(57)【要約】  本発明は、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法に関する。特に、本発明は、分子水素以外の還元剤を用いる、または別法として、１種もしくは複数の還元剤と分子水素の組合せを用いることによる、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの改良された培養方法を提供する。本発明はまた、本明細書で開示する方法を用いて培養したＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから調製されるワクチンおよび診断用試薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させた細胞を、分子Ｈ２の不在下、かつ分子Ｈ２以外の還元剤の存在下で培養することを含む、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法。
【請求項２】
前記の分子Ｈ２以外の還元剤が、酸化還元電位範囲が＋３００ｍＶ〜−６００ｍＶの有機または無機還元剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が有機還元剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機還元剤が、アルキルチオール、アリールチオール、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、エタンチオール、プロパンチオール、ジチオスレイトール、システアミン、過硫化システイン、グルタチオン、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ならびにこれらの鏡像異性体、ラセミ体またはラセミ混合物、遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記還元剤が、任意の形態のシステインまたはその塩である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記還元剤が無機還元剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記無機還元剤が、ハイドロサルファイト（ジチオナイト）、チオサルフェート、ジサルファイト（メタバイサルファイト）、硫化水素、ならびにこれらの遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記還元剤の濃度が次の範囲から選択され、すなわち酸化還元電位の範囲が約＋３００ｍＶ〜−６００ｍＶ（ｍＶはミリボルト）、より好ましくは＋１００ｍＶ〜−４００ｍＶ、最も好ましくは−１００ｍＶ〜−３００ｍＶであり、あるいは還元剤濃度が、約０．８％〜０．０００８％、より好ましくは０．４％〜０．００４％、より好ましくは０．１０％〜０．００２％、最も好ましくは０．０２〜０．００２％の範囲にあり、あるいは特に有用な濃度範囲であるとされるミリモル（ｍＭ）での濃度範囲が、約０．０５ｍＭ〜５０．０ｍＭ、より好ましくは０．１０ｍＭ〜１０．０ｍＭ、最も好ましくは０．１０ｍＭ〜１．０ｍＭである、請求項１から７に記載の方法。
【請求項９】
約２％〜約１８％の範囲のＯ２濃度で細胞を培養する、請求項１から８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させた細胞を、分子Ｈ２と分子Ｈ２以外の少なくとも１種の有機もしくは無機還元剤の存在下で培養することを含む、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法。
【請求項１１】
前記還元剤が、請求項２から８に記載した当該範囲の還元剤から選択されてもよい有機または無機還元剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
２％〜１８％の範囲のＯ２濃度で細胞を培養する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる動物の疾患を治療または予防するのに有効であり、請求項１から１２の方法のいずれかによって増殖させた免疫学的有効量のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含み、アジュバントを含有していてもよく、ブタの治療に使用してもよいワクチン組成物。
【請求項１４】
本明細書乃至特許請求の範囲に記載の手順に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと反応性である動物からのサンプル中の抗体の存在を、または、本明細書乃至特許請求の範囲に記載の手順に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを用いて生成された抗体とともにＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの存在を、または、本明細書乃至特許請求の範囲に記載の手順に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから単離されたポリヌクレオチドとともにＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの存在を、検出することを含むＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓにより引き起こされる動物の疾患の診断方法。
【請求項１５】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる動物の疾患を診断するのに有用なキットであって、本明細書乃至特許請求の範囲に記載のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、またはそれから単離されたポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または本明細書乃至特許請求の範囲に記載の手順に従ってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養したときにＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対して産生された抗体を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法に関する。本発明はまた、本明細書で開示する方法に従って培養したＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから調製されるワクチンおよび診断用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素ガスは、気体の形または溶液中の水素であり、「Ｈ２」または「分子水素」または「分子Ｈ２」と呼ばれる。水素ガスは、気体の形でもよいし、または溶液中に溶解したものもしくは導入されたものでもよい。非分子の水素は、有機または無機の還元剤で見られるものなどのＨの任意の結合型であり、例を挙げる。
