(57)【要約】本発明は、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）の主要標的タンパク質であるＲｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２活性を増加させる方法に関するもので、より詳細には、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してユビキチン化による分解を抑制することで、Ｒｕｎｘ２の安定性を高めてＢＭＰによる骨形成経路を活性化させる方法に関するものである。本発明のＲｕｎｘ２活性増加方法は、Ｒｕｎｘ２の分解を抑制して骨形成を誘導することによって骨粗しょう症や骨形成不全症、歯周疾患、骨折などの骨疾患予防及び治療に利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２活性を増加させる方法。
【請求項２】
Ｒｕｎｘ２の活性が、転写活性であることを特徴とする、請求項１に記載のＲｕｎｘ２活性を増加させる方法。
【請求項３】
Ｒｕｎｘ２をアセチル化させてＲｕｎｘ２を安定化させることによって、請求項１に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項４】
アセチル化されたＲｕｎｘ２の安定化が、半減期の増加によるものであることを特徴とする、請求項２に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項５】
Ｒｕｎｘ２の活性が、ＢＭＰ−２によって調節されることを特徴とする、請求項１に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項６】
Ｒｕｎｘ２の活性が、ｐ３００によって調節されることを特徴とする、請求項１に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項７】
Ｒｕｎｘ２の活性が、Ｓｍｕｒｆ１によるユビキチン化によって調節されることを特徴とする、請求項１に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項８】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化される部位が、配列番号１で表されるＲｕｎｘ２アミノ酸配列のリジンであることを特徴とする、請求項５、請求項６または請求項７に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項９】
アセチル化されたＲｕｎｘ２の脱アセチル化を抑制して、請求項１に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項１０】
脱アセチル化が、ヒストンデアセチラーゼによって行われることを特徴とする、請求項９に記載のＲｕｎｘ２の活性を増加させる方法。
【請求項１１】
脱アセチル化抑制が、ブタン酸、ペンタン酸、カルバマート（carbamate）、オクタンジアミド、２，４−ヘプタジエンアミド、シクロ［（αＳ，２Ｓ）−α−アミノ−η−オキソオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル］（９Ｃｌ）、シクロ［（２ｓ）−２−アミノ−８−（ヒドロキシアミノ）−８−オキソオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニルプロピル］（９Ｃｌ）、オキサムフラチン、Ｄ−スレオ−Ｄ−イド（ｉｄｏ）−ウンデコ（ｕｎｄｅｃｏ）−１，６−ジエニトール，４，５，８，９−ジアンハイドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−（９Ｃｌ）、シクロ［（２Ｓ）−２−アミノ−８−オキソデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトピル−Ｌ−イソルシル−Ｄ−プロピル］（９Ｃｌ）、シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｉｅ−Ｄ−Ｐｒｏ二合体、シクロ（−Ｌ−Ａｍ７−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−）、ツバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）及びその誘導体からなるヒストンデアセチラーゼ阻害剤群から選択された阻害剤によるものであることを特徴とする、請求項９に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項１２】
Ｒｕｎｘ２をアセチル化させて骨形成を増加させる方法。
【請求項１３】
Ｒｕｎｘ２をアセチル化させてＲｕｎｘ２を安定化させることによって、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１４】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化が、ＢＭＰによって調節されることを特徴とする、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１５】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化が、ｐ３００によって調節されることを特徴とする、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１６】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化される部位が、配列番号１で表されるＲｕｎｘ２アミノ酸配列のリジンであることを特徴とする、請求項１３、請求項１４または請求項１５に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１７】
アセチル化されたＲｕｎｘ２の脱アセチル化を抑制して、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１８】
脱アセチル化が、ヒストンデアセチラーゼによって行われることを特徴とする、請求項１７に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項１９】
脱アセチル化抑制が、ブタン酸、ペンタン酸、カルバマート（carbamate）、オクタンジアミド、２，４−ヘプタジエンアミド、シクロ［（αＳ，２Ｓ）−α−アミノ−η−オキソオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル］（９Ｃｌ）、シクロ［（２ｓ）−２−アミノ−８−（ヒドロキシアミノ）−８−オキソオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニルプロピル］（９Ｃｌ）、オキサムフラチン、Ｄ−スレオ−Ｄ−イド（ｉｄｏ）−ウンデコ（ｕｎｄｅｃｏ）−１，６−ジエニトール，４，５，８，９−ジアンハイドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−（９Ｃｌ）、シクロ［（２Ｓ）−２−アミノ−８−オキソデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトピル−Ｌ−イソルシル−Ｄ−プロピル］（９Ｃｌ）、シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｉｅ−Ｄ−Ｐｒｏ二合体、シクロ（−Ｌ−Ａｍ７−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−）、ツバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）及びその誘導体からなるヒストンデアセチラーゼ阻害剤群から選択された阻害剤によるものであることを特徴とする、請求項１８に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項２０】
骨形成が、造骨細胞分化を促進させることによって起きることを特徴とする、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項２１】
骨形成が、アルカリフォスファターゼまたはオステオカルシンの発現等の造骨細胞マーカー遺伝子発現を増加させる活性であることを特徴とする、請求項１２に記載の骨形成を増加させる方法。
【請求項２２】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化剤を有効成分として含む骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２３】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化剤が、ＢＭＰによる骨形成経路を活性化させるヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２４】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ブタン酸、ペンタン酸、カルバマート（carbamate）、オクタンジアミド、２，４−ヘプタジエンアミド、シクロ［（αＳ，２Ｓ）−α−アミノ−η−オキソオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル］（９Ｃｌ）、シクロ［（２ｓ）−２−アミノ−８−（ヒドロキシアミノ）−８−オキソオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニルプロピル］（９Ｃｌ）、オキサムフラチン、Ｄ−スレオ−Ｄ−イド（ｉｄｏ）−ウンデコ（ｕｎｄｅｃｏ）−１，６−ジエニトール，４，５，８，９−ジアンハイドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−（９Ｃｌ）、シクロ［（２Ｓ）−２−アミノ−８−オキソデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトピル−Ｌ−イソルシル−Ｄ−プロピル］（９Ｃｌ）、シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｉｅ−Ｄ−Ｐｒｏ二合体、シクロ（−Ｌ−Ａｍ７−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−）、ツバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）及びその誘導体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２５】
破骨細胞抑制剤または破骨細胞分化抑制剤をさらに含む、請求項２２に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２６】
ＢＭＰまたはＢＭＰ生産誘導剤をさらに含んで相乗効果を示すことを特徴とする、請求項２２乃至２４のいずれか一項に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２７】
ＢＭＰ生産誘導剤が、スタチン類であることを特徴とする、請求項２６に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２８】
スタチン類が、ロバスタチン、シムバスタチン及びコムパクチン及びそれらの誘導体から選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項２９】
