(57)【要約】  哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定する、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別する、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法であって、該方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中のミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)のレベルを測定することを含む。哺乳動物対象の心臓健康をモニタリングする方法をさらに含む。また、前記方法を実行するためのキットを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法であって：前記哺乳動物対象からの体液試料中の第１マーカのレベルを測定することを含み、ここで前記第１マーカがミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)である、前記方法。
【請求項２】
前記体液が血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第１マーカのレベルと比較する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
心不全の非存在を示す第１マーカのレベルが、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの該第１マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第１マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１マーカのレベルが、前記試料を前記第１マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
心不全を示す第２マーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記第２マーカが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、又はＮ−末端プロ脳ナトリウム利尿ペプチド(Ｎ-ＢＮＰ)である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記第２マーカが、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ)である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記第２マーカがウロテンシンである、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記第２マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第２マーカのレベルと比較する、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
心不全の非存在を示す第２マーカのレベルが、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの該第２マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の第２マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第２マーカのレベルが、前記試料を前記第２マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項７記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１７】
哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用のキットであって：
前記哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書；及び
該試料中のミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)のレベルを測定するための１以上の試薬を含む、前記キット。
【請求項１８】
前記体液が血漿である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
前記１以上の試薬が、前記第１マーカに特異的に結合する抗体を含む、請求項１７記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
心不全を示す第２マーカのレベルを測定するための１以上の試薬をさらに含む、請求項１７記載のキット。
【請求項２２】
前記第２マーカがナトリウム利尿ペプチドである、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、又はＮ-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(Ｎ-ＢＮＰ)である、請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記第２マーカが、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ)である、請求項２１記載のキット。
【請求項２５】
前記第２マーカを測定するための１以上の試薬が、該２マーカに特異的に結合する抗体を含む、請求項２１記載のキット。
【請求項２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
前記第２マーカがウロテンシンである、請求項２１記載のキット。
【請求項２８】
哺乳動物対象からの体液試料中の第１マーカのレベルを測定することを含む、哺乳動物対象の健康をモニタリングする方法であって、前記第１マーカがミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)である、前記方法。
【請求項２９】
前記体液が血漿である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記第１マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第１マーカのレベルと比較する、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心不全の悪化を示す第１マーカのレベルと比較する、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心臓突然死を示す第１マーカのレベルと比較する、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
前記第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の治療への応答を示す第１マーカのレベルと比較する、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
心不全の非存在を示す第１マーカのレベルが、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの該第１マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第１マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記第１マーカのレベルが、前記試料を該１マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
心不全を示す第２マーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３８】
前記第２マーカが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、又はＮ-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(Ｎ-ＢＮＰ)である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記第２マーカが、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ)である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記第２マーカが、ウロテンシンである、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
