(57)【要約】  ヒトにおける胃腸感染症の予防又は治療方法であって、泌尿生殖器及び／又は胃腸の病原菌を殺菌する能力、及び胃腸管上皮細胞内への泌尿生殖器及び／又は胃腸管暴言体の内在化を阻害する能力について選択された、Ｌ.アシドフィラス(L. acidophilus)、Ｌ.クリスパタス(L. crispatus)、Ｌ.ガセリ(L. gasseri)、Ｌ.ヘルベチカス(L. helveticus)、及びＬ.ジェンセニー(L. jensenii)のうちの少なくとも１の治療有効量を、適切な製剤上の担体と組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおいて胃腸感染症を予防又は治療する方法であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(L. crispatus KS 116.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(L. crispatus KS 119.4)(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、 Ｌ.クリスパタス １２７.１(L. crispatus 127.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリ ＫＳ１１４.１(L. gasseri KS 114.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８２)、Ｌ.ガセリ ＫＳ１２０.１(L. gasseri KS 120.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３２１８)、Ｌ.ガセリ ＫＳ１２３.１(L. gasseri KS 123.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８５)、Ｌ.ガセリ ＫＳ１２４.３(L.gasseri KS 124.3)(ＣＮＣＭ Ｉ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカス ＫＳ３００(L. helveticus KS 300)(ＣＮＣＭ Ｉ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニー ＫＳ１１９.１(L. jensenii KS 119.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニー ＫＳ１２１.１(L. jensenii KS 121.1)(ＣＮＣＭ Ｉ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の株の治療有効量を適切な製剤上の担体と組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
ヒトの胃腸管内で病原菌の付着、コロニー形成、及び／又は増殖を妨げるか又は阻害する方法であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の治療有効量を適切な製剤上の担体と組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３】
特に炎症性症候群及び感染性症候群を阻害するために、膣及び／又は胃腸管レベルで免役の細胞性又は液性免役応答を調節する方法であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の治療有効量を適切な製剤上の担体と組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記適切な製剤上の担体が、経口投与用に設計される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヒトにおいて胃腸感染症を予防又は治療するために有用な医薬組成物であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の治療有効量を含む、前記組成物。
【請求項６】
ヒトの胃腸管内で病原菌の付着、コロニー形成、及び／又は増殖を妨げるか又は阻害するために有用な医薬組成物であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の治療有効量を含む、前記方法。
【請求項７】
特に、炎症性症候群並びに感染性症候群を阻害するために胃腸管レベルで細胞性又は液性免役の調節に有用な医薬組成物であって、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の治療有効量を含む、前記医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物がＬＡＢ増殖因子をさらに含み、そして経口投与用に設計される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載される医薬組成物の製造のための、以下の：
Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ１１９.４(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８４)、Ｌ.クリスパタス１２７.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８６)、Ｌ.ガセリＫＳ１１４.１(ＣＮＣＭＩ-３４８２)、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(ＣＮＣＭＩ-３２１８)、Ｌ.ガセリＫＳ１２３.１(ＣＮＣＭＩ-３４８５)、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３(ＣＮＣＭＩ-３２２０)、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００(ＣＮＣＭＩ-３３６０)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１(ＣＮＣＭＩ-３２１７)、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１２１.１(ＣＮＣＭＩ-３２１９)
からなる群から選ばれる少なくとも１の乳酸菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける様々な病原菌により引き起こされる感染性の問題を治療することに関し、より特異的にヒトの胃腸病原菌の予防及び/又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかの実験及び臨床研究により、特定の胃腸感染症の予防又は治療において特定の乳酸菌の能力が評価され、そして関連する治療がすでに数十年にわたり適用されている。
【０００３】
胃腸感染症は、人間集団における一般的な問題のまま残っている。胃腸管上皮に付着する細菌は、胃腸感染症(ＧＩＩ)の開始及び病原進行の重要なメカニズムとして認識されてきた。腸管においてコロニー形成する多くの胃腸病原菌は、宿主因子及び細菌毒性因子に依存して、通常有効な宿主防御メカニズムに抵抗することを可能にする病原特性を発現する。
【０００４】
