(57)【要約】  本発明は、癌又は非癌性の病変の予防若しくは治療を目的とした医薬品製造のための、ネトリン−４、変異ネトリン−４、ネトリン−１、ネトリン−Ｇ１、又はネトリン−３から選択されたネトリン、又はこれらの断片の１つ、又は前記ネトリンの１つ又は前記断片の１つをコードするヌクレオチド配列、又は前記ネトリンの１つ又は前記断片の１つの抗イディオタイプ抗体、又は前記抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が抗血管新生活性、及び／又は周皮細胞活性化活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が抗血管新生活性及び／又は周皮細胞活性化活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が抗血管新生活性及び／又は周皮細胞活性化活性を示す前記相同な配列、
の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が抗血管新生活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が抗血管新生活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が抗血管新生活性を示す前記相同な配列、
の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質。
【請求項３】
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が周皮細胞活性化活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が周皮細胞活性化活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が周皮細胞活性化活性を示す前記相同な配列、
の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質。
【請求項４】
請求項１、２、又は３に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５】
−  配列番号：５２２をコードする配列番号：５２１のヌクレオチド配列、又は配列番号：５２４をコードする配列番号：５２３のヌクレオチド配列；
−  前記ヌクレオチド配列の１つの断片であって、そして、特には配列番号：２ｑ−１（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２５の配列によってか、又は配列番号：５２７の配列よって表されるヌクレオチド配列の１つの断片；
−  又は、遺伝子コードの縮重による、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列であって、そして配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列によって表されるタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１以上のヌクレオチドの置換、欠失又は追加による、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列であって、前記で定義した、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）由来のタンパク質か、又は配列番号：５２６の配列か、又は配列番号：５２８の配列をコードする、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列の１つに相同な任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは、前記で定義した、配列番号：２ｑに相同なタンパク質をコードする配列番号：２ｑ−１の配列の１つか、又は配列番号：５２６の配列をコードする配列番号：５２５の配列か、又は配列番号：５２８の配列をコードする配列番号：５２７の配列、と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記ヌクレオチド配列の１つに相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列と相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列の１つに相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる任意のヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項４及び５で定義したヌクレオチド配列を含む組換えベクター、特にはプラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡであって、前記組換えベクターが、特には、前記ベクター中に挿入された、前記核酸によりコードされるポリペプチドの宿主細胞での発現に必要な要素を含むことを特徴とする、前記組換えベクター。
【請求項７】
宿主細胞、特に、細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞から選択された宿主細胞であって、前記宿主細胞が、特に、請求項６で定義した組換えベクターを用いて形質転換される、前記宿主細胞。
【請求項８】
請求項１、２、又は３で定義したタンパク質に対して特異的であることを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１、２、又は３で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体。
【請求項１０】
請求項９で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片。
【請求項１１】
請求項１、２、又は３で定義したタンパク質、又は
請求項４又は５で定義したヌクレオチド配列、又は
請求項８で定義した抗体、又は
請求項９で定義した抗イディオタイプ抗体、又は
請求項１０で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１、２、又は３で定義したタンパク質、又は
請求項４又は５で定義したヌクレオチド配列、又は
請求項９で定義した抗イディオタイプ抗体、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走を阻害することを必要とする病変の、予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であって、特には、以下のフレームの中の病変、癌及び白血病、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームの中の病変である、前記使用。
【請求項１３】
請求項８で定義した抗体、又は
請求項１０で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走の促進を必要とする病変の、予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であって、特には、以下のフレームの中の病変、虚血性病変、例えば、下肢動脈の虚血性病変、心筋梗塞、脳血管障害、強皮症、又はレイノー病である、前記使用。
【請求項１４】
請求項１、２、又は３で定義したタンパク質、又は
請求項４又は５で定義したヌクレオチド配列、又は
請求項８で定義した抗体、又は
請求項９で定義した抗イディオタイプ抗体、又は
請求項１０で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用であって、周皮細胞又は平滑筋細胞の、消耗に関連するか又は消耗により引き起こされる、非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用。
【請求項１５】
周皮細胞又は平滑筋細胞の、消耗に関連するか又は消耗により引き起こされ、そして周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖又は走化性の活性化を必要とする前記非癌性病変が；
加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管性複雑近視、
糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、
血管新生緑内障、
特に、移植拒絶における角膜血管新生、
リューマチ性多発性関節炎、
乾癬、特に、乾癬性多発性関節炎、
血管腫、
アテローム性動脈硬化症、
肥満症、
腸奇形、
クローン病、
血管性、皮質下血管性認知症アルツハイマー病、
変性骨病変及び骨折、及び
動脈瘤及び血管解離、
から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は、
前記配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列の断片、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２６の配列によってか、又は配列番号：５２８の配列によって示される断片、
の化学療法剤との併用における、癌の治療を意図した薬剤の製造のための、使用。
【請求項１７】
以下の配列、
−  配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列；又は
−  前記配列の一つに由来する任意の配列であって、特には、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による配列であって、但し、この由来配列が抗血管新生活性を示す前記配列；又は
−  前記配列の１つに相同な任意の配列であって、好ましくは、配列番号：５０２のアミノ酸の２８４位と４８７位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列は、抗血管新生活性を有する前記配列、
の１つを含むか、又はその配列の１つによって構成されることを特徴とするタンパク質であって、但し、前記タンパク質が配列番号：５０２配列番号又は：５０４の配列と異なる、前記タンパク質。
【請求項１８】
請求項１７に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１９】
以下の配列、
−  配列番号：２ｉ−１（ｉは６４から１３１まで変化する）のヌクレオチド配列；又は
−  遺伝子コードの縮重による、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列であって、配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つで表されるタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列、
−  特に、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は追加による、前記で定義した配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つに由来するタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、
−  前記ヌクレオチド配列の１つに相同な任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは、前記で定義した配列番号：２ｉに相同なタンパク質をコードする配列番号：２ｉ−１（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つと少なくとも約５０％の同一性を有する、前記ヌクレオチド配列、又は
−  前記配列と相補的な任意のヌクレオチド配列、又は
−  前記の配列の１つに相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる任意のヌクレオチド配列、
を含むか、それにより構成されることを特徴とし、但し、前記ヌクレオチド配列が配列番号：５０１又は配列番号：５０３の配列と異なる、請求項１８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２０】
−  請求項１７で定義したタンパク質、又は
−  請求項１８又は１９定義したヌクレオチド配列、又は
−  請求項１７で定義したタンパク質に対して特異的であることを特徴とする、抗体、又は
−  請求項１７で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、又は
−  請求項１７で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
を、有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２１】
−  請求項１７で定義したタンパク質、又は
−  請求項１８又は１９定義したヌクレオチド配列、又は
−  請求項１７で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走を阻害することを必要とする病変の、予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であって、特には、以下のフレームの中の病変、癌及び白血病、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームの中の病変である、前記使用。
【請求項２２】
−  請求項１７で定義したタンパク質に対して特異的であることを特徴とする抗体、又は
−  請求項１７で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走の促進を必要とする病変の、予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であって、特には、以下のフレームの中の病変、虚血性病変、例えば、下肢動脈の虚血性病変、心筋梗塞、脳血管障害、強皮症、又はレイノー病である、前記使用。
【請求項２３】
アバスチン（ベバシズマブ）、マクゲン（ペガプタニブ）及びルセンチス（ラニビズマブ）又は他の任意の抗ＶＥＧＦ薬との併用における、請求項１２で定義した癌性又は非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための、
配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は、
前記配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列の断片、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２６の配列によってか、又は配列番号：５２８の配列によって示される断片、
の使用。
【請求項２４】
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４で示される変異ネトリン、又は
−  前記配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列の断片、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２６の配列によってか、又は配列番号：５２８の配列によって示される断片、
を含む併用産物であって、アバスチン（ベバシズマブ）、マクゲン（ペガプタニブ）及びルセンチス（ラニビズマブ）又は他の任意の抗ＶＥＧＦ薬との併用における、請求項１２で定義した癌性又は非癌性の病変の予防又は治療を意図した前記併用産物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の課題は、変異ネトリン４、その断片及びこれらの薬剤としての使用である。
【０００２】
また、本発明の課題は、非変異ネトリン４及びこの断片の新規治療法への使用である。
【０００３】
また、本発明の課題は、ネオゲニンリガンド、例えば、ネトリン（すなわち、ネトリン１、ネトリン３、ネトリンＧ１又はネトリン４）及びＲＧＭ（反発誘導分子）の、化学療法剤との併用における、特には癌治療を意図した薬剤の製造のフレームにおける、新規使用である。
【０００４】
また、本発明の課題は、特に、周皮細胞の消耗と関連した非癌性の病変の治療のフレームにおける、ネトリン（特に、ネトリン１、ネトリンＧ１、ネトリン３及びネトリン４）の新規使用である。
【０００５】
ネトリン４は軸索誘導分子であるネトリンファミリーに属する。現在のところ、このファミリーの４つのメンバーが知られている（ネトリン１、Ｇ、３、４）。ネトリン４は、へパリンと相互作用する１つのＣ末端塩基ドメイン、３つのＥＧＦ型ドメイン、及び１つのラミニン型ドメインにより構成されているタンパク質である（Yurchenko et al., 2004）。
【０００６】
ネトリン１は、ｄｃｃレセプター（又はネオゲニンに）結合するときに誘引を促進し、そしてｄｃｃレセプター及びＵＮＣ５Ｈファミリーのレセプターの１つと結合した時に反発を促進する（Livesey, 1999; Mehlen et al., 2003; Cooper et al., 1999）。更に、ネトリン１はＡ２レセプターに結合し、細胞のｃＡＭＰレベルを変化させることが可能で、また、誘引又は反発はｃＡＭＰ／ｃＧＭＰレベルによりコントロールされる（Corset et al., 2000）。
【０００７】
ネトリンＧは、グリコシル・ホスホイノシトールリン酸と結合する親水性のＣ末端ドメインを有するという点で他のネトリンと異なる遺伝子のファミリーを代表する（Nakashiba et al., 2000）。これらの機能はまだ不明である。一方、ネトリンＧはｄｃｃにも又ＵＮＣ５Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３にも結合しないことが報告されている（Nakashiba et al., 2002）。
【０００８】
ネトリン３はｄｃｃレセプター又はネオゲニンに結合するとニューロンの誘引を促進し、そしてＵＮＣ５Ｈファミリーのレセプターの１つのレセプターに結合するとその反発を促進する（Livesey et al., 1999）。
【０００９】
ＲＧＭ（反発誘導分子）分子はニューロン軸索の誘導に関与した分子である。これらには三つの遺伝子が存在し、それらはＲＧＭ−Ａ、ＲＧＭ−Ｂ、ＲＧＭ−Ｃとして知られている。最近、ＲＧＭ−Ａはネオゲニンリガンド（Matsunaga et al., 2004）であり、ＲＧＭ−Ｃの変異形はＨＦＥとして知られている鉄輸送遺伝子であることが、知られるようになった（Papanicolaou et al., 2004）。
【００１０】
２００３年１１月６日に公開された出願ＵＳ２００３／０２０７３４７Ａ１には、天然のネトリン４及びその使用が記載されている。より詳しくは、この出願は、血管新生修飾特性を有するネトリン４由来ポリペプチド、並びに血管発達修飾方法における、特に血管新生における、より詳しくは血管新生阻害における、特に癌のフレームにおける、ネトリン４の使用を記載している。
【００１１】
現在のところ、ネトリン４レセプターについても、又、その可能性としてのニューロン機能についても何も分かっていない。
【００１２】
ネトリン１及びネトリン４はＵＮＣ５Ｈ２レセプターにより内皮細胞の活性を阻害すること（Lu et al., 2004）及び網膜の血管形成を阻害することが最近発表された。
【００１３】
また、本発明の目的は、新規抗血管新生阻害剤を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、特に従来の抗癌治療における、血管新生を含む治療効果を高めること、若しくは癌以外の病変における抗血管新生治療使用における効果を高めることを可能にする、併用療法を提供することである。
【００１５】
現在のところ、加齢性黄斑変性症、又は他の新生血管形成を含む眼疾患の治療のフレームにおいて標準的な方法で使用されている薬剤と相乗作用をもたらすことの可能な治療薬は存在しない。
【００１６】
本発明は、
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が抗血管新生活性、及び／又は周皮細胞活性化活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が抗血管新生活性及び／又は周皮細胞活性化活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が抗血管新生活性及び／又は周皮細胞活性化活性を示す前記相同な配列、の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質に関する。
【００１７】
配列番号：５２２の前記タンパク質は、変異ネトリン４タンパク質に相当する新規タンパク質であり、配列番号：５２４の前記タンパク質はシグナルペプチドを有しない配列番号：５２２のタンパク質に相当する。
【００１８】
配列番号：５２２の配列は６２８アミノ酸を含み、そして配列番号：５２４の配列は６０９アミノ酸を含み、配列番号：５２２の配列の２０残基から６２８残基までの断片に相当する。
【００１９】
配列番号：５２２の配列に示される変異ネトリン４は、以下の９ポイントの変異を有する配列番号：４９８に示されるネトリン４タンパク質に相当する：
−  １３位のシステインをアルギニンで置換、
−  ６８位のリジンをスレオニンで置換、
−  １８３位のセリンをプロリンで置換、
−  ２０５位のヒスチジンをチロシンで置換、
−  ２３４位のシステインをチロシンで置換、
−  ３３１位のアラニンをアスパラギンで置換、
−  ３３２位のシステインをアルギニンで置換、
−  ３５３位のアスパラギンをセリンで置換、
−  ５１５位のアスパラギンをリジンで置換。
【００２０】
配列番号：３７４から配列番号：４９６のタンパク質配列に相当する前記断片は、前記変異ネトリン４に相当する新規断片である。
【００２１】
前記配列番号：２ｑの配列は、配列番号：３７４から４９６までのタンパク質の配列、すなわち、次のタンパク質配列に相当する：配列番号：３７４、配列番号：３７６、配列番号：３７８、配列番号：３８０、配列番号：３８２、配列番号：３８４、配列番号：３８６、配列番号：３８８、配列番号：３９０、配列番号：３９２、配列番号：３９４、配列番号：３９６、配列番号：３９８、配列番号：４００、配列番号：４０２、配列番号：４０４、配列番号：４０６、配列番号：４０８、配列番号：４１０、配列番号：４１２、配列番号：４１４、配列番号：４１６、配列番号：４１８、配列番号：４２０、配列番号：４２２、配列番号：４２４、配列番号：４２６、配列番号：４２８、配列番号：４３０、配列番号：４３２、配列番号：４３４、配列番号：４３６、配列番号：４３８、配列番号：４４０、配列番号：４４２、配列番号：４４４、配列番号：４４６、配列番号：４４８、配列番号：４５０、配列番号：４５２、配列番号：４５４、配列番号：４５６、配列番号：４５８、配列番号：４６０、配列番号：４６２、配列番号：４６４、配列番号：４６６、配列番号：４６８、配列番号：４７０、配列番号：４７２、配列番号：４７４、配列番号：４７６、配列番号：４７８、配列番号：４８０、配列番号：４８２、配列番号：４８４、配列番号：４８６、配列番号：４８８、配列番号：４９０、配列番号：４９２、配列番号：４９４又は配列番号：４９６。
【００２２】
配列番号：３７４の配列は、変異ネトリン４ヒトタンパク質のラミニン型断片（特定のインテグリンに結合する細胞外マトリックスタンパク質）に相当し、前記断片は配列番号：３７３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２６０アミノ酸を含み、残基１から残基２６６に跨る、配列番号：５２２の変異ネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００２３】
配列番号：３７６の配列は、変異ネトリン４ヒトタンパク質ＥＧＦ型断片（ＥＧＦ因子繰返しドメインに相当し、前記断片は配列番号：３７５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２５５アミノ酸を含み、配列番号：５２２の残基２６１から残基５１５に跨る変異ネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００２４】
