(57)【要約】本発明は、遊離した炭水化物が、修飾された固体表面上に固定された炭水化物チップの製作に関するものである。さらに詳しくは、本発明はヒドラジド基またはアミノオキシ基によって誘導体化された固体表面に、非修飾の炭水化物が、その大きさに関係なく部位特異的に、および共有的に結合した炭水化物チップの製作方法に関するものである。本発明によると、非修飾の炭水化物が、その大きさに関係なく固体表面上に効率的に固定され、本発明の方法は修飾された炭水化物を必要としないため、炭水化物チップを製作し易い。さらに本発明は、炭水化物−蛋白質相互作用の迅速な分析および炭水化物に基づく疾病の診断のために製作された炭水化物チップの用途に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）炭水化物が結合する官能基によって誘導体化された固体基質を製作する段階、
（ｉｉ）前記誘導体化された固体表面上に、リンカーを使わず非修飾の炭水化物を印刷する段階、および
（ｉｉｉ）前記固体表面と前記炭水化物とを反応させて部位特異的に、および共有的に炭水化物を固定化させる段階を含む、炭水化物チップの製作方法。
【請求項２】
前記（ｉ）段階の官能基は、ヒドラジド基またはアミノオキシ基であることを特徴とする請求項１に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項３】
前記固体表面上においてヒドラジドまたはアミノオキシに接続されたリンカーは、原子数１０を超える長さの、ヘテロ原子が挿入された複数の炭化水素鎖で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項４】
前記炭化水素鎖は非分岐であり、２５から５５の原子数を有することを特徴とする請求項３に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項５】
前記固体表面は、シリコン、高分子、雲母、プラスチック、ガラス、金、紙、膜またはこれらの組み合わせで構成される群から選ばれることを特徴とする請求項１から請求項４に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項６】
前記非修飾の炭水化物は、単糖類、二糖類、オリゴ糖および多糖類で構成される群から選ばれた、天然の、または化学的もしくは酵素的に製造された炭水化物であることを特徴とする請求項１に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項７】
前記（ｉｉ）段階における前記非修飾の炭水化物の印刷は、マイクロピペットまたはマイクロアレイヤを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項８】
前記（ｉｉｉ）段階における前記固体基質上に前記炭水化物を部位特異的に、および共有的に固定化させる工程は、固体表面上で炭水化物を４０〜６０℃の温度で８時間以上反応させることにより行われることを特徴とする請求項１に記載の炭水化物チップの製作方法。
【請求項９】
標識または非標識の検出システムで分析する工程を含む、請求項１に従って製作された炭水化物チップ上で蛋白質に結合した炭水化物を検出する方法。
【請求項１０】
前記非標識の検出システムは、質量分析計および表面プラズモン共鳴撮像装置で構成された群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の炭水化物の検出方法。
【請求項１１】
前記標識検出システムは、走査系器具およびＣＣＤカメラを用いた器具で構成された群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の炭水化物の検出方法。
【請求項１２】
前記試料は、ヒトまたは動物の、組織または血液、血清、尿、乳、汗、骨髄およびリンパ液で構成された群から選択された体液であることを特徴とする請求項９に記載の炭水化物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離した炭水化物が、修飾された固体表面上に固定された炭水化物チップの製作に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、ヒドラジド基またはアミノオキシ基によって誘導体化された固体表面に、非修飾の炭水化物がその大きさに関係なく部位特異的に、および共有的に結合した炭水化物チップの製作方法に関するものである。さらに本発明は、これらの、炭水化物−蛋白質相互作用の迅速な分析、および病原菌、癌およびその他等の検出による炭水化物に基づく疾病の診断のための用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
