(57)【要約】  複数のリボ核酸を生成するための方法及び組成物が提供される。主題の方法では、アレイは、イン・ビトロでの転写反応における鋳型として用いられる。また、主題の方法で用いられるアレイ、及び主題の方法を実施するためのキットが提供される。主題の方法により生産される複数のリボ核酸は、差次的遺伝子発現分析及び遺伝子サイレンシング用途を含む多種多様な用途に役立つ。
2008515432.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のリボ核酸を生産する方法であって、以下の：
（ａ）（ｉ）固体支持体の表面上に固定化され、且つ表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを有する一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個のフィーチャのアレイを、
（ｉｉ）前記ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸と接触させることであって、それにより二重鎖核酸を含むオーバーハングの鋳型アレイを生産する、接触させること（前記アレイの二本核酸を含む各オーバーハングは、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び一本鎖可変領域オーバーハングを含む）、及び
（ｂ）前記鋳型アレイをイン・ビトロでの転写プロトコルに付すことであって、それにより異なる配列のリボ核酸の複数の産物を生産する、イン・ビトロでの転写プロトコルに付すこと
を含む、複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項２】
前記アレイの前記一本鎖表面固定化核酸は、前記プロモータード面と前記可変ドメインとの間に連結ドメインをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項３】
前記アレイの前記一本鎖表面固定化核酸は、前記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインと前記表面との間にスペーサーをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項４】
前記機構それぞれの前記固定化核酸は、同じＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインを有する、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインは、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ポリメラーゼプロモータードメインから選択される、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項６】
前記方法は、前記接続させる工程（ａ）の前記鋳型アレイの産物を、前記イン・ビトロでの転写プロトコルに付す工程（ｂ）に先立って、プライマー伸長反応条件に付すことをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項７】
前記方法は、前記鋳型アレイからの前記複数の産物を分離することをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項８】
前記複数の産物は、標識リボ核酸を含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項９】
前記複数の産物は、非標識リボ核酸を含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項１０】
前記機構の前記一本鎖表面固定化核酸は、下記式：
表面−Ｓｓ−Ｒ−Ｌｌ−Ｖ−５’
（式中、
Ｓは、スペーサードメインであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、前記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
Ｌは、連結ドメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、前記表面遠位可変ドメインである）
により記載される、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項１１】
前記アレイは、機構１個当たり約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２の範囲の核酸の密度を有する機構を含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項１２】
前記方法は、差次的遺伝子発現分析用途において前記複数の産物を用いることをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項１３】
前記方法は、遺伝子サイレンシング用途において前記複数の産物を用いることをさらに含む、請求項１に記載の複数のリボ核酸を生産する方法。
【請求項１４】
基材の表面上に固定化される一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイであって、前記表面固定化一本鎖核酸はそれぞれ、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを含む、少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ。
【請求項１５】
前記表面固定化一本鎖核酸は、下記式：
表面−Ｓｓ−Ｒ−Ｌｌ−Ｖ−５’
（式中、
Ｓは、スペーサードメインであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、前記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
Ｌは、連結ドメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、前記表面遠位可変ドメインである）
により記載され、前記表面固定化一本鎖核酸の前記可変ドメインＶのみが、機構間で異なる、請求項１４に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ。
【請求項１６】
前記Ｒは、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ポリメラーゼプロモータードメインから選択される、請求項１５に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ。
【請求項１７】
前記アレイは、機構１個当たり約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２の範囲の核酸の密度を有する機構を含む、請求項１４に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ。
【請求項１８】
二重鎖核酸を含む表面固定化オーバーハングをそれぞれが含む少なくとも２つの別個の核酸機構を含む鋳型アレイであって、前記アレイの二本核酸を含む各オーバーハングは、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び一本鎖可変領域オーバーハングを含む、少なくとも２つの別個の核酸機構を含む鋳型アレイ。
【請求項１９】
前記表面固定化オーバーハングは、下記式：
【化１】
2008515432.tif 000003
（式中、
Ｓは、スペーサードメインであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、前記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
ｃＲは、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸であり、
Ｌは、連結ドメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、前記表面遠位可変ドメインである）
により記載され、前記表面固定化一本鎖核酸の前記可変ドメインＶのみが、機構間で異なる、請求項１４に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含む鋳型アレイ。
【請求項２０】
前記Ｒは、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ポリメラーゼプロモータードメインから選択される、請求項１９に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含む鋳型アレイ。
【請求項２１】
前記アレイは、機構１個当たり約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２の範囲の核酸の密度を有する機構を含む、請求項１８に記載の少なくとも２つの別個の核酸機構を含む鋳型アレイ。
【請求項２２】
リボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキットであって、以下の：
（ａ）基材の表面上に固定化される一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ（前記表面固定化一本鎖核酸はそれぞれ、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを含む）、及び
（ｂ）前記ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸
を含む、リボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２３】
前記キットは、ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２２に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２４】
前記キットは、リボヌクレオチドをさらに含む、請求項２２に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２５】
前記リボヌクレオチドは標識される、請求項２４に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２６】
前記表面固定化一本鎖核酸は、下記式：
表面−Ｓｓ−Ｒ−Ｌｌ−Ｖ−５’
（式中、
Ｓは、スペーサードメインであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、前記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
Ｌは、連結ドメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、前記表面遠位可変ドメインである）
により記載され、前記表面固定化一本鎖核酸の前記可変ドメインＶのみが、機構間で異なる、請求項２２に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２７】
前記Ｒは、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ポリメラーゼプロモータードメインから選択される、請求項２６に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２８】
前記アレイは、機構１個当たり約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２の範囲の核酸の密度を有する機構を含む、請求項２２に記載のリボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキット。
【請求項２９】
サンプル中での核酸分析物の存在を検出する方法であって、以下の：
（ａ）（ｉ）第１の標識で標識された標識デオキシリボ核酸標的分子、及び
（ｉｉ）前記第１の標識と識別可能な第２の標識で標識されたリボ核酸参照(ribonucleic acid reference)（前記参照は、請求項１に記載の方法に従って生産される）
を含む標的組成物を、前記サンプルから生産すること、
（ｂ）前記標的組成物を、核酸アレイと接触させること、
（ｃ）前記アレイの表面上で任意の結合複合体を検出することであって、それにより前記サンプル中での前記核酸分析物の存在を確定する、検出すること
を含む、サンプル中での核酸分析物の存在を検出する方法。
【請求項３０】
前記方法は、前記アレイの読取りからの結果が第１の位置から第２の位置へと伝送されるデータ伝送工程をさらに含む、請求項２９に記載のサンプル中での核酸分析物の存在を検出する方法。
【請求項３１】
前記第２の位置は、遠隔位置である、請求項３０に記載のサンプル中での核酸分析物の存在を検出する方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法により得られる読取りの結果を表すデータを受信することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸及びタンパク質アレイ等の化学アレイの技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
［イントロダクション］
［発明の背景］
