(57)【要約】構造的に充分に定義された２分岐型および３分岐型のポリマーと接合されたインスリンは、注射によって他のインスリンを投与する必要性を低減または排除するために、肺を介した全身吸収のための肺送達によって使用することができる。【選択図】なし
2008528549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンに共有結合された、構造的に充分に定義された分岐鎖ポリマーを含んでなる接合体。
【請求項２】
下記一般式IIによって表される接合体：
Ins-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n       (II)
ここで、
Insは、そのA1またはB1位のアミノ酸に存在するαアミノ基から、またはB29位もしくは何れか他の位置のリジンに存在するεアミノ基から水素が除去されたインスリンを表し、
第１世代の２分岐化合物については、
Y1はYbであり；Y2はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは2であり；
第２世代の２分岐化合物については、
Y1およびY2はYbであり；Y3はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは2であり；
第３世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2およびY3は全てYbであり；Y4はZであり；rおよびqはゼロであり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
第４世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3およびY4は全てYbであり；Y5はZであり；rはゼロであり；qは16であり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
第５世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3、Y4およびY5は全てYbであり；Y6はZであり；rは32であり；qは16であり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
ここで、Ybは、
【化１】
2008528549.tif 000146
であり、
第1世代の３分岐化合物については、
Y1はYtであり；Y2はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは3であり；
第２世代の３分岐化合物については、
Y1およびY2はYtであり；Y3はZであり；r、q、およびpは全てゼロであり；sは9であり；nは3であり；
第３世代の３分岐化合物については、
Y1、Y2およびY3は全てYtであり；Y4はZであり；rおよびqはゼロであり；pは27であり；sは9であり；nは3であり；
第４世代の３分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3およびY4は全てYtであり；Y5はZであり；rはゼロであり；qは81であり；pは27であり；sは9であり；nは3であり；
ここで、Ytは、
【化２】
2008528549.tif 000147
であり、
ここで、Aは-CO-、-C(O)O-、-P(=O)(OR)-、または-P(=S)(OR)-であり、ここでのRは水素、アルキルまたは任意に置換されたアリールであり；
Bは、-NH-または-O-であり；
但し、Bが-NH-であるときは、Aは-CO-または-C(O)O-であり、またBが-O-であるときは、Aは-P(=O)(OR)-または-P(=S)(OR)-であり；
一つの単分子層（世代）（Y1、Y2、およびY3で例示）のB基は、Yが接尾語としての次の数を有する隣接した後続の層（それぞれY2、Y3およびY4で例示される）のA基に結合され、またはZに結合され；
X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、アルカントリオキシ、式-CO-N<のアミノカルボニル部分、式-CH2CO-N<のアセタミド部分、または次式
【化３】
2008528549.tif 000148
の部分であり、ここでのQはアルカントリイルであり；
X4は、アルカンテトライルまたはアレーンテトライルであり；
L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの最後の３部分の末端アルキル部分は、好ましくはAに結合され；
L2は、原子価結合、オキシアルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの最後の３部分の末端アルキル部分は、好ましくはBに結合され；
L3は、原子価結合、アルキレン、オキシ、ポリアルコキシジイル、オキシアルキル、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、アルキルアミノカルボニルアルキルアミノ、カルボニルアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、カルボニル(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、またはカルボニルアルコキシアルキルアミノを表し、ここでの最後の１０部分の末端カルボニル、アルキルおよびオキシ部分は、好ましくは任意にL4部分を介してIns基に結合され； 
mは、ゼロ、1、2または3であり；
L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中から選択され、ここでのL5は原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、ここで前記L4部分における末端カルボニル部分は、好ましくはIns部分に結合され；
Zは、水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ポリアルコキシ、オキシアルキル、アシル、ポリアルコキシアルキルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルである。
【請求項３】
請求項２に記載の接合体であって、Y1がYb（即ち、２分岐化合物）である接合体。
【請求項４】
請求項２または３に記載の接合体であって、X3は、分岐した３価の有機基（リンカー）、好ましくは親水性で、更に好ましくは18以下の炭素、より好ましくは1〜約１０の炭素原子を含む多官能化されたアルキル基、一つの窒素原子、プロパン-1,2,3-トリイルであり、好ましくは、X3は次の六つの式のうちの一つの部分であり、
【化４】
2008528549.tif 000149
また幾つかの実施形態において、X3は対称である接合体。
【請求項５】
請求項２に記載の接合体であって、Y1がYt（即ち、３分岐化合物）である接合体。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の接合体であって、X4は対称であり、好ましくはベンゼン-1,3,4,5-テトライルである接合体。.
【請求項７】
請求項２〜６の何れか１項に記載の接合体であって、L1およびL2が同一かまたは異なり、各々が独立に親水性である接合体。
【請求項８】
請求項２〜７の何れか１項に記載の接合体であって、L1およびL2が同一かまたは異なり、各々が独立にアルキレン、m’が2、3、4、5、または6であり且つn’が0〜10の整数である一般式-((CH2)m’O)n’-の部分、原子価結合、または約1〜約5のPEG(-CH2CH2O-)基を含む二価の有機基である接合体。
【請求項９】
請求項２〜８の何れか１項に記載の接合体であって、L1は、オキシ(-O-)、オキシメチル (-OCH2-)、またはn”が0〜10の整数として一般式-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-の部分であり、好ましくは、L1は原子価結合、オキシ、または次の三つの部分：-OCH2-、-CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、および-CH2OCH2-のうちの一つである接合体。
【請求項１０】
請求項２〜９の何れか１項に記載の接合体であって、L2は式(-CH2CH2O-)2の部分であり、また式
【化５】
2008528549.tif 000150
を有し、好ましくは、L2は四つの部分：-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2-、または-CH2CH2-のうちの一つである接合体。
【請求項１１】
請求項２〜１０の何れか１項に記載の接合体であって、L3が原子価結合、または下記の六つの式によって表される二価のリンカー基である接合体：
【化６】
2008528549.tif 000151
ここで、これら部分の末端カルボニル部分は、好ましくはIns基に結合される。
【請求項１２】
請求項２〜１１の何れか１項に記載の接合体であって、L4および隣接するL3が、下記の八つの式によって示されるような二価のリンカー基である接合体：
【化７】
2008528549.tif 000152
ここで、これら部分の末端カルボニル部分は、好ましくはIns基に結合される。
【請求項１３】
請求項２〜１２の何れか１項に記載の接合体であって、L4が原子化結合、または下記の五つの式によって示されるような二価のリンカー基であり：
【化８】
2008528549.tif 000153
好ましくは、L4は、下記の二つの式の部分のうちの一つのsyn形またはanti形である接合体：
【化９】
2008528549.tif 000154
【請求項１４】
請求項２〜１３の何れか１項に記載の接合体であって、Zが、末端のアミノ基またはヒドロキシ基、好ましくは下記の三つの式の一つを有する基と反応できるキャッピング剤である接合体：
【化１０】
2008528549.tif 000155
ここで、Meはメチルであり、好ましくは、Zは水素または次の三つの基の一つである：CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-、CH3-、およびC6H5C(O)-。
【請求項１５】
請求項２〜１４の何れか１項に記載の接合体であって、Insはヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイル GlnB3 des(B30) ヒトインスリン、NεB29-トリデカノイルヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン、NεB29-デカノイルヒトインスリン、およびNεB29-ドデカノイルヒトインスリン、インスリンaspart（即ち、AspB28 ヒトインスリン）、インスリンlispro（即ち、LysB28,ProB29 ヒトインスリン)、およびインスリンglagine（即ち、GlyA21,ArgB31,ArgB32 ヒトインスリン）または水素が除去されているインスリンdetemir（即ち、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン）、好ましくは、Insは、B29Lys(Asn(eps))-desB30ヒトインスリン、B29Lys(Asn(eps))ヒトインスリン、B28Asp-B29Lys(Asn(eps))-desB30ヒトインスリン、B28Asp-B29Lys(Asn(eps))ヒトインスリン、B28Lys(Asn(eps))-B29P ヒトインスリン、またはB3Lys(Asn(eps))-B29Gluヒトインスリンである接合体。
【請求項１６】
請求項２〜１５の何れか１項に記載の接合体であって、Aが、次の三つの部分：-CO-、-P(O)O-および-P(S)O-の一つである接合体。
【請求項１７】
請求項２〜１６の何れか１項に記載の接合体であって、Bが、オキシまたは部分-NH-である接合体。
【請求項１８】
請求項２〜１７の何れか１項に記載の接合体であって、前記記号が上記で述べた何れか特定の意味を有する接合体。
【請求項１９】
請求項２〜１８の何れか１項に記載の接合体であって、一般式-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n［Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、L3、L4、m、r、q、p、sおよびnは各々上記で定義した通り］の基が、約500 Da超、好ましくは約3 kDa超、より好ましくは約5 KDa超で、且つ約10 kDa未満、好ましくは約7 kDa未満の分子量を有する接合体。
【請求項２０】
請求項１に記載の接合体であって、約500 Da超、好ましくは約3 kDa超、より好ましくは約5 KDa超で、且つ約10 kDa未満、好ましくは約7 kDa未満の分子量を有する分岐ポリマーを含んでなる接合体。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の接合体であって、3〜7の等電点を有する接合体。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載の接合体であって、生理学的条件下において、正味の負電荷を有する接合体。
【請求項２３】
医薬、好ましくは糖尿病の治療のための医薬として使用するための、請求項１〜２２の何れか１項に記載の接合体。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか１項に記載の接合体であって、明細書において詳細に言及した式IIの特定の化合物の何れか、好ましくは、実施例５５〜１２３、および１２５〜１２５の何れか一つに記載の化合物である接合体。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか１項に記載の接合体インスリンであって、特に、医薬として使用するための式IIの化合物。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の接合体インスリン、特に式ＩＩの化合物の使用であって、抗糖尿病剤の調製のための使用。
【請求項２７】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の接合体インスリン、特に式ＩＩ化合物を投与する方法であって、有効量の式IIの接合体インスリンを、それを必要としている患者に対して、肺手段によって投与すること、好ましくは、前記式IIの接合体インスリンが前記患者の。口を通して吸入される方法。
【請求項２８】
ここに記載した新規な特徴または特徴の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般には、糖尿病に罹患しているヒトを治療する方法に関する。より詳しくは、本発明は、構造的に充分に定義された分岐ポリマーに接合されたインスリンに関する。該分岐ポリマーは、モノマービルディングブロックで構成される。更に、本発明は、注射による他のインスリンを投与する必要性を低減または排除するために、例えば肺を介した全身的吸収のための肺送達による、このような接合体インスリンの使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
１９２０年代におけるインスリンの導入以来、糖尿病の治療を改善するための連続的な進歩がなされてきた。インスリンの純度および利用可能性において大きな進歩がなされ、また異なる時間-作用をもった種々の製剤も開発されてきた。集中的なインスリン療法に対する患者のコンプライアンスを増大させ、またその合併症の危険を低下させるためには、非注射形態のインスリンが望ましい。
【０００３】
糖尿病は世界の人口の約6％を冒している病気である。更に、殆どの国の人口は高齢化しており、糖尿病は高齢化した人口において特に共通している。屡々、注射によって自分でインスリンを投与することの困難さを経験し、またはこれを好まないのは、この人口集団である。アメリカ合衆国では、人口の約5％が糖尿病を有しており、これら糖尿病患者の約1/3が、１日に1回以上のインスリン投与量を皮下注射により自分で投与している。このタイプの集中療法は、血中グルコースのレベルを低下させるために必要とされる。高レベルの血中グルコースは、内因性インスリンのレベルが低いことまたは欠如の結果であり、正常な身体化学を変化させ、また多くの器官において微小血管系の損傷を導く可能性がある。未治療の糖尿病は、屡々、手足の切断をもたらし、また失明および腎不全を経験する。糖尿病の副作用の治療、および糖尿病の不十分な治療により喪失される生産性は、アメリカ合衆国単独でも年間約400億ドルの費用に上ると見積もられている。
【０００４】
1,441人の１型糖尿病患者を含む９年の糖尿病抑制および合併症試験（DCCT；Diabetes Control and Complications Trial）は、血中グルコースレベルを耐容能の範囲内に維持することによって、糖尿病合併症の頻度および重篤度が低下することを示した。従来のインスリン療法は、1日2回の注射を含むだけであった。DCCT研究における集中的インスリン療法は、毎日3回以上のインスリンの注射を含んでいた。この研究において、糖尿病副作用の発生率は劇的に低下した。例えば、集中療法を用いた患者において、網膜症は50〜76％減少し、腎症は35〜56％減少し、神経障害は60％減少した。
【０００５】
不運にも、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの緻密な制御を維持するために必要とされる多くの注射に伴う不快感のために、集中療法を受けることを嫌う。このタイプの療法は、心理的にも身体的にも痛みを伴う可能性がある。経口投与すると、インスリンは胃腸管内で迅速に分解し、血流の中に吸収されない。従って、多くの研究者は、経口経路、直腸経路、経皮経路、および鼻経路のような、インスリンを投与するための別の投与経路を研究してきた。しかし、これらの投与経路は、これまで効果的なインスリン吸収をもたらしてこなかった。事実、吸入エアロゾルとしてのインスリンの肺への投与は、1925年にGaensslenによって最初に報告された。多くのヒトおよび動物での研究は、幾つかのインスリン製剤が肺を通して吸収され得ることを示したが、肺送達は、糖尿病を効果的に治療するための手段として広く容認されるに至ってはいない。これは、部分的には、送達される量に比較して吸収されるインスリンが小量であることに起因する。加えて、研究者等は、異なるインスリン製剤の肺送達の後、または異なる時点での等しい投与量の同じ製剤の肺送達の後に吸収された、インスリンの量における大きな変動を観察してきた。
【０００６】
従って、肺手段によってインスリンを送達するための効率的で且つ信頼性のある方法を提供することが必要とされている。
【０００７】
全てのタンパク質が、肺において効率的に吸収され得るものでないことは明らかである。タンパク質が肺を通して効果的に送達され得るかどうかに影響する多くの因子が存在する。肺を通しての吸収は、送達されるべき特定の治療的タンパク質の物理的特性に大きく依存する。
【０００８】
タンパク質の効率的な肺送達は、該タンパク質を深部肺胞上皮に送達する能力に依存する。上気道上皮に沈着されるタンパク質は、有意な範囲では吸収されない。これは、厚さが約30〜40μmで且つ吸収に対する障壁として作用する、表面を覆っている粘膜によるものである。加えて、この上皮に堆積したタンパク質は、粘膜毛様体によってクリアされ、気道を上方に移動され、次いで胃腸管を介して排除される。この機構はまた、幾つかのタンパク質粒子の低い吸収に実質的に寄与する。タンパク質が吸収されずにこれら経路によって排除される程度は、それらの可溶性、サイズ、並びに他のあまり理解されていない特徴に依存する。
【０００９】
例えば、タンパク質が深部肺胞上皮へと首尾よく送達されたとしても、該治療的タンパク質が肺から血液へと迅速に輸送され得るかどうかを予測することは困難である。肺に存在するペプチダーゼの広域スペクトルの故に、より長い吸収時間は、該タンパク質が吸収される前に有意に分解され、または粘膜毛様体輸送によってクリアされる可能性を増大させる。
【００１０】
ホルモン、可溶性受容体、サイトカイン、酵素などのような治療的に興味あるペプチドは、タンパク質分解、腎もしくは肝によるクリアランス、または幾つかの場合には中和抗体の出現の結果として、身体内において短い循環半減期を有することが多い。これは、一般的にはペプチドの治療的有用性を低下させる。
【００１１】
しかし、有機鎖状分子をペプチドにグラフトすることによって、該ペプチドの性質を向上できることがよく認識されている。このようなグラフト化は、血清中の半減期、タンパク質分解に対する安定性、および減少した免疫原性のような医薬的性質を改善することができる。
【００１２】
性質を向上するために屡々使用される有機鎖状分子は、ポリエチレングリコールに基づく鎖またはポリエチレンに基づく鎖、即ち、反復単位-CH2CH2O-に基づく鎖である。以後、ポリエチレングリコールについて「PEG」の略語が使用される。しかし、PEGまたはPEGに基づく鎖を調製するために使用される技術は、全く低分子量のものであっても、制御性の悪い重合段階を含んでおり、これは平均値に関して広がり幅の大きな鎖長を有する製剤を導く。結局、PEGグラフトに基づくペプチド接合体は、一般には広範囲の分子量分布を特徴付としている。
【００１３】
表題によれば、WO 02/094200 A2は、「化学的に修飾されたインスリン」を取り扱っており、前記明細書の要約に従えば、これはポリマーに結合されたインスリンの接合体である。一実施形態において、前記ポリマーはポリエチレングリコール（PEG）である。実施例においては、メトキシポリ(エチレングリコール)プロピオンアミドインスリンが調製され、ここでの線型ポリ(エチレングリコール)単位は750、2000および5000の平均分子量分布を有している（実施例２〜４参照）。
【００１４】
US 2003-0229010は、その名称に従えば、インスリン−オリゴマー接合体に関する。請求項１に従えば、それは式-A-(CH2)m-(OC2H4)-XRを有する線型オリゴマーに共有結合されたインスリン、例えば線型メチル(エチレングリコール)7-O-ヘキサン酸に接合されたインスリン（実施例XVII参照）に関する。
【００１５】
Kochendoefer et al.は、最近、均一なポリマーで修飾されたエリスロポエチンタンパク質の設計および合成を記載した（Science 2003, 299, 884-887）、またWO 02/20033（PCT特許出願）において、充分に定義されたポリマーで修飾されたペプチドを合成するための一般的方法を案出した。この仕事において使用されたビルディングブロックは、溶液中または固相支持体上で標準のペプチド化学を使用した連続的な付加により伸長された、交互の水溶性線型長鎖親水性ジアミンおよびコハク酸に基づいていた。
【００１６】
最小の合成工程で大きな十分に定義されたポリマーを調整するための更に魅力的な別の戦略は、限定された数の連続的なオリゴマー化工程における、２分岐、３分岐または多分岐のモノマーに依拠している。この場合に、ポリマーの大量増殖は、冪数が分岐数によって決定される指数曲線に従う。例えば、２分岐モノマーは２乗増殖、３分岐モノマーは３乗増殖を与える。この方法により得られるポリマーのタイプは、文献に十分に記載されており（S.M. Grayson and J.M.J. Frechet, Chem. Rev. 2001, 101, 3819）、デンドリマーとして一般に知られている。
【００１７】
2,2-ビス(ヒドロキシメチル）プロピオン酸に基づき、且つカルバメート結合を介してポリエチレンオキシドでキャップされた生分解性の第4世代ポリエステルデンドリマーが、最近報告された（E.R.Gillies and J.M.J.Frechet, J. Amer. Chem. Soc, 2002, 124, 14137-14146）。このシステムの構成は、キャップされたポリエチレンオキシド尾部のための結合点として機能するポリヒドロキシ足場を生成するために、当該構造の樹状部分が使用されるので、上記で述べたKochendoefer et al.により記載されたシステムに密接に類似している。しかし、印象的な12 KDaの構造を作製することはできるが、コア構造だけが化学的に十分に定義されるので、各ポリエチレンオキシド尾部から大きな分散性が導入される。
【００１８】
バイオ医薬に接合された充分に定義されたポリマーについての多くの潜在的な応用（例えば修飾された薬物動態学および薬力学）を考慮すると、当該技術においては、正確な数のモノマー単位から充分に定義されたポリマーおよびコポリマーを調製するための技術を改善する必要性が継続して存在している。
【００１９】
本発明の一つの側面は、肺経路を介して糖尿病患者を治療するために使用できる医薬を提供することに関する。
【００２０】
本発明のもう一つの側面は、肺経路を介して糖尿病患者を治療するために使用できるインスリンの誘導体を提供することに関する。
【００２１】
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも一つを克服もしくは緩和し、また有用な代替技術を提供することである。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、インスリンに接合された新規分類の分岐ポリマーを提供する。
【００２３】
これらの新規な化合物は、以下で述べる定義と共に以下で述べる、一般式IIを有する。式IIの化合物は、制御された数のモノマービルディングブロック（以下ではYbおよびYtと称する）を含んでいる。
【００２４】
本発明はまた、上記の接合体の医薬としての使用を提供する。
【定義】
【００２５】
本発明の化合物に関してここで「インスリン」の用語が用いられるとき、それはブタインスリン、ウシインスリン、およびヒトインスリン、並びにそれらの塩、例えば亜鉛塩およびプロタミン塩のようなそれらの塩、並びにそれらの二量体およびポリマー、例えばヘキサマーのように、如何なる種に由来するインスリンをもカバーするものである。更に、ここでの「インスリン」の用語はまた、当業者が一般にインスリンの誘導体と看做すような「インスリンの活性誘導体」（一般的教科書を参照されたい）、例えば親インスリン分子に存在しない置換基を有するインスリンをもカバーするものである。例えば、「インスリン」の用語はまた、1以上の位置、例えばヒトインスリンまたはdesB30ヒトインスリンのB29位でアシル化されたインスリン分子をもカバーする。アシル化されたインスリンの例は、NεB29-テトラデカノイルGlnB3 des(B30)ヒトインスリン、NεB29-トリデカノイル ヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン、NεB29-デカノイルヒトインスリン、およびNεB29-ドデカノイルヒトインスリンである。加えて、ここでの「インスリン」の用語は、所謂「インスリン類似体」をカバーする。インスリン類似体は、ヒトインスリン分子に比較して、Aアミノ酸鎖および／Bアミノ酸鎖の１以上の突然変異、置換、欠失および／または付加を有するインスリン分子である。より詳細には、該インスリン類似体は、充分なインスリン活性を有することを条件に、１以上のアミノ酸残基がもう一つのアミノ酸残基と置換されており、および／または１以上のアミノ酸残基が欠失されており、および／または１以上のアミノ酸残基が付加されている。インスリン類似体は、好ましくは、１以上の天然に存在するアミノ酸残基、好ましくはそれらの1、2または3個がもう一つのコード化可能なアミノ酸残基で置換されているようなものである。こうしてB鎖の28位は、天然のPro残基からAsp、Lys、またはIleの一つへと変更されてよい。もう一つの実施形態では、B29位のLysがProに修飾され、またA21位のAsnがAla、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、TyrまたはValに、特にGly、Ala、SerまたはThrに、好ましくはGlyに変更されてもよい。更に、B3位におけるAsnはLysに修飾されてよい。インスリン類似体の更なる例は、des(B30) ヒトインスリン、PheB1が欠失されたインスリン類似体；A鎖および／またはB鎖がN末端延長部を有するインスリン類似体、およびA鎖および／またはB鎖がC末端延長部を有するインスリン類似体である。従って、1または2のArgがB1位に付加されてよい。インスリン類似体の例は、以下の特許およびその均等物に記載されている：US 5,618,913、EP 254,516、EP 280,534、US 5,750,497、およびUS 6,011,007。特定のインスリン類似体の例は、インスリンaspart（即ち、AspB28ヒトインスリン）、インスリンlispro（即ち、LysB28,ProB29ヒトインスリン）、およびインスリンglagine（即ち、GlyA21,ArgB31,ArgB32ヒトインスリン)である。ここでの「インスリン」の用語は、他のインスリンのための前駆体または中間体をも含むものである。このような前駆体の一例は、アミノ酸配列B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21)を含んでなるインスリン前駆体であり、ここでのA(1-21)はヒトインスリンのA鎖であり、またB(1-29)は、Thr(B30)が欠失したヒトインスリンのB鎖である。最後に、ここでの「インスリン」の用語はまた、インスリン誘導体およびインスリン類似体の両者であると看做すことができる化合物をも包含するものである。このような化合物の例は、次の特許およびその均等物に記載されている：US 5,750,497、およびUS 6,011,007。特定のインスリン類似体および誘導体の一例は、インスリンdetemir （即ち、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン）である。この段落においては、アミノ酸について既知の3文字コードが使用されている。また、以下では既知の1文字コードも使用される。
【００２６】
所謂遊離脂肪細胞アッセイからの結果を使用することにより、当業者、例えば医師は、インスリン類似体を何時、如何なる投与量で投与すべきかを知ることができる。
【００２７】
「共有結合」の用語は、ポリマー分子およびインスリンが相互に直接共有結合されるか、またはブリッジ、スペーサ、もしくは連結部分のような1以上の介在部分を介して相互に間接的に共有結合されることを意味する。
【００２８】
「分岐ポリマー」、「樹状ポリマー」、「樹状構造」または「デンドリマー」の用語は、その幾つかは分岐を含むモノマービルディングブロックの選択から組み立てられた有機ポリマーを意味する。
【００２９】
「接合体」または「接合体インスリン」の用語は、1以上のポリマー分子への1以上のインスリンの共有結合によって形成された、異種分子（複合またはキメラの意味で）を示すものである。
【００３０】
