(57)【要約】  本発明は、細菌感染を処置するためのワクチンであって、担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも1種の莢膜多糖類を含む複合糖質免疫原を含み、該莢膜多糖類が、該ワクチンの特性を改善するために有効な量のペプチドグリカンを含有するようになっているワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含むワクチン:
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原であって、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、前記複合糖質免疫原および、
(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体。
【請求項２】
上記複合糖質免疫原が、ブドウ球菌(Staphylococcus)によって発現される莢膜多糖類を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
上記複合糖質免疫原が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)によって発現される莢膜多糖類および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)によって発現される莢膜多糖類からなる群から選択される1種以上の莢膜多糖類を含み、少なくとも1種の莢膜多糖類が少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
上記莢膜多糖類が、5型莢膜多糖類、8型莢膜多糖類、336莢膜多糖類、PS-1莢膜多糖類、およびその組み合わせからなる群から選択され、少なくとも1種の莢膜多糖類が少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項２記載のワクチン。
【請求項５】
上記担体タンパク質が、シュードモナス(Pseudomonas)由来の外毒素A、テタヌストキソイド、ジフテリア、α溶血素、およびPanton-Valentineロイコシジンからなる群から選択される、請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
上記莢膜多糖類が5型莢膜多糖類および8型莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項７】
(i) シュードモナス由来の外毒素A担体タンパク質にコンジュゲートされた5型莢膜多糖類および(ii) シュードモナス由来の外毒素A担体タンパク質にコンジュゲートされた8型莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項８】
336莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項９】
PS-1莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項１０】
上記莢膜多糖類が336莢膜多糖類およびPS-1莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１記載のワクチンを投与することを含む、細菌感染の処置方法。
【請求項１２】
少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質からなる複合糖質免疫原を含むワクチンの製造方法であって、
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、ここで、該莢膜多糖類は該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、および、
(B) 治療上有効量の前記複合糖質免疫原を、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体とともに製剤化すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
担体タンパク質に対する莢膜多糖類のコンジュゲーション効率を向上させるための方法であって、(i) 莢膜多糖類および担体タンパク質のコンジュゲーション効率の向上に寄与するために有効な量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、および(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートすることを含む、前記方法。
【請求項１４】
上記莢膜多糖類が、莢膜多糖類と担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記莢膜多糖類が、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ワクチンの免疫原性を向上させるための方法であって、(i) ワクチンの免疫原性の向上に寄与する量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質とコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、および(iii) 該複合糖質免疫原および製薬的に許容しうる担体を含むワクチンを調製することを含む、前記方法。
【請求項１７】
上記莢膜多糖類が、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下のものを含むワクチン:
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原であって、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む、前記複合糖質免疫原および、
(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
1.  発明の属する分野
本発明は、概して、細菌感染を処置(治療)するためのワクチンに関する。具体的には、本発明は、担体タンパク質にコンジュゲートされた治療上有効量の莢膜多糖類を含む複合糖質ワクチンを提供し、その場合、該莢膜多糖類は、該ワクチンの特性を向上させるために有効な量のペプチドグリカンを含み、それは、例えば、該莢膜多糖類と該担体タンパク質のコンジュゲーション効率の改善または該ワクチンの免疫原性の向上によって実証される。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
ペプチドグリカン(PG)は、細菌細胞壁に特有の、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびN-アセチルムラミン酸(MurNAc)の交互の単位のグリカン主鎖からなるヘテロポリマーであり、該MurNAc部分のラクチル基に短いペプチドが連結されている。ほとんどの細菌種では、該糖はβ-1,4-グリコシド結合によって連結され、該ペプチドの一般構造はL-アラニン-D-グルタミン酸-ジアミノ酸-D-アラニン-D-アラニンである。3位の二塩基性アミノ酸(上記式中の「ジアミノ酸」)は、典型的に、グラム陽性球菌ではリシンであり、グラム陽性桿菌およびグラム陰性菌ではジアミノピメリン酸(diaminopimelic (DAP))である。異なるグリカン鎖上に位置するアミノ酸の間のペプチド架橋結合によって、複雑な三次元巨大分子が形成され、それは細菌細胞壁の不可欠な部分を形成する。該ポリマーグリカンの前記強固な配置およびペプチドに対する追加の架橋による一体化は、細菌の細胞形態の決定において主要な役割を果たし、該細菌の物理的統合性を維持する。異なる細菌種間のペプチドグリカンの構造には、微妙な変動が存在しうる。その変動は主に該架橋性ペプチドに委ねられる。
【０００３】
多数の報告で、動物モデルでのペプチドグリカンの病原性効果が記載されている。したがって、細菌細胞壁でできているワクチンからペプチドグリカンを除去することが強く望まれている。例えば、Simelyte et al., Infect. Immun. 68: 3535-40 (2000)では、グラム陽性細菌細胞の粗製の細胞壁調製物が、ラット腹腔内に導入されると慢性関節炎を生じさせることが開示されている。同様に、Li et al., Infect. Immun. 69: 5883-91 (2001)では、ペプチドグリカン調製物を関節内（intrarticular）注射すると、関節炎様症状が生じることが報告されている。Myhre et al., Infect. Immun. 72: 1311-17 (2004)では、ペプチドグリカンが敗血症および器官傷害における主要な病原因子として特徴付けられている。同様の傾向で、Mattsson et al., Infect. Immun. 70: 3033-39 (2002)では、ペプチドグリカンが細菌性敗血症および心内膜炎の誘発における主要な病原因子であり、凝血原系の同時活性化を伴うことが述べられている。これらの報告されているペプチドグリカンの有害な影響は、ワクチンおよび他の医薬調製物中のペプチドグリカン含量を最小限にする分野における従来の賢明さを強調する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要