配列番号：３７８の配列は、配列番号：３６４の配列を欠失した変異ネトリン４ヒトタンパク質断片に相当し、前記断片は配列番号：３７７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５１５アミノ酸を含み、配列番号：５２２の残基１から残基５１５に跨る配列の変異ネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００２５】
配列番号：３８６の配列は変異ネトリン４ヒトタンパク質のラミニン型断片であり、前記断片は配列番号：３８５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２２９アミノ酸を含み、残基３２から残基２６０に跨る配列番号：５２２の配列の変異ネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００２６】
配列番号：３８４の配列は変異ネトリン４ヒトタンパク質断片のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：３８３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５６アミノ酸を含み、配列番号：５２２の残基３３２から残基３８７に跨る配列の変異ネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００２７】
配列番号：３８０から配列番号：４９６までのタンパク質配列に相当する変異ネトリン４タンパク質断片、並びに配列番号：３７９から配列番号：４９５までの相当するヌクレオチド配列は次の表に示す：
【表１】
2008520222.tif 000002
2008520222.tif 000003
【００２８】
配列番号：５２６の配列は、配列番号：５２２の１位から２８８位に区切られた断片に相当する。
【００２９】
配列番号：５２８の配列は、２４アミノ酸のペプチド配列に融合した配列番号：５２２の１位から２８８位の区切られた断片に相当する。
【００３０】
本発明は、
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が抗血管新生活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が抗血管新生活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が抗血管新生活性を示す前記相同な配列、
の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質に関する。
【００３１】
また、血管新生抑制活性は抗血管新生活性と示される。この活性は、例えば、内皮細胞の増殖、遊走及び分化が前記タンパク質により阻害されることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで明らかにすることで示すことが可能である。内皮細胞の増殖阻害は、その活性を評価すべきタンパク質又はその断片存在下で内皮細胞を培養することで測定することができる。内皮細胞の遊走阻害は、内皮細胞でできたシート（芝生）に「傷」をつけ、次にこの細胞をテストすべき断片存在下でインキュベートすることで測定することが可能である。次いで、傷に遊走する細胞数を数える。内皮細胞の分化（管形成）阻害はゲルの上でテストすべき断片の存在下で培養している内皮細胞により形成された管の長さを測ることで測定することが可能である。
【００３２】
標準の血管新生測定モデルの中で、以下のローカル送達モデルに言及することができる：
−  本発明の化合物を染み込ませたマトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）の皮下注射（Inoki et al., 2002）、又は
−  本発明の化合物を含む埋め込み物のニワトリ漿尿膜への適用（Celerier et al., 2002）。
【００３３】
あるいは、実験的な血管新生疾患を創出した動物に本発明の断片を全身ルートで注射する（静脈、腹腔内、皮下）ことが可能である。また、本発明の断片は直接腫瘍に注射することもできる。あるいは、本発明に記載の断片又は抗イディオタイプ抗体（後述する）を遺伝子療法により、本発明に記載の断片又は抗イディオタイプ抗体を発現させることのできる任意の方法を用いて、局所又は全身ルートで送達することが可能である。あるいは、本発明に記載の断片又は抗イディオタイプ抗体の遺伝子をプラスミドに挿入し、それを癌細胞に遺伝子導入することも可能である。これらの全ての測定方法は、特に、Jain et al. (1997)の文献に記載されている。
【００３４】
抗腫瘍活性という用語は、腫瘍の成長及び／又はその退縮の誘導を、若しくは腫瘍の消失さえも可能とするような活性を示す。この活性は、例えば、in vivoで腫瘍の重量を測定することで示すことが可能で、本発明のペプチドの投与及び／又は本発明のペプチド配列を発現する核酸投与の存在下及び非存在下でマウスに腫瘍を注入することにより、その系の開発が誘導された。
【００３５】
本発明は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は
＊  配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片であって、但し、この断片が周皮細胞活性化活性を示し、特には、前記断片が約４０から約４５０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２６０アミノ酸、及び好ましくは約４０から約２３０アミノ酸を含み、特には、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列で表される配列の断片、
＊  特に、１以上のアミノ酸の置換、欠失、又は追加による、前記配列の１つから由来する任意の配列であって、但し、この由来配列が周皮細胞活性化活性を示す、前記任意の配列、又は
＊  前記配列の１つと相同な配列であって、好ましくは、配列番号：５２２のアミノ酸の２６１位と５１５位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を有し、但し、この相同配列が周皮細胞活性化活性を示す前記相同な配列、
の１つを含むか、又はそれにより構成されていることを特徴とするタンパク質に関する。
【００３６】
周皮細胞の活性化活性は、特に、後述のように定義され、そして実験の部分で示される増殖及び遊走テストで証明される。
【００３７】
本発明は、特に、本発明者によりなされた周皮細胞及び平滑筋細胞のＵＮＣ５Ｈ４レセプターへのネトリンの結合による周皮細胞の活性化機能の実証に基づく。
【００３８】
また、本発明は前記で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列、すなわち、変異ネトリン４をコードするヌクレオチド配列、に関する。
【００３９】
本発明に記載の好ましいヌクレオチド配列は、
−-  配列番号：５２２をコードする配列番号：５２１のヌクレオチド配列、又は配列番号：５２４をコードする配列番号：５２３のヌクレオチド配列；
−  前記ヌクレオチド配列の１つの断片であって、そして、特には配列番号：２ｑ−１（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２５の配列によってか、又は配列番号：５２７の配列よって表されるヌクレオチド配列の１つの断片；
−  又は、遺伝子コードの縮重による、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列であって、そして配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つによってか、又は配列番号：５２６の配列又は配列番号：５２８の配列によって表されるタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１以上のヌクレオチドの置換、欠失又は追加による、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列であって、前記で定義した、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）由来のタンパク質か、又は配列番号：５２６の配列か、又は配列番号：５２８の配列をコードする、前記ヌクレオチド配列の１つに由来する任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列の１つに相同な任意のヌクレオチド配列であって、好ましくは、前記で定義した、配列番号：２ｑに相同なタンパク質をコードする配列番号：２ｑ−１の配列の１つか、又は配列番号：５２６の配列をコードする配列番号：５２５の配列か、又は配列番号：５２８の配列をコードする配列番号：５２７の配列、と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記ヌクレオチド配列の１つに相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列と相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列の１つに相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる任意のヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項４に記載のヌクレオチド配列である。
【００４０】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、０．５ＸＳＳＣ）、６０℃のハイブリダイゼーション温度、並びに洗浄液（例えば、１％ＳＤＳを添加した０．１ＸＳＳＣ）及び５０℃の洗浄温度に特に相当する。
【００４１】
配列番号：２ｑ−１の前記配列は配列番号：２ｑに示される前記変異ネトリン４断片をコードし、以下のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：３７４をコードする配列番号：３７３、配列番号：３７６をコードする配列番号：３７５、配列番号：３７８をコードする配列番号：３７７、配列番号：３８０をコードする配列番号：３７９、配列番号：３８２をコードする配列番号：３８１、配列番号：３８４をコードする配列番号：３８３、配列番号：３８６をコードする配列番号：３８５、配列番号：３８８をコードする配列番号：３８７、配列番号：３９０をコードする配列番号：３８９、配列番号：３９２をコードする配列番号：３９１、配列番号：３９４をコードする配列番号：３９３、配列番号：３９６をコードする配列番号：３９５、配列番号：３９８をコードする配列番号：３９７、配列番号：４００をコードする配列番号：３９９、配列番号：４０２をコードする配列番号：４０１、配列番号：４０４をコードする配列番号：４０３、配列番号：４０６をコードする配列番号：４０５、配列番号：４０８をコードする配列番号：４０７、配列番号：４１０をコードする配列番号：４０９、配列番号：４１２をコードする配列番号：４１１、配列番号：４１４をコードする配列番号：４１３、配列番号：４１６をコードする配列番号：４１５、配列番号：４１８をコードする配列番号：４１７、配列番号：４２０をコードする配列番号：４１９、配列番号：４２２をコードする配列番号：４２１、配列番号：４２４をコードする配列番号：４２３、配列番号：４２６をコードする配列番号：４２５、配列番号：４２８をコードする配列番号：４２７、配列番号：４３０をコードする配列番号：４２９、配列番号：４３２をコードする配列番号：４３１、配列番号：４３４をコードする配列番号：４３３、配列番号：４３６をコードする配列番号：４３５、配列番号：４３８をコードする配列番号：４３７、配列番号：４４０をコードする配列番号：４３９、配列番号：４４２をコードする配列番号：４４１、配列番号：４４４をコードする配列番号：４４３、配列番号：４４６をコードする配列番号：４４５、配列番号：４４８をコードする配列番号：４４７、配列番号：４５０をコードする配列番号：４４９、配列番号：４５２をコードする配列番号：４５１、配列番号：４５４をコードする配列番号：４５３、配列番号：４５６をコードする配列番号：４５５、配列番号：４５８をコードする配列番号：４５７、配列番号：４６０をコードする配列番号：４５９、配列番号：４６２をコードする配列番号：４６１、配列番号：４６４をコードする配列番号：４６３、配列番号：４６６をコードする配列番号：４６５、配列番号：４６８をコードする配列番号：４６７、配列番号：４７０をコードする配列番号：４６９、配列番号：４７２をコードする配列番号：４７１、配列番号：４７４をコードする配列番号：４７３、配列番号：４７６をコードする配列番号：４７５、配列番号：４７８をコードする配列番号：４７７、配列番号：４８０をコードする配列番号：４７９、配列番号：４８２をコードする配列番号：４８１、配列番号：４８４をコードする配列番号：４８３、配列番号：４８６をコードする配列番号：４８５、配列番号：４８８をコードする配列番号：４８７、配列番号：４９０をコードする配列番号：４８９、配列番号：４９２をコードする配列番号：４９１、配列番号：４９４をコードする配列番号：４９３又は配列番号：４９６をコードする配列番号：４９５。
【００４２】
配列番号：５２５の配列は配列番号：５２６の配列をコードする。
【００４３】
配列番号：５２７の配列は配列番号：５２８の配列をコードする。
【００４４】
また、本発明は組換えベクター（特に、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡ）に関し、これらは前記で定義したヌクレオチド配列、すなわち、前記で定義した変異ネトリン４又はその断片の１つをコードするヌクレオチド配列を含み、前記の組換えベクターは、特に、前記ベクター中に挿入された核酸によりコードされるポリペプチドを宿主細胞で発現させるのに必要な要素を含むことを特徴とする。
【００４５】
また、本発明は、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞から選択された宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、特に、前記で定義した組換えベクターを用いて形質転換される。
【００４６】
また、本発明は、前記で定義したタンパク質に、特に、前記で定義した変異ネトリン４又はその断片の１つに対する特異的な抗体に関する。
【００４７】
また、本発明は、前記で定義したタンパク質の、特に、前記で定義した変異ネトリン４又はその断片の抗イディオタイプ抗体、に関する。
【００４８】
また、本発明は、特に前記で定義した変異ネトリン４又はその断片に対する、特に、前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片に関する。
【００４９】
また、本発明は有効成分として以下のものを含む医薬組成物に関する、
−  前記で定義したタンパク質、又は
−  前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  前記で定義した抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片。
【００５０】
また、本発明は、前記で定義した配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列で示される、約０．１から約２０００μｇ／ｋｇの割合で投与可能な薬剤の製造のための変異ネトリン４タンパク質に関し、特に、その投与は静脈ルート、皮下ルート、全身ルート、硝子体内注射、浸透又は洗眼液による局所ルート、場合により電気透過法（electropermeation）との組み合わせが挙げられる。
【００５１】
また、変異ネトリン４タンパク質は、目的の変異ネトリン４タンパク質をコードするプラスミドを注射により送達することも可能である。
【００５２】
あるいは、本発明のネトリンの任意の１つ又はその断片の１つを、そのタンパク質又はその断片を任意の血管内装置（ステント）に固定した後に、前記装置の方法を用いて送達することも可能である。
【００５３】
本発明は、
−  前記で定義したタンパク質、又は
−  前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走を阻害することを必要とする病変の、予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であって、特には、以下のフレームの中の病変、癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームの中の病変である、前記使用に関する。
【００５４】
「内皮細胞の増殖阻害」という表現は、後に記載される増殖テストの結果、内皮細胞の増殖を鈍化させることのできる任意の物質を指す。
【００５５】
本発明は次のものを含む組合せ産物に関する：
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は
−  特に、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６又は配列番号：５２８の配列に示される、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列断片、で
これらは特に次から選択された抗血管新生剤と併用する：ジェネンティク及びロシュの開発によるアバスチン（ベバシズマブ）、アイテクおよびファイザーにより開発されたマクゲン（ペガプタニブ）及びジェネンティク及びノバルティスにより開発されたルセンチス（ラニビズマブ）で、これらは同時に又は個別に、又は長時間にわたり使用され、以下の病変の治療を意図している：癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変。
【００５６】
本発明の枠組みの中で、変異ネトリン４の用量は、６週間毎に、約１０から約１０，０００ｎｇ／注射であり、好ましくは約１００から約５，０００ｎｇ／注射である。
【００５７】
本発明の枠組みの中で、抗イディオタイプ抗体薬（例えば、アバスチン、マクゲン又はルセンチス）の用量は、６週間毎に、約０．３および１ｍｇである。
【００５８】
本発明の課題は、
−  前記で定義した抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の内皮細胞の増殖及び／又は遊走の促進を必要とする病変、特に、以下のフレームにおける病変；：虚血性病変、例えば、下肢動脈の虚血性病変、心筋梗塞、脳血管障害、強皮症、又はレイノー病、の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用である。
【００５９】
内皮細胞の増殖の活性化は、内皮細胞を適切な培地に置き、次いで全細胞数を数えることで測定することができる。
【００６０】
内皮細胞の遊走の活性化は、細胞のシート（芝生）に「傷」をつけ、次いで細胞を試験すべきタンパク質、又はヌクレオチド配列、又は抗イディオタイプ抗体の存在下でインキュベートすることで測定することが可能である。次いで、傷のところへ遊走した細胞数を数える。
【００６１】
本発明は、
−  前記で定義したタンパク質、
−  前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  前記で定義した抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用であって、周皮細胞又は平滑筋細胞の、消耗に関連するか又は消耗により引き起こされる、非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用に関する。
【００６２】
本発明は、
−  前記で定義したタンパク質、
−  前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体、
の使用であって、周皮細胞又は平滑筋細胞の、消耗に関連するか又は消耗により引き起こされる、非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用に関する。
【００６３】
本発明に記載された使用は、周皮細胞又は平滑筋細胞の消耗に関連ないしそれにより引き起こされた非癌性病変であり、それは周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖の活性化を必要とすることを特徴とし、これらの病変は、
−  加齢性黄斑変性症、
−  脈絡膜新生血管性複雑近視、
−  糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、
−  血管新生緑内障（角膜の、網膜のなど）、
−  特に、移植拒絶における角膜血管新生、
−  リューマチ性多発性関節炎、
−  乾癬、特に、乾癬性多発性関節炎、
−  血管腫、
−  アテローム性動脈硬化症、
−  肥満症、
−  腸奇形、
−  クローン病、
−  カダシルを例とする、血管性、皮質下血管性認知症、
−  アルツハイマー病、
−  変性骨病変及び骨折、及び
−  動脈瘤及び血管解離
から選択されることを特徴とする。
【００６４】
好適な実施態様によれば、本発明に記載される使用は、周皮細胞又は平滑筋細胞の消耗に関連し、それにより引き起こされた非癌性病変であり、それは周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖又は遊走の活性化を必要とすることを特徴とするが、その病変は、
−  糖尿病性網膜症、
−  腸奇形、
−  クローン病、
−  アテローム性動脈硬化症、
−  肥満症、
−  血管性認知症（例えば、アルツハイマー病）、
−  変性骨病変及び骨折、及び
−  動脈瘤及び血管解離、
から選択される。
【００６５】
また、本発明は前記で定義した使用に関し、それは周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖又は遊走の活性化を、増殖又は遊走テストで測定することを特徴とし、また、この活性化活性は、前記で定義したタンパク質、又はヌクレオチド配列又は抗イディオタイプ抗体の非存在下で得られた活性の少なくとも１２０％に相当することを特徴とする。
【００６６】
この特性は、細胞療法を実施する目的で、任意の前駆細胞又は幹細胞のサンプルから平滑筋細胞又は周皮細胞を拡大増殖させることに使用することができる。
【００６７】
周皮細胞又は平滑筋細胞の遊走の活性化は、細胞のシート（芝生）の上に「傷」をつけ、次いで細胞をテストすべきタンパク質、又はヌクレオチド配列又は抗イディオタイプ抗体の存在下で培養することで測定することができる。次いで、傷に向かい遊走した細胞数が測定される。
【００６８】
周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖の活性化は、周皮細胞又は平滑筋細胞を適切な培地、特に、血清を含まないＤＭＥＭ培地に置いて、次いで全細胞数を数えることで測定することができる。
【００６９】
本発明は、癌の治療を意図した薬剤の製造のために、化学療法剤と併用する、
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は
−  特に、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列、又は配列番号：５２８の配列により示される、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片、
の使用に関する。
【００７０】
本発明は、同時に又は個別に、又は長時間にわたり使用される癌病変の治療を意図した薬剤の製造のために、化学療法剤と併用する、
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は
−  特に、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列、又は配列番号：５２８の配列により示される、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片、
の併用産物に関する。
【００７１】
本発明は、
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は
−  特に、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列、又は配列番号：５２８の配列により示される、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片を含む併用産物に関し、前記で定義した癌性又は非癌性病変の治療又は予防を意図した、同時に又は個別に、又は長時間にわたり使用するための、ジェネンティク及びロシュの開発によるアバスチン（ベバシズマブ）、アイテクおよびファイザーにより開発されたマクゲン（ペガプタニブ）及びジェネンティク及びノバルティスにより開発されたルセンチス（ラニビズマブ）、又は任意の他の抗ＶＥＧＦ薬、から選択される抗血管新生剤を併用する組合せ産物である。
