(57)【要約】  試料中の核酸配列内の特定の位置にある多型の有無を検出する方法であって、ｉ）一対のプローブを前記核酸配列にアニーリングさせること、ここで、前記プローブは、互いに隣接し、そしてＡＴＰを実質的に含まない反応混合物中で、ある形態の配列に対して唯一完全にアニーリングするように設計されている；ｉｉ）任意の完全にアニーリングしたプローブ対をＮＡＤ及び鋳型としてＮＡＤを使用する核酸リガーゼの存在下で一緒にライゲーションすること；ｉｉｉ）ライゲーションイベントによって放出された任意のＡＭＰをＡＴＰにリン酸化すること；及びｉｖ）得られた反応混合物中のＡＴＰを検出すること、を含んで成る方法。この方法を実施するキットも説明され、そして特許請求の範囲に記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列内の特定の位置にある多型の有無を検出する方法であって
ｉ）一対のプローブであって、それらが互いに隣接してアニーリングし、そしてある形態の配列に対して唯一完全にアニーリングするように設計されているプローブを、前記核酸配列に対し、ＡＴＰを実質的に含まない反応混合物中で、アニーリングさせること；
ｉｉ）任意の完全にアニーリングしたプローブ対をＮＡＤ及び鋳型としてＮＡＤを使用する核酸リガーゼの存在下で一緒にライゲーションすること；
ｉｉｉ）ライゲーションイベントによって放出された任意のＡＭＰをＡＴＰにリン酸化すること；及び
ｉｖ）得られた反応混合物中のＡＴＰを検出すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
ＡＴＰが生物発光系を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物発光系がルシフェラーゼ／ルシフェリン系である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前処理ステップとして、核酸配列含有試料がＡＴＰを除去するように処理される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が遺伝子試料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
核酸リガーゼが熱安定性リガーゼであり、前記方法がリガーゼ連鎖反応の一部をなす、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
二対のプローブが使用され、一方の対が二本鎖標的核酸の各鎖に相当する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数の対のプローブが標的核酸鎖上で互いに直接隣接してアニーリングされる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数の対のプローブが、小さなギャップが存在するように結合し、その間にはアデニン塩基が全く含まれておらず、そして反応混合物が更に、上流プローブが前記ギャップを横切って伸長するのに適したポリメラーゼとヌクレオチドを含み、但し、当該上流プローブの３’末端が標的核酸上の相当の塩基とマッチする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、基質としてＮＡＤを使用する核酸リガーゼ、リン酸化試薬、及び生物発光シグナルを生成することができる１又は複数の試薬、を含んで成るキット。
【請求項１１】
前記リン酸化試薬が、ホスホエノールピルビン酸合成酵素、リン酸及びホスホエノールピルビン酸の組み合わせ；ヌクレオシド三リン酸−アデニル酸キナーゼ、ＮＴＰ及びアデニル酸キナーゼの組み合わせ；又はピルビン酸・リン酸ジキナーゼ、の組み合わせ、である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
生物発光反応系を生成することができる１又は複数の試薬が、ルシフェラーゼ及び／又はルシフェリンを含んで成る、請求項１０又は請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
標的核酸とアニーリングするのに適した一対のプローブを更に含んで成る、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１４】
二対のプローブを含んで成り、各対が標的二本鎖核酸の反対の鎖上にある相当の領域とアニーリングすることができる、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
