(57)【要約】本発明は、ＣｒｇＥタンパク質を利用してスクリーニングする方法およびｃｒｇＥを発現するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌を利用してスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、ｃｒｇＲ遺伝子および／またはｃｒｇＥ遺伝子がノックアウトされている細菌を提供する。本発明はまた、Ｓｐｙ１５４２（ｃｒｇＥ）をコードするポリペプチドを含む融合タンパク質、およびＣｒｇＥを含有する薬学的組成物を提供する。
2008514196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣｒｇＥおよび／またはＣｒｇＲの発現がノックアウトされている、連鎖球菌属の細菌。
【請求項２】
前記細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓである、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）配列番号２もしくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号２もしくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５】
ＣｒｇＥまたはＣｒｇＲを含む、融合タンパク質。
【請求項６】
ＣｒｇＥポリペプチドの基質に結合できない、変異体ＣｒｇＥポリペプチド。
【請求項７】
治療におけるＣｒｇＥの使用。
【請求項８】
移植片拒絶を予防および／または処置する方法であって、
移植片拒絶の危険性がある被験体にＣｒｇＥを投与する工程
を包含する、方法。
【請求項９】
移植片拒絶の予防および／または処置のための医薬の製造における、ＣｒｇＥの使用。
【請求項１０】
アジュバントとしてのＣｒｇＥの使用。
【請求項１１】
ワクチン接種を増強する方法であって、
ワクチンおよびＣｒｇＥの両方を被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
試験化合物がＣｒｇＥポリペプチドの発現をダウンレギュレートするか否かを決定するための方法であって、
（ａ）試験化合物とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌とを接触させて混合物を形成する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートして該化合物と該細菌とを相互作用させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドの発現がダウンレギュレートされるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
試験化合物がＣｒｇＥポリペプチドまたはＣｒｇＲポリペプチドに結合するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）該試験化合物と該ポリペプチドとを接触させて混合物を形成する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートして該化合物と該ポリペプチドとを相互作用させる工程；および
（ｃ）該化合物と該ポリペプチドとが相互作用するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
試験化合物がＣｒｇＥポリペプチドまたはＣｒｇＲポリペプチドの酵素活性を阻害するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）該試験化合物と、該ポリペプチド、および該ポリペプチドによって触媒される酵素反応についての基質とを接触させる工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートして該化合物と該ポリペプチドと該基質とを相互作用させる工程；ならびに
（ｃ）該ポリペプチドの酵素活性による該基質の改変が該試験化合物によって阻害されるか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法によって同定される、化合物。
【請求項１６】
ＣｒｇＥポリペプチドまたはＣｒｇＲポリペプチドを発現する細菌を検出するための方法であって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌と、ＣｒｇＲに特異的な抗体またはＣｒｇＥに特異的な抗体とを接触させる工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートして該抗体と該細菌とを相互作用させる工程；および
（ｃ）該細菌に対する該抗体の結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
ＣｒｇＥポリペプチドまたはＣｒｇＲポリペプチドを発現する細菌を検出するための方法であって、
（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌と、ＣｒｇＲに特異的な第１の抗体またはＣｒｇＥに特異的な第１の抗体とを接触させる工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートして該第１の抗体と該細菌とを相互作用させる工程；
（ｃ）該混合物と、該第１の抗体に特異的な標識した第２の抗体とを接触させる工程；および
（ｄ）該第１の抗体に対する該標識した第２の抗体の結合を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
ＣｒｇＥまたはそのホモログを含有する、薬学的組成物。
【請求項１９】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
医薬としての請求項１８または請求項１９に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、ＣｒｇＥの使用。
【請求項２２】
哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であって、
請求項１８または請求項１９に記載の組成物の有効量を投与する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）の殺菌活性を阻害し得る、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓによって分泌されるタンパク質の同定および特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００３】
抗菌活性を有するペプチドは、天然全体に見出される。哺乳動物において、カテリシジンファミリー（遺伝子にコードされた抗生物質の一クラス）に属する抗菌ペプチドは、細菌の細胞膜と相互作用することによって、種々の微生物病原体に対する生得的な防御障壁を提供し得ることが示されている［１］。カテリシジンは、１２〜１００アミノ酸の低分子であり、そして多くの特性をディフェンシンと共有する。それらは、Ｎ末端シグナルペプチド、高度に保存されたプロ配列（ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）および構造的に可変であるＣ末端成熟ペプチドからなる前駆体として産生される。不活性な前駆体分子のタンパク質分解性の切断は、上記成熟Ｃ末端抗菌ペプチドを放出させ、この切断は、活性化好中球の脱顆粒の際に、エラスターゼまたはプロテイナーゼ−３によって達成される。約３０種の異なるカテリシジンが記載されているが、現在までに１種（ＬＬ−３７）のみが、ヒトにおいて同定されており［２］、そして１種（ＣＲＡＭＰ）が、マウスにおいて同定されている［３］。上記ヒトおよびマウスのペプチドは、生体膜との有利な相互作用を促すカチオン性特性および両親媒性特性を共有する。ＬＬ−３７と負に荷電した膜との相互作用は、「絨毯様（ｃａｒｐｅｔ−ｌｉｋｅ）」の機構を介する洗浄剤様の効果を示唆する［４］。しかし、他の実験は、脂質二重層破壊についてのドーナツ孔機構を支持する［５］。
【０００４】
ＬＬ−３７およびＣＲＡＭＰは、両方とも、Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）に対して非常に有効であることが示されている。Ａ群連鎖球菌は、咽頭または皮膚においてコロニー形成し、そして多くの化膿性感染および非化膿性続発症を引き起こすグラム陽性の細胞外病原菌である［６］。ＬＬ−３７およびＣＲＡＭＰの増加した発現が、無菌切開後のヒトおよびマウスの皮膚、またはＡ群連鎖球菌による感染後のマウスにおいて記載された。カテリシジンは、創傷、および気道の粘膜上皮において検出されているように、微生物病原体に直接曝された細胞において生じる［６］。最初に、ＬＬ−３７は、ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）から単離された［２］。抗菌活性に加えて、カテリシジンは、数種の他の機能（例えば、プロテオグリカン発現の誘導［７］、好中球の遊走および走化性の活性に対する効果［８］、アポトーシスの誘導［９］、有糸分裂誘発および新脈管形成（ａｎｇｉｏｎｅｓｅｓｉｓ）［１０］）を有すると記載されている。さらに、ＬＬ−３７およびＣＲＡＭＰの両方は、口腔の広スペクトル防御に寄与する唾液の系（いくつかの口腔上皮、および唾液）に存在する［１１および１２］。
