(57)【要約】本発明は、ＢＬｙＳ受容体に結合することができ、そして例えば、細胞傷害性ペプチドのような細胞傷害性因子を送達する、標的化させられたＢＬｙＳポリペプチドに関する。特定の態様においては、細胞傷害性因子には、ｒゲロニンの少なくとも一部が含まれる。これらの組成物は、Ｂ細胞増殖性疾患を処置するため、予防するため、および／またはその治療をモニタリングするために有用である。本発明は、（例えば、腫瘍を含むガン細胞に対する）標的化活性、および細胞傷害活性を有している分子を作成し、そして使用する方法に関する。この分子には、例えば、結合ポリペプチドが含まれ得る。本発明にはまた、これらの結合ポリペプチドから作成される組成物も含まれる。
2008528633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬に結合されたＢＬｙＳポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記治療薬が、細胞傷害性因子、化学療法薬、抗体、サイトカイン、プロ−アポトーシス因子、または脈管形成阻害剤の１つ以上としてさらに定義される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞傷害性因子は、ペプチド、ポリペプチド、または低分子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が融合タンパク質としてさらに定義される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＢＬｙＳポリペプチドがＢ細胞標的化ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＢＬｙＳポリペプチドがＤ−Ｅ受容体認識ループを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＢＬｙＳポリペプチドと細胞傷害性因子とが化学的に結合されている、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞傷害性因子がゲロニン分子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記ゲロニン分子がＢＬｙＳポリペプチドに対して５’に存在している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞傷害性因子が、リシンＡ、ジフテリア毒素、アブリン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオジン、ミラビリス抗ウイルスタンパク質、オオムギリボソーム不活化タンパク質（ＢＲＩＰ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ルフィン、シュードモナスエキソトキシン、およびモモルジンからなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が組み換え体ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体に含まれるとしてさらに定義される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物を含む、宿主細胞。
【請求項１４】
個体に治療有効量の請求項１に記載の組成物を投与する工程を含む、Ｂ細胞増殖性疾患の個体の処置方法。
【請求項１５】
前記Ｂ細胞増殖性疾患が以下からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法：Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫／リンパ形質細胞性リンパ腫（＋／−ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−有毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞性骨髄腫（多発性骨髄腫）、意味未確定の単クローン性免疫グロブリン血（ＭＧＵＳ）、無痛性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、形質細胞腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病（ＨＣＤ）、免疫グロブリン沈着症、全身性軽鎖病、原発性アミロイドーシス、ホジキン病、非ホジキン病、狼瘡、または関節炎。
【請求項１６】
細胞を有効量の請求項１に記載の組成物と接触させる工程を含む、ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞を選択的に標的化する方法。
【請求項１７】
個体に治療有効量の請求項１に記載の組成物を投与する工程を含む、Ｂ細胞増殖性疾患の個体において治療をモニタリングする方法。
【請求項１８】
適切な容器に収められた請求項１に記載の組成物を含む、キット。
【請求項１９】
前記組成物が薬学的に許容された担体の中に含まれている、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記組成物が個体への送達のために適切にアリコートされている、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００５年２月１日に出願された米国仮特許出願番号６０／６４９，４７８に優先権を主張し、これは本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞生物学、分子生物学、ガン生物学、および医薬品の分野に少なくとも関係する。さらに具体的には、本発明は、細胞傷害性因子に結合させられたＢＬｙｓポリペプチドを含む組成物と、そのような組成物の治療での使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｂリンパ球刺激因子は、インビボおよびインビトロの両方でＢ細胞の増殖と分化を誘導する、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーである（非特許文献１）。ＢＬｙＳは、その単球特異的遺伝子とタンパク質発現パターン、およびその特異的受容体の分布とＢリンパ球に対する生物学的活性によって、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）のような他のＢ細胞増殖および分化因子とは区別することができる。ＢＬｙＳの発現は、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞上では検出されず、骨髄を起源とする細胞に限られる。休止している単球上でのＢＬｙＳの発現は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）によってアップレギュレートされる。ＢＬｙＳをコードする遺伝子は、染色体１３ｑ３４にマップされている。
【０００４】
ヒトＢＬｙＳは、２８５アミノ酸のＩＩ型膜結合ポリペプチド、および可溶性の１５２アミノ酸のポリペプチドとして発現される（非特許文献１、前出）。膜に結合した形態のＢＬｙＳは、４７位のアミノ酸残基と７３位のアミノ酸残基の間に膜貫通ドメインを有していると予想される。可溶性形態のＢＬｙＳのＮＨ２末端は、膜結合形態のＢＬｙＳのＡｌａ１３４で始まる。可溶性の組み換え体ＢＬｙＳは、マウスの脾臓Ｂ細胞の増殖をインビトロで誘導し、そして、これらの細胞上の細胞表面受容体に結合することが示されている（非特許文献１、前出）。可溶性のＢＬｙＳのマウスへの投与によっては、ＣＤ４５Ｒｄｕｌｌ、Ｌｙ６Ｄｂｒｉｇｈｔ（ＴｈＢとしても知られている）Ｂ細胞の割合の増加、および血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルの上昇が生じることが示されている（非特許文献１、前出）。したがって、ＢＬｙＳは、その受容体の分布と生物学的活性の両方においてＢ細胞向性を示す。
【０００５】
腫瘍を標的化する治療薬の開発の成功は、治療薬の部位特異的送達に一部依存し、そして、送達される薬剤の生物学的活性にも依存する。モノクローナル抗体が、ほかのあらゆる細胞傷害性因子（例えば、毒素、放射性核種、および成長因子）に対して選択性を与えるために使用されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎ−Ｂｕｓｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｗａｈｌ，１９９４）。１つのこのような分子はゲロニンであり、これは、リシンＡ鎖（ＲＴＡ）と同様の効力および作用機構を有しているが、安定性が改善されており、そして毒性が低い、２９ｋＤａのリボソーム不活化植物毒素である（Ｓｔｉｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これまでの研究によって、植物毒素であるゲロニンと様々な抗体の多数の化学的結合体の生物学的特性が明らかにされ、試験されてきた（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これまでの研究では、抗体ＺＭＥ−０１８が精製されたゲロニンに化学的に結合させられ、そしてこの免疫結合体は、組織培養物中、およびヒト腫瘍異種移植モデルのいずれにおいても、抗原陽性黒色腫細胞に対して特異的な細胞傷害性を示した（非特許文献２；Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０００６】
異常に増殖しているＢ細胞に対して特異性を有している改良された治療薬が必要とされている。
【非特許文献１】Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：２６０−２６３（１９９９）
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ＭＧ，Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ，Ｃｈｅｕｎｇ  Ｌ，Ｒｉｆｋｉｎ  Ｒ，Ｓａｌｍｏｎ  Ｓ，Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ｒ．Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＺＭＥ−０１８  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｔｏｘｉｎ  ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．１９９１；３：６−１３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、（例えば、腫瘍を含むガン細胞に対する）標的化活性、および細胞傷害活性を有している分子を作成し、そして使用する方法に関する。この分子には、例えば、結合ポリペプチドが含まれ得る。本発明にはまた、これらの結合ポリペプチドから作成される組成物も含まれる。本発明のタンパク質様結合体には、例えば、毒素とＢＬｙＳポリペプチドの両方を含む化合物が含まれる。いくつかの実施形態においては、結合ポリペプチドは、融合タンパク質を生産するように組み換えによって操作される。結合させられた化合物はまた、例えば、リンカーによって互いに結合させられている場合がある。
【０００８】
本発明の特異的な実施形態においては、標的化活性および細胞傷害活性は、分子の別の部分によって、その分子に提供されるが、あるいは、１つの部分に、標的化活性と細胞傷害活性の両方の一部または両方が含まれる場合もある。
【０００９】
当業者は、「ＢＬｙＳ」は、ＢＡＦＦ、ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＺＴＮＦ４、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦＳＦ２０、およびδＢＡＦＦポリヌクレオチドまたはポリペプチドと置き換えることができることを認識しているが、別の実施態様においては、置き換えることはできない。当業者は、ＢＬｙＳとおそらく置き換わることができる分子が適切であるかどうかを、例えば、本明細書中に提供される開示および／または当該分野で入手できる開示によって決定する方法を認識している。本発明で想定されるように、配列番号１は、全長の２８５アミノ酸のヒトＢＬｙＳポリペプチドを意味する。配列番号２０は、ヒトＢＬｙＳのポリヌクレオチド配列を意味する。配列番号１の１３４位〜２８５位のアミノ酸残基には、ＢＬｙＳポリペプチドの可溶性イソ型が含まれる。特定の実施形態においては、これは、本発明の結合ポリペプチドにおいて使用されるイソ型である。マウスＢＬｙＳ（ポリペプチド：配列番号２；ヌクレオチド：配列番号３）、またはＢＬｙＳの任意の他のオルトログもまた本発明によって意図される。ＢＬｙＳの機能的等価物もまた、本発明の標的化させられた結合ポリペプチドと共に使用するのに適している。例えば、配列番号１または配列番号２のいずれかに対して少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも８５％の配列相同性、および少なくとも９０％の配列相同性を有している、ＢＬｙＳ活性を保持しているポリペプチドが意図される。さらなる特異的な実施形態においては、ＢＬｙＳのアミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２に由来する、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２５個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１７５個、少なくとも約２００個、少なくとも約２２５個、少なくとも約２５０個、または少なくとも約２７５個の連続しているアミノ酸である。他の実施形態においては、機能的等価物には、受容体の認識に関係している、Ｄ−Ｅループが少なくとも含まれる（Ｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ａｐｒ；９（４）２８８−９２を参照のこと）。
【００１０】
いくつかの実施形態においては、野生型ＢＬｙｓが利用され得、他の実施形態においては、変異体ＢＬｙＳが利用され得る。例示的なＢＬｙＳ変異体としては、Ｃｙｓ１４６での変異体（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；２００４；２００５）が挙げられ、特異的な実施形態においては、変異は、アラニンまたはバリンへの変異である。本発明で使用されるＢｌｙＳ変異体はＢ細胞を標的化する能力を、例えば、少なくとも１つのＢＬｙＳ受容体に結合する能力を保持することによって保持するであろう。ＢＬｙＳ変異体は、例えば、ＢＬｙＳ受容体を介してＢ細胞に結合する能力を含む、野生型ＢＬｙＳに関する任意の活性が増強される場合がある。
【００１１】
本発明のＢＬｙＳ標的化ポリペプチドは、ＢＬｙＳ受容体（例えば、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ（配列番号４）、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ（配列番号５）、およびＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ／ＢＡＦＦＲ（配列番号６））を発現する細胞に対して標的化させられる。本発明の特定の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の機能的等価物を発現している細胞に特異的に結合するであろう。本発明の特定の実施形態においては、ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞が異常なＢ細胞の増殖に関係している可能性があることが意図される。当業者は、ＢＬｙＳが、受容体の認識を媒介するために、二量体を形成する場合があり、また、三量体を形成する場合もあることを認識している。本明細書中で想定される結合ポリペプチドのタンパク質様組成物は、ＢＬｙＳ二量体、三量体、または任意の多量体タンパク質複合体を形成できるであろうことが理解されるであろう。
【００１２】
