(57)【要約】本発明は、ニューモリシンに特異的に結合することができる少なくとも１つの結合ドメインを含む抗−溶血結合メンバー、特に、少なくとも２つの結合ドメインを有する結合メンバー、診断方法における、ならびに治療のための該結合メンバーの使用に関する。好ましい実施形態において、結合メンバーはヒト抗体のような抗体、またはその断片であり、それは二重特異的抗体であってもよい。この結合ドメインは、１×１０−６未満であるニューモリシンに対する解離定数Ｋｄを有する。好ましくは、結合ドメインを含む結合メンバーは前記定義の解離定数Ｋｄを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューモリシンに特異的に結合することができる少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された抗−溶血結合メンバーであって、ここで、該結合ドメインは配列番号１１のアミノ酸１〜４３６に対応するニューモリシンのＮ−末端部分におけるエピトープを認識する、結合メンバー。
【請求項２】
前記結合ドメインが配列番号１１のアミノ酸２００〜４３６に対応するニューモリシンの領域におけるエピトープを認識する、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項３】
純粋な単離された結合メンバーである、請求項１ないし２に記載の単離された結合メンバー。
【請求項４】
抗体または抗体の免疫学的に活性な断片、または抗体の単一鎖から選択される、請求項１ないし３に記載の単離された結合メンバー。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物から選択される請求項４に記載の単離された結合メンバー。
【請求項６】
ニューモリシンに対して一特異的である、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項７】
ニューモリシンに対して特異的な少なくとも１つの部分を有して二重特異的である、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項８】
ニューモリシンに向けられた少なくとも１つの部分を有して多重特異的である請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項９】
前記結合ドメインがヒト抗体フレームワークによって保持される、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項１０】
前記結合ドメインがヒト化抗体フレームワークによって運ばれる、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項１１】
前記結合ドメインが配列番号２７に含まれるエピトープを認識する、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１２】
前記結合ドメインが配列番号２８、２９、３０または３１に含まれるエピトープを認識する、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１３】
前記結合ドメインが配列番号１１によって識別されるニューモリシンのアミノ酸４２５〜４３６によって含まれるエピトープを認識する、請求項１〜１２のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１４】
前記結合ドメインが配列番号３、４、５、６、７、８、９および１０より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはそのホモログを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１５】
前記結合ドメインが配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１０より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、またはそのホモログを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１６】
前記結合ドメインが配列番号１０によって識別される配列を含むアミノ酸配列またはそのホモログを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１７】
前記結合ドメインが配列番号８または配列番号１７によって識別される配列を含むアミノ酸配列またはそのホモログを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１８】
前記結合ドメインが配列番号９または配列番号１８によって識別される配列を含むアミノ酸配列またはそのホモログを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項１９】
２以上の異なるＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型からのニューモリシンに結合することができる、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項２０】
前記ホモログが、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８から選択される配列の１以上に対して、少なくとも６５％同一のように、少なくとも７０％同一のように、少なくとも７５％同一のように、少なくとも８０％同一のように、少なくとも８５％同一のように、少なくとも９０％同一のように、少なくとも９５％同一のように、少なくとも９８％同一のように、少なくとも６０％同一である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２１】
解離定数が１×１０−９Ｍ未満のように、５×１０−９Ｍ未満である、請求項１に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２２】
前記結合ドメインがＶＬドメインに位置する、請求項１〜２１のいずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項２３】
前記結合ドメインがＶＨドメインに位置する、請求項１〜２２いずれかに記載の単離された結合メンバー。
【請求項２４】
前記結合ドメインが前記結合メンバーにおける相補性−決定領域（ＣＤＲ）として配置される、請求項１４〜２３いずれか一項に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２５】
前記抗体の断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖから選択される、請求項３に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２６】
少なくとも第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含み、該第一の結合ドメインはニューモリシンに特異的に結合することができ、かつ該第二の結合ドメインは該第一の結合ドメインとは異なる、請求項１〜２５のいずれかに記載の結合メンバー。
【請求項２７】
前記第二の結合ドメインが、ＣＤ６４またはＣＤ８９から選択される蛋白質のような、ヒト蛋白質のような、哺乳動物蛋白質に特異的に結合することができる、請求項２５に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２８】
前記第二の結合ドメインが、白血球、マクロファージ、リンパ球、好中球細胞、好塩基球細胞、および好酸球細胞から選択される細胞のようなヒト細胞のような、哺乳動物細胞に特異的に結合することができる、請求項２５に記載の単離された結合メンバー。
【請求項２９】
前記第二の結合ドメインが、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ蛋白質に特異的に結合することができる請求項２６に記載の単離された結合メンバー。
【請求項３０】
前記第二の結合ドメインが、前記第一の結合ドメインとは異なるニューモリシンエピトープに特異的に結合することができる、請求項２８に記載の単離された結合メンバー。
【請求項３１】
前記結合メンバーが２つの結合ドメインを含む、請求項２５に記載の単離された結合メンバー。
【請求項３２】
前記２つの結合メンバーがスペーサー領域を介して連結されている、請求項３０に記載の単離された結合メンバー。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３５】
前記核酸分子によってコードされた抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む請求項３３に記載のベクター。
【請求項３６】
請求項３２に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１〜３２のいずれかに記載の結合メンバーを発現するように作製された細胞株。
【請求項３８】
個体においてＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに関連した疾患または障害を検出または診断する方法であって、該方法は、
該個体から生物学的試料を提供する工程、
請求項１〜３２のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを該生物学的試料に添加する工程、
該生物学的試料に結合した結合メンバーを検出し、それにより、該疾患または障害を診断または検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項３９】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含み、前記抗体が標識されている、キット。
【請求項４０】
請求項１〜３１のいずれかに記載の少なくとも１つの結合メンバーを含む医薬組成物。
【請求項４１】
少なくとも２つの異なる結合メンバーを含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
医薬組成物の生産のための、請求項１〜３２のいずれかに記載の結合メンバーの使用。
【請求項４３】
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ感染の治療用の医薬組成物の生産のための請求項１〜３２のいずれかに記載の結合メンバーの使用。
【請求項４４】
請求項１〜３２のいずれかに記載の結合メンバーによって認識される、配列番号１１のアミノ酸１〜４３６よりなるニューモリシンペプチド、その断片またはその変種。
【請求項４５】
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６によって識別されるアミノ酸配列を含むニューモリシンペプチド、その断片またはその変種。
【請求項４６】
ニューモリシンペプチドを含み、ここで、該ニューモリシンペプチドが配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６によって識別されるアミノ酸配列またはその変種を含むワクチン組成物。
【請求項４７】
さらに、アジュバントを含む請求項４６に記載のワクチン。
【請求項４８】
前記ニューモリシンペプチドが、請求項１〜３２のいずれかに記載の結合メンバーによって認識される配列番号１１のアミノ酸４２５〜４３６、その断片または変種を含む請求項４６に記載のワクチン。
【請求項４９】
前記ニューモリシンペプチド、その断片または変種が８０アミノ酸、６０アミノ酸、４０アミノ酸、２０アミノ酸、１５アミノ酸のような、または多くても１２アミノ酸のような、多くても１００アミノ酸によって構成される請求項４６〜４８に記載のワクチン組成物。
【請求項５０】
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ感染の予防的処置のための、請求項４６〜４９に記載のワクチン組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューモリシン（Ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの結合ドメインを含む結合メンバー、特に、少なくとも２つの結合ドメインを有する結合メンバー、診断方法における、ならびに治療のための該結合メンバーの使用に関する。さらに、ニューモリシンペプチドおよびニューモリシンペプチドを含むワクチン組成物がさらに記載される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは生命を脅かす細菌感染の主な原因の１つである。先進国において、５歳未満の数百万の子供は毎年Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで死亡すると見積もられてきた（非特許文献１）。工業化した世界においては、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎の発生は１０００００人当たり５ないし１０人であり、死亡の症例は５ないし７％である。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ脊髄炎は１０００００人当たり１ないし２人で起こり、死亡の症例は３０ないし４０％である（非特許文献２）。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは細菌血症の最も頻繁な原因の１つである。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、中耳炎を持つ子供から単離される最も頻繁な生物である。６歳未満の全ての子供の約７５％は中耳炎に罹るであろう。
【０００３】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはペアまたは短い鎖にて増殖するグラム陽性菌である。表面は三層：被膜、細胞壁および原形質膜から構成される。該被膜は最も厚い層であり、増殖するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの内部構造を完全に覆い隠す。オリゴ糖（多糖）の反復ユニットのポリマーは、該被膜を占領している。異なる血清型はそれらのその被膜の一部としてリビトール、アラビチノールまたはホスホリルコリンを含有し、その結果、血清型特異的である化学構造がもたらされる。細胞壁はペプチドグリカンのみならず、テイコ酸およびリポテイコ酸よりなる。原形質膜は、細胞を包み、種々の分子をその表面に係留させる二重リン脂質膜である（非特許文献３）。
【０００４】
現在、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０の異なるタイプがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ被膜の多様性に基づいて認識されている（非特許文献４）。該被膜はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の病因において中枢的である。１つの被膜型に対して生起された抗体はこのタイプでの感染からの保護を与えるが、他の被膜型での感染に対しては保護を与えない。現在の２３−価多糖ワクチンは、最も頻繁な血清型の６０ないし８０％を超える保護を供する。
【０００５】
ニューモリシンはいくつかのグラム陽性菌の主要ビルレンス因子であって、コレステロール−結合トキシンのファミリーのメンバーである（非特許文献５）。それは、リング−形状のオリゴマー（ポリン）を形成することによって、細胞のコレステロール−含有膜を破壊する多様性蛋白質である（非特許文献６）。さらに、ニューモリシンは、Ｆｃおよび補体蛋白質との相互作用を介して非−特異的様式で補体系を活性化させる。ニューモリシンの毒性は、ニューモリシン遺伝子の部位特異的突然変異誘発（Ｔｒｐ−４３３からＰｈｅへの置換）によって減弱化でき、その結果、ニューモリソイド（ＰｄＢ）が発現される（非特許文献７）。
【０００６】
ニューモリシンは、テストしたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の中で保存されているようである（非特許文献８）。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの異なる株からのニューモリシン遺伝子に基づく推定アミノ酸配列は＞９９％同一である（非特許文献９）。
【０００７】
ニューモリシンに対するＩｇＡは子供（２６１人のうち２４２人）および成人（１７人のうち１７人）からの唾液で検出できる（非特許文献１０）。抗−ニューモリシンＩｇＧは２歳未満のほとんどの子供（１１０８人のうち８０３人）および全ての成人（３２５人／３２５人）においてＥＩＡによって検出可能であった（非特許文献１１）。血清変換はキャリアーの状態に相関し、すなわち、鼻咽頭または中耳検体から培養したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを感染させた子供は、抗−ニューモリシンＩｇＧ陽性であるようであった。ＥＬＩＳＡ方法を用いる種々の研究において、ＩｇＧは４０人の健康な成人のうち７人、慢性閉塞性肺病を持つ３２人の患者のうち１７人、および肺炎球菌肺炎を持つ３１人の患者のうち１３人で検出された（非特許文献１２）。興味深いことには、肺炎および細菌血症を持つ有意により少数の患者が、細菌血症を持たないが肺炎を持つ患者と比較して検出可能なＩｇＧを有した（４人／１６人  ｖｓ．  ９人／１５人）。これは、抗−ニューモリシン抗体が、肺炎が細菌血症まで進行するのを妨げることができることを示唆する。
【非特許文献１】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ．“Ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒ  ｆｉｖｅｓ：  １５  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｄｅａｔｈｓ  ａ  ｙｅａｒ．”Ｌａｎｃｅｔ  １９８５年  ２：６９９−７０１
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ＣＪら、“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｅｐｉｔｏｐｅ，  ｇｅｎｅ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．”Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７年  ２３：１２１−１４２
【非特許文献３】ＡｌｏｎｓｏＤｅＶｅｌａｓｃｏ，Ｅ．“Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９５年．Ｄｅｃ．５９：５９１−６０３
【非特許文献４】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  Ｕ．Ｂ．“Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：  ｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃ−ｐｏｌｙ-ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．  Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．”Ｄａｎ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１９９５年  Ｆｅｂ．４２：４７−５３
【非特許文献５】ｄｅ  ｌｏｓ  Ｔｏｙｏｓ  ＪＲら、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９６年  Ｆｅｂ．６４：４８０−４８４
【非特許文献６】Ｂｏｎｅｖら、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｏｘｉｎ  ｐｎｅｕ-ｍｏ-ｌｙｓｉｎ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年  ２７６（８）：５７１４−５７１９
【非特許文献７】Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕ-ｍｏｌｙｓｉｎ  ｔｏｘｏｉｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｎｉｎｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９４年  ６２：５６８３
【非特許文献８】Ｐａｔｏｎら、“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８３年  ４０：５４８
【非特許文献９】Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ２．”Ｎｕｃｌｅｉ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０年  １８：４０１０
【非特許文献１０】Ｓｉｍｅｌｌら、“Ｐｎｅｕｍｏ-ｃｏｃｃａｌ  ｃａｒｒｉａｇｅ  ａｎｄ  ｏｔｉｔｉｓ  ｍｅｄｉａ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ，  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ，  ａｎｄ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．”Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００１年  １８３：８８７−８９６
【非特許文献１１】Ｒａｐｏｌａら、“Ｎａｔｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ，  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｄｈｅｓｉｎ  Ａ，  ａｎｄ  ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃａｒｒｉａｇｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｏｔｉｔｉｓ  ｍｅｄｉａ．”Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０００年  １８２：１１４６−１１５２
【非特許文献１２】Ｍｕｓｈｅｒら、“Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｓｓａｙｉｎｇ  ｆｏｒ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｐｎｅｕ-ｍｏ-ｌｙｓｉｎ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．”Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２００１年  ３２：５３４−５３８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、ニューモリシンに特異的に結合することができる少なくとも１つの結合ドメインを含む抗−溶血結合メンバーに関し、ここで、該結合メンバーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する疾患および障害を予防し、治療するための医薬組成物で用いるのに適当である。
