(57)【要約】  本発明は、抗炎、抗アレルギーおよび抗喘息活性を有するPseudolysimachion属植物の抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体を含有する組成物に関する。 前記Pseudolysimachion属植物の抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導された喘息マウスモデルにおいて、プラズマとＢＡＬＦで増加したＩｇＥ、ＩＬ−４およびＩＬ−１３水準、並びに好酸球増多を強力に抑制し、肺組織における粘液過多分泌を抑制する機能を行う。したがって、炎症、アレルギーおよび喘息疾患を予防および治療するための治療薬または健康機能食品として使用できる。
2008542363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎、抗アレルギー、抗喘息活性を有する Pseudolysimachion属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶抽出物を有効成分として含有する、炎症、アレルギーおよび喘息疾患の予防または治療のための薬学組成物。
【請求項２】
前記粗抽出物または有機溶媒可溶抽出物は、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタンまたはこれらの混合物よりなる群から選ばれた溶媒で抽出した抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項３】
前記抽出物は、P. longifolium、P. ovutum、P. kiusianum、P. kiusianum var. diamanticum、P. kiusianum var. villosum、P. dahuricum、P. pyrethrinum、P. linarifolium、P. linarifolium var. villosulum、P. rotundum var. subintegrum、P. rotundum var. coreanum、P. insulareまたはP. undulataから抽出されたことを特徴とする、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項４】
下記一般式（Ｉ）で表されるカタルポール誘導体またはその薬学的に許容される塩を含む、炎症、アレルギーまたは喘息疾患の予防または治療のための薬学組成物。
［一般式Ｉ］
【化１】
2008542363.tif 000006
（式中、Ｒは独立に水素原子、Ｃ１〜Ｃ３低級アルキル基またはＣ１〜Ｃ３低級アルコキシ基でそれぞれ置換されたベンゾイルまたはシンナモイル基から選ばれた少なくとも一つの基である。）
【請求項５】
前記Ｒ基は、３，４−ジヒドロキシベンゾイル、４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイル、３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイル、４−ヒドロキシベンゾイル、３，４−ジメトキシベンゾイル、３，４−ジヒドロキシシンナモイル、および３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
抗炎、抗アレルギー、抗喘息を治療または予防するための薬物の製造のための請求項１に記載の Pseudolysimachion属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶抽出物、または請求項４に記載のカタルポール誘導体の用途。
【請求項７】
食品学的に許容される添加剤、および請求項１に記載の Pseudolysimachion属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶抽出物、または請求項４に記載ののカタルポール誘導体を含む、炎症、アレルギー、喘息の予防および改善のための健康機能食品。
【請求項８】
前記健康機能食品は、丸薬、粉末、顆粒剤、錠剤、チューイン錠剤、カプセル剤、または液剤である、請求項７に記載の健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎、抗アレルギーおよび抗喘息活性を有するPseudolysimachion longifolium抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体を含有する薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
喘息(asthma)とは、気道に発生する複合症状であって、気道障害、急性または慢性炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）および構造リモデリングを示す(Kumar R. K. Pharmacol. Ther., 91, pp 93-104, 2001)。
気道に発生するアレルギー性炎症は、喘息発生に重要な役割を果たすものと報告されている。また、アレルギー性喘息患者の数は、最近、世界人口の約１０％に増加した。その数は米国で１７００万名に達し、アレルギー性喘息治療剤の米国市場の規模は現在まで約６４億＄であると報告されている。
【０００３】
喘息は、２つの類型、すなわち外因性喘息と内因性喘息に分けられる。外因性喘息とは、抗原に露出されたときに症状が現われる喘息をいい、イエダニが主原因抗原であり、その他に花粉、動物の上皮、カビなどが原因抗原として作用する。原因抗原に対する皮膚試験または気管支誘発試験では陽性反応を示し、一般に若い年齢で発生する。内因性喘息は、上気道感染、運動、情緒不安、寒冷気候および湿度の変化などが喘息を誘発または悪化させる場合であるが、成人型喘息に良く見られる。
【０００４】
病態生理学的な側面からみて、喘息は、Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ２免疫細胞で生成するサイトカインによって炎症細胞が増殖、分化および活性化され、気道および気道周辺組織に移動、浸潤して現われる慢性炎症疾患として認識されている。好酸球や肥満細胞などの活性化された炎症細胞はサイトカイン、ケモカイン、シグナル分子、接着分子および成長因子などの多様な炎症媒介因子を分泌し、気道中の構造細胞は多様な段階の喘息に関与する(Elias JA et al., J Clin Invest., 111, pp 291-7, 2003)。ノックアウトマウスモデルおよび臨床研究を用いた多数の研究において、喘息の臨床観察はいろいろの特性因子、例えば免疫反応、好酸球増加症、ＡＨＲおよび構造リモデリングに分けられる(Moffatt JD. Pharmacol Ther. 107, pp 343-57, 2005; Spina D et al., Trends Pharmacol Sci, 23, pp 311-5, 2002)。それぞれの因子は、互いに直接関連していないものと見られるが、ＩｇＥ−媒介免疫反応および好中球増加症はアレルギー性喘息の気道に発生する重要な症状であり(Bochner B.S. et al., Annu. Rev. Immunol., 12, pp 295-335, 1994; Bousquet H et al. N. Med. 323, pp 1033-9, 1990)、アレルギー過程でＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３などの生産されたサイトカインはＡＨＲ発生および気道リモデリングに重要な役割を果たす(Riffo-Vasquez Y et al., Pharmacol. Ther., 94, pp 185-211, 2002)。当然、喘息は組織化された炎症の結果であり、その大部分は喘息の気道に作用する特殊な抑制剤を含み、例えばヒスタミンＨ１拮抗剤、トロンボキサン拮抗剤、血小板活性因子拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ抑制剤、窒素モノオキシゲナーゼ抑制剤、およびプロスタグランジン抑制剤が試みられたが、臨床実験で失敗した(Moffatt J.D., Pharmacol. Ther., 107, pp 343-57, 2005)。反面、サイトカイン合成およびサイトカイン媒介細胞生存の広範囲な抑制によって炎症細胞の先駆濃度を基底線(baseline)として抑制するグルココルチコイドは、これまで３０年の期間にわたって喘息患者の症状を管理するのに用いられてきた(Baatjes A. J. et al., Pharmacol, Ther., 95, pp 63-72, 2002)。これらの報告によれば、喘息管理治療研究は喘息過程の特殊な気道の強力な抑制剤を探すことよりは喘息因子の均衡を回復するのに焦点を合わせるべきであるということを提案している。