骨疾患が、骨粗しょう症、骨形成不全症、骨折及び歯周疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の骨疾患予防及び治療用組成物。
【請求項３０】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を有効成分として含むＲｕｎｘ２アセチル化剤。
【請求項３１】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を有効成分として含む造骨細胞分化促進剤。
【請求項３２】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を有効成分として含むオステオカルシン発現促進剤。
【請求項３３】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を有効成分として含む骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＭＰの主要標的タンパク質であるＲｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２活性を増加させることによってＢＭＰの活性を亢進させる方法に関するもので、より詳細には、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してユビキチン化による分解を抑制することでＲｕｎｘ２の安定性を高めて、ＢＭＰによる骨形成経路を活性化させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨疾患は、主に骨密度が減少して起きる疾患であり、代表的骨疾患には骨粗しょう症と歯周疾患がある。これは骨密度が減少して骨折または歯が簡単に抜ける症状を誘発する疾患であり、このような骨疾患は、高齢化が急速に進行している過程で生活の質を低下させる深刻な社会問題になっている。このような骨疾患の治療のために多くの研究が進行されている。
【０００３】
骨組織には、骨代謝に深く関与する３種の代表的な細胞、すなわち造骨細胞、破骨細胞、骨細胞が存在し、骨組織の機能と量は、造骨細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収の平衡関係によって綿密に調節される。骨粗しょう症や歯周疾患は、骨形成と骨吸収の平衡関係が維持されないで骨吸収が骨形成より増加するために起きる疾患である。
【０００４】
骨粗しょう症や歯周疾患などの骨疾患予防及び治療は、破骨細胞による骨吸収を抑制して、造骨細胞による骨形成を促進させることによってなされる。これまでに、破骨細胞の機能阻害活性を有する骨吸収抑制剤が主に開発され、破骨細胞の機能を阻害するカルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）誘導体などが、現在臨床に応用されている。しかし、前記の薬剤は、効能や薬効、投与方法及び期間などにおいて多くの問題点を有している。
【０００５】
最近では、破骨細胞の分化を抑制するＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ  ｌｉｇａｎｄ）のデコイ受容体及び抗体、破骨細胞がインテグリンを通じて骨表面に接着することを阻害するペプチド化合物、破骨細胞の骨吸収機能を阻害するｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤、ハイドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）の分解と関連した液胞型ＡＴＰａｓｅ阻害剤、骨組織内有機物の分解と関連したカテプシンＫ阻害剤の開発が活発に進行されている。
【０００６】
前記のように、破骨細胞による骨吸収抑制剤開発には多くの研究が進行されて来たが、造骨細胞による骨形成促進剤の開発に対しては、ほとんど研究されていない。現在は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、特に−２、−４、−７）やＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）が骨形成を促進する物質として知られていて、ＰＴＨが間欠的全身投与によって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）研究で骨形成を促進させる活性があるということが報告されている。ＢＭＰの場合には、全身投与によって骨形成が誘導されたという実験結果はない。しかし、ＢＭＰの発現を誘導する低分子物質であるスタチンは、生体内で骨形成を促進するということが知られていて（Ｍｕｎｄｙ等，ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第２８６（５４４６）巻，１９４６−１９４９頁）、ＢＭＰによる信号伝達体系を研究すると、生体内で骨形成因子の生産及び活性を促進させて骨形成を誘導する低分子物質の開発可能性が大きいと考えられる。
【０００７】
最近Ｒｕｎｘ２遺伝子に関する研究が非常に発展している。Ｒｕｎｘファミリーには、Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３があって、癌細胞の発達過程で重要な役割をすることが知られている。最近の研究成果によると、Ｒｕｎｘ２（Ｒｕｎｘ  Ｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）は、骨分化に深い関連があるということが明らかにされたが、造骨細胞の分化の初期表現形質であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）と後期表現形質であるオステオカルシン（ＯＣ）の発現を調節する重要な転写因子で（Ｄｕｃｙ，Ｐ．等，Ｃｅｌｌ，１９９７年，第８９巻，７４７−７５４頁；Ｍｕｎｄｌｏｓ，Ｓ．等，Ｃｅｌｌ，１９９７年，第８９巻，７７３−７７９頁；Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．等，Ｃｅｌｌ，１９９７年，第８９巻，７５５−７６４頁；Ｏｔｔｏ，Ｆ．等，Ｃｅｌｌ，１９９７年，第８９巻，７６５−７７１頁）、前記Ｒｕｎｘ２の発現は、ＢＭＰによって活性化になった信号伝達媒体であるＳｍａｄｓ（Ａｖａｎｔａｇｇｉａｔｉ，Ｍ．Ｌ．等，Ｃｅｌｌ，１９９７年，第８９巻，１１７５−１１８４頁；Ｈａｎａｉ，Ｊ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９年，第２７４巻，３１５７７−３１５８２頁；Ｊｉｎ，Ｙ．Ｈ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，２９４０９−２９４１７頁）によって調節されることが知られている（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，８７８３−８７９２頁）。また、Ｓｍｕｒｆ１（Ｓｍａｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １）がユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）媒介されたＲｕｎｘ２のタンパク質分解の原因分子であり、造骨細胞の前駆細胞でＳｍｕｒｆ１が過発現されると、ＢＭＰによる信号伝達と造骨細胞の分化を阻害することが報告されている（Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，１２８５４−１２８５９頁；Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，２７９３９−２７９４４頁）。
【０００８】
以上のことに鑑みて、本発明者は、ＢＭＰによるＲｕｎｘ２の調節メカニズムを明らかにすると、骨形成を促進する物質を捜し出すことができると判断して研究した結果、ＢＭＰがＲｕｎｘ２のアセチル化を増加させることによって、Ｓｍｕｒｆ１によってＲｕｎｘ２が分解されることを抑制して、骨細胞の分化を促進することを明らかにして、ＢＭＰによるＲｕｎｘ２のアセチル化を増加させる薬物、すなわちヒストンデアセチラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、ＨＤＡＣ）阻害剤を使用してＲｕｎｘ２の分解を抑制すると、骨形成を促進することができることを確認することによって本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、Ｒｕｎｘ２をアセチル化して安定化できる方法を提供することにより、骨形成促進によって、骨粗しょう症、骨形成不全症、歯周疾患、骨折などの骨疾患の予防及び治療を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の目的を達成するために、本発明は、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２活性を増加させる方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２による骨形成を増加させる方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ＢＭＰ−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）の機能を亢進させる、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むＲｕｎｘ２アセチル化剤を提供する。
【００１３】
また、本発明は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化剤を有効成分として含む、骨疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００１４】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１５】
本発明は、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してＲｕｎｘ２活性を増加させる方法を提供する。
【００１６】
Ｒｕｎｘ２は、骨生成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）の調節子として骨−特異的な（ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）遺伝子の発現調節において重要な物質である。このようなＲｕｎｘ２は、様々な信号伝達経路によって調節され、その中には骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）が媒介する信号伝達経路も含まれている。ＢＭＰは、ＳｍａｄのＲｕｎｘ２との結合を誘導して骨成長を促進して骨形成を誘導する。
【００１７】
Ｒｕｎｘ２は、ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）経路によってリン酸化されて活性化する。この経路は、ＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）、ＢＭＰのような骨形成因子、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）のようなホルモンなどによって刺激される。
