(57)【要約】  本開示は、ヒト免疫不全ウイルスに対する免疫応答、例えば予防的免疫応答を誘導するための組成物を提供する。組成物は、複数の分岐群又は系統のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを含む。被験体に組成物を投与することにより免疫応答を誘導する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫正常者においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導可能な組成物であって、
各々が、ＣＭＶ／Ｒ転写制御配列に機能できるように連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、複数の異なる核酸コンストラクトであって、複数のＨＩＶ分岐群又は系統の抗原ポリペプチドをコードする前記核酸コンストラクトを含む組成物。
【請求項２】
免疫正常者においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導可能な組成物であって、
各々が、単一のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、複数の異なる核酸コンストラクトであって、複数のＨＩＶ分岐群又は系統の抗原ポリペプチドをコードする前記核酸コンストラクトを含む組成物。
【請求項３】
複数の核酸コンストラクトが、
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸コンストラクト、
ＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸コンストラクト、
ＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の核酸コンストラクト、及び、
ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つ核酸コンストラクトを更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
各々が異なるＨＩＶ分岐群又は系統のＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む複数の核酸コンストラクトを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
第１の核酸コンストラクトが分岐群Ｂ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
第２の核酸コンストラクトが分岐群Ｂ  Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
第３の核酸コンストラクトが分岐群Ｂ  Ｎｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
第１の核酸コンストラクトが配列番号２０と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし、
第２の核酸コンストラクトが配列番号２１と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし、且つ／又は
第３の核酸コンストラクトが配列番号２２と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
複数の更なる核酸コンストラクトを含み、
第１の更なる核酸コンストラクトが分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
第２の更なる核酸コンストラクトが分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、
第３の更なる核酸コンストラクトが分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
第１の更なる核酸コンストラクトが配列番号２３と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし、
第２の更なる核酸コンストラクトが配列番号２４と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし、及び／又は
第３の更なる核酸コンストラクトが配列番号２５と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
複数の異なるＨＩＶ分岐群又は系統の少なくともサブシーケンスを含むキメラＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの更なる核酸コンストラクトを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
複数の異なる核酸コンストラクトが、
Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸コンストラクト、
Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸コンストラクト、
Ｎｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の核酸コンストラクト、
分岐群ＡのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第４の核酸コンストラクト、
分岐群ＢのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第５の核酸コンストラクト、及び、
分岐群ＣのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第６の核酸コンストラクトを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１１】
第１の核酸コンストラクトが配列番号１と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、
第２の核酸コンストラクトが配列番号２と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、
第３の核酸コンストラクトが配列番号３と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、
第４の核酸コンストラクトが配列番号４と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、
第５の核酸コンストラクトが配列番号５と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、及び／又は
第６の核酸コンストラクトが配列番号６と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
第１の核酸コンストラクトが配列番号１のポリヌクレオチド配列を含み、
第２の核酸コンストラクトが配列番号２のポリヌクレオチド配列を含み、
第３の核酸コンストラクトが配列番号３のポリヌクレオチド配列を含み、
第４の核酸コンストラクトが配列番号４のポリヌクレオチド配列を含み、
第５の核酸コンストラクトが配列番号５のポリヌクレオチド配列を含み、
第６の核酸コンストラクトが配列番号６のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
実質的に等しい重量比の前記６つの各核酸コンストラクトを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
単独又は少なくとも１つの更なる免疫原性組成物と組合せて投与した場合に、免疫が正常なヒト被験体においてＨＩＶに対する防御的免疫応答を誘導可能な、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１５】
複数の異なるコンストラクトが複数のプラスミドを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１７】
アジュバントを更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１８】
ＣＭＶ／Ｒ転写制御配列が配列番号２６のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
免疫正常者においてＨＩＶに対する免疫応答を誘導可能な組成物であって、
各々が、転写制御配列と機能できるように連結された単一のＨＩＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む複数の異なる核酸コンストラクトを含む組成物。
【請求項２０】
ＨＩＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、ヒト被験体に請求項１、２又は１９に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項２１】
免疫応答がＨＩＶの複数の分岐群又は系統に対する防御的免疫応答である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数の核酸コンストラクトを筋肉注射で投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
無針デリバリー装置を用いて複数の核酸コンストラクトを投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
複数のウイルスベクターを投与することを更に含み、該複数のウイルスベクターがＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を少なくとも１つ含み、該少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記組成物の核酸によりコードされるポリペプチドと同一の抗原ポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスベクターが組換えアデノウイルスベクターを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
組換えアデノウイルスベクターが複製欠損性アデノウイルスベクターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数のアデノウイルスベクターが、
ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチド及びＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、
分岐群ＡのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の組換えアデノウイルスベクター、
分岐群ＢのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の組換えアデノウイルスベクター、及び、
分岐群ＣのＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第４の組換えアデノウイルスベクターを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１の組換えアデノウイルスベクターが配列番号１６を含み、
第２の組換えアデノウイルスベクターが配列番号１７を含み、
第３の組換えアデノウイルスベクターが配列番号１８を含み、そして、
第４の組換えアデノウイルスベクターが配列番号１９を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＭＶ／Ｒ転写調節配列と機能できるように連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離又は組換え核酸。
【請求項３０】
プラスミドを含む、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
ウイルスベクターを含む、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド配列がＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチド、ＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチド、ＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチド又はＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードする、請求項２９、３０又は３１に記載の核酸。
【請求項３３】
ポリヌクレオチド配列が、複数のＨＩＶ分岐群又は系統の少なくともサブシーケンスを含むキメラＨＩＶポリペプチドをコードする、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
キメラＨＩＶポリペプチドがＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドである、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
ポリヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から成る群から選択される、請求項２９、３０又は３１に記載の核酸。
【請求項３６】
請求項３５に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野］
本出願は、ワクチンの技術分野に関する。より詳細には、本出願は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の予防のためのマルチプラスミドワクチンに関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００４年７月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／５８８，３７８号に対する優先権及びその利益を、並びに、共に係属中の２００４年９月１５日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３０２８４及び２００５年４月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００５／１２２９１に対する優先権を主張する。これらのそれぞれの出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０００３】
［政府支援の承認］
本開示の態様は、政府支援によりなされた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
４０００万人を超える人々が、世界中でＨＩＶ−１に感染しており、毎日１４，０００人が新たに感染していると見積もられている。ＡＩＤＳの最初の症例が１９８１年に認定されて以来、２５００万人を超える人々がＨＩＶ／ＡＩＤＳで死亡している（CDC, MMWR Morb. Mortal Wkly. Rep., 52: 1145-1148, 2003；UNAIDS, 2003 世界規模のＡＩＤＳ拡大の要旨に関する報告, 2004）。世界的に重要性を有するＨＩＶ−１ワクチンの開発は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ世界的流行病を制御するために重要である。
【０００５】
転写における誤差の割合が高いこと及び組換えの頻度が高いことが組合わさることにより、ＨＩＶ−１系統間の膨大な遺伝的多様性を生じ、ウイルス抗原の選択を困難にする。ＨＩＶ遺伝子変異のその他の潜在的影響は、各個体内における突然変異の割合が高いことであり、これはウイルスがエピトープ特異的免疫応答から逃れる機会を作り、Ｔ細胞ベースのワクチンアプローチを非常に困難なものにする（Altfield et al., J. Virol., 77: 12764-12772, 2002；Bhardwaj et al., Nat. Med., 9: 13-14, 2003；Brander et al., Curr. Opin. Immunol., 11: 451-459, 1999；Letvin et al., Nat. Med., 9: 861-866, 2003）。ＨＩＶ−１に対する有効な免疫を誘導するための、ワクチンを利用した種々の戦略が探究されてきた。それらの中で、ＨＩＶタンパク質抗原の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡによる免疫化は、有望なワクチンアプローチである（Mascola et al., Curr. Opin. Immunol., 13: 489-494, 2001；Nabel, G.J., Nature, 410: 1002-1007, 2001）。遺伝子ベースの免疫化は、宿主細胞におけるウイルス抗原の合成及び発現、並びに細胞質中における生理学的翻訳後プロセシング及びフォールディングを促進する。従ってＤＮＡによる免疫化は、動物モデルにおいて種々の免疫原を用いたＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔリンパ球の両方の応答を誘導する（Graham, B.S., Annu. Rev. Med., 53: 207-221, 2002；Rollman et al., Gene Ther., 11: 1146-1154, 2004；Barouch et al., Science, 290: 486-492, 2000；Subbramanian et al., J. Virol., 77: 10113-10118, 2003；Mascola et al., J. Virol., 79: 771-779, 2005）。
【０００６】
ＤＮＡプラスミドワクチンベクターによるウイルス抗原のデリバリーは、他のベクターデリバリーシステムを上回る潜在的利点、特に抗ベクター免疫の欠如を有する。しかしながら、マウス及びヒト以外の霊長類におけるワクチン誘導性防御に関する例が多数あるにもかかわらず、ＤＮＡ免疫化は、ヒトにおいて限られた免疫原性しか示さなかった（Roll
man et al., Gene Ther., 11: 1146-1154, 2004；Donnelly et al., Nat. Med., 1: 583-587, 1995）。抗原処置されていないヒトにおいて免疫原性であることが実証された最初のＤＮＡワクチンは、Biojector（登録商標）によりデリバリーされる熱帯熱マラリア原虫由来のスポロゾイト周囲抗原を発現するコンストラクトであった。この研究では、ＣＤ８+ＣＴＬ応答は、エフェクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで展開した後にのみ検出された（Wang et al., Science, 282: 476-480, 1998）。別の報告には、異なる無針注射装置であるPowderject（商標）によりデリバリーされるＢ型肝炎表面抗原を発現するＤＮＡプラスミド、誘導抗体、並びに抗原処置されていないヒトにおけるワクチン特異的Ｔ細胞応答を記載されている（Roy et al., Vaccine, 19: 764-778, 2000）。ＨＩＶ感染及びＨＩＶ非感染被験体において試験されたＨＩＶ−１Ｅｎｖ及びＲｅｖタンパク質を発現するＤＮＡプラスミドワクチン（MacGregor et al., J. Infect. Dis., 178: 92-100, 1998）は有害事象を伴わず、散在的なリンパ球増殖及び抗体応答のみが観察された（MacGregor et al., J. Infect. Dis., 181: 406, 2000；MacGregor et al., AIDS, 16: 2137-2143, 2002）。
【発明の開示】
【０００７】
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス１の複数の分岐群及び系統の重要な免疫原性エピトープに相当するＨＩＶ抗原の強い発現により、ＨＩＶに対して広範囲の免疫を誘導するワクチン組成物を記載する。本発明の上記の及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら進行する以下の詳細な説明から、より明らかになる。
【０００８】
［発明の概要］
本開示は、ＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクトに関する。これらの核酸コンストラクトは、複数の変異型ＨＩＶに対する免疫応答を誘導することが可能であり、治療的（例えば予防的）投与に適している。免疫原性組成物との関連において、複数の核酸が組合され、これらの各々はＨＩＶ抗原ポリペプチド、例えば異なるＨＩＶ抗原ポリペプチド（例えばＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ）をコードする。単一の免疫原性組成物としては、複数の分岐群又は系統のＨＩＶの抗原ポリペプチド、例えば複数の分岐群又は系統のＧａｇ、Ｐｏｌ又はＮｅｆをコードする核酸コンストラクト、或いはＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆに関する複数の分岐群又は系統が挙げられる。このように、被験体に投与されると、組成物は、ヒト集団中で流行している複数の分岐群又は系統に対する免疫応答を誘導する。
【０００９】
組成物の使用方法も記載される。このような方法は、例えば複数の分岐群又は系統のＨＩＶに対する免疫応答を誘導するために、開示された核酸コンストラクトを含む組成物を被験体に投与することを含む。組成物は、単独で、又は更なる免疫原性組成物と組合せて投与することができる。
【００１０】
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら進行する以下の詳細な説明から、より明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
［詳細な説明］
本発明の開示は、ＨＩＶ−１の予防的ワクチンとして用いるのに適した核酸コンストラクトに関する。本明細書中に開示される組成物の具体例は、これまでのＨＩＶワクチン候補と比べて２つの際立った利点を提供する。このような組成物は発現及び免疫原性の増大を示し、複数のＨＩＶの系統に対する免疫応答を誘導することができる。ワクチンは異なる核酸コンストラクトの混合物を含み、ヒトの感染において単離される複数のＨＩＶ−１サブタイプに対する広範な免疫応答を誘導するためにＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及びＥｎｖ
ＨＩＶ−１タンパク質を産生するよう設計される。最も典型的には、核酸はプラスミドベクター中に組み入れられる。マルチプラスミドワクチンの臨床的実施形態の例は、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰと呼ばれる。
【００１２】
本明細書中に開示される例示的なワクチンの開発の原理は、融合タンパク質免疫原を産生する１つのコンストラクトを有するよりむしろ、これまでに開発されたＨＩＶワクチンの場合と同様に、別個の核酸コンストラクト、例えばプラスミドにｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ遺伝子を分離することである。例示的な実施形態では、核酸コンストラクトは、ｉｎ
ｖｉｖｏにおける免疫原性タンパク質産物の産生を増大するよう改変された。改変としては、１）これらのプラスミドに組み込まれるプロモーター中の改変、及び／又は２）ｇａｇ遺伝子への６８番アミノ酸の付加（例えばＶＲＣ４４０１（Ｇａｇタンパク質のみ）プラスミドにおける）が挙げられる。従来のＨＩＶワクチンプラスミドが、抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の転写を調節するためにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーターを最も一般的に利用したのに対し、本明細書中に開示される核酸コンストラクトにおいては、免疫原性ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、機能できる状態でＣＭＶ／Ｒと呼ばれるプロモーターと連結される。ＣＭＶ／Ｒプロモーターは、公開済みの米国特許出願第２００４０２５９８２５号に記載されており、この開示内容は参照により全体が本明細書中に援用される。
【００１３】
複数の分岐群及び／又は系統に対応する抗原が含まれる限り、本明細書中に開示される核酸コンストラクトは、本質的に任意のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組み込むことができる。組成物は、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰワクチン組成物と総称される核酸コンストラクトの特定の例に関して詳細に記載される。この例示的な実施形態は、図１に示されている。
【００１４】
ワクチン組成物ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰとしては、６つの閉環プラスミドＤＮＡ高分子、ＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０９、ＶＲＣ４４０４、ＶＲＣ５７３６、ＶＲＣ５７３７及びＶＲＣ５７３８が挙げられ、これらは例えば等濃度（ｍｇ／ｍｌ）で連結される。ＶＲＣ４４０１は、ウイルスＲＮＡをキャプシドで包み、高度に保存されたドメインを有する分岐群Ｂ  ＨＩＶ−１Ｇａｇ構造コアタンパク質をコードする。ＶＲＣ４４０９は、同様に高度に保存された分岐群Ｂポリメラーゼ（Ｐｏｌ）をコードし、ＶＲＣ４４０４は、自然感染において活発なＴ細胞応答が備えられている付属タンパク質である分岐群Ｂ  Ｎｅｆをコードする。ＨＩＶ−１  Ｐｏｌを発現するＤＮＡプラスミドは、プロテアーゼ、逆転写酵素及びインテグラーゼ活性に影響を及ぼす領域に変化を組込むことにより潜在的毒性を低減するよう改変された。ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子のミリストイル化部位中の２つのアミノ酸は、Ｎｅｆタンパク質によるＭＨＣクラスＩ及びＣＤ４＋の発現減少を阻害するために除かれた。Ｇａｇのアミノ酸配列に対しては改変はなされなかった。他の３つのプラスミドは、ＨＩＶ−１の３つの系統：ＶＲＣ５７３６（分岐群Ａ）、ＶＲＣ５７３７（分岐群Ｂ）及びＶＲＣ５７３８（分岐群Ｃ）から、改変型、切断型エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１４５）の合成バージョンを発現する。ＥｎｖをコードするＤＮＡプラスミドを作製するために用いられる配列は、３つのＨＩＶ−１  ＣＣＲ５−親和性系統のウイルスに由来する。これらの遺伝子は、免疫原性を改善するよう改変されており、これはマウス及びサルで実証されている。ワクチンは、広範囲のＨＩＶ−１系統に対する免疫応答を誘導できるように設計される。
【００１５】
特定の例では、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及びＥｎｖの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むプラスミドを用いて、ＣＭＶ／Ｒプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を用いたプラスミドＤＮＡ発現ベクターへ挿入する、対応するインサートをサブクローニングした。ＨＩＶ−１遺伝子を発現するプラスミドはすべて、ヒトにおいて典型的に見出されるコドンを用いたタンパク質発現を制限するウイルスＲＮＡ構造を破壊するように設計された配列を用いて合成的に作製し、それにより遺伝子発現が増大した。ＣＭＶ最初期領域１エンハンサーの翻訳エンハンサー領域は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）の長末端反復（ＬＴＲ）の５’非翻訳ＨＴＬＶ−１  Ｒ−Ｕ５領域により置換さ
れて、遺伝子発現が更に最適化される。
【００１６】
ＤＮＡプラスミドは典型的には、カナマイシン選択培地を含有する細菌細胞培養物中で産生される。このような場合はすべて、細菌細胞の増殖は、プラスミドＤＮＡの一部分によりコードされるカナマイシン耐性タンパク質の細胞発現によっている。プラスミドを有する細菌細胞の増殖後、プラスミドＤＮＡは細胞構成成分から精製される。特定の例では、Ｇａｇプラスミド（ＶＲＣ４４０１）は５８８６ヌクレオチド対長であり、およそ３．９ＭＤａの分子量を有する；Ｐｏｌプラスミド（ＶＲＣ４４０９）は７３４４ヌクレオチド対長であり、およそ４．８ＭＤａの分子量を有する；Ｎｅｆプラスミド（ＶＲＣ４４０４）は５０３９ヌクレオチド対長であり、およそ３．３ＭＤａの分子量を有する；分岐群Ａ、Ｂ及びＣ  Ｅｎｖプラスミド（ＶＲＣ５７３６、５７３７及び５７３８）はそれぞれ６３０５、６３３８及び６２９８ヌクレオチド長であり、およそ４．２ＭＤａの分子量を有する。
【００１７】
このように本開示の一態様は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導することができる組成物に関する。例えば組成物は、単独又は少なくとも１つの更なる免疫原性組成物と組合せて投与される場合、ＨＩＶに対する防御的免疫応答を誘導することができる。抗原への曝露後に免疫応答を示す能力は、複雑な細胞性及び体液性プロセスの一機能であるということ、そして異なる被験体が免疫学的刺激に応答する種々の能力を有するということが、当業者により理解されよう。従って本明細書中に開示される組成物は、免疫正常者、即ち免疫学的刺激と特異的に相互作用する抗体の産生、及び／又は免疫学的刺激と特異的に相互作用する受容体を有する機能性Ｔ細胞（ＣＤ４+及び／又はＣＤ８+Ｔ細胞）の産生などの実質的に正常な免疫応答を示すことにより、免疫学的刺激に生理学的に応答することができる被験体における免疫応答を誘導することができる。ＨＩＶ感染特有の影響は、従来の免疫正常者を免疫不全にさせることであると更に理解される。したがって下記の治療方法に関して、ＨＩＶへの曝露の前（即ち予防的に、例えばワクチンとして）、又は抗原ポリペプチドのような刺激物に対する免疫応答を被験体が示すことができる間のＨＩＶへの曝露後の時点で治療的に、被験体に組成物を投与するのが一般的に望ましい。
