(57)【要約】細胞、組織、または動物の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節するための化合物、組成物、および方法が、本明細書中で開示される。標的の検証方法もまた提供される。疾患および障害の処置のための医薬品の製造における、開示される化合物および組成物の使用もまた提供される。糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、および高脂肪酸血症の予防、緩和、および／または処置のための方法もまた提供される。いくつかの実施形態においては、糖尿病はＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させられたアンチセンス化合物の投与による、ＩＩ型糖尿病である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの化学修飾を含み、配列番号５の活性のある標的セグメントの少なくとも１２ヌクレオ塩基部分に対して標的化させられた、１５から３５ヌクレオ塩基のキメラアンチセンス化合物であって、ここで、該活性のある標的セグメントは、領域ＢＡ、領域ＢＢ、領域ＢＣ、領域ＢＤ、領域ＢＥ、領域ＢＦ、領域ＢＧ、領域ＢＨ、領域ＢＩ、領域ＢＪ、および領域ＢＫからなる群より選択される、キメラアンチセンス化合物。
【請求項２】
前記化合物が、配列番号５の活性のある標的セグメントの少なくとも２０ヌクレオ塩基部分に対して標的化させられており、ここで、該活性のある標的セグメントは、領域ＢＡ、領域ＢＢ、領域ＢＣ、領域ＢＤ、領域ＢＥ、領域ＢＦ、領域ＢＧ、領域ＢＨ、領域ＢＩ、領域ＢＪ、および領域ＢＫからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
１５から３０ヌクレオ塩基長を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
１８から２２ヌクレオ塩基長を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
標的核酸に対して４個未満の不適合を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化学修飾が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合、少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基、少なくとも１つの修飾された糖、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合を含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記修飾された糖部分は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２−Ｏ−メチル、ＬＮＡ、ＥＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む高親和性修飾を含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
前記キメラアンチセンス化合物は、第１の領域の中のデオキシヌクレオチド、それぞれ５’末端と３’末端で該第１の領域と隣接している第２の領域と第３の領域のそれぞれの中に少なくとも１つの高親和性修飾された糖、ならびに、少なくとも１つの修飾されたホスホロチオエート修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
前記第１の領域は１０デオキシヌクレオチド長であり、前記第２の領域および前記第３の領域はそれぞれ５ヌクレオチド長であり、５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含み、そして前記キメラオリゴヌクレオチドの中の個々のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される浸透促進剤、担体、または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物のトリグリセリド濃度を低下させる方法。
【請求項１３】
前記トリグリセリド濃度が、血中トリグリセリド濃度、血漿トリグリセリド濃度、または血清トリグリセリド濃度である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物のインシュリン感受性を改善する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物のインシュリン感受性を改善する方法であって、前記インシュリン感受性の改善がインシュリン濃度の低下として測定される、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物の血中グルコース濃度を低下させる方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物のコレステロール濃度を低下させる方法。
【請求項１８】
前記コレステロールがＬＤＬコレステロールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コレステロールがＶＬＤＬコレステロールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー化合物を投与する工程を含む、動物の耐糖能を改善する方法。
【請求項２１】
動物の症状を緩和するかまたは症状の重篤度を低下させる方法であって、該動物を、有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程を含み、その結果、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現が阻害され、該症状の１つ以上の物理的指標の測定が該症状の重篤度の低下を示す、方法。
【請求項２２】
前記症状が糖尿病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記症状が肥満である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記肥満が食事によって誘導される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記症状が肥満であり、そして前記物理的指標が体脂肪の減少である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記症状がインシュリン耐性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状がインシュリン欠乏である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記症状が高コレステロール血症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
インシュリン感受性の低下に関係している疾患または症状の予防、緩和、または処置のための方法であって、請求項１〜１１のいずれかの化合物をそのような介入が必要な個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３１】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子を阻害するためのアンチセンス化合物を設計および合成するための方法であって；
（ａ）アンチセンス化合物がそれに対して標的化させられる活性のある標的領域の中のヌクレオチド配列を同定する工程、および
（ｂ）該同定されたヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有しており、不適合が４個未満であるヌクレオ塩基を有しているアンチセンス化合物を合成する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記活性のある標的セグメントが、配列番号５の領域ＢＡ、領域ＢＢ、領域ＢＣ、領域ＢＤ、領域ＢＥ、領域ＢＦ、領域ＢＧ、領域ＢＨ、領域ＢＩ、領域ＢＪ、および領域ＢＫからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性のある標的セグメントが、配列番号４の領域ＡＡ、領域ＡＢ、領域ＡＣ、領域ＡＤ、領域ＡＥ、領域ＡＦ、領域ＡＧ、領域ＡＨ、領域ＡＩ、領域ＡＪ、および領域ＡＫからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性のある標的セグメントが、配列番号３の領域Ａ、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄ、領域Ｅ、領域Ｆ、領域Ｇ、領域Ｈ、領域Ｉ、領域Ｊ、および領域Ｋからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記アンチセンス化合物が、１５から３５ヌクレオ塩基長のキメラ化合物であり、そして少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学修飾は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合、少なくとも１つの修飾されたヌクレオ塩基、少なくとも１つの修飾された糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記修飾された糖部分に、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、２−Ｏ−メチル、ＬＮＡ、ＥＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む高親和性修飾を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記修飾されたヌクレオ塩基が５−メチルシトシンを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記キメラアンチセンス化合物が、第１の領域の中のデオキシヌクレオチド、それぞれ５’末端と３’末端で該第１の領域と隣接している第２の領域と第３の領域のそれぞれの中に少なくとも１つの高親和性修飾された糖、ならびに、少なくとも１つの修飾されたホスホロチオエート修飾されたヌクレオシド間結合が含まれている、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の領域は１０デオキシヌクレオチド長であり、前記第２の領域および前記第３の領域はそれぞれ５ヌクレオチド長であり、５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含み、そして前記キメラオリゴヌクレオチドの中の個々のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートである、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
細胞、組織または動物におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅを調節するための化合物、組成物および方法が、本明細書中に開示される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
チロシンキナーゼとチロシンホスファターゼの特性決定および疾患状態とそれらの関与にかなりの注目が集まっている（Ｚｈａｎｇ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，３３，１−５２）。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ（ＡＣＰ１としても知られている；酸性ホスファターゼ１、可溶性；Ｂｆイソ型；Ｂｓイソ型；ＨＡＡＰ；ＨＣＰＴＰ；細胞質ホスホチロシルプロテインホスファターゼ；ＭＧＣ３４９９；ＲＣＡＰ；赤血球酸性ホスファターゼ１、イソ酵素Ｆ；赤血球酸性ホスファターゼ１イソ酵素Ｓ；赤血球の酸性ホスファターゼ；含脂肪細胞の酸性ホスファターゼ；低分子量のホスホチロシンプロテインホスファターゼ；赤血球酸性ホスファターゼ１）は、赤血球から酸性ホスファターゼとして最初に単離され、その後、多くの別の組織（胎盤、脳、腎臓、肝臓、および白血球が含まれる）の中でも発現されていることが明らかにされた（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，３０，１３３−１４０；Ｄｉｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｖｅｎｓｍａｒｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ．，１９９０，１０４１，２３２−２４２；Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９６３，１９９，９６９−９７１；Ｗｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，１０８５６−１０８６５）。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ遺伝子座は、２番染色体の２ｐ２３〜ｐ２５にマップされ（Ｂｒｙｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９５，３０，１３３−１４０；Ｍａｇｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｒｔｈ．Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｏｒｉｇ．Ａｒｔｉｃ．Ｓｅｒ．，１９７６，１２，３２６−３２７；Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，７１，２５９−２６０）、そしてこれには、１８キロベースにまたがる７個のエキソンが含まれていることが明らかにされた（Ｅｍａｎｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，４，１６７−１７２；Ｊｕｎｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７９，４８，１７−２１）。
【０００３】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅは、インシュリンによって刺激されるインシュリン受容体と直接相互作用し、代謝性の、および分裂促進性のインシュリンシグナルの伝達をネガティブに調節する（Ｃｈｉａｒｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２３８，６７６−６８２）。１つのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅイソ型の組み換え型であるＨＡＡＰβは、インシュリン受容体キナーゼの基質であり得る含脂肪細胞の脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）を脱リン酸化する（Ｓｈｅｋｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１９９２，１，７１０−７２１）。まとめると、これらの知見は、インシュリンシグナルの伝達の調節におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの役割を示唆している。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅはまた、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のレベルも調節し、そして、赤血球の陰イオントランスポーターであるＢａｎｄ３の脱リン酸化もまた行う。これらの機能によって赤血球の代謝と完全性が調節され、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅと疾患（例えば、溶血性ソラマメ中毒症（ソラマメに由来する分子に対する急性の特有の溶血性反応を特徴とする疾患））との間の関係が説明される（Ｂｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ），２００２，５０，９５−１０４）。
【０００４】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ（ＡＣＰ１としても知られている）の最も一般的な遺伝的多形性の結果として、３種類の対立遺伝子（ＡＣＰ１＊Ａ、ＡＣＰ１＊Ｂ、およびＡＣＰ１＊Ｃ）の存在が生じ、そして６種類の遺伝子型の原因となる。これらのそれぞれは、酵素活性全体において強さのバリエーションを示す（Ｇｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８６，７２，３４０−３４３；Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９６３，１９９，９６９−９７１）。多数の珍しい対立遺伝子が報告されており、これらには、ＡＣＰ１＊Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、ＴＩＣ１、ＧＵＡ、およびサイレントな対立遺伝子ＡＣＰ１＊Ｑ０が含まれる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．１９８７，３７，３７１−３７５）。別のスプラシングは２つのイソ型の原因となり、これらは、それらの電気泳動の移動度に基づいてｆａｓｔ（Ｆ）およびｓｌｏｗ（Ｓ）と標示されている（Ｄｉｓｓｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８７，２５，９０１−９１８）。Ｆイソ型およびＳイソ型は異なる触媒特性を示し、これは、これらのイソ型の割合の差に関係している。結果として、活性の調節にバリエーションが生じる（Ｂｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，９６，６２９−６３７）。
【０００５】
プロテインチロシンホスファターゼは、様々な細胞性のプロセス（細胞増殖および分化、細胞周期の進行、ならびに増殖因子のシグナル伝達が含まれる）を調節するシグナル伝達分子である。例えば、多数のプロテインチロシンホスファターゼが、インシュリンシグナルの伝達のネガティブな調節因子として関係しているとされている（Ｚｈａｎｇ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，３３，１−５２）。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅは、複数のシグナル伝達経路に関係しているホスホチロシンホスファターゼである。例えば、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅはインシュリンによって刺激されるインシュリン受容体と直接相互作用し、そして代謝性および分裂促進性のインシュリンシグナルの伝達をネガティブに調節する（Ｃｈｉａｒｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２３８，６７６−６８２）。１つのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅイソ型の組み換え型であるＨＡＡＰβは、インシュリン受容体キナーゼの基質であり得る含脂肪細胞の脂質結合タンパク質（ＡＬＢＰ）を脱リン酸化する（Ｓｈｅｋｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１９９２，１，７１０−７２１）。まとめると、これらの知見は、インシュリンシグナルの伝達におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの役割を示唆している。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅはまた、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のレベルも調節し、そして、赤血球の陰イオントランスポーターであるＢａｎｄ３の脱リン酸化もまた行う。これらの機能によって赤血球の代謝と完全性が調節され、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅと疾患（例えば、溶血性ソラマメ中毒症（ソラマメに由来する分子に対する急性の特有の溶血性反応を特徴とする疾患））との間の関係が説明される（Ｂｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ），２００２，５０，９５−１０４）。
