(57)【要約】  本発明は、ハロコンブスタチンと命名される新規化合物に関する。ハロコンブスタチンは、コンブレタスタチンＡ−３の誘導体であり、ヒト癌細胞系のパネルとマウスＰ３８８白血病に対する癌細胞増殖阻害だけでなく、チューブリン重合化の阻害剤とコルヒチンのチューブリンへの結合の阻害剤としての活性を明示する化合物が含まれる。
2008514614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
【化１】
2008514614.tif 000079
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである］の構造を有する化合物。
【請求項２】
以下：
【化２】
2008514614.tif 000080
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、Ｒは、Ｎａ、Ｌｉ、Ｋ、Ｃｓ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇのような金属カチオンであるか、又はモルホリン、ピペリジン、グリシン−ＯＣＨ３、トリプトファン−ＯＣＨ３、又はＮＨ（ＣＨ２ＯＨ）３である］の構造を有する化合物。
【請求項３】
以下：
【化３】
2008514614.tif 000081
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、Ｚは、Ｎａ、Ｌｉ、Ｋ、Ｃｓ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇのような金属カチオンであるか、又はモルホリン、ピペリジン、グリシン−ＯＣＨ３、トリプトファン−ＯＣＨ３、又はＮＨ（ＣＨ２ＯＨ）３である］の構造を有する化合物。
【請求項４】
Ｘ＝Ｆであり、Ｚ配置で存在する、請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｘ＝Ｉであり、Ｚ配置で存在する、請求項１の化合物。
【請求項６】
Ｘ＝Ｆである、請求項２の化合物。
【請求項７】
Ｘ＝Ｉである、請求項２の化合物。
【請求項８】
Ｘ＝Ｉである、請求項３の化合物。
【請求項９】
請求項１の化合物の有効量をヒト又は哺乳動物へ投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
【請求項１０】
請求項２の化合物の有効量をヒト又は哺乳動物へ投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
【請求項１１】
請求項３の化合物の有効量をヒト又は哺乳動物へ投与することを含んでなる、癌を治療するための方法。
【請求項１２】
癌が甲状腺癌であり、化合物においてＸ＝Ｉである、請求項９の方法。
【請求項１３】
癌が甲状腺癌であり、化合物においてＸ＝Ｉである、請求項１０の方法。
【請求項１４】
癌が甲状腺癌であり、化合物においてＸ＝Ｉである、請求項１１の方法。
【請求項１５】
請求項１の化合物とそのための医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
請求項２の化合物とそのための医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項３の化合物とそのための医薬的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、そのいずれの開示も参照によりそのまま本明細書へ組み込まれる、２００４年９月２４日に出願された米国特許出願第１０／９４８，９２６号と、やはり２００４年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／６１２，８８８号に基づいて、これらへの優先権を主張する。
【０００２】
連邦支援研究に関する陳述
本発明への資金支援は、米国政府、癌治療及び診断部門、国立癌研究所、厚生福祉サービス分野優秀研究助成番号（the United States Government, Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, Department of Health and Human Services Outstanding Investigator Grant Numbers）ＣＡ４４３４４−０５−１２；Ｒ０１−ＣＡ９０４４１−０１；及びＲ０１  ＣＡ０９０４４１−０３−４４１；アリゾナ疾患制御研究委員会契約番号（the Arizona Disease Control Research Commission contract Number）９８１５；及び、民間寄付金により提供された。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
技術分野
本発明は、癌の治療において、及び／又は抗微生物薬として有用性を有する新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
癌及び／又は腫瘍を治療するための医薬剤が広く求められている。有望な抗腫瘍治療剤として抗血管新生剤が探究されている。コンブレタスタチンＡ−４は、１つのそのような抗血管新生剤である。種々の研究は、コンブレタスタチンＡ−４が培養中のヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の微小管を破壊することを実証した。該化合物が細胞に入るときに、無細胞系において示されるチューブリン結合特性が保持されること、そしてチューブリン結合が生物活性の重要な要素であることも示されている。
【０００５】
アフリカヤブヤナギ（African Bush Willow）の Combretum caffrum は、コンブレタスタチンと呼ばれる癌細胞増殖阻害性の構成成分のきわめて重要な供給源であることがわかっている。これらの構成成分の中で最も強力であるのは、コンブレタスタチンＡ−４（１ａ，「ＣＡ−４」）であり、そのリン酸ナトリウム誘導体（１ｂ，「ＣＡ−４Ｐ」）は、１９９８年にフェーズＩヒト癌臨床試験へ進んだ（Remick, S. C. et al., (1999) Phase I Pharmacokinetics Study of Single Dose Intravenous (IV) Combretastatin A-4 Prodrug (CA4P) in Patients (pts) with Advanced Cancer「進行癌の患者でのコンブレタスタチンＡ−４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）単回静脈内投与（ＩＶ）のフェーズＩ薬物動態試験」, Molecular Targets and Cancer Therapeutics Discovery, Development, and Clinical Validation「分子標的及び癌治療薬の探索、開発、及び臨床評価」, Proceedings of the AACR-NCI-EORTC International Congress, Washington, DC, #16, p. 4.）。全体の結果は依然として有望であり、ヒト癌フェーズＩＩ及び組合せＩｂの試験が現在進行中である。
【０００６】
ＣＡ４Ｐの抗血管、抗血管新生、及び全般的な抗転移活性だけでなく、他の抗癌剤、放射免疫療法、及び高熱療法との組合せにおけるその相乗的な有用性も、積極的な研究対象の分野である（Griggs, J., et al., Combretastatin A-4 Disrupts Neovascular Development in Non-Neoplastic Tissue「コンブレタスタチンＡ−４は、非新生物組織における新血管発生を妨害する」, British J. of Cancer 2001, 84, 832-835; Folkman, J., Angiogenesis-Dependent Diseases「血管新生依存性の疾患」, Seminars in Oncology 2001, 28, 536-542; Kruger, E. A. et al., Approaches to Preclinical Screening of Antiangiogenic Agents「抗血管新生剤の前臨床スクリーニングへのアプローチ」, Seminars in Oncology 2001, 28, 570-576; Jin, X., et al., Evaluation of Endostatin Antiangiogenesis Gene Therapy in vitro and in vivo「エンドスタチン抗血管新生遺伝子治療の in vitro 及び in vivo での評価」, Cancer Gene Therapy 2001, 8, 982-989; Vacca, A. et al., Bone Marrow Angiogenesis in Patients with Active Multiple Myeloma「活動性多発性骨髄腫の患者における骨髄血管新生」, Seminars in Oncology 2001, 28, 543-550; Rajkumar, S. V., et al., Angiogenesis in Multiple Myeloma「多発性骨髄腫における血管新生」, Seminars in Oncology 2001, 28, 560-564; Griggs, J., et al., Potent Anti-metastatic Activity of Combretastatin A-4「コンブレタスタチンＡ−４の強力な抗転移活性」, Int. J. Oncol. 2001, 821-825; Pedley, R. B. et al., Eradication of Colorectal Xenografts by Combined Radioimmunotherapy and Combretastatin A-4 3-O-Phosphate「放射免疫療法とコンブレタスタチンＡ−４  ３−Ｏ−リン酸塩の組合せによる結直腸異種移植片の根治」, Cancer Research 2001, 61, 4716-4722; Eikesdal, H. P., et al., Tumor Vasculature is Targeted by the Combination of Combretastatin A-4 and Hyperthermia「腫瘍の脈管構造は、コンブレタスタチンＡ−４及び高熱療法の組合せの標的になる」, Radiotherapy and Oncology 2001, 61, 313-320 を参照のこと）。
【０００７】
本発明の化合物のいくつかは、甲状腺癌の治療に特に関わる。２００２年には、約２０，０００の米国民が甲状腺癌と診断され；この分布は、約８０％が乳頭状であり、１４％が、甲状腺ホルモンを産生する小胞性上皮細胞より派生した小胞分化癌であった。残る甲状腺の悪性腫瘍のうち、約４％は髄様癌（神経内分泌）であり、２％は例外的に侵襲性の未分化癌（メジアン生存期間は４〜５ヶ月で、ほぼ１００％致死性のアウトカム）であった。重要にも、小胞癌と未分化癌の発症は、ヨウ素欠乏の地理領域において上昇する。甲状腺癌では、放射線被曝が最も一般的な危険因子である。さらに、甲状腺の発育及び機能を調節するのにきわめて重要である、脳下垂体ホルモンの甲状腺刺激ホルモン（ＴＨＳ）の過剰産生は、甲状腺癌の病因において重要であるかもしれない。これまで使用されてきた甲状腺癌の臨床療法には、外科手術、ＴＨＳの抑制、１３１Ｉ−放射線療法、及び抗癌剤が含まれる。しかし、２００２年には、米国でほぼ１，３００人の甲状腺癌の犠牲者が死亡し、より定常的に有効な抗癌剤への大きなニーズが重視されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要約
本発明は、コンブレタスタチンＡ−３（３ａ）とそのリン酸エステルプロドラッグ（３ｂ）の修飾を構成する新規化合物に関連し、ここでは、３−ヒドロキシキ又は３−ヒドロキシ及び５−ヒドロキシ基がハロゲン化物に置き換えられている。代表的なハロゲン化物は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素である。この新規化合物の塩も本明細書に開示する。また本明細書に記載するのは、３−フルオロ、３−クロロ、３−ブロモ、及び３−ヨードースチルベンのリン酸エステル誘導体である。
【０００９】
本発明の化合物は：
【００１０】
【化１】
2008514614.tif 000003
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである］；