特定の実施形態においては、ＢＬｙＳポリペプチドは分子に結合させられる。好ましい実施形態においては、結合は共有結合である。さらなる実施形態においては、分子は例えば、細胞傷害性因子、薬物、化学療法薬、放射性同位元素、プロ−アポトーシス因子、脈管形成阻害因子、ホルモン、サイトカイン、成長因子、ペプチド、タンパク質、抗生物質、酵素（例えば、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢまたはＧｒａｎｚｙｍｅ  Ａ）、抗体、抗体のＦａｂ断片、造影剤、核酸または抗原である。これらの分子は代表的なものにすぎない。本発明の範囲に含まれる分子としては、ＢＬｙＳポリペプチドに結合させることができ、ヒト被験体に投与することができる実質的にあらゆる分子が含まれる。好ましい実施形態においては、プロ−アポトーシス因子は、例えば、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、またはセクロピンである。他の好ましい実施形態においては、脈管形成阻害因子は、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、エンドスタチン、または色素上皮由来因子である。さらに好ましい実施形態においては、サイトカインは、例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ（ＩＦ−γ）、ＩＦ−α、ＩＦ−β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。このような例は代表的なものにすぎず、当該分野で公知の他のプロ−アポトーシス因子、脈管形成阻害因子、またはサイトカインを排除するようには意図されない。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態においては、組み換え体ゲロニンペプチド毒素が提供される（配列番号７に示される）。これは、米国特許第５，６３１，３４８号に開示されており、引用により本明細書中に組み入れられる。本発明の組み換え体ゲロニン毒素は毒素活性を保持している配列番号７の任意の部分または断片であり得る。特定の実施形態においては、ゲロニンには、配列番号７の１１０位から２１０位の残基が含まれる。さらなる特異的な実施形態においては、ｒゲロニンのアミノ酸配列は、配列番号７に由来する、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７５個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２５個、少なくとも約１５０個、少なくとも約１７５個、少なくとも約２００個、少なくとも約２２５個、または少なくとも約２５０個の連続しているアミノ酸である。本発明の他の化合物には、コア毒素領域に加えて、配列番号７の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個またはそれ以上の連続しているアミノ酸残基が含まれている、組み換え体ゲロニン毒素が含まれる。本発明の他の実施形態においては、ゲロニンには、配列番号２１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｐ３３１８６）が含まれる。いくつかの実施形態においては、野生型ｒＧｅｌが利用され得、他の実施形態においては、変異体ｒＧｅｌが利用され得る。本発明の特異的な実施形態においては、２００２年２月１２日に提出された米国特許出願番号１０／０７４，５９６（その全体が引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているｒＧｅｌ分子が、本発明において使用される。
【００１４】
本発明の１つの実施形態においては、配列番号８に示される配列を有している例示的な結合ポリペプチドが提供される。結合ポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号９に示される。本発明の別の実施形態においては、配列番号１０に示される配列を有している例示的な結合ポリペプチドが提供される。結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１に示される。
【００１５】
本発明の他の実施形態においては、本発明によって提供される細胞傷害性因子は、例えば、アブリン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオジン、ミラビリス抗ウイルスタンパク質、オオムギリボソーム不活化タンパク質（ＢＲＩＰ（ｂａｒｌｅｙ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ルフィン、および／またはモモルジンであり得る。
【００１６】
本発明のポリペプチドは、本発明の特定の態様においては、結合させられる場合がある。一般的には、これらの結合ポリペプチドは、少なくとも５アミノ酸の長さである。本発明の特定の実施形態においては、結合ポリペプチドは、例えば、約５〜約１０アミノ酸の長さ、約５〜約５０アミノ酸の長さ、約５〜約１００アミノ酸の長さ、約５〜約１５０、約５〜約５００、約５〜約１０００、または約５〜約５０００アミノ酸の長さである。
【００１７】
本発明のポリペプチドの結合体は、例えば、化学的結合および「遺伝的結合」の両方を含む任意の適切な手段によって、生産することができ、例えば、細胞傷害性ペプチドに動作可能であるように連結させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む組み換え体融合タンパク質である。ＢＬｙＳポリペプチドとの意図される結合体には、タンパク質のＮ末端領域（最初の１００アミノ酸の中）、内部領域（Ｎ末端領域とＣ領域の間）、および／またはタンパク質のＣ末端領域（最後の１００アミノ酸の中）に結合が含まれる。本発明で使用されると想定される結合技術は、本明細書中に詳細に記載される。
【００１８】
本発明の結合ポリペプチドは、細胞外で発現させることができる。本発明の特異的な実施形態においては、ポリペプチドには、融合体またはキメラポリペプチドが含まれる。キメラポリペプチドには、２つ以上のポリペプチドの全体または不連続な部分が含まれる。ポリペプチドの不連続な部分は、特定できる機能または活性を含むアミノ酸領域を意味する。融合タンパク質は、第１のポリペプチドまたは第１のポリペプチドの一部が、第２のポリペプチドまたは第２のポリペプチドの一部に対して、末端−対−末端で連結させられている、キメラタンパク質のタイプである。
【００１９】
本発明によってはまた、Ｂ細胞増殖性疾患の被験体を処置するための方法も提供される。この方法には、結合ポリペプチドを含む、本発明の１つ以上の分子の治療有効量を、疾患を有している被験体に投与する工程が含まれる。用語「Ｂ細胞増殖性疾患」は、悪性細胞の集団ならびに非悪性細胞の集団を示し、これらは、多くの場合は、形態学的に、かつ遺伝学的にも、周辺組織とは異なる概観を示す。細胞傷害性ポリペプチドは、当業者に公知であり、本明細書中でさらに詳細に記載される様々な手段によって、ＢＬｙＳポリペプチドに連結させることができる。
【００２０】
本発明によって処置することができる例示的なＢ細胞増殖性疾患としては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫／リンパ形質細胞性リンパ腫（＋／−ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−有毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞性骨髄腫（多発性骨髄腫）、意味未確定の単クローン性免疫グロブリン血（ＭＧＵＳ）、無痛性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、形質細胞腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病（ＨＣＤ）、免疫グロブリン沈着症、全身性軽鎖病、および原発性アミロイドーシス。
【００２１】
本発明の具体的な態様においては、組成物および方法は、処置に不応性であるＢ細胞増殖性疾患に向けられる。疾患は、最初、処置に対して不応性である場合があり、また、疾患は、最初の処置もしくはその後の処置の間に、処置に対して不応性となる場合もある。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、Ｂ細胞増殖性疾患の少なくとも１つの症状の予防および／または処置のための本発明の組成物に関する。本発明の特定の実施形態においては、本発明の組成物は、例えば、自己免疫疾患（例えば、関節炎または狼瘡）の予防および／または処置のために使用される。予防の実施形態に関しては、症状は、発症が完全に妨げられる場合も、また、症状が現れるのが遅らせられる場合もある。処置の実施形態に関しては、症状は、完全に解消される場合も、また、部分的に改善される場合もある。
【００２３】
本発明の他の態様においては、複数の方法と複数の組成物が、同じＢ細胞増殖性疾患について別の処置を受けた個体、別の処置を受けるであろう個体、または処置を受けている個体に利用される。任意のさらなる治療を使用することができるが、具体的な実施形態においては、さらなる治療には、放射線治療、化学療法、外科手術、遺伝子治療、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００２４】
特異的な実施形態においては、Ｂ細胞増殖性疾患の個体を処置する方法が存在する。この方法には、患者に、治療有効量の組成物（例えば、結合ポリペプチド（細胞傷害性ペプチドに結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む））を投与する工程が含まれる。具体的な態様においては、この方法にはさらに、ＢＬｙＳ受容体の発現を増大させる薬剤を個体に投与する工程が含まれる。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態においては、ＢＬｙＳ受容体が宿主細胞に導入され、宿主細胞の中で発現させられる。これによって、ＢＬｙＳを、その自然な向性ではない細胞に対して標的化させることができる。特定の実施形態においては、本発明のＢＬｙＳ結合体（例えば、融合タンパク質）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、組織特異的プロモーターによる発現において調節される。例えば、ＢＬｙＳ受容体分子（例えば、配列番号４（遺伝子配列：配列番号１２））が、適切なベクターによって宿主の肝細胞に導入される。ＢＬｙＳ受容体の発現は、肝ガン特異的プロモーターによって制御される。したがって、ＢＬｙＳ結合ポリペプチドは、治療のために肝ガン細胞に対して標的化させることができる。本発明の他の実施形態においては、結合ポリペプチドは、患者の中でのポリペプチドの標的化の前進を追跡するために、造影剤に結合させられる場合がある。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態においては、ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞を選択的に標的化する方法が存在する。この方法には、細胞を、細胞傷害性ペプチドに結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む結合ポリペプチドと接触させられる工程が含まれる。
【００２７】
本発明の別の実施形態においては、Ｂ細胞増殖性疾患の治療をモニタリングする方法が存在する。この方法には、細胞傷害性ペプチドと造影剤に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む、治療有効量の結合ポリペプチドを、患者に投与する工程が含まれる。
【００２８】
本発明は、２つ以上のポリペプチド構成要素が１つの化合物として提示される多ポリペプチド組成物に関する。したがって、ＢＬｙＳタンパク質は、例えば、ゲロニン毒素に、そして、第２、第３、第４、第５、第６、またはそれ以上のポリペプチドにも結合させられる場合がある。
【００２９】
本発明の他の実施形態においては、Ｂ細胞増殖性疾患の処置および／または予防のためのキットが存在する。これには、例えば、別の分子（例えば、細胞傷害性因子または医薬品）に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む組成物が含まれる。特異的な実施形態においては、組成物には、ｒＧｅｌとＢＬｙＳの融合タンパク質、および／またはそれをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３０】
したがって、本発明の実施形態においては、別の分子（これには、ＢＬｙＳと同一ではない分子が含まれる）に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む組成物が存在する。特異的な態様においては、別の分子はＢＬｙＳのホモログではない。本発明の具体的な態様においては、別の分子には、例えば、医薬品、キレート、細胞傷害性因子が含まれる。組成物の成分は、例えば、融合タンパク質として含まれる場合も、また、化学的に結合させられている場合もある。本発明の組成物には、組み換え体ポリペプチドおよび／または組み換え体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれ得る。特異的な態様においては、組成物にはさらに、放射活性物質、細胞造影剤、または両方が含まれる。組成物は、薬学的に許容される担体の中に含まれる場合がある。
【００３１】
ＢＬｙＳポリペプチドの特異的な態様においては、ポリペプチドには、Ｂ細胞標的化ドメインが含まれ、Ｄ−Ｅ受容体認識ループが含まれ、配列番号１または配列番号２の全体またはそれらの機能的な部分が含まれ、そして／あるいは、ＢＬｙＳの機能的等価物が含まれる。この場合、機能的等価物は、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも８０％の配列相同性を有している。
【００３２】
細胞傷害性因子が使用される複数の実施形態においては、細胞傷害性因子は任意の適切な種であり得るが、具体的な実施形態においては、細胞傷害性因子には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、または低分子が含まれる。特異的な態様においては、細胞傷害性ペプチドには、ゲロニンペプチドが含まれ、これは、例示的な実施形態においては、ＢＬｙＳポリペプチドに対して５’側に存在する。本発明の特異的な実施形態においては、ゲロニンペプチドには配列番号７が含まれる。さらなる特異的な実施形態においては、ゲロニンペプチドには、配列番号７の１１０〜２１０位のアミノ酸残基が含まれる。
【００３３】
本発明の特異的な実施形態においては、細胞傷害性因子は、例えば、リシンＡ、ジフテリア毒素、アブリン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオジン、ミラビリス抗ウイルスタンパク質、オオムギリボソーム不活化タンパク質（ＢＲＩＰ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ルフィン、シュードモナスエンドトキシン、およびモモルジンからなる群より選択される。
【００３４】
本発明の特定の態様においては、組成物には、例えば、配列番号８および／または配列番号１０が含まれる。
【００３５】
本発明の具体的な態様においては、本発明の組成物を含む宿主細胞が存在する。本発明の他の具体的な態様においては、本発明の組成物の少なくとも一部（組成物全体を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチドが存在する。特異的な実施形態においては、ポリヌクレオチドには、配列番号９または配列番号１１が含まれる。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態においては、Ｂ細胞増殖性疾患の個体を処置する方法が存在する。この方法には、例えば、患者に、別の分子（例えば、細胞傷害性因子）に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む、治療有効量の組成物を投与する工程が含まれる。この方法にはさらに、例えば、ＢＬｙＳ受容体の発現を増大させる薬剤を個体に投与する工程が含まれる。本発明の特異的な態様においては、ＢＬｙＳ受容体は、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ（配列番号４）、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ（配列番号５）、およびＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ／ＢＡＦＦＲ（配列番号６）からなる群より選択される。
【００３７】
本発明の１つの実施形態においては、ＢＬｙＳ受容体を発現する細胞を選択的に標的化する方法が存在する。この方法には、細胞を、細胞傷害性因子に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む組成物と接触させる工程が含まれる。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態においては、Ｂ細胞増殖性疾患の個体において治療をモニタリングする方法が存在する。この方法には、個体に、細胞傷害性因子と造影剤に結合させられたＢＬｙＳポリペプチドを含む、治療有効量の組成物を投与する工程が含まれる。
【００３９】
前述には、以下の本発明の詳細な説明がより理解され得るように、本発明の特徴と技術的な利点がかなりおおまかに説明された。本発明のさらなる特徴と利点は本明細書中で以下に記載され、これは、本発明の特許請求の範囲の主題を形成する。開示される概念と特異的な実施形態を、本発明の同じ目的を実施するための改良または他の構造の設計の基礎として容易に利用できることは、当業者に理解されるべきである。そのような同等の構成は、本明細書中に示される本発明の精神および範囲から逸脱しないこともまた、当業者に理解されるべきである。その構成と操作方法の両方に関する、本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、さらなる目的および利点とともに、添付の図面と組み合わせて考慮されると、以下の説明からより理解されるであろう。しかし、それぞれの図は、例示および説明の目的のためにのみ提供され、そして、本発明の限定の定義とは意図されないことは、明確に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される場合は、「ａ」または「ａｎ」の指定は、１つ以上を意味する場合がある。特許請求の範囲（単数または複数）において本明細書中で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合は、用語「ａ」または「ａｎ」は、１つを意味する場合も、また１つ以上を意味する場合もある。本明細書中で使用される場合は、「別の」は、少なくとも１つの第２のもの、またはそれ以上を意味する場合がある。本発明のいくつかの実施形態においては、１つ以上のエレメント、方法の工程、および／または本発明の方法から構成される場合があり、あるいは原則として１つ以上のエレメント、方法の工程、および／または本発明の方法から構成される場合もある。本明細書中に記載される任意の方法または組成物は、本明細書中に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施できることが意図される。
【００４１】
Ｉ．定義