【０００３】
無機還元剤は、炭素核を含まない任意の化学還元剤であり、そのような薬品の非限定的な例は、ハイドロサルファイト（ジチオナイト）、チオサルフェート、ジサルファイト（メタバイサルファイト）、硫化水素、ならびにこれらの遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩である。
【０００４】
Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、ブタ増殖性腸疾患（ＰＰＥ）を引き起こす病原体である。この生物は、以前に「カンピロバクター様」生物（ＭｃＯｒｉｓｔら、Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．第２６巻：２６０〜２６４ページ、１９８９年）および「Ｉｌｅａｌ  ｓｙｍｂｉｏｎｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ」（Ｓｔｉｌｌｓ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５９巻：３２２７〜３２３６ページ、１９９１年）とも呼ばれていた。
【０００５】
Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、従来の無細胞培地を使用する通常の細菌培養法によって培養することができない偏性細胞内細菌である。この細菌は、インビトロで組織培養細胞を用いて培養することしかできない（Ｊｏｅｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．第５８巻：１１２５〜１１３１ページ、１９９７年；Ｌａｗｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ第３１巻：１１３６〜１１４２ページ、１９９３年；ＭｃＯｒｉｓｔ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第４５巻：８２０〜８２５ページ、１９９５年；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９５７６）。
【０００６】
感染した動物では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、絨毛細胞および腸陰窩細胞の細胞質に所在が示される。ＰＰＥに罹患しているブタは、不揃いな絨毛細胞および上皮細胞異形成を伴う腸陰窩構造を特徴とし、陰窩膿傷は絨毛の形態、腸陰窩は分枝状になり、炎症細胞でいっぱいになっている。
【０００７】
有機還元剤は、炭素を含む任意の化学還元剤であり、そのような薬品の非限定的な例は、アルキルチオール、アリールチオール、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、エタンチオール、プロパンチオール、ジチオスレイトール、システアミン、過硫化システイン、グルタチオン、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ならびにこれらの鏡像異性体、ラセミ体またはラセミ混合物、遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩からなる群である。
【０００８】
ＰＰＥは、養豚産業にとって商業的に重要な疾患である。ＰＰＥは、家畜の損失、薬物適用コスト、ブタの生育速度の低下、および飼料コストの増大と関連付けられる。ＰＰＥはまた、たとえば、抗生物質残留物による汚染の取扱いや、この生物体が他の動物もしくはヒトに伝わり、または運ばれないようにするためのコントロール処置における追加の労働コストおよび環境コストにおいて、下流部門の間接的なコストの一因となる。
【０００９】
還元剤は、水素供与体として作用し得る任意の化学化合物である。
【００１０】
還元剤は、その強度およびどれだけを使用するかに従って酸化還元電位と呼ばれる還元強度を有する。ここで、特に有用であるとされる酸化還元電位の範囲は、＋３００ｍＶ〜−６００ｍＶ（ｍＶはミリボルト）、より好ましくは＋１００ｍＶ〜−４００ｍＶ、最も好ましくは−１００ｍＶ〜−３００ｍＶである。還元剤の強度は、薬品の濃度によって言うこともできる。ここで、特に有用であるとされる濃度範囲は、パーセントとして使用するとき、０．８％〜０．０００８％、より好ましくは０．４％〜０．００４％、より好ましくは０．１０％〜０．００２％、最も好ましくは０．０２〜０．００２％である。ここで、還元剤の濃度範囲は、ミリモル（ｍＭ）で考えることもでき、特に有用であるとされる濃度範囲は、０．０５ｍＭ〜５０．０ｍＭ、より好ましくは０．１０ｍＭ〜１０．０ｍＭ、最も好ましくは０．１０ｍＭ〜２．０ｍＭである。酸化還元電位および濃度は、溶液中の他の還元剤または酸化剤に応じて変化し、使用する還元剤、酸化還元電位、または濃度の最適なレベルを決定することは、当業者にとって日常的な問題であるはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
今までに同定された最適な条件下でさえ、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養する難しさは、ＰＰＥを理解しコントロールする障害となったままである。Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養するための、改良されたより安全な方法、ならびにＰＰＥを治療および予防するための組成物の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法を対象とする。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、分子水素Ｈ２なしでＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養する方法を提供する。
【００１４】
本発明の特定の実施形態では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの強化された培養のための組織培養培地中に、分子水素以外の１種または複数の有機もしくは無機の還元剤を使用する。
【００１５】
