(57)【要約】【課題】ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチド、これを暗号化するポリヌクレオチド及びその用途を開示する。【解決手段】下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）ポリペプチドからなる群より選ばれる、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドである。  （ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；  （ｂ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；及び  （ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。【選択図】図１
2008528025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）ポリペプチドからなる群より選ばれる、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチド。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；及び
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
配列番号２に記載されたアミノ酸配列又はそれと類似の配列からなるピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドの発現又はその機能を抑制する段階を含む、植物の生長を抑制する方法。
【請求項７】
前記段階は、請求項４に記載のアンチセンスヌクレオチドを植物体内に導入する段階を含むことを特徴とする、請求項６に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項８】
前記段階は、遺伝子除去、遺伝子挿入、Ｔ−ＤＮＡ導入、同種組み換え、トランスポゾン標識及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれるいずれか一つの方式によって行われることを特徴とする、請求項６に記載の植物の生長を抑制する方法。
【請求項９】
配列番号２に記載されたアミノ酸配列又はそれと類似の配列からなるピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドの発現又はその機能を抑制する物質を検出する段階を含む、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項９に記載のスクリーニング方法によって得られた植物の生長を抑制する物質。
【請求項１１】
前記物質は、請求項３に記載のアンチセンスヌクレオチド、請求項３に記載のアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクター、及び請求項３に記載のアンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換されたアグロバックテリウムチュメファシエンスからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の植物の生長を抑制する物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチド、これを暗号化するポリヌクレオチド及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
化合物名が２−メチル−３−ヒドロキシ−４，５−ジ（ヒドロキシメチル）ピリジンであるピリドキシンはビタミンＢ６群に属する化合物であって、動物と植物の生長に必須な化合物である（Gregory JF, Ann Rev Nutr 18： 277-296, 1998）。ピリドキシンの外に、ピリドキシンの誘導体であるピリドキサミン、ピリドキーサルなどもビタミンＢ６群に属する化合物である。このような化合物は生体内でピリドキーサル−５−リン酸に転換される。このピリドキーサル−５−リン酸はすべての生物体で窒素代謝作用に関与するだけでなく、アミノ酸代謝などの生体内多様な代謝作用に関与する助酵素であると知られている。
【０００３】
植物にはピリドキシン生合成経路が存在する一方、人間などの動物においては、ピリドキシン生合成経路が欠けている（Dolphin et al., in Vitamin B6 Pyridoxal Phosphate, 1986）。したがって、人間などの動物においては、ピリドキシンを必ず外部から摂取しなければならない。
【０００４】
一方、動物と植物の生長に必須なピリドキシンは、植物にはその生合成経路が存在するが、人間などの動物にはその生合成経路が欠けているというのは重要な意味を有する。それは、ピリドキシンの生合成を阻害することができれば、人間などの動物には無害でありながらも植物の生長を効果的に抑制することができることを示唆するからである。
【０００５】
このような理由で、植物分野バイオテクノロジー従事者らは、植物においてピリドキシン生合成に関与するポリペプチド（酵素）又はポリヌクレオチド（遺伝子）を捜し出そうと努力している。
本発明はこのような背景下で完成されたものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、ピリドキシン生合成に関連機能を有するポリペプチドを提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドを提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター及びこの組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、植物の生長を抑制する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記スクリーニング方法によって得た植物の生長抑制物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一側面によれば、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
下記実施例で確認されるように、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のストレス−反応タンパク質と推定されるタンパク質（GeneBank accession number NM 129380）のアミノ酸配列を基にして製作されたプライマーを使用し、シロイヌナズナから全長ｃＤＮＡを得、それの塩基配列、つまり配列番号１の塩基配列と、読み取り枠（open reading frame）に基づいたアミノ酸配列、つまり配列番号２のアミノ酸配列を分析し、それが暗号化するポリペプチドの分子量を推定した後、そのｃＤＮＡを含む組み換え発現ベクターを大膓菌に形質転換させて発現させ、それから得られたポリペプチドの分子量を分析した結果、前記推定された分子量と同一であることを確認し、さらに前記ｃＤＮＡの塩基配列、つまり配列番号１に基づいて製作されたアンチセンスヌクレオチドをシロイヌナズナに形質転換させて見た結果、ピリドキシンの処理によってその表現型が回復されるピリドキシン栄養素要求突然変異体である形質転換されたシロイヌナズナが得られることを確認することができた。これは、前記ポリペプチドがピリドキシンの生合成に直接的に関与することを意味するものである。
