(57)【要約】  本発明は、フコシル残基を欠く抗ＰＳＭＡ抗体に関する。本発明の抗体は、フコシル化された形態の抗体と比較して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性が増加している。本発明はまた、フコシル残基を欠く抗ＰＳＭＡ抗体を発現する宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼを欠いている。ＰＳＭＡ＋細胞、例えば、腫瘍細胞の成長を阻害するための、該抗体の使用方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコース残基を欠く、単離された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）抗体。
【請求項２】
前記抗体は、フコース残基を含有する形態の抗体と比較した場合、細胞表面ＰＳＭＡを発現する細胞の抗体依存性細胞傷害性を増強させた、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記フコース残基を欠く抗体は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０が０．０５μｇ／ｍｌ以下である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記フコース残基を欠く抗体は、フコース残基を含有する形態の抗体のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０より少なくとも３倍低いＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記ヒト化抗体またはキメラ抗体は、３Ｆ５．４Ｇ６、３Ｄ７．１．１、４Ｅ１０−１．１４、３Ｅ１１、４Ｄ８、３Ｅ６、３Ｃ９、２Ｃ７、１Ｇ３、３Ｃ４、３Ｃ６、４Ｄ４、１Ｇ９、５Ｃ８Ｂ９、３Ｇ６、４Ｃ８Ｂ９、Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３およびＪ５９１からなる群から選択されるマウス抗ＰＳＭＡ抗体から調製される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項９】
前記ヒト抗体は、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含み、
（ａ）該ヒト重鎖可変領域は、配列番号１乃至９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）該ヒト軽鎖可変領域は、配列番号１０乃至１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：２のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１１のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：３のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：５のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１５】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：６のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１５のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１６】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：７のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１６のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１８】
前記ヒト重鎖可変領域は、配列番号：９のアミノ酸配列を含み、前記ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１９】
ａ）配列番号：１９乃至２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：２８乃至３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：３７乃至４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４６乃至５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５５乃至６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６４乃至７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項２０】
ａ）配列番号：１９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：２８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：３７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
ａ）配列番号：２０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：２９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：３８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２２】
ａ）配列番号：２１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：３９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２３】
ａ）配列番号：２２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２４】
ａ）配列番号：２３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：５０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２５】
ａ）配列番号：２４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：５１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：６０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２６】
ａ）配列番号：２５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：５２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：６１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：７０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２７】
ａ）配列番号：２６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：５３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：６２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：７１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２８】
ａ）配列番号：２７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：３６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：４５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：５４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：６３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：７２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２９】
ヒトＶＨ５−５１またはＶＨ３−３０．３遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項３０】
ヒトＶｋＬ６、０４／０１４またはＬ１８遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒトＶＨ５−５１またはＶＨ３−３０．３遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域、およびヒトＶｋＬ６、０４／０１４またはＬ１８遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項３２】
抗ＰＳＭＡ抗体をコードするイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含む宿主細胞であって、前記宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼを欠くため、前記宿主細胞によって発現される前記抗ＰＳＭＡ抗体はフコース残基を持たない、宿主細胞。
【請求項３３】
前記イムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ８である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
ＣＨＯ細胞である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
ＰＳＭＡ＋細胞の成長を阻害する方法であって、前記細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発するのに十分な条件下で、前記細胞を脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体に接触させることを含む、方法。
【請求項３７】
前記細胞は腫瘍細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗ＰＳＭＡ抗体は、ヒト抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、該腫瘍細胞または血管内皮細胞がＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞に近接し、被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を、被験者に投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記抗ＰＳＭＡ抗体は、ヒト抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍細胞が前立腺癌腫瘍細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍細胞は、結腸、腎臓、直腸、尿路上皮、乳房、膀胱、肝臓、膵臓からなる群から選択される癌またはメラノーマである、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
前立腺癌は、男性において罹患率および死亡率が最も高い癌である。前立腺癌の治療としては、外科的手術、ホルモン療法、放射線療法、化学治療が挙げられる。転移性の前立腺疾患には有効な治療方法が少ない。したがって、診断および予後マーカー、ならびに治療の標的を表す遺伝子および／または遺伝子産物を同定することは重要である。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、そのような癌マーカーの１つであり、それは、前立腺癌の臨床診断および病期決定において有用である。しかしながら、ＰＳＡは、良性の前立腺肥大症（ＢＰＨ）と、前立腺炎または４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲の前立腺癌とを区別することができない。したがって、適切な診断を確定するための細胞学的および／または組織学的評価が必要である（Barren, R.J. et al. （1998） Prostate 36:181-188）。
【０００２】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、７５０アミノ酸で、トランスフェリンレセプターと５４％の相同性を有する約１１０ｋＤのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、１９のアミノ酸細胞内ドメイン、２４のアミノ酸膜貫通ドメイン、および７０７のアミノ酸細胞外ドメインを含む、３種類の構造ドメインを有している。ＰＳＭＡタンパク質は、ニューロカルボキシペプチダーゼおよび葉酸加水分解酵素活性を示し、それは、前立腺の成長および分化の神経内分泌調節に関与することが報告されている（Heston, W.D. （1996） Urologe-Ausgabe A. 35:400-407）。ＰＳＭ’は、ＰＳＭＡから代替的にスプライスさたもので、細胞質に局在する。
【０００３】
ＰＳＭＡは、主に前立腺上皮細胞において発現する。ＰＳＭＡの発現は、前立腺癌、特に低分化型、転移性およびホルモン難治性癌腫において上昇する（Gregorakis, A.K. et al. （1998） Seminars
in Urologic Oncology 16:2-12; Silver, D.A.（1997） Clinical
Cancer Research 3:81-85）。ＰＳＭＡの低レベルの発現は、小腸、唾液腺、十二指腸粘膜、近位腎尿細管および脳などの前立腺以外の組織においても認められている（Silver, D.A. （1997） Clinical Cancer Research 3:81-85）。ＰＳＭＡ発現は、腎細胞癌腫または大腸癌腫など特定の悪性腫瘍の腫瘍周辺および腫瘍内部分の毛細血管の上皮細胞においても見られるが、正常組織の血管においては見られない。さらに、ＰＳＭＡの発現は、腫瘍の血管形成に関与することが報告されている（Silver, D.A. （1997） Clinical Cancer Research 3:81-85）。
【０００４】
ＰＳＭＡの細胞外ドメインに対する抗体について記載されている（例えば、Liu, H. et al. （1997）Cancer Res. 57:3629-3634; Murphy, G.P. et al. （1998） J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S. et al. （2001） Int. J.
Cancer 92:871-876; Kato, K. et al. （2003） Int. J. Urol. 10:439-444; 米国特許第６，１５０，５０８号および米国特許第６，１０７，０９０号参照）。さらに近年、ＰＳＭＡに結合するヒト抗体およびヒト化抗体について記載されている（例えば、Bander, N.H. et al. （2003） Semin.
Oncol. 30:667-676;ＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／０９８８９７号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０９１９２号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０６４６０６号；ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０３４９０３号；および米国出願第２００４／００３３２２９号参照）。このような抗体は、前立腺癌細胞のイメージングに用いられてきた（例えば、Yao, D. et al. （2002） Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H. et al. （2003） J. Urol. 170:1717-1721参照）。抗ＰＳＭＡ抗体は、典型的には化学治療薬または放射性同位体との結合体として、前立腺癌の治療における治療的インターベンションにも用いられてきた（例えば、Nanus, D.M. et al. （2003） J. Urol.
170:S84-89; Milowsky, M.I. et al. （2004） J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D. et
al. （2004） Cancer Res. 64:7995-8001参照）。 
【０００５】
ＰＳＭＡ発現に関与する疾患を治療および／または予防するのに有効な、ＰＳＭＡに対する改良された治療用抗体、特に、化学治療薬または放射性同位体と結合させる必要なく細胞傷害効果を有する抗体が望まれる。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ヒトＰＳＭＡに結合し、脱フコシル化されていない形態の抗体（すなわち、フコース残基を含有する抗体）の場合と比較して細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のＰＳＭＡ発現細胞の殺傷が増強されている抗体である、単離された脱フコシル化された抗体（すなわち、フコース残基を欠く抗体）を提供する。また、本発明の抗体および組成物を使用した、ＰＳＭＡ発現に関与する種々の疾患を治療する方法も提供する。
【０００７】
本発明の脱フコシル化された抗体は、ＰＳＭＡに結合し、ヒトエフェクター細胞（例えば、単球もしくは単核細胞）の存在下で、フコシル化された形態の抗体と比較して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強させることによって、ＰＳＭＡ発現細胞の成長を阻害する。したがって、本発明は、ＰＳＭＡの発現を特徴とする障害を治療するための改良された手段を提供する。
【０００８】
したがって、ある局面において、本発明は、フコース残基を欠く、単離された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）抗体に関する。好ましくは、該抗体は、フコース残基を含有する形態の抗体と比較した場合、細胞表面ＰＳＭＡを発現する細胞の抗体依存性細胞傷害性を増強させている。好ましい態様において、前記フコース残基を欠く抗体は、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０が、０．０５μｇ／ｍｌ以下、または０．０４μｇ／ｍｌ以下、または０．０３μｇ／ｍｌ以下、または０．０２μｇ／ｍｌ以下、または約０．０１８μｇ／ｍｌである。別の好ましい態様において、前記フコース残基を欠く抗体は、フコース残基を含有する形態の抗体のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０より少なくとも３倍低い（または少なくとも４倍低い、または少なくとも５倍低い、または少なくとも６倍低い）ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞に対するＡＤＣＣ活性のＥＣ５０を有する、
【０００９】
好ましくは、本発明の脱フコシル化された抗体は、モノクローナル抗体である。ある局面において、本発明は、ヒト化抗体またはキメラ抗体に関する。好ましくは、該ヒト化抗体またはキメラ抗体は、３Ｆ５．４Ｇ６、３Ｄ７．１．１、４Ｅ１０−１．１４、３Ｅ１１、４Ｄ８、３Ｅ６、３Ｃ９、２Ｃ７、１Ｇ３、３Ｃ４、３Ｃ６、４Ｄ４、１Ｇ９、５Ｃ８Ｂ９、３Ｇ６、４Ｃ８Ｂ９、Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３およびＪ５９１からなる群から選択されるマウス抗ＰＳＭＡ抗体から調製される。別の局面において、本発明は、ヒトモノクローナル抗体である。
【００１０】
好ましい態様において、該ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含み、
（ａ）該ヒト重鎖可変領域は、配列番号１乃至９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
（ｂ）該ヒト軽鎖可変領域は、配列番号１０乃至１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
様々な局面において、以下の重鎖および軽鎖の組み合わせが好ましい。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１１のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：３のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：５のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：６のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１５のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：７のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１６のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：８のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１７のアミノ酸配列を含む。
ヒト重鎖可変領域は、配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ヒト軽鎖可変領域は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
別の態様において、本発明のモノクローナル抗体は、
ａ）配列番号：１９乃至２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：２８乃至３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：３７乃至４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：４６乃至５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：５５乃至６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：６４乃至７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００１３】
様々な態様において、以下の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組み合わせが好ましい。
（ａ）配列番号：１９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
または、
（ａ）配列番号：２０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３
または、
（ａ）配列番号：２１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
または、
（ａ）配列番号：２７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【００１４】
別の局面において、本発明は、ヒトＶＨ５−５１またはＶＨ３−３０．３遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたヒト抗ＰＳＭＡ抗体を提供する。本発明はまた、ヒトＶｋＬ６、０４／０１４またはＬ１８遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたヒト抗ＰＳＭＡ抗体を提供する。本発明はさらに、ヒトＶＨ５−５１またはＶＨ３−３０．３遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域、およびヒトＶｋＬ６、０４／０１４またはＬ１８遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたヒト抗ＰＳＭＡ抗体を提供する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、抗ＰＳＭＡ抗体をコードするイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含み、抗ＰＳＭＡ抗体がキメラニワトリの卵において発現するようにしたキメラニワトリであって、該キメラニワトリの卵において発現する抗ＰＳＭＡ抗体は、フコース残基を持たない、キメラニワトリに関する。好ましくは、イムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、抗ＰＳＭＡ抗体をコードするイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含む宿主細胞であって、該宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼを欠き、その結果、該宿主細胞によって発現される前記抗ＰＳＭＡ抗体はフコース残基を持たない、宿主細胞に関する。好ましくは、該イムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子は、ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子である。好ましくは、フコシルトランスフェラーゼは、ＦＵＴ８である。好ましくは、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ＰＳＭＡ＋細胞の成長を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発するのに十分な条件下で、細胞を脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体に接触させることを含む。細胞は、例えば、腫瘍細胞とすることができる。好ましくは、抗ＰＳＭＡ抗体は、ヒト抗体である。
【００１８】
本発明はまた、被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、該腫瘍細胞または血管内皮細胞は、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞に近接している。被験者において腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を、被験者に投与することを含む。好ましくは、抗ＰＳＭＡ抗体は、ヒト抗体である。好ましい態様において、腫瘍細胞は、前立腺癌腫瘍細胞である。
【００１９】
本発明の他の特徴および利点については、以下の詳細な説明および限定されることが意図されない実施例において明らかにする。引用文献の内容、ジェンバンク（Genbank）の記載、本明細書において引用する特許および公開されている特許出願は、本明細書において明確に引用によって援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ＰＳＭＡ発現および／またはＰＳＭＡ発現細胞に関連する種々の疾患を治療および診断するための、抗体組成物および改良された抗体をベースとした治療を提供する。本発明の抗体は、糖鎖上にフコシル残基を有している。さらに、該抗体は、抗体指向性のＰＳＭＡ＋細胞の増強された細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）殺傷を示す。
【００２１】
特定の態様において、本発明の抗体は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり、ヒトにおけるＰＳＭＡ発現細胞に関連する傷害の治療に特に有用である。フコシル残基を欠く抗ＰＳＭＡ抗体を、治療のため（例えば、ＰＳＭＡ発現に関連する疾患を治療および／または予防するため）に用いる方法も本発明に包含される。
【００２２】
本発明をより理解しやすくするためにいくつかの用語をまず定義する。さならる定義は、詳細な明細書全体に記載する。
【００２３】
用語「前立腺特異的膜抗原」および「ＰＳＭＡ」は、本明細書において互換可能に用いられ、細胞によって天然に発現し、本明細書に記載の抗体４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３との結合を維持するヒトＰＳＭＡのあらゆる変形、アイソフォーム、種ホモログを含む。ヒトＰＳＭＡタンパク質の完全アミノ酸配列は、Genbank受入番号ＮＰ＿００４４６７を持つ。ヒトＰＳＭＡタンパク質の完全ｃＤＮＡ配列は、Genbank受入番号NM＿００４４７６を持つ。
【００２４】
本明細書において用いられる用語「フコース残基を欠く抗体」および「脱フコシル化された抗体」は、互換可能に用いられており、抗体の糖部分がフコシル残基を含有しない、またはフコシル残基が除去されている抗体を意味している。フコース残基を欠く抗体は、例えば、細胞中の抗体の発現によって、またはフコシル残基を最小化する、もしくはフコシル残基を抗体の糖鎖に付着せず、または糖鎖からフコシル残基を除去するようにした抗体の化学的改変（例えば、フコシダーゼによる抗体の処理）によって、作製することができる。そうであるので、用語「フコース残基を欠く」および「脱フコシル化された」は、改変された糖構造を有する抗体を調製するメカニズムに限定されることを意図しない。
【００２５】
本明細書において用いられる用語「フコース残基を発現する抗体」および「フコシル化された抗体」は互換可能に用いられており、抗体の糖部分がフコースを含有する抗体を意味することが意図されている。  
【００２６】
用語「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、およびそれら細胞または肝臓によって産生された可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を意味し、その結果、病原体感染、細胞もしくは病原体に侵された組織、癌性細胞の人体からの選択的傷害、その破壊もしくは排除、または自己免疫もしくは病原性炎症の場合には、正常ヒト細胞もしくは組織の選択的傷害、破壊または排除が起こる。
【００２７】
本明細書において用いられている用語「エフェクター細胞」は、免疫応答の認識および活性化段階でなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言う。免疫細胞の例としては、骨髄またはリンパ系由来の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多核白血球、顆粒球、マスト細胞、および好塩基球、挙げられる。いくつかのエフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。好ましい態様において、エフェクター細胞は、ＡＤＣＣを誘導できる好中球など、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的殺傷や、他の免疫系構成成分への抗原提示又は抗原提示細胞への結合に関与している。他の態様においては、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食することができる。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子により調節することができる。例えば、ＦｃαＲＩの発現がＧ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦにより上方調節されることがわかっている。この発現亢進により、ＦｃαＲＩ担持細胞の標的に対するエフェクター機能が増す。エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食又は溶解することができる。
【００２８】
「標的細胞」とは、本発明の組成物（例えば、抗体）の標的となる可能性がある、被験体（例えば、ヒトまたは動物）中の、除去することを望まれるあらゆる細胞または病原体を意味する。例えば、標的細胞は、ＰＳＭＡを発現、または過剰発現する細胞である。
【００２９】
用語「抗体依存性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」は、細胞媒介性の細胞傷害性反応を意味する。そこでは抗ＰＳＭＡ抗体が結合した状態のＰＳＭＡ＋標的細胞がＦｃレセプターを保有するエフェクター細胞によって認識され、補体の関与を必要とせずに引き続き溶解される。
【００３０】
本明細書において用いられる用語「ＡＤＣＣを増強させる」（例えば、細胞に関して）は、細胞溶解における、フコシル残基を欠く抗ＰＳＭＡ抗体に接触したとき、エフェクター細胞の存在下（例えば、標的細胞：エフェクター細胞の比１：５０）でフコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体と接触した同じ細胞の細胞殺傷と比較した場合の、あらゆる測定可能な増加を含むことが意図される。例えば、細胞溶解における増加は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、または３２５％である。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、全抗体、およびそのあらゆる抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって内部結合している少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質およびその抗原結合部分を言う。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においては、ＶＨのように省略する）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においては、ＶＬのように省略する）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、超可変性の領域、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる部分、より保存されている領域に分散したフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる部分に分類される。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で並んでいる。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、イムノグロブリンと宿主組織もしくはファクターの結合を媒介することもあり、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）や古典的相補系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む。
【００３２】
本明細書において用いられている抗体の「抗原結合部分」という用語（単に、「抗体部分」）は、抗原（例えば、ＰＳＭＡ）と特異的に結合する能力を保持する１以上のフラグメントを言う。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって達成することができる。用語、抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でのジスルフィドブリッジによって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１つの腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ward et al., （1989） Nature
341:544-546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子にコードされているが、これらは、組換え方法によって、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを結合する合成リンカーを用いて結合することができる（例えば、Bird et al. （1988） Science
242:423-426；およびHuston et
al. （1988） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものと、意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントは、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。
【００３３】
本明細書において用いられている用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒトイムノグロブリン遺伝子またはそれによって調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明する）のトランスジェニックまたはトランスクロモソーム動物（例えば、マウス）から単離された抗体；（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体；および（ｄ）ヒトイムノグロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることに関する他のあらゆる手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、いくつかの態様において、そのような組換えヒト抗体は、in vitro 突然変異生成を行うことができ（または、ヒトＩｇ配列に遺伝子変異された動物を用いる場合、in vivo 体細胞性突然変異生成）、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、またそれに関連するものの、天然にヒト抗体生殖系列レパートリーにin vivoで存在しないことがある。
【００３４】
本明細書において用いられている用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の分子組成物の抗体分子調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを示す。
【００３５】
本明細書において用いられている用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図されている。さらに抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列（例えば、in vitro でランダムもしくは部位特異性の突然変異生成、またはin vivoで体細胞性突然変異によって導入された突然変異）によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。