前記第２マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第２マーカのレベルと比較する、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
心不全の非存在を示す第２マーカのレベルが、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの該第２マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第２マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記第２マーカのレベルが、前記試料を前記２マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項３７記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトなどの哺乳動物対象における心不全の診断方法に関するものである。特に、体液試料中のミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)のレベルを測定する前記方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
心不全は、心臓が体に効率的に血液を拍出するほど強くない場合に生じ、かつ年齢とともに増加しつつある。結果として、体液が肺及び体組織に集まり、うっ血（目詰まり）を生じる。多くの場合、うっ血性心不全の原因はわかっていない。１つの共通した原因には、冠状動脈疾患があり得る。別の共通した原因には、高血圧があり得る。また別の共通した原因には、心臓弁膜症（特に大動脈疾患、及び僧帽弁疾患）があり得る。また他の原因には下記のものがあり得る：ウイルス（ヒト免疫不全ウイルスを含む）、細菌、及び寄生生物による感染；薬剤（例えばドキソルビシン［アドリアマイシン］、シクロホスファミド[Cytoxan]、コカイン）；アルコール；結合組織疾患；浸潤性疾患（例えばアミロイド症、サルコイドーシス、血色素症、悪性疾患）；頻脈；閉塞性心筋症；神経筋疾患（例えば筋ジストロフィー又は筋強直性ジストロフィー、フリートライヒ運動失調）；代謝障害（例えば２型糖原病［ポンペ病］、及び５型糖原病［マッカードル病］）；栄養障害（例えば脚気、クワシオルコル）；褐色細胞腫；放射線；心内膜心筋線維症；好酸球性心内膜疾患；高拍出量性心不全（例えば心内短絡、心房瘻（atrioventricular fistula）、脚気、妊娠、パジェット病、甲状腺機能亢進症、貧血）；産辱性心筋症；及び拡張特発性心筋症（dilated idiopathic cardiomyopathy）である。しかし、主な因子は年齢である：年齢を伴う心臓衰弱、及び血管狭窄である。従って、５５歳を超えるヒトが最も発症する。
【０００３】
多くの場合、心不全は左室の収縮機能障害(ＬＶＳＤ)の結果である。臨床的心不全の患者の４０％ほどが、正常な収縮機能とともに拡張機能障害を有する。さらに、収縮機能障害患者の多くが、拡張機能障害の因子を有し得る。収縮機能障害が原因で、心室のポンプ機能に障害が生じる。拡張機能障害が原因で、心室充満に欠陥が生じる。心室拡張機能は、左室の圧力対容量（pressure-to-volume）の関係に依存する。左心室壁のコンプライアンスの低下は、所定の拡張期容積のための高い圧力をもたらす。最終的に、障害性心室充填、左心房及び肺静脈の不適切な圧力増加、及び心拍出量増加の減衰の結果となる。これらの機能障害は、心不全の臨床的症候群をもらたし得る。
【０００４】
心不全及びＬＶＳＤは、死亡及び罹患の重大な原因であるが、一般社会における診断には、問題が残されている。なぜなら、心エコー図の手段が、費用、訓練された人材の欠如、及び設備により制限されるためである。ＬＶＳＤのためのスクリーニングは、その罹患率、無症候性対象の存在、及び治療有効性により支持される。最近の証拠は、ナトリウム利尿ペプチド、例えばＢ型ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、及びその前駆体であるＮ-末端プロＢＮＰ(Ｎ-ＢＮＰ)が、幾つかの研究においては性能が次善である可能性があった(Vasanらの論文, JAMA 2002；288: 1252-1259)が、ＬＶＳＤスクリーニングに有用であることを示唆している(McDonaghらの論文, Lancet 1998；351:9-13；Hobbsらの論文, BMJ 2002；324: 1498-1500；Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782)。しかし、ＬＶＳＤを除外するための感度及び高い陰性予測値(ＮＰＶ)を有するが、ＢＮＰ、及びＮ-ＢＮＰは、とりわけ特異的ではなく、かつ低い陽性予測値(ＰＰＶ)を有する。
【０００５】
特に炎症性マーカを用いるマルチマーカアプローチ（Multimarker approaches）は、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ)及びミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)が利用される場合、例えば急性冠症候群の重症度分類において、予測の特異性の促進に有用であり得る(Sabatineらの論文, Circulation. 2002；105: 1760-3；Brennanらの論文, N Engl J Med. 2003；349: 1595-604)。ＣＲＰは、将来の心血管系疾患を予測する(Ridkerらの論文, N Eng J Med 1997;336: 973-979；Ridkerらの論文, N Eng J Med 2000；342: 836-43)。また、心不全の発症において、ＣＲＰが、非代償性の症例における大きな値とともに上昇するという幾つかの証拠がある(Vasanらの論文, Circulation 2003；107: 1486-91；Yinらの論文, Am Heart J 2004；147(5): 931-8)。
ＭＰＯは、冠状動脈疾患において役割を有し(Zhangらの論文, JAMA. 2001；286: 2136-42)、かつ梗塞後心室リモデリング(Askariらの論文, J Exp Med. 2003；197:615-24)に関係している可能性があるが、ヒト心不全において、ＭＰＯは調査されていない。
【０００６】
US 特許出願第2002/0164662号は、白血球及び血液ＭＰＯのレベルが、環状動脈疾患患者において上昇することを開示している。この知見に基づき、著者らは、ＭＰＯが一般に心不全を含む心血管系疾患の診断薬になり得ることを提案している。しかし、ＭＰＯが心不全を示すという主張を支持するデータはない。さらに、ＭＰＯの放出をもたらす好中球の動員及び活性化の結果として、ＭＰＯが冠状動脈に放出されることは知られているが、心不全においてＭＰＯが放出されることは明らかなことではない。（安定な又は循環血液量増加での）心不全において、ＭＰＯの測定が、診断又は予後となることを示唆するデータはない。実際に、本明細書中に示したデータは、虚血性心疾患(ＩＨＤ)の存在が、ＭＰＯレベル上昇の存在を独立に予測することはないが、心不全の存在が、ＭＰＯレベル上昇の存在を独立に予測することを証明している。本明細書中の実施例における心不全患者は、高血圧（心不全患者の約１／３）を含む、心不全の根底にある様々な原因を有していた。しかし、ＭＰＯはそれでも、患者が現在ＩＨＤ又心不全の発端としてはＩＨＤを有しているかどうかとは無関の心不全の診断となった。本明細書中に、ＭＰＯが非ＩＨＤ患者からＩＨＤ患者を識別することはないが、ＩＨＤ患者から心不全患者を、及び非ＩＨＤ患者から心不全患者を識別することを示す。従って、ＭＰＯが冠状動脈内で上昇することに基づいて、ＭＰＯを心不全患者の診断に使用することができると合理的に言うことはできない。De Pasqualeらの論文, Am J Physiol Hart Circ Physiol 2003, 284: H2136-H2145は、虚血性心筋障害が心不全を導く場合、ＭＰＯが、浮腫肺組織（oedematous lung tissue）内の好中球の集積のために肺組織内に含まれることを開示している。上記のこの理由、特に、ある割合の症例において、ＩＨＤのみが心不全の原因に起因するという事実のために、これが、心不全マーカとしての使用にとって、安定又は非代償性であるかどうかを推定することはできない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本発明は、ＭＰＯが心不全の診断となる意外かつ予想外の発見に基づく。ＭＰＯは、心不全を選別又は診断するためにＣＲＰ、Ｎ-ＢＮＰ、ＢＮＰ、又はウロテンシンなどの第２マーカと組合せて使用され得る。さらに、驚くべきことに、ＣＲＰ及びＭＰＯの双方が、Ｎ-ＢＮＰとともにＬＶＳＤの検出において増分値を有することがわかり、心不全のスクリーニングを可能にするように、その特異性及び陽性予測を十分に改善することができる。
