(57)【要約】細胞試料の中の非生存細胞を検出する方法であって、該細胞の試料を検出可能な試薬と接触させるステップ、及び前記試料の細胞への前記試薬の結合を検出するステップを含む方法が記載されている。検出可能な試薬は、乳、乳製品又はこれらの成分である。使用できる成分は、リポ多糖結合性タンパク質であり、例えば、ラクトフェリンである。該方法は、低Ｃａ２＋又はＣａ２＋のない状態で実施される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料の中の非生存細胞を検出する方法であって、
ａ）前記細胞の試料を検出可能な試薬と接触させるステップと、
ｂ）前記試料の細胞への前記試薬の結合を検出するステップと
を含み、
前記試薬は、乳、乳製品、又はこれらの成分である、
方法。
【請求項２】
生体試料の中の非生存細胞を生存細胞より分離する方法であって、
ａ）前記試料を検出可能な試薬と接触させるステップと、
ｂ）前記試薬が結合した細胞を前記試料から単離するステップと
を含み、
前記試薬は、乳、乳製品又はこれらの成分である、
方法。
【請求項３】
ｃ）溶解した細胞と無傷細胞とを区別するステップをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
検出可能なマーカーによって、溶解した細胞が無傷細胞と区別される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能なマーカーは、ヨウ化プロピジウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料から、アポトーシス細胞又は死細胞を分離するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
０．５ｍＭ未満のＣａ２＋の存在下で、前記細胞の試料を前記検出可能な試薬と接触させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
遊離のＣａ２＋の不存在下で、前記細胞の試料を前記検出可能な試薬と接触させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞のアポトーシスを調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）細胞の試料をアポトーシス調節候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）細胞の前記試料を検出可能な試薬と接触させ、前記試薬は、乳、乳製品又はこれらの成分であるステップと、
ｃ）前記試料の細胞への前記試薬の結合を検出し、前記結合は、死細胞又はアポトーシス細胞を示すステップと、
ｄ）前記アポトーシス調節候補化合物に曝露されていない細胞の対照試料で、ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）を繰り返すステップと、
を含み、
前記候補調節剤に曝露された細胞と前記対照細胞との間における試薬の結合性の違いが、前記候補調節剤がアポトーシスを調節することを示す、
方法。
【請求項１０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏで対象領域中の細胞死を画像化する方法であって、
標識に結合した乳又は乳製品を含む検出可能な試薬を、対象に投与するステップと、
走査型装置の視野において対象の位置決めをするステップと、
走査型装置を使用して、対象内の検出可能な試薬及び標識の位置を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項１１】
前記検出可能な試薬は、乳の主要成分である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な試薬は、リポ多糖類結合性タンパク質（ＬＢＰ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＬＢＰは、ラクトフェリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な試薬は、再構成された粉ミルクである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
生体試料の中のアポトーシス細胞を検出するためのキットであって、
（ｉ）乳、乳製品又はこれらの成分である検出可能な試薬、及び
（ｉｉ）溶解した細胞のための検出可能なマーカー、
を含むキット。
【請求項１６】
