(57)【要約】接着性コラーゲン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲルのみを、滑膜組織で補填したもの又は支持マトリクスと共に損傷部位に導入することによって半月板の修復及び再生を誘導することを備える半月板損傷の生体内修復方法。
2008521502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
半月板の損傷、障害、破裂又は裂傷部位に接着性コラーゲン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲル複合体を導入することによる生体内での半月板の損傷、障害、破裂又は裂傷を修復する方法。
【請求項２】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体が、Ｉ型コラーゲンを含む微小線維又は滑膜組織との混合物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体が、更に増殖因子、自然凝血塊又は線維芽細胞で補われていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体を単独で又は支持マトリクスと共に損傷部位へ導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記支持マトリクスが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン又はグリコプロテインを含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、生物活性ペプチド性増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、ポリ酸、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル又はこれらのコポリマー、或いはこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記支持マトリクスがコラーゲンハニカム、コラーゲンスポンジ又はコラーゲン足場であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記支持マトリクスがコラーゲンハニカムであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記支持マトリクスがコラーゲン足場であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記支持マトリクスがコラーゲンスポンジであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記コラーゲンが誘導体化されているか、又は誘導化されていないことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記誘導体化コラーゲンがアルキル化されていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導体化コラーゲンがメチル化されていることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールが誘導体化されているか又は誘導体化されていないことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールが誘導体化されていないことを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールがコハク酸イミジルエステル、チオール、コラーゲン又はメチル化コラーゲンで誘導体化されていることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体中のコラーゲンがメチル化コラーゲンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体を、患者の細胞又は患者の凝血塊との混合物として、半月板の損傷、障害又は裂傷部位に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体を、縫合と組み合わせて半月板の損傷、障害又は裂傷部位に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体を、滑膜組織と共に半月板の損傷、障害又は裂傷部位に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２０】
支持マトリクスに添合した前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを、縫合と組み合わせて半月板の損傷、障害又は裂傷部位に導入することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
半月板の損傷、破裂、変形又は裂傷を生体内で治療又は修復する方法であって、該方法が以下のステップ：
ａ）半月板損傷の大きさ及び範囲を測定し、
ｂ）半月板損傷の大きさ及び範囲に応じて治療法を選択し、
ｃ）接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを調製し、
ｄ）前記コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、若しくは滑膜組織で補ったコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、又は支持マトリクスと共にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、又はこれら両方を、関節鏡視下手術中に半月板損傷部位に沈着させ、
ｅ）患者に通常の生理活動をさせること
を備えることを特徴とする半月板の損傷、破裂、変形又は裂傷を生体内で治療又は修復する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、半月板損傷の生体内(in situ)での修復方法に関する。特に、本発明は、接着性コラーゲン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲルを損傷部位に導入することにより生体内で半月板再生を誘導することを備える半月板損傷を修復するための低侵襲的方法に関する。コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、半月板の裂傷領域を治癒に必要な期間強固に結合し、該裂傷区画において細胞移動及び細胞外マトリクスの形成を促進する。
【背景技術】
【０００２】
半月板損傷の修復は、今日の整形外科手術において利用されている最も一般的な術式の一つである（非特許文献１）。
【０００３】
半月板の裂傷は、変形性関節疾患に苦しむ年輩の人々と同様に、通常スポーツに関連した活動の結果として若者にもよく起きる。半月板は、荷重の移動、衝撃の吸収及び膝関節の安定性において重要な役割を果たす。半月板が損傷すると、大腿骨及び脛骨表面上の関節軟骨に疼痛、障害及び損傷を生じ、退行性変化及び変形性関節炎が発現する。
【０００４】
半月板損傷の初期治療は、通常部分的又は全体的半月板切除からなる。この方法は、接合接触領域の減少、結果として接触応力の増大により、しばしば軟骨の変性を加速させる。半月板を１５−３４％除去しただけで接触応力を３５０％増加させ得る（非特許文献２）。従って、半月板組織を保存し且つうまく損傷を修復することは、現行の半月板損傷のための治療方法の大部分が目標としている。
【０００５】
これまでのところ、半月板移植は、半月板裂傷のような損傷が深刻で複雑な患者に利用できる治療法の選択肢の一つである。新鮮な凍結半月板の同種移植片は、実験モデルにおいて移植部位周辺にうまく接着し治癒することが示されている。また、研究は同種移植片が移植受容者の細胞と共に増殖している証拠を示している。臨床研究は、半月板移植をした７１％が手術後８ヶ月で完全に治癒することを示している。これらの肯定的な結果にもかかわらず、同種移植片組織の可用性、組織拒絶反応、疾病の伝染及び長期データがないことにより、この方法の使用は限定されている。
【０００６】
