(57)【要約】  本発明は、選択された生物もしくはそのような生物の抽出物中に存在するプロセシング活性、または他の天然なプロセシング作用因子によって、天然に存在する生物分子の制御された天然バイオプロセシングを行う手順を対象とする。本発明は、これらの手順を開発する方法および上記手順によって調製された組成物も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆体から機能的生体分子を生成させる方法を開発するプロセスであって、
ａ．生成させる機能的生体分子を同定するステップと、
ｂ．前記機能的生体分子の中にある、機能に必要な属性を同定するステップと、
ｃ．前記機能に必要な属性を有する前駆体分子を含有する前駆体食品源を同定するステップと、
ｄ．前記機能に必要な属性を有する前記前駆体から遊離させるのに使用できる作用因子を同定するステップと
を含むプロセス。
【請求項２】
前記機能的分子が生理活性分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機能的分子が自己組織化／自己集合ができるバイオマテリアルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記機能的分子が、ペプチド、タンパク質、核酸重合体、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記機能的分子の中にある、機能に必要な化学的属性を同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記機能的分子の中にある、機能に必要な構造的属性を同定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆体食品源は食品である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記前駆体食品源が強化タンパク質源である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆体食品源が、コメ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、コーヒー、および乳からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記作用因子が細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記作用因子が、乳酸菌株およびビフィズス菌株からなる群から選択された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記作用因子が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記作用因子が、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、リパーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択された酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用因子がプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記機能的分子が、受容体に結合する生理活性分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
機能的生体分子が豊富な機能性食品を調製する方法であって、
ａ．生成させる機能的生体分子を同定するステップと、
ｂ．機能に必要な属性を有する前駆体分子を含有する前駆体食品源を取得するステップと、
ｃ．前記機能に必要な属性を含む化合物を前駆体分子から遊離させるのに使用できる作用因子を取得するステップと、
ｄ．前記前駆体食品源を前記プロセシング作用因子で処理して、前記前駆体分子から前記機能的生体分子を遊離させるステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記機能的生体分子が生理活性分子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能的生体分子が自己組織化／自己集合ができるバイオマテリアルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生理活性分子が、ペプチド、タンパク質、核酸重合体、またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記前駆体食品源が、コメ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、コーヒー、および乳からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前駆体食品源が食用タンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記作用因子が細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記作用因子が酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記作用因子が、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、およびリパーゼ、ならびにこれらの組合せからなる群から選択された酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記作用因子がプロテアーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチドを含む生理活性因子。
【請求項２７】
前記食品がコメである、請求項２６に記載の生理活性因子。
【請求項２８】
