(57)【要約】本発明はCTGFが血管疾患の発症及び進行リスクの増加を示す診断マーカーとなるという発見に関する。【選択図】    図１
2008541062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病に罹患しているか又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体において糖尿病と関連する血管合併症の発症のリスクを診断する方法であって、被験体から生体サンプルを採取するステップ、該生体サンプル中のCTGF（connective tissue growth factor：結合組織増殖因子）又はCTGF断片のレベルを測定するステップ、及び生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルをCTGF又はCTGF断片の標準レベルと比較するステップを含み、ここで、生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルの上昇が糖尿病と関連する血管合併症の発症リスクの存在を示す前記方法。
【請求項２】
糖尿病に罹患しているか又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体がヒト被験体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血管合併症が大血管合併症又は細小血管合併症である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
血管合併症が心血管系合併症、脳血管系合併症及び末梢血管系の合併症よりなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
血管合併症が内膜中膜肥厚（intima-medial thickness：IMT）の増加である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生体サンプル中のCTGF断片又はCTGFのレベルが、国際公開第03/024308号パンフレットに記載されたアッセイを用いて検出可能及び定量化可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生体サンプルが体液に由来するサンプルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルが尿又は血漿である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
被験体が１型糖尿病に罹患している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験体が上昇した血圧を呈する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
被験体がミクロアルブミン尿症である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CTGFが血管疾患の発症及び進行リスクの増加を示す診断マーカーとなるという発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、心血管系合併症に主に由来する罹患率及び死亡率の増加と関連がある。
【０００３】
血管病変の進行は糖尿病状態で強まり、またこのリスクは高血圧との共存により一層際立つ(Christliebら(1981) Diabetes 30 (Suppl 2):90-96； Krolewskiら (1988) N Engl J Med 318:140-145.)。糖尿病と高血圧が共に分離され(cosegregate)、血管の損傷を促進させる機構は、いまだに明らかにされていない。いずれの病状も内皮機能不全、炎症細胞の蓄積、血管平滑筋細胞（vascular smooth muscle cell：VSMC）の増殖及び移動、並びに血管壁における細胞外マトリックスの沈着と関連している（Ross (1993) Nature 362:801-809；ClowesとKarnovsky (1977) Nature 265:625-626；Clowesら(1983) Lab Invest 49:327-333；及びJacksonとSchwartz (1992) Hypertension 20:713-736を参照されたい)。
【０００４】
糖尿病個体と非糖尿病個体におけるミクロ及びマクロアルブミン尿の発症は、大血管疾患の発症リスクを増大させる。タンパク尿を呈する１型糖尿病患者は、タンパク尿を示さない１型患者と比べて大血管疾患のリスクを１０倍有する。ミクロアルブミン尿と頚動脈内膜中膜肥厚(intima medial thickness：IMT)のような血管疾患合併症との関係が、最近になって１型糖尿病患者のDCCT/EDICコホートで明らかにされた（The Diabetes Control and Complications Trial/ Epidemiology of Diabetes and Complications Research Group (2003) N Engl J Med 348:2294-2303）。糖尿病性腎症は、血圧上昇及び脂質代謝異常と関連がある。これらの病状は、通常は糖尿病患者において血管疾患の進行に先行し、血管疾患を促進する（Perkinsら(2003) N Engl J Med 348:2285-2293）。
