(57)【要約】  ポリエチレングリコール鎖など、少なくとも１つの親水性ポリマー部分の化学結合によって修飾されたインターフェロンアルファ（ＩＦＮα）類似体タンパク質について記載する。一実施形態では、ＩＦＮα類似体タンパク質は、成熟インターフェロンタウ（ＩＦＮτ）タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基に基づいて選択された１つ又は複数の置換により、ほぼ残基１〜２７（両端を含む）を含むＮ末端領域中の１つ又は複数のアミノ酸残基で天然ヒトＩＦＮαインターフェロンアルファと異なるアミノ酸配列を有する。ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質でウイルス疾患及び他の障害を治療する方法についても記載する。
2008543943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体
を含む、組成物。
【請求項２】
前記親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質類似体が、天然ヒトインターフェロンアルファ−ｄのタンパク質類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質類似体中のアミノ酸の配列が、１９、２０、２２、２４、及び２７位のうち１つ又は複数で天然ヒトインターフェロンアルファ−ｄ中のアミノ酸の配列と異なる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記タンパク質類似体が、天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂのタンパク質類似体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールが分枝状ポリエチレングリコールである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
タンパク質類似体中のアミノ酸の配列が、１９、２０、２２、２４、及び２７位のうち１つ又は複数で天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂ中のアミノ酸の配列と異なる、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記タンパク質類似体が、配列番号４８として特定される配列を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリエチレングリコールが分枝状ポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ウイルス感染症を治療する方法であって、
ウイルス感染症に冒されている対象に、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を投与することを含む、方法であって、前記タンパク質類似体は、前記感染症の治療に有効な量で投与される、
上記方法。
【請求項１３】
前記ウイルス感染症が、肝炎ウイルス感染症、ヒト乳頭腫ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、及びヒト免疫不全ウイルス感染症からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記肝炎ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎感染症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記肝炎ウイルス感染症が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、非経口投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、タンパク質類似体を少なくともほぼ毎週投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、タンパク質類似体を毎週少なくとも約２００μｇの投与量で投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、天然ヒトインターフェロンアルファ−ｄのタンパク質類似体を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与が、天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂのタンパク質類似体を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与が、配列番号４８として特定される配列を有するタンパク質類似体を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与が、ポリエチレングリコールと共有結合したタンパク質類似体を投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与が、分枝状ポリエチレングリコールと共有結合したタンパク質類似体を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
増殖障害を治療する方法であって、
増殖障害に冒されている対象に、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を投与することを含む、方法であって、前記タンパク質類似体は、前記障害の治療に有効な量で投与される、
上記方法。
【請求項２５】
前記増殖障害が、腫瘍又は癌である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与が、非経口投与することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与が、天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂのタンパク質類似体を投与することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与が、ポリエチレングリコールと共有結合したタンパク質類似体を投与することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が、分枝状ポリエチレングリコールと共有結合したタンパク質類似体を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の対象は、ポリマー修飾インターフェロンアルファタンパク質類似体、身体からの排泄率が低い低毒性ヒトインターフェロンアルファ類似体、及びこれらの類似体を使用して治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮ）は、２つの別々の群：ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮτ、及びＩＦＮω（ＩＦＮαＩＩとしても知られる）を含むＩ型インターフェロン；並びにＩＦＮγによって代表されるＩＩ型インターフェロン（ＤｅＭａｅｙｅｒ，Ｅ．ら、ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮＳ  ＡＮＤ  ＯＴＨＥＲ  ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ  ＣＹＴＯＫＩＮＥＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）によって総説されている）に分類される。ヒトインターフェロンアルファ（ＨｕＩＦＮα）は、約２５種知られている別々のサブタイプからなるＩ型インターフェロンである。これらのＨｕＩＦＮαは、広域の抗ウイルス、抗増殖及び免疫調節特性を有する高度に多面的なサイトカインである。具体的には、それらは様々なＲＮＡ及びＤＮＡ含有ウイルスの複製を阻害し、悪性細胞の増殖を阻害し、様々な癌遺伝子の発現に影響を及ぼし、ナチュラルキラー細胞を活性化する。
【０００３】
ＨｕＩＦＮαのサブタイプＨｕＩＦＮα２は、様々なウイルス疾患及び癌の治療で使用されている。しかし、治療効果に必要な投与量では、患者は、「インフルエンザ様の症状」、倦怠感、食欲不振、好中球減少、及び異常な肝機能を含めた毒性の副作用にしばしば冒される。多くの患者は副作用に耐えることができず、ＩＦＮαでの治療は中断される。
【０００４】
耐えられない副作用を引き起こさないＩＦＮαを提供する試みによって、例えば、ハイブリッドＩＦＮ、コンセンサスＩＦＮα、及びｐｅｇ化ＩＦＮαなどの長時間作用型インターフェロンが開発された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたＩＦＮαの例には、ｐｅｇ化インターフェロンアルファ−２ｂ（ＰＥＧ  Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標））及びアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））があり、１２ｋＤａのポリエチレングリコール又は４０ｋＤａの分枝鎖ＰＥＧ鎖がそれぞれＩＦＮαと結合している。
【０００５】
しかし、これらのＰＥＧ修飾ＩＦＮαの安全性プロファイルは、対応する天然タンパク質と質的に同様であるか又はそれより悪かった（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  Ｒ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ；９５（２）：３８９〜９６（２００２）；Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  Ｒ．Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；２０（１８）：３８４１〜３９４９（２００２）；Ｍｏｔｚｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ、１９（５）：１３１２〜９（２００１）；Ｔｏｎｇ  Ｍ．Ｊ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：８１〜８６（１９９８）；Ｙａｏ  Ｇ．Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ．、１５：１１６５〜１１７０（２０００）；Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ  Ｅ．Ｊ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４３（２３）：１６７３〜８０（２０００）；Ｔｏｎｇ  Ｍ．Ｊ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；２６（３）：７４７〜５４（１９９７））。最も一般的に報告されている有害作用は、悪心、食欲不振、疲労及び硬直であり、その発生率は投与量に関連していた。さらに、治療期間が長くなるにつれて、重度の疲労、神経毒性、肝機能異常、及び骨髄抑制を含めた用量制限毒性が、ＰＥＧ  Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）の投与量７．５μｇ／ｋｇ以上で観察された（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  Ｒ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ；９５（２）：３８９〜９６（２００２））。投与量＞９μｇのコンセンサスＩＦＮαもすべての患者が耐えられず、一部の患者では試験の終了に投与量の低下が必要であった（Ｙａｏ  Ｇ．Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ．、１５：１１６５〜１１７０（２０００））。したがって、現在のｐｅｇ化型のＩＦＮα及びコンセンサスＩＦＮαは、ＩＦＮα療法に伴う毒性の問題に対処することができなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
改良されたポリマー修飾ＩＦＮαが、当技術分野で依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、組成物が提供され、その組成物は、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した、天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を含む。
【０００８】
一実施形態では、親水性ポリマー鎖はポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、直鎖状でもよく、又は分枝状でもよい。
【０００９】
別の実施形態では、タンパク質類似体は、天然ヒトインターフェロンアルファ−ｄのタンパク質類似体である。他の実施形態では、タンパク質類似体は、天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂのタンパク質類似体である。
【００１０】
一実施形態では、タンパク質類似体中のアミノ酸の配列は、１９、２０、２２、２４、及び２７位のうち１つ又は複数で天然ヒトインターフェロンアルファ２ｂ中のアミノ酸の配列と異なる。
【００１１】
好ましい一実施形態では、タンパク質類似体は、配列番号４８として特定される配列を有する。
【００１２】
別の態様では、ウイルス感染症を治療する方法が提供される。その方法は、ウイルス感染症に冒されている対象に、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した、天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を投与することを含み、前記タンパク質類似体は、感染症の治療に有効な量で投与する。
【００１３】
一実施形態では、ウイルス感染症は、肝炎ウイルス感染症、ヒト乳頭腫ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、及びヒト免疫不全ウイルス感染症から選択される。具体的な実施形態では、肝炎ウイルス感染症は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症又はＢ型肝炎ウイルス感染症である。
【００１４】
その方法では、一実施形態においてタンパク質類似体を非経口投与することができる。一実施形態では、投与は少なくともほぼ毎週行うことができる。投与量は様々でよいが、一実施形態では、タンパク質類似体は、毎週少なくとも約２００μｇの投与量で投与する。代替の実施形態では、タンパク質類似体は、少なくとも約４５０又は９００μｇの投与量で毎週又は隔週で投与する。
【００１５】
なお別の態様では、ウイルス感染症を治療する方法が提供される。その方法は、ウイルス感染症に冒されている対象に、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した、天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を投与することを含み、前記タンパク質類似体は、実質的な定常状態のタンパク質類似体血漿濃度を実現する投与頻度で投与し、それにより前記投与は肝細胞に対する細胞毒性作用を及ぼさない。
【００１６】
化学修飾された治療用タンパク質を含む医薬組成物、またその医薬組成物を含むキットを提供することも一実施形態である。
【００１７】
本明細書に記載の組成物を使用して、例えば腫瘍増殖又はウイルス複製を阻害することによって疾患を治療し、或いは自己免疫疾患を治療する方法を提供することが追加の実施形態である。
【００１８】
