(57)【要約】  本発明は、ヒト不死化神経前駆細胞系、ＮＧＣ−４０７に関する。該細胞系は、ヒト胎児組織から樹立された。該細胞系は、ｖ−ｍｙｃ癌遺伝子を含有するレトロウィルスベクターを用いて不死化された。該細胞系は、星状細胞ならびにドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンに分化することのできる神経始原細胞系である。ＮＧＣ−４０７細胞は、ラットの脳に移植されたグリア芽腫に移動して、腫瘍細胞とギャップ結合を形成することができる。活性化ヌクレオシド類似体の形態の活性化プロドラッグを腫瘍にデリバリーするための、自殺遺伝子を発現するＮＧＣ−４０７細胞を使用することができる。
2008533995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタペスト条約の下、２００５年３月３１日に受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１８でＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎにて寄託された、ＮＧＣ−４０７細胞から得ることのできるか、それらに由来するか、またはそれらにより構成されるヒト細胞系。
【請求項２】
ポリクローナル細胞系である、請求項１記載の細胞系。
【請求項３】
モノクローナル細胞系である、請求項１記載の細胞系。
【請求項４】
異種治療遺伝子の発現の指令能を有する発現構築物でさらにトランスフェクトまたは形質導入されている、請求項１記載の細胞系。
【請求項５】
異種遺伝子が治療的ポリペプチドをコードするところの、請求項４記載の細胞系。
【請求項６】
異種遺伝子が自殺遺伝子を含むところの、請求項４記載の細胞系。
【請求項７】
自殺遺伝子が、
ａ．配列番号１ないし１７のいずれかのアミノ酸配列を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ；
ｂ．配列番号１ないし１７のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデオキシリボヌクレオシドキナーゼ変異体；および
ｃ．配列番号１ないし１７のいずれかをコードするヌクレオチド配列と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列によってコードされるデオキシリボヌクレオシドキナーゼ
からなる群から選択されるところの、請求項６記載の細胞系。
【請求項８】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、
ａ．配列番号１ないし５のいずれかのアミノ酸配列を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ；および
ｂ．配列番号１ないし５のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｄＮＫ活性を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ変異体
からなる群から選択されるデオキシリボヌクレオシドキナーゼを含むところの、請求項７記載の細胞系。
【請求項９】
異種治療遺伝子が神経栄養因子、特に神経成長因子（ＮＧＦ）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、特にＩＧＦ  ＩまたはＩＧＦ  ＩＩ；形質転換成長因子−αおよび−β（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、形質転換成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）、ノイルチュリン（ＮＴＮ）、パーセフィン（ＰＳＰ）を含む形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバー；グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；ノイブラスチン（ＮＢＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン（ＮＴ）、特にＮＴ３ないし９；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αをコードするところの、請求項４記載の細胞系。
【請求項１０】
異種治療遺伝子が神経生存因子、特にスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、またはヘッジホッグをコードするところの、請求項２記載の細胞系。
【請求項１１】
異種治療遺伝子が神経生長因子、特に線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、特に酸性または塩基性の線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ）；内皮成長因子（ＥＧＦ）、特に血管内皮成長性および透過性因子（ＶＥＧＰＦ）；インターフェロン、特にインターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＧＭＣＳＦまたはＩＬ２ないし１４をコードするところの、請求項２記載の細胞系。
【請求項１２】
異種治療遺伝子が、神経伝達物質、特にコリンアセチルトランスフェラーゼ；チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；チロシンデカルボキシラーゼ；チミジンキナーゼ、シトシンデアミダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の合成に寄与する生物学的に活性な分子をコードするところの、請求項２記載の細胞系。
【請求項１３】
神経伝達物質がアセチルコリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、オクトパミン、グルタメート、アスパルテート、グリシン、プロリン、χ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン、タウリン、アラニン、シスタチオン、ヒスタミン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）、サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、コレシストキニン、ニューロテンシン、エンケファリン、またはソマトスタチンであるところの、請求項１２記載の細胞系。
【請求項１４】
異種治療遺伝子が受容体、特にアセチルコリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、オクトパミン、グルタメート、アスパルテート、グリシン、プロリン、χ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン、タウリン、アラニン、シスタチオン、ヒスタミン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）、サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、コレシストキニン、ニューロテンシン、エンケファリン、またはソマトスタチンに結合する受容体をコードするところの、請求項２記載の細胞系。
【請求項１５】
自殺遺伝子がチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、特に単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、サイトメガロウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、または水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；Ｇｐｔ遺伝子；あるいはシトシンデアミナーゼ遺伝子であるところの、請求項６記載の細胞系。
【請求項１６】
星状細胞への分化能を有する、請求項１記載の細胞系。
【請求項１７】
ドーパミン作動性ニューロンなどのニューロンへの分化能を有する、請求項１記載の細胞系。
【請求項１８】
グリア細胞への分化能を有する、請求項１記載の細胞系。
【請求項１９】
接着培養物としての増殖能を有する、請求項１記載の細胞系。
【請求項２０】
実験的適用のための、特に薬物のスクリーニングおよび／またはインビトロ特徴化のための、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載のヒト不死化神経細胞系の使用。
【請求項２１】
治療的適用のための、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の不死化細胞系の使用。
【請求項２２】
置換療法のための、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の不死化細胞系の使用。
【請求項２３】
病変および外傷ニューロン、特に末梢神経、延髄、および／または脊髄の外傷病変、脳虚血性ニューロン損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、グリア芽腫、筋萎縮性側索硬化症を含む、神経学的疾患または他の神経変性疾患、認知症に関係した記憶障害、あるいは遺伝性代謝性疾患の治療における、正常または免疫抑制のヒトを含む、哺乳動物の脳に移植するための請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
予防的治療のための、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の不死化治療細胞系の使用。
【請求項２５】
病変および外傷ニューロン、特に末梢神経、延髄、および／または脊髄の外傷病変、脳虚血性ニューロン損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、グリア芽腫、筋萎縮性側索硬化症を含む、神経学的疾患または他の神経変性疾患、認知症に関係した記憶障害、あるいは遺伝性代謝性疾患の治療における、正常または免疫抑制のヒトを含む、哺乳動物の脳に移植するための請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
抗癌治療のための、請求項１ないし１９のいずれか一項に記載の不死化治療細胞系の使用。
【請求項２７】
ａ．請求項１に記載の細胞の組成物を含むコアであって、該細胞が個体に生物学的機能をデリバリーする化合物の分泌能を有するコアと、
ｂ．細胞の組成物を包囲し、細胞の組成物によって分泌された化合物を通過させる半透膜と
を含む、生体適合性カプセル。
【請求項２８】
コアが細胞のための支持体を含むところの、請求項１９記載のカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト不死化神経前駆細胞系、ＮＧＣ−４０７に関する。該細胞系はヒト胎児組織から確立された。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胎児組織の移植による神経変性障害治療の有効性は、動物モデル〔Ｂｒｕｎｄｉｎら、Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔａｌ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｇｒａｆｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｅｘｐ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、６５（１９８６）２３５〜４０頁；Ｗｉｃｔｏｒｉｎら、Ｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ａｘｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ、３４７（１９９０）５５６〜８頁；〕、ならびにパーキンソン病（ＰＤ）およびハンチントン病患者〔Ｂａｃｈｏｕｄ−Ｌｅｖｉら、Ｍｏｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｌａｎｃｅｔ、３５６（２０００）１９７５〜９頁；Ｆｒｅｅｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４４（２００１）７１０〜９頁；Ｈａｇｅｌｌら、Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｒａｆｔ、Ｂｒａｉｎ、１２２（Ｐｔ６）（１９９９）１１２１〜３２頁；Ｋｏｒｄｏｗｅｒら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｉａｔａｌ  ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３３２（１９９５）１１１８〜２４頁；Ｌｉｎｄｖａｌｌら、Ｇｒａｆｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ    Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７（１９９０）５７４〜７頁；Ｏｌａｎｏｗら、Ｆｅｔａｌ  ｎｉｇｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９（１９９６）１０２〜９頁〕において示されている。しかし、ヒト由来の胎児ドナー細胞では、倫理的および実用的双方で難しい問題が生じるため、将来の移植のための代替となる細胞供給源を開発しなければならない。治療遺伝子を発現するように遺伝子改変された細胞の脳内への移植は、神経変性障害に対する可能性のある治療として提案されている〔Ｖｉｌｌａ，Ａ．、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｂ．およびＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｅｒｒａｎｏ，Ａ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｅｒｐｅｔｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｃ���ｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ、５７（２００２）７８９〜９４頁〕。したがって、遺伝子操作と細胞移植を組み合わせる場合、重要な問題は、好適な細胞ビヒクルを見い出すことである。
【０００３】
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を発現するように改変された腫瘍細胞は、非毒性ヌクレオシド類似体ガンシクロビル（ＧＣＶ）をその細胞毒性代謝物、ガンシクロビル三リン酸に変換する能力を獲得する。この「自殺」遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞は、ガンシクロビルに曝露されると排除される。腫瘍細胞の実験的組織培養物ならびにＴＫ発現細胞と非改変「天然」腫瘍細胞の混合物からなる脳腫瘍移植物もまた、ガンシクロビル治療の後、隣接正常組織を害することなく退縮する。少数のＴＫ発現細胞が死に至るこの現象およびＴＫを発現しない隣接天然腫瘍細胞の排除は、「バイスタンダー効果」と称されている。
【０００４】