【０００５】
CTGF（connective tissue growth factor：結合組織増殖因子）は、線維芽細胞の走化性と分裂促進性の双方に作用するヒト臍帯静脈内皮細胞の産物として最初に同定された（例えば、Bradhamら(1991) J Cell Biol 114:1285-1294及び米国特許第5,408,040号を参照されたい）。CTGFは、CCN遺伝子ファミリーに属する。CCNとは、このファミリーのプロトタイプメンバーであるCTGF、Cyr61及びNovにちなんで名づけられた(Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130)。CTGF様因子の分子量は35〜40kDaで変化し、またこれらの分子の構造は４つのモジュールからなっている。すなわち、N末端のIFGBP様ドメイン、Von Willebrand因子C型リピートドメイン、トロンボスポンジン１型リピートドメイン、及びC末端二量化ドメインである(Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130)。
【０００６】
CTGFは、それを構成する全アミノ酸量の11％を超える３８個の保存されたシステイン残基によって特徴付けられる。この分泌タンパク質の４つのエクソンの各々にコードされているシステインは、内部で、短く、フレキシブルでかつプロテアーゼに感受性の高い３２アミノ酸ペプチドによって連結されたアミノ末端ドメインとカルボキシ末端ドメインをもたらす対をなす (Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130)。CTGFは、いわゆる「ヒンジ」と呼ばれる領域内部で容易に切断され、その結果、血液及び尿中に存在するCTGFの優勢型であるCTGFのアミノ末端断片(CTGF N断片；国際公開第00/035936号パンフレット参照)が生じる。
【特許文献１】米国特許第5,408,040号
【特許文献２】国際公開第00/035936号パンフレット
【非特許文献１】Christliebら(1981) Diabetes 30 (Suppl 2):90-96
【非特許文献２】Krolewskiら (1988) N Engl J Med 318:140-145
【非特許文献３】Ross (1993) Nature 362:801-809
【非特許文献４】ClowesとKarnovsky (1977) Nature 265:625-626
【非特許文献５】Clowesら(1983) Lab Invest 49:327-333
【非特許文献６】JacksonとSchwartz (1992) Hypertension 20:713-736
【非特許文献７】The Diabetes Control and Complications Trial/ Epidemiology of Diabetes and Complications Research Group (2003) N Engl J Med 348:2294-2303
【非特許文献８】Perkinsら(2003) N Engl J Med 348:2285-2293
【非特許文献９】Bradhamら(1991) J Cell Biol 114:1285-1294
【非特許文献１０】Bork (1993) FEBS Lett 327:125-130
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
CTGF N断片の血漿中レベルにおける変化によりCTGFの活性化と産生の程度が予測されるので、本研究はCTGF及びCTGF N断片の血中レベルが１型糖尿病患者の血管疾患及び腎疾患の発症リスクの増加のマーカーになるかどうかを決定するために行われた。したがって、本発明は、血管疾患の発症及び進行のリスク増加を示す診断マーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、糖尿病に罹患している又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体において糖尿病と関連する血管合併症の発症のリスクを診断する方法であって、被験体から生体サンプルを採取するステップ、該生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルを測定するステップ、及び生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルをCTGF又はCTGF断片の標準レベルと比較するステップを含み、ここで、生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルの上昇が糖尿病と関連する血管合併症の発症リスクの存在を示す、前記方法を提供する。
【０００９】
典型的には、糖尿病に罹患している又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体は、ヒト被験体である。
【００１０】
いくつかの実施形態で、血管合併症は、大血管合併症又は細小血管合併症である。特に、血管合併症は、心血管系合併症若しくは脳血管系合併症、又は末梢血管系の合併症であってもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態で、血管合併症は、頚動脈内膜中膜肥厚である。
【００１２】
一般に、生体サンプル中のCTGF断片又はCTGFのレベルは、国際公開第03/024308号パンフレットに記載されたアッセイを用いて検出可能及び定量化可能である。