【００３６】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を言う。ある態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化した細胞に融合するヒト重鎖トランスジーンおよび軽鎖トランスジーンを含むゲノムを持つ、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって作製される。本明細書において用いられている用語「ヒトモノクローナル抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出、または単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒトイムノグロブリン遺伝子またはそれによって調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明する）のトランスジェニックまたはトランスクロモソーム動物（例えば、マウス）から単離された抗体；（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体；（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体；および（ｄ）ヒトイムノグロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることに関する他のあらゆる手段によって調製、発現、作出、または単離された抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト生殖系列イムノグロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、いくつかの態様において、そのような組換えヒト抗体は、in vitro 突然変異生成を行うことができ（または、ヒトＩｇ配列に遺伝子変異された動物を用いる場合、in vivo 体細胞性突然変異生成）、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、またそれに関連する一方、天然にヒト抗体生殖系列レパートリーにin vivoで存在しないことがある。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を持つ他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ＰＳＭＡと特異的に結合する単離された抗体は、ＰＳＭＡ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を意味することが意図されている。しかしながら、ヒトＰＳＭＡのエピトープ、アイソフォーム、またはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種（例えば、ＰＳＭＡ種ホモログ）からの他の関連抗原に対して交差反応性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質も実質的に含まなくてもよい。本発明のある態様において、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、十分に確定された組成に組み合わされている。
【００３８】
用語「ヒト化抗体」は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を言う。追加のフレームワーク領域改変も、ヒトフレームワーク配列内部で行うこともできる。
【００３９】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列と定常領域配列とが別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を意味する。
【００４０】
用語「エピトープ」とは、抗体に結合すること、すなわち抗体による特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面の基からなり、通常特異的な３次元構造的特徴、ならびに特異的な電荷的特徴を有している。高次構造エピトープと非高次構造エピトープとは、後者に対する結合はそうではないが、前者に対する結合は変性溶媒中で失われる点において区別される。
【００４１】
本明細書において用いられる「特異的結合」は、所定の抗原に抗体が結合することを意味する。典型的に、抗体は、解離定数（ＫＤ）１０−７Ｍ以下で結合するが、所定の抗原に対しては、所定の抗原または関連性の高い抗原以外の非特異性抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合する場合のＫＤの少なくとも２倍低いＫＤで結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原特異的抗体」という表現は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という表現と互換可能に用いられる。
【００４２】
本明細書において使用されている用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域の遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を意味する。
【００４３】
本明細書において用いられる用語「ベクター」は、それが結合した他の核酸を輸送することのできる核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、環状二本鎖ＤＮＡのループであって、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーションできる。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションできる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌性の複製オリジンを有する細菌性ベクターおよびエピゾーム性哺乳動物用ベクター）。他のベクター（例えば、非エピゾーム性哺乳動物用ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中にインテグレートされ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に結合した遺伝子の発現を指図することができる。かかるベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と言う。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミド形態である。本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドが最も普通に用いられる型のベクターであるので、互換可能に用いる。しかしながら、本発明は、かかる他の型の発現ベクター、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含することを意図している。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味することが意図される。このような用語は、特定の被検細胞のみならず、そのような細胞の子孫を意味することも意図されている。突然変異や環境の影響によって後の世代において特定の変形が生じるかも知れず、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲に含むものとする。組換え宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、トランスフェクトーマ、リンパ性細胞が挙げられる。
【００４５】
本明細書において用いられる用語「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれをも含む。用語「非ヒト動物」は、脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００４６】
用語「トランスジェニック動物」は、１以上のヒト重鎖および／もしくは軽鎖トランスジーンまたはトランスクロモソーム（その動物の天然のゲノムＤＮＡに導入されている、もしくはされていない）を含むゲノムを有し、完全ヒト抗体を発現することができる非ヒト動物を言う。例えば、トランスジェニックマウスは、ＰＳＭＡ抗原および／またはＰＳＭＡを発現する細胞によって免疫されたとき、マウスがヒト抗ＰＳＭＡ抗体を生成することができるように、ヒト軽鎖トランスジーンとヒト重鎖トランスジーンまたはヒト重鎖トランスクロモソームを有することができる。トランスジェニックマウス、例えば、ＨｕＭＡｂマウスの場合、ヒト重鎖トランスジーンをマウスの染色体ＤＮＡに統合することができ、または、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーム（例えば、ＫＭ）マウスの場合のようにヒト重鎖トランスジーンは、染色体外部に維持され得る。このようなトランスジェニックおよびトランスクロモソームマウスは、ＰＳＭＡに対する多数のヒトモノクローナル抗体のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ）を、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え、およびアイソタイプスイッチングを行うことによって生成することができる。
【００４７】
以下のサブセクションにおいて、本発明の種々の局面をさらに詳細に説明する。
【００４８】
フコース残基を欠き、ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＰＳＭＡ抗体
本発明は、フコシル化された形態の抗体と比較した場合、ＰＳＭＡを発現する細胞に対する抗体指向性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増強されている、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体に関する。好ましい態様において、本発明の脱フコシル化された抗体において、フコシル化された形態の抗体、例えば、抗体濃度が０．１μｇ／ｍｌで、標的細胞とエフェクター細胞の比が１：１００の条件と比較して、ＬｎＣａＰ前立腺癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）のin
vitroでのＡＤＣＣが高められている。好ましくは、使用されるエフェクター細胞は、ヒト末梢血由来のＩＬ−２刺激エフェクター細胞である（例えば、１×１０６ヒト末梢血単核細胞を１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２とともに３７℃で一晩インキュベートする）。好ましくは、脱フコシル化された形態の抗体を、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞において発現させて得られたフコシル化された形態と比較する。
【００４９】
好ましい態様において、脱フコシル化された形態の抗体は、ＡＤＣＣ活性のＥＣ５０が、０．０５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．０４μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは０．０３μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは０．０２μｇ／ｍｌ以下、そしてさらにより好ましくはＥＣ５０が約０．０１８μｇ／ｍｌである。他の好ましい形態において、脱フコシル化された形態の抗体は、ＡＤＣＣ活性のＥＣ５０が、０．０１μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．００９μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは０．００８μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは０．００７μｇ／ｍｌ以下、さらにより好ましくは０．００５μｇ／ｍｌ以下、またはさらにより好ましくはＥＣ５０が約０．００２μｇ／ｍｌである。好ましくは、ＡＤＣＣ活性のＥＣ５０は、ＩＬ−２刺激エフェクター細胞を用いて実施例４に記載のアッセイによって、または新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞を用いて実施例４に記載のアッセイによって測定することができる。
【００５０】
他の好ましい形態において、脱フコシル化された形態の抗体は、フコシル化された形態の抗体（例えば、ＣＨＯ細胞を発現する形態の抗体）でのＡＤＣＣ活性のＥＣ５０より少なくとも３倍低い。より好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも４倍低い。さらに好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも５倍低い。さらにより好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも６倍低い。さらにより好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも７倍低い。さらにより好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも８倍低い。さらにより好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも９倍低い。さらにより好ましくは、フコシル化された形態の抗体でのＥＣ５０より少なくとも１０倍低い。また、好ましくは、ＡＤＣＣ活性のＥＣ５０は、ＩＬ−２刺激エフェクター細胞を用いて実施例４に記載のアッセイによって、または新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞を用いて実施例４に記載のアッセイによって測定することができる。通常、ＥＣ５０（フコシル化された形態）：ＥＣ５０（脱フコシル化された形態）は、新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞を用いた場合、より大きいことが認められたが、最大パーセント溶解は、新鮮な末梢血エフェクター細胞を用いた場合に低いことが認められた。
【００５１】
本発明の脱フコシル化された抗体の増強したＡＤＣＣ活性は、例えば、ＡＤＣＣ活性を脱フコシル化された形態およびフコシル化された形態ともに同じ条件で（例えば、同じ抗体濃度および同じ標的：エフェクター細胞の比率）で測定して、フコシル化された形態の抗体と比較した場合のパーセント細胞溶解における増加分として定量することができる。さらにまたは別法として、本発明の脱フコシル化された抗体の増強したＡＤＣＣ活性は、例えば、フコシル化された形態の抗体と比較した場合の、脱フコシル化された形態のＥＣ５０値の減少によって測定される力価の増加として定量することができる。これは、フコシル化された形態：脱フコシル化された形態のＥＣ５０の比によって定量化することができる。
【００５２】
本発明のＡＤＣＣアッセイに用いることができ、本発明の脱フコシル化された抗体が、フコシル化された形態の抗体に比べてＡＤＣＣ活性の増強を示すＰＳＭＡ＋細胞系列の例としては、ＬｎＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞および／またはＰＣａ２ｂ細胞が挙げられる。脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体によってＡＤＣＣ効果が増強する結果、フコシル化された形態の抗体を用いたときには観察されなかったであろう抗体濃度で、ＰＳＭＡ＋細胞に対するＡＤＣＣ活性が得られる。 
【００５３】
抗ＰＳＭＡ抗体の脱フコシル化
抗ＰＳＭＡ抗体（例えば、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体）は当該技術分野において公知であり、本発明に用いてもよい。本発明の抗ＰＳＭＡ抗体は、該抗体がフコシル残基を欠くように改変される。抗体は、種々の方法の１つでフコシル残基を欠くように改変することができる。例えば、抗体は、組換えＤＮＡ技術を用いて、フコシル残基の糖鎖への追加が阻害されるように改変されたグリコシル化メカニズムを有する細胞内で発現させることができる。さらに、または別法として、抗体は、フコシル残基の化学的除去によって脱フコシル化されたすることができる。 
【００５４】
さらに好ましい態様において、該抗体は、キメラニワトリ発現系において、抗体が該キメラニワトリ卵内で作製されるように発現させることができる。ニワトリ卵内で抗ＰＳＭＡ抗体を発現するキメラニワトリの調製は、実施例１において詳細に述べている。またそのようなニワトリ卵発現型抗ＰＳＭＡ抗体上でのフコース残基の欠如については、実施例３で説明している。ニワトリ卵におけるタンパク質発現に用いるのに好適なキメラニワトリについては、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０１５１２３に記載がある。したがって、別の局面において、本発明は、抗ＰＳＭＡ抗体を、該抗ＰＳＭＡ抗体がキメラニワトリ卵内で発現するようにコードするイムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を含むキメラニワトリに関する。そこで、キメラニワトリ卵内で発現した抗ＰＳＭＡ抗体はフコース残基を欠いている。好ましくは、該イムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子は、ヒトイムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子である。 
【００５５】
別の形態において、該抗体は、細胞株がそれらの糖内にフコースを持たないタンパク質を作製するようにフコシルトランスフェラーゼ酵素を欠失している細胞内で発現される（実施例５および６参照）。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、ＭＳ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞株で発現した抗体がその糖上にフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９のＦＵＴ８−／−細胞株は、２つのリプレイスメントベクター（米国特許公報２００４０１１０７０４（Yamane et
al.）およびYamane-Ohnuki et al.
（2004） Biotechnol
Bioeng 87:614-22）を用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中でＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって作製した。別の例として、ＥＰ１，１７６，１９５（Hanai et
al.）は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載している。この遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードしており、このような細胞株中で発現した抗体は、アルファ１，６結合関連酵素の減少または消失によって低フコシル化を示している。Hanai et
al.は、抗体のＦｃ領域に結合するかまたはその酵素活性を有していないＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性が本質的に低い細胞株、例えば、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）についても述べている。ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０３５８３５（Presta）には、フコースをＡｓｎ（２９７）結合糖に付着させる能力が低下しており、その結果、その宿主細胞中で発現した抗体のフコシル化が低下することになる変形のＣＨＯ細胞やＬｅｃ１３細胞について記載されている（同様に、Shields, R.L. et al. （2002） J.
Biol. Chem. 277:26733-26740を参照）。ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／５４３４２（Umana et al.）は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学的処理を行った細胞株を記載しており、この工学的処理を行った細胞株中で発現した抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加することになる（同様に、Umana et
al. （1999） Nat.
Biotech. 17:176-180参照）。
【００５６】
別の態様において、抗ＰＳＭＡ抗体が発現し、そのフコシル残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断することができる。例えば、当該フコシダーゼアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Tarentino, A.L. et al. （1975） Biochem. 14:5516-23）。
【００５７】
さらに別の態様において、抗体を他の形態のグリコシル化修飾する。例えば、非グリコシル化抗体を作製できる（すなわち、当該抗体はグリコシル化を欠いている）。このような糖修飾は、例えば、抗体配列内部の１個以上のグリコシル化部位を改変することによって達成できる。例えば、１個以上のアミノ酸置換を作製し、その結果、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させ、それによってその部位でのグリコシル化を消失させる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体のアフィニティーを高めることができる。このようなアプローチは、さらに詳細に、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号（Co et al.）に記載されている。
【００５８】
抗ＰＳＭＡ抗体上のフコシル残基の欠落の特徴
本発明の抗体は、例えば、Ｆｃ部分の糖鎖においてフコシル残基を欠いている。ＡＰＴＳレーザー誘導蛍光によるＡＰＴＳキャピラリー電気泳動法などの当該技術分野において公知の標準的な技法によって、抗体におけるフコシル残基の欠落を調べることができる。簡単に述べれば、精製された抗ＰＳＭＡ抗体のＮ−結合オリゴ糖は、ペプチドＮ−グリカナーゼ（Prozyme）を添加して、一晩インキュベートすることによって放出することができる。糖を再懸濁させ、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）を用いて、フコシル残基の脱アシル化および損失を最小限にする穏やかな還元性アミノ化の条件下で誘導体化する。反応付加物を、レーザー誘導蛍光検出装置（Beckman Coulter）を用いたキャピラリー電気泳動法により分析する。フコースの欠落は、同じ抗体でフコースを含有するものと比較した電気泳動におけるシフトによって観察することができる。抗ＰＳＭＡ抗体上のフコースの欠落を調べるための別の技法は、ＨＰＬＣを用いた単糖分析である。糖含有量および該抗体の構造を分析する別の技法は、発現した糖（グリコミックス（glycomics））のＭＳプロファイリング、放出されたインタクトなグリカンの直接的ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析（糖のクラスの質量を提供する）、低ＣＩＤ ＭＳＭＳスペクトル（グリカンの構造組成物を提供する）、高ＣＩＤ ＭＳＭＳスペクトルおよびＭＳｎスペクトル（グリカンの結合性に関する情報を提供する）、ならびに連続的なエキソグリコシダーゼ消化（グリカンの構造結合性に関する情報を提供する）がある。抗体の糖含有量を調べる方法については、実施例３に詳細する。  
【００５９】
ＰＳＭＡ＋細胞の抗体依存性細胞殺傷の特徴
脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を試験し、貪食作用およびＰＳＭＡを発現する細胞の殺傷を媒介する能力について試験することができる。ある態様において、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体は、フコースを含有する同じ抗体と同じ濃度で比較した場合、ＰＳＭＡを発現する細胞の殺傷性を増強させる。別の態様において、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体は、ＰＳＭＡを発現する細胞の殺傷を誘発し、フコースを含有する同じ抗体は、同じ濃度で殺傷を誘発しない。
【００６０】
モノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性は、確立されたin vitroアッセイによって試験することができる。例としては、クロム放出ＡＤＣＣアッセイを用いることができる。簡単に説明すると、健康なドナーから採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはその他のエフェクター細胞を、フィコールハイパックで密度遠心分離してから混入赤血球を細胞溶解して精製することができる。洗浄したＰＢＭＣを、１０％熱不活化ウシ胎仔血清を補足したＲＰＭＩ中に懸濁し、様々なエフェクター細胞対腫瘍細胞比（エフェクター細胞：腫瘍細胞）で５１Ｃｒ標識ＰＳＭＡ発現細胞と混合することができる。その後、各種濃度の抗ＰＳＭＡ抗体をを加えることができる。アイソタイプが一致する抗体を陰性対照として用いることができる。アッセイは、３７℃で４〜１８時間行うことができる。培養上清への５１Ｃｒ放出を測定することにより、サンプルの細胞溶解についてアッセイすることができる。抗ＰＳＭＡモノクローナルを互いに組み合わせて、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で促進されるかどうかを検査することもできる。
【００６１】
ＰＳＭＡ発現細胞の貪食作用および細胞殺傷の媒介能に関して、抗ＰＳＭＡ抗体を試験するのに使用することができる別の方法は、時間決定フルオロメトリーアッセイである。簡単に説明すると、ＰＳＭＡ発現細胞に、細胞膜を貫通する蛍光発光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルを付加する。細胞内では、エステル結合が加水分解され、該化合物は、もはや細胞膜を通過することができない。次に、抗ＰＳＭＡ抗体を種々の濃度で添加することができる。溶解に続いて、ユーロピウム溶液（Perkin Elmer）を添加する。あらゆるフリーのリガンドがユーロピウムを結合させ、高度に蛍光性の安定したキレート（EuTDA）を生成する。それをマクロプレートリーダー（Perkin Elmer）で読み取ることができる。測定されたシグナルは、溶解した細胞に相関している。 
【００６２】
本発明の抗ＰＳＭＡ抗体のＡＤＣＣ活性を調べるための好ましいＡＤＣＣアッセイについては、実施例４において詳細に説明する。
【００６３】
抗ＰＳＭＡ抗体をin vivoモデル（例えばマウス）において検査し、例えば、腫瘍細胞などのＰＳＭＡ発現細胞の貪食作用および細胞殺傷の媒介の有効性を調べることもできる。このような抗体は、例えば、以下の基準に基づいて選択されてよいが、それに限定されることを意図しない。
１）ＰＳＭＡ発現生細胞への結合；
２）ＰＳＭＡへの結合の高アフィニティー；
３）ＰＳＭＡ上の固有エピトープへの結合（相補的活性を有するモノクローナル抗体を組み合わせて使用した場合に同一のエピトープへの結合と競合する可能性を除くため）；
４）ＰＳＭＡを発現する細胞による内在化；
５）ヒトエフェクター細胞存在下における、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖阻害、貪食作用および／または細胞殺傷のin vitro媒介。
【００６４】
本発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、これらの基準の一つ以上に合致する。特定の態様では、モノクローナル抗体を組み合わせて、例えば、二種類以上の抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物として用いる。例えば、異なるが相補的な活性を有するヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を一種類の治療法に組み合わせて、望ましい治療または診断効果を達成することができる。この具体例は、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の高効率的な殺傷を媒介する抗ＰＳＭＡヒトモノクローナル抗体と、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する別の抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体とを組み合わせて有する組成物であってよいだろう。
【００６５】
ＰＳＭＡに対する結合の特徴
本発明の抗体は、ＰＳＭＡへの結合について、当該技術分野において公知の標準的なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析および／またはBiacore分析などによって試験することができる。典型的なＥＬＩＳＡにおいては、簡単に説明すると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍＬの精製ＰＳＭＡでコーティングし、次に、ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミンでブロックする。抗体希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次に、アルカリホスファターゼ結合第２試薬（例えば、ヒト抗体用には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間、インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍＬ）で発色させ、ＯＤ４０６−６５０で分析する。
【００６６】
モノクローナル抗体とＰＳＭＡを発現する生細胞の結合を確認するために、フローサイトメトリーを用いることができる。フローサイトメトリープロトコルの典型的な（但し、これに限定されない）例では、ＰＳＭＡを発現する細胞株（標準的な成長条件下で成長）を、０．１％ＢＳＡおよび２０％マウス血清を含有する各種濃度のモノクローナル抗体のＰＢＳ溶液と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、細胞を、蛍光標識二次抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体）と、一次抗体染色と同一の条件下で反応させる。サンプルを、光および側方散乱特性を用いて細胞一個ずつをゲート制御する機器ＦＡＣＳｃａｎで分析することができる。蛍光顕微鏡を用いた代替検定法をフローサイトメトリーアッセイに（追加してまたはその代わりに）用いてよい。細胞の染色は上述の通り正確に行い、蛍光顕微鏡で検査することができる。この方法により個々の細胞の可視化が可能になるが、抗原の濃度により感度が減少しているかもしれない。
【００６７】
抗ＰＳＭＡヒトＩｇＧは、さらに、ウェスタンブロッティングによりＰＳＭＡ抗原との反応性を試験できる。例えば、ＰＳＭＡ発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清でブロッキングし、検査対象のモノクローナル抗体でプローブする。抗体の結合は、アルカリホスファターゼに結合した抗種特異性二次抗体を用いて検出することができ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Sigma Chem. Co., St. Louis, MO）で展開することができる。ＰＳＭＡに対する抗体の結合能を評価するための、ＲＩＡやBiacore分析をはじめとした他の技法が当該技術分野において公知である。ＰＳＭＡ結合を測定するための好適なアッセイは、実施例４に詳細に説明する。
【００６８】
キメラまたはヒト化抗ＰＳＭＡ抗体
いくつかの態様において、本発明の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体は、キメラまたはヒト化抗体である。このような抗体は、マウス抗体をキメラ抗体またはヒト化抗体に変換するための、当該技術において利用可能な、確立された処置によってマウス抗ＰＳＭＡ抗体を用いて調製することができる。そのような抗ＰＳＭＡ抗体の例としては、限定されないが、３Ｆ５．４Ｇ６、３Ｄ７．１．１、４Ｅ１０−１．１４、３Ｅ１１、４Ｄ８、３Ｅ６、３Ｃ９、２Ｃ７、１Ｇ３、３Ｃ４、３Ｃ６、４Ｄ４、１Ｇ９、５Ｃ８Ｂ９、３Ｇ６、４Ｃ８Ｂ９、Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３およびＪ５９１モノクローナル抗体が含まれる。３Ｆ５．４Ｇ６、３Ｄ７．１．１、４Ｅ１０−１．１４、３Ｅ１１、４Ｄ８、３Ｅ６、３Ｃ９、２Ｃ７、１Ｇ３、３Ｃ４、３Ｃ６、４Ｄ４、１Ｇ９、５Ｃ８Ｂ９、３Ｇ６または４Ｃ８Ｂ９を分泌するハイブリドーマは、公的機関に寄託されており、米国特許第６，１５９，５０８号に記載がある。Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３またはＪ５９１を分泌するハイブリドーマは、公的機関に寄託されており、米国特許第６，１０７，０９０号に記載がある。さらに、Ｊ５９１のヒト化バージョンを含むヒト化抗ＰＳＭＡ抗体は、さらにＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／０９８８９７号に記載されている。さらに、他のマウス抗ヒトＰＳＭＡ抗体は、当該技術において記載がある、例えば、ｍＡｂ１０７−１Ａ４（Wang, S. et
al. （2001） Int. J. Cancer 92:871-876）やｍＡｂ２Ｃ９（Kato, K. et
al. （2003） Int. J. Urol. 10:439-444）など。
【００６９】
ヒトモノクローナル抗ＰＳＭＡ抗体
本発明の好ましい抗体は、ヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体である。ヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体の例としては、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０９１９２およびＷＯ０３／０６４６０６ならびに米国仮特許出願第６０／６５４，１２５号（発明の名称：「前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対するヒトモノクローナル抗体」、２００５年２月１８日出願）（それぞれの内容は、本明細書において引用によって援用する）にもともと記載されていたように、単離され、構造的に特徴付けられている４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３抗体が挙げられる。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＨアミノ酸配列を、配列番号：１〜９にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＬアミノ酸配列を配列番号：１０〜１８にそれぞれ示す。本発明において用いることができる他のヒト抗ＰＳＭＡ抗体としては、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０３４９０３号および米国特許出願第２００４／００３３２２９号に開示されている抗体が挙げられる。
【００７０】
これらの抗体のそれぞれがＰＳＭＡに結合することができれば、ＶＨおよびＶＬ配列を「混合して、一致させ」、本発明の他の抗ＰＳＭＡ結合分子を作製することができる。このような「混合して、一致させた」抗体のＰＳＭＡ結合は、上記の結合アッセイを用いて、実施例において試験することができる（例えば、ＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡ）。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖を混合して、一致させ、特定のＶＨ／ＶＬペアリングからのＶＨ配列を構造的に類似するＶＨ配列と置き換えることができる。同様に、特定のＶＨ／ＶＬペアリングからのＶＬ配列を構造的に類似するＶＬ配列と置き換えることができる。例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６および２Ｆ５のＶＨ配列は、混合して一致させるのに特に適している。なぜならこれらの抗体は、同じ生殖系列配列（ＶＨ５−５１）に由来するＶＨ配列を用いており、したがってそれらは構造的類似性を示すからである。同様に、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２および２Ｃ６のＶＬ配列は、混合して一致させるのに特に適している。なぜならこれらの抗体は、同じ生殖系列配列（ＶＬＬ６）に由来するＶＬ配列を用いており、したがってそれらは構造的類似性を示すからである。同様に、８Ａ１１および１６Ｆ９のＶＬ配列は、混合して一致させるのに特に適している。なぜならこれらの抗体は、同じ生殖系列配列（ＶＬ０４／０１４）に由来するＶＬ配列を用いており、したがってそれらは構造的類似性を示すからである。同様に、１Ｃ３、２Ａ１０および２Ｆ５のＶＬ配列は、混合して一致させるのに特に適している。なぜならこれらの抗体は、同じ生殖系列配列（ＶＬＬ１８）に由来するＶＬ配列を用いており、したがってそれらは構造的類似性を示すからである。
【００７１】
特定の態様において、本発明は、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。それは、以下を含む。
（ａ）配列番号：１〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および、
（ｂ）配列番号：１０〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。該抗体は、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する。
【００７２】
好ましくは、重鎖および軽鎖の組み合わせは、以下を含む。
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ａ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００７３】
別の局面において、本発明は、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはその組み合わせを含む脱フコシル化された抗体を提供する。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のアミノ酸配列を配列番号：１９〜２７にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号：２８〜３６にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のアミノ酸配列を配列番号：３７〜４５にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＫＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：４６〜５４にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＫＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号：５５〜６３にそれぞれ示す。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＫＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：６４〜７２にそれぞれ示す。ＣＤＲ領域を、Kabatシステム（Kabat, E. A., et al.