さらなる態様では、増殖障害を治療する方法が提供される。その方法は、増殖障害に冒されている対象に、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合した、天然ヒトインターフェロンアルファのタンパク質類似体を投与することを含み、前記タンパク質類似体は、障害の治療に有効な量で投与する。
【００１９】
配列の簡単な説明
配列番号１は、残基１９〜２７間のヒトＩＦＮα（ＨｕＩＦＮα）のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号２は、残基１９〜２７間のヒツジインターフェロンタウ（ＯｖＩＦＮτ）のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号３は、残基１１〜２７間のＨｕＩＦＮαｄのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号４は、残基１１〜２７間のＯｖＩＦＮτのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号５は、残基６〜２７間のＨｕＩＦＮαｄのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号６は、残基６〜２７間のＯｖＩＦＮτのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号７は、残基１〜２７間のＨｕＩＦＮαのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号８は、残基１〜２７間のＯｖＩＦＮτのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号９は、成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸配列である（ＩＦＮα−ｄ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２１０、ＰＩＤｇ３８６７９６）。
【００２８】
配列番号１０は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ０のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１１は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ０のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１２は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ１のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１３は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ１のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１４は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ２のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１５は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ２のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１６は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ３のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１７は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ３のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号１８は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ４のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１９は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ４のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２０は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ５のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号２１は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ５のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号２２は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ６のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２３は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ６のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号２４は、ＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ７のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２５は、残基１〜２７間のＩＦＮα類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ７のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号２６は、成熟ＯｖＩＦＮτのアミノ酸配列である（ｏＴＰ−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｙ００２８７；ＰＩＤｇ１３５８）。
【００４５】
配列番号２７は、類似体ＩＦＮαｄ−Ｎ０をコードする合成遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号２８は、リンカー１のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号２９は、リンカー２のヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３０は、Ｎ１類似体の残基１〜２７、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号３１は、断片Ｎ１、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号３２は、断片Ｎ２、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５１】
配列番号３３は、断片Ｎ２、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３４は、断片Ｎ３、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５３】
配列番号３５は、断片Ｎ３、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号３６は、断片Ｎ４、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５５】
配列番号３７は、断片Ｎ４、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号３８は、断片Ｎ５、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号３９は、断片Ｎ５、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号４０は、断片Ｎ６、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号４１は、断片Ｎ６、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号４２は、断片Ｎ７、順方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００６１】
配列番号４３は、断片Ｎ７、逆方向鎖のヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号４４は、成熟ヒツジＩＦＮτのアミノ酸配列に対応し、配列番号２６の配列と比べて配列の５及び６位のアミノ酸残基が修飾されている。
【００６３】
配列番号４５は、配列番号２６で示すヒツジＩＦＮτの最初の３７アミノ酸残基に対応する。
【００６４】
配列番号４６は、配列番号４４で示す修飾ヒツジＩＦＮτの最初の３７アミノ酸残基に対応する。
【００６５】
配列番号４７は、インターフェロン−τに由来するＣ末端領域及び他のインターフェロンに由来する領域からなるハイブリッドインターフェロンタンパク質である。
【００６６】
配列番号４８は、本明細書においてＩＦＮα２ｂ−Ｎ７類似体と呼ばれるＩＦＮα類似体のアミノ酸配列に対応し、ＩＦＮα２ｂのＮ末端領域中のアミノ酸残基１９、２０、２２、２４、２７がヒツジＩＦＮτの対応する残基と置換されている。
【００６７】
配列番号４９は、ヒトＩＦＮα２ｂのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
Ｉ．定義
インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）は、配列番号９として示されるアミノ酸配列を有するＩＮＦαＤ、及び配列番号４９として示されるアミノ酸配列を有するＩＦＮα２ｂ配列によって例示される単離インターフェロンアルファタンパク質のファミリーのいずれか１つを指す。
【００６９】
ＩＦＮτ又はインターフェロン−τと略されるインターフェロンタウは、既知のＩＦＮτ配列（例えば、Ｏｔｔら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ、１１：３５７（１９９１）；Ｈｅｌｍｅｒら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．、７９：８３（１９８７）；Ｉｍａｋａｗａら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、３：１２７（１９８９）；Ｗｈａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１０８４６（１９９４）；Ｂａｚｅｒら、ＷＯ９４／１０３１３（１９９４））とのアミノ酸相同性が７０％を超え、又は好ましくは約８０％を超え、又はより好ましくは約９０％を超える単離インターフェロンタンパク質のファミリーのいずれか１つを指す。ＩＦＮτ配列は、それだけに限らないが、雌ウシ（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐ．、ＨｅｌｍｅｒＳ．Ｄ．、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．、７９：８３（１９８７）；Ｉｍａｋａｗａ，Ｋ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１９：５３２（１９８８））、ヒツジ（Ｏｖｉｎｅ  ｓｐ．）、ジャコウウシ（Ｏｖｉｂｏｓ  ｓｐ．）、キリン（Ｇｉｒａｆｆａ  ｓｐ．、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５５０５０）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、シマウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｂｕｒｃｈｅｌｌｉ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ００５０２７）、カバ（Ｈｉｐｐｏｐｏｔａｍｕｓ  ｓｐ．）、ゾウ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ｓｐ．）、ラマ（Ｌｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ヤギ（Ｃａｐｒａ  ｓｐ．、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３５７３３６、ＡＹ３５７３３５、ＡＹ３４７３３４、ＡＹ３５７３３３、ＡＹ３５７３３２、ＡＹ３５７３３１、ＡＹ３５７３３０、ＡＹ３５７３２９、ＡＹ３５７３２８、ＡＹ３５７３２７）、及びシカ（Ｃｅｒｖｉｄａｅ  ｓｐ．）を含めて、様々な反芻動物種中で同定されている。これらの種のうち多数のＩＦＮτヌクレオチド配列が、公的データベース及び／又は文献中で報告されている（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、１８：８０５（１９９８）、Ｌｅａｍａｎ  Ｄ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．、１２：１（１９９３）、Ｒｙａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ａｎｉｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３４：９（１９９６）を参照）。
【００７０】
ヒツジＩＦＮτ（ＯｖＩＦＮτ）とは、本明細書において配列番号２６として特定されるアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに本明細書において配列番号４４として特定されるＩＦＮτタンパク質など、そのタンパク質の活性に著しい影響を及ぼさない中性アミノ酸置換などのアミノ酸の置換及び変更を有するタンパク質を指す。より一般には、ヒツジＩＦＮ−τタンパク質は、配列番号２６として特定される配列と約８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有するものである。配列同一性は、例えば、厳密なアミノ酸比較によって、又は市販されている多数のプログラムの１つを使用して決定する。
【００７１】
「成熟タンパク質」とは、そのリーダー配列除去後のＩＦＮタンパク質を指す。例えば、成熟ＩＦＮτタンパク質の配列は、完全なＩＦＮτアミノ酸配列の残基Ｃｙｓ２４から開始し、これは、成熟タンパク質の配列のＣｙｓ１と対応する。
【００７２】
ポリヌクレオチド配列又は断片が、それが由来する配列又は断片中に存在するものと同じ配列のヌクレオチドを含むとき、それは、他のポリヌクレオチド配列又は断片に「由来する」。例えば、挿入物中のポリヌクレオチドの配列が、選択されたヒト遺伝子中のポリヌクレオチドの配列と同じである場合、細菌プラスミドは、選択されたヒト遺伝子に「由来する」挿入物を含む。同様に、ポリペプチド配列又は断片が、それが由来する配列又は断片中に存在するものと同じ配列のアミノ酸を含むとき、それは、他のポリペプチド配列又は断片に「由来する」。
【００７３】
２つのアミノ酸配列に関して、パーセント（％）同一性とは、配列を最適に整列し、ペナルティーが「ギャップ」に割り当てられないときに、２つの配列中で同一である残基の％を指す。言い換えると、第１の配列を第２の配列と最適に整列するために第１の配列中にギャップを挿入することが必要である場合、％同一性は、対応するアミノ酸残基と対になる残基のみを使用して計算する（すなわち、計算では、第１の配列の「ギャップ」中にある第２の配列中の残基は考慮しない）。最適なアラインメントは、最も高い％同一性スコアを示すアラインメントと定義される。そのようなアラインメントは、比較的短いポリペプチドでは視覚的に行うこともでき、或いは「ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ」プログラムを使用して行うこともできる。或いは、アラインメントは、局所的アラインメントプログラムＬＡＬＩＧＮを使用して、ｋｔｕｐを１にし初期設定のパラメーター及び初期設定のＰＡＭを用いて行うことができる。
