(57)【要約】  本発明は、核酸を検出するためのプローブ、該プローブの製造方法、分析反応の実施方法、および該プローブに基づく分析反応を実施するのに必要とされる試薬を含有する試験キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
2008530982.tif 000006
［式中
ＰＮＡ１は、いずれかの配列および長さ、好ましくは２〜１００塩基、とりわけ好ましくは２〜１０塩基の間の配列のペプチド核酸鎖であり、
ＰＮＡ２は、いずれかの配列および長さ、好ましくは２〜１００塩基、とりわけ好ましくは２〜１０塩基の間の配列のペプチド核酸鎖であり、
Ａは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、好ましくはメチレン基であり、
Ｂは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、置換若しくは未置換アミノ基、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
Ｃは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、置換若しくは未置換アミノ基、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
ｍは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
ｎは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
ｏは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
Ｘは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはＮＨ基であり、
ｐは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数であり、
Ｒは、それが蛍光でありかつＤＮＡに挿入することが可能であることを特徴とする蛍光の普遍的塩基代理物、好ましくはシアニン色素、さらに好ましくはエチジウム、さらに好ましくは置換アントラセン、さらに好ましくはアクリジン色素、さらに好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにより販売される色素、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５から選択される色素（および、修飾リンカー構造を有する、これらの化合物由来のフルオロフォア）、とりわけ好ましくはチアゾールオレンジであり、
Ｍは、ＣＨ若しくはＣＲ型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはＣＨ基であり、
Ａ’は、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、置換若しくは未置換アミノ基、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
Ｂ’は、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、置換若しくは未置換アミノ基、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
Ｙは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
ｑは０〜５からの自然数、好ましくは０であり、
ｒは０〜５からの自然数、好ましくは０であり、
ｓは０〜５からの自然数、好ましくは０である］
のＰＮＡプローブ。
【請求項２】
一般式
【化２】
2008530982.tif 000007
［式中
５’−ＮＡ１は、３’末端リン酸基で終端するいずれかの配列および長さの核酸若しくは核酸アナログ、好ましくは長さ３〜１００塩基の核酸配列、とりわけ好ましくは長さ３〜２０塩基の核酸配列、非常にとりわけ好ましくは長さ３〜１５塩基の核酸配列であり、
ＮＡ２−３’は、いずれかの配列および長さの核酸若しくは核酸アナログ、好ましくは長さ３〜１００塩基の核酸配列、とりわけ好ましくは長さ３〜２０塩基の核酸配列、非常にとりわけ好ましくは長さ３〜１５塩基の核酸配列であり、
Ａは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、好ましくはメチレン基であり、
ｍは、０〜５からの自然数であり、
Ｘは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは、水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
Ｙは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは、水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはＮＨ基であり、
Ｚは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは、水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはメチレン基であり、
ｐは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数、とりわけ好ましくは１であり、
ｑは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数、とりわけ好ましくは１であり、
ｒは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数であり、
Ｒは、それが蛍光でありかつＤＮＡに挿入することが可能であることを特徴とする蛍光の普遍的塩基代理物、好ましくはシアニン色素、さらに好ましくはエチジウム、さらに好ましくは置換アントラセン、さらに好ましくはアクリジン色素、さらに好ましくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにより販売される色素、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５から選択される色素（および、修飾リンカー構造を有する、これらの化合物由来のフルオロフォア）、とりわけ好ましくはチアゾールオレンジであり、
Ｍは、ＣＨ若しくはＣＲ型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換アミノ基（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、あるいは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウ、とりわけ好ましくはＣＨ基であり、
Ａ’は、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分（ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換メチル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換アルキル基、さらに好ましくは置換若しくは未置換フェニル基である）、置換若しくは未置換アミノ基、または周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくはイオウ、好ましくはメチレン基であり、
ｎは、０〜５からの数である］
のプローブ。
【請求項３】
