(57)【要約】  本発明は、ドーパミンＤ３受容体遺伝子又はタンパク質の変異が調査される、本態性振顫を診断するためのインビトロ方法に関する。さらに、本発明は、本態性振顫の治療のために、抗ドーパミンＤ３受容体活性を有するリガンドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドーパミンＤ３受容体（ＤＲＤ３）遺伝子中の変異を検出することを含み、前記変異が本態性振顫の又は本態性振顫を発症する増加されたリスクの指標である、本態性振顫又は本態性振顫を発症するリスクを診断するためのインビトロ方法。
【請求項２】
前記変異が、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、挿入又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異が、ＤＲＤ３遺伝子の、制御領域中、コード領域中又はイントロン中にある、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異がＤＲＤ３遺伝子のコード領域中にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異がＤＲＤ３遺伝子のコード領域中の３１Ａ＞Ｇ置換である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記変異が、配列番号１に示されているＤＲＤ３遺伝子のコード配列中の３１Ａ＞Ｇ置換である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記変異がＤＲＤ３タンパク質の変異をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記変異がＤＲＤ３タンパク質中のＳ９Ｇ置換である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記変異が、配列番号２に示されているＤＲＤ３アミノ酸配列中のＳ９Ｇ置換である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
対照被験者と比較された、検査被験者に対するＤＲＤ３タンパク質活性の増加を検出することを含み、増加されたＤＲＤ３タンパク質活性が本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクの指標である、本態性振顫又は本態性振顫を発症するリスクを診断するインビトロ方法。
【請求項１１】
ＤＲＤ３タンパク質の発現又は活性のレベルが検査被験者において評価され、及び対照被験者における発現又は活性のレベルと比較され、対照被験者と比較された検査被験者中のＤＲＤ３タンパク質の増加された発現又は基底活性が本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクの指標である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクのインビトロ診断のための、ＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に特異的にハイブリダイズする又はＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に隣接するオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
前記変異部位が、配列番号１に示されているＤＲＤ３遺伝子コード配列のヌクレオチド３１位である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
配列番号３及び配列番号４からなるオリゴヌクレオチドの対が使用される、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
本態性振顫の治療用医薬の製造のための、抗Ｄ３受容体活性を有するドーパミンＤ３受容体（ＤＲＤ３）リガンドの使用。
【請求項１６】
前記リガンドが、ＤＲＤ３の部分的アゴニスト又はアンタゴニストである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＤＲＤ３部分的アゴニスト又はアンタゴニストが、ＢＰ８９７（１−（４−（２−ナフトイルアミノ）ブチル）−４−（２−メトキシフェニル）−１Ａ−ピペラジン）、アリピラゾール、４−ジヒドロ−２（１Ｈ−キノリン）、ナファドトリド、ＳＴ１９８（（Ｅ）−Ｎ−（４−［１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル］−ブチル）−３−フェニルアクリルアミド）、ＳＢ−２７７７０１Ａ  トランス−Ｎ−［４−［２−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル）エチル］シクロヘキシル］−４−キノリンカルボキサミド）及びＳ３３０８４（（３ａＲ，９ｂＳ）−Ｎ−［４−（８−シアノ−１，３ａ，４，９ｂ−テトラヒドロ−３Ｈ−ベンゾピラノ［３，４−ｃ］ピロール−２−イル）ブチル］−フェニル）からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本態性振顫を診断する方法に関し、及び該疾病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
本態性振顫（ＥＴ）は、最も患者数が多い成人の運動障害である（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。全世界での様々な研究での患者数の推定は、一般的な集団では０．４％から３．９％までにわたり、年齢とともに患者数が増加し、６０歳を超える年齢群では少なくとも５％が罹患している（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０００３】
本態性振顫は、変動する発現を示す進行性疾患であり、振顫の重篤度は、軽微な形態から高振幅新生までかなりの幅がある。ＥＴは、腕、手及び声の動作時（運動及び姿勢の）振顫によって特徴付けられることが最も多く、これより頻度は少ないが、頭部の振顫によっても特徴付けられる。足が冒されることは希である。ＥＴは、重度の身体的障害をもたらす頭部及び姿勢の振顫を引き起こすことによって、並びに細かい手の動作の調節を不可能にすることによって、極めて衰弱性となることがあり、このため、心理社会的問題を引き起こす場合がある。本態性振顫は、カフェイン、不安又はストレスなどの因子を刺激することによって悪化する。現在のＥＴの治療は、部分的に有効であるにすぎず、β遮断薬（プロパノロールなど）及びプリミドンは限定された有効性を有する。
【０００４】
本態性振顫は、複数の病因を同定し得る症候群である。ＥＴには、患者の少なくとも５０ないし７０％で、正の家族歴が伴うので、これらの原因の多くは、おそらく、遺伝的な起源を有する。伝達は、常染色体優性であると考えられており、可変的な発現性と高い浸透度を示す（Ｂｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＥＴの常染色体優性家系に関する以前の研究によって、２つの疾患遺伝子座が同定されている。１６のアイスランド人家族から得た７５人の罹患個体の最初の研究（Ｇｕｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）では、家族性ＥＴ（ＥＴＭ１）に対する遺伝子が、染色体３ｑ１３にマッピングされ、最大化された総ＬＯＤスコアは３．７を上回った。この家族の独立した分析から得られたＬＯＤスコアは、−０．７２０から１．２９０にわたり（０．９０の浸透度）、１６の家族のうち１０の家族が正のＬＯＤスコアに寄与していた。続いて、チェコの家系の大家族の連鎖分析によって（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、染色体２ｐ２２−２５上にある第二の遺伝子座が同定され（ＥＴＭ２）、ＥＴを有する３つの無関係なアメリカ人家族のこの第二の遺伝子座への連鎖に関して、その後、証拠（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が提示された。さらに最近になって、ＥＴと合致する姿勢振顫のみを示す家系中の個体間で分離されたレヴィー小体パーキンソン病に対して、染色体４ｐハプロタイプが報告された（Ｆａｒｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０００５】
しかしながら、現在まで、例えば、血液又は尿サンプルを分析することによる、本態性振顫の単純な診断のために遺伝的検査を利用することはできない。現在まで、本疾病は、臨床的及び神経学的検査に基づいて、専門家によって診断されるにすぎないが、それにもかかわらず、これにより、本態性振顫の正確な診断が可能となっている。
【０００６】
Ｌ−ドパ、ロピニロール、プラミペキソール、ブロモクリプチンなどの抗パーキンソン病薬は、本態性振顫に対して軽度に活性である。実際、振顫の軽減に対するこれらの薬物の有効性の欠如が、本態性振顫の診断基準である。
【０００７】
現在、治療は使用可能である。しかしながら、副作用のために、これらの投与は限定される。アルコールは、自己治療の最も古い形態の１つである。ベンゾジアゼピン及びバルビツール酸などの他の鎮静剤を使用してもよいが、薬物乱用のリスクが高く、鎮静効果が時折過剰となる。β遮断薬などの末梢活性を有する薬剤、特にプロパノロールを投与してもよく、さらに耐性が優れた治療となり得る。しかしながら、部分的な症状の改善が、患者の約５０％に観察されるにすぎないので、β遮断薬に対する応答は一定しない。さらに、β遮断薬は、ＥＴの最も重い形態において有効性を欠く。多くの患者で観察される副作用には、男性の性的不能とうつ病が含まれる。β遮断薬治療には、心血管リスクの増加も伴う。
【０００８】
現在の薬物療法に対して難治性である、本疾病の最も重い形態については、視床を部分的に破壊するために深部脳電気刺激を使用してもよい。しかしながら、この侵襲的な手術は、多くの合併症を誘導する可能性がある。
【０００９】
従って、診断検査と治療的な解決策の両方が、本態性振顫に対して強く必要とされている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、ドーパミンＤ３受容体の変異が本態性振顫と関連していることを突き止めた。候補遺伝子アプローチを用いて、本発明者らは、変異を受けた可能性があるＥＴ遺伝子として、３ｑ１３．３中に位置するドーパミンＤ３受容体遺伝子（ＤＲＤ３）を調べた。特に、本発明者らは、本疾病の発症に、ＤＲＤ３のＳｅｒ−９−Ｇｌｙ多型における対立遺伝子Ｇｌｙが関与していることを実証した。この発見は、患者におけるＥＴの診断、及びＤＲＤ３アンタゴニスト又は部分的アゴニストを用いたＥＴ治療に関して重要な示唆を与える。
【００１１】
これらの結果に照らして、本発明者らは、ＤＲＤ３遺伝子又はタンパク質中の変異の検出を基礎として、本態性腫瘍を診断するためのインビトロ方法、並びに本態性振顫を有する患者を治療するための、Ｄ３受容体リガンドの使用を提案する。
【００１２】
定義
「コード配列」又はＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質若しくは酵素などの発現産物を「コードする」配列とは、発現されたときに、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質又は酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列である。すなわち、このヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質又は酵素に対するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は、開始コドン（通常、ＡＴＧ）及び停止コドンを含んでもよい。
【００１３】