【０００９】
従って、本発明の１つの具体例において、本発明は、ニューモリシンに特異的に結合することができる少なくとも１つの結合ドメインを含む単離された結合メンバーに関し、該結合ドメインは、１×１０−６未満であるニューモリシンに対する解離定数Ｋｄを有する。好ましくは、結合ドメインを含む結合メンバーは前記定義の解離定数Ｋｄを有する。
【００１０】
高結合強度のため、結合メンバーは医薬組成物で用いるのに適している。抗−溶血活性を持つさらにより多くの結合メンバーは特に有用である。
【００１１】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも第一の結合ドメインおよび第二の結合ドメインを含む単離された結合メンバーに関し、該第一の結合ドメインはニューモリシンに特異的に結合することができる。
【００１２】
本発明による結合メンバーは、好ましくは、抗体または抗体の断片である。抗体は当業者に知られたいずれの適当な方法によっても生産することができるが、結合メンバーの少なくとも一部は組換え方法を介して生産されるのが好ましい。従って、本発明は、１つの態様において、前記した結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子、ならびに前記定義の核酸分子を含むベクター、および前記核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、前記定義の結合メンバーの少なくとも一部を発現するように作製された、より好ましくは、前記定義の全結合メンバーを発現するように作製された細胞株に関する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、
−個体から生物学的試料を供し、
−前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを該生物学的試料に加え、
−該生物学的試料に結合した結合メンバーを検出し、それにより、疾患または障害を検出し、または診断する；
ことを特徴とする、個体においてＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに関連した疾患または障害を検出し、または診断する方法に関する。
【００１５】
また、該方法において、本発明は、さらに、前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを含むキットに関し、ここで、該結合メンバーは、診断方法で用いるために標識されている。
【００１６】
なおもう１つの態様において、本発明は、前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを含む医薬組成物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、肺炎、脊髄炎および／または敗血症のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する障害および疾患の治療または予防用の医薬組成物の製造における前記定義の結合メンバーの使用に関する。
【００１８】
なおさらなる態様において、本発明は、有効量の前記定義の結合メンバーを投与することによって、肺炎、脊髄炎および／または敗血症のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する障害または疾患に罹った個体を治療または予防する方法に関する。
【００１９】
さらなる態様は、抗−溶血結合メンバーによって認識されるニューモリシンペプチド、およびそのようなペプチドを含むワクチン組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（配列表）
配列番号：１  ニューモリシンのアミノ酸４２５ないし４３６
配列番号：２  ニューモリシンのアミノ酸４２３ないし４３８
配列番号：３  可変軽鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：４  可変重鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：５  ＣＤＲ１軽鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：６  ＣＤＲ２軽鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：７  ＣＤＲ３軽鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：８  ＣＤＲ１重鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：９  ＣＤＲ２重鎖２６−５Ｆ１２．１
配列番号：１０  ＣＤＲ３重鎖２６−５Ｆ１２．１および２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１１  ニューモリシン配列
配列番号：１２  可変軽鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１３  可変重鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１４  ＣＤＲ１軽鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１５  ＣＤＲ２軽鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１６  ＣＤＲ３軽鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１７  ＣＤＲ１重鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１８  ＣＤＲ２重鎖２６−２３Ｃ２．２
配列番号：１９  可変軽鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２０  可変重鎖２２１Ｃ１１
配列番号：２１  ＣＤＲ１軽鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２２  ＣＤＲ２軽鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２３  ＣＤＲ３軽鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２４  ＣＤＲ２１重鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２６  ＣＤＲ２重鎖２２−１Ｃ１１
配列番号：２６  ＣＤＲ３重鎖２２−１Ｃ１１
（定義）
親和性：受容体およびそのリガンドの間、例えば、抗体およびその抗原の間の結合の強度
結合力：エピトープおよびパラトープの間の反応の親和性、および抗体および抗原の価数の双方に関連する抗体とその抗原との機能的結合強度
アミノ酸残基：そのペプチド結合におけるペプチドの化学的消化（加水分解）に際して形成されるアミノ酸。本明細書に記載するアミノ酸残基は好ましくは「Ｌ」異性体形態である。しかしながら、所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体形態の残基はいずれかのＬ−アミノ酸残基に代えて置換することができる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基をいう。標準的なポリペプチドと歩調を合わすために、アミノ酸残基に対する略語を以下の対応の表に示す：
【００２１】
【化１】
2008515390.tif 000002
式によって本明細書に表される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端ないしカルボキシ末端の慣用的方向にて左から右の向きを有することに注意すべきである。加えて、フレーズ「アミノ酸残基」は、対応の表にリストされたアミノ酸、ならびに修飾された、および異常なアミノ酸を含むように広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは最後におけるダッシュは、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチド、またはＮＨ２またはアセチルのようなアミノ−末端基に、あるいはＣＯＯＨのようなカルボキシ−末端基に対する共有結合を示すことに注意すべきである。
【００２２】
抗体：その種々の文法的形態における該用語抗体は、本明細書中においては、免疫グロブリン分子、および本発明の組成物の免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含有する分子をいうように用いる。抗体分子の例は無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の部分であり、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような当該分野で知られた部分を含む。Ｆａｂの模式図を図１に示す。本明細書中で用いる用語「抗体」は、ヒト単一鎖およびヒト化抗体、ならびに抗体分子に由来する少なくとも１つの抗原結合決定基を有する多重特異的、二重特異的およびキメラ分子のような、そのような抗体の結合断片、あるいはそのような抗体の修飾されたバージョンを含むことも意図する。
【００２３】
抗体のクラス：それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに帰属させることができる。少なくとも５つの免疫グロブリンの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの内いくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる。抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つに明瞭に区別されるタイプの１つに帰属させることができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００２４】
抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原に特異的に結合する（それと免疫反応性である）重鎖および軽鎖可変および超可変領域よりなる抗体分子のその構造的部分である。その種々の形態における用語免疫反応は、抗原決定基含有分子、および全抗体分子またはその部分のような抗体結合部位を含有する分子の間の特異的結合を意味する。別法として、抗体結合部位は抗原結合部位として知られている。
【００２５】
抗−溶血：溶血を阻害する能力。ここに、赤血球に対するニューモリシンの溶血活性の阻害による。
【００２６】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデノシン（Ａ）とチミン（Ｔ）との、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とのパートナーシップ。ＲＮＡにおいては、ウラシル（Ｕ）はチミンによって置き換えられる。
【００２７】
結合メンバー：特に、ニューモリシンに特異的に結合することができる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ蛋白質上のエピトープに結合することができるポリペプチド。
【００２８】
結合ドメイン：抗原に特異的に結合する抗原結合部位。結合メンバーは多重特異的であってよく、２つの免疫学的に区別される抗原に特異的に結合する２以上の結合ドメインを含有する。
【００２９】
キメラ抗体：可変領域が動物の１つの種からのものであって、定常領域が動物のもう１つの種からのものである抗体。例えば、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒトのものである定常領域を有する抗体であり得る。
【００３０】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖立体配置を取る場合に通常対合するヌクレオチド。
【００３１】
相補性決定領域またはＣＤＲ：抗体認識および結合ドメインを一緒に形成する抗体のＶ−ドメイン中の領域。
【００３２】
相補的ヌクレオチド配列：もう１つの単一鎖上のそれに対して十分に相補的であって、結果としての水素結合でそれに特異的にハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子中のヌクレオチドの配列。
【００３３】
保存された：もしヌクレオチド配列が予め選択された配列の正確な相補体に対してランダムではなくハイブリダイズするならば、それは予め選択された（参照）配列に対して保存されている。
【００３４】
保存的置換：本明細書中で用いる用語保存的置換は、もう１つの生物学的に同様な残基によるアミノ酸残基の置き換えを示す。保存的置換の例は、もう１つのものに代えてのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基の置換、あるいはリシンに代えてのアルギニン、アスパラギン酸に代えてのグルタミン、あるいはアスパラギンに代えてのグルタミンの置換のようなもう１つのものに代えての１つの極性残基の置換等を含む。該用語保存的置換は、置換されていない親アミノ酸の代わりの置換されたアミノ酸の使用も含む。但し、置換されたポリペプチドを含む分子は同一の機能をやはり有するものとする。
【００３５】
定常領域または定常ドメインまたはＣ−ドメイン：定常領域は、その中に保存的置換を含有してもよい与えられたイソタイプ内のアミノ酸残基配列を含む抗体分子の構造部分である。重鎖免疫グロブリン定常領域の例は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４およびＣＨ５のような当該分野で公知の免疫グロブリン分子の部分である。軽鎖免疫グロブリン定常領域の例は、ＣＬのような当該分野で公知の免疫グロブリン分子のその部分である。
【００３６】
ダイアボディー：この用語は、２つの抗原−結合部位を持つ小さな抗体断片をいい、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには余りにも短いリンカーを用いることによって、ドメインはもう１つの鎖の相補的ドメインとで対合し、２つの抗原−結合部位を作り出すよう強制される。ダイアボディー、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【００３７】
解離定数Ｋｄ：受容体およびそれらのリガンド、例えば、抗体およびその抗原の間の結合の強度（または親和性または結合力）を記載するための尺度。より小さなＫｄであれば、結合はより強くなる。
【００３８】
下流：配列転写または読み出しの方向においてＤＮＡ配列にさらに沿うこと、すなわち、ＤＮＡの非−コーディングストランドに沿っての３’−ないし５’−方向、あるいはＲＮＡ転写体に沿っての５’−ないし３’−方向の移動。
デュプレックスＤＮＡ：当該デュプレックスの塩基対に存在する相補的塩基の各々の間の１以上の水素結合によって一緒に保持された実質的に相補的なポリヌクレオチドの２つのストランドを含む二本鎖核酸分子。塩基対を形成するヌクレオチドはリボヌクレオチド塩基またはデオキシリボヌクレオチド塩基いずれかであり得るので、フレーズ「デュプレックスＤＮＡ」とは、２つのＤＮＡストランドを含むＤＮＡ−ＤＮＡデュプレックス、あるいは１つのＤＮＡおよび１つのＤＮＡストランドを含むＲＮＡ−ＤＮＡデュプレックスいずれかをいう。
【００３９】
融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチドおよび２つのポリペプチドを１つの連続ポリペプチドに操作可能に連結するための連結配列を含むポリペプチド。融合ポリペプチドにおいて連結された２つのポリペプチドは、典型的には、２つの独立した源に由来し、従って、融合ポリペプチドは通常は天然では連結されて見いだされない２つの連結されたポリペプチドを含む。
【００４０】
Ｆｖ：ＶＨおよびＶＬ双方を含有するデルある鎖抗体断片。
【００４１】
遺伝子：そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡいずれかであり得る。
【００４２】
ヒト抗体フレームワーク：抗原結合部位、およびヒト免疫グロブリンに由来する当該分子の実質的に全ての残りの免疫グロブリン−由来部分を有する分子。
【００４３】
ヒト化抗体フレームワーク：非−ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子であるが、当該分子の残りの免疫グロブリン−由来部分のいくらかまたは全てはヒト免疫グロブリンに由来する。抗原結合部位は：１以上のヒト定常ドメインに融合した非−ヒト免疫グロブリンからの完全な可変ドメイン；または可変ドメインにおける適当なヒトフレームワーク領域へグラフトされた１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）いずれかを含むことができる。ヒト化抗体においては、ＣＤＲはマウスモノクローナル抗体からのものであり得、抗体の他の領域はヒトである。
【００４４】
ハイブリダイゼーション：相補的な塩基対の間の水素結合の確立によってデュプレックスまたはヘテロデュプレックスを形成するための実質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸のストランド）の対合。それは、競合的に阻害できる２つの相補的なポリヌクレオチドの間の特異的な、すなわち、ランダムでない相互作用である。
【００４５】
免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤを含めた血清抗体。
【００４６】
免疫グロブリンのイソタイプ：異なるＨ鎖を有するＩｇに与えられた名称。該名称はＩｇＧ（ＩｇＧ１，２，３，４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，２）、ｓＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤである。
【００４７】
免疫学的に区別される：フレーズ免疫学的に区別されるとは、ポリペプチドの一方に特異的に結合し、他方のポリペプチドには特異的には結合しない抗体の能力について２つのポリペプチドの間を区別する能力をいう。
【００４８】
個体：疾患、特に、以下に定義する感染性疾患に対して感受性であることが必要な生きた動物またはヒト。該対象は、抗原刺激および成長因子刺激に対して応答することができる白血球を保有する生物である。好ましい具体例において、該対象はヒト、ならびにイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスのような非−ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物である。最も好ましい具体例において、対象はヒトである。
【００４９】
感染性疾患：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの１以上の種、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる障害。
【００５０】
単離された：は、同定されており、その天然環境の成分から分離され、および／または回収されている、本明細書中に開示された種々の結合メンバーポリペプチドおよびヌクレオチドを記載するのに用いる。その天然環境の汚染成分は、典型的には、該ポリペプチドについての診断または治療の使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含むことができる。好ましい具体例において、ポリペプチドは精製されるであろう。
【００５１】
標識および表示手段：とは、検出可能なシグナルの生成に直接的にまたは間接的に関与して、複合体の存在を示す単一原子および分子をその種々の文法的形態でいう。
【００５２】
モノクローナル抗体：その種々の文法的形態におけるフレーズモノクローナル抗体とは特定の抗原と免疫反応できる抗体結合部位の唯一の種を含有する抗体分子の集団をいう。かくして、モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応するいずれかの抗原に対する単一結合親和性を表示する。モノクローナル抗体は、各々が異なる抗原に対して免疫特異的である、複数の抗原結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異的モノクローナル抗体を含むことができる。
【００５３】
マルチマー：１を超えるポリペプチドを含むポリペプチド分子。マルチマーはダイマーであって、２つのポリペプチドを含有してもよく、マルチマーはトリマーであって、３つのポリペプチドを含有してもよい。マルチマーはホモマーであって２以上の同一のポリペプチドを含有してもよく、あるいは、マルチマーはヘテロマーであって、２以上の非−同一ポリペプチドを含有してもよい。
【００５４】
核酸：一本鎖または二本鎖いずれかの、ヌクレオチドのポリマー。
【００５５】
ヌクレオチド：糖部位（ペントース）、リン酸、および窒素性複素環塩基よりなるＤＮＡまたはＲＮＡのモノマーユニット。該塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部位に連結し、塩基および糖のその組合せがヌクレオシドである。該ヌクオレオシドがペントースの３’または５’位置に結合したリン酸基を含有する場合、それをヌクレオチドという。操作可能に連結されたヌクレオチドの配列は、典型的には、本明細書中においては、「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」、およびそれらの文法的同等体をいい、本明細書中においては、その左から右への向きが５’末端または３’末端の慣用的方向にある式によって表される。
【００５６】
ヌクレオチドアナログ：構造的にＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵとは異なるが、核酸分子における通常のヌクレオチドに代えての代替物に対して十分に同様であるプリンまたはピリミジンヌクレオチド。
【００５７】
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ：は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと同義で用いる。
【００５８】
ポリクローナル抗体：ポリクローナル抗体は、特異的な与えられた抗原を認識する抗体分子の混合物であり、よって、ポリクローナル抗体は該抗原内の異なるエピトープを認識することができる。
【００５９】
ポリヌクレオチド：一本鎖または二本鎖ヌクレオチドのポリマー。本明細書中で用いるように、「ポリヌクレオチド」およびその文法的同等体は十分な範囲の核酸を含むであろう。ポリヌクレオチドは、典型的には、２以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの線状ストランドを含む核酸分子をいう。正確なサイズは多くの因子に依存し、該因子は、今度は、当業者に良く知られているように使用の最終的な条件に依存する。本発明のポリヌクレオチドはプライマー、プローブ、ＲＮＡ／ＤＮＡセグメント、オリゴヌクレオチドまたは「オリゴ」（比較的短いポリヌクレオチド）、遺伝子、ベクター、プレスミド等を含む。