【０００５】
最近の研究において、Ｇａｌｌｏおよび共同研究者は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの推定上のＧｎｔＲ様転写性抑制遺伝子（カテリシジン耐性遺伝子調節因子についてｃｒｇＲ）の不活性化がＣＲＡＭＰに対する耐性を誘発することを示し、そしてインビボで増加したビルレンスを示す証拠を提示した［１３］。このグループは、Ｃｎｌｐについてヌルのトランスジェニックマウスを作製することによって、ＣＲＡＭＰ発現がＧＡＳの皮膚感染を制御することに必須であることを明確に示した。特に、野生型マウス、ヘテロ接合ヌルマウスおよびホモ接合ヌルマウスにおけるカテリシジン感受性ＧＡＳの同一の注射後に、ＣＲＡＭＰ欠損マウスは、ずっと大きい病変を発現すると報告された。補完的な実験アプローチにおいて、ＣＲＡＭＰ耐性変異体が、野生型と比較され、これは、マウスにおいて壊死性の皮膚感染をもたらす能力の増加を示した［１３］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ｃｒｇＲの作用様式は、未知であった。さらに、ｃｒｇＲが作用する遺伝子およびコードされるタンパク質は、未知であった。したがって、ｃｒｇＲによってコードされるタンパク質を解明すること、およびこのタンパク質の作用方法を見出すことが、本発明の目的である。ｃｒｇＲによってコードされるタンパク質の新規な用途を提供すること、およびＣＲＡＭＰ／ＬＬ−３７に対して耐性を有する細菌によって引き起こされる細菌感染を処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
（ｃｒｇＥ遺伝子の同定）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの遺伝子ｃｒｇＲは、ｃｒｇＥと称される遺伝子の調節を担うことが、見出された。さらなる実験は、ｃｒｇＥ遺伝子がオープンリーディングフレームｓｐｙ１５４２にマッピングされること、およびこの遺伝子によってコードされるタンパク質がカテリシジンに対する耐性を与えることを示した。
【０００８】
したがって、本発明は、このタンパク質を利用してスクリーニングする方法およびｃｒｇＥを発現するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌を利用してスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、ｃｒｇＲ遺伝子および／またはｃｒｇＥ遺伝子がノックアウトされている細菌を提供する。本発明はまた、ｓｐｙ１５４２（ｃｒｇＥ）によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０００９】
（ノックアウト細菌）
本発明は、ＣｒｇＲおよび／またはＣｒｇＥの発現がノックアウトされている連鎖球菌属の細菌を提供する。好ましくは、上記細菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓである。ｃｒｇＲのノックアウトは、ＣｒｇＥ発現の抑制解除を生じ、それによって、ＣＲＡＭＰ／ＬＬ−３７耐性の表現型を生じる。対照的に、ｃｒｇＥのノックアウトは、ＣＲＡＭＰ／ＬＬ−３７感受性の表現型を生じる。ｃｒｇＲおよびｃｒｇＥの両方のノックアウトは、ＣＲＡＭＰ／ＬＬ−３７感受性の表現型を生じる。
【００１０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１の公開されたゲノムに由来するｃｒｇＲのヌクレオチド配列が、本明細書中で配列番号１として記載される。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１の公開されたゲノムに由来するｃｒｇＥのヌクレオチド配列が、本明細書中で配列番号３として記載される。当業者は、配列相同性および遺伝的環境に基づき、当該分野で公知である方法を使用して、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ株におけるｃｒｇＲ遺伝子およびｃｒｇＥ遺伝子を容易に同定し得る。さらに、当業者は、配列相同性および遺伝的環境に基づき、当該分野で公知である方法を使用して、他の連鎖球菌属の株におけるｃｒｇＲ遺伝子およびｃｒｇＥ遺伝子を容易に同定し得る。このような同定を補助するのに有用なマーカーは、ａｒｃＢおよびｓｐｙ１５４３であり、ａｒｃＢおよびｓｐｙ１５４３は、それぞれ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ中のｃｒｇＥ遺伝子に、この遺伝子の５’末端および３’末端にて隣接する。
【００１１】
遺伝子ノックアウトのための技術は、周知であり、連鎖球菌属のノックアウト変異体が、先に報告されている（例えば、参考文献１４）。
【００１２】
上記ノックアウトは、好ましくは対立遺伝子交換による遺伝子置換変異誘発を使用して達成される［１５］が、任意の他の適切な技術（例えば、プロモータの欠失または変異、開始コドンの欠失または変異、アンチセンス阻害、抑制性ＲＮＡ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）など）が使用され得る。しかし、得られる細菌において、ｃｒｇＲおよび／もしくはｃｒｇＥの遺伝子産物をコードするｍＲＮＡは存在せず、そして／またはその翻訳は、（例えば、野生型レベルの１％未満まで）阻害される。
【００１３】
上記細菌は、ノックアウトされた遺伝子の代わりにマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含み得る。
【００１４】
（ポリペプチド）
ｃｒｇＲによってコードされるポリペプチドが、配列番号２に記載される。ｃｒｇＥによってコードされるポリペプチドが、配列番号４に記載される。
【００１５】
本発明は、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、（ａ）配列番号２もしくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列と配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｂ）配列番号２もしくは配列番号４から選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含むアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。上記配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。上記フラグメントは、好ましくは上記参照配列由来の７個以上（例えば、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個、３２個、３４個、３６個、３８個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個またはそれ以上）連続したアミノ酸を含む。他の好ましいフラグメントは、そのＮ末端配列を有さない（例えば、Ｎ末端から、３５個〜４０個（例えば、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個）のアミノ酸を欠く）ポリペプチドである。より好ましくは、３８個のＮ末端アミノ酸が、欠失している。本発明はまた、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基を有さないポリペプチドを提供する。
【００１６】
配列番号２に記載されるポリペプチド、そのフラグメントおよびホモログは、本明細書中で以下、ＣｒｇＲと称される。配列番号４に記載されるポリペプチド、そのフラグメントおよびホモログは、本明細書中で以下、ＣｒｇＥと称される。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、種々の手段（例えば、化学合成（少なくとも部分的に）、プロテアーゼを使用してより長いポリペプチドを消化すること、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物（例えば、組換え発現またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ培養物）からの精製など）によって調製され得る。
【００１８】
ポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態または実質的に単離された形態（すなわち、他の連鎖球菌タンパク質または宿主細胞タンパク質から実質的に遊離している）で調製される。一般に、上記ポリペプチドは、天然に存在しない環境において提供される（例えば、それらのポリペプチドは、そのポリペプチドの天然に存在する環境から隔てられる）。特定の実施形態において、上記ポリペプチドは、コントロールと比較してそのポリペプチドが濃縮されている組成物中に存在する。そのようなものとして、精製されたポリペプチドが提供され、精製されたとは、そのポリペプチドが、他の発現したポリペプチドを実質的に含まない組成で存在することを意味し、実質的に含まないとは、その組成のうちの５０％未満、通常では３０％未満、より通常では１０％未満が、他の発現したポリペプチドから構成されていることを意味する。
