(57)【要約】  糖質ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物を生成する方法が提供される。一方法は、糖タンパク質と２Ｇ１２抗体との結合を促進する、改変されたグリコシル化を含む糖タンパク質を発現させる工程を含む。別の方法は、２Ｇ１２抗体に高い親和性をもつ細胞を反復して選択する工程を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉ．（Ａ）発現系のグリコシル化経路を変化させる工程、および
（Ｂ）発現した糖タンパク質が、発現した糖タンパク質の２Ｇ１２抗体に対する親和性を高める改変されたグリコシル化をうけるように、発現系において糖タンパク質を発現させる工程；または
ＩＩ．前記糖タンパク質の自然の発現系以外の発現系において糖タンパク質を発現させる工程（この際、発現した糖タンパク質は、発現した糖タンパク質の２Ｇ１２に対する親和性を高める改変されたグリコシル化をうける）
を含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物を生成する方法。
【請求項２】
前記変化させる工程が、マンノシダーゼ欠損細胞株をもたらすグリコシル化を遺伝子操作することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変化させる工程が、前記発現系とα−マンノシダーゼ阻害剤を接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記α−マンノシダーゼ阻害剤が、アウストラリン(Australine)、カスタノスペルミン、デオキシノジリマイシン、１，４−ジデオキシ-１，４−イミニ−Ｄ−マンニトール（ＤＩＭ）、デオキシマンノジリマイシン、６−デオキシ−ＤＩＭ、マンノスタチンＡ、スワインソニン、Ｄ−マンノノラクタム(mannonolactam)アミドラゾンまたはプロピルアミノマンノアミジンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記α−マンノシダーゼ阻害剤がキフネンシン(Kifunensine)である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質がｇｐ１２０糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記糖タンパク質が自己糖タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記自己糖タンパク質が、ＣＤ４８、ＣＤ２９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ８０、ＣＤ９６ａ、アミノペプチダーゼまたはＲＰＴＰｍｕである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記自己糖タンパク質が可溶性糖タンパク質構築物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
発現した糖タンパク質のＮ−グリカンが、主に非グルコシル化高マンノース型グリカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記高マンノース型グリカンが、Ｍａｎ9ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ8ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ7ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ6ＧｌｃＮＡcグリカンからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
改変されたグリコシル化を含む糖タンパク質を発現させる工程が、高収率哺乳類発現系で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記高収率哺乳類発現系が、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖タンパク質にＮ−結合型グリコシル化部位を加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１の方法により製造されたＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記糖タンパク質のＮ−グリカンが主に高マンノース型グリカンであるように、改変されたグリコシル化を含む糖タンパク質を含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記糖タンパク質がｇｐ１２０糖タンパク質である、請求項１６に記載のワクチンまたは組成物。
【請求項１８】
前記糖タンパク質が自己糖タンパク質である、請求項１６に記載のワクチンまたは組成物。
【請求項１９】
ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物を生成する方法であって、
（ｉ）細胞の第１のプールから細胞のサブプールを選択する工程（この際、サブプールの細胞は、第１のプールの細胞よりも２Ｇ１２抗体に対して高い親和性を有する）；および
（ｉｉ）サブプールの細胞を複製して細胞の第２のプールを生成する工程；
を含む、少なくとも１回の反復（この際、ワクチンまたは組成物は直前の反復から得た第２のプールの細胞を含む）を行う工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記反復を２回またはそれ以上行う工程を含み、その際、直前でない反復の第２の細胞プールが、該直前でない反復の直後の反復の第１の細胞プールである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のプールの細胞が酵母細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵母細胞が、カンジダ・アルビカンス細胞またはサッカロミセス・セレビシエ（S. cervisiae）細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酵母細胞が、マンナン合成に関与する１またはそれ以上の遺伝子を欠損している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記選択工程が、蛍光活性化セルソーターによるかまたはアフィニティー分離のための固定化された２Ｇ１２抗体を用いる直接濃縮により行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１９の方法により生成されたＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２６】
２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有するマンナンを含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記マンナンが酵母または細菌細胞のマンナンである、請求項２６に記載のワクチンまたは組成物。
【請求項２８】
前記マンナンが人為的に選択されたマンナンである、請求項２６に記載のワクチン。
【請求項２９】
（ｉ）２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナン；および