【００７２】
本発明は、
−  配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、又は
−  特に、配列番号：２ｑ（ｑは１８７から２４８まで変化する）の配列の１つ、又は配列番号：５２６の配列、又は配列番号：５２８の配列により示される、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の前記配列の断片、を含む併用産物に関し、前記で定義した癌性又は非癌性病変の予防又は治療を意図した、ジェネンティク及びロシュの開発によるアバスチン（ベバシズマブ）、アイテクおよびファイザーにより開発されたマクゲン（ペガプタニブ）及びジェネンティク及びノバルティスにより開発されたルセンチス（ラニビズマブ）、又は任意の抗ＶＥＧＦ薬から選択される抗血管新生剤を併用する組合せ産物である。
【００７３】
また、本発明は抗血管新生薬及び化学療法剤の併用に関する。
【００７４】
特に、本発明は、癌の治療を意図した薬剤の製造のために、化学療法剤との併用による、ネオゲニンリガンド、又は、もし適切であれば、ネオゲニンリガンドをコードするレオチド配列、又は前記リガンドをコードするベクターを含むヌクレオチド配列、又は前記ベクターにより形質転換された宿主細胞、又は前記リガンドに対する抗イディオタイプ抗体の使用に関する。
【００７５】
前記ネオゲニンリガンド又は前記ヌクレオチド配列又は前記ベクター又は前記宿主細胞又は前記抗イディオタイプ抗体から選択された抗血管新生薬と化学療法剤との併用は、相乗効果及び通常の抗癌療法に対する低減された耐性の誘導を可能にする。
【００７６】
本発明に記載の好ましい化学療法剤としては、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、クラドリビン、フルオロウラシル、シタラビン、アントラサイクリン、シスプラチン、シクロホスファミド、フルダラビン、ゲムスタビン、アロマターゼ阻害剤、イリノテカン、ナベルビン、オキザリプラチン、タキソフェン(taxofene)、タキソール及びタキソテールに言及することができる。
【００７７】
本発明の好適な実施態様によれば、本発明に記載の使用は、リガンド又はヌクレオチド配列又は抗イディオタイプ抗体が、
−  次のタンパク質の１つ：配列番号：５０２又は配列番号：５０４に示されるネトリン１、又は配列番号：５０６又は配列番号：５０８に示されるネトリンＧ１、配列番号：５１０に示されるネトリン３、配列番号：４９８又は配列番号：５００に示されるネトリン４、配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０に示されるＲＧＭ分子の１つ、又は配列番号：５２２又は配列番号：５２４に示される変異ネトリン４、
−  又は、特に、配列番号：２ｎ（ｎは１から２４８まで変化する）の配列の１つに示される、これらタンパク質の１つの断片、
−  又は、前記タンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列で、それは特に以下のヌクレオチド配列である：配列番号：５０１、配列番号：５０３、配列番号：５０５、配列番号：５０７、配列番号：５０９、配列番号：４９７、配列番号：４９９、配列番号：５１１、配列番号：５１３、配列番号：５１５、配列番号：５１７、配列番号：５１９、配列番号：５２１、配列番号：５２３、又は配列番号：２ｎ−１（ｎは１から２４８まで変化する）の配列の１つ、
−  又は、前記で定義したタンパク質の１つの抗イディオタイプ抗体、
から選択されることを特徴とする。
【００７８】
配列番号：２ｎの前記配列は、配列番号：２から配列番号：４９６のタンパク質配列に相当する。
【００７９】
配列番号：２ｎの前記配列は次のタンパク質配列に相当する：配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４、配列番号：１２６、配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１４４、配列番号：１４６、配列番号：１４８、配列番号：１５０、配列番号：１５２、配列番号：１５４、配列番号：１５６、配列番号：１５８、配列番号：１６０、配列番号：１６２、配列番号：１６４、配列番号：１６６、配列番号：１６８、配列番号：１７０、配列番号：１７２、配列番号：１７４、配列番号：１７６、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８２、配列番号：１８４、配列番号：１８６、配列番号：１８８、配列番号：１９０、配列番号：１９２、配列番号：１９４、配列番号：１９６、配列番号：１９８、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２０４、配列番号：２０６、配列番号：２０８、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１６、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４、配列番号：２３６、配列番号：２３８、配列番号：２４０、配列番号：２４２、配列番号：２４４、配列番号：２４６、配列番号：２４８、配列番号：２５０、配列番号：２５２、配列番号：２５４、配列番号：２５６、配列番号：２５８、配列番号：２６０、配列番号：２６２、配列番号：２６４、配列番号：２６６、配列番号：２６８、配列番号：２７０、配列番号：２７２、配列番号：２７４、配列番号：２７６、配列番号：２７８、配列番号：２８０、配列番号：２８２、配列番号：２８４、配列番号：２８６、配列番号：２８８、配列番号：２９０、配列番号：２９２、配列番号：２９４、配列番号：２９６、配列番号：２９８、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０４、配列番号：３０６、配列番号：３０８、配列番号：３１０、配列番号：３１２、配列番号：３１４、配列番号：３１６、配列番号：３１８、配列番号：３２０、配列番号：３２２、配列番号：３２４、配列番号：３２６、配列番号：３２８、配列番号：３３０、配列番号：３３２、配列番号：３３４、配列番号：３３６、配列番号：３３８、配列番号：３４０、配列番号：３４２、配列番号：３４４、配列番号：３４６、配列番号：３４８、配列番号：３５０、配列番号：３５２、配列番号：３５４、配列番号：３５６、配列番号：３５８、配列番号：３６０、配列番号：３６２、配列番号：３６４、配列番号：３６６、配列番号：３６８、配列番号：３７０、配列番号：３７２、配列番号：３７４、配列番号：３７６、配列番号：３７８、配列番号：３８０、配列番号：３８２、配列番号：３８４、配列番号：３８６、配列番号：３８８、配列番号：３９０、配列番号：３９２、配列番号：３９４、配列番号：３９６、配列番号：３９８、配列番号：４００、配列番号：４０２、配列番号：４０４、配列番号：４０６、配列番号：４０８、配列番号：４１０、配列番号：４１２、配列番号：４１４、配列番号：４１６、配列番号：４１８、配列番号：４２０、配列番号：４２２、配列番号：４２４、配列番号：４２６、配列番号：４２８、配列番号：４３０、配列番号：４３２、配列番号：４３４、配列番号：４３６、配列番号：４３８、配列番号：４４０、配列番号：４４２、配列番号：４４４、配列番号：４４６、配列番号：４４８、配列番号：４５０、配列番号：４５２、配列番号：４５４、配列番号：４５６、配列番号：４５８、配列番号：４６０、配列番号：４６２、配列番号：４６４、配列番号：４６６、配列番号：４６８、配列番号：４７０、配列番号：４７２、配列番号：４７４、配列番号：４７６、配列番号：４７８、配列番号：４８０、配列番号：４８２、配列番号：４８４、配列番号：４８６、配列番号：４８８、配列番号：４９０、配列番号：４９２、配列番号：４９４、又は、配列番号：４９６．
【００８０】
配列番号：２ｎ−１の前記配列は配列番号：１から配列番号：４９５のヌクレオチド配列に相当する。
【００８１】
配列番号：２ｎ−１の前記配列は配列番号：２ｎの前記タンパク質配列をコードし、次のヌクレオチド配列に相当：配列番号：２をコードする配列番号：１、配列番号：４をコードする配列番号：３、配列番号：６をコードする配列番号：５、配列番号：８をコードする配列番号：７、配列番号：１０をコードする配列番号：９、配列番号：１２をコードする配列番号：１１、配列番号：１４をコードする配列番号：１３、配列番号：１６をコードする配列番号：１５、配列番号：１８をコードする配列番号：１７、配列番号：２０をコードする配列番号：１９、配列番号：２２をコードする配列番号：２１、配列番号：２４をコードする配列番号：２３、配列番号：２６をコードする配列番号：２５、配列番号：２８をコードする配列番号：２７、配列番号：３０をコードする配列番号：２９、配列番号：３２をコードする配列番号：３１、配列番号：３４をコードする配列番号：３３、配列番号：３６をコードする配列番号：３５、配列番号：３８をコードする配列番号：３７、配列番号：４０をコードする配列番号：３９、配列番号：４２をコードする配列番号：４１、配列番号：４４をコードする配列番号：４３、配列番号：４６をコードする配列番号：４５、配列番号：４８をコードする配列番号：４７、配列番号：５０をコードする配列番号：４９、配列番号：５２をコードする配列番号：５１、配列番号：５４をコードする配列番号：５３、配列番号：５６をコードする配列番号：５５、配列番号：５８をコードする配列番号：５７、配列番号６０をコードする配列番号：５９、配列番号：６２をコードする配列番号：６１、配列番号：６４をコードする配列番号：６３、配列番号：６６をコードする配列番号：６５、配列番号：６８をコードする配列番号：６７、配列番号：７０をコードする配列番号：６９、配列番号：７２をコードする配列番号：７１、配列番号：７４をコードする配列番号：７３、配列番号：７６をコードする配列番号：７５、配列番号：７８をコードする配列番号：７７、配列番号：８０をコードする配列番号：７９、配列番号：８２をコードする配列番号：８１、配列番号：８４をコードする配列番号：８３、配列番号：８６をコードする配列番号：８５、配列番号：８８をコードする配列番号：８７、配列番号：９０をコードする配列番号：８９、配列番号：９２をコードする配列番号：９１、配列番号：９４をコードする配列番号：９３、配列番号：９６をコードする配列番号：９５、配列番号：９８をコードする配列番号：９７、配列番号：１００をコードする配列番号：９９、配列番号：１０２をコードする配列番号：１０１、配列番号：１０４をコードする配列番号：１０３、配列番号：１０６をコードする配列番号：１０５、配列番号：１０８をコードする配列番号：１０７、配列番号：１１０をコードする配列番号：１０９、配列番号：１１２をコードする配列番号：１１１、配列番号：１１４をコードする配列番号：１１３、配列番号：１１６をコードする配列番号：１１５、配列番号：１１８をコードする配列番号：１１７、配列番号：２００をコードする配列番号：１１９、配列番号：１２２をコードする配列番号：１２１、配列番号：１２４をコードする配列番号：１２３、配列番号：１２６をコードする配列番号：１２５、配列番号：１２８をコードする配列番号：１２７、配列番号：１３０をコードする配列番号：１２９、配列番号：１３２をコードする配列番号：１３１、配列番号：１３４をコードする配列番号：１３３、配列番号：１３６をコードする配列番号：１３５、配列番号：１３８をコードする配列番号：１３７、配列番号：１４０をコードする配列番号：１３９、配列番号：１４２をコードする配列番号：１４１、配列番号：１４４をコードする配列番号：１４３、配列番号：１４６をコードする配列番号：１４５、配列番号：１４８をコードする配列番号：１４７、配列番号：１５０をコードする配列番号：１４９、配列番号：１５２をコードする配列番号：１５１、配列番号：１５４をコードする配列番号：１５３、配列番号：１５６をコードする配列番号：１５５、配列番号：１５８をコードする配列番号：１５７、配列番号：１６０をコードする配列番号：１５９、配列番号：１６２をコードする配列番号：１６１、配列番号：１６４をコードする配列番号：１６３、配列番号：１６６をコードする配列番号：１６５、配列番号：１６８をコードする配列番号：１６７、配列番号：１７０をコードする配列番号：１６９、配列番号：１７２をコードする配列番号：１７１、配列番号：１７４をコードする配列番号：１７３、配列番号：１７６をコードする配列番号：１７５、配列番号：１７８をコードする配列番号：１７７、配列番号：１８０をコードする配列番号：１７９、配列番号：１８２をコードする配列番号：１８１、配列番号：１８４をコードする配列番号：１８３、配列番号：１８６をコードする配列番号：１８５、配列番号：１８８をコードする配列番号：１８７、配列番号：１９０をコードする配列番号：１８９、配列番号：１９２をコードする配列番号：１９１、配列番号：１９４をコードする配列番号：１９３、配列番号：１９６をコードする配列番号：１９５、配列番号：１９８をコードする配列番号：１９７、配列番号：２００をコードする配列番号：１９９、配列番号：２０２をコードする配列番号：２０１、配列番号：２０４をコードする配列番号：２０３、配列番号：２０６をコードする配列番号：２０５、配列番号：２０８をコードする配列番号：２０７、配列番号：２１０をコードする配列番号：２０９、配列番号：２１２をコードする配列番号：２１１、配列番号：２１４をコードする配列番号：２１３、配列番号：２１６をコードする配列番号：２１５、配列番号：２１８をコードする配列番号：２１７、配列番号：２２０をコードする配列番号：２１９、配列番号：２２２をコードする配列番号：２２１、配列番号：２２４をコードする配列番号：２２３、配列番号：２２６をコードする配列番号：２２５、配列番号：２２８をコードする配列番号：２２７、配列番号：２３０をコードする配列番号：２２９、配列番号：２３２をコードする配列番号：２３１、配列番号：２３４をコードする配列番号：２３３、配列番号：２３６をコードする配列番号：２３５、配列番号：２３８をコードする配列番号：２３７、配列番号：２４０をコードする配列番号：２３９、配列番号：２４２をコードする配列番号：２４１、配列番号：２４４をコードする配列番号：２４３、配列番号：２４６をコードする配列番号：２４５、配列番号：２４８をコードする配列番号：２４７、配列番号：２５０をコードする配列番号：２４９、配列番号：２５２をコードする配列番号：２５１、配列番号：２５４をコードする配列番号：２５３、配列番号：２５６をコードする配列番号：２５５、配列番号：２５８をコードする配列番号：２５７、配列番号：２６０をコードする配列番号：２５９、配列番号：２６２をコードする配列番号：２６１、配列番号：２６４をコードする配列番号：２６３、配列番号：２６６をコードする配列番号：２６５、配列番号：２６８をコードする配列番号：２６７、配列番号：２７０をコードする配列番号：２６９、配列番号：２７２をコードする配列番号：２７１、配列番号：２７４をコードする配列番号：２７３、配列番号：２７６をコードする配列番号：２７５、配列番号：２７８をコードする配列番号：２７７、配列番号：２８０をコードする配列番号：２７９、配列番号：２８２をコードする配列番号：２８１、配列番号：２８４をコードする配列番号：２８３、配列番号：２８６をコードする配列番号：２８５、配列番号：２８８をコードする配列番号：２８７、配列番号：２９０をコードする配列番号：２８９、配列番号：２９２をコードする配列番号：２９１、配列番号：２９４をコードする配列番号：２９３、配列番号：２９６をコードする配列番号：２９５、配列番号：２９８をコードする配列番号：２９７、配列番号：３００をコードする配列番号：２９９、配列番号：３０２をコードする配列番号：３０１、配列番号：３０４をコードする配列番号：３０３、配列番号：３０６をコードする配列番号：３０５、配列番号：３０８をコードする配列番号：３０７、配列番号：３１０をコードする配列番号：３０９、配列番号：３１２をコードする配列番号：３１１、配列番号：３１４をコードする配列番号：３１３、配列番号：３１６をコードする配列番号：３１５、配列番号：３１８をコードする配列番号：３１７、配列番号：３２０をコードする配列番号：３１９、配列番号：３２２をコードする配列番号：３２１、配列番号：３２４をコードする配列番号：３２３、配列番号：３２６をコードする配列番号：３２５、配列番号：３２８をコードする配列番号：３２７、配列番号：３３０をコードする配列番号：３２９、配列番号：３３２をコードする配列番号：３３１、配列番号：３３４をコードする配列番号：３３３、配列番号：３３６をコードする配列番号：３３５、配列番号：３３８をコードする配列番号：３３７、配列番号：３４０をコードする配列番号：３３９、配列番号：３４２をコードする配列番号：３４１、配列番号：３４４をコードする配列番号：３４３、配列番号：３４６をコードする配列番号：３４５、配列番号：３４８をコードする配列番号：３４７、配列番号：３５０をコードする配列番号：３４９、配列番号：３５２をコードする配列番号：３５１、配列番号：３５４をコードする配列番号：３５３、配列番号：３５６をコードする配列番号：３５５、配列番号：３５８をコードする配列番号：３５７、配列番号：３６０をコードする配列番号：３５９、配列番号：３６２をコードする配列番号：３６１、配列番号：３６４をコードする配列番号：３６３、配列番号：３６６をコードする配列番号：３６５、配列番号：３６８をコードする配列番号：３６７、配列番号：３７０をコードする配列番号：３６９、配列番号：３７２をコードする配列番号：３７１、配列番号：３７４をコードする配列番号：３７３、配列番号：３７６をコードする配列番号：３７５、配列番号：３７８をコードする配列番号：３７７、配列番号：３８０をコードする配列番号：３７９、配列番号：３８２をコードする配列番号：３８１、配列番号：３８４をコードする配列番号：３８３、配列番号：３８６をコードする配列番号：３８５、配列番号：３８８をコードする配列番号：３８７、配列番号：３９０をコードする配列番号：３８９、配列番号：３９２をコードする配列番号：３９１、配列番号：３９４をコードする配列番号：３９３、配列番号：３９６をコードする配列番号：３９５、配列番号：３９８をコードする列番号：３９７、配列番号：４００をコードする配列番号：３９９、配列番号：４０２をコードする配列番号：４０１、配列番号：４０４をコードする配列番号：４０３、配列番号：４０６をコードする配列番号：４０５、配列番号：４０８をコードする配列番号：４０７、配列番号：４１０をコードする配列番号：４０９、配列番号：４１２をコードする配列番号：４１１、配列番号：４１４をコードする配列番号：４１３、配列番号：４１６をコードする配列番号：４１５、配列番号：４１８をコードする配列番号：４１７、配列番号：４２０をコードする配列番号：４１９、配列番号：４２２をコードする配列番号：４２１、配列番号：４２４をコードする配列番号：４２３、配列番号：４２６をコードする配列番号：４２５、配列番号：４２８をコードする配列番号：４２７、配列番号：４３０をコードする配列番号：４２９、配列番号：４３２をコードする配列番号：４３１、配列番号：４３４をコードする配列番号：４３３、配列番号：４３６をコードする配列番号：４３５、配列番号：４３８をコードする配列番号：４３７、配列番号：４４０をコードする配列番号：４３９、配列番号：４４２をコードする配列番号：４４１、配列番号：４４４をコードする配列番号：４４３、配列番号：４４６をコードする配列番号：４４５、配列番号：４４８をコードする配列番号：４４７、配列番号：４５０をコードする配列番号：４４９、
配列番号：４５２をコードする配列番号：４５１、配列番号：４５４をコードする配列番号：４５３、配列番号：４５６をコードする配列番号：４５５、配列番号：４５８をコードする配列番号：４５７、配列番号：４６０をコードする配列番号：４５９、配列番号：４６２をコードする配列番号：４６１、配列番号：４６４をコードする配列番号：４６３、配列番号：４６６をコードする配列番号：４６５、配列番号：４６８をコードする配列番号：４６７、配列番号：４７０をコードする配列番号：４６９、配列番号：４７２をコードする配列番号：４７１、配列番号：４７４をコードする配列番号：４７３、配列番号：４７６をコードする配列番号：４７５、配列番号：４７８をコードする配列番号：４７７、配列番号：４８０をコードする配列番号：４７９、配列番号：４８２をコードする配列番号：４８１、配列番号：４８４をコードする配列番号：４８３、配列番号：４８６をコードする配列番号：４８５、配列番号：４８８をコードする配列番号：４８７、配列番号：４９０をコードする配列番号：４８９、配列番号：４９２をコードする配列番号：４９１、配列番号：４９４をコードする配列番号：４９３、又は配列番号：４９６をコードする配列番号：４９５。
【００８２】
配列番号：４９８の配列は配列番号：４９７のヌクレオチド配列でコードされるヒトネトリン４タンパク質に相当し、そして配列番号：５００の配列は、配列番号：４９９のヌクレオチド配列でコードされるシグナルペプチドを有しない前記ヒトネトリン４タンパク質に相当する。配列番号：４９８の配列は６２８アミノ酸を含み、そして配列番号：５００の配列は６０９アミノ酸を含み、配列番号：４９８の配列の２０残基から６２８残基までの領域の断片に相当する。
【００８３】
配列番号：５０２の配列は、配列番号：５０１のヌクレオチド配列よりコードされているヒトネトリン１タンパク質に相当し、配列番号：５０４の配列は、配列番号：５０３のヌクレオチド配列でコードされるシグナルペプチドを有しない前記ヒトネトリン１タンパク質に相当する。配列番号：５０２配列は６０４アミノ酸を含み、配列番号：５０４の配列は５８０アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の２５残基から６０４残基までの範囲の断片に相当する。
【００８４】
配列番号：５０６の配列は、配列番号：５０５のヌクレオチド配列によりコードされるヒトネトリンＧ１タンパク質に相当し、配列番号：５０８の配列は配列番号：５０７のヌクレオチド配列でコードされるシグナルペプチドを有しない前記ヒトネトリンＧ１タンパク質に相当する。配列番号：５０６の配列は４３８アミノ酸を含み、配列番号：５０８の配列は４１０アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の２９残基から４３８残基までの範囲の断片に相当する。
【００８５】
配列番号：５１０の配列は、配列番号：５０９のヌクレオチド配列によりコードされるヒトネトリン３タンパク質に相当する。配列番号：５１０の配列は５８０アミノ酸を含む。
【００８６】
配列番号：５１２の配列は、配列番号：５１１のヌクレオチド配列によりコードされるＲＧＭ−Ａ分子に相当する。配列番号：５１２の配列は４５０アミノ酸を含む。
【００８７】
配列番号：５１４の配列は、配列番号：５１３のヌクレオチド配列によりコードされるＲＧＭ−Ｂ分子に相当し、配列番号：５１８の配列は配列番号：５１７のヌクレオチド配列でコードされるシグナルペプチドを有しない前記ＲＧＭ−Ｂ分子タンパク質に相当する。配列番号：５１４の配列は４３７アミノ酸を含み、配列番号：５１８の配列は３９２アミノ酸含み、そして配列番号：５１４の配列の４６残基から４３７残基までの範囲の断片に相当する。
【００８８】
配列番号：５１６の配列は、配列番号：５１５のヌクレオチド配列によりコードされるＲＧＭ−Ｃ分子に相当し、配列番号：５２０の配列は配列番号：５１９のヌクレオチド配列でコードされるシグナルペプチドを有しない前記ＲＧＭ−Ｃ分子タンパク質に相当する。配列番号：５１６の配列は４２６アミノ酸を含み、配列番号：５２０の配列は３９１アミノ酸含み、そして配列番号：５１６の配列の３６残基から４２６残基までの範囲の断片に相当する。
【００８９】
配列番号：３６０の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のラミニン型断片（特定のインテグリンに結合する細胞外マトリックスのタンパク質）に相当し、前記断片は配列番号：３５９のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２６０アミノ酸含み、そして配列番号：４９８の配列の１残基から２６０残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９０】
配列番号：３６２の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のＥＧＦ型断片（ＥＧＦ因子繰り返しドメイン）に相当し、前記断片は配列番号：３６１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２５５アミノ酸含み、そして配列番号：４９８の配列の２６１残基から５１５残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９１】