自発的であっても外科的修復後であっても、半月板が治癒する能力は、裂傷の限定された血管供給への接近、裂傷の大きさ及び複雑さ、また併発した靱帯不安定の存在により影響を受ける。半月板の周囲１０−２５％、所謂血管が最も密集しているレッドゾーンに位置する損傷はうまく修復する可能性が最も高い。半月板の残りの血管がない領域、所謂ホワイトゾーンにおける損傷は、修復及び治癒の能力が、仮にあったとしても大きく限定されることが示されている。
【０００７】
フィブリル塊が形成して治癒するプロセスの重要性を認めて、ある研究者は自家凝血塊を使用して血管の無い部位の半月板損傷の修復を高める。直径２ｍｍの不変の欠陥部を新鮮な凝血塊で満たしたイヌ科のモデルを用いると、線維性の修復組織が欠陥部位を満たすのが観察された。かかる凝血塊は、血小板由来増殖因子及びフィブロネクチンのような走行性刺激及び増殖性刺激と同様に、細胞移動及び増殖用の足場をもたらしていると考えられている。  しかしながら、これらの研究において、修復組織の組織学的所見は正常な半月板と特に著しく異なっていた。更に、凝血塊へ移動する細胞は、相当量の細胞外マトリクスを合成していないように見えた（非特許文献４）。結果として、報告された自家凝血塊を用いて実行した臨床結果はあまり肯定的な結果ではなかった。
【０００８】
再生による取り組みを実現するため、修復が不可能な場合、近年の研究の多くが、半月板の損傷部位を元に戻すための吸収性多孔質コラーゲン足場の開発に向けられている。これらの足場は、自然細胞による移動及び増殖のための基質を提供する。例えば、発明者らによる特許文献１〜５を見ること。これら全てをここに引用して援用する。
【０００９】
イヌの半月板の部分切除モデル及び適切な形態のコラーゲンの移植片を用いることにより、ストーン及びその共同研究者等は、移植した６３％が１２ヶ月で十分に半月板再生の兆しを示すことを実証した（非特許文献３）。これらの研究において、修復した組織は組織学的には正常なイヌの半月板に類似したものであった。この取り組み関する限られた臨床結果は、部分的又は全体的な半月板切除受けなければならなかったであろう重篤な半月板損傷を負った患者に半月板様組織の再生が可能であることを示す。
【００１０】
引用した上記特許出願に記載されている研究は、フィブリン塊又はその他の適当な足場材料の使用により、細胞の集積、増殖及び組織内成長を通じて、線維軟骨の代替物が形成可能であることを示している。こうした再生治療への取り組みは、関節機能の回復と同時に、軟骨退化を予防する可能性のある半月板切除に対する適切な検証を提供する。血管のない領域での多くの半月板裂傷は当初は小さく、患者に軽い不快感を生じさせ、その結果として半月板の機能的完全性を維持する迅速で確実な関節鏡による修復技術を欠いているため、半月板裂傷の非常に多くが治療されないままである。やがて、これら半月板裂傷のサイズが大きくなり、重大な軟骨損傷並びに関節の疼痛及び可動性欠如を生じる。
【００１１】
上記の問題を克服するため、本発明は、生体内で半月板裂傷を修復するため、関節鏡による方法を利用して半月板損傷部位に接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、好ましくは関節内線維芽細胞の源又は半月板裂傷の修復を導く支持マトリクスで補われたヒドロゲルを導入する低侵襲的方法を提供する。従って、本発明は、半月板の部分切除の代替の保存療法を提供する。
【００１２】
ここに引用した全ての特許文献、特許出願及び非特許文献をここに援用する。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第１０／６２６，４５９号願書
【特許文献２】米国特許第１０／１０４，６７７号願書
【特許文献３】米国特許第１０／６２５，８２２号願書
【特許文献４】米国特許第１０／６２５，２４５号願書
【特許文献５】米国特許第１０／８８２，５８１号願書
【非特許文献１】コスキ  ＪＡ、イバラ  Ｃ、ロデオ  ＳＡ、ウォレント  ＲＦ著、半月板損傷と修復−臨床状態、ティシューエンジニアリングオルトペディクスサージェリー（Tissue Engr. Orthop. Surg.）、第３１巻３号、２０００年、ｐ．４１９−４３５
【非特許文献２】シードン  Ｂ、ハーグリーブス  Ｄ著、半月板の役割に特に関連した膝関節における荷重の伝達、ＩＩ．実験結果、考察、及び結論、実験医学（Engineering in Med.）、第８巻、１９７９年、ｐ．２２０
【非特許文献３】ストーン  ＫＲ、ロッドキー  ＷＧ、ウェッバー  ＲＪ著、コポリマー性コラーゲンスキャホールドによる半月板の再生、臨床的、組織学的、及び生化学的に評価したインビボ及びインビトロの研究、アメリカンジャーナルオブスポーツメディシン、第２０巻、１９９２年、ｐ．１０４〜１１１
【非特許文献４】アメリカンジャーナルオブスポーツメディシン、第１７巻、１９８９年、ｐ.393-400
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様は、生体内で半月板の損傷、障害及び裂傷を修復するための低侵襲的方法に関する。
【００１５】
本発明の他の態様は、半月板の損傷、障害又は裂傷の修復を促進する接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみ、或いは関節内線維芽細胞の源又は支持マトリクスとの混合した接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを導入するための関節鏡による方法を用いた生体内での半月板損傷の修復方法に関する。
【００１６】
また、本発明の他の態様は、生体内での半月板及び半月板組織を修復及び再生するための好ましい手段として強力な接着性を有するコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを用いた方法に関する。
【００１７】
本発明のまた更に他の態様は、損傷した半月板組織における線維ネットワークの修復するための方法に関し、かかる修復は、ヒドロゲルの重合前にコラーゲン微小線維を加えることによって機能強化した接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルによって達成される。
【００１８】
本発明の更に他の態様は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの重合速度を制御する方法であり、該ヒドロゲルの重合速度はコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのｐＨを変えることによって制御される。
【００１９】
本発明の他の態様は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共にコラーゲン微小線維を利用した生体内での半月板組織の修復方法に関し、この場合前記ヒドロゲルがコラーゲン微小線維と半月板の線維性コラーゲンネットワークの切断端との架橋を促進し、一方前記コラーゲン微小線維がコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルとの化学結合によって該ヒドロゲルの接着作用を増強する。
【００２０】
本発明の更に他の態様は、生体内で半月板組織を修復し、大きな半月板裂傷を治療する方法に関し、この場合前記修復及び治療が、内部に存在するコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル又はその他のヒドロゲルと共に又は無しに、支持マトリクスを加えることによって増強され、また前記支持マトリクスを障害部位や裂傷に接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共に固定して、支持マトリクス中にコラーゲン微小線維を増殖させ、Ｉ型コラーゲン及びＳ−ＧＡＧを、健全な半月板組織において観察されるこれら化合物のレベルに相当するレベルで産生及び集積させる。
【００２１】
本発明の更に他の態様は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを生体内で半月板細胞の分化を促進する患者自身のリューロポテント細胞（pleuropotent cell）に追加することによって生体内で半月板組織を修復する方法に関し、該方法は、関節鏡視下手術中に外科医が任意に患者の滑膜組織及び／又は他の線維芽細胞の源を除去し、そこから懸濁液を調製し、該懸濁液をコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを混合してからヒドロゲル含有混合物を半月板障害又は半月板裂傷に投与する任意のステップを備える。
【００２２】