【００７４】
「保存的置換」とは、１つのクラス中のアミノ酸の、同じクラス中のアミノ酸による置換を指し、クラスは、アミノ酸側鎖の共通する生理化学的特性及び（標準的なＤａｙｈｏｆｆ頻度交換行列によって決定される）天然に認められる相同タンパク質中での高い置換頻度によって定義される。上記のように分類されるアミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスには、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）がある。例えば、Ａｓｐの、Ａｓｎ、ＧｌｎやＧｌｕなど他のクラスＩＩＩの残基との置換は、保存的置換である。
【００７５】
「非保存的置換」とは、１つのクラス中のアミノ酸の、他のクラスのアミノ酸との置換、例えば、クラスＩＩの残基であるＡｌａの、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕやＧｌｎなどのクラスＩＩＩの残基との置換を指す。
【００７６】
「類似体」とは、天然タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に対する１つ又は複数のアミノ酸の欠失（いわゆる切断）又は付加；天然ポリペプチド中の１つ又は複数の部位における１つ又は複数のアミノ酸の欠失又は付加；或いは天然ポリペプチド中の１つ又は複数の部位における１つ又は複数のアミノ酸の置換により、単離された天然ポリペプチドと配列において関係するポリペプチドを指す。そのような類似体は、例えば、遺伝的多型又は人的操作から生じ得る。そのような操作の方法は、当技術分野で一般に周知である。
【００７７】
「融合」タンパク質とは、第１のタンパク質の少なくとも１つの連続した部分を、第２の異なるタンパク質の少なくとも１つの連続した部分に付加することによって構築されたタンパク質を指す。融合タンパク質の類似体では、２つの異なるインターフェロンのキメラ配列である融合タンパク質が天然タンパク質であることが想定される。したがって、連続した部分の一方又は両方がキメラを含む融合タンパク質の類似体では、そのような構成成分の天然配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失又は付加することができる。
【００７８】
「タンパク質」及び「ポリポリペプチド」という用語は、互換性のあるものとして使用され、それはアミノ酸のポリマーを指し、特別な長さのアミノ酸ポリマーを指すものではない。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾物、例えば、グリコシル化物、アセチル化物、リン酸化物などをも含む。
【００７９】
「結合体」とは、第２の化合物と結合又は会合した第１の化合物を含む化合物を指す。
【００８０】
「増殖障害」とは、腫瘍及び癌を含むがそれだけに限らない、新たな細胞の急速な産生を特徴とする障害又は疾患を意味する。
【００８１】
ＩＩ．低毒性長期循環性ヒトＩＦＮα類似体
一態様では、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖との共有結合によって結合したＩＦＮα類似体タンパク質が提供される。様々なヒトＩＦＮα類似体タンパク質が使用に適し、様々な例についてこの節で説明する。下記の節である第ＩＩＩ節では、これらのＩＦＮα類似体を親水性ポリマーと結合する方法について説明する。
【００８２】
Ａ．ＩＦＮα類似体タンパク質
第１の例示的な実施形態では、天然ヒトＩＦＮαタンパク質の類似体が提供され、天然ＩＦＮαの残基１〜２７の配列と対応する類似体中のアミノ酸の配列が、類似体中の配列が２２位と対応するアミノ酸残基でのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓ、Ｇｌｎ又はＧｌｙの存在により対応する天然ＩＦＮαと異ならないという条件で、１９、２０、２２、２４、及び２７位のうち１つ又は複数で異なる。その類似体は、例えば、例えば培養中のヒト単核細胞又は肝細胞を使用するアッセイにおいて、天然ＩＦＮαと比べて低毒性を示すことができる。
【００８３】
図１は、成熟ＨｕＩＦＮαＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２１０、ＰＩＤｇ３８６７９６：配列番号９）、及び成熟ＯｖＩＦＮτ（配列番号２６）の最初のＮ末端アミノ酸残基２７個を示し、同一でない残基は太字で示す。ＯｖＩＦＮτからの特定のアミノ酸置換を含むＨｕＩＦＮαＤ類似体は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第６，２０４，０２２号に記載のように調製した。図１はまた、ＩＦＮα−Ｎ０からＩＦＮα−Ｎ７（配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５）と称するいくつかのＨｕＩＦＮαＤ類似体のアミノ酸残基１〜２７をも示す。図１で示す類似体断片の１つと対応するアミノ酸残基１〜２７を有するＮ末端領域、及びＩＦＮαＤと対応するタンパク質の残り（アミノ酸残基２８〜１６６）を有するＩＦＮα類似体タンパク質は、本明細書において配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、及び２４によって特定される。これらのＩＦＮα類似体はすべて、本明細書において、好ましいＩＦＮα−Ｎ７類似体断片（配列番号２４）を含むタンパク質類似体とともに使用することが意図される。
【００８４】
図２で示すベクターを使用するこれらの類似体の調製を実施例１で簡潔に説明する。調製のより詳細な説明は、米国特許第６，２０４，０２２号で示されている。米国特許第６，２０４，０２２号でも記載されているこれらの類似体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験から、アミノ酸残基１９、２０、２２、２４、及び２７位が、成熟ＩＦＮαＤの細胞毒性の低下に関与することが示された。１９、２０、２２、２４、及び２７のうち１つ又は複数に対するアミノ酸置換は毒性を低下させるが、その類似体は成熟した天然ＩＦＮαの望ましい治療特性を保持する。
【００８５】
ヒトＩＦＮα２ｂ（配列番号４９、アクセッション番号ＡＡＰ２００９９）が、アミノ酸残基１９、２０、２２、２４、及び２７位で、これらの位置で対応するヒツジＩＦＮτの残基を含むように修飾された他のＩＦＮα類似体タンパク質を実施例１Ｂで説明する。このＩＦＮα２ｂ類似体タンパク質は、本明細書において配列番号４８として特定される。具体的には、ＩＦＮα２ｂ中の下記のアミノ酸残基が、下記のように修飾された：Ａ１９→Ｄ；Ｑ２０→Ｒ；Ｒ２２→Ｎ；Ｉ２４→Ｌ；及びＦ２７→Ｈ。
【００８６】
より一般には、任意のＩＦＮαサブタイプに基づくＩＦＮα類似体が意図される。天然のＩＦＮαタンパク質を、下記の置換のうち１つ又は複数を含むように修飾してＩＦＮα類似体にすることができる：成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸１９を、成熟ＯｖＩＦＮτの１９位にあるＡｓｐ、或いは同じクラスの残基であるＡｓｎ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕと置換することができる；成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸２０を、成熟ＯｖＩＦＮτの２０位にあるＡｒｇ、或いは同じクラスの残基であるＨｉｓ又はＬｙｓと置換することができる；成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸２２を、成熟ＯｖＩＦＮτの２２位にあるＡｓｎ、或いは同じクラスの残基であるＡｓｐ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕと置換することができる；成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸２４を、成熟ＯｖＩＦＮτの２４位にあるＬｅｕ、或いは同じクラスの残基であるＶａｌ又はＭｅｔと置換することができる；成熟ＨｕＩＦＮαのアミノ酸２７を、成熟ＩＦＮτの２７位にあるＨｉｓ、或いは同じクラスの残基であるＡｒｇ又はＬｙｓと置換することができる。そのような置換は、ＨｕＩＦＮαタンパク質の毒性の低下に有効であるが、望ましい治療特性を著しく変化させるものではない。
【００８７】
いくつかのさらなる例示的なＨｕＩＦＮα類似体タンパク質の変化した位置を包含する他の例示的な配列には、本明細書において配列番号２、配列番号４、及び配列番号６として示される配列がある。最も好ましい実施形態は、置換された残基１９〜２７（両端を含む）から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基を有するＨｕＩＦＮα類似体である。別の実施形態では、（ｉ）図１において残基１９〜２７によって特定される領域中の、（ｉｉ）残基が成熟ＩＦＮτ（好ましくは成熟ヒツジＩＦＮτ）と同一でない１つ又は複数のアミノ酸残基が、成熟ＩＦＮτタンパク質中の残基と置換されているＩＦＮα類似体が提供される。例えば、成熟ヒトＩＦＮα（配列番号１、配列番号４９）のアミノ酸１９〜２７が成熟ＯｖＩＦＮτのアミノ酸１９〜２７（配列番号２）と置換されている類似体タンパク質は、成熟ヒトＩＦＮα中の１９、２０、２２、２４、及び２７位が変化しているが、残りの成熟ヒトＩＦＮα配列は変化しないままである。例は、本明細書においてＩＦＮαｄ−Ｎ７（配列番号２４）及びＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）と呼ばれる類似体と対応する。
【００８８】
別の実施形態では、ＩＦＮα類似体タンパク質は、ヒトＩＦＮαの１９、２０、２２、及び２７位で１つ又は複数のアミノ酸が置換された、保存されていないアミノ酸残基を含む。置換には、それだけに限らないが、１９位のアミノ酸とクラスＩＩＩのアミノ酸、具体的にはＡｓｐの置換；２０位のアミノ酸とクラスＩＶのアミノ酸、具体的にはＡｒｇの置換；２２位のアミノ酸とクラスＩＩＩのアミノ酸、具体的にはＡｓｎの置換；及び２７位のアミノ酸とクラスＩＶのアミノ酸、具体的にはＨｉｓの置換がある。別の実施形態では、置換は、２４位のアミノ酸とクラスＶのアミノ酸、具体的にはＬｅｕの置換の置換を含んでよい。
【００８９】
例示的な類似体には、残基１９〜２７間の成熟ＨｕＩＦＮαの配列と、配列番号２によって定義される９−ｍｅｒの置換が関与する。具体的には、残基１９〜２７間の成熟ＨｕＩＦＮαの配列は配列番号１である。９−ｍｅｒの配列番号２は、成熟ヒツジインターフェロンタウ（ＯｖＩＦＮτ）の残基１９〜２７と対応し、１９、２０、２２、２４、及び２７位で成熟ＨｕＩＦＮαと同一でない残基を含む。他の実施形態では、類似体には、残基１１〜２７間のＨｕＩＦＮαの配列と、配列番号４によって定義される１７−ｍｅｒの置換が関与する。具体的には、残基１１〜２７間の成熟ＨｕＩＦＮαの配列は配列番号３である。１７−ｍｅｒの配列番号４は、成熟ＯｖＩＦＮτの残基１１〜２７と対応し、１１、１３、１４、１６、１９、２０、２２、２４、及び２７位でＨｕＩＦＮαと同一でない残基を含む。他の実施形態では、類似体には、残基６〜２７間のＨｕＩＦＮαの配列と、配列番号６によって定義される２２−ｍｅｒの置換が関与する。具体的には、残基６〜２７間の成熟ＨｕＩＦＮαの配列は配列番号５である。２２−ｍｅｒの配列番号６は、成熟ＯｖＩＦＮτの残基６〜２７と対応し、６、７、８、１１、１３、１４、１６、１９、２０、２２、２４、及び２７位でＨｕＩＦＮαと同一でない残基を含む。
【００９０】
記載した低毒性ヒトＩＦＮα類似体が「成熟」タンパク質であり、すなわち、（成熟タンパク質のＣｙｓ１と対応する）完全なインターフェロン配列の残基Ｃｙｓ２４から開始するが、リーダー配列を含む、すなわち開始メチオニンから開始するＩＦＮα類似体も適切であることが理解されるであろう。そのようなヒトＩＦＮα類似体中のリーダー配列は、ヒトＩＦＮα、ヒツジＩＦＮτ、又は他のＩ型インターフェロンに由来し得る。
【００９１】
上記で述べたように、これらのＨｕＩＦＮα類似体は、天然ヒトＩＦＮαと比べて毒性が低下し、ほとんどの場合、天然ヒトＩＦＮαと同じ生物学的活性を有し得る。
【００９２】
Ｂ．ＩＦＮ−α類似体タンパク質：融合又はハイブリッドタンパク質
別の実施形態では、親水性ポリマーで化学修飾されたＩＦＮαタンパク質は、ＩＦＮαタンパク質及びＩＦＮτタンパク質を含む融合タンパク質である。これから記載するように、ＩＦＮαＤやＩＦＮα２ｂなどのＩＦＮαは、Ｎ末端又はＣ末端で、ＩＦＮτに由来するアミノ酸残基の任意の長さの連続したセグメントを用いて修飾することができる。いくつかの例示的な実施形態を記載するが、これらが単に例示的なものに過ぎないことが理解され、他の融合又はハイブリッドタンパク質が当業者には明らかとなるであろう。融合及びハイブリッドという用語は、本明細書において、第１のタンパク質のセグメントと第２のタンパク質のセグメントを結合する概念を意図するように使用される。これらのハイブリッド又は融合タンパク質は、ＩＦＮ−α類似体タンパク質のより一般的な用語の範囲に入っている。
【００９３】
インターフェロンタウタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を含む第１のセグメント、及びタウでないインターフェロンＩ型ポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列を含む第２のセグメントを含む融合タンパク質が意図される。ほぼ残基８〜３７間の成熟インターフェロンポリペプチドの領域中で２つのセグメントを結合する。別の一般的な実施形態では、ほぼ残基８〜２８間の成熟インターフェロンポリペプチドの部分と対応する領域中で２つのセグメントをスプライスする。なお別の一般的な実施形態では、ほぼ残基８〜２２間の成熟インターフェロンポリペプチドの部分と対応する領域中で２つのセグメントをスプライスする。いっそう別の一般的な実施形態では、ほぼ残基８〜１６間の成熟インターフェロンポリペプチドの部分と対応する領域中で２つのセグメントをスプライスする。
【００９４】
参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９３９，２８６号に記載のように、ＩＦＮτのＮ末端領域は、ＩＦＮτに低毒性を付与し、したがって、ＩＦＮτのＮ末端領域は、融合又はハイブリッドタンパク質での使用に特に魅力的である。図３を参照すると、キメラ核酸分子によってコードされるそのようなハイブリッドインターフェロン融合タンパク質又はポリペプチド４０は、Ｎ末端４２及びＣ末端４４を有する。融合タンパク質は、第１の（Ｎ末端）セグメント４６及び第２の（Ｃ末端）セグメント４８で構成される。Ｎ末端セグメントは、キメラ核酸分子の５’末端セグメントによってコードされるインターフェロンタウポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を含む。Ｃ末端セグメントは、キメラ核酸分子の３’末端セグメントによってコードされる、タウでないインターフェロンＩ型ポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列及びインターフェロンタウポリペプチドのアミノ酸配列を含む。アミノ酸残基ほぼ８〜３７間の成熟インターフェロンポリペプチドの部分と対応する領域（結合領域）中にある結合点５０で２つのセグメントを結合又はスプライスする。成熟ＩＦＮτポリペプチドが通常、（リーダー配列を含み、メチオニンから開始する）完全配列のアミノ酸２４にあるシステインから開始することに留意されたい。
【００９５】