【０００８】
第一の態様において、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中の第１マーカのレベルを測定することを含み、ここで該第１マーカがミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)である。該体液は、血漿であり得る。該第１マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第１マーカのレベルと比較する。心不全の非存在を示す第１マーカのレベルは、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの第１マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第１マーカの以前に測定された参照範囲であり得る。第１マーカのレベルは、該試料を該１マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定することができる。該抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
【０００９】
さらに、該方法は、心不全を示す第２マーカのレベルを測定することを含む。第２マーカは、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、又はＮ-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(Ｎ-ＢＮＰ)などのナトリウム利尿ペプチドであり得る。第２マーカは、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ)又はウロテンシンであり得る。該第２マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第２マーカのレベルと比較することができる。例えば、心不全の非存在を示す第２マーカのレベルを、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの第２マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第２マーカの以前に測定された参照範囲と比較することができる。第２マーカのレベルは、該試料を該２マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定することができる。該抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
【００１０】
別の態様において、哺乳動物対象の健康をモニタリングするための方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中の第１マーカのレベルを測定することを含み、ここで該第１マーカはミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)である。特定の実施態様において、該第１マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第１マーカのレベルと比較する。他の実施態様において、該第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心不全の悪化を示す第１マーカのレベルと比較する。他の実施態様において、該第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心臓突然死を示す第１マーカのレベルと比較する。また別の実施態様において、該第１マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の治療への応答を示す第１マーカのレベルと比較する。
【００１１】
さらなる態様において、前記方法を実行するためのキットも提供する。
予想外にも、哺乳動物対象からの体液試料中の該第１マーカＭＰＯのレベルは、心不全の診断に用い、かつ対象の症状を診断又は予測することができる。特に、ＭＰＯのレベルを、初期の選別として使用し、続いて、心不全をさらに効率的に診断し、心不全の悪化を検出し、心不全の変質を検出して、又は突然死の可能性若しくは対象の治療への応答を予測するために、第２マーカ用の任意検定を用いることができる。ＭＰＯは、心疾患の他の徴候のない対象において、心不全の診断となり得る。
【００１２】
特定の態様において、ＭＰＯは、心不全の緊急でない症状を有する対象、又は明白な急性心臓異常（例えば心筋梗塞又は不安定狭心症）のない対象の心不全を選別するために、ＣＲＰ、Ｎ-ＢＮＰ、ＢＮＰ、又はウロテンシンなどの第２マーカと組合せて使用され得る。該対象は、そのような選別のために医師により選択され得る。そのような選別にとって適切な対象は、明白な急性心臓異常がなく、かつ約２５、３５、４５、又は５５歳以上の男性又は女性であろう。該試験は、ＢＮＰ、Ｎ-ＢＮＰ、又はＣＲＰなどの第２マーカと組合せて、ＭＰＯのパネルから選択され得る。これらのマーカのレベルは、心不全の非存在を示すマーカのレベルと比較され得る。マーカの増加測定値を有する対象が、心不全の診断のために心エコー図法により選択されるであろう。従って、心不全と診断された対象は、適切な薬理学的薬剤及び生活様式の改善を用いて、該症状に対して治療されるであろう。
１以上の実施態様の詳細は、添付図面及び下記明細書で説明される。他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面から、並びに請求項から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（詳細な説明）
ＭＰＯは、正常な対象よりも心不全患者において高レベルで検出されている。従って、このマーカの測定は、心不全の存在、及び心不全の重症度の評価に対する診断補助として有用である。また、このマーカの測定は、哺乳動物対象の健康のモニタリングに有用である。ＭＰＯ、或いはＣＲＰ、Ｎ-ＢＮＰ、ＢＮＰ、又はウロテンシンなどの第２マーカと組合せたＭＰＯは、段階Ａ（ＨＦに関する危険因子）又は段階Ｂ（心不全前、例えば高血圧）の個人のＨＦ発症の危険因子として、及び／又は突然心臓死発症の危険因子として、今まで診断未確定の患者の心不全を検出すること、心不全患者の循環血液量増加（代償不全）を検出すること、患者の状態が悪化しているかどうかを決定すること（例えばNYHAクラスの変化）、心不全患者の状態が治療に反応するかどうかを決定することに使用され得る。例えば、他のマーカ及び心拍変動（heart rate variability）の測定とともに使用され得る。
【００１４】
ミエロペルオキシダーゼ (EC 1.11.1.7)は、主要な好中球タンパク質である。また、単球中に存在する。好中球において、それは、アズール顆粒に保存され、食作用時に放出される。それは、食細胞の酸化的バーストにより生じるスーパーオキシド及び過酸化水素を使用し、次亜ハロゲン酸及び他の反応性酸化剤を産生する、約１５０ｋＤａの四量体重グルコシル化ヘム酵素である。ヒトミエロペルオキシダーゼヌクレオチド配列は、3213ヌクレオチド長さであり、815-ヌクレオチド長の３’非コード領域に２つの異なるポリアデニル化シグナルを含む。一次翻訳産物は、745アミノ酸を有し、ＭＰＯ機能性タンパク質のプロ配列(166アミノ酸)、及び小(122アミノ酸)及び大(467アミノ酸)サブユニットからなる。試料中のＭＰＯ量を、全分子として、ＭＰＯのフラグメントとして定量化することにより、或いは試料又は試料の誘導体におけるＭＰＯ活性を測定することにより、試料中のＭＰＯレベルを測定することができる。