「遺伝子」という用語は、１又は複数のタンパク質又は酵素の全部又は一部を含むアミノ酸の特定配列をコードする又は該特定配列に対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列などの制御ＤＮＡ配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。「プロモーター」又は「プロモーター配列」とは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。構造遺伝子でない遺伝子の幾つかは、ＤＮＡからＲＮＡへと転写され得るが、アミノ酸配列へと翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の制御因子として、又はＤＮＡ転写の制御因子として機能し得る。特に、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、制御因子、プロモーター、イントロン及びエクソン配列を含む配列を意図する場合があり得る。
【００１４】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般的には少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１５、さらに好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００以下のヌクレオチド、さらに好ましくは７０以下のヌクレオチドの核酸であって、ＤＲＤ３ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡに対してハイブリダイズ可能な核酸を表す。
【００１５】
本明細書において使用される、増幅プライマーとは、標的配列へのハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの伸長によって、又は標的配列にハイブリダイズしたときに隣接する複数のオリゴヌクレオチドの連結によって、標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドである。増幅プライマーの少なくとも一部が標的にハイブリダイズする。この部分は、標的結合配列と称され、プライマーの標的特異性を決定する。「プライマー」及び「プローブ」という用語は、オリゴヌクレオチドの機能を表す。典型的には、プライマーとは逆に、プローブは、標的へのハイブリダイゼーション後に、ポリメラーゼ又は連結によって伸長されない。このため、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉又は検出するために使用されれば、プローブとして機能することができ、増幅プライマー中の標的結合配列として使用される場合には、同じオリゴヌクレオチドがプライマーとして機能し得る。
【００１６】
本明細書において使用される「ドーパミンＤ３受容体」、「Ｄ３受容体」又は「ＤＲＤ３」という用語は、主に辺縁系内で発現されるドーパミン受容体のサブタイプを表す（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ  ｅｔ  ａ．，  １９９０）。Ｄ３受容体は、さらに、国際特許出願ＷＯ９１／１５５１３号に記載されている。本発明において、ＤＲＤ３は、ラット又はマウスなどの齧歯類、ネコ、イヌ、霊長類、特にサル又はヒトを含む任意の哺乳類種を起源とし得る。好ましくは、ＤＲＤ３は、ヒト起源である。ヒトＤＲＤ３遺伝子は、Ｇｉｒｏｓら（１９９０）によってクローニングされた。この遺伝子の配列は、受託番号Ａ１９６６７でデータベースＧｅｎｂａｎｋに寄託されている。この遺伝子の配列は、配列表中に配列番号１として示された配列中にさらに記載されている。対応するポリペプチド配列は、受託番号ＣＡＡ０１４８３（配列番号２）でデータベース中に寄託されている。
【００１７】
「変異体」及び「変異」という用語は、遺伝物質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの検出可能なあらゆる変化、又はこのような変化のあらゆるプロセス、機序若しくは結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変化されている遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子又はＤＮＡ、及び修飾された遺伝子又はＤＮＡ配列によって発現された任意の発現産物（例えば、タンパク質又は酵素）が含まれる。変異には、１又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入又は置換が含まれる。変異は、遺伝子のコード領域中（すなわち、エクソン中）、イントロン中又は遺伝子の制御領域（例えば、エンハンサー、応答要素、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、プロモーター）中に生じてもよい。一般的には、被験者によって発現された核酸又はポリペプチドの配列を、対照集団中に発現された対応する核酸又はポリペプチドと比較することによって、被験者中で変異が同定される。変異が遺伝子コード配列内にある場合には、変異は、遺伝子産物中のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置換する「ミスセンス」変異であってもよく、又は、アミノ酸コドンを停止コドンと置換する「ナンセンス」変異であってもよい。変異は、変異がエクソン−イントロンスプライシングのための信号を創造又は破壊するスプライシング部位中に生じてもよく、これによって、変化された構造の遺伝子産物をもたらし得る。遺伝物質中の変異は、「サイレント」であってもよい。すなわち、変異は、発現産物のアミノ酸配列の変化をもたらさない。
【００１８】
ヒトＤＲＤ３遺伝子の幾つかの変異は、国際特許出願ＷＯ９２／０７９３７号中に記載されており、具体的には、配列番号１に記載の置換３１Ａ＞Ｇが記載されている。変異３１Ａ＞Ｇは、配列番号２に示されているＤＲＤ３タンパク質の配列中に置換Ｓ９Ｇをもたらす。ヒトＤＲＤ３遺伝子の直接的配列決定によって、本発明者らは、さらに、配列番号１に記載されている、変異５７Ａ＞Ｇ、７２６Ａ＞Ｇ及び９９３Ａ＞Ｇを同定した。これらは全て、ＤＲＤ３タンパク質中のアミノ酸配列を変化させない同義（サイレント）変異である。配列番号２に記載のＤＲＤ３タンパク質中にＡ３８Ｔ置換をもたらす配列番号１に記載の置換１１８Ｇ＞Ａも、記載されている（Ｉｓｈｉｇｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００１９】
本出願において、ＤＲＤ３遺伝子又はタンパク質中に同定された変異は、Ｄｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ（２０００）の命名法に従って表記されている。Ｄｕｎｎｅｎ及びＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓによって核酸レベルで定義されているように、置換は、「＞」によって表記される。例えば、「３１Ａ＞Ｇ」は、基準配列のヌクレオチド３１において、ＡがＧへと変化されていることを表記する。欠失は、欠失された間隔（その後ろに欠失されたヌクレオチドが続く。）の後の「ｄｅｌ」によって表記される。例えば、１９９７−１９９９ｄｅｌ（あるいは、１９９７−１９９９−ｄｅｌＴＴＣ）は、ヌクレオチド１９９７から１９９９までのＴＴＣ欠失を表す。配列ＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣ中のＴＧ欠失（Ａは、ヌクレオチド１９９１）は、１９９７−１９９８ｄｅｌ（又は１９９７−１９９８ｄｅｌＴＧ）として表記される。挿入は、「ｉｎｓ」によって表記され、その後に、挿入されたヌクレオチドが続く。例えば、１９９７−１９９８ｉｎｓＴは、ヌクレオチド１９９７と１９９８の間にＴが挿入されたことを表す。ＡＣＴＧＴＧＴＧＣＣのＴＧタンデム反復配列中のＴＧ挿入（Ａは、ヌクレオチド１９９１である。）は、１９９８−１９９９ｉｎｓＴＧとして記載される（１９９８は、ＴＧ反復の最後のＧである。）イントロン変異は、イントロン番号（「ＩＶＳ」が前置される。）又はｃＤＮＡ位置によって表記される。正の番号はＧＴスプライスドナー部位のＧから始まるのに対して、負の番号はＡＧスプライスアクセプター部位のＧから始まる。例えば、ＩＶＳ４−２Ａ＞Ｃ（１９９８−２Ａ＞Ｃ）は、ｃＤＮＡレベルではヌクレオチド１９９７と１９９８の間に位置したイントロン４のｎｔ−２でのＡからＣへの置換を表す。ＩＶＳ４＋１Ｇ＞Ｔ（１９９７＋１Ｇ＞Ｔ）は、イントロン４のヌクレオチド＋１におけるＧからＴへの置換を表す。完全長ゲノム配列が公知である場合には、ゲノム参照のヌクレオチド番号によって、変異が最良に表記される。本明細書において使用される対立遺伝子１は、配列番号１に従って、ヌクレオチド３１にＡを有するＤＲＤ３遺伝子バリアントを表す。対立遺伝子２は、配列番号１に従って、ヌクレオチド３１にＧを有するＤＲＤ３遺伝子バリアントを表す。
【００２０】
タンパク質レベルでの変化は、変異の結果を記載し、以下のように報告される。停止コドンは、Ｘによって表記される（例えば、Ｒ９７Ｘは、Ａｒｇ９６の終末コドンへの変化を表す。）。アミノ酸置換は、例えば、「Ｓ９Ｇ」によって表記され、これは、９位のＳｅｒがＧｌｙによって置換されていることを意味する。欠失は、アミノ酸間隔後の「ｄｅｌ」によって示される（例えば、Ｔ９７−Ｃ１０２ｄｅｌは、アミノ酸Ｔｈｒ９７からＣｙｓ１０２までが欠失されていることを表す。）。挿入は、アミノ酸間隔後の「ｉｎｓ」によって表され、その後に挿入されたアミノ酸又は挿入されたアミノ酸の数が続く（例えば、Ｔ９７−Ｗ９８ｉｎｓＬＱＳ又はＴ９７−Ｗ９８ｉｎｓ３は、アミノ酸９７と９８の間に３つのアミノ酸が挿入されていることを表す。）。本明細書において使用される、配列番号２に記載の残基９にＳｅｒを有するＤＲＤ３バリアントは、９Ｓｅｒバリアントと表される。配列番号２に従って、残基９にＧｌｙを有するバリアントは、９Ｇｌｙバリアントと表される。
【００２１】
本明細書において「被験者」という用語は、齧歯類、ネコ、イヌ及び霊長類などの哺乳動物を表す。好ましくは、本発明における被験者はヒトである。
【００２２】
診断方法
本発明者らは、ドーパミンＤ３受容体をコードする遺伝子中の変異と本態性振顫との間の遺伝的関連を示した。
【００２３】
本発明は、このように、ドーパミンＤ３受容体（ＤＲＤ３）遺伝子中の変異を検出することからなる工程を含み、前記変異が本態性振顫の又は本態性振顫を発症する増加されたリスクの指標である、本態性振顫又は本態性振顫を発症するリスクを診断するインビトロ方法に関する。
【００２４】
第一の実施形態に従えば、ＤＲＤ３遺伝子中の変異は、本態性振顫に罹患している可能性があり、又は本態性振顫を発症する可能性がある被験者から得た核酸試料中に求めてもよい。
【００２５】
特に、ＤＲＤ３遺伝子の変異は、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、挿入又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００２６】
変異は、ＤＲＤ３遺伝子の、コード領域中、イントロン中又は制御領域中であり得る。変異がコード配列中にある場合には、前記変異は、ＤＲＤ３ゲノム配列のエクソン中又はＤＲＤ３  ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ中に求め得る。
【００２７】
有利に、ＤＲＤ３コード配列中の変異は、配列番号１に記載の、置換３１Ａ＞Ｇ、５７Ａ＞Ｇ、１１８Ｇ＞Ａ、７２６Ａ＞Ｇ及び９９３Ａ＞Ｇからなる群から選択され得る。好ましくは、ＤＲＤ３遺伝子中の前記変異は、配列番号１に示されているように、ＤＲＤ３コード配列中の３１Ａ＞Ｇ置換である。
【００２８】
ＤＲＤ３コード配列中の前記変異は、ＤＲＤ３タンパク質中に変異をもたらし得る。好ましくは、配列番号２の配列中に示されているように、前記変異は、ＤＲＤ３タンパク質中のＳ９Ｇ及びＡ３８Ｔ変異からなる群から選択される。さらに好ましくは、ＤＲＤ３タンパク質中の前記変異はＳ９Ｇ置換である。
【００２９】
核酸試料は、任意の細胞源又は組織生検から取得し得る。利用可能な細胞源の非限定的な例には、血液細胞、口腔細胞、上皮細胞、繊維芽細胞又は生検によって得られた組織中に存在する任意の細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞は、血液、血漿、血清、リンパなどの体液から取得してもよい。ＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載されている方法など、本分野において公知の任意の方法を使用して抽出し得る。ＲＮＡは、例えば、チオシアン酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出など（Ｃｈｏｍｏｃｙｚｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、当業者に周知の標準的な方法を用いて、組織生検から単離し得る。