病原菌が胃腸管にコロニー形成することを妨げるために元々存在するマイクロフローラ由来の細菌、例えば乳酸菌を使用することは、かなり大規模に研究されてきた概念である(例えば、Alain Servinの“Antagonist activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens”  FENS Microbiologyの総説(2004年)近刊、http ://www.sciencedirect.com/scienceにおいてオンラインで利用可、を参照のこと)。上記文献において言及された幾つかの乳酸菌株は、胃腸管におけるその効果について強調されており、そして病原菌により引き起こされる様々な問題又は疾病、例えば下痢を治療するのに適した有力な活性物質として示唆された。
【０００５】
この関係で使用される場合、乳酸菌は、種々のメカニズム、例えば、病原菌成長阻害、病原菌付着の妨害、乳酸産生並びにバクテリオシン及びＨ2Ｏ2などのアンタゴニスト作用性の物質の産生、当該バクテリオシン様物質を介した殺菌効果、免役調節、抗炎症性、及び他のメカニズムなどによる局所マイクロフローラの調節に寄与すると信じられている。
【０００６】
細菌製剤を用いた治療の主要な目的は、通常の腸管マイクロフローラが再び確立できるときまで病原菌の異常増殖を妨げることであろう。さらに、細菌治療は、「自然」のものと考えられており、そして慣用される化学治療又は薬品治療に比べて副作用を伴わないと考えられている。
【０００７】
この関係において、泌尿生殖器感染症の治療において有効性を示した健康なヒトの膣フローラを代表する乳酸菌株(例えば、Medinova AG, CH - Zurichにより２００４年１０月２２日に出願された国際特許出願第PCT/EP2004/011980号を参照のこと)が、胃腸病原菌により開始される胃腸の感染症又は疾病の予防又は治療処置において利用できるものであり、そして結果として当該処置に有用であることが驚くべきことに観察された。
【０００８】
さらに、プロバイオティック乳酸菌(ＬＡＢ)株、その性質及び医薬品の分野におけるその利用可能性についての知識について既になされた成果にも関わらず、より便利でかつより有効なＬＡＢ株を医学界に提示する必要性が未だに残っている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、様々な病原菌により引き起こされる感染の治療において、より具体的に、ヒトにおける胃腸感染症の治療において、又は例えば抗生物質を用いて行われた強い薬物療法後のバランスのとれた健常な胃腸管フローラへの修復において、特に効果的で有用なＬＡＢ株及び組成物を提供することである。本発明は、特異的に選択されたＬＡＢ株を含むこのような感染の新たな予防又は治療処置方法を提供する。
【００１０】
本発明
第一目的として、本発明は、ヒトにおける胃腸感染症の予防又は治療法であって、泌尿生殖器及び/又は胃腸病原菌を殺菌する能力、及び胃腸管上皮細胞内において泌尿生殖器及び/又は胃腸病原菌の内在化を阻害する能力について選択されたＬ.アシドフィラス(L. acidophilus)、Ｌ.クリスパタス(L. crispatus)、Ｌ.ガセリ(L. gasseri)、Ｌ.ヘルベチカス(L. helveticus)、及びＬ.ジェンセニー(L. jensenii)属のうちの少なくとも１つの治療有効量を、医薬として許容されるか又は食品品質である担体と組み合わせて含む、前記予防又は治療方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、ヒトの胃腸管における病原菌の付着、コロニー形成及び/又は成長を妨げるか又は阻害する方法であって、少なくとも１の前記ＬＡＢ株の治療有効量を、医薬として許容されるか又は食品品質の担体と組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む、前記方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、ヒトの胃腸管における健常なフローラを確立、維持、又は修復する方法であって、少なくとも１の前記ＬＡＢ株の治療有効量を医薬として許容されるか又は食品品質のキャリアと組み合わせて含む医薬製剤を投与することを含む、前記方法に関する。
【００１３】
本発明は、組成物、特に上記の範囲において有用である医薬組成物であって、泌尿生殖器及び/又は胃腸病原菌を殺菌する能力、及び胃腸管上皮細胞内への泌尿生殖器及び/又は胃腸病原菌の内在化を阻害する能力について選択されたＬ.アシドフィラス、Ｌ.クリスパタス、Ｌ.ガセリ、Ｌ.ヘルベチカス、及びＬ.ジェンセニー属のうちの少なくとも１のＬＡＢ株の治療有効量を、医薬として許容される担体と組み合わせて含む、上記組成物を提供する。 
【００１４】
結局のところ、本発明は、組成物、より好ましくは上記医薬組成物の製造において当該ＬＡＢ株のうちの一つを使用することに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＬＡＢ株は、モデルとして選択された頸部ＨｅＬａ又はＣａｃｏ-２などの上皮細胞に付着する能力について第一に選択された。細胞付着性は、必須の選別特徴である。なぜなら、細胞付着性は、当該ＬＡＢ株が上皮組織、例えば泌尿生殖管の上皮細胞にコロニー形成し、そうして特定の領域への病原菌の付着に競合、阻害又は排除する能力を条件付けするからである。
【００１６】
当該ＬＡＢ株は、病原菌、つまり泌尿生殖器及び胃腸病原菌の付着、増殖、及びさらに生存を阻害する更なる能力についてさらに選択された。本明細書の以下の部分に記載されるグラム陰性又はグラム陽性病原菌：サルモネラ属(Salmonella species)、例えばＳ.エンテリカ血清型チフィムリウム(S. enterica serovar Typhimurium)、大腸菌(E. coli)、及びスタフィロコッカス属(Staphylococcus species)、例えばＳ.アウレウス(S. aureus)は、付着、増殖、又は病原性活性の点で本発明のＬＡＢ株により有意に影響を受ける病原菌を代表する。上記病原菌の列挙は包括的なものではない。
【００１７】
本発明のＬＡＢ株は、病原菌、つまり泌尿生殖器又は胃腸管グラム陰性又はグラム陽性病原菌の上皮細胞への内在化を阻害する能力を有する。
【００１８】
本発明のＬＡＢ株は、さらに重要な特徴、つまり、胃腸管粘膜細胞の免役応答を調節する能力、言い換えると、上で言及される病原菌などのグラム陰性病原菌、特に泌尿生殖器病原性大腸菌により感染された際に当該細胞の免役応答を開始するか、刺激するか又は高める能力を示す。その特徴のため、当該ＬＡＢ株は、病原菌汚染に晒される場合に胃腸管粘膜細胞の炎症反応症候群を阻害する能力を結果として有する。
【００１９】
具体的な態様が、２個の異なる経路を用いて、つまり、炎症促進性又は抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ-１０、それぞれ、ＩＬ-１２、ＴＮＦ、又はＩＦＮの誘導を介して、上で記載される免役応答の調節を行うということが、特に興味深いことである。本発明の幾つかのＬＡＢ株、つまり、Ｌ.アシドフィラス ＫＳ １１６.１ (L. acidophilus KS 116.1)及びＬ.ガセリＫＳ１２４.３(L. gasseri KS 124.3)が、高いＩＦＮγ誘導能力を示すということがさらに観察された。当該ＩＦＮγ誘導能力は、これらのＬＡＢ株を抗-病原菌薬として使用することを支持する。
【００２０】
この株の特異性は、当業者に、求められる治療法を実行するために最も適した株又は株の組合せを選択する能力を提供する。
【００２１】