（1991） Sequences of Proteins
of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human
Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて表示する。
【００７４】
これらの抗体のそれぞれがＰＳＭＡに結合することができ、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域によって提供される場合、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列およびVkＣＤＲ１、２および３配列は、「混合して、一致させ」ることができる（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、２および３配列およびVkＣＤＲ１、２および３配列が、異なる抗体からのＣＤＲを混合して一致させることができる）、本発明の他の抗ＰＳＭＡ結合分子を作製することができる。そのような「混合して、一致させた」抗体のＰＳＭＡ結合は、上記の結合アッセイを用いて、当該技術分野において公知の、例えば、ＦＡＣＳ分析やＥＬＩＳＡアッセイによって試験することができる。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列を混合して、一致させ、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。同様に、ＶＫＣＤＲ配列を混合して、一致させ、特定のＶＫ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を構造的に類似するＣＤＲ配列と置き換える。１以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列を、本明細書に開示されているモノクローナル抗体４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＣＤＲ配列からの構造的に類似する配列と置き換えることによって、新規なＶＨおよびＶＬ配列を作製することができることが当業者にとっては、容易に明らかであろう。
【００７５】
したがって、別の局面において、本発明は、以下を含む、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む。
（ａ）配列番号：１９〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２８〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３７〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４６〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５５〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６４〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。
【００７６】
好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：１９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００７７】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：２９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３８を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６５を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００７８】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：３９を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６６を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００７９】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４０を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：４９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６７を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８０】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４１を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：５９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６８を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８１】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４２を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：６９を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８２】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４３を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７０を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８３】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４４を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７１を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８４】
別の好ましい態様において、該抗体は、
（ａ）配列番号：２７を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：３６を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：４５を含むヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：５４を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：６３を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：７２を含むヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含む。
【００８５】
特定の生殖系列配列を有する抗体
いくつかの態様において、本発明の脱フコシル化された抗体は、特定の生殖系列重鎖イムノグロブリン遺伝子からの重鎖可変領域、および／または、特定の生殖系列軽鎖イムノグロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
例えば、好ましい態様において、本発明は、ヒトＶＨ５−５１遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶＨ３−３０．３遺伝子の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含む脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶｋＬ６遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶｋ０４／０１４遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶｋＬ１８遺伝子の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。そこでは、該抗体は、ＰＳＭＡに特異的に結合する。  
【００８７】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。該抗体は、
（ａ）ヒトＶＨ５−５１または３−３０．３遺伝子（配列番号７３および７６にそれぞれ記載のアミノ酸配列をそれぞれコードする）の生成物である、またはそれに由来する重鎖可変領域を含み；
（ｂ）ヒトＶＫＬ６、０４／０１４、またはＬ１８遺伝子（配列番号７４、７５および７７にそれぞれ記載のアミノ酸配列をそれぞれコードする）の生成物である、またはそれに由来する軽鎖可変領域を含み；
（ｃ）ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する。
【００８８】
好ましいＶＨおよびＶｋ生殖系列の組み合わせは、ＶＨ５−５１とＶｋＬ６である。ＶＨおよびＶｋとしてＶＨ５−５１およびＶｋＬ６をそれぞれ有する抗体の例としては、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２および２Ｃ６抗体が挙げられる。他の好ましいＶＨおよびＶｋ生殖系列の組み合わせは、ＶＨ５−５１とＶｋ０４／０１４である。ＶＨおよびＶｋとしてＶＨ５−５１およびＶｋ０４／０１４をそれぞれ有する抗体の例としては、８Ａ１１および１６Ｆ９抗体が挙げられる。他の好ましいＶＨおよびＶｋ生殖系列の組み合わせは、ＶＨ５−５１とＶｋＬ１８である。ＶＨおよびＶｋとしてＶＨ５−５１およびＶｋＬ１８をそれぞれ有する抗体の例としては、２Ａ１０および２Ｆ５抗体が挙げられる。他の好ましいＶＨおよびＶｋ生殖系列の組み合わせは、ＶＨ３−３０．３とＶｋＬ１８である。ＶＨおよびＶｋとしてＶＨ３−３０．３およびＶｋＬ１８をそれぞれ有する抗体の例としては、１Ｃ３抗体が挙げられる。
【００８９】
本明細書で用いられるヒト抗体は、該抗体の可変領域がヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖系列配列の「生成物である」または「それに由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。そのような系は、対象の抗原を有するヒトイムノグロブリン遺伝子をもつトランスジェニックマウスを免疫すること、または、ファージ上に提示されたヒトイムノグロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列イムノグロブリン配列の「生成物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列イムノグロブリンのアミノ酸配列を比較し（例えば、Ｖ塩基データベースを用いる）、配列においてヒト抗体の配列に最も近いヒト生殖系列イムノグロブリン配列を選択することによって（すなわち、最大パーセント（％）同一性）、同定することができる。特定のヒト生殖系列イムノグロブリン配列の「生成物である」または「それに由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞性突然変異によって、または部位指向性突然変異の意図的な導入によって、生殖配列と比較してアミノ酸の相違を含有するかもしれない。しかしながら、選択されたヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子がコードするアミノ酸配列の配列に対してアミノ酸配列において、一般的に９０％以上の同一性を有し、他の種の生殖系列（例えば、ネズミ生殖系列配列）イムノグロブリンアミノ酸配列と比較した場合、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。いくつかの場合には、ヒト抗体は、生殖系列イムノグロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列において、９５％以上、さらに９６％、９７％、９８％、または９９％以上の同一性を有することがある。典型的に、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の相違をもつ。ある場合には、ヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と５以下、またさらに、４、３、２または１以下のアミノ酸の相違をもつ。
【００９０】
相同抗体
さらに別の態様において、本発明の脱フコシル化された抗体は、本明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。該抗体は、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体の望ましい機能的特性を維持している。  
【００９１】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号：１〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列に８０％以上相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号：１０〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列に８０％以上相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体は、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する。
【００９２】
別の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上記の配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であればよい。上記の配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち、８０％以上）の相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号：１〜１８をコードする核酸分子の１以上の突然変異生成（例えば、部位指向性またはＰＣＲ媒介性突然変異生成）によって取得し、その後、本明細書に記載の結合アッセイを用いてコードされた改変抗体を、維持されている機能（すなわち、ヒトＰＳＭＡへの結合）について試験することができる。配列番号６〜９および１５〜１８をコードする核酸分子は、配列番号７８〜８５に見出すことができる。配列番号１〜５および１０〜１４をコードする核酸分子は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０６４６０６号、図１７Ａおよび１７Ｂに見出すことができる。
【００９３】
本明細書において用いられているように、アミノ酸配列間のパーセントホモロジーは、２つの配列間のパーセント同一性と等しい。２つの配列間のパーセント同一性は、当該配列が共有する同一の位置数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置数＃／位置数の合計＃×１００）、ギャップの数、各ギャップの長さを考慮する。このことは、２つの配列の任意の配列比較のために導入される必要がある。配列同士の比較および２つの配列間のパーセント同一性は、数学的アルゴリズムを用いて測定することができる。それには、限定されないが下記のものを含む。
【００９４】
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、NWSgapdna.を用いたＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから利用可能）のＧＡＰプログラムを用いて測定することができる。ＣＭＰマトリックスおよびギャップ重量は、４０、５０、６０、７０または８０であり、長さ重量（length weight）は１、２、３、４、５または６である。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、E. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズムを用いて測定することもできる（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 （1988））、それは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、NeedlemanとWunsch （J. Mol. Biol. 48:444-453 （1970）） のアルゴリズムを用いて行うことができる。それは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから利用可能）に組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いる。ギャップ重量は１６、１４、１２、１０、８、６または４であり、長さ重量（length weight）は１、２、３、４、５または６である。
【００９５】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、E. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズムを用いて測定することができる（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 （1988））、それは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、NeedlemanとWunsch （J. Mol. Biol. 48:444-453 （1970））のアルゴリズムを用いて行うことができる。それは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから利用可能）に組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用いる。ギャップ重量は１６、１４、１２、１０、８、６または４であり、長さ重量（length weight）は１、２、３、４、５または６である。
【００９６】
さらにまたは別法として、本発明のタンパク質配列は、さらに「クエリー配列」として用いて、例えば、関連する配列を同定するために、公的なデータベースを検索することができる。そのような検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Altschul, et al. （1990） J.
Mol. Biol. 215:403-10）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行い、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較の目的で、ギャップのある配列比較をするために、Altschul et al., （1997） Nucleic
Acids Res. 25（17）:3389-3402に記載されているようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。 
【００９７】
保存的改変をもつ抗体
いくつかの態様において、本発明の脱フコシル化された抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む。これらのＣＤＲ配列の１以上は、本明細書に記載の好ましい抗体（例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３抗体）またはそれらの保存的改変体に基づいて、特定のアミノ酸配列を含み、該抗体は、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体の望ましい機能的特性を維持している。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を含む、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。尚、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：３７〜４５のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列およびその保存的改変を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：６４〜７２のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列およびその保存的改変を含み；
（ｃ）抗体は、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する。
【００９８】
好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：２８〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびそれらの保存的改変を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号：５５〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびそれらの保存的改変を含む。別の好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号：１９〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号：４６〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列およびそれらの保存的改変を含む。
【００９９】
本明細書において用いられる用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意な影響および変更をきたさないアミノ酸の改変を意味することが意図される。そのような保存的改変は、アミノ酸の置換、追加、および欠失を含む。改変は、当該技術において公知の標準的な技法（例えば、部位指向性の突然変異生成およびPCR媒介性の突然変異生成）によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖をもつアミノ酸残基と置換するものである。類似の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーは、当該技術において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）をもつアミノ酸、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）をもつアミノ酸、非電化極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）をもつアミノ酸、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）をもつアミノ酸、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）をもつアミノ酸、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）をもつアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基と置換し、その変更された抗体を、維持された機能（すなわち、上記（ｉ）乃至（ｉｖ）に記載の機能）について、本明細書に記載の機能性アッセイを用いて調べることができる。  
【０１００】
別法として、別の態様において、突然変異を、抗ＰＳＭＡ抗体がコードする配列の全部もしくは一部に沿ってランダムに、例えば、飽和突然変異誘発によって、導入することができる。そして得られた保存された抗ＰＳＭＡ抗体をスクリーニングして、結合活性を調べることができる。
【０１０１】
本発明の抗ＰＳＭＡ抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３抗体と同じエピトープに結合する他のヒト抗体など、ここに提供する本発明の種々の抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体に結合するのと同じエピトープに結合する脱フコシル化された抗体を提供する。そのような更なる抗体は、本発明の他の抗体、例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３に交差競合する（例えば、統計学的に有意なやり方で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて、標準的なＰＳＭＡ結合アッセイにおいて、同定することができる。試験抗体が、例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３のヒトＰＳＭＡへの結合を阻害する能力は、試験抗体が、ヒトＰＳＭＡに結合する抗体と競合することができること、例えば、非限定的な理論によれば、そのような抗体が同じ、もしくは関連する（例えば、構造的に類似し、空間的に近い）、競合する抗体であるヒトＰＳＭＡのエピトープと結合すること、を示すものである。好ましい態様において、ヒトＰＳＭＡ上のエピトープと同じ抗体に結合する脱フコシル化された抗体、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３などは、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、ＰＣＴ国際公開０１／０９１９２号およびWO０３／０６４６０６号に記載のようにして調製および単離することができる。
【０１０２】
工学処理された、改変された抗体
本発明の脱フコシル化された抗体は、さらに、本明細書に開示されている１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を開始物質として用いて、改変された抗体を工学的処理することによって調製することができる。その改変された抗体は、開始抗体から特性を改変しておいてもよい。抗体は、１つまたは双方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基を改変することによって、工学的処理することができる。さらにまたは別法として、抗体は、定常領域内で残基を改変することによって、工学的に処理して、例えば、抗体のエフェクター機能を変更することができる。
【０１０３】
行うことが可能な可変領域工学的処理の１つのタイプは、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、標的抗原と、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）中に位置づけられたアミノ酸残基を介して相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間で、ＣＤＲの外部よりも多様性を持つ。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原相互作用を担うので、特定の天然に存在する抗体の特性に類似した組換え抗体を、異なる特性をもつ他の抗体からフレームワーク配列上に移植された特定の天然に存在する抗体からＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって発現させることができる（例えば、Riechmann, L. et al. （1998） Nature 332:323-327; Jones, P. et al.
（1986） Nature 321:522-525;
Queen, C. et al. （1989） Proc. Natl. Acad.
See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第５，２２５，５３９号（Winter）および米国特許第5,530,101号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０（Queen et al.）参照）。
【０１０４】
したがって、本発明の別の態様は、脱フコシル化されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。それは、それぞれ配列番号：１９〜２７、配列番号：２８〜３６、配列番号：３７〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号：４６〜５４、配列番号：５５〜６３、配列番号：６４〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。したがって、モノクローナル抗体４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を含有するそのような抗体は、これらの抗体のフレームワーク配列とは異なるものを含有してもよい。
【０１０５】
そのようなフレームワーク配列は、公的なＤＮＡデータベース、または公開された生殖系列抗体遺伝子配列を含む参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡは、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅからインターネットで利用可能）、ならびにKabat, E. A., et al. （1991） Sequences of
Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health
and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al.
（1992） "The Repertoire of Human Germline VH
Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different
Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; and Cox, J.