一般構造（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の複数の単位が共有結合され、かつ、複数の標識を有するプローブが得られることを特徴とする、請求項１および２のいずれか若しくは双方に記載のプローブ。
【請求項４】
固相合成、好ましくは自動固相合成による請求項１〜３のいずれかに記載のプローブの製造方法。
【請求項５】
核酸アッセイを実施するための、好ましくは均質核酸アッセイを実施するための、請求項１〜３のいずれかに記載のプローブの使用。
【請求項６】
ＰＣＲ反応を実施するための、好ましくは定量的ＰＣＲ反応を実施するための、請求項１〜３のいずれかの記載のプローブの使用。
【請求項７】
異なるプローブが異なる蛍光塩基代理物により標識されることを特徴とする、多重アッセイを実施するための請求項１〜３のいずれかに記載のプローブの使用。
【請求項８】
前記プローブが、蛍光塩基代理物、好ましくはチアゾールオレンジが結合されているＬ−オルニチンを含んでなる、請求項１若しくは３に記載のプローブ。
【請求項９】
前記プローブが、蛍光塩基代理物、好ましくはチアゾールオレンジが結合されているＤ−オルニチンを含んでなる、請求項１若しくは３に記載のプローブ。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれかに記載のアッセイを実施するのに必要とされる試薬を含んでなる試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を検出するためのプローブ、前記プローブの製造方法、検出反応の実施方法、および該プローブに基づく検出反応を実施するのに必要とされる試薬を含んでなる試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出は、例えばヒト若しくは家畜の診断薬、食品分野、環境分析、作物保護、生化学若しくは薬理学的研究および法医学で広範に応用されている。
【０００３】
従来技術によれば、核酸は不均質若しくは均質いずれのアッセイによっても検出される。不均質アッセイは、結合および未結合プローブを相互から分離するために最低１回の洗浄段階を必要とする方法である。不均質アッセイは、例えば、検出されるべき核酸が溶液中にある間にプローブを固相に固定させることにより実施する。不均質アッセイによる核酸の検出の例は、フィルター若しくはＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーションである（例えば、非特許文献１若しくは非特許文献２を参照されたい）。不均質アッセイの利点は、複数の被検体を同時に検出する固有の能力（多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ））であり、欠点は例えば洗浄段階の要件である。均質アッセイは、全成分が溶液中で相互と反応して、洗浄段階が完全に排除されるために区別される。均質アッセイは、通常、比較的単純な装置を用いる方法を使用して選択し得るが、しかし、多重化の能力は通常制限される。洗浄段階の放棄は、自動化を助長し、汚染の危険を低下させ、そして検出反応が費用効率のよい様式で実施されることを可能にする。
【０００４】
ＤＮＡを検出するためのプローブは、通常、ハイブリダイズ単位およびシグナリング単位よりなる。ハイブリダイズ単位はＤＮＡ標的に配列特異的に結合し、そして、例えばＤＮＡ、ＰＮＡ若しくは他のＤＮＡアナログよりなる。シグナリング単位は、例えば、放射標識、微小若しくはナノ粒子、酸化還元活性分子、発光若しくは蛍光分子であることができる。シグナリング単位は、通常、ハイブリダイズ単位に共有結合される。ハイブリダイズ単位は、シグナリング単位がハイブリダイゼーションを妨害することを予防するため、一般に、プローブの５’若しくは３’末端でシグナリング単位に連結される。不均質アッセイは、検出されるべき核酸に結合したプローブおよび溶液中で遊離のプローブを分離するために洗浄段階を使用する一方、均質アッセイは、シグナリング単位が、ハイブリダイズした状態のプローブで遊離の状態でのものと異なる特性を有することを確実にしなければならない。プローブのハイブリダイゼーション後のシグナリング単位の変化は、例えば蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）若しくはＤＮＡ挿入分子により達成しうる。ＦＲＥＴ原理に従って作用する蛍光の均質プローブの例は、ＴａｑＭａｎ（Ｒ）プローブ（非特許文献３）若しくは「分子ビーコン」（特許文献１；非特許文献４）である。ＦＲＥＴ原理に従って作用するプローブは、それらの末端にフルオロフォアおよびクエンチャーを含有し、それにより、ハイブリダイゼーションの状態に依存して蛍光をいわば切り替え得る。分子ビーコンの場合、使用されるプローブは、その末端でフルオロフォアおよびクエンチャーに連結されているＤＮＡヘアピン構造である。標的へのハイブリダイゼーションのない状態では、蛍光はクエンチャーの近接により抑制される。標的結合の場合は、フルオロフォアおよびクエンチャーは空間的に分離され、それにより蛍光信号を生成し、その強度は増大する標的量に応じて増大する。分子ビーコンは、各周期後に生成される生成物の量を定量するために、ＰＣＲ反応でプローブとして使用しうる。従来技術によれば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、研究室および診断薬での核酸の最も一般的な検出および定量方法の１つである。分子ビーコンの欠点は、感度を制限するそれら固有の蛍光、相補標的と一塩基不適正標的の識別における制限された特異性、および前記プローブを使用し得る非常に狭い温度窓である。特異性および感度を結びつけることは、とりわけ一塩基突然変異（ＳＮＰ）を検出するのに決定的に重要であるハイブリダイゼーションプローブの開発における中心的課題である。
【０００５】
例えばＳｙｂｒＧｒｅｅｎのような挿入色素をＰＣＲ混合物に添加する場合、この色素は、形成されるＤＮＡ二本鎖に挿入して、増大する生成物量に応じて蛍光の増大をもたらす。この方法は、プローブを用いない定量的ＰＣＲが実施されることを可能にする（一例は非特許文献５に見出し得る）。しかしながら、該方法の欠点は、高濃度で使用しなければならない色素の固有の蛍光、および完全に非特異的な染色である。この方法はまた、例えば異なる産物を識別するのに使用し得る融解曲線を記録することによるｑＰＣＲの制限された多重化のみを達成し得る。前記ＤＮＡ結合によりその信号特性が変化する、ＤＮＡに結合するシグナリング分子を、均質プローブを開発するために同様に利用することができ、特異性は該プローブにシグナリング分子を連結することにより確実にされる。この原理は、ルテニウム（ＩＩ）錯体をＤＮＡプローブに連結したＢａｒｔｏｎらにより最初に実現された（特許文献２；非特許文献６）。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションに際して蛍光の増大を表す。しかしながら、蛍光は二本鎖の標的以外のＤＮＡの添加に際してもまた増大する。陽イオン性のルテニウム錯体は、さらに、非特異的ハイブリダイゼーションに有利であり、そしてプローブの特異性を実質的に制限する。特許文献３は、それらの末端で非対称シアニン色素に連結したＤＮＡプローブを使用することによる核酸の検出を記述する。これらのプローブのハイブリダイゼーションは蛍光の小さな増大（約４の係数だけ）を生じ、これは核酸の感受性検出を可能にしない。特許文献４は、その末端で非対称シアニン色素に連結されているＰＮＡプローブを記述する。このＬｉｇｈｔＵｐ（Ｒ）プローブは、核酸へのハイブリダイゼーションに際して蛍光の著しい増大を表す。これらのプローブは感受性の基準に合致し、これはｑＰＣＲの情況でもまた示された（非特許文献７）。しかしながら、特異性に関して、ＬｉｇｈｔＵｐ（Ｒ）プローブはＰＮＡ配列それ自身の識別能力に制限され、その結果として、マッチする（ｍａｔｃｈｉｎｇ）塩基対とマッチしない塩基対の間の蛍光強度の制限された差違のみが、一塩基突然変異の検出で達成され得る（一例はＧ：ＣおよびＧ：Ｔ塩基対の困難な識別である）。