【００３０】
ＤＲＤ３変異は、好ましくは増幅後に、ＲＮＡ又はＤＮＡ試料中に検出し得る。例えば、単離されたＲＮＡは、変異された部位に対して特異的であるか、又は変異された部位を含有する領域の増幅を可能とする特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写と増幅のような、逆転写と増幅の結合に供してもよい。第一の代替法に従えば、プライマーアニーリングのための条件は、増幅産物の出現が特定のＤＲＤ３変異の存在の診断であるように、特異的な逆転写（適切な場合）及び増幅を確保するように選択し得る。あるいは、ＲＮＡを逆転写及び増幅してもよく、又は、ＤＮＡを増幅してもよく、その後、適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって、又は直接の配列決定によって、又は本分野において公知の他の任意の適切な方法によって、変異された部位を増幅された配列中に検出してもよい。例えば、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡは、ＤＲＤ３配列中の変異を同定するためにクローニング及び配列決定してもよい。
【００３１】
現在、遺伝子型分析のための多数の戦略が利用可能である（Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  ；  Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１  ；  Ｇｒｏｍｐｅ，  １９９３）。手短に述べると、制限部位の存在又は不存在について、核酸分子を検査してもよい。塩基置換変異が制限酵素の認識部位を創造又は喪失させる場合には、これによって、変異のための単純な直接ＰＣＲ検査が可能となる。さらなる戦略には、直接の配列決定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析；適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で完全に一致する配列にのみハイブリダイズする短い合成プローブである対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリダイゼーション；対立遺伝子特異的ＰＣＲ；変異原性プライマーを用いたＰＣＲ；リガーゼ−ＰＣＲ、ＨＯＴ切断；変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ；ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、温度変性グラジエントゲル電気泳動（ＴＧＧＥ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）及び変性高性能液体クロマトグラフィー（Ｋｕｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．．，１９９７）が含まれるが、これらに限定されない。直接の配列決定は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を用いた化学的配列決定；Ｓａｎｇｅｒ法を用いた酵素的配列決定によって；質量分析法配列決定；チップを基礎とした技術を用いた配列決定（例えば、Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）及びリアルタイム定量的ＰＣＲなどの任意の方法（これらに限定されない。）によって達成し得る。好ましくは、被験者から得たＤＮＡは、まず、特異的な増幅プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に供される。しかしながら、幾つかの他の方法が利用可能であり、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標登録）アッセイ又はオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）など、ＰＣＲとは独立にＤＮＡを調べることが可能となる。塩基置換変異を明らかにするために、ＯＬＡを使用してもよい。この方法に従って、標的核酸中の隣接する配列にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドが構築され、連結は、変異の位置に存在する。ＤＮＡリガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドが完全にハイブリダイズされた場合にのみ、２つのオリゴヌクレオチドを共有結合する（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、配列タグなどの、本分野で公知の任意の技術に従って標識することが可能である。標識されたオリゴヌクレオチドは、変異されたＤＲＤ３核酸の存在を検出するためのプローブとして使用してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの一方又は両方が標識されてもよい。）は、例えば、ＰＣＲによって、ＤＲＤ３核酸を増幅して（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，  ２３９：４８７）、変異の存在を検出するために使用することが可能である。一般的には、オリゴヌクレオチドは、好ましくは核酸合成機上で、合成的に調製される。従って、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などの、天然に存在しないホスホエステル類縁体結合を用いて調製することが可能である。
【００３３】
核酸分子の一本鎖形態が、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で、他の核酸分子にアニールすることが可能な場合には、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９参照）。
【００３４】
温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸に対する予備的スクリーニングの場合には、５５℃のＴｍ（融解温度）に対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％ミルク及びホルムアミドなし、又は３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを使用することが可能である。中度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、さらに高いＴｍ、例えば、５×又は６×ＳＳＣを有する４０％ホルムアミドに対応する。高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣに対応する。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、本分野において周知な変数である、核酸の長さ及び相補の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きくなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（さらに高いＴｍに対応する。）は、以下の順序で減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が得られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  ９．５０−９．５１参照）。これより短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がさらに重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  １１．７−１１．８を参照）。ハイブリダイズ可能な核酸に対する最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００３５】
具体的な実施形態において、「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、５５℃のＴｍを表し、上述されている条件を使用する。好ましい実施形態において、Ｔｍは、６０℃である。より好ましい実施形態において、Ｔｍは、６５℃である。特定の実施形態において、「高ストリンジェンシー」とは、０．２×ＳＳＣ中、６８℃、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中４２℃でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を表し、又はこれら２つの条件の何れかの下で観察されるものと等価なハイブリダイゼーションのレベルを与える条件下でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を表す。
【００３６】
３１Ａ＞Ｇ置換は、酵素ＭｓｃＩ又はそのアイソシゾマーＢａｌＩに対する制限部位を作出する。従って、好ましくは、３１Ａ＞Ｇ置換の検出は、例えば、「Ｌａｎｎｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）」に記載されている方法に従って、ＭｓｃＩ又はＢａｌＩを用いたＰＣＲ増幅及び制限酵素消化によって実施してもよい。
【００３７】
あるいは、ＤＲＤ３遺伝子の前記変異は、ＤＲＤ３タンパク質中に生じた変化を検出することによって、本態性振顫に罹患している可能性がある被験者又は本態性振顫を発症する可能性がある被験者から得た生物学的試料中に求めてもよい。
【００３８】
変異は、好ましくは、アミノ酸置換である。好ましくは、ＤＲＤ３タンパク質中の前記変異は、Ｓ９Ｇ、Ａ７９Ｖ、Ｖ１８９Ｉ及びＩ３９７Ｔからなる群から選択される。好ましくは、前記変異は、配列番号２の配列中に示されているように、ＤＲＤ３タンパク質中のＳ９Ｇ置換である。
【００３９】
前記変異は、本分野で公知の任意の適切な方法に従って検出してもよい。特に、被験者から得られた試料（組織生検など）は、抗体によって指定されるＤＲＤ３の有無を測定するために、ＤＲＤ３タンパク質の変異形態に特異的な抗体（すなわち、ＤＲＤ３の変異形態と野生型タンパク質の間を区別することが可能な抗体）と接触させてもよい。
【００４０】
変異されたＤＲＤ３タンパク質を特異的に認識する抗体も、本発明の一部を構成する。抗体は、変異されたＤＲＤ３タンパク質に対して特異的である。すなわち、抗体は、野生型ＤＲＤ３タンパク質と交叉反応しない。
【００４１】
本発明の抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、一本鎖若しくは二本鎖、キメラ抗体、ヒト化抗体又は免疫グロブリン分子の一部（抗原結合断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ｖ）のような本分野で公知の免疫グロブリン分子の一部を含む。）であり得る。本発明の抗体は、例えば、トキシンと免疫複合体を形成し、又は標識された抗体とすることも可能である。
【００４２】
ポリクローナル抗体を使用してもよいが、モノクローナル抗体の方が、長い目で見れば再現性が高いので、モノクローナル抗体が好ましい。  
「ポリクローナル抗体」を産生するための手順も周知である。ポリクローナル抗体は、変異されたＤＲＤ３タンパク質に対して免疫された動物の血清から取得することが可能であり、変異されたＤＲＤ３タンパク質は、例えば、当業者に周知の標準的な方法に従って、遺伝子工学によって作製してよい。典型的には、このような抗体は、免疫前血清を得るために、まず採血を行われたニュージーランドシロウサギに変異されたＤＲＤ３タンパク質を皮下投与することによって産生されることが可能である。抗原は、６つの異なる部位に、部位当たり１００μＬの総容量で注射することが可能である。注射された各物質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質又はポリペプチドを含有する粉砕されたアクリルアミドゲルあり又はなしに、アジュバントを含有してもよい。次いで、最初の注射から２週後に、ウサギから採血し、６週毎に、同じ抗原で３回、定期的に強化免疫を行う。次いで、各強化免疫から１０日後に、血清の試料を集める。次いで、抗体を捕捉するために対応する抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリクローナルを血清から回収する。ポリクローナル抗体を生産するためのこの手順及びその他の手順は、「Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）」によって開示されており、本明細書の参考文献に組み込まれる。