【００１３】
いくつかの実施形態で、生体サンプルは体液に由来するサンプルである。特に、生体サンプルは、尿又は血漿である。
【００１４】
好ましい実施形態で、被験体は１型糖尿病に罹患している。このような被験体はまた、血圧上昇又はミクロアルブミン尿を呈し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、アッセイ及び試薬は変わり得るので、それらに限定されないことを理解すべきである。また、本明細書で使用した専門用語は、本発明の具体的な実施形態を説明することを目的としており、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するつもりは全くないことも理解すべきである。
【００１６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形は、本文にて別段の定めのない限り、複数形の意味も包含していることに留意しなければならない。したがって、例えば「断片」と言うのは、複数の断片を包含し、また「抗体」と言うのは、一以上の抗体及び当業者に既知のそれと同等のものを言う。
【００１７】
別段の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載された方法及び材料と類似又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験に際して使用することができるが、ここでは、推奨する方法、装置及び材料について説明をする。本明細書で引用した全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る該刊行物で報告された方法論、試薬及びツールを記載並びに開示する目的で、参照によりその全てを本明細書に援用する。本明細書において、本発明は先行発明を理由に前記公開に先行する権利を与えられない出願として一切解釈されるべきではない。
【００１８】
本発明の実施に当たっては、別段の断りがない限り、従来の化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学及び薬学の方法を当分野の技術範囲内で使用することができる。このような技術は、文献中に全て説明されている。例えば、Gennaro, A.R.編 (1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第１８版, Mack Publishing Co.； Colowick, S. ら編, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.； Handbook of Experimental Immunology, I〜IV巻 (D.M. Weir及びC.C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications)； Maniatis, T.ら編 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, I〜III巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press； Ausubel, F. M.ら編 (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 第４版, John Wiley & Sons； Reamら編 (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press)； PCR (Introduction to Biotechniques Series),第２版 (Newton & Graham編, 1997, Springer Verlag)を参照されたい。
【００１９】
本発明は、CTGFが血管疾患の発症及び進行リスクの増加を示す診断マーカーとなるという発見に関する。
【００２０】
一の態様において、本発明は、糖尿病に罹患している又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体において糖尿病と関連する血管合併症の発症のリスクを診断する方法であって、被験体から生体サンプルを採取するステップ、該生体サンプル中のCTGF（connective tissue growth factor：結合組織増殖因子）又はCTGF断片のレベルを測定するステップ、及び生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルをCTGF又はCTGF断片の標準レベルと比較するステップを含み、ここで、生体サンプル中のCTGF又はCTGF断片のレベルの上昇が糖尿病と関連する血管合併症の発症リスクの存在を示す前記方法を提供する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、糖尿病に罹患している又は糖尿病に罹患するリスクのある被験体がヒト被験体である。被験体が糖尿病に罹患しているか糖尿病に罹患するリスクがあるかは、当業者に認められ使用されているいずれの手段でも決定することができる。例えば、約200 mg/dL(例えば、空腹時血糖試験、経口ブドウ糖負荷試験、又はランダム血糖試験での測定)を超える血糖値を呈するヒト被験体を、糖尿病に罹患した患者として特徴付けることができる。