【０００６】
Ｐｒｉｖａｔらは、中央のヌクレオチド間リン酸基がリンカーを介してチアゾールオレンジに連結されたＤＮＡプローブを記述している（非特許文献８）。これらのプローブは、相補標的にハイブリダイズさせる場合に、蛍光の低い増大（５の係数だけ）のみを表した。生じる低検出感度により、記述されるプローブは核酸診断薬での実務的応用に適しない。
【０００７】
蛍光ヌクレオシドに基づく核酸の均質検出のためのＤＮＡプローブがＯｋａｍｏｔｏら（非特許文献９）により記述されている。プローブに組み込まれた蛍光ヌクレオシドは、メトキシベンゾデアザアデニン（ＭＤＡ）およびメトキシベンゾデアザイノシン（ＭＤＩ）であり、ＭＤＡは対鎖中のＣの存在下で顕著な蛍光を生じる一方、ＭＤＩは対鎖中のＴの存在下で顕著な蛍光を生じる。これらのプローブは、原則として均質アッセイで一塩基突然変異を識別するのに適するが、しかし、欠点は、蛍光ヌクレオシドの蛍光が隣接するＧ：Ｃ対により抑制される（蛍光消光）という事実である。この特性は、これらのプローブの一般的応用性を著しく制限する。特許文献５は類似の原理を開示する。すなわち、核酸塩基ウラシルおよびシトシンを、プロパルギルリンカーを介してピレンカルボキサミドに連結し、そしてこうして得られた蛍光塩基（ＰｙＵおよびＰｙＣ）をＤＮＡプローブに組込んだ。マッチする塩基対ＰｙＵ：ＡおよびＰｙＣ：Ｇは、より弱く対形成する組合せより顕著により高い蛍光を表すとは言え、ＰｙＵおよびＰｙＣプローブのハイブリダイゼーションは、蛍光の小さな増大（２〜８倍）のみもたらす。この方法の別の欠点は、１種の蛍光色素のみが利用可能であり、そして従ってアッセイ多重化が実施し得ないという事実である。      
【０００８】
ＫｏｅｈｌｅｒとＳｅｉｔｚは、蛍光色素チアゾールオレンジを、アミノエチルグリシンバックボーンをもつＰＮＡプローブに普遍的塩基代理物として結合し得、そして従って改良された特異性を有するＰＮＡプローブが設計されることを可能にすることを示した（非特許文献１０）。一塩基突然変異がこれらのプローブにより検出される場合、普遍的塩基チアゾールオレンジは突然変異の部位の隣に導入される。環境に感受性の色素は、それが完全な塩基対の近傍にある場合にのみ最大の蛍光信号を生じる。このプローブを用いる実験は、該プローブおよびそれに相補的な標的の完全に対形成した二重鎖が、該二重鎖の融点より下でハイブリダイゼーションが起きた場合であっても、不適正を含有する二重鎖より多い蛍光を表したことを示した。この観察結果は、チアゾールオレンジが、相補的対形成の特異性を越える特異性を該プローブが達成することを可能にすることを示す。アミノエチルグリシンバックボーンをもつＰＮＡ配列に基づくこれらのプローブの特異性は従来技術を上回る改良である一方、達成される蛍光増幅係数は他の均質プローブに匹敵する。
【０００９】
特異性および感度を向上させることは、とりわけ一塩基突然変異（ＳＮＰ）の検出に決定的に重要であるハイブリダイゼーションプローブの開発における中心的問題である。加えて、該プローブは、可能な限り広範な温度範囲にわたり使用可能でありかつアッセイ多重化を可能にするべきである。
【００１０】
従って、高特異性および選択性を伴いかつ非常に大きな温度範囲にわたりハイブリダイズし、均質アッセイで使用し得、そして多重検出を可能にする、核酸を検出するためのプローブを提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
驚くべきことに、前記目的を解決するプローブが存在することが判明した。
【００１２】
【特許文献１】第ＷＯ  ９５／１３３９９  Ａ１号
【特許文献２】米国特許第５，１５７，０３２号
【特許文献３】第ＥＰ  ０  ７１０  ６６８  Ｂ１号
【特許文献４】第ＵＳ  ６，３２９，１４４  Ｂ１号
【特許文献５】第ＷＯ２００４０５８７９３  Ａ１号
【非特許文献１】Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９９８
【非特許文献２】Ｄ．Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、２００３
【非特許文献３】Ｐ．Ｍ．Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、１９９１、８８、７２７６−７２８０
【非特許文献４】Ｓ．ＴｙａｇｉとＦ．Ｋｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６、１４、３０３−３０７
【非特許文献５】Ａ．Ｋ．Ｂｈａｒら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１、３９、２８３５−２８４５
【非特許文献６】Ｙ．Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９２、３１、１０８０９−１０８１６
【非特許文献７】Ｎ．Ｓｖａｎｖｉｋら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００、２８７、１７９−１８２
【非特許文献８】Ｅ．Ｐｒｉｖａｔら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００２、７５、２０１−２１０
【非特許文献９】Ａ．Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３、１２５、９２９６−９２９７
【非特許文献１０】Ｏ．Ｋｏｅｈｌｅｒ、Ｏ．Ｓｅｉｔｚ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、２３、２９３８−２９３９
【発明の開示】
【００１３】
［発明の要約］
本発明は、従って、その鎖中で内的位置の核酸塩基が蛍光塩基代理物により置換されているペプチド核酸鎖、核酸鎖若しくはＤＮＡアナログの鎖よりなる、核酸を検出するためのプローブに関する。驚くべきことに、例えば、オルニチンに結合されたチアゾールオレンジが、不適正を伴わない標的配列へのハイブリダイゼーションに際して、従来技術によりアミノエチルグリシンバックボーンに結合されたチアゾールオレンジよりも顕著により高い蛍光増幅を表したことが見出された。別の驚くべき観察結果は、Ｌ−オルニチンおよびＤ−オルニチン複合物が、達成可能な蛍光増幅に対するハイブリダイゼーションの特異性の比に関して異なるという事実であった。すなわち、Ｌ−オルニチン複合物はＤ−オルニチン複合物より高い蛍光増幅を表した一方、Ｄ−オルニチン複合物は前記蛍光増幅のより高い特異性を表した。
【００１４】
本発明は、従って、一般式：
【００１５】
【化１】
2008530982.tif 000002
【００１６】
［式中
ＰＮＡ１は、いずれかの配列および長さ、好ましくは２〜１００塩基、とりわけ好ましくは２〜１０塩基の間の配列のペプチド核酸鎖である。
ＰＮＡ２は、いずれかの配列および長さ、好ましくは２〜１００塩基、とりわけ好ましくは２〜１０塩基の間の配列のペプチド核酸鎖である。
ＡおよびＡ’は、相互に独立にメチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、置換若しくは未置換フェニル基、とりわけ好ましくは各場合で未置換かつ非分枝状の態様、ならびに非常にとりわけ好ましくは水素若しくはメチル基であり、Ａは好ましくはメチレン基である。