【００１８】
組成物は、複数の（即ち、２、３、４、５、６又はそれより多い）異なる核酸コンストラクトを含む。異なる各々の核酸コンストラクトの複数のコピーが通常存在する。異なる各々の核酸コンストラクトは、全身又は局所投与後の被験体の細胞中におけるＨＩＶ抗原ポリペプチドの発現を調節する転写調節配列と機能可能な状態で連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。核酸コンストラクトの中に含まれるのは、ＨＩＶの２つ以上の（複数の）分岐群又は系統の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。従って組成物は複数の核酸コンストラクトを含み、そのうちの少なくとも２つは、異なる分岐群又は系統由来のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組み込む。しばしば、組成物は、少なくとも３つの異なる分岐群又は系統由来のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを含む。
【００１９】
一実施形態では、組成物は複数の別個の核酸コンストラクトを含み、その各々は、機能可能な状態でＣＭＶ／Ｒ転写制御配列と連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＣＭＶ／Ｒ転写制御配列は配列番号２６の配列を有する。別の実施形態では、組成物は複数の別個の核酸コンストラクトを含み、その各々が単一のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、核酸コンストラクトはプラスミドである。
【００２０】
組成物は典型的には、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の核酸コンストラクト、ＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の核酸コンストラクト、ＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド配列を含む第３の核酸コンストラクト、並びにＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの更なる核酸コンストラクトを含む。組成物は、異なるＨＩＶ分岐群又は系統のＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ又は複数の更なる核酸コンストラクトも包含し得る。
【００２１】
例えば第１の核酸コンストラクトは、分岐群Ｂ  Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得るし、第２の核酸コンストラクトは分岐群Ｂ  Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得るし、第３の核酸コンストラクトは分岐群Ｂ  Ｎｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。或いは第１、第２及び第３の核酸コンストラクトは、分岐群Ａ又は分岐群Ｃ等のような異なる分岐群のＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば組成物は、配列番号２０と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＧａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト；配列番号２１と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＰｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト；及び／又は配列番号２２と少なくとも約９５％の配列相同性を有するＮｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含み得る。一実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号２０のＧａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１の核酸コンストラクト、配列番号２１のＰｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第２の核酸コンストラクト；及び配列番号２２のＮｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第３の核酸コンストラクトを含む。例えば組成物は、配列番号１の１３７５〜２８８３位と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト；配列番号２の１３４９〜４３５７位と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト；及び／又は配列番号３の１３９２〜２００６と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト；或いは１つ又は複数の縮重コドンの置換により参照配列と異なる核酸コンストラクトを含み得る。一実施形態では、組成物は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３により表わされる核酸コンストラクト（プラスミドＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０９及びＶＲＣ４４０４）、又はそれと少なくとも９５％の配列相同性を有するコンストラクトを含む。
【００２２】
更に組成物は、異なる分岐群又は系統由来のＥｎｖポリペプチドをコードする複数の核酸コンストラクトを含み得る。例えば組成物は、分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の更なる核酸コンストラクト、分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の更なる核酸コンストラクト、更に分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の更なる核酸コンストラクトを含み得る。一般に、分岐群Ａ、分岐群Ｂ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドは集合的に世界中のＨＩＶ感染で最も高い比率を占める分岐群Ａ、Ｂ及びＣとして利用される。しかしながらＨＩＶ分岐群又は系統の任意の組合せに由来するＥｎｖポリペプチドを含む組成物が産生されると当業者は認識するだろう。特定の実施形態において免疫原性組成物は、配列番号２３と少なくとも９５％の配列相同性を有する分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の更なる核酸コンストラクト；配列番号２４と少なくとも９５％の配列相同性を有する分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の更なる核酸コンストラクト；及び／又は配列番号２５と少なくとも９５％の配列相同性を有する分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第３の更なる核酸コンストラクトを含む。一実施形態において組成物は、配列番号２３の分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１の更なる核酸コンストラクト；配列番号２４の分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第２の更なる核酸コンストラクト；及び配列番号２５の分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列を有する第３の更なる核酸コンストラクトを含む。例えば免疫原性組成物は、配列番号４の１３９２〜３２７２位と少なくとも約９５％相同であるポリヌクレオチド配列を有する核酸コンストラクト；配列番号５の１３８４〜３３１２位と少なくとも約９５％相同であるポリヌクレオチド配列を有する核酸コンストラクト；及び／又は配列番号６の１３９２〜３２７２位と少なくとも約９５％相同であるポリヌクレオチド配列を有する核酸コンストラクトを含み得る。一実施形態において免疫原性組成物は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６により表わされる核酸コンストラクト（それぞれプラスミドＶＲＣ５７３６、５７３７及び５７３８）、又はそれと少なくとも９５％の配列相同性を有するコンストラクト、或いは縮重コドンの置換により参照配列と異なるコンストラクトを含む。
【００２３】
従って特定の実施形態において免疫原性組成物は、Ｇａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第１の核酸コンストラクト、Ｐｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第２の核酸コンストラクト、Ｎｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第３の核酸コンストラクト、分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第４の核酸コンストラクト、分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第５の核酸コンストラクト、及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する第６の核酸コンストラクトを含む。このような一実施形態において第１の核酸コンストラクトは、配列番号２０と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし；第２の核酸コンストラクトは、配列番号２１と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし；第３の核酸コンストラクトは、配列番号２２と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし；第４の核酸コンストラクトは、配列番号２３と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし；第５の核酸コンストラクトは、配列番号２４と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードし；更に第６の核酸コンストラクトは、配列番号２５と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態において免疫原性組成物は６つの核酸コンストラクトを含み、その１つ又は複数が、配列番号１の１３７５〜２８８３位；配列番号２の１３４９〜４３５７位；配列番号３の１３９２〜２００６位；配列番号４の１３９２〜３２７２位；配列番号５の１３８４〜３３１２位；及び配列番号６の１３９２〜３２７２位と少なくとも９５％相同である。例えば組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６により表わされるポリヌクレオチド配列を有する６つの核酸コンストラクト（それぞれプラスミドＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０９、ＶＲＣ４４０４、ＶＲＣ５７３６、ＶＲＣ５７３７及びＶＲＣ５７３８）、又はそれと少なくとも９５％の配列相同性を有するコンストラクト、或いは縮重コドンの置換により参照配列と異なるコンストラクトを含む。免疫原性組成物中に組み込まれた場合、核酸コンストラクトは実質的に等しい重量比（即ち、約１：１：１：１：１：１の比）で組み込まれる。
【００２４】
いくつかの場合、組成物は、各々が単一の分岐群又は系統のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトを含む。他の場合、キメラＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を組み入れた核酸コンストラクトを含むことは有用である。従って、特定の実施形態では、核酸コンストラクトは配列番号７〜１５のうちの１つによりコードされるポリペプチドと少なくとも９５％の相同性を有するキメラＥｎｖポリペプチドをコードすることができる。
【００２５】
通常、被験体への投与のために処方される場合、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は別の中性生理学的塩溶液のような水性担体も含む。組成物は、アジュバント又は他の免疫刺激性分子も含み得る。組成物は、免疫応答を誘導するために、被験体に1回又は複数回投与され得る。例えば組成物は
、少なくとも約２８日間隔又は物質輸送上又は治療上決定される異なる間隔で複数回投与され得る。
【００２６】
このように本開示の特徴の一つは、ＨＩＶ感染の治療又は予防のための薬学的組成物又は薬剤を含む。ＨＩＶの治療又は予防のための薬剤の生産における本明細書中に開示される組成物の使用も当然予期される。組成物に関して上で開示された制限又は処方のいずれかが、ＨＩＶ感染治療のための薬剤におけるそれらの使用、又は薬剤として適用可能である。
【００２７】
本開示の別の態様は、ヒト被験体に上記の組成物を投与することによりＨＩＶに対する免疫応答を誘導するための方法に関する。免疫正常者に投与される場合、組成物は、ＨＩＶの複数の分岐群又は系統に対する免疫応答を誘導する。例えば一実施形態において該方法は、複数の異なる核酸コンストラクトを含む組成物で、その各々が機能可能な状態でＣＭＶ／Ｒ転写制御配列と連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することを含む。別の実施形態において該方法は、複数の異なる核酸コンストラクトで、その各々が単一のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物を投与することを含む。特定の実施形態では、投与される核酸コンストラクトはプラスミドである。実際、上記組成物のいずれかは、本明細書中に開示される方法におけるヒト被験体への投与に適している。
【００２８】
目的の特性、例えばＨＩＶ特異的抗体の産生又はＨＩＶと反応する機能性Ｔ細胞の産生を有する免疫応答を誘導するために、１回量又は複数回量の組成物が被験体に投与される。特定の実施形態において組成物は、例えば無針デリバリー装置を用いて筋肉内投与される。或いは組成物は、静脈内、経皮、鼻内、経口（又は別の粘膜を介する）などの他の経路により投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態において該方法は、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするウイルスベクターを、すでに記載された１つ又は複数の核酸コンストラクトの代わりに、又はそれと組合せて投与することも含む。いくつかの場合、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター（例えば複製欠損アデノウイルスベクター）である。例えば上に開示されたもののような「プライマー」組成物の1又は複数回量が被験体に投与され、その後、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする複数のアデノウイルスベクターを含む1又は複数回量の「追加免疫」組成物が投与される。特定の実施形態においてアデノウイルスベクターは、プライマー組成物中で前に投与されたＨＩＶ抗原ポリペプチドと同一である１つ又は複数のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする。例示的な組換えアデノウイルスベクターは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９により表わされる。もちろん、例えばこれらの配列のうちの１つによりコードされるポリペプチドと少なくとも約９５％の配列相同性を有するポリペプチドをコードする、或いはこれらの配列のうちの１つと少なくとも約９５％の配列相同性を有する代替的なアデノウイルスベクターも用いられる。
【００３０】
別の態様では、該開示は、機能可能な状態でＣＭＶ／Ｒ転写調節配列と連結されたＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離又は組換え核酸に関する。例えばこのような核酸は、プラスミド又はウイルスベクターである。ポリヌクレオチド配列は、ＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチド、ＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチド、ＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチド又はＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードし得る。いくつかの例では、核酸コンストラクトによりコードされるＨＩＶポリペプチドは、単離又は組換え核酸によりコードされる唯一のＨＩＶ抗原である。これらの核酸によりコードされる例示的なポリペプチドは、配列番号２０〜２５により表わされ、配列番号２０〜２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％相同である配列を含む。例えばこのような核酸は、配列番号１の１３７５〜２８８３位；配列番号２の１３４９〜４３５７位；配列番号３の１３９２〜２００６位；
配列番号４の１３９２〜３２７２位；配列番号５の１３８４〜３３１２又は配列番号６の１３９２〜３２７２位と少なくとも９５％相同であるポリヌクレオチド配列を含み、それらのいずれもが機能可能な状態でＣＭＶ／Ｒ転写制御配列と連結され得る。例えばＣＭＶ／Ｒ転写制御配列は、配列番号２６と少なくとも９５％の配列相同性を有するポリヌクレオチド配列である。このような核酸の例示的な実施形態は、それぞれ配列番号１〜６により表わされるプラスミドＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０９、ＶＲＣ４４０４、ＶＲＣ５７３６、ＶＲＣ５７３７及びＶＲＣ５７３８を含む。
【００３１】
他の実施形態では、核酸は、複数のＨＩＶ分岐群又は系統の少なくともサブシーケンスを組み込んだキメラＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。例えばキメラＨＩＶポリペプチドは、異なるＨＩＶ分岐群又は系統のサブシーケンスを含むキメラＥｎｖポリペプチドである。このような核酸の例としては、配列番号７〜１５、配列番号７〜１５のうちの１つと少なくとも約９５％の配列相同性を有するような実質的に同様のポリヌクレオチド配列、或いは１つ又は複数の縮重コドンが互いに置換されたポリヌクレオチド配列が挙げられる。或いは核酸は、機能可能な状態でＣＭＶ／Ｒ転写調節領域以外の転写調節配列（例えばＣＭＶ最初期プロモーター及び／又はエンハンサー、或いは後述するようなその他のプロモーター及び／又はエンハンサー）と連結されたキメラＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。キメラＥｎｖポリペプチドも、本開示の一つの特徴である。
【００３２】
更なる技術的詳細は、以下の特定の題目の見出しの下において示される。本開示の種々の実施形態の検討を助ける、特定の用語について以下に説明を提示する：
【００３３】
用語
別途記載しない限り、本明細書中で用いられる技術及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及びRobert A. Meyers (ed.),
Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出される。
【００３４】
単数用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、「又は」という語は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、「及び」を含むよう意図される。「複数」という用語は、２又はそれ以上を指す。核酸又はポリペプチドに関して示される全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、並びに全ての分子量又は分子質量値はおよそのものであり、説明のために用いられると更に理解される。本明細書中に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料が本開示の実施又は試験に用いられ得るが、適切な方法及び材料が以下に記載される。「〜から成る」という用語は、「含む」を意味する。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語のexempli gratiaに由来し、非限定的な例を示すために本明細書中で用いられる。従って、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「例えば」と同義語である。
【００３５】
本開示の種々の実施形態の検討を助けるために、特定の用語について以下に説明を提示する：
【００３６】
アジュバント：  抗原性を増強するために用いられる媒体；例えばその上に抗原が吸着される無機物の懸濁液（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）；又は抗原溶液が油中に乳化される（ＭＦ−５９、フロイント不完全アジュバント）、時としては抗原性を更に増強する（抗原の分解を抑制する及び／又はマクロファージの流入を引き
起こす）ために死菌マイコバクテリアの封入を伴う（フロイント完全アジュバント）油中水乳濁液。アジュバントは、サイトカイン、共刺激性分子のような免疫刺激性分子、並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドのような免疫刺激性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子も含む。
【００３７】
抗原：  動物における抗体産生又はＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物又は物質で、動物中に注射されるか、吸収されるか又は別の方法で導入される組成物。「抗原」という用語は、すべての関連抗原エピトープを含む。「抗原ポリペプチド」とは、Ｔ細胞応答又は抗体応答のような免疫応答が刺激されるポリペプチドである。「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。一実施形態では、エピトープがＭＨＣ分子とともに提示される場合、Ｔ細胞はエピトープに対して応答する。エピトープは、連続アミノ酸、又は抗原ポリペプチドの三次元的フォールディングにより並列される非連続アミノ酸の両方から形成される。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次元的フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶媒による処理時に失われる。エピトープは、通常少なくとも３、より頻繁には少なくとも５、約９又は約８〜１０個のアミノ酸を特有の空間コンフォメーションで含む。エピトープの空間コンフォメーションの決定方法としては、例えばＸ線結晶学及び多次元核磁気共鳴分光学が挙げられる。
【００３８】
抗体：  免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、即ち抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有する分子。天然抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）は、ジスルフィド結合により相互連結される４つのポリペプチド鎖、即ち２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。「抗体応答」という語句は、抗原に特異的な抗体の分泌を含む、抗原に対する免疫学的応答を指す。抗体応答は、抗原（又はエピトープ）とＢ細胞の表面のＢ細胞受容体（膜結合ＩｇＤ）との相互作用により開始されるＢ細胞媒介性免疫応答である。その同種抗原によるＢ細胞受容体の刺激の結合後、Ｂ細胞は、抗原特異的免疫グロブリンを分泌するプラズマ細胞に分化して、抗体応答を生じさせる。「中和抗体」とは、例えばプラーク中和検定で測定されるような、ウイルス上のエピトープと結合して感染及び／又は複製を抑制する抗体である。
【００３９】
ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）：  内部非コードセグメント（イントロン）並びに転写を決定する調節配列を欠くＤＮＡ断片。ｃＤＮＡは通常、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡからの逆転写により実験室で合成される。ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを調製する際には、ｃＤＮＡは、例えばＨＩＶ  ＲＮＡゲノム（又はゲノムセグメント）からの逆転写又は増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により）により調製される。
【００４０】
宿主細胞：  ポリヌクレオチドベクター又はウイルスベクターのようなポリヌクレオチドが増殖でき、、そのＤＮＡが発現する細胞。細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞であり得る。該用語は、被験体の宿主細胞の全ての子孫細胞も含む。複製中に起こる突然変異が存在し得るため、全子孫細胞が親細胞と同一であるというわけではないと理解される。しかしながら、「宿主細胞」という用語が用いられる場合、このような子孫細胞が含まれる。従って本明細書中に記載される核酸コンストラクトは、それらのポリヌクレオチド配列（ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするものを含む）が発現し得る宿主細胞中に導入される。
【００４１】
免疫応答：  刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞又は単球のような免疫系細胞の応答。いくつかの場合、応答は特定の抗原に特異的である（即ち、「抗原特異的応答」）。いくつかの場合、免疫応答は、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答のようなＴ細胞応答である。或いは応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体を産生する。「防御的免疫応答」は、病原体（ＨＩＶのような）の有害な機能又は活性を抑制する免疫応答であり、病原体による感染を低減
し、或いは病原体による感染に起因する症候（死亡を含む）を低減する。防御的免疫応答は、例えばプラーク低減アッセイ又はＥＬＩＳＡ−中和アッセイ（ＮＥＬＩＳＡ）におけるウイルス複製又はプラーク形成の抑制により、或いはｉｎ  ｖｉｖｏ実験系におけるウイルス攻撃に対する耐性を測定することにより測定される。
【００４２】
免疫原性組成物：  免疫正常者に投与される場合に、測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか又は測定可能なＢ細胞応答（例えばエピトープと特異的に結合する抗体の産生）を誘導するか、或いはその両方を誘導する病原性生物の少なくとも１つのエピトープを含む組成物。従って免疫原性組成物は、免疫正常者における免疫応答を誘導し得る組成物である。例えば免疫原性組成物は、エピトープを発現するために用いられる（従って、このポリペプチド、又は病原体により発現する関連ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するために用いられる）ＨＩＶ抗原ポリペプチドの１つ又は複数の免疫原性エピトープをコードする単離核酸コンストラクト（プラスミド又はウイルスベクターのような）を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用に関しては、免疫原性組成物は、単離核酸、タンパク質又はペプチドから成る。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用に関しては、免疫原性組成物は通常、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤、及び／又はその他の物質、例えばアジュバント中で免疫原性エピトープを発現する核酸又はウイルスを含む。免疫原性ポリペプチド（ＨＩＶ抗原のような）又は該ポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野で既知のアッセイにより、ＣＴＬ又は抗体応答を誘導する能力に関して容易に試験される。
【００４３】
薬学的に許容可能な担体及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤：  薬学的に許容可能な担体又は賦形剤の使用は従来の通りである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、本明細書中に開示されるポリペプチド及びポリヌクレオチドの薬学デリバリーに適した組成物及び処方物を記載する。