前記検出可能なマーカーは、ヨウ化プロピジウムである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記検出可能な試薬は、乳の主要成分である、請求項１５又１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記検出可能な試薬は、リポ多糖類結合性タンパク質である、請求項１５、１６又は１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記リポ多糖類結合性タンパク質は、ラクトフェリンである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記検出可能な試薬は、再構成された粉ミルクである、請求項１５又は１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、死細胞及び瀕死細胞の検出方法、このような方法に使用するための試薬、及びこのような試薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、正常な発生及び恒常性における根本的に重要な過程である。アポトーシスは、多くの病状に関与していることも知られている。例えば、アポトーシス及びアポトーシス経路における欠陥は、癌、心臓疾患、脳卒中、アルツハイマー病、虚血及び自己免疫疾患に特に関連すると考えられている。例えば癌は、たとえ増殖速度が増大しない場合でも、アポトーシス経路における欠陥により生じることがある。
【０００３】
アポトーシスを誘発しない抗癌剤候補は、臨床効果を減少させる可能性があり、アポトーシス分析は、薬剤のハイスループットスクリーニングのための重要な手段となる。アポトーシス調節薬剤の開発には、アポトーシス細胞及び／又は死細胞の存在を判定する確固たる分析法を必要とする。先行技術においていくつもの方法が利用され、生体試料、例えば、血液試料又は生検試料においてアポトーシス細胞及び／又は死細胞の存在が、確認及び／又は定量されているが、それらの方法はそれぞれ、特有の不都合な点がある。
【０００４】
当分野において、アポトーシスを分析するためのいくつもの方法が知られている。核酸染色法は、細胞集団中のアポトーシス細胞の同定に使用でき、アポトーシス中の核の特徴的な分解を利用するが、この分解が、クロマチンの崩壊及び断片化、核膜の分解並びに核の泡状化をもたらし、「アポトーシス小体」の形成をもたらす。
【０００５】
先行技術で使用される他の方法は、細胞中のプロテアーゼ活性の測定、例えば、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８などの、アポトーシス経路のエフェクターの活性測定を含む。アポトーシスの特徴は、活性ミトコンドリアの崩壊なので、ミトコンドリア染色法はアポトーシス細胞の同定に使用できる。他のアポトーシス分析法は、フリーラジカルのプローブ又はイオン指示薬を用いて、アポトーシス細胞の変化を測定する。
【０００６】
アポトーシスの分析に最も一般的に使用される方法の１つは、血管抗凝血物質のアネキシンＶの使用に基づく。アネキシンＶは、ホスファチジルセリンに高い親和性を有するリン脂質結合性タンパク質である。しかし、生存細胞においては、アネキシンＶは、ホスファチジルセリンが細胞膜の細胞質面に位置しているためにホスファチジルセリンと結合しない。しかし、アポトーシス細胞においては、ホスファチジルセリンは、細胞膜の外表面に外面化されており、そこでホスファチジルセリンは、アネキシンＶと結合できる。しかし、アポトーシスの検出のための分析にアネキシンＶを使用することには、いくつもの不都合な点がある。特に、アネキシンＶのホスファチジルセリンに対する結合はＣａ２＋依存性なので、分析に使用されるバッファーの選択が限定される。これにより、試料が分析される前にバッファーを交換することになり、そのことが、細胞に対するストレスの増加を生じ、非生存細胞の増加をもたらす可能性がある。
【０００７】
したがって、試料における非生存細胞の存在を検出するために使用できる更なる分析法、例えばハイスループット分析で使用するための分析法が必要である。
【発明の開示】
【０００８】
アポトーシス細胞の潜在的指標として多くの化合物を試験する際に、本発明者らは多くの「対照」物質を使用した。
【０００９】
驚くべきことに、「試験」物質と「対照」物質を使用した結果を比較すると「対照」物質のひとつであるビオチン化乳が、思いがけず、死細胞及び瀕死細胞に選択的に結合することを発見した。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様において、細胞試料の中の非生存細胞を検出する方法が提供され、前記方法は、