【０００６】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ（ＡＣＰ１としても知られている）の最も一般的な遺伝的多形性の結果として、３種類の対立遺伝子（ＡＣＰ１＊Ａ、ＡＣＰ１＊Ｂ、およびＡＣＰ１＊Ｃ）の存在が生じ、そして６種類の遺伝子型の原因となる。これらのそれぞれは、酵素活性全体において強さのバリエーションを示す（非特許文献１；非特許文献２）。多数の珍しい対立遺伝子が報告されており、これらには、ＡＣＰ１＊Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、ＴＩＣ１、ＧＵＡ、およびサイレントな対立遺伝子ＡＣＰ１＊Ｑ０が含まれる（非特許文献３）。別のスプラシングは２つのイソ型の原因となり、これらは、それらの電気泳動の移動度に基づいてｆａｓｔ（Ｆ）およびｓｌｏｗ（Ｓ）と標示されている（非特許文献４）。Ｆイソ型およびＳイソ型は異なる触媒特性を示し、これは、これらのイソ型の割合の差に関係している。結果として、活性の調節にバリエーションが生じる（非特許文献５）。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの遺伝子型、および結果として、イソ型のレベルと酵素活性全体は、多数の疾患状態と関係性を示す。（例えば、非特許文献６を参照のこと）。これらの知見は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅがインシュリンシグナルの伝達に関与していることの証拠とあわせて、代謝性疾患（例えば、糖尿病）におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅについての役割をサポートしている。
【０００７】
ヒトの疾患におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの関与についての遺伝的証拠を既定の事実とすると、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの活性および／または発現の薬物動態的調節は、これらおよび他の病理学的状態への治療的介入の適切なポイントである。現在、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの合成を効率よく阻害する治療薬は知られていない。結果として、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ機能を効率よく阻害することができる薬剤の必要性は長く残されたままである。
【０００８】
アンチセンス技術は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を低下させるための有効な手段であり、多数の治療適用、診断適用、および研究適用において他に類を見ないほど有用である。一般的には、アンチセンス技術の背後にある原理は、アンチセンス化合物が標的核酸にハイブリダイズし、そして遺伝子の発現、活性、または機能（例えば、転写または翻訳）の調節に影響を与えることである。遺伝子発現の調節は、例えば、標的ＲＮＡの変性または占有に基づく阻害によって行われ得る。変性による標的ＲＮＡ機能の調節の一例は、ＤＮＡ様のアンチセンス化合物とハイブリダイゼーションした際の、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨに基づく変性である。標的の変性による遺伝子発現の調節の別の例は、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉは二本鎖の（ｄｓ）ＲＮＡ様オリゴヌクレオチドの導入が含まれている、アンチセンスによって媒介される遺伝子のサイレンシングの１つの形態であり、これによっては、標的化された内因性ｍＲＮＡのレベルの配列特異的低下が導かれる。この配列特異性は、標的の検証および遺伝子の機能化のためのツールとして、さらには、疾患に関係している遺伝子の発現を選択的に調節するための治療薬として、アンチセンス化合物を極めて魅力的なものとしている。
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８６，７２，３４０−３４３
【非特許文献２】Ｈｏｐｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９６３，１９９，９６９−９７１
【非特許文献３】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．１９８７，３７，３７１−３７５
【非特許文献４】Ｄｉｓｓｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８７，２５，９０１−９１８
【非特許文献５】Ｂｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５，９６，６２９−６３７
【非特許文献６】Ｂｏｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ），２００２，５０，９５−１０４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子に対して標的化させられ、それとハイブリダイズすることができ、そしてＭＬＶ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節するアンチセンス化合物が、本明細書中に開示される。好ましい実施形態においては、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子は、以下の表１に示され、そして引用により本明細書中に組み入れられるＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４３００．２、ＮＭ＿００７０９９．２、ＮＭ＿１７７５５４．１、およびＮＴ＿０２２３２７．１３＿（それぞれ、配列番号３〜６）の１つ以上に対して実質的に類似しているヌクレオチド配列を有している。さらなる態様においては、アンチセンス化合物は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子の１つの領域に対して標的化させられ、そしてその領域にハイブリダイズすることができる。なおさらに、アンチセンス化合物は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子のセグメントに対して標的化させられ、そしてそれとハイブリダイズすることができる。なおさらに、アンチセンス化合物は，ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子の１つの部位に対して標的化させられ、そしてそれとハイブリダイズすることができる。
【００１０】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子のセグメントが含まれている活性のある標的セグメントが、本明細書中でさらに開示される。活性のある標的セグメントは、アンチセンスハイブリダイゼーションに利用することができ、結果として、アンチセンスの調節に適している。１つの実施形態においては、活性のある標的セグメントが、以下に示される経験によるデータを使用して本明細書中で発見されている。ここで、少なくとも２つのキメラオリゴヌクレオチドが、活性のある標的セグメントの中にハイブリダイズし、そして標的核酸の発現を低下させることが示される（本明細書中以後、「活性のあるアンチセンス化合物」）。少なくとも２つの活性のあるアンチセンス化合物は、好ましくは、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子上で約６０ヌクレオ塩基離れている。別の実施形態においては、アンチセンス化合物は、活性のある標的セグメントを標的化し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子の発現を調節するように設計される。
【００１１】
１つの態様においては、１２から３５ヌクレオチドの長さの配列が含まれているアンチセンス化合物が本明細書中で提供され、これには修飾されたヌクレオシド間結合、修飾されたヌクレオ塩基または修飾された糖から選択される少なくとも２種類の化学的修飾が含まれている。羽領域（ｗｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）がそれぞれ５’末端および３’末端で隣接しているデオキシヌクレオチド中心（ｍｉｄ）領域が含まれているキメラオリゴヌクレオチドが本明細書中で提供される。それぞれの羽領域には、少なくとも１つの高親和性ヌクレオチドが含まれている。
【００１２】
１つの実施形態においては、羽領域がそれぞれ５’末端および３’末端で隣接している１０個のデオキシヌクレオチドの中心領域が含まれているキメラオリゴヌクレオチドが、本明細書中で提供され、これには、５個の２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドが含まれている。ここで、キメラオリゴヌクレオチドの個々のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。別の実施形態においては、羽領域がそれぞれ５’末端および３’末端で隣接している１４個のデオキシヌクレオチドの中心領域が含まれているキメラオリゴヌクレオチドが、本明細書中で提供され、これには、３つのロックされた核酸ヌクレオチドが含まれている。ここで、キメラオリゴヌクレオチドの個々のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。さらなる実施形態においては、羽領域がそれぞれ５’末端および３’末端で隣接している１４個のデオキシヌクレオチドの中心領域が含まれているキメラオリゴヌクレオチドが、本明細書中で提供され、これには、２つの２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドが含まれている。ここで、キメラオリゴヌクレオチドの個々のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。さらなる実施形態においては、アンチセンス化合物には、少なくとも１つの５−メチルシトシンが含まれ得る。
【００１３】
さらに、細胞、組織、または動物の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節する方法が提供される。この方法には、上記細胞、組織、または動物を、本発明の化合物または組成物の１つ以上と接触させる工程が含まれる。例えば、１つの実施形態においては、化合物は、細胞、組織、または動物の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を阻害するために使用することができる。本発明のこの態様においては、細胞は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの直接の測定によってＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現の低下の指標について、ならびに／あるいは、疾患または症状の指標（例えば、グルコース濃度、脂質濃度、体重、またはそれらの組み合わせ）について、分析される。
【００１４】
１つの実施形態によっては、グルコース濃度およびトリグリセリド濃度を低下させる方法が提供される。グルコースは、血液、血漿、または血清グルコースであり得る。トリグリセリドは、血液、血漿、または血清トリグリセリドであり得る。別の実施形態によっては、インシュリン感受性を改善する方法が提供される。別の実施形態では、コレステロール濃度を低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態においては、コレステロールは、ＬＤＬまたはＶＬＤＬコレステロールである。１つの実施形態では、耐糖能を改善する方法が提供される。
【００１５】
他の実施形態は、動物の症状を緩和する、またはその重篤度を低下させる方法に関する。これには、上記動物を有効量のアンチセンス化合物と接触させる工程が含まれる。その結果、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現が阻害され、そして、上記の症状の１つ以上の物理的指標の測定が、上記の症状の重篤度の低下を示す。いくつかの実施形態においては、症状としては、糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、および高脂肪酸血症（ｈｙｐｅｒｆａｔｔｙａｃｉｄｅｍｉａ）が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態においては、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。別の実施形態においては、症状はメタボリック症候群である。別の実施形態においては、症状は前糖尿病である。別の実施形態においては、症状は脂肪症である。１つの実施形態においては、脂肪症は脂肪性肝炎である。別の実施形態においては、脂肪症はＮＡＳＨである。別の実施形態においては、症状は心臓血管疾患である。別の実施形態においては、心臓血管疾患は冠状動脈性心臓病である。別の実施形態においては、症状は心血管系危険因子である。
【００１６】
別の実施形態においては、動物において肝臓でのグルコース生産を減少させる方法が提供される。この方法には、本発明のオリゴマー化合物を投与する工程が含まれる。１つの実施形態においては、本発明により、肝臓でのグルコース−６−ホスファターゼの発現を低下させる方法が提供される。この方法には、本発明のオリゴマー化合物を投与する工程が含まれる。本発明の別の態様は、肝臓、脂肪、または両方の組織の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を低下させる方法である。
【００１７】
動物の症状を緩和する、またはその重篤度を低下させる方法もまた提供される。この方法には、上記の動物を、付加的な治療効果を得るためにグルコース濃度を低下させる薬剤、脂質濃度を低下させる薬剤、または抗肥満薬と組み合わせられた本発明のオリゴマー化合物と接触させる工程が含まれる。
【００１８】
糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、メタボリック症候群、および高脂肪酸血症、脂肪症、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、心臓血管疾患、冠状動脈性心臓病、心血管系危険因子、またはそれらの組み合わせを予防、緩和、および／または処置するための方法もまた提供される。これらの方法には、本発明の少なくとも１つの化合物を、そのような介入が必要な個体に投与する工程が含まれる。
【００１９】
本発明によってはまた、疾患（具体的には、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、メタボリック症候群、および高脂肪酸血症、脂肪症、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、心臓血管疾患、冠状動脈性心臓病、心血管系危険因子、またはそれらの組み合わせに関係している疾患、ならびにそれらの少なくとも１つの指標を含む疾患）予防、緩和、および／または処置のための医薬品の調製に本発明の組成物を使用する方法も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅは、インビボでグルコース濃度、トリグリセリド濃度、コレステロール濃度、インシュリン感受性、および耐糖能に影響を与えることが示されており、したがって、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅは、それが関係している疾患および症状に適用される。これらの疾患および症状としては、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、前糖尿病、肥満、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、メタボリック症候群、心臓血管疾患、および冠状動脈性心臓病が挙げられるが、これらに限定はされない。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ機能に関係している疾患および症状の予防、緩和、および／または処置のためのアンチセンス化合物が、本明細書中で提供される。本明細書中で使用される場合は、用語「予防」は、症状もしくは疾患の発症または進行を、数時間から数日間、好ましくは、数週間から数ヶ月間の期間にわたって、遅らせるあるいは未然に防ぐことを意味する。本明細書中で使用される場合は、用語「緩和」は、症状または疾患の重篤度の少なくとも１つの指標の低下を意味する。指標の重篤度は、当業者に公知の主観的測定によって決定される場合も、また、客観的測定によって決定される場合もある。本明細書中で使用される場合は、「処置」は、疾患もしくは症状を変化させるまたは改善するために、本発明の組成物を投与することを意味する。予防、緩和、および／または処置には、一定の間隔での、または症状もしくは疾患の経過を変化させるための薬剤への暴露の前の、複数回の用量の投与が必要である場合がある。
【００２１】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子の発現の調節に使用されるアンチセンスオリゴヌクレオシドおよび他のアンチセンス化合物が含まれているアンチセンス化合物が、本明細書中で開示される。これは、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする１つ以上の標的核酸分子とハイブリダイズするアンチセンス化合物を提供することによって達成することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「標的核酸」および「ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子」は、便宜上、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードするＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはその一部が含まれる）、ならびに、そのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡをもまた含むように使用される。好ましい実施形態においては、標的核酸は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードするｍＲＮＡである。
【００２２】
標的核酸
特定の標的核酸分子に対してアンチセンス化合物を「標的化」させることは、多段階のプロセスであり得る。このプロセスは通常、その発現が調節される標的核酸の同定で始まる。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害または疾患状態に関係している細胞性の遺伝子（またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、あるいは感染性病原体に由来する核酸分子であり得る。本明細書中で開示される場合は、標的核酸はＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードし、そして配列番号１〜４の１つ以上に実質的に類似しているポリヌクレオチド配列を有している。
【００２３】
別のＲＮＡ転写物がＤＮＡの同じゲノム領域から生産され得ることもまた、当該分野で公知である。これらの別の転写物は、一般的には、「変異体」として知られている。より具体的には、「プレ−ｍＲＮＡ変異体」は、それらの開始部位または終結部位のいずれかが、同じゲノムＤＮＡから生産された他の転写物とは異なる、同じゲノムＤＮＡから生産された転写物であり、これにはイントロン配列とエキソン配列の両方が含まれる。変異体は、ｍＲＮＡ変異体を生じ得、これには、別のスプライシング連結点、または別の開始コドンおよび終結コドンを有しているものが含まれるが、これらに限定はされない。ゲノム配列およびｍＲＮＡ配列における変異体が、疾患を生じ得る。このような変異体に対して標的化させられたアンチセンス化合物は、本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節するための組成物および方法は、本発明にしたがう。表１には、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする核酸分子に対応する配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号（ｎｔ＝ヌクレオチド）、ＧｅｎＢａｎｋに登録された配列のバージョンの日付、および割り当てられた本出願における対応する配列番号が列挙される（これらはそれぞれ、引用により本明細書中に組み入れられる）。