これらの性質を示すＬＡＢ株の中で、本発明に記載される好ましい株が以下に列挙される：Ｌ.ジェンセニーKS 109(L. jensenii KS 109)、Ｌ.ガセリ KS 114.1(L. gasseri KS 114.1)、Ｌ.クリスパタスKS 116.1 (L. crispatus KS 116.1)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ １１９.１(L. jensenii KS 119.1)、Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１９.４(L. crispatus KS 119.4)、Ｌ.ガセリ ＫＳ １２０.１(L. gasseri KS 120.1)、Ｌ.ジェンセニー ＫＳ １２１.１(L. jensenii KS 121.1)、Ｌ.ジェンセニーKS 122.1(L. jensenii KS 122.1)、Ｌ.ガセリKS 123.1(L. gasseri KS 123.1)、Ｌ.ガセリ124.3(L. gasseri 124.3)、Ｌ.ガセリKS 126.2(L. gasseri KS 126.2)、Ｌ.クリスパタス127.1 (L. crispatus 127.1)、Ｌ.ジェンセニーKS 129.1(L. jensenii KS 129.1)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ １３０.１(L. jensenii KS 130.1)、Ｌ.ヘルベチカスKS 300、及びＬ.アシドフィラスKS 400 (L. acidophilus KS 400)。これらの株の多くは、健常なヒト膣フローラを代表する。
【００２２】
特に好ましい種として、以下の株がさらに挙げられる：
Ｌ.ガセリ KS 114.1(CNCM Ｉ-3482)：グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性 - 乳酸生産量 １０.５ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産量１０ｍｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、及びＧＥＮに陽性である。
以下の：ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧに対して陰性である。
【００２３】
Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１６.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３４８３):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陽性 - 乳酸生産量  ９.６ｇ／ｌ  -  Ｈ2Ｏ2生産量  ２ｍｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＭＡＬ、及びＳＡＣに対して陽性である。
以下の：ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧに対して陰性である。
【００２４】
Ｌ.ジェンセニー ＫＳ １１９.１(ＣＮＣＭ Ｉ-３２１７):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性 -  乳酸生産量  ７.４ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産量  ２０ｍｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＭＥＬ、ＳＡＣ、ＧＥＮ、及びＴＡＧに対して陽性である。ＲＩＢについて擬陽性である。
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＲＢ、ＬＡＣ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧについて陰性である。
【００２５】
Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１９.４(ＣＮＣＭ１-３４８４):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陽性 - 乳酸生産量 １０.３ ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産なし
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、及びＡＭＤについて陽性である。以下の：ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧについて陰性である。
【００２６】
Ｌ.ガセリ ＫＳ １２０.１(ＣＮＣＭ１-３２１８):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性- 乳酸生産量 １０.６ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産量１mｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、及びＡＭＤについて陽性である。以下の：ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＮＡＧ、ＡＲＢ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧについて陰性である。
【００２７】
Ｌ.ジェンセニー ＫＳ １２１.１(ＣＮＣＭ１-３２１９):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性- 乳酸生産量１０.６ｇ／ｌ -Ｈ2Ｏ2生産量 １mｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、及びＡＭＤについて陽性である。ＲＩＢ、ＮＡＧ、ＬＡＣ、ＲＡＦ、及びＬＦＵＣについて擬陽性である。ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、及び５ＫＧについて陰性である。
【００２８】
Ｌ.ガセリ ＫＳ １２３.１(ＣＮＣＭ１-３４８５):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性- 乳酸生産量 ８.５ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産量１０mｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験:ＧＬＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＭＡＬ、及びＳＡＣについて陽性である。ＲＩＢ及び５ＫＧについて擬陽性である。ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＦＲＵ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、及び２ＫＧについて陰性である。
【００２９】
Ｌ.ガセリ ＫＳ １２４.３(ＣＮＣＭ１-３２２０):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陰性- 乳酸生産量１７.０ｇ／ｌ - Ｈ2Ｏ2生産量２０ｍｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、及びＴＲＥについて陽性である。ＲＩＢ、ＡＭＤ、ＧＥＮ、及び５ＫＧについて擬陽性である。ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、及び２ＫＧについて陰性である。
