(57)【要約】  本発明は、HMGB1関連病変の予防又は治療のための、微生物により産生される生理学的に活性な物質であるK−252a、及びその塩又は合成及び／又は化学修飾した誘導体の使用に関する。とりわけ、本発明は、再狭窄の予防又は治療のための、K−252aの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HMGB1関連病変の予防又は治療用薬剤の製造のための、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
前記HMGB1関連病変が、HMGB1の非アセチル化型及び／又はアセチル化型と関連する病変、及びHMGB1相同タンパク質の非アセチル化型及び／又はアセチル化型と関連する病変である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記HMGB1相同タンパク質が、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記HMGB1関連病変が、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介される病的状態である、請求項１乃至３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記病的状態が、再狭窄、心臓血管疾患、再かん流傷害、炎症性疾患、自己免疫疾患、産婦人科領域疾患、感染症、アトピー性疾患、腫瘍病変、臓器又は組織移植と関連する疾患、先天性疾患、皮膚病、神経系疾患、悪液質、腎臓病、医原性中毒状態、代謝性及び特発性疾患、眼科疾患、肥満、関節リウマチ、乾癬、メラノーマ、全身性エリテマトーデス、神経変性疾患、敗血症からなる群から選択される、請求項１乃至４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記疾患が、血管形成術の間又は後にもたらされるアテローム性動脈硬化症及び／又は再狭窄を含む、請求項１乃至５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
血管形成術の間又は後の再狭窄における結合組織再生を阻害、遅延、又は減じるための、請求項６記載の使用。
【請求項８】
さらなる薬剤と組み合わされる、請求項１乃至７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記さらなる薬剤が、炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害できる、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記さらなる薬剤が、TNF、IL−1α、IL−1β、IL−Ra、IL−8、MIP−1α、MIF1β、MIP−2、MIF、及びIL−6からなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記さらなる薬剤が、RAGEに対する抗体、RAGE発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又はRAGE若しくは可溶性RAGE（sRAGE）とのHMGB1相互作用の合成小分子アンタゴニストである、請求項８記載の使用。
【請求項１２】
前記さらなる薬剤が、HMGB1のアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項８記載の使用。
【請求項１３】
前記アンタゴニスト又は阻害剤が、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型のアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記さらなる薬剤が、Toll様レセプター（TLR）、特に、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9とHMGB1との相互作用の阻害剤、好ましくは、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、TLR発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又は1000ダルトン未満のサイズを有する合成分子である、請求項８記載の使用。
【請求項１５】
前記さらなる薬剤が、Toll様レセプター、特に、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9の公知の阻害剤、特にTLR発現を阻害できる核酸又は核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、又はRNA干渉分子である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記さらなる薬剤が、トロンボモジュリンのN末端レクチン様ドメイン（D1）である、請求項８記載の使用。
【請求項１７】
いずれのさらなる薬剤も、折れ曲がり構造を有する合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子でない、請求項８記載の使用。
【請求項１８】
前記合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子が、二本鎖ベント又は十字型DNA、PNA、又はDNA／PNAキメラ又はハイブリッドである、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
HMGB1関連病変の治療のための活性成分として、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体の有効量を含み、かつ医薬として許容可能なキャリア、希釈剤、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
前記HMGB1関連病変が、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変、及びHMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変である、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記HMGB1相同タンパク質が、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記活性成分が、請求項８乃至１５のいずれか一項中で定義したとおりのさらなる薬剤と組み合わされる、請求項１９乃至２１のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２３】
診断的適用のための、請求項１９乃至２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
治療への応用のための、請求項１９乃至２２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
結合組織再生を阻害、遅延、又は低減するための、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はホスホキナーゼ阻害剤から選択される、請求項１９乃至２５のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、TrkA、TrkB、TrkC、PKA、PKC、PKG、Rafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、PI3Kγの阻害剤、並びにRon、c−Met、及びSeaレセプターを含むチロシンキナーゼレセプターのサブファミリーの阻害剤から選択される、請求項１９乃至２７のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、公知のキナーゼ阻害剤である、請求項１９乃至２７のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２９】
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体が、医療デバイスの表面上に可逆的に固定されている、請求項１乃至１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項３０】
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体が、医療デバイスの表面上にコーティングされているか、又は医療デバイスの表面に埋め込まれている、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
前記医療デバイスが、手術器具、インプラント、カテーテル、又はステントから選択される、請求項２９又は３０記載の使用。