P. L. et al. （1994） "A Directory of Human Germ-line VH
Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836を参照。それぞれの内容は、本明細書において明確に援用により引用する。
【０１０６】
本発明の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列としては、本発明の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似するもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体によって使用されるＶＨ５−５１または３−３０．３フレームワーク配列（それぞれ配列番号：７３および７６）、および／またはＶｋＬ６、０４／０１４またはＬ１８フレームワーク配列（それぞれ配列番号：７４、７５および７７）に類似するものがある。ＶＨＣＤＲ１、２および３配列、およびＶＫＣＤＲ１、２および３配列を、フレームワーク配列が由来している生殖系列イムノグロブリン遺伝子に認められる配列と同一のフレームワーク領域に移植することができる。またはＣＤＲ配列を、生殖系列配列と比較して１以上の突然変異を含有するフレームワーク領域に移植することができる。例えば、いくつかの例においては、抗体の抗原結合能力を維持する、もしくは高めるために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有効であることがわかっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０（Queen et al））。
【０１０７】
別のタイプの可変領域改変は、ＶＨおよび／またはＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を改変して、当該抗体の１以上の結合特性（例えば、アフィニティー）を高めることができる。部位指向性の突然変異生成またはＰＣＲ媒介性の突然変異生成を行って、突然変異および作用を抗体結合に及ぼすことができる。または対象となる他の機能的特性を、本明細書に記載のin vitro もしくはin vivo アッセイで評価することができる。それを実施例において記載する。（上記のような）保存的改変を導入することが好ましい。突然変異は、アミノ酸の置換、追加、および欠失とすることができるが、置換が好ましい。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の改変は、１、２、３、４、または５残基以下とする。  
【０１０８】
したがって、別の態様において、本発明は、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。それは、（ａ）配列番号：１９〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１９〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸に対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号：２８〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：２８〜３６からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸に対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号：３７〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：３７〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸にに対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域と；（ｄ）配列番号：４６〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：４６〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸に対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号：５５〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：５５〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸に対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号：６４〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：６４〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４もしくは５のアミノ酸に対して置換、欠失、もしくは追加がなされているアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む。
【０１０９】
本発明の工学的に処理された抗体としては、例えば、抗体の特性を向上させるためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に改変が施されたものが挙げられる。典型的には、そのようなフレームワーク改変を行って、抗体の免疫原性を減少させる。１つのアプローチは、例えば、１以上のフレームワーク残基を「逆突然変異」して、対応する生殖系列配列にすることである。さらに具体的には、体細胞性の突然変異を行った抗体は、抗体が由来する生殖系列とは異なるフレームワーク残基を含有している。そのような残基は、抗体フレームワーク配列と、それが由来する生殖系列配列とを比較することによって同定することができる。例えば、８Ｃ１２および８Ａ１１に関しては、ＶＨのアミノ酸残基＃１３（ＦＲ１内）は、トレオニンであるが、一方、対応するＶＨ５−５１生殖系列配列内のこの残基は、リジンである。フレームワーク領域配列を、それらの生殖系列構成に戻すために、体細胞性の突然変異を、例えば、部位指向性の突然変異生成およびＰＣＲ媒介性の突然変異生成によって、「逆突然変異して」生殖系列配列にすることができる（例えば、８Ｃ１２または８Ａ１１のＶＨのＦＲ１の残基１３をトレオニンからリジンに「逆突然変異」することができる）。そのような「逆突然変異した」抗体も本発明の包含されることが意図される。
【０１１０】
別のタイプのフレームワーク改変では、フレームワーク領域内、さらには１以上のＣＤＲ領域内の１以上の残基を変異して、Ｔ細胞エピトープを除去して、それによって抗体の潜在的免疫原性を減少させる。このアプローチは、「脱免疫化（deimmunization）」と呼ばれる。それについては、米国特許公報第２００３０１５３０４３号（Carr et al.）に詳細に記載されている。
【０１１１】
フレームワーク内もしくはＣＤＲ領域内に成される改変に加えて、または、替えて、本発明の抗体を工学的に処理して、Ｆｃ領域内に改変が含まれるように、典型的には、抗体の１以上の機能的特性、例えば、血清半減期、補足的固定、Ｆｃレセプター結合、および／または抗原依存性細胞傷害性を変えてもよい。さらに本発明の抗体を化学的に改変してもよい（例えば、１以上の化学的部分を抗体に付着させることができる）、または改変してそのグリコシル化を変更してもよい、再び、抗体の１以上の機能的特性を変更してもよい。これらの態様のそれぞれについては、以下において詳細に説明する。Ｆｃ領域の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１１２】
ある態様において、ＣＨ１のヒンジ領域を改変して、ヒンジ領域中のシステイン残基を改変、例えば、増加または減少させる。このアプローチは、米国特許第５，６７７，４２５号（Bodmer et al.）にさらに詳細に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を改変して、例えば、軽鎖および重鎖の結合を容易にする。または抗体の安定性を増加もしくは減少させる。  
【０１１３】
別の態様において、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１以上のアミノ酸突然変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に導入して、抗体がブドウ状球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）の固有のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合に対する結合を損傷させるようにする。このアプローチは、米国特許第６，１６５，７４５号（Ward et al.）にさらに詳細に記載されている。
【０１１４】
別の態様において、抗体を改変して、その生物学的半減期を増加させる。種々のアプローチが可能である。例えば、米国特許第６，２７７，３７５号（Ward）に記載されているように、以下の突然変異の１以上を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。別法として、生物学的半減期を増加させるため、、米国特許第５，８６９，０４６号および第６，１２１，０２２号（Presta et al.）に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取り出されたサルベージレセプター結合エピトープを含有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で抗体を改変させることができる。  
【０１１５】
さらに別の態様において、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換して、Ｆｃ領域を改変して、抗体のエフェクター機能を変える。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えて、該抗体がエフェクターリガンドのための改変されたアフィニティーを持つようにするが、親抗体の抗原結合可能性を維持するようにする。アフィニティーが改変されたエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃレセプターまたは補体のＣ１成分とする。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号（ともにWinter et al.）にさらに詳細に記載されている。
【０１１６】
別の例において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えて、該抗体がＣ１ｑ結合を改変し、および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を減少もしくはなくすように改変した。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号（Idusogie et al.）にさらに詳細に記載されている。
【０１１７】
別の例において、アミノ酸位置２３１および２３９内の１以上のアミノ酸残基を改変して、それによって抗体が補体を固定する能力を改変する。このアプローチは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／２９３５１号（Bodmer et al）にさらに詳細に記載されている。
【０１１８】
さらに別の例において、位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の１以上のアミノ酸を改変することによって、Ｆｃ領域を改変して、抗体が抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増加させ、および／または、Ｆｃγレセプターに対するアフィニティーを増加させる。このアプローチは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ００／４２０７２号（Presta）にさらに詳細に記載されている。さらに、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎのヒトＩｇＧ１上の結合位置をマッピングし、結合が改善された変異体について記載されている（Shields, R.L. et al. （2001） J.
Biol. Chem. 276:6591-6604参照）。ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を高めるために位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９の特定の突然変異を示す。ＦｃγＲＩＩＩ結合を高めるためにさらに以下の組み合わせの変異体を示す。Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、およびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ。
【０１１９】
本発明によって考えられる抗体の別の改変は、ペグ化（pegylation）である。抗体は、ペグ化して、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、抗体、またはそのフラグメントを、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体といったＰＥＧと、１以上のＰＥＧ基が抗体もしくは抗体フラグメントに付着した条件で反応させる。好ましくは、ペグ化（pegylation）は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いたアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。本明細書で用いられている用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するあらゆる形態のＰＥＧ、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール−マレイミドなどを包含することが意図される。いくつかの態様において、ペグ化される抗体は、無グリコシル化抗体（aglycosylated antibody）である。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用される。例えば、欧州特許第０１５４３１６号（Nishimura et al.） および欧州特許第０４０１３８４（Ishikawa
et al.）に記載されている。
【０１２０】
抗体を工学的に処理する方法
上記のように、本明細書に開示されているＶＨおよびＶＫ配列をもつ、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を用いて、ＶＨおよび／またはＶＫ配列、またはそこに付着された定常領域を改変することによって新たな抗ＰＳＭＡ抗体を作出することができる。このように、本発明のさらに別の局面において、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体、例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３の構造的特徴を用いて、構造的に関連し、本発明の抗体の、例えば、ヒトＰＳＭＡへの結合といった、少なくとも１つの機能的特性を維持している、脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を作製することができる。例えば、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５または１Ｃ３の１以上のＣＤＲ領域、またはその突然変異と、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲとを組換え技術により組み合わせて、上で述べたように本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を作出することができる。他のタイプの改変としては、前のセクションで述べたものが挙げられる。工学的処理のための開始物質は、本明細書に記載のＶＨおよび／またはＶＫ配列の１以上、そのＣＤＲ領域の１以上である。工学的処理された抗体を作出するために、実際に本明細書に記載のＶＨおよび／またはＶＫ配列の１以上またはそのＣＤＲ領域をもつ抗体を調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、その配列に含まれる情報を開始材料として用いて、オリジナルの配列に由来する「第２の世代」の配列を作出し、次いで、「第２の世代」の配列を調製してタンパク質として発現させる。
【０１２１】
したがって、別の態様において、本発明は、抗ＰＳＭＡ抗体を調製する方法を提供する。それは、
（ａ）（ｉ）配列番号：１９〜２７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：２８〜３６からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および/もしくは配列番号：３７〜４５からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域の抗体配列、ならびに/または（ｉｉ）配列番号：４６〜５４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：５５〜６３からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：６４〜７２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の抗体配列を提供すること；
（ｂ）重鎖可変領域の抗体配列、および／または、軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも１つの変更された抗体配列を生成すること、ならびに、
（ｃ）前記変更された配列をタンパク質として発現させることを含む。
【０１２２】
標準的な分子生物学の技法を用いて、変更した抗体配列を調製し、発現させることができる。そのように調製されるように改変された抗体配列をその後、本明細書に記載の方法を用いて脱フコシル化された形態に作製し、脱フコシル化された改変抗ＰＳＭＡ抗体を得ることができる。
【０１２３】
変更された抗体の機能的特性は、当該技術分野において利用可能な、および／または本明細書に記載されている、例えば、実施例に記載のもの（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ）などの標準的なアッセイを用いて評価することができる。
【０１２４】
本発明の抗体を工学的に処理する方法のいくつかの態様において、突然変異をランダムにまたは選択的に、配列をコードする抗ＰＳＭＡ抗体の全ての部分もしくは一部に沿って導入し、得られた改変抗ＰＳＭＡ抗体をスクリーニングして、本明細書に記載のように結合アッセイおよび／または他の機能的特性を調べることができる。突然変異の方法は、当該技術分野において記載がある。例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０２／０９２７８０（Short）は、飽和突然変異生成、合成ライゲーションアッセンブリー、またはその組み合わせを用いて、抗体の突然変異を作製およびスクリーニングする方法を記載している。また、ＰＣＴ公開公報ＷＯ０３／０７４６７９（Lazar et al. ）は、計算的なスクリーニング方法を用いて、抗体の生理化学的特性を最適化する方法を記載している。 
【０１２５】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。本明細書において用いられる「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、細胞全体に存在していてもよいし、細胞ライセート中に存在してもよい。または、特定の、精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、他の細胞成分もしくは他の混入物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー, アガロースゲル電気泳動、および当該技術分野において公知の他の方法をはじめとした標準的な技法によって精製された状態のとき、「単離されている」または「実質的に純粋である」という（F. Ausubel, et al.,
ed. （1987） Current Protocols
in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York）。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、イントロンの配列を含有していてもしていなくてもよい。好ましい態様において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０１２６】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（以下においてさらに説明するように、例えば、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから分離したハイブリドーマ）によって発現される抗体としては、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。イムノグロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ法）から得られた抗体としては、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収することができる。
【０１２７】
本発明の核酸分子としては、モノクローナル抗体４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９、２Ａ１０、２Ｃ６、２Ｆ５および１Ｃ３のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものが好ましい。４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１、１６Ｆ９のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０６４６０６（図１７Ａおよび１７Ｂ参照）に公開されている。その内容を明確に引用によって援用する。１Ｃ３のＶＨ配列をコードするＤＮＡを配列番号：７８に示す。１Ｃ３のＶＬ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８２に示す。２Ａ１０のＶＨ配列をコードするＤＮＡを配列番号：７９に示す。２Ａ１０のＶＬ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８３に示す。２Ｃ６のＶＨ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８０に示す。２Ｃ６のＶＬ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８４に示す。２Ｆ５のＶＨ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８１に示す。２Ｆ５のＶＬ配列をコードするＤＮＡを配列番号：８５に示す。
【０１２８】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントを得たら、これらのＤＮＡフラグメントを標準的な組換えＤＮＡ技法によって、さらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子へと変換することができる。これらの操作において、ＶＬもしくはＶＨコードＤＮＡフラグメントを、抗体定常領域または柔軟なリンカーなど別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作用可能に連結することができる。この文脈で用いられている用語「作用可能に連結する」は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に維持されるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを言う。  
【０１２９】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である（例えば、Kabat, E. A., el al. （1991） Sequences
of Proteins of Immunological Interest, Fifth
Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242）。これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはＩｇＤ定常領域とすることができるが、最も好ましくはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子としては、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結される。  
【０１３０】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作用可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である（例えば、Kabat, E. A., et al. （1991） Sequences
of Proteins of Immunological Interest, Fifth
Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242）。これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域とすることができるが、最も好ましくはカッパ定常領域である。
【０１３１】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡフラグメントを、柔軟性のあるリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３（配列番号：８９）をコードする別のフラグメントに作用可能に連結して、ＶＨおよびＶＬ配列を、柔軟性のあるリンカーによって接続されたＶＬおよびＶＨ領域と隣接する一本鎖タンパク質として発現することができるようにする（例えば、Bird et al. （1988） Science 242:423-426; Huston et al.
（1988） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., （1990） Nature 348:552-554）。
【０１３２】
本発明の核酸組成物は、ｃＤＮＡ、ゲノムまたは混合物からの未変性の配列（改変された制限部位などを除く）にしばしば認められるが、標準的な技法にしたがって、突然変異して遺伝子配列を作製してもよい。コードする配列にとって、これらの突然変異は、上記アミノ酸配列に影響を及ぼすかもしれない。特に、未変性のＶ、Ｄ、Ｊ定常領域、スイッチおよび本明細書に記載の他のそのような配列に、実質的に相同もしくはそれに由来するＤＮＡ配列が考慮される（「由来する」は、配列が、他の配列から独立している、または改変されていることを示す）。
【０１３３】
本発明のモノクローナル抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、標準的な体細胞性の細胞ハイブリダイゼーション技法（Kohler and Milstein （1975） Nature 256: 495）を含む、種々の技法によって作製することができる。体細胞性の細胞ハイブリダイゼーション技法が好ましいが、原則的に、他のモノクローナル抗体作製法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または腫瘍形成性の形質転換などを採用することができる。
【０１３４】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、ネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は非常によく確立した処置である。免疫プロトコルおよび融合するための免疫化された脾細胞を単離する技術は当該技術において公知である。融合パートナー（例えば、ネズミミエローマ細胞）および融合処置も公知である。
【０１３５】
種々の態様において、該抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
【０１３６】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のようにして調製されたネズミモノクローナル抗体に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖イムノグロブリンをコードするＤＮＡは、対象となるネズミハイブリドーマから取得することができ、また、標準的な生物学的技法を用いて、非ネズミ（例えば、ヒト）イムノグロブリン配列を含有するように工学的に処理することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当該技術分野において公知の方法を用いて、ネズミ可変領域をヒト定常領域に連結することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.））。ヒト化抗体を作製するために、当該技術分野において公知の方法を用いて、ネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号（Winter）、および米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０（Queen et al.））。種々のマウス抗ＰＳＭＡ抗体が、キメラまたはヒト化抗ＰＳＭＡ抗体、例えば、３Ｆ５．４Ｇ６、３Ｄ７．１．１、４Ｅ１０−１．１４、３Ｅ１１、４Ｄ８、３Ｅ６、３Ｃ９、２Ｃ７、１Ｇ３、３Ｃ４、３Ｃ６、４Ｄ４、１Ｇ９、５Ｃ８Ｂ９、３Ｇ６、４Ｃ８Ｂ９、Ｅ９９、Ｊ４１５、Ｊ５３３およびＪ５９１を作出するために使用される技術分野において公知である。好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなＰＳＭＡに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソーム性マウスを用いて生成される。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソーム性マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスやＫＭマウスとよばれるマウスを含み、それらを本明細書において「ヒトＩｇマウス」と一括して呼ぶ。
【０１３７】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex,
Inc.）は、転位されていないヒト重鎖（μおよびγ）ならびに軽鎖イムノグロブリン配列をコードするヒトイムノグロブリン遺伝子の小さな座を、内因性μおよびκ鎖座に不活性な標的化された突然変異とともに含有している（例えば、Lonberg, et
al. （1994） Nature 368（6474）: 856-859）。したがって、マウスにおいては、マウスＩｇＭまたはκの発現が減少し、免疫化に反応して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランスジーンは、クラススイッチングおよび体細胞性の突然変異を行い、高アフィニティーヒトＩｇＧκモノクローナルを産生させる（Lonberg, N. et al. （1994）、上掲； Lonberg, N. （1994） Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. （1995） Intern.
Rev. Immunol. 13: 65-93, and Harding, F. and
Lonberg, N. （1995） Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546で検討されている）。HuMabマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスが持つゲノム改変は、Taylor, L. et al. （1992）Nucleic acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. （1993） International
Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al.
（1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al.
（1993） Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. （1993） EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al.
（1994） J. Immunol. 152:2912-2920;
Taylor, L. et al. （1994） International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. （1996） Nature
Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されている。その内容の全体を引用によってここに援用する。例えば、さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；および第５，７７０，４２９号（すべてLonbergとKay）；米国特許第５，５４５，８０７号（Surani et al.）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０３９１８号；ＷＯ９３／１２２２７号；ＷＯ９４／２５５８５号；ＷＯ９７／１３８５２号；ＷＯ９８／２４８８４号；およびＷＯ９９／４５９６２号（全てLonbergとKay）；ならびにＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／１４４２４号（Korman et al）。
【０１３８】
別の態様において、本発明のヒト抗体は、トランスジーンおよびトランスクロモソーム上にヒトイムノグロブリン配列を保有するマウス、例えば、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスを用いて産生させることができる。本明細書において「ＫＭマウス」と称される、このようなマウスについては、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／４３４７８（Ishida et al.）に詳細な記載がある。
【０１３９】
ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現するさらに別のトランスジェニック動物系が当該技術において入手可能であり、それらを利用して本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を産生させることができる。例えば、キセノマウス（Xenomouse）（Abgenix, Inc.）と呼ばれる別のトランスジェニック系を用いることができる。このようなマウスについては、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号；および第６，１６２，９６３号（Kucherlapati et al.）に記載がある。
【０１４０】
さらに、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモソーム性動物系が当該技術において入手可能であり、それらを利用して本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を産生させることができる。例えば、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの双方を保有するマウス、「ＴＣマウス」と称されるマウスを用いることができる。このようなマウスについては、Tomizuka et al. （2000） Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載がある。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有するウシについて、当該技術において記載があり（Kuroiwa et al. （2002） Nature
Biotechnology 20:889-894）、本発明の抗ＰＳＭＡ抗体を産生させるために用いることができる。
【０１４１】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒトイムノグロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立している。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；および第５，５７１，６９８号（Ladner et al.）；米国特許第５，４２７，９０８号および第５，５８０，７１７号（Dower et al.）、米国特許第５，９６９，１０８号；および第６，１７２，１９７号（McCafferty et al.）；ならびに米国特許第５，８８５，７９３号；第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号；および第６，５９３，０８１号（Griffiths et al.）を参照されたい。
【０１４２】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫細胞が再構成されて免疫化に応じてヒト抗体反応が生じるようにしたＳＣＩＤマウスを用いて作製することもできる。そのようなマウスについては、例えば、米国特許第５，４７６，９９６号および第５，６９８，７６７号（Wilson et al.）に記載がある。
【０１４３】
ヒトＩｇマウスの免疫
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を産生させる場合、通常、Lonberg, N. et al. （1994） Nature 368（6474）: 856-859;
Fishwild, D. et al. （1996） Nature Biotechnology 14: 845-851およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９８／２４８８４号およびＷＯ０１／１４４２４号に記載されているようにして、ＰＳＭＡ（ＬｎＣａＰ細胞膜など、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）を発現する細胞株、精製もしくは濃縮されたＰＳＭＡ抗原（ＬｎＣａＰ細胞膜など）、および／または、組み換えＰＳＭＡもしくはＰＳＭＡ融合タンパク質により、このようなマウスを免疫できる。好適には、６〜１６週齢の当該マウスに対して最初の注入を行う。例えば、ＬｎＣａＰ細胞の膜調製を用いて、腹腔中でヒトＩｇマウスに免疫できる。
【０１４４】
ＰＳＭＡに対する全長ヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な操作については、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／０９１９２およびＷＯ０３／０６４６０６に記載されている。様々な抗原による累積的な経験により、完全フロイントアジュバントの抗原で最初に腹腔内（ＩＰ）免疫し、次に隔週で不完全フロイントアジュバントの抗原でＩＰ免疫（最大６まで）した時、形質転換マウスが応答することが明らかにされている。しかしながら、フロイント以外のアジュバントも有効であることがわかる。さらに、アジュバントの非存在下において全細胞が極めて免疫原性が高いことがわかっている。この免疫応答を、眼窩後方出血により得られた血漿サンプルによる免疫プロトコル過程でモニターできる。血漿は、ＥＬＩＳＡ（下記で述べたように）によりスクリーニングでき、十分な抗ＰＳＭＡヒトイムノグロブリン力価を有するマウスを融合に使用できる。マウスを、屠殺３日前に抗原を静注することでブーストし、脾臓を取り出した。各免疫化について２〜３回融合を実施する必要がある。通常、６〜２４匹のマウスを各抗原について免疫する。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の両者を使用する。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジーンの両者を、２つの異なるヒト重鎖トランスジーン（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する１匹のマウスで作製できる。
【０１４５】
本発明のヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製のため、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保有する免疫したトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞株のような適切な不死化細胞株に融合できる。得られたハイブリドーマについて、抗原特異的抗体の産生をスクリーニングできる。例えば、免疫したマウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧにより、６分の１の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）に融合できる。細胞は、約２×１０５で平底マイクロタイタープレートに播種し、２０％胎児クローン血清、１８％“６５３”調整培地、５％オリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトメタノール、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１ｘＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴを、注入２４時間後に添加する）を含む選択培地中で２週間インキュベートする。約２週後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で培養する。次に、それぞれのウェルをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体をスクリーニングする。いったん広範なハイブリドーマ増殖が起こると、培地は、通常、１０〜１４日後に観察できる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングし、もしヒトＩｇＧがまだ陽性であるならば、モノクローナル抗体を少なくとも２回、限定希釈によってサブクローニングする。次に、安定なサブクローンをin vitroで培養し、少量の抗体を組織培地に産生させ、特性解析する。
【０１４６】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択したハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させ、モノクローナル抗体を精製できる。上清をろ過し、濃縮した後、プロテインＡ−セファロース（Pharmacia,Piscataway、N.J.）によるアフィニティークロマトグラフィーを行う。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動と高速液体クロマトグラフィーでチェックし、純度を確認できる。緩衝液はＰＢＳに交換し、濃度は、１．４３吸光係数を用いてＯＤ２８０で決定できる。モノクローナル抗体を等量にアリコートし、−８０℃で保存できる。
【０１４７】
本発明のモノクローナル抗体産生トランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体は、例えば、当該技術において公知の組み換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション技術を組み合わせて用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生させることができる（例えば、Morrison,S.（1985）Science 229:1202）。
【０１４８】
例えば、抗体またはその抗体フラグメント発現のため、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または問題の抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）により得られ、このＤＮＡを、遺伝子が適切に作用するように転写および翻訳調節配列に連結されるように、発現ベクター中に挿入できる。この文脈において、用語「適切に作用するように連結する」とは、ベクター内部の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写と翻訳を制御するというそれらの目的機能を果たすようにベクターに連結されることを意味することを意図している。発現ベクターと発現調節配列は、使用した発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入できるが、さらに典型的には、両者の遺伝子ともに同一発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補性制限部位とベクターとのライゲーション、または制限部位が全く存在しないならば、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター中に挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、ＶＨセグメントがベクター内部のＣＨセグメントに作用可能なように連結され、ＶＫセグメントはベクター内部のＣＬセグメントに作用可能なように連結されるよう、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター中に挿入することによって、いかなる抗体のアイソタイプの全長抗体遺伝子をも創製できる。さらにまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。当該抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるようにベクター中にクローニングできる。当該シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドまたは非相同シグナルペプチド（すなわち、非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【０１４９】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中において抗体鎖遺伝子の発現を調節できる制御配列を有している。用語「制御配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような制御配列は、例えば、Goeddel（Gene Expression Technology. Methods in
Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA（1990））に記載されている。当業者は、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような因子に依存することを理解できる。哺乳類宿主細胞発現のための好適な制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳類細胞におけるタンパク質高発現を指示するウイルスエレメントを含む。これとは別に、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列も使用できる。さらに、制御エレメントは、ＳＲαプロモーターシステムのような異なる起源由来の配列で構成され、それらはＳＶ４０アーリープロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端繰り返し由来の配列を含む（Takebe,Y.ら（1988）Mol.Cell.Biol. 8:466-472）。
【０１５０】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子のような付加的配列も有することができる。当該選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号（全てAxel et al）を参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞上でＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する。好適な選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。
【０１５１】
軽鎖および重鎖発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術により宿主細胞に導入できる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に用いた広範囲の技術を包含することを意図しており、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−ホスフェート沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等である。本発明の抗体を原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれにも発現させることは理論的には可能であるが、そのような真核細胞、特に、哺乳類細胞が原核生物に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性のある抗体を集合させ分泌させやすいため、真核細胞での抗体の発現、さらにもっとも好適には哺乳類宿主細胞での抗体の発現が最も好適である。抗体遺伝子の原核生物における発現は高収率の活性抗体産生には無効であると報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. （1985） Immunology
Today 6:12-13）。
【０１５２】
本発明の組み換え抗体発現のために好適な宿主細胞には、発現された抗体のフコシル化を改変する細胞が挙げられる。例えば、該宿主細胞は、フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠き、その結果、宿主細胞がその糖中にフコースを欠くタンパク質を生成する細胞であってもよい。または、グリコプロテイン改変グリコシルトランスフェラーゼを発現し、その結果、宿主細胞中で発現された抗体が、フコシル化を阻止するＧｌｃＮａｃ構造を二分するような宿主細胞であってもよい。本発明の組み換え抗体発現のために好適な、他の哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（UrlaubとChasinの （1980） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。これは、例えば、R. J. KaufmanとP. A. Sharp （1982） Mol. Biol.