好ましい実施形態では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養するための組織培養培地は、システインまたはその塩で補充したものである。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、組織培養培地が、分子水素と、分子水素以外の１種または複数の有機もしくは無機還元剤の両方を補充したものである、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法を提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、組織培養培地は、分子水素とシステインもしくはその塩の両方を補充したものである。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明は、周囲酸素濃度付近および濃縮された酸素濃度でのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法を提供する。
【００１９】
特定の実施形態では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、周囲酸素濃度付近および濃縮酸素濃度のもと、１種または複数の有機もしくは無機還元剤の存在下、かつ分子水素の不在下で培養する。
【００２０】
別の特定の実施形態では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、周囲酸素濃度付近および濃縮酸素濃度のもと、分子水素と、分子水素以外の１種または複数の有機もしくは無機還元剤の存在下で培養する。
【００２１】
本発明の方法に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチンおよび診断用試薬の製造で使用することができる。したがって、本明細書に記載の方法で培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから調製されるワクチンおよび診断用試薬は、本発明の別の実施形態となる。
【００２２】
本発明は、分子Ｈ２を用いるまたは用いない化学還元剤の使用を含む、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの新規な培養方法を開示する。この方法を使用すると、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを成長させるのに一般に使用されるＨガスのレベルを低減することができ、または分子Ｈ２の追加の使用をなくすことができる。例および詳細を示す。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる動物の疾患を治療または予防するのに有効な、この方法のいずれかによって増殖させた免疫学的有効量のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含み、アジュバントを含有していてもよく、ブタの治療に使用してもよい、有用な関連したワクチン；手順に従って培養されたＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから生成した抗体、または単離されたポリヌクレオチドと反応性の、前記動物からのサンプル中の抗体の存在を検出することを含む疾患の診断方法、ならびにＡキットを提供する。細胞を約２％〜１８％の範囲のＯ２濃度で培養するＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法も提供する。
【００２３】
分子Ｈ２以外の還元剤は、酸化還元電位の範囲が＋３００ｍＶ〜−６００ｍＶである有機または無機還元剤でよい。これは、アルキルチオール、アリールチオール、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、エタンチオール、プロパンチオール、ジチオスレイトール、システアミン、過硫化システイン、グルタチオン、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ならびにこれらの鏡像異性体、ラセミ体またはラセミ混合物、遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩からなる群から選択される有機還元剤でよい。無機還元剤でもよい。前記無機還元剤は、ハイドロサルファイト（ジチオナイト）、チオサルフェート、ジサルファイト（メタバイサルファイト）、硫化水素、ならびにこれらの遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩からなる群から選択される。
【００２４】
前記還元剤の濃度は、次の範囲から選択され、酸化還元電位の範囲は、約＋３００ｍＶ〜−６００ｍＶ（ｍＶはミリボルト）、より好ましくは＋１００ｍＶ〜−４００ｍＶ、最も好ましくは−１００ｍＶ〜−３００ｍＶであり、あるいは還元剤の濃度は次の範囲、約、０．８％〜０．０００８％、より好ましくは０．４％〜０．００４％、より好ましくは０．１０％〜０．００２％、最も好ましくは０．０２〜０．００２％にあり、あるいは特に有用な濃度範囲であるとされるミリモル（ｍＭ）での濃度範囲は、約、０．０５ｍＭ〜５０．０ｍＭ、より好ましくは０．１０ｍＭ〜１０．０ｍＭ、最も好ましくは０．１０ｍＭ〜２．０ｍＭである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明以前から、組織培養細胞でのＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養に、容器の気相または上部空間への分子水素（Ｈ２）の追加が必要であることは一般に理解されていた。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、約７３〜９４％のＨ２の存在下、酸素濃度を低下させ、組織培養細胞中で常法どおりに培養されていた。培養中に水素供給源を提供する必要に加え、４％を超えるＨ２濃度の使用は、実験室で潜在的に危険なシナリオを描くものであった。
【００２６】
本発明者らは、分子水素以外の還元剤が、分子水素なしでの  Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養を可能にすることを発見した。これらの還元剤が、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を促進することにおいて少なくとも分子水素と同じ程度に強力であることは予想外である。さらに、これらの還元剤の１種または複数と分子水素の組合せは、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養を強化し得る。したがって、本発明は、より安全かつより経済的なＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養方法を提供する。