（ｉｉ）糖タンパク質（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主に高マンノース型グリカンである）
を含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項３０】
糖タンパク質を含む組成物を被験体へ投与する工程（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主に高マンノース型グリカンである）を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化(immunogenizing)の方法。
【請求項３１】
２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナンを含む組成物を被験体へ投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化の方法。
【請求項３２】
糖タンパク質を含む第１の組成物（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主に高マンノース型グリカンである）および２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナンを含む第２の組成物を被験体へ投与する工程（この際、第１および第２の組成物は一緒にまたは別々に投与される）を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は一般に、糖鎖工学、および、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）糖鎖ワクチンおよび／または免疫原性組成物、ならびにこのようなワクチンおよび組成物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗糖鎖認識は、適応免疫および自然免疫の双方の主要な構成要素である。しかし限られたケースにおいてのみ、表面糖鎖に対する抗体の防御特性がワクチンデザインにおいて活用されている。
【０００３】
グリコシル化の抗原性の役割は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の場合、特に重要である。ＨＩＶ−１の表面は、液性免疫回避を促進する「進化性グリカン・シールド」を形成する、大きく柔軟な、免疫原性の低いＮ−結合型糖鎖により覆われている（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、X. Wei et. al. "Antibody neutralization and escape by HIV-1", Nature, 422(6929), pp. 307-312, 2003参照）。ＨＩＶグリカンの免疫原性の低さに対して、３つの主要な説明が提案されている。まず第１に、ＨＩＶと結合しているグリカンは宿主細胞により合成され、そのため、免疫学的には「自己」である。第２に、タンパク質の糖鎖への結合は一般に弱く、従って、高親和性の抗糖鎖抗体の可能性が制限される。最後に、複数の異なる糖型を任意の所与のＮ−結合型付加部位に付加することができ、従って、非常に不均一な潜在的抗原の混合物が生成される。広範な複合体、オリゴマンノースおよびハイブリッド型グリカンはすべてＨＩＶ上に存在し、オリゴマンノースグリカンはｇｐ１２０の露出した外側ドメイン上に高度にクラスターを形成している。しかし、ＨＩＶ糖鎖に対する抗体は、感染時には通常は見られない。
【０００４】
ＨＩＶ−１のｇｐ１２０分子は広範囲にわたりＮ−グリコシル化されており、この糖タンパク質の分子量の約半分は共有結合しているＮ−グリカンにより占められる。糖タンパク質表面をモデルとする、Ｎ−グリカンを有するｇｐ１２０コアの結晶構造は、Ｎ−グリカンのクラスターを含むｇｐ１２０分子の１つの面を特定する(例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、P.D. Kwong et. al. "Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody", Nature, 393(6686) pp.648-659, 1998参照）。現在までに、糖タンパク質分子のこの領域を認識できる抗体はわずか１つ（２Ｇ１２）しか確認されていないため、この面は免疫学的にサイレントであることが示されている。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０分子のＮ−グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化部位の下部に位置する抗原タンパク質エピトープへの抗体の到達性を妨害することにより、免疫回避において主要な役割を果たしていると考えられている。この場合、Ｎ−グリカンがその下部に位置するｇｐ１２０分子を抗体認識から保護しているならば、Ｎ−グリカンの正確な構造はほとんど重要ではない。従って、ｇｐ１２０グリカン・シールドは、ウイルスゲノムの突然変異の後に新しいＮ−グリコシル化部位を導入することにより発展させることができる。これは、宿主の免疫性の持続的な回避を促進する。
【０００５】
ＨＩＶの糖鎖に対する抗体は稀であるにもかかわらず、糖鎖部分が強い抗体反応を誘発するその他の病原体が多く存在する。実際に、ヒト液性抗糖鎖反応性の注目すべき特徴は、α１→２結合マンノースオリゴ糖に特異的な抗マンノース抗体が広範囲に存在することである。しかし、２Ｇ１２とは異なり、これらの抗体は「自己」であるオリゴマンノースグリカンの中に提示されているマンノースとは結合しない。天然の抗マンノース抗体の予想標的は、多くの天然に存在する酵母の脂質およびタンパク質上に存在する細胞壁マンナンである。酵母マンナンを用いる免疫化は、ｇｐ１２０糖鎖と何らかの液性交差反応性をもたらしうる（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、W. E. Muller et. al "Polyclonal antibodies to mannan from yeast also recognize the carbohydrate structure of gp120 of the AIDS virus: an approach to raise neutralizing antibodies to HIV-I infection in vitro", AIDS. 1990 Feb;4(2), pp. 159-62；および参照によりその全文が本明細書に援用される、W. E. Muller et. al. "Antibodies against defined carbohydrate structures of Candida albicans protect H9 cells against infection with human immunodeficiency virus-1 in vitro", J Acquir Immune Defic Syndr. 1991;4(7) pp. 694-703参照）。しかし、力価および観察される親和性は、予防薬としての使用を保証するに十分なものではない。
【０００６】