用語「結合させられた」は、いくつかの実施形態において本明細書中で使用される場合は、細胞傷害性因子である分子に対するＢＬｙＳ分子の結合を意味する。結合は、当該分野の任意の適切な方法によって行われ得るが、特異的な態様においては、結合は、リンカーなどによる組み換えによって行われる。具体的な態様においては、イオン結合が使用され、例えば、アビジン−ビオチン結合の使用によって行われる。
【００４２】
ＩＩ．本発明
本発明によって、ＢＬｙＳポリペプチドの受容体を提示する、異常に増殖しているＢ細胞に対して標的化させられた組成物が提供される。正常に増殖しているＢ細胞、ならびに他の細胞タイプは、ＢＬｙＳ受容体を発現しない。本発明のポリペプチドには、標的化ドメインとしての役割を担うＢＬｙＳポリペプチドと、標的化させられた細胞（単数または複数）の増殖を減少させるか増殖させないようにする細胞傷害性ペプチドが含まれる。このようなポリペプチドは、異常に増殖しているＢ細胞に対して特異的な細胞傷害活性を有しており、したがって、任意のＢ細胞増殖性疾患の治療に有用である。このような治療用のポリペプチドを設計し、使用する方法が本明細書中に記載される。
【００４３】
ＩＩＩ．ＢＬｙＳタンパク質様化合物
本発明は、標的化させられた結合ポリペプチド、具体的には、被験体に対して治療的利点を付与する標的化させられた結合ポリペプチドに関する。特定の実施形態においては、本発明は、タンパク質様分子を含む新規の組成物に関する。特定の実施形態においては、タンパク質様化合物を、アミノ酸残基の欠失、置換、または付加によって修飾できることが意図される。具体的な実施形態においては、ＢＬｙＳには、分子がＢＬｙＳ受容体に結合する活性を含むことをなおも可能にする変異が含まれる。変異は、ＢＬｙＳ分子をコードするポリヌクレオチドの中に存在し得る。例示的なＢＬｙＳ変異体としては、Ｃｙｓ１４６での変異体（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；２００４；２００５）が挙げられ、特異的な実施形態においては、変異は、アラニンまたはバリンへの変異である。本発明で使用されるＢＬｙＳ変異体は、Ｂ細胞を標的化する能力を、例えば、少なくとも１つのＢＬｙＳ受容体に結合する能力を保持することによって保持するであろう。ＢＬｙＳ変異体は、例えば、ＢＬｙＳ受容体を介してＢ細胞に結合する能力を含む、野生型ＢＬｙＳに関する任意の活性が増強される場合がある。
【００４４】
さらに、タンパク質様化合物には、２つ以上のポリペプチド構成要素を含むアミノ酸分子が含まれ得る。本明細書中で使用される場合は、「タンパク質様分子」、「タンパク質様組成物」、「タンパク質様化合物」、「タンパク質様鎖」、または「タンパク質様材料」は、一般的に、約３個から約１００個のアミノ酸のペプチド、約１００個を超えるアミノ酸のポリペプチド、および約２００個を超えるアミノ酸のポリペプチド、または、遺伝子から翻訳された全長の内因性配列を意味するが、これらに限定はされない。上記に記載された全ての「タンパク質様」用語は、本明細書中では同義的に使用され得る。さらに、これらの用語は、さらに、結合ポリペプチドまたはタンパク質結合体に適用される場合もある。
【００４５】
特定の実施形態においては、少なくとも１つのタンパク質様分子の大きさには、約または少なくとも、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００個、またはそれ以上のアミノ酸分子の残基、ならびにその中の導くことができる任意の範囲が含まれ得るが、これらに限定はされない。
【００４６】
したがって、用語「タンパク質様組成物」には、自然界に存在している合成のタンパク質中の少なくとも２０個の一般的なアミノ酸の少なくとも１つ、または、少なくとも１つの修飾されたアミノ酸もしくは稀なアミノ酸（以下の表１に示されるものが含まれるが、これらに限定はされない）を含む、アミノ酸分子の配列が含まれる。
【００４７】
【化１】
2008528633.tif 000003
本明細書中で使用される場合は、「アミノ分子」は、当業者に公知の、任意のアミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸模倣物を意味する。特定の実施形態においては、タンパク質様分子の残基は連続しており、アミノ分子の残基の配列の間にはいずれの非アミノ分子も存在しない。他の実施形態においては、配列には、１つ以上の非アミノ分子部分が含まれる場合がある。特定の実施形態においては、タンパク質様分子の残基の配列の間には、１つ以上の非アミノ分子が存在している場合がある。
【００４８】
本発明の標的化させられた結合ポリペプチドは、アミノ酸の欠失および／または置換が含まれ得、したがって、欠失を含むタンパク質、置換を含むタンパク質、および欠失と置換を含むタンパク質が、標的化させられた結合ポリペプチドである場合がある。いくつかの実施形態においては、これらの標的化させられた結合ポリペプチドには、例えば、さらに、リンカーのような挿入または付加されたアミノ酸が含まれる場合がある。「標的化させられた融合体欠失タンパク質」は、自然界に存在しているタンパク質の１つ以上の残基が欠失しているが、自然界に存在しているタンパク質の特異性および／または活性は有している。
【００４９】
置換変異体または置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）変異体には、通常、タンパク質の中の１つ以上の部位での１つのアミノ酸の別のアミノ酸での交換が含まれ、そして、ポリペプチドの１つ以上の特性が調節される、具体的には、その効力または特異性が高まるように設計され得る。この種の置換は、好ましくは保存的であり、すなわち、１つのアミノ酸は、類似する形状または電荷を有しているもので置き換えられる。保存的置換は当該分野で周知であり、これには、例えば、以下の変化が含まれる：アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００５０】
欠失または置換に加えて、標的化させられた融合タンパク質は、残基の挿入を有している場合がある。これには、通常、ポリペプチド中の少なくとも１つの残基の付加が含まれる。これには、標的化ペプチドもしくはポリペプチド、または単純に１つの残基の挿入が含まれる場合もある。融合タンパク質と呼ばれる末端付加が以下で議論される。
【００５１】
用語「生物学的な機能的等価物」は当該分野で十分に理解されており、本明細書中でさらに詳細に定義される。したがって、自然界に存在しているポリペプチドのアミノ酸と同じであるかまたは機能的に等価であるアミノ酸の、約７０％から約８０％の間、または約８１％から約９０％の間、またはさらに、約９１％から約９９％の間を有している配列が、タンパク質の生物学的活性が維持されている限りにおいては、含まれる。標的化させられた融合タンパク質は、その自然界に存在している対応物に対して生物学的な機能的等価物であり得る。例えば、これは、受容体結合能力に関して、機能的に等価であり得る。他の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、それらの自然界に存在している対応物よりもそれらの受容体に対して高い親和性を有している場合がある。
【００５２】
用語「機能的に等価であるコドン」は、同じアミノ酸をコードするコドンを意味するように（例えば、アルギニンまたはセリンについての６種類のコドン）、そして、生物学的に等価であるアミノ酸をコードするコドン（以下の表２を参照のこと）をもまた意味するように本明細書中で使用される。
【００５３】
【化２】
2008528633.tif 000004
アミノ酸配列および核酸配列には、さらなる残基（例えば、さらなるＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸、または５’配列もしくは３’配列）が含まれる場合があり、そしてその配列が上記の基準（タンパク質の発現に関係している生物学的なタンパク質活性の維持を含む）を満たす限りは、なおも本質的には、本明細書中に開示される配列の１つに示されるとおりであることが理解されよう。具体的には、末端配列の付加が、例えば、コード領域の５’部分もしくは３’部分のいずれかに隣接している様々な非コード配列を含む場合があるか、または、様々な内部配列（すなわち、イントロン（これは、遺伝子の中に存在することが公知である））が含まれる場合がある核酸配列に適用される。
【００５４】
以下は、等価物、またはさらには改良された第２世代分子を作成するための、タンパク質のアミノ酸の変化に基づく考察である。例えば、タンパク質構造の中の特定のアミノ酸は、例えば、基質分子に対する結合部位のような構造との相互作用による結合能力の感知できるほどの低下を伴うことなく、他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を定義するものはタンパク質の相互作用能力または性質であるので、特定のアミノ酸の置換をタンパク質配列の中に、そしてその基礎となるＤＮＡコード配列の中に作成することができ、そしてそれでもなお、同様の特性を有しているタンパク質を生産させることができる。したがって、以下で議論されるように、様々な変化を、それらの生物学的有用性または活性の感知できるほどの低下を伴うことなく、遺伝子のＤＮＡ配列の中にもたらすことができることが、本発明者らによって意図される。表２は、具体的なアミノ酸をコードするコドンを示す。
【００５５】
このような変化がもたらされる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用による生物学的機能を与えるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該分野で一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性特性が得られるタンパク質の二次構造に関係しており、これは次いで、他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのタンパク質の相互作用を決定することは、認められている。
【００５６】
類似のアミノ酸の置換を、疎水性親水性指標に基づいて効果的に行うことができることもまた、当業者に理解されている。引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第４，５５４，１０１号には、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均疎水性親水性指標（ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｌｏｃａｌ  ａｖｅｒａｇｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が、タンパク質の生物学的特性と相関していることが記載されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００５７】
アミノ酸を、類似する親水性値を有している別のアミノ酸で置換することができ、なおも、生物学的に等価であり、免疫学的にも等価であるタンパク質が生じることが理解される。このような変化においては、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１の範囲内のものが特に好ましく、そして、±０．５の範囲内のものがさらになお、具体的に好ましい。
【００５８】
上記でおおまかに説明されたように、アミノ酸の置換は、一般的には、アミノ酸側鎖の置換（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさなど）の相対的な類似性に基づく。様々な上記の特性を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、これには、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイシンが含まれる。
【００５９】
ＩＶ．結合ポリペプチド
本発明により、さらに、結合体を形成するように少なくとも１つの因子に連結させられた、翻訳されたタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド（通常は、モノクローナルのタイプ）のような、結合ポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドの結合には、化学的結合および「遺伝的結合」の両方が含まれ、例えば、組み換え体融合タンパク質である。本発明のポリペプチドは、当業者に公知の技術を使用して新しく合成することができることもまた意図される。
【００６０】
Ａ．ペプチド合成
本発明の結合ポリペプチドは合成することができる。ペプチド合成技術は当業者に周知である（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６）；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８５；Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｌｉａ，１９８４）；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９７６）。このような合成において使用される適切な保護基は上記のテキストの中に、さらには、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３に見ることができるであろう。これらの合成方法には、成長しつつあるペプチド鎖に対して、１つ以上のアミノ酸残基または適切な保護されたアミノ酸残基の連続的な付加が含まれる。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかは、適切な、選択的に除去することができる保護基によって保護される。様々な選択的に除去することができる保護基が、リジンのような反応性側鎖を含むアミノ酸に利用される。
【００６１】
例として固相合成を使用して、保護されたアミノ酸または誘導されたアミノ酸が、その保護されていないカルボキシル基またはアミノ基を介して、不活性な固体支持体に結合させられる。アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、その後、選択的に除去され、そして、適切に保護された相補的な基（アミノ基またはカルボキシル基）を有している配列の中の次のアミノ酸が混合され、そして、固体支持体にすでに結合させられた残基と反応させられる。アミノ基またはカルボキシル基の保護基は、その後、この新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、そして、（適切に保護された）次のアミノ酸が付加される、などである。所望されるアミノ酸が全て適切な配列に連結させられた後、任意の残っている末端と側鎖保護基（および固体支持体）が、連続的または同時に除去されて、最終的なペプチドが得られる。本発明のペプチドは、ベンジル化またはメチルベンジル化されたアミノ酸を含まないことが好ましい。このような保護基部分は、一連の合成において使用することができるが、これらは、ペプチドが使用される前に除去される。立体構造を拘束するための分子内結合を形成させるためには、他の場所に記載されるように、さらなる反応が必要な場合がある。
【００６２】
Ｂ．リンカー／カップリング剤
複数のペプチドまたはポリペプチドを、生物学的に解離させることができる結合（例えば、選択的に切断することができるリンカーまたはアミノ酸配列）を介して結合させることができる。例えば、腫瘍環境の中に主に存在しているかまたは腫瘍環境において活性である酵素の切断部位を含むペプチドリンカーが意図される。このようなペプチドリンカーの例示的な形態は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、またはメタロプロテイナーゼ（例えば、コラゲナーゼ、ゲラチナーゼ、またはストロメリシン）によって切断されるリンカーである。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、アジュバントに結合させられる。
【００６３】
選択的に切断することができるリンカー、合成のリンカー、または他のアミノ酸配列のようなアミノ酸を、タンパク質様部分を分離させるために使用することができる。加えて、多数のタイプのジスルフィド結合を含むリンカーが公知であり、これらは、毒素部分を標的化剤と結合させるためにうまく使用することができるが、特定のリンカーは、通常、薬物動態特性および能力の差に基づいて他のリンカーに比べ好ましい。例えば、立体的に「隠されている」ジスルフィド結合を含むリンカーは、それらのより大きなインビボでの安定性の理由から好ましく、したがって、作用部位での結合の前に毒素部分の放出を妨げる。さらに、本発明の特定の利点は、ゲロニンおよびリシンの脱グリコシル化されたＡ鎖を含む、任意の多数の毒素部分の使用によって実現されるであろう。
【００６４】
一般的な指針としては、本発明での使用に適している任意の生化学的クロスリンカーもまた、本発明の状況で使用されるであろうことを考慮することができ、そして、さらなるリンカーもまた考慮することができる。
【００６５】
架橋剤は、２つの異なる分子（例えば、安定剤と凝固剤）の官能基を互いに結ぶ分子架橋を形成させるために使用される。２つの異なるタンパク質を段階的な様式で連結させるためには、ヘテロ二官能性クロスリンカーを、望ましくないホモポリマーの形成を排除するために使用することができる。
【００６６】