ａ）前記細胞の試料を検出可能な試薬と接触させるステップと、
ｂ）前記試料の細胞への前記試薬の結合を検出するステップと
を含み、前記試薬は乳、乳製品又はこれらの成分である。
【００１１】
非生存細胞は、死細胞又は瀕死細胞、例えば、アポトーシス細胞であってよい。本発明のいくつかの実施形態において、異なる型の非生存細胞、例えば、死細胞とアポトーシス細胞とを区別する必要はなかろう。しかし、いくつかの実施形態においては、このような細胞を区別することが有益となり得る。
【００１２】
したがって、本発明の好ましい一実施形態において、該方法はさらに（ｃ）溶解した細胞と無傷細胞とを区別するステップを含む。
【００１３】
溶解した細胞と無傷細胞とを区別する、当分野で公知の適切な方法は、いずれも使用できる。例えば、溶解細胞の検出可能なマーカーが使用できる。一実施形態において、該検出可能なマーカーはヨウ化プロピジウムである。使用可能な他の検出可能なマーカーは、細胞非透過性のエチジウム剤、例えば、エチジウムホモダイマー−１、７−アミノアクチノマイシンＤ、ＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物を含む（すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓより入手可能）。
【００１４】
上記のように、本発明者らは、乳又は再構成された粉ミルクなどの乳製品が、非生存細胞を選択的に検出するために使用できることを発見した。このような組成物が、このように使用できることが確立したため、本発明者らは、観察された選択的結合に関与する、又はその原因となる可能性のある、乳の特定の成分を同定しようと努めた。
【００１５】
実施例で明示したように、本発明者らは、リポ多糖類結合性タンパク質であるラクトフェリン（乳の主要な成分）が、死細胞又は瀕死細胞に特異的結合を示すことを発見した。
【００１６】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明で使用する検出可能な試薬は、リポ多糖類結合性タンパク質、例えば、ラクトフェリン又はこの類似体である。一実施形態において、該試薬はラクトフェリンである。
【００１７】
いずれのラクトフェリンも使用できる。例えば、乳より精製された天然のものであっても、又は組換えで製造されたものであってもよい。ラクトフェリンは、例えば、ヒト、乳牛、羊、ヤギのどのような哺乳類由来であってもよい。一実施形態において、該ラクトフェリンはヒトラクトフェリンである。代替の実施形態では、該ラクトフェリンはウシラクトフェリンである。
【００１８】
本発明に関しては、ラクトフェリンの類似体は、ヒトラクトフェリンのアミノ酸配列に対して９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、さらにより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を有し、ラクトフェリン活性を維持しているタンパク質である。「ラクトフェリン活性」は非生存細胞と選択的に結合する能力であり、好ましくは鉄と結合する能力である。
【００１９】
相同性比較は、目視により実施でき、あるいはより一般には、容易に利用できる配列比較プログラムの支援を用いて実施できる。
【００２０】
２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列の一致率（％）は、最適な比較をするために配列を整列させ（例えば、配列の最適な整列のために第１の配列にギャップ（ｇａｐ）を導入できる）、対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することにより決定できる。「最適な整列」は、最も高い一致率をもたらす２本の配列の整列である。一致率（％）は、比較されている配列中の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数により決定される（すなわち、一致率（％）＝一致した位置数／総位置数×１００）。
【００２１】
２本の配列の間の一致率（％）の決定は、当業者には周知の数学的アルゴリズムを使用して達成できる。２本の配列の比較のための数学的アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin andAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように修正された。Altschul, et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムは、このようなアルゴリズムを組み入れている。