159:601-621に記載されているようにＤＨＦＲ選択マーカーとともに使用される）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯミエローマ細胞とともに使用する場合には、別の好適な発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６および欧州特許第３３８，８４１号に開示されたＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞中に導入する時、宿主細胞中で抗体を発現させる、またはさらに好適には、宿主細胞を増殖させる培地中に抗体を分泌させるだけの十分な時間宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。抗体は標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収できる。
【０１５３】
免疫複合体
別の局面において、本発明は、サイトトキシン、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性トキシンのような治療分子に複合させた脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体またはそのフラグメントを特徴とする。このような複合物を、ここで、「免疫複合体」と称する。１個以上のサイトトキシンを含む免疫複合体は、「イムノトキシン」と称される。サイトトキシン、すなわち、細胞傷害性物質には、細胞に有害な（例えば、死滅させる）あらゆる物質が含まれる。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジハイドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログが挙げられる。また、治療薬には、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルカリ化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【０１５４】
本発明の抗体に複合できる治療薬サイトトキシンの他の好適な例として、デュオカルマイシン、カリケアミシン、マイタンシンおよびオーリスタチン並びにそれらの誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合物の例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。
【０１５５】
サイトトキシンは、先行技術であるリンカー技術を用いて本発明の抗体に結合できる。サイトトキシンを抗体に結合するために用いたリンカータイプの例として、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント内部の低ｐＨによる切断を受けやすいか、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のような腫瘍組織中に主に発現するプロテアーゼのような、プロテアーゼによる切断を受けやすいものが選択される。
【０１５６】
サイトトキシンのタイプ、リンカーおよび抗体に治療物質を結合する方法をさらに検討するためには、Saito, G. et al. （2003）
Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215;
Trail, P.A. et al. （2003） Cancer Immunol.
Immunother. 52:328-337; Payne, G.  （2003） Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. （2002） Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and
Kreitman, R. J. （2002） Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. （2001）
Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照できる。
【０１５７】
本発明の抗体は、放射性同位元素に結合させ、放射性免疫複合体とも称される細胞傷害性放射性薬物を作製できる。診断または治療に使用するための抗体結合放射性同位元素の例として、ヨード１３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が含まれるが、これらに限定されない。放射免疫複合体を調製する方法は、当該技術分野において確立されている。放射免疫複合体の例は市販されており、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（IDEC Pharmaceuticals）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Corixa
Pharmaceuticals）が含まれ、類似の方法を用いて本発明の抗体を用いて放射免疫複合体を調製できる。
【０１５８】
ある生物応答を修飾するために、本発明の抗体複合物を用いることができるが、薬物部分は、旧来の化学的治療薬剤のみに限定されるとみなされない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素またはジフテリアトキシンのような、例えば、酵素的に活性の毒物またはその活性断片、腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γのようなタンパク質、または、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（“ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（“ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（“ＩＬ−６”）、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）または他の増殖因子のような生物学的応答調節物質が含まれる。
【０１５９】
このような治療部分を抗体に結合するための技術は公知であり、例えば、Arnon et al.,
"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer
Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. （eds.）, pp. 243-56 （Alan R. Liss, Inc. 1985）; Hellstrom et al., " Antibodies
For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery （2nd Ed.）, Robinson et al. （eds.）, pp. 623-53 （Marcel Dekker, Inc. 1987）; Thorpe, "Antibody Carriers Of
Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies
'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. （eds.）, pp. 475-506 （1985）; "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer
Therapy", in Monoclonal
Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. （eds.）, pp. 303-16 （Academic Press 1985）、およびThorpe et al., "The
Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",
Immunol. Rev., 62:119-58 （1982） を参照できる。
【０１６０】
薬剤組成物
別の局面において、本発明は、例えば、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を１種、またはその組み合わせを含有し、薬学的に許容できる担体とともに調剤された医薬組成物を提供する。このような組成物は、本発明の（例えば、２種以上の異なる）抗体、または免疫複合体を１個、または、その組み合わせを含んでいてもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または補完的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含むことができる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は、また、併用療法すなわち他の作用物質と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、他の抗新生物剤、抗炎症剤、または免疫抑制剤を少なくとも１つ組み合わせた本発明の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体を含んでいてもよい。そのような治療薬としては、とりわけ、高用量のステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）、例えば、アスピリンや他のサリチレート、例えば、イブプロフェン（Motrin、Advil）、ナプロキセン（Naprosyn）、スリンダク（Clinoril）、ジクロフェナク（Voltaren）、ピロキシカム（Feldene）、ケトプロフェン（Orudis）、ジフルニサル（Dolobid）、ナブメトン（Relafen）、エトドラク（Lodine）、オキサプロジン（Daypro）、インドメタシン（Indocin）、およびアスピリンを高用量で含む。併用療法に使用することができる他の治療薬の例は、本発明の抗体の使用に関しての以下のセクションにおいて、かなり詳細に記載している。
【０１６２】
本文中、「薬学的に許容できる担体」には、あらゆる溶媒、分散剤、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延物質等が全て含まれ、それらは生理学的に両立できる。好適には、当該担体は、（例えば、注入または点滴による）静注、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体または免疫複合体は、化合物を不活性化する可能性のある酸や他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することもできる。
【０１６３】
本発明の医薬化合物は、１種以上の薬学的に許容できる塩を含むことができる。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物が望ましい生物活性を保持するが、望ましくない毒性効果を全く示さない塩を称する（例えば、Berge, S.M., et al. （1977） J.
Pharm. Sci. 66:1-19を参照）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、燐等のような無毒性の無機酸由来、ならびに脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土金属、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンチルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような無毒の有機アミン由来のものが含まれる。
【０１６４】
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤を含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として、（１）アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ハイドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、α−トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が含まれる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物に使用できる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、オリーブオイルのような植物油、およびエチルオレイン酸のような注入可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、レシチンのような被覆物質を使用すること、分散体の場合、必要な粒子径を保持すること、および界面活性剤を使用することによって保持することができる。
【０１６６】
また、これらの組成物は保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含有してもよい。微生物存在の防止は、殺菌操作、同上のようにおよび、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌剤および抗真菌剤を包含させることによって確保できる。また、糖、塩化ナトリウム等のような等張化剤を当該組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射製剤形態の吸収を持続させることは、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を包含させることによって実現することができる。
【０１６７】
薬学的に許容できる担体には、無菌の注射用溶液または分散体を即時調製するための無菌水溶液または分散体および無菌粉末が含まれる。このような媒体および物質を薬学的に活性の物質のために使用することが当該技術において知られている。これまで従来の媒体または物質が当該活性化合物と両立できなかったので、本発明の医薬組成物中でそれを使用することを検討している。補助的な活性化合物もまた、当該組成物中に組み込むことができる。
【０１６８】
治療用組成物は、通常、製造および保存条件下で、無菌でかつ安定でなければならない。当該組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポゾームまたはその他高濃度の薬物に適した、調剤された構造体として製剤化できる。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、レシチンのようなコーティング剤を使用すること、分散体の場合必要な粒子径を保持することおよび界面活性剤を使用することによって保持できる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウムのような等張化剤を当該組成物に含有させることが望ましい。モノステアリン酸アルミニウム塩およびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を包含させることによって、注射用組成物の吸収を持続させることができる。
【０１６９】
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上記に述べた成分の一つまたはそれらの組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて無菌的精密ろ過をすることにより調製できる。一般的に、分散体は、基本的分散媒体と上記に述べたものの中から必要な他の成分を含む無菌媒体中に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌の注射用溶液調製のための無菌粉末の場合、好適な調製方法は真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）であり、活性成分に、事前に無菌ろ過した溶液からのあらゆる所望の追加成分を加えた粉末を産生できる。
【０１７０】
単回投与剤形を作製するために担体物質と組み合わせられる活性成分の量は、治療すべき対象と特定の投与様式に応じて変わる。単回投与剤形を作製するために担体物質と組み合わせられる活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす組成物量である。一般的に、この活性成分の量は、１００％のうち、薬学的に許容できる担体との組み合わせにおいて、約０．０１％〜約９９％、好適には約０．１％〜約７０％、さらに好適には約１％〜約３０％の範囲である。
【０１７１】
投与法は、望ましい最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスで投与することができるか、数回に投与量を分けて時間をかけて投与することもでき、または治療状況の緊急性に応じて投与量を減ずるかまたは増量することもできる。特に、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を単位投与形態として製剤化するのが好都合である。本文中、単位投与形態とは、治療対象に対する単位投与として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と関連させて所望の治療効果をもたらすために計算され、あらかじめ決定した量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特異性と目的とする特定の治療効果、および（ｂ）個人への治療感受性のため、そのような活性化合物を調剤する技術に固有の限界により規定されかつ直接それらに依存する。
【０１７２】
抗体投与のため、当該投与量は、患者体重を基準として、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、投与量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるかまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。典型的な治療方法には、例えば、週１回投与、２週間おきに１回投与、３週おきに１回投与、４週おきに１回投与、１ヶ月に１回投与、３ヶ月おきに１回投与または３〜６ヶ月おきに１回投与を必要とする。本発明の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体の好適な投与方法は、静注投与により、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重であり、当該抗体は、下記の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）投与６回を４週おきに、次に３週おき、（ｉｉ）３週おき、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次いで３週おきに１ｍｇ／ｋｇ体重、の一つを用いて投与される。
【０１７３】
ある方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の投与量は、例示した範囲内に入る。通常、抗体は、複数回投与される。単回投与間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月おきまたは１年おきとすることができる。また、患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示唆されるように、不定期とすることもできる。血漿中の抗体濃度を約１〜１０００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法や、約２５〜３００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法もある。
【０１７４】
あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することもでき、この場合、投与頻度を少なくすることが必要となる。投与量と頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変わる。一般的に、ヒト抗体の半減期が最も長く、次に、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体が続く。投与量と投与頻度は、治療が予防なのか治療なのかにより変わる。予防的用途においては、比較的低用量が、比較的低い頻度で、長期にわたり投与される。寿命のある限り治療を受けることになる患者もいる。治療的用途では、疾患進行を遅らせるかまたは停止させるまで、好ましくは、患者が部分的または完全に疾患症状の改善を示すまで、比較的高用量を比較的短期間に必要とすることがある。その後、患者は、予防的方法で投与される。
【０１７５】
本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与レベルを変化させることで、毒性を起こすことなしに、特定患者に対して望ましい治療応答を得る有効な活性成分、組成および投与様式を得ることができる。選択した投与量は、本発明で使用した特定組成物、またはそのエステル、その塩若しくはそのアミドの活性、投与経路、投与時間、使用した特定化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、使用した特定組成物と組み合わせて使用した化合物および／または物質、治療患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および既往歴、ならびに医学分野において公知の諸因子といった、種々の薬物動態因子に左右される。
【０１７６】
本発明の抗ＰＳＭＡ抗体の「治療有効投与量」は、疾患症状の重篤度の低下、疾患に由来する症状が消失する期間の頻度と期間の増加、または疾患に罹患したことによる不全または障害の予防につながるものである。例えば、癌性の腫瘍の治療については、「治療有効投与量」は、未処置被験体に比較して、好適には少なくとも約２０％、さらに好適には少なくとも約４０％、さらにより好適には約６０％、さらに好適には約８０％以上として、細胞増殖すなわち腫瘍増殖を阻害する。化合物の腫瘍増殖阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測できる動物モデル系で評価できる。別法とし、このような組成物の特性は、当業者に公知のアッセイによって化合物の阻害活性、例えば、in vitroにおける阻害能を調べることによって評価することができる。治療化合物の治療有効投与量は、腫瘍の大きさを減じるか、またはそうでなければ、被験体の症状を改善させる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重篤度、および特定組成物または選択した投与経路のような要素に基づき量を決定することができる。
【０１７７】
本発明の組成物は、当該技術で公知の様々な方法の１つ以上の方法を用いて、１種以上の投与経路にて投与することもできる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または様式は、望ましい結果に応じて変わる。本発明の抗体の好適な投与経路は、例えば、注射または輸液による、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下、脊髄投与または他の非経口投与経路を含む。本明細書で用いられているフレーズ「非経口投与」とは、腸および局所投与以外の通常の注入による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下嚢内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注入および点滴が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７８】
あるいは、本発明の脱フコシル化された抗体は、局所、上皮のような非経口経路で、または、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下または局所で粘膜投与経路により投与できる。
【０１７９】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびミクロカプセル包含デリバリシステムのような徐放性製剤のような、迅速放出に対して当該化合物を保護する担体とともに調製できる。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸といった、生分解性、生体適合性ポリマーも使用できる。このような製剤の調製方法は多くが特許を得ており、または、通常、当業者に公知である。例えば、Sustained and
Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.
Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New
York, 1978参照。
【０１８０】
治療用組成物は、当該技術において公知の医療用具により投与できる。例えば、好適な態様において、本発明の治療組成物は、針のない皮下注入用具により投与できる。そのような装置は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されている。本発明で有用な公知のインプラントおよびモジュールの例として、制御された速度で医薬を投薬するためのインプラント可能なミクロインフィージョンポンプを開示した米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚から医薬を投与するための治療用具を開示した米国特許第４，４８６，１９４号、精密な点滴速度で医薬を運搬するための医薬インヒュージョンポンプを開示した米国特許第４，４４７，２３３号、連続的薬物運搬のための可変フローインプラント可能な点滴装置を開示した米国特許第４，４４７，２２４号、複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧ドラッグデリバリシステムを開示した米国特許第４，４３９，１９６号および浸透圧ドラッグデリバリシステムを開示した米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。これらの特許は引用によって、本明細書において援用する。他にも多くのインプラント、デリバリシステムおよびモジュールが当業者に公知である。
【０１８１】
いくつかの態様において、本発明の脱フコシル化された抗体を製剤化して、in vivoにおける適切な分布を確保することができる。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）バリアは、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを（必要に応じて）確実に通過できるようにするため、それらを、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポゾーム製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；および第５，３９９，３３１号を参照できる。当該リポソームは、特定細胞または臓器に選択的に運搬される一種以上の分子を含むことができ、それによって標的ドラッグデリバリを増強できる（例えば、V.V. Ranade （1989） J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。標的となる分子の例として、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許５，４１６，０１６号（Low et al.）を参照）、マンノシド（Umezawa et al., （1988） Biochem.
Biophys. Res. Commun. 153:1038）、抗体（P.G.
Bloeman et al. （1995） FEBS Lett.
357:140; M. Owais et al. （1995） Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）、界面活性剤プロテインＡレセプター（Briscoe et al. （1995） Am.
J. Physiol. 1233:134）、ｐ１２０（Schreier et al. （1994） J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれ、また、K. Keinanen; M.L. Laukkanen （1994） FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J.