【００４３】
様々な文法的形態の「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープとの免疫反応を可能とする部位に結合する抗体の唯一の種を含有する抗体分子の集団を表す。このように、モノクローナル抗体は、典型的には、モノクローナル抗体が免疫反応する任意のエピトープに対して単一の結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、それぞれが異なるエピトープに対して免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子（例えば、二重特異的モノクローナル抗体）を含有し得る。歴史的には、モノクローナル抗体は、クローン的に純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の不死化によって作製されたが、抗体分子のモノクローン的に純粋な集団は、本発明の方法によって調製することも可能である。
【００４４】
モノクローナル抗体を調製するための実験室方法は、本分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８参照）。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ヒト及びこれらに類する哺乳動物中に、精製された変異ＤＲＤ３タンパク質を免疫することによって調製し得る。免疫された哺乳動物中の抗体産生細胞を単離し、ミエローマ又はヘテロミエローマ細胞と融合されて、ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）を生じる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、所望のモノクローナル抗体源として使用される。ハイブリドーマ培養のこの標準的な方法は、「Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）」に記載されている。
【００４５】
ｍＡｂは、ハイブリドーマ培養によって生産することが可能であるが、本発明は、これに限定されるものではない。本発明のハイブリドーマからクローニングされた核酸を発現することによって生産されたｍＡｂの使用も想定される。すなわち、本発明のハイブリドーマによって分泌された分子を発現する核酸を、別の細胞株中に移して、形質転換体を作製することが可能である。形質転換体は、元のハイブリドーマとは遺伝子型が異なっているが、ハイブリドーマによって分泌された抗体分子に対応する本発明の抗体分子（完全な抗体分子の免疫学的活性断片を含む。）を生産することも可能である。例えば、Ｒｅａｄｉｎｇらに付与された米国特許第４，６４２，３３４号；ＰＣＴ公開番号；Ｗｉｎｔｅｒらに付与された欧州特許公開０２３９４０号及びＣａｂｉｌｌｙらに付与された０１２５０２３号を参照されたい。
【００４６】
例えば、（免疫化されていない動物から得た）ナイーブライブラリーを調べるために、ファージディスプレイ技術を用いるなど、免疫化を行わない抗体作製技術も想定される。「Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）」を参照されたい。
【００４７】
変異されたＤＲＤ３タンパク質に対して生産された抗体は、野生型ＤＲＤ３タンパク質と交叉反応性であり得る。従って、変異されたＤＲＤ３タンパク質に対して特異的な抗体の選択が必要とされる。これは、野生型ＤＲＤ３タンパク質と反応性を示す抗体から得られる抗体のプールを枯渇させることによって、例えば、産生された抗体を、野生型ＤＲＤ３タンパク質に対するアフィニティークロマトグラフィーにかけることによって達成してよい。
【００４８】
あるいは、本発明において、抗体以外の結合剤を使用してもよい。これらは、例えば、分子認識に関して抗体の代用物となる分子のクラスであるアプタマーであり得る。アプタマーとは、標的分子の実質的にあらゆるクラスを、高い親和性と特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、「Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ．，  １９９０」に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの指数的濃縮によるリガンドの系統的発生（ＳＥＬＥＸ；Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を通じて単離し得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーでは、各構成要素が、ユニークな配列の直鎖オリゴマーであり、最終的に化学的に修飾される。分子のこのクラスの可能な修飾、使用及び利点は、「Ｊａｙａｓｅｎａ  Ｓ．Ｄ．，１９９９」にまとめられている。ツーハイブリッド法（Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａ．，１９９６）によって、コンビナトリアルライブラリーから選択されるペプチドアプタマーは、Ｅ．コリ  チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によってディスプレイされる、立体構造的に制約された抗体可変領域からなる。
【００４９】
別の実施形態に従えば、本発明は、対照被験者（すなわち、健康な被験者）又は標準的な試料と比較された、検査被験者に対する野生型又は変異ＤＲＤ３タンパク質活性の増加を検出することを含み、増加されたＤＲＤ３タンパク質活性が本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクの指標である、本態性振顫又は本態性振顫を発症するリスクを診断するインビトロ方法に関する。
【００５０】
検査被験者又は生物学的試料におけるＤＲＤ３の「増加された活性」とは、対照との比較における検査被験者又は生物学的試料中の総ＲＤＤ３活性がより高いことを表す。対照中に比べて、検査被験者又は試料中において、活性は、好ましくは（但し、常にではない。）、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％高い。
【００５１】
ＤＲＤ３タンパク質活性の増加は、ＤＲＤ３タンパク質発現のレベルの増加によるものであり得る。野生型又は変異ＤＲＤ３タンパク質のより高い発現レベルは、例えば、ＤＲＤ３遺伝子のプロモーター領域などのＤＲＤ３遺伝子の非コード領域中の変異から、又はＤＲＤ３転写若しくは翻訳に関与するコード若しくは非コード遺伝子中の変異から生じ得る。ＤＲＤ３タンパク質活性の増加は、ＤＲＤ３タンパク質の基底活性の増加によるものであり得る。本明細書において使用される「基底」活性という用語は、アゴニストの結合によって受容体が活性化される場合に観察され得るように、健康な被験者中の野生型ＤＲＤ３タンパク質の活性を表す。増加された基底活性は、例えば、野生型ＤＲＤ３と比較した場合の、変異ＤＲＤ３タンパク質に対するリガンドの親和性の増加に関連し、又は、ＤＲＤ３関連経路の下流成分の延長された刺激（例えば、環状ＡＭＰ形成の阻害）（Ｇｒｉｆｆｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に関連する。ＤＲＤ３タンパク質の基底活性の増加は、ＤＲＤ３タンパク質中の機能獲得変異をもたらすＤＲＤ３遺伝子中のミスセンス変異に関連し得る。
【００５２】
従って、本発明の方法は検査被験者におけるＤＲＤ３タンパク質の発現又は活性のレベルを評価すること、及び対照被験者における発現又は活性のレベルと比較することによって実施され得る、対照被験者と比較された検査被験者中のＤＲＤ３タンパク質の増加された発現又は基底活性が本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクの指標である。
【００５３】
ＤＲＤ３の発現のレベルは、生物学的試料中のＤＲＤ３タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を測定することによって、又は生物学的試料中のＤＲＤ３タンパク質の濃度を測定することによって評価してもよい。ＤＲＤ３タンパク質の活性のレベルは、例えば、報告されたＤＲＤ３リガンドの結合活性を測定することによって評価してもよい。
【００５４】
ＤＲＤ３の機能獲得は、ＤＲＤ３選択的アゴニスト又は部分的アゴニストの投与、及び、例えば、陽電子放出断層撮影法（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）による局所的血流測定を用いた機能的神経画像化によるＤＲＤ３刺激の効果の測定後に評価してもよい。ＤＲＤ３部分的アゴニストの例には、ＢＰ８９７（１−（４−（２−ナフトイルアミノ）ブチル）−４−（２−メトキシフェニル）−１Ａ−ピペラジン、Ｐｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）及びアリピラゾール（７−［４−［４−２，３ジクロロフェニル］−１−ピペラジニル］ブトキシ）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリン）（Ｌａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）が含まれる。あるいは、ＤＲＤ３の機能獲得は、ＤＲＤ３選択的アンタゴニストの効果の減弱によって測定してもよく、また、機能的神経画像化によって測定してもよい。ＤＲＤ３アンタゴニストの例には、ナファドトリド（Ｎ［（ｎ−ブチル−２−ピロリジニル）メチル］−１−メトキシ−４−シアノナフタレン−２−カルボキサミド、Ｓａｕｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、ＳＴ１９８（（Ｅ）−Ｎ−（４−［１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル］−ブチル）−３−フェニルアクリルアミド）、ＳＢ−２７７７０１Ａ  （トランス−Ｎ−［４−［２−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル）エチル］シクロヘキシル］−４−キノリンカルボキサミド、Ｒｅａｖｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｓ３３０８４（（３ａＲ，９ｂＳ）−Ｎ−［４−（８−シアノ−１，３ａ，４，９ｂ−テトラヒドロ−３Ｈ−ベンゾピラノ［３，４−ｃ］ピロール−２−イル）ブチル］−フェニル）ベンズアミド、Ｍｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００］が含まれる。
【００５５】
オリゴヌクレオチド及び診断キット
本発明の側面によれば、ＤＲＤ３変異は、被験者から得た核酸試料を、必要に応じて標識された核酸プローブと接触させることによって検出される。
【００５６】
プライマーは、目的の変異を含有するＤＲＤ３遺伝子の一部を増幅又は配列決定するためにも有用であり得る。
【００５７】
このようなプローブ又はプライマーは、「配列特異的オリゴヌクレオチド」、すなわち、高いストリンジェンシーの条件下で、目的の変異を含有するＤＲＤ３遺伝子配列の一部と特異的にハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチド又は核酸である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【００５８】
本発明は、このように、本態性振顫の又は本態性振顫を発症するリスクのインビトロ診断のための、ＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に特異的にハイブリダイズする、又はＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に隣接するオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５９】