本発明の他の態様は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと混合した患者自身の血液による凝血塊を利用することにより半月板組織を修復する方法に関し、前記凝血塊が細胞外マトリクス産生を刺激する自家増殖因子を提供する。
【００２３】
本発明のまた更なる態様は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを滑膜組織、線維芽細胞及び患者の血餅から得た自家増殖因子の懸濁液と混合することによって、半月板の障害又は裂傷を修復する方法に関する。
【００２４】
（定義）
ここで用いる“コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル”、“接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル”又は“ヒドロゲル”は、コラーゲン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は例えばコハク酸イミジルエステルとチオールで誘導された４−アームドポリエチレングリコール誘導体のようなヒドロゲルポリマー、更にメチル化コラーゲン（米国特許第 ６，３１２，７２５号、２００１年１１月）又はコラーゲンと好ましくは架橋するアルブミンのようなタンパク質を含む、本定義の範囲内に含まれる如何なる化合物を意味する。本発明のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、通常組織、特にコラーゲン含有組織と接触すると速やかにゲル化及び／又は結合する。
【００２５】
“支持マトリクス”は、半月板の裂傷又は障害に導入するのに適し、細胞の増殖及び３次元的な伝播用の構造的支持を提供する生物学的に許容され且つ生分解性である材料を意味する。支持マトリクスは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン又はグリコプロテインを含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、生物活性ペプチド性増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸又はポリアミノ酸のようなポリ酸から製造される合成重合繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル、これらのコポリマー及びこれらの組み合わせのような材料から調製する。ゲル溶液マトリクスは重合性の熱可逆性ゲル化ヒドロゲルでもよい。支持マトリクスは、生体適合性で、生分解性で、親水性で、非反応性で、電気的に中性で、また明確な構造を有することが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、半月板の障害、裂傷又は他の損傷を、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみ、又はコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと他の再生を促進する成分、薬剤、添加剤もしくは促進剤との組み合わせを含む接着剤組成物で治療する際に、半月板裂傷を高侵襲的な外科的処置なしに有利に治癒できるという知見に基づく。
【００２７】
従って、本発明は、生体内において半月板の障害、裂傷及び損傷を修復する方法に関する。本発明は、従来使用されていた市販の組織封止剤及び接着剤に較べて優れた接着特性を有する強力な接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを生体内で損傷部位に直接導入することにより半月板再生を誘導することを備える低侵襲的方法を利用する。本発明のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、治癒に十分必要な期間半月板の裂傷領域に強力に結合する。増殖ホルモン、自家凝血塊、コラーゲン微小線維などのような他の薬剤、添加剤又は促進剤で補った場合、このような補填ヒドロゲルも裂傷領域において細胞移動及び細胞外マトリクスの形成を促進する。一方、これら薬剤、促進剤及び添加剤のいくつかもまたコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの接着性を増強する。
【００２８】
更に具体的には、本発明は、半月板障害、裂傷及び損傷の生体内治療に適した接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル混合物の同定並びに半月板の修復及び半月板機能の回復を助ける付加的な成分の同定に関する。
【００２９】
（Ｉ．半月板）
半月板は二形性の組織である。これは２つの別々の異なった組織、いわゆるレッドゾーン組織といわゆるホワイトゾーン組織からなる。
【００３０】
血管の血液供給に最も近接した半月板周縁に位置するレッドゾーンは、形態学的に線維芽細胞様である細胞を主に含む。更に、レッドゾーンはホワイトゾーンよりも細胞外マトリクス塊の量がずっと少ない。血液供給の近接により、半月板のレッドゾーンにおける障害、裂傷及び損傷はホワイトゾーンで生じたものよりもずっと早く治癒する。レッドゾーンの障害又は裂傷を切除して縫合することにより、レッドゾーンのコラーゲン線維ネットワークの回復を含むレッドゾーンの半月板機能を通常十分に回復することができる。
【００３１】
他方、半月板のホワイトゾーンの損傷は、これまでのところほぼ治療不可能である。ホワイトゾーンそれ自体には血液供給が無く、また血液供給の近接に位置していない。ホワイトゾーンは、通常関節軟骨で観察される軟骨細胞様の細胞を含む。しかしながら、ホワイトゾーンでの細胞に対する細胞外マトリクスの割合は、関節軟骨で見られる細胞外マトリクスの１０倍である。また、軟骨関節には血液供給が全く無く、軟骨関節の損傷は非常に治療が難しく、もし完治したとしても、その結果生じる軟骨は、健全なヒアリン軟骨よりもむしろ線維軟骨と呼ばれる性質の劣った軟骨であることはよく知られている。この点で半月板のホワイトゾーンは関節軟骨と共通点がある。
【００３２】
（ＩＩ．半月板損傷とその治療）  
半月板の損傷、特にホワイトゾーンでの半月板の損傷は、患者の生活様式を著しく損なう。半月板の損傷は、隣接した膝関節に対し膝関節機能を変化させ、疼痛と永続的な損傷を生じうる。上記のように、半月板のホワイトゾーン内部に元々血管がないため、非常に多くの半月板の障害及び裂傷が自然治癒せず、また手術後にさえ治癒しない。治療せずに放置すれば、これら障害及び裂傷は軟骨損傷及び膝機能を悪化させるより大きな障害へと広がり得る。
【００３３】
これまでのところ、一般に損傷した半月板を治療するために、部分的又は全体的な半月板切除が行われている。しかしながら、半月板を除去すると、関節の安定性が減少し、関節軟骨表面をより高い接触応力に露出させる。従って、本発明につながった研究の目的は、生体内でのユニークな低侵襲的治療法を開発することにあり、該方法は、損傷部位に高接着性のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみ又は他の薬剤、促進剤又は添加剤との組み合わせを導入することによる半月板組織の再生を誘導することからなる。このような高接着性のヒドロゲルは半月板障害又は裂傷の隙間を充填し、また共に保持することによって、半月板及び隣接する関節軟骨に対する更なる障害を防ぐ。また、半月板裂傷の迅速な修復手段を提供し、膝関節面の変性を最小化する。
【００３４】
本発明の方法は、レッドゾーンの線維ネットワークの回復を誘導し、支持することにより再生プロセスを助長する。また一方で、本発明の方法は、半月板障害又は裂傷が通常治癒せず、もし確かに治癒しても、半月板の耐久性及び機能が例証する裂傷又は障害に対する保護抵抗を付与する線維コラーゲンネットワークを通常回復しないところの血管のないホワイトゾーンの損傷の治療に特に有用である。従って、ホワイトゾーンの障害及び裂傷は、治癒するために、損傷表面のより近くを縫合することが必要になる。
【００３５】
レッドゾーンと特にホワイトゾーンの半月板障害と裂傷の両方を、半月板損傷部位にコラーゲン及びＰＥＧポリマーヒドロゲル複合体を含む高接着性の材料を導入することによって修復できることが見出されている。レッドゾーン及びホワイトゾーンにおける障害及び裂傷の再生及び治癒のプロセスは、かかるプロセスを促進し助長する他の成分の添加により更に増強することができる。
【００３６】
（ＩＩＩ．コラーゲンポリエチレングリコールヒドロゲル複合体）
