(57)【要約】  本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子において機能的に重要な新規の結合ドメイン、ならびにそれらと相互作用し、これらの分子の生物学的活性を調節することで哺乳動物の卵巣機能および排卵率を変化させるための作動薬および拮抗薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
（Ｘ）３２ＥＣＥ（Ｘ）１０ＬＫＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＡＶＧＨＲＹ（Ｘ）６Ｍ（Ｘ）２ＮＩ（Ｘ）２ＥＫ（Ｘ）３３Ｙ（配列番号１）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、前記結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩ型受容体結合ドメイン。
【請求項２】
アミノ酸配列：
（Ｘ）５１ＩＶＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＳＰＬＳＶＬ（Ｘ）８ＡＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号２）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、前記結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩＩ型受容体結合ドメイン。
【請求項３】
アミノ酸配列：
（Ｘ）２６Ｆ（Ｘ）１１Ｆ（Ｘ）Ｌ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＲＹＣ（Ｘ）１４ＰＶＨＴ（Ｘ）ＶＱ（Ｘ）２Ｉ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＤＭ（Ｘ）Ａ（Ｘ）５Ｒ（配列番号３）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、前記二量化結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上の二量化結合ドメイン。
【請求項４】
Ｘは図１中に示されるＧＤＦ−９配列内に存在するアミノ酸残基を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の推定上の結合ドメイン。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の配列番号１、配列番号２および配列番号３の１つもしくは複数の前記推定上のＧＤＦ−９結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも５個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項５に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項７】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも８個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも１０個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも１２個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも１４個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも１６個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１２】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも１８個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも２０個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項６に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の推定上の結合ドメインの少なくとも１個のアミノ酸と隣接するかまたはそれらを含むペプチドを含む、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１５】
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ        （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                  （配列番号５）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳ                  （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                      （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                        （配列番号８）、および
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                      （配列番号９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項１６】
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ        （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                  （配列番号５）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳ                  （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                      （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                        （配列番号８）、および
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                      （配列番号９）、
を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の前記推定上の結合ドメインの作動薬または拮抗薬として有用な単離ペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体。
【請求項１７】
請求項１６に記載の１種もしくは複数種のペプチドに対して結合し、かつ請求項１〜４のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の推定上の結合ドメインの作動薬または拮抗薬として有用な抗体または抗体断片。
【請求項１８】
アミノ酸配列：
（Ｘ）２２ＱＣＳ（Ｘ）１０ＬＧＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＶＬＨＹＧＬ（Ｘ）６Ｉ（Ｘ）３Ｌ（Ｘ）２ＥＬ（Ｘ）３３Ｙ（配列番号１０）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、前記結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩ型受容体結合ドメイン。
【請求項１９】
アミノ酸配列：
（Ｘ）４１ＩＩＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＶＰＩＳＩＬ（Ｘ）８ＬＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号１１）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、前記結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩＩ型受容体結合ドメイン。
【請求項２０】
アミノ酸配列：
（Ｘ）２８Ｆ（Ｘ）Ｖ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＮＹＣ（Ｘ）１４ＰＮＨＡ（Ｘ）ＩＱ（Ｘ）２Ｖ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＧＭＩＡ（Ｘ）５Ｒ（配列番号１２）
（式中、前記アミノ酸（Ｘ以外）は、前記ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、前記二量化結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上の二量化結合ドメイン。
【請求項２１】
Ｘが図２中に示されるＧＤＦ−９Ｂ配列内に存在するアミノ酸残基を示す、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の推定上の結合ドメイン。
【請求項２２】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２の１つもしくは複数の前記推定上のＧＤＦ−９Ｂ結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬。