前記食品がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）である、請求項２６に記載の生理活性因子。
【請求項２９】
前記ペプチド配列が配列番号９を含む、請求項２６に記載の生理活性因子。
【請求項３０】
前記ペプチドが、前駆体分子からの遊離によって生成する、請求項２６に記載の生理活性因子。
【請求項３１】
前記ペプチドが、コメの中の前駆体分子からの遊離によって生成する、請求項２６に記載の生理活性因子。
【請求項３２】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３からなる配列群から選択された配列を含むペプチドを含む生理活性因子。
【請求項３３】
機能的分子を調製する方法であって、
ａ．生成させる機能的生体分子を同定するステップと、
ｂ．前記機能的生体分子の中にある、機能に必要な属性を同定するステップと、
ｃ．前記機能に必要な属性を有する前駆体分子を含有する前駆体食品源を同定するステップと、
ｄ．前記機能に必要な属性を含む化合物を前駆体分子から遊離させるのに使用できる作用因子を同定するステップと、
ｅ．前記前駆体食品源を前記プロセシング作用因子で処理して、前記機能に必要な属性を含有する分子を前記前駆体分子から遊離させるステップと
を含む方法。
【請求項３４】
プロセシングされた前記前駆体食品源から前記機能的生体分子を精製するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
プロセシングされた前記前駆体食品源中にある前記機能的生体分子を濃縮するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
高濃度の前記生体分子を含有する、プロセシングされた前記前駆体食品源の抽出物を調製するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロセシング作用因子が、前記生体分子を前記前駆体分子から遊離させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
消化された前駆体分子と、前記消化中に前記前駆体分子から遊離した生体分子とを含む食品産物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
[0001]１９９０年代のゲノミックス−プロテオミックス革命は、多数の小分子薬物および潜在的薬物の同定および設計をもたらした。多くの場合、これらの化合物は天然に存在しておらず、かつ、それらの多くが、毒性であるか、抗原性であるか、あるいは不適当な薬物動態学的特性を有するものであった。
【０００２】
[0002]多くの生理活性分子が、より大きな前駆体分子の部分として、食品中に天然に存在している。それらは一般的に摂取される食物の成分なので、そのような作用因子はヒトおよび動物にとって毒性がより少ないものである可能性が高い。これらの化合物をそれらの前駆体食品源から遊離させる方法を見出すことができたならば、食品の質を高めるのに、これらの分子を利用することができるであろうし、あるいは単離して、栄養物質または治療薬として用いることができよう。
【０００３】
[0003]例えば、ＰＹＹは、Ｙ２  Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の高親和性陽性アゴニストであり、疾患のなかでも、とりわけ肥満に用いる比較的新しいクラスの治療処置を代表するものである。ＰＹＹは、腸の特異的内分泌Ｌ細胞によって、食事のカロリー含量に比例して産生される天然ホルモンである。ＰＹＹは、視床下部の食欲回路を調節することによって、食欲および食物摂取を減少させることで機能する。この作用因子は、対象が９０分間の静脈注入を受けた２時間後に、肥満していても、肥満していなくても、カロリー摂取を３０％減少させることが示されている。それらの対象は、２４時間の累積カロリー摂取でも有意な減少を経験した。他の研究では、肥満個体が、より低レベルの循環ＰＹＹを有することが観察された。
【０００４】
[0004]本発明は、ＰＹＹなどの天然に存在する生理活性因子を単離する方法を提供し、結果として得られる発明性のある組成物自体を対象とする。本発明は、これらの方法を開発するプロセスも包含する。本発明のこれらの利点および他の利点、ならびに発明性のある追加の特徴は、本明細書に提示する本発明の説明から明らかとなろう。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]本発明は、機能的生体分子が豊富な機能性食品を産生する方法、それらの方法を開発する手順、およびそれらの方法で調製された組成物を提供する。この手順では、最初に、生成される機能的生体分子を同定する。次に、これらの生体分子の中にある、機能に必要な属性を、上記生体分子の構造と機能との間の相関を分析することによって同定する。次に、活性に必要な化学的属性および構造的属性をすべて備えた、このコンセンサスモチーフを含有する前駆体分子を、様々な前駆体食品源のゲノムデータベースを電子的に検索することによって同定する。潜在的前駆体分子および食品源が同定されたならば、上記前駆体分子から、機能に必要であると同定されたすべての属性を含有するより小さな化合物を遊離させるのに使用できる生物または酵素を同定するために、別のデータベース検索を行う。次に、上記プロセシング作用因子で前駆体を処理し、機能的生体分子を前駆体から遊離させることによって、機能的分子を生成させることができる。機能的分子には、生理活性分子またはバイオマテリアルが含まれ、その機能は、それぞれ生理活性、ならびに自己組織化および自己集合である。前駆体食品源には、食品もしくは食用タンパク質、またはそれらの混合物が含まれる。
【０００６】
[0006]このアプローチは、原料の栄養源と、摂取された機能性食品産物の栄養性および健康増進効果を強化する活性小分子をｉｎ  ｓｉｔｕで遊離させることのできる生物とを組合せる設計において、ゲノム情報を処理する新規な方法を提供する。