上記にもかかわらず、１つの稀な抗ｇｐ１２０中和抗体である２Ｇ１２は、ＨＩＶエンベロープ上の特定の糖鎖エピトープと結合する。２Ｇ１２に認識されるエピトープは、ｇｐ１２０の外側ドメイン上に存在するマンノース残基の非常に特異なクラスターである（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、C. N. Scanlan et. al. "The Broadly Neutralizing Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody 2G12 Recognizes a Cluster of α1→2 Mannose Residues on the Outer Face of gp120 J. Virol. 76 (2002) 7306-7321参照）。２Ｇ１２結合のための第１の分子決定基は、ｇｐ１２０のＡｓｎ３３２およびＡｓｎ３９２と結合したグリカンのα１→２結合マンノース末端である。このクラスターは、「自己」のグリカンから構成されているとはいえ、哺乳類のグリコシル化では非常に特殊な、密集した配列で配置されており、従って、２Ｇ１２による「非自己」識別のための構造的基礎を提供している。２Ｇ１２のＦａｂの構造研究から、Ｆａｂの２本の重鎖が、これまで観察されなかったドメイン交換構造を介して連結されていることが明らかとなった（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、D. Calarese et. al. "Antibody domain exchange is an immunological solution to carbohydrate cluster recognition", Science, vol. 300, pp. 2065-2071, 2003参照）。このドメインを交換したＦａｂにより形成される延長されたパラトープは、多価糖鎖の高親和性結合のための広い表面を提供する。
【０００７】
２Ｇ１２の受動伝達研究から、この抗体がＨＩＶ−１の動物モデルにおいてウイルス攻撃から身を守ることができることが示されている。一連のＨＩＶ−１の一次分離株に対する２Ｇ１２の広い特異性に関して、分子基盤が明らかにされている。従って、２Ｇ１２エピトープの公知構造に基づいて、２Ｇ１２様抗体を誘発することができ、ＨＩＶ−１に対する殺菌免疫(sterilizing immunity)に寄与し得る免疫原を開発することが非常に望ましい。しかし、このような免疫原の設計は、ｇｐ１２０上のグリカンエピトープの抗原模倣に必要な構造的制約、および免疫原性の低いＨＩＶのＮ−結合グリカンに固有の免疫学的制約の両方を克服する必要がある。
【０００８】
ｇｐ１２０免疫原設計の１つのアプローチは、２Ｇ１２が結合するｇｐ１２０の抗原性部分を合成によって再現することである（例えば、参照によりその全文が本明細書に援用される、H.K Lee et. al. "Reactivity-Based One-Pot Synthesis of Oligomannoses: Defining Antigens Recognized by 2G12, a Broadly Neutralizing Anti-HIV-1 Antibody", Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 43(8), pp. 1000-1003, 2004；参照によりその全文が本明細書に援用される、H. Li et. al. "Design and synthesis of a template-assembled oligomannose cluster as an epitope mimic for human HIV-neutralizing antibody 2G12", Org. Biomol. Chem., 2 (4), pp. 483-488, 2004;参照によりその全文が本明細書に援用される、L.-X. Wang, "Binding of High-Mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV-I Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34, 2004参照）。
【０００９】
多価型の合成マンノシドの提示は、２Ｇ１２に対するそれらの親和性をほぼ１００倍高めることができる（例えば、L.-X. Wang, "Binding of High- Mannose-Type Oligosaccharides and Synthetic Oligomannose Clusters to Human Antibody 2G12: Implications for HIV-I Vaccine Design", Chem. Biol. 11(1), pp. 127-34, 2004参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
免疫原設計に対する合成アプローチは潜在的に効果を発揮するものであるとはいえ、免疫原の「合理的」な設計には重要な課題がある。何よりも基本的には、免疫原として使用された場合に、抗体に対する抗原の親和性は、抗原が類似の抗体の進化を誘発する可能性と必ずしも相関しない。従って、グリカン抗原性およびグリカン免疫原性の両方に固有の制限に対応する、ＨＩＶワクチン設計の代替法の開発が非常に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＨＩＶワクチンおよび免疫原性組成物、このようなワクチンおよび組成物を生成する方法、ならびにワクチン接種および／または免疫原化（immunogenizing）の関連手法を提供する。一実施形態によれば、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物の生成方法は、
Ｉ）（Ａ）発現系のグリコシル化経路を変化させる工程、および
（Ｂ）発現した糖タンパク質が、発現した糖タンパク質の２Ｇ１２抗体に対する親和性を高める改変されたグリコシル化をうけるように、発現系において糖タンパク質を発現させる工程；または
ＩＩ）糖タンパク質の自然の発現系以外の発現系において糖タンパク質を発現させる工程（この際、発現した糖タンパク質は、発現した糖タンパク質の２Ｇ１２抗体に対する親和性を高める改変されたグリコシル化を有する）
を含む。
【００１２】
もう１つの実施形態によれば、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物の生成方法は：
（ｉ）細胞の第１のプールから細胞のサブプールを選択する工程（この際、サブプールの細胞は、第１のプールの細胞よりも２Ｇ１２抗体に対して高い親和性を有する）；および
（ｉｉ）サブプールの細胞を複製して細胞の第２のプールを生成する工程；
を含む、少なくとも１回の反復（この際、ワクチンまたは組成物は直前の反復から得た第２のプールの細胞を含む）を行う工程を含む。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、糖タンパク質を含むＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物であり、この際の糖タンパク質のＮ−グリカンは主として高マンノース型グリカンである。
【００１４】
さらにもう１つの本発明の態様は、２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有するマンナンを含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物である。