【００６０】
ポリペプチド：フレーズポリペプチドとは、隣接するアミノ酸残基の間のアミノ結合以外の結合を含有しないアミノ酸残基を含む分子をいう。
【００６１】
受容体：受容体は、もう１つの分子に特異的に（ランダムではなく）結合することができる、蛋白質、等蛋白質等のような分子である。
【００６２】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：２つのＤＮＡセグメントを操作可能に連結することによって生じたＤＮＡ分子。かくして、組換えＤＮＡ分子は、天然では通常は一緒に見いだされない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を有しない、すなわち、進化的に異なるｒＤＮＡは「異種」といわれる。
【００６３】
特異性：用語特異性とは、ポリペプチドにおける与えられた抗原と免疫反応する（それに特異的に結合する）潜在的抗原結合部位の数をいう。ポリペプチドは単一ポリペプチドであってよく、あるいは、ジスルフィド結合によって連結された２以上のポリペプチドであってよい。ポリペプチドはモノ特異的であって、抗原に特異的に結合する１以上の抗原結合部位を含有してもよく、あるいはポリペプチドは二重特異的であって、２つの免疫学的に区別される抗原に特異的に結合する２以上の抗原結合部位を含有してもよい。かくして、ポリペプチドは同一または異なる抗原に特異的に結合する複数の抗原結合部位を含有することができる。
【００６４】
血清型：種々の特徴において相互に異なる多くの株よりなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種内の細菌の同定。血清型を規定する共通に用いられる特徴は特別な抗原性分子である。
【００６５】
単一鎖抗体またはｓｃＦｖ：フレーズ単一鎖抗体とは、１以上の抗原結合部位を含む単一ポリペプチドをいう。さらに、Ｆｖ断片のＨおよびＬ鎖は別々の遺伝子によってコードされるが、それらは直接的にまたはペプチドを介して連結されていてよく、例えば、組換え技術によってそれらが（単一鎖抗体として知られた、ｓＡｂ；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８  ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３）単一蛋白質鎖として差癖されるのを可能とする合成リンカーを作製することができる。そのような単一鎖抗体もまた用語「抗体」内に含まれ、多重特異的結合分子の設計および作製において結合決定体として利用することができる。
【００６６】
上流：ＤＮＡ転写の方向とは反対の方向、従って、非−コーディングストランド上では５’から３’へ、またはｍＲＮＡ上では３’から５’へ行くこと。
【００６７】
価数：用語価数とは、ポリペプチドにおいて、潜在的抗原結合部位、すなわち、結合ドメインの数を言う。ポリペプチドは一価であって、１つの抗原結合部位を含有してもよく、あるいは、ポリペプチドは二価であって、２つの抗原結合部位を含有してもよい。加えて、ポリペプチドは四価であって、４つの抗原結合部位を含有してもよい。各抗原結合部位は１つの抗原に特異的に結合する。ポリペプチドが１を超える抗原結合部位を含む場合、各抗原結合部位は同一または異なる抗原に特異的に結合することができる。かくして、ポリペプチドは複数の抗原結合部位を含有し、従って、多価であってよく、ポリペプチドは同一または異なる抗原に特異的に結合することができる。
【００６８】
Ｖ−ドメイン：可変ドメインは、抗原結合部位を形成するアミノ酸残基配列を含む抗体分子の構造的部分である。例示的な軽鎖免疫グロブリン可変領域は、ＶＬとして当該分野で知られた免疫グロブリン分子のその部分である。
【００６９】
ＶＬ：軽鎖の可変ドメイン。
【００７０】
ＶＨ：重鎖の可変ドメイン。
【００７１】
ベクター：細胞において自律複製が可能であって、それに対して、ＤＮＡセグメント、例えば、遺伝子またはポリヌクレオチドを操作可能に連結させて付着されたセグメントの複製を実現することができるｒＤＮＡ分子。１以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指令することができるベクターを、本明細書中において「発現ベクター」という。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いて生じたｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（相補的なＤＮＡ）のクローニングを可能とする。
【００７２】
（記載）
前記したように本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ蛋白質、より特別にはニューモリシンを特異的に認識し、それに結合することができる結合メンバー、特に抗体またはその断片に関する。本発明による結合メンバーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされた疾患の治療において、ならびに診断方法および細菌を検出するためのキットで使用するのに特に有用である。ニューモリシンは、好ましくは、図２に示されたアミノ酸配列（配列番号：１１）を有するポリペプチドである。
【００７３】
かくして、本発明による結合メンバーは、好ましくは、例えば、抗原に結合し、該抗原を免疫活性細胞に提示し、それにより、該抗原のファゴサイトーシスを容易とすることができるような抗体として免疫学的に活性であるべきである。
【００７４】
特に、結合メンバーは、当該分野で公知のいずれかの適当な抗体のような抗体、特に、抗体または抗体の免疫学的に活性な断片または単一鎖抗体のような本明細書中に定義された抗体である。抗体分子は、典型的には、その塩基性ユニットが、ジスルフィド結合によって一緒に共有結合連結された、４つのポリペプチド、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖よりなるＹ−形状の分子である。これらの鎖の各々は区別されるドメインに折り畳まれる。重鎖および軽鎖双方のＣ−末端領域は配列で保存されており、定常領域と呼ばれ、Ｃ−ドメインとしても知られている。Ｖ−ドメインとしても知られているＮ−末端領域は配列が可変であって、抗体特異性を担う。該抗体は、そのＶ−ドメインに位置する６つの短い相補性−決定領域を主に通じて抗原を特異的に認識し、それに結合する（図１参照）。
【００７５】
本発明による抗体はニューモリシンに向けての強い親和性を有するので特に有用である。
【００７６】
従って、本発明による結合メンバーは、１×１０−６Ｍ未満であるニューモリシンに対する解離定数Ｋｄを有する結合ドメインを有する。より好ましくは、ニューモリシンに対する解離定数Ｋｄは１×１０−７Ｍ未満、より好ましくは、１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは、５×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは、５×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満である。
【００７７】
ニューモリシンに向けての結合メンバーの親和性は、好ましくは、実施例４に記載されたように測定される。
【００７８】
結合メンバーは、好ましくは、前記した単離された結合メンバー、より好ましくは、単離された純粋な結合メンバーである。
【００７９】
（抗−溶血活性）
さらに、抗溶血活性を有する結合メンバーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされた疾患の治療に特に適当であると考えられる。理論に拘束されるつもりはないが、抗−溶血結合メンバーのニューモリシンへの結合は標的細胞の膜へのニューモリシンの付着を妨げると考えられる。イン・ビトロ機能的アッセイは好ましくは、実施例２および３に記載されているように行われる。
【００８０】
本発明による結合メンバーは、実施例３に記載されたアッセイにおいて、４０００ｎｍ／ｍｌの濃度において溶血を少なくとも５０％阻害することができるのが好ましい。より好ましくは、結合メンバーは実施例３に記載されたアッセイにおいて、４０００ｎｇ／ｍｌの濃度にて８０のような、８５のような、最も好ましくは、９０％のような、少なくとも６０％だけ溶血を阻害する。
【００８１】
本発明による最も好ましい結合メンバーは、実施例３に記載されたアッセイにおいて、１６０ｎｇ／ｍｌの濃度で溶血を少なくとも５０％阻害することができる。より好ましくは、結合メンバーは、実施例３に記載されたアッセイにおいて、１６０ｎｇ／ｍｌの濃度で溶血を８０のような、８５のような、最も好ましくは９０％のような、少なくとも６０％だけ阻害する。
【００８２】
（相補性決定領域）
理論に拘束されるつもりはないが、高結合強度および／または抗−溶血活性は、後に示す配列の以下のモチーフの１以上を有するアミノ酸配列を結合部位に一体化させることによって引き起こされると考えられる。
【００８３】
具体例において、結合ドメインは：
−アミノ酸配列組配列番号：５またはそのホモログ、配列番号６またはそのホモログ、および配列番号：７またはそのホモログ、または
−アミノ酸配列組配列番号：１４またはそのホモログ、配列番号１５またはそのホモログ、および配列番号：１６またはそのホモログ；
の群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、あるいは
−好ましくは、結合ドメインは：
−アミノ酸配列組配列番号：８またはそのホモログ、配列番号：９またはそのホモログ、および配列番号：１０またはそのホモログ、
−アミノ酸配列組配列番号：１７またはそのホモログ、配列番号：１８またはそのホモログ、および配列番号：１０；
の群から選択されるアミノ酸配列組の少なくとも１つを含む。
【００８４】
前記アミノ酸配列組において、アミノ酸配列は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３としての結合ドメインに配置され、すなわち、他のアミノ酸配列によって離される。
【００８５】
より具体的には、結合ドメインは、好ましくは、配列番号：５および配列番号：８またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ１領域を含み、および／または結合ドメインは、好ましくは、配列番号：６および配列番号：９またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ２領域を含むおよび／または結合ドメインは、好ましくは、配列番号：７および配列番号：１０またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ３領域を含む。
【００８６】
別法として、結合ドメインは、好ましくは、配列番号：１４および配列番号：１７またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ１領域を含み、および／または結合ドメインは、好ましくは、配列番号：１５および配列番号：１８またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ２領域を含み、および／または結合ドメインは、好ましくは、配列番号：１６および配列番号：１０またはそのホモログから選択される配列を含むＣＤＲ３領域を含む。
【００８７】
本明細書中に記載された出願人の発見は、可変重鎖の配列が溶血活性で重要であろうことを示唆する。かくして、好ましい具体例は；配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１７、配列番号：１８および配列番号：１０またはそのホモログの群から選択される１以上の配列を含む結合ドメインを含む。特に好ましいのは、配列番号：９または配列番号：１８またはそのホモログを含む結合ドメインである。最も好ましいのは、配列番号：１０またはそのホモログを含む結合ドメインである。
【００８８】
かくして、結合ドメインの可変領域は配列番号：３および配列番号：４またはそのホモログから選択される配列を含み、ここに、ホモログは本明細書中の他の箇所に定義されたとおりであるのが特に好ましい。
【００８９】
別法として、結合ドメインの可変領域は配列番号：１２および配列番号：１３またはそのホモログから選択される配列を含み、ここに、ホモログは本明細書中の他の箇所に定義されたとおりである。
【００９０】
好ましい特別な具体例において、結合ドメインの可変軽鎖は配列番号：３および配列番号：１２から選択される配列を含み、および／または最も好ましくは、結合ドメインの可変重鎖は配列番号：４および配列番号：１３から選択される配列を含む。
【００９１】
前記したホモログのいずれか１つの相同性は、好ましくは、１以上のホモログを含む結合ドメインに、前記定義のニューモリシンに対する解離定数Ｋｄを付与する。
【００９２】
（同一性および相同性）
用語「同一性」は、配列を整列させ、ギャップを導入して、必要であれば、全配列に対する最大パーセント同一性を達成した後に、それに対してそれを比較する対応する配列の残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージを意味するように解釈されるべきであり、配列同一性の一部としていずれかの保存的置換は考慮しない。Ｎ−またはＣ−末端延長または挿入は同一性または相同性を減少するものと解釈されるべきではない。整列のための方法およびコンピュータープログラムは当該分野でよく知られている。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを用いて測定することができる（例えば、配列分析ソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  １７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）。このソフトウェアは、相同性の程度を種々の置換、欠失、および他の修飾に帰属させることによって同様な配列にマッチする。
【００９３】
本明細書中で特定された１以上の配列のホモログは、定義された配列と比較して１以上のアミノ酸において変化していてもよいが、同一機能を実行することができ、すなわち、ホモログは所定の配列と機能的に同等なものと考えることができる。
【００９４】
前記したように、本明細書中における所定の配列のいずれかのホモログは；
ｉ）やはり所定のアミノ酸配列によって認識される抗原を認識することができるアミノ酸配列を含むホモログ、および／または
ｉｉ）抗原に選択的に結合することができるアミノ酸配列を含むホモログ、ここに、該抗原は所定の配列によってやはり選択的に結合される、および／または
ｉｉｉ）配列番号：３、４、１２および１３のような所定の配列を含む結合ドメインとして、ニューモリシンに対して実質的に同様な、またはより高い結合親和性を有するホモログ；
と定義することができる。
【００９５】
ホモログの例は、所定のアミノ酸の同一群内の１以上の保存的アミノ酸置換を含む１以上の保存的アミノ酸置換、あるいは各保存的置換が所定のアミノ酸の異なる群内での置換によって生じる複数の保存的アミノ酸置換を含む。
【００９６】
ホモログは、かくして、当該ホモログの少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅよりなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換された相互に独立した保存的置換、およびそれとは独立した、その当該ホモログの当該アラニン（Ａｌａ）の少なくとも１つがＧｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたホモログ、およびそれとは独立してその当該ホモログの少なくとも１つのバリン（Ｖａｌ）がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたホモログ、およびそれとは独立して、その当該ホモログの当該ロイシン（Ｌｅｕ）の少なくとも１つがＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたホモログ、およびそれとは独立して、その当該ホモログの少なくとも１つのイソロイシン（Ｉｌｅ）がＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＬｅｕよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立した、その当該ホモログの当該アスパラギン酸（Ａｓｐ）の少なくとも１つがＧｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立して、その当該ホモログの当該フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の少なくとも１つがＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏよりなるアミノ酸の群から選択され、好ましくは、ＴｙｒおよびＴｒｐよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立して、その当該ホモログの当該チロシン（Ｔｙｒ）の少なくとも１つがＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏよりなるアミノ酸の群から選択され、好ましくは、ＰｈｅおよびＴｒｐよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログおよびそれとは独立して、当該断片の当該アルギニン（Ａｒｇ）の少なくとも１つがＬｙｓおよびＨｉｓよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立して、その当該ホモログの少なくとも１つのリシン（Ｌｙｓ）がＡｒｇおよびＨｉｓよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立してその当該ホモログの当該アスパラギン（Ａｓｎ）の少なくとも１つがＡｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立してその当該ホモログの少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）がＡｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立してその当該ホモログの少なくとも１つのプロリン（Ｐｒｏ）がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログ、およびそれとは独立してその当該ホモログの当該システイン（Ｃｙｓ）の少なくとも１つがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒよりなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されたそのホモログを含むことができる。
【００９７】
保存的置換は、好ましい所定の配列のいずれかの部分に導入することができる。しかしながら、非−保存的置換、特に、限定されるものではないが、いずれかの１以上の位置における非−保存的置換を導入するのも望ましいであろう。
【００９８】
配列の機能的に同等なホモログの形成に導く非−保存的置換は、ここでは、例えば、ｉ）極性が実質的に異なり、例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎのような極性側鎖を持つ残基、あるいはＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓのような荷電したアミノ酸に代えて置換された、あるいは非−極性のものに代えて荷電したまたは極性残基を置き換えた非−極性側鎖（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）を持つ残基；および／または、ｉｉ）もう１つの残基の、またはもう１つの残基によるＰｒｏまたはＧｌｙに代えての置換のようなポリペプチド骨格の向きに対するその効果が実質的に異なり；および／または、ｉｉｉ）電荷において実質的に異なり、例えば、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇのような正に荷電した残基に代えてのＧｌｕまたはＡｓｐのような負に荷電した残基の置換（およびその逆）；および／または、ｉｖ）立体的嵩において実質的に異なり、例えば、従たる側鎖を有するもの、例えば、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＳｅｒに代えてのＨｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＴｙｒのような嵩高い残基の置換（およびその逆）。
【００９９】
アミノ酸の置換は、１つの具体例においては、その疎水性および親水性値、および電荷、サイズなどを含めたアミノ酸側鎖置換基の相対的同様性に基づいてなすことができる。種々のこれまでの特徴を考慮したアミノ酸置換の例は当業者によく知られており、アルギニンおよびリシン；グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；バリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。
【０１００】
具体例において、結合ドメインは、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７および１８より選択される配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するホモログを含む。好ましい具体例において、結合ドメインは、配列番号：３、４、１２、および１３より選択される配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するホモログを含む。
【０１０１】
より好ましくは、ホモログは、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１４、１５、１６、１７および１８、好ましくは、配列番号：３、４、１２および１３より選択される配列に対して少なくとも７０％同一のような、少なくとも７５％同一のような、少なくとも８０％同一のような、少なくとも８５％同一のような、少なくとも９０％同一のような、少なくとも９５％同一のような、少なくとも９８％同一のような、少なくとも６５％同一である。
【０１０２】
より好ましい具体例において、前記したパーセンテージは、配列番号：３、４、１２および１３より選択される配列と比較した、ホモログの配列の同一性に関する。
【０１０３】
（エピトープ）
本発明による抗−溶血結合メンバーは、好ましくは、配列番号：３、４、１２または１３の群から選択される配列を含む可変部分を有する抗体によってやはり認識されるエピトープを認識し、それに結合する。
【０１０４】
具体例において、抗−溶血結合メンバーの結合ドメインは、ニューモリシンのＮ−末端部分においてエピトープを認識する。好ましくは、配列番号：１１によって同定されるニューモリシンのアミノ酸１ないし４３６に対応するＮ−末端部分内。結合ドメインによって認識されるエピトープは、配列番号：１１によって同定されるニューモリシンのアミノ酸５０ないし４３６、または好ましくはアミノ酸１００ないし４３６内にあるのがさらに好ましい。特別な具体例において、結合メンバーによって認識されるエピトープは配列番号：１１によって同定されるニューモリシンのアミノ酸２００ないし４３５または３００ないし４３５内にある。
【０１０５】