【００１１】
【化２】
2008514614.tif 000004
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、Ｒは、Ｎａ、Ｌｉ、Ｋ、Ｃｓ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇのような金属カチオンであるか、又はモルホリン、ピペリジン、グリシン−ＯＣＨ３、トリプトファン−ＯＣＨ３、又はＮＨ（ＣＨ２ＯＨ）３である］；及び、
【００１２】
【化３】
2008514614.tif 000005
［式中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、Ｚは、Ｎａ、Ｌｉ、Ｋ、Ｃｓ、Ｒｂ、Ｃａ、Ｍｇのような金属カチオンであるか、又はモルホリン、ピペリジン、グリシン−ＯＣＨ３、トリプトファン−ＯＣＨ３、又はＮＨ（ＣＨ２ＯＨ）３である］を含む。
【００１３】
本発明の化合物のいくつかは、ヒト癌細胞系のパネルとマウスＰ３８８白血病に対して、ＣＡ−４及びＣＡ−３のような先行技術のコンブレタスタチン化合物に比較して、きわめて高められた（＞１０〜１００ｘ）癌細胞増殖阻害を明示する。このヨード化合物は、甲状腺癌の治療に特に有望であるように見える。本発明の化合物は、チューブリン重合化とコルヒチンのチューブリンへの結合の阻害活性を明示する。さらに、本化合物のいくつかは、抗微生物特性を明示する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の詳細な説明
癌、特に腫瘍の治療のための療法アプローチとしての抗血管新生の概念は、有望な戦略として活発に探究されている。化合物、コンブレタスタチンＡ−４は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の微小管を培養において破壊するとかつて実証された。それらの研究により、その化合物が細胞に入ったときに、無細胞系において示されたチューブリン結合特性が保持されること、そしてチューブリン結合が生物活性の重要な要素であることが確かめられた。
【００１５】
従って、本発明の目的は、チューブリン結合剤として有用であり得る新しい化合物を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、抗血管新生特性を保有する化合物を提供することである。
【００１７】
本発明のなお別の目的は、癌、特に腫瘍に罹患した、ヒトが含まれる哺乳動物の治療に療法剤として使用の化合物を提供することである。
【００１８】
本発明のなおさらなる目的は、抗微生物薬として使用の化合物を提供することである。
【００１９】
結果と考察
本発明のスチルベンの製造は、本明細書において詳しく記載するようにして達成した。この反応系列は、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル（４）としてのイソバニリンの保護により開始した。ホウ水素化ナトリウムを使用して、ベンズアルデヒド（４）をベンジルアルコール（５）へ還元し、臭化ホスホニウム（６）への変換を続けた。ＴＨＦ中のｎ−ブチルリチウムを使用する、ウィテッヒ中間体（６）のそれぞれのハロ−アルデヒドとの縮合により、シリル基保護化スチルベン（７〜１０）を得た。フッ化テトラブチルアンモニウムでの後続の脱保護化（図３ａ）により、３−ハロ−スチルベン（１１〜１４）を得た。亜リン酸ジベンジル（dibenzylphosphite）、ジイソプロピルエチル−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン、及び四塩化炭素をアセトニトリル中で使用して、Ｚ異性体（１１ａ、１３ａ、及び１４ａ）をリン酸化して、リン酸ビスベンジル（１５〜１７）を得た。トリメチルシリルブロミドに続いて対応の塩基を使用して、リン酸エステル（１５〜１７）の脱ベンジル化を達成して、リン酸エステル(phosphate)（１８〜２０）を得た（Pettit, G. R. et al., Antineoplastic Agents 440. Asymmetric Synthesis and Evaluation of the Combretastatin A-1 SAR Probes (1S,2S) and (1R,2R)-1-2-Dihydroxy-1-(2', 3'-dihydroxy-4'-methoxyphenyl)-2-(3",4",5"-trimethoxyphenyl)-ethane「抗新生物剤４４０．コンブレタスタチンＡ−１  ＳＡＲプローブ（１Ｓ，２Ｓ）及び（１Ｒ，２Ｒ）−１−２−ジヒドロキシ−１−（２'，３'−ジヒドロキシ−４'−メトキシフェニル）−２−（３”，４”，５”−トリメトキフェニル）−エタンの不斉合成と評価」，J. Nat. Prod. 2000, 63, 969-974; Pettit, G. R. et al., Antineoplastic Agents 460. Synthesis of Combretastatin A-2 Prodrugs「抗新生物剤４６０．コンブレタスタチンＡ−２プロドラッグの合成」，Anticancer Drug Design,. 2001, 16, 185-194; Pettit, G. R. et al., Antineoplastic Agents 463. Synthesis of Combretastatin A-3 Diphosphates「抗新生物剤４６３．コンブレタスタチンＡ−３二リン酸エステルの合成」，Anticancer Drug Design,. 2000, 15, 397-404; Ladd, D. L., et al., A New Synthesis of 3-Fluoroveratrole and Z-Fluoro-3,4 Dimethoxy Benzaldehyde「３−フルオロベラトロール及びＺ−フルオロ−３，４−ジメトキシベンズアルデヒドの新たな合成」，Synth. Cummun. 1985, 15. 61 を参照のこと）。
【００２０】
化合物（１１ａ）〜化合物（２０ａ）として表Ｉに、そして化合物として表Ｉａに示す新たなハロ−スチルベン又はハロコンブスタチンは、関連のコンブレタスタチンに比べて、いずれもきわめて強い癌細胞増殖の阻害を明示した。リン酸塩へ変換した３つのスチルベン（１１ａ，１３ａ，１４ａ）は、いずれも強い活性を保持して、それらの３−ハロ−スチルベン前駆体より著しく優れた水溶性を示した。評価したＥ幾何異性体は、in vitroで、癌細胞増殖の阻害剤としてずっと有効でないように見えた。
【００２１】
ヨード−スチルベン系列の癌細胞増殖を阻害する能力について特に検証して、コンブレタスタチンＡ−３及びコンブレタスタチンＡ−４と比較した（表Ｉａ）。リン酸塩へ変換したヨード−スチルベンは、いずれも強い活性を保持して、予期されるように、ヨード−スチルベン前駆体より著しく優れた水溶性を示した（表Ｉａ）。
【００２２】
２系統のヒト未分化甲状腺癌、ＫＡＴ−４及びＳＷ１７３６を利用する別の試験において（表７を参照のこと）、新規化合物のいくつかを、特異性増加のポテンシャルについて評価した。ジヨードコンブスタチン（２２ａ）は、ヨードコンブスタチン（１４ａ，表７）よりやや阻害性であることがわかった。カリウムリン酸塩の（２０ｃ）及び（２４ｃ）は、同様の活性を生じた。ヒト甲状腺癌、ＫＡＴ−４細胞の増殖は有意に抑えられたが、ＳＷ１７３６細胞は、上記化合物に対してやや抵抗性であるように見え、概して言えば、特異性の増加を認めなかった。今後、療法アプローチとしての抗血管新生を有望な抗腫瘍戦略として積極的に探究する。
【００２３】
それらの強力な細胞傷害性のために、４種のハロコンブスタチン（１１ａ、１２ａ、１３ａ、及び１４ａ）について、チューブリン重合化と［３Ｈ］コルヒチンのチューブリンへの結合に対する阻害効果をコンブレタスタチンＡ−４（１ａ）と比較した。この比較の結果を表ＩＩに示す。これらの実験結果は、この５種の化合物がチューブリンとの見かけの相互作用において本質的に同一であることを実証する。４種のハロコンブレタスタチンは、重合化反応を１．５〜１．６μＭのＩＣ５０値で阻害し、これに対してＣＡ４（１ａ）では、１．８μＭのＩＣ５０値であった。これらの化合物間のわずかな差は、標準偏差により示されるように、実験誤差内にあった。
【００２４】
同様に、４つのｃｉｓ−スチルベンは、いずれもコルヒチン結合アッセイのきわめて強力な阻害剤であった。［３Ｈ］コルヒチンの１／５の濃度であるが、チューブリン濃度に等しいモル濃度で存在する場合、放射標識リガンドの結合は、７５〜８９％阻害された（最低の阻害効果と最高の阻害効果がスチルベン（１１ａ）と（１３ａ）で観察されて、これらが重合化アッセイでは最大の阻害効果を表示した２つの化合物であることに注目せよ）。より初期の試験において、Ａ環のＣ−３位にメトキシキ又はハロゲンの代わりにヒドロキシル置換基があるコンブレタスタチンＡ−３（３ａ）は、チューブリンアセンブリーの阻害剤としてＣＡ４（１ａ）の約半分の活性、チューブリンへのコルヒチン結合の阻害剤として約１／５の活性、そして細胞増殖の阻害剤としては約１／７の活性であることが見出された（Lin, C. M., et al, Interactions of Tubulin with Potent Natural and Synthetic Analogs of the Antimitotic Agent Combretastatin: A Structure-activity Study「抗有糸分裂剤、コンブレタスタチンの強力な天然及び合成類似体とチューブリンの相互作用：構造−活性研究」，Mol. Pharmacol., 1988, 34, 200-208 を参照のこと）。関連した知見は、Ｃ−３置換基を水素原子で置き換えることによって完全に消失させると、重合化に対する阻害効果の約７倍の低下と細胞傷害活性の完全な消失をもたらすことである（Cushman, M., et al., Synthesis and Evaluation of (Z)-1-(4-methoxyphenyl)-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethane as Potential Cytotoxic and Antimitotic Agents「潜在的な細胞傷害剤及び抗有糸分裂剤としての（Ｚ）−１−（４−メトキシフェニル）−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）エタンの合成及び評価」, J. Med. Chem. 1992, 35, 2293-2306 を参照のこと）。
【００２５】
従って、上記の理論に束縛されることを企図しないが、ＣＡ４（１ａ）と本発明の新規ハロコンブスタチンで観察される最適の活性には、ある大きさ（ここでは、フッ素原子が最小であり得る）のＣ−３置換基が必要とされるようである。故に、この置換基の支配的な効果がリガンドのタンパク質との相互作用の直接的な亢進より生じることはありそうにないと思われる。最もあり得るのは、Ａ環の置換基が、活性のあるｃｉｓ−スチルベンに薬物−チューブリン相互作用に有利であるコンホメーションをより高い確率で取らせることである（Hamel, E.; Evaluation of Antimitotic Agents by Quantitative Comparisons of Their Effects on the Polymerization of Purified Tublin「精製チューブリンの重合化に対する効果の定量比較による抗有糸分裂剤の評価」，Cell Biochem. Biophys., 投稿中、を参照のこと）。
【００２６】
チューブリン重合化は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ７４００／７５００分光光度計を他所で詳しく記載されるように使用する３５０ｎｍでの濁度測定によって評価した（National Committee for Clinical Laboratory Standards「臨床実験の全国委員会基準」酵母のブロス希釈抗真菌感受性試験の標準法を参照のこと。承認スタンダード：Ｍ２７−Ａ。ペンシルヴェニア州ウェイン：ＮＣＣＬＳ，１９９７）。様々な濃度の薬物を１０μＭ：Ｍ（１０ｍｇ／ｍｌ）の精製チューブリンとプレインキュベートした（Hamel, E., et al., Separation of Active Tubulin and Microtubule-associated Proteins by Ultracentrifugation and Isolation of a Component Causing the Formation of Microtubule Bundles「超遠心分離による活性チューブリンと微小管会合タンパク質の分離と、微小管束の形成を引き起こす成分の単離」，Biochemistry 1984, 23, 4173-4184 を参照のこと）。試料を氷上で冷やし、ＧＴＰ（０．４ｍＭ）を加えて、重合化を３０℃で追跡した。測定する変数は、２０分後の反応の程度であった。先に詳しく記載されたようにして、コルヒチン結合を測定した。反応混合物は、１．０μＭ：Ｍチューブリン、５．０：Ｍ［３Ｈ］コルヒチン（Ｄｕｐｏｎｔより）、及び１．０μＭ：Ｍの阻害剤を含有した。インキュベーションは、３７℃で１０分間であった。