【０００５】
Pseudolysimachion longifoliumは、Pseudolysimachion属に属し、韓国、中国、ロシアおよびヨーロッパなどに分布する多年生草本である。このような属の多数種、例えばPseudolysimachion ovutum、Pseudolysimachion kiusianum、 Pseudolysimachion kiusianum var diamanticum、Pseudolysimachion kiusianum var villosum、Pseudolysimachion dahuricum、Pseudolysimachion pyrethrinum、Pseudolysimachion linarifolium、Pseudolysimachion linarifolium var. villosulum、Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum、 Pseudolysimachion rotundum var. coreanum、Pseudolysimachion insulare、 およびPseudolysimachion undulataが報告されており、植物は主成分としてマンニトール、６−ヒドロキシルテオリン(6-hydroxyluteolin)を含む(Chun BS and Shin MK, HyangyakDaeSaJeon, Youngrimsa, pp913-914, 1998)。
【０００６】
したがって、Pseudolysimachion longifoliumからの抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体の炎症性、アレルギーおよび喘息疾患に対する抑制効果は、本明細書において参考として紹介する前記引用文献の何処にも報告または掲載されていない。
そこで、本発明者らは、Pseudolysimachion longifolium抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体が、ＯＶＡ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ／ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄマウスモデルにおいて免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）水準、サイトカイン放出、および好酸球増加、ＡＲと粘液過多分泌などの喘息因子を抑制する効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、毒性なしで炎症、アレルギーおよび喘息疾患の治療および予防のためのより効果的な薬剤の開発が求められる。
それ故に、本発明の目的は、Pseudolysimachion 属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶性抽出物を含有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ここに記述された用語「粗抽出物」は、植物質を水、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、好ましくはメタノール、またはその混合物で抽出することにより製造された抽出物を含む。
ここに記述された用語「有機溶媒可溶性抽出物」は、上述した粗抽出物を有機溶媒、例えばブタノール、アセトン、エチルアセトン、クロロホルムまたはジクロロホルム、好ましくはブタノールで抽出して製造することができる。
【０００９】
ここに記述された用語、「Pseudolysimachion属」は、P. longifolium、P. ovutum、P. kiusianum、P. kiusianum var. diamanticum、P. kiusianum var. villosum、P. dahuricum、P. pyrethrinum、P. linarifolium、P. linarifolium var. villosulum、P. rotundum var. subintegrum、P. rotundum var. coreanum、P. insulareまたはP. undulataを含む。
本発明は、活性成分として、下記一般式（Ｉ）で表されるカタルポール誘導体またはその薬学的に許容される塩を炎症、アレルギーまたは喘息疾患の予防または治療に有効な量で含む、薬学組成物を提供する。
［一般式Ｉ］
【化１】
2008542363.tif 000003
式中、Ｒは独立に水素原子、Ｃ１〜Ｃ３低級アルキル基またはＣ１〜Ｃ３低級アルコキシ基でそれぞれ置換されたベンゾイルまたはシンナモイル基から選ばれた少なくとも一つの基である。
【００１０】
前記一般式（Ｉ）の好適な化合物群としては、Ｒ置換基が３，４−ジヒドロキシベンゾイル、４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイル、３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイル、４−ヒドロキシベンゾイル、３，４−ジメトキシベンゾイル、３，４−ジヒドロキシシンナモイル、または３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルである化合物群である。
本発明のカタルポール誘導体は、Pseudolysimachion longifoliumから分離し、或いは当業界で公知の一般手続きによって合成することができる(Herbert O. house., Modern Synthetic Reactions, 2" Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972)。
本発明によれば、Pseudolysimachion属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶性抽出物の用途、または炎症、アレルギーおよび喘息疾患を予防または治療するために使用される薬剤の製造のために、前記抽出物から分離されたカタルポール誘導体が提供される。
【００１１】
本発明によれば、Pseudolysimachion属植物の粗抽出物または有機溶媒可溶性抽出物、またはこれから分離されたカタルポール誘導体の治療学的に有効な量を炎症、アレルギーおよび喘息の患者に投与することを含む、哺乳動物の炎症、アレルギーおよび喘息を予防または治療する方法が提供される。
Pseudolysimachion属植物から分離された本発明の抽出物、またはこれから分離されたカタルポール誘導体は、次の好適な実施態様によって製造することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、抗炎、抗アレルギーおよび抗喘息活性を有するカタルポール誘導体を有効成分として含有する炎症疾患、アレルギーおよび喘息の予防または治療のための薬学組成物および健康機能食品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明のカタルポール誘導体化合物をPseudolysimachion longifolium抽出物から分離する過程を考察すると、本発明のPseudolysimachion longifolium粗抽出物は、Pseudolysimachion longifoliumを採集し、陰乾した後、磨砕して粉末化した後、これをPseudolysimachion longifolium試料重量の約２〜２０倍、好ましくは５〜１０倍に達する体積極性溶媒、例えば水、およびメタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１〜Ｃ４の低級アルコールの極性溶媒またはこれらの混合物、好ましくはメタノールと混合し、２０〜１００℃、好ましくは２０〜５０℃で約１０時間〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間熱水抽出、冷浸抽出、還流冷却抽出または超音波抽出などの適切な抽出方法、好ましくは冷浸抽出を用いて、残基を濾した後、極性溶媒可溶抽出物を乾燥させた。
【００１４】
前記抽出物を前述の過程で製造する際に、本発明の有機溶媒可溶抽出物を得るために、水に懸濁させた後、１〜１００倍で混合し、好ましくは１〜５倍体積のブタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムまたはジクロロメタン、好ましくはブタノール有機溶媒と混合する。
【００１５】