【請求項３２】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はホスホキナーゼ阻害剤から選択される、請求項１乃至１５及び２９乃至３１のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、TrkA、TrkB、TrkC、PKA、PKC、PKG、Rafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、PI3Kγの阻害剤、並びにRon、c−Met、及びSeaレセプターを含むチロシンキナーゼレセプターのサブファミリーの阻害剤から選択される、請求項１乃至医１５及び２９乃至３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
前記少なくとも1種のキナーゼ阻害剤が、公知のキナーゼ阻害剤である、請求項１乃至１５及び２９乃至３３のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体で可逆的にコーティングされているか、及び／又はこれらが埋め込まれている、医療デバイス。
【請求項３６】
前記医療デバイスが、手術器具、インプラント、カテーテル、又はステントから選択される、請求項３５記載の医療デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HMGB1関連病変の予防又は治療のための、微生物により産生される生理学的に活性な物質であるK−252a、及び／又はキナーゼ阻害剤、及びその塩又は合成及び／又は化学修飾した誘導体の使用に関する。とりわけ、本発明は、再狭窄の予防又は治療のための、K−252a及び／又はキナーゼ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症及び炎症の分野における最近の研究により、その臨床的発症及び進行の根底にある発症機序及び事象の理解が高められている。敗血症の初期段階においては、例えば、細菌内毒素が、炎症性サイトカイン（TNF、IL−1α、及びIL−6）を放出する先天性免疫反応の細胞を刺激する。これらの初期サイトカインは、順々に、既知タンパク質HMGB1として同定された、その後に作用する下流のメディエーターの放出を誘起し、これにより、TNF、IL−1α、IL−1β、IL−1Ra、IL−6、IL−8などのサイトカインのその後の放出により媒介される病的続発症が誘発され、複合（multisystem）病因又は致死性の全身性炎症が導かれる。
【０００３】
HMGB1タンパク質は、高移動度群（HMG）タンパク質ファミリーに属する。HMGタンパク質は、ポリアクリルアミドゲルにおけるその高い電気泳動移動度に起因してそのように呼ばれており、真核生物における単離されたクロマチンと関連する、最も普遍的な非ヒストンタンパク質である。これらのタンパク質は、転写因子又はヒストンとのDNA複合体構造を歪めるか、折れ曲がるか、又は修飾するので、DNAベンディング、ルーピング、フォールディング、及びラッピングにおいて、一般的「構造上の」役割を担う。高移動度群1（HMGB1）タンパク質は、通常、核因子であり、特に、DNAベンディングをもたらし、複数の転写複合体の結合を容易にする転写制御分子である。
【０００４】
細胞外に放出されたHMGB1は、強力なサイトカインとして作用し、非常に強力なマクロファージ刺激因子として作用する。HMGB1は、シグナリング及び走化性を誘起する細胞膜と結合することにより直接作用し、ケモカイン様機能を有しており、さらに、炎症性サイトカインの発現及び分泌を上方制御することにより間接的に作用する。これにより、細胞外HMGB1タンパク質が、有効な炎症性免疫応答を促進する強力な走化性かつ免疫調節性のタンパク質となることが可能となる。
【０００５】
さらに、HMGタンパク質ファミリーに属し、DNAを折り曲げることのできる他のタンパク質は、細胞外媒体において、HMGB1と一緒になって放出される。これらのタンパク質は、とりわけ、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及びSP100−HMGである。これらは、高度の相同性を示すアミノ酸配列をHMGB1と共有している。HMGB1などのこれらのタンパク質は、同一のレセプターと相互作用し、相互作用の同一の下流経路を導く炎症性病変を誘発／持続する。
【０００６】
損傷及び壊死細胞によるHMGB1の放出が、in vitroにおいてはラット平滑筋細胞（RSMC）を積極的（actively）に動員し（1）、in vivoにおいては炎症を誘発することが実証されている。
【０００７】
正常細胞において、HMGB1は、受動輸送と能動輸送の両方により細胞質に移動する。しかし、全ての培養細胞及び休止期の単球が、細胞核にHMGB1の大部分を含んでいることから、ベースライン状態において、移入が、移出よりもより有効であることが示唆される。細胞は、HMGB1に豊富であるリシン残基をアセチル化することにより、核からHMGB1を輸送し、それにより、その塩基性電荷を中和し、それらを核局在シグナルとして機能できなくする。核のHMGB1高アセチル化は、核から細胞質へのこのタンパク質の再配置（例えば、線維芽細胞において）、又は分泌性エンドリソソームへの蓄積（例えば、活性化単球及びマクロファージにおいて）と、それに続く、非古典的な小胞媒介分泌経路を介した放出への方向転換を決定する。ついで、炎症部位において、活性化後数時間で単球により産生される分泌型ホスホリパーゼsPLA2の作用を介して、ホスファチジルコリンからその後産生される、生物活性リゾホスファチジルコリン（LPC）により、すでに活性化された単球によるHMGB1分泌が誘発される。従って、HMGB1の分泌は、2つのシグナルにより誘起され（Bonaldi et al., 2003）、3つのステップを介して行われるようである：1）初めに、炎症シグナルが、HMGB1のアセチル化、及び核から細胞質へのその再配置を促進し（ステップ1）、細胞質の分泌小胞への貯蔵を促進する（ステップ2）；ついで、分泌シグナル（細胞外ATP又はリゾホスファチジルコリン）が、エキソサイトーシスを促進する（ステップ3）（Andersson et al., 2002；Scaffidi et al., 2002；Bonaldi et al., 2003；Friedman et al., 2003；Gardella et al., 2002）。
【０００８】
放出HMGB1は、RAGEレセプターと結合するリガンドの1つとして同定された。このレセプターは、大部分の細胞タイプで発現しており、主に、内皮細胞、血管平滑筋細胞、単球及びマクロファージ、並びに単核食細胞において高レベルで発現している。認識には、HMGB1のC末端が必要となる。HMGB1とRAGEとの相互作用により、RAGE上方制御及びレセプター依存性シグナリングにより媒介される、持続された時間の細胞活性化が誘発される。特に、HMGB1とRAGEとの相互作用により、以下を含む複数の細胞内シグナル伝達経路が活性化される：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）、Cdc−42、p21ras、Rac、及び炎症プロセスと古典的に関連のある転写因子である核転座因子kB（NF−kB）（Schmidt et al., 2001）。
【０００９】
複数の実験的証拠によれば、放出HMGB1はまた、Toll様レセプター（TLR）ファミリーに属するレセプター、例えば、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9サブクラスなどとも相互作用し得る。
【００１０】
さらに、HMGB1はまた、トロンボモジュリンの機能的N末端レクチン様ドメイン（D1）とも相互作用し得る。トロンボモジュリンの機能的D1ドメインが循環（circulating）HMGB1を妨害及び結合できることにより、HMGB1とRAGEレセプター及びToll様レセプターとの相互作用が妨げられる。
【００１１】
構造的には、HMGB1タンパク質は、哺乳動物間で高度に保存された配列を有するおよそ25 kDaのタンパク質であり、それにより、214アミノ酸中2個のアミノ酸が、全ての哺乳動物種において同類置換されている。HMGB1は、全ての脊椎動物の核に普遍的に存在し、特に、線維芽細胞、ニューロン、肝細胞、グリア、並びに単球／マクロファージ、好中球、及び血小板を含む造血肝細胞由来の細胞で発見され得る。HMGB1分子は、3つの異なるドメインからなる3部構造を有する：HMG Box A及びBox Bと称される2種のDNA結合ドメイン、及び両極性電荷を可能にする酸性カルボキシル末端。box−A及びbox−Bと称される2種の塩基性DNA結合ドメインは、高アフィニティでDNAを認識及び結合でき、複数の転写因子及び核内ステロイドレセプターと相互作用できる。これらは、転写プロセスだけでなく、アポトーシス（プログラム細胞死）誘導にも重要な役割を担う（3〜5）。
【００１２】
最近、単純拡散によりHMGB1を放出し、それにより炎症を誘発する損傷又は壊死細胞とは異なって、アポトーシス細胞が、それらの最終的な溶解の後でさえも、クロマチン断片と結合したHMGB1を非常に保持することが示された。また、細胞外HMGB1は、主として、組織損傷のシグナルであり、単球及びマクロファージは、昔からの警告シグナルを模倣することを「学んで」いることも示された。加えて、ごく最近になって、HMGB1が、成体及び胎児の両方の中胚葉性血管芽細胞（mesoangioblast）及び平滑筋細胞の移動及び増殖を誘起することが示された（2及び国際公開第02／074337号）。
【００１３】