【００２７】
本明細書では、「培養する」または「培養」という用語は、組織培養細胞中でのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの成長、繁殖、および／または増殖を促進する過程を指す。
【００２８】
概して言えば、組織培養細胞を、最初にＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ細菌の種菌に感染させる。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養する際の使用に適する細胞は、当業界で知られており（たとえば、米国特許第５７１４３７５号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／３０２８４を参照されたい）、その限りでないが、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、ヒト細胞、ウマ細胞、魚細胞、ウシ細胞、およびブタ細胞がこれに含まれる。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、ラット腸上皮細胞ＩＥＣ−１８（ＡＴＣＣ１５８９）、ヒト類表皮癌細胞ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ２３）、マウスＭｃＣｏｙ細胞（ＡＴＣＣ１６９６）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ３４）、バッファローグリーンモンキー腎細胞ＢＧＭＫ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ＃７１−１７６）、ブタ腸上皮細胞、およびベロ細胞を使用して培養することが好ましい。特に好ましい細胞は、ＨＥｐ−２、ＭｃＣｏｙ、またはＩＥＣ−１８細胞である。
【００２９】
播種する前に、増殖培地を含む従来の組織培養フラスコ、ボトル、またはチャンバーの中で細胞を培養することができる。増殖培地は、市販されているどんな培地でもよく、通常は、窒素供給源、選択した培養細胞に必要な成長因子、およびグルコースやラクトースなどの炭素供給源を含む。好ましい培地は、２〜１０％のウシ胎児血清で補充したＤＭＥＭである。
【００３０】
種菌は、たとえば、アメリカ培養細胞系統保存機関から、または当業者によく知られている単離および精製技術を使用して、感染したブタもしくは他の動物から得られる、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの純粋な培養物でよい。
【００３１】
種菌を細胞培養物に加えて細胞を感染させ、次いで、植えつけた細胞を適切な条件下でインキュベートする。本発明によれば、播種した細胞を分子水素なしで培養することができる。特に、本発明によれば、分子水素以外の還元剤が、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養するのに分子水素と同程度に強力であることが独自に確認された。したがって、播種した細胞を、分子水素なし、かつ分子水素以外の１種または複数の還元剤の存在下で培養して、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの十分な成長、繁殖、および増殖を実現することができる。
【００３２】
本発明によれば、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの培養にふさわしい還元剤には、その限りでないが、たとえば、アルキルチオール、アリールチオール、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ホモシステイン、β−メルカプトエタノール、エタンチオール、プロパンチオール、ジチオスレイトール、システアミン（２−メルカプトエチルアミン）、過硫化システイン、グルタチオン、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、他のチオール含有物質などの還元型の有機硫黄化合物、および還元型と酸化型のチオール含有物質の混合物（たとえば、システイン−シスチン、システアミン−シスタミン）；たとえば、ハイドロサルファイト（ジチオナイト）、チオサルフェート、ジサルファイト（メタバイサルファイト）、硫化水素などの還元型の無機硫黄化合物；たとえば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）やトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）などのホスフィン誘導体；アスコルビン酸；すべての関連する還元剤の鏡像異性体、ラセミ体もしくはラセミ混合物、遊離塩基形態、塩酸塩、水和物、および塩、Ｏｘｙｒａｓｅ（登録商標）および他の酵素に基づく還元系、ならびに培地中で還元性のレドックス環境を確立することのできる他の成分、構成要素、添加剤、または条件が含まれる。培地にこれらの還元剤を供給することはかなり好都合である。したがって、本発明によるこれらの還元剤の特定は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを培養するのに好都合かつ有効な選択肢を提供する。
【００３３】
さらに、本発明によれば、植えつけた細胞を、上述の１種または複数の還元剤と組み合わせた分子水素の存在下で培養すると、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの強化された培養を実現することができる。「強化された培養」とは、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの繁殖、生存度、または運動性が、分子水素または還元剤の個々の存在下での培養と比べて増大していることを意味する。
【００３４】
他の重要な培養パラメータには、Ｏ２およびＣＯ２の濃度が含まれる。本発明以前は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを植えつけた細胞は、通常は、一般に２％〜１８％の範囲、好ましくは約４％〜約１０％の範囲、より好ましくは約８．０％の低めのＯ２濃度で培養した。本発明によれば、上述のような分子水素以外の１種または複数の還元剤の使用は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを植えつけた細胞の、周囲Ｏ２濃度付近および濃縮されたＯ２濃度、たとえば１９〜２１％、およびそれ以上での培養を可能にする。