【００１８】
リジン残基で起きるタンパク質ユビキチン化（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）は、基質選択及び引き継いで起きるプロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）による分解において、重要な役割をする。Ｒｕｎｘ２は、Ｓｍｕｒｆ１（ｓｍａｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  １）が媒介したユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）によって分解される。Ｓｍｕｒｆ１が、過発現すると、Ｒｕｎｘ２が分解されて、それによりＢＭＰ−２による信号伝達が遮断されて造骨細胞分化が抑制される。
【００１９】
今まで、前記のような事実以外に、Ｒｕｎｘ２タンパク質が詳細にはどんな分子的機序によって調節されるのかは、知られていなかったが、本発明者はこのような信号伝達がＲｕｎｘ２のアセチル化によるものであることを明らかにした。本発明者は、Ｒｕｎｘ２がＢＭＰ信号伝達経路の主要ターゲットであり、ＢＭＰがＲｕｎｘ２の転写レベルを調節することを確認し（Ｌｅｅ  Ｋ．Ｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，８７８３−８７９頁）、さらにＲｕｎｘ２の翻訳後（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）レベルにもＢＭＰが関与するのかを調査した。詳細には、ＢＭＰ−２の存在または不在下において、多能性幹細胞をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させた後、抗−ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロットを実施した。その結果、ＢＭＰ−２を処理した方でＲｕｎｘ２タンパク質量がより多く現れることを観察した（図１）。この結果から、ＢＭＰ−２が翻訳後の段階でＲｕｎｘ２を調節することを確認した。前記結果を検証するために、ＢＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＢＭＰＲ１）の量を増加させながらＨＡ−標識Ｒｕｎｘ２を一緒に発現させた結果、ＢＭＰＲ１の量に比例してＲｕｎｘ２の発現が増加され（図２）、Ｒｕｎｘ２の半減期は、ＢＭＰＲ１の存在時は１２時間であるのに対し、ＢＭＰＲ１の不在時はわずか２時間であった（図３）。前記結果は、ＢＭＰ信号伝達体系によるＲｕｎｘ２のアップレギュレーション（up-regulation）は、Ｒｕｎｘ２の半減期の増加によるものであることを示す。
【００２０】
本発明者は、ＢＭＰが転写を介してＲｕｎｘ２が増加するのかを調べるためのＲＴ−ＰＣＲ実験で、内在性のＲｕｎｘ２  ｍＲＮＡは増加したが、外部から導入したＲｕｎｘ２の量は変化しないことを確認した（図４）。これは、ＢＭＰ−２による外来Ｒｕｎｘ２の蓄積は、転写とは無関係でタンパク質の安定性に起因するということを示す。本発明者は、Ｒｕｎｘ２がユビキチン−プロテオソーム（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）経路によって分解され、ＢＭＰ−２によって誘導されたＲｕｎｘ２のアセチル化がＲｕｎｘ２を安定化させたのかを確認した。詳細には、ＢＭＰ−２の存在または不在下でＣ２Ｃ１２細胞をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させて、抗−アセチル−リジン抗体で免疫沈降して抗−Ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットすることでＲｕｎｘ２のアセチル化を確認した［リジン（Ｌｙｓ）は、Ｒｕｎｘ２内でアセチル化が起きる残基である］。その結果、ＢＭＰ−２が存在時にウエスタンブロットでバンドが確認されたが（図５）、これはＲｕｎｘ２がＢＭＰ−２処理によってアセチル化されるということを示す。
【００２１】
ｐ３００タンパク質の第一の機能は、Ｅ２Ｆ１、ｐ５３  Ｓｍａｄｓ、ＢＲＣＡ１及びＲｕｎｘ２などを含む多数の核タンパク質の転写のためのコアクチベーター（ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）である。ｐ３００は、ＨＡＴ（Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）として機能し、ヒストンテール上でのリジン残基特異的なアセチル化は、負電荷を中和し、転写因子にとってよりアクセスしやすいクロマチン構造を生じさせると信じられている。ｐ３００はまた、多数の非ヒストンタンパク質をアセチル化することができる。例えば、ｐ３００は、Ｅ２Ｆ１の機能領域をアセチル化してＤＮＡ結合能を増加させてタンパク質半減期を増加させる。また、Ｅ２Ｆ１のアセチル化は、ヒストン脱アセチル化酵素−１（ＨＤＡＣ−１、ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ−１）によって脱アセチル化され、脱アセチル化によって半減期が増加すると、タンパク質をユビキチン化から保護することができる。なぜなら、アセチル化とユビキチン化はリジン残基で起こるからである。本発明者は、ｐ３００がＳＭＡＤ、Ｒｕｎｘ２と結合し（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｉ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８年，第１７巻，２９９４−３００４頁；Ｓｈｅｎ，Ｘ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１９９８年，第９巻，３３０９−３３１９頁）、Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ３をアセチル化させるので（Ｇｒｏｎｒｏｏｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２年，第１０巻，４８３−４９３頁；Ｊｉｎ  Ｙ．Ｈ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，２９４０９−２９４１頁；Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｉ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８年，第１７巻，２９９４−３００４頁）Ｒｕｎｘ２が、ｐ３００によってもアセチル化されるのかを確認した。より詳細には、ＢＭＰ−２の代わりにｐ３００を処理して前記のような方法で実験した結果、ｐ３００の存在時にウエスタンブロットでバンドが確認されたので、Ｒｕｎｘ２はｐ３００によってアセチル化されたことが分かり、また、ＢＭＰによってｐ３００を介したＲｕｎｘ２アセチル化が増加されたことが分かる（図５）。同様に、ＢＭＰＲ１単独で、またはｐ３００と一緒にＲｕｎｘ２アセチル化を増加させてタンパク質を蓄積させた（図６）。前記結果は、一定量のＲｕｎｘ２とｐ３００の量を増やして形質導入した時、ｐ３００の量が増えるにつれてＲｕｎｘ２のアセチル化とタンパク質レベルが増加する実験結果から検証された（図７）。前記結果によって、ＢＭＰ信号伝達経路でｐ３００によるＲｕｎｘ２アセチル化が、Ｒｕｎｘ２タンパク質蓄積を起こすということを確認した。
【００２２】
一方、Ｒｕｎｘ２は、１０個のリジン残基があり（図２２）、Ｒｕｎｘ２の中間部位に７個のリジン残基を含み、Ｃ−末端に２個の残基を有している。Ｒｕｎｘ２のどの部位のリジン残基がアセチル化するのかを確認するために、Ｒｕｎｘ２欠失変異体Ｒｕｎｘ２−ＫＲをｐ３００と一緒に発現させて抗アセチルリジン抗体で免疫沈降させた結果、Ｃ−末端が中間部位よりさらに多くアセチル化されたことを確認した（図９）。より詳細には、リジンをアルギニンで置換した変異体を使用して実験した結果では、配列番号１で表されるＲｕｎｘ２アミノ酸配列の２２５、２３０、３５０及び３５１番目のリジンが、ｐ３００のアセチル化活性に対する主要ターゲットであることを明らかにした（図１０）。また、Ｒｕｎｘ２の半減期は約２時間であるが、ｐ３００と一緒に発現させると非常に安定する一方、２２５、２３０、３５０、３５１番目リジンが欠失した変異体Ｒｕｎｘ２−ＫＲ２２５、２３０、３５０及び３５１は、ｐ３００がなくても非常に安定だった（図１１）。このような結果は、Ｒｕｎｘ２のリジン残基が変異されなければ分解に非常に敏感であるが、変異するとＲｕｎｘ２が分解されることを防止することができるということを示す。
【００２３】
Ｓｍｕｒｆ１は、Ｒｕｎｘ２のユビキチンリガーゼでＲｕｎｘ２を認識してプロテオソームによって分解されるようにするので（Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，１２５８４−１２５８９頁；Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，２７９３９−２７９４４頁）Ｓｍｕｒｆ１を過発現させるとＲｕｎｘ２は早く分解されるが（図１２）、ｐ３００を追加して発現させると、Ｓｍｕｒｆ１−媒介Ｒｕｎｘ２分解が相殺される。一方、Ｒｕｎｘ２−ＫＲ２２５、２３０、３５０及び３５１変異体は、Ｓｍｕｒｆ１媒介分解によって分解されない。本発明者は、Ｒｕｎｘ２のＰＰｘＹがＳｍｕｒｆ１のＷＷドメインと反応するので（Ｏｔｔｅ，Ｌ．等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２００３年，第１２巻，４９１−５００頁）（図２２）、ＰＰｘＹが欠失されたＲｕｎｘ２−ｄｅｌ−４１５−４１８と４１５のプロリンをアルギニンに置換した変異体Ｒｕｎｘ２−Ｐ４１５Ｒを作って実験した結果、Ｒｕｎｘ２−ｄｅｌ−４１５−４１８とＲｕｎｘ２−Ｐ４１５Ｒが非常に安定したこと、すなわちＳｍｕｒｆ１によって分解されないことを確認した（半減期２４時間以上）（図１１）。前記結果から２２５、２３０、３５０及び３５１番目リジンが、ｐ３００媒介アセチル化及びＳｍｕｒｆ１媒介ユビキチン化の標的であることを確認した。すなわち、Ｒｕｎｘ２がアセチル化されると、Ｒｕｎｘ２内のリジン残基を認識することができないのでＳｍｕｒｆ１によるＲｕｎｘ２分解が抑制される。
【００２４】
Ｒｕｎｘ２アセチル化レベルは、アセチル化と脱アセチル化間の動的平衡（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）によって決定する。したがって、脱アセチル化を抑制すると、Ｒｕｎｘ２アセチル化が増加するはずなので、大部分のタンパク質を脱アセチル化させるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤をＲｕｎｘ２に処理した。詳細にはは、ＨＤＡＣ阻害剤をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させたＣ２Ｃ１２細胞にコマツ等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１年，第６１巻，４４５９−４４６６頁）の方法によって処理した。その結果、前記ＨＤＡＣ阻害剤を処理したＣ２Ｃ１２細胞は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化が増加した（図１３参照）。前記のように脱アセチル化を抑制するとアセチル化が増加したことは、Ｒｕｎｘ２アセチル化／脱アセチル化が可逆的な過程で、ＨＤＡＣがＲｕｎｘ２脱アセチル化に生理学的イフェクターとして作用することができるということを示す。それだけではなく、Ｒｕｎｘ２と結合して転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を起こすＴＧＦ−ベータ反応因子が挿入されたＴβＲＥルシフェラーゼリポーター（ＴβＲＥ−ｌｕｃ）プラスミドで実験した結果、ＨＤＡＣ阻害剤処理時リポーター遺伝子の活性が促進される結果が観察された。これは、ＨＤＡＣ阻害剤によってＲｕｎｘ２の転写活性が増加することを示すものである（図１６）。
