(57)【要約】  本発明は、クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子をクローニングするため、およびウィルス感染疾患に対するＤＮＡワクチン候補としての発現ベクターに関する。【選択図】図１
2008521384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子をクローニングするＤＮＡワクチン候補としての発現ベクターであって、前記発現ベクターは、
ｉ）内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）が膜タンパク質遺伝子とエンベロープタンパク質遺伝子との結合部に挿入されている、コロナウィルスの膜タンパク質遺伝子（Ｍタンパク質遺伝子）、コロナウィルスのエンベロープタンパク質遺伝子（Ｅタンパク質遺伝子）、および内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）配列を含む第１の転写単位、
ｉｉ）前記Ｍタンパク質遺伝子の上流に位置し、かつ前記第１の転写単位の発現を駆動する、膜タンパク質遺伝子に作動可能に連結された第１の真核生物プロモーター、
ｉｉｉ）マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）がＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の開始部位に位置しかつ制限酵素切断部位を有する、コロナウィルスのＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子、およびクラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子のクローニングまたはフレーム内での挿入のためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む第２の転写単位、ならびに
ｉｖ）前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の上流に位置し、かつ前記第２の転写単位の発現を駆動する、前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子に作動可能に連結された第２の真核生物プロモーターを含み、
前記第１の真核生物プロモーターの転写活性が前記第２の真核生物プロモーターよりも強力であることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記コロナウィルスが、ブタ、ヒト、またはトリのコロナウィルスであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項３】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記コロナウィルスが、ブタＴＧＥＶコロナウィルス、ヒト２２９Ｅコロナウィルス、またはヒトＳＡＲＳウィルスであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項４】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記エンベロープタンパク質遺伝子が、配列番号１に示される配列を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記膜タンパク質遺伝子が、配列番号２に示される配列を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子が、配列番号３に示される配列を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
宿主細胞中でのプラスミドの増殖のための複製起点をさらに含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子をさらに含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記第１の転写単位および前記第２の転写単位がポリＡシグナルを有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターにおいて、
前記ポリＡシグナルがＢＧＨポリＡシグナルであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
配列番号４９に示される配列を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子が、前記コロナウィルスのＳｐｉｋｅタンパク質の膜貫通セグメントと並列した、芳香族性残基リッチの領域の上流に位置するＣ末端のヘプタッドリピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）をコードすることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記マルチプルクローニングサイトが、ＳｍａＩ、ＢｓａＢ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、およびＢｓｐＥ  Ｉからなる群より選択される制限部位を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子が、ＨＩＶのｇｐ１６０、インフルエンザウィルスのＨＡ、およびＳＡＲＳウィルスのＳｐｉｋｅからなる群より選択されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記第１の真核生物プロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、筋特異的デスミン、クレアチンキナーゼ、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１α、ユビキチンプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記第１の真核生物プロモーターが、ｐＣＭＶ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、およびβ−アクチンプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記第２の真核生物プロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、筋特異的デスミン、クレアチンキナーゼ、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１α、ユビキチンプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１記載の発現ベクターにおいて、
前記第２の真核生物プロモーターが、ｐＣＭＶ、ＳＶ４０、β−アクチン、およびＥＦ１αプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野、より詳細にはＤＮＡワクチンの分野における、クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子をクローニングするＤＮＡワクチン候補としての、ウィルス様粒子をコードする新規な発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、過去３０年間の間、ウィルス性疾患の制御において鍵となる役割を果たしてきた。ワクチン接種は、免疫の単純な原理に基づいている。一旦感染性因子に曝されると、動物は、同じ因子による感染から保護する免疫防御を仕掛ける。ワクチン接種の目的は、感染の前に、防御を仕掛けるように動物を誘導することである。従来、このことは、免疫原として、弱毒化した生型ウィルス、または死滅型ウィルスの使用を通して達成されてきた。
【０００３】
しかし、過去におけるこれらの手法は、固有の抗原の提示や、天然の感染において得られる範囲での免疫応答を誘発する弱毒化ウィルスの能力に概ね依存していたので、常に多くの潜在的な制限を受けてきた。つまり、弱毒化株は、変異して、より毒性または非免疫原性になることがあり得る。また、不適切に不活性化されたワクチンは、それらのワクチンが予防するはずの疾患を引き起こす可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