【００１５】
ＭＰＯを、そのポリペプチド配列を含む構造により同定することができる。例えば、該構造を、ＭＰＯの全ポリペプチド配列を表す一本鎖ポリペプチド配列により記載することができ、又は該構造を、ＭＰＯのフラグメントに相当する部分配列により記載することができる。複数の部分配列を組み合わせて、より大きい部分配列、又は全配列を作ることができる。例えば、第一ペプチド配列は、ＭＰＯのＮ-末端ポリペプチド配列を表すことができ、かつ第二配列は、ＭＰＯのＣ-末端ポリペプチド配列を表すことができる。ＭＰＯのフラグメントは、ＭＰＯ特有のアミノ酸配列を有するＭＰＯタンパク質のフラグメントである。該フラグメントは、わずか６アミノ酸であってもよいが、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５以上のアミノ酸であってもよい。ヒトＭＰＯのアミノ酸配列を図３に提供し（NCBIデータベースのアクセッション番号NM_000250、アクセッション番号AH_002972）、かつ本明細書中に使用される「ＭＰＯ」は、その変異体及び孤立遺伝子多型を含む。
【００１６】
ＭＰＯを改質することができる。N-又はＣ-末端を、例えば、Ｎ-末端上で、ホルミル基で改質することができる。該ポリペプチド配列を改質（例えば、グリコシル化、リン酸化）、疎水性基で改質（例えばミストイル化、又はゲラニルゲラニル化）、又は他のペプチド修飾で改質することができる。
【００１７】
一般に、該ペプチドのアミノ酸残基を、保存的置換において、他のアミノ酸残基で置換することができる。保存的置換の例を挙げると、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの非極性（すなわち疎水性）残基を他の非極性残基に置換；アルギニン及びリジン間、グルタミン及びアスパラギン間、又はグリシン及びセリン間の置換など、１つの極性（すなわち親水性）残基を他の極性残基に置換；リジン、アルギニン、又はヒスチジンなどの１つの塩基性残基を他の塩基性残基に置換；又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などの１つの酸性残基を他の酸性残基に置換がある。保存的置換において、アミノ酸残基を、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換することができる。化学的類似性の側鎖を有するアミノ酸残基群は、技術的に規定されている。これらの群は、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
【００１８】
また、保存的置換は、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基の使用を含むことができる。化学的誘導体残基を、残基の官能基の反応により化学的に誘導体化することができる。前記化学的誘導体の例を挙げると、例えばアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成するように遊離アミノ酸基を誘導体化した分子があるが、これらに制限されない。遊離カルボキシル基を、塩、メチル及びエチル、エステル、又は他種のエステル、又はヒドラジドを形成するように誘導体化することができる。遊離ヒドロキシル基を、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化することができる。また、化学的誘導体に含まれるものは、２０種標準アミノ酸の１以上の天然アミノ酸誘導体を含むポリペプチドである。例えば、プロリンに対して4-ヒドロキシプロリンを置換することができ；ヒスチジンに対して5-ヒドロキシルシンを置換することができ；セリンに対してホモセリンを置換することができ；かつリジンに対してオルニチンを置換することができる
【００１９】
該ポリペプチドのアミノ酸残基を、非保存的置換において、他のアミノ酸残基で置換することができる。幾つかの場合において、非保存的置換は、該ポリペプチドの当該特性を変更しない。当該特性は、限定されないが、ＭＰＯ認識抗体に結合する能力、又は他の生物活性とすることができる。
例えば免疫クロマトグラフ形式において、アッセイを定性的又は定量的に使用することにより、試料中のＭＰＯレベルを測定することができる。定性的アッセイは、ＭＰＯの存在又は非存在を区別することができ、又は非存在、低濃度、中間の濃度、又は高濃度又はその組合せなど、試料中のＭＰＯレベルの分類を区別することができる。定量的アッセイは、試料中のＭＰＯの数値計測を提供することができる。該アッセイは、ＭＰＯをＭＰＯ認識抗体と接触させること、ＭＰＯを質量分析により検出すること、ＭＰＯ遺伝子の発現（例えば、mRNA又はポリペプチド）細胞を含む試料を評価すること、又は測定の組合せを含むことができる。例えば、該アッセイは、試料をＭＰＯ認識抗体と接触させること、及び質量分析測定を含むことができる。
【００２０】
ＭＰＯタンパク質、又はそのフラグメントのレベルを測定することに加えて又は代替的に、ＭＰＯ産生酸化的産物のレベルを測定することにより、ＭＰＯレベルを測定することができる。適切なＭＰＯ産生酸化的産物の例は、クロロチロシン、ジチロシン、ニトロチロシン、及びメチオニンスルホキシドである。さらに、ＭＰＯ産生脂質過酸化産物を測定することができる。適切なＭＰＯ産生脂質過酸化産物は、下記のものである：ヒドロキシ-エイコサテトラエン酸(HETE)；ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(HODE)；F2イソプラスタン；2-リソPC(2-lysoPC)のグルタル酸及びノナン二酸モノエステル(それぞれG-PC及びND-PC)；2-リソPCの9-ヒドロキシ-10-ドデセン二酸及び5-ヒドロキシ-8-オキソ-6-オクテン二酸エステル(それぞれHDdiA-PC及びHOdiA-PC)；2-リソPCの9-ヒドロキシ-12-オキソ-10-ドデセン酸及び5-ヒドロキシ-8-オキソ-6-オクテン酸エステル(それぞれHODA-PC及びHOOA-PC)；2-リソPCの9-ケト-12-オキソ-10-ドデセン酸及び5-ケト-8-オキソ-6-オクテン酸エステル(それぞれKODA-PC及びKOOA-PC)；2-リソPCの9-ケト-12-オキソ-10-ドデセン二酸及び5-ケト-8-オキソ-6-オクテン二酸エステル(それぞれKDdiA-PC及びKOdiA-PC)；2-リソPCの5-オキソ吉草酸及び9-オキソノナン酸エステル(それぞれOV-PC及びON-PC)；5-コレステン-5α,6α-エポキシ-3β-オール(コレステロールα-エポキシド)；5-コレステン-5β,6α-エポキシ-3β-オール(コレステロールβ-エポキシド)；5-コレステン-3β,7β-ジオール(7-OH-コレステロール)；5-コレステン-3β,25-ジオール(25-OHコレステロール)；5-コレステン-3β-オール-7β-ヒドロペルオキシド(7-OOHコレステロール)；及びコレスタン-3β,5α,6β-トリオール(トリオール)である。
ＭＰＯは、血漿、又は組織液、尿、唾液、血清、リンパ、胃液、胆汁、汗、涙液、及び脳及び髄液などの哺乳動物体から得られ得る他の体液中で検出され得る。体液は、処理済（例えば血清）又は未処理であってもよい。該哺乳動物対象は、ヒトであってもよい。
【００２１】
それらのＭＰＯの測定レベルを、心不全の非存在を示すＭＰＯレベルと比較することができる。このレベルは、心不全のない１以上の哺乳動物対象からのＭＰＯのレベル、又は前記哺乳動物対象内のＭＰＯに対して以前に測定された参照範囲を有するＭＰＯのレベルであり得る。この方法において、診断又は予後診断のために、該レベルを、心不全のない対象の個体群研究から測定された参照レベルと比較することができる。前記対象は、年齢及び／又は性別に対して一致させることができる。一実施態様において、心不全の非存在を示すＭＰＯのレベルは、約80 pmol/L（又は27 ng/ml）以下、例えば、25 ng/ml未満、23 ng/ml未満、又は20 ng/ml未満であり得る。心不全を示すＭＰＯのレベルは、約88 pmol/L（又は30 ng/ml）以上、例えば、32 ng/ml超過、35 ng/ml超過、又は38 ng/ml超過であり得る。当業者は、正確な値が、アッセイ形式により変更され得ることを理解するであろう。心不全を有する哺乳動物対象に投与される治療効果をモニターするために、測定ＭＰＯレベルを、該対象の基礎レベルと比較することができる。該基礎レベルを、該治療の開始前に決定することができる。この基礎レベルからの偏差は、心不全状態の改善又は悪化があるかどうかを示し、従って、治療が効果的かどうかを示す。ＭＰＯレベルの増加は、心不全の悪化を示し、かつ逆もまた同様である。哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断に使用されるか、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度の測定に使用されるか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象の識別に使用されるか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果のモニタリングに使用される各ＭＰＯレベルが、互いに異なり得ることは、当業者により理解されるであろう。これらのレベルは、本明細書中に記載されている方法と類似の方法において容易に決定され得る。