したがって、いくつかの実施形態では、約200 mg/dLを超える血糖値を有するヒト被験体が、本発明の方法を用いた治療又は本発明の提供する医薬の使用に適した患者であると考えられる。糖尿病に罹患するリスクのある被験体、例えば糖尿病に罹患するリスクのあるヒト被験体は、糖尿病の発症リスクの増加に関連することが知られている一以上の様々な要因の評価により同定することができる。このような要因には、糖尿病の家族暦、ある民族若しくは人種集団、妊娠性糖尿病暦、肥満、特に高レベルの内臓脂肪若しくは腹部脂肪、あまり運動をしない生活スタイル、年齢、高血圧、統合失調症等、並びに耐糖能障害（impaired glucose tolerance：IGT）又は前糖尿病を含むグルコース代謝の変化が含まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、血管合併症は大血管合併症であり、他の実施形態では細小血管合併症である。各種実施形態において、合併症は心疾患、腎障害、神経障害及び網膜症からなる群より選択される。一の実施形態において、合併症は心血管系合併症又は脳血管系合併症である。他の実施形態において、合併症は末梢血管系の合併症である。
【００２３】
本方法の好ましい実施形態では、生体サンプル中のCTGF断片若しくはCTGFレベルの測定は、CTGF若しくはCTGF断片のレベルを国際公開第03/024308号パンフレットに記載された各種アッセイのいずれかを用いて検出及び定量することからなる。この文献は、参照によりその全てを本明細書に援用する（例えば、国際公開第03/024308号パンフレットの実施例５を参照されたい）。
【００２４】
生体サンプルは、唾液、血液、尿、血清、血漿、ガラス体等を含むが、これらに限定はされない、体液、分泌物、組織又は細胞に由来するサンプルであることが、好ましい態様である。
【００２５】
横断的研究で糖尿病患者における血管合併症の発症リスクの増加を示す診断マーカーとしてのCTGFの関連性及び重要性が試験された。糖尿病のコントロールと合併症に関する臨床試験／糖尿病と合併症の疫学(DCCT/EDIC)研究コホートに由来するＩ型糖尿病患者1,050人におけるCTGF及びCTGF N-断片の循環液（すなわち血漿）中及び尿中のレベルが調査された。高血圧糖尿病被験体は血漿log CTGF N-断片の値が正常血圧被験体よりも有意に高いレベルを呈することが判明した（3±0.04 ng/ml 対 3.21±0.03 ng/ml, P=0.0005）。回帰分析により、CTGF N断片レベルが連続変数としてポジティブかつ有意に最大血圧と相関することが明らかとなった(P<0.0001)。単変量及び多変量回帰分析は、CTGF N-断片レベルとlogアルブミン排泄率(albumin excretion rate：AER)間のポジティブかつ独立した関連性を示した(P<0.0001)。分類別分析では、マクロアルブミン尿を呈する患者が、ミクロアルブミン尿及び正マクロアルブミン尿(normoalbuminuric)の糖尿病患者よりも有意に高いレベルのCTGF N断片を有していた(P<0.0001)。単変量及び多変量回帰分析により、log CTGF N断片が独立にかつ有意に大血管疾患の代理マーカーである総頚動脈内膜中膜肥厚度(IMT)と関連することが実証された(P<0.0428)。最後に、頚動脈IMT増加の相対リスク（RR）は、正常な血漿CTGF N断片及び正常なアルブミン尿を呈する患者よりも血漿CTGF N断片及びマクロアルブミン尿のレベルが上昇している患者で、より高かった（RR=4.76; 95%信頼区間、2.21〜10.25, P<0.0001）。
【００２６】
本発見は、１型糖尿病患者においてCTGF N断片レベルが血圧増加と関連して上昇すること、AERと独立に相関し、かつマクロアルブミン尿を呈する患者で明らかに高まること、頚動脈IMTと独立に関連すること、及びより大きなIMTとポジティブに関連することを実証している。したがって、血漿CTGFレベルは糖尿病性血管障害のリスクマーカーとなる。
【００２７】
本発見は、血漿CTGFレベルと低密度リポタンパク質（low density lipoprotein ： LDL）のポジティブかつ有意な関連性を示す。これは、LDLが糖尿病患者のCTGFレベルを調節できることを証明している。さらに、以前の報告から、ヒトの大動脈内皮細胞及びメサンギウム細胞におけるCTGFの発現はLDLによって誘導されることが明らかとなっている(Sohnら(2005) Kidney Int 67:1286-1296)。メサンギウム細胞におけるCTGFのLDLによる誘導は、TGF−βのオートクリン活性化を通して、かつc-Jun NH2末端キナーゼ（c-Jun NH2 terminal Kinase：JNK）の活性化を通して仲介される(Sohnら (2005) Kidney Int 67:1286-1296)。これは、リポタンパク質が糖尿病の血管硬化を促進し得る経路を、CTGFが提供していることを示唆している。
【００２８】