クロスリンカーを本発明のタンパク質分子と組み合わせることができることが想定される。２官能性架橋試薬は、親和性マトリックスの調製、多様な構造の改良および安定化、結合部位の同定、ならびに構造の研究を含む様々な目的のために広く使用されている。本発明の状況においては、このようなクロスリンカーを使用して、ポリペプチドを安定化させるか、あるいは、例えば、修飾されたタンパク質の標的化能力または全体的な効力を改善することによって、治療薬としてそれをより有用なものにすることができる。例えば、ジスルフィド、酸感受性リンカーなど）のクロスリンカーもまた切断することができる。２つの同じ官能基を有しているホモ２官能性試薬は、同じおよび異なるマクロ分子またはマクロ分子のサブユニットの間での架橋、ならびに、結合パートナー上の特異的な結合部位に対するポリペプチドの結合を誘導することにおいて、非常に有効であることが証明されている。ヘテロ２官能性試薬には、２つの異なる官能基が含まれる。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用することにより、架橋を、選択的および連続的の両方で制御することができる。２官能性架橋試薬は、それらの官能基（例えば、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的基）の特異性にしたがって分けることができる。これらのうち、遊離のアミノ基に向けられた試薬は、それらの商業的有用性、合成の容易さ、およびそれらを適用することができる穏やかな反応条件の理由から、特によく知られている。ほとんどのヘテロ２官能性架橋試薬には、第１級アミン反応基とチオール反応基が含まれている。
【００６７】
別の例においては、ヘテロ２官能性架橋試薬と架橋試薬を使用する方法が記載されている（その全体が引用により本明細書中に具体的に組み入れられる、米国特許第５，８８９，１５５号）。架橋試薬は、求核性ヒドライド残基を求電子性マレイミド残基と結合させ、それによって、一例では、遊離のチオールに対してアルデヒドをカップリングさせる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように修飾することができ、したがって、ポリペプチドと糖を架橋するために有用である。特定のポリペプチド（例えば、ゲロニン）にその自然界に存在している配列の中に所定の架橋試薬の影響を受けやすい残基が含まれていない例においては、一次配列の中での保存的な遺伝子の変化または合成によるアミノ酸の変化を利用することができる。
【００６８】
その結合部分に対するポリペプチドの結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）または結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）のためのいくつかの方法は当該分野で公知である。このような結合方法には、例えば、以下を使用する金属キレート錯体の使用が含まれる：例えば、有機キレート化剤（例えば、ジエチレントリアミン５酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン４酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはポリペプチドに結合させられたテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル−３（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる））。ポリペプチドはまた、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩のようなカップリング剤の存在下で、酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとの結合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。米国特許第４，９３８，９４８号においては、乳房の腫瘍の画像化がモノクローナル抗体を使用して行われ、そして検出することができる画像化部分が、メチル−ｐ−ヒドロキシベンズイミデートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオネートのようなリンカーを使用してポリペプチドに結合させられる。
【００６９】
Ｃ．造影剤
本発明のいくつかの態様においては、ＢＬｙＳポリペプチドは、少なくとも１つの造影剤に結合させられる。ポリペプチドに結合させられている造影剤の限定ではない例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、色のついた粒子もしくはリガンド（例えば、ビオチン）が挙げられる。
【００７０】
多くの適切な造影剤は当該分野で公知であり、抗体に対するそれらの結合のための方法も公知である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；４，９３８，９４８号；および４，４７２，５０９号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと）。使用される画像化部分は、常磁性イオン；放射性同位元素；蛍光色素；ＮＭＲで検出することができる物質；Ｘ線画像化であり得る。
【００７１】
常磁性イオンの場合には、例えば、以下を例示的なイオンとしてあげることができる：例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）。ガドリウムが特に好ましい。他の状況（例えば、Ｘ線画像化）に有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩＩ）、そして特に、ビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７２】
治療用途および／または診断用途のための放射性同位元素の場合には、以下をあげることができる：アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５イオウ、テクネシウム９９ｍ、および／またはイットリウム。１２５Ｉが、しばしば、特定の実施態様での使用に好ましく、そしてテクネシウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１もまた、多くの場合に、それらの低エネルギーと長い範囲の検出に適しているとの理由から、好ましい。本発明の放射標識されたモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法にしたがって生産することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウム、および化学的酸化剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム）、あるいは、酵素酸化剤（例えば、ラクトペルオキシダーゼ）との接触によってヨウ素化させることができる。ポリペプチドに対する金属イオンとして存在する、放射性同位体に結合させるためにしばしば使用される中間段階の官能基は、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【００７３】
結合体としての使用が意図される蛍光標識の中には、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｄｉｃ  Ｂぅえ）、ＲＥＧ、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ）、レノグラフィン（Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが挙げられる。
【００７４】
アジド基を含む分子もまた、低強度の紫外線によって生じる反応性ナイトレン中間体を通じてタンパク質に対して共有結合を形成させるために使用することができる（Ｐｏｔｔｅｒ  ＆  Ｈａｌｅｙ，１９８３）。具体的には、プリンヌクレオチドの２−アジドアナログおよび８−アジドアナログが、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するために、部位特異的フォトプローブ（ｐｈｏｔｏｐｒｏｂｅ）として使用されている（Ｏｗｅｎｓ  ＆  Ｈａｌｅｙ，１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。２−アジドヌクレオチドおよび８−アジドヌクレオチドはまた、精製されたタンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマップするためにも使用されており（Ｋｈａｔｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、そして結合剤として使用することができる。
【００７５】
Ｖ．治療薬
本発明の特定の態様においては、本発明のＢＬｙＳポリペプチドは別の分子（治療薬と考えられ得る）に結合させられる。特定の態様においては、治療薬は、細胞傷害性因子、放射性同位元素、低分子、化学療法薬、プロ−アポトーシス因子、自然界に存在している産物、抗体、サイトカイン、ケモカイン、血管形成阻害因子、プログラムされた細胞死の調節因子などであり得る。
【００７６】
治療薬のいくつかの例が以下のテキストで議論される。
【００７７】
Ａ．細胞傷害性因子
本発明では、標的化分子において細胞傷害活性が利用される。そして特異的な実施形態においては、細胞傷害活性は、毒素と呼ばれる場合もある。任意の毒素は、（例えば）それが、結合させられたポリペプチドの標的化部分を妨害しない限り、そしてそれが、標的化させられた細胞の増殖を（完全には阻害できないにしても）少なくとも遅くする限りは、本発明に適している。
【００７８】
リボソーム阻害毒素（ＲＩＴ）は、真核生物でのタンパク質合成の強力な阻害因子である。これらのタンパク質の酵素ドメインは、細胞傷害性ｎ−グリコシダーゼとしての役割を担う。これは、一旦これらが細胞内区画に侵入できると、リボソームを触媒によって不活化させることができる。これには、２８ｓｒＲＮＡ中の４３２４位のアデニンのｎ−グリコシド結合の切断によって行われ、これによって、おそらくは伸張因子の結合部位が破壊されることによってリボソームが不可逆的に不活化させられる。ＲＩＴ（これは、細菌から単離されている）は、高等植物において一般的である。植物においては、２つのタイプがある：タイプＩ毒素は、リボソーム阻害活性を有している１つのポリペプチド鎖を有し、タイプＩＩ毒素は、細胞結合特性を有しているＢ鎖に対するジスルフィド結合によって連結させられた、タイプＩタンパク質と同様のＡ鎖を有している。タイプＩ  ＲＩＴの例は、ゲロニン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオジン、ミラビリス抗ウイルスタンパク質、オオムギリボソーム不活化タンパク質（ＢＲＩＰ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ルフィン、およびモモルジンである。タイプＩＩ毒素としては、リシンとアブリンが挙げられる。毒素は、本明細書中で議論されるポリペプチドの任意のもの結合させることができるか、またはポリペプチドの任意のものとともに融合タンパク質として発現させることができる。
【００７９】
本発明の一部としては、リシンＡ鎖（Ｂｕｒｂａｇｅ，１９９７），ジフテリア毒素Ａ（Ｍａｓｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｉｄｏｒ，１９９７）、破傷風毒素Ａサブユニット、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）腸毒素Ａサブユニット、コレラ毒素Ａサブユニット、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）毒素ｃ末端のような毒素が適している。融合タンパク質の調節することができるジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子を含むプラスミドのトランスフェクションは、ガン細胞にとっては細胞傷害性であることが明らかにされている。本発明に有用であることが想定される他の毒素としては、アブリン、Ａ／Ｂ熱不安定性毒素、ボツリヌス菌（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ、ジャッカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）またはジャックフルーツ、ピーナッツ凝集素（Ｐｅａｎｕｔ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ）、およびビスカミン（Ｖｉｓｃｕｍｉｎ）が挙げられる。
【００８０】
上記の治療薬の任意のものを、本発明のポリペプチドに結合させることができることが想定される。いくつかの例においては、他のタンパク質の毒素部分を含むキメラタンパク質を組み換えによって発現させることが好ましい場合がある。他の例においては、本明細書中に記載される転換させられたインターナライジングポリペプチドに対して低分子化合物を化学的に結合させることが好ましい場合がある。
【００８１】
特定の実施形態においては、毒素には、分子がなおも細胞傷害活性を含むことを可能にする変異が含まれる。この変異は、毒素をコードするポリヌクレオチドの中に存在する場合がある。
【００８２】
Ｂ．放射性医薬品
放射性同位元素を含む多数の様々な放射性物質をガンの治療に使用することができる。治療用途のための放射性同位体の例としては、例えば、アスタチン２１１、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２ユーロピウム、ガリウム６７、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレニウム、３５イオウ、テクネシウム９９ｍ、イットリウム９０、ルテチウム１７７、サマリウム１５３、ホルミウム１６６、およびアクチニウム２２５が挙げられる。
【００８３】
Ｃ．化学的医薬品
用語「化学療法」はガンを処置するために薬剤を使用することを意味する。「化学療法薬」は、ガンの処置において投与される化合物または組成物を暗示するように使用される。生化学的治療として知られている化学療法の１つのサブタイプには、生物学的療法との化学療法の組み合わせが含まれる。
【００８４】
化学療法薬としては、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ），シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合薬、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ジェムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソ尿素、ピコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、ビンクリスチン、または上記の任意のアナログもしくは誘導変異体が挙げられるが、これらに限定はされない。これらの試薬または薬剤は、細胞内でのそれらの活性の形式（例えば、これらが細胞周期に影響を与えるかどうか、およびこれらがどの段階で細胞周期に影響を与えるかどうか）によって分類される。あるいは、薬剤は、ＤＮＡを直接架橋する、ＤＮＡの中にインターカレートする、または核酸の合成の影響を与えることによって染色体および有糸分裂の異常を誘導するその能力に基づいて特性決定することができる。ほとんどの化学療法薬は、以下のカテゴリーに入る：アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、副腎皮質ホルモン、有糸分裂阻害因子、およびニトロソ尿素、ホルモン剤、混合剤、ならびに、それらの任意のアナログもしくは誘導変異体。
【００８５】
化学療法薬および投与方法、投与量などは当業者に周知であり（例えば、関連部分が引用により本明細書中に組み入れられる、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」を参照のこと）、そして、本明細書中の開示を参照して本発明と組み合わせることができる。投与量のいくつかのバリエーションは、処置される被験体の症状に応じて当然起こるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の被験体について適している用量を決定するであろう。特異的な化学療法薬および投与レジュメの例もまた、本明細書中に記載される。もちろん、本明細書中に記載されるこれらの投与量および薬剤の全ては限定ではない例示にすぎず、他の用量または薬剤を、特異的な患者または用途のために当業者は使用できる。これらの点の間の任意の投与量またはそれらから導くことができる範囲もまた、本発明での使用について予想される。
【００８６】
１．アルキル化剤
アルキル化剤としては、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（サイトキサン）、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、およびメルファランが挙げられるが、これらに限定はされない。特異的な態様においては、トログリタゾンを、これらのアルキル化剤の任意の１つ以上と組み合わせて、ガンを処置するために使用することができる。これらのいくつかは、以下で議論される。
【００８７】
２．代謝拮抗物質
代謝拮抗物質としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、フルダラビン、ジェムシタビン、およびメトトレキセートが挙げられるが、これらに限定はされない。プリンアナログおよび関連する化合物としては、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）、およびペントスタチン（２−デオキシコフォルマイシン）が挙げられるが、これらに限定はされない。メルカプトプリンは、急性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、および慢性顆粒球性白血病において使用されている。トリオグアニン（ｔｈｒｉｏｇｕａｎｉｎｅ）は、急性顆粒球性白血病、急性リンパ球性白血病、および慢性リンパ球性白血病のようなガンの処置に使用されている。ペントスタチンは、ヘアリー細胞白血病、菌状息肉腫、および慢性リンパ球性白血病のようなガンに使用されている。有糸分裂阻害因子としては、例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。エピポドフィロトキシンとしては、テノポシドおよびＶＰ１６のような化合物が挙げられる。タキソイドとしては、ドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が挙げられるが、これらに限定はされない。ビンカアルカロイドとしては、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのような化合物が挙げられる。