【００４４】
概して、担体の性質は、用いられる特定の投与方式によっている。例えば、非経口処方物は通常、媒体として、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールのような薬学的及び生理学的に許容可能な流体を含む注射用流体を含有する。固体組成物（例えば粉末、ピル、錠剤又はカプセル形態）に関しては、通常用いられる非毒性固体担体として、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき薬学的組成物は、酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタン等の湿潤剤又は乳化剤、防腐剤及びｐＨ緩衝剤のような少量の非毒性補助物質を含有し得る。
【００４５】
「治療的有効量」とは、被験体において目的の作用を達成するために用いられる組成物の量である。例えばこれは、ウイルス（又は他の病原体）の複製を抑制するために、或いはウイルス（又は他の病原体）感染の外見的症候を防止するか又はかなり改善するために必要な組成物の量である。被験体に投与される場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける作用を達成することが示された標的組織濃度（例えばリンパ球中の）を達成する投薬量が一般的に用いられる。
【００４６】
疾患の抑制又は治療：  ＨＩＶへの感染の抑制とは、ヒト免疫不全ウイルスへの曝露により引き起こされる疾患の完全発症を抑制することを指す。例えばＨＩＶ感染の抑制は、ウイルスに曝露されたことが既知であるヒトにおける症候の発症を防止するというような、ウイルス感染に起因する症候を減少すること、或いはウイルスに曝露された被験体におけるウイルス負荷又はウイルスの感染性を低減することを指す。「処置」とは、被験体のウイルスへの感染に関連した疾患又は病理学的状態の兆候又は症候を改善するか又は抑制するか又はそうでなければ回避する治療的又は予防的介入を指す。
【００４７】
被験体：  ヒト及び非ヒト哺乳類を含み、ヒト及び獣医学的被験体の両方を含む部類である多細胞脊椎動物。ＨＩＶに関する臨床的設定では、被験体は通常はヒト被験体である。免疫正常者は、抗原性刺激に対して実質的に正常な免疫応答を生じ得る被験体である。
【００４８】
Ｔ細胞：  免疫応答に重要な白血球。Ｔ細胞としては、ＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４+Ｔリンパ球は、ＣＤ４として既知のマーカーをその表面上に有する免疫細胞、例えば「ヘルパー」Ｔ細胞がある。ヘルパーＴ細胞としても既知のこれらの細胞は、抗体応答、並びにキラーＴ細胞応答のような免疫応答を統合するのを手助けする。ＣＤ８+Ｔ細胞はＣＤ８マーカーを有し、細胞傷害性又は「キラー」エフェクター機能を有するＴ細胞を含む。
【００４９】
形質導入又はトランスフェクション：  形質導入細胞は、例えば分子生物学技法により、核酸分子が導入された細胞である。本明細書中で用いる場合、導入又は形質導入という用語は、核酸分子がこのような細胞中に導入されるすべての技法、例えばプラスミドベクターによる形質転換、ウイルスベクターによるトランスフェクション、並びにエレクトロポレーション、リポフェクション及びパーティクルガンによる裸ＤＮＡの導入を含む。
【００５０】
ワクチン：  ワクチンは、被験体における予防的又は治療的免疫応答を誘導する薬学的組成物である。いくつかの場合、免疫応答は防御的免疫応答である。典型的にはワクチンは、病原体の抗原に対する抗原特異的免疫応答を誘導する。この開示の中では、ワクチンはＨＩＶに対する免疫応答を誘導する。本明細書中に記載されるワクチンは、ＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクト、例えばプラスミド又はウイルスベクターを含む。
【００５１】
ベクター：  宿主細胞中に導入され、それにより形質転換宿主細胞を産生するような核酸分子。ベクターは、複製起点のように宿主細胞中で複製できる核酸配列を含む。ベクターは、１つ又は複数の選択可能マーカー遺伝子及び当該技術分野で既知のその他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターという用語は、プラスミド、線状核酸分子、並びにアデノウイルスベクター及びアデノウイルスのようなウイルスベクターを含む。アデノウイルスベクターという用語は、本明細書中では宿主細胞中でウイルス粒子を生じるアデノウイルスの１つ又は複数の構成成分を含む核酸を指すのに用いられる。このような粒子は、１又は複数回の感染及び複製が可能であり得るか、或いは、例えば突然変異のために複製欠損性であり得る。アデノウイルスは、集合ウイルスの少なくとも一部分をコードする核酸を含む。従って多くの状況では、該用語は互換的に用いられる。
【００５２】
ＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクト
本開示は、ヒト免疫不全ウイルス−１（「ＨＩＶ−１」又は単に「ＨＩＶ」）の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトに関する。ポリヌクレオチド又は核酸配列という用語は、少なくとも１０塩基長ヌクレオチドの重合体形態を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのヌクレオチドの改変体である。該用語は、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡを含む。この開示においては、核酸コンストラクトは「組換え」核酸である。組換え核酸は、天然でない配列を有するか、又は２つの異なる分離されたセグメントの人工的組合せにより作製された配列、例えば由来生物の天然ゲノム中では近接している（一方は５’末端、一方は３’末端）コード配列の両方と近接していない異種配列を有する核酸である。この人工的組合せは、しばしば、化学合成により、又は更に一般的には、例えば遺伝子工学処理技法のような、核酸の単離セグメントの人工的操作により成し遂げられる。
【００５３】
いくつかの場合、核酸は「単離」核酸である。「単離」核酸（及び同様に単離タンパク質）は、核酸が天然に生じる生物体の細胞中の他の生物学的構成成分、例えば他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質及び細胞小器官から実質的に分離又は精製さ
れた。「単離」された核酸及びタンパク質としては、標準的な精製法により精製される核酸及びタンパク質が挙げられる。該用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製される核酸及びタンパク質、並びに化学合成核酸も含む。
【００５４】
「ＨＩＶ抗原ポリペプチド」又は「ＨＩＶ抗原」は、免疫が正常な哺乳類における免疫応答を誘導し得る任意のタンパク質様ＨＩＶ分子又はその一部を含み得る。「ＨＩＶ分子」は、ヒト免疫不全ウイルスの一部である分子であり、ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列によりコードされるか、又は任意のこのような分子に由来するか若しくはこのような分子に基づいて合成される。免疫応答を誘導するＨＩＶ抗原をコードする核酸の投与は、好ましくはＨＩＶに対する防御的免疫をもたらす。この点で、ＨＩＶに対する「免疫応答」は、任意の１つ又は複数のＨＩＶ抗原に対する免疫応答である。
【００５５】
適切なＨＩＶ抗原の例としては、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ又はＥｎｖタンパク質の全部又は一部が挙げられる。ウイルス中では、Ｇａｇタンパク質はウイルスキャプシドの構成成分である。Ｐｏｌポリタンパク質は、逆転写酵素（ＲＴ）；インテグラーゼ（ＩＮ）及びプロテアーゼ（ＰＲ）の機能を提供し、これは、宿主細胞の染色体中に組み込まれる二本鎖ＤＮＡにウイルスＲＮＡを逆転写し、ｇａｇ−ｐｏｌ由来タンパク質を切断して、それぞれ機能性ポリペプチドにする。Ｎｅｆポリペプチドは、感染後のウイルスの病原性の確定に関与する陰性調節因子である。Ｅｎｖタンパク質は、ウイルス付着及び標的細胞との融合に関与するエンベロープタンパク質である。ポリペプチドの機能的属性は、ポリペプチドの抗原特性を変更せずに変更され得る（例えば欠失される）、と当業者は認識するだろう。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ又はＥｎｖの各々の免疫原性バリアント又は断片も、本明細書中に開示される免疫原性組成物中に含まれるＨＩＶ抗原ポリペプチドである。免疫原性バリアントとしては、例えば配列番号２０〜２５と少なくとも９０％、９５％又は９８％の配列相同性を有するもの、又はその免疫原性断片が挙げられる。本明細書中に開示される核酸ワクチンは、配列番号１〜１９、又は配列番号２０〜２５のようなＨＩＶ抗原をコードする配列により表わされるもの、或いは配列番号２０〜２５と少なくとも９０％、９５％又は９８％の配列相同性を有するＨＩＶ抗原を含む。
【００５６】
適切なＥｎｖタンパク質は当該技術分野で既知であり、例えばｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１及びｇｐ１４０が挙げられる。ＨＩＶ分岐群Ａ、Ｂ、Ｃ等の任意の分岐群のＨＩＶが抗原選択に適している。従って、以下のＨＩＶ抗原のうちの任意の１つ又は組合せが本発明の方法に用いられると理解される：ＨＩＶ分岐群Ａ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖ；ＨＩＶ分岐群Ｂ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖタンパク質；並びにＨＩＶ分岐群Ｃ  ｇｐ１４０、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖタンパク質。組成物及び方法はＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖタンパク質に関して詳細に記載されるが、哺乳類における免疫応答を誘導し得る任意のＨＩＶタンパク質又はその一部が、本発明の方法とともに用いられ得る。ＨＩＶ分岐群Ａ、Ｂ、Ｃ由来のＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖタンパク質、並びにこのようなタンパク質をコードする核酸配列及びこのような核酸配列をベクター中で操作し、挿入するための方法は既知である（例えばHIV Sequence Compendium, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 2003, HIV Sequence Database（the world wide web at hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/mainpage.html上で）、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,
New York, N.Y., 1994参照）。
【００５７】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及びＥｎｖポリペプチド配列は当該技術分野で既知であり、複数のアミノ酸配列がＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）のような公的にアクセス可能なデータベ
ースから利用可能である。例えばＨＸＢ２系統のアミノ酸配列に相当するＧａｇポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号Ｋ０３４５５の配列により表わされる。ＮＬ４−３系統のアミノ酸配列に相当するＰｏｌ及びＮｅｆポリペプチドは、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号Ｍ１９９２１の配列により表わされる。例えば分岐群Ａ、Ｂ及びＣに相当する例示的なＥｎｖポリペプチドは、それぞれＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）寄託番号Ｕ０８７９４、Ｋ０３４５５及びＡＦ２８６２２７の配列により表わされる。本明細書中に開示される核酸コンストラクトによりコードされる特定の例示的な配列は、それぞれＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、分岐群Ａ  Ｅｎｖ、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖに相当する配列番号２０〜２５により表わされる。これらの例示的なポリペプチドのいくつかは機能的に改変されているが（実施例で更に詳細に示されるように）、それでもなお天然タンパク質の重要な抗原特質を保持する。
【００５８】
完全な無傷のＨＩＶタンパク質が、免疫応答を生じるために必要というわけではない。実際、ＨＩＶタンパク質の抗原エピトープのほとんどは相対的にサイズが小さい。従って、本明細書中に記載されるＨＩＶタンパク質のいずれかのようなＨＩＶタンパク質の断片（例えばエピトープ又は他の抗原断片）が、ＨＩＶ抗原として用いられ得る。ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及び／又はＥｎｖタンパク質の抗原断片及びエピトープ、並びにこのような抗原断片及びエピトープをコードする核酸配列が既知である（例えばHIV Immunology and HIV/SIV Vaccine Databases, Vol. 1, Division of AIDS, National Institute
of Allergy and Infectious Diseases, 2003参照）。
【００５９】
核酸コンストラクトは、コンストラクト中に組み込まれたポリヌクレオチド配列が、抗原を構成するアミノ酸配列を生じる細胞転写及び翻訳プロセスによる認識及び活性により１つ又は複数のオープンリーディングフレームを含む場合、抗原を「コードする」といわれる。
【００６０】
ＨＩＶ抗原は、それらが異なる抗原アミノ酸配列を含む場合、「異なる」ものである。複数の異なるＨＩＶ抗原を参照すると、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原が、本明細書中に記載された２つ以上（又は３、又は４、又は５、又は６、又はそれ以上）のＨＩＶ抗原のようなＨＩＶ抗原であり得る。異なるＨＩＶ抗原ポリペプチドは、ＨＩＶゲノム中の異なる遺伝子によりコードされるタンパク質である異なるＨＩＶタンパク質由来の２つ以上の抗原ポリペプチドである（例えばＨＩＶ  ＧａｇポリペプチドはＨＩＶ  Ｐｏｌポリペプチドとは異なり、これはＨＩＶ  Ｎｅｆポリペプチドとは異なり、更にまたＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドとは異なる）。従ってＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及びＥｎｖは、異なるＨＩＶタンパク質又は抗原ポリペプチドである。或いは異なるＨＩＶ抗原ポリペプチドは、ＨＩＶの異なる系統又は分岐群由来の相同ゲノムセグメント（又は遺伝子）によりコードされる場合、異なっている。従って、分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドは分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドとは異なり、これは分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチド等とは異なる。本明細書中に記載された免疫原性（例えばワクチン）組成物において、２つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、分岐群Ａ、Ｂ及びＣのような３つ以上の異なるＨＩＶ分岐群由来の、或いは２つ以上の同一分岐群の変異体ＨＩＶ系統由来のような、２つ以上の異なるＨＩＶ分岐群又は系統由来のＨＩＶ抗原を含む。異なるＨＩＶ抗原の「カクテル」に哺乳類の免疫系を曝露すると、単一のＨＩＶ抗原のみに免疫系を曝露するよりも広範なそしてより有効な免疫応答が誘導される。
【００６１】
従って、単一のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を各々が含む複数の別個の核酸コンストラクトであって、複数の抗原ポリペプチド又は複数のＨＩＶ分岐群又は系統をコードする核酸コンストラクトは、同一の分岐群又は系統（例えばすべて分岐群Ｂ）の複数のコード化ポリペプチド、或いは異なる分岐群又は系統（例えばあるものは分岐群Ａで他は分岐群Ｂ）のコード化ポリペプチドを含む。
【００６２】
いくつかの特に開示された実施形態では、組成物は複数の異なる核酸コンストラクトを含む。核酸コンストラクトは、機能可能な状態で転写制御配列と連結される単一（１回だけ）のＨＩＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含み、該単一のＨＩＶ抗原は他の核酸コンストラクトとは異なる。特定の実施形態では、異なる核酸コンストラクトの異なる単一のＨＩＶ抗原は同一分岐群又は系統の異なるコード化ポリペプチドであるが、しかし同一分岐群又は系統を共有するコード化ポリペプチドと異なる分岐群又は系統の、異なるコンストラクトから発現される異なるコード化ポリペプチドを更に含む。例えば同一分岐群又は系統のＨＩＶ抗原をコードする異なる核酸コンストラクトは、コンストラクトの各々から発現される唯一のＨＩＶ抗原としてＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆをそれぞれコードする３つの別個のコンストラクトであり、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆの各々が同一分岐群又は系統（例えばすべて分岐群Ｂ）のものである。更に、いくつかの実施形態では、組成物は更に、異なる分岐群又は系統のＥｎｖ抗原をコードする別個の核酸コンストラクトを含む。例えば少なくとも３つの別個のコンストラクトは、独立して、それらの唯一のコード化ＨＩＶ抗原として分岐群Ａ  Ｅｎｖ、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖをコードする。
【００６３】
例えば核酸コンストラクトは、単一のＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書中に示される特定の例において核酸コンストラクトは、単一のＧａｇポリペプチド、単一のＰｏｌポリペプチド、単一のＮｅｆポリペプチド又は単一のＥｎｖポリペプチドをコードする。例えば核酸コンストラクトは、分岐群Ｂ  Ｇａｇポリペプチド（例えば配列番号２０のアミノ酸配列）のような単一のＧａｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；分岐群Ｂ  Ｐｏｌポリペプチド（例えば配列番号２１）のような単一のＰｏｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；分岐群Ｂ  Ｎｅｆポリペプチド（例えば配列番号２２）のような単一のＮｅｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；又は分岐群Ａ、分岐群Ｂ又は分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチド（例えば配列番号２３、配列番号２４及び配列番号２５）のような単一のＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリペプチドをコードする例示的な核酸コンストラクトは、それぞれ配列番号１〜６により表わされる。
【００６４】
或いは核酸コンストラクトは、複数の分岐群又は系統のサブシーケンスを含むＨＩＶ抗原ポリペプチド、即ち「キメラ」ＨＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。キメラＨＩＶ抗原ポリペプチドは、３つ以上の異なる分岐群又は系統ののような、２つ以上の分岐群又は系統のサブシーケンスを含む。例えばキメラＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドは、１つ又は複数の分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドのサブシーケンスを、１つ又は複数の分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドのサブシーケンス及び／又は１つ又は複数の分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドのサブシーケンスと組合せて、或いは異なるアミノ酸配列を有するＨＩＶの異なる分岐群Ａ系統の１つ又は複数のサブシーケンスと組合せて含む。同様に、分岐群Ｂ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドのサブシーケンスは、他の分岐群及び／又は系統のサブシーケンスと組合せられる。キメラＥｎｖポリペプチドを含む核酸コンストラクトは、配列番号７〜１５により表わされる。
【００６５】
通常、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトはプラスミドである。しかしながら他のベクター（例えばウイルスベクター、ファージ、コスミド等）が、核酸を複製するために利用される。この開示において、核酸コンストラクトは典型的には、宿主の挿入遺伝子配列の効率的転写を促すプロモーター配列を有する発現ベクターである。発現ベクターは通常、複製起点、プロモーター、並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の核酸配列を含む。例示的な核酸コンストラクトにおいて、コード配列は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）の長い末端反復（ＬＴＲ）のＲ領域由来の調節配列を含むよう改変されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期（ＩＥ）エン
ハンサー／プロモーターの転写制御下で、機能可能な状態で連結される。この転写調節配列は、「ＣＭＶ／Ｒ」又は「ＣＭＶ／Ｒプロモーター」と呼ばれる。ＣＭＶ／Ｒ転写調節配列（或いは「転写制御配列」と呼ばれる）は、５’から３’方向に：ＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーター；ＨＴＬＶ−１  Ｒ領域；及びＣＭＶ  ＩＥ３’イントロンの１２３塩基対（ｂｐ）断片を含有する。ＣＭＶ／Ｒ転写調節領域は、発現並びにその制御下で機能可能な状態で連結されたＨＩＶ抗原に対する細胞免疫応答を実質的に増大させる。例示的なＣＭＶ／Ｒは、配列番号２６により表わされる。しかしながら、配列番号２６と少なくとも約９０％又は９５％又は９８％相同である転写調節領域を含む、調節特性を保持するか又は発現が増大するよう改変された転写制御配列も用いられる。
【００６６】
更に一般的には、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞中への導入後に核酸の発現を促進する任意のプロモーター及び／又はエンハンサーと機能可能な状態で連結される。プロモーターは、核酸の転写を導くする核酸制御配列のアレイである。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター（ＴＡＴＡ因子）の場合のように、転写開始部位近く（に存在し得る）に必要な核酸配列を含む。プロモーターは、転写開始部位からほぼ数千塩基対付近に位置する遠位エンハンサー又はリプレッサー因子も含む。構成性及び誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えばBitter et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, 1987参照）。プロモーターの特定の非限定的な例としては、哺乳類細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、又は哺乳類ウイルス由来のプロモーター（例えばサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター、レトロウイルスの長い末端反復；アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が挙げられ、用いられる。組換えＤＮＡ又は合成的手法により産生されるプロモーターも用いられる。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係で配置される場合、第１の核酸配列は機能可能な状態で第２の核酸配列と連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは機能可能な状態でコード配列と連結される。
【００６７】
このような核酸コンストラクトを産生するために、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＭＶ／Ｒプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列を用いて発現を調節するプラスミド発現ベクターのような適切な発現ベクター中に挿入される。ＣＭＶ／Ｒプロモーターは、遺伝子発現を最適化するために、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）長末端反復（ＬＴＲ）の５’非翻訳ＨＴＬＶ−１  Ｒ−Ｕ５領域で置換されたＣＭＶ最初期領域１エンハンサー（ＣＭＶ−ＩＥ）の翻訳エンハンサー領域から成る。ＨＩＶ−１ポリヌクレオチド配列は、通常、ヒト細胞中での発現が最適化するよう改変される。プラスミド発現ベクターは、カナマイシン選択培地中における培養により増殖する、大腸菌のような細菌細胞中に導入される。すべての場合において、細菌細胞増殖は、プラスミドＤＮＡの一部によりコードされるカナマイシン耐性タンパク質の細胞発現によっている。プラスミドを有する細菌細胞の増殖後、プラスミドＤＮＡは細胞構成成分から精製される。ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を産生するための手法、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらを操作するための手法は当業者に既知であり、例えば上述のSambrook及びAusubelに見出される。
【００６８】
本明細書中に開示されるような配列番号１〜６（並びに配列番号７〜１５により表わされるキメラＥｎｖポリペプチドをコードする核酸、及び配列番号１６〜１９により表わされるアデノウイルスベクターをコードする核酸）のような、本明細書中に開示される配列番号２０〜２５により表わされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に加えて、核酸コンストラクトは、配列番号２０〜２５と実質的に同様である（例えば配列番号１〜６及び／又は配列番号１６〜１９と実質的に同様である）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドバリアント配列を含む。同様に、核酸コンストラクトは、配列番号７〜１５によりコードされるものと実質的に同様であるキメラポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを含む。アミノ酸（及びポリヌクレオチド）配列間の相同性は、配列間の相同性として表され、配列相同性と呼ばれる。配列相同性は、しばしば、パーセンテージ相同性（又は相同性）として測定される；パーセンテージが高いほど、２つの配列の一次構造は類似する。概して、２つのアミノ酸配列の一次構造が類似するほど、フォールディング及びアセンブリーに起因する高次構造は類似する。ＨＩＶ抗原ポリペプチドの（例えば特定分岐群の）バリアントは、１つ又は少数のアミノ酸欠失、付加又は置換を有し得るが、それにもかかわらず非常に高いパーセンテージのアミノ酸（及び一般的にはそれらのポリヌクレオチド配列）を共有する。サブタイプのバリアントが互いに異なる程度に、それらの全体的抗原特質は保持される。逆に、異なる分岐群のＨＩＶ抗原は、相同性が低いか、及び／又は抗原特質がもはや同一でないくらいに互いに異なる。従って核酸コンストラクトは、アミノ酸配列に関して配列番号２０〜２５のうちの１つと少なくとも約９０％、９５％又は９８％相同であるか、或いは配列番号１〜１９のうちの１つ又は複数と少なくとも約９０％、９５％又は９８％の配列相同性を有するか、及び／又は縮重コドンの置換によりこれらの配列のうちの１つと異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
配列相同性を決定する方法は、当該技術分野で既知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、以下に記載されている：Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970；Higgins and Sharp, Gene 73: 237, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research 16: 10881, 1988；及びPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988。Altschul et al., Nature Genet. 6: 119, 1994は、配列アラインメント方法及び相同性算定についての詳細な考察を示す。ＮＣＢＩベイシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol.