結合領域は通常、ＩＦＮτの３７アミノ酸のＮ末端ペプチド（配列番号４５及び配列番号４６）中に含まれる。アミノ酸１〜３７間のいくつかのＩＦＮτ、ＩＦＮα、及びＩＦＮβクローンの成熟アミノ酸配列のアラインメントから、配列間の最大の発散がＮ末端の近くで生じることが明らかとなった。具体的には、配列間の最高度の発散がアミノ酸１〜１６間で生じ、中程度の発散がアミノ酸１７〜２８間で生じる。アミノ酸２９〜３７間の領域は、異なるＩ型インターフェロン間で比較的よく保存されている。最適な結合部、すなわち（Ｎ末端又は５’末端に向かって）その上流で配列がＩＦＮτと対応し、（Ｃ末端又は３’末端に向かって）その下流でそれが他のインターフェロン、例えばＩＦＮα又はＩＦＮβと対応するアミノ酸残基の位置は、例えば、ＩＦＮτ（１〜３７）内の長い領域及び短い領域と対応するペプチド又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して、（抗ウイルス、抗増殖及び細胞毒性アッセイなどの）当技術分野で知られている機能アッセイと組み合わせて同定することができる。例えば、ＩＦＮτのアミノ酸１〜２８、及びタウでないＩ型インターフェロン由来の残りのアミノ酸を含むハイブリッド又はキメラインターフェロンが、正常ではそのようなＩ型インターフェロンに起因して伴う生物学的活性と一緒に、インターフェロンタウに伴う低毒性を有することが意図される。例えば、ＩＦＮτ／ＩＦＮα融合ハイブリッドは、例えば、ＩＦＮαの毒性を低下させるが、ＩＦＮαの抗ウイルス特性に干渉しない可能性がある。
【００９６】
それからインターフェロン融合タンパク質の最初の８〜３７アミノ酸を選択することができる例示的な配列には、ＩＦＮτ由来の下記の連続したセグメントと対応する配列がある：１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５、及び１〜３６、並びに１〜３７。これらの連続したセグメントを、例えば、保存的アミノ酸置換で修飾することができ、それが依然として本明細書で意図される融合タンパク質の範囲に入ることが理解されるであろう。
【００９７】
残りの配列（すなわち、キメラ核酸分子の３’末端セグメントによってコードされる「第２の」Ｃ末端セグメントのアミノ酸配列）は、インターフェロンアルファ（例えば、アルファ−１又はアルファ−２）、インターフェロンベータ、インターフェロンオメガ、ハイブリッドインターフェロンやコンセンサスインターフェロンなどのタウでない任意の適切なＩ型ポリペプチドから選択することができる。タウでないＩ型インターフェロンの配列は当技術分野で知られている。コンセンサスインターフェロンの例示的な配列も知られている（米国特許第４，８９７，４７１号）。例示的なＩＦＮα配列は、欧州特許第８８６２２号、米国特許第４，８２０，６３８号、米国特許第４，７８０，５３０号、及び米国特許第４，７４８，２３３号で提示されている。さらなるインターフェロンアルファ及びベータの配列は、Ｆｉｓｈ，Ｅ．Ｎ．、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１２：２５７〜２６６（１９９２）で提供されている。適切な配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋ又は他の公的な配列保管場所からも得ることができる。
【００９８】
それから３’末端又はＣ末端セグメントが開始するタウでないＩ型インターフェロンのアミノ酸残基の位置の決定は、親配列を最適に整列し、得られたキメラインターフェロン分子の配列が、（ｉ）５’末端又はＮ末端セグメント中のインターフェロンタウ親配列、及び（ｉｉ）３’末端又はＣ末端セグメント中のタウでないＩ型インターフェロン親配列と完全に整列するような結合部を設計することによって行うことができる。親配列とは、もちろん、５’末端又はＮ末端セグメント及び３’末端又はＣ末端セグメントが由来するインターフェロンの配列である。
【００９９】
それから３’末端又はＣ末端セグメントが開始するタウでないＩ型インターフェロン中の残基の位置は通常、５’末端又はＮ末端ＩＦＮ−タウセグメントの最後のアミノ酸残基に続く番号となる。例えば、最初の１０アミノ酸が配列番号２６の最初の１０アミノ酸の配列を有するハイブリッドインターフェロン融合タンパク質では、残りのアミノ酸が、インターフェロンアルファの最初の１０アミノ酸を引いた成熟インターフェロンアルファ（例えば、Ｆｉｓｈ、同上に記載のＩＦＮ−αＣｏｎ１）の配列を有してよい。他の例では、最初の２８アミノ酸が、配列番号４４として特定されるＩＦＮτの最初の２８アミノ酸の配列を有し、残りのアミノ酸が、ＩＦＮαＤ（配列番号９）などの天然の成熟インターフェロンの配列を有する。
【０１００】
記載したインターフェロン融合タンパク質が「成熟」タンパク質であり、すなわち、完全なインターフェロン配列の残基２４から開始するが、本発明がまた、リーダー配列を含む、すなわち開始メチオニンから開始する融合タンパク質及び融合タンパク質をコードするキメラ核酸分子をも含むことが理解されるであろう。そのようなインターフェロン融合タンパク質中のリーダー配列は、タウ又はタウでないＩ型インターフェロンに由来し得る。
【０１０１】
さらに、第１の断片と第２の断片の両方の配列が、「コンセンサス」配列である可能性があることが理解されるであろう。言い換えると、５’セグメントの配列は、「自然の」ＩＦＮτと対応せず、いくつかの異なるＩＦＮτ由来の整列させた配列を比較することによって得られたコンセンサス配列と対応する可能性がある。同様に、３’セグメントの配列は、タウでない「自然の」Ｉ型ＩＦＮと対応せず、いくつかの異なるタウでないＩ型ＩＦＮ由来の整列させた配列を比較することによって得られたコンセンサス配列と対応する可能性がある。
【０１０２】
或いは、どちらかの断片の配列が、「内部一致」配列、すなわち、配列中の各位置がその位置で（Ｎ末端セグメントについて）ＩＦＮτ又は（Ｃ末端セグメントについて）タウでないＩ型ＩＦＮの天然に存在する少なくとも１つのアイソフォーム中で認められる残基を含むが、最終的な配列が、天然に存在するアイソフォームともコンセンサス配列とも対応しない配列と対応する可能性もある。例えば、長さが各３アミノ酸である２つのアイソフォームが「Ｃ  Ｒ  Ｓ」及び「Ｃ  Ｋ  Ｇ」の配列を有する場合、内部一致配列は「Ｃ  Ｒ  Ｇ」となる。
【０１０３】
さらに、複合キメラ、例えば、ＩＦＮτに由来する複数の別個の領域及び／又は他の適切なインターフェロン由来の複数の領域を含むキメラが意図されることが理解されるであろう。そのようなキメラは、例えば、第２の（Ｃ末端）セグメントを含むタウでないＩ型インターフェロンがそれ自体、例えば、アルファインターフェロン及びベータインターフェロン（米国特許第４，７５８，４２８号）、アルファ−１及びアルファ−２インターフェロン（米国特許第４，８９２，７４３号）又はアルファインターフェロン及びオメガインターフェロン（米国特許第４，９１７，８８７号）から形成されるハイブリッドインターフェロンである場合に生じる可能性がある。
【０１０４】
キメラ核酸分子は、合成により作製することもでき、或いは標準的な分子的プロトコール及び操作で作製することもできる。親ポリペプチド（ハイブリッドタンパク質を形成する２つのセグメントがその配列に由来する２つのポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を、標準的な組換え方法を使用して（例えば、翻訳されたアミノ酸配列を変化させない制限部位をＤＮＡ配列中に工学的に作製し、プラスミドを消化し、選択した発現ベクター中に適当な断片をクローン化することにより）発現ベクター中で互いに隣接させてクローン化する。
【０１０５】
別の実施形態では、インターフェロン−τに由来するＣ末端領域、及び他のインターフェロンに由来する領域からなるハイブリッドインターフェロンタンパク質が、親水性ポリマーでの化学修飾用のタンパク質としての使用に意図される。参照により本明細書に組み込まれている米国公報第２００３／０１３０４８６号に記載のように、そのようなハイブリッドタンパク質は、ＩＦＮτのＣ末端領域、及びＩＦＮ−βやＩＦＮ−αの種々のアイソフォームなどのタウでないインターフェロンＩ型ポリペプチドに由来するＮ末端部分を有する。例示的なタンパク質は、本明細書において配列番号４７として特定される。そのようなタンパク質は、キメラ核酸分子によってコードされ得又は天然の化学的連結を介して作製することができ、ＩＦＮ−αＤの１アミノ酸位〜１６３アミノ酸位を含むＮ末端、及びＩＦＮ−τの１６３アミノ酸位〜１７２アミノ酸位を含むＣ末端を有する。Ｎ末端セグメントは、キメラ核酸分子の５’末端セグメントによってコードされ得るτでないインターフェロンポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を含む。Ｃ末端セグメントは、キメラ核酸分子の３’末端セグメントによってコードされ得るＩＦＮ−τポリペプチドのＣ末端アミノ酸配列を含む。
【０１０６】
最適な結合部、又はその上流で配列がτでないインターフェロンと対応しその下流でＩＦＮ−τと対応するアミノ酸残基の位置は、ＩＦＮ−τ（１６３〜１７２）内又はそれを越えて伸長している長い領域及び短い領域と対応するペプチド又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して、抗ウイルスアッセイや毒性アッセイなどの機能アッセイと組み合わせて、既知の方法により同定することができる。ヒトＩＦＮ−αＤのアミノ酸１〜１６６及びＩＦＮ−τのＣ末端の最後の１０アミノ酸を含むハイブリッド又はキメラインターフェロンは、ＩＦＮ−αに伴い、又は正常ではそれに起因する生物学的活性と一緒に、インターフェロンタウに伴う低毒性を有する。ＩＦＮ−α／ＩＦＮ−τハイブリッドは、例えば、ＩＦＮ−αの毒性を低下させるが、ＩＦＮ−αの抗ウイルス特性に干渉せず、又はそれを増大させる可能性もある。好ましい融合タンパク質の１つでは、Ｎ末端セグメントの配列がヒトＩＦＮ−αＤに由来し、Ｃ末端セグメントがヒツジＩＦＮ−τに由来する。
【０１０７】
ＩＩＩ．親水性ポリマーで修飾する方法
この節では、上記に記載のタンパク質を親水性ポリマー化合物で修飾するための様々な合成反応スキームについて説明する。単純にするために、この節において「ＩＦＮα類似体タンパク質」又は「類似体タンパク質」という用語は、ある特定の残基置換を有するＩＦＮα類似体や、他のタンパク質の特定の残基を置換し、又はそのタンパク質と結合した一タンパク質の連続したセグメント又はカセットを有する例示的な融合又はハイブリッドタンパク質など、上記の第ＩＩ節で記載した任意のＩＦＮ−α類似体タンパク質を意味する。
【０１０８】
本明細書に記載の類似体タンパク質は、その類似体タンパク質と合成又は天然に存在するポリマー、オリゴマー、小分子又は官能基を結合することによって修飾することができ、それによって天然に存在しない組合せが生じる。構成成分の結合は、静電気的結合やファンデルワールス力などの非共有結合的手段によるものでよいが、有利には、構成成分間の共有結合によってなされる。共有結合は、当業者には容易に理解されるであろうが、より操作し易く、共有結合が強いために解離させずに様々な化学的環境中で使用される複合体を有する利点をもたらす。１つ又は複数の他の分子でのタンパク質の共有結合的修飾は一般に「結合」と呼ばれ、その結合産物は「修飾タンパク質」と呼ばれる。
【０１０９】
類似体タンパク質に対する修飾は、類似体タンパク質中に存在する任意の１つ又は複数の官能基で行うことができる。多数の官能基がＩＦＮα類似体タンパク質の外側で露出し、これらの基は、当技術分野で知られている方法によって、容易に官能化し、又は官能化することができる基に転換することができる。修飾の数及び性質は、類似体タンパク質の特定の特性及び構造、並びに結合産物中で所望される効果の型によって決まる。また、実質的に同質の産物が所望される場合、部位選択的修飾が有利であり、それにより、使用する反応の化学的性質の型並びに結合部位となる類似体タンパク質の官能基の選択が大部分決定される。選択的結合に特に都合のよい２つの部位は、類似体タンパク質のＮ末端及びＣ末端である。これら２つのうち、Ｎ末端は一般により容易に部位選択的修飾されるが、それは、カルボン酸を有するアミノ酸側鎖が、容易に調節される反応条件下でＣ末端のカルボキシル基とおおよそ同じ化学反応性を有するが、リシン残基のアミノ基は、Ｎ末端のアミノ基が活性である条件下では反応しないからである。システインのスルフヒドリル基やスレオニンのヒドロキシル基などの存在する他の官能基も、結合反応の部位をもたらす。
【０１１０】
タンパク質の三次元構造を示す結晶構造によって援助されるタンパク質のアミノ酸配列の知識から、どの部位がタンパク質の表面上での結合に利用可能であるかが決定される。本明細書に記載のＩＦＮα類似体タンパク質に関しては、ＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎらによりＩＦＮτの結晶構造が公開され、ＩＦＮαの構造と比較された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８６：１５１〜１６２（１９９９））。天然タンパク質の結晶構造を使用して、ＩＦＮα類似体タンパク質の部位特異的修飾を導くことができる。
【０１１１】
親水性ポリマーは、修飾ＩＦＮα類似体タンパク質の調製での使用に特に有利である。親水性ポリマーは、血液や血清などの水性の系中における結合体の溶解性を維持し、治療用途における使用に適する。類似体タンパク質との結合に適したポリマー分子には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などの一般的な誘導体、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアルコール、ポリプロピレングリコール、ポリアミン酸、ポリビニルピロリドン、デキストラン、ポリサッカリド、セルロース及びカルボキシメチルやカルボキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにデンプン及びデンプン誘導体がある。化学的に活性化され保護された形態で入手しやすいだけでなく、各種の分子量のものを入手しやすいことから、好ましい分子の１つはＰＥＧである。
【０１１２】
ＰＥＧは、インターフェロンタンパク質を含めたタンパク質の結合において何度も使用されている。開示には米国特許第５，７１１，９４４号及び米国特許第５，２８１，６９８号があり、それらは参照により本明細書に組み込まれている。インターフェロンベータ結合体は、米国特許第６，８００，７３５号及び米国特許第６，５３１，１２２号で開示され、それらは参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１３】
ポリマーの分子量は、１００〜５００，０００ダルトンの範囲となることが意図されている。より好ましくは、ポリマーの分子量は、約１０，０００〜５０，０００ダルトンである。使用される分子量は、結合体当たりのポリマーの数、結合体の所望される水力学的半径、並びに結合したポリマーによる立体干渉に対するタンパク質活性部位の感受性の関数である。
【０１１４】
多分散も、結合体用のポリマーを選択する際のファクターである。多分散が狭いと、ポリマーのサイズ及び分子量が比較的狭いことが示唆される。狭い分布域を使用すると、より均一且つ同質な結合産物となる。
【０１１５】
直鎖状又は分枝状ポリマーを使用することが意図される。分枝状ポリマーは、結合体の立体的なかさ及びサイズを大きくしつつ、必要とするタンパク質上の結合部位が少ない利点をもたらす。
【０１１６】
部位選択的結合反応も意図される。例示的な部位の１つは、タンパク質のＮ末端修飾である。還元アルキル化条件下でＰＥＧを使用する結合反応は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９８５，２６５号で示されている。この方法では、１つのポリマーが各タンパク質と結合する。ここでまた、分枝状ＰＥＧ化合物又は他の親水性ポリマーの使用も意図される。
【０１１７】