Fidler （1994） Immunomethods 4:273を参照することができる。
【０１８２】
本発明の用途および方法
本発明の脱フコシル化された抗体、抗体組成物および方法は、ＰＳＭＡの発現に関連する障害の診断治療に関わる、多数のin vitroおよびin vivoでの診断的および治療的用途を有している。例えば、これらの分子は、培養細胞に対してin vitroでもしくはex vivoで、あるいはヒト被験体に対して、例えば、in vivoで投与して、様々な障害において、治療、予防および診断をするために投与することができる。本明細書において用いられている用語「被験体」とは、ヒトおよび非ヒト動物類を含むことを意味している。非ヒト動物には、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等のような哺乳類および非哺乳類である、全脊椎動物類が含まれる。好適な被験体には、ＰＳＭＡ発現に関連する障害を有するヒト患者が含まれる。ＰＳＭＡに対する抗体を別の物質とともに投与するときには、その２つは、順番にまたは同時に投与できる。
【０１８３】
本発明の抗体組成物（例えば、抗体または免疫複合体））のin vivoおよびin
vitroの好適な投与経路は、当該技術分野において公知であり、当業者によって選択され得る。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈内もしくは皮下注射）によって投与することができる。好適な投与量は患者の年齢および体重、そして抗体組成物の濃度および／または製剤によって変わるであろう。
【０１８４】
ある態様において、本発明の抗体を、in vitroでの治療的もしくは診断的用とその結合活性に関して試験する。例えば、本発明の組成物は、ＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーアッセイによって試験することができる。さらに、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖および／または死滅を阻害することを含む、少なくとも１つのエフェクター媒介性エフェクター細胞活性を惹起する際のこれらの分子の活性を評価する。エフェクター媒介性ＡＤＣＣをアッセイするためのプロトコルは、実施例において後述する。
【０１８５】
Ａ．検出方法
ある態様において、本発明の抗体は、ＰＳＭＡのレベル、またはＰＳＭＡをその膜表面に含有する細胞のレベルを検出するために使用することができる。次にそのレベルは特定の疾患の症状と結びつけることができる。
【０１８６】
ある特定の態様では、本発明は、サンプル中のＰＳＭＡの有無を検出する方法、または細胞表面上のＰＳＭＡ量を測定する方法を提供する。この方法では、脱フコシル化された抗体またはその部分とＰＳＭＡの間で複合体形成することが可能な条件下で、当該サンプルと対照サンプルを、ＰＳＭＡに結合している本発明の抗体またはその抗原結合部分に接触させる。その後、複合体形成を検出し、当該サンプルと、比較される対照と間に複合体形成に差が認められれば、当該サンプル中にＰＳＭＡが存在することが示唆される。これは、例えば、当該技術分野において公知の標準的な検出方法、例えば、ＥＬＩＳＡやフローサイトメトリー法などによって、本発明の組成物を用いて行うことができる。
【０１８７】
したがって、ある局面では、本発明はさらに、サンプル中のＰＳＭＡ（例えば、ヒトＰＳＭＡ）の有無を検出する方法、またはＰＳＭＡの量を測定する方法を提供する。この方法では、抗体またはその部分とＰＳＭＡの間で複合体形成することが可能な条件下で、当該サンプルと対照サンプルを、ＰＳＭＡに特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部分に接触させる。その後、複合体形成を検出し、当該サンプルと、比較される対照と間に複合体形成に差が認められれば、当該サンプル中にＰＳＭＡが存在することが示唆される。
【０１８８】
本発明の組成物は、例えばこのような細胞を標識するなど、ＰＳＭＡ発現細胞を標的とするために用いることもできる。このような使用法のために、結合剤を、検出される分子に結合することができる。したがって、本発明は、ＰＳＭＡをエキソビボまたはインビトロにおいて局在化する方法を提供する。検出用標識は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子などであってよい。
【０１８９】
Ｂ．ＰＳＭＡ＋細胞の増殖の阻害
抗体を用いて、ＰＳＭＡ発現に関連する、いくつかの疾患の症状を予防もしくは寛解することにつながり得る、ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害することができる。疾患状態と非疾患状態の間のＰＳＭＡ発現の差は、抗体とＰＳＭＡの間で複合体形成することが可能な条件下で、該疾患に罹患した患者から採取した試験サンプルと対照サンプルとを抗ＰＳＭＡ抗体に接触させることによって測定することができる。抗体とＰＳＭＡとの間に形成された何らかの複合体を検出し、サンプル中と対照中で比較する。
【０１９０】
例えば、該抗体は、以下の生物学的活性の１以上をin vivoまたはin vitroで惹起する；ＰＳＭＡを発現する細胞の増殖を阻害する、および／またはＰＳＭＡを発現する細胞を死滅させる；ヒトエフェクター細胞の存在下でＰＳＭＡを発現する細胞の貪食作用またはＡＤＣＣを媒介する；可溶性ＰＳＭＡのシェディングを阻害するために使用することができる。本明細書に記載のように、本発明の脱フコシル化された抗体は、フコシル化された形態の抗体と比較してＡＤＣＣ活性が高められることが示された。
【０１９１】
したがって、別の局面において、本発明は、ＰＳＭＡ＋細胞の増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、前記細胞を前記細胞の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を誘発するのに十分な条件下で前記細胞と脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体とを接触させることを含む。細胞は、例えば、腫瘍細胞とすることができる。好ましい態様において、抗ＰＳＭＡ抗体はヒト抗体である。
【０１９２】
ある態様において、本発明の抗体またはその結合部分は、例えば、細胞表面上のレセプターをキャップしたり、除去したりすることによって、標的細胞上のＰＳＭＡレベルを調節するために使用することができる。抗体Ｆｃレセプター抗体の混合物もこの目的のために用いることができる。
【０１９３】
本発明の組成物に結合したエフェクター細胞などの標的特異性エフェクター細胞は、治療薬として用いることもできる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球であってもよい。その他の細胞としては、好酸球、ナチュラルキラー細胞、およびその他のＩｇＧまたはＩｇＡレセプターを有する細胞が含まれる。必要であれば、エフェクター細胞は、治療される被験体から採取することもできる。標的特異性エフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与される細胞数は約１０８〜１０９個程度とすることができるが、治療目的により変化するであろう。一般に、その量であれば、例えば、ＰＳＭＡを発現する腫瘍細胞などの標的細胞に局在化するのに十分であり、貪食作用などにより細胞死滅を引き起こすのに効果的であろう。投与経路も変えることができる。
【０１９４】
標的特異性エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の技術と併用して行うことができる。例えば、本発明の組成物、および／またはこれらの組成物に保護されたエフェクター細胞を用いた抗腫瘍療法は、化学療法と併用することができる。さらに、併用免疫療法は、二つの異なる細胞傷害性エフェクター群を腫瘍細胞拒絶に向かわせるように用いることができる。
【０１９５】
Ｃ．免疫複合体の使用と併用治療
ある態様において、本発明の免疫複合体は、化合物（例えば、治療薬、標識、サイトトキシン、放射性トキシン、免疫抑制薬など）を、ＰＳＭＡ細胞表面分子をもつ細胞に標的化するために使用することができる。それはそのような化合物を抗体に結合させることによって行う。したがって、本発明はまた、ex vivo または in vitroでＰＳＭＡ（例えば、検出可能な標識、放射性同意体、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子など）を発現する細胞を局在化する方法も提供する。あるいは、免疫複合体は、サイトトキシンまたは放射性トキシンが、ＰＳＭＡ、例えば、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を標的とし、その結果、腫瘍細胞を除去することによって、ＰＳＭＡ細胞表面レセプターをもつ細胞を死滅させるために使用することができる。 
標的特異性エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の技術と併用して行うことができる。例えば、本発明の組成物、および／またはこれらの組成物に保護されたエフェクター細胞を用いた抗腫瘍療法は、化学療法と併用することができる。さらに、併用免疫療法は、二つの異なる細胞傷害性エフェクター群を腫瘍細胞拒絶に向かわせるように用いることができる。
【０１９６】
他の態様において、患者は、ＦｃγレセプターまたはＦｃγレセプターの発現または活性を調節、例えば、増強または阻害させる物質を用いて、例えば、サイトカインを用いて患者を治療することによって、さらに治療することができる。治療中、投与される好適なサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０１９７】
別の態様において、本発明の抗体組成物を用いて治療された患者に、ヒト抗体での治療効果を高めるまたは増強させる細胞傷害性物質または放射毒性物質などの別の治療薬をさらに投与する（本発明の抗体の投与の前、投与と同時、もしくは投与後）ことができる。抗体はその物質と結合することができる（免疫複合物として）、または該物質とは別々に投与することができる。後者の場合（別個の投与）、抗体は、物質投与の前、後、もしくは同時に投与することができる、公知の他の治療方法、例えば、放射線治療などの抗癌治療と共投与することもできる。そのような治療薬としては、とりわけ、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロランブシル、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素などの抗悪性腫瘍薬が含まれ、それらは、それら自身、患者に対して毒性もしくは亜毒性となるレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週間毎に１回、１００ｍｇ/ｍｌの投与量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日毎に１回、６０〜７５ｍｇ/ｍｌの投与量で静脈内投与される。本発明のヒト抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の化学治療薬と共投与することによって、細胞傷害性効果をヒト腫瘍細胞にもたらす、異なる機序で作用する２つの抗癌剤を提供する。そのような共投与は、薬剤抵抗性の発達によって生じる問題を解決することができ、または抗体と反応性を示さないそれらの腫瘍細胞の抗原特性に変化をもたらす。
【０１９８】
Ｄ．癌の治療
ＰＳＭＡは、前立腺癌腫瘍細胞などの腫瘍上で発現することがわかっている。また、それは癌細胞に近接する血管内皮細胞上、例えば、尿路上皮の癌性細胞、結腸の癌性細胞、直腸の癌性細胞、肺の癌性細胞、乳房の癌性細胞、および肝臓の転移性のアデノカルシノーマでも発現することがわかっている（例えば、米国特許第６，１３６，３１１号を参照）。したがって、本発明の抗体は、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、または腫瘍細胞に近接する血管内皮細胞の増殖を阻害することによって、癌を治療するために使用することができる。したがって、別の態様において、本発明は、被験体の腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。そこで、腫瘍の細胞または腫瘍に近接する血管内皮細胞は、ＰＳＭＡ＋であり、この方法においては、本発明の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体が、腫瘍の増殖が阻害されるように患者に投与される。ヒト被験体においては、該抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが好ましい。好ましい態様において、腫瘍細胞は前立腺腫瘍細胞である。他の態様において、腫瘍細胞は、結腸、腎臓、直腸、尿路上皮、乳房、膀胱、肝臓、膵臓から選択される癌またはメラノーマである。
【０１９９】
本発明の治療方法は、障害を治療または予防するのに有効な量の本発明の抗体組成物を患者に投与することを含む。該組成物は、単独で、あるいは抗体組成物とあわせて、もしくは相乗的に、ＰＳＭＡ発現と関連する疾患を治療または予防する働きをする他の治療薬、例えば、細胞傷害性薬物もしくは放射毒性薬物と併用（抗体に結合、もしくは一緒に投与）して投与することができる。
【０２００】
キット
また、本発明の抗体を含むキットおよび使用説明書も本発明の範囲内である。そのキットはさらに、免疫刺激剤、細胞障害剤、または放射毒性剤、または１以上の本発明のさらなる抗体（例えば、第１のヒト抗体とは別のＰＳＭＡ抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）などの少なくともさらに一つの試薬を含むことができる。キットは、通常、キット内容物の目的用途を示したラベルを有している。用語ラベルは、すべての文書を含み、キットの上面またはキットとともに付与されるか、そうでない場合にはキットに添付される。
【０２０１】
本発明は以下の実施例においてさらに具体化されるが、本発明をさらに限定するものと解釈されてはならない。本願全体に引用されるすべての図面、およびすべての引用文献、特許および特許出願公報の内容を引用によって本明細書中に援用する。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：キメラニワトリの卵における抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体の発現
本実施例では、キメラニワトリの卵における抗ＰＳＭＡヒトモノクローナル抗体７Ｆ１２の発現について述べる。キメラニワトリの卵においてタンパク質を発現するための一般的な方法については、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０１５１２３号に記載されている。その内容を本明細書に引用によって明確に援用する。キメラニワトリの卵における抗体に関する更なる情報は、米国特許出願第１１／０６２，３２５号（発明の名称：「ニワトリにおける抗体の組織特異的発現」、２００５年２月１８日出願）に記載されている。その内容を本明細書に引用によって明確に援用する。
【０２０３】
以下の実施例では、外因性のイムノグロブリン軽鎖および重鎖遺伝子とともにプロモーターを含む内因性卵白制御配列を含有するトランスジーンが構築され、輸卵管の管状腺細胞に組織特異的抗体発現をもたらす。次いで、そのようにして発現させた抗体をトランスジェニックニワトリの卵白中に置く。この態様において、あらゆる再配列させたイムノグロブリン遺伝子によってコードされる抗体を、輸卵管の筒部領域の管状腺細胞を含む組織中に特異的に発現させ、卵白から単離させることができる。モノクローナル抗体をコードする再配列させたイムノグロブリン遺伝子は、輸卵管中で優先的に発現させ、他の組織での発現が検出可能なレベル以上起こることもあるが、他の組織での発現を実質的に排除する。
【０２０４】
卵白アルブミン由来のモノクローナル抗体構築物のための好ましいトランスジーン構築物を図１２に示す。これらのトランスジーン構築物（Ｏｖ７．５およびＯｖ１５と命名）は、それぞれ約７．５ｋｂおよび１５ｋｂの、ＭＡｂコード領域に５’末端で隣接する卵白アルブミンプロモーター、および１５ｋｂのプロモーター配列３’のコード領域を有する。該コード領域は、軽鎖および重鎖双方の可変領域、Ｊ−Ｃイントロン配列、カッパ軽鎖定常領域、ＩＲＥＳ配列およびガンマ１アイソタイプ重鎖定常領域を含む。該構築物の３’末端は、ＧＦＰ遺伝子および選択可能なマーカー、この場合はＣＸプロモーターによって駆動するピューロマイシン抵抗遺伝子を含む。卵白アルブミンプロモーター配列の、モノクローナル抗体コード領域の３’および５’末端の長さは、例示に過ぎず、類似の構築物として、２５〜１００ｋｂ以上の５’配列ならびに３’配列の可変領域が含まれる。当業者は、組織学的試料中に検出される場合のみＧＦＰマーカーが存在し、トランスジーンのユーティリティーから離れることなく除去することができるということを理解するであろう。ピューロマイシン抵抗マーカーは、当該技術分野において公知のトランスジーンによって形質転換に成功した胚性幹細胞を選択する可能性のある他のあらゆるマーカーに代えることができ、本実施の形態において、ピューロマイシン抵抗遺伝子を互換可能に用いることができる。  
【０２０５】
ヒト抗ＰＳＭＡ ｍＡｂ ７Ｆ１２の発現に用いられるトランスジーンを、Ｏｖ１５ｍＡｂ７Ｆ１２と称する。そしてそれは、卵白アルブミンプロモーターの１５ｋｂの５’制御配列を含んでいた。さらに、シグナルペプチドを直接的にＶＬに接合し、ｍＲＮＡプロセシング中にそれが除去されるのを阻止した。新たに誘導した雌ｃＥＳ細胞株（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０１５１２３において調製されたもの）を用いて、高いグレードのキメラが卵を生成するようにした。Ｏｖ１５ＭＡｂ７Ｆ１２ベクターを、雌ｃＥＳ細胞株にトランスフェクトし、安定して、トランスフェクトされたクローンをＰＣＲによってスクリーニングした。１つのクローン（ＯＶＨ）をさらに、サザンブロッティングによって分析した。Ｏｖ１５ＭＡｂ７Ｆ１２トランスジーンの１つの複製のみがｃＥＳゲノムに統合され、該トランスジーンが少なくとも１０ｋｂの５’Ｏｖプロモーター配列を含有することがわかった。
【０２０６】
トランスジーン分析のために、キメラニワトリをＯＶＨクローンから作製した。１０匹のキメラヒヨコを早期エストロゲン誘導のために用いた。輸卵管筒部、筋肉、脳、肝臓および腸を含む種々の組織からのドナーｃＥＳ由来領域（ＧＦＰ陽性）を回収した。Ｌ鎖およびＨ鎖に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、トランスジーンの発現をモニターした。Ｌ鎖およびＨ鎖の転写は、筒部においては検出されたが、雌ヒヨコから誘導された４検体のうち３検体（ＯＶ１５−３４、ＯＶ１５−７６およびＯＶ１５−８３）からの筋肉、脳、肝臓では検出されなかった。しかしながら、回腸、盲腸および結腸においても低レベルの発現が検出された。エストロゲン誘導筒部からの切片の免疫組織化学的特性は、ＧＦＰ陽性管状腺細胞においては、モノクローナル抗体の発現を確認したが、ＧＦＰ陽性上皮細胞においては確認されなかった。あわせて、これらのデータは、Ｏｖ１５ＭＡｂ７Ｆ１２ベクターが輸卵管の管状腺細胞でのトランスジーンの発現を導くことを示した。腸で検出された低レベルの異所性発現は、１５ＫｂのＯｖの５’制御配列は、位置依存性、組織特異性のトランスジーンの発現を付与するのに十分でないかもしれないことを示唆した。
【０２０７】
６９のキメラを、Ｏｖ１５ＭＡｂ７Ｆ１２を保有するＯＶＨ
ｃＥＳ細胞から作製し、完全ヒトＭＡｂの卵への沈降を評価した。３０のキメラメンドリを性成熟させ、産卵を開始した。ＥＬＩＳＡ分析によれば、全てのメンドリからの卵は、その卵白中にＭＡｂを含有していた。卵中のＭＡｂの濃度および量はキメラニワトリにおいて異なっていた。それはおそらく筒部でのキメラ化の程度の相違によって異なるものである。８羽のキメラメンドリは、１卵あたり１ｍｇを超えるＭＡｂを含有する卵を産んだ。３０キメラ中の最大のレベルは、１卵あたりＭＡｂは３．４ｍｇであった。４羽のキメラメンドリが、そのＭＡｂの平均レベルが、卵１つあたり１．２ｍｇ乃至１．６ｍｇの卵を産んだ。６羽のキメラメンドリがそのＭＡｂの平均レベルが、卵１つあたり０．５ｍｇ乃至１．０ｍｇの卵を産んだ。
【０２０８】
卵白中のＭＡｂの有無を、Ｈ鎖およびＬ鎖の双方を認識するウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いたウェスタンブロッティングによってさらに分析した。野生型、非キメラ白色レグホン種メンドリからの採取した卵白を、陰性対照として用いた。精製されたＩｇＧ１、κ（Ｓｉｇｍａ）を、参照標準として用いた。全長Ｌ鎖およびＨ鎖を、５羽のキメラメンドリ（ＯＶ１５−１７、ＯＶ１５−２９、Ｏｖ１５−７１、ＯＶ１６−３４およびＯＶ１６−４２）からの卵白サンプル中において検出した。完全に構成されたＨ２Ｌ２も認められた。少量の組立体中間物質も存在していた。
【０２０９】
卵白中に蓄積したＭａｂ濃度の変化を測定するために、５羽の異なるキメラメンドリ（ＯＶ１６−３４、ＯＶ１６−４２、ＯＶ１７−２９、ＯＶ１７−５２およびＯＶ１７−８３）から採取した卵を、３〜４ヶ月間モニターした。3羽のメンドリで、ＭＡｂの量は、第１週目でピークに達し、その後、約２倍減少し、次の２〜３ヶ月間以上の安定に維持された。２羽のメンドリで、クールの間中、発現レベルが維持された。すべての管状腺ではないが、卵が輸卵管の筒部を通過するとき、卵白アルブミンタンパク質を分泌し、蓄積した。卵白に蓄積されたＭＡｂの量は、これらのメンドリの管状腺のキメラ性によって、各卵が筒部を通過するときに変化することができた。
【０２１０】
２６のキメラメンドリおよび縞模様のプリマスロック種（Barred Plymouth Rock）（ＢＰＲ）メンドリ（陰性対照）から採取した血液サンプルを、ＥＬＩＳＡによって分析し、ヒトＩｇＧの有無を調べた。１８羽のメンドリにおいて、血中ＭＡｂ濃度が検出でき、ＯＶ１７−８３メンドリにおいて最大濃度３９ｎｇ／ｍｌが認められた。血中ＭＡｂ濃度と卵白中ＭＡｂ濃度濃度の相関（ｒ）は、０．６７であった。しかしながら、この比較は、異なる組織においてキメラ化の程度が有意に変わりうるという事実によって複雑になっていた。例えば、ＯＶ１７−１２２においては、卵中ＭＡｂは非常に低かったが（平均で１卵あたり０．０２ｍｇ）、血中ＭＡｂ濃度は２番目に高かった（３６ｎｇ／ｍｌ）。発明者らは、血中にＭＡｂが存在するのは、輸卵管での発現がもれてきた結果ではなく、異所性の発現によるものであると推測している（例えば、腸においては、エストロゲン誘導性キメラにおいて、ＲＴ−ＰＣＲによって異所性の発現が検出された）。
【０２１１】
実施例２：抗体生成物の精製およびタンパク質特徴づけ
ＭＡｂ７Ｆ１２を下記のようにして卵白から精製した。まず卵白を、低せん断速度で３０分間、室温で混合し、その後、当該技術において公知の方法でオボムチンを析出させた。１体積の均質化した卵白懸濁液を添加し、３倍体積の逆浸透圧水にし、３０分間攪拌した。この希釈した懸濁液を、０．５Ｍリン酸を用いてｐＨ６．０に調整し、１２，１００ｇで２０分間遠心分離した。主としてオボムチンを含有する約３％の卵白タンパク質をこの方法によって除去した。上清を、０．５Ｍリン酸水素ナトリウムと１５０ｍＭ塩化ナトリウム濃縮物を結晶塩とともに用いてｐＨ７．４に調整した。ヒトＩｇＧをプロテインＡセファロースＦＦ（Protein A-Sepharose FF）カラム（Amersham
Biosciences）上で直線流速１２０ｃｍ／ｈで精製した。吸着したヒトＩｇＧを５カラム体積の添加緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで３ｍＭリン酸を用いて溶出させた。溶出したＩｇＧ画分を、２３０ｍＭのＮａＣｌを含有する６０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を用いてｐＨ７．５に調整し、最終濃度４０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌを得た。サンプルを、０．２μｍシリンジフィルター（Pall）を通して濾過した。
【０２１２】
精製物質の大半は、純度９０％超（ＥＬＩＳＡおよびＡ２８０によって測定）の完全に回収されたＭＡｂ分子であった。ニワトリにおいて生成したＭＡｂ７Ｆ１２と、従来のＣＨＯ細胞培養によって作製したＭＡｂ７Ｆ１２とを、いくつかのアッセイにおいて、下記のように比較した。
【０２１３】
１．抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
約１０μｇのＩｇＧサンプルを、４．６ｘ３００ｍｍのBioSep SEC S3000カラム（Phenomenex）を用いたWaters2795ＨＰＬＣで分析した。０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍ硫酸ナトリウム、ｐＨ７．２で、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎで２０分間、クロマトグラフィーを行った。Ａ２８０で分離をモニターした。分子量標準（Bio-Rad）を用いて近似の分子量を測定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析によれば、双方とも９０％を超えるＩｇＧモノマーであった。
【０２１４】
２．タンパク質のナノＬＣ ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ配列分析