215: 403, 1990）は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn及びtblastxとともに用いるために、いくつかの供給元、例えばNational Center for Biotechnology
Information（NCBI, Bethesda, MD）から、並びにインターネット上で利用可能である。このプログラムを用いて配列相同性を決定する方法についての説明は、インターネット上のＮＣＢＩウエブサイトで利用可能である。
【００７０】
２つの核酸間の配列相同性の別の証拠は、ハイブリダイズする能力である。２つの核酸の配列が類似するほど、それらがハイブリダイズする条件はよりストリンジェントになる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列依存性であり、異なる条件パラメーター下では異なる。従ってある程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、選択するハイブリダイゼーション方法の種類、並びにハイブリダイズした核酸配列の組成及び長さによって変わる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ+及び／又はＭｇ++濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、しかし洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。一般に、ストリンジェントな条件は、限定イオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔm）より約５℃〜２０℃低いように選択される。Ｔmは、標的配列の５０％が完全一致プローブとハイブリダイズする温度（限定イオン強度及びｐＨ下での）である。核酸ハイブリダイゼーションに関する条件及びストリンジェンシーの算定は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001；Tijssen, Hybridization
With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993；及びAusubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John
Wiley & Sons, Inc., 1999に見出される。
【００７１】
本発明の開示の目的のために、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーショ
ンがハイブリダイゼーション分子及び標的配列間の不一致が２５％未満である場合にのみ起きる条件を含む。「ストリンジェントな条件」は、より正確に決定するために特定レベルのストリンジェンシーに分解される。従って、本明細書中で用いる場合、「適度にストリンジェント」な条件とは、配列の不一致が２５％より高い分子がハイブリダイズしない条件であり；「中程度にストリンジェント」な条件とは、不一致が１５％より高い分子がハイブリダイズしない条件であり、「高程度のストリンジェント」な条件とは、配列の不一致が１０％より高い配列がハイブリダイズしない条件である。「極めて高程度のストリンジェント」な条件とは、配列の不一致が６％より高い配列がハイブリダイズしない条件である。逆に、「低程度のストリンジェント」な条件下でハイブリダイズする核酸は、配列相同性が非常に低いか、又は核酸の短いサブシーケンスのみに関して配列相同性を有するものを含む。例えば核酸コンストラクトは、高程度にストリンジェント又は極めて高程度にストリンジェントな条件下で、或いはそれより高いストリンジェントな条件下でさえ、配列番号２０〜２５のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。同様に、核酸コンストラクトは、このような条件化で、配列番号１〜１９のいずれか１つとハイブリダイズし得る。
【００７２】
従って、配列番号２０〜２５により表わされる特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号１〜１９のコドン最適化コンストラクトにより表わされるポリヌクレオチドに加えて、ワクチン組成物中に用いられる核酸コンストラクトは、例えば高程度のストリンジェント又は極めて高程度のストリンジェントな条件下で（或いはそれより高いストリンジェントな条件下でさえ）、これらの配列のうちの１つとハイブリダイズする、高パーセンテージの配列相同性を有するポリヌクレオチド配列を含む。天然又は突然変異体系統のＨＩＶ中に見出される１つ又は複数の位置でのコドン組成物も、本明細書中に開示される核酸コンストラクト内に包含される。当業者は複数のＨＩＶポリヌクレオチド配列を容易に同定し、コード化ポリペプチドのアミノ酸含量を実質的に変更せずにどのヌクレオチドが変更できるかを決定し得る。更に、少数のアミノ酸付加、欠失又は置換を有するバリアントをコードするポリヌクレオチド配列も、本明細書中に記載される核酸コンストラクト内に包含される。通常、任意のアミノ酸付加、欠失及び／又は置換は、抗原エピトープを変更せず、フォールディング或いはその他の翻訳又は翻訳後プロセッシングを妨害しない位置に配置される。最も一般的には、任意のアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。例えばポリヌクレオチドバリアント配列は、１又は２又は３又は４又は５つ、或いはそれより多いアミノ酸付加、欠失又は置換を有するＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードし得る。
【００７３】
特定のアミノ酸の保存的バリアントは当該技術分野で既知であり、例えば表１に記述された組分けから選択され得る。
【００７４】
【表１】
2008508866.tif 000002
【００７５】
免疫原性組成物
組合せて用いられる場合、配列番号１〜６により例示されるもののような核酸コンストラクトは、ＨＩＶに対する広範囲の免疫応答を誘導する免疫原性組成物を提供するために用いられる。核酸コンストラクトのこの特定の組合せは、本明細書中ではＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰと呼ばれ、配列番号１〜６にそれぞれ相当するプラスミドＶＲＣ−４４０１、ＶＲＣ−４４０９、ＶＲＣ−４４０４、ＶＲＣ−５７３６、ＶＲＣ−５７３７及びＶＲＣ−５７３８が挙げられる。
【００７６】
異なるＨＩＶ抗原をコードする２つ以上の核酸コンストラクトを含む組成物は、通常、その各々が単一のＨＩＶ抗原をコードする複数の核酸コンストラクトを含む組成物により提供される。まとめて、２つ以上の核酸コンストラクトは、２つ以上の分岐群又は系統からの、例えば２つ以上の分岐群又は系統から、或いは３つ以上の分岐群又は系統からの抗原をコードする。いくつかの場合において組成物は、キメラＨＩＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を、２つ以上の分岐群又は系統のサブシーケンスとともに含む。
【００７７】
臨床目的のために、「Points to Consider in the Production and Testing of New Drugs and Biologicals Produced by Recombinant DNA Technology」 (1985)、「Supplement: Nucleic Acid Characterization and Genetic Stability」 (1992)及び「Points to Consider in Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy」 (1991, 1998)、「Points to Consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventive Infectious Disease Indications」 (1996)の関連の節に従って、ワクチンの製造に用いられる、プラスミドのような全核酸コンストラクト及び宿主大腸菌株が特徴付けられる。更に、臨床試験及び使用のために、全ての組成物は、一般適正製造基準（ｃＧＭＰ）に従って製造される。
【００７８】
従って一実施形態では、免疫原性組成物は、分岐群Ｂ  ＨＩＶ−１由来のＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質並びに分岐群Ａ、Ｂ及びＣ由来のＥｎｖ糖タンパク質を発現するＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ、６−構成成分多分岐群プラスミドＤＮＡワクチンである。この組成物は、ＨＩＶの予防的処置のため、即ち予防用ＨＩＶ−１ワクチンとして適している。ワクチンは、種々のＨＩＶ−１系統由来のいくつかのタンパク質に対
する免疫応答を誘導するよう設計されている。このワクチンは、２つの点で、従来の多分岐群ワクチン組成物とは大きく異なる。第１に、従来の組成物は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質をコードする単一プラスミドによっていた。本明細書中に記載される特定の例では、これら３つのタンパク質は、独立して、Ｇａｇ（ＶＲＣ４４０１）、Ｐｏｌ（ＶＲＣ４４０９）及びＮｅｆ（ＶＲＣ４４０４）をコードする３つの異なるプラスミドに分けられる。更に、従来の融合タンパク質組成物と比較して、ｇａｇ遺伝子中に６８のアミノ酸付加が存在する。第２に、プロモーターは、従来のコンストラクト中に用いられるＣＭＶ最初期領域１エンハンサーの翻訳エンハンサー領域の一部というよりむしろ、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）長末端反復（ＬＴＲ）の５’−非翻訳化ＨＴＬＶ−１  Ｒ−Ｕ５領域を含むよう改変される。ＣＭＶ／Ｒ転写調節領域を含有するプラスミドを用いた、例えば非ヒト霊長類のワクチン接種は、非改変ＣＶＭ  ＩＥプロモーター／エンハンサー配列を用いて構築されたプラスミドによるワクチン接種より高く、より強いＨＩＶ−１特異的細胞免疫応答を誘導した。
【００７９】
ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰは、種々のＨＩＶ−１系統由来のいくつかのタンパク質に対する免疫応答を誘導するよう設計される。このワクチン産物は、ＨＩＶ−１分岐群Ｂ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする初期ＨＩＶ−１  ＤＮＡプラスミド産物（ＶＲＣ−４３０２；ＢＢ−ＩＮＤ９７８２）から生まれた。前臨床試験は小動物における免疫原性タンパク質の発現を証明し、継続的な第Ｉ段階臨床試験は、今日までに試験された用量での安全性を明示していない。ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰワクチン（ＢＢ−ＩＮＤ  １０６８１）は、ＨＩＶ−１の複数のサブタイプ（分岐群）由来のタンパク質を含むという産物概念から発展し、高免疫原性調節タンパク質（Ｎｅｆ）、並びにアカゲザルにおける免疫応答を生じさせることができる改変エンベロープ糖タンパク質を含むようにワクチン構成成分の数を増大した。
【００８０】
４プラスミド産物ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰは、アカゲザル及びマウスにおいて実行される前臨床免疫原性試験、並びに同一の４つのプラスミド及び２つの更なるＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ発現プラスミドから成るワクチン産物（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００６−００−ＶＰ）の前臨床安全性試験に基づいて臨床試験に進めるために選択された。これらのプラスミド産物の生物学的安全性試験、並びに候補ワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ（ＢＢ−ＩＮＤ  １０６８１）及びＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ間の高度の相同性に基づいて、６プラスミドワクチンはヒト臨床試験に関して安全であることが確定された。
【００８１】
治療方法
本明細書中に記載されるＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、治療的、例えば予防的投与（例えばワクチン）に用いるための薬学的組成物（薬剤）として、例えば組合せて用いられ、ＨＩＶの１つ又は複数の分岐群又は系統に対する免疫応答を誘導するために被験体（例えばヒト被験体）に投与される。例えば本明細書中に記載される組成物は、ウイルス感染又はウイルスの複製を抑制するために、ＨＩＶへの感染の前にヒト（又は非ヒト）被験体に投与される。従って上記薬学的組成物は、ＨＩＶに対する防御的免疫応答を誘導するために被験体に投与される。免疫応答を誘導するために、治療的有効（例えば免疫学的有効）量の核酸コンストラクトが、、ヒト（又は非ヒト）被験体のような被験体に投与される。
【００８２】
「治療的有効量」とは、治療対象の被験体において目的の作用を達成するために用いられる化学的組成物（核酸コンストラクト又はベクターなど）の量である。例えばこれは、抗体又はＴ細胞応答を誘導するために、或いはウイルス感染又はウイルスの複製を抑制するか又は防止するために、或いはウイルス感染により引き起こされる症候を防止、減少又は改善するために、適切な量の抗原を発現するのに必要な量である。被験体に投与される
場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を達成するよう経験的に決定される標的組織又は全身濃度を達成する投薬量が一般に用いられる。このような投薬量は、過度の実験を伴わずに、当業者により決定される。例示的な投薬量は、実施例に詳細に記載される。
【００８３】
ＨＩＶコード核酸コンストラクトを含む薬学的組成物は、筋肉内、皮下、又は静脈内注射のように当業者に既知の任意の手段（Banga, A., "Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins," Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995；DNA Vaccines: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine), Douglas B. Lowrie and Robert G. Whalen (Eds.), Humana Press, 2000参照）により投与されるが、しかし経口、鼻又は肛門投与も意図される。一実施形態では、投与は皮下又は筋肉内注射による。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知であるか又は明らかであり、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995のような出版物に更に詳細に記載されている。
【００８４】
核酸コンストラクトに適切な処方物、例えば本明細書中に開示されるプライマー又は追加免疫組成物としては、酸化防止剤、緩衝剤及び静菌剤を含有してもよい水性及び非水性溶液等張滅菌溶液、並びに沈殿防止剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含有してもよい水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。処方物は、アンプル及びバイアルのような単位量又は複数回量の密封容器に存在し、フリーズドライ（凍結乾燥）条件中で保存され、使用直前に滅菌液体担体、例えば水を加えるだけでよい。その場で調合する溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。好ましくは担体は、緩衝生理食塩溶液である。更に好ましくは、本発明の方法において用いる組成物は、投与前に核酸コンストラクトが損傷しないよう処方される。例えば組成物は、発現ベクターを調製、保存又は投与するために用いられる、ガラス容器、注射器又は針のような用具によってアデノウイルスベクターの損失を低減するよう処方され得る。組成物は、構成成分の光感受性及び／又は温度感受性を低減するよう処方される。この目的のために、組成物は好ましくは薬学的に許容可能な液体担体、例えば上記のようなもの、並びにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース及びそれらの組合せから成る群から選択される安定剤を含む。このようなアデノウイルスベクター組成物の使用は、ベクターの保存寿命を延長し、投与を促し、そして本発明の方法の効率を増大する。アデノウイルスベクター含有組成物の処方は更に、例えば米国特許第６，２２５，２８９号、第６，５１４，９４３号、米国特許出願公開第２００３／０１５３０６５  Ａ１号、及び国際特許出願公開ＷＯ００／３４４４４に記載されている。アデノウイルスベクター組成物はまた、形質導入効率を増強するよう処方される。更に、組成物はその他の治療的又は生物学的に活性な物質を含み得ると当業者は理解するであろう。例えば、イブプロフェン又はステロイドのような炎症を制御する因子は、アデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ投与に関連した腫脹及び炎症を低減するためのアデノウイルスベクター組成物の一部である。本明細書中で考察されるように、免疫系刺激剤は、抗原に対する任意の免疫応答を増強するために投与される。抗生物質、即ち殺微生物薬及び殺真菌薬は、既存の感染を治療し、且つ／又は遺伝子移入手法に関連した感染のようなさらなる感染の危険を低減するために存在する。
【００８５】
組成物は、治療的処置のために投与される。治療的適用においては、ＨＩＶへの暴露又はそれへの感染の前又は後に、治療的有効量の組成物が被験体に投与される。曝露前に投与される場合、治療的適用は、予防的投与（例えばワクチン）と呼ばれる。組成物の１回又は複数回投与は、被験体に必要とされ、且つ耐容されるような投薬量及び頻度によって投与される。一実施形態では、投薬量はボーラスとして１回投与されるが、しかし別の実施形態では、防御的免疫応答のような治療結果が達成されるまで、定期的に適用される。一般に、用量は、被験体が許容不可能な毒性を生じることなく、疾患の症候又は兆候を治
療するか又は改善するのに十分である。全身又は局所投与が利用される。
【００８６】
制御放出非経口処方物は、移植片、油状注射液として、又は粒子系として作製される。粒子系としては、ミクロスフィア、ミクロ粒子、ミクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフィア、及びナノ粒子が挙げられる。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフィア及びミクロカプセルは、一般にそれぞれナノ粒子、ナノスフィア及びナノカプセルと呼ばれる。毛管は、ナノ粒子のみが静脈内に投与されるよう、約５μｍの直径を有する。ミクロ粒子は、通常直径約１００μｍであり、皮下又は筋肉内に投与される（Kreuter, Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 219-342ページ, 1994；Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus,
ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 315-339ページ, 1992参照）。
【００８７】
特定の実施形態では、薬学的組成物はアジュバントを含む。アジュバントは、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムの懸濁液のような抗原が吸着する無機物であるか、又は抗原溶液が油中に乳化される（ＭＦ−５９、フロイント不完全アジュバント）油中水水型乳濁液、時としては抗原性を更に増強する（抗原の分解を抑制する且つ／又はマクロファージの流入を引き起こす）ために死菌マイコバクテリアの封入を伴う（フロイント完全アジュバント）油中水型乳濁液であり得る。核酸ワクチンにおいては、生得免疫に関与する受容体と結合し、それを刺激する天然又は合成免疫刺激性組成物が、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトとともに投与される。例えば特定のトール様受容体（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９など）を刺激する物質が、ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトと組合せて投与される。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドと組合せて投与される。
【００８８】
ＨＩＶ抗原ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、裸ＤＮＡプラスミドとしてｉｎ  ｖｉｖｏで導入される。ＤＮＡベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション（例えば経皮エレクトロポレーション）、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用又はＤＮＡベクター運搬体の使用のような当該技術分野で既知の方法により、目的のの宿主細胞中に導入されるが、これらの方法に限定されない。（例えばWu他、 J. Biol. Chem., 267: 963-967ページ, 1992；Wu 及び Wu、 J. Biol. Chem., 263: 14621-14624ページ, 1988；及びWilliams他、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730ページ, 1991を参照）。実施例において詳細に記載されるように、治療用核酸コンストラクトをｉｎ  ｖｉｖｏで導入するために、Biojector（登録商標）無針注射装置のような無針デリバリー装置が利用される。受容体媒介性ＤＮＡデリバリーアプローチも用いられる（Curiel他、 Hum. Gene Ther., 3: 147-154ページ, 1992；及びWu 及び Wu、 J. Biol. Chem., 262: 4429-4432ページ, 1987）。哺乳類筋肉組織に裸ＤＮＡを処方し、投与するための方法は、米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，５８９，４６６号に開示されており、これらの記載内容はともに参照により本明細書中で援用される。陽イオン性オリゴペプチド（例えばＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えばＷＯ９６／２５５０８）又は陽イオン性ポリマー（例えばＷＯ９５／２１９３１）のような他の分子も、ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクションを促すために有用である。
【００８９】
或いは、ＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクトを細胞中に導入するために、エレクトロポレーションを利用するのが便利である。エレクトロポレーションは当業者に既知である（例えば：Lohr他 Cancer Res. 61: 3281-3284ページ, 2001；Nakano他、 Hum Gene Ther. 12: 1289-1297ページ, 2001；Kim他、 Gene Ther. 10: 1216-1224ページ, 2003；Dean他、 Gene Ther. 10: 1608-1615ページ, 2003；及びYoung他、 Gene Ther 10: 1465-1470ページ, 2003参照）。例えばエレクトロポレーションにおいて、高濃度のベクター