【００１９】
本発明はまた、ＣｒｇＲおよび／またはＣｒｇＥを含む融合タンパク質を提供する。例えば、１種以上のさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利であり、そのさらなるアミノ酸配列は、分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、精製に役立つ配列（例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ）、（例えば、組換え体産生の間に）より高いタンパク質安定性を与える配列、または検出可能な標識（例えば、放射性標識、または緑色蛍光タンパク質のような蛍光標識）を含み得る。
【００２０】
このような融合タンパク質は、一般式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−Ｃ−ＣＯＯＨを有し、−Ａ−は、任意のＮ末端配列であり；−Ｂ−は、ＣｒｇＲ配列またはＣｒｇＥ配列であり；そして−Ｃ−は、任意のＣ末端配列である。ＡおよびＣの各々は、好ましくは、独立して、２０個以下のアミノ酸を含む。
【００２１】
あるいは、またはさらに、本発明のポリペプチドは、そのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにて別の化合物と融合され得る。このような化合物としては、上記ポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）、上記タンパク質の精製を容易にする化合物（例えば、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ）または検出可能な標識（例えば、放射性標識、または緑色蛍光タンパク質のような蛍光標識）が挙げられる。
【００２２】
（変異体酵素）
本発明はまた、変異体ＣｒｇＥ酵素を提供し、この変異体ＣｒｇＥ酵素において、その活性部位における１個以上のアミノ酸は、その酵素がもはやその酵素の基質に結合できないように、変更されている。このような変異は、当該分野において公知である多くの方法のうちのいずれか１つ（例えば、ランダム変異誘発）によって行われ得る。ランダム変異誘発は、化学的に誘導されても放射線への曝露であってもよい。次いで、この方法で変異誘発されたＣｒｇＥ分子がスクリーニングされて、もはや機能的ではない変異体が検出され得る。
【００２３】
（ｃｒｇＥ遺伝子産物の使用）
カテリシジンが組織修復において役割を果たすことが示されている［１６］ので、カテリシジンは、移植片拒絶おいても役割を果たし得る。したがって、カテリシジンのダウンレギュレーションは、移植片拒絶のレベルを減少させ得る。分泌カテリシジンの活性のＣｒｇＥによるダウンレギュレーションは、移植片拒絶を減少させる１つの方法であり得る。したがって、本発明は、治療におけるＣｒｇＥの使用を提供する。本発明は、移植片拒絶を予防および／または処置する方法をさらに提供し、この方法は、移植片拒絶の危険性がある被験体にＣｒｇＥを投与する工程を包含する。本発明はまた、移植片拒絶の予防および／または処置のための医薬の製造における、ＣｒｇＥの使用を提供する。移植片拒絶は、哺乳動物において発生し得、この哺乳動物は、好ましくはヒトである。移植片拒絶の危険性がある被験体は、臓器移植者であり得、そしてさらに、喫煙者であり得る。
【００２４】
同様に、カテリシジンＬＬ−３７は、ワクシニアウイルスを殺すこと［１７］、および他のエンベロープウイルスに対する阻害活性を有すること［１６］が示されている。これは、ワクチン接種ストラテジーに対する関連を有する。なぜなら上記ワクチンは、免疫系の適応可能なアーム（ａｒｍ）が応答する機会を有する前に、先天免疫応答によって破壊され得るからである。このようなウイルスワクチンに対するＬＬ−３７の活性を減少させるためにＣｒｇＥを使用することが、可能であり得る。したがって、本発明は、アジュバントとしてのＣｒｇＥの使用を提供する。本発明はまた、ワクチン接種を増強する方法を提供し、この方法は、ワクチンおよびＣｒｇＥの両方を被験体に投与する工程を包含する。上記被験体は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり、そして最も好ましくは、上記ワクチンに対して、応答しない者または応答が低い者である。本発明は、（ａ）ワクチンと（ｂ）ＣｒｇＥポリペプチドとを含有するワクチン組成物をさらに含む。
【００２５】
（スクリーニング方法）
本発明は、試験化合物が標的ポリペプチドの発現をダウンレギュレートするか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記試験化合物とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌とを接触させて混合物を形成する工程；（ｂ）上記混合物をインキュベートして上記化合物と上記細菌とを相互作用させる工程；および（ｃ）上記標的ポリペプチドの発現がダウンレギュレートされるか否かを決定する工程を包含する。上記化合物は、転写または翻訳を阻害することによって作用し得る。
【００２６】
本発明はまた、試験化合物が標的ポリペプチドに結合するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記試験化合物と上記標的ポリペプチドとを接触させて混合物を形成する工程；（ｂ）上記混合物をインキュベートして上記化合物と上記標的ポリペプチドとを相互作用させる工程；および（ｃ）上記化合物と上記ポリペプチドとが相互作用するか否かを決定する工程を包含する。
【００２７】
標的ポリペプチドが酵素（例えば、ＣｒｇＥ）である場合、本発明はまた、試験化合物が標的ポリペプチドの酵素活性を阻害するか否かを決定するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上記試験化合物と、上記標的ポリペプチド、および上記標的ポリペプチドによって触媒される酵素反応についての基質とを接触させる工程；（ｂ）上記混合物をインキュベートして上記化合物と標的ポリペプチドと上記基質とを相互作用させる工程；ならびに（ｃ）上記酵素活性による上記基質の改変が上記試験化合物によって阻害されるか否かを決定する工程を包含する。
【００２８】
本発明はまた、上記ポリペプチドＣｒｇＲまたはポリペプチドＣｒｇＥを発現する細菌を検出するための方法を提供する。このような方法は、（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌と、ＣｒｇＲに特異的な抗体またはＣｒｇＥに特異的な抗体とを接触させる工程；（ｂ）上記混合物をインキュベートして上記抗体と上記細菌とを相互作用させる工程；および（ｃ）上記細菌に対する上記抗体の結合を検出する工程を包含し得る。あるいは、このような方法は、（ａ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌と、ＣｒｇＲに特異的な第１の抗体またはＣｒｇＥに特異的な第１の抗体とを接触させる工程；（ｂ）上記混合物をインキュベートして上記第１の抗体と上記細菌とを相互作用させる工程；（ｃ）上記混合物と、上記第１の抗体に特異的な標識した第２の抗体とを接触させる工程；および（ｄ）上記第１の抗体に対する上記標識した第２の抗体の結合を検出する工程を包含し得る。
【００２９】
上記方法における標的ポリペプチドは、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓポリペプチドＣｒｇＲまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓポリペプチドＣｒｇＥである。代わりのものとして、上記ポリペプチドは、別の連鎖球菌属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来か、もしくは別のグラム陽性菌由来の、ｃｒｇＲまたはｃｒｇＥによってコードされるポリペプチドのホモログであり得る。
【００３０】
上記試験化合物は、細胞外または細胞内の化合物であり得、そして生物学的起源または化学的起源を有し得る。代表的な試験化合物としては、ペプチド、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、有機低分子、抗生物質、ポリアミン、ポリマー、またはそれらの誘導体が挙げられる。有機低分子は、５０Ｄａと２５００Ｄａとの間の分子量を有し、そして最も好ましくは約３００Ｄａと約８００Ｄａとの間の分子量を有する。
【００３１】