【００１５】
したがって、ここで使用する前記“ピリドキシン生合成関連機能”とはピリドキシン生合成に必須な機能を意味し、より直接的には、ピリドキシン生合成酵素機能を意味する。
【００１６】
具体的に、本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドは下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチドの一つである。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。
ここで、“配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド”は、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較したとき、依然としてピリドキシン生合成関連機能を有すると思うに十分な程度の配列番号２のアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドに定義される。依然として、ピリドキシン生合成関連機能を保有すれば十分なので、前記ポリペプチドの長さ及びそのようなポリペプチドが有する活性の程度は問題にならない。すなわち、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べて活性が低くても、依然としてピリドキシン生合成関連機能を保有するポリペプチドであれば、その長さにかかわらず、前記‘配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド’に含まれるというものである。
【００１７】
当業者であれば、すなわち本出願時点を基準に知られた関連先行技術を熟知している者であれば、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、一部分が欠失あるいは付加されても、そのようなポリペプチドは依然としてピリドキシン生合成関連機能を有すると期待される。そのようなポリペプチドとして、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドにおいて、Ｎ−末端領域又はＣ−末端領域が欠失されたポリペプチドを挙げることができる。それは、一般的に、Ｎ−末端領域又はＣ−末端領域が欠失されてもそのようなポリペプチドは本来のポリペプチドが有する機能を有すると当業界に知られているからである。もちろん、場合によって、Ｎ−末端領域又はＣ−末端領域が酵素の機能に必須なモチーフに関与することにより、Ｎ−末端領域又はＣ−末端領域が欠失されたポリペプチドが前記酵素の機能を現わさない場合があり得るが、それでもそのような非活性のポリペプチドを活性のポリペプチドと区分し検出し出すことは当業者の通常の能力範囲内に属する。さらに、Ｎ−末端領域又はＣ−末端領域だけでなく、その他の部分が欠失されても、本来のポリペプチドが有する機能を依然として有することができる。ここでも、当業者であれば、通常の能力範囲内で、このような欠失されたポリペプチドが、依然として本来のポリペプチドが有する機能を有するかを充分に確認することができる。
【００１８】
特に、本明細書が配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列を開示しており、さらに配列番号１の塩基配列によって暗号化され、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがピリドキシン生合成関連機能を有するかを確かに確認した実施例を開示しているという点で、配列番号２のアミノ酸配列において一部配列が欠失されたポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する機能を依然として保有するかを、当業者は通常の能力範囲内で充分に確認することができるというのが非常に明らかになるであろう。
【００１９】
したがって、本発明において、前記“配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド”は、前記定義のように、本明細書の開示内容に基づいて当業者がその通常の能力範囲内で製造可能なピリドキシン生合成関連機能を有する、欠失された形態のすべてのポリペプチドを含む意味として理解しなければならない。
【００２０】
また、ここで、“前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド”とは、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有する機能、つまりピリドキシン生合成関連機能を依然として保有するポリペプチドを言う。ここで、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドがピリドキシン生合成関連機能を依然として保有すれば、そのようなポリペプチドが有する活性の程度又はアミノ酸が置換された程度は問題にならない。言い換えて、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに比べ、その活性がいくら低くても、かつ多数の置換されたアミノ酸を含んでいると言っても、そのようなポリペプチドがピリドキシン生合成関連機能を保有すれば、本発明に含まれるというものである。一つ以上のアミノ酸が置換されても、置換される前のアミノ酸が置換されたアミノ酸と化学的に等価であれば、そのような置換されたアミノ酸を含むポリペプチドは依然として本来のポリペプチドの機能を保有する。例えば、疎水性アミノ酸であるアラニンが他の疎水性のアミノ酸、例えばグリシン、又は一層疎水性のアミノ酸、例えばバリン、ロイシン又はイソロイシンで置換されても、そのような置換されたアミノ酸を有するポリペプチドは、活性は低くても本来のポリペプチドが有する機能を依然として保有するであろう。同様に、陰に荷電されたアミノ酸、例えばグルタミン酸が他の陰に荷電されたアミノ酸、例えばアスパラギン酸で置換されても、そのような置換されたアミノ酸を有するポリペプチドド活性は低くても、本来のポリペプチドが有する機能を依然として保有し、さらに陽に荷電されたアミノ酸、例えばアルギニンが他の陽に荷電されたアミノ酸、例えばリシンで置換されても、そのような置換されたアミノ酸を有するポリペプチドも活性は低くても、本来のポリペプチドが有する機能を依然として保有する。また、ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端領域で置換されたアミノ酸を含むポリペプチドも本来のポリペプチドが有する機能を依然として保有する。当業者であれば、前述したような一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが有するピリドキシン生合成関連機能を依然として保有するポリペプチドを製造することができる。