幾つかの分画物を得るために、前記有機溶媒可溶抽出物は、混合割合の変化に伴って極性が増加するクロロホルム：メタノールの混合溶媒（メタノール０〜１００％、段階的増加）に溶けているシリカゲルで充填されたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって得られる。このような分画物のうち、本発明のカタルポール誘導体を得るために、正常相シリカカラムクロマトグラフィーを用いて３番目の分画物に対してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行った（メタノール１０〜５０％段階的増加）。前述したＮＭＲ、ＥＩ−ＭＳおよび光学回転を用いて構造を確認し(Afifi-Yazar F et al., Helv Chim Acta, 63, pp 1905-7, 1980)、カタルポール誘導体の精製物はＨＰＬＣシステムを用いて９９．５％以上の純度で得られた。
【００１６】
本発明の別の様態として、粗抽出物およびPseudolysimachion longifoliumの有機溶媒可溶抽出物、または前記製造方法で得られたカタルポール誘導体化合物を有効成分として含有する抗塩、抗アレルギーおよび喘息疾患の予防および治療用薬学組成物を提供する。
本発明の別の様態として、抗炎、抗アレルギーおよび喘息疾患の予防および治療用薬剤の生産のための粗抽出物およびPseudolysimachion longifoliumの有機溶媒可溶抽出物、または前記製造方法で得られたカタルポール誘導体化合物の用途を提供する。
本発明の別の様態として、抗炎、抗アレルギーおよび喘息疾患の予防および治療のための方法を提供するが、これは、炎症、アレルギーおよび喘息疾患を持つ哺乳類に、粗抽出物およびPseudolysimachion longifoliumの有機溶媒可溶抽出物、または前記製造方法で得られたカタルポール誘導体化合物の治療学的有効量を投与することを含む。
【００１７】
前記一般式（Ｉ）のカタルポール誘導体化合物は、当該技術分野における通常の方法によって、薬学的に許容される塩および溶媒和物に製造できる。薬学的に許容される塩としては、遊離酸によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、通常の方法、例えば化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩をメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルなどの水混和性有機溶媒を用いて沈殿させて製造する。同じモル量の化合物および水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、その後前記混合物を蒸発させて乾燥させ、或いは析出された塩を吸引濾過させることができる。
【００１８】
この際、遊離酸としては、有機酸と無機酸を使用することができ、有機酸としては、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、シュウ酸、安息香酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、炭酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などを使用することができ、無機酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸、酒石酸などを使用することができる。
また、塩基を用いて、薬学的に許容される金属塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土金属塩は、通常の方法で製造できるが、例えば化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土金属水酸化物溶液中に溶解させ、非溶解化合物塩を濾過した後、ろ液を蒸発、乾燥させて得る。この際、金属塩としては、特にナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが薬学的に適し、また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土金属塩を適当な銀塩（例えば硝酸銀）と反応させて得る。
【００１９】
前記化合物の薬学的に許容される塩は、別に指示しない限りは、トリシン化合物に存在しうる酸性または塩基性基の塩を含む。例えば、薬学的に許容される塩としては、ヒドロキシル基のナトリウム、カルシウムおよびカリウム塩などが含まれる。アミノ基のその他の薬学的に許容される塩としては、臭化水素塩、水素硫酸塩、リン酸塩、水素リン酸塩、二水素リン酸塩、酢酸塩、琥珀酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、およびｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）などがあり、当業界で知られている塩の製造方法または製造過程によって製造できる。
炎症、アレルギー、喘息を予防および治療するための本発明の薬学組成物は、組成物の総重量に対して前記抽出物または化合物を０．１〜５０重量％で含む。
【００２０】
本発明の化合物を含む薬学組成物は、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができるが、その例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、硫酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。これらの投与後、活性組成物の成分は速く提供でき、当業界で公知の過程によって患者に投与された以後、活性成分の投与が維持または遅滞できる。
【００２１】
例えば、本発明の組成物は、注射剤に製造するためによく用いられる方法であって、他の溶媒、プロピレングリコールまたはオイルに溶解できる。キャリアの適切な例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイル、ミリスチン酸イソプロピルなどがあるが、これらの例によって限定されない。局所性(topical)投与方法のために、本発明の抽出物は軟膏またはクリームの形で製造できる。
【００２２】
本発明の組成物を含む薬学的形態は、口腔投与形態（粉末、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、液状薬剤、シロップ、エリキシル丸薬、サシェ(sachet)、顆粒剤）、または局所用製剤（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム(balm)、パッチ(patch)、ペースト、エアロゾルなど）、または注射用製剤（液状、懸濁液、エマルジョン）などのいずれの形態でも製造できる。
本発明の化合物の薬学的投与形態は、これらの薬学的に許容される塩の形態でもあってもよく、単独でまたは他の薬学的活性化合物との結合および適切な集合形態であってもよい。
【００２３】
本発明の化合物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。ところが、好ましい効果のために、本発明の化合物は１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与することがよい。投与は１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。
本発明の化合物は、例えばラット、マウス、家畜またはヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与できる。投与の全ての方式は予想できるが、例えば経口、直腸を介して、または静脈、筋肉、皮下、子宮内くも膜または脳血管内注射によって投与できる。
【００２４】
本発明の他の目的は、抗炎、抗アレルギーおよび喘息疾患の治療と予防のために、薬学的に許容される添加剤とPseudolysimachion longifoliumからの抽出物または化合物を含む健康機能食品を提供することにある。
健康機能食品の改善のために、追加可能な、本発明の前記抽出物および化合物を含む食品は、例えば多様な食品、飲料、チューインガム、ビタミン複合体、健康増進食品などがあり、粉末、顆粒、錠剤、チューイン錠剤、カプセルまたは液剤の形で使用できる。
【００２５】
前述した組成物は、食品または飲料に添加できる。この際、食品または飲料中の前記抽出物の量は、全体食品重量の０．０１〜８０重量％で加えることができ、好ましくは０．０１〜１５重量％であり、健康飲料組成物は、１００ｍＬを基準として０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇの割合で加えることができる。