本発明は、ＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に特異的にハイブリダイズする、又はＤＲＤ３遺伝子の変異の部位に隣接するオリゴヌクレオチドを含む、本態性振顫を診断し、又は本態性振顫を発症するリスクを診断するためのキットも提供する。
【００６０】
キットは、以下の要素を含んでよい。
【００６１】
（ｉ）ＤＮＡから通常作製され、予め標識されてもよい上記定義のプローブ。あるいは、このプローブは、標識されていなくてもよく、別の容器中に、標識のための成分をキット中に含めてもよい；及び
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション試薬：キットは、特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要とされる適切に梱包された他の試薬及び材料（固相マトリックス、及び、適切であれば、標準物を含む。）を含有してもよい。
【００６２】
別の側面において、キットは、以下のものを含んでよい。
【００６３】
（ｉ）配列測定又は増幅プライマー：配列決定プライマーは、予め標識されてもよく、又は親和性精製若しくは付着部分を含有してもよい；及び
（ｉｉ）配列測定又は増幅試薬：キットは、特定の配列決定増幅プロトコールに必要とされる適切に梱包された他の試薬及び材料を含有してもよい。好ましい一実施形態において、キットは、その配列が多型位置の少なくとも１つに隣接した配列に対応する配列決定プライマー又は増幅プライマーのパネルと、及び各多型配列の存在を検出するための手段とを含む。
【００６４】
変異の部位は、ＤＲＤ３遺伝子の、コード領域中、イントロン中又はプロモーター中であり得る。好ましくは、変異部位は、配列番号１のヌクレオチド位置３１、５７、１１８、７２６及び９９３からなる群から選択される。さらに好ましくは、変異部位は、配列番号１のヌクレオチド３１である。有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３及び配列番号４を含む又は配列番号３及び配列番号４からなるオリゴヌクレオチドから選択し得る。
【００６５】
特定の実施形態において、上で同定された変異した位置の少なくとも１つを含むＤＲＤ３遺伝子の全部又は一部を増幅するための特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの対を含むキットが提供される。好ましくは、前記キットは、オリゴヌクレオチド配列番号３及び配列番号４からなるプライマー対を含んでもよい。さらに、本発明は、配列番号１の位置３１を包含するＤＲＤ３遺伝子の領域を増幅するための、配列番号３及び配列番号４からなるオリゴヌクレオチドの対の使用に関する。
【００６６】
別の実施形態に従って、本発明のキットは、ＤＲＤ３タンパク質の変異を特異的に認識する抗体を含んでもよい。
【００６７】
変異は、好ましくは、アミノ酸置換である。好ましくは、ＤＲＤ３タンパク質中の前記変異は、配列番号２の配列中のＳ９Ｇ及びＡ３８Ｔ置換からなる群から選択される。好ましくは、ＤＲＤ３タンパク質中の前記変異は、配列番号２の配列中のＳ９Ｇ置換である。
【００６８】
本態性振顫の治療
本発明は、さらに、ＤＲＤ３変異によって産生される機能獲得を打ち消すことを目的とする、本態性振顫を治療する方法を提供する。本方法は、治療を必要とする患者に、抗Ｄ３受容体活性を有するドーパミンＤ３受容体リガンドを投与することを含む。
【００６９】
本発明は、本態性振顫の治療を必要としている患者における本態性振顫の治療を目的とした医薬の製造のための、抗Ｄ３受容体活性を有するドーパミンＤ３受容体リガンドの使用にも関する。
【００７０】
好ましくは、前記ＤＲＤ３リガンドは、ＤＲＤ３部分的アゴニスト又はＤＲＤ３アンタゴニストである。
【００７１】
本発明との関連で、本明細書において使用される「治療する」又は「治療」という用語は、このような用語が適用される疾患若しくは症状又はこのような疾患若しくは症状の１若しくは複数の症候を回復させ、緩和させ、その進行を阻害し、又は予防することを意味する。
【００７２】
本発明に従えば、「患者」又は「これを必要としている患者」という用語は、本態性振顫に罹患し、又は罹患する可能性があるヒト又はヒト以外の哺乳動物を表すものとする。
【００７３】
本明細書において使用される「Ｄ３受容体リガンド」という用語は、ドーパミンＤ３受容体を結合する能力を有する分子を表す。結合すると、リガンドは、ＤＲＤ３の活性を修飾若しくは妨害してもよく、又は修飾若しくは妨害しなくてもよい。ＤＲＤ３リガンドには、Ｄ３受容体部分的アゴニスト及びアンタゴニストが含まれる。
【００７４】
「抗Ｄ３受容体活性を有するドーパミンＤ３受容体リガンド」という用語には、Ｄ３受容体部分的アゴニスト及びＤ３受容体アンタゴニストが含まれる。
【００７５】
「Ｄ３受容体部分的アゴニスト」という用語は、ＤＲＤ３と複合体を形成し、及び混合アゴニスト−アンタゴニストとして作用する化合物を表すものとする。ＤＲＤ３の部分的アゴニストは、インビトロでは、ＤＲＤ３を発現している細胞中で、活性な応答を産生し、その最大強度は、ドーパミン又はその完全アゴニスト、例えば、キンピロール（トランス−（−）４ａＲ−４，４ａ−５，６，７，８，８ａ，９−オクタヒドロ−５−プロピルー１Ｈ（又は２Ｈ）−ピラゾロ［３，４−ｇ］キノリン）によって産生される最大強度より低い。Ｄ３受容体部分的アゴニストは、ドーパミン又はその完全アゴニストによって産生される応答を部分的に阻害することもできる。ＤＲＤ３部分的アゴニストは、インビボで、特に、６−ヒドロキシドーパミンによって損傷を受けたラット、又は１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処理されたサルなどにおいて、ドーパミンが枯渇したときに、ドーパミン模倣応答を産生する。さらに、ＤＲＤ３部分的アゴニストは、インビボで、特にドーパミンによってＤＲＤ３が持続的な刺激に供される場合に、アンタゴニストとして作用し得る。ＤＲＤ３部分的アゴニストの例は、ＢＰ８９７（１−（４−（２−ナフトイルアミノ）ブチル）−４−（２−メトキシフェニル）−１Ａ−ピペラジン、Ｐｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）及びアリピプラゾール（７−［４−［４−（２，３ジクロロフェニル）−１−ピペラジニル］ブトキシ］−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリン（Ｌａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）を含む。
【００７６】
「Ｄ３受容体アンタゴニスト」とは、ＤＲＤ３と複合体を形成し、ドーパミン又はそのアゴニストによって、ＤＲＤ３を発現している細胞から引き起こされる活性な応答を阻害することが可能である分子を表す。Ｄ３受容体アンタゴニストの例には、ナファドトリド、（Ｎ［（ｎ−ブチル−２−ピロリジニル）メチル］−１−メトキシ−４−シアノナフタレン−２−カルボキサミド、Ｓａｕｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ＳＴ１９８（（Ｅ）−Ｎ−（４−［１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル］−ブチル）−３−フェニルアクリルアミド）、ＳＢ−２７７７０１Ａ  （トランス−Ｎ−［４−［２−（６−シアノ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−イル）エチル］シクロヘキシル］−４−キノリンカルボキサミド、Ｒｅａｖｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）及びＳ３３０８４（（３ａＲ，９ｂＳ）−Ｎ−［４−（８−シアノ−１，３ａ，４，９ｂ−テトラヒドロ−３Ｈ−ベンゾピラノ［３，４−ｃ］ピロール−２−イル）ブチル］−フェニル）ベンズアミド、Ｍｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）が含まれる。
【００７７】
有利には、投与されるべきＤＲＤ３部分的アゴニスト又はアンタゴニストは、インビボでの抗ＤＲＤ３活性について特性を決定し得る。特性決定は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／３１２９０に記載されているようなスクリーニング方法に従って実施し得る。簡潔に述べると、このスクリーニング方法は、ＤＲＤ３によって媒介される精神的行動を誘導するために、ＮＭＤＡアンタゴニストの少量を、哺乳動物に単発に又は継続的に投与することに立脚としている。次いで、精神的行動を緩和するために哺乳動物に投与されるリガンドの能力が評価され、この能力は、インビボでの抗ＤＲＤ３活性を有するリガンドの指標となる。
【００７８】
ドーパミンＤ３受容体部分的アゴニスト又はアンタゴニストは、好ましくは、ＢＰ８９７、アリピプラゾール、ナファドトリド、ＳＴ１９８、ＳＢ−２７７７０１Ａ及びＳ３３０８４からなる群から選択してもよい。さらに好ましくは、前記ドーパミンリガンドは、部分的アゴニストＢＰ８９７である。
【００７９】
上記治療方法又は適用において、ドーパミンＤ３受容体リガンド、及び、特にＤ３受容体部分的アゴニスト又はアンタゴニストは、薬学的に許容される慣用の無毒な担体、佐剤及びビヒクルを含有する投薬単位製剤中に入れて、経口、非経口（皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を含む。）、吸入スプレーによって、又は直腸から投与してもよい。
【００８０】
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」とは、動物、又は適宜ヒトに投与されたときに、有害な反応、アレルギー反応又はその他の面倒な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を表す。
【００８１】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」には、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような溶媒及び薬剤の使用は、本分野において周知である。慣用の溶媒又は薬剤が活性成分と適合しない場合を除き、治療的組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分も、組成物中に取り込むことが可能である。
【００８２】
単独で、又は別のＤ３リガンド若しくは別の活性成分と組み合わされたドーパミンＤ３受容体のリガンドを含有するこのような薬学的組成物は、このため、経口投与可能な懸濁液又は錠剤；経鼻スプレー；無菌注射可能調製物（例えば、無菌注射可能水性又は油性懸濁液又は坐剤として）の形態としてもよい。
【００８３】
懸濁液として経口投与される場合には、これらの組成物は、薬学的製剤の分野において周知の技術に従って調製され、本分野において公知の、嵩を付与するための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース及び甘味剤／着香剤を含有してもよい。即時放出錠剤として、これらの組成物は、本分野において公知の、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース及び／又は他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び潤滑剤を含有してもよい。
【００８４】
経鼻エアロゾル又は吸入によって投与される場合には、これらの組成物は、薬学的製剤の分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール若しくは他の適切な防腐剤、生物学的利用可能性を増強するための吸収促進物質、フッ化炭素及び／又は本分野において公知の他の可溶化剤又は分散剤を用いて、生理的食塩水中の溶液として調製してもよい。
【００８５】
注射可能溶液又は懸濁液は、マニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液若しくは等張塩化ナトリウム溶液などの非経口的に許容される適切な無毒の希釈剤若しくは溶媒、又は無菌、無刺激性、不揮発性油（合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む。）及びオレイン酸を含む脂肪酸などの適切な分散又は湿潤及び懸濁剤を用いて、公知の技術に従って調合してもよい。