【０００７】
[0007]このために本発明は、前駆体食物またはタンパク質源から生理活性分子を生成させる方法を提供する。この方法は、生理活性分子を同定するステップと、上記生理活性分子の中にある、生理活性に必要な属性を同定するステップと、上記生理活性に必要な属性を有する前駆体分子を含有する前駆体食品源を同定するステップと、上記生理活性に必要な属性を含む化合物を前駆体分子から遊離させるのに使用できる作用因子を同定するステップと、上記前駆体食品源を上記プロセシング作用因子で処理して、それによって上記生理活性に必要な属性を含有する分子を上記前駆体分子から遊離させるステップとを含む。
【０００８】
[0008]この方法の別の態様では、上記生理活性分子が、ペプチド、タンパク質、および核酸重合体でありうる。
【０００９】
[0009]別の態様では、この方法は、上記生理活性分子の中にある、生理活性に必要な化学属性を同定するステップをさらに含む。
【００１０】
[0010]別の態様では、この方法は、バイオマテリアル中にある、高次構造への自己組織化／自己集合に必要な化学的属性を同定するステップをさらに含む。
【００１１】
[0011]別の態様では、この方法は、生理活性分子中にある、生理活性または自己組織化／自己集合に必要な位相的（二次元）属性および／または構造的（三次元）属性を同定するステップをさらに含む。
【００１２】
[0012]この方法の別の態様では、前駆体食品源を、コメ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、およびコーヒーなどの植物、乳、肉、ならびに同様のものから取得できる。
【００１３】
[0013]別の態様では、この方法は、細胞である作用因子を用いて生体分子を調製するステップを含み、上記細胞が、例えば、ラクトバシラス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（Ｌａ１）を含む乳酸菌、またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）（Ｂ１２９）などのビフィズス菌でありうる。
【００１４】
[0014]別の態様では、この方法は、酵素である作用因子を用いて生体分子を調製するステップを含む。
【００１５】
[0015]別の態様では、この方法は、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、もしくはリパーゼ、またはこれらの組合せなどの酵素である作用因子を用いて生体分子を調製するステップを含む。
【００１６】
[0016]本発明の別の態様では、上記生体分子が受容体に結合する。
【００１７】
[0017]本発明の特定の実施形態は、食品または食品タンパク質から生成された、ＬＮＬＶ［ＴＳ］［ＲＫ］Ｘ［ＲＫ］［ＹＦＷ］というアミノ酸配列を含むペプチドを含む生理活性因子を対象とし、配列中、Ｘは天然に存在するいかなるアミノ酸でもよく、かつ括弧は論理ＯＲ演算を示し、かつ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、Ｙは標準的なアミノ酸略記号である。
【００１８】
[0018]本発明の特定の実施形態では、機能物質が食品から単離され、かつ上記食品がコメである。
【００１９】
[0019]本発明の特定の実施形態では上記食品がイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）である。
【００２０】
[0020]特定の実施形態では上記生理活性因子が、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）アミロゲニンタンパク質ＲＧＰに由来するＹＳＣＲＹＦＧＹＬＶＳＫＫＫＹ（配列番号１）という配列、または食用植物であるイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に由来する、それに最も近い類似体ペプチド配列、すなわちＲＧＰ２タンパク質中にあるＨＳＣＲＹＦＧＹＬＶＳＲＫＫＹ（配列番号２）もしくはＲＧＰ１タンパク質中にあるＳＡＣＲＣＦＧＹＭＶＳＫＫＫＹ（配列番号３）、もしくはＢｉＰタンパク質中にあるＦＤＧＶＤＦＳＥＰＬＴＲＡＲＦ（配列番号４）という配列を含むペプチドまたはタンパク質である。
【００２１】
[0021]特定の実施形態では、上記生理活性因子が、ＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫ（配列番号５）、ＰＷＭＤＦＫ（配列番号６）、ＰＷＭＤＦＫＥＬＱＥＦＫ（配列番号７）、ＰＷＭＤＦ（配列番号８）、またはＶＷＥＫＰＷＭＤＦ（配列番号９）という配列を含むペプチドまたはタンパク質である。これらの配列はすべてイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のオリザシスタチンに由来する。
【００２２】
[0022]本発明の特定の実施形態では、上記機能物質が、前駆体分子からそれを遊離させることによって生成される。
【００２３】
[0023]本発明の特定の実施形態では、上記機能物質が、前駆体分子からそれを遊離させることによって生成され、上記前駆体分子はコメの中にある。
【００２４】
[0024]本発明のさらなる機能および利点は、以下の発明の詳細な説明に記載されており、それより明らかとなろう。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
[0025]本明細書では、生理活性分子およびバイオマテリアルという用語を両方とも、機能的生体分子であるとする。これら用語は、それらの特有の機能が考慮されている限り、互換的に使用できる。したがって、生理活性分子に関して本明細書中で記述する方法および組成物は、バイオマテリアルにも等しく適用される。
【００２６】