【００２５】
【表１−１】
2008541729.tif 000002
【００２６】
【表１−２】
2008541729.tif 000003
標的の発現の調節
標的核酸の発現の調節は、多数の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）機能の変更によって行うことができる。「調節」は、機能の摂動、例えば、発現の増大（刺激もしくは誘導）または減少（阻害もしくは低下）のいずれかを意味する。別の例においては、発現の調節には、プレ−ｍＲＮＡプロセシングのスプライシング部位の選択の摂動が含まれ得る。「発現」には、それによって遺伝子のコードされる情報が、細胞内に存在しており、そして細胞内で動作する構造へと変換される全ての機能が含まれる。これらの構造には、転写産物および翻訳産物が含まれる。「発現の調節」は、このような機能の摂動を意味する。調節されるＲＮＡの機能には、転座機能（これには、ＲＮＡのタンパク質の翻訳部位への転座、ＲＮＡのＲＮＡ合成の部位とは異なる細胞内の部位への転座が含まれるが、これらに限定はされない）およびＲＮＡからのタンパク質の翻訳が含まれ得る。調節することができるＲＮＡプロセシング機能としては、１つ以上のＲＮＡ種を生じるためのＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡのキャップング、ＲＮＡの３’成熟、および触媒活性、または、ＲＮＡが関与し得るかもしくはＲＮＡによって促進され得るＲＮＡを含む複合体の形成が挙げられるが、これらに限定はされない。発現の調節によっては、１つ以上の核酸種のレベルの増大、または１つ以上の核酸種のレベルの低下が、一時的または最終的な一定のレベルのいずれかで、得られ得る。標的核酸機能とのこのような干渉の１つの結果は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現の調節である。したがって、１つの実施形態においては、発現の調節は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルの増加または低下を意味し得る。別の実施形態においては、発現の調節は、１つ以上のＲＮＡスプライシング産物の増加または減少、あるいは、２つ以上のスプライシング産物の割合の変化を意味し得る。
【００２７】
標的核酸の発現に対する本発明のアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在するという条件で、任意の様々な細胞のタイプにおいて試験することができる。標的核酸の発現に対する本発明のアンチセンス化合物の効果は、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して、日常的に行われているように決定することができる。複数の細胞株が、正常な組織および細胞のタイプの両方から、さらには、様々な疾患（例えば、過剰増殖性疾患）に罹患している細胞から導かれる。複数の組織および種に由来する細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）および他の公的な供給源から得ることができ、そして当業者に周知である。初代細胞、すなわち、動物から単離され、そして連続培養が行われていないそのような細胞は、当該分野で公知の方法にしたがって調製することができ、また、様々な商業的な供給業者から得ることもできる。加えて、初代細胞には、薬が使用される状況にあるドナーであるヒト被験体（すなわち、血液のドナー、外科手術を受ける患者）から得られたものが含まれる。初代細胞は当該分野で公知の方法によって調製される。
【００２８】
発現の調節についてのアッセイ
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現の調節は、当該分野で公知の様々な方法でアッセイすることができる。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲによって定量することができる。ＲＮＡ分析は、当該分野で公知の方法によって、細胞性ＲＮＡ全部について、またはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡについて行うことができる。ＲＮＡの単離方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、ｐｐ．４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３に教示されている。
【００２９】
ノーザンブロット分析は当該分野で日常的に行われており、例えば、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、ｐｐ．４．１．１−４．２．９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６に教示されている。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、通常、市販されているＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手することができる）を使用し、そして製造業者による説明書にしたがって行うことができる。ＲＮＡレベルの調節の分析方法は、本発明に限定されない。
【００３０】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅによってコードされるタンパク質のレベルは、当該分野で周知の様々な方法（例えば、免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、または蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ））で定量することができる。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅによってコードされるタンパク質に対する抗体は、様々な供給源（例えば、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）から同定し、得ることができ、また、従来の抗体作成方法によって調製することもできる。ポリクローナル抗血清の調製のための方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、ｐｐ．１１．１２．１−１１．１２．９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示されている。モノクローナル抗体の調製は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、ｐｐ．１１．４．１−１１．１１．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に教示されている。
【００３１】
免疫沈降方法は当該分野で標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、ｐｐ．１０．１６．１−１０．１６．１１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見ることができる。ウェスタンブロット（イムノブロット）分析は当該分野で標準的であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、ｐｐ．１０．８．１−１０．８．２１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見ることができる。
【００３２】
活性のある標的セグメント
それに対して標的化させられた少なくとも２つの活性のあるアンチセンス化合物を有していることによって定義される標的核酸上の位置は、「活性のある標的セグメント」と呼ばれる。活性のある標的セグメントは、少なくとも２つの活性のあるアンチセンス化合物のうちの１つによって定義される。これらは、一方は、活性のある標的セグメントの５’末端にハイブリダイズし、他方は、活性のある標的セグメントの３’末端にハイブリダイズする。さらに別の活性のあるアンチセンス化合物は、この定義された活性のある標的セグメントの内部にハイブリダイゼーションすることができる。化合物は、好ましくは、標的配列上ではわずかに約６０ヌクレオチドしか離れておらず、より好ましくは、標的配列上では約３０ヌクレオチドしか離れておらず、なおさらに好ましくは、化合物は連続しており、最も好ましくは、化合物は重複している。活性のある標的セグメントの内部のアンチセンス化合物の活性（例えば、阻害率（％）として定義される）には、実質的なバリエーションが存在し得る。活性のあるアンチセンス化合物は、それらの標的ＲＮＡの発現を調節する化合物である。本明細書中で提供されるアッセイの１つにおいては、活性のあるアンチセンス化合物は、それらの標的ＲＮＡの発現を少なくとも１０％、好ましくは２０％阻害する。好ましい実施形態においては、活性のある標的セグメントに対して標的化させられたオリゴヌクレオチドの少なくとも約５０％、好ましくは約７０％が、それらの標的ＲＮＡの発現を少なくとも４０％調節する。より好ましい実施形態においては、活性のあるアンチセンス化合物を定義するために必要な阻害のレベルは、活性のある標的セグメントを定義するために使用されたスクリーニングによる結果に基づいて定義される。当業者は、任意の１回のアッセイによって得られた値は、他の同様のアッセイと比較すると、アッセイ間での条件の理由から異なるであろうことを容易に理解するであろう。
【００３３】
ハイブリダイゼーション
本明細書中で使用される場合は、「ハイブリダイゼーション」は、それらの標的配列に対するアンチセンス化合物の相補鎖の対合を意味する。特定の機構には限定はされないが、最も一般的な対合の機構には、水素結合が含まれ、これは、相補的なヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基（ヌクレオ塩基）間での、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合、または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る。例えば、自然界に存在している塩基であるアデニンは、自然界に存在しているヌクレオ塩基であるチミジンおよびウラシルと相補的であり、これらは水素結合の形成によって対合する。自然界に存在している塩基であるグアニンは、自然界に存在している塩基である５−メチルシトシンと、Ｇ−ｃｌａｍｐとして知られている人工の塩基に相補的である。ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で起こり得る。
【００３４】
アンチセンス化合物は、特異的な結合が所望される条件下（すなわち、インビボでのアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下、そしてインビトロでのアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下）で標的以外の核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するために、十分な程度の相補性が存在する場合には、特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合は、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物がその標的配列にハイブリダイズするであろうが、他の配列には最小限にしかハイブリダイズしないであろう条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、状況により異なるであろう。アンチセンス化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物の性質および組成、ならびに、それらが研究されるアッセイによって決定される。
【００３６】
相補性
「相補性」は、本明細書中で使用される場合は、２つのオリゴマー化合物鎖上のいずれかの２つのヌクレオ塩基の間で、または、その標的核酸とアンチセンス化合物が正確に対合する能力を意味する。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置のヌクレオ塩基が、標的核酸の特定の位置のヌクレオ塩基と水素結合することができる場合には、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間での水素結合の位置は相補的な位置であると考えられる。アンチセンス化合物、およびさらにＤＮＡまたはＲＮＡは、それぞれの分子の中の十分な数の相補性位置が、互いに水素結合することができるヌクレオ塩基によって占有されている場合には、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズすることができる」および「相補的である」は、アンチセンス化合物と標的核酸との間で安定であり特異的な結合が起こるためのヌクレオ塩基の十分な数を上回る、正確な対合または相補性の十分な程度を示すように使用される用語である。
【００３７】
当業者には、アンチセンス化合物が活性であるためには、それがハイブリダイズする標的核酸部位に対する１００％の相補性は必ずしも必要ではないことが理解される。多くの場合は、一旦アンチセンス化合物が活性のあるアンチセンス化合物として同定されると、化合物は、標的核酸部位の配列と比較して不適合であるヌクレオ塩基を含むように、日常的に行われている方法によって修飾される。当該分野では、その活性を実質的に変化させてしまうことなく、アンチセンス化合物の中に不適合を導入するための方法が教示されている。アンチセンス化合物は、（特に、高い親和性の修飾に不適合が付随する場合には）活性の有意な変化を伴うことなく、約２０％までの不適合を寛容化することができる。
【００３８】
同一性
アンチセンス化合物またはその一部は、１つの配列番号に対して、または特異的な化合物の番号を有している化合物に対して、定義された同一性の割合（％）を有し得る。本明細書中で使用される場合は、配列は、それが同じヌクレオ塩基対合能力を有している場合には、本明細書中に開示される配列と同一である。例えば、本発明の開示される配列の中のチミジンの代わりにウラシルが含まれているＲＮＡは、これらがいずれもアデニンと対合するので、同一と考えられる。同様に、Ｇ−ｃｌａｍｐによって修飾された複素環塩基は、本出願の配列の中のシトシンまたは５−Ｍｅと同一であると考えられる。なぜなら、これはグアニンと対合するからである。この同一性は、オリゴマー化合物の全長にわたっている場合があり、またアンチセンス化合物の一部である場合もある（例えば、２７マーのヌクレオ塩基１〜２０が、その配列番号のオリゴマー化合物の同一性の割合（％）を決定するために２０マーに対して比較され得る）。当業者は、アンチセンス化合物には、本明細書中に記載されるアンチセンス化合物と同様の機能するためには、本明細書中に記載される化合物と同じ配列を有している必要は無いことが理解される。本明細書中で教示されるアンチセンス化合物の短縮型バージョン、または本明細書中に教示されるアンチセンス化合物の同一ではないバージョンが、本発明の範囲に含まれる。同一ではないバージョンは、個々の塩基が本明細書中に開示されるアンチセンス化合物と同じ対合活性を有していないバージョンである。塩基は、短縮されることによって、または少なくとも１つの脱塩基部位を有することによって、同じ対合活性を有していない。あるいは、同一ではないバージョンには、様々な対合活性を有している異なる塩基で置き換えられた少なくとも１つの塩基が含まれ得る（例えば、Ｇは、Ｃ、Ａ、またはＴで置き換えることができる）。同一性の割合（％）は、比較される配列番号またはアンチセンス化合物に対応している同一である塩基の対合を有している塩基の数にしたがって計算される。同一ではない塩基は互いに隣接している場合があり、オリゴヌクレオチド全体に分散している場合も、また、両方である場合もある。
【００３９】
例えば、２０マーのうちのヌクレオ塩基２〜１７と同じ配列を有している１６マーは、その２０マーに対して８０％同一である。あるいは、２０マーに対して同一ではない４個のヌクレオ塩基が含まれている２０マーも、その２０マーに対して８０％同一である。１８マーのうちのヌクレオ塩基１〜１４と同じ配列を有している１４マーは、１８マーに対して７８％同一である。このような計算は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００４０】
パーセント同一性は、修飾された配列の一部の中に存在しているもとの配列のヌクレオ塩基の割合に基づく。したがって、２０ヌクレオ塩基の活性のある標的セグメントの相補鎖の配列全てを含む３０マーのヌクレオ塩基であるアンチセンス化合物は、その２０ヌクレオ塩基の活性のある標的セグメントの相補鎖と１００％同一である部分を有しており、一方ではさらに、別の１０ヌクレオ塩基の部分も含まれている。本発明の状況においては、活性のある標的セグメントの相補鎖は１つの部分を構成する場合がある。好ましい実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書中に示される活性のある標的セグメントの相補鎖の少なくとも一部に対して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００４１】
アンチセンス化合物の長さを長くするまたは短くすること、および／あるいは、活性を損なうことなく不適合である塩基を導入することが可能であることは、当業者には周知である。例えば、Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７３０５−７３０９，１９９２、引用により本明細書中に組み入れられる）においては、１３〜２５ヌクレオ塩基長の一連のＡＳＯが、卵母細胞の注射モデルにおいて標的ＲＮＡの切断を導入するそれらの能力について試験された。ＡＳＯの末端付近に８個または１１個の不適合である塩基を有している２５ヌクレオ塩基長のＡＳＯは、標的ｍＲＡの特異的切断を支持することができ、不適合が含まれていないＡＳＯよりも弱い程度に作用することができる。同様に、標的特異的切断は、１個または３個の不適合を有しているものを含む１３ヌクレオ塩基のＡＳＯを使用して行うことができた。Ｍａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８、引用により本明細書中に組み入れられる）では、タンデムな１４ヌクレオ塩基のＡＳＯ、ならびに、２つまたは３つのタンデムなＡＳＯの配列から構成されている２８ヌクレオ塩基のＡＳＯと４２ヌクレオ塩基のＡＳＯのシリーズが、ウサギの網状赤血球アッセイにおいてヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させるそれらの能力について、それぞれ、試験された。３種類の１４ヌクレオ塩基のＡＳＯはそれぞれ、単独で翻訳を阻害することができ、２８ヌクレオ塩基のＡＳＯまたは４２ヌクレオ塩基のＡＳＯよりも低いレベルで作用した。
【００４２】
治療薬
本発明のアンチセンス化合物は、動物（例えば、ヒト）の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節するために使用することができる。１つの限定ではない実施形態においては、この方法には、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅが関係している疾患または症状についての治療が必要な上記の動物に対して、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を阻害する有効量のアンチセンス化合物を投与する工程が含まれる。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅが関係している疾患または症状としては、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、メタボリック症候群、心臓血管疾患、および冠状動脈性心臓病が挙げられるが、これらに限定はされない。臨床的な指標が関係している疾患または症状としては、血中グルコース濃度、血中脂質濃度、肝臓での脂質濃度、インシュリン濃度、コレステロール濃度、トランスアミナーゼ濃度、心電図、グルコースの取り込み、糖新生、インシュリン感受性、体重、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。１つの実施形態においては、本発明のアンチセンス化合物は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ＲＮＡのレベルおよび機能を効率よく阻害する。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡレベルの低下によっては、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのタンパク質発現産物に変化が導かれ得、さらには、そのような得られた変化を測定することもできる。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ＲＮＡまたはタンパク質発現産物のレベルまたは機能を効率よく阻害する本発明のアンチセンス化合物は、活性のあるアンチセンス化合物であると考えられる。１つの実施形態においては、本発明のアンチセンス化合物は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を阻害して、ＲＮＡの、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の減少を引き起こす。
