(57)【要約】本発明は、アラニンとの交叉反応性の結果としてもたらされるアラニン２，３アミノムターゼ（ＡＡＭ）活性を有する野性型酵素に対して、ＡＡＭ活性および／もしくは温度安定性を有するポリペプチドに関する。加えて、本発明は、本発のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含む核酸配列、プロモーターに作動可能に連結されたそのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、そのＡＡＭポリペプチドを発現するように形質転換された宿主細胞、および本発明のＡＡＭポリペプチドを産生するための方法に関する。
2008517607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニン２，３−アミノムターゼ活性を有するポリペプチド（特許請求の範囲において以下「ＡＡＭポリペプチド」）であって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するか；
（ｂ）配列番号２、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２、配列番号および配列番号３６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有するか；
（ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４および配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するか；
（ｄ）（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖、のいずれかと、高いストリンジェンシーの下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるポリペプチドであるか；あるいは
（ｅ）該（ｄ）のポリペプチドの改変体であって、該（ｄ）のポリペプチドからの１〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含み、かつｐＨ７．０〜７．６、２５℃において１細胞ＯＤ当たり毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有する改変体である、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２、配列番号および配列番号３６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４および配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９のヌクレオチド配列；（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖、のいずれかと、高いストリンジェンシーの下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記（ｄ）のポリペプチドの改変体であって、該（ｄ）のポリペプチドからの１〜６個のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含み、かつｐＨ７．０〜７．６、２５℃において１細胞ＯＤ当たり毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有する改変体である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６もしくは配列番号４８のアミノ酸配列を有する、ＡＡＭポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４６もしくは配列番号４８のアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のＡＡＭポリペプチド。
【請求項９】
配列番号２８もしくは配列番号３４のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のＡＡＭポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＡＡＭ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されかつ精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
プロモーターに作動可能に連結した、請求項１０または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを発現するように形質転換された、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のＡＡＭポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、（ａ）該ＡＡＭポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの産生に適した条件下で培養する工程；および（ｂ）該ＡＡＭポリペプチドを回収する工程を包含する方法。
【請求項１６】
凍結乾燥形態である、請求項１に記載のＡＡＭポリペプチド。
【請求項１７】
緩衝化媒体中に請求項１に記載のＡＡＭポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１８】
配列番号５９に対して５〜１１個のアミノ酸残基変化を有するＡＡＭポリペプチドまたはそのフラグメントであって、該残基変化は、Ｇ３０８Ｒ、Ｇ３０８Ｋ、Ｆ４１６Ｓ、Ｆ４１６Ｍ、Ｄ４４７Ｇ、Ｄ４４７Ｌ、Ｄ４４７Ａ、Ｄ４４７ＩおよびＤ４４７Ｖからなる群より選択される１〜３残基の変化を含む、ＡＡＭポリペプチドまたはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は酵素学の分野、特にアラニン２，３−アミノムターゼ（ＡＡＭ）酵素学の分野に関連している。より詳細には、本発明は、改良された酵素活性（すなわち高い基質代謝回転）および安定性を有するアラニン２，３−アミノムターゼポリペプチド、および改良されたアラニン２，３−アミノムターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。本発明は有用である。なぜなら、アラニン２，３−アミノムターゼポリペプチドは、パントテン酸もしくは３−ヒドロキシプロピオン酸などの合成有機化合物を高収量産生するために、他の酵素と結合体化し得るからである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
有機酸、エステル、およびポリオールなどの有機化合物は、プラスチック物質および他の産物の合成に使用され得る。有機化合物への高まる需要に答えるため、炭化水素よりむしろ炭水化物に基づく原材料を利用する、より効率的かつ費用効果の高い生産方法が開発され続けている。例えば、ある細菌は、ポリ乳酸の生成に使用される大量の乳酸を産生するために、使用されている。
【０００３】
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）は有機酸である。３−ＨＰを生成する、いくつかの化学合成ルートが記載され、生体触媒ルートもまた開示されている（例えば、Ｓｕｔｈｅｒｓらの特許文献１参照のこと。）。３−ＨＰは、専門的な合成に有用であり、化学産業において公知の方法によって、商用的に重要な中間体に転化され得る。この中間体は、例えば、脱水によるアクリル酸、酸化によるマロン酸、アルコールとのエステル化反応によるエステル、および還元による１，３−プロパンジオールである。
【０００４】
３−ＨＰ化合物は、ＰＥＰもしくはピルビン酸より、主要なβ−アラニン中間体（図１）を由来して生体触媒的に生成され得る。β−アラニンは、細胞内において、カルノシン、β−アラニルアルギニン、β−アラニルリジン、５．６−ジヒドロウラシルおよびＮ−カルバモイル−β−アラニン経由のウラシル、Ｎ−アセチル−β−アラニン、アンセリン、もしくはアスパラギン酸より合成され得る。しかしながら、これらのルートは、希少な前駆体もしくは３−ＨＰより価値の高い出発化合物を必要とするため、商業的に発展できない。それゆえ、生体触媒ルートを使用した３−ＨＰ生成は、α−アラニンを直接β−アラニンに転換（ＦＩＧ．１）し得れば、より効率的になる。不運にも、α−アラニンをβ−アラニンへ内部転換する、天然に存在する酵素は、まだ同定されていない。もし、アラニン２，３−アミノムターゼのような、α−アラニンのβ−アラニンへの転換を行う酵素活性が同定されれば、有利であろう。それゆえ、改善されたアラニン２，３−アミノムターゼ活性を持つ酵素を同定することは、本発明の１つの目的である。
【０００５】
リジン２，３−アミノムターゼ（ＫＡＭ）は、β−リジンへとリジンの嫌気的相互変換を触媒し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＳＢ４（現在はＣ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ）において、リジンの発酵における初期段階を触媒することが、Ｂａｒｋｅｒによってはじめて記載された。ＫＡＭは、Ｃ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅより精製され、その遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現された。（例えば、２００１年６月１９日Ｆｒｅｙらに付与された、特許文献２を参照のこと。）特許文献２の全体が、本明細書中で参考として援用される。Ｃ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ  ＳＢ４細胞由来の、精製ＫＡＭの特異的な活性は、３０〜４０ユニット／ｍｇと報告されており（例えば、Ｌｉｅｄｅｒらの非特許文献１参照）、ユニットは，１分間あたりのμｍｏｌリジンと定義されている。それに対応する、組み換え体として産生した精製ＫＡＭは、同等の酵素活性（３４．５±１．６μｍｏｌ  リジン／分／ｍｇ  タンパク質）を有する（例えば、２００３年６月１９日Ｆｒｅｙらに付与された、特許文献３を参照のこと。）。特許文献３の全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０００６】
Ｃ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ由来のＫＡＭ配列に基づき、ＫＡＭ遺伝子は他の生物体のゲノム中にアノテートされた。しかしながら、多くの場合、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドの酵素活性は、確認されていない。例外は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ遺伝子（例えば、非特許文献２を参照のこと）、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓおよびＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ遺伝子である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＫＡＭは、ｙｏｄＯ遺伝子にコードされていて、Ｃ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅＫＡＭよりも、Ｏ２に対して耐性であるが、活性は顕著に低い。Ｆｒｅｙによって報告されたように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＫＡＭは、わずか０．６２Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。
【０００７】
Ｃ．ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ  ＳＢ４のＫＡＭは、Ｌ−アラニンとのいくらかの交叉反応を有し、それをβ−アラニンに転換する、と報告されている（例えば、特許文献３を参照のこと）。特許文献４および特許文献５では、ｋａｍ遺伝子の改変に基づく、ＡＡＭ活性の最初の報告が開示されている。これらの出願において、その合成ａａｍ遺伝子は、ΔｐａｎＤ  Ｅ．ｃｏｌｉ株の相補によって検出される、ＡＡＭ活性を有した。しかしながら、アラニンはこの酵素の天然の基質ではないため、この転換によるその活性は、リジン（この酵素の天然の基質）の転換によるその活性より、かなり低い。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＫＡＭの改変体もまた、およそ０．００１Ｕ／ｍｇのＡＡＭ活性を有した。野生酵素中に発見されたＡＡＭ活性を、実質的に促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが、本発明の目的である。
【特許文献１】国際公開第０１／１６３４６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，２４８，８７４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１１３８８２号明細書
【特許文献４】国際公開第０３／０６２１７３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／４２４１８号パンフレット
【非特許文献１】Ｌｉｅｄｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８年，第３７巻，ｐ．２５７８
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，Ｄ．，Ｒｕｚｉｃｋａ，Ｆ．Ｊ．，Ｆｒｅｙ，Ｐ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０００年，第３４８巻，ｐ．５３９−５４９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、複数の局面を有する。１つの局面では、本発明は図１の反応を触媒するポリペプチドに関する。この最初の側面の１つの実施形態では、本発明は、好ましくは実施例８のアッセイによって測定された時、アラニン２，３−アミノムターゼ（ＡＡＭ）活性を有し、かつ以下；
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１からなる群より選択されるポリペプチドを有するか；
（ｂ）配列番号２、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２および配列番号３６からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するか；
（ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４および配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するか；