[0026]バイオマテリアルは、通常、自己組織化および自己集合できる分子と考えられている。したがって、バイオマテリアルは、それらの前駆体分子から遊離した際に、フィラメントおよびフィブリル、ヒドロゲル、界面活性物質、ならびにペプチドハイブリッドを形成できるペプチドでありうる。
【００２７】
[0027]本発明は、天然の食品源および食品タンパク質を用いて、生理活性ペプチド、タンパク質、または核酸重合体など、バイオマテリアルまたは生理活性分子が豊富な機能性食品を産生する方法を提供する。加えて、本発明は、そのように設計された食品にも関する。
【００２８】
[0028]一実施形態では、本発明は、天然に存在する生体分子、選択された生物もしくはそのような生物の抽出物中に存在するプロセシング活性、または他の天然のプロセシング作用因子で処理して強化食品を産生する天然のバイオプロセシング手順を開発する方法を対象とする。本発明は、上記手順によって調製できる様々な食品組成物、ならびにそれらを産生するための生理活性分子および方法も包含する。
【００２９】
[0029]生理活性分子の場合、上記方法は、概して、産生する生理活性分子を同定するステップと、上記生理活性分子の中にある、生理活性に必要な属性を同定するステップと、上記属性を有する前駆体分子を含有する前駆体食品源を同定するステップと、上記生理活性に必要な属性を含む化合物を前駆体分子から遊離させるのに使用できる１つまたは複数の作用因子を同定するステップとを含む。適当なプロセシング方法が同定されたならば、上記前駆体食品源を上記プロセシング作用因子で処理して、生理活性に必要な属性を含有する分子の遊離を引き起こすことによって、上記方法を実行することができる。
【００３０】
[0030]上記方法は、潜在的前駆体分子の存在量を評価するステップも含むことが望ましい。加えて、上記機能物質が前駆体タンパク質から得られる場合、上記方法は、それを遊離させるのに使用できるペプチダーゼと他の酵素または処理に対する、潜在的前駆体タンパク質の安定性の評価も含むことが好ましい。
【００３１】
[0031]機能物質は、望ましい活性を有するいかなる適当な生物分子、特にペプチド、タンパク質、核酸重合体、およびそれらの誘導体でもよく、それらは、脂質、糖、ペプチド、および核酸、またはこれらの組合せが結合していても良い。機能物質は、食品用タンパク質または他の農業供給源を含めた食品から、本発明の方法によって切り出すことができる。通常、望ましい生理活性分子は、標的受容体に特異的に結合し、食品のプロセシングによって得られる濃度で受容体を活性化または不活性化するであろう。機能物質の濃度が望ましい濃度より低い特定の実施形態では、選択された機能物質を、食品源中に濃縮することができる。あるいは、機能物質の濃度が上昇しているプロセシング済み食品の抽出物を調製できる。物質を部分的に、もしくは実質的に純粋な形態に精製するのに、複数の精製方法が使用できる。濃縮物または抽出物を調製する方法、および機能物質を精製する方法は、標的の機能物質の性質に応じて必然的に異なるが、これらの方法は当技術分野で周知であり、当業者ならば容易に実施することができる。
【００３２】
[0032]前駆体分子も、濃縮または精製し、処理して、生理活性分子を遊離させることができ、その後、それを望み通りに食品に添加して戻すことができる。
【００３３】
[0033]様々な方法を、生理活性分子中にある、生理活性に必要な属性を同定するために用いることができる。例えば、文献調査を用いることができ、ペプチド、タンパク質、または核酸重合体の構造における差異が、望ましい活性にどのように影響を与えるか判定し、さらにペプチドもしくはタンパク質活性物質中に存在する、保存されているすべてのアミノ酸、または糖質構造、ヌクレオチド、もしくは脂質などの他の構造を同定するための情報を集めることができる。加えて、しばしば変異導入によって差異を生成させることができ、この結果生じた化合物の活性を測定した。最終的に、活性の原因となるコンセンサスモチーフを得ることができる。コンセンサスモチーフは、生理活性分子中にある、生理活性に必要なすべての属性を含有していることが望ましいであろう。そして、コンセンサスモチーフは、活性があると知られている最も単純な分子骨格を規定する。上記分子骨格は、分子の中にある、活性に必要な化学的属性と、一次、二次、および三次構造要件などの構造的属性とを、グリコシル化、アシル化、および同様のものなどの修飾に加えて、含むことができる。
【００３４】
[0034]その後、生理活性に必要なすべての属性を有する分子を含有する前駆体食品源を同定することができる。そのような食品源は、例えばＥＮＳＥＭＢＬ（登録商標）、Ｎｅｓｔｌｅゲノムデータベース、ならびにコメ、ダイズ、トウモロコシ、ジャガイモ、コーヒー、および牛乳などの食物原料の公開ゲノムシーケンシングプロジェクトを含めたゲノム情報の大規模な集積において配列レベルおよび構造レベルの両方でコンセンサスモチーフの存在を検索することによって同定することができる。これらの食品源中に見出された前駆体分子は、望ましい生体分子の性質に応じて、タンパク質、ペプチド、または核酸重合体、およびその誘導体でありうる。好ましくは上記物質がペプチドである場合には、ＢＬＡＳＴを用いて短いほぼ正確な一致を検索することによって、および／またはＥＭＢＯＳＳパターンマッチングモジュールである「ｐａｔｍａｔｄｂ」を用いて短いほぼ正確な一致を検索することによって、そのような検索を行う。三次元構造モチーフが必要な場合には、当技術分野で知られている通り、構造予測ソフトウェアを用いて、これらの構造は見つけることができる。
【００３５】
[0035]この方法によって、多数の潜在的前駆体分子を同定できると想定されている。そのような場合、望ましい物質を適当な量産生するであろう前駆体を同定するために、前駆体分子の存在量を測定することが望ましい場合がある。
【００３６】
[0036]あるいは、上記生体分子を調製するのに、コンセンサスモチーフを含有する食品タンパク質を取得し、使用することができる。
【００３７】
