(57)【要約】薬剤結合の所定部位および化学量論を有する抗体薬剤コンジュゲートを提供する。抗体薬剤コンジュゲートを使用する方法も提供する。特定の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、操作された抗体を含む、イムノコンジュゲートであって、該操作された抗体は、（ａ）標的抗原のための機能的に活性な抗原結合領域、（ｂ）鎖間システイン残基少なくとも１つ、（ｃ）鎖間システイン残基のアミノ酸置換少なくとも１つ、および（ｄ）鎖間システイン残基少なくとも１つにコンジュゲートした診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤を有する。
2008521828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された抗体を含む、イムノコンジュゲートであって、該操作された抗体は、（ａ）標的抗原のための機能的に活性な抗原結合領域、（ｂ）鎖間システイン残基少なくとも１つ、（ｃ）鎖間システイン残基のアミノ酸置換少なくとも１つ、および（ｄ）鎖間システイン残基少なくとも１つにコンジュゲートした診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤を有する、イムノコンジュゲート。
【請求項２】
鎖間システイン残基４つおよび鎖間システイン残基のアミノ酸置換４つを有する、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
鎖間システイン残基２つおよび鎖間システイン残基のアミノ酸置換６つを含む、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
各アミノ酸置換がシステインからセリンへの置換である、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
前記診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤が治療薬剤である、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
前記治療薬剤がオーリスタチンまたはオーリスタチン誘導体である、請求項６記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
前記オーリスタチン誘導体がドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）またはモノメチオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、請求項７記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤が診断薬剤である、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記診断薬剤が放射性薬剤、酵素、蛍光化合物または電子移動剤である、請求項９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗体がＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７０またはＬｅｗｉｓ  Ｙに結合する、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記抗体が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質に結合する、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗体が微生物抗原に結合する、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記抗体がウイルス抗原に結合する、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
前記抗体が抗核抗体、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体、抗カルジオリピン抗体ＩｇＭもしくはＩｇＧ、抗リン脂質抗体ＩｇＭもしくはＩｇＧ、抗ＳＭ抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗甲状腺抗体、抗ミクロソーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ＳＣＬ７０抗体、抗Ｊｏ抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体、抗ＳＳＡ抗体、抗ＳＳＢ抗体、抗壁細胞抗体、抗ヒストン抗体、抗ＲＮＰ抗体、抗Ｃ  ＡＮＣＡ抗体、抗Ｐ  ＡＮＣＡ抗体、抗中心体抗体、抗フィブリラリン抗体または抗ＧＢＭ抗体である、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
前記抗体が抗体フラグメントである、請求項１記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’およびｓｃＦｖＦｃから選択される、請求項１６記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
前記フラグメントがＦａｂ’またはｓｃＦｖＦｃである、請求項１７記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１記載のイムノコンジュゲートであって、下記の式：
【化１】
2008521828.tif 000024
を有するか、または薬学的に受容可能なその塩または溶媒和物であり、
ここで：
Ａｂは抗体であり、
Ａはストレッチャー単位であり、
ａは０または１であり、
各Ｗは独立してリンカー単位であり、
ｗは０〜１２の範囲の整数であり、
Ｙはスペーサー単位であり、
ｙは０、１または２であり、
ｐは１〜約２０の範囲であり、
Ｄは診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤であり、そして、
ｚはタンパク質上の所定のコンジュゲーション部位の数である、イムノコンジュゲート。
【請求項２０】
下記の式：
【化２】
2008521828.tif 000025
を有し、ここで、Ｒ１７は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ−、−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択される、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
下記の式：
【化３】
2008521828.tif 000026
ここで、Ｒ１７は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ−、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択される］を有する、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
下記の式：
【化４】
2008521828.tif 000027
を有する、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
下記の式：
【化５】
2008521828.tif 000028
を有する、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
下記の式：
【化６】
2008521828.tif 000029
を有する、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２５】
下記の式：
【化７】
2008521828.tif 000030
を有する、請求項１９記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２６】
請求項１記載のイムノコンジュゲートおよび薬学的に受容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
前記イムノコンジュゲートが薬学的に受容可能な非経口ビヒクルを用いて製剤される、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記イムノコンジュゲートが単位用量の注射可能形態に製剤される、請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２９】
腫瘍細胞または癌細胞を殺傷または増殖抑制するための方法であって、該腫瘍細胞または癌細胞を殺傷または増殖抑制するために有効な量の請求項６記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物で該腫瘍細胞または癌細胞を処理する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
癌を処置するための方法であって、ある量の請求項６記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を包含し、該量が、癌の処置に有効である、方法。
【請求項３１】
自己免疫疾患を処置するための方法であって、ある量の請求項６記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を包含し、該量が該自己免疫疾患の処置に有効である、方法。
【請求項３２】
感染性疾患を処置するための方法であって、ある量の請求項６記載のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与する工程を包含し、該量が該感染性疾患の処置に有効である、方法。
【請求項３３】
請求項６記載の抗体薬剤コンジュゲート化合物；
容器；および
ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７０およびＬｅｗｉｓ  Ｙのうちの少なくとも１つの過剰発現を特徴とする癌を処置するために該化合物を使用することができることを示す、パッケージインサートまたはラベル
を備える、製造品。
【請求項３４】
癌を診断するための方法であって、患者に請求項９記載のイムノコンジュゲートの有効量を投与する工程であって、ここで該イムノコンジュゲートは該癌により過剰発現される抗原に結合する工程；および該患者における該イムノコンジュゲートを検出する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
感染性疾患を診断するための方法であって、患者に請求項９記載のイムノコンジュゲートの有効量を投与する工程であって、ここで該イムノコンジュゲートは微生物抗原またはウイルス抗原に結合する、工程；および該患者における該イムノコンジュゲートを検出する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患を診断するための方法であって、患者に請求項９記載のイムノコンジュゲートの有効量を投与する工程であって、ここで該イムノコンジュゲートは該自己免疫疾患に関連する抗原に結合する、工程；および該患者における該イムノコンジュゲートを検出する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
イムノコンジュゲートを製造するための方法であって：
（ａ）操作された抗体を発現する宿主細胞を培養する工程であって、ここで、該操作された抗体は、（ｉ）標的抗原のための機能的に活性な抗原結合領域、（ｉｉ）鎖間システイン残基少なくとも１つ、および（ｉｉｉ）鎖間システイン残基のアミノ酸置換少なくとも１つを含み、該宿主細胞は、該操作された抗体をコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトされている、工程；
（ｂ）培養された宿主細胞または培養培地から該抗体を回収する工程；ならびに
（ｃ）該鎖間システイン残基少なくとも１つに診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤をコンジュゲートする工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
前記アミノ酸置換がシステインからセリンへの置換である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体がインタクトな抗体または抗原結合フラグメントである、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖＦｃである、請求項３９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は各々参照により全体が本明細書に援用される２００４年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６０／６３１，７５７号および２００５年４月１９日出願の米国仮特許出願第６０／６７３，１４６号の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本発明は活性部分に対する結合の予め決められた点を有する操作された抗体に関する。特に本発明は抗体のアミノ酸残基の選択的置換により活性部分に対する結合の予め決められた点を有する抗体に関する。
【０００３】
放射性核種または他の細胞傷害性剤にコンジュゲートしたターゲティングモノクローナル抗体の使用は、腫瘍部位に直接そのような薬剤を送達することにより薬剤の正常組織への曝露を制限するという可能性をもたらす（例えば非特許文献１参照）。近年、抗体系の治療の潜在性および腫瘍関連抗原の局在化におけるその正確さが、実験室および臨床の両方の研究において明らかにされている（例えば非特許文献２；非特許文献３；Ｂａｌｄｗｉｎ等の特許文献１および特許文献２；Ｙｏｕｎｇの特許文献３および特許文献４；Ｉｒｉｅ等の特許文献５；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等の特許文献６および特許文献７参照）。一般的に、腫瘍関連マーカーに対する放射標識された抗体または抗体フラグメントの使用は、治療のためよりも腫瘍の位置特定のために良好に使用されているが、その理由は部分的には、腫瘍による抗体の取り込みが一般的に低値であり、注射した総量の僅か０．０１％〜０．００１％の範囲に過ぎないためである（非特許文献４）。腫瘍への用量を増大させるために放射標識の濃度を増大させることは、一般的に、放射能への健康な組織の曝露も増大させるため、逆効果である。
【０００４】
モノクローナル抗体は放射性核種以外の種々の薬剤にコンジュゲートして診断および治療において使用するためのイムノコンジュゲートを形成することができる。これらの薬剤は、イムノコンジュゲートが放射性同位体ならびに毒素および化学療法剤などの細胞傷害性剤と安定な結合を形成できるようにするキレートを包含する。例えば、通常は全身投与されれば患者にとって毒性が高すぎる細胞傷害性剤は、その毒性作用が標的抗原を担持する腫瘍細胞のみに対して指向されるような様式において抗癌抗体にコンジュゲートすることができる。イムノコンジュゲートの診断上または治療上の効果は数種の要因に依存している。これらの要因に包含されるものは、薬剤の抗体に対するモル比およびイムノコンジュゲートの結合活性である。
【０００５】
研究者等は、抗体に直接連結できる薬剤の最大数が抗体分子上の修飾可能な部位の数および抗体の免疫反応性の潜在的損失により制限されることを見出している。例えば、非特許文献５は、抗原結合活性を大きく低減することなく抗体に取り込ませることのできる薬剤分子の数には限界があることを報告している。Ｋｕｌｋａｒｎｉ等によれば、メトトレキセートに関して得られた最大取り込みは抗体分子当たり約１０個のメトトレキセート分子であり、約１０を超えて薬剤−抗体のモル比を上昇させる試みはイムノコンジュゲートの収率を低下させ、抗体活性を損なうものであることが見出されている。非特許文献６は同様の結果を報告している。
【０００６】
薬剤および放射性核種のための送達ビヒクルとしてモノクローナル抗体が機能するためには、その部位特異的コンジュゲーションのための方法を、最終的な免疫反応性の変動を最小限にしながら開発することが重要である。最も一般的には、薬剤と放射性核種とのコンジュゲーションはアミノ酸残基の側鎖への共有結合を介して行われる。これらの残基の非部位制限性の特徴のため、抗原結合部位（ＡＢＳ）の内部または近接部に存在する残基における望ましくないカップリングを回避することは困難であり、低減された親和性および非均質な抗原結合特性がもたらされてしまう。あるいは、コンジュゲーションはスルフィドリル基に指向させることもできる。しかしながら、直接の標識はジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の還元に依存しており、タンパク質のフラグメント化の危険性を伴う可能性がある。このような結合の不完全な還元は結合の非均質なパターンをもたらす場合がある。
【０００７】
例えば、ｃＡＣ１０抗体薬剤コンジュゲート（ＣＤ３０を指向）の早期前臨床型は、システイン残基を介した抗体への８ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）薬剤分子の連結を行っている。システイン残基は４つの鎖間ジスルフィド結合の還元により得られる（非特許文献７）。最近の報告はｃＡＣ１０ＡＤＣのインビボのパラメーターに対する薬剤の多重度の作用を説明している（非特許文献８）。抗体当たり４薬剤分子が結合したｃＡＣ  １０ＭＭＡＥ薬剤コンジュゲート（Ｃ８−Ｅ４と標記、ここでＣ＃はコンジュゲーションのために使用できる鎖内システイン残基の数を示し、Ｅ＃は抗体分子当たり結合した薬剤分子の平均数を示す）は、動物モデルにおいて、抗体当たり８薬剤が結合したｃＡＣ１０薬剤コンジュゲート（Ｃ８−Ｅ８と標記）よりも大きい治療ウインドウを有することが示されている。Ｃ８−Ｅ４はｃＡＣ１０単独と同様の薬物動態特性を示すのに対し、Ｃ８−Ｅ８はより急速に循環から消失する（非特許文献８）。これらの特性はＣ８−Ｅ４が臨床開発の候補であることを示唆している。
【０００８】
ｃＡＣ１０からのＣ８−Ｅ４の製造は、コンジュゲーションの方法によっては低収量で薬剤結合が非均一となる。抗体当たり８薬剤未満が負荷されたＭＭＡＥコンジュゲートを得るために使用される１つの方法は、システイン残基の部分還元を利用している（非特許文献８）。このコンジュゲーションプロセスは、抗体分子当たり０、２、４、６または８薬剤分子を有する物質種（それぞれＣ８−Ｅ０、Ｃ８−Ｅ２、Ｃ８−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ６およびＣ８−Ｅ８と標記）の混合物をもたらし、そのうち約３０％がＣ８−Ｅ４である。このコンジュゲート混合物を疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離することにより純粋なＣ８−Ｅ４を得ることができるが、このプロセスは、薬剤が８つの可能なコンジュゲーション部位に渡って分布するため、全体収量の更なる低下と比均質性の存続とをもたらす。さらにまた、重鎖から軽鎖へのジスルフィド結合の還元が重鎖から重鎖ジスルフィドへの頻度のほぼ２倍で起こり、該当するＣ８−Ｅ４異性体は２：１の比となってしまう（例えば非特許文献９参照）。
【特許文献１】米国特許第４，９２５，９２２号明細書
【特許文献２】米国特許第４，９１６，２１３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９１８，１６３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，２０４，０９５号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１９６，３３７号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１３４，０７５号明細書
【特許文献７】米国特許第５，１７１，６６５号明細書
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｓｅｍｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９：３３２（１９８９）
【非特許文献２】Ｔｈｏｒｐｅ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１；４２（１９９３）
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：６４（１９９４）
【非特許文献４】Ｖａｕｇｈａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．６０：５６７（１９８７）
【非特許文献５】Ｋｕｌｋａｒｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１：２７００−２７０６（１９８１）
【非特許文献６】Ｋａｎｅｌｌｏｓら、ＪＮＣＩ７５：３１９−３２９（１９８５）
【非特許文献７】Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−８４（２００３）
【非特許文献８】Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：７０６３−７０７０（２００４）
【非特許文献９】Ｓｕｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １６：１２８２−１２９０（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、化学量論的な薬剤結合のために１つ以上の予め決められた部位を有する抗体が必要とされている。過去における上記および他の制約および問題は本発明により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の簡単な要旨）
本発明は操作された抗体およびイムノコンジュゲートに関する。本発明は操作された抗体およびイムノコンジュゲート、ならびに、このような操作された抗体およびイムノコンジュゲートを製造する方法を提供する。本発明はまた、イムノコンジュゲートの医薬組成物ならびに種々の状態および疾患を治療または診断するためにイムノコンジュゲートを使用する方法を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、標的抗原のための機能的に活性な抗原結合部位、鎖間システイン残基少なくとも１つ、鎖間システイン残基のアミノ酸置換少なくとも１つ、および鎖間システイン残基少なくとも１つにコンジュゲートした診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤を有する操作された抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、本発明は鎖間システイン残基４つおよび鎖間システイン残基のアミノ酸置換４つを有するイムノコンジュゲートを提供する。関連する実施形態において、本発明は鎖間システイン残基２つおよび鎖間システイン残基のアミノ酸置換６つを含むイムノコンジュゲートを提供する。別の実施形態において、本発明はＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプであるイムノコンジュゲートを提供する。アミノ酸置換は例えば鎖間システイン残基のシステインからセリンへのアミノ酸置換であり得る。
【００１２】
別の態様において、本発明は鎖間システイン残基少なくとも１つに治療薬剤がコンジュゲートしている上記したイムノコンジュゲートを提供する。１つの実施形態において、治療薬剤はオーリスタチンまたはオーリスタチン誘導体である。一部の実施形態においては、オーリスタチン誘導体はドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）またはモノメチオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
【００１３】