本発明の結合メンバーの結合ドメインは、好ましくは、配列番号：２７によって同定されるアミノ酸配列に含まれるエピトープを認識する。好ましい具体例において、結合ドメインは配列番号：２８、２９、３０および３１に含まれるエピトープ、より好ましくは、配列番号：２９および３０に含まれるエピトープを認識する。
【０１０６】
結合ドメインによって認識されるエピトープは配列番号：１１によって同定されるニューモリシンのアミノ酸４００ないし４３８、またはより好ましくはアミノ酸４２０ないし４３６内にあるのがさらに好ましい。特別な具体例において、結合メンバーによって認識されるエピトープは配列番号：１１によって同定されるニューモリシンのアミノ酸４２２ないし４３６または４２５ないし４３６内にある。
【０１０７】
（血清型）
前記したように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０の異なる血清型が同定されている。本発明による結合メンバーは、３以上の異なるＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型からのように、４以上の異なるＰｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型からのような、５以上の異なるＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型からのような、２以上の異なるＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ血清型からのニューモリシンに結合することができるのが好ましい。最も好ましくは、本発明による結合メンバーは実質的に全ての血清型からのＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓを認識し、それに結合することができる。
【０１０８】
（モノクローナル／ポリクローナル抗体）
１つの具体例において、結合メンバーは抗体であり、ここに、該抗体は哺乳動物に由来するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体の混合物であり得る。好ましい具体例において、結合メンバーはモノクローナル抗体またはその断片である。該抗体はいずれの種類の抗体であってもよいが、それは好ましくは、ＩｇＧ抗体である。より好ましくは、該抗体はＩｇＧ１抗体またはその断片である。
【０１０９】
モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、各抗体分子が同様であって、かくして、同一エピトープを認識する。モノクローナル抗体は、一般には、ハイブリドーマ細胞株によって生産される。モノクローナル抗体および抗体−合成ハイブリドーマ細胞を作製する方法は当業者に良く知られている。抗体−生産ハイブリドーマは、例えば、抗体−生産Ｂリンパ球と不滅化細胞株との融合によって調整することができる。
【０１１０】
モノクローナル抗体は以下の工程によって生産することができる。全ての手法において動物は、ポリクローナル抗体の調製について前記したように蛋白質（またはそのペプチド）のような抗原で免疫化する。免疫化は、典型的には、免疫学的に有効な量、すなわち、免疫応答を生じさせるのに十分な量の免疫原を免疫学的にコンピテントな哺乳動物に投与することによって達成される。好ましくは、哺乳動物はウサギ、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。次いで、哺乳動物を該哺乳動物にとって記載された高親和性抗体分子を生じさせるのに十分な期間、ブースタースケジュールに維持する。抗体−生産細胞の懸濁液は、所望の抗体を分泌する各免疫化哺乳動物から取り出す。高親和性抗体を生じさせるのに十分な時間の後、動物（例えば、マウス）を犠牲にし、抗体−生産リンパ球はリンパ節、脾臓および末梢血液の１以上から得られる。脾臓細胞は好ましく、当業者によく知られた方法を用いて、生理学的媒体中で個々の細胞に機械的に分離することができる。抗体−生産細胞は、マウスミエローマ系の細胞への融合によって不滅化される。マウスリンパ球はマウス相同ミエローマとの安定な融合の高いパーセンテージを与えるが、ラット、ウサギおよびカエル体細胞を用いることもできる。所望の抗体−生産動物の脾臓細胞は、一般には、ポリエチレングリコールのような融合剤の存在下でミエローマ細胞と融合させることによって不滅化させる。融合パートナーとして適した多数のミエローマ細胞株のいずれも、標準的な技術で用いられる。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手可能なＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系。
【０１１１】
モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ技術の分野における当業者によく知られた他の方法によって作製することもできる。「コンビナトーリアル抗体ディスプレイ」方法と言われる代替方法が、特定の抗原特異性を有する抗体断片を同定し、単離するために開発されており、モノクローナル抗体を生産するのに利用することができる。
【０１１２】
ポリクローナル抗体は、特異的な与えられた抗原を認識する抗体分子の混合物であり、よって、ポリクローナル抗体は該抗原内の異なるエピトープを認識することができる。一般には、ポリクローナル抗体は、先に抗原で免疫化されている哺乳動物の血清から生成される。ポリクローナル抗体は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂｙ  Ｅｄ  ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載された方法のいずれかによって調製することができる。ポリクローナル抗体は、いずれかの適当な哺乳動物種から、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギおよびヒツジから由来することができる。
【０１１３】
（特異性）
結合メンバーはニューモリシンに対して一特異的であってよく、ここに、ニューモリシンに対する特異性が結合メンバーがニューモリシンと免疫反応することを意味する。もう１つの具体例において、結合メンバーは、ニューモリシンに対して特異的である少なくともひとつの部分を有して、二重特異的または多重特異的である。
【０１１４】
（一価抗体）
該一特異的結合メンバーは、一特異的であってよく、すなわち、ただ１つの結合ドメインを有する。
【０１１５】
一価抗体では、免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸残基配列は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４のような当該分野で知られた抗体分子の構造部分を含む。好ましいのは、ＣＬのような当該分野で知られた結合メンバーである。好ましいＣＬポリペプチドはＣカッパおよびＣラムダよりなる群から選択される。
【０１１６】
さらに、定常ドメインが重鎖または軽鎖定常ドメイン（各々、ＣＨまたはＣＬ）いずれかで有り得る限り、種々の一価結合メンバー組成物が本発明で考えられる。例えば、軽鎖定常ドメインは、もう１つの軽鎖定常ドメインに、または重鎖定常ドメインにジスルフィドブリッジすることができる。対照的に、重鎖定常ドメインは２つの独立したジスルフィドブリッジを形成することができ、もう１つの重鎖および軽鎖双方に対するブリッジングの確立を可能とし、または重鎖のポリマーを形成するのを可能とする。
【０１１７】
かくして、もう１つの具体例において、本発明では、一価ポリペプチドを含む組成物が考えられ、ここに、定常鎖ドメインＣは少なくとも１つのジスルフィドブリッジを形成することができるシステイン残基を有し、ここに、組成物は該ジスルフィドブリッジによって共有結合連結された少なくとも２つの一価ポリペプチドを含む。
【０１１８】
好ましい具体例において、定常鎖ドメインＣはＣＬまたはＣＨいずれかであり得る。ＣがＣＬである場合、ＣＬポリペプチドは好ましくは、ＣカッパおよびＣラムダよりなる群から選択される。
【０１１９】
もう１つの具体例において、本発明では、当該組成物はジスルフィドブリッジによって共有結合により連結された２つの一価ポリペプチドを含有するように、Ｃがジスルフィドブリッジを形成することができるシステイン残基を有するＣＬである以外は、前記した一価ポリペプチドを含む結合メンバー組成物が考えられる。
【０１２０】
（多価）
本発明のもう１つの具体例において、結合メンバーは少なくとも２つの結合ドメインヲ有する多価結合メンバーである。結合ドメインは、同一リガンドに対する、または異なるリガンドに対する特異性を有することができる。
【０１２１】
（二特異性を含めた多特異性）
好ましい具体例において、本発明は、少なくとも２つの異なる存在に対して特異性を有し、該存在に結合することができる。多重特異的結合メンバーに関する多重特異的結合メンバーは二重特異的結合メンバーを含むことができる。
【０１２２】
１つの具体例において、多重特異的分子は、その各々１つが抗体起源である少なくとも２つの異なる結合ドメインを運ぶ二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）である。
【０１２３】
本発明の二重特異的分子は、単一鎖二重特異的抗体、１つの単一鎖抗体および結合ドメインを含む単一鎖二重特異的分子、または２つの結合ドメインを含む単一鎖二重特異的分子のような単一鎖二重特異的分子でもあり得る。多重特異的分子は単一鎖分子でもあり得るか、少なくとも２つの単一鎖分子を含む事ができる。
【０１２４】
二重特異的を含めた多重特異的抗体は当業者に知られたいずれかの適当な方法によって生産することができる。
【０１２５】
二重特異的全抗体を作り出すためのアプローチは各々が所望の特異性を有する抗体を生産する２つのハイブリドーマ細胞株を融合することであった。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム会合のため、これらのハイブリッドハイブリドーマは、そのうちただ１つが二重特異的抗体である、１０までの異なる重鎖および軽鎖組み合わせの混合物を生じる。従って、これらの二重特異的抗体は、面倒な手法で生成されなければならず、これは、所望の産物の収率をかなり減少させる。
【０１２６】
代替アプローチは、前記したように、ヒンジにおいて、または遺伝的に導入されたＣ−末端Ｃｙｓを介して、システイン残基の化学的架橋による２つの抗原の特異性のイン・ビトロ連結を含む。そのようなイン・ビトロアセンブリーの改良は、Ｆａｂ’と、ヘテロダイマーの形成を促進するペプチドとの組換え融合を用いることによって達成された。しかしながら、これらの方法における二重特異的産物の収率は１００％よりもはるかに小さい。
【０１２７】
イン・ビトロ化学アセンブリー工程を含まない、二価または二重特異的抗体断片を生じさせるためのより効果的なアプローチはＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）によって記載された。このアプローチは、細菌から分泌されたｓｃＦｖ’がしばしばモノマーおよびダイマー双方として存在するという観察を利用する。該観察は、異なる鎖のＶＨおよびＶＬが対合することができ、かくして、ダイマーおよびより大きな複合体を形成することを示唆した。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって「ダイアボディー」と命名されたダイマー抗体断片は、事実、イン・ビボで組み立てられた小さな二価抗体断片である。２つの異なる抗体１および２のＶＨおよびＶＬを連結して、「クロス−オーバー」鎖ＶＨ  １ＶＬ  ２およびＶＨ  ２−ＶＬ−１を形成することによって、ダイマー化プロセスは、双方の抗原−結合部位を再度組み立てることが示された。２つの結合部位の親和性は、出発ｓｃＦｖ’と同等であり、あるいはＶＨおよびＶＬを共有結合連結させるポリペプチドリンカーを除去し、かくして、各々がＶＨと対合するのではなくＶＨに直接的にかつ共有結合連結したＶＨよりなる２つの蛋白質を生じさせた場合には、１０倍さえ増加することが示された。２特異的抗体断片を生じさせるこの戦略もまたいくつかの特許出願において記載されている。特許出願ＷＯ  ９４／０９１３１（ＳＣＯＴＧＥＮ  ＬＴＤ；優先日１９９２年１０月１５日）は、結合ドメインが、２つの鎖に存在するか、あるいはｓｃＦｖにおいて連結されたＶＨおよびＶＬ領域双方に由来し、他方、他の融合した抗体ドメイン、例えば、Ｃ−末端定常ドメインを用いて、ダイマー構築体を安定化させる二重特異的結合蛋白質に関する。特許出願ＷＯ／９４／１３８０４（ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ／ＭＥＤＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＵＮＣＩＬ；最初の優先日１９９２年１２月４日）は、相互に会合することができず、それにより、Ｖ−ドメインをリンカーで、またはそれなしで連結することができるＶＨおよびＶＬを含有するポリペプチドに関する。
【０１２８】
（特許出願ＷＯ  ９４／１３８０６；ＤＯＷ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯ；優先日１９９２年１２月１１日にも記載されている）Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓｓ，１９９４は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける単一鎖二重特異的抗体断片のイン・ビボ生産を報告した。二価蛋白質の二特異性は、一緒に、フレキシブルなポリペプチドリンカーによって遺伝子レベルで連結されている、区別される特異性を保有する２つの従前に生産された一価ｓｃＦｖ分子に基づいた。伝統的には、単一鎖抗体断片をいう場合には常に、ポリペプチドリンカーの存在または不存在下において１つの（対応する）軽鎖に連結された１つの重鎖よりなる単一分子が意味される。「ダイアボディー」アプローチを通じて（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）および特許出願ＷＯ  ９４／０９１３１）、あるいは「二重ｓｃＦｖ」アプローチ（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓｓ，１９９４および特許出願ＷＯ  ９４／１３８０６）によって、二価または二重特異的抗体断片を作製する場合、再度、ＶＨを（対応する）ＶＬに連結させる。
【０１２９】
前記した多重特異的分子は多数の方法によって作製することができる。例えば、全ての特異性は同一ベクターにおいて高度し、同一宿主細胞において発現させ、組み立てることができる。この方法は、多重特異的分子がｍＡｂ  ×  ｍＡｂ、ｍＡｂ  ×  Ｆａｂ、Ｆａｂ  ×  Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×  Ｆａｂ融合蛋白質である場合に特に有用である。二価または多価抗体を調製するための種々の他の方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；第５，４５５，０３０号；第４，８８１，１７５号；第５，１３２，４０５号；第５，０９１，５１３号；第５，４７６，７８６号；第５，０１３，６５３号；第５，２５８，４９８号；および第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１３０】
本発明による二重特異的または多重特異的結合メンバーを用いることによって本発明は、一特異的／一価結合メンバーと比較していくつかの利点を供する。
【０１３１】
二重特異的／多重特異的結合メンバーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ蛋白質、特にニューモリシンを特異的に認識し、それに結合することができる第一の結合ドメインを有し、他方、他の結合ドメインは他の目的で用いることができる。
【０１３２】
１つの具体例において、少なくとも１つの他の結合ドメインを、第一の結合ドメインと比較して、同一のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ蛋白質上のもう１つのエピトープへの結合のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ蛋白質への結合で用いる。それにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種に対する特異性は増加させることができ、ならびに結合メンバーの結合力を増加させることができる。
【０１３３】
もう１つの具体例において、少なくとも１つの他の結合ドメインは、ヒト細胞のような哺乳動物細胞に特異的に結合させるために用いることができる。該少なくとも他の結合ドメインは白血球、マクロファージ、リンパ球、好塩基球および／または好酸球細胞のような免疫活性細胞に結合して、治療方法における結合メンバーの効果を増加させることができるのが好ましい。これは、少なくとも１つの他の結合ドメインが、クラスター分化蛋白質（ＣＤ）のいずれか、特に、ＣＤ６４および／またはＣＤ８９から選択される蛋白質のようなヒト蛋白質のごとき哺乳動物蛋白質に特異的に結合することができることを確立することによって達成することができる。ＣＤ６４特異性を有する二重特異的抗体を生産するための方法は、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．に対する米国特許第６，０７１，５１７号に記載されている。
【０１３４】
本明細書中で用いる「エフェクター細胞」とは、白血球またはリンパ球である免疫細胞をいう。特異的エフェクター細胞は特異的Ｆｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を行う。例えば、ＣＤ８９受容体を発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球、およびリンパ球は標的細胞の特異的殺傷、および免疫系の他の成分への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。
【０１３５】
（ヒト化抗体フレームワーク）
非−ヒト「外来性」エピトープは治療すべき個体において免疫応答を誘導し得るので、ヒト治療のために非−ヒト抗体を用いるのは常には望ましくない。非−ヒト抗体に関連する問題をなくし、または最小化するには、キメラ抗体誘導体、すなわち、非−ヒトＦａｂ可変領域結合決定基をヒト定常領域（Ｆｃ）と組み合わせる「ヒト化」抗体分子を作製するのが望ましい。そのような抗体は、前記したモノクローナルおよびポリクローナル抗体の同等な抗原特異性および親和性によって特徴付けられ、ヒトに投与した場合には免疫原性は低く、従って、治療すべき個体によってより許容されるようである。
【０１３６】
従って、１つの具体例において、結合メンバーは、ヒト化抗体とも呼ばれる。ヒト化抗体フレームワークに運ばれる結合ドメインを有する。
【０１３７】
ヒト化抗体は、一般には、ヒト抗体に由来する領域、およびげっ歯類抗体のような非−ヒト抗体に由来する領域を含むキメラ抗体である。（再形成またはＣＤＲ−グラフティングとも呼ばれる）ヒト化は、異種間源（通常はげっ歯類）からのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低下させ、ヒト免疫グロブリンに対する相同性を増加させるための、およびヒト免疫系のその活性化を改良するためのよく確立された技術である。かくして、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および、恐らくは、いくつかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体における類似の部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１３８】
ヒト化抗体は抗原に対する高い親和性、および他の好都合な生物学的特性を保有するのがさらに重要である。この目標を達成するには好ましい方法に従い、親およびヒト化配列の三次元モデルを用い、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析のプロセスによってヒト化抗体を分離する。三次元免疫グロブリンモデルは通常に入手でき、当業者は精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の恐らくは三次元の立体配座構造を示し、それを表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能化におけるある種の残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、抗原結合に直接的かつ最も実質的に影響するのはＣＤＲ残基ではあるが、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が最大化されるように、ＦＲ残基を受容者から選択し、組み合わせ、配列を輸入することができる。
【０１３９】
ＭＡｂをヒト化する１つの方法は、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が第２の抗体、好ましくはヒト抗体に由来する定常ドメインに融合したキメラ抗体の生産に関連するものであった。そのようなキメラ化手法を行うための方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０  １２０  ６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＥＰ−Ａ−０  １２５  ０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、ＥＰ−Ａ−０  １７１  ４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびＥＰ−Ａ−０  １９４  ２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。抗体のヒト化のより複雑な形態は、非−ヒト抗体結合部位を構成するアミノ酸が、ヒト抗体可変領域のフレームワークに一体化させるような、可変領域ドメインの再設計を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。
【０１４０】
本発明のヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部を、非−ヒト抗体から由来するＣＤＲで置き換えることができるいずれの方法によって作製することもできる。Ｗｉｎｔｅｒは、その内容をここに引用して例示的に援用する、本発明のヒト化抗体を調製するために用いることができる方法を記載する（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願ＧＢ  ２１８８６３８Ａ）。ヒトＣＤＲは、後の実施例に記載されるオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発を用いて非−ヒトＣＤＲで置き換えることができる。
【０１４１】
その例として、本発明のヒト化抗体は、後に簡単な説明で記載するように作製することができる。本発明のヒト化抗体は以下のプロセス：
（ａ）慣用的にＣＤＲおよび抗体結合特異性を保有するのに必要な可変ドメインフレームワークの領域のそのような最小部分が非−ヒト免疫グロブリンに由来し、かつ抗体鎖の残りの部分がヒト免疫グロブリンに由来する抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を含むオペロンを含有する発現ベクターを構築し、それにより、本発明のベクターを製造し；