【００３０】
Ｌ.クリスパタス ＫＳ １２７.１(L. crispatus KS 127.1)(ＣＮＣＭ１-３４８６):グラム陽性 - カタラーゼ陰性 - オキシダーゼ陽性 - 乳酸生産量１６.７ｇ／ｌ-Ｈ2Ｏ2生産なし
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験：ＲＩＢ、ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＮＡＧ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ  ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、ＭＬＺ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＧＥＮ、ＴＡＧ、及びＧＮＴについて陽性である。ＧＬＹ及びＤＸＹＬについて擬陽性である。ＫＯＮ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＲＢ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、２ＫＧ及び５ＫＧについて陰性である。
【００３１】
Ｌ.ヘルベチカス ＫＳ ３００(ＣＮＣＭ１-３３６０):グラム陽性 - 乳酸生産量 10.45 g/kg - Ｈ2Ｏ2生産量 1 mｇ／ｌ
ＡＰＩ５０ＣＨＩ試験 ：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＡＲＢ５  ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、及びＡＭＤについて陽性である。ＲＩＢ、ＭＡＮ、ＧＬＹ、ＳＯＲ、ＫＯＮ、ＥＲＹ、ＭＬＺ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＲＡＦ、ＴＡＧ、ＧＮＴ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、２ＫＧ、及び５ＫＧについて陰性である。
【００３２】
これらの株を、ブタペスト条約に従ってパスツール研究所(Pasteur Institute、Paris (France)）に規定どおりに寄託した。
【００３３】
本発明に従って、その特異的な抗病原菌活性のため、当該ＬＡＢ株は、ヒトにおいて胃腸感染症を予防又は治療するために、及びヒトの胃腸管において病原菌のコロニー形成及び／又は増殖を予防又は阻害するために、つまり、当該ＬＡＢ株が特に効果的であることが証明される脈絡で有利に使用することができる。
【００３４】
また、当該ＬＡＢ株は、ヒトにおいて健常な胃腸管フローラを維持又は修復するために、より具体的に、抗生物質を用いて行われる治療などの強力な薬品治療の後にバランスがとれた健常な胃腸管フローラを修復するために、かなり効果的な方法で使用することができる。
【００３５】
対応する治療又は予防処置は、本発明のＬＡＢ株の治療有効量を、医薬として許容されるか又は食品品質である賦形剤、サポート、又は担体であって、そのために設計されたものと組み合わせて投与することにより行われる。
【００３６】
上記治療を実行するために適した組成物は、通常のＬＡＢ増殖因子をさらに含みうる。当該組成物は、好ましくは、摂取可能なカプセル又はジェル(gelules)であって、凍結乾燥された微生物及び必要ならばＬＡＢ増殖因子を含む形態であり、又は経口摂取可能な濁液又は乳濁液の形態である。
【００３７】
上で記載される組成物は、本発明のＬＡＢ株の混合物、並びに従来技術に知られていた１又は幾つかの株と組み合わせた少なくとも１の本発明の株との混合物を含むことができる。また、これらの組成物は、特異的に選択された化学成分などの医薬として活性な追加の成分を含んでもよい。
【００３８】
上記組成物は、約１０6ｃｆｕ(コロニー形成ユニット)〜約１０11ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０8〜約１０11ｃｆｕ／ｇの範囲である量、又は用量、又はユニットで選択された微生物を、その生存率及び特異性を損なわないで維持する無水形態、例えば凍結乾燥形態で含んでもよい。当該組成物並びにその用量の最終的な詳細は、それらが意図される具体的な適用、患者の年齢又は健康状態、病原菌汚染の性質に最終的に依存するであろう。全ての関連するパラメーターを調節することは、医学界における現在の技術及び知識の範囲内である。
【００３９】
従来から知られている基準株(以下の実施例を参照のこと)と比較する場合、本発明のＬＡＢ株は、比較のために選ばれた実験モデルに左右されて、同等又はそれより高い抗病原菌活性のいずれかを示した。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の実施態様の幾つかしか例示せず、そしてその制限を構成するものとして意図されるものではない。
【実施例】
【００４１】
【表１】
2008517015.tif 000002
対照となる付着性乳酸菌は、Ｌ.カゼイ ラムノサスＧＧ株(L. casei rhamnosus strain GG)(ＡＴＣＣ受託番号53103)、Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株(L. rhamnosus strain GR-１)(ＡＴＣＣ受託番号55826)、及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株(L. fermentum strain RC- 14)(ＡＴＣＣ受託番号55845)である。
【００４２】
全ての乳酸菌を、De Man, Rogosa, Sharpe (ＭＲＳ)培地(Biokar Diagnostic, Beauvais, France)にて３７℃で１８時間増殖させた。
【００４３】
細菌病原菌：サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウムＳＬ１３４４株をB.A.D. Stocker (Stanford, California)から頂いた。細菌をＬｕｒｉａ培地（Difco Laboratoies）中において３７℃で一晩１８時間増殖させた。
【００４４】
尿路疾患性びまん性付着性大腸菌ＩＨ１１２８及び７３７２株、並びに下痢性株C1845を、B.Nowichki(テキサス大学、Galvestone)及びS. Moseley(シアトル大学)から頂いた。７３７２株は、クラスＩＩ ｐａｐＧ アレル、ｈｌｙ遺伝子(溶血素)及びＤｒオペロンを有する。ＩＨ１１１２８株は、Ｄｒオペロンを有する。Ｃ１８４５株はＤａａオペロンを有する。全ての細菌株をＬＢプレート上で維持し、そして感染前に、細菌をＬＢ培地中で３７℃で１８時間増殖させた。
【００４５】
スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)株を、パスツール菌株保存機関(Pasteur culture collection)(Paris)から取得した。細菌をＴＳＡ培地(Difco Laboratories)中にて３７℃で一晩増殖させた。
【００４６】