【００２７】
本発明者はまた、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において微小管を破壊する、ハロコンブスタチン（１１ａ）及び（１２ａ）の能力を実証した。ＨＵＶＥＣは、当業者に知られた方法に従って単離した（Jaffe, E. A. et al., Culture of Human Endothelial Cells Derived From Umbilical Veins. Identification by Morphologic and Immunologic Criteria「臍静脈に由来するヒト内皮細胞の培養。形態学及び免疫学の判定基準による同定」，J. Clin. Invest. 1973, 52, 2754-2756 を参照のこと）。
【００２８】
さらに詳しい実験の系列において、化合物（１１ａ）（フルオロコンブスタチン）をＨＵＶＥＣに対して in vitro でさらに評価した。これらの細胞は、フルオロコンブスタチン（１１ａ）に対して有意な感受性を示した：ＥＤ５０  ０．０００２５μｇ／ｍＬ。臍帯長さだけでなくジャンクション数も、未処置対照に比較して、０．０１μｇ／ｍＬと０．００１μｇ／ｍＬの両方で著しく低下した。内皮細胞に抗するそのような活性は、内皮細胞が血管新生プロセスにおいて中心的な役割を担うことが知られているので、重要である。モノ及びジヨードコンブスタチン（１４ａ及び２２ａ）の両方で、臍帯長さだけでなくジャンクション数も、未処置対照（図５Ａ）に比較して、０．００１μｇ／ｍｌで著しく低下し（表ＩＩＩと図５Ｂ及び５Ｄを参照のこと）、０．０００１μｇ／ｍｌで対照と同様であった（図５Ｃ及び５Ｅ）。０．００１μｇ／ｍｌで、（２０ｃ）（図５Ｆ）は、（１４ｃ）（図５Ｇ）に比較して、臍帯サイズのやや大きな低下を示した。ＨＵＶＥＣ内皮細胞に抗するそのような阻害活性は、これらの細胞が血管新生プロセスにおいて中心的な役割を担うので、きわめて興味深い。
【００２９】
本発明のハロコンブスタチンは、抗微生物特性も有するようである。より具体的に言えば、それらは、抗真菌及び／又は抗菌特性を有するようである。ハロコンブスタチンの抗微生物評価は、基準ブロス微量希釈アッセイによって実施する感受性試験を伴った。ハロコンブスタチンの抗菌活性はきわめて類似していて、グラム陽性菌と病原性真菌 Cryptococcus neoformans を標的とした。結果を表ＩＶに示す。フルオロコンブスタチン（１１ａ）のリン酸ナトリウム誘導体（１６ａ）は、有意な抗微生物活性を保持しなかった。
【００３０】
同様に、本発明者は、コンブレタスタチンＡ−３（但し、そのリン酸ナトリウムプロドラッグではない）が病原性真菌 Cryptococcus neoformans の増殖を阻害することをすでに示した（Pettit, G. R., et al., Antineoplastic Agents 463. Synthesis of Combretastatin A-3 Diphosphates「抗新生物剤４６３．コンブレタスタチンＡ−３二リン酸塩の合成」，Anticancer Drug Design 2000, 15, 397-404 を参照のこと）。本化合物の抗微生物活性を判定するために、基準ブロス微量希釈アッセイによって感受性試験を実施した（National Committee for Clinical Laboratory Standards「臨床実験の全国委員会基準」好気的に増殖する細菌についての希釈抗微生物感受性試験法。承認スタンダード：Ｍ７−Ａ５。ペンシルヴェニア州ウェイン：ＮＣＣＬＳ，２０００；National Committee for Clinical Laboratory Standards「臨床実験の全国委員会基準」酵母のブロス希釈抗真菌感受性試験の標準法。承認スタンダード：Ｍ２７−Ａ。ペンシルヴェニア州ウェイン：ＮＣＣＬＳ，１９９７を参照のこと）。本発明のハロコンブレタスタチンの抗微生物活性はきわめて類似していて、グラム陽性菌と Cryptococcus neoformans を標的とした。これを表ＩＶにさらに詳しく例示する。また、表Ｖには、ジヨードコンブスタチン（２２ａ）及び（２２ｂ）の２つが M. Luteus に対して活性があり、ジヨードコンブスタチン（２４ａ〜２４ｈ）が N. gonorrhoeae に対してきわめて活性があったことが示される（表Ｖ）。ヨードコンブスタチン（２０ｄ）、（２０ｇ）、及び（２０ｈ）も、N. gonorrhoeae に対しても活性があり、ヨードコンブスタチン（１４ａ）は、病原性酵母 Cryptococcus neoformans に対してわずかな活性しかなかった（表Ｖ）。このように、見られるように、本発明の新規化合物のいくつかは、抗真菌剤及び抗菌剤のような抗微生物剤としてのポテンシャルを有するようである。
【００３１】
我々のヨード及びジヨードコンブスタチンの選択物をヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対してin vitro で評価した（表ＶＩ）。上記の細胞は、これらの化合物のいずれに対しても有意な感受性を示した。最も活性のあるヨードコンブスタチン（１４ａ）：ＥＤ５０  ０．００００４０μｇ／ｍＬは、ジヨードコンブスタチン（２２ａ）より活性があり、リン酸エステル（２０ｃ）と（２０ａ）の間で同様のパターンが観察された。
【００３２】
表ＶＩＩは、ヒト未分化甲状腺癌細胞系に対する我々のヨード及びジヨードコンブスタチンの阻害値を示す。この阻害値（ＧＩ５０）は、μｍ／ｍｌで表す。
【実施例】
【００３３】
実験の部
材料と方法。溶媒（エーテルは、ジエチルエーテルを意味する）と試薬は、いずれも市販の供給元（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，シグマ−アルドリッチ社，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｃｉｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、又はＬａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社）より入手した。３−ヨード−４，５−ジメトキシベンズアルデヒドは、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓより購入した。溶媒は再蒸留した。水溶液の溶媒抽出物は、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（７０〜２３０メッシュ）又はメルク（２３０〜４００メッシュ）からのシリカゲルを使用して、重力カラムクロマトグラフィーを実施した。ＴＬＣには、ＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＨＬＦプレートを利用した。
【００３４】
融点は、いずれも電気化学デジタル融点装置、Ｍｏｄｅｌ  ９１００又はＩＡ−９２００で決定して、補正しなかった。１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ３００ＭＨｚ又はＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００又は５００ＭＨｚ機器を利用して、他に述べなければ、ＣＤＣｌ３（テトラメチルシラン内部標準）を溶媒として記録した。３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚ又はＵｎｉｔｙ  ５００ＭＨｚ機器を利用して、ＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ溶液において８５％  Ｈ３ＰＯ４を外部標準として入手した。化学シフトは、ＣＤＣｌ３又は（注目する場合は）Ｄ２Ｏ中の内部標準としてのテトラメチルシランからの下方磁場（ｐｐｍ）で報告する。高解像質量スペクトルは、Ｋｒａｔｏｓ  Ｍｓ−５０機器（ミッドウェスト質量分析センター、ネブラスカ−リンカーン大学）を用いて、又はアリゾナ州立大学・癌研究所においてＪｏｅｌ  ＬＣｍａｔｅ機器を用いて入手した。元素分析は、Galbraith Laboratories 社（テネシー州ノックスヴィル）により定量した。
【００３５】
ジメトキシハロベンズアルデヒドの合成の一般手順
３−フルオロ−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド。１００ｍＬのＤＭＦと５−フルオロバニリン（正味１．０ｇ，５．８８ミリモル）より調製した撹拌溶液へ１５分後にヨードメタンを加えて、室温での撹拌を１６時間続けた。水の添加により反応を止めて、この混合物をヘキサン（３ｘ１００ＭＬ）で抽出して、溶媒を真空で除去した。ヘキサン−酢酸エチル（４：１）を溶出液として使用するシリカゲルのカラムでのフラッシュクロマトグラフィーによる精製によって、無色の固形物（１ｇ，収率９３％）を得た；
【００３６】
【化４】
2008514614.tif 000006
３−クロロ−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド。５−クロロバニリン（１０ｇ，５４ミリモル）を用いて先の反応を繰り返して本化合物を得て、これを先の実験に示したように単離して、無色の固形物（１０．４ｇ，収率９７％）を得た；
【００３７】
【化５】
2008514614.tif 000007
３−ブロモ−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド。５−ブロモバニリン（１０ｇ，４３．３ミリモル）を用いて先のアルデヒドについて記載のように実験を繰り返して化合物（６）を得て、ヘキサン−酢酸エチル（９：１）を溶出液として使用するシリカゲルのカラムでのフラッシュクロマトグラフィーにより分離して、無色の固形物（８ｇ，収率７５％）を得た；
【００３８】
【化６】
2008514614.tif 000008
３，５−ジヨード−４−メトキシベンズアルデヒド。３，５−ジヨード−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（５ｇ，１３．３７ミリモル）の無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）溶液を０℃へ冷やして、水素化ナトリウム（０．６４ｇ，１６ミリモル、鉱油中６０％分散液）をゆっくり加えた。次いで、ヨードメタンを加えて、撹拌を室温で暗所に１９時間続けた。水（５０ｍＬ）の添加により反応を止めて、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：１，３ｘ５０ｍＬ）へ抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ、濾過して、濃縮した。ＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：９）を溶出液として使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって残渣を分離して、無色の固形物（４．２ｇ，８０％；ｍｐ  １２３〜１２３℃，ｌｉｔ１１  ｍｐ  １２４℃）を得て、これをヘキサンより再結晶して、無色の結晶を得た。
【００３９】
【化７】
2008514614.tif 000009
元素分析  Ｃ８Ｈ６Ｉ２Ｏ２の計算値：Ｃ，２４．７７；Ｈ，１．５６。実測値：Ｃ，２４．８６；Ｈ，１．５８％。
【００４０】
３−ヨード−４，５−ジメトキシベンズアルデヒドは、シグマ−アルドリッチ・ケミカル・カンパニーより入手した。
【００４１】