[0037]その後、遊離された化合物が生理活性に必要なすべての属性を含有するように、前駆体分子から化合物を遊離させるのに使用できる１つまたは複数のプロセシング作用因子を同定することができる。選択される作用因子は、当然ながら、遊離される機能物質の性質と、機能物質がその中に存在する基質の特徴とによるであろう。潜在的な作用因子には、微生物、微生物の抽出物、タンパク分解酵素、解糖酵素、核酸分解酵素、脂肪分解酵素、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、および化学物質が含まれる。一部の事例では、共生細菌などの細胞のゲノムレパートリーで、これらの活性を見出すことができる。
【００３８】
[0038]プロテアーゼが必要な場合には、適切な酵素活性を同定するのに、ＥｘＰＡＳｙウェブサイトによって提供されている、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒと呼ばれる自動サービス、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＥＭＢＯＳＳのＤＩＧＥＳＴモジュール、および／またはＭＥＲＯＰＳプロテアーゼデータベースを用いることができる。知られている通り、知識依存アルゴリズムであるＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒは、２０超の異なったプロテアーゼによって生じる、タンパク質配列上の切断部位を同定するのに使用できる（Ｋｅｉｌ，Ｂ．、Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）。
【００３９】
[0039]ある特定の方法は、機能物質をその基質から遊離させるのに微生物を利用する。プロテアーゼ活性などの望ましい活性を含有する微生物を同定するために、有用であると考えられる酵素の配列を既知の細菌ゲノムと比較して、それらのゲノムにある類似のプロテアーゼ配列を同定することができる。例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ１２９）ゲノムは、プロテアーゼまたはペプチダーゼとしてアノテートされている７４のタンパク質配列を含有している。それらの１つはＡｒｇ−Ｃプロテイナーゼに対して高い類似性を有しており、その切断の結果は、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒモデルによってコンピュータ予測することができる。したがって、生理活性因子を供給源から遊離させる際に使用するための潜在的活性としてＡｒｇ−Ｃプロテイナーゼ活性が同定された場合、その配列を含有している細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ１２９）を使用することができよう。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ１２９）ゲノムは、セドリシンとの類似性が高い配列も有する。前駆体食品源から生理活性物質を遊離させるのに、両方の活性が有用であろう状況で、この細菌を用いることができる。この方法は、他の酵素活性でも等しく適用できる。
【００４０】
[0040]あるいは、関与する酵素の性質に関する特別な知識なしに、共生細菌株の活性を同定し、利用することができる。少なくともプロテアーゼに関しては、細胞内および細胞外両方の活性プロファイルが報告されている。同様に、最も有望な株を選択するために、解糖活性、核酸分解活性、および脂肪分解活性をスクリーニングし、ＮＣＣ細菌コレクション全体を評価することができる。
【００４１】
[0041]両者、すなわち前駆体分子が食品源中に同定され、機能物質を遊離させるためのプロセシング作用因子が同定されたならば、食品源をプロセシング作用因子で処理して、コンセンサスモチーフを含有する分子を前駆体分子から遊離させることによって、上記方法は実施することができる。食品源は、単一の発酵または処理で機能物質を遊離させるのに十分な作用因子で処理することが好ましい。しかし、複数のプロセシング作用因子が必要であり、かつ、それらが相互に両立しないものであるか、あるいは使用するのに異なった環境を必要とする場合には、複数のプロセシングステップを行うことができる。
【００４２】
[0042]機能物質は、タンパク質またはペプチド配列由来のものでよい。そのような場合、前駆体分子は、例えば、知られているすべての植物の発現配列タグおよび生理活性因子の配列を含有するタンパク質を検索することによって同定できる。公開されている構造と活性との相関関係の分析によって、そして、知られているすべての類似配列の配列アラインメントによって、配列中の可変アミノ酸もしくは重要でないアミノ酸と、重要なアミノ酸とを同定することができる。より大きな前駆体タンパク質中にあるコンセンサスモチーフを同定するために、このコンセンサスモチーフを用いて、知られているすべての植物タンパク質を含有するデータベースを探索することができる。同定された前駆体の中にある、生理活性因子の活性に必要な構造をとるであろう内部配列を同定するために、三次構造のコンピュータ評価を使用することもできる。これは、当技術分野で周知な標準法を用いて実施できる。例えば、ペプチド配列が既知な三次元構造によく類似している場合には、相同性モデリングを用いることができる。ペプチド配列が既知構造から、より離れている場合には、フォールド認識法を用いることができる。上記生理活性因子の受容体の三次元構造情報が利用可能である場合には、同定された配列を、知られている様々なモデリング技法によって分析して、予測されたそれらの構造が受容体に結合する可能性が高いか否か判定することができる。そして、前駆体タンパク質のリストの評価を行う。そして、前駆体分子が、生物学的に適切な量の機能物質を前駆体から調製するのを可能にするのに十分なほど豊富であるかどうか判定するために、種子および作物で異なって発現している遺伝子を示すマイクロアレイなど、既知な方法によって分析することができる。加えて、標的生理活性因子を遊離する素質を評価するために、プロテアーゼに対する前駆体分子の感度を測定することもできる。同定されたペプチド配列のペプチド合成を行うことができ、その後、そのペプチドの活性を試験することができる。