K−252a（分子量＝467.5）は、1986年に、Nocardiopsis sp.から初めて単離された（6）、グリコシル化インドールカルバゾールである（米国特許第4555402号、及び国際公開第97／38120号−欧州特許第0834574号）。これは親油性分子であるので、生存細胞の膜を横断できる。K−252aは、pkA、pkC、pkG、ミオシン軽鎖キナーゼ（7）、CaMキナーゼIIなどのセリン／スレオニンタンパク質キナーゼの広範なファミリーの非特異的阻害剤であり、NGFレセプター（TrkA）に対するnMアフィニティにより特徴付けられる。K−252aの化学構造を下記式（I）に示す：
【００１４】
【化１】
2008508220.tif 000002
【００１５】
K−252aは、ヒト前立腺癌細胞系（8）及びヒト乾癬性ケラチノサイト（PCT／EP03／08077）に対して、抗ヒスタミン放出、抗アレルギー効果（米国特許第4533402号）及び抗増殖効果を有する。後者の活性は、TrkAリン酸化遮断及びその結果として生じるNGF活性阻害に起因する。さらに、ヒト及びラットの両方の平滑筋細胞が、NGF及びそのレセプターであるTrkAを発現することが示されている（9）。
【特許文献１】米国特許第４５５５４０２号明細書
【特許文献２】欧州特許第０８３４５７４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
血管形成術の間の外科的処置は、内皮細胞を含む様々な細胞タイプの損傷及び壊死をもたらす内膜損傷を頻繁に誘起する。これは、血管細胞の再増殖及び再移動によりもたらされる動脈の再閉塞により特徴付けられる病態である再狭窄を招き得る。今日、再狭窄は、外科的血管形成術後の患者の20％超で生じており、この病態は、第二の手術を必要とする。従って、再狭窄を予防又は治療するのに適した新規薬剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明では、K−252aが、（i）外科的ステント術により誘起される機械的損傷に反応する、HMGB1誘導性の平滑筋細胞の移動及び増殖に対して、強力な生物学的効果を有しており、かつ（ii）炎症性の走化性ケモカインのその役割におけるHMGB1自身により、及び／又はその放出により誘起される炎症性サイトカインのカスケードにより、誘発及び持続／増幅される広範囲の病的活性のアンタゴニスト／阻害剤として作用することを実証する。
【００１８】
さらに、驚くべきことに、HMGB1が、ヒトアテローム斑における平滑筋細胞により分泌されることが発見された（M. Bianchi、未発表の結果）。
【００１９】
従って、本発明の第一の側面は、HMGB1関連病変の予防又は治療用薬剤の製造のための、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体の使用に関する。この側面において、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体は、HMGB1関連病変を予防又は治療するために、これを必要とする対象に治療上有効量で投与される。
【００２０】
本発明に関連して、HMGB1関連病変には、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変が含まれる。本発明に関連して、HMGB1関連病変には、HMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連するさらなる病変が含まれる。好ましいHMGB1相同タンパク質は、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである。従って、本発明の使用に際して、HMGB1関連病変は、HMGB1又はHMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変である。HMGB1関連病変を予防又は治療するための本発明の方法において、HMGB1関連病変は、好ましくは、HMGB1又はHMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変である。
【００２１】
本発明に関連して、「HMGB1」には、HMGB1の非アセチル化型及び／又はアセチル化型を含める。同様に、「HMGB1相同タンパク質」には、HMGB1相同タンパク質の非アセチル化型及び／又はアセチル化型を含める。好ましいHMGB1相同タンパク質は、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである。
【００２２】
HMGB1の相同タンパク質は、本発明に関連して、HMGB1タンパク質のアミノ酸配列と比較して、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％のアミノ酸レベルの同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質として定義される。
【００２３】
「同一性」という用語は、本発明との関連において、比較されるべき2種のアミノ酸配列の同一アミノ酸数を、2種のアミノ酸配列の1つのアミノ酸総数で割った場合に得られるパーセンテージ値として理解される。
【００２４】
本発明に関連して用いられるK−252aは、（i）K−252aを含む微生物細胞、及びK−252aを産性できる微生物を培養することにより得られる微生物細胞を抽出及び精製するか、及び／又は（ii）化学合成するか（Wood et al., J. Am. Chem. Soc. 117：10413−10414, 1995）のいずれかにより得ることができる。K−252aを産生する微生物及びそこからK−252aを単離できる微生物は、好ましくは、Nocardiopsis sp.及びSaccaromyces sp.属に属する。
【００２５】
理論に束縛されることを望むことなく、本発明の円偏光ニ色性データ及び蛍光データにより、HMGB1活性に対するK−252aの阻害作用は、K−252aとHMGB1との直接的な相互作用に必ずしも依存しないことが示される。K−252aがHMGB1活性を阻害するメカニズムは、未だに十分には解明されていないが、恐らく、K−252aは、少なくとも1種のキナーゼ、例えば、チロシンキナーゼ、ホスホキナーゼ、及び／又はさらなるキナーゼなどの阻害により、HMGB1の活性を阻害する可能性が高い。細胞外HMGB1は、その膜レセプター、特にRAGE及びTLRレセプターと相互作用し、細胞内部のキナーゼカスケードの開始を誘発する。このカスケードは、細胞質全体及び核内において、細胞外HMGB1結合の情報を輸送し、細胞の外部刺激への応答をもたらす。K−252aは、異なる段階において、HMGB1結合により誘発されるカスケードを阻害でき、それにより、細胞に対するHMGB1作用の全体的な阻害がもたらされると想定される。
【００２６】
本発明の発明者らは、67個のヒトキナーゼに対するK−252aの阻害活性を試験し、K−252aが複数のこれらの分子を阻害できることを発見した、実際に、試験した67個のキナーゼ中17個が、90％を超える阻害を示した（実施例5を参照されたい）。従って、K−252aは、表1及び2に示すとおりの1種以上のキナーゼと関連する疾患の治療剤として同定され、そのために、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の阻害が発見される。
【００２７】
キナーゼと関連する疾患は、好ましくは、非異常細胞又は生物と比較して、異常細胞又は生物におけるキナーゼ活性が高いという、高キナーゼ活性と関連する疾患である。キナーゼ活性は、転写レベルで（例えば、mRNAを測定することによる）又はタンパク質レベル（例えば、タンパク質の量及び／又は活性を測定することによる）で決定されてよい。
【００２８】
さらに、先に示したとおり、K−252aは、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はホスホキナーゼ阻害剤から選択される、少なくとも1種のさらなるキナーゼ阻害剤とともに用いられてよい。好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、TrkA、TrkB、TrkCの阻害剤、及び／又はRonレセプター、c−Met（HGF／スキャッターファクターのレセプター）、及びSeaレセプターを含むチロシンキナーゼレセプターのサブファミリーの阻害剤である。好ましいホスホキナーゼ阻害剤は、PKA、PKC、及び／又はPKGの阻害剤である、別の好ましいキナーゼ阻害剤は、例えば、Rafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、及び／又はPI3Kγなどの他のキナーゼの阻害剤である。
【００２９】
本発明の使用に適した、当分野で公知のキナーゼ阻害剤が存在する。従って、本発明において適した少なくとも1種のキナーゼ阻害剤は、好ましくは、公知のキナーゼ阻害剤である。CaMキナーゼの適した公知の阻害剤は、カルモジュリン結合ドメイン、Ca2＋／カルモジュリンキナーゼII阻害剤281−309、ヒペリシンである。TrkA、TrkB、及び／又はTrkCの適した公知の阻害剤は、CP701、ゲニステイン、ハービマイシン、ラベンダスチン、ケルセチン、ラジシコールである。MAPキナーゼの適した公知の阻害剤は、ヒメニアルジシン（hymenialdisine）、CP−1347、オロモウシン、CC−401である。適した公知のMLCキナーゼ阻害剤は、ピセアタンノール、スタウロスポリン（Staurosporine）、ミオシン軽鎖阻害剤ペプチド18である。適した公知のホスファチジルイノシトール−3キナーゼ（PI3Kγ）阻害剤は、ケルセチン、ウォルトマンニンである。適した公知のPKA阻害剤は、スタウロスポリン、KT−5720である。適した公知のPKC阻害剤は、スタウロスポリン、ビスインドリルマレイミドI、カルフォスチンC、及びケレリトリンである。適した公知のPKG阻害剤は、スタウロスポリン、H−7、H−9、及びKT−5823である。