【００４３】
例えば、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現の低下は、動物の体液、組織、または臓器の中で測定することができる。分析用の試料（例えば、体液（例えば、血液）、組織（例えば、生検）、または臓器）を得るための方法、および分析できる試料の調製方法は、当業者に周知である。ＲＮＡおよびタンパク質レベルの分析のための方法は上記で議論されており、当業者に周知である。処置の効果は、当該分野で公知の日常的に行われている臨床的方法によって、本発明の１つ以上の化合物と接触させられた動物から回収された上記の体液、組織、または臓器の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現に関係している生体マーカーを測定することによって、評価することができる。これらの生体マーカーとしては、肝臓のトランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチン、ならびに、腎機能および肝機能の他のマーカー；グルコース濃度、トリグリセリド濃度、インシュリン濃度、脂肪酸濃度、コレステロール濃度、心電図、グルコース摂取、糖新生、インシュリン感受性、および体重、ならびに、糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、インシュリン耐性、インシュリン欠乏、高コレステロール血症、高血糖症、異常脂質血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、肝臓脂肪症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、メタボリック症候群、心臓血管疾患、および冠状動脈性心臓病の他のマーカーが挙げられるが、これらに限定はされない。加えて、処置の効果は、改善された疾患状態または症状の侵襲的ではない指標（例えば、心電図、体重など）を使用して評価することができる。
【００４４】
本発明のアンチセンス化合物は、適切な薬学的に許容される稀釈物または担体に対して有効量の化合物を添加することによって、薬学的組成物の中で利用することができる。許容される担体および希釈剤は当業者に周知である。希釈剤または担体の選択は、多数の要因に基づき、これには、化合物の溶解度および投与経路が含まれるが、これらに限定はされない。このような考慮は、当業者に十分に理解されている。１つの態様においては、本発明の化合物は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を阻害する。本発明の化合物はまた、グルコース濃度、トリグリセリド濃度、インシュリン濃度、脂肪酸濃度、コレステロール濃度、グルコース濃度、グルコース摂取、糖新生、およびインシュリン感受性を疾患ではない状態のプロフィールにまで回復させることによる、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現が関係している疾患および障害の処置のための医薬品の製造にも使用することができる。
【００４５】
体液、臓器、または組織が有効量の本発明のアンチセンス化合物または組成物の１つ以上の有効量と接触させられる方法もまた意図される。体液、臓器、または組織は、本発明の化合物の１つ以上と接触させることができ、それによって、体液、臓器、または組織の細胞の中でのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現が調節される。
【００４６】
キット、研究用試薬、および診断薬
本発明のアンチセンス化合物は、診断薬に、そして研究用試薬およびキットとして利用することができる。さらに、特異性を有している遺伝子発現を阻害することができるアンチセンス化合物は、多くの場合は、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の様々なメンバーの機能を識別するために、当業者によって使用される。
【００４７】
キットおよび診断薬において使用するためには、本発明のアンチセンス化合物は、単独で、または他の化合物もしくは治療薬と組み合わせてのいずれかで、細胞および組織の中で発現される遺伝子の相補体の一部または全体の発現パターンを解明するための、ディファレンシャル分析および／または組み合わせ分析においてツールとして使用することができる。遺伝子の発現の分析方法は当業者に周知である。
【００４８】
アンチセンス化合物
用語「アンチセンス化合物」は、核酸分子の１つの領域にハイブリダイズすることができるポリマー構造をいう。本明細書中で使用される場合は、「活性のあるアンチセンス化合物」は、標的核酸とハイブリダイズし、そしてその発現を調節することが示されているアンチセンス化合物である。一般的には、アンチセンス化合物には、ヌクレオシド間結合基および／またはヌクレオチド結合模倣物によって互いに連結させられた複数のモノマーサブユニットが含まれる。個々のモノマーサブユニットには、糖、脱塩基糖、修飾された糖、または糖模倣物が含まれ、脱塩基糖を除いて、ヌクレオ塩基、修飾されたヌクレオ塩基、またはヌクレオ塩基模倣物が含まれる。好ましいモノマーサブユニットにはヌクレオシドと修飾されたヌクレオシドが含まれる。アンチセンス化合物は、それがハイブリダイズし、その発現を調節する（増大させるまたは低下させる）標的核酸分子の領域に対して少なくとも一部相補的である。この用語には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチドアナログ、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴマー化合物、およびこれらのキメラ結合体が含まれる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸をベースとするオリゴマーであるアンチセンス化合物である。アンチセンスオリゴヌクレオチドには、いくつかの場合には、糖、塩基、および／またはヌクレオシド間結合に対する１つ以上の化学的修飾が含まれ得る。アンチセンス化合物の限定ではない例としては、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオシド、オルタナティブスプライサー、およびｓｉＲＮＡが挙げられる。このように、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐した、またはヘアピンの形態で導入することができ、そしてこれらの化合物には、構造エレメント（例えば、内部もしくは末端のブリッジまたはループ）が含まれ得る。いくつかの実施形態においては、別のアンチセンス機構（例えば、ＲＮＡｉ）を利用することが望ましい。これらの別の機構を使用するアンチセンス化合物には、状況に応じて、アンチセンス化合物に相補的である第２の化合物が含まれる場合がある。言い換えると、アンチセンスである二本鎖の化合物は、二本鎖の化合物を形成するようにハイブリダイズした２つの鎖である場合も、また、完全なもしくは部分的な二本鎖の化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするために十分な自己相補性を有している一本鎖である場合もある。本発明の化合物は、自己触媒性ではない。本明細書中で使用される場合は、「自己触媒性」は、アクセサリー因子（例えば、タンパク質）が存在しない条件で標的ＲＮＡの切断を促進する能力を有している化合物を意味する。
【００４９】
本発明の１つの実施形態においては、二本鎖のアンチセンス化合物には、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語「ｓｉＲＮＡ」は、第１の鎖と第２の鎖を有している二本鎖の化合物として定義される。それぞれの鎖は、中心部分と、２つの独立した末端部分を有している。第１の鎖の中心部分は第２の鎖の中心部分に相補的であり、これによってこれらの鎖のハイブリダイゼーションが可能である。末端部分は、独立して、状況に応じて、相補鎖の対応する末端部分に相補的である。鎖の末端は、突出を形成するように１つ以上の自然界に存在しているヌクレオ塩基または修飾されたヌクレオ塩基の付加によって修飾される場合がある。
【００５０】
ｓｉＲＮＡ二本鎖のそれぞれの鎖は、約１２ヌクレオ塩基から約３５ヌクレオ塩基であり得る。好ましい実施形態においては、ｓｉＲＮＡ二本鎖のそれぞれの鎖は、約１７ヌクレオ塩基から約２５ヌクレオ塩基である。２つの鎖は完全に相補的である（すなわち、平滑末端の化合物を形成する）場合も、また、２つの鎖の一方もしくは両方に５’または３’突出が含まれる場合もある。二本鎖の化合物には、本明細書中で議論されるように、化学修飾を含めることができる。
【００５１】
本発明の１つの実施形態においては、アンチセンス化合物には、一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のいくつかの実施形態においては、アンチセンス化合物には化学修飾が含まれる。好ましい実施形態においては、アンチセンス化合物は一本鎖のキメラオリゴヌクレオチドであり、この場合、糖、塩基、およびヌクレオシド間結合の修飾は別々に選択される。
【００５２】
アンチセンス化合物には、約１２ヌクレオ塩基から約３５ヌクレオ塩基までの長さ（すなわち、約１２個から約３５個の連結されたヌクレオシド）が含まれ得る。言い換えると、本発明の一本鎖の化合物には、約１２ヌクレオ塩基から約３５ヌクレオ塩基が含まれ、そして本発明の二本鎖のアンチセンス化合物（例えば、ｓｉＲＮＡ）には、それぞれが独立して約１２個から約３５個のヌクレオ塩基である、２つの鎖が含まれる。これには１５から３５、および１６から３６ヌクレオ塩基長のオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のアンチセンス化合物には、（一本鎖であるか二本鎖であるかは問わず、そして少なくとも一方の鎖の上に）アンチセンス部分が含まれる。「アンチセンス部分」は、上記のアンチセンス機構の１つによって作用するように設計されたアンチセンス化合物の一部である。当業者は、約１２ヌクレオ塩基から約３５ヌクレオ塩基に、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオ塩基が含まれることを理解するであろう。便宜上、本発明者らはアンチセンス化合物と記載するが、当業者であれば、アナログおよび模倣物がこの同じ範囲の長さを有し得ることを理解するであろう。
【００５３】
活性のある標的領域の中から選択された少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも１５個の連続しているヌクレオ塩基のストレッチが含まれている、約１２ヌクレオ塩基から３５ヌクレオ塩基長、好ましくは、約１５ヌクレオ塩基から約３５ヌクレオ塩基長のアンチセンス化合物が、さらに、適しているアンチセンス化合物であると考えられる。
【００５４】
本発明のアンチセンス化合物に対して修飾を行うことができ、そして修飾には、末端の一方、選択されたヌクレオ塩基部分、糖部分、またはヌクレオシド間結合の１つに結合させられた結合基が含まれ得る。可能な修飾としては、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）糖修飾、反転した脱塩基キャップ、デオキシヌクレオ塩基、およびニ環式のヌクレオ塩基アナログ（例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ（登録商標））およびＥＮＡ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００５５】
化学修飾
当該分野で公知であるように、ヌクレオシドは塩基−糖結合体である。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環塩基（「ヌクレオ塩基」または単純に「塩基」と呼ばれる場合もある）である。このような複素環塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合させられたリン酸基がさらに含まれているヌクレオシドである。ペントフラノシル糖が含まれているこれらのヌクレオシドについては、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に結合させられ得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸基は、直鎖状のポリマー化合物を形成するように互いに隣接するヌクレオシドを共有結合する。オリゴヌクレオチドにおいては、リン酸基は一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると見なされている。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または骨格は３’から５’方向のホスホジエステル結合である。多くの場合には、それらの活性を変化させるためにオリゴヌクレオチドの中に化学修飾が含められることが好ましい。化学修飾によっては、オリゴヌクレオチドの活性は、例えば、その標的ＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を増大させること、ヌクレアーゼ耐性を増大させること、および／またはオリゴヌクレオチドの薬物動態を変化させることによって変化させることができる。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる化学反応の使用によっては、より短いオリゴヌクレオチド化合物の使用が可能となる。
【００５６】
用語「ヌクレオ塩基」または「複素環塩基部分」は、本明細書中で使用される場合は、ヌクレオシドの複素環塩基部分を意味する。一般的に、ヌクレオ塩基は、１つ以上の原子が含まれている任意のグループ、または別の核酸の塩基に対して水素結合することができる原子のグループである。加えて、「修飾されていない」または「自然界に存在している」ヌクレオ塩基（例えば、プリンヌクレオ塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジンヌクレオ塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））、当業者に公知である多くの修飾されたヌクレオ塩基またはヌクレオ塩基模倣物は、本発明に適している。用語「修飾されたヌクレオ塩基」および「ヌクレオ塩基模倣物」は重複している場合があるが、一般的には、「修飾されたヌクレオ塩基」はもとのヌクレオ塩基と構造がかなり類似しているヌクレオ塩基（例えば、７−デアザプリンまたは５−メチルシトシン）を意味し、一方、ヌクレオ塩基模倣物には、より複雑な構造（例えば、三環式フェノキサジンヌクレオ塩基模倣物）が含まれる。上記の修飾されたヌクレオ塩基の調製のための方法は当業者に周知である。
【００５７】
アンチセンス化合物にはまた、修飾された糖部分を有している１つ以上のヌクレオシドが含まれる場合がある。ヌクレオシドのフラノシル糖環は、多数の方法で修飾することができる。これには、置換基の付加、ニ環式核酸（ＢＮＡ）を形成するような一つの原子に同種原子が二つ結合した（ｇｅｍｉｎａｌ）２つの環原子の架橋、および原子または基（例えば、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、または−Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２））の４’位の環酸素についての置換が含まれるが、これらに限定はされない。修飾された糖部分は周知であり、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を変化させる（通常は、増大させる）ために、および／またはヌクレアーゼ耐性を高めるために使用することができる。好ましい修飾された糖の代表的なリストとしては、ニ環式の修飾された糖（ＢＮＡ）（ＬＮＡおよびＥＮＡ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋が含まれる）；および置換された糖（特に、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ２、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３置換基を有している２’置換糖）が挙げられるが、これらに限定はされない。糖はまた、何よりも糖模倣物基で置き換えることもできる。修飾された糖の調製のための方法は当業者に周知である。
【００５８】
ヌクレオシド間結合基によって、ヌクレオシドまたはそれ以外の修飾されたモノマー単位が互いに連結され、それによってアンチセンス化合物が形成される。ヌクレオシド間結合基の２つの主要なクラスは、リン原子の存在、またはそれが存在しないことによって定義される。代表的なリンが含まれているヌクレオシド間結合としては、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、およびホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定はされない。代表的なリンが含まれていないヌクレオシド間結合基としては、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；およびＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられるが、これらに限定はされない。リンが含まれていないヌクレオシド間結合基を有しているアンチセンス化合物は、オリゴヌクレオシドと呼ばれる。修飾されたヌクレオシド間結合は、自然界に存在しているホスホジエステル結合と比較して、アンチセンス化合物のヌクレアーゼ耐性を変化させる（通常は、高める）ために使用することができる。キラル原子を有しているヌクレオシド間結合は、ラセミ化合物、キラル化合物、または混合物として調製することができる。代表的なヌクレオシド間結合としては、アルキルホスホネートおよびホスホロチオエートが挙げられるが、これらに限定はされない。リンが含まれている結合およびリンが含まれていない結合の調製方法は当業者に周知である。
【００５９】
本明細書中で使用される場合は、用語「模倣物」は、糖、ヌクレオ塩基、および／またはヌクレオシド間結合について置換されている基を意味する。一般的には模倣物は、糖または糖ヌクレオシド間結合の組み合わせの代わりに使用され、そしてヌクレオ塩基は、選択された標的に対するハイブリダイゼーションについては維持される。糖模倣物の代表的な例としては、シクロヘキセニルまたはモルホリノが挙げられるが、これらに限定はされない。糖−ヌクレオシド間結合の組み合わせについての模倣物の代表的な例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）および電荷を有していないアキラル結合によって連結させられたモルホリノ基が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの例においては、模倣物はヌクレオ塩基の代わりに使用される。代表的なヌクレオ塩基模倣物は当該分野で周知であり、これには、三環式フェノキサジンアナログ、およびユニバーサル塩基が含まれるが、これらに限定はされない（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２０００，２８：２９１１−１４、引用により本明細書中に組み入れられる）。糖、ヌクレオシド、およびヌクレオ塩基の模倣物の合成方法は当業者に周知である。
【００６０】
本明細書中で使用される場合は、用語「ヌクレオシド」には、ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、修飾されたヌクレオシド、ならびに、模倣物である塩基および／または糖基を有しているヌクレオシドが含まれる。
【００６１】
本開示の状況においては、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーであるオリゴマー化合物を意味する。この用語には、自然界に存在しているヌクレオ塩基、糖、およびヌクレオシド間共有結合、ならびに自然界には存在しないヌクレオ塩基、糖、およびヌクレオシド間共有結合から構成されているオリゴヌクレオチドが含まれ、おそらくは、非核酸結合体もさらに含まれる。