別の態様において、本発明は鎖間システイン残基少なくとも１つに診断薬剤がコンジュゲートしている上記したイムノコンジュゲートを提供する。診断薬剤は例えば放射性薬剤、酵素、蛍光化合物または電子移動剤であり得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は抗体が標的抗原に対して機能的に活性な抗原結合部位を有する上記したイムノコンジュゲートを提供する。抗体は例えばＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７０またはＬｅｗｉｓ  Ｙに結合することができる。抗体はまた、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質に結合することもできる。他の例では、抗体はまた、微生物抗原またはウイルス抗原に結合する。抗体はまた、抗核抗体、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗ｓｓＤＮＡ抗体、抗カルジオリピン抗体ＩｇＭまたはＩｇＧ、抗リン脂質抗体ＩｇＭまたはＩｇＧ、抗ＳＭ抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗甲状腺抗体、抗ミクロソーム抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ＳＣＬ７０抗体、抗Ｊｏ抗体、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体、抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体、抗ＳＳＡ抗体、抗ＳＳＢ抗体、抗壁細胞抗体（ａｎｔｉ−ｐｅｒｉｔａｌ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗ヒストン抗体、抗ＲＮＰ抗体、抗Ｃ  ＡＮＣＡ抗体、抗Ｐ  ＡＮＣＡ抗体、抗中心体抗体、抗フィブリラリン抗体または抗ＧＢＭ抗体であり得る。
【００１５】
別の態様において、本発明は抗体が抗体フラグメントであるイムノコンジュゲートを提供する。１つの実施形態においては、抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖＦｃから選択される。
【００１６】
１つの態様において、本発明は下記の式のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を提供する：
【００１７】
【化８】
2008521828.tif 000003
ここで、
Ａｂは抗体であり、
Ａはストレッチャー単位であり、
ａは０または１であり、
各Ｗは独立してリンカー単位であり、
ｗは０〜１２の整数であり、
Ｙはスペーサー単位であり、
ｙは０、１または２であり、
ｐは１〜約２０の範囲であり、そして、
Ｄは診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤であり、そして、
ｚはタンパク質上の所定のコンジュゲーション部位の数である。
【００１８】
一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは以下の式を有する：Ａｂ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ、Ａｂ−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ａｂ−ＭＣ−ＭＭＡＥまたはＡｂ−ＭＣ−ＭＭＡＦ。
【００１９】
別の態様において、本発明は上記したイムノコンジュゲートおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態において、イムノコンジュゲートは薬学的に受容可能な非経口ビヒクルを用いて製剤される。別の実施形態においては、イムノコンジュゲートは単位用量の注射可能形態に製剤される。関連する特徴において、本発明は治療薬剤にコンジュゲートしたイムノコンジュゲート、容器、ならびに、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７０およびＬｅｗｉｓ  Ｙのうちの少なくとも１つの過剰発現を特徴とする癌を処置するためにこの化合物を使用することができることを示すパッケージインサートまたはラベルを含む製造品を提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は治療薬剤にコンジュゲートした上記イムノコンジュゲートを用いて種々の状態または疾患を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、腫瘍細胞または癌細胞を殺傷または増殖抑制するために有効な量のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を腫瘍細胞または癌細胞に投与することにより腫瘍細胞または癌細胞を殺傷または増殖抑制することを包含する。別の実施形態において、この方法は、癌を処置するために有効な量のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与することにより癌を処置することを包含する。別の実施形態において、この方法は、自己免疫疾患を処置するために有効な量のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与することによりこの自己免疫疾患を処置することを包含する。さらに別の実施形態において、この方法は感染性疾患を処置するために有効な量のイムノコンジュゲートまたは薬学的に受容可能なその塩もしくは溶媒和物を患者に投与することにより感染性疾患を処置することを包含する。
【００２１】
別の態様において、本発明は診断薬剤にコンジュゲートした上記イムノコンジュゲートを用いて種々の状態または疾患を診断する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は癌により過剰発現される抗原に結合するイムノコンジュゲートの有効量を患者に投与することおよび患者におけるイムノコンジュゲートを検出することにより癌を診断することを包含する。別の実施形態において、方法は微生物またはウイルス抗原に結合するイムノコンジュゲートの有効量を患者に投与することおよび患者におけるイムノコンジュゲートを検出することにより感染性疾患を診断することを包含する。さらに別の実施形態においては、方法は自己免疫疾患に関連する抗原に結合するイムノコンジュゲートの有効量を患者に投与することおよび患者におけるイムノコンジュゲートを検出することにより自己免疫疾患を診断することを包含する。
【００２２】
別の態様において、本発明は標的抗原のための機能的に活性な抗原結合領域、鎖間システイン残基少なくとも１つ、および、鎖間システイン残基のアミノ酸置換少なくとも１つを有する操作された抗体を発現する宿主細胞を培養することを含むイムノコンジュゲートの製造方法を提供する。宿主細胞は操作された抗体をコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトされ得る。抗体は培養された宿主細胞または培養培地から回収され、そして鎖間システイン残基少なくとも１つを介して診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤にコンジュゲートされ得る。１つの実施形態において、抗体はインタクトな抗体または抗原結合フラグメントである。好ましい実施形態においては、抗原結合フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖＦｃである。
【００２３】
本発明は、以下に記載する好ましい実施形態の詳細な説明を、添付する図面と組み合わせて参照することにより最も良好に理解されよう。以下の考察は説明、解説および例示であり、添付する請求項により定義される範囲を限定するものとはみなされない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（定義）
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的な用語は、記載する方法および組成物に関する分野における通常の技術者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書においては、以下の用語および表現は特段の記載が無い限りそれらに帰属する意味を有する。
【００２５】
抗体。本明細書においては、「抗体」とはモノクローナル抗体、例えばネズミ、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体、抗体の混合物、ならびにその抗原結合フラグメントを指す。そのようなフラグメントにはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２が包含される。抗体フラグメントはまた、軽鎖可変領域よりなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域よりなる「Ｆｖ」フラグメント、ならびに、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組み換え一本鎖ポリペプチド分子（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃ）も包含する。一部の実施形態においては、抗体は鎖間システイン残基少なくとも１つを含む。
【００２６】
インタクトな抗体。「インタクトな」抗体はＶＬおよびＶＨ抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン（例えばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってよい。
【００２７】
鎖間システイン残基：本明細書においては、「鎖間システイン残基」または「鎖間システイン」とは未操作抗体の別の鎖のシステイン残基との鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することができる抗体鎖のシステイン残基を指す。鎖間システイン残基は軽鎖のＣＬドメイン、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域に位置する。抗体中の鎖間システイン残基の数は変動できる。例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプはそれぞれ４、６、１３および４つの鎖間システイン結合を有する。特定の例においては、抗体ｃＡＣ１０を参照すれば、鎖間システインチオールは、Ｋａｂａｔのナンバリング法に従って、軽鎖のアミノ酸２１４位ならびに重鎖のアミノ酸２２０、２２６および２２９位に位置する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。
【００２８】
鎖間ジスルフィド結合。「鎖間ジスルフィド結合」という用語は、抗体に関する場合、２つの重鎖または重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合を指す。
【００２９】
操作された抗体。本明細書においては、「操作された抗体」とは別のアミノ酸残基との鎖間システイン残基のアミノ酸置換（例えばシステインからセリンへの置換）少なくとも１つを有し、そして、未置換の鎖間システイン残基少なくとも１つを保持している、天然に存在しないインタクトな抗体または抗原結合フラグメントを指す。
【００３０】
異性体。「異性体」という用語は、抗体に関する場合、鎖間システイン残基のアミノ酸置換の特定のパターンまたは順序を有する抗体を指す。イムノコンジュゲートに関する場合、「異性体」という用語は、鎖間システイン残基のアミノ酸置換の特定のパターン若しくは順序および／または活性部分のコンジュゲーション部位の特定のパターンを有する抗体を指す。抗体の異性体は命名法Ｃ＃ｖ＃により指し示すことができ、ここでＣ＃はコンジュゲーションのために使用可能な鎖間システイン残基の数を示し、そしてｖ＃は鎖間システイン残基の特定のパターンまたは順序を指す。イムノコンジュゲートの異性体は命名法Ｃ＃ｖ＃−Ｙにより指し示すことができ、ここでＣ＃およびｖ＃は上記と同様の意味を有し、そしてＹは抗体分子当たりに結合している診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤の平均数を指す。
【００３１】
完全に負荷された。「完全に負荷された」という用語は、特定の型および／または同様の反応性のコンジュゲーションの予め決められた点が活性部分にコンジュゲートし、イムノコンジュゲートの均質な集団（Ｃ＃＝Ｙ）を与える抗体を指す。
【００３２】
部分的に負荷された。「部分的に負荷された」という用語は、特定の型および／または同様の反応性のコンジュゲーションの予め決められた点の一部分のみが活性部分にコンジュゲートし、イムノコンジュゲートの特定の異性体（Ｃ＃＞Ｙ）の形成をもたらす抗体を指す。
【００３３】
診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤。本明細書においては、「診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤」という用語は診断、予防および／または治療のために有用なイムノコンジュゲートを製造するために抗体にコンジュゲートされる巨大分子、分子または原子などの活性部分である。診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤の例は薬剤、毒素および検出可能な標識を包含する。
【００３４】
イムノコンジュゲート。本明細書においては、「イムノコンジュゲート」とは少なくとも１つの診断薬剤、予防薬剤および／若しくは治療薬剤、または、診断薬剤、予防薬剤および／若しくは治療薬剤に結合するキレート形成剤に直接または間接的にコンジュゲートしている抗体を含む分子である。イムノコンジュゲートは抗体の免疫反応性を保持しており、例えば抗体はコンジュゲーション前とほぼ同じか僅かにのみ低減したコンジュゲーション後の抗原結合能を有する。本明細書においては、イムノコンジュゲートはまた抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）とも称する。
【００３５】
機能的に活性。「機能的に活性」という用語は、抗体に関する場合、抗体が標的抗原に免疫特異的に結合することを意味する。
【００３６】
単離された。「単離された」という用語は、分子または巨大分子（例えば抗体または核酸）に関する場合、その天然の環境の成分から識別、分離および／または回収されているものである。その天然の環境の夾雑成分は分子の所望の用途（例えば診断または治療）を妨害する物質であり、そして酵素、ホルモンおよび他の蛋白性または非蛋白性の溶質を包含してよい。一部の実施形態においては、単離された分子または巨大分子は、（１）例えばＬｏｗｒｙまたはＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した場合に分子または巨大分子の９５％超、または９９％超まで、（２）スピニングカップシーケンサーを用いることによりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基が得られるのに十分な程度まで、あるいは（３）例えばクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色法により測定した場合の還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで、精製することになる。単離された分子および巨大分子は組み換え細胞内のインサイチュの分子および巨大分子も包含するが、その理由は分子および巨大分子の天然の環境の成分少なくとも１つが存在しないためである。しかしながら通常は単離された分子および巨大分子は少なくとも１つの精製工程により製造される。
【００３７】
構造遺伝子。本明細書においては、「構造遺伝子」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次に特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される配列を有するＤＮＡ分子である。
【００３８】
プロモーター。本明細書においては、「プロモーター」とは構造遺伝子の転写を指向してｍＲＮＡを生産する核酸の配列である。典型的には、プロモーターは構造遺伝子の開始コドンに近位の遺伝子の５’領域内に位置する。プロモーターが誘導プロモーターである場合は、転写率は誘導剤に応答して増大する。これとは対照的に、プロモーターが構成プロモーターである場合には、転写率は誘導剤により調節されない。
【００３９】
エンハンサー。本明細書においては、「エンハンサー」とは、転写の開始部位と相対的なエンハンサーの距離または方向とは無関係に、特定の遺伝子がｍＲＮＡに転写される効率を増大できるプロモーターエレメントである。
【００４０】
相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）。本明細書においては、「相補ＤＮＡ」とは、酵素である逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部分に相補なプライマーを逆転写の開始に使用する。当業者はまた、そのような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補体よりなる２本鎖ＤＮＡ分子を指すために「ｃＤＮＡ」という用語も使用する。
【００４１】
発現。本明細書においては、「発現」とは構造遺伝子またはｃＤＮＡ分子からポリペプチドが生成されるプロセスである。プロセスはコーディング領域のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を包含する。
【００４２】
クローニングベクター。本明細書においては、「クローニングベクター」とは、宿主細胞内で自律複製する能力を有し、そして細胞を形質転換して遺伝子を調整するために使用されるプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなどのＤＮＡ分子である。クローニングベクターは典型的には、ベクターの本質的な生物学的機能を損失することなく測定可能なやり方において外来性ＤＮＡ配列を挿入してよい制限エンドヌクレアーゼ認識部位１つまたは少数、ならびに、クローニングベクターにより形質転換された細胞の識別および選択において使用するために適するマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性をもたらす遺伝子を包含する。
【００４３】
発現ベクター。本明細書においては、「発現ベクター」とは組み換え宿主中の外来タンパク質の発現を可能とする外来タンパク質をコードする異種の構造遺伝子またはｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子である。典型的には、異種の遺伝子の発現はプロモーターおよび／またはエンハンサー配列などの特定の調節配列の制御下に（即ちこれらに作動可能に連結して）置かれる。プロモーター配列は構成または誘導の何れかであってよい。
【００４４】
組み換え宿主。「組み換え宿主」とは、異種（外来）タンパク質の発現のための何れかの原核生物または真核生物の細胞であってよい。一部の実施形態においては、組み換え宿主はクローニングベクターまたは発現ベクターを含有する。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム内の異種タンパク質をコードする核酸を含有するように遺伝子的に操作されている原核生物または真核生物の細胞を包含することも意味する。安定な宿主の例は、例えば、全て参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。
【００４５】
ＭＭＡＥ。略語「ＭＭＡＥ」は下記：
【００４６】
【化９】
2008521828.tif 000004
のモノメチルオーリスタチンＥを指す。
【００４７】
ＭＭＡＦ。略語「ＭＭＡＦ」は下記：
【００４８】
【化１０】
2008521828.tif 000005
のドバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニンを指す。
【００４９】
ＡＦＰ。略語「ＡＦＰ」は下記：
【００５０】
【化１１】
2008521828.tif 000006
のジメチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミンを指す。
【００５１】
ＡＥＢ。略語「ＡＥＢ」はオーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸と反応させることにより製造されるエステルを指す。
【００５２】
ＡＥＶＢ。略語「ＡＥＶＢ」はオーリスタチンＥをベンゾイル吉草酸と反応させることにより製造されるエステルを指す。
【００５３】
患者。「患者」とは限定しないがヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリおよび家禽類を包含する。
【００５４】
有効量。「有効量」という用語は哺乳類における疾患または障害の診断、予防または治療のために十分な診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤の量を指す。
【００５５】
治療有効量。「治療有効量」という用語は哺乳類における疾患または障害を予防または治療するために有効な薬剤、毒素または他の分子の量を指す。癌の場合は、治療有効量は、癌細胞の数を低減し；腫瘍の大きさを低減し；末梢臓器への癌細胞の浸潤を抑制（即ちある程度まで緩徐化および好ましくは停止）し；腫瘍の転移を抑制（即ちある程度まで緩徐化および好ましくは停止）し；腫瘍の増殖をある程度まで抑制し；および／または癌に関連する症状の１つ以上をある程度まで緩解してよい。薬剤、毒素または他の分子が既存の癌細胞を増殖抑制および／または殺傷する限り、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性である。癌の治療の場合は、薬効は例えば疾患の進行までの時間（ＴＴＰ）の試験および／または応答率（ＲＲ）の測定により調べることができる。
【００５６】
「薬学的に受容可能な塩」という語句は本明細書においては、分子または巨大分子の薬学的に受容可能な有機または無機の塩を指す。酸付加塩はアミノ基で形成することができる。例示される塩は、限定しないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（即ち１，１’−メチレンビス−（２−ヒドロキシ３−ナフトエート））の塩を包含する。薬学的に受容可能な塩はアセテートイオン、スクシネートイオンまたは他の対イオンなどの別の分子の封入を包含してよい。対イオンは親化合物上の電荷を安定化させる何れかの有機または無機の部分であってよい。さらにまた、薬学的に受容可能な塩はその構造中に１つより多い荷電した原子を有してよい。複数の荷電原子が薬学的に受容可能な塩の部分となる場合は、塩は複数の対イオンを有することができる。従って、薬学的に受容可能な塩は１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有することができる。
【００５７】
「薬学的に受容可能な溶媒和物」または「溶媒和物」は１つ以上の溶媒分子と分子または巨大分子との会合を指す。薬学的に受容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例は、限定しないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンを包含する。
【００５８】
（詳細な説明）
本発明は、操作された抗体およびイムノコンジュゲート、ならびにこのような抗体およびイムノコンジュゲートを製造する方法を提供する。操作された抗体は診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤などの活性部分に対するコンジュゲーションのための予め決められた部位少なくとも１つを有する。一部の態様において、操作された抗体は診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤に化学量論的にコンジュゲートして薬剤の予め決められた平均負荷量とのイムノコンジュゲートを形成することができる。イムノコンジュゲートはインビボの画像化のため、および他の用途のために治療上、診断上（例えばインビトロまたはインビボで）使用できる。開示を明確化するためであって限定するものではないが、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分割する。