（ｂ）慣用的技術によって、ＣＤＲおよびドナー抗体結合特異性を保有するのに必要な可変ドメインフレームワーク領域のそのような最小部分が非−ヒト免疫グロブリンに由来し、かつ抗体鎖の残りの部分がヒト免疫グロブリンに由来する相補的抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を持つオペロンを含有する発現ベクターを構築し、それにより、本発明のベクターを製造し；
（ｃ）慣用的技術によって発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして、本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を生じさせ；次いで、
（ｄ）慣用的技術によってトランスフェクトされた細胞を培養して、本発明のヒト化抗体を生じさせる；
ことによって、製造することができる。
【０１４２】
宿主細胞は本発明の２つのベクターで共トランスフェクトすることができ、第１のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有し、第２のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有する。２つのベクターは異なる選択マーカーを含有するが、そうでなければ、抗体重鎖および軽鎖コーディング配列とは別に、好ましくは、同一であって、可能な限り、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を確実とする。別法として、単一のベクターを用いることができ、該ベクターは軽鎖および重鎖双方のポリペプチドをコードする配列を含む。軽鎖および重鎖についてのコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、あるいは双方を含むことができる。
【０１４３】
本発明の改変された抗体を発現させるのに用いる宿主細胞は、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、または真核生物細胞いずれかであり得る。特に、ミエローマ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のようなこの目的用のよく規定されたタイプの哺乳動物細胞を用いることができる。
【０１４４】
本発明のベクターがそれによって構築できる一般的方法、本発明の宿主細胞を製造するのに必要なトランスフェクション方法、およびそのような宿主細胞から本発明の抗体を生産するのに必要な培養方法は全て慣用的な技術である。同様に、一旦製造されれば、本発明のヒト化抗体は、後に記載するような標準的な手法に従って精製することができる。
【０１４５】
（ヒト抗体フレームワーク）
より好ましい具体例において、本発明は結合メンバーに関し、ここに、結合ドメインはヒト抗体フレームワークによって行われ、すなわち、ここに、抗体はヒト化抗体よりも大きな程度のヒトペプチド配列を有する。
【０１４６】
ヒト蛋白質に対して向けられたヒトｍＡｂ抗体は、マウス系よりはむしろ完全なヒト免疫系を運ぶトランスジェニックマウスを用いて生じさせることができる。注目する抗原で免疫化されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾臓細胞を用いて、ヒト蛋白質からのエピトープに対する特異的親和性を持つヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生産する（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願ＷＯ  ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願ＷＯ  ９２／０３９１８；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６参照）。
【０１４７】
そのようなトランスジェニックマウスはＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．から入手可能である。キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＩＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされると記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスへのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の結果、抗原攻撃に際してヒト抗体が生産されるであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）参照。ヒト抗体はファージ−ディスプレイライブラリーに由来することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１４８】
（断片）
本発明の１つの具体例において、結合メンバーは抗体の断片、好ましくは、抗原結合断片または可変領域である。本発明で有用な抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。抗体のパパイン消化は、各々が単一抗原結合部位、および容易に結晶化するその能力のためのいわゆる残りの「Ｆｃ」断片を持つ、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生じさせる。ペプシン処理は、抗原を架橋させることができる２つの抗原結合断片、および（ｐＦｃ’といわれる）残りの他の断片を有するＦ（ａｂ’）２断片を生じる。さらなる断片はダイアボディー、線状抗体、単一鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異的抗体を含むことができる。
【０１４９】
抗体断片Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖは、抗体断片が単一の抗原−結合部位のみを運ぶ点で全抗体と異なる。２つの結合部位を持つ組換え断片は、例えば、ＦｖのＶＨのＣ−末端に（Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）、あるいはｓｃＦｖのＶＬのＣ−末端に）（Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９２）導入されたシステイン残基の化学的架橋によって、あるいはＦａｂ’のヒンジシステイン残基を通じて（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）いくつかの方法で作製されてきた。
【０１５０】
好ましい抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合する抗体のいくらかまたは実施的に全ての能力を保有する。いくつかの好ましい断片を以下に定義する：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原−結合断片を含む断片である。Ｆａｂ断片は酵素パパインでの全抗体の消化によって生じさせて、無傷軽鎖および１つの重鎖の一部を得ることができる。
【０１５１】
（２）Ｆａｂ’は抗体分子の断片であって、全抗体をペプシンで消化し、続いて還元して、無傷軽鎖および重鎖の一部を生じさせることによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片が抗体分子当たり得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基の添加によってＦａｂ断片とは異なる。
【０１５２】
（３）（Ｆａｂ’）２は、全抗体を引き続いての還元なくして酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体の断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片のダイマーである。
【０１５３】
（４）Ｆｖは完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの密な非−共有結合会合したダイマーよりなる（ＶＨ−ＶＬダイマー）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定するのはこの立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも低い親和性においてであるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【０１５４】
本発明の１つの具体例において、抗体は、遺伝子的に融合した単一鎖分子としての適当なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学により作製された分子と定義される、単一鎖抗体（「ＳＣＡ」）である。そのような単一鎖抗体は、「単一−鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片とも言われる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含む。
【０１５５】
本発明による抗体断片は、当業者に知られたいずれかの適当な方法で製造することができる。いくつかの微生物発現系が既に活性な抗体断片を製造するために開発されており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｋｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９８８，Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、酵母（Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、およびフィラメント状真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）のような種々の宿主におけるＦｂの製造は記載されている。これらの代替系における組換え蛋白質の収率は比較的高くすることができるか（高細胞密度発酵においてＥ．ｃｏｌｉのフェリプラズム空間に分泌されたＦａｂについて１ないし２ｇ／ｌ；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２参照）、あるいはファーメンタ中の酵母におけるＦａｂについてより低いレベル、例えば、約０．１ｍｇ／ｌ、およびファーメンタ中のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａでの融合蛋白質ＣＢＨＩ−Ｆａｂについての１５０ｍｇ／ｌおよびＦａｂについての１ｍｇ／ｌ（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）におけるものであり、そのような製造は、哺乳動物細胞（ハイブリドーマ、ミエローマ、ＣＨＯ）における全抗体生産と比較して非常に安価である。
【０１５６】
断片はＦａｂ’としてまたはＦｖ’ｓとして生産することができるが、加えて、ＶＨおよびＶＬを、フレキシブルなポリペプチドリンカーによっていずれかの順序で遺伝子的に連結することが示されており、その組み合わせはｓｃＦｖとして公知である。
【０１５７】
（単離された核酸分子／ベクター／宿主細胞）
１つの態様において、本発明は、前記定義の結合メンバーの少なくとも一部をコードする単離された核酸分子に関する。１つの具体例において、核酸分子は軽鎖をコードし、もう１つの核酸は重鎖をコードする。２つの核酸分子は別々であってもよく、あるいはそれらは、所望により、リンカー配列によって離されていてもよい１つの核酸分子に融合することができる。特に、抗体断片に関しては、核酸分子は全結合メンバーをコードすることができるが、結合メンバーの設計に依存して、これはいくつかのより大きな結合メンバーに関連させることもできる。核酸分子は、好ましくは、ＤＮＡ配列、より好ましくはその上流末端に、一旦核酸分子が宿主細胞に配置されれば結合メンバーの発現を促進する調節エレメントを含むＤＮＡ配列である。
【０１５８】
従って、１つの具体例において、本発明は：
ｉ）実施例６のヌクレオチド配列から選択される配列を含むポリペプチド、
配列番号：３、４、１２または１３の群から選択される１以上のアミノ酸配列を含む結合メンバーをコードするポリヌクレオチド、
ｉｉ）ポリヌクレオチドｉ）によってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、ここに、該断片は：
ａ）ｉｉ）の結合メンバーによってやはり認識される抗原を認識することができ、および／または
ｂ）抗原に選択的に結合することができ、ここに、該抗原はｉｉ）の結合メンバーによってやはり選択的に結合され、および／または
ｃ）配列番号：３、４、１２または１３のような所定の配列を含む結合ドメインとしてのニューモリシンに対する実質的に同様なまたはより高い結合親和性を有し、
ｉｉｉ）その相補的ストランドがストリンジェントな条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）のいずれかにおいて規定されたポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつｉｉｉ）で規定されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ｉｖ）ｉ）ないしｉｖ）のいずれかにおいて規定されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して縮重したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、
およびそのようなポリヌクレオチドの相補的なストランドに関する。
【０１５９】
本発明は、さらに、核酸当たり１つのベクター、あるいは同一ベクターにおいて２以上の核酸いずれかの、前記定義の核酸分子を含むベクターに関する。該ベクターは、好ましくは、核酸分子によってコードされた抗体の発現を調節するヌクレオチド配列を含む。
【０１６０】
さらにもう１つの態様において、本発明は、前記定義の核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【０１６１】
また、本発明は、前記定義の結合メンバーを発現するように作製された細胞株に関し、この細胞株は、例えば、ネズミリンパ球および不滅化細胞系のハイブリドーマである。該細胞株はいずれの適当な細胞株であってもよいが、細胞株Ｐ３が好ましい。もう１つの具体例において、ＣＨＯ細胞株が好ましい。
【０１６２】
（結合メンバーの精製）
生産の後、本発明による結合メンバーが好ましくは精製される。用いる精製方法は必要な順序、抗体の源、抗体についての意図した使用、抗体が生産される種、抗体のクラスおよび、抗体がモノクローナル抗体である場合は、抗体のサブクラスを含めたいくつかの因子に依存する。
【０１６３】
抗体を含むポリペプチドを精製するいずれかの適当な慣用的方法は沈殿およびカラムクロマトグラフィーを含み、精製分野における当業者によく知られており、クロス−フロー濾過、硫酸アルミニウム沈殿、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを用いることができる。
【０１６４】
抗−免疫グロブリン抗体で抗体を精製する方法は、単一精製手法または順次の精製手法いずれかであり得る。単一および順次の精製方法は精製分野における当業者によく知られている。単一−工程精製手法において、抗体は、単一の抗−免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。非−特異的に結合した分子は洗浄工程で除去され、特異的に結合した分子は特異的に溶出される。順次の精製手法においては、抗体は第一の抗−免疫グロブリン抗体に特異的に結合し、非−特異的に結合した分子は洗浄工程で除去され、特異的に結合した分子は特異的に溶出される。次いで、第一の抗−免疫グロブリン抗体からの溶出物は第二の抗−免疫グロブリン抗体に特異的に結合される。非−特異的に結合した分子は洗浄工程で除去され、特異的に結合された分子は特異的に溶出される。好ましい具体例において、抗体は、重鎖および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体よりなる群から選択される第一および第二の抗−免疫グロブリン抗体によって順次に精製される。
【０１６５】
精製の通常使用される方法はアフィニティークロマトグラフィであり、そこでは、精製すべき抗体をプロテインＡ、プロテインＧによって、または抗−免疫グロブリン抗体によって結合させる。当業者によく知られたアフィニティークロマトグラフィのもう１つの方法は、その各抗原への抗体の特異的結合である。
【０１６６】
特に、二重特異的抗体を含めた多重特異的抗体を精製するためには、順次の精製手法を用いることができ、ここに、２以上の可変ドメインを含む二重特異的抗体を第一の抗原に特異的に結合させ、次いで、第二の抗原に特異的に結合させる。
【０１６７】
別の具体例において、２以上の可変領域を含む二重特異的抗体は、第一の精製工程において第一の抗原に、および第二の精製工程において第二の抗原に抗体を特異的に結合させることによる順次の精製によって精製される。
【０１６８】
抗−免疫グロブリン抗体で抗体を精製する方法は、単一精製手法または順次の精製手法いずれかであり得る。単一および順次精製の方法は精製分野における当業者によく知られている。単一−工程精製手法において、抗体は単一の抗−免疫グロブリン抗体によって特異的に結合される。非−特異的に結合した分子は洗浄工程で除去し、特異的に結合した分子を特異的に溶出させる。順次の精製手法においては、抗体を第一の抗−免疫グロブリン抗体に特異的に結合させ、非−特異的に結合した分子は洗浄工程で除去し、特異的に結合した分子は特異的に溶出させる。次いで、第一の抗−免疫グロブリン抗体からの溶出物を第二の抗−免疫グロブリン抗体に特異的に結合させる。非−特異的に結合した分子を洗浄工程で除去し、特異的に結合した分子を特異的に溶出させる。好ましい具体例において、抗体は、重鎖および軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体よりなる群から選択される第一および第二の抗−免疫グロブリン抗体によって順次に精製される。より好ましい具体例において、抗体は、ＩｇＧの重鎖定常領域およびカッパおよびラムダの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体よりなる群から選択される第一および第二の抗−免疫グロブリン抗体によって順次に精製される。なおより好ましい具体例において、抗−免疫グロブリン抗体は、カッパおよびラムダの軽鎖定常領域に特異的に結合する抗体よりなる群から選択される。
【０１６９】
（診断方法）
また、本発明は、生物学的試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在についてアッセイするための好ましくはキット形態である診断システムも記載し、ここに、本明細書中に記載する診断方法に従って試料中の細菌の存在および、好ましくは、量を検出するのが望ましい。
【０１７０】
診断システムは、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量にて、好ましくは、別々にパッケージされた試薬としての本発明による結合メンバー組成物、およびより好ましくは使用のための指示書も含む。
【０１７１】
生物学的試料は組織、組織抽出物、流体試料あるいは血液、血漿または血清のような体液試料であり得る。
【０１７２】
パッケージされたとは、本発明の結合メンバーを固定された制限内に保持することができるガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカルボネート）、紙、ホイルなどのような固体マトリックスまたは材料の使用をいう。かくして、例えば、パッケージは、考えられる標識された結合メンバー調製のミリグラム量を含有するのに用いることができるガラスバイアルであり得、あるいはそれは、考えられる結合メンバーのマイクログラム量が固定された、すなわち、連結されて、リガンドに結合されるのが可能とされているマイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１７３】
「用いるための指示書」は、典型的には、混合すべき試薬および試料の相対的量、試薬／試料混合のための維持時間、温度、緩衝液条件等のような試薬濃度または少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを記載する触知できる表現を含む。
【０１７４】
本発明の診断システムは、好ましくは、予め選択されたリガンドと複合体化された結合メンバーを含有する結合反応複合体の形成をシグナリングすることができる標識または指示手段も含む。
【０１７５】
いずれの標識または指示手段も、診断方法で用いられる表現されたポリペプチドまたはファージ粒子に連結し、または一体化させることができる。そのような標識は、それ自体、臨床診断化学においてよく知られている。
【０１７６】
標識手段は、それらを変性して、有用な免疫蛍光トレーサーであるフルオロクローム（色素）を形成することなく、抗体または抗原に化学的に結合する蛍光標識剤であり得る。適当な蛍光標識剤はフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００塩化スルホニル（ＲＢ  ２００  ＳＣ）等である。免疫蛍光分析技術の記載は、ここに引用して援用する、ＤｅＬｕｃａ，“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ，  Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）に見出される。
【０１７７】
好ましい具体例において、指示基はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等のような酵素である。主な指示基がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素であるそのような場合、受容体−リガンド複合体（免疫反応体）が形成されたという事実を可視化するのにさらなる試薬が必要である。ＨＲＰのためのそのようなさらなる試薬は過酸化水素、およびジアミノベンチジンのような酸化色素前駆体を含む。グルコースオキシダーゼで有用なさらなる試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１７８】
放射性元素もまた有用な標識剤であって、本明細書中において説明されるように用いられる。例示的な放射性標識剤は、ガンマ線放射を生じる放射性元素である。１２４Ｉ．１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒのようなそれ自体がガンマ線を放射する元素は、ガンマ線放射を生じる放射性元素指示グループの１つのクラスを表す。特に好ましいのは１２５Ｉである。有用な標識手段のもう１つのグループは、それ自体が陽子を放出する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。そのように放出された陽子は、動物の身体に存在する電子との遭遇に際してガンマ線を生じる。また、有用なのは１１１インジウムまたは３Ｈのようなベータ放射体である。
【０１７９】