上記試験化合物は、精製された形態であっても、物質の混合物（例えば、天然産物を含む抽出物）の一部であっても、混合型コンビナトリアル合成の産物であってもよい。試験化合物は、合成化合物の広いライブラリーまたは天然化合物の広いライブラリーに由来し得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーがそうであるように、市販されている。混合物が有用な活性を有すると示される場合、その活性は、特定の成分まで追跡され得、この追跡には、その成分を識別し、そしてそれらを個別に試験すること、または精製もしくは逆重畳を用いる。さらに、試験化合物は、コンビナトリアルケミストリーを使用し、個別の化合物または混合物のいずれかとして合成的に生成され得る。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、好ましくは、ハイスループット形式で準備される。都合の良いことに、この方法は、マイクロタイタープレートにおいて行われる。
【００３３】
試験化合物がＣｒｇＥに結合し、かつこの結合がカテリシジン活性に対するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌の耐性を阻害する場合、その試験化合物は、抗菌治療を補助するために使用され得る。あるいは、試験化合物がＣｒｇＲに結合し、かつこの結合がＣｒｇＥの抑制をアップレギュレートする場合、その試験化合物は、抗菌治療を補助するために使用され得る。
【００３４】
転写のダウンレギュレーションを検出するための方法は、当該分野において周知であり、そしてその検出方法は、本発明に不可欠ではない。ｍＲＮＡを検出するための方法としては、増幅アッセイ（例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、および／またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザン分析、ドットブロット、スロットブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＤＮＡアッセイ、マイクロアレイなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
翻訳のダウンレギュレーションを検出するための方法もまた、当該分野において周知であり、そして再び、その検出方法は、本発明に不可欠ではない。ポリペプチド検出の方法としては、免疫検出法（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、および酵素的アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
結合相互作用を検出するための方法は、当該分野において周知であり、そしてその方法は、ＮＭＲ、フィルター結合アッセイ、ゲル遅延度（ｇｅｌ−ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）アッセイまたはゲルシフトアッセイ、置換アッセイ（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット、放射標識型の競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分取、共沈、クロスリンク、表面プラスモン共鳴、逆ツーハイブリッド（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）などのような技術を含み得る。ポリペプチドに結合することが見出される化合物は、上記化合物とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（または別の細菌）とを接触させ、カテリシジンと接触させ、次いで増殖の阻害またはビルレンス決定因子の阻害についてモニタリングすることによって、抗菌治療におけるその化合物の使用について試験され得る。
【００３７】
結合相互作用を検出するための直接的な方法は、標識した試験化合物および／またはポリペプチドを含み得る。上記標識は、フルオロフォア、放射性同位体、または他の検出可能な標識であり得る。上記標識と上記ポリペプチドとの結合は、結合相互作用を示す。上記試験化合物と標的ポリペプチドとの間の相互作用を評価するための他の直接的な方法は、ＮＭＲを使用して、ポリペプチド化合物複合体が存在するか否かを決定する工程を包含し得る。
【００３８】
ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を評価する別の方法は、固体表面上にそのポリペプチドを固定する工程、および遊離している試験化合物の存在についてアッセイする工程を包含し得る。上記試験化合物と上記ポリペプチドとの間に相互作用が存在しない場合、遊離している試験化合物が、検出される。上記試験化合物は、検出を容易にするために標識され得る。この型のアッセイはまた、上記固体表面上に固定化されている上記試験化合物を用いて行われ得る。上記固定化されたポリペプチドと上記遊離している試験化合物との間の相互作用はまた、表面プラスモン共鳴のような方法によってモニタリングされ得る。
【００３９】
酵素活性の阻害を評価するための方法は、周知である［例えば、参考文献１８］。酵素基質は、商業的な製造業者から広く入手可能であり、この酵素基質としては、インビトロアッセイに適した基質（例えば、酵素活性の可視的指標を与える、有色の基質または有色の生成物など）が挙げられる。
【００４０】
本発明の方法において、参照基準は、代表的に、標的ポリペプチドと試験化合物とが相互作用するか否かを検出するためか、または所与の標的ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを検出するためか、または酵素活性が阻害されるか否かを検出するために必要とされる。１つの基準は、本発明の方法と並行して、上記試験化合物の非存在下で行なわれるコントロール実験である。次いで、上記コントロール実験および本発明の方法において得られた結果は、上記試験化合物の効果を評価するために比較され得る。並行して上記基準を測定する代わりに、その基準は、本発明の方法を行なう前に決定されていてもよいし、この方法が行われた後に決定されてもよい。上記基準は、先の研究から得られた絶対的な基準であり得る。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態は、競合的スクリーニングアッセイを使用する工程を包含し、その競合的スクリーニングアッセイにおいて、標的ポリペプチドを特異的に結合し得る中和抗体が、そのポリペプチドに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、上記抗体が使用されて、１つ以上の抗原決定基をＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓポリペプチドと共有するあらゆるペプチドが検出され得る。放射標識型の競合結合研究は、参考文献１９に記載される。
【００４２】
他の実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓポリペプチドは、相互作用する調節タンパク質の同定、特徴付けおよび精製のための研究手段として用いられる。適切な標識が、当該分野において公知である種々の方法によって本発明のポリペプチドに組み込まれ、そしてそのポリペプチドが使用されて、相互作用する分子が捕捉される。例えば、分子は、上記の標識されたポリペプチドと一緒にインキュベートされ、洗浄されて結合していないポリペプチドが除去され、そしてそのポリペプチド複合体は、定量される。種々の濃度のポリペプチドを使用して得られたデータが使用されて、上記複合体に関するポリペプチドの数、親和性、および結合についての値が算出される。
【００４３】
（スクリーニング方法によって同定される化合物）
標的ポリペプチドの発現をダウンレギュレートし、かつ／または標的ポリペプチドに結合し、かつ／または酵素活性を阻害する試験化合物は、抗生物質、抗生物質候補、または抗生物質開発のためのリード化合物として有用であり得る。このような試験化合物は、ＣｒｇＲの活性を増強し、それによりＣｒｇＥ発現を抑制することによってか、またはＣｒｇＥを結合し、そしてＣｒｇＥの活性を抑制することによって、作用し得る。
【００４４】
一旦、試験化合物が、標的ポリペプチドに結合する化合物としてか、または細菌における標的ポリペプチドの発現を阻害する化合物として同定されると、さらなる実験を行なって、細菌の増殖を阻害することにおけるその化合物のインビボでの機能を確認することが、所望され得る。したがって、上記の方法のいずれも、上記試験化合物と細菌とを接触させ、そして細菌の増殖および／または生存に対するその化合物の効果を評価するさらなる工程を包含し得る。細菌の増殖および生存を測定するための方法は、慣用的に利用可能である。
【００４５】
本発明は、上に記載される方法のうちのいずれかによって得られた化合物、またはそれらの方法によって入手可能な化合物を提供する。好ましくは、その化合物は、有機化合物である。
【００４６】
一旦、化合物が、本発明の方法を使用して同定されると、その化合物の薬学的特性についてのさらなる研究を行なうことが、必要であり得る。例えば、上記化合物を変化させて、その化合物の薬物動態特性またはバイオアベイラビリティーを改善することが、必要であり得る。本発明は、その薬物動態特性および／またはバイオアベイラビリティーを改善するために変化させられた、本発明の方法によって同定されたあらゆる化合物、ならびにそれらの化合物を含有する組成物に及ぶ。