「多分散」の用語は、ポリマーの純度を示すために使用される。「多分散指数」（PDI）の用語は、MwのMnに対する比であり、ここでのMwはΣ(Mi2Ni)/Σ(MiNi)であり、MnはΣ(MiNi)/Σ(Ni)であり、Miは当該混合物中に存在する個々の分子の分子量であり、またNiは一定の分子量によって表される分子の数である。PDIは、混合物中に存在する特定のポリマーの分布の広さの概略の指標を提供する。一定のポリマーのPDIが1であれば、該ポリマーは100％の純度を有する。小さい世代、例えば1〜3世代のポリマー場合、PDIを示すよりも純度を示す方が便利であるかもしれない。しかし、より長いポリマーの場合は、PDIを使用するのが便利であるかもしれない。
【００３１】
「単分散」の用語は、ここでは、1.09未満、好ましくは1.08未満、より好ましくは1.07未満、且つ少なくとも1のPDIを有するポリマーについて使用される。ここでは、生成物との関係において「構造的に充分に定義された」の用語は、当該生成物が高純度の、特定の化学的に充分に定義された化合物を有することを示す。このような純度は、好ましくは約80％超、より好ましくは約90％超、更により好ましくは約95％超、最も好ましくは約97.5％超である。
【００３２】
ポリマーで修飾されたインスリンの「免疫原性」とは、人に投与されたときに液性、細胞性またはその両方の免疫応答を誘発する、該ポリマーで修飾されたインスリンの能力を言う。
【００３３】
「結合基」の用語は、ポリマー分子を直接に、またはリンカーを介して間接的に結合できる、インスリンまたはリンカーで修飾されたインスリン上の官能基を示すものである。有用な結合基は、例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、またはハロアセテートである。
【００３４】
「反応性官能基」の用語は、限定ではなく例示として、何れかの遊離のアミノ、カルボキシ、チオール、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アシル、クロロギ酸エステル、アリールオキシカルボネート、ヒドロキシもしくはアルデヒド基、カーボネート、例えばp-ニトロフェニル、もしくはスクシンイミジル；カルボニルイミダゾール、塩化カルボニル；インサイチューで活性化されるカルボン酸；塩化カルボニル、活性化されたエステル、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン、ホスホロアミダイトおよびH-ホスホネートエステルを含むもの等のエステル、ホスホルトリエステルまたはホスホルジエステルは、インサイチューで、イソシアネートまたはイソチオシアネートを活性化し、加えて、-NH2、-OH、-N3、-NHR’または-OR’（ここでのR’は下記で定義する保護基である）、-O-NH2、アルキンのような基、または次の何れかを活性化する：ヒドラジン誘導体（-NH-NH2）、ヒドラジンカルボキシレート誘導体（-O-C(O)-NH-NH2）、セミカルバジド誘導体（-NH-C(O)-NH-NH2）、チオセミカルバジド誘導体（-NH-C(S)-NH-NH2）、炭酸ジヒドラジド誘導体（-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2）、カルバジド誘導体（-NH-NH-C(O)-NH-NH2）、チオカルバジド誘導体（-NH-NH-C(S)-NH-NH2）、アリールヒドラジン誘導体（-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2）、ヒドラジド誘導体（-C(O)-NH-NH2）、およびオキシルアミン誘導体、例えば-C(O)-O-NH2、-NH-C(O)-O-NH2および-NH-C(S)-O-NH2を意味する。
【００３５】
「保護された官能基」の用語は、本質的に非反応性になるように保護された官能基を意味する。アミンのために使用される保護基の例には、tert-ブトキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、アジド等が含まれるが、これらに限定されない。カルボキシル基については、tert-ブチル、更に一般的にはアルキル基のような他の基が関連するようになる。適切な保護基が当業者に知られており、その例は、Green & Wutsの「有機合成における保護基」第３版（Wiley-interscience）に見ることができる。
【００３６】
「開裂可能な部分」の用語は、選択的に開裂して、例えば固相担体から分岐したポリマーリンカーまたは分岐したポリマーリンカーインスリンを放出することができる部分を意味するものである。
【００３７】
「世代」の用語は、有機分子上の１以上の同一の官能基を特定のモノマービルディングブロックと反応させることによって形成された、単一の均一な層を意味するものである。デンドリマー合成は高レベルの合成制御を必要とし、これは一度に一つのモノマー層（または「世代」）でデンドリマーを構築する段階的反応を介して達成される。各デンドリマーは、各官能部位に樹状ウエッジが結合した多官能のコア分子からなっている。該コア分子は「世代０」と称される。各々の連続する反復単位は、全ての枝と共に、最終世代まで次の世代、即ち、「世代１」、「世代２」等を形成する。デンドリマーが専ら２分岐モノマーから作製されれば、反応のために利用可能な反応性表面基の数は2mであり、ここでのmは特定の世代を表す1、2、3 … 8の整数である。専ら３分岐モノマーで作製されたデンドリマーの場合、反応性基の数は3mであり、また専らｎ分岐の多分岐モノマーで作製されたデンドリマーの場合は、反応性基の数はnmである。それぞれの個々の世代で異なるモノマーが使用される分岐ポリマーの場合、特定の層または世代における反応基の数は、当該層の位置および個々のモノマーの分岐の数を機能的に知ることによって計算することができる。
【００３８】
「機能的インビボ半減期」の用語は、その通常の意味、即ち、インスリンもしくは接合体の生物学的活性の50％が身体もしくは標的器官内において未だ存在する時間、またはインスリンもしくは接合体の活性がその初期値の50％である時間の意味で使用される。機能的インビボ半減期を決定する代替法として、「血清半減期」、即ち、インスリンもしくは接合体分子の50％が、排泄される前に血漿流もしくは血流中を循環する時間が決定されてもよい。血清半減期の決定は、屡々、機能的半減期の決定よりも簡単であり、また血清半減期の大きさは、通常は機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標である。血清半減期に対する代替用語には、血漿半減期、循環する半減期、循環半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が含まれる。インスリンもしくは接合体は、細網内皮系（RES）、腎臓、脾臓、もしくは肝臓の１以上によって、組織因子、SEC受容体もしくは他の受容体に媒介された除去によって、または特異的もしくは非特異的なタンパク質分解によって排泄される。通常、クリアランスはサイズ（糸球体のカットオフに対して相対的な）、電荷、結合された糖鎖、およびインスリンの細胞性受容体の存在に依存する。保持されるべき機能は、通常は凝血原活性、タンパク質分解活性、補因子結合活性または受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、当該技術において既知の如何なる適切な方法によって決定されてもよい。
【００３９】
機能的インビボ半減期または血漿半減期に関して使用される「増大した」の用語は、インスリンもしくは接合体の相対的半減期が、基準分子のそれに対して統計的に有意に増大することを示すために使用される。例として、相対的半減期は、少なくとも約10％または少なくとも約25％、例えば少なくとも約50％、少なくとも約100％、150％、200％、250％、もしくは500％増大されてよい。
【００４０】
「ハロゲン」の用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。
【００４１】
「アルキル」、「アルキレン」、「アルカントリイル」、および「アルカンテトライル」の用語は、それぞれ1、2、3、または4の結合を伴った、好ましくは1〜18の炭素原子、好ましくは1〜10の炭素原子、より好ましくは1〜6の炭素原子を有する飽和された分岐もしくは直鎖の炭化水素基を表す。典型的な基には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、およびヘキシルが含まれるが、これらに限定されない。特定のアルキレン基、アルカントリイル基、およびアルカンテトライル基には、対応する二価、三価、および四価の基が含まれる。
【００４２】
「アルケニル」および「アルケニレン」の用語は、好ましくは、それぞれC2-6-アルケニルおよびC2-6-アルケニレンを意味するものであり、2〜6の炭素原子および少なくとも一つの二重結合を有し、且つそれぞれ1または2の結合を有する分岐鎖もしくは直鎖の炭化水素基を表す。典型的なC2-6-アルケニル基には、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、イソプロペニル、1,3-ブタジエニル、1-ブテニル、2-ブテニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、1-エチルプロパ-2-エニル、1,1-(ジメチル)プロパ-2-エニル、1-エチルブタ-3-エニル、および1,1-(ジメチル)ブタ-2-エニルが含まれるが、これらに限定されない。C2-6-アルケニレン基の例には、対応する二価の基が含まれる。
【００４３】
「アルキニル」および「アルキニレン」の用語は、好ましくは、それぞれC2-6-アルキニルおよびC2-6-アルキニレン基を意味するものであり、2〜6の炭素原子および少なくとも一つの三重結合を有し、且つそれぞれ1または2の結合を有する分岐鎖もしくは直鎖の炭化水素基を表す。典型的なC2-6-アルキニル基には、限定されるものではないが、ビニル、1-プロピニル、2-プロピニル、イソプロピニル、1,3-ブタジイニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、1-エチルプロパ-2-イニル、1,1-(ジメチル)プロパ-2-イニル、1-エチルブタ-3-イニル、1,1-(ジメチル)ブタ-2-イニルが含まれ、またC2-6-アルキニレン基には対応する二価の基が含まれる。
【００４４】
「アルコキシ」および「アルキレンオキシ」の用語は、好ましくは、それぞれ-O-C1-6-アルキル基または-O-C1-6-アルキレン基を表す「C1-6-アルコキシ」またはC1-6-アルキレンオキシを意味し、ここでのC1-6-アルキル(レン)は上記で定義した通りである。代表的な例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、ペントキシ、イソペントキシ、ヘキソキシ、およびイソヘキソキシ等である。
【００４５】
「アルキレンチオ」、「アルケニレンチオ」および「アルキニレンチオ」の用語は、上記で定義したオキシ基の対応するチオ類似体を意味する。代表的な例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ、並びにこれも上記で定義した対応する二価の基および対応するアルケニルおよびアルキニル誘導体である。
【００４６】
ここで、「-ジイル」および「-トリイル」の用語が使用され、それぞれ二つおよび三つの結合点を備えた異なるアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたは芳香族基を意味する。
【００４７】
ここで、「アルカントリオキシ」の用語は、三つのアルカントリイル結合の各々に一つのオキシ（-O-）が結合したアルカントリイル部分を意味する。代表的な例は、プロパントリオキシ、tert-ブチルトリオキシ等である。
【００４８】
「シクロアルキル」の用語は、好ましくは、3〜8の炭素原子を有する単環式の炭素環基を表すC3-8-シクロアルキルを意味する。代表的な例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル等である。
【００４９】
「シクロアルケニル」の用語は、好ましくはC3-8-シクロアルケニルを意味し、3〜8の炭素原子および少なくとも一つの二重結合を有する単環式の炭素環基を表す。代表的な例は、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、およびシクロオクテニル等である。
【００５０】
「ポリアルコキシ」の用語は、アルコキシ-アルコキシ-アルコキシ-アルコキシ等を意味し、ここでの各アルコキシ部分における炭素原子の数は同じかまたは異なり、好ましくは同じである。同様に、ポリアルコキシアルキルおよびポリアルコキシアルキルカルボニルは、それぞれ、(ポリアルコキシ)-アルキルおよび(ポリアルコキシ)-アルキル-CO-を意味する。Tポリアルコキシジイルの用語は、二つの自由結合を有するアルコキシ-アルコキシ-アルコキシ-アルコキシ等を意味する。
【００５１】
「ポリ」の用語は、多くのを意味し、好ましくは2〜24、より好ましくは2〜12、更に好ましくは3、4または5の範囲の数である。
【００５２】
「オキシアルキル」の用語は、-O-アルキル-、即ち二価の基である。
【００５３】
ここで使用する「アリール」の用語は、フェニル、ビフェニリル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル、およびアズレニル等のような炭素環式芳香族環系を含むものである。アリールまたは、上記で列記した炭素環式系の部分的に水素化された誘導体をも含むものである。このような部分的に水素化された誘導体の非限定的例は、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、および1,4-ジヒドロナフチル等である。
【００５４】
「アレーントリイル」および「アレーンテトライル」の用語は、上記で定義したアリールと同じ部分であるが、但し、アレーントリイルおよびアレーンテトライルにおいては自由結合が一つではなく、それぞれ三つおよび四つの自由結合が存在する。同じ条件において、アレーントリイルおよびアレーンテトライルの例は、アリールについて上記で述べた通りである。
【００５５】
ここで使用する「ヘテロアリール」の用語は、窒素、酸素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を含んだヘテロ環式芳香族環系、例えばフリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾチオフェニル（チアナフタレニル）、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、プリニル、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、およびアクリジニル等を含むものである。ヘテロアリールはまた、上記で列記したヘテロ環系の部分的に水素化された誘導体を含むものである。このような部分的に水素化された誘導体の非限定的な例は、2,3-ジヒドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、およびオキサゼピニル等である。
【００５６】
ここで使用するアリール-C1-6-アルキルの用語は、好ましくは、上記で定義したヘテロアリール、および上記で定義したC1-6-アルキルを意味する。
【００５７】
ここで使用する「アリール-C1-6-アルキル」および「アリール-C2-6-アルケニル」の用語は、それぞれ上記で定義したアリール、並びにC1-6-アルキルおよびC2-6-アルケニルを示す。
【００５８】
ここで使用する「アシル」の用語は、好ましくは-(C=O)-C1-6-アルキルを示し、ここでのC1-6-アルキルは上記で定義した通りである。
【００５９】
ＤＭＴは、
【化１１】
2008528549.tif 000003
であり、
リチルは、
【化１２】
2008528549.tif 000004
【００６０】
であり、
Ｂｏｃは、
【化１３】
2008528549.tif 000005
【００６１】
であり、
Ｆｍｏｃは、
【化１４】
2008528549.tif 000006
【００６２】
である。
【００６３】
上記で定義した用語の或るものは、構造式中に２回以上出てくることがあり、そのような場合には、各用語は他から独立に定義されるべきである。更に、二価もしくは三価の部分について組合された用語が使用されるとき、このような組合された用語の化学構造への解釈は、組合された用語を左から右へ、または逆に読み取ることによって行われる。従って、二価のアミノアルキル部分のような用語は、アルキルアミノ部分をもカバーするものである。ここで、該用語部分は、好ましくは二価および三価の基との関連で使用される。
【００６４】
より詳細に言えば、ここでは異なる用語の組合せからなる幾つかの二価の部分の名称は、各二価部分の後に四角い括弧の中の別の定義が続き、任意にこのような二価の部分の1以上の特定の例が続く：アルキレンアミノカルボニルアルキルアミノ[-アルキレン-NH-CO-アルキレン-NH-、例えば、-NH-CH2CH2-CO-NH-CH2CH2CH2CH2-]、アルキレンカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ[-アルキレン-CO-NH-(ポリアルコキシ)-アルキレンNH-]、アルキレンオキシアルキル[-アルキレン-O-アルキレン、例えば、-CH2CH2-O-CH2CH2-]、カルボニルアルキルアミノ-[-CO-アルキレン-NH-、例えば、-NHCH2CH2C(O)-]、カルボニルアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ[-CO-アルキレン-CO-NH-(ポリアルコキシ)-アルキレン-NH-]、カルボニルアルコキシアルキルアミノ[-CO-アルコキシ-アルキレンNH-]、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ[-CO-アルコキシ-アルキレン-CO-NH-(ポリアルコキシ)-アルキレン-NH-]、カルボニル(ポリアルコキシ)アルキルアミノ[-CO-(ポリアルコキシ)-アルキレン-NH-]、(ポリアルコキシ)アルキル[-(ポリアルコキシ)-アルキレン、例えば、-CH2OCH2CH2OCH2CH2O-CH2-および-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-CH2-]、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル[-(ポリアルコキシ)-アルキレン-CO-]。角括弧の中の式において、異なる部分の間の結合は「−」によって示される。
【００６５】
ここで使用される「任意に置換された」の用語は、問題の基が非置換であるか、または特定された1以上の置換基で置換されることを意味する。問題の基が1以上の置換基で置換されるとき、これらの置換基は同じでも異なってもよい。
【００６６】
ここで使用する「治療」の用語は、疾患、障害または状態と闘う目的での、患者の予防、管理および看護を意味する。この用語は、疾患の予防、疾患、障害または状態の進行の遅延、症候群および合併症の緩和もしくは寛解、および／または疾患、障害もしくは状態の治癒または排除を含むものである。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳類、特に人間である。
【発明の詳細な説明】
【００６７】
本発明は、インスリンに結合した分岐ポリマーであって、正確な数のモノマービルディングブロックで形成される分岐ポリマーに関する。該モノマービルディングブロックは、適切なモノマー保護および活性化戦略を使用して、固相担体上または溶液中でオリゴマー化されてよい。インスリンに結合された分岐ポリマーは、ここでも接合体インスリン、またはインスリン接合体と称される。下記に記載する方法を使用することにより、分岐ポリマーが構造的に充分に定義されている接合インスリンを調製することが可能である。従って、本発明の化合物は単分散である。ここに記載する方法を使用することにより、重量／重量で50％超、好ましくは75％超、より好ましくは90％超、更に好ましくは95％超、更に好ましくは99％超の純度を有する下記一般式IIの化合物を調製することが可能である。
【００６８】
一つの実施形態において、本発明は、式IIの単一の特別な化合物をこのような高純度で含有する生成物に関する
本発明の一っ実施形態は、下記一般式IIによって表される上記で述べた接合体を提供する：
Ins-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3(Y4(Y5(Y6)r)q)p)s)n       (II)
ここで、
Insは、そのA1またはB1位のアミノ酸に存在するαアミノ基から、またはB29位もしくは何れか他の位置のリジン残基に存在するεアミノ基から水素が除去されたインスリンを表し、
第１世代の２分岐化合物については、
Y1はYbであり；Y2はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは2であり；
第２世代の２分岐化合物については、
Y1およびY2はYbであり；Y3はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは2であり；
第３世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2およびY3は全てYbであり；Y4はZであり；rおよびqはゼロであり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
第４世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3およびY4は全てYbであり；Y5はZであり；rはゼロであり；qは16であり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
第５世代の２分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3、Y4およびY5は全てYbであり；Y6はZであり；rは32であり；qは16であり；pは8であり；sは4であり；nは2であり；
ここで、Ybは、
【化１５】
2008528549.tif 000007
【００６９】
であり、
第1世代の３分岐化合物については、
Y1はYtであり；Y2はZであり；r、q、p、およびsは全てゼロであり；nは3であり；
第２世代の２分岐化合物については、
Y1およびY2はYtであり；Y3はZであり；r、q、およびpは全てゼロであり；sは9であり；nは3であり；
第３世代の３分岐化合物については、
Y1、Y2およびY3は全てYtであり；Y4はZであり；rおよびqはゼロであり；pは27であり；sは9であり；nは3であり；
第４世代の３分岐化合物については、
Y1、Y2、Y3およびY4は全てYtであり；Y5はZであり；rはゼロであり；qは81であり；pは27であり；sは9であり；nは3であり；
ここで、Ytは、
【化１６】
2008528549.tif 000008
【００７０】
であり、
ここで、Aは-CO-、-C(O)O-、-P(=O)(OR)-、または-P(=S)(OR)-であり、ここでのRは水素、アルキルまたは任意に置換されたアリールであり；
Bは、-NH-または-O-であり；
但し、Bが-NH-であるときは、Aは-CO-または-C(O)O-であり、またBが-O-であるときは、Aは-P(=O)(OR)-または-P(=S)(OR)-であり；
一つの単分子層（世代）（Y1、Y2、およびY3で例示）のB基は、Yが接尾語としての次の数を有する隣接した後続の層（それぞれY2、Y3およびY4で例示される）のA基に結合され、またはZに結合され；
X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、アルカントリオキシ、式-CO-N<のアミノカルボニル部分、式-CH2CO-N<のアセタミド部分、または次式
【化１７】
2008528549.tif 000009
【００７１】
の部分であり、ここでのQはアルカントリイルであり；
X4は、アルカンテトライルまたはアレーンテトライルであり；
L1は、原子価結合、オキシ、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの最後の３部分の末端アルキル部分は、好ましくはAに結合され；
L2は、原子価結合、オキシアルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの最後の３部分の末端アルキル部分は、好ましくはBに結合され；
L3は、原子価結合、アルキレン、オキシ、ポリアルコキシジイル、オキシアルキル、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、アルキルアミノカルボニルアルキルアミノ、カルボニルアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、カルボニルアルコキシアルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、カルボニル(ポリアルコキシ)アルキルアミノ、またはカルボニルアルコキシアルキルアミノを表し、ここでの最後の１０部分の末端カルボニル、アルキルおよびオキシ部分は、好ましくは任意にL4部分を介してIns基に結合され； 
mは、ゼロ、1、2または3であり；
L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中から選択され、ここでのL5は原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、ここで前記L4部分における末端カルボニル部分は、好ましくはIns部分に結合され；
Zは、水素、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、ポリアルコキシ、オキシアルキル、アシル、ポリアルコキシアルキルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルである。
【００７２】
上記で述べたように、L1、L2、L3 およびL4 は全て二価の基として解釈されるべきであり、X3は三価の基であり、X4は四価の基である。
【００７３】
上記および本明細書の何処かにおける式IIの定義において、２分岐、３分岐および世代の三つの用語は、その理解を容易にするために使用されるものであり、如何なる意味においても限定的な解釈を生じるべきものではない。
【００７４】
従って、第１世代の２分岐化合物は式IIaによって示すことができ、
Ins-L4-(L3)m-Y1(Y2)2              (IIa)
これはまた、式IIa’によっても表すことができ、
【化１８】
2008528549.tif 000010
【００７５】
ここでのIns、Y1、Y2、L3、L4、m、YbおよびZは、各々、上記で定義した通りである。更に、第二世代の２分岐化合物は、式IIbによって示すことができ、
Ins-L4-(L3)m-Y1(Y2(Y3)4)2          (IIb)
これはまた、式IIb’によって示すことができ
【化１９】
2008528549.tif 000011
【００７６】
ここでのIns、Y1、Y2、Y3、L3、L4、m、YbおよびZは、各々、上記で定義した通りである。
【００７７】
或いは、本発明は、次式IIcにおけるように、例えば第四世代の２分岐化合物の式を描くことによって示すことができる：
【化２０】
2008528549.tif 000012
【００７８】
ここで、全ての記号は上記で述べたとおりである（垂直の線は式の一部ではなく、異なるレベルを示すものである）。式IIcは、本発明を例示する目的で与えられたものに過ぎず、保護の範囲を限定するために使用されるべきものではない。
【００７９】
本発明の一つの実施形態において、rはゼロである。本発明のもう一つの実施形態において、rおよびqは各々ゼロである。本発明のもう一つの実施形態において、nは2（２分岐化合物について）または3（３分岐化合物について）である。本発明のもう一つの実施形態において、sは4（２分岐化合物について）または9 （３分岐化合物について）である。本発明のもう一つの実施形態においては、sが4で且つp は8であり（２分岐化合物について）、またはsが9で且つpが27である（３分岐化合物について）。
【００８０】
上記で述べたように、式IIの化合物は１以上のYb部分を含んでいる。式IIの化合物が２以上のYb部分を含むとき、これらの部分は同じであっても異なってもよい。本発明の一実施形態において、全てのYb部分は同一である。本発明のもう一つの実施形態においては、同じレベルからのYb部分は同一であるが、一つのレベルにおけるYb部分はもう一つのレベルにおけるYb部分とは異なっており、各レベルはそれぞれ、式IIにおける下添字n、s、p、qおよびrによって同定される。特定の部分Ybにおいて、二つのB部分は同じであるかまたは異なっているが、好ましくは、このような二つのB部分は同じである。更に、特定の部分Ybにおいて、二つのL2部分は同じかまたは異なっているが、好ましくは、このような二つのL2部分は同じである。このことは、Yb部分およびその中に存在するBおよびL2部分についても同様に適用される。
【００８１】
一つの実施形態において、本発明は２分岐化合物に関し、もう一つの実施形態においては、本発明は３分岐化合物に関する。
【００８２】
YbまたはYt部分に存在する二つまたは三つのL2部分は、それぞれ、同じでも異なってもよい。本発明の一実施形態において、YbまたはYt部分の何れかに存在する二つまたは三つのL2部分はそれぞれ同じである。 present in any Yb or Yt moiety、respectively、
少なくとも説明の目的で、幾らかは実際にも、式IIの化合物の非インスリン部分の大部分は、下記の式を有する式IbまたはIcの化合物から構築することができる：
【化２１】
2008528549.tif 000013
【００８３】
ここでのL1、L2、X3およびX4 は上記で定義した通りであり、また-A’および-B’は、反応して-A-B-部分を形成できる基であり、AおよびBは上記で定義した通りである。
【００８４】
基A’およびB’の間の反応によって形成される共有結合の性質は、A’およびB’の選択に依存し、また上記で示したように、アミド結合、カルバメート結合、リン酸エステル結合、チオリン酸エステル結合、およびホスファイト結合が含まれる。
【００８５】
一つの実施形態において、A’は-COOH、-COOR、-OCOOR、-OP(NR2)OR、-(O=)P(OR)2、-(S=)P(OR)(OR´)、-(S=)P(SR)(OR´)、-(S=)P(SR)(SR´)、-COCl、-COBr、-OCOBr、-P(OR)3、炭酸p-ニトロフェニル(-OC(=O)OC6H4NO2)、炭酸スクシンイミジル(-OC(=O)-Nhs、ここでのNhsはN-ヒドロキシスクシンイミドである)、カルボニルイミダゾール(-C(=O)-Im、ここでのImはイミダゾールである)、オキシカルボニルイミダゾール(-OC(=O)-Im、ここでのImはイミダゾールである)、塩化カルボニル (-C(=O)Cl)、クロロギ酸エステル(-OC(=O)Cl)、イソシアネート(-N=C=O)、およびイソチオシアネート(-N=C=S)からなる群から選択され、ここでのRおよびR’はC1-6-アルキル、アリールまたは置換アリールを表す。