【００２２】
本発明はラクトフェリンに限定されない。主要乳成分のラクトフェリンが非生存細胞を同定するために使用できるという実証は、特性を共有する他の乳成分の同定を可能にする。
【００２３】
したがって、本発明に使用するための検出可能な試薬は、非生存細胞に選択的に結合するいずれの乳成分であってもよい。好ましくは、該乳成分は主要成分である。本発明の文脈の中で、乳成分が、乳全体中に０．０５ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌより高い濃度で存在する場合、該乳成分は「主要成分」であると考えられる。
【００２４】
好ましい実施形態において、検出可能な試薬はリポ多糖類結合性タンパク質である。
【００２５】
本発明において使用するための検出可能な試薬は、当分野のいずれの適切な方法を使用しても検出できる。例えば、一実施形態において、該試薬は試薬特異的抗体を使用して検出できる。別の実施形態において、該試薬は標識できる。適切な標識はいずれも使用できる。例えば、使用できる標識には、限定するものではないが、フェリチン、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジン並びにこれらの誘導体などのタンパク質、蛍光マーカー、例えば、フルオロセイン、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射性標識、アルコール脱水素酵素、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどの酵素、エバンズブルー、クマシーブリリアントブルーなどの色素、検出可能な金属あるいは検出可能な免疫グロブリンが含まれる。
【００２６】
上記のように、本発明者らは、先行技術のアポトーシス検出用薬剤のいくつかと対照的に、ラクトフェリンは二価カチオン濃度が低い状態、例えば、Ｃａ２＋のない状態で、アポトーシス細胞の同定に使用できることを発見した。
【００２７】
したがって、本発明の好ましい実施形態において、該試薬は、Ｃａ２＋の低い、好ましくはＣａ２＋のない状態で生存細胞と非生存細胞との間の識別が可能である。
【００２８】
したがって、本発明の一実施形態において、Ｃａ２＋の存在が１ｍＭ未満で、前記細胞の試料が検出可能な試薬と接触させられる。一実施形態において、Ｃａ２＋濃度は、０．５ｍＭ未満、より好ましくは１００μＭ未満、例えば、２５μＭ未満である。一実施形態において、前記細胞の試料は、遊離のカルシウムなしで検出可能な試薬と接触させられる。その上、さらに好ましい実施形態において、Ｃｄ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、又はＣｏ２＋などの、他の二価カチオン濃度は、０．５ｍＭ未満、より好ましくは１００μＭ未満、例えば、２５μＭ未満である。一実施形態において、前記細胞の試料は、遊離の二価カチオンなしで検出可能な試薬と接触させる。
【００２９】
該方法は、前記アポトーシス細胞及び／又は死細胞を、前記試料より分離するステップを含むことができる。
【００３０】
第２の態様において、本発明は、生体試料の中の非生存細胞を生存細胞より分離する方法であって、
ａ）前記試料を検出可能な試薬と接触させるステップと、
ｂ）前記試薬が結合した細胞を前記試料から単離するステップと
を含み、前記試薬が乳、乳製品又はこれらの成分である方法を提供する。
【００３１】
さらに本発明は、細胞におけるアポトーシスを調節する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて、非生存細胞の検出に乳又は乳成分を使用することを可能にする。
【００３２】
したがって、本発明の第３の態様において、細胞のアポトーシスを調節する化合物の同定方法が提供され、前記方法は、
ａ）細胞の試料をアポトーシス調節候補化合物と接触させるステップと、
ｂ）細胞の前記試料を検出可能な試薬と接触させるステップで、前記試薬が乳、乳製品又はこれらの成分であるステップと、
ｃ）前記試料の細胞への前記試薬の結合を検出するステップで、該結合が死細胞又はアポトーシス細胞を示すステップと、
ｄ）前記アポトーシス調節候補化合物に曝露されていない、細胞の対照試料を用いて、ステップ（ｂ）及びステップ（ｃ）を繰り返すステップと
を含み、前記候補調節剤に曝露された細胞と前記対照細胞との、試薬の結合性の違いが、前記候補調節剤がアポトーシスを調節することを示す。
【００３３】