【００１５】
さらに本発明はまた、
（ｉ）２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナン；および、
（ｉｉ）糖タンパク質（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主に高マンノース型グリカンである）
を含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物も提供する。
【００１６】
さらにもう１つの実施形態によれば、本発明は、糖タンパク質を含む組成物を被験体に投与すること（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主として高マンノース型グリカンである）を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化の方法を提供する。
【００１７】
さらにもう１つの実施形態は、２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナンを含む組成物を被験体に投与することを含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化の方法である。
【００１８】
またさらにもう１つの実施形態は、糖タンパク質を含む第１の組成物（この際、前記糖タンパク質のＮ−グリカンは主に高マンノース型グリカンである）および２Ｇ１２抗体のエピトープに対して特異的な相補性を有する、人為的に選択されたマンナンを含む第２の組成物を被験体へ投与すること（この際、第１および第２の組成物は一緒にまたは別々に投与される）を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種および／または免疫原化の方法である。
【００１９】
さらにもう１つの実施形態は、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物により作製された抗体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ＨＩＶワクチン、抗体、および免疫原性組成物、ならびにそれらを生成する方法、および、特に、ＨＩＶ糖鎖ワクチンおよび免疫原性組成物、ならびにそれらを生成する方法を対象とする。
【００２１】
ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物は、発現した糖タンパク質が、改変されていない自然のグリコシル化をうけた同じ種類の糖タンパク質と比較して、糖タンパク質の２Ｇ１２抗体に対する親和性が高くなるように改変されたグリコシル化をうける糖タンパク質を発現することにより、作製することができる。
【００２２】
グリコシル化の改変は、グリコシル化経路を変更させた発現系において糖タンパク質を発現させた結果であるか、または糖タンパク質の自然の発現系以外の発現系において糖タンパク質を発現させた結果であり得る。
【００２３】
本明細書において、グリコシル化経路を変化させるとは、発現系におけるグリカン合成のための遺伝的基盤を変化させること、および発現系をグリカン・プロセシング酵素の活性を妨害／修飾する化学阻害剤に曝露させて変化させることのいずれか、または両方をさす。
【００２４】
本明細書において、用語「改変されたグリコシル化」とは、糖タンパク質上に天然に見出されるグリカンとは少なくとも１つ、および好ましくは１またはそれ以上異なる、グリコシル化経路が改変された系において発現した糖タンパク質のグリカン（オリゴ糖）を意味する。
【００２５】
糖タンパク質のグリコシル化は、糖タンパク質上のＮ−グリカンが主に高マンノース型グリカンとなるように、改変され得る。用語「主に」は、Ｎ−グリカンの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％が高マンノース型グリカンであることを意味する。高マンノース型グリカンには、少なくとも１つの末端Ｍａｎα１，２Ｍａｎ結合を有するグリカンが挙げられる。
【００２６】
このようなオリゴ糖の例は、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２またはそれらの異性体である。好ましくは、糖タンパク質のＮ−グリカンは、主にＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２またはその異性体である。Ｎ−グリカン含量のプロフィールは、公知の技術を用いて特定できる。例えば、Ｎ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦにより糖タンパク質から遊離し、次に１またはそれ以上の高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、質量分析により分析することができる。
【００２７】
一部の実施形態において、発現系のグリコシル化経路は、グリカン・プロセシング酵素の活性を妨害／修飾する化学阻害剤に系を曝露させることにより変化させうる。このような阻害剤は、グリコシダーゼ阻害剤、好ましくは、α−マンノシダーゼ阻害剤であってよい。表１は、例示的なグリコシダーゼ阻害剤およびその活性のリストを示す。各グリコシダーゼ阻害剤は、単独で、または他の阻害剤と組合せて使用することができる。
【表１】
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【００２８】
グリコシダーゼ阻害剤の特定の濃度は、阻害剤の種類、発現される糖タンパク質の種類によって決まり得る。例えば、好ましいマンノシダーゼ阻害剤であるキフネンシンは、わずか約１００μＭ、またはわずか約５０μＭ、またはわずか約１０μＭ、またはわずか約５μＭ、またはわずか約１μＭ、またはわずか約０．５μＭの濃度で、発現系である細胞と接触させることができる。
【００２９】
本発明のための発現系は、高収率の哺乳類発現系、例えばヒト胚腎臓２９３Ｔ−ＥおよびＳ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＨｅｐＧ２細胞であってよい。
【００３０】
一部の実施形態において、発現系のグリコシル化経路を変化させることは、グリコシル化経路を遺伝子操作することにより行われ得る。従って、発現系は、オリゴマンノースグリカンを有する糖タンパク質を生成するためのＮ−結合グリコシル化が破壊された、例えば、α−マンノシダーゼおよび／またはＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ活性が欠損している哺乳類発現系であってよい。発現系はまた、α−マンノシダーゼおよび／またはＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ活性が欠損している細胞株を含む、レクチン耐性細胞株であってもよい。
【００３１】
一部の実施形態において、糖タンパク質の発現は、糖タンパク質の自然の発現系以外の、糖タンパク質のグリコシル化を改変する任意の発現系において行われることも可能であり、それは自然に見出される同じ種類の糖タンパク質と比較して、２Ｇ１２抗体に対して高い親和性を有する。特に、企図される発現系としては、Ｎ−結合型グリコシル化遺伝子が変化している、真菌／酵母細胞株、昆虫細胞株または哺乳類細胞株、例えば高マンノース型構造を有する糖タンパク質を発現することのできるＬｅｃ系突然変異体が挙げられる。例えば、酵母細胞株は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cervesiae）の突然変異体Δｏｃｈｌ、Δｍｎｎｌであってよい（Nakanishi-Shindo, Y., Nakayama, K. I, Tanaka, A., Toda, Y. and Jigami, Y. (1993). Journal of Biological Chemistry 268: 26338-26345）。