【００８８】
３．抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌活性と細胞傷害活性の両方を有する。これらの薬剤または、化学的に酵素および有糸分裂を阻害すること、または細胞膜を変化させることによって、ＤＮＡを妨害する。これらの薬剤は周期特異的ではないので、これらが細胞周期の全ての期において役割を担っている。したがって、これらは、様々なガンに広く使用される。抗腫瘍抗生物質の例としては、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびイダルビシンが挙げられるが、これらに限定はされない。新生物の処置のための臨床的な設定において広く使用されるこれらの化合物は、通常は、静脈内でのボーラス注射、または経口で投与される。
【００８９】
４．ホルモン
副腎皮質ホルモンは、これらがガン細胞を死滅させるか、またはその増殖を送らせるように意図される場合には、化学療法薬とみなされる。副腎皮質ホルモンは他の化学療法薬の有効性を高めることができ、結果として、これらは、併用療法において頻繁に使用される。プレドニソンおよびデキサメタゾンが、副腎皮質ホルモンの例である。
【００９０】
プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）は、子宮内膜および乳房のガンに使用されている。エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）は、乳房および前立腺のようなガンに使用されている。抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）は、乳房のようなガンに使用されている。アンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフロキシメステロン）もまた、乳ガンの処置に使用されている。フルタミドのような抗アンドロゲンは、前立腺ガンの処置に使用されている。性腺刺激ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド）は、前立腺ガンの処置に使用されている。
【００９１】
５．混合剤
いくつかの化学療法薬は、それらの活性に基づくと上記のカテゴリーには適していない。これらとしては、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換された尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００９２】
Ｄ．自然界に存在している産物
自然界に存在している産物は、自然界の供給源からもともと単離され、そして薬理学的活性を有していることが同定された化合物を意味する。このような化合物、そのアナログおよび誘導体は、自然界の供給源から単離されることも、化学合成されることも、また、当業者に公知の任意の技術によって組み換えによって生産することもできる。自然界に存在している産物としては、有糸分裂阻害因子、抗腫瘍抗生物質、酵素、および生物学的応答変更因子のようなカテゴリーが挙げられる。
【００９３】
有糸分裂阻害因子としては、植物アルカロイドおよび他の自然界に存在している因子が挙げられる。これらは、細胞分裂または有糸分裂に必要ないずれかのタンパク質の合成を阻害することができる。これらは、細胞周期の特異的な期の間に動作する。有糸分裂阻害因子としては、例えば、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。
【００９４】
タキソイドは、アッシュ（ａｓｈ  ｔｒｅｅ、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ））の樹皮から単離された関連化合物の１つのクラスである。タキソイドとしては、ドセタキセルおよびパクリタキセルのような化合物が挙げられるが、これらに限定はされない。パクリタキセルは、チューブリンに（ビンカアルカロイドによって使用される部位とは異なる部位で）結合し、そして微小管のアセンブリを促進する。
【００９５】
ビンカアルカロイドは、薬学的活性を有していることが明らかにされている植物アルカロイドの１つのタイプである。これらとしては、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンのような化合物が挙げられる。
【００９６】
Ｅ．ペプチド模倣物
本発明のポリペプチドの調製のための別の実施形態は、ペプチド模倣物の使用である。模倣物は、タンパク質の二次構造のエレメントを模倣する、ペプチドを含む分子である。例えば、引用により本明細書中に組み入れられるＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ」ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，Ｐｅｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，編、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。ペプチド模倣物の使用の背景にある根底となる論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、分子の相互作用（例えば、抗体と抗原の相互作用）を促進するような様式で、アミノ酸側鎖に対して正しい方向を向くように主に存在することである。ペプチド模倣物は、自然界に存在している分子と同様に分子が相互作用することを可能にすると予想される。これらの原理は、本明細書中に開示される標的化ペプチドの自然界での特性の多くを有しているが、変化させられ、そしてさらには改良された特性を有している、第２世代の分子の操作のために使用することができる。
【００９７】
Ｆ．抗体
特定の実施形態においては、同定された標的化ペプチドまたはそれらの受容体に対する抗体を作成することが所望される場合がある。適切な標的化ペプチドまたは受容体、あるいはそれらの一部はリンカー、ポリリンカー、または誘導されたアミノ酸を介して、１つ以上の因子に対してカップリングさせる、接着させる、固定させる、結合させる、または化学的に連結させることができる。これは、二重特異的もしくは多価組成物、またはワクチンが生じるように行うことができる。さらに、これらの組成物の調製に使用される方法は当業者によく知られており、そしてヒト被験体への投与に適して（すなわち、薬学的に許容されて）いなければならないことが想定される。好ましい薬剤は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００９８】
用語「抗体」は、抗原結合領域を有している任意の抗体様分子を意味するように使用され、これには、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体断片が含まれる。様々な抗体ベースの構築物及び断片を調製し使用するための技術は、当該分野で周知である。抗体を調製し、特性決定するための手段もまた当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと；これは、引用により本明細書中に組み入れられる）。
【００９９】
Ｇ．サイトカインおよびケモカイン
特定の実施形態においては、１つの臓器または組織への標的化させられた送達のために、特異的な生体活性物質を１つ以上の標的化ペプチドにカップリングさせることが望ましい場合がある。このような物質としては、サイトカイン、ケモカイン（ｃｈｅｍｉｋｉｎｅ）、プロ−アポトーシス因子、および脈管形成阻害因子が挙げられるが、これらに限定はされない。用語「サイトカイン」は、細胞間媒介因子として別の細胞に対して作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質に関する包括的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、成長因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトーゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インシュリン様成長因子−Ｉおよびインシュリン様成長因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔ−リガンド、またはＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子、およびＬＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語サイトカインには、自然界の供給源に由来するタンパク質、または組み換え細胞培養物に由来するタンパク質と、自然界に存在している配列のサイトカインの生物学的活性のある等価物が含まれる。
【０１００】
刺激活性を有しているサイトカイン、または成長阻害活性を有しているサイトカインを使用することができ、そして特異的な実施形態においては、本発明の組成物ではいずれか１つが利用される。
【０１０１】
ケモカインは、一般的には、ケモカインの発現の部位に対して免疫エフェクター細胞を動員させるための化学誘引物質として作用する。処置部位に対する他の免疫系の成分の動員を強化するためには、例えば、サイトカイン遺伝子と組み合わせて、特定のケモカイン遺伝子を発現させることが有効な場合がある。ケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が挙げられるが、これらに限定はされない。特定のサイトカインはまた化学誘引効果をも有していることが知られており、そして特定のケモカインはまた、用語ケモカインとして分類することもできることは、当業者に理解されるであろう。
【０１０２】
Ｈ．プログラムされた細胞死の調節因子
アポトーシス、すなわち、プログラムされた細胞死は正常な胚発生に不可欠なプロセスであり、これによって、成体組織の恒常性が維持され、そして発ガンが抑えられる（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１０７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーとＩＣＥ様プロテアーゼは、他のシステムでのアポトーシスの重要な調節因子でありエフェクターであることが明らかにされている。Ｂｃｌ２タンパク質は濾胞性リンパ腫と関係していることが発見されており、これは、様々なアポトーシスの刺激に応答してアポトーシスを制御し、細胞の生存性を高めることにおいて突出した役割を担っている（Ｂａｋｈｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｋｌａｒ，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ２タンパク質は、現在は、関連するタンパク質のファミリーのメンバーであると考えられており、これは、「死アゴニスト（ｄｅａｔｈ  ａｇｏｎｉｓｔ）」または「死アンタゴニスト（ｄｅａｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として分類することができる。
【０１０３】
その発見に続いて、Ｂｃｌ２は、様々な刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示されている。また、Ｂｃｌ２細胞死調節タンパク質のファミリー（これは、共通する構造と配列相同性を有している）が存在することが、現在明らかである。これらの様々なファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ２と同様の機能を有しているか（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）、またはＢｃｌ２の機能と反対に作用して、細胞死を促進するかのいずれかである（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが示されている。
【０１０４】
例示的なプロ−アポトーシス因子にはまた、ＴＮＦ、任意のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−６、カスパーゼ−９、またはカスパーゼ−１０ａ／ｂを含む）、または任意のグランザイム（例えば、グランザイムＡまたはグランザイムＢを含む）も含まれる。
【０１０５】
本発明の範囲に含まれることが意図されるプロ−アポトーシス因子の限定ではない例としては、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、またはそれらの組み合わせもしくは混合物が挙げられる。
【０１０６】
Ｉ．血管形成阻害因子
特定の実施形態においては、本発明は、脈管形成阻害因子（例えば、アンギオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＬ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシイミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポエチン２（リジェネロン（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、インターフェロン−α、ヘルビマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（Ｌｉｎｏｍｉｄｅ）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ジェニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、またはミノサイクリン）に結合させられた標的化ペプチドの投与に関係し得る。
【０１０７】
Ｊ．投与量
当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、および具体的には、６２４〜６５２ページに導かれる。投与量のいくつかのバリエーションは、処置される被験体の症状に応じて必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の被験体について適している用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与のためには、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄによって要求される、滅菌性、発熱性、および一般的安全性、および純度についての基準を満たさなければならない。
【０１０８】
上記治療薬の任意のものの用量は、当業者が決定することができる。特定の実施形態においては、適切な用量は約０．１ｍｇ／ｋｇから約０．３ｍｇ／ｋｇであり得、また、約１．５ｍｇ／ｍ２から約２ｍｇ／ｍ２を投与することもできる。あるいは、約０．１ｍｇ／ｍ２、約０．１２ｍｇ／ｍ２、約０．１４ｍｇ／ｍ２、約０．１５ｍｇ／ｍ２、約０．２ｍｇ／ｍ２、約０．２５ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２、約１．０ｍｇ／ｍ２、約１．２ｍｇ／ｍ２、約１．４ｍｇ／ｍ２、約１．５ｍｇ／ｍ２、約２．０ｍｇ／ｍ２、約２．５ｍｇ／ｍ２、約５．０ｍｇ／ｍ２、約６ｍｇ／ｍ２、約８ｍｇ／ｍ２、約９ｍｇ／ｍ２、約１０ｍｍｇ／ｍ２が適切な用量であり得る。
【０１０９】
ＶＩ．融合タンパク質
本発明の他の実施形態は融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的には、第２のポリペプチドまたはタンパク質の全体または一部に対して、Ｎ末端でまたはＣ末端で連結させられた標的化ペプチドの全体または実質的な部分を有する。例えば、融合体は、異種宿主中でのタンパク質の組み換え発現を可能にするために、他の種に由来するリーダー配列を使用する場合がある。別の有用な融合体には、融合タンパク質の精製を容易にするための免疫学的活性のあるドメイン（例えば、抗体エピトープ）の付加が含まれる。融合部分に、またはその近くに切断部位を含めることによって、精製後の余分なポリペプチドの除去が容易になるであろう。他の有用な融合体としては、機能的ドメイン（例えば、酵素に由来する活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナル、または膜貫通領域）の連結が含まれる。好ましい実施形態においては、本発明の融合タンパク質には、治療用タンパク質またはペプチドに連結させられた標的化ペプチドが含まれる。融合タンパク質に取り込ませることができるタンパク質またはペプチドの例としては、細胞増殖抑制タンパク質、細胞破壊性タンパク質、プロ−アポトーシス因子、脈管形成阻害因子、ホルモン、サイトカイン、成長因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および細胞結合タンパク質が挙げられる。これらの例は、限定とは意味されず、本発明の範囲に実質的に含まれると意図され、そしてタンパク質またはペプチドは、標的化ペプチドを含む融合タンパク質に組み込まれ得る。融合タンパク質を作成する方法は当業者に周知である。このようなタンパク質は、例えば、２官能性架橋試薬を使用する化学結合によって、または完全な融合タンパク質の新規合成によって、または、第２のペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列への標的化ペプチドをコードするＤＮＡ配列の結合、その後の完全な融合タンパク質の発現によって、生産させることができる。