本発明は、アポトーシス細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化にも使用できる。したがって、本発明の第４の態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象領域中の細胞死を画像化する方法であって、
標識に結合した乳又は乳製品を含む検出可能な試薬を、対象に投与するステップと、
走査型装置の視野において対象の位置決めをするステップと、
走査型装置を使用して、対象内の検出可能な試薬及び標識の位置を検出するステップと
を含む方法が提供される。
【００３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化に適切な標識はいずれも使用でき、該標識に適した走査型装置が使用される。例えば、標識は放射性核種であり、走査型装置は放射線放出検出装置であっても良い。別の実施形態において、標識は磁気標識、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用標識、例えば超常磁性ナノ粒子であってもよく、走査型装置としてＭＲＩスキャナーが使用される。
【００３５】
放射線放出パターンを使用して、対象の走査領域における細胞死を示すことができる。
【００３６】
本発明のこの態様において、適切な放射線走査装置はいずれも使用できる。装置の選択は、放射線放出の選択に依存するであろう。例えば、放出される放射線がポジトロンである場合、放射線走査装置が、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）装置であってよい。放出される放射線がγ線放射を含む場合、走査型装置はγ線放射検出器であってよい。該方法に有益な放射性核種は、ポジトロン放出体が必要とされる場合のフッ素１８、又はγ放出の標準的検出に有益な、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、ガリウム６７、インジウム１１１及びテクネチウム９９を含む。
【００３７】
本発明の第５の態様は、生体試料の中のアポトーシス細胞を検出するためのキットであって、
（ｉ）検出可能な試薬（前記試薬は乳、乳製品又はこれらの成分である）、及び
（ｉｉ）溶解した細胞のための検出可能なマーカー
を含むキットからなる。
【００３８】
本発明の第４の態様の好ましい実施形態において、該キットはさらに検出可能な試薬を標識するための標識を含む。
【００３９】
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要に応じて変更を加えたその他の態様それぞれに対しても同様である。
【００４０】
次に、本発明を以下の限定されない実施例においてさらに説明する。添付の図面を参照されたい。
【実施例】
【００４１】
実施例１  異なる種由来の死細胞及び瀕死細胞を検出するために、牛乳が使用できる
再構成された、ビオチン化スキムミルク粉末（Ｔｅｓｃｏ）を、アポトーシスによる死を誘発されたヒトＢ細胞培養物、又は自然細胞死を含むマウスのハイブリドーマ細胞培養物とともにインキュベートした。スキムミルク粉末の飽和溶液をＰＢＳで調製し、０．２μｍのフィルターでろ過し、Ｓｉｇｍａのキット（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｂｅビオチン化キット）を使用して、使用説明書に従ってビオチン化した。細胞に結合している乳のビオチン化成分を、当業者により使用されるように、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、次いでフローサイトメトリー解析を用いて検出した。
【００４２】
図１ａは、ビオチン化乳成分とヒトＢ細胞の非生存細胞との選択的結合を示している。生存細胞及び非生存細胞は、当業者により使用される方法のとおり、それらの光散乱特性（ＦＳ対ＳＳ）により識別された。
【００４３】
図１ｂは、ビオチン化乳成分とマウスハイブリドーマ非生存細胞との選択的結合を示している。生存細胞及び非生存細胞は、当業者により使用される方法のとおり、それらの光散乱特性（ＦＳ対ＳＳ）により識別された。
【００４４】
実施例２  死細胞及び瀕死細胞を検出するために、ヒトの母乳が使用できる