結合用の様々な化学的性質が、ＰＥＧ及びＰＥＧ様誘導体とタンパク質の結合に使用されている。下記の方法は例示的なものであり、どんな形であってもそれに限定されない。Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５：１００〜１１４（１９９２））により教示されているものや、タンパク質のＮ末端に対するＰＥＧ分子の還元アルキル化について開示する米国特許第５，９８５，２６５号で教示されているものなどの他の方法に使用を見出すことができる。米国特許第６，６３８，５００号では、チオール選択的反応によって、二硫化オルトピリジルを活性化剤として使用してポリマーがタンパク質のシステイン部分に付加された結合体を作製した。他の例では、米国特許第５，３６２，８５２号において、２−ヒドロキシエチルアミン部分を酸化してアルデヒド基を生成することによってタンパク質中にｉｎ  ｓｉｔｕで官能基を生成し、次いでそれをヒドラジンと反応させて結合体を作製した。
【０１１８】
活性化ＰＥＧ及びＰＥＧ様誘導体、並びにそのような誘導体との反応に利用可能な官能基を有するタンパク質を調製する他の方法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載のＩＦＮα類似体タンパク質の修飾で意図される。そのような他の方法には、米国特許出願第２００５／００１４２４０号及び第２００４／００６２７４６号；ＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０６０３００及びＷＯ２００４／０６０２９９；並びに米国特許第６，７８３，９６５号で示されているものがあり、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１９】
行われた研究では、本明細書においてＩＦＮα２ｂ類似体（配列番号４８）と呼ばれるＩＦＮα類似体タンパク質が、実施例１Ｃに記載の手順による例示的な親水性ポリマーである分枝状ポリ（エチレングリコール）で修飾された。実施例２〜７に記載のように、例示的なＰＥＧ−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７類似体タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで特徴付けられた。
【０１２０】
ＩＶ．使用方法
本明細書に記載の修飾ＩＦＮ−αタンパク質類似体には、ＩＦＮα又はＩＦＮτでの治療に対する任意の状態の応答を治療する際の使用が見出される。これには、それだけに限らないが、ウイルス感染症、細胞増殖を特徴とする障害、炎症状態、及び自己免疫障害から選択される状態がある。
【０１２１】
好ましい実施形態では、修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、又はＣ型肝炎を含めた肝炎感染症などのウイルス感染症の治療に使用する。他の好ましい実施形態では、修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、ヒト乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルスやヒト免疫不全ウイルスなどのさらなるウイルス感染症の治療に使用する。実施例８及び９では、ＰＥＧ−修飾ＩＦＮα類似体タンパク質であるＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７を使用して、ウイルス感染症に冒されている対象を治療する研究について記載した。
【０１２２】
好ましい実施形態では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、ヒト対象におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症の治療に使用する。肝不全につながる肝硬変、及び肝細胞癌へのリスクの増加は、ＨＣＶ感染症に伴う重大な病的状態である。慢性Ｃ型肝炎から肝硬変への進行を予測するファクターには、高レベルのウイルス血症、性別が男性であること、年齢が感染時に４０歳を超えていること、ＨＩＶ１又はＨＢＶとの同時感染、高いアルコール消費、及び関係するウイルスの遺伝子型がある。ＨＣＶは、多数のサブタイプを伴う６つの遺伝子型に分けられ、一実施形態では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質は、遺伝子型２又は遺伝子型３による感染症の治療に意図される。したがって、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体をＨＣＶ患者に投与して、ウイルス感染症を治療し、又は肝不全の進行を軽減する治療方法が意図される。
【０１２３】
別の実施形態では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を投与して、持続的なウイルス応答及びＨＣＶの根絶のために類似体タンパク質への連続的な曝露を実現する。最初の１２〜２４週間の治療の間におけるウイルス量の最低２−ｌｏｇの低下と定義される初期ウイルス応答は、応答の良好な予測因子であることが確認されている。ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質での治療に応答性のある、ＨＣＶ感染症に罹患者は、肝臓酵素の低下、又はＨＣＶウイルス量の少なくとも２−ｌｏｇの低下を示すことにより、投与の最初の１２週間で治療に応答する者として特定することができる。例えば、治療開始後約２週間以内に＞１．３９ｌｏｇ１０の低下となるウイルス血症応答を示すＨＣＶ対象は、治療に応答性がある。
【０１２４】
ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質はまた、固形癌など細胞増殖と関係する障害を治療する際の使用にも意図される。別の実施形態では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、多発性硬化症、乾癬、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群などの自己免疫状態の治療に使用する。
【０１２５】
ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、薬剤として有用な組成物を調製する既知の方法に従って製剤することができる。インターフェロン又はインターフェロン様化合物を含む製剤は以前に記載されている（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．、ＤＩＳＰＥＮＳＩＮＧ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＡＴＩＯＮ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＤＩＳＰＥＮＳＩＮＧ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊ．Ｅ．編）、第８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ（１９７６））。一般に、組成物の有効な投与を促進するために、有効量の修飾インターフェロンアルファ類似体が適切な担体と混合されるように組成物を製剤する。
【０１２６】
これらの治療で使用する組成物はまた、様々な形態のものでもよいが、好ましくは、注射可能な又は注入可能な溶液などの非経口投与に適した形態でよい。非経口投与に適した医薬組成物には、適切な緩衝液、例えばトリス−ＨＣｌ、リン酸水素ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝液などの酢酸塩又はリン酸塩、並びに場合によっては製剤上許容される添加剤、例えばスクロース、担体、例えばヒト組換え血漿アルブミン、等張化剤、例えばＮａＣｌ、保存剤、例えばチメロサール、クレゾール又はベニルアルコール、及び界面活性剤、例えば注射用滅菌水中のｔｗｅｅｎ又はポリソルベートを伴うポリマー修飾ＩＦＮαタンパク質類似体の製剤がある。ポリマー修飾ＩＦＮαタンパク質類似体は、凍結乾燥粉末として冷蔵して貯蔵し、使用前に再調製することができる。或いは、ポリマー修飾ＩＦＮαタンパク質類似体を含む水溶液は、インスリンなどの薬剤の送達に有用なものなどの充填済み多回投与用シリンジ中で貯蔵することもできる。典型的な、適切なシリンジには、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋから入手可能なＮｏｖｏｌｅｔ（登録商標）Ｎｏｖｏ  Ｐｅｎなどのペン型シリンジに取り付けた充填済みバイアルを含む系、並びに使用者による簡単な自己注射を可能にする充填済みペン型シリンジがある。他のシリンジの系には、別々の区画中に希釈剤及び凍結乾燥させたポリマー修飾ＩＦＮαタンパク質類似体粉末を含むガラスカートリッジを含むペン型シリンジがある。
【０１２７】
修飾タンパク質の適切な投与量は、成熟ＩＦＮ−αで知られている治療的投与量に基づいて、熟練した医療提供者によって容易に決定することができる。本明細書に記載のＩＦＮα類似体は細胞毒性の低下をもたらすので、成熟ＩＦＮ−αで投与される量より高い投与量が意図される。一実施形態では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質の非経口投与量は、ＰＥＧ  Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）やＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）など現在承認されているｐｅｇ化インターフェロンで推奨されるヒト投与量より少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらにより好ましくは５倍高い。例えば、Ｃ型肝炎の治療で、現在投与されているＰＥＧ−修飾ＩＦＮαの投与量は毎週１８０μｇであり、毎週３６０μｇ、又は毎週５４０μｇ、好ましくは毎週７２０μｇ、又はそれ以上の本明細書に記載のポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質の投与量が意図される。好ましい実施形態では、投与量９００μｇのポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を毎週又は隔週で投与して、現在承認されている治療薬であるＰＥＧ−修飾ＩＦＮαタンパク質で認められるものより、患者において持続的なウイルス応答を発生させる効果を高くし、毒性を低くし、忍容性を良好にする。大きな投与量を、小さい投与量より少ない回数で投与できることが理解されるであろう。他の実施形態では、毎週又は隔週で投与する少なくとも約２００μｇ又は４５０μｇの投与量が意図される。
【０１２８】
一実施形態では、タンパク質類似体の実質的に安定した状態の血漿濃度の達成に十分な投与量及び回数で、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を患者に投与する。この実施形態では、安定した状態の血漿濃度は、肝細胞に対して実質的な細胞毒性効果を有さず、それは、例えば、実施例５に記載の試験と同様に、選択された濃度のポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質とともに選択された期間肝細胞を培養し、毒性を示すものとして肝細胞の代謝を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から明らかである。
【０１２９】
もちろん、本明細書に記載の組成物を、他の治療薬と組み合わせて使用できることを理解されたい。例えば、慢性肝炎ウイルス感染の治療では、ポリマー修飾ＩＦＮα類似体タンパク質を、合成ヌクレオシドＲｉｂａｖｉｒｉｎと組み合わせて投与することができる。他の組合せは、医療分野の技術者には明らかであろう。
【実施例】
【０１３０】
下記の実施例は事実上例示的なものであり、限定的なものでは全くない。
【０１３１】
（実施例１）
ＩＦＮα類似体及びＰｅｇ化ＩＦＮα−Ｎ７の合成
Ａ．天然ヒトＩＦＮαＤに基づいたＩＦＮαタンパク質類似体の調製
ＨｕＩＦＮα−ＮＬＶと称するヒトＩＦＮαタンパク質類似体をコードする合成遺伝子を、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）用にコドン使用を最適化した、最初の２７個のＮ末端位置内に１５個のインターフェロンタウ（ＩＦＮτ）のアミノ酸置換を含むＨｕＩＦＮαのアミノ酸配列を最初に逆翻訳することによって構築した。構築物の長さ全体にわたって間隔のあいた５つの制限部位を含むようにヌクレオチド配列を編集した。合成遺伝子配列を４つのヌクレオチド断片に分割した。それぞれ長さが約１５０塩基対の個々の断片は、オリゴヌクレオチドを順次連結することによって構築した。Ｇ２細菌ベクター（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ）中に断片を順次クローン化して、ＨｕＩＦＮα−Ｎ０をコードする遺伝子を得た（図１を参照）。次いで合成遺伝子を細菌ベクターから切り出し、メタノール資化酵母中での発現用のｐＰＩＣＺ−αベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位中にそれを連結した。この発現ベクター構築物はｐＮＬＶと呼ばれ、それを図２に示す。
【０１３２】
図１に示し、ＨｕＩＦＮα−Ｎ１、ＨｕＩＦＮα−Ｎ２、ＨｕＩＦＮα−Ｎ３、ＨｕＩＦＮα−Ｎ６、及びＨｕＩＦＮα−Ｎ７として特定される類似体をコードする合成遺伝子も、オリゴヌクレオチドを順次連結することによって構築した。上記に記載のｐＮＬＶ構築物をＸｂａＩ及びＢｓｔＥＩＩで消化し、アニールオリゴヌクレオチドのリンカー１（配列番号２８）及びリンカー２（配列番号２９）をこれらの部位に連結して、中間ベクター構築物を作製した。このステップでは、ＨｕＩＦＮα−Ｎ０のＮ末端セクションと対応するヌクレオチド配列を除去した。ＩＦＮα−Ｎ１、ＩＦＮα−Ｎ２、ＩＦＮα−Ｎ３、ＩＦＮα−Ｎ６及びＩＦＮα−Ｎ７のＮ末端配列突然変異をコードするヌクレオチド断片を、オリゴヌクレオチドを順次連結することによって調製した。中間ベクター構築物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次いでヌクレオチド断片を中間構築物のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位中に連結して、ｐＰＩＣＺ−αベクター中で類似体ＨｕＩＦＮα−Ｎ１、ＨｕＩＦＮα−Ｎ２、ＨｕＩＦＮα−Ｎ３、ＨｕＩＦＮα−Ｎ６、及びＨｕＩＦＮα−Ｎ７を作製した。各断片の順方向鎖及び逆方向鎖のヌクレオチド配列を、配列番号３０〜４３で示す。
【０１３３】
組換えインターフェロン類似体の発現では、各遺伝子のコード配列を、ｐＰＩＣＺ−α発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）中に、ベクター上のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して挿入した。ｐＰＩＣＺ−α発現ベクターは、組換えインターフェロンの発現及び精製を促進する種々のエレメントを提供する。例えば、ベクターは、メタノール制御性アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターを含む発現カセットを含む。メタノールで増殖する酵母細胞では、約５％のポリＡ＋ＲＮＡがＡＯＸ１遺伝子由来である。さらに、ベクターはまた、培地中へのタンパク質の分泌を誘導する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子プレプロペプチド由来の分泌シグナル配列をも含む。そのベクターはまた、Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子（ストレプトアロテイクスヒンダスタヌスｂｌｅ遺伝子）によってコードされるＺｅｏｃｉｎ抗生物質を使用した組換え細菌及び酵母細胞の選択をも提供する。
【０１３４】