マグネシウム塩を更に含んで成る、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
１又は複数のＮＡＤ、緩衝液、又はカリウム塩、を更に含んで成る、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
デアミナーゼ酵素を更に含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の核酸配列を検出する方法、特に多型又は突然変異を含む配列を同定する方法、並びにこのアッセイを実施するためのキット、に関する。
【０００２】
特定の核酸配列を検出する、特に核酸配列の正確な配列を決定する広範な方法が利用可能となりつつある。これらの多くが核酸増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に基づいている。
【０００３】
これらの方法は、病原、例えば細菌及びウイルスによって引き起こされる疾患を検出又は診断する広範な方法で使用されている。これは遺伝子解析又は診断において特に有用であり、ここで、多型、特に一塩基多型（ＳＮＰ）の存在は病状、特定の病状に対しての素因をもたらすことがある。
【０００４】
ヒトゲノムの配列決定の完了、及び特定の疾患又は疾患素因に対する特定の多型の関係の知識の増大に伴い、診断目的で実施される解析の数が増大している。
【０００５】
リガーゼ連鎖反応は、多型の検出に特に有用である。この反応において、相補的なプローブの対であって、正確な鋳型が利用可能である場合には、鋳型上で隣同士でハイブリダイズするプローブ対が、試験中の試料に添加される。それらは、かかるハイブリダイゼーションが起こる条件にかけられ、そして次に、ヌクレオチドの存在下でリガーゼ酵素を用いてライゲーションされる。当該ヌクレオチドは、一般的にはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）であるが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）も使用することができる。
【０００６】
例えば、J. M. Pascalらの論文であるNature, (2004) 432, pp473-478で説明されているように、３段階のライゲーションイベントがこの方法では行われ、結果としてアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）分子が各ライゲーションイベントの副産物として放出される。
【０００７】
ライゲーションされたプローブ及び元の鋳型は、その後次の一連のハイブリダイゼーション及びライゲーションのための更なる鋳型としての役割を果たす。これは、核酸鎖が変性するように最初に混合物を加熱して８０〜９０℃の温度、好適には約８５℃にし、そしてその後プローブのアニーリング及びライゲーションが生じる温度、例えば４０〜６０℃、典型的には５０℃に冷却することで達成される。次のサイクルが実施される際、正確な鋳型が試料中に存在している場合にのみ増幅される。
【０００８】
一対が二本鎖の元の鋳型分子の各鎖に相当する、４つのプローブを用いることで、指数関数的な増幅が生じうる。この場合において、予備的な段階で二本鎖の鋳型ＤＮＡが変性される。
【０００９】
更に、場合によっては、前記プローブは、近傍で一緒にアニーリングするものの、直接互いに隣接しないように設計される。これらの場合、上流プローブが小さいギャップ（通常２〜３塩基対）全体に広げられるのに必要なポリメラーゼ、ヌクレオチド及び他の試薬も、上流プローブ（続いて、当該プローブはポリメラーゼ伸長反応のプライマーとして機能する）がライゲーション前に当該ギャップ全体に広がるように反応混合物中に含められる。伸長は、上流プローブの３’塩基が鋳型上の対応する塩基にマッチする場合にのみ生じ、そしてこれが生じないと、多型等の結果として、その後のライゲーションは起こらない。
【００１０】
その後、プローブのライゲーション生成物は、当該生成物をサイズベースで、例えば電気泳動ゲル上で分離し、そしてそれらが検出されるように前記ゲルを染色することで検出することができる。ライゲーションされたプローブに相当するバンドは、個々のプローブよりも大きいため、かかるバンドの存在により、ライゲーションが起こったこと、そして正確な鋳型が試料中に存在していたことが示唆される。
【００１１】
しかしながら、この分離段階及び検出段階は実施するのに時間がかかり、そして複雑である。これは研究所の環境でのみ実施可能であり、そして相当の技術者レベルを必要とし、また、多数の分離反応段階を必要とする。