【００４７】
本発明は、医薬（例えば、抗生物質）として使用するための、本発明の方法を使用して得られたかまたはその方法を使用して入手可能な化合物、およびそれらの化合物を含有する組成物をさらに提供する。本発明はまた、抗生物質（特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ感染を処置するための抗生物質）の製造における、本発明の方法を使用して得られたかまたはその方法を使用して入手可能な化合物の使用を提供する。
【００４８】
本発明はまた、抗生物質作用組成物を生産するための方法を提供し、この方法は、（ａ）上に記載される通りに化合物を同定する工程；（ｂ）上記化合物を製造する工程；（ｃ）患者に対する投与のために上記化合物を処方する工程；および（ｄ）上記処方した化合物をパッケージ化して上記抗生物質作用組成物を生産する工程を包含する。薬学的処方の詳細は、参考文献２０に見出され得る。
【００４９】
（組成物）
本発明はまた、別の連鎖球菌属由来のＣｒｇＥまたはホモログを含有する薬学的組成物を提供する。
【００５０】
本発明の組成物は、免疫原性であり、そしてその組成物は、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防する）または治療的（すなわち、感染を処置する）のいずれかであり得るが、代表的には予防的である。
【００５１】
上記組成物のｐＨは、好ましくは６と８との間であり、好ましくは約７である。安定なｐＨは、緩衝液の使用によって維持され得る。上記組成物は、無菌であり得、かつ／または発熱物質を含まない可能性がある。本発明の組成物は、ヒトに対して等張であり得る。
【００５２】
組成物は、バイアル中ににて与えられ得るか、または予め満たされた注射器中にて与えられ得る。上記注射器は、針を備えても針を備えなくてもよい。注射器が上記組成物の単一用量を含むのに対し、バイアルは単一用量または複数用量を含み得る。注射用組成物は、通常、溶液または懸濁液である。あるいは、注射用組成物は、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するために、（例えば、凍結乾燥された）固体形態で与えられ得る。
【００５３】
本発明の組成物は、単位用量形態または複数用量形態にパッケージ化され得る。複数用量形態のために、バイアルは、事前に満たされた注射器より好ましい。有効投薬量は、慣用的に確立され得るが、上記組成物のヒトにおける注射のための代表的な用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【００５４】
本発明の組成物が使用前に即座に調製されるものであり（例えば、成分は、凍結乾燥形態で含まれている）、そしてキットとして存在している場合、そのキットは、２つのバイアルを備え得るか、またはそのキットは、予め満たされた注射器および１つのバイアルを備え得、その注射器の内容物は、注射前にそのバイアルの成分を再度活性化させるために使用される。
【００５５】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。上記医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を惹起し得（すなわち、それは、免疫原性組成物である）、そしてその医薬は、より好ましくはワクチンである。
【００５６】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造において、ＣｒｇＥ（および他の必要に応じた抗原）の使用を提供する。上記医薬は、好ましくはワクチンである。
【００５７】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供し、この方法は、本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。上記免疫応答は、好ましくは防御的であり、そしてその免疫応答は、好ましくは抗体を伴う。その方法は、ブースター応答を惹起し得る。
【００５８】
上記哺乳動物は、好ましくはヒトである。上記ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは小児（例えば、歩き始めの幼児、または乳児）であり；上記ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、上記ヒトは、好ましくは成人である。小児を対象とするワクチンは、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に対しても投与され得る。
【００５９】
これらの使用および方法は、好ましくは、連鎖球菌属によって引き起こされる疾患（例えば、肺炎、敗血症、菌血症など）の予防および／または処置のための使用ならびに方法である。
【００６０】
治療的処置の効力を確認する１つの方法は、本発明の組成物の投与後に連鎖球菌感染をモニタリングすることを包含する。予防的処置の効力を確認するための１つの方法は、上記組成物の投与後に、上記抗原に対する免疫応答をモニタリングすることを包含する。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体（例えば、１２〜１６月齢の小児、または動物モデル［２１］）にその組成物を投与し、次いで標準パラメータ（抗体のＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）が挙げられる）を測定することによって、決定され得る。
【００６１】
本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、または組織の間隙空間に対する注射）によってか、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼投与、耳投与、肺投与もしくは他の粘膜投与によって達成され得る。大腿または上腕に対する筋肉内投与が、好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介し得るが、針を用いない注射が、代替的に使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【００６２】
本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を誘発するために使用され得る。
【００６３】
投薬処置は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであり得る。複数用量は、一次免疫化スケジュールおよび／またはブースター免疫化スケジュールにおいて使用され得る。一次用量スケジュールは、その次にブースター用量スケジュールを伴い得る。初回刺激用量（例えば、４週間〜１６週間の間）の間の適切なタイミング、および初回刺激と追加免疫との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【００６４】
連鎖球菌感染は、身体の種々の領域を冒し、したがって本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、上記組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。注射前に、液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥された組成物）。上記組成物は、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として、局所投与のために調製され得る。上記組成物は、例えば、錠剤もしくはカプセル、または（必要に応じて香り付けされた）シロップとして、経口投与のために調製され得る。上記組成物は、例えば、微細な粉末またはスプレーを使用する吸入器として、肺投与のために調製され得る。上記組成物は、坐剤または膣坐剤として調製され得る。上記組成物は、例えば、スプレー、点滴剤、ゲルまたは粉末として、鼻投与、耳投与または眼投与のために調製され得る［例えば、参考文献２２および２３］。
【００６５】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、抗原の免疫学的有効量、および必要に応じて、任意の他の成分を含有する。「免疫学的有効量」によって、個体に対するその量の投与（単一用量または一連の用量の一部のいずれかとして）が処置または予防に有効であることが、意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、上記ワクチンの処方、処置する医師による医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変動する。その量は、慣用的な試行によって決定され得る比較的幅広い範囲内にあることが予想される。
【００６６】
本発明の組成物中に含まれ得る抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、参考文献２４〜２７に開示される調製物など）。