１型糖尿病患者の糖尿病性腎症のマーカーであるミクロアルブミン尿は、進行性腎不全及び腎疾患のリスクが高いことを意味する。ミクロアルブミン尿は、糖尿病及び非糖尿病被験体の双方の集団における心血管系死亡率の増加と関連しており、また全身性及び糸球体内皮機能不全にも関連している(Stehouwerら(1992) Lancet 340:319-323)。ミクロアルブミン尿発症の一因となるバイオマーカーの同定は、糖尿病性血管損傷の機構を理解する上での手掛かりとなり得る。本明細書で示したように、マクロアルブミン尿を呈する患者の血漿及び尿中のCTGFN断片レベルは、ミクロアルブミン尿を呈する患者又は正常なアルブミン排泄率を有する患者のレベルよりも２倍高かった。これらの発見は、CTGFが進行性腎症のマーカーとなることを示唆している。単変量及び多変量回帰分析により、CTGF N断片とAER間の独立した及びポジティブな関連性が明らかとなった。これらの発見は、少人数の１型糖尿病患者で実施されたCTGF N断片とAER間の関連性を実証した文献における先の報告と一致している(例えば、国際公開第03/024308号パンフレットを参照されたい)。
【００２９】
本発明は、CTGF N断片と最大及び最小血圧の上昇との間の関連性の証拠を初めて提供する。これらのデータは、高血圧であると立証された糖尿病被験体が現在の血圧又は血圧降下剤の使用に関わりなく正常血圧の糖尿病被験体よりも著しく高い血漿CTGF N断片のレベルを示すことを立証している。この発見は、糖尿病における進行性腎損傷及び心臓血管系疾患のリスクが高血圧によって高まるため重要である。ACE阻害剤（ACEI）で血圧を調節することを目的とした介入研究により、糖尿病性腎損傷の発症が著しく遅くなることが明らかとなった(Lweisら(1993) N Engl J Med 329:1456-1462)。ACEI療法の有利な効果は、アンジオテンシンIからアンジオテンシンIIへの転換の減少又はブラジキニンの分解の減少のいずれかに起因すると考えられ得る (Gainerら(1998) N Engl J Med 339:1285-1292)。
【００３０】
ACEIで治療した糖尿病患者は、CTGF N断片の血漿レベルで顕著な増加を示した。ACEI療法に応答した血漿CTGFレベルでのこのような増加は、アンジオテンシンII形成の減少というよりもむしろブラジキニンレベルの増大に起因し得る。これに関して、本研究は、ブラジキニンがヒトの大動脈内皮細胞及び血管平滑筋細胞においてCTGFの発現を誘導し、またこの調節はTGF-βのオートクリン活性化を通して仲介されていることを証明する（データ示さず）。
【００３１】
本発明は、さらに血漿CTGF N断片レベルと、１型糖尿病に罹患している患者における冠状動脈疾患及び脳血管疾患の公認マーカーである頚動脈及び内部内膜中膜肥厚度との間の独立かつポジティブな関連性を立証する(The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes and Complications Research Group (2003) N Engl J Med 348:2294-2303)。内膜中膜肥厚を呈する高血糖症及び高脂血症と、CTGF調節に対するLDL及び高血糖症の影響間の関連性を考えると、CTGFは、リポタンパク質と高血糖症が糖尿病患者の血管損傷を促進する有害な効果を仲介する機構的経路とすることができる。
【００３２】
要するに、本研究の発見は血漿CTGF N断片レベルが１型糖尿病を呈する患者の血管疾患の独立したリスクマーカーとなること、並びにCTGFが血管疾患の発症及び進行のリスクの増加を示す診断マーカーとして役立つことを実証している。
【実施例】
【００３３】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より一層理解することができる。これらの実施例は、単に本発明の例示を目的とするものであり、特許請求の範囲に記載されている発明を例証するに過ぎない。本発明の範囲は、本発明の一態様のみの説明を目的とする例示の実施形態によって制限されない。機能的に同等ないずれの方法も本発明の範囲に入る。本明細書に記載した改変に加え、本発明の様々な改変は、前述の記載と添付の図面から当業者には明らかである。このような改変は特許請求項の範囲に含まれることを目的としている。
【００３４】
＜実施例１＞
（本研究の方法）
以下の方法を本研究に使用した。
【００３５】
調査集団
調査集団は、北アメリカDCCT/EDICコホートであり、オリジナルの1,441人のDCCT被験者に由来する1,325人の１型糖尿病患者からなる。オリジナルのDCCT(糖尿病の管理と合併症に関する試験：Diabetes Control and Complications Trial)コホートは、調査参加時に1〜15年の糖尿病暦をもつ13〜40歳の男女からなり(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986)、1983年から1989年の間に登録された。患者集団の半数がランダムに従来の糖尿病治療に割り当てられ、残り半分が強化糖尿病治療に割り当てられた。1993年に、強化治療が網膜症、腎障害及び神経障害のリスクを減じることを明確に示したときに、DCCT調査を平均6.5年のフォローアップ期間後停止した(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986)。その後、患者を招聘し、大血管合併症の発症及びさらに細小血管合併症の進行の多施設長期観察調査であるEDICに登録させた(EDIC Research Group (1999) Diabetes Care 22:99-111)。1994年のEDIC基準において、DCCT/EDICコホートの平均年齢は35歳（19〜50歳の範囲）であった。54％のコホートは男性で、その糖尿病平均罹患期間は12 ± 5年であった。空腹時の血漿サンプルをCTGF測定用に被験者から採取し、EDIC加入の病院からサウスカロライナ医科大学(MUSC)に直接輸送した。MUSCの施設内倫理委員会（The Institutional Review Boards：IRB）及び全DCCT/EDIC加入病院の承認を受けた後、参加した各患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００３６】