驚くべきことに、本発明者らは、有益なワクチン特性が、担体タンパク質にコンジュゲートされた莢膜多糖類を含む複合糖質ワクチン中に少なくとも最小有効量のペプチドグリカンが存在することと関連していることを見出した。これらの利点には、例えば、コンジュゲーション効率の向上および免疫原性の向上が含まれ、過度の(intolerable)毒性は生じない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって本発明の一態様では、以下のものを含むワクチンが提供される: (A) 少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原、その場合、該莢膜多糖類は最小有効量のペプチドグリカンを含む、および(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体。一実施形態では、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と該担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、例えば約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。別の実施形態では、該莢膜多糖類は、該ワクチンの免疫原性を増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。別の実施形態では、該莢膜多糖類は少なくとも約5%のペプチドグリカンを含む。いくつかの実施形態では、該複合糖質免疫原はブドウ球菌(Staphylococcus)によって発現される1種以上の莢膜多糖類、例えば黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)によって発現される莢膜多糖類および/または表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)によって発現される莢膜多糖類を含む。例えば、該莢膜多糖類は、5型莢膜多糖類、8型莢膜多糖類、336莢膜多糖類、PS-1莢膜多糖類、またはその組み合わせであってよい。さらに別の実施形態では、該担体タンパク質は、シュードモナス(Pseudomonas)由来の外毒素A、テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイド、α溶血素、またはPanton-Valentineロイコシジン(PVL)である。
【０００６】
別の態様では、本発明は、細菌感染を処置するための方法であって、(A) 治療上有効量の複合糖質免疫原、その場合、(i) 該複合糖質免疫原は少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含み、かつ(ii) 該莢膜多糖類は最小有効量のペプチドグリカンを含む、および(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体、を含むワクチンを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と該担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、例えば約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。別の実施形態では、該莢膜多糖類は、該ワクチンの免疫原性を増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。一実施形態では、該莢膜多糖類は少なくとも約5%のペプチドグリカンを含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質からなる複合糖質免疫原を含むワクチンの製造方法であって、(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、その場合、該莢膜多糖類は最小有効量のペプチドグリカンを含む、および(B) 治療上有効量の該複合糖質免疫原を、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体とともに製剤化することを含む方法を提供する。一実施形態では、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と該担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、例えば約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。別の実施形態では、該莢膜多糖類は、該ワクチンの免疫原性を増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。一実施形態では、該莢膜多糖類は少なくとも約5%のペプチドグリカンを含む。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、担体タンパク質に対する莢膜多糖類のコンジュゲーション効率を向上させるための方法であって、(i) 該莢膜多糖類および担体タンパク質のコンジュゲーション効率の向上に寄与するために有効な量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、および(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートすることを含む方法を提供する。一実施形態では、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と該担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む。別の実施形態では、該莢膜多糖類は少なくとも約5%のペプチドグリカンを含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ワクチンの免疫原性を向上させるための方法を提供する。該方法は、(i) 該ワクチンの免疫原性の向上に寄与する量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質とコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、および(iii) 該複合糖質免疫原および製薬的に許容しうる担体を含むワクチンを調製することを含む。一実施形態では、該莢膜多糖類は少なくとも5%のペプチドグリカンを含む。
【００１０】
図面の簡単な説明
図1は、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の8型莢膜多糖類のペプチドグリカン含量とチオレーションの間の相関を示す。精製8型莢膜多糖類をアミノ酸分析によってペプチドグリカン濃度に関して分析した後、担体タンパク質とコンジュゲートする。エルマンアッセイを使用して、還元型の誘導体化多糖類に関するチオレーションの割合を決定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
好ましい実施形態の詳細な説明
上述のように、本発明者らは、少なくとも最小有効量のペプチドグリカン(PG)の存在が、担体タンパク質にコンジュゲートされた莢膜多糖類(CPS)を含む複合糖質ワクチンに利点をもたらすことを見出した。本明細書中で使用される「莢膜多糖類」には、細胞壁関連および表面多糖類抗原の両者が含まれる。一態様では、CPSと関連するPGの存在が、例えばCPSのチオレーションを向上させることによって、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率を増加させる。コンジュゲーション効率の向上は、コンジュゲーション反応の効率の向上(すなわち高いパーセンテージの反応物がコンジュゲート型になる)、およびCPSおよび担体タンパク質間の高い架橋性を含めた利点を提供する。高い架橋性は、次いで、大型で、より免疫原性で、かつ、より安定な複合糖質免疫原分子を含めた利点を提供する。別の態様では、CPSと関連するPGの存在は複合糖質ワクチンの免疫原性を向上させる。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本発明者らは、細菌多糖類抗原とタンパク質担体のコンジュゲーションは、該抗原を変化させて、それらをT細胞依存的免疫原にし、それによって該ワクチンを増強すると考える。ゆえに、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率の向上は該ワクチンの免疫原性を向上させる。したがって、本発明のワクチンは、PG含量が低い先行技術の製剤より免疫原性である。したがって、本発明は、PGを含む新規ワクチン製剤ならびにその製造および使用方法を提供する。
【００１２】
組成物
本発明は、少なくとも1種のCPSおよび担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原(該CPSは少なくとも最小有効量のPGを含む)および該免疫原用の製薬的に許容しうる担体を含むワクチンを提供する。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本明細書中に記載のように取得されるCPSは、該CPS分子に共有結合しているPG分子を含むことが考えられる。あるいは、該CPS分子は他の力によって該PG分子と密接に関連しているであろう。
【００１３】
莢膜多糖類抗原(CPS)
上述のように、本明細書中で使用される用語「莢膜多糖類」には、細胞壁関連および表面多糖類抗原の両者が含まれる。一実施形態では、該CPSはブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)によって発現される。典型的な黄色ブドウ球菌のCPSには、5型莢膜多糖類、8型莢膜多糖類、および336型莢膜多糖類が含まれる。典型的な表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)の抗原には、PS-1莢膜多糖類が含まれる。本発明のワクチンは、1種以上のこれらの型のCPSを含んでよい。本発明にしたがって、他のCPS、例えば他の細菌性莢膜多糖類細胞壁抗原を、単独で、あるいは他の抗原、例えば上記ブドウ球菌の抗原と組み合わせて使用することもできる。