組換えＤＮＡ技術は、免疫原として、インタクトな感染性因子ではなく、所定の抗原を使用したワクチンの開発を可能にすることによって、従来的なワクチンの制限のいくつかを除去できる可能性がある。これらのワクチンとしては、化学合成された免疫反応性エピトープからなるペプチドワクチン、組換え異種細胞におけるウィルスタンパク質の発現によって産生されるサブユニットワクチン、および１つまたは多数の所定の抗原を提示する生ウィルスベクターが挙げられる。
【０００５】
しかし、ペプチドワクチンおよびサブユニットワクチンは、いずれも多くの潜在的な制限を受ける。つまり、操作されたタンパク質のコンホメーションが、それらの天然の環境における抗原のコンホメーションを確実に模倣することが困難であるという大きな問題がある。また、アジュバントやペプチドの場合におけるキャリアタンパク質は、免疫応答を高めるために適していなければならない。加えて、これらのワクチンは、主に体液性応答を誘発し、効果的な免疫を引き出せないことがある。
【０００６】
このため、様々な方法が、標的細胞に新しい遺伝情報を導入するために開発されてきた。現在、標的細胞にＤＮＡを導入する最も効率的な手段は、改変されたウィルス、いわゆる組換えウィルスベクターを利用することによる。最も頻繁に使用されているウィルスベクター系としては、レトロウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、またはアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）由来のものが挙げられる。これらのウイルスベクター系は、いずれも特有の利点や欠点を有する。あるベクター系は、宿主細胞ゲノムにベクター系のＤＮＡを組み込む能力を有するのに対して、他のベクター系はそれを有さない。あるベクター系では、ベクターからウィルス遺伝子が完全に除去可能であるのに対して、他のベクター系ではまだ可能ではない。あるベクター系では、極めて良好にｉｎ  ｖｉｖｏで送達可能であるのに対して、他のベクター系では可能でない。また、あるベクター系は、大量に産生することが極めて容易であるのに対して、他のベクター系は産生することが極めて困難である。
【０００７】
コロナウィルスは、それらのエンベロープ中に、３個または４個のタンパク質を有する。中でも、Ｍタンパク質は最も多く含まれるタンパク質である。スモールＥタンパク質は、含まれる量は少ないが必須のウィルス成分である。また、病原性Ｓタンパク質は、ウィルスの侵入とウィルスの伝播との両方におけるその生物学的機能が一致している点で重要である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１９：３５８−３７１；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：５５３３−５５３６）。
【０００８】
ウィルスエンベロープ上で発現すると、Ｓタンパク質は細胞受容体に結合し、ウィルスの侵入の間に、ウィルスと細胞膜との融合を誘導する。感染に続いて、感染した細胞の原形質膜上で発現したＳタンパク質は、細胞同士の融合を誘導する。また、Ｓタンパク質はウィルス感染に対する免疫応答において、中和抗体のための標的（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１９：３５８−３７１）、および細胞性免疫の誘導体（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３１５−３２５；Ｃａｓｔｒｏ，Ｒ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｐｅｒｌｍａｎ，１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：８１２７−８１３１）としての役割を果たす。
【０００９】
Ｍタンパク質およびＥタンパク質は、ウィルスアセンブリーのための最小のタンパク質ユニットであり（Ｂａｕｄｏｕｘ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８６３６−８６４３；Ｂｏｓ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：５２−６０；ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｃ．Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６８３８−６８５０；Ｇｏｄｅｋｅ，Ｇ．−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５６６−１５７１；Ｖｅｎｎｅｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２０２０−２０２８）、両方とも内在性膜タンパク質である。
【００１０】
ウィルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を誘発するには、Ｍタンパク質およびＥタンパク質が同時発現すればよく、Ｓタンパク質がＭタンパク質およびＥタンパク質と同時発現すると、Ｓタンパク質は、真正と推定されるコンホメーションで、ＶＬＰに取り込まれる。このことは、現在、マウス肝炎ウィルス（ＭＨＶ）（Ｂｏｓ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：５２−６０；ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｃ．Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６８３８−６８５０；Ｖｅｎｎｅｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２０２０−２０２８）、伝染性胃腸炎ウィルス（Ｂａｕｄｏｕｘ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８６３６−８６４３）、およびネコ伝染性腹膜炎ウィルス（Ｇｏｄｅｋｅ，Ｇ．−Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５６６−１５７１）で実証されている。
【００１１】
コロナウィルス膜は、基本的に、横方向に相互作用するＭタンパク質の密集したマトリックスからなり、これは何らかの方法で出芽のためにＥタンパク質を必要とし、利用可能な場合には、Ｓｐｉｋｅのカルボキシル末端および膜貫通領域を介するＭとの特異的相互作用によって、ＳおよびＨＥ糖タンパク質が取り込まれるという仮説がある（ｄｅ  Ｈａａｎ，Ｃ．Ａ．Ｍ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７４４１−７４５２；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｖ．−Ｐ．およびＢ．Ｇ．Ｈｏｇｕｅ．１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９２７８−９２８４；Ｏｐｓｔｅｌｔｅｎ，Ｄ．−Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３１：３３９−３４９；Ｖｅｎｎｅｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２０２０−２０２８）。
【００１２】
このようなＳｐｉｋｅ含有ＶＬＰは、真正のウィルスと同程度の感染力で細胞に感染することができる（Ｂｏｓ，Ｅ．Ｃ．，１９９６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１８：５２−６０）。しかし、ＤＮＡワクチンとしての使用のために有効なＤＮＡベクターは開発されてはいない。
【００１３】
それゆえに、ＶＬＰの表面において機能的なウィルス融合タンパク質を提示することができる、ウィルス様粒子をコードする有効なＤＮＡベクターを開発する必要性が存在し、これらのＶＬＰは、ウィルス感染疾患に対するワクチンとして極めて有用性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子をクローニングするＤＮＡワクチン候補としての発現ベクターに関し、前記発現ベクターは、
ｉ）内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）が膜タンパク質遺伝子とエンベロープタンパク質遺伝子との結合部に挿入されている、コロナウィルスの膜タンパク質遺伝子（Ｍタンパク質遺伝子）、コロナウィルスのエンベロープタンパク質遺伝子（Ｅタンパク質遺伝子）、および内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）配列を含む第１の転写単位、