【００８６】
もう一つの実施形態において、B’は、-NH2、-OH、-N3、-NHR’および-OR’からなる群から選択され；ここでのR’は保護基であり、例えばペプチド化学およびオリゴヌクレオチド化学に使用されるときにモノマーの段階的オリゴマー化を容易にするものである。
【００８７】
保護基の非限定的な例には、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmocと称する）、tert-ブトキシカルボニル（Bocと称する）、フタロイル、トリフェニルメチル、および置換トリフェニルメチル、トリフルオロアセチルもしくはトリクロロアセチルのようなトリハロアセチル、ピクシル（pixyl）、トリメチルシリル、tert-ブチルジメチルシリル、およびtert-ブチルジフェニルシリルが含まれる。適切な保護基の他の例は、当業者に既知であり、Green & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd edition, Wiley-interscienceの中に示唆を見ることができる。
【００８８】
X3は、分岐鎖で三価の、好ましくは親水性の基（リンカー）である。一実施形態において、それは18以下、より好ましくは1〜約10の炭素原子を含む多官能化されたアルキル基である。もう一つの実施形態において、X3は単一の窒素原子である。もう一つの実施形態において、X3はアルカントリイルである。もう一つの実施形態において、X3はプロパン-1,2,3-トリイルである。もう一つの実施形態において、X3はアルカントリオキシである。もう一つの実施形態において、X3はアルカントリイル、アルカントリオキシ、または式
【化２２】
2008528549.tif 000014
【００８９】
の部分であり、ここでのQはアルカントリイルであり；更に、X3は式-CO-N<のアミノカルボニル部分、または式-CH2CO-N<のアセタミド部分であることができ、好ましくは、X3 は次式のうちの一つを有する：
【化２３】
2008528549.tif 000015
【００９０】
最後の二つの部分は、(R)および(S)-1,5-ビス(アミノカルボニル)ペンチルである。
【００９１】
本発明の一実施形態において、X4はベンゼン-1,3,4,5-テトライルである。
【００９２】
本発明のもう一つの実施形態において、X3またはX4は対称である。
【００９３】
L1およびL2の例は、アルキレン、および-((CH2)m’O)n’-であり、ここでのm’は2、3、4、5、または6であり、n’は0〜10の整数である。一実施形態において、L1およびL2は親水性のものである。本発明のもう一つの実施形態において、L1、L2またはその両方が原子価結合である。本発明のもう一つの実施形態において、L1は、-CH2(OCH2CH2)n”-OCH2C(O)-であり、ここでのn”は0〜10の整数である。
【００９４】
本発明のもう一つの実施形態において、L1およびL2は水溶性の二価の有機基から選択される。本発明のもう一つの実施形態において、L1もしくはL2またはその両者は、約1〜5のPEG（-CH2CH2O-）基を含む二価の有機基である。本発明のもう一つの実施形態において、L1およびL2は、それぞれ相互に独立に、トリ-、テトラ-たはペンタ-エチレングリコール部分、即ち、(-CH2CH2O-)3、(-CH2CH2O-)4 または(-CH2CH2O-)5である。本発明のもう一つの実施形態において、L1はオキシ(-O-)またはオキシメチル(-OCH2-)であり、またL2は式(-CH2CH2O-)2の部分であり、また式
【化２４】
2008528549.tif 000016
【００９５】
を有する。
【００９６】
本発明の一実施形態において、L1は、原子価結合、オキシ、アルキレンオキシアルキル、オキシアルキル、または(ポリアルコキシ)アルキルであり、好ましくは、L1は原子価結合、-O-、または次の三つの部分のうちの一つである：-OCH2-、-CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2- および-CH2OCH2-。本発明のもう一つの実施形態において、L1は原子価結合、オキシ、アルキレン、ポリアルコキシジイル、またはオキシアルキルである。もう一つの実施形態において、L1は、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの末端アルキル部分は好ましくはAに結合される。
【００９７】
本発明の一実施形態において、L2は、アルキレン、アルキレンオキシアルキル、ポリアルコキシジイル、または(ポリアルコキシ)アルキルであり、好ましくは、L2は次の四つの部分のうちの一つである：-CH2CH2OCH2CH2O-、-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2-、-CH2CH2OCH2CH2- または-CH2CH2-。本発明のもう一つの実施形態において、L2は、原子化結合、オキシ、アルキレン、ポリアルコキシジイル、またはオキシアルキルである。もう一つの実施形態において、L2は、(ポリアルコキシ)アルキルカルボニル、オキシアルキルまたは(ポリアルコキシ)アルキルであり、ここでの末端アルキル部分は好ましくはBに結合される。
【００９８】
本発明の一実施形態において、X3は、窒素原子、アルカントリイル、アレーントリイル、または式
【化２５】
2008528549.tif 000017
【００９９】
の部分であり、ここでのQはアルカントリイルである。
【０１００】
本発明の一実施形態において、Qは、1,1,5-ペンタトリイルである。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、mは整数、または1、2もしくは3である。本発明のもう一つの実施形態において、mは整数である。本発明のもう一つの実施形態において、mは1、2または3である。
【０１０２】
本発明の一実施形態において、L3はアルキレン、ポリアルコキシジイル、オキシ、オキシアルキル、および原子価結合であり、L4は結合であり、またL3の一部は以下の部分のうちの一つを含んでいる：両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアリールカルボニル(-O-N=CH-Ar-CO-)、および両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノカルボニル(-O-N=CH-CO-)、この場合、L3は全体としてアミノアルケニルまたはアミノポリアルコキシジイル誘導体、例えばアミノアルキルオキシイミノアリールカルボニルまたはアミノポリアルコキシイミノカルボニルである。本発明のもう一つの実施形態において、L3は、アルキレン、ポリアルコキシジイル、オキシ、オキシアルキル、および原子価結合であり、L4は結合であり、L3の一部は下記の部分のうちの一つを含んでよい：両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノメチルアリールカルボニル(-O-N=CH-Ar-CO-)、および両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアセチル(-O-N=CH-CO-)、この場合、L3は全体としてアミノアルケニルまたはアミノポリアルコキシジイル誘導体、例えばアミノアルキルオキシイミノメチルアリールカルボニルまたはアミノポリアルコキシイミノアセチルである。本発明のもう一つの実施形態において、L3は、アルキルアミノ、カルボニルアルキルアミノ、またはアルキルアミノカルボニルアルキルアミノであり、好ましくは、L3は次の三つの部分のうちの一つである：-C(O)CH2CH2NH-、-CH2CH2CH2CH2NHC(O)CH2CH2NH-、または-CH2CH2CH2CH2NH-。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、L4はオキシイミノアルキルカルボニル部分、例えば両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアセチル(-O-N=CH-CO-)である。本発明のもう一つの実施形態において、L4は、オキシイミノアルキルアリールカルボニル部分、例えば両異性体（synおよびanti）形態のオキシイミノアルキルアリールカルボニル(-O-N=CH-Ar-CO-)である。本発明のもう一つの実施形態において、L4は原子価結合である。本発明のもう一つの実施形態において、L4は、次式の部分のうちの一つのsynまたはanti形態である：
【化２６】
2008528549.tif 000018
【０１０４】
本発明のもう一つの実施形態において、L4は、次式の部分のうちの一つのsynまたはanti形態である：
【化２７】
2008528549.tif 000019
【０１０５】
本発明の一実施形態において、Aは、-CO-、-C(O)O-、-P(=O)(OR)-または-P(=S)(OR)-であり、ここでのRは水素であり、好ましくは、Aは-CO-、-C(O)O-、-P(=O)(OH)-または-P(=S)(OH)-である。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、Bは-NH-または-O-である。
【０１０７】
本発明の一実施形態において、Zは水素、アルキル、アシルまたはポリアルコキシアルキルカルボニルであり、好ましくは、ZはH-、CH3OCH2CH2OCH2CH2OCH2C(O)-、CH3-またはC6H5C(O)-である。
【０１０８】
本発明の一実施形態において、A’はカルボキシル基であり、またB’は保護されたアミノ基であり、脱保護の後にそのカルボキシ基を介して同じ構造の新しいモノマーに結合されて、アミド結合を形成してよい。標準のオリゴペプチド合成から知られているように、反復法においてより大きなポリマーを組み立てることができる。もう一つの実施形態において、A’は、p-ニトロフェニルカーボネート(-C(O)-O-pC4H6NO2)、カルボニルイミダゾール(-C(O)-Im)、-COOHまたは-C(O)Clである。本発明のもう一つの実施形態において、B’は、N3-、FmocNH-、または次式のうちの一つの基である：
【化２８】
2008528549.tif 000020
【０１０９】
L3がアミノアルキルのとき、その炭素原子は、好ましくはIns-L4部分を含む式IIの一部に結合される。L3がオキシアルキルであるとき、その炭素原子は、好ましくはIns-L4部分を含む式IIの一部に結合される。L1がポリアルコキシジイル、ポリアルコキシアルキルまたはオキシアルキルであるとき、その末端アルキレン部分は、好ましくはA部分に結合される。L2がポリアルコキシジイルまたはオキシアルキルであるとき、そのオキシ部分は、好ましくはX3およびX4部分に結合される。
【０１１０】
本発明の一実施形態において、請求項２において述べる記号の1を除く全部、好ましくは2を除く全部、より好ましくは3を除く全部、最も好ましくは4を除く全部が、実施例55〜123および125〜127の何れか一つにおいて特に述べた式IIの化合物に存在するこれら基または部分であり、また残りの記号は請求項4および6〜16の何れかにおいて述べたものである。
【０１１１】
本発明のもう一つの実施形態において、A’はホスホロアミダイトであり、B’適切に保護されたヒドロキシル基であり、これは脱保護されたときに同じタイプのもう一つのモノマーに結合されて、亜リン酸トリエステルを形成することができ、これは引続き酸化されて安定なリン酸トリエステルまたはチオリン酸トリエステルを形成する。こうして、標準のオリゴヌクレオチド合成から既知の反復法において、より大きなポリマーを組み立てることができる。
【０１１２】
もう一つの実施形態において、A’は反応性炭酸エステル、例えば炭酸ニトロフェニルであり、またB’はアミノ基（好ましくはその保護された形態）である。従って、より大きなポリマーを、標準のオリゴカルバメート合成から既知の反復方法で組み立てることができる。
【０１１３】
もう一つの実施形態において、A’はハロゲン化アシル、例えば-COClもしくは-COBrであり、またB’はアミノ基（好ましくはその保護された形態）である。
【０１１４】
もう一つの実施形態において、Insは、ヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイルGlnB3des(B30)ヒトインスリン、NεB29-トリデカノイルヒトインスリン、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン、NεB29-デカノイルヒトインスリン、およびNεB29-ドデカノイル ヒトインスリン、インスリンaspart（即ち、AspB28ヒトインスリン）、インスリンlispro（即ち、LysB28,ProB29ヒトインスリン）、およびインスリンglagine（即ち、GlyA21,ArgB31,ArgB32ヒトインスリン）またはインスリンdetemir（即ち、NεB29-テトラデカノイルヒトインスリン）であり、それらから水素が一つ除去されている。本発明のもう一つの実施形態において、Insは、B29Lys(Asn(eps))-desB30ヒトインスリン、B29Lys(Asn(eps))ヒトインスリン、B28Asp-B29Lys(Asn(eps))-desB30ヒトインスリン、B28Asp-B29Lys(Asn(eps))ヒトインスリン、B28Lys(Asn(eps))-B29Pヒトインスリン、またはB3Lys(Asn(eps))-B29Gluヒトインスリンである。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の化合物の分岐ポリマーは、約500 Da超、好ましくは約3 kDa超、より好ましくは約5 Kda超の分子量を有する。
【０１１６】
一実施形態において、本発明の化合物の分岐ポリマーは、約500 Da超、好ましくは約3 kDa超、より好ましくは約5 Kda超の分子量を有する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の化合物の分岐ポリマーは、約10 kDa未満、好ましくは約7 Kda未満の分子量を有する。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の化合物は、約3〜約7の等電点を有する。
【０１１９】
一実施形態において、本発明の化合物は、生理学的条件下において正味の負の電荷を有する。
【０１２０】
更なる実施形態において、式A’-L1-X3-(L2-B’)2のモノマービルディングブロックは、
【化２９】
2008528549.tif 000021
【０１２１】
である。
【０１２２】
もう一つの実施形態において、式A’-L1-X3-(L2-B’)2のモノマービルディングブロックは、
【化３０】
2008528549.tif 000022
【０１２３】
である。
【０１２４】
もう一つの実施形態において、式A’-L1-X3-(L2-B’)2ののモノマービルディングブロックは、
【化３１】
2008528549.tif 000023
【０１２５】
である。
【０１２６】
一実施形態において、L3は、下記の三つの式のような二価のリンカー基である：
【化３２】
2008528549.tif 000024
【０１２７】
一実施形態において、Zは、末端アミノ基もしくはヒドロキシ基と反応できるキャッピング剤である。Zの好ましい例には、次の三つの例が含まれる：
【化３３】
2008528549.tif 000025
【０１２８】
２分岐化合物についての一実施形態において、式IIの化合物の非インスリン部分の主要部は、式A’-L1-X3-(L2-B’)2のモノマーから構築される
【化３４】
2008528549.tif 000026
【化３５】
2008528549.tif 000027
【化３６】
2008528549.tif 000028
【化３７】
2008528549.tif 000029
【化３８】
2008528549.tif 000030
【０１２９】
３分岐化合物についての本発明の一実施形態において、式IIの化合物の非インスリン部分の主要部は、式A’-L1-X4-(L2-B’)3のモノマーから構築される：
【化３９】
2008528549.tif 000031
【０１３０】
分岐ポリマーは、一般に、発散アプローチおよび収束アプローチと称される二つの基本的に異なるオリゴマー化戦略のうちの一つを使用して、上記のモノマービルディングブロックから組み立てることができる。
【０１３１】
明らかに、特許請求の範囲を含めて、ここに記載した本発明の１以上の実施形態を組み合わせることにより、新たな実施形態が得られる。
【０１３２】
＜分岐ポリマーの発散型アセンブリー＞：
一つの実施形態において、分岐ポリマーは、合成サイクルの反復プロセスによって組み立てられ、各サイクルは適切な活性化された反応性の２分岐もしくは３分岐モノマービルディングブロックを使用し、これらブロック自身が、更なる延長（即ち、ポリマー「成長」）を可能にする機能的な末端基を含んでいる。この機能的末端基は、自己重合を防止するために通常は保護されることを必要とし、このような場合には、更なる延長のために必要な機能的末端基を発生させるために、脱保護工程が必要とされるであろう。反復工程において、活性化された（反応性）モノマービルディングブロックを付加し、引き続くプロセスにおいて脱保護する一つのこのようなサイクルは、一つの世代を完成させる。この発散型アプローチは、溶液層化学を使用した反応スキーム４、および固相化学を使用した反応スキーム３に図示されている。
【０１３３】
＜分岐ポリマーの収束型組み立て＞：
しかし、このような反復プロセスにおいてより高世代の材料に到達するときには、高充填密度の機能的末端基が頻繁に出現し、これにより更なる正常な成長が妨げられて不完全な世代が導かれる。事実、成長が多数の表面官能基の反応を必要とする全ての系について、各成長段階において全部が反応することを保証するのは困難である。未反応の機能性末端基は、段階的成長シーケンスの後の方の段階で欠損配列（短縮）または擬似反応性を導く可能性があるので、これは正常な単分散および高度に組織化された分岐構造の合成において重要な問題を提示する。
【０１３４】
従って、一実施形態において、分岐ポリマーは米国特許第5,041,516号に記載された収束型アプローチによって組み立てられる。巨大分子を構築するための収束型アプローチには、発散型アプローチにおけるようにそのコアではなく、その周辺から出発することにより最終分子を構築することが含まれる。これは、典型的には数が徐々に大きくなる部位での反応に伴った共有結合の不完全な形成等の問題を回避する。
【０１３５】
第二世代の分岐ポリマーを組み立てるための収束型アプローチが、モノマービルディングブロックの一つを含む特定の例を使用して、反応スキーム１および反応スキーム２に図示されている。分岐ポリマーの剛性は、特定のモノマーの設計によって、例えば剛性コア構造（X3またはX4）を使用することによって、または剛性のリンカー部分（L1およびL2）を使用することによって制御することができる。もう一つの実施形態において、剛性の調節は、より可撓性のモノマーと混合して、1以上の特定の層において剛性モノマーを使用することによって得られる。もう一つの実施形態においては、当該ポリマーの全体の親水性が制御可能である。これは、1以上の樹状層において、より疎水性のコア構造（X3またはX4）またはより疎水性のリンカー部分（L1およびL2）をもったモノマーを選択することによって達成される。
【０１３６】
もう一つの実施形態においては、分岐ポリマーの外側末端層（Z）の中に異なるモノマーが使用され、これは最終インスリン接合体において周囲環境に露出されるであろう。ここに記載されたモノマーの幾つかは、末端基（B’）として保護されたアミン官能基を有しており、これは脱保護工程の後に、生理的条件下、即ち約7.4のpH値に緩衝された中性の生理的条件においてプロトン付加され、全体の構造がポリ陽イオン的に帯電されるであろう。或いは、種々のアシル化試薬を用いてキャッピングすることにより、中性構造を作製することができる。反応スキーム５に描写された一つの例は、そうでなければアミンで終端するであろう樹状構造の最終層（Z）をキャッピングするために、CH3(OCH2CH2)2CH2COOHを使用する。
【０１３７】
もう一つの実施形態においては、天然に存在する糖ペプチドを模した分岐ポリマーが与えられ、それらは共通に、それらのN-グリカンのアンテナ構造上の末端基として複数の負に帯電したシアル酸を有する。最終層（Z）を形成するために使用されるモノマーを適正に選択することによって、このようなグリカンはそれらのポリ陰イオン性に関して模倣されることができる。一つのこのような例が反応スキーム６に描かれており、ここでは分岐ポリマーがコハク酸モノtertブチルエステルでキャップされ、これは酸での脱保護に際してポリマー表面を生理的条件下で負に帯電させる。
【０１３８】
モノマーをポリマーにアセンブリーすることは、例えば、N.J. Wells, A. Basso and M. Bradley in Bioポリmers 47, 381-396 (1998)に記載されたように固体支持体上で、または、例えばFrechet et alが米国特許第5,041,516号に記載したように、古典的な溶液相化学によって適切な有機溶媒中で実行されてよい。
【０１３９】
従って、一実施形態において、分岐ポリマーは、上記で説明し且つ反応スキーム３に図示した反復発散法プロセスにおいて適切な結合で誘導体化された適切な固相支持体上で組み立てられる。FmocまたはBocで保護されたアミノ基（B'）および反応性の機能的アシル化部分（A'）を用いて設計されたモノマーについては、従来のペプチド合成に有用な固相プロトコールを便利に適合することができる。文献（Fields、editor、Solid phase peptide synthesis、in Meth Enzymol 289参照）に記載されたような適用可能な標準の固相技術は、適切なプログラム可能な機器（例えばABI 430A）または同様の過程で組み立てる機械の使用によって、また支持体の分離および洗浄のために標準の濾過技術を手動で使用することによって、実施することができる。
【０１４０】
例えばDMT保護されたアルコール基（B'）、および例えば反応性ホスホロアミダイト（A'）
を備えたモノマーについては、Applied Biosystems Expidite 8909のような標準のオリゴヌクレオチド合成のために使用される固相装置、および最近M. Dubber and J.M.J. FrechetがBioconjugate chem. 2003、14、239-246に記載したような条件を、便利に適用することができる。このような従来のホスホルアミダイト法に従うリン酸ジエステルの固相合成は、通常、中間体のホスファイトトリエステルがリン酸トリエステルに酸化されることを必要とする。この種の固相支持体酸化は、典型的には、ヨウ素／水または過酸化物（例えばtert-ブチル過酸化水素および3-クロロ過安息香酸であるが、これらに限定されない）を用いて達成され、また保護されまたは保護されないモノマーが酸化条件に耐えることを必要とする。ホスホルアミダイト法はまた、ヨウ素をピリジン中の元素状硫黄または有機チオール化試薬（例えば3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド）で置き換えることにより、チオホスフェートの便利な合成を可能にする（例えば、M. Dubber and J.M.J. Frechet in Bioconjugate chem. 2003, 14、239-246参照）。
【０１４１】
樹脂に結合された分岐ポリマーは、完成されたときに、適切な条件化で樹脂から開裂することができる。成長するポリマーと固相支持体との間の開裂可能なリンカーが、個々の合成サイクルに使用される何れかの脱保護工程、酸化工程または還元工程を含めた個々のモノマーのオリゴマー化プロセスの際に完全なままで残るが、所望のときは、適切な条件下で開裂して最終の分岐ポリマーを無傷で残すように選択されることが重要である。当業者は、リンカーおよび支持体、並びにオリゴマー化プロセス、脱保護プロセス、および任意に酸化プロセスのための反応条件を、問題のモノマーに応じて適切に選択できるであろう。
【０１４２】
モノマー単位の結合を可能にし且つ後で開裂可能な部分として作用する、適切な官能基で誘導体化された樹脂は、商業的に入手可能である（例えばBachem and NovoBiochemのカタログを参照されたい）。
【０１４３】
もう一つの実施形態において、分岐したポリマーは適切なリンカーを用いて樹脂上で合成され、これは開裂したときに、官能基を備えた分岐したポリマー生成物を生じ、該官能基は、以下で述べる後続のインスリンへの溶液相接合プロセスにおいて結合基として直接作用することができ、或いは、適切な化学的手段により、このような結合基へと変換することができる。
【０１４４】
もう一つの実施形態において、一定のサイズおよび組成の樹状分岐ポリマーは、古典的な溶液相技術を使用して合成される。
【０１４５】
この実施形態において、該分岐ポリマーは、成長しているポリマーに対して適切な活性化モノマーを逐次付加させることにより、適切な溶媒中で組み立てられる。各々の付加の後、次の世代の構築を開始できる前に、脱保護工程が必要とされるかも知れない。完全な反応に達するためには、過剰のモノマーを使用するのが望ましいかもしれない。一実施形態において、過剰のモノマーの除去は、親水性ポリマーがジエチルエーテル等の溶媒中で低い溶解度を有するという事実を利用する。こうして、成長しているポリマーは、過剰のモノマー、カップリング剤、副生成物等を溶液中に残して沈殿することができる。次いで、単純なデカント、より好ましくは遠心分離に続くデカントによって相分離を行うことができる。ポリマーはまた、例えばシリカゲル上での従来のクロマトグラフィー技術によって、またはP.R. Ashton in et al. in J.Org.Chem. 1998、63、3429-3437に記載された正常条件または逆相条件下でHPLCもしくはMPLCシステムを使用することによって、副生成物から分離することができる。或いは、著しく大きなポリマーは、E.R.Gillies and J.M.J. Frechet in J. Am. Chem. Soc. 2002、124、14137-14146に記載されたように、任意に透析と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、過剰なモノマーおよび副生成物のような低分子成分から分離することができる。
【０１４６】
もう一つの実施形態においては、収束溶液相合成が使用される。固相技術とは対照的に、溶液相はまた、上記で説明され且つS.M.Grayson and J.M.J.Frechet in Chem.Rev. 2001、101、3819-3867に更に概観されている分岐ポリマーの組み立てのために、収束型アプローチを使用することを可能にする。従って、一般式Iの官能部分（A’）は、殆どの場合、末端基（B’）の段階的化学操作を可能にする適切な保護を必要とするであろう。官能部分（A’）のための保護基の選択は、実際の官能基に依存する。例えば、一般式IｂまたはIｃにおけるA’がカルボキシ基であれば、TFAによって除去できるtert-ブチルエステル誘導体は適切な選択であろう。適切な保護基が当業者に既知であり、他の例は、Green & Wuts “Protection groups in organic synthesis”, 3rd edition、Wiley-intersciencenに見ることができる。分岐ポリマーの収束型組み立てが、反応スキーム１および反応スキーム２に図示されている。これら反応スキームは以下に見ることができる。反応スキーム１の工程(i)において、tert-ブチルエステル官能基（A’）が、適切な前駆体とα-ブロモ酢酸tert-ブチルとの反応によって調製される。工程(ii)においては、工程（iv）でハロゲン化アシルに変換されるカルボン酸を用いたアシル化工程（iii）を可能にするように、末端基（B’）が操作される。工程（v）においては、tert-ブチルエステル官能基（A’）が除去されて、末端（B’）がキャップされたモノマーが形成される。この末端キャップされたモノマーは、反応スキーム２において第二世代の生成物を調製するための出発材料として働き、ここでは２当量が、反応スキーム１の工程（ii）における生成物とのアシル化反応に使用される。この反応生成物は新しいtert-ブチルエステルであり、これは反復的に、脱保護した後に反応スキーム２の最初の工程に再導入することにより、より高い世代の材料を作製することができる。
【０１４７】
インスリンへの分岐ポリマー分子の結合を行うために、溶液中または固相支持体上において、分岐ポリマーに反応性ハンドルが設けられなければならない。即ち、反応性官能基を与えなければならず、その例には、カルボン酸、一級アミノ基、ヒドラジド、O-アルキル化ヒドロキシルアミン、チオール、スクシネート、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロプリオネート、スクシンイミジルカルボキシメチレート、ヒドラジドアリールカルボネート、およびアリールカルバメート、例えばニトロフェニルカルバメートおよびニトロフェニルカルバメート、クロロカルボネート、イソチオシアネート、イソシアネート、マレイミド、および活性化型エステル
【化４０】
2008528549.tif 000032
【０１４８】
が含まれる。
【０１４９】
分岐ポリマーのインスリンへの接合は、当業者に既知の従来の方法によって行われる。当業者は、使用すべき活性化方法および／または接合の化学（例えば反応基などの選択）が、インスリン上の選択される結合基（例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等）および分岐ポリマー上の結合基（例えばスクシンイミジルプロピオネート、ニトロフェニルカルボネート、マレイミド、ビニルスルホン、ハロアセテート等）に依存することを知っているであろう。もう一つの実施形態において、上記でのべたような分岐ポリマー上の適切な結合部分は、従来の溶液相化学をい使用して、分岐ポリマーが組み立てられた後に形成される。カルボン酸基を含む分岐ポリマー上の求核性結合部分を形成するための、異なる方法を示す本発明の実施形態が反応スキーム７に挙げられている。
【０１５０】