【００３０】
本発明では、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤を、塩及び／又は誘導体の形態で用いてよい。
【００３１】
好ましいK−252a塩及び／又はキナーゼ阻害剤の塩は、医薬として許容可能なカチオン、例えば、アルカリ又はアルカリ土類カチオンなど、又は医薬として許容可能なアニオン、例えば、無機アニオン又は有機アニオンなど、との塩である。好ましいK−252a誘導体には、合成及び／又は化学修飾した化合物が含まれ、例えば、環系上に置換基、例えばC1〜C4アルキル基などを有する化合物、メチルエステル基が別のエステル基、アミド基、又はH若しくはカチオンにより置換されている化合物、及び／又は環式アミド基のN原子が、C1〜C4アルキル基で置換されている化合物などが含まれる。
【００３２】
HMGB1関連病変とは、HMGB1タンパク質及び／又はHMGB1相同タンパク質のアセチル化又は非アセチル化型が、実質的に検出不可能である正常な対象における濃度と比較して、増加濃度のこれらのHMGB1タンパク質が、生体液及び生物組織中に存在する患者の病態である。HMGB1関連病変及び／又はHMGB1相同タンパク質と関連する病変は、TNF−α、IL−1、IL−6などのサイトカインの刺激に起因する強度の炎症理由（basis）若しくは病変、又は中毒、感染、火傷などの毒性イベントに起因する病変である。特に、高濃度のHMGB1タンパク質及び相同タンパク質が、敗血症に罹患した患者の血漿、関節リウマチ患者の血漿及び関節液、アルツハイマー病患者の脳、メラノーマ患者の血漿及び組織、全身性エリテマトーデス患者の血漿、アテローム性動脈硬化症患者のアテローム斑などにおいて発見され測定されている。生体液及び生物組織中のHMGB1タンパク質及び／又は相同タンパク質の測定及び証明は、例えばELISAアッセイなどによる検出を含む、当業者に公知の一般的診断手段により検出されてよい。
【００３３】
本発明のHMGB1関連病変は、好ましくは、炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介される病態である。本発明を用いて有効に治療され得る病態の非限定的な例には、HMGB1−ケモカインにより、及び炎症性サイトカインのHMGB1誘導性カスケードにより誘起される広範囲の病態が含まれ、以下のカテゴリーに分類される：再狭窄及び他の心臓血管疾患、再かん流傷害、炎症性大腸炎などの炎症性疾患、全身性炎症反応症候群、例えば、敗血症、成人呼吸促迫症候群など、関節リウマチ及び骨関節炎などの自己免疫疾患、産婦人科領域疾患（obstetric and gynecological disease）、感染症、アトピー性疾患、例えば、喘息、湿疹など、腫瘍病変、例えば、臓器又は組織移植と関連する固形又は非固形腫瘍疾患、例えば、臓器移植後の再かん流傷害、臓器拒絶反応、及び移植片対宿主拒絶反応など、先天性疾患、乾癬又は脱毛症などの皮膚病、神経系疾患、眼科疾患、腎臓の代謝性又は特発性疾患、並びに医原性毒性などの中毒状態であって、ここで、上記疾患は、HMGB1タンパク質放出と関連することにより、及び／又はHMGB1タンパク質放出を伴うことによりもたらされるものである。
【００３４】
特に、炎症性疾患及び自己免疫疾患に属する病変には、以下が含まれる：関節リウマチ／血清反応陰性関節症、骨関節炎、炎症性大腸炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、虹彩毛様体脈絡膜炎／ブドウ膜炎、視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、睾丸炎／精管切除を戻す手術。全身性炎症反応には、以下が含まれる：敗血症症候群（グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、感染性結膜炎（septic conjunctivitis）を含む）、髄膜炎菌血症、外傷性出血、唸音（hums）、電離放射線暴露、急性及び慢性膵臓炎、成人呼吸促迫症候群（ARDS）、前立腺炎。再かん流傷害には、ポストポンプ（post−pump）症候群及び虚血再かん流傷害が含まれる。心臓血管疾患には、アテローム性動脈硬化症、腸梗塞、心臓性失神（cardiac stun）症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全、及び再狭窄が含まれる。産婦人科領域疾患には、早期分娩、子宮内膜症、流産、及び不妊症が含まれる。感染症には、以下が含まれる：HIV感染／HIVニューロパシー、感染性（septic）髄膜炎、B型及びC型肝炎ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、喉頭蓋炎、E. coli O157：H7、溶血性尿毒症症候群／血栓性血小板減少性紫斑病（thrombolytic thrombocytopenic purpura）、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、トキシックショック症候群、連鎖球菌性筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核菌（mycobacterium tuberculosis）、トリ型結核菌（mycobacterium avium intracellulare感染症）、ニューモシスティシス・カリニ肺炎、骨盤炎症性疾患、睾丸炎／副睾丸炎、レジオネラ菌、ライム病、A型インフルエンザ、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ウイルス関連血球貪食症候群、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎。アトピー性疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎が含まれる。悪性腫瘍（固形及び液性腫瘍病変）には、以下が含まれる：メラノーマ、ALL、AML、CML、CLL、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、鼻咽腔癌、悪性組織球増殖症、及び腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症。移植疾患には、臓器移植拒絶反応及び移植片対宿主拒絶反応が含まれる。先天性疾患には、嚢胞性線維症、家族性血球貪食リンパ組織球増多症、及び鎌状赤血球貧血が含まれる。皮膚病には、乾癬、乾癬性関節炎、及び脱毛症が含まれる。神経系疾患には、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、片頭痛、アミロイド関連病変、プリオン病／クロイツフェルトヤコブ病、脳梗塞、及び末梢性ニューロパシーが含まれる。腎臓病には、ネフローゼ症候群、血液透析、及び尿毒症が含まれる。医原性中毒状態には、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法、及び慢性サリチル酸塩中毒が含まれる。代謝性及び特発性疾患には、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α−1抗トリプシン欠乏症、糖尿病、橋本甲状腺炎、骨粗しょう症、視床下部−脳下垂体−副腎軸評価（evaluation）、及び原発性胆汁性肝硬変症が含まれる。眼科疾患には、緑内障、網膜症、及びドライアイが含まれる。
【００３５】