【００６２】
ヌクレオシド間結合（例えば、ヌクレオシド間ホスホジエステル結合およびヌクレオシド間ホスホロチオエート結合が含まれる）を形成するために有用な反応性リン酸基を有している化合物が提供される。本発明の前駆体またはアンチセンス化合物の調製および／または精製方法は、本発明の組成物または方法の限定ではない。ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンス化合物の合成および精製のための方法は、当業者に周知である。
【００６３】
本明細書中で使用される場合は、用語「キメラアンチセンス化合物」は、同じオリゴマー化合物の中の他の糖、ヌクレオ塩基、およびヌクレオシド間結合と比較した場合に異なるように修飾されている、少なくとも１つの糖、ヌクレオ塩基、および／またはヌクレオシド間結合を有しているアンチセンス化合物を意味する。残りの糖、ヌクレオ塩基、およびヌクレオシド間結合は、別々に修飾されている場合も、また、修飾されていない場合もある。一般的には、キメラオリゴマー化合物は、単離された位置に存在し得るか、または特定のモチーフを定義するであろう領域の中に一緒にグループ分けされ得る、修飾されたヌクレオシドを有しているであろう。修飾および模倣物基のあらゆる組み合わせが、キメラオリゴマー化合物に含まれる。
【００６４】
キメラアンチセンス化合物には、通常、少なくとも１つの修飾された領域が含まれており、その結果、ヌクレアーゼでの消化に対する高い耐性、細胞により取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大がもたらされる。オリゴマー化合物のさらなる領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての役割を担っている場合がある。例えば、ＲＮａｓｅＨは細胞性のエンドヌクレアーゼであり、これはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化によってＲＮＡ標的の切断が生じ、それによって遺伝子発現の阻害の効率が大幅に高められる。結果として、例えば、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して同等の結果を、多くの場合には、キメラが使用して、より短いアンチセンス化合物を用いて得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、および必要に応じて、当該分野で公知の核酸ハイブリダイゼーション技術と組み合わせて、日常的に行われているように検出することができる。
【００６５】
特定のキメラ、さらには、キメラではないアンチセンス化合物は、特定のモチーフを有しているとしてさらに記載することができる。本明細書中で使用される場合は、用語「モチーフ」は、同様にもしくは異なるように修飾されたか、または修飾されていないヌクレオシドと比較した、アンチセンス化合物の中の修飾された糖部分および／または糖模倣物基の方向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を意味する。本明細書中で使用される場合は、用語「糖」、「糖部分」、および「糖模倣物基」は同義的に使用される。このようなモチーフとしては、ギャップが含まれているモチーフ（ｇａｐｐｅｄ  ｍｏｔｉｆ）、オルタナティブモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、ヘミマーモチーフ（ｈｅｍｉｍｅｒ  ｍｏｔｉｆ）、ブロックマーモチーフ（ｂｌｏｃｋｍｅｒ  ｍｏｔｉｆ）、および位置修飾されたモチーフ（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｏｔｉｆ）が挙げられるが、これらに限定はされない、ヌクレオ塩基の配列および構造、ならびにヌクレオシド間結合のタイプは、アンチセンス化合物のモチーフを決定する要因ではない。
【００６６】
本明細書中で使用される場合は、用語「ギャップが含まれているモチーフ」は、３つの領域（２つの外部領域（羽）が隣接している内部領域（ｇａｐ））に分けられるヌクレオシドの連続している配列が含まれているアンチセンス化合物を意味する。これらの領域は、互いに、ヌクレオシドが含まれている異なるように修飾された糖基を有していることによって、少なくとも互いに異なる。いくつかの実施形態においては、個々の修飾された領域は一様に修飾されている（例えば、所定の領域の中の複数の修飾された糖基が同じである）；しかし、他のモチーフをこの領域に適用することができる。例えば、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）の中の羽は別のオルタナティブモチーフを有し得る。ギャップが含まれているアンチセンス化合物のギャップの中に存在しているヌクレオシドは、個々の羽の中に修飾された糖部分とは異なる糖部分を有している。
【００６７】
本明細書中で使用される場合は、用語「オルタナティブモチーフ」は、原則としてアンチセンス化合物の配列全体わたって交互である、または、原則としてアンチセンス化合物の１つの領域の配列全体にわたって交互である、２つの異なるように糖が修飾されたヌクレオシドが含まれているヌクレオシドの連続している配列が含まれているアンチセンス化合物を意味する。
【００６８】
本明細書中で使用される場合は、用語「完全に修飾されたモチーフ」は、原則としてそれぞれのヌクレオシドが一様な修飾を有している糖が修飾されたヌクレオシドである、ヌクレオシドの連続する配列が含まれているアンチセンス化合物を意味する
本明細書中で使用される場合は、用語「ヘミマーモチーフ」は、一様な糖部分（同じ、修飾された糖または修飾されていない糖）を有しているヌクレオシドの配列を意味し、この場合、５’末端または３’末端の一方には、ヘミマーが修飾されたアンチセンス化合物中の他のヌクレオシドとは異なる、糖が修飾されたヌクレオシドである、２個から１２個のヌクレオシドの配列を有している。
【００６９】
本明細書中で使用される場合は、用語「ブロックマーモチーフ」は、一様に修飾された糖が修飾されたヌクレオシドのブロックが間に挟まれている、一様な糖（同じ、修飾された糖または修飾されていない糖）を有しているヌクレオシドの配列を意味する。この場合、修飾は、他のヌクレオシドとは異なる。キメラオリゴヌクレオチド化合物の調製方法は当業者に周知である。
【００７０】
本明細書中で使用される場合は、「位置修飾されたモチーフ」には、全ての他のモチーフが含まれる。位置修飾されたオリゴヌクレオチド化合物の調製方法は当業者に周知である。
【００７１】
本明細書中に記載される化合物には、１つ以上の非対称中心が含まれ、したがって、エナンチオマー、ジアステレオマー、および他の立体異性体立体配置が生じる。これらは、絶対立体化学の観点で、アミノ酸らについて（Ｒ）または（Ｓ）、．α、または．β、あるいは、（Ｄ）または（Ｌ）として定義することができる。これは、全てのこのような可能な異性体、さらには、それらのラセミ形態および光学的に純粋な形態が含まれるように意味される。
【００７２】
１つの態様においては、アンチセンス化合物は、１つ以上の結合基の共有結合によって修飾される。結合基は、可逆的結合によって結合させることも、または不可逆的結合によって結合させることもできる。結合基は、アンチセンス化合物に直接結合させることも、またはリンカーの使用によって結合させることもできる。リンカーは、単官能性リンカーである場合も、また、二官能性リンカーである場合もある。このような結合方法およびリンカーは当業者に周知である。一般的には、結合基は、１つ以上の特性を修飾するためにアンチセンス化合物に結合させられる。このような考えは当業者には周知である。
【００７３】
オリゴマーの合成
修飾されたヌクレオシドのオリゴマー化、および修飾されていないヌクレオシドのオリゴマー化は、ＤＮＡについての文献に記載されている手順（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ編（１９９３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／またはＲＮＡについての文献に記載されている手順（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６−２１７．Ｇａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｍｉｔｈ編（１９９８）、１−３６．、Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７−５７１３）にしたがって、日常的に行われているように行うことができる。
【００７４】
アンチセンス化合物は、通常は、周知の固相合成技術によって、日常的に行われているように行うことができる。このような合成のための装置は、いくつかの供給メーカー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））から販売されている。当該分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段がさらに使用される場合も、または代わりに使用される場合もある。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することは周知である。本発明は、アンチセンス化合物の合成方法によっては限定されない。
【００７５】
オリゴマーの精製および分析
オリゴヌクレオチドの精製および分析の方法は当業者に公知である。分析方法としては、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびエレクトロスプレー−質量スペクトル分析が挙げられる。このような合成および分析方法は、マルチウェルプレートにおいて行うことができる。本明細書中に開示される組成物および方法は、オリゴマーの精製方法によっては限定されない。
【００７６】
塩、プロドラッグ、および生物学的等価物
アンチセンス化合物には、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または、任意の他の機能性である化学的等価物が含まれ得る。これらは、動物（ヒトが含まれる）に投与されると、生物学的活性のある代謝物質またはその残留物を提供する（直接または間接的に）ことができる。したがって、例えば、開示にはまた、アンチセンス化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、ならびに、他の生物学的等価物が含まれる。
【００７７】
用語「プロドラッグ」は、体内またはその細胞内で、内因性の酵素、化合物、および／または症状の作用によって活性な形態（すなわち、薬物）に変換される、不活性な形態または活性の低い形態で調製された治療薬を示す。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンが、ＷＯ９３／２４５１０またはＷＯ９４／２６７６４に開示されている方法にしたがって、ＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート）誘導体として調製される。プロドラッグにはまた、一方の末端または両方の末端に、切断されて小さい活性のある化合物を生じるヌクレオ塩基（例えば、ホスホジエステル骨格結合）が含まれている、アンチセンス化合物も含まれ得る。
【００７８】
用語「薬学的に許容される塩」は、アンチセンス化合物の生理学的に、および薬学的に許容される塩、すなわち、もとの化合物の所望される生物学的活性を保持しているが、それに対して望ましくない毒物学的作用を与えることのない塩を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が有用であり、ヒトへの治療的投与に十分に適している。別の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ化合物のナトリウム塩もまた提供される。
【００７９】
処方物
アンチセンス化合物はまた、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と一緒に投与することができ、それらでカプセル化することができ、それらと結合させることができ、また、別の方法でそれらと会合させることができる。
【００８０】
アンチセンス化合物にはまた、薬学的組成物および処方物も含まれる場合がある。本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身的処置が所望されるかどうか、および処置される領域に応じて、多数の方法で投与することができる。
【００８１】
通常は単位投与量形態で提示され得る薬学的処方物は、薬学的産業で周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術としては、有効成分を薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）と会合させる工程が含まれる。一般的には、処方物は、有効成分と液体担体、微粉化された固体担体、またはそれらの両方とを均一に、そして密接に会合させ、その後、必要に応じて、生成物を成型する（例えば、送達のための特異的な粒子の大きさになるように）ことによって調製される。
【００８２】
「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体であり得、そして当該分野で公知である。賦形剤は液体である場合も、また、固体である場合もあり、核酸および所定の薬学的組成物の他の成分と混合した場合に、所望される容積、稠度などが得られるように考慮して計画された投与様式と共に、選択される。
【００８３】
組み合わせ
本明細書中に提供される組成物には、２つ以上のアンチセンス化合物が含まれ得る。別の関連する実施形態においては、組成物には、１つ以上のアンチセンス化合物（具体的には、第１の核酸に対して標的化させられたオリゴヌクレオチドと、第２の核酸標的に対して標的化させられた１つ以上のさらなるアンチセンス化合物が含まれ得る。あるいは、組成物には、同じ核酸標的の異なる領域に対して標的化させられた２つ以上のアンチセンス化合物が含まれ得る。２つ以上の混合された化合物は、一緒に使用される場合も、また、連続して使用される場合もある。本発明の組成物はまた、他のアンチセンス以外の化合物である治療薬と混合することもできる。
【００８４】
限定ではない開示および引用による組み入れ
特定の化合物、組成物、および方法が特定の実施形態にしたがって特異的に記載されているが、以下の実施例は、化合物および方法の例示として提供されるにすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するようには意図されない。本出願に記載される参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号などのそれぞれは、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【実施例】
【００８５】
実施例１
細胞のタイプおよびトランスフェクション方法
細胞のタイプ−標的核酸の発現に対するオリゴマー化合物の効果を、以下の細胞のタイプの１つ以上において試験した。
【００８６】
Ａ５４９：ヒトの肺ガン細胞株Ａ５４９をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞は、１０％のウシ胎児血清、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、および１ｍｌあたり１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で、日常的に行っているように培養した。細胞は、それらがおよそ９０％のコンフルエンスに達した時点で、日常的に行っているトリプシン化および稀釈によって継代した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に、オリゴマー化合物のトランスフェクション実験において使用するために、およそ５０００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００８７】
ｂ．ＥＮＤ：マウスの脳の内皮細胞株ｂ．ＥＮＤは、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＷｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕ博士から入手した。ｂ．ＥＮＤ細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で、日常的に行っているように培養した。細胞は、それらがおよそ９０％のコンフルエンスに達した時点で、日常的に行っているトリプシン化および稀釈によって継代した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、オリゴマー化合物のトランスフェクション実験において使用するために、およそ３０００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００８８】
Ａ．１０：ラットの大動脈平滑筋細胞株Ａ１０は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ａ１０細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の中で、日常的に行っているように培養した。細胞は、それらがおよそ８０％のコンフルエンスに達した時点で、日常的に行っているトリプシン化および稀釈によって継代した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に、オリゴマー化合物のトランスフェクション実験において使用するために、およそ２５００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００８９】
初代マウス肝細胞：初代マウス肝細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから購入したＣＤ−１から調製した。初代マウス肝細胞は、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、１％の抗生物質−抗有糸分裂薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と、１０ｎＭのウシインシュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充した肝細胞接着培地（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉａ）の中で、日常的に行っているように培養した。細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、オリゴマー化合物のトランスフェクション実験において使用するために、およそ１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００９０】
初代ラット肝細胞：初代ラット肝細胞は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製し、そして初代マウス肝細胞は、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ｍｌあたり１００単位のペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ、高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で、日常的に行っているように培養した。細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、本発明のオリゴマー化合物での処理のために、４０００〜６０００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００９１】
ノーザンブロッティングまたは他の分析のためには、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的な組織培養プレートに播種し、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理することができる。
【００９２】
オリゴマー化合物での処理：細胞がほぼコンフルエントに達した時点で、これらを、記載するトランスフェクション方法を使用してオリゴヌクレオチドで処理した。
【００９３】
リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）：細胞が６５〜７５％のコンフルエンスに達した時点で、これらをオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチドは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と共にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−１還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で混合して、所望されるオリゴヌクレオチド濃度、および１００ｎＭのオリゴヌクレオチドあたり２．５または３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度とした。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ０．５時間インキュベートした。９６ウェルプレート中で細胞を増殖させるために、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）−１で一旦洗浄し、その後、１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理した。細胞は、２４ウェルプレートの中で増殖させたか、または、他の標準的な組織培養プレートを、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理した。細胞を処理し、そしてデータを２連または３連で得た。３７℃でのおよそ４〜７時間の処理の後、トランスフェクション混合物が含まれている培地を新しい培養培地と交換した。細胞を、オリゴヌクレオチドでの処理の１６〜２４時間後に回収した。
【００９４】
サイトフェクチン（ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ）（登録商標）：細胞が６５〜７５％のコンフルエンスに達した時点で、これらをオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチドは、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（登録商標）還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｅｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の中で混合して、所望されるオリゴヌクレオチド濃度、および１００ｎＭのオリゴヌクレオチドあたり２または４μｇ／ｍＬのＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度とした。このトランスフェクション混合物を室温でおよそ０．５時間インキュベートした。９６ウェルプレート中で細胞を増殖させるために、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１．ｓｕｐ．ＴＭで一旦洗浄し、その後、１３０μＬのトランスフェクション混合物で処理した。細胞は、２４ウェルプレートの中で増殖させたか、または、他の標準的な組織培養プレートを、適切な容量の培地およびオリゴヌクレオチドを使用して同様に処理した。細胞を処理し、そしてデータを２連または３連で得た。３７℃でのおよそ４〜７時間の処理の後、トランスフェクション混合物が含まれている培地を新しい培養培地と交換した。細胞を、オリゴヌクレオチドでの処理の１６〜２４時間後に回収した。
【００９５】
対照のオリゴヌクレオチド
対照のオリゴヌクレオチドを、特定の細胞株についての最適なオリゴマー化合物濃度を決定するために使用した。さらに、本発明のオリゴマー化合物を、オリゴマー化合物のスクリーニング実験、または表現形のアッセイにおいて使用した場合には、対照のオリゴヌクレオチドは、本発明の化合物と平行して試験した。
【００９６】
【表２】
2008541729.tif 000004
使用したオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。特定の細胞株についての最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を、１つの範囲の濃度でポジティブ対照であるオリゴヌクレオチドで処理した。ポジティブ対照を表２に示す。ヒト細胞およびヒト以外の霊長類の細胞については、ポジティブ対照であるオリゴヌクレオチドは、化合物番号１３６５０、化合物番号３３６８０６、または化合物番号１８０７８から選択した。マウスまたはラットの細胞については、ポジティブ対照であるオリゴヌクレオチドは、化合物番号１５７７０または化合物番号１５３４６である。その後、標的ｍＲＮＡ（例えば、化合物１３６５０についてはヒトＲａｆキナーゼＣ）の８０％の阻害を生じるポジティブ対照であるオリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株についてのその後の実験において、新しいオリゴヌクレオチドについてスクリーニング濃度として利用した。８０％の阻害が得られない場合には、標的ｍＲＮＡの６０％の阻害を生じるポジティブ対照であるオリゴヌクレオチドの最も低い濃度を、その細胞株についてのその後の実験においてオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用した。６０％の阻害が得られない場合には、特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドでのトランスフェクション実験には適していないと考えた。本明細書中で使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをリポソーム試薬を使用してトランスフェクトした場合には５０ｎＭから３００ｎＭ、そして、アンチセンスオリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトした場合には１μＭから４０μＭである。
【００９７】
実施例２
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ｍＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造業者による説明書にしたがってリアルタイム定量的ＰＣＲによって行った。
【００９８】
定量的ＰＣＲ分析の前に、測定するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに特異的なプライマー−プローブのセットを、ＧＡＰＤＦ増幅反応によって「多重化させられる」それらの能力について評価した。単離後に、ＲＮＡについて、連続して逆転写（ＲＴ）反応とリアルタイムＰＣＲを行った。これらはいずれも、同じウェルの中で行った。ＲＴおよびＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲは、２０μＬのＰＣＲ混合液（ＭｇＣｌ２が加えられていない２．５×ＰＣＲ緩衝液、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、３７５μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、３７５ｎＭのそれぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマー、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮＡｓｅ阻害剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素、および２．５×ＲＯＸ色素）を、３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）が含まれている９６ウェルプレートに添加することによって、同時に行った。ＲＴ反応は、４８℃で３０分間のインキュベーションによって行った。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化させるための９５℃で１０分間のインキュベーション後、４０サイクルの２工程のＰＣＲプロトコールを行った：９５℃で１５秒間（変性）、続いて、６０℃で１．５分間（アニーリング／伸張）。
【００９９】
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲによって得られた遺伝子標的の量を、その発現が一定である遺伝子ＧＡＰＤＨの発現レベル、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して全ＲＮＡを定量することのいずれかを使用して正規化した。ＧＡＰＤＨの発現は、標的と同時に、複数回、または別々に行うことによって、ＲＴ、リアルタイムＰＣＲによって定量した。全ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して定量した。
【０１００】
１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）作業試薬（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５の中に１：３５０に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬）を、３０μＬの精製した細胞性ＲＮＡが含まれている９６ウェルプレートにピペッティングした。プレートを、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの放射で読み取った。
【０１０１】
ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合させられたＪＯＥと、３’末端に共有結合させられたＴＡＭＲＡまたはＭＧＢを有している。この場合、ＪＯＥは蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢは消光色素である。いくつかの細胞のタイプにおいては、様々な種に由来するＧＡＰＤＨ配列に対して設計されたプライマーとプローブを使用して、ＧＡＰＤＨの発現を測定した。例えば、ヒトＧＡＰＤＨプライマーとプローブのセットを使用して、サルに由来する細胞および細胞株の中でのＧＡＰＤＨの発現を測定した。
【０１０２】
リアルタイムＰＣＲで使用したプローブおよびプライマーは、標的特異的配列にハイブリダイズするように設計した。プライマーとプローブ、およびそれらがハイブリダイズする標的核酸配列を、表３に示す。標的特異的ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合させられたＦＡＭと、３’末端に共有結合させられたＴＡＭＲＡまたはＭＧＢを有している。この場合、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢは消光色素である。
【０１０３】
【表３】
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実施例３
オリゴマー化合物によるヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害
公開されている配列、または表１に記載した公開されている配列の一部を使用して、ヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ＲＮＡの様々な領域を標的化するアンチセンス化合物のシリーズを設計した。設計したアンチセンス化合物は、表１の標的核酸の１つ以上に相補的である。それぞれのアンチセンス化合物についての標的核酸上の開始部位および終結部位を、表４ａ、ｂ、ｃ、およびｄに示す。
【０１０４】
【表４−１】
2008541729.tif 000006
【０１０５】
【表４−２】
2008541729.tif 000007
【０１０６】
【表４−３】
2008541729.tif 000008
【０１０７】
【表４−４】
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上記のように、標的に対して、またはより好ましくは、活性のある標的セグメントに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１３個から約８０個の結合させられたヌクレオ塩基であり得る。以下の表４ｅに、配列番号１を標的化するそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの限定ではない例を提供する。
【０１０８】
【表４−５】
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標的に対して、またはより好ましくは、活性のある標的セグメントに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、標的配列と比較した場合に不適合であるヌクレオ塩基をも含めることができる。以下の表４ｆには、配列番号５のヌクレオ塩基２８２から３０１を標的化するそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの限定ではない例を提供する。不適合であるヌクレオ塩基には下線が付けた。当業者は、アンチセンス化合物が不適合を寛容することができるが、なおも標的部位とハイブリダイズするそれらの能力を保持しており、アンチセンス機構を通じて標的核酸を調節することを理解している。
【０１０９】
【表４−６】
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アンチセンス化合物は、表１に公開されたヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ標的核酸配列の１つ以上に対して設計し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする標的核酸の発現を調節する化合物の能力を決定するためにインビトロでスクリーニングした。表５に示す化合物は全て、２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（ギャップマー）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド（これは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている）から構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、遺伝子標的のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって、ヒトＬＭＷ−ＰＴＰｓｅにハイブリダイズするように設計したプライマー−プローブのセット（表２）を使用して分析した。データは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用して６５ｎＭの開示したオリゴマー化合物でＡ５４９細胞を処理した２回の実験による平均である。発現の低下を、阻害率（％）として表５に表した。存在する場合には、「Ｎ．Ｄ．」は「決定しなかった」を示す。使用した対照のオリゴマー化合物は、配列番号２５であった。
【０１１０】
【表５−１】
2008541729.tif 000012
【０１１１】
【表５−２】
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【０１１２】
【表５−３】
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スクリーニングによって、ヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡ配列の中の活性のある標的セグメント（特に、配列番号３、４、および５）を同定した。個々の活性のある標的セグメントは、少なくとも１つの活性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化した。配列番号３について同定したこれらの活性のある領域には、８０．５％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１１１から１１８９（領域Ａ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド４８９から６５６（領域Ｂ）、６４．１％の平均阻害率を有しているヌクレオチド５３６から６５６（領域Ｃ）、６２．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド４８９から６１０（領域Ｄ）、７７．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１１１から１２０３（領域Ｅ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド８４０から９２４（領域Ｆ）、５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１０２２から１０６９（領域Ｇ）、５９．５％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から２０９（領域Ｈ）、５５．２％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から１３６（領域Ｉ）、６３．０％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１７から２０９（領域Ｊ）、および５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド３３８から４６０（領域Ｋ）が含まれる。この領域の中で試験したオリゴヌクレオチドの半分以上が６３％より大きく発現を阻害した。これらの領域の同定いより、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することが可能となる。
【０１１３】
配列番号４について同定した活性のある標的領域には、５８．４％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から１８９（領域ＡＡ）、５６．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から１４６（領域ＡＢ）、６３．２％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１２７から１８９（領域ＡＣ）、５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド３３８から４６０（領域ＡＤ）、６２．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド４８９から６１０（領域ＡＥ）、６４．１％の平均阻害率を有しているヌクレオチド５３６から６５６（領域ＡＦ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド４８９から６５６（領域ＡＧ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド８４０から９２４（領域ＡＨ）、５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１０２２から１０６９（領域ＡＩ）、８０．５％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１１１から１１８９（領域ＡＪ）、および７７．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１１１から１２０３（領域ＡＫ）が含まれる。
【０１１４】
配列番号５についての活性のある標的領域もまた同定した。これらの活性のある標的領域には、５５．２％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から１３６（領域ＢＡ）、６３．０％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１７から２０９（領域ＢＢ）、５９．５％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６５から２０９（領域ＢＣ）、５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド３６７から４８９（領域ＢＤ）、６２．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド５１８から６３９（領域ＢＥ）、６４．１％の平均阻害率を有しているヌクレオチド５６５から６８５（領域ＢＦ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド５１８から６８５（領域ＢＧ）、６２．８％の平均阻害率を有しているヌクレオチド６８９から９５３（領域ＢＨ）、５５．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１０５１から１０９８（領域ＢＩ）、８０．５３％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１４０から１２１８（領域ＢＪ）、および７７．６％の平均阻害率を有しているヌクレオチド１１４０から１２３２（領域ＢＫ）が含まれる。