ＨｕＩＦＮα類似体をコードする組換えプラスミドを、大規模増殖用のＸ−３３野生型メタノール資化酵母株中にエレクトロポレーションで入れた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるプロトコールに従って、組換え酵母コロニーを増殖させ誘導した。上清を収集し、０．８／０．２ｍｍ孔サイズのアクロディスク（ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルター（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）を使用して濾過した。これらの上清を濃縮し、緩衝液を１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと交換し、それをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）で最終体積２ｍＬまで濃縮した後、４℃でＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ２６／６０  Ｓ−１００  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎサイズ排除カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｅａｐａｃｋ）上にそれを添加した。大部分のＨｕＩＦＮα類似体タンパク質は、分画３に入っていた。
【０１３５】
Ｂ．ＨｕＩＦＮα２ｂに基づいた類似体の調製
同様の手法を使用して遺伝子及び発現ベクターを生成して、天然ヒトＩＦＮα２ｂタンパク質であるＨｕＩＦＮα２ｂに基づいて類似体を作製した。簡潔に述べると、ＮＬＶｇα２ｂで示す類似体ｒＨｕＩＦＮα２ｂをコードする遺伝子を、メタノール資化酵母用にコドン使用を最適化した、残基１９、２０、２２、２４、及び２７での所望のＩＦＮα置換を含むＨｕＩＦＮα２ｂのアミノ酸配列を最初に逆翻訳することによって構築した。オリゴヌクレオチドを合成して、順次連結することにより、長さが約１５０塩基対の４つのヌクレオチド断片を生成した。Ｇ２細菌ベクター（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ）中に断片を順次クローン化して、遺伝子ＮＬＶｇα２ｂを得た。他のヒトＩＦＮα類似体で使用した同じ方法を使用して（実施例１Ａ）遺伝子を発現させそれを精製した。ＩＦＮα２ｂ類似体の配列は、配列番号４７によって特定され、本明細書においてＩＦＮα２ｂ−Ｎ７と呼ばれる。
【０１３６】
Ｃ．ポリ（エチレングリコール）での類似体の修飾
実施例１Ｂに記載のように調製した、本明細書においてＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）として特定される類似体を、４０ｋＤａの分枝状メトキシポリエチレングリコール部分と、Ｎ末端のシステインで、類似体とｍＰＥＧ２−ブチルアルデヒド（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ）の間の還元的アミノ化により結合した。
【０１３７】
（実施例２）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性
Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞系及び誘発ウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に基づくアッセイを使用して、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）及びＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（ＰＥＧで修飾した配列番号４８、実施例１Ｃに記載のように調製）の抗ウイルス活性（単位／ｍＬ）を決定し、ＩＦＮα−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標））、及び商標名Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）によって特定されるｐｅｇ化ＩＦＮα２ａ産物の抗ウイルス活性と比較した。
【０１３８】
インターフェロンの抗ウイルス作用強度を、ＶＳＶに対するＭＤＢＫ細胞でのインターフェロンの保護効果を試験することにより評価した。インターフェロンの希釈物を集密状態のＭＤＢＫ細胞単層に添加し、それを９６穴平底プレート中で増殖させ１８時間インキュベートした後、ウイルスの誘発物を添加した。組換えヒトＩＦＮ−αＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）を、アッセイの標準インターフェロン対照として使用した。各インターフェロン試料の希釈物のアッセイを行って、５０パーセントのＭＤＢＫ細胞がＶＳＶ感染から保護されるポイントを得た。パーセント保護は、下記の式を使用して計算した：
平均（試験穴のＡ４５０〜６３０−平均（ウイルス対照穴のＡ４５０〜６３０））×１００／平均（非処理細胞対照穴のＡ４５０〜６３０）
上式でＡ４５０〜６３０は４５０〜６３０ｎｍでの吸光度である。
【０１３９】
１抗ウイルス単位は、５０％保護と定義する。産物の作用強度単位は、１ミリグラム当たりの単位（Ｕ／ｍｇ）として表される。その結果を表１に示す。ＩＦＮα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標））及びＩＦＮα２ｂ−Ｎ７は同様の抗ウイルス作用強度を示し、比活性約１０９Ｕ／ｍｇである。インターフェロン分子に４０ｋＤａのＰＥＧ部分を付加すると、商標名Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）によって特定されるｐｅｇ化ＩＦＮα産物、及びＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７でみられるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス比活性が１０分の１に低下した。したがって、ＭＤＢＫ／ＶＳＶ抗ウイルスアッセイから、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７が、ｐｅｇ化ＩＦＮα産物Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）と同等の抗ウイルス活性を有することが示される。ｐｅｇ化インターフェロン産物は、非ｐｅｇ化インターフェロンと比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性が低いことが示された。
【０１４０】
【表１】
2008543943.tif 000003
【０１４１】
（実施例３）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖活性
実施例１Ｃに記載のように調製したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を、商標名Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）によって特定されるｐｅｇ化ＩＦＮα産物の抗増殖活性と比較した。主要な新生物の分類を代表する７種のヒト腫瘍細胞系を培養し、それをインターフェロンで処理した。テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の還元によって、細胞増殖の大きさを測定した。インターフェロン処理細胞のＷＳＴ−１還元の程度を非処理対照細胞と比較した。
【０１４２】
その結果を表２に示す。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７とＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）の抗増殖活性は、試験した７種の細胞系中で類似していた。
【０１４３】
【表２】
2008543943.tif 000004
【０１４４】
（実施例４）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性
ＩＦＮα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標））、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）、ＰＥＧ修飾ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、及び商標名Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）インターフェロンによって特定されるｐｅｇ化ＩＦＮα産物（表４．１．２．Ａ）を、ヒトＰＢＭＣにおけるアポトーシスのレベルによって測定される毒性について評価した。志願供与者１７名から収集したバフィーコートからヒトＰＢＭＣを単離した。試験したインターフェロンの濃度は、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）及びＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）で１ｍＬ当たり０．０１μｇ〜１μｇ、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）で１ｍＬ当たり０．０２５μｇ〜９μｇであった。２４穴プレートの穴中で、１穴当たり細胞１．５×１０６個の密度でＰＢＭＣをインターフェロンとともに培養した。培養１２日目に、細胞をアネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによりアポトーシスについてそれを分析した。
【０１４５】
ヒトＰＢＭＣにおけるアポトーシスの誘導によってＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）の相対レベルの毒性を測定し、それを非処理対照と比較し、平均パーセント比細胞死として表した。
【０１４６】
細胞培地１ｍＬ当たり０．０１μｇ〜１．０μｇのインターフェロン濃度でのＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）及びＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）によりＰＢＭＣで誘導された平均パーセント比細胞死を図４に示す。その結果から、試験した最低濃度である１ｍＬ当たり０．０１μｇで４０％の細胞にアポトーシスを誘導したＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）と対照的に、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）は１ｍＬ当たり０．０２５μｇ以下の濃度では明らかな毒性効果を有さないことが示される。１ｍＬ当たり０．０２５μｇでは、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）処理ＰＢＭＣ培養物で毒性は検出されなかったが、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）培養物では平均パーセント細胞死が５３％検出された（ｐ＜０．００１、スチューデントＴ−検定）。ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）は、試験した最高濃度の１ｍＬ当たり１μｇで、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）と比較して平均パーセント比細胞死が５３％対７１％と有意に毒性が低いままであった（ｐ＝０．０１５、スチューデントＴ−検定）。しかし、推奨されている投与量でヒト患者に皮下又は筋内注射した後、Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）の最大血清濃度は約０．１〜１．０ｎｇ／ｍｌである。Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）で推奨されている投与量より５００倍高い投与量でも、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）は、その推奨されている投与量のＩｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）より毒性が依然として低い。
【０１４７】
Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）と比較してＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）の毒性が低いことと一致して、ＰＥＧ修飾ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）は、図４Ｂでみられるように、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）と比較して、アポトーシスの誘導によって測定される有意に低い毒性を示した。１ｍＬ当たり１μｇで、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７は、約０％の平均パーセント比細胞死を示したが、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、対照と比較して３０％の平均比細胞死を示した（ｐ＜０．００１、スチューデントＴ−検定）。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）の最大血清濃度は、その推奨されている投与量で約０．０２５μｇ／ｍｌである。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７は、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）の推奨されている投与量（１８０μｇ／投与）により達する概算血清濃度より最大で１０倍高くても毒性を示さなかった。
【０１４８】
この試験のデータは、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７が、市販されているその同等のインターフェロンであるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）と比較して、アポトーシスの誘導によって測定される有意に低い毒性をもたらすことを明らかに示すものである。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）もＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７も天然インターフェロン分子に結合した４０ｋＤａのＰＥＧ部分を有するので、毒性プロファイルの違いは、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７分子内での５つのアミノ酸変化に由来する。このデータは、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）の推奨されている投与量より５倍高いＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の投与量を支持するものである。
【０１４９】
（実施例５）
ヒト肝細胞におけるＰｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性
肝毒性は、Ｃ型肝炎並びに癌治療でのインターフェロン治療の別の潜在的治療制限的有害副作用である。患者におけるＩＦＮα関連の肝毒性はしばしば投与レベルと関係し、トランスアミナーゼの上昇により検出される。肝細胞におけるＩＦＮα及びＩＦＮα類似体の毒性を評価する試験を行った。
【０１５０】