【請求項２３】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも５個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２２に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２４】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも８個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２５】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１０個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２６】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１２個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２７】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１４個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２８】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１６個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項２９】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも１８個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項３０】
配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも２０個の隣接アミノ酸のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２３に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項３１】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の推定上の結合ドメインの少なくとも１個のアミノ酸と隣接するかまたはそれらを含むペプチドを含む、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項３２】
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ          （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                      （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                    （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）                  （配列番号１６）、
ＰＩＳＩＬＬＩＥＡＮＧＳＩＬ（Ｃ）                （配列番号１７）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                          （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ                  （配列番号１９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の作動薬または拮抗薬。
【請求項３３】
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ          （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                      （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                    （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）                  （配列番号１６）、
ＰＩＳＩＬＬＩＥＡＮＧＳＩＬ（Ｃ）                （配列番号１７）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                          （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ                  （配列番号１９）、
を含む群から選択される請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の推定上の結合ドメインの作動薬または拮抗薬として有用な単離ペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体。
【請求項３４】
請求項３３に記載の１種もしくは複数種のペプチドに対して結合し、かつ請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の推定上の結合ドメインの作動薬または拮抗薬として有用な抗体または抗体断片。
【請求項３５】
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、請求項１〜４および１８〜２１のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＩ型もしくはＩＩ型受容体結合ドメインおよび／または二量化結合ドメインと相互作用し、かつそれらの生物学的活性を変化させることが可能な、請求項５〜１５および２２〜３２のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
雌哺乳動物の排卵率を調節する方法であって、配列番号４〜９および１３〜１９から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の有効量を前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項３７】
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、請求項５〜１８および２２〜３２のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬。
【請求項３８】
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、請求項１６または３３に記載の１種もしくは複数種のペプチドの使用。
【請求項３９】
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、請求項１７または３４に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片の使用。
【請求項４０】
雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、ａ）請求項１６または３３に記載の１種もしくは複数種のペプチドおよびｂ）請求項１７または３４に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片の使用であって、前記薬剤がａ）およびｂ）の分割、連続または同時投与を意図して調合される、使用。
【請求項４１】
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項５〜１５および２２〜３２のいずれか一項に記載の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬を含む医薬組成物。
【請求項４２】
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項１６または３３に記載の１種もしくは複数種のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４３】
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに請求項１７または３４に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片を含む医薬組成物。
【請求項４４】
医薬的に許容される担体または賦形剤とともに、ａ）請求項１６または３３に記載の１種もしくは複数種のペプチドおよびｂ）請求項１７または３４に記載の１種もしくは複数種の抗体または抗体断片を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子上の機能的に重要な新規ドメインの同定、ならびにそれらと相互作用し、これらの分子の生物学的活性を調節することで哺乳動物卵巣機能および排卵率を変化させるための作動薬および拮抗薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ（ＢＭＰ１５としても知られる）は、発達中の卵胞の卵母細胞内で発現され、哺乳動物の受精能（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）に関与する（フィッツパトリック（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ）ら、１９９８年）。ＧＤＦ−９は形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーであり（マクヘロン（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ）およびリー（Ｌｅｅ）、１９９３年）、卵胞発達の初級段階から排卵に至るまで卵母細胞内で発現される（マクグラス（ＭｃＧｒａｔｈ）ら、１９９５年；ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年）。ＧＤＦ−９ＢはＧＤＦ−９と密接な関連があり（デュベ（Ｄｕｂｅ）ら、１９９８年；ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年）、マウス卵母細胞内ではＧＤＦ−９と同時に発現されるが、ヒト一次卵胞内ではＧＤＦ−９よりもやや遅れて発現される。今では卵巣内でのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ヒト（アールトーネン（Ａａｌｔｏｎｅｎ）ら、１９９９年）、齧歯動物（ライティネン（Ｌａｉｔｉｎｅｎ）ら、１９９８年；デュベ（Ｄｕｂｅ）ら、１９９８年；ヤーティネン（Ｊａａｔｉｎｅｎ）ら、１９９９年）、反芻動物（ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、１９９９年；ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、２０００年；ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）および有袋動物（エッケリー（Ｅｃｋｅｒｙ）ら、２００２年）における発達中の卵母細胞内で発現されることが判明している。ヒツジでは、ＧＤＦ−９の発現が原始卵胞内で見られる一方、ＧＤＦ−９Ｂは一次卵胞内で発現される（ボーデンスタイナー（Ｂｏｄｅｎｓｔｅｉｎｅｒ）ら、１９９９年；ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）。