ＢおよびＢ’は、相互に独立にメチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、置換若しくは未置換フェニル基、とりわけ好ましくは各場合で未置換かつ非分枝状の態様、ならびに非常にとりわけ好ましくは水素若しくはメチル基であり、Ｂは好ましくはメチレン基である。
ｍは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
ｎは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
ｏは１〜５からの自然数、好ましくは１であり、
Ｘは、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、または置換若しくは未置換フェニル基であるか、あるいは
Ｘは、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、置換若しくは未置換フェニル基であるか、
あるいは、Ｘは周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウであるか、
Ｘは、とりわけ好ましくはＮＨ基である。
ｐは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数であり、
Ｓは、それが蛍光でありかつＤＮＡに挿入することが可能であることを特徴とする蛍光の普遍的塩基代理物、好ましくはシアニン色素、さらに好ましくはエチジウム、さらに好ましくは置換アントラセン、さらに好ましくはアクリジン色素、さらに好ましくはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにより販売される色素、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５から選択される色素（および修飾リンカー構造を有する、これらの化合物由来のフルオロフォア）、とりわけ好ましくはチアゾールオレンジであり、
Ｍは、ＣＨ若しくはＣＲ型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは水素であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、または置換若しくは未置換フェニル基であるか、あるいは
Ｍは、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ぶことができ）、置換若しくは未置換フェニル基であるか、
あるいは、Ｍは、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウであるか、
Ｍはとりわけ好ましくはＣＨ基である。
ＹはＡのように定義される。
ｑは０〜５からの自然数、好ましくは０であり、
ｒは０〜５からの自然数、好ましくは０であり、
ｓは０〜５からの自然数、好ましくは０である］
の、固相合成により入手可能なＰＮＡプローブに関する。
【００１７】
該核酸型のハイブリダイズするオリゴマーは、ＰＮＡの代替として、ＤＮＡ、または例えばＬＮＡ、モルホリノ−ＤＮＡ若しくはアラビノ−ＤＮＡのようなＤＮＡアナログでもまたありうる。従って、本発明は、一般式（ＩＩ）：
【００１８】
【化２】
2008530982.tif 000003
【００１９】
［式中
５’−ＮＡ１は、３’末端リン酸基で終端するいずれかの配列および長さの核酸若しくは核酸アナログ、好ましくは長さ３〜１００塩基の核酸配列、とりわけ好ましくは長さ３〜２０塩基の核酸配列、非常にとりわけ好ましくは長さ３〜１５塩基の核酸配列であり、
ＮＡ２−３’は、いずれかの配列および長さの核酸若しくは核酸アナログ、好ましくは長さ３〜１００塩基の核酸配列、とりわけ好ましくは長さ３〜２０塩基の核酸配列、非常にとりわけ好ましくは長さ３〜１５塩基の核酸配列であり、
ＡおよびＡ’は、上で定義されたとおりであり、
ｗおよびｘは、０〜５からの自然数であり、
Ｘ’およびＺは、相互に独立に、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは、水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ぶことができ）、または置換若しくは未置換フェニル基であるか、あるいは
Ｘ’およびＺは、相互に独立に、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、置換若しくは未置換フェニル基であるか、あるいは
Ｘ’およびＺは、相互に独立に、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウであるか、
Ｘ’およびＺは、相互に独立に、とりわけ好ましくはメチレン基である。
Ｙ’は、メチレン基またはＣＨＲ若しくはＣＲ２型の置換炭素部分であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは置換若しくは未置換アミノ基、第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ばれることができ）、または置換若しくは未置換フェニル基であるか、あるいは
Ｙ’は、ＮＨ若しくはＮＲ型の置換若しくは未置換アミノ基であり、ここで、Ｒは水素または有機基、好ましくは置換若しくは未置換の分枝状若しくは非分枝状Ｃ１−Ｃ１０アルキル基（該置換基は、好ましくは第五若しくは第六主族の元素、好ましくはＯ若しくはＳよりなる群から選ぶことができ）、置換若しくは未置換フェニル基であるか、
あるいは、Ｙ’は、周期律表の第五若しくは第六主族の原子、好ましくは酸素若しくはイオウであるか、
Ｙ’は、とりわけ好ましくはＮＨ基である。
ｖは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数、とりわけ好ましくは１であり、
ｕは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数、とりわけ好ましくは１であり、
ｔは、０から１０までの自然数、好ましくは１〜６からの数であり、
ＳおよびＭは上で定義されるとおりである］
の、固相合成により得ることができるプローブにもまた関する。
【００２０】
［発明の詳細な記述］
好み、特定の好み、若しくは非常に特定の好みが、好ましい、とりわけ好ましい若しくは非常に好ましいとして列挙されるパラメータ、化合物、定義および具体的説明を利用して、態様に与えられる。
【００２１】
全般として若しくは好みの領域内で、記述中に列挙される定義、パラメータ、化合物および具体的説明は、しかしながら、所望のとおり相互と、すなわち好みの特定の領域（１個若しくは複数）の間で組合せてもまたよい。
【００２２】