分岐ポリマー誘導体を備えたリジン上におけるε-アミノ基の直接アシル化に対する代替として、インスリンは、最初に、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、および1-ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル等のような活性化を使用して、ホルミル誘導体化されたカルボン酸でアシル化されてよい。アルデヒド官能基を持った得られたインスリンは、次いで、例えばO-置換されたヒドロキシアミン、ヒドラジン、またはヒドラジンのように適切に誘導体化された本発明のモノマー-、オリゴマー-もしくはポリマー-ビルディングブロックと共に、これら二つの成分を、任意に有機共溶媒を含む中性、酸性もしくはアルカリ性pHの水性媒質中で混合することによって縮合されてよい。この場合、L4は原子化結合であり、また一般式IIにおける二価の基L3はオキシム基を含んでいる。部分L4＋隣接するL3の代表的かつ非限定的例には、次のものが含まれる（syn形態およびanti形態として）：
【化４１】
2008528549.tif 000033
【０１５１】
L3はまた、前記定義に従って二価の基であってよく、L4は、原子価結合および式-CO-L5-CH=N-O-の部分の中から選択され、ここでのL5は原子価結合、アルキレンまたはアリーレンであり、また前記L4部分における末端カルボニル部分は、好ましくはIns部分に結合される。L4の代表的かつ非制限的な例には、次のものが含まれる（syn形態およびanti形態として）：
【化４２】
2008528549.tif 000034
【０１５２】
或いは、インスリンは、例えば過ヨウ素酸酸化のような化学反応の後にアルデヒド官能基を含むインスリン分子を生じ得る部分で誘導体化されてよい。アルデヒド官能基を有するインスリンは、次いで、上記のように同様に誘導体化された本発明のモノマー-、オリゴマー-もしくはポリマー-ビルディングブロック、例えばO-置換ヒドロキシルアミン、ヒドラジンもしくはヒドラジドと共に、これら二つの成分を、任意に有機共溶媒を含む中性、酸性もしくはアルカリ性pHの水性媒質中で混合することによって縮合されてよい。
【０１５３】
特別な例は、セリンを用いたリジン上でのε-アミノ基の初期アシル化に続く、過ヨウ素酸開裂であり、グリオキシル誘導体化されたインスリンを生じる。この場合、二価のL4部分＋隣接のL3部分の代表的かつ非制限的な例には、次のものが含まれる（syn形態およびanti形態として）：
【化４３】
2008528549.tif 000035
【０１５４】
L3はまた、定義に従って二価の基でもよく、またL4は、オキシイミノアルキルカルボニル基であってもよい。代表的かつ非制限的な例には、次のものが含まれる（syn形態およびanti形態として）：
【化４４】
2008528549.tif 000036
【０１５５】
生物学的に活性なインスリンは、インスリンのpH要求性に応じて任意に緩衝された水性反応媒質中において、活性化された分岐ポリマーと反応される。該反応のための最適pH値は、殆どのインスリンについて、一般には約6.5〜約8であり、好ましくは約7.4である。
【０１５６】
インスリン安定性、反応効率等のための最適な反応条件は、当業者の知識レベルの範囲内である。好ましい温度範囲は、約4℃〜約37℃である。反応媒質の温度は、インスリンが変性または分解する温度を超えることはできない。好ましくは、インスリンは過剰の活性化された分岐ポリマーと反応される。この反応の後、該接合体は、例えばダイアフィルトレーション、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーを含むカラムクロマトグラフィー、電気泳動、またはこれらの組合せによって回収および精製される。
【０１５７】
＜デス(B30)ヒトインスリンのアシル化によるNεB29-樹状デス(B30)ヒトインスリン＞：
デス(B30)ヒトインスリン（500 mg、0.088 mmol）を、室温で100 mM Na2CO3（5 ml、pH 10.2）の中に溶解する。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルとして活性化された該カルボン酸（0.105 mmol）を、アセトニトリル（5 ml）の中に溶解し、続いてインスリン溶液に加える。30〜60分後に、0.2 M メチルアミン（0.5 ml）を添加する。HClにより、pHを5.5に調節し、遠心分離により等電沈殿物を回収し、真空中で乾燥し、HPLCにより精製する。任意に、HPLCによって直接に、または凍結乾燥後にHPLCによって、反応混合物（pH 5.5）を精製する。
【０１５８】
＜A1N,B1N-diBocデス(B30) ヒトインスリンのアシル化による、NεB29-樹状デス(B30)ヒトインスリンの一般的合成＞
A1N,B1N-diBocデスB30ヒトインスリン（Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J、Biochemical Journal、1995、312、725-731）（186 mg、0.031 mmol）を、DMSO（1.8 ml）中に溶解する。THF（1.8 ml）およびトリエチルアミン（0.045 ml、0.31 mmol）中の、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（0.04 mmol）として活性化されたカルボン酸を添加する。室温で45分間ゆっくりと撹拌した後に、THF（0.20 ml）中の0.2Mメチルアミンで反応をクエンチする。水（5 ml）ヲ添加し、1N HClでpHを5.5に調節する。遠心分離により等電沈殿物を回収し、凍結乾燥する。任意に、この反応混合物（pH 5.5）を凍結乾燥する。残渣（0.075 g）をTFA（0.5 ml）中に溶解し、室温で1時間ゆっくりと撹拌し、濃縮する。この残渣をHPLCにより精製する。
【０１５９】
一実施形態において、接合方法は標準の化学に基づいており、以下の方法で行われる。分岐ポリマーは、例えば、反応スキーム７に記載したようなジアミノアルキル結合アミノオキシ酢酸のアシル化によって、合成の際に結合されたアミノオキシアセチル基を有している。該インスリンは、末端のセリンもしくはスレオニン残基を有しており、これはRose in J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 30-33、およびヨーロッパ特許第0243929号に従って、温和な条件下に過ヨウ素酸を用いてグリオキシル基へと酸化される。或いは、アルデヒドもしくは一時的に保護されたアルデヒド基を含むアシル化部分を用いて、リジン残基のε-アミノ基のような露出したアミノ基をアシル化することにより、アルデヒド官能基が導入されてよい。分岐ポリマーのアミノオキシ成分およびインスリンのアルデヒド成分は、温和な酸性条件、例えば約2〜約5の範囲のpH値で、且つ特に概ね室温の水溶液中において、約1〜約10 mMの濃度範囲の概ね等しい比率で混合され、また接合反応（この場合はオキシム化）の後に逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）および電子スプレーイオン化式質量スペクトル測定（ES-MS）が行われる。反応速度は濃度、pH値、および立体因子に依存するが、通常は数時間以内に平衡に達し、該平衡は接合体の方に有利に大きく傾く（Rose, et al., Bioconjugate Chemistry 1996, 7, 552-556）。一つの成分の僅かな過剰（約５倍以下）は、接合反応を完了方向に駆動する。生成物を単離し、オキシムについて先に記載したようにして特徴付けする。インスリンは、例えば逆相HPLCによって精製される（Rose, J Am. Chem.Soc., supra and Rose, et al., Bioconjugate Chemistry, supra）。
【０１６０】
もう一つの実施形態において、接合方法は次のようにして行われる：分岐ポリマーは、反応スキーム３に記載したようにして、Sasrin樹脂またはWang樹脂（Bachem）上で合成される。樹脂製造業者（Bachem）が推奨する方法を使用すると、ジクロロメタン中のTFAで反復処理することにより分岐ポリマーは樹脂から開裂され、また開裂されたポリマーの溶液はメタノール中のピリジンで中和される。室温（加熱なし）で溶媒を蒸発させ、それがインスリンであれば開裂されたポリマーを精製した後、樹脂に結合されたカルボキシ基を活性化され（例えば、HBTU、TSTUまたはHATUで）、且つペプチド化学の標準技術によりインスリン上の求核性基（アミノ基、即ち、リジン側鎖のε-アミノ基）に結合される。所望であれば、修飾された標的分子または材料は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、調製的等電集中法等のような当業者に周知の多くの精製方法の一つによって、反応混合物から精製することができる。巨大分子の精製、特にペプチド精製のための一般的な方法および原理は、例えば、Seeresによる「タンパク質精製：原理および実際」（"Protein Purification: Principles and Practice" by Seeres, 2nd edition, Springer-Verlag, New York, NY, (1987)）に見ることができ、これを本明細書の一部として援用する。
【０１６１】
本発明の化合物を製造するために使用される親インスリン、インスリン誘導体またはインスリン類似体の多くは既知であり、また他は既知の化合物の調製との類似により、または当業者に明らかな他の方法によって調製することができる。
【０１６２】
上記は、分岐ポリマーとの接合に適したインスリンの例示である。特に言及していないが、適切な性質を有するインスリンもまた意図されており、本発明の範囲内である。
【０１６３】
もう一つの実施形態においては、水溶性ポリマーが提供される。これらは、インスリンの特性を高めるための物質として重要である。例えば、水溶性ポリマーをインスリンに接合することによって、溶解度を増大させる。固有の免疫原性を有するインスリン類似体への分岐ポリマーの接合は、該接合体に対して、非接合体インスリン類似体により生じる免疫応答に比較して減少した免疫応答性、または増大した薬物動態学的プロファイル、増大した保存寿命、および増大した生物学的半減期を与える。本発明は、非修飾インスリンの生物学的活性を実質的に減少たは妨害することなく、水溶性の親水性分岐ポリマーの結合によって修飾されるインスリンを提供する。
【０１６４】
本発明は、構造的に充分に定義されたポリマーによって修飾されたインスリンであって、実質的に均一な化合物であり、分岐ポリマーの世代数が充分に定義されたインスリンを提供する。
【０１６５】
本発明は、非接合体インスリンの生物学的活性を維持している接合体を提供する。本発明のもう一つの実施形態において、該接合体インスリンは、非接合体インスリンに比較して改善された特性を有している。
【０１６６】
本発明のもう一つの実施形態において、インスリンの一定の部分に接合した当該分岐ポリマーは、インスリンの生体利用性、能力および効力もしくは活性を減少させる。このような減少は、持続放出原理に基づく薬物デリバリーシステムにおいて望ましい可能性がある。もう一つの実施形態では、生理学的条件下で開裂できるリンカーに結合した前記分岐ポリマーが使用され、それによって生体活性型のインスリンが前記分岐ポリマーから徐々に放出される持続放出原理が想定される。この場合、インスリンは、前記分岐ポリマーが除去される前には生物学的に活性でなくてもよい。特定の実施形態において、前記開裂可能なリンカーは、例えば血清中に存在するプロテアーゼの基質として機能できる小ペプチドである。
【０１６７】
ポリマー接合は、結合されるポリマー分子の数、サイズ、および組成（例えば世代の数および各世代にしよいうされる特定のモノマー）、およびインスリン上の結合部位に関して最適な分子を生じるように設計される。使用される分岐ポリマーの特定の分子量は、例えば、達成されるべき望ましい効果に基づいて選択される。例えば、接合体の主な目的が高分子量（例えば腎クリアランスを低下させるため）を有する接合体を達成することであれば、通常は、望ましい分子量を得るために、できるだけ少ない高分子量の分岐ポリマーを接合するのが望ましい。他の場合には、特異的もしくは非特異的なタンパク質分解的開裂に対する保護、またはインスリン上の免疫原性エピトープをシールドすることが望ましく、また特異的な低分子量の分岐ポリマーが最適な選択であるかもしれない。
【０１６８】
こうして、本発明によれば、精密に調製された予め定められた質量をもったポリマー誘導体化されたインスリン（接合体）が得られる。
【０１６９】
本発明の更にもう一つの実施形態では、ここに説明したようにして調製された分岐ポリマーが、インスリンに接合される。本発明のもう一つの実施形態において、これは、増大した肺での生体利用性をもった接合体を生じる。本発明のもう一つの実施形態において、これは、肺での増大した作用持続時間をもった接合体を生じる。
【０１７０】
関連の実施形態において、ここに記載した分岐ポリマーは、非ヒト機嫌から得られたバイオ医薬的インスリン上の免疫原エピトープをシールドするために使用される。
【０１７１】
更にもう一つの実施形態において、分岐された水溶性ポリマーは、その非修飾状態および生理学的条件下において、低い溶解度を有するインスリンに接合される。
【０１７２】
もう一つの実施形態において、本発明の一定のインスリン接合体のインビボ半減期は、10％以上改善される。一実施形態において、一定のインスリン接合体のインビボ半減期は25％以上改善される。一実施形態において、一定のインスリン接合体のインビボ半減期は50％以上改善される。一実施形態において、一定のインスリン接合体のインビボ半減期は75％以上改善される。一実施形態において、一定のインスリン接合体のインビボ半減期は100％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリンのインビボ半減期は、分岐ポリマーと接合されたときに250％増大する。
【０１７３】
もう一つの実施形態において、本発明の一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は、10％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は25％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は50％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は75％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は100％以上改善される。もう一つの実施形態において、一定のインスリン接合体の機能的インビボ半減期は、分岐ポリマーと接合されたときに250％増大する。
【０１７４】
一般に、溶液中におけるインスリンの安定性は非常に乏しい。従って、本発明の一実施形態では、ここに記載した充分に定義された水溶性分岐ポリマーが、インスリンを接合すして、再折り畳みのような構造的変形を最小化することによりインスリンを安定化することができ、インスリン活性を維持することができる。
【０１７５】
関連の実施形態において、インスリンの棚お気保存寿命は、ここに記載の分岐ポリマーに接合したときに改善される。
【０１７６】
反応スキーム１：溶液中での収束型合成−キャップされた第一世代
【化４５】
2008528549.tif 000037
【０１７７】
反応スキーム２：焦点が保護された第二世代
【化４６】
2008528549.tif 000038
【０１７８】
反応スキーム３：第二世代分岐ポリマーの固相合成
【化４７】
2008528549.tif 000039
【０１７９】
反応スキーム４：溶液中での第二世代材料の発散型合成
【化４８】
2008528549.tif 000040
【０１８０】
反応スキーム５：Me(PEG)2CH2COOH酸を使用した、第二世代ポリマーの末端キャッピングの説明
【化４９】
2008528549.tif 000041
【０１８１】
反応スキーム６：ポリ陰イオン性グリコ擬似ポリマーを作製するための、コハク酸モノtert-ブチルエステルを使用することによる、固相支持体もしくはインスリン（R）に結合された第二世代ポリマーの末端キャッピングの説明
【化５０】
2008528549.tif 000042
【０１８２】
反応スキーム７：第二世代ポリマー材料のために例示された、インスリン接合のための適切な反応性ハンドルの形成
【化５１】
2008528549.tif 000043
【０１８３】
＜医薬的投与＞
式IIの本発明の接合体インスリンは、例えば、皮下投与、経口投与、または肺投与することができる。
【０１８４】
皮下投与の場合、式IIの化合物は既知のインスリン製剤と類似して製剤化される。更に、皮下投与の場合、式IIの化合物は既知のインスリンの投与と類似して投与され、また一般に、この方法には医師が精通している。
【０１８５】
経口投与について、式IIの化合物は、経口で投与されるべき他の医薬製剤に類似して製剤化される。更に、経口投与については、式IIの化合物は既知の経口医薬の投与に類似して投与され、主に、このような方法には医師が精通している。
【０１８６】
肺製品の場合、以下の詳細が与えられる：  本発明の接合体インスリンは、循環インスリンレベルを増大し、および／または循環グルコースレベルを低下させるような、効果的な投与量で投与されてよい。このような投与は、糖尿病または高血糖症のような障害を治療するために有効であることができる。インスリンの有効投与量を達成することは、約0.5 μg/kg〜約50 μg/kgを超える吸入投与量の本発明の接合体インスリンの投与を必要とする。治療的に有効な量は、見識のある実務家が決定することができるが、彼はインスリンレベル、血中グルコースレベル、患者の身体的条件、または患者の肺の状態などを含む因子を考慮するであろう。
【０１８７】
本発明によれば、本発明の接合体インスリンは、その迅速な吸収を達成するために、吸入によって送達されてよい。吸入による投与は、インスリンの皮下投与に匹敵する薬物動態をもたらすことができる。本発明の接合体インスリンの吸入は、循環インスリンのレベルにおける迅速な上昇と、これに続く血中グルコースレベルの迅速な降下を導く。同様の粒子サイズおよび同様の肺沈着レベルが比較されるときは、異なる吸入装置が、典型的には同様の薬物動態を提供する。
【０１８８】
本発明によれば、本発明の接合体インスリンは、吸入による治療剤投与のための、当該技術において既知の種々の吸入装置の何れかによって送達されてよい。これらの装置には、計量された投与量の吸入器、ネブライザ、乾燥粉末発生器、および噴霧器等が含まれる。好ましくは、本発明の接合体インスリンは、乾燥粉末吸入器または噴霧器によって送達される。本発明の接合体インスリンを投与するための吸入装置の、幾つかの望ましい特徴が存在する。例えば、吸入装置による送達は、有利なことに信頼性があり、再現性があり、且つ正確である。この吸入装置は、良好な吸入性のために、例えば約10 μm未満、例えば約1〜5 μmの小粒子を送達すべきである。本発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置の幾つかの特定の例は、TurbohalerTM（Astra）、Rotahaler（登録商標；Glaxo）、Diskus（登録商標；Glaxo）、SpirosTM吸入器（Dura）、Inhale Therapeuticsによって市販される装置、AERxTM （Aradigm）、the Ultravent（登録商標）ネブライザ（Mallinckrodt）、the Acorn II（登録商標）ネブライザ（Marquest Medical Products）、the Ventolin（登録商標）計量された投与量の吸入器（Glaxo）、the Spinhaler（登録商標）粉末吸入器（Fisons）等である。
【０１８９】
当業者が理解するように、本発明の接合体インスリン製剤、送達される製剤の量、および1回投与量の投与持続時間は、用いられる吸入装置の種類に依存する。ネブライザのような幾つかのエアロゾル送達システムについて、投与の頻度および該システムが駆動される時間の長さは、主に、エアロゾル中のインスリン接合体の濃度に依存する。例えば、短い投与の期間は、ネブライザ溶液中における高いインスリン接合体濃度で使用することができる。定量投与量吸入器のような装置は、より高いエアロゾル濃度を生じることができ、短時間だけ動作させて、望ましい量のインスリン接合体を送達することができる。粉末吸入器のような装置は、所定量の薬剤が当該装置から排出されるまで、活性薬剤を送達する。このタイプの吸入器において、所定量の粉末中の本発明の接合体インスリンの量は、1回投与において送達される投与量を決定する。
【０１９０】
吸入装置によって送達される製剤中における本発明の接合体インスリンの粒子サイズは、それが肺、好ましくは下部気道もしくは肺胞の中に侵入する能力に関して重要である。好ましくは、本発明の接合体インスリンは、送達されたインスリン接合体の少なくとも約10％、好ましくは約10〜約20％以上が肺の中に沈着するように製剤化される。口で呼吸するヒトの場合、肺沈着の最大効率は、約2 μm〜約3 μmの粒子サイズで得られる。粒子サイズが約5 mμ超のとき、肺沈着は実質的に減少する。約1 μm未満の粒子サイズは、肺沈着を減少させ、また治療的に有効であるために充分な量で粒子を送達するのが困難になる。吸入により送達されるインスリン接合体の粒子は、好ましくは約10 μm未満、より好ましくは約1 μm〜約5 μmの範囲である。インスリン接合体の製剤は、選択された吸入装置において望ましい粒子サイズを生じるように選択される。
【０１９１】
乾燥粉末としての投与に有利なように、本発明の接合体インスリンは、約10μm未満、好ましくは約1〜約5μmの粒子サイズをもった粒子形状で調製される。この好ましい粒子サイズは、患者の肺の肺胞に送達するために有効である。好ましくは、この乾燥粉末は主として、大部分の粒子が望ましい範囲のサイズを有するように製造された粒子で構成される。有利には、乾燥粉末の少なくとも約50％が、約10μm未満の直径を有する粒子でできている。このような製剤は、噴霧乾燥、ミル粉砕、またはインスリン接合体および他の望ましい成分を含有する溶液の臨界点凝集によって達成することができる。本発明に有用な粒子を発生するためにも適した他の方法が、当該技術において知られている。
【０１９２】
該粒子は、通常は容器内の乾燥粉末製剤から分離され、次いで、キャリア空気流を介して患者の肺の中に輸送される。典型的には、現在の乾燥粉末吸入器において、固体を粉砕するための力は患者の吸入によってのみ提供される。一つの適した乾燥粉末吸入器は、Astra（Sodertalje、Sweden）が製造するTurbohalerTM である。もう一つのタイプの吸入器においては、患者の吸入によって発生した空気流がインペラーモータを駆動し、これがモノマーインスリン類似体粒子を脱凝集させる。Dura SpirosTM吸入器はこのような装置である。
【０１９３】
乾燥粉末吸入器から投与するための本発明の接合体インスリンの製剤は、典型的には、インスリン接合体を含有する微細に分割された乾燥粉末を含んでいるが、該粉末はまた、バルキング剤、キャリア、賦形剤、もう一つの添加剤等を含むことができる。添加剤は、特定の粉末吸入器からの送達のために必要とされる粉末を希釈するために、該製剤の加工を容易にするために、該製剤に対して有利な粉末特性を与えるために、吸入装置からの粉末の分散を促進するために、該製剤を安定化するために（例えば抗酸化剤または緩衝剤）、該製剤に味を与える等のために、インスリン接合体の乾燥粉末製剤の中に含めることができる。有利には、該添加剤は患者の気道に悪影響を与えない。該インスリン接合体は、分子レベルで添加剤と混合することができ、或いは、固体製剤が、添加剤の粒子と混合されたインスリン接合体の粒子、または添加剤の粒子上にコートされたインスリン接合体の粒子を含むことができる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類および多糖類；糖アルコールおよび他のポリオール、例えば乳糖、グルコース、ラフィノース、メレチトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、蔗糖、マンニトール、デンプン、またはそれらの組合せ；表面活性剤、例えばソルビトール、じホスファチジルコリン、またはレクチン；等が含まれる。典型的には、バルキング剤のような添加剤は、上記で述べた目的のために有効な量で、多くの場合は、当該製剤の約50〜約90重量％で存在する。インスリン類似体タンパク質のようなタンパク質製剤のために当該技術で知られた追加の薬剤もまた、当該製剤の中に含めることができる。
【０１９４】
本発明の接合体インスリンを含むスプレーは、インスリン接合体の懸濁液または溶液を、加圧下にノズルを通して圧入することにより製造することができる。ノズルのサイズおよび構成、加える圧力、並びに液体供給速度は、望ましい出力および粒子サイズを達成するように選択することができる。例えば、キャピラリーまたはノズル供給と組み合わせた電解により、電気スプレーを製造することができる。有利には、インスリン接合体の粒子は約10μm、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲の粒子サイズを有するスプレー機によって送達される。
【０１９５】
スプレー機での使用に適した本発明の接合体インスリンの製剤は、典型的には、溶液1 mL当たり約1〜20 mgの濃度で、水溶液中のインスリン接合体を含んでいる。この製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、表面活性剤、および好ましくは亜鉛のような物質を含むことができる。該製剤はまた、インスリン接合体を安定化するための賦形剤または物質、例えば緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、または炭水化物を含むことができる。インスリン接合体の製剤化に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。インスリン接合体の製剤化において有用な典型的な炭水化物には、蔗糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが含まれる。また、当該インスリン接合体製剤は表面活性剤を含むこともでき、これはエアロゾルの形成において溶液の噴霧により生じるインスリン接合体の表面誘導性凝集を低減または防止することができる。種々の従来の表面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを用いることができる。量は、一般には当該製剤の約0.001〜約4重量％の間で変化する。本発明の目的のために特に好ましい表面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエート、ポリソルベート80、ポリソルベート20等である。インスリン類似体タンパク質のようなタンパク質の製剤化のために当該技術で知られている追加の物質もまた、当該製剤の中に含めることができる。
【０１９６】
本発明の接合体インスリンは、ジェットネブライザまたは超音波ネブライザのようなネブライザによって投与することができる。典型的には、ジェットネブライザにおいては、オリフィスを通過する高速空気ジェットを形成するために圧縮空気源が使用される。ガスがノズルを越えて膨張するときに低圧領域が形成され、該低圧領域が、液体容器に結合されたキャピラリー管を通してインスリン接合体の溶液を引き出す。キャピラリー管からの液体流は、それが管を出るときに不安定なフィラメントおよび液滴に剪断されて、エアロゾルを形成する。所定のジェットネブライザから望ましい特性を達成するために、ある範囲の構成、流速、およびバッフル型を用いることができる。超音波ネブライザにおいては、典型的にはピエゾ電気トランスジューサを用いて振動（機械的）エネルギーを生じるために、高周波電気エネルギーが使用される。このエネルギーは、直接またはカップリング液を介してインスリン接合体の製剤に伝達され、インスリン接合体を含むエアロゾルを作製する。有利には、ネブライザによって送達されるインスリン接合体の粒子は、約10 μm未満、好ましくは約1 μm〜約5 μmの範囲の粒子サイズを有している。
【０１９７】
ネブライザでの使用に適したインスリン接合体の製剤は、ジェットまたは超音波の何れであれ、典型的には、溶液1 mL当たり約1〜約20mgのインスリン接合体の濃度で、水溶液中にインスリン接合体を含んでいる。この製剤は、賦形剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、表面活性剤、および好ましくは亜鉛のような物質を含むことができる。当該製剤はまた、賦形剤もしくはインスリン接合体を安定化させるための物質、例えば緩衝剤、還元剤、バルクタンパク質、または炭水化物をも含むことができる。インスリン接合体を処方する上で有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。インスリン接合体を処方する際に有用な典型的な炭水化物には、蔗糖、マンニトール、乳糖、トレハロース、グルコースなどが含まれる。当該インスリン接合体製剤はまた、表面活性剤を含むことができる。また、当該インスリン接合体製剤は表面活性剤を含むこともでき、これはエアロゾルの形成において溶液の噴霧により生じるインスリン接合体の表面誘導性凝集を低減または防止することができる。種々の従来の表面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、並びにポリオキシエチレンソルビタール脂肪酸エステルを用いることができる。量は、一般には当該製剤の約0.001〜約4重量％の間で変化する。本発明の目的のために特に好ましい表面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエート、ポリソルベート80、ポリソルベート20等である。インスリン類似体タンパク質のようなタンパク質の製剤化のために当該技術で知られている追加の物質もまた、当該製剤の中に含めることができる。
【０１９８】
定量吸入器（meterd dose hihaler；MDI）においては、噴射剤、本発明のインスリン接合体、および何れかの賦形剤もしくは他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターの中に収容される。計量弁の駆動は、上記混合物を好ましくは、約10 μm未満、好ましくは約1 μm〜5 μmのサイズ範囲の粒子を含むエアロゾルとして放出する。望ましいエアロゾル粒子サイズは、ジェットミリング、噴霧乾燥、臨界点凝集などを含む当業者に既知の種々の方法によって製造された、本発明のインスリン接合体の製剤を用いることによって得ることができる。好ましい定量投与吸入器には、フッ化炭化水素噴射剤を用いるスリーエム社またはグラクソ社により製造されたものが含まれる。
【０１９９】