【０００３】
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ＴＧＦβファミリーの大部分の他のメンバーのように、シグナルペプチド、プロ領域および生物活性ペプチドであるＣ末端成熟領域を含むプレプロペプチドとしてコードされる。成熟領域のプロ領域からの切断が、細胞内フリン様プロテアーゼによって行われ、かつ保存されたフリンプロテアーゼ切断部位で生じる。ＴＧＦβスーパーファミリーの大部分のメンバーは二量体として生物活性を示し、またＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂはほぼすべてのファミリーメンバー内に見られる鎖間のジスルフィド共有結合を担うシステイン分子を含有しないが、これらの分子は二量体として生物活性を示すと考えられる（ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年；ヤン（Ｙａｎ）ら、２００１年）。しかし、生理活性を示す二量体がホモ二量体（ＧＤＦ９−ＧＤＦ９およびＧＤＦ９Ｂ−ＧＤＦ９Ｂ）であるかまたはヘテロ二量体（ＧＤＦ９−ＧＤＦ９Ｂ）であるか、あるいは３種の二量体形態がすべて関与するか否かについては定かではない。上記モデルに基づき、ＧＤＦ−９ホモ二量体がマウスにおいてより重要な役割を果たすがヒツジではＧＤＦ−９Ｂホモ二量体が最も生物活性が高いと仮定されている（ヤン（Ｙａｎ）ら、２００１年）。かかる差異のいずれもが、ヒツジが（通常、１周期当たり卵１個のみを成熟させる）単一排卵動物である一方、マウスは多排卵動物であるという事実に関係するか否かは定かではない。明らかに、ＧＤＦ−９とＧＤＦ−９Ｂの双方は哺乳動物における受精能の制御および維持に重要な役割を果たし、それらの作用の性質を理解することは治療の発展にとって不可欠である。
【０００４】
ジェフリー（Ｊｅｆｆｅｒｙ）ら、２００３年では、バイオインフォマティクスツール（ＧｏＣｏｒｅ）が使用され、機能的に重要な領域の同定を意図して、多種のＴＧＦ−βファミリーメンバー間および異なる種間のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂにおける保存領域について分析した。しかし、この試験は、インビボでの排卵の調節に対する効果を有する機能的に重要であり得る部位として同定された領域と相関がなかった。
【０００５】
ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ分子に対して機能的に重要なドメインを同定し、かつかかるドメインまたはかかるドメインの模倣体と相互作用し、それらの生物学的活性を調節することによりインビボで哺乳動物の卵巣機能および排卵率を調節する作動薬および拮抗薬を同定し、かつ／あるいは公共に有用な選択肢を与えることが本発明の目的である。
【０００６】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも部分的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｉｎ  ｐａｒｔ  ｏｆ）」、すなわち、この用語を含む独立請求項を解釈する場合、各請求項中のこの用語によって前置きされた特徴がすべて存在する必要があるが、他の特徴も存在しうることを意味する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子上の機能的に重要な新規ドメインの同定に基づき、それらと相互作用する作動薬および拮抗薬に関する。
【０００８】
より詳細には、本発明は、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩ型およびＩＩ型受容体結合ドメインの同定および特徴づけならびにＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの推定上の二量化結合ドメインに基づき、かつそれらと相互作用する作動薬および拮抗薬に関する。
【０００９】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）３２ＥＣＥ（Ｘ）１０ＬＫＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＡＶＧＨＲＹ（Ｘ）６Ｍ（Ｘ）２ＮＩ（Ｘ）２ＥＫ（Ｘ）３３Ｙ（配列番号１）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩ型受容体結合ドメインに関する。
【００１０】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）５１ＩＶＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＳＰＬＳＶＬ（Ｘ）８ＡＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号２）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩＩ型受容体結合ドメインをさらに提供する。
【００１１】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）２６Ｆ（Ｘ）１１Ｆ（Ｘ）Ｌ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＲＹＣ（Ｘ）１４ＰＶＨＴ（Ｘ）ＶＱ（Ｘ）２Ｉ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＤＭ（Ｘ）Ａ（Ｘ）５Ｒ（配列番号３）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、二量化結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９の推定上の二量化結合ドメインをさらに提供する。
【００１２】
配列番号１、２および３中のＸは、図１中に示されるＧＤＦ−９配列内に存在するアミノ酸残基を示す。Ｘのアミノ酸は、本発明の推定上の結合ドメインの一部を形成することはない。Ｘ以外のアミノ酸記号は、下記の表１に示される一文字コードに対応する。
【００１３】
本発明は、配列番号１、配列番号２および配列番号３を含む群から選択される１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬をさらに提供する。
【００１４】
作動薬または拮抗薬は、好ましくは、配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも５個の隣接アミノ酸を含むペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、ペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。本発明のペプチドは、好ましくは推定上の結合ドメインの少なくとも１個のアミノ酸に隣接するかまたはそれらを含む。
【００１５】
最も好ましくは、作動薬または拮抗薬は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ            （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                      （配列番号５）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳ                      （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                          （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                            （配列番号８）、および
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                          （配列番号９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。
【００１６】
括弧内のアミノ酸は、場合によって抱合目的に添加されるアミノ酸を示し、本質的にＧＤＦ−９配列と対応することはない。
【００１７】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）２２ＱＣＳ（Ｘ）１０ＬＧＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＶＬＨＹＧＬ（Ｘ）６Ｉ（Ｘ）３Ｌ（Ｘ）２ＥＬ（Ｘ）３３Ｙ（配列番号１０）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩ型受容体結合ドメインにも関する。
【００１８】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）４１ＩＩＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＶＰＩＳＩＬ（Ｘ）８ＬＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号１１）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩＩ型受容体結合ドメインも提供する。
【００１９】
本発明は、アミノ酸配列：
（Ｘ）２８Ｆ（Ｘ）Ｖ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＮＹＣ（Ｘ）１４ＰＮＨＡ（Ｘ）ＩＱ（Ｘ）２Ｖ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＧＭＩＡ（Ｘ）５Ｒ（配列番号１２）
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、二量化結合ドメインを形成する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上の二量化結合ドメインも提供する。
【００２０】