さらに、本発明を用いて有効に治療され得る病変には、さらに以下が含まれる：多臓器不全症候群、筋ジストロフィー、感染性髄膜炎、医原性末梢神経病変、アテローム性動脈硬化症、虫垂炎、消化性潰瘍又は胃潰瘍又は十二指腸潰瘍、潰瘍性偽膜性の急性又は虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、発熱、腹膜炎、アカラシア、胆嚢炎、腸炎、ウィップル病、喘息、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器壊死、花粉症、敗血症、内毒素性ショック、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、感染流産、膣炎、前立腺炎、尿道炎、肺気腫、鼻炎、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、珪性肺塵症（pneumoultramicroscopicsilico−volcanoconiosis）、胸膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、播種性菌血症、カンジダ症、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、皮膚筋炎、火傷、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、心膜炎、心筋炎、動脈炎、血栓性静脈炎、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、脳炎、脳塞栓症、ギラン−バレー（Guillaume−Barre）症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺症、肥満、体重減少、拒食症、悪液質、上皮バリア機能障害、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、滑膜炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、バブセッツ（Babcets's）症候群、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター（Retier's）症候群、水疱性皮膚炎（水疱性類天疱瘡）、脱毛性天疱瘡（alopecia pemphigous）及び異常性天疱瘡、座瘡、前立腺肥大症、乳癌、子宮頸癌、クラミジア感染症、肝硬変、慢性閉塞性肺疾患、膀胱炎、下痢、陰部ヘルペス、生殖器いぼ、レジオネラ症、卵巣癌、皮膚癌、睾丸癌、西ナイルウイルス感染、百日咳。
【００３６】
本発明に関連して、HMGB1関連病変の予防又は治療用薬剤の製造のためにK−252aを使用する場合には、アレルギー、アレルギー関連疾患、及び前立腺癌などの病変は、本発明の範囲に包含されない。
【００３７】
特に好ましい実施態様では、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤は、心臓血管疾患、特に、血管形成術の間又は後にもたらされるアテローム性動脈硬化症及び／又は再狭窄の予防又は治療のために用いられる。より好ましくは、前記薬剤は、血管形成術の間又は後の再狭窄における結合組織再生を阻害、遅延、及び／又は減じるために用いられる。
【００３８】
HMGB1活性を阻害することにより、再狭窄の間に生じる平滑筋細胞（SMC）の移動及び増殖を予防及び／又は阻害できる。SMCは、中膜に位置しており、ここで、これらは、細胞外マトリックスに埋め込まれている。無傷の血管では、SMC細胞は、収縮状態にあり、血管壁の剛性、弾性維持、及び末梢血圧制御に関与する細胞分裂及び移動の欠如により特徴付けられる表現型を示す。
【００３９】
機械的（ステント挿入による擦り）又は局所炎症性損傷のいずれかの後に血管内皮が傷つけられると、SMCは、合成表現型に移行し、細胞分裂及び移動を行う。中膜から内膜へとSMCが移動することにより、血管内膜肥厚がもたらされ、冠動脈血管形成術後の多くの血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄などの病態生理において重要な役割を果たす。合成状態において、SMCはまた、大量の細胞外プロテイナーゼ、成長因子、サイトカインを産生し、線維状の細胞外マトリックスを分泌する。血管壁の外傷後、活性化された循環血液中の単球、マクロファージ、及び血小板によるか、又は損傷内皮細胞によるかのいずれかにより、複数の成長因子及び／又は化学誘引物質及び細胞増殖誘導物質（HMGB1及びHMGB1相同タンパク質は、最重要のものの1つである）が放出され、これにより、収縮表現型から合成表現型へのSMC細胞の移行が誘起され、それらの移動が血管内膜へと向けられる。本発明に関連して、驚くべきことに、HMGB1及びHMGB1相同タンパク質が、ヒトアテローム斑の平滑筋細胞により分泌されることが発見された。従って、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体は、例えば全身投与及び／又は薬剤溶出ステントなどを介した、再狭窄の予防及び／又は治療における適した治療剤である。
【００４０】
K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体は、単独で、又は1種以上のさらなる薬剤と組み合わせて用いられてよい。特に、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体は、炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害できる、少なくとも1種のさらなる薬剤と組み合わせて用いられてよい。例えば、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体は、炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害できる薬剤、例えば、TNF、IL−1α、IL−1β、IL−Ra、IL−8、MIP−1α、MIF1β、MIP−2、MIF、及びIL−6からなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニスト又は阻害剤などと一緒に投与されてよい。
【００４１】
K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体と組み合わせて用いられるさらなる薬剤はまた、RAGEの阻害剤であってもよく、これは、例えば、RAGEに対する抗体、RAGE発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又はHMGB1とRAGEとの相互作用の、好ましくはHMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型とRAGE若しくは可溶性RAGE（sRAGE）との相互作用の合成小分子アンタゴニストなどである。RAGEに対する抗体は、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはキメラ若しくはヒト化抗体、又は組み換え抗体、例えば、一本鎖抗体又はこのような抗体の抗原結合フラグメントなどである。可溶性RAGEアナログは、任意選択で、例えばヒト抗体のFcドメインなどとの融合タンパク質として存在してもよい。RAGEとのHMGB1相互作用の合成小分子アンタゴニストは、好ましくは、1000ダルトン未満の分子量を有する。合成小分子アンタゴニストは、好ましくは、HMGB1の非アセチル化型及び／又はアセチル化型とRAGEとの相互作用、及びHMGB1相同タンパク質、特に、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGの非アセチル化型及び／又はアセチル化型とRAGEとの相互作用を阻害する。
【００４２】
さらに、前記のさらなる薬剤は、HMGB1アンタゴニスト／阻害剤であってよく、例えば、HMGB1に対する抗体、特にHMGB1 Box−Bに対する抗体、又はアンタゴニスト活性を有するHMGB1フラグメント、例えばBox−Aフラグメントなどであってよい。適したHMGB1アンタゴニスト及び阻害剤は、米国特許第6468533号、国際公開第02／074337号、及び米国特許出願公開第2003／144201号に開示されており、これらは参照として本明細書に援用される。HMGB1アンタゴニスト／阻害剤は、好ましくは、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型のアンタゴニスト／阻害剤である。
【００４３】
K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体と組み合わせて用いられるさらなる薬剤はまた、Toll様レセプター（TLR）、例えば、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9などとHMGB1との相互作用の阻害剤であってもよく、この阻害剤は、好ましくは、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、TLR発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又は合成分子、好ましくは1000ダルトン未満のサイズを有するものである。阻害剤は、Toll様レセプター、特に、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9の公知の阻害剤であってよい。阻害剤は、好ましくは、HMGB1の非アセチル化型及び／又はアセチル化型とToll様レセプターとの相互作用、及びHMGB1相同タンパク質、特に、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGの非アセチル化型及び／又はアセチル化型とToll様レセプターとの相互作用を阻害する。
【００４４】
さらに別の実施態様では、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体と組み合わせて用いられるさらなる薬剤は、トロンボモジュリンの機能的N末端レクチン様ドメイン（D1）である。トロンボモジュリンのD1ドメインは、放出されたHMGB1、及び放出されたHMGB1相同タンパク質、特に、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGの非アセチル化型及び／又はアセチル化型を妨害でき、従って、RAGE及びToll様レセプターとのそれらの相互作用を妨げることができる。トロンボモジュリンのD1ドメインは、天然であるか、又はプロテアーゼに対する耐性を可能にするために変異型であってよい。