ＤＮＡが宿主細胞（単離自己由来末梢血又は骨髄細胞など）の懸濁液に加えられ、混合物は電場で通電される。経皮エレクトロポレーションは、ｉｎ  ｖｉｖｏで固形組織（筋肉など）の細胞中に非相同核酸を導入するために、動物及びヒトに利用される。通常、例えば１つ又は複数の電気パルスを送達するための電極とともに針又は外套針を用いて、ＤＮＡを含有する溶液を標的組織中に導入することにより、核酸コンストラクトがｉｎ  ｖｉｖｏで組織中に導入される。例えば一連の電気パルスは、例えば１００Ｖで５０ｍｓｅｃの３〜１０回のパルスで、トランスフェクションを最適化するために利用される。いくつかの場合、複数回のセッション又は投与が実施される。
【００９０】
ＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクトを宿主細胞中に導入するために用いられる別の既知の方法は、粒子衝撃（バイオリスティック形質転換としても既知）である。バイオリスティック形質転換は一般に、いくつかの方法のうちの１つで成し遂げられる。一つの一般的な方法は、細胞に不活性又は生物学的に活性な粒子を噴射することを含む。この手法は、例えば米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号及び第５，１００，７９２号（全てSanford他による）に開示されており、これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される。この手法は一般的に、細胞の外表面を貫通し、粒子を内部に組み入れられるのに有効な条件下で、細胞に不活性又は生物学的に活性な粒子を噴射することを含む。不活性粒子が利用される場合、外因性ＤＮＡを含有するプラスミドで粒子をコーティングすることにより、プラスミドは細胞中に導入される。或いは標的細胞はプラスミドに取り囲まれ、プラスミドが粒子の通った跡により細胞中に運搬される。
【００９１】
或いはベクターはリポフェクションによりｉｎ  ｖｉｖｏで導入される。過去１０年間に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける核酸の封入及びトランスフェクションのためのリポソームの使用が増大してきた。リポソーム媒介性トランスフェクションに伴って生じる困難及び危険を限定するために設計される合成陽イオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションのためにリポソームを調製するために用いられる（Felgner他、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417ページ, 1987；Mackey他、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-8031ページ, 1988；Ulmer他、 Science 259: 1745-1748ページ, 1993）。陽イオン性脂質の使用は負荷電核酸の封入を促進し、負荷電細胞膜との融合を促す（Felgner 及び Ringold Science 337: 387-388ページ, 1989）。核酸の導入に特に有用な脂質化合物及び組成物は、ＷＯ９５／１８８６３及びＷＯ９６／１７８２３に、そして米国特許第５，４５９，１２７号に記載されており、これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される。
【００９２】
他の実施形態では、核酸コンストラクトはウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用するための方法は、当該技術分野で既知である（例えばMiller 及び Rosman, BioTech., 7: 980-990ページ, 1992参照）。好ましくはウイルスベクターは複製欠陥性であり、即ちそれらは標的細胞中で自律的に複製できない。概して、本開示の範囲内で用いられる複製欠陥性ウイルスベクターのゲノムは、感染細胞中におけるウイルスの複製に必要である少なくとも１つの領域を欠く。これらの領域は、当業者に既知の任意の手法により、（全部又は一部）が除去されるか、又は非機能性にされる。これらの手法は、全体的除去、（他の配列による、特に挿入核酸による）置換、（複製のために）必須な領域に対する１つ又は複数の塩基の部分的欠失又は付加を含む。このような手法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される（例えば単離ＤＮＡに関して）。
【００９３】
いくつかの場合には、複製欠陥性ウイルスは、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要なゲノムの配列を保持する。ＤＮＡウイルスベクターは一般に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、モロニー白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む弱毒化又は欠損ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定
されない。ウイルス遺伝子を完全に又はほぼ完全に欠く欠損ウイルスは、細胞中への導入後は感染性でないので好ましい。欠損ウイルスベクターの使用は、ベクターが他の細胞を感染し得るという問題を伴わずに、特定の局在化領域での細胞への投与を可能にする。従って特定組織を、特に標的とすることが可能である。特定ベクターの例としては、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Kaplitt他、 Mol. Cell. Neurosci., 2: 320-330ページ, 1991）、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠く欠損ヘルペスウイルスベクター（例えば特許公開ＲＤ３７１００５Ａ参照）、又は他の欠損ヘルペスウイルスベクター（例えばＷＯ９４／２１８０７及びＷＯ９２／０５２６３参照）； Stratford-Perricaudet他（J. Clin. Invest., 90: 626-630ページ 1992；La Salle他、 Science 259: 988-990ページ, 1993）により記載された弱毒化アデノウイルスベクター；及び欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Samulski他、 J. Virol., 61: 3096-3101ページ, 1987；Samulski他、 J. Virol., 63: 3822-3828ページ, 1989；及びLebkowski他、 Mol. Cell. Biol., 8: 3988-3996ページ, 1988）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
一実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、開示の核酸を種々の細胞型に効率的に送達するよう改変することができる真核生物ＤＮＡウイルスである。アデノウイルスの種々の血清型が存在する。これらの血清型のうち、２型又は５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）、或いは動物起源のアデノウイルス（例えばＷＯ９４／２６９１４参照）に対して本開示の範囲内で選択される。本開示の範囲内で用いられ得る動物起源のアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１、Beard他、 Virol., 75-81ページ, 1990）、ヒツジ、ブタ、鳥類及びサル（例えばＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、動物起源のアデノウイルスは、ＣＡＶ２アデノウイルス（例えばマンハッタン又はＡ２６／６１系統（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００））のようなイヌアデノウイルスである。
【００９５】
本明細書中に記載される複製欠損性アデノウイルスベクターとしては、ＩＴＲ、キャプシド形成配列及び該ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターの少なくともＥ１領域は非機能性である。Ｅ１領域における欠失は、好ましくはＡｄ５アデノウイルスの配列中のヌクレオチド４５５〜３３２９（ＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片）、又は３８２〜３４４６（ＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａ断片）から伸長する。他の領域、特にＥ３領域（例えばＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（例えばＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（例えばＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９及びＷＯ９５／０２６９７）、又は後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれかの領域も改変され得る。
【００９６】
他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域における欠失を有する（Ａｄ１．０）。Ｅ１−欠失アデノウイルスの例は、ＥＰ１８５，５７３に開示されており、この記載内容は参照により本明細書中で援用される。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ１及びＥ４領域における欠失を有する（Ａｄ３．０）。Ｅ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの例は、ＷＯ９５／０２６９７及びＷＯ９６／２２３７８に開示されている。
【００９７】
本開示による複製欠損性組換えアデノウイルスは、当業者に既知の任意の手法により調製される（例えばLevrero他、 Gene 101: 195ページ, 1991；ＥＰ  １８５５７３；及びGraham EMBO J., 3: 2917ページ, 1984参照）。特にそれらは、目的のＤＮＡ配列を含むアデノウイルス及びプラスミド間の相同組換えにより調製される。相同組換えは、適切な細胞株中へのアデノウイルス及びプラスミドの同時トランスフェクション後に成し遂げられる。用いられる細胞株は、好ましくは（ｉ）用いられる因子により形質転換可能であり、そして（ｉｉ）組換えの危険を回避するために好ましくは組込まれた形態で、複製欠損性アデノウイルスのゲノムの一部と相補的でありる配列を含有する。用いられる細胞株の例は、ヒト胚性腎細胞株２９３（Graham他、 J. Gen. Virol. 36: 59ページ, 1977）であり、これはそのゲノム中に組み込まれたＡｄ５アデノウイルスのゲノムの左手部分（１２％
）を含有し、出願ＷＯ９４／２６９１４及びＷＯ９５／０２６９７に記載されたようなＥ１及びＥ４機能を補足し得る細胞株である。組換えアデノウイルスは、当業者に既知である標準的な分子生物学的手法を用いて回収、精製される。ＨＩＶ抗原をコードする核酸は、例えばレンチウイルスベクター又はアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのレトロウイルスベクターのような他のウイルスベクターを用いても導入される。
【００９８】
実施例に詳細に記載されるように、一実施形態では、ＨＩＶの複数の分岐群又は系統の抗原ポリペプチドに対応するＨＩＶ抗原をコードする核酸コンストラクトを含む薬学的組成物は、ＨＩＶへの曝露前に被験体中に導入されて、防御的免疫応答を誘導する。通常、核酸コンストラクトはプラスミドである。例えば、異なるＨＩＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含むいくつかのプラスミドは、薬学的組成物中に含まれる。例えば、異なるＨＩＶ分岐群又は系統の抗原ポリペプチドをコードする一群のプラスミドは、複数の分岐群又は系統のＨＩＶへの感染に対して防御する免疫を誘導するために組成物中に含まれる。例示的な一実施形態では、組成物は６つのプラスミドを含む。プラスミドの各々は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原ポリペプチドの発現を促進する転写調節配列と機能可能な状態で連結された、異なるＨＩＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例えば組成物は、Ｇａｇポリペプチド、Ｐｏｌポリペプチド、Ｎｅｆポリペプチド、及び任意の異なる分岐群又は系統のＥｎｖポリペプチド（例えば分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチド、分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチド及び／又は分岐群Ｃポリペプチド）をコードする異なるプラスミドを含む。特定の一実施形態では、ワクチン組成物は、６つのプラスミド（ぞれぞれ配列番号１〜６により表わされるＶＲＣ４４０９、ＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０４、ＶＲＣ５７３６、ＶＲＣ５７３７及びＶＲＣ５７３８）を含む。この特定の実施形態はＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰと呼ばれ、実施例に更に詳細に記載される。
【００９９】
典型的にはマルチプラスミド組成物は、実質的に等しい比率（例えば約１：１：１：１：１：１）で６つのプラスミドを含む。薬学的組成物は、１回又は複数回量で被験体に投与される。用量範囲は、被験体の身体的、代謝的及び免疫学的特質によって変えられるが、しかしながら少なくとも約１ｍｇ及び約１２ｍｇ以下の用量が通常投与される。例えば１回量は、少なくとも約２ｍｇ、又は少なくとも約３ｍｇ、又は少なくとも約４ｍｇの複合ＤＮＡである。通常、１回量は、約６ｍｇ、又は約８ｍｇ又は約１０ｍｇの複合ＤＮＡを超えない。実施例に記載されるように、約４ｍｇの複合プラスミド重量という用量が、典型的には免疫が正常な成人における防御的免疫応答を誘導するために有効である。
【０１００】
１回量又は時間間隔をおいて分けられる複数回量は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘導するために投与される。例えば２回量又は３回量又は４回量又は５回量又は６回量又はそれ以上が、数週間、数ヶ月にわたって又は数年にわたって被験体に投与され、免疫応答を最適化する。
【０１０１】
いくつかの場合、核酸コンストラクトを含む薬学的組成物、例えばマルチプラスミドワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰが、ＤＮＡワクチン初回刺激としてそれを用い、その後、アデノウイルスベクター追加免疫される組合せ療法処方に含まれる。初回刺激−追加免疫処方は、ＨＩＶ感染の非ヒト霊長類モデルにおいて有望であることを示している。このような処方は、高レベルの免疫応答を誘導する能力を有する。例えばアデノウイルスベクター組成物のアデノウイルスベクターによりコードされるＨＩＶ抗原と同一である少なくとも１つのＨＩＶ抗原をコードする１つ又は複数の核酸コンストラクトを含む「初回刺激」組成物が、被験体に投与される。例えば初回刺激組成物は、１つ又は複数のアデノウイルスベクターを含む「追加免疫」組成物の投与の少なくとも約１週間前に投与される。初回刺激組成物（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰなど）の１つ又は複数の核酸配列は、遺伝子導入ベクターの一部又は裸ＤＮＡとして投与される。任意の遺伝子導入ベクターが初回刺激組成物中に用いられ、例としてはプラスミド、レトロウイ
ルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な一実施形態では、導入ベクターはプラスミドである。
【０１０２】
従って上記のマルチプラスミド組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答を初回刺激するために、ＨＩＶ抗原をコードする１つ又は複数のアデノウイルスベクターを含む組成物の投与と組合せて用いられる。例えばアデノウイルスベクター組成物は、（ｉ）例えばＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆポリペプチドをコードする融合タンパク質のようなポリタンパク質又は融合タンパク質として、２つ以上のＨＩＶ抗原をコードする単一アデノウイルスベクターを含む。或いはアデノウイルスベクター組成物は、（ｉｉ）各々がＥｎｖポリペプチドのような単一のＨＩＶ抗原をコードする、２つ以上、例えば３、又は４つ以上のアデノウイルスベクターのような１つのＨＩＶ抗原をコードするマルチアデノウイルスベクターを含む。構成（ｉ）と一致して、３つ以上の異なるＨＩＶ抗原（例えば３つ以上、４つ以上、或いは５つ以上の異なるＨＩＶ抗原）をコードするか又は同一抗原のマルチコピーをコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクターを用いることは、本発明の範囲内であるが、アデノウイルスベクターが少なくとも２つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードすることを条件とする。同様に、構成（ｉｉ）と一致して、各々が異なるＨＩＶ抗原又は同一抗原のマルチコピーをコードするいくつかの核酸配列（例えば３つ以上、４つ以上、或いは５つ以上の異なる核酸配列）を含むアデノウイルスベクターを用いることは本発明の範囲内であるが、アデノウイルスベクターが少なくとも２つの異なるＨＩＶ抗原をコードすることを条件とする。構成（ｉ）であっても（ｉｉ）であっても、アデノウイルスベクター組成物は、好ましくは、３つ以上、或いは４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ又は複数のアデノウイルスベクターを含む（例えばこの場合、各ベクターは、３つ以上、或いは４つ以上の異なるＨＩＶ抗原をコードする核酸配列を含み、又は各ベクターは、３つ以上、或いは４つ以上の核酸配列を含み、そして各核酸配列は異なるＨＩＶ抗原をコードする）。特定の実施形態では、２つ以上、３つ以上、或いは４つ以上の異なるＨＩＶ抗原は、２つ以上、３つ以上、或いは４つ以上の異なるＨＩＶ分岐群由来のものである。用いられるアデノウイルスベクターの数、或いはそれによりコードされる異なるＨＩＶ抗原の数に上限はない。
【０１０３】
もちろん、アデノウイルスベクターの上記の構成の組合せは、単一の組成物中で用いられ得る。例えば本発明に従って用いられるアデノウイルスベクター組成物は、単一のＨＩＶ抗原をコードする第１のアデノウイルスベクター、並びに第１のアデノウイルスベクターによりコードされるＨＩＶ抗原とは異なる２つ以上のＨＩＶ抗原をコードする第２のアデノウイルスベクターを含み得る。本明細書中に開示されるアデノウイルスベクター構成の他の同様の組合せ及び順列は、当業者により容易に決定される。
【０１０４】
特定の実施形態では、追加免疫組成物はマルチアデノウイルスベクターを含む。例えば追加免疫は、その各々が異なる分岐群又は系統のＥｎｖポリペプチドのようなＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドをコードする複数のアデノウイルスベクターを含み得る。更に、追加免疫組成物は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及び／又はＮｅｆポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含み得る。特定の一実施形態では、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１４−００ＶＰと呼ばれる追加免疫組成物は、４つのアデノウイルスベクターを含み、そのうちの３つは異なる分岐群（即ち分岐群Ａ、分岐群Ｂ及び分岐群Ｃ）のＥｎｖポリペプチドをコードし、そして１つのアデノウイルスベクターはＧａｇ及びＰｏｌ抗原（分岐群Ｂ）をコードする。もちろん、より少ない又はより多いアデノウイルスベクターを組み込む、及び／又は同一若しくは異なるＨＩＶ分岐群又は系統の抗原をコードする複数のバリアントが当業者により容易に設計される。
【０１０５】
追加免疫組成物の１つ又は複数の核酸配列によりコードされるＨＩＶ抗原はしばしば初
回刺激組成物の核酸コンストラクトによりコードされるＨＩＶ抗原と同一であるが、しかしいくつかの実施形態では、アデノウイルスベクター組成物によりコードされる抗原とは異なるＨＩＶ抗原をコードする１つ又は複数の核酸配列を含む初回刺激組成物を用いるのが適切である。例えば異なる分岐群又は系統のＧａｇ及び／又はＰｏｌ及び／又はＮｅｆ抗原、或いは異なる分岐群又は系統のＥｎｖ抗原。
【０１０６】
初回刺激組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答を初回刺激するために哺乳類に投与される。２回以上の用量のプライマー組成物は、任意の適切な時間枠（例えば追加免疫前少なくとも約１週間、２週間、４週間、８週間、１２週間、１６週間、又はそれより長い期間）で提供される。好ましくは初回刺激組成物は、追加免疫組成物の投与の少なくとも３ヶ月（例えば３、６、９、１２ヶ月又はそれ以上）前に哺乳類に投与される。最も好ましくは初回刺激組成物は、追加免疫組成物の投与の少なくとも約６ヶ月〜約９ヶ月前に哺乳類に投与される。２回以上の用量の追加免疫投与は、免疫を保持するために任意の適切な時間枠で提供される。
【０１０７】
哺乳類にアデノウイルスベクター組成物及び／又は初回刺激組成物をデリバリーするために、任意の投与経路が用いられる。実際、アデノウイルスベクター組成物及び／又は初回刺激組成物を投与するために２つ以上の経路が用いられるが、しかし特定経路は、別の経路より即時的且つより有効な反応を提供し得る。最も一般的には、アデノウイルスベクター組成物及び／又は初回刺激組成物は、筋肉内注射により投与される。アデノウイルスベクター組成物及び／又は初回刺激組成物は、体腔中に注入されるか又は滴注され、皮膚を通して吸収され（例えば経皮パッチにより）、吸入され、摂取され、組織に局所的に適用されるか、或いは例えば静脈内、腹腔内又は動脈内投与により非経口的に投与される。
【０１０８】
アデノウイルスプライマー組成物及び／又は追加免疫組成物は、スポンジ、生体適合性網目構造物、機械的レザバー、又は機械的埋込み物のような、制御又は持続的放出が可能な装置を用いて投与される。埋込み物（例えば米国特許第５，４４３，５０５号参照）、例えば高分子組成物で構成される機械的レザバー又は埋込み物又は装置などの埋込み可能装置のような装置（例えば米国特許第４，８６３，４５７号参照）は、組成物の投与のために特に有用である。アデノウイルスベクター組成物及び／又は初回刺激組成物は、例えばゲル発泡体、ヒアルロン酸、ゼラチン、硫酸コンドロイチン、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタレート（ＢＨＥＴのようなポリホスホエステル、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含む持続性放出処方物（例えば米国特許第５，３７８，４７５号参照）の形態でも投与される。