（ｄ）高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）ヌクレオチド配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９；（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）のいずれかとハイブリダイズする核酸配列にコードされているポリペプチドであるか；あるいは
（ｅ）ポリペプチド（ｃ）より、１から６アミノ酸の置換、欠失、および／もしくは挿入を含み、かつ２５℃、ｐＨ７．０〜７．６において１細胞ＯＤ当たり）毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有するポリペプチド（ｃ）改変体であるポリペプチドに関する。
【０００９】
集合的に、上記ポリペプチド（ｂ）および（ｃ）は、本明細書中において「相同ポリペプチド」と言われる。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の相同性の程度は、「パーセント相同性」、「パーセント同一性」、「％同一性」、「パーセント同一」および「％同一」と表現され、これらは本明細書中において交換可能に使用され、アミノ酸配列同一性パーセントをいう。その同一性パーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ解析（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫより入手可能なバージョンＷ  １．８）によって、アライメント中の同一性合致の数を計数して、参照配列の長さによって同一性合致の数を除算し、そしてｓｌｏｗ／ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｏｐｔｉｍａｌアライメントを得るために、以下のデフォルトのＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターを使用することによって、得られた。デフォルトのＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター−Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１０；Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：０．１０；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ＝ＳＬＯＷまたはＦＵＬＬアライメント。
【００１０】
１つの実施形態において、本発明はまた、単離され、精製された形態の、本明細書に記載されるようなＡＡＭポリペプチドに関する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、凍結乾燥形態の、本明細書に記載されるようなＡＡＭポリペプチドに関する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるような、ＡＡＭポリペプチド、および適切なキャリア（代表的には緩衝液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する水性緩衝液）を含む組成物に関する。その組成物はまた、凍結乾燥形態であり得る。
【００１３】
本発明の新規ＡＡＭポリペプチドは、それが、最終的に由来する野生型ＫＡＭポリペプチドと比較して、有意に増進されたＡＡＭ活性を有する。有意に増進されたＡＡＭ活性とは、本発明のＡＡＭポリペプチドが、約１μＭから約３２μＭの範囲で、β−アラニンを毎時産生する１セルＯＤ（ユニット）のＡＡＭ活性を有し、好ましくは約１０ユニットから約３２ユニット、より好ましくは約２０ユニットから約３２ユニット；最も好ましくは約２５ユニットから３２ユニットである。
【００１４】
本発明の好ましいＡＡＭポリペプチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６または配列番号４８のアミノ酸配列を有し；より好ましくは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４，配列番号４６または配列番号４８のアミノ酸配列を有し；最も好ましくは配列番号２８または配列番号３４のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
祖父（ｇｒａｎｄｐａｒｅｎｔ）分子の１つはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＫＡＭであり、これは検出可能なＡＡＭ活性は有さなかった。この祖父分子をコードするＤＮＡは、「Ａｌａｎｉｎｅ  ２，３−ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ」という名称のＷＯ０３／０６２１７３号に記載のように改変され、検出可能なアラニン２，３−アミノムターゼ活性を有するポリペプチドを産生する。
【００１６】
本願において、出願人は、ひとつの親分子として配列番号５８のポリヌクレオチド配列を利用し、その配列は、配列番号５９のポリペプチドの４７１残基をコードし、およそ０．００１Ｕ／ｍｇ（ユニット／細胞質量ｍｇ）のＡＡＭ活性を示した。配列番号５９の分子は、以下の４つのアミノ酸置換（Ｌ１０３Ｍ，Ｍ１３６Ｖ，Ｙ１４０ＨおよびＤ３３９Ｈ）を有するため、ＡＡＭ活性が検出されない野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＡＭとは異なる。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明は、約１ユニットから約３２ユニットのＡＡＭ活性を有し、配列番号５９のポリペプチドから、代表的に１から７アミノ酸残基、より代表的には１から６アミノ酸残基、さらに代表的には１から５アミノ酸残基、そして最も代表的には１から４アミノ酸残基改変するポリペプチドに関する。
【００１８】
その第２の局面において、本発明は、対応して参照されるＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。遺伝子コードの縮重のため、本発明はまた、上記で参照された本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする、任意のポリヌクレオチドに関する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ある特定のポリヌクレオチド（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１の新規ＡＡＭポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９のポリヌクレオチド）に関する。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のポリペプチドをコードし；より好ましくは、それらは配列番号６、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４６または配列番号４８のポリペプチドをコードし；最も好ましくは、それらは配列番号２８または配列番号３４のポリペプチド配列を有する。
【００１９】
第３の局面において、本発明は、核酸構造物、ベクター、またはプロモーターに作動可能に連結された、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。
【００２０】
第４の局面において、本発明は、（ａ）ポリペプチドの産生に適切な条件下において、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする核酸配列によって形質転換された宿主細胞を培養する工程、および（ｂ）β−アラニン産生のために適切な条件下において、培養された宿主細胞にグルコースを添加する工程を包含する、本発明のＡＡＭポリペプチドを作製する方法に関する。そのβ−アラニンは、必要に応じてその細胞から回収され得る。
【００２１】
第５の局面において、本発明は、（ａ）ＡＡＭポリペプチドの産生に適切な条件下において、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする核酸配列によって形質転換された宿主細胞を培養する工程、および（ｂ）ｂ−アラニンの産生に適切な条件下において、培養された宿主細胞にグルコースの添加する工程を包含する、ｂ−アラニンを産生する方法に関する。そのｂ−アラニンは、必要に応じてその細胞から回収され得る。
【００２２】
前記の要約は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な記述と同様に、添付される図面と共に読むことで、より良く理解され得る。本発明の例示の目的で、特定の実施形態が図面中に示される。しかしながら、本発明が、添付の図面に示される配置および手段に制限されないことを、理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、複数の局面を有する。１つの局面では、本発明は、好ましくは実施例８のアッセイによって測定されたときに、アラニン２，３−アミノムターゼ（ＡＡＭ）活性を有し、かつ以下；
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１からなる群より選択されるポリペプチドを有するか；
（ｂ）配列番号２、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３２および配列番号３６からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するか；
（ｃ）配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４および配列番号４０からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％のホモロジーを有するアミノ酸配列を有するか；
（ｄ）高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）ヌクレオチド配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９；（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）のいずれかとハイブリダイズする核酸配列にコードされているポリペプチドであるか；あるいは
（ｅ）ポリペプチド（ｄ）より、１から６アミノ酸の置換、欠失、および／もしくは挿入を含み、かつ２５℃、ｐＨ７．０〜７．６において（１細胞ＯＤ当たり）毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有するポリペプチド（ｄ）改変体である
ポリペプチドに関する。
【００２４】
集合的に、上記ポリペプチド（ｂ）および（ｃ）は、本明細書中において「相同ポリペプチド」と言われる。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の相同性の程度は、「パーセント相同性」、「パーセント同一性」、「％同一性」、「パーセント同一」および「％同一」と表現され、これらは本明細書中において交換可能に使用され、アミノ酸配列同一性パーセントをいう。その同一性パーセントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ解析（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫより入手可能なバージョンＷ  １．８）によって、アライメント中の同一性合致の数を計数して、参照配列の長さによって同一性合致の数を除算し、そしてｓｌｏｗ／ａｃｃｕｒａｔｅ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｏｐｔｉｍａｌアライメントを得るために、以下のデフォルトのＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターを使用することによって、得られた。デフォルトのＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター−Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１０；Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：０．１０；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ；ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：ＩＵＢ；Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ＝ＳＬＯＷまたはＦＵＬＬアライメント。
【００２５】
ＡＡＭポリペプチドは、酸素に対して感受性であり、好ましくは酸素欠乏環境下において、維持および、使用される。そのＡＡＭポリペプチドが酸素へ曝露されることにより不活化される場合、それはメルカプト化合物と一緒に３７℃で１時間、Ｃｈｉｒｐｉｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５（７）：１７７８−１７８９（１９７０）（これは本明細書中に、その全体が参考として援用される）に記載の方法に従って嫌気培養することによって活性化され得る。本発明のＡＡＭ活性は、好ましくは全細胞形態（すなわち、コードされたＡＡＭポリペプチドが細胞中に発現されるような条件下で使用される、ＡＡＭポリペプチドによって形質転換された細胞全体として）で利用されるか、もしくは代替的に、低酸素条件下において単離され、利用される。本発明のＡＡＭポリペプチドは、嫌気条件下（例えば、窒素ガス下）において、Ｐｅｔｒｏｖｉｃｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（１２）：７６５６−７６６０（１９９１）に記載の方法に従って、単離され得、必要に応じて精製され得る。その文献は、リジン−２，３−アミノムターゼの単離および精製を記載し、本明細書中に、その全体が参考として援用される。本明細書中に使用するとき、「低酸素」という用語は、酸素欠乏を意味する。全細胞形態において、もしくは単離された酵素としてのＡＡＭポリペプチドは、凍結乾燥され得る。さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＡＡＭポリペプチド（例えば、全細胞形態、もしくは単離されたポリペプチド）、および適切なキャリア、代表的には緩衝液、さらに代表的には約６．０から約８．０のｐＨを有する水性緩衝液を含む組成物に関する。凍結乾燥形態において組成物を提供するために凍結乾燥された水性緩衝化組成物もまた、本発明の範囲内であり、ここで、その組成物は、水ベースの組成物の添加により再構成される。