ｉｉ）前記Ｍタンパク質遺伝子の上流に位置し、かつ前記第１の転写単位の発現を駆動する、膜タンパク質遺伝子に作動可能に連結された第１の真核生物プロモーター、
ｉｉｉ）マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）がＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の開始部位に位置しかつ制限酵素切断部位を有する、コロナウィルスのＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子、およびクラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子のクローニングまたはフレーム内での挿入のためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む第２の転写単位、ならびに
ｉｖ）前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の上流に位置し、かつ前記第２の転写単位の発現を駆動する、前記ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子に作動可能に連結された第２の真核生物プロモーターを含み、
前記第１の真核生物プロモーターの転写活性は、前記第２の真核生物プロモーターよりも強力である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
欠損性で、自己増殖しないウィルス粒子への自己アセンブリーが可能であるウィルスポリペプチドをコードする遺伝子は、ＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡウィルスのゲノムｃＤＮＡから、またはその遺伝子を含む利用可能なサブゲノムクローンから、入手することができる。これらの遺伝子には、ウィルスキャプシドタンパク質（すなわち、ウィルスタンパク質の殻を含むタンパク質）をコードするもの、およびエンベロープを有するレトロウィルスなどのウィルスの場合、ウィルスエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
【００１６】
ウィルス様粒子は、それ自体を免疫原として、病原性ウィルスに対するワクチン接種のため、感染した個体において免疫応答を高めることなどの治療目的のため、あるいは特定の細胞型に対して、細胞障害性ドラッグなどの治療用薬剤を標的に送達するために、単離したり使用してもよい。
【００１７】
本発明は、クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子をクローニングするＤＮＡワクチン候補としての発現ベクターを提供し、発現ベクターは、
ｉ）内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）が膜タンパク質遺伝子とエンベロープタンパク質遺伝子との結合部に挿入されている、コロナウィルスの膜タンパク質遺伝子（Ｍタンパク質遺伝子）、コロナウィルスのエンベロープタンパク質遺伝子（Ｅタンパク質遺伝子）、および内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）配列を含む第１の転写単位、
ｉｉ）Ｍタンパク質遺伝子の上流に位置し、かつ第１の転写単位の発現を駆動する、膜タンパク質遺伝子に作動可能に連結された第１の真核生物プロモーター、
ｉｉｉ）マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）がＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の開始部位に位置しかつ制限酵素切断部位を有する、コロナウィルスのＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子、およびクラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子のクローニングまたはフレーム内での挿入のためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む第２の転写単位、ならびに
ｉｖ）ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の上流に位置し、かつ第２の転写単位の発現を駆動する、ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子に作動可能に連結された第２の真核生物プロモーターを含み、
第１の真核生物プロモーターの転写活性は、第２の真核生物プロモーターよりも強力である。
【００１８】
本発明によれば、この発現ベクターは、コロナウィルスの膜タンパク質遺伝子（Ｍタンパク質遺伝子）、コロナウィルスのエンベロープタンパク質遺伝子（Ｅタンパク質遺伝子）、および内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）配列を含む第１の転写単位を含み、ＩＲＥＳは、膜タンパク質遺伝子とエンベロープタンパク質遺伝子との結合部に挿入されている。
【００１９】
本発明によれば、本発明のエンベロープタンパク質遺伝子は、コロナウィルスのエンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）をコードする。
【００２０】
Ｅタンパク質は、小さな、エンベロープ結合タンパク質であり、コロナウィルス中に含まれる量は少ないが必須のウィルス成分である。Ｅタンパク質は、細胞中で蓄積し、中間区画（ＩＣ）の膜の融合を誘導して、典型的な構造を生じる。Ｅタンパク質の画分は、同一性が知られていない膜構造で、細胞外に見られる。
【００２１】
本発明のコロナウィルスは、好ましくは、ブタ、ヒト、またはトリのコロナウィルスであり、より好ましくは、ブタＴＧＥＶコロナウィルス、ヒト２２９Ｅコロナウィルス、またはヒトＳＡＲＳウィルスである。
【００２２】
本発明のＥタンパク質遺伝子は、より好ましくは、配列番号１に示される配列を有する。
【００２３】
ＳＡＲＳ  Ｅ遺伝子のコード配列（配列番号１）
ATGGCATACT CTTTTGTGTC TGAGGAAACT GGCACTCTGA TCGTGAACTC TGTACTGCTG
TTTCTCGCTT TTGTGGTATT CCTGCTGGTC ACTCTCGCTA TCCTCACTGC TCTTCGTCTG
TGTGCCTACT GTTGTAATAT CGTGAACGTG TCTCTGGTTA AGCCTACTGTGTATGTGTAT 
TCTCGTGTGA AAAATCTCAA TTCTTCTGAA GGAGTTCCCG ATCTGCTGGT CTAG
本発明によれば、本発明の膜タンパク質遺伝子は、コロナウィルスの膜タンパク質（Ｍタンパク質）をコードする。Ｍタンパク質はコロナウィルス中に最も多く含まれ、短いアミノ末端外部ドメイン、３つの連続する膜貫通ドメイン、およびビリオンの内部（または細胞質中）の長いカルボキシ末端ドメインからなるＩＩＩ型糖タンパク質である。
【００２４】
本発明のコロナウィルスは、好ましくは、ブタ、ヒト、またはトリのコロナウィルスであり、より好ましくは、ブタＴＧＥＶコロナウィルス、ヒト２２９Ｅコロナウィルス、またはヒトＳＡＲＳウィルスである。
【００２５】
本発明のＭタンパク質遺伝子は、より好ましくは、配列番号２に示される配列を有する。
【００２６】
ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子のコード配列（配列番号２）
ATGGCAGATA ACGGCACTAT TACTGTGGAG GAACTGAAAC AACTGCTGGAACAATGGAAC 
CTCGTAATCG GCTTTCTCTT TCTGGCTTGG ATTATGTTGT TACAGTTTGC GTATTCTAAT
CGTAACCGTT TCCTCTACAT TATTAAGCTC GTTTTCCTGT GGTTGTTGTG GCCTGTAACT
CTTGCTTGCT TTGTGCTTGC TGCTGTCTAT CGTATCAACT GGGTTACTGG TGGTATTGCT
ATCGCTATGG CTTGTATTGT AGGCTTGATG TGGCTGTCTT ATTTCGTTGC TTCTTTCCGT