【０１１５】
実施例４
オリゴマー化合物によるマウスＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害
アンチセンス化合物を、表１に記載したマウスのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ標的核酸配列の１つ以上に対して設計し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする標的核酸の発現を調節する化合物の能力を決定するために、インビトロでスクリーニングした。表６に示す化合物は、全てキメラである、２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド（これは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている）から構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、遺伝子標的のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって、マウスＬＭＷ−ＰＴＰｓｅにハイブリダイズするように設計したプライマー−プローブのセット（表２）を使用して分析した。データは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用して７５ｎＭの開示したオリゴマー化合物でｂ．ＥＮＤ細胞を処理した２回の実験による平均である。発現の低下を、阻害率（％）として表６に表した。使用した対照のオリゴマー化合物は、配列番号２５であった。存在する場合には、「Ｎ．Ｄ．」は「決定しなかった」を示す。
【０１１６】
【表６−１】
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【０１１７】
【表６−２】
2008541729.tif 000016
【０１１８】
【表６−３】
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実施例５
オリゴマー化合物によるラットＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害
アンチセンス化合物を、表１に記載したラットのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ標的核酸配列の１つ以上に対して設計し、そしてＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅをコードする標的核酸の発現を調節する化合物の能力を決定するために、インビトロでスクリーニングした。表７に示す化合物は、全てキメラである、２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド（これは、２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている）から構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。化合物を、遺伝子標的のｍＲＮＡレベルに対するそれらの効果について、本明細書中の他の実施例に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲによって、ラットＬＭＷ−ＰＴＰｓｅにハイブリダイズするように設計したプライマー−プローブのセット（表２）を使用して分析した。データは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用して５０ｎＭの開示したオリゴマー化合物でＡ１０細胞を処理した２回の実験による平均である。発現の低下を、阻害率（％）として表７に表した。使用した対照のオリゴマー化合物は、配列番号２５であった。存在する場合には、「Ｎ．Ｄ．」は「決定しなかった」を示す。
【０１１９】
【表７−１】
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【０１２０】
【表７−２】
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【０１２１】
【表７−３】
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実施例６
２’−ＭＯＥ羽とデオキシギャップを有しているキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡレベルの阻害：用量応答試験
さらなる実施形態において、６種類のオリゴヌクレオチドを、用量応答試験のために選択した：化合物番号２８８２８５、化合物番号２８８２７６、化合物番号２８８２６８、化合物番号２８８２８６、化合物番号２８８２６７、および化合物番号２８８２９１。化合物番号１２９６８９（ＧＡＧＧＴＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＣＣＧＣＴ、配列番号２７１として本明細書中に組み入れられる）および化合物番号１２９６９５（ＴＴＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＣＧＡＴＴＴＡＣ、配列番号２７２として本明細書中に組み入れられる）は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対しては標的化されておらず、ネガティブ対照として使用した。化合物番号１２９６８９と化合物番号１２９６９５は、２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’方向）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドを、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して細胞にトランスフェクトした。ｂ．ＥＮＤ細胞を、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、または１００ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。処理しなかった対照細胞を対照とし、データはこれに対して正規化した。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅレベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲを本明細書中に記載したように行った。
【０１２３】
データは３回の実験による平均であり、そして結果を、処理しなかった対照と比較した阻害率（％）として表８に示す。いずれの対照オリゴヌクレオチド（化合物番号１２９６８９または化合物番号１２９６９５）も、この実験ではＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡの発現を阻害しなかった。
【０１２４】
【表８】
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表８に示したように、化合物番号２８８２６７、化合物番号２８８２６８、化合物番号２８８２７６、化合物番号２８８２８５、化合物番号２８８２８６、および化合物番号２８８２９１は、用量依存性の様式でマウスＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡの発現を阻害した。
【０１２５】
実施例７
２’−ＭＯＥ羽とデオキシギャップを有しているキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡレベルの阻害：用量応答試験
さらなる実施形態において、７種類のオリゴヌクレオチドを、用量応答試験のために選択した：化合物番号３５５６２１、化合物番号３５５６３６、化合物番号３５５６７６、化合物番号３５５６２６、化合物番号３５５６５４、化合物番号３５５６４０、および化合物番号３５５６４１。化合物番号１５７７０、化合物番号１２９６９０（ＴＴＡＧＡＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＧ、配列番号２７３として本明細書中に組み入れられる）および化合物番号１４１９２３（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ、配列番号２７４として本明細書中に組み入れられる）は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対しては標的化されておらず、ネガティブ対照として使用した。化合物番号１２９６９０と化合物番号１４１９２３は、２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’方向）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１２６】
ラットの初代肝細胞を、オリゴヌクレオチドを、本明細書中に記載したＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を使用して、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または２００ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。処理しなかった対照細胞を対照とし、データはこれに対して正規化した。ラットのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅレベルを測定するためのトランスフェクション混合物での処理と、定量的リアルタイムＰＣＲはいずれも、本明細書中に記載したように行った。
【０１２７】
これらの実験の結果を表９に示す。データは、４回の実験による平均であり、そして処理しなかった対照と比較した阻害率（％）として示す。試験したいずれの対照オリゴヌクレオチド（化合物番号１４１９２３、化合物番号１５７７０または化合物番号１２９６９０）も、４％を超えるラットのＬＭＷ−ＰＴＰｓｅの阻害は生じなかった。化合物番号１５７７０で処理した細胞によるデータを表８に示し、これは、対照のオリゴヌクレオチドでの処理の典型である。
【０１２８】
【表９】
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表９に示したように、化合物番号３５５６２１、化合物番号３５５６２６、化合物番号３５５６３６、化合物番号３５５６４０、化合物番号３５５６４１、化合物番号３５５６５４、および化合物番号３５５６７６は、用量依存性の様式でＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡ発現を阻害した。
【０１２９】
実施例８
インビボでのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害：ｏｂ／ｏｂマウス
レプチンは、食欲を調節する、脂質によって生産されるホルモンである。このホルモンの不足は、ヒトおよびヒト以外の動物のいずれにおいても、肥満を導く。ｏｂ／ｏｂマウスは、肥満および高血糖を生じるレプチン遺伝子の中に変異を有している。このように、これらのマウスは、肥満および糖尿病の研究、ならびに、これらの症状を処置するために設計された処置の有用なモデルである。ｏｂ／ｏｂマウスは、インシュリンの高い循環レベルを有しており、そしてレプチン受容体の中に変異を有しているｄｂ／ｄｂマウスよりも高血糖性は低い。本発明にしたがい、本発明のオリゴマー化合物を、肥満および糖尿病のｏｂ／ｏｂモデルにおいて試験した。
【０１３０】
Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ−Ｌｅｐ  ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、２５ｍｇ／ｋｇの用量で、１週間に２回、４週間の間、化合物番号２８８２６７（配列番号１８６）を皮下注射した（ｎ＝５）。生理食塩水を注射した動物を対照とした（ｎ＝４）。処置期間の後、マウスを屠殺し、そして標的レベルを肝臓および脂肪の中で評価した。ＲＮＡの単離と標的ｍＲＮＡの発現レベルの定量を、本明細書中の他の実施例によって記載したように行った。化合物２８８２６７で処置した動物は、平均すると、生理食塩水で処置した対照の動物と比較して、肝臓のＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅレベルの９０％の低下を示した。副睾丸脂肪の中のＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ  ｍＲＮＡレベルは、化合物番号２８８２６７で処置した動物においては、平均すると７０％低下した。
【０１３１】
標的ｍＲＮＡの阻害によって生じる生理学的効果を評価するために、ｏｂ／ｏｂマウスを、血清トリグリセリド濃度および血清グルコース濃度について処置期間（２８日間）の終わりに評価した。これらのパラメーターは、日常的に使用している臨床分析装置（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって測定した。２８日目の、生理食塩水で処置した対照動物について測定した平均のトリグリセリド濃度は、１６８ｍｇ／ｄＬであったが、化合物番号２８８２６７で処置した動物についての平均は７５ｍｇ／ｄＬであった。２８日目の、生理食塩水だけで処置した動物についてのグルコース濃度は４９１ｍｇ／ｄＬであり、そして化合物番号２８８２６７で処置した動物については２５８ｍｇ／ｄＬであった。したがって、化合物番号２８８２６７での処置によって、グルコース濃度およびトリグリセリド濃度に実質的な低下が生じた。したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによりグルコース濃度を低下させる方法であり、そして本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによりトリグリセリド濃度を低下させる方法である。１つの実施形態においては、トリグリセリド濃度は、血液、血漿、または血清トリグリセリド濃度である。本発明の別の実施形態は、動物の症状を緩和するまたは症状の重篤度を低下させる方法である。いくつかの実施形態においては、症状は糖尿病である。いくつかの実施形態においては、糖尿病はＩＩ型糖尿病である。他の実施形態においては、症状は、メタボリック症候群である。
【０１３２】
グルコースの代謝に対する標的ｍＲＮＡの阻害の効果をさらに評価するために、空腹時血清グルコース濃度を、日常的に行っている臨床的分析によって測定した。化合物番号２８８２６７で処置した動物についての平均の空腹時血清グルコース濃度は１９４ｍｇ／ｄＬであり、一方、生理食塩水だけで処置した動物について測定した平均の空腹時濃度は３３０ｍｇ／ｄＬであった。したがって、本発明の別の実施形態は、血清グルコース濃度を低下させる方法である。
【０１３３】
インシュリン濃度もまた、市販されているキット（例えば、Ａｌｐｃｏインシュリン特異的ＥＬＩＳＡキット、Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を使用して処置の４週間後に測定した。化合物番号２８８２６７での処置によっては、循環している血漿インシュリン濃度の約４５％の低下が生じた。インシュリン濃度の低下は、インシュリン感受性の改善を示すことができる。１つの実施形態においては、本発明により、インシュリン感受性を改善する方法が提供される。さらなる実施形態においては、低いインシュリン濃度がインシュリン感受性の改善の指標である。
【０１３４】
実験の終了時点でマウスを屠殺し、そして組織の重量を測定した。平均の肝臓および脾臓の重量は、生理食塩水で処置した対照と比較すると、化合物番号２８８２６７での処置によっては実質的には変化しなかった。精巣上体の白色脂肪組織の重量は、化合物２８８２６７で処置した動物においては約１０％低下した。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる動物の脂肪過多症を軽減する方法である。
【０１３５】
実施例９
ｏｂ／ｏｂマウスのインシュリン受容体のリン酸化に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのアンチセンス阻害の効果
受容体のリン酸化に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの阻害の効果を評価するために、インシュリンのボーラス（２Ｕ／ｋｇ）を、実施例８に記載したように化合物番号２８８２６７（配列番号１８６）または生理食塩水で処置したｏｂ／ｏｂマウスのグループに投与し、約８から９分後に屠殺した。肝臓試料をプールし、標準的な免疫沈降とウェスタンブロットの手順および分析を行った。簡単に説明すると、組織を溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％のＮＰ−４０、０．２５％のＮａｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＮａＯＶ、１ｍＭのＮａＦ、およびプロテアーゼ阻害剤混合液Ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の中に溶解させた。溶解物を１２０００ｇで１５分間の遠心分離によって明澄化させた。明澄化させた溶解物を、最初に、プロテインアガロースＡ／Ｇビーズ（１：１の割合）とともに４℃でさらに３〜４時間インキュベートし、その後、抗ホスホチロシン抗体とともに４℃で３〜４時間インキュベーションした。その後、免疫複合体を溶解緩衝液で洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ’ｓ試料緩衝液中でボイルし、そしてウェスタンブロットによって分析した。メンブレンを市販されている抗インシュリン受容体β（ＩＲ−β）サブユニット抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でブロットした。シグナルを、市販されているＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体とＥＣＬを使用することによって検出した。
【０１３６】
得られるビーズの定量は、生理食塩水で処置した対照について測定したものに対して比較した、化合物番号２８８２６７で処置した動物に由来する試料中でインシュリン刺激した場合に、インシュリン受容体のリン酸化がおよそ４から６倍増加することを示していた。これらのデータは、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置すると、インシュリン感受性が改善されることを示唆している。
【０１３７】
実施例１０
ｏｂ／ｏｂマウスのＰＩ３−Ｋ活性に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのアンチセンス阻害の効果
インシュリン受容体によるシグナル伝達経路におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの役割をさらに評価するため、およびインシュリンの作用に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのアンチセンス阻害の効果を評価するために、明澄化した溶解物を、実施例８および実施例９に記載したように処置したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓または脂肪組織から実施例１１に記載したように調製し、そしてさらなる分析を行った。
【０１３８】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）は、インシュリン受容体での刺激の下流で活性化される酵素である。ＰＩ３−キナーゼ活性を当該分野で公知の方法を使用して測定した（Ｐａｎｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３７，７００６−７０１４）。簡単に説明すると、明澄化した溶解物を、４℃で２時間、ＩＲＳ−１／２抗体（１μｇ）で免疫沈降させ、その後、プロテインＡ／Ｇセファロースと共にさらに２時間インキュベーションした。免疫複合体を洗浄し、インビトロでＰＩ３−キナーゼアッセイを、外因性の基質としてＬ−α−ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を使用して行った。リン酸化された脂質を単離し、そして薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離した。ＴＬＣプレートをＫｏｄａｋフィルムに感光させ、そしてＰＩ３−Ｋ活性の産物（ＰＩＰ２）が結合した放射活性のあるスポットを、ＴＬＣプレートから引っ掻いて取り、そしてシンチレーションカウンターでカウントした。シンチレーションカウントによる結果の平均を、インシュリンで処置したグループ、またはインシュリンで処置しなかったグループのそれぞれに由来する肝臓について、恣意的単位で表１０に示す。免疫沈降に使用した抗体を、「ＩＰ」と標示した列に示す（ＩＲＳ−１またはＩＲＳ−２）。