本発明の高接着性のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体は、少なくともコラーゲン又はコラーゲン誘導体と、ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール誘導体との混合物からなる。線維芽細胞、滑膜組織、凝血塊又は治療促進剤のような他の成分をかかる複合体に加えてもよい。更に、他のタイプのヒドロゲル、すなわち支持マトリクスを通常形成する構造体ヒドロゲル、例えばコラーゲンハニカム、コラーゲンスポンジ又はコラーゲン足場を、高接着性のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共に使用しても良い。
【００３７】
例えばメチル化コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのような高接着性コラーゲンヒドロゲルは、半月板の損傷、障害又は裂傷に沈着させると、裂傷又は障害を充填し、半月板組織に結合し、治療期間中共に半月板組織の裂傷領域を保持する。更に、損傷領域において細胞の移動及び細胞外マトリクスの形成を可能にするか、又は誘導する。
【００３８】
長期間の結合については、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体、特にコラーゲンがメチル化コラーゲンである場合に、ＰＥＧ、コラーゲン又は繊維素系接着剤よりも接着性がずっと強力になり、エポキシ樹脂又はグルタルアルデヒド架橋材料等を備える接着剤よりも生体適合性がずっと高くなる。
【００３９】
（Ａ．コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの比較評価）
コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの機械的接着性能を評価するために、前記ヒドロゲルを市販の２つの接着剤、すなわちティシール（登録商標）（フィブリン封止剤）及びコシール（登録商標）（ＰＥＧ封止剤）と比較した。
【００４０】
膝のせん断試験方法を実施例１に記載する。膝のせん断測定に使用した装置を図７Ａ及び７Ｂに示す。試験結果を図８に示す。
【００４１】
図８から分かるように、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの膝せん断強度はＰＥＧ封止剤及びｆフィブリン（fFibrin）封止剤よりも静的に強い（ｐ＜０．０５）。コラーゲン−ＰＥＧはフィブリン封止剤よりも９倍以上強く（ｐ＜０．０５）、またＰＥＧ封止剤よりも３倍以上強かった（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
膝のせん断試験の結果は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの接着性がフィブリン又はＰＥＧのみのような従来の市販の手術用組織接着剤よりも著しく強いことを明確に示している。また、これらの研究は、フィブリン封止剤が細胞移動への能力に乏しく、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが細胞移動に有利で、またこれを支持することを示している。この結果は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの使用が、細胞の移動だけでなく非常に強力な組織の接着を必要とする損傷した組織の修復のために有益であることを示している。
【００４３】
コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、コラーゲン、コラーゲン化合物又はアルキル化、例えばメチル化コラーゲンのようなコラーゲン誘導体と、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール誘導体のようなヒドロゲルポリマーとを備える複雑な混合物である。これらコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは生物学的に許容され、完全に生物分解される。体内において、これらはゆっくりと且つ安全に生物分解される。それ故、有害な結果を生じることなく、また除去する必要なしに、数週間から数ヶ月間損傷部位に放置できる。細胞の移動及び細胞外マトリクスの形成を誘導することに関しては、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、自家半月板細胞を囲む細胞移動に適した環境をもたらすＩ型コラーゲンのネットワークを含む。
【００４４】
（Ｂ．接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル）
接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、接着性及び／又は膠状の性質を有し、生物学的に許容され速やかにゲル化する合成化合物複合体である。かかる複合体の最も代表的なものは、コラーゲン化合物、通常アルキル化コラーゲンと架橋している非誘導体化又は誘導体化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合体である。望ましいヒドロゲルの例は、テトラヒドロコハク酸イミジルもしくはテトラチオールで誘導体化されたＰＥＧヒドロゲル又はこれらの混合物で、コヒージョンテクノロジー社、ポロアルト、カルフォルニアから市販されている商標名コシール（COSEAL）（ジャーナルオブバイオメディカルマテリアルリサーチ、アプリケーション、バイオマテリアル、第５８巻、２００１年、ｐ．５４５−５５５に記載されている）、或いはここに引用して援用した米国特許第 ６，３１２，７２５Ｂｌ号に記載されいるような速やかにマトリクスを形成する二液ポリマー組成物で、これら化合物の少なくとも一つが例えばポリアミノ酸、ポリサッカライド、ポリアルキレンオキシド又はポリエチレングリコールのようなポリマーであり、第２の化合物がコラーゲンもしくはコラーゲン誘導体で、２つの部分が共有結合によって架橋されているである。最も好ましいものは、メチル化コラーゲンで架橋したポリエチレングリコールヒドロゲルのようなアルキル化コラーゲンで架橋したＰＥＧである。また、該合成化合物は、例えばアルブミンのようなタンパク質で誘導体化したポリエチレングリコールとすることができる。本発明のヒドロゲルは、通常半月板組織との接触により速やかに且つ強力にゲル化及び／又は結合する。
【００４５】
従って、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、コラーゲン、コラーゲン化合物又はコラーゲン誘導体と、ポリエチレングリコールヒドロゲルポリマーとを含む複合体の混合物である。ＰＥＧは、コハク酸イミジルエステル及びチオールで誘導体化した４−アームドポリエチレングリコールでもよく、これは２００１年１１月６日発行の米国特許第６，３１２，７２５Ｂｌ号に記載されており、ここに引用して援用する。
【００４６】
本発明は強力な接着性を有する全てのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの使用を含むことを意図している。
【００４７】
（Ｃ．他の薬剤、添加剤及び促進剤）
加えて、半月板組織の線維ネットワークを回復する本発明の能力は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルに、自家であろうと自家でなかろうと、また生体起源であるか合成起源であるかにかかわらず、他の薬剤、添加剤及び促進剤を混合することによって増強できる。例えば、I型コラーゲンを含む自家コラーゲン微小線維は、その重合前にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体に添加することができる。
【００４８】
コラーゲン微小線維は、例えば電気紡績法のような当業者に既知の様々な方法により作ることが可能である。微小線維をコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体に加える場合、該複合体はコラーゲン微小線維と半月板の繊維状コラーゲンネットワークの切断端との架橋を促進する。更にこのプロセスはコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの治療上の機能を増進し、その結果、半月板の損傷をより速やかに修復し、半月板の機能を完全に回復させる。更に、コラーゲン微小線維を加えると、その化学結合により、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの接着機能が増進する。