【００３２】
発現した糖タンパク質のグリコシル化は、自然にグリコシル化された同じ種類の糖タンパク質と比較して、２Ｇ１２抗体に対する糖タンパク質の親和性が高まるように改変されている。従来の方法は、抗体に対する糖タンパク質の親和性を決定するために存在する。このような方法の一例は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であってよい。
【００３３】
本発明に従って発現され得る糖タンパク質としては、ｇｐ１２０糖タンパク質および「自己」糖タンパク質が挙げられる。糖タンパク質は、任意の都合のよい供給源から、例えば、糖タンパク質生成のための標準的な組換え技術により得ることができる。
【００３４】
ｇｐ１２０
天然に存在するｇｐ１２０のグリコシル化は、高度に不均一である。２Ｇ１２結合に必須であるα１→２結合構造は、より大きなオリゴマンノースグリカン上にのみ存在する。従って、通常、２Ｇ１２と結合する２個または３個のｇｐ１２０グリカンは、ｇｐ１２０上に存在するＮ−結合型糖鎖の総数のごく一部分を示しているにすぎない(最大でＮ−結合型部位３０個まで)。
【００３５】
従って、ｇｐ１２０グリコシル化の微小不均一性の程度が、２Ｇ１２および他の類似の抗グリカン抗体の結合部位数を制限する。複合体が変動しやすいほど、ハイブリッドおよびより小さなオリゴマンノースグリカンは２Ｇ１２結合を支持することができない。この制限は、ｇｐ１２０上のグリカンの種類を２Ｇ１２と結合するものに限定するために、グリカンのプロセシング経路を操作することにより克服できる。この改変の後、２Ｇ１２に対して類似の特異性を有する他の抗体を誘発する、この免疫原の潜在的可能性を高めることができる。従って、キフネンシンの存在下で生成されたｇｐ１２０は、２Ｇ１２に対してのみならず、潜在的に、他の形状で提示されるマンノース残基を必要としうるその他の抗マンノースクラスター抗体に対しても、強化されたリガンドとしての機能を果たすことができる。
【００３６】
自己タンパク質
ｇｐ１２０に対する免疫応答は、通常、コアタンパク質に特異的な抗体に支配されている。Ｎ−結合型グリカンは、通常、抗体認識において直接的な役割を果たさない。タンパク質部分に対する免疫応答およびタンパク質部分による免疫調節の双方を排除するために、「自己」タンパク質を、「非自己」オリゴマンノースクラスターの足場として利用することができる。マンノシダーゼ阻害剤の存在下での、またはグリコシル化経路が遺伝子操作されている細胞系統からの、組換え型「自己」糖タンパク質の発現は、２Ｇ１２エピトープを模倣する、オリゴマンノース型グリカンの足場を提供し得る。このアプローチの利点は、いずれの抗体応答もオリゴマンノースクラスターにのみ向けられ、免疫学的にサイレントな(immunosilent)タンパク質足場に２Ｇ１２エピトープが提示され得ることである。
【００３７】
本発明はまた、２Ｇ１２抗体に対して特異的な相補性を有するマンナンを含む、ＨＩＶワクチンまたは免疫原性組成物も提供する。マンナンは、マンノースを含む多糖類であり、酵母または細菌細胞由来であることが好ましい。マンナンは、単離された形のマンナン；死細胞または弱毒化細胞であってよい、酵母または細菌の完全細胞；または、担体分子もしくはタンパク質と結合しているマンナンとしてであってよい。マンナンは２Ｇ１２抗体に対して天然の親和性を有する酵母または細菌細胞のマンナンであってよい。このようなマンナンの一例は、２Ｇ１２エピトープを模倣する、すなわち２Ｇ１２抗体に対する天然の特異的な相補性を有するカンジダ・アルビカンスのマンナン構造であり得る。
【００３８】
マンナンはまた、人為的または遺伝学的に選択されたマンナンであってよい。このようなマンナンは、２Ｇ１２抗体に対してより高い親和性を有する酵母または細菌細胞を反復して選択することにより、生成することができる。この反復のための細胞の開始プールは、多少の非ゼロ(non-zero)親和性または特異性を示す細胞も含んでよい。開始プールからは、残りの細胞よりも２Ｇ１２抗体に対して高い親和性を有する細胞サブセットを選択することができる。次に、サブセットの細胞を複製し、その後の反復のための開始プールとして使用することができる。２Ｇ１２抗体に対してより高い親和性を有する細胞サブセットを特定するために、さまざまな判定基準を用いることができる。例えば、最初の反復では、細胞は２Ｇ１２抗体に対する検出可能な親和性を有する。その後の反復では、選択される細胞は、代表細胞であってよい。２Ｇ１２抗体に対して高親和性を示す細胞は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、またはアフィニティー分離のための固定化された２Ｇ１２を用いる直接濃縮により選び出すことができる。
【００３９】
細胞の開始プールに用いられ得る限定されない一例は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cervisiae）細胞である。２Ｇ１２抗体はサッカロミセス・セレビシエ（S. cervisiae）のマンナンと結合することができ、従って、マンナンとｇｐ１２０糖タンパク質の間の、ある程度の非ゼロ抗原性の模倣を示している。サッカロミセス・セレビシエ（S. cerivisiae）細胞壁の糖鎖構造は、ｇｐ１２０のオリゴマンノースグリカンと共通の抗原構造を共有している。しかし、天然に存在するサッカロミセス・セレビシエ（S. cervisiae）のマンナンは、免疫原として使用された場合、ｇｐ１２０に対して十分な液性の交差反応性を誘発しない。
【００４０】
本発明に用いることのできる細胞は、マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子産物Ｍｎｎ２ｐ欠損細胞など、マンナン合成に関与する１またはそれ以上の遺伝子が欠損している細胞でもありうる。
【００４１】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、ＨＩＶに対するヒトを含む、哺乳類のＨＩＶに対してワクチン接種および／または免疫原化するために投与することができる。ワクチンまたは免疫原性組成物は、２Ｇ１２抗体に対して特異的な相補性を有するマンナンおよび／または上記の方法により調製された糖タンパク質を含んでよい。糖タンパク質は、そのグリコシル化というさらなる修飾をうけずに、単離または精製された糖タンパク質として、ワクチン中に含まれ得る。