CTGTTTGCTC GTACTCGCTC TATGTGGTCC TTTAATCCTG AGACTAATAT CCTGCTGAAT
GTTCCGCTCC GTGGTACTAT CGTTACTAGA CCGCTGATGG AATCTGAACT GGTTATTGGT
GCCGTCATTA TCCGTGGTCA TTTGCGTATG GCTGGTCACTCTCTGGGTCG TTGCGATATT
AAGGATCTGC CAAAGGAAAT CACTGTAGCC ACTTCTCGTA CTCTGTCTTACTATAAACTC
GGTGCATCGC AACGTGTGGG AACTGATTCG GGCTTCGCTG CGTATAATCG TTATCGTATT
GGCAACTATA AACTGAACAC CGACCACGCA GGCTCTAATGACAACATCGC TCTCCTCGTT
CAGTGA
本発明によれば、コロナウィルスエンベロープのアセンブリーのために、Ｍタンパク質およびＥタンパク質のみが必要とされる（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ  Ａ．Ｍ．ｄｅ  Ｈａａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ  ２０００，ｐ．４９６７−４９７８）。これらのタンパク質をコードする遺伝子が細胞中で発現すると、真正のビリオンに近いサイズおよび形状のウィルス様粒子（ＶＬＰ）が形成および放出される。
【００２７】
本発明によれば、第１の転写単位は、Ｍ遺伝子およびＥ遺伝子の結合部に挿入されている内在性リボソーム認識部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。ＩＲＥＳは、ジシストロニックまたはポリシストロニックｍＲＮＡからなる２つ以上のタンパク質の翻訳を可能にする。ＩＲＥＳ単位は、１つ以上のコード配列の５’末端に融合され、次いで、当初のコード配列の末端でベクターに挿入される。その結果、コード配列は、ＩＲＥＳによって互いから分離される。
【００２８】
本発明によれば、任意のＩＲＥＳ誘導体も、本発明のプラスミド構築物中で使用することができる。
【００２９】
ＩＲＥＳ配列は、リボソーム機構が、単一の転写物内で、次の部位から翻訳を開始することを可能にする。
【００３０】
本発明によれば、本発明の発現ベクターは、Ｍタンパク質遺伝子の上流に位置し、かつ第１の転写単位の発現を駆動する、膜タンパク質遺伝子に作動可能に連結された第１の真核生物プロモーターを含む。
【００３１】
第１の真核生物プロモーターは、好ましくは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、筋特異的デスミン、クレアチンキナーゼ、β−アクチンプロモーターなどのウィルス由来のプロモーター、およびＥＦ１α、ユビキチンプロモーターなどのその他の遍在性の発現プロモーターあり、特に好ましくは、ｐＣＭＶ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、β−アクチンプロモーターである。
【００３２】
本発明によれば、第２の転写単位は、ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子、および制限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含み、ＭＣＳはＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の開始部位に位置する。
【００３３】
ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子は、Ｍタンパク質相互作用ドメインと相互作用し、コロナウィルスのＳｐｉｋｅタンパク質の膜貫通セグメントと並列した、芳香族性残基リッチの領域の上流に位置するＣ末端のヘプタッドリピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）をコードする。
【００３４】
マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）は、数個の制限酵素切断部位を有する。この制限酵素切断部位としては、ＳｍａＩ、ＢｓａＢ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、およびＢｓｐＥ  Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
ＭＣＳは、ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の開始部位に位置し、クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子のクローニングまたはフレーム内での挿入のために使用することができる。
【００３６】
クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子としては、ＨＩＶのｇｐ１６０、インフルエンザウィルスのＨＡ、およびＳＡＲＳウィルスのＳｐｉｋｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
クラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子は、コロナウィルス、ＨＩＶ、およびインフルエンザウィルスを含む、クラスＩウィルス融合機構を本発明のクローニング／発現ベクターに適合させるウィルスから誘導され、ＤＮＡワクチン候補として使用される。
【００３８】
ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子は、好ましくは、配列番号３に示される配列を有する。
【００３９】
ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子のコード配列（配列番号３）
GATATCTCCGGA ATCAATGCGA GCGTAGTGAA CATCCAGAAA
GAGATTGACC GTTTGAATGA AGTTGCTAAA AATCTGAATG AACCTCTGATTGACCTCCAA
GAACTCGGCA AATATGAGCA ATACATTAAA TGGCCTTGGT ATGTCTGGTT GGGTTTCATC
GCAGGTCTCA TCGCTATCGT TATGGTGACT ATTCTGCTGTGTTGTATGAC TTCTTGTTGC
TCTTGTCTGA AAGGTGCGTG TTCTTGTGGT TCTTGTTGTA AGTTTGATGAGGATGATTCT
GAGCCAGTTC TGAAGGGTGT GAAGCTGCAT TATACCTAGT TCGAA
本発明によれば、本発明の発現ベクターは、ウィルス様粒子を産生し、ウィルス様粒子の表面上にクラスＩウィルスの機能的融合遺伝子を発現することができる。つまり、いくつかの制限酵素切断部位（マルチプルクローニングサイト、ＭＣＳ）が存在する。
【００４０】
ＭＣＳとしては、「ＳｐｉｋｅＣＴ」遺伝子の開始部位に位置するＳｍａＩ、ＢｓａＢ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、およびＢｓｐＥ  Ｉが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４１】
これらの部位は、本発明のクローニング／発現ベクターへのクラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子の挿入またはクローニングのために、ＤＮＡワクチン候補として使用することができる。
【００４２】
クラスＩウィルス融合機構を適合させるウィルスには、コロナウィルス、ＨＩＶ、およびインフルエンザウィルスなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
本発明によれば、第２の真核生物プロモーターは、ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子の上流に位置し、第２の転写単位の発現を駆動する。第２の真核生物プロモーターは、好ましくは、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ、ハイブリッドβ−アクチン／ＣＭＶプロモーターエンハンサー、筋特異的デスミン、クレアチンキナーゼ、β−アクチンプロモーターなどのウィルス由来のプロモーター、およびＥＦ１α、ユビキチンプロモーターなどのその他の遍在性または構成的発現プロモーターであり、特に好ましくは、ｐＣＭＶ、ＳＶ４０、β−アクチン、およびＥＦ１αプロモーターである。