【０１０９】
追加免疫組成物は、少なくとも約１×１０5粒子（粒子単位とも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの１回量を含む。この用量は、好ましくは少なくとも約１×１０6粒子（例えば約１×１０6〜１×１０12粒子）、更に好ましくは少なくとも約１×１０7粒子、更に好ましくは少なくとも約１×１０8粒子（例えば約１×１０8〜１×１０11粒子又は約１×１０8〜１×１０12粒子）、そして最も好ましくは少なくとも約１×１０9粒子（例えば約１×１０9〜１×１０10粒子又は約１×１０9〜１×１０12粒子）、或いは少なくとも約１×１０10粒子（例えば約１×１０10〜１×１０12粒子）のアデノウイルスベクターである。或いはこの用量は、約１×１０14粒子以下、好ましくは約１×１０13粒子以下、更に好ましくは約１×１０12粒子以下、更に好ましくは約１×１０11粒子以下、そして最も好ましくは約１×１０10粒子以下（例えば約１×１０9粒子以下）を含む。言い換えれば、アデノウイルスベクター組成物は、例えば約１×１０6粒子単位（ｐｕ）、２×１０6ｐｕ、４×１０6ｐｕ、１×１０7ｐｕ、２×１０7ｐｕ、４×１０7ｐｕ、１×１０8ｐｕ、２×１０8ｐｕ、４×１０8ｐｕ、１×１０9ｐｕ、２×１０9ｐｕ、４×１０9ｐｕ、１×１０10ｐｕ、２×１０10ｐｕ、４×１０10ｐｕ、１×１０11ｐｕ、２×１０11ｐｕ、４×１０11ｐｕ、１×１０12ｐｕ、２×１０12ｐｕ又は４×１０
12ｐｕのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの１回用量を含む。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：プラスミドの構築
核酸コンストラクトは、ヒトＣＭＶ最初期（ＩＥ）エンハンサー、プロモーター及びイントロンを含む親１０１２ＤＮＡワクチンプラスミドから得られる。ＣＭＶ／Ｒ調節エレメントを構築するために、ＣＭＶ  ＩＥイントロンの大多数を含有する１０１２プラスミドのＳａｃＩＩ／ＨｐａＩ断片を、ＨＴＬＶ−１  Ｒ領域の２２７ｂｐ  ＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片で置換した（Seiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3618-3622ページ, 1983年）。生じたＣＭＶ／Ｒプラスミドは、ヒトＣＭＶ  ＩＥエンハンサー／プロモーターを、その後にＨＴＬＶ−１  Ｒ領域及びＣＭＶ  ＩＥ３’イントロンの１２３ｂｐ断片を含有する。Ｒ領域におけるスプライス・ドナー及びＣＭＶ  ＩＥ３’イントロンにおけるスプライス・アクセプターは、一対のスプライシング・シグナルとして働く。同様に、ＣＭＶ／ＲプラスミドのＣＭＶエンハンサー／プロモーター領域をラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー／プロモーターの３８１ｂｐ  ＡｆｌＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片又はマウスユビキチンＢ（ｍＵＢ）エンハンサー／プロモーターの８４２ｂｐ  ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＶ断片でそれぞれ置換することにより、ＲＳＶ／Ｒ及びｍＵＢ／Ｒプラスミドを構築した。ｍＵＢエンハンサー／プロモーターは、前に記載されている（Yew他、 Mol. Ther. 4: 75-82ページ, 2001年）。
【０１１１】
ＣＭＶ／Ｒ分岐群Ｂ  Ｇａｇ／ｈ（ＶＲＣ−４４０１）の構築
図１に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−４４０１を構築するために、ＨＸＢ２（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｋ０３４５５）由来のｇａｇポリタンパク質のアミノ酸配列（Ｐｒ５５、アミノ酸１〜４３２）を、ヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを用いてｇａｇ遺伝子の合成バージョンを作製するために用いた。合成ｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列はＨＸＢ２遺伝子との相同性をほとんど示さないが、しかしコードされるタンパク質は同一である。Ｇａｇ（Ｂ）をコードする合成遺伝子を含むＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＶＲ１０１２主鎖中に同一インサートを含むプラスミドＶＲＣ３９００から切り出し、上記のＣＭＶ／Ｒ主鎖のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩサイト中にクローニングした。予測されるＶＲＣ−４４０１ドメインの概要を、表２に示す。プラスミドは５８８６ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ３．９ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−４４０１の配列は、配列番号１で示される。
【０１１２】
【表２】
2008508866.tif 000003
【０１１３】
ＣＭＶ／Ｒ分岐群Ｂ  Ｐｏｌ／ｈ（ＶＲＣ−４４０９）の構築
図２に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−４４０９を構築するために、ＮＬ４−３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｍ１９９２１）由来のＰｏｌポリタンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸３〜１００３）を、ヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを用いてｐｏｌ遺伝子の合成バージョンを作製するために用いた。Ｐｏｌの冒頭部分で翻訳を開始させるために、メチオニンコドンを合成ポリメラーゼ遺伝子の５’末端に付加して、Ｐｏｌ／ｈ遺伝子を作製した。更にプロテアーゼ（ＰＲ）突然変異をアミノ酸５５３に導入し（ＡＧＧ→ＧＧＣ又はアミノ酸Ｒ→Ｇ）、逆転写酵素（ＲＴ）突然変異をアミノ酸７７１に導入し（ＧＡＣ→ＣＡＣ又はアミノ酸Ｄ→Ｈ）、そしてインテグラーゼ（ＩＮ）突然変異をアミノ酸１２０９に導入した（ＡＣＴ→ＣＡＴ又はアミノ酸Ｄ→Ａ）。Ｐｏｌを発現する遺伝子を、上記のＣＭＶ／Ｒ主鎖中に導入した。予測されるＶＲＣ−４４０９ドメインの概要を、表３に示す。プラスミドは７３４４ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ４．８ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−４４０９の配列は、配列番号２で示される。
【０１１４】
【表３】
2008508866.tif 000004
【０１１５】
ＣＭＶ／Ｒ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ／ｈ（ＶＲＣ−４４０４）の構築
図３に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−４４０４を構築するために、ＨＩＶ−１  ＮＹ５／ＢＲＵ（ＬＡＶ−１）クローンｐＮＬ４−３（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｍ１９９２１）由来のＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列を、ヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを用いてＮｅｆ遺伝子の合成バージョン（Ｎｅｆ／ｈ）を作製するために用いた。ヌクレオチド配列Ｎｅｆ／ｈはウイルス遺伝子との相同性をほとんど示さないが、コードされるタンパク質は同一である。ミリストール部位（ＧＧＣ−Ｇｌｙ、アミノ酸２〜３）を欠失させた。Ｎｅｆをコードする断片を、それが元々挿入されていたｐＶＲ１０１２主鎖から、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化して、上記のＣＭＶ／Ｒ主鎖のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩサイト中にクローニングした。予測されるＶＲＣ−４４０４ドメインの概要を、表４に示す。プラスミドは５０３９ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ３．３ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−４４０４の配列は、配列番号３で示される。
【０１１６】
【表４】
2008508866.tif 000005
【０１１７】
ＣＭＶ／Ｒ−ＨＩＶ−１分岐群Ａ  Ｅｎｖ／ｈ（ＶＲＣ−５７３６）
図４に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−５７３６を構築するために、９２ｒｗ０２０（Ｒ５向性、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｕ０８７９４）由来のエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）のアミノ酸配列を、ヒト細胞中での発現のために改変されたコドンを用いて遺伝子の合成バージョン（分岐群Ａ  ｇｐ１４５ｄｅｌＣＦＩ）を作製するために用いた。ヒト細胞中に典型的に見出されるコドンを用いることにより、タンパク質発現を制限するウイルスＲＮＡ構造を破壊するよう意図された配列を用いてＨＩＶ−１遺伝子を発現するプラスミドを合成的に製造した。ヌクレオチド配列Ｒ５ｇｐ１４５ｄｅｌＣＦＩは９２ｒｗ０２０遺伝子との相同性をほとんど示さないが、コードされるタンパク質は同一である。切頭化エンベロープポリタンパク質は、全ＳＵタンパク質及びＴＭドメインを含有するが、融合ドメイン及び細胞質ドメインを欠く。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１、Ｈｅｐｔａｄ２及びそれらの間空（ＩＳ）は、オリゴマー形成に関与する。アミノ酸４８６〜５１９からなる融合及び切断（Ｆ／ＣＬ）ドメインは欠失している。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１及び２間のアミノ酸５７６〜６０４からなる間空（ＩＳ）は欠失している。ＸｂａＩ（ＡＴＧから１８ヌクレオチド上流）〜ＢａｍＨ１（ＡＴＧから１９１２ヌクレオチド下流）断片は、５’末端のポリリンカー、コザック配列及びＡＴＧを含有しており、これを上記のＣＭＶ／Ｒ主鎖のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイト中にクローニングした。予測されるＥｎｖ  ＡのＶＲＣ−５７３６ドメインの概要を、表５に示す。プラスミドは６３０５ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ４．２ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−５７３６の配列は、配列番号４で示される。
【０１１８】
【表５】
2008508866.tif 000006
【０１１９】
ＣＭＶ／Ｒ  分岐群Ｂ  Ｅｎｖ／ｈ（ＶＲＣ−５７３７）の構築
図５に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−５７３７を構築するために、ＨＸＢ２（Ｘ４向性、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｋ０３４５５）由来のエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）のアミノ酸配列を、ヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを用いて遺伝子の合成バージョン（Ｘ４ｇｐ１６０／ｈ）を作製するために用いた。ヌクレオチド配列Ｘ４ｇｐ１６０／ｈはＨＸＢ２遺伝子との相同性をほとんど示さないが、コードされるタンパク質は同一で、以下のアミノ酸置換を有する：Ｆ５３Ｌ、Ｎ９４Ｄ、Ｋ１９２Ｓ、Ｉ２１５Ｎ、Ａ２２４Ｔ、Ａ３４６Ｄ及びＰ４７０Ｌ。エンベロープタンパク質（Ｒ５ｇｐ１６０／ｈ）のＲ５向性バージョンを産生するために、Ｘ４ｇｐ１６０／ｈ（ＶＲＣ３３００）由来のＨＩＶ−１エンベロープポリタンパク質のアミノ酸２７５〜３６１をコードする領域を、ＨＩＶ−１のＢａＬ系統（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号Ｍ６８８９３、この場合もヒトの好ましいコドンを用いる）由来の対応する領域で置換した。ｐＲ５ｇｐ１６０／ｈ（ＶＲＣ３０００）由来のエンベロープタンパク質遺伝子の全長Ｒ５向性バージョンを、アミノ酸７０４に関するコドンの後で終結させた。切頭化エンベロープポリタンパク質（ｇｐ１４５）は、全ＳＵタンパク質及び融合ドメインを含むＴＭタンパク質の一部、膜貫通ドメイン、及びオリゴマー形成のために重要な領域を含有する。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１、Ｈｅｐｔａｄ２及びそれらの間空（ＩＳ）は、オリゴマー形成に関与する。アミノ酸５０３〜５３６の融合及び切断（Ｆ／ＣＬ）ドメインは欠失している。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１及び２間のアミノ酸５９３〜６２０からなる間空（ＩＳ）は欠失している。発現ベクター主鎖は、上記のＣＭＶ／Ｒである。予測されるＶＲＣ−５７３７ドメインの概要を、表６に示す。プラスミドは６３３８ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ４．２ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−５７３７の配列は、配列番号５で示される。
【０１２０】
【表６】
2008508866.tif 000007
【０１２１】
ＣＭＶ／Ｒ  ＨＩＶ−１分岐群Ｃ  Ｅｎｖ／ｈ（ＶＲＣ−５７３８）の構築
図６に示したＤＮＡプラスミドＶＲＣ−５７３８を構築するために、９７ＺＡ０１２（Ｒ５向性、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、寄託番号ＡＦ２８６２２７）由来のエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１４５ｄｅｌＣＦＩ）のアミノ酸配列を、ヒト細胞中での発現のために最適化されたコドンを用いて遺伝子の合成バージョン（分岐群Ｃ  ｇｐ１４５ｄｅｌＣＦＩ）を作製するために用いた。ヌクレオチド配列Ｒ５ｇｐ１４５ｄｅｌＣＦＩは遺伝子９７ＺＡ０１２との相同性をほとんど示さないが、コードされるタンパク質は同一である。切頭化エンベロープポリタンパク質は、全ＳＵタンパク質及びＴＭドメインを含有するが、しかし融合ドメイン及び細胞質ドメインを欠く。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１、Ｈｅｐｔａｄ２及びそれらの間空（ＩＳ）は、オリゴマー形成に関与する。アミノ酸４８７〜５２０の融合及び切断（Ｆ／ＣＬ）ドメインは欠失している。Ｈｅｐｔａｄ（Ｈ）１及び２間のアミノ酸５７７〜６０５からなる間空（ＩＳ）は欠失している。ＸｂａＩ（ＡＴＧから１８ヌクレオチド上流）〜ＢａｍＨ１（ＡＴＧから１９１４ヌクレオチド下流）断片は、５’末端のポリリンカー、コザック配列及びＡＴＧを含有しており、これをＣＭＶ／Ｒ主鎖のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩサイト中にクローニングした。予測されるＶＲＣ−５７３８ドメインの概要を、表７に示す。プラスミドは６２９８ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長であり、およそ４．２ＭＤａの分子量を有する。ＶＲＣ−５７３８の配列は、配列番号６で示される。
【０１２２】
【表７】
2008508866.tif 000008
【０１２３】
実施例２：ＣＭＶ／Ｒ転写調節配列によるＨＩＶ抗原ポリペプチドの発現増大
ＣＭＶ／Ｒ転写調節エレメントを含むプラスミド由来の抗原発現を評価するために、３Ｔ３細胞を上記の発現ベクターでトランスフェクトして、ｇｐ１４５ΔＣＦＩ発現をウエスタンブロットにより測定した。ネズミ繊維芽細胞３Ｔ３細胞を、リン酸カルシウムを用いて６−ウェルプレート中で、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５ΔＣＦＩ（９）を発現する０．５μｇの親１０１２（ＣＭＶ）、ＣＭＶ／Ｒ、ＲＳＶ、ＲＳＶ／Ｒ、ｍＵＢ及びｍＵＢ／Ｒ  ＤＮＡワクチンでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０中に溶解した。１０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ｇｐ１４５の発現をウエスタンブロット分析により評価した。ヒトＨＩＶ−ＩｇＧの５０００倍希釈液を一次抗体として利用し、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの５０００倍希釈液を二次抗体として利用した。ブロットを、ＥＣＬウエスタンブロット現像系（Amersham Biosciences, ピスカタウェイ, ニュージャージー州）を用いて現像した。
【０１２４】
ＣＭＶ／Ｒプラスミド由来のｇｐ１４５ΔＣＦＩの発現は、親１０１２プラスミド由来の発現と比べて５〜１０倍高かった（図８）。従って、ＨＴＬＶ−１  Ｒエレメントの付加は、ＣＭＶプロモーターにより促進される抗原発現を実質的に増大した。ｍＵＢプラスミド由来の基本発現は１０１２プラスミド由来のものより高かったが、Ｒエレメントの付加により更に増強されなかった（図８）。このことは、Ｒエレメント付加の効果がプロモーター依存性であることを実証した。ＲＳＶプラスミドと比較して、ＲＳＶ／Ｒにおいて発現の増大が観察された（図８）。ＲＳＶプラスミド由来の発現は、１０１２プラスミド由来のものより決まって低い。
【０１２５】
実施例３：ＣＭＶ／Ｒ多分岐群ＨＩＶワクチンの免疫原性
ＤＮＡプラスミドワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰを含むプラスミドコンストラクト、並びに組換えアデノウイルスベクターワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰを用いたＤＮＡプラスミド初回刺激／アデノウイルスベクター追加免疫投与で、マウス及び非ヒト霊長類において、非臨床免疫原性試験を実行した。免疫した動物からの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮ−γの産生を定量的に測定するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、これらの非臨床的免疫原性試験において細胞性免疫応答を試験した。ＨＩＶ−１抗原（ワクチン中で発現されるタ
ンパク質の長さに及ぶ一連の短い重複ペプチド）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を曝露した。抗原刺激を受けたＴリンパ球により産生されるＩＦＮ−γをアッセイプレートを被覆する抗体と結合させて、アルカリ性ホスファターゼ標識読出しシステムを用いてスポット形成細胞（ＳＦＣ）として比色計で計数することができる。結果を、ＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣとして表す。
【０１２６】
臨床等級ワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ（４プラスミドワクチン、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／０５０３４９９２）又はＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰと組成が同一であるＨＩＶ−１遺伝子を発現するプラスミドを用いて、ＤＮＡプラスミド初回刺激を実施した。前臨床免疫学的試験に用いられる組換えアデノウイルスベクターワクチンは、GenVec, Inc.（ゲイサーズバーグ、メリーランド州）から供給される分岐群Ｂ
ｇａｇ／ｐｏｌ及び分岐群Ａ、Ｂ及びＣ  Ｅｎｖをコードする４つのアデノウイルスベクターから成るＧＭＰ等級ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（ロット番号０２６−０３０１７、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／１２２９１、２００５年４月１２日出願）で構成される。表８は、プラスミドの概要を示す。
【０１２７】
マウス及び非ヒト霊長類で実施した免疫学的試験についての一覧を、表９に示す。
【０１２８】
【表８】
2008508866.tif 000009
【０１２９】
【表９】
2008508866.tif 000010
【０１３０】
ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合タンパク質をコードするＣＭＶ／Ｒプラスミドによるワクチン接種は同一融合タンパク質をコードする非改変１０１２プラスミドより高いＨＩＶ−１特異的細胞性応答をマウスにおいて誘導する
抗原発現の増強がｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれら新規のＤＮＡワクチンの免疫原性を改善する可能性を調べるために、５０μｇの親１０１２ＤＮＡワクチン又はＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５ΔＣＦＩを発現するＣＭＶ／Ｒ、ＲＳＶ／Ｒ、ｍＵＢ、又はｍＵＢ／Ｒ
ＤＮＡワクチンを用いてＢａｌｂ／ｃマウス（Ｎ＝５／群）を免疫した。０、２及び６週目に、マウスを３回免疫した。最終免疫の１０日後に、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイにより、脾臓細胞のＥｎｖ特異的細胞性免疫応答を評価した。ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンは、同一抗原を発現する親１０１２ＤＮＡワクチンと比較して、約２倍高いＣＤ４+（ｐ＝０．１５）及びＣＤ８+（ｐ＝０．０４３）Ｔリンパ球応答を誘導した（図９）。逆に、ＲＳＶ／Ｒ、ｍＵＢ及びｍＵＢ／Ｒ  ＤＮＡワクチンはＣＤ８+免疫応答の増強を誘導しなかったが、これは、ＨＴＬＶ−１  ＲエレメントがＣＭＶプロモーターに関連して、免疫原性を選択的に改善したことを示唆する。
【０１３１】
次に、親１０１２ＤＮＡワクチン及び別の抗原を発現するＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンの免疫原性を比較した。偽プラスミド、又はＨＩＶ−１  Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タ
ンパク質を発現するこれらのＤＮＡワクチンを用いて、マウス（Ｎ＝８／群）を免疫した。０及び６週目に、マウスを２回免疫し、初回免疫又は追加免疫の３週間後に採取した脾臓細胞を用いて、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、細胞性免疫応答を評価した。標準生理食塩水中で希釈されるプラスミドを以下の投与計画を用いて、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（８匹／群）の群を免疫した：