【００４３】
[0043]典型的な一実施形態では、生理活性ペプチドであるＰＹＹ３−３６のアナログの産生を選択することができる。この化合物は、サブタイプＹ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５として存在するＧＰＣＲペプチドホルモン受容体Ｙのリガンドである。上記受容体は、満腹感および空腹感の調節に関与している。ＰＹＹ３−３６ペプチドは、約０．５ｎＭの濃度で、その標的受容体であるＹ１およびＹ２を活性化する。この方法は、例えば、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、およびメラノコルチンなど、糖尿病および肥満などの疾患に対する他の調節ペプチドの同定および産生にも有用であろう。
【００４４】
[0044]以下に、限定ではなく例として、本発明の実施例を記述することができる。
【００４５】
実施例１
[0045]この実施例は、ＰＹＹ３−３６に類似した陽性アゴニスト活性を有する生理活性因子の調製を示すものである。ＰＹＹ３−３６は、サブタイプＹ１、Ｙ２、Ｙ４、およびＹ５として存在するＧＰＣＲペプチドホルモン受容体Ｙのリガンドである。上記受容体は、満腹感、空腹感、および血圧の調節に関与している。このペプチドは、約０．５ｎＭの濃度で、その標的受容体であるＹ１およびＹ２を活性化する。
【００４６】
最も単純な生理活性分子骨格の決定：
[0046]広範な文献調査を行い、それを用いて、ＰＹＹ３−３６ペプチドのＣ末端部分にある短い配列のみが、食欲調節と、同系の受容体への結合とに必須であることを判定した。この配列セグメント周囲の変異が公表されている。公表された配列のいくつかを集め、下記表１に示す。表１中、太字のアミノ酸は、ＰＹＹ３−３６の最も単純かつ生理活性を有する骨格を構成する高度に保存されたアミノ酸である。
【００４７】
[0047]ＮＭＲ構造決定法は、ＰＹＹ３−３６ペプチドがＰＰ−ターン型またはＰＰ−フォルド型として知られている極めて独特な三次元形態をとっていることを示した。Ｎ末端領域は構造化されておらず、Ｃ末端領域は独特のαヘリックス構造を形成する。天然なＰＹＹ３−３６リガンドペプチドの潜在的ホモログを見出すために、この情報を用いて、類似した配列および三次構造を有するペプチドを同定した。
【００４８】
[0048]この検索は、ＥＭＢＯＳＳの「ｐａｔｍａｔｄｂ」を使用し、ＰＹＹ３−３６のＣ末端断片の化学的性質を最もよく再現する以下のパターン、すなわち、ＸＸＸ［ＲＫ］Ｘ［ＹＦＷ］ＸＸＸＸ［ＴＳ］［ＲＫ］Ｘ［ＲＫ］［ＹＦＷ］を用いて行った。興味深いことに、様々な植物ゲノムに存在する何十個もの一致した断片が同定された。そのうちのいくつかの例を表１に示す。標的断片の必要なαヘリックス構造の存在は、ペプチド構造予測ソフトウェアを用いて確認した。
【００４９】
【表１】
2008515841.tif 000002
【００５０】
ＰＹＹ２２−３６アナログについて同定されたヒット：
[0049]表１は、ＥＭＢＯＳＳプログラムを用いた既知なＥＳＴの検索から得られた３つの潜在的生理活性ペプチドも同定する。これらの配列には、アミロゲニンタンパク質に由来する２つのペプチドが含まれる。すなわち、１つはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来（ＡｔＲＧＰ２）であり、もう１つはイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）由来（ＯｓＲＧＰ１）である。もう１つの潜在的ペプチド配列は、イネの結合タンパク質（ＯｓＢｉＰ）に由来するものであった。
【００５１】
[0050]アミロゲニンは、植物におけるデンプン生合成に関与していると考えられており、可逆的糖化タンパク質（ＲＧＰ）としても知られている。シロイヌナズナ種子のマイクロアレイおよび微生物学的データの解析は、このタンパク質が種子および根で豊富なタンパク質であり、かつほとんど植物ゴルジ膜にのみ局在していることを示す。ＢｉＰ、すなわち結合タンパク質は、環境ストレスに対する作物の耐性を強化するのに関与している。微生物学的データは、ＢｉＰ合成が、作物における活性貯蔵タンパク質の発生と同調していることを示す。
【００５２】
[0051]タンパク質ＡｔＲＧＰ２、ＯｓＲＧＰ１、およびＯｓＢｉＰから得られたペプチドを５ｍｇの量合成し、約９０％超の純度まで精製した。これらのペプチドのＧＰＣＲ受容体への結合を、ＰＹＹ２２−３６に対する競合的結合アッセイで試験した。
【００５３】
標的生理活性分子骨格の同定。Ｎｅｓｔｌｅの共生細菌ゲノムレパートリーにおける適切なタンパク質分解酵素の探索：
[0052]ＰＹＹ３−３６アナログを遊離できるであろうプロテアーゼを同定するために、ＥｘＰＡＳｙウェブサイトによって無料で提供されている、「ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒ」と呼ばれる自動サービスと、バイオインフォマティクスソフトウェアパッケージＥＭＢＯＳＳのモジュールＤｉｇｅｓｔとを用いた。生理活性因子をその天然基質から遊離させることができるであろう活性を有するとして、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼおよびセドリシンを同定した。高度に類似した配列が存在するかどうか調べるために、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒ、ＭＥＲＯＰＳ、およびＤｉｇｅｓｔで使用したプロテアーゼの配列を、いくつかの細菌ゲノムと比較した。例えばビフィドバクテリウム・ロンガムゲノムには、７４のタンパク質配列がプロテアーゼまたはペプチダーゼとしてアノテートされている。