【００４９】
更に、速やかな治癒を促すために、全ての望ましい促進物、増殖因子、ＰＤＧＦ及び通常の血液成分のような内生的に存在する化合物を接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルに加えることができる。
【００５０】
半月板は比較的細胞充実度が低く、また高度に組織化された構造を有するため、損傷部位の速やかな治癒及び効果的なリモデリングを実現するために、追加の細胞及び／又は適切な支持マトリクスを有利に加えることができる。
【００５１】
コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル単独、又は他の薬剤、添加剤又は促進剤で増強されたコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体の何れかを、損傷が生じた後に関節鏡によって容易に適用する。組織内の限られた細胞集団を維持し、関節軟骨表面を保護するために半月板組織を除去する必要がない。両方法においてコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルによって生み出される強力な化学結合は、患者のリハビリテーションを早め、また通常の活動への早期の復帰を可能にする。
【００５２】
また更に、半月板細胞に分化しそうな患者自身のリューロポテント細胞（pleuropotent cell）を生体内で接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体に追加することによって、半月板細胞の再生を達成することができる。例えば、関節鏡視下手術中、外科医は滑膜組織又は線維芽細胞の他の源を除去し、これをすりつぶしもしくは均質化し、ヒドロゲル複合体と混合することができる。また、例えば、患者自身の血液による凝血塊を使用し、これと接着性コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと混合することによって、細胞外マトリクスの生産を刺激する自家増殖因子が提供できる。
【００５３】
更に、ヒドロゲル複合体の重合速度は、生理学的に適合した弱酸又は塩基を加えて緩衝液のｐＨを制御することにより操作できる。
【００５４】
（Ｄ．支持マトリクス）
真の半月板組織の回復を実現する能力及びより大きなすき間を治癒する能力は、支持マトリクスを障害又は裂傷のすき間に据え付けることによって強化できる。支持マトリクスは、例えば、マトリクスの据え付け前に支持マトリクス内部に存在又は吸収されたコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル又はその他のヒドロゲルの有無にかかわらずコラーゲンハニカム、コラーゲン足場、又はコラーゲンスポンジのような多孔質のＩ型コラーゲンとすることができる。かかる支持マトリクスは、障害又は開裂の大きさに近付け、選択したヒドロゲル複合体と共に裂傷又は障害部位に沈着させる。これらの治療条件において、Ｉ型コラーゲン及びＳ−グリサミノグリカンの集積並びに原線維の増殖が、構成物の至る所に生じているのが見出された。
【００５５】
支持マトリクスは、半月板損傷を治癒するための構造的な支持を提供する生物学的に適合し且つ生分解可能な如何なる材料でもよい。かかる支持マトリクスは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ゼラチン、アガロース、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン又はグリコプロテインを含む細胞収縮コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、生物活性ペプチド性増殖因子、サイトカイン、エラスチン、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸もしくはポリアミノ酸のようなポリ酸からなる合成ポリマー繊維、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリペプチドゲル又はこれらのコポリマー又はこれらの組み合わせのような材料から調製する。ゲル溶液マトリクスは重合性で熱可逆的なゲル化ヒドロゲルでもよい。
【００５６】
かかる支持マトリクスは生体適合性で、生分解性で、親水性で、非反応性であり、中性電荷を有し、明確な形態を有していることが好ましい。
【００５７】
（ＩＶ．半月板損傷の治療及び修復方法）
本発明の方法は、半月板損傷を治療及び修復することを対象にしている。
【００５８】
実際には、外科医が半月板の裂傷又は障害の大きさ及び損傷の程度を決定する。裂傷又は障害の大きさに応じて、外科医は損傷をコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル複合体を用いて治療するか、又はコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共に支持マトリクスを沈着させることが必要であるかを判断する。
【００５９】
両方の場合とも、裂傷又は障害部位にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみを、或いはこれに任意にコラーゲン微小線維、滑膜繊維分散液、増殖因子、増殖メディエーター、血液成分もしくは他の促進剤を補って沈着させる。サイズがより小さい損傷には、通常、裂傷又は障害部位にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみを沈着させる。より大きい又は複雑な損傷、裂傷又は障害には、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共に支持マトリクスを沈着させる。コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、支持マトリクスを沈着させた後に沈着させてもよく、又は裂傷又は障害部位に移植する前に支持マトリクスに導入してもよい。
【００６０】
両方の場合とも、裂傷又は障害部位が生体内で関節鏡視下手術中にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで満たされる。一般に、液体のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは組織との接触によりゲル化し、すき間を完全に充填し、またそれ自体が裂傷又は障害部位を囲む半月板内壁に結合する。従って、裂傷又は障害部位が塞がるか治癒するまで、通常数週間から数ヶ月の間そのまま留まる。裂傷又は障害部位が充填されるので、裂傷又は障害部位の２つの側面の摩擦が無くなり、裂傷又は障害部位の更なる悪化、拡大がなくなり、また付随して起きる近傍の関節軟骨の悪化も生じない。
【００６１】
この種の治療のため、外科医は、液体のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが裂傷又は障害部位に沈着している間に、簡単な関節鏡検査を実行する。その後、外科医は切開部を閉じ、患者に手術後数日以内に歩行又は運動等の普通の活動の再開について指示する。歩行は、治癒しつつある半月板組織に間欠静水圧を作用させるので、半月板の治癒に極めて重要である。かかる静水圧は、関節接合部において新しいヒアリン軟骨の発達を支持することが示され、このことは発明者らによって米国特許出願第 １０／６２６，４５９号、第１０／６２５，８２２号、第１０／６２５，２４５号、第１０／８８２，５８１号、及び第１０／１０４，６７７号、２００５年９月２７日発行の米国特許第６，９４９，２５２号中に記載されており、これら全てをここに引用して援用する。
【００６２】
裂傷又は障害部位がより大きい場合、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと共に支持マトリクスを沈着させることからなる第２のアプローチが推奨される。このアプローチにおいては、最も効果的な治療への臨床的判断に応じて、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを添合することなく支持マトリクスをまず沈着させてからコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを沈着させるか、或いは手術前に支持マトリクスにコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを添合してから完全な構造にして、裂傷又は障害部位に沈着させる。