【００２２】
また、哺乳動物対象の心不全を示す第２マーカを測定することができる。該第２マーカは、C-反応性タンパク質(ＣＲＰ−スイスプロット(SwissProt) P02741)、酵素調節タンパク質(ORP150−NCBIデータベースアクセッション番号AAC50947、アクセッション番号NP_006380)、ウロテンシン(UTN−GenBank登録番号NM_021995及びNM_006786)、血漿サーファクタントプロテインB(GenBank登録番号J02761)、Nourin-1(特許出願シリアル番号10/945,442に記載されている。該文献は、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)、或いは、天然型心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ−Brennerらの論文, Physiol. Rev., 1990, 70: 665を参照)、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)及びC-型ナトリウム利尿(CNP−Stingoらの論文, Am. J. Physiol. 1992, 263: H1318を参照)、及びそれらの変異体又は対立遺伝子多型を含むナトリウム利尿ペプチドとすることができる。ＣＲＰのアミノ酸配列を図５に示す。適切なナトリウム利尿ペプチドは、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)、又はＮ-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(Ｎ-ＢＮＰ)である。心不全において、脳ナトリウム利尿ペプチド(ＢＮＰ)(Weiらの論文, Circulation 1993；88: 1004-9；McDonaghらの論文, Lancet 1998；351: 9-13)、及びその前駆体Ｎ-末端タンパク質(Ｎ-ＢＮＰ)(Huntらの論文, Clin Endocrinol 1997；47: 287-96；Hughesらの論文, Clinical Science 1999；96: 373-380)の血漿レベル増加とともに、脳ナトリウム利尿ペプチド系の上方制御が証明されている。タンパク質の全体(図４参照)(Sudohらの論文, Biochem Biophys Res Commun 1989；159: 1427-34)は、シグナルペプチド配列(アミノ酸1-26)、及びプロＢＮＰ(アミノ酸27-134)からなり、それらからＮ-ＢＮＰ(アミノ酸27-102)、及びＢＮＰ (アミノ酸103-134)が誘導される。左心室心筋細胞からのプロＢＮＰ(２つの循環形態、ＢＮＰ(活性ペプチド)及びＮ-ＢＮＰ (不活性ペプチド)に対する無処置前駆体)の放出、及びＢＮＰの増強産生は、心筋拡張、心筋伸張、及び心筋負傷により誘発される。他の適切なナトリウム利尿ペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)(Hall, Eur J Heart Fail, 2001, 3:395-397)である。ウロテンシンは、プロホルモン前駆体、成熟ウロテンシンに処理されるプロウロテンシン(GenBank登録番号O95399)、及びＮ-末端ペプチドから誘導される。本明細書中に使用される用語「ウロテンシン」は、プロウロテンシン、成熟ウロテンシン、そのＮ-末端誘導ペプチド、そのシグナルペプチド、及びＣ-末端ペプチド(Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val(配列番号：6)(Cys5とCys10との間のジスルフィド結合))、並びに、それらのフラグメントをさらに含む。また、用語ウロテンシンは、ウロテンシン関連ペプチド(URP)(Ala-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val(配列番号：7)(Cys2とCys7との間のジスルフィド結合))、並びに、ウロテンシン関連ペプチドのプロフォーム(proform)(GenBank登録番号NM_198152)を意味する。De Pasqualeらの論文, Circulation, 2004, 110:1091-1096において、心不全マーカとして血漿サーファクタントプロテインBを記載する。
【００２３】
上記第２マーカのフラグメントを測定することができる。この場合において、該フラグメントは、問題となっている該第２マーカ特有のアミノ酸配列を有するであろう。該フラグメントは、わずか６アミノ酸であってもよいが、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５以上のアミノ酸であってもよい。ORP150に対して、該フラグメントは、配列LAVMSVDLGSESM(配列番号：8)を含むか、又はそれから構成され得る。ＢＮＰに対して、該フラグメントは、配列PQTAPSRALLLLL(配列番号：9)から構成されるか、又はそれを含み得る。
【００２４】
第１マーカＭＰＯに類似の方法において、測定された第２マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第２マーカのレベルと比較することができる。このレベルは、心不全のない１以上の哺乳動物対象からの第２マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第２マーカの以前に測定された参照範囲を有し得る。例えば、心不全のリスク増加を示すＢＮＰ又はＮ-ＢＮＰのレベルは、25 fmol/ml以上、例えば28 fmol/ml超過であり得る。心不全のリスク増加を示すＣＲＰのレベルは、40 ng/ml以上、例えば42 ng/ml超過であり得る。さらに、当業者は、正確な値がアッセイ形式により変更され得ることを理解するであろう。
【００２５】
本明細書中にさらに詳細に説明するように、本発明者らは、ＭＰＯ、ＣＲＰ、及びＮ-ＢＮＰの組合せ使用が、改良型特異性、及びこれらのマーカの幾つかの単独使用に対する陽性予測値を提供することを証明している。この結果は、超音波心臓検査計が、心不全を確認するように実行される必要性を減らし、結果、有意なコスト削減をもたらす。
マーカレベルは、濃度、質量、モル、体積、又は存在しているマーカの量を示す任意の他の測度の単位で提供され得る。
【００２６】
第１及び第２マーカの各レベルは、免疫アッセイを用いて、すなわち、試料を該マーカと特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合を測定することにより測定され得る。前記アッセイは、競合的又は非競合的免疫アッセイとすることができる。前記アッセイ、均一及び不均一の双方は、技術的に周知のものであり、検出されるべき分析物は、ラテックス又は金粒子、蛍光成分、酵素、電気化学的活性種などの検出可能種でラベル化されている抗体のような、特異的結合相手と結合を生じる。あるいは、該分析物を、任意の上記検出可能種でラベル化し、かつ制限量の特異抗体と競合させてもよい。次に、存在する分析物の存在又は量を、該ラベルの存在又は濃度の検出により測定する。前記アッセイを、実験室分析機器を用いて、或いはEP291194に記載されているような側方流動免疫アッセイ（lateral flow immunoassay）などのケアテスティングデバイス（care testing device）又はホームテスティングデバイス（home testing device）の点で、従来の方法で行ってもよい。
【００２７】