【００４５】
前記のさらなる薬剤はまた、HMGB1タンパク質と結合できる、折れ曲がり構造を有する合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子であってもよく、特に、二本鎖ベントDNA、PNA、若しくはDNA／PNAキメラ若しくはハイブリッド、又は二本鎖十字型DNA、PNA、若しくはDNA／PNAキメラ若しくはハイブリッド構造であってよい。好ましい核酸及び核酸アナログ分子は、共同所有され係属中である国際特許出願PCT／EP2005／007198（2005年7月4日に出願；2004年7月2日に出願されたUS仮出願第60／584678号の優先権を主張）に開示されており、これらは参照として本明細書に援用される。折れ曲がり構造を有する合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子は、好ましくは、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型、及びHMGB1相同タンパク質、特に、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG4L、及び／又はSP100−HMGの非アセチル化及び／又はアセチル化型と結合できる。
【００４６】
K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤及び／又はこれらの誘導体は、通常は、医薬組成物として投与され、これには、医薬として許容可能なキャリア、希釈剤、及び／又はアジュバントがさらに含まれる。
【００４７】
投与は、公知の方法により実施されてよく、例えば、注射、特に、静脈注射、筋肉注射、経粘膜注入、皮下注射、若しくは腹腔内注射、及び／又は経口、局所、経鼻、吸入、エアロゾル及び／又は直腸適用などであってよい。投与は、局所投与又は全身投与であってよい。
【００４８】
従って、本発明のさらなる側面は、HMGB1関連病変の治療のための活性成分として、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体の有効量を含み、かつ医薬として許容可能なキャリア、希釈剤、及び／又はアジュバントを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、好ましくは、HMGB1及び／又はHMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変の治療に適している。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はホスホキナーゼ阻害剤から選択される少なくとも1種のキナーゼ阻害剤を、単独で、又はK−252aと組み合わせて含むことが好ましい。本発明の医薬組成物における好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、TrkA、TrkB、TrkCの阻害剤、及び／又はRon、c−Met、及びSeaレセプターを含むチロシンキナーゼレセプターのサブファミリーの阻害剤である。本発明の医薬組成物における好ましいホスホキナーゼ阻害剤は、PKA、PKC、及び／又はPKGの阻害剤である。本発明の医薬組成物における別の好ましいキナーゼ阻害剤は、Rafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、及び／又はPI3Kγの阻害剤である。本発明の医薬組成物における少なくとも1種のキナーゼ阻害剤は、好ましくは、公知のキナーゼ阻害剤であり、例えば、上述のとおりの公知のキナーゼ阻害剤などである。
【００５０】
さらに好ましい実施態様では、K−252a及び／又は少なくとも1種のキナーゼ阻害剤を含む本発明の医薬組成物は、先に定義したとおりのさらなる薬剤を含む。
【００５１】
正確な配合、投与経路、及び用量は、患者の容体を考慮して、個々の医師により選択され得る。投与は、単回投与、又は間隔を置いた反復投与で達成されてよい。用量及び間隔は、結果として症状の改善又は患者の寿命の延長をもたらす治療効果を提供するために、個々に調整されてよい。投与される組成物の実際の量は、もちろん、治療されるべき対象、対象の体重、病気の重症度、投与方法、及び医師による処方判断によって決まるだろう。適した日用量は、0.001〜10 mg／kg、特に0.1〜5 mg／kgであるだろう。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、診断又は治療への応用のために用いられてよい。診断的適用のために、化合物は、ラベル化形態で存在してよく、例えば、放射性同位体又は核磁気共鳴により検出され得る同位体などの同位体を含む形態で存在してよい。好ましい治療への応用は、結合組織再生を阻害、遅延、又は低減するものである。
【００５３】
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体は、遊離（free）化合物、及び／又は医療デバイスの表面上に可逆的に固定されたものとして投与されてよい。この目的のために、特に、医療デバイスの表面上又は医療デバイス表面のコーティング層上に、薬剤分子を結合、埋め込み、及び／又は吸着させることにより、活性成分と任意選択でさらなる薬剤とを医療デバイスに可逆的に負荷してよい。医療デバイスを体液又は生体組織と接触させると、可逆的に固定された化合物が解放される。結果として、コーティングされた医療デバイスは、薬剤を溶出するドラッグデリバリーデバイスとして作用し、それにより、ドラッグデリバリー動態を制御でき、例えば、急速放出性、又は制御された遅延性若しくは徐放性ドラッグデリバリーが提供される。制御された遅延性又は徐放性放出のために、活性剤を、ナノカプセル若しくはマイクロカプセル、又はマトリックスコーティング、特に、ステントなどの医療デバイス上に適用され得るポリマーマトリックスコーティングに埋め込むことができる。医療デバイスのコーティング技術は、当業者に周知である。
【００５４】
従って、本発明のさらなる側面は、
（i）K−252a、及び／又は
（ii）少なくとも1種のキナーゼ阻害剤、
及び／又は、（i）及び／又は（ii）の塩若しくは誘導体で可逆的にコーティングされているか、又はこれらが埋め込まれている医療デバイスに関する。好ましくは、医療デバイスは、手術器具、インプラント、カテーテル、又はステント、例えば、血管形成術用のステントなどから選択される。最も好ましくは、本発明の医療デバイスは、薬剤溶出ステント（DES）である。
【００５５】
さらに、以下の図面及び実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【００５６】
[実施例]
（1.  走化性アッセイ）
周知かつ有効なプロトコル（1）を用いて走化性アッセイを実施した。修正ボイデンチャンバー（Modified Boyden chamber）を、5〜8μmの細孔サイズを有するフィルターとともに用い、I型コラーゲン（0.5 M酢酸中、100μg／mL）及びフィブロネクチン（10μg／mL、Roche）で処理した。BASMC（ウシ大動脈平滑筋細胞）を、血清不含DMEMで培養し、20000〜40000の細胞サンプルをボイデンチャンバーの上部ウェルに添加した。
【００５７】
K−252aを、同一の血清不含培地に溶解及び希釈し、チャンバーの下部ウェルに添加した。HMGB−1（仔ウシ胸腺由来）濃度は25 ng／mLであり、fMLPの濃度は0.1μMである一方、K−252aは、3、10、30、100 nMであった。37℃±0.5℃で、一晩、細胞を移動させ、ついで、細胞を擦り取り、フィルターをメタノールで固定し、20％メタノール中10％クリスタルバイオレットの溶液で染色した。全ての実験は、3連（triplicate）で少なくとも2回実施した。結果は、フィルター当たり10高倍率視野で計測された細胞数の平均値±SDであり、コントロールを超える倍数として（as folds）表される。ランダムな細胞移動、すなわち、化学誘引物質不在下での移動を、100％の任意値とした。統計分析は、治療の一対比較のためにスチューデント検定を用いるか、又は増加濃度の試薬を用いた治療の評価のためにANOVAモデルを用いて実施した。結果を図1に示す。
【００５８】
上述のとおりの走化性アッセイを、BAEC細胞を用いて同様に実施できる。対応する結果が得られる。
【００５９】
（2.  増殖アッセイ）
既述の有効な方法（1）を用いて増殖アッセイを実施した。BASMC細胞（ウシ大動脈平滑筋細胞）を6ウェルプレートに播種し（105細胞／ウェル）、20％FCS添加RPMI培地で培養した。24時間後、培地を血清不含RPMIと置き換え、ついで、細胞集団を同調させるために、16時間、細胞を飢餓状態にした。ビヒクル（ネガティブコントロール又は基底増殖）又は25 ng／mL（1 nM）のHMGB1（バクテリアで産生）を、3、10、30、100、又は300 nMのK−252a（血清不含培地に溶解及び希釈されたもの）の存在下又は不在下、添加する。各実験ポイントは、3連測定の平均値±SDを表す。実験は3回繰り返した。指示時間（培養1、2、3、及び4日目）において細胞をプレートから離し、顕微鏡下でトリパンブルー排除細胞を計測することにより、BASMC細胞増殖を測定した。結果を図2に示す。