本発明の健康機能性飲料組成物は、指示された割合で必須成分として前記化合物を含有する以外には他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例としては、例えばブドウ糖、果糖などの単糖類、例えばマルトース、スクロースなどの二糖類、例えばデキストリン、シクロテキストリンなどの通常の糖、および例えばキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールがある。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン(taumatin)、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシド(levaudioside)Ａ、グリシルヒジン(glycyrrhizin)など）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当り一般に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００２６】
この他に、本発明の化合物は、いろいろの栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の化合物は、天然果物ジュースおよび果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、あまり重要ではないが、本発明の化合物１００重量部当り０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。上述した抽出物を含む多様な食品、飲料、チューインガム、ビタミン複合体、健康増進食品およびこれと類似の様々なものが例示できる。
本発明の独創的な抽出物は、毒性がなく、副作用なしで安全に使用できる。
当業界で公知の技術として多様な変形が可能であり、変形物は合成物で製造されることも可能である。このような用途と製造は、本発明の思想および領域を逸脱しないことを明かしておく。
【００２７】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の組成物、用途および製剤において多様な改良および変化を加え得ることは、当業者には自明なことである。
本発明は、次の実施例によってさらに具体的に説明されるであろう。ところが、本発明は、これらの実施例に限定されないものと理解すべきである。
【実施例】
【００２８】
本発明は、次の実施例によってさらに具体的に説明されるであろう。ところが、本発明は、これらの実施例に限定されないものと理解すべきである。
下記の実施例および実験例は、その領域が制限されることなく、本発明をさらに具体的に説明するためのものである。
【００２９】
実施例１．Pseudolysimachion longifoliumの粗抽出物の製造
Pseudolysimachion longifolium７．９ｋｇを乾燥、粉砕してメタノール５０Ｌを加えた後、常温で２４時間攪拌し、真空濾過によって上澄み液を回収した。この過程を３回繰り返して上澄み液を集めた後、減圧下の５５〜６５℃の回転式攪拌器による濃縮によってPseudolysimachion longifoliumメタノール粗抽出物９５０．５ｇを得た。
【００３０】
実施例２．極性溶媒および非極性溶媒可溶性抽出物の製造
２−１．酢酸エチル可溶性分画の製造
１０Ｌの蒸留水を、実施例１で得た４２５ｇの粗抽出物に添加した。１．１０１Ｌの酢酸エチルを分離漏斗に添加し、激烈に振とうして酢酸エチル層および水可溶性層に分離した。
上述した酢酸エチル層は、回転式攪拌器で濃縮し、冷凍乾燥機で乾燥させて酢酸エチル可溶性抽出物を得た。
２−２．ブタノール／水溶解性分画の製造
水溶解性層は、１０Ｌのブタノールと混合し、最終的に１４４．０ｇのｎ−ブタノール溶解性抽出物と混合して分画し、水溶解性抽出物を得て次の実験でサンプルとして使用した。
【００３１】
実施例３．Pseudolysimachion longifolium抽出物からのカタルポール誘導体の製造
３−１．ベルプロシド(verproside)（６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポール）の製造
ｎ−ブタノール溶解性分画物１４４．０ｇに対してシリカゲルクロマトグラフィー（７２〜２３０メッシュ、８．５×６５ｃｍ）を行い、クロロホルム−メタノール混合物（メタノール０〜１００％、段階的に増加させる）で溶出させて５つの分画物を得た。分画２（２９．１ｇ）に対して、正常相シリカカラムクロマトグラフィーを用いてカラムクロマトグラフィーを繰り返し行った（シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール１０〜５０％段階的増加）。分画２−４をメタノールで再結晶してベルプロシド、すなわち６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポールを得た。その構造は、以前に報告された光学回転、ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｄ、ＤＥＰＴ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ）およびＥＩ−ＭＳで確認した(Afifi-Yazar F et al., HeIv ChimActa, 63, pp 1905-7, 1980)。ベルプロシドの純度は９５．５％以上のＨＰＬＣ計で分析した(Shimadzu SCL-IOA with SPD-M 1OA vp PDA detector, column; Phenomenex Synergi 4 um Fusion RP-80, 4.6x150 mm, elution: MeOH/DW, 35/65, v/v, 0.8 ml/min)。
６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシベンゾイルカタルポール（ベルプロシド）
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.47(1H, dd, J=8.0, 9.2 Hz, H-9), 2.59(1H, dddd, J=1.6, 4.0, 8.0, 8.0, H-5), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.42, 3.71(2H, m, H-G6). 3.67(1H, s, H-7), 3.71, 3.91(2H, d, J=13.2 Hz, each, H-10), 4.61(1H, d, J=7.6 Hz, H-G1), 4.94(1H, dd, J=4.0, 6.0 Hz, H-4), 5.03 (1H, d, J=8.0 Hz, H-6), 5.09(1H, d, J=9.2 Hz, H-1), 6.41(1H, dd, J=1.6. 6.0 Hz, H-3), 6.82(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 7.35(1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz, H-6'), 7.39(1H, d, J=2.0 Hz, H-2')。
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 93.0(C-1), 141.1(C-3), 101.8 (C-4), 35.2(C-5), 79.5(C-6), 58.2(C-7), 65.8(C-8), 41.8(C-9), 120.0 (C-1'), 116.4(C-2'), 145.1(C-3'), 150.8(C-4'), 115.4(C-5'), 122.6 (C-6'), 165.6(C-7'), 97.9(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.5(C-G5), 61.4(C-G6)。
【００３２】
３−２．Pseudolysimachion longifolium抽出物からのイソバニリルカタルポールの製造
分画３ １７．３ｇに対して正常相シリカカラムを用いてカラムクロマトグラフィーを行った（シリカゲル、２３０〜４００メッシュ、６．０×６０ｃｍ、クロロホルム−メタノール混合物、メタノール１０〜５０％段階的増加）。８．５ｇの分画３−３をメタノールで再結晶して７．２ｇのイソバニリルカタルポール、すなわち６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイルカタルポールを得た。
６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾイルカタルポール（イソバニリルカタルポール）