【０１１０】
ＶＩＩ．合成ペプチド
それらの比較的小さなサイズの理由から、本発明の標的化ペプチドは、従来技術にしたがって溶液の中で、または固体支持体上で合成することができる。様々な自動合成装置が市販されており、そして、公知のプロトコールにしたがって使用することができる。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９８４）；Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６）；およびＢａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。短いペプチド配列（通常は、約６アミノ酸から約３５〜５０アミノ酸まで）を、このような方法によって容易に合成することができる。あるいは、組み換えＤＮＡ技術を使用することができる。この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターの中に挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適している条件下で培養される。
【０１１１】
ＶＩＩＩ．タンパク質の精製
本発明の実施形態のいくつかは組み換えタンパク質に関係しているが、いくつかの実施形態においては、本発明では、タンパク質（組み換えタンパク質を含む）を精製するための方法およびプロセスが利用される。一般的には、これらの技術には、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分に対する細胞環境の粗画分が、あるレベルで含まれる。ポリペプチドが他のタンパク質から分離されると、目的のポリペプチドを、さらに、部分的な精製または完全な精製（または均質にするための精製）を行うためのクロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用して精製することができる。純粋なペプチドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動法；等電点電気泳動法である。特に有効なペプチドの精製方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、より適切に言えば、ＨＰＬＣである。加えて、このような技術が実行される条件は、精製される分子の特性（例えば、機能的活性）の影響を受ける場合がある。
【０１１２】
本発明の特定の態様は精製に関係し、具体的な実施形態においては、コードされるタンパク質またはペプチドの実質的な精製に関係する。用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、本明細書中で使用される場合は、他の成分から単離することができる組成物を意味するように意図される。この場合、タンパク質またはペプチドは、その自然界で得ることができる状態と比較して任意の程度に精製される。したがって、精製されたタンパク質またはペプチドはまた、それが自然界において存在し得る環境から取り出されたタンパク質またはペプチドを意味する。「実質的に精製された」タンパク質またはペプチド。
【０１１３】
一般的には、「精製された」は、様々な他の成分を除去するための分画に供されている、タンパク質またはペプチド組成物を意味し、そしてこの組成物はその発現させられた生物学的活性を実質的に保持している。用語「実質的に精製された」が使用される場合は、この表記は、タンパク質またはペプチドが組成物の主要な成分を構成する、例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．２％、約９９．４％、約９９．６％、約９９．８％、約９９．９％、約またはそれ以上を構成している組成物を意味する。
【０１１４】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法が、本発明の開示を参照して当業者に公知であろう。これらには、例えば、活性のある画分の比活性を決定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析による画分の中のポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、最初の抽出物の比活性に対してそれを比較すること、およびしたがって、「精製倍数（−ｆｏｌｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）」によって本明細書中で評価される純度の程度を計算することである。活性の量を示すために使用される実際の単位は、もちろん、後に続く精製のために選択される特定のアッセイ技術、および発現させられたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに応じて様々であろう。
【０１１５】
タンパク質の精製での使用に適している様々な技術は当業者に周知であろう。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などでの沈殿、または熱変性、その後の遠心分離；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）；等電点電気泳動法；ゲル電気泳動法；ならびにこれらの技術と他の技術の組み合わせが挙げられる。当該分野で一般的に公知であるように、様々な精製工程を行う順序は変えることができるか、または、特定の工程を省略することができ、なおも、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適している方法が生じると考えられる。
【０１１６】
タンパク質またはペプチドが、常にそれらの最も精製された状態で提供されることは、一般的な要件ではない。実際、実質的にはほとんど精製されていない産物が、特定の実施形態において有用性を有していることが想定される。部分的な精製は、より少ない精製工程を組み合わせて使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの様々な形態を利用することによって行うことができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われた陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって、一般的には、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも、高い「倍数」精製が生じるであろうことが理解される。相対的に低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収率において、または発現させられたタンパク質の活性の維持において利点を有している場合がある。
【０１１７】
ポリペプチドの移動度は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの様々な条件によって、ある場合には有意に、変わり得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。したがって、様々な電気泳動条件下では、精製されたか部分的に精製された発現産物の見かけの分子量が変わる場合があることが理解されるであろう。
【０１１８】
本発明の方法および組成物と組み合わせたペプチドタグの使用もまた想定される。タグは、２つのポリペプチドの間での相互作用を利用する。相互作用に関係しているポリペプチドの１つの部分がタグとして使用される場合がある。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の結合領域をタグとして使用することができる。その結果、グルタチオンビーズは、ＧＳＴタグを含む化合物を富化させるために使用することができる。エピトープタグ（これは、抗体またはＴ細胞受容体によって認識されるアミノ酸領域）を使用することができる。このタグは、修飾されたタンパク質をコードする核酸セグメントに動作可能であるように連結させられた核酸セグメントによってコードされ得、その結果、融合タンパク質は、核酸分子によってコードされる。他の適切な融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、ユビキチン、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）などとの融合タンパク質である。
【０１１９】
ＩＸ．核酸分子
本発明の１つの態様においては、本発明の結合ポリペプチドをコードする核酸分子が利用される。
【０１２０】
Ａ．結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、全ゲノムＤＮＡから取り出された、本発明の標的化させられた融合タンパク質またはポリペプチドの全体または一部を発現することができる、細胞から単離することができるポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、標的化させられた融合タンパク質をコードするように操作することができる自然界に存在しているタンパク質をコードし得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ＢＬｙＳ標的化ポリペプチドに共有結合させられたゲロニンポリペプチドのような、複数の部分をコードする場合がある。本出願で使用される場合は、用語「ポリヌクレオチド」は、全ゲノム核酸のない形で単離された核酸分子を意味する。したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、哺乳動物またはヒトの全ゲノムＤＮＡから単離された、またはそれらが存在しない形で精製された、ポリペプチドをコードする配列であるＤＮＡセグメントを意味する。したがって、例えば、本出願が、ポリヌクレオチドによってコードされるゲロニン、「自然界に存在しているゲロニンポリペプチド」、または「融合ゲロニンポリペプチド」の機能または活性について言及する場合には、ポリヌクレオチドがゲロニンの酵素活性を有している分子をコードすることが意味される。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合は、用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡのない形で単離されたＤＮＡ分子を意味する。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、野生型、多形、または変異体ポリペプチドをコードする配列を含み、哺乳動物またはヒトの全ゲノムＤＮＡから単離された、またはそれらが存在しない形で精製された、ＤＮＡセグメントを意味する。用語「ＤＮＡセグメント」には、ポリペプチド（単数または複数）、ポリペプチドより小さいＤＮＡセグメント、および組み換え体ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が含まれる。
【０１２２】
用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されたＤＮＡを意味するように意図される。ｃＤＮＡを使用することの利点は、ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＲＮＡ、プロセシングされていないＲＮＡ、もしくは部分的にしかプロセシングされていないＲＮＡ鋳型から重合させられたＤＮＡとは反対に、ｃＤＮＡには主に対応するタンパク質のコード配列が含まれることである。全長のゲノム配列または部分的なゲノム配列が好ましい場合（例えば、非コード領域が最適な発現に必要な場合、または非コード領域（例えば、イントロン）がアンチセンスストラテジーにおいて標的化される場合）があり得る。
【０１２３】
所定の種に由来する特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有しているが、それにもかかわらず同じタンパク質をコードする、自然界に存在している変異体によって提示される場合があることもまた想定される（上記の表１を参照のこと）。
【０１２４】
同様に、単離されたかまたは精製された野生型、多形、または変異体ポリペプチド遺伝子を含むポリヌクレオチドは、野生型、多形、または変異体ポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡセグメント意味し、そして特定の態様においては、他の自然界に存在している遺伝子またはタンパク質をコードする配列から実質的に単離された調節配列を意味する。この態様においては、用語「遺伝子」は、簡単にするために、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするユニットを意味するように使用される。当業者によって理解されるように、この機能に関する用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および小さい操作された遺伝子セグメント（これは、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、結合ポリペプチド、および変異体を発現するか、またはそれらを発現するように適応させられている）が含まれる。自然界に存在しているポリペプチドまたは修飾されたポリペプチドの全体または一部をコードする核酸には、以下の長さの、そのようなポリペプチドの全体または一部をコードする連続する核酸配列が含まれ得る：約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１０９５、１１００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、９０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基対。１つのポリヌクレオチド分子は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の異なるポリペプチド（全体または一部）をコードする場合があることが意図される。
【０１２５】
特定の実施形態においては、本発明は、自然界に存在しているポリペプチドに従うか、または自然界に存在しているポリペプチドに原則として対応している連続しているアミノ酸配列をそのアミノ酸配列の中に含む標的化させられた融合ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列が組み込まれている、単離されたＤＮＡセグメントおよび組み換え体ベクターに関する。したがって、単離されたＤＮＡセグメントまたはＤＮＡセグメントを含むベクターは、例えば、自然界に存在しているゲロニンポリペプチドのリボソーム不活化活性と特異性を有しており、そしてＢＬｙＳポリヌクレオチド（例えば、配列番号４または配列番号５）に動作可能であるように連結された、融合ゲロニンポリペプチドをコードし得る。用語「組み換え体」は、ポリペプチドまたは特異的なポリペプチドの名称と組み合わせて使用することができ、これは、一般的には、インビトロで操作されたか、またはそのような分子の複製産物である核酸分子から生産されたポリペプチドを意味する。
【０１２６】
本発明で使用される核酸セグメントは、コード配列自体の長さとは無関係に、他の核酸配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と結合させることができ、その結果、それらの配列の全体の長さは相当に変わる場合がある。したがって、ほとんどのあらゆる長さの核酸断片を使用することができ、全体の長さは、好ましくは、意図される組み換えＤＮＡプロトコールでの調製および使用の容易さによって制限されることが意図される。
【０１２７】
本発明の核酸構築物は、任意の供給源に由来する全長のポリペプチドをコードする場合があり、また短縮バージョンのポリペプチド（例えば、短縮型ゲロニンポリペプチド）をコードする場合もあることが意図される。その結果、コード領域の転写によって短縮されたバージョンが提示される。短縮型の転写物は、その後、短縮型のタンパク質に翻訳される。あるいは、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送、分泌、翻訳後修飾を可能にするため、または標的化もしくは効力のような治療上の利点を可能にするための、さらなる異種コード配列を含む全長のポリペプチド配列をコードする場合がある。上記で議論されるように、タグまたは他の異種ポリペプチドは、修飾されたポリペプチドをコードする配列に付加することができる。この場合、「異種」は、修飾されたポリペプチドと同じではないポリペプチドを意味する。
【０１２８】