配列番号：３６４の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のへパリンに結合する断片に相当し、前記断片は配列番号：３６３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１１３アミノ酸含み、そして配列番号：４９８の配列の５１６残基から６２８残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９２】
配列番号：３６６の配列は、配列番号：３６４の配列を欠失したヒトネトリン４タンパク質の断片に相当し、前記断片は配列番号：３６５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５１５アミノ酸含み、そして配列番号：４９８の配列の１残基から５１５残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９３】
配列番号：８の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のラミニン型断片に相当し、前記断片は配列番号：７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２２９アミノ酸含み、そして配列番号：４９８の配列の３２残基から２６０残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９４】
配列番号：２の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は６０アミノ酸を含み、そして配列番号：４９８の配列の２６１残基から３２０残基の範囲までのネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９５】
配列番号：４の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５６アミノ酸を含み、そして配列番号：４９８の配列の３３２残基から３８７残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９６】
配列番号：６の配列は、ヒトネトリン４タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５２アミノ酸を含み、そして配列番号：４９８の配列の３９４残基から４４５残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【００９７】
配列番号：１０から配列番号：１２６のタンパク質配列及び配列番号：３６８及び配列番号：３７０のタンパク質配列に相当し、並びに配列番号：９から配列番号：１２５のヌクレオチド配列及び配列番号：３６７と配列番号：３６９のヌクレオチド配列に相当する、ネトリン４タンパク質の断片は次の表に示す：
【表２】
2008520222.tif 000004
2008520222.tif 000005
【００９８】
配列番号：１２８の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のラミニン型断片（特定のインテグリンに結合する細胞外マトリックスのタンパク質）に相当し、前記断片は配列番号：１２７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２８３アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の１残基から２８３残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【００９９】
配列番号：１３０の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のＥＧＦ型断片（ＥＧＦ因子繰り返しドメイン）に相当し、前記断片は配列番号：１２９のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２０４アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の２８４残基から４８７残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【０１００】
配列番号：１３２の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のへパリンに結合する断片に相当し、前記断片は配列番号：１３１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１１７アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の４８８残基から６０４残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【０１０１】
配列番号：３７２の配列は、配列番号：１３２の配列を欠失したヒトネトリン１タンパク質の断片に相当し、前記断片は配列番号：３７１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は４８７アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の１残基から４８７残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【０１０２】
配列番号：１４０の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のラミニン型断片に相当し、前記断片は配列番号：１３９のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２３５アミノ酸含み、そして配列番号：５０２の配列の４９残基から２８３残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【０１０３】
配列番号：１３４の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：１３３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は４８アミノ酸を含み、そして配列番号：５０２の配列の２８４残基から３３１残基までの範囲のネトリン４タンパク質断片に相当する。
【０１０４】
配列番号：１３６の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：１３５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５６アミノ酸を含み、そして配列番号：５０２の配列の３４１残基から３９６残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【０１０５】
配列番号：１３８の配列は、ヒトネトリン１タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：１３７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は４８アミノ酸を含み、そして配列番号：５０２の配列の４０３残基から４５０残基までの範囲のネトリン１タンパク質断片に相当する。
【０１０６】
配列番号：１４２から配列番号：２６２のタンパク質配列に相当し、そして配列番号：１４１から配列番号：２６１のヌクレオチド配列に相当する、ネトリン１タンパク質の断片は次の表に示す：
【表３】
2008520222.tif 000006
2008520222.tif 000007
【０１０７】
配列番号：２６４の配列は、ヒトネトリンＧ１タンパク質のラミニン型断片（特定のインテグリンに結合する細胞外マトリックスのタンパク質）に相当し、前記断片は配列番号：２６３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２９５アミノ酸含み、そして配列番号：５０６の配列の１残基から２９５残基までの範囲のネトリンＧ１タンパク質断片に相当する。
【０１０８】
配列番号：２６６の配列は、ヒトネトリンＧ１タンパク質のＥＧＦ型断片（ＥＧＦ因子繰り返しドメイン）に相当し、前記断片は配列番号：２６５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１４３アミノ酸を含み、そして配列番号：５０６の配列の２９６残基から４３８残基までの範囲のネトリンＧ１タンパク質断片に相当する。
【０１０９】
配列番号：２６８の配列は、ヒトネトリンＧ１タンパク質のラミニン型断片に相当し、前記断片は配列番号：２６７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２２５アミノ酸含み、そして配列番号：５０６の配列の７１残基から２９５残基までの範囲のネトリンＧ１タンパク質断片に相当する。
【０１１０】
配列番号：２７０の配列は、ヒトネトリンＧ１タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：２６９のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は４７アミノ酸を含み、そして配列番号：５０６の配列の２９６残基から３４２残基までの範囲のネトリンＧ１タンパク質断片に相当する。
【０１１１】
配列番号：２７２の配列は、ヒトネトリンＧ１タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：２７１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は３７アミノ酸を含み、そして配列番号：５０６の配列の３７３残基から４０９残基までの範囲のネトリンＧ１タンパク質断片に相当する。
【０１１２】
配列番号：２７４から配列番号：２９６のタンパク質配列に相当し、そして配列番号：２７３から配列番号：２９５のヌクレオチド配列に相当する、ネトリンＧ１タンパク質の断片は次の表に示す：
【表４】
2008520222.tif 000008
【０１１３】
配列番号：２９８の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のラミニン型断片（特定のインテグリンに結合する細胞外マトリックスのタンパク質）に相当し、前記断片は配列番号：２９７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２５３アミノ酸含み、そして配列番号：５１０の配列の１残基から２５３残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１４】
配列番号：３００の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のラミニン型断片に相当し、前記断片は配列番号：２９９のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は２２０アミノ酸含み、そして配列番号：５１０の配列の３４残基から２５３残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１５】
配列番号：３０２の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のＥＧＦ型断片（ＥＧＦ因子繰り返しドメイン）に相当し、前記断片は配列番号：３０１のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１８０アミノ酸を含み、そして配列番号：５１０の配列の２５４残基から４３３残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１６】
配列番号：３０４の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：３０３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は４６アミノ酸を含み、そして配列番号：５１０の配列の２５４残基から２９９残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１７】
配列番号：３０６の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のＥＧＦ型断片に相当し、前記断片は配列番号：３０５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は５０アミノ酸を含み、そして配列番号：５１０の配列の３７３残基から４２２残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１８】
配列番号：３０８の配列は、ヒトネトリン３タンパク質のへパリンに結合する断片に相当し、前記断片は配列番号：３０７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１４８アミノ酸含み、そして配列番号：５１０の配列の４３３残基から５８０残基までの範囲のネトリン３タンパク質断片に相当する。
【０１１９】
配列番号：３１０から配列番号：３５２のタンパク質配列に相当し、そして配列番号：３０９から配列番号：３５１のヌクレオチド配列に相当する、ネトリン３タンパク質の断片は次の表に示す：
【表５】
2008520222.tif 000009
【０１２０】
配列番号：３５４の配列は、ＲＧＭ−Ａタンパク質に相当し、前記断片は配列番号：３５３のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１１１アミノ酸含み、そして配列番号：５１２の配列の１８０残基から２９０残基までの範囲のＲＧＭ−Ａタンパク質断片に相当する。
【０１２１】
配列番号：３５６の配列は、ＲＧＭ−Ｂタンパク質に相当し、前記断片は配列番号：３５５のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１１１アミノ酸含み、そして配列番号：５１４の配列の１８０残基から２９０残基までの範囲のＲＧＭ−Ｂタンパク質断片に相当する。
【０１２２】
配列番号：３５８の配列は、ＲＧＭ−Ｃタンパク質に相当し、前記断片は配列番号：３５７のヌクレオチド配列によりコードされる。この断片は１１１アミノ酸含み、そして配列番号：５１６の配列の１８０残基から２９０残基までの範囲のＲＧＭ−Ｃタンパク質断片に相当する。
【０１２３】
また、本発明は、少なくとも１つのネオゲニンリガンド、又は、もし適切であれば、特に、
−  次のタンパク質の１つ：配列番号：５０２又は配列番号：５０４で示されるネトリン１、配列番号：５０６または配列番号：５０８で示されるネトリンＧ１、配列番号：５１０で示されるネトリン３、配列番号：４９８又は配列番号：５００で示されるネトリン４、配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０で示されるＲＧＭ分子の１つ、又は配列番号：５２２又は配列番号：５２４で示される変異ネトリン４、
−  又は、特に、配列番号：２ｎ（ｎは１から２４８まで変化する）の配列の１つに示される、これらタンパク質の１つの断片、
−  又は、特に、次のヌクレオチド配列の１つに示される、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列：配列番号：５０１、配列番号：５０３、配列番号：５０５、配列番号：５０７、配列番号：５０９、配列番号：４９７、配列番号：４９９、配列番号：５１１、配列番号：５１３、配列番号：５１５、配列番号：５１７、配列番号：５１９、配列番号：５２１、配列番号：５２３、又は配列番号：２ｎ−１（ｎは１から２４８まで変化する）の配列の１つ、
−  又は、前記で定義したタンパク質の１つの抗イディオタイプ抗体、
及び、特に次から選択される、少なくとも１つの化学療法剤：ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、クラドリビン、フルオロウラシル、シタラビン、アントラサイクリン、シスプラチン、シクロホスファミド、フルダラビン、ゲムスタビン、アロマターゼ阻害剤、イリノテカン、ナベルビン、オキザリプラチン、タキソフェン（taxofene）、タキソール、又はタキソテール、から選択される、ネオゲニンリガンドをコードするヌクレオチド配列を含む、組合せ産物に関し、これらは癌の治療を意図した、同時又は個別の又は、長時間にわたる使用のためのものである。
【０１２４】
本発明の枠組みの中で、抗血管新生薬の用量は約１０から約２０，０００μｇ／ｋｇ体重を含む。注射間の時間は、特に、アバスチンの名前で最近市販のものが使用可能な抗血管新生薬の用量と類似で決定される。
【０１２５】
本発明は新規ネトリン４断片に関する。
【０１２６】
特に、本発明は、
＊  配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）の配列、又は
＊  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、但しその由来する配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、前記配列より由来する任意の配列、又は
＊  好ましくは、その相同配列が抗血管新生活性を有していることを条件として、配列番号：４９８のアミノ酸２６１位から５１５位までの間の領域と約５０％の同一性を有する前記配列の１つに相同な任意の配列、
の１つを含むか、又はその１つにより構成されていることを特徴とする、新規ネトリン４タンパク質に関する。
【０１２７】
前記配列番号：２ｐの配列は配列番号：２から配列番号：１２６までのタンパク質配列、すなわち、次の前記で定義したタンパク質配列に相当する：配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００、配列番号：１０２、配列番号：１０４、配列番号：１０６、配列番号：１０８、配列番号：１１０、配列番号：１１２、配列番号：１１４、配列番号：１１６、配列番号：１１８、配列番号：１２０、配列番号：１２２、配列番号：１２４又は配列番号：１２６。
【０１２８】
配列番号：２ｐ断片は、血管新生阻害活性を示す新規ネトリン４断片である。
【０１２９】
配列番号：２ｐ−１の前記配列は配列番号：２ｐの前記タンパク質配列をコードし、次のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：２をコードする配列番号：１、配列番号：４をコードする配列番号：３、配列番号：６をコードする配列番号：５、配列番号：８をコードする配列番号：７、配列番号：１０をコードする配列番号：９、配列番号：１２をコードする配列番号：１１、配列番号：１４をコードする配列番号：１３、配列番号：１６をコードする配列番号：１５、配列番号：１８をコードする配列番号：１７、配列番号：２０をコードする配列番号：１９、配列番号：２２をコードする配列番号：２１、配列番号：２４をコードする配列番号：２３、配列番号：２６をコードする配列番号：２５、配列番号：２８をコードする配列番号：２７、配列番号：３０をコードする配列番号：２９、配列番号：３２をコードする配列番号：３１、配列番号：３４をコードする配列番号：３３、配列番号：３６をコードする配列番号：３５、配列番号：３８をコードする配列番号：３７、配列番号：４０をコードする配列番号：３９、配列番号：４２をコードする配列番号：４１、配列番号：４４をコードする配列番号：４３、配列番号：４６をコードする配列番号：４５、配列番号：４８をコードする配列番号：４７、配列番号：５０をコードする配列番号：４９、配列番号：５２をコードする配列番号：５１、配列番号：５４をコードする配列番号：５３、配列番号：５６をコードする配列番号：５５、配列番号：５８をコードする配列番号：５７、配列番号：６０をコードする配列番号：５９、配列番号：６２をコードする配列番号：６１、配列番号：６４をコードする配列番号：６３、配列番号：６６をコードする配列番号：６５、配列番号：６８をコードする配列番号：６７、配列番号：７０をコードする配列番号：６９、配列番号：７２をコードする配列番号：７１、配列番号：７４をコードする配列番号：７３、配列番号：７６をコードする配列番号：７５、配列番号：７８をコードする配列番号：７７、配列番号：８０をコードする配列番号：７９、配列番号：８２をコードする配列番号：８１、配列番号：８４をコードする配列番号：８３、配列番号：８６をコードする配列番号：８５、配列番号：８８をコードする配列番号：８７、配列番号：９０をコードする配列番号：８９、配列番号：９２をコードする配列番号：９１、配列番号：９４をコードする配列番号：９３、配列番号：９６をコードする配列番号：９５、配列番号：９８をコードする配列番号：９７、配列番号：１００をコードする配列番号：９９、配列番号：１０２をコードする配列番号：１０１、配列番号：１０４をコードする配列番号：１０３、配列番号：１０６をコードする配列番号：１０５、配列番号：１０８をコードする配列番号：１０７、配列番号：１１０をコードする配列番号：１０９、配列番号：１１２をコードする配列番号：１１１、配列番号：１１４をコードする配列番号：１１３、配列番号：１１６をコードする配列番号：１１５、配列番号：１１８をコードする配列番号：１１７、配列番号：１２０をコードする配列番号：１１９、配列番号：１２２をコードする配列番号：１２１、配列番号：１２４をコードする配列番号：１２３、又は配列番号：１２６をコードする配列番号：１２５。
【０１３０】
また、本発明は前記で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１３１】
好適な実施態様によれば、本発明によるヌクレオチド配列は、
−  配列番号：２ｐをコードする配列番号：２ｐ−１のヌクレオチド配列（ｐは１から６３まで変化する）の１つ、
−  又は、遺伝子コードの縮重により前記ヌクレオチド配列の１つに由来し、そして配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）をコードする、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸による置換、欠失、又は追加により、前記で定義した配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）の１つに由来するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、又は、
−  又は、好ましくは、前記で定義した配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）に相同なタンパク質をコードする配列番号：２ｐ−１配列の１つと少なくとも約５０％の同一性を持つ、前記ヌクレオチド配列の１つと相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列と相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列の１つと相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な任意のヌクレオチド配列、
を含むか次の配列により構成されていることを特徴とする。
【０１３２】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、０．５ＸＳＳＣ）、６０℃のハイブリダイゼーション温度、並びに洗浄液（例えば、１％ＳＤＳを添加した０．１ＸＳＳＣ）及び５０℃の洗浄温度に特に相当する。
【０１３３】
また、本発明は組換えベクター（特に、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡ）に関し、これらは前記で定義したヌクレオチド配列、特に、配列番号：２ｐ−１（ｐは１から６３まで変化する）を含む。
【０１３４】
本発明に記載の好適なベクターは、前記核酸、特に、前記ベクターに挿入された配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）でコードされるペプチドを宿主細胞で発現させるのに必要な要素を含む。
【０１３５】
本発明は、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞から選択された宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、特に、前記で定義した組換えベクターを用いて形質転換される。