【００８６】
坐剤の形態で直腸投与する場合には、これらの組成物は、常温では固体であるが、直腸腔内では液化及び／又は溶解して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤（カカオバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールなど）と薬物を混合することによって調製してもよい。
【００８７】
Ｄ３受容体の部分的アゴニスト又はアンタゴニストなどのＤ３リガンドは、ヒトＤ３受容体の特異的遮断が必要とされる場合にはいつでも、先述の組成物の何れかに入れて、本分野で確立された投薬計画に従って投与し得る。
【００８８】
産物の一日投薬量は、０．０１から１，０００ｍｇ／成人／日までの広い範囲にわたって変動し得る。経口投与の場合、治療されるべき患者に対する投薬の症状による調整のために、前記組成物は、好ましくは、活性成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００ミリグラムを含有する錠剤の形態で与え得る。医薬は、典型的には、活性成分約０．０１ｍｇから約５００ｍｇまでを含有し、好ましくは、活性成分約１ｍｇから約１００ｍｇまでを含有する。薬物の有効量は、通常、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重／日から約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日までの投薬レベルで供給される。好ましくは、この範囲は、約０．００１から１０ｍｇ／ｋｇ体重／日までであり、特に、約０．００１から７ｍｇ／ｋｇ体重／日までである。この化合物は、１から４回／日の投与計画で投与することができる。しかしながら、具体的な患者に対する具体的な投薬レベル及び投薬の頻度は、変化させ得、使用される具体的な化合物の活性、その化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄の速度、薬物の組み合わせ、症状の重さ、並びに治療を受けている宿主など、様々な要因に依存し得ることが理解される。
【００８９】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。
【００９０】
実施例
本明細書を通じて、対立遺伝子１は、位置３１にＡを有し、位置９にＳｅｒを有するＤＲＤ３タンパク質をコードする対立遺伝子を表す。対立遺伝子２は、位置３１にＧを有し、位置９にＧｌｙを有するＤＲＤ３タンパク質をコードする対立遺伝子を表す。従って、遺伝子型１−２はヘテロ接合性の患者Ａ−Ｇ（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）を表し、遺伝子型２−２はホモ接合性の患者Ｇ−Ｇ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を表す。
【００９１】
第一に、ＰＣＲアッセイを使用して、継続的な指標的症例の無関係な２５のＥＴ家族性症例における、ＤＲＤ３のＮ末端細胞外ドメイン中の機能的Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型についてのコード配列を検出して、対照と比較した。１３症例（５２％）はヘテロ接合性１−２であり、６症例（２４％）はホモ接合性２−２であり、これら比は対照の比と有意に異なっている。患者における対立遺伝子２の頻度は、対照における頻度よりも有意に大きく（ｐ＝０．００１）、本研究では、少なくとも１つの対立遺伝子２を保有する被験者におけるＥＴである相対リスクは、２．９２に等しい。
【００９２】
第二に、３０の無関係なフランス人ＥＴ家族において分離研究を実施した。これら家族の各々は、指標的症例として明確に診断された臨床ＥＴ患者を有していた。この研究のために、前記家族の罹患構成員及び非罹患構成員において、ＤＲＤ３  Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型の遺伝子型を同定した。３０のうち２３の家族においてＥＴを伴っていた。この対立遺伝子は、対立遺伝子２が存在するすべての家族において、患者において完全に同時分離している（年齢による浸透度を考慮に入れて）。ホモ接合性２−２（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）患者は、この疾病のより重度の又はより早発性の形態を示し、遺伝子量の効果を示唆している。
【００９３】
これらの家族におけるＳｅｒ９Ｇｌｙ多型のパラメトリック連関分析を実施し、０．９０の浸透度を推定した。この浸透度は、家族性ＥＴに関する公表されたデータと類似し、研究された家族の観察された罹病率と矛盾しない。０．０１ないし０．１０の範囲の表現型模写率及び０．０１ないし０．５０の範囲の突然変異頻度を推定する分析は、θ＝０で５．３８ないし７．９９の範囲のＬＯＤスコアを与えた。
【００９４】
随伴の存在との関連が、両親がいて及び少なくとも一方の親がヘテロ接合性１−２（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）を有する家族（家族２、９、１２、１４、１９、２１）における罹病率／不均衡テスト（ＴＤＴ）の使用によって、また、陽性と示され、カイ二乗値＝５．４４４を与えた。親の遺伝子型が入手不可能な家族（家族７、８、１５、１７、１８、２５、２６、３０）において、Ｓｉｂ−ＴＤＴテスト（Ｓ−ＴＤＴ）も使用した。Ｓ−ＴＤＴ  ｚ’のスコアは４．３０６（Ｐ＜０．００００１）であった。併合ＴＤＴ−ＳＴＤＴ  ｚ’スコアは４．９５１（Ｐ＜０．０００００１）であり、これらの家族における前記９ＧｌｙバリアントとＥＴとの強い連鎖不均衡を示した。
【００９５】
Ｈａｐｍａｐデータ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ）を調べ、Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型を含有する強い連鎖不均衡のハプロタイプブロックを描写した。最初の３つのＤＲＤ３エクソンを含有する−５０ｋｂ及びＤＲＤ３プロモーター領域から上流の非コード配列の−３０ｋｂを含むブロックへ、Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型を位置づけした。
【００９６】
前記家族のほとんどで、ＥＴと前記９Ｇｌｙ対立遺伝子が同時分離していることは、この突然変異が表現型の原因であることを示唆した。ＤＲＤ３の総計５０９８塩基対を９名の家族発端者において増幅及び配列決定した（各遺伝子型についてｎ＝３）。コード配列におけるその他の非同義的突然変異及びスプライシング接合部又はプロモーター領域の８７１塩基対中の変動は認められなかった。
【００９７】
９Ｇｌｙ突然変異の機能的結果を、ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ２９３）細胞中に２つのＤＲＤ３バリアントの各々を安定的に形質移入することによってさらに評価した。次に、表面ＤＲＤ３受容体への結合を阻害するドーパミンの能力について研究した。これらの結果は、ドーパミンが先行研究（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ及びＴｕｒｐｉｎ、１９９６）と同様に、９Ｇｌｙバリアント（対立遺伝子２）に対してさらに高い親和性を有したことを示している。
【００９８】
従って、これらの結果は、対立遺伝子２の存在が、ＥＴを発症するリスクの増大についての特徴であることを示す。さらに、Ｓ９Ｇ突然変異は機能獲得効果を伴うので、このことは、ＤＲＤ３を刺激する抗パーキンソン剤（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；  Ｂｅｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）がＥＴの治療において有効性を欠く理由を説明し得る。
【実施例１】
【００９９】
関連研究
被験者及び方法
患者及び対照
ＥＴの独特な専門知識を有する神経学者により、１９９９年から２００３年の間、患者が調査された。プロトコールには、神経学的検査、振顫のタイプ及びその組織分布、付随する兆候又は症状についての検索、使用された薬物、及び診断を確定するための傍臨床研究が含まれた。家族性ＥＴを有する２５の無関係な家族由来の２５名の継続的指標症例患者（男性９名及び女性１６名）に対して、ＤＮＡ分析を実施した。すべての被験者は、運動障害協会の同意書（Ｄｅｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）によって定義される古典的な遺伝的ＥＴの診断基準を満たし、可能性が高い家族性ＥＴ及び明確な家族性ＥＴを有する患者のみが本研究に含まれた（Ｗａｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本研究において、本発明者らは、ＥＴの臨床的なサブタイプの分類（振顫の解剖学的分布、発症年齢及び進行速度における差異）を採用した（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ）。
【０１００】
５０名の健常者を対照として供し、患者及び対照は性別及び年齢が一致するようにした（すべての患者及び対照は、フランスに由来する。）。
【０１０１】
ＤＲＤ３の遺伝子型同定及び分析
インフォームドコンセントの後、プロテイナーゼＫ消化及び数回のフェノール−クロロホルム抽出を含む標準的な方法を使用して、被験者の全血から採取した白血球についてゲノムＤＮＡを調製し、ＤＲＤ３  ＭｓｃＩ多型の遺伝子型を同定した。
【０１０２】
Ｄ３受容体遺伝子のエクソン１に隣接する以下のプライマー、すなわち、特定の３０４塩基対セグメントを増幅するように指定された、２３５０Ａ：  ５’−ＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＣＡ−３’（順方向、配列番号３）及び２３５１Ｂ：  ５’−ＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡ−３’（逆方向、配列番号４）を使用して、ＰＣＴ−２００サーモサイクラーを使用するＰＣＲ増幅を実施した。ゲノムＤＮＡの１００ｎｇ、１Ｕのｔａｑポリメラーゼ、２μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、各プライマーの１０ｐｍｏｌ及び各ｄＮＴＰの２００ｍＭを含有する５０μｌの総容積で、ＰＣＲ増幅を実施した。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で３０秒間、５６℃で４０秒間、７２℃で４０秒間のプロファイルで３０サイクルを実施し、このプロファイルの後、７２℃で５分間の伸長を行った。
【０１０３】
他のＤＲＤ３変異を同定するために、９名の発端者から得たゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｌｉ−Ｃｏｒ４０００Ｌ自動ＤＮＡ配列決定装置で直接配列決定することによって配列の変動についてスクリーニングした。
【０１０４】
配列決定に使用したプライマーの配列は次のとおりであった。
【０１０５】
【化１】
2008508857.tif 000002
2008508857.tif 000003
【０１０６】
結果
ＭｓｃＩ制限酵素処理の後、臭化エチジウムによって着色された１％アガロースミニゲル上に、遺伝子型１−１（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（３０４塩基対バンド））、遺伝子型１−２（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（２０６塩基対バンドをともに有する３０４塩基対バンド））及び遺伝子型２−２（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（２０６塩基対バンド））という３つの遺伝子型が個体間に観察できる。
【０１０７】
対照集団における異なる遺伝子型の割合が、以下の表１に示されている。
【０１０８】
【表１】
2008508857.tif 000004
【０１０９】