EDIC方法
おおよそDCCT登録した日に、各EDIC被験者は、健康全般、糖尿病管理、糖尿病性合併症の発生、新しい病気の発症、及び使用した薬物の詳細な評価を含む規格化された年間病歴調査と健康診断を受ける。年間評価には、HbA1c、安静時心電図、及び上肢血圧（BP）測定も含まれる。血圧及びHbA1c測定は、血液サンプリングと同時に行われた。血圧は、右腕で水銀柱血圧計を用いて患者が座位した状態で測定された。腎機能は２年毎に評価された。評価には規格化された4時間回収における尿アルブミン排泄率（Albumin Excretion Rate：AER）の測定が含まれる(The Diabetes Control and Complications Trial Research Group (1993) N Engl J Med 329:977-986.を参照されたい)。ミクロアルブミン尿はDCCTによりAER40〜299mg／24時間、またマクロアルブミン尿はAER≧300mg／24時間と定義された。正常なアルブミン排泄はAER≦40mg／24時間と定義された。全AER測定の約98％は、サンプリング後1年以内の血液で行われた。
【００３７】
超音波検査法と画像解析
頚動脈超音波検査法を1325人の患者（オリジナルDCCTコホートの92%）についてEDIC基礎実験の一環として行い、1994年６月〜1995年４月の間（CTGF測定前の２年間）、以前に記載された(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications (EDIC) Research Group (1999) Diabetes 48:383-390)ように実行した。
【００３８】
CTGF測定
血漿及び尿中のCTGFは、以前に記載されたELISAアッセイ法を用いて測定された（例えば、国際公開第03/024308号パンフレットを参照されたい。この文献は、明細書を通して参照によりその全てを本明細書に援用する）（Gilbertら(2003) Diabetes Care 26:2632-2636.参照）。簡単に言えば、CTGF特異的モノクローナル抗体の組を使用して、CTGF全体（Wアッセイ）又はCTGFのN末端断片＋CTGF全体（N+Wアッセイ）を捕捉し、検出するために設計された二つの異なるELISAを構築した。アッセイでは、CTGFを捕捉するために使用される抗CTGFモノクローナル抗体（10μg/mL）でマイクロタイタープレート（Maxisorb, Nunc, Rochester, NY）を４℃にて一晩コーティングした。その後、プレートを洗浄し、1% BSAを含むPBSで少なくとも２時間ブロッキングした。アルカリホスファターゼが直接結合した捕捉ｍAbとして用いたものと異なる非クロスブロッキング抗CTGFｍAbを検出用に用いた。パラニトロフェノールホスフェート(Para nitrophenol phosphate：PNPP)を比色反応用の基質として用いた。プレートを405nm（Vmax Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で読んだ。標準曲線は、それぞれサンプル一式でrhCTGFの標準ランを使用した三重実験で作成された。サンプルを、二重分析する前に1：10で50μg/mlヘパリン、0.1% Triton X-100、0.1% BSAを含むアッセイバッファで希釈した。重複物のCV（変動係数）は15％内であった。標準曲線に対する二次フィットを較正に用いた。組換えヒトCTGFを使用したスパイク回復実験により、患者サンプルの定量的検出が立証された。分析感度（LLOQ：最低定量限度）は、N+Wアッセイの尿サンプルで0.6ng/ml、Wアッセイ又はN+Wアッセイの血清サンプルで5ng/mlであった。ELISAで用いられた抗体は、CTGFに特異的でありCCNファミリーのメンバーであるcyr61及びNovとは交差反応しない。尿のCTGF含有量をN+Wアッセイを用いて測定したが、これらのアッセイにより測定されたときの尿中に存在するCTGFの構造は、基本的にN断片であった。ラン内％CVは5％、ラン間％CVは15％であった。
【００３９】
統計学的解析
血漿及び尿中のCTGFの測定レベルは非対称分布に従い、またCTGFへのBox Cox変換が適用された。対数変換により、CTGFの生データを正規化変換した。したがって、対数変換されたCTGF N断片を本明細書の解析に用いた。さらに、AERの対数変換を用いて残差の正規化を提供した。T検定を用いて、連続変数対各共変量を独立に解析した。カイ２乗検定を用いて、離散変数対各共変量を解析した。ピアソンの相関係数（Pearson’s correlation coefficients）及びスピアマンのノンパラメトリック相関をコンピュータ計算し、血漿log CTGF N-断片とそれぞれのEP、AER及びIMT間の関連性を評価した。
【００４０】