一実施態様において、免疫アッセイは、試験されるべき対象からの試料を、マーカが存在する場合に免疫特異的結合が生じ得るような条件下で適切な抗体と接触させること、及び該抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出又は測定することにより行われる。該抗体を、少なくとも１０分間、３０分間、１時間、３時間、５時間、７時間、１０時間、１５時間、又は１日間、試料と接触させることができる。制限されないが、ウエスタンブロット、放射線免疫アッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ（agglutination assays）、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイ、及びタンパク質Ａ免疫アッセイ（protein A immunoassays）などの技術を使用する競合的及び非競合的アッセイ系を含む、任意の適切な免疫アッセイを使用することができる。
【００２８】
例えば、２段階サンドイッチアッセイの手段により、マーカを体液試料中に検出することができる。第一段階において、捕獲試薬（例えば抗マーカ抗体）を使用して、該マーカを捕獲する。該捕獲試薬を、固相上に選択的に固定化することができる。第二段階において、直接的又は間接的ラベル化検出試薬を使用して、捕獲されたマーカを検出する。一実施態様において、該検出試薬は抗体である。他の実施態様において、該検出試薬は、レクチンである。
【００２９】
一実施態様において、側方流動免疫アッセイ機器を、該「サンドイッチ」形式に使用することができる。ここで。試料中の十分なマーカの存在は、側方流動アッセイの捕獲帯（capture zone）で、「サンドイッチ」相互作用の形成を生じるであろう。本明細書中に使用される該捕獲帯は、ＭＰＯ及び本明細書中に記載した他のマーカの捕獲に適した抗体分子、抗原、核酸、レクチン、及び酵素などの捕獲試薬を含むことができる。また、該機器は、分析物の存在により測定される捕獲の範囲の捕獲帯における捕獲に適した１以上の発光ラベルを組み込むことができる。適切なラベルは、ポリスチレンミクロスフェアに固定化した蛍光標識を含む。ミクロスフェアを、免疫グロブリンでコートし、該捕獲帯における捕獲を可能にすることができる。
使用することができる他のアッセイは、流入機器（flow-through device）を含むが、これに制限されない。
【００３０】
流入アッセイにおいて、１つの試薬（通常、抗体）を、膜表面上の規定領域に固定化する。次に、この膜を、容器として作用する吸収層上に重ね、該機器に渡って試料体積を注入する。固定化後に、該膜上の残りのタンパク質結合部位を遮断し、非特異的相互作用を最小化する。該アッセイを使用する場合、該抗体に特異的であるマーカを含む体液試料を、該膜に加え、該マトリクスを通して濾過し、該マーカを固定化抗体に結合させる。任意の第二段階において（第一反応物質が抗体である実施態様において）、タグ化二次抗体（酵素接合体、着色ラテックス粒子に結合した抗体、又は着色コロイドに組み込んだ抗体）を加える又は遊離させることができ、捕獲マーカと反応させて、該サンドイッチを完成する。あるいは、該二次抗体を該試料と混合し、かつ一段階で加えることができる。マーカが存在する場合、着色スポットが、該膜の表面上で現像される。
【００３１】
本明細書中に使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。該免疫グロブリン分子は、任意クラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA）、又は免疫グロブリン分子のサブクラスのものである。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二種特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びF(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（anti-Id）抗体、及び上記のいずれかの抗原決定基結合フラグメントを含むが、これらに制限されない。抗体、又は一般的に任意分子は、抗体が抗原に優先的に結合する場合、抗原（又は他の分子）に「特異的に結合」し、かつ例えば、他の分子と、約３０％未満、好ましくは２０％、１０％、又は１％未満の交差反応性を有する。抗体の部分は、Fv及びFv’部分を含む。
【００３２】
本明細書中に記載したＭＰＯ及び他のマーカを検出する抗体は、商業的に入手可能である。例えば、抗ＭＰＯ及び抗ＢＮＰ抗体は、Abcam Ltd, 21 Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0TP, UKから入手可能であり、抗ＣＲＰ抗体は、Alpha Diagnostic International社, 5415 Lost Lane, San Antonio, TX 78238 USA、及びResearch Diagnostic社, Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, USAから入手可能であり、かつ抗ORP150抗体は、Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd, 1091-1 Naka, Fujioka-shi, Gunma, 375-0005, Japanから入手可能である。ＢＮＰ及びＡＮＰに結合する抗体を、商業的に入手できる。ＢＮＰに結合する市販の抗体の例は、ウサギ抗ヒトＢＮＰポリクローナル抗体（Biodesign International）、ウサギ抗ＢＮＰアミノ酸1-20ポリクローナル抗体（Biodesign International）、抗ヒトＢＮＰモノクローナル抗体（Immundiagnostik）、及びウサギ抗ヒトＢＮＰアミノ酸1-10ポリクローナル抗体（Immundiagnostik）がある。ＡＮＰに結合する市販の抗体の例は、マウス抗ヒトＡＮＰモノクローナル抗体（Biodesign International）、ウサギ抗ヒトＡＮＰモノクローナル抗体（Biodesign International）、マウス抗ヒトＡＮＰモノクローナル抗体（Chemicon）、ウサギ抗ヒトＡＮＰアミノ酸95-103抗体（Immundiagnostik）、ウサギ抗ヒトＡＮＰアミノ酸99-126抗体（Immundiagnostik）ヒツジ抗ヒトＡＮＰアミノ酸99-126抗体（Immundiagnostik）、マウス抗ヒトＡＮＰアミノ酸99-126モノクローナル抗体（Immundiagnostik）、及びウサギ抗ヒトa-ＡＮＰポリクローナル抗体（United States Biological）がある。
【００３３】
また、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。
また、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用キットを提供する。該キットは、該哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書、及び該試料中のミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)のレベルを測定するための１以上の試薬を含む。
１以上の試薬は、上記のような、第１マーカに特異的に結合する抗体を含むことができる。該キットは、哺乳動物対象の心不全を示す第２マーカのレベルを測定するための１以上の試薬を含むことができる。
【００３４】
該哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書は、任意であってもよい。さらに、キットは、１以上の下記のものを任意に含むことができる：（１）哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用キットを使用するための説明書；（２）該キット内に存在する任意の抗体に対するラベル化された結合相手；（３）前記抗体が固定化された固相（試薬ストリップなど）；及び（４）診断使用、予測使用、又は治療的使用、或いはこれらの任意組合せのための規制認可を示すラベル又は折り込み紙である。該抗体又は各抗体に対する非ラベル化結合相手を提供する場合、該抗体又は各抗体自身を、検出可能なマーカ、例えば化学発光成分、酵素成分、蛍光成分、又は放射性活性成分でラベル化することができる。
【００３５】