【００４２】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、任意の簡便な方法により投与してよい。例えば、糖タンパク質および／またはマンナンは、任意の医薬上許容される担体をさらに含む、医薬上許容される組成物の一部として、またはリポソームもしくは放出制御医薬組成物などの送達システムを用いて、投与してよい。用語「医薬上許容される」とは、生理学的に許容でき、一般に、投与時にアレルギー性または類似の望ましくない反応、例えば胃の不調またはめまいを引き起こさない分子および組成物をさす。好ましくは、「医薬上許容される」とは、動物、好ましくは、ヒトにおける使用が連邦規制機関または州政府により承認されているか、米国薬局方もしくは一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」とは、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをさす。このような医薬用担体は無菌の液体、例えば、生理食塩液、デキストロース溶液、グリセロール溶液、水と油のエマルジョン、例えば、石油、動物油、植物油、または合成起源の油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、またはゴマ油）で作られたエマルジョンであってよい。
【００４３】
水、生理食塩液、デキストロース溶液、およびグリセロール溶液は、特に注射用溶液の担体として好んで用いられる。
【００４４】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、糖タンパク質および／またはマンナンに適合する任意の標準的な技術により投与してよい。このような技術としては、経口投与、経皮投与、および経粘膜投与（例えば、経口または鼻腔投与）が挙げられる。以下の限定されない実施例で、本発明をさらに例証する。
【００４５】
実施例１．抗原性を高めるマンノシダーゼ阻害剤存在下でのｇｐ１２０の生成
本試験の目的は、広域中和性の２Ｇ１２様抗ＨＩＶ抗体を選択的に誘発できる、修飾ｇｐ１２０分子を生成することである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の安定な細胞株において、２Ｇ１２に対しより高い親和性を示すオリゴマンノースエピトープを有するように糖タンパク質を修飾することを意図して、マンノシダーゼ阻害剤を用いてＨＩＶ−１IIIBｇｐ１２０糖タンパク質を生成した。
【００４６】
２Ｇ１２エピトープの形成時のキフネンシンによるマンノシダーゼ阻害の役割を調べるために、ＥＥ６ＨＣＭＶｇｐ１２０ＧＳをトランスフェクトされた、組換え型ＨＩＶ−１ＩＩＩＢｇｐ１２０を分泌しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ウシ胎仔血清（１０％）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０1ｇ／ｍｌ）を添加したＣＢ２  ＤＭＥＭベース培地中で培養した。試薬はすべて、Gibco Ltd, Uxbridge, UKから入手した。メチオニンスルホキシミン（２００ｎＭ）の添加により、ｇｐ１２０の高レベルの発現が維持された。キフネンシンの存在下および不在下で、細胞を増殖させた(図１Ａ、１Ｂ参照)。
【００４７】
キフネンシンおよびデオキシマンノジリマイシン（ＤＭＪ、表１）の双方は、ＥＲおよびゴルジ体に常在するクラスＩのα−マンノシダーゼの双方を阻害するが、キフネンシン
がＤＭＪよりも１０００倍低い濃度でマンノシダーゼ阻害をもたらすことができるという理由で、本試験ではキフネンシンをマンノシダーゼ阻害剤として選択した。
【００４８】
マンノシダーゼ阻害剤であるキフネンシンの存在下でのＣＨＯのｇｐ１２０の生成の結果、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）において、モノクローナル抗体２Ｇ１２に対し、より高い結合性を示す分子が得られた。
【００４９】
２Ｇ１２の２つのＥＬＩＳＡ結合実験では、キフネンシンの存在下で生成されたｇｐ１２０の各分子上に、少なくとも１つのさらなる２Ｇ１２結合部位が存在することが実証された。糖タンパク質は、プラスチック製のタンパク質結合プレート上に固定化された。最初の実験（図１Ａ）には、２Ｇ１２（５ｕｇ／ｍｌ）でプレートを被覆し、４℃にて一晩静置した。次にプレートをウシ血清アルブミン（３％  ｗ／ｖ）を用いて１時間ブロッキングした。
【００５０】
続いて、ｇｐ１２０ＩＩＩＢ発現ＣＨＯ細胞（キフネンシンの存在下または非存在下）由来の上清を、室温にて１時間添加した。次に、プレートを３回ＰＢＳ中で洗浄した。次に、２Ｇ１２（１０ｙｇ／ｍｌから滴定）を加えた。洗浄後、ホスファターゼコンジュゲート抗ＩｇＧ二次抗体により２Ｇ１２結合を測定し、最終洗浄工程および、次にホスファターゼ基質測定（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、４０５ｎｍでの吸光度）を行った。
【００５１】
ｂ１２結合（図１Ｂ）により判定されるさらなる結合部位の存在は、２Ｇ１２結合部位ともｂ１２結合部位とも競合しない抗ｇｐ１２０抗体（Ｄ７３２４）を用いて、ｇｐ１２０を捕捉することにより判定した。ｇｐ１２０の結合、およびｂ１２／２Ｇ１２の判定は、再度、ホスファターゼコンジュゲート抗ＩｇＧ二次抗体により行った。
【００５２】
図１は、定められた濃度の２Ｇ１２に対するホスファターゼコンジュゲート抗ＩｇＧ二次抗体由来の、４０５ｎｍでの吸光度によって検出されたキフネンシン処理ｇｐ１２０糖タンパク質、および対照抗体（ｕｇ／ｍｌ）と抗体の結合を示す。図１のパネルＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の結果を示し、０μＭキフネンシン（白色のひし形）、０．０５μＭキフネンシン（白色の三角形）、０．１μＭキフネンシン（白色の四角形）、０．２５μＭキフネンシン（＋）、０．５μＭキフネンシン（黒色の三角形）、１μＭキフネンシン（黒色の三角形）、および５μＭキフネンシン（黒色の四角形）存在下で生成されたＣＨＯのｇｐ１２０に、２分子以上の２Ｇ１２が結合していることを実証する。ＢＳＡ（ｘ）は、これらの実験で陰性対照として用いられた。図１のパネルＢは、キフネンシン処理ＣＨＯｇｐ１２０と２Ｇ１２の二重の抗体結合、未処理ｇｐ１２０とのｂ１２の結合（黒色の四角形）、未処理ｇｐ１２０との２Ｇ１２の結合（黒色のひし形）、ｇｐ１２０とのｂ１２および２Ｇ１２の二重の抗体結合（黒色の三角形）；５μＭキフネンシンの存在下で生成されたｇｐ１２０とのｂ１２の結合（白色の四角形）および２Ｇ１２の結合（白色のひし形）を示している。
【００５３】
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果は、キフネンシン濃度の増加とともに、２またはそれ以上の２Ｇ１２抗体分子と同時に結合することのできるｇｐ１２０分子の比率が高くなることを示している（図１、パネルＡ）。キフネンシン処理ｇｐ１２０との２Ｇ１２の結合と、未処理ｇｐ１２０の二重抗体ＥＬＩＳＡとの比較（図１、パネルＢ）から、キフネンシン処理ｇｐ１２０上には、２Ｇ１２に対して２つの異なるエピトープが存在することが確認される。
【００５４】
結論：キフネンシン処理糖タンパク質のＮ−グリカン分析から、複合体のグリコシル化が阻害され、ＥＲおよびゴルジ体に常在するマンノシダーゼに対するキフネンシンの公知の阻害活性と一致する、オリゴマンノース糖型をもたらすことが示される。結果として、キフネンシンの存在下で発現したｇｐ１２０糖タンパク質の２Ｇ１２の結合は大幅に増加し、単一のｇｐ１２０分子に少なくとも２つの２Ｇ１２分子が結合できる。
【００５５】
実施例２．ＨＩＶ糖鎖に対して抗原交差反応性を有する「自己」糖タンパク質の生成
ａ）ＣＤ４８およびＲＰＴＰｍｕ