【００２６】
１つの実施形態において、本発明はまた、単離され、精製された形態の、本明細書に記載されるようなＡＡＭポリペプチドに関する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、凍結乾燥形態の、本明細書に記載されるようなＡＡＭポリペプチドに関する。凍結乾燥は、標準的な凍結乾燥装置を使用して行われる。代表的には、そのポリペプチドを含む溶液は、適当な大きさのバイアルに分注され、凍結され、そして水分を蒸発させ、凍結乾燥（凍結し、乾燥された）ポリペプチドが残るように減圧下に静置される。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるような、ＡＡＭポリペプチド、および適切なキャリア（代表的には緩衝液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する水性緩衝液）を含む組成物に関する。その組成物はまた、凍結乾燥形態であり得る。
【００２９】
本発明の新規ＡＡＭポリペプチドは、それが最終的に由来する野生型ＫＡＭポリペプチドと比較して、有意に増進されたＡＡＭ活性を有する。有意に増進されたＡＡＭ活性とは、本発明のＡＡＭポリペプチドが、約１μＭから約３２μＭの範囲の、β−アラニン産生／時間・１細胞ＯＤ（ユニット）のＡＡＭ活性を有し、好ましくは約１０ユニットから約３２ユニット、より好ましくは約２０ユニットから約３２ユニット；最も好ましくは約２５ユニットから３２ユニットである。
【００３０】
表１は、それらのクローン番号および配列番号によって同定される、本発明の種々のＡＡＭポリペプチドのＡＡＭ活性を示す図を提供する。表１において、ＯＤ６００ｎｍは５時間（ｔ＝５）のインキュベーション後に収集され、報告されている。表１はまた、１細胞ＯＤ当たり、５時間後に産生されたβ−アラニンの総μＭを報告する。最終的に、表１の最後の列は、１細胞ＯＤ当たりの毎時産生されるβ−アラニン（μＭ）の速度を提供する。
【００３１】
（表１）
【００３２】
【表１】
2008517607.tif 000003
本発明の好ましいＡＡＭポリペプチドは、アミノ酸配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６または配列番号４８；より好ましくはアミノ酸配列番号６、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４６または配列番号４８；最も好ましくは、アミノ酸配列番号２８または配列番号３４を有する。
【００３３】
最終的な祖父分子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＫＡＭであり、これは検出可能なＡＡＭ活性を有さない。この祖父分子をコードしているＤＮＡは、検出可能なアラニン２，３−アミノムターゼ活性を有するポリペプチドを産生するため、ＷＯ０３／０６２１７３号における名称「Ａｌａｎｉｎｅ  ２，３−ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ」において記載されるように、改変された。
【００３４】
本願において、出願人は、一つの親分子として配列番号５８のポリヌクレオチド配列を利用し、その配列は、配列番号５９のポリペプチドの４７１残基をコードし、およそ０．００１Ｕ／ｍｇ（ユニット／細胞質量ｍｇ）のＡＡＭ活性を示した。配列番号５９の分子は、以下の４つのアミノ酸置換（Ｌ１０３Ｍ，Ｍ１３６Ｖ，Ｙ１４０ＨおよびＤ３３９Ｈ）を有することによって、検出可能なＡＡＭ活性を有さない野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＡＭとは異なる。
【００３５】
本発明において出発物質として利用される他の祖父分子は、ＫＡＭポリペプチドをコードする他の微生物（例えば、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ，およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）由来のＤＮＡ配列であった。これらのＤＮＡ配列は、またα−アラニンとの検出可能な相互反応性を有するＫＡＭポリペプチドを最終的に産生する、点置換を導入するための標準技術を用いて改変した。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の、１つのそのような親分子は、配列番号５４のポリヌクレオチドであり、配列番号５５のポリペプチドの４１６残基をコードする。配列番号５５の親ポリペプチドは、以下の７つのアミノ酸置換（Ｎ１９Ｙ，Ｅ３０Ｋ，Ｌ５３Ｐ，Ｈ８５Ｑ，Ｉ１９２Ｖ，Ｄ３３１Ｇ，およびＭ３４２Ｔ）を有することによって、野生型Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとは異なる。Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ由来の別のそのような親分子は、配列番号５６のポリヌクレオチドであり、それは配列番号５７のポリペプチドの４２５残基をコードする。
【００３６】
さらに別の親ポリヌクレオチドは、ＫＡＭをコードするＣ．ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉのポリヌクレオチドの改変によって誘導された。α−アラニンとの検出可能な相互反応性を有した、生じた親ポリヌクレオチドは、配列番号５３のポリペプチドの４１６残基をコードする、配列番号５２のポリヌクレオチドである。
【００３７】
上記の配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７および配列番号５８の親ポリペプチドは、図４のアライメント図において比較される。このアライメント図より、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｃ．ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ，およびＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ由来のＫＡＭは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＫＡＭに関して、Ｎ末端およびＣ末端において切断され得る。一方、４種の間で、ＫＡＭポリペプチドの中央部において、約４０％の残基部位が保存されている。図４のアライメント図における切断された種に基づき、配列番号５８のＮ末端における最初の８アミノ酸残基、および配列番号５８のＣ末端において最後の４０残基が、ＫＡＭ活性またはそれに由来するＡＡＭ活性に必要ではないことが、推測され得る。図４において、コンセンサス配列もまた、提供される。
【００３８】
増進されたＡＡＭ活性を有する本発明のＡＡＭポリペプチド分子は、上記の親分子に方向付けられた進化技術を適用することによって作製された。これらの技術は、本明細書中にさらに詳細に記載される。
【００３９】
さらに別の局面において、本発明は、共役反応において増進された活性を有するＡＡＭポリペプチドに関する。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）ヌクレオチド配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９；（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）のいずれかとハイブリダイズする核酸配列にコードされているＡＡＭポリペプチドに関する。少なくとも１００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドにとって、低ストリンジェンシー条件から非常に高ストリンジェンシー条件は、標準的なサザンブロッティング方法に従い、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ切断および変性させたサケ精子ＤＮＡ、および、低ストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中ストリンジェンシーもしくは中〜高ストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、または高ストリンジェンシーもしくは非常に高ストリンジェンシーでは５０％ホルムアミドのいずれかの中で４２℃におけるプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。
【００４１】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドにとって、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェンシー）、少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、そして少なくとも７０℃（非常に高ストリンジェンシー）において、キャリア物質は最終的に３回、それぞれ１５分間、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて洗浄される。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、ポリペプチドの改変体であって、（ｄ）このポリペプチドの改変体からの１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含み、そして実施例８の方法によって決定されるように、ｐＨ７．０〜７．６、２５℃において１細胞ＯＤ当たり毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有する、ポリペプチドの改変体に関する。好ましくは、アミノ酸改変は、重要でない性質のものであり、すなわちタンパク質の折り畳みおよび／または活性に有意に影響しない、保存的アミノ酸置換であるか；代表的には１〜６アミノ酸の僅かな欠失であるか；僅かなアミノ末端伸長もしくはカルボキシル末端伸長であるか；僅かなリンカーペプチドであるか；または電荷全体もしくは別の機能を変化させることによって精製を容易にするわずかな伸長（例えば、ポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープもしくは結合ドメイン）である。
【００４３】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）の群、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）の群、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）の群、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）の群、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）の群、小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン、システインおよびメチオニン）の群の中の置換である。一般に特異的活性を変化させないアミノ酸置換は、当該分野で公知であり、そして例えば、以下に記載される：Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。最も一般的に起こる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙならびに逆の置換である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、詳細な説明の第１節において上記したように、（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）のフラグメントに関し、これらは、実施例８の方法によって決定されるように、ｐＨ７．０〜７．６、２５℃において１細胞ＯＤ当たり毎時約１μＭから約３０μＭのβ−アラニンを産生するＡＡＭ活性を有する、ポリペプチドの改変体に関する。用語「フラグメント」は、Ｎ末端からの１〜８個、もしくはＣ末端からの１〜４０個、あるいはその両方のアミノ酸残基の欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、Ｃ末端からの１〜２０個の残基の欠失であり、より好ましくは、Ｃ末端からの１〜１０個の残基の欠失である。
【００４５】
（ポリヌクレオチド）
その第２の局面において、本発明は、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。遺伝コードの縮重を考慮し、本発明はまた、上で参照した本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドに関する。その第２の局面において、本発明は、同様に参照ＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝コードの縮重を考慮し、本発明はまた、上で参照した本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の特定の特異的ポリヌクレオチドに関し、これは、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８および配列番号５１の新規なＡＡＭポリペプチドをコードする。好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号６、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４６もしくは配列番号４８のポリペプチドをコードする；より好ましくは、これらは、配列番号６、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４６もしくは配列番号４８のポリペプチドをコードする；より好ましくは、これらは、配列番号２８もしくは配列番号３４の配列のポリペプチドを有する。
【００４６】
本発明の改善されたＡＡＭポリペプチドを作製するために、ＫＡＭポリペプチドをコードする１種以上の野生型ポリヌクレオチドで出発する。用語「野生型」ポリヌクレオチドは、この核酸フラグメントが、天然から単離された形態からのいかなる変異も含まないことを意味する。用語「野生型」タンパク質は、このタンパク質が、天然で見出される活性のレベルで活性であり、そして代表的には、天然で見出されるアミノ酸配列を含むことを意味する。従って、用語「野生型」もしくは「祖父配列」は、本発明の操作の前の、出発配列もしくは参照配列を示す。
【００４７】