悪性脳腫瘍は、悪性疾患が全て脳に限定され、バイスタンダー効果により根絶し易いため、自殺遺伝子デリバリーにとって興味ある標的である。この戦略を成功させる重要な要素は、自殺遺伝子を発現させる遺伝子ベクターおよびそのデリバリービヒクルである。例えば、グリア芽腫多型における個々の全ての腫瘍を、遺伝子療法ベクターの個別の注射を用いて標的にすることは不可能なため、他のデリバリー戦略が必要とされる。神経膠腫を探し出すことができ、治療的分子をデリバリーするように操作された移動性細胞は、正常な脳組織に侵入している神経膠腫細胞の問題に対する理想的な解決法となる。神経幹細胞（ＮＳＣ）の移動能力は、脳の広範な細胞置換および遺伝子発現を必要とする神経変性疾患モデルにおける療法に対して理想的に適していることが実証されている。ＮＳＣは脳内の疾患部位を特異的に目指すのではないかと仮定されている。また、いくつかの研究では、移植されたＮＳＣが腫瘍自体から離して注射しても、原発腫瘍塊内へ進入できるという興味ある観察が得られており、さらに、ＮＳＣはそれ自体、腫瘍床全体に分布することが観察されており、したがって、進行している単発性腫瘍の細胞にさえ並行して移動する（Ｄｕｎｎ  ＆  Ｂｌａｃｋ、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、２００３年、５２：１４１１〜１４２４頁；Ａｂｏｏｄｙら、ＰＮＡＳ、２０００年、９７：１２８４６〜１２８５１頁）。ＮＳＣは、腫瘍塊周辺の脳組織における浸潤性神経膠腫細胞を探し出し、単発性腫瘍の細胞を「ピギーバック」して細胞間接触をさせることが、これらの著者により示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、神経変性疾患の治療の分野、および癌の治療におけるいくつかの問題に取り組んでいる。したがって、大量の胎児組織の必要性を除く置換細胞療法のための十分な材料を提供することが、本発明の目的の一つである。ＣＮＳ内への移植後、導入遺伝子を安定に発現することのできる細胞を提供することが他の目的である。さらに、癌細胞とギャップ結合を形成することのできる細胞を提供することが一つの目的である。また、ＣＮＳ内の癌細胞を探し出すことのできる細胞を提供することが一つの目的である。最後に、このような細胞は、増殖し、治療遺伝子をトランスフェクトし、保存するのに十分な継代ができるように増殖できなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、ＮＧＣ−４０７細胞から得ることのできるか、それらに由来するか、またはそれらにより構成されるヒト細胞系に関する。該細胞系は、ブタペスト条約に従い、受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２７１８の下、２００５年３月３１日にＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ドイツ国Ｄ−３８１２４ブラウンシュベーク、マッシェローダー通り１ｂ）に寄託された。
【０００７】
本発明の細胞系は、いくつかの利点を有する。それは、増殖させて、１３０回超の個体数倍増の間、安定のままであった、安定な不死化細胞系である。該細胞系は、分化条件に依存して、ニューロン、星状細胞およびドーパミン作動性ニューロンに分化できる神経始原細胞系である。ＮＧＣ−４０７細胞系は移植に用いることができる。該細胞系は、ラットで少なくとも３週間、移植時生存することができることが示されている。したがって、ＮＧＣ−４０７細胞系は、ヒト脳内では、さらに長時間生存できると考えられる。移植期間中、該細胞系は、異種遺伝子を安定して発現できる。したがって、ＮＧＣ−４０７細胞系は、置換療法（神経系の損失または損傷細胞の置換）と保護療法（分泌成長因子、神経栄養因子または神経伝達物質などの生物学的機能をデリバリーするビヒクルとして）の双方に使用できる。
【０００８】
該細胞系はまた、異種のチミジンキナーゼを発現するように形質転換された。この異種キナーゼを高レベルに発現するモノクローナル細胞系が選択された。神経系における腫瘍細胞にチミジンキナーゼをデリバリーするためのビヒクルとして、これらの細胞系が使用できる。また、ＮＧＣ−４０７細胞系は、中枢神経系内の癌細胞に向かって移動できること、およびＮＧＣ−４０７細胞系は、癌細胞とギャップ結合を形成でき、該細胞系から該癌細胞に低分子量化合物を移送できることも示された。したがって、ＮＧＣ−４０７細胞系は、該細胞系が癌細胞に移動し、これらとギャップ結合を形成した後、プロドラッグ（例えば、ＡＺＴ、ガンシクロビル）を活性化するデリバリービヒクルとして使用できる。次いで、活性化されたプロドラッグは、癌細胞に移送され、これら癌細胞とデリバリー細胞系の双方を死滅させる。これは、グリア芽腫多型を治療する実行可能で有望な方法である。
【０００９】
さらなる一態様において、本発明は、インビトロの薬剤スクリーニングおよび特性化など、実験的な目的に関するＮＧＣ−４０７細胞系の使用に関する。これは例えば、安全試験および毒性試験の一部であり得る。中脳起源の既知細胞系（国際公開第００／０９６６９号に記載されたＭＥＳ−ＩＩ（１）−Ｃ２；Ｌｏｔｈａｒｉｕｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２、２７７：３８８８４〜３８８９４頁に記載されたＭＥＳＣ２．１０としても知られている）と比較して、ＮＧＣ−４０７は、幹細胞マーカー、ネスチンを発現し、ニューロンと星状細胞の双方に分化することができる。他方、ＭＥＳＣ２．１０は、ネスチンを発現せず、ニューロンに分化するように誘導され得るだけである。したがって、ＮＧＣ−４０７は、早期発生段階を示し、ＭＥＳＣ２．１０と比較してより広範な可能性を有している。星状細胞は、ニューロンの機能性維持に重要な多数の成長因子（ＧＤＮＦなど）およびホルモンを分泌する。したがって、例えば、パーキンソン病治療のための強力な生物学的薬剤の同定に関して、星状細胞を相当な割合で含有する細胞系は、ニューロン細胞系と比較してより良好なモデル系となる。
【００１０】
他の態様において、本発明は、治療適用のためのＮＧＣ−４０７細胞系の使用に関するものであり、さらなる一態様においては、置換療法に関するものである。特に好ましい一実施形態において、該細胞系は癌療法に用いられる。
【００１１】
さらなる一態様において、本発明は、ＮＧＣ−４０７細胞系に由来する細胞の組成物を含むコアを含む生体適合性カプセル剤に関するものであり、前記細胞は、個体に生物学的機能をデリバリーする化合物を分泌することができ、半透膜が細胞の組成物を包囲して、細胞の組成物によって分泌された化合物の通過を可能にする。
【００１２】
本発明の一実施形態において、「治療」、「療法」、および「医療的使用」は、予防を含むことが意図されている。「治療」、「療法」、および「医療的使用」はまた、疾患または障害の阻止、疾患または障害に対する防御、および／または疾患または障害の防止（絶対的ではない）を含み得る。「治療」、「療法」、および「医療的使用」はまた、治癒の、寛解の、および／または症状の治療、療法および医療的使用を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＮＧＣ−４０７細胞系のトランスフェクションまたは形質導入
好ましい一実施形態において、本発明のＮＧＣ−４０７細胞系由来の細胞は、ゲノム中に組み込まれ、組み込まれた染色体と一緒に複製される異種ＤＮＡエレメントを、真核生物プロモーター、異種治療遺伝子、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）との作動可能な組合せで含む。
【００１４】
異種ＤＮＡエレメントは、任意の好適な出所のものでよいが、本明細書に記載されたものの中から選択されることが好ましい。
【００１５】
好ましい一実施形態において、異種治療遺伝子は、ヒトユビキチン（ＵｂＣ）プロモーターの転写制御下で発現できる。
【００１６】
発現のダウンレギュレーションの可能性は、導入遺伝子およびその付随プロモーターの部位特異的組み込みを指示する操作によって無効化できる。
【００１７】
本発明の一実施形態によれば、該プロモーターは、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＪｅＴプロモーター（米国特許第６，５５５，６７４号）、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）、ＲＳＶ、およびＭｏ−ＭＬＶ−ＬＴＲよりなる群から選択される構成的プロモーターである。
【００１８】
誘導／抑制プロモーターの例としては、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ラパマイシン誘導性プロモーター、Ｍｘ１が挙げられる。
【００１９】
好適な発現制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンに関するスプライシングシグナル、および停止コドンが挙げられ、全ては、ｍＲＮＡの適切な翻訳が可能になるように、本発明のポリヌクレオチドの正しいリーディングフレーム内に維持されている。発現制御配列はまた、リーダー配列および融合パートナー配列などの追加要素を含み得る。
【００２０】
好適な発現ベクターは、単純疱疹、アルファウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、バキュロウィルス、ＨＳＶ、コロナウィルス、ウシパピローマウィルス、Ｍｏ−ＭＬＶ由来のウィルスベクターであり得るが、好ましくは、アデノ関連ウィルス、または種々の細菌産生プラスミド由来のウィルスベクターである。
【００２１】
他のトランスフェクション法としては、限定はしないが、リポソームトランスフェクション、電気穿孔法、および核または他の局在化シグナルを含有する担体ペプチドのトランスフェクションが挙げられる。
【００２２】
他の好適な発現ベクターとしては、やはり市販供給源（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｅｃｅｎｃｅｓなど）から得られる一般的目的の哺乳動物ベクターが挙げられ、ジェネティシン／ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン／ブレオマイシン、ブラスチシジンＳＩ、マイコフェノール酸、またはヒスチジノールに関する選択性を含有する。
【００２３】
該ベクターとしては、以下のクラスのベクター：一般的な真核生物の発現ベクター、安定で一時的な発現のためのベクターおよびエピタグベクター、ならびに、所望の挿入体の高速クローニングのためのそれらのＴＯＰＯ誘導体が挙げられる（ベクターの非限定例に関しては、下記のリストを参照）。
エクジソン誘導性発現：ｐＩＮＤ（ＳＰ１）ベクター、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓタグベクターセット；ｐＩＮＤ（ＳＰ１）／Ｖ５−Ｈｉｓタグベクターセット；ＥｃＲ細胞系；ムリステロン（Ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）Ａ
安定発現：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ；ＰＣＩ；ＰＳＩ；ｐＳｅｃＴａｇ  Ａ，Ｂ＆Ｃ；ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＭｙｃＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ；ｐｃＤＮＡ３．１±；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ；ｐＲｃ／ＣＭＶ２；ｐＺｅｏＳＶ２（＋）およびｐＺｅｏＳＶ２（−）；ｐＲｃ／ＲＳＶ；ｐＴｒａｃｅｒ（商標）−ＣＭＶ；ｐＴｒａｃｅｒ（商標）−ＳＶ４０
一時的発現：ｐＣＤＭ８；ｐｃＤＮＡ１．１；ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ。
エピタグベクター：ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ；ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ，Ｂ＆Ｃ
【００２４】
異種治療遺伝子
異種治療遺伝子は、治療活性を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子（治療因子とも称される）である。治療活性を有する好ましいポリペプチドまたはタンパク質は、神経学的障害を寛解するか、または治療することのできるポリペプチドまたはタンパク質である。
【００２５】
好ましい一実施形態において、異種治療遺伝子は、神経栄養因子をコードしている。より好ましい一実施形態において、該神経栄養因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、特にＩＧＦ  ＩまたはＩＧＦ  ＩＩ；形質転換成長因子−αおよび−β（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、形質転換成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）、ノイルチュリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ）、パーセフィン（Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰ）などの形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバー；グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；ノイブラスチン（ＮＢＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン（ＮＴ）、特にＮＴ３からＮＴ９；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦ−αである。
【００２６】
他の好ましい実施形態において、異種治療遺伝子は、神経生存因子をコードしている。より好ましい一実施形態において、該神経生存因子は、可溶性または分泌されたスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸＬ、またはヘッジホッグタンパク質である。
【００２７】
第３の好ましい実施形態において、異種治療遺伝子は、神経生長因子をコードしている。より好ましい一実施形態において、該神経生長因子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、特に酸性または塩基性の線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはｂＦＧＦ）；内皮成長因子（ＥＧＦ）、特に血管内皮成長因子および血管透過性因子（ＶＥＧＰＦ）；インターフェロン、特にインターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γ、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２からＩＬ１４である。
【００２８】
第４の好ましい実施形態において、異種治療遺伝子は、神経伝達物質の合成に寄与する生物活性分子をコードしている。より好ましい一実施形態において、該神経伝達物質は、アセチルコリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、オクトパミン、グルタメート、アスパルテート、グリシン、プロリン、χ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン、タウリン、アラニン、シスタチオン、ヒスタミン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）、サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、コレシストキニン、ニューロテンシン、エンケファリン、またはソマトスタチンである。他の好ましい実施形態において、該神経伝達物質の合成において機能する生物活性分子は、コリンアセチルトランスフェラーゼ；チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；チロシンデカルボキシラーゼ；チミジンキナーゼ、シトシンデアミダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、Ｌ−ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）である。
【００２９】