それらのうち、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼに類似していること判明したのは１つのみであり、その切断結果は、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒモデルによってコンピュータ予測可能である。Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ活性のみでは必要な活性ペプチドを産生することができなかった。しかし、ビフィドバクテリウム・ロンガムゲノム中には、セドリシンに類似した配列が同定された。ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるこれら２つのプロテアーゼの組み合わされた活性は、イネ前駆体タンパク質を、望ましいＰＹＹホモログにプロセシングできることが示された。
【００５４】
生理活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ試験：
[0053]サブタイプＹ１、Ｙ２、およびＹ３の受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体ベーススクリーニングを、当技術分野で知られているプロトコールに従って行った（Ｍｕｎｏｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０７、７７（１９９５年）、Ｆｕｈｌｅｎｄｏｒｆら、ＰＮＡＳ８７、１８２（１９９０年））。ＯｓＢｉＰ、ＺｍＲＧＰ１、およびＡｔＲＧＰ１のスクリーニングを、上述の通り既知な方法を用いてＹ２−ＧＰＣＲに関して行い、内因性リガンドであるＰＹＹ２２−３６配列の結合を阻害するパーセンテージとして活性を測定した。ＰＹＹ２２−３６配列はポジティブコントロールとして用いた。試験されたペプチドのうち、ＡｔＲＧＰ１タンパク質由来のものは、ＰＹＹ２２−３６ペプチドおよびＯｓＢｉＰペプチドの両方を濃度１０μＭで結合アッセイに用いた際に、ＰＹＹ２２−３６の結合を２０〜４０％阻害することができた。コメタンパク質ＯｓＲＧＰ２中に見出された、シロイヌナズナタンパク質ＡｔＲＧＰ１由来のペプチドに近いアナログは、化学的に同等な１アミノ酸の相違を有するのみであり、同様な活性を有するにちがいないと予測される。この技法を用いて、ＯｓＢＩＰタンパク質も、Ｙ２受容体に結合することが示された。ラット結腸細胞を培養して組織ベースのｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングを、Ｄｕｍｏｎｔら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３８、３７（１９９３年）などに記載の既知なプロトコールに従って実施できる。
【００５５】
実施例２
[0054]この実施例は、ＣＣＫ−Ｂサブタイプ受容体へのペプチドＣＣＫ−４活性化物質の作用を阻害する生理活性因子の調製を示す。ＣＣＫ−８およびＣＣＫ−４ペプチドは、ＡおよびＢという少なくとも２つのサブタイプで存在する、ＧＰＣＲペプチドホルモン受容体であるＣＣＫのリガンドである。ＣＣＫ受容体サブタイプＡは、腸で発現しており、満腹感および空腹感の調節に関与していると考えられている。ＣＣＫ受容体サブタイプＢは、ガストリン受容体としても知られており、胃酸の分泌、ならびに胃潰瘍および癌などの疾患状態の発症に関与していると考えられている。ＣＣＫ−Ｂ受容体のアンタゴニストは、これらの状態を治療するのに使用できる。
【００５６】
最も単純な生理活性分子骨格の定義：
[0055]アンタゴニスト設計の一般的戦略は、陽性アゴニストを模倣すること、およびアンタゴニストが結合部位を占めるように、同系の受容体への結合を促進する分子構造変化を導入し、それによって、アゴニスト結合を阻止することである。広範な文献調査および配列比較を用いて、ヒトＣＣＫペプチドのＣ末端部分における短い配列のみが受容体結合に必須であることを決定した。この情報の概要を表２に提示する。表２中、太字のアミノ酸は、ＣＣＫペプチドの最も単純かつ生理活性な骨格を構成する高度に保存されたアミノ酸である。
【００５７】
[0056]この検索は、ＥＭＢＯＳＳの「ｐａｔｍａｔｄｂ」を使用し、ＣＣＫペプチドのＣ末端断片の化学的性質を表す以下のパターン、すなわち、Ｐ［ＹＦＷ］Ｘ［ＤＥ］［ＹＦＷ］を用いて行った。様々な植物ゲノムに存在する何十個もの一致した断片が同定された。そのうちのいくつかの例を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2008515841.tif 000003
【００５９】
同定されたヒット：
[0057]表２は、ＥＭＢＯＳＳプログラムを用いた、既知なＥＳＴの検索から２つの潜在的生理活性ペプチドも同定する。これらの２つの配列には、生物イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のオリザシスタチンタンパク質に由来する２つの断片ペプチドが含まれる。
【００６０】
[0058]オリザシスタチンは、システインプロテイナーゼ阻害タンパク質である。文献の分析は、このタンパク質がコメ作物で大量に産生されること、およびこのタンパク質が、作物１キログラムあたり１ｍｇのタンパク質にまで達しうるであろうことを示した。ペプチドＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫ、ＰＷＭＤＦＫ、およびＰＷＭＤＦＫＥＬＱＥＦＫを５ｍｇの量に合成し、約９０％超の純度まで精製した。これらのペプチドのＣＣＫ−Ｂ  ＧＰＣＲ受容体への結合を、ＣＣＫ−８に対する競合的結合アッセイで試験した。
【００６１】
標的生理活性分子骨格の同定。適切なタンパク質分解酵素の探索：
[0059]コメ（イネ）由来の活性断片を生成させるのには、トリプシンまたはカルボキシペプチダーゼなどの市販のタンパク質分解酵素が使用されている。