【００１４】
黄色ブドウ球菌単離体の約85〜90%が5型または8型CPSであることが調査によって示されている。5型および8型莢膜多糖類抗原の両者を含有するワクチンでワクチン接種された正常な個体は、85〜90%の黄色ブドウ球菌株による感染から保護される。ゆえに、本発明の一実施形態では、該ワクチンは5型および8型CPSの両者の複合糖質を含む。
【００１５】
黄色ブドウ球菌の5型および8型CPSの化学組成は同一であるが、その構造は異なる。両者は、1:2の割合のN-アセチル-マンヌロン酸(ManNAcAPp)およびN-アセチル-フコサミン(FucNAcp)からなるポリマーであるが、それらは、これらの糖の間のグリコシド結合ならびにO-アセチル化の部位および程度が異なる。Moreau et al., Carbohydr. Res., 201(2):285-97 (1990); Fournier et al., Ann. Inst. Pasteur Microbiol., 138(5):561-7 (1987)。両者はその反復単位中にFucNAcpを有し、ならびにManNAcApを有する。それを使用して、スルフヒドリル基を導入することができる。5および8型多糖類抗原の構造は、Moreau et al., Carbohydr. Res. 201:285 (1990); およびFournier et al., Infect. Imm. 45:87 (1984)によって解明されており、以下に示される通りである:
5型:
→4)-β-D-ManpNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-FucpNAc-(1→
8型:
→3)-β-D-ManpNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-FucpNAc-(1→
構造上の類似性にもかかわらず、該2型間の実証可能な免疫学的交差反応性は見出されていない。
【００１６】
本発明に基づくワクチン中で使用できる別のブドウ球菌の抗原は、米国特許第5,770,208号および第6,194,161号に記載の336 CPSである。この負に帯電した抗原は、GlcNAcおよび1, 5-ポリ(リビトールリン酸)成分を含み、O-アセチル基を含有しない。典型的な336抗原は、ATCC 55804の下に寄託されている、黄色ブドウ球菌の336型に対する抗体と特異的に結合する。この抗原を担持する黄色ブドウ球菌株は、5型または8型株ではないほとんどすべての臨床的に重要な黄色ブドウ球菌株を占める。ゆえに、本発明は、とりわけ、それぞれ5型、8型、および366 CPSの複合糖質を含むワクチンを考慮する。そのようなワクチンは、ほぼ100%の黄色ブドウ球菌株による感染に対して保護を提供するであろう。
【００１７】
多数の臨床的に重要な表皮ブドウ球菌株が存在する。表皮ブドウ球菌株による感染の処置または予防のためのワクチンは、米国特許第5,961,975号および第5,866,140号に開示される1型抗原を含むコンジュゲートを含んでよい。PS-1とも称されるこの抗原は、ATCC 55254 (I型単離体)に対する抗血清を凝集させる表皮ブドウ球菌の単離体の細胞を培養する段階、該細胞から多糖類抗原を抽出して、多糖類抗原の粗製の抽出物を得る段階、この粗製の抽出物を精製して、少なくとも最小有効量のペプチドグリカンを含有する精製抗原を得る段階(それは以下でさらに詳細に記載される通りである); 該精製抗原を分離用カラムに積載し、NaCl勾配を用いてそれを溶出させる段階; および、I型単離体に対して特異的な抗体を使用して、該多糖類抗原を含有するフラクションを特定する段階を含むプロセスによって取得できる酸性多糖類抗原である。
【００１８】
本発明に基づくワクチンにおいて有用なさらに別のブドウ球菌の抗原はWO 00/56357に記載されている。この抗原は、アミノ酸およびN-アセチル化ヘキソサミンをα立体配置で含み、O-アセチル基を含有せず、ヘキソースを含有しない。それは、ATCC 202176の下に寄託されているブドウ球菌株に対する抗体と特異的に結合する。該抗原のアミノ酸分析では、約39:25:16:10:7のモル比のセリン、アラニン、アスパラギン酸/アスパラギン、バリン、およびスレオニンの存在が示される。アミノ酸は該抗原分子の約32重量%を構成する。
【００１９】
担体タンパク質
細菌性莢膜多糖類抗原は概して不十分な免疫原である。ゆえに、それらを担体タンパク質にコンジュゲートして、その免疫原性を向上させることが多い。本発明の好適な担体タンパク質には、テタヌストキソイドおよびジフテリアトキソイドならびに、組換え生産され、遺伝的に無毒化されたその変異体、ブドウ球菌の内毒素またはトキソイド、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の外毒素Aまたはその誘導体、例えば組換え生産された緑膿菌の外毒素Aの無毒の変異株(例えばFattom et al., Inf. and Imm. 61: 1023-32 (1993)に記載されている)、ならびに免疫担体としての使用に好適な他のタンパク質、ペプチドおよびウイルス様粒子が含まれる。本発明での使用に好適な他の担体タンパク質には、黄色ブドウ球菌の外毒素、例えばα溶血素(α毒素)およびPanton-Valentineロイコシジンが含まれる。
【００２０】
外毒素Aは緑膿菌由来の主要な病原因子であり(Callahan et al., Infect. Immun. 43: 1019-26 (1984)を参照のこと)、本発明のワクチンの副産物として毒素中和抗体を生成させるであろう。そのように、外毒素Aにコンジュゲートされたブドウ球菌のCPSを含む本明細書中に記載のワクチンは、シュードモナスならびにブドウ球菌感染のリスクにさらされている患者に有用であろう。さらにPollack et al., J. Clin. Invest. 63: 276-86 (1979), およびCryz et al., Rev. Infect. Dis. 9 (Suppl 5): S644-S649 (1987)を参照のこと。組換え型で無毒の型のこのタンパク質(rEPA)を、その酵素活性部位の553位のグルタミン酸を欠失させることによって取得した。Lukac et al., Infect. Immun. 56: 3095-98 (1988)。この欠失によって、完全タンパク質は、依然としてネイティブ毒素の抗原性を維持したまま、酵素活性を欠いている状態にされた。したがって、本発明の範囲内のワクチンは、担体タンパク質としてrEPAを含む複合糖質を含んでよい。
【００２１】
最小有効量のペプチドグリカン
本発明では、ワクチンは、担体タンパク質にコンジュゲートされた、少なくとも最小有効量のPGを含むCPSからなる複合糖質免疫原を含有することができる。PGの「最小有効量」は、該ワクチンの特性を改善するために有効な量である。一実施形態では、特性の改善はコンジュゲーション効率の向上に反映され、「最小有効量」とは、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーションを向上させるために十分なPGの量を示す。別の実施形態では、特性の改善は免疫原性の増加に反映され、フレーズ「最小有効量」とは、該ワクチンの免疫原性を増加させるために十分なPGの量を示す。
【００２２】
例えば、該複合糖質免疫原は、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、例えば約2%のPGを含むCPSと比較して少なくとも約20%増加(すなわち比較上のCPSの1.20倍のコンジュゲーション効率)させるために有効な量のPGを含むCPSを含んでよい。あるいは、該複合糖質免疫原は、該ワクチンの免疫原性を増加させるために有効な量のPGを含むCPSを含んでよい。当然、該複合糖質免疫原は、コンジュゲーション効率および該ワクチンの免疫原性の両者を増加させるために有効な量のPGを含むCPSを含んでよい。
【００２３】
本明細書中で使用されるフレーズ「コンジュゲーション効率」とは、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーションに関する。コンジュゲーション効率の向上は、コンジュゲーションプロセス中に担体タンパク質にコンジュゲートされるCPSのパーセントがより高くなることに反映されるであろう。例えば、本発明では、下記コンジュゲーションプロセスによって少なくとも50%のCPS分子が担体タンパク質にコンジュゲートされる。あるいは、コンジュゲーション効率の向上は、CPSおよび担体タンパク質間の架橋性の増加に反映されるであろう。架橋性の増加は、概して、大型の複合糖質免疫原分子を生じさせ、それは概してより高い免疫原性を示す。さらに、架橋性の増加は、概して、より安定な複合糖質免疫原分子を生じさせる。
【００２４】
所定のCPS調製物のコンジュゲーション効率は、当技術分野において公知の方法によって決定してよく、それには、以下に記載の、実施例で例証される方法が含まれる。本明細書中で使用されるコンジュゲーション効率は、以下および図1で例証されるように、CPSのチオレーション効率を測定することによって決定することができる。ゆえに、本明細書中で提供されるPGの「最小有効量」の定義には、CPSのチオレーションを向上させるために十分なPGの量が含まれる。例えば、該複合糖質免疫原は、CPSのチオレーション効率を、約2%のPGを含むCPSと比較して少なくとも約20%増加(すなわち比較上のCPSの1.20倍のチオレーション効率)させるために有効な量のPGを含むCPSを含んでよい。