第５の好ましい実施形態において、異種治療遺伝子は、受容体をコードしている。より好ましい一実施形態において、該受容体は、アセチルコリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、オクトパミン、グルタメート、アスパルテート、グリシン、プロリン、χ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシン、タウリン、アラニン、シスタチオン、ヒスタミン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）、サブスタンスＰ、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、コレシストキニン、ニューロテンシン、エンケファリン、またはソマトスタチンに結合する受容体である。
【００３０】
置換療法
本発明の細胞系は、特定の治療因子をコードする追加の異種ＤＮＡを含有するために操作されてもよいし、されなくてもよい。本発明の細胞系が特定の治療因子をコードする追加の異種ＤＮＡを含有しない場合は、回復療法に特に好適であり得る。
【００３１】
本明細書に定義されているとおり、置換療法は、移植後に、特定の位置において、またはＣＮＳおよび／またはＰＮＳ全体において、欠陥があるか、不在であるか、または消失した細胞およびそれらの機能に置き換わる、神経系における起源細胞の移植に関する。
【００３２】
さらなる一態様において、本発明は、ＣＮＳ内で、またはＣＮＳ外での置換療法に使用する方法および組成物を提供する。本発明の置換療法は、細胞置換、細胞により産生される細胞分泌内因性物質のデリバリー、造血系に関する療法、ヒトを含めた哺乳動物における神経学的疾患に、特に適用できる。
【００３３】
本発明によって考慮される神経学的欠損には、任意の神経変性の疾患、障害または病態が含まれる。神経学的欠損は、病変ニューロンおよび外傷ニューロン、特に末梢神経、延髄、および／または脊髄の外傷病変、脳虚血性ニューロン損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、グリア芽腫、筋萎縮性側索硬化症を含む、特に神経変性疾患または他の任意の神経変性疾患、および認知症に関係した記憶障害であり得る。
【００３４】
保護療法
特定の治療因子をコードする追加の異種ＤＮＡを保持しない本発明の不死化細胞系は、置換療法に十分好適であるが、特定の治療因子をコードする追加の異種ＤＮＡ導入に供された本発明の不死化細胞系は、保護療法に特に好適であり得る。
【００３５】
本明細書に定義されているとおり、保護療法は、移植後に、特定の位置において、またはＣＮＳおよび／またはＰＮＳ全体において、レシピエント個体の神経系における細胞死または機能障害を防止または保護するか、またはこれらの細胞の機能または再生能力および神経再支配能力を刺激する内因性または外因性治療因子を産生する、神経系における起源細胞の移植に関する。
【００３６】
特に、本発明は、保護療法に用いられる方法および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、ヒトを含めた、正常な、または免疫抑制された哺乳動物の脳に、治療的および／または予防的意図で、移植により用いられる方法および組成物を提供する。特に、本発明は、神経学的欠損の持続的で安全な治療に有用な方法および組成物を提供する。
【００３７】
本発明によって考慮される神経学的欠損には、任意の神経変性の疾患、障害または病態が含まれる。神経学的欠損は、病変ニューロンおよび外傷ニューロン、特に末梢神経、延髄、および／または脊髄の外傷病変、脳虚血性ニューロン損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、グリア芽腫、筋萎縮性側索硬化症を含む、特に神経変性疾患または他の任意の神経変性疾患、および認知症に関係した記憶障害であり得る。
【００３８】
分化
ＮＧＣ−４０７細胞系は、実施例１に記載されたもの（Ｂａｒｄｆｏｒｄ分化、Ｓａｈ分化、Ｓｔｏｒｃｈ分化）などの公知のインビトロ分化処置、さらに、国際公開第０２／０８６１０６号に記載されたＴＨ誘導法（Ｎｓ遺伝子）などの他の公知の分化方法に供することができる。このような分化は、置換療法の前に、またはインビトロアッセイまたは遺伝子発現プロファイリングの一部として実施できる。
【００３９】
分化プロトコルのさらなる例示例としては、実施例８に記載された２つのプロトコル（ＥＧＦおよびｂＦＧＦのないＮ２培地中での分化（Ｎ２分化）、ＥＧＦおよびｂＦＧＦがなく、ｃＡＭＰおよびＧＤＮＦを有するＮ２培地（ＤＡ分化培地）中での分化）が挙げられる。
【００４０】
さらに、ＮＧＣ−４０７細胞は、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、ＥｎおよびＬｍｘ１ｂなどの、ドーパミン作動性分化を担うか、またはそれに関与する転写因子をコードする発現ベクターの形質導入またはトランスフェクションによって分化させることができる。好ましい転写因子は、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎらにより記載されたようなＬｍｘ１ａである（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、２００６年、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｃｅｌｌ  １２４：３９３〜４０５頁）。
【００４１】
インビトロアッセイ
ＮＧＣ−４０７細胞系は、種々のインビトロアッセイにおいて、可能性のある薬剤（低分子量およびタンパク質、遺伝子またはｉＲＮＡ）の試験に使用できる。簡単に述べると、該細胞系を対象となっている化合物に曝露し、その応答を対照処理と比較する。該応答は、生存、分化、代謝活性、シグナル伝達、受容体活性化などであり得る。
【００４２】
遺伝子プロファイリング
ＮＧＣ−４０７細胞系は、腹側中脳がドーパミン作動性ニューロンを発達させるおよその時期におけるヒト胎児腹側中脳から樹立された。したがって、制御がＮＧＣ−４０７に特異的である遺伝子は、腹側中脳からの細胞のマーカーとして、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーとして、または、腹側中脳からの幹細胞／前駆細胞のマーカーとして使用できる。ＮＧＣ−４０７を用いて同定される遺伝子もまた治療可能性に関して試験できる。
【００４３】
自殺遺伝子療法
本出願の背景技術の項で説明したとおり、神経幹細胞は、自殺遺伝子の産物を癌細胞にデリバリーするためのデリバリービヒクルとして使用できる。本明細書の実施例で実証されているように、ＮＧＣ−４０７は、実際に、マーカー遺伝子（ＧＦＰ）の発現を維持しながらグリア芽腫に移動することができる。したがって、該細胞系は、異種自殺遺伝子を腫瘍にデリバリーするためのビヒクルとして使用できる。４−ＰＢの投与によって、移植された腫瘍の周囲にＧＦＰ陽性細胞の数が増加することが観察された。したがって、好ましい実施形態において、ＮＧＣ−４０７細胞を発現する自殺遺伝子が移植された患者に４−ＰＢが投与される。自殺遺伝子療法に関連した４−ＰＢおよび類似体の投与に関する方法および投与量は、国際公開第２００５／０７９８４９号に記載されている。
【００４４】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼ
バイスタンダー媒介自殺遺伝子療法の好ましい一実施形態において、本発明の細胞系は、異種デオキシリボヌクレオシドキナーゼを過剰発現するように遺伝子操作された。種々の生物のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ（ｄＮＫ）は、それらの基質特異性、遺伝子発現の調節および細胞局在化が異なっている。哺乳動物細胞には、重複する特異性を有する４つの酵素、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）および２（ＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）およびデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）ホスホリレートプリンおよびピリミジンデオキシリボヌクレオシドがある。ＴＫ１およびＴＫ２は、ピリミジン特異的であり、デオキシウリジン（ｄＵｒｄ）およびチミジン（ｄＴｈｄ）をリン酸化し、ＴＫ２は、デオキシシチジン（ｄＣｙｄ）もまたリン酸化する。ｄＣＫは、ｄＣｙｄ、デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）およびデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）をリン酸化するが、ｄＴｈｄはリン酸化しない。ｄＧＫは、ｄＧｕｏおよびｄＡｄｏをリン酸化する。哺乳動物では、ＴＫ１は細胞内可溶質であり、ＴＫ２およびｄＧＫは、ミトコンドリアに局在化しているが、最近の報告により、ＴＫ２の細胞質局在化も同様に示されている。
【００４５】
自殺遺伝子療法の最もよく知られ、最も研究された例は、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（Ｋａｒｒｅｍａｎ、１９９８年、Ａ  ｎｅｗ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ／ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ．２１８：５７〜６１頁）である。ＨＳＶ  ｔｋ遺伝子は、増殖細胞を、ガンシクロビル（ＧＣＶ）などの抗疱疹ヌクレオシド類似体に曝露すると、細胞死に至る。これおよび他のプロドラッグは、ＨＳＶ  ＴＫによって毒性代謝物へと代謝されるからである。
【００４６】
キイロショウジョウバエデオキシリボヌクレオシドキナーゼ（Ｄｍ−ｄＮＫ）は、４種全ての天然デオキシリボヌクレオシド、ならびに数種のヌクレオシド類似体をリン酸化する（Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９８年、キイロショウジョウバエの４種のデオキシヌクレオシドキナーゼ活性は、単一のモノマー酵素、新規の多機能デオキシヌクレオシドキナーゼ内に含有されている。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：３９２６〜３１頁；Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０００年、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：６６７３〜９頁；国際公開第００／３６０９９号「Ｎｅｗ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（ｄＮＫ）」）。高い触媒速度と共に、この酵素の広範な基質特異性により、この酵素は、癌の遺伝子療法／化学療法の組合せにおいて自殺遺伝子として使用するヌクレオシドキナーゼの中でもユニークなものになっている。
【００４７】
広範な基質特異性を有するキイロショウジョウバエＤｍ  ｄＮＫの変異体が開発されている（国際公開第０１／８８１０６号「Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ」）。特に好ましい変異体は変異体Ｂ５である。この活性化度が、ゲムシタビンに対して、野生型Ｄｍ  ｄＮＫよりおよそ５０倍良好だからである。活性化度は、トランスフェクトした細胞系におけるヌクレオシド類似体のＩＣ５０に対するトランスフェクトしていない細胞系におけるプロドラッグのＩＣ５０の比として定義される。
【００４８】
遺伝子療法アプローチにおけるこれらおよび他の組換えキナーゼは、ＣＭＶプロモーター、ヒトＵｂｉＣプロモーター、ＪｅＴプロモーター（米国特許第６，５５５，６７４号）、ＳＶ４０プロモーター、および伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−アルファ）などの強力な構成的プロモーターの制御下にそれらを置くことによって、ＮＧＣ−４０７細胞において過剰発現させることができる。
【００４９】
デオキシリボヌクレオシドキナーゼの特定の公知の配列の非限定的な例は、例えば、以下を含む。
ＨＳＶ−ｔｋ野生型受入番号Ｖ００４７０（配列番号１）
MASYPGHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRPEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWRVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQCGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRSMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）野生型キナーゼＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＮ  Ｙ１８０４８（配列番号２）
MAEAASCARKGTKYAEGTQPFTVLIEGNIGSGKTTYLNHFEKYKNDICLLTEPVEKWRNVNGVNLLELMYKDPKKWAMPFQSYVTLTMLQSHTAPTNKKLKIMERSIFSARYCFVENMRRNGSLEQGMYNTLEEWYKFIEESIHVQADLIIYLRTSPEVAYERIRQRARSEESCVPLKYLQELHELHEDWLIHQRRPQSCKVLVLDADLNLENIGTEYQRSESSIFDAISSNQQPSPVLVSPSKRQRVAR
トマトＴＫ（配列番号３）
MAFSSSARNPVDLRNGSKNSFCPVGEIHVIVGPMFAGKTTALLRRVNLESNDGRNVVLIKSSKDARYAVDAVVTHDGTRFPCWSLPDLSSFKQRFGKDAYEKVDVIGIDEAQFFGDLYEFCCNAADFDGKIIVVAGLDGDYLRKSFGSVLDIIPLADTVTKLTARCELCNRRAFFTFRKTNETETELIGGADIYMPVCRQHYVNGQSVNESAKMVLESHKVSNELILESPLVDP
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ｄＮＫ（配列番号４）
MVDYLRSSVGIIHRNHAESITTFIKESVDDELKDSGPEPNLNVKKRLTFCVEGNISVGKSTFLQRIANETVELQDLVEIVPEPVDKWQDVGPDHFNILDAFYSEPQRYAYTFQNYVFVTRLMQEKESASGVKPLRLMERSVFSDRMVFVRAVHEAKWMNEMEISIYDSWFDPVVSSLPGLVPDGFIYLRASPDTCHKRMMLRKRAEEGGVSLKYLQDLHEKHESWLLPFESGNHGVLSVSRPSLHMDNSLHPDIKDRVFYLEGNHMHSSIQKVPALVLDCEPNIDFSRDIEAKTQYARQVAEFFEFVKKKQETSTEKSNSQSPVLLPHQNGGLWMGPAGNHVPGLDLPPLDLKSLLTRPSA
キイロショウジョウバエ、変異体Ｂ５（配列番号５）
MAEAASCARKGTKYAEGTQPFTVLIEGNIGSGKTTYLNHFEKYKNDICLLTEPVEKWRNVNGVNLLELMYKDPKKWAMPFQSYATLTMLQSHTAPTNKKLKIMERSIFSARYCFVENMRRNGSLEQGMYNTLEEWYKFIEESIHVQADLIIYLRTSPEVAYERIRQRARSEESCVPLKYLQELHELHEDWLIHQRRPQSCKVLVLDADLDLENIGTEYQRSESSIFDAISSNQQPSPVPVSPSKRQRVAR
＞シロイヌナズナｄＣＧＫ  ＮＰ＿５６５０３２（配列番号６）
1 mqkilckstt sstpvlstpv nslaagfisl gfktpvknlp pcsttkplst cffstsampt
61 ttasvssggv gfsaylqrtv hkpapasvrf stagyrtcrc sidgtnrawv grtgswralf
121 csdstggltp vnatagavve seeesdgede deekdekpvr mnrrnrsssg sgefvgnpdl
181 lkipgvglrn qrklvdngig dvaelkklyk dkfwkasqkm vdylrssvgi ihrnhaesit