【００６３】
半月板裂傷を修復するための本発明の方法は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみ、又はこれと支持マトリクスの複合体の関節鏡による沈着には、ヒドロゲルを正確に沈着させるために小切開のみが必要であるという点で、ほんの少し侵襲的である。
【００６４】
手術後、沈着させたヒドロゲルに間欠静水圧を作用させるために、患者はできるだけ早く歩き始めるように勧められる。このことは細胞を活性化し、周囲の半月板組織から裂傷内に沈着したヒドロゲルへの細胞の移動につながる。実験的な検討の節に記載したように、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの接着及び細胞の移動がコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのブタ半月板裂傷への沈着により存在することが示され、この場合ヒドロゲルの半月板裂傷部位の壁への接着及び細胞移動の両方が観察される。
【００６５】
本発明の方法は実用的であり、侵襲が非常に少なく、安全であり且つ患者にほとんど痛みを生じない。
【実施例】
【００６６】
（Ｖ．実験的な検討）
実験的な検討を半月板裂傷治療のための最適条件を決定するために実行した。
【００６７】
この研究の第一の具体的目的は、強力な接着性を有するコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを使用して半月板の無血管帯の裂傷を修復することの有効性を判定することにある。促進剤による活性化に続いて、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが自家コラーゲンと架橋して、損傷部位に強力な化学結合を生み出す。このコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル材料は、やがてリモデリングし、配向性の線維軟骨性組織と置き換わる。
【００６８】
最初の研究において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−（Ｉ型）コラーゲンのコポリマーからなるコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを半月板の修復に関して評価した。フィブリン接着剤と異なり、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルコポリマーは、生体内において相当な接着強度を急速に増強できる。コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルと自家コラーゲンとの間の架橋反応を開始させ、その界面に強力な化学結合を提供する。これまでのところ、このタイプのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、発明者らによって、膝関節の荷重負荷領域における組織構築軟骨の構造を固定するために利用されている。これらの興味深い負荷条件において、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルは、適切な位置でこの構造を首尾よく固定し、細胞移動及び組織内成長を可能にする。
【００６９】
ＰＥＧに基づくマトリクスは、組織封止剤、手術後の接着形成に対する障壁及び生物活性のある分子の局所送達用の賦形薬のような用途について予め記載されている。これらのマトリクスは、ある程度膨らみ、また弾力性が高く、引張り強度が低い傾向にあった。また、これらは急速に分解し、細胞接着と抗争する。
【００７０】
しかしながら、ここに開示するＰＥＧヒドロゲルとＩ型コラーゲンの組み合わせは、著しい引張り強度及びＰＥＧゲルのみよりも高い化学的安定性を有する特異的なゲルである。かかるコラーゲンは、より大きくより硬い支持マトリクス上に更なる架橋部位を提供し、その結果、水性環境下で強度を増加させ、膨らむのを減らし、且つ分解を遅らせる。更に、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル中にコラーゲンが存在することにより、細胞接着、移動及び増殖のために望ましいマトリクスをもたらす著しい生体適合性の材料を産出する。
【００７１】
（Ａ．器官培養研究）
発明者らは、器官培養研究において、半月板裂傷の治療に対するコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの有効性を評価した。
【００７２】
骨格が未成熟なブタの左膝を地元の食肉処理場から得、半月板の内側を無菌的に得た。器官培養におけるブタ半月板を図１に示す。図２に示すように、半月板のホワイトゾーンにそれぞれ長さ約５ｍｍの３つの裂傷（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）をつけた。
【００７３】
半月板の３つの異なる裂傷を修復するために、３つの異なる治療を用いた。
【００７４】
【表１】
2008521502.tif 000003
【００７５】
裂傷（Ａ）はコントロールとして用い、治療せず放置した。裂傷（Ｂ）は裂傷上を縫合治療した。縫合は図２に見られる。裂傷（Ｃ）は本発明のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルにより治療した。
【００７６】
治療後、半月板を１０％のウシ胎児血清及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンを有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｆ−１２）中で２週間培養した。培養期間の終わりに、組織学的評価をするため組織を回収した。サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。断面（厚さ１０μｍ）をヘマトキシリン及びエオシン及びサフラニン  Ｏで染色した。
【００７７】
組織学的結果を表２にまとめる。
【００７８】
【表２】
2008521502.tif 000004
【００７９】
表２から分かるように、裂傷（Ａ）は接着性及び細胞集積を示さない。同様なことが裂傷（Ｂ）で観察され、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル接着性及び細胞集積が無かった。しかしながら、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで処置した裂傷（Ｃ）においては、適切な場所で組織にヒドロゲルが接着し、裂傷にいくらかの細胞が集積しているのが見られた。
【００８０】
サフラニン  Ｏで染色した裂傷（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の代表的な断面を図３−５に示す。
【００８１】
培養２週間後、図３Ａ（倍率４×）及び３Ｂ（倍率１０×）に示す未処置コントロールの裂傷（Ａ）、並びに図４Ａ（倍率４×）及び４Ｂ（倍率１０×）に示す縫合した裂傷（Ｂ）には、有意な組織形成及び接着がなく、損傷の縁間に空き間を有することが観察された。これに対し、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで処置した図５Ａ（倍率４×）及び５Ｂ（倍率１０×）に示す裂傷（Ｃ）は裂傷部位に充填したヒドロゲルとの界面で緊密な接触を示し、ヒドロゲルの裂傷部位への接着を証明している。
【００８２】
更に、処置グループ（Ｂ）では、裂傷領域へのいくらかの細胞移動が起こった。このことは、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが半月板組織と結合し、半月板組織内部への細胞成長を支持しうることを示している。
【００８３】
（Ｂ．半月板の治癒）
去勢されたオスのシンクレアブタを、半月板治癒を検討するための研究に利用する。実験室内での検討は、内側半月板の前部領域（図６）が、本研究のために外科的に最も利用しやすいことを示している。この動物の半月板の無血管領域は、内側半月板の内縁から半月板本体の約3分の１にまで放射状に広がっている。
【００８４】