【００５９】
（操作された抗体）
１つの態様において、操作された抗体が提供される。操作された抗体は鎖間システイン残基少なくとも１つのアミノ酸置換を有しつつ、診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤へのコンジュゲーションのための鎖間システイン残基少なくとも１つを保持している。
【００６０】
一部の実施形態においては、抗体はインタクトな抗体である。抗体は例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥクラスのもの、そしてこれらのクラス内に置いて、種々のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のアイソタイプであり得る。例えば一部の実施形態においては、抗体はＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得る。
【００６１】
一部の実施形態においては、操作された抗体は別のアミノ酸で鎖間システイン残基を置き換えるアミノ酸置換少なくとも１つを含む。鎖間システイン残基は、軽鎖と重鎖との間、および／または、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することができる。即ち、アミノ酸置換は軽鎖のＣＬドメイン、重鎖のＣＨ１度メインおよび／またはヒンジ領域内の鎖間システイン残基であり得る。例えば抗体ｃＡＣ１０を参照すれば、鎖間システイン残基はＫａｂａｔのナンバリング法に従って、軽鎖のアミノ酸２１４位ならびに重鎖のアミノ酸位２２０（ＣＨ１）および２２６および２２９（ヒンジ領域）にある（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。ｃＡＣ１０のこれらの鎖間システイン残基の１つ以上が置換され得る。
【００６２】
一部の実施形態においては、アミノ酸置換はシステイン残基に対するセリンである。一部の実施形態においては、アミノ酸置換導入はセリンまたはスレオニン残基である。一部の実施形態においては、アミノ酸置換導入はセリン、スレオニンまたはグリシン残基である。一部の実施形態においては、アミノ酸置換は中性（例えばセリン、スレオニンまたはグリシン）または親水性（例えばメチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）残基を導入する。一部の実施形態においては、アミノ酸置換はシステイン残基以外の天然アミノ酸を導入する。
【００６３】
操作された抗体は活性部分へのコンジュゲーションのための未置換の鎖間システイン残基少なくとも１つを保持している。操作された抗体における保持されたシステイン間残基の数は０より大きいが、親（非操作）抗体の鎖間システイン残基の総数より小さい。即ち、一部の実施形態においては、操作された抗体は鎖間システイン残基少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは少なくとも７つを有する。典型的な実施形態においては、操作された抗体は鎖間システイン残基偶数個（例えば少なくとも２、４、６または８反応性部位）を有する。一部の実施形態においては操作された抗体は鎖間システイン残基８つ未満を有する。
【００６４】
典型的な実施形態においては、鎖間システイン残基は対状態で置換され、その場合、鎖間ジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基両方が置換される（このような鎖間システイン残基は「相補」鎖間システイン残基と称する）。例えば、ＣＬ鎖間システイン残基が置換される場合、相補ＣＨ１鎖間システイン残基もまた置換される。別の例においては、ヒンジ領域の鎖間システイン残基の各対が置換されるか、または対状態で未置換のままとなり得る。別の実施形態においては、鎖間システイン残基は置換され、相補残基は未置換のままとなり得る。
【００６５】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有し、且つヒンジ領域の鎖間システイン残基を保持している重鎖を含む。関連する実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはヒンジ領域の鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００６６】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換およびヒンジ領域の鎖間システイン残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連する実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００６７】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基を保持し、そしてヒンジ領域鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、このように操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基および重鎖ＣＨ１鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００６８】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基を保持し、そしてヒンジ領域鎖間システイン残基の少なくとも１つであるが全てよりは少ないアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、このように操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基に、重鎖ＣＨ１鎖間システイン残基に、そして、残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００６９】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換、および、ヒンジ領域鎖間システイン残基の少なくとも１つにおけるアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００７０】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換、および、ヒンジ領域鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００７１】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基およびヒンジ領域鎖間システイン残基を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＨ１鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００７２】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基を有し、そしてヒンジ領域鎖間システイン残基の少なくとも１つにおいてアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＨ１鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００７３】
一部の実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基を有し、そしてヒンジ領域鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＨ１鎖間システイン残基にコンジュゲートした活性部分を有する。
【００７４】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換およびヒンジ領域の鎖間システイン残基を保持している重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはヒンジ領域の鎖間システイン残基にコンジュゲートした４つの活性部分を有する。
【００７５】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基を保持し、そして、両方のヒンジ領域の鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、そのように操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基および重鎖ＣＨ１鎖間システイン残基にコンジュゲートした４つの活性部分を有する。
【００７６】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換、および、一方のヒンジ領域の鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基およびヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした４つの活性部分を有する。
【００７７】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換および一方のヒンジ領域鎖間システイン残基の置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態においては、操作された抗体のイムノコンジュゲートはヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした２つの活性部分を有する。
【００７８】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換、および、両方のヒンジ領域の鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした２つの活性部分を有する。
【００７９】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基、および、一方のヒンジ領域の鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の残存する鎖間システイン残基にコンジュゲートした６つの活性部分を有する。
【００８０】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有し、そして、両方のヒンジ領域の鎖間システイン残基を保持している重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＬ鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の鎖間システイン残基にコンジュゲートした６つの活性部分を有する。
【００８１】
親抗体が８つの鎖間システイン残基を有する例示的な実施形態においては、操作された抗体は、各々がＣＬ鎖間システイン残基のアミノ酸置換を有する軽鎖、および、各々がＣＨ１鎖間システイン残基および両方のヒンジ領域鎖間システイン残基を保持している重鎖を含む。関連の実施形態において、操作された抗体のイムノコンジュゲートはＣＨ１鎖間システイン残基に、そして、ヒンジ領域の鎖間システイン残基にコンジュゲートした６つの活性部分を有する。
【００８２】
抗体はまた、抗原結合抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ鎖、一本鎖Ｆｖ（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦｖＦｃ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインの何れかを含むフラグメント、ミニボディー、マキシボディー、Ｆ（ａｂ’）３、またはＦａｂ発現ライブラリにより形成されるフラグメントであり得る。抗原結合抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体は、可変領域を単独で、または以下、即ち、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４および／若しくはＣＬドメインの全体または一部分と組み合わせて含むことができる。さらにまた、抗原結合フラグメントはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４および／またはＣＬドメインとの可変領域の何れかの組み合わせを含むことができる。参照により本明細書に援用されるＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６（２００５）を参照のこと。
【００８３】
一部の実施形態においては、抗体フラグメントは鎖間システイン残基少なくとも１つを包含するドメインまたはドメインの部分少なくとも１つを含む。例えば、抗体フラグメントはヒンジ領域、ＣＬおよびＣＨ１ドメイン、ＣＬおよびＣＨ１ドメインならびにヒンジ領域等を包含することができる。
【００８４】
抗体フラグメントは何れかの適切な抗体クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）およびサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のものであり得る。
【００８５】
典型的には、抗体はヒト、げっ歯類（例えばマウス、ラットまたはハムスター）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリのものである。本明細書においては、「ヒト」抗体はヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリンライブラリから、ヒトＢ細胞から、または、後述若しくは例えばＲｅｉｃｈｅｒｔ等（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１０７３−８（２００５））ならびに米国特許第５，９３９，５９８および第６，１１１，１６６号に記載されている通り、ヒト免疫グロブリン１つ以上に関してトランスジェニックである動物から単離された抗体を包含する。抗体は単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれより多重の特異性のものであってよい。
【００８６】
抗体は典型的には、モノクローナル抗体であるが、モノクローナル抗体の混合物でもあり得る。対象がヒト対象である場合は、抗体は抗原に対する使用可能な免疫応答を搭載することができる何れかの動物を免疫化することにより得てよい。動物はマウス、ラット、ヤギ、イツジ、ウサギまたは他の適切な実験動物であってよい。抗原は天然に存在する免疫原またはハプテンと免疫原性担体との合成免疫原性コンジュゲートの形態で提示してよい。免疫化された動物の抗体生産細胞を「不死」若しくは「不死化」ヒトまたは動物細胞と融合させて、抗体を生産するハイブリドーマを得てよい。所望により、抗体が異なる宿主細胞において生産されるように免疫グロブリン鎖１つ以上をコードする遺伝子をクローニングしてよく、そして所望により、配列を、そしてそれゆえに生産される抗体の免疫学的特性を改変するように遺伝子を変異させてよい（Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：７３０８−７３１２（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９（１９８３）；およびＯｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６（１９８２）参照）。ヒトモノクローナル抗体は当該分野で知られた多くの手法の何れか、例えばファージディスプレイ（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５−１６（２００５）参照）；ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（例えばＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１１７−２５（２００５）参照）；リボソーム−、ｍＲＮＡ−およびコウボ−ディスプレイライブラリ（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，前出参照）および患者由来のヒトハイブリドーマ（Ｂｒａｅｎｄｌｅｉｎら、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１９：８９７−９０５（２００４）；およびＩｌｌｅｒｔら、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１３：７６５−７０（２００５））並びびに／または単一抗原選択リンパ球（例えばＬａｇｅｒｋｖｉｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：８６２−９（１９９５）；およびＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−８（１９９６）参照）により作製してよい。
【００８７】
抗体は例えば当該分野で良く知られている手法により生産されたネズミ、キメラ、ヒト化または完全ヒト型の抗体であり得る。標準的な組み換えＤＮＡ手法を用いて作成できるヒト型および非ヒト型の部分の両方を含む組み換え抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体が有用な抗体である。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種から誘導された分子、例えばネズミモノクローナルから誘導した可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものである（例えば参照により全体が本明細書に援用されるＣａｂｉｌｌｙ等の米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓ等の米国特許第４，８１６，３９７号を参照）。一部の実施形態においては、抗体軽鎖定常領域ドメインはキメラではない。一部の実施形態においては、抗体重鎖定常領域はキメラではない。これに関する場合、「キメラ」とは２つの異なる種に由来する部分よりなる定常領域または定常領域ドメインを指す。
【００８８】
抗体はまた、二重特異性抗体でもあり得る。二重特異性抗体を作成するための方法は当該分野で知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な製造は２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいており、その場合、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。二重特異性抗体を形成するための更なる詳細は、例えばＳｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：６９５４−６９６１（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６３−４７０（１９９５）；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：６７７−６８１（１９９８）を参照のこと。このような手法を用いながら、疾患の治療または予防において使用するための二重特異性抗体を製造することができる。二官能性抗体はまた、欧州特許公開ＥＰＡ０１０５３６０号に記載されている。ハイブリッドまたは二官能性抗体は生物学的に、即ち細胞融合の手法により、あるいは、化学的に、特に架橋剤またはジスルフィド架橋試薬を用いながら誘導することができ、そして全抗体またはそのフラグメントを含んでよい。このようなハイブリッド抗体を得るための方法は例えばともに参照により本明細書に援用される国際公開ＷＯ８３／０３６７９号および欧州特許公開ＥＰＡ０２１７５７７号に開示されている。
【００８９】
一部の実施形態においては、抗体の定常ドメインはエフェクター機能を有する。「抗体エフェクター機能」即ちＡＥＣという用語は本明細書においては、ＩｇのＦｃドメインにより寄与される機能を指す。このような機能は、例えば、貪食作用または溶解活性を有する免疫細胞上のＦｃ受容体にＦｃエフェクタードメインを結合させることにより、または、補体系の成分にＦｃエフェクタードメインを結合させることにより、発揮させることができる。エフェクター機能は例えば「抗体依存性細胞性細胞傷害性」即ちＡＤＣＣ、「抗体依存性細胞貪食作用」即ちＡＤＣＰ、「補体依存性細胞傷害性」即ちＣＤＣであり得る。別の実施形態においては、定常ドメインは１つ以上のエフェクター機能を欠失している。
【００９０】
抗体は診断、予防および／または治療目的等、目的の抗原に対して指向させてよい。例えば抗原は感染性の病原体（例えば、限定しないが、ウイルス、細菌、カビおよび原虫）、寄生虫、腫瘍細胞または特定の医学的状態に関連するものであり得る。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の場合は、癌は免疫系、肺、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、頭部、頚部、骨または何れかの他の解剖学的位置のものであってよい。一部の実施形態においては、抗原はＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＥＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−Ｄｒ１０、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｌ６、Ｌｅｗｉｓ  X、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、アルファフェトプロテイン、ＣＡ２４２、胎盤アルカリホスファターゼ、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、前立腺酸性ホスファターゼ、表皮成長因子、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、抗トランスフェリン受容体、ｐ９７、ＭＵＣ１、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＩＬ−２受容体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ムチン、Ｐ２１、ＭＰＧおよびＮｅｕ癌遺伝子産物である。
【００９１】
一部の特定の有用な抗体は、例えば、限定しないが、ＢＲ９６ｍＡｂ（Ｔｒａｉｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：２１２−２１５（１９９３））、ＢＲ６４（Ｔｒａｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：１００−１０５（１９９７））、ＣＤ４０抗原に対するｍＡｂ、例えばＳ２Ｃ６ｍＡｂ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３２２５−３２３１（２０００））およびＣＤ３０抗原に対するｍＡｂ、例えばＡＣ１０（Ｂｏｗｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５８９６−５９０６（１９９３））を包含する。腫瘍特異的抗原に結合する多くの他の内在化抗体を使用することができ、そして研究されている（例えばＦｒａｎｋｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１５：４５９−７６（２０００）；Ｍｕｒｒａｙ，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２７：６４−７０（２０００）；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８を参照のこと）。これらの参考文献の開示は参照により本明細書に援用される。
【００９２】