241 tfikesvdde lkdsgpepnl nvkkrltfcv egnisvgkst flqrianetv elqdlveivp
301 epvdkwqdvg pdhfnildaf ysepqryayt fqnyvfvtrl mqekesasgv kplrlmersv
361 fsdrmvfvra vheakwmnem eisiydswfd pvvsslpglv pdgfiylras pdtchkrmml
421 rkraeeggvs lkylqdlhek heswllpfes gnhgvlsvsr pslhmdnslh pdikdrvfyl
481 egnhmhssiq kvpalvldce pnidfsrdie aktqyarqva effefvkkkq etsteksnsq
541 spvllphqng glwmgpagnh vpgldlppld lkslltrpsa
＞イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）ｄＣＧＫ  ＢＡＢ８６２１３（配列番号７）
1 mveflqssvg iihknhaesi tlfikesvde elkgtdspnv sknkrltfcv egnisvgktt
61 flqrianeti elrdlveivp epiakwqdvg pdhfnildaf yaepqryayt fqnyvfvtrv
121 mqekesssgi kplrlmersv fsdrmvvkfl kvfvravhea nwmnemeisi ydswfdpvvs
181 slpglipdgf iylraspdtc hkrmmvrkrs eeggvtldyl rglhekhesw llpskgqgpg
241 vlsvsqvpvh megslppdir ervfylegdh mhssiqkvpa lvldcehdid fnkdieakrq
＞ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ｄＣＫ  ＸＰ＿００３４７１（配列番号８）
MATPPKRSCPSFSASSEGTRIKKISIEGNIAAGKSTFVNILKQLCEDWEVVPEPVARWCNVQSTQDEFEELTMSQKNGGNVLQMMYEKPERWSFTFQTYACLSRIRAQLASLNGKLKDAEKPVLFFERSVYSDRYIFASNLYESECMNETEWTIYQDWHDWMNNQFGQSLELDGIIYLQATPETCLHRIYLRGRNEEQGIPLEYLEKLHYKHESWLLHRTLKTNFDYLQEVPILTLDVNEDFKDKYESLVEKVKEFLSTL
＞ヒトｄＧＫ  ＸＰ＿００２３４１（配列番号９）
MAAGRLFLSRLRAPFSSMAKSPLEGVSSSRGLHAGRGPRRLSIEGNIAVGKSTFVKLLTKTYPEWHVATEPVATWQNIQAAGNQKACTAQSLGNLLDMMYREPARWSYTFQTFSFLSRLKVQLEPFPEKLLQARKPVQIFERSVYSDRYIFAKNLFENGSLSDIEWHIYQDWHSFLLWEFASRITLHGFIYLQASPQVCLKRLYQRAREEEKGIELAYLEQLHGQHEAWLIHKTTKLHFEALMNIPVLVLDVNDDFSEEVTKQEDLMREVNTFVKNL
＞ヒトＴＫ２  ＮＰ＿００４６０５（配列番号１０）
MGAFCQRPSSDKEQEKEKKSVICVEGNIAGGKTTCLEFFSNATDVEVLTEPVSKWRNVRGHNPLGLMYHDASRWGLTLQTYVQLTMLDRHTRPQVSSVRLMERSIHSARYIFVENLYRSGKMPEVDYVVLSEWFDWILRNMDVSVDLIVYLRTNPETCYQRLKKRCREEEKVIPLEYLEAIHHLHEEWLIKGSLFPMAAPVLVIEADHHMERMLELFEQNRDRILTPENRKHCP
＞ヒトＴＫ１  ＸＰ＿０３７１９５（配列番号１１）
MSCINLPTVLPGSPSKTRGQIQVILGPMFSGKSTELMRRVRRFQIAQYKCLVIKYAKDTRYSSSFCTHDRNTMEALPACLLRDVAQEALGVAVIGIDEGQFFPDIMEFCEAMANAGKTVIVAALDGTFQRKPFGAILNLVPLAESVVKLTAVCMECFREAAYTKRLGTEKEVEVIGGADKYHSVCRLCYFKKASGQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQQILQCSPAN
＞カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ｄＮＫ  ＡＡＫ２８３１８（配列番号１２）
1 msannvkpft vfvegnigsg kttflehfrq feditlltep vemwrdlkgc nllelmykdp
61 ekwamtfqsy vsltmldmhr rpaptpvklm erslfsaryc fvehimrnnt lhpaqfavld
121 ewfrfiqhni pidadlivyl ktspsivyqr ikkrarseeq cvplsyieel hrlhedwlin
181 rihaecpapv lvldadldls qitdeykrse hqilrkavnv vmsspnkhsp kkpisttpik
241 itphmril
＞ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）ｄＮＫ  ＡＡＯ４９４６２（配列番号１３）
MPPIASEKLGASGKKPFTVFVEGNIGSGKTTFLNHFQKFNDICLLTEPVEKWRNCGGVNL
LDLMYKESHRWAMPFQTYVTLTMLDMHTCQTDKSVKLMERSLFSARNCFVESMLASGSLH
QGMYNVLQEWYDFICCNIHIQADLIVYLQTSPEVVYERMKQRARSEESCVPLEYLKELHE
LHENWLIHGASPRPAPVLVLNADLDLNTIGAEYERSETSILKPILIENTNQHAILTSPAK
RAKTDF
＞イネＴＫ１（配列番号１４）
MSSICAMRSLLAASTFLRSGASPLLRPLSRPLPSRLNLSRFGPVRPVSAAAAAADKSRGGGG
SAMEAQPSYPGEIHVIVGPMFAGKTTALLRRVQVEAGTGRNVALIKSDKDNRYGLDSVVTHD
GTKMPCWALPELSSFQDKLGTEAYDKVDVIGIDEAQFFDDLHDFCCKAADRDGKIVVVAGLD
GDYKRNKFGSVLDIIPLADSVTKLTARCELCGRRAFFTLRKTRETKTELIGGADVYMPVCRQ
HYLDGQIVIEATRIVLDLEKSKVIHAFK
＞シロイヌナズナＴＫ１  ＡＡＦ１３０９７（配列番号１５）
MATLKASFLIKTLDSDVTGDFLSDLERRGSGAVHVIMGPMFSGKSTSLLRRIKSEISDGRS
VAMLKSSKDTRYAKDSVVTHDGIGFPCWALPDLMSFPEKFGLDAYNKLDVIGIDEAQFFG
DLYEFCCKVADDDGKIVIVAGLDGDYLRRSFGAVLDIIPIADSVTKLTARCEVCGHKAFF
TLRKNCDTRTELIGGADVYMPVCRKHYITNHIVIKASKKVLEDSDKARAESCVAATI
＞シロイヌナズナＴＫ１ｂ（配列番号１６）
MRTLISPSLAPFSLHLHKPSLFSTALRFSFSINNITPTNSPPST
ISTRKLQTKATRVTSSSSSQPLSSSSPGEIHVVVGPMFSGKTTTLLRRILAERETGKR
IAIIKSNKDTRYCTESIVTHDGEKYPCWSLPDLSSFKERFGFDDYENRLDVIGIDEAQ
FFGDLYEFCREAADKEGKTVIVAGLDGDFMRRRFGSVLDLIPIADTVTKLTSRCEVCG
KRALFTMRKTEEKETELIGGAEVYMPVCRSHYVCGQNVLETARAVLDSSNNHSVVASS
L
＞トマトｄＣＧＫ（配列番号１７）
MVEFLQSSIGIIHRNHAESITTYIRKSVDEELKENNSDS 
NVKSTQKKRLTFCVEGNISVGKTTFLQRIANETLELQDLVEIVPEPIAKWQDIGPDHFNI 
LDAFYAEPQRYAYTFQNYVFVTRVMQERESSGGIRPLRLMERSVFSDRMVFVRAVHEANW 
MNEMEISIYDSWFDPVVSTLPGLIPDGFIYLRASPDTCHKRMMLRKRTEEGGVSLEYLRG 
LHEKHESWLFPFESGNHGVLSVSELPLNFDKFCVPPEIRDRVFYLEGNHMHPSIQKVPAL 
VLDCEPNIDFNRDIEAKRQYARQVADFFEFVKKKQEVMPGAGEEQPKGNQAPVMLPQNGG 
LWVPGGKFSESTLNLDFRRNMSFMSH
【００５０】
対応するヌクレオチド配列は、上記に提供された参考文献、植物キナーゼに関しては、国際公開第０３／１０００４５号（チミジンキナーゼ）、および国際公開第２００４／００３１８５号（ｄＣＫ／ｄＧＫ）に、上記の受入番号を用い、ＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。
【００５１】
好ましい一実施形態において、デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、
ａ）配列番号１から１７のいずれかのアミノ酸配列を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
ｂ）配列番号１から１７のいずれかと少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むデオキシリボヌクレオシドキナーゼ変異体、
ｃ）配列番号１から１７のいずれかをコードするヌクレオチド配列と、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列によってコードされるデオキシリボヌクレオシドキナーゼ
からなる群から選択される。
【００５２】
本発明の状況において、用語のキナーゼ変異体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７で示された配列と、１つまたは複数のアミノ酸位置が異なっていて、ｄＮＫ活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはタンパク質）である。このような類似ポリペプチドとしては、他の種の保存的置換、スプライス変異体、イソ型、相同体、および多型が挙げられる。
【００５３】
本明細書に定義される用語の「保存的置換」とは、他の生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的置換の例としては、
（ｉ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンなどの１つの非極性または疎水性残基による別の残基の置換、特に、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンによる別の残基の置換；または
（ｉｉ）セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、またはシステインなどの１つの中性（非荷電）極性残基による別の残基の置換、特に、リシンによるアルギニン、アスパラギン酸によるグルタミン酸、またはアスパラギンによるグルタミンの置換；または
（ｉｉｉ）リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの正に荷電した残基による別の残基の置換；または
（ｉｖ）アスパラギン酸またはグルタミン酸などの負に荷電した残基による別の残基の置換
が挙げられる。
【００５４】
この一次アミノ酸配列の改変により、非改変対応ポリペプチドと比較して、実質的に等価の活性を有し、したがって、親タンパク質と機能的に類似と考えることができるタンパク質をもたらすことができる。このような改変は、例えば、部位特異的変異誘発などにより計画的であり得るか、またはそれらは自然に生じ得、他の種のスプライス変異体、イソ型、相同体、および多型が挙げられる。このような機能的類似体もまた、本発明によって考慮されている。
【００５５】
Ｃ末端および／またはＮ末端に変化を受けたデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、それらの性質を、特にターンオーバーおよび基質特異性などの速度論的性質に関して著しく変化させることが見出されている。したがって、本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を、より限定された特異性、通常、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）活性およびデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）活性を有することから、４種全てのデオキシリボヌクレオシドをリン酸化する能力を有する本質的に多基質酵素へと変換できる。
【００５６】
変異デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、上記に開示されたキナーゼのいずれかなどの公知のデオキシリボヌクレオシドキナーゼのアミノ酸配列を参照にして定めることができる。好ましい一実施形態において、変異キナーゼは、参照配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも６０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有する。個々の参照配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７のいずれかであり得る。
【００５７】
より好ましい一実施形態において、デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、
ａ）配列番号１から配列番号５までのいずれかのアミノ酸配列を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ；および
ｂ）配列番号１から配列番号５までのいずれかに少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｄＮＫ活性を有するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ変異体
からなる群から選択されるデオキシリボヌクレオシドキナーゼを含む。
また、同一の個体に、２種以上のデオキシリボヌクレオシドキナーゼを投与することも可能である。
限定はしないが、キナーゼとヌクレオシド類似体の以下の組合せが好ましい。
ＨＳＶ−ｔｋ−ＧＣＶ、ＡＣＶ、ペンシクロビル
キイロショウジョウバエｄＮＫまたはＢ５−ゲムシタビン、ＣｄＡ、ＦａｒａＡ、ａｒａＣ、ｄｄＣ
トマトＴＫなどの植物ＴＫ−ＡＺＴ、Ｄ４Ｔ、ｄｄＴ、フルオロウリジン
シロイヌナズナｄＮＫなどの植物ｄＮＫ−ゲムシタビン、ＣｄＡ、ＦａｒａＡ、ａｒａＣ、ｄｄＣ
【００５８】
配列の比較および配列同一性の算出に利用される数学的演算の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）の演算である。このような演算は、ＦＡＳＴＡ配列アラインメントソフトウェアパッケージ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０００年、１３２：１８５−２１９頁）の一部であるＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に組み込まれている。Ａｌｉｇｎは、全体的なアラインメントに基づいて配列同一性を算出する。Ａｌｉｇｎ０は、配列末端のギャップにペナルティーを与えない。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮまたはＡｌｉｇｎ０プログラムを利用する場合、−１２／−２のギャップ開始／延長ペナルティーを有するＢＬＯＳＵＭ５０置換行列を用いることが好ましい。
【００５９】
カプセル化