また、当業者であれば、一つ以上の置換されたアミノ酸を含むポリペプチドが依然として前記機能を有するかを確認することができる。さらに、本明細書が配列番号１の塩基配列及び配列番号２のアミノ酸配列を開示しており、かつ配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドがピリドキシン生合成関連機能を有することを確認した実施例を開示しているので、本発明の“前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド”は当業者に容易に実施可能なものであることが明らかである。したがって、“前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド”は、一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、依然としてピリドキシン生合成関連機能を有するすべてのポリペプチドを含む意味として理解しなければならない。このように、“前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド”は、一つ以上の置換されたアミノ酸を含みながらも、依然としてピリドキシン生合成関連機能を有するすべてのポリペプチドを含むことを意味するが、それでも活性の程度の観点で見るとき、前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と配列上同性が高いほど望ましい。前記ポリペプチドは、配列上同性の下限において、６０％以上の配列上同性を有することが望ましい一方、配列上同性の上限においては、当然１００％の配列上同性を有することが望ましい。
【００２１】
より具体的に、前記配列上同性は、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に高いほど望ましい。
【００２２】
そして、本発明の“前記（ａ）及び（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド”は‘配列番号２のアミノ酸配列全体を含むポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド’だけでなく‘配列番号２のアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド’を含むので、前述したようなすべての説明は‘配列番号２のアミノ酸配列全体を含むポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド’に対してだけでなく、‘配列番号２のアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド’に対しても適用される。
【００２３】
本発明は、他の側面において、前述したようなポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドに係るものである。ここで、“前述したようなポリペプチド”とは、ピリドキシン生合成関連機能を有しながら、配列番号２に記載されたアミノ酸配列全体を含むポリペプチド、配列番号２に記載されたアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド、及び前記ポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドを含むだけでなく、前述したような望ましい様態のすべてのポリペプチドを含むことを意味するものである。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、ピリドキシン生合成関連機能を有しながら、配列番号２に記載されたアミノ酸配列全体又はその実質的な部分を含むポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチド及びこのようなポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドを暗号化は単離されたポリヌクレオチドを含み、また望ましい様態として、ピリドキシン生合成関連機能を有しながら、前述したような配列上同性の順にその配列上同性を有するすべてのポリペプチドを暗号化する単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００２４】
アミノ酸配列が明かされたとき、そのようなアミノ酸配列に基づいて、そのようなアミノ酸配列を暗号化するポリヌクレオチドを当業者であれば容易に製造することができる。
【００２５】
本発明において、ここで使用する“単離されたポリヌクレオチド”は、化学的に合成されたポリヌクレオチド、生物体、特にシロイヌナズナから分離されたポリヌクレオチド及び変形されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをすべて含み、単一本又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの重合体をすべて含むものに定義される。したがって、前記“単離されたポリヌクレオチド”とは、ｃＤＮＡを含み、ヌクレオチドを化学的に重合させたポリヌクレオチドだけでなく、さらに生物体、特にシロイヌナズナから分離されるｇＤＮＡを含む。ここで、本明細書が開示している配列番号２のアミノ酸配列、これを暗号化する配列番号１の塩基配列、及び当業界に知られた技術などに基づいて、ｃＤＮＡと、前記化学的に合成されるポリヌクレオチドの製造及び前記ｇＤＮＡの分離などは当業者の通常の能力範囲内に属する。
【００２６】
本発明は、さらに他の側面において、配列番号１の塩基配列の一部分を含むポリヌクレオチド又は前記一部分と実質的に類似のポリヌクレオチドに関するものである。ここで、前記“配列番号１の塩基配列の一部分を含むポリヌクレオチド”とは、シロイヌナズナを含む植物などの生物体において、ピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離するのに十分な長さの配列を含むポリヌクレオチドをいい、また、前記“配列番号１の塩基配列の一部分と実質的に類似のポリヌクレオチド”とは、配列番号１の塩基配列の一部分と比較し、一つ以上の置換されたヌクレオチドを含みながらも、シロイヌナズナを含む植物などの生物体において、ピリドキシン生合成機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離するのに十分な程度の配列依存的結合力を有するポリヌクレオチドを言う。
【００２７】
当業者であれば、シロイヌナズナ又はその他の生物体において、本明細書が開示している配列番号１の塩基配列に基づいてこれを用いて、通常の能力範囲内でシロイヌナズナ又はその他の生物体からピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離することができる。
【００２８】