配列番号１０、１１および１２中のＸは、図２中に示されるＧＤＦ−９Ｂ配列内に存在するアミノ酸残基を示す。Ｘのアミノ酸は、本発明の推定上の結合ドメインの一部を形成することはない。Ｘ以外のアミノ酸記号は、下記の表１に示される一文字コードに対応する。
【００２１】
本発明は、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む群から選択される１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９Ｂ結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬をさらに提供する。
【００２２】
作動薬または拮抗薬は、好ましくは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも５個の隣接アミノ酸を含むペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、ペプチドは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。本発明のペプチドは、好ましくは推定上の結合ドメインのアミノ酸に隣接するかまたはそれらを含む。
【００２３】
最も好ましくは、作動薬または拮抗薬は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ            （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                        （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                      （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）                    （配列番号１６）、
ＰＩＳＩＬＬＩＥＡＮＧＳＩＬ（Ｃ）                  （配列番号１７）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                            （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ                    （配列番号１９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。
【００２４】
括弧内のアミノ酸は、場合によって抱合目的に添加されるアミノ酸を示し、本質的にＧＤＦ−９Ｂ配列と対応することはない。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、上で定義された、１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＩ型もしくはＩＩ型受容体結合ドメインおよび／または二量化結合ドメインと相互作用し、かつそれらの生物学的活性を変化させることが可能な１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含む、雌哺乳動物の排卵率を調節する方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、本発明は、配列番号４〜９および１３〜１９から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含む、雌哺乳動物の排卵率を調節する方法を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、上で定義された、１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＩ型もしくはＩＩ型受容体結合ドメインおよび／または二量化結合ドメインと相互作用可能な１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬の使用を提供する。
【００２８】
好ましくは、本発明は、雌哺乳動物の排卵率を調節するための薬剤の製造における、配列番号４〜９および１３〜１９を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに、上で定義された、１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢのＩ型もしくはＩＩ型受容体結合ドメインおよび／または二量化結合ドメインと相互作用可能な１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
好ましくは、組成物は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに、配列番号４〜９および１３〜１９を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。
【００３１】
図面の説明
ここで、本発明を、以下の添付図面における図面を参照して詳細に説明する：
図１は、ヒツジＧＤＦ−９上の配列番号４〜９のペプチドの位置を示す；
図２は、ヒツジＧＤＦ−９Ｂ上の配列番号１３〜１９のペプチドの位置を示す；
図３は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＩ型およびＩＩ型受容体の結合複合体を示す；
図４ａおよび図４ｂは、異なる方向でのＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
図４ｃは、ＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上のＩＩ型受容体結合ドメインを示す。
図４ｄは、ＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上の二量化結合ドメインを示す。
図５ａおよび図５ｂは、異なる方向でのＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
図５ｃは、ＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上のＩＩ型受容体結合ドメインを示す。
図５ｄは、ＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上の二量化結合ドメインを示す。
図６ａから６ fは、多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
図７は、ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号１４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
図８は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号８）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、５回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
図９は、ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号１９）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。２つの独立抗体試料から得られる結果を示す。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
図１０は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号６）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
図１１は、ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号８）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのネズミ（ｍ）ＧＤＦ−９およびヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｍＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｍＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩ型、ＩＩ型および二量化結合ドメインを提供する。これらのドメインと相互作用する作動薬または拮抗薬によるこれらのドメインの刺激または阻害が雌哺乳動物の排卵率の調節において有効であることが仮定される。
【００３３】
本発明に至るまでの研究では、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂにおける推定上のＴＧＦ−βのＩ型およびＩＩ型受容体結合ドメインならびに推定上の二量化結合ドメインの三次元構造が、これらのドメインに結合し、かつそれらの生物学的活性をインビボにおいて増強または減弱することが潜在的に可能な作動薬および拮抗薬の分子解析において用いられた。３−Ｄ分子構造ならびに推定上のＩ型、ＩＩ型および二量化結合ドメインは、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂに対する図４ａ〜４ｄおよび図５ａ〜５ｄの中でそれぞれ示される。
【００３４】