同意したボランティアのドナーによるヒトの母乳を、後述のようにビオチン化した。完全なヒトの母乳を高速で（１４０００×ｇ）で１０分間遠心分離機にかけた。上の脂質層を廃棄し、下の濁った下層を回収した。下層は、使用説明書に従って、ビオチン化キット（ｌｍｍｕｎｏｐｒｏｂｅキット、Ｓｉｇｍａ）を用いてビオチン化する前に、０．２μｍのフィルターでろ過した。ビオチン化母乳を、アポトーシスによる死を誘発された、ヒトＢ細胞培養物とともにインキュベートした。細胞と結合した乳のビオチン化成分を、当業者により使用されるとおり、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Ｓｉｇｍａ  Ｌｔｄ）、及び次いでフローサイトメトリー解析を用いて検出した。
【００４５】
図２は、ある範囲の希釈度の母乳による細胞の染色を示している。染色は、それらの光散乱特性により明示されているように、非生存細胞に対して特異的であった。母乳の希釈度が高い場合、及び低い場合に細胞の弱い染色を認めた。この結合パターンは、ａ）活性結合因子より速く弱まる阻害剤が、乳の中に存在する、又はｂ）活性成分は、高濃度でそれ自体の結合を阻害できる、とすると矛盾がない。
【００４６】
実施例３  生存促進タンパク質のＢｃｌ−２による死の阻害は、ヒトの母乳の結合を阻害する
ヒトＢ細胞（図１及び図２で使用したような）を、Ｂｃｌ−２のｃＤＮＡを用いて、安定にトランスフェクトした。Ｂ／ｂｃｌ−２（Ｂｃｌ−２を用いてトランスフェクトされたＢ細胞）をイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートすると死の誘発が限定された。（図１及び図２で使用した、トランスフェクトされていない対応細胞とは異なっている）。図３は、ある範囲の希釈度の母乳を用いた細胞の染色を示している。それらの光散乱特性により示されるように、この染色は少数の非生存細胞に特異的であった。母乳の希釈度が高い場合、及び低い場合に細胞の弱い染色を認めた。Ｂｃｌ−２は、イオノマイシン誘発性の死、及びビオチン化母乳による染色を明らかに阻害していた。この結果は、細胞の乳による染色が非生存細胞に特異的であったことを示唆している。
【００４７】
実施例４  ウシラクトフェリンは、ハイブリドーマ死細胞と結合する
ラクトフェリンが乳中の活性成分であった場合、精製されたＬｆが死細胞に結合すると期待されよう。この目的を達成するために、ウシラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ）をビオチン化した。ビオチン化ウシラクトフェリンを、自然細胞死を含む、マウスハイブリドーマ細胞培養物とともにインキュベートした。細胞に結合したビオチン化ウシラクトフェリンを、当業者により使用されるように、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、次いでフローサイトメトリー解析を用いて検出した。
【００４８】
図４Ａは、ウシラクトフェリンとマウスハイブリドーマ非生存細胞との用量依存性結合を示している。図４Ｂは、ラクトフェリンの結合が用量依存性であり、対照であるＢＳＡ−ビオチンが用量依存性結合を示さないことを示している。図４Ｃは、ウシラクトフェリンとマウスハイブリドーマ非生存細胞との結合が、非標識ラクトフェリンの添加により阻害されることを示している。図４Ｄは、ウシラクトフェリンとマウスハイブリドーマ非生存細胞との結合が、非標識スキムミルク（ＳＭＰ）の添加により阻害されることを示している。
【００４９】
実施例５  ウシラクトフェリンとハイブリドーマ死細胞との結合が、非標識ラクトフェリン又は牛乳により阻害できる
図５は、マウスハイブリドーマ細胞（死細胞を含む）培養物の染色を示している。この染色は、非標識ウシラクトフェリンの添加により阻害され（図５ａ）、又は非標識牛乳（再構成されたスキムミルク）の添加により阻害される（図５ｂ）。阻害は用量依存的に生じる。
【００５０】
実施例６  ビオチン化ウシラクトフェリン（Ｌｆ−ｂｉｏ）は、ヒトＢ細胞の死細胞に結合する（アポトーシス細胞及びネクローシス細胞の両方）
図６は、１μｇ／ｍｌまでのイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｌｔｄ）を添加することにより、アポトーシスによる死を誘発されたヒトＢ細胞培養物とＬｆ−ｂｉｏとの結合を示している。乳の染色（図２）で認めたように、Ｌｆ−ｂｉｏが高濃度及び低濃度では染色が弱かった。さらに、染色は死亡帯域の細胞に選択的に限定されていた。
【００５１】
図７は、熱処理によるネクローシスを誘発されたヒトＢ細胞培養物とＬｆ−ｂｉｏとの結合を示している。細胞を、５６℃で１時間インキュベートし、得られた細胞は色素のヨウ化プロピジウムに対して透過性が９０％より大であることを示した。これらのネクローシス細胞はＬｆ−ｂｉｏを用いて染色され、Ｌｆ−ｂｉｏがアポトーシス細胞及びネクローシス細胞の両方に結合できることを示唆していた。