細菌を、緩衝化塩化ナトリウム-ペプトン溶液(ｐＨ７.０)に、約１０6コロニー形成ユニット(ＣＦＵ/ｍｌ)で懸濁した。５００μｌ又は調製された懸濁液をアガー・プレート上に撒いた。植菌されたプレートを滅菌送風条件下で乾燥させた。次に、アガープレートを、密封嫌気容器(Becton Dickinson, USA)を用いて嫌気条件下で最大３６時間３７℃でインキュベーションした。使用前に、ガルドネラ バジナリス株(Gardnerella vaginalis strain)を、密封嫌気容器を用いて最大３６時間３７℃で用いて嫌気条件下で、酵母抽出物、マルトース、及びウマ血清を添加したＢＨＩ中で継代培養した。
【００４７】
使用前に、細菌培養物を５５００×ｇで５分間４℃で遠心した。培養培地を捨て、そして細菌をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で１回洗浄し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。
【００４８】
細胞系列及び培養：以前に記載されたように(１４)、ヒト頸部ＨｅＬａ細胞を、１０％熱不活性化(３０分、５６℃)胎児ウシ血清(ＦＣＳ；Boehringer、 Mannheim, Germany)を添加したＬ-グルタミン(Life Technologies)入りＲＰＭＩ１６４０中で、５％ＣＯ2-９５％空気雰囲気下で３７℃で培養した。コンフルエントになる前に、つまり培養５日後に細胞を感染アッセイに用いた。
【００４９】
用いられたヒト腸細胞系列は、ＴＣ７クローン(Ｃａｃｏ-２/ＴＣ７)であり、Ｃａｃｏ-２親細胞系列から樹立した。以前に記載されたように、１５％熱不活性化(３０分、５６℃)ウシ胎児血清(Invitrogen)及び１％非必須アミノ酸(Invitrogen)を添加したダルベッコ改変イーグル最小必須培地(ＤＭＥＭ)(２５ｍＭグルコース)(Invitrogen, Cergy, France)中で細胞を通常どおりに成長させた。維持のため、３ｍＭ・ＥＤＴＡを含むＰＢＳであって、Ｃａ2+Ｍｇ2+を含まないＰＢＳ中に溶解した０.０２％トリプシンを用いて毎週継代した。実験及び細胞の維持を、１０％ＣＯ2/９０％の空気雰囲気下で３７℃で行った。培養培地を毎日交換した。培養１５日後にコンフルエントになった後に(完全に分化した細胞)、Ｓ.エンテリカ血清型チフィムリウムの感染アッセイに細胞を用いた。
【００５０】
付着アッセイ：頸部ＨｅＬａ細胞及び腸管Ｃａｃｏ-２/ＴＣ７細胞上のラクトバチルス株の付着性を、以下のステップに従って試験した：細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄した。各付着アッセイについて、０.５ｍｌのラクトバチルス懸濁液(培養液の使用済み上清を伴う細菌)を、ＤＭＥＭ(０.５ｍｌ)と混合し、次に組織培養プレート(２４ウェル)の各ウェルに加え、次に当該プレートを１０％ＣＯ2/９０％空気中で３７℃でインキュベーションした。被験細胞の最終濃度は、１ｍｌあたり１×１０8、２×１０8、１×１０9、及び２×１０9の細菌である。１時間のインキュベーションの後に、単層を滅菌ＰＢＳで５回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色で染色し、そして油浸を用いて顕微鏡で調べた。３回の継代をした細胞を用いて、各付着アッセイを２回行った。各アッセイについて、付着した細菌の数を、２０回のランダムの顕微視野で測定した(付着スコアは０〜５である)。さらに、付着した生乳酸菌を、感染細胞単層に付随する細菌の定量的測定により測定した。感染後、細胞を滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、そして滅菌Ｈ2Ｏで溶解させた。適切な希釈液をトリプティック・ソイ・アガー(ＴＳＡ)上に撒いて、細菌コロニー計数により生きた細胞付着性細胞の数を測定した。
各細胞付着アッセイを、３回の連続細胞継代を用いて少なくとも３回行った。結果を細胞に付着した細菌のＣＦＵ／ｍｌとして表した。
【００５１】
病原菌増殖に対する活性：ＭＲＳ(５ｍｌ)を含む培養培地及び特定病原菌の培養培地(５ｍｌ)を含む培養培地に、０.１ｍｌの培養病原菌及び０.１ｍｌの培養乳酸菌株を植菌した。対照は、０.１ｍｌの培養病原菌及びｐＨ４.５に調節された０.１ｍｌの非培養性ＭＲＳを植菌された培養培地であった。指定された時間点で、一定量を採取し、連続希釈し、そしてトリプティック・ソイ・アガー上に撒いて、病原菌の細菌コロニー計数を測定した。各アッセイを少なくとも３回行った。結果をＣＦＵ/ｍｌとして表した。
【００５２】
病原菌の生存性に対する活性：１０8ＣＦＵ/ｍｌ病原菌を乳酸菌培地(１０8ＣＦＵ/ｍｌ、０.５ｍｌ)と３７℃でインキュベーションすることにより、コロニー計数アッセイを行った。対照は、ｐＨ４.５に調節された非培養性ＭＲＳであった。最初に、そして予め決められた間隔で、一定量を採取し、連続希釈し、そしてトリプティック・ソイ・アガー上に撒いて、病原菌の細菌コロニー計数を測定した。各アッセイを少なくとも３回行った。結果をＣＦＵ/ｍｌとして表した。
【００５３】
上皮ＨｅＬａ細胞上への尿路疾患性大腸菌の付着の阻害：細胞単層感染について、上で記載されるように適切な培養培地中で３７℃で１８時間培養した。感染前に、２４ウェルＴＰＰ組織培養プレート(ＡＴＧＣ、Paris, France)に調製された細胞単層をＰＢＳで２回洗浄した。感染性の細菌を培養培地中に懸濁し、そして全体で０.５ｍｌＤＭＥＭ+０.２５ｍｌ培養病原菌(１×１０8ＣＦＵ/ｍｌ)+０.２５ｍｌ乳酸菌培養物(１.５×１０9ＣＦＵ/ｍｌ)を、組織培養プレートの各ウェルに加えた。当該プレートを３７℃で１０％ＣＯ2/９０％空気中で、指定された感染の様々な時間の間インキュベーションし、次に滅菌ＰＢＳで３回洗浄し、そして滅菌Ｈ2Ｏで溶解した。適切な希釈液をトリプティック・ソイ・アガー上に撒いて、細胞に付着した生細菌数を、細菌コロニー計数により測定した。各アッセイを、３回継代させたＨｅＬａ細胞を用いて３回行った。
【００５４】
分析：結果を、平均±(平均に対する)標準誤差として表す。統計比較について、スチューデントのＴ検定を行った。
【００５５】
結果
実施例１
１.  ＨｅＬａ及びＣａｃｏ-２/ＴＣ７細胞上へのＬ.ジェンセニーＫＳ １１９.１及びＫＳ １３０.１、Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１６.１、及びＬ.ガセリＫＳ １２４.３の付着能力
当該細胞を４種の濃度の乳酸菌(５×１０7；５×１０8；１×１０9ＣＦＵ/ウェル)で植菌した後に、上記株の付着レベルを測定した。一般的に、濃度依存性の付着性が観察された。
【００５６】
頸部ＨｅＬａ細胞において、観察された付着レベルにより、全ての被験株が付着性であることが示された。Ｌ.ジェンセニー ＫＳ １１９.１及びＫＳ １３０.１株、対照の付着性株であるＬ.カゼイ ラムノサスＧＧ(L. casei rhamnosus GG)及びＬ.ラムノサスＧＲ１(L. rhamnosus GR１)株と比べて、最良の付着性を有する株であるようだ(５×１０8ＣＦＵ/ウェルで７.５ｌｏｇＣＦＵ/ｍｌ)。
【００５７】
腸Ｃａｃｏ-２/ＴＣ７細胞では、観察された付着レベルにより、全てのＭｅｄｉｎｏｖａ株が付着することが示された。Ｌ.クリスパタスＫＳ １１６.１、Ｌ.ジェンセニー 119.1、129.1、及びＫＳ １３０.１株、Ｌガセリ１２４.３株は、対照の付着性株であるＬ.カゼイ ラムノサスＧＧ(L. casei rhamnosus GG)及びＬ.ラムノサスＧＲ１(L. rhamnosus GR１)株と比べて、最良の付着性を有する株であるようだ(５×１０8ＣＦＵ/ウェルで７.５〜８ｌｏｇＣＦＵ/ｍｌ)。