一部の実施形態においては、抗原は「腫瘍特異的抗原」である。「腫瘍特異的抗原」とは本明細書においては、特定の腫瘍に特徴的な、または、そのような腫瘍に強力に相関する抗原を指す。しかしながら、腫瘍特異的抗原は必ずしも腫瘍組織に独特のものではなく、即ち腫瘍特異的抗原に対する抗体は正常組織の抗原とも交差反応する場合がある。腫瘍特異的抗原が腫瘍細胞に独特のものではない場合において、実際上は、腫瘍特異的抗原に対する抗体の結合は、交差反応に起因する保証されない危険や妨害を伴うことなく所望の手順を実施するためには十分に腫瘍細胞に特異的である場合が多い。多くの要因がこの実際上の特異性に寄与している。例えば、腫瘍細胞上の抗原の量は正常細胞上に見出される交差反応性抗原の量を遥かに超過しているか、または、腫瘍細胞上の抗原はより効果的に提示される場合がある。従って、「腫瘍特異的抗原」という用語は、本明細書においては、実際上利用される特異性に関し、そして、絶対的な特異性を指し示すことや、抗原が腫瘍に独特であること意味することは意図していない、
腫瘍関連または腫瘍特異的な抗原に対して免疫特異的な抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋのデータベースまたは類似のデータベース、商業的な入手元、文献出版物から、または、通常のクローニングおよび配列決定により得ることができる。
【００９３】
一部の実施形態においては、抗体は自己免疫疾患の診断、治療または予防のために、抗原に対して指向される。自己免疫抗体の製造を担っている細胞の抗原に対して免疫特異的な抗体は、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースまたは類似のデータベース、商業的またはその他の入手元から、または当該分野で知られた何れかの方法、例えば化学合成若しくは組み換え発現手法により得ることができる。
【００９４】
一部の実施形態においては、抗体は抗核抗体；抗ｄｓＤＮＡ；抗ｓｓＤＮＡ；抗カルジオリピン抗体ＩｇＭ、ＩｇＧ；抗リン脂質抗体ＩｇＭ、ＩｇＧ；抗ＳＭ抗体；抗ミトコンドリア抗体；甲状腺抗体；ミクロソーム抗体；サイログロブリン抗体；抗ＳＣＬ７０；抗Ｊｏ；抗Ｕ１ＲＮＰ；抗Ｌａ／ＳＳＢ；抗ＳＳＡ；抗ＳＳＢ；抗壁細胞抗体；抗ヒストン；抗ＲＮＰ；抗ＣＡＮＣＡ；抗ＰＡＮＣＡ；抗中心体；抗フィブリラリンまたは抗ＧＢＭ抗体である。
【００９５】
一部の実施形態においては、抗体は標的細胞（例えば活性化リンパ球）上に発現される受容体または受容体複合体に結合することができる。受容体または受容体複合体は免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、インテグリン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、主要組織適合性タンパク質、レクチンまたは補体制御タンパク質を含むことができる。適切な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ７９、ＣＤ９０、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＩＣＯＳである。適切なＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ９５／Ｆａｓ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４１ＢＢ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、オステオプロテゲリン、Ａｐｏ２／ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４およびＡＰＯ３である。適切なインテグリンの非限定的な例は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ４１、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３およびＣＤ１０４である。適切なレクチンの非限定的な例はＣ型、Ｓ型およびＩ型レクチンである。他の実施形態において、受容体はＣＤ７０である。
【００９６】
一部の実施形態において、抗体はウイルスまたは微生物抗原に対して免疫特異的である。本明細書においては、「ウイルス抗原」という用語は、限定しないが、免疫応答を誘発することができる何れかのウイルスペプチド、ポリペプチドタンパク質（例えばＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｎｅｆ、ＲＳＶＦ糖タンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＨＴＬＶｔａｘ、単純疱疹ウイルス糖タンパク質（例えばｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＥ）およびＢ型肝炎表面抗原）を包含する。本明細書においては、「微生物抗原」という用語は、限定しないが、免疫応答を誘発することができる何れかの微生物ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖類、多糖類または脂質の分子（例えば、細菌、カビ、病原性原虫またはコウボのポリペプチド、例えばＬＰＳおよび莢膜多糖類５／８）を包含する。
【００９７】
ウイルスまたは微生物抗原に免疫特異的な抗体は、市販品として、例えばＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から得るか、または、または当該分野で知られた何れかの方法、例えば化学合成または組み換え発現手法により製造することができる。ウイルスまたは微生物抗原に対して免疫特異的である抗体をコードするヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースまたは類似のデータベース、文献出版物から、または、通常のクローニングおよび配列決定により得ることができる。
【００９８】
ウイルス感染症または微生物感染症の診断または治療のために有用な抗体の例は、限定しないが、ヒト化抗呼吸器シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）感染症の患者の治療のために有用なＲＳＶモノクローナル抗体であるＳＹＮＡＧＩＳ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）；ＨＩＶ感染の治療に有用なＣＤ４融合抗体であるＰＲＯ５４２（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）；Ｂ型肝炎ウイルスの治療に有用なヒト抗体であるＯＳＴＡＶＩＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の治療に有用なヒト化ＩｇＧ１抗体であるＰＲＯＴＯＶＩＲ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）；および抗ＬＰＳ抗体を包含する。
【００９９】
他の抗体は、限定しないが、例えば細菌の病原性菌株（ストレプトコッカス・ピオゲンス、ストレプトコッカス・ニューモニア、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギチジス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、クロストリジウム・テタニ、ヘモフィルス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニア、クレブシエラ・オザエナス、クレブシエラ・リノスクレロモチス、スタフィロコッカス・アウレウス、ビブリオ・コレラ、エシェリシア・コリ、シュードモナス・アエルギノーサ、カンピロバクター（ビブリオ）フェタス、エアロモナス・ヒドロフィリア、バチルス・セレウス、エドワルドシエラ・タルダ、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ペスチス、エルシニア・シュードツベルクロシス、シゲラ・ジセンテリア、シゲラ・フレキシネリ、シゲラ・ソネイ、サルモネラ・チフムリウム、トレポネマ・パリダム、トレポネマ・ペルテヌ、トレポネマ・カラテネウム、ボレリア・ビンセンチ、ボレリア・ブルゴドルフェリ、レプトスピラ・イクテロヘモラジエ、マイコバクテリウム・ツベルクロシス、ニューモシスティス・カリニ、フランシセラ・ツラレンシス、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・スイス、ブルセラ・メリテンシス、マイコプラズマ種、リケッチア・プロワゼキ、リケッチア・ツツガムシ、クラミジア種）；病原性のカビ（例えばコクシジオイデス・イミティス、アスペルギルス・フミガタス、カンジダ・アルビカンス、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオホルマンス、ヒストプラズマ・カプスラタム）；原虫（エントモエバ・ヒストリチカ、トキソプラズマ・ゴンジ、トリコモナス・テナス、トリコモナス・ホミニス、トリコモナス・バギナリス、トリパノソマ・ガンビエンス、トリパノソマ・ロデシエンス、トリパノソマ・クルジ、レイシマニア・ドノヴァニ、レイシマニア・トロピカ、レイシマニア・ブラジリエンシス、ニューモシチス・ニューモニア、プラズモジウム・ビバックス、プラズモジウム・ファルシパラム、プラズモジウム・マラリア）；または蠕虫（エンテロビウス・ベルミクラリス、トリクリス・トリキウア、アスカリス・ルンブリコイデス、トリキネラ・スピラリス、ストロンギロイデス・ステルコラリス、スキストソマ・ジャポニカム、スキストソマ・マンソニ、スキストソマ・ヘマトビウムおよび十二指腸虫）由来の抗原に対する抗体を包含する。
【０１００】
他の抗体としては、限定しないが、病原性ウイルス、例えばポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、アデノウイルス科、パポバウイルス科、エンテロウイルス科、ピコナウイルス科、パルボウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜ、麻疹、呼吸器シンシチウムウイルス、風疹、アルボウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルス、リノウイルス科、コロナウイルス科、ロトウイルス科およびヒト免疫不全ウイルスの抗原に対する抗体を包含する。
【０１０１】
（タンパク質をコードする核酸配列を改変することにより抗体にアミノ酸置換を導入するための方法）
アミノ酸置換は何れかの適切な方法により抗体をコードする核酸配列内に導入することができる。このような方法はポリメラーゼ連鎖反応系の変異誘発、部位特異的変異誘発、合成ＤＮＡオリゴマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子合成、および核酸合成、ならびに、その後の適宜重鎖および／または軽鎖の他の部分を含む、発現ベクターへの合成ＤＮＡのライゲーションを包含する（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ等およびＡｕｓｕｂｅｌ等を参照のこと）。
【０１０２】
抗体をコードするヌクレオチド配列は例えばＧｅｎＢａｎｋのデータベース若しくは類似のデータベース、文献出版物から、または、通常のクローニングおよび配列決定により得ることができる。指向された変異誘発のために使用できる一部の方法の例は、Ｍ１３ＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド指向変異誘発、プラスミドＤＮＡを用いたオリゴヌクレオチド指向変異誘発、および、ＰＣＲ増幅オリゴヌクレオチド指向変異誘発である（例えばＧｌｉｃｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，１７１−１８２頁（１９９８）参照。変異誘発およびクローニングの例は実施例１に記載する。
【０１０３】
オリゴヌクレオチド指向変異誘発の詳細なプロトコルおよびクローニングされたＤＮＡの変異誘発のための関連する手法は当該分野で良く知られている（例えばＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）参照；また前出のＳａｍｂｒｏｏｋ等およびＡｕｓｕｂｅｌ等を参照）。
【０１０４】
一部の実施形態においては、アミノ酸置換はシステイン残基に対するセリンである。一部の実施形態においては、アミノ酸置換導入はセリンまたはスレオニン残基である。一部の実施形態においては、アミノ酸置換は中性（例えばセリン、スレオニンまたはグリシン）または親水性（例えばメチオニン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）残基を導入する。一部の実施形態においては、アミノ酸置換はシステイン残基以外の天然のアミノ酸を導入する。
【０１０５】
本発明は抗体または抗体フラグメント内に鎖間システイン残基のアミノ酸置換（例えばシステインからセリンへの置換）を導入するための方法を提供するが、本発明はそれに限定されない。当業者の知る通り、コンジュゲーションのために他のアミノ酸、例えばリジン残基を抗体または抗体フラグメントの別の位置において導入／除去することも可能である。さらにまた、スルフィドリル基を鎖間システイン残基以外のアミノ酸において抗体内に組み換え導入することもできる。コンジュゲーションのための別の代替変異誘発部位は当該分野で良く知られている分子モデリング手法を用いて識別することができる。例えばＬｅｓｋ等“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  Ｇｕｉｄｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ．），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ｐｐ．１−３８（１９９２）；Ｃｈｅｅｔｈａｍ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ”，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ（前出），３９−６７頁を参照のこと。一般的には、部位指向性変異誘発のための方法に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）（これら全ては参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１０６】
（操作された抗体のＤＮＡ配列のタンパク質産物を発現させ単離するための方法）
（Ａ．操作された抗体を発現させる方法）
ヌクレオチド配列を改変した後、核酸配列のコンホーメーション等をさらに分析するためにクローニングベクター内に核酸を挿入する。核酸によりコードされるポリペプチドを発現するためには、発現ベクター内の転写発現を制御する調節配列に核酸を作動可能に連結し、そして次に、原核生物または真核生物の宿主細胞に導入することができる。プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列のほかに、発現ベクターは翻訳調節配列および／または発現ベクターを含有する細胞の選択に適するマーカー遺伝子を包含してよい。
【０１０７】
原核生物宿主内での発現のためのプロモーターは抑制、構成または誘導のものであり得る。適切なプロモーターは当該分野で良く知られており、そして例えばＴ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼに対するプロモーター、バクテリオファージラムダのＰＲおよびＰＬプロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショックおよびｌａｅＺプロモーター、Ｂ・サブチルスのアルファーアミラーゼおよびシグマ２８特異性プロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトマイセスプロモーター、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のベータラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、ならびに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを包含する。原核生物プロモーターはＧｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２２７−２８２（１９８７）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｓ（１９８７）；Ａｕｓｕｂｅｌ等（前出）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ等（前出）により検討されている。
【０１０８】
一部の実施形態においては、原核生物宿主は大腸菌である。大腸菌の適切な菌株は例えばＹ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１およびＥＲ１６４７を包含する（例えばＢｒｏｗｎ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）参照）。代替となる宿主はバチルス・サブチルス、例えばＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０およびＢ１７０などの菌株である（例えばＨａｒｄｙ，“Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｌｏｖｅｒ  （Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照）。
【０１０９】
大腸菌中で抗体フラグメントを生産するための方法は当該分野で良く知られている。例えば、Ｈｕｓｅ，“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｐｈａｇｅ”，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ．），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１０３−１２０頁（１９９２）；Ｗａｒｄ，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ａ  Ｈｏｓｔ”同上、１２１−１３８頁（１９９２）を参照のこと。Ｆｖフラグメントもまた当該分野で知られた方法により生産できる。例えば上記を参照のこと。またさらにＷｈｉｔｌｏｗら、“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２（２）（１９９１）も参照のこと。さらにまた、原核生物細胞において抗体をクローニングするための特定の発現系が市販されている。
【０１１０】
一部の実施形態においては、核酸配列は真核生物細胞、そして特に哺乳類、昆虫およびコウボ細胞内において発現させる。１つの実施形態において、真核生物宿主は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は適切な折り畳みおよびグリコシル化を含む、クローニングされたポリペプチドへの翻訳後の修飾を提供する。例えばこのような哺乳類宿主細胞は、ＣＯＳ−７細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、非分泌型ミエローマ細胞（例えばＳＰ２／０−ＡＧ１４；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１；ＣＨＯ−ＤＧ４４、Ｕｒｌａｕｂら、Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１２（６）：５５５−６６（１９８６））、ラット下垂体細胞（例えばＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａＳ３細胞（例えばＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）およびラット肝細胞癌細胞（例えばＨ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５４８）を包含する。
【０１１１】
哺乳類宿主については、転写および翻訳の調節シグナルは種々の原料、例えばアデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスおよびシミアンウイルスから誘導してよい。さらに、アクチン、コラーゲンまたはミオシンなどの哺乳類細胞由来のプロモーターも使用できる。あるいは、原核生物プロモーター（例えばバクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を使用することができ、その場合、原核生物プロモーターは真核細胞プロモーターにより調節される（例えば、Ｚｈｏｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９−４５３７（１９９０）；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０（１９９１）を参照のこと）。遺伝子の発現がモジュレートできるように抑制または活性化を可能にする転写開始調節シグナルを選択してよい。
【０１１２】
一般的に、真核生物調節領域はＲＮＡ合成の開始を指向するために十分なプロモーター領域を包含することになる。このような真核生物プロモーターは例えばマウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０早期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１））；ラウス肉腫ウイルスプロモーター（（Ｇｏｒｍａｎ，”Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１４３−１９０頁（１９８５））；サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８０））；コウボｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９：６９７１−６９７５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５９５１−５９５５（１９８４）；およびＩｇＧプロモーター（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３−３８３７（１９８９））であり得る。
【０１１３】
強力な調節配列を使用できる。そのような調節配列の例はＳＶ４０プロモーター−エンハンサー（Ｇｏｒｍａｎ，”Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”，ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１４３−１９０頁（１９８５））；ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター−エンハンサー（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５（１９９２））、チャイニーズハムスターＥＦ−１αプロモーター（例えば米国特許第５，８８８，８０９号参照）および抗体重鎖プロモーター（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３−３８３７（１９８９）を包含する。同様に包含されるものは、軽鎖の発現のためのカッパ鎖エンハンサーおよびＩｇＨエンハンサーである（Ｇｉｌｌｉｅｓ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｃ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（Ｅｄ．），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１３９−１５７頁（１９９２）；Ｏｒｌａｎｄｉら、前出）。
【０１１４】
操作された抗体コード核酸および作動可能に連結したプロモーターは直鎖分子または環状分子の何れかであってよい非複製ＤＮＡ分子として真核生物細胞内に導入してよい。そのような分子は自律的に複製できないため、タンパク質の発現は導入された配列の一過性の発現を介して起こってよい。１つの態様において、永久的な発現は宿主染色体内への導入された配列の組み込みを介して起こる。