−血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および／または血清群ＹのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の糖抗原（例えば、参考文献２８に開示される血清群Ｃ由来のオリゴ糖［参考文献２９もまた参照のこと］、または参考文献３０のオリゴ糖）。
−血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのタンパク質抗原（例えば、参考文献３１〜３９に開示される抗原など）。
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ［４０〜４３］、ＶａｃＡ［４４、４５］、ＮＡＰ［４６、４７、４８］、ＨｏｐＸ［例えば、４９］、ＨｏｐＹ［例えば、４９］および／またはウレアーゼ）。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、５０、５１、５２］。
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス［例えば、５３、５４］）。
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原［例えば、５４、５５］）。
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、５６］。
−ＨＩＶ由来の抗原［５７］。
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド［例えば、参考文献５８の第３章］）。
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド［例えば、参考文献５８の第４章］）。
−必要に応じてペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３と組み合わされる、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）［例えば、参考文献５９および６０］）。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖抗原［例えば、２９］。
−ポリオ抗原［例えば、６１、６２］（例えば、ＩＰＶ）。
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、６３、６４、６５、６６］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、参考文献６７〜７３］。
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、７４］。
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、７５］。
−狂犬病抗原［例えば、７６］（例えば、凍結乾燥された不活性化ウイルス［例えば、７７、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］）。
−麻疹抗原、ムンプス抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献５８の第９章、第１０章および第１１章］。
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献５８の第１９章］（例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）。このインフルエンザ抗原は、汎発流行性の株から選択され得る。
−パラミクソウイルス（例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ［７８、７９］）および／またはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３［８０］）由来の抗原。
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、８１］。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、８２、８３、８４］。
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、８５］。
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原［例えば、８６、８７、８８］。
−フラビウイルス科（フラビウイルス属）に属するウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの４種の血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）由来の抗原。
−ペスチウイルス抗原（例えば、古典的ブタ熱ウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ウシウイルス性下痢ウイルス、および／またはボーダー病ウイルスに由来する）。
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９に由来する）。
−コロナウイルス抗原（例えば、ＳＡＲＳコロナウイルス抗原［８９］）。
−ノーウォークウイルス抗原［９０］。
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）。
−アミロイドタンパク質（例えば、βペプチド［９１］）。
−癌抗原（例えば、参考文献９２の表１または参考文献９３の表３および表４に列挙される抗原）。
−アレルギー反応または喘息反応を誘発するアレルゲン。
【００６７】
（上記組成物のさらなる非抗原成分）
代表的に、本発明の組成物は、上述の成分に加えて、一種以上の「薬学的に受容可能なキャリア」を含有し、このキャリアとしては、上記組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的に、大きくゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸のポリマー、アミノ酸コポリマー、乳糖、および脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム））である。このようなキャリアは、当業者にとって周知である。上記ワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、食塩水、グリセロールなど）を含み得る。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、存在し得る。発熱物質を含まない滅菌リン酸緩衝化生理食塩水が、代表的なキャリアである。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、参考文献２０で入手可能である。
【００６８】
本発明の組成物は、特に、複数用量形式でパッケージ化される場合に、抗菌剤を含有し得る。
【００６９】
本発明の組成物は、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート））を含有し得る。洗浄剤は、一般に、低レベル（例えば、＜０．０１％）で存在する。
【００７０】
本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有し得る。１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌが、代表的である。
【００７１】
本発明の組成物は、一般に、緩衝液を含有する。リン酸緩衝液が、代表的である。
【００７２】
（定義）
用語「含む（包含する、含有する）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を意味する。Ｘを「含む（含有する）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、またはさらなるものも含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００７３】
数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００７４】
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを実質的に含まない組成物は、Ｙを完全に含まない可能性がある。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省かれ得る。
【００７５】
用語「異種」とは、天然では一緒に見出されない２つの生物学的成分をいう。これらの成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。上記異種成分は天然では一緒に見出されないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結される場合のように、それらは一緒に機能し得る。別の例は、連鎖球菌属の配列がマウス宿主細胞に対して異種である場合である。さらなる例は、天然において見出されない配置で単一のタンパク質に組み立てられている、同じタンパク質または異なるタンパク質に由来する２つのエピトープである。