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.47(1H, m, H-9), 2.55(1H, m H-5), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.43, 3.70(2H, m, H-G6), 3.70(1H, br s, H-7), 3.72, 3.92(2H, d, J=13.2, each, H-10), 4.62(1H, d, J=8.0 Hz, H-G1), 4.95(1H, dd, J=4.4, 6.0 Hz, H-4), 5.06 (1H, d, J=8.0 Hz, H-6), 5.11(1H, d, J=9.2 Hz, H-1), 6.42(1H, d, J=6.0 Hz, H-3), 7.04(1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 7.42(1H, br s, H-2'), 7.48(1H, d, J= 8.4 Hz, H-6'), 3.84(3H, s, 4'-O-CH3)。 
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 93.0(C-1), 141.0(C-3), 101.6 (C-4), 35.2(C-5), 79.7(C-6), 58.2(C-7), 65.8(C-8), 41.8(C-9), 58.4(C-10), 121.7(C-1'), 115.7(C-2'), 146.3(C-3'), 152.1(C-4'), 111.4(C-5'), 121.3 (C-6'), 165.3(C-7'), 97.8(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.4(C-G5), 61.4(C-G6), 55.7(4'-OCH3)。
【００３３】
３−３．Pseudolysimachion longifolium抽出物からのピクロシド(picroside)ＩＩの製造
１．５ｇの分画３−５を可逆相シリカゲルカラム（ＲＰ−８、ＹＭＣ ｇｅｌ ＯＤＳ−Ａ，６．０×６０ｃｍ、メタノール／水、１／４、ｖ／ｖ）で処理し、Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（メタノール／水、８５／１５、ｖ／ｖ）で処理して１０１．０ｍｇのピクロシドＩＩ、すなわち６−Ｏ−４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイルおよび３０．０ｍｇのベルミノシド(verminoside)、すなわち６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシシンナモイルカタルポールを得た。
６−Ｏ−４−ヒドロキシ−３−メトキシベンゾイル（ピクロシドＩＩ）
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.47(1H, dd, J=8.0, 9.6 Hz, H-9), 2.58(1H, dddd, J=1.2, 6.0, 8.0, 8.4 Hz, H-5), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.42, 3.71(2H, m, H-G6), 3.67(1H, br s, H-7), 3.72, 3.92(2H, d, J=13.2, each, H-10), 4.62(1H, d, J=7.6 Hz, H-G1), 4.99(1H, dd, J=4.4, 6.0 Hz, H-4), 5.06 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 5.11(1H, d, J=9.6 Hz, H-1), 6.42(1H, dd, J=1.6. 6.0 Hz, H-3), 6.89(1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 7.46(1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 7.52(1H, dd, J=2.0, 8.4 Hz, H-6'), 3.83(3H, s 3'-O-CH3)。
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 93.0(C-1), 141.1(C-3), 101.8 (C-4), 35.2(C-5), 79.7(C-6), 58.2(C-7), 65.8(C-8), 41.8(C-9), 58.5(C-10), 121.0(C-1'), 112.7(C-2'), 147.5(C-3'), 152.0(C-4'), 115.3 (C-5'), 123.8(C-6'), 165.6(C-7'), 97.9(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.5(C-G5), 61.4(C-G6), 55.7(3'-OCH3)。
６−Ｏ−３，４−ジヒドロキシシンナモイルカタルポール（ベルミノシド）
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.43(1H, m, H-9), 2.45(1H, m, H-5), 3.01(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.42, 3.70(2H, m, H-G6), 3.64(1H, br s, H-7), 3.71, 3.90(2H, d, J=13.2 Hz, each, H-10), 4.61(1H, d, J=8.4 Hz, H-G1), 4.94(1H, dd, J=4.0, 5.6 Hz, H-4), 4.99 (1H, d, J=7.2 Hz, H-6), 5.08(1H, d, J=9.2 Hz, H-1), 6.42(1H, d, J=5.6 Hz, H-3), 6.77(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 7.08(1H, d, J=1.6 Hz, H-2'), 7.05(1H, dd, J=1.6, 8.0 Hz, H-6')。 
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 92.9(C-1), 141.1(C-3), 101.7 (C-4), 35.1(C-5), 79.2(C-6), 58.2(C-7), 65.7(C-8), 41.8(C-9), 58.5 (C-10), 125.4(C-1'), 115.8(C-2'), 146.0(C-3'), 148.6(C-4'), 113.3 (C-5'), 121.6(C-6'), 145.6(C-7'), 115.0 (C-8'), 97.9(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.5(C-G5), 61.4(C-G6)。
【００３４】
３−４．Pseudolysimachion longifolium抽出物からの６−Ｏ−ベラトロイルカタルポールの製造
６．２ｇの分画４に対してカラムクロマトグラフィーを行った。１．２ｇの分画４−３をメタノールで再結晶して６７２．６ｍｇの６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール、すなわち６−Ｏ−３，４−ジメトキシベンゾイルを得た。
６−Ｏ−３，４−ジメトキシベンゾイルカタルポール（６−Ｏ−ベラトロイルカタルポール）
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.47(1H, dd, J=8.0, 9.6 Hz, H-9), 2.59(1H, dddd, J=1.6, 4.8, 8.0,8.0 Hz, H-5), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.42, 3.71(2H, m, H-G6), 3.70(1H, br s, H-7), 3.72, 3.90(2H, d, J=13.2 Hz, each, H-10), 4.61(1H, d, J=7.6 Hz, H-G1), 4.97(1H, dd, J=4.8, 6.0 Hz, H-4), 5.08 (1H, d, J=8.8 Hz, H-6), 5.10(1H, d, J=9.6 Hz, H-1), 6.42(1H, dd, J=1.6. 6.0 Hz, H-3), 7.09(1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 7.46(1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 7.64(1H, dd, J=2.0, 8.4 Hz, H-6'), 3.81, 3.84(6H, s each, 3', 4'-OCH3)。