【０１１５】
一部の実施形態においては、導入された核酸はレシピエント宿主内で自律複製が可能なプラスミドまたはウイルスベクターに取り込まれる。この目的のために多くの可能なベクター系が利用可能である。ベクターの１つのクラスはウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスまたはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスから誘導した自律複製染色体外プラスミドを与えるＤＮＡエレメントを利用する。ベクターの第２のクラスは宿主染色体内への所望のゲノムまたはｃＤＮＡ配列の組み込みに依存している。ｍＲＮＡの最適な合成のためには別のエレメントが必要となる場合もある。これらのエレメントにはスプライスシグナルならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルが包含される。このようなエレメントを取り込んだｃＤＮＡ発現ベクターはＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３），Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、前出、Ｏｒｌａｎｄｉら、前出、Ｆｏｕｓｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１１２１−１１２７（１９９２）；およびＧｉｌｌｉｅｓ，前出により記載されているものを包含する。イントロン配列を含むゲノムＤＮＡ発現ベクターはＯｒｌａｎｄｉら、前出に記載されている。さらに一般的にＬｅｒｎｅｒ等（Ｅｄｓ．），Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２（２）（１９９１）も参照のこと。
【０１１６】
インタクトな抗体を発現する哺乳類細胞を得るためには、抗体軽鎖をコードする核酸を含む発現ベクターを抗体重鎖発現ベクターと共に哺乳類細胞内に同時トランスフェクトまたはトランスフェクトすることができる。あるいは、重鎖発現ベクターを含有する哺乳類細胞を抗体軽鎖発現ベクターでトランスフェクトすることができ、あるいは、抗体軽鎖発現ベクターを含有する哺乳類細胞を抗体重鎖発現ベクターでトランスフェクトすることができる。さらに、哺乳類細胞は抗体軽鎖をコードする核酸（例えばＤＮＡ）フラグメントならびに抗体重鎖をコードする核酸（例えばＤＮＡ）フラグメントを含む単一の発現ベクターでトランスフェクトすることができる。例えばＧｉｌｌｉｅｓ前出；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、前出を参照できる。これらの方策の何れも全体の操作された抗体分子を発現するトランスフェクトされた細胞を生成する。標準的なトランスフェクションおよび形質転換の手法は当該分野で良く知られている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照できる。
【０１１７】
細胞系統の開発およびタンパク質発現の例は実施例１に記載する。
【０１１８】
（Ｂ．トランスフェクトされた細胞から操作された抗体を単離するための方法）
発現ベクターを担持する形質転換またはトランスフェクトされた細胞は適切な薬剤を使用しながら選択される。例えば、Ｇ４１８はアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択するために使用できる（例えばＳｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：３２７−３４１（１９８２）参照）。あるいは、ハイグロマイシン−Ｂを用いて、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択することができる（例えばＰａｌｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：１０５５−１０５９（１９８７）参照）。アミノプテリンおよびマイコフェノール酸を用いて、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択することができる（例えばＭｕｌｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２−２０７６（１９８１）参照）。メトトレキセートを用いてジヒドロフォレート還元酵素遺伝子を有する発現ベクターを担持するトランスフェクトされた細胞を選択することができる（例えばＷｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７（６）：３５６７−７０（１９８０）参照）。
【０１１９】
操作された抗体を生産する形質転換またはトランスフェクトされた細胞は種々の方法を用いて識別することができる。例えば、何れかの免疫検出試験を用いてこのような「トランスフェクトーマ」を識別することができる。
【０１２０】
形質転換体またはトランスフェクト体が識別された後、細胞を培養し、抗体を細胞および／または培養上澄みから単離する。単離の手法はプロテインＡセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを包含する。詳細なプロトコルについては例えばＣｏｌｉｇａｎ等（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）を参照のこと。
【０１２１】
（イムノコンジュゲートを製造するための方法）
（Ａ．抗体フラグメントの製造）
本発明はまた、操作された抗体または抗原結合抗体フラグメント由来のイムノコンジュゲートを提供する。抗体フラグメントは例えば組み換え宿主細胞（例えば形質転換体またはトランスフェクト体）から、および／または、インタクトな操作された抗体の蛋白分解切断により得ることができる。抗体フラグメントは変異されている重鎖構造遺伝子で細胞をトランスフェクトすることにより、形質転換体またはトランスフェクト体から直接得ることができる。例えば、ＣＨ１ドメインの配列の後に停止コドンが挿入されれば、トランスフェクトーマはＦａｂフラグメントを生産できる。あるいは、重鎖のヒンジ領域をコードする配列の後に停止コドンが挿入されれば、トランスフェクトーマはＦａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを生産できる。
【０１２２】
あるいは、抗体フラグメントはよく知られた蛋白分解の手法を用いてインタクトな抗体から製造できる。例えばＣｏｌｉｇａｎら、前出を参照できる。さらに、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはインタクトな抗体のペプシン消化を用いて得ることができる。２価のフラグメントは従来のジスルフィド結合還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等を用いて分解することにより１価のフラグメントにすることができる。
【０１２３】
（Ｂ．コンジュゲーション方法）
広範な種類の診断、予防および治療薬剤を本発明の抗体に好都合にコンジュゲートすることができる。一部の実施形態においては、抗体を化学量論的に、即ち完全に負荷することができる（即ちＣ＃＝Ｙ、ここでＹは各抗体分子に結合した活性部分の平均数を指す）。他の実施形態においては、抗体を部分的に負荷することができる（即ちＣ＃＞Ｙ）。
【０１２４】
イムノコンジュゲートは診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤をインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートすることにより製造できる。このような手法は、Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２−８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；Ｓｈｉｈ等の米国特許第５，０５７，３１３号；Ｓｈｉｈ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：４１９２，国際公開ＷＯ０２／０８８１７２号；米国特許第６，８８４，８６９号；国際特許公開ＷＯ２００５／０８１７１１号；および米国特許出願２００３−０１３０１８９Ａ１に記載されており、これらは全て参照により本明細書に援用される。
【０１２５】
さらに、当業者の認知する通り、コンジュゲーション方法には種々の可能な変法があり得る。例えば「２価のイムノコンジュゲート」は診断または治療薬剤を炭水化物部分に、または、遊離のスルフィドリル基に結合することにより構築することができる。
【０１２６】
一部の実施形態においては、鎖間システイン残基はシステイン残基のチオール（−−ＳＨ）側鎖基の酸化の結果としてジスルフィド結合として存在する。ジスルフィド結合を還元剤で処理することによりジスルフィド結合の還元的開裂が起こり、遊離のチオール基が残存する。
【０１２７】
一部の実施形態においては、薬剤は鎖間システイン残基と反応性を有する基を有するか、それを含むように修飾される。例えば、薬剤はチオール基へのコンジュゲーションにより結合できる。コンジュゲーションのために使用できる化学物質の例は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）、Ｃａｐｔｅｒ  １５（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を参照のこと（この開示内容は参照により全体が本明細書に援用される）。
【０１２８】
例えば、抗体の化学的活性化が遊離のチオール基の形成をもたらす場合、タンパク質はスルフィドリル反応性の薬剤とコンジュゲートしてよい。一部の実施形態においては、薬剤は遊離のチオール基に対して実質的に特異的なものである。このような薬剤は例えばマレイミド、ハロアセトアミド（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジル性ハロゲン化物（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ビニルスルホンおよびピリジルチオを包含する。
【０１２９】
特定の実施形態においては、スルフィドリル反応性薬剤はアルファハロアセチル化合物、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、例えばＮ−エチルマレイミド、水銀誘導体、例えばアセテート、クロリドまたはニトレートの対イオンを有する３，６−ビス−（水銀メチル）ジオキサン、および、ジスルフィド誘導体、例えばジスルフィドジオキサン誘導体、ポリメチレンビスメタンチオスルホネート試薬およびクラベセイン（還元された抗体の交差ジスルフィド結合を付加することがわかっている２つの遊離スルフィドリル基を含有するフルオレセインの蛍光誘導体）であり得る。
【０１３０】
アルファ−ハロアセチル化合物、例えばヨードアセテートは、スルフィドリル基と容易に反応してアミドを形成する。これらの化合物を用いて遊離チオールをカルボキシメチル化している。それらは厳密にはＳＨ特異的ではなく、アミンと反応する。反応にはチオレートの親核攻撃が含まれ、ハライドの置き換えが起こる。反応性のハロアセチル部分、Ｘ−−ＣＨ２ＣＯ−−は種々の目的のために化合物に取り込まれている。例えば、ブロモトリフルオロアセトンはＦ−１９の取り込みのために使用されており、そしてＮ−クロロアセチルヨードトリアミンはタンパク質への放射性ヨウ素の導入のために使用されている。
【０１３１】
マレイミド、例えばＮ−エチルマレイミドは特に他の基がプロトン化される７未満のｐＨ値においてスルフィドリル基に顕著な特異性を示すと考えられる。チオールはマレイミドとマイケル反応を起こし、二重結合への付加物のみを与える。形成されるチオエーテル結合は極めて安定である。それらはまた、アミノおよびイミダゾリル基とも遥かに緩徐な速度において反応する。例えばｐＨ７においては、単純なチオールとの反応は相当するアミンに対するよりも約１０００倍高速に起こる。反応に伴う３００ｎｍ領域の特徴的な吸光度の変化は反応をモニタリングするための好都合な方法を与える。これらの化合物は低ｐＨにおいて安定であるが、高ｐＨでは加水分解を受けやすい。一般的には、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１：Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ４を参照のこと。
【０１３２】
スルフィドリルとは元来反応性ではない薬剤（例えば薬品）もなお、薬剤と反応性の基およびスルフィドリル反応性の基の両方を担持した二官能性の架橋剤を用いることにより、化学的に活性化された抗体にコンジュゲートしてよい。架橋剤は目的の分子と（例えばアミノ、カルボキシまたはヒドロキシ基を介して）、そして化学的に活性化されたタンパク質と同時に反応してよく、あるいは、それを用いて目的の分子を誘導体化することにより相手分子を形成し、次にこれが薬剤から誘導した部分によりスルフィドリル反応性となってよく、あるいは、それを用いることにより化学的に活性化されたタンパク質が目的分子と反応性となるように誘導体化してよい。
【０１３３】
薬剤はまたリンカーにより抗体に連結できる。適切なリンカーは例えば切断可能、または非切断可能なリンカーを包含する。切断可能なリンカーは典型的には細胞内条件下の切断を受けやすいものである。適切な切断可能なリンカーは例えばリソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーを包含する。例示的な実施形態においては、リンカーはジペプチドリンカー、例えばバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）またはフェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーであり得る。他の適切なリンカーは５．５未満のｐＨで加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーを包含する。別の適切な切断可能なリンカーはジスルフィドリンカーを包含する。
【０１３４】
リンカーは抗体への連結のための基を包含できる。例えばリンカーはスルフィドリル反応性の基（例えばマレイミド、ハロアセトアミド（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロエステル（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ハロメチルケトン（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ベンジル性ハロゲン化物（例えばヨード、ブロモまたはクロロ）、ビニルスルホンおよびピリジルチオ）を包含できる。一般的には、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１を参照のこと。
【０１３５】
特定の実施形態においては、イムノコンジュゲートは下記の式：
【０１３６】
【化１２】
2008521828.tif 000007
を有するか、または薬学的に受容可能なその塩または溶媒和物であり、ここで、
Ａｂは抗体であり、
Ａはストレッチャー単位であり、
ａは０または１であり、
各Ｗは独立してリンカー単位であり、
ｗは０〜１２の整数であり、
Ｙはスペーサー単位であり、
ｙは０、１または２であり、
ｐは１〜約２０の範囲であり、そして、
Ｄは診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤であり、そして、
ｚはタンパク質上の所定のコンジュゲーション部位の数である。
【０１３７】
抗体が完全に負荷されている場合、ｐ＝ｚである。抗体が部分的に負荷されている場合はｐ＜ｚである。一部の実施形態においては、ｐは偶数である。特定の実施形態においては、ｐ＝２、４、６または８である。特定の実施形態においては、ｐ＝ｚ＝４である。別の実施形態においては、０＜ｐ＜８である。
【０１３８】
ストレッチャー単位は抗体にリンカー単位を連結することができる。ストレッチャー単位は抗体の鎖間システイン残基と結合を形成できる官能基である。有用な官能基は限定しないが上記したスルフィドリル反応性基を包含する。
【０１３９】
リンカー単位は典型的にはアミノ酸単位、例えばジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチドである。リンカー単位は細胞内で切断可能または非切断可能である。
【０１４０】
１つの実施形態において、アミノ酸単位はバリン−シトルリンである。別の実施形態において、アミノ酸単位はフェニルアラニン−リジンである。さらに別の実施形態において、アミノ酸単位はＮ−メチルバリン−シトルリンである。さらに別の実施形態において、アミノ酸単位は５−アミノ吉草酸、ホモフェニルアラニンリジン、テトライソキノリンカルボキシレートリジン、シクロヘキシルアラニンリジン、イソネペコチック酸リジン、ベータアニリンリジン、グリシンセリンバリングルタミンおよびイソネペコチック酸である。特定の実施形態においては、アミノ酸単位は天然のアミノ酸を含み得る。別の実施形態においては、アミノ酸単位は非天然のアミノ酸を含む。
【０１４１】
スペーサー単位は、存在する場合は、リンカー単位をＤに連結する。あるいは、スペーサー単位は、リンカー単位が存在しない場合に、ストレッチャー単位を薬剤部分に連結することができる。スペーサー単位はまた、リンカー単位とストレッチャー単位との両方が存在しない場合に、抗体に診断、予防および治療薬剤を連結することができる。１つの実施形態において、スペーサー単位はｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位、ｐ−アミノベンジルエーテル単位、またはｐ−アミノベンジルカルバモイル単位である（例えば米国特許公開第２００３−０１３０１８９号を参照のこと）。
【０１４２】
一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは下記の式を有する：
【０１４３】
【化１３】
2008521828.tif 000008
ここで、Ｒ１７は−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ−、−Ｏ（Ｃ１−Ｃ８アルキル）−、−アリーレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−アリーレン−、−アリーレン−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ）−Ｃ１−Ｃ１０アルキレン−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−および（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−から選択される。一部の実施形態においては、Ｒ１７は−（ＣＨ２）５−または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒは２である。
【０１４４】
別の実施形態において、イムノコンジュゲートは下記の式を有する：
【０１４５】
【化１４】
2008521828.tif 000009
ここで、Ｒ１７は上記の通り定義される。
【０１４６】
別の実施形態において、イムノコンジュゲートは下記の式のうちの１つを有する：
【０１４７】
【化１５】
2008521828.tif 000010
。
【０１４８】
最終的なイムノコンジュゲートは従来の手法、例えばセファクリルＳ−３００上のサイジングクロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースなどのアフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製してよい。
【０１４９】
タンパク質の精製およびコンジュゲーションの例を実施例１および２において記載する。
【０１５０】
（診断および治療のためのイムノコンジュゲートの使用）
（Ａ．診断のためのイムノコンジュゲートの使用）
イムノコンジュゲートは診断画像化のために使用できる。例えばイムノコンジュゲートは放射標識モノクローナル抗体であり得る。例えばＳｒｉｖａｓｔａｖａ（ｅｄ．）．Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｃｈａｓｅ，“Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ”，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｎａｒｏ等（ｅｄｓ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，６２４−６５２頁（１９９０）；Ｂｒｏｗｎ．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｐｅｚｚｕｔｏ等（ｅｄｓ．），Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，２２７−２４９頁（１９９３）を参照できる。イムノシンチグラフィーとしても知られているこの手法は、モノクローナル抗体にコンジュゲートしたガンマ線発射放射性同位体の位置を検出するためにガンマカメラを使用している。診断画像化は癌、自己免疫疾患、感染症および／または心臓血管疾患を診断するために使用できる（例えばＢｒｏｗｎ，前出を参照）。
【０１５１】
一例において、イムノコンジュゲートは心臓血管疾患を診断するために使用できる。例えば、抗ミオシン抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートは、急性心筋梗塞に伴う心筋壊死を画像化するために使用できる。血小板またはフィブリンに結合する抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートは、深静脈血栓を画像化するために使用できる。さらに、活性化血小板に結合する抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートはアテローム性動脈硬化症のプラークを画像化するために使用できる。
【０１５２】
イムノコンジュゲートはまた、感染性疾患の診断において使用できる。例えば、特定の細菌抗原に結合する抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートは、膿瘍の位置特定のために使用できる。さらに、顆粒球および炎症性白血球に結合する抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートは、細菌感染症の部位を特定するために使用できる。
【０１５３】
多くの研究が癌のシンチグラフィー検出のためのモノクローナル抗体の使用を評価している。例えば前出Ｂｒｏｗｎを参照のこと。研究対象は黒色腫、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、肉腫および肺癌などの固形腫瘍の主要な型を包含する。即ち、本発明はまた、癌を検出するための腫瘍マーカーに結合する抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートを用いる癌の検出を意図している。このような腫瘍マーカーの例は、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、癌遺伝子産物、腫瘍関連細胞表面抗原、および、壊死関連細胞内抗原、ならびに後述する腫瘍関連抗原および腫瘍特異的抗原を包含する。
【０１５４】
診断のほかに、モノクローナル抗体画像化は治療応答をモニタリングし、疾患の再発を検出し、そして、後の臨床判断の指針とするために使用できる。
【０１５５】
診断およびモニタリング目的のためには、放射性同位体を直接、または中間的官能基を用いて間接的に、抗体フラグメントに結合してよい。このような中間的官能基には例えばＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）およびＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）が包含される。患者に送達される放射線の線量は典型的には可能な限り低水準に維持する。これは検出および正確な測定を可能にする最小限の半減期、最小限の体内保持時間、および、最小限の同位体量の最良の組み合わせとなるように同位体を選択することにより達成できる。抗体に結合することができ、そして診断画像化に適切な放射性同位体の例は、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎを包含する。