したがって、本発明の前記ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの長さにかかわらず、あるいはそのポリヌクレオチドの配列番号１の塩基配列との配列上同性の程度にかかわらず、シロイヌナズナを含む植物などの生物体からピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離するのに十分な配列長さ及び／又は配列依存的結合力を有するすべてのポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
一般に、機能が知られた遺伝子の塩基配列を未知の遺伝子の塩基配列と比較し、その未知の遺伝子が対比される公知の遺伝子と同一の機能を有するものと推定するために、かつ未知の遺伝子を単離するためのプローブとして使用されるためには、３０個以上の連続するヌクレオチド配列が必要であると知られている。したがって、本発明の前記ポリヌクレオチドは、配列番号１に開示された塩基配列において３０個以上のヌクレオチドを含むことが望ましい。それにもかかわらず、依然として本発明のポリヌクレオチドは３０個以下のヌクレオチドからなるポリ（又はオリゴ）ヌクレオチドを含む。それは、配列番号１に開示された塩基配列と１００％の配列上同性を有するか同定及び／又は単離条件（バッファのｐＨ又は濃度など）が厳しければ、シロイヌナズナ又はその他の生物体からピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離するのに十分であるからである。ここで、シロイヌナズナ又はその他の生物体からピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離するのに十分な３０個以下のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを製作、検出すること、及びそのようなポリヌクレオチドを利用してシロイヌナズナ又はその他の生物体からピリドキシン生合成関連機能を有する遺伝子を同定及び／又は単離することは通常の当業者の能力範囲内に属する。
【００３０】
本発明は、さらに他の側面において、前述したようなポリヌクレオチドに相補的に結合することができるアンチセンスヌクレオチドに関するものである。
【００３１】
前記アンチセンスヌクレオチドは、前述したようなポリヌクレオチドに相補的に結合して転写（transcription）（ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合）又は翻訳（translation）（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合）を阻害することができるすべてのポリ（又はオリゴ）ヌクレオチドを含む。このようなアンチセンスヌクレオチドは、前述したようなピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドに相補的に結合して転写（ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合）又は翻訳（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合）を阻害することができれば、その長さ又は相補的な配列上同性は問題にならない。短い長さ、例えば３０個ヌクレオチド程度のポリヌクレオチドと言っても、それの該当遺伝子（ＤＮＡ及びＲＮＡ含み）に１００％の相補的配列上同性を有し、その他の条件、例えば濃度又はｐＨなどが適切に備えられれば、アンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。また、配列においても、それの該当遺伝子と１００％の相補的な配列上同性を有しないとしても、適当な長さを有すれば、同様にアンチセンスヌクレオチドとして作用することができる。したがって、アンチセンスヌクレオチドの長さ、相補的な配列上同性の程度にかかわらず、アンチセンスヌクレオチドとして作用することができれば、すなわち該当遺伝子の転写又は翻訳を阻害する能力を保有していれば、すべて本発明のアンチセンスヌクレオチドに含まれるものと見なされなければならない。ここで、アンチセンスヌクレオチドとして必要な長さの決定、該当遺伝子と相補的な配列上同性の程度、かつそのようなアンチセンスヌクレオチドの製造方法などは本明細書が開示している配列番号１の塩基配列、配列番号２のアミノ酸配列、及び当業界に知られた技術に基づいて、すべて当業者の通常の能力範囲内に属する。
【００３２】
一方、前記アンチセンスヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドが望ましい。ここで、“配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分”とは、前述したものを考慮すれば、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれから転写されたＲＮＡと相補的に結合して、その転写又は翻訳を妨害するのに十分な長さを含むものと理解できる。
【００３３】
本発明は、さらに他の側面において、前述したようなポリヌクレオチドを含む組み換えベクター及びこの組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関するものである。
【００３４】
下記の本発明の実施例においては、配列番号１に記載された塩基配列からなるピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドをｐＣＡＬ−ｎ（Stratagene, USA）に挿入して製作された組み換えベクターｐＣＡｔＰＤＸ５を製作し、このｐＣＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで大膓菌を形質転換させた後、前記ポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを分離し、その分子量を確認した結果、配列番号１の塩基配列の読み取り枠（ＯＲＦ）から推定された分子量と同一であることを確認することができた。
【００３５】
このような本発明の望ましい実施様態を考慮すれば、前記組み換えベクターはｐＣＡｔＰＤＸ５であることが望ましく、本発明の形質転換体は前記組み換えベクターで形質転換された大膓菌であることが望ましい。
【００３６】
本発明は、さらに他の側面において、植物の生長を抑制する方法を提供する。具体的に、本発明の植物の生長を抑制する方法は、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと類似の配列からなるピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドの発現又は機能を抑制する段階を含むことを特徴とする。
【００３７】
前述したように、ピリドキシンは植物及び動物の生長に必須なビタミンでありながらも、植物にはその生合成経路が存在する一方、動物にはその生合成経路が存在しない。したがって、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドが発現されないかあるいはその機能が抑制されれば、結局、植物の生長の抑制につながることができる。本発明の実施例が開示するように、実際配列番号１の塩基配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドをシロイヌナズナに形質転換させたとき、形質転換されたシロイヌナズナにおいて生長が遅滞する現象などを見つけることができた。したがって、本発明の植物の生長を抑制する方法は、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドの発現を抑制するかあるいはその機能を抑制することで可能になるものである。