【００２５】
一方、本発明者は、ヒストンデアセチラーゼが実際にＲｕｎｘ２を脱アセチル化させるかどうかを調べるために、Ｒｕｎｘ２と多様なヒストンデアセチラーゼを共形質導入した実験を実施した結果、図１４に示したように、ヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）と５（ＨＤＡＣ５）がＲｕｎｘ２と結合して、図１５に示したように、ヒストンデアセチラーゼ４と５がＲｕｎｘ２を脱アセチル化させることを確認した。
【００２６】
本発明者は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化が、Ｒｕｎｘ２の転写活性を増加させるかどうかを調べるために、ＴＧＦ−ベータ反応因子ルシフェラーゼ（ＴβＲＥ−Ｌｕｃ）リポータープラスミドとＲｕｎｘ２発現プラスミドを２９３細胞で一緒に発現させてＨＤＡＣ阻害剤を細胞に処理した後、ルシフェラーゼの量を測定した結果、ＨＤＡＣ阻害剤によってリポーター遺伝子の活性が増加することを発見した（図１６）。これは、Ｒｕｎｘ２脱アセチル化が抑制されるとＲｕｎｘ２のアセチル化が増加してＲｕｎｘ２の転写活性が増加するということを示すものである。
【００２７】
本発明者は、Ｒｕｎｘ２の転写活性増加が、タンパク質の量が増加するためまたはタンパク質がアセチル化された結果であるということを証明するために、ｐ３００がない状態でＲｕｎｘ２及びＲｕｎｘ２−ＫＲ変異体の転写活性を測定した。その結果、ｐ３００によって標的になるリジン残基を変異させるとＲｕｎｘ２の転写活性が非常に減少し（図１７）、さらにｐ３００は、変異Ｒｕｎｘ２タンパク質の活性を増加させることができなかった。このような結果は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化はＲｕｎｘ２の安定化のために必要であるだけではなく、Ｒｕｎｘ２の転写活性のためにも必要であることを示す。
【００２８】
また、本発明は、Ｒｕｎｘ２をアセチル化してＢＭＰの活性を亢進させることによって骨形成を増加させる方法を提供する。
【００２９】
本発明者は、Ｒｕｎｘ２で形質転換された多能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）に、ＨＤＡＣ阻害剤を処理した後、活性染色法で観察した結果、造骨細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼの活性が増加することを確認し（図１８）、骨形成後期誘導物質であるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣ）遺伝子のプローモーターを挿入したルシフェラーゼリポータープラスミドで実験した結果、ＨＤＡＣ阻害剤処理時にＯＣプローモーターの活性が増加することを確認した（図１９参照）。オステオカルシン遺伝子自体の発現を調べるＲＴ−ＰＣＲ実験でも、ＨＤＡＣ阻害剤処理時にオステオカルシンｍＲＮＡの発現量が増加することから、前記のＯＣプローモーター活性増加結果と一致することを確認した（図２０参照）。マウスにＨＤＡＣ阻害剤を皮下注射した後、組織染色法で生体内骨形成誘導有無を確認した結果でも、図２２のようにＨＤＡＣ阻害剤が実際に生体内に骨組織を形成するということを確認した。
【００３０】
前記のようにＨＤＡＣ阻害剤を処理した場合、Ｒｕｎｘ２のアセチル化とＲｕｎｘ２の転写活性が増加した結果、下記のような直接的な骨形成誘導効果が現れることを確認した。
【００３１】
また、本発明は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化剤を有効成分として含む骨疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００３２】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化を活性化させる物質は、すべて本発明の範囲に属し、好ましくは脱アセチル化酵素阻害剤である。
【００３３】
Ｒｕｎｘ２のアセチル化は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）経路によって促進されるので、ＢＭＰまたはＢＭＰ生産誘導剤を処理する時もアセチル化増加効果がある（図５）。それのみならず、Ｒｕｎｘ２のアセチル化は、ｐ３００（ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＨＤＡＣ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）によってアセチル化と脱アセチル化が調節される動的平衡を成している。したがって、ｐ３００とＢＭＰ−２によってアセチル化されるのみならず、ＨＤＡＣ阻害剤によって脱アセチル化が抑制されることで、Ｒｕｎｘ２のアセチル化が増加する。それとともに、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ生産誘導剤とＨＤＡＣ阻害剤を併用して処理すると、ＢＭＰ−２によってアセチル化が促進されてＨＤＡＣ阻害剤によって脱アセチル化が抑制され、ＨＤＡＣ阻害剤を単独で処理するよりＲｕｎｘ２のアセチル化を増加させる。実際に、本発明の実験の結果、アセチル転移酵素（ｐ３００）処理によってＲｕｎｘ２のアセチル化がさらに増加した。ＢＭＰ生産誘導剤の例としては、スタチン類化合物であるロバスタチン（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、シムバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、コンパクチン（Ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）があるがこれに限定されない。
【００３４】
また、ＨＤＡＣ阻害剤を処理した場合、骨形成初期誘導物質であるアルカリフォスファターゼの活性が増加し（図１８）、オステオカルシン遺伝子のプローモーターでリポーターアッセイを実施したりオステオカルシン遺伝子発現を確認するＲＴ−ＰＣＲ実験でも、ＨＤＡＣ阻害剤処理時のプローモーターの活性が増加及び遺伝子発現を確認した（図１９及び図２０）。それとともに、マウスにＨＤＡＣ阻害剤注入時に骨形成が促進されることも確認した（図２２）。
【００３５】
したがって、前記成分を有効成分として含む組成物は、骨疾患予防及び治療剤に使用することができる。
【００３６】
また、本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤とＢＭＰまたはＨＤＡＣ阻害剤とＢＭＰ生成促進剤との併用によって、相乗効果を示すことを特徴とする骨疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００３７】
前記のように、Ｒｕｎｘ２のアセチル化は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）経路によって促進され、ＨＤＡＣ（ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）によってアセチル化と脱アセチル化が調節される動的平衡を成している。したがって、ＢＭＰまたはＢＭＰ生産誘導剤とＨＤＡＣ阻害剤を併用して処理すると、ＢＭＰによってアセチル化が促進されてＨＤＡＣ阻害剤によって脱アセチル化が抑制され、ＨＤＡＣ阻害剤を単独で処理するよりＲｕｎｘ２のアセチル化を増加させるようになる。ＢＭＰ生成促進剤には、前記のようなスタチン類がある。
【００３８】
また、本発明は、追加で破骨細胞抑制剤または破骨細胞分化抑制剤とＲｕｎｘ２アセチル化剤（ＨＤＡＣ阻害剤）の併用による、骨疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００３９】
骨組織には、造骨細胞、破骨細胞、骨細胞が存在し、骨粗しょう症や歯周疾患などの骨疾患予防及び治療は、破骨細胞による骨吸収を抑制して、造骨細胞による骨形成を促進させることによって成り立つ。破骨細胞抑制剤には、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビスホスホネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）誘導体など、市販されている製品とともに、破骨細胞の分化を抑制するＲＡＮＫＬのデコイ受容体やＲＡＮＫＬの抗体、破骨細胞のインテグリンを通じた骨表面への接着を阻害するペプチド化合物、破骨細胞の骨吸収機能を阻害するｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ阻害剤、ハイドロキシアパタイトの分解と関連した液胞型ＡＴＰａｓｅ阻害剤、骨組織の主要有機物の分解と関連したカテプシンＫ阻害剤などをあげることができる。したがって、本発明のＨＤＡＣ阻害剤と前記破骨細胞抑制剤を平行使用すれば、高い骨疾患治療効果を得ることができる。
【００４０】
ＨＤＡＣ阻害剤の単独使用の場合の有効濃度は、１０ｎＭ〜１０μＭであり、好ましくは５０ｎＭ〜１μＭである。前記ＨＤＡＣ阻害剤とＢＭＰ−２、破骨細胞抑制剤またはスタチン類を併用して使用する場合、１０ｎＭ〜５００ｎＭで効果を得ることができる。ここで、前記有効成分の有効濃度が前記範囲より低い場合には、本発明による相乗効果を得ることができないので好ましくない。
【００４１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤は、下記化学式（１〜１４）で表される化合物またはその誘導体を有効成分として含む薬剤学的組成物であることを特徴とする。
【００４２】
＜式１＞
【化１】
2008523138.tif 000003
【００４３】
一般式：Ｃ４Ｈ８Ｏ２
ＣＡ索引名：ブタン酸（Ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（９Ｃｌ））
別称：ブチルサン（６Ｃｌ、７Ｃｌ、８Ｃｌ）；１−プロパンカルボキシル酸；エチル酢酸；ハニーラバー（ｈｏｎｅｙ  ｒｏｂｂｅｒ）；ＮＳＣ８４１５；プロピルホルム酸；ｎ−ブタン酸；ｎ−ブチル酸
【００４４】
＜式２＞
【化２】
2008523138.tif 000004
【００４５】
一般式：Ｃ８Ｈ１６Ｏ２
ＣＡ索引名：ペンタン酸（ｐｅｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、２−プロピル−（９Ｃｌ）
別称：バルブロ酸、バレル酸、２−プロピル−（６Ｃｌ，７Ｃｌ，８Ｃｌ）；２−プロピルペンタン酸；２−プロピルバレル酸；４−ヘプタンカルボキシル酸；４４０８９；酢酸、ジプロピル−；ＤＰＡ；デパキン（ｄｅｐａｋｉｎｅ）；ジプロピル酢酸；エルゲニル（ｅｒｇｅｎｙｌ）；ミルプロイン（ｍｙｌｐｒｏｉｎ）；ＮＳＣ９３８１９；ｎ−ジプロピル酢酸
【００４６】
＜式３＞
【化３】
2008523138.tif 000005
【００４７】