スイス（Ｓｗｉｓｓ）モデルの比較タンパク質モデリングサーバー（シュヴェーデ（Ｓｃｈｗｅｄｅ）ら、２００３年）を使用し、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、Ａｌｋ６エクトドメインおよびＢＭＰＲ２エクトドメインの推定上の三次元構造が作成された。ＢＭＰ２（キルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ）ら、２０００年）およびＢＭＰ７（グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）およびスコット（Ｓｃｏｔｔ）、１９９５年）がＢＭＰ１５に対する鋳型として用いられた。Ａｌｋ３エクトドメイン（キルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ）ら、２０００年）がＡｌｋ６エクトドメインに対する鋳型として用いられた。ＡｃｔＲ２エクトドメイン（グリーンウォルド（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）ら、２００２年）がＢＭＰＲ２エクトドメインに対する鋳型として用いられた。推定上のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＩ型結合ドメインは、ＢＭＰ２のそのＩ型受容体ＡＬＫ３への結合のモデルを用いたＣｈｉｍｅｒａマッチメーカーホモロジー（ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）（ペッテルソン（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ）ら、２００４年）によって判定された（キルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ）ら、２０００年）。推定上のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＩＩ型結合ドメインは、ＢＭＰ７のそのＩＩ型受容体ＡｃｔＲ２への結合のモデルを用いたホモロジーによって判定された（グリーンウォルド（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）ら、２００２年）。ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの推定上の二量化結合ドメインは、ＢＭＰ２二量化のモデルを用いたホモロジーによって判定された（キルシュ（Ｋｉｒｓｃｈ）ら、２０００年）。Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、サンフランシスコ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）（ＮＩＨ  Ｐ４１  ＲＲ−０１０８１による支援）からのＵＣＳＦ  Ｃｈｉｍｅｒａパッケージを使用し、分子グラフィック画像が生成された（ペッテルソン（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ）ら、２００４年）。
【００３５】
次いで、推定上の結合ドメインの配列は、多数の異なる種におけるＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂタンバク質の対応する配列、ならびにＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢにおけるＩ型、ＩＩ型および二量化結合ドメインに対応する図６ａ〜６ｆに示される判定されたコンセンサス配列とそれぞれ比較された。
【００３６】
次いで、多数のペプチドが合成され、それらは、推定上の結合ドメイン内の配列またはそれらと重なる配列と対応されるかあるいは推定上の結合ドメインに隣接され、かつインビボで投与される場合、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性に対してアゴニスト効果もしくはアンタゴニスト効果を有すると予想された。特に、ペプチドの三次元構造に従って分子の外側に存在し；分子の可動領域内に存在し；少なくとも９個のアミノ酸の長さを有し；他のＴＧＦベータファミリーメンバーと非相同性であり；他の既知のタンパク質とは非収束性であり；グリコシル化部位を含まない領域内にあり；かつ担体タンパク質に結合可能であるように、ペプチドが設計された。これらの要素を組み合わせる結果、生物学的活性に影響を与えかつ交差反応の問題を有することのない抗体を産生するのに使用可能なペプチドが生成されると考えられた。
【００３７】
したがって、第１の実施形態では、本発明は、
１．アミノ酸配列：
（Ｘ）３２ＥＣＥ（Ｘ）１０ＬＫＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＡＶＧＨＲＹ（Ｘ）６Ｍ（Ｘ）２ＮＩ（Ｘ）２ＥＫ（Ｘ）（配列番号１）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩ型受容体結合ドメイン、
２．アミノ酸配列：
（Ｘ）５１ＩＶＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＳＰＬＳＶＬ（Ｘ）８ＡＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号２）
を含むＧＤＦ−９の推定上のＩＩ型受容体結合ドメイン、および
３．アミノ酸配列：
（Ｘ）２６Ｆ（Ｘ）１１Ｆ（Ｘ）Ｌ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＲＹＣ（Ｘ）１４ＰＶＨＴ（Ｘ）ＶＱ（Ｘ）２Ｉ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＤＭ（Ｘ）Ａ（Ｘ）５Ｒ（配列番号３）
を含むＧＤＦ−９の推定上の二量化結合ドメイン
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９分子が三次元の三次構造をなす場合、推定上の結合ドメインを形成し、かつ残りのアミノ酸記号は、下記表１に示される１文字コードに対応する）
を含むＧＤＦ−９の推定上の結合ドメインに関する。
【００３８】
配列番号１、２および３中のＸは、図１中に示されるＧＤＦ−９配列内に存在するアミノ酸残基を示し、本発明の推定上の結合ドメインの一部を形成することはない。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号１〜３を含む群から選択される１つもしくは複数の推定上のＧＤＦ−９結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬に関する。
【００４０】
好ましくは、作動薬または拮抗薬は、配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも５個の隣接アミノ酸を含むペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、ペプチドは、配列番号１、配列番号２または配列番号３の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。本発明のペプチドは、好ましくは推定上の結合部位の少なくとも１個のアミノ酸に隣接するかまたはそれらを含む。
【００４１】
最も好ましくは、作動薬または拮抗薬は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ            （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                      （配列番号５）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳ                      （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                          （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                            （配列番号８）、および
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                          （配列番号９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。
【００４２】
括弧内のアミノ酸は、場合によって抱合目的に添加されるアミノ酸を示し、本質的にＧＤＦ−９配列と対応することはない。
【００４３】
第２の実施形態では、本発明は、
１．アミノ酸配列：
（Ｘ）２２ＱＣＳ（Ｘ）１０ＬＧＷ（Ｘ）２ＷＩ（Ｘ）１６ＲＶＬＨＹＧＬ（Ｘ）６Ｉ（Ｘ）３Ｌ（Ｘ）２ＥＬ（Ｘ）３３Ｙ（配列番号１０）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩ型受容体結合ドメイン、
２．アミノ酸配列：
（Ｘ）４１ＩＩＡＰＨ（Ｘ）Ｙ（Ｘ）４７ＶＰＩＳＩＬ（Ｘ）８ＬＹ（Ｘ）６Ｉ（配列番号１１）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上のＩＩ型受容体結合ドメイン、および
３．アミノ酸配列：
（Ｘ）２８Ｆ（Ｘ）Ｖ（Ｘ）４Ｌ（Ｘ）Ｗ（Ｘ）９Ｙ（Ｘ）ＰＮＹＣ（Ｘ）１４ＰＮＨＡ（Ｘ）ＩＱ（Ｘ）２Ｖ（Ｘ）７ＶＰ（Ｘ）ＰＳＣＶＰ（Ｘ）２Ｙ（Ｘ）２０ＧＭＩＡ（Ｘ）５Ｒ（配列番号１２）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上の二量化結合ドメイン
（式中、アミノ酸（Ｘ以外）は、ＧＤＦ−９Ｂ分子が三次元の三次構造をなす場合、推定上の結合ドメインを形成し、かつ残りのアミノ酸記号は、下記表１に示される１文字コードに対応する）
を含むＧＤＦ−９Ｂの推定上の結合ドメインに関する。
【００４４】
配列番号１０、１１および１２中のＸは、図２中に示されるＧＤＦ−９Ｂ配列内に存在するアミノ酸残基を示し、本発明の推定上の結合ドメインの一部を形成することはない。
【００４５】
本発明は、配列番号１０〜１２を含む群から選択される１つもしくは複数の推定上の結合ドメインと相互作用可能な作動薬または拮抗薬にも関する。
【００４６】
好ましくは、作動薬または拮抗薬は、配列番号１０〜１２の少なくとも５個の隣接アミノ酸を含むペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片である。好ましくは、ペプチドは、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個または少なくとも２０個の隣接アミノ酸、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。本発明のペプチドは、好ましくは推定上の結合ドメインの少なくとも１個のアミノ酸に隣接するかまたはそれらを含む。
【００４７】
最も好ましくは、作動薬または拮抗薬は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ      （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                  （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）              （配列番号１６）、