さらなる態様において、ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)を、哺乳動物対象の心不全のマーカとして使用する。該ミエロペルオキシダーゼ(ＭＰＯ)のレベルを測定するための試薬は、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用診断薬の製造において、試料中に使用され得る。
【００３６】
さらなる態様において、心筋梗塞、又は不安定狭心症などの明白性のない急性心臓状態を有する対象は、これらの医師により、心臓状態のスクリーニングに選択される。血液試料を、アプロチニンを含む予め冷却したNa-EDTAチューブ内に回収し、検定まで、血漿を−７０℃で保存する。血漿を、ＢＮＰ、Ｎ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、及びＭＰＯマーカレベルに対して検定する。マーカのレベルを、該試料と特定の抗体に特異的に結合する抗体との接触、及び該抗体と該試料中の少なくとも１種との間で生じる結合の測定により測定する。該マーカレベルを使用して、該対象が心不全を発症している又は将来発症するかどうかを決定する。マーカのレベルは、心不全の非存在を示すマーカのレベルと比較される。マーカの増加測定値を有する対象は、心エコー図による心不全のさらなる診断を選択される。心エコー図により心不全と診断された対象は、適切な医薬、及び生活様式改善により、該状態が治療される。
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えた他の態様の各々に関する。本明細書中の先行技術文献は、法的に認められる全範囲に取り込まれている。
本発明は、下記の非制限的例においてさらに記載される。
【実施例】
【００３７】
（方法）
（患者採用）
Leicestershire（人口約１００万人）の２１の一般診療から、ランダムに選択した男性（４５〜８０歳）及び女性（５５〜８０際）を、スクリーニングのために募集した（１９９９年９月〜２００２年５月）。心不全又はＬＶＳＤの前歴を有する対象は全て除外した。対象は、インフォームドコンセントを与え、かつ研究は、Leicestershire研究倫理委員会（Leicestershire Research Ethics Committee）により承認された。
【００３８】
（心エコー図）
患者は、心エコー図、及び血液サンプリングのために、Leicester Royal Infirmaryに出席した。Sonos 5500分析機器(Philips Medical Systems)を用いて、１人のオペレーターにより経胸郭心エコー図法を行った。スキャニングプロトコルの全詳細は、(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782)に記載されている。米国学会の心エコー図モデル(Schillerらの論文, J Am Soc Echocardiogr 1989；2: 358-67)に基づき、１６セグメントウォールモーション指数（segment wall motion index（LVWMI））を、ペプチド測定に左右されずに３人の調査員により計算した。≧１．８（４０％のLV駆出分画に相当）のLVWMIスコアを有する対象はＬＶＳＤと考えられる（Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782）。下記の大きな異常を有するECGは顕著であった：−心房細動、LV肥大、左脚ブロック、Ｑ波である。
【００３９】
（研究室の方法）
静脈血液２０ｍｌを、アプロチニンを含む予め冷却したNa-EDTAチューブ内に回収し、検定まで、血漿を−７０℃で保存した。血漿を、Ｎ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、及びＭＰＯに対して、非競合的免疫発光測定アッセイ（non-competitive immunoluminometric assays）を用いて検定した。Ｎ-ＢＮＰアッセイは、以前に記載されている(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782；Omlandらの論文, Circulation 2002；106: 2913-8)。ＣＲＰは、モノクローナルＣＲＰ抗体(100ng/100μL)(Unipath PLC, Bedford) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を用いて測定した。ＭＰＯアッセイには、モノクローナルＭＰＯ抗体(100ng/100μL)(Research Diagnosis社, Flanders, New Jersey, USA) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を使用した。検出には、二次試薬（Sigma, Poole, UKからのビオチン化抗ウサギIgG、1:250,000希釈）、及びメチルアクリジニウムエステルラベル化ストレプトアビジン(Omlandらの論文, Circulation 2002；106: 2913-8)を使用した。全ての免疫発光測定アッセイを、0.05％過酸化水素及び250 mmol/l NaOHを含む100 mmol/l HNO3の逐次的注入を用いて、Dynex MLX照度計で読み込んだ。ＣＲＰ及びＭＰＯアッセイは、それぞれ、検出下限値20及び0.25 ng/mlで、アッセイ間及びアッセイ内変動係数が10％未満であった。
【００４０】
（統計分析）
統計分析をSPSSバージョン12.0(SPSS Inc, IL)を用いて行った。中央値[範囲]を記録し、かつマン-ホイットニー又はχ2検定を用いて行った。スピアマン相関係数(rs)、及び受信者操作特性(ROC)曲線(AUC)の領域、及びこれらの95％信頼区間を概算した。一般線形モデル、及びロジスティック回帰分析を、該モデルを含んだ定数とともに状態変数を用いてSPSSで行った。回帰において、エントリー又は除外の確率を、それぞれ、P＜0.05、及びP＜0.10とした（前向き又は後向き尤度比（forward or backward likelihood ratio）回帰分析を用いる場合）。
【００４１】
（結果）
アプローチした2392対象のうち、1360をスクリーニングした。分析可能な心エコー図スキャン及び血液試料を有する参加者の数は、1331であった（表１）。上記定義（LVWMI≧1.8、又はLVEF≦40％）で、以前にＬＶＳＤ診断未確定であった28対象（全個体群の2.1％）は、正常対象と比べて、血漿Ｎ-ＢＮＰが上昇していた（表１、図１）。また、血漿ＣＲＰ及びＭＰＯレベルは、ＬＶＳＤにおいて有意に上昇した（表１、図１）。血漿Ｎ-ＢＮＰとＣＲＰ(rs =0.071, P＜0.0005)及びＭＰＯ(rs =0.139, P＜0.0005)との相関は、血漿ＣＲＰとＭＰＯ(rs =0.168, P＜0.0005)との相関と比べて、比較的小さかった。LVWMIスコアは、血漿Ｎ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、及びＭＰＯ(それぞれrs =0.145, 0.168, 0.113, 全てに対してP＜0.0005)に相関があった。血漿ＣＲＰは、喫煙者において上昇していた（中央値[範囲]が、非喫煙者88.8[20-3012.2] ng/mlに比べて、161.5[20-3935.8] ng/ml）が、血漿ＭＰＯは、喫煙による影響はなかった。
【００４２】
さらなる分析のために、血漿Ｎ-ＢＮＰ、ＭＰＯ、及びＣＲＰをlog変換した。単変量解析において、血漿ＭＰＯは、虚血性心疾患（ＩＨＤ）暦の有する対象、大きなECG異常を有する対象、及び高齢対象においても上昇した（表２）。同様に、血漿ＣＲＰは、これらのグループ、また高血圧対象、女性、及び肥満度（中央値26.22 kg/m2超過）の対象において上昇した（表２）。しかし、一般線形モデル（SPSS）を用いた多変量解析において、ＣＲＰ及びＭＰＯレベル、双方に独立に影響を与える唯一の因子は、ＬＶＳＤの存在であった（表２）。特に注目することは、ＭＰＯレベルにおいてＬＶＳＤ（心不全）の存在のそれとは独立に、ＩＨＤ暦の影響がないことである。
【００４３】
ＬＶＳＤ診断に対して、３つのマーカ全てにおいて、受信者動作特性曲線（ROC AUC）の領域が対角線（P＜0.0005）から有意に異なっていた（図２、表３）。個々のマーカは、高感受性及びＮＰＶを有していたが、低特異性及びＰＰＶであった（ＣＲＰ又はＮ-ＢＮＰ、どちらかよりもより良く振舞うＭＰＯで）。1 ＬＶＳＤケースを診断するために心エコー図により検査しなければならない対象の数は、29.7（Ｎ-ＢＮＰ）及び35.5（ＣＲＰ）と比べて、ＭＰＯでは13.5であった。