一般式：Ｃ２１Ｈ２０Ｎ４Ｏ３
ＣＡ索引名：カルバン酸、［［４−［［（２−アミノ−フェニル）アミノ］カルボニル］フェニル］メチル］−、３−ピリジンメチルエステル（９Ｃｌ）
別称：ＭＳ２７−２７５；ＭＳ２７５；ＭＳ２７５−２７
【００４８】
＜式４＞
【化４】
2008523138.tif 000006
【００４９】
一般式：Ｃ１４Ｈ２０Ｎ２Ｏ３
ＣＡ索引名：オクタンジアミド、Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ’−フェニル−（９Ｃｌ）
別称：ＳＡＨＡ；スベロイルアニリドヒドロキサム酸（Ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）
【００５０】
＜式５＞
【化５】
2008523138.tif 000007
【００５１】
一般式：Ｃ１７Ｈ２２Ｎ２Ｏ３
ＣＡ索引名：２，４−ヘプタジエンアミド、７−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−、（２Ｅ，４Ｅ，６Ｒ）−（９Ｃｌ）
別称：２，４−ヘプタジエンアミド、７−［４−（ジメチルアミノ−）フェニル］−Ｎ−ヒドロキシ−４，６−ジメチル−７−オキソ−、［Ｒ−（Ｅ，Ｅ）］−；（Ｒ）−トリコスタチンＡ；ＴＳＡ；トリコスタチンＡ
【００５２】
＜式６＞
【化６】
2008523138.tif 000008
【００５３】
一般式：Ｃ３３Ｈ４０Ｎ４Ｏ６
ＣＡ索引名：シクロ［（αＳ，２Ｓ）−α−アミノ−η−オキソオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル］（９Ｃｌ）
別称：シクロ（η−オキソ−Ｌ−α−アミノオキシランオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−プロリル）、（Ｓ）−；ピロロ［１，２−ａ］［１，４，７，１０］テトラアザシクロドデシン、サイクリックペプチド誘導体；ＲＦ１０２３Ｂ；トラポキシンＢ
【００５４】
＜式７＞
【化７】
2008523138.tif 000009
【００５５】
ＣＨＡＰ３１  Ｒ＝ＣＨ２
ＣＨＡＰ５０  Ｒ＝Ｃ２Ｈ４
一般式：Ｃ３１Ｈ３９Ｎ５Ｏ６
ＣＡ索引名：シクロ［（２Ｓ）−２−アミノ−８−（ヒドロキシアミノ−）−８−オキソオクタノイル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニルプロピル］（９Ｃｌ）
ＣＨＡＰ３１
シクロ（−Ｌ−Ａｓｕ（ＮＨＯＨ）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−）
ＣＨＡＰ５０
シクロ（−Ｌ−Ａｓｕ（ＮＨＯＨ）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｉｐ−）
別称：ＣＨＡＰ
【００５６】
＜式８＞
【化８】
2008523138.tif 000010
【００５７】
ＦＫ２２８
【００５８】
＜式９＞
【化９】
2008523138.tif 000011
【００５９】
オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）
【００６０】
＜式１０＞
【化１０】
2008523138.tif 000012
【００６１】
一般式：Ｃ１１Ｈ１６Ｏ４
ＣＡ索引名：Ｄ−スレオ−Ｄ−イド（ｉｄｏ）−ウンデコ（ｕｎｄｅｃｏ）−１，６−ジエニトール，４，５：８，９−ジアンハイドロ−１，２，６，７，１１−ペンタデオキシ−（９Ｃｌ）
別称：（−）−デプデシン；デプデシン（ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）
【００６２】
＜式１１＞
【化１１】
2008523138.tif 000013
【００６３】
一般式：Ｃ３３Ｈ４７Ｎ５Ｏ６
ＣＡ索引名：シクロ［（２Ｓ）−２−アミノ−８−オキソデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトピル−Ｌ−イソルシル−Ｄ−プロピル］（９Ｃｌ）
別称：シクロ（８−オキソ−Ｌ−２−アミノデカノイル−１−メトキシ−Ｌ−トリプトピル−Ｌ−イソルシル−Ｄ−プロピル）；アピシジンＢ；アピシジンｌｂ
【００６４】
＜式１２＞
【化１２】
2008523138.tif 000014
【００６５】
ＳＣＯＰ３０４
一般式：
ＣＡ索引名：シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ）二合体
別称：化合物７（Ｎｉｓｈｉｎｏ等，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第５（２６）巻，５０７９−５０８２頁）
下記のような誘導体も類似の活性を有する。
シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｐｒｏ）二合体（誘導体ａ）
シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｉｐ）二合体（誘導体ｂ）
シクロ（Ｌ−Ａｍ７（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｐｉｐ）二合体（誘導体ｃ）
シクロ（Ｌ−Ａｍ６（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ）二合体（誘導体ｄ）
シクロ（Ｌ−Ａｍ８（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ）二合体（誘導体ｅ）
シクロ（Ｌ−Ａｍ９（−）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ）二合体（誘導体ｆ）
これらの物質の構造は、次の論文に報告されている（Ｎｉｓｈｉｎｏ等，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第５（２６）巻，５０７９−５０８２頁）。
【００６６】
＜式１３＞
【化１３】
2008523138.tif 000015
【００６７】
ＳＣＯＰ１５２［シクロ（−Ｌ−Ａｍ７−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｄ−Ｐｒｏ−）］及びその誘導体
【００６８】
＜式１４＞
【化１４】
2008523138.tif 000016
【００６９】
ツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）
【００７０】
本発明による前記化学式（１〜１４）で表される化合物またはその誘導体は、Ｃ２Ｃ１２細胞においてＢＭＰによるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性とオステオカルシン（ＯＣ）のタンパク質発現を強力に促進させて、動物実験で骨形成を誘導することにより、臨床的に有用な骨形成促進物質として、骨粗しょう症や歯周疾患などの治療剤として有用に応用することができる。
【００７１】
本発明のＨＤＡＣ阻害剤を有効成分として含む製薬組成物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００７２】
本発明の組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に、追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希薄剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当該分野の適正な方法でまたはレミントン薬剤学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を利用して各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。
【００７３】
本発明の組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）できて、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。一回投与量は、ＨＤＡＣ阻害剤の化合物が約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、ひと月に一回または数回投与するのがさらに好ましい。
【００７４】
本発明の組成物は、骨粗しょう症、歯周疾患などを含む骨疾患の予防及び治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７５】
以下、本発明を下記実施例によって見て詳しく説明する。
【００７６】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞細胞培養及びプラスミド製作
＜１−１＞細胞培養
すべての細胞培養培地と抗体は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７７２）、２９３細胞は１０％牛胎児血清、抗生剤及び抗−マイコティックス（ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃｓ）を含むＤＭＥＭで５％ＣＯ２、３７℃で培養した。Ｈ１−１２７−２１−２細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を含むアルファ−ＭＥＭで培養した。
＜１−２＞プラスミドと抗体
ＭｙｃまたはＨＡ−標識された全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）Ｒｕｎｘ２（配列番号２）を挿入して、ＣＭＶプロモーターから誘導された哺乳類発現ベクターｐＣＳ４−３ＭｙｃとｐＣＳ４−３ＨＡを製作した（Ｊｉｎ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，２９４０９−１７頁；Ｏｇａｗａ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  米国，１９９３年，第９０巻，６８５９−６３頁）。Ｒｕｎｘ２アセチル化に影響を及ぼす突然変異は、ＰＣＲで導入して（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ等，ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｑｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０年）ｐＣＳ４−３Ｍｙｃベクターにクローニングした。ＢＭＰｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＢＭＰＲ１）発現プラスミドとＨＡ−ｐ３００発現ベクターであるｐｃＤＭＡ３．１ＨＡ−ｐ３００は、Ｍ．Ｅｗｅｎ（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ）から提供を受けた（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９４年，第８巻，８６９−８４頁）。ｍｙｃ−ＨＤＡＣ発現プラスミドは、ｐＣＳ４−３Ｍｙｃにクローニングした。ルシフェラーゼリポータープラスミドｐＧＬ３−ＴｂＲＥは、二つのコピーのＴｂＲＥ（兔疫グロブリンＣａプローモーターに由来）を含んでいる（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，８７８３−８７９２頁；ｐＧＬ３は、Ｐｒｏｍｅｇａ製品）。ラットオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）の−１０５０／＋２３部位をｐＧＬ２−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングしたｐＧＬ２１０５０  ＯＣ−ｌｕｃ（Ｈｏｆｆａｍａｎｎ等，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００年，第８０巻，１５６−６８頁）は、Ｄｒ．Ｌｉａｎから譲り受けた（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ０１６５５，米国）。