限定ではない例においては、特定の遺伝子（例えば、毒素であるゲロニン）と同じであるかまたはそれに相補的なヌクレオチドの連続しているストレッチを含む１つ以上の核酸構築物が調製される場合がある。核酸構築物は、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、２５０，０００、５００，０００、７５０，０００から、少なくとも１，０００，０００ヌクレオチドの長さであり得、さらには、酵母の人工染色体のような核酸構築物の出現が当業者に公知であることを当然とすると、染色体の大きさまで、および染色体の大きさを含む（全ての中間の長さと中間の範囲を含む）、より大きなサイズの構築物である場合もある。「中間の長さ」および「中間の範囲」が、本明細書中で使用される場合は、引用された値を含み、また、引用された値の間の任意の長さまたは範囲（すなわち、そのような値とその間を含む全ての整数）を意味することは、容易に理解されるであろう。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合は、用語「ＤＮＡセグメント」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡのない形で単離されているＤＮＡ分子を意味する。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、野生型、多形、または変異体ポリペプチドをコードする配列を含み、なおも、哺乳動物またはヒトの全ゲノムＤＮＡから単離された、またはそれらが存在しない形で精製されたＤＮＡセグメントを意味する。用語「ＤＮＡセグメント」には、ポリペプチド（単数または複数）、ポリペプチドより小さいＤＮＡセグメント、および組み換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスを含む）などが含まれる。本発明で使用されるＤＮＡセグメントには、生物学的機能が等価なポリペプチドおよびペプチド（例えば、修飾された機能的に等価なゲロニン毒素、または修飾された機能的に等価なＢＬｙＳ）が含まれる。このような配列は、核酸配列の中に、そしてしたがって、コードされるタンパク質の中に自然界において生じることが知られている、コドンの冗長と機能的等価性の結果として生じる場合がある。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組み換えＤＮＡ技術の適用によって作成することができる。この場合、タンパク質構造の変化を、変化させられるアミノ酸の特性の考慮に基づいて操作することができる。ヒトによって設計された変化は、部位特異的突然変異誘発技術の適用によって、例えば、タンパク質の細胞傷害性の改善を導入するために、またはタンパク質を含む任意の処置の効力を高めるために、導入することができる。
【０１３０】
Ｂ．ベクター
自然界に存在しているポリペプチドおよび修飾されたポリペプチドは、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされ得る。用語「ベクター」は、細胞内への導入のためにその中に核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を意味するように使用される。細胞では、ベクターは複製することができる。核酸配列は「外因性」であり得る。これは、ベクターがその中に導入される細胞に対して外来であること、または配列が、細胞内の配列と相同であるが、その配列が通常は見られない宿主細胞の核酸の中の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組み換え技術によってベクターを構築するための知識を十分に身につけている。これは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６に記載されており、いずれも引用により本明細書中に組み入れられる。修飾されたポリペプチド（例えば、修飾されたゲロニン）をコードすることに加えて、ベクターは、例えば、タグまたは標的化分子のような、修飾されていないポリペプチド配列をコードする場合もある。このような融合タンパク質をコードする有用なベクターとしては、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、ヒスチジンのストレッチをコードするベクター、およびその後の精製および分離または切断のためのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の作成において使用される、ｐＧＥＸベクターが挙げられる。標的化分子は、特定の臓器、組織、細胞、または被験体の体内の他の位置に対して修飾されたポリペプチドを指向させるものである。
【０１３１】
用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。いくつかの例においては、その後、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合には、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生産においては、翻訳されない。発現ベクターには、様々な「制御配列」を含めることができる。「制御配列」は、特定の宿主生物の中での動作可能であるように連結させられたコード配列の転写およびおそらくは翻訳に必要な核酸配列を意味する。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターには、他の機能を担っている核酸配列、および下記に記載されている核酸配列も含まれる場合がある。
【０１３２】
１．プロモーターおよびエンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。これには、調節タンパク質および分子が、その位置で、例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子に結合することができる遺伝的エレメントが含まれる場合がある。表現「動作可能であるように配置された」、「動作可能であるように連結させられた」、「制御下」、および「転写制御下」は、プロモーターが、１つの核酸配列に対してその配列の転写開始および／または発現を制御するような関係で、正確な機能的位置および／または方向で存在していることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用することができ、また、「エンハンサー」とは組み合わせずに使用される場合もある。「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化に関係しているシス作用性調節配列を意味する。
【０１３３】
プロモーターは、自然界において遺伝子または配列と結合しているものであり得る。したがって、これは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に存在している５’非コード配列を単離することによって得ることができる。このようなプロモーターは「内因性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーも、その配列の下流または上流のいずれかに存在している核酸配列と、自然界において結合しているものであり得る。あるいは、特定の利点は、組み換え体プロモーターまたは異種プロモーターの制御下にコードする核酸セグメントを配置することによって得られるであろう。組み換え体プロモーターまたは異種プロモーターは、その自然界での環境においては核酸配列とは通常結合していないプロモーターを意味する。組み換え体エンハンサーまたは異種エンハンサーもまた、その自然界での環境においては核酸配列とは通常結合していないエンハンサーを意味する。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核生物、ウイルス、もしくは真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに、「自然界には存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち、発現を変化させる様々な転写調節領域の様々なエレメントおよび／または突然変異を含む）を挙げることができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成によって生産することに加えて、配列は、組み換えクローニング技術および／または核酸増幅技術（本明細書中に開示される組成物と組み合わせたＰＣＲ（登録商標）（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号（それぞれが引用により本明細書中に組み入れられる））を含む）を使用して生産することができる。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの核を含まない細胞小器官（ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）の中での配列の転写および／または発現を指示する制御配列を同様に使用できることが意図される。
【０１３４】
自然界においては、発現のために選択された細胞のタイプ、細胞小器官、および臓器の中でのＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要である場合がある。分子生物学の当業者であれば、通常、タンパク質の発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞のタイプの組み合わせの使用を知っている。例えば、引用により本明細書中に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）を参照のこと。使用されるプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指示するために適切な条件下で、構成的であり得、組織特異的であり得、誘導性であり得、そして／または有用であり得、例えば、組み換え体タンパク質および／またはペプチドの大規模な生産に有利であり得る。プロモーターは異種のものである場合も、また、内因性のものである場合もある。
【０１３５】
組織特異的プロモーターまたはエンハンサーの同定、ならびにそれらの活性を特性決定するためのアッセイは、当業者に周知である。このような領域の例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ソマトスタチン受容体２遺伝子（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、Ｄ１Ａドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、インシュリン様成長因子ＩＩ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）が挙げられる。
【０１３６】
本発明の結合ポリペプチド（例えば、融合タンパク質）の発現での使用が意図されるプロモーターは、以下の表３に示される。
【０１３７】
【化３】
2008528633.tif 000005
【０１３８】
【化４】
2008528633.tif 000006
【０１３９】
【化５】
2008528633.tif 000007
２．開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特異的な開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳に必要である場合がある。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が挙げられる。外因性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）を提供することが必要とされる場合がある。当業者は、これを容易に決定することができ、そして必要なシグナルを提供することができる。挿入断片全体の翻訳を確実にするためには、開始コドンは、所望されるコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、自然界に存在しているもの、または合成のもののいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって高めることができる。
【０１４０】
本発明の特定の実施形態においては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用が、多遺伝子または多シストロン性のメッセージを作成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性の翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスし、そして内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスと脳心筋炎ウイルス）に由来するＩＲＥＳエレメントが記載されており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、さらに、哺乳動物のメッセージに由来するＩＲＥＳも記載されている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。それぞれがＩＲＥＳによって間隔を明けられており、多シストロン性メッセージを形成している複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させることができる。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近することができる。複数の遺伝子を、１つのメッセージを転写させるための１つのプロモーター／エンハンサーを使用して効率よく発現させることができる（引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第５，９２５，５６５号および同第５，９３５，８１９号を参照のこと）。
【０１４１】
３．マルチクローニング部位
ベクターにはマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含めることができる。マルチクローニング部位は、複数の制限酵素部位を含み、それらのいずれかをベクターを消化するための標準的な組み換え技術と組み合わせて使用することができる、核酸領域である（引用により本明細書中に組み入れられるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、およびＣｏｃｅａ，１９９７を参照のこと）。「制限酵素消化」は、核酸分子中の特異的な位置でだけ機能する酵素での核酸分子の触媒的切断を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。頻繁に、ベクターは、外因性の配列をベクターに連結させることができるようにＭＣＳの中を切断する制限酵素を使用して、直鎖状にされるか、または断片化させられる。「連結」は、２つの核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する。２つの核酸断片は、互いに連続している場合も、また、連続していない場合もある。制限酵素反応と連結反応を含む技術は、組み換え技術の当業者には周知である。
【０１４２】
４．スプライシング部位
ほとんどの転写される真核生物ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためのＲＮＡスプライシングを受けるであろう。真核生物のゲノム配列を含むベクターには、タンパク質の発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするためのドナースプライシング部位および／またはアクセプタープロセシング部位が必要である場合がある（引用により本明細書中に組み入れられるＣｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照のこと）。
【０１４３】
５．終結シグナル
本発明のベクターまたは構築物には、通常、少なくとも１つの終結シグナルが含まれるであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関係しているＤＮＡ配列が含まれる。したがって、特定の実施形態においては、ＲＮＡ転写物の生産を終わらせる終結シグナルが意図される。ターミネーターは、所望されるメッセージレベルを得るためにインビボで必要である場合がある。
【０１４４】
真核生物システムにおいては、ターミネーター領域にはまた、新しい転写物の部位特異的切断を可能にし、その結果、ポリアデニル化部位を露出させる、特異的なＤＮＡ配列も含まれる場合がある。これは、約２００個のＡ残基のストレッチ（ポリＡ）を転写物の３’末端に付加させるように、特異的な内因性ポリメラーゼにシグナルを送る。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子はさらなる安定性を示すようであり、そしてより効率よく翻訳される。したがって、真核生物が関係している他の実施形態においては、ターミネーターには、ＲＮＡの切断のためのシグナルが含まれることが好ましく、そしてターミネーターシグナルによってメッセージのポリアデニル化が促進されることがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージのレベルを高めるための、および／またはカセットから他の配列への読取を最少にするような役割を担い得る。
【０１４５】
本発明での使用が意図されるターミネーターとしては、本明細書中に記載されるかまたは当業者に公知である、任意の公知の転写のターミネーターが挙げられる。これには、例えば、遺伝子の終結配列（例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター）、またはウイルス終結配列（例えば、ＳＶ４０ターミネーター）が含まれるが、これらに限定はされない。特定の実施形態においては、終結シグナルは、例えば、配列の短縮が原因で、転写され得る配列または翻訳され得る配列を欠いている場合がある。
【０１４６】
６．ポリアデニル化シグナル
発現（特に、真核生物での発現）においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化を行うためのポリアデニル化シグナルが含まれるであろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功にとっては重要ではないと考えられており、そして／または任意のそのような配列を使用することができる。好ましい実施形態には、便利であり、そして／または様々な標的細胞の中で十分に機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化によっては、転写物の安定性が高まる場合があり、また、細胞質輸送が促進される場合もある。
【０１４７】
７．複製起点
宿主細胞の中でベクターを増幅させるためには、そこから複製が開始される特異的な核酸配列である、１つ以上の複製起点部位（しばしば「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含めることができる。あるいは、自律複製配列（ＡＲＳ）を、宿主細胞が酵母である場合には使用することができる。