【０１３６】
また、本発明は、前記で定義したタンパク質、すなわち、特に配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）に示されるネトリン４断片に対して特異的であることを特徴とする抗体に関する。
【０１３７】
また、本発明は有効成分として、
−  ネトリン４断片、好ましくは配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）の１つ、に相当する前記で定義したタンパク質、又は
−  特に、配列番号：２ｐ−１（ｐは１から６３まで変化する）の配列の１つに相当する前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  特に、配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）に対する前記で定義した抗体、
を含む医薬組成物に関する。
【０１３８】
また、本発明は、
−  好ましくは、特に、配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）配列の１つである、ネトリン４断片に相当する前記で定義したタンパク質、又は
−  特に、配列番号：２ｐ−１（ｐは１から６３まで変化する）配列の１つの前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  特に、配列番号：２ｐ（ｐは１から６３まで変化する）配列の１つに対する前記で定義した抗体、
の使用に関し、それは内皮細胞の増殖を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には特に癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病（Castelman’s disease）及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変、のフレームにおけるものが含まれる。
【０１３９】
本発明はＲＧＭ及び新規ＲＧＭ断片の使用に関する。
【０１４０】
特に、本発明は、
−  次の配列を含むか又は次の配列により構成されることを特徴とするタンパク質、
＊  配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０の配列、
＊  その断片が抗血管形成活性を示すことを条件にとし、前記断片が特に約４０から約１５０のアミノ酸を含み、特に配列番号：３５４、配列番号：３５６又は配列番号：３５８の配列の１つに示される、このタンパク質の断片、
＊  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸による置換、欠失、又は追加により、前記で定義した配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０の配列、又は前記で定義した断片、に由来する、但しこの由来配列が抗−血管新生活性を提供することを条件とする、任意の配列、又は
＊  好ましくは、配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０の配列の１８０位から２９０位までを含む領域に少なくとも約５０％の同一性を有する、配列番号：５１２、配列番号：５１４、配列番号：５１６、配列番号：５１８又は配列番号：５２０の配列、または前記で定義した断片に相同な、但しこの相同配列が抗血管新生活性を示すことを条件とする、任意の配列、
−  又は、次のものをコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれにより構成されることを特徴とするヌクレオチド配列：
＊  前記で定義したタンパク質、
＊  又は前記で定義したタンパク質の断片、
＊  又は前記で定義したタンパク質に由来する配列、
＊  又は前記で定義したタンパク質に相同な配列のいずれかで、
特に前記ヌクレオチド配列が、配列番号：５１２をコードする配列番号：５１１ヌクレオチド配列に、又は配列番号：５１４をコードする配列番号：５１３ヌクレオチド配列に、配列番号：５１６をコードする配列番号：５１５ヌクレオチド配列に、配列番号：５１８をコードする配列番号：５１７ヌクレオチド配列に、配列番号：５２０をコードする配列番号：５１９ヌクレオチド配列に、配列番号：３５４をコードする配列番号：３５３ヌクレオチド配列に、配列番号：３５６をコードする配列番号：３５５ヌクレオチド配列に、配列番号：３５８をコードする配列番号：３５７ヌクレオチド配列に、対応し、
−  又は、前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
の使用に関し、それらは内皮細胞の増殖及を阻害することを必要とする非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には特に、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、リューマチ性多発性関節炎、血管腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変のフレームにおけるものが含まれる。
【０１４１】
また、本発明は、
＊  配列番号：３５４、配列番号：３５６又は配列番号：３５８の配列、又は
＊  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸による置換、欠失、又は追加により前記の配列の１つに由来する、但しこの由来配列が抗血管新生活性を提供することを条件とする、任意の配列、又は
＊  好ましくは、配列番号：５１２の配列の１８０位から２９０位までを含む領域に少なくとも約５０％の同一性を有する、但しこの相同配列が抗−血管新生活性を示すことを条件とする、前記の配列の１つに由来する任意の配列、
の１つを含むか又はそれにより構成されることを特徴とするＲＧＭ断片に関する。
【０１４２】
また、本発明は前記で定義したＲＧＭ断片の１つをコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１４３】
本発明に記載される好適なヌクレオチド配列は、
−  配列番号：３５３、配列番号：３５５、又は配列番号：３５７のヌクレオチド配列、
−  又は、遺伝子コードの縮重により前記ヌクレオチド配列の１つに由来し、配列番号：３５４、配列番号：３５６、又は配列番号：３５８に示されるタンパク質をコードする、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のヌクレオチドによる置換、欠失、又は追加により、前記で定義した配列番号：３５４、配列番号：３５６、又は配列番号：３５８に由来するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは、前記で定義した配列番号：３５４、配列番号：３５６、又は配列番号：３５８と相同なタンパク質をコードする、配列番号：３５３、配列番号：３５５、又は配列番号：３５７の配列と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記ヌクレオチド配列の１つと相同な、任意のヌクレオチド配列。
−  又は、前記配列と相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列の１つと相補的な任意のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、任意のヌクレオチド配列、
を含むか又はその配列により構成されることを特徴とする。
【０１４４】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という表現は、ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、０．５ＸＳＳＣ）、６０℃のハイブリダイゼーション温度、並びに洗浄液（例えば、１％ＳＤＳを添加した０．１ＸＳＳＣ）及び５０℃の洗浄温度に特に相当する。
【０１４５】
また、本発明は組換えベクター（特に、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡ）に関し、前記組換えベクターは好ましくは、前記ベクターに挿入された前記核酸によりコードされたポリペプチドを宿主細胞に発現させるために必要な要素を含む。
【０１４６】
また、本発明は、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞から選択された宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、特に、前記で定義した組換えベクターを用いて形質転換される。
【０１４７】
本発明は、ＲＧＭの前記断片の１つに対して特異的であることを特徴とする、抗体に関する。
【０１４８】
また、本発明は有効成分として、
−  ＲＧＭの前記断片の１つ、又は
−  ＲＧＭの前記断片の１つをコードする、前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  ＲＧＭの前記断片の１つに向けられた、前記で定義した抗体、
を含む医薬組成物に関する。
【０１４９】
また、本発明は、
−  ＲＧＭの前記断片の１つ、又は
−  ＲＧＭの前記断片の１つをコードする、前記で定義したヌクレオチド配列、又は
−  ＲＧＭの前記断片の１つに向けられた、前記で定義した抗体、
の使用に関し、それらは内皮細胞の増殖を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には特に、癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変のフレームにおけるものが含まれる。
【０１５０】
また、本発明はネトリン１断片、ネトリン３およびその断片、ネトリンＧ１及びその断片、並びに相当する新規断片の使用に関する。
【０１５１】
特に、本発明は、
−  次の配列を含むか又は次の配列により構成されることを特徴とするタンパク質：
＊  配列番号：５０６の配列、又は配列番号：５０８の配列に示されるネトリンＧ１、又は配列番号：５１０の配列に示されるネトリン３、
＊  前記断片が、特に、約４０から約４００のアミノ酸を含み、そして、特に、配列番号：２ｍ（ｍは６４から１７６まで変化する）の１つの配列、又は配列番号：３７２の配列により示される、但しその断片が抗血管新生活性を示すことを条件とした、これらタンパク質の１つ又は配列番号：５０２、又は配列番号：５０４の配列に示されるネトリン１の断片、
＊  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸による置換、欠失、又は追加により、配列番号：５０６、配列番号：５０８、配列番号：５１０の配列、又は前記で定義した断片に由来する、但しその由来配列が抗血管新生活性を示すことを条件とした、任意の配列、又は
＊  好ましくは、配列番号：５０６の配列のアミノ酸２９６位と４３８位の間を含む領域と少なくとも約５０％の同一性を有する、配列番号：５０６、配列番号：５０８、配列番号：５１０の配列、又は前記で定義した断片と相同な、但しその相同な配列が抗血管新生抑制活性を示すことを条件とした、任意の配列、
−  又は、次の配列をコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれにより構成されることを特徴とするヌクレオチド配列：
＊  前記で定義したタンパク質、
＊  又は前記で定義したタンパク質の断片、
＊  又は前記で定義したタンパク質の１つに由来する配列、
＊  又は前記で定義したタンパク質１つに相同な配列のいずれかで、
特に、配列番号：５０６をコードする配列番号：５０５のヌクレオチド配列、又は配列番号：５０８をコードする配列番号：５０７のヌクレオチド配列、又は配列番号：５１０をコードする配列番号：５０９のヌクレオチド配列、又は配列番号：２ｍをコードする配列番号：２ｍ−１の配列（ｍは６４から１７６まで変化する）、配列番号：３７２をコードする配列番号：３７１配列、
−  又は、前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
−  又は、前記で定義したタンパク質の１つの抗体、
−  又は、前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用であって、それらは内皮細胞の増殖を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には、特に、癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症又、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変のフレームにおけるものが含まれる。
【０１５２】
配列番号：２ｍの前記配列は配列番号：１２８から配列番号：３５２までのタンパク質配列、すなわち、次のタンパク質配列に相当する：配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１４４、配列番号：１４６、配列番号：１４８、配列番号：１５０、配列番号：１５２、配列番号：１５４、配列番号：１５６、配列番号：１５８、配列番号：１６０、配列番号：１６２、配列番号：１６４、配列番号：１６６、配列番号：１６８、配列番号：１７０、配列番号：１７２、配列番号：１７４、配列番号：１７６、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８２、配列番号：１８４、配列番号：１８６、配列番号：１８８、配列番号：１９０、配列番号：１９２、配列番号：１９４、配列番号：１９６、配列番号：１９８、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２０４、配列番号：２０６、配列番号：２０８、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１６、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４、配列番号：２３６、配列番号：２３８、配列番号：２４０、配列番号：２４２、配列番号：２４４、配列番号：２４６、配列番号：２４８、配列番号：２５０、配列番号：２５２、配列番号：２５４、配列番号：２５６、配列番号：２５８、配列番号：２６０、配列番号：２６２、配列番号：２６４、配列番号：２６６、配列番号：２６８、配列番号：２７０、配列番号：２７２、配列番号：２７４、配列番号：２７６、配列番号：２７８、配列番号：２８０、配列番号：２８２、配列番号：２８４、配列番号：２８６、配列番号：２８８、配列番号：２９０、配列番号：２９２、配列番号：２９４、配列番号：２９６、配列番号：２９８、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０４、配列番号：３０６、配列番号：３０８、配列番号：３１０、配列番号：３１２、配列番号３１４、配列番号：３１６、配列番号：３１８、配列番号：３２０、配列番号：３２２、配列番号：３２４、配列番号：３２６、配列番号：３２８、配列番号：３３０、配列番号：３３２、配列番号：３３４、配列番号：３３６、配列番号：３３８、配列番号：３４０、配列番号：３４２、配列番号：３４４、配列番号：３４６、配列番号：３４８、配列番号：３５０、配列番号：３５２。
【０１５３】
配列番号：２ｍ−１の前記配列は配列番号：２ｍの前記タンパク質配列をコードし、そして次のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：１２８をコードする配列番号：１２７、配列番号：１３０をコードする配列番号：１２９、配列番号：１３２をコードする配列番号：１３１、配列番号：１３４をコードする配列番号：１３３、配列番号：１３６をコードする配列番号：１３５、配列番号：１３８をコードする配列番号：１３７、配列番号：１４０をコードする配列番号：１３９、配列番号：１４２をコードする配列番号：１４１、配列番号：１４４をコードする配列番号：１４３、配列番号：１４６をコードする配列番号：１４５、配列番号：１４８をコードする配列番号：１４７、配列番号：１５０をコードする配列番号：１４９、配列番号：１５２をコードする配列番号：１５１、配列番号：１５４をコードする配列番号：１５３、配列番号：１５６をコードする配列番号：１５５、配列番号：１５８をコードする配列番号：１５７、配列番号：１６０をコードする配列番号：１５９、配列番号：１６２をコードする配列番号：１６１、配列番号：１６４をコードする配列番号：１６３、配列番号：１６６をコードする配列番号：１６５、配列番号：１６８をコードする配列番号：１６７、配列番号：１７０をコードする配列番号：１６９、配列番号：１７２をコードする配列番号：１７１、配列番号：１７４をコードする配列番号：１７３、配列番号：１７６をコードする配列番号：１７５、配列番号：１７８をコードする配列番号：１７７、配列番号：１８０をコードする配列番号：１７９、配列番号：１８２をコードする配列番号：１８１、配列番号：１８４をコードする配列番号：１８３、配列番号：１８６をコードする配列番号：１８５、配列番号：１８８をコードする配列番号：１８７、配列番号：１９０をコードする配列番号：１８９、配列番号：１９２をコードする配列番号：１９１、配列番号：１９４をコードする配列番号：１９３、配列番号：１９６をコードする配列番号：１９５、配列番号：１９８をコードする配列番号：１９７、配列番号：２００をコードする配列番号：１９９、配列番号：２０２をコードする配列番号：２０１、配列番号：２０４をコードする配列番号：２０３、配列番号：２０６をコードする配列番号：２０５、配列番号：２０８をコードする配列番号：２０７、配列番号：２１０をコードする配列番号：２０９、配列番号：２１２をコードする配列番号：２１１、配列番号：２１４をコードする配列番号：２１３、配列番号：２１６をコードする配列番号：２１５、配列番号：２１８をコードする配列番号：２１７、配列番号：２２０をコードする配列番号：２１９、配列番号：２２２をコードする配列番号：２２１、配列番号：２２４をコードする配列番号：２２３、配列番号：２２６をコードする配列番号：２２５、配列番号：２２８をコードする配列番号：２２７、配列番号：２３０をコードする配列番号：２２９、配列番号：２３２をコードする配列番号：２３１、配列番号：２３４をコードする配列番号：２３３、配列番号：２３６をコードする配列番号：２３５、配列番号：２３８をコードする配列番号：２３７、配列番号：２４０をコードする配列番号：２３９、配列番号：２４２をコードする配列番号：２４１、配列番号：２４４をコードする配列番号：２４３、配列番号：２４６をコードする配列番号：２４５、配列番号：２４８をコードする配列番号：２４７、配列番号：２５０をコードする配列番号：２４９、配列番号：２５２をコードする配列番号：２５１、配列番号：２５４をコードする配列番号：２５３、配列番号：２５６をコードする配列番号：２５５、配列番号：２５８をコードする配列番号：２５７、配列番号：２６０をコードする配列番号：２５９、配列番号：２６２をコードする配列番号：２６１、配列番号：２６４をコードする配列番号：２６３、配列番号：２６６をコードする配列番号：２６５、配列番号：２６８をコードする配列番号：２６７、配列番号：２７０をコードする配列番号：２６９、配列番号：２７２をコードする配列番号：２７１、配列番号：２７４をコードする配列番号：２７３、配列番号：２７６をコードする配列番号：２７５、配列番号：２７８をコードする配列番号：２７７、配列番号：２８０をコードする配列番号：２７９、配列番号：２８２をコードする配列番号：２８１、配列番号：２８４をコードする配列番号：２８３、配列番号：２８６をコードする配列番号：２８５、配列番号：２８８をコードする配列番号：２８７、配列番号：２９０をコードする配列番号：２８９、配列番号：２９２をコードする配列番号：２９１、配列番号：２９４をコードする配列番号：２９３、配列番号：２９６をコードする配列番号：２９５、配列番号：２９８をコードする配列番号：２９７、配列番号：３００をコードする配列番号：２９９、配列番号：３０２をコードする配列番号：３０１、配列番号：３０４をコードする配列番号：３０３、配列番号：３０６をコードする配列番号：３０５、配列番号：３０８をコードする配列番号：３０７、配列番号：３１０をコードする配列番号：３０９、配列番号：３１２をコードする配列番号：３１１、配列番号：３１４をコードする配列番号：３１３、配列番号：３１６をコードする配列番号：３１５、配列番号：３１８をコードする配列番号：３１７８、配列番号：３２０をコードする配列番号：３１９、配列番号：３２２をコードする配列番号：３２１、配列番号：３２４をコードする配列番号：３２３、配列番号：３２６をコードする配列番号：３２５、配列番号：３２８をコードする配列番号：３２７、配列番号：３３０をコードする配列番号：３２９、配列番号：３３２をコードする配列番号：３３１、配列番号：３３４をコードする配列番号：３３３、配列番号：３３６をコードする配列番号：３３５、配列番号：３３８をコードする配列番号：３３７、配列番号：３４０をコードする配列番号：３３９、配列番号：３４２をコードする配列番号：３４１、配列番号：３４４をコードする配列番号：３４３、配列番号：３４６をコードする配列番号：３４５、配列番号：３４８をコードする配列番号：３４７、配列番号：３５０をコードする配列番号：３４９、配列番号：３５２をコードする配列番号：３５１。
【０１５４】
本発明は、
−  配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列、又は
−  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、前記配列の１つに由来する、但しその由来する配列が抗血管新生活性を有していることを条件にした、任意の配列、又は
−  好ましくは、配列番号：５０２の配列のアミノ酸２８４位と４８７位の間を含む領域と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記配列の１つと相同な、但しその相同配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、そして前記タンパク質が配列番号：５０２又は配列番号：５０４の配列と異なることを条件とした、任意の配列、
の１つを含む又はそれにより構成されていることを特徴とする、タンパク質に関する。
【０１５５】
配列番号：２ｉの前記配列はネトリン１断片であり、そして配列番号：１２８から配列番号：２６２のタンパク質配列、すなわち、次のタンパク質配列に相当する：配列番号：１２８、配列番号：１３０、配列番号：１３２、配列番号：１３４、配列番号：１３６、配列番号：１３８、配列番号：１４０、配列番号：１４２、配列番号：１４４、配列番号：１４６、配列番号：１４８、配列番号：１５０、配列番号：１５２、配列番号：１５４、配列番号：１５６、配列番号：１５８、配列番号：１６０、配列番号：１６２、配列番号：１６４、配列番号：１６６、配列番号：１６８、配列番号：１７０、配列番号：１７２、配列番号：１７４、配列番号：１７６、配列番号：１７８、配列番号：１８０、配列番号：１８２、配列番号：１８４、配列番号：１８６、配列番号：１８８、配列番号：１９０、配列番号：１９２、配列番号：１９４、配列番号：１９６、配列番号：１９８、配列番号：２００、配列番号：２０２、配列番号：２０４、配列番号：２０６、配列番号：２０８、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１６、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４、配列番号：２３６、配列番号：２３８、配列番号：２４０、配列番号：２４２、配列番号：２４４、配列番号：２４６、配列番号：２４８、配列番号：２５０、配列番号：２５２、配列番号：２５４、配列番号：２５６、配列番号：２５８、配列番号：２６０、又は配列番号：２６２。
【０１５６】
また、本発明は、
−  配列番号：２ｊ（ｊは１３２から１４８まで変化する）の配列、又は
−  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、前記配列の１つに由来する、但しその由来する配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、任意の配列、又は