【００１２】
場合によって、二本鎖ＤＮＡと会合する蛍光色素であって、一本鎖ＤＮＡと比較して二本鎖ＤＮＡと会合した際にその蛍光が変化する蛍光色素を、反応混合物に加えることもある。増幅が進められると、続いてかかる色素からの蛍光シグナルの性質から検出可能となる。しかしながら、この場合には、かかるシグナルを、比較的複雑な装置である蛍光光度計を用いて測定することが必要となる。特定の波長の蛍光は試料に供されなければならず、そしてその発光シグナルは異なる波長で測定される。
【００１３】
本発明によると、試料中の核酸配列内の特定の位置にある多型の有無を検出する方法であって
ｉ）一対のプローブを、ＡＴＰを実質的に含まない反応混合物中で、前記核酸配列にアニーリングさせること、ここで、前記プローブは、互いに隣接し、そして、ある形態の前記配列に対して唯一完全にアニーリングするように設計されている；
ｉｉ）任意の完全にアニーリングしたプローブ対をＮＡＤ及び鋳型としてＮＡＤを使用する核酸リガーゼの存在下で一緒にライゲーションすること；
ｉｉｉ）ライゲーションイベントによって放出された任意のＡＭＰをＡＴＰにリン酸化すること；及び
ｉｖ）得られた反応混合物中のＡＴＰを検出すること、
を含んで成る方法、が提供される。
【００１４】
ステップｉ）は、かかる反応で常用の方法で実施することができる。従って、前記プローブは、鋳型の鎖上で互いに直接隣接するように結合されることがあり、その結果、プローブの隣接の末端が鋳型と完全にマッチする場合にステップ（ｉｉ）でライゲーションが起こる。
【００１５】
あるいは、前記プローブは、それらの間に小さなギャップが存在するように結合することがあり、但し、このギャップ領域にはアデニン塩基は存在しない。この場合、反応混合物はポリメラーゼ、アデニン以外のヌクレオチド及び、上流プライマーを伸長させギャップを閉じるのに必要で、且つ、プローブの３’末端が鋳型上の対応する塩基とマッチする場合にのみライゲーションさせるその他の任意の試薬、を含む。この塩基がマッチしない場合、ギャップ全体へのプローブの伸長は起こらず、そしてステップ（ｉｉ）のライゲーションは生じない。
【００１６】
この方法を用いた（ｉｉ）におけるライゲーション反応は、両プローブが十分に結合する配列を前記試料が含む場合にのみ生じる。
【００１７】
マッチを生じさせる核酸配列の存在は、ステップ（ｉｖ）におけるライゲーション反応の間に放出されるＡＭＰに由来するＡＴＰを検出することによって決定することができる。
【００１８】
かかるアッセイの標的を形成する核酸配列における突然変異又は差異、特に、プローブが互いに隣接して結合する位置での突然変異又は差異の結果として、プローブの一方の末端は標的に結合せず、その結果ライゲーションイベントはステップ（ｉｉ）で起こらない。ＡＭＰが全く生成しない結果として、ステップ（ｉｉｉ）でのリン酸化はＡＴＰを何ら生じさせない。ステップ（ｉｖ）での反応混合物中のＡＴＰの不在は、試料が標的核酸を含んでおらず、そしてそのために異なる形態のものが存在しうること、を示唆するものである。
【００１９】
同様に、又は基質としてＡＴＰの代わりにＮＡＤを利用することができる核酸リガーゼが知られている。かかるリガーゼの具体例にはＥ．コリ(E. coli)リガーゼがある。
【００２０】
ライゲーションのＡＭＰ副産物は、ステップ（ｉｉｉ）の間に、直接的に又はアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の産生を経由して、酵素によってＡＴＰへとリン酸化されうる。
【００２１】
産生したＡＭＰをＡＴＰに変換する（上記ステップ（ｉｉｉ））のに必要な１又は複数の酵素は、例えば、反応混合物に対し試薬として添加される、リン酸塩及びホスホエノールピルビン酸塩の存在下、ＡＭＰから直接ＡＴＰを生成するホスホエノールピルビン酸合成酵素から選択されうる。あるいは、ヌクレオシド三リン酸アデニル酸キナーゼ及びＮＴＰの組み合わせにより、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）が生成し、これはその後アデニル酸キナーゼのような酵素を添加することでＡＴＰに変換されうる。
【００２２】
適当な酵素の更に追加の例には、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ、例えばEisaki et al, Biochim. et Biophys Acta 1431 (1999) 363-373に記載のものが含まれる。
【００２３】
ＡＴＰの代わりに、通常ＬＣＲで利用されるＮＡＤを用いることで、ＡＴＰ検出をベースとするシグナル伝達系を使用しうる可能性が生じる。