３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシロキシ−４−メトキシベンジルトリフェニルホスホニウムブロミド（６）。４００ｍＬの乾燥ジクロロメタンへベンジルアルコール（５）（８４ｇ，２１４ミリモル）（Pettit, G. et al., Antineoplastic Agents 463. Synthesis of Combretastatin A-3 Diphosphates「抗新生物剤４６３．コンブレタスタチンＡ−３二リン酸エステルの合成」，Anticancer Drug Design,. 2000, 15, 397-404）と三臭化リン（１０ｍＬ，１０６ミリモル、０．５当量）を加えた。この反応混合物をそのまま１６時間撹拌して、１０％  ＮａＨＣＯ３の添加により止めて、生成物をジクロロメタンで抽出した。溶媒を（真空で）除去し、生じる臭化ベンジルを５００ｍＬのトルエンに溶かして、トリフェニルホスフィン（６２ｇ，２３６ミリモル、１．１当量）を加えた。この混合物を還流で１時間加熱して、室温で１５時間撹拌した。沈殿を採取し、エーテルで摩砕して、１３２ｇのホスホニウム塩を収率８６％で得た；
【００４２】
【化８】
2008514614.tif 000010
スチルベン合成の一般手順
３−フルオロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｚ−スチルベン（７ａ）。ホスホニウム塩（６）（４．７ｇ，６．５ミリモル）及びテトラヒドロフラン（２５ｍｌ，−７８℃へ冷却した）の混合物へｎ−ＢｕＬｉ（２．６ｍＬ，２．５Ｍ，６．５ミリモル、５分にわたり）を加え、続いて１時間撹拌した。次に、テトラヒドロフラン（１０ｍｌ）中の３−フルオロ−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド（１ｇ，５．４ミリモル）を３０分にわたり加えた（滴下）。この混合物をそのまま室温へ温めて、撹拌を１６時間続けた。水（５０ｍＬ）の添加によって反応を止め、生成物を酢酸エチルで抽出し、溶媒を真空で除去して、得られる残渣（１：１  Ｅ／Ｚ，収率７５％）を、ヘキサン−酢酸エチル（９：１）を溶出液として使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーへ処して、Ｚ−スチルベン（７ａ）（１ｇ，３４％）を澄明なオイルとして得た；
【００４３】
【化９】
2008514614.tif 000011
ＨＲＭＳ（Ｃ３３Ｈ３６ＦＯ４Ｓｉの計算値）［Ｍ＋Ｈ］＋５４３．２３６８，実測値５４３．２３７２。
【００４４】
さらなる溶出によって、Ｅ−異性体（７ｂ）（１．２ｇ，収率４１％）を得た：
【００４５】
【化１０】
2008514614.tif 000012
ＨＲＭＳ（Ｃ３３Ｈ３６ＦＯ４Ｓｉの計算値）［Ｍ＋Ｈ］＋５４３．２３６８，実測値５４３．２３９２。
【００４６】
３−クロロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−Ｚ−スチルベン（８ａ）。（７ａ）について上記に述べた実験手順を３−クロロ−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド（２．８ｇ，１４ミリモル）で繰り返して、Ｚ−異性体（８ａ）（１．６ｇ，２１％）を澄明なオイルとして得た：
【００４７】
【化１１】
2008514614.tif 000013
ＨＲＭＳ（Ｃ３３Ｈ３６ＣｌＯ４ＳｉＣｌの計算値）５６１．２０４２［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値５６１．２４４９，Ｃｌ  ５５９．２０７１［Ｍ＋Ｈ］＋；実測値５５９．１９９６。
【００４８】
クロマトグラフィーカラムの継続溶出によって、Ｅ−スチルベン（８ｂ）（４．９ｇ，収率６２％）の澄明なオイルとしての単離をもたらした；
【００４９】
【化１２】
2008514614.tif 000014
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−Ｚ−スチルベン（９ａ）。１００ｍＬのＴＨＦへホスホニウム塩（６）（２５．７ｇ，３６ミリモル）を加えて、この溶液を−７８℃へ冷やした。温度が−７８℃へ達したらすぐに、ｎ−ＢｕＬｉ（１４．４ｍＬ，２．５Ｍ，３６ミリモル）を５分にわたり加えて、１時間撹拌することを続けた。次いで、ブロモ−ベンズアルデヒド（１００ｍＬ  ＴＨＦ中８ｇ，３３ミリモル）を３０分にわたり滴下した。この混合物をそのまま室温へ温めて、撹拌を１６時間続けた。次いで、水（５０ｍＬ）の添加によって反応を止め、生成物を酢酸エチルで抽出し、溶媒を真空で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィーによって分離して、４．２ｇの（９ａ）（Ｚ−スチルベン）、２：１，Ｅ：Ｚ（全体収率６５％）を得た；
【００５０】
【化１３】
2008514614.tif 000015
クロマトグラムのさらなる溶出によって、８．１ｇのＥ−異性体（９ｂ）の単離をもたらした；
【００５１】
【化１４】
2008514614.tif 000016
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｚ−スチルベン（１０ａ）。ヘキサン中０〜３％酢酸エチルからの勾配カラムクロマトグラムによって、Ｚ−スチルベン（１０ａ）（１．４ｇ）を収率２１％で得た。ｍｐ  １２２〜１２４℃：ＨＲＭＳ，実測値：［Ｍ＋Ｈ］＋６５１．１４７４。Ｃ３３Ｈ３６Ｏ４Ｓｉは、［Ｍ＋Ｈ］＋６５１．１４２７を要求する；
【００５２】
【化１５】
2008514614.tif 000017
シリルエーテル保護基の切断の一般手順
３−フルオロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（１１ａ，フルオロコンブスタチン）。Ｚ−異性体（７ａ）（２．４ｇ，４．４ミリモル）、テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）、及び１Ｍフッ化テトラブチルアンモニウム（４．５ｍｌ，４．５ミリモル）より調製した溶液を３時間撹拌した。水（５０ｍｌ）の添加によって反応を止め、この混合物を酢酸エチルで抽出して、溶媒を真空で除去した。１：４  酢酸エチル−ヘキサンを溶出液として使用するフラッシュクロマトグラフィーによる分離によってＺ−スチルベン（１１ａ）（１．１２ｇ，８３％）を無色の固形物として得て、これを酢酸エチル−ヘキサンより再結晶した：
【００５３】
【化１６】
2008514614.tif 000018
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１８ＦＯ４Ｓｉの計算値：３０５．１１８９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５４】
３−フルオロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（１１ｂ）。シリルエステル（７ｂ）（１５０ｍｇ，０．２７ミリモル）の切断を（１１ａ）の合成に記載のように実施した。酢酸エチル−ヘキサン（３：７）を使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによる分離によって、無色の固形物（１１ｂ）（７５ｍｇ，収率８８％）を得た：
【００５５】
【化１７】
2008514614.tif 000019
３−クロロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（１２ａ）。シリルエステル（８ａ）（１．５ｇ，２．７ミリモル）の脱保護を（１１ａ）の合成について要約したように実施した。酢酸エチル−ヘキサン（３：７）を使用するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによる分離によって、化合物（１２ａ）（７５４ｍｇ，８９％）を得た。ヘキサンからの再結晶によって白い固形物を得た；
【００５６】
【化１８】
2008514614.tif 000020
３−クロロ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（１２ｂ）。カラムクロマトグラフィー（７：３  ヘキサン−酢酸エチルでの溶出）によって無色の固形物、Ｅ−異性体（１２ｂ）（ｍｐ：１３８〜１４０℃）を収率７９％で得た：
【００５７】
【化１９】
2008514614.tif 000021
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１７ＣｌＯ４の計算値：３２１．０８９４［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：３２１．０８９３。元素分析  Ｃ１７Ｈ１７ＣｌＯ４のＣ，Ｈ。
【００５８】
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（１３ａ）。（９ａ）（４ｇ，６．６ミリモル）のシリルエステル切断反応をフェノール（１１ａ）の合成について記載のように完了した。酢酸エチル−ヘキサン（１：４）を使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによる単離によって、化合物（１３ａ）（２．２２ｇ，９２％）を得た。ヘキサンからの再結晶によって無色の固形物を得た：ｍｐ  １０８〜１０９℃；ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１７ＢｒＯ４の計算値：３６４．０３０３，実測値［Ｍ＋２］３６６．０２８７；
【００５９】
【化２０】
2008514614.tif 000022
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１７Ｏ４８１Ｂｒの計算値：３６６．０２８７。
【００６０】
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（１３ｂ）。フェノール（１３ａ）を入手するために使用するのと同じ手順によって、シリルエステル（９ｂ）をＥ−フェノール（１３ｂ）へ変換して、酢酸エチル−ヘキサン（３：７）を用いたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって単離して、Ｅ−異性体（１３ｂ）（０．１４ｇ，８１％）を得た。ヘキサンからの再結晶によって、無色の固形物を得た。
【００６１】
【化２１】
2008514614.tif 000023
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（１４ａ）。（１０ａ）のシリルエステル切断反応をフェノール（１１ａ）について記載のように完了した。粗生成物を、１：４  酢酸エチル−ヘキサンを溶出液として使用するカラムクロマトグラフィーによって分離して、１．３８ｇのＺ−異性体（１４ａ）を収率８１％で得た：ｍｐ  ９２〜９４℃；ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１８Ｏ４Ｓｉの計算値  実測値（Ｍ＋Ｈ）＋４１３．０２５０。
【００６２】
【化２２】
2008514614.tif 000024
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（１４ｂ）。カラムクロマトグラフィー（溶出液として３０％酢酸エチル−ヘキサン）による分離によって、０．２９ｇのＥ−異性体（１４ｂ）を収率９８％で得た：
【００６３】
【化２３】
2008514614.tif 000025
（Ｚ）−３−フルオロ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ジベンジル（１５）。２０ｍＬのアセトニトリル（２０ｍＬ）と３．５ｍＬ（３６ミリモル）の四塩化炭素中のＺ−スチルベン（１１ａ）（１．１ｇ，３．６ミリモル）を−１０℃へ冷やして、１０分間撹拌した。次いで、ＤＩＰＥＡ（１．３ｍＬ，７．４ミリモル）に続いてすぐにＤＭＡＰ（４４ｍｇ，０．３６ミリモル）を加えた。１分後、亜リン酸ジベンジル（１．２ｍＬ，５．４ミリモル）を５分にわたり加えて、この混合物を−１０℃でさらに３時間撹拌した。この反応を０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４の添加によって止め、この混合物を酢酸エチルで抽出し、溶媒を真空で除去して、生成物をカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサンでの１：１溶出）により単離して、１．５ｇのリン酸エステルを収率７４％で得た：
【００６４】
【化２４】
2008514614.tif 000026