９６穴プレート形式のマトリゲル中で初代ヒト肝細胞を培養し、肝細胞培養培地１ｍＬ当たり０．０００１μｇ〜１μｇのＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）又はＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）、及び１ｍＬ当たり０．０１０μｇ〜１０μｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７又はＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）でその細胞を処理した。培養７日目に、インターフェロンが媒介する肝細胞毒性のマーカーであるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−１の還元によって細胞代謝の相対的な程度を決定し、それを非処理対照細胞と比較した。
【０１５１】
結果を図５Ａ〜５Ｂに示す。ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で処理した初代ヒト肝細胞は、培養してから７日目において、培地１ｍＬ当たり０．０１μｇ以下では細胞代謝に対して負の効果を示さなかった。これは、培養培地１ｍＬ当たり０．０１μｇの濃度で肝細胞代謝の低下をもたらしたＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）と対照的である（ｐ＝０．０２、スチューデントＴ−検定）。１ｍＬ当たり０．１μｇ及び１μｇのインターフェロン濃度では、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７処理肝細胞は７．３％（＋／−２．１ＳＥＭ）及び１０．９％（＋／−１．８ＳＥＭ）の代謝の低下をそれぞれ示した。これは、１ｍＬ当たり０．１μｇで１８．３％（＋／−２．７１ＳＥＭ）の代謝の低下を示し、１ｍＬ当たり１μｇで２６．５％（＋／−０．７ＳＥＭ）の代謝の低下を示した、肝細胞に対するＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）の有意に大きな負の効果と対照的である。１ｍＬ当たり０．１μｇ及び１μｇで、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）は、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７と比較して肝細胞代謝に対する負の効果が２倍高かった（ｐ＝０．０５、スチューデントＴ−検定）。
【０１５２】
図５Ｂについて、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）で処理した初代ヒト肝細胞は、１ｍＬ当たり最大１μｇでも毒性効果を示さなかった。特に、１ｍＬ当たり０．０１μｇ及び１μｇでどちらのインターフェロンによっても等しく媒介され、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７では１ｍＬ当たり最大１０μｇでも媒介される、肝細胞に対する保護効果があるように思われ、７日目で対照と比較して高い代謝の読み取り値が得られた。しかし、１ｍＬ当たり１μｇを超えると、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、１ｍＬ当たり２．５μｇ（ｐ＜０．００１、スチューデントＴ−検定）及び５μｇ（ｐ＜０．００２、スチューデントＴ−検定）での４０％から１ｍＬ当たり７．５μｇ（ｐ＜１．３×１０−５、スチューデントＴ−検定）及び１０μｇ（ｐ＜１×１０−４、スチューデントＴ−検定）での５０％までの、肝細胞代謝の低下によって測定される有意な毒性を明らかに示した。
【０１５３】
したがって、この試験の結果は、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及びＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の両方が、初代ヒト肝細胞において、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）と比較して有意に低い毒性プロファイルを有することを明らかに示すものである。Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）は、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の１０分の１のレベル（１ｍＬ当たり０．１μｇと比較して１ｍＬ当たり０．０１μｇ）でも肝細胞に負の影響を及ぼしたが、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７は、試験したどの濃度でも肝細胞に対して明らかな有意に負の効果を示さなかった。対照的に、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、１ｍＬ当たり２．５μｇ以上の濃度で肝細胞に対して有意な毒性を示した。
【０１５４】
（実施例６）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態
皮下に（ｓ．ｃ．）１０７Ｕ／Ｋｇを単回投与した後のマウスにおける、実施例１Ｃに記載のように調製したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の血清排出プロファイルを決定した。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の血清排出曲線を、やはり１０７Ｕ／Ｋｇで投与したｐｅｇ化ＩＦＮαａ産物のＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）の排泄曲線と比較して、吸収及び排泄の差を決定した。さらに、複数回の毎週及び隔週注射後のＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の試験終了時血清濃度も決定した。
【０１５５】
滅菌ＰＢＳを使用してＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）を適当な濃度に希釈し、投与日に調製した。各動物の体重を測定し、イソフルランでそれに軽く麻酔をかけ、試験物を１０７Ｕ／Ｋｇでｓ．ｃ．投与した。試験物群当たりに時点当たり２匹のマウスを、所定の時間にＣＯ２窒息により安楽死させた。その直後心臓内出血により血液を簡単に収集した。血液試料を１０，０００で３分間遠心し、血清を収集した。分析まで血清試料を−８０℃で貯蔵した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのＬｉｎｅａｒ  Ｃｕｒｖｉｎｇ  Ｆｉｔｔｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍを使用して、異なる時期での排出速度の概算値を決定した。各線形曲線フィットの傾きを、排出速度の概算値（ｎｇ／ｍＬ／時間）として使用した。
【０１５６】
Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓによって製造されたＨｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＣＡＴ＃  ＢＭＳ２１６）を使用して、すべての血清試料のアッセイを行った。プロトコールを改変して、ＰＥＧ化インターフェロンを分析した。
【０１５７】
結果を図６に示す。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（四角形）の実質的な血清レベルは、早くも投与後１時間に検出可能であった（約１０．２６ｎｇ／ｍＬ）。最大血清濃度には２４時間で到達し（約１０００．００ｎｇ／ｍＬ）、その後インターフェロン濃度は着実に低下した。ｔ＝２４〜７２時間の間の概算排出速度は約１３．８３ｎｇ／ｍＬ／時間であり、７２時間での血清濃度は３３９．３８ｎｇ／ｍＬ（最大血清濃度の約３３．８４％）に低下した。７２〜２１６時間の間に排出速度は２．２７ｎｇ／ｍＬ／時間に低下し、１６８時間（７日）での血清濃度は７９．９８ｎｇ／ｍＬ（最大濃度の約７．９７％）であった。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の実質的な血清レベルは、２６４時間（１１日、約８ｎｇ／ｍｌ）及び３８４時間（１４日、約１ｎｇ／ｍｌ、データは示さず）で依然として測定可能であった。１０７Ｕ／ＫｇでのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の血清排出プロファイルは１０７Ｕ／ＫｇでのＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）（ひし形、図５）と非常に類似していたが、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、その毒性により１０７Ｕ／Ｋｇのヒト相当用量の５分の１であるその推奨されている投与量により到達する最大血清濃度を過ぎて高い血清濃度を維持できなかった。
【０１５８】
（実施例６）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｖｏ抗増殖活性
ヒト腎細胞癌のヌードマウス異種移植モデルを使用して、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）及びＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の抗腫瘍（抗増殖）効果を評価した。抗腫瘍効果を、同様の試験条件下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は２つの市販されているＩＦＮα製品であるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）で処置した異種移植体と比較した。
【０１５９】
雌ヌードマウスの右側腹部に、２００μＬ当たり５×１０６個の腎癌細胞系（ＡＣＨＮ）をｓ．ｃ．で移植した。ＡＣＨＮ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１１）は、悪性の腎腺癌に由来する。異種移植片移植の日に治療を開始した。マウスにＰＢＳ（１０ｍＬ／Ｋｇ）、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、又はＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）（１０６又は１０７Ｕ／Ｋｇ）を１週間に１回投与した。別の組のマウスには、ＰＢＳ（１０ｍＬ／Ｋｇ）、ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）、又はＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）（１０６又は１０７Ｕ／Ｋｇ）を１週間当たり３回投与した。デジタルキャリパーを使用して腫瘍を測定した。各腫瘍について１週間に２回２つの測定を行って、腫瘍の体積及び腫瘍の長円の面積を決定した。異種移植片移植から２８日後にマウスを屠殺した。腫瘍の体積及び面積の測定値の対数正規変換を使用して、データを正規化し、異常値によるデータのひずみを減らした。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、治療効果を比較した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、治療効果の統計的有意性（ｐ≦０．０５）を決定した。ＡＮＯＶＡに続いて、試験物処置の有意性（ｐ≦０．０５）をＰＢＳ処置と比較するスチューデントｔ−検定：不等分散を想定する２標本（Ｔｗｏ−Ｓａｍｐｌｅ  Ａｓｓｕｍｉｎｇ  Ｕｎｅｑｕａｌ  Ｖａｒｉａｎｃｅｓ）を行った。
【０１６０】
結果を図７Ａ〜７Ｂに示す。移植後７日目の群すべてにおける平均腫瘍体積及び面積はそれぞれ約２００ｍｍ３及び３０ｍｍ２であった。腫瘍増殖に対する薬物効果は、移植後７日目の後に明らかとなった。１０７Ｕ／Ｋｇで投与したＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、腫瘍増殖を有意に阻害した。１０６Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及びＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）での処置は、中等度の腫瘍増殖阻害を示したが、統計的に有意ではなかった。１週間当たり３回投与するＩｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）で処置した動物は、移植後１１〜２１日目にいくらかのレベルの腫瘍増殖阻害を示した。しかし、２１日目までに、Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）で処置したマウスは、治療効果の低下を示し、その結果、図７Ａでみられるように、試験の終了時に、ＰＢＳで処置した動物と比較して腫瘍の体積及び面積に有意差が認められなかった。
【０１６１】
マウスでの１０７Ｕ／Ｋｇの投与量は、ヒト相当用量（ＨＥＤ）で８４０μｇ／投与となり、それはＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）で推奨されているヒト投与量（１８０μｇ／投与）の約５倍である。Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）は、その毒作用によりそのような高濃度で投与することができないが、そのような投与量のｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７は、治療を制限する有害事象を伴わない。
【０１６２】
（実施例７）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７のｉｎ  ｖｉｖｏ作用強度
ヒト乳癌のヌードマウス異種移植モデルでＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７の効果を抗腫瘍効果について試験した。毎週及び隔週の薬物投与間隔の比較も、このモデルでＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７について決定した。
【０１６３】
雌ヌードマウスの右側腹部に、２００μＬ当たり５×１０６個の乳管癌細胞系（ＨＣＣ１９５４）をＳＣ移植した。ＨＣＣ１９５４細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３３８）は、リンパ節転移を伴わない初期段階の浸潤性腺管癌に由来する。異種移植片移植後４日目に治療を開始した。試験対象にＰＢＳ（１０ｍＬ／Ｋｇ）、（毎週又は隔週で）１０７Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７又は隔週で１０８Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７を投与した。デジタルキャリパーを使用して腫瘍を測定した。各腫瘍について１週間に２回２つの測定を行って腫瘍の体積を決定した。腫瘍体積測定値の幾何平均を使用して、データを正規化し、異常値によるデータのひずみを減らした。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌの線形回帰曲線適合プログラムを使用して、それぞれの腫瘍増殖曲線の線形増殖速度（傾き）を決定した。台形法を使用して曲線下面積（ＡＵＣ）を決定し、対数正規変換データを使用して統計分析を行い、治療効果を比較した。試験の終了時（異種移植片移植後２８日目）に、試験対象を安楽死させた。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、治療効果の統計的有意性（ｐ≦０．０５）を決定した。ＡＮＯＶＡに続いて、試験物処置の有意性（ｐ≦０．０５）をＰＢＳ処置と比較するスチューデントｔ−検定：不等分散を想定する２標本を行った。