【００３５】
適切な二酸化炭素濃度については、当業界、たとえば米国特許第５７１４３７５号で述べられている。植えつけた細胞は、約６％〜約９％の範囲の二酸化炭素濃度でインキュベートすることが好ましく、約８．８％の二酸化炭素濃度が最も好ましい。
【００３６】
本発明によれば、植えつけた細胞を窒素（Ｎ２）の存在下で培養することも好ましい。植えつけた細胞は、約７１％〜約９８％、より好ましくは約７４％〜約８７％の範囲のＮ２濃度でインキュベートすることが好ましく、約８３．２％のＮ２濃度が最も好ましい。
【００３７】
特に好ましい実施形態では、細胞は、約８．０％Ｏ２、約８．８％ＣＯ２、および約８３．２％Ｎ２の雰囲気中、塩酸システインを補充した培地でインキュベートする。
【００３８】
別の特定の実施形態では、細胞は、約８．０％Ｏ２、約８．８％ＣＯ２、および約８３．２％Ｎ２の雰囲気中で、水素ガス補充処理してある塩酸システイン補充培地でインキュベートする。
【００３９】
植えつけた細胞は通常、組織培養フラスコまたはボトルに播種し、これを当業者によって日常的に使用される適切なインキュベート装置、たとえば、デュアルガスインキュベーター、またはインキュベーターもしくはチャンバー内の雰囲気および温度を容易に調節することのできる他のガスチャンバーに入れる。所望ならば、組織培養フラスコまたはボトルを撹拌して、インキュベートの間細胞を懸濁した状態に保つこともできる。最適な細胞成長のために、２〜３日毎に培養物の約２５〜５０％を取り除き、新鮮な培地と交換する。
【００４０】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの産生を拡大するために、培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓは、新鮮な培養細胞へと継代培養することができる。懸濁培養液中のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの継代は、感染細胞の懸濁培養液の一部を取り除き、それを新鮮な（すなわち、感染していない）培養細胞を含む新しいフラスコに加えることで実現することができる。単層細胞培養物の継代は、細胞を溶解させ、細胞溶解物からＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採取し、採取したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓで新鮮な細胞培養を感染させることによって実現される。
【００４１】
培養細胞を十分に成長させた後、次いで、培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを当業者によく知られている技術を使用して収集する。概して言えば、たとえば細胞懸濁液を２５ゲージの針に通すことによって培養細胞を収集し、溶解させる。細胞の核および細片を細胞溶解物から取り出し、遠心分離によって上清からＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを収集することができる。収集したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ細菌は、継代培養、または診断用試薬もしくはワクチン組成物の調合のいずれかに適するふさわしい希釈液に懸濁させる。
【００４２】
本発明の別の態様では、本方法を用いて培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを診断用試薬の調製で使用する。たとえば、細菌細胞は、細菌に感染した疑いのある動物の血清および他の体液中でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体を検出するための抗原としてそのまま使用することができる。あるいは、細菌細胞を使用して、ポリヌクレオチド、ポリペプチドを単離することができ、これらを使用して抗体を生成することもできる。次いで、単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体を診断アッセイで使用することができる。診断用試薬は、キットの形で提供することができる。
【００４３】
本発明の別の態様では、本発明に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをワクチン組成物の調合で使用する。細菌は、ホルマリンまたは他の不活性化剤を使用して不活化することができる。あるいは、細菌は、既知の弱毒化技術のいずれかを使用して、たとえば高次の連続的な継代培養または化学的手段によって弱毒化することができる。不活化または弱毒化された生きた細菌は、水酸化アルミニウムや鉱油などの適切なアジュバントと組み合わせると、ワクチンの免疫原性を強化することができる。
【００４４】
本発明に従って培養したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから調製されたワクチン組成物は、（ブタ、げっ歯類、ウサギ、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、シカ、キツネ、トリなどの）動物、特にブタを、ＰＰＥなどのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる疾患から守るのに有用である。したがって、動物においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる疾患を治療または予防する方法は、本発明の別の実施形態となる。
【００４５】
本発明を以下の実施例よってさらに例示するが、本発明はこれによって限定されない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１）
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓブタ分離菌ＶＰ１での初期繁殖試験：塩酸システイン対水素ガス補充