双方のＭａｂ調製物（ニワトリ卵発現およびＣＨＯ細胞発現）を還元し、アルキル化し、一晩透析し、３７℃で４時間、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＰＨ８）中でトリプシン消化した。双方のトリプシン分解物のタンデムマススペクトロメトリーを、陽イオンモードで、QSTARパルサーマススペクトロメーター（MDS Sciex, Concord, Ontario, Canada）操作に接続し、衝突誘導性解離（ＣＩＤ）を用いてタンデムスペクトルを得る、Nano HPLCシステム（Dionex, Sunnyvale, CA）上で行った。各サンプルの１μｌずつのアリコートを、７５μｍ径のPepmap C18カラムを用いて、流速２５０ｎｌ／分で注入した。移動相は、溶媒Ａ（９５％水、５％アセトニトリル、０．５％ギ酸）および溶媒Ｂ（２０％水、８０％アセトニトリル、０．５％ギ酸）とした。７ｓ操作サイクル、２ｓのフルスペクトル記録、次の５ｓで大強度のイオンを選択してＣＩＤスペクトルを記録する、情報依存性取得モードで機器を操作した。Mascot（Matrix Science, London, UK）を用いてスペクトルを分析した。双方のＭＡｂ調製物の分析を以下に記載の方法で分析したところ、発現系に依存する配列の相違は認められなかった。
【０２１５】
３．ＬＣ−ＭＳ分析
４ＭグアニジンＨＣ１中ＩｇＧサンプル（５０μｇ）を、６０℃で９０分間サンプルをインキュベートすることによって、２５ｍＭのＤＴＴ中で還元した。次いでサンプルを室温で１５分間暗室にて４５ｍＭヨード酢酸中でアルキル化し、２２ｍＭのＤＴＴを用いてその反応を止めた。ＬＣ−ＭＳサンプルを、１Ｌの２５ｍＭ重炭酸アンモニウムで透析する前に、５０μｌの各サンプルをMicromass ZQマススペクトロメーターを備えたWaters 2795 HPLCを用いたPoros R1/10 ２．１ｘ１００ｍｍカラム（Applied Biosystems）に注入し、陽イオンモードで分析した。移動相は、（Ａ）０．１％ギ酸および０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および（Ｂ）０．１％ギ酸および０．０１％ＴＦＡを含む１００％ＣＨ３ＣＮとした。１００分以上かけて発生させた１０〜６０％の（Ａ）中（Ｂ）の直線勾配によって溶出（０．２５ｍｌ／ｍｉｎ）を行った。
【０２１６】
Ｌ鎖の分析によれば、双方のＭＡｂ調製物の質量は同一であった（＋／−３Ｄａ）。
【０２１７】
４．ｃＩＥＦ分析
ＩｇＧサンプル（５０μずつ、１．０ｍｇ／ｍｌ）を水で透析し、ＣＥ分析前に塩を除去した。キャピラリー電気泳動法等電フォーカシングを、P/ACE MDQ CEシステム（Beckman）上で、通常の極性で、有効長３０ｃｍの５０μ内径のｅＣＡＰニュートラルキャピラリー（eCAP neutral capillary）（Beckman）を用いて行った。圧力２０ｐｓｉでの注入により、サンプルを６０ｓ間注入した。１５ｋＶで４５分間、分離を行った。キャピラリーの温度は２０℃とした。アノード液は、２０ｍＭリン酸とし、カソード液は４０ｍＭ水酸化ナトリウムとした。すすぎ用溶液は、１０ｍＭリン酸とし、あれば陰極モビライザー溶液（cathodic mobilizer solution）（Beckman）を用いた。Ａ２８０で分離をモニターした。ｃＩＥＦ分析によれば、ＣＨＯ由来ＭＡｂ７Ｆ１２において充電不均質性が増加していたが、双方の等電点（ｐＩ）は同じであった。  
【０２１８】
５．差動走査熱量による熱安定性
ニワトリ発現系およびＣＨＯ発現系において生成した熱安定性７Ｆ１２を、差動走査熱量（ＤＳＣ）を用いて取得し、Ｆｃドメインにおいて脱グリコシル化された、それらの対応する形態と比較した。融解温度（Ｔｍ）の熱量計による測定を、自動サンプラー（MicroCal LLC, Northampton, MA, USA）と組み合わせたVP-Capillary
DSC差動スキャニングマイクロカロリーメータープラットフォーム上で行った。サンプル細胞の体積は、０．１４４ｍＬである。グリコシル化形態および脱グリコシル化形態の抗体に関する変性データを、濃度２．３μＭで、３０〜９５℃で、１℃／分で、サンプルを加熱することによって取得した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中にタンパク質サンプルが存在していた。参照細胞中で同じ緩衝液を用いて、モル熱容量を比較によって取得した。取得したサーモグラムをベースライン補正し、正規化したデータをOrigin ｖ７．０を用いて分析した。 
【０２１９】
ＣＨＯ由来抗体とニワトリ由来抗体のアンフォールディングプロファイルはかなり異なっていた。一方、Ｆｃ脱グリコシル化抗体アンフォールディングプロファイルはほぼ同じであった。ＤＳＣデータによれば、それぞれのＣＨ２ドメインにおけるＣＨＯ由来Ｍａｂとニワトリ由来Ｍａｂの熱安定性の相違は、主にグリコシル化パターンが異なることが原因であることが示された。低温で抗体の全体の安定性を決定するため、複数の融解遷移点の中の第１のものが重要である。ニワトリ由来抗体のＴｍ１は、６３．８℃と測定された。一方、ＣＨＯ発現抗体のＴｍ１は、６２．７℃と測定された。ニワトリ由来抗体のＴｍ１がＣＨＯ発現抗体のＴｍ１より高いとすれば、室温でニワトリ由来抗体の熱安定性が高い可能性がある。 
【０２２０】
実施例３：ニワトリ発現抗ＰＳＭＡ抗体のオリゴ糖分析
本実施例において、種々の異なる技術を用いて、ニワトリ卵発現７Ｆ１２抗体のグリコシル化パターンを分析した。
【０２２１】
１．ＣＥ−ＬＩＦによるオリゴ糖特徴づけ
ＩｇＧサンプルを１２．５ｍＵのPNGaseF（Prozyme）とともに４０℃で一晩インキュベートすることによって、該ＩｇＧサンプル（１００μｇ）からオリゴ糖を放出させた。使用条件下で、ＣＨＯ細胞およびニワトリにおいて発現したＨｕＭＡｂＦ１のＦｃ部分からＮ−結合グリカンを放出させた。エタノール沈澱によってＭＡｂタンパク質を除去した後、グリカンを含む上清を、真空遠心分離によって乾燥させ、１５％酢酸中１９ｍＭのＡＰＴＳ（Beckman）中とＴＨＦ（Sigma）中１Ｍシアノヒドリドほう酸ナトリウムに再懸濁させた。グリカン標識反応を４０℃で一晩継続させ、その後、サンプルを水で２５倍に希釈した。ＡＰＴＳ標識グリカンを、逆極性のP/ACE MDQ CEシステム（Beckman）上で、有効長５０ｃｍの内径５０μｍのＮ−ＣＨＯをコーティングしたキャピラリー（Beckman）を用いて、レーザー誘導性蛍光を用いてキャピラリー電気泳動法に付した。サンプルに圧力をかけて注入し（８秒）、糖分離ゲル緩衝液（Carbohydrate Separation Gel Buffer）（Beckman）を用いて２０℃、２５ｋＶで２０分間、分離を行った。３ｍＷのアルゴンイオンレーザーおよび励起波長４８８ｎｍおよび５２０ｎｍのレーザー誘導性蛍光検出システム（Beckman）を用いて分離を行った。ニワトリにおいて生成された７Ｆ１２のオリゴ糖プロファイルは、ＣＨＯ細胞で生成された７Ｆ１２のそれとかなり異なっていることがわかった。
【０２２２】
２．ＭＡＬＤＩ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳによるオリゴ糖の特徴づけ
精製した抗体（１００μｇずつ、１．０ｍｇ／ｍｌ）を４μｌのＰＮＧａｓｅＦ、Ｎ−結合糖（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を切断するエンドグリコシダーゼで処理した。サンプルを３７℃で一晩インキュベートし、続いて５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８）で透析した。エタノール沈澱によって該タンパク質を除去した。Glygen Corp（Columbia, MD）製のマイクロカーボンカラムから放出した糖を、発売元のプロトコルにほぼしたがって脱塩した。溶出は５μｌに減少していた。１μｌずつのグリカンサンプルのアリコートを、１：１（ｖ：ｖ）で基質溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシけい皮酸、もしくは２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Applied Biosystems）と混合し、ＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットし、空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−Ｑ−ＴＯＦタンデム分析によって、未反応の糖複合体の分析を行った。ｏ−ＭＡＬＤＩソース２（MDS Sciex， Concord， Ontario， Canada）を備えたＱＳＴＡＲパルサーｉマススペクトロメーター全ての質量スペクトルを記録した。それは、いくつかのクラスの糖の質量（組成物）を提供するものである。双方のＭＡｂのグリカンプロファイリングを行った後、各グリカン中の可能なグリコシド結合を調べた。高ＣＩＤ質量スペクトルを、ＴＯＦ／ＴＯｆオプティックス（Applied Biosystems， Forster City，CA）を備えた4700 Proteomicsアナライザーに記録した。高ＣＩＤ ＭＳＭＳ実験では、衝突エネルギーを１ｋＶとした。衝突細胞中で、選択されたオリゴ糖イオンを２ｘ１０−６Ｔｏｒｒの圧力でアルゴンと衝突させる。
【０２２３】
ニワトリ由来７Ｆ１２における１１の主なグリカンでの糖組成物および可能なグリコシド結合をＭＡＬＤＩ ＴＯＦマススペクトロメトリーによって分析し、図１３Ａおよび１３Ｂにまとめた。オリゴ糖の構造は、高マンノースタイプ、複合体タイプ、およびハイブリッドタイプＮ-グリカンを含有することがわかった。いずれの構造もフコシル残基を含んでいなかった。
【０２２４】
ＩｇＧサンプル（２００μｇ）を、２Ｎ ＴＦＡ （中性糖の推定用）または６Ｎ ＨＣｌ（アミノ糖の推定用）を用いて、１００℃で４時間、酸加水分解に供した。サンプルを、真空遠心分離によって常温で乾燥させ、ＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Dionex）による分析を行う前に２００μｌの水に再構成した。単糖を、予備カラムAmino Trapを備えたCarboPac PA10 ４ｘ２５０ｍｍカラムとBorate Trap （Dionex）を用いて分離した。処理は、Dionex Technical Note 53にしたがって行った。単糖のピーク同一性および相対量を、単糖標準（Dionex）を用いて行った。
【０２２５】
ニワトリおよびＣＨＯ生成７Ｆ１２の糖分析を以下の表１にまとめた。
【０２２６】
【表１】
2008530243.tif 000002
【０２２７】
単糖分析によって、糖組成物における相違が明らかになった。Ｎ−アセチルグルコサミン残基、マンノース残基、および非常に低レベルのガラクトース残基がニワトリ生成７Ｆ１２に存在することがわかった。フコース残基は、ニワトリ生成７Ｆ１２において検出されなかった。対照的に、ＣＨＯ発現抗体調製物は、フコシル残基を含有していた。
【０２２８】
末端糖残基を同定するためのＣＥおよびマス・スペクトロメトリーによるグリカンのエキソグリコシダーゼ分析によって、ニワトリ管状腺細胞で生成されたＭＡｂ７Ｆ１２においては、末端シアル酸およびフコース残基が欠如していることが確認された。 
【０２２９】
要約すれば、Ｎ結合オリゴ糖プロファイルにおける最も顕著な違いは、ニワトリにおいて生成された抗体においては、マンノースタイプＮ-グリカンが多く存在し、フコースが存在せず、ガラクトース残基の含有率が非常に低いことであった。
【０２３０】
実施例４：ニワトリ発現抗ＰＳＭＡ抗体の機能的分析
本実施例においては、ニワトリ卵発現７Ｆ１２抗ＰＳＭＡ抗体の結合アフィニティー、内在化、in vivoでの血清半減期、および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を含む機能的特性を調べた。
【０２３１】
１．ＰＳＭＡの結合アフィニティー
ＬＮＣａＰ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）上のＰＳＭＡを抗原として用いて、フローサイトメトリーによる抗体結合のアッセイを行った。１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で、細胞を増殖させた。ニワトリ管状腺細胞において生成された７Ｆ１２の抗原結合特性を、ＣＨＯ細胞において生成された７Ｆ１２の抗原結合特性と比較した。２００，０００細胞／ウェルを、様々な濃度の抗体の５０μｌアリコートとともに３０分間、２回インキュベートした。細胞を２回洗浄し、その後、１：２００で稀釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ ＰＥ標識抗体（Jackson ImmunoResearch）、５０μｌ／ウェルを３０分間４℃で添加した。細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２回希釈し、ＦＡＣＳでアッセイした。ＬＮＣａＰ細胞上でのＭＡｂのＰＳＭＡへの結合のＥＣ５０値を、GraphPad Prism 3.0（GraphPad Software）を用いた結合曲線から測定した。
【０２３２】
双方の抗体調製物は、類似のＥＣ５０値をもつＬＮＣａＰ細胞上に発現したＰＳＭＡに対してほぼ同一の結合曲線を示した。該データは、ニワトリ由来の抗体とＣＨＯ由来の抗体は、異なるようにグリコシル化されるが、同じように抗原を認識し、結合することが示された。
【０２３３】
２．抗体内在化
７Ｆ１２ｍＡｂとＰＳＭＡとが結合することによって、抗体の内在化が導かれる。ある可能な適用において、ＭＡｂは、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞を標的とし、それを破壊するためにサイトトキシンと結合することがある。ＬＮＣａＰ細胞上でＰＳＭＡと結合した抗体の内在化は、細胞をＭＡｂおよびＨｕｍ−Ｚａｐ （Advanced Targeting Systems）とともにインキュベートすることによって測定することができる。ＨｕｍＺａｐは、リボソーム不活性化タンパク質、サポニン、と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体である。７Ｆ１２ＭＡｂ／Ｈｕｍ−Ｚａｐ複合体が細胞表面上でＰＳＭＡと結合したとき、細胞は殺傷され、内在化される。一方、抗体もしくはＨｕｍ−Ｚａｐのみでは、ＬＮＣａＰ細胞に対して毒性を持たない。ＬＮＣａＰ細胞（１０，０００／ウェル）を２回、４８時間３７℃で、３００ｎｇのＨｕｍ−Ｚａｐおよび３００ｎｇの７Ｆ１２ＭＡｂまたは対照ＭＡｂを含有する１５０μｌの培養培地中でインキュベートした。CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay （Promega）を用いて、細胞増殖および生存を測定した。１０，０００の接着性ＬＮＣａＰ細胞／ウェルを含む細胞培地中で、抗体の希釈液を４℃で２時間インキュベートすることによる内在化アッセイも行った。抗体溶液を除去し、２００ｎｇのＨｕｍＺａｐを含有する１５０μｌの培地と取り換えた。３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞生存度を測定した。抗体内在化のＥＣ５０値をPrism3.0（GraphPad Software）を用いて図で表した。 
【０２３４】
ニワトリ発現抗体およびＣＨＯ発現抗体調製物は、類似の有効性で内在化した。抗体濃度の範囲で試験したとき、ニワトリ由来７Ｆ１２ＭＡｂおよびＣＨＯ由来７Ｆ１２ＭＡｂ双方の内在化のＥＣ５０値は、０．４９ｎＭであった。
【０２３５】
３．In vivo半減期
ニワトリ生成７Ｆ１２ＭＡｂのin
vivo 半減期を、ＢＡＬＢ／ｃマウス中ＣＨＯ生成7Ｆ１２ＭＡｂ抗体と並行して、放射線標識抗体を静脈注射することによって分析した。１０μｇのＭＡｂタンパク質を、１２５Ｉを用いたヨードビーズ法（Pierce）によって軽くヨード化した（抗体あたり１ヨード未満）。実験前１週間、６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Taconic Farms, Germantown, NY）に、０．１ｍｇ／ｍｌのヨウ化カリウムを飲み水に混ぜて摂食させた。４匹のマウスにタンパク質あたり約６００，０００ｃｐｍの標識ＭＡｂを用いて尾の静脈に静脈注射した。全身の放射能を、選択された時間に、全身ガンマカウンター（Ludlum計数装置を備えたWm. B. Johnson NaI結晶検波器）を用いて測定した。半減期を、残存放射能の指数回帰式分析によって計算した。 
【０２３６】
ニワトリ管状腺細胞によって生成された７Ｆ１２ＭＡｂは、半減期（ｔ１／２）＝１０２．４±０．９時間でなくなったが、ＣＨＯ細胞によって生成された７Ｆ１２ＭＡｂは、半減期＝２０７．５±１８．３時間で無くなった。
【０２３７】
４．ＡＤＣＣ活性
ＬＮＣａＰ−Ｃ４２Ｂ細胞を改良５１Ｃｒ、ＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。ヘパリン化全血からヒト末梢血単核細胞を、標準的なフィコール−ペーク分離（Ficoll-paque separation）によって精製した。該細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、該細胞を採集し、培養培地で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。２００万個の標的ＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ細胞を、２００μＣｉ５１Ｃｒを用いて、合計体積の１ｍｌで、３７℃で一晩インキュベートした。該標的細胞を１回洗浄し、１ｍｌの培地中に再懸濁し、３７℃でさらに３０分インキュベートした。最終インキュベート後、該標的細胞を１回洗浄し、最終体積を１×１０５細胞／ｍｌとした。最終的なＡＤＣＣアッセイでは、１００μｌの標識されたＬＮＣａＰ細胞を、５０μｌのエフェクター細胞および５０μｌの抗体とともにインキュベートした。最終的な標的対エフェクターの比率は、１：１００とした。全ての研究において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を用い、ＣＨＯ由来抗ＰＳＭＡ、７Ｆ１２抗体と比較した。他の対照としては、ａ）標的およびエフェクター細胞、但し抗体を含まないもの、ｂ）エフェクター細胞を含まない標的細胞、およびｃ）３％ Triton X-100の存在下での標的およびエフェクター細胞、が挙げられる。３７℃で４時間のインキュベートを行った後、上清を回収し、２４０〜４００ｋｅＶの読み取りウインドウをもつガンマカウンター（Cobra II自動ガンマ、Packard Instruments社製）で計数した。１分ごとのカウントを、抗体濃度の関数としてプロットし、データを非線形回帰式、およびプリズム・ソフトウェア（Prism software）（San Diego, CA）を用いたＳ字形の容量反応（sigmoidal dose response）（変数傾斜）によって分析した。パーセント溶解は以下の式によって求められる。  
【０２３８】
％溶解＝（サンプルＣＰＭ−抗体を含まないＣＰＭ）／ＴｒｉｔｏｎＸ ＰＭ−抗体を含まないＣＰＭ）Ｘ１００
【０２３９】
全ての研究において、ＥＣ５０値および％溶解の両方をモニターすることが重要であることがわかった。例えば、２つの抗体を比較して、ＥＣ５０値および％溶解のいずれか、または双方における変化を求めることができる。
【０２４０】
２つの異なるＡＤＣＣ実験の結果を、図１４Ａ（ＩＬ−２刺激エフェクター細胞）および図１４Ｂ（新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞）に示す。図１４Ａは、ＣＨＯ由来ＭＡｂが容量依存性の細胞溶解を誘発し、それがＩＬ−２刺激エフェクター細胞で、ＥＣ５０＝０．１１μｇ／ｍｌの３８％溶解でプラトーに達することを示している。対照的に、ニワトリ卵由来ＭＡｂは、より力価が高く、有効である。ニワトリ卵由来ＭＡｂの最大％溶解は、６０％であり、２つの異なる抗体製剤を有していた。この物質のＥＣ５０が０．０１８μｇ／ｍｌであったので、ＣＨＯ由来ＭＡｂに対する力価の上昇も証明された。すなわち、ニワトリ発現抗体のＥＣ５０は、ＣＨＯ発現抗体のそれの約６倍であった。最終的に、期待通りに、アイソタイプ対照は、細胞溶解を誘発しなかった。非刺激エフェクター細胞（新鮮なＰＢＭＣｓ）をもつＡＤＣＣにおいては、この値の違いはより大きかったが、細胞殺傷はより小さかった（図１４Ｂ）。
【０２４１】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）は、ＡＤＣＣを媒介する重要なレセプターである。ＡＤＣＣ反応の特異性は、標的細胞とエフェクターの相互作用をブロックすることが知られている。モノクローナル抗体を用いる細胞は、ＣＤ１６に対するものである。抗ＣＤ１６でのＡＤＣＣの遮断は、上記ＡＤＣＣアッセイのようにして、以下の変形を用いて行われる。該細胞を１μｇ／ｍｌ（飽和容量）または０．０１μｇ／ｍｌ（サブ最適容量）のいずれかの７Ｆ１２抗ＰＳＭＡ抗体（ニワトリもしくはＣＨＯ発現）とともに、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８またはアイソタイプ対照抗体の存在下または不存在下で、インキュベートした。その結果を図１５に示す。１μｇ／ｍｌの抗ＰＳＭＡ抗体は、抗ＣＤ１６抗体の不存在下で、ＣＨＯ由来抗体およびニワトリ由来抗体のそれぞれの場合、約１５％および３８％溶解を誘発した。この％溶解は、抗ＣＤ１６抗体の不存在下で４％に減少したが、一方、アイソタイプ対照では、影響がなかった。  
【０２４２】
実施例５：ＦＵＴ８陰性宿主細胞中の脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体の調製および特徴
この実施例において、フコシルトランスフェラーゼ酵素を欠くため、その細胞株が糖中にフコースを欠くタンパク質を生成する細胞株中に、完全ヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体を発現させた。抗体間の構造的および特性的違いを調べるために、キャピラリー電気泳動法、アミノ酸配列の比較、質量分光による質量差、およびキャピラリー等電点フォーカシングによる負荷ばらつきを含む種々の科学的技法を用いて、脱フコシル化された抗体を、フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体（フコシルトランスフェラーゼ酵素を含有する異なる細胞株中で発現させたもの）と対照させて調べた。
【０２４３】
抗ＰＳＭＡ完全ヒトモノクローナル抗体２Ａ１０を用いた。２Ａ１０重鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を図５Ａに示す。２Ａ１０軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を図５Ｂに示す。２Ａ１０重鎖および軽鎖可変領域の配列を、発現ベクターにサブクローニングした。シグナル配列および最適Ｋｏｚａｋ配列を含む２Ａ１０カッパ可変領域ｃＤＮＡを、ヒトカッパ定常領域を持つフレーム内にサブクローニングした。シグナル配列および最適Ｋｏｚａｋ配列を含む２Ａ１０重鎖可変領域ｃＤＮＡを、ヒトガンマ１重鎖定常領域を持つフレーム内にサブクローニングした。軽鎖および重鎖の発現は、両方とも、ＳＲアルファプロモーターによって駆動される。この発現ベクターについては、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８９５４号にさらに詳しく記載されている。その内容を本明細書において引用によって援用する。 
【０２４４】
ＤＮＡエレクトロポレーションによって、該発現ベクターをＦＵＴ８−／−宿主細胞株Ｍｓ７０４にトランスフェクトした。該Ｍｓ７０４ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作製されたものである（例えば、米国特許公開第２００４０１１０７０４号（Yamane et al. およびYamane-Ohnuki
et al. （2004） Biotechnol Bioeng 87:614-22）。該Ｍｓ７０４細胞を採用して、１００μＭのヒポキサンチンおよび１６μＭのチミジン（Invitrogen、＃１１０６７−０３０）ならびに６ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen、＃２５０３０−０８１）が添加された成長培地ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３２５ＰＦ ＣＨＯ培地（ＪＲＨ、＃１４３３５）中で、懸濁培養液において増殖させた。エレクトロポレーションに用いられるベクターＤＮＡをエタノール沈澱させ、水中に再懸濁させた。１．５μｇのＤＮＡを８つのエレクトロポレーションに使用した。Ｍｓ７０４細胞を、細胞をスクロース緩衝液（ＳＢＳ）で洗浄し、該細胞を１×１０７細胞／ｍｌのＳＢＳ溶液に再懸濁させ、トランスフェクションに供するために調製した。４００μｌの細胞を構築物ＤＮＡと混合し、２５０ボルト、２７５マクロファラデー容量、および２５オームの抵抗に設定してエレクトロポレーションを行った（BTX Molecular Delivery Systems＃６３０エレクトロセルマニピュレーター）。該細胞をエレクトロポレーションキュベットから除去し、２０ｍｌの成長培地を添加した。該細胞を、２００μｌを用いて、９６ウェル皿に、約４×１０４細胞／ウェルの濃度で各ウェルに播いた。エレクトロポレーションの２日後、１５０μｌの培地を各ウェルから除去し、１５０μｌの選択培地、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Invitrogen ＃１０１３１−０３５）を含む成長培地と置換した。３〜７日おきに、各ウェルにつき１５０μｌの選択培地を新鮮な培地と取り換えた。 
【０２４５】
ＣＨＯ ＤＧ４４宿主細胞（ＦＵＴ８＋／＋）を、類似の処置を用いた同一の２Ａ１０構築物を用いてエレクトロポレーションし、フコシル化された糖を含有する組換え２Ａ１０抗体を発現するＣＨＯ ＤＧ４４トランスフェクタントを確立した。
【０２４６】
最大作製Ｍｓ７０４およびＣＨＯ ＤＧ４４クローンを拡張し、組換え２Ａ１０抗体を細胞培養上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。.