【００２５】
所定のワクチン調製物の免疫原性は、当技術分野において公知の方法によって決定してよく、それには、以下に記載の、実施例で例証される方法が含まれる。
【００２６】
CPSのPG含量は特定のアミノ酸のw/w %で表すことができる。それは以下のように実行されるアミノ酸分析(AAA)によって決定される。
【００２７】
水中の1 mg/mLの精製CPSのサンプルを気相式塩酸で加水分解する。再構成された一次および二次アミノ酸を安定な蛍光性誘導体に変換する。それは395 nmで強く蛍光を発する。再懸濁されたタンパク質加水分解産物の分析を逆相HPLCによって実施する。外部および内部標準を用いて該アミノ酸を定量する。多糖類溶液中に存在するアミノ酸は、(1) PG (残基Ala、Glx、GlyおよびLys)および(2) 残りのタンパク質(残基Arg、Asx、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Thy、Val、HisおよびPro)に起因する。2アミノ酸(CysおよびTrp)は定量されず、したがって報告されていない。PGおよび残りのタンパク質と関連するアミノ酸の濃度は、以下の式を使用して、CPSと比較された質量パーセンテージとして報告される:
(Gln/Glu) + (Gly) + (Ala) + (Lys) = (PG)
[PG] x 100 = %ペプチドグリカン
[cPS]
Σ(アミノ酸) =         (ペプチド)cps
(ペプチド)cps  - (PG) / (cPS) X 100 =  %RP
式中:
[タンパク質]  =      AAAによるサンプルのタンパク質濃度(mg/mL)
[PG]          =      サンプルの算出ペプチドグリカン含量(mg/mL)
[CPS]         =      サンプルの公知の多糖類濃度(mg/mL)
(ペプチド)cps  =      トータルペプチド濃度
%RP           =      残りのタンパク質(%)。
【００２８】
一実施形態では、CPSは少なくとも約5%のPG、例えば少なくとも5%のPGを含み、少なくとも約7%のPG、少なくとも約9%のPG、および少なくとも約11%のPGを含む。有効である他のPGの量は、少なくとも約13%のPG、少なくとも約15%のPG、少なくとも約17%のPG、少なくとも約19%のPG、少なくとも約21%のPG、少なくとも約23%のPG、少なくとも約25%のPG、および少なくとも約27%のPGである。フレーズ「少なくとも約」には、指定量の1%上または下の範囲内のPGのパーセンテージが含まれる。ゆえに、「少なくとも約5%」は、4〜6%のPGを包含する。フレーズ「少なくとも」には、指定量を超えるか、あるいはそれと等しいPGのパーセンテージが含まれる。ゆえに、「少なくとも5%」は、5%以上のPGを含む。
【００２９】
例えば、本発明において考慮されるワクチンは、少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含み、その場合、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5%の(w/w)ペプチドグリカンを含み、かつ、その場合、該担体タンパク質は、α溶血素、Panton-Valentineロイコシジン、シュードモナス由来の外毒素A、テタヌストキソイドまたはジフテリアトキソイドであり、および製薬的に許容しうる担体を含む複合糖質免疫原を含むワクチンである。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、ワクチンは、無毒の担体タンパク質、例えば組換えエキソプロテインA (rEPA)にコンジュゲートされた2種以上の臨床的に重要なCPS型、例えば黄色ブドウ球菌の5型、8型および/または366の複合糖質を含む。そのような一実施形態では、少なくとも1種のCPS抗原は、少なくとも最小有効量のPGを含み、例えば少なくとも5%のPGを含む。それは上記のように決定される。そのような別の実施形態では、各CPS抗原は、少なくとも最小有効量のPG、例えば5%のPGを含む。さらに別の実施形態では、複合糖質は、全体として、最小有効量のPGを含み、例えばすべてのCPS抗原の総重量に基づいて全体として少なくとも5%のPG含量を含む。
【００３１】
最小有効量のPGの選択には、該PGが提供する該ワクチンの効力の改善(すなわちコンジュゲーション効率および免疫原性の向上)に対して、PGに起因する毒性を均衡させることが必要であろう。ワクチンの分野に特有の必要条件は、効力に対して毒性を均衡させる要求であり、当業者は、所定の環境において、日常的実験法を手段としてこの均衡に達することができる。毒性は、例えば、上で考察される報告されているPGの病原性効果に重点を置いて、周知の技術によって決定することができる。同様に効力は、下記実施例において例証されるように公知の方法論にしたがって決定することができる。ゆえに、効力は免疫原性、すなわち抗体産生を誘発する能力の点、またはコンジュゲーション効率の向上、すなわちCPSと担体タンパク質のコンジュゲーションを向上させる能力の点から測定することができる。有効量のPGは、臨床家が毒物学的に容認できるが、依然として効果的であるとみなすであろう、複合糖質ワクチンを提供する。例えば、PG含量が少なくとも約5%〜少なくとも約27%まで(両端を含む)の範囲であり、例えば少なくとも約19%であるCPSを含む本発明に基づくワクチンは、効力の向上(すなわちコンジュゲーション効率および/または免疫原性の向上)を提供し、容認できない毒性作用を示さないことを臨床家は見出すであろう。
【００３２】
方法
本発明は、本発明の複合糖質ワクチンを製造するための方法およびその使用方法をさらに提供する。CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率を向上させるための方法、複合糖質ワクチンの免疫原性を向上させるための方法、および細菌感染を処置または予防するための方法が具体的に記載される。
【００３３】
CPSコンジュゲートワクチンを製造するための方法および関連方法
一態様では、本発明は、少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSを含む複合糖質ワクチンを製造するための方法を提供する。該方法は、少なくとも1種のCPS抗原を担体タンパク質にコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させることを含み、その場合、該CPS抗原は少なくとも最小有効量のPGを含む。治療上有効量の複合糖質免疫原を、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体とともに製剤化すると、ワクチンが得られる。一実施形態では、PGの量は、コンジュゲーション効率を、例えば2%のPGを含むCPSと比較して少なくとも約20%向上させるために有効な量である。別の実施形態では、PGの量は、該ワクチンの免疫原性を増加させるために有効な量である。別の実施形態では、該CPSは少なくとも約5%のPGを含む。
【００３４】
例えば、本明細書中で記載される方法は、少なくとも1種のCPSおよび担体タンパク質を含む複合糖質免疫原を含み、その場合、該莢膜多糖類は最小有効量のPGを含み、かつ、その場合、該担体タンパク質は、α溶血素、Panton-Valentineロイコシジン、シュードモナス由来の外毒素A、テタヌストキソイドまたはジフテリアトキソイドであり、および製薬的に許容しうる担体を含むワクチンを製造するための方法である。一実施形態では、最小有効量のPGは、CPSの重量に基づいて少なくとも約5%のPGである。
【００３５】
別の態様では、本発明は、ワクチンの免疫原性を向上させるための方法を提供する。該方法は、該ワクチンの免疫原性の向上に寄与するための少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSを選択すること、およびCPSを担体タンパク質にコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させることを含む。治療上有効量の複合糖質免疫原を、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体とともに製剤化すると、ワクチンが得られる。一実施形態では、該CPSは少なくとも約5%のPGを含む。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率を向上させるための方法を提供する。該方法は、コンジュゲーション効率の向上に寄与するための少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSを選択すること、およびCPSを担体タンパク質にコンジュゲートすることを含む。一実施形態では、PGの量は、コンジュゲーション効率を、例えば2%のPGを含むCPSと比較して少なくとも約20%向上させるために有効な量である。別の実施形態では、該CPSは少なくとも約5%のPGを含む。
【００３７】
これらの方法における使用に好適な精製CPS (PGを含む)は、例えば細菌を処理してCPSを放出させ、次いで該CPSを精製することによって取得してよい。このプロセスは、細菌の酵素消化(例えばリソスタフィン、RNA分解酵素および/またはDNA分解酵素を使用)およびCPSの回収(例えばエタノール沈殿、遠心分離およびろ過を使用)を含んでよい。追加の精製ステップは、透析(例えば微量のエタノールを除去するため)、二次酵素消化(例えばRNA分解酵素、DNA分解酵素および/またはプロテアーゼ、例えばプロナーゼEを使用)および透析、追加のCPS回収(例えばエタノール沈殿、遠心分離、透析およびろ過を使用)、およびクロマトグラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除/ゲルろ過クロマトグラフィーを含んでよい。