【０１３９】
【表１０】
2008541729.tif 000023
表１０に示したように、化合物番号２８８２６７（配列番号１８６）は、生理食塩水で処置した動物について観察された増大を上回る、インシュリンで刺激されたＰＩ３−Ｋ活性の増大を生じた。
【０１４０】
シンチレーションカウントによるおおよその結果を、インシュリンで処置したグループ、またはインシュリンで処置しなかったグループのそれぞれに由来する脂肪組織について、恣意的単位での平均として表１１に示す。免疫沈降に使用した抗体はＩＲＳ−１である。
【０１４１】
【表１１】
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表１１に示したように、化合物番号２８８２６７は、生理食塩水で処置した動物について観察された増大を上回る、インシュリンで刺激されたＰＩ３−Ｋ活性の増大を生じた。まとめると、これらの結果は、インシュリン作用におけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの新規の役割を明らかにしており、そして、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのアンチセンス阻害によって、ｏｂ／ｏｂマウスにおけるインシュリンシグナル伝達が改善されることを示している。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することにより動物でのインシュリンシグナルの伝達を改善する方法である。
【０１４２】
実施例１１
インシュリンシグナル伝達に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのアンチセンス阻害の効果：インビトロでの実験
本発明にしたがうと、インシュリンシグナル伝達に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させられたアンチセンスオリゴの効果を、本明細書中に記載した方法を使用して、ｏｂ／ｏｂマウスから培養した初代肝細胞中で研究した。ｏｂ／ｏｂ初代肝細胞を、化合物番号２８８２６７（配列番号１８６）または対照のオリゴヌクレオチドである化合物番号１４１９２３（配列番号２７４）で、本明細書中に記載したトランスフェクション方法によって処置した。処置した細胞を、インシュリンが存在しない条件で、または１００ｎＭのインシュリンの存在下で１０分間インキュベートした。トランスフェリン試薬だけで処理した細胞を対照とした。
【０１４３】
細胞溶解物を調製し、そして、抗ホスホチロシン抗体で免疫沈降させ、続いて、抗ＩＲ−β抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用して、標準的な方法によってウェスタンブロット分析を行った。化合物番号２８８２６７で処置した細胞は、対照細胞または化合物番号１４１９２３で処置した細胞について観察されたよりも、インシュリンで刺激したＩＲ−βのリン酸化の大幅な増加を示した。
【０１４４】
リン酸化Ａｋｔを認識する市販されている抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した同様の実験において、化合物番号２８８２６７で処理した細胞は、対照細胞または化合物番号１４１９２３で処置した細胞について観察されたよりも、インシュリンで刺激したＡｋｔのリン酸化の大幅な増加を示した。これらのデータは、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅがインシュリンシグナル伝達経路において役割を担っていることを示している。
【０１４５】
ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現レベルのアンチセンス化合物による調節を、初代マウス肝細胞を使用して、上記で記載したように１００ｎｇの化合物２８８２６７または媒体で細胞を処理することによって決定した。インキュベーション後、細胞をＲＴＬ緩衝液中で溶解させ、全ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ  ＲＮＡ  ｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｕａ，ＣＡ）を使用して単離した。ＲＴ−ＰＣＲを上記のように行った。これらのデータは、対照と比較するとＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのｍＲＮＡレベルにおけるおよそ９０％の低下を示した。ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのタンパク質レベルにおける対応する低下が、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅタンパク質のウェスタンブロット分析によって見られた。興味深いことに、対照細胞（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから入手できる抗体）と比較すると、化合物２８８２６７の存在下でのＰＴＰ１ｂレベルには有意な低下はなかった。
【０１４６】
インシュリンシグナル伝達経路に対するＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅアンチセンス化合物の作用をさらに決定するために、初代マウス肝細胞が含まれている２連の細胞培養ウェルを、化合物番号２８８２６７、化合物番号２８８２９１、対照の化合物番号１４１９２３、ＰＴＰ１ｂのアンチセンス阻害剤、または対照番号２８８２９１とＰＴＰ１ｂのアンチセンス阻害剤との組み合わせのいずれかの１００ｎｇで処理した。さらに、生理食塩水で処理した細胞を使用した。それぞれの処置グループについて、ウェルの１つを５ｎＭのインシュリンとともに１０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、リン酸化ＩＲ−β、ホスホＡｋｔ、リン酸化されていないＡｋｔ、ＰＴＰ１ｂ、またはＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅのレベルについて、ウェスタンブロット技術を使用して分析した。これらのデータは、ＩＲ−βがＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅアンチセンス化合物の存在下ではリン酸化されるが、ＰＴＰ−１ｂアンチセンス化合物が単独で存在する条件、またはＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅアンチセンス化合物と組み合わせてＰＴＰ−ａｂアンチセンス化合物が存在する条件のいずれにおいてもリン酸化されないことを示している。ウェスタンブロット技術は当業者に周知であり、抗体は多数の市販の供給業者（例えば、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）から容易に入手することができる。（Ｈａｅｌｏｗ，Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１４７】
実施例１２
ヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅを標的化するオリゴマー化合物の設計
ヒトＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの様々な領域を標的化するように、表１に記載した公開されている配列を使用して、オリゴマー化合物のシリーズを設計した。化合物を表１２に示す。表１２の化合物は全て、２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド（２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている）から構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１４８】
【表１２−１】
2008541729.tif 000025
【表１２−２】
2008541729.tif 000026
実施例１３
マウスＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅを標的化するオリゴマー化合物の設計
マウスＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの様々な領域を標的化するように、表１に記載した公開されている配列を使用して、オリゴマー化合物のシリーズを設計した。化合物を表１３に示す。表１３の化合物は全て、２０ヌクレオチドの長さのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５個のヌクレオチドの「羽」が両側（５’および３’）に隣接している、１０個の２’−デオキシヌクレオチドから構成される中心の「ギャップ」領域から構成されている。羽は、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド（２’−ＭＯＥヌクレオチドとしても知られている）から構成されている。ヌクレオシド間（骨格）結合は、オリゴヌクレオチドの始めから終わりまで完全にホスホロチオエートである。全てのシチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０１４９】
【表１３−１】
2008541729.tif 000027
【０１５０】
【表１３−２】
2008541729.tif 000028
実施例１４
インビボでのＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害：食事によって誘導した肥満のマウスモデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウス株は、異常脂質症によって誘導されるアテローム斑の形成にかかりやすいことが報告されている。これらのマウスに高脂肪の餌を与えた場合には、食事によって誘導される肥満を発症する。したがって、これらのマウスは、肥満、およびこの症状を処置するために設計された処置の研究のための有用なモデルである。本発明のさらなる実施形態においては、本発明のオリゴマー化合物を、食事によって誘導した肥満のモデルにおいて試験した。
【０１５１】
雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、約１２〜１３週間の間、６０％の脂肪を含む餌を与え、その後、マウスに化合物番号２８８２６７（配列番号１８６）（ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させられたアンチセンスオリゴヌクレオチド）、または対照化合物である化合物番号１４１９２３（配列番号２７４）を、２５ｍｇ／ｋｇの用量で１週間に２回、６週間の間、皮下注射した。それぞれの処置グループを、約８匹から１０匹の動物とした。生理食塩水を注射した高脂肪の餌を与えた動物を対照とした。さらなる対照として、通常の餌を与えたマウスを、生理食塩水だけで処置した。
【０１５２】
体重と累積の餌の摂取量を、それぞれの処置グループについて実験の間中、測定した。累積の餌の摂取量についての有意な変化は、高脂肪の餌を与えた動物については、処置とは無関係に観察されなかった。実験の終了時点で、体格の比較をＭＲＩによって評価した。化合物番号２８８２６７での処置によっては、処置期間全体を通じて、高脂肪の餌を与えたマウスの脂肪含有量において約１２％の低下が生じた。生理食塩水だけで、または対照化合物である化合物番号１４１９２３で処置した、高脂肪の餌を与えた動物の脂肪含有量は、実験の経過全体を通じて低下することはなかった。したがって、本発明の別の実施形態は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させられたオリゴマー化合物を投与することによる、動物の脂肪過多症を軽減する方法である。
【０１５３】
標的ｍＲＮＡの阻害によって生じる生理学的効果を評価するために、処置を行った、食事によって誘導した肥満のマウスを、さらに、血漿トリグリセリド濃度および血漿コレステロール濃度について、実験の開始時点（０週）、３週目の処置の間（３．５週）、および処置期間の終わり（６週）で評価した。トリグリセリド濃度とコレステロール濃度は、日常的に使用している臨床分析装置（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって測定した。それぞれの処置グループについての結果の平均を、表１４にｍｇ／ｄＬで示す。
【０１５４】
【表１４】
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表１４に示したように、化合物番号２８８２６７での処置は、食事によって誘導した肥満のマウスにおいて血漿コレステロール濃度の低下が生じた。したがって、本発明の複数の実施形態には、本発明のオリゴマー化合物を投与することにより動物においてコレステロール濃度を低下させる方法が含まれる。
【０１５５】
グルコースおよびインシュリンの代謝に対する標的阻害の効果もまた、本発明のオリゴマー化合物で処置した、食事によって誘導した肥満のマウスにおいて評価した。血漿グルコース濃度を、実験の開始時点（０週）、３週目の処置の間（３．５週）、および処置期間の終わり（６週）で、同様に測定した。血漿インシュリン濃度を、同様に、実験の開始時点（０週）、３週目の処置の間（３．５週）、および処置期間の終わり（６週）で測定した。コレステロール濃度は、標準的な方法（例えば、ＹＳＩグルコース分析装置、ＹＳＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＯＨ）を使用して測定し、そしてインシュリン濃度は、市販されているキット（例えば、Ａｌｐｃｏインシュリン特異的ＥＬＩＳＡキット、Ｗｉｎｄｈａｍ，ＮＨ）を使用して測定した。低血糖は、化合物番号２８８２６７で処置した動物においては観察されなかった。インシュリン濃度を、生理食塩水だけで処置した高脂肪の餌を与えた動物について測定したインシュリン濃度の割合として、表１５に示す。
【０１５６】
【表１５】
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表１５に示したように、化合物番号２８８１６７での処置によって、生理食塩水で、または対照化合物である化合物番号１４１９２３で処置した、高脂肪の餌を与えた動物で観察した実験の経過全体にわたり、インシュリンレベルの増加が妨げられた。したがって、本発明の別の実施形態は、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅに対して標的化させられたオリゴマー化合物を投与することにより、動物のインシュリン感受性を改善する方法である。１つの実施形態においては、インシュリン感受性の改善は、循環しているインシュリンレベルの低下によって示される。
【０１５７】
耐糖能試験もまた、空腹時のマウスについて行った。処置の５週目の間に、マウスに一晩絶食させ、その後、１ｇ／ｋｇの用量でグルコースの腹腔内注射を投与した。血中グルコース濃度を、グルコースでのチャレンジの前、および３０分の間隔で２時間まで測定した。結果を、それぞれの処置グループについて表１６に示す。
【０１５８】
【表１６】
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時間の関数としてのグルコース濃度として表１６に示したデータのプロットにより、それぞれの処置グループについての曲線下面積の比較ができる。これらのデータは、化合物番号２８８２６７で処置した高脂肪の餌を与えた動物における耐糖能の改善を明らかにしている。したがって、本発明の別の態様は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、動物の耐糖能を改善する方法である。
【０１５９】
インシュリン耐性試験もまた、空腹時のマウスについて行った。処置の４週目の間に、マウスをおよそ４から５時間絶食させ、その後、０．５Ｕ／ｋｇの用量でインシュリンの腹腔内注射を投与した。グルコース濃度を、インシュリンでのチャレンジの前、および３０分の間隔で２時間まで測定した。結果を表１７に示す。
【０１６０】
【表１７】
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時間の関数としてのグルコース濃度として表１７に示したデータのプロットにより、それぞれの処置グループについての曲線下面積の比較ができる。これらのデータは、化合物番号２８８２６７で処置した高脂肪の餌を与えた動物におけるインシュリン耐性の改善を明らかにしている。したがって、本発明の別の態様は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、動物のインシュリン耐性を改善する方法である。
【０１６１】
実施例１５
食事によって誘導した肥満のマウスモデルにおけるＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現のアンチセンス阻害
高脂肪の餌を与え、実施例１４に記載したように処置したＣ５７ＢＬ／６マウスに由来する肝臓および脂肪組織を、さらに、標的の減少について、実験の終了時に評価した。組織中の標的の減少についての分析は、本明細書中に記載したように行った。化合物番号２８８２６７での処置によっては、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅ遺伝子の発現は肝臓の中では約９０％、そして脂肪（白色脂肪組織）の中では約７５％低下したが、化合物番号１４１９２３での処置によっては、いずれの組織においてもＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現は低下しなかった。化合物番号２８８１６７での処置によっては、肝臓でのグルコース−６−ホスファターゼの発現の有意な低下も起こり、このことは、肝臓でのグルコース生産の抑制を示唆している。化合物番号２８８２６７での処置は、ＳＨＰ２、ＳＨＰＴＰ２、またはＰＴＥＮの発現に対しては、効果はなかった。同様の結果が、ｏｂ／ｏｂマウスについても見られた。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、動物の肝臓でのグルコース生産を低下させる方法である。本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、グルコースの代謝に関係している遺伝子を調節する方法である。１つの実施形態においては、調節される遺伝子は、グルコース−６−ホスファターゼである。
【０１６２】
肝臓でのトリグリセリド濃度もまた、市販されているキット（例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮによるＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ＧＰＯ  Ａｓｓａｙを使用して）評価した。肝臓のトリグリセリド含有量は、化合物番号１４１９２３での処置と比較すると、化合物番号２８８２６７での処置によって低下した（それぞれ、約５６ｍｇ／ｇ組織に対して、約３５ｍｇ／ｇ組織）。
【０１６３】
肝臓脂肪症もまた、オイルレッドＯ染色で染色した凍結させた肝臓の組織切片の日常的に行っている組織学的分析によって評価した。これは、通常、脂質沈着を視覚化するために使用され、そして核と細胞質をそれぞれ視覚化するために、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色される。
【０１６４】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、動物の肝臓でのトリグリセリドの蓄積を減少させる方法である。本発明の別の実施形態は、本発明のオリゴマー化合物を投与することによる、動物の脂肪症を処置する方法である。１つの実施形態においては、脂肪症は脂肪性肝炎である。１つの実施形態においては、脂肪症はＮＡＳＨである。
【０１６５】
本発明の別の実施形態は、糖尿病またはメタボリック症候群を処置する方法であり、この方法には、本発明のオリゴマー化合物を投与する工程が含まれる。いくつかの実施形態においては、オリゴマー化合物は、肝臓、脂肪、またはそれらの両方の組織の中で、ＬＭＷ−ＰＴＰａｓｅの発現を阻害する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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