核酸及びタンパク質アレイのような化学アレイは、多種多様な用途での使用が増大しつつあり、そうすることで、研究、医学等を含む多種多様な分野で重大な影響を与えている。多くの場合、アレイは、基材上の既定の形状に配列された通常異なる組成物の領域を包含する。これらの領域（「機構」と称される場合もある）は、基材上の既知の各々の位置（「アドレス」）に位置付けられ、したがって「アドレス可能」である。
【０００３】
かかるアレイを使用する際、アレイは、多くの用途においてサンプルへ暴露される。サンプル暴露時に、アレイは、サンプル組成物に依存する観察される結合パターンを示す。次いで、この観察される結合パターンがアレイへの問い合わせに応じて検出される。続いて、この観察される結合パターンを使用して、サンプルの１つ又は複数のポリヌクレオチド構成成分の存在及び／又は濃度を確定する。サンプル調製、標識及びハイブリダイゼーションの代表的な方法としては、特許文献１、特許文献２及び特許文献３、並びに特許文献４に開示されるものが挙げられる。
【０００４】
アレイは、予め得られた生体高分子を基材上へ堆積することにより、或いは原位置での合成方法により製作され得る。原位置での製作方法としては、特許文献５及び特許文献６、並びに特許文献７及びそこで引用される参照文献に記載されるものが挙げられる。生体高分子アレイを製作することのさらなる詳細は、特許文献８、特許文献９、特許文献１０及び特許文献１１に記載されている。生体高分子アレイを製作するための他の技法としては、既知の光指向性合成技法が挙げられる。
【０００５】
アレイを作製及び使用する技術は進歩し続けるため、これらの強力なツールに関する新たな用途の開発に継続して興味がもたれている。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，２０１，１１２号
【特許文献２】米国特許第６，１３２，９９７号
【特許文献３】米国特許第６，２３５，４８３号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２０１９２６５０号
【特許文献５】米国特許第５，４４９，７５４号
【特許文献６】米国特許第６，１８０，３５１号
【特許文献７】ＰＣＴ出願公開第ＷＯ  ９８／４１５３１号
【特許文献８】米国特許第６，２４２，２６６号
【特許文献９】米国特許第６，２３２，０７２号
【特許文献１０】米国特許第６，１８０，３５１号
【特許文献１１】米国特許第６，１７１，７９７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
［発明の概要］
複数の別個のリボ核酸を生成するための方法及び組成物が提供される。主題の方法では、鋳型アレイをイン・ビトロでの転写反応で用いて、それにより複数の別個のリボ核酸を生産する。主題の方法で用いられる鋳型アレイの特徴は、鋳型アレイが、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインで構成される表面固定化核酸の複数の別個の機構を含むことである。また、主題の方法で用いられるアレイ、及び主題の方法を実施するためのキットも提供される。主題の方法により生産されるリボ核酸は、差次的遺伝子発現分析、遺伝子サイレンシング用途及び核酸ライブラリー作成用途を包含する多種多様な用途に役立つ。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の特定のいくつかの態様では、複数のリボ核酸を生産する方法であって、以下の：（ｉ）固体支持体の表面上に固定化され、且つ表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを有する一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の機構のアレイを、（ｉｉ）機構の一本鎖核酸のＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸と接触させることであって、それにより二重鎖核酸を含むオーバーハングの鋳型アレイを生産する、接触させる第１のステップ（ここで、得られるアレイの二本核酸を含む各オーバーハングは、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び一本鎖可変領域オーバーハングを含む）を含む、複数のリボ核酸を生産する方法が提供される。次いで、得られた鋳型アレイをイン・ビトロでの転写プロトコルに付し、それにより異なる配列のリボ核酸の複数の産物を生産する。特定のいくつかの実施の形態では、アレイの一本鎖表面固定化核酸は、プロモータード面と可変ドメインとの間に連結ドメインをさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、アレイの一本鎖表面固定化核酸は、基材表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインと基材表面との間にスペーサーをさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、機構それぞれの固定化核酸は、同じＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインを有する。特定のいくつかの実施の形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインは、Ｔ７、Ｔ３及びＳＰ６ポリメラーゼプロモータードメインから選択される。特定のいくつかの実施の形態では、方法は、鋳型アレイ産物を、イン・ビトロでの転写反応条件に付すことに先立って、プライマー伸長反応条件に付すことをさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、方法は、鋳型アレイからの産物混合物を分離することをさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、複数の産物は標識され、他の実施の形態では標識されない。特定のいくつかの実施の形態では、アレイの機構の一本鎖表面固定化核酸は、下記式：
表面−Ｓｓ−Ｒ−Ｌｌ−Ｖ−５’
（式中、
Ｓは、スペーサードメインであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
Ｌは、連結ドメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、表面遠位可変ドメインである）
により記載される。
【０００９】
代表的な実施の形態では、主題のアレイは、約１，０００〜約１０，０００の機構／ｃｍ２、例えば約２，０００〜約１０，０００個の機構／ｃｍ２（約２，０００〜約５，０００個の機構／ｃｍ２を包含する）の範囲の機構密度を有する。
【００１０】
代表的な実施の形態では、所定の機構内の一本鎖核酸の密度は、ＲＮＡポリメラーゼの効率を最適化するように選択される。これらの代表的な実施の形態のいくつかでは、一本鎖核酸の密度は、約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２、例えば約１０−２〜約０．１ｐｍｏｌ／ｍｍ２（約５×１０−２〜約０．１ｐｍｏｌ／ｍｍ２）の範囲であり得る。
【００１１】
特定のいくつかの実施の形態では、上記方法は、差次的遺伝子発現分析用途において産物混合物を用いることをさらに包含する。特定のいくつかの実施の形態では、上記方法は、遺伝子サイレンシング用途において産物混合物を用いることをさらに包含する。特定のいくつかの実施の形態では、上記方法は、核酸ライブラリー作成用途において産物混合物を用いることをさらに包含する。
【００１２】
また、基材の表面上に固定化される一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイが本発明により提供され、ここで上記表面固定化一本鎖核酸はそれぞれ、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを含む。特定のいくつかの実施の形態では、アレイはさらに、主題の方法の説明に関連して上記で概説されるようなさらなる機構の１つ又は複数を特徴とする。
【００１３】
また、表面固定化オーバーハング二重鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の機構を含む鋳型アレイが提供され、ここで上記アレイの各オーバーハング二本核酸は、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び一本鎖可変領域オーバーハングを含む。特定のいくつかの実施の形態では、アレイはさらに、主題の方法の説明に関連して上記で概説されるようなさらなる機構の１つ又は複数を特徴とする。
【００１４】
また、リボ核酸の混合物を生産する際に使用するためのキットが提供され、ここで上記キットは、（ａ）基材の表面上に固定化される一本鎖核酸をそれぞれが含む少なくとも２つの別個の核酸機構を含むアレイ（ここで、上記表面固定化一本鎖核酸はそれぞれ、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを含む）、及び（ｂ）上記ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸を包含する。特定のいくつかの実施の形態では、上記キットは、ＲＮＡポリメラーゼをさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、上記キットは、リボヌクレオチドをさらに含み、ここで特定のいくつかの実施の形態では、リボヌクレオチドは標識される。特定のいくつかの実施の形態では、上記キット構成成分はさらに、主題の方法の説明に関連して上記で概説されるようなさらなる機構の１つ又は複数を特徴とする。
【００１５】
また、サンプル中での核酸分析物の存在を検出する方法が提供され、ここで上記方法は、（ａ）（ｉ）第１の標識で標識された標識デオキシリボ核酸標的分子及び（ｉｉ）上記第１の標識と識別可能な第２の標識で標識されたリボ核酸参照（ここで、上記参照は、本発明の方法に従って生産される）を含む標的組成物を、上記サンプルから生産すること、（ｂ）上記標的組成物を、核酸アレイと接触させること、及び（ｃ）上記アレイの表面上で任意の結合複合体を検出することであって、それにより上記サンプル中での上記核酸分析物の存在を確定する、検出することを包含する。特定のいくつかの実施の形態では、上記方法は、上記アレイの読取りからの結果が第１の位置から第２の位置へと伝送されるデータ伝送工程をさらに含む。特定のいくつかの実施の形態では、上記第２の位置は、遠隔位置である。また、上述の方法により得られる読取りの結果を表すデータを受信する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
［定義］
「生体高分子」は、１つ又は複数のタイプの反復単位の高分子である。生体高分子は通常生体系に見出され、特に多糖（例えば、炭水化物）及びペプチド（この用語は、ポリペプチド及びタンパク質（多糖に結合される結合されないかに問わない）を包含するのに使用される）及びポリヌクレオチド並びにそれらの類縁体（例えば、アミノ酸類縁体若しくは非アミノ酸基又はヌクレオチド類縁体若しくは非ヌクレオチド基から構成されるか、或いはそれらを含有する化合物）を包含する。したがって、この用語は、従来の骨格が、天然に存在しない骨格又は合成骨格で置き換えられたポリヌクレオチド、及び従来の塩基の１つ又は複数が、ワトソン・クリック型水素結合相互作用に関与することが可能な基（天然又は合成）で置き換えられた核酸（或いは合成類縁体又は天然に存在する類縁体）を包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は多重鎖形状を包含し、ここで鎖の１つ又は複数は、互いに完全に整列されてもよく、或いは整列されなくてもよい。具体的に、「生体高分子」として、その供給源にかかわらず、デオキシリボ核酸即ちＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、リボ核酸即ちＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１７】
「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は本明細書中で使用する場合、リボヌクレオチドから構成される高分子を意味する。
【００１８】
「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」という用語は本明細書中で使用する場合、デオキシリボヌクレオチドから構成される高分子を意味する。
【００１９】
「ｍＲＮＡ」という用語は、メッセンジャーＲＮＡを意味する。
【００２０】
「生体モノマー」は単一単位を言及し、これは同じ生体モノマー又は他の生体モノマーと連結されて、生体高分子を形成することができる（例えば、その一方又は両方が除去可能な保護基を有し得る２つの連結基を有する単一アミノ酸又はヌクレオチド）。生体モノマー液又は生体高分子液は、それぞれ生体モノマー又は生体高分子のいずれかを含有する液体（通常、溶液中）を言及する。
【００２１】
「ヌクレオチド」は、リン酸基、五炭糖及び窒素含有塩基を有する核酸のサブユニット、並びに高分子形態で（ポリヌクレオチドとして）、２つの天然に存在するポリヌクレオチドの様式に類似した配列特異的様式で天然に存在するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるかかるサブユニットの機能的類縁体（合成又は天然に存在する）を指す。デオキシリボ核酸のヌクレオチドサブユニットはデオキシリボヌクレオチドであり、リボ核酸のヌクレオチドサブユニットはリボヌクレオチドである。
【００２２】
「オリゴヌクレオチド」は概して、約１０〜１００ヌクレオチド長のヌクレオチド多量体を指すのに対して、「ポリヌクレオチド」は、任意数のヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体を包含する。