【００５８】
電子顕微鏡により観察されると、「本発明の乳酸菌菌株」の全てが、ＨｅＬａ及びＣａｃｏ-２/ＴＣ７細胞に密接に付着していることが分かった。
その付着性質に基づいて、Ｌ.クリスパタス KS 116.1及びＬ.ジェンセニー 119.1を尿路膣及び胃腸病原菌に対する抗細菌活性の以下の研究について選択した。
【００５９】
２.  泌尿生殖器及び胃腸の病原菌の増殖に対するＫＳ１１６.１及びＫＳ１１９.１の活性
上記の株がスタフィロコッカス・アウレウス、尿路疾患性及び下痢性大腸菌、及び下痢性サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム(Salmonella enterica serovar Typhimurium)の増殖に対して活性であるかを試験した。病原菌の生育を５、８、１８、及び２４時間で計測した。
【００６０】
スタフィロコッカス・アウレウスについて、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株(L. rhamnosus strain GR-１)及びＬ.ファーメンタムＲＣ１４株(L. fermentum strain RC- 14)は、細菌の生育を阻害した。同様に、Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１６.１及びＬ.ジェンセニー ＫＳ １１９.１は、スタフィロコッカス・アウレウスの増殖を阻害し、そして生菌数を低下させた。乳酸菌株の活性が比較される場合、Ｌ.ジェンセニーＫＳ １１９.１は、最も活性な株であるようだ。
【００６１】
尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１２８及び７３７２株について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ−１４は、細菌の生育を阻害した。同様に、Ｌ.クリスパタス ＫＳ １１６.１及びＬ.ジェンセニー及びＫＳ １１９.１は、大腸菌の生育を阻害した。乳酸菌の活性を比較をする場合、Ｌ.ジェンセニー１１９.１が最も活性な株であるようだ。
【００６２】
下痢性大腸菌Ｃ１８４５について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株は、細菌の生育を阻害した。同様に、Ｌ.クリスパタス KS 116.1及びＬ.ジェンセニーＫＳ １１９.１は、大腸菌の生育を阻害した。乳酸菌の菌株の活性を比較した場合、同程度の活性が被験乳酸菌株の全てについて見られた。
【００６３】
下痢性Ｓ.エンテリカ血清型チフィムリウムＳＬ１３４４株(S. enterica serovar TyphimuriumＳＬ１３４４株)について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株は、細菌の生育を阻害した。同様に、Ｌ.ジェンセニー１１９.１は、Ｓ.エンテリカ血清型チフィムリウムの生育を阻害した。 乳酸菌株の活性を比較した場合、同程度の活性が対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１１９.１株について見られた。対照的に、Ｌ.クリスパタスＫＳ１１６.１は低い活性を示した。
【００６４】
３.泌尿生殖器及び胃腸の病原菌に対するＫＳ１１６.１及びＫＳ１１９.１の殺菌活性
スタフィロコッカス・アウレウス、尿路疾患性及び下痢性大腸菌、及び下痢性サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウムの生存性について本乳酸菌が活性であるかを試験した。病原菌の生存性についての効果を、２、３、及び４時間で計測した。
【００６５】
スタフィロコッカス・アウレウスについて、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株、及びＬ.ジェンセニー(ＫＳ１１９.１)は、細菌の生存性を２ｌｏｇ低下させた(decreased for 2 logs)。対照的に、Ｌ.クリスパタスＫＳ１１６.１は活性を示さなかった。
【００６６】
尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８及び７３７２株について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株は、細菌の生存性を４ｌｏｇ低下させた。Ｌ.クリスパタスＫＳ１１６.１及びＬ.ジェンセニーＫＳ１１９.１は、活性ではなく、細菌の生存性について１ｌｏｇの低下しか示さなかった。
【００６７】
下痢性大腸菌Ｃ１８４５株について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株の両者、並びにＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１及びＬ.ジェンセニーＫＳ１１９.１が、Ｃ１８４５細菌の生存性について低い活性(２ｌｏｇの低下)しか示さなかった。
【００６８】
下痢性Ｓ.エンテリカ血清型チフィムリウムＳＬ１３４４株について、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株、及びＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１１９.１は、ＳＬ１３４４細菌の生存性を低下させること(５ｌｏｇの低下)によって高い活性を示した。
【００６９】
４.  ＫＳ１１６.１及びＫＳ１１９.１による尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８株のＨｅＬａ細胞への付着の阻害。
当該乳酸菌が尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８株のＨｅＬａ細胞への付着を阻害することができるかを試験した。対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株、及びＬ.ジェンセニー１１９.１及びＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１を、以下の３つの濃度：１ウェルあたり１×１０8、５×１０8、及び１×１０9の細菌で計測した。
【００７０】
ＩＨ１１１２８の付着性の３０〜４０％の阻害は、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株について１ウェルあたり１×１０8の細菌濃度で見られた。当該濃度において、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１及びＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１は不活性であった。ＩＨ１１１２８の付着阻害は、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１１９.１及びＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１について１ウェルあたり５×１０8の細菌濃度で有効であり、そして対照のＬ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株について同様の阻害が得られた。ＩＨ１１１２８の付着阻害の高いレベルが、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株、及びＬ.ジェンセニーＫＳ１１９.１、及びＬ.クリスパタスＫＳ１１６.１を１ウェルあたりで１×１０9の細菌濃度で用いて得られた。