分岐群Ｂ  ｇ−ｐ−ｎ（１０１２）：ＶＲＣ−４３０６（５０μｇ／動物）；このプラスミドは融合タンパク質としてＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆを発現し、４−プラスミドワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ（ＢＢ−ＩＮＤ  １０６８１）中に含入される；
分岐群Ｂ  ｇ−ｐ−ｎ（ＣＭＶ／Ｒ）：ＶＲＣ−４４００（５０μｇ／動物）；このプラスミドは融合タンパク質としてＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆを発現する。
【０１３２】
総計５０μｌのＤＮＡを筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化利用して、０日目のマウス四頭筋に注射した。免疫した２１日後に、免疫学的アッセイのためにマウスを屠殺した。
【０１３３】
ＩＣＳアッセイ。  インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）に関する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔリンパ球応答を評価した。つまり、免疫化マウスから脾臓細胞を採取し、全長ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を網羅する１１アミノ酸（２．５μｇ／ｍｌ）で重複する１５アミノ酸ペプチドのプールと共にインキュベートし、続いて１０μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma, セントルイス, ミズーリ州）で処理した。次に細胞を固定し、透過化処理し、ラット抗マウスＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αモノクローナル抗体（BD Pharmingen, サンディエゴ, カリフォルニア州）を用いて染色した。ＣＤ４+及びＣＤ８+細胞集団中のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α陽性細胞を、ＦｌｏｗＪｏプログラム（Tree Star, アッシュランド, オレゴン州）を用いて分析した。
【０１３４】
脾臓細胞を無菌的に取り出して、ホモジナイズして単一細胞懸濁液を作製した。次に、ワクチン接種マウス由来の脾臓細胞を用いてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施して、ワクチン誘発細胞性免疫応答の大きさを評価した。ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＦＮ−γ（Pharmingen, サンディエゴ, カリフォルニア州）１００μｌ／ウェルで一晩被覆した９６ウェル・マルチスクリーン・プレート（Millipore, ベッドフォード, マサチューセッツ州）を、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．２５％含有する内毒素を持たないダルベッコＰＢＳ（Life Technologies, ゲイサーズバーグ, ミズーリ州）で洗浄し、ＦＢＳを５％含有するＰＢＳを用いて、３７℃で２時間ブロッキングした。プレートをＴｗｅｅｎ−２０を０．２５％含有するダルベッコＰＢＳで３回洗浄し、ＦＢＳを１０％含有するＲＰＭＩ１６４０ですすぎ、プールペプチドを含む反応容積１００μｌ中の５×１０5脾臓細胞／ウェルを用いてインキュベートし、三重反復試験を行った。ＨＩＶ−１
Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆペプチドプール（VRC, ベテスダ, ミズーリ州）を用いて、応答を測定した。１８時間インキュベーションを行った後、プレートを、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むダルベッコＰＢＳで９回、そして蒸留水で１回洗浄した。次に５μｇ／ｍｌのビオチニル化ラット抗マウスＩＦＮ−γ（Pharmingen, サンディエゴ, カリフォルニア州）を７５μｌ／ウェルとなるよう加え、プレートを２時間インキュベートし、コールター洗浄液（Coulter Corporation, マイアミ, フロリダ州）で６回洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰ（Southern Biotechnology Associates, バーミンガム, アラバマ州）の５００倍希釈液を加えて２時間インキュベートした。コールター洗浄液で５回、ＰＢＳで１回洗浄後、プレートをＮＢＴ／ＢＣＩＰ色原体（Pierce, ロックフォード, イリノイ州）で現像して、水道水で洗浄することにより停止させ、乾燥し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Hitech Instruments, エッジモント, ペンシルベニア州）を用いて読み取った。
【０１３５】
標準誤差を伴う平均として、免疫学的データを示す。GraphPad Prismバージョン４．０
１（GraphPad Software, Inc., 2004年）を用いて、統計的分析を実施した。両側ノンパラメトリック・マン・ホイットニー検定により、動物の群間の平均細胞性免疫応答を比較した。すべての場合に、０．０５未満のｐ値は有意であるとみなされた。
【０１３６】
従来の実験と一致して、初回免疫の後の親１０１２ＤＮＡワクチンと比較して、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンにより誘導される約２倍高いＧａｇ（ｐ＝０．０３８）及びＰｏｌ特異的（ｐ＝０．０２０）応答を観察した（図１０Ａ）。追加免疫後、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンにより引き出される応答は、非分画化脾臓細胞（図１０Ｂ）及びＣＤ８欠損脾臓細胞（図１０Ｃ）の両方を用いて親ＤＮＡワクチンにより誘導される応答より約２倍高いままであった。
【０１３７】
カニクイザルのＤＮＡ初回刺激／組換え体アデノウイルスベクター追加免疫の免疫原性
カニクイザルにおいて、親１０１２ＤＮＡワクチンの免疫原性を、多ＨＩＶ−１抗原を発現するＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンと比較した。成体カニクイザルの２つの群（Ｎ＝６／群）を、１０１２の４−プラスミド、又は分岐群Ａ、Ｂ及びＣ由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５ΔＣＦＩを発現するＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチン並びに分岐群ＢからのＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質の１：１：１：３比の混合物を用いて免疫した。この多分岐群多価ＤＮＡワクチンは以前に記載されており、現在、臨床試験で評価されつつある（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ；ＰＣＴ公開番号ＷＯ／０５０３４９９２）。Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質を、別個のプラスミド上でコードされる別個の遺伝子に分離するとこれらの抗原（ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ）に対する免疫応答が更に増大されるか否かを調べるために、第３の群のサルを加えた。この第３の群のサルには、分岐群Ａ、Ｂ及びＣ由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ  ｇｐ１４５、並びに分岐群Ｂ由来の別個のＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質をコードするＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンを１：１：１：１：１：１の比で含む６−プラスミド混合物を投与した。全サルには、０、４及び８週目に、８ｍｇの総ＤＮＡワクチンで３回免疫した。
【０１３８】
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆタンパク質、又はＧａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質、及び分岐群Ａ、Ｂ及びＣ  Ｅｎｖを発現するプラスミドＤＮＡベクター（Althea Technologies, Inc., サンディエゴ、カリフォルニア州）を、ＤＮＡ初回免疫のために用いた。該プラスミドは、４−プラスミドワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ及び６−プラスミドワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ中に含まれるものと同一タンパク質を発現した。
【０１３９】
１０１２プラスミドＶＲＣ４３０６（分岐群Ｂ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ）、ＶＲＣ５３０５（分岐群Ａ  Ｅｎｖ）、ＶＲＣ２８０５（分岐群Ｂ  Ｅｎｖ）、及びＶＲＣ５３０９（分岐群Ｃ  Ｅｎｖ）を用いて、４−プラスミドの組合せを処方した。動物試験における３つの予定された注射のために必要な容積を得るために、３ロットの処方物質を調製した。３ロットを、５０ｍＬコニカルチューブ中で併合した。チューブを数回倒置して混合した後、１５．６〜１５．７ｍＬの混合物を３つの５０ｍＬコニカルチューブ中の各々に分注した。チューブに試験番号、ロット番号、プラスミド番号、チューブ番号及び調製日を書いたラベルを貼った。配分するまでチューブを−２０℃で保存した。
【０１４０】
ＣＭＶ／ＲプラスミドＶＲＣ４４０１（分岐群Ｂ  Ｇａｇ）、ＶＲＣ４４０９（分岐群Ｂ  Ｐｏｌ）、ＶＲＣ４４０４（分岐群Ｂ  Ｎｅｆ）、ＶＲＣ５７３６（分岐群Ａ  Ｅｎｖ）、ＶＲＣ５７３７（分岐群Ｂ  Ｅｎｖ）及びＶＲＣ５７３８（分岐群Ｃ  Ｅｎｖ）を用いて、６−プラスミドの組合せを処方した。動物試験における３つの予定された注射のために必要な容積を得るために、３ロットの処方物質を調製した。３ロットを、滅菌容器中で併合した。容器を数回倒置して混合した後、１６．８ｍＬの混合物を３つの５０ｍＬコニカルチューブ中の各々に分注した。チューブに試験番号、ロット番号、プラスミド番
号、チューブ番号及び調製日を書いたラベルを貼って、配分するまで−２０℃で保存した。
【０１４１】
ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（ロット番号０２６−０３０２４）をｒＡｄ追加免疫として用いた。
【０１４２】
非近交系成体カニクイザル（６匹／群）にＤＮＡワクチン初回刺激をワクチン接種し、Biojectorにより、０、４及び８週目に筋肉内デリバリーした。各々の場合、３号Biojector注射器（ＢＩＯＪＥＣＴ）を用いて、四頭筋への２回の０．５ｍｌ注射としてプラスミドワクチンをデリバリーした。３８週目（群１）及び２４週目（群２）に、針及び注射器により、ｒＡｄワクチン追加免疫を筋肉内デリバリーした。以下のワクチン接種計画で投与した：
群１：１０１２プラスミドＤＮＡ初回刺激（４−プラスミドの組合せ）：分岐群Ｂ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質（４ｍｇ）、分岐群Ａ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）の組合せとしてデリバリーされる８ｍｇの総用量。これは、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ００９−００−ＶＰ臨床産物（ＢＢ−ＩＮＤ  １０６８１）の非ＧＭＰバージョンである。ｒＡｄワクチン追加免疫：ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（１０11ＰＵ総用量；ＧＭＰロット番号０２６−０３０２４）。
群２：ＣＭＶ／ＲプラスミドＤＮＡ（６−プラスミドの組合せ）：分岐群Ｂ  Ｇａｇ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｐｏｌ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｎｅｆ（１．３ｍｇ）、分岐群Ａ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）の組合せとしてデリバリーされる８ｍｇの総用量。これは、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ臨床産物（このＩＮＤ寄託の対象）の非ＧＭＰバージョンである。ｒＡｄワクチン追加免疫：ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（ＧＭＰロット番号０２６−０３０２４）。
群３：ＣＭＶ／ＲプラスミドＤＮＡ（４−プラスミドの組合せ）：分岐群Ｂ  Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質（４ｍｇ）、分岐群Ａ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）の組合せとしてデリバリーされる８ｍｇの総用量。ｒＡｄワクチン追加免疫：ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（ＧＭＰロット番号０２６−０３０２４）。
群４：１０１２プラスミドＤＮＡ（６−プラスミドの組合せ）：分岐群Ｂ  Ｇａｇ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｐｏｌ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｎｅｆ（１．３ｍｇ）、分岐群Ａ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖ（１．３ｍｇ）の組合せとしてデリバリーされる８ｍｇの総用量。ｒＡｄワクチン追加免疫：ＶＲＣ−ＨＩＶＡＤＶ０１４−００−ＶＰ（ＧＭＰロット番号０２６−０３０２４）。
【０１４３】
免疫後４２週目の間に種々の間隔でサルを放血させた。
【０１４４】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、複数のウイルス抗原に対するワクチン誘発性Ｔ細胞免疫応答の発生をモニタリングした。ワクチン免疫原の配列と一致するＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、分岐群Ａ  Ｅｎｖ、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖタンパク質を網羅する１１アミノ酸で重複する１５アミノ酸ペプチドのプールを用いて、各動物に関して別個のアッセイを実施した。内毒素を持たないダルベッコのＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中の５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂ２７；BD Pharmingen）１００μｌ／ウェルで、９６ウェル・マルチスクリーン・プレートを一晩被覆した。次にプレートを、０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＤ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、５％ＦＢＳを含有するＤ−ＰＢＳを用いて、３７℃で２時間ブロッキングし、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０ですすいでＴｗｅｅ
ｎ−２０を除去し、ペプチドプール及び反応容積１００μｌ中の２×１０5ＰＢＭＣと共にインキュベートし、三重反復試験を行った。３７℃で１８時間インキュベーションした後、プレートを、Ｄ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで９回、蒸留水で１回洗浄した。次に２μｇ／ｍｌのビオチニル化ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ（Biosource）と共にプレートを室温で２時間インキュベートし、コールター洗浄液（Beckman-Coulter）で６回洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰ（Southern Biotechnology）の５００倍希釈液で２．５時間インキュベートした。コールター洗浄液で５回、ＰＢＳで１回洗浄後、プレートをＮＢＴ／ＢＣＩＰ色原体（Pierce）で現像し、水道水で洗浄することにより停止させ、乾燥して、ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Hitech Instruments）を用いて読み取った。スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０6ＰＢＭＣを算定した。培地バックグラウンドは、全て＜１５スポット形成細胞／１０6ＰＢＭＣであった。
【０１４５】
Ｅｎｖ分岐群Ａ、Ｅｎｖ分岐群Ｂ、Ｅｎｖ分岐群Ｃ、並びに分岐群Ｂ由来のＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆに対する細胞性免疫応答を、ＣＭＶ（１０１２）（群１）又はＣＭＶ／Ｒ調節エレメント（群３）の制御下で４−プラスミド混合物を摂取したサルにおいて比較した。親１０１２ＤＮＡワクチンで免疫したサルは、６週目の二次免疫の２週間後にＥｎｖに対する低く、散発性のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を示し、バックグラウンドを上回る顕著な応答は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆに対しては検出されなかった（図１１Ａ）。逆に、類似のＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンで免疫したサルは、全ての抗原に対して有意に高い応答を示した（図１１Ｂ）。この時点では、親１０１２ＤＮＡワクチンと比較して、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンは、Ｇａｇ（ｐ＝０．００２２）、Ｐｏｌ（ｐ＝０．００４３）及びＮｅｆ（ｐ＝０．０４１）に対しては１０倍より高いＥＬＩＳＰＯＴ応答を、並びにＥｎｖ分岐群Ａ（ｐ＝０．０２６）、Ｂ（ｐ＝０．００８７）及びＣ（ｐ＝０．０３０）に対しては７〜９倍高い応答を誘導した。これらの結果は、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンが、非ヒト霊長類における多ＨＩＶ−１抗原に関して親１０１２ＤＮＡワクチンより顕著に免疫原性が高かったということを実証する。
【０１４６】
Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質を、異なるプラスミド上で発現する個々の遺伝子に分離すると、これらの応答は更に改善された。特に、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質を含むＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンの４−プラスミド混合物を摂取した動物（図１１Ｂ）と比較して、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチン（群２）の６−プラスミド混合物を摂取したサルは、Ｇａｇに対しては４倍高い応答（ｐ＝０．００２２）を、Ｐｏｌに対しては２倍高い応答（ｐ＝０．１９）傾向を、そしてＮｅｆに対しては４倍高い応答（ｐ＝０．０４９）を示した（図１１Ｃ）。ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンの４−プラスミド及び６−プラスミド混合物を摂取したこれら２つの群間のサルのＥｎｖ特異的応答は同程度であった（ｐ＝０．４８）。
【０１４７】
これらのサルの群における平均ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答の進行を、０、２、６、１０及び１２週目に評価した。８週目の３回目のＤＮＡ免疫後、応答は全てのサルの群において増大した（図１２）。１０週目では、親１０１２ＤＮＡワクチンはＥｎｖ−及びＰｏｌ特異的応答を大多数の動物において誘導したが、しかしＧａｇ−及びＮｅｆ特異的応答は依然として低かった（図１２Ａ）。逆にＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンは、全ての抗原に対して強力且つ広範な応答を誘導した（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。１０週目では、４−プラスミド親１０１２ＤＮＡワクチン（図１２Ａ）と比較して、４−プラスミドＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチン（図１２Ｂ）は、Ｇａｇ（ｐ＝０．００２２）及びＮｅｆ（ｐ＝０．００２２）に対しては１０倍より高いＥＬＩＳＰＯＴ応答を、Ｐｏｌ（ｐ＝０．０４３）に対しては４倍高いＥＬＩＳＰＯＴ応答を、Ｅｎｖ分岐群Ａ、Ｂ及びＣに対しては１．５〜４倍高い応答傾向を誘導した（図１２Ｂ）。Ｇａｇ−、Ｐｏｌ−及びＮｅｆ特異的応答は、別個のプラスミド上でコードされるこれらの遺伝子を有する６−プラスミドＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンを摂取した動物においては依然として最高であった（図１２Ｃ）。応
答は全て、ｒＡｄで顕著に増加した。これらの試験は、親１０１２ＤＮＡワクチンと比較して、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンは多抗原に対して実質的に大きく、且つ広範な細胞性免疫応答を誘導するということを確証する。従って、ＨＴＬＶ−１  Ｒエレメントを含むこと、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ遺伝子を分離することは、非ヒト霊長類におけるＨＩＶ−１  ＤＮＡワクチンの免疫原性を有意に増大した。
【０１４８】
マウス及びカニクイザルの両方において、ＨＩＶ−１抗原を発現するＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンは、同一抗原を発現する親１０１２ＤＮＡワクチンより高い細胞性免疫応答を誘導した。しかしながら、観察された効果の大きさは２つの種の間で実質的に異なった。ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンがマウスにおいて２倍高い応答を誘導しただけであった（図１０）のに対し、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンはカニクイザルにおいては、２回の免疫後、Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆに対しては１０倍より高い細胞性免疫応答を、Ｅｎｖに対しては７〜９倍高い応答を誘導した（図１１、図１２）。この差は、非ヒト霊長類において親１０１２ＤＮＡワクチンの基線免疫原性がより低いことを反映しており、Ｒエレメントの有益な効果が限られた状況において顕著であるということを示す。この観察と一致して、Ｒエレメントは、Ｇａｇ及びＮｅｆに対する親１０１２ＤＮＡワクチンにより誘導される最も弱い応答の増強に対して最大の効果を有した。しかしながら、ＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンにより誘導される場合、親１０１２ＤＮＡワクチンと比較してＥｎｖ−及びＰｏｌ特異的細胞性免疫も有意に高かった。