血漿log CTGF N断片、log AER及び頚動脈IMTを、全て回帰分析の変数として使用した。特に、血漿log CTGF N断片が変数だった場合、ANOVA及びANCOVAを使用して腎症サブグループ間の血漿と尿との血漿log CTGF N断片の平均レベルの差を測定した。変数と共に、単変量解析に由来するlogAERと頚動脈IMTを多重線形回帰の初期モデルを作成するのに使用した。その後、非有意な部分検定及び／又は同一線上にある変数を排除するために、このモデルに後退モデル選択方法を適用した。血漿logCTGF N断片を、log AER及びIMTの両変数回帰モデルでの共変量とみなした。Log AERを、頚動脈IMTのモデルにおける共変量とみなした。これらの回帰モデルを、年齢、HbA1c、糖尿病期間、性別及びDCCT治療グループのような他の共変量に合わせて調整した。重偏相関係数の二乗が算出され、他の全ての共変量を含んだモデルの中にその変数を導入することにより説明される従変数の分散パーセンテージの増加を評価した。ボンフェローニ調整（Bonferroni adjustment）を多重比較用に行った。全統計解析は、SAS (v. 91)を用いて行われた。中央傾向の測定を平均± 標準偏差（SD）として示した。統計的有意性は両側検定を用いて決定され、p≦0.05に仮定した。
【００４１】
＜実施例２＞
（1型糖尿病患者のDCCT/EDICコホートにおけるCTGF N断片レベル）
CTGF測定を行った調査集団の臨床的特徴を表1（性別によるDCCT/EDICコホートの臨床的特徴＊）に示す。CTGF N断片の血漿循環レベル及び尿中排泄率を1,052人の１型糖尿病患者で測定した。患者コホートのlog CTGF N断片と生化学的パラメータの関係を表２に示す（予測log CTGF N断片レベルの単変量回帰分析）。表２の単変量回帰係数は、所与の共変量の1ユニット変化あたりの平均log CTGF N断片の変化として解釈できる。もう一つの解釈は、exp(β)が共変量において1ユニット変化あたりのCTGF N断片の相対的増加とおおよそ等しいことである。
【表１】
2008541062.tif 000003
【００４２】
*変数は、連続変数及びカテゴリ変数にそれぞれT及びカイ２乗検定を用いて、グループ間で評価した。
【表２】
2008541062.tif 000004
【００４３】
単変量解析により、血漿logCTGF N断片レベルと、年齢、糖尿病期間、DCCT強化グループ、最大血圧、log AER、LDL、総コレステロール、内部頚動脈IMT、総頚動脈IMT、及びACE阻害剤の使用との間でポジティブな強い関連性が明らかとなった。血漿logCTGF N断片とHbA1c、性別、体重、肥満度指数（body mass index：BMI）及びウェスト・ヒップ比との間には、関連性は見られなかった。
【００４４】
log尿CTGF N断片と、体重、ウェスト・ヒップ比、SBP、DBP及び性別との間で強い関連性が見られた。logCTGF N断片の排泄率は、年齢、糖尿病期間、HbA1c、logAER、総コレステロール、LDL及びACEIによる影響を受けなかった。
【００４５】
＜実施例３＞
（血漿CTGF N断片と血圧間の関連性）
図１で示した結果は、非高血圧被験者(n=668)と高血圧被験者（全患者が高血圧と診断され、SBP（最大血圧）＞140、DBP（最小血圧）＞90；また血圧降下剤で治療されている）（n=382）についてプロットされた血漿logCTGF N断片の推定累積分布を示している。これらの結果は、高血圧被験者が正常血圧被験者よりも高い値の血漿logCTGF N断片を有する傾向にあることを証明している。
【００４６】
高血圧と立証された患者の血漿log CTGF N断片の平均値は、高血圧を発症していない患者のそれと比較して有意に大きい（3.36 ± 0.04 ng/ml 対 3.21 ± 0.03 ng/ml, P=0.0005）。高血圧患者の血漿で測定された実際の平均血漿CTGFレベルは、41.57 ± 3.47ng/mlであり、対して正常血圧患者における実測平均血漿CTGFレベルは32.28 ± 1.81 ng/mlであった（P=0.0109）。また、logCTGF N断片の尿排泄率と、SBP、DBP及びMBPとの間で強い関連性が見られた（全てP<0.0001）。これらの結果は、血漿CTGF N断片レベルが高血圧を伴った１型糖尿病患者で高められることを証明している。
【００４７】
高血圧患者の数人は、ACE阻害剤（ACEI）療法を受けていた。本患者コホートの血漿及び尿のCTGF N断片レベルに対するACEIの影響を、（それが、もしあるのであれば）調べた。その結果、ACEIで処理された患者の平均血漿log CTGF N断片レベル3.43 ± 0.07 ng/ml(n=126)は、ACEIで処理されていない患者の平均血漿log CTGF N断片レベル3.25 ± 0.02 ng/ml(n=984)と異なることが証明された（P=0.0159）。一方、ACEI療法は、log CTGF N断片の尿排泄率には有意な影響を及ぼさなかった。ACEIで処理された患者の平均尿log CTGF N断片が2.13 ± 0.07μg/24時間(n=122)だったのに比べて、ACEIで処理されていない患者の平均尿log CTGF N断片は2.08 ± 0.02 μg/24h (n=906)であった（P=0.4344）。
【００４８】
＜実施例４＞
（CTGF N断片とアルブミン排泄間の関係）
血漿及び尿のCTGFレベルを1,052人の1型糖尿病患者で測定した。平均±標準誤差として表した結果を表３に示す（アルブミン尿状態により血漿及び尿のCTGF N断片レベル；P値を基準グループ（AER＜40）と比較し、年齢に合わせて調整した）。
【表３】
2008541062.tif 000005
【００４９】