標識の連結、すなわち、ポリペプチドおよび蛋白質またはファージの標識は当該分野で良く知られている。例えば、蛋白質は、培養基における成分として供される放射性同位体−含有アミノ酸の代謝的取り込みによって標識することができる。例えば、Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）参照。活性化された官能基を通じての蛋白質コンジュゲーションまたはカップリングの技術は特に適用できる。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８  Ｓｕｐｐｌ．７：７−２３（１９７８），Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：８８９−８９４（１９８４），および米国特許第４，４９３，７９５号参照。
【０１８０】
診断システムは、好ましくは別々のパッケージとしての特異的結合剤を含むこともできる。「特異的結合剤」は、本発明の結合メンバー種に選択的に結合することができる分子体、またはそのような種を含有する複合体であるが、それ自体は、本発明の結合メンバーではない。例示的な特異的結合剤は抗体分子、補体蛋白質またはその断片、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡ等である。好ましくは、特異的結合剤は、その種が複合体の一部として存在する場合、結合メンバー種に結合する。
【０１８１】
好ましい具体例において、特異的結合剤を標識する。しかしながら、診断システムが標識されない特異的結合剤を含む場合、該剤は、典型的には、増幅手段または試薬として用いる。これらの具体例において、標識された特異的結合剤は、増幅手段を試薬種−含有複合体に結合させる場合に、増幅手段に特異的に結合することができる。
【０１８２】
本発明の診断キットは「ＥＬＩＳＡ」フォーマットで用いて、流体試料中の予め選択されたリガンドの量を検出することができる。「ＥＬＩＳＡ」とは、固相に結合した抗体または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを使用して、試料に存在する抗原の量を検出し、定量し、かつ本発明の方法に容易に適用することができる酵素結合免疫吸着検定法をいう。
【０１８３】
かくして、いくつかの具体例において、本発明の結合メンバーを固体マトリックスに固定して、主題の診断システムにおけるパッケージを含む固体支持体を形成することができる。
【０１８４】
試薬は、典型的には、水性媒体からの吸着によって固体マトリックスに固定されるが、蛋白質およびポリペプチドに適用できる他の固定方法を用いることができ、それは当業者によく知られている。例示的な吸着方法は本明細書中に記載する。
【０１８５】
有用な固体マトリックスも当該分野で良く知られている。そのような材料は水不溶性であって、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）からの商標ＳＥＴＨＡＤＥＸ下で入手可能な架橋されたデキストラン；アガロース；Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＩＩ．のＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な直径が約１ミクロンないし約５ミリメートルであるポリスチレンビーズのビーズ；シート、ストリップまたはパドルのような塩化ポリビニル、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、ニトロセルロース−またはナイロン−ベースのウェブ；またはポリスチレンまたはポリ塩化ビニルから作製されたもののようなマイクロタイタープレートのチューブ、プレートまたはウェルを含む。
【０１８６】
本明細書中に記載されたいずれの診断システムの結合メンバー種、標識された特異的結合剤または増幅試薬も液体分散液として溶液中にて、あるいは例えば凍結乾燥形態の実質的に乾燥された粉末として供することができる。指示手段が酵素である場合、酵素の基質もシステムの別々のパッケージにて供することもできる。前記したマイクロタイタープレートおよび１以上の緩衝液のような固体支持体もまた、この診断アッセイシステムにおいて別々にパッケージされたエレメントとして含めることもできる。
【０１８７】
（診断方法）
また、本発明では、典型的には、生物学的試料中に存在するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在、好ましくは量を測定するための種々のアッセイ方法も考えられる。
【０１８８】
従って、本発明は：
−固体からの生物学的試料を供し、
−前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを該生物学的試料に加え、
−該生物学的試料に結合した結合メンバーを検出し、それにより、疾患または障害を検出または診断する；
ことを含む、固体においてＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓに関連する疾患または傷害を検出し、または診断する方法に関する。
【０１８９】
結合した結合メンバーは、試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの量に対して直接的または間接的に検出することができる。
【０１９０】
当業者であれば、本発明の結合試薬を用いて、その量が試料中のリガンドの量に関連する結合反応生成物を形成することができる多数のよく知られて臨床診断化学手法があることを理解するであろう。かくして、例示的なアッセイ方法を本明細書中に記載するが、本発明はそのように限定されるものではない。
【０１９１】
種々の不均一および均一プロトコルは、競合的であるかまたは非競合的であれ、本発明のアッセイ方法を行うのに使用することができる。
【０１９２】
結合条件は、受容体のリガンド−結合活性を維持するものである。それらの条件は、約４ないし５０℃の温度範囲、約５ないし９のｐＨ値、および蒸留水のそれから約１モラーの塩化ナトリウムのそれまで変化するイオン強度を含む。
【０１９３】
免疫学の分野においてよく知られているように、検出工程は複合体または結合試薬（複合体の受容体成分）いずれかに向けることができる。かくして、受容体に対して特異的な抗体のような二次結合試薬を利用することができる。
【０１９４】
別法として、複合体は、標識された受容体分子を用い、それにより、標識された複合体を作製することによって検出することができる。この場合における検出は、複合体に存在する標識を検出することを含む。
【０１９５】
さらなる診断方法は、本発明の１つの具体例の結合メンバー組成物の多価性を利用して、リガンドを架橋させ、それにより、複数のリガンドおよびポリペプチドの凝集を形成し、沈殿可能な凝集体を生じさせることができる。この具体例は、免疫沈澱のよく知られた方法に匹敵する。この具体例は、本発明の結合メンバー組成物と試料とを混合して、結合条件下で結合混合物を形成させる工程、続いての、形成された結合複合体を単離する分離工程を含む。典型的には、単離は、混合物から凝集体を除去するための遠心または濾過によって達成される。結合複合体の存在は、検出すべき予め選択されたリガンドの存在を示す。
【０１９６】
（医薬組成物）
好ましい態様において、本発明では、本明細書中に記載された治療方法を実施するのに有用な医薬組成物が考えられる。本発明の医薬組成物は、有効成分としてその中に溶解または分散された、本明細書中に記載された結合メンバーの少なくとも１つの種と共に生理学上許容される担体を含有する。好ましい具体例において、医薬組成物は、その目的が免疫応答を誘導することにあるのではなければ、治療目的でヒト個体に投与した場合には免疫原性ではない。
【０１９７】
１つの態様において、本発明は、前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを含む医薬組成物に関する。好ましい具体例において、医薬組成物は、前記定義の少なくとも２つの異なる結合メンバーを含んで、治療の効果を増加させる。
【０１９８】
本明細書中で用いるように、用語「医薬上許容される」、「生理学上許容される」およびその文法的変形は、組成物、担体、希釈剤および試薬をいい、相互交換的に使用され、物質が、嘔吐、めまい、胃の不調等のような望ましくない生理学的効果を生じさせることなくヒトに投与することができることを表す。
【０１９９】
その中に溶解されまたは分散された有効成分を含有する薬理学的組成物の調製は当該分野で良く理解されている。典型的には、そのような組成物は水性または非−水性の液状溶液または懸濁液いずれかとして滅菌注射剤として調製され；しかしながら、使用に先立って液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。該調製は乳化することもできる。
【０２００】
有効成分は、医薬上許容され、有効成分に適合し、本明細書中に記載された治療方法で用いるのに適した量の賦形剤と混合することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組合せである。加えて、所望であれば、組成物は、有効成分の有効性を高める湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような補助的物質の少量を含有することができる。
【０２０１】
本発明の医薬組成物は、その中に成分の医薬上許容される塩を含むことができる。医薬上許容される塩は、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とで形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基とで形成される）酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄水酸化物のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来することもできる。
【０２０２】
生理学上許容される担体は当該分野で良く知られている。液体担体の例は、有効成分および水以外に物質を含有しない滅菌水性溶液であり、あるいは生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムのような緩衝液、リン酸−緩衝化生理食塩水のような生理食塩水または双方を含有する。なおさらに、水性担体は１を超える緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよびカリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質のような塩を含有することができる。
【０２０３】
液体組成物は水に加えて、および水を除いて、液体相を含むこともできる。そのようなさらなる液体相の例はグリセリン、綿実油のような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル、および水−油エマルジョンである。
【０２０４】
医薬組成物は、典型的には、合計医薬組成物の重量当たり少なくとも０．１重量パーセントの抗体の量の本発明の結合メンバーを含有する。重量パーセントは、合計組成物に対する抗体の重量比率である。かくして、例えば、０．１重量パーセントは１００グラムの合計組成物当たり０．１グラムの抗体である。
【０２０５】
また、本発明は、前記定義の少なくとも１つの結合メンバーを生理学上許容される担体と混合することを特徴とする、本発明の抗体を含む医薬または医薬組成物を調製する方法に関し、該医薬は肺炎、髄膜炎および敗血症のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する疾患または障害の免疫療法で用いられる。
【０２０６】
さらに、本発明は、前記定義の結合メンバーの、肺炎、髄膜炎および敗血症のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する疾患または障害の治療用の医薬組成物の製造のための使用に関する。
【０２０７】
また、医薬組成物は、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリンおよびアミノグリコシドから選択される抗生物質のような抗生物質剤をさらに含むキット−イン−パートであってもよく、および／またはサイトカイン、インターフェロン、成長因子、例えば、ＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのような免疫刺激剤を含むこともできる。該キット−イン−パートは同時、順次または別々の投与で用いることができる。
【０２０８】
さらに、医薬組成物は、特にワクチンとして、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ蛋白質ニューモリシンと組み合わされた本発明による結合メンバーを含むことができる。本発明による結合メンバーを蛋白質ニューモリシンと組み合わせることによって、組合せ産物の免疫特性は蛋白質ニューモリシン単独についてよりも良好であることが判明した。これは、蛋白質ニューモリシンが結合メンバーによって免疫系に提示されるという事実によるものであろう。
【０２０９】
もう１つの具体例において、本発明による抗体は、もう１つの抗−ニューモリシン抗体、例えば、非−溶血、抗−ニューモリシン抗体のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するもう１つの抗体と組み合わされる。
【０２１０】
本発明による抗体は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＤＫ２００４／０００４９２に記載された抗−Ｐｓａａ抗体であってもよい。
【０２１１】
（治療方法）
本発明による結合メンバーは、それらの高い親和性および特異性のため治療方法で特に有用である。従って、結合メンバーは、肺炎、髄膜炎および敗血症のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する疾患または障害に向けて免疫治療的に用いることができる。
【０２１２】
本発明の結合メンバーと組み合わせて本明細書中で用いられる用語「免疫治療的に」または「免疫療法」は、共に、予防的ならびに治療的投与を示す。かくして、結合メンバーを高いリスクの患者に投与して、疾患の尤度および／または重症度を低下させ、既に活性な感染の証拠がある患者に投与し、または感染危険性がある患者に投与することができる。
【０２１３】
本発明の結合メンバーの投与のための用量範囲は、疾患の兆候が軽減され、あるいは感染の尤度が減少する所望の効果を生じさせるのに十分大きいものである。一般に、用量は患者における年齢、状態、性別および疾患の程度と共に変化し、それは当業者によって決定され得る。用量は、いずれかの合併症の事象において個々の医師によって調整され得る。
【０２１４】
本発明の結合メンバーの治療上有効量は、典型的には、生理学的に許容できる組成物にて投与した場合に、ミリリットル（ｍｌ）当たり約０．１マイクログラム（μｇ）ないし約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌないし約５μｇ／ｍｌ、通常約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分なような、抗体の量である。別の言い方をすれば、用量は、１または数日の間の、毎日の１以上の用量当量において、約０．１ｍｇ／ｋｇないし約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇないし約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇないし約２０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【０２１５】
本発明の結合メンバーは、注射によって、または経時的な暫時の注入によって非経口投与することができる。感染は全身的であって、従って、最もしばしばは、医薬組成物の静脈内投与によって治療できるが、他の組織および送達手段が考えられ、そこでは、組織を標的化する結果、疾患が減少することをもたらす可能性がある。かくして、本発明の抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮のように非経口投与することができ、また、ペリスタ手段によって送達することができる。
【０２１６】
本発明の結合メンバーを含有する医薬組成物は、例えば、単位用量の注射によるように便宜には静脈内投与される。本発明の医薬組成物の関連で用いる場合、用語「単位用量」とは、対象に対する単位の用量として適当な物理的に区別されるユニットをいい、各ユニットは、必要な希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルと組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性な物質を含有する。
【０２１７】
治療方法は、さらに、前記定義のキット−イン−パートの使用を含むことができる。
【０２１８】
（受動免疫保護）
結合メンバーは、受動免疫保護で特に有用であり得、それにより、結合メンバーはニューモリシンの作用を中和する。結合メンバーは、実施例１に記載されたアッセイで評価することができる。アッセイの結果、ニューモリシンに向けた結合メンバーの投与が、マウスにおけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する生存、かくして、受動免疫保護の誘導を延長できることを示す。
【０２１９】
（能動的免疫保護）
本発明の抗原性エピトープはワクチンとして用いて、ニューモリシンに対して向けられた哺乳動物における免疫学的応答を刺激することができ、哺乳動物は、例えば、マウス、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ等であり、好ましくは、ヒトである。そのような応答は、ニューモリシンの特異的抗体の誘導を含むことができる。本発明の抗原性エピトープに対して向けられた抗体は、前記したように、ニューモリシン機能を阻害することができ、免疫化は、さらに、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされた感染の予防的処置で用いることができる。
【０２２０】
（ニューモリシンペプチド）
ある態様において、本発明は、本発明による結合メンバーによって認識されるエピトープも含むニューモリシンペプチドに関する。好ましくは、ニューモリシンペプチド、断片、または変種は、好ましくは、配列番号：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６によって識別されるアミノ酸配列を含む。本発明によるニューモリシンペプチドは、配列番号：１１のアミノ酸１ないし４３６よりなるペプチドであり得る。さらに、配列番号：１１のアミノ酸１ないし４３６よりなるニューモリシンペプチドの断片および変種がさらに含まれ、これは、配列番号：１１によって識別されるニューモリシンのアミノ酸５０ないし４３６、またはより好ましくはアミノ酸１００ないし４３６を含む断片を含む。特別な具体例において、ニューモリシンペプチドは、配列番号：１１によって識別されるニューモリシンのアミノ酸２００ないし４３６または３００ないし４３６を含む。ニューモリシンペプチドの変種またはホモログは、前記した結合メンバーに関連したホモログとして定義することができる。
【０２２１】
ニューモリシンペプチド、断片または変種は、好ましくは、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６によって識別されるアミノ酸配列を含む。ニューモリシンペプチドは、８０、６０、４０、３０、２５、２０、１５のような、あるいは１２アミノ酸のようなせいぜい１００のアミノ酸によって構成されるのが好ましい。ニューモリシンペプチドは１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０のような、あるいは少なくとも１００アミノ酸のような少なくとも１２のアミノ酸によって構成されるのがさらに好ましいであろう。
【０２２２】
特別な具体例において、ニューモリシンペプチド断片は配列番号：２７、２９、３０、３１または３２によって識別される。
【０２２３】
ニューモリシンペプチドは、免疫系を刺激することができる抗原性エピトープとして用いることができる。
【０２２４】
（ワクチン組成物）
本発明によるワクチン組成物は、ヒトへの投与で好ましくは許容される、有効成分と１以上の医薬上許容される賦形剤または担体の混合物によるような公知の方法に従って処方することができる。そのような賦形剤、担体、および処方の方法の例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見出すことができる。効果的な投与に適した医薬上許容される組成物を処方するためには、本発明によるそのような組成物は、有効量のニューモリシンペプチドまたはそのアナログを含有する。
【０２２５】
本発明によるワクチン組成物は、治療上有効量で個体に投与することができる。有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢のような種々の因子によって変化し得る。他の因子は投与の形態を含む。
【０２２６】
以下において、ワクチン組成物は、免疫応答を刺激することを含めた、治療的使用で有用な組成物を含むことを意味する。
【０２２７】
ワクチンまたは免疫原性組成物を得るためには、ニューモリシンペプチドまたはアナログ因子を、アジュバント、免疫刺激成分および／または担体のような種々の物質と組み合わせることが必要であろう。アジュバントは、特異的な免疫応答を高めるためにワクチン組成物に含める。
【０２２８】
そのようなアジュバントは、当業者に知られたアジュバント効果を含むいずれの化合物であってもよい。例えば、そのようなアジュバントはミネラル、細菌、植物、合成または宿主起源のものであり得、あるいはそれらは水中油型エマルジョンであり得る。
【０２２９】
アジュバントは：ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラミル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ノル−ＭＤＰともいう）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミミル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ―グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥともいう）、２％スクワレン−Ｔｗｅｅｎ−８０．ＲＴＭ．エマルジョン中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、脂質Ａを含めたリポ多糖及びその種々の誘導体、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイントの不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからのワックスＤ、結核菌、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓで見出される物質、および属Ｂｒｕｃｅｌｌａのメンバー、リポソームまたは他の脂質エマルジョン、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ  ５８７６７および５，５５４，３７２参照）、脂質Ａ誘導体、コレラトキシン誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１およびインターロイキン２よりなる群から選択することができる。