【００２３】
化学「アレイ」は、相容れない意図が現れない限り、アドレス可能な領域に結合される特定の化学部分（単数又は複数）（例えば、ポリヌクレオチド配列のような生体高分子）を保有するアドレス可能な領域の任意の１次元、２次元又は３次元の配列を包含し、ここで、化学的部分（単数又は複数）は、当該領域において表面上に固定化される。「固定化される」とは、部分（単数又は複数）がアレイを使用する条件（例えば、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件）下で領域から分離しないように、部分（単数又は複数）が領域において基材表面と安定に結合されることを意味する。当該技術分野で既知であるように、部分（単数又は複数）は、領域において表面へ共有結合的に又は非共有結合的に結合され得る。例えば、各領域は、基材が多孔質である場合に第三次元へと伸長し得るのに対して、基材が多孔質でない場合、任意の実質的な第三次元寸法（厚さ）を有しない。任意のアレイは、２０ｃｍ２未満又はさらには１０ｃｍ２未満の面積において、１０個を上回る、１００個を上回る、１，０００個を上回る、１０，０００個を上回る機構、或いはさらには１００，０００個を上回る機構を含有し得る。例えば、機構は、約１０μｍ〜約１．０ｃｍの範囲の幅（即ち、円形スポットに関する直径）を有し得る。他の実施形態では、各機構は、約１．０μｍ〜約１．０ｍｍ、例えば約５．０μｍ〜約５００μｍ（約１０μｍ〜約２００μｍを包含する）の範囲で幅を有し得る。非円形機構は、上述の幅（直径）範囲を有する円形機構の面積範囲に相当する面積範囲を有し得る。所定の機構が特定の標的に相当するように、所定の機構は、同じ標的（例えば、標的核酸）へ結合する（例えば、ハイブリダイズする）化学的分、例えば核酸で構成される。機構の少なくともいくつか又は全ては、異なる組成物である（例えば、各機構組成物の任意の反復が排除される場合、残存する機構の総数の少なくとも５％、１０％又は２０％を占め得る）。任意のポリヌクレオチドを保有しない機構間の面積が、通常（しかし、本質的ではない）存在する。かかる機構間の面積は通常、アレイが試薬の液滴堆積を包含する方法により形成される場合に存在するが、例えば光指向性合成製作プロセスが使用される場合には存在しない場合がある。しかしながら、機構間の面積は、存在する場合、様々な大きさ及び形状であり得ることが理解されよう。機構１個当たりのオリゴヌクレオチド分子の総数は極めて重要である。アレイは、アレイ上の特定の既定位置（「アドレス」）での領域が特定の標的又は標的類を検出するように種々の部分（例えば、種々のポリヌクレオチド配列）の複数の領域（アレイの「機構」又は「スポット」とも称される）を有する点で、アレイは「アドレス可能」である（しかしながら、機構は、当該機構の非標的を付随的に検出する場合がある）。代表的な実施形態では、各機構が特異的である標的は既知である。アレイ機構は概して、組成及び濃度が均質であり、機構は、介在するスペースにより分離され得る（しかしながら、かかる分離を伴わないアレイを製作することができる）。
【００２４】
アレイの場合、「標的」は、様々な領域で基材へ結合されるプローブ（「標的プローブ」）により検出されるべき移動相（通常、液体）中の部分として言及され得る。しかしながら、「標的」又は「標的プローブ」のいずれかは、一方が他方により検出されるべきものであり得る（したがって、いずれか一方は、他方との結合により検出されるべきポリヌクレオチドの未知の混合物であり得る）。「プローブのアドレス可能な組」及び類似した用語は、アレイ表面により支持されるか、或いはアレイ表面により支持されることが意図される種々の部分の多重領域を指す。
【００２５】
「アレイ配置」又は「アレイ特性」は、アレイの１つ又は複数の物理的、化学的又は生物学的特性（例えば、アレイ内及び基材上のいくつか又は全ての機構の位置付け、１つ又は複数の機構寸法、或いは所定の位置での部分の独自性又は機能（例えば、化学的又は生物学的）のいくつかの表示）、或いはアレイを取り扱うべき方法（例えば、アレイがサンプルに暴露される条件、又はサンプル暴露後のアレイ読取り仕様及び制御）を指す。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」及び「結合」は、ポリヌクレオチドに関して交換可能に使用される。
【００２７】
「プラスチック」は、高分子量（例えば、少なくとも１，０００グラム／モル、或いはさらには少なくとも１０，０００又は１００，０００グラム／モル）の任意の合成有機高分子である。
【００２８】
基材又は基材ウェブ（ハウジング、或いはハウジングベース及び／又はカバーのような１つ又は複数のハウジング構成要素を含む）に関して「可撓性」は、基材が、半径が１．２５ｃｍ未満のローラーの周囲を１８０度曲がることができることを言及する。そこで、基材は、破損（例えば、亀裂）又はプラスチック変形を伴わずに少なくとも１００回、いずれかの方向に繰り返し曲げて且つまっすぐにすることができる。この曲げは、材料の弾性限界内でなくてはならない。可撓性に関する上述の試験は、温度２０℃で実施される。「硬質」は、可撓性でない基材（ハウジング、或いはハウジングベース及び／又はカバーのような１つ又は複数のハウジング構成要素を含む）を指し、約２．５×７．５ｃｍのセグメントがその形状を保持し、且つ破壊することなく任意の方向に沿って６０度を上回って（多くの場合、４０度、２０度、１０度又は５度を上回って）曲がることができないように構築される。
【００２９】
１つのアイテムが別のアイテムから「遠隔」であると示される場合、この記述語は、２つのアイテムが少なくとも異なる建築物に存在し、且つ少なくとも１マイル（１．６ｋｍ）、１０マイル（１６ｋｍ）又は少なくとも１００マイル（１６０ｋｍ）離れている場合があることを示す。異なるアイテムが互いに「局所的」であると示される場合、それらは互いに遠隔ではない（例えば、それらは、同じ建築物又は建築物の同じ部屋に存在し得る）。情報の「伝達」、「伝送」等は、適切な伝達チャネル（例えば、プライベート又はパブリックネットワーク（有線、光ファイバ、無線通信又はサテライト、或いは他の方法））を通じて電気信号又は光信号として情報を表すデータを伝えることを言及する。任意の伝達又は伝送は、互いに局所又は遠隔であるデバイス間に存在し得る。アイテムを「転送すること」は、当該アイテムを物理的に輸送することによっても、或いは他の既知の方法（それが可能である場合）を使用することによっても、当該アイテムを或る位置から次の位置へと至らせる任意の手段を指し、少なくともデータの場合では、データを保有する媒体を物理的に輸送すること、或いは伝達チャネル（電気、光又は無線を含む）を通じてデータを伝達することを包含する。或ることを「受信すること」は、それが物理的アイテム（例えば、アレイ又はアレイ保有パッケージ）の送達のような任意の考え得る手段により得られることを意味する。情報が受信される場合、それは、伝送（例えば、本明細書中で言及されるタイプの任意の伝達チャネルを通じた電気信号又は光信号により）の結果としてのデータとして受信され得るか、或いはそれは、情報を保有するいくつかの他の媒体（例えば、磁気、光又はソリッドステートストレージデバイス）を読取ることから電気信号又は光信号として得られ得る。しかしながら、情報が伝達により受信される場合、それは、他の場所（局所又は遠隔）からの当該情報の伝送の結果として受信される。
【００３０】
２つのアイテムが互いに「関連される」場合、それらは、例えば一方が他方を参照する場合、一方が他方に関連していることが明らかであるような方法で提供される。例えば、アレイ識別子は、アレイを保有するアレイアセンブリ上（例えば、基材又はハウジング上）、或いはアレイアセンブリを保有するパッケージ若しくはキット上又は中に存在することにより、アレイと関連させることができる。データのアイテムは、同じデータ入力（例えば、ファイル名又はディレクトリ名又は検索語）がそれらのアイテム（同じファイル中又は同じファイル中でない）を検索するか、関連アイテムの１つ又は複数の入力が他のアイテムの１つ又は複数を検索する場合、データのアイテムは、メモリ中で互いに「接続される」。特に、アレイ配置が当該アレイの識別子と「接続される」場合、接続されるアレイ配置を保有するメモリにアクセスするプロセッサへの識別子の入力は、当該アレイに関してアレイ配置を検索する。
【００３１】
「コンピュータ」、「プロセッサ」又は「プロセシングユニット」は交換可能に使用され、それぞれ、列挙されるステップを実行するのに必要とされるように構成要素を制御することができる任意のハードウェア又はハードウェア／ソフトウェアの組合せを言及する。例えば、コンピュータ、プロセッサ又はプロセッサユニットは、その必要とされるステップ全てを実施するように適切にプログラムされた汎用デジタルマイクロプロセッサ、或いはそれらのステップ又は同等のステップを実施する任意のハードウェア又はハードウェア／ソフトウェアの組合せを包含する。プログラミングは、例えば必要なプログラムコードを保有するコンピュータ読取り可能な媒体（例えば、携帯ストレージ媒体）から、或いは遠隔位置からの伝達（例えば、伝達チャネルを介して）により達成され得る。
【００３２】
「メモリ」又は「記憶装置」は、プロセッサにより信号として検索するための情報を格納することができる任意のデバイスを指し、磁気デバイス又は光学デバイス（例えば、ハードディスク、フロキシブルディスク、ＣＤ又はＤＶＤ）、或いはソリッドステートメモリデバイス（例えば、揮発性ＲＡＭ又は不揮発性ＲＡＭ）を包含し得る。メモリ又はメモリユニットは、同じタイプ又は異なるタイプの２つ以上の物理的メモリデバイスを有し得る（例えば、メモリは、複数のハードドライブ又は複数のソリッドステートメモリデバイス或いはハードドライブとソリッドステートメモリデバイスのいくつかの組合せのような複数のメモリデバイスを有し得る）。
【００３３】
アレイ「アセンブリ」は、基材及びそれらの表面上の少なくとも１つの化学アレイを包含する。アレイアセンブリは、複数の突起を支持する台座を包含するデバイスの表面上に存在する１つ又は複数の化学アレイ、例えばかかるデバイスの１つ又は複数の突起の表面上に存在する１つ又は複数の化学アレイを包含し得る。アセンブリは、他の機構（例えば、基材部分を取り外すことができるチャンバを有するハウジング）を包含してもよい。「アレイユニット」は、「アレイアセンブリ」と交換可能に使用され得る。
【００３４】
アレイからの信号データを「読取ること」は、アレイからの信号データの検出（例えば、検出器による）を指す。このデータは、メモリ中に保存され得る（比較的短期間であろうと長期間であろうと）。
【００３５】
「パッケージ」は、全て一緒に保持される１つ又は複数のアイテム（例えば、任意に他のアイテムを伴うアレイアセンブリ）である（例えば、一般的なラッピング又は保護カバー又はバインディングにより）。通常、一般的なラッピングはまた、パッケージ中に含有されるアイテムに対し、外部環境への暴露からのさらなる保護を提供する保護カバー（例えば、一般的なラッピング又は箱）である。１つのみのアレイアセンブリの場合、パッケージは、アレイアセンブリを覆ういくつかの保護カバー（この保護カバーは、アレイユニット自体のさらなる部分であってもよく、或いはさらなる部分でなくてもよい）を伴う当該アレイアセンブリであってもよい。
【００３６】
また、本出願全体にわたって、「カバー」、「基部」、「前面」、「背面」、「上部」、「上部の」又は「下部の」のような単語は、相対的な意味合いでのみ使用されることが理解されるであろう。
【００３７】
「得る」は、任意であることを指す。
【００３８】
２つ以上のアイテム（例えば、要素又はプロセス」）が選択的な「又は」により言及される場合、これは、いずれかが別個に存在し得るか、又は一方の存在が他方（単数又は複数）を必然的に排除する場合を除いて、それらの任意の組合せが一緒に存在し得ることを示す。
【００３９】
「緊縮アッセイ条件」という用語は本明細書中で使用する場合、アッセイにおいて所望のレベルの特異性を提供するのに十分な相補性を有する核酸（例えば、表面結合核酸及び溶液相核酸）の結合対を生産するのに適合性であるのに対して、所望の特異性を提供するのに不十分な相補性の結合成員間での結合対の形成にあまり適合性でない条件を指す。緊縮アッセイ条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の両方の総和又は組合せ（全体）である。
【００４０】
核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレイ等の場合では、サザンハイブリダイゼーション又はノーザンハイブリダイゼーション）の文脈では、「緊縮ハイブリダイゼーション条件」及び「緊縮ハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、種々の実験パラメータ下で異なる。本発明の範囲内の核酸を同定するのに使用することができる緊縮ハイブリダイゼーション条件としては、例えば４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション、或いは６５℃での５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション（ともに、６５℃での０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの洗浄を伴う）を挙げることができる。また、例示的な緊縮ハイブリダイゼーション条件としては、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ及び１％ＳＤＳの緩衝液中でのハイブリダイゼーション並びに４５℃での１×ＳＳＣ中での洗浄を挙げることができる。別法として、６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中でのフィルタ結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション並びに６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を用いることができる。さらなう緊縮ハイブリダイゼーション条件としては、６０℃以上及び３×ＳＳＣ（４５０ｍＭ塩化ナトリウム／４５ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、或いは３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０ｍＭ  ＭＥＳを含有する溶液（ｐＨ６．５）中における４２℃でのインキュベーションが挙げられる。代替的であるが、匹敵するハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して、類似の緊縮性の条件を提供することができることは当業者に容易に理解されよう。