【０１５６】
研究によれば、抗体フラグメント、特にＦａｂおよびＦａｂ’が適切な腫瘍／バックグラウンド比を与えるとされる（例えば前出Ｂｒｏｗｎ参照）。
【０１５７】
イムノコンジュゲートはまた、インビボの診断の目的のために常磁性イオンで標識できる。磁気共鳴画像化のために特に有用な元素はＧｄ、Ｍｎ、ＤｙおよびＦｅイオンである。
【０１５８】
イムノコンジュゲートはインビトロの特定の抗原の存在を検出することもできる。そのような免疫試験において、イムノコンジュゲートは液相中で使用するか、または、固相担体に結合させてよい。例えば、重合体コーティングビーズ、プレートまたはチューブなどの不溶性の支持体に抗体成分を連結するためには、アミノデキストランなどの重合体にインタクトな抗体、または、その抗原結合フラグメントを結合することができる。
【０１５９】
あるいは、イムノコンジュゲートは、組織学的標本から調製した組織切片における特定の抗原の存在を検出するために使用できる。このようなインサイチュの検出は例えば検出可能に標識されたイムノコンジュゲートを組織切片に適用することにより達成できる。インサイチュ検出は特定の抗原の存在を調べるため、および、検査組織における抗原の分布を調べるために使用できる。インサイチュ検出の一般的手法は当該分野で良く知られている（例えばＰｏｎｄｅｒ，“Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｋｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍｏｎｋ（ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１１５−１３８頁（１９８７）；Ｃｏｌｉｇａｎら、前出参照）。
【０１６０】
酵素、蛍光化合物、電子転移剤等の検出可能な標識は、当該分野で良く知られている従来の方法により担体に連結できる。これらの標識された担体およびそれから製造されたイムノコンジュゲートは、抗体コンジュゲートが抗体への標識の直接の結合により製造できるが、インビトロ免疫試験およびインサイチュ検出のために使用できる。複数の標識によるイムノコンジュゲートの負荷は免疫試験または組織学的手順の感度を上昇させることができ、その場合、標的抗原への抗体または抗体フラグメントの結合を低値とすることができる。
【０１６１】
（Ｂ．治療のためのイムノコンジュゲートの使用）
イムノコンジュゲートを用いてウイルスおよび細菌の感染性疾患、心臓血管疾患、自己免疫疾患および癌を治療することができる。そのような治療の目的は非標的組織への曝露を最小限にしながら、標的細胞に活性剤（例えば放射線、毒素または薬剤）の細胞傷害性または細胞増殖抑制用量を送達することである。
【０１６２】
放射性同位体は直接、または、キレート形成剤を介して間接的に、インタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントに結合できる。例えば６７Ｃｕは、キレート形成剤ｐ−ブロモ−アセトアミドベンジルテトラエチルアミン４酢酸（ＴＥＴＡ）を用いて抗体成分にコンジュゲートできる（例えば前出のＣｈａｓｅ参照）。
【０１６３】
さらに、イムノコンジュゲートは治療薬剤が毒素または薬剤であるように製造できる。そのようなイムノコンジュゲートの製造のための有用な毒素はリシン、アブリン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素およびシュードモナス内毒素を包含する。イムノコンジュゲートを製造するための有用な化学療法剤は、オーリスタチン、ドラスタチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＡＦＰ、ＡＥＢ、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、メルファリン、クロラムブシル、ビンカアルカロイド、５−フルオロウリジン、マイトマイシン−Ｃ、タキソール、Ｌ−アスパラギナーゼ、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イフォスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルバジン、トポテカン、ナイトロジェンマスタード、シトキサン、エトポシド、ＢＣＮＵ、イリノテカン、カンプトテシン、ブレオマイシン、イダルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセルおよびドセタキセルならびにこれらの塩、溶媒和物および誘導体を包含する。他の適切な薬剤は、検出可能な標識、例えば蛍光分子、または、細胞傷害性剤、例えば重金属若しくは放射性核種を複合体化することができるキレート形成剤、例えばＤＴＰＡ；および毒素、例えばシュードモナス内毒素等を包含する。
【０１６４】
一部の実施形態においては、診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤はオーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０としても知られている）またはその誘導体、ならびに、薬学的に受容可能なその塩または溶媒和物である。典型的には、オーリスタチンＥ誘導体は、例えばオーリスタチンＥとケト酸との間に形成したエステルである。例えばオーリスタチンＥをパラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させることによりそれぞれＡＥＢおよびＡＥＶＢを生成することができる。他の典型的なオーリスタチンＥ誘導体はＡＦＰ、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥを包含する。オーリスタチンＥおよびその誘導体ならびにリンカーの合成および構造は米国特許第０９／８４５，７８６号（米国特許出願公開第２００３００８３２６３号）、米国特許出願公開第２００５−０２３８６２９号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５号；国際特許公開ＷＯ０４／０７３６５６号；および米国特許第６，８８４，８６９号；第６，３２３，３１５号；第６，２３９，１０４号；第６，２１４，３４５号；第６，０３４，０６５号；第５，７８０，５８８号；第５，６６５，８６０号；第５，６６３，１４９号；第５，６３５，４８３号；第５，５９９，９０２号；第５，５５４，７２５号；第５，５３０，０９７号；第５，５２１，２８４号；第５，５０４，１９１号；第５，４１０，０２４号；第５，１３８，０３６号；第５，０７６，９７３号；第４，９８６，９８８号；第４，９７８，７４４号；第４，８７９，２７８号；第４，８１６，４４４号；および第４，４８６，４１４号に記載されている（これらは全て参照により全体が本明細書に援用される）。
【０１６５】
一部の実施形態においては、抗癌剤は例えば以下の薬剤表に列挙する薬剤を包含するがこれらに限定されない。
【０１６６】
【表１Ａ−１】
2008521828.tif 000011
【０１６７】
【表１Ａ−２】
2008521828.tif 000012
【０１６８】
【表１Ａ−３】
2008521828.tif 000013
一部の実施形態においては、診断薬剤、予防薬剤または治療薬剤は放射性同位体ではない。
【０１６９】
一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは以下の特定の型の癌の１つを治療するために使用できる：
固形腫瘍、例えば、限定しないが、
肉腫
線維肉腫
粘液肉腫
脂肪肉腫
軟骨肉腫
骨原性肉腫
軟骨腫
血管肉腫
内皮肉腫
リンパ管肉腫
リンパ管内皮肉腫
骨膜腫
中皮腫
ユーイング腫
平滑筋肉腫
横紋筋肉腫
結腸癌
結腸直腸癌
腎臓癌
膵臓癌
骨癌
乳癌
卵巣癌
前立腺癌
食道癌
胃癌（例えば胃腸の癌）
口腔癌
鼻腔癌
咽喉癌
扁平細胞癌（例えば肺の）
基底細胞癌
腺癌（例えば肺の）
肝腺癌
皮脂腺癌
乳頭状癌
乳頭状腺癌
嚢胞腺腫
髄様癌
気管支原生癌
腎細胞癌
肝細胞癌
胆管癌
絨毛癌
精上皮腫
胎生期癌
ウイルムス腫
子宮頸癌
子宮癌
精巣癌
小細胞肺癌
膀胱癌
肺癌
非小細胞肺癌
上皮癌
神経膠腫
多形神経膠芽腫
星状細胞腫
髄芽細胞腫
頭蓋咽頭腫
脳室上衣細胞腫
松果体腫
血管芽腫
聴神経腫
乏突起神経膠腫
髄膜腫
皮膚癌
黒色腫
神経芽腫
網膜芽腫
血液骨癌、例えば、限定しないが、
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）
急性リンパ芽球性Ｂ細胞白血病
急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病
急性骨芽球性白血病（ＡＭＬ）
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）
急性単芽球性白血病
急性赤白血病
急性巨核芽球白血病
急性骨髄単球性白血病
急性非リンパ球性白血病
急性未分化型白血病
慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）
ヘアリーセル白血病
多発性骨髄腫
急性および慢性白血病：
リンパ芽球性
骨髄原性
リンパ球性
骨髄球性白血病
リンパ腫：
ホジキン病
非ホジキンリンパ腫
多発性骨髄腫
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症
重鎖疾患
真性赤血球増加症
他の癌：
腹腔癌
肝細胞癌
肝細胞腫
唾液腺癌
外陰部癌
甲状腺
陰茎癌
肛門癌
頭部頚部癌
腎細胞癌
急性未分化大細胞癌
皮膚未分化大細胞癌。
【０１７０】
一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは以下の特定の型の自己免疫疾患の１つを治療するために使用できる：
活動性慢性肝炎
アジソン病
アレルギー性肺胞炎
アレルギー反応
アレルギー性鼻炎
アルポート症候群
アナフィラキシー
強直性脊椎炎
抗リン脂質症候群
関節炎
回虫症
アスペルギルス症
アトピー性アレルギー
アトピー性皮膚炎
アトピー性鼻炎
ベーチェット病
鳥飼育者肺
気管支喘息
キャプラン症候群
心筋症
セリアック病
シャーガス病
慢性糸球体腎炎
コーガン症候群
寒冷凝集素病
先天性風疹感染
ＣＲＥＳＴ症候群
クローン病
クリオグロブリン血症
クッシング症候群
皮膚筋炎
円板状エリテマトーデス
ドレスラー症候群
イートン−ランバート症候群
エコーウイルス感染症
脳脊髄炎
内分泌性眼障害
エプスタインバーウイルス乾癬
ウマ慢性肺気腫
紅斑
エバンズ症候群
フェルティ症候群
線維筋肉痛
フックス毛様体炎
胃萎縮
胃腸アレルギー
巨細胞性動脈炎
糸球体腎炎
グッドパスチャー症候群
対宿主性移植片病
グレーブス病
ギヤン−バレー病
橋本甲状腺炎
溶血性貧血
ヘーノホ−シェーンライン紫斑病
特発性副腎萎縮
特発性肺線維症
ＩｇＡ腎症
炎症性腸疾患
インスリン依存性真性糖尿病
若年性関節炎
若年性真性糖尿病（Ｉ型）
ランバート−イートン症候群
蹄葉炎
扁平苔癬
ルポイド肝炎
狼瘡
リンパ球減少症
メニエール病
混合結合組織病
多発性硬化症
重症筋無力症
悪性貧血
多腺症候群
初老期痴呆
原発性無ガンマグロブリン症
原発性胆汁性肝硬変
乾癬
乾癬性関節炎
レイノー兆候
再発性流産
ライター症候群
リューマチ熱
関節リューマチ
サンプター症候群
住血吸虫症
シュミット症候群
硬皮症
シャルマン症候群
シェーグレン症候群
スティッフマン症候群
交感性眼炎
全身エリテマトーデス
高安動脈炎
側頭動脈炎
甲状腺炎
血小板減少症
甲状腺中毒症
中毒性表皮壊死症
Ｂ型インスリン抵抗性
Ｉ型真性糖尿病
潰瘍性結腸炎
ブドウ膜炎
白斑
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症
ヴェーゲナー肉芽腫症。
【０１７１】
他の癌または自己免疫疾患の治療のためのイムノコンジュゲートの使用も意図され、本発明の範囲に包含される。
【０１７２】
（Ｃ．イムノコンジュゲートの投与）
一般的に投与されるイムノコンジュゲートの用量は患者の年齢、体重、性別、全身状態およびそれまでの病歴のような要因に応じて変動する。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ（薬剤量／患者体重）の範囲のイムノコンジュゲートの用量をレシピエントに与えることが望ましいが、より低用量または高用量を投与してもよい。例えば多くの研究は０．１〜１．０ミリグラムの用量を用いた場合の良好な診断画像化を実証しているが、別の研究では１０ミリグラム超の用量で向上した位置特定が示されている（例えば前出Ｂｒｏｗｎ参照）。
【０１７３】
治療用途のためには、プロトコルに応じて一般的に約１０〜２００ミリグラムのイムノコンジュゲートを投与する。一部の実施形態においては、用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１５ｍｇ／ｋｇである。一部のプロトコルは数日間、数週間または数ヶ月の期間、毎日投与する。一部の実施形態においては、イムノコンジュゲートは週に１〜３回、週１回、隔週または月１回投与する。患者の感受性を低減させるために、用量を低減、および／または、他の種由来の抗体を使用、および／または低アレルギー性の抗体、例えばハイブリッドヒト若しくは霊長類抗体を使用することが必要となる場合がある。
【０１７４】
イムノコンジュゲートの患者への投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄膜内とするか、局所用カテーテルを介した灌流によるか、または、直接の患部内注射により行うことができる。注射によりイムノコンジュゲートを投与する場合は、投与は連続注入によるか、または、単回または複数回の瞬時投与であってよい。
【０１７５】
イムノコンジュゲートは知られた方法に従って製剤することにより薬学的に有用な組成物、例えば医薬品を製造することができ、これによりイムノコンジュゲートを薬学的に受容可能な担体との混合物中で組み合わせる。組成物は、その投与がレシピエント患者により耐容され得る場合に、「薬学的に受容可能な担体」ということができる。滅菌されたリン酸塩緩衝食塩水は薬学的に受容可能な担体の一例である。他の適切な担体は当該分野で良く知られている（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０）を参照）。
【０１７６】
免疫療法の目的のためには、イムノコンジュゲートおよび薬学的に受容可能な担体は治療有効量で患者に投与する。「治療有効量」とは生理学的に意味のある投与量である。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理学的状態の検出可能な変化をもたらす場合に、生理学的に意味のあるものとなる。
【０１７７】
追加的な薬学的方法を用いることにより、治療用途においてイムノコンジュゲートの作用の持続時間を制御してよい。制御放出調製物はイムノコンジュゲートと複合体形成するかこれを吸着するための重合体の使用を介して調製できる。例えば、生体適合性重合体はポリ（エチレンコビニルアセテート）のマトリックス、および、ステアリン酸２量体とセバシン酸とのポリ無水物共重合体のマトリックスを包含する（例えばＳｈｅｒｗｏｏｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６−１４４９（１９９２）参照）。そのようなマトリックスからのイムノコンジュゲートの放出速度は、イムノコンジュゲートの分子量、マトリックス内のイムノコンジュゲートの量、および、分散された粒子の大きさに依存する（例えばＳａｌｔｚｍａｎら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ．Ｊ．５５：１６３−１７１（１９８９）；および前出のＳｈｅｒｗｏｏｄら、参照）。他の固体剤型はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０）に記載されている。
【０１７８】
本発明は本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されない。本明細書に記載したものに加えて本発明の種々の変形は上記説明および添付図面から当業者には自明となるものである。このような変形は添付する請求項の範囲内に包含されるものとする。
【０１７９】
本発明は以下の実施例においてさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例において記載する細胞系統はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＤＭＳＺ）により特定される条件に従って培養物中に維持した。細胞培養試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手した。
【実施例】
【０１８０】
（実施例１）
（ｃＡＣ１０システイン変異体の構築および発現）
（手順）
ＡＣ１０ハイブリドーマからのキメラＡＣ１０（ｃＡＣ１０）の構築、およびＣＨＯ細胞系統におけるｃＡＣ１０の発現が報告されている（Ｗａｈｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（１３）：３７３６−４２（２００２））。
【０１８１】
（ｉ）変異誘発およびクローニング
ｃＡＣ１０の変異体はｃＤＮＡをｃＡＣ１０重鎖について（配列番号６）（ｐＢＳＳＫ−ＡＣ１０Ｈ内）またはｃＡＣ１０軽鎖について（配列番号８）（ｐＢＳＳＫ−ＡＣ１０Ｌ内）含有し、そして、それぞれｃＡＣ１０重鎖（配列番号７）またはｃＡＣ１０軽鎖（配列番号９）をそれぞれコードするｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター内で作成した。変異誘発はＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向性変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いながら製造元の説明書に従って実施した。ｃＡＣ１０重鎖ｃＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、即ち図４に示すｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈを鋳型として使用することにより重鎖Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ二重変異体（システインからセリンへの置換は２２６位および２２９位にある）を作成した（残基の番号付けは、シグナル配列を除き、成熟ｃＡＣ１０重鎖および軽鎖によるものである）。プライマーＣ２２６Ｓ：Ｃ２２９Ｓ：
【０１８２】
【化１６】
2008521828.tif 000014
（配列番号１）およびそのリバース相補相手を用いてアミノ酸置換を導入した（変異したコドンに下線を付した）。得られたプラスミドはｃＡＣ１０Ｈ２２６／２２０に関するｃＤＮＡ（配列番号１４）を含有し、そしてｃＡＣ重鎖Ｃ２２６Ｓ，Ｃ２２９Ｓ二重変異体（配列番号１５）をコードするｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２６，２２９と命名した。
【０１８３】
ｃＡＣ１０重鎖Ｃ２２０Ｓ変異体は鋳型としてのｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０ＨおよびプライマーＣ２２０Ｓ：
【０１８４】
【化１７】
2008521828.tif 000015
（配列番号２）およびそのリバース相補相手を用いて作成（変異したコドンに下線を付した）することにより、ｃＡＣ１０Ｈ２２０に関するｃＤＮＡ（配列番号１０）を含有し、そしてｃＡＣ１０Ｃ２２０Ｓ変異体（配列番号１１）をコードするコンストラクトｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２０を作成した。ｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２０を鋳型として使用することにより、プライマーＣ２２６Ｓ：
【０１８５】
【化１８】
2008521828.tif 000016
（配列番号３）およびそのリバース相補相手（第２の変異コドンに下線を付した）を用いながら重鎖Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ二重変異体を作成した。得られたプラスミドはｃＡＣ１０Ｈ２２０／２２６に関するｃＤＮＡ（配列番号１２）を含有し、そしてｃＡＣ重鎖Ｃ２２０Ｓ，Ｃ２２６Ｓ二重変異体（配列番号１３）をコードするｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２０，２２６と命名した。ｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２６，２２９を鋳型として使用することにより、プライマーＣ２２０Ｓ：
【０１８６】
【化１９】
2008521828.tif 000017
（配列番号４）およびそのリバース相補相手（変異コドンに下線を付した）を用いながら重鎖Ｃ２２０Ｓ，Ｃ２２６Ｓ，Ｃ２２９Ｓ変異体を作成した。得られたプラスミドはｃＡＣ１０Ｈ２２０／２２６／２２９に関するｃＤＮＡ（配列番号１６）を含有し、そしてｃＡＣ重鎖Ｃ２２０Ｓ，Ｃ２２６Ｓ，Ｃ２２９Ｓ変異体（配列番号１７）をコードするｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈ２２０，２２６，２２９と命名した。
【０１８７】
ｃＡＣ１０軽鎖ｃＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、即ち図５に示すｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｌを鋳型として使用することにより、プライマーＣ２１８Ｓ：
【０１８８】
【化２０】
2008521828.tif 000018
（配列番号５）およびそのリバース相補相手（変異コドンに下線を付した）を用いて軽鎖Ｃ２１８Ｓ変異体ｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｌ２１８を作成した。得られたプラスミドはｃＡＣ１０Ｌ２１８に関するｃＤＮＡ（配列番号１８）を含有し、そしてｃＡＣ１０軽鎖Ｃ２１８Ｓ変異体（配列番号１９）をコードするｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｌ２１８と命名した。
【０１８９】
ｃＡＣ１０重鎖の親およびシステイン変異体のｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断することによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから遊離させ、ＣＨＥＦ  ＥＦ−１αプロモーターの下流においてｐＤＥＦ３８発現ベクター（Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｄｅｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０（３）：８８０−９（２００４））内にライゲーションした。ｃＡＣ１０軽鎖の親およびシステイン変異体のｃＤＮＡをＭｌｕＩでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから遊離させ、ＣＨＥＦ  ＥＦ−１αプロモーターの下流においてｐＤＥＦ３８のＭｌｕＩ部位にクローニングした。
【０１９０】
（ｉｉ）安定な細胞系統の開発およびタンパク質発現
