１１】実施例４以下に詳細に記載する通り、Ｔ１５  ＩｇＭ処置が、定量Ｔａｑｍａｎアッセイにより検出されるように、炎症関連サイトカイン及び因子の転写物のレベルを低減することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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