−  好ましくは、配列番号：５０６の配列のアミノ酸２９６位と４３８位の間を含む領域と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記配列の１つと相同な、但しその相同配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、任意の配列、
の１つを含むか又はそれにより構成されていることを特徴とする、ネトリンＧ１断片に関する。
【０１５７】
配列番号：２ｊの前記配列は、配列番号：２６４から配列番号：２９６のタンパク質配列、すなわち、配列番号：２６４、配列番号：２６６、配列番号：２６８、配列番号：２７０、配列番号：２７２、配列番号：２７４、配列番号：２７６、配列番号：２７８、配列番号：２８０、配列番号：２８２、配列番号：２８４、配列番号：２８６、配列番号：２８８、配列番号：２９０、配列番号：２９２、配列番号：２９４、又は配列番号：２９６のタンパク質配列に相当する。
【０１５８】
また、本発明は、
−  配列番号：２ｋ（ｋは１４９から１７６まで変化する）の配列、又は
−  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、前記配列の１つに由来する、但しその由来する配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、任意の配列、又は
−  好ましくは、配列番号：５１０の配列のアミノ酸２５４位と４３３位の間を含む領域と少なくとも約５０％の同一性を有する、前記配列の１つと相同な、但しその相同配列が抗血管新生活性を有していることを条件とした、任意の配列、
の１つを含むか又はそれにより構成されていることを特徴とする、ネトリン３断片に関する。
【０１５９】
配列番号：２ｋの前記配列は配列番号：２９８から３５２までのタンパク質配列、すなわち、次のタンパク質配列に相当する：配列番号：２９８、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０４、配列番号：３０６、配列番号：３０８、配列番号：３１０、配列番号：３１２、配列番号：３１４、配列番号：３１６、配列番号：３１８、配列番号：３２０、配列番号：３２２、配列番号：３２４、配列番号：３２６、配列番号：３２８、配列番号：３３０、配列番号：３３２、配列番号：３３４、配列番号：３３６、配列番号：３３８、配列番号：３４０、配列番号：３４２、配列番号：３４４、配列番号：３４６、配列番号：３４８、配列番号：３５０、又は配列番号：３５２。
【０１６０】
また、本発明は、前記で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列、すなわち、ネトリン１の断片をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１６１】
本発明に記載の好適なヌクレオチド配列は、
−  配列番号：２ｉ−１（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列、又は
−  又は、遺伝子コードの縮重により前記ヌクレオチド配列の１つから由来し、そして配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つにより示されるタンパク質をコードする、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は追加により、配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つにより示されるタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは、配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列の１つにより示されるタンパク質をコードする配列番号：２ｉ−１の配列の１つと少なくとも約５０％の同一性を有する前記ヌクレオチド配列の１つと相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列と相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、但し前記ヌクレオチド配列が、配列番号：５０１又は配列番号：５０３の配列と異なることを条件とした、任意のヌクレオチド配列、
を含むか又はそれにより構成されていることを特徴とする。
【０１６２】
配列番号：２ｉ−１の前記配列は配列番号：２ｉで示されるネトリン１の前記断片をコードし、そして次のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：１２８をコードする配列番号：１２７、配列番号：１３０をコードする配列番号：１２９、配列番号：１３２をコードする配列番号：１３１、配列番号：１３４をコードする配列番号：１３３、配列番号：１３６をコードする配列番号：１３５、配列番号：１３８をコードする配列番号：１３７、配列番号：１４０をコードする配列番号：１３９、配列番号：１４２をコードする配列番号：１４１、配列番号：１４４をコードする配列番号：１４３、配列番号：１４６をコードする配列番号：１４５、配列番号：１４８をコードする配列番号：１４７、配列番号：１５０をコードする配列番号：１４９、配列番号：１５２をコードする配列番号：１５１、配列番号：１５４をコードする配列番号：１５３、配列番号：１５６をコードする配列番号：１５５、配列番号：１５８をコードする配列番号：１５７、配列番号：１６０をコードする配列番号：１５９、配列番号：１６２をコードする配列番号：１６１、配列番号：１６４をコードする配列番号：１６３、配列番号：１６６をコードする配列番号：１６５、配列番号：１６８をコードする配列番号：１６７、配列番号：１７０をコードする配列番号：１６９、配列番号：１７２をコードする配列番号：１７１、配列番号：１７４をコードする配列番号：１７３、配列番号：１７６をコードする配列番号：１７５、配列番号：１７８をコードする配列番号：１７７、配列番号：１８０をコードする配列番号：１７９、配列番号：１８２をコードする配列番号：１８１、配列番号：１８４をコードする配列番号：１８３、配列番号：１８６をコードする配列番号：１８５、配列番号：１８８をコードする配列番号：１８７、配列番号：１９０をコードする配列番号：１８９、配列番号：１９２をコードする配列番号：１９１、配列番号：１９４をコードする配列番号：１９３、配列番号：１９６をコードする配列番号：１９５、配列番号：１９８をコードする配列番号：１９７、配列番号：２００をコードする配列番号：１９９、配列番号：２０２をコードする配列番号：２０１、配列番号：２０４をコードする配列番号：２０３、配列番号：２０６をコードする配列番号：２０５、配列番号：２０８をコードする配列番号：２０７、配列番号：２１０をコードする配列番号：２０９、配列番号：２１２をコードする配列番号：２１１、配列番号：２１４をコードする配列番号：２１３、配列番号：２１６をコードする配列番号：２１５、配列番号：２１８をコードする配列番号：２１７、配列番号：２２０をコードする配列番号：２１９、配列番号：２２２をコードする配列番号：２２１、配列番号：２２４をコードする配列番号：２２３、配列番号：２２６をコードする配列番号：２２５、配列番号：２２８をコードする配列番号：２２７、配列番号：２３０をコードする配列番号：２２９、配列番号：２３２をコードする配列番号：２３１、配列番号：２３４をコードする  配列番号：２３３、配列番号：２３６をコードする配列番号：２３５、配列番号：２３８をコードする配列番号：２３７、配列番号：２４０をコードする���列番号：２３９、配列番号：２４２をコードする配列番号：２４１、配列番号：２４４をコードする配列番号：２４３、配列番号：２４６をコードする配列番号：２４５、配列番号：２４８をコードする配列番号：２４７、配列番号：２５０をコードする配列番号：２４９、配列番号：２５２をコードする配列番号：２５１、配列番号：２５４をコードする配列番号：２５３、配列番号：２５６をコードする配列番号：２５５、配列番号：２５８をコードする配列番号：２５７、配列番号：２６０をコードする配列番号：２５９、又は配列番号：２６２をコードする配列番号：２６１。
【０１６３】
また、本発明は有効成分として、
−  前記で定義したネトリン１断片に相当するタンパク質、又は
−  前記で定義したネトリン１断片をコードするヌクレオチド配列、又
は
−  前記で定義したタンパク質に特異的に向けられていることを特徴とする抗体、又は
−  前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、又は
−  前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
を含む医薬組成物に関する。
【０１６４】
本発明は、
−  前記で定義したネトリン１断片に相当するタンパク質、又は
−  前記で定義した前記ネトリン１断片をコードするヌクレオチド配列、又は
−  前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
の使用に関し、それは内皮細胞の増殖及び／又は遊走を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には、特に癌及び白血病、加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、糖尿病性網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変のフレームにおけるものが含まれる。
【０１６５】
また、本発明は、
−  前記で定義したタンパク質に対して特異的に向けられていることを特徴とする抗体、又は
−  前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用に関し、これらは内皮細胞の増殖及び／又は遊走を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には特に、虚血性病変、例えば、下肢動脈の虚血性病変、心筋梗塞、脳血管障害、強皮症、又はレイノー病のフレームおけるものが含まれる。
【０１６６】
また、本発明は前記で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列、すなわち、ネトリンＧ１断片をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１６７】
本発明に記載の好適なヌクレオチド配列は、
−  配列番号：２ｊ−１（ｊは１３２から１４８まで変化する）の配列のヌクレオチド配列、
−  又は、遺伝子コードの縮重により、前記ヌクレオチド配列の１つに由来し、そして配列番号：２ｊ（ｊは１３２から１４８まで変化する）の配列の１つに示されるタンパク質をコードする、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は追加により、配列番号：２ｊ（ｊは１３２から１４８まで変化する）の配列の１つにより示されるタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは、前記で定義した配列番号：２ｊ（ｊは１３２から１４８まで変化する）の配列の１つに由来するタンパク質をコードする配列番号：２ｊ−１の配列の１つと少なくとも約５０％の同一性を有する前記ヌクレオチド配列の１つ、と相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列に相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、任意のヌクレオチド配列、
を含むか又はそれにより構成されていることを特徴とする。
【０１６８】
配列番号：２ｊ−１の前記配列は配列番号：２ｊで示されるネトリンＧ１の前記断片をコードし、そして次のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：２６４をコードする配列番号：２６３、配列番号：２６６をコードする配列番号：２６５、配列番号：２６８をコードする配列番号：２６７、配列番号：２７０をコードする配列番号：２６９、配列番号：２７２をコードする配列番号：２７１、配列番号：２７４をコードする配列番号：２７３、配列番号：２７６をコードする配列番号：２７５、配列番号：２７８をコードする配列番号：２７７、配列番号：２８０をコードする配列番号：２７９、配列番号：２８２をコードする配列番号：２８１、配列番号：２８４をコードする配列番号：２８３、配列番号：２８６をコードする配列番号：２８５、配列番号：２８８をコードする配列番号：２８７、配列番号：２９０をコードする配列番号：２８９、配列番号：２９２をコードする配列番号：２９１、配列番号：２９４をコードする配列番号：２９３又は配列番号：２９６をコードする配列番号：２９５。
【０１６９】
また、本発明は前記で定義したタンパク質をコードするヌクレオチド配列、すなわち、ネトリン３断片をコードするヌクレオチド配列、に関する。
【０１７０】
本発明に記載の好適なヌクレオチド配列は、
−  配列番号：２ｋ−１（ｋは１４９から１７６まで変化する）のヌクレオチド配列、
−  又は、遺伝子コードの縮重により、前記ヌクレオチド配列の１つに由来し、配列番号：２ｋ（ｋは１４９から１７６まで変化する）の配列の１つに示されるタンパク質をコードする、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は追加により、配列番号：２ｋ（ｋは１４９から１７６まで変化する）の配列の１つに由来するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の１つに由来する、任意のヌクレオチド配列、
−  又は、好ましくは、前記で定義した配列番号：２ｋの配列の１つ相同なタンパク質をコードする配列番号：２ｋ−１の配列（ｋは１４９から１７６まで変化する）の１つと少なくとも約５０％の同一性を有する、前記ヌクレオチド配列の１つと相同な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記配列に相補的な任意のヌクレオチド配列、
−  又は、前記ヌクレオチド配列の１つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な、任意のヌクレオチド配列、
を含むか又はそれにより構成されていることを特徴とする。
【０１７１】
配列番号：２ｋ−１の前記配列は配列番号：２ｋで示されるネトリン３の前記断片をコードし、そして次のヌクレオチド配列に相当する：配列番号：２９８をコードする配列番号：２９７、配列番号：３００をコードする配列番号：２９９、配列番号：３０２をコードする配列番号：３０１、配列番号：３０４をコードする配列番号：３０３、配列番号：３０６をコードする配列番号：３０５、配列番号：３０８をコードする配列番号：３０７、配列番号：３１０をコードする配列番号：３０９、配列番号：３１２をコードする配列番号：３１１、配列番号：３１４をコードする配列番号：３１３、配列番号：３１６をコードする配列番号：３１５、配列番号：３１８をコードする配列番号：３１７、配列番号：３２０をコードする配列番号：３１９、配列番号：３２２をコードする配列番号：３２１、配列番号：３２４をコードする配列番号：３２３、配列番号：３２６をコードする配列番号：３２５、配列番号：３２８をコードする配列番号：３２７、配列番号：３３０をコードする配列番号：３２９、配列番号：３３２をコードする配列番号：３３１、配列番号：３３４をコードする配列番号：３３３、配列番号：３３６をコードする配列番号：３３５、配列番号：３３８をコードする配列番号：３３７、配列番号：３４０をコードする配列番号：３３９、配列番号：３４２をコードする配列番号：３４１、配列番号：３４４をコードする配列番号：３４３、配列番号：３４６をコードする配列番号：３４５、配列番号：３４８をコードする配列番号：３４７、配列番号：３５０をコードする配列番号：３４９、又は配列番号：３５２をコードする配列番号：３５１。
【０１７２】
また、本発明は組換えベクター（特に、プラスミド、コスミド、ファージ又はウイルスＤＮＡ）に関し、これらは前記で定義したヌクレオチド配列、すなわち、前記で定義したネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの断片の１つをコードするヌクレオチド配列を含み、前記の組換えベクターは、特に、前記ベクター中に挿入された核酸によりコードされるポリペプチドを宿主細胞で発現させるのに必要な要素を含むことを特徴とする。
【０１７３】
また、本発明は、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物又は哺乳動物細胞から選択された宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、特に、前記で定義した組換えベクターを用いて形質転換される。
【０１７４】
また、本発明は、前記で定義したタンパク質、すなわち、前記で定義した、特に、ネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの断片、に対して特異的であることを特徴とする抗体に関する。
【０１７５】
また、本発明は、有効成分として、
−  前記で定義したネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの断片の１つ、又は
−  前記で定義したネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの前記断片の１つをコードするヌクレオチド配列、又は
−  前記のネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの断片の１つに特異的に向けられていることを特徴とする前記で定義した抗体、又は
−  前記で定義したネトリン１、ネトリン３、又はネトリンＧの抗イディオタイプ抗体、又は
−  前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
を含む医薬組成物に関する。
【０１７６】
本発明は、
−  次の配列を含むか又はそれにより構成されることを特徴とするタンパク質：
−  配列番号：２ｉ（ｉは６４から１３１まで変化する）の配列、又は
−  又は、特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、前記配列の１つに由来する、但しその由来配列が抗血管新生活性を示すことを条件とした、任意の配列、又は
−  又は、好ましくは、配列番号：５０２のアミノ酸２８４位及び４８７位の間の領域と少なくとも約５０％の同一性を持つ、但し前記配列が抗血管新生活性を有することを条件とした、また、前記タンパク質が配列番号：５０２又は配列番号：５０４の配列と異なることを条件とした、前記配列の１つと相同な任意の配列、
−  又は、前記タンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列、
−  又は、前記で定義したタンパク質に対して特異的に向けられていることを特徴とする抗体、
−  又は、前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
−  又は、前で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用に関し、それらは内皮細胞の増殖を阻害することを必要とする病変の阻止又は治療を意図した薬剤の製造のための使用であり、その病変には、特に、癌及び白血病、脈絡膜新生血管性複雑近視、特に移植拒絶における角膜新血管形成、緑内障、糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、リューマチ性多発性関節炎、乾癬性多発性関節炎、血管腫、血管肉腫、カステルマン氏病及びカポジ肉腫、若しくは肥満症又は網膜性新血管形成の治療のフレームにおける病変、のフレームにおけるものが含まれる。
【０１７７】
本発明はネトリンの新規使用に関する。
【０１７８】
特に、本発明は、
−  次の配列を含むか又はそれにより構成されることを特徴とするタンパク質：
＊  配列番号：５０６の配列又は配列番号：５０８の配列に示されるネトリンＧ１、又は配列番号：５１０の配列に示されるネトリン３、又は配列番号：４９８の配列又は配列番号：５００の配列に示されるネトリン４、
＊  これらタンパク質の１つ又は配列番号：５０２又は配列番号：５０４の配列で示される、但しその断片が周皮細胞の活性化活性を示すことを条件とした、ネトリン１の断片で、特に、前記断片が約４０から約４００までのアミノ酸を含み、そして、特に、配列番号：２ｍ（ｍは１から１７６まで変化する）の１つ、又は配列番号：３７２の配列で示されること、又は
＊  特に、１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、欠失又は追加により、前記配列の１つに由来する、但しその由来する配列が周皮細胞の活性化活性を示すことを条件とした、配列番号：５０６、配列番号：５０８、配列番号：５１０、配列番号：４９８、配列番号：５００の配列に由来する又は前記で定義した断片の、任意の配列、又は
＊  好ましくは、配列番号：５０６のアミノ酸２９６位及び４３８位の間を含む領域と少なくとも約５０％の同一性を持つ、配列番号：５０６、配列番号：５０８、配列番号：５１０、配列番号：４９８、配列番号：５００、の配列と、又は前記断片の１つと相同な、但しその相同配列が周皮細胞の活性化活性を示すことを条件とした、任意の配列、
−  又は、次のものをコードするヌクレオチド配列を含むか又はそれにより構成されていることを特徴とするヌクレオチド配列：
＊  前記で定義したタンパク質、
＊  又は前記で定義したタンパク質の１つの断片、
＊  又は前記で定義したタンパク質の１つに由来する配列、
＊  又は前記で定義したタンパク質の１つに相同な配列のいずれかで、
前記ヌクレオチド配列が、特に、配列番号：５０６をコードする配列番号：５０５のヌクレオチド配列、配列番号：５０８をコードする配列番号：５０７のヌクレオチド配列、配列番号：５１０をコードする配列番号：５０９のヌクレオチド配列、配列番号：４９８をコードする配列番号：４９７のヌクレオチド配列、配列番号：５００をコードする配列番号：４９９のヌクレオチド配列、又は配列番号：２ｍをコードする配列番号：２ｍ−１の配列（ｍは１から１７６まで変化する）又は配列番号：３７２をコードする配列番号：３７１の配列、に相当する、
−  又は、前記で定義したタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
−  又は、前記で定義したタンパク質の１つの抗体、
−  又は、前記で定義した抗イディオタイプ抗体のＦａｂ断片、
の使用であって、これらは周皮細胞又は平滑筋細胞の消耗と関連した又はそれにより引き起こされる、非癌性の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のための使用である。
【０１７９】
また、本発明は約０．１から約２０ｍｇ／ｋｇの割合で投与可能な薬剤の製造のための配列番号：４９８又は配列番号：５００の配列に示される上記で定義したネトリン４タンパク質の使用に関するもので、特に、その投与としては静脈ルート、皮下ルート、全身ルート、硝子体内注射、浸透又は洗眼液による局所ルート、場合により電気透過法との組み合わせが挙げられる。
【０１８０】
また、本発明は、アテローム・プラーク形成の阻害活性を前記増殖又は遊走テストにより測定することを特徴とし、また、この阻害活性が、前記のタンパク質、又はヌクレオチド配列、又は抗イディオタイプ抗体の非存在下で得られた値の２０％から１００％の阻害百分率に相当することを特徴とする、前記で定義した使用に関する。
【０１８１】
抗アテローム活性はArnal et al. (2003)に記載のテストにより測定される。
【０１８２】
好適な実施態様によれば、本発明は、前記で定義したネトリン、特に配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列及び配列番号：４９８又は配列番号：５００の配列に示される、変異又は非変異のネトリン４タンパク質の抗イディオタイプ抗体であって、周皮細胞又は平滑筋細胞の表面のＵＮＣ５Ｈ４レセプターを認識する抗イディオタイプ抗体の使用に関するものであり、
−  加齢性黄斑変性症、脈絡膜新生血管性複雑近視、
−  糖尿病性網膜症又は未熟児の網膜症、
−  血管新生緑内障（角膜の、網膜のなど）、
−  特に、移植拒絶における、角膜血管新生、
−  リューマチ性多発性関節炎、
−  乾癬、特に、乾癬性多発性関節炎、
−  血管腫、
−  アテローム性動脈硬化症、
−  肥満症、
−  腸奇形、
−  クローン病、
−  カダシルを例とする、血管性、皮質下血管性認知症、
−  アルツハイマー病、
−  変性骨病変及び骨折、及び