外科的手法により、内側半月板の左右両側の内縁から約２−３ｍｍの前部に、厚さ５ｍｍの縦長の傷を作った。この裂傷は、スポーツに関連した損傷においてよく生じる一般的な縦長のタイプの裂傷を擬態することを目的としている。裂傷が十分に大きいことにより、結果として半月板組織の反対側の縁の不安定性をもたらし、治癒プロセスをさらに興味深くする。
【００８５】
表３に記載した処置により、裂傷の修復を直ちに実行する。
【００８６】
【表３】
2008521502.tif 000005
【００８７】
本研究に必要な合計１３匹の動物からなる各処置グループに、５つの部位を無作為に割り当てた。未処置のコントロールグループＣ１において、裂傷に無菌食塩水を注ぎ、写真文書化し、更に診療せずに関節被膜及び表面薄膜を閉鎖する。縫合したコントロールグループＣ２は、長さに沿って均等に分布した幾つかの非再吸収性縫合糸によって修復した。この後所定の洗浄、写真文書化、及び外科創傷の閉鎖を行った。
【００８８】
コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを用いて実験グループ（Ａ）における半月板裂傷を修復する。かかる裂傷を鉗子で開き、接触面に約０．５ＣＣのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを塗布する。その後、促進剤を加えて架橋反応を活性化する。鉗子を取り除き、裂傷を放置し自然に閉ざした。接着剤を接着させるため５分間放置した後、裂傷の長さに沿って非吸収性の縫合糸を使用した。この部位を洗浄し、写真文書化し、閉鎖した。
【００８９】
グループ（Ｂ）における裂傷の修復では、関節内線維芽細胞の源を供給するすりつぶした滑膜組織を増補した。約０．５ＣＣの線維性結合組織を膝関節被膜から術中に回収し、無菌的にすりつぶした。その後、該組織及び０．５ＣＣのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを十分に混合した。裂傷を鉗子で開き、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル混合物をこの部位に施した。架橋促進剤を加えた後、鉗子を取り除き、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを５分間結合させた。その後、かかる裂傷に非吸収性の縫合糸を用いて縫合、閉鎖した。この部位を洗浄し、写真文書化し、また閉鎖した。
【００９０】
グループ（Ｃ）に関しては、放射状のコラーゲンマトリクス産生を導いて裂傷界面を強化するため、配向性のコラーゲンスポンジ支持マトリクスを裂傷中に置いた。コラーゲン支持マトリクスは、裂傷の方向に垂直に対向する管の長軸を有する、平行な微小管構造を有している。このタイプのコラーゲン支持マトリクスは、静水圧下で関節軟骨の形成を導くために、発明者等によって成功裡に使用されている。かかる支持マトリクス材料は、手術中に損傷範囲の大きさに合わせて切断する。支持マトリクスの幅は０．５ｍｍである。裂傷部位に挿入する前に、管をコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで被覆する。更に、支持マトリクスを所定の場所に置いてから、裂傷の縁に追加のコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを塗布する。架橋促進剤の添加に引き続いて、裂傷を開放しコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを５分間放置して結合させる。その後、裂傷を非吸収性縫合糸で縫合して閉鎖する。この部位を洗浄し、写真文書化し閉鎖する。
【００９１】
手術後の回復の後に、動物を作動する膝関節を固定せずに囲いの中で自由に動かさせる。動物の健康全般についての一般的な観察と共に、日ごとに硬さ、歩行困難性、又は不活発さを記録する。手術の２ヶ月後、治癒の証明のために、動物に麻酔し、半月板損傷を関節鏡によって検査する。裂傷部位を鈍器で穏やかに探り、裂傷の縁での組織の結合について検討する。また、内側半月板の大腿部表面及び反対側の大腿顆上の関節軟骨を、線維化又はその他の変性変化の兆候について視覚的に検査する。
【００９２】
手術の４ヶ月後、全ての動物を安楽死させ膝関節を回収する。その後、注意深く解体し、内側半月板を分離し、その肉眼的形態を文書化する。また、大腿顆中央及び脛骨平坦部中央表面の関節軟骨表面の接触部位の外観を検討し、文書化する。
【００９３】
裂傷部位の修復に対する治療効果を、組織学的評価によって査定する。裂傷部位から軸方向断面の切片を得、サフラニンＯに加えてヘマトキシン及びエオシンで染色し、裂傷中の修復組織の細胞充実度及び質を測定する。裂傷及びその周囲の領域の細胞表現形を特徴付ける。各裂傷の少なくとも３つの切片を、ホワットレーらによって報告された方法（ジャーナルオブアースロスコピックリペアーアンドサージェリー（Ｊ．Arthroscopic ReI. Sur.）、第１６（２）巻、２０００年、ｐ．１２７−１３６）から開発した等級付けの方法によって盲的に記録した（表４）。
【００９４】
【表４】
2008521502.tif 000006
【００９５】
等級付けの尺度は修復組織の質を示し、３は最も強く耐久性が高い損傷界面を提供することが予想される最上級の組織である。処置した標本及びコントロール標本間の統計比較を、分散分析を用いて行う。
【００９６】
本発明による半月板治療に使用したコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの関節鏡による評価は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが半月板の裂傷又は障害を修復するに十分な接着性を有することを示す。この観察は、図８から分かるように、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが現在使用されている組織封止剤よりも良好な接着性を有することを示す試験に加えて、コントロールに較べて受容者の組織でのより良好な統表面集積である上記結果によっても裏付けられる。滑膜組織又は細胞を含む他の薬剤、促進剤又は添加剤の添加は、生体内でのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルの接着性に影響を与えること又は変化させることはないが、特に半月板のより大きな障害、裂傷もしくは損傷をより速やかに治癒させるために役に立つ可能性がある。
【００９７】
同様な研究における半月板又は軟骨の治療の組織学的評価の結果は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが、炎症反応、細胞毒性を生じさせず、また生体内で半月板組織に他の有害作用を有さず、またコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルが十分に生体分解性であり、通常手術の約４ヶ月後に生体分解されることを示す。他方、治療又は縫合なしに放置された未治療のコントロールについて予め行われた組織学的評価は、線維軟骨の形成及び半月板の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の分解と同様に、半月板組織の退行性変化の存在を示す。
【００９８】
（ＶＩ．好ましい実施態様）
一つの好ましい実施態様は、損傷した半月板、すなわち損傷、障害、裂傷、又は破裂部位にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを投与することにより該半月板の障害、裂傷又は破裂を治療する方法である。
【００９９】
本発明の他の好ましい実施態様は、すりつぶした滑膜及び／又はコラーゲン足場で補ったコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを用いて半月板組織を治療することからなる方法である。この治療は、これらの補助剤が半月板組織中のより大きな空隙においてコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルに構造支持を加え、修復及び治療のリモデリングに役立つため、より大きい障害、裂傷又は破裂の修復に更に好適である。
【０１００】