定量吸入器と共に使用するための本発明のインスリン接合体の製剤は、一般に、非水媒質中の懸濁物、例えば表面活性剤を助剤として噴射剤の中に懸濁された本発明のインスリン接合体を含有する、微細に分割された粉末を含むであろう。この噴射剤は、この目的のために用いられる如何なる慣用の材料であってもよく、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、またはヒドロカーボンであり、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタン、HFA-134a (ヒドロフルオロアルカン-134a)、HFA-227 (ヒドロフルオロアルカン-227)等である。好ましくは、該噴射剤はヒドロフルオロカーボンである。表面活性剤は、本発明のインスリン接合体を噴射剤中の懸濁液として安定化させ、該活性物質を化学分解等に対して保護するるように選択される。適切な表面活性剤には、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイン酸等が含まれる。幾つかの場合、エタノールのような溶媒を使用した溶液エアロゾルが好ましい。インスリン類似体タンパク質のようなタンパク質の製剤のための当該技術で既知の追加の物質を、当該製剤の中に含めることができる。
【０２００】
当業者は、本発明の方法が、ここには記載しない装置を介して本発明の接合体インスリンを肺投与することにより達成され得ることを理解するであろう。
【０２０１】
本発明はまた、本発明のインスリン接合体を含み、且つ吸入による投与に適した医薬組成物または製剤に関する。本発明によれば、本発明のインスリン接合体は、吸入による投与に適した製剤または医薬を製造するために使用することができる。本発明はまた、吸入による投与に適した形態で、本発明のインスリン接合体を含む製剤を製造するための方法に関する。例えば、乾燥粉末製剤は、慣用技術を使用して幾つかの方法で製造することができる。下部気道中での最大沈着のために適したサイズ範囲にある粒子は、微細化、ミリング、噴霧乾燥等によって製造することができる。また、液体製剤は、本発明のインスリン接合体を、適切なpHで且つ緩衝剤または他の賦形剤を含有する、水等の適切な溶媒に溶解することによって製造することができる。
【０２０２】
従って、一実施形態において、本発明は式IIの接合体インスリンを投与する方法であって、有効量の式IIの接合体インスリンを、それを必要としている患者に対して肺手段によ投与することを具備し、好ましくは、前記式IIの接合体インスリンが前記患者の口を通して吸入される方法に関する。
【０２０３】
より正確には、本発明はまた、以下の実施形態に関する：
ａ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが、前記患者の下部気道に送達される方法。
【０２０４】
ｂ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが肺胞中に沈積される方法。
【０２０５】
ｃ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが、医薬的に許容可能なキャリアの中の式IIの接合体インスリンを含んでなる医薬製剤として投与される方法。
【０２０６】
ｄ）ここに記載の方法であって、前記製剤が、水性媒質中の溶液、および非水性媒質中の懸濁液からなる群から選択される方法。
【０２０７】
ｅ）ここに記載の方法であって、前記製剤がエアロゾルとして投与される方法。
【０２０８】
ｆ）ここに記載の方法であって、前記製剤が乾燥粉末の形態である方法。
【０２０９】
ｇ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが約10ミクロン未満の粒子サイズを有する方法。
【０２１０】
ｈ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが約1〜約5ミクロンの粒子サイズを有する方法。
【０２１１】
ｉ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが約2〜約3ミクロンの粒子サイズを有する方法。
【０２１２】
ｊ）ここに記載の方法であって、送達された前記式IIの接合体インスリンの少なくとも約10％が肺の中に堆積される方法。
【０２１３】
ｋ）ここに記載の方法であって、式IIの接合体インスリンが、肺投与に適し且つ該インスリン類似体を患者のないの中に堆積させることができる吸入装置から送達される方法。
【０２１４】
ｌ）ここに記載の方法であって、前記装置がネブライザー、定量吸入器、乾燥粉末吸入器、および噴霧器からなる群から選択される方法。
【０２１５】
ｍ）ここに記載の方法であって、前記装置が乾燥粉末吸入器である方法。
【０２１６】
ｎ）ここに記載の方法であって、前記装置がネブライザーである方法。
【０２１７】
ｏ）ここに記載の方法であって、前記装置が定量吸入器である方法。
【０２１８】
ｐ）ここに記載の方法であって、前記装置が噴霧器である方法。
【０２１９】
ｑ）ここに記載の方法であって、前記装置の駆動によって、約3 μg/kg〜約20 μg/kgの前記式IIの接合体インスリン、好ましくは約7 μg/kg〜約14 μg/kgの前記式IIの接合体インスリンが投与される方法。
【０２２０】
ｒ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが、上記例の何れかで具体的に述べた化合物の何れかである方法。
【０２２１】
ｓ）糖尿病を治療するためのここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが、上記例の何れかで具体的に述べた化合物の何れかである方法。
【０２２２】
ｔ）ここに記載の方法であって、前記式IIの接合体インスリンが、医薬的に許容可能なキャリアの中に式IIの接合体インスリンを含有してなる医薬製剤として投与される方法。
【０２２３】
ｕ）ここに記載の方法であって、前記インスリン接合体が、特にここでの具体例において詳細に述べた化合物の何れかである方法。
【０２２４】
上記実施形態は方法に関連して特に記載したが、それは使用される製品または製剤についても類似的に適用される。
【０２２５】
ここで引用した刊行物、特許出願および特許を含む全ての参照文献は、その全体を、各参照文献が個別に且つ具体的に本明細書の一部として援用されることが指定されたのと同じ範囲で、その全体がここに記載されたかの如く（法によって許容される最大範囲で）、本明細書の一部としてここに援用する。
【０２２６】
ここでの全ての見出しおよび副見出しは、便宜のためだけに使用されており、如何なる意味でも本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２２７】
ここに与えられる何れかおよび全ての実施例、または例示的用語（例えば「…のような」）の使用は、単に本発明をより良く例示することを目的としたものであり、別途主張しない限り、本ｈ多雨名の範囲を限定するものではない。明細書における用語は、特許請求の範囲に記載されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すように解釈されるべきではない。
【０２２８】
ここでの特許文献の引用および援用は便宜のためのものであり、故意のような特許文献の有効性、特許性および／または強制執行可能性についての如何なる見解をも反映するものではない。参考文献のここでの言及は、それらが先行技術を構成することの自認ではない。
【０２２９】
ここで、「含んでなる」の語は、「含む」「含有する」または「包含される」を意味するように広く解釈されるべきものである（EPOガイドラインC 4.13）。
【０２３０】
本発明は、特許請求の範囲に記載した主題の、適用可能な法により許される全ての変形および均等物を含むものである。
【０２３１】
以下の実施例は、適用可能な法により許される、例示として提供されるものである。
【実施例】
【０２３２】
以下の例および一般手順は、構造的明細および合成スキームにおいて特定される中間体化合物および最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製を、以下の例を用いて詳細に記載するが、記載される化学反応は、本発明の選択された分岐ポリマーの調製に対する一般的な適用の観点から記載される。場合によっては、本発明の開示する範囲に含まれる各化合物に対し、反応が記載通りに適用され得ない。このようなことが生じる化合物については、当業者が容易に認識するであろう。そのような場合、当業者に既知の従来の修飾、すなわち、干渉基の適切な保護、他の従来試薬への変更、または反応条件の所定の改変により、反応を首尾よく実施することができる。或いは、ここに記載する以外の他の反応、さもなくば従来の反応が、本発明の対応する化合物の調製に適用されるであろう。全ての調製方法において出発物質は全て公知であるか、または公知の出発物質から容易に調製され得る。
【０２３３】
特に他の記載がなければ、温度は全て摂氏度で記載され、収率を表す場合、部数(parts)およびパーセンテージは全て重量で記載され、溶媒および溶出液を表す場合、全ての部数は重量で記載される。全ての試薬は、Aldrich、Sigma等から供給された状態での標準的な等級のものであった。プロトン、炭素およびリンの核磁気共鳴(1H-、13C-および31P-NMR)は、テトラメチルサリンまたはリン酸から低磁場への化学シフト(δ)と共にBruker NMR 装置で記録された。
【０２３４】
LC-MS質量スペクトルは、以下の装置および設定条件を用いて得られた：
Hewlett Packardシリーズ 1100 G1312A ビンポンプ、Hewlett Packardシリーズ 1100 カラムコンパートメント、Hewlett Packardシリーズ 1100 G13 15A DADダイオードアレイ検出器およびHewlett Packardシリーズ 1100 MSD。
【０２３５】
装置は、HP Chemstation ソフトウェアにより制御された。
【０２３６】
HPLCポンプは、以下を含んだ２つの溶出液リザーバに連結された：
A：水中の0.01％TFA 
B：アセトニトリル中の0.01％TFA。
【０２３７】
分析は、アセトニトリルの勾配を用いて溶出するカラムに、適切な体積の試料（好ましくは1μL）を注入することにより40℃で実施された。使用されたHPLC 条件、検出器の設定および質量分析計の設定を以下の表に挙げる。
【表１】
2008528549.tif 000044
【０２３８】
インスリン接合体は、次の一方または両方のHPLC系を用いて分析された：
HPLC(A)：RP-分析は、Waters 2487二重バンド（dualband）検出器を備えたAlliance Waters 2695 系を用いて行われた。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300 C18（5um、3.9mm x 150mm カラム、42℃）を用いて回収した。0-60％アセトニトリル、90-30％水、および水中の10％(NH4)2SO4(0.5M)の直線状勾配を15分にわたり流速0.75mL/分で溶出させた。
【０２３９】
HPLC(B)：RP-分析は、Waters 2487二重バンド検出器を備えたAlliance Waters 2695 系を用いて行われた。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300 C18（5um、3.9mm x 150mm カラム、42℃）を用いて回収した。5-95％アセトニトリル、90-0％水、および水中の5％トリフルオロ酢酸(1.0％)の直線状勾配を15分にわたり流速1.0分/分で溶出させた。
【０２４０】
以下の例で示されるNMRデータの一部は選択されたデータのみである。
【０２４１】
例において、以下の用語は次の意味を有することが意図される：
以下の略語が用いられた：AcOEt：酢酸エチル、Ala：アラニン、Boc：tert-ブトキシカルボニル、CDI：カルボニルジイミダゾール、DBU：1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン、DCM：ジクロロメタン、塩化メチレン、DIC：ジイソプロピルカルボジイミド、DIPEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン、DhbtOH：3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン、DMAP：4-ジメチルアミノピリジン、DMF：N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO：ジメチルスルホキシド、DTT：ジチオトレイトール、Me：メチル、Et：エチル、EtOH：エタノール、Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、HCl：塩酸、HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、MeCN：アセトニトリル、MeOH：メタノール、NMP：N-メチル-2-ピロリジノン、NEt3：トリエチルアミン、PhMe：トルエン、Rf：保持因子、Rt：保持時間、SiO2：シリカゲル、THF：テトラヒドロフラン、TFA：トリフルオロ酢酸、TLC：薄膜クロマトグラフィ、TSTU：2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート。
【０２４２】
以下の非制限的な例は、固相合成または溶相合成を用いた、モノマーの合成および重合の手法を説明する。
【０２４３】
モノマービルディングブロックおよびリンカーの合成：
例１
2-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシメチル]オキシラン
【化５２】
2008528549.tif 000045
2-(2-クロロエトキシ)エタノール(100.00g；0.802 mol)をジクロロメタン(100mL)中に溶解させ、触媒量の三フッ化ホウ素エーテラート(2.28g；16mmol)を添加した。透明な溶液を０℃にまで冷却し、温度を０℃に維持しながらエピブロモヒドリン(104.46g；0.762mol)を滴下添加した。透明な溶液をさらに３ｈ０℃で撹拌し、ついで溶媒を回転蒸発により除去した。残った油状物をアセトニトリルから一度蒸発させて粗製の1-ブロモ-3-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オールを得、これをTHF(500mL)中に再び溶解させた。ついで粉末状のtert-ブトキシドカリウム(85.0g；0.765mmol)を添加し、混合物を加熱して30分還流させた。不溶性の塩を濾過除去し、濾液を真空下で濃縮し、透明な黄色の油状物を得た。油状物をさらに減圧蒸留により精製して、56.13g(41％)の純粋な標題物質を得た。
【０２４４】
bp＝65-75℃(0.65mbar)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.61ppm(m、1H)；2.70(m、1H)；3.17(m、1H)；3.43(dd、1H)；3.60-3.85(m、9H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝42.73ppm；44.18；50.80；70.64 & 70,69(may collapse)；71.37；72.65。
【０２４５】
例２
1,3-ビス[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール
【化５３】
2008528549.tif 000046
2-[2-(2-クロロエトキシ)エトキシメチル]オキシラン(2.20g；12.2mmol)をDCM(20mL)中に溶解させ、2-(2-クロロエトキシ)エタノール(1.52g；12.2 mol)を添加した。混合物を０℃にまで冷却し、触媒量の三フッ化ホウ素エーテラート(0.2mL；1.5mmol)を添加した。この混合物を０℃で2h撹拌し、ついで溶媒を回転蒸発により除去した。残った三フッ化ホウ素エーテラートを、アセトニトリルから２回共蒸発することにより除去した。これにより得られた油状物を、Kuglerohr蒸留により精製した。標題物質を、透明な粘度のある油状物で2.10g(45％)収量で得た。
【０２４６】
bp.＝270℃、0.25mbar。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.31(bs、1H)；3.55ppm(ddd、4H)；3.65-3.72(m、12H)；3.75(t、4H)； 3.90(m、1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝43.12ppm；69.92；70.95；71.11；71.69；72.69。
【０２４７】
例３
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール
【化５４】
2008528549.tif 000047
1,3-ビス[2-(2-クロロエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(250mg；0.81mmol)をDMF(2.5mL)中に溶解させ、アジ化ナトリウム(200mg；3.10mmol)およびヨウ化ナトリウム(100mg；0.66mmol)を添加した。この懸濁物を100℃(内部温度)にまで加熱した。ついでこの混合物を冷却し、濾過した。濾液を取り出して乾燥させ、半結晶状の油状物をDCM(5mL)中に再び懸濁させた。不溶性の塩を濾過により除去した；濾液を乾燥するまで蒸発させ、純粋な標題物質を無色の油状物で得た。収量：210mg(84％)。
【０２４８】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.48ppm(t、4H)；3.60-3.75(m、16H)；4.08(m、1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝51.05ppm；69.10；70.24；70.53；70.78；71.37. LC-MS：m/e＝319(M+1)+；341(M+Na)+；291(M-N2)+。Rt＝2.78分。
【０２４９】
例４
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニル炭酸塩
【化５５】
2008528549.tif 000048
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(2.00g；6.6mmol)をTHF(50mL)中に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(10mL)を添加した。ついでこの透明な黄色の溶液に4-ジメチルアミノピリジン(1.60g；13.1mmol)およびp-ニトロフェニルクロロ蟻酸塩(2.64g；13.1mmol)を添加し、周囲温度で撹拌した。沈殿物が素早く形成された。この懸濁物を5h室温で撹拌し、ついで濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、酢酸エチル−ヘプタン−トリエチルアミン(40／60／2)を溶出剤として用いるクロマトグラフィーによりさらに精製した。生成物を透明な黄色の油状物で500mg(16％)収量で得た。
【０２５０】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.38ppm(t、4H)；3.60-3.72(m、12H)；3.76(m、4H)；5.12(q、1H)；7.41(d、2H)；8.28(d、2H)。LC-MS：m/e＝506(M+Na)+；456(M-N2)、Rt＝4.41分。
【０２５１】
例５
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルクロロホルメート
【化５６】
2008528549.tif 000049
塩化トリクロロアセチル(1,42g，7.85mmol)をTHF(10mL)中に溶解させ、この溶液を０℃にまで冷却した。THF(5mL)中の1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(1.00g；3.3mmol)およびトリエチルアミン(0,32g，3.3mmol)の溶液を、10分にわたりゆっくりと滴下添加した。冷却を除去し、得られた懸濁物を6h 周囲温度で撹拌した。混合物を濾過し、濾液を蒸発させて薄茶色の油状物を得た。油状物をアセトニトリルで用いて２回処理し、続いて蒸発させ、生成物をさらに精製せずに用いた。
【０２５２】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.40(t、4H)；3,55-3,71(m、12H)；3,75(d、4H)；5.28(m、1H)。
【０２５３】
例６
2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸
【化５７】
2008528549.tif 000050
水素化ナトリウム(7.50g；80％油状懸濁物)をヘプタンで２回洗浄し、ついで乾燥THF(100mL)中に再び懸濁させた。ついで乾燥THF(100mL)中の1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(10.00g；33.0mmol)の溶液を30分にわたり室温でゆっくりと添加した。ついでTHF(100mL)中のブロモ酢酸(6.50mg；47mmol)の溶液を20分にわたり滴下添加した→わずかに発熱。クリーム色の懸濁物が形成された。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物を冷却しながら、水(20mL)を添加することにより過剰の水素化ナトリウムを慎重に消滅せしめた。懸濁物を取り出して回転蒸発により乾燥させ、残渣をDCMおよび水の間で分配した。水相をDCMを用いて２回抽出し、ついで酢酸(25mL)を添加することにより酸性にした。ついで水相をDCMを用いて２回抽出し、合体した有機相を硫安ナトリウム上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。この時点において残りの油状物は標題物質と、ブロモ酢酸も含んでいた。後者を、該油状物をピペリジン(5mL)を含んだDCM(50mL)中に溶解させることにより除去し；30分撹拌し、ついで該有機溶液を1N HCl水溶液(3x)で洗浄した。ついで乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を蒸発させた後、純粋な標題物質得た。収量：7.54g(63％)。
【０２５４】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.48ppm(t、4H)；3.55-3.80(m、16H)；4.28(s、2H)；4.30(m、1H)；8.50(bs、1H)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝51.04ppm；69.24；70.50；70.72；71.39；71.57；80.76；172.68。LC-MS：m/e＝399(M+Na)+；349(M-N2)。Rt＝2.34分。
【０２５５】
例７
イミダゾール-1-カルボン酸 1,3-ビス(2-(2-アジドエトキシ)エトキシ)プロパン-2-イルエステル
【化５８】
2008528549.tif 000051
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(1.00g；3.3mmol)をDCM(5mL)中に溶解させ、カルボニルジイミダゾール(1.18g 、6.3mmol)を添加した。混合物を2h室温で撹拌した。溶媒を除去し、残渣をメタノール(20mL)中に溶解させ、20分撹拌した。溶媒を除去して透明な油状物を得、これをさらに、DCM 中の2％MeOHを溶出剤として用いる、シリカ上のカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：372.4mg(35％)。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.33(t、4H)；3,60-3,75(m、12H)；3,80(d、4H)；5.35(m、1H)；7.06(s、1H)；7.43(s、1H)；8.16(s、1H)。LC-MS：m/e＝413(M+1)。Rt＝2.35分。
【０２５６】
例８
2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル
【化５９】
2008528549.tif 000052
2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(5.0g；13.28mmol)をトルエン(20mL)中に溶解させ、反応混合物を不活性雰囲気下で加熱して還流させた。ついでN,N-ジメチルホルムアミド-ジ-tert-ブチルアセタール(13mL；54.21mmol)を30分にわたり滴下添加した。還流を24h継続した。ついで暗褐色の溶液をセライトを介して濾過した。溶媒を真空下で除去し、油状の残渣を、3％メタノールジクロロメタンを溶出剤として用いるシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。純粋な画分をプールし、蒸発させて乾燥させた。標題物質を黄色の透明な油状物で得た。収量：5.07g(88％)。
【０２５７】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.42ppm(s、9H)；3.35(t、4H)；3.54-3.69(m、16H)；3.75-3.85(m、1H)；4.16(s、2H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝30.35ppm.；52.93；70.65；72.25；73.12；73.90；80.44；83.55；172.28。TLC：Rf＝0.33  ｓ酢酸エチル−ヘプタン(1:1)中。
【０２５８】
例９
2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル
【化６０】
2008528549.tif 000053
2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル(5.97g，11.7mmol)をエタノール-水(25mL；2:1)中に溶解させ、酢酸(5mL)を添加し、続いてラネー-ニッケルの水溶懸濁物(5mL)を添加した。ついで混合物を3atmで16h、Parr 装置を用いて水素化した。ついで触媒を濾過により除去し、反応混合物を取り出して回転蒸発により乾燥させた。油状の残渣を水中に溶解させ、凍結乾燥させて定量的収率の標題物質を得た。
【０２５９】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.45ppm(s、9H)；3.15(bs、4H)；3.48-3.89(broad m、17H)；4.15(s、2H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝28.44ppm.；39.81；68.17；70.58；70.79；70.99；78.81；82.31；170.59。
【０２６０】
例10
2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸
【化６１】
2008528549.tif 000054
2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(1.00g；2.65mmol)を1N 塩酸水溶液(10mL)中に溶解させ、炭素上の5％パラジウムの50％水溶液(1mL)を添加した。混合物を3.5atmでParr 装置を用いて水素化した。１時間後、反応を停止させ、触媒を濾過により除去した。溶媒を回転蒸発により除去し、残渣をアセトニトリルから２回蒸発させた。収量：930mg(88％)。
【０２６１】
1H-NMR(D2O)：δ＝3.11ppm(t、4H)；3.53-3.68(m、16H)；3.80(m、1H)；4.25(s、2H)。13C-NMR(D2O)：δ＝38.18ppm.；65.43；66.09；68.55：69.13；69.23；77.18；173.42。
【０２６２】
例11
2-(1,3-ビス[2-(2-{9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸
【化６２】
2008528549.tif 000055
2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(9.35g；28.8mmol)にDIPEA(10mL；57mmol)を添加した。該反応混合物を氷浴で冷却し、クロロトリメチルサリン(15mL；118mmol)をDCM(50mL)中に溶解させ、続いてDIPEA(11mL；62.7mmol)を滴下添加した。ほぼ透明な溶液に、DCM(50mL)中のFmoc-Cl(15.0g；57mmol)溶液を滴下添加した。反応混合物を一晩撹拌し、ついでDCM(500mL)で希釈し、0.01N HCl水溶液(500mL)に添加した。有機層を分離し；水で洗浄し(3x 200mL)、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。回転蒸発により溶媒を除去した。粗成物を、酢酸エチル-ヘプタン(1:1)を溶出剤として用いるシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより生成した。純粋な画分を回収し、取り出して乾燥させ、9.20g(42％)の標題物質を得た。
【０２６３】
1H-NMR(D2O)：δ＝3.34ppm(t、4H)；3.45-3.65(m、16H)；3.69(bs、1H)；4.20(t、2H)；4.26(s、2H)；4.38(d、4H)；5.60(t、2H)；7.30(t、4H)；3.35(t、4H)；7.58(d、4H)；7.72(d、4H)。13C-NMR(D2O；選択されたピーク)：δ＝21.20ppm.；30.75；34.64；67.66；68.90；70.38；70.51；80.02；120.37；125.54；127.48；128.09；128.67；136.27；141.69；173.63；176.80。
【０２６４】
例12
2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エタノール
【化６３】
2008528549.tif 000056
ジメチルホルムアミド(250mL)中の2-(2-(-2-クロロエトキシ)エトキシ)エタノール(25.0g，148mmol)およびナトリウムアジド(14.5g，222mmol)のスラリを100℃で一晩静置した。反応混合物を氷浴で冷却し、濾過し、有機溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン(200mL)中に溶解させ、水(75mL)で洗浄し、水相をさらなるジクロロメタン(75mL)で抽出し、合体した有機相を硫酸マグネシウム(MgSO4)で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて油状物を得、これをさら精製せずに用いた。