【００７７】
野生型及び突然変異ＯＳＥ部位［ＯＣプローモーター部位（−２０８／＋２３）のＲｕｎｘ２結合部位Ｃ］は、以前論文に記述された（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，３１９−３２６頁）。本発明では、アセチル−リジンに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＨＡ（１２ＣＡ５、Ｒｏｃｈｅ）を使用した。
＜実施例２＞リポーター分析及び免疫ブロット
＜２−１＞形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
２９３細胞は、カルシウムフォスファート方法で形質導入を遂行し、Ｃ２Ｃ１２細胞株とＲｕｎｘ２（−／−）マウス頭蓋骨（ｃａｌｖａｒｉａ）から製造されたＨ１−１２７−２１−２細胞株（Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，８７８３−８７９２頁）は、リポフェクタミンプラス試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＰＬＵＳ  ＲＥＡＧＥＮＴ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、製造者の指示事項にしたがって形質導入を遂行した。
＜２−２＞リポーター分析（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ）
ルシフェラーゼ分析のために、細胞を形質転換一日前に２４ウェルプレートにプレーティングして、細胞はルシフェラーゼリポータープラスミドと多様なＲｕｎｘ２コンストラクトで共形質導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。形質導入３６時間後に細胞を回収してルミノメーター（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を利用して細胞破砕液でルシフェラーゼリポーター分析キット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の製造者指示事項にしたがって、ルシフェラーゼとベータ−ガラクトシダーゼ活性検査を実施した。ｐＣＭＶｂｅｔａ−Ｇａｌ（ｂｅｔａ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）プラスミドは、形質転換効率確認のための対照群に使用した。
＜実施例３＞免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）と免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
形質導入後に、Ｃ２Ｃ１２と２９３細胞を氷で冷やした細胞溶解緩衝溶液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．２５％Ｎａ  デオキシコール酸、１０％グリセロール、２５ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２５０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０ｍｇ／ｍｌ  レウペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン）で破砕して遠心分離後、上澄み液を回収した。これを各々の実験に適合する１次及び２次抗体とタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ−セファロースビード（Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を利用して４時間免疫沈降を実施した。すべての定温放置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、４℃で実施した。セファロースビードを洗浄した後、ビッドに結合しているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰＤＶＦ膜に移動させた。最後に、各々の実験に適合する抗体と定温放置して洗浄した後、西洋わさび過酸化酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体と定温放置した。洗浄後、反応タンパク質をＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で可視化した。
【００７８】
ＨＤＡＣ阻害剤処理時には、Ｃ２Ｃ１２細胞または２９３細胞を形質転換させた後、一日の間新鮮な培地で培養して、表示された濃度の阻害剤（トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＣＨＡＰ、及びＳＣＯＰ）などを１６時間、各々コマツ等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１年，第６１巻，４４５９−４４６６頁）とニシノ等（Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｎ．等，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第５巻，５０７９−５０８２頁）の方法にしたがって処理した。
＜実施例４＞ＢＭＰ−２によるＲｕｎｘ２のアセチル化関与度の測定
＜４−１＞ＢＭＰ−２によるＲｕｎｘ２タンパク質の安定性増加確認
本発明者は、Ｒｕｎｘ２がＢＭＰ−２信号伝達経路の主要ターゲットで、ＢＭＰ−２がＲｕｎｘ２の転写レベルを調節するので（Ｌｅｅ  Ｋ．Ｓ．等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０００年、第２０巻，８７８３−８７９頁）Ｒｕｎｘ２の転写の後レベルにもＢＭＰ−２が関与するのかを確認してみた。詳細には、ＢＭＰ−２を３００ｎｇ／ｌ添加するか添加しない状態で、Ｃ２Ｃ１２多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させた後、抗−ｍｙｃ抗体を利用してウエスタンブロットを実施した。その結果、ＢＭＰ−２処理した方でＲｕｎｘ２のタンパク質量がずっと多く現れた（図１）。前記結果は、ＨＡ標識されたＲｕｎｘ２とＢＭＰ受容体１（ＢＭＰＲ１）の量を０、０．２５、０．５、１、２μｇに漸次増加させながら一緒に発現させた結果、ＢＭＰＲ１の量に比例してＲｕｎｘ２の発現が増加することを通じて検証された（図２）。また、ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で２９３細胞を形質転換させてタンパク質合成抑制剤であるシクロヘキサミド（ＣＨＸ）４０μｇ／ｍｌを処理した後、ＢＭＰＲ１を入れるか入れないで、０、２、４、６、８、１２時間後、ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットを実施した結果、Ｒｕｎｘ２の半減期は、１２時間、ＢＭＰＲ１を入れなかった時は２時間であった（図３）。形質転換されたＲｕｎｘ２遺伝子のＢＭＰ−２媒介転写活性の効果を排除するために、本発明者は、ＢＭＰ−２が転写を活性化させてＲｕｎｘ２が増加するのかを調べるため、定量的なＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。詳細には、２９３細胞をｐ３００で形質転換させたりＢＭＰ−２を処理したりした後、Ｒｕｎｘ２の発現レベルを詳しく調べた。耐性のＲｕｎｘ２は、配列番号３と４で表されるプライマーを利用し、外来のＲｕｎｘ２は、配列番号５と６で表されるプライマーを利用して下記のように定量的なＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、タカラ社）を使用し、プライマー対と鋳型を９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で１分間反復して反応させ、２５回反応後から３０回まで反応液の１／２０を取ってアガロースゲル電気泳動方法で分析した。その結果、内因性のＲｕｎｘ２ｍＲＮＡ量は増加したが、外部から導入したＲｕｎｘ２ｍＲＮＡ量は変化がないことを確認した（図４）。これは、外部から導入したＲｕｎｘ２タンパク質のＢＭＰ−２による蓄積は、転写増加とは無関係でタンパク質安定性増加と関連あることを示す。
＜４−２＞ＢＭＰ−２によるＲｕｎｘ２アセチル化確認
本発明者は、Ｒｕｎｘ２がユビキチン−プロテオソーム（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｅ−ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）経路によって分解されて、アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）が前記ユビキチン化を抑制することにより、ＢＭＰ−２がＲｕｎｘ２のアセチル化を誘発してＲｕｎｘ２を安定化させたのかを確認した。詳細には、ＢＭＰ−２とｐ３００の存在または不在下でＣ２Ｃ１２細胞をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させて抗−アセチル−リジン抗体で免疫沈降して、抗−Ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットすることによってＲｕｎｘ２のアセチル化を確認した（リジン（Ｌｙｓ）は、Ｒｕｎｘ２内でアセチル化が起きる残基である）。その結果、ＢＭＰ−２またはｐ３００が存在する時のみウエスタンブロットでバンドが確認され、ＢＭＰ−２とｐ３００が一緒に存在する時、さらに強いバンドが確認された（図５）。これは、Ｒｕｎｘ２が、ＢＭＰ−２処理によってｐ３００によるアセチル化が促進されるということを示す。
＜実施例５＞ｐ３００によるＲｕｎｘ２アセチル化確認
本発明者は、ｐ３００がＳＭＡＤ、Ｒｕｎｘ２と結合して（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｉ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８年，第１７巻，２９９４−３００４頁；Ｓｈｅｎ，Ｘ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１９９８年，第９巻，３３０９−３３１９頁）Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ３をアセチル化させるので（Ｇｒｏｎｒｏｏｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２年，第１０巻，４８３−４９３頁；Ｊｉｎ  Ｙ．Ｈ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，２９４０９−２９４１頁；Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｉ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９８年，第１７巻，２９９４−３００４頁）Ｒｕｎｘ２が、ｐ３００によってもアセチル化されるかどうかを確認した。詳細には、実施例４と同じ方法で実験し、ｐ３００とＢＭＰＲ１を処理した。その結果、ｐ３００が存在する時ウエスタンブロットでバンドが確認され、ｐ３００とＢＭＰＲ１が存在する時さらに強いバンドが確認されたので、Ｒｕｎｘ２はｐ３００によってアセチル化されたことが分かり、またＢＭＰ−２によってｐ３００−媒介されたＲｕｎｘ２アセチル化が増加されたことが分かる（図６）。