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ジベンジル（１６）。先述の反応（化合物（１５）を参照のこと）をＺ−スチルベン（１３ａ）（１ｇ，２．７ミリモル）で繰り返して、１．６ｇのリン酸エステル（１６）を収率９４％で得た：
【００６５】
【化２５】
2008514614.tif 000027
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ジベンジル（１７）。リン酸エステル（１５）を入手するために使用するリン酸化反応をＺ−スチルベン（１４ａ）（２．３９ｇ，０．９５ミリモル）で繰り返して、０．５５ｇのＺ−スチルベン（１７）を収率８６％で無色のオイルとして得た：ｂ．ｐ．ｄｅｃ．２７４℃（０．０１ｍｍＨｇ）；ＨＲＭＳ  Ｃ３１Ｈ３１ＰＩＯ７［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値，６７３．０８５２；実測値［Ｍ＋Ｈ］＋，６７３．０８０８。
【００６６】
【化２６】
2008514614.tif 000028
ｃｉｓ−スチルベン（９ａ）（０．６８ｇ，１．６４ミリモル）のアセトニトリル（７ｍＬ）溶液を−１０℃へ冷やした。四塩化炭素（１．６ｍＬ，１６．４ミリモル）を加えて、この混合物を暗所に−１０℃で１０分間撹拌した。次に、ジイソプロピルアミン（０．５７ｍＬ，３．２８ミリモル）に続いてすぐにＤＭＡＰ（２０ｍｇ，触媒）を加えた。１分後、亜リン酸ジベンジル（０．４４ｍＬ，１．９６ミリモル）を加えて、この混合物を−１０℃で２０分間撹拌した。この反応を０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（７ｍＬ）の添加によって止め、ＥｔＯＡｃ（３ｘ１５ｍＬ）へ抽出し、この抽出溶液を乾燥させ、濾過して、濃縮した。油状の残渣を、４：１  ヘキサン−ＥｔＯＡｃを溶出液として使用するカラムクロマトグラフィーによって分離して、０．９４ｇ（８６％）の純粋なオイルを得た：Ｃ３１Ｈ３１ＩＯ７Ｐの元素分析  計算値：Ｃ，５５．３７；Ｈ，４．５０。実測値：Ｃ，５５．３７；Ｈ，４．６４％。
【００６７】
リン酸カチオン誘導体の合成の一般手順
方法Ａ。ナトリウム塩（１９ａ）を製造するための以下に概説した手順によって、それぞれの金属カチオン含有塩を入手した。金属対イオンは、リン酸を対応の水酸化物（例、カリウム、リチウム）又は酢酸塩（例、マグネシウム）のいずれかで処理することによって導入した。
【００６８】
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム（１９ａ）。リン酸ジベンジル（１６）（０．２８ｇ，０．４５ミリモル）の乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液へトリメチルシリルブロミド（１２５μＬ，０．９５ミリモル）を加えた。この反応混合物をアルゴン下に３０分間撹拌して、反応をメタノール（２０ｍＬ）の添加によって止めた。溶媒の（真空での）除去に続き、遊離リン酸をエタノール（１０ｍＬ）に溶かして、ナトリウムメトキシド（４９ｍｇ，０．９ミリモル）を残渣へ加えた。この反応混合物を３０分間撹拌した後で、沈殿を採取し、エーテルで洗浄して、ナトリウム塩（１９ａ）（０．１７ｇ）を無色の固形物として得た：
【００６９】
【化２７】
2008514614.tif 000029
３−フルオロ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム（１８ａ）。
【００７０】
【化２８】
2008514614.tif 000030
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム（１９ｂ）。
【００７１】
【化２９】
2008514614.tif 000031
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム（１９ｃ）。
【００７２】
【化３０】
2008514614.tif 000032
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−フェニル−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸セシウム（１９ｄ）。
【００７３】
【化３１】
2008514614.tif 000033
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ルビジウム（１９ｅ）。
【００７４】
【化３２】
2008514614.tif 000034
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カルシウム（１９ｆ）。
【００７５】
【化３３】
2008514614.tif 000035
３−ブロモ−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸マグネシウム（１９ｇ）。
【００７６】
【化３４】
2008514614.tif 000036
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム（２０ａ）。
【００７７】
【化３５】
2008514614.tif 000037
方法Ｂ。カリウム塩（１８ｃ）（ほぼ３０ｍｇ）を脱イオン水（１ｍＬ）に溶かし、Ｄｏｗｅｘ−５０ｗ（ＨＣＲ−Ｗ２）樹脂カラム（アミン又はアミノ酸）へ適用して、水によって展開した。溶出液を凍結乾燥によって濃縮して、必要とされる化合物を得た。
【００７８】
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｚ−スチルベン（１０ａ）と３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｅ−スチルベン（１０ｂ）。
【００７９】
方法Ａ。臭化ホスホニウム（６）（３．６７ｇ，５．１３ミリモル）をＤＣＭに０℃で溶かした。水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、０．４１ｇ，１０．２ミリモル）を加えると、この混合物は橙色になった。次に、３−ヨード−４，５−ジメトキシベンズアルデヒド（１ｇ，３．４２ミリモル）を加えて、撹拌を２１時間続けた。水（５０ｍＬ）を加えることによって反応を止めて、ＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で抽出して、これを乾燥させ、濾過して、濃縮した。得られたオイルを、ヘキサン中０〜３％酢酸エチルの溶出液を用いたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーへ処して、Ｚ−スチルベン（１０ａ）（０．８６ｇ，３９％）を得て、これをヘキサンより無色の固形物として結晶させた：
【００８０】
【化３６】
2008514614.tif 000038
ＨＲＭＳ  Ｃ３３Ｈ３６ＩＯ４Ｓｉの計算値：６５１．１４２８［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：６５１．１４７４；元素分析  Ｃ３３Ｈ３５ＩＯ４Ｓｉの計算値：Ｃ，６０．９２；Ｈ，５．４５。実測値：Ｃ，６０．７９；Ｈ，５．６７％。
【００８１】
さらなる溶出によって、Ｅ−スチルベン（１０ｂ）（０．９６ｇ，４３％）を得て、これをヘキサンより無色の固形物として結晶させた；
【００８２】
【化３７】
2008514614.tif 000039
ＨＲＭＳ  Ｃ３３Ｈ３６ＩＯ４Ｓｉの計算値：６５１．１４２８［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：６５１．１４００；元素分析  Ｃ３３Ｈ３５ＩＯ４Ｓｉの計算値：Ｃ，６０．９２；Ｈ，５．４５。実測値：Ｃ，６０．８８；Ｈ，５．６３％。
【００８３】
方法Ｂ。臭化ホスホニウム（６）の乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）撹拌及び冷却（−７０℃）懸濁液へブチルリチウム（４．５ｍＬ，１１．３ミリモル）を加えた。この溶液を−７０℃で３０分間、次いで室温で６時間撹拌した。水（５０ｍＬ）を加えて、この反応混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、抽出物を乾燥させ、濾過して、濃縮した。得られたオイルを、ヘキサン中０〜３％酢酸エチルの溶出液を用いたシリカでのフラッシュクロマトグラフィーへ処して、Ｚ−スチルベン（１０ａ）（１．４ｇ，２１％）を無色の固形物として得た：ｍｐ  １２２〜１２４℃。
【００８４】
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−Ｚ−スチルベン（２５ａ）と３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−Ｅ−スチルベン（２５ｂ）。
【００８５】
方法Ａ。臭化ホスホニウム（６）（２．７７ｇ，３．８７ミリモル）（８）をＤＣＭに０℃で溶かした。水素化ナトリウム（鉱油中６０％分散液、０．３１ｇ，７．７ミリモル）を加えると、この混合物は橙色になった。アルデヒド（１．０ｇ，２．５７ミリモル）を加えて、撹拌を７．５時間続けた。水（５０ｍＬ）を加えることによって反応を止めて、ＤＣＭ（３ｘ５０ｍＬ）で抽出した。この有機抽出物を乾燥させ、濾過して、濃縮した。油状の残渣を、ヘキサンを溶出液として使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーへ処して、表題化合物の異性体の混合物（収率７１％，１．３５ｇ）を得た。さらなる溶出によって、Ｅ−異性体（０．１０ｇ，５％）を無色のオイルとして純粋な形態で得た：
【００８６】
【化３８】
2008514614.tif 000040
及び、ＨＲＭＳ  Ｃ３２Ｈ３３Ｉ２Ｏ３Ｓｉの計算値：７４７．０２８９［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：７４７．０４４２。
【００８７】
方法Ｂ。臭化ホスホニウム（６）（１．０１ｇ，１．４ミリモル）の乾燥ＴＨＦ（８０ｍＬ）撹拌及び冷却（−１０℃）懸濁液へブチルリチウム（０．６ｍＬ，１．４７ミリモル）を加えた。この橙色〜赤色の溶液を室温で１０分間撹拌した。アルデヒド（０．５０ｇ，１．３３ミリモル）を加えると、この反応混合物の色が赤色から黄色へ変化した。撹拌を室温で１０分間続け、氷水（１００ｍＬ）を加えて、この混合物をＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出した。抽出物を水（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過して、濃縮した。生じるオイルを、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ（１００：１）を溶出液として使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって一部分離して、異性体の混合物（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ，０．９０ｇ，９０％）をほぼ１：１．９の比率で得た。
【００８８】
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（１４ａ）。シリルエーテル（７ａ）（１．３０ｇ，１．９９ミリモル）のＴＨＦ溶液へフッ化テトラブチルアンモニウム（２．２ｍＬ，２．２ミリモル）を加えた。この混合物をＡｒ下に暗所で１０分間撹拌して、水（５ｍＬ）の添加によって反応を止めて、生成物をＥｔＯＡｃ（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、抽出物を乾燥させ、濾過して、濃縮した。この粗生成物を、１：４  酢酸エチル：ヘキサンを溶出液として使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって分離して、スチルベン（１４ａ）（０．７０ｇ，８５％）を無色の固形物として得た：
【００８９】
【化３９】
2008514614.tif 000041
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１８ＩＯ４の計算値：４１３．０２５９［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：４１３．０２５０；元素分析  Ｃ１７Ｈ１７ＩＯ４の計算値：Ｃ，４９．５３；Ｈ，４．１６。実測値：Ｃ，４９．３８；Ｈ，４．２４％。