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 92.9(C-1), 141.1(C-3), 101.8 (C-4), 35.2(C-5), 79.9(C-6), 58.2(C-7), 65.9(C-8), 41.8(C-9), 58.4 (C-10), 121.3(C-1'), 111.8(C-2'), 148.5(C-3'), 153.2(C-4'), 111.2 (C-5'), 123.5(C-6'), 165.5(C-7'), 97.8(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.5(C-G5), 61.4(C-G6), 55.6, 55.7(3', 4'-OCH3)。
【００３５】
３−５．Pseudolysimachion longifolium抽出物からのミネコシド(minecoside)の製造
２６１．０ｍｇの分画４−４および２８８．０ｍｇの分画４−５をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール混合物、メタノール１０〜２０％、段階的増加）で処理して５２．５ｍｇのミネコシド、すなわち６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルカタポールを得た。
６−Ｏ−３−ヒドロキシ−４−メトキシシンナモイルカタルポール（ミネコシド）
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.46(1H, m, H-9), 2.48(1H, m, H-5), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05 (1H, m, H-G2), 3.14(1H, m, H-G5), 3.18(1H, m, H-G3), 3.42, 3.70(2H, m, H-G6), 3.67(1H, br s, H-7), 3.72, 3.91(2H, d, J=13.2 Hz, each, H-10), 4.61(1H, d, J=8.8 Hz, H-G1), 4.94(1H, dd, J=4.0, 6.0 Hz, H-4), 5.00 (1H, d, J=7.2 Hz, H-6), 5.09(1H, d, J=9.2 Hz, H-1), 6.42(1H, dd, J=1,2, 5.6 Hz, H-3), 6.96(1H, d, J=8.0 Hz, H-5'), 7.13(1H, d, J=2.0 Hz, H-2'), 7.17(1H, dd, J=2.0, 8.0 Hz, H-6'), 3.82(3H, s, -OCH3)。 
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 93.0(C-1), 141.1(C-3), 101.7 (C-4), 35.1(C-5), 79.3(C-6), 58.2(C-7), 65.7(C-8), 41.8(C-9), 58.5 (C-10), 126.8(C-1'), 114.5(C-2'), 146.7(C-3'), 150.2(C-4'), 112.0(C-5'), 121.4(C-6'), 145.7(C-7'), 114.5 (C-8'), 97.9(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.3(C-G4), 77.5(C-G5), 61.4(C-G6), 55.6 (4'-OCH3)。
【００３６】
３−６．Pseudolysimachion longifolium抽出物からのカタルポールの製造
ベルプロシド(verproside)を０．１ＮのＮａＯＨで加水分解してカタルポール（化合物１）を得た。溶液を室温で８時間攪拌し、０．１ＮのＨＣｌ溶液で中和した。生成物を減圧の下に回転式蒸発器で濃縮し、可逆相シリカゲルカラム（ＲＰ１８、メタノール／水、１／４、ｖ／ｖ）を行って５４．０ｍｇのカタルポールを得た。
カタルポール
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 2.12(1H, dddd, J=1.6, 4.0, 8.0, 8.0Hz, H-5), 2.31(1H, d, J=8.0, 9.6Hz, H-9), 3.00(1H, m, H-G4), 3.05(1H, m, H-G2), 3.11(1H, m, H-G5), 3.17(1H, m,H-G3), 3.34(1H, br s, H07), 3.40, 3.70(2H, m, H-G6), 3.63, 3.87(2H, d, J=12.8, each, H-10), 3.76(1H, d, J=8.0Hz, H-6), 4.59(1H, d, J=8.0Hz, H-G1), 4.90(1H, d, J=9.6Hz, H-1), 5.01(1H, dd, J=4.6, 6.0Hz, H-4), 6.36(1H, dd, J=1.6, 6.0Hz, H-3)
13C-NMR (100 MHz, DMSO- d6) δ: 93.2(C-1), 140.2(C-3), 103.3 (C-4), 37.4(C-5), 77.1(C-6), 60.7(C-7), 64.8(C-8), 42.1(C-9), 58.9(C-10), 97.8(C-G1), 73.4(C-G2), 76.4(C-G3), 70.2(C-G4), 77.4(C-G5), 61.3(C-G6)。
【００３７】
実験例１．ＭＴＴ分析
Pseudolysimachion longifolium抽出物およびこれから分離された化合物の細胞毒性は、（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ））方法で測定した(Wang Z et al., Biol., Pharm. Bull., 24, pp159-162, 2001)。
Ｐｒｏｍｙｅｌｏｔｉｃ ＨＬ−６０細胞（ＨＬ−１８１０３、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をＮＧＦ非含有条件で９６ウェルプレートに播種した。２４時間培養後、細胞は１０μＬのＤＭＳＯおよび１０μＬのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）中に溶解されたサンプルの混合物で処理し、類似の条件下に４時間培養し、４時間後にＭＴＴを除去し、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに滴下して結晶を溶解させた。５７０ｎｍでＵＶ吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、米国）で測定して細胞生存度を計算した。
表１に示すように、結果は、細胞生存度が５０μＭで９８％〜１１６％、１００μＭで９５％〜１１４％の範囲であることを立証する。本発明の抽出物または化合物は、細胞毒性がないものと確認された。
【００３８】
【表１】
2008542363.tif 000004
【００３９】
実験例２．気道過敏性（ＡＨＲ）
最終卵白アルブミン（ＯＶＡ）感作２４時間後、Ｐｅｎｈ値（増加した後で停止した値）を計算して測定した。ＯＶＡ処理されたグループのＰｅｎｈ値は、ＰＢＳ対照グループに比べて著しく増加した。Pseudolysimachion longifolium抽出液＋ＯＶＡ−Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄグループは、３０ｍｇ／ｍＬのメタコリンにＯＶＡ処理されたグループと比較して、Ｐｅｎｈ値が著しく減少した（表２参照）。ＯＶＡ処理されたグループ（Ｐ＜０．０５）の値と比較して、ベルプロシド＋ＯＶＡ−ＣｈａｌｌｅｎｇｅｄグループはＰｅｎｈ値が著しく減少した。陽性調節、抗喘息薬剤として広く用いられるモンテルカスト(montelukast、ＭＬ)はベルプロシド処理時のＡＨＲと類似の減少を示す。
【００４０】
【表２】
2008542363.tif 000005
【００４１】
実験例３．ＢＡＬＦにおける卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導された好酸球上のPseudolysimachion longifolium抽出物の効果
３−１．動物感作と気道免疫
関連した呼吸器病原体を血清学的に周期的に測定した８〜１０週齢の特定の病原体未感染白マウス雌（ＢＡＬＢ／ｃ）を（株）オリエント（ソウル、韓国）から購入した。