【００７６】
「抗生物質」によって、本発明者らは、細菌を破壊し得るか、もしくは細菌の増殖を阻害し得るか、またはビルレンス決定因子をダウンレギュレートし得る、化合物または組成物に言及する。
【００７７】
「抗菌の」によって、本発明者らは、細菌を破壊するか、もしくは細菌の増殖を阻害するか、またはビルレンス決定因子をダウンレギュレートする、能力を意味する。
【００７８】
「アジュバント」は、薬物に添加されてその薬物の効果を増大させるかもしくは補助する薬理学的因子、または抗原反応を増大させる免疫学的因子である。
【実施例】
【００７９】
（発明を実施するための形態）
（実施例１：ＧＡＳ株ＳＦ３７０とそのΔｃｒｇＲ変異体とのトランスクリプトームの比較による推定上のｃｒｇＲ調節遺伝子の同定）
耐性の表現型を担う遺伝子を同定するために、ＧＡＳ株ＳＦ３７０とそのΔｃｒｇＲ変異体とのトランスクリプトームの比較を行った。
【００８０】
上記変異体を、対立遺伝子交換による遺伝子置換変異誘発を使用して得た［１５］。ポジティブクローンを、ＰＣＲによって確認し、そしてさらなる実験のために使用した。定量的リアルタイムＰＣＲにより、上記変異体においてｃｒｇＲ  ｍＲＮＡが存在しないことを確認した。ΔｃｒｇＲ変異体のカテリシジン耐性を、細菌死滅アッセイにおいて試験した。細菌を、ＴＨＢ中でＯＤ６００  ０．２まで増殖させ、そして５ｍＭのグルコースを含む１０ｕＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に希釈した。１ｍｌの細菌（約１０６ｃｆｕ）を、種々の濃度のカテリシジンと一緒に、撹拌せずに３７℃にて１時間インキュベートした。殺菌活性を、ＴＨＹ−血液寒天上にそのインキュベーション混合物の系列希釈物をプレートすることによって評価した。使用した実験条件の下で、５０％の細菌細胞を死滅させるのに必要なＬＬ−３７の濃度（ＬＤ５０）は、ＷＴに関しては０．１０３μＭであり、ΔｃｒｇＲ変異体に関する濃度（０．２８μＭ）よりもほぼ３倍高かった（図１）。ＣＲＡＭＰのＬＤ５０は、ＷＴに関しては０．０８７μＭである結果を生じたが、ＣＲＡＭＰのＬＤ５０は、ΔｃｒｇＲ変異体に関しては０．１４７μＭであった（図１）。これらのデータにより、ＣＲＡＭＰ耐性およびＬＬ−３７耐性の両方におけるｃｒｇＲの関与が確認される。
【００８１】
対数増殖する変異体細胞から抽出した細菌の全ＲＮＡを、相補ＤＮＡの合成のために使用し、Ｃｙ−５（またはＣｙ−３）によって標識し、そしてＣｙ−３（またはＣｙ−５）標識した共通参照（対数増殖する野生型ＳＦ３７０株）の存在下においてマイクロアレイにハイブリダイズさせた。各サンプルを、二つ組でハイブリダイズさせ、そして相対蛍光強度を測定した。データを、定量化し、正規化し、そして補正して、各遺伝子の相対的な転写物のアバンダンスを、参照シグナルの強度に対する強度比として得た。１．５倍程度の低いｍＲＮＡの変化が、生物学的関連性を有し得る（Ｈｕｇｈｅｓら、２０００）が、よりストリンジェントな閾値（２倍）を、ここで使用した。
【００８２】
表１において報告した通り、１１個の転写ユニットの遺伝子メンバーは、ΔｃｒｇＲ変異体において２より高い発現の変化倍数（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を示した。上記の１１個のうちの８個の転写ユニットは、アップレギュレートされ、そして上記の１１個のうちの３個（ｃｒｇＲ自体を含む）はダウンレギュレートされた。ａｒｃオペロンのプロモーター領域中の−５９位〜−４２位にわたる推定上のパリンドロームオペレーター配列（ａｒｃＡｐ）を、同定した。この推定上の共通配列は、ＧｎｔＲファミリーのメンバーに関する共通配列に、非常に似ている（Ｒｉｇａｌｉら、２００２）。別の推定上のパリンドロームｃｒｇＲオペレーター配列を、−１４４位〜−１２９位にわたる、ａｒｃＢとｓｐｙ１５４３との間の遺伝子間領域に見出した（図２）。さらなる配列の分析は、−１３５位〜−１２０位にわたる共通配列を同定した（図２）。この共通配列は、ｃｒｅエレメント（カタボライト応答性エレメント）に対する高い相同性を有した。この結果は、ｃｒｇＲ遺伝子の、ＧｎｔＲ様の転写抑制因子としてのｃｒｇＲ遺伝子の仮定上の機能と一致する。ＧｎｔＲファミリーのメンバーは、実際に、アミノ酸代謝に関する酸化物質の調節に関与するか、または種々の代謝経路（例えば、アスパラギン酸（ＡｎｓＲ）、ピルビン酸（ＰｄｈＲ）、グリコール酸（ＧｌｃＣ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）（ＤｇｏＲ）、乳酸（ＬＩｄＲ）、マロン酸（ＭａｔＲ）、またはグルコン酸（ＧｎｔＲ））の岐路において関与することが示されている（Ｒｉｇａｌｉら、２００２）。
【００８３】
上記調節遺伝子の間で、ａｒｃオペロンのｓｐｙ１５４２（図３）を、最初に、さらなる調査のために選択した。
【００８４】
ａｒｃオペロンＤＮＡの場合において、マイクロアレイの転写プロファイリングにより、ΔｃｒｇＲ変異体において顕著にアップレギュレートされた、ただ１つの遺伝子を同定したが、オペロン全体の実際のアップレギュレーションを、定量的リアルタイムＰＣＲによって確認した（発現の変化倍数（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）の値を、（図３）に示す）。これらの観察に基づいて、カテリシジン耐性においてあり得るａｒｃオペロンのｓｐｙ１５４２の関与をさらに調査することを、決定した。
【００８５】
（実施例２：Ｓｐｙ１５４２は、カテリシジン耐性に有効に関与する）
ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２変異体（図１６）を、ΔｃｒｇＲエレクトロコンピテント細胞を変異させることによって得た。Δｓｐｙ１５４２変異体を、最後の１８０アミノ酸をコードするｓｐｙ１５４３の最終部分の５３９ｂｐ、１６ｂｐの遺伝子間領域、および最初の２３アミノ酸をコードするｓｐｙ１５４２の５’末端に位置する６９ｂｐを欠失させることによって作製した（表２を参照のこと）。上記変異体中のｓｐｙ１５４２遺伝子の不活性化を、精製したＳｐｙ１５４２タンパク質を用いて免疫化したマウスから得た血清を使用して、ＷＴ株およびΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３株の両方の総タンパク質抽出物に対するウェスタンブロットによって検証した。予想される大きさ（４９ＫＤａ）のシグナルは、ＷＴにおいて検出できたが、ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３のレーンにおいては検出できなかった（図４）。
【００８６】
ＬＬ−３７の存在下における上記の新規変異体の挙動を調査するために、新規の細菌死滅実験を行った。対数増殖するＷＴ細胞、ΔｃｒｇＲ変異体細胞およびΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３変異体細胞を、種々の量のＬＬ−３７によって負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）し、そして系列希釈物を、コロニー計数のためにプレートした。図５ａにおいて報告した通り、ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３変異体のＬＤ５０値は、ＷＴのＬＤ５０値に戻った。０．２μＭのＬＬ−３７の存在下における生存率（図５ｂ）は、不活性化したｓｐｙ１５４２遺伝子および不活性化したｓｐｙ１５４３遺伝子を有する変異体が、ＬＬ−３７に対して感受性に戻ることを示した。同様の結論が、マウスのカテリシジンＣＲＡＭＰを用いた細菌死滅実験を繰り返すことによって引き出された（図６）。
【００８７】
（実施例３：Ｓｐｙ１５４２タンパク質産物は、インビトロでＬＬ−３７抗細菌作用を中和する）
抗菌ペプチドに対する耐性機構におけるＳｐｙ１５４２の関与を、Ｓｐｙ１５４２をクローニングしてネイティブなタンパク質として発現させることによって、さらに調査した。発現したタンパク質を、Ｑセファロースカラムを使用し、次いでＣｕキレート化を行い、最後にゲル濾過することによって、精製した（図７）。精製したタンパク質を連続して使用して、細菌死滅アッセイにおいて培地に添加した場合の、そのタンパク質の効果を研究した。
【００８８】
野生型株、ΔｃｒｇＲ株およびΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３株を、０．４μＭのＬＬ−３７またはＣＲＡＭＰによって負荷し、そして種々の濃度の上記精製したタンパク質を加えた。
【００８９】
図８ａに示す通り、Ｓｐｙ１５４２タンパク質は、用量依存的様式でＬＬ−３７の作用を阻害する。コロニーの数の増加を、漸増量のＳｐｙ１５４２を添加したときに、ＷＴおよびそのΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３変異体の両方について観察した。さらに、Ｓｐｙ１５４２タンパク質はまた、ΔｃｒｇＲ変異体の生存率を用量依存的様式で上昇させ得た（図８ａ）。この実験を、ＣＲＡＭＰを用いて繰り返た。再び、Ｓｐｙ１５４２は、カテリシジンの殺菌活性を用量依存的な様式で阻害した（図８ｂ）。