【００９０】
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（１４ｂ）。ｃｉｓ−異性体（１４ａ）の合成について上記に記載されるように、シリルエーテル（１０ｂ）（０．４６ｇ，０．７ミリモル）よりｔｒａｎｓ−異性体（１４ｂ）（０．２９ｇ，９８％）を入手した。カラムクロマトグラフィー（溶出液として７：３  ヘキサン−酢酸エチル）による分離によって、Ｅ−異性体（１４ｂ）（０．２９ｇ，９８％）を無色の固形物として得た：
【００９１】
【化４０】
2008514614.tif 000042
ＨＲＭＳ  Ｃ１７Ｈ１８ＩＯ４の計算値：４１３．０２５７［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：４１３．０２５０；元素分析  Ｃ１７Ｈ１８ＩＯ４の計算値：Ｃ，４９．５３；Ｈ，４．１６。実測値：Ｃ，４９．３８；Ｈ，４．２４％。
【００９２】
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン（２２ａ）と３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン（２２ｂ）。
【００９３】
これらのスチルベンは、ｃｉｓ−異性体（１４ａ）の合成について上記に記載のように、Ｚ及びＥ−シリルエーテル混合物（２１ａｂ）（１．３５ｇ，１．８１ミリモル）より入手した。この油状の混合物を、２：１  ヘキサン−ＥｔＯＡｃを溶出液とするカラムクロマトグラフィーにより分離して、ｃｉｓ−異性体（２２ａ）（０．４５ｇ，４９％）をオイルとして得た：
【００９４】
【化４１】
2008514614.tif 000043
ＨＲＭＳ  Ｃ１６Ｈ１５Ｉ２Ｏ３の計算値：５０８．９１１３［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：５０８．９１１１；元素分析  Ｃ１６Ｈ１４Ｉ２Ｏ３の計算値：Ｃ，３７．８２；Ｈ，２．７８。実測値：Ｃ，３７．８０；Ｈ，２．８３。
【００９５】
さらなる溶出によって、Ｅ−スチルベン（２２ｂ）（０．４６ｇ，収率５０％）を無色の固形物として得て、これをヘキサンより結晶させた：
【００９６】
【化４２】
2008514614.tif 000044
ＨＲＭＳ  Ｃ１６Ｈ１５Ｉ２Ｏ３の計算値：５０８．９１１３［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：５０８．９１１９；元素分析  Ｃ１６Ｈ１４Ｉ２Ｏ３の計算値：Ｃ，３７．８２；Ｈ，２．７８。実測値：Ｃ，３８．０１；Ｈ，２．９１。
【００９７】
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−アセチル−Ｚ−スチルベン（２２ｃ）
適切なフェノール（２２ａ）（０．４５ｇ）をピリジン（３ｍＬ）−無水酢酸（１７０μＬ）に溶かして、２時間撹拌した。この混合物を減圧でトルエン（３ｘ１０ｍＬ）より濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（１０％水溶液、１０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥させて、この溶液を濾過して濃縮した。このアセテートを、１：２４  ヘキサン−ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを溶出液として使用するシリカのフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製して、アセテート（２２ｃ）（０．２０ｇ，４１％）を無色の固形物として得て、ヘキサンより再結晶させた。
【００９８】
【化４３】
2008514614.tif 000045
ＨＲＭＳ  Ｃ１９Ｈ２０Ｉ２Ｏ５の計算値：５８２．９４７９［Ｍ＋ＣＨ３ＯＨ］＋，実測値：５８２．９４８２；元素分析  Ｃ１８Ｈ１６Ｉ２Ｏ４の計算値：Ｃ，３９．３０；Ｈ，２．９３。実測値：Ｃ，３９．３０；Ｈ，３．１３％。
【００９９】
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−アセチル−Ｚ−スチルベン（１４ｃ）。
【０１００】
適切なフェノール（０．１ｇ，０．２４ミリモル）を３ｍＬ無水ピリジンに溶かした。無水酢酸（５０μＬ，０．５１ミリモル）を触媒量のＤＭＡＰとともに加えた。この混合物を９０分間撹拌した。５ｍＬ  ＣＨ３ＯＨの添加によって反応を止めた。この混合物をトルエンで希釈して、減圧で濃縮した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：９）を溶出液として使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーでこれを精製して、白い固形物（０．１ｍｇ，９１％）を得た。この固形物をヘキサンより結晶させた：
【０１０１】
【化４４】
2008514614.tif 000046
ＨＲＭＳ  Ｃ１９Ｈ２０ＩＯ５の計算値：４５５．０３５５［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：４５５．０３５６；元素分析  Ｃ１９Ｈ１９ＩＯ５の計算値：Ｃ，５０．２４；Ｈ，４．２２。実測値：Ｃ，４９．６７；Ｈ，４．１８％。
【０１０２】
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ジベンジル（２３）
ヨウ化物（１０ａ）の合成について上記に記載のように、適切なリン酸ジベンジル（０．３８ｇ，収率５５％）を入手した（０．４６ｇ，０．９１ミリモル）。無色のオイル：ｂｐ  ｄｅｃ  ２２０℃；
【０１０３】
【化４５】
2008514614.tif 000047
ＨＲＭＳ  Ｃ３０Ｈ２８Ｉ２Ｏ６Ｐの計算値：７６８．９７１３［Ｍ＋Ｈ］＋，実測値：７６８．９６９９；３１Ｐ−ＮＭＲ（162 MHz, CDCl3）δ-5.51。
【０１０４】
リン酸及び誘導体の合成の一般手順
方法Ａ。水酸化リチウム又はナトリウムメトキシドのいずれかを使用するリン酸の処理によって導入する金属対イオン以外は、カリウム塩（２０ｃ）を製造するための本明細書に概説する手順によって、金属カチオンリン酸塩のそれぞれを入手した。
【０１０５】
方法Ｂ。Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（２ｇ）（ＨＣＲ−Ｗ２）をカラムに入れて、ＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）、１Ｎ  ＨＣｌ（ｐＨ１まで）、水（ｐＨ７まで）、塩基／アミン／アミノ酸（ｐＨ７〜１４まで）、そして水（ｐＨ７まで）で連続的に洗浄した。このカラムは、再使用した。カリウム塩又はその対応のジヨードリン酸塩（約２５ｍｇ）を脱イオン水（１ｍＬ）に溶かし、Ｄｏｗｅｘ−５０ｗ（ＨＣＲ−Ｗ２）樹脂カラム（適正なアミン又はアミノ酸メチルエステルを担う）へ適用して、ほぼ４０ｍＬの水で展開した。溶出液を凍結乾燥によって濃縮して、必要とされるカチオン誘導体を得た。
【０１０６】
方法Ｃ。アミノ酸メチルエステル。アミノ酸メチルエステル塩酸塩をＣＨ３ＯＨ溶液において炭酸カリウムを加えることによって中和した。エーテルを加えて塩化カリウムを沈殿させて、この溶液を濾過して濃縮した。次いで、アミノ酸メチルエステル残渣を、方法Ｂに記載のように、Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ（ＨＣＲ−Ｗ２）へ適用した。
【０１０７】
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム（２０ｃ）。
【０１０８】
リン酸エステル（９ａ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）冷却（０℃）溶液へトリメチルブロモシラン（２７７μＬ，１．８ミリモル）を加えた。９０分間撹拌後、チオ硫酸ナトリウム（１０％水溶液、１０ｍＬ）を加えて、この混合物をさらに１分間撹拌した。相を分離させて、水相をＤＣＭ（２０ｍＬ）に続いてＥｔＯＡｃ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ、濾過し、濃縮して、リン酸中間体を澄明なオイルとして得た。１時間乾燥（高真空）後、オイルをＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）に溶かし、０℃へ冷やして、ＫＯＨ（１．８ｍＬ，ＣＨ３ＯＨ中１Ｍ溶液）を加えた。この混合物を２０分間撹拌し、沈殿を採取し、エーテルで摩砕して、カリウム塩を無色の固形物として得た：
【０１０９】
【化４６】
2008514614.tif 000048
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム（２０ａ）。
【０１１０】
無色の固形物として単離した：
【０１１１】
【化４７】
2008514614.tif 000049
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム（１１ｃ）。
【０１１２】
無色の固形物として明らかにした：
【０１１３】
【化４８】
2008514614.tif 000050
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン（２０ｄ）。
【０１１４】
別の無色のオイル：
【０１１５】
【化４９】
2008514614.tif 000051
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン（２０ｅ）。
【０１１６】
無色のオイル：
【０１１７】
【化５０】
2008514614.tif 000052
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−Ｏ−Ｍｅ（２０ｆ）。
【０１１８】
無色の固形物として得た：
【０１１９】
【化５１】
2008514614.tif 000053
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−Ｏ−Ｍｅ（２０ｇ）。
【０１２０】
無色の固形物：
【０１２１】
【化５２】
2008514614.tif 000054
３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ（２０ｈ）。
【０１２２】
無色の固形物：
【０１２３】
【化５３】
2008514614.tif 000055
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム（２４ａ）。
【０１２４】
リン酸がＥｔＯＡｃとＤＣＭに溶けないので、水相をブチルアルコール（２ｘ２５ｍＬ）で抽出すること以外は、（２０ｃ）の合成について上記に記載のように、適切なエステル（９ｃ）（０．２９ｇ，０．３８ミリモル）よりリン酸エステル（０．２０ｇ，８０％）を得た。このカリウム塩は、無色の固形物であった：
【０１２５】
【化５４】
2008514614.tif 000056
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム（２４ｂ）。
【０１２６】
無色の固形物として得た：
【０１２７】
【化５５】
2008514614.tif 000057
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム（２４ｃ）。
【０１２８】
２５０〜２７０℃（分解）で融ける無色の固形物；
【０１２９】
【化５６】
2008514614.tif 000058
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン（２４ｄ）。
【０１３０】
無色のロウ状の固形物：
【０１３１】
【化５７】
2008514614.tif 000059
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン（２４ｅ）。
【０１３２】
無色の固形物として単離した；
【０１３３】
【化５８】
2008514614.tif 000060
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−ＯＭｅ（２４ｆ）。
【０１３４】
無色の固形物；
【０１３５】
【化５９】
2008514614.tif 000061
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−ＯＭｅ（２４ｇ）。