【００７９】
前記結果によって、ｐ３００が媒介されたＲｕｎｘ２アセチル化が、ＢＭＰ−２信号伝達経路によってＲｕｎｘ２タンパク質蓄積を起こすということを確認した。
＜実施例６＞Ｒｕｎｘ２のアセチル化部位確認
Ｒｕｎｘ２は、１０個のリジン残基があり、Ｒｕｎｘ２の中間部位に７個のリジン残基を含み、Ｃ−末端に２個の残基を有している（図８）。Ｒｕｎｘ２のどの部位のリジン残基がアセチル化になるのかを確認するために、Ｒｕｎｘ２欠失変異体Ｒｕｎｘ２−ＫＲをｐ３００と一緒に発現させて抗‐アセチルリジン抗体で免疫沈降させた結果、Ｃ−末端が中間部位よりさらに多くアセチル化されたことを確認した（図９）。より詳細には、リジンをアルギニンに置換した変異体で実験した結果では、配列番号１で表されるＲｕｎｘ２アミノ酸配列の２２５、２３０、３５０及び３５１番目リジンが、ｐ３００のアセチル化活性に対する主要ターゲットであることを明らかにした（図１０）。
＜実施例７＞Ｒｕｎｘ２アセチル化によるＳｍｕｒｆ１−媒介分解阻害確認
Ｒｕｎｘ２の半減期は、約２時間であるが、ｐ３００と一緒に発現させると非常に安定する一方、２２５、２３０、３５０、３５１番目リジンが欠失した変異体Ｒｕｎｘ２−ＫＲ２２５、２３０、３５０及び３５１は、ｐ３００がなくても非常に安定した（図１１）。このような結果は、Ｒｕｎｘ２のリジン残基が変異されなければ分解に非常に敏感であるが、変異するとＲｕｎｘ２が分解されることを防止することができるということを示す。
【００８０】
Ｓｍｕｒｆ１は、Ｒｕｎｘ２のユビキチンリガーゼでＲｕｎｘ２を認識して、プロテオソームによって分解されるようにするので（Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４年，第２７９巻，１２５８４−１２５８９頁；Ｚｈａｏ，Ｍ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，２７９３９−２７９４４頁）Ｓｍｕｒｆ１を過発現させると、Ｒｕｎｘ２は早く分解されるが（図１２）、ｐ３００を追加して発現させると、Ｓｍｕｒｆ１−媒介Ｒｕｎｘ２分解が相殺される。一方、Ｒｕｎｘ２−ＫＲ２２５、２３０、３５０及び３５１変異体は、Ｓｍｕｒｆ１媒介分解によって分解されない。本発明者は、Ｒｕｎｘ２のＰＰｘＹがＳｍｕｒｆ１のＷＷドメインと反応するので（Ｏｔｔｅ，Ｌ．等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２００３年，第１２巻，４９１−５００頁）（図８）、ＰＰｘＹが欠失したＲｕｎｘ２−ｄｅｌ−４１５−４１８と４１５のプロリンをアルギニンに置換した変異体Ｒｕｎｘ２−Ｐ４１５Ｒを作って実験した結果（Ｍｉｃｈａｅｌｓ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ等，ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｑｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９０年）、Ｒｕｎｘ２−ｄｅｌ−４１５−４１８とＲｕｎｘ２−Ｐ４１５Ｒが、非常に安定したこと、すなわちＳｍｕｒｆ１によって分解されないことを確認した（半減期２４時間以上）（図１１）。前記結果から、２２５、２３０、３５０及び３５１番目リジンが、ｐ３００媒介アセチル化及びＳｍｕｒｆ１媒介ユビキチン化の標的であることを確認した。
＜実施例８＞ＨＤＡＣとＲｕｎｘ２アセチル化
＜８−１＞ＨＤＡＣ阻害剤によるＲｕｎｘ２アセチル化確認
Ｒｕｎｘ２アセチル化レベルは、アセチル化と脱アセチル化間の動的平衡（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）によって決定される。したがって、脱アセチル化を抑制すると、Ｒｕｎｘ２アセチル化が増加するはずなので、大部分のタンパク質を脱アセチル化させるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤をＲｕｎｘ２に処理した。詳細には、ＨＤＡＣ阻害剤であるＳＣＯＰ３０４、ＳＣＯＰ４０２、ＳＣＯＰ１５２、ＣＨＡＰ２７、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、ＦＫ２２８、トラフォキシンＢ（ＴｒａｆｏｘｉｎＢ）、オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）をｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で形質転換させたＣ２Ｃ１２細胞に、コマツ等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１年，第６１巻，４４５９−４４６６頁）の方法によって処理した。抗−アセチル−リジン抗体で免疫沈降して、抗−ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットした結果、前記ＨＤＡＣ阻害剤を処理したＣ２Ｃ１２細胞は、Ｒｕｎｘ２のアセチル化の増加が観察された（図１３）。Ｒｕｎｘ２のＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５との物理的相互作用は、免疫共沈殿方法によって確認され（図１４）、ＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５によるＲｕｎｘ２脱アセチル化は、Ｒｕｎｘ２とＨＤＡＣをトランスフェクションした後、抗−アセチル−リジン抗体で免疫沈降して抗−ｍｙｃ抗体でウエスタンブロットした結果として確認された（図１５）。
【００８１】
前記のようにＨＤＡＣによってＲｕｎｘ２のアセチル化が減少して、脱アセチル化の抑制によってアセチル化の増加した結果は、Ｒｕｎｘ２アセチル化／脱アセチル化が可逆的な過程で、ＨＤＡＣがＲｕｎｘ２ジアセチル化に生理学的イフェクターとして作用することができるということを示す。
＜実施例９＞ＨＤＡＣ阻害剤によるＲｕｎｘ２転写活性の促進
Ｒｕｎｘ２のアセチル化レベルを増加させるＨＤＡＣ阻害剤が、実際にＲｕｎｘ２の転写活性を促進することができるのかどうかを確認するために、Ｒｕｎｘ２とｐＧＬ３−ＴβＲＥ−ｌｕｃリポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を過発現させた２９３細胞に各々のＨＤＡＣ阻害剤を処理した。Ｒｕｎｘ２の転写活性は、ルシフェラーゼレポートアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｓｓａｙ）を行って評価した。ルシフェラーゼアッセイは、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示事項にしたがって実施した。その結果、Ｔｕｂａｃｉｎ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、トラフォキシンＢ（ＴｒａｆｏｘｉｎＢ）、オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、ＣＨＡＰ２７、ＣＨＡＰ３１、ＳＣＯＰ１５２、ＳＣＯＰ３０４、ＳＣＯＰ４０２が、Ｒｕｎｘ２の転写活性を増加させた（図１６）。したがって、ＨＤＡＣ阻害剤がＲｕｎｘ２のアセチル化レベルを増加させるだけではなく、Ｒｕｎｘ２の転写活性も増加させるということを確認した。
＜実施例１０＞ＨＤＡＣ阻害剤による造骨細胞分化促進確認
＜１０−１＞ＨＤＡＣ阻害剤によるアルカリフォスファターゼの活性化確認
本発明者は、Ｒｕｎｘ２が造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）分化の主な調節因子でＢＭＰ−２信号伝達の主なターゲットであるから、Ｒｕｎｘ２アセチル化を増加させてＲｕｎｘ２を安定化させるＨＤＡＣ阻害剤も、造骨細胞分化を誘導することができるかどうか調べた。
【００８２】
詳細には、Ｃ２Ｃ１２多能性幹細胞に各々のＨＤＡＣ阻害剤を処理した後、３．７％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１０分間固定させてウエスタンブルー基質（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｕｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて、１０分間発色させる活性染色法（Ｋａｔａｇｉｒｉ等，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７７５年，第１２７巻，１７５５−６６頁）で、アルカリフォスファターゼの活性を測定した。造骨細胞分化の初期表現形質であるアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰ）の活性を肉眼で観察した結果、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ、ＭＳ−２７５、ＦＫ２２８、オキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）、ＣＨＡＰ２７、ＳＣＯＰ１５２、ＳＣＯＰ３０４、ＳＣＯＰ４０２は、ＡＬＰの活性を増加させることを確認した（図１８）。
＜１０−２＞ＨＤＡＣ阻害剤によるオステオカルシンの発現促進確認
本発明者は、Ｒｕｎｘ２アセチル化が造骨細胞分化を刺激することができるのか確認するまた他の方法として、造骨細胞分化の後期表現形質であるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＯＣ）の発現を誘導するのかどうか、すなわちＨＤＡＣ阻害剤がＯＣプローモーターに影響を及ぼすのかどうか実験した。
【００８３】
詳細には、Ｒｕｎｘ２（−／−）マウス頭蓋骨から製作したＨ１−１２７−２１−２細胞（Ｌｅｅ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２０巻，８７８３−８７９頁）に、ｐＣＳ４−３Ｍｙｃ−ＲｕｎｘとｐＧＬ２−１０５０  ＯＣ−ｌｕｃを形質導入して過発現させて、前記細胞にＨＤＡＣ阻害剤であるＳＣＯＰ３０４をＨＤＡＣ阻害剤処理方法（Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｎ．等，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第５巻，５０７９−５０８２頁）によって処理した後、製造者の指示事項にしたがってルシフェラーゼレポートアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ａｓｓａｙ）を実施して、ＯＣプローモーター活性を評価した。その結果、ＨＤＡＣ阻害剤はＲｕｎｘ２単独の時より、ＯＣプローモーターを２〜４倍活性化させるということを確認した（図１９）。ＯＣプローモーター内のＲｕｎｘ２結合部位（ＯＳＥ）は、ＨＤＡＣ阻害剤やＲｕｎｘ２過発現によってＯＣプローモーター活性が完全に除去された（図１９）