ｃＡＣ１０変異体をｃＡＣ１０親抗体に関して前述の通りＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系統内で安定に発現させた（Ｗａｈｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：３７３６−３７４２（２００２））。ｐＤＥＦ３８発現コンストラクトを制限酵素ＰｖｕＩで線状化した後に、トランスフェクションに付した。線状化ｐＤＥＦ３８  ｃＡＣ１０  Ｈ鎖の親またはシステイン変異体のコンストラクト５０マイクログラムを、エレクトロポレーションにより、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞内に線状化ｐＤＥＦ３８ｃＡＣ１０Ｌ鎖の親またはシステイン変異体のコンストラクト５０μｇと同時トランスフェクトした（Ｕｒｌａｕｂら、Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１２（６）：５５５−６６（１９８６））。エレクトロポレーションの後、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）および４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＥＸ−ＣＥＬＬ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ培地中で２日間、細胞を回復させた。２日間の後、培地をヒポキサンチンおよびチミジンを含有しない選択培地と交換することによりｃＡＣ１０変異体を発現している安定な細胞系統を選択した。選択可能なマーカーを含有する、プラスミドＤＮＡを取り込んだ細胞のみがヒポキサンチンおよびチミジンの不在下で増殖することができた。細胞を回収し、安定なプールを３０ｍｌ容の振とうフラスコ培養にスケールアップした。細胞のクローニングは非トランスフェクトＣＨＯ−ＤＧ４４フィーダー細胞のバックグラウンド中の限界希釈法を用いて実施した。慨すれば、ヒポキサンチンおよびチミジンの不在下、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ培地中、マイクロプレートのウェル当たり０．５トランスフェクト細胞および１０００非トランスフェクト細胞をプレーティングした。７〜１０日間インキュベーションした後、個々のコロニーを採取し、増殖させた。高力価のクローンを選択し、スピナー中終容量２．５Ｌで、またはＷＡＶＥバイオリアクター（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）中終容量５〜１０Ｌで培養した。
【０１９１】
（結果）
ｃＡＣ１０はヒトＣＤ３０に結合するキメラＩｇＧ１である（Ｗａｈｌら、前出）。抗体ｃＡＣ１０は、容易に還元され且つほぼ定量的な収率でチオール反応性オーリスタチン薬剤であるｖｃＭＭＡＥにコンジュゲートされる溶媒接触可能な鎖間ジスルフィド結合４つを有している（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４（２００３））。全てで８つの接触可能なシステイン有するｃＡＣ１０親抗体を含み、そしてｖｃＭＭＡＥを負荷されているこのＡＤＣを本明細書においてはＣ８−Ｅ８と標記する（図１Ａ）。ｃＡＣ１０内の接触可能なシステインを系統的に変異させて相同性残基であるセリンとすることにより４つ（Ｃ４ｖ１、Ｃ４ｖ２およびＣ４ｖ３）または２つ（Ｃ２ｖ１およびＣ２ｖ２）の残存する接触可能なシステインを有する抗体変異体を作成した（表１および図１Ａ）。さらに、重鎖システイン残基２２６がセリンに変化した抗体変異体Ｃ６ｖ１（図示せず）は６つの接触可能なシステインを有した。これらの操作された抗体変異体を薬剤結合の厳密に定められた化学量論および部位においてコンジュゲートを形成するための出発点とした。
【０１９２】
全抗体変異体を安定なＣＨＯ−ＤＧ４４細胞系統において２５〜１２５ｍｇ／Ｌの力価で発現させた。抗体変異体をプロテインＡアフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィー（表１）により２．５〜１０Ｌ培養物から精製し、次にサイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｃ４ｖ３を除く全ての抗体変異体はサイズ排除クロマトグラフィーによれば＞９８％単量体であると推定された（表２）。還元条件下で電気泳動に付した全変異体が重鎖および軽鎖の存在と合致する２つの主要なバンドを示した（データ示さず）。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては、全ての抗体変異体（Ｃ４ｖ３を除く）が予想された鎖間ジスルフィド結合パターン（図１Ａ）と合致した電気泳動パターン（図１Ｂ）を示した。抗体変異体Ｃ４ｖ３は、その予想とは異なる電気泳動パターンおよびサイズ排除クロマトグラフィーのプロファイルがかなりの凝集を示唆していたことに基づいて、これらの試験の残余からは除外した。
【０１９３】
【表１】
2008521828.tif 000019
【０１９４】
【表２】
2008521828.tif 000020
精製したタンパク質は還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｃＡＣ１０Ｃ４ｖ３を除く全変異体が表３および図１Ｂに示すとおり非還元条件下で予想されたバンド形成パターンを示した。
【０１９５】
【表３】
2008521828.tif 000021
凝集はサイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより評価し、ｃＡＣ１０Ｃ４ｖ３を除く全ての変異体が＞９４％単量体であることが判明した。ｃＡＣ１０Ｃ４ｖ３は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除分析の両方において不均質であることが分かった。非還元条件下のｃＡＣ１０Ｃ４ｖ３のバンド形成パターンは表３に示すとおり予想された重鎖−重鎖２量体および軽鎖のバンドを含んでいたが、重鎖−軽鎖２量体および重鎖単独も存在しており、遊離の軽鎖システインがＨ２２９位において重鎖システインとジスルフィド結合を形成できたことを示唆している。
【０１９６】
（抗体薬剤コンジュゲートの製造および分析）
（手順）
（ｉ）抗体薬剤コンジュゲートの製造
ｃＡＣ１０親株およびシステイン変異体の抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。ｃＡＣ１０Ｃ６ｖ１を除く全てのｃＡＣ１０システイン変異体は、３７℃１時間で、０．０２５Ｍホウ酸ナトリウムｐＨ８、０．０２５Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭジエチレントリアミン４酢酸（ＤＴＰＡ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）中約１００Ｘの抗体より過剰量の１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて還元した。還元された抗体を水で１５０ｍＬに希釈し、７０ｍＬ容のヒドロキシアパタイトカラム（ＭａｃｒｏｐｒｅｐセラミックＩ型４０μｍ、ＢｉｏＲａｄ）に流量１０ｍＬ／分で適用した。カラムは、予め、５カラム容の０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５カラム容の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化させた。適用の後、カラムを５カラム容の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、次いで１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、１０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。還元された抗体を５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）で滴定することにより抗体−システインチオールの濃度を測定した。還元された抗体を０℃に冷却し、そしてＤＭＳＯ中マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイル−ＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）２．７５等量で処理した。最終ＤＭＳＯ濃度は１０％とすることにより薬剤が完全に溶解するようにした。０℃で４０分の後、過剰なシステインを添加することにより未反応のｖｃＭＭＡＥがあればそれをクエンチングし、混合物を水で２５０ｍＬに希釈した。コンジュゲートは上記した通りヒドロキシアパタイトカラム上で精製した。抗体−薬剤コンジュゲートを濃縮し、１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ３０Ｋカットオフスピン濃縮装置を用いながら緩衝液をＰＢＳに交換した。ｃＡＣ１０Ｃ６ｖ１を限定数の等量のＴＣＥＰ（２−カルボキシエチル）ホスフィン、Ａｃｒｏｓ）で還元し、過剰なＴＣＥＰを除去することなくｖｃＭＭＡＥに以下の通りコンジュゲートした；即ち、Ｃ６ｖ１（２．１ｍｇ／ｍｌまたは１４．３μＭ；７４ｍｇ）３５ｍｌを３７℃で２．５時間１ｍＭＤＴＰＡ含有ＰＢＳ中、ＴＣＥＰ（５７．１μＭ、１００ｍＭ保存溶液より）４．０等量で処理した。
【０１９７】
還元の程度はＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通しながら還元反応物少量を精製し、そしてＤＴＮＢで抗体−システインチオールの数を滴定することにより確認し、Ｃ６ｖ１当たり５．７であることがわかった。還元された抗体を０℃に冷却し、ＤＭＳＯ３．９ｍｌ中のｖｃＭＭＡＥ８．０等量で処理した（抗体チオールの濃度は７３．５μＭであり、ｖｃＭＭＡＥの濃度は１０３．２μＭであった）。０℃１３５分の後、１００ｍＭシステイン０．４ｍｌを添加することにより未反応のｖｃＭＭＡＥがあればそれをクエンチングし、混合物を水で２５０ｍｌに希釈した。コンジュゲートを上記した通りヒドロキシアパタイトカラム上で精製した。ｃＡＣ１０−Ｃ６ｖ１−ｖｃＭＭＡＥ（２．４ｍｇ／ｍｌを２０ｍｌ；４８ｍｇ）（Ｃ６ｖ１−Ｅ６）を濃縮し、１５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ３０Ｋカットオフスピン濃縮装置を用いながら緩衝液をＰＢＳに交換した。
【０１９８】
抗体当たり２つおよび４つのＭＭＡＥ分子を有する親ｃＡＣ１０抗体薬剤コンジュゲート（ＡＣＤ）、即ち、それぞれ、Ｃ８−Ｅ２およびＣ８−Ｅ４の作成は報告されている（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５  ７０６３−７０７０（２００４））。慨すれば、方法では、ｍＡｂの部分的還元を行うことによりＡｂ当たり〜４の還元Ｃｙｓを曝露させ、その後ｖｃ−ＭＭＡＥとの反応を行う。Ｃ８−Ｅ４−混合物（またはＣ８−Ｅ４Ｍ）と称される部分的に負荷したｃＡＣ１０−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥを得た。
【０１９９】
Ｃ８−Ｅ２およびＣ８−Ｅ４は緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）５カラム容よりも多くの量で平衡化させたＴｏｙｏｐｅｒａｌフェニル−６５０Ｍ  ＨＩＣ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上の分取用ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）分画によりＣ８−Ｅ４Ｍから調製した。カラムに負荷する試料を調製するために、Ｃ８−Ｅ４混合物（１２．９ｍｇ／ｍｌ）３９ｍｌを等容量の緩衝液Ａ’（５０ｍＭリン酸ナトリウム、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と混合した。試料を負荷した後、カラムをＡ２８０ベースラインとなるまで緩衝液Ａで洗浄した。６５％緩衝液Ａ／３５％緩衝液Ｂ（８０％ｖ／ｖ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２０％ｖ／ｖアセトニトリル）よりなる段階的勾配を用いながらＣ８−Ｅ２を溶出採取した。再度ベースラインとなった後に、３０％緩衝液Ａ／７０％緩衝液Ｂよりなる段階的勾配を用いてＣ８−Ｅ４を溶出採取した。Ｃ８−Ｅ２およびＣ８−Ｅ４のピークは共にそれぞれのピーク高さの〜２０％となるまで採取した。３０ｋＤａの分子量カットオフのＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心分離フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、目的画分をＰＢＳに緩衝液交換した。
【０２００】
（ｉｉ）薬剤負荷の分析
薬剤負荷は２５０および２８０ｍｍの吸光度の比（Ａ２５０／２８０）を測定することにより調べた。ｃＡＣ１０当たりのｖｃＭＭＡＥの数は実験的に（Ａ２５０／Ａ２８０−０．３６）／０．０６８６であることがわかっている。ＡＤＣは流量１ｍＬ／分およびカラム温度３０℃においてＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  エーテル−５ＰＷカラム（パート０８６４１）を用いながら疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により分析した。溶媒Ａは５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７および２．５Ｍ  ＮａＣｌとした。溶媒Ｂは８０％５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７、１０％２−プロパノールおよび１０％アセトニトリルとした。１５分間０％Ｂ一定、５０分０〜１００％Ｂの直線勾配、０．１分１００〜０％Ｂの直線勾配、そして１４．９分０％Ｂ一定とした。注入（典型的には９０〜１００μＬ）は１容のＡＤＣ（濃度は少なくとも３ｍｇ／ｍｌ）および１容の５Ｍ  ＮａＣｌとした。
【０２０１】
ＨＩＣクロマトグラフィーのＡＤＣをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。タンパク質２００チップは製造元の説明に従って変性非還元条件下に使用した。慨すれば１ｍｇ／ｍｌ  ＡＤＣ  ４μＬを非還元ローディング緩衝液２μＬと混合し、５分間１００℃に加熱した。水（８４μＬ）を添加し、この混合物６μＬをチップの各ウェルに負荷した。
【０２０２】
ＡＤＣをＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｐａｒｔ  １９１２−１８０２：１０００Ａ，８ｕ，２．１×５０ｍｍ）上で分析した。流量は１ｍｌ／ｍｌとし、カラム温度は８０℃とした。溶媒Ａは水中０．０５％トリフルオロ酢酸、溶媒Ｂはアセトニトリル中０．０４％トリフルオロ酢酸とした。３分間２５％Ｂ一定、１５分５０％Ｂまで直線勾配、２分間９５％Ｂまで直線勾配、１分間２５％Ｂまで直線勾配、そして２分間２５％Ｂ一定とした。注入は残存鎖間ジスルフィドを切断するために１５分間３７℃において２０ｍＭ  ＤＴＴで予め還元しておいた１ｍｇ／ｍｌ  ＡＤＣ１０〜２０μＬとした。
【０２０３】
（結果）
ｃＡＣ１０システイン変異体のＭＭＡＥコンジュゲートを抗体の還元およびその後のｖｃＭＭＡＥによるアルキル化により作成した。２８０ｎｍの吸光度におけるＵＶ−ＶＩＳ分析およびＰＬＲＰクロマトグラフィーの両方による各コンジュゲートｃＡＣ１０システイン変異体の分析によれば、表４に示す通り、予想された薬剤負荷に近似する水準が達成されていた。
【０２０４】
【表４】
2008521828.tif 000022
サイズ排除クロマトグラフィーによる分析によれば、表４に示すとおり全てのコンジュゲートが９８％単量体かそれ以上よりなるものであった。この試験において記載した対照分子は親ｃＡＣ１０がＭＭＡＥ２分子（Ｃ８−Ｅ２）またはＭＭＡＥ４分子（Ｃ８−Ｅ４）のいずれかとコンジュゲートしたものとした。これらの２剤および４剤負荷ＭＭＡＥコンジュゲートは親ｃＡＣ１０抗体の部分的還元により作成し、Ｈａｍｂｌｅｔｔら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：７０６３−７０７０（２００４）において前述の通り分析した。
【０２０５】
（ｃＡＣシステイン変異体コンジュゲートのインビトロの細胞傷害性）
（手順）
ｃＡＣ１０システイン変異体コンジュゲートを投与したＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ２９９細胞の増殖阻害はＤＮＡ合成を測定することにより調べた。コンジュゲートを９２時間細胞と共にインキュベートし、その後３７℃で４時間、［３Ｈ］−チミジン、０．５μＣｉ／ウェルで標識した。細胞をフィルター上に採取し、シンチレーション液と混合し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて放射能を測定した。未投与の対照と相対比較した場合の取り込まれた放射能のパーセントをコンジュゲート濃度に対してプロットし、データをＰｒｉｓｍ４ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてシグモイド型の用量応答曲線にフィットさせた。あるいは、コンジュゲートとの９２時間インキュベーション時間の後に５０μＭレサズリンをＫａｒｐａｓ２９９細胞に添加した。４時間のインキュベーション期間の後、染料の還元をＦｕｓｉｏｎＨＴ蛍光プレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｃｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて測定した。
【０２０６】
（結果）
ＡＣ１０システイン変異体Ｃ２ｖ１、Ｃ４ｖ１、Ｃ４ｖ２およびＣ６ｖ１のＭＭＡＥコンジュゲート（それぞれＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびＣ６ｖ１−Ｅ６）の細胞傷害性をＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ２９９細胞における［３Ｈ］−チミジン取り込み試験を用いて調べた。使用した対照コンジュゲートは、完全負荷親ｃＡＣ１０ＭＭＡＥコンジュゲート（Ｃ８−Ｅ８）（最も強力）と２剤負荷コンジュゲート（Ｃ８−Ｅ２）との間に位置する力価を有することがわかっている４剤負荷親ｃＡＣ１０（Ｃ８−Ｅ４）とした。図２Ａに示す通り、Ｃ６ｖ１−Ｅ６は０．０１２ｎＭの最低ＩＣ５０値を有していたのに対し、４剤負荷システイン変異体Ｃ４ｖ１−Ｅ４およびＣ４ｖ２−Ｅ４および４剤負荷親ｃＡＣ１０コンジュゲートＣ８−Ｅ４はそれぞれ０．０２０ｎＭ、０．０２７ｎＭおよび０．０１８ｎＭの極めて同様のＩＣ５０を有していた。図２Ｂに示す通り、Ｃ２ｖ１−Ｅ２ＭＭＡＥコンジュゲートは０．０２９ｎＭのＩＣ５０を有していた。次に、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞におけるＣ２ｖ１−Ｅ２およびＣ２ｖ２−Ｅ２ＭＭＡＥ薬剤コンジュゲートの両方のインビトロ細胞傷害性活性を評価した。細胞傷害性はコンジュゲートへの９２時間連続曝露の後の培養物に導入されたレサズリン染料の還元により評価した。抗体当たり２ＭＭＡＥ薬剤分子（Ｃ８−Ｅ２）にコンジュゲートしたｃＡＣ１０を対照として使用した。Ｃ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２でそれぞれ５２．４ｎｇ／ｍｌ、３９．８ｎｇ／ｍｌおよび３９．８ｎｇ／ｍｌと、３コンジュゲート全てが同様のＩＣ５０値を有していた。これらのデータは、システイン変異体コンジュゲートが、部分還元により親ｃＡＣ１０抗体から作成した部分負荷ＭＭＡＥコンジュゲートに対して、活性において近似匹敵するものであることを示している。
【０２０７】
（ヒトＡＬＣＬの異種移植片モデルを用いたインビボのｃＡＣ１０システイン変異体コンジュゲートの抗腫瘍活性）
（手順）
皮下疾患モデルを樹立するために、ＡＬＣＬ  ５×１０６Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の右体側に移植した。ＡＤＣによる治療は６〜１０匹の各群における腫瘍サイズが平均１００ｍｍ３となった時点で開始した。投与は単回注射とした。腫瘍体積は式（長さ×幅２）／２を用いて計算した。触診できない程度に縮小した腫瘍は完全な退行（ＣＲ）と定義した。腫瘍移植後１００日を越えて持続した完全な退行は治癒と定義した。腫瘍体積が約１０００ｍｍ３に達した時、動物を安楽死させた。
【０２０８】
（結果）
ｃＡＣ１０システイン変異体薬剤コンジュゲートの薬効をＳＣＩＤマウスにおけるＡＬＣＬの皮下異種移植片モデルにおいて評価した。Ｋａｒｐａｓ２９９細胞をＳＣＩＤマウスの体側に移植し、１００ｍｍ３の平均体積となるまで腫瘍を増殖させた。腫瘍担持マウスは無作為に８〜１０匹の群に分割し、未投与のまま、または、ｃＡＣ１０システイン変異体ＭＭＡＥコンジュゲートＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ４ｖ１−Ｅ４またはＣ４ｖ２−Ｅ２または部分ＭＭＡＥ負荷親ｃＡＣ１０コンジュゲートＣ８−Ｅ２およびＣ８−Ｅ４を単回用量試験において投与した。ＡＤＣ用量は群当たり等しい濃度のＭＭＡＥが注射されるように正規化し、Ｃ８−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびｃ４ｖ１−Ｅ４ではそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ、１．１４ｍｇ／ｋｇおよび１．０５ｍｇ／ｋｇを注射し、そして、Ｃ８−Ｅ２およびＣ２ｖ１−Ｅ２ではそれぞれ２ｍｇ／ｋｇおよび１．９ｍｇ／ｋｇとした。図３Ａに示す通り、Ｃ２ｖ１−Ｅ２はＣ８−Ｅ２と同様の抗腫瘍活性を示し、Ｃ８−Ｅ２を投与した全動物およびＣ２ｖ１−Ｅ２を投与した８匹中６匹では完全な腫瘍退行が観察された。図３Ｂに示す通り、Ｃ４ｖ１−Ｅ４およびＣ４ｖ２−Ｅ４はＣ８−Ｅ４と同様の抗腫瘍活性を示した。完全な退行はＣ８−Ｅ４およびＣ４ｖ２−Ｅ４の１０匹中８匹およびＣ４ｖ１−Ｅ４の１０匹中６匹で観察された。
【０２０９】
総括すれば、システイン変異体から形成した２および４薬剤負荷ＡＤＣは、部分還元法により作成したＣ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ２コンジュゲートと同様のインビボ活性を有していた。
【０２１０】
（実施例２）
（抗体コンジュゲートの製造および分析）
（手順）
実施例１に記載の通り製造したｃＡＣ１０の親および変異体抗体を、プロテインＡ、次にＡＥＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。慨すれば、抗体を含有するコンディショニングされた培地を約１０倍に濃縮し、旋回流濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりＰＢＳｐＨ７．４に緩衝液交換した。内毒素除去のために４℃で一夜穏やかに攪拌しながら０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で濃縮した試料を処理した後に、ＰＢＳｐＨ７．４で予備平衡化したプロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に負荷した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２〜３カラム容（ＣＶ）の０．５％ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１Ｍ  ＮａＣｌ、次にＰＢＳ  ｐＨ７．４で安定なベースラインに達するまでカラムを洗浄した。結合した抗体は３０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３．６でプロテインＡから溶出させ、次に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）で透析した。合わせた抗体は次に緩衝液Ａで予備平衡化させたＱセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、２〜３ＣＶの緩衝液Ａ、インキュベートしながら５〜１０ＣＶの０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有緩衝液Ａ、そして、５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。段階的または直線的なＮａＣｌ勾配（緩衝液Ａ中１０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ）によりＱセファロースから抗体を溶出させ、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で透析した。精製した抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）により分析した。