【００４４】
本発明によれば、本発明の第１の転写単位および第２の転写単位は、ポリＡシグナルを有する。当業者は、任意の転写がポリＡシグナルを有することを認識することができる。本発明の転写単位は、好ましくは、ＢＧＨポリＡシグナルを含む。
【００４５】
本発明によれば、本発明の発現ベクターは、宿主細胞中でのプラスミドの増殖のための複製起点をさらに含む。複製起点は、宿主細胞の型により決まる。
【００４６】
本発明によれば、本発明の発現ベクターは、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子をさらに含む。
【００４７】
本発明によれば、本発明の発現ベクターは、ウィルス様粒子を自発的に形成することができる。
【００４８】
ウィルス様粒子は、ウィルス感染に対するワクチン候補として使用することができる。ウィルス様粒子は、ウィルスの遺伝物質を欠いているので、感染能力を有さない。
【００４９】
本発明の発現ベクターは、動物に投与することができ、ウィルス様粒子を産生するために宿主細胞でトランスフェクトすることができる。
【００５０】
大部分のウィルスは、それらに影響を及ぼす構造的な制限を有する数少ないタンパク質のみからなる。実際に、ウィルスは、これらの数少ないタンパク質により、準結晶性の、反復性が高い外観になる。このように反復性の高い抗原は、Ｂ細胞受容体を効率的に架橋し、Ｂ細胞における強力な活性化シグナルを生成する。対照的に、自己抗原、特に、Ｂ細胞に接近可能でないものは、通常、高度に組織化されていない。従って、Ｂ細胞は、抗原組織を感染性の非自己のマーカーとして使用する。ウィルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくワクチンは、この基本的な現象を利用する。なぜなら、ＶＬＰは、ウィルスと同様に、反復性でかつ組織化されているからである。
【００５１】
その結果、ＶＬＰは、ウィルスと同様に、アジュバントの非存在下で、強力なＢ細胞応答を誘発することができる。
【００５２】
上記の原理に基づいて、細胞中で本発明の発現ベクターの発現を通して産生されたウィルス様粒子は、ウィルス性疾患に対するワクチン候補として使用することができる。
実施例
ＰＣＲによって合成されるＥ遺伝子
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ＳＡＲＳウィルスのＥ遺伝子を合成した。ＳＡＲＳ  Ｅ遺伝子のＰＣＲ鋳型（０．１ｐｍｏｌｅ）は、以下に列挙するプライマーの混合物である。
【００５３】
ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を使用して、標準的なＰＣＲ法（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）にて実施した。ＰＣＲプライマーを以下に示す。
5'-ACC ATG GCA TAC TCT TTT GTG TCT GAG GAA ACT G-3'* (SEQ ID NO: 4)
E1L
5'-ACA GCA GTA CAG AGT TCA CGA TCA GAG TGC CAG TTT CCT CAG ACA CAA AAG-3' (SEQ ID NO: 5)
E2L
5'-TGA CCA GCA GGA ATA CCA CAA AAG CGA GAA ACA GCA GTA CAG AGT TCA CGA-3' (SEQ ID NO: 6)
E3L
5'-GCA CAC AGA CGA AGA GCA GTG AGG ATA GCG AGA GTG ACC AGC AGG AAT ACC ACA-3' (SEQ ID NO: 7)
E4L
5'-ACC AGA GAC ACG TTC ACG ATA TTA CAA CAG TAG GCA CAC AGA CGA AGA GCA G-3' (SEQ ID NO: 8)
E5L
5'-GAT TTT TCA CAC GAG AAT ACA CAT ACA CAG TAG GCT TAA CCA GAG ACA CGT TCA CGA T-3'* (SEQ ID NO: 9)
E6L
5'-TCT AGA CCA GCA GAT CGG GAA CTC CTT CAG AAG AAT TGA GAT TTT TCA CAC GAG AAT ACA CA-3' (SEQ ID NO: 10)
E7L
5'-TCT AGA CCA GCA GAT CGG GA-3' (SEQ ID NO: 11)
まず、ＤＮＡ鋳型を、９５℃で３分間変性させた。ＰＣＲ条件を以下に列挙する。
第１のＰＣＲ反応、３段階で１０サイクル
１．アニーリング：５８℃、２０秒間
２．伸長：７２℃、４０秒間
３．変性：９５℃、１分間
第２のＰＣＲ反応、３段階で２０サイクル
１．変性：９５℃、１分間
２．アニーリング：６２℃、２０秒間
３．伸長：７２℃、４０秒間
得られる二本鎖で全長のＥ遺伝子産物を、１．２％アガロースゲル上で分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【００５４】
次いで、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．）とライゲーションして、ｐＧＥＭ（Ｔ）／ＥＡ＋クローンを得た。Ｅ遺伝子の配列は、配列番号１に示す通りである。
ＰＣＲ上でのスプライシングによって合成されるＭ遺伝子
ＳＡＲＳウィルスのＭ遺伝子を、上述した、ＫＯＤ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を使用することによるＰＣＲ法にて合成した。ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子のＰＣＲ鋳型（０．１ｐｍｏｌｅ）は以下に列挙するプライマーの混合物である。
ＰＣＲプライマーを以下に列挙する。
M1-1U
5'-TGA TCA TGG CAG ATA ACG GCA C-3' (SEQ ID NO: 12)
M1U
5'-TGA TCA TGG CAG ATA ACG GCA CTA TTA CTG TGG
AGG A-3' (SEQ ID NO: 13)
M1L
5'-GTT CCA TTG TTC CAG CAG TTG TTT CAG TTC CTC
CAC AGT AAT AGT GCC G-3' (SEQ ID NO: 14)
M2L
5'-AAG CCA GAA AGA GAA AGC CGA TTA CGA GGT TCC       
ATT GTT CCA GCA GTT G-3' (SEQ ID NO: 15)
M3L
5'-AGA ATA CGC AAA CTG TAA CAA CAT AAT CCA AGC 
CAG AAA GAG AAA GCC GA-3' (SEQ ID NO: 16)
M4L 
5'-CGA GCT TAA TAA TGT AGA GGA AAC GGT TAC GAT 
TAG AAT ACG CAA ACT GTA ACA ACA-3' (SEQ ID NO: 17)
M5L
5'-CAA GAG TTA CAG GCC ACA ACA ACC ACA GGA AAA
CGA GCT TAA TAA TGT AGA GGA AA-3' (SEQ ID NO: 18)
M6L 
5'-TTG ATA CGA TAG ACA GCA GCA AGC ACA AAG CAA 
GCA AGA GTT ACA GGC CAC AAC A-3' (SEQ ID NO: 19)
M7L 
5'-CAA GCC ATA GCG ATA GCA ATA CCA CCA GTA ACC
CAG TTG ATA CGA TAG ACA GCA GCA A-3' (SEQ ID NO: 20)
M8L 
5'-AAC GAA ATA AGA CAG CCA CAT CAA GCC TAC AAT
ACA AGC CAT AGC GAT AGC AAT AC-3' (SEQ ID NO: 21)
M9L
5'-ACA TAG AGC GAG TAC GAG CAA ACA GAC GGA AAG
AAG CAA CGA AAT AAG ACA GCC ACA TC-3' (SEQ ID NO: 22)
M10U
5'-TCC TGC TGA ATG TTC CGC TC-3' (SEQ ID NO: 23)
M10L
5'-GAG CGG AAC ATT CAG CAG GAT ATT AGT CTC AGG
ATT AAA GGA CCA CAT AGA GCG AGT ACG AGC AA-3'(SEQ ID NO: 24)