【００５２】
実施例７  ビオチン化ヒト母乳（ＢＭ−ｂｉｏ）と死細胞との結合は、ヒトラクトフェリン又はウシラクトフェリンにより阻害できるが、コンアルブミン又はＢＳＡによっては阻害できない
ヒトＢ細胞培養物に、ＵＶを照射（１００ｍＪ／ｃｍ２）し、その後３７℃で２４時間インキュベートすることによりアポトーシスを誘発した。細胞を、以下の非標識タンパク質のうちの１種が、ある範囲の濃度で存在する、又は存在しない状態で、ＢＭ−ｂｉｏにより染色した。ウシＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、ヒトＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、コンアルブミン（実質的に鉄を含有しない；Ｓｉｇｍａ）、又はコンアルブミン（鉄含有；Ｓｉｇｍａ）。図８は、コンアルブミン調製品又はＢＳＡは、死細胞のＢＭ−ｂｉｏ染色に阻害効果を示さなかったが、Ｌｆ（ウシ又はヒト）が、死細胞のＢＭ−ｂｉｏ染色を阻害したことを示している。この結果は、複数種由来のＬｆが実質的に同様に死細胞と相互作用することを示唆している。この結果はさらに、もう１つのメカニズム（イオノマイシン又は熱ではなくＵＶ）により誘発された死細胞が、ＢＭ−ｂｉｏにより検出できることを示している。
【００５３】
実施例８  ビオチン化ウシラクトフェリン（ｂｏｖＬｆ−ｂｉｏ）と死細胞との結合は、ヒトラクトフェリン又はウシラクトフェリンにより阻害できるが、コンアルブミン又はＢＳＡによっては阻害できない
ヒトＢ細胞培養物に、ＵＶを照射（１００ｍＪ／ｃｍ２）し、その後３７℃で２４時間インキュベートすることによりアポトーシスを誘発した。細胞を、以下の非標識タンパク質のうちの１種が、ある範囲の濃度で存在する、又は存在しない状態で、ｂｏｖＬｆ−ｂｉｏにより染色した。ウシＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、ヒトＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、コンアルブミン（実質的に鉄を含有しない；Ｓｉｇｍａ）、又はコンアルブミン（鉄含有；Ｓｉｇｍａ）。図９は、コンアルブミン調製品又はＢＳＡは、阻害効果を示さなかったが、Ｌｆ（ウシ又はヒト）が、死細胞のｂｏｖＬｆ−ｂｉｏ染色を阻害したことを示している。この結果は、複数種由来のＬｆが実質的に同様に死細胞と相互作用することを示唆している。この結果はさらに、もう１つのメカニズム（イオノマイシン又は熱ではなくＵＶ）により誘発された死細胞が、ｂｏｖＬｆ−ｂｉｏにより検出できることを示している。
【００５４】
実施例９  さまざまな方法で標識されたラクトフェリンは、死細胞の検出に使用できる
上記の結果は、ビオチン−タグで標識され、ストレプトアビジン−蛍光色素複合体により検出されたＬｆは、死細胞に結合することを示唆している。異なる検出試薬でタグを付けた時に、Ｌｆが死細胞の検出のために機能する能力を評価するために、精製されたウシＬｆ及びヒトＬｆをＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と結合させた。これは、ＦＩＴＣ結合キット（Ｓｉｇｍａ）を使用説明書に従って使用して実行した。精製されたウシＬｆは、さらに単独で、使用説明書に従って、ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合させた。ヒトＢ細胞培養物にＵＶを照射（１００ｍＪ／ｃｍ２）し、その後３７℃で２４時間インキュベートすることによりアポトーシスを誘発した。これらの細胞は、その後染色の前に氷上で４〜６時間保存した。細胞は、次いである範囲の濃度のｂｏｖＬｆ−ＦＩＴＣ、ｈｕｍＬｆ−ＦＩＴＣ、ＢＳＡ−ＦＩＴＣ、ｂｏｖ−Ｌｆ−Ａｌｅｘａ４８８又はＢＳＡ−Ａｌｅｘａ４８８のうちの１種で染色した。図１０は、誘発された該細胞集団がｂｏｖ−Ｌｆ−ＦＩＴＣ又はｈｕｍ−Ｌｆ−ＦＩＴＣのどちらかで強く染色されたことを示している。対照タンパク質のＢＳＡ−ＦＩＴＣでは、このような染色は見られなかった。ａｌｅｘａ４８８で標識されたｂｏｖＬｆでも同様の結果が得られた。誘発された該細胞集団はｂｏｖ−Ｌｆ−Ａｌｅｘａで強い染色が認められたが、ＢＳＡ−Ａｌｅｘａでは認められなかった。これらの結果は、Ｌｆは、死細胞との結合能力を失わずにさまざまな方法で標識できることを示唆している。
【００５５】
実施例１０  トランスフェリンは死細胞と結合しない