【００６０】
上述のとおりの増殖アッセイを、BAEC細胞を用いて同様に実施できる。対応する結果が得られる。
【００６１】
（3.  円偏光二色性（CD）によるタンパク質結合実験）
K−252aのタンパク質結合を調べるために、CD研究を実施した。1 cmの光路長を有する円筒型石英キュベット（Jasco）を用いて、NesLab RTE111温度制御装置ユニティ（thermal controller unity）を備えたJasco J710分光偏光計に、全てのCDスペクトルを集めた。20 nm／分のスキャン速度、1 nmのバンド幅、及び1 nmの分解能を常に用いた。
【００６２】
3.42μM、6.84μM、及び10.26μMの濃度のK−252aをHMGB1に添加することにより、200〜約235 nmの範囲におけるHMGB1のCDに多大な影響が誘起されたが（図3を参照されたい）、約235〜260 nmの範囲ではこの影響は誘起されなかった。しかし、200〜約235 nmの範囲のこの作用は、K−252aの溶媒（ジメチルホルムアミド、DMF）の変性作用によって生じるか、又はHMGB1のバクテリア混入物質とK−252aとの相互作用によって生じたのかもしれない。スペクトルは、恐らくDMFに起因して、大きく妨害される。
【００６３】
1：1の結合化学量論が、HMGB1とK−252aとの間に起こるとすれば、複合体の見かけのKdは、およそ2μMであるはずであり、これは、非常に弱い相互作用を特徴付ける値である。従って、直接的な相互作用が、K−252aがHMGB1誘導性の細胞増殖及び移動を阻害するメカニズムであるとは考えられない。蛍光アッセイは、K−252aとHMGB1との直接的な相互作用が存在しないことを裏付けるようである。
【００６４】
K−252aは、チロシンキナーゼ（TrkA、TrkB、TrkC）、ホスホキナーゼ（PKA、PKC、PKG）、及びさらなるキナーゼ（Rafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、PI3Kγ）の阻害剤である。恐らく、K−252aは、レセプター（RAGE）レベルでもHMGB1を阻害しないが、TrkAに干渉するか、及び／又はRAGE若しくはTollレセプターとのHMGB1相互作用の下流キナーゼの1種に干渉し得る。
【００６５】
（4.  マウスにおけるLPS誘導性内毒素血症のK−252aによる逆転）
Charles River（Calco, Italy）から、6〜7週齢のBALB／c雄マウスを32匹購入し、使用前に1週間適応させた。実験日に、0.9％生理食塩水に溶解した、LD70〜90（右鼠径領域に10.5 mg／kgを腹腔内投与）のリポ多糖類（LPS、大腸菌由来、株0111：B4、SIGMA、ロット034154105）を、全てのマウスに与えた。LPS注入15分前、並びにLPS投与後2、12、及び24時間において、DMSO：生理食塩水（8：92 v／v）に溶解したK−252a（左鼠径領域に、6.7 mg／kgを腹腔内投与、10 mL／kg）を、16匹のマウスに与えた。残りの16匹のマウスには、同体積のビヒクルを単独で与えた（コントロール）。1日に少なくとも2回、連続7日間マウスを観察し、死亡を記録した。
【００６６】
結果を図4に示す。観察期間の最後（7日目）において、K−252aで処理された16匹のマウスのうち10匹（62.5％）が未だ生存していた一方、最後のコントロールマウスは、5日目のうちに既に死亡が発見された。統計分析（カプラン−マイヤー生存分析）は、0.0001の「P」値を与える。
【００６７】
（5.  キナーゼ阻害プロファイリング研究）
200 nMの濃度で、67個のタンパク質キナーゼに対するK−252aの阻害活性を測定する目的で、分析を実施する。特に、標的キナーゼは、チロシンキナーゼ及びセリン／スレオニンキナーゼであった。
【００６８】
（5.1  材料及び方法）
（1.  試験化合物）
試験化合物K−252aを、使用前まで、暗所下、−20℃で貯蔵した。以下に列記したアッセイコントロール用対照化合物を用いた。
【００６９】
【表１】
2008508220.tif 000003
【００７０】
（2.  試験化合物溶液の調製）
各試験化合物の重さを量り、DMSOに溶解して1 mMの原液を作製した。原液をDMSOで希釈して、20μMにした。化合物溶液をアッセイバッファーで希釈し、0.8μMにした。対照化合物の調製を試験化合物の調製方法と同様の方法で実施した。
【００７１】
（3.  用いたキナーゼ）
【００７２】
【表２Ａ】
2008508220.tif 000004
【表２Ｂ】
2008508220.tif 000005
【表２Ｃ】
2008508220.tif 000006
【表２Ｄ】
2008508220.tif 000007
【表２Ｅ】
2008508220.tif 000008
【表２Ｆ】
2008508220.tif 000009
【表２Ｇ】
2008508220.tif 000010
【００７３】
（4.  アッセイ試薬）
【００７４】
【表３】
2008508220.tif 000011
【００７５】
（5.  アッセイ手順）
【００７６】
【表４Ａ】
2008508220.tif 000012
【表４Ｂ】
2008508220.tif 000013
【表４Ｃ】
2008508220.tif 000014
【００７７】
（6.  アッセイ条件）
【００７８】
【表５Ａ】
2008508220.tif 000015
【表５Ｂ】
2008508220.tif 000016
【００７９】
（7.  基質情報）
【００８０】
【表６】
2008508220.tif 000017
【００８１】
（8.  データ分析）
反応コントロール（ATPを用いたもの）の読み出し値を0％阻害として設定し、バックグラウンド（ATPを用いていないもの）の読み出し値を100％阻害として設定し、各試験溶液のパーセント阻害を計測した。
【００８２】
（5.2  結果）
表1−チロシンキナーゼ
【００８３】
【表７】
2008508220.tif 000018
【００８４】
表2−セリン／スレオニンキナーゼ
【００８５】
【表８】
2008508220.tif 000019
【００８６】
（6.  結論）
細胞移動及び増殖のin vitroモデルにおける、K−252aにより示される非常に強力な阻害効果により、K−252aは、HMGB1関連疾患の全身又は局所療法に用いられるべき有望な薬剤候補となる。
【００８７】
これらの結果に基づいて、損傷／死滅内皮細胞により放出されるか、又は活性化された循環血液中のマクロファージ及び単球により分泌される両方のHMGB1は、外科的血管形成術後の再狭窄、並びに炎症及び免疫分野における複数の重症病変の最重要標的の1つであることが明白である。主にin situにおける、正確には、機械的外傷がもたらされ、再狭窄形成を導くプロセスが開始及び進行する部位における、典型的な走化性ケモカインのその役割及び活性の阻害は、特異的HMGB1アンタゴニストの予防的／治療的活性を示すようである。
【００８８】
同一の理由により、HMGB1により誘起される病的活性の阻害剤の全身投与は、広範な全身性及び局所性の病気の一団を治療するための有望な治療的アプローチであるようだ。K−252aが、再狭窄誘導及び形成、並びに局所性及び全身性の炎症及び免疫反応の誘発、持続、及び増幅に主に関与する、HMGB1の2種類の活性のin vitroにおける強力な阻害剤であることが本明細書で実証されている。
【００８９】
実際に、ナノモル範囲の濃度で、HMGB1誘導性細胞移動（図1）及び増殖（図2）が阻害された。これは、in vivoに変換すると、単独の治療剤としてのK−252a、又は病変部位における、K−252a自身が埋め込まれた／コーティングされたステントにより放出されるK−252aが、細胞分裂及び移動の不在により特徴付けられる表現型から、再狭窄を生じさせる、損傷血管内皮細胞壁へのそれらの走化及び増殖を導く合成表現型への平滑筋細胞シフトを阻害／抑制することにより、積極的（actively）にHMGB1をアンタゴナイズするであろうことを意味する。同様に、HMGB1により誘発され持続される炎症及び免疫学的病変の治療の場合には、K−252aの全身投与が、この走化性ケモカインにより誘起される病的カスケードを阻害／抑制し、病気の発症及び経過に有益な効果をもたらすだろう。
【００９０】
さらに、K−252aとともにLPSにより誘起される重症内毒素血症に罹患したマウスのK−252での治療により得られるin vivoデータは、上述の細胞移動及び増殖のin vitroデータで達成された結果をさらに裏付ける。実際に、重篤なLPS誘導性内毒素血症を有するマウスに、4回、6.7 mg／kgのK−252aを腹腔内投与すると、コントロールマウスの生存率と比較して、試験マウスの生存率が顕著に増加した（60％超）。実際に、コントロールマウスは、5日目を超えては生存しない。従って、in vivoにおける結果は、K−252aで処理されたマウスの死亡率の顕著な低下を示しており、K−252aが、HMGB1関連病変の全身又は局所治療で用いられるべき有望な薬剤候補であることが確認される。
【００９１】