ＰＩＳＩＬＬＩＥＡＮＧＳＩＬ（Ｃ）            （配列番号１７）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                      （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ              （配列番号１９）、
を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチド、あるいはそれらの機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片を含む。
【００４８】
括弧内のアミノ酸は、場合によって抱合目的に添加されるアミノ酸を示す。
【００４９】
本発明のペプチドは、既知の技術を用いて合成されうる。本発明のペプチドの類似体、誘導体または変異体は、配列修飾または非配列修飾（ｎｏｎ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）を含みうる。非配列修飾は、アセチル化、メチル化、ホスホメチレーション（ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシル化またはグリコシル化を含みうる。
【００５０】
本発明において例示される特異的結合部位のペプチドは、図１および図２中で示されるそれらのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ分子上の位置に関連してそれぞれ示される。
【００５１】
第３の実施形態では、本発明は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ                （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                          （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                              （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                                （配列番号８）、
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                              （配列番号９）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ                （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                            （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                          （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）                        （配列番号１６）、
ＰＩＳＩＬＬＩＥＡＮＧＳＩＬ（Ｃ）                      （配列番号１７）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                                （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ                        （配列番号１９）、
を含む群から選択される単離ペプチド、あるいはその機能的誘導体、相同体、類似体または模倣体に関する。
【００５２】
第４の実施形態では、本発明は、配列番号４〜９および１３〜１９における１種もしくは複数種のペプチドに属する抗体または抗体断片に関する。
【００５３】
好ましい類似体は、本発明の配列に対し、ペプチドの生物学的活性に作用しない１つもしくは複数の保存的アミノ酸の置換、欠失または挿入の分だけ異なる配列を有するペプチドを含む。保存的置換は、典型的には１個のアミノ酸と類似する特徴を有する別のアミノ酸との置換、例えば、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの群の中での置換を含む。保存的置換の例を図６ａ〜６ｆ中のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列内に見出すこともでき、それにより、異なる哺乳動物種における置換が、コンセンサス配列と比較して示される。下記表１から他の保存的置換を得ることができる。
【００５４】
【表１】
2008521892.tif 000002
【００５５】
他の類似体は、ペプチドの安定性を高める修飾を有するペプチドを含む。かかる類似体は、例えばペプチド配列内で（ペプチド結合を置換する）１つもしくは複数の非ペプチド結合を含みうる。自然発生Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸、または非自然発生合成アミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸および環状類似体を含む類似体も含まれる。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の双方を含む雌哺乳動物の排卵率を調節する方法における本発明の作動薬および拮抗薬の使用を提供する。かかる非ヒト哺乳動物は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ブタ、ウマ、ラクダ科哺乳類、フクロネズミ、マーモセット、ネコ、イヌおよび他の商業的に重要な種などの非ヒト霊長類を含む。
【００５７】
本方法は、１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬、あるいはそれらの機能的変異体、あるいはそれらに結合する抗体または抗体断片の有効量を該哺乳動物に投与するステップを含みうる。
【００５８】
治療されるべき哺乳動物のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂに対応する結合部位ペプチドが、下記表１中に示されるように、本発明の方法において使用されることになると考えられる。
【００５９】
【表２】
2008521892.tif 000003
【表３】
2008521892.tif 000004
【００６０】
排卵率の調節は、本発明の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬の雌哺乳動物への投与の結果、抗体がインビボで該１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬に対して産生され、次いでＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ上の特定の結合ドメインに結合してそれらの生物学的活性に作用することによる、該動物の排卵率の増減を含みうる。
【００６１】
理論に縛られずに、作動薬／拮抗薬ならびに特に配列番号４〜１０および１４〜２０を含む群から選択される１種もしくは複数種のペプチドに対して産生された１種もしくは複数種の抗体による、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９ＢにおけるＩ型、ＩＩ型および／または二量化結合ドメインの結合により、生物活性を示すＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度の変化がもたらされると考えられる。かかる低下がＧＤＦ−９Ｂ活性における約５０％の低下を含む場合、排卵率の増加がこれまで観察されており、特にＨａｎｎａヒツジの場合、ＧＤＦ−９Ｂ遺伝子において単一の点突然変異が生じた結果、ヘテロ接合体動物における活性のあるＧＤＦ−９Ｂの量が半分になり、排卵率や双子出産が増加したはずである。ホモ接合体動物では、活性のあるＧＤＦ−９Ｂの循環が全くないかまたは極めて少ない場合、動物は不妊であった（ギャロウェイ（Ｇａｌｌｏｗａｙ）ら、２０００年）。同様に、ＧＤＦ−９遺伝子における点突然変異およびそれに伴う排卵率における調節がヒツジにおいて観察されている（国際公開第０３／１０２１９９号パンフレット；ハンラハン（Ｈａｎｒａｈａｎ）ら、２００３年）。
【００６２】
したがって、活性のあるＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度において約５０％の低下をもたらす本発明の作動薬または拮抗薬あるいはそれらの併用によって排卵率の増加がもたらされる一方、活性のあるＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの循環濃度において約ゼロに至る低下をもたらす作動薬または拮抗薬あるいはそれらの併用により、雌哺乳動物における排卵および滅菌の低下がもたらされると仮定されている。
【００６３】
好ましくは、本発明の作動薬または拮抗薬は、配列番号１、２、３、１０、１１および１２のＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂのコンセンサス結合ドメインに結合する抗体である。「抗体」という用語は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２断片、ＳｃＦｖ分子などを含むがこれらに限定されない、本明細書において定義されるコンセンサス結合ドメインに対する結合能を保持する抗体の断片または類似体を包含することは理解される必要がある。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうるが、好ましくはモノクローナルである。かかる抗体は、動物への投与、すなわち受動免疫における使用を意図した当該技術で既知の任意の技術（例えば、ジュエンゲル（Ｊｕｅｎｇｅｌ）ら、２００２年）によって調製されうる。あるいは、かかる抗体は、適切なアジュバント中での、すなわち能動免疫における使用を意図した抗原の投与によってインビボで産生されうる。適切なアジュバントには、フロイント完全または不完全アジュバント、ＤＥＡＥデキストランあるいは類似の免疫賦活剤が含まれる。本発明の抗体を、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能な、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含む、キメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体などの遺伝子工学的方法によって産生することが可能である。