【００２４】
様々なこのタイプの系が知られている。しかしながら、それらは通常迅速に実施することができ、そして、例えばin situではっきりと視認可能なシグナルをもたらすことができる。その結果、ライゲーション反応は、ライゲーション生成物のサイズの解析をする必要なく、均質に決定することができる。
【００２５】
特に、ＡＴＰは、生物発光系を用いて検出される。かかる検出系の利用例は、例えばＷＯ９６／０２６６５に記載されている。
【００２６】
ＡＴＰの存在に対し反応する特に適当な生物発光試薬には、ルシフェリン及びルシフェラーゼが含まれ、必要により、マグネシウムイオン源、例えば酢酸マグネシウムを伴う。ＡＰＴの存在下、これらの試薬は蛍光シグナルを生成し、これは、例えば常用のルミノメーター装置を用いて容易にモニタリングすることができる。これらは通常、蛍光光度計よりも操作して使用するのがはるかに単純である。
【００２７】
シグナルを生成する際に、これらの試薬はＡＭＰ分子を再生させ、これは（ｉｉｉ）の酵素及び／又は試薬の存在下で、再びＡＴＰに再変換される。従って、このシグナルは指数関数的に累積し、そして容易に且つ迅速に検出される。かかる系の一例は、Sakakibara et al., Analytical Biochemistry, 268, 94-101 (1999)に記載されている。この指数関数的なシグナルの増大は、検出が、予め増幅反応が要求されている環境において、直接的に実施可能であることを意味しうる。
【００２８】
生物発光シグナル伝達系は、蛍光系よりも感度が良い。
【００２９】
かかる反応の検出は、単純な光検出器、例えばカメラを用いて、単純且つ容易に実施することができる。蛍光シグナル伝達系において幅広く使用されている、シグナルを検出するのに必要な複雑な装置、例えば蛍光光度計等の使用は、その結果回避される。
【００３０】
適当には、上記方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の一部をなす。この増幅反応は、通常の方法で、例えば変性、アニーリング／ライゲーションのサイクルを反応混合物について繰り返すことで実施されうる。従って、事実上上記ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、所望の増幅レベルに達するまで繰り返される。
【００３１】
適当には、当該反応は２対のプローブを用いて実施され、この一方が二本鎖鋳型核酸の各鎖に対応しているため、増幅が指数関数的に進行しうる。この場合、二本鎖鋳型核酸はステップ（ｉ）前に変性される。
【００３２】
この場合、上述の少なくともステップ（ｉｖ）、好ましくはステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、反応の終了時に実施されうる。これにより良好な終点の検出方法がもたらされる。
【００３３】
しかしながら、所望により、増幅反応中、リン酸化試薬及び生物発光試薬が存在しており、又は添加され、その結果、当該反応の進行がモニタリングされうる。一般的に言えば、試薬、例えばルシフェラーゼの熱安定性は、有意な熱サイクルを伴う増幅反応を通じてその試薬が存在することを可能とするほど十分ではないため、好ましくは当該試薬は各サイクルの終わりに添加され、そして測定は次のサイクルが開始する前に行われる。しかしながら、例として、例えばＥＰ−Ａ−５２４４４８、ＷＯ９５／２５７９８、ＷＯ９９／１４３３６、ＷＯ００／２４８７８、ＷＯ０１／３１０２８及びＷＯ２００３／００６８８０１に記載のような熱安定性ルシフェラーゼ酵素の選択は、ステップ（ｉｖ）のモニタリング反応がＬＣＲを通じて連続的に実施されるのを容易にする。
【００３４】
特に、このことは、ＬＣＲで使用する反応条件又は試薬が、例えば、所望の結果を得るために必要とされる温度範囲の観点でサーマルサイクリングの範囲を軽減又は最小化するためのものであるならば、更に容易にされうる。
【００３５】
例えば、試薬、例えばベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）を添加することにより、必要な変性温度を下げ、あるいは溶媒、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の量を増大させることで、必要とされる変性温度を低下させることができる。
【００３６】