改善されるべき出発物質としての野生型ＫＡＭの適切な供給源は、ＫＡＭ活性についてのゲノムライブラリーのスクリーニングによって、容易に同定される。ＫＡＭの特に適切な供給源は、天然で見出されるＢａｃｉｌｌｕｓ種細菌のｙｏｄＯ遺伝子である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについて公開された（例えば、ＷＯ  ０３  ０６２３１７３  Ａ２）ＫＡＭ配列を用い、その対応する遺伝子ライブラリーからのこの遺伝子の増幅のためのプライマーが、従来技術を用いて作製された。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＫＡＭを単離するためのこのような１つの技術は、Ｃｈｅｎら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ２，３−ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｙｏｄＯ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｒａｄｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３４８：５３９−５４９（２０００）（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００４８】
配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６および配列番号５８の出発ポリヌクレオチドは、ＷＯ  ０３  ０６２３１７３  Ａ２（この中の実施例に記載される技術の開示について、本明細書中で参考として援用される）に開示される技術を用いて得られた。具体的には、ＷＯ  ０３  ０６２３１７３  Ａ２は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ野生型リジン２，３−アミノムターゼ（ＫＡＭ）、およびアラニン２，３−アミノムターゼ（ＡＡＭ）をコードするその変異型を開示する。さらに、ＷＯ  ０３  ０６２３１７３  Ａ２はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ野生型リジン２，３−アミノムターゼ（ＫＡＭ）、およびアラニン２，３−アミノムターゼ（ＡＡＭ）をコードするその変異型を開示する。
【００４９】
配列番号５８のポリヌクレオチドで出発し、天然に存在せず、突然変異されそして／または進化した、未知のＡＡＭ活性を有する酵素が、周知の突然変異誘発方法もしくは方向付けられた進化方法のいずれか１つを用いて作製される。例えば、Ｌｉｎｇら，「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｒａｍｅｒら，「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｗｅｌｌｓら，「Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ」，Ｇｅｎｅ．３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：２８４−２９０（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら，「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：２５９−２６４（１９９９）；Ｃｒａｍｅｒｉら，「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１５：４３６−４３８（１９９７）；Ｚｈａｎｇら，「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら，「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３１５−３１９（１９９６）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，「Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；ＷＯ  ９５／２２６２５；ＷＯ  ９７／００７８；ＷＯ  ９７／３５９６６；ＷＯ  ９８／２７２３０；ＷＯ  ００／４２６５１；ＷＯ  ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号（Ａｒｎｏｌｄらに対し２００３年３月２５日に発行、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．」）を参照のこと。
【００５０】
これらの方法のいずれかが、ＡＡＭポリヌクレオチドを作製するために適用され得る。任意の多様性を最大化するために、上記の技術のいくつかを連続的に使用し得る。代表的に、シャッフルしたポリヌクレオチドのライブラリーが、１つの突然変異誘発技術もしくは進化技術によって作製され、そしてその発現産物が、最高のＡＡＭ活性を有するポリヌクレオチドを見出すためにスクリーニングされる。次いで、第２の突然変異誘発技術もしくは進化技術が、最高の活性のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに適用されて、第２のライブラリーを作製し、次いで、これが、同じ技術によってＡＡＭ活性についてスクリーニングされる。変異およびスクリーニングのプロセスは、必要なだけ何回も繰り返され得る。これらのプロセスとしては、所望の活性、熱安定性もしくは補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに到達するための点変異の挿入が挙げられる。
【００５１】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成方法に従って、標準的固相方法によって調製され得る。代表的に、約１００塩基までのフラグメントが、個々に合成され、次いで、結合されて（例えば、酵素的ライゲーション方法もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼ媒介型の方法）、本質的に任意の所望の連続配列を形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−６９によって記載される古典的ホスホルアミダイト方法またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５によって記載される方法を用いて、例えば代表的に自動化合成方法において実施されているように、化学的合成によって調製され得る。ホスホルアミダイト方法に従い、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされて、そして適切なベクターにクローニングされる。
【００５２】
さらに、本質的に任意の核酸を、任意の種々の商業的供給業者にカスタム注文し得る。これらの供給業者は、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ（これらの全ては、インターネットウェブサイトを有する）その他多数である。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々の供給業者にカスタム注文し得る。これらの供給業者は、例えば、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ，ＨＴＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、ＢＭＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｕ．Ｋ．）、Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．他多数である。
【００５３】
ポリヌクレオチドもまた、技術文献に記載される周知の技術によって合成される。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９８２）およびＡｄａｍｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）を参照。従って、二本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖の合成およびこれらの鎖を適切な条件下でアニーリングして一緒にすること、またはＤＮＡポリメラーゼを適切なプライマー配列と共に用いて相補鎖を付加することのいずれかによって得られ得る。
【００５４】
本明細書中で有用な分子生物学的技術（突然変異誘発を含む）を記載する一般的テキストとしては、以下が挙げられる：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との共同事業（２０００年を通して補遺されている）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介型技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、当業者をインビトロ増幅方法に導くために十分な技術の例は、以下に見出される：Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅｄ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７、ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４。インビトロ増幅した核酸をクローニングする改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら，米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅する改善された方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびその中の参考文献にまとめられており、ここでは、４０ｋｂまでのＰＣＲアンプリコンが作製される。当業者は、本質的に任意のＲＮＡが、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、ＰＣＲ拡大および配列決定��適する二本鎖ＤＮＡに変換され得ることを理解する。Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）を参照のこと。
【００５５】
当業者は、遺伝コードの縮重に起因して、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列が生成され得、これらのうちのいくつかは、本明細書中に明白に開示される核酸配列と実質的に同一な核酸配列を有することを、理解する。本発明のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの必要に応じた産生のためにコドン最適化され得る。当業者は、広範な範囲の生物についてのコドン選択性情報を提供する表および他の参照が、容易に利用可能であることを理解する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ，「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ら編、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ｐ．２０４７−２０６６（１９９６）を参照。
【００５６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現は、他の生物における発現と異なることに、留意されたい。例えば、本発明において、コドン（ｔｇｇ）は、配列番号５９の親ポリペプチドにおける３１位の残基についてＴｒｐ（Ｗ）をコードする。しかし、３１位の残基について対応するコドンは、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、および配列番号４８をコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、および配列番号４７の子孫ポリヌクレオチドの各々において「ｔｇａ」である。当業者は、コドン「ｔｇａ」は、通常、停止（非センス）コドンであることを理解する。しかし、ΔｐａｎＤ  Ｅ．ｃｏｌｉ株においてかつ課された選択条件下で使用される本発明の発現系において、このコドンは、Ｅ．ｃｏｌｉによって、センスコドンとして読み流され、そしてＴｒｐ（Ｗ）として発現されると推定される。「ｔｇａ」がＥ．ｃｏｌｉについてもっとも弱い停止コドンであり、そしてしばしば高発現においてＴｒｐ（Ｗ）についてのセンスコドンとして読み流されることは、他でも報告されている。例えば、Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．，「Ｅｒｒｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５３（３）：２７３−２９８（１９８９）；Ｒｏｔｈ，Ｊ．，「ＵＧＡ  Ｎｏｎｓｅｎｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ」，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１０２（２）：４６７−４７５（１９７０）；ならびにＭｃＢｅａｔｈ，Ｇ．およびＫａｓｔ，Ｐ．，「ＵＧＡ  Ｒｅａｄ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｒｔｉｆａｃｔｓ−Ｗｈｅｎ  Ｐｏｐｕｌａｒ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｅｅｄ  ａ  Ｐａｔｃｈ」，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：７８９−７９４（１９９８年５月）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。非Ｅ．ｃｏｌｉ系における発現のために、３１位の残基においてコドン（ｔｇａ）をＴｒｐ（Ｗ）についての汎用的なセンスコドンである「ｔｇｇ」に変更することは、有利である。
【００５７】
配列４９において、残基７２をコードするコドンは、停止コドンとして読まれる「ｔａｇ」である。しかし、２つのフラグメントが産生される。第１のフラグメントは、配列番号５０の残基１〜７１を有し、いかなる検出可能なＡＡＭ活性をも有さない。第２のフラグメントは、通常のＭｅｔの代わりに残基７３（Ｖａｌ）で始まるように産生される。この第２フラグメントは、３９９残基を有し（配列番号５１）、そして実施例８のアッセイに基づき、有意なＡＡＭ活性を有する（表２参照）。従って、ＡＡＭポリペプチドのＮ末端の最初の７２残基（コンセンサス配列もしくはＢ．ｓｉｉｂｔｉｌｉｓからの親ＫＡＭ配列に基づく）は、ＡＡＭ活性について絶対的に必須ではない。
【００５８】
本発明の場合、数回の第１ライブラリーが、種々の突然変異誘発技術を配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６および配列番号５８のポリヌクレオチドに対して適用することによって作製された。
【００５９】