【００３８】
ここで、“配列番号２のアミノ酸配列と類似の配列からなるポリペプチド”とは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの同族体であって、ピリドキシン生合成関連機能を有しながら、植物体の種類による進化的経路の相違によって配列番号２のアミノ酸配列と異なる配列からなるすべてのポリペプチドを含む意味である。したがって、前記本発明の植物の生長を抑制する方法において、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドがたとえシロイヌナズナから分離されたものであると言っても、前記植物の範囲には、シロイヌナズナだけでなく、その他のすべての植物が含まれるものと理解しなければならない。ただし、ここで、配列番号２のアミノ酸配列と類似の配列からなるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と配列上同性が高いほど望ましく、一番望ましくは、当然１００％の配列上同性を有するときである。一方、配列上同性の下限においては、前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸配列と６０％以上の配列上同性を有する場合が望ましい。より具体的には、前記配列上同性が６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の順に高いほど望ましい。
【００３９】
一方、前記において、ポリペプチドの発現抑制は当業界に知られた方法によって充分に可能である。すなわち、アンチセンスヌクレオチドの導入、遺伝子除去（gene deletion）、遺伝子挿入（gene insertion）、Ｔ−ＤＮＡの導入、同種組み換え（homologous recombination）又はトランスポゾン標識法（transposon tagging）、ｓｉＲＮＡ（small interfereing RNA）などの方法が利用できる。
【００４０】
下記の本発明の実施例においては、アンチセンスヌクレオチドを植物体内に導入する方法を利用した。具体的には、先に配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスヌクレオチドを製造した後、これを含む組み換えベクター（ｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５ベクター）を製作し、その組み換えベクターをアグロバックテリウムテュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換させた後、この形質転換体をシロイヌナズナに形質転換させる過程を経った。その形質転換されたシロイヌナズナの種子を育種した結果、すべて生長が著しく低下する現象などを確認することができた（下記実施例３参照）。
【００４１】
したがって、本発明の植物の生長を抑制する方法において、前記段階は配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドを該当植物体内に導入する段階を含むことが望ましく、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体を植物体内に導入する段階を含むことがより望ましい。特に、前記形質転換体は、前記組み換えベクターで形質転換されたアグロバックテリウムチュメファシエンスであることがより望ましい。ここで、“配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分”とは、前記本発明のアンチセンスヌクレオチドに関連して説明したようである。
【００４２】
一般に、アンチセンスヌクレオチドは、核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）内の標的ヌクレオチド配列と結合して、前記核酸の機能又は合成を抑制する役目をすると知られている。すなわち、ある特定の遺伝子に相応するアンチセンスヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両者に共に混成化する能力を有することにより、転写又は翻訳過程で特定遺伝子の発現を阻害するものである。
【００４３】
したがって、配列番号２のアミノ酸配列又はそれと類似のアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現抑制又はその機能抑制によって、ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドが本来の機能を発揮することができなければ、結果的に植物の生長が抑制できる。
【００４４】
本発明の植物の生長を抑制する方法は、植物にだけその生合成経路が存在するピリドキシンの生成を阻害する機序を利用するという点で、ピリドキシン生合成経路が存在しない人間又は動物には特別に有害でない方法になることができる。
【００４５】
本発明は、さらに他の側面において、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法に関するものである。前記方法は、配列番号２のアミノ酸配列及びそれと類似の配列からなるピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドの発現又はその機能を抑制する物質を検出する段階を含むことを特徴とする。
【００４６】
ここで、“配列番号２のアミノ酸配列と類似の配列からなるポリペプチド”とは、前記本発明の植物の生長を抑制する方法で説明したものがそのまま適用できる。
【００４７】
一方、前記ポリペプチドの発現を抑制する物質は、本発明の植物の生長を抑制する方法に関連して既に説明したような理由で、配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチドであることが望ましく、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された形質転換体であることがより望ましいし、特に、前記組み換えベクターで形質転換されたアグロバックテリウムチュメファシエンスであることが最も望ましい。ここでも、“配列番号１の塩基配列の一部分に相補的な部分”とは、前記本発明のアンチセンスヌクレオチドに関連して説明したようである。
【００４８】
本発明は、さらに他の側面において、前記スクリーニング方法によって得られた植物の生長を抑制する物質に関するものである。
【００４９】
そのような物質として、先に説明したような配列番号１の塩基配列に相補的な部分を含むアンチセンスヌクレオチド、前記アンチセンスヌクレオチドを含む組み換えベクター、その組み換えベクターで形質転換されたアグロバックテリウムチュメファシエンスなどが例示できる。
【発明の効果】
【００５０】