機能的糖鎖と呼ばれる炭水化物の機能に関する研究は、生物学的研究および生物医学の応用のために大きな注目を浴びてきた。細胞表面は、糖蛋白質および糖脂質等の複合糖質の形態で主に存在する様々な構造のグリカンで覆われている。前記細胞表面の炭水化物は、蛋白質との特異的相互作用を通じた、細胞間情報交換、細胞付着、受精、発生、分化、および免疫反応を含む生物学的に重要な様々な過程に関与する。また、これらの相互作用は、有害な疾病の過程にも関連している。例えば、バクテリアまたはウイルスが宿主細胞に付着し病原性特性を付与することは、このような相互作用を通じて行われる。さらに、腫瘍の転移および炎症もまた、炭水化物−蛋白質の認識過程を通じて行われる。そのため、腫瘍細胞または病原菌に特異的に発見される、炭水化物、または炭水化物に結合する蛋白質は度々、それらの診断のためのマーカーとして利用される。よって、グリカン−蛋白質相互作用に関する分子的基礎に対する説明は、癌および病原菌の検出のための新規な診断の開発だけでなく、抗癌剤、抗生剤、抗ウイルス剤および抗炎症剤等の強力な生物医学治療剤の開発の助けとなる。
【０００３】
炭水化物−蛋白質相互作用における詳細な内容は、従来は生物理学的または生化学なアプローチによって研究されていた。これらの方法はこのような相互作用の理解には大きく寄与したが、これらは蛋白質と炭水化物と間の相互作用の迅速な分析には適していない。よって、短時間で多数の試料を同時に検査できる炭水化物チップが要求されていた［Shin, I. et al., Chem. Eur. J. 2005, 11, 2894; Shin, I. et al., Combinatorial Chemistry and High-Throughput Screening 2004, 7, 565; Feizi, T. et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 2003, 13, 637］。
【０００４】
炭水化物チップは、生物学的研究および生物医学的応用に適用されてきた：１）グリカン−蛋白質相互作用のハイスループット分析、２）グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、およびその他等の炭水化物−プロセシング酵素の迅速な特性分析、３）炭水化物および蛋白質間の親和性結合の定量的測定、４）炭水化物−蛋白質相互作用を抑制する阻害剤のハイスループットスクリーニング、５）糖蛋白質に結合したグリカンの分析、および６）癌または病原菌の診断。
【０００５】
炭水化物チップの製作に関する従来の方法は、１）適当に誘導体化された固体表面上に、修飾された炭水化物を部位特異的に、および共有的に固定化させる方法［図１（ａ）参照］、２）非誘導体化の固体表面上にネオ糖脂質を部位特異的であるが非共有的に固定化させる方法［図１（ｂ）参照］、および３）非誘導体化の固体表面上に非修飾の炭水化物を非特異的に、および非共有的に固定化させる方法［図１（ｃ）参照］である。先の二つの方法は、表面上への炭水化物の効率的な固定化を表すが、時折、合成が非常に困難で長時間を要する修飾された炭水化物を必要とする。三つ目の方法は、多糖類チップの製作には適するが、単糖類、二糖類、またはオリゴ類等の小さな炭水化物の結合には非効率的だという短所を有する。
【０００６】
そのため、炭水化物チップの製作のためのこのような制限を克服するための、より効率的な方法がこれらの様々な応用のために必要となる。本発明者らは、ヒドラジド基またはアミノオキシ基によって誘導体化された固体表面上に、様々な非修飾の炭水化物をその大きさに関係なく効率的に固定化させる方法を開発し［図１（ｄ）参照］、よって、炭水化物−蛋白質相互作用を迅速に測定し、病原菌および癌の検出に利用できる炭水化物チップを製作した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、様々な非修飾の炭水化物が、その大きさに関係なく部位特異的に、および共有的に固定化可能な炭水化物チップの製作方法を提供すること、および炭水化物−蛋白質相互作用を迅速に分析することによる前記炭水化物チップの生物学的研究および生物医学的応用への用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記炭水化物チップの製作は、（ｉ）炭水化物が結合する固体表面を修飾させる段階；（ｉｉ）前記誘導体化された固体表面上に非修飾の炭水化物を印刷する段階；および（ｉｉｉ）前記炭水化物を前記修飾された固体表面と反応させて部位特異的に、および共有的に固体表面上に前記炭水化物を固定化させる段階を含む。前記製造された炭水化物チップは、炭水化物−蛋白質相互作用を迅速に分析するのに使用されるとともに、病原菌、癌およびその他等を検出することによって炭水化物に基づく疾病の診断に用いられる。