【００４４】
３ペプチド全てを使用するＬＶＳＤ診断のために、２成分ロジスティック回帰分析を使用して、Nagelkerke r2が0.448（P＜0.0005）のモデルを、独立に寄与する３ペプチド全てを用いて構築した（表４、ロジスティックモデル１）。予測確率（又はＣ統計値）は、ROC曲線としてプロットした場合、0.949の領域をもたらし、改善された特異性及びＰＰＶを有していた（表３）。スキャンの必要がある対象の数は、ＭＰＯのみの使用と比べて半分であった。
【００４５】
３ペプチド全て、及び臨床的特性（年齢、性別、ＩＨＤ暦、高血圧、又は糖尿病）を、２成分ロジスティック回帰分析に組み入れ、ＬＶＳＤに関連したこれらの容易に利用可能な因子及び変量が、診断アルゴリズムをさらに改善し得るかどうかを試験した。該３ペプチドに加えて、唯一の有意な独立予測因子は、Nagelkerke r2が0.52（P＜0.0005）の男性、及びＩＨＤ暦であった（表４、ロジスティックモデル２）。改善した特異性及びＰＰＶ（表３）は、これらの単純な算入を正しいとするであろう。約４対象のみが、ＬＶＳＤの１ケースを検出するためにスキャンを必要とする。
【００４６】
血漿ＭＰＯは、単独と考えると、特異性及びＰＰＶに対して最もよい値を有していた。33.9 ng/mlでの血漿ＭＰＯレベルのカットオフレベルで、28 ＬＶＳＤ 患者のうち27患者は、388の他の正常対象(n=365)とともに回収されるであろう。ＭＰＯレベル33.9 ng/ml超過の対象において、ＣＲＰ、Ｎ-ＢＮＰ、及びこれらの２ペプチドを用いたロジスティックモデルの有用性を試験した。図２は、ＣＲＰ及びＮ-ＢＮＰのROC曲線を示し、かつ表５は、ROC AUC、特異性、これらのペプチドのＰＰＶ、及び心エコー図を必要とするケースの数を示す。Ｎ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、ＩＨＤ暦を用いたロジスティックモデルは、それぞれオッズ比10.06[P＜0.0005]、5.41[P＜0.0005]、3.93 [P＜0.01]、及び4.17[P＜0.007]で、Nagelkerke r2が0.43（P＜0.0005）と計算された。Ｎ-ＢＮＰ及びＣＲＰは、必要とされるスキャンの数を個々に減少させたが、Ｎ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、ＩＨＤ暦、及び性別を用いた該ロジスティックモデル（Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782）は、最も大きな減少を達成した（表５）。
【００４７】
血漿Ｎ-ＢＮＰ、ＭＰＯ、及びＣＲＰを単独、並びに上記ロジスティックモデル１、及び２との組合せにおいて関与するスクリーニング計画の費用を表６に示した。費用は、心エコー図スキャン及び血漿Ｎ-ＢＮＰのコストをそれぞれUS$420及び32と仮定した、Heidenreichらの論文による最近の費用対効果分析に基づく（Heidenreichらの論文, J Am Coll Carジオール 2004；43 : 1019-26）。本発明者らは、ＭＰＯ及びＣＲＰ試験コストがＮ-ＢＮＰと類似することを想定している。この見解は、ロジスティックモデル２（戦略Ｆ）が、検出される１ケースあたり最も低コストでＬＶＳＤを検出できることを示唆している。血漿ＭＰＯ（＞33.9 ng/ml）を初期選別に使用した場合、Ｎ-ＢＮＰ又はＣＲＰを用いた次の試験は、ＬＶＳＤ検出において幾らかのコスト削減を達成するが、最も大きな削減は、性別及びＩＨＤ暦を用いたロジスティックモデル（Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782）において、これらのマーカ双方を用いることである。
【００４８】
（議論）
ＬＶＳＤのスクリーニングにおいての関心は、B-型ナトリウム利尿ペプチド試験の導入により促進されていることである(McDonaghらの論文, Lancet 1998；351:9-13；Hobbsらの論文, BMJ 2002；324: 1498-1500；Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003；5: 775-782；Vasanらの論文, JAMA 2002；288: 1252-1259)が、その効果は、幾つかの研究において、比較的低特異性のために疑問がある(Vasanらの論文, JAMA 2002；288: 1252-1259)。費用対効果分析において、Heidenreichらの論文 (Heidenreichらの論文, J Am Coll Carジオール 2004；43 : 1019-26)は、1% ＬＶＳＤの全個体群罹患率で、B-型ナトリウム利尿ペプチドを用いた選別のための費用対効果が、その制限された特異性でさえ存在することを示唆する。全てのＬＶＳＤ既知患者を除外した本研究は、スクリーニングを正しいとし得るレベルで、全個体群罹患率2.1％を検出した。Ｎ-ＢＮＰ特異性を改善し得る任意のスクリーニング戦略は、さらにコストを低下し得る。
【００４９】
心血管系疾患に関連したマーカ（ＭＰＯ及びＣＲＰ）を使用することにより、ＬＶＳＤスクリーニングにおいてＮ-ＢＮＰと比較してＭＰＯの特異性増加を示した。ＣＲＰは、Ｎ-ＢＮＰと同様に振舞うことはなかった。大部分健康なこの個体群において、血漿ＭＰＯ及びＣＲＰの唯一の独立予測因子は、ＬＶＳＤの存在であった。ロジスティックモデルは、３マーカ全ての独立的な診断役割を確認し、これは、ＩＨＤの存在及び男性などの因子により改善され得る。この最終的なロジスティックモデルを使用することにより、有意な節約を達成することができる（全個体群に心エコー図スキャンを実施することに対して三分の一、又は初期スクリーニング試験として血漿Ｎ-ＢＮＰ単独を、陽性試験を有する対象の心エコー図とともに実施することに対して半分に下げる）。しかし、最も有意な節約は、初期スクリーニング試験として血漿ＭＰＯを使用すること、続いてＮ-ＢＮＰ及びＣＲＰを、これらのマーカ、ＩＨＤ暦、及び性別とともにロジスティックモデルにおいて使用することから生じる。後者の２つの因子は、容易に利用可能であり、ＬＶＳＤ診断の特異性を改善する。
【００５０】
（結論）
本群集団において、ＣＲＰ及びＭＰＯなどの炎症性マーカの分析は、以前に診断未確定であったＬＶＳＤの検出において、血漿Ｎ-ＢＮＰの特異性を改善した。スクリーニング計画のコストは、初期スクリーニング試験として血漿ＭＰＯを使用し、次に性別及びＩＨＤ暦を用いたロジスティックモデルにおいてＣＲＰ及びＮ-ＢＮＰを使用することにより最小化することができる。前記戦略は、２〜３倍の血漿Ｎ-ＢＮＰを用いる、証明された費用対効果スクリーニング戦略のコストを低下させる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
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【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
（図面の説明）
本発明は、下記における添付図面を参照してさらに記載されるであろう。
【図１】図１a〜cは、それぞれ、正常及びＬＶＳＤ対象における血漿ＭＰＯ、ＣＲＰ、及びＮ-ＢＮＰのボックスプロットである。
【図２】図２aは、ＬＶＳＤ診断におけるＮ-ＢＮＰ、ＣＲＰ、及びＭＰＯの受信者動作特性(ROC)曲線である。ロジスティックモデル１(Ｎ-ＢＮＰ, ＣＲＰ, ＭＰＯ)、及び２(Ｎ-ＢＮＰ, ＣＲＰ, ＭＰＯ, ＩＨＤ病歴, 性別)をプロットした。図２ｂは、血漿ＭＰＯ＞33.9 ng/mlの対象に関する、ＬＶＳＤ診断におけるＮ-ＢＮＰ及びＣＲＰのROC曲線である。また、Ｎ-ＢＮＰ, ＣＲＰ, ＩＨＤ病歴, 性別を用いるロジスティックモデルをプロットした。
【図３】図３は、ヒトＭＰＯ(配列番号：１)のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、プロＢＮＰ(配列番号：２〜４, それぞれ出現順)のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ＣＲＰ(配列番号：５)のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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