【０１６４】
結果を図８Ａ〜８Ｂに示す。異種移植片移植後７日目の最初の測定で腫瘍体積における薬物治療効果が観察された。ＰＢＳ（ひし形、図８Ａ）、毎週１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（四角形）、隔週で１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（三角形）、及び隔週で１０８Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（円形）についての、最初の測定での平均腫瘍体積は、それぞれ約１４４±１５．００、１２２±１４．００、１０３±７．３３及び１１０±１５．４１ｍｍ３であった。ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７を使用したすべての投与群及び投与間隔で、試験全体を通じて著しい腫瘍増殖阻害が認められた。
【０１６５】
ｔ＝０〜１８日の間で、各腫瘍増殖曲線の傾きによって決定される、毎週１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、隔週で１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及び隔週で１０８Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７での腫瘍増殖速度（それぞれ５．２７、３．６１４及び３．６１４ｍｍ３／日）は、ＰＢＳ対照群（８．６３ｍｍ３／日）よりわずかに遅かった。しかし、ｔ＝１８〜２８日の間で、処置試験対象の腫瘍増殖速度は、ＰＢＳ処置と比較して著しく低下した（毎週１０７Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７：７．３ｍｍ３／日；隔週で１０７Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７：１２．６７ｍｍ３／日；隔週で１０８Ｕ／ＫｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７：７．９１ｍｍ３／日；及びＰＢＳ  ３９．６４ｍｍ３／日）。
【０１６６】
毎週１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、隔週で１０７Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７及び隔週で１０８Ｕ／Ｋｇ投与したＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で処置した試験対象の腫瘍体積のＡＵＣの分析から、ＰＢＳ処置と比較したとき、腫瘍増殖に対して統計的に有意な効果が示された（それぞれ３８．８５、４７．０７及び６１．２７％阻害）。
【０１６７】
（実施例８）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７でのウイルス感染症のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
シリアンゴールデンハムスターは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染に高度に感受性である。したがって、ＥＭＣＶ及びＨＳＶをハムスター誘発試験用に選択して、ＩＦＮαのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ウイルス効果を評価した。
【０１６８】
シリアンゴールデンハムスター（雌；６〜８週齢；体重６５〜７５ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１×１０３ＰＦＵ及び３×１０３ＰＦＵのＥＭＣＶをｉ．ｐ．で（３００μＬ）注射する。ＥＭＣＶを注射する６時間前に、ハムスター１匹当たりに下記の投与量のＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、ｒＨｕＩＦＮα２ｂ、又はＰＥＧ−ＨｕＩＦＮα２ｂをｉ．ｐ．で注射する：１０４Ｕ、１０５Ｕ、１０６Ｕ、及び１０７Ｕ。対照としてＰＢＳをｉ．ｐ．で注射する。５つの各試験群中にはハムスターが５匹いる。
【０１６９】
試験動物の別の群では、シリアンハムスター（雌；体重６５〜７５ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、平均生存期間が５日となる１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌを含むＨＳＶ−２をｉ．ｐ．で３００μＬウイルス接種する。感染に対して−６又は１０時間目に、投与量１０５、１０６、及び１０７単位のＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７、ｒＨｕＩＦＮα２ｂ、又はＰＥＧ−ＨｕＩＦＮα２ｂを単回ｉ．ｐ．投与する。対照としてＰＢＳをｉ．ｐ．で注射する。５つの各試験群中にはハムスターが１０匹いる。
【０１７０】
感染したハムスターの生存期間を、毎日の記録から決定する。処置間での生存期間の差の有意性を、ログランクカイ二乗法によって評価する。
【０１７１】
ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で処置した動物の生存期間は、他の試験動物より長い。
【０１７２】
（実施例９）
Ｐｅｇ化ＩＦＮα−Ｎ７でのＣ型肝炎のｉｎ  ｖｉｖｏ治療
Ｃ型肝炎と診断されたヒト対象２４名を４つの治療群に割付ける。群１の患者は、９０μｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で治療する；群２の患者は、１８０μｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で治療する；群３の患者は、４５０μｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で治療する；群４の患者は、９０μｇのＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７で治療する。示した投与量で患者に週に１回４週間投与する。試験期間中及び治療後４週間の間血液試料を取って、Ｃ型肝炎感染症治療のバイオマーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼを測定する。
【０１７３】
いくつかの例示的な態様及び実施形態を上記で論じてきたが、当業者なら、その特定の改変、置換、追加及びサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、下記に添付する特許請求の範囲及びこの後紹介する特許請求の範囲は、その真の趣旨及び範囲の中に入るそのような改変、置換、追加及びサブコンビネーションをすべて含むと解釈されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】成熟ヒトＩＦＮαＤ、成熟ヒツジＩＦＮτ、及びＩＦＮα−Ｎ０からＩＦＮα−Ｎ７と称する８つのＩＦＮα類似体の最初のＮ末端アミノ酸残基２７個のアラインメントを示す図である。
【図２】ＩＦＮα−Ｎ０からＩＦＮα−Ｎ７と称するＩＦＮα類似体調製用のベクターの図である。各類似体をコードする合成遺伝子を構築し、ｐＰＩＣＺαベクター中に挿入してＮＬＶと呼ばれる発現ベクターを生成し、オリゴヌクレオチドを順次連結することによって各類似体をコードする合成遺伝子を構築し、所望のヌクレオチド変化を含む長さ約１５０塩基対の断片を生成した。次いでそのヌクレオチド断片を構築物のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位中に連結して、ｐＰＩＣＺαベクターバックグラウンドでの異なる類似体を作製した。
【図３】例示的なハイブリッドインターフェロン融合タンパク質の概略図である。
【図４Ａ】示した濃度のＩＦＮα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）、輪郭のみの棒）又はＩＦＮα類似体のＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（点からなる棒）とともに培養したヒト抹消血単核細胞のパーセント比細胞死を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）（点からなる棒）又はＩＦＮα２ａ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、輪郭のみの棒）とともに培養したヒト抹消血単核細胞のパーセント比細胞死を示す棒グラフである。
【図５Ａ】代謝活性の測定前にインターフェロンの存在下で７日間培養した初代ヒト肝細胞に対するＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８、点からなる棒）及びＩＦＮα２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）、輪郭のみの棒）の効果を示す図である。
【図５Ｂ】代謝活性の測定前にインターフェロンの存在下で７日間培養した初代ヒト肝細胞に対するＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（点からなる棒）及びＩＦＮα２ａ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、輪郭のみの棒）の効果を示す図である。
【図６】ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（四角形）又はＩＦＮα２ａ−ＰＥＧ（４０ｋＤａ）（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標）、ひし形）を１０７Ｕ／ｋｇで投与したマウスの、投与後の時間の関数であるｎｇ／ｍＬ単位の血清濃度を示す図である。
【図７Ａ】腎癌細胞を移植し、ＩＦＮαタンパク質類似体のＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）（１０６及び１０７Ｕ／Ｋｇ）又はＩｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）（１０６及び１０７Ｕ／ｋｇ）を１週間当たり３回、移植の日から開始して２８日間投与したヌードマウスの腫瘍体積測定値の曲線下面積を示す図である。
【図７Ｂ】腎癌細胞を移植し、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（配列番号４８）（１０６及び１０７Ｕ／Ｋｇ）又はＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）（１０６及び１０７Ｕ／Ｋｇ）を週に１回、移植の日から開始して２８日間投与したヌードマウスの腫瘍体積測定値の曲線下面積を示す図である。
【図８Ａ】食塩水（ひし形）、毎週１０７Ｕ／ｋｇ投与するＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（四角形）、隔週で１０７Ｕ／ｋｇ投与するＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（三角形）、及び隔週で１０８Ｕ／ｋｇ投与するＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７（円形）で処置した後の、日単位の時間の関数である、ヒト乳癌腫瘍異種移植片を有するマウスのｍｍ３単位の腫瘍体積を示す図である。
【図８Ｂ】初期乳腺管癌細胞（ＨＣＣ１９５４）を移植し、ＰＥＧ（４０ｋＤａ）−ＩＦＮα２ｂ−Ｎ７を隔週で（１０７及び１０８Ｕ／ｋｇ）又は毎週（１０７Ｕ／Ｋｇ）、移植後４日目から開始して２８日間投与した腫瘍体積測定値の曲線下面積を示す棒グラフである。
【図１】
2008543943.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
2008543943000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月13日(2007.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの療法に使用するための、天然ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）アルファタンパク質のタンパク質類似体を含む、組成物であって、
該類似体中のアミノ酸の配列が、１９、２０、２２、２４、及び２７位のうち１つ又は複数の置換によってインターフェロン−αと異なり、ただし１〜２７位の中のアミノ酸残基の大部分が、ＩＦＮ−α残基であって、該タンパク質類似体が、少なくとも１つの親水性ポリマー鎖と共有結合している、
上記組成物。
【請求項２】
前記親水性ポリマー鎖がポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質類似体が、天然ヒトインターフェロンアルファ−ｄのタンパク質類似体である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質類似体が、天然ヒトインターフェロンアルファ−２ｂのタンパク質類似体である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールが分枝状ポリエチレングリコールである、請求項３又は請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質類似体が、配列番号４８として特定される配列を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールが分枝状ポリエチレングリコールである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス感染症を治療する方法であって、
ウイルス感染症に冒されている対象に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物を、前記感染症の治療に有効な量で投与することを含む、
上記方法。
【請求項９】
前記ウイルス感染症が、肝炎ウイルス感染症、ヒト乳頭腫ウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、及びヒト免疫不全ウイルス感染症からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス感染症が、Ｃ型肝炎ウイルス感染症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス感染症が、Ｂ型肝炎ウイルス感染症である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与が、非経口投与することを含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が、タンパク質類似体を少なくともほぼ毎週投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が、タンパク質類似体を毎週少なくとも約２００μｇの投与量で投与することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
増殖障害を治療する方法であって、
増殖障害に冒されている対象に、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物を、前記障害の治療に有効な量で投与することを含む、
上記方法。
【請求項１６】
前記増殖障害が腫瘍又は癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、非経口投与することを含む、請求項１５又は請求項１６に記載の方法。
【国際調査報告】
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