【００７１】
実施例２
１.  泌尿生殖器及び胃腸病原菌の増殖に対するＬ.ガセリＫＳ１２４.３、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００、及びＬ.アシドフィラスＫＳ４００の活性
上で記載された株が、スタフィロコッカス・アウレウス、並びに尿路疾患性及び下痢性大腸菌ＩＨＩ１１２８株及び７３７２株の生育に対して活性であるかを試験した。病原菌の生育を、５、８、１８、及び２４時間で計測した。
【００７２】
スタフィロコッカス・アウレウスに関して、対照Ｌ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株は、細菌の生育を効果的に阻害した。同様に、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００、及びＬ.アシドフィラスＫＳ４００は、スタフィロコッカス・アウレウスの生育を阻害し、そして生菌数の減少を示した。乳酸菌株の活性が比較される場合、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００は、最も活性な株であるようである。
【００７３】
尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８株では、対照株であるＬ.ラムノサスＧＲ-１及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４は効果的に細菌の生育を阻害した。同様に、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００は、大腸菌の生育を効果的に阻害した。乳酸菌株の活性化が比較される場合、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３及びＬ.アシドフィラスＫＳ４００について低い活性が見られた。
【００７４】
尿路疾患性大腸菌７３７２株では、対照であるＬ.ラムノサスＧＲ-１及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４株の両方が、細菌生育を阻害した。同様に、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００は、当該細菌の生育を阻害した一方、Ｌ.アシドフィラスＫＳ４００は２５時間においてのみ活性であった。
【００７５】
２.  泌尿生殖器及び胃腸病原菌に対するＫＳ１２４.３、ＫＳ３００、及びＫＳ４００の殺菌活性
当該乳酸菌がスタフィロコッカス・アウレウス、尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８及び７３７２、及び下痢性大腸菌Ｃ１８４５の生存性について活性であるかを試験した。病原菌の生存性についての効果を、２、３、及び４時間で計測した。
【００７６】
スタフィロコッカス・アウレウスについて、対照株であるＬ.ラムノサスＧＲ-１及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４、及びＬ.ガセリＫＳ１２４.３、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００、及びＬ.アシドフィラスＫＳ４００は、細菌の生存性を２〜３ｌｏｇ低下させた。
【００７７】
尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８、対照株であるＬ.ラムノサスＧＲ-１株及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４及びＬ.ヘルベチカスＫＳ３００は、３ｌｏｇの低下させた一方、Ｌ.アシドフィラスＫＳ４００及びＬ.ガセリＫＳ１２４.３は同じ条件で活性ではなかった。
【００７８】
下痢性大腸菌Ｃ１８４５株では、対照株であるＬ.ラムノサスＧＲ-１及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１４の両者が細菌を殺し、当該細菌の生存性の３ｌｏｇの低下させた。同様の効果をＬ.ガセリＫＳ１２４.３について観察した一方、Ｌ.アシドフィラスＫＳ４００に関して活性が検出されなかった。Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００は、上記対照株について観察されるより確かに高い殺菌力を示す。
【００７９】
実施例３
１.  泌尿生殖器及び胃腸病原菌に対する、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１２１.１及びＫＳ１２２.１、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１、及びＬ.ヘルベチカスＫＳ３００の殺菌活性
当該乳酸菌株が尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８及びサルモネラ・エンテリカ・チフィムリウムの生存性について活性であるかが試験された。病原菌の生存性についての効果を接触後４時間で計測した。
【００８０】
尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８株について、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１２１.１及びＫＳ１２２.１は、活性を示さない一方、対照的に、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１は、非振盪条件において大腸菌の生存性を効果的に低下させた(４ｌｏｇ)。Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００及びＬ.ファーメンタムＲＣ-１対照株は、未振盪条件で２ｌｏｇだけしか大腸菌の生存性を低下させない。
【００８１】
サルモネラ・チフィムリウムに関して、Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１(３ｌｏｇ)、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１２１.１及びＬ.ヘルベチカスＫＳ３００、及び対照株であるＬ.ファーメンタムＲＣ-１４は、未振盪条件でかなり活性であった(６ｌｏｇの低下)。Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１は、振盪条件でさえ活性であった。
【００８２】
２.  ＫＳ１２０.１、ＫＳ１２１.１、及びＫＳ３００による尿路疾患性大腸菌ＩＨ１１１２８株のＨｅＬａ細胞への付着及び内在化の阻害
宿主の防御メカニズムを免れるために大腸菌などの腸外病原菌(extra-intestinal pathogens)によりしばしば用いられる戦略は、上皮細胞内の局所リザーバー(local reservoir)を確立することであり(M. A. Muvlea in Escherichia coli. Cell Microbiol. 4, 257-271 -2002)、そしてＩＨ１１１２８株による細胞内侵入は、これらの病原菌が尿路に長期間とどまることを促進するためのメカニズムに有効であるようだ。