また、ＲＴ−ＰＣＲを利用してＨＤＡＣ阻害剤が、ＯＣ遺伝子発現に影響を及ぼすのかどうか調べた。詳細には、配列番号７と８で表されるプライマーを使用して下記のような条件でＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＯＣ遺伝子の発現量を調べた。ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、タカラ社）を使用して、前記記載したプライマー対と鋳型を９５℃で５分間変性させて、９５℃で３０秒、５５℃で１分及び７２℃で１分間３０回反応させて、７２℃で１０分間延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）して反応を終結した。その結果、ＨＤＡＣ阻害剤は、Ｒｕｎｘ２存在下でＯＣ発現を３倍増加させた。これは、ＯＣプローモーター活性分析結果と一致する（図２０）。
＜実施例１１＞Ｒｕｎｘ２アセチル化による特異的なＯＣ発現増加確認
ＯＣ発現は、Ｄｌｘ５（Ｌｅｅ，Ｍ．Ｈ．等，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９年，第７３巻，１１４−１２５頁）または、Ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｏｓｘ）（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．等，Ｃｅｌｌ，２００２年，第１０８巻，１７−２９頁）のような他の骨形成転写因子によって調節されるので、本発明者は、前記＜実施例１０＞と同一プライマー及び同一ＲＴ−ＰＣＲ条件を使用して、Ｒｕｎｘ２がＯＣプローモーター活性化のためのＨＤＡＣ阻害剤の特異的な標的なのかどうか調べた。Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５（Ｌｅｅ  Ｍ．Ｈ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，第２７８巻，３４３８７−３４３９４頁）及びＯｓｔｅｒｉｘ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．等，Ｃｅｌｌ，２００２年，第１０８巻，１７−２９頁）遺伝子をＲｕｎｘ２（−／−）細胞にリポフェクタミン＋プラス試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ＰＬＵＳ  ＲＥＡＧＥＮＴ；ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で製造者の指示事項によって形質導入を遂行して、６時間後にＨＤＡＣ阻害剤を処理した。その後、２４時間経過後、オステオカルシン（ＯＣ）ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ＰＣＲ方法で分析した。ＯＣ  ｍＲＮＡの増幅に利用したプライマー対とＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、＜実施例１０−２＞で使用した方法と同一である。
【００８４】
その結果、Ｒｕｎｘ２が発現されないＲｕｎｘ２（−／−）細胞で外来のＲｕｎｘ２は、ＯＣ発現を増加させたし、ＨＤＡＣ阻害剤を追加するとＯＣ発現をさらに増加させた。一方、Ｄｌｘ５またはＯｓｘは、ＯＣ発現を若干増加させたが、ＨＤＡＣ阻害剤を追加してもＯＣ発現を増加させることができなかった（図２１）。このような結果は、三種類の骨形成転写因子中でＲｕｎｘ２だけが、造骨細胞分化においてＨＤＡＣ阻害剤の唯一の標的であることを示す。
＜実施例１２＞ＨＤＡＣ阻害剤による骨形成の促進
本発明者は、骨形成においてＨＤＡＣ阻害剤の役割を確認するために、ＣＨＡＰ２７、ＳＣＯＰ４０２及びＳＣＯＰ３０４が生体内で、げっ歯類の骨膜性骨形成（ｐｅｒｉｏｓｔｅａｌ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にどんな影響を及ぼすのか調べた。詳細には、マウスの頭蓋骨（ｃａｌｖａｒｉａｌ）近くの皮下内に１０μｌのＨＤＡＣ阻害剤（６０ｕＭ）を注射した（Ｚｈａｏ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０４年，第２７９巻，１２８５４−１２８５９頁）。２週後にマウスを犠牲にして、ヘマトキシン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ  ＆  Ｅｏｓｉｎｅ）組織染色（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｕｌｉｏ  Ｅ．Ｃｅｌｉｓ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４年）を行って組織を観察した結果、ＣＨＡＰ２７とＳＣＯＰ３０４が著しい骨形成促進効果を示すことを確認した（図２２）。
【００８５】
以上の実験結果は、ＨＤＡＣ阻害が生体内で骨形成を促進させてＲｕｎｘ２のアセチル化と脱アセチル化が造骨細胞の機能を調節する重要なメカニズムであるということを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
前記で詳しくみたように、本発明のＲｕｎｘ２のアセチル化によってＲｕｎｘ２活性を増加させる方法は、Ｒｕｎｘ２分解を抑制することで骨形成を促進させて、骨粗しょう症、骨形成不全症、歯周疾患、骨折などの骨疾患治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＢＭＰ−２による細胞内Ｒｕｎｘ２タンパク質の量的増加を測定した結果を示したウエスタンブロット写真である。
【図２】ＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲＩ）によるＲｕｎｘ２のタンパク質の量的増加を測定した結果を示したウエスタンブロット写真である。
【図３】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２で細胞を形質転換させた後、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）で処理してＢＭＰ−２の存在または不在下にＲｕｎｘ２タンパク質量の減少速度差を示したウエスタンブロット写真である。
【図４】ｐ３００で形質転換させたりＢＭＰ−２で処理したりして、定量的なＲＴ−ＰＣＲによってＲｕｎｘ２の発現量を比べた結果を示した写真である。
【図５】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２とｐ３００をＢＭＰ−２の不在または存在下に細胞で発現させた後、Ｒｕｎｘ２タンパク質レベルとそのアセチル化レベルを示したウエスタンブロット写真である。
【図６】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２をＢＭＰＲＩまたはｐ３００または両方の存在下に細胞で発現させた後、Ｒｕｎｘ２タンパク質レベルとそのアセチル化レベルを示したウエスタンブロット写真である。
【図７】一定量のｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２とｐ３００の量を段々ふやして共形質導入した後、Ｒｕｎｘ２タンパク質レベルとそのアセチル化レベルを示したウエスタンブロット写真である。
【図８】Ｒｕｎｘ２のリジン残基の概路図である。
【図９】ｐ３００とｍｙｃ標識された全長または切断したＲｕｎｘ２で形質転換した後、Ｒｕｎｘ２のアセチル化を示したウエスタンブロット写真である。
【図１０】ｐ３００と多様なｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２リジン変異を、細胞に形質導入後、Ｒｕｎｘ２のアセチル化を示したウエスタンブロット写真である。
【図１１】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２、様々なＲｕｎｘ２変異を細胞に形質導入して、シクロヘキサミド（Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ；ＣＨＸ）を処理した後、Ｒｕｎｘ２タンパク質量の減少速度差を示したウエスタンブロット写真である。
【図１２】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２、様々なＲｕｎｘ２変異とＳｍｕｒｆ１の量を段々増加させて共形質導入した後、ｐ３００の存在または不在下にＲｕｎｘ２の量を測定した結果を示した写真である。
【図１３】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２を細胞で発現させた後、ＨＤＡＣ阻害剤を処理してＲｕｎｘ２とそのアセチル化レベルを測定した結果を示した写真である。
【図１４】ＨＡ標識されたＲｕｎｘ２をｍｙｃ標識されたＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５と共形質導入した後、免疫沈降法で相互作用の有無を確認した結果を示した写真である。
【図１５】ｍｙｃ標識されたＲｕｎｘ２をＨＤＡＣ４またはＨＤＡＣ５及びｐ３００と一緒に発現させた後、Ｒｕｎｘ２とそのアセチル化レベルを測定した結果を示した写真である。
【図１６】一定量のｐＧＬ３−ＴβＲＥ−ｌｕｃとＲｕｎｘ２を一緒に発現させた後、ＨＤＡＣ濃度を増加させてルシフェラーゼアッセイを実施した結果を示した写真である。
【図１７】リジン残基をアルギニンに置換した後、ルシフェラーゼアッセイを実施すると、Ｒｕｎｘ２の遺伝子発現促進活性が除去されることを示した写真である。
【図１８】ＢＭＰ−２の存在下にＨＤＡＣの濃度を増加させて造骨細胞マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイを実施した結果を示した写真である。
【図１９】正常のＯＳＥと突然変異ＯＳＥをＲｕｎｘ２の存在または不在下に細胞に形質導入して、ルシフェラーゼアッセイを実施した結果を示した写真である。
【図２０】Ｒｕｎｘ２で形質転換させた後、ＨＤＡＣ阻害剤を処理してオステオカルシン発現レベルを測定した結果を示した写真である。
【図２１】Ｒｕｎｘ２、Ｄｌｘ５またはＯｓｘ発現プラスミドを形質導入して、ＨＤＡＣ阻害剤を処理してオステオカルシン発現レベルを測定した結果を示した写真である。
【図２２】ＨＤＡＣ阻害剤によって生体内で骨形成が促進される結果を示した顕微鏡写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号３と４は、耐性のＲｕｎｘ２を増幅させるための正方向及び逆方向プライマーである。
【００８９】
配列番号５と６は、外来のＲｕｎｘ２を増幅させるための正方向及び逆方向プライマーである。
【００９０】
配列番号７と８は、ＯＣ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲを実施するための正方向及び逆方向プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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