本発明の他の実施態様においては、組織をすりつぶした滑膜で補ったコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療した場合、半月板組織の修復の質が改善される。この実施態様は、せん断応力、圧縮、静水圧、又は低酸素圧のような自然の機械的刺激が細胞移動及び細胞の表現形の変化に影響することを示すと同様、一般的に滑膜組織が前記細胞又は幹細胞及び半月板周囲の組織を含む可能性があるので、大きな損傷に対する好適な治療とすることができる。これら全ての刺激は、共にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療した損傷部位への細胞移動に寄与し、最終的にはこれを導き、更に半月板組織の修復及びその生体内での修復に役立つ。
【０１０１】
他の好ましい実施態様は、損傷した半月板組織を治療する方法であり、この場合前記半月板組織をコラーゲン足場又は他の支持マトリクスと共にコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療する。かかる実施態様は、損傷がより大きい場合に特に好ましく、この場合ヒドロゲル及び足場が、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルのみで治療した損傷組織よりも、よりよくまた速やかに未損傷の周囲の組織に集積される。このことは、自家の未損傷半月板内の主たるコラーゲンがＩ型コラーゲンだからである。自家半月板中でのＩ型コラーゲン線維の配向は水平である。足場材料もＩ型コラーゲンであり、また自家半月板のコラーゲンと配向が同じであるため、この足場の特性により、周囲の受容組織から細胞の移動を誘導することが可能になる。ひとたび細胞がヒドロゲル及び足場に移動すると、自然の機械的刺激及び周囲の自家半月板からの増殖因子が、半月板組織の修復及び再生を強化、促進する。
【０１０２】
本発明の他の好ましい実施態様は、コラーゲン支持マトリクスと共に裂傷又は損傷に沈着させたすりつぶした滑膜組織で補ったコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを投与することからなる治療の組み合わせを提供することにより、損傷した半月板を治療するための方法である。
【０１０３】
これら実施態様の如何なる変化も本発明の範囲内であることを意図している。
【０１０４】
（実施例１，膝のせん断試験）
この実施例は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、フィブリン組織封止剤及びＰＥＧ組織封止剤のせん断強度の比較試験のための方法及び実験の設計について記載している。
【０１０５】
膝のせん断試験は、引張り荷重による膝のせん断における組織接着性の強度特性の標準的な試験方法であるＡＳＴＭ  Ｆ−２２５５に記載の方法に従って実行した。
【０１０６】
アクリル樹脂板で作った基板を準備し、テストに使用するブタのソーセージの皮を取り付けた。手短に言えば、ブタのソーセージの皮を水につけて塩分を取り除いた。かかる皮を開き、２５×２５ｍｍの大きさに切り、３７℃のインキュベーター中の加湿器内に置いた。かかる皮を、ヘンケル民生接着剤（Henkel Consumer Adhesives）、オハイオから入手したジェルタイプのシアノアクリレート接着剤であるロクタイトクイックタイト  スーパーグルー（登録商標）で基板にのり付けした。２つのコントロールの接着剤、すなわちフィブリン組織封止剤及びＰＥＧ組織封止剤を選択した。比較のためにこれら２つの封止剤を選択したのは、アルデヒド架橋剤を用いた組織接着剤に較べて組織毒性が非常に低いからである。
【０１０７】
コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル、フィブリン封止剤（ティシール VH、バクスター、イリノイ）及びＰＥＧ封止剤（コシール、バクスター、イリノイ）のそれぞれ５つのサンプルを調製し、２つの基板に各サンプルをのり付けした。各試験の重なり領域は４mmであった。この実験の構成を図７Ａ及び７Ｂに示す。各材料の膝のせん断強度を機械的強度測定器（モデル 3342、インストロン、MA）によって評価した。
【０１０８】
統計的有意性のため、一方向スチューデントｔ検定によって比較した。実験を３回繰り返し、結果の再現性を確認した。
【０１０９】
表５は材料の製造物名、化学組成、及びサンプルの数について記載している。
【０１１０】
【表５】
2008521502.tif 000007
【０１１１】
これら比較研究の結果は図８に示し、これは前述したとおりである。
【０１１２】
（実施例２、半月板損傷のための生体内における単一外科治療）
この実施例は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを用いたブタモデルにおける半月板損傷のための生体内での単一外科治療の３ヶ月間及び６ヶ月間の臨床前研究の方法を記載している。
【０１１３】
この研究は、生体内でのコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル材料の安全性及び分解時間を評価すること、生体内での強力な接着性を有するコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルを使用して無血管帯の半月板裂傷を修復するための方法を評価すること、及び生体内での半月板裂傷を生体内で治療するためにコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルに装填する追加の薬剤、添加剤、又は促進剤の必要性についての測定をすることを意図している。
【０１１４】
動物：ミニチュアハンフォード、シンクレアブタ又はマイクロユカタンブタ
動物の数：８匹
半月板の数：１６の内側半月板
研究期間：４ヶ月
評価：
手術後２ヶ月：関節鏡による評価
手術後４ヶ月：肉眼解剖学、ＭＲＩ、組織学的評価
【０１１５】
表６は、各グループにおいて、本研究で一半月板当たりの治療部位数の目安として使用するコントロール及び実験グループの概略である。
【０１１６】
【表６】
2008521502.tif 000008
【０１１７】
表７は、各半月板上の各部位の治療の等級付け及び評価の概略である。
【０１１８】
【表７】
2008521502.tif 000009
【０１１９】
表８は、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療した後の裂傷内の、細胞外マトリクス組織を等級付けするための定量的で組織学的な尺度について規定する。
【０１２０】
【表８】
2008521502.tif 000010
【０１２１】
以前実施した研究に基づいて予想される関節鏡による評価の結果について表９に記載する。
【０１２２】
【表９】
2008521502.tif 000011
【０１２３】
以前実施した研究に基づいて予想される関節鏡による評価の結果について表１０に記載する。
【０１２４】
【表１０】
2008521502.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は培養中のブタ半月板を示す写真である。
【図２】図２はＡ、Ｂ、及びＣで示されている裂傷部位を持つ半月板の写真である。
【図３】図３Ａは治療していない裂傷領域の写真である（４×）。図３Ｂは治療していない裂傷領域の写真である（１０×）。スケールは２５０μｍである。
【図４】図４Ａは縫合治療を示す裂傷領域の写真である（４×）。図４Ｂは縫合部位を示す裂傷領域の写真である（１０×）。
【図５】図５Ａはコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療した半月板部位の顕微鏡写真である（４×）。図５Ｂは細胞の集積を示すコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルで治療した半月板部位の顕微鏡写真である（１０×）。
【図６】図６はシンクレアブタの内側半月板を示す。
【図７】図７は３つの接着剤の接着強度を試験するために使用した装置の略図である。図７Ａは接着剤を適用する前に重なり領域を有する２つの装置を示す。図７Ｂは接着剤を２つの重なり領域間に適用し、コラーゲン−ＰＥＧヒドロゲルとフィブリン封止剤及びＰＥＧ封止剤間の機械的性質を評価することを特徴とする、組み立て後の装置を示す。
【図８】図８は、市販のフィブリン封止剤及びＰＥＧ封止剤と、本発明の方法で用いたコラーゲン−ＰＥＧヒドロゲル接着剤を比較した、膝のせん断強度の比較試験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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