−  動脈瘤及び血管解離、
の病変の予防又は治療を意図した薬剤の製造のため使用に関する。
【０１８３】
また、本発明は、周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖又は遊走を活性化する化合物のスクリーニング方法を実施するための、周皮細胞又は平滑筋細胞の表面のＵＮＣ５Ｈ４レセプター、又はこれらレセプターを細胞表面に有する周皮細胞又は平滑筋細胞の使用に関する。
【０１８４】
本発明は、以下の段階、
−  ネトリン４のＵＮＣ５Ｈ４レセプターへの結合の阻害、又はネトリン又は他の任意のネトリン型因子の平滑筋細胞又周皮細胞に対する分裂、走化性、抗アポトーシス活性、又は分化の阻害の測定及び
−  ＵＮＣ５Ｈ４レセプターの中和抗体を添加することによる、ネトリン又は他の任意のネトリン型因子による平滑筋細胞又は周皮細胞の分裂、走化性、抗アポトーシス活性、又は分化の阻害の喪失の測定、
を含むことを特徴とする、周皮細胞又は平滑筋細胞の増殖又は遊走を活性化する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０１８５】
このスクリーニング方法のフレームにおいて使用されるテストは、前記の増殖又は遊走テストである。
【０１８６】
本発明は、以下の段階、
−  前記修飾用化合物とＵＮＣ５Ｈ４レセプター及びネトリン４を一緒に合わせること、及び
−  ＵＮＣ５Ｈ４レセプターとネトリン４の間の結合を修飾する前記化合物の特性の指標である、前記化合物非存在下での正常レベルに比較した前記化合物存在下のレベルの差異について、ＵＮＣ５Ｈ４レセプターとネトリン４の間の特異的結合を測定すること、
を含むことを特徴とする、ＵＮＣ５Ｈ４レセプターと、配列番号：５２２又は配列番号：５２４の配列、又は配列番号：４９８又は配列番号：５００の配列に示される変異又は非変異のネトリン４との結合を修飾する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０１８７】
スクリーニングテストは次に様に実施される：
【０１８８】
ヒトＩｇＧのＦｃドメインに対するヒツジ免疫グロブリンは、マイクロタイタープレートにインキュベートする（ｐＨ９．６の５０ｍＭの炭酸緩衝液中に０．１−２０μｇ／ｍｌ）。同一緩衝液に血清アルブミンを５ｍｇ／ｍｌに希釈した溶液で非特異的部位を飽和した後に、ＵＮＣ５Ｈ４レセプターの細胞外ドメインをヒトＩｇＧのＦｃ配列を融合させたものを含むタンパク質をマイクロタイタープレートに固定化する（１及び１０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度でインキュベート）。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および１０−５００ｐｇ及び任意の好都合な方法で標識したネトリン１、３、４又はＧ（放射性ヨード、ビオチン、蛍光色素）を含むＰＢＳ緩衝液に、化合物の希釈系列を添加した。洗浄した後に、ペルオキシダーゼを結合した適切な濃度の抗ネトリン抗体を加えるか、放射能を測定するか、又はペルオキシダーゼを結合したアビジンを加えるか、又は蛍光を測定することで、レセプターに結合したネトリンの量は示される。次いで、ペルオキシダーゼは発色反応で示される。全ての場合で、テストすべき化合物の量は、結合ネトリンの量を阻害する能力で測定された。
【表６】
2008520222.tif 000010
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【図面の簡単な説明】
【０１８９】
[実験部分］
【図１】図１はＨＵＡＥＣ細胞の遊走試験に相当する。細胞は８視野で数え、平均と標準偏差をｙ軸に示す。ｘ軸は５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）存在下（Ｖ５０）又は非存在下におけるネトリン４タンパク質のｎｇ／ｍｌで表示した濃度に相当する。
【図２】図２は大動脈平滑筋細胞の遊走テストに相当する。細胞は８視野で数え、平均と標準偏差をｙ軸に示す。ｘ軸はネトリン１及びネトリン４タンパク質のｎｇ／ｍｌで表示した濃度に相当する。白いカラムは０ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する；縦線のカラムは６ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する；横線のカラムは１８ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する；斜線のカラムは５５ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する；灰色のカラムは１６０ｎｇ／ｍｌの濃度に相当しそして黒いカラムは５００ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する。
【図３】図３はＨＵＡＥＣ細胞増殖テストに相当する。ｘ軸は図に示すように、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はＦＧＦ２の存在下でのネトリン４タンパク質に（５００ｎｇ／ｍｌ）濃度に、そしてｙ軸は増殖百分率に相当する。黒いカラムはコントロールに相当する；白いカラムは５００ｎｇ／ｍｌのネトリン４存在下における増殖百分率に相当し、そして灰色のカラムは５００ｎｇ／ｍｌのネトリン４及び５μｇ／ｍｌのネオゲニン・レセプターに対するＩｇＧ存在下における増殖百分率に相当する。
【図４】図４はネトリン４（ＮＥＴ−４）、ネトリン１（ＮＥＴ−１）及びネトリンＧ１（ＮＥＴ−Ｇ１）のＶＳＭの増殖に対する効果の分析に相当する。ダイアモンドで示される曲線はネトリン４に相当する。四角で示される曲線はネトリンＧ１に相当する。三角で示される曲線はネトリン１に相当する。
【図５】図５はＶＳＭ増殖に対する抗ネオゲニン抗体の効果を示す。ｙ軸は５９５ｎｍにおける吸光度を示す。白いカラムは抗ネオゲニン抗体非存在下における増殖に、そして黒いカラムは５μｇ／ｍｌの抗ネオゲニン抗体の存在下における増殖に相当する。
【図６】図６はＨＵＡＥＣ細胞アポトーシステストに相当する。ｘ軸は、図に示すように、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はＦＧＦ２の存在下でのネトリン４タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）濃度に、そしてｙ軸はアポトーシス百分率に相当する。白いカラムはネトリン４非存在下におけるコントロールに相当する；灰色のカラムは５００ｎｇ／ｍｌのネトリン４存在下におけるアポトーシスの百分率に相当する。
【図７Ａ】図７Ａは大動脈平滑筋細胞の増殖テストに相当する。ｘ軸はｎｇ／ｍｌで表示したネトリン４タンパク質又は変異ネトリン４タンパク質の濃度に、そしてｙ軸は増殖百分率に相当する。四角で示される左の曲線は変異ネトリン４に相当する。ダイアモンドで示される右の曲線はネトリン４に相当する。
【図７Ｂ】図７Ｂは大動脈平滑筋細胞の遊走テストに相当する。細胞は８視野で数え、平均と標準偏差をｙ軸に示す。ｘ軸はｎｇ／ｍｌで表示したネトリン４タンパク質及び変異ネトリン４タンパク質の濃度に相当する。四角で示す曲線は変異ネトリン４に相当する。ダイアモンドで示す曲線はネトリン４に相当する。
【図８】図８は、変異（クローン１及びクローン５）又は非変異（クローン８、１０、及び１５）ネトリン４を導入したＰＣ３細胞の上清の効果を調べるための、ＨＵＡＥＣ細胞増殖テストに相当する。ｙ軸は増殖百分率に相当する。カラム１はコントロールに（ＤＭＥＭのみ）に相当する；カラム２は非導入ＰＣ３細胞に相当する；カラム３はクローン１に相当する；カラム４はクローン５に相当する；カラム５はクローン８に相当する；カラム６はクローン１０に相当する；カラム７はクローン１５に相当する。
【図９】図９は腫瘍進行の分析に相当する。ｘ軸は日で表した時間に相当し、ｄ＝０は腫瘍の移植が実施された日を示す。Ｙ軸は腫瘍の体積（ｍｍ３で）に相当する。ダイアモンドを含む曲線は非導入のＰＣ３細胞に相当する。四角を含む曲線はクローン１を導入したＰＣ３細胞に相当する。三角を含む曲線はクローン５を導入したＰＣ３細胞に相当する。
【図１０】図１０はアバスチン存在下における腫瘍の進行の分析に相当する。ｙ軸は処置前に測定された腫瘍体積に対する処置後の腫瘍体積の比率に相当する。カラム１は非導入ＰＣ３細胞に相当する；カラム２はクローン８のＰＣ３に相当する；カラム３はクローン１０のＰＣ３に相当する；カラム４はクローン１５のＰＣ３に相当する。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂはマウス脈絡膜血管形成に対するネトリン４効果の分析に相当する。図１１Ａでは、１μｌのＰＢＳを注射された。図１１Ｂでは、１μｇのネトリン４を含む１μｌのＰＢＳを注射された。内皮細胞は免疫標識により示し、それらは図１１Ａおよび１１Ｂに白く見える。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃは、中心の灰色のレーザー衝撃周辺に脈絡膜を可視化させている環流蛍光デキストランに相当する。ラットは二回又は三回のレーザー衝撃をＤ（日）＝０に受けて、次いでＤ＝７、Ｄ＝１０に、網膜下に、賦形剤（ＰＢＳ）のみ（１２Ａ）を、又はネトリン１（１２Ｂ）又は２μｇのネトリン４（１２Ｃ）又は１００ｐｇの変異ネトリン４（１２Ｄ）を含む賦形剤を注射された。Ｄ＝１４にラットは犠牲にし、そして、蛍光レクチンを還流させたが、それにより図に示すように、脈絡膜新生血管が白く、そしてその周りのレーザー衝撃が灰色に可視化することが可能になる。
【図１３】図１３はネトリン４の欠失変異体の存在下における大動脈平滑筋細胞の遊走テストに相当する。細胞は８視野で数え、平均と標準偏差をｙ軸に示す。ｘ軸はｎｇ／ｍｌで表したネトリン４の濃度に相当する。十字の曲線は非変異ネトリン４に相当する。ダイアモンドの曲線は変異ネトリン４の完全配列を導入した細胞のコンディション培地に相当する。四角の曲線は配列番号：５２８の配列を導入した細胞のコンディション培地に相当する。
【０１９０】
[実験部分]
《材料：》
ネトリン１（配列番号：５０２）、ネトリン４（配列番号：４９８）、ネトリンＧ１（配列番号：５０６）、ネトリン３（配列番号：５１０）及び変異ネトリン４（配列番号：５２２）分子は組換えタンパク質である。ネトリン１、ネトリン４及びネトリンＧ１分子はＲ＆Ｄより市販されている。
１６５アミノ酸のＶＥＧＦイソフォームは相当するｃＤＮＡ(Plouet et al., 1997)を含む組換えバキュロウイルスによりＳＦ９昆虫細胞を感染させることで調製される。
ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）は、基底膜を消化するためのコラゲナーゼ（シグマ）を用いて臍帯動脈を還流し、単離した。ＨＵＡＥＣ細胞は、１５％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加されたＥＢＭ培地（クロネティクス）を用いて、３７℃で１０％ＣＯ２にて維持した。基幹となる培養は２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの添加を二日ごとに受けた。
大動脈平滑筋細胞は１５％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加されたＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃で１０％ＣＯ２にて維持した。基幹となる培養は２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦの添加を二日ごとに受けた。
【０１９１】
[変異ネトリン４の同定]
《変異ネトリン４のクローニング》
ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）の全細胞ＲＮＡはトリピュア（ロシュ）を用いて抽出した。次いで、ロシュのＲＴ−ＰＣＲ（ＡＭＶ）キットを用い、メーカーの使用説明書に従い、ＲＮＡを転写した。
プライマー（５’）−ＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＧ−（３‘）（センス）及び（５’）−Ｃ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＡＴＣ−（３’）（アンチセンス）は配列ネトリン４の１−１０３９の配列の増幅に供され、一方、プライマー（５’）−ＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡ−（３‘）（センス）及び（５’）−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  Ｃ（３’）（アンチセンス）はネトリン４の９１４−１８８４の配列の増幅に用いられた。
増幅に採用された条件は：９４℃で１分間の変性；５５℃で１分間のハイブリダイゼーション；及び７２℃で１分間の伸長、の３５サイクルである。
得られた産物は混合し、プライマー（５’）−ＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＣＧＧ（３‘）（センス）及び（５’）−ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  Ｃ−（３’）（アンチセンス）を用い、サイクル数が３５の代わりに２５であること以外は前記と同一条件の、新たなＰＣＲを実施するために使用した。ネトリン４の全配列を含むこのＰＣＲ産物を中間ベクターであるｐＣＲ２．１（インビトロジェン）にクローニングした。ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化後に、ネトリン４の配列はこのベクターから抽出し、同じ制限酵素で消化したベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣに挿入した。この最後の変異ネトリン４の全配列を含むベクターは、細胞に導入するために使用した。同一の操作により野生型ネトリン４の配列を用いて、野生型ネトリン４発現ベクターを得た。
変異ネトリン４は、前記に既に記載されたプロトコル（Plouet, 1997）に従い、野生型ネトリン４配列を含むベクターをＣＨＯｐｇｓＡ７４５細胞に導入することにより調製された。タンパク質はヘパリン−セファロース親和性クロマトグラフィーにより精製され、不連続なＮａＣｌ勾配（０、３；１．０及び２．０ＭのＮａＣｌ。ＮＥＴ４ｍは２ＭＮａＣｌにより溶出され、その純度は＞９０％であった）で溶出された。
変異ネトリン４（ＮＥＴ４ｍ）の生物学的活性は、平滑筋細胞増殖テストにより、野生型ネトリン４（ＮＥＴ４）と比較した。図７Ａは、ＮＥＴ４ｍがＮＥＴ４の１０００分の１の濃度で分裂活性の引き金を引くことを示している。同様に、遊走テストでは、ＮＥＴ−４ｍはＮＥＴ−４より１０００倍の活性を有していることが示されている（図７Ｂ参照）。
【０１９２】
《変異ネトリン４の欠失変異体の構築》
変異ネトリン４（６２８ＡＡ）の完全な配列を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣを制限酵素ＢａｍＨ１で消化し、ポリメラーゼ１のクレノーフラグメントで処理し、次いで制限酵素ＰｓｈＡ１で消化した。この線状化した、中心ドメイン（４７８−６２８）を欠失する変異ネトリン４の配列を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣ断片は、次いで、アガロース・ゲル・マイグレーションにより単離し、キアジェン（Qiagen）カラムで精製した。従って、ライゲーション後に、中心ドメインを欠失する変異ネトリン４の配列（１−４７７）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣ配列が得られた。完全な変異ネトリン４の配列（６２８アミノ酸）を含むベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣ配列は制限酵素Ｘｃｍ１で消化した。この酵素は、ネトリン４の内部配列を二つの部分（２８８アミノ酸／４８８アミノ酸）で切断するので、タンパク質から中心ドメイン（ＥＧＦ単位を有するＶドメイン）を欠失させることが可能になる。その断片を精製しライゲーションすることで、中心ドメイン（２８８／４８８）を欠失した変異ネトリン４配列を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＨｉｓｍｙｃＣをその結果として得ることができる。しかし、二つのＸｃｍ１部位をライゲーションするとストップ・コドンが出現するので、このベクターは３１２アミノ酸よりなる、ラミニンドメイン（１−２８８）及び２４アミノ酸のタンパク質配列を含む、短縮した変異ネトリン４タンパク質をコードすることになる。
【０１９３】
《ヒト臍帯動脈管内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）の遊走テスト》
ヒト臍帯動脈管内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）は４ｃｍ２のウェルに高密度で播種される（５０，０００細胞／ウェル）。単層細胞が密集したら、２％のＦＣＳを含むＭ１９９（ライフサイエンス）の存在下で一夜インキュベートすることで増殖を停止させる。次いで、単層細胞に泡掻器（foam scraper）を用いて傷をつけ、任意の細胞が自由に動ける範囲を定める。次いで、単層細胞を、非付着細胞を除くためにＭ１９９で３回洗浄する。次いで、任意の細胞が遊走する前の範囲を確定するために写真を撮る。次いで、ウェルは２％のＦＣＳのみを含むＭ１９９若しくは５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ存在下、種々の濃度のネトリン４（ＮＥＴ−４）又はネトリン１（ＮＥＴ−１）又はネトリンＧ１（ＮＥＴ−Ｇ１）と一緒にインキュベートする。２４時間後に、ウェルを３回洗浄し、メイ・グルンワルド・ギムザで染色し、撮影し、細胞を１つの条件につき８視野で数える。次いで、遊走した細胞を数えることを可能にするために、実験前後に撮影した写真を重ね合わせる。結果は、分野当たりの細胞数として表現される。
ネトリン４に関するこれらのテストの結果を図１に示す。
図１によれば、ＶＥＧＦ非存在下でＮＥＴ−４を加えてもＨＵＡＥＣ細胞の基礎的な遊走には効果のないことが、特筆される。一方、ＮＥＴ−４はＶＥＧＦ活性を阻害し、２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＥＴ−４で最大５０％の効果が得られる。
【０１９４】
《平滑筋（ＶＳＭ）細胞の遊走テスト》
平滑筋細胞（ＶＳＭ）は４ｃｍ２のウェルに高密度で播種される（５０，０００細胞／ウェル）。単層細胞が密集したら、２％のＦＣＳを含むＭ１９９（ライフサイエンス）の存在下で一夜インキュベートすることで増殖を停止させる。次いで、単層細胞に泡掻器を用いて傷をつけ、任意の細胞が自由に動ける範囲を定める。次いで、単層細胞を、非付着細胞を除くためにＭ１９９で３回洗浄する。次いで、任意の細胞が遊走する前の範囲を確定するために写真を撮る。次いで、ウェルはＦＣＳを含まないＤＭＥＭ培地で、種々の濃度のネトリン４（ＮＥＴ−４）又はネトリン１（ＮＥＴ−１）と一緒にインキュベートする。２４時間後に、ウェルを３回洗浄し、メイ・グルンワルド・ギムザで染色し、撮影する。次いで、遊走した細胞を数えるのを可能にするために、実験前後に撮影した写真を重ね合わせる。
これらのテストの結果を図２に示す。
図２によれば、ネトリン１及びネトリン４はＶＳＭのよる遊走に対してポジティブな効果を及ぼすことが特筆される。事実、ネトリン１及びネトリン４は平滑筋細胞の遊走を促進し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＮＥＴ−４で最大５０％の効果が得られる。
【０１９５】
《ヒト臍帯動脈管内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）の増殖テスト》
９６ウェル培養用プレートに１０％のＦＣＳを添加したＥＢＭ存在下でウェル当たり２，０００のＨＵＡＥＣ細胞を播種した。細胞の一部は２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５及び異なる濃度のネトリン１又はネトリン４により刺激し、他の細胞は刺激しなかった。５ｍｇ／ｍｌの抗ネオゲニン抗体は特定のウェルに加えた。５日後に、ウェルはＤＭＥＭで丁寧に洗浄し、細胞は１％のグルタルデヒドにより２０分間室温で固定した。固定した細胞はクリスタル・バイオレット（シグマ）の取り込みで定量した(Kueng et al., 1989)：細胞は０．１％のクリスタル・バイオレット（シグマ）と２０分間室温でインキュベートし、取り込まれない色素は大量の水による洗浄で完全に除き、次いで、取り込まれた結晶化したバイオレットの色素はウェル当たり１００μｌの１０％酢酸で可溶化された。５９５ｎｍで吸光度の読み取りを行った。同様の結果が３回の別個の実験（図１参照）で得られた。示された値は６ウェルの平均吸光度±ＳＤである。
ネトリン１又はネトリン４タンパク質のみでは基礎的な増殖（血清のみによる）には有意の効果をもたらさない。一方、図３に示すように、ネトリン４タンパク質は、ＶＥＧＦにより誘導される増殖を用量依存的に阻害する。５０％の最大効果は２００ｎｇ／ｍｌの濃度で得られる。抗ネオゲニン抗体の添加によりネトリン１又はネトリン４により誘導される増殖の阻害活性は元に戻される。
【０１９６】
《平滑筋（ＶＳＭ）細胞の増殖テスト》
９６ウェル培養用プレートに１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地存在下でウェル当たり２，０００のＶＳＭ細胞を播種した。６時間後に細胞は２％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に移し、次いで、異なる濃度のネトリン１、ネトリンＧ１又はネトリン４により細胞の一部を刺激したが、他の細胞は刺激しなかった。５日後に、ウェルはＤＭＥＭで丁寧に洗浄し、細胞は１％のグルタルデヒドにより２０分間室温で固定し、クリスタル・バイオレットで染色し、酢酸で可溶化した。５９５ｎｍでの吸光度の読み取りを行った。同様の結果が３回の別個の実験で得られた。示された値は６ウェルの平均吸光度±ＳＤである。
図４は、ネトリンＧ１及びネトリン４のタンパク質は、単独で使用されると、用量依存的な増殖に対する有意な効果を有することを示す。５０％の最大効果は２０ｎｇ／ｍｌの濃度で得られる。一方、ネトリン１は増殖に対して有意な効果はもたらさない。
９６ウェル培養用プレートに１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地存在下でウェル当たり２，０００のＶＳＭ細胞を播種した。６時間後に細胞は２％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に移し、次いで、異なる濃度のネトリン１又はネトリン４により細胞の一部を刺激し、他の細胞は刺激しない。５日後に、ウェルはＤＭＥＭで丁寧に洗浄し、細胞は１％のグルタルデヒドにより２０分間室温で固定した。固定した細胞はクリスタル・バイオレットの取り込みで定量した(Kueng et al., 1989)：細胞は０．１％のクリスタル・バイオレット（シグマ）と２０分間室温でインキュベートし、取り込まれない色素は大量の水による洗浄で完全に除き、次いで取り込まれ結晶化したバイオレットの色素は次いでウェル当たり１００μｌの１０％酢酸で可溶化された。５９５ｎｍでの吸光度の読み取りを行った。同様の結果が３回の別個の実験（図４参照）で得られた。示された値は６ウェルの平均吸光度±ＳＤである。
図５は抗ネオゲニン抗体の添加はネトリン４により誘導された増殖の促進活性を元に戻さないことを示している。
【０１９７】
《細胞付着テスト》