K−252aがHMGB1活性を阻害するメカニズムは、キナーゼ阻害であるようだ。従って、他のキナーゼ阻害剤、特に公知のキナーゼ阻害剤、例えば、TrkA、TrkB、TrkCなどのチロシンキナーゼの阻害剤、PKA、PKC、PKGなどのホスホキナーゼの阻害剤、及び／又はRafキナーゼ、Rasキナーゼ、CaMキナーゼ、MLCキナーゼ、MAPキナーゼ、MEK、ERK、JUNキナーゼ、PI3Kγなどのさらなるキナーゼの阻害剤などはまた、in vitro及びin vivoにおいて、HMGB1の活性を阻害するための適した化合物であり得る。従って、このようなキナーゼ阻害剤は、放出されたHMGB1の活性に関与する病気における有望な治療的アプローチを提供し得る。
【００９２】
[参考文献]
2008508220.tif 000020
2008508220.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図1には、走化性アッセイにおけるK−252aの活性を示す。修正ボイデンチャンバー及び2種の異なる化学誘引物質：HMGB1及びfMLP（ホルミルメチオニンロイシンフェニルアラニンペプチド−又はfMetLeuPhe−白血球の特異的化学誘引物質）、を用いて実施した典型的な移動（走化性）アッセイにおける、ウシ大動脈平滑筋細胞（BASMC）に対するK−252aの阻害活性。K−252aは、HMGB1誘導性BASMC細胞移動を、積極的かつ濃度依存的（ナノモル範囲において）にアンタゴナイズする一方、試験濃度のいずれにおいても、fMLPにより誘起される細胞移動に干渉しない。
【図２】図2には、増殖アッセイにおけるK−252aの活性を示す。HMGB1誘導性ウシ大動脈平滑筋細胞（BASMC）増殖に対するK−252a阻害活性。K−252aは、時間依存的様式及びnM範囲において、試験した全ての濃度でBASMC細胞増殖をアンタゴナイズする。
【図３】図3には、K−252aの存在下、HMGB1の円偏光二色性を示す。
【図４】図4には、LPS誘導性内毒素血症による死亡のK−252aによる阻害を示す。K−252aで処理することにより、マウスにおいて、LPSにより誘起される死亡率の明らかな逆転が示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月29日(2006.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HMGB1誘導性及び／又は持続性の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、及び虚血再かん流傷害からなる群から選択されるHMGB1関連病変の予防又は治療用薬剤の製造のための、K−252a及び／又はその塩若しくは誘導体の使用。
【請求項２】
前記HMGB1関連病変が、HMGB1の非アセチル化型及び／又はアセチル化型と関連する病変、及びHMGB1相同タンパク質の非アセチル化型及び／又はアセチル化型と関連する病変である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記HMGB1相同タンパク質が、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記HMGB1関連病変が、HMGB1及び／又はその相同タンパク質により誘起される炎症性サイトカインカスケードの活性化により媒介される病的状態である、請求項１乃至３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
血管形成術の間又は後の再狭窄における結合組織再生を阻害、遅延、又は減じるための、請求項１乃至４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
さらなる薬剤と組み合わされる、請求項１乃至５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記さらなる薬剤が、炎症性サイトカインカスケードの初期メディエーターを阻害できる、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記さらなる薬剤が、TNF、IL−1α、IL−1β、IL−Ra、IL−8、MIP−1α、MIF1β、MIP−2、MIF、及びIL−6からなる群から選択されるサイトカインのアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記さらなる薬剤が、RAGEに対する抗体、RAGE発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又はRAGE若しくは可溶性RAGE（sRAGE）とのHMGB1相互作用の合成小分子アンタゴニストである、請求項６記載の使用。
【請求項１０】
前記さらなる薬剤が、HMGB1又はその相同タンパク質のアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項６記載の使用。
【請求項１１】
前記アンタゴニスト又は阻害剤が、HMGB1又はその相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型のアンタゴニスト又は阻害剤である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記さらなる薬剤が、Toll様レセプター（TLR）、特に、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9とHMGB1との相互作用の阻害剤、好ましくは、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、TLR発現を阻害できる核酸若しくは核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、若しくはRNA干渉分子、又は1000ダルトン未満のサイズを有する合成分子である、請求項６記載の使用。
【請求項１３】
前記さらなる薬剤が、Toll様レセプター、特に、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、及び／又はTLR9の公知の阻害剤、特にTLR発現を阻害できる核酸又は核酸アナログ、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、又はRNA干渉分子である、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記さらなる薬剤が、トロンボモジュリンのN末端レクチン様ドメイン（D1）である、請求項６記載の使用。
【請求項１５】
前記さらなる薬剤が、折れ曲がり構造を有する合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子である、請求項６記載の使用。
【請求項１６】
前記合成二本鎖核酸又は核酸アナログ分子が、二本鎖ベント又は十字型DNA、PNA、又はDNA／PNAキメラ又はハイブリッドである、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
HMGB1誘導性及び／又は持続性の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、及び虚血再かん流傷害からなる群から選択されるHMGB1関連病変の治療のための活性成分として、K−252a及び／又はその塩若しくは誘導体の有効量を含み、かつ医薬として許容可能なキャリア、希釈剤、及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
前記HMGB1関連病変が、HMGB1の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変、及びHMGB1相同タンパク質の非アセチル化及び／又はアセチル化型と関連する病変である、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記HMGB1相同タンパク質が、HMGB2、HMGB3、HMG−1L10、HMG−4L、及び／又はSP100−HMGである、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記活性成分が、請求項６乃至１６のいずれか一項中で定義したとおりのさらなる薬剤と組み合わされる、請求項１７乃至１９のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２１】
K−252a及び／又はその塩若しくは誘導体が、医療デバイスの表面上に可逆的に固定されている、請求項１乃至１３のいずれか一項記載の使用。
【請求項２２】
K−252a及び／又はその塩若しくは誘導体が、医療デバイスの表面上にコーティングされているか、又は医療デバイスの表面に埋め込まれている、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記医療デバイスが、手術器具、インプラント、カテーテル、又はステントから選択される、請求項２１又は２２記載の使用。
【請求項２４】
K−252a及び／又はその塩若しくは誘導体で可逆的にコーティングされているか、及び／又はこれらが埋め込まれている、医療デバイス。
【請求項２５】
前記医療デバイスが、手術器具、インプラント、カテーテル、又はステントから選択される、請求項２４記載の医療デバイス。
【国際調査報告】
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