Ｌ.ガセリＫＳ１２０.１、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００の効果、並びに対照株ＲＣ-１４株及びＧＧ株の効果は、上記尿路疾患性大腸菌に関して試験され；Ｌ.ジェンセニー１２１.１は生きた内在化大腸菌のレベルを２ｌｏｇ低下させた一方、Ｌ.ガセリ１２０.１、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００、及び両方の対照株は内在化大腸菌のレベルを４ｌｏｇ低下させることを示した。
【００８３】
実施例４
免役応答の調節(ヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験)
以下の株：Ｌ.クリスパタスＫＳ１１６.１、Ｌ.ジェンセニー１１９.１、Ｌ.ジェンセニーＫＳ１２１.１及びＫＳ１２２.１、Ｌ.ガセリ ＫＳ １２０.１、Ｌ.ガセリＫＳ１２４.３、Ｌ.ヘルベチカスＫＳ３００、及びＬ.アシドフィラスＫＳ４００を、その免役応答を誘導、調節、又は影響する能力について、より具体的にサイトカインなどの分泌を誘導できる能力について以下に記載される条件で試験された。
【００８４】
サイトカイン誘導の検出は、単離末梢血単核細胞(ＰＭＢＣ)のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激について試験する手段により行われた。これらの試験の間に誘導されたサイトカインのなかには、インターロイキン１０及び１２(ＩＬ１０及びＩＬ１２)、γ-インターフェロン(γ-ＩＦＮ)、及び腫瘍壊死因子α(ＴＮＦα)が存在した。
【００８５】
実験方法
ＰＢＭＣの調製：健常な対象(四人のドナー)から得た新鮮血をＰＢＳ-Ｃａ(ＧＩＢＣＯ)を用いて１：２の比で希釈し、そしてＦｉｃｏｌｌ勾配(ＧＩＢＣＯ)上で精製した。２０℃で３０分間４００×ｇにて遠心した後に、末梢血単核細胞(ＰＭＢＣ)は血清中に界面環状層(Interphase ring lyaer)を形成した。ＰＭＢＣを注意深く吸い取り、ＰＢＤ-Ｃａを用いて最終体積５０ｍｌの体積に懸濁し、そして２０℃で１０分間３５０×ｇでの遠心ステップを用いて同じ緩衝液中で３回洗浄した。
【００８６】
続いて１０％ｗ/ｖのＬ-グルタミン(ＧＩＢＣＯ)及びゲンタマイシン(１５０μｇ/ｍｌ)(ＧＩＢＣＯ)を添加した完全ＲＰＭＩ培地(ＧＩＢＣＯＰ)を用いて再懸濁した。ＰＢＭＣを顕微鏡下で計数し、そして２×１０6細胞/ｍｌの濃度で調節し、そして１ｍｌの分量で２４ウェル組織培養プレート(Corning, Inc.)中に分配した。
【００８７】
細菌の調製：一晩培養したＬＡＢ培養物をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７.２で２回洗浄し、次に２×１０9ｃｆｕ/ｍｌの濃度でＰＢＳ中に懸濁した。
【００８８】
ＰＭＢＣのインキュベーション：これらの懸濁液から１０μｌをＰＭＢＣプレートのウェルに移し、当該プレートを５％ＣＯ2/９５％空気の雰囲気下にて３７℃でインキュベーションした。２４時間のインキュベーション後に上清を吸い取り、２０００ｒｐｍで遠心し、そして上清を取り、そして-２０℃で貯蔵した。対照は、細菌を含まない緩衝液からなった。
【００８９】
サイトカインの定量：サイトカインの発現レベルをＥＬＩＳＡ試験(酵素結合免役吸着アッセイ)により測定した。ＥＬＩＳＡプレートを抗サイトカイン抗体で(一晩)被膜し、そして抗体をＰＢＳ/ＢＳＡ１％でブロッキングした。適切な標準を既知の濃度のサイトカインを用いて調製し、１５.６２〜２０００ｐｇ/ｍｌの検出範囲をカバーした(一晩インキュベーションした)。
【００９０】
基質(ＴＭＢ Pharmingen)上でストレプトアビジン反応を用いて抗サイトカインの検出及び定量を行った。市販のキット(Pharmingen)を、使用方法に従って使用した。４種のサイトカイン：炎症促進性／Ｔｈ１サイトカインであるＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、及び抗炎症性/Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ１０を測定した。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
観察：
・全ての被験ＬＡＢ株について高いレベルのＴＮＦαが誘導された。
・Ｌ.ジェンセニーＫＳ１２１.１についてＩＦＮγのレベルが比較的低かった。
・Ｌ.クリスパタスＫＳ１１６.１及びＫＳ４００についてＩＬ１０の誘導が最も高かった。
・２種のＬ.ジェンセニー株と対照的に、特にＩＬ１０/ＩＬ１２比及びＴＮＦα/ＩＮＦγ比を考慮すると、２種のＬ.ガセリ株は同様のプロファイルを示した。
上記試験枠の範囲で、サイトカイン誘導プロファイルは株特異的であることが明らかである。
【００９３】
実施例５
抗炎症性活性の測定(動物モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験)
マウスの急性モデルは、Camoglioらのモデルから適用された(Eur. J. Immunol. 2000を参照のこと)。 ここで、当該動物に、-５日目〜＋２日目までのあいだ選択された乳酸菌株をマウス１匹あたり１日あたり１０8細菌数の割合で与えた。次に、急性大腸炎を誘導するために１２０ｍｇ／ｋｇマウスの割合でＴＮＢＳを注射し、そして当該動物を＋２日目に屠殺し、そして続いて肉眼採点(Wallaceスコア-表１)及び組織学的採点(Amehoスコア-表２)にかけた。
これらの表により、基準株と比較した場合、選択された乳酸菌株がかなりの抗炎症性効果を示すことが示された。
【００９４】
実施例６
６.１  経口投与用組成物(食用カプセル)
本発明のＬＡＢ株のサンプル(上記を参照のこと)を、上で記載された要件と同様の条件で２４時間培養した。培養した株を単離し、洗浄し、そして凍結し、個別にラクトース／ＭＳＫ粉末混合物中に懸濁し、そして最終的に約１０8〜１０9ｃｆｕ (コロニー形成ユニット)を含む単位用量に分けた。
【００９５】
それぞれ約１０8〜１０9ｃｆｕの選択されたＬＡＢ株を含む食用セルロースカプセル(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)は、以下の成分：
・乾燥ヨーグルト粉末
・無水デキストロース
・ポテトスターチ
・微結晶セルロース
・選択された凍結乾燥ＬＡＢ株
を含む賦形剤を用いて製造した。
【００９６】
６.２  経口投与用組成物(ヨーグルト)
いわゆる「ヨーグルト・ネイチャー・ライト」の部分は、以下の過程を用いて製造した：標準１.５％脂肪ミルクのバッチに、３％スキムミルク粉末(ＭＳＫ)を加え、そしてその全てを９０℃で３０分間滅菌した。Ｌ.ブルガリカス(Ｌ. bulgaricus)及びS.サーモフィラス(S. thermophilus)の１％体積の市販のスターターカルチャーを低温滅菌乳汁に加え、次に全体をゆっくり室温で攪拌し、１００ｍｌの容器にいれ、当該容器を次に４０℃で約４時間インキュベーションして所望のｐＨにした。
【００９７】
次に本発明の凍結乾燥されたＬＡＢ株の一部を、ヨーグルト缶あたり約１０8〜１０9ｃｆｕを有する量になるようにヨーグルト缶に加え、そしてさらに約４.５〜４.７のｐＨになるまで３０分間インキュベーションを行った。これらのヨーグルト部分は、消費するまで４℃で貯蔵できる。
【表３】
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【表４】
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【国際調査報告】
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