式（Ｉ）および（ＩＩ）のプローブで指定されるところの本発明の蛍光の普遍的塩基代理物Ｓは、それがＤＮＡに挿入することが可能であり、かつ、核酸標的中の代理物に相対する塩基に独立に該ＤＮＡ−プローブ二重鎖について同一の若しくは類似の融解温度を生じることを特徴とする。この点で、該塩基代理物は普遍的と称しうる。本発明の塩基代理物の例は、例えば、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー（第ＥＰ  ０  ７１４  ９８６  Ａ１号明細書）、エチジウム、Ｄａｐｏｘｙｌ（Ｒ）、２，６−ドナー−アクセプター−置換アントラセン（Ｈ．Ｉｈｍｅｌｓら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２、２８６５−２８６７）、アクリジン（例えばＫ．Ｆｕｋｕｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｃｈｅｍ．１９９６、７、３４９−３５５を参照されたい）のようなシアニン色素、例えばＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５（および改変された若しくは欠けているリンカー構造を伴うこれらのフルオロフォア由来の化合物）のような、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓにより販売される色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓマニュアル：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを参照されたい）、ならびにＢＴＣＳ発色団（ＢＴＣＳ発色団は、例えばＲ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．２０００、５、１、１７−２２に記述されている）である。それらの配列が異なるプローブは、それらの蛍光励起および蛍光発射波長に関して異なる塩基代理物を使用することにより言わば色標識することができ、それにより、複数の被検体が同時に検出される（多重化）ことを可能にする。
【００２３】
蛍光塩基代理物は、ＤＮＡ中の隣接する核酸塩基の距離を模倣するバックボーンより長い、前記塩基代理物に隣接する核酸塩基間の距離を生じるバックボーンに結合する。ＤＮＡの標準構造を模倣するバックボーンの例は、ＰＮＡ中のアミノエチルグリシンバックボーンである。蛍光塩基代理物と隣接する核酸塩基の間の距離が、ＤＮＡバックボーンの標準構造からより逸脱するほど、塩基スタッキング相互作用は単一鎖中の蛍光塩基代理物の発射をより少なく効率的に増大し得る。結果として、プローブ一本鎖の蛍光は低い。しかしながら、選ばれた距離は、ハイブリダイゼーション後に生じられる二本鎖中で塩基スタッキングが予防されるとみられるほど大きくてはならない。アミノエチルグリシンバックボーンをもつＰＮＡプローブ内の蛍光塩基代理物と隣接する核酸塩基の間の適する距離は、例えば、塩基代理物を運搬するバックボーン位置に３〜１０個のメチレン基を導入することにより生じさせうる。塩基代理物を運搬するバックボーン構造は、炭素部分に加え、例えば酸素、窒素、イオウ、リン若しくはケイ素のようなヘテロ原子もまた包含しうる。蛍光塩基代理物の部位での本発明のバックボーンの一例は、アミノエチルグリシンバックボーンをもつＰＮＡプローブ内のオルニチンである。
【００２４】
一般構造（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の複数の単位が相互に共有結合される場合、複数標識をもつプローブを得ることができる。こうした手順は、本発明のプローブを使用する場合に検出感度を増大させる。プローブあたり最大２個の標識を可能にする末端蛍光標識と対照的に、蛍光塩基代理物の組込みは複数の標識を可能にする。
【００２５】
本発明のプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイ、とりわけ均質ハイブリダイゼーションアッセイを実施するのに適する。該プローブは、例えば水性サンプル中に存在する標的核酸の型および量を測定するための均質ハイブリダイゼーションアッセイで使用しうる。この目的のため、該プローブを、溶解された標的核酸に添加し、そして数秒から数時間までインキュベートする。その後、該溶液の蛍光を対照（標的核酸を含まない同一の溶液）と比較して測定する。プローブの蛍光と使用した標的の量の間の相関が決定されている標準曲線と蛍光値を比較することは、検出されるべき核酸の定量化を可能にする。核酸の定量的検出をとりわけ高感度で実施することを意図している場合、とりわけ有利な様式で単一若しくは複数標識したプローブをＰＣＲ過程と組合せることが可能である。定量的ＰＣＲ中に、標的増幅による蛍光の増大を測定する。蛍光の予め決められた閾値を超えることが必要とされるＰＣＲサイクル数を「サイクル閾値」（ＣＴ）と定義する。較正曲線を介して、使用した標的濃度にＣＴ値を関係づけることができ、そして従って前記標的濃度の尺度を表す。プローブは、ここで、プライマー配列間に配置された標的配列区分に相補的でありかつ該ゲノムの他配列と可能な限り少ない交差ハイブリダイゼーションを表すように選ばなければならない。
【００２６】
該プローブは、一塩基突然変異（ＳＮＰ）を検出するのに適し、この検出は、例えばハイブリダイゼーション若しくはＰＣＲによって実施しうる。メチル化パターンを分析するのに該プローブを使用することもまた可能である。研究されるべきＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理する場合、全部のメチル化されていないシトシンがウラシルに転化される一方、メチル化シトシンは反応から変化されず出現する。生じる部分的に修飾された標的を、その後、例えばＰＣＲ、定量的ＰＣＲ若しくはハイブリダイゼーションのようなアッセイにより分析しうる。ＰＣＲおよび定量的ＰＣＲを使用するこうした方法は、例えば、それぞれＪ．Ｇ．Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９６、９３、９８２１−９３２６ら、およびＴ．−Ｓ．Ｗｏｎｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３、３９、１８８１−１８８７に記述されている。亜硫酸水素ナトリウムで処理したＤＮＡを分析するために、該プローブをアッセイ、好ましくはＰＣＲ若しくは定量的ＰＣＲで使用しうる。
【００２７】
該プローブは、化学合成、好ましくは固相合成、とりわけ好ましくは自動固相合成により製造する。核酸、核酸アナログおよびペプチド核酸の製造方法は当業者に既知であり、そして例えばＬ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８、６０、３８１−３９０およびＢ．Ｅ．ＨｙｒｕｐとＰ．Ｅ：Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６、４、５−２３に記述されている。該プローブは、固相合成後に蛍光塩基代理物に共有結合しうるか、若しくは、塩基代理物は収束的合成中に既に組込まれている。オルニチンは、例えばフルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）によりＮ末端で保護しうる一方、塩基代理物をオルニチンの一級アミノ基に共有結合する。例えば、チアゾールオレンジを、カルボキシル基を介してオルニチンの一級アミノ基に結合しうる。こうした構成要素は、Ｆｍｏｃ法によるプローブの自動固相合成での使用に適する。
【００２８】
本発明のプローブは、核酸を検出するための従来技術で開示されたプローブを上回る以下の利点を有する。すなわち
ａ）プローブと検出されるべき核酸の間の認識の高特異性。これは、一塩基突然変異（ＳＮＰ）若しくはメチル化シトシンを検出する場合にとりわけ有利である。
ｂ）バックボーンの拡張による一本鎖中での低蛍光、およびその結果として、プローブ−被検体複合体の形成に際しての上昇された蛍光増大。
ｃ）バックボーンを選択することによるとりわけ高蛍光増幅（＝検出感度）若しくは特異性を有するプローブを生成する可能性。
ｄ）該プローブは、複数の塩基代理物を組込むことにより複数で標識しうる。
ｅ）蛍光ピークが異なる波長にある塩基代理物を利用することによる多重アッセイでの使用。
ｆ）非緊縮性ハイブリダイゼーション条件下の広範な温度範囲内でのハイブリダイゼーションおよび一塩基特異的識別。これは、プローブ設計およびアッセイの至適化をかなり助長する。