次の処理方法：（１）ＰＢＳ(phosphate-buffered saline；ｉｐＮｅｂ)にＳｈａｍ−感作させる。（２）ＯＶＡ(ovalbumin：Ｓｉｇｍａ Ａ５５０３；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)（ｉｐＮｅｂ）に添加して感作させる。（３）ＯＶＡ（Ｎｅｂ）とサンプル（Pseudolysimachion longifolium抽出物またはモンテルカスト）の攻撃が加えられたＯＶＡ（ｉ．ｐ．）感作させたものはマウスのグループに注入される（ｎ＝５）。要するに、マウスは０日と１４日に２０μｇ卵白アルブミンを腹腔内注入することにより感作させ、この卵白アルブミンはＰＢＳバッファ１００μＬ（ｐＨ７．４）に水酸化アルミニウム２ｍｇと乳化させて注入した。その後、２８日、２９日、３０日目に超音波噴霧器（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｎｕｂｕｉｌｉｚｅｒ、ＮＥ−Ｕ１２；Ｏｍｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，東京、日本）を用いて卵白アルブミン（ＰＢＳ内１％）を２０分間気道を介して噴霧した。マウスはアレルギー性喘息の気道上におけるPseudolysimachion longifolium抽出物またはベルプロシドの抑制効果を確認するために、最終投与（３２日）４８時間後に致死させた。
【００４２】
３−２．サンプル処理
Pseudolysimachion longifoliumおよびベルプロシドは、ＰＢＳに懸濁させ、２５−ゲージステンレススチルブラントフィーディングニッドル(25-gauge stainless steel blunt feeding needle)を用いて各処理１時間前に胃内に投与し、対照群はＰＢＳ溶液にのみ露出させた。陽性対照群として、実験における同じ過程を経てモンテルカスト（ＭＳＫ Ｋｏｒｅａ Ｌｔｄ．，ソウル、韓国）を処理した。
マウスは、最終投与後に過量のペントバルビタール(pentobarbital)（Ｓｉｇｍａ Ｐ３７６１）を用いて致死させ、気管切開が行われた。冷たいＰＢＳ０．５ｍＬを肺に染み込ませた後、気管挿管方法(Yamazaki T, J. Jap. Bot, 43, pp 117-24,1968)で３回吸い込んで気管支肺胞液（ＢＡＬＦ）を得た（総１．５ｍＬ）。
【００４３】
３−３．気管支肺胞洗浄液における炎症細胞の測定
全体炎症細胞の数は、トリパンブルー(Daigle I. et al., Swiss Med Wkly, 131 pp231-7, 2001)で染色されて確認された死細胞を除いたヘモサイトメーター(hemocytometer)で少なくとも５区域の細胞数を数えて測定した。得た気管支肺胞液（ＢＡＬＦ）１００μＬをスライドに置き、サイトスピン機器(cytospine machine)（Ｈａｎｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、韓国）を用いて遠心分離（２００×ｇ、４℃、１０分）して細胞をスライドに固定した。製造者の指針に基づいて、細胞はＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｔ染色試薬（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｃａｔ Ｎｏ．３８７２１、スイス）で染色された。統計学的分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｔ−ｔｅｓｔで行い、Ｐ＜０．０５の臨界値を示した。
【００４４】
卵白アルブミン投与マウスにおける好酸球へのベルプロシドの抑制程度を測定するために、気管支肺胞洗浄液に誘引された細胞数を最終投与４８時間後に測定した。卵白アルブミンは、ＰＢＳ対照群において気管支肺胞洗浄液への顕著な白血球流入を引き起こした。図２に示すように、ＰＢＳ処理された対照群（２．３±０．６×１０４細胞／マウス）と比較し、全体細胞は４０±１６．４×１０４細胞／マウス（Ｐ＜０．００１）で計算された。好酸球はＰＢＳ処理されたマウスにおいて全体細胞の５％未満で示されたが、卵白アルブミン投与されたマウスの気管支肺胞洗浄液において、全体白血球は７５％以上と急激に増加した。ベルプロシド処理されたマウスにおいて、細胞移動は顕著に鈍化した；卵白アルブミン投与された対照群から全体細胞の７９．３±１３．１％減少（Ｐ＜０．００５）および好酸球の８６．２±７．２％減少（Ｐ＜０．００１）。陽性対照、モンテルカスト（ＭＬ）を処理したグループでは、全体細胞の７８．３±１２．１％減少（Ｐ＜０．００５）および好酸球の８０．７±１１．１％の減少（Ｐ＜０．００５）（図２を参照）を示し、気管支肺胞洗浄液における白血球流入抑制効果と同一の効果を示した。Pseudolysimachion longifoliumとＯＶＡを処理するにおいて、細胞の流入も顕著に減少した；それぞれ、全体細胞の６６．０±１３．２％減少および好酸球の７５．８±７．６％減少。
【００４５】
実験例４．肺組織学
好酸球においてベルプロシドの抑制効果を測定するために、肺組織は最終処理４８時間後に収集された。肺は、１０％中和されたホルマリン溶液に２４時間浸漬固定した。パラフィンに固定された後、４−μｍの厚さに切片を製造し、組織はＨ＆Ｅ溶液で染色された（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ；Ｓｉｇｍａ ＭＨＳ−１６およびｅｏｓｉｎ、Ｓｉｇｍａ ＨＴ１１０−Ｉ−３２）。卵白アルブミン処理されたマウスにおいて、白血球は気管支周辺および血管周辺の結合組織に浸透するものと明らかになった；このような白血球の好酸球増加症が主に観察された。（図３−ＩＶを参照。ＰＰ＜０．００５）ベルプロシド＋卵白アルブミン−浸透されたマウスにおいて、好酸リッチ白血球の浸透は卵白アルブミン処理されたマウスと比較し、顕著に鈍化した（図３−ＩＩＩを参照、Ｐ＜０．０５）。モンテルカスト（ＭＬ）の抑制効果はベルプロシドのそれと類似であった（図３−ＩＶ参照、Ｐ＜０．０５）。 Pseudolysimachion longifolium抽出物＋卵白アルブミンの処理において、白血球浸透の抑制効果は明確に示されていない（図３−Ｖを参照）。
【００４６】
ＰＡＳ(periodic acid Schiff)染色において、正常マウスに比べて、卵白アルブミン処理されたマウスで粘液過多分泌が気管支から紫色で明確に観察された。反面、粘液は、ベルプロシド＋卵白アルブミン処理されたマウスで顕著に減少した（図４−Ａを参照）。気道表面にける杯細胞過多増殖を５段階システムで分析した；０，杯細胞なし；１，上皮の＜２５％；２，上皮の２５〜５０％；３，上皮の５０〜７５％；４，上皮の＞７５％。各マウスにおいて、左肺を介して無作為に選定した５部分の気道セクションが分析され、それらの平均が測定された。粘液生産の定量分析は、イメージ分析器（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｌｔｄ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて行われた。図４−Ｂに示すように、ＰＢＳ処理されたマウスと比較するとき、 粘液区域は、卵白アルブミン処理されたマウスでは３．６０±０．６４（Ｐ＜０．０５）であり、ベルプロシド＋卵白アルブミン処理されたマウスでは１．４３±０．２３と顕著に減少したが、これは陽性対照群としてのモンテルカスト（１．５３±０．２４、Ｐ＜０．０５）よりさらに低い数値であった。このような結果は、ベルプロシドが気道リモデリング過程で顕著な好酸球増加と粘液過多分泌を減少させるということが分かった。
【００４７】
実験例５．ＩｇＥとサイトカインの測定
マウスＩｇＥ抗体における相補的な結合および検出抗体対は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、製造社の方法に従い、ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）を行った。プラズマにおいて、２倍のサンプルは１：１００で希釈された。各サンプルにおけるＩｇＥ水準は４５０ｎｍで光学密度を測定し、ＩｇＥ濃度は組み換えＩｇＥ（５〜２０００ｎｇ／ｍＬ）を用いて測定された標準曲線から計算された。ＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）に含有されているＩＬ−４およびＩＬ−１３の量は特異的マウスＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で測定された。分析の検出限界は２５０ｐｇ／ｍＬであった。
【００４８】
図５−Ａに示すように。ＩｇＥ水準は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）で感作された実験群で急激に増加することが観察された：ＰＢＳ処理されたマウス（プラズマでは１６．９±２３．９μｇ／ｍＬ、気管支肺胞洗浄液では１．０±０．１ｎｇ／ｍＬ）と比較して８５．６±１７．３μｇ／ｍＬ（プラズマ、Ｐ＜０．０５）および５９．４±３８．４（ＢＡＬＦ、Ｐ＜０．００５）であった。ベルプロシド処理されたマウスのＩｇＥ水準は４０．２±１３．２μｇ／ｍＬ（プラズマ、Ｐ＜０．００５）および２１．５±１１．２ｎｇ／ｍＬ（気管支肺胞洗浄液、Ｐ＜０．０５）と顕著に減少した。モンテルカストの場合、前記ＩｇＥ水準は３１．４±１４．２μｇ／ｍＬ(プラズマ、Ｐ＜０．００５)および３．８±０．７ｎｇ／ｍＬ（気管支肺胞洗浄液、Ｐ＜０．０５）とさらに一層減少した。