前述したように、本発明によれば、ピリドキシン生合成に関連機能を有するポリペプチド、前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、この組み換えベクターで形質転換された形質転換体、植物の生長を抑制する方法、植物の生長を抑制する物質のスクリーニング方法、及び前記スクリーニング方法によって得られた植物の生長抑制物質を提供することができる。
【００５１】
［図面の簡単な説明］
図１は本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された大膓菌及び対照群大膓菌のタンパク質に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。
図２は本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入されたｐＳＥＮベクターの構造を示す概略図である。
図３は本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが図２のｐＳＥＮベクターにアンチセンス方向に導入されたｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターの構造を示す概略図である。
図４は図２のｐＳＥＮベクターと図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターでそれぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ１種子を生長分化させて得たシロイヌナズナの写真である。
図５は図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子から育ったシロイヌナズナの写真である。
図６は図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子から育ったシロイヌナズナと野生型シロイヌナズナの配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの転写体含量を比較するためにＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す写真である。
図７は図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子をピリドキシンの添加された培地で栽培して得たシロイヌナズナの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。しかし、このような実施例が本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５３】
＜実施例１＞シロイヌナズナからピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子の分離
ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子をシロイヌナズナから分離するためのスクリーニングを行った。
【００５４】
＜実施例１−１＞シロイヌナズナの栽培及び培養
シロイヌナズナは、土壌を入れた植木鉢で栽培するか、あるいは２％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ５．７）と０．８％寒天（ａｇａｒ）を含むＭＳ（Murashige and Skoog salts, Sigma, USA）培地を入れたペットリ皿で栽培した。本研究で使用したすべてのＭＳ培地は、ビタミン混合物のなかでＢ６群（ピリドキシンなど）が除去された状態である。植木鉢で栽培するときは、２２℃の温度で１６／８時間明暗周期で調節される生長調節機内で栽培した。
【００５５】
＜実施例１−２＞ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡライブラリーの製造
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーを作るために、多くの分化段階のシロイヌナズナ葉からＴＲＩ試薬（Sigma, USA）を使用してＲＮＡを抽出し、抽出されたすべてのＲＮＡからｍＲＮＡ分離キット（Pharmacia, USA）のプロトコルによってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを分離した。プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）としてＮｏｔＩ−（ｄＴ）１８を利用し、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとｃＤＮＡ合成キット（Time Saver cDNA synthesis kit, Pharmacia, USA）で二本鎖のｃＤＮＡを製造した。
【００５６】
＜実施例１−３＞ピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化する遺伝子分離
シロイヌナズナのストレス−反応タンパク質と推定されるタンパク質（GeneBank accession number NM 129380）のアミノ酸配列に基づき、配列番号３で表示され、制限酵素ＸｂａＩの配列を含むセンスプライマーと、配列番号４で表示され、制限酵素ＢｇｌＩＩの配列を含むアンチセンスプライマーを合成した。前記２種のプライマーを使用し、前記＜実施例１−２＞で製造されたシロイヌナズナｃＤＮＡからＰＣＲ（polymerase chain reaction）を利用して全長ｃＤＮＡを増幅し分離した。
【００５７】
前記分離されたｃＤＮＡの分析結果、約３２．８ｋＤａの分子量を有する３０９個のアミノ酸を暗号化する９３０ｂｐ大きさの読み取り枠（ＯＲＦ）を持っており、一つのエクソン（ｅｘｏｎ）で構成されていることを確認し、これをＡｔＰＤＸ５（Arabidopsis thaliana pyridoxine biosynthesis protein 5）と名付けた。前記遺伝子が暗号化するＡｔＰＤＸ５タンパク質の等電点（isoelectric point）は５．８として現われた（以下、遺伝子はイタリック体を使用して“ＡｔＰＤＸ５”あるいは“ＡｔＰＤＸ５遺伝子”といい、タンパク質は“ＡｔＰＤＸ５”あるいは“ＡｔＰＤＸ５タンパク質”と言う）。
【００５８】
一方、前記ＡｔＰＤＸ５から推定されるアミノ酸配列のうち、２０番−２２７番アミノ酸配列部位にＳＯＲ／ＳＮＺファミリドメインと、１７番−３０７番部位にＳＮＺ１ドメインを含むことを確認することができた。このようなドメインを含むタンパク質はピリドキシン生合成経路に関与する酵素機能を有すると提案されているから、本発明では、本発明のポリヌクレオチドが直接ピリドキシン生合成経路に関与するかどうかをシロイヌナズナ変異体の製作などによって調査した。
【００５９】
＜実施例２＞大膓菌においてＡｔＰＤＸ５遺伝子から発現されるタンパク質の精製