ｇ）該プローブは慣習的固相合成により製造される。
【００２９】
［実施例］
プローブ合成の実施例
ＰＮＡ単量体はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、そして合成前に中度真空下で乾燥した。固相ＮｏｖａＳｙｎ（Ｒ）  ＴＧＲ、ＰｙＢＯＰおよび塩酸Ｄ−オルニチンはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入し、また、塩酸Ｌ−オルニチンはＡｖｏｃａｄｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈから得た。全部の他の化学物質は、Ａｃｒｏｓ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｖｏｃａｄｏ、ＦｌｕｋａおよびＲｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎから得た。使用した溶媒は、適切な場合は、使用前に標準的方法により蒸留若しくは乾燥した。全部の水性溶液は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｐｏｒｅ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって精製した水を用いて調製した。
【００３０】
プローブは多岐的若しくは収束的（直線的）戦略を使用して合成しうる。直線的合成戦略を適用することによるプローブの合成を下述する。後者は完全に自動化し得るためである。本発明の例示的一態様において、Ｆｍｏｃ保護したチアゾールオレンジオルニチン１および２を合成した。
【００３１】
【化３】
2008530982.tif 000004
【実施例１】
【００３２】
Ｎδ−［９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−オルニチン］−Ｎα−［臭化２−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−キノリン−４−イリデンメチル）−３−メチルベンゾチアゾル−３−イウム］アリルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌ）の製造
チアゾールオレンジカルボン酸は、Ｚｈｏｕら（Ｘ．−Ｆ−Ｚｈｏｕ  ｔｅ  ｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９５、３９、２４４−２５２）によるプロトコルに従って製造した。無水ＤＭＦ（２．３ｍｌ）中のチアゾールオレンジカルボン酸（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ（１４５ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（５８ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と混合した。懸濁液は、澄明な溶液Ａが得られるまでアルゴン雰囲気下で攪拌した。Ｌ−オルニチンは、ＦｍｏｃでＮ末端で、およびアリル基でＣ末端で、標準的方法に従って保護した（＝Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ−ＯＡｌｌ）。澄明な溶液Ａを、ＤＭＦ（２．３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ−ＯＡｌｌ（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で１２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をメタノール（２ｍｌ）に溶解した。１時間攪拌した後、固形物を濾過分離し、そしてその後メタノール（５ｍｌ）で洗浄した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  ９７：３、１％ギ酸）により精製した。１１８ｍｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌを、橙色固形物の形態で得、６３％の収率に対応した。
Ｒｆ（クロロホルム：メタノール  ８０：２０、１％ギ酸）＝０．５６
【実施例２】
【００３３】
Ｎδ−［９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−オルニチン］−Ｎα−［臭化２−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−キノリン−４−イリデンメチル）−３−メチルベンゼンゾチアゾル−３−イウム］ＯＨ（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＨ）１の製造
ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌ（８１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液をＮ−メチルアニリン（１１．３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）と混合し、そして該溶液を数回脱気した。［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４］（１２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の添加後に、混合物を、光の排除を伴い１４時間攪拌した。溶媒を真空中で除去した。残渣をメタノール（４ｍｌ）に溶解し、そして沈殿物を濾過分離した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  ９７：３、１％ギ酸）により精製した。５３ｍｇの生成物Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＨ（１）を橙色固形物の形態で得、６８％の収率に対応した。
Ｒｆ（クロロホルム：メタノール  ８０：２０、１％ギ酸）＝０．２２
【実施例３】
【００３４】
Ｎδ−［９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−オルニチン］−Ｎα−［臭化２−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−キノリン−４−イリデンメチル）−３−メチルベンゼンゾチアゾル−３−イウム］アリルエステル（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌ）の製造