【０２１１】
ｃＡＣ１０Ｃｙｓ→Ｓｅｒ抗体変異体のＭＭＡＥ分子２等量（Ｃ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２）または４等量（Ｃ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびＣ４ｖ３−Ｅ４）とのコンジュゲーションでは、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の数（２．５〜４）等量による還元、および過剰なトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを除去することのないマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイル−ＭＭＡＥ（ｖｃＭＭＡＥ）へのコンジュゲーション（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、前出）を行った。薬剤添加の前に、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通して還元反応物少量を精製し、そして５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）で抗体システインチオールの数を滴定することにより還元の程度を評価した（Ｅｌｌｍａｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７４：４４３−４５０（１９５８））。還元した抗体を０℃で６０分間ｖｃＭＭＡＥと反応させ、次に過剰なＮ−アセチルシステイン（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を添加することにより未反応のマレイミドカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＭＭＡＥがある場合はそれをクエンチングした。次に反応混合物を水で５倍希釈し、そして、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化されているヒドロキシアパタイトカラム上に負荷した。カラムを５ＣＶの同緩衝液で洗浄し、コンジュゲートを１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。コンジュゲートを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ遠心分離フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳに緩衝液交換した。
【０２１２】
抗体当たり４薬剤（範囲０〜８薬剤）、即ちＣ８−Ｅ４混合物（Ｃ８−Ｅ４Ｍ）および抗体当たり２薬剤、即ちＣ８−Ｅ２Ｍの平均化学量論の親ｃＡＣ１０コンジュゲートの形成が報告されている（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）（Ｓｕｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１６：１２８２−１２９０（２００５））。Ｃ８−Ｅ２Ｍを疎水性相互作用クロマトグラフィーに付して抗体当たり４（Ｃ８−Ｅ４）および２（Ｃ８−Ｅ２）ＭＭＡＥ分子を負荷されているコンジュゲートを前述の通り単離した（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）。
【０２１３】
２４８ｎｍおよび２８０ｎｍの波長におけるモル消衰係数を抗体（それぞれ９．４１×１０４および２．３４×１０５Ｍ−１ｃｍ−１）および薬剤（それぞれ１．５０×１０３および１．５９×１０４Ｍ−１ｃｍ−１）について使用しながら薬剤負荷の化学量論を調べるために前述の通り（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）ＡＤＣを分析した。抗体重鎖および軽鎖への薬剤結合の位置は、ＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ；＃１９１２−１８０２；１０００Å、８μｍ、２．１×１５０ｍｍ）および溶媒Ａ（水中０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．０４％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）を用いた逆相ＨＰＬＣにより調べた。泳動条件（１ｍｌ／分、８０℃）は、２５％溶媒Ｂ一定（３分）、５０％溶媒Ｂまで直線勾配（２５分）、９５％溶媒Ｂまで直線勾配（２分）、２５％溶媒Ｂまで直線勾配（１分）および２５％溶媒Ｂ一定を２分間とした。クロマトグラフィーの前にＡＤＣ試料（１０〜２０μｌ、１ｍｇ／ｍｌ）を１５分間３７℃で２０ｍＭ  ＤＴＴで還元し、残存する鎖間ジスルフィド結合を切断した。
【０２１４】
（結果）
ｃＡＣ１０親抗体（Ｃ８）を部分的に還元して抗体当たり平均２または４個のスルフィドリル基とし、次にｖｃＭＭＡＥと反応させた。相当するコンジュゲート産物Ｃ８−Ｅ２ＭおよびＣ８−Ｅ４ＭはそれぞれＭＭＡＥの２および４等量の平均負荷を有している。Ｃ８−Ｅ２ＭおよびＣ８−Ｅ４Ｍは抗体当たり０、２、４、６または８等量のＭＭＡＥを負荷された物質種の混合物である（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）。ＭＭＡＥの２等量（Ｃ８−Ｅ２）または４等量（Ｃ８−Ｅ４）の何れかの均一な化学量論を有するコンジュゲートを前述の通り疎水性相互作用クロマトグラフィーによりＣ８−Ｅ２Ｍ混合物から精製した（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）。操作された抗体変異体のＭＭＡＥコンジュゲートは抗体の還元とその後のｖｃＭＭＡＥとの反応により作製した。
【０２１５】
各ＡＤＣにつき、スペクトル分析（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）および逆相ＨＰＬＣ分析（Ｓｕｎら、前出）による観察された薬剤負荷化学量論は予想されたものと緊密に合致していた。サイズ排除クロマトグラフィー後のピーク面積分析によれば、全てのＡＤＣが≧９８％単量体であることが示唆された（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、前出）。Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体コンジュゲートの収率（８９〜９６％）はＣ８−Ｅ２Ｍから精製したコンジュゲートＣ８−Ｅ４（１１％）およびＣ８−Ｅ２（２７％）と比較して大きく向上していた。還元条件下におけるＡＤＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、他のＡＤＣにおける未コンジュゲートの軽鎖と比較した場合のＣ２ｖ２−Ｅ２、Ｃ８−Ｅ２、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４ＭにおけるＭＭＡＥコンジュゲート軽鎖の予想された低下した運動性が示されていた。コンジュゲートした重鎖の低下した運動性は、顕著度は低値であったが、Ｃ８−Ｅ２およびＣ８−Ｅ４Ｍにおけるコンジュゲートした重鎖の負均一性は顕著であった（図１Ｃ）。
【０２１６】
還元条件下における逆相ＨＰＬＣを用いてＡＤＣの負均一性を評価した。この方法はＭＭＡＥ０または１等量を負荷された軽鎖（それぞれＬ−Ｅ０およびＬ−Ｅ１）ならびにＭＭＡＥ０、１、２または３等量を負荷された重鎖（それぞれＨ−Ｅ０、Ｈ−Ｅ１、Ｈ−Ｅ２およびＨ−Ｅ３）を分解する。Ｃ８−Ｅ４Ｍ（図６Ａ）は全ての６つの可能な物質種を含有する最も不均質なコンジュゲートである。Ｃ８−Ｅ４を形成するためのＣ８−Ｅ４Ｍの精製は不均質性を以下の４物質種：Ｌ−Ｅ０、Ｌ−Ｅ１、Ｈ−Ｅ１およびＨ−Ｅ２まで低減する（図６Ｂ）。ｃＡＣ１０Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体の均質性は、それぞれＣ４ｖ１−Ｅ４（図６Ｃ）およびＣ４ｖ２−Ｅ４（図６Ｄ）について予想された単一の軽鎖および重鎖のピーク、Ｌ−Ｅ０＋Ｈ−Ｅ２およびＬ−Ｅ１＋Ｈ−Ｅ１の存在により実証される。
【０２１７】
（ｃＡＣ１０変異体および薬剤のコンジュゲートのインビトロの特徴付け）
（手順）
ＣＤ３０陽性ＡＬＣＬ系統Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＣＤ３０陰性ＷＳＵ−ＮＨＬをＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。Ｌ５４０ｃｙ、即ち異種移植片増殖に適合されたＨＤ系統Ｌ５４０の誘導体はＤｒ．Ｈａｒａｌｄ  Ｓｔｅｉｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｅｔ  ｆｕｅｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｉｎｉｋｕｍ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により開発された。細胞系統は１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で増殖させた。
【０２１８】
ｃＡＣ１０変異体およびその相当するＡＤＣの競合結合を行うことにより抗原結合に対する変異および薬剤コンジュゲーションの影響を調べた。慨すれば、ＣＤ３０陽性Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞を、氷上で３０分間、染色培地（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、０．５％ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、１０μＭ  ＥＤＴＡ）中ユーロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で標識した１μｇ／ｍｌ  ｃＡＣ１０の存在下、ｃＡＣ１０の親抗体、変異体または相当するＡＤＣ（実施例１に記載の通り製造）の連続希釈物と混合し、次に氷冷染色培地で２回洗浄した。標識された細胞はＦｕｓｉｏｎ  ＨＴマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。試料のデータはベースライン補正し、１μｇ／ｍｌ  ｃＡＣ１０−ユーロピウム単独で染色した細胞の蛍光で割った試料蛍光により計算した最大蛍光のパーセントとして報告した。
【０２１９】
ｃＡＣ１０Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体コンジュゲートを投与したＣＤ３０陽性Ｋａｒｐａｓ２９９またはＬ５４０ｃｙ細胞またはＣＤ３０陰性ＷＳＵ−ＮＨＬ細胞の増殖阻害は、コンジュゲートを細胞と共に９２時間インキュベートし、その後、３７℃４時間５０μＭレサズリンと共にインキュベートすることにより調べた。染料の還元はＦｕｓｉｏｎ  ＨＴマイクロプレートリーダーを用いて測定した。データはＰｒｉｓｍ  ｖ４．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて非最小自乗４パラメーターフィットにより分析した。
【０２２０】
（結果）
競合結合実験によれば、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異（表１）およびＭＭＡＥコンジュゲーション（表５）の何れも抗原結合を損なわなかった。次に、ｃＡＣ１０Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体コンジュゲートの細胞傷害性をＣＤ３０陽性（Ｋａｒｐａｓ−２９９およびＬ５４０ｃｙ）および陰性（ＷＳＵ−ＮＨＬ）細胞系統において評価した。Ｃ２ｖ１−Ｅ２およびＣ２ｖ２−Ｅ２コンジュゲートは両方のＣＤ３０陽性細胞系統に対してＣ２−Ｅ２と極めて同様の力価を有していた（表５）。同様に、Ｃ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ４ＭおよびＣ８−Ｅ４は試験した両方のＣＤ３０陽性細胞系統に対して同様の活性を示した（表５）。即ち、薬剤結合の化学量論の部位を厳密に定義することはコンジュゲートの細胞傷害性活性に有意な影響を与えなかった。２から４ＭＭＡＥ／Ａｂに薬剤負荷量を増大させたところ、以前の観察（Ｈａｍｂｌｅｔｔら、前出）と合致して力価が増大した（ＩＣ５０の低下）。ＣＤ３０陰性ＷＳＵ−ＮＨＬ細胞は全てのｃＡＣ１０ＡＤＣに対して無反応であった。
【０２２１】
【表５】
2008521828.tif 000023
（インビボのＣｙｓ→Ｓｅｒ変異体コンジュゲートの抗腫瘍活性）
（異種移植片モデル）
５×１０６Ｋａｒｐａｓ−２９９またはＬ５４０ｃｙ細胞をＣ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の右体側に移植することにより、それぞれ未分化大細胞型リンパ腫またはホジキン病の皮下疾患モデルを樹立した。腫瘍体積は式（Ａ×Ｂ２）／２で計算し、ここでＡおよびＢはそれぞれ最も大きい、および次に大きい直行腫瘍寸法とした。平均腫瘍体積が１００ｍｍ３となったとき、腫瘍担持マウスを無作為に８〜１０匹の群に分割した。マウスの群は未投与のままとするか、ＡＤＣの単回静脈内投与を行った。Ｌ５４０ｃｙ異種移植片試験の場合は、使用した用量は２剤／Ａｂコンジュゲートの場合は６．０および１２．０ｍｇ／ｋｇ、そして４剤／Ａｂコンジュゲートの場合は３．０および６．０ｍｇ／ｋｇとした。Ｋａｒｐａｓ２９９異種移植片モデルの場合は、使用した用量は２剤／Ａｂコンジュゲートの場合は０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｋｇ、そして４剤／Ａｂコンジュゲートの場合は０．５および１．０ｍｇ／ｋｇとした。触診できない程度に縮小した腫瘍は完全な退行と定義した。腫瘍移植後１００日を越えて持続した完全な退行は「治癒」と定義した。腫瘍体積が〜１０００ｍｍ３に達したとき、動物を安楽死させた。
【０２２２】
（結果）
ｃＡＣ１０Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体薬剤コンジュゲート、Ｃ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２、Ｃ４ｖ１−Ｅ４およびＣ４ｖ２−Ｅ４の薬効を、ＳＣＩＤマウスにおいて、未分化大細胞型リンパ腫（Ｋａｒｐａｓ−２９９）またはホジキン病（Ｌ５４０ｃｙ）の皮下異種移植片モデルにおいて親抗体Ｃ８−Ｅ２、Ｃ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４Ｍのコンジュゲートと比較した。慨すれば、１００ｍｍ３のＬ５４０ｃｙ腫瘍（平均の大きさ）を担持したマウスには単回、２剤／Ａｂコンジュゲート（６．０または１２．０ｍｇ／ｋｇ）または４剤／Ａｂコンジュゲート（３．０または６．０ｍｇ／ｋｇ）または未投与のままとした。Ｃ２ｖ１−Ｅ２およびＣ２ｖ２−Ｅ２の投与への応答は同等であり、６．０および１２．０ｍｇ／ｋｇ用量の両方において完全な退行が誘導された（図７Ａ、７Ｂ）。Ｃ８−Ｅ２はＣ２ｖ１−Ｅ２およびＣ２ｖ２−Ｅ２よりも僅かに高力価であり、両方の用量水準で治癒が達成された（図３Ａ、Ｂ）。２剤負荷コンジュゲートの単回用量を投与されたＫａｒｐａｓ２９９異種移植片モデルは同様の応答の傾向を示し、Ｃ２ｖ１−Ｅ２およびＣ２ｖ２−Ｅ２で１０匹中３匹の完全な退行およびＣ８−Ｅ２で１０匹中８匹の完全な退行が１ｍｇ／ｋｇの用量で達成された（データ示さず）。Ｃ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４ＭのＬ５４０ｃｙ異種移植片モデルへの投与は同等の応答をもたらし、各ＡＤＣについて３および６ｍｇ／ｋｇの両方において治癒が達成された（図７Ｃ、Ｄ）。０．５および１ｍｇ／ｋｇにおける４剤負荷変異体のＫａｒｐａｓ２９９モデルへの投与もまた分子間の差を示さなかった（データを示さず）。
【０２２３】
（最大耐容用量の決定および分析）
各ＡＤＣの単回用量耐容性をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて決定した（Ｈａｒｌａｎ，ＩＮ）。３匹のラットの群に４０〜８０ｍｇ／ｋｇのＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２ならびに２０〜４０ｍｇ／ｋｇのＣ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４Ｍを尾静脈を介して注射し、単回最大耐容用量（ＭＴＤ）を決定した。ラットは１４日間に渡り毎日モニタリングし、体重および臨床観察結果の両方を記録した。窮迫の顕著な兆候を発症したラットは安楽死させた。最大耐容用量は、＞２０％の体重減少または重度の窮迫兆候を何れの動物にも誘導しなかった最高用量として定義した。
【０２２４】
２剤負荷コンジュゲートについては、ラットには４０、６０および８０ｍｇ／ｋｇを投与した。４０ｍｇ／ｋｇ用量は十分耐容性を示したのに対し、６０ｍｇ／ｋｇ用量はＣ２ｖ２−Ｅ２を投与したラットによってのみ十分な耐容性が示された。Ｃ２ｖ１−Ｅ２の６０ｍｇ／ｋｇを注射した一匹は第７日に屠殺し、残余の２匹は第８日に最大体重減少６％を示したがその後は体重減少は回復した。Ｃ８−Ｅ２の６０ｍｇ／ｋｇを投与した一匹は１１％の体重減少を示し、第１１日に死亡していた。各２負荷ＡＤＣの８０ｍｇ／ｋｇ用量には十分な耐容性が示されなかった。これらのデータに基づけば、Ｃ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２のＭＴＤはそれぞれ４０、６０および４０ｍｇ／ｋｇであることが分かった。４剤負荷ＡＤＣは各々２０、３０および４０ｍｇ／ｋｇで投与した。Ｃ４ｖ１−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４の２０ｍｇ／ｋｇを注射した動物は副作用を経験しなかったのに対し、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４Ｍの２０ｍｇ／ｋｇを投与された群の数匹は窮迫の兆候を示し、各群の一匹は第９日に屠殺した。各４剤負荷ＡＤＣの３０および４０ｍｇ／ｋｇの高用量は耐容性が示されなかった。Ｃ４ｖ１−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４のＭＴＤは２０ｍｇ／ｋｇであることがわかり、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４ＭのＭＴＤは＜２０ｍｇ／ｋｇであることがわかった。
【０２２５】
本明細書において言及または組み込んだ如何なる特許または特許出願も明確または絶対的に許可を付与されたわけではない。上記した考察は説明、解説および例示であり、添付の特許請求の範囲により定義される範囲を限定するものではない。
【０２２６】
特許出願、特許および学術文献を含む種々の参考文献を本明細書において引用したが、それらの各々の開示は参照により全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２２７】
【図１】図１は抗体Ｃｙｓ→Ｓｅｒ変異体および相当する抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の設計および分析を示す。（Ａ）接触可能なシステインの位置（ひし形）、鎖間ジスルフィド結合（−）および後にコンジュゲートされる薬剤（＋）を明示した抗体変異体ならびに薬剤のコンジュゲートの模式図。抗体およびＡＤＣはその変異体名称（表１参照）、および薬剤ＭＭＡＥの負荷の化学量論により識別される。例えばＣ８−Ｅ８はｃＡＣ１０親抗体（Ｃ８）中の全て８つの溶媒接触可能な鎖間システイン残基がＭＭＡＥ（Ｅ８）にコンジュゲートしているＡＤＣを示す。（Ｂ）非還元条件下の抗体変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＨＨＬＬ、ＨＨ、ＨＬ、ＨおよびＬはそれぞれ抗体重鎖−軽鎖４量体、重鎖２量体、重鎖軽鎖２量体、重鎖および軽鎖に関する移行パターンを示す。（ｃ）還元条件下のＭＭＡＥを有する抗体変異体コンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図２】図２はＭＣ−ｖｃＭＭＡＥにコンジュゲートした抗体システイン変異体および親ｃＡＣ１０抗体を用いた成育増殖試験の滴定プロファイルを示す。（Ａ）ｃＡＣ１０ＡＤＣのＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ６ｖ１−Ｅ６およびＣ８−Ｅ４の連続する希釈物をＫａｒｐａｓ−２９９細胞と共に９６時間インキュベートした。次に［Ｈ３］−ＴｄＲを添加し、その取り込みを測定した。（Ｂ）Ｋａｒｐａｓ−２９９細胞はｃＡＣ１０ＡＤＣのＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２と共に９６時間インキュベートした。次にレサズリンを添加して染料還元を測定した。
【図３】図３はＭＣ−ｖｃＭＭＡＥにコンジュゲートした抗体システイン変異体および親ｃＡＣ１０抗体を投与したＫａｒｐａｓ−２９９皮下異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおける単回用量薬効試験を示す。マウスには２ｍｇ／ｋｇのＣ２ｖ１−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２（Ａ）ならびに１ｍｇ／ｋｇのＣ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４（Ｂ）の単回用量を投与した。
【図４】図４はプラスミドマップｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｈである。
【図５】図５はプラスミドマップｐＢＳＳＫ  ＡＣ１０Ｌである。
【図６】図６は還元条件下のＡＤＣの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。（Ａ）Ｃ８−Ｅ４Ｍ。（Ｂ）Ｃ８−Ｅ４。（Ｃ）Ｃ４ｖ１−Ｅ４。（Ｄ）Ｃ４ｖ２−Ｅ４（表１参照）。ピークは２４８ｎｍおよび２８０ｎｍの波長におけるその吸収の比により識別した。Ｌ−Ｅ０およびＬ−Ｅ１はそれぞれＭＭＡＥの０または１等量を負荷した軽鎖を示すために使用し、Ｈ−Ｅ０、Ｈ−Ｅ１、Ｈ−Ｅ２およびＨ−Ｅ３はそれぞれＭＭＡＥの０、１、２または３等量を負荷した重鎖を示すために使用した。
【図７】図７はＬ５４０ｃｙ皮下異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおける単回用量薬効試験を示す。マウスには腫瘍移植の１２日後に単回用量のＣ２ｖ１−Ｅ２、Ｃ２ｖ２−Ｅ２およびＣ８−Ｅ２を６ｍｇ／ｋｇ（Ａ）または１２ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）で投与した。マウスにはＣ４ｖ１−Ｅ４、Ｃ４ｖ２−Ｅ４、Ｃ８−Ｅ４およびＣ８−Ｅ４Ｍは３ｍｇ／ｋｇ（Ｃ）および６ｍｇ／ｋｇ（Ｄ）で投与した。
【図１】
2008521828.tif 000031
【図２】
2008521828.tif 000032
【図３】
2008521828.tif 000033
【図４】
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【図５】
2008521828.tif 000035
【図６】
2008521828.tif 000036
【図７】
2008521828.tif 000037
【配列表】
2008521828000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月17日(2007.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008521828000001.app
【国際調査報告】
2008521828.tif 000059