カプセル化細胞療法は、宿主内に移植する前に、半透過性の生体適合性材料で細胞を包囲することによって、該細胞をレシピエント宿主の免疫系から隔離する考え方に基づいている。本発明は、本発明の細胞を免疫隔離性カプセル内に封入するデバイスを含む。「免疫隔離性カプセル」とは、該カプセルが、レシピエント宿主に移植された際、該デバイスのコア内で、細胞に及ぼす宿主免疫系の有害な作用を最少化することを意味する。微多孔膜により形成された移植可能なポリマーカプセル剤内に細胞を包みこむことによって、該細胞は宿主から免疫隔離される。この方法により、直接的提示を介した抗原認識を排除して、宿主と移植組織との間の細胞対細胞接触が防止される。また、使用される膜は、抗体および補体などの分子の拡散を、それらの分子量に基づいて制御する一方、治療タンパク質の拡散を可能にするように調整することもできる。カプセル化法を用いることによって、免疫抑制剤を用いて、または用いずに、細胞を免疫拒絶なしに宿主へ移植することができる。有用な生体適合性ポリマーカプセルは、通常、液体培地に懸濁させたか、または固定化マトリックス内に固定化された細胞を含有するコア、および生体適合性の単離細胞を含有せず、有害な免疫学的攻撃からコア内の細胞を保護する上で十分な選択透過性マトリックスまたは膜（「ジャケット」）の周囲または周辺領域を含有する。カプセル化により、免疫系の要素がカプセルに進入することが妨げられ、それによって、カプセル化された細胞は免疫的破壊から保護される。また、該カプセル膜の半透過性の性質により、対象となっている生物活性分子が該カプセルから周囲の宿主組織内へ容易に拡散することが可能になる。
【００６０】
該カプセルは、生体適合性材料から作製できる。「生体適合性材料」は、宿主への移植後、該カプセルの拒絶をもたらすかまたは、例えば分解によってそれが操作不可能になるような有害な宿主応答を誘発することのない材料である。該生体適合性材料は、宿主免疫系の成分などの大型分子には比較的不透過性であるが、インスリン、成長因子、および栄養物質などの小型分子には透過性である一方、代謝廃棄物は除去できる。種々の生体適合性材料が、本発明の組成物により成長因子のデリバリーに好適である。種々の外表面形態および他の機械的および構造的特徴を有する多数の生体適合性材料が知られている。本発明のカプセルは、参照として組み込まれている国際公開第９２／１９１９５号または国際公開第９５／０５４５２号；または参照として組み込まれている米国特許第５，６３９，２７５号；第５，６５３，９７５号、第４，８９２，５３８号、第５，１５６，８４４号、第５，２８３，１８７号、または第５，５５０，０５０号に記載されているものと同様であることが好ましい。このようなカプセルにより、代謝物、栄養物および治療的物質の通過を可能にする一方、宿主免疫系の有害な作用を最少化できる。生体適合性材料の成分は、周囲の半透膜および内部の細胞を支持している足場を含み得る。組換え細胞を該足場に接種し、それを透過選択性の膜によってカプセル化することが好ましい。細胞を支持する線維状の足場は、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステル、絹、綿、キチン、炭素、または生体適合性金属よりなる群から選択される任意の生体適合性材料から作製できる。また、細胞移植には、結合線維構造を使用できる（参照として組み込まれている米国特許第５，５１２，６００号）。生物分解性ポリマーとしては、ポリ（乳酸）ＰＬＡ、ポリ（乳酸−コグリコール酸）ＰＬＧＡ、およびポリ（グリコール酸）ＰＧＡならびにそれらの等価物からなるものが挙げられる。移植細胞が付着し得る表面を提供するために、泡状足場が用いられている（参照として組み込まれている国際公開第９８／０５３０４号）。血管移植片として繊維メッシュ管が用いられている（参照として組み込まれている国際公開第９９／５２５７３号）。また、該コアは、該細胞の位置を安定化させるヒドロゲルから形成した固定マトリックスからなり得る。ヒドロゲルは、実質的に水よりなる、ゲルの形態における架橋親水性ポリマーの三次元網状構造である。
【００６１】
該ジャケットは、１０００ｋＤ未満、より好ましくは、５０ｋＤ〜７００ｋＤの間、最も好ましくは、７０ｋＤ〜３００ｋＤの分子量カットオフを有する。生物学的に活性な治療的タンパク質がカプセルから流出することができる一方、封入された細胞を親の免疫系から保護することが確実なように、分子量カットオフを選択するべきである。
【００６２】
該ジャケットの厚さは典型的に、２ミクロンから２００ミクロン、より好ましくは、５０ミクロンから１５０ミクロンの範囲にある。該ジャケットは、細胞の封入を維持する上で十分な強度をカプセルに与える厚さを有すべきだが、これを考慮に入れつつ、できるだけスペースをとらないようにできるだけ薄くすべきである。
【００６３】
周囲の半透過膜を製造するために、ポリアクリレート（アクリルコポリマーを含む）、ポリビニリデン、ポリビニルクロリドコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースナイトレート、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）、ならびにそれらの誘導体、コポリマーおよび混合物などの種々のポリマーおよびポリマー混合物を用いることができる。周囲の半透過膜は、生体適合性半透過中空線維膜であることが好ましい。このような膜、およびそれらを製造する方法は、参照として組み込まれている米国特許第５，２８４，７６１号および第５，１５８，８８１号に開示されている。周囲の半透過膜は、参照として組み込まれている米国特許第４，９７６，８５９号または米国特許第４，９６８，７３３号に記載されているものなどのポリエーテルスルホン中空線維から形成することができる。代替の周囲半透過膜材料は、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）である。
【００６４】
カプセルは、生物活性を維持し、生成物または機能のデリバリーのアクセスを提供するために、例えば、円筒状、角状、円盤状、パッチ状、卵状、星状、または球状などの任意の適切な形状であり得る。さらに、該カプセルは、渦巻き状にするか、またはメッシュ状または入れ子形構造に巻き付けることができる。該カプセルを移植後に回収する場合は、レシピエント宿主の血管内へ移動する上で十分に小さな球状カプセルなど、移植部位からのカプセルの移動に至る傾向のある形状は好ましくない。角状、パッチ状、円盤状、円筒状、および平坦なシート状などの形状は、より大きな構造完全性を提供し、回収が望まれる場合に好ましい。特に好ましい形状は、円筒状である。このような形状は工業的に製造できる中空線維から容易に製造できるからである。
【００６５】
マクロカプセルが用いられる場合、各デバイスに、１０３から１０８の細胞がカプセル化されるなど、好ましくは少なくとも１０３の細胞がカプセル化され、最も好ましくは１０５から１０７の細胞がカプセル化される。勿論、各カプセル剤中の細胞数はそのカプセルのサイズに依る。泡を有するカプセル（下記に説明）中、おおよそ、１μＬ（泡を含めた内部容量として計算した容量）のカプセル当たり、１０，０００から１００，０００の細胞、より好ましくは、１μＬ当たり、２５，０００から５０，０００の細胞、より好ましくは、１μＬ当たり、３０，０００から４０，０００の細胞が入ることを、本発明者らは見出した。入れる細胞数はまた、該細胞のサイズにも依る。
【００６６】
投与量は、より少ない、またはより多い数のカプセル、好ましくは、患者一人当たり、１カプセルと１０カプセルとの間を移植することにより制御できる。
【００６７】
本脈絡におけるマクロカプセルは、１μＬから１０μＬなど、少なくとも１μＬの容量を有するカプセルである。
【００６８】
該足場は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子によってコーティングできる。細胞外マトリックス分子の好適な例としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンが挙げられる。細胞の接着を増進させる目的で電荷を付与するために、プラズマ照射を用いた処理により、該足場の表面を修飾することもできる。
【００６９】
ポリマー接着剤またはポリマークリンピング、ノッティングおよびヒートシーリングの使用など、カプセルを密封する任意の好適な方法を使用できる。また、例えば、参照として組み込まれている米国特許第５，６５３，６８７号に記載されているような、任意の好適な「ドライ」密封法も使用できる。
【００７０】
カプセル化された細胞デバイスは、公知の技法によって移植される。本発明のデバイスおよび方法に関して多くの移植部位が考慮される。これらの移植部位としては、限定はしないが、脳、脊髄などの中枢神経系（参照として組み込まれている米国特許第５，１０６，６２７号、第５，１５６，８４４号、および第５，５５４，１４８号を参照）、ならびに目の眼房水およびガラス体液（参照として組み込まれている国際公開第９７／３４５８６号）が挙げられる。
【００７１】
フォーム足場
フォーム足場は、開放気泡または網状構造の孔によるマクロ孔構造を有する生体適合性のフォームを形成する任意の好適な材料から形成できる。開放気泡のフォームは、連続孔の網状構造である。フォーム足場により、接着性細胞を付着させる非生物分解性で安定な足場材料が提供される。本発明のデバイスのためのフォーム足場の形成に有用なポリマーの中でも、熱可塑性樹脂および熱可塑性エラストマーがある。
【００７２】
好適なフォーム足場の形成に有用な材料のいくつかの例は、表１に挙げられている。
【００７３】
【表１】
2008533995.tif 000003
【００７４】
ポリスルホンおよびポリエーテルスルホンから作製された熱可塑性フォーム足場、ならびにポリウレタンおよびポリビニルアルコールから作製された熱可塑性エラストマーフォーム足場が好ましい。
【００７５】
泡は、細胞が孔内の壁または表面に付着することを可能にするサイズのいくつかの（しかし必ずしも全てではない）孔を有する必要がある。フォーム足場の孔のサイズ、孔密度および間隙容量は変わり得る。孔の形状は、円形、楕円形または不規則形であり得る。孔の形状はかなり変化し得るため、その寸法は、測定される軸によって変化し得る。本発明の目的に関しては、フォームの少なくともいくつかの孔は、２０〜５００μｍの間、好ましくは５０〜１５０μｍの間の孔直径を有する必要がある。先の寸法は、泡の平均孔サイズを表すことが好ましい。円形でない場合、孔は、そのサイズが接着性細胞を孔内の壁または表面に付着させるのに十分である限り、種々の寸法を有し得る。一実施形態において、短軸に沿って、２０〜５００μｍの直径、および長軸に沿って１５００μｍまでの直径を有するいくつかの楕円形の孔を有するフォームが考慮されている。
【００７６】
先の細胞許容的な孔サイズに加えて、フォームにおける孔の少なくとも一部が、細胞非許容的になるために１０μｍ未満である必要があるが、フォーム全体に、栄養物および生物活性分子を輸送するためのチャネルを依然として提供することが好ましい。
【００７７】
フォームの孔密度（すなわち、上記のとおり、細胞を収容できる孔の容量当たりの数）は、２０％〜９０％の間、好ましくは５０％〜７０％の間で変化し得る。
【００７８】
同様に、フォームの間隙容量は、２０％〜９０％の間、好ましくは３０％〜７０％の間で変化し得る。
【００７９】
孔の壁または表面は典型的に、細胞外マトリックス分子（一種または複数種）、または他の好適な分子によってコーティングされる。このコーティングは、孔の壁への細胞の接着を促進するため、特定の表現型に細胞を保持するため、および／または細胞分化を誘導するために使用できる。
【００８０】
フォームの孔内の表面に接着できる細胞外マトリックス分子（ＥＣＭ）の好ましい例としては、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ポリオルニチンおよびフィブロネクチンが挙げられる。他の好適なＥＣＭ分子としては、グルコサミノグリカンおよびプロテオグリカン；例えば、クロンドロイチン（ｃｈｒｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）およびエラスチンが挙げられる。
【００８１】
ＥＣＭは、間充織起源または星状細胞起源の細胞など、ＥＣＭを蓄積することが知られている細胞を培養することによって得ることができる。シュバン細胞を、アスコルベートおよびｃＡＭＰで処理すると、ＥＣＭを合成するように誘導できる。例えば、Ｂａｒｏｎ−Ｖａｎ  Ｅｖｅｒｃｏｏｒｅｎら、「Ｓｃｈｗａｎｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８、１８２−９６頁（１９８６）を参照されたい。
【００８２】
また、接着ペプチド断片、例えば、ＲＧＤ含有配列（ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ）、ＹＩＧＳＲ含有配列（ＴｙｒＩｌｅＧｌｙＳｅｒＡｒｇ）、ならびにＩＫＶＡＶ含有配列（ＩｌｅＬｙｓＶａｌＡｌａＶａｌ）は、細胞付着の促進に有用であることが分かっている。いくつかのＲＧＤ含有配列は、例えば、ＰｅｐＴｉｔｅ−２０００．ＴＭ．（Ｔｅｌｉｏｓ）が市販されている。
【００８３】
本発明のフォーム足場はまた、該デバイス内の細胞分散を増進させる他の材料によって処理することもできる。例えば、フォームの孔を、細胞の増殖または移動を阻止する非許容的ヒドロゲルによって充填することができる。このような修飾により、フォーム足場に対する接着性細胞の付着を改善することができる。好適なヒドロゲルとしては、荷電により細胞をはねのけることができるアニオン性ヒドロゲル（例えば、アルギン酸塩またはカラゲナン）が挙げられる。あるいは、細胞により分泌された細胞外マトリックス分子の結合を妨げることにより細胞増殖を阻害するために、「固体」ヒドロゲル（例えば、アガロースまたはポリエチレンオキシド）を用いることもできる。
【００８４】
非許容的材料の領域でフォーム足場を処理することにより、２種以上の異なる細胞集団を、１種の細胞集団を他より過増殖させることなく、該デバイス内にカプセル化することができる。したがって、カプセル化細胞の別個の集団を分離するために、フォーム足場内に非許容的材料を使用することができる。細胞の異なる集団は、同一の、または異なる細胞型であり得、同一の、または異なる生物活性分子を産生し得る。一実施形態において、ある細胞集団は、他の細胞集団の増殖および／または生存を増強させる物質を産生する。他の実施形態において、複数の生物活性分子を産生する複数の細胞型がカプセル化される。これによって、治療的物質の混合物または「カクテル」がレシピエントに提供される。
【００８５】
本発明のデバイスは任意の好適な方法によって形成できる。一実施形態において、フォーム足場を予備形成して、別個の成分として予備製造されたジャケット、例えば、中空線維膜内に挿入できる。
【００８６】
予備製造されたジャケット内に挿入するための任意の好適な熱可塑性樹脂または熱可塑性エラストマーのフォーム足場材料を予備形成できる。一実施形態において、フォーム足場としての使用に我々が推奨するのは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）スポンジである。いくつかのＰＶＡスポンジが市販されている。例えば、ＰＶＡフォームスポンジ＃Ｄ−３、６０μｍ孔径が好適である（Ｒｉｐｐｅｙ  Ｃｏｒｐ、Ｋａｎｅｂｏ）。同様に、ＰＶＡスポンジはＩｖａｌｏｎ社から市販されている。（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）。ＰＶＡスポンジは、架橋剤としてホルムアルデヒド蒸気を用いた通気ポリ（ビニルアルコール）溶液の反応によって形成された水不溶性フォームである。ＰＶＡ上のヒドロキシル基はアルデヒド基と共有的に架橋してポリマー網状構造を形成する。該フォームは湿潤時は可撓性および弾性であり、乾燥時は半剛性である。
【００８７】
代替として、米国特許第６，６２７，４２２号に記載されるとおり、支持体メッシュまたはヤーンを使用することができる。回収を容易にするために、該カプセルに係留アンカーを備えることができる。
【００８８】
本発明のＮＧＣ−４０７またはＮＧＣ−４０７由来細胞を実施例に記載されるとおりに増殖させ、免疫隔離的カプセルに装入することができる。装入後、該カプセルは、インビトロで多週間維持できる。この期間の増殖培地は、カプセル内の継続的増殖を可能にするものでもよいし、カプセル化細胞を分化させ、それによって増殖を停止させるために、培地を分化培地に取り替えてもよい。