その第３の局面において、本発明は、制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞に関する。ＡＡＭポリペプチドをコードする遺伝子の発現を得るために、改変体遺伝子は、まず、遺伝子発現を制御する１種以上の異種調節配列に作動可能に連結されて、発現ベクターもしくは発現カセットのような核酸構築物を作製する。その後、生じた核酸構築物（例えば、発現ベクターもしくは発現カセット）は、シャッフルされた遺伝子によってコードされるＡＡＭポリペプチドの最終的な発現のために、適切な宿主細胞に挿入された。「核酸構築物」は、本明細書中で、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの核酸分子であって、天然に存在する遺伝子から単離されているか、もしくは、さもなければ天然に存在しないような様式で組み合わされそして並列された核酸のセグメントを含むように改変されている、核酸分子として定義される。従って、１つの局面において、本発明は、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【００６０】
用語「核酸構築物」は、この核酸構築物が本発明のコード配列の発現のために必要とされるすべての制御配列を含む場合、用語「発現カセット」と同義語である。用語「コード配列」は、本明細書中で、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に特定する核酸配列として定義される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、このポリペプチドの発現のために提供される種々の方法によって操作され得る。この単離されたポリヌクレオチドの、ベクター中へのその挿入前の操作は、発現ベクターに依存して所望され得るかもしくは必要とされ得る。組換えＤＮＡ方法を用いてポリヌクレオチド配列および核酸配列を改変するための技術は、当該分野で周知である。
【００６２】
用語「制御配列」は、本明細書中で、本発明のポリペプチドの発現のために必要であるかもしくは有利である、全ての構成成分を含むように定義される。各制御配列は、このポリペプチドをコードする核酸に対して、天然であっても外来性であってもよい。このような制御配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写終結因子。最低でも、制御配列は、プロモーターならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、特定の制限部位を導入する目的のリンカーと共に提供され、この制限部位は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする。
【００６３】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で、ＤＮＡ配列のコード配列に対する位置で制御配列が適切に配置され、それによってこの制御配列が、ポリペプチドの発言を支持するような構成として定義される。
【００６４】
制御配列は、適切なプロモーター配列であり得る。「プロモーター配列」は、後に続くより長いコード領域の発現のために、宿主細胞によって認識される、比較的短い核酸配列である。プロモーター配列は、転写制御配列を含み、これは、ポリペプチドの発現を媒介する。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、変異体プロモーター、切断されたプロモーター、およびハイブリッドプロモーターが挙げられ、宿主細胞に対して同種もしくは異種のいずれかである細胞外ポリペプチドもしくは細胞内ポリペプチドから得られ得る。
【００６５】
細菌宿主細胞について、本発明の核酸構築物の転写を指示するための適切なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｈｉｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８０：２１−２５）が挙げられる。さらなるプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９（前出）に記載される。
【００６６】
繊維状真菌宿主細胞について、本発明の核酸構築物の転写を指示するために適切なプロモーターとしては、以下についての遺伝子から得られるプロモーターが挙げられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉのグルコシダーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ  ９６／００７８７）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼについての遺伝子からのプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターとのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体プロモーター、切断されたプロモーター、およびハイブリッドプロモーター。
【００６７】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、以下についての遺伝子から得られる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／繰りセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ。酵母宿主についての他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８によって記載される。
【００６８】
制御配列はまた、適切な転写終結因子配列（宿主によって認識され、転写を終結させる配列）であり得る。転写終結配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択した宿主中で機能的である任意の転写終結因子が、本発明において使用され得る。
【００６９】
繊維状真菌宿主細胞のために好ましい転写終結因子は、以下についての遺伝子から得られる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ。
【００７０】
酵母宿主細胞についての好ましい終結因子は、以下についての遺伝子から得られる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ。酵母宿主についての他の有用な終結因子は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２（前出）によって記載される。
【００７１】
制御配列はまた、適切なリーダー配列（宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）であり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択した宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が、本発明において使用され得る。繊維状真菌宿主細胞について好ましいリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、以下についての遺伝子から得られる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）。
【００７２】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写された際に、転写したｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）であり得る。選択した宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。繊維状真菌宿主細胞についての好ましいポリアデニル化配列は、以下についての遺伝子から得られる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼ。酵母宿主細胞についての有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：５９８３−５９９０によって記載される。
【００７３】
制御配列はまた、シグナルペプチドコード領域（ポリペプチドのアミノ末端に連結するアミノ酸配列をコードし、そして細胞の分泌経路にコードしたポリペプチドを導くコード領域）であり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードする転写リーディングフレームに天然に連結したシグナルコード領域を固有に含み得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合、必要とされ得る。
【００７４】
あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの分泌を増大するために、天然のシグナルペプチドコード領域と単純に置き換えられ得る。しかし、選択された宿主細胞の分泌経路に発現されたポリペプチドを導く任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００７５】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、以下についての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣ１Ｂ  １１８３７マルトジェニックアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｎｉｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡ。さらなるシグナルペプチドが、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７によって記載される。
【００７６】
繊維状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、以下についての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼ。
【００７７】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドコードペプチドは、以下についての遺伝子から得られる：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら，１９９２（前出）によって記載される。
【００７８】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列についてコードするポリペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素もしくはプロポリペプチド（あるいは、場合によってはチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、そして、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒性切断もしくは自己触媒性切断によって、成熟した活性なポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、以下についての遺伝子から得られ得る：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ  ９５／３３８３６）。
【００７９】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域との両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００８０】
調節配列を付加することもまた、所望され得る。この調節配列は、宿主細胞の成長に関連してポリペプチドの発現を調節し得る。制御系の例は、遺伝子の発現を、化学的刺激もしくは物理的刺激（調節性化合物の存在を含む）に応答してオンもしくはオフにする調節系である。原核生物宿主細胞において、適切な制御配列としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適切な調節系としては、ＡＤＨ２系もしくはＧＡＬ１系が挙げられる。繊維状真菌において、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【００８１】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列である。真核生物系において、調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅するジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合において、本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列に作動可能に連結される。
【００８２】
（発現ベクター）
別の局面において、本発明はまた、（本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする）本発明のポリヌクレオチドおよび１つ以上の発現調節領域を含む組換え発現ベクターに関する。発現調節領域としては、導入される宿主の型に依存して、プロモーター、終結因子、複製起点などが挙げられる。上記の種々の核酸および制御配列は、互いに結合されて、組換え発現ベクターを産生し、この組換え発現ベクターは、１つ以上の便利な制限部位（そのような部位におけるポリぺプチドをコードする核酸配列の挿入もしくは置換を可能にする）を含み得る。あるいは、本発明の核酸配列は、発現のための適切なベクター内に、この核酸配列もしくはこの配列を含む核酸構築物を挿入することによって、発現され得る。発現ベクターの作製において、コード配列は、ベクター内に位置し、それによって、このコード配列は、発現のために適切な調節配列と作動可能に連結される。
【００８３】
この組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に供され得、そしてポリヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る、任意のベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、代表的に、ベクターとこのベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。このベクターは、直鎖状もしくは閉環状のプラスミドであり得る。
【００８４】