【００４１】
特定のいくつかの実施形態では、洗浄条件の緊縮性は、核酸が表面結合核酸へ特異的にハイブリダイズされるかどうかを確定する条件を説明する。核酸を同定するのに使用される洗浄条件としては、例えば、ｐＨ７及び少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃の温度での約０．０２モルの塩濃度、或いは７２℃で約１５分間の約０．１５Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度、或いは少なくとも約５０℃又は約５５℃〜約６０℃で約１５〜約２０分間の約０．２ＳＳＣの塩濃度、或いはハイブリダイゼーション複合体が、室温で１５分間、０．１％ＳＤＳを含有する約２×ＳＳＣの塩濃度を有する溶液で２度洗浄された後、６８℃で１５分間、０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにより２度洗浄されること、或いは同等の条件が挙げられ得る。洗浄に関する緊縮条件はまた、例えば４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳであり得る。
【００４２】
緊縮アッセイ条件の具体例は、総一価陽イオン濃度１．５Ｍを有する塩ベースのハイブリダイゼーション緩衝液中で６５℃での回転性ハイブリダイゼーション（例えば、その開示が参照により本明細書に援用される、２０００年９月５日に出願された米国特許出願第０９／６５５，４８２号に記載されるような）に続く室温での０．５×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣの洗浄である。
【００４３】
緊縮アッセイ条件は、上記代表的な条件と少なくとも同程度緊縮であるハイブリダイゼーション条件であり、ここで所望の特異性を提供するのに十分な相補性を欠いているさらなる結合複合体が、上記特定の条件と比較した場合に所与の条件組で実質的に生産されない場合に、所与の条件組は少なくとも緊縮であると見なされ、ここで「実質的に超えない」とは、約５倍以下、通常３倍以下を意味する。他の緊縮ハイブリッド条件は、当該技術分野で既知であり、同様に必要に応じて用いられ得る。
【００４４】
「複数のリボ核酸」という語句は、異なる配列を有する２つ以上の異なるリボ核酸の一群を指す。複数とは、異なる配列を有する少なくとも２個、例えば少なくとも約５個（少なくとも約１０個を包含する）異なるリボ核酸を意味し、ここで所与の複数での異なる配列を有する別個のリボ核酸の数は、少なくとも約２５個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約５００個、少なくとも約１０００個又はそれ以上、例えば少なくとも約５，０００個又はそれ以上、少なくとも約１０，０００個又はそれ以上、少なくとも約２５，０００個又はそれ以上等であり得る。
【００４５】
「一本鎖核酸」という語句は、第２の核酸へハイブリダイズされない第１の核酸分子を指し、ここで第２の核酸分子は、第１の核酸分子へ依然として共有結合されない。したがって、一本鎖核酸は、直鎖分子であってもよく、ここで直鎖分子は、例えばヘアピン立体配置で見られるように、分子の一部がそれ自体へハイブリダイズされるように二次的な立体配置を構築してもよく、又は構築しなくてもよい。
【００４６】
「ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン」という語句は、適切な条件下で、リボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼの存在下で操作可能に連結されるＤＮＡ配列の転写を開始させることが可能な配列を有するヌクレオチドの領域又は広がりを指す。プロモータードメインは、Alberts他(1989)(Molecular Biology of the Cell, 2d Ed. Garland Publishing, Inc.)に記載されるように、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼプロモーター又はコンセンサスプロモーター領域由来の約１５個〜約２５０個のヌクレオチド、例えば約１７個〜約６０個のヌクレオチドを包含し得る。原核生物プロモーター又は真核生物プロモーターは関心が持たれており、代表的な実施形態では、ファージ又はウイルスプロモーターのような原核生物プロモーターが用いられる。本明細書中で使用する場合、「操作可能に連結される」という用語は、影響を及ぼす配列（通常、プロモーター）と制御される配列（例えば、以下に記載されるような可変ドメイン）との間での機能的結合を指す。役立つプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡへ堅く結合し、且つＲＮＡ合成が開始するための開始部位及びシグナルを含有する領域である。多種多様なプロモーターが既知であり、多くが非常に十分特性化されている。関心が持たれている代表的なプロモーター領域としては、Chamberlin及びRyan著「The Enzymes」(P. Boyer編、Academic Press, New York)(1982) pp 87-108に記載されるようにＴ７、Ｔ３及びＳＰ６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
「可変ドメイン」という語句は、アレイが使用されるべきである特定の用途、具体的には、主題の方法によりアレイを使用して生産されるリボ核酸混合物の意図する使用を達成するのに選択される配列を有する核酸の広がり又は領域を指す。可変ドメインの長さはかなり変わってもよく、主題の方法の合成制約内で生産されるべきＲＮＡ組成物中での生じるリボ核酸の所望の長さに基づいて選択される。代表的な実施形態では、可変ドメインの長さは、約１０〜約１５０ｎｔ、例えば約１５〜約１００ｎｔ（約２０〜約８０ｎｔを包含する）の範囲である。
【００４８】
「連結ドメイン」という語句は、プロモーターと可変ドメインとの間のヌクレオチドの任意の広がり又は領域を指す。存在する場合、リンカードメインは、約５個〜約２０個の塩基を包含し得るが、所望に応じて、より小さくてもよく、又はより大きくてもよい。代表的な実施形態では、リンカードメインは存在する場合、約１個〜約２０個の塩基、例えば約１個〜約１５個（約１個〜約１０個の塩基を包含する）、例えば約５〜約１０ｎｔの範囲の長さを有する。
【００４９】
「スペーサー」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインと表面との間に位置する任意のドメイン（即ち、広がり又は領域）を指す。代表的な実施形態では、スペーサードメインは存在する場合、約１〜約２５ｎｔ、例えば約５〜約２０ｎｔ（約５〜約１５ｎｔを包含する）の範囲の核酸配列の長さに等しい長さを有し得る。上述のように、スペーサーは任意であり、ランダム配列又は非ポリヌクレオチド化学リンカー（例えば、エチレングリコールベースのポリエーテルオリゴマー）を含む任意の利便性のよい配列であってもよく、ここで特定のいくつかの実施形態では、スペーサードメインの目的は、基材表面から離れて表面固定化核酸の他のドメインを突出させることである。特定のいくつかの実施形態では、スペーサードメインは、スペーサーがワトソン・クリック塩基対形成相互作用に関与しないように、即ちスペーサーがハイブリダイズ不可能であるように選択されるモノマー残基の高分子である。かかるスペーサーの代表的なタイプとしては、ポリエチレングリコールスペーサー、脱塩基ヌクレオチド残基の高分子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
「ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸」という語句は、オリゴヌクレオチドが緊縮条件下でＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインへハイブリダイズするように、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインの配列に相補的である配列を有するオリゴヌクレオチドの一群（即ち、集団）を指す。
【００５１】
「核酸を含むオーバーハングの鋳型アレイ」という語句は、以下でより詳細に記載するように、部分的に二重鎖の核酸で構成される機構を有するアレイを指し、ここで核酸を含むオーバーハングは、二本鎖ＤＮＡポリメラーゼプロモーター領域及び一本鎖可変領域オーバーハングを含む。「二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域」という語句は、互いにハイブリダイズされるＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及びそれに相補的な核酸で構成される塩基対形成された核酸の二本鎖の広がり又は領域を指す。「一本鎖可変領域オーバーハング」という語句は、別の核酸へハイブリダイズせず、且つ可変ドメイン配列を有する核酸の部分又は広がりを指す。
【００５２】
「イン・ビトロでの転写プロトコル」という語句は、少なくとも部分的に二重鎖のＤＮＡがＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、ＲＮＡ産物を生じる反応条件を指す。かかるプロトコルは当該技術分野で既知であり、例えば、Milligan及びUhlenbeck (1989)(Methods in Enzymol. 180, 51)を参照されたい。
【００５３】
「プライマー伸長反応条件」という語句は、以下でさらに記載するように、水性反応混合物中でのプライマー付与された(primed)核酸を、所望の表面固定化二重鎖核酸を生産するのに十分な条件下で、ＤＮＡポリメラーゼの供給源、ｄＮＴＰ及び任意の他の所望又は必須のプライマー伸長試薬と接触させることを包含する反応条件を指す。
【００５４】
「分離すること」という用語は、２つの初期には組み合わせられていた物体を物理的に分割することを指す。
【００５５】
「標識」という用語は、検出可能な部分又は作用物質を指す。関心が持たれる標識としては、直接的に検出可能な放射性又は非放射性標識及び間接的に検出可能な放射性又は非放射性標識（例えば、蛍光色素）が挙げられる。直接的に検出可能な標識は、１つ又は複数のさらなる化学作用物質との相互作用なしで直接的に検出可能なシグナルを提供する標識である。直接的に検出可能な標識の例としては、蛍光標識が挙げられる。間接的に検出可能な標識は、１つ又は複数の付加的な成員と相互作用して、検出可能なシグナルを提供する標識である。この後者の実施形態では、標識は、一緒に作動して、検出可能なシグナルを提供する２つ以上の化学作用物質を含むシグナル発生系の成員である。間接的に検出可能な標識の例としては、蛍光色素又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）へ結合された適切な抗体により検出され得るビオチン又はジゴキシゲニンが挙げられる。多くの好ましい実施形態では、標識は、直接的に検出可能な標識である。特に関心が持たれる直接的に検出可能な標識としては、蛍光標識が挙げられる。主題の発明で役立つ蛍光標識としては、フルオロフォア部分が挙げられる。関心が持たれる具体的な蛍光色素としては、キサンテン色素、例えば、フルオレセイン及びローダミン色素（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、２−［（エチルアミノ）−３−（エチルイミノ）−２−７−ジメチル−３Ｈ−キサンテン−９−イル］安息香酸エチルエステル一塩酸塩（Ｒ６Ｇ）（約５００〜５６０ｎｍの範囲の波長で応答放射を放出する）、１，１，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドジカルボシアニンヨージド（ＨＩＤＣ）（約６００〜６６０ｎｍの範囲の波長で応答放射を放出する）、６−カルボキシフルオレセイン（一般的に略語ＦＡＭ及びＦで知られる）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ又はＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ又はＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ又はＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５又はＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６又はＧ６）及びローダミン１１０）；シアニン色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７色素；クマリン、例えばウンベリフェロン；ベンジミド色素、例えばヘキスト３３２５８；フェナントリジン色素、例えばテキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えばシアニン色素（例えば、Ｃｙ３（約５４０〜５８０ｎｍの範囲の波長で応答放射を放出する）、Ｃｙ５（約６４０〜６８０ｎｍの範囲の波長で応答放射を放出する）等）；ＢＯＤＩＰＹ色素及びキノリン色素が挙げられる。関心が持たれる具体的なフルオロフォアとしては、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、ＨＩＤＣ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３及びＣｙ５等が挙げられる。