【００３８】
得られる精製CPSのPG含量は、例えば酵素消化ステップの時点で制御することができる。例えば、細菌からCPSを放出させるために使用されるリソスタフィンの量を調節すると、該CPSのPG含量に影響を与えることができ、その場合、概して、リソスタフィンが低濃度であるほど、PG含量が高くなる。一実施形態では、使用されるリソスタフィン濃度は、細胞ペースト1グラムあたり約100μg〜約1000μgのリソスタフィンの範囲である(およそ約7〜約64単位/細胞ペースト1グラムに相当する)。別の実施形態では、細胞ペースト1グラムあたり約225μgのリソスタフィン(およそ約16単位/細胞ペースト1グラム)が使用される。オプションの第二リソスタフィンステップにおいても、同様の量のリソスタフィンを使用してよい。
【００３９】
一実施形態では、細菌培養を発酵させ、遠心分離して、細胞ペーストを得る。例えばペースト1グラムあたり約16単位のリソスタフィンの濃度でリソスタフィンを加えて、上記プロセスの第一酵素消化ステップを達成する。別の実施形態では、精製プロセス中に二度目のリソスタフィンを加える。例えば、第一回収ステップ(エタノール沈殿)後にペースト1グラムあたり約16単位のリソスタフィンを加えてよい。
【００４０】
これらのリソスタフィンの量は単に説明目的であり、標的PG含量にしたがって調節することができる。上記のように、概して、リソスタフィン濃度を増加させるとPG含量が低くなり、概して、リソスタフィン濃度を減少させるとPG含量が高くなる。また、リソスタフィン酵素消化の温度を調節することによってPG含量を制御することができ、その場合、37℃が最適温度であり、20〜30℃の範囲のより低い温度では酵素消化が延長される。ゆえに、リソスタフィン酵素消化を低い温度で行うと、高いPG含量の製剤が得られる。
【００４１】
得られる精製CPSのPG含量は、(オプションの)第二酵素消化ステップで使用されるプロテアーゼの量を調節するか、あるいは該ステップにおいてプロテアーゼの使用を省略することによって制御することもできる。
【００４２】
例えば、CPSは、概して、米国特許第6,194,161号, Fattom et al., Vaccine 13: 1288-93 (1995), およびFattom et al., Infect. Immun. 58: 2367-74 (1990)に記載の方法にしたがって、細菌から単離および精製することができる。しかし、少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSを達成するために、酵素処理ステップ中に、前記刊行物に記載されるよりも低い濃度、例えば細胞ペースト1グラムあたり約7〜約64単位のリソスタフィンを使用する。さらに、前記刊行物に開示されるプロナーゼ(プロテアーゼ)ステップを改変または省略して、本発明に準じる、少なくとも最小有効量のペプチドグリカンを伴うCPSを達成してよい。
【００４３】
精製CPS、例えば黄色ブドウ球菌の5型および8型の血清型由来のCPSを二次元NMRを使用して分析して、PG含量を評価(asses)することができる。例えば、NMRスペクトルの分析によって、PGの主要アミノ酸成分である、アラニン、グルタミン/グルタミン酸およびリシンの存在が示されるであろう。同様に、脱-O-アセチル化5型および8型CPSのNMRスペクトルは、2種の非置換型ヒドロメチル基の証拠をもたらすであろう。それはPG中のβ-GlcNAcおよびβ-MurNAc残基の存在と合致する。
【００４４】
少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSが、本発明の方法における使用のために選択される。精製CPSのPG含量は上記AAAを使用して決定することができる。
【００４５】
CPSの単離および精製後に、少なくとも最小有効量のPGを含むCPSを担体タンパク質にコンジュゲートする。一実施形態では、担体タンパク質を当技術分野において公知の方法によって誘導体化して、コンジュゲーションを容易にする。また、当技術分野において公知の方法によってCPS抗原を誘導体化して、コンジュゲーションを容易にしてもよい。例えば、ADH、シスタミンまたはPDPHを用いてCPS抗原上の活性化型カルボキシレート基を誘導体化することができ、次いで、部分アミド化抗原と担体タンパク質上のカルボキシレート基のカルボジイミド媒介反応またはチオール化(thiolated) CPS抗原とSPDP誘導体化担体タンパク質のジスルフィド交換によって、CPS抗原を担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。臭化シアンまたは1-シアノ-4-ジメチルアミノ-ピリジニウムテトラフルオロボレートを使用して抗原上のヒドロキシル基を活性化することができ、次いで、6炭素二機能性スペーサーアジピン酸ジヒドラジド(ADH)を用いて該抗原を誘導体化することができる。それはKohn et al., FEBS Lett. 154: 209:210 (1993)の方法にしたがって、当技術分野において公知の技術にしたがって行う。
【００４６】
一実施形態では、CPSの誘導体化は、チオレーションを含むプロセスによって達成される。そのようなプロセスは、CPSをジアミノジスルフィド(シスタミン)でアミド化することによって行うことができる。この反応は、ジスルフィド結合を導入することから「チオレーション」と称される。活性化型カルボキシル末端型リンカー、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)を用いて、担体タンパク質のアミド化をパラレルで実行してよい。チオール化CPSをジチオスレイトール(DTT)で還元することによって生成された遊離チオールをSPDP誘導体化担体タンパク質に加えて、ピリジンチオンを置換し、該リンカーを介するCPSおよび担体タンパク質間のジスルフィド結合を形成させると、コンジュゲーションが達成される。典型的に、得られた複合糖質をろ過によって回収する。
【００４７】
担体タンパク質のSPDP誘導体化およびCPSのチオレーションの割合は、該担体タンパク質およびCPS上の抗原決定基が保存され、かつ、より安定で、ならびに/あるいは、より免疫原性のコンジュゲートが生産されるように最適化してよい。遊離チオールの量を、選択される置換密度がチオール化CPSの架橋を最小化し、かつ、CPS-タンパク質コンジュゲーションに好都合であるように制御および最適化してもよい。
【００４８】
例えば、初期誘導体化反応は、1:1の割合の各反応物を用いて行うことができる。得られる生成物の抗原性は、該生成物で動物を免疫化し、通常の方法によって免疫原性応答を決定することによって評価することができる。所望であれば、異なる割合の反応物を用いて追加の誘導体化反応を行い、得られる生成物の特性を最適化することができる。
【００４９】
上で考察されるように、誘導体化CPS抗原は、任意の好適な担体タンパク質、例えばジフテリアトキソイド(DTd)、緑膿菌由来の組換えエキソプロテインA (rEPA)、テタヌストキソイド(TTd)、α溶血素、Panton-Valentineロイコシジン(PVL)または別の好適な担体タンパク質に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)によって連結することができる。得られるコンジュゲートは、サイズ排除クロマトグラフィーによって非コンジュゲートCPS抗原から分離することができる。
【００５０】
CPS抗原を担体タンパク質にコンジュゲートするために使用される方法に関わらず、CPS抗原と担体タンパク質を共有結合によって連結すると、該CPS抗原の免疫原性は顕著に向上する。このことは、例えば、マウスにおいて一回目および二回目の両ワクチンブースト後に該抗原に対して誘発される抗体のレベルの増加として観察されている。したがって、本発明に基づく少なくとも最小有効量のPGを伴うCPSを使用すると、該CPSと担体タンパク質のコンジュゲーション効率が向上し、かつ、ワクチンの免疫原性が向上する。
【００５１】
エルマンアッセイを使用して、チオレーション効率によって測定されるコンジュゲーション効率を評価してよく、すなわち、残存する遊離スルフヒドリル基を測定することによって還元型の誘導体化CPSのチオレーションの割合を決定してよい。例えば、還元型の誘導体化CPSサンプルまたはコントロールを5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)と室温で5分間反応させることによって、遊離スルフヒドリル基を定量することができる。この反応によって、混合されたジスルフィドおよび2-ニトロ-5-チオ安息香酸(TNB)が生じる。TNBの濃度は412 nmでの吸光度によって定量してよく、モル吸光係数は13,600である。その結果は、多糖類(PS)三糖反復単位あたりの遊離スルフヒドリル基のモル比として報告することができる。
【００５２】
図1に示されるように、約5%のPGを含むCPSは、約2%のPGを含むCPSの少なくとも約1.20倍のチオレーション効率を有する。ゆえに、約5%のPGを含むCPSは、2%のPGを含むCPSと比較してコンジュゲーション効率の25%増加を示す。
【００５３】
本発明に基づくワクチンは、典型的に、複合糖質免疫原用の製薬的に許容しうる担体を含む。製薬的に許容しうる担体は、複合糖質用のビヒクルとして使用できる物質であり、ビヒクルとして使用できる理由は、ワクチン投与の関連で、該物質が不活性であるか、あるいは別の様式で医学的に許容しうるものであり、ならびに活性物質と適合性であるからである。好適な賦形剤に加えて、製薬的に許容しうる担体は、慣用のワクチン添加物、例えば希釈剤、アジュバントおよび他の免疫刺激剤、酸化防止剤、保存料および可溶化剤を含有することができる。例えば、ポリソルベート80を加えて、凝集を最小化し、安定化剤として作用させてよく、pH調節のためにバッファーを加えてよい。本明細書中に記載のワクチン製剤は、比較的簡単に、かつ、組成物を乱すことなく、アジュバントの添加を許容する。