M11L
5'-CAT CAG CGG TCT AGT AAC GAT AGT ACC ACG GAG
CGG AAC ATT CAG CAG GA-3' (SEQ ID NO: 25)
M12L
5'-ACC ACG GAT AAT GAC GGC ACC AAT AAC CAG TTC
AGA TTC CAT CAG CGG TCT AGT AAC GAT-3' (SEQ ID NO: 26)
M13L
5'-ATA CGC AAA TGA CCA CGG ATA ATG ACG GCA C-3' (SEQ ID NO: 27)
M14L
5'-AAC GAC CCA GAG AGT GAC CAG CCA TAC GCA AAT
GAC CAC GGA TAA-3' (SEQ ID NO: 28)
M15L
5'-TAC AGT GAT TTC CTT TGG CAG ATC CTT AAT ATC
GCA ACG ACC CAG AGA GTG-3' (SEQ ID NO: 29)
M16L
5'-CCG AGT TTA TAG TAA GAC AGA GTA CGA GAA GTG
GCT ACA GTG ATT TCC TTT GGC AGA-3' (SEQ ID NO: 30)
M17L
5'-CGA AGC CCG AAT CAG TTC CCA CAC GTT GCG ATG
CAC CGA GTT TAT AGT AAG ACA GAG T-3' (SEQ ID NO: 31)
M18L 
5'-CAG TTT ATA GTT GCC AAT ACG ATA ACG ATT ATA
CGC AGC GAA GCC CGA ATC AGT TCC C-3' (SEQ ID NO: 32)
M19L
5'-GAG AGC GAT GTT GTC ATT AGA GCC TGC GTG GTC
GGT GTT CAG TTT ATA GTT GCC AAT ACG AT-3' (SEQ ID NO: 33)
M20L
5'-TCA CTG AAC GAG GAG AGC GAT GTT GTC ATT AGA 
G-3' (SEQ ID NO: 34)
ＰＣＲ条件は、基本的に、上述した通りである。得られる二本鎖で全長のＭ遺伝子産物を、１．０％アガロースゲル上で分析し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットまたはゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【００５５】
次いで、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．）とライゲーションして、ｐＧＥＭ（Ｔ）／Ｍクローンを得た。Ｍ遺伝子の配列は配列番号２に示す通りである。
【００５６】
ＳＡＲＳウィルスのＳｐｉｋｅタンパク質遺伝子のヘプタッドリピート領域２および膜貫通ドメインをコードする「ＳｐｉｋｅＣＴ」遺伝子は、ＰＣＲによって合成される。
【００５７】
ＰＣＲの方法および条件、ＰＣＲ産物の精製およびクローニングは、上述の通りである。ＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子のＤＮＡ鋳型（０．１ｐｍｏｌｅ）は、以下に列挙するプライマーの混合物である。
ＰＣＲプライマーを以下に列挙する。
SpikeCTup-EcoRV
5’-GAT ATC TCC GGA ATC AAT GCG AGC GT-3' (SEQ ID NO: 35)
DI-1U/BspE I
5'-5'-TCC GGA ATC AAT GCG AGC GTA GTG AAC ATC CAG 
AA-3' (SEQ ID NO: 36)
DI-1L
5'-GCA ACT TCA TTC AAA CGG TCA ATC TCT TTC TGG ATG TTC 
ACT ACG CTC-3' (SEQ ID NO: 37)
DI-2L
5'-ATC AGA GAT TCA TTC AGA TTT TTA GCA ACT TCA TTC AAA
CGG TCA-3' (SEQ ID NO: 38)
DI-3L
5'-TCA TAT TTG CCG AGT TCT TGG AGG TCA ATC AGA GAT TCA 
TTC AGA TTT TTA-3' (SEQ ID NO: 39)
DI-4L
5'-CAA GGC CAT TTA ATG TAT TGC TCA TAT TTG CCG AGT TCT 
TGG A-3' (SEQ ID NO: 40)
DI-5L
5'-ACC TGC GAT GAA ACC CAA CCA GAC ATA CCA AGG CCA TTT AAT GTA TTG CT-3' (SEQ ID NO: 41)
DI-6L
5'-CAG AAT AGT CAC CAT AAC GAT AGC GAT GAG ACC TGC GAT GAA ACC CAA CC-3' (SEQ ID NO: 42)
DI-7L
5'-AGA GCA ACA AGA AGT CAT ACA ACA CAG CAG AAT AGT CAC CAT AAC GAT AG-3' (SEQ ID NO: 43)
DI-8L
5'-ACC ACA AGA ACA CGC ACC TTT CAG ACA AGA GCA ACA AGA AGT CAT ACA AC-3' (SEQ ID NO: 44)
DI-9L
5'-GAA TCA TCC TCA TCA AAC TTA CAA CAA GAA CCA CAA GAA CAC GCA CCT TT-3' (SEQ ID NO: 45)
DI-10L
5'-GCT TCA CAC CCT TCA GAA CTG GCT CAG AAT CAT CCT CAT 
CAA ACT TAC A-3' (SEQ ID NO: 46)
DI-11L
5'-CCT AGG TAT AAT   GCA GCT TCA CAC CCT TCA GAA CT-3' (SEQ ID NO: 47)
SpikeCTdn-BstB I
5'- TTC GAACT AGG TAT AAT GCA GCT TCA C -3' (SEQ ID NO: 48)
ＰＣＲ条件は上述の通りである。得られる二本鎖のＳＣＴ３２０遺伝子産物を、Ｑｉａｇｅｎ／ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．）とともにクローニングして、ｐＧＥＭ（Ｔ）／ＳｐｉｋｅＣＴ（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢＩ）を得た。
【００５８】
ｐＧＥＭ（Ｔ）／ＳｐｉｋｅＣＴ（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢＩ）プラスミドは、ＳＡＲＳコロナウィルスのＳｐｉｋｅタンパク質の膜貫通セグメントと並列した、芳香族性残基リッチの領域の上流に位置するＣ末端のヘプタッドリピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）をコードする遺伝子を含む。「ＳＣＴ３２０」遺伝子のコード配列は、配列番号３に示す通りである。
本発明の発現ベクターの構築
ＤＮＡの操作は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓに従う。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ．ｃｏｍから購入し、製造業者の推奨に従って実施する。
Ｉ．ｐＣＭＶプロモーターによって駆動されるＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子プラスミドの構築
ｐＧＥＭ（Ｔ）／Ｍクローンは、Ｔ７およびＳＰ６プロモータープライマーを用いたＰＣＲのＤＮＡ鋳型として使用し、ＰＣＲ条件は、アニーリング条件を５０℃、２０秒間に設定した以外は、上述した条件と同様である。
【００５９】
得られるＭ遺伝子ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製し、Ｂｃｌ  ＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子を含むＤＮＡインサートを得た。