【０２４７】
Ｍｓ７０４に由来するＮ−結合オリゴ糖サンプルとＣＨＯ
ＤＧ４４由来抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体サンプルの比較分析を、キャピラリー電気泳動法レーザー誘導性蛍光（ｃＬＩＦ）（Chen and Evangelista （1998） Electrophoresis 15:1892）を用いて行った。精製された抗体のＮ−結合オリゴ糖を、ペプチドＮ−グリカナーゼ（プロザイム）を添加し、一晩インキュベートすることによって放出させた。タンパク質をエタノール沈澱させた。そして、上清を含有する糖を新しい試験管に移し、Speedvacを用いて乾燥させた。その糖を再懸濁し、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）を用い、脱シアル化とフコース残基の喪失を最小限にした穏やかな還元アミノ化条件のもとで誘導体化した。該反応付加物を、レーザー誘導性蛍光検出装置（ベックマンコールター（Beckman Coulter））を用いたキャピラリー電気泳動法によって分析した（MaとNashabeh （1999） Anal.
Chem. 71:5185）。オリゴ糖プロファイルにおける、Ｍｓ７０４細胞株から取得した抗体と、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株からのものとの相違を観察した。Ｍｓ７０４由来の抗ＰＳＭＡ抗体においてフコース残基が存在しないことに一致している。パルス型アンペロメトリー検出方式をもつＤｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣアニオン交換を用いた単糖分析の結果、Ｍｓ７０４発現抗体があらゆるフコース残基を持たないことが明らかになった。その結果を以下の表２にまとめた。
【０２４８】
【表２】
2008530243.tif 000003
【０２４９】
キャピラリー電気泳動法および単糖分析によって示されたオリゴ糖における相違は別にして、Ｍｓ７０４由来およびＣＨＯ ＤＧ４４由来抗ＰＳＭＡ抗体タンパク質サンプルは、実質的に同一であった。Ｎ末端タンパク質配列の分析から、Ｎ末端アミノ酸配列が同一であることが明らかにされた。Ｍｓ７０４由来、およびＣＨＯ ＤＧ４４由来抗ＰＳＭＡ抗体の軽鎖の、質量分光による質量は、それぞれ２３，５５２および２３，５４８であった。これは、器具の誤差の範囲である。この２つの抗体について、標準的なキャピラリー等電分画キットアッセイ（ベックマンコールター（Beckman Coulter））を用いた試験も行った。それによれば、この２つの抗体サンプルは、実質的に同一の等電点を持っていた。これらの研究は、Ｍｓ７０４およびＣＨＯ ＤＧ４４細胞に由来する抗体サンプルのタンパク質成分が、Ｍｓ７０４由来抗体の脱フコシル化を除き、実質的に同じであることを示すものである。糖分析によれば、脱フコシル化された形態の抗体は、フコシル化された形態の抗体より多くの末端ガラクトース残基を有していた。
【０２５０】
実施例６：ＦＵＴ８陰性宿主細胞において発現した脱フコシル化された抗ＰＳＭＡ抗体のＡＤＣＣ活性の評価
ＬＮＣａＰ−Ｃ４２Ｂ細胞（ViroMed
Laboratories, Minnetonka, MNから市販されているものを取得）に対する、Ｍｓ７０４０由来（脱フコシル化された）２Ａ１０抗体の細胞傷害性活性を、改良５１Ｃｒ、ＡＤＣＣアッセイにおいて試験した。ヘパリン化全血からヒト末梢血単核細胞を、標準的なフィコール−ペーク分離（Ficoll-paque separation）によって精製した。該細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、該細胞を採集し、培養培地で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁させた。２００万個の標的ＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ細胞を、２００μＣｉ５１Ｃｒを用いて、合計体積の１ｍｌで、３７℃で一晩インキュベートした。該標的細胞を１回洗浄し、１ｍｌの培地中に再懸濁させ、３７℃でさらに３０分インキュベートした。最終インキュベート後、該標的細胞を１回洗浄し、最終体積を１×１０５細胞／ｍｌとした。最終的なＡＤＣＣアッセイでは、１００μｌの標識されたＬＮＣａＰ細胞を、５０μｌのエフェクター細胞および５０μｌの抗体とともにインキュベートした。最終的な標的対エフェクターの比は、１：１００とした。全ての研究において、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を用い、ＣＨＯ ＤＧ４４由来（フコシル化された）抗ＰＳＭＡ２Ａ１０抗体と比較した。他の対照としては、ａ）標的およびエフェクター細胞、但し抗体を含まないもの、ｂ）エフェクター細胞を含まない標的細胞、およびｃ）３％ Triton X-100の存在下での標的およびエフェクター細胞、が含まれる。３７℃で４時間のインキュベートを行った後、上清を回収し、２４０〜４００ｋｅＶの読み取りウインドウをもつガンマカウンター（Cobra II自動ガンマ、Packard Instruments社製）で計数した。１分ごとのカウントを、抗体濃度プロットし、データを非線形回帰式、およびプリズム・ソフトウェア（Prism software）（San Diego, CA）を用いたＳ字形の容量反応（sigmoidal dose response）（変数傾斜）によって分析した。パーセント溶解は以下の式によって求められる。 
【０２５１】
％溶解＝（サンプルＣＰＭ−抗体を含まないＣＰＭ）／ＴｒｉｔｏｎＸ ＰＭ−抗体を含まないＣＰＭ）Ｘ１００
【０２５２】
３つの異なるＡＤＣＣ実験の結果を、図１６Ａ、１６Ｂ（ＩＬ−２刺激エフェクター細胞）および図１６Ｃ（新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞）に示す。フコシル化された２Ａ１０および脱フコシル化された２Ａ１０の濃度を変えながら、ＬｎＣａＰ細胞株の細胞傷害性の曲線を求め、また、ＥＣ５０および％溶解値を求めた。図１６Ａ、１６Ｂおよび図１６Ｃに対応する３つの実験の結果をそれぞれ下記の表３に示す。
【０２５３】
【表３】
2008530243.tif 000004
【０２５４】
脱フコシル化された形態の抗体において、ＥＣ５０値が低く、溶解値が高いことから、Ｍｓ７０４由来（すなわち、脱フコシル化された）２Ａ１０ ｍＡｂの力価は、ＣＨＯ ＤＧ４４由来（すなわち、フコシル化された）２Ａ１０ｂ ｍＡｂと比較して、明らかに上昇している。例えば、脱フコシル化された形態のＥＣ５０値は、約３倍乃至１８倍低い。未刺激のエフェクター細胞（新鮮なＰＢＭＣ）でのＡＤＣＣ活性は、ＩＬ−２刺激エフェクター細胞と比較して、ＥＣ５０値には大きな差を示したが、全体的な細胞殺傷は低かった（図１６）。
【０２５５】
ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）は、ＡＤＣＣを媒介する重要なレセプターである。ＡＤＣＣ反応の特異性は、ＣＤ１６に対するモノクローナル抗体を用いる標的細胞とエフェクターの相互作用を遮断することが知られている。抗ＣＤ１６でのＡＤＣＣの遮断は、上記ＡＤＣＣアッセイのようにして、以下の変形を用いて行われる。該細胞を１μｇ／ｍｌ（飽和容量）または０．０１μｇ／ｍｌ（サブ最適容量）のいずれかの２Ａ１０抗ＰＳＭＡ抗体（Ｍｓ７０４またはＣＨＯ ＤＧ４４発現）とともに、５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体３Ｇ８またはアイソタイプ対照抗体の存在下または不存在下で、インキュベートした。その結果を図１７に示す。１μｇ／ｍｌの抗ＰＳＭＡ抗体は、抗ＣＤ１６抗体の不存在下で、フコシル化された抗体および脱フコシル化された抗体のそれぞれの場合、約１２％および３７％溶解を誘発した。この％溶解は、抗ＣＤ１６抗体の不存在下で５％未満に減少したが、一方、アイソタイプ対照では、影響がなかった。  
【０２５６】
均等物
当業者であれば、ルーチンの実験以上のことをすることなく、ここに解説した本発明の具体的な実施の形態の均等物を数多く、認識し、または確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】図１は、４Ａ３、７Ｆ１２、８Ｃ１２、８Ａ１１および１６Ｆ９（それぞれ、配列番号：１〜５）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号：７３）との配列比較を示す図である。
【図２】図２は、４Ａ３、７Ｆ１２および８Ｃ１２（それぞれ、配列番号：１０〜１２）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶｋＬ６アミノ酸配列（配列番号：７４）との配列比較を示す図である。
【図３】図３は、８Ａ１１および１６Ｆ９（それぞれ、配列番号：１３および１４）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖｋ０４／０１４アミノ酸配列（配列番号：７５）との配列比較を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、１Ｃ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：７８）およびアミノ酸配列（配列番号：９）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：２７）、ＣＤＲ２（配列番号：３６）およびＣＤＲ３（配列番号：４５）領域を線で表し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、１Ｃ３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８２）およびアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：５４）、ＣＤＲ２（配列番号：６３）およびＣＤＲ３（配列番号：７２）領域を線で表し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図５Ａ】図５Ａは、２Ａ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：７９）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：２４）、ＣＤＲ２（配列番号：３３）およびＣＤＲ３（配列番号：４２）領域を線で表し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２Ａ１０ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８３）およびアミノ酸配列（配列番号：１５）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：５１）、ＣＤＲ２（配列番号：６０）およびＣＤＲ３（配列番号：６９）領域を線で表し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、２Ｃ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８０）およびアミノ酸配列（配列番号：７）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：２５）、ＣＤＲ２（配列番号：３４）およびＣＤＲ３（配列番号：４３）領域を線で表し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２Ｃ６ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８４）およびアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：５２）、ＣＤＲ２（配列番号：６１）およびＣＤＲ３（配列番号：７０）領域を線で表し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、２Ｆ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８１）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：２６）、ＣＤＲ２（配列番号：３５）およびＣＤＲ３（配列番号：４４）領域を線で表し、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、２Ｆ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：８５）およびアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す図である。ＣＤＲ１（配列番号：５３）、ＣＤＲ２（配列番号：６２）およびＣＤＲ３（配列番号：７１）領域を線で表し、ＶおよびＪ生殖系列起源を示している。
【図８】図８は、２Ａ１０、２Ｃ６および２Ｆ５（それぞれ、配列番号：６〜８）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号：７３）との配列比較を示す図である。
【図９】図９は、１Ｃ３（配列番号：９）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶＨ３−３０．３アミノ酸配列（配列番号：７６）およびＪＨ６ｂ生殖系列（配列番号：８６）との配列比較を示す図である。
【図１０】図１０は、２Ｃ６（配列番号：１６）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶｋＬ６アミノ酸配列（配列番号：７４）およびＪＫ３生殖系列（配列番号：８７）との配列比較を示す図である。
【図１１】図１１は、１Ｃ３、２Ａ１０および２Ｆ５（それぞれ、配列番号：１８、１５および１７）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号：７７）およびＪＫ４生殖系列（配列番号：８８）との配列比較を示す図である。
【図１２】図１２は、Ｏｖ７．５およびＯｖ１５発現ベクターを示す図である。Ｏｖの５’および３’制御配列の位置を示している。ベクターの３’末端には、全ての細胞タイプにおいて機能するプロモーター（Ｃｘ）によって動かされるＥＧＥＰとピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）の双方を有するカセットが含まれており、安定にトランスフェクトされたｃＥＳ細胞株の単離およびキメラに寄与するｃＥＳ細胞の同定を容易にしている。ＭＡｂカセットの詳細を、図の下部に示している。細いブラックのラインは、ヒトＬおよびＨ鎖に由来する、イントロン配列もしくは非翻訳配列を表す（但し、Ｏｖ１５Ｍａｂ７Ｆ１２構築物にはイントロン配列は存在しない）。ＳｉＧＶＬ：Ｌ鎖のシグナルペプチドの配列、ＶＬ：Ｌ鎖のＶ遺伝子の配列、Ｃκ：カッパＬ鎖の定常領域の配列、ＩＲＥＳ：内部リボソームエントリー配列、ＳｉＧＶＨ：Ｈ鎖のシグナルペプチドの配列、ＶＨ：Ｈ鎖のＶ遺伝子の配列、ＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３：ガンマ１Ｈ鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの配列。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦマス・スペクトロメトリーによって測定された、ニワトリ卵において発現した７Ｆ１２抗ＰＳＭＡ抗体のオリゴ糖構造をまとめた図である。濃い色の丸印はマンノースを表し；薄い色の丸印はヘキソース（マンノースまたはガラクトース）を表す。そして濃い色の四角はＮ−アセチルグルコサミンを表す。垂直方向の線は、最後のヘキソースがマンノースまたはＮ−アセチルグルコサミン残基のいずれかに、その線に沿って結合することができることを示している。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＣＨＯ細胞発現７Ｆ１２（“７Ｆ１２”）およびニワトリ発現７Ｆ１２を用いたＡＤＣＣアッセイの結果を、アイソタイプ対照と比較して示すグラフである。結果をパーセント溶解で表している。図１４Ａは、 ＩＬ−２刺激エフェクター細胞を用いた結果を示す図である。図１４Ｂは、新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞を用いた結果を示す図である。
【図１５】図１５は、ＣＨＯ細胞発現７Ｆ１２（“７Ｆ１２”）およびニワトリ発現７Ｆ１２のＡＤＣＣアッセイが抗ＣＤ１６抗体によってブロックされる実験の結果を、アイソタイプ対照と比較して示す棒グラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、脱フコシル化された２Ａ１０ｍＡｂ（“脱フコース”）を用いたＡＤＣＣアッセイの結果を、フコシル化された２Ａ１０ｍＡｂ（“親”）およびアイソタイプ対照と比較して示すグラフである。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ標的細胞およびＩＬ−２刺激エフェクター細胞を用いた別個の２つの実験を示す。図１６Ｃは、ＬＮＣａＰ−Ｃ４２ｂ標的細胞および新鮮なヒト末梢血エフェクター細胞を用いた実験を表している。
【図１７】図１７は、脱フコシル化された２Ａ１０ｍＡｂ（“脱フコース”）を用いたＡＤＣＣアッセイの結果を、フコシル化された２Ａ１０ｍＡｂ（“親”）を用いた場合、およびアイソタイプ対照を用いた場合または抗体対照を用いない場合と比較して示す棒グラフであり、ＡＤＣＣ活性が抗ＣＤ１６抗体によってブロックされたことを示すものである。
【図１】
2008530243.tif 000005
【図２】
2008530243.tif 000006
【図３】
2008530243.tif 000007
【図４Ａ】
2008530243.tif 000008
【図４Ｂ】
2008530243.tif 000009
【図５Ａ】
2008530243.tif 000010
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2008530243.tif 000012
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008530243.tif 000018
【図１１】
2008530243.tif 000019
【図１２】
2008530243.tif 000020
【図１３Ａ】
2008530243.tif 000021
【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
2008530243.tif 000023
【図１４Ｂ】
2008530243.tif 000024
【図１５】
2008530243.tif 000025
【図１６Ａ】
2008530243.tif 000026
【図１６Ｂ】
2008530243.tif 000027
【図１６Ｃ】
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【図１７】
2008530243.tif 000029
【配列表】
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【国際調査報告】
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