【０２３０】
マウス、ラットおよびウサギのような、実験室動物での抗体の創製のために、非常に多数のアジュバントが記載されており、使用されてきた。そのような状況において、副作用の許容性は、主な目的が強い抗体応答を得ることにあるのでむしろ高い。
【０２３１】
使用のため、および医薬での使用での認可のために、ならびに特にヒトでの使用のために、アジュバントを含めたワクチン組成物の成分はよく特徴付けられていることが要求される。組成物は肉芽種、膿瘍または熱のようないずれかの有害反応の最小の危険性を有することがさらに必要とされる。
【０２３２】
好ましい具体例において、ワクチン組成物はヒト対象への投与に適しており、かくして、好ましいアジュバントはヒト対象への投与に適している。
【０２３３】
治療ワクチンで有用なアジュバントは水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムまたはカルシウムゲルのようなミネラル塩、ＭＦ５９（ミクロ流動化洗剤安定化水中油型エマルジョン）、ＱＳ２１（精製されたサポニン）、ＡＳ０２（ＳＢＡＳ２、水中油型エマルジョン＋モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）＋ＱＳ２１）、モンタナイド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ  ５１およびＩＳＡ−７２０（安定化された油中水型エマルジョン）、（落花生油、マンナイドモノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウムを含有する；ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｕｔａｈ）アジュバント６５のような油エマルジョンおよび界面活性剤ベースの処方、ビロソーム（インフルエンザヘマグロチニンを一体化させるユニラメラリポソームビヒクル）のような粒状アジュバント、ＡＳ０４（ＭＰＬを含むＡｌ塩）、ＩＳＣＯＭＳサポニンおよび（コレステロールのような）脂質の構造複合体、ポリアクチドコ−グリコリド（ＰＬＧ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）のような微生物誘導体（天然および合成）、Ｄｅｔｏｘ（ＭＰＬ＋Ｍ．Ｐｈｌｅｉ細胞壁骨格）、ＡＧＰ（ＲＣ−５２９（合成アシル化単糖））、ＤＣ ｃｈｏｌ（リポソームへ自己組織化することができるリポニダル免疫刺激体）、ＯＭ−１７４（脂質Ａ誘導体）、ＣｐＧモチーフ（免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有する合成オリゴ糖）、非毒性アジュバント効果を持つ修飾された細菌トキシン、ＬＴおよびＣＴ、内因性ヒト免疫モジュレーター、例えば、ｈＧＭ−ＣＳＦまたはｈｌＬ−１２またはＩｍｍｕｄａｐｔｉｎ（Ｃ３ｄタンデムアレイ）、金粒子のような不活性ビヒクルであり得る。
【０２３４】
いくつかの具体例において、ワクチン組成物は、さらに、１以上のさらなる免疫刺激成分を含むことができる。それらは、限定されるものではないが、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）；例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ａｌａ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノルＭＤＰ）およびＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＯ−ＰＥ）、ジメチルグリシン、タフトシン（ｔｕｆｔｓｉｎ）、およびトレハロースジムコレート．モノホスホリル−脂質Ａ（ＭＰＬ）、およびＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅのようなホルミル−メチオニン含有トリペプチドを含む。そのような化合物は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）から商業的に入手可能である。
【０２３５】
担体はアジュバントと独立して存在させることができる。担体の機能は、例えば、特にスルビビン断片の分子量を増加させて、それらの活性または免疫原性を増加させ、安定性を付与し、生物学的活性を増加させ、あるいは血清中半減期を増加させることができる。担体は当業者に知られたいずれの適当な担体であってもよい。担体蛋白質は限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンのような血清蛋白質、チログロブリンまたはオボアルブミン、免疫グロブリン、インスリンのようなホルモン、あるいはパルミチン酸であり得る。ヒトの免疫化では、担体はヒトに許容される生理学上許容される担体であって、安全でなければならない。しかしながら、破傷風トキソイドおよび／またはジフテリアトキソイドは本発明の１つの具体例において適当な担体である。別法として、担体はデキストラン、例えば、セファロースであり得る。
【０２３６】
ある具体例において、ワクチン組成物は、配列番号：２７、２８、２９、３０、３１または３２によって識別されるアミノ酸配列を含むニューモリシンペプチドを含む。配列番号：２９、３０または３１によって識別されるアミノ酸配列を含むペプチドを含むワクチンが好ましい。特に好ましいのは、配列番号：１１によって識別されるニューモリシンの４００ないし４３６、４２２ないし４３６または４２５ないし４３６のアミノ酸配列を含むペプチドである。
【０２３７】
ニューモリシンペプチドは８０、６０、４０、２０、１５、１２、１０、８アミノ酸のような、あるいは６アミノ酸のようなせいぜい１００アミノ酸によって構成されるのが好ましい。ニューモリシンペプチドは８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０アミノ酸のような、あるいは少なくとも１００アミノ酸のような少なくとも６アミノ酸によって構成されるのがさらに好ましいであろう。ある具体例において、ワクチン組成物は、配列番号：２７、２８、２７、３０、３１、３２、３３、３４，３５または３６によって識別される少なくとも１つのニューモリシンペプチドを含む。配列番号：２８、２９、３０または３１によって識別されるペプチドを含むワクチンは好ましい。特に好ましいのは、配列番号：１１によって識別されるニューモリシンのＡＡ  ４２３ないし４３８、４２４ないし４３７、４２５ないし４３６または４２６ないし４３６として確認されるアミノ酸配列を含むペプチドである。
【０２３８】
免疫応答を刺激することができるワクチン組成物が好ましい。ワクチン組成物は投与に際して抗体応答を誘導することができるのが特に重要である。最も好ましいのは、ニューモリシンの溶解活性を阻害することができる抗体の生産を誘導することによって、ニューモリシン阻害応答を誘導することができるワクチンである。他の好ましい具体例は、ニューモリシンのファゴサイトーシスを高めることができる抗体を含む。そのような抗体は、本明細書中で記載する結合メンバーとしての可変領域を含むことによって特徴付けることができる。
【０２３９】
（図面の詳細な説明）
図１  Ｆａｂ断片の模式図
ＶＬ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３およびＶＨ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３から構成される抗原ポケットが示される。
【０２４０】
図２  配列番号：１１を有するニューモリシンアミノ酸配列
Ｇｅｎｅ−ｂａｎｋ  ｎｏ．Ｘ５２４７４の配列に対応するニューモリシンのアミノ酸配列が示される。
【０２４１】
図３  抗−ニューモリシン軽鎖および重鎖可変セグメント
図３Ａは、抗体２６−５Ｆ１２．１の可変軽鎖および重鎖ならびに相補性決定領域のコンセンサス配列を含む。図３Ｂは、抗体２６−２３Ｃ  ２．２の可変軽鎖および重鎖ならびに相補性決定領域のコンセンサス配列を含む。図３Ｃは、抗体２２−１Ｃ１１の可変軽鎖および重鎖ならびに相補性決定領域のコンセンサス配列を含む。該配列は実施例６に記載されたように得られる。
【０２４２】
図４  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓおよび抗体と共にインキュベートされたマウスについての生存ダイアグラム
単独で、あるいはペニシリンおよび／またはニューモリシン抗体（２６−５Ｆ１２）と組み合わせてＰｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｄ３９を注射したマウスの生存は、実施例１に記載するように接種から２４時間後に評価した。
【０２４３】
図５  ニューモリシン抗体の抗溶血活性
ニューモリシン抗体の抗−溶血活性は、実施例３に記載するように、赤血球のニューモリシン媒介溶解に対する阻害効果を評価することによって分析した。３つの抗体（２６−５Ｆ１２、２６−２３Ｃ  ２および２２−６Ｅ６）は特に効果的である。
【０２４４】
図６  エピトープマッピング用のペプチド
ニューモリシンのアミノ酸配列４１９ないし４４６、およびエピトープマッピング用の種々のペプチド配列の概観。
【０２４５】
図７  ニューモリシン抗体エピトープ
図７Ａおよび図７Ｂは、抗体エピトープの同定に関する実施例７で記載したように得られた結果のグラフ表示である。
【０２４６】
図８  ２６−５Ｆ１２クローンの単離
図８Ａは、２６−５Ｆ１２ハイブリドーマ細胞から単離された全ＲＮＡを示す。該ＲＮＡは、重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡ合成で用いた。ＰＣＲ産物を図８Ｂに示す。クローニングの後、コロニーＰＣＲを用いて陽性形質転換体を同定した（図８Ｃ）。
【０２４７】
図９  ２６−２３Ｃ２クローンの単離
図９Ａは、２６−２３Ｃ２ハイブリドーマ細胞から単離された全ＲＮＡを示す。該ＲＮＡは、重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡ合成で用いた。ＰＣＲ産物を図９Ｂに示す。クローニングの後、コロニーＰＣＲを用いて陽性形質転換体を同定した（図９Ｃ）。
【０２４８】
図１０  ２２  １Ｃ１１クローンの単離
２２  １Ｃ１１ハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡを、重鎖および軽鎖可変領域をｃＤＮＡ合成で用いた。ＰＣＲ産物を図１０ＢＡに示す。クローニングの後、コロニーＰＣＲを用いて陽性形質転換体を同定した（図１０Ｂ）。
【０２４９】
図１１  ２６−５Ｆ１２、２６−２３Ｃ２および２２  １Ｃ１１のＣＤＲ配列
２６−５Ｆ１２、２６−２３  Ｃ２および２２  １Ｃ１１の軽鎖および重鎖ＣＤＲの配列を整列させる。２６−５Ｆ１２および２６−２３Ｃ２の重鎖はほとんど同一であり、他方、２２  １Ｃ１１重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３は６−５Ｆ１２および２６−２３Ｃ２の配列から発散する。
【実施例】
【０２５０】
以下の実施例により、本発明をさらに説明し；実施例は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０２５１】
（実施例１）
Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｄ３９（タイプ２）を接種したトランスジェニックメスマウスの生存に対する抗体およびペニシリンの効果の実験。
【０２５２】
（材料）
・８２トランスジェニック雌マウス（Ｍ−Ｂプロジェクト番号＃２４９、プロジェクト名称ＣＤ６４、約８ないし１２週齢）
・０．９％生理食塩水（ＡＡＳ）
・ＰＢＳ  ｐＨ７．４
・シリンジ
・針
・５％血液プレート
・濾過されたウシブロス
・溶媒  ＡＤペニシリン
・ペニシリン１００万ＩＵ（Ｌｏｖｅｎ  Ｄ６７２６）、１０ｍｇ／マウスないし４０ｍｇ／ｍｌ
株：Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  Ｄ３９（タイプ２）（Ｆ１／Ｓ１／ＡＥ２）
抗体：
ＰｄＢ２６−５Ｆ１２．１、１．０ｍｇ／ｍｌ  ０４０５２０
ＯｍｐＡ６−４Ｂ６．１、１．３８ｍｇ／ｍｌ。
【０２５３】
（方法）
時間−２４：Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ株を３×５％血液プレートに接種し、３５℃／ＣＯ２で一晩インキュベートする。
【０２５４】
時間０：Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ株を濾過されたブロス中で１０８ＣＦＵ／ｍｌ（ｃｆ．ＭＵ／Ｆ０７４−０１）までスラリー化し、２×１０５ＣＦＵ／ｍｌまで希釈する（５９．８８ｍｌのＰＢＳ中１２０μｌ  １０８ＣＦＵ／ｍｌ）。
抗体を２００μｇ／ｍｌまで希釈する：
３．００ｍｌのＰｄＢ２６−５Ｆ１２．１＋１２．００ｍｌのＰＢＳ
２．１７ｍｌのＯｍｐＡ６−４Ｂ６．１＋１２．８３ｍｌのＰＢＳ
マウスを細菌（０．５ｍｌ腹腔内）および抗体（０．５ｍｌ腹腔内）で処理する。
【０２５５】
時間１８：ペニシリン：１アンプルを３ｍｌ溶媒中に希釈し、ペニシリン〜２００ｍｇ／ｍｌを加える；さらに希釈：３ｍｌの「２００ｍｇ／ｍｌ」＋１２．００ｍｌの生理食塩水〜４０ｍｇ／ｍｌ。
抗体を２００μｇ／ｍｌまで希釈する：
３．００ｍｌのＰｄＢ２６−５Ｆ１２．１＋１２．００ｍｌのＰＢＳ
２．１７ｍｌのＯｍｐＡ６−４Ｂ６．１＋１２．８３ｍｌのＰＢＳ
マウスをペニシリン（０．２５ｍｌ皮下）および抗体（０．５ｍｌ腹腔内）で処理する。
【０２５６】
時間４８：ペニシリン：１アンプルを３ｍｌ溶媒中に希釈し、ペニシリン〜２００ｍｇ／ｍｌを加え；さらに希釈：３ｍｌの「２００ｍｇ／ｍｌ」＋１２．００ｍｌの生理食塩水〜４０ｍｇ／ｍｌ
マウスをペニシリン（０．２５ｍｌ皮下）で処理する。
【０２５７】
【化２】
2008515390.tif 000003
実験の期間の間の以下の日の朝および午後：マウスをスケールする１ないし４に従ってスコア取りする。
【０２５８】
【化３】
2008515390.tif 000004
結果
マウスの生存を２４時間に評価する。
２６−５Ｆ１２．１を用いて行った実験の結果を図４にまとめ、これは２４時間における増大生存率を示す。
【０２５９】
（実施例２）
（培養上清からの抗体における抗−溶血特性の検出）
（記載）
ニューモリシンに対する抗体はニューモリシンの溶解効果を阻害することができる。溶解効果は血清の存在下でなくなり、それにより、抗体に結合し、抗−溶血アッセイを行う前に洗浄することによって血清を徐供することを必要とする。
【０２６０】
（デバイス）
インキュベーター３７℃
ピペット
遠心機
ＥＬＩＳＡリーダー、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＥＬ  ８００
デジタルカメラ、Ｃａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ  Ｓ２０。
【０２６１】
（材料）
チップ
試薬トレイ
プレートカバー
９６−ウェルマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ２６０８３６−平底）
Ｒｅａｃｔｉ−結合プロテインＧ被覆マイクロウェルストリップ、Ｐｉｅｒｃｅ番号１５１３３。
【０２６２】
（試薬）
Ｒｅｃ．ＰｄＢ、ＰＢＳ  ｗ  １０  ｍＭ  ＤＴＴ中に４μｇ／ｍｌまで希釈
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
ＰＢＳ、ｐＨ７．４
Ｄｅｍ．Ｈ２Ｏ
Ａｌｓｅｖｅｒ流体、ＳＳＩ番号２９４３１中ヒツジ赤血球５０％
緩衝液：
ＰＢＳ  ｐＨ７．４
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でＰＢＳ  ｐＨ７．４。
【０２６３】
（対照）
キャッチング：
陰性：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でＰＢＳ  ｐＨ７．４
溶血：０．０５％Ｔ  ｗｅｅｎ２０でＰＢＳ  ｐＨ７．４
高い陽性：ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈されたＰｄＢ２２−６Ｅ６
低い陽性：ＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌまで希釈されたＰｄＢ２２−６Ｅ６。
【０２６４】
（試料）
試料は１ないし５μｇ／ｍｌであると予測された抗体濃度を持つ未希釈培養上清である。
【０２６５】
（手法）
ストリップをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄する。
５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．０５％Ｔｗ２０、続いて５０μｌ／ウェルの未希釈培養上清または５０μｌ／ウェルの対照を添加する。
室温にて１時間インキュベートする。
「Ｔｗｅｅｎ２０なしの」ＰＢＳで４回洗浄する。
５０μｌのＰＢＳを各ウェルに加え、Ａ１−Ｂ１を１００μｌ／ウェル添加する。
組換えＰｄＢを予め加熱されたＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌまで希釈し、１０ｍＬ  ＤＴＴ（最終濃度）で３７℃にて１５分間活性化する。
Ａ１−Ｂ１を除いて、５０μｌ／ウェルの活性化されたＰｄＢを加える。
３７℃にて３０分間インキュベートする。
ヒツジ赤血球をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中に２％容量／容量まで再度懸濁させる。
５０μｌを各ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートする。
１０００×ｇにおいて５分間プレートを遠心する。
プレートのデジタルイメージを得る。
１００μｌの上清を平底マイクロウェルに注意深く移し、４０５ｎｍにおいてＯＤを読む。
【０２６６】
【化４】
2008515390.tif 000005
（実施例３）
ニューモリシンの溶解活性を阻害する抗体の能力の測定。
【０２６７】
（記載）
ニューモリシンに対する精製された抗体は、赤血球で観察される溶解効果を阻害することができ、これは、抗体のスクリーニングについての機能的アッセイを表す。
【０２６８】
（デバイス）
インキュベーター３７℃
ピペット
遠心機
ＥＬＩＳＡリーダー、ＢＩＯ−ＰＥＫ  ＥＬ  ８００
デジタルカメラ、Ｃａｎｏｎ  Ｐｏｗｅｒｓｈｏｔ  Ｓ２０。
【０２６９】
（材料）
チップ
試薬トレイ
プレートカバー
９６−ウェルマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ２６０１７０−Ｕ−形状）
９６−ウェルマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ２６０８３６−平底）。
【０２７０】
（試薬）
Ｒｅｃ．ニューモリシン（ＰＬＹ）またはＲｅｃ．ニューモリソイド（Ｐｎｅｕｏｍｏｌｙｓｏｉｄ）（ＰｄＢ）
１０μｇ／ｍｌまで希釈されたＰＢＳ中ＰｄＢロット番号Ｐ０１１１０３  ０．２ｍｇ／ｍｌ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
ＰＢＳ、ｐＨ７．４
Ｄｅｍ．Ｈ２Ｏ
Ａｌｓｅｖｅｒ流体、ＳＳＩ番号２９４３１中のヒツジ赤血球５０％
緩衝液：
ＰＢＳ  ｐＨ７．４
１０ｍＭ  ＤＴＴを含むＰＢＳ。
【０２７１】
（試料）
精製された抗体試料をＰＢＳ中に希釈する。
【０２７２】
（手法）
（溶血終点の測定）
これは、ＰＬＹまたはＰｄＢの各新しいバッチにつき測定される。全ての試料は三連でなされる。対照は以下の通りである：
ブランク：１００μｌの緩衝液（０％溶血）
合計：１００μｌのＤｅｍ．Ｈ２Ｏ（１００％溶血）
ＰＬＹ／ＰｄＢの希釈系列はＰＢＳ  ｗ．１０ｍＭ  ＤＴＴ中で調製する：４０−２０−１０−５−２、５−１、２５−０、６２５−０、３１２５μｇ／ｍｌ。１００μｌを各ウェルに加え、３７℃にて１５分間インキュベートする。ヒツジ赤血球（５０％）をＰＢＳ中に３回洗浄し、２％容量／容量まで戻す。５０μｌを各ウェルに加え、３７℃にて３０分間インキュベートする。１０００×ｇにおいて５分間遠心する。
プレートのデジタルイメージを得る。
１００μｌの上清を平底マイクロウェルプレートに移し、４０５ｎｍにおいて読む。９０％溶血を与えるニューモリシンの濃縮を２回、阻害アッセイにおける標準濃縮として用いる。
【０２７３】
（阻害アッセイ）
全てのテストは二連にて丸底プレートで行う。
対照は以下の通りである：
ブランク＝１００μｌのＰＢＳ
全溶血＝１００μｌのｄｅｍ．Ｈ２Ｏ
陰性＝５０μｌのニューモリシン＋５０μｌのＰＢＳ
ニューモリシン：２０μｌ／ｍｌ＝１μｇ／ウェルまで希釈されたＰｄＢ  ０３１２０１、０．５ｍｇ／ｍｌをプールする。
ＰＬＹ／ＰｄＢを予熱したＰＢＳ中に希釈し、１０ｍＭ  ＤＴＴ（最終濃度）で３７℃にて１５分間活性化する。
５０μｌの抗体希釈を各ウェルに加え、続いて、５０μｌの活性化されたＰＬＹ／ＰｄＢに加える。
プレートを３７℃にて３０分間インキュベートする。
ヒツジ血液をＰＢＳ中で３回洗浄し、２％容量／容量まで戻す。
５０μｌを各ウェルに加え、３７℃にて３０分間プレートをインキュベートする。
１０００×ｇにおいて５分間遠心する。
プレートのデジタルイメージを得る。
１００μｌの上清を第ニの平底マイクロウェルプレート（プレート２）に移し、４０５ｎｍにおいて読む（その例を表１に示す）。力価を、５０％溶血を阻害する抗体の希釈として測定し、以下の表４に含める。
【０２７４】
（試料）
全ての精製された抗体はＰＢＳ中に５００μｌ／ｍｌまで希釈する。
Ｓ１＝  Ｒａ−ａ−ニューモリシン
Ｓ２＝  ＯｍｐＡ１７−１０Ｃ７  ０３１０２４
Ｓ３＝  ２２−６Ｅ６．５  ０４０２２４
Ｓ４＝  ２６−５Ｆ１２．１  ０４０５２０
Ｓ５＝  ２６−２３Ｃ２．２  ０４０３１９
Ｓ６＝  ２６−１８Ｇ８．２  ０４０３１９
Ｓ７＝  ２６−３０Ｈ１０．２  ０４０３１９
Ｓ８＝  ２８−１０Ｅ７．２  ０４０５１４
Ｓ９＝  ２６−１４Ｇ４  ０４０３０５
Ｓ１０＝  １３−２Ｅ１２．１  ０３１１０５
Ｓ１１＝  ２２−１Ｃ１１．１  ０３１２１１
【０２７５】
【化５】
2008515390.tif 000006
試料１ないし１１に関するデータをここに以下の表に示す。
【０２７６】
【化６】
2008515390.tif 000007
表１  ４０５ｎｍにおけるＯＤ
溶血の％は得られたデータ（表１）から得られ、これをここに以下の表に示す。
【０２７７】
【化７】
2008515390.tif 000008
表２  ％で表す溶血
阻害の％は得られたデータ（表２）から計算し、ここに以下の表３に示す。
【０２７８】
【化８】
2008515390.tif 000009
表３  溶血の阻害の％
結果のグラフ表示を図５に示す。
【０２７９】
抗体の力価は前記したデータに基づいて測定し、ここに以下の表４にまとめる。
【０２８０】
【化９】
2008515390.tif 000010
表４  選択された抗体の力価。
【０２８１】
（実施例４）
（抗−ニューモリシンＨｕＭａｂのアフィニティー特徴付け）
結合力測定は、１つの濃度のｍＡｂを抗原被覆表面に流すことによって行った。
【０２８２】
（方法および材料）
チップ上に被覆された材料：プロテイン−Ｇチップタイプ：ＣＭ５。２００３年９月１６日に調製されたチップ。
被覆密度：ＦＣ１  ＆  ３＝ブランク、ＦＣ２＝６２８６  ＲＵ、ＦＣ４＝６７００ＲＵ