【０００９】
また本発明は、標識または非標識の検出システムを含む前記方法によって製造された、表面上に固定された炭水化物に結合した蛋白質の検出方法を提供する。
【００１０】
さらに本発明は、本発明によって製造された炭水化物チップを用いて炭水化物に基づく疾患を診断する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、好ましくは、前記（ｉ）段階の官能基はヒドラジド基またはアミノオキシ基である。
【００１２】
本発明において、好ましくは、前記固体表面は、シリコン、高分子、雲母、プラスチック、ガラス、金、紙、膜、およびこれらの組み合わせで構成される群から選択される。
【００１３】
前記非修飾の炭水化物は、天然の、または化学的もしくは酵素的に製造された炭水化物であり、好ましくは、前記炭水化物は単糖類、二糖類、オリゴ糖および多糖類で構成される群から選択される。ここで、前記単糖類は、より好ましくはグルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、ラムノース（Ｒｈａｍ）およびキシロース（Ｘｙｌ）で構成される群から選択され、前記二糖類は、より好ましくはマルトース、セロビオース、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース、ラクトース、ガラクトース−β  １，４−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮａｃ；ＬａｃＮＡｃ）およびマンノース−α１，６−マンノース（Ｍａｎα１，６Ｍａｎ；マンノビオース）で構成される群から選択され、前記オリゴ糖は、より好ましくはＦｕｃα１，３（Ｇａｌβ１，４）Ｇｌｃ（ＦｕｃＬａｃ）、ＮｅｕＮＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（ＮｅｕＮＡｃＬａｃＮＡｃ）、シアリルＬｅｘおよびＦｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃで構成される群から選択され、前記多糖類は、より好ましくはマンナンである。
【００１４】
本発明において、好ましくは、前記（ｉｉ）段階における前記非修飾の炭水化物の印刷は、マイクロピペットまたはマイクロアレイヤを用いて行われる。
【００１５】
本発明において、好ましくは、前記（ｉｉｉ）段階の固体表面上に前記炭水化物を部位特異的に、および共有的に結合させるための工程は、前記印刷されたプレートを４０〜６０℃で８時間以上インキュベートすることにより行われる。
【００１６】
図２は本発明の原理を説明する。先ず、様々な長さのリンカーを経由して、ヒドラジド基またはアミノオキシ基によって被覆されたチップ基盤を図３に提示した通りに製造する。
好ましくは、固体表面上のヒドラジド基またはアミノオキシ基に接続された前記リンカーは、複数の炭化水素鎖で構成される群から選択され、好ましくは、原子数１０を超える、ヘテロ原子が挿入された非分岐鎖であり、好ましくは２０〜５５の原子を含む。
より具体的に、アミノオキシ誘導体化チップ基盤は、アミンチップ基盤が化合物ｂと反応した後、または長いリンカーａもしくはｃと反応した後に化合物ｂが結合した後、ヒドラジンを用いた処理によって表面にヒドラジド基が導入されることにより製造され（図３の（ａ）参照）、一方ヒドラジドチップ基盤は、アミンチップ基盤が６−アミノヘキサン酸ヒドラジドと反応することによって、または長いリンカーａもしくはｂと反応した後に保護基が除去されることによって製造される（図３の（ｂ）参照）。
【００１７】
３０〜５０％グリセロールを含むＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ４．０〜５．０）中の、単糖類、二糖類、オリゴ糖および多糖類を含む炭水化物溶液（０．１μｌ〜１ｎｌ）が、マイクロピペットまたはマイクロアレイヤを用いて前記チップ基盤上に印刷される。この工程で、前記炭水化物の濃度は、好ましくは０．１〜５０ｍＭである。印刷が終わった後に、前記チップを４０〜６０℃で８時間以上反応させた後に洗浄する。その後、チップを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に１時間浸す。ＢＳＡ処理されたチップを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝溶液（ｐＨ７．４）で１５分ずつ３回にわたり洗浄することにより、炭水化物チップの製作が完成される。
【００１８】