【００９０】
（実施例４：ΔｃｒｇＲ変異体は、インビボでカテリシジンの作用を阻害するが、ΔｃｒｇＲ／ΔＳｐｙ１５４２−４３変異体は、インビボでカテリシジンの作用を阻害しない）
ｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３変異体を、マウスモデルにおいて壊死性の皮膚感染をもたらすその能力について、ΔｃｒｇＲ変異体および野生型ＧＡＳと比較した。一群が８頭のＣＤ１雌マウスからなる群３つに、１０８ＣＦＵの野生型株、ΔｃｒｇＲ株またはΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３株を皮下に注射し、そして皮膚病変を毎日観察した。Ｇａｌｌｏおよび共同研究者によって先に示された通り、上記ΔｃｒｇＲ変異体は、ＷＴと比較した場合、より大きい皮膚の病変をもたらすその能力を裏付けた（図９；表３）。この実験はまた、ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３変異体株に感染したマウスが、野生型ＧＡＳ株に感染したマウスより小さい大きさの病変を有したことを示す。ΔｃｒｇＲ病変の平均の大きさは、上記ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−４３がもたらした病変の、１３倍よりもさらに大きかった（図９）。
【００９１】
（実施例５：異種タンパク質に対する作用）
同様の作用機構が異種タンパク質をコードする他の細菌において見出されるか否かを調べるために、上記の抗菌アッセイを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを使用したことを除いて、上記の通りに行った。これまでの通り、この細菌を、その細菌を殺すことが示された漸増濃度のＬＬ−３７に供した（図１０を参照のこと）。この実験を、０．４μＭ、０．８μＭまたは１．６μＭのＬＬ−３７に加えて、７０μｇのネイティブＳｐｙ１５４２を添加することによって繰り返した。この第２の実験において、０．４μＭにおける１００％の生存が記録された。したがって、Ｓｐｙ１５４２は、異種の系においてもカテリシジンの作用を阻害し得るようである。
【００９２】
（実施例６：Ｓｐｙ１５４２の作用様式）
Ｓｐｙ１５４２は、分泌タンパク質であることが示された（図１１を参照のこと）。この結果が示す通り、Ｓｐｙ１５４２は、上記ＷＴ株の上清中に存在するが、上記変異体株の上清中には存在しないようである。これは、予想外である。なぜならば、ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｉｐ／）を使用すると、このタンパク質が上記細菌の細胞質中に実際に見出されることが、予測される（図１２参照のこと）からである。
【００９３】
したがって、Ｓｐｙ１５４２を使用して、上記の細菌死滅アッセイと同様の方法で０．４μＭのＬＬ−３７によって負荷したＷＴ株を処理した。３０分後、上記細菌をペレットにし、そしてその上清を分析した。上記上清中のＬＬ−３７がＳｐｙ１５４２の作用によって改変されなかったことが、質量分析によって見出された（図１３）。
【００９４】
実験を、ＬＬ−３７が上記細菌表面に結合したか否かを調べるために行った。０．８μＭのＬＬ−３７を、上記細菌死滅アッセイについてと同様の方法で、上記細菌に添加した。その後、細菌表面に局在化したＬＬ−３７の量を、ＷＴ株およびΔｓｐｙ１５４２変異体株についてＦＡＣＳ分析によって比較した。この結果（図１４）は、ＷＴ株がその細菌表面上に、（０μＭのＬＬ−３７または０．８μＭのＬＬ−３７を示す２つのグラフのピークにおける、より小さいシフトによって実証されるように）より少ないＬＬ−３７しか有さなかったこと示す。この「防御」効果はまた、時間と共に増大した。したがって、ＷＴ株は、ＬＬ−３７に対して防御されるようである。
【００９５】
したがって、さらなる実験を行って、Ｓｐｙ１５４２の効果が間接的であることを確認した。Ｓｐｙ１５４２を、上記細菌に添加した。次いで上記細菌を、ペレットにし、洗浄し、そして再懸濁した。次いで０．４μＭのＬＬ−３７を、その懸濁液に添加した。図１５は、Ｓｐｙ１５４２の防御効果が維持されたこと、およびその防御効果が用量依存的であったことを示す。
【００９６】
カテリシジンに対する耐性は、ＣｒｇＥの活性によってもたらされる、正に荷電したペプチドグリカンによる正に荷電したカテリシジンの静電反発に起因することが、仮定される。
【００９７】
本発明が例示のためにのみ記載されており、そして本発明の範囲および精神の中に留まりながら改変がなされ得ることが、理解される。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
【表２】
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【０１００】
【表３】
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（参考文献（その内容は、全体が本明細書によって援用される））
【０１０１】
【化１】
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【０１０２】
【化２】
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【０１０３】
【化３】
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【０１０４】
【化４】
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【０１０５】
【化５】
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【０１０６】
【化６】
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、（Ａ）ＣＲＡＭＰおよび（Ｂ）ＬＬ−３７の両方についての細菌死滅アッセイを示す。
【図２】図２は、ａｒｃＢとｓｐｙ１５４３との間の、推定上のパリンドロームｃｒｇＲオペレーター配列を示す。
【図３】図３は、ａｒｃオペロンの転写プロファイリングを示す。
【図４】図４は、ΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２変異体中のｓｐｙ１５４２の不活性化を実証するウェスタンブロットを示す。
【図５】図５は、ａ）ＬＬ−３７の系列希釈物に対する野生型株および変異体株の応答、ならびにｂ）０．２μＭのＬＬ−３７に対する野生型株および変異体株の応答を示す。
【図６】図６は、ＣＲＡＭＰの系列希釈物に対する野生型株および変異体株の応答を示す。
【図７】図７は、クローニング後のＳｐｙ１５４２の発現の確認およびネイティブタンパク質としての発現の確認を示す。
【図８】図８は、ａ）種々の比のＬＬ−３７とＳｐｙ１５４２による負荷に対する野生型株および変異体株の応答、ならびにｂ）種々の比のＣＲＡＭＰとＳｐｙ１５４２とによる負荷に対する野生型株および変異体株の応答を示す。
【図９】図９は、ｗｔマウスにおける病変と比較した、ΔｃｒｇＲマウスおよびΔｃｒｇＲ／Δｓｐｙ１５４２−１５４３マウスにおける病変を示す。
【図１０】図１０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて行われた細菌死滅アッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、ＷＴ細菌株の上清においてＳｐｙ１５４２が存在するが、変異体株においてはＳｐｙ１５４２が存在しないことを示す。そのレーンは、Ａ）ＷＴ、Ｂ）ΔＣｒｇＲ／ΔＳｐｙ１５４２−１５４３、Ｃ）ΔＣｒｇＲ１、Ｄ）ΔＣｒｇＲ２である。
【図１２】図１２は、ＣｒｇＥポリペプチド配列によって問い合わせたときのＰＳＯＲＴ出力（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）を与える。
【図１３】図１３は、Ｓｐｙ１５４２による処理を伴うＬＬ−３７の質量分析の結果（Ａ）およびＳｐｙ１５４２による処理を伴わないＬＬ−３７の質量分析の結果（Ｂ）を示す。
【図１４】図１４は、０μＭのＬＬ−３７もしくは０．８μＭのＬＬ−３７を用いて５分間または１０分間処理されたＷＴ株およびΔＳｐｙ１５４２株のＦＡＣＳ分析を示す。各グラフにおける条件は、以下の通りである：Ａ）ＷＴ、３７℃にて５分間、Ｂ）ΔＳｐｙ１５４２、３７℃にて５分間、Ｃ）ＷＴ、３７℃にて１０分間およびＤ）ΔＳｐｙ１５４２、３７℃にて１０分間。
【図１５】図１５は、洗浄およびＬＬ−３７による負荷の前に、Ｓｐｙ１５４２によって細菌を前処理することの防御効果を示す。
【図１６】図１６は、上記ノックアウト変異体中のａｒｃオペロンにおける遺伝子の配置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月6日(2007.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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