被覆条件：蛋白質の濃度＝５μｇ／ｍＬ、希釈緩衝液：酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．５
流す緩衝液：ＨＢＳ＝ＥＰ。
【０２８３】
（試薬）
抗体（精製）：
１．４Ｅ８                        ０．９４ｍｇ／ｍＬ
２．２２−６Ｅ６                  ２．５０ｍｇ／ｍＬ
３．２６−２３Ｃ２                ３．４０ｍｇ／ｍＬ
４．２６−５Ｆ１２                １．２６ｍｇ／ｍＬ
５．２２−１Ｃ１１                ５．８０ｍｇ／ｍＬ
６．１３−２Ｅ１２                １．０３ｍｇ／ｍＬ
７．１０−３Ｇ７．２              １．１０ｍｇ／ｍＬ
８．１０−５Ｇ３．３              ０．８２ｍｇ／ｍＬ
９．１０−１４Ａ５．２            ０．９１ｍｇ／ｍＬ
１０．１０−５Ｇ３．２            １．１４ｍｇ／ｍＬ
抗原：０．６ｍｇ／ｍＬ、５７ｋＤａ（全長ｗ／  Ｈｉｓ−タグ）。
【０２８４】
（実験条件）
捕獲（Ａｂ）濃度：２０ｕｇ／ｍＬ濃度、２００ｕＬ＠５０ｕＬ／分流速
会合時間：４分
解離時間：２０分
チップの再生：１７ｕＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋７５  ＮａＣｌ＠７５ｕＬ／分流速の１つのパルス。
【０２８５】
（結果）
この実験からのアフィニティー見積もりおよび速度定数をここに以下の表１にリストする。会合および解離の最初の数秒は１：１ラングミュアーモデルに適合させて、アフィニティーおよび速度定数を得た。
【０２８６】
【化１０】
2008515390.tif 000011
表１  ニューモリシン抗体のアフィニティーおよび速度定数。
【０２８７】
（実施例５）
（抗−ＣＤ６４×抗−ニューモリシン５−９Ａ７二重特異的抗体の創製）
ＨｕＭＡｂ、抗−ＣＤ６４（８８．５３）、および抗−ニューモリシンの各々のＦ（ａｂ’）２断片をペプシン消化によって作製し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーによって均一になるまで精製する。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、Ｆ（ａｂ’）２断片の双方は＞９５％純度である。
【０２８８】
該８８．５３のＦａｂ’断片は、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）でのＦ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド結合間の温和な還元によって生じる。正確な還元条件は、小規模の実験におけるコンジュゲーションに先立って決定する。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、該８８．５３Ｆａｂ’は＞９０％純度である。
【０２８９】
該８８．５３のＦａｂ’断片をＧ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離する。Ｆａｂ’断片をジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）と共にインキュベートして、Ｆａｂ−ＴＮＢコンジュゲートを得る。
【０２９０】
抗−ニューモリシン抗体のＦａｂ’断片は、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）でのＦ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド結合間の温和な還元によって生じさせる。正確な還元条件は、小規模な実験におけるコンジュゲーションに先立って決定する。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、Ｆａｂ’は９０％純度である。
【０２９１】
Ｆａｂ’断片はＧ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、１：１モル比の８８．５３Ｆａｂ−ＴＮＢと室温にて一晩混合する。
【０２９２】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって、二重特異的抗体を汚染Ｆａｂ’分子から精製し、精製された分子をＨＰＬＣによって分析する。
【０２９３】
対照については、抗−ＣＤ６４×抗−ＣＤ８９二重特異的抗体を生じさせる。ＨｕＭＡｂ、抗−ＣＤ６４（８８．５３）、および抗−ＣＤ８９（１４Ａ８）の各々のＦ（ａｂ’）２断片はペプシン消化によって生じさせ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーによって均一になるまで精製する。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、Ｆ（ａｂ’）２断片の双方は＞９５％純度である。
【０２９４】
該８８．５３のＦａｂ’断片は、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）でのＦ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド結合間の温和な関係によって生じさせる。正確な還元条件は小規模な実験におけるコンジュゲーションに先立って決定する。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、該８８．５３Ｆａｂ’は＞９０％純度である。
【０２９５】
該８８．５３のＦａｂ’断片は、Ｇ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離する。Ｆａｂ’断片はジニトロチオベンゾエート（ＤＴＮＢ）  １６ａおよび１６ｂと共にインキュベートして、Ｆａｂ−ＴＮＢコンジュゲートを得る。
【０２９６】
１４Ａ８のＦａｂ’断片は、メルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）でのＦ（ａｂ’）２断片の重鎖ジスルフィド結合の間の温和な還元によって生じさせる。正確な還元条件は小規模な実験におけるコンジュゲーションに先立って決定される。サイズ排除ＨＰＬＣを行い、このタイプの分析によると、１４Ａ８  Ｆａｂ’は＞９５％純度である。
【０２９７】
１４Ａ８のＦａｂ’断片はＧ−２５カラムクロマトグラフィーによって遊離ＭＥＡから分離し、１：１モル比の８８．５３Ｆａｂ−ＴＮＢと室温にて一晩混合する。
【０２９８】
二重特異的抗体はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって汚染Ｆａｂ’分子から精製し、精製された分子をＨＰＬＣによって分析する。８８．５３×１４Ａ８二重特異的抗体はほとんど均一となるまで精製する。
【０２９９】
（抗−ＣＤ６４×抗−ニューモリシン二重特異的抗体の結合特異性の特徴付け−二重特異的ＥＬＩＳＡ）
１．ＥＬＩＳＡプレートを組換えニューモリシン、５０μｌ／ウェル、５μｇ／ｍｌで被覆し、４℃にて一晩インキュベートする。
【０３００】
２．プレートをＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロックする。
【０３０１】
３．二重特異的抗体の滴定をプレートに加える。対照は抗−ＣＤ６４×抗−ＣＤ８９二重特異的（対照二重特異的）、および抗−ＣＤ６４  Ａｂ、８８．５３または抗−ニューモリシンＡｂのＦ（ａｂ’）２断片を含む。
【０３０２】
４．次いで、ヒトＩｇＭのＦｃ部分に連結された可溶性ＣＤ６４よりなる融合蛋白質を含有する上清と共にプレートをインキュベートする。
【０３０３】
５．プレートを、最後に、アルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗−ヒトＩｇＭ抗体と共にインキュベートする。陽性ウェルをアルカリ性ホスファターゼ基質で検出する。
【０３０４】
（抗−ＣＤ６４×抗−ニューモリシン二重特異的抗体の結合特異性の特徴付け−ヒトＣＤ６４−トランスジェニックマウス上のＣＤ６４への結合）
血液は、ＣＤ６４トランスジェニックマウスから、または非−トランスジェニック同腹子から採取し、３０μｇ／ｍｌの濃度の８８．５３×抗−ニューモリシン二重特異的抗体と共に室温にて３０分間インキュベートする。
【０３０５】
血液を洗浄し、次いで、ＦＩＴＣ−標識抗−ヒトＩｇＧ抗体と共に室温にて３０分間インキュベートする。赤血球細胞を溶解させ、残存する白血球をフローサイトメトリーによって染色につき分析する。リンパ球、単球および好中球集団に対応する領域をゲートし、別々に分析する。
【０３０６】
ヒトＣＤ６４を、ＣＤ６４トランスジェニックマウスの単球にて、および程度は低いが好中球にて発現させる。ヒトにおけるように、ＣＤ６４はトランスジェニックマウスのリンパ球によって発現されない。二重特異的抗体はＣＤ６４トランスジェニック単球および好中球に結合するが、非−トランスジェニックマウスに由来するいずれの細胞集団にも結合しない。
【０３０７】
（実施例６）
（モノクローナル抗体の配列決定）
本発明による抗体をコードするＤＮＡを、抗体２６−５Ｆ１２．１につき後に記載されるように配列決定する。
【０３０８】
全ＲＮＡはＳＴＡＴ６０試薬（ＢｉｏＧｅｎｅｓｉｓ）を用いてハイブリドーマ細胞から単離し、ＰＣＲにおける鋳型として用いるためにｃＤＮＡに変換した。アガロースゲル分析は、ペレットからの抽出されたＲＮＡの高い収率を示した（図８Ａ）。
【０３０９】
ｃＤＮＡは該ＲＮＡから作製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＨｅａｖｙプライマーおよびＬｉｇｈｔプライマーミックスを用い、重鎖および軽鎖可変領域を増幅した。ＰＣＲ産物をトリス−アセテート−ＥＤＴＡアガロースゲルで分析した。ｃＤＮＡでのこれらのプライマーを用いるＰＣＲは、図８Ｂに示したバンドを与えた。
【０３１０】
ＰＣＲ産物の直接的クローニングは貧弱な形質転換効率を与え、従って、ＰＣＲ産物をゲル精製し、クローン化した。ＰＣＲにおいて陽性の試料を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローン化した。
【０３１１】
精製されたＶＬおよびＶＨ  ＰＣＲ産物を配列決定ベクターにクローン化し、コロニーＰＣＲによって陽性形質転換体を測定した（図８Ｃ）。
【０３１２】
各鎖につき全ての陽性クローンを拾い出し（通常３）、順方向および逆方向配列決定プライマー双方で配列決定した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｖ３．１  ＤＮＡ配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるジデオキシ方法によってクローンを配列決定した。
【０３１３】
配列決定分析は、可変重鎖について５つの正しいクローンを同定し、モノクローナル抗体２６−５Ｆ  １２．１の可変軽鎖については７つ同定した。これらのクローンの各々についてのＤＮＡおよび蛋白質配列を以下に示す。
モノクローナル抗体２６−５Ｆ  １２．１配列決定結果
【０３１４】
【化１１】
2008515390.tif 000012
【０３１５】
【化１２】
2008515390.tif 000013
【０３１６】
【化１３】
2008515390.tif 000014
【０３１７】
【化１４】
2008515390.tif 000015
【０３１８】
【化１５】
2008515390.tif 000016
【０３１９】
【化１６】
2008515390.tif 000017
【０３２０】
【化１７】
2008515390.tif 000018
２６−５Ｆ  １２．１の可変軽鎖および重鎖の配列を図３Ａに示し、ここに、ＣＤＲの配列も含める。
モノクローナル抗体２６−２３  Ｃ２．２配列決定分析
ＲＮＡを前記したように抽出し、高い収率を示す（図９Ａ）。
【０３２１】
ｃＤＮＡはＲＮＡから作製した。ＶＬ領域を増幅するために調製した最初のＰＣＲ反応は成功しなかった。新しいプライマーを順序立てて、別々の反応にてＶＨおよびＶＬを増幅した。元来のｃＤＮＡでこれらのプライマーを用いるＰＣＲにより、図９Ｂに示されるＶＨおよびＶＬバンドを与えた。
【０３２２】
精製されたＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物を配列決定ベクターにクローン化し、陽性形質転換体をコロニーＰＣＲによって測定した（図９Ｃ）。
【０３２３】
ＶＨおよびＶＬクローンを拾い、配列決定した。５つのＶＨクローンおよび３つのＶＬクローンの配列をここに以下に示す。
モノクローナル抗体２６−２３  Ｃ２．２配列決定の結果
【０３２４】
【化１８】
2008515390.tif 000019
【０３２５】
【化１９】
2008515390.tif 000020
【０３２６】
【化２０】
2008515390.tif 000021
【０３２７】
【化２１】
2008515390.tif 000022
２６−２３  Ｃ２の可変軽鎖および重鎖の配列を図３Ｂに示し、ここに、ＣＤＲの配列も含める。
モノクローナル抗体２２  １Ｃ  １１配列決定分析
ｃＤＮＡはｍＲＮＡから作製した。モノクローナル抗体ＤＮＡのＶＨおよびＶＬ領域を増幅するためのＰＣＲ反応は、図１０Ａに示されるバンドを与えた。
【０３２８】
精製されたＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物を配列決定ベクターにクローン化し、コロニーＰＣＲによって陽性形質転換体を測定した（図１０Ｂ）：
７つのＶＨおよび６つのＶＬクローンを各鎖につき拾い出し、順方向および逆方向配列決定プライマー双方で配列決定した。配列決定分析により、モノクローナル抗体２２−１Ｃ１１のＶＨ鎖について５つの正しいクローンを同定した。
【０３２９】
ＶＬ配列決定は貧弱な品質のものであった。さらに６つのクローンを拾い出し、配列決定して、合計６つのクローンからのコンセンサス配列を得た。
【０３３０】
陽性ＶＨおよびＶＬクローンについてのＤＮＡおよび蛋白質配列を以下に示す。
モノクローナル抗体２２−１Ｃ  １１配列決定の結果
【０３３１】
【化２２】
2008515390.tif 000023
【０３３２】
【化２３】
2008515390.tif 000024
【０３３３】
【化２４】
2008515390.tif 000025
悪い品質の配列
【０３３４】
【化２５】
2008515390.tif 000026
【０３３５】
【化２６】
2008515390.tif 000027
【０３３６】
【化２７】
2008515390.tif 000028
２２−１Ｃ  １１の可変軽鎖および重鎖の配列を図３Ｃに示し、ここに、ＣＤＲの配列も含める。
【０３３７】
２６−５Ｆ１２、２６−２３  Ｃ２および２２  １Ｃ  １１のＣＤＲ配列の整列を図１１に示す。
【０３３８】
（実施例７）
エピトープの局所化の同定
ニューモリシンの２８アミノ酸残基を表す１２アミノ酸のニューモリシンの合成ペプチド断片を生産する。該ペプチドは、少なくとも８つのアミノ酸残基を持つ隣接断片と重複する。ペプチドを図６に示す。断片への抗体結合を、ここに以下に示すように標準ＥＬＩＳＡアッセイでテストする。用いる全てのペプチドはビオチニル化ペプチドである。
デバイス：
３７におけるインキュベーター
ピペット
Ｅｌｉｓａリーダー
材料：
チップ
試薬トレイ
プレートカバー
Ｒｅａｃｔｉ−結合ストレプトアビジンＨＢＣ被覆９６−ウェルマイクロ−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）
試薬：
ウサギ−α−ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ  Ｐ０２１４）
ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）
緩衝液：
洗浄および希釈緩衝液：０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ
ブロッキング緩衝液：洗浄緩衝液に２％ＳＭＰ（脱脂粉乳）を加える
対照
陰性：ブランク
陰性：ＰｓａＡペプチド９１４４  ビオチン−ＫＤＰＮＮＫＥＦＹＥＫＮＬＫＥＹＴＤＫＬＤＫＬＤＫ−ＮＨ２、１ｍｇ／ｍｌ  ０４０６３０
陽性：ＰＬＹペプチド１０１４６  ビオチン−ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴ−ＯＨ、５ｍｇ／ｍｌ
ペプチド：
ペプチド  ”ＧＮＴ−０１”  ビオチン−ＲＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ−ＯＨ，  ５  ｍｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０２”  ビオチン−ＩＲＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷ−ＯＨ，  ５  ｍｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０３”  ビオチン−ＫＩＲＥＣＴＧＬＡＷＥＷ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０４”  ビオチン−ＶＫＩＲＥＣＴＧＬＡＷＥ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０５”  ビオチン−ＳＶＫＩＲＥＣＴＧＬＡＷ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０６”  ビオチン−ＬＳＶＫＩＲＥＣＴＧＬＡ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ  
ペプチド  ”ＧＮＴ−０６１”  ビオチン−ＮＬＳＶＫＩＲＥＣＴＧＬ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０６２”  ビオチン−ＲＮＬＳＶＫＩＲＥＣＴＧ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０７”  ビオチン−ＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０８”  ビオチン−ＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＹ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−０９”  ビオチン−ＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＹＥ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ  
ペプチド  ”ＧＮＴ−１０”  ビオチン−ＬＡＷＥＷＷＲＴＶＹＥＫ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−１３”  ビオチン−ＥＷＷＲＴＶＹＥＫＴＤＬ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
ペプチド  ”ＧＮＴ−１４”  ビオチン−ＷＷＲＴＶＹＥＫＴＤＬＰ−ＯＨ，  ５０  μｇ／ｍｌ
手法
被覆されたプレートをウェル当たり３×３００μｌの洗浄緩衝液でよく濯ぐ。
【０３３９】
全てのペプチドをＰＢＳ中に２．５μｌ／ｍｌまで希釈する。１００μｌをウェル当たり加え、平板を室温にて１時間インキュベートする。設定をここに以下に示す。
【０３４０】
プレートをウェル当たり３×２００μｌの洗浄緩衝液で流しつつ濯ぎ、２％ＳＭＰを含む洗浄緩衝液で室温にて３０分間ブロックする。引き続いて、各ウェルを３×２００μｌの洗浄緩衝液で濯ぐ。全てのＭａｂを０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μｌをウェル当たり加え、プレートを３７℃にて１時間インキュベートする。抗体を以下に示すように適用する。
【０３４１】
ウェル当たり２×２００μｌの洗浄緩衝液を用いてプレートを濯ぐ。
【０３４２】
二次抗体ウサギ−α−ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（ＤＡＫＯ  Ｐ０２１４）をブロッキング緩衝液中に１：２０００希釈し、１００μｌをウェル当たり加え、プレートを３７℃にて３０分間インキュベートする。各ウェルを３×２００μｌの洗浄緩衝液ですすぎ、ＯＰＤで３０分間発色させる。
【０３４３】
３つの独立した実験を行い、結果をここに以下にまとめる。プレート１の結果の概観を図７Ａに示し、プレート２の結果を図７Ｂに示す。
【０３４４】
【化２８】
2008515390.tif 000029
【０３４５】
【化２９】
2008515390.tif 000030
【０３４６】
【化３０】
2008515390.tif 000031
【０３４７】
【化３１】
2008515390.tif 000032
【０３４８】
【化３２】
2008515390.tif 000033
結果のグラフ表示を図７Ａおよび７Ｂに示す。
【０３４９】
【化３３】
2008515390.tif 000034
【０３５０】
【化３４】
2008515390.tif 000035
【図面の簡単な説明】
【０３５１】
【図１】Ｆａｂ断片の模式図。
【図２】配列番号：１１を有するニューモリシンアミノ酸配列。
【図３Ａ】抗−ニューモリシン軽鎖および重鎖可変セグメント。
【図３Ｂ】抗−ニューモリシン軽鎖および重鎖可変セグメント。
【図３Ｃ】抗−ニューモリシン軽鎖および重鎖可変セグメント。
【図４】Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓおよび抗体を接種したマウスについての概観図。
【図５】ニューモリシン抗体の抗溶血活性。
【図６】エピトープマッピングのためのペプチド。
【図７】ニューモリシン抗体エピトープの決定を示すグラフ。
【図８】２６−５Ｆ１２クローンの単離。
【図９】２６−２３  Ｃ２クローンの単離。
【図１０】２２  １Ｃ１１クローンの単離。
【図１１】２６−５Ｆ１２、２６−２３Ｃ２および２２−１Ｃ１１のＣＤＲ配列。
【図１】
2008515390.tif 000036
【図２】
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【図３Ａ】
2008515390.tif 000038
【図３Ｂ】
2008515390.tif 000039
【図３Ｃ】
2008515390.tif 000040
【図４】
2008515390.tif 000041
【図５】
2008515390.tif 000042
【図６】
2008515390.tif 000043
【図７】
2008515390.tif 000044
【図８】
2008515390.tif 000045
【図９】
2008515390.tif 000046
【図１０】
2008515390.tif 000047
【図１１】
2008515390.tif 000048
【配列表】
2008515390000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月27日(2007.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008515390000001.app
【国際調査報告】
2008515390.tif 000061
2008515390.tif 000062
2008515390.tif 000063
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