【００５６】
［特定の実施形態の説明］
複数の別個のリボ核酸を生成するための方法及び組成物が提供される。主題の方法では、アレイは、イン・ビトロでの転写反応において鋳型として用いられる。主題の方法で用いられる鋳型アレイの特徴は、鋳型アレイが、表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び表面遠位可変ドメインを包含する表面固定化核酸の複数の別個の機構を含むことである。また、主題の方法で用いられるアレイ、及び主題の方法を実施するためのキットも提供される。主題の方法により生産されるリボ核酸は、差次的遺伝子発現分析及び遺伝子サイレンシング用途を包含する多種多様な用途に役立つ。
【００５７】
主題の発明についてさらに記載する前に、特定の実施形態の変形がなされてもよく、それは依然として添付の特許請求の範囲の範疇にあり得るため、本発明は、以下に記載する本発明の特定の実施形態に限定されないことが理解されよう。同様に、用いられる専門用語は、特定の実施形態について記載する目的であり、限定的であると意図されないことが理解されよう。そうではなくて、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により確立される。
【００５８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈が明らかに別の状況を指示しない限り、複数の言及を包含する。さらに、特許請求の範囲は、任意の随意的な要素を排除するように描かれ得ることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」等のような排他的専門用語の使用、或いは「否定的な」限定の使用の根拠として利用できると意図される。
【００５９】
値の範囲が提供される場合、当該範囲の上限と下限の間にある各介在する値（文脈が明らかに別の状況を指示しない限り下限の単位の１０分の１まで）、及び当該規定範囲における任意の他の規定値又は介在する値は、本発明内に包含される。これらのより小範囲の上限及び下限は、独立してより小範囲に包含されてもよく、同様に規定の範囲における任意の具体的に排除される限界に制約されて、本発明内に包含される。規定の範囲が限界の一方又は両方を包含する場合、包含される限界の一方又は両方を排除する範囲もまた本発明に包含される。
【００６０】
別途定義しない限り、本明細書中で使用する技術用語及び化学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同義を有する。本明細書中に記載するものに類似するか、又は等価である任意の方法、デバイス及び材料は、本発明の実施又は実験で使用することができるが、好ましい方法、デバイス及び材料についてここで記載する。本明細書中で列挙される方法は、論理上可能である列挙事象の任意の順序、並びに事象の列挙順序で実施され得る。
【００６１】
本出願で引用される特許及び他の参照文献は全て、それらがこの出願に抵触し得る場合（この場合は、この出願が優勢である）を除いて、参照により本出願に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日に先立つその開示に関するものであり、本発明が先行発明によりかかる刊行物に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
【００６２】
この開示に目を通すことで当業者に明らかであるように、本明細書中に記載され、且つ本明細書中に示される個々の実施形態はそれぞれ、本発明の範囲又は精神を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴と容易に分離され得るか、又はそれらの特徴と組み合わせられ得る別個の構成要素並びに特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で、又は論理上可能である任意の他の順序で実施されてもよい。本明細書中で示される図は、必ずしも一定の尺度で描かれているわけではなく、いくつかの構成要素及び特徴は、明瞭のために誇張されている。
【００６３】
方法
上記で概要するように、主題の発明は、複数の別個のリボ核酸を生成又は生産するためのアレイベースの方法を提供する。複数とは、少なくとも２個、例えば少なくとも約５個（少なくとも約１０個を包含する）を意味し、ここで複数での別個の産物核酸の数は、少なくとも約２５個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約５００個、少なくとも約１，０００個以上、例えば少なくとも約５，０００個以上、少なくとも約１０，０００個以上、少なくとも約２５，０００個以上（３０，０００個以上、５０，０００個以上、１００，０００個以上、２５０，０００個以上、４００，０００個以上を包含するが、これらに限定されない）等であり得る。産物リボ核酸は、以下でより詳細に記載するように、異種混合物又は個々の同種集団の一群であり得る。
【００６４】
上述の複数を生産する主題の方法は、アレイベースの方法であり、ここで主題の方法の特徴は、核酸アレイが鋳型として用いられることである。主題の方法を実施する際、第１の工程は概して、二重鎖核酸を含有するオーバーハングの鋳型アレイを生産するのに十分な条件下で、初期前駆体核酸アレイを、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインに相補的な核酸（即ち、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター相補組成物）と接触させることである。続いて、得られた鋳型アレイは、主題の方法の第２の工程で用いられて、リボ核酸の複数の産物を生産する。これらの工程はそれぞれ、ここで別々により詳細に記載される。
【００６５】
主題の方法の第１の工程（これは、便宜上鋳型アレイ生成工程と称され得る）で用いられる初期アレイは、（代表的な実施形態では）表面固定化核酸の複数の別個の核酸機構が固定化された平面を有する基材である。（当該技術分野で既知であるように、アレイはまた、複数の異なるビーズ又は類似した構造体で構成される「流体」アレイとして存在してもよく、ビーズ又は類似した構造体はそれぞれ、固定化核酸を保有し、且つアレイの「領域」として利用できる）。アレイ上の所与の機構の表面固定化核酸は、一本鎖核酸で構成され、多くの実施形態では、一本鎖デオキシリボ核酸（ここで、一本鎖核酸は、第２の非共有結合核酸へハイブリダイズされない核酸である）で構成される。表面固定化一本鎖核酸は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び可変ドメインを含む。主題の方法で用いられる初期アレイは、新規に生成されてもよく、或いは商業的供給源から予め作成されたアレイとして入手されてもよく、いずれの場合でも、アレイは、以下に記載する特性を有する。核酸のアレイは当該技術分野で既知であり、ここで主題の発明のアレイとなるように変更され得る代表的なアレイとして、第６，６５６，７４０号、第６，６１３，８９３号、第６，５９９，６９３号、第６，５８９，７３９号、第６，５８７，５７９号、第６，４２０，１８０号、第６，３８７，６３６号、第６，３０９，８７５号、第６，２３２，０７２号、第６，２２１，６５３号及び第６，１８０，３５１号、並びにそこで引用される参照文献に記載されるものが挙げられる。
【００６６】
初期アレイ又は前駆体アレイの核酸機構の数は様々であってもよく、ここでアレイの表面上に存在する機構の数は、少なくとも２個、５個若しくは１０個又はそれ以上、例えば少なくとも２０個（及び少なくとも５０個を包含する）であってもよく、ここで数は、約１００個程度、約５００個程度、約１，０００個程度、約５，０００個程度、約１０，０００個以上（例えば、２５，０００個以上、５０，０００個以上、１００，０００個以上、５００，０００個以上、１，０００，０００個以上）程度等と高くてもよい。代表的な実施形態では、主題のアレイは、約１０００個〜１０，０００個の機構／ｃｍ２、例えば約２，０００個〜約１０，０００個の機構／ｃｍ２（約２，０００個〜約５，０００個の機構／ｃｍ２を包含する）の範囲の密度を有する。代表的な実施形態では、所与の機構内の一本鎖核酸の密度は、ＲＮＡポリメラーゼの効率を最適化するように選択される。これらの代表的な実施形態のいくつかでは、一本鎖核酸の密度は、約１０−３〜約１ｐｍｏｌ／ｍｍ２、例えば約１０−２〜約０．１ｐｍｏｌ／ｍｍ２（約５×１０−２〜約０．１ｐｍｏｌ／ｍｍ２）の範囲であり得る。
【００６７】
上述のように、アレイ上の機構の別個の表面固定化核酸はそれぞれ、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び可変ドメインを含む。代表的な実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインが表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインと見なされ得て、且つ可変ドメインが表面遠位可変ドメインとして見なされ得るように、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインは、可変ドメインよりも表面の近くに位置付けられる。表面固定化核酸がそれらの３’末端により表面へ固定化される実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインが核酸の３’末端に位置し、且つ可変ドメインが核酸の５’末端に位置するように、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインは通常、核酸における可変ドメインの３’にある。
【００６８】
前駆体アレイの機構の可変ドメインは、アレイが使用されるべきである特定の用途、具体的には、主題の方法によりアレイを使用して生産されるリボ核酸混合物の意図する使用に基づいて選択される配列を有する。可変ドメインの長さはかなり変わってもよく、主題の方法の合成制約内で生産されるべきＲＮＡ組成物中での生じるリボ核酸の所望の長さに基づいて選択される。代表的な実施形態では、可変ドメインの長さは、約１０〜約１５０ｎｔ、例えば約１５〜約１００ｎｔ（約２０〜約８０ｎｔを包含する）の範囲である。
【００６９】
上述のように、可変ドメインのほかに、アレイ上に存在する各表面固定化核酸は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインを包含し、このドメインは、アレイの機構間で同じであり得るか、又は異なり得る。異なるＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインがアレイの機構集団において示される場合、異なるＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインの数は、約５を超過せず、特定のいくつかの実施形態では約３を超過しない。代表的な実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインがアレイの機構全ての核酸全ての間で共通であるか、又は同じであるように、単一ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインは、アレイの機構全てにおいて示されるか、或いは存在する。主題の方法で役立つ適切なポリメラーゼプロモータードメインは、適切な条件下で、リボヌクレオチド及びＲＮＡポリメラーゼの存在下で操作可能に連結されるＤＮＡ配列の転写を開始させることが可能なものである。プロモータードメインは、以下でより詳細に記載するように、ＲＮＡの転写を可能にする配向性で連結される。プロモーター領域は、Alberts他(1989)(Molecular Biology of the Cell, 2d Ed. Carland Publishing, Inc.)に記載されるように、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼプロモーター又はコンセンサスプロモーター領域由来の約１５個〜約２５０個のヌクレオチド、例えば約１７個〜約６０個のヌクレオチドを包含し得る。原核生物プロモーター又は真核生物プロモーターを用いてもよく、代表的な実施形態では、ファージ又はウイルスプロモーターのような原核生物プロモーターが用いられる。本明細書中で使用する場合、「操作可能に連結される」という用語は、影響を及ぼす配列（通常、プロモーター）と制御される配列（例えば、可変ドメイン）との間での機能的結合を指す。役立つプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡへ堅く結合し、且つＲＮＡ合成が開始するための開始部位及びシグナルを含有する領域である。多種多様なプロモーターが既知であり、多くが非常に十分特性化されている。関心が持たれている代表的なプロモーター領域としては、Chamberlin及びRyan著「The Enzymes」(P. Boyer編、Academic Press, New York)(1982) pp 87-108に記載されるようにＴ７、Ｔ３及びＳＰ６が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