【００４９】
卵白アルブミン誘導された喘息マウスにおけるサイトカインへのベルプロシドの効果を確認するために、気管支肺胞洗浄液におけるサイトカインの水準（ＩＬ−４およびＩＬ−３）は、最終投与４８時間後にＥＬＩＳＡを用いて測定した。卵白アルブミン投与は、対照群（ＩＬ−４、０．１±０．５ｐｇ／ｍＬ；ＩＬ−１３、０．１±１．０ｐｇ／ｍＬ）と比較するとき、気管支肺胞洗浄液において１４．１±６．１ｐｇ／ｍＬ（ＩＬ−４）および１７８．５±９６．４ｐｇ／ｍＬ（ＩＬ−１３）とサイトカインの顕著な上昇を誘導した。ベルプロシド投与群において、サイトカインは顕著に減少した；卵白アルブミン処理された群において、ＩＬ−４（Ｐ＜０．０５）では６４．５±２７．７％、ＩＬ−１３（Ｐ＜０．００５）では７４．９±１５．５％）と減少した。モンテルカストもＩＬ−４（６９．５±２２．０％減少、Ｐ＜０．０５）およびＩＬ−１３（８４．５±８．２％減少、Ｐ＜０．０５）と対照群に比べて顕著な減少を示した。このような結果は、ベルプロシドはモンテルカストのように喘息モデルの気管支肺胞洗浄液でＩＬ−４およびＩＬ−１３の濃度が減少することを示す（図５−Ｃおよび５−Ｄ）。
次に、添加剤の種類および方法についての製剤例を説明するが、これらの製剤例は本発明を限定するものではない。その代表的な製剤例は、次の通りである。
【００５０】
注射剤の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム(Sodium metabisulfite)   ３．０ｍｇ
メチルパラベン    ０．８ｍｇ
プロピルパラベン  ０．１ｍｇ
注射用蒸留水適量
注射剤は、活性成分を溶解させて製造され、約ｐＨ７．５程度に調節した後、全成分を２ｍＬのアンプルに充填し、通常の注射剤製造方法に従って滅菌した。
【００５１】
パウダーの製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    ５００ｍｇ
トウモロコシ澱粉    １００ｍｇ
乳糖    １００ｍｇ
タルク    １０ｍｇ
パウダーの製造は、前記の成分を混合してシールパッケージに充填することにより行われる。
【００５２】
錠剤の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    ２００ｍｇ
トウモロコシ澱粉    １００ｍｇ
乳糖    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    適量
錠剤の製造は、前記の成分を混合し、通常の錠剤製造方法によって打錠することにより行われる。
【００５３】
カプセル剤の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    １００ｍｇ
乳糖    ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉    ５０ｍｇ
タルク    ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    適量
錠剤の製造は、前記の成分を混合し、通常のゼラチン製造方法によってゼラチンカプセルに充填することにより行われる。
液剤の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    １０００ｍｇ
砂糖    ２０ｇ
多糖類    ２０ｇ
レモン香(Lemon flavor)    ２０ｇ
液剤の製造は、活性成分を溶解させた後、通常の液剤製造方法に従って全成分を１０００ｍＬのアンプルに充填することにより行われる。
【００５４】
健康食品の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド    １０００ｍｇ
ビタミン混合物    適量
ビタミンＡアセテート    ７０ｍｇ
ビタミンＥ    １．０ｍｇ
ビタミンＢ１  ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２    ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６    ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２    ０．２ｍｇ
ビタミンＣ    １０ｍｇ
ビオチン    １．７ｍｇ
葉酸    ５０ｍｇ
パントテン酸カルシウム    ０．５ｍｇ
無機質混合物    適量
硫酸第１鉄    １．７５ｍｇ
酸化亜鉛    ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム    ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム    １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム    ５５ｍｇ
クエン酸カリウム    ９０ｍｇ
炭酸カルシウム    １００ｍｇ
塩化マグネシウム    ２４．８ｍｇ
前記のビタミンおよびミネラル混合物は様々に変化させることができる。このような多様な方法が本発明の思想および領域を逸脱するのではない。
【００５５】
健康飲料の製造
実施例１の乾燥パウダーまたはベルプロシド      １０００ｍｇ
クエン酸    １０００ｍｇ
オリゴー糖    １００ｇ
梅濃縮液    ２ｇ
タウリン    １ｇ
精製水    ９００ｍＬ
健康飲料の製造は、活性成分を溶解させ、混合し、８５℃で１時間攪拌して製造され、ろ過後、１０００ｍＬのアンプルに成分を充填し、通常の健康飲料製造方法に従って滅菌することにより行われる。
上述した本発明は様々な方法で変化できる。このような変形が本発明の思想または領域を逸脱するのではなく、当業界で公知の全ての変形は請求の領域内に含まれることは自明である。
【００５６】
上述したように、本発明は、Pseudolysimachion longifolium抽出物およびこれから分離されたカタルポール誘導体は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）誘導された喘息マウスモデルにおいて、プラズマとＢＡＬＦで増加したＩｇＥ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３水準を抑制し、好酸球増多を抑制し、肺組織における粘液過多分泌を抑制する機能を行う。したがって、炎症、アレルギーおよび喘息疾患を予防または治療するのに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
この発明の前記および他の目的、特徴およびその他の利点は、添付図面を参照する次の詳細な説明によって明確に理解されるであろう。
【図１】図１は気道過敏性（ＡＨＲ、airway hyperre-sponsiveness）へのPseudolysimachion longifolium抽出物の効果を示す図である。
【図２】図２は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ、bronchoalveolar lavge fluid）で炎症細胞の誘引においてベルプロシド(verproside)、ピクロシドII(picroside II)、Pseudolysimachion longifoliumから分離された分画３の効果を示す図である。
【図３】図３は気管支肺胞洗浄の組織学的検査を用いて、好酸球増加症における、Pseudolysimachion longifoliumから分離されたベルプロシドの効果を示す図である。
【図４】図４は気管支肺胞洗浄の組織学的検査を用いて、杯細胞(goblet-cell)における、Pseudolysimachion longifoliumから分離されたベルプロシドの効果を示す図である。
【図５】図５は気管支において粘液過多分泌を減少させるPseudolysimachion longifoliumから分離されたベルプロシドの効果を示す図である。
【図６】図６は気管支肺胞洗浄液においてＩｇＥ水準、ＩＬ−４、およびＩＬ−３を減少させるPseudolysimachion longifoliumから分離されたベルプロシドの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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