発現ベクターは、自動的に複製するベクター（すなわち、染色体外の実態として存在し、その複製は、染色体複製と無関係であるベクター）であり得、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、もしくは人工染色体であり得る。このベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。あるいは、このベクターは、宿主細胞内に導入される場合、ゲノム内に組み込まれ、このベクターが組み込まれる染色体と共に複製されるベクターであり得る。さらに、１つのベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノム内に導入される全ＲＮＡを一緒に含む２つ以上のベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが利用され得る。
【００８５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、１つ以上の選択可能マーカーを含み、このマーカーは、形質転換した細胞の選択を容易にする。選択可能マーカーは、殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）耐性もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株になるための原栄養体性などを提供する産物である遺伝子である。細菌選択可能マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、もしくは抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）もしくはテトラサイクリン耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞についての適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰｌ、およびＵＲＡ３である。
【００８６】
繊維状真菌宿主細胞における使用のための選択可能マーカーは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにその等価物。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞における使用のために好ましいものは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子である。
【００８７】
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの組み込みを可能にするエレメント、またはゲノムと無関係な細胞内でのベクターの自己複製を可能にするエレメントを含み得る。宿主ゲノム中への組み込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列に依存し得るか、または同種組換えもしくは同種でない組換えによるこのベクターのゲノム中への組み込みのための任意の他のこのベクターのエレメントに依存し得る。
【００８８】
あるいは、このベクターは、同種組換えによる宿主のゲノム内への直接的組み込みのためのさらなる核酸配列を含み得る。さらなる核酸配列は、このベクターが、染色体中の正確な位置で宿主細胞ゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な位置における組み込みの可能性を増大するために、組み込みエレメントは、好ましくは、同種組換えの可能性を増大する対応する標的配列と非常に相同である、十分な数（例えば、１００〜１００，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、もっとも好ましくは８００〜１０，０００塩基対）の核酸を含むべきである。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列であっても、コード核酸配列であってもよい。他方、ベクターは、非相同的組換えによって、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【００８９】
自己複製のために、ベクターは、このベクターを目的の宿主細胞内で自己複製可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＭＢ１およびＣｏｌＥ１である。プラスミドｐＢＲ３２２（ｐＭＢ１複製起点を有する）ｐＵＣ１９（ＣｏｌＥ１複製起点を有する）、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４（Ｐ１５Ａ複製起点を有する）の複製起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にする；プラスミドの複製起点の例である、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、もしくはｐＡＭ．β．１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にする。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロンの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。複製起点は、宿主細胞においてその機能的温度感受性を生じさせる突然変異を有するものであり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１４３３を参照）。
【００９０】
１コピーより多くの本発明の核酸配列が、宿主細胞内に挿入されて、遺伝子産物の産生を増大し得る。核酸配列のコピー数における増加は、宿主細胞ゲノム中へのこの配列の少なくとも１つのさらなるコピーの組み込みによって得られ得るか、または、この核酸配列に増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含めることによって得られ得、ここで、この選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーと、従って核酸配列のさらなるコピーとを含む細胞が、適切な選択可能薬剤の存在下でこの細胞を培養することによって、選択され得る。
【００９１】
上記のエレメントをライゲーションし、そして本発明の組換え核酸構築物および発現ベクターを構築するために使用される手順は、当該分野で周知である。（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。
【００９２】
本発明における使用のための発現ベクターの多くは、市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ．からのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクターが挙げられ、これは、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位、ならびにＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ  ＣＡから市販される）ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）もしくはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら，１９８７，Ｇｅｎｅ  ５７，１９３−２０１）に由来するプラスミドである。
【００９３】
本明細書中の実施例６は、図３のベクターマップにおいて示される、ｐＣＫ１１０９００−Ｉ  Ｂｌａの使用を開示する。
【００９４】
（宿主細胞）
本発明の発現ベクターの発現における使用のための宿主細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞。上記の宿主細胞についての適切な培養培地および条件は、当該分野で周知である。
【００９５】
例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０は、本発明のシャッフル化遺伝子を発現する発現ベクターによって形質転換された。この発現ベクターは、本発明の改変体遺伝子を、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下のｌａｃプロモーターに作動可能に連結することによって、作製された。この発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んだ。形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０を、クロラムフェニコールを含む適切な培養培地の下で培養し、それによって、この発現ベクターを発現した形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のみが生き残った。例えば、実施例１を参照。
【００９６】
（精製）
一旦、ＡＡＭポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉにおいて改変体遺伝子によって発現されると、このポリペプチドは、タンパク質精製のための任意の１つ以上の周知技術（例えば、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーなど）を厳密な無酸素条件下で用いて、細胞からそして／または培養培地から精製された。細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）からのタンパク質の効率のよい抽出のために適切な溶液は、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＢＴＭの商標の下でＳｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。化学的プロセスにおける適用のための、ＡＡＭポリペプチドを細胞溶解物から十分に精製するための適切なプロセスは、以下の文献において開示される：Ｃｈｉｒｐｉｃｈ，Ｔ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７０，２４５，１７７８−１７８９；およびＰｅｔｒｏｖｉｃｈ，Ｒ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，７６５６−７６６０（これら両方は、本明細書中で参考として援用される）。
【００９７】
（スクリーニング）
数回の方向付けられた進化が実施された後、得られた代表的なＡＡＭポリペプチドのライブラリーを、スクリーニングした。ＡＡＭ活性を有するポリペプチドを発現する形質転換された細胞についてのスクリーニングは、一般に、二工程プロセスである。第１に、細胞を物理的に分離し、次いで、どの細胞が所望の特定を有し、どの細胞が有さないのかを決定する。選択は、スクリーニングの形態であり、ここで、同定および物理的分離は、特定の遺伝的環境においてこのマーカーを発現する細胞を生き残らせ一方で他の細胞が死ぬ（またはその逆である）ような、選択マーカーの発現によって、同時に達成される。例示的なスクリーニングマーカーとしては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子および毒素耐性遺伝子が挙げられ、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリンなどに対する耐性である。自発的な選択は、自然の進化の過程において起こり得、かつ起こるが、本発明の方法において、選択は、ヒトによって達成される。
【００９８】
突然変異誘発もしくは方向付けられた進化方法によって作製されたＡＡＭポリヌクレオチドは、実施例８に記載されるプロトコールに従ってスクリーニングされて、本発明の改善されたＡＡＭポリペプチドに含めるために適する、増強された活性を有するものを同定する。実施例８のプロセスにおいて、増強されたＡＡＭ活性についての発現ライブラリーからのクローンのスクリーニングは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を用いるα−アラニンのβ−アラニンへの変換を測定することによって、実施される。スクリーニング結果に基づいて、本発明のＡＡＭポリペプチドは、１つの親ＡＡＭポリペプチド（すなわち、配列番号５９のポリペプチド）と比較したその残基変化および増強したＡＡＭ活性と共に、下の表２に列挙される。
【００９９】
（表２）
【０１００】
【表２−１】
2008517607.tif 000004
【０１０１】
【表２−２】
2008517607.tif 000005
上の表２において、本発明のＡＡＭポリペプチドは、配列番号５９の親ポリペプチドから２〜１１残基の相違を有し、そして実施例８のアッセイにおけるβ−アラニンの産生によって証明されるように非常に高いＡＡＭ活性を有する。比較として、β−アラニンは、ＡＡＭ改変体を試験するために使用したアッセイ条件下では、検出されなかった。しかし、親の配列番号５９について、ある程度のβ−アラニン産生は、相補性分析に基づく定性的増殖において検出された。
【０１０２】
上の表２を参照して、配列番号５９の親配列に対する本発明のＡＡＭポリペプチドについての２つの好ましい残基変化は、Ｇ３０８ＲおよびＦ４１６Ｓである。本発明のＡＡＭポリペプチドは、少なくとも４４７残基の長さであり、さらなる好ましい残基変化は、配列番号５９の親配列に対するＤ４４７Ｇである。さらなる適切な残基変化は、Ｇ３０８Ｋ、Ｆ４１６ＭおよびＤ４４７Ｌ、Ａ、ＩもしくはＶである。従って、１つの局面において、本発明は、配列番号５９の親配列に対して少なくとも５つのアミノ酸残基の変化、代表的には５〜１１個の残基の変化を有するＡＡＭポリペプチド、またはその切断されたフラグメントに関し、本明細書中で教示されるように、この残基変化は、以下からなる群より選択される１〜３個の残基の変化を含む：Ｇ３０８Ｒ、Ｇ３０８Ｋ、Ｆ４１６Ｓ、Ｆ４１６Ｍ、Ｄ４４７Ｇ、Ｄ４４７Ｌ、Ｄ４４７Ａ、Ｄ４４７ＩおよびＤ４４７Ｖ。
【０１０３】
表２におけるＡＡＭ活性に基づき、特に好ましい本発明のＡＡＭポリペプチドは、配列番号３４のポリペプチドと９５％の配列相同性を有するポリペプチドであり、より好ましくは、９８％の配列相同性を有するポリペプチドであり、もっとも好ましくは、９９％の配列相同性を有するポリペプチドである。
【０１０４】
配列番号５３、配列番号５５および配列番号５７の親ポリペプチドは、Ｎ末端の１〜８個の残基およびＣ末端の４３４〜４７３個の残基は、ＫＡＭ活性もしくはＡＡＭ活性に必要でないことを示す。同様に、配列番号５１のポリペプチドフラグメント（３９９残基の発現産物である）は、配列番号５９の親クローンに対するＮ末端の最初の７２アミノ酸は、ＡＡＭ活性に必要でないことを開示する（表２参照）。従って、本明細書中に記載されるポリペプチドは、配列番号５９の親配列と比較してＮ末端から１〜７２個の残基（代表的には１〜４０個の残基、より代表的には１〜２０個の残基、最も代表的には１〜１１個の残基）が欠失している、ポリペプチドのフラグメントを含むこともまた、本発明の範囲内である。上記のＮ末端切断は、本明細書中他所で記載されるＣ末端切断と組み合わせて使用されることもまた、本発明の範囲内である。
【０１０５】
親のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＡＭ（配列番号５９）骨格に対する非常に僅かな（０．５％未満）の突然変異のみが、有益であることが見出されている。特に、スクリーニングした１０００クローン毎に、有益である３〜５個の１点変異もしくは２点変異が存在する。実際に、いくつかの突然変異は、有害であることが見出されている。
【０１０６】
以下の２組の配列のうちの最初のものは、先行技術であり、寄託されている（ＧＩ＿２５２９４６７＿ＧＢ＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓリジン２，３−アミノムターゼポリペプチド（ＫＡＭ）の配列を提供する。この配列（配列番号６０）は、親配列として使用されないが、比較の目的のみのために提供される。
【０１０７】
【化１】
2008517607.tif 000006
この組の第２の配列は、公知の野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＡＭ配列に対する本発明のＡＡＭポリペプチドの相違点を示す（「Ｘ」の文字によって示され、その後出願人のＡＡＭポリペプチドにおいて野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＡＭ配列の残基と異なる残基の残基番号が続く）：
【０１０８】
【化２】
2008517607.tif 000007
本発明のＡＡＭポリペプチドの種々の残基の位置における変化の相違点は、以下の表２において矢印の右側に示され、そしてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの野生型ＫＡＭの相対的アミノ酸残基（ＧＩ＿２５２９４６７＿ＧＢ＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）（配列番号６０）は、矢印の左側に示される：
（表３）
【０１０９】
【表３−１】
2008517607.tif 000008
【０１１０】
【表３−２】
2008517607.tif 000009
第４の局面において、本発明は、本発明のＡＡＭポリペプチドを作製する方法に関し、この方法は、（ａ）本発明のＡＡＭポリペプチドをコードする核酸によって形質転換された宿主細胞を、このポリペプチドの産生のために適する条件下で培養する工程；および（ｂ）β−アラニンの産生のために適する条件下で、培養した宿主細胞にグルコースを提供する工程を包含する。β−アラニンは、必要に応じて、細胞から回収され得る。
【実施例】
【０１１１】
（実施例１：ａａｍライブラリー（ΔｐａｎＤ株）のための形質転換プロトコル）
突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ株ΔｐａｎＤは、Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．および  Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００）に記載されているＢＷ２５１１３に由来し、ａａｍ遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための宿主株として使用した。欠失を作成するために用いたプロトコルは、Ｃａｒｇｉｌｌの特許出願ＷＯ０３／０６２１７３号の実施例４に詳述されている。
【０１１２】
化学的に反応能を持つＥ．ｃｏｌｉ株ΔｐａｎＤを−８０℃の凍結保存から取り出し、融解した。その後、これを使用まで氷上に維持した。アリコート（形質転換あたり１００μｌ）を、滅菌した１．５ｍｌ遠心管に移した。ＫＣＭ（５×）塩溶液を、そのアリコートが１×になる濃度まで加えた。ＫＣＭは７００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなり、ｐＨ５．８に調整した。１〜５μｌのライゲーション混合液をその細胞に加えた。ライゲーション混合液を含むその細胞を、まず氷上で３０分間インキュベートした。その細胞を、４２℃で１分間熱ショックを与え、続いて氷上で２分間インキュベートした。５００μｌのＳＯＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第１版、ｐｐ．Ａ．２  およびＡ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を、その細胞に加え、３７℃で１時間、振とうしながらインキュベートした。次いで、この細胞を５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上記ＳＯＣを取り除いた。細胞ペレットは５００μｌのＭ９選択培地（（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第一版、ｐｐ．Ａ．２  およびＡ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）中に再懸濁し、３０℃で２〜４時間振とうしながらインキュベートした。次いでこの細胞を、１％マンノース、２０μｌ鉄クエン酸塩、５．０ｇ／ｌα−アラニン、０．１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、２５ｍＭ重炭酸塩、および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニンコールを加えたＭ９最小寒天培地にプレーティングした。プレーティングした細胞を、３０℃で３日間、またはコロニーがＱ−ＢＯＴＴＭ  ｒｏｂｏｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）を用いて回収するのに十分な大きさになるまでインキュベートした。
【０１１３】
形質転換の第２期では、上記の手法における最後の２回のインキュベーションのインキュベーション温度を３７℃に上げ、Ｍ９最小選択培地にはα−アラニンを加えなかった（０ｇ／Ｌ  α−アラニン）ことを除いて、上記の手法に従った。
【０１１４】
（Ａ．ａａｍライブラリー（ΔｐａｎＤ  ＫＩｆｌｄＡ株）のための代替形質転換プロトコル）
突然変異Ｅ．ｃｏｌｉ株ΔｐａｎＤは、Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００）に記載されているＢＷ２５１１３に由来し、ａａｍ遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための宿主株として使用する。欠失を作成するために用いられたプロトコルは、国際特許出願ＷＯ０３／０６２１７３号の実施例４に詳述されている。最適な方法として、付加的にフラボドキシン（ｆｌｄＡ）遺伝子の発現が増加た株を、ａａｍ遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための宿主株として使用した。なぜなら、増加したフラボドキシンは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で産生されたときにアミノムターゼ活性を促進するからである。Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｉａｏら）によって、２００５年１０月１４日に出願された「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ＳＡＭ）Ｅｎｚｙｍｅｓ」というタイトルのＵＳＳＮ      を参照のこと。この出願は、実施例１〜４で、ＡＡＭを発現し、かつフラボドキシンを過剰発現する細胞由来のβ−アラニンの産生について詳述してあり、これらの実施例は、本明細書中に参考として援用される。Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｉａｏら）によって、２００５年１０月１４日に出願された同じ出願であるＵＳＳＮ      は、実施例４（本明細書に援用される）に、人工Ｐｌａｃ／ａｒａハイブリッドプロモーターをｆｌｄＡ遺伝子のすぐ上流に配置したＥ．ｃｏｌｉ株の構築が詳述されている。ｆｌｄＡ遺伝子の前にこの人工プロモーターを有する株は、ＫｉｆｌｄＡと称され、ＫＩは「ノック・イン」を意味する。  
【０１１５】
反応能を持つＥ．ｃｏｌｉ株ΔｐａｎＤ  ＫＩｆｌｄＡの細胞を、標準的なプロトコルを用いて、化学的もしくは電子化学的のいずれかで調製する。反応能を持つＥ．ｃｏｌｉ株ΔｐａｎＤ  ＫＩｆｌｄＡを−８０℃の凍結保存から取り出し、融解した。その後、これを使用するまで氷上に維持した。アリコート（形質転換あたり１００μｌ）を、滅菌した１．５ｍｌ遠心管に移した。ＫＣＭ（５×）塩溶液を、そのアリコートが１×になる濃度まで加えた。ＫＣＭは７００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなり、ｐＨ５．８に調整した。１〜５μｌのライゲーション混合液をその細胞に加えた。ライゲーション混合液を含むその細胞を、まず氷上で３０分間インキュベートした。その細胞を、４２℃で１分間熱ショックを与え、続いて氷上で２分間インキュベートした。５００μｌのＳＯＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第１版、ｐｐ．Ａ．２  およびＡ．３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を、その細胞に加え、この細胞を３７℃で１時間、振とうしながらインキュベートした。次いで、この細胞を５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上記ＳＯＣを取り除いた。続いてペレットは、相補性分析（実施例３）もしくは生体内変換分析（実施例４）のいずれかに適切な培地中に再懸濁した。
【０１１６】
（実施例２：ａａｍ遺伝子のｐＣＫ１１０９００ベクターへのクローニング）
アラニンアミノムターゼ遺伝子を、誘導発現系へクローニングするために用いた戦略は、ＰＣＲによるａａｍ遺伝子の単離および、変異ｌａｃプロモーター／オペレーター系より下流のＳｆｉＩ制限酵素部位に、そのＰＣＲ断片をクローニングすることを包含した。はじめに、ＰＣＲプライマーを、ａａｍ遺伝子の５’末端および３’末端、およびリボソーム結合部位のシャイン・ダルガーノ配列、および独自のＳｆｉＩ制限部位に特異的な塩基配列を含むように設計した。次いで、上記遺伝子をテンプレートより増幅し、精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩによる消化を行った。上記ＰＣＲ制限酵素フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、図３の発現ベクターｐＣＫ１１０９００−Ｉ  ＢｌａのＳｆｉＩ部位に、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の支配下に、クローニングを行った。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んだ。シャッフルしたａａｍ遺伝子ライブラリーは、上記と同様の方法によってクローニングした。活性アラニン２，３−アミノムターゼを発現したいくつかのクローンが見つかり（実施例８の方法により）、その合成遺伝子を配列決定した。ＢＳＡＡＭ（配列番号５８）と命名したポリヌクレオチド配列をすべてのさらなる変異およびシャッフリングのための出発物質として用いた。ＢＳＡＡＭ（配列番号５８）は、野生株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓリジンアミノムターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  Ｈ１０３２９）と、およそ９９．２％のヌクレオチド同一性を有する。
【０１１７】
（実施例３：Ｔｉｅｒ  ２ａ成長分析によるスクリーニング）
Ｔｉｅｒ  ２ａ成長分析
その成長分析では、Ｅ．ｃｏｌｉΔｐａｎＤ宿主株におけるＡＡＭ改変体によって産生されたβ−アラニンを介して、必須代謝産物アセチルＣｏＡを産生することのできる改変体を同定する。それゆえ、成長はＣｏＡ生成物の、そして間接的にはＡＡＭ活性の関数である。
【０１１８】
（Ａ．手法）
ｔｉｅｒ１相補分析由来のＡＡＭ活性クローンを、ＱＢＯＴＴＭ  ｒｏｂｏｔ  ｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）によって回収し、９６ウェルマスタープレートに播種した。その播種したものを、９６ウェルマスタープレート中で、０．１μＭ  β−アラニンおよび０．５ｇ／Ｌ  α−アラニンを加えた緩衝化最小選択培地（Ｎａ２ＨＰＯ．７Ｈ２Ｏ  １２．８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、  ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、ＣａＣｌ２  ０．０４ｍＭ、マンノース  ２％、  ＩＰＴＧ  １ｍＭ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）  ２０μＭ、クロラムフェニコール  ３０μｇ／ｍｌ、ＭＯＰＳ  ｐＨ７、５０ｍＭ、および炭酸水素ナトリウム  ｐＨ９、２５ｍＭ）（後に「ＭＳＭ」と記す）によって成長させた。プレートを、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてカバーし、２５℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％で培養物が飽和に達するまでインキュベートし、その時点で、グリセロールを培養物に終濃度２０％から３０％になるよう加え、そのプレートを−８０℃で保存した。
【０１１９】
凍結させたマスタープレート由来のサンプルを、上述のように０．５ｇ／Ｌ  α−アラニンをさらに加えた緩衝化最小選択培地（ＭＳＭ）を含む「播種」プレートに整列させた。この播種プレートを、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）によってカバーし、２５℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％において培養物が飽和に達するまでインキュベートした。
【０１２０】
上記播種プレートより１５μｌを、０．５ｇ／Ｌ  α−アラニンを含有する新鮮なＭＳＭ１８５μｌを含む９６ウェル「アッセイ」プレートに播種した。このアッセイプレートは、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびふたを用いてカバーし、２５℃、湿度８５％、２５０ｒｐｍにおいてインキュベートした。６００ｎｍにおけるＯＤの測定を、およそ（約）４０時間の間に別々の時間に行った。
【０１２１】
（Ｂ．データ解析）
ライブラリー改変体は独特の成長過程を示したので、すべての潜在的に改良された改変体を同定するために、３つの異なる成長段階（初期、中期、後期）における成長率（勾配）を算出し、比較することが好ましかった。３段階のいずれかにおいて、そのプレートの平均値の３標準偏差以上を示したクローンは、潜在的に改善された改変体として命名し、相対的な順位づけのためにｔｉｅｒ  ２ｂにおいて追試した。
【０１２２】