二本鎖を不安定化する酵素、例えばトポイソメラーゼ又はＤＮＡジャイレースの添加も、変性温度を、ルシフェラーゼ酵素が耐えうる温度に軽減するのに有効なことがある。これらの酵素の量は、かかる温度が、不安定化酵素が十分活性である温度よりも低い温度に下げられている場合でもアニーリングとライゲーションが可能であるように平衡反応を続けるのに十分なものであるべきである。
【００３７】
また更に別の態様において、変性は、実質的に等温の様式で、例えば電気化学ポテンシャルを反応混合物に適用して変性ステップを引き起こすことで実施されうる。
【００３８】
更に、オキシルシフェリンからルシフェリンを再生させるルシフェリンリサイクルタンパク質、例えば米国特許第５，８１４，５０４号及びＷＯ０３／０４２６９３に記載のものを反応混合物に添加することで、反応混合物にルシフェリンを連続して添加することが必要となるのを回避することもできる。
【００３９】
このような情報は、当業界で知られているアルゴリズム等を用いた、試料中の標的核酸配列の定量に使用することができる。
【００４０】
上述の反応は、種々の常用の装置で実施することができる。これらには、例えば、既に適切なシグナル検出手段を備えているパイロシークエンサー（スウェーデンのPyrosequencing ABから入手可能）が含まれる。あるいは、かかる反応は、例えばＥＰ−Ａ−０８１００３０に記載され、Perkin-Elmer Corporationによって供給されているブロックヒーティング装置、ラピッドホットエアーサーマルサイクラー、例えばIdaho Technologys Inc.のRapidCycler（登録商標）及びLightCycler（登録商標）又は他のタイプのサーマルサイクラー、例えばＷＯ９８／２４５４８に記載のものを用いて実施することもできる。
【００４１】
ＡＴＰがアッセイ前の試料に存在しないか、少なくとも最低レベルのものが存在することを保証するために、ＡＴＰが除去される前処理ステップを実施することが好ましいであろう。これは、例えば核酸配列を含む試料がアピラーゼで処理され、ＡＴＰが除去される場合に実施されうるが、これにより多少ＡＴＰが産生されうるので、デアミナーゼを利用してアデノシン残基を破壊するのが好ましい。しかしながら、ビーズウォッシュステップによると、それへのＤＮＡの結合が増大することでアデニル酸塩からの核酸の有効な分離が確保されるはずであり、その結果、この方法はそのようなあらゆるステップ無しに実施することができる。
【００４２】
前記方法は、ＬＣＲが現在実施可能なあらゆる用途、微生物、ウイルス又は他の病原等の配列の検出、又は疾患の診断に使用することができる。従って、好ましくは、前記試料は遺伝子試料である。
【００４３】
別の観点において、本発明は、上述の方法を実施するためのキットであって、ＮＡＤを基質として使用する核酸リガーゼ、リン酸化試薬、及び生物発光シグナルを産生することができる１又は複数の試薬を含んで成るキットを提供する。
【００４４】
好ましいリン酸化試薬には、酵素、例えば上述のものや、ホスホエノールピルビン酸合成酵素、リン酸及びホスホエノールピルビン酸の組み合わせ；ヌクレオシド三リン酸−アデニル酸キナーゼ、ＮＴＰ及びアデニル酸キナーゼの組み合わせ；又はピルビン酸・リン酸ジキナーゼ、の組み合わせが含まれる。
【００４５】
生物発光反応系を産生することができる適当な試薬は、ルシフェラーゼ及び／又はルシフェリンを含んで成る。任意に、かかるキットは更に、ルシフェラーゼ／ルシフェリン系を活性するために必要なマグネシウム塩を含んで成ることがあるが、これはＬＣＲでも使用されうる。
【００４６】
前記キットは更に、標的核酸に対してのアニーリングに適した一対のプローブ、好ましくは二対のプローブであって、それぞれの対が標的二本鎖核酸の反対鎖上の相当の領域にアニーリングすることができるプローブ、を含んで成ることがある。
【００４７】
前記キットは更に、ＬＣＲの実施に適した他の試薬、例えばＮＡＤ、緩衝液（例えば２５０ｍＭ  ＥＰＰＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（３−プロパンスルホン酸）、又はカリウム塩を含んで成ることがある。
【００４８】
更に、上文で概説した前処理ステップを実施するためにアピラーゼ酵素、更に好ましくはデアミナーゼ酵素を含むこともある。
【００４９】
本発明は、以下添付図面を参照して例示目的のために特に説明されるが、これは本発明の方法を図示するものである。
【００５０】