シロイヌナズナのＡｔＰＤＸ５タンパク質発現を誘導するために、配列番号５に表示され、制限酵素ＢｇｌＩＩの配列を含むセンスプライマーと、配列番号６に表示され、制限酵素ＸｈｏＩの配列を含むアンチセンスプライマーを使用し、前記＜実施例１−２＞のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲを利用して全長ｃＤＮＡを増幅し分離した。増幅されたＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ制限酵素とＸｈｏＩ制限酵素で切断し、ｐＣＡＬ−ｎベクター（Stratagene, USA）のＢａｍＨ１制限酵素部位（BglII compatible end ligation部位）とＸｈｏＩ制限酵素部位にクローニングしてｐＣＡｔＰＤＸ５組み換えベクターを製作した。ここで、前記ｐＣＡＬ−ｎベクターはカルモジュリン−結合ペプチド標識（calmodulin-binding peptide tag）配列を含んでいるから、前記ベクターから発現されるタンパク質はカルモジュリンレジン（calmodulin resin）によって易しく分離できるという利点がある。
【００６０】
前記ｐＣＡｔＰＤＸ５組み換えベクターを大膓菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Stratagene, USA）に形質転換させた後、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（ampicillin）を含むＬＢ（Luria-Bertani broth, USB, USA）培地で、Ｏ．Ｄ．６００値が０．７になるまで、３７℃で１５０ｒｐｍで撹拌培養した。目標タンパク質の大膓菌細胞内発現を誘導するために、前記懸濁液に、ＩＰＴＧ（isopropyl-D-thiogalactoside）を最終濃度１ｍＭになるように添加した後、さらに２時間培養した。培養された細胞を５０ｍＭのＭｇＳＯ4と０．４ＭのＮａＣｌが溶存する５０ｍＭ−リン酸カリウムバッファ（potassium phosphate buffer、ｐＨ７．０）で洗浄した後、さらに４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、沈殿物を収集して−２０℃で保管した。
【００６１】
前記タンパク質の発現を確認するために、ｐＣＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換された大膓菌から分離した溶出液を対象としてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、図１に示すように、ｐＣＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換された大膓菌から分離された溶出液が約３７ｋＤａ大きさの融合タンパク質（ＡｔＰＤＸ５遺伝子から発現されるタンパク質の分子量３２．８ｋＤａ＋カルモジュリン結合ペプチドの分子量４ｋＤａ）を含むことを確認することができた。一方、対照群大膓菌（ｐＣＡＬ−ｎベクターで形質転換された大膓菌）の溶出液においては、前記大きさのタンパク質を含んでいないことを確認することができた。図１において、矢印（←）は３７ｋＤａ大きさの融合タンパク質（ＡｔＰＤＸ５遺伝子から発現されるタンパク質の分子量３２．８ｋＤａ＋カルモジュリン結合ペプチドの分子量４ｋＤａ）を示す。そして、レーン１及び３は対照群大膓菌溶出液に対するものであり、レーン２及び４はそれぞれＡｔＰＤＸ５遺伝子を含む組み換えベクターで形質転換された大膓菌コロニー−１と大膓菌コロニー−２の溶出液に対するものである。
【００６２】
＜実施例３＞ＡｔＰＤＸ５遺伝子に対するアンチセンス構成体が導入された形質転換シロイヌナズナの製造及び特性分析
【００６３】
＜実施例３−１＞ＡｔＰＤＸ５遺伝子に対するアンチセンス構成体が導入された形質転換シロイヌナズナの製造
前記＜実施例２＞で分離されたタンパク質の生理学的特性を確認するために、ＡｔＰＤＸ５遺伝子がアンチセンス方向に導入された形質転換シロイヌナズナを製造してＡｔＰＤＸ５転写体の発現を抑制した。
配列番号３で表示され、制限酵素ＸｂａＩの配列を含むセンスプライマー、及び配列番号４で表示され、制限酵素ＢｇｌＩＩの配列を含むアンチセンスプライマーを利用し、シロイヌナズナのｃＤＮＡからＰＣＲを利用してＡｔＰＤＸ５ｃＤＮＡを増幅した。前記ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切断し、発芽時期に植物体の致死を避けるために、ストレス又は老化関連遺伝子であるｓｅｎ１プロモーターの調節を受けるように製作したｐＳＥＮベクターにアンチセンス方向にクローニングして、ＡｔＰＤＸ５遺伝子に対するアンチセンス構成体であるｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターを製作した。前記で、ｓｅｎ１プロモーターは、植物の生長段階によって発現される遺伝子に対して特異性を有する。一方、図２及び３はそれぞれｐＳＥＮベクターとｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターの構成を示す。図２に示すものはｐＳＥＮベクターの構成であり、図３に示すものはｐＳＥＮベクターにＡｔＰＤＸ５遺伝子がアンチセンス方向に導入されたｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターの構成である。図２及び図３において、ＢＡＲはバスタ除草剤に対する抵抗性を付与するｂａｒ遺伝子（phosphinothricin acetyltransferase gene）を示し、ＲＢは右側境界、ＬＢは左側境界、Ｐ３５ＳはＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡのプロモーター、３５Ｓ ｐｏｌｙ ＡはＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡ ｐｏｌｙ Ａ、ＰＳＥＮはｓｅｎ１プロモーター、Ｎｏｓ ｐｏｌｙ Ａはノパリンシンターゼ遺伝子（nopaline synthase gene）のｐｏｌｙ Ａを示す。
【００６４】
前記ｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターをアグロバックテリウムチュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）にエレクトロポレーション（electroporation）法を利用して導入した。形質転換されたアグロバックテリウム培養液を２８℃でＯ．Ｄ．６００値が１．０になるまで培養し、２５℃で５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を収穫した。収獲された細胞を最終Ｏ．Ｄ．６００値が２．０になるまで浸透媒体（infiltration medium）（1X MS SALTS, 1X B5 vitamin, 5% sucrose, 0.005% Silwet L-77, Lehle Seed, USA）培地に懸濁した。４周齢のシロイヌナズナを真空チェンバーにあるアグロバックテリウム懸濁液に浸漬させ、１０分間１０4Ｐａの真空に置いた。浸漬の後、シロイヌナズナを２４時間の間ポリエチレンバッグに置いた。以後、形質転換されたシロイヌナズナを継続して生長させて種子（Ｔ１）を収穫した。対照群としては、形質転換されなかった野生型シロイヌナズナ又はアンチセンスＡｔＰＤＸ５遺伝子を含まないベクター（ｐＳＥＮベクター）のみで形質転換されたシロイヌナズナを使用した。