これらの割合は、対立遺伝子頻度に対してハーディ−ワインバーグ平衡（ＨＷＥ）にある（χ２＝２．８９<５．９９、ｄ．ｆ．＝２）。患者におけるこれらの割合は、１−１が６（２４％）、１−２が１３（５２％）及び２−２が６（２４％）であり、ヘテロ接合性１−２及びホモ接合性２−２が著しく過剰であるために、有意（Ｘ２＝５．７７＞３．８４、ｄ．ｆ．＝１、ｐ＜０．０２）なＨＷ不均衡にある。
【０１１０】
表２は、研究した継続的指標の無関係な２５名の患者の遺伝子型及び性別、実年齢、発症年齢及び振顫の解剖学的局在に関する特徴を要約する。
【０１１１】
【表２】
2008508857.tif 000005
【０１１２】
１３名のヘテロ接合性１−２の多く（患者１、２、７、９、１０、１１、１３、１５、１７及び１８）は、本疾病の「古典的な」形態を呈する（発症年齢５５歳以上、腕振顫が比較的速やかに腕＋頭部振顫へと進行する。）。
【０１１３】
対立遺伝子２の頻度は、対照（＝０．２６）と比較して、患者（＝０．５０）にで有意に大きい（χ２＝３．３９＞１．９６、ｐ＝０．００１）。本研究において、少なくとも１つの対立遺伝子２を有する被験者においてＥＴを発症する相対的リスクは、（１９／３９）（６／３６）＝２．９２である。
【０１１４】
家族２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０由来の９名の発端者において、ＤＲＤ３エクソンのゲノム配列及びプロモーターを包含するＰＣＲ断片を配列決定した（基準配列：ヒト染色体３ゲノムコンティグ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＴ＿００５６１２）。すべてのヌクレオチドの位置は、（エクソン２における）ＤＲＤ３翻訳開始部位に関して付与される。
【０１１５】
Ｐ．２１、Ｐ．２２等は家族２１、２２等の発端者を表し、その後に、それらの２つの染色体に関して配列決定されたヌクレオチドが続く。すなわち、低頻度の対立遺伝子のホモ接合又はヘテロ接合性保因者のみ、各ヌクレオチドの変化が言及されている。
【０１１６】
Ｓｅｒ９Ｇｌｙバリアント以外の非同義突然変異は、コード配列中に認められなかった。すべての他のヌクレオチド変化は、稀少かつ同義的、非コード又はイントロン性であり、スプライシング接合部には存在しなかった。疾病を生じる突然変異がこれらの家族で７０％よりも高い頻度を有するとすれば、９名の患者でそれを検出する確率は９９．９９９９８より高い。
【０１１７】
【表３】
2008508857.tif 000006
【実施例２】
【０１１８】
分離研究
患者及び家族
（陽性の家族歴を有する）無関係なフランス人家族に属する３０名の患者（指標的症例）を本研究に包含した。すべての臨床検査及び遺伝子検査の前に、インフォームドコンセントを彼らの各々から得た。すべての患者は、確定的なＥＴの診断についての振顫研究グループ基準（Ｄｅｕｓｃｈｌｅｔ  ａｌ．，、１９９８）を満たしていた。ＥＴの兆候についてのスクリーニング手順は、予め印刷された線の中で利き手によりアルキメデスの螺旋を描写すること（Ｌｏｕｉｓｅｔ  ａｌ．，、１９９６）、及び臨床検査からなった。（前記指標的症例以外の）総計５１名のＥＴ患者及びこれらの３０家族の５８名の非ＥＴ被験者を遺伝子研究に包含めた（図１）。
【０１１９】
分子分析
ＰＣＲ増幅を前述のとおり実施した（実施例１）。次に、ＭｓｃＩを使用して３７℃で４時間、ＰＣＲ産物を処理し、紫外線光の下で臭化エチジウムによって染色された３％メタフォアアガロースゲル中での電気泳動後に、消化産物を分析した。
【０１２０】
制限酵素処理は、３０４塩基対の産物（対立遺伝子１）、又は２０６塩基対（対立遺伝子２）及び９８塩基対の産物、並びに１１１塩基対及び４７塩基対の定常バンドを生じる。
【０１２１】
対立遺伝子２とＥＴとの同時分離
対立遺伝子２は、３０家族のうち２３家族において同時分離する（約３／４）。対立遺伝子２とＥＴとの間の同時分離が、これらの２３家族に観察された（図１）。加齢に伴う浸透度の効果が、家族３において（第二世代において、ヘテロ接合性ＥＴ患者は５５歳であり、２人の兄弟は３１歳未満である。）、及び家族８において（第四世代において、ホモ接合性ＥＴ患者は３０歳であり、そのヘテロ接合性兄弟は２７歳であり、２名のヘテロ接合性患者は非常に若い。）見られる。
【０１２２】
連鎖分析
パラメトリック連鎖分析を実施するため、ＧＥＮＥＨＵＮＴＥＲプログラム（Ｋｒｕｇｌｙａｋｅｔ  ａｌ．，１９９６）を使用し、０．９０の浸透度を有する遺伝の常染色体性優性モードを推定した。本分析では、突然変異及び表現型模写率に関する多様な値を検査した。
【０１２３】
ＴＤＴ−ＳＴＤＴプログラム１．１（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｓｐｉｅｌｍａｎ／ＴＤＴ．ｈｔｍ）を使用して、関連の存在下での連鎖のノンパラメトリック分析を実施した（Ｓｐｉｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｅｗｅｎｓ，１９９８）。
【０１２４】
【表４】
2008508857.tif 000007
【０１２５】
ＴＤＴ伝達／不均衡検査（Ｓｐｉｅｌｍａｎｅｔ  ａｌ．，１９９３）によって、対立遺伝子２とＥＴとの家族ベースでの関連を、少なくとも１名のヘテロ接合性の親を有する家族において評価した。Ｓｉｂ−ＴＤＴ（Ｓ−ＴＤＴ）分析も出生前データのない同胞群において実施した（Ｓｐｉｅｌｍａｎ及びＥｗｅｎｓ、１９９８）。以下の表５は、家族８における指標的症例の夫が推断されない場合のＴＤＴ及びＳ−ＴＤＴ値を示している。
【０１２６】
【表５】
2008508857.tif 000008
【０１２７】
０．９０の浸透度（家族性ＥＴに関する公表されたデータと同様であり、我々の家族における観察された伝達と適合性がある）を仮定した、パラメトリックな連鎖分析によって、対立遺伝子２及びＥＴの連鎖がこれらの家族においても実証された。０．０１ないし０．１０の範囲の表現型模写率及び０．０１ないし０．５０の範囲の突然変異した対立遺伝子の頻度を仮定する分析は、θ＝０で５．３８ないし７．９９の範囲のＬＯＤスコアを生じた。
【０１２８】
ＤＲＤ３のＳｅｒ９Ｇｌｙ多型を含有するハプロタイプブロックの描写
ＤＲＤ３  Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型についての連鎖不均衡（ＬＤ）を、ハップマップ（ＨａｐＭａｐ）ハプロタイプデータ（ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ）を使用して研究した。対象となる１Ｍｂ間隔を定義し、ＤＲＤ３遺伝子上の中央に置き、１２５個の単一ヌクレオチド多型から遺伝子型データを取り出した（ｒｓ１２６３０７９１、染色体位置：１１４、７０８、６１８からｒｓ９８２０４５０、染色体位置１１５、６９７、８８６まで）。長距離ＬＤ及びハプロタイプ分析を、ハプロビュー（Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ）２．０５版ソフトウェア（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｅｒｓｏｎａｌ／ｊｃｂａｒｒｅｔ／ｈａｐｌｏ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を使用して実施した。
【０１２９】
（ｄｂＳＮＰでは、ｒｓ６２８０と命名された、染色体位置１１５、２１１、７１６）ＤＲＤ３  Ｓｅｒ９ｇｌｙバリアントは、Ｇａｂｒｉｅｌら（２００２）において定義されている約５０ｋｂのハプロタイプブロック（ＨＢ）中に位置しており、両端がマーカーｒｓ１６７７７０及びｒｓ６７９８１０２と境を接している。以下の表６は、ＨＢ境界（ｒｓ１６７７７０及びｒｓ６７９８１０２）とＨＢ（太字型）中の各ハップマップ（ＨａｐＭａｐ）マーカーとの間のＬＤ値（Ｄ’）を示す。ＨＢの外側にある最も近接したマーカー（ｒｓ１６７７７１及びｒｓ１５０３６７３）を有するＬＤ値が、比較のために記載されている。
【０１３０】
【表６】
2008508857.tif 000009
【０１３１】
ＨＢの他の定義の使用（Ｗａｎｇほか（２００２）に記載されている「４配偶子則」、又はハプロビュー文書で定義されている「ＬＤの硬いとげ（ｓｏｌｉｄ  ｓｐｉｎｅ）」）は、ＨＢ境界を変化させなかった。ＤＲＤ  Ｓｅｒ９Ｇｌｙ多型は、ハップマップ遺伝子型同定されたマーカーに含まれていなかったので、一般的な集団由来の１７２の無関連対照でｒｓ６２８０及びｒｓ１６７７７０を遺伝子型同定することによって、このバリアントをハプロタイプマップに「固定」した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｉｓｔｅｍｓ；プライマー及びプローブの配列は必要に応じて入手可能である。）でのＴａｑＭａｎ法によって、両マーカーを遺伝子型同定した。両マーカーは完全な連鎖不均衡にあり（Ｄ’＝１．００；ｒｓ６２８０  ＭＡＦ：０．３１、ｒｓ１６７７７０  ＭＡＦ：０．２４）、ｒｓ６２８０はこのＨＢに属することを確認した。
【０１３２】
対立遺伝子２ヘテロ接合及びホモ接合での発症年齢
表７には、対立遺伝子２が分離している２３のＥＴ家族中の、ヘテロ接合性１−２及びホモ接合性２−２患者（指標症例）における本疾病の発症年齢がまとめられている。
【０１３３】
【表７】
2008508857.tif 000010
【０１３４】
６名のホモ接合性患者において、平均発症年齢は１９．７歳であり、１７名のヘテロ接合性患者において平均発症年齢は４９．２歳である（図３）。前記２つの平均は有意に異なっており（ε＝３．５２、ｐ＜０．００１）、ホモ接合性は本疾病の早期発症と明確に関連がある。
【０１３５】
対立遺伝子２のヘテロ接合及びホモ接合における症状の重度
対立遺伝子２についてホモ接合である発端者は、ヘテロ接合体よりも重度の症状を有する。例えば、表８は、前腕振顫スコアがより高かったことを示す（図４）。平均振顫スコアは、１７名のヘテロ接合性患者及び６名のホモ接合性患者において、それぞれ、９．２９±２．９（平均±標準偏差）及び１２．８３±３．０６である。この差は有意である（マン−ホイットニーＵ検定による両側Ｐ＝０．０１５７）。
【０１３６】
【表８】
2008508857.tif 000011
【０１３７】
いくつもの局在が提唱されたが、現在までに研究された多くの家族は３ｑ１３中に位置するＥＴ遺伝子について分離される（Ｇｕｌｃｈｅｒｅｔ  ａｌ．，１９９７）。本明細書に報告されているように、ＥＴについての有力な候補遺伝子として、ドーパミンＤ３受容体（ＤＲＤ３）遺伝子を検査した。より具体的には、ＰＣＲアッセイを実施して、受容体タンパク質Ｄ３のＮ末端細胞外ドメイン中のＳｅｒ−９−Ｇｌｙ多型に対応する２つのＭｓｃＩ対立遺伝子（対立遺伝子１及び対立遺伝子２）をコードするＤＲＤ３遺伝子の一部を増幅した。
【０１３８】
本発明者らは、対照と比べたとき優性の様式で疾病が伝達されている、無関連のＥＴ家族の継続的な指標ＥＴ患者２５名における、対立遺伝子２とＥＴ遺伝子との間の顕著な関連を見出した。すなわち、これらの患者のうち１９名（７６％）は、最も稀少な対立遺伝子２の少なくとも１コピーを有する。ヘテロ接合性１−２患者のほとんどが共通のＥＴ表現型を表した場合、遺伝子量効果が明白に観察された。なぜならば、ホモ接合性患者２−２はこの疾病のある種の重度及び／又は早期発症形態を有するからである。全体にわたる対立遺伝子２は、この対立遺伝子の少なくとも１つを有する患者において約３の相対的な危険度を与える。
【実施例３】
【０１３９】
機能的研究
ＤＲＤ３のＮ末端細胞外ドメインにおける多型性Ｓ９Ｇ置換のインビボでの機能的重要性を、２つのＤＲＤ３バリアントの各々を発現する組換え型細胞において研究した。
【０１４０】
Ｓｅｒ９Ｇｌｙ突然変異は、受容体リガンド結合に参加することが予測されない領域であるＤＲＤ３の細胞外Ｎ末端に位置する。２つのＤＲＤ３バリアントの各々を、ヒト胎児由来腎（ＨＥＫ２９３）細胞中に安定的に形質移入し、それぞれ９Ｓｅｒバリアント及び９Ｇｌｙバリアントについて発現レベルが類似するクローン細胞株を得た。
【０１４１】
プラスミド構築
９ＳｅｒバリアントをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｐｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を使用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）複数部位指定変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する部位指定変異誘発によって、９ＧｌｙバリアントをコードするｃＤＮＡを作成した。