【００５４】
さらに、本発明のワクチンは、投与部位での抗原性物質の保持を高めるための「貯留」成分を含むように製剤化してよい。一例として、アジュバント(使用される場合)に加えて、硫酸デキストランまたは鉱油を加えて、この貯留効果を提供してよい。
【００５５】
ワクチン製剤の免疫原性は、in vitroオプソノファゴサイトーシス(opsonophagocytosis)アッセイによって評価することができる。例えば、5型および8型rEPAコンジュゲートによって生じる5型および8型特異的抗体の免疫原性は、白血球(HL-60前骨髄球性白血病細胞系)、補体、モノクローナルまたはポリクローナルCPS特異的抗体および5型または8型細菌を使用して、以下のように評価することができる。0および60分の時点で、細菌のオプソノファゴサイトーシスまたは死滅を測定する。5型および8型抗原に結合する誘発抗体の存在を検出するELISA (酵素結合免疫吸着検定)、および5型および8型の両者に関するオプソニン抗体活性の間の高い相関が存在すれば、ワクチンによって誘発された抗体が機能的であること、およびそれらが型特異的オプソノファゴサイトーシスを媒介することが示される。
【００５６】
追加的または代替的に、下記実施例において記載されるような動物アッセイによって、免疫原性を評価することができる。そのようなアッセイでは、ワクチンで免疫化された動物において誘発される抗体のレベルを非ワクチン接種動物における抗体のレベルと比較する。
【００５７】
複合糖質免疫原を含む本発明のワクチンの典型的な製剤は、担体タンパク質、例えばシュードモナス由来の外毒素A、テタヌストキソイドまたはジフテリアにコンジュゲートされた1種以上のブドウ球菌のCPS抗原(例えば黄色ブドウ球菌の5型、黄色ブドウ球菌の8型、黄色ブドウ球菌の336、および表皮ブドウ球菌のPS-1)を含む。上記のように決定されると、CPS抗原は典型的に少なくとも約5%のPGを含むが、チオレーション効率および/または免疫原性を向上させるために有効で、許容しえないほど有毒ではない任意の量のPGを含んでよい。例えば、PGの量が臨床家にとって許容しえない有毒な限界に達しない限り、10%、15%、または20%より高いPGパーセンテージを使用してよい。
【００５８】
細菌感染を処置および予防するための方法
本発明によってさらに提供される方法は、本発明のワクチンを使用して細菌感染を処置および/または予防するための方法である。そのような方法は、治療上有効量の複合糖質免疫原を含むワクチンをそれを必要としている患者に投与する段階を含み、その場合(i) 該複合糖質免疫原は少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含み、かつ(ii) 該莢膜多糖類は少なくとも最小有効量のPGを含む。それは上記の通りである。典型的に、該ワクチンは、上記のように、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体をさらに含む。
【００５９】
これらの方法の標的患者集団には、黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌等の細菌性病原体に感染しているか、あるいはそれに感染するリスクにさらされている、ヒトを含めた哺乳動物が含まれる。該ワクチンは任意の所望の剤形で提供してよく、その剤形には、ヒト静脈内、筋肉内、または皮下に投与してよい剤形が含まれる。該ワクチンは、一回量で、または複数回投薬プロトコルにしたがって投与してよい。
【００６０】
投与は、皮下、皮内、および静脈内を含めた任意の数の経路による投与であってよい。一実施形態では、筋肉内投与が使用される。当業者は、処置対象の細菌感染およびワクチンの組成物に応じて投与の経路が変動することを認識する。
【００６１】
本発明に基づくワクチンは、アジュバントを伴って、または伴わずに投与することができる。アジュバントが使用される場合、アジュバントによって誘発される毒性を回避するように選択される。本発明に基づくワクチンは、β-グルカンまたは顆粒球コロニー刺激因子、特に米国特許第6,355,625号(September 14, 1999提出、March 12, 2002発行)に記載のβ-グルカンをさらに含んでよい。
【００６２】
本発明のワクチンの治療上有効量は、当技術分野において通常の方法によって決定することができる。当業者は、該量が、該ワクチンの組成物、具体的な患者の特徴、選択される投与経路、および処置対象の細菌感染の性質に伴って変動するであろうことを認識する。一般的なガイダンスは、例えば、International Conference on Harmonisationの刊行物およびRemington's Pharmaceutical Sciences, chapters 27 and 28, at pages. 484-528 (Mack Publishing Company 1990)に見出すことができる。典型的なワクチン用量は1μg〜400μgの範囲であってよい。
【００６３】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、該実施例は単に説明目的で提供されるものである。本発明は該実施例に限定されず、それどころか、本明細書中で提供される教示内容から自明のすべてのバリエーションを含む。
【実施例】
【００６４】
実施例
実施例1.   5型莢膜多糖類の単離
一次酵素消化および遠心分離
以下のように5型CPSを細菌から放出させる:
5型細胞ペーストをトリスバッファー中に再懸濁することによって黄色ブドウ球菌から5型CPSを精製する。リソスタフィン(Lyostaphin)を16単位/ペースト1グラムの終濃度で加える。3時間のリソスタフィン消化の終了時点で、RNA分解酵素およびDNA分解酵素を40μg/混合物1 mLの終濃度で加え、核酸を消化し、混合物の粘性を低減する。継続的に撹拌しながら、この混合物を37℃で3時間インキュベートする。酵素混合物を23,000 Gで1時間遠心分離し、上清を回収する。
【００６５】
一次エタノール沈殿、遠心分離およびろ過
消化済み核酸および他の細胞成分を除去するために、無水アルコールおよびCaCl2を上清に加える。その溶液を4℃で6〜18時間保存する。25%エタノール沈殿物を遠心分離し、ペレットを捨てる。その後、再度沈殿させて、粗製のCPSを回収する。無水エタノールおよびCaCl2を加え、その溶液を4℃で6〜18時間保存する。75%エタノール沈殿物を遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを水に再溶解し、ろ過する。
【００６６】
透析およびろ過
エタノール精製済みCPSを透析して、透析管中の微量のエタノールを除去する。CPSを透析し、その透析物および貯留物(retentate)をCPSの存在に関して検査する。その検査はキャピラリー沈殿試験を使用する血清型同一性試験に基づく。
【００６７】
キャピラリー沈殿試験では、細菌サンプルをショ糖溶液で溶解し、室温で15分間インキュベートし、溶解細胞の部分を水で希釈し、さらに15分間インキュベートする。そのサンプルを遠心分離し、上清のアリコートをキャピラリー管に回収し、等容量の特異的抗血清を第二の試験管に回収する。抗血清試験管の内容物をサンプル試験管に移し、蛍光条件下で検査する。抗血清/サンプル界面での沈殿物の存在を陽性の結果として記録し、沈殿物の不存在を陰性の結果として記録する。試験対象の貯留物をろ過し、凍結乾燥する。
【００６８】
二次酵素消化および透析
粗製の5型CPSをさらに精製するために、2 mM MgSO4を伴う0.05 Mトリス、pH 7.2に前記凍結乾燥材料を溶解する。リソスタフィン(Lyostaphin)を16単位/ペースト1グラムの終濃度で加える。透析管(MW 10,000)中にある間に、RNA分解酵素およびDNA分解酵素を100μg/mLの終濃度で加える。この混合物を37℃で4時間インキュベートする。透析済み混合物をPSの存在に関して検査する。その検査はキャピラリー沈殿試験を使用する血清型同一性試験に基づく。
【００６９】
二次エタノール沈殿、透析およびろ過
透析管由来の貯留物に二水和のアルコールおよびCaCl2を加え、懸濁液を4℃で6〜18時間保存し、1時間遠心分離する。上清を回収し、無水アルコールおよびCaCl2と混合する。この懸濁液を23,000 Gで1時間遠心分離する。ペレットを一晩透析して、微量のエタノールを除去する。透析物および貯留物をCPSの存在に関して検査する。その検査はキャピラリー沈殿試験を使用する血清型同一性試験に基づく。貯留物を0.45μmフィルターに通してろ過し、4℃で6〜18時間保存する。サンプルを凍結乾燥し、次のステップまで保存する。
【００７０】
イオン交換クロマトグラフィー
前記サンプルを分離のためにイオン交換クロマトグラフィーに付する。サンプルをDEAEカラムにアプライし、該カラムを60 mL/hrの流速で5回洗浄する。流出物のフラクションを分光光度測定(OD206)によってモニターする。
【００７１】
サイズ排除/ゲルろ過クロマトグラフィー
サイズ排除/ゲルろ過クロマトグラフィーを使用し、分子サイズによって前記凍結乾燥CPSをさらに精製する。凍結乾燥材料を0.2 M NaClに溶解し、カラムに積載し、同バッファーで溶出させる。フラクションを回収し、OD206でモニターする。ピークフラクションを回収し、上記のように血清型同一性に関して検査し、0.45μmフィルターを通してろ過し、凍結乾燥する。