（実施例４：Ｔｉｅｒ  ２ｂ成長分析によるスクリーニング）
成長スクリーニングの厳密さを、培地からα−アラニン（ＡＡＭの基質）を除くことによって、Ｔｉｅｒ  ２ｂにおいて増した。これらの条件下では、上記細胞は、ＡＡＭの、またそれに続く細胞成長の基質として供給するために、α−アラニンの内部／細胞内プールに依存している。α−アラニンの少ない、細胞内のプールを利用することができるＡＡＭ改変体は、、低ＫＭ改変体を代表する可能性がある。
【０１２３】
（Ａ．手法）
凍結させたマスタープレート由来のサンプルを、上述のように、０．５ｇ／Ｌ  α−アラニンをさらに加えた緩衝化最小選択培地（ＭＳＭ）を含む「播種」プレートに整列させた。この播種プレートを、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープによってカバーし、２５℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％において、培養物が成長飽和に達するまでインキュベートした。
【０１２４】
ＴＥＣＡＮＴＭ  Ｒｏｂｏｔｉｃ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）を、播種プレートよりＴｉｅｒ  ２ａ改変体各々由来の播種物を取り出し、それを以下の各々の中に８個の複製となるよう播種するために用いた：
０．５ｇ／Ｌ  α−アラニンを含有する新鮮なＭＳＭ１９０μｌを含む９６ウェルアッセイプレート。
α−アラニンを含有しない新鮮なＭＳＭ１９０μｌを含む９６ウェルアッセイプレート。
このアッセイプレートを、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープおよびふたを用いてカバーし、２５℃、湿度８５％、２５０ｒｐｍにおいて成長させた。サンプルを、およそ３〜４日の時点で回収し、そのＯＤ６００ｎｍを各サンプルごとに測定した。
【０１２５】
（Ｂ．Ｔｉｅｒ  ２ｂ  データ解析）
改変体を以下の３つの評価基準によって評価した：
ｉ）増殖速度は、α−アラニンを含まない培地の最終培養ＯＤ６００と、α−アラニンを含む培地の最終培養ＯＤ６００ｎｍとで等しい；
ｉｉ）最終培養ＯＤ６００；および
ｉｉｉ）初期増殖速度（第１段階において、およそ０時間〜２０時間）
最終培養ＯＤ６００ｎｍ＞０．７であるクローンを維持した。
【０１２６】
次いで、クローンを、評価基準（ｉ）の増殖速度に基づいて評価した。ＯＤ６００ｎｍ＞０．７である、いかなるクローンも維持した。しかし、上の２つの評価基準を満たさないが、非常に優れた初期増殖速度（ｉｉｉ）を有するクローンもまた、さらなる評価のために選択した。
（実施例５：Ｔｉｅｒ  ２ｃ−ＰＣＲ解析を介したスクリーニング）
そのＰＣＲスクリーニングでは、機能についてのさらなるスクリーニングに先立って、発現ベクターにおいて正しいサイズの遺伝子を有する改変体を同定する。それによって、スクリーニングプロセスで欠失／短縮化を受けた可能性のある、不安定な遺伝子改変体は除外する。
【０１２７】
（Ａ．手法）
凍結させたマスタープレート由来の、潜在的に改善された改変体を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地を含む９６マイクロウェルプレートに播種した。培養物を、２５℃、２５０ｒｐｍ、湿度８５％において、ＡｉｒＰｏｒｅＴＭ  微孔性テープ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いてカバーしたプレート内で、培養物が飽和に達するまで、およそ２日間増殖させた。その培養物１０μｌをＰＣＲプレートに移し、９９℃において１０分間ボイルして、細胞を破砕した。次いで、以下のＰＣＲマスターミックス９０μｌを、その破砕した細胞に加えた。
ＰＣＲマスターミックス
【０１２８】
【化３】
2008517607.tif 000010
ＰＣＲ反応に用いたＢａｃｉｌｌｕｓ特異的なプライマーは以下のとおりである。
【０１２９】
【化４】
2008517607.tif 000011
増幅反応は３０サイクル行った。最初のサイクルは９４℃において１分間行った。次いで、伸長反応を、９４℃１分間、５５．０℃３０秒、および７２℃１分間によって、２９サイクル行った。最終伸長を、７２℃において５分間行った。ＰＣＲ反応産物を、０．８％アガロースゲルにおいて、ゲル電気泳動によって解析した。
【０１３０】
（実施例６：β−アラニン生成のためのＡＡＭ改変体の増殖（５０ｍｌスケール））
ＡＡＭ活性を同定するための細胞選択方法
アラニン２，３−アミノムターゼ反応を行い得るポリペプチドをコードする遺伝子を同定するために、所望の活性のための効率的なスクリーニングまたは選択が必要とされる。それゆえ、Ｅ．ｃｏｌｉがパントテン酸（これは、次々とコエンザイムＡ（ＣｏＡ）およびアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）の構成成分となる）の合成のために、β−アラニンを利用することを認識することによって選択方法を開発した。ＣｏＡおよびＡＣＰは、生体内で主要なアシル基キャリアであり、生育に必須である。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、β−アラニンへの主要なルートは、アスパラギン酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１１）により触媒化される反応におけるアスパラギン酸由来であり、その酵素はｐａｎＤ遺伝子によってコードされている。ｐａｎＤの機能欠失変異体（ΔｐａｎＤと示す）はβ−アラニン栄養要求性と増殖阻害を引き起こす。それらは、パントテン酸もしくはβ−アラニンの外的付加、またはもう片方の供給源由来で産生されたβ−アラニンによって、軽減される。
【０１３２】
菌株の解説：Ｅ．ｃｏｌｉΔｐａｎＤ宿主株（ＢＷ２５１１３由来であり、Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５（２０００）に記載されている）は、ｐＣＫ１１０９００−Ｉ  Ｂｌａベクター（変異ｌａｃプロモーター配列によってもたらされる、低いプロモーター強度を有する）を用いて形質転換した。播種培養物を、緩衝化最小選択培地（ＭＳＭ）：Ｍ９塩、ｐＨ７．０〜７．４、５０ｍＭ  ＭＯＰｓ、ｐＨ７．０、２５ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、ｐＨ９．０、１ｍＭ  イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール、０．１ｇ／Ｌ  アラニン、５μＭ  ピリドキシンＨＣｌおよび２０μＭ  クエン酸酸化鉄）において増殖させた。播種培養物の１：２０希釈液を、上記に詳述したＭＳＭ培地５０ｍｌに播種するために用いた。培養物を、２５℃、２５０ｒｐｍにおいて、およそ３日間、あるいは培養物のＯＤ６００ｎｍが約１に達するまでインキュベートした。次いで、α−アラニンを終濃度が３００ｍＭ、パントテン酸を終濃度がおよそ３００μＭになるよう培地に加えた。その補足培地によるインキュベーションを、２５℃、２５０ｒｐｍにおいて継続した。α−アラニンの添加後、ｔ＝０時間からｔ＝５時間の時点において、解析のためにサンプルを培地から回収した。
（実施例７：β−アラニン検出のための細胞抽出方法）
実施例６の培養物由来の細胞を、その培養物の遠心分離によって回収した。その上清（消費された培地）をデカントし、さらなる分析（下記）のために保存した。その細胞ペレットを水を用いて洗浄した。そのペレットは、−８０℃において、さらなる抽出のために保存し得る。その５０ｍｌの細胞ペレット（ＯＤ約４．０）を試験管内において、０．９ｍｌの水中に完全に再懸濁した。各々のサンプルの抽出容量を、回収物のＯＤ６００に従って調整した。等量のメタノール（−２０℃）および２００μｌの微小ガラスビーズを加え、その混合物を激しく攪拌した。その混合物を含む試験管を、ドライアイス／エタノール上、もしくは−８０℃フリーザー中に約３０分間静置した。その試験管内の凍結内容物を室温で融解し、再び激しく攪拌し、かつ最高速で約１０分間遠心分離を行った。その上清を、０．２ミクロン〜０．４５ミクロンのフィルタープレート、もしくはシリンジフィルターを用いて濾過した。
【０１３３】
その消費された培地を、０．２ミクロン〜０．４５ミクロンのフィルタープレート、もしくはシリンジフィルターを用いて濾過した。その濾過した消費された培地を、−２０℃メタノール／水（メタノール終濃度５０％）中において、１：１０に希釈した。
【０１３４】
細胞抽出物および使用後培地中のβ−アラニン量を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて分析した（実施例８）。
【０１３５】
消費された培地については、最初の１分間は廃棄するようにした。β−アラニンのピークは、およそ２．０分に達した。
【０１３６】
消費された培地のみを分析する場合は、分析スケールを２ｍｌにし得る。
【０１３７】
（実施例８：β−アラニンのアッセイ（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ））
β−アラニンを、液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせを用いて定量した。適した分析物は、実施例７において調製された細胞抽出物および消費された培地である。
【０１３８】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）段階を、ＡＳＴＥＣ  ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣＴＭＴ  ４．６ｃｍ×５０ｍｍキラルＬＣカラム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ）を用いて行った。移動相は、２つの溶液：Ａ：０．２５％酢酸水溶液およびＢ：０．２５％（ｖ／ｖ）酢酸／メタノールからなり、溶出を、０．６ｍｌ／分アイソクラティック（無勾配）で行った。
【０１３９】
質量分析（ＭＳ）法を、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ質量分析計において、以下の調整パラメーターを用いて行った。：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン電圧：２０Ｖ；六重極１（ｈｅｘ１）：１５Ｖ；開口部：１．０Ｖ；ソース温度：１００℃；放出温度：３５０℃；コーンガス：４０Ｌ／ｈｒ；放出ガス：５００Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１２；高質量分解能（Ｑ１）：１２；イオンエネルギー（Ｑ１）：０．１；コリジョンセル入口：−５；コリジョンエネルギー：１４；出口：１；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．０；倍増管：６５０Ｖ。
【０１４０】
【化５】
2008517607.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、アラニン２，３−アミノムターゼによって触媒される、α−アラニン（すなわち、Ｌ−アラニンまたは２−アミノプロピオン酸）とβ−アラニン（３−アミノプロピオン酸）との間の可逆反応を示す。
【図２】図２は、中間体としてのβ−アラニンを経由した、α−アラニンから３−ヒドロキシプロピオン酸塩（３−ＨＰ）合成の経路である。
【図３】図３は、Ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）、ｌａｃＩリプレッサー、ＣＡＰ結合部位、ｌａｃプロモーター（ｌａｃ）、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０  ＲＢＳ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含む、本発明の４０３６ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０９００−Ｉ  Ｂｌａ）である。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｇ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｈ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｉ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図４Ｊ】図４Ａ〜図４Ｊの組み合わせは、本発明のＡＡＭを産生するために使用された、４つの親ポリペプチドのアミノ酸配列のアライメント図を示す。その親ポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｓｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄｉｉ（配列番号５３）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（配列番号５５）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（配列番号５７）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号５９）のＫＡＭに、それぞれ部分的に由来した。２つの野生型ＫＡＭの配列は、配列番号６０（Ｐ  ＧＩ２５２９４６７＿Ｇ８＿ＡＡＢ８１１５９．１＿）および６１（Ｐ＿ＧＩ２６３４３６１＿ＥＭＢ＿ＣＡＢ１３８６０．１）において、開示されている。コンセンサス配列はまた、配列番号６２として提供される。
【図１】
2008517607.tif 000013
【図２】
2008517607.tif 000014
【図３】
2008517607.tif 000015
【図４Ａ】
2008517607.tif 000016
【図４Ｂ】
2008517607.tif 000017
【図４Ｃ】
2008517607.tif 000018
【図４Ｄ】
2008517607.tif 000019
【図４Ｅ】
2008517607.tif 000020
【図４Ｆ】
2008517607.tif 000021
【図４Ｇ】
2008517607.tif 000022
【図４Ｈ】
2008517607.tif 000023
【図４Ｉ】
2008517607.tif 000024
【図４Ｊ】
2008517607.tif 000025
【配列表】
2008517607000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月2日(2007.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008517607000001.app
【国際調査報告】
2008517607.tif 000132
2008517607.tif 000133
2008517607.tif 000134
2008517607.tif 000135
2008517607.tif 000136