【０１３６】
無色の固形物として採取した；１２５〜１３０℃で融ける；
【０１３７】
【化６０】
2008514614.tif 000062
３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ（２４ｈ）。
【０１３８】
無色の固形物；
【０１３９】
【化６１】
2008514614.tif 000063
癌細胞系の処理手順
国立癌研究所（National Cancer Institute）の標準スルホローダミンＢアッセイを使用して、ヒト癌細胞増殖の阻害を評価した。４８時間後、プレートをトリクロロ酢酸で固定し、スルホローダミンＢで染色して、自動化マイクロプレートリーダーで読み取った。５０％の増殖阻害（ＧＩ５０、又は正味タンパク質増加の５０％抑制を引き起こす薬物濃度）を光学密度データよりＩｍｍｕｎｏｓｏｆｔソフトウェアを用いて計算した。マウス白血病Ｐ３８８細胞の阻害を、１０％ウマ血清／Ｆｉｓｈｅｒ培地溶液で２４時間に続く、化合物の系列希釈液との４８時間インキュベーションで評価した。次いで、Ｚ１  Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子カウンターを使用して、細胞増殖阻害（ＥＤ５０）を計算した。
【０１４０】
チューブリン評価：当業者に知られるように、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ７４００／７５００分光光度計を使用して、３５ｎｍでの濁度測定によってチューブリン重合化を評価した。様々な濃度の化合物を１０μＭでプレインキュベートした。インキュベーションは、３７℃で１０分間であった。
【０１４１】
抗血管新生
ＨＵＶＥＣ手順
当業者に知られる Developmental Therapeutics Program（開発治療薬プログラム）ＮＣＩ／ＮＩＨプロトコールに従って、インビトロマトリジェル（in vitro Ｍａｔｒｉｇｅｌ）抗血管新生アッセイを実施した。基底膜マトリックスのマトリジェル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより入手した。ＧｌｙｃｏＴｅｃｈより入手したヒト臍静脈内皮細胞を使用して、増殖阻害アッセイと臍帯形成アッセイを実施した。
【０１４２】
臍帯形成アッセイ
氷冷９６ウェルプレートの各ウェルに６０マイクロリットルのアリコートを入れた。次いで、このプレートを室温に１５分間放置してから、３７℃で３０分間インキュベートして、マトリゲルを重合させた。この間に、ＨＵＶＥＣ細胞を採取して、２ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度へ希釈した。次に、試験する化合物を含有する１００μＬの溶液を加えた。２４時間のインキュベーション後、Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ倒立顕微鏡とＤ１００デジタルカメラを使用して、各濃度について画像を撮った。形成される臍帯の長さとジャンクションの数を測定することによって、未処置対照に比較して、薬物効果を評価した。
【０１４３】
標準スルホローダミンＢアッセイ（上記の「癌細胞系の処理手順」を参照のこと）を使用して、ＨＵＶＥＣ細胞を使用した結果を評価した。プロットしたデータより、ＩＣ５０又はＥＤ５０（５０％阻害を引き起こす濃度）を算出した。
【０１４４】
投与
投与量
治療を必要とするヒトや他の動物へ投与すべき投与量は、新生物疾患又は微生物感染症の本体；その年齢、健康、及び体重が含まれる、関わる宿主のタイプ；（もしあれば）併用治療の種類；治療の頻度と療法比に依存するものである。以下は例示に他ならないものであり、投与する実際の投与量と投与又は送達の方法はそれから変化してよいという理解の基に、様々な可能な投与の投与量及び方法を下記に記載する。適切な投与量と投与の形態及び方法は、当業者が決定してよい。
【０１４５】
例示的には、投与する有効成分の予測される投与量レベルは、以下の範囲にあり得る：静脈内、０．１〜約２００ｍｇ／ｋｇ；筋肉内、１〜約５００ｍｇ／ｋｇ；経口、５〜約１０００ｍｇ／ｋｇ；鼻腔内点滴注入、５〜約１０００ｍｇ／ｋｇ；及び、エアゾール、５〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（宿主の体重）。
【０１４６】
濃度に関して表せば、有効成分は、本発明の組成物において、皮膚、鼻腔内、咽頭喉頭、気管支、膣内、直腸、又は眼の付近での局在化した使用に、組成物の約０．０１〜約５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１〜約２０％（ｗ／ｗ）の濃度で；そして、非経口使用には、組成物の約０．０５〜約５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約５〜約２０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在してよい。
【０１４７】
本発明の組成物は、ヒト及び動物への投与のために、好適な量の有効成分を含有する、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤、無菌の非経口溶液剤又は懸濁液剤、無菌の非腸管外溶液剤又は懸濁液剤、及び経口溶液剤又は懸濁液剤、等のような単位剤形で提示すると企図される。当該技術分野で知られた他の剤形も使用してよい。
【０１４８】
経口投与では、固体又は液体の単位剤形のいずれを調製してもよい。
【０１４９】
散剤は、有効成分を好適に微細な大きさへ粉砕して、同様に粉砕した希釈剤と混合することによって調製してよい。希釈剤は、乳糖又はデンプンのような食用の炭水化物材料であり得る。有利には、甘味剤又は糖だけでなく芳香オイルが存在する。
【０１５０】
カプセル剤は、上記に記載の粉末混合物を調製して、成型されたゼラチンの鞘へ充填することによって製造してよい。有利には、充填操作への補助剤として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、等のような滑沢剤を充填操作の前に粉末混合物へ加える。
【０１５１】
軟ゼラチンカプセル剤は、許容される植物油、軽流動パラフィン、又は他の不活性オイル又はトリグリセリド、又は他の医薬的に許容される担体と有効成分のスラリーの機械被包化によって調製してよい。
【０１５２】
錠剤は、粉末混合物を調製し、造粒又はスラッギング（slugging）、滑沢剤を加えて、錠剤へ圧縮することによって作製してよい。粉末混合物は、好適に粉砕した有効成分をデンプン、乳糖、カオリン、リン酸二カルシウム、等のような希釈剤又は基剤と混合することによって調製してよい。粉末混合物は、コーンシロップ、ゼラチン溶液、メチルセルロース溶液、又はアカシア粘液のような結合剤で加湿して、篩いに通過させることによって造粒することができる。造粒への代替法として、粉末混合物は、スラグにしてよい、即ち、錠剤機に通して、生じる不完全に成型された錠剤を破片（スラグ）へ壊してよい。このスラグは、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク、又は鉱油の添加によって滑沢化させて、錠剤形成ダイへ粘着することを防ぐことができる。次いで、この滑沢化した混合物を錠剤へ圧縮する。
【０１５３】
有利には、錠剤そのものの保護のために、及び／又は嚥下を容易にするために、錠剤は、密封コート又はシェラックの腸溶外皮コート、糖及びメチルセルロースのコーティング剤、及びカルナウバロウの光沢コーティング剤といった医薬的に許容されるコーティング剤とともに提供することができる。
【０１５４】
茶さじ１杯の各組成物が投与用に予め決定された量の有効成分を含有する、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤のような経口投与用の液体の単位剤形を調製してよい。
【０１５５】
水溶性の形態は、糖、芳香剤、及び保存剤と一緒に水系の担体に溶かして、シロップ剤を形成してよい。エリキシル剤は、親水アルコール担体を芳香剤と一緒の好適な甘味剤とともに使用することによって調製する。不溶性の形態の懸濁剤は、アカシア、トラガカント、メチルセルロース、等のような医薬的に許容される懸濁剤の助けを借りて好適な担体とともに調製してよい。
【０１５６】
非経口投与では、有効成分と無菌の担体、例えば水を利用して、液体の単位剤形を調製してよい。有効成分は、使用する形態及び濃度に依存して、担体中に懸濁させても、溶かしてもよい。溶液剤を調製するには、水溶液の有効成分を注射水に溶かして、濾過滅菌した後で、好適なバイアル又はアンプルへ充填して、密封することができる。有利には、局所麻酔薬、保存剤、及び緩衝剤のような補助剤を担体に溶かすことができる。非経口懸濁液剤は、有効成分を担体に溶かすのではなく懸濁させて、滅菌を濾過によって達成し得ないこと以外は、実質的に同じやり方で調製してよい。有効成分は、無菌の担体に懸濁させる前に、酸化エチレンへの曝露によって滅菌してよい。有利には、医薬的に許容される界面活性剤又は湿潤剤を組成物に含めて、有効成分の均一な分布を促進してよい。
【０１５７】
経口及び非経口の投与に加えて、直腸及び膣の経路を利用することができる。坐剤の手段によって有効成分を投与することができる。融点をほぼ体温に有する担体、又は容易に溶ける担体を利用することができる。例えば、ココア脂や様々なポリエチレングリコール（Ｃａｒｂｏｗａｘｅｓ）が担体として役立つことができる。
【０１５８】
鼻腔内点滴注入には、有効成分と精製水のような好適な医薬担体を利用して液体の単位剤形を調製してよく、吸入が選択される投与である場合は、乾燥散剤を製剤化することができる。
【０１５９】
エアゾール剤としての使用では、有効成分を、気体又は液化の推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、二酸化炭素、窒素、プロパン、等と一緒に、必要であるか所望されるならば、助溶剤及び湿潤剤のような通常の補助剤とともに加圧エアゾール容器に詰めてよい。
【０１６０】
本明細書と請求項に使用する用語「単位剤形」は、ヒト及び動物の被検者への単位投与量として好適な物理的に別個な単位を意味し、各単位は、所望される治療効果をもたらすように計算された活性材料の予め決定された量を、必要とされる医薬希釈剤、担体、又は運搬体と一緒に含有する。本発明の新規な単位剤形の仕様は、（ａ）活性材料の独自の特性と達成すべき特別な治療効果と（ｂ）本明細書に開示されるような、ヒトにおける療法使用のために活性材料を調合する技術に内在する限界によって規定され、それに直接的に依存して、これらは、本発明の特徴である。本発明に一致した好適な単位剤形の例は、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、坐剤、パウダーパケット剤、ウェーハ剤、カシェ剤、茶さじ量剤、大さじ量剤、滴ビン量剤、アンプル剤、バイアル剤、上記のいずれの分離複合剤、そして本明細書に記載する他の剤形である。
【０１６１】
抗新生物剤として利用すべき有効成分は、それ自身が当該技術分野で利用可能であり、確立された手順によって調製することができる医薬材料を利用した単位剤形において調製してよい。以下の調製物は、本発明の単位剤形の調製の例示であり、それを限定するものではない。以下に示すのは、本発明の化合物の剤形の例であって、ここで「有効成分」は、本明細書に記載の化合物を意味する。
【０１６２】
組成物「Ａ」
硬ゼラチンカプセル剤
１００２個の経口使用のための硬ゼラチンカプセル（各カプセルは、２００ｍｇの有効成分を含有する）は、以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１６３】
【化６２】
2008514614.tif 000064
空気ミクロナイザーの手段によって微細化した有効成分を他の微粉化した成分へ加え、徹底的に混合してから、通常のやり方で被包化する。
【０１６４】
上記の手順を使用して、上記に使用の２００ｇの代わりに５０ｇ、２５０ｇ、及び５００ｇの有効成分を用いることによって、有効成分を５０、２５０、及び５００ｍｇの量で含有するカプセル剤を同様に調製してよい。
【０１６５】
組成物「Ｂ」
軟ゼラチンカプセル剤
１個の経口使用のための軟ゼラチンカプセル（空気ミクロナイザーの手段によって微細化した、２００ｍｇの有効成分をそれぞれ含有する）は、はじめに化合物を０．５ｍｌのとうもろこし油に懸濁させて材料をカプセル化可能（capsulatable）にしてから、上記のやり方で被包化することによって調製してよい。
【０１６６】
組成物「Ｃ」
錠剤