【００６４】
本発明では、本発明の１種もしくは複数種の作動薬および／または拮抗薬と、排卵率を調節して排卵に対する効果を高めることで知られる１種もしくは複数種の活性成分との併用についてさらに検討される。活性成分は、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰＲＩＩ、ＢＭＰＩＢ受容体（ＡＬＫ６）、ＡＬＫ５およびＢＭＰ６を含む群、あるいはそれらの機能的断片または変異体から選択されうる。特に本発明では、雌哺乳動物での排卵の調節における、ＢＭＰ１Ｂ受容体と配列番号１３〜１９のペプチドに結合する抗体または抗体断片（Ｆｃ）との併用について検討される。
【００６５】
本発明は、本発明の少なくとも１種の作動薬または拮抗薬を、排卵率の調節に対して有用な医薬的に許容される担体とともに含む医薬組成物をさらに提供する。
【００６６】
本発明の作動薬または拮抗薬における生物学的活性が動物モデルまたはインビトロモデルにおいて試験され、かつ適切に活性を示す化合物が医薬組成物中に調合されることが検討される。本発明の医薬組成物は、本発明の１種もしくは複数種の作動薬または拮抗薬に加え、医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当該技術で周知の他の物質を含みうる。かかる物質は、毒性がなく、活性成分の有効性と干渉しない必要がある。担体または他の物質の正確な性質は、医薬組成物の望ましい性質、および経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、筋肉内または腹腔内を例とする投与経路に依存することになる。
【００６７】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、粉剤、散剤または液体形態でありうる。錠剤または他の固体経口剤形は、通常、一般に医薬品製造において使用される、ゼラチン、澱粉、マンニトール、結晶セルロース、または他の不活性物質などの固体担体を含むことになる。同様に、シロップ剤または乳剤などの液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含むことになる。
【００６８】
静脈内、皮膚、皮下、皮内または腹腔内注射において、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態で存在することになる。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明では、本発明の医薬組成物との同時投与によって治療計画（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅ）に対する相加または相乗効果が得られる、１種もしくは複数種のさらなる排卵調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｏｖｕｌａｔｉｏｎ）の使用について検討する。排卵のかかるさらなる調節剤の例として、卵胞刺激ホルモン、Ａｎｄｒｏｖａｘ（アンドロステンジオンタンパク質の抱合体ワクチン）、およびステロイドホルモンが挙げられる。かかる調節剤は、当業者によって理解されるように、排卵が促進されるべきかまたは抑制されるべきかに応じ、本発明の少なくとも１種の作動薬または拮抗薬とともに分割投与、連続投与または同時投与されうる。
【００７０】
本発明の医薬組成物の投与は、好ましくは、個人に対して所望の利益を示すのに十分な「治療有効量」で行われる。実際の投与量、ならびに投与の頻度および時間推移は、雌哺乳動物の基礎症状における性質および重症度に依存することになる。例えば、用量に関する決定などの治療処方は、一般医師および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療を要する疾患、個別患者の症状、送達部位、投与方法および医師に既知の他の要素が考慮されている。上記の技術およびプロトコルの例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、オスロ  Ａ．（Ｏｓｌｏ  Ａ．）（編）、１９８０年の中に見出されうる。
【００７１】
ここで本発明は、特定の実施例を参照することによってより詳細に記載され、本発明の範囲を限定する任意の方法などで解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
排卵を操作するためのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ上の推定上のＩ型およびＩＩ型受容体ドメインおよび推定上の二量化ドメインに対するペプチドおよび抗体の使用
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ  ３−Ｄタンパク質配列上の推定上のＴＧＦ−βＩ型、ＩＩ型および二量化結合ドメインに対応し、かつ必要に応じてスカシガイヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）に対する抱合を促進して抗原を生成するための付加残基を含む、１２個の１０〜１８ｍｅｒペプチドを合成した。ペプチド配列は、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳＰＶＨＴＭ        （配列番号４）、
ＦＳＱＬＫＷＤＮＷＩＶＡ（Ｃ）                  （配列番号５）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＡＶＧＨＲＹＧＳ                  （配列番号６）、
ＳＶＰＲＰＳＣＶＰＡＫＹＳ                      （配列番号７）、
ＧＳＩＡＹＫＥＹＥ（Ｃ）                        （配列番号８）、
ＡＫＹＳＰＬＳＶＬＡ（Ｃ）                      （配列番号９）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳＰＮＨＡＩ        （配列番号１３）、
ＳＦＱＱＬＧＷＤＨＷＩ（Ｃ）                    （配列番号１４）、
Ｃ（ＧＧ）ＰＲＶＬＨＹＧＬＮＳ                  （配列番号１５）、
ＮＶＰＱＰＳＣＶＰＹＫＹＶ（Ｃ）                （配列番号１６）、
ＧＳＩＬＹＫＥＹＥ（Ｃ）                        （配列番号１８）、および
Ｃ（ＧＧ）ＶＰＹＫＹＶＰＩＳＩＬ                （配列番号１９）、
であった。
【００７３】
本試験では、無発情期のロムニー雌ヒツジ（Ｒｏｍｎｅｙ  ｅｗｅｓ）１０頭の群にフロイント完全アジュバント中の０．４ｍｇ／雌ヒツジの各ペプチド−ＫＬＨ抗原抱合体を注射し、対照群として１０頭の無発情期のロムニー雌ヒツジに０．４ｍｇ／雌ヒツジのＫＬＨ抗原を注射した。次いで１か月間隔で４回、スパン（Ｓｐａｎ）／トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）／油混合物中のさらなる抗原（各回、０．２ｍｇ／雌ヒツジ）で動物を追加免疫し（皮下）、精管切除術がなされた雄ヒツジを用いて繁殖期間にわたり発情活性（ｏｅｓｔｒｏｕｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を監視した。４回の連続する発情周期にわたり、かつ最後の腹腔鏡検査から約２０〜３０日後の実験完了時に再度、腹腔鏡によって排卵率を評価した。すべての対照雌ヒツジは周期的な発情活性を示した。下記の表２に、排卵率に対する配列番号４〜９および１３〜１６、１８および１９のペプチドの効果の結果を示す。
【００７４】
【表４】
2008521892.tif 000005
【００７５】
ＧＤＦ−９のＩ型受容体結合部位に特異的なペプチド（配列番号４〜６）およびＧＤＦ−９ＢのＩ型受容体結合部位に特異的なペプチド（配列番号１３〜１５）では、対照（ＫＨＬ）雌ヒツジの場合と比べて排卵率の顕著な変化が示された。
【００７６】
ＧＤＦ−９の二量化部位に特異的なペプチド（配列番号７）およびＧＤＦ−９のＩＩ型受容体結合部位に特異的なペプチド（配列番号９）は、処理した雌ヒツジの排卵率に対し、対照（ＫＨＬ）雌ヒツジの場合と比べて何らかの顕著な効果を有するようには見られなかった。しかし、（ＧＤＦ−９のＩＩ型受容体結合部位に特異的な）配列番号８のペプチドでは、４回目および５回目の観察時（すなわち３回の追加免疫注射後）に、雌ヒツジにおける排卵率の顕著な変化が示された。
【００７７】
ＧＤＦ−９ＢのＩＩ型受容体結合部位に特異的なペプチド（配列番号１８および１９）では、排卵率に関して顕著な変化が示された。配列番号１９のペプチドは、ＧＤＦ−９ＢのＩＩ型受容体における排卵の調節時に、最初の追加免疫注射後に排卵率に顕著に作用する点で配列番号１８のペプチドよりも有効であるように見られた。
【００７８】
ＧＤＦ−９Ｂの二量化部位に特異的なペプチド（配列番号１６）は、処理した雌ヒツジの５０％が排卵率の変化を示す場合の最終観察後に至るまで排卵率に対して全く顕著な効果を有しなかった。
【００７９】
実施例２
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチドに対して産生された抗体のインビトロでのラット顆粒膜細胞による３Ｈチミジンの取り込みに対する効果
様々な抗体製剤が過去に示された方法（マクナッティ（ＭｃＮａｔｔｙ）ら、２００５年）を用いて顆粒膜細胞培養物に直接添加される場合、ヒツジまたはネズミのＧＤＦ−９およびヒツジのＧＤＦ−９Ｂのラット顆粒膜細胞への効果に対するそれらの中和能について試験した。ＫＬＨで免疫したヒツジから精製したＩｇＧの均衡下で特定のＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂペプチドで免疫したヒツジから精製したＩｇＧからなる全部で１００μｇ／ｍｌのＩｇＧを各処理において添加した。抗体は、それらに対して特異的な成長因子の効果を中和させることができた（図７〜１１を参照）。図９では、対照抗体による抑制効果が少ないことが観察されても、ＧＤＦ−９Ｂ抗体試料によってチミジン取り込みがさらに抑制され、ＧＤＦ−９Ｂ抗体試料のいずれもが、チミジン取り込みに対するｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂの促進効果を完全に抑制でき、これはＧＤＦ−９Ｂの効果を特異的に遮断しつつあることを示した。同様に、図１０では、対照抗体による抑制効果が少ないことが観察されても、ＧＤＦ−９抗体によってチミジン取り込みがさらに抑制され、ＧＤＦ−９抗体試料が、チミジン取り込みに対するｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂの促進効果を完全に抑制でき、これはＧＤＦ−９の効果を特異的に遮断しつつあることを示した。