チアゾールオレンジカルボン酸は、Ｚｈｏｕら（Ｘ．−Ｆ−Ｚｈｏｕ  ｔｅ  ｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９５、３９、２４４−２５２）によるプロトコルに従って製造した。無水ＤＭＦ（２．３ｍｌ）中のチアゾールオレンジカルボン酸（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＰｙＢＯＰ（１４５ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（５８ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と混合した。懸濁液は、澄明な溶液Ａが得られるまでアルゴン雰囲気下で攪拌した。Ｌ−オルニチンは、ＦｍｏｃでＮ末端で、およびアリル基でＣ末端で、標準的方法に従って保護した（＝Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ−ＯＡｌｌ）。澄明な溶液Ａを、ＤＭＦ（２．３ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ−ＯＡｌｌ（１００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で１２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をメタノール（２ｍｌ）に溶解した。１時間攪拌した後、固形物を濾過分離し、そしてその後メタノール（５ｍｌ）で洗浄した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  ９７：３、１％ギ酸）により精製した。１０３ｍｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌを、橙色固形物の形態で得、５５％の収率に対応した。
Ｒｆ（クロロホルム：メタノール  ８０：２０、１％ギ酸）＝０．５６
【実施例４】
【００３５】
Ｎδ−［９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｄ−オルニチン］−Ｎα−［臭化２−（１−カルボキシメチル−１Ｈ−キノリン−４−イリデンメチル）−３−メチルベンゼンゾチアゾル−３−イウム］ＯＨ（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＨ）２の製造
ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＡｌｌ（８１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液をＮ−メチルアニリン（１１．３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）と混合し、そして該溶液を数回脱気した。［Ｐｄ（ＰＰｈ３）４］（１２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の添加後に、混合物を、光の排除を伴い１４時間攪拌した。溶媒を真空中で除去した。残渣をメタノール（４ｍｌ）に溶解し、そして沈殿物を濾過分離した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール  ９７：３、１％ギ酸）により精製した。５２ｍｇの生成物Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＴＯ）−ＯＨ（１）を橙色固形物の形態で得、６５％の収率に対応した。
Ｒｆ（クロロホルム：メタノール  ８０：２０、１％ギ酸）＝０．２２
【実施例５】
【００３６】
プローブの固相合成
ＮｏｖａＳｙｎ（Ｒ）  ＴＧＲ固相の負荷：
固相（５００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ／ｇ）を洗浄した（３×ジクロロメタン、３×ジメチルホルムアミド、３×ジクロロメタン、３×ジメチルホルムアミド）。固相をジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）中で３０分間膨潤させたままとした。前活性化のため、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾル−１−イルオキシ）−トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ（Ｒ）３０１．２ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（８７．７ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（５．８ｍｌ）中のＦｍｏｃ保護したグリシン（１７２．３ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。３分間インキュベートした後に、得られた溶液を固相と混合した。別の４時間インキュベートした後に、固相を洗浄し（３×ジメチルホルムアミド、３×ジクロロメタン、３×ジメチルホルムアミド）、そして、反応していなかった基を、ピリジン中無水酢酸の溶液（１：４、５ｍｌ）でブロッキングした。ブロッキング段階を５分後に反復した。固相を洗浄し（３×ジメチルホルムアミド、３×ジクロロメタン、３×ジメチルホルムアミドおよび５×ジクロロメタン）、そして最後に真空中で乾燥した。
【００３７】
自動合成機を使用する合成
プローブは、以下の一般的プロトコルに従って、自動合成機（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡＧからのＩｎｔａｖｉｓ  ＲｅｓＰｅｐ）で合成した。
【００３８】
負荷した固相をジメチルホルムアミド（２ｍｌ）中で膨潤させたままとした。３０分後に、膨潤した固相を合成機に移し、そしてジメチルホルムアミド（１８０μｌ）で２回洗浄した。
【００３９】
Ｆｍｏｃ除去：固相をジメチルホルムアミド／ピペリジン（４：１、１００μｌ）と混合した。該手順を２分後に反復し、そして最後に固相をＤＭＦ（１×１８０μｌ、３×１００μｌおよび１×１８０μｌ）で洗浄した。
【００４０】
カップリング：固相を、ジメチルホルムアミド中の４等量のカップリングされるべきＦｍｏｃ保護された構成要素および８等量のＮ−メチルモルホリンの溶液に懸濁した（構成要素の濃度：３．６等量の５−クロロヘキサフルオロリン酸１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］（ＨＣＴＵ）とのインキュベーションにより８分間前活性化したＮＭＰ中０．３Ｍ）。固相を３０分後に洗浄した（２×１８０μｌのジメチルホルムアミド）。
【００４１】
キャッピング：キャッピングは、無水酢酸／２，６−ルチジン／ピリジン（５：６：８９、１００μｌ）での３分間の処理によって実施した。その後、固相を洗浄した（２×１８０μｌのジメチルホルムアミド、１×１００μｌのジメチルホルムアミド）。
【００４２】
化合物１および２のカップリングは、上で指定されたプロトコルに従って実施し、溶解性を向上させるためにＰＰＴＳ（２ｍｇ、８μｍｏｌ）を添加した。前記カップリングは２回実施した。
【００４３】
固相からの取り出し：トリフルオロ酢酸／ｍ−クレゾール／水（３７：２：１、１ｍｌ）中のシステインメチルエステル塩酸塩（５ｍｇ、２９μｍｏｌ）の溶液を、事前に乾燥した固相を４０分間通過させた。固相をトリフルオロ酢酸（５００μｌ）で洗浄した。合わせた濾液を真空中で濃縮した。
【００４４】
精製：冷ジエチルエーテルを、濃縮された除去溶液に添加した。沈殿物を遠心分離し、そして上清を廃棄した。残渣を水に溶解し、そして、水で平衡化したＳｅｐＰａｋ（Ｒ）Ｃ１８カラムを使用して前精製した。勾配溶離（１×２０：８０  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ：０．１％トリフルオロ酢酸；１×４０：６０  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ：１％トリフルオロ酢酸；１×８０：２０  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ：０．１％トリフルオロ酢酸；１×８０：２０  アセトニトリル：Ｈ２Ｏ：０．１％トリフルオロ酢酸；各２ｍｌ）後に得られた着色した溶離液を、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析し、そして半調製的ＨＰＬＣにより精製した。
プローブ使用の実施例
【００４５】