前記製作された炭水化物チップは、蛋白質−炭水化物相互作用の研究に適用される。前記研究で、前記炭水化物チップは０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝溶液で１時間、非標識蛋白質またはフルオロフォア標識蛋白質とインキュベートされる。Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＦＩＴＣ等の蛍光染料によって標識された蛋白質は商業的に利用可能であり、蛋白質と蛍光染料との反応により製造可能である。その後、結合しなかった蛋白質を除去するために、前記蛋白質処理チップは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む緩衝溶液で１０分ずつ３回にわたり洗浄される。
【００１９】
本発明の一つの実施形態において、前記表面上に固定された蛋白質と炭水化物との間の結合パターンが、標識または非標識の検出システムによって分析される。非標識の検出システムは、質量分析計および表面プラズモン共鳴撮像装置で構成された群から選択される。標識検出システムは、走査系器具およびＣＣＤカメラを用いた器具で構成された群から選択される。前記試料は、ヒトまたは動物の、組織または血清、尿、乳、汗、骨髄およびリンパ液を含む体液である。
【００２０】
本発明の別の態様において、前記の経路によって製造された炭水化物チップを利用して炭水化物に基づく疾病を診断する方法が提供される。診断可能な前記疾病は、遺伝疾病、癌、ならびにウイルスおよびバクテリア感染を含む。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を次のような実施例によって更に詳しく説明する。説明された実施例は単に例示的なものとして全ての面で考慮されるべきであり、限定的なものではない。
【００２２】
＜実施例１＞
固体表面上における非修飾の炭水化物の固定化に必要となる官能基の選択
【００２３】
本発明者らはまず、非修飾の炭水化物と非常に効果的且つ選択的に反応する官能基を選択した。非修飾の炭水化物とアミノオキシ基またはヒドラジド基との間の反応は、様々な複合糖質の合成に広く用いられている（Hatanaka, Y. et. al.,J. Org. Chem. 2000, 65, 5639 ; Leteux, C. et. al., Glycobiology1998, 8, 227 ; Zhao, Y. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 1629）。したがって、本発明者らは、固体表面に非修飾の炭水化物を部位特異的に、および共有的に結合するために前記反応を用いた。
【００２４】
＜実施例２＞
アミノオキシおよびヒドラジド修飾チップ基盤の製造
【００２５】
アミノオキシ基およびヒドラジド基によって修飾された固体表面を図３の提示の通りに製作する。手順を以下にて詳しく説明する。
【００２６】
アミノオキシチップ基盤を、次の三つの方法によって製作する（図３（ａ）参照）。一番目に、アミンチップ基盤を化合物ｂおよびトリエチルアミン（ＴＥＡ）と１２時間反応させた後、３％ヒドラジンと３〜６時間反応させてフタロイル（Ｐｈｔｈ）保護基を除去することにより、短いリンカーが接続されたアミノオキシチップ基盤を製造する。二番目に、リンカーａ（４，７，１０−トリオキサ−１，３−トリデカンジアミン）が接続されたアミノオキシチップ基盤の製作では、まずアミンチップ基盤と無水コハク酸とを３時間反応させる。その後、前記製作されたカルボン酸チップ基盤を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）と３時間反応させ、その後リンカーａと３時間反応させて前記表面上にアミン基を導入する。前記製作された長鎖のアミンチップ基盤を化合物ｂと１２時間反応させ、その後ヒドラジンと３〜６時間反応させて、中間の長さのリンカーが接続されたアミノオキシチップ基盤を製作する。三番目に、リンカーａとｃ（ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル）が接続された最も長いアミノオキシチップ基盤の製造では、まずリンカーａが結合したアミンチップ基盤と、化合物ｃとをｐＨ８．３で１時間反応させてエポキシドを導入する。その結果物であるエポキシドチップ基盤をリンカーａとｐＨ８．３で３時間反応させる。前記製作されたアミンチップ基盤を化合物ｂと反応させた後のヒドラジン処理により、最も長いリンカーが接続されたアミノオキシチップ基盤を製作する。
【００２７】