【００６０】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｏ．）はＢｇｌＩＩおよびＮｏｔ  Ｉを用いて消化し、得られるＢｇｌ  ＩＩ、Ｎｏｔ  Ｉ消化ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ消化ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子ＤＮＡインサートとのライゲーションのためのＤＮＡベクターとして使用し、ｐＮ１／Ｍ  ＤＮＡプラスミドを得た。このｐＮ１／Ｍ  ＤＮＡプラスミドを、ＮｈｅＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子を含むＤＮＡインサートを得た。
【００６１】
ｐＡＣＴプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．）を、Ｎｈｅ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化した。得られるＮｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ消化ｐＡＣＴ  ＤＮＡベクターを、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ消化ＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子ＤＮＡインサートとライゲーションし、ｐＡＣＴ／Ｍ  ＤＮＡプラスミドを得た。このｐＡＣＴ／Ｍ  ＤＮＡプラスミドは、  Ｂｇｌ  ＩＩおよびＡｓｐ  ７１８で消化し、ＣＭＶプロモーターおよびＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子を含むＤＮＡインサートを得た。
【００６２】
ｐＣＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を、ＢｇｌＩＩおよびＡｓｐ７１８で消化した。得られるＢｇｌＩＩ、Ａｓｐ７１８消化ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＤＮＡベクターを、ＣＭＶプロモーターおよびＳＡＲＳ  Ｍ遺伝子インサートを含むＢｇｌＩＩ、Ａｓｐ７１８消化ＤＮＡとライゲーションし、ｐＣＤＮＡ  ３．１＋Ｍ  ＤＮＡプラスミドを得た。
ＩＩ．ＩＲＥＳ−ＳＡＲＳ  Ｅ遺伝子プラスミドの構築
ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｏ．）を、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉで消化し、「ＩＲＥＳ」ＤＮＡインサートを得た。ＧＬ３ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．）を、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉで消化した。Ｘｈｏ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ消化ｐＧＬ３ベーシックＤＮＡベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ  Ｃｏ．）を使用して、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ消化ＩＲＥＳ  ＤＮＡインサートとライゲーションした。ライゲーションミックスを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＥ５αコンピテント細胞に形質転換し、ｐＧＬ３Ｂ／ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼＤＮＡプラスミドを得た。
【００６３】
第２のアラニン挿入変異を有するＳＡＲＳ  Ｅ遺伝子を含むＴ／ＥＡ＋クローンを、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化して、ＳＡＲＳ  Ｅ遺伝子ＤＮＡインサートを得た。ｐＧＬ３Ｂ／ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼＤＮＡプラスミドを、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化した。Ｎｃｏ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ消化ｐＧＬ３Ｂ／ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼＤＮＡベクターを、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ消化ＳＡＲＳ  ＥＡ＋遺伝子ＤＮＡインサートとライゲーションし、ｐＧＬ３Ｂ／ＩＲＥＳ−ＥＡ＋ＤＮＡプラスミドを得た。
ＩＩＩ．ｐＣＭＶ駆動Ｍ＋Ｅ遺伝子発現プラスミド（コロナウィルス様粒子（ＣｏｒｏｎａＶｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＣｏＶＬＰ）発現ベクター））の構築
ｐＧＬ３Ｂ／ＩＲＥＳ−ＥＡ＋ＤＮＡプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、ＩＲＥＳおよびＳＡＲＳ  ＥＡ＋遺伝子を含むＤＮＡインサートを得た。ｐＣＤＮＡ３．１＋Ｍ  ＤＮＡプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した。
【００６４】
得られるＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ消化ｐＣＤＮＡ３．１＋Ｍ  ＤＮＡベクターを、ＩＲＥＳおよびＳＡＲＳ  ＥＡ＋融合遺伝子を含むＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ消化ＤＮＡインサートとライゲーションして、ｐＣＤＮＡ３．１＋Ｍ／ＩＲＥＳ−ＥＡ＋プラスミドを得た。
ＩＶ．本発明のＤＮＡベクターの構築
ＳＡＲＳコロナウィルスのＳｐｉｋｅタンパク質の膜貫通セグメントと並列した、芳香族性残基リッチな領域の上流に位置するＣ末端のヘプタッドリピート（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）をコードする遺伝子を含むｐＧＥＭ（Ｔ）／ＳｐｉｋｅＣＴ（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｔＢＩ）プラスミドを、Ｓｐｅ  Ｉで消化し、クレノウ酵素およびｄＮＴＰを作用させた。１．２％アガロースゲル上で分離した後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ．Ｃｏｍ．）を用いて精製し、さらにＢｓｔＢ  Ｉで消化した。
【００６５】
得られる「ＳｐｉｋｅＣＴ」遺伝子フラグメントをＤＮＡインサートとして使用し、ＢｓａＢ  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉ消化してゲル精製したｐＣＤＮＡ３．１＋Ｍ／ＩＲＥＳ−ＥＡ＋  ＤＮＡベクタープラスミドとライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞への形質転換後、本発明のＤＮＡベクター、いわゆるＣｏＶＬＰ−クローニングベクターを得た。
【００６６】
「ＳｐｉｋｅＣＴ」遺伝子の開始部位に位置する、ＳｍａＩ、ＢｓａＢ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、ＢｓｐＥ  Ｉを含む、いくつかの制限酵素切断部位（マルチプルクローニングサイト、ＭＣＳ）が存在し、これらの部位は、クローニングのため、または本発明のベクター中でＳｐｉｋｅＣＴ遺伝子とフレーム内で融合されるクラスＩウィルス融合タンパク質遺伝子のために使用することができる。次いで、得られるＤＮＡプラスミドは、ＤＮＡワクチン候補として使用することができる。
【００６７】
ＣｏＶＬＰ−クローニングベクターのマップは図１に示す。ＣｏＶＬＰ−クローニングベクターの配列は、配列番号４９に示される通りである。
The DNA sequence of CoVLP cloning vector (pCDNA3.1+M+IRES-E+SpikeCT) (SEQ ID NO:49)
GACGGATCGGGAGATCTTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTG
GCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATT
GATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAA
CTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT
AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGT
ATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA
CGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAA
TGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTAC
GGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGT
TAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCA
GAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTG
TCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGG
TGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCGCTACCGGACTCA
GATCATGGCAGATAACGGCACTATTACTGTGGAGGAACTGAAACAACTGCTGGAACAATGGAACCTCGTAATCGGCTTTC
TCTTTCTGGCTTGGATTATGTTGTTACAGTTTGCGTATTCTAATCGTAACCGTTTCCTCTACATTATTAAGCTCGTTTTC
CTGTGGTTGTTGTGGCCTGTAACTCTTGCTTGCTTTGTGCTTGCTGCTGTCTATCGTATCAACTGGGTTACTGGTGGTAT
TGCTATCGCTATGGCTTGTATTGTAGGCTTGATGTGGCTGTCTTATTTCGTTGCTTCTTTCCGTCTGTTTGCTCGTACTC
GCTCTATGTGGTCCTTTAATCCTGAGACTAATATCCTGCTGAATGTTCCGCTCCGTGGTACTATCGTTACTAGACCGCTG
ATGGAATCTGAACTGGTTATTGGTGCCGTCATTATCCGTGGTCATTTGCGTATGGCTGGTCACTCTCTGGGTCGTTGCGA
TATTAAGGATCTGCCAAAGGAAATCACTGTAGCCACTTCTCGTACTCTGTCTTACTATAAACTCGGTGCATCGCAACGTG
TGGGAACTGATTCGGGCTTCGCTGCGTATAATCGTTATCGTATTGGCAACTATAAACTGAACACCGACCACGCAGGCTCT
AATGACAACATCGCTCTCCTCGTTCAGTGAAATCACTAGTGCGGCCGCAGGTACCGAGCTCGGATCCGCCCCTCTCCCTC
CCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATAT
TGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTC
GCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGT
AGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACAC
CTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTA
TTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTAC
ATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGAT
AATATGGCCACAACCATGGCATACTCTTTTGTGTCTGAGGAAACTGGCACTCTGATCGTGAACTCTGTACTGCTGTTTCT
CGCTTTTGTGGTATTCCTGCTGGTCACTCTCGCTATCCTCACTGCTCTTCGTCTGTGTGCCTACTGTTGTAATATCGTGA
ACGTGTCTCTGGTTAAGCCTACTGTGTATGTGTATTCTCGTGTGAAAAATCTCAATTCTTCTGAAGGAGTTCCCGATCTG
CTGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCT
CCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGT
CTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCA
TGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCT
GTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCT
CCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGG
GTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCT
GATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTC
AACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA
ACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAG
AAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGC
AAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCC
GCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCA
GAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTG
ATCAAGAGACAGGATGACTAGTGATTGATATCTCCGGAATCAATGCGAGCGTAGTGAACATCCAGAAAGAGATTGACCGT
TTGAATGAAGTTGCTAAAAATCTGAATGAACCTCTGATTGACCTCCAAGAACTCGGCAAATATGAGCAATACATTAAATG
GCCTTGGTATGTCTGGTTGGGTTTCATCGCAGGTCTCATCGCTATCGTTATGGTGACTATTCTGCTGTGTTGTATGACTT
CTTGTTGCTCTTGTCTGAAAGGTGCGTGTTCTTGTGGTTCTTGTTGTAAGTTTGATGAGGATGATTCTGAGCCAGTTCTG
AAGGGTGTGAAGCTGCATTATACCTAGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTC
CACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATC
TCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAAT
TTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTAT
ACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC
CACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTG
CGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG
TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAG
CTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の発現ベクターの１つの好ましい実施形態のプラスミドマップを示す。
【図１】
2008521384.tif 000003
【配列表】
2008521384000001.app
【国際調査報告】
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