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓブタ分離菌ＶＰ１（１７継代）を使用してＭｃＣｏｙ細胞を感染させた。ＭｃＣｏｙ細胞は、２５ｃｍ２容フラスコあたり１．２５×１０５細胞、およびＴｒａｃボトル（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｉｌｉｎ  Ｌｔｄ．、英国スタフォードシャー）あたり１．２５×１０４細胞で、組織培養フラスコ中の７％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充したＤＭＥＭに播種した。Ｔｒａｃボトルは、フラスコ中で模擬実験による感染をモニターするために使用した。フラスコおよびＴｒａｃボトルを、５％のＣＯ２を含む加湿したインキュベーターに入れて３７℃で一晩インキュベートした。翌日、フラスコおよびＴｒａｃボトル中の細胞を、７％のＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭ中のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓブタ分離菌（１７継代）に感染させた。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを加えた後、フラスコおよびＴｒａｃボトルを３通りの異なる方法で処理した。１つのフラスコおよび対応するＴｒａｃボトルは、１５水銀柱ｐｓｉの吸引で真空にし、純粋水素でパージした。第２のフラスコおよび対応するＴｒａｃボトルは、真空にもせず、水素パージもせず、代わりに塩酸システイン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−７４７７、米ミズーリ州セントルイス）、β−ＮＡＤ、およびホスファチジルコリンで、最初の２回の継代の際にそれぞれ０．０１％、５ｍＭ、および１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで、後の継代の際に塩酸システイン（０．０２％の最終濃度）のみで補充した。第３のフラスコおよび対応するＴｒａｃボトルは、真空にもせず、水素パージもせず、どんな補充も行わなかった。すべてのフラスコおよびＴｒａｃボトルを、８．０％のＯ２、８．８％のＣＯ２、および８３．２％のＮ２を含むインキュベーターに入れて３７℃でインキュベートした。感染後２日および５日目に、すべてのフラスコおよびＴｒａｃボトルの培地の５０％を、塩酸システイン、β−ＮＡＤ、およびホスファチジルコリンを含むまたは含まない、５％のＦＢＳを含む新鮮なＤＭＥＭと交換した。
【００４７】
感染後５日または６日目に、組織培養フラスコ中の単層を、対応するＴｒａｃボトルカバーガラスの免疫ペルオキシダーゼ染色によってモニターした。簡潔に述べると、Ｔｒａｃボトルのカバーガラスを取り外し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で穏やかに洗浄し、永久接着剤を使用して顕微鏡スライドに接着した。次いで、カバーガラスを室温で３０秒間かけてアセトン固定した。ＰＢＳで４００分の１希釈したウサギ抗Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓポリクローナル抗体を加えて、カバーガラス全体を覆い、次いでこれを３７℃の加湿環境で３０分間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで穏やかに洗浄し、ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）の２０分の１希釈物をカバーガラスに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１０ｍｇの３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米ミズーリ州セントルイス）を２０ｍｌのＰＢＳに溶解させて、ペルオキシダーゼ基質溶液を調製した。Ｗｈａｔｍａｎ  １１３Ｖ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．、英国ケント州）で濾過した後、溶解した基質に４０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を加えた。最終基質溶液をカバーガラスに加え、室温で５分間インキュベートした。水道水ですすいだ後、カバーガラスを、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈａｒｒｉｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して３０秒間かけて対比染色した。次いで、染色したスライドを水道水ですすぎ、顕微鏡で観察した。フラスコ内の培地にいる細菌も顕微鏡観察して、ＭｃＣｏｙ細胞の感染を評価した。
【００４８】
フラスコ中の感染したＭｃＣｏｙ細胞は、感染後６日または７日目に、０．１％の塩化カリウム（ＫＣｌ）溶液を使用して溶解させた。溶解させた材料を使用して、フラスコおよびＴｒａｃボトル中の新鮮なＭｃＣｏｙ細胞単層を再び感染させた。簡潔に述べると、フラスコから培地を取り出した後、０．１％のＫＣｌ溶液を加え（２５ｃｍ２あたり５ｍｌ）、３７℃で５〜１０分間インキュベートした。フラスコからＫＣｌ溶液を取り除き、５％のＦＢＳを含む２ｍｌのスクロースグルタミン酸カリウム（ＳＰＧ；０．２１８Ｍのスクロース、０．００３８ＭのＫＨ２ＰＯ４、０．００７２ＭのＫ２ＨＰＯ４、および０．００４９Ｍのグルタミン酸カリウム）を加えた。次いで、細胞スクレーパーを使用して細胞をフラスコから取り出した。次いで、細胞を、１８ｇａの針を装着したシリンジに強引に通して溶解させた。溶解が良好であることを確実にするために、溶解させた材料の一定分量を顕微鏡観察した。溶解させた材料および溶解の前にフラスコから取り出した上清を３５００ｇで１５〜２０分間遠心分離した。その結果得られたペレットを、５％のＦＢＳを含む、細菌数に応じた適切な体積のＳＰＧに再懸濁した。再懸濁した細胞溶解物に、５％のＦＢＳを含む適切な量のＤＭＥＭを加え、これを使用して、これより前に記載した通りに新鮮なＭｃＣｏｙ細胞単層を再び感染させた。
【００４９】
これらの実験の結果（表１）に基づき、ＭｃＣｏｙ細胞のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓでの感染には、水素の使用またはシステインＨＣｌの補充が必要であったことが結論付けられた。どちらかの使用なしでは、感染を実現することができなかった。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
別のセットの実験では、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ分離菌ＶＰ１（２３継代）を使用してＭｃＣｏｙ細胞単層を感染させた。次いで、細胞を１５日間微好気性環境に置いた。その時点で、培地中に多くの死細胞が見え、培地中のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物は活性があるようには思われなかった。フラスコに新鮮な培地を供給し直した。翌日、単層がフラスコから剥離し始めたことが認められ、個々の細菌はまだ活性がないと思われた。フラスコからの単層細胞を、水を使用して溶解させた。簡潔に述べると、フラスコから培地を取り出し、フラスコに約１６ｍｌの無菌の脱イオン水を加えた後、３７℃で１０分間インキュベートした。フラスコを顕微鏡で検査すると、膨張し多孔性のＭｃＣｏｙ細胞が顕われた。次いで、フラスコを手掌に当てて穏やかに叩き、溶解した材料の液滴を顕微鏡で観察した。無傷の細胞は観察されず、単層の完全な溶解が示された。４．２５％のＮａＣｌ溶液を直ちに加えて、培地をほぼ通常の生理学的モル浸透圧濃度にした。