ヒドラジドチップ基盤を、次の三つの方法によって製作する（図３（ｂ）参照］。一番目に、無水コハク酸との３時間の反応、ＮＨＳおよびＤＩＣとの３時間の反応、ｔ−ブチルオキシカルボニル６−アミノヘキサン酸ヒドラジドとの３時間の反応、およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）との１時間の反応の連続的な反応によって、短いリンカーが接続されたアミンチップ基盤を製作する。二番目に、中間の長さのリンカーが接続されたヒドラジドチップ基盤を、アミノオキシチップ基盤の製作で説明したように、リンカーａが繋がれたアミノオキシチップ基盤を用いて製作する。前記アミノチップ基盤をコハク酸と反応させて前記表面にカルボン酸を導入し、更にＤＩＣおよびＮＨＳと反応させ、次にヒドラジンと３時間反応させ、中間の長さのリンカーが接続されたヒドラジドチップ基盤を提供する。三番目に、最も長いヒドラジドチップ基盤を、前記の説明の通り、エポキシド被覆チップ基盤から製作する。前記エポキシドチップ基盤をリンカーａと反応させ、続いて無水コハク酸、ＮＨＳおよびＤＩＣ、ｔ−ブチルオキシカルボニル６−アミノヘキサン酸ヒドラジド、ならびにＴＦＡと連続的に反応させて最も長いヒドラジドチップ基盤を生産する。
【００２８】
前記の様々な長さのリンカーがチップ基盤内に導入される理由は、蛋白質が固体表面上の炭水化物リガンドに結合する際に、立体障害および非特異的相互作用を最少化することができる方法を見出すためである。
【００２９】
＜実施例３＞
固定化条件の最適化
【００３０】
前記実施例２で製作されたアミノオキシ基およびヒドラジド基によって誘導体化された固体表面上に炭水化物を固定させるための条件（温度、時間、ｐＨおよび濃度）を最適化するために実験を行った。
【００３１】
＜３−１＞  最適固定化温度および時間
【００３２】
固定化温度および時間を最適化するために、フコースおよびＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（３０ｍＭ、３０％グリセロールを含むｐＨ５．０のリン酸ナトリウム緩衝溶液）の溶液を、アミノオキシ基またはヒドラジド基によって修飾された固体表面上に印刷し、その結果得られたチップを２２℃、３７℃または５０℃でインキュベートする。１〜２１時間後、前記チップを、標識Aleuria aurantia（Ｃｙ５−ＡＡ）およびTriticum vulgaris（Ｃｙ３−  ＴＶ、wheat germ agglutininとしても知られている）または非標識蛋白質とインキュベートする。
【００３３】
前記表面上の蛋白質と炭水化物との間の結合強度を、標識蛋白質の場合は蛍光スキャナまたは蛍光顕微鏡を用いて測定し、非標識蛋白質の場合は表面プラズモン共鳴撮像装置または質量分析計を用いて測定した。５０℃で製作された炭水化物チップは、テストされた温度中で最も良い結果を表す。更に、５０℃で１２時間以上のインキュベート時間から得られた炭水化物チップは、蛍光強度の実質的な変化を表さない（図４参照）。よって、約１２時間程度の固定化時間が固定化に最適である。
【００３４】
＜３−２＞最適固定化ｐＨおよび濃度
【００３５】
前記実施例＜３−１＞から得られた最適温度（５０℃）および最適時間（１２時間）で最適ｐＨおよび濃度を調査する。
【００３６】
具体的に、ｐＨ４〜５で約３０ｍＭ濃度の炭水化物濃度が効率的な固定化に理想的であることが見出される。また、固体表面上の炭水化物とアミノオキシ基またはヒドラジド基との間の共有結合は、緩衝溶液を用いた炭水化物チップの広範囲な洗浄がレクチン結合に影響を及ぼさないという観察を根拠に、非常に安定的であることが見出される。更に、実施例２の三番目の方法に従って製作された、最も長いリンカーが接続されたアミノオキシおよびヒドラジドチップは、より短いリンカーが繋がれたチップ基盤と比較して最善の結果を表す。
【００３７】
＜実施例４＞
炭水化物チップの応用
【００３８】
炭水化物チップは、様々な生物学的過程に関与し、新たな治療剤の開発、並びに腫瘍および病原菌等の炭水化物に基づく疾病の迅速な診断のために重要な炭水化物−蛋白質相互作用の迅速な評価のために用いられる。このような目的のために、下記表１に提示された２１個の単糖類、二糖類、オリゴ糖および多糖類の各溶液（３０％グリセロールを含むリン酸ナトリウム緩衝溶液、ｐＨ５．０）を、アミノオキシ基またはヒドラジド基によって被覆された固体基質に印刷した。実施例３で説明した前記方法で製作された炭水化物チップを、Ｃｙ３−ＴＶ、Ｃｙ５−ＡＡおよびＦＩＴＣ−ＣｏｎＡとインキュベートした。蛍光スキャナで検出後に、チップ内のスポットの蛍光強度に従って、ＴＶは、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（１３）に強く、ＧｌｃＮＡｃ（２）およびシアリルＬｅｘ（１９）にはさほど強くなく、そしてＧａｌＮＡｃ（５）、ＬａｃＮＡｃ（１５）およびＮｅｕＮＡｃＬａｃＮＡｃ（１８）には弱く結合する（図５（ａ）参照）。ＡＡで処理された炭水化物チップは、レクチンがＦｕｃ（８）、ＦｕｃＬａｃ（１７）および六糖類（２０）に強く結合するが、シアリルＬｅｘ（１９）には非常に弱く結合する（図５（ｂ）参照）。ＣｏｎＡとインキュベートさせた炭水化物チップは、マンナン（２１）にレクチンの強い結合を表すが、マンノビオース（１６）にはさほど強くない結合を表し、そしてマルトース（１１）には非常に弱い結合を表す（図５（ｃ）参照）。