９６ウェル・エライザ・プレート（ヌンク）はHutchings et al. (2003)による文献に記載されたプロトコルに従い、ＶＥＧＦ１６５タンパク質で覆い、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸緩衝液で一夜４℃で希釈した。非特異的結合部位は炭酸緩衝液中の５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で１時間３７℃でブロックし、そして実験の前にＤＭＥＭで二度洗浄した。細胞はトリプシン処理し、洗浄後、非処理プラスチックチューブ中の１０％のＦＣＳを含む５ｍｌのＤＭＥＭに再度浮遊させ、１０％のＣＯ２の下、１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、細胞は遠心して濃縮し、再び血清を含まないＤＭＥＭ＋０．２％ＢＳＡ混合液に再度浮遊させ、付着性を修飾するために細胞浮遊液は２０分間（３７℃、１０％ＣＯ２）使用するネトリン４タンパク質で処理した。ウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ＋０．２％のＢＳＡ中の４０，０００の細胞をウェルに配った。細胞を付着させるために、３７℃で１０％ＣＯ２下で必要な時間だけ放置した。非付着細胞を除くために、ウェルは丁寧に三回ＤＭＥＭで洗浄し、次いで細胞は１％のグルタルデヒドにより２０分間室温で固定した。固定した細胞はクリスタル・バイオレットの取り込みで定量した（Kueng et al., 1989）：細胞はｐＨ９．５の０．２０Ｍホウ酸緩衝液で希釈した０．１％のクリスタル・バイオレット（シグマ）と２０分間室温でインキュベートし、取り込まれない色素は大量の水による洗浄で完全に除き、次いで取り込まれた結晶化したバイオレットの色素は次いでウェル当たり１００μｌの１０％酢酸で可溶化した。
【０１９８】
《アポトーシステスト》
５０，０００のＨＵＡＥＣ細胞は、予め１０％のＦＣＳ及び２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＥＢＭ培地中でゼラチン化した培養ウェルに入れる。２日後に、細胞はＦＧＦ２又はＶＥＧＦの存在下または非存在下の、２％のＦＣＳ及び２００ｎｇ／ｍｌのネトリン４を含むＥＢＭ培地で一夜、インキュベートする。細胞は２４時間後に洗浄し、ヨー化プロピジウムとインキュベートし、固定し、そして蛍光顕微鏡で調べる。断片化した核を有する細胞は蛍光下で数え、全細胞数は直接光のもとで数えた。この操作は少なくとも８個の、最小３００個の細胞を有する視野で実施される。次いで、断片化された核を有する細胞の百分率が計算される。
ネトリン４のみを使用したのでは有意な効果は無い。一方ネトリン４タンパク質はＶＥＧＦ又はＦＧＦ−２による抗アポトーシス効果は完全に阻害する（図６参照）。
【０１９９】
《抗イディオタイプ抗体の調製》
第一相では、ネトリン１、３、Ｇ１又は４、若しくはその前記断片の１つ（配列番号：２から３５２）の中和抗体を、動物、特にマウス、にフロインド完全アジュバント（ネトリン又はネトリン断片の体積当たり１体積）と混合した前記ネトリン又は前記断片を注射することで調製する。体重ｋｇ当たり１０と５００μｇの間のネトリン又はネトリン断片の量を、動物の免疫のために選択する。完全アジュバントを不完全アジュバントに置き換える点を除き、同様の操作が１５日及び３０日の間隔を置いて実施される。４０日目に採血を行い、血清を調製し、そして免疫グロブリンを任意の通常の分画法、特に硫酸アンモニアによる沈殿、タンパク質Ａ又はＧのアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製する。免疫グロブリンの中和活性は任意の記載された方法で測定する（例えば、ネトリン４又はその断片の１つの場合には、そのレセプターの任意の１つへの標識ネトリン４の結合、増殖、遊走、細胞付着）。従って、免疫グロブリンの１つのバッチは、それがネトリン１、３、４又はＧ１と細胞外ドメインであるｄｃｃ、ネオゲニン、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２、ＵＮＣ５Ｈ３又はＵＮＣ５Ｈ４との相互作用を阻害する能力を有しているときに、中和すると記載される。
第二相では、ネトリン１、３、Ｇ１又は４、若しくはこれらの断片の１つの抗イディオタイプ抗体は、マウスに皮下ルートで１−１００μｇの前記に記載した前記ネトリン又は前記断片を中和する活性を有する免疫グロブリンの調製物を１００μｌのアジュバント、特にフロインド完全アジュバント（シグマ）と、免疫することで、調製する。注射は１５、３０及び４５日後に繰り返される。最初の注射後５５日目に、マウスは１０μｇの同一の抗体を腹腔ルートで注射される。最初の注射後５８日目に、マウスを犠牲にして脾臓を摘出し、脾臓細胞を放出させるためにイスコブ培地中で二つに裂く。脾臓細胞はマウスミエローマ細胞、特にＡＧ８Ｘ６３細胞（Kearney et al., 1979）、と融合させ、そして１００，０００細胞／ウェルの割合でインキュベートする。融合は、３０秒間の間隔で５０μｌのポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）を２０回添加することで実施される。次いで、予め３７℃に温めた４ｍｌのイスコブ培地を細胞浮遊液に滴下し、次いで、３７℃での４分間のインキュベーションの後に、４ｍｌが添加される。浮遊液は遠心し、次いで細胞のペレットを２０％のウシ胎児血清及びＨＡＴ１Ｘ（５０Ｘ：ヒポキサンチン５ｍＭ、アミノプテリン２０μＭ及びチミジン０．８ｍＭ）を補った１００ｍｌのイスコブ培地に入れ、そしてマクロファージ上にウェル当たり１００μｌの割合で播種する。５日後に、１００μｌのＨＡＴ培地を加え、８と１４日の間にそれぞれのハイブリドーマのコンディション培地を、免疫グロブリン、すなわち、抗ネトリン１、３、Ｇ１又は４抗体に対する抗体剤としての抗体のＥＬＩＳＡ測定のために、サンプルとして採取する。次いで、抗イディオタイプ抗体活性はＥＬＩＳＡテストで測定される：
従来の任意の技術、特に、パパイン消化、により調製された抗ネトリン１、３、Ｇ１又は４の免疫グロブリンのＦａｂ断片は、微量滴定プレートに固定化する（ｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸緩衝液中、０．１−２０μｇ／ｍｌ）。非特異的部位を同一の緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈した血清アルブミンにより飽和した後に、ハイブリドーマの培養上清を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝液）緩衝液で、半々に添加・希釈する。洗浄した後に、抗イディオタイプ抗体は適当濃度のペルオキシダーゼを結合したマウス抗Ｆｃ抗体の添加により顕在化される。次いで、固定化された抗イディオタイプ抗体の量はペルオキシダーゼを発現させることで測定するが、これは発色反応の強度に比例する。
抗ネトリン１、３、Ｇ１又は４抗体に向けられた抗体を分泌する能力で選択されたハイブリドーマは、次いで、クローン化し、すなわち、細胞を限界希釈の条件下、ウェル当たり０．１ｍｌの体積で（５細胞／ｍｌ）で播種する。培地は１０日後に交換する。１５日後には、特定のウェルは、最初に播種された細胞から増殖した細胞の集団を含み、従ってこれらの全ての細胞は同一であり、同一のクローンに由来する。細胞に占められる表面が少なくともウェルの全表面の半分になるときに、培地のサンプルを採取し分析する。
次いで、二番目のＥＬＩＳＡを実施する：ヒトＩｇＧのＦｃドメインに向けられたヤギ免疫グロブリンを微量滴定プレートでインキュベートする（ｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸緩衝液中、０．１−２０μｇ／ｍｌ）。非特異的部位を同一の緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈した血清アルブミンにより飽和した後に、ネトリンレセプターの細胞外ドメインとヒトＩｇＧのＦｃ配列の融合を含むタンパク質を微量滴定プレートに固定する（１と１００μｇ／ｍｌの間の濃度でインキュベートする）。ハイブリドーマの培養上清を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝液）緩衝液に、半々に添加・希釈する。洗浄した後に、抗イディオタイプ抗体はペルオキシダーゼを結合した適当濃度のマウス抗Ｆｃ抗体の添加により顕在化させる。固定化された抗イディオタイプ抗体の量はペルオキシダーゼを発現させることで測定し、それは発色反応の強度に比例する。
一旦クローンが同定されたら、そのモノクローナル抗体としての性質は、前記の限界希釈により得た同一のクローンに由来する細胞の９６ウェルへの播種を含む、標準の操作で確認される。従って、その分泌クローンは、その抗体がモノクローナル宣言とされるための条件である、全てが同一の特異性を有する抗体を分泌するはずである。次いで、三回目のクローニングは、そのクローンが実際にモノクローナルであることを確保するために、正確に同一条件下で実施される。
モノクローナル抗イディオタイプ抗体は一連のテスト、特に、ネトリンの既知の細胞外ドメインのＥＬＩＳＡテスト（ｄｃｃ、ネオゲニン、ＵＮＣ５−Ａ、ＵＮＣ５−Ｂ、ＵＮＣ５−Ｃ、ＵＮＣ５−Ｄ）、増殖阻害、又はＨＵＡＥＣ細胞の遊走、又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗血管新生活性測定テスト、でスクリーニングされる。
従って、抗イディオタイプ抗体はネトリン・ドメインと類似している。目的は、ネトリン・ドメインの「内部イメージ」を作製し、それにより全てのレセプターと結合することなく、１つのネトリンレセプターに結合する抗体の獲得を可能にすることである。一旦特異性が証明されると、この提供された抗体のアゴニスト（作動）機能は、細胞に対する活性を測定することで決定されるが、その作用とはすなわち、ＨＵＡＥＣ機能がＶＳＭに対するネトリンの機能を阻害又は促進することなく阻害されること、及び／又はＨＵＡＥＣに影響することなくネトリンのＶＳＭ機能を刺激することである。
これらの抗体の一般的な利益は、他の標的に影響することなく標的細胞に対してネトリンに類似した機能を有することである。従って、内皮細胞のアポトーシスを誘導しないか、又は、その遊走、増殖、分化を阻害することなく、周皮細胞の機能を促進することは、以下の特定の病変において有益であろう：
−  加齢性黄斑変性症、
−  周皮細胞の消耗が新血管形成に先行する、初期段階の糖尿病性網膜症、
−  血管新生緑内障（角膜の、網膜のなど）、
−  リューマチ性多発性関節炎、
−  乾癬、特に、乾癬性多発性関節炎、
−  血管腫、
−  アテローム性動脈硬化症、
−  肥満症、
−  癌。
逆に、前記の病変に関して周皮細胞に影響することなく周皮細胞の増殖を阻害するのも有益であろう。
【０２００】
《Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生》
大部分がＩ型コラーゲンで構成されている白束（ｗｈｉｔｅ  ｂｕｎｄｌｅｓ）を回収するために、４匹のラットの尾の皮をはいで切り取った。コラーゲンをこれらの線維より５０ｍｌの冷０．５Ｍ酢酸で抽出し、一夜攪拌する。次いで溶液を５０００ｇで４０分間遠心し、上清を回収する。この抽出は２０ｍｌの酢酸でもう一度繰り返し、上清を一緒に混ぜて、次いで１リットルの０．２Ｍの酢酸に対して透析する。コラーゲンの濃度は重量で３ｍｇ／ｍｌに調整する。コラーゲン溶液の液状を保持するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生のためのゲルの調製は氷上で行う。１ｍｌのコラーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）は０．５ｍｌのＤＭＥＭ１０Ｘ（１０Ｘ濃度の抗生物質及びグルタミンを含む）、０．９ｍｌの滅菌Ｈ２Ｏ及び０．１ｍｌの１Ｍ炭酸水素ナトリウムと混合する。一旦ｐＨを７．４に調整した後に、等体積のマトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）を加える。ゲルを培養用ウェル（厚さ２ｍｍ）に注ぎ、固形化するために３７℃でインキュベートする。１５分間後に細胞をゲルの表面に加える（１００，０００細胞／ｃｍ２）。２時間後に、異なる可溶化した因子を加え、２４時間後に細胞を観察し、撮影する。
【０２０１】
《ＶＳＭ増殖（図７Ａ）及び遊走（図７Ｂ）に対するＮＥＴ−４及びＮＥＴ−４ｍ活性の比較》
９６ウェル培養用プレートに１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地存在下でウェル当たり２，０００のＶＳＭ細胞を播種した。６時間後に細胞は２％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に移し、次いで、異なる濃度のネトリン４（ＮＥＴ−４）又は変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）により、細胞の一部は刺激し、他の細胞は刺激しなかった。５日後に、ウェルはＤＭＥＭで洗浄し、細胞は１％のグルタルデヒドにより固定し、クリスタル・バイオレットで染色し、酢酸で可溶化した。５９５ｎｍで吸光度の読み取りを行った。同様の結果が３回の別個の実験（図４参照）で得られた。示された値は６ウェルの平均吸光度±ＳＤである。
【０２０２】
《ＶＳＭ増殖テスト（図７Ａ）》
変異ネトリン４はすでに記載したプロトコル（Plouet, 1997）に従い野生型ネトリン４配列を含むベクターをＣＨＯｐｇｓＡ７４５細胞に導入することで調製した。タンパク質はヘパリンセファロース・アフィニティー・クロマトグラフィーにより精製し、そして不連続なＮａＣｌ勾配（０、３；１．０及び２．０ＭのＮａＣｌ）で溶出した。ＮＥＴ４ｍは２ＭＮａＣｌにより溶出され、その純度は＞９０％である。
ＮＥＴ４ｍの生物学的活性は野生型ＮＥＴ４のそれと、平滑筋細胞の増殖テストにより比較された。図７Ａは、最大促進効果の半分が１２０ｎｇ／ｍｌの濃度の非変異ネトリン４（ＮＥＴ−４）及び０．１ｎｇ／ｍｌの濃度の変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）で得られることを示す。このことは、変異ネトリン４の増殖促進活性は非変異ネトリン４のそれの１０００倍強いことを示す。
【０２０３】
《ＶＳＭ遊走テスト（図７Ｂ）》
ＶＳＭの密集単層細胞は一夜ＤＭＥＭ存在下でインキュベートする。次いで、単層細胞に泡掻器（foam scraper）を用いて傷をつけ、次いでウェルをＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで種々の濃度ネトリン４（ＮＥＴ−４）又は変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）存在下でインキュベートする。２４時間後に、ウェルを３回洗浄し、メイ・グルンワルド・ギムザで染色し、撮影し、細胞を１つの条件につき８視野で数える。結果は、分野当たりの細胞数として表現される。
最大促進効果の半分が１２ｎｇ／ｍｌの濃度の非変異ネトリン４（ＮＥＴ−４）及び０．００４ｎｇ／ｍｌの濃度の変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）で得られるように見て取れる。このことは、変異ネトリン４の走化性活性は非変異ネトリン４のそれの３０００倍強いことを意味する。
【０２０４】
《ＰＣ３癌細胞での導入》
前立腺癌細胞は添加した抗生物質及び１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で培養する。導入プロトコルは次の通りである：
−  Ｄ１：直径１０ｃｍのディシュ（皿）に低密度（１００００細胞／ｃｍ２）での細胞の播種
−  Ｄ２：ｐｃＤＮＡ３−ＮＥＴ４又はｐｃＤＮＡ−３−ＮＥＴ−４ｍによる導入
５μｇのプラスミドを５μｌのリポフェクチン及び１００μｌのＤＭＥＭ（抗生物質無しで）と３０分間室温で混ぜ、そして丁寧に攪拌する。次いで、混合物はＤＭＥＭで５ｍｌに希釈し、ＰＣ３細胞を含むディシュに滴下する。３７℃のオーブンで６時間インキュベートした後に、培地を吸引し、１０ｍｌの新鮮な培地と置き換える。
−  Ｄ３：ディシュの洗浄、及び１０％のウシ胎児血清及び抗生物質を含むＤＭＥＭ培地での２４時間インキュベーション
−  Ｄ４：細胞をトリプシン処理、及び５００μｇ／ｍｌのジェネティシン（シグマ）を添加した完全ＤＭＥＭ培地での４個の直径１０ｃｍのディシュを用いたインキュベーション
−  Ｄ１７：マイクロピペットを用いたクローン細胞（１００−４００細胞／クローン）のサンプル採取、及び２ｃｍ２ウェルへの移動
−  Ｄ２４：トリプシン処理及び１２ウェル・ディシュ（１２０，０００細胞／ウェル）におけるクローン細胞のインキュベーション
−  Ｄ２７：細胞の洗浄及び無血清ＤＭＥＭ培地への移植
−  Ｄ３０：コンディション培地の回収及びそれぞれの培地でのネトリン４の定量分析
ネトリン４（ＮＥＴ−４）又は変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）を導入したクローンは同等の倍加時間（２６−３０時間）を有していることを証明した後に、増殖テストに関する前記のパラグラフに記載したように、各培地のネトリン４含量を測定した。４μｌの慣らし培地を１００μｌの培養用の培地に加えた。結果は、コントロール（４μｌＤＭＥＭの培地を含むウェル）に比較した増殖の百分率で表される。
図８より、クローン１０及び１５は同程度のＨＵＡＥＣ細胞の誘導をもたらし、それはコントロールに比較し３００％のオーダーであることが、見て取れる。
一方、ＮＥＴ−４ｍのクローン１、５並びに、ＮＥＴ−４のクローン８のコンディション培地はＨＵＡＥＣ細胞の増殖を僅か２００％促進したのに過ぎず、それはコンディション培地により誘導されたＰＣ３細胞の増殖の５０％に過ぎない。
従って、ネトリン４（ＮＥＴ−４）又は変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）はＰＣ３癌細胞の増殖を修飾することなくＨＵＡＥＣの増殖を阻害する。
【０２０５】
《導入ＰＣ３クローンの腫瘍性の分析》
非導入ＰＣ３細胞及びＮＥＴ−４ｍ（クローン１及び５）を導入したＰＣ３細胞をヌードマウスの脇腹に（注射当たり百万個の細胞）注射した。
それぞれの腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（ｗ）をキャリパーで測定し、その体積は０．５２ｘＬｘｗ２の式で表した。
図９より、クローン１及び５はＰＣ３細胞に比較し小さな腫瘍しか作らないことが見て取れる。減少率は８０％より大きい。
従って、変異ネトリン４（ＮＥＴ−４ｍ）はその抗血管新生活性による抗腫瘍活性を示す。
【０２０６】
《ＶＥＧＦ阻害に対するＮＥＴ４の相乗効果》
今や、ＶＥＧＦが血管新生病変における主要な因子であり、その阻害は主要な治療ルートであることは受け入れらている。抗ＶＥＧＦ抗体はアバスチンの名前の下に市販されている。ネトリン４（ＮＥＴ−４）はＶＥＧＦとは異なる作用機構で作用することは知られているので、本発明者はネトリン４（ＮＥＴ−４）と、アバスチンの名前の下に市販されている抗ＶＥＧＦ抗体の相乗効果を測定した。
マウスは非導入ＰＣ３、又は腫瘍体積の境界領域の低減を示したＮＥＴ−４クローン８を導入したＰＣ３、又は非導入ＰＣ３と同程度の腫瘍体積（データ示さず）を示したＮＥＴ−４クローン１０又は１５を導入したＰＣ３の移植を受けた。一旦腫瘍が６００ｍｍ３を超える腫瘍体積を示したら、マウスはアバスチン（３日毎に５０μｇ）の腹腔内投与を受けたが、これはヒトの病変で推奨されて治療での用量に相当（５ｍｇ／ｋｇ／週）し、その腫瘍体積は前記に記載したように測定した。
図１０から、アバスチンは非導入ＰＣ３腫瘍又は腫瘍の進行を阻害するのに十分な活性のＮＥＴ−４を分泌しないＰＣ３クローン１０又は１５腫瘍では効果がないことが見て取れる。４日後では、処理開始時点と比較した腫瘍体積の増加は、それぞれ２００、１５０及び２００％である。一方、十分な活性のＮＥＴ−４を分泌するクローン８腫瘍体積は変化しない：従ってネトリン４は腫瘍サイズの上で有意に、抗ＶＥＧＦ治療に対する感受性を回復させることを可能にする。
【０２０７】
《マウスにおける脈絡血管新生》
１２匹の９週令Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは以下のプロトコルに従いレーザーによる網膜光凝固術を受けた。
マウスはソジウム・ペントバルビタール（セントラベット：Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ）（０．６ｍｇ／１００μｌに希釈した溶液をマウス当たり２００μｌ）の腹腔内注射により麻酔する。無意識になったら、マウスの瞳孔を１％のトロピカミドで開く。直径１ｍｍの丸いガラス板を、眼底を拡大するためにコンタクトレンズとして供する。次いで、レーザー衝撃（５０μｍ、４００ｍＷ、０．０５秒）を、それぞれの網膜に鼻側の視神経より約２乳頭直径で実施する。
７日後に、マウスは、眼にテトラカインを点滴して局所麻酔を、そして５％ベタジンを点滴して感染防御を施す。マイクロキャピラリ−の微量注射器を用いて、１μｌのＰＢＳ溶液又は異なる濃度のネトリン４の硝子体への注射が実施される。３匹のマウスはＰＢＳを注射され、３匹のマウスはネトリン４（０．１ｍｇ／ｍｌ）を注射され、２匹のマウスはネトリン４（０．３ｍｇ／ｍｌ）を注射され、２匹のマウスはネトリン４（１ｍｇ／ｍｌ）を注射され、２匹のコントロールマウスは注射が実施されない。
１０日後に、マウスを犠牲にして、両眼をＯＣＴに置いてくり抜き、次いで網膜をミクロトームで切片とし、抗ＣＤ３抗体をかけて内皮細胞を標識することで顕在化すると、それは白く見える。
図１１Ａ及び１１Ｂにより、０．１及び０．３μｇのネトリン４では効果がないことが見て取れる。一方、１μｇ／眼の容量では脈絡血管形成とグリアの炎症反応の明らかな減少が認められる。
特に図１１Ａでは、網膜の内側に点状の血管形成の増加及び白く見える全ての脈絡血管形成の蛍光発光の増加が認められる。
図１１Ｂは、網膜での血管新生の減少、とりわけ血管新生領域の厚みと血管数の減少を示す。
【０２０８】
《ラットのおける脈絡血管新生》
ラットはソジウム・ペントバルビタール（セントラベット：Centravet）（０．６ｍｇ／１００μｌに希釈した溶液をラット当たり２００μｌ）の腹腔内注射により麻酔する。無意識になったら、ラットの瞳孔を１％のトロピカミドで開く。直径１２ｍｍの丸いガラス板を、眼底を拡大するためにコンタクトレンズとして供する。次いで、レーザー衝撃（５０μｍ、４００ｍＷ、０．０５秒）それぞれの網膜に鼻側の視神経より約２乳頭直径で実施する。
７及び１０日後に、ラットは（群当たり４匹、又は１つの条件につき６−８個の眼球が分析され、従って１つの条件につき１２−１８の衝撃となる）次のものを含む網膜下注射（５μｌの体積で）を受けた：
−  ＰＢＳ
−  ＮＥＴ−４（２μｇ）
−  ＮＥＴ−１（２μｇ）
−  精製したＮＥＴ−４ｍ（１００ｐｇ）
１４日後にラットは麻酔され、蛍光デキストラン（白色）の還流を受け、これにより還流中の血管を可視化することが可能になる。次いで、網膜は平らにして撮影した。
賦形剤のみで処理した眼球では、灰色にマークされる中心領域は内皮細胞の増殖に相当する衝撃のレベル及び白くマークされる血管の頂上で確認される。デキストラン蛍光で可視化されるこれらの血管では、これらが機能的であることが確認することができる。２μｇ／ラットのＮＥＴ−４及びＮＥＴ−１の注射では、効果は境界領域である。一方、１００ｐｇのＮＥＴ−４ｍでは還流が、従って脈絡血管新生も、ほとんど完全に阻害される。
定量は、μ２当たりの画素を測定することで実施され、還流は５０％減少された。
図１２Ａから１２Ｄまでの結果は、ネトリン１及びネトリン４はコントロールに比較して境界領域の血管新生の減少をもたらすが。一方、２０００倍も低用量の変異ネトリン４は有意な大きな減少をもたらす：ｐは０．０２より小さい。
【０２０９】
《ＮＥＴ−４ｍ（ＭＣ４）及び配列番号：５２８の配列断片のＶＳＭ遊走（ＭＣ５）に対する効果》
ＣＨＯｐｇｓＡ−７４５細胞は変異ネトリン４（ＭＣ４）の完全配列を含む、又は配列番号：５２８（ＭＣ５）の配列を含むＰＣＤＮＡ−３発現ベクターを導入された。１６時間後に、細胞をＤＭＥＭ培地と共にインキュベートし、そしてコンディション培地を４８時間後に回収した。ＶＳＭ細胞の走化性活性は前記の記載のように測定する（図１３参照）。
図１３によれば、ＭＣ４及びＭＣ５は同一の特異的活性を有する（２μｇ／ｍｌの参考ネトリン４と同等の）。従って、Ｃ末端に位置する３４０アミノ酸の欠失は変異ネトリン４の活性に影響しない。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008520222.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
2008520222.tif 000036
【配列表】
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【国際調査報告】
2008520222.tif 000037
2008520222.tif 000038
2008520222.tif 000039
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