本試験の目的は、２Ｇ１２抗体と結合し、および結果としてＨＩＶｇｐ１２０に対して抗原交差反応性を示す、オリゴマンノースグリカンを有する「自己」糖タンパク質を生成することである。２つの標的糖タンパク質、ＣＤ４８および受容体タンパク質チロシンリン酸ｍｕ（ＲＰＴＰｍｕ）を、５μＭ濃度のマンノシダーゼ阻害剤キフネンシンの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させた。マンノシダーゼ阻害剤がオリゴマンノースグリカンを含有する糖タンパク質の生成に有効であることを証明するために、タンパク質Ｎ−グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）で消化させてグリカンを遊離させ、次に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により分析した。
【００５６】
Kurster et al (Anal. Biochem. 250(1)82-101)に記載されるように、タンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦ消化により、組換え型糖タンパク質からグリカンを遊離させた。要するに：１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、クマシー染色されたバンドをゲルから切り出して、−２０℃で凍結させた。次に凍結ゲル片を、アセトニトリルおよび２０ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファーで交互に洗浄した。次に、２０ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー中で３７℃にてＰＮＧａｓｅＦ(EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)を用いて一晩酵素消化することにより、脱グリコシル化を行った。グリカンを含む、一晩反応させた混合物を保持し、追加の蒸留水を用いてゲル片を音波処理することにより、ゲル中の残りのグリカンを抽出した。
【００５７】
抽出されたグリカンを、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ酵素結合カラム(Millipore, Bedford, MA, USA)に通して、質量分析のために最終的に精製した。
【００５８】
さらに、グリカンを、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼを用いる消化後に分析した。図２は、５μＭキフネンシンの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現した標的糖タンパク質（ＲＰＴＰｍｕ）からのＰＮＧａｓｅＦ−遊離グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。未消化グリカンおよびエンドグリコシダーゼＨを用いて消化されたグリカンのデータを、図２のパネルＡおよびＢに対応させて示す。
【００５９】
図２の結果は、遊離されたグリカンのプールが、エンドグリコシダーゼＨ消化およびタチナタマメ由来のα−マンノシダーゼに対して完全に感受性があったことを証明する。
【００６０】
得られたオリゴマンノース型Ｎ−結合型グリカンを含有する糖タンパク質を、２Ｇ１２結合についてＥＬＩＳＡにより試験した（図４）。特に、１５．６μｇのＣＤ４８、２μｇ、１μｇおよび０．４μｇのＲＰＴＰｍｕをプレートに加え、１μｇのキフネンシン未処理ＩｇＧを陰性対照としてプレートに加えた。図４のデータから、マンノシダーゼ阻害剤の存在下で生成された糖タンパク質は２Ｇ１２と結合でき、従って、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０の抗原性模倣体であることが確認された。
【００６１】
キフネンシンの存在下で発現した糖タンパク質上に存在するグリカンの抗原的に重要な特徴は、非天然オリゴマンノース異性体の生成である。
【００６２】
一部の発現系、特にＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、キフネンシンの導入は、天然の異性体と化学組成は同じであるが、異なる配置の単糖類成分を含み得るＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2の合成を引き起こし得る。図３は、正常なＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2（上のパネル）およびキフネンシンの存在下で発現した糖タンパク質由来のＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2（下のパネル）の特徴的な構造フィンガープリントの質量分析を比較したものであり、抗原的に新規なＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2異性体の存在が確認される。
【００６３】
キフネンシン処理細胞に由来する糖タンパク質上に存在する、天然に存在しない異性体は、ＨＩＶを含む哺乳類細胞上に通常みられるＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2とは抗原的に異なるため、キフネンシン処理細胞に由来する糖タンパク質は、免疫原として用いられた場合に、増強された抗原反応を示しうることが予想される。従って、既存のＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2構造の修飾は、記載されたクラスター化効果を上回って、免疫原性を高める可能性がある。
【００６４】
図３に示されるように、キフネンシン処理ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のオリゴマンノースグリカンは、抗原的には「非自己」異性体である。従って、ｇｐ１２０の天然のグリカンに対して抗原交差反応性を保持する一方で、これらの新規グリカンは免疫原としての高い潜在能力を示すで。
【００６５】
ｂ）ＣＤ６６ａ
ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ−１）自己糖タンパク質は、マンノシダーゼ阻害剤であるキフネンシン５０μＭ濃度の存在下で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現した。
【００６６】
ラットＣＥＡＣＡＭ１を用いてトランスフェクトし、ヒトＦｃと融合させたＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｆｃキメラタンパク質を１０日間静置した蓄積させ、ファーストフロープロテインＡ−セファロース（Amersham Biosciences）を用いて精製した。
【００６７】
ウエスタンブロット分析
溶出させたタンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにかけ、タンク−トランスファー装置（Bio-Rad, Hertfordshire, UK）を用いてＰＶＤＦ膜（Immobillon-P, Millipore）上にエレクトロブロットした。免疫ブロット法は、モノクローナル抗ＣＥＡＣＡＭｌマウスモノクローナル抗体Ｂｅ９．２（Dr. B. B. Singerより提供）およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体（１：１０，０００希釈）の１：５００希釈を用いて行った。ＨＲＰ依存性発光は、改良された化学発光技術（ECL, Pierce, Northumberland, UK）を用いて発現させた。
【００６８】