【０２６５】
収量：30.0g(100％)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝72.53；70.66-70.05；61.74；50.65。
【０２６６】
例13
(2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ)酢酸
【化６４】
2008528549.tif 000057
上記2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エタノール(26g,148mmol)をテトラヒドロフラン(100mL)中に溶解させ、窒素雰囲気下にて、テトラヒドロフラン(250mL)中の水素化ナトリウム(24g，593mmol、油状物中に60％)(予めヘプタンで洗浄(2x100mL)の氷冷したスラリにゆっくりと添加した。反応混合物を40分静置し、ついで氷槽で冷却し、続いてテトラヒドロフラン(150mL)中に溶解させたブロモ酢酸(31g，223mmol)中にゆっくり添加し、ついで約３時間室温で静置した。有機溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をジクロロメタン(400mL)中に溶解させた。水(100mL)をゆっくりと添加した後、機械式撹拌のもとで混合物を30分静置した。水相を分離し、塩酸塩(4N)で酸性にし、ジクロロメタンで抽出した(2x75mL)。全ての合体した有機相を真空下で蒸発させて黄色の油状物を得た。この油状物に、ジクロロメタン(250mL)中のピペリジン(37mL、371mmol)溶液をゆっくりと添加し、混合物を機械式撹拌のもとで１時間静置した。透明な溶液をジクロロメタン(100mL)で希釈し、塩酸塩で洗浄した(4N、2x100mL)。水相をさらなるジクロロメタンで抽出し(2x75mL)、合体した有機相を真空下で蒸発させて黄色の油状物を得、これをさらに精製せずに用いた。
【０２６７】
収量：27.0g(66％)。13C-NMR(CDCl3)：δ＝173.30；71.36；70.66-70.05；68.65；50.65。
【０２６８】
例14
(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化６５】
2008528549.tif 000058
上記(2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ)酢酸(13g，46.9mol)をジクロロメタン(100mL)中に溶解させた。N-ヒドロキシスクシンイミド(6.5g，56.3mmol)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩(10.8g，56.3mmol)を添加し、反応混合物を１時間静置した。ジイソプロピルエチルアミン(39ml、234mmol)およびL-リジンメチルエステル二塩酸塩(6.0g，25.8mmol)を添加し、反応混合物を16時間静置した。反応混合物をジクロロメタン(300mL)で希釈し、水(100mL)、塩酸塩(2N、2x100mL)、水(100mL)、炭酸水素ナトリウム50％飽和物(100mL)および水(2x100mL)で抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて、油状物を得、これをさらに精製せずに用いた。収量：11g(73％)。LCMS：m/z＝591。
【０２６９】
13C-NMR(CDCl3):(選択)δ＝172.48；169.87；169.84；71.093-70.02；53.51；52.34；51.35；50.64；38.48；36.48；31.99；31.40；29.13；22.82。
【０２７０】
例15
(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)-ヘキサン酸 メチルエステル
【化６６】
2008528549.tif 000059
酢酸エチル(15mL)中の上記(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(1.0g，1.7mmol)の溶液に、二炭酸ジ-tert-ブチル(0.9g，4.24mmol)および10％Pd/C(0.35g)を添加した。ついで水素を該溶液中で３時間絶えずバブリングさせた。反応混合物を濾過し、有機溶媒を真空下で除去した。残渣を、酢酸エチル／メタノール9:1を溶出剤として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含んだ画分をプールし、有機溶媒を真空下で除去し、油状物を得た。収量：0.60g(50％)。LC-MS：m/z＝739(M+1)。
【０２７１】
例16
(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化６７】
2008528549.tif 000060
上記(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}-アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(0.6g，0.81mmol)をジクロロメタン(5mL)中に溶解させた。トリフルオロ酢酸(5mL)を添加し、反応混合物を約１時間静置した。
【０２７２】
反応混合物を真空下で蒸発させ、油状物を得、これをさらに精製せずに用いた。
【０２７３】
収量：0.437g(100％)。LC-MS m/z＝539(M+1)。
【０２７４】
例17
(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸
【化６８】
2008528549.tif 000061
メタノール(10mL)中の(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(2.0g，3.47mmol)の溶液に水酸化ナトリウム(4N，1.8ml、6.94mmol)を添加し、反応混合物を２時間静置した。有機溶媒を真空下で蒸発させ、残渣を水(45mL)中に溶解させ、塩酸(4N)を酸性にした。混合物をジクロロメタン(150mL)で抽出し、これを塩化ナトリウム飽和水溶液で洗浄した(2x25mL)。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させ、油状物を得た。LC-MS m/z＝577(M+1)。
【０２７５】
例18
N-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル)フタルイミド
【化６９】
2008528549.tif 000062
N-(4-ブロモブチル)フタルイミド(18.9g，67.0mmol)、MeCN(14mL)、およびN-Boc-ヒドロキシルアミン(12.7g，95.4mmol)の撹拌混合物に、DBU(15.0mL、101mmol)を数回にわけてを添加した。得られた混合物を50℃で24h撹拌した。水(300mL)および12M HCl(10mL)を添加し、生成物をAcOEtで３回抽出した。合体した抽出物を塩水で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、減圧下で濃縮した。得られた油状物(28g)をクロマトグラフィーにより精製した(140g SiO2、ヘプタン／AcOEtでの勾配溶出)。17.9g(80％)の標題化合物を油状物で得た。
【０２７６】
1H NMR(DMSO-d6)δ＝1.36(s、9H)、1.50(m、2H)、1.67(m、2H)、3.58(t、J＝7Hz、2H)、3.68(t、J＝7Hz、2H)、7.85(m、4H)、9.90(s、1H)。
【０２７７】
例19
4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン
【化７０】
2008528549.tif 000063
EtOH(10mL)中のN-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル)フタルイミド(8.35g，25.0mmol)の溶液に、ヒドラジン水和物(20mL)を添加し、混合物を80℃で38h撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をEtOHおよびPhMeで共蒸発させた。残渣にEtOH(50mL)を添加し、沈殿したフタルヒドラジドを濾過除去し、EtOH(50mL)で洗浄した。合体した濾液を濃縮して5.08gの油状物を得た。この油状物を、水(20mL)中のK2CO3(10g)の溶液と混合させ、生成物をDCMで抽出した。乾燥(MgSO4)および濃縮により、2.28g(45％)の標題化合物を油状物で得、これをさらに精製せずに用いた。
【０２７８】
1H NMR(DMSO-d)：δ＝1.38(m、2H)、1.39(s、9H)、1.51(m、2H)、2.51(t、J＝7Hz、2H)、3.66(t、J＝7Hz、2H)。
【０２７９】
例20
2-(1,3-ビス[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸 tert-ブチルエステル
【化７１】
2008528549.tif 000064
1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(0.3g，0.40mmol)を乾燥ピリジンから１回、乾燥アセトニトリルから１回蒸発させた。残渣を乾燥DMF(2mL)中に窒素下で溶解させ、60％NaH-油状懸濁物(24mg，0.6mmol)を添加した。混合物を室温で15分撹拌した。ブロモ酢酸tert-ブチル(0.07mL、0.48mmol)を添加し、混合物をさらに60分撹拌した。反応を氷で抑制し、ついでジエチルエーテル(100mL)および水(100mL)の間で分配した。有機相を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N(49:50:1)を用いるシリカゲルカラムで溶出させた。主要な生成物を含んだ画分を回収した。溶媒を真空下で除去し、残渣を酢酸の80％水溶液(5mL)中に溶解させ、室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗製の物質をジエチルエーテル(25mL)中に溶解させ、水で洗浄した(2 x 5mL)。水相を回収し、水を回転蒸発器(rotorvap)で除去して、63mgの標題化合物を得た。
【０２８０】
1H NMR(CDCl3)：δ＝4.19(s、2H)、3.78-3.55(m、21H)、1.49(s、9H)。
【０２８１】
例21
N,N-ビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸
【化７２】
2008528549.tif 000065
N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸を、THFまたはDMFのような極性の非-プロトン性の溶媒中に溶解させる。水素化ナトリウム(鉱物油中に60％懸濁)を該溶液にゆっくりと添加する。混合物を３時間撹拌する。N-(2-ブロモエチル)フタルイミドを添加する。反応が完了するまで、混合物を撹拌する。メタノールをゆっくり添加することにより反応を抑制する。酢酸エチルを添加する。溶液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、続いて真空下で可能な限り濃縮する。粗製の化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【０２８２】
例22
N,N-ビス(2-(2-アミノエトキシ)エチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸
【化７３】
2008528549.tif 000066
N,N-ビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸を、エタノールのような極性溶媒中に溶解させる。ヒドラジン(または、フタロイル保護基を除去することで知られる他の試薬)を添加する。混合物を、反応が完了するまで室温で(または必要であれば上昇した温度で)撹拌する。混合物を真空下で可能な限り濃縮する。粗製の化合物をカラムクロマトグラフィーにより、または可能であれば真空蒸留により精製する。
【０２８３】
例23
N,N-ビス(2-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエトキシ)エチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸
【化７４】
2008528549.tif 000067
N,N-ビス(2-(2-アミノエトキシ)エチル)-O-tert-ブチルカルバミン酸を、水酸化ナトリウム水溶液およびTHFの混合物中、または水酸化ナトリウム水溶液およびアセトニトリルの混合物中に溶解させる。ベンジルオキシクロロホルメートを添加する。混合物を、反応が完了するまで室温で撹拌する。必要ならば体積を真空下で減少させる。酢酸エチルを添加する。有機相を塩水で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、続いて真空下で可能な限り濃縮する。粗製の化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【０２８４】
例24
ビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)アミン
【化７５】
2008528549.tif 000068
ビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)-tert-ブチルカルバミン酸をトリフルオロ酢酸中に溶解させる。混合物を反応が完了するまで室温で撹拌する。混合物を真空下で可能な限り濃縮する。粗製の化合物を標準的なカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【０２８５】
例25
11-オキソ-17-フタルイミド-12-(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)-3,6,9,15-テトラオキサ-12-アザヘプタデカン酸
【化７６】
2008528549.tif 000069
3,6,9-トリオキサウンデカン酸をジクロロメタン中に溶解させる。カルボジイミド(例えば、N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはN,N-ジイソプロピルカルボジイミド)を添加する。溶液を一晩室温で撹拌する。混合物を濾過する。必要ならば濾液を真空下で濃縮することができる。形成された分子内の無水物を用いたアミンのアシル化は文献により知られている(例えば、Cook, R. M.；Adams, J. H.；Hudson, D. Tetrahedron Lett., 1994, 35, 6777-6780またはStora, T.；Dienes, Z.；Vogel, H.；Duschl, C. Langmuir 2000, 16, 5471-5478)。無水物を、ジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドのような非-プロトン性溶媒中のビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)アミンの溶液と混合する。混合物を反応が完了するまで撹拌する。粗製の化合物を、抽出、続いて標準的なカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【０２８６】
例26
5-オキソ-11-フタルイミド-6-(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)-3,9-ジオキサ-6-アザウンデカン酸
【化７７】
2008528549.tif 000070
ジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドのような非-プロトン性溶媒中のジグリコール無水物の溶液を、ジクロロメタンまたはN,N-ジメチルホルムアミドのような非-プロトン性溶媒中のビス(2-(2-フタルイミドエトキシ)エチル)アミンの溶液に滴下添加する。混合物を反応が完了するまで撹拌する。粗製の化合物を、抽出および続いて標準的なカラムクロマトグラフィーにより精製する。
【０２８７】
例27
ビス-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)エチル]アンモニウム酢酸塩
【化７８】
2008528549.tif 000071
ジエチレントリアミン(15.8mL、145.4mmol)を、氷槽で冷却しながら氷酢酸(175mL)にゆっくり添加した。無水フタル酸(43.1g，290.8mmol)を添加した。得られた混合物を20h還流させた。溶液を冷却した。混合物を真空下で濃縮した。得られた粘性のある油状物を、アセトニトリルから３回共蒸発させた。油状物をアセトニトリル(250mL)と混合させ、混合物を加熱して短時間還流させた。溶液を一晩冷蔵庫内に放置した。形成された結晶を濾過により分離した。分離した明るい黄色の結晶を真空オーブンで乾燥させた。収量：33.5g，63％。濾液を濃縮(真空下で)後に再結晶化させることにより、さらなる物質を得ることができた。1H-NMR(d6-DMSO)δ：7.81-7.74(m、8H)、3.60(t、J＝6.32Hz、4H)、3.70-3.20(b、15H)、2.76(t、J＝6.32Hz、4H)、1.91(s、5H おそらく残余の酢酸が存在する)。
【０２８８】
13C-NMR(d6-DMSO)δ：168.3、146.0、134.5、132.0、123.2、46.5、37.5−アセトニトリルおよび酢酸からのマイナーピークも観察される。LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：364。
【０２８９】
例28
2-[2-({ビス-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)エチル]カルバモイル}メトキシ)エトキシ]-エトキシ}酢酸
【化７９】
2008528549.tif 000072
3,6,9-トリオキサウンデカン二酸(trioxaununcandioic acid)(2.67g，12mmol)およびN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(2.48g，12mmol)をジクロロメタン(90mL)中で混合させた。得られた混合物を30分撹拌した。混合物を濾過し、続いて真空下で濃縮した。形成された化合物をジクロロメタン(250mL)中に溶解させた。ビス-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロ-イソインドール-2-イル)-エチル]-アンモニウム酢酸塩(4.0g，9.45mmol)およびN,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン(1.15g，10.0mmol)を溶液に添加した。得られた混合物を少なくとも20h撹拌した。混合物を真空下で濃縮した。酢酸エチル(150mL)および炭酸水素ナトリウム水溶液(5％w/w、150mL)を添加した。相は分離した。水相に、pHが１〜２になるまで濃塩酸を添加した。溶液をジクロロメタンで抽出した(4 x100mL)。合体した有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して明るい黄色のシロップ状物を得た。収量：2.55g，48％。
【０２９０】
1H-NMR(CDCl3)δ：7.86-7.69(m、8H)、4.17(s、2H)、4.09(s、2H)、3.94-3.51(いくつかの多重、16H)。13C NMR(CDCl3)δ：172.2、170.4、168.3、168.0、134.4、134.0、132.0、131.7、123.6、123.4、71.3、70.5、70.4、70.3、69.2、69.0、44.6、44.0、35.7、35.4。
【０２９１】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：568 [M+H]+および591 [M+Na]+。
【０２９２】
例29
({ビス-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)エチル]カルバモイル}メトキシ)酢酸
【化８０】
2008528549.tif 000073
ビス-[2-(1,3-ジオキソ-1,3-ジヒドロイソインドール-2-イル)エチル]アンモニウム 酢酸塩(25.8g，60.9mmol)をDCM(100mL)中に懸濁させた。N,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン(7.00g，60.9mmol)を添加したところ、大量の沈殿物が発生した。さらにジクロロメタン(50mL)を添加した。ジグリコール無水物(8.48g，73.0mmol)を一度で添加した。混合物を少なくとも20h撹拌した。混合物を真空下で濃縮した。得られたシロップを酢酸エチル(750mL)および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(750mL)の混合物中に溶解させた。有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で抽出した(2x200mL)。合体した水相を濃塩酸で酸性にした(pH 1〜2)−白色固体の大量の沈殿。合体した水相をジクロロメタンで抽出した(400および2 x 200mL)。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過した。有機相を真空下で濃縮して約200mLとした後、再び濾過した。濾過および濃縮の間にさらに沈殿が発生した。濾液を蒸発させて、白色の固体を得た。収量：6.04g。
【０２９３】
1H-NMR(d6-DMSO)δ：12.65(b、1H)、7.89-7.80(m、8H)、4.08(s、2H)、3.81-3.75(m、6H)、3.59-3.50(m、4H)。
【０２９４】
13C-NMR(CDCl3)δ：171.4、169.4、168.3、168.1、134.9、134.7、131.9、131.8、123.5、123.3、68.4、67.4、44.3、43.5、35.9、35.5。
【０２９５】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：480 [M+H]+。
【０２９６】
例30
ベンジルフェニルカーボネート
【化８１】
2008528549.tif 000074
Pittelkow、M.；Lewinsky、R.；およびChristensen、J. B. Synthesis  2002、15、2195-2202に従う：
クロロ蟻酸フェニル(54.1g，500mmol)を、コンデンサおよび添加漏斗を備えた1Lフラスコ中のベンジルアルコール(78.3g，500mmol)、ジクロロメタン(90mL)およびピリジン(50mL)の混合物に滴下添加した。混合物を1h撹拌した。水(125mL)を添加した。相が分離した。有機相を希硫酸で洗浄した(2M、2x125mL)。良好に分離させるために、最後の洗浄の際に塩水を添加しなければならなかった。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗製の化合物を減圧蒸留し、無色の液体を得た。収量：104.3g，91％。
【０２９７】
1H-NMR(CDCl3)δ：7.46-7.17(２つの多重線、10H)、5.27(s、2H)。
【０２９８】
13C NMR(CDCl3)δ：152.5、149.9、133.5、128.3、127.6、127.5、127.3、124.8、119.8、69.1。
【０２９９】
例31
塩化ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)アンモニウム
【化８２】
2008528549.tif 000075
Pittelkow、M.；Lewinsky、R.；およびChristensen、J. B. Synthesis 2002、15、2195-2202にしたがう：
ベンジルフェニルカーボネート(25,1g，110mmol)を、ジクロロメタン(100mL)中のジエチレントリアミン(5,16g，50mmol)の溶液に滴下添加した。混合物を少なくとも20h撹拌した。有機相をリン酸緩衝液で洗浄した(0.025M K2HPO4、0.025M NaH2PO4、2000mL、2M 硫酸でpHを3に調整)。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。収量：25.2g。
【０３００】
粗製油状物の一部(5g)を塩酸(2M、15mL)と混合した。混合物を15分撹拌した。混合物を濾過した。分離した固体を無水エタノール(600mL)と混合した。混合物を還流させた。不溶性の不純物を除去するために、沸騰する混合物をからデカントした。化合物を一晩５℃で結晶化させた。収量：2.84g(白色の結晶)。
【０３０１】
1H-NMR(d6-DMSO)δ：8.96(b、2H)、7.51(t、J＝5.56Hz、2H)、7.40-7.30(b、10H)、5,04(s、4H)、3.33(q、J＝6.06Hz、4H)、3.00(b、4H)。
【０３０２】
13C-NMR(d6-DMSO)δ：156.6、137.2、128.7、128.3、128.2、66.0、46.8、37.1。
【０３０３】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：372.5 [M+H]+。
【０３０４】
例32
[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸 
【化８３】
2008528549.tif 000076
3,6,9-トリオキサウンデカン二酸(1.83g，8.3mmol)およびN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.70g，8.3mmol)をジクロロメタン(10mL)中で混合させた。得られた混合物を30分撹拌した。混合物を濾過し、続いて真空下で濃縮した。形成された化合物を、N,N-ジメチルホルムアミド(27mL)中の塩化ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)アンモニウム(2.8g，6.87mmol)およびN,N,N’,N’-テトラメチルグアニジン(791mg，6.87mmol)(250mL)と混合した。得られた混合物を20h撹拌した。混合物を真空下で濃縮した。酢酸エチル(150mL)および炭酸水素ナトリウム水溶液(5％w/w、150mL)を添加した。相を分離した。有機相を炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出した(5％w/w、2 x 100mL)。合体した水溶液抽出物を酢酸エチル(200mL)と混合させた。pHが2〜3になるまで混合物に濃塩酸を添加した。相がただちに分離した。水相を酢酸エチルで抽出した(2 x 200mL)。合体した有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮して無色のシロップを得た。収量：2.17g，55％。
【０３０５】
1H-NMR(CDCl3)δ：10.2(b、1H)、7.31(b、10H)、6.10(b、1H)、5.84(b、1H)、5.06(s、2H)、5.04(s、2H)、4.17-4.09(m、4H)、3.72-3.22(いくつかの多重線、16H)
13C-NMR(CDCl3)δ：172.9、171.2、157.3、137.0、128.9-128.4(いくつかの信号)、71.3、70.8、70.7、70.3、68.9、67.1、67.0、47.5、46.0、39.6。
【０３０６】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：576 [M+H]+ 。
【０３０７】
例33
[2-(2-{[ビス-(2-アミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸
【化８４】
2008528549.tif 000077
[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸(725mg，1.26mmol)をメタノール(50mL)中に溶解させる。活性炭素上のパラジウム(150mg，5％Pd、湿潤、Degussa 触媒型E101 NO/W)を添加した。混合物を水素ガス雰囲気中で20h撹拌した。混合物を濾過した。濾液を真空下で濃縮した。
【０３０８】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：309 [M+H]+、291 [M-H2O]+ 。
【０３０９】
例34
[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル
【化８５】
2008528549.tif 000078
[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸(1.45g，2.52mmol)をN-ヒドロキシスクシンイミド(291mg，2.53mmol)、1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド 塩酸塩(485mg，2.53mmol)およびN,N,N',N'-テトラメチルグアニジン(291mg，2.53mmol)と混合した。混合物を20h撹拌した。硫化水素ナトリウム水溶液(5％w/w、150mL)およびジクロロメタン(100mL)を添加した。相を分離した。水相をジクロロメタンで抽出した(2 x 100および2 x 50mL)。合体した有機相を固体硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。
【０３１０】
LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：674 [M+H]+、577(無反応の出発物質)。
【０３１１】
例35
1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン-3-イル2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸塩
【化８６】
2008528549.tif 000079