【００５２】
溶解した材料を３２００×ｇで１５分間遠心分離した。その結果得られたペレットを７％のＦＢＳを含む４１ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁し、これを使用して新鮮なＭｃＣｏｙ細胞を感染させた。この溶解したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染性の材料３５ｍｌを、ＭｃＣｏｙ細胞を播種した１つの１７５ｃｍ２容フラスコに加え、０．５ｍｌを１つの播種したＴｒａｃボトルに加えた。フラスコおよびＴｒａｃボトルの両方を１５水銀柱ｐｓｉの吸引によって真空にし、次いで純粋水素でパージした。また５ｍｌおよび０．５ｍｌの材料を使用して、それぞれ２５ｃｍ２容フラスコおよびＴｒａｃボトルに播種されたＭｃＣｏｙ細胞を感染させた。１５ｐｓｉの真空吸引による排気および窒素フラッシュの後、システインＨＣｌの５倍保存液を２５ｃｍ２容フラスコおよび対応するＴｒａｃボトルに加えて、最終濃度を０．０２％とした。すべてのフラスコおよびＴｒａｃボトルを、８．０％の酸素、８．８％の二酸化炭素、および８３．２％の窒素を含むインキュベーターに入れて３７℃でインキュベートした。再補給は、上述のように実施したが、システインＨＣｌを加えたフラスコおよびＴｒａｃボトルにも再補給して同じ最終濃度（０．０２％）とした。
【００５３】
感染後６日または７日目に、対応するカバーガラスの免疫ペルオキシダーゼ染色によって上述のように感染をモニターした。感染は、蛍光抗体染色によってもモニターした。簡潔に述べると、Ｃｙｔｏｆｕｎｎｅｌサンプルチャンバー（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｉｎｃ．、米ペンシルヴェニア州ピッツバーグ）および１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用して、細胞溶解物をＣｙｔｏｓｐｉｎ顕微鏡スライド上に収集した。サンプルを風乾し、３０秒間かけてアセトン固定した。次いで、スメアを、ウサギ抗Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓポリクローナル血清の４００分の１希釈物で覆い、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで穏やかに洗浄し、フルオレセイン標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｓ）の２０分の１希釈物をスメアに加え、スライドを３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、これを蛍光顕微鏡で観察した。
【００５４】
これらの実験は、システインＨＣｌで補充したＭｃＣｏｙ細胞のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染が、水素ガス補充を使用する感染と比べて強化されていることを示している（表２）。システインＨＣｌの使用に伴ってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに生存度を回復することができたことも実証された。細菌の活性／運動性のフラスコ中での増大は、鞭毛の蛍光抗体での染色によって実証されるように、鞭毛の発現の増加によって裏付けられた。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
（実施例２）
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓハムスター分離菌ＳＴＲの繁殖：塩酸システイン対水素ガス補充
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓハムスター分離菌ＳＴＲ（４４継代）を使用して、次のようにＭｃＣｏｙ細胞を感染させた。すなわち、２５ｃｍ２容フラスコあたり２×１０５細胞のＭｃＣｏｙ細胞を、７％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに播種し、感染をモニターするために匹敵する密度の８×１０３細胞を４８ウェルプレートに播種した。細胞を５％のＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートし、翌日２５ｃｍ２容フラスコあたり約５×１０５個の細菌で感染させた。感染させたフラスコおよび４８ウェルプレートを１５水銀柱ｐｓｉの吸引で真空にし、水素パージした。第２のセットのフラスコおよび対応するＴｒａｃボトルを真空にし、純粋窒素でパージし、塩酸システインを加えて、最終濃度を０．０２％とした。感染させたフラスコおよびプレートを、８．０％のＣＯ２、８．８％のＯ２、および８３．２％のＮ２の二気体インキュベーターでインキュベートした。感染後２日および５日目に、５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用して、フラスコに５０％体積の培地を再供給した。感染度の決定は、５日目に免疫ペルオキシダーゼ染色を使用して行った。溶解および再感染は、４８ウェルプレートの感染の免疫染色によってモニターした感染程度に基づいて（感染後７日目に常法どおりに）実施した。フラスコから培地上清を収集し、３５００ｇで３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを５％ＦＢＳ含有ＳＰＧに再懸濁した。単層をＰＢＳで洗浄した後、水を加え、３７℃で１５分間インキュベートしたが、その時点で、細胞がフラスコから剥離し始めた。次いで、細胞を、１８ｇａの針を装着したシリンジに４〜５回通して溶解させた。溶解液を３５０ｇで５分間遠心分離して、細胞の核をペレットにした。溶解液の上清を収集し、培地上清からの再懸濁したペレットと組み合わせ、次いでこれを使用して、ＭｃＣｏｙ細胞の新鮮な単層を感染させた。
【００５７】
感染後５日目に、水素および塩酸システインの両方のＴｒａｃボトルからのカバーガラスは、約２０％の感染を示した。したがって、塩酸システインは、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ成長を補助するための水素ガス補充と同程度に有効な補充であった。
【００５８】