【００８９】
本発明の細胞のための支持体マトリックス
本発明の方法はさらに、本発明の細胞を哺乳動物の脳内に移植する前に、支持体マトリックス上、インビトロで培養することを含む。移植細胞の長期生存性を高め、長期の機能的利益を提供するために、脳に移植する前に、マイクロキャリアへの細胞の予備接着がデザインされる。支持体マトリックス上で細胞を培養する方法および前記細胞を脳内に移植する方法は、米国特許第５，７５０，１０３号（Ｃｈｅｒｋｓｅｙ）に記載されている。
【００９０】
移植細胞の長期生存性を高めるために、移植する細胞を、移植前に、支持体マトリックスにインビトロで付着させることができる。支持体マトリックスに含まれ得る材料としては、細胞がインビトロインキュベーション後に接着し、その上で増殖でき、移植細胞を破壊するか、そうでなければ、移植細胞の生物活性または治療的活性を妨害すると考えられる毒性反応または炎症反応を生じさせずに、哺乳動物の体内へ移植できる材料が挙げられる。このような材料は、合成化学物質でも、天然化学物質でも、また、生物学的起源を有する物質でもよい。
【００９１】
該マトリックス材料としては、限定はしないが、ガラスおよび他の酸化シリコン類、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー類、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテント、ナイロン、アミラーゼ類、天然および修飾ゼラチンならびに天然および修飾（ｃｏｄｉｆｉｅｄ）コラーゲン、デキストラン類およびセルロース類（例えば、ニトロセルロース）などの天然および修飾多糖類、寒天、およびマグネタイトが挙げられる。再吸収性材料または非再吸収性材料を使用することができる。また、当業界によく知られている細胞外マトリックス材料も考慮されている。細胞外マトリックスは市販のものを入手してもよいし、そのようなマトリックスを分泌する細胞を増殖させ、分泌細胞を取り出し、移植する細胞を該マトリックスと相互作用させてそれに接着させることによって調製してもよい。移植される細胞が上で増殖するか、または該細胞を混合させるマトリックス材料は、該細胞の固有の産物であってもよい。したがって、例えば、該マトリックス材料は、移植される細胞によって産生され、分泌される細胞外マトリックスまたは基底膜の材料であってもよい。
【００９２】
細胞の接着、生存性、機能を改善するために、該固体マトリックスは、細胞の接着、増殖または生存を促進することが当業界に知られている因子によって、所望により、外表面をコーティングできる。このような因子としては、細胞接着分子、細胞外マトリックス、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカンなど、または成長因子が挙げられる。
【００９３】
あるいは、移植細胞が付着する固体マトリックスが多孔性材料から構築される場合、増殖促進因子または生存促進因子を該マトリックス材料に組み込むことができ、インビボでの移植後、そこからそれらを徐々に放出させることが考えられる。
【００９４】
本発明による支持体に付着した際、移植に用いられる細胞は一般に、該支持体の「外表面」上にある。該支持体は、固体であっても、多孔性であってもよい。しかし、たとえ多孔性であっても、該細胞は介在膜または他のバリアなしに、外部環境と直接接触する。したがって、本発明により、たとえ該細胞が接着する表面が、粒子またはビーズそれ自体の外部にない多孔性支持体材料の内部ひだまたは畳み込みの形態であっても、該細胞は該支持体の「外表面」上にあると考えられる。
【００９５】
該支持体の形状は、ビーズにおけるような球状であることが好ましいが、円筒状、楕円状、平坦シート状またはストリップ状、針状またはピン状などであってもよい。支持体マトリックスの好ましい形態は、ガラスビーズである。他の好ましいビーズは、ポリスチレンビーズである。
【００９６】
ビーズのサイズは、直径が約１０μｍから１ｍｍの範囲、好ましくは、約９０μｍから約１５０μｍの範囲であり得る。種々のマイクロキャリアビーズの説明に関しては、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｏｕｒｃｅ  ８７−８８頁、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１９８７年、７２−７５頁；Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、１９９１年、１６２−１６３頁；Ｖｅｎｔｒｅｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ、Ｖｅｎｔｒｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８９年を参照されたい。これらの参考文献は、参照として本明細書に組み込まれている。ビーズサイズの上限は、移植細胞の機能を妨害し得るか、または周囲の組織に損傷を生じさせ得る望ましくない宿主反応のビーズ刺激により決定され得る。ビーズサイズの上限はまた、投与の方法によっても決定され得る。このような限界は当業者によって容易に決定できる。
【実施例】
【００９７】
実施例１  ＮＧＣ−４０７細胞系の作出および特性化
本実施例では、ＮＧＣ−４０７細胞系の作出およびインビトロ特性化を示す。
【００９８】
一次培養液中のヒト中脳細胞を、第１トリメスターのヒト胎児脳（Ｌｕｎｄ大学、スウェーデン国を介して入手）から調製した。該組織はスウェーデンの法律および規則を遵守して入手した。腹側中脳の切開直後、該組織をペトリ皿内で、１滴の細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ５９１４）中に入れることによって、＜０．５ｍｍ３片に切り離した。次いで、２つの解剖刀を互いに動かすことによって、該組織を切り離した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ＃３１３３１−０２８）、０．５％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ  １６５３）、０．６％グルコース（Ｓｉｇｍａ＃Ｇ８７６９）、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１５６３０−０５６）、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０４−０４４）、４０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２３３−ＦＢ）、２０μｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃２３６−ＥＧ）を添加したＮ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ＃１７５０２−０４８）からなる２ｍｌの培養培地に移し、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、新鮮培養培地中に再懸濁した。ＰＬＬ／フィブロネクチンでコーティングした４ｗチャンバースライド内の１〜４個のウェル中、または２４ｗプレート中に組織片を接種した。標準的な細胞培養プラスチックを用い、ＰＬＬ／フィブロネクチンコーティングは以下のとおり実施した：
培養容器のコーティング：
１．０．０１％ポリ−Ｌ−リシン溶液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ４８３２）と共に、３７℃で１時間インキュベートする
２．ＰＬＬを取り出し、ｄＨ２Ｏ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２３０−０７１）ですすぎ、表面を２時間乾燥させる。
３．細胞接種の直前に、フィブロネクチンの溶液（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｆ０８９５）を十分加え、ｄＨ２Ｏ中、５０μｇ／ｍｌに希釈し、表面を被覆し、直ちに吸引し、表面を４５分間乾燥させてから組織／細胞を加える。
【００９９】
接種４日目に、細胞培養物にＴＤ１−２レトロウィルスベクターを形質導入し、１のＭＯＩでウィルス貯蔵物を加え、一晩インキュベートし、培養培地の交換により取り出した。ベクターＴＤ１−２は、ＥｃｏＲＩとｐＬＸＳＮ（ＢＤＣｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号：６３１５０９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ２８２４８）のＨｐａｌ部位との間のＥｃｏＲＩ／Ｄｒａｌ断片として、ｖ−ｍｙｃ（ｇａｇ−ｖｍｙｃ断片として）（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０３３８０９）のクローニングにより作製した（図５）。ネオマイシン耐性を与える遺伝子もまた該ベクター内に存在する。該培養物を培養培地およびＰＬＬ／フィブロネクチンコーティング容器中で、コンフルエントなＴ２５フラスコへ増殖させた。形質導入細胞を選択するために、８００μｇ／ｍｌの濃度のジェネティシンを加えた。選択後、培養物を、上記の培養培地中、単層として増殖を維持した。コンフルエントに近づいた培養物を細胞スクレイパーを用いて継代し、３日〜７日ごとに１：４に分割した。
【０１００】
成長因子、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの除去により、該細胞系の分化が生じる。分化後、異なる因子の添加により、細胞の表現型の組成が影響される（図１および図２）。３種の異なる分化培地が用いられた：
１．５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１および５０μＭのフォルスコリンにより置換した、分裂促進成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを有する培養培地（Ｓａｈら、１９９７年）。
２．５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、５０μＭのフォルスコリンおよび５０μＭのドーパミンにより置換した、分裂促進成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを有する培養培地（Ｂｒａｄｆｏｒｄ；Ｒｉａｚら、２００２年）。
３．１０％ＦＣＳ、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１ｂ、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１、１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦにより置換した、分裂促進成長因子ｂＦＧＦおよびＥＧＦを有する培養培地（Ｓｔｏｒｃｈら、２００１年）。
【０１０１】
分化後、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、β−ＩＩＩ−チューブリン、およびＧＦＡＰ（グリア原線維酸性タンパク質）免疫反応性細胞が見られた。このような免疫細胞化学に関して、細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、一次抗体（ＴＨ抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＃ＡＢ１５２、ＧＦＡＰ抗体ＤＡＫＯ  ＃Ｚ０３３４、β−ＩＩＩ−チューブリン抗体、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ−８６６０）と共に、ブロッキング緩衝液中、室温で２時間インキュベートし、すすいでから、蛍光体結合（ＦＩＴＣまたはＣｙ３、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）種特異的二次抗体と共に、ブロッキング緩衝液中、室温でさらに１時間インキュベートした。次いで、培養物をＰＢＳですすぎ、ＤＡＫＯ封入剤でカバースリップしてから、細胞をカウントし、代表的なフィールドを写真撮影した。種々の細胞型のパーセンテージは、分化に用いた因子のタイプに依って変わり、ＴＨ陽性細胞の数は、分化培地中の細胞総数の約２％であった。ニューロンの数（ベータ−ＩＩＩ−チューブリン陽性細胞）は、４％〜１７％の間で変化し、ＧＦＡＰ陽性星状細胞は、０％〜６％の間で変化した。増殖細胞培養物は、一貫して、いずれかのマーカーで免疫標識した１％以下の細胞を有した（図１および図２）。
【０１０２】
これらの結果により、ＮＧＣ−４０７は、ニューロン、星状細胞およびドーパミン作動性ニューロンに分化することのできる神経始原細胞系であることが示される。
【０１０３】
実施例２  ＮＧＣ−４０７細胞系の移植およびインビボ導入遺伝子発現
本実施例では、レンチウィルス形質導入、導入遺伝子発現の安定性およびラット脳への実験的移植後のＮＧＣ−４０７細胞系の組み込みを例示する。
【０１０４】
ＮＧＣ−４０７細胞を、実施例１に記載された方法により増殖させた。移植４８時間前に、ＮＧＣ−４０７細胞に、ＧＦＰを発現する自己不活性化レンチウィルスベクター（ＬＶ−ＧＦＰ−ＳＩＮ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  Ｒら、１９９８年）により形質導入した。１の複数感染を用い、６０％〜７０％の導入率となった。移植日に、該細胞を３回洗浄し、トリプシン処理し、６００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞ペレットをハンクス塩溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ、スウェーデン）中に再懸濁した。細胞数を血球計数器で予測し、ＨＢＳＳ中、５０，０００細胞／μｌの密度で単一細胞懸濁液中に調製した。
【０１０５】
合計４０匹の成体メスＳＤラット（Ｂ＆Ｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ、ストックホルム、スウェーデン）を１ケージ当たり３匹ずつ入れ、１２時間の明：暗サイクル下、食料と水を自由に取らせた。外科的操作は全て、スウェーデン国、Ｌｕｎｄ大学における実験動物の使用に関する倫理委員会の指針により承認され、それに従って実施した。該動物はハロタン（Ｏ２中２％）で麻酔し、定位フレーム（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、タハンガ、カリフォルニア州、米国）内に入れた。ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎに従って（ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ、１９８６年）、ブレグマから以下の座標で、１０μｌのハミルトン注射器を用いて、１００，０００個の細胞を線条体内に両側注入した（ツースバーを０．０ｍｍに設定、前−後：±１．２；内側−外側：±３．０；背側−腹側：−４．０および−５．０）。移植後、ＧＦＰが移植細胞から宿主細胞に移送されたかどうかを評価するために、１匹の動物に細胞の両側注入を行い、凍結−解凍の反復サイクルによって殺処置した。これらの移植片に、ＧＦＰまたはヒト核（ｈＮｕｃ）陽性細胞は見られなかった（データは示していない）。
【０１０６】
第１組の１２匹の動物は、手術の１日前および２日前に、それぞれ、ベタメタゾン（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｂｅｔａｐｒｅｄ（商標）、Ｄｅｆｉａｎｔｅ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ）およびシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）により免疫抑制を受け、一方、第２ラウンドの１７匹の動物には、手術２日前に開始したシクロスポリンＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）のみが投与された。該物質は、殺処置まで毎日、食道までシリコンチップのプラスチックチューブを用いて経口投与された。