3-ヒドロキシ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン(10.0g；61.3mmol)および2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸(10.9g；61.3mmol)をDCM(125mL)中に懸濁させ、DIC(7,7g；61.3mmol)を添加した。混合物を乾燥雰囲気下で周囲温度にて一晩撹拌した。ジイソプロピル尿素の沈殿物が形成され、これを濾過除去した。有機溶液を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で広範囲に洗浄し、ついで乾燥させ(Na2SO4)、真空下で蒸発させて、標題生成物を透明な黄色の油状物で得た。収率は16.15g(81％)であった。
【０３１２】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.39ppm(s、3H)；3.58(t、2H)；3.68(t、2H)；3.76(t、2H)；3.89(t、2H)；4.70(s、2H)；7.87(t、1H)；8.03(t、1H)；8.23(d、1H)；8.37(d、1H)。
【０３１３】
13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝57.16ppm；64.96；68.71；68.79；69.59；69.99；120.32；123.87；127.17；130.96；133.63；142.40；148.22；164.97。
【０３１４】
オリゴマー生成物：
固相オリゴマー化：
下記の反応は全てWang リンカーを用いて官能化されたポリスチレン上で行われる。反応は、通常、同様の他の型の固相支持体上でも、他の型の官能化リンカーを用いて作用するであろう。
【０３１５】
固相のアジド還元：
この反応は知られており(Schneider、S.E. et al. Tetrahedron、1998、54(50)15063-15086)、支持体に結合されたアジドを、THFおよび水の混合物中の過剰量のトリフェニルホスフィンを用いて12〜24時間室温で処理することにより行うことができる。代替的には、T.Y. et al Tetrahedron Lett. 1997、38(16)、2821-2824に記載されるように、THF水溶液中のトリメチルホスフィンを使用できる。またアジドの還元は、ジチオトレイトール(Meldal、M. et al. Tetrahedron Lett. 1997、38(14)、2531-2534)、1,2-ジメルカプトエタンおよび1,3-ジメルカプトプロパン(Meinjohanns、E. et al. J. Chem. Soc、Perkin Trans 1、1997,6、871-884)のような硫化物、または、塩化スズ(II)のようなスズ(II)塩(Kim、J.M. et al. Tetrahedron Lett、1996、37(30)、5305-5308)を用いて固相上で行うこともできる。
【０３１６】
固相カルバメート形成：
この反応は知られており、通常、活性化された炭酸塩またはハロ蟻酸誘導体を、アミンと、好ましくは塩基の存在下で反応させることにより行われる。。
【０３１７】
例36
3-(1,3-ビス{2-[2-([ベンゾイルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシカルボニル)アミノ)プロパン酸
【化８７】
2008528549.tif 000080
この例では、2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸でキャッピングされた第二世代カルバメート系分岐ポリマーの合成において例４で調製された、1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニル炭酸塩 モノマービルディングブロックを用いる。カップリング化学反応は、標準的な固相カルバメート化学反応に基づいており、保護化法は上述の固相アジド還元工程に基づく。
【０３１８】
工程１：Fmoc-β-Ala-Wang 樹脂(100mg；負荷量0.31mmol/g BACHEM)をジクロロメタン中に30分懸濁させ、ついでDMFで２回洗浄した。DMF中の20％ピペリジンの溶液を添加し、混合物を15分周囲温度で振盪した。この工程を繰り返し、樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３１９】
工程２：モノマービルディングブロックのカップリング：
1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イル-p-ニトロフェニル炭酸塩(527mg；1,4mmol、4x)の溶液をDIPEAと共に上記樹脂に添加した(240μL；1,4mmol、4x)。樹脂を90分振盪し、ついで排液してDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３２０】
工程３：無水酢酸を用いたキャッピング：
ついで樹脂を、無水酢酸、DIPEA、DMF(12:4:48)の溶液で10分 周囲温度で処理した。溶媒を除去し、樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３２１】
工程４：脱保護(アジド基の還元)：樹脂を、DMF中のDTT(2M)およびDIPEA(1M)の溶液を用いて50℃で１時間処理した。ついで樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。少量の樹脂を回収し、DMF中の塩化ベンゾイル(0.5M)およびDIPEA(1M)の溶液を用いて1h処理した。樹脂を50％TFA/DCMを用いて開裂させ、ジベンゾイル化生成物をNMRおよびLC-MSで分析した。
【０３２２】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.50-3.75(m、20H)；3.85(s、1H)；4.25(d、2H)；6.95(t、1H)；7.40-7.50(m、6H)；7.75(m、4H)。LC-MS：m/z＝576(M+1)；Rt＝2.63分。
【０３２３】
例37
3-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパン酸
【化８８】
2008528549.tif 000081
工程１：Fmoc-β-Ala 結合Wang樹脂(A22608、Nova Biochem、3.00g；負荷量0.83mmol/g)をDCM中で20分膨張させ、ついでDCM(2x20mL)およびNMP(2x20mL)で洗浄した。ついで樹脂をNMP中の20％ピペリジン(2x15分)で２回処理した。樹脂をNMP(3x20mL)およびDCM(3x20mL)で洗浄した。
【０３２４】
工程２：2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(3.70g；10mmol)をNMP(30mL)中に溶解させ、DhbtOH(1.60g；10mmol)およびDIC(1.55mL；10mmol)を添加した。混合物を周囲温度で30分撹拌し、ついでに、工程１で得られた樹脂にDIPEA(1.71mL；10mmol)と共に添加した。反応混合物を1.5h振盪し、ついで排液し、NMP(5x20mL)およびDCM(3x20mL)で洗浄した。
【０３２５】
工程３：ついでNMP(15mL)およびDCM(15mL)中でSnCl2.2H2O(11.2g；49.8mmol)の溶液を添加した。反応混合物を1h振盪した。排液して樹脂を得、これをNMP:MeOHで洗浄した(5x20mL；1:1)。ついで樹脂を真空下で乾燥させた。
【０３２６】
工程４：NMP(10mL)中の2-[2-(2-メトキシエチル)エトキシ]酢酸(1.20g；6.64mmol)、DhbtOH(1.06g；6.60mmol)およびDIC(1.05mL；6.60mmol)の溶液を10分室温で混合させ、ついで、工程３で得られた3-[2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパン酸接合(tethered)Wang 樹脂(1.0g；0.83mmol/g)に添加した。DIPEA(1.15mL、6.60mmol)を添加し、反応混合物を2.5h振盪した。溶媒を除去し、樹脂をNMP(5x20mL)およびDCM(10x20mL)で洗浄した。
【０３２７】
工程５：工程４の樹脂生成物を、TFA:DCM(10mL、1:1)を用いて１時間処理した。樹脂を濾過し、TFA:DCM(10mL、1:1)で１回洗浄した。ついで合体した濾液および洗浄物を取り出して乾燥させて、黄色の油状物(711mg)を得た。この油状物を10％アセトニトリル−水(20mL)中に溶解させ、C18 カラムと15-40％アセトニトリル−水の勾配とを用いる分取用HPLC装置で２回にわたり精製した。続いて画分をLC-MSにより分析した。生成物を含んだ画分をプールし、取り出して乾燥させた。収量：222mg(37％)。LC-MS：m/z＝716(M+1)、Rt＝1.97分。
【０３２８】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.56ppm(t、2H)；3.36(s、6H)；3.46-3.66(m、39H)；4.03(s、4H)；4.16(s、2H)；7.55(t、2H)；8.05(t、1H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝33.71ppm；34.90；58.89；68.94；69.40；69.98；70.09；70.33；70.74；70.91；71.07；71.74；79.07；171.62；171.97；173.63。
【０３２９】
例38
3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパン酸
【化８９】
2008528549.tif 000082
この物質を、例37の工程３で得られた3-[2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパン酸接合Wang樹脂(1.0g；0.83mmol/g)から、用いる試薬の量を２倍にして工程２〜５を繰り返すことにより得た。
【０３３０】
収量：460mg(33％)。MALDI-MS(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)：m/z＝1670(M+Na)。
【０３３１】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.57ppm(t、2H)；3.38(s、12H)；3.50-3.73(m、85 H)；4.05(s、8H)；4.17(s、2H)；4.19(s、4H)；7.48(m、4H)；7.97(m、3H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝38.81ppm；58.92；69.46；69.92；70.05；70.05；70.13；70.40；70.73；70.97；71.11；71.88；76.74；77.06；77.38；171.33；172.02。
【０３３２】
調製の代替的態様：
この例では、酢酸でキャッピングされた第２世代アミド系2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]分岐ポリマーの合成において、例６で調製された2-(1,3-ビス[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸モノマービルディングブロックを用いる。カップリング化学反応は標準的な固相ペプチド化学反応にもとづき、保護化法は上述の固体アジド還元工程にもとづく。
【０３３３】
工程１：Fmoc-β-Ala-Wang樹脂(100mg；0.31mmol/g BACHEM負荷)をジクロロメタン中に30分懸濁させ、ついでDMFで２回洗浄する。DMF中の20％ピペリジンの溶液を添加し、混合物を15分周囲温度で振盪した。この工程を繰り返し、樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３３４】
工程２：モノマービルディングブロックのカップリング：
2-(1,3-ビス[アジドエトキシエチル]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(527mg；1,4mmol、4x)およびDhbtOH(225mg；1,4mmol、4x)の溶液をDMF(5mL)中に溶解させ、DIC(216μL、1,4mmol、4x)を添加した。混合物を10分放置し(予備活性)、ついでに樹脂にDIPEA(240ul；1,4mmol、4x)と共に添加した。樹脂を90分振盪させ、ついで排液し、DMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３３５】
工程３：無水酢酸をキャッピング：
ついで樹脂を、無水酢酸、DIPEA、DMFの溶液(12:4:48)で10分周囲温度で処理した。溶媒を除去し、樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３３６】
工程４：脱保護(アジド基の還元)：
樹脂を、DMF中のDTT(2M)およびDIPEA(1M)の溶液を用いて50℃で１時間処理した。ついで樹脂をDMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。少量の樹脂を取り出し、DMF中の塩化ベンゾイル(0.5M)およびDIPEA(1M)の溶液を用いて1h処理した。樹脂を50％TFA/DCMを用いて開裂させ、ジベンゾイル化生成物をNMRおよびLC-MSで分析した。
【０３３７】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.50-3.75(m、20H)；3.85(s、1H)；4.25(d、2H)；6.95(t、1H)；7.40-7.50(m、6H)；7.75(m、4H)。LC-MS：m/e＝576(M+1)；Rt＝2.63分。
【０３３８】
工程５〜７を、工程２〜４に従い、２倍のモル量の試薬および同量の溶媒を用いて行った。
【０３３９】
工程８：2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸を用いたキャッピング：
2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸(997mg；5.6mmol、樹脂負荷に対し16x)とDhbtOH(900mg；5.6mmol、16x)との溶液を、DMF(5mL)中に溶解させ、DIC(864ul、5.6mmol、16x)を添加した。混合物を10分放置し(予備活性)、ついで樹脂にDIPEA(960ul；5.6mmol、16x)と共に添加した。樹脂を90分振盪し、ついで排液し、DMF(3x)およびDCM(3x)で洗浄した。
【０３４０】
工程９：樹脂からの開裂：
樹脂を50％TFA−DCM溶液を用いて周囲温度で30分処理した。溶媒を回収し、樹脂をさらなる時間にわたり50％TFA-DCMを用いて洗浄した。合体した濾液を蒸発させて乾燥させ、残渣をクロマトグラフィーにより精製した。
【０３４１】
例39
3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパン酸
【化９０】
2008528549.tif 000083
この物質は、例37における工程３で得られた3-[2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-いルオキシ)アセチルアミノ]プロパン酸接合Wang樹脂(1.0g；0.83mmol/g)から、2x量の試薬を用いて工程２〜３を繰り返し、ついで4x量の試薬を用いて工程２〜５を繰り返すことにより調製された。
【０３４２】
収量：84mg(4％)。LC-MS:(m/2)+1＝1758；(m/3)+1＝1172；(m/4)+1＝879；(m/5)+1＝704。Rt＝2.72分。1H-NMR(CDCl3)：δ＝2.51ppm(t、2H)；3.33(s、24H)；3.44-3.70(m、213H)；3.93(s、16H)；4.08(s、14H)；7.25(m、8H)；7.69(m、7H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝38.94ppm；59.33；69.78；70.08；70.37；70.44；70.56；70.82；71.10；71.26；71.51；72.17；79.24；170.60；171.22。
【０３４３】
例40
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパノアート
【化９１】
2008528549.tif 000084
3-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパン酸(67mg；82μmol)をTHF(5mL)中に溶解させた。反応混合物を氷槽で冷却した。DIPEA(20μL；120μmol)およびTSTU(34mg；120μmol)を添加した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した時点で、LC-MSによれば反応は完了した。LC-MS：m/z＝813(M+H)；Rt＝2.22分。
【０３４４】
例41
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパノアート
【化９２】
2008528549.tif 000085
3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパン酸およびTSTUから、例40の記載と同様に調製された。LC-MS:(m/2)+1＝873、Rt＝2.55分。
【０３４５】
例42
N-ヒドロキシスクシミジル3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパノアート
【化９３】
2008528549.tif 000086
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパン酸およびTSTUから、例40に記載のとおりに調製された。LC-MS:(m/4)+1＝903、Rt＝2.69分。
【０３４６】
例43
N-(4-tert-ブトキシカルボニルアミノキシブチル)3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパンアミド
【化９４】
2008528549.tif 000087
N-ヒドロキシスクシンイミジル3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパノアート(105mg；0.06mmol)をDCM(2mL)中に溶解させた。ついで4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン(49mg；0.24mmol)の溶液を添加し、続いてDIPEA(13μL；0.07mmol)を添加した。混合物を周囲温度で１時間撹拌し、ついで減圧下で濃縮した。残渣を20％アセトニトリル-水(4mL)中に溶解させ、C18カラム、および0、10、20、30および40％アセトニトリル-水(各々の溶出液10mL)の段階的勾配を用いる分取用HPLC装置で精製した。純粋生成物を含んだ画分を濃縮し、16時間真空オーブンで乾燥させて、黄色の油状物を得た。
【０３４７】
収量：57mg(51％)。LC-MS:(m/2)+1＝918、Rt＝2.75分。1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.42ppm(s、9H)；2.40(t、2H)；3.21(dd、2H)；3.33(s、12H)；3.38-3.72(m、99H)；3.80(m、2H)；3.95(s、8H)；4.08(s、6H)；6.99(m、1H)；7.23(m、4H)；7.69(m、2H)；7.85(m、1H)；8.00(m、1H)。13C-NMR(CDCl3、選択されたピーク)：δ＝28.27ppm；38.58；58.97；69.42；69.72；70.01；70.08；70.20；70.41；70.46；70.73；70.91；71.16；71.22；71.81；78.89；81.33；170.27；170.89。
【０３４８】
例44
N-(4-アミノキシブチル)3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパンアミド
【化９５】
2008528549.tif 000088
N-(4-tert-ブトキシカルボニルアミノキシブチル)3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパンアミド(19mg；10μmol)を50％TFA/DCM(10mL)中に溶解させ、透明な溶液を周囲温度で30分撹拌した。溶媒を回転蒸発により除去し、残渣をDCMから２回ストリッピングさせて、定量的収量(19mg)の標題生成物を得た。LC-MS:(m/2)+1＝868、(m/3)+1＝579、Rt＝2,35分。
【０３４９】
例45
2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル
【化９６】
2008528549.tif 000089
2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル(1.74g；4.5mmol、例9)および1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン-3-イル2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]酢酸塩(2.94g；9mmol、例35)をDCM(100mL)中に溶解させた。DIPEA(3.85mL；22.3mmol)を添加し、透明な混合物を90分室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を、MeOH-DCM(1:16)を溶出剤として用いるシリカ上のクロマトグラフィーにより精製した。純粋な画分をプールし、取り出して乾燥させ、標題物質を透明な油状物で得た。収量は1.13g(36％)であった。
【０３５０】
1H-NMR(CDCl3)：δ＝1.46ppm(s、9H)；3.38(s、6H)；3.49-3.69(m、37H)；4.01(s、4H)；4.18(s、2H)；7.20(bs、2H)。
【０３５１】
例46
2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸：
【化９７】
2008528549.tif 000090
2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチル(470mg；0.73mmol)をDCM-TFA(25mL、1:1)中に溶解させ、混合物を30分周囲温度で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をDCMから２回ストリッピングした。
【０３５２】
LC-MS:(M+1)＝645、Rt＝2,26分。1H-NMR(CDCl3)：δ＝3.45ppm(s、6H)；3.54-3.72(m、37H)；4.15(s、4H)；4.36(s、2H)。
【０３５３】
例47
2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸N-ヒドロキシスクシミジル
【化９８】
2008528549.tif 000091
2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸(115mg；0.18mmol)をTHF(5mL)中に溶解させた。反応混合物を氷槽に配した。TSTU(65mg，0.21mmol)およびDIPEA(37μL；0.21mmol)を添加し、反応混合物を０℃で30分、ついで室温で一晩撹拌した。ついで反応物を取り出して乾燥させ、130mgの標題物質を透明な油状物で得た。LC-MS:(m+1)＝743、(m/2)+1＝372、Rt＝2,27分。
【０３５４】
例48
3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)酢酸t-ブチル
【化９９】
2008528549.tif 000092
この物質は、２等量のN-ヒドロキシスクシミジル2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸塩および１等量の2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチルから、例45に記載のプロトコールおよび精製方法を用いて調製された。
【０３５５】
例46に記載にしたがいtert-ブチル基を除去し、続いて例47に記載にしたがいN-ヒドロキシスクシミジルエステルを形成し、続いてこの例に記載にしたがい2-(1,3-ビス[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)酢酸tert-ブチルへのカップリングすることより、樹状成長(dendritic growth)が達成され得る。
【０３５６】
例49
(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-(2,6-ビス-[2-(2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化１００】
2008528549.tif 000093
(S)-2,6-ビス(2-{2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸(1.8g，3.10mmol)を、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタンの1:3混合物(10mL)中に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミンを用いてpHを塩基性反応に調整し、N-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を添加し、反応混合物を30分静置し、ついでこの反応混合物を、(S)-2,6-ビス-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(0.37g，0.70mmol  ジクロロメタン中)の溶液に添加し、反応混合物を一晩静置した。反応混合物をジクロロメタン(150mL)で希釈し、水(2x40mL)、炭酸水素ナトリウム50％飽和物(2x30mL)および水(3x40mL)で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、および真空下で蒸発させて油状物を得た。
【０３５７】
収量：1.6g(89％)。LC-MS：m/z＝1656(M+1)、828.8(M/2)+1および553(M/3)+1。
【０３５８】
例50
(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス[2-(2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化１０１】
2008528549.tif 000094
酢酸エチル(60mL)中の、上記(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス[2-(2-[2-(2-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(1.6g，0.97mmol)の溶液に、二炭酸ジ-tert-ブチル(1.0g，4.8mmol)およびPd/C(10％、1.1g)を添加した。反応混合物中で水素を２時間絶えずバブリングさせた。反応混合物を濾過し、有機溶媒を真空下で除去し、油状物を得、これをさらに精製せずに用いた。収量：1.8g(98％)。LC-MS：m/z＝1953(M+1)、977(M/2)+1。
【０３５９】
例51
(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス[2-(2-[2(2アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化１０２】
2008528549.tif 000095
上記(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス[2-(2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステルをジクロロメタン(20mL)中に溶解させ、トリフルオロ酢酸(20mL)を添加した。反応混合物を２時間静置した。有機溶媒を真空下で蒸発させて、油状物を得た。収量：1.4g(100％)。LC-MS：m/z＝1552(M+1)；777.3(M/2)+1；518.5(M/3)+1および389.1(M/4)+1。
【０３６０】
例52
(S)-2,6-ビス-(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル
【化１０３】
2008528549.tif 000096
ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミドの3:1混合物(20mL)中の2-(2-(メトキシエトキシ)エトキシ)酢酸(1.3g，7.32mmol)の溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.8g，7.32mmol)およびN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(1.4g，7.32mmol)を添加した。反応混合物を１時間静置した後、混合物を、ジクロロメタン(10mL)中の(S)-2,6-ビス(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス[2-(2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステル(1.42g，0.92mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(2.4ml、14.64mmol)の溶液に添加した。反応混合物を一晩静置した。該反応混合物をジクロロメタン(100mL)で希釈し、水で抽出した(3x25mL)。合体した水相をさらなるジクロロメタンで抽出した(2x75mL)。合体した有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させた。残渣を、500mL 酢酸エチル、続いて500mL 酢酸エチル／メタノール  9:1、最後にメタノールを溶出液として用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含んだ画分を真空下で蒸発させて油状物を得た。収量：0.75g(38％)。LC-MS：m/z＝1097(M/2)+1；732(M/3)+1および549(M/4)+1。
【０３６１】