特定のいくつかの実施形態では、アレイの機構の表面固定化核酸は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインと表面との間に位置されるスペーサードメインをさらに包含する。代表的な実施形態では、スペーサードメインは存在する場合、約１〜約２５ｎｔ、例えば約５〜約２０ｎｔ（約５〜約１５ｎｔを包含する）の範囲の核酸配列の長さに等しい長さを有し得る。上述のように、スペーサードメインは任意であり、ランダム配列又は非ポリヌクレオチド化学リンカー（例えば、エチレングリコールベースのポリエーテルオリゴマー）を含む任意の利便性のよい配列であってもよく、ここで特定のいくつかの実施形態では、スペーサードメインの目的は、基材表面から離れて表面固定化核酸の他のドメインを突出させることである。特定のいくつかの実施形態では、スペーサードメインは、高分子スペーサーがワトソン・クリック塩基対形成相互作用に関与しないように、即ちスペーサーがハイブリダイズ不可能であるように選択されるモノマー残基の高分子である。かかるスペーサーの代表的なタイプとしては、ポリエチレングリコールスペーサー、脱塩基ヌクレオチド残基の高分子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
特定のいくつかの実施形態では、プロモーターと可変ドメインとの間のリンカードメインが存在し得る。存在する場合、リンカードメインは、約５個〜約２０個の塩基を包含し得るが、所望に応じて、より小さくてもよく、又はより大きくてもよい。代表的な実施形態では、リンカードメインは存在する場合、約１個〜約２０個の塩基、例えば約１個〜約１５個（約１個〜約１０個の塩基を包含する）、例えば約５〜約１０ｎｔの範囲の長さを有する。特定のいくつかの実施形態では、リンカードメインは、切断可能であってもよく、例えばヌクレオチドのヌクレアーゼ認識される配列を有してもよい。
【００７２】
代表的な実施形態では、主題の方法で用いられるアレイ上の各表面固定化核酸は、下記式：
表面−Ｓｓ−Ｒ−Ｌｌ−Ｖ−５’
（式中、
Ｓは、スペーサーであり、
ｓは、０又は１の整数であり、
Ｒは、上記表面近位ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインであり、
Ｌは、リンカードメインであり、
ｌは、０又は１の整数であり、
Ｖは、上記表面遠位可変ドメインである）
により記載され、ここで上記機構はそれぞれ、上述の通りである。
【００７３】
代表的な実施形態のいくつかでは、上記表面固定化一本鎖核酸の可変ドメインＶのみが機構間で異なる。
【００７４】
主題のアレイは、商業的供給源からアレイを入手することを含む任意の利便性のよい手段により、或いはアレイを新たに合成することにより供給される。主題の方法で用いられるアレイを合成するためには、第１の工程は概して、主題の方法に従って主題のアレイを使用して生産されるべき核酸の混合物の性質を確定することである。例えば、核酸混合物が以下でより詳細に記載するように差次的遺伝子発現用途における参照又は対照として用いられるべきである実施形態では、第１の工程は、実施されるべき特定のプロトコルでアッセイされるべき遺伝子を同定することである。続いて、これらの遺伝子の同定後、プローブ核酸がハイブリダイズすべき各産物ＲＮＡの特定の領域（即ち、広がり又はドメイン）が同定される。米国特許第６，２５１，５８８号並びに公開済米国特許出願第２００４０１０１８４６号、同第２００４０１０１８４５号、同第２００４００８６８８０号、同第２００４０００９４８４号、同第２００４０００２０７０号、同第２００３０１６２１８３号及び同第２００３００５４３４６号（これらの開示は、参照により本明細書に援用される）に記載されるアルゴリズムを包含するがこれらに限定されないプローブ設計アルゴリズムを含む任意の利便性のよい方法を使用して、表面固定化核酸の配列を確定してもよい。上記で定義されるようなプローブ配列の同定に続いて、同定された組のプローブ配列それぞれが存在するアレイが生産される。
【００７５】
上述のような主題の方法で用いられるアレイの供給後、次工程は、アレイの表面上で二重鎖核酸を含む複数のオーバーハングを含む鋳型アレイを生産するのに十分なハイブリダイゼーション条件下で、アレイをＲＮＡポリメラーゼプロモーター相補組成物（即ち、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに相補的な核酸）と接触させることであり、ここでオーバーハングは、初期アレイ又は前駆体アレイの各表面固定化核酸の可変ドメインで構成される。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター相補組成物は、種々の配列の核酸の１つ又は複数の別個のタイプで構成される核酸組成物であり、ここで相補組成物の所定の核酸成員は、アレイ上に存在するＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインへハイブリダイズすることが可能である。相補組成物は、アレイ上に示される単一ＲＮＡポリメラーゼプロモータードメインが存在するか、或いは複数の異なるかかるプロモータードメインが存在するかどうかに応じて、同質又は異種であり得る。相補組成物の核酸成員は、アレイ上で相補ドメインへ結合し、且つ機能的ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を生産するのに十分な長さを有し、ここで構成成分である核酸成員の長さは、約１０〜約４５ｎｔ、例えば約１５〜約３５ｎｔ（約２０〜約３０ｎｔを包含する）の範囲であり得る。
【００７６】
上述のように、この方法により生産される鋳型アレイは、ポリメラーゼプロモーター及び相補可変ドメインを有する第１の核酸、並びにポリメラーゼプロモータードメインへハイブリダイズされる第２の核酸で構成される二本鎖（即ち、二重鎖）核酸のアレイである。したがって、この工程で生産されるアレイは、二重鎖核酸分子を含むオーバーハングのアレイであり、ここでオーバーハングは、アレイ上の各プローブの可変ドメインで構成される。
【００７７】
任意に、得られた鋳型アレイは、便宜上本明細書中で完全長二重鎖核酸の鋳型アレイと称される表面固定化完全長二重鎖核酸のアレイを生産するのに十分なプライマー伸長反応条件に付してもよい。二重鎖核酸を含むオーバーハングの鋳型アレイが付される特定のプライマー伸長反応条件は、その条件が所望の表面固定化二重鎖核酸を生産する限りは多様であり得る。代表的な実施形態では、アレイを、所望の固定化二重鎖核酸を生産するのに十分な条件下で、水性反応混合物中でＤＮＡポリメラーゼの供給源、ｄＮＴＰ及び任意の他の所望又は必須のプライマー伸長試薬と接触させる。主題の方法のこの任意の工程で用いられるポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであってもよく、或いはそうでなくてもよい。様々な熱安定性ポリメラーゼが当業者に既知であり、ここで代表的なポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。反応混合物中に存在するポリメラーゼの量は多様であり得るが、ポリメラーゼ活性の必須の量を提供するのに十分であり、ここで用いられる特定の量は、当業者により容易に確定され得る。また、４つのｄＮＴＰ、即ちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの一群が反応混合物中に存在する。ｄＮＴＰは、様々な量又は等モル量で存在してもよく、ここで各ｄＮＴＰの量は通常、約１０μＭ〜１０ｍＭ、通常約１００μＭ〜３００μＭの範囲である。反応混合物中に存在し得る他の試薬としては、一価陽イオン（例えば、Ｎａ＋）、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ＋＋）、緩衝液（例えば、トリス）、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）等が挙げられる。反応混合物は、適切な期間、適切なプライマー伸長温度で維持され、ここで代表的な実施形態では、プライマー伸長温度は、約５５℃〜７５℃、通常約６０℃〜７０℃の範囲であり、約３０秒〜１０分、例えば約１分〜５分の範囲の期間維持される。
【００７８】
続いて、上述のように、鋳型アレイ、例えばオーバーハング又は任意の二重鎖鋳型アレイの生産後、得られた鋳型アレイは、所望の複数の産物リボ核酸を生産するのに十分なイン・ビトロ転写反応条件に付される。この工程の間、上記方法の第１の工程で生産される少なくとも部分的に二重鎖であるＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼにより転写されて、ＲＮＡ産物を生じる。この工程では、少なくとも部分的に二重鎖であるＤＮＡを、ＲＮＡ転写が起こるのに十分な条件下で、４つのリボヌクレオチドの存在下で適切なＲＮＡポリメラーゼと接触させ、ここで用いられる特定のポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡに存在するプロモーター領域に基づいて選択され、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．コリ(E. coli)ＲＮＡポリメラーゼ等である。ＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ転写に適した条件は当該技術分野で既知であり、例えば、Melligan及びUhlenbeck (1989)(Methods in Enzymol. 180, 51)を参照されたい。
【００７９】
望ましい場合、主題の方法により生産される複数のＲＮＡは、標識された複数のＲＮＡとして生産されてもよい。標識は、例えばイン・ビトロでの転写反応混合物中で標識ＮＴＰを用いることにより、又は標識されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター相補体を用いることにより、任意の利便性のよいプロトコルを使用して産物ＲＮＡへ組み込まれ得る。代表的な標識に関するさらなる詳細及びそれらを使用する様式は上記で提供される。
【００８０】
上述の方法は、複数のリボ核酸の生産をもたらし、ここで鋳型アレイの種々の可変ドメインはそれぞれ、複数において、即ち鋳型アレイ上に存在する各機構に関して示され、機構に相当する複数において少なくとも１つのリボ核酸が存在し、ここで相当するとは、核酸が鋳型として機構の可変ドメインを使用するイン・ビトロでの転写により生成されるものであることを意味する。代表的な実施形態では、生じる複数に存在する産物リボ核酸の長さはそれぞれ、約２０〜約５００ｎｔ以上、例えば約５０〜約２００ｎｔ（約６０〜約１００ｎｔを包含する）の範囲である。主題の方法のこれらの実施形態で生産される複数のリボ核酸は、既知の組成を有することを特徴とする。既知の組成とは、複数が生産される方法のため、複数の産物における各別個のリボ核酸の配列は、高度の信頼性で予測することができることを意味する。したがって、主題の方法のポリメラーゼ媒介性リボ核酸生成工程で不義が起こらないと仮定すると、複数の産物における個々の又は別個の核酸の配列は既知である。多くの実施形態では、複数における種々の配列の各別個のリボ核酸の相対量又はコピー数は既知である。換言すると、リボ核酸の複数の産物は、鋳型アレイの各機構が複数の産物で示されるように、構成するリボ核酸を生産するのに使用される鋳型アレイの各機構に相当する構成するリボ核酸を包含することが既知である。
【００８１】
複数の産物のリボ核酸の特徴は、それらが一本鎖リボ核酸であることである。したがって、主題の複数のリボ核酸は、相補リボ核酸にハイブリダイズしない。換言すると、複数の産物の構成するリボ核酸は、相補配列を有する独立したリボ核酸へハイブリダイズせず、ここで独立したリボ核酸は、それらへ共有結合されない。複数の産物リボ核酸が一本鎖である一方で、それらは直鎖であってもよく、或いはいくつかの二次的な立体配置、例えばヘアピン立体配置等を取ってもよい。複数の産物に存在する種々の又は別個のリボ核酸の数は多様であり得るが、概して少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、例えば少なくとも約２０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個以上であり、ここで数は、約１００個、約５０００個又は約２５，０００個以上程度と多くてもよい。複数の産物における任意の２つの所与のＲＮＡは、それらが、ＦＡＳＴＡプログラムを使用して（デフォルト設定を使用して）確定される場合に、配列類似性が９８％未満である少なくとも２０ヌクレオチド長の広がりを含む場合に、別個であるか、又は異なると見なされる。
【００８２】
上述のように、リボ核酸の複数の産物は、複数の産物の意図する使用に応じて、異種混合物又は個々の同種ＲＮＡ組成物の組であり得る。
【００８３】
複数の生成物が混合物である実施形態に関して、混合物という用語は、残基配列が互いに異なる複数の異なるリボ核酸の異種組成物を指す。したがって、主題の方法により生産される混合物は、互いと化学的に組み合わせられず、且つ例えば相補表面固定化核酸のアレイを使用することにより分離させることが可能であるが、実際には分離されない２つ以上のリボ核酸の組成物と見なされ得る。
【００８４】