【０１４２】
細胞培養及び形質移入
ＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２、９５％空気の湿度の高い大気中、１０％ウシ胎児血清及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及びＦ−１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１の混合物を用いて作製された細胞培地中で培養した。細胞は、５０％ないし８０％集密度で１０ｃｍ皿に播種され、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｒ）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して９Ｓｅｒバリアント又は９ＧｌｙバリアントをコードするｃＤＮＡが形質移入された（１０６個の細胞につきＤＮＡの１０μｇ）。８００μｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、形質移入体を選別した。２つの代表的なクローン細胞系を選択し、結合アッセイ及び機能的アッセイのために使用した。
【０１４３】
結合アッセイ
細胞を、０．２％トリプシンの存在下で培養皿から剥離し、遠心分離によって回収し、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）を補充したたＤＭＥＭ−Ｆ１２中に懸濁し、３０℃で３０分間、０．１ｎＭの［１２５Ｉ］ヨードスルプリド（ｉｏｄｏｓｕｌｐｒｉｄｅ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び上昇する濃度のドーパミンとともにインキュベートした。エノマプリド（ｅｎｏｍａｐｒｉｄｅ）（１μＭ）の存在下で、非特異的結合を測定した。ポリエチレンイミン（０．３％）でコーティングしたＧＦ／Ｃフィルターを通じてろ過することによって、結合を停止させ、γシンチグラフィーによってフィルター上で放射能を計数した。
【０１４４】
環状ＡＭＰ蓄積アッセイ
９Ｓｅｒバリアント又は９Ｇｌｙバリアントを発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した。これらの細胞を、Ｖ型のアデニル酸シクラーゼをコードするｃＤＮＡで一過性に形質移入した（Ｓａｌｉｍほか、２００３）。細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２中の１０μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンとともに、２５分間プレインキュベートし、０．５μＭフォルスコリンの存在下で、１０分間、増加する濃度のドーパミンとともにインキュベートした。氷冷した０．１ＭのＨＣｌの５０μｌの添加により反応を停止させた。細胞を穏やかに超音波処理し、Ｒｉａｎｅｎ［１２５Ｉ］ｃＡＭＰラジオイムノアッセイキット（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ）を使用して、ｃＡＭＰの蓄積アッセイを行った。
【０１４５】
９Ｓｅｒバリアント及び９Ｇｌｙバリアントにおけるドーパミン親和性
２つのＤＲＤ３バリアントの各々をヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞中に安定的に形質移入することによって、９Ｇｌｙ変異の機能的結果をさらに評価した。クローン細胞系を同様の発現レベルで得た（９Ｓｅｒバリアント及び９Ｇｌｙバリアントについてそれぞれ２．１及び２．２ｐｍｏｌ・ｍｇタンパク質−１）。
【０１４６】
表面ＤＲＤ３受容体への結合を阻害するドーパミンの能力を、異なるクローン細胞株から得た全細胞に関して測定した。４０ｎＭのドーパミンは、それぞれ、９Ｓｅｒバリアント（ｎ＝８）及び９Ｇｌｙバリアント（ｎ＝９）への結合の３８±２％及び５８±２％を阻害した（Ｐ＜０．０００１）。各ＤＲＤ３バリアントの代表的なクローン細胞株で、完全な阻害曲線を得た。
【０１４７】
ドーパミンは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に共通の特徴である二相性の様式、すなわち、シグナルをエフェクターへ伝達するＧタンパク質に共役している高親和性状態に対応する部位、および非共役状態である低親和性状態に対応する部位の２つ部位、で表面ＤＲＤ３結合を阻害した（図４）。２つの部位の各々は、前記変異によって同じ様に影響を受け、ドーパミン親和性を４倍ないし５倍まで増大させた（Ｐ＜０．０１）が、各親和性部位の比は変化させなかった（９Ｓｅｒバリアント及び９Ｇｌｙバリアントについて、それぞれ４５±２％及び４９±２％）。これらの結果は、先行研究（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ及びＴｕｒｐｉｎ、１９９６）と一致していて、ドーパミンが９Ｇｌｙバリアントに対してさらに高い親和性を有したことを示しており、２つの親和性部位の各々で、この差異が生じたことを示し、前記変異が、受容体のＧタンパク質共役形態と非共役形態間の平衡に影響を与えるのではなく、むしろ受容体の全体的な立体構造に影響を与えることを示唆している。
【０１４８】
９Ｇｌｙバリアントの機能獲得
典型的なＤＲＤ３媒介性反応（Ｇｒｉｆｆｏｎほか、１９９７）であるフォルスコリン誘発性環状ＡＭＰ蓄積の阻害を使用して、ＤＲＤ３シグナル伝達に関する突然変異の結果を研究した。ドーパミンによるＤＲＤ３の刺激は、濃度依存的な様式で、環状ＡＭＰのフォルスコリン誘発性蓄積を阻害することがわかった。ドーパミンの最大反応は、９Ｇｌｙバリアントにおいて９Ｓｅｒバリアントの２倍の高さであった（図５）。
【０１４９】
総合すると、ここに示されている結果は、Ｓｅｒ９Ｇｌｙ変異がＤＲＤ３の機能獲得を生じ、研究した家族におけるＥＴの原因となることを示している。このことは、ＤＲＤ３過剰発現がレボドパ誘発性運動障害などの他の運動性疾患を生じるという知見（Ｂｅｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）と一致している。レボドパ誘発性運動障害の場合、大脳基底核中に発現されるＤＲＤ３受容体の関連が推測され一方、小脳ＤＲＤ３受容体がＥＴの原因であり得る。抗パーキンソン薬はＤＲＤ３を刺激するので、ＥＴに対して有効でない。
【０１５０】
それゆえ、ＥＴの特異的治療は、ＢＰ８９７などのＤＲＤ３選択的部分アゴニスト、又はＤＲＤ３選択的アンタゴニストの投与に立脚し得る。
【０１５１】
世界中の種々研究におけるＥＴの罹患率の概算は、一般的な集団で０．３％ないし４．０％に及ぶ（Ｆｉｎｄｌｅｙ，２０００）。年齢に関連する明白な効果が存在し、４０歳ないし６９歳でのＥＴの罹患率に比べて、７０歳ないし７９歳でのＥＴの罹患率は１０倍増加することが報告されている。このため、高齢者集団では、罹患率が２２％に達すると報告されている（Ｆｉｎｄｅｌｙ，２０００）。罹患率の推測の大きな変動は、ＥＴの重度が変動することによって説明され、このため、症例の臨床的評価は、恣意的な判断基準に依存する度合いが高くなる。
【０１５２】
合意された分類では、少なくとも３年間、中核的基準として存在する手及び前腕の両側性動作性振顫（但し、安静時振顫はない。）としてＥＴを定義する（Ｄｅｕｔｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。たとえ、はっきり認識できる疾患を呈する証拠が存在しなくても、発症したばかりの症状及びより穏やかなこの疾病の形態は診断を免れることがある。したがって、穏やかであるが、検査で検出可能な振顫は、年齢を通じて７６名の成人コホート中のほぼ全個体に存在したが、厳密な基準ではＥＴと診断されず、３６．８％に＋２の振顫スコアが与えられ、これは明白且つ持続的な振顫に対応する（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００ｂ）。それゆえ、広義に定義されるＥＴの罹患率は、高齢者集団において２２％を大きく超過するものと思われる。ＤＲＤ３対立遺伝子２保因者の頻度は、一般的な集団の研究試料において４０％であり、他の対照白人で報告されたもの（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）と同じ範囲にある。
【０１５３】
それゆえ、本明細書に開示された結果は、ＥＴのほとんどの事例で、Ｓｅｒ９Ｇｌｙ突然変異が原因となっているという仮説と合致するものであり、加齢に伴って増加し、高齢者集団においてほぼ完全である浸透度を有し、しかし、極めて変動的である発現率を有する。
【０１５４】
ヒト以外の３種の霊長類におけるＤＲＤ３配列（受託号Ｐ５２７０３；ＡＹ４０７５００  ａｎｄ  Ｗｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３参照）は、すべて９Ｇｌｙコドンを有しており、９Ｇｌｙが先祖のＤＲＤ３バリアントであること、及び９Ｓｅｒ変異がヒト系統の間に出現し、選択されて、広く伝播されたことを示唆する。現在のＤＲＤ３  ９Ｓｅｒ対立遺伝子頻度は、かなりの人種異種性を呈し、コンゴ人集団で１６％、アフリカ系アメリカ人で４０％、白人では７０％に及ぶ（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；  Ｃｒｏｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。おそらく環境因子と関連している、ＤＲＤ３とは異なる遺伝的因子がこれらの集団でのＥＴに対する罹患率に影響している可能性があり、このことは、白人と比較してアフリカ系アメリカ人においてＥＴの罹患率が低い（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ｃ）が、アフリカ系アメリカ人の集団で疾病重度がより高いことを説明するであろう（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１５５】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１−１】図１は、本研究で登録した３０のフランス人ＥＴ家族におけるＥＴを有する対立遺伝子２の同時分離を示す。矢印は指標症例を示す。遺伝子型が同定された患者は、１−１ホモ接合性、１−２ヘテロ接合性又は２−２ホモ接合性のいずれかである（家族８の、指標患者の夫の遺伝子型は推定。）。対立遺伝子２は、これが存在するすべての家族においてＥＴと同時分離するが、家族３（第二世代の、１−２患者が５５歳であり、その２人の兄弟が５１歳未満である。）及び家族８（第四世代の、２−２患者が３０歳であり、１−２兄弟が２７歳であり、２人の１−２従兄弟が非常に若い。）においては同時分離していない。家族２７の、第二世代の３番目の妹は「執筆業者の痙攣」（ｗｃ）の特殊な場合である。星印のついた７家族（家族５、６、１６、２０、２２、２３、及び２４）はすべての遺伝子型メンバーがホモ接合性１−１であるので、前記遺伝子マーカーについて分離しない。これらのうち、家族５では、指標症例は、頭部のみ（ｈ）に振顫症状を有し、家族１６では、指標症例は、主に唇（ｌｐ）に振顫症状を有し、家族２４では、指標患者の父はパーキンソン（ｐ）が疑われる症例である。）。
【図１−２】図１は、本研究で登録した３０のフランス人ＥＴ家族におけるＥＴを有する対立遺伝子２の同時分離を示す。
【図２】図２は、ヘテロ接合性１−２ＥＴ患者とホモ接合性２−２ＥＴ患者との平均発症年齢及び分布における差異を示す。
【図３】図３は、振顫の重度（前腕振顫スコア）が、ヘテロ接合性１−２よりもホモ接合性２−２のＥＴ患者において大きいことを示す。
【図４】図４は、９Ｓｅｒバリアント（対立遺伝子１）よりもＤ３受容体の９Ｇｌｙバリアント（対立遺伝子２）に対するより高いドーパミン親和性を示す。
【図５】図５は、環状ＡＭＰ蓄積の阻害によって測定されるドーパミンにより誘発される反応が９Ｇｌｙバリアント（対立遺伝子２）において９Ｓｅｒバリアントの２倍の高さであることを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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