(S)-2,6-ビス-(2-[2-(2-[2-((S)-2,6-ビス-[2-(2-[2-(2-(2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ]エトキシ)アセチルアミノ]ヘキサノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)ヘキサン酸 メチルエステルを遊離酸に鹸化し、インスリンのＡ鎖またはＢ鎖のいずれかのB29のεアミノリジンまたはα-アミノ基のいずれかのアミノ基に、活性化エステルを介して付加させることができる。活性化されたエステルが生成され、ジイソプロピルエチルアミンおよびN-ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは他の活性化条件のような当業で知られた標準的なカップリング方法により、ペプチドまたはタンパク質のアミノ基にカップリングされ得る。
【０３６２】
例53
[2-(2-{[ビス-(2-{2-[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸
【化１０４】
2008528549.tif 000097
テトラヒドロフラン(50mL)中の[2-(2-{[ビス-(2-ベンジルオキシカルボニルアミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(2.53mmol−先の実験より。質量は未測定)の溶液、および炭酸水素ナトリウム水溶液中の[2-(2-{[ビス-(2-アミノエチル)カルバモイル]メトキシ}エトキシ)エトキシ]酢酸(1.26mmol−先の実験より。質量は未測定)の溶液(5％w/w、50mL)を混合した。混合物を少なくとも20h撹拌した。固体の硫化水素ナトリウムを添加し、pHを2〜3とした。相を分離させた。水相をジクロロメタンで抽出した(3 x 50mL)。合体した有機相を、硫化水素ナトリウム水溶液(5％w/w、50mL)で洗浄した。水相をジクロロメタンで抽出した(2 x 50mL)。合体した有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。
【０３６３】
収量：989mg。LC-MS(ES-ポシティブモード)、m/z：1423 [M+H]+。
【０３６４】
帯電したリン酸エステル骨格を用いるデンドリマー合成の一般手順
【化１０５】
2008528549.tif 000098
代替的に、インスリンへの付加のために、上記tertブチル保護化カルボン酸中間体を脱保護した後、OSu エステル(例えば例47に記載)として活性化してよい。
【０３６５】
例54
【化１０６】
2008528549.tif 000099
2-(2-トリチルオキシエトキシ)エタノール：
【化１０７】
2008528549.tif 000100
トリフェニルクロロメタン(10g，35.8mmol)を乾燥ピリジン中に溶解させ、ジエチレングリコール(3.43mL、35.8mmol)を添加し、混合物を窒素下で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去した。ジクロロメタン(100mL)中に溶解させ、水で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、溶媒を真空下で除去した。粗成物を、ヘプタン／トルエン(3:2)から再結晶化させることにより精製し、標題化合物を得た。
【０３６６】
1H NMR(CDCl3)：δ＝7.46(m、6H)、7.28、(m、9H)、3.75(t、2H)、3.68(t、2H)、3.62(t、2H)、3.28(t、2H)。LC-MS：m/z＝371(M+Na)；Rt＝2.13分。
【０３６７】
2-[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシメチル]オキシラン：
【化１０８】
2008528549.tif 000101
2-(2-トリチルオキシエトキシ)エタノール(6.65g，19mmol)を乾燥THF(100mL)中に溶解させた。60％NaH(0.764mg，19mmol)をゆっくり添加した。懸濁物を15分撹拌した。エピブロモヒドリン(1.58mL、19mmol)を添加し、混合物を窒素下で室温で一晩撹拌した。反応を氷で抑制させ、ジエチルエーテル(300mL)および水(300mL)の間で分配した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去し、油状物を得、これをDCM／MeOH／Et3N(98:1:1)で溶出するシリカゲルカラムで精製して標題化合物を得た。
【０３６８】
1H NMR(CDCl3)：δ＝7.45(m、6H)、7.25、(m、9H)、3.82(dd、1H)、3.68(m、6H)、3.45(dd、1H)、3.25(t、2H)、3.15(m、1H )、2.78(t、1H)、2.59(m、1H)。LC-MS：m/z＝427(M+Na)；Rt＝2.44分。
【０３６９】
1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール：
【化１０９】
2008528549.tif 000102
2-(2-トリチルオキシエトキシ)エタノール(1.14g，3.28mmol)を乾燥DMF(5mL)中に溶解させた。60％NaH(144mg，3.61mmol)をゆっくりと添加し、混合物を窒素下で室温で30分撹拌した。混合物を40℃にまで加熱する。2-[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシメチル]オキシラン(1.4g，3.28mmol)をDMF(5mL)中に溶解させ乾燥、撹拌し続けながら、前記溶液に窒素下で滴下添加した。混合物の添加が終了したら、窒素下に40℃で一晩撹拌した。加熱を取り外し、室温にまで冷却した後、反応を氷で抑制させ、NaHCO3飽和水溶液(100mL)中に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出する(3 x 75mL)。有機相を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これを、EtOAc／ヘプタン／Et3N(49:50:1)で溶出するシリカゲルカラムで精製して標題化合物を得た。
【０３７０】
1H NMR(CDCl3)：δ＝7.45(m、12H)、7.25、(m、18H)、3.95(m、1H)、3.78-3.45(m、16H)、3.22(t、4H)、LC-MS：m/z＝775(M+Na)；Rt＝2.94分。
【０３７１】
1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(2-シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイト)：
【化１１０】
2008528549.tif 000103
1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(0.95g，1.26mmol)を乾燥ピリジンから２回乾燥させ、乾燥アセトニトリルから１回乾燥させた。窒素下で撹拌しながら乾燥THF(15mL)中に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(1.2mL、6.95mmol)を添加した。混合物を氷槽で０℃にまで冷却し、2-シアノエチルジイソプロピルクロロホスホラミダイト(0.39mL、1.77mmol)を窒素下で添加した。混合物を10分０℃で撹拌し、続いて30分室温で撹拌した。NaHCO3水溶液(50mL)を添加し、混合物をDCM／Et3N(98:2)で抽出した(3x30mL)。有機相を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去して油状物を得、EtOAc／ヘプタン／Et3N(35:60:5)で溶出するシリカゲルカラムで精製して、703mgの標題化合物を得た。31P-NMR(CDCl3)：δ 149.6ppm。
【０３７２】
{2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]-1-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシメチル]エトキシ}酢酸 tert-ブチルエステル：
【化１１１】
2008528549.tif 000104
1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オール(0.3g，0.40mmol)を乾燥ピリジンから１回蒸発させ、乾燥アセトニトリルから１回蒸発させた。窒素下で乾燥DMF(2mL)中に溶解させ、60％NaH(24mg，0.6mmol)を添加した。混合物を室温で15分撹拌した。ブロモ酢酸tert-ブチル(0.07mL、0.48mmol)を添加し、混合物をさらに60分撹拌した。反応を氷で抑制した。ジエチルエーテル(2 x50mL)および水(2 x 50mL)の間で分配し、有機相を回収し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去して油状物を得、これをEtOAc／ヘプタン／Et3N(49:50:1)を用いるシリカゲルカラムで溶出した。主要な生成物を含んだ画分を回収し、溶媒を真空下で除去し、酢酸80％水溶液(5mL)中に溶解させ、室温一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、粗製物質をジエチルエーテル(25mL)中に溶解させ、水で洗浄した(2 x 5mL)。水相を回収し、水を回転蒸発器(rotorvap)で蒸発させ、63mgの標題化合物を得た。1H NMR(CDCl3)：δ＝4.19(s、2H)、3.78-3.55(m、21H)、1.49(s、9H)。
【０３７３】
2-(1,3-ビス[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オキシ)酢酸 tert-ブチルエステル(63mg，0.16mmol)を乾燥アセトニトリルから２回蒸発させた。1,3-ビス[2-(2-トリチルオキシエトキシ)エトキシ]プロパン-2-オキシ β-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホラミダイト(353mg，0.37mmol)を乾燥アセトニトリルから２回蒸発させ、乾燥アセトニトリル(2mL)に溶解させ、添加した。乾燥アセトニトリル中のテトラゾールの溶液(0.25 M、2.64mL)を窒素下で添加し、該混合物を室温で１時間撹拌した。5.5mLのI2-溶液(0.1M THF/ルチジン/H2O  7:2:1中)を添加し、混合物をさらに１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル(20mL)で希釈し、ヨウ素の色が消えるまで、硫酸ナトリウム2％水溶液で洗浄した。有機相を乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を真空下で除去した。残渣を酢酸80％水溶液(5mL)中に溶解させ、室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、真空下で粗製の物質にジエチルエーテル(25mL)および水(10mL)を添加した。水相を回収し、水を真空下で除去した。生成物を、0.1％TFAを含んだアセトニトリル勾配0〜40％を用いる逆相分取用HPLC C-18 カラムで精製して、標題のtert-ブチル-保護化された第２世代の分岐ポリマー生成物を得た。LC-MS：m/z＝1171(M+Na)；1149(M+)、1093(MS 中のtert-ブチルの損失)；Rt＝2.76分。
【０３７４】
続いてβ-シアノエチル基の脱保護およびtert-ブチルエステル基の除去を、当業の熟練者に知られた従来の塩基および酸処理を用いて行った。
【０３７５】
デンドリマーのインスリンへの結合：
例55
B29K(N(eps)-{3-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパノイル})desB30 ヒトインスリン
【化１１２】
2008528549.tif 000105
DesB30 ヒトインスリン(262mg，46 umol)を100mM Na2CO3水溶液(3mL)中に溶解させた。ついでアセトニトリル(1.5mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミジル3-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]プロパノアート (37.4mg；46 umol、例40)の溶液を添加した。反応混合物を室温で1hおよび45分間穏やかに撹拌し、ついで1M HCl水溶液を用いてpHを5.5に調整した。混合物を氷浴で1h冷却した。わずかに形成された沈殿物質が観察された。混合物にアンモニア1％水溶液を添加して沈殿物を溶解させた。透明な溶液を0.45μmフィルタで濾過し、ついで25〜42％のアセトニトリル-水の直鎖状の勾配を用いるC18-逆相分取用HPLCで精製した。次いで画分をLC-MSおよびMALDI-TOFをそれぞれ用いて分析した。純粋な生成物を含んだ画分をプールし、水で希釈し、凍結乾燥させて12.6mgの標題物質を得た。LC-MS：電子スプレー：(m/4z)+1＝1599；(m/5z)+1＝1279；(m/6z)+1＝1066；(m/7z)+1＝915。Rt＝3.25分。HPLC(方法(B))：Rt＝7,130分；100,0％純度；UV 214 nm。
【０３７６】
MALDI-TOF-MS(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)；m/z＝6404。
【０３７７】
例56
B29K(N(eps)-{3-(1,3-ビス{2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ])エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパノイル})desB30 ヒトインスリン
【化１１３】
2008528549.tif 000106
DesB30 ヒトインスリン(262mg，46 umol)を100mM 水溶液 Na2CO3(3mL)中に溶解させた。ついでアセトニトリル(1.5mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミジル3-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)プロパノアート(80.3mg；46 umol、例41)の溶液を添加した。反応物を室温で3h穏やかに撹拌した。ついで1M HCl水溶液を用いてpHを5.5に調整した。透明な溶液を氷浴で10分冷却し、この間に沈殿物が形成された。沈殿物を遠心分離(6000rpmで10分)により分離した。沈殿物(アセトニトリル−水の1；1混合物1mL中に溶解)および浮遊物をHPLCにより分析したところ、同量の生成物および出発物質(非誘導体インスリン)を含んでいると思われた。浮遊物および沈殿物をプールし、水で希釈し、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた粉末を12mLの25％アセトニトリル−水中に溶解させ、35％〜55％のアセトニトリル−水のリニア勾配を用いるC18-逆相分取用HPLCで２回にわたり精製した。ついで画分を、LC-MSおよびMALDI-TOFを用いて各々分析した。純生成物を含んだ画分をプールし、水で希釈し、凍結乾燥させて14.61mgの標題物質を得た。
【０３７８】
LC-MS：電子スプレー：（m/5z)+1＝1468；(m/6z)+1＝1223；(m/7z)+1＝1048。Rt＝2,94分；metode：Scan  3001：TFA；ms-anyone2。HPLC(方法(A))：Rt＝11,411分。97,65％純度、UV 254 nm。HPLC(方法(B))：Rt＝7,140分。100,0％純度、UV 214 nm。MALDI-TOF-MS(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)；m/z＝7337。
【０３７９】
例57〜66
上述と同様に、かつ上述のビルディングブロックをdesB30 ヒトインスリンと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
以下において、分子のインスリン部分は省略されており、例57においては、省略形と構造全体の両方が示される。
【０３８０】
例57
【化１１４】
2008528549.tif 000107
例58
【化１１５】
2008528549.tif 000108
例59
【化１１６】
2008528549.tif 000109
例60
【化１１７】
2008528549.tif 000110
例61
【化１１８】
2008528549.tif 000111
例62
【化１１９】
2008528549.tif 000112
例63
【化１２０】
2008528549.tif 000113
例64
【化１２１】
2008528549.tif 000114
例65
【化１２２】
2008528549.tif 000115
例66
【化１２３】
2008528549.tif 000116
例67〜77
上述と同様に、かつ上述のビルディングブロックをヒトインスリンと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
【化１２４】
2008528549.tif 000117
【化１２５】
2008528549.tif 000118
【化１２６】
2008528549.tif 000119
【化１２７】
2008528549.tif 000120
例78〜87
上述と同様に、上述のビルディングブロックをdesB30インスリンアスパルトと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
【化１２８】
2008528549.tif 000121
【化１２９】
2008528549.tif 000122
【化１３０】
2008528549.tif 000123
【化１３１】
2008528549.tif 000124
例88〜98
上述と同様に、かつ上述のビルディングブロックをインスリンアスパルトと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
【化１３２】
2008528549.tif 000125
【化１３３】
2008528549.tif 000126
【化１３４】
2008528549.tif 000127
【化１３５】
2008528549.tif 000128
例99〜109
上述と同様に、かつ上述のビルディングブロックをインスリンリスプロと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
【化１３６】
2008528549.tif 000129
【化１３７】
2008528549.tif 000130
【化１３８】
2008528549.tif 000131
【化１３９】
2008528549.tif 000132
例110〜120
上述と同様に、かつ上述のビルディングブロックをインスリングラルギンと共に用いて、以下の化合物が調製され得る：
【化１４０】
2008528549.tif 000133
【化１４１】
2008528549.tif 000134
【化１４２】
2008528549.tif 000135
【化１４３】
2008528549.tif 000136
例121〜123
上述と同様に、かつ下記のように改変し、以下のオキシムが連結したdesB30 ヒトインスリン化合物が調製され得る：
インスリンは、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての活性化を使用することにより、4-(または3-、または2-)ホルミル安息香酸でアシル化してよい。次いで、得られたアルデヒド官能基を有するアルデヒドインスリンは、本発明のモノマー、オリゴマーもしくはポリマーのビルディングブロックと共に、任意に有機共溶媒を含んだ水性媒質中において中性、酸性またははアルカリ性のpHで混合することにより、両者を縮合させることができる。
【化１４４】
2008528549.tif 000137
式中、NH2-O-R は、例えば例44の化合物のような本発明のモノマー、オリゴマーもしくはポリマーのビルディングブロックを表す。他のそのようなビルディングブロックは、カルボン酸ハンドルを有するビルディングブロックを4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン(例19)とカップリングさせ、続いてヒドロキシルアミン部分をTFA-媒介性の脱保護を行うことにより調製され得る。
【０３８１】
例121
【化１４５】
2008528549.tif 000138
例122
【化１４６】
2008528549.tif 000139
例123
【化１４７】
2008528549.tif 000140
例124〜127
上述と同様に、下記のように改変し、以下のグリオキシルオキシムが連結されたdesB30 ヒトインスリン化合物が調製された：
インスリンを、Boc-Ser(tBu)-OH のO-スクシンイミジルエステルを用いてアシル化した。BocおよびtBu 基を、TFAを用いた処理により除去し、得られたデマスキングされた1,2-ヒドロキシルアミンを、過ヨウ化ナトリウムを用いた処理により酸化させて、対応するグリオキシルインスリン(例124)を得た：
【化１４８】
2008528549.tif 000141
例124
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリン
Boc-L-Ser(tBu)-OSu
THF(15mL)中のBoc-L-Ser(tBu)(1.0g，3.8mmol)を、スクシンイミジルテトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(1.4g，4.6mmol)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.79mL、4.6mmol)を用いて処理し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、溶媒を真空下で蒸発させた。粗成物を酢酸エチル中に溶解させ、0.1M HClおよび水で２回洗浄した。溶液をMgSO4上で乾燥させ、濾過し、真空下で蒸発させて1.06g(77％)を得た。
【０３８２】
1H-NMR(CDCl3)δ：5.41(d、NH、1H)、4.78(d、αH、1H)、3.92(dd、βH、1H)、3.66(dd、βH、1H)、2.82(s、スクシニル、4H)、1.46(s、tert-ブチル、9H)、1.20(s、tert-ブチル、9H)。
【０３８３】
B29K(N(eps)-N-tert-ブチルオキシカルボニル-O-tert-ブチル-セリニル)desB30インスリン
DesB30インスリン(2.0g，0.35mmol)を10％炭酸ナトリウム(26mL)中に溶解させ、アセトニトリル(26mL)中のBoc-L-Ser(tBu)-OSu(125mg，0.35mmol)を用いて処理した。混合物を室温で30分撹拌し、0.2M メチルアミンを添加した(2.6mL)。水を添加し(26mL)、1M HClを添加することにより混合物のpHを5.5に調整した。沈殿物を遠心分離により分離し、真空下で乾燥させて1.66g(80％)を得た。インスリンを、C4-カラム（緩衝液A：20％EtOH＋0.1％TFA、緩衝液B：80％EtOH＋0.1％TFA；勾配 15-60％B）上のRP-HPLCにより精製し、ついで、C4-カラム（緩衝液A：20％EtOH中の10mM Tris＋15mM 硫酸アンモニウム、pH 7.3、緩衝液B：80％EtOH、勾配 15〜60％B）上のHPLCにより精製した。回収した画分をSep-Pak上で、70％アセトニトリル＋0.1％TFAを用いて脱塩し、アンモニアの添加により中性にし、凍結乾燥させた。
【０３８４】
LCMS 5846.7；C260H389N65O77S6(M−Boc)の要求値5849.8。
【０３８５】
LCMS 5792.5；C256H381N65O77S6(M−Boc−tert-ブチル)の要求値5793.7。
【０３８６】
B29K(N(eps)-セリニル)desB30インスリン
B29K(N(eps)-N-tert-ブチルオキシカルボニル-O-tert-ブチル-セリニル)desB30インスリン(50mg，8.4μmol)を95％TFA(2mL)で処理した。溶液を室温で15分放置し、溶媒を真空下で除去した。
【０３８７】
LCMS 5793.3；C256H381N65O77S6の要求値5793.6。
【０３８８】
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリン
B29K(N(eps)-セリニル)desB30インスリン(20mg，3.5μmol)を水（pH 7.5(0.5mL)）中に溶解させた。過ヨウ化ナトリウム(4mg，17μmol)を添加し、該混合物を15分撹拌した。水(1mL)を添加し、1M HClを添加することにより混合物のpHを5.5に調整した。沈殿物を遠心分離により分離し、真空下で乾燥させた。
【０３８９】
LCMS 5742.3；C255H375N64O76S6(M-H2O)の要求値5745.6。
【０３９０】
該アルデヒド官能基は、本発明のオリゴマーもしくはポリマービルディングブロックと共に、中性、酸性またはアルカリ性pHで、任意に有機性共溶媒を含んだ水性媒質中で混合させることにより、下記のようにオキシム化することができる：
【化１４９】
2008528549.tif 000142
式中、 NH2-O-R は、例えば例44の化合物である本発明のモノ-、オリゴ-または重合体ビルディングブロックを表す。他のこのようなビルディングブロックは、カルボン酸 ハンドルを含んだビルディングブロックを4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン(例19)とカップリングさせ、続いてヒドロキシルアミン部分をTFA-mediated 脱保護に供することにより調製され得る。
【０３９１】
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリンを用いたオキシム連結の一般的手順
B29N(eps)-グリオキシルdesB30インスリンを水/DMF、1:1中に溶解させ、pHを4.5に調整する。オキシアミンビルディングブロック(５等量)をアセトニトリル中に溶解させ、前記インスリン溶液に添加する。反応物を室温で一晩放置し、インスリン誘導体を等電沈殿により分離し、RP-HPLCにより上述のように精製する。
【０３９２】
例125
B29K(N(eps)-{4-(2-[1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]ブチル-1-オキシアミン、グリオキシルオキシム)desB30インスリン
【化１５０】
2008528549.tif 000143
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリンを水／DMF  1:1中に溶解させ、pHを4.5に調整する。4-(2-[1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ]アセチルアミノ)ブチル-1-オキシアミン(５等量)をアセトニトリル中に溶解させ、前記インスリン溶液に添加する。反応物を室温で一晩放置し、インスリン誘導体を等電沈殿により分離し、RP-HPLCにより上述のように精製する。
【０３９３】
例126
B29K(N(eps)-{4-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)}ブチル-1-オキシアミン、グリオキシルオキシム)desB30インスリン
【化１５１】
2008528549.tif 000144
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリンを水／DMF  1:1中に溶解させ、pHを4.5に調整する。4-(1,3-ビス(2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)ブチル-1-オキシアミン(５等量)をアセトニトリル中に溶解させ、前記インスリン溶液に添加する。反応物を室温で一晩放置し、インスリン誘導体を等電沈殿により分離し、RP-HPLCにより上述のように精製する。
【０３９４】
例127
B29K(N(eps)-[4-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]-アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]ブチル-1-オキシアミン、グリオキシルオキシム)desB30インスリン
【化１５２】
2008528549.tif 000145
B29K(N(eps)-グリオキシル)desB30インスリンを水／DMF  1:1中に溶解させ、pHを4.5に調整する。4-{1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス{2-(2-[2-(1,3-ビス[2-(2-{2-[2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ]アセタミノ}エトキシ)エトキシ]プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ]エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ}プロパン-2-イルオキシ)アセチルアミノ}ブチル-1-オキシアミン(５等量)をアセトニトリル中に溶解させ、前記インスリン溶液に添加する。反応物を室温で一晩放置し、インスリン誘導体を等電沈殿により分離し、RP-HPLCにより上述のように精製する。
【０３９５】
例128
ヒトインスリン5 nmol/kg(破線)および例46の化合物10nmol/kg(直線)をラット肺に適用したときの、グルコースプロファイルを図１に示す。この図が示すように、本発明の化合物は、肺に投与された際に、ヒトインスリンよりも長期に亘る作用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０３９６】
【図１】図１は、ヒトインスリン5 nmol/kg(破線)および例46の化合物10nmol/kg(直線)をラット肺に適用したときの、グルコースプロファイルを示すグラフである。
【図１】
2008528549.tif 000156
【国際調査報告】
2008528549.tif 000157
2008528549.tif 000158
2008528549.tif 000159
2008528549.tif 000160
2008528549.tif 000161
2008528549.tif 000162
2008528549.tif 000163
2008528549.tif 000164