ＰＮＧａｓｅ消化およびグリカンの抽出
精製したラットＣＥＡＣＡＭ１タンパク質を１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離し、クマシー染色されたバンドをゲルから切り出して、−２０℃にて凍結した。次に凍結ゲル片を、アセトニトリルおよび２０ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファーで交互に洗浄した。次に、２０ｍＭ重炭酸ナトリウムバッファー中、３７℃にてＰＮＧａｓｅＦ(EC 3.2.2.18, Roche Biochemicals)を用いて一晩酵素消化することにより、脱グリコシル化を行った。グリカンを含む、一晩反応させた混合物を保持し、追加の蒸留水を用いてゲル片を音波処理することにより、ゲル中の残りのグリカンを抽出した。
【００６９】
抽出されたグリカンは、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ酵素結合カラム(Millipore, Bedford, MA, USA)に通して、質量分析のために最終的に精製した。
【００７０】
マンノシダーゼ阻害剤がオリゴマンノースグリカンを含有する糖タンパク質の生成に有効であることを証明するために、プロテインＮ−グリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いる消化によりグリカンを遊離させ、次にマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により分析した。
【００７１】
図７は、ＣＤ６６ａ上に通常見られるグリカン、すなわち未処理細胞において発現したＣＤ６６ａ（上のパネル）、およびキフネンシンの存在下で発現したＣＤ６６ａから遊離されたグリカン（下のパネル）のＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す。ＣＤ６６ａ上に一般に見られるグリカンは複雑なＮ−結合糖鎖の多様なプールを形成するが、キフネンシンの存在下で発現したＣＤ６６ａ由来のグリカンはオリゴマンノースグリカンであり、大部分はＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ9である。図８において、このグリカンの複雑性の低減は、ＣＤ６６ａの２Ｇ１２抗体に対する親和性の増大と相関している。固定化されたＣＤ６６ａとの２Ｇ１２の結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＤ６６ａ上のグリカン多様性へのキフネンシン処理の影響もまた、ゲルシフトにより示され、通常見られるＣＤ６６ａ（−）と比較して、キフネンシンの存在下で発現したＣＤ６６ａ（＋）に、下方の一段と集中した明らかな質量が観察された。
【００７２】
実施例３．遺伝学的に選択された酵母の表面のマンナンとの２Ｇ１２の結合
酵母マンナンを選択する戦略は、すでに免疫原性を有する糖鎖構造（サッカロミセス・セレビシエ(S. cerivisiae)のマンナン）を選び、そのｇｐ１２０との抗原類似性を高めるためのものである。この試験のために、野生型サッカロミセス・セレビシエ(S. cerivisiae)（ＷＴ  Ｍａｔ−ａ  Ｂ４７４１）およびマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子産物Ｍｎｎ２ｐ欠損株（ΔＭｎｎ２  Ｍａｔ−ａ  Ｂ４７４１）の双方を選択した。多くの他の病原体表面がこの構造を共有できるか、または人為的選択を経て共有するように進化することができる。特に、ΔＭｎｎ２変異株は、Ｍｎｎ２ｐによりその付加が触媒される、分枝したマンナンの末端Ｍａｎαｌ−３Ｍａｎ残基が２Ｇ１２の認識を妨げることが予想されるという理由で選択された（図５）。２Ｇ１２のサッカロミセス・セレビシエ(S. cericisiae)マンナンへの結合は、蛍光活性化細胞セルソーター（ＦＡＣＳ）により測定することができる。２Ｇ１２に対して検出可能な親和性を示す細胞が選択され、娘細胞集団の播種に用いられる。選択を繰り返すことにより、２Ｇ１２への親和性のより高い酵母マンナンの進化を促進することができる。
【００７３】
図６は、選択を３回繰り返した酵母細胞の表面に対する２Ｇ１２の親和性を示す。ｙ軸の値は、最初の野生型集団の９９．５％よりも高い親和性で２Ｇ１２と結合する酵母細胞の画分を示す。野生型（白いバー）および△Ｍｎｎ２（斜線のバー）細胞集団の進化を図６に示す。図６のデータは、２Ｇ１２との結合能力に従って酵母を選択することにより、細胞表面の２Ｇ１２親和性の遺伝的増大を引き起こすことができることを示す。予想したように、ΔＭｎｎ２株は野生型よりもこのような選択判定基準への適応をより一層支援することができる。さらなる選択および複製の繰り返しは、マンナン構造を変化させるために継続することができ、従って、それらの２Ｇ１２エピトープの抗原性の模倣が促進される。このようにして生成されたマンナン構造は、単離物、およびタンパク質コンジュゲートとして、その双方を免疫付与試験に用いることができる。
【００７４】
これまで、特に好ましい実施形態について述べてきたが、本発明がそれに制限されないことが当然理解されよう。当業者であれば、開示された実施形態には種々の改変がなされてよく、また、このような改変は本発明の範囲内にあることが意図されることに当然思い及ぶであろう。
【００７５】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許出願および特許は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】キフネンシン処理ＨＩＶ−１IIIBｇｐ１２０への抗体結合を示す。
【図２】５μＭキフネシンの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現した標的糖タンパク質（ＲＰＴＰｍｕ）からＰＮＧａｓｅＦにより遊離したグリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳを示す。
【図３】通常のＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２（上のパネル）およびキフネシン存在下で発現した糖タンパク質由来のＭａｎ9ＧｌｃＮＡｃ2（下のパネル）の、特徴的な構造フィンガープリントの質量分析による解析を示す。
【図４】５μＭキフネシン処理ＣＤ４８およびＲＰＴＰｍｕとの抗体の結合を示す。
【図５】α−結合マンノース（○）および２Ｇ１２の一次リガンド：Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎ（枠内）を示す、サッカロミセス・セレビシエ(S. cerivisiae)マンナンの構造の模式図を示す。
【図６】選択を３回繰り返した酵母細胞表面に対する２Ｇ１２の親和性を示す。
【図７】未処理細胞（上のパネル）およびキフネンシン処理細胞（下のパネル）において発現したＣＤ６６ａ自己糖タンパク質の、ＰＮＧａｓｅ−Ｆにより遊離したグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【図８】キフネンシンの存在下で発現したＣＤ６６ａ糖タンパク質の２Ｇ１２結合に関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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