【００８０】
タンパク質（例えば、配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１９）の特異的領域に特異的な抗体によるヒツジおよびネズミのＧＤＦ−９ならびにヒツジのＧＤＦ−９Ｂのインビトロでのラット顆粒膜細胞によるチミジン取り込みの取り込みに対する効果の中和は、インビボでのヒツジにおけるこれらのペプチドを用いた能動免疫の効果を併せて考慮すると（実施例１を参照）、タンパク質のこれらの領域のターゲティングによって複数の種におけるタンパク質の生物学的活性の遮断が可能であることを示している。これらの結果は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの成熟領域におけるこれらの領域に対する抗体がＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂを受動的に中和する場合に有効であることも示す。
【００８１】
要するに、本明細書において開示されたＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＩ型およびＩＩ型受容体の結合部位に特異的なペプチドは、雌哺乳動物における排卵率を変化させる場合に有用である。この試験からは、二量化部位に特異的なペプチドがインビボでの排卵への干渉時に有効であるように思われない。
【００８２】
本発明が明確さおよび理解を意図してある程度詳細に記載されている一方、本明細書に記載の実施形態および方法に対する様々な改良および変更を、本明細書に開示された本発明の範囲から逸脱することなく行うことが可能であることは当業者にとって明らかであろう。
【００８３】
以下のページでは参考文献が挙げられ、本明細書中に参照により援用される。
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【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、ヒトを含む雌哺乳動物における排卵率およびそれによる受精能を調節するための組成物および方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ヒツジＧＤＦ−９上の配列番号４〜９のペプチドの位置を示す。
【図２】ヒツジＧＤＦ−９Ｂ上の配列番号１３〜１９のペプチドの位置を示す。
【図３】ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９ＢのＩ型およびＩＩ型受容体の結合複合体を示す。
【図４ａ】異なる方向でのＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図４ｂ】異なる方向でのＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図４ｃ】ＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上のＩＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図４ｄ】ＧＤＦ−９における３−Ｄ分子構造および推定上の二量化結合ドメインを示す。
【図５ａ】異なる方向でのＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図５ｂ】異なる方向でのＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上のＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図５ｃ】ＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上のＩＩ型受容体結合ドメインを示す。
【図５ｄ】ＧＤＦ−９Ｂにおける３−Ｄ分子構造および推定上の二量化結合ドメインを示す。
【図６ａ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図６ｂ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図６ｃ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図６ｄ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図６ｅ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図６ｆ】多数の異なる種由来のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列相同性ならびに機能的に重要な様々な部位における推定上の配列を示す。
【図７】ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号１４）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
【図８】ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号８）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、５回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
【図９】ヒツジＧＤＦ−９Ｂペプチド（配列番号１９）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。２つの独立抗体試料から得られる結果を示す。対照培地で処理された細胞に対しては＊Ｐ＜０．０５、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
【図１０】ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号６）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｏＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｏＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５、ｂＰ＜０．０１。
【図１１】ヒツジＧＤＦ−９ペプチド（配列番号８）に対して免疫されたヒツジ由来のポリクローナル抗体の、バイオアッセイに直接添加される場合でのネズミ（ｍ）ＧＤＦ−９およびヒツジ（ｏ）ＧＤＦ−９Ｂで刺激されたラット顆粒膜細胞の３Ｈ−チミジン取り込みに対する効果を示す。横線は、対照培地（すなわちｍＧＤＦ−９またはｏＧＤＦ−９Ｂを含まない培地）で処理された顆粒膜細胞の応答レベルを示す。示されるデータは、３回の繰り返し実験の平均値および平均値の標準誤差である。対照培地で処理された細胞に対しては＊＊Ｐ＜０．０１、抗体を受けていない、ｍＧＤＦ−９およびｏＧＤＦ−９Ｂで処理された細胞に対してはａＰ＜０．０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ−１】
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【図６ａ−２】
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【図６ｂ−１】
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【図６ｂ−２】
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【図６ｃ−１】
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【図６ｃ−２】
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【図６ｄ−１】
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【図６ｄ−２】
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【図６ｅ−１】
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【図６ｅ−２】
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【図６ｆ−１】
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【図６ｆ−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月28日(2006.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
次いで、多数のペプチドが合成され、それらは、推定上の結合ドメイン内の配列またはそれらと重なる配列と対応されるかあるいは推定上の結合ドメインに隣接され、かつインビボで投与される場合、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性に対してアゴニスト効果もしくはアンタゴニスト効果を有すると予想された。特に、ペプチドの三次元構造に従って分子の外側に存在し；分子の可動領域内に存在し；少なくとも５個、好ましくは少なくとも９個のアミノ酸の長さを有し；他のＴＧＦベータファミリーメンバーと非相同性であり；他の既知のタンパク質とは非収束性であり；グリコシル化部位を含まない領域内にあり；かつ担体タンパク質に結合可能であるように、ペプチドが設計された。これらの要素を組み合わせる結果、生物学的活性に影響を与えかつ交差反応の問題を有することのない抗体を産生するのに使用可能なペプチドが生成されると考えられた。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月6日(2007.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008521892.tif 000051
2008521892.tif 000052
2008521892.tif 000053
2008521892.tif 000054