この反応スキームにおいて、ステップ１〜３は、ＮＡＤがリガーゼ酵素（ＮＨ2−ＬｙｓＬｉｇ）の基質として使用されている点のみを除き、ＬＣＲで常用されているサイクルを表している。最初の段階において、ＮＡＤは酵素と結合し始め、そしてＡＭＰを解離させる（これはこの段階のリン酸化には利用できない）。ピロリン酸塩（ＰＰｉ）は、この過程で放出される。鋳型ＤＮＡ（１）と上流プローブ（２）及び下流プローブ（３）とがハイブリダイズしたものの存在下で、酵素はそのＡＭＰを下流プローブ（３）の５’に転移させ、これは続いて上流プローブ（２）の３’末端にある遊離ヒドロキシ基とライゲーションされてライゲート（４）を形成し、そして遊離ＡＭＰを放出させる（ステップ３）。
【００５１】
この段階でのリン酸化酵素の添加又は存在は、遊離ＡＭＰからＡＴＰへの変換をもたらし、これは続いて常用のルシフェラーゼ／ルシフェリン生物発光反応において検出することができる。これをステップ４で例示する。
【００５２】
従って、本発明の反応系により、アッセイ、特に多型の検出、例えばＳＮＰを実施する際の信頼性及び容易性が、特に実施例１に記載のように提供される。
【実施例】
【００５３】
実施例１
Ａ．試料の調製
試料の調製は、Thermo Labsystem KingFisherの機械などの機器で実施することができる。
【００５４】
血液試料（２００μｌ）は、３００μｌの３．８Ｍ塩酸グアニジンに添加される。これは続いて１分間室温で混合され、それにより細胞材料が溶解し、そしてＤＮＡを放出させる。Promega MagneSil KF常磁性粒子（２０μｌ）を添加し（これらは最初の洗浄溶液を含むウェルで保存されることもあり（以下参照のこと）、そしてそのウェルから移されることもある）、そして２分間混合されうる。抽出されたＤＮＡは、シリカ粒子と結合する。ＤＮＡと結合した粒子は、続いて磁気によりエタノールとＴＥバッファー（ｐＨ７．４）の５０％の混合物（ＴＥバッファーは１０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡである）を含む最初のウォッシュウェルに移される。ビーズは放出され、そして最初の洗浄溶液と１分間混合される。これを２回以上同一の洗浄溶液で繰り返す。３回目の洗浄の後、ビーズは、ｐＨ８．３の５０℃超のＴＥバッファーに移し、同時に１２分間混合され、この間にＤＮＡがシリカマトリックスから溶出される。続いて、ビーズが除去されて、ウォッシュウェルの１つに廃棄され、そして調製されたＤＮＡは次のステップに使用される。
【００５５】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）
これは、ブロックサーマルサイクラー、例えばPerkin Elmer 9600において実施することができる。
【００５６】
前記ＤＮＡを等量のＬＣＲアッセイミックスと混合して、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのジチオトレイトール、１０ｍＭのＮＡＤ+、４μｇ／ｍＬのサーモン精子ＤＮＡ、１５ユニットのＴ．アクアチクス(T. aquaticus)リガーゼと２つの診断用オリゴヌクレオチド（それぞれ５μＭの濃度）とを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．６）バッファーを含む溶液で最終反応量を５０μｌにした。反応は、９４℃で１分間、そして６５℃で４分間、の熱プロファイルで実施し、これを４０サイクル繰り返す。次に、ＮＡＤから形成したＡＭＰの生物発光検出を使用して、ＬＣＲが生じたか否かの指標とする。前記診断用オリゴヌクレオチドは、６５℃を約２℃上回るような融解温度となるように設計する。
【００５７】
生物発光検出
このアッセイは、室温で、Thermo LabsystemsのLabsystems Luminoskan Ascentプレートルミノメーターを用いて、９６ウェルのマイクロタイタープレート中１００μｌの量で実施することができる。
【００５８】
添加した生物発光アッセイの混合物は、２０ユニット／ｍｌのアデニル酸キナーゼ、５ｍＭのアセチルリン酸、２ユニット／ｍｌの酢酸キナーゼ、３００ｎｇ／ｍｌの新鮮なルシフェラーゼ及び１ｍＭのＤ−ルシフェリン／９０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのジチオスレイトールを含むことで、最終的なｐＨは７．９となる。発光は、前記診断用オリゴヌクレオチドがＤＮＡ標的の相補塩基とエンドマッチする場合には強く、例えば、ここでは一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
（原文記載なし）
【図１】
2008533983.tif 000002
【国際調査報告】
2008533983.tif 000003
2008533983.tif 000004
2008533983.tif 000005