【００７２】
S4000 HPLCサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)法は、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖類(CPS)の分子サイズを決定するための定性的手順である。その場合、Biosep-SEC-S4000カラムを使用する。各多糖類サンプルおよびマーカーを206 nmでモニターし、領域報告を作成する。多糖類サンプルの分子サイズを分配係数(Kd)として表し、それは、カラムマーカー容量およびサンプル溶出容量、カラム空隙容量(2000 kDデキストラン)、およびトータルカラム容量(グリシル-L-チロシン)から算出される。
【００７３】
実施例2.   CPS PG含量およびタンパク質および核酸混入の評価
本実施例では、アミノ酸分析(AAA)によるペプチドグリカンのアミノ酸および残りのタンパク質のアミノ酸の定量化および核酸混入の定量化を説明する。
【００７４】
手順
アミノ酸分析(AAA)を使用して、黄色ブドウ球菌の多糖類サンプル中に存在するペプチドグリカンおよび残りのタンパク質の濃度を決定する。気相式塩酸を用いてサンプル(水中の1 mg/mL 精製済み多糖類として調製)を加水分解することによって多糖類溶液のAAAを実施する。再構成された一次および二次アミノ酸を安定な蛍光性誘導体に変換する。それは395 nmで強く蛍光を発する。再懸濁されたタンパク質加水分解産物の分析を逆相HPLCによって実施する。外部および内部標準を用いて該アミノ酸を定量する。多糖類溶液中に存在するアミノ酸は、(1) ペプチドグリカン(残基Ala、Glx、GlyおよびLys)および(2) 残りのタンパク質(残基Arg、Asx、Ile、Leu、Met、Phe、Ser、Thr、Thy、Val、HisおよびPro)に起因する。2アミノ酸(CysおよびTrp)は定量されず、したがって報告されていない。ペプチドグリカンおよび残りのタンパク質と関連するアミノ酸の濃度は、以下の式を使用して、多糖類と比較された質量パーセンテージとして報告される。
【００７５】
% ペプチドグリカン(w/w)の計算:
% ペプチドグリカン  =    [PG] x 100 =
[CPS]
[PG] mg/mL          =    Glu/Gln + Gly + Ala + Lys
式中:
[タンパク質]      =    アミノ酸分析によるサンプルのタンパク質濃度(mg/mL)
[PG]              =    サンプルの算出ペプチドグリカン濃度(mg/mL)
[CPS]             =    サンプルの既知の多糖類濃度(1 mg/mL)。
【００７６】
例えば、以下のものを含むワクチン製剤は:
[PG] mg/mL   =   Glu/Gln + Gly + Ala + Lys
[PG] mg/mL   =   0.0119 + 0.0208 + 0.0132 + 0.0122 = 0.0581 mg/mL
[CPS]        =   0.96 mg/mL
6.05% PG (% PG = [PG] /[CPS] X 100 = 0.0581 / 0.96 X 100 = 6.05%)を含有する。
【００７７】
% 残りのタンパク質(w/w)の計算:
%RP = (ペプチド)cps  - (PG) / (cPS) X 100
Σ(アミノ酸) =       (ペプチド)cps
式中:
(ペプチド)cps        =    トータルペプチド濃度
[RP]        =    サンプルの計算上の残りのタンパク質濃度(mg/mL)
[PS]        =    サンプルの既知の多糖類濃度(1 mg/mL)。
【００７８】
例えば、以下のものを含むワクチン製剤は:
(ペプチド)cps   =   0.0647 mg/mL
[PG]           =   0.0581 mg/mL
[cPS]          =   0.96 mg/mL
0.68% RP (% [RP]  = 0.0647-0.0581 /  0.96 = 0.68%)を含有する。
【００７９】
UV分光測定による残留核酸の定量化
精製済みCPSの残留核酸濃度を分光光度測定による分析によって測定することができる。260 nmでのサンプルの吸光度をニシン精子DNAの溶液の吸光度と比較する。後者は50μg/mLで1.0 AUの吸光度を有する。サンプル中のDNAの濃度をトータル5型多糖類濃度のフラクション(%)として報告する。
【００８０】
実施例3.   5型および8型CPSワクチン効率
上記実施例1に記載のように調製された5型および8型CPSが以下の特性を有することを測定した。
【００８１】
2008523142.tif 000002
【００８２】
表に示されるように、5型および8型CPSを精製し、少なくとも5%のPGを含むこと、およびマウスにおいて免疫原性であることを決定した。残りのタンパク質が低レベルであることは算出ペプチドグリカン含量に信頼性を与える。その理由は、それが、実質的にすべての検出アミノ酸が、他の残りのタンパク質ではなく、ペプチドグリカンに起因することを示すからである。マウスにおける5型および8型CPSの効力についての評価は、以下にさらに詳細に記載される。
【００８３】
黄色ブドウ球菌の5型および8型CPSワクチンの効力はマウス免疫原性に基づいて測定してよい。個々のマウス血清中の抗体応答を測定し、抗体応答の有意な(例えば4倍)増加を実証するマウスの割合を特定することによって、該ワクチンの効力を決定する。例えば、以下の手順を使用してよい。
【００８４】
雌性の6〜8週齡マウスを10匹からなる2群に分けて投薬する。各群に2週間隔で2回ワクチン接種する。第一群には、PBS/0.01%ポリソルベート80で100μLに希釈された0.25μgワクチン/用量を服用させる。第二群のマウスはネガティブコントロール群であり、それには100μLのPBS/0.01%ポリソルベート80を服用させる。各群の選択マウスから1回目の注射の少なくとも48時間前にワクチン接種前の血液サンプルを回収する。すべてのマウスから最後の免疫化の1週間後にワクチン接種後の血液サンプルを回収する。遠心分離によって全血サンプルから血清サンプルを分離する。
【００８５】
すべての血清サンプル中で定量的ELISAによって黄色ブドウ球菌の5/8型多糖類に対する抗体を定量する。前記サンプルを5型または8型CPSでコーティングされたマイクロタイタープレートにアプライし、インキュベートし、洗浄溶液(0.01 Mリン酸、0.15 M塩化ナトリウム、0.1% v/vポリソルベート20)で洗浄して、すべての未結合マウス抗体を除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートされたヤギ抗マウス免疫グロブリン(IgG)抗体を用いる以後の反応によって、CPSに結合したままである抗体の量を決定する。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を用いるエンドポイント色素生産反応によって結合HRPのレベルを決定する。ペルオキシダーゼ活性を停止液(Stop Solution) (1.0M リン酸)によってクエンチし、450 nmでの吸光度によって定量する。
【００８６】
本アッセイから取得できる効力の1測定値は、コントロール群におけるマウスの幾何平均抗体レベルと比較された両5型および8型血清抗体レベルの4倍増加を示す0.25μg用量群中のマウスの割合(%)である。黄色ブドウ球菌ワクチン群における各マウスに関して、コントロール群と比較された力価の倍増はコントロール群におけるマウスの幾何平均抗体レベルに対するその血清抗体レベルの比である。
【００８７】
本アッセイから取得できる効力の別の測定値は、0.025μg用量群において観察される5型および8型抗体レベル(μg/mL)の幾何平均である。
【００８８】
実施例4.   毒物学試験
以下のように、5型および8型莢膜多糖類を含む本発明に基づくワクチンに関して一回量急性毒性試験を行う。その場合、各CPSは少なくとも5%のPGを含み、rEPAにコンジュゲートされている。
【表１】
2008523142.tif 000003
【００８９】
試験1: 一回量急性毒性試験(IM)
バッファー中の低用量(2.92μg/kg)または高用量(29μg/kg)の製剤で、10ラットからなる3群に一回量のワクチンを投与する。各群の半数の動物を24時間後に犠牲にし、試験およびコントロール物質の投与後7日で残りの動物を犠牲にする。死亡率、臨床徴候、体重、臨床病理学(血液学および臨床化学)、総病理学および組織病理学に関して被験動物を評価する。臨床徴候、体重、臨床病理学(血液学および臨床化学)、総病理学および組織病理学に関して無処置関連効果を観察する。本試験は、前記ワクチンが最大試験用量29μg/kg (重量:重量ベースで100μｇのヒト用量の20倍)で有毒な症状を誘発しないことを実証する。
【００９０】
試験2: 一回量急性毒性試験(IP)
11群の10 ICRマウスに、一回量のワクチン(25μg 5型および8型CPS)、1価5型および8型-rEPAコンジュゲート(25μg)、rEPA (50μg)、緑膿菌の外毒素A (0.1〜0.5μg)またはウシ血清アルブミンを投与する。試験物質の投与後48時間、被験動物を観察する。血清サンプルをトランスアミナーゼ肝臓酵素、SGOTおよびSGPTに関して測定する。外毒素Aのみが致死を生じさせ、SGOTおよびSGPTレベルを上昇させた。黄色ブドウ球菌CPS-rEPAワクチンまたはrEPA (各物質に関して重量:重量ベースで100μgのヒト用量のおよそ900倍)を投与された群において、異常な臨床観察、予定外の死または有毒な影響は観察されない。
【００９１】
実施例5.   ワクチン製剤