複数のリボ核酸が、同種リボ核酸集団の組である実施形態では、組の構成する成員は、特定のいくつかの実施形態では物理的に分離される（例えば、固体支持体の異なる位置上に存在する、異なる格納構造に存在する、等）。
【００８５】
特定のいくつかの実施形態では、リボ核酸の複数の産物は、それらの生産で使用される鋳型アレイから物理的に分離される。さらに他の実施形態では、複数の産物は、鋳型アレイと結合されてもよい（例えば、鋳型アレイの機構上に存在する）。
【００８６】
図１は、主題の方法の代表的な実施形態の概略図を提供する。図１では、アレイの機構の核酸は、その３’末端でアレイ基材表面へ結合された縦線として示される。描かれる代表的な実施形態の第１の工程では、本明細書中の他の箇所で概説されるようなＴ７プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ並びにｄＮＴＰ及び他のプライマー伸長試薬（例えば、緩衝液等）を、プライマー伸長条件下で基材と接触させて、二本鎖核酸の鋳型アレイを生産する。次工程では、生じた鋳型アレイを、上記で概説されるようなＴ７ポリメラーゼ、ＮＴＰ及び他のイン・ビトロでの転写試薬と接触させて、複数のＲＮＡ転写物を生産する。転写物の意図する使用に応じて、転写物は標識されてもよく、或いは標識されなくてもよい。
【００８７】
図２は、主題の方法の代替的な代表的な実施形態の概略図を提供する。図２は、アレイ上でのＤＮＡ合成の進行を示し、特定のアドレス可能な機構上で示される所定の配列を代表する。工程１では、３’−Ｔ７相補配列が印刷された後、所定の核酸の配列が印刷される。続いて、Ｔ７プライマーが表面固定化配列へハイブリダイズされた後、プライマー依存的伸長が行われて、工程３で表されるような二本鎖構造を生産する。イン・ビトロでの転写時に、５’−ＵＧＣＡＵＣＡＵ−リンカー−ＡＵＧＡＵＧＣＡと読取られる工程４で示される配列が得られる。リンカーは、折り返しを助長し、所望の場合、例えばｓｉＲＮＡ二重鎖を生産するために、酵素的に又はヌクレアーゼを使用することにより除去することができる。
【００８８】
リボ核酸の複数の産物は、多種多様な用途で役立ち、その代表的な用途が、以下のセクションでより詳細に概説される。
【００８９】
実用性
主題の方法により生産される複数のリボ核酸は、多種多様な用途で役立ち、ここで以下でより詳細に記載する２つの代表的なタイプの用途は、遺伝子発現用途及び遺伝子サイレンシング用途である。
【００９０】
遺伝子発現用途
遺伝子発現分析プロトコルは、当業者に既知であり、したがって、詳細に概説する必要はない。遺伝子発現分析プロトコルでは、標的核酸の集団（標識されてもよい）を、緊縮ハイブリダイゼーション条件のようなハイブリダイゼーション条件下で、例えばアレイの形態で、例えば固体支持体の表面上に固定化されたプローブ核酸の集団と接触させる。ハイブリダイゼーション後に、未結合標的を、例えば洗浄によりプローブから除去又は分離する。洗浄は、ハイブリダイズされた標的のパターンをもたらし、これは、任意の利便性のよいプロトコルを使用して、例えば蛍光標識が用いられる蛍光スキャナー装置で読取られ得る。このパターンから、標的集団が生産された初期ｍＲＮＡサンプルにおけるｍＲＮＡ発現プロフィールに関する情報が容易に導き出され得るか、或いは推定され得る。
【００９１】
対照又は参照としての複数のＲＮＡの使用
遺伝子発現分析用途では、主題の発明により生産される複数のＲＮＡは、特定のいくつかの実施形態では、標的核酸の対照組として役立ち得て、ここでアッセイで用いられるプローブ核酸の少なくともサブセット、及び特定のいくつかの実施形態では、アッセイで用いられ、且つアレイ上に存在するプローブ核酸全てが対照組で示される。換言すると、対照組は、それが用いられるアレイの種々のプローブ核酸の少なくともサブセット又は全ての異なるプローブ核酸それぞれにハイブリダイズすることが可能な核酸を包含する。
【００９２】
複数の産物ＲＮＡが遺伝子発現アッセイに関する対照又は参照として用いられる実施形態では、主題の方法により生産される標的核酸の対照組は、それらが使用されるアレイ上に存在するプローブ核酸の少なくともサブセットに存在するプローブ核酸それぞれに相補的な少なくとも１つの標的核酸を包含し得る。換言すると、所定のアレイ上に存在するプローブ核酸の少なくともサブセットは、所定のアレイとの使用を意図する対照組において示される。代表的な実施形態では、少なくともサブセットとは、アレイ上に存在するプローブ核酸の少なくとも２０個、通常少なくとも３０個、より通常では少なくとも５０個が対照組において示されることを意味する。いくつかの実施形態では、アレイ上に存在するプローブ核酸の少なくとも２０％、通常少なくとも３０％、より通常では少なくとも５０％が、アレイにおいて示される。代表的な実施形態では、アレイ上に存在するプローブ核酸全てが、対照組において示される。例えば、所定のアレイが、配列に基づいて互いに別個である５００個の別個のプローブ核酸を包含する場合、この特定のアレイとの使用に関する対照組は、アレイ上の各プローブ核酸につき１個、即ち少なくとも５００個の異なる標的核酸を包含する。
【００９３】
アレイ上の非プローブ配列、アレイ上に存在し得る例えば配向配列、ネガティブ対照配列及びポジティブ対照配列等のようなアレイ配列は、対照組において標的核酸を有さなくてもよい。概して、対照標的核酸は、定量化を要さないアレイ上の配列に必要はなく、ここで特定のプロトコルは、定量化データのみを提供すると意図される。
【００９４】
代表的な実施形態では、対照標的核酸の組又はプールにおける特有の対照標的核酸の数は、少なくとも約２０個、通常少なくとも約５０個、より通常では少なくとも約１００個であり、ここで数は、１，０００個以上程度と多くてもよい。
【００９５】
対照標的核酸は、アレイ上のそれらの相当するプローブ配列又は溶液中の試験核酸（存在する場合）と同じ長さであってもよく、それらより短くてもよく、或いはそれらより長くてもよい。しかしながら、各対照標的核酸は、その相当するプローブ核酸に対する少なくとも部分的な相補性、並びにその相当する試験標的核酸（存在する場合）との少なくとも部分的な配列同一性を有するように設計され得る。概して、かかる使用に関して設計される所定の対照組における各標的核酸の長さは、少なくとも約２５個のヌクレオチド、例えば少なくとも約５０個のヌクレオチド（少なくとも約１００個以上のヌクレオチドを包含する）である。さらに、対照標的核酸は、その相当する試験核酸に非常に類似した構造特性及びハイブリダイゼーション特性を有するように設計されてもよく、即ち、対照標的核酸は、類似したハイブリダイゼーション効率、相補プローブ配列との類似した動態、他の配列との類似したバックグラウンドハイブリダイゼーション等を有するように設計されてもよい。
【００９６】
標的核酸の対照組の特徴は、組中に存在する各対照標的核酸の濃度が既知であることであり、ここでかかる特徴は、対照組を調製するのに主題の方法を使用することにより提供される。したがって、適切な機構及びそれらの数、並びにイン・ビトロでの転写の条件を選択することにより、続いて対照又は参照として使用される複数の産物ＲＮＡの組成は、所望通りに調整されることができ、したがって既知であり得る。
【００９７】
標的核酸の対照組が用いられる特定のアッセイプロトコルに応じて、標的核酸の対照組及び試験（所定のプロトコルでアッセイされるサンプルから調製される標的核酸を意味する）組は、試験組及び対照組が互いに識別できないように同じ標識で標識してもよく、或いは標的核酸の試験組及び対照組は、２つの組が互いに容易に識別可能であるように差次的に標識してもよい。
【００９８】
したがって、特定のいくつかの実施形態では、標的核酸の試験組及び対照組は、差次的に標識される。「差次的に標識される」とは、標的核酸の試験組及び対照組は、それらが互いに同時に識別され得るように互いに異なって標識される。例えば、標的核酸の対照組及び標的核酸の試験組を有する場合、試験組における各標的核酸は、同じ第１の標識で標識し、対照組における各標的核酸は、第１の標識と異なり、且つ第１の標識と識別可能である同じ第２の標識で標識される。同様に、２つの対照組が上記方法で用いられる場合、第２の対照組における各標的核酸は、第１の標識及び第２の標識と異なり、且つ第１の標識及び第２の標識と識別可能な第３の標識で標識される。
【００９９】
さらに別の実施形態では、標的核酸の試験組及び対照組は、互いに識別不可能であるように同じ標識で標識される。標的核酸の試験組及び対照組が同じ標識で標識される場合、各組の各標的核酸は、同じ標識で標識される。
【０１００】
多種多様な標識が用いられてもよく、ここでかかる標識としては、上述のように蛍光標識、同位体標識、酵素標識、粒子標識等が挙げられる。標識が互いに識別可能である場合に、標識の任意の組合せ、例えば第１の標識と第２の標識、第１の標識と第２の標識と第３の標識等が、試験標的組及び対照標的組に関して用いられ得る。識別可能な標識の例は当該技術分野で既知であり、Ｃｙ３とＣｙ５又はＡｌｅｘａ  ５４２とＢｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０のような２つ又はそれ以上の異なる放出波長蛍光色素；３２Ｐと３３Ｐのような異なる放射エネルギーを有する２つ又はそれ以上の同位体；温度、ｐＨ、さらなる化学作用物質による処理等のような種々の処理条件下でシグナルを発生する標識、及び処理後に異なる時点でシグナルを発生する標識が挙げられる。シグナル発生に関して１つ又は複数の酵素を使用することにより、酵素の異なる基質特異性に基づいたさらに多様な識別可能な標識の使用が可能となる（例えば、アルカリホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）。
【０１０１】
使用に際して、標的核酸の試験組及び対照組は、アレイへハイブリダイズされてもよく、ここで標的核酸の組は、同じアレイ又は異なるアレイへハイブリダイズされてもよく、ここで標的核酸の組が異なるアレイへハイブリダイズされる場合、異なるアレイは全て、プローブ核酸の共通アレイを少なくとも共有し、即ち、それらは、それらのプローブ核酸に関して同一である。
【０１０２】
特定のいくつかの実施形態では、標的核酸の試験組及び対照組は、同じアレイへハイブリダイズされる。かかる実施形態では、アレイは、標識標的核酸の試験組及び標識標的核酸の少なくとも１つの対照組によりハイブリダイズされる。標的核酸の１つを上回る対照組が用いられる実施形態では、異なる対照組の数は、２個〜６個、通常２個〜４個、より通常では２個〜３個の範囲であり得る。標的核酸の１個又は２個の異なる対照組が用いられる実施形態は、特に関心が持たれている。
【０１０３】
標的核酸の試験組及び対照組は、アレイへハイブリダイズされることができ、且つ／又は同時に若しくは順次検出されることができる。したがって、対照組及び試験組が用いられる場合、標的核酸の２つの組は、ハイブリダイゼーションに先立って組み合わせてもよく、アレイは、ハイブリダイゼーション条件における潜在的な変動性を最低限に抑えるように同時に両方へハイブリダイズされてもよい。例えば、試験標的核酸及び対照標的核酸の既知の量の標識組を同じハイブリダイゼーション緩衝液へ添加することができ、続いて、ハイブリダイゼーション条件下で１つ又は複数のアレイと同時に接触させることができる。別の例では、試験標的核酸及び対照標的核酸の既知の量の標識組を同じハイブリダイゼーションミックスへ添加し、この緩衝液は、異なるアレイの別個のハイブリダイゼーション用に分取される。ハイブリダイゼーションミックスの分取量を貯蔵することにより（例えば、−２０℃〜−７０℃での貯蔵）、異なるアレイは、異なる時刻でおよそ同量の標的核酸配列とハイブリダイズさせてもよい。
【０１０４】
試験標的核酸及び対照標的核酸が所定のアレイへ同時にハイブリダイズされる上記実施形態では、標識試験核酸及び対照試験核酸は、アレイとの接触に先立って予め混合され得るか、或いはプールされ得る。代表的な実施形態では、試験標的核酸及び対照標的核酸の混合物は、アレイで観察されるバックグラウンドシグナルよりも少なくとも１０倍、通常少なくとも２０倍、より通常では少なくとも５０倍高いシグナルを生成するのに十分な量の対照核酸及び標的核酸を有する。混合物中の対照標的核酸及び試験標的核酸の相対量は、アレイ上の倍過剰でない(nofold excess of)未結合プローブ核酸との試験標的核酸の完全な結合を可能にすると同時に、プローブ核酸に相補的な試験配列の信頼性高い検出を可能にするのに十分であるように選択される。
【０１０５】
或いは、１つ又は複数のアレイは、標的核酸の対照組及び試験組と順次ハイブリダイズさせてもよい。例えば、アレイは、標識試験標的核酸を含有するハイブリダイゼーションミックスとハイブリダイズさせて、これらの分子がアレイのプローブ配列へ制約されずに接近するのを可能にしてもよい。続いて、このハイブリダイゼーション後に、対照標的核酸を内部対照として使用するためにアレイへ暴露させることができる。対照標的核酸のハイブリダイゼーションは、例えば異なる時刻で異なるハイブリダイゼーションミックスを使用して、試験標的核酸のハイブリダイゼーションと完全に分離させてもよく、或いは対照標的配列は、試験標的核酸とのインキュベート期間後に、試験標的核酸を含有するハイブリダイゼーション緩衝液へ添加してもよい。順次使用される場合、検出が個々に行われるため、対照標的核酸及び試験標的核酸は、差次的に標識され得るか、或いは同じ標識で標識され得る。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、標的核酸の試験組及び対照組は、異なるアレイへハイブリダイズさせてもよく、ここで異なるアレイはそれぞれ、プローブ配列の同一集団を有し、即ち、異なるアレイは、それらのプローブ配列に関して異ならない。かかる方法では、対照標的核酸及び試験標的核酸は、上記で論述されるように、互いに識別不可能であるように同じ標識で標識されてもよい。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされてない標識核酸は、洗浄により利便性よく支持体表面から除去されて、基材表面上にハイブリダイズされた核酸のパターンを生成させる。様々な洗浄溶液及びプロトコルが当業者に既知であり、使用され得る。上記で挙げた代表的な条件を参照されたい。