【０１０７】
移植後３日目、１週間目、２週間目、および３週間目に、ラットをペントバルビタールで深く麻酔し、以前記載されたとおり潅流（Ｅｒｉｃｓｏｎ  Ｃら、２００２年）してから、６シリーズにおいて、４０μｍに凍結ステージミクロトーム上で切片化した。光照射野および蛍光染色を他に記載されている（Ｅｒｉｃｓｏｎ  Ｃら、２００２年）とおり実施し、使用された一次抗体は、以下のものであった：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウス抗ｈＮｕｃ（１：１００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、２種のグリアマーカー；ウサギ抗グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；１：５０００；ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）およびマウス抗Ｓ１００（１：５００；Ｓｉｇｍａ）、グリア始原マーカーウサギ抗ＮＧ２（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ニューロンマーカーマウス抗ＮｅｕＮ（１：１０００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、未熟神経細胞および反応性星状細胞に関する２種のマーカー；ウサギ抗ネスチン（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）ならびにマウス抗ビメンチン（１：５０；ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）および早期ニューロンマーカーマウス抗βＩＩＩ−チューブリン（１：３３３；Ｓｉｇｍａ）。
【０１０８】
移植片中のｈＮｕｃ陽性細胞およびＧＦＰ陽性細胞の総数を、光学式精留塔（Ｗｅｓｔ  ＭＪ、１９９９年）を用いて、またはＡｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ式（Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ  Ｍ、１９４６年）により、以前記載されたとおり（Ｅｒｉｃｓｏｎ  Ｃら、２００２年）、立体的解析により予測した。
【０１０９】
移植細胞は、ｈＮｕｃによって試験、検出された最長時点である移植後３週間まで生存した。ｈＮｕｃ発現細胞は最初の２週間にわたって減少したが、細胞数は３週間目に維持された（ＮＧＣ−４０７：３ｄ、３２７１±１８６６；１ｗ、３７２９±３７１５；２ｗ、１１５９±８６５；３ｗ、１２０７±１２２５）ことが、立体的評価によって明らかにされた。さらに、少なくとも３５％のｈＮｕｃ陽性細胞は、全ての時点でＧＦＰを共発現した。（３ｄ、２３５８±１０７０（７２％）；１ｗ、１４８７±８２１（４０％）；２ｗ、５６０±４０３（４８％）；３ｗ、４２５±２７５（３５％））。
【０１１０】
１２匹の動物中、ｈＮｕｃ陽性細胞よりも多数のＧＦＰ発現細胞が検出されたことは、ｈＮｕｃが全ての移植細胞を検出していなかったことを示唆している。したがって、全ての移植片中に見られた予測されたｈＮｕｃ陽性細胞の数が少ないのは、ｈＮｕｃ発現のダウンレギュレーションによるものと考えられ、検出できない細胞は不明の数となり、その結果、移植細胞の総数が過少に見積もられたと考えられる。
【０１１１】
結論として、レンチウィルス形質導入ＮＧＣ−４０７細胞はラットの脳に移植後、炎症または腫瘍形成の徴候なく、良好に生存し、組み込まれる。高パーセンテージの移植細胞が、少なくとも３週間まで、導入遺伝子を発現した。
【０１１２】
実施例３  ＮＧＣ−４０７＆Ｕ３４３ＭＧａ−ｃｌ  ２：６細胞間のギャップ結合連絡および蛍光色素移行により分析した、４−フェニルブチレートによるその増強
方法
ドナーヒト胚性神経幹細胞（ＮＧＣ−４０７）およびレシピエントヒトグリア芽腫細胞（Ｕ３４３ＭＧａ−ｃｌ  ２：６）を、各々３５ｍｍペトリ皿に増殖させた（１×１０５／皿）。ＮＧＣ−４０７細胞に関して、プレートはポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）コーティングし、培地は、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＥＧＦ、１×Ｎ２サプリメント、１×非必須アミノ酸、５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）、０．５％ヒト血清アルブミンおよび６ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａから）を含有するグルタマックス１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２  １：１であった。レシピエント細胞は、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。該細胞がおよそ６０％コンフルエントの時、ドナー細胞には、０ｍＭ＆０．５ｍＭの４−フェニルブチレート（ＰＢ）、レシピエント細胞には、０ｍＭ＆４ｍＭのＰＢによる処理を開始し、７２時間継続した。次いで、該ドナー細胞を、１０μＭのＤｉｌおよび５μＭのカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する１ｍｌの細胞培地と共に２０分間インキュベートすることによって二重標識した。培地を含有する色素を吸引後、該細胞を純粋培地で４〜５回、次いで、ＰＢＳで洗浄し、遊離の色素を除く。きわめて短時間のトリプシン処理をした後、該細胞を遠心分離し、共培養培地（０．５％ＦＢＳを含むドナー細胞培地）中に再懸濁させた。レシピエント細胞の培地を、共培養培地によって置換し、５×１０４のドナー細胞を１つのレシピエントプレートに加えた。ＰＢ処理したドナー細胞をＰＢ処理したレシピエント細胞と混合し、この処理を０．５ｍＭのＰＢ濃度において継続した。４時間の共培養の後、ドナー細胞からレシピエント細胞へのカルセイン色素の移行が、Ｏｌｙｍｐｕｓ蛍光顕微鏡下で見られた。
【０１１３】
結果
ＮＧＣ−４０７細胞が、Ｕ３４３ＭＧａ−ｃｌ  ２：６細胞と、ギャップ結合細胞カップリングの形成によって機能的に連絡すること、およびその連絡が、４−ＰＢによって著しく増強されることが分かった。図４を参照されたい。
【０１１４】
他の同様な実験において、ＨＤＡＣ阻害剤４−ＰＢが、ＮＧＣ−４０７細胞間ならびにＮＧＣ−４０７細胞とＵ８７グリア芽腫細胞との間のギャップ結合伝達（ＧＪＣ）を増強することが示された。これは、蛍光色素移行法を用いることにより、半定量的／定性的に分析された。ＧＪＣが、インビトロの分化条件下および増殖条件下の双方で、４−ＰＢにより増強されることが明白である。分化も増殖も刺激しない条件で、インビボ環境が移植細胞を提示できることから、これは関連性がある。
【０１１５】
実施例４：インビボで、Ｕ８７ＭＧグリア芽種細胞異種移植片への ＢｒｄＵ標識ＮＧＣ−４０７細胞の移動
方法
Ｕ８７細胞（２μｌ中２００，０００）をヌードラットの脳内へ、ブレグマから３ｍｍ右側、２ｍｍ尾側、５ｍｍの深さに注入した。Ｕ８７−ＭＧ細胞は、ＡＴＣＣから、受入番号ＨＴＢ−１４で入手できる。腫瘍が樹立された１週間後、ＮＧＣ−４０７細胞を２μＭのＢｒｄＵで７２時間予備標識し、ブレグマから３ｍｍ右側、１ｍｍ前方、５ｍｍの深さの所に注入した。
【０１１６】
幹細胞注入の２週間後、該動物を殺処置し、脳を切片化し（１４μｍ）、ＢｒｄＵおよびヒトネスチンに対する抗体を用いて、免疫蛍光染色に供した。
【０１１７】
結果
腫瘍境界付近および腫瘍内部に、少数のＢｒｄＵ標識細胞が見られた。これらの細胞はまた、ヒトネスチンに関して陽性であった。
【０１１８】
これらの結果により、注入部位からＵ８７細胞腫瘍へのこの神経始原細胞系の向性移動が示されている。
【０１１９】
実施例５：幹細胞に関するレトロウィルス発現ベクター内へのトマトＴＫ１キナーゼのクローニング
モロニーマウス白血病ウィルス（ＭｏＭｕＬＶ）およびモロニーマウス肉腫ウィルス（ＭｏＭｕＳＶ）に由来する要素を含有し、レトロウィルス遺伝子のデリバリーおよび発現のためにデザインされているレトロウィルス発現ベクターｐＬＨＣＸ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手、カタログ番号Ｋ１０６１−１）を、トマトＴＫ１キナーゼの発現のために用いた。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｐａｌ−ＣｌａｌからＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｈｏｌ−Ｓａｌｌ−ＢａｍＨＩ−Ｓｐｈｌ−Ｍｆｅｌ−Ｃｌａｌへと、ＰＬＨＣＸの複数のクローニング部位を変化させた。この変化は、ＨｉｎｄＩＩ／Ｃｌａｌ切断ｐＬＨＣＸベクターに結合させた２種のオリゴヌクレオチド
5´-AGCTTCTCGAGGTCGACGGATCCGCATGCCAATTGAT-´3 および
5´- CGATCAATTGGCATGCGGATCCGTCGACCTCGAGA-´3
によって得られた。修飾されたベクターの新規ポリリンカーは、ｐＬＨＣＸＺと称され、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０１２０】
トマトＴＫ１野生型およびトマトＴＫ１デルタＣ遺伝子（Ｃ末端の２６個のアミノ酸を欠失したトマトチミジンキナーゼＩをコードしている、国際公開第０３／１０００４５号）を、それぞれ、ｐＺＧ６９（ＴｏｍＴＫ１）およびｐＺＧ５９（ＴｏｍＴＫ１ΔＣ２６）（双方とも国際公開第０３／１０００４５号に記載）から、Ｘｈｏｌ／ＢｇＩＩＩ断片として切り出し、ｐＬＨＣＸＺベクターのＸｈｏｌ／ＢａｍＨＩ部位内へクローン化した。ｐＬＨＣＸＺ内にトマトＴＫ１野生型遺伝子を含有する構築体をｐＺＧ５５６と称し、ｐＬＨＣＸＺ内にトマトＴＫ１デルタＣ遺伝子を含有する構築体をｐＺＧ５６１と称した。
【０１２１】
実施例６．ＮＧＣ−４０７細胞へのｐＺＧ５５６およびｐＺＧ５６１の形質導入
細胞培養  ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ４８３２）でコーティングしたフラスコ／プレート（ＣＭ−Ｌａｂ、デンマーク）内で、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１６５３）、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０２−０４８）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１７５０４−０４４）、グルコース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ８７６９）、ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３３−ＦＢ）、ＥＧＦ（Ｒ＆  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２３６−ＥＧ）、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、×１００（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１４０−０３５）、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５６３０−０５６）、で馴化したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１３３１−０２８）中、ヒト神経始原細胞系ＮＧＣ−４０７を培養した。加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を増殖させた。
【０１２２】
レトロウィルスベクターの構築および形質導入操作
合計１０７の形質導入単位を典型的に生じる、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）由来の複製欠失ＶＳＶ−Ｇ偽型レトロウィルスの中間規模の製造および濃縮を、２９３Ｔ細胞において実施した。２９３Ｔパッケージング細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）を、ＯＰＴＩＭＥＭ  １培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１２３】
供給元により提供されたプロトコルに従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、構築したｐＬＨＣＸＺ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミドベクターｐＺＧ５６１（Ｃ末端の２６個のアミノ酸を欠失したトマトチミジンキナーゼＩをコードする、国際公開第０３／１０００４５号）およびｐＶＰａｃｋ−ＧＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスｐＶＰａｃｋ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、パッケージング細胞内へトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養したトランスフェクト細胞からの培地を採取し、０．４５μｍのフィルターを通してろ過し、超遠心分離（５０，０００ｇ、４℃で９０分間）によりペレット化し、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に溶解させた。該ウィルスの力価を、逆転写酵素アッセイにより決定した。該ウィルスを引き続き、ＮＧＣ−４０７細胞系の形質導入に用いた。
【０１２４】
レトロウィルス形質導入
形質導入の前日に、１×１０６細胞／ウェルを６ウェルプレートに接種した。形質導入の日に、１のＭＯＩと共にウィルスを加えた。細胞を３時間インキュベートした後、培地を取り替え、細胞を増殖させ、１４日間、ヒグロマイシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３２７４）の添加により選択した。引き続き、細胞を実験用に準備した。
【０１２５】
Ｕ８７ＭＧ／トマトキナーゼ陽性細胞におけるＡＺＴの殺細胞効果
１００μｌの馴化培地中、ポリ−L−リシンコーティングした９６ウェルプレート内で、５，０００細胞/ウェルの密度で、指数関数的に増殖するＮＧＣ−４０７ｗｔおよびトマトキナーゼ（ＺＧ５６１）発現細胞を蒔き、５％ＣＯ２気体相の加湿インキュベーター内、３７℃でインキュベートした。４８時間後、培地を、２０ｍＭ以下から開始して種々の濃度のＡＺＴを含有する培地と置換した。その後、構成的な１２０時間の間、薬剤馴化培地に細胞を曝露した。薬剤濃度の関数として細胞フラクションを生存させることによって培養細胞の化学療法抵抗性をモニターした。比色ＸＴＴアッセイ（ＸＴＴキットＩＩ−Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４６５０１５）により細胞の生存度を判定した。簡単に述べると、細胞培地を注意して取り出し、１００μｌの新鮮培地および５０μｌのＸＴＴ混合物を各ウェルに加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ）を用いて、４５０ｎｍおよび６９０ｎｍにおける吸光度を測定した。調べた化合物のＩＣ５０値（５０％阻害濃度）を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）（Ｄｒｙｂｅｒｇ  Ｔｒａｄｉｎｇ、デンマーク）を用い、各実験の平均値として算出した。
【０１２６】
結果
ヒグロマイシン選択ＺＧ５６１細胞および親細胞を、ＡＺＴ活性化に関して試験した。親細胞系と比較して、著しい感度の増大（ＩＣ５０の低下）があった（それぞれ、０．０５１０５ｍＭおよび１１．７８１ｍＭ）。図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい。
【０１２７】
結論