【００６２】
生理活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験：
[0060]サブタイプＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂの受容体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体ベーススクリーニングを、当技術分野で知られているプロトコールに従って行った。ＣＣＫ−ＡおよびＣＣＫ−Ｂ  ＧＰＣＲ上での、ペプチドＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫ、ＰＷＭＤＦＫ、およびＰＷＭＤＦＫＥＬＱＥＦＫの結合活性を、内因性リガンドであるＣＣＫ−８配列の結合を阻害するパーセンテージとして活性を測定した。このアッセイでは、ＣＣＫ−８配列をポジティブコントロールとして用いた。結果は、ペプチドＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫ、ＰＷＭＤＦＫ、およびＰＷＭＤＦＫＥＬＱＥＦＫが、１０μＭの濃度で、ＣＣＫ−Ｂ受容体へのリガンドＣＣＫ−８の結合を、それぞれ２７％、１６％、および５％阻害したことを示した。試験されたペプチドは、１０μＭという高い濃度でも、ＣＣＫ−Ａ受容体を活性化しなかった。これはおそらく、ＣＣＫ−Ａ受容体にアゴニストとして作用するのに必要な化学修飾であるスルホン化が不足していたためである。
【００６３】
[0061]加水分解物は、イネから単離されたオリザシスタチンタンパク質を組換え発現させ、精製したものから生成させた。各試料１０ｍｇを加水分解するのに、標準条件を用いて、トリプシンを使用した。第１のスクリーニングで、２つのペプチド、すなわちＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫおよびＰＷＭＤＦＫペプチドが最も高い活性を示したので、これらのペプチドを、これらの加水分解物から同定し、精製した。再び、加水分解物および精製された２つのペプチドを、受容体ベースのスクリーニングにかけた。加水分解物はそれ自体で、加水分解物濃度１００μＭで、ＣＣＫ−Ｂ受容体へのＣＣＫ−８の結合を２１％阻害した。一方、精製されたペプチドであるＶＷＥＫＰＷＭＤＦＫおよびＰＷＭＤＦＫは、濃度１０μＭで、ＣＣＫ−８の結合を１６％および１４％阻害した。
【００６４】
[0062]Ｃ末端リジン残基の除去によって生じるペプチドＶＷＥＫＰＷＭＤＦおよびＰＷＭＤＦの取得を目標として、トリプシンおよび限定的カルボキシペプチダーゼ消化の併用逐次作用による、加水分解の最終最適化を行った。これらのペプチド中に豊富な加水分解物は、ＣＣＫ−Ｂ受容体へのリガンドＣＣＫ−８の結合にさらに高い阻害を示し、この阻害は、活性ペプチドの濃度が１０μＭのときに３８％にまで達した。これと比較して、トリプシン処理をしていない場合には、１０倍高い濃度である１００μＭで２１％であった。
【００６５】
[0063]トリプシン消化は、２００μｌのオリザシスタチンタンパク質（２ｍｇ）に、９６ｍｇの尿素を添加し、尿素が溶解するまで、室温でインキュベートすることによって行った（最終濃度約４Ｍの尿素）。この尿素溶液に、１００ｍＭの重炭酸アンモニウムを含む１ｍＭのＣａＣｌ２  ９００μｌを添加し、続いて、１２０μｌのアセトニトリルを添加した。４０μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａシーケンシンググレードトリプシン４０μｇを含むＰｒｏｍｅｇａ再懸濁バッファー）を添加し、この溶液を３７℃で終夜インキュベートした。第２アリコートのトリプシン１０μｇを添加し、それに続いて、３７℃で３ｈインキュベートした。
【００６６】
[0064]オリザシスタチン消化溶液の５０％を、Ｃ１８逆相物質を用いた固相抽出法による脱塩用に−２０℃で保存し、オリザシスタチン消化溶液の５０％をカルボキシペプチダーゼ消化した。
【００６７】
[0065]カルボキシペプチダーゼＹ消化は、オリザシスタチンのトリプシン消化溶液７２０μｌ（約１ｍｇ）に、１０％アセトニトリルを含む、ｐＨ５の２００ｍＭ酢酸緩衝液１０８０μｌを添加して行った。１００μｇのカルボキシペプチダーゼＹ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、カルボキシペプチダーゼＹ溶液は３日前に調製した。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社によればこの溶液は１週間保存できる）を添加し、この溶液を室温で３０分間インキュベートし、続いて、１％のギ酸９１０μｌを添加した。
【００６８】
[0066]各試料のうち少量の画分をナノＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳＭＳによって特性分析した。
【００６９】
[0067]両方の試料とも、５００μｌのＣ１８固相抽出カラムを用いて脱塩した。洗浄溶液として０．１％ギ酸を用い、溶離溶液として８０％アセトニトリル／０．１％ギ酸を用いた。
【００７０】
[0068]本明細書に記載した現在好ましい実施形態への様々な改変および修正は、当業者にとっては明らかなものであろうと理解されよう。本発明の精神および範囲から逸脱せずに、また意図された利点を減弱せずに、そのような改変および修正を加えることができる。したがって、そのような改変および修正も、添付した特許請求の範囲に包含されているものとする。
【配列表】
2008515841000001.app
【国際調査報告】
2008515841.tif 000004
2008515841.tif 000005
2008515841.tif 000006
2008515841.tif 000007
2008515841.tif 000008
2008515841.tif 000009