ラクトフェリン、コンアルブミン及びトランスフェリンは、すべてトランスフェリンファミリーのタンパク質に属する。それらは鉄結合性分子であると報告されている。図８及び図９は、コンアルブミンがＬｆと同様の様式では死細胞と結合しないことを示唆している。さて、ビオチン化トランスフェリン（Ｔｆ−ｂｉｏ；Ｓｉｇｍａ）を、さまざまな濃度で、ＵＶ照射及びその後の３７℃でのインキュベートにより死を誘発されたヒトＢ細胞の集団を染色するために使用した。図１１は、ｂｏｖＬｆ−ｂｉｏが３７μｇ／ｍｌで良好に細胞を染色する一方で、Ｔｆ−ｂｉｏは、１ｍｇ／ｍｌから１．６μｇ／ｍｌまでの範囲の濃度では、死細胞と結合しないことを示している。
【００５６】
本明細書中で引用したすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の上記の実施形態に対するさまざまな改良及び変更は、本発明の範囲と精神とを逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載したが、特許請求した発明をこのような特定の実施形態に過度に限定すべきでないことは、理解されたい。実際、発明を実行する上記方式の、当業者には明らかな多様な改良は、本発明により包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１ａ】ビオチン化乳成分とヒトＢ細胞の生存細胞及び非生存細胞との結合に関する細胞数測定分析を示す図である。
【図１ｂ】ビオチン化乳成分とマウスハイブリドーマ細胞の生存細胞及び非生存細胞との結合に関する細胞数測定分析を示す図である。
【図２】ある範囲の希釈度の母乳による、細胞の染色を示す図である。
【図３】ある範囲の希釈度の母乳による、細胞の染色を示す図である。
【図４Ａ】ウシラクトフェリン（ＬＦＮ）とマウスハイブリドーマ非生存細胞との用量依存性結合を示す図である。
【図４Ｂ】ラクトフェリンの結合が用量依存性であり、対照であるＢＳＡ−ビオチンが用量依存性結合を示さないことを示す図である。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。
【図４Ｃ】ウシラクトフェリンとマウスハイブリドーマ非生存細胞との結合が、非標識ラクトフェリンの添加により阻害されることを示す図である。
【図４Ｄ】ウシラクトフェリンとマウスハイブリドーマ非生存細胞との結合が、非標識スキムミルク（ＳＭＰ）の添加により阻害されることを示す図である。
【図５】マウスハイブリドーマ細胞（死細胞を含む）培養物の染色を示す図である。染色は、非標識ウシラクトフェリン（図５ａ）又は非標識牛乳（再構成スキムミルク）（図である図５ｂ）の添加により阻害される。
【図６】アポトーシスによる死を誘発された、ヒトＢ細胞培養物とＬｆ−ｂｉｏとの結合を示す図である。
【図７】熱処理を介してネクローシスを誘発された、ヒトＢ細胞培養物とＬｆ−ｂｉｏとの結合を示す図である。
【図８】ＵＶの照射によりアポトーシスを誘発された、ヒトＢ細胞培養物の染色を示す図である。該細胞は、以下の非標識タンパク質のうちの１種がある範囲の濃度で存在する、又は存在しない状態でＢＭ−ｂｉｏにより染色された。ウシＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、ヒトＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、コンアルブミン（実質的に鉄を含まない；Ｓｉｇｍａ）又はコンアルブミン（鉄含有；Ｓｉｇｍａ）。
【図９】ＵＶの照射によりアポトーシスを誘発された、ヒトＢ細胞培養物の染色を示す図である。該細胞は、以下の非標識タンパク質のうちの１種がある範囲の濃度で存在する、又は存在しない状態でｂｏｖＬｆ−ｂｉｏにより染色された。ウシＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、ヒトＬｆ（Ｓｉｇｍａ）、コンアルブミン（実質的に鉄を含まない；Ｓｉｇｍａ）又はコンアルブミン（鉄含有；Ｓｉｇｍａ）。
【図１０】ＵＶの照射によりアポトーシスを誘発された、ヒトＢ細胞培養物の染色を示す図である。細胞は、ある範囲の濃度のｂｏｖＬｆ−ＦＩＴＣ、ｈｕｍＬｆ−ＦＩＴＣ、ＢＳＡ−ＦＩＴＣ、ｂｏｖ−Ｌｆ−Ａｌｅｘａ４８８又はＢＳＡ−Ａｌｅｘａ４８８のうちの１種により染色された。
【図１１】ＵＶの照射により死を誘発された、ヒトＢ細胞培養物の染色を示す図である。細胞は、ある範囲の濃度のビオチン化トランスフェリン（Ｔｆ−ｂｉｏ；Ｓｉｇｍａ）により染色された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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