データは、マクロアルブミン尿を呈する患者（アルブミン排泄率＞300 mg/日）の血漿及び尿中のCTGF N断片レベルが、ミクロアルブミン尿を呈する患者（アルブミン排泄率40〜299mg/日）又は正常アルブミン排泄率の患者（アルブミン排泄率＜40mg/日）の血漿及び尿中のそれよりも有意に高いことを立証した。これは、以前の報告で示された尿中のCTGF N断片のレベルとアルブミン尿度との相関と一致する(国際公開第03/024308号パンフレット参照)。AER≧300mg/日を呈する患者の血漿CTGF N断片レベルは、65.79 ± 11.89ng/mlであったのに対し、40〜299mg/日のAERを呈する患者では32.39 ± 2.73ng/ml、また正常なAER＜40mg/日を呈する患者では34.19 ± 1.84 ng/mlであった(P=0.0005)。これは、以前の報告で示された尿中のCTGF N断片のレベルとアルブミン排泄率の相関と一致する（国際公開第03/024308号パンフレット参照)。AER≧300mg/日を呈する患者のCTGF N断片の排泄率は、18.53 ± 4.33μg/24時間であったのに対し、40〜299ｍg/日のAERを呈する患者では9.25 ± 0.70μg/24時間、また正常なAER＜40mg/日を呈する患者では10.61 ± 0.34μg/24時間であった（P=0.0001）。これらの結果は、CTGFがマクロアルブミン尿への進行リスク増加を有する患者を効率的に同定する診断マーカーとして役立つことを示唆している。
【００５０】
表２により、血漿logCTGF N断片とlogアルブミン排泄率（AER）とのポジティブかつ有意な関連性が示された(P=0.001, n=1052)。血漿log CTGF N断片とlog AERとの関連性の強さを、重回帰分析によってさらに評価した。重回帰モデルは、表２で示したデータを血漿log CTGF N断片よりもむしろ変数としてlog AERを用いた単変量回帰分析に基づいて作成された。log AERに影響し得る多数の変数をこのモデルに包含した。非有意変数及び共線変数を後退選択回帰分析によって排除し、リスクの増加を示す診断マーカー機能としての変数を最も良く説明できるモデルを作成した。表４に示された結果（logAERの多重線形回帰モデル）から、年齢、体重、BMI、糖尿病期間、HbA1c、DCCT強化グループ、SBP及び総コレステロールの調整後に、血漿logCTGFとlogAERの有意な関連性が立証された(P<0.0001)。これらの結果は、血漿CTGF N断片の２倍差がAERの20%の増加をもたらすことを示すと解釈された。
【表４】
2008541062.tif 000006
【００５１】
＜実施例５＞
（CTGF及び頚動脈壁肥厚）
CTGF活性と総頚動脈及び／又は内部頚動脈内膜中膜肥厚度（IMT）との関係を調べ、血漿CTGF N断片レベルにおける差異が大血管疾患と関連するかどうかを検討した。単変量解析により、1,050人の対象者において血漿log CTGF N断片レベルと総頚動脈及び内部頚動脈IMT（いずれもP<0.0001)との間で有意な関連性が立証された（表２）。これらの結果は、血漿CTGFレベルが頚動脈IMTとポジティブに関連し、大血管疾患の代理マーカーとなることを示している。
【００５２】
重回帰モデルを構築し、血漿log CTGF N断片と総頚動脈IMT間の関連性の強さを評価した。後退選択回帰分析を行い、血漿log CTGF N断片、log AER、年齢及び性別を含むモデル（表５、総頚動脈IMTに関する多重線形回帰モデル）によって、log CTGF N断片が独立に、かつ有意に総頚動脈IMTと関連することが実証された。
【表５】
2008541062.tif 000007
【００５３】
IMTを75パーセンタイルに基づいた高低カテゴリに２分して、変数としてこれを有するロジスティック回帰モデルにフィットさせた。年齢に合わせて調整されたロジスティックモデルにより、CTGFと頚動脈IMTのリスク増加との関連性が確認された。本結果から、高CTGFレベルでAER≧300mg／日を呈する被験者は、低CTGFレベルでAER＜40mg／日の被験者よりも頚動脈IMFの増加に関して著しく高いリスク（相対リスク：4.76；95%CI, 2.21〜10.25, P<0.0001)を有することが立証された（表6参照、血漿CTGF N断片とAERによる頚動脈IMF@の増加に関する相対リスク）。
【表６】
2008541062.tif 000008
【００５４】
上記のように、本調査は、1型糖尿病患者のDCCT/EDICコホートから得られたデータに基づいており、糖尿病性血管疾患が異常なCTGFレベルとリンクしていることを示す。これらの結果は、CTGF N断片レベルと大血管疾患の代理マーカー（総及び頚動脈IMT）間の独立した、かつポジティブな関連性の証拠を提供する。さらに、本結果は、CTGF N断片レベルと、高血圧及びミクロアルブミン尿（いずれも大血管疾患の発症リスクの増加を示す診断マーカーである）との間の独立した関連性を立証している。さらに、これらの横断結果は、頚動脈IMTの相対リスクが高CTGFレベルを呈する糖尿病患者で高まることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、高血圧状態による対数(log) CTGF(N-断片)の累積分布を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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