【００３９】
シアリルＬｅｘは、重要な生物学的認識マーカーであり創薬のための興味深いターゲットである。血液内の糖蛋白質にシアリルＬｅｘを有するグリカンは、Ｔ細胞、内皮細胞または血小板に結合する。前記結合事象は急性および慢性炎症の原因になる（Somers, W.S. et al., Cell2000, 103, 467; Wild M.K. et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 31602）。更に、シアリルＬｅｘは腫瘍関連炭水化物抗原の一つであると知られている（Hakamori, S. Adv. Cancer Res. 1989, 52, 257）。
【００４０】
そのため、シアリルＬｅｘの検出およびシアリルＬｅｘ結合蛋白質に関する阻害剤の開発は、基礎生物学的研究および創薬の両方にとって重要である。前記の方法によって製作された炭水化物チップを、シアリルＬｅｘ結合蛋白質の検出に用いた。前記炭水化物チップを抗シアリルＬｅｘ抗体とインキュベートした。前記チップの蛍光イメージは、シアリルＬｅｘがこのような抗体によって選択的に認識されることを表す（図５（ｄ）参照）。
【００４１】
病原菌を含む多くのバクテリアは、線毛（pili）上に特異的な炭水化物結合蛋白質を表す。特異的な炭水化物−蛋白質相互作用による宿主細胞への病原菌の最初の付着は、病原菌の特性を付与する。例えば、タイプ１の線毛状（fimbriated）Ｅ．ｃｏｌｉのマンノース結合蛋白質は、宿主細胞上のグリカンへの結合により一般的な尿路感染の原因になると知られている（Connell, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9827）。そのため、炭水化物チップもまた、診断のための病原菌の検出に用いた。線毛上にマンノース結合因子を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＯＲＮ  １７８は、マンノース、マンノビオースおよびマンナンを含むスポットに結合する（図５（ｅ）参照）。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
前記で説明した通り、本発明者らは、誘導体化された固体基質上に部位特異的に、および共有的に非修飾の炭水化物を固定化させる、新規で効率的な炭水化物チップの製作方法を提供する。前記方法で製作された炭水化物チップを用いた蛋白質および細胞結合実験は、如何なる形態の炭水化物も、その大きさに関係なく、アミノオキシ基またはヒドラジド基によって誘導体化された固体表面上に効率的に固定化できることを証明する。更に、炭水化物チップは炭水化物−蛋白質相互作用の迅速な分析および炭水化物に基づく疾病の診断のための抗体および病原菌の検出に有用であることを表す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】炭水化物チップの製作方法を示す概略図である。
【図２】本発明の原理を説明する概略図である。
【図３】様々な長さのリンカーを経由した（ａ）アミノオキシまたは（ｂ）ヒドラジドで誘導体化された固体表面の製作を示すフローチャートである。
【図４】（ａ）Ｃｙ５標識ＡＡおよび（ｂ）Ｃｙ３標識ＴＶとのインキュベート後に、アミノオキシ（黒線）およびヒドラジド（赤線）によって被覆された固体表面上へのフコースおよびＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースの固定化の時間依存を示すグラフである。
【図５】（ａ）Ｃｙ３−ＴＶ、（ｂ）Ｃｙ５−ＡＡ、（ｃ）ＦＩＴＣ−ＣｏｎＡ、（ｄ）抗シアリルＬｅＸ抗体、および（ｅ）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でプレインキュベートされたＥ．  ｃｏｌｉでプローブされた２１個の炭水化物からなる炭水化物チップの蛍光像である。
【図１】
2008541011.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月30日(2007.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
前記固体表面は、シリコン、高分子、雲母、プラスチック、ガラス、金、紙、膜またはこれらの組み合わせで構成される群から選ばれることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の炭水化物チップの製作方法。
【国際調査報告】
2008541011.tif 000009
2008541011.tif 000010