【０１０８】
生じた標識核酸の、ハイブリダイゼーションパターンは、様々な方法で可視化又は検出されてもよく、特定の検出様式は、標的核酸の特定の標識に基づいて選択され、ここで代表的な検出手段としては、シンチレーション計数、オートラジオグラフィ、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等が挙げられる。
【０１０９】
検出又は可視化後に、対照標的核酸及び試験標的核酸により生成されるハイブリダイゼーションパターンを比較して、シグナル間の差異を同定し得る。種々のプローブがそれぞれ既知の遺伝子に相当するアレイが用いられる場合、シグナル強度の差異は、特定の遺伝子の異なる標的濃度に関連させることができる。プローブ配列への試験標的核酸の結合の強度の比較は、相当する対照標的配列の結合強度と比較することができ、測定値は、当該標的サンプルに関する定量的ＲＮＡ濃度に変換することができる。試験標的の定量的ＲＮＡレベルをアレイ間で比較して、特定のサンプルにおける遺伝子の差次的発現を同定又は確認することができる。
【０１１０】
上記で概説するように対照標的核酸又は参照標的核酸として主題の方法により生産される複数のＲＮＡを使用することにより、多数の異なる作業課題を達成することができ、当該作業課題としては、標的配列の相対的なハイブリダイゼーションを検出すること、ハイブリダイゼーションを較正すること、ハイブリダイゼーションアッセイ間のデータを調和させること、及びハイブリダイゼーションアッセイで使用される試薬を試験することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
標的核酸の対照組又は参照組は、内部ハイブリダイゼーション対照を提供することにより、サンプルにおける種々の遺伝子のハイブリダイゼーションの相対的なレベルを検出する際に有用である。核酸の対照組が既知の量で既知の配列を有し、且つ既知の比活性を有する（ここで、好ましい実施形態では、対照標的及び試験標的は、同じ比活性で標識される）ため、対照核酸のハイブリダイゼーションのレベルを使用して、プローブ配列への結合のそのレベルに基づいて試験サンプルにおける各遺伝子の発現のレベルを確定することができる。各プローブ配列が各自の内部対照を有するという事実はまた、サンプル間での潜在的な発現差異及びプローブ配列間での結合親和性の差異（ともに単一アレイ上及びアレイ間で）の検出を可能にする。したがって、対照配列のハイブリダイゼーションの強度レベルを使用して、相当するプローブ配列への試験標的ハイブリダイゼーションの強度に基づいてサンプルにおける遺伝子の発現レベルを算出することができる。
【０１１２】
標的核酸の対照組又は参照組としての主題の複数のＲＮＡの使用はまた、ハイブリダイゼーションアッセイの較正に役立つ。既知の濃度のプローブ核酸、試験標的核酸及び対照標的核酸を使用することにより、特定の使用に関してハイブリダイゼーション条件（例えば、或るレベルの配列相同性を有する核酸（例えば、同じ遺伝子に関して単一ファミリー又は選択的スプライス形態由来の遺伝子間の差次的発現）のより良好な検出を可能にするための緊縮性の増大）を最適化することが可能となる。主題の発明の方法の内部標準の使用により、ハイブリダイゼーション、標識手順等を特定の使用に関して最適化することが可能であり、これは生物学的サンプルのハイスループットスクリーニングのような大規模のハイブリダイゼーションアッセイの標準化に特に有益である。したがって、最適化は、相補プローブ配列による特異的なハイブリダイゼーションシグナルの最大強度、及び非相補プローブ配列による非特異的なハイブリダイゼーションの最小レベルを達成するためにハイブリダイゼーション条件を変更させることができることを意味する。
【０１１３】
対照組又は参照組としての本発明の複数のＲＮＡの使用はまた、ハイブリダイゼーションアッセイ間のデータを調和させる機会を提供し、したがってハイブリダイゼーション条件における差異、サンプル調製物における差異及びさらには異なるタイプのアレイ間での差異、異なるアレイ内及び間での品質並びに性能における差異、標識標的核酸の比活性における差異等のような変数に起因した潜在的な差異にもかかわらず、発現レベルの直接的な比較を可能にする。各ハイブリダイゼーションアッセイは、アレイ上のプローブ配列の少なくともサブセットに関してその内部対照を有するため、データは、対照標的核酸の強度及び試験標的核酸の強度の比を使用して比較することができる。したがって、アッセイ間の差異を補正するための簡素な数式の使用により、これらの種々のアッセイにおける遺伝子発現のレベルを同じレベルに調節して、続いて生物学的に関連した様式で比較することが可能となる。
【０１１４】
主題の方法により調製される標的核酸の対照組又は参照組はまた、ハイブリダイゼーション試薬の有効性を確定する際に有用である。かかる試薬は、例えば新たな試薬（例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション用の種々の緩衝溶液）又は確立された試薬（例えば、既知の市販の試薬の新たなバッチ）であり得る。主題の発明の方法の内部対照は、試薬を試験する際に二段階の品質保証を提供し、基本的には単一ハイブリダイゼーションにおいて試薬の有効性を確定するための追加の対照を提供する。有効性は、最小レベルの非特異的なシグナル及び固体表面へのバックグラウンド結合を伴う最大の特異的なシグナルを意味する。温度、緩衝液組成、ハイブリダイゼーション及び／洗浄時間の長さ等のような他のパラメータは、較正対照を使用して最適化され得る。また、同じ較正標的核酸は、シグナルの予測レベル強度に対して検出機器を試験及び較正するのに日常的に使用することができ、したがって機器の機能性に起因した変動性を制限し、また対照手順に関してアレイの品質を試験及び較正するのに使用してもよい。
【０１１５】
単一色アレイアッセイにおけるノイズ及び／又はクロスハイブリダイゼーションに関して推定／補正するための複数のＲＮＡの使用
ＲＮＡ産物混合物は、単一色アレイアッセイにおけるノイズ及び／又はクロスハイブリダイゼーションの推定或いは補正において対照標的混合物としても役立つ。例えば、主題の方法を用いて、アレイのプローブ中に存在する配列に関して既知のミスマッチの配列を有する標的核酸を含むリボ核酸の規定の混合物を生産することができ、また当該技術分野で既知であるように、かかるミスマッチ標的核酸から得られるシグナルを使用して、ノイズを推定及び／又は補正することができる。例えば、複雑な混合物が使用されるアレイのプローブに関して（１）完全なマッチ、（２）２個〜５個の塩基よりも多いミスマッチ（配列逆位による）（３）欠失及び（４）ランダムであるＲＮＡを含む複雑なＲＮＡ標的混合物は、主題の方法を使用して生産することができる。続いて、かかる混合物を使用することから得られるシグナルを適切なアルゴリズムと併用して、所定の単一色実験におけるノイズを推定してもよく、したがって補正してもよい。所定のプローブ核酸に関して様々な度合いのミスマッチを有する複数個の、例えば２個〜７個の異なる標的を含むＲＮＡ混合物もまた、主題の方法により生産することができ、非特異的シグナル及び感受性の推定を提供するのに使用され得る。かかる混合物は、ＱＣマトリックスとして用いられ得る。主題の方法はまた、ＲＮＡ品質を確定するのに用いることができるＲＮＡ混合物を生産するのに用いられ得る。
【０１１６】
特定のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的混合物は、アレイ上に存在するプローブに特異的に結合するように設計されるか、或いはアレイ上に存在するプローブへ特異的に結合するように設計されない主題の方法により生産される。前者のタイプの混合物は、アレイから得られる特異的なシグナルをモデリング又は推定するのに用いられ得るのに対して、後者のタイプの混合物は、アレイから得られる非特異的なシグナルをモデリング又は推定するのに用いられ得る。試験標的シグナルチャネルと異なるシグナルチャネルが用いられる場合、特異的又は非特異的なシグナルの推定は、試験シグナルチャネルに由来し得るシグナル混入を回避する。この様式でノイズ又は非特異的なシグナル値を推定すること（及び望ましい場合、例えばシグナル（例えば、緑及び赤）チャネル間での強度の差異を相殺するために、このシグナル値を実験チャネルへ再構築させること）、続いて生強度シグナルからノイズシグナルを除去することにより、シグナルの真の強度が帰属され得る。この真の強度シグナルは、未調節の生データ又は標準化データよりもサンプルにおける転写物濃度と良好に相関する。
【０１１７】
遺伝子サイレンシング用途
複数のリボ核酸を生産する主題の方法はまた、遺伝子サイレンシング用途にも役立つ。例えば、複数のリボ核酸を生産するアレイベースの方法は、短いヘアピンＲＮＡ分子のようなＲＮＡｉ作用物質を生産する際に役立つ。
【０１１８】
かかる用途では、鋳型アレイの可変配列は、ＲＮＡｉ分子、例えばｓｈＲＮＡ分子をコードするように選択される。鋳型アレイは、多種多様な遺伝子に対するＲＮＡｉ分子、又は同じ遺伝子をサイレンシングするように設計される複数の異なるＲＮＡ分子を生産するように設計され得る。鋳型アレイは、サブアレイのアレイ（マルチウェル方式、例えば８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル等を包含する）として構成されてもよく、ここでかかる構成は当該技術分野で既知であり、ここで各サブアレイは、異なる遺伝子に対するｓｉＲＮＡ分子を生産するように設計される機構を有する。
【０１１９】
主題の方法がｓｉＲＮＡ分子を生産するのに用いられる場合、複数の産物のＲＮＡ分子は通常、標識されない。特定のいくつかの実施形態では、産物ｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシング実験での使用に先立って、アレイから分離されなくてもよく、ここでイン・ビトロでの転写工程を受けて各機構において未結合の産物ｓｉＲＮＡ分子を含む生じる鋳型アレイは、例えば米国特許出願公開第２００３０２２８６９４号、同第２００３０２２８６０１号、同第２００３０２０３４８６号及び同第２００２０００６６６４号（これらの開示は、参照により本明細書に援用される）に記載されるように、ｓｉＲＮＡアレイとして用いられる。或いは、複数の産物は、それらを生産するのに使用される鋳型アレイから分離されてもよく、続いてＲＮＡｉ媒介性遺伝子サイレンシング用途で使用され得る。
【０１２０】
上記で概説した用途は、主題の発明の方法により生産される複数の産物ＲＮＡが役立つ種々の用途の単なる代表であることに留意されたい。
【０１２１】
データ伝送実施形態
特定のいくつかの実施形態では、主題の方法は、上述するような検出工程及び抽出工程の少なくとも１つからのデータを遠隔位置へ伝送する工程を包含する。「遠隔位置」とは、アレイが存在し、且つハイブリダイゼーションが行われる位置以外の位置を意味する。例えば、遠隔位置は、同じ都市における別の位置（例えば、オフィス、研究室等）、異なる都市における別の位置、異なる州における別の位置、異なる国における別の位置等であり得る。データは、さらなる評価及び／又は使用のために遠隔位置へ伝送されてもよく、遠隔位置へ到着するとすぐに、データは使用者により受信され得る。任意の利便性のよい電気通信手段（例えば、ファクシミリ、モデム、インターネット等）が、データを伝送するのに用いられ得る。
【０１２２】
キット
また、核酸の主題の標的集団を調製する際に使用するためのキットが、主題の発明により提供される。キットは、例えば緩衝液、ｄＮＴＰ、逆転写酵素等を包含する上記方法で利用される様々な試薬（通常、濃縮形態で）の１つ又は複数をそれぞれが有する容器を含んでもよく、ここでキットは、十分な量のＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン相補核酸（例えば約２５ｐｍｏｌ〜２５μｍｏｌの範囲の量）を少なくとも包含する。さらに、主題のキットは、一本鎖プローブ核酸のアレイ（又はそれらを生産するための手段）を含んでもよく、ここで各プローブは、上述のようにＲＮＡポリメラーゼプロモータードメイン及び相補可変ドメインを有する。キットが鋳型アレイを生産するための手段を有する場合、キットは、平面を有する基材、及びプローブの合成に必要な１つ又は複数の試薬を含んでもよく、これはアレイを作成するのに使用されるべきプロトコルの性質に応じて様々であり得る。キットは、標識標的核酸を生産するのに必要な試薬をさらに含んでもよく、ここでかかる試薬は、逆転写酵素、標識ｄＮＴＰ等を包含し得る。１組の説明書もまた通常包含され、ここで説明書は、キット又はそれらの構成要素の添付文書(package insert)及び／又は包装に付随され得る。
【０１２３】
上述の発明は、理解の明瞭性の目的で実例及び一例として幾らか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、特定のいくつかの変更及び修正がそれらに対して成されてもよいことが、本発明の教示を鑑みて当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】主題の方法の代表的な実施形態の概略図を提供する図である。
【図２】主題の方法の第２の代表的な実施形態の概略図を提供する図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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