以下の２実施例は、該プローブを均質ＤＮＡ検出に使用し得る方法を例として示し、かつ、従来技術との比較を示す。
【実施例６】
【００４６】
チアゾールオレンジ−アミノエチルグリシンプローブと比較した、チアゾールオレンジ−Ｌ−オルニチンおよびチアゾールオレンジ−Ｄ−オルニチンプローブでの均質ＤＮＡ検出
蛍光スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒからの分光計ＬＳ  ５０Ｂを使用して２５℃で記録した。測定はリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で実施した。各場合に、１ｍｌの緩衝溶液中の１ｎｍｏｌのＤＮＡ標的および特定のＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションに使用した。使用したＰＮＡプローブは、Ａｃ−ｇｃｃｇｔａ−Ｏ−ｔａｇｃｃｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号４）の一般配列を有し、式中Ｏはアミノエチルグリシン、Ｄ−オルニチン若しくはＬ−オルニチンバックボーンにカップリングしたチアゾールオレンジ色素である。ＤＮＡ標的は、一般配列５’−ＣＧＧＣＴＡＸＴＡＣＧＧＣ（配列番号５）を有し、式中Ｘは二重鎖中の塩基代理物に相対する核酸塩基、すなわちＣ、Ｔ、Ａ若しくはＧであった。図１は、ＤＮＡ標的の添加の前および後の、チアゾールオレンジを結合したバックボーン構造に対する、および塩基代理物に相対する塩基に対する、該プローブの測定された蛍光強度の比を描く。該結果は、全部の場合で、Ｌ−オルニチンバックボーンがアミノエチルグリシンバックボーンより高い蛍光信号を生じる例として示す。全４つの場合で、Ｄ−オルニチンバックボーンはＬ−オルニチンバックボーンより弱い蛍光信号を生じる。アミノエチルグリシンバックボーンと比較して、Ｄ−オルニチンバックボーンは、全３つの場合でアミノエチルグリシンバックボーンより高い蛍光強度を生じ、強度は１つの場合で等しい。本実施例は、プローブ配列の適切な選択が、ハイブリダイゼーションに際しての蛍光増大を最大化し得ることもまた示す。
【実施例７】
【００４７】
チアゾールオレンジ−アミノエチルグリシンプローブと比較した、チアゾールオレンジ−Ｌ−オルニチンおよびチアゾールオレンジ−Ｄ−オルニチンプローブでの一塩基突然変異の検出
蛍光スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒからの分光計ＬＳ  ５０Ｂを使用して２５℃で記録した。測定はリン酸緩衝液、ｐＨ７．０（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で実施した。各場合に、１ｍｌの緩衝溶液中の１ｎｍｏｌのＤＮＡ標的および特定のＰＮＡプローブをハイブリダイゼーションに使用した。使用したＰＮＡプローブは、Ａｃ−ｇｃｃｇｔａ−Ｏ−ｔａｇｃｃｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号４）の一般配列を有し、式中Ｏはアミノエチルグリシン、Ｄ−オルニチン若
しくはＬ−オルニチンバックボーンにカップリングしたチアゾールオレンジ色素である。ＤＮＡ標的は、一般配列５’−ＣＧＧＣＴＸＴＴＡＣＧＧＣ（配列番号６）を有し、式中ＸはＤＮＡ標的中の一塩基突然変異、すなわちＣ、Ｔ、Ａ若しくはＧであった。Ｘ＝Ａは完全に対形成する二重鎖である。図２は、ＤＮＡ標的の添加の後および前の、チアゾールオレンジを結合したバックボーン構造に対する、および標的中に存在する一塩基突然変異に対する、該プローブの測定された蛍光強度の比を描く。該結果は、オルニチンプローブが、全般として、一塩基突然変異の認識においてアミノエチルグリシンプローブより高い特異性を有することを示す。Ｄ−オルニチンプローブは、一般に、Ｌ−オルニチンプローブより弱い蛍光信号を表す。完全に対形成した二重鎖および不適正を含有する多様な二重鎖の該信号比は、Ｌ−オルニチンの場合に６〜１２である一方、Ｄ−オルニチンについて８〜１２という比が観察される。本実施例は、Ｄ−オルニチンプローブの全般により高い特異性を示す。
【実施例８】
【００４８】
チアゾールオレンジ−アミノエチルグリシン、チアゾールオレンジ−Ｌ−オルニチンおよびチアゾールオレンジ−Ｄ−オルニチンプローブとの多様な二重鎖の融解温度の測定
プローブ−ＤＮＡ複合体の融解曲線を、ＶａｒｉａｎからのＵＶ−ＶＩＳ分光計（Ｃａｒｙ  １００）を使用して水中で記録した。測定は１分あたり０．３℃の勾配を使用して実施し、２回の測定を各場合で８５〜１５℃および１５〜８５℃から実施した。融解曲線の屈曲点を特定の二重鎖の融解温度として決定した。配列５’−ＡＧＴＧＡＡＡＴＧＴＴＡＴＡＣＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号７）（マッチした標的）および５’−ＧＡＡＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡ−３’（配列番号８）（不適正標的）を有する２種のＤＮＡ標的を使用した。使用したプローブは、一般配列Ｎ−ｔｔｃｇｔａｔ−Ｏ−ａｃａｔｔｔｃ−Ｌｙｓ−Ｃ（配列番号９）の化合物であり、式中Ｏはアミノエチルグリシン、Ｄ−オルニチン若しくはＬ−オルニチンバックボーンに結合されたチアゾールオレンジ色素である。以下の融解温度が、多様な二重鎖について測定された。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
本実施例は、該二重鎖が、オルニチンプローブの場合に、改変（拡張）されたバックボーン構造により有意に不安定化されなかったことを示す。さらに、マッチおよび不適正二重鎖の融解温度の差違は、実験誤差範囲内で同一である。本実施例は、オルニチンバックボーンによるマッチおよび不適正二重鎖の間の向上された識別が、変えられた融点よりはむしろ塩基代理物の環境の変化に帰され得ることを示す。これは、該プローブが、広範な温度範囲内での一塩基識別に適用されることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
本発明は、態様および図面に基づき、下でより詳細に具体的に説明され、ここで、
【図１】二重鎖中の、ＰＮＡプローブＧＣＣＧＴＡ−Ｒ（ＴＯ）−ＴＡＧＣＣＧ（配列番号１）の、ＤＮＡ標的５’−ＣＧＧＣＴＡＺＴＡＣＧＧＣ−３’（配列番号２）の添加の後および前の、チアゾールオレンジ（ＴＯ）が結合されているバックボーンのＲに対する、ならびに、塩基代理物に相対するヌクレオチドに対する蛍光強度の比を描き、ここで、Ｚ＝１＝チミジン（Ｔ）、２＝グアノシン（Ｇ）、３＝アデノシン（Ａ）および４＝シチジン（Ｃ）、式中、５＝Ｒ＝アミノエチルグリシン（Ａｅｇ）、６＝Ｒ＝Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）および７＝Ｒ−Ｄ−オルニチン（Ｄ−Ｏｒｎ）。
【図２】ＰＮＡプローブＡｃ−ＧＣＣＧＴＡ−Ｒ（ＴＯ）−ＴＡＧＣＣＧ（配列番号１）の、ＤＮＡ標的５’−ＣＧＧＣＴＹＴＴＡＣＧＧＣ−３’（配列番号３）の添加の後および前の、チアゾールオレンジ（ＴＯ）が結合されているバックボーンのＲに対する、ならびに、標的中に存在する一塩基突然変異に対する蛍光強度の比を描き、ここで、Ｙ＝８＝アデニン（Ａ）、９＝グアノシン（Ｇ）、１０＝シチジン（Ｃ）および１１＝チミジン（Ｔ）、式中、５＝Ｒ＝アミノエチルグリシン（Ａｅｇ）、６＝Ｒ＝Ｌ−オルニチン（Ｌ−Ｏｒｎ）および７＝Ｒ−Ｄ−オルニチン（Ｄ−Ｏｒｎ）。
【国際調査報告】
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