１０００個の錠剤（２００ｍｇの有効成分をそれぞれ含有する）は、以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１６７】
【化６３】
2008514614.tif 000065
空気ミクロナイザーの手段によって微細化した有効成分を他の成分へ加えてから、徹底的に混合してスラグにする。１６号篩いに強制的に通すことによって、このスラグを壊す。次いで、生じる顆粒を錠剤へ圧縮する（各錠剤は、２００ｍｇの有効成分を含有する）。
【０１６８】
上記の手順を使用して、上記に使用の２００ｇの代わりに２５０ｇ及び１００ｇの有効成分を用いることによって、有効成分を２５０ｍｇ及び１００ｍｇの量で含有する錠剤を同様に調製してよい。
【０１６９】
組成物「Ｄ」
経口懸濁液剤
経口使用のための１リットルの水性懸濁液剤（それぞれ茶さじ（５ｍｌ）用量に５０ｍｇの有効成分を含有する）は、以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１７０】
【化６４】
2008514614.tif 000066
クエン酸、安息香酸、ショ糖、トラガカント、及びレモンオイルを十分な水に分散させて、８５０ｍｌの懸濁液とする。空気ミクロナイザーの手段によって微細化した有効成分をこのシロップユニット中で撹拌して、均一に分配する。十分な水を加えて、１０００ｍｌとする。
【０１７１】
組成物「Ｅ」
非経口製品
新生物疾患を治療するための３０ｍｇの有効成分を１ｍｌに含有する、非経口注射用の無菌の水懸濁液剤は、以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１７２】
【化６５】
2008514614.tif 000067
有効成分以外のすべての成分を水に溶かして、この溶液を濾過により滅菌する。この無菌溶液へ空気ミクロナイザーの手段によって微細化した無菌の有効成分を加えて、この最終懸濁液を無菌バイアルへ充填して、このバイアルを密封する。
【０１７３】
組成物「Ｆ」
坐剤、直腸及び膣
それぞれ２．５ｇの重量で２００ｍｇの有効成分を含有する１０００個の坐剤を以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１７４】
【化６６】
2008514614.tif 000068
有効成分を空気ミクロナイザーの手段によって微細化してプロピレングリコールへ加えて、この混合物をコロイドミルに通して、均一に分散させる。ポリエチレングリコールを融かして、このプロピレングリコール分散液を撹拌しながらゆっくり加える。この懸濁液を４０℃で非冷蔵の型へ注ぐ。この組成物をそのまま冷やして固めてから、型より外して、それぞれの坐剤ホイルを包む。
【０１７５】
組成物「Ｇ」
鼻腔内懸濁液
１ｍｌに２０ｍｇの有効成分を含有する、鼻腔内点滴注入用の１リットルの無菌水懸濁液を以下の種類と成分の量より調製してよい：
【０１７６】
【化６７】
2008514614.tif 000069
有効成分以外のすべての成分を水に溶かして、この溶液を濾過により滅菌する。この無菌溶液へ空気ミクロナイザーの手段によって微細化した無菌の有効成分を加えて、この最終懸濁液を無菌容器へ無菌的に充填する。
【０１７７】
組成物「Ｈ」
散剤
バルク形態の５グラムの有効成分を空気ミクロナイザーの手段によって微細化する。この微小化した粉末をシェーカー型の容器に入れる。
【０１７８】
組成物「Ｉ」
経口散剤
バルク形態の１００グラムの有効成分を空気ミクロナイザーの手段によって微細化してよい。この微小化した粉末をそれぞれ２００ｍｇの用量へ分割して、包装する。
【０１７９】
組成物「Ｊ」
絶縁剤（insulation）
バルク形態の１００グラムの有効成分を空気ミクロナイザーの手段によって微細化する。
【０１８０】
当然ながら、本開示に対峙する当業者が容易に思いつくような修飾、改変、及び適応は、本発明の精神内にあるとみなされると理解される。
【０１８１】
表Ｉ．ハロコンブスタチンと他の化合物のヒト癌細胞系増殖阻害（ＧＩ５０μｇ／ｍＬ）及びマウスＰ３８８リンパ球性白血病阻害活性（ＥＤ５０μｇ／ｍＬ）
【０１８２】
【表１】
2008514614.tif 000070
表Ｉａ．いくつかの合成修飾体の溶解度、ヒト癌細胞系阻害（ＧＩ５０μｇ／ｍＬ）、及びマウスＰ３８８リンパ球性白血病阻害活性（ＥＤ５０μｇ／ｍＬ）
【０１８３】
【表２】
2008514614.tif 000071
ａ溶解度の数値は、１ｍＬ  Ｄ２Ｏを２５℃で使用して得た。
【０１８４】
表Ｉａの記号
１ａ＝コンブレタスタチンＡ−４
１ｂ＝コンブレタスタチンＡ−４リン酸ナトリウム
３ａ＝コンブレタスタチンＡ３
１１ａ＝フルオロコンブスタチン
１４ａ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン
１４ｂ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン
２２ａ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン
２２ｂ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン
２２ｃ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−アセチル−Ｚ−スチルベン
１４ｃ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−アセチル−Ｚ−スチルベン
２０ｃ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム
２０ａ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム
１１ｃ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム
２０ｄ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン
２０ｅ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン
２０ｆ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−Ｏ−Ｍｅ
２０ｇ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−Ｏ−Ｍｅ
２０ｈ＝ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ
２４ａ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム
２４ｂ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム
２４ｃ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム
２４ｄ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン
２４ｅ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン
２４ｆ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−ＯＭｅ
２４ｇ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−ＯＭｅ
２４ｈ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ
表ＩＩ．チューブリン重合化と［３Ｈ］コルヒチンのチューブリンへの結合のハロコンブスタチンによる阻害
【０１８５】
【表３】
2008514614.tif 000072
表ＩＩＩ．形成される臍帯の長さ、ジャンクションの数、及び相対増殖百分率
【０１８６】
【表４−１】
2008514614.tif 000073
【０１８７】
【表４−２】
2008514614.tif 000074
表ＩＶ．ハロコンブスタチンと他の化合物の抗微生物活性
【０１８８】
【表５】
2008514614.tif 000075
表Ｖ．ヨードコンブスタチンの抗微生物活性
【０１８９】
【表６】
2008514614.tif 000076
表Ｖの記号
１１ａ＝フルオロコンブスタチン
１４ａ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン
２２ａ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｚ−スチルベン
２２ｂ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−ヒドロキシ−Ｅ−スチルベン
２２ｃ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−３’−アセチル−Ｚ−スチルベン
２０ｃ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム
２０ａ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム
１１ｃ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム
２０ｄ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン
２０ｅ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン
２０ｆ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−Ｏ−Ｍｅ
２０ｇ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−Ｏ−Ｍｅ
２０ｈ＝３−ヨード−４，４’，５−トリメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ
２４ａ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸カリウム
２４ｂ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ナトリウム
２４ｃ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸リチウム
２４ｄ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸モルホリン
２４ｅ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ピペリジン
２４ｆ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸グリシン−ＯＭｅ
２４ｇ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸トリプトファン−ＯＭｅ
２４ｈ＝３，５−ジヨード−４，４’−ジメトキシ−Ｚ−スチルベン３’−Ｏ−リン酸ｔｒｉｓ
表ＶＩ．ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
μｇ／ｍＬで表した阻害値（ＧＩ５０）
【０１９０】
【表７】
2008514614.tif 000077
表ＶＩＩ．μｇ／ｍＬで表したヒト未分化甲状腺癌細胞系阻害値（ＧＩ５０）
【０１９１】
【表８】
2008514614.tif 000078
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、いくつかの先行技術の化合物の構造式を示す。
【図２】図２は、本発明の化合物の構造式が含まれる、本発明の化合物のいくつかを合成するための反応スキームを示す。
【図３】図３は、図２の反応スキームの続きを示す。
【図４】図４は、本発明の化合物の構造式が含まれる、本発明の化合物のいくつかを合成するための反応スキームを示す。
【図５−１】図５−１は、臍帯形成アッセイの結果の写真を示す。
【図５−２】図５−２は、臍帯形成アッセイの結果の写真を示す。
【図１】
2008514614.tif 000082
【図２】
2008514614.tif 000083
【図３】
2008514614.tif 000084
【図４】
2008514614.tif 000085
【図５−１】
2008514614.tif 000086
【図５−２】
2008514614.tif 000087
【国際調査報告】
2008514614.tif 000088