本発明に基づく、黄色ブドウ球菌の5型および8型CPSを含む複合糖質ワクチンを調製した。典型的に、該ワクチン製剤は以下のものを含有する:
黄色ブドウ球菌5型コンジュゲート      100μg
黄色ブドウ球菌8型コンジュゲート      100μg
ポリソルベート80                      0.1 mg
塩化ナトリウム                        11.7 mg
リン酸ナトリウム, 二塩基性            2.23 mg
リン酸ナトリウム, 一塩基性            0.23 mg
注射用水                              1.0 mL。
【００９２】
精製済みCPSの試験では、以下のことが実証される:
分子サイズ                            0.16〜0.34 Kd
残りのタンパク質                      <1%
ODに基づく核酸含量                    <1%
O-アセチル含量                        >55%
ペプチドグリカン含量                  少なくとも約5%
チオール:CPSモル比                    0.05〜.11。
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月31日(2006.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含むワクチン:
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原であって、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、前記複合糖質免疫原および、
(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体。
【請求項２】
上記複合糖質免疫原が、ブドウ球菌(Staphylococcus)によって発現される莢膜多糖類を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
上記複合糖質免疫原が、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)によって発現される莢膜多糖類および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)によって発現される莢膜多糖類からなる群から選択される1種以上の莢膜多糖類を含み、少なくとも1種の莢膜多糖類が少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
上記莢膜多糖類が、5型莢膜多糖類、8型莢膜多糖類、336莢膜多糖類、PS-1莢膜多糖類、およびその組み合わせからなる群から選択され、少なくとも1種の莢膜多糖類が少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項２記載のワクチン。
【請求項５】
上記担体タンパク質が、シュードモナス(Pseudomonas)由来の外毒素A、テタヌストキソイド、ジフテリア、α溶血素、およびPanton-Valentineロイコシジンからなる群から選択される、請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
上記莢膜多糖類が5型莢膜多糖類および8型莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項７】
(i) シュードモナス由来の外毒素A担体タンパク質にコンジュゲートされた5型莢膜多糖類および(ii) シュードモナス由来の外毒素A担体タンパク質にコンジュゲートされた8型莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項８】
336莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項９】
PS-1莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項１０】
上記莢膜多糖類が336莢膜多糖類およびPS-1莢膜多糖類を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１記載のワクチンを投与することを含む、細菌感染の処置方法。
【請求項１２】
少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質からなる複合糖質免疫原を含むワクチンの製造方法であって、
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、ここで、該莢膜多糖類は該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、および、
(B) 治療上有効量の前記複合糖質免疫原を、該免疫原用の製薬的に許容しうる担体とともに製剤化すること、
を含む、前記方法。
【請求項１３】
担体タンパク質に対する莢膜多糖類のコンジュゲーション効率を向上させるための方法であって、(i) 莢膜多糖類および担体タンパク質のコンジュゲーション効率の向上に寄与するために有効な量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、および(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質にコンジュゲートすることを含む、前記方法。
【請求項１４】
上記莢膜多糖類が、莢膜多糖類と担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記莢膜多糖類が、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ワクチンの免疫原性を向上させるための方法であって、(i) ワクチンの免疫原性の向上に寄与する量のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類を選択すること、(ii) 該莢膜多糖類を担体タンパク質とコンジュゲートして、複合糖質免疫原を形成させること、および(iii) 該複合糖質免疫原および製薬的に許容しうる担体を含むワクチンを調製することを含む、前記方法。
【請求項１７】
上記莢膜多糖類が、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下のものを含むワクチン:
(A) 少なくとも1種の莢膜多糖類および担体タンパク質を含む治療上有効量の複合糖質免疫原であって、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類と担体タンパク質のコンジュゲーション効率を、約2%のペプチドグリカンを含む莢膜多糖類と比較して少なくとも約20%増加させるために有効な量のペプチドグリカンを含む、前記複合糖質免疫原および、
(B) 該免疫原用の製薬的に許容しうる担体。
【請求項１９】
請求項１３記載の方法により取得可能な、担体タンパク質にコンジュゲートされた莢膜多糖類を含むコンジュゲート。
【請求項２０】
上記莢膜多糖類が、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、請求項１９記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
以下のものを含む組成物:
(A) (i)少なくとも1種の莢膜多糖類および(ii)担体タンパク質を含むコンジュゲートであって、該莢膜多糖類は、該莢膜多糖類の重量に基づいて少なくとも約5% (w/w)のペプチドグリカンを含む、前記コンジュゲートおよび、
(B) 免疫原用の製薬的に許容しうる担体。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月15日(2007.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
所定のCPS調製物のコンジュゲーション効率は、当技術分野において公知の方法によって決定してよく、それには、以下に記載の、実施例で例証される方法が含まれる。本明細書中で使用されるコンジュゲーション効率は、以下で例証されるように、CPSのチオレーション効率を測定することによって決定することができる。精製8型莢膜多糖類をアミノ酸分析によってペプチドグリカン濃度に関して分析した後、担体タンパク質とコンジュゲートする。エルマンアッセイを使用して、還元型の誘導体化多糖類に関するチオレーションの割合を決定する。これにより、黄色ブドウ球菌(S. aureus)の8型莢膜多糖類のペプチドグリカン含量とチオレーションの間の相関が示される。ゆえに、本明細書中で提供されるPGの「最小有効量」の定義には、CPSのチオレーションを向上させるために十分なPGの量が含まれる。例えば、該複合糖質免疫原は、CPSのチオレーション効率を、約2%のPGを含むCPSと比較して少なくとも約20%増加(すなわち比較上のCPSの1.20倍のチオレーション効率)させるために有効な量のPGを含むCPSを含んでよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
約5%のPGを含むCPSは、約2%のPGを含むCPSの少なくとも約1.20倍のチオレーション効率を有する。ゆえに、約5%のPGを含むCPSは、2%のPGを含むCPSと比較してコンジュゲーション効率の25%増加を示す。
【国際調査報告】
2008523142.tif 000004
2008523142.tif 000005
2008523142.tif 000006
2008523142.tif 000007