同様のセットの実験では、２本の２５ｃｍ２容フラスコ中の７％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに２×１０５個のＭｃＣｏｙ細胞を播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２枚の４８ウェルプレートにも、匹敵する密度でＭｃＣｏｙ細胞を播種した。翌日、４９継代のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ（ＳＴＲ分離菌）に感染したＭｃＣｏｙ細胞の上清および細胞溶解物を使用して、これより前に記載した通りにフラスコを感染させた。一方のフラスコを真空にし、水素パージし、インキュベーターに入れた。第２のフラスコを０．０２％の塩酸システインで補充し（水素パージせず）、二気体インキュベーターに入れた。２枚の４８ウェルプレートを、２本のフラスコと並行してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させ、感染のモニターおよび免疫染色用の対照として使用した。フラスコおよび４８ウェルプレートを両方とも、８．０％のＣＯ２、８．８％のＯ２、および８３．２％のＮ２のインキュベーターでインキュベートした。感染後２日および５日目に、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを使用してフラスコに５０％体積の培地を再供給した。
【００５９】
細胞溶解によって細菌を継代培養した。両方のフラスコから前述のように上清および細胞溶解物を調製し、これを、４８ウェルプレート単層の免疫染色によって決定される感染度に応じて１：１または１：２の分割比で使用して、２５ｃｍ２または７５ｃｍ２容フラスコに播種されたＭｃＣｏｙ細胞の新鮮な単層を感染させた。水素ガス補充または（水素ガス補充なしの）システインＨＣｌを用いるＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの繁殖を、分割比を査定し、４８ウェルプレート中の単層の免疫染色を評価することによって１０継代を超える期間にわたって比較した。１０継代後、水素ガス補充を使用して繁殖させていた培養物は、１本の２５ｃｍ２容フラスコから４本の２５ｃｍ２容フラスコに、すなわち４倍の増加に拡大した。塩酸システインを使用して繁殖させた培養物は、１本の２５ｃｍ２容フラスコから１２本の２５ｃｍ２容フラスコに、すなわち１２倍の増加に拡大した。したがって、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの繁殖の際に塩酸システインを水素ガス補充の代わりに用い、同等または優れた細菌収量を実現することができる。
【００６０】
塩酸システインを用いまたは用いずに感染させた４８ウェルプレートを、感染後５日目に８０％のアセトンで固定し、免疫ペルオキシダーゼ法および免疫蛍光法を使用して、前述のように染色した。水素ガス補充対システインＨＣｌを使用して感染させたＭｃＣｏｙ細胞のパーセントを各細菌の継代後に評価した。ここでも、これらのデータは、塩酸システインが、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ繁殖の際に水素ガス補充の代わりに使用できることを示している。
【００６１】
（実施例３）
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓブタ分離菌ＰＨＥ／ＭＮ−００１の培養
追加のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ分離菌ＰＨＥ／ＭＮ−００１のＭｃＣｏｙ細胞単層中での培養を促進するかどうか、ならびに水素ガス補充および塩酸システインを使用する複合効果についても、塩酸システインを水素ガス補充と比較した。
【００６２】
２本の７５ｃｍ２容フラスコの７％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに、ハムスターＳＴＲ分離菌について記載したのと同じようにして、６×１０５個のＭｃＣｏｙ細胞から始めて播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした。２枚の４８ウェルプレートに、ＭｃＣｏｙ細胞を匹敵する密度で播種した。翌日、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ（ＰＨＥ／ＭＮ−００１分離菌）に感染した４０継代目のＭｃＣｏｙ細胞の上清および細胞溶解物を使用して、フラスコを感染させた。一方のフラスコを真空にし、０．０２％の塩酸システインで補充し、水素パージし、インキュベーターに入れた。第２のフラスコを０．０２％の塩酸システインで補充し、最初に水素を使用してパージせずにインキュベーターに入れた。２枚の４８ウェルプレートを、２本のフラスコと並行してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させ、感染のモニターおよび免疫染色用の対照としてもう一度使用した。フラスコおよび４８ウェルプレートを、８．０％のＣＯ２、８．８％のＯ２、および８３．２％のＮ２のインキュベーターでインキュベートした。感染後２日および５日目に、５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを使用してフラスコに５０％体積の培地を再供給した。
【００６３】
細菌を細胞溶解によって前述のように継代培養した。各フラスコから上清および細胞溶解物を調製し、これを１：２および１：４の分割比で使用して、２５ｃｍ２または７５ｃｍ２のフラスコに播種されたＭｃＣｏｙ細胞の新鮮な単層を感染させた。塩酸システインおよび水素ガス補充、または（水素ガス補充なしで）システインＨＣｌのみを用いるＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの繁殖を、拡大したフラスコを査定し、４８ウェルプレート中の単層の免疫染色を評価することによって、９継代を超える期間にわたって比較した。９継代後、上清中で得られた細菌数は、水素ガス補充の有無にかかわらず同様であった（表３）。塩酸システインおよび水素ガス補充を用いて感染させたＭｃＣｏｙ細胞のシステインＨＣｌのみに対するパーセントを、各細菌の継代後に評価した。これらの結果は、塩酸システインが、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの感染および繁殖の際に水素ガス補充の代わりに使用できることをさらに実証している。
【００６４】
【表３】
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【国際調査報告】
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