トマトチミジンキナーゼは、ＮＧＣ−４０７細胞を、ヌクレオシド類似体ＡＺＴに対して、２３０倍オーダーの大きさで明らかに鋭敏化し、したがって、ヒトのグリア芽腫多形治療に対する設定に臨床的な適合性を示している。
【０１２８】
実施例７：トマトＴＫ１発現ＮＧＣ−４０７細胞のモノクローンの選択
トマトＴＫ１発現ＮＧＣ−４０７細胞系のモノクローナル細胞系を単離し、チミジンおよびＡＺＴを基質として用いて、酵素活性に関して試験した。最良のモノクローナル細胞系は、トマトＴＫ１を発現するポリクローン細胞系のＡＺＴ活性の２倍の高さのＡＺＴ活性を有した。（図６Ｂ）。
【０１２９】
モノクローンに関する選択
トマトＴＫΔＣ  ｐＬＨＣＸＺ（ＺＧ５６１）を発現するレトロウィルス形質導入ＮＧＣ−４０７細胞（実施例６を参照）を、１４日間、１００μｇのヒグロマイシン／ｍｌ培地（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ３２７４）の添加により選択した。その後、ポリ−Ｌ−リシンコーティングした２４ウェルプレートに、３０細胞／ウェルの細胞密度で細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２で、加湿インキュベーター内に置いた。培地を定期的に取り替え、２１日後、３２クローンをピペット操作により採取し、ポリ−Ｌ−リシンコーティングした６ウェルプレートに移した。
【０１３０】
増殖させた細胞を凍結保存後、キナーゼ活性アッセイ用にペレットを調製した。
【０１３１】
チミジンキナーゼアッセイ
活性アッセイ用の細胞を採取し、活性試験まで−８０℃で保存した。抽出緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標））中、細胞を短時間の音波処理に供し、その後、トリチウム標識ヌクレオシド基質を用いたＤＥ−８１フィルター紙アッセイにより、４種の時間サンプルに基づいた初速度測定によって、細胞抽出物中、チミジンキナーゼ活性を測定した。該アッセイには、およそ２０μｇの抽出物が用いられた。該アッセイは、Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎらにより記載されたとおり行われた〔Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．、Ｋｎｅｃｈｔ，Ｗ．、Ｌｅｎｚ、Ｃ．、Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｌ．＆Ｐｉｓｋｕｒ，Ｊ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年  ２７５  ６６７３−６６７９頁〕。デオキシリボヌクレオシドを、２００μＭの一定濃度で試験した。デオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性の１単位を、タンパク質１ｍｇ当たり１分間当たりに形成される、対応するモノホスフェートの１ｎｍｏｌとして定義する。
【０１３２】
タンパク質濃度は、標準タンパク質としてＢＳＡを用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄに従って判定した〔Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｍ  Ｍ：Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ；Ａｎａｌ．Ｂｏｃｈｅｍ．１９７６年  ７２  ２４８−２５４頁〕。
【０１３３】
これらの実験の結果は、下記の表２に示されている。
【０１３４】
【表２】
2008533995.tif 000004
【０１３５】
２種のモノクローン（４番および９番）は、親細胞およびＺＧ６５１を形質導入した細胞と比較して、チミジンおよびＡＺＴ双方のより高いリン酸化活性を示した。
【０１３６】
実施例８．ＭＥＳＣ２．１０に対するＮＧＣ−４０７の比較
材料および方法
８週齢のヒト胚の腹側中脳を切開することにより、ＭＥＳＣ２．１０ヒト中脳細胞系（Ｌｕｎｄ大学およびＳｉｇｎａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ＬＡ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州、米国〔Ｌｏｔｈａｒｉｕｓ，Ｊ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｏｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７（４１）：３８８８４−９４頁〕）を作出し、ｔｅｔオフ系の制御下で、ｖ−ｍｙｃ癌遺伝子を含有するレトロウィルスベクターを用いて不死化した。Ｎ２サプリメント（Ｎ２培地）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、ＭＥＳＣ２．１０細胞を培養し、テトラサイクリンを含有するＮ２培地からなる分化培地に細胞を蒔いて培養することによって分化（「Ｎ２培地中での分化」）させるか、またはドーパミン作動性分化では、テトラサイクリン、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ、Ｓｉｇｍａ）、およびグリア細胞系由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ、ＲＤｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＮ２培地（「ＤＡ分化培地」）中で分化させる。
【０１３７】
７週齢のヒト胚の腹側中脳を切開し、ｖ−ｍｙｃ癌遺伝子を含有するレトロウィルスベクター用いて細胞を不死化することによってＮＧＣ−４０７細胞系を開発した。この細胞系において、不死化遺伝子は、標準的な増殖培地中で構成的に発現され、増殖は細胞の培養条件を変えることによって制御される。したがって、Ｎ２サプリメント＋上皮成長因子（ＥＧＦ）およびｂＦＧＦを有するＤＭＥＭ−Ｆ１２を含有する培地中、ＮＧＣ−４０７細胞は接着性単層として増殖する。ｂＦＧＦおよびＥＧＦのないＮ２培地（「Ｎ２培地中の分化」）、またはドーパミン作動性分化では、ｂＦＧＦおよびＥＧＦがなく、ＧＤＮＦおよびｄｂｃＡＭＰを有するＮ２培地（「ＤＡ分化培地」）中に移すと、それらはニューロンおよび星状細胞への分化を開始する（詳細に関しては表３を参照）。
【０１３８】
免疫細胞化学および細胞カウンティング
免疫細胞化学染色前に、並行して４日間分化させたＭＥＳＣ２．１０細胞培養物およびＮＧＣ−４０７細胞培養物を、４％パラホルムアルデヒドにより、室温で２０分間固定した。固定した培養物を、５％正常ヤギ血清および０．３％トリトン−Ｘ−１００を含有するブロッキング緩衝液により予備インキュベートしてから、以下の抗体のうちの１つと共にインキュベートし、２％正常ヤギ血清および０．３％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中に希釈した：マウス抗チューブリンβ−ＩＩＩ（１：７５０；Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：２００；ＤＡＫＯ）、ウサギ抗ＴＨ（１：４００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、またはウサギ抗ネスチン（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。インキュベーションは、４℃で一晩実施した。洗浄後、フルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはテキサスレッドに結合させた種特異的二次抗体と共に、培養物をインキュベートし、再度すすぎ、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）と共に、核の対比染色を行った。全体集団に対するＴＨ免疫陽性細胞のパーセンテージを定量化するために、細胞を２００×の倍率でカウントした。各培養物において、３つのフィールドを無作為に選択し、ＤＡＰＩ陽性核によって示される、細胞全体数に対するＴＨ免疫陽性細胞のパーセンテージを算出した。データは３つの独立した実験からのものである。平均して、各実験で、４００の細胞を調べた。
【０１３９】
細胞系分化の結果
免疫細胞化学を用いて、ニューロン分化およびドーパミン作動性分化の異なる段階での胚性ヒトＶＭ由来の２種のヒト細胞系を特性化した。これらの不死化細胞系は、非制御形質転換なしに長期間、増殖、培養することができ、細胞の均一で、安定で、再現性のある供給源となる。異なる分化プロトコル下でのＴＨ陽性細胞のパーセンテージが、表３に示してある。「ＤＡ分化培地」中、４日後、分化したＭＥＳＣ２．１０細胞の１９．１±０．２％、および分化したＮＧＣ−４０７細胞の３．５±１．２％に、ＴＨ免疫陽性ニューロンが検出されるが、一方、「Ｎ２培地中での分化」の４日後では、ＭＥＳＣ２．１０細胞のわずか０．６±０．１％およびＮＧＣ−４０７細胞のわずか０．５±％がＴＨ陽性であった。ＮＧＣ−４０７は、βＩＩＩ−チューブリン−陽性ニューロン（１８．１±４．９％）およびＧＦＡＰ陽性星状細胞（２６．５±４．０％）の双方に分化する能力を有するが、ＭＥＳＣ２．１０細胞は、βＩＩＩ−チューブリン−陽性ニューロンを増加させる（＞９０％）だけである。したがって、ポリクローンのＮＧＣ−４０７細胞系は、神経幹／始原細胞系と言うことができ、ＭＥＳＣ２．１０細胞系は、単能性神経始原細胞系と言うことができる。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
実施例９  ヒトグリア芽腫多形のヌードラットモデルにおけるＮＧＣ−４０７細胞のインビボ移動試験（Ｕ８７ＭＧ細胞系を用いて）
材料及び方法
我々のヒトグリア芽腫多形異種移植片モデルに、平均体重２００ｇの８〜９週齢無胸腺オスヌードマウス（ｒｎｕ／ｒｎｕ；Ｈａｒｌａｎ、ドイツ国）を用いた。それらを、１２／１２昼／夜変化、５０％〜７０％の相対湿度、２０℃〜２４℃の温度で、標準化大型ケージに３匹の群で入れた。これらの免疫無防備動物に使用する食料（自由摂取）、水および他の材料は、使用前に加圧滅菌した。動物をイソフルラン吸入により麻酔し、頭部を定位装置に固定した。顕微鏡誘導下、ブレグマの２ｍｍ右側、右半球上に１ｍｍ直径のバーホールを作製した。５μｌ容量のハミルトン注射器を用いて、３μｌ容量における１．５×１０５のＵ８７ＭＧ細胞を、脳梁に達するように、表面から３．５ｍｍの深さに、バーホールを介してゆっくり注入した。
【０１４２】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を組換え発現する２×１０６の神経始原細胞（ＮＧＣ−４０７）を、１００ｍｍのペトリ皿に蒔き、４８時間、ニューロスフェアとして増殖させた。それらを採取し、遠心分離し、５０μｌの増殖培地中に再懸濁させた。腫瘍細胞移植の１週間後（腫瘍を増殖させるため）、Ｕ８７ＭＧ細胞移植のちょうど対側の各ラットの脳に３μｌのニューロスフェアを注入した。動物の半分は、ＮＳＣ接種時から１日２回、ＰＢ  ２５０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内処置し、残りは、媒体としてのリン酸緩衝生理食塩水で処置した。全ての動物を、実験のエンドポイントとして設定した著しい体重減少、異常行動または他の神経学的症状に関して、１日２回観察した。そうでない場合は、該処置を２週間継続してから、断頭術により動物を殺処置した。採取した脳は、ドライアイスで冷却した２−メチルブタン中で直ちに凍結してから、それらを１４μｍの厚さにクリオスタットにより切片化するまで、−７５℃の冷凍庫に保存した。
【０１４３】
該移植片のサイズおよび位置を判定するために、ヘマトキシリンおよびエオシンの染色により、該切片の組織病理学的分析を実施した。ラット脳内のＮＧＣ−４０７細胞は、ニワトリ抗ＧＦＰ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎカタログ番号ＡＢ１６９０１）を用いて、免疫蛍光試験によって追跡した。免疫組織化学的に、腫瘍の位置は、組織学的分析との関連づけと細胞密度により判定し、一方、該切片は、ヘキストによって対比染色した。
【０１４４】
結果
当該の結果により、先のインビトロの結果が確認され、それらが、ヒトＮＧＣ−４０７神経幹細胞のインビボでの移動を含むものに拡張される。
【０１４５】
自殺遺伝子を組換え発現するＮＧＣ−４０７細胞を用いる自殺遺伝子治療パラダイムは、脳を通って腫瘍部位までのそれらの移動、および近隣腫瘍細胞への活性化プロドラッグの効率的移送に依存している。
【０１４６】
ヌードラットに形成された異種移植片を対側に移植された、緑色蛍光タンパク質、（ＧＦＰ）を発現するＮＧＣ−４０７細胞は、脳梁を通って腫瘍床まで、さらには腫瘍内部まで移動することができた。数日間、腹腔投与で４−ＰＢによりラットを処置することにより、腫瘍内部周囲のＧＦＰ染色が増強した。これは、腫瘍の周囲および内部により多くのＧＦＰ発現細胞が存在したと解釈され、脳腫瘍の部位に自殺遺伝子を移送するためのこれらの細胞の将来の有用性を高めるものである。しかし、ＧＦＰ染色の増強が、ＧＦＰ遺伝子を駆動するＣＭＶプロモーターの４−ＰＢによる誘導によるものであると決定することはできない。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】分化した免疫標識ＮＧＣ−４０７細胞の写真を示す図である。図１Ａで、ＴＨ標識ニューロンは矢印で示してある。図１Ｂで、β−ＩＩＩ−チューブリン標識細胞は矢印で示し、ＧＦＡＰ標識細胞は矢印頭部で示してある。
【図２】種々のマーカーで標識した分化ＮＧＣ−４０７細胞のパーセンテージを示す図である。ＴＨニューロンは、ＴＨ抗体で標識した細胞であり、ニューロンは、β−ＩＩＩ−チューブリン抗体で標識した細胞であり、星状細胞は、ＧＦＡＰ抗体で標識した細胞である。このダイアグラムは、４つの異なる群：増殖細胞（Ｐｒｏｌｉｆ）およびＲｉａｚら（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｄｉｆｆ）、Ｓａｈら（Ｓａｈ  ｄｉｆｆ）およびＳｔｏｒｃｈら（Ｓｔｏｒｃｈ  ｄｉｆｆ）による３つの分化プロトコルにより分化させた３つの群を示している。
【図３】ラット線条体への移植後、１週目および３週目におけるｈＮｕｃ発現およびＧＦＰ発現ＮＧＣ−４０７細胞の免疫組織化学的可視化を示す図である。１週目、大部分のｈＮｕｃ陽性細胞が、注入部位の周囲に見られたが、一部の細胞は移動してしまっていた（Ｂ）。ＧＦＰ染色により、ｈＮｕｃ陽性細胞のおよそ５０％がＧＦＰを共発現したこと、および該細胞が星状細胞形態を示す（Ａ、ＣおよびＡ’、Ｃ’）ことが明らかになった。Ａ’〜Ｃ’は、Ａ〜Ｃにおける白いボックス内に表された細胞集団のクローズアップである。３週目、高パーセンテージ（＞３５％）のｈＮｕｃ陽性細胞が依然として導入遺伝子（矢印頭部）を発現しており、より分化した形態（Ｄ〜Ｆ）を示した。Ｄ〜Ｆの矢印は、ＧＦＰに陰性であるｈＮｕｃ陽性細胞を示す。Ｃ、Ｃ’およびＦにおける縮尺バーは、５０μｍを表す。
【図４Ａ】カルセインの対照細胞ギャップ結合媒介移送を示す図である。非標識Ｕ３４３ＭＧａ−ｃｌ  ２：６細胞は、黄色（点線矢印）二重標識（赤Ｄｉｌ＆緑色カルセイン）ＮＧＣ−４０７細胞からの移送性カルセイン色素を受け取った後、緑色（直線矢印）になった。双方の細胞型とも工程延長により、互いに物理的に接触する。
【図４Ｂ】ＰＢ処理した細胞を示す図である。該工程は、ＰＢ処理によりより顕著になり（三重矢印）、この群で緑色レシピエント細胞数が著しく増加した。
【図５】ＮＧＣ−４０７細胞系の不死化に使用されるＴＤ１−２不死化ベクターのベクター地図を示す図である。
【図６Ａ】ＡＺＴに関して、ＮＧＣ−４０７細胞系のＩＣ５０値を示す図である。詳細に関しては、実施例６を参照。
【図６Ｂ】ＡＺＴに関して、トマトチミジンキナーゼ発現ＮＧＣ−４０７細胞系のＩＣ５０値を示す図である。詳細に関しては、実施例６を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月3日(2007.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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