【０１４９】
別個のプラスミド上にＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆを含むＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンの６−プラスミド混合物は、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質を含むＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンの４−プラスミド混合物と比較して、これらの抗原に対する有意に高い細胞性免疫応答を誘導した。別個のＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆプラスミドは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ−Ｎｅｆ融合タンパク質をコードするプラスミドの用量の３分の１で各々利用されるため、これらの効果は特に顕著である。理論にとらわれずに考えると、この免疫原性の増大は、融合遺伝子と比較して、より短い遺伝子の翻訳又はｍＲＮＡ安定性増強を反映し得るが、これは、抗原プロセッシング及び提示に潜在的に影響を及ぼし得る。
【０１５０】
データの蓄積によって、ヒトにおけるＨＩＶ−１複製及びアカゲザルにおけるＳＩＶ複製の制御における細胞性免疫応答の重要性が実証された。更に、ウイルス特異的細胞性免疫応答を誘導することを目的としたワクチンは、アカゲザルにおけるＳＨＩＶ及びＳＩＶ感染の部分的制御をもたらした。従って、本発明の研究において非ヒト霊長類のＣＭＶ／Ｒ  ＤＮＡワクチンによりもたらされるＨＩＶ−１特異的細胞性免疫応答の大きさ及び幅の顕著な増大は、ＨＩＶ−１及びその他の病原体のための第２の世代ＤＮＡワクチンの開発に有益であると考えられる。特に、ＨＴＬＶ−１  Ｒエレメントを組込むこと、融合遺伝子の代わりに個別の遺伝子を利用することは、これらのワクチンを臨床用途に適したものにするためにＤＮＡワクチンを改良するための簡単且つ実際的な戦略を示す。
【０１５１】
実施例４：臨床的使用のための材料の調製
ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰ薬剤産物の製造、充填及び包装方法は、大腸菌発酵、精製、並びに筋肉内注射用の滅菌液体注射剤形としての処方を含む。この裸ＤＮＡ産物は、脂質、ウイルス又は細胞性ベクター構成成分を包含しない。
【０１５２】
ワクチンＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰは、６つの閉環プラスミドＤＮＡ高分子（ＶＲＣ−４４０１、４４０９、４４０４、５７３６、５７３７及び５７３８）の組合せで構成される。臨床的使用のためのプラスミドの調製のために、各起源プラスミド（ＶＲＣ−４４０１、４４０９、４４０４、５７３６、５７３７及び５７３８）に関してマスターセルバンド（ＭＣＢ）を調製した。これらのＭＣＢの各々からのプラスミドＤＮＡ試料の同一性及び組成を、配列分析により確認した。制限酵素分析及び微生物分析（カビ
及び酵母を含む）も、同一性及び滅菌性を確認するために実施した。
【０１５３】
カナマイシン選択培地を含有する細菌細胞培養から、大量のプラスミド調製物を調製した。すべての場合、細菌細胞増殖は、プラスミドＤＮＡの一部によりコードされるカナマイシン耐性タンパク質の細胞性発現によっていた。プラスミドを有する細菌細胞の増殖後、プラスミドＤＮＡを細胞構成成分から精製した。
【０１５４】
ｃＧＭＰ条件下で、臨床試験ワクチンを調製した。ワクチンは、投与前にロット放出規定を合わせた。リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に４．０ｍｇの用量で、ＤＮＡワクチンを製造した。１：１：１：１：１：１の比で６つのプラスミド１．２ｍＬ容積を無菌的にバイアルに充填した。４．０ｍｇプラスミドＤＮＡワクチンバイアルを、ドライアイス上で試験薬学者に輸送し、非盲検化し、使用するまで−２０℃以下で保存した。２．４ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２±０．２のプラゼボ対照バイアルを、Bell-More Labs, Incorporated (ハムステッド、メリーランド州)から入手した。
【０１５５】
個々のプラスミド及び最終処方薬剤産物の発現試験を、ワクチン産物の放出前に実行した。同一条件下での標準的実行によるウエスタンブロットに基づいた反応タンパク質バンドと比較することにより、プラスミドタンパク質の定性的発現を検証した。プラスミドを結合したら、同様の検定手法を用いて発現を検証した。トランスフェクト化２９３ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞により発現されるタンパク質を検出することにより発現を確定した。トランスフェクションに関しては、リン酸カルシウム法を用いて、１〜５μｇのプラスミドＤＮＡで１０5〜１０6細胞をトランスフェクトした。細胞を１４〜２０時間インキュベートして、ＤＮＡを取り込ませた。培地を取り替えた後、細胞を更に２４〜４８時間増殖させた後採取した。同一主鎖の既知の類似ベクターを用いて、トランスフェクション効率をモニタリングした。細胞溶解後、１０μｇの適量の総細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せて、粗溶解物タンパク質を分離した。
【０１５６】
約１．５時間の電気泳動後、ウエスタンブロット分析のためにタンパク質をニトロセルロース膜（０．４５μｍ）に転写した。スキムミルクで膜をブロッキングして、非特異的結合相互作用を阻害した後、一次抗体とともに６０分間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識二次抗体とともに４５分間、膜をインキュベートした。化学発光物質と共に膜をインキュベートし、Ｘ線フィルムに２分間又は適切な時間露出することにより、タンパク質バンドを可視化した。ウエスタンブロット上の発現タンパク質の強度を観察することにより、トランスフェクト化細胞により産生されるタンパク質の発現を確認した。ワクチンプラスミドによるタンパク質発現の半定量的分析を可能にするために、アッセイ法が更に開発されている。
【０１５７】
実施例５：ヒトにおける臨床的安全性
臨床的使用のために、ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰは、ワクチンの各々１６．６７％（重量で）を占める６つの閉環ＤＮＡプラスミドで構成された。このワクチン中の６つのプラスミドの各々は、単一遺伝子産物を発現した。プラスミドＶＲＣ４４０１、ＶＲＣ４４０９及びＶＲＣ４４０４は、それぞれ分岐群Ｂ  ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆを発現するよう設計された。ＶＲＣ５７３６、ＶＲＣ５７３７及びＶＲＣ５７３８は、それぞれ分岐群Ａ、分岐群Ｂ及び分岐群Ｃ由来のＨＩＶ−１  Ｅｎｖ糖タンパク質を発現するよう設計された。４ｍｇ／ｍＬとなるようにワクチンバイアルを作製した。各ＤＮＡ投与は、Biojector2000（登録商標）無針注射操作システム（商標）を用いた筋肉内（三角筋中）へデリバリーされるワクチン組成物１ｍＬである。
【０１５８】
このワクチンの安全性の評価は、実験室試験、病歴、臨床医による身体査定、並びに日誌で報告される被験体の自己査定を含む。免疫計画を続行する前に、考え得る副作用を更
に評価した。０日目は、登録及び初回注射日と定義した。初回注射前０日目評価は、その後の安全性査定のための基準である。ワクチン接種の日程は、０日目、２８±７日目、５６±７日目（注射日間に少なくとも２１日の間隔を置く）である。Biojector2000（登録商標）無針注射操作システムを用いて、４ｍｇの用量でＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰの筋肉内投与により、全試験注射を施した。
【０１５９】
試験注射後、最低３０秒間、被験体を観察した。免疫後３０〜４５分に、生命徴候（温度、血圧、脈拍及び呼吸速度）を調べた。局所反応の証拠に関して、注射部位を検査した。５日間毎日温度及び症候を記録するための「日誌」を被験体に渡した。各注射後１日目及び２日目に、電話で、被験体が良好状態であるかの追跡調査を実施した。電話インタビューにより指摘された場合には、来院した。各注射日（注射の前）及び各注射後１４±３日目に、臨床検査及び実験室試験により試験被験体を評価した。長期追跡調査来院は、１２週±７日、２４週±１４日及び３２週±１４日目であった。試験中に間を置いて、免疫学的アッセイのために被験体から採血した。用いられなかった任意の細胞、血清又は血漿を、将来のウイルス学的及び免疫学的アッセイのために保存した。更にまた、社会的不自由、例えば雇用、旅行、移住、保険に入る権利、医学的又は歯科学的ケア、並びに家族、友人及び同僚からの否定的な反応に伴う問題に関して、最終来院時（３２週目）に被験体と面談した。
【０１６０】
生成物の安全性の査定は、血液学的及び化学的パラメーターの臨床的観察及びモニタリングを含む。以下のパラメーターを査定した：局所反応原性兆候及び症状；全身反応原性兆候及び症状；安全性の実験室測定値；並びに有害及び重度有害経験。
【０１６１】
主要免疫原性の終点を、０週目（基準）、並びに６、８、１０及び１２週目（細胞性免疫応答に関して）に測定したが、それは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイにより測定されるような、ＨＩＶ−１特異的Ｔ細胞応答から成る。他の試験時点でのＩＣＳ、並びにＨＩＶ特異的抗体アッセイにより測定されるようなＨＩＶ−１特異的体液性免疫応答を、探索的評価として行った。
【０１６２】
会社の指示に従いBiojector2000（登録商標）無針注射操作システムを用いて、ワクチン組成物の投与を実施した。注射する物質及び三角筋注射部位皮膚調製物も、標準手順により調整することができる。つまり、注射部位を消毒し、その領域を完全に乾燥させた。注射器を注射部位に対して９０°の角度で配置しながら、注射部位周囲の皮膚をしっかり保持した。作動装置を押して、該物質を筋肉中に放出した。３秒間、しっかり保持し続けた。注射後、該部位を滅菌カバーで被覆し、３本指で１分間押さえた。Biojector2000（登録商標）は、１．０ｍＬまでの種々の用量の薬剤投与のための滅菌使い捨て注射器を使用する。Biojector（登録商標）の内部に収容された圧縮ＣＯ2ガスカートリッジにより、圧力下で試験作用物質をデリバリーした。Biojector（登録商標）の作動装置が押し下げられると、ＣＯ2が放出され、プランジャーが試験物質を滅菌注射器から押し出して、皮膚を通して、その下の組織中にデリバリーする。試験物質は、１秒の何分の一の高速で、微小開口を通して押出されて、皮膚を貫通する。ＣＯ2は注射物とは接触せず、注射器設計は、被験体の組織による、装置のいかなる逆跳ね返り又は汚染をも防止する。
【０１６３】
１５人の被験体は、０、１、２ヶ月のスケジュールで４ｍｇ／ｍＬでの１ｍＬ用量を３回摂取した。Biojector2000（登録商標）を用いてワクチンを筋肉内投与した。１５人の被験体のうちの１４人の被験体は、Biojector2000（登録商標）により投与されるワクチン４ｍｇ用量の筋肉内注射を３回受けた；１人の被験体は、２回のワクチン接種後、追跡調査できなくなった。ワクチン接種後に発熱を報告した被験体はいなかった。反応原性は無し乃至軽度であったが、但し、２人の被験体が中等度の注射部位疼痛を報告し、そして１人の被験体が中等度の悪心及び倦怠感を報告した。ＩＮＤスポンサーへの迅速報告を要
する唯一の有害事象は、等級３の汎発性蕁麻疹であった。該被験体は初回ワクチン接種後約２週間での抗ヒスタミン薬の開始を報告したが、しかしその時点で、理由はラテックスアレルギーと報告した。ロールオーバー追加免疫試験、ＶＲＣ０１０に関してスクリーニングする間に、抗ヒスタミン薬の供給が尽きると、２回目のワクチン接種の時期辺りで被験体は汎発性蕁麻疹を発症することが判明した。被験体は、抗ヒスタミン薬により良好に制御される慢性蕁麻疹を有する。評価は進行中である。病因は不明であるが、この時点で、慢性蕁麻疹は試験ワクチンにおそらくは関連すると査定される。今日まで、おそらくはワクチンが関与する２つの中等度（等級２）の有害事象が認められている。これらは、１人の被験体（この被験体は症候の再発を伴わずに３回目のワクチン接種を受けた）において、２回目のワクチン接種後１３日目に始まり、２日間持続する間欠性眩暈であり、そして別の被験体では無症候性低血糖症で、最初に気づいたのは３回目のワクチン接種後１４日目の追跡調査来院時であった。追跡調査できなかった被験体の最終安全性評価は、２回目のワクチン接種後１日目の電話によるものであった；その時点で、被験体はワクチン接種による副作用を全く報告しなかった。
【０１６４】
このＤＮＡワクチンに関する予期せぬ局所注射部位反応が観察された。ワクチン接種部位に軽度皮膚病変（直径０．５〜１．０ｃｍ）が、投与した４４例のうち４例（９％）に生じた；これらは、１５人の被験体中３人の被験体（２０％）に生じた。試験ワクチン接種後に何らかの異常な問題を経験した場合には、被験体には決まって電話するよう求めた。次の定期的予定来院前にＶＲＣクリニックに来院するように被験体に認識させるには、ワクチン接種部位の皮膚病変では十分でなかった。振り返ってみると、３人の被験体は、ワクチン接種後３日以内に小丘疹又は小胞として始まった皮膚病変を経験したと報告した。数日後、丘疹又は小胞は表面が剥がれて、痂皮が生じた。周囲の軽度紅斑及び軽度硬結が認められた。痂皮が剥がれた後、皮膚は治療せずに治癒した。膿胞性滲出物、発熱、発疹又は蕁麻疹を伴わない皮膚病変はなかった。それらは、局所感染であるか又はアレルギー反応であるとは考えられなかった。
【０１６５】
最初の３つの皮膚病変は、最初のワクチン接種後来院時（１４±３日目）に発見された；その時点で、それらは大部分は分解された。４番目の皮膚病変は、まだ活動期の間に該クリニックで検査され、ワクチン接種後６日目に生検された。この生検は、顕微鏡的皮下及び真皮性血管周囲リンパ球浸潤物を示した。浸潤物はほとんど、ＣＤ４+及びＣＤ８+の両方を含むＣＤ３陽性細胞で構成された。まれに好酸球が存在し、まれに巨大細胞が認められた。そのプロセスは主として、皮膚症状発現を伴う、ワクチン接種に対する皮下及び真皮性応答であると思われた。
【０１６６】
これらの反応がワクチン誘導性免疫応答の強度と相関するか否かは、未だ不明である。追跡調査中である１４人の被験体のうち８人の被験体は、１つ又は複数の時点での市販試験によるワクチン誘導性陽性ＨＩＶ  ＥＬＩＳＡを示した；これは、皮膚病変を有した全３被験体を含む。６−プラスミドＤＮＡに関する予備的免疫原性データは、Ｅｎｖ特異的Ｔ細胞応答が４−プラスミドＤＮＡで観察されたものと類似すること、そしてＧａｇ−及びＮｅｆ特異的応答も存在することを示す。
【０１６７】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーにより、被験体における細胞性応答を測定して、ウイルス抗原を提示するペプチドプールによる刺激後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の両方におけるＩＦＮ−γ又はＩＬ−２を検出した（図１３）。個々の被験体に関するデータを縦列に示す。各ペプチドプールに対する応答を横列に示す。各ボックスは、前ワクチン接種から１２週間（最終免疫後４週間）までの全時間経過を表す。各ボックスのスケールは、試験した全ＣＤ４＋又はＣＤ８＋集団の０〜０．２％である。ＣＤ４＋応答を赤色で、ＣＤ８＋応答を緑色で示す。ほぼすべての被験体が、Ｅｎｖペプチドに対して検出可能な応答を有する。４−プラスミド産物と対比して、被験体の
大多数がＧａｇに対して検出可能応答を有し、Ｎｅｆに対して応答するものも存在する。
【０１６８】
実施例６：キメラＥｎｖタンパク質の免疫原性
中和抗体の誘導における異なる遺伝子配列の役割を示すために、２つの異なる分岐群由来のウイルスエンベロープの、異なる領域を有するキメラ抗原ポリペプチドを発現する核酸コンストラクトを産生した。分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチド及び分岐群Ｂ  Ｅｎｖポリペプチドの異なる部分をコードする核酸コンストラクトを分析し、分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドと比較した。分岐群Ｂ主鎖上への近位２５％の分岐群Ｃの転位は、種々の分岐群Ｂ単離物に対する中和の潜在力及び幅の増大、並びに分岐群Ｃ単離物の中和の改善を示した。分岐群Ｃ  Ｅｎｖによる分岐群Ｂ  Ｅｎｖの遠位領域の置換は、分岐群Ｂ単離物に対する中和改善を生じたが、これは、分岐群Ｂ単離物中のＶ3を含有する領域が種々の多様なウイルス単離物を抑制する能力に寄与ことを示す。これらの核酸コンストラクトは、配列番号７〜１５により表わされる。従って、開示される組成物の特定の実施形態は、多分岐群を併せ持つキメラＥｎｖポリペプチドをコードするコンストラクトを含む。
【０１６９】
代替的な分岐群中のＶ領域の役割を示すために、分岐群Ａ、Ｂ及びＣのＶ1Ｖ2並びにＶ3領域の両方に突然変異を加えた。分岐群Ａ中のＶ1Ｖ2の役割を示すために、分岐群Ａ原型を、Ｖ1及びＶ2領域の欠失を含有するものと比較した。Ｖ1Ｖ2及び／又はＶ3の除去は、分岐群Ａ  Ｅｎｖポリペプチドの能力を増強し、種々の分岐群Ｂ単離物を中和する免疫応答を誘導したが、これらの領域の欠失が、抗原ポリペプチドの、中和抗体を広範に引き出す能力を増大する（例えば交差反応性抗体を誘導する特異的エピトープへの接近可能性を増大することによる）ことを示す。従って、本明細書中に開示される特定の実施形態では、核酸コンストラクトはＶ1、Ｖ2及び／又はＶ3領域の欠失を含む。
【０１７０】
分岐群Ｃ由来の非相同的Ｖ3に対する分岐群Ｂ中のＶ1Ｖ2の役割を確認するために、南アフリカ分岐群Ｃ単離物由来のＶ3を分岐群ＢからのＶ3の代わりに挿入し、分岐群Ｂ  Ｖ3ループを用いて中和を増強することが示されている基部短縮化バージョンと比較した。中和抗体を誘導する組換えアデノウイルス追加免疫と組合せたこれらのプラスミドＤＮＡベクターの能力を、表示された系統に対して評価した。両Ｖ3置換による免疫は分岐群Ａ、Ｂ及びＣ由来のウイルス単離物の中和を可能にしたが、応答の大きさは基部短縮化１ＡＢＶ3より大きかった。更に、ペプチド抑制は、この応答で誘導される中和抗体がより大きな幅を有し且つ多様な分岐群Ａ、Ｂ及びＣ由来のＶ3領域と相互作用したことを示した。従って、分岐群Ｃ  Ｖ3ループは広範に反応性Ｖ3中和抗体を誘導すると思われた。
【０１７１】
これらのエンベロープのＶ1及びＶ2領域の欠失は、中和抗体応答を誘導する能力を改善する。これらの応答は、大部分は多様な分岐群中のＶ3領域に対して向けられる。異なる分岐群由来の代替的なＶ領域の使用は、これらのＶ領域が系統特異的応答を誘導する能力の差も示ことを実証する。例えば、分岐群Ｃ由来のＶ3領域の含入は、種々の分岐群Ｂ単離物の中和並びに多様な系統からのＶ3ペプチドによるより大きな幅の中和を可能にした。従って、Ｖ1及びＶ2領域の両方の排除、並びにより広範な反応性のＶ3の提示は、Ｅｎｖ抗原ポリペプチドにより媒介される中和の幅を増強し得る。
【０１７２】
Ｖ3媒介性中和の他に、Ｖ3が曝露されない場合は、他の可変部がウイルス中和に関与する。これらの間で、Ｖ1中の高度曝露領域が同定された。この領域は系統特異的変異を示す可能性が大いにあるが、この可変ループに対する免疫応答の幅の増大に寄与するＶ1内の保存サブ領域も存在する。
【０１７３】
ウイルス多様性に基づいた遺伝子情報を用いて免疫原改良を限定する能力は、有効なＨＩＶワクチンを設計する能力を改善し得る。上記の結果は、遺伝子型配列変異が分岐群と関係のない中和感受性を生じ得ることを示す。この知見は、遺伝子配列に基づいた改良型
ＨＩＶ免疫原の設計のための重要な示唆を有する。
【０１７４】
開示された本発明の原理が適用され得る複数の考えられる実施形態に鑑みて、例証された実施形態は本発明の好ましい例に過ぎないと認識されるべきであり、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。むしろ本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により規定される。従って、これらの特許請求の範囲の範囲及び精神内に含まれるもの全てを、我々の発明として主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】多分岐群、多価ＨＩＶワクチン組成物の模式図である。
【図２】プラスミドＶＲＣ４４０１の模式図である。
【図３】プラスミドＶＲＣ４４０９の模式図である。
【図４】プラスミドＶＲＣ４４０４の模式図である。
【図５】プラスミドＶＲＣ５７３６の模式図である。
【図６】プラスミドＶＲＣ５７３７の模式図である。
【図７】プラスミドＶＲＣ５７３８の模式図である。
【図８】Ａ：異なる転写調節配列を有する抗原発現コンストラクトを模式的に表す図である。Ｂ：種々のコンストラクトの相対的発現を示すウエスタンブロットの画像である。
【図９】異なる転写調節配列を有する発現プラスミドで免疫感作下マウスにおけるＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を例示する棒グラフである。
【図１０】ＣＭＶ／Ｒ転写制御配列又はＣＭＶ  ＩＥ転写制御配列を有する核酸コンストラクトで免疫感作したマウスにおけるＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ抗原に対する相対的免疫応答を例示する棒グラフである。
【図１１】異なるワクチン組成物で免疫感作したカニクイザルにおけるＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ及びＥｎｖ抗原に対する相対的免疫応答を例示する棒グラフである。
【図１２】異なるワクチン組成物によるカニクイザルの免疫感作後のＨＩＶ抗原に対する免疫応答の発生の時間経過を例示する棒グラフである。
【図１３】ＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰで免疫感作したヒトにおける細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により測定した細胞免疫応答を例示する一連の棒グラフである。
【０１７６】
［配列表の簡単な説明］
配列番号１〜６は、それぞれＶＲＣ−ＨＩＶＤＮＡ０１６−００−ＶＰプラスミド４４０１、４４０９、４４０４、５７３６、５７３７及び５７３８を表す。これらのプラスミドの各々は、単一ＨＩＶ抗原ポリペプチドを発現するための核酸コンストラクトである。
配列番号７〜１５は、キメラＥｎｖプラスミドを表す。
配列番号１６〜１９は、アデノウイルスベクターを表す。
配列番号２０〜２５は、それぞれ例示的なＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、分岐群Ａ  Ｅｎｖ、分岐群Ｂ  Ｅｎｖ及び分岐群Ｃ  Ｅｎｖポリペプチドを表す。
配列番号２６は、ＣＭＶ／Ｒ転写調節配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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