【００６５】
＜実施例３−２＞Ｔ１及びＴ２形質転換シロイヌナズナの特性分析
前記＜実施例３−１＞と同様に、形質転換されたシロイヌナズナから収穫した種子は０．１％バスタ（Ｂａｓｔａ）除草剤（キョンノン、大韓民国）溶液に３０分間浸漬させて培養することで選別した。その後、後形質転換されたシロイヌナズナの生育のうち、前記植木鉢にバスタ除草剤を５回処理した後、各植木鉢でのシロイヌナズナの生長様相を調査した。形質転換されたシロイヌナズナは、対照群（アンチセンスＡｔＰＤＸ４遺伝子が含まれないベクター（ｐＳＥＮベクター）のみで形質転換されたシロイヌナズナ）と比較して見れば、生長が非常に抑制され、葉、子房、幹などの黄化現象が引き起こされることを発見した（図４参照）。また、本遺伝子に対する力強いアンチセンス効果は、形質転換体の深刻な生長抑制及び黄化現象だけでなく、形質転換体の致死までも誘導した。
【００６６】
一方、ＡｔＰＤＸ５遺伝子に対するアンチセンス構成体で形質転換された形質転換シロイヌナズナの表現型を確認するために、Ｔ１形質転換シロイヌナズナからＴ２形質転換種子を受け、これらの表現型を調査した。まず、Ｔ２形質転換シロイヌナズナを選別するために、３日間低温処理（４℃）した３０個のＴ２形質転換種子を、ＭＳ培地などのペットリ皿（３０種子／ペットリ皿）で栽培した。その結果、１０日間栽培された個体のなかで５個だけ野生型シロイヌナズナ表現型を有する一方、残りの２５個体は生長抑制現象が引き起こされ、特徴的に葉全体にわたって黄化現象が発生した（図５参照）。その後、これらの表現型が１ｃｏｐｙに対するアンチセンスラインの正常な分離比（ｍｕｔａｎｔ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ＝３：１）を有するかどうかを確認するために、前記ペットリ皿に１２．５ｍｇ／Ｌ ＰＰＴ（phosphinothricin, Duchefa, Netherlands）を処理して見た結果、野生型表現型を有する５個体がＰＰＴによって致死的表現型に転換される一方、残りとして、黄化現象を表し、生長が抑制される表現型を有する２５個体はその表現型がそのまま維持されることを観察することができた。
【００６７】
このような形質転換シロイヌナズナの表現型的特徴がＡｔＰＤＸ５遺伝子の発現変化に起因するものであるかを確認するために、前記＜実施例１−２＞と同様に、ＲＮＡを分離し、配列番号３と４のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を寒天ゲル電気泳動して、野生型シロイヌナズナからＰＰＴ処理によって選別され、生長抑制、黄化現象などのような表現型的特徴を有する形質転換されたシロイヌナズナの転写体含量を比比較した。形質転換されたシロイヌナズナ（Ａｔｐｄｘ５−１−３）のＡｔＰＤＸ５遺伝子発現が野生型（Ｃｏｌ．）に比べ、著しく減少することを観察することができた（図６参照）。このような現象は、ＡｔＰＤＸ５遺伝子の発現抑制は、植物体の生長抑制、かつ黄化現象誘発などのような表現型的特徴を提供するという事実を裏付け、よって本遺伝子が植物体発達に重要な役目を担当し、必須遺伝子であるものと推測される。
【００６８】
前述したように、ＡｔＰＤＸ５のドメインの分析結果、ＡｔＰＤＸ５遺伝子がピリドキシン生合成経路に関与する酵素機能を有すると類推されるので、ＡｔＰＤＸ５遺伝子がピリドキシン生合成経路に関与するかどうかを確認するために、２．５ｍｇ／Ｌピリドキシン−ＨＣｌ（Sigma, USA）が添加されたＭＳ培地を含むペットリ皿（３０種子／ペットリ皿）でＴ２形質転換シロイヌナズナを栽培した。その結果、１０日間栽培された形質転換のシロイヌナズナと野生型シロイヌナズナを比較して見れば、少しの黄化現象を引き起こしたが、生長遅延などの大きな表現型の変化は観察されなかった（図７参照）。形質転換植物体において部分的な黄化現象が引き起こされることは、培地に添加されたピリドキシンの含量が不足であるからと推測される。このような表現型回復はピリドキシンの添加によって引き起こされ、よって、ＡｔＰＤＸ５遺伝子がピリドキシン生合成に直接的な機能を有するとの結論を下すことができる。前記結果において、Ｔ２形質転換シロイヌナズナの表現型の特徴は、深刻な生長抑制、葉全体にわたる黄化現象、そして形質転換シロイヌナズナの致死誘導を挙げることができ、形質転換シロイヌナズナはピリドキシン処理によって表現型が回復することが分かった。したがって、前記ＡｔＰＤＸ５遺伝子に対するアンチセンス構成体で形質転換された植物体がピリドキシン栄養素要求突然変異体であることを確認することができ、このような事実は本遺伝子のポリヌクレオチドが新規植物生長調節物質又は除草剤の開発のための良い標的になることができることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組み換えベクターで形質転換された大膓菌及び対照群大膓菌のタンパク質に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。
【図２】本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドがアンチセンス方向に導入されたｐＳＥＮベクターの構造を示す概略図である。
【図３】本発明のピリドキシン生合成関連機能を有するポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、特に配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが図２のｐＳＥＮベクターにアンチセンス方向に導入されたｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターの構造を示す概略図である。
【図４】図２のｐＳＥＮベクターと図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターでそれぞれ形質転換されたシロイヌナズナのＴ１種子を生長分化させて得たシロイヌナズナの写真である。
【図５】図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子から育ったシロイヌナズナの写真である。
【図６】図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子から育ったシロイヌナズナと野生型シロイヌナズナの配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドの転写体含量を比較するためにＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す写真である。
【図７】図３のｐＳＥＮ−ａｎｔｉＡｔＰＤＸ５組み換えベクターで形質転換されたシロイヌナズナのＴ２種子をピリドキシンの添加された培地で栽培して得たシロイヌナズナの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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