【０１４８】
８．選択マーカーおよびスクリーニングマーカー
本発明の特定の実施形態においては、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクターの中にマーカーを含めることによって、インビトロまたはインビボで同定することができる。このようなマーカーは、細胞に対して同定することができる変化を与え、それによって、発現ベクターを含む細胞の簡単な同定が可能となる。一般的には、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。ポジティブな選択マーカーは、マーカーの存在によってその選択が可能となるものであり、一方、ネガティブな選択マーカーは、その存在によってその選択が妨げられるものである。ポジティブな選択マーカーの一例は薬剤耐性マーカーである。
【０１４９】
通常、薬剤選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の履行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現形を付与するマーカーに加えて、他のタイプのマーカー（その根拠が比色分析であるＧＦＰのようなスクリーニングマーカーを含む）もまた意図される。あるいは、スクリーニングが可能な酵素（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））を利用することができる。当業者はまた、おそらくは、ＦＡＣＳ分析と組み合わせて、免疫学的マーカーを使用する方法も知っている。使用されるマーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限りは、重要あるとは考えられない。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【０１５０】
９．宿主細胞
本明細書中で使用される場合は、用語「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、同義的に使用することができる。これらの用語には全て、それらの子孫（これは任意のおよび全てのその後の世代である）も含まれる。全ての子孫は、意図的な変異または故意ではない変異が原因で同じではない場合もあることが理解される。異種核酸配列を発現させる状況においては、「宿主細胞」は原核生物細胞または真核生物細胞を意味し、そしてこれには、ベクターを複製させることができる、および／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現させることができる、任意の形質転換することができる生物が含まれる。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用することができ、そしてそのように使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」され得るかまたは「形質転換」され得る。「トランスフェクト」または「形質転換」は、外因性核酸（例えば、修飾されたタンパク質コード配列）がそれによって宿主細胞にトランスファーされるか導入されるプロセスを意味する。形質転換された細胞には、最初のその細胞とその子孫が含まれる。
【０１５１】
所望される結果が、ベクターの複製、またはベクターによってコードされる核酸配列の一部もしくは全体の発現を生じるかどうかに応じて、宿主細胞は、原核生物または真核生物（これには、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる）に由来し得る。多数の細胞株および培養物を宿主細胞として使用することができ、そしてこれらは、生存している培養物および遺伝的材料の記録保存機関としての役割を担っている組織である、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）。適切な宿主は、ベクター骨格と所望される結果に基づいて当業者が決定できる。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多くのベクターの複製のために原核生物宿主細胞に導入することができる。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、およびＫＣ８、さらには、ＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ）およびＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のような多数の市販されている細菌宿主が挙げられる。あるいは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２のような細菌細胞を、ファージウイルスのための宿主細胞として使用することができる。適切な酵母細胞としては、サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【０１５２】
ベクターの複製および／または発現のための真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ  ２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ，Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられる。様々な細胞のタイプおよび生物に由来する多くの宿主細胞を利用することができ、これらは当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターを、真核生物または原核生物のいずれかの宿主細胞と組み合わせて使用することができる。具体的には、ベクターの複製または発現に対して許容状態である宿主細胞を使用することができる。
【０１５３】
いくつかのベクターでは、原核生物細胞と真核生物細胞の両方の中でそれが複製され、そして／または発現させられることを可能にする制御配列を使用することができる。当業者は、上記の宿主細胞の全てを、それらを維持し、そしてベクターの複製を可能にするためにその下でインキュベートする条件についてさらに理解している。ベクターの大規模な生産、さらには、ベクターによってコードされる核酸の産物、およびそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生産が可能な技術および条件もまた、理解されており、公知である。
【０１５４】
１０．発現システム
上記で議論された組成物の少なくとも一部または全てを含む多数の発現システムが存在している。原核生物をベースとするシステムおよび／または真核生物をベースとするシステムを、核酸配列、またはそれらの同族であるポリペプチド、タンパク質、およびペプチドを生産させるために、本発明と共に使用するために使用することができる。多くのこのようなシステムは市販されており、広く利用されている。
【０１５５】
昆虫細胞／バキュロウイルスシステムによって、米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号（いずれも、引用により本明細書中に組み入れられる）に記載されているように、異種核酸セグメントの高レベルでのタンパク質発現を生じることができ、これは、例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から商品名ＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０として、およびＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）から商品名ＢＡＣＰＡＣＫ（商標）ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭとして入手することができる。
開示される本発明の発現システムに加えて、発現システムの他の例としては、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬ（商標）誘導性哺乳動物発現システム（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（これには、合成のエクジソン誘導性受容体が含まれる）、またはそのｐＥＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現システムが挙げられる。誘導性の発現システムの別の例はＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手することができ、これは、Ｔ−ＲＥＸ（商標）（テトラサイクリンによって調節される発現）システムを有している、全長のＣＭＶプロモーターを使用する誘導性の哺乳動物発現システムである。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）によってはまた、メチロトローフ酵母であるピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）の中での組み換えタンパク質の高レベルでの生産のために設計されたものである、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現システム（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれる酵母発現システムも提供されている。当業者は、ベクター（例えば、発現構築物）を、核酸配列、またはその同族であるポリペプチド、タンパク質、もしくはペプチドを生産するために発現させる方法について知っている。
【０１５６】
１１．ウイルスベクター
発現ベクターを細胞に導入することができる多数の方法が存在している。本発明の特定の実施形態においては、発現ベクターには、ウイルス、またはウイルスのゲノムに由来する操作されたベクターが含まれる。遺伝子ベクターとして使用される第１のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマウイルス）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは外来ＤＮＡ配列に対しては比較的低い能力を有しており、制限された宿主の範囲を有している。さらに、許容状態である細胞の中でのそれらの発ガン能力および細胞変性効果によっては、安全性の懸念が生じる。これらは、８ｋｂまでの外来の遺伝的材料にしか適応できないが、様々な細胞株および研究室用動物の中に容易に導入することができる（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。レトロウイルスは、感染させられた細胞の中でそれらのＲＮＡを二本鎖のＤＮＡに変換させる能力を特徴とする一本鎖のＲＮＡウイルスのグループであり、これらもまたベクターとして使用することができる。他のウイルスベクターを、本発明の発現構築物として使用することができる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを使用することができる。これらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１５７】
Ｘ．処置方法
本発明の分子（例えば、治療的な使用が想定されるタンパク質結合体）は、毒素または治療薬の細胞傷害能力と共にＢＬｙＳ部分の特異性を保持している分子である。
【０１５８】
本発明のポリペプチドがそれが必要な患者に治療有効量で投与されることが意図される。用語「治療上有効」は、本明細書中で使用される場合は、疾患に伴ういくつかの症状を改善させるために必要な化合物の量を意味する。例えば、ガンの処置においては、ガンを任意の程度改善させるか、またはガンの任意の症状を停止させる化合物が治療上有効である。例えば、ガンの改善は、ガン細胞および／または組織の血管形成の阻害、細胞増殖の阻害もしくは遅延、細胞死の促進、あるいはそれらの組み合わせであり得る。化合物の治療有効量によっては、疾患を治癒させることは必要ではなく、疾患の処置が提供されるであろう。
【０１５９】
本発明のポリペプチドが、以下の処置に有用であることが想定される：Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫／リンパ形質細胞性リンパ腫（＋／−ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−有毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞性骨髄腫（多発性骨髄腫）、意味未確定の単クローン性免疫グロブリン血（ＭＧＵＳ）、無痛性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、形質細胞腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病（ＨＣＤ）、免疫グロブリン沈着症、全身性軽鎖病、および原発性アミロイドーシス。
【０１６０】
好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドはヒトを処置するために使用される。
【０１６１】
ＸＩ．併用療法／ガン治療
本発明の結合ポリペプチドまたはそれをコードする発現構築物の有効性を高めるためには、これらの組成物をＢ細胞増殖性疾患の処置に有効な他の薬剤（例えば、抗ガン剤）と組み合わせることが所望される場合がある。実際、特定の実施形態においては、本発明の結合ポリペプチドは、１つ以上の化学療法薬と共に使用され、それによって、細胞（感受性細胞または耐性細胞を含む）に対して化学療法薬が有効となる。結合ポリペプチドは単独で、または１つ以上の化学療法薬との組み合わせにおいて、別のガン治療（例えば、放射線治療、外科手術、遺伝子治療など）に加えて、Ｂ細胞増殖性疾患を有している個体に投与することができる。
【０１６２】
「抗ガン」剤は、被験体のガンに対して、例えば、ガン細胞を死滅させること、ガン細胞においてアポトーシスを誘導すること、ガン細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生または数を減少させること、腫瘍の大きさを縮小させること、腫瘍の増殖を阻害すること、腫瘍もしくはガン細胞に対する血液の供給を減少させること、ガン細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進させること、ガンの進行を妨げるかもしくは阻害すること、あるいは、ガンを有している被験体の寿命を延ばすことによって、ネガティブな影響を与えることができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害するために有効な合計量で提供される。このプロセスには、同じタイミングで、細胞を、発現構築物と薬剤（単数または複数）または複数の因子（単数または複数）と接触させることが含まれる場合がある。これは、細胞を、両方の薬剤を含む１つの組成物または薬学的処方物と接触させることによって、あるいは、細胞を、２つの異なる組成物または処方物と同時に（この場合、１つの組成物には発現構築物が含まれ、他方の組成物には第２の薬剤（単数または複数）が含まれる）接触させることによって行うことができる。
【０１６３】
化学療法薬および放射線治療薬に耐性である腫瘍細胞は、臨床腫瘍学において重要な問題を示す。現在のガン研究の１つ目的は、化学療法および放射線治療の効力を、それを別の治療と併用することによって改善する方法を見出すことである。例えば、単純ヘルペス−チミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクターシステムによって脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤であるガンシクロビルに対する感受性をうまく誘導した（Ｃｕｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。本発明の状況においては、結合ポリペプチドは、他のプロアポトーシス性因子または細胞周期調節因子に加えて、化学療法、放射線治療、遺伝子治療、または免疫療法による介入と組み合わせて同様に使用することができることが意図される。
【０１６４】
治療は、数分から数週間までの範囲の間隔をあけて他の薬剤での処置の前に行われる場合も、またその後に行われる場合もある。他の薬剤と結合ポリペプチドが細胞に対して別々に投与される実施形態においては、通常、個々の送達時間の間に有意な時間が過ぎてしまわないことが確実に守られ、その結果、薬剤と発現構築物は、なおも、細胞に対して有利な複合効果を発揮することができる。このような例においては、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６〜１２時間に両方の態様で細胞が接触させられえることが意図される。いくつかの状況では、処置期間を有意に延長することが所望される場合があるが、この場合は、それぞれの投与の間に、数日（２日、３日、４日、５日、６日、または７日）から数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間）が経過する。
【０１６５】
種々の組み合わせを使用することができる。この場合、結合ポリペプチド治療は「Ａ」であり、そして第２の薬剤（例えば、放射線治療または化学療法）、例えば「Ｂ」である。
【０１６６】
【化６】
2008528633.tif 000008
本発明の治療用発現構築物の患者への投与の後には、存在する場合にはベクターの毒性を考慮した、化学療法薬の投与のための一般的なプロトコールが続くであろう。処置サイクルは、必要に応じて繰り返されると予想される。様々な標準的な治療方法、さらには、外科手術による介入を、記載される過増殖性細胞の治療と組み合わせて適用できることもまた意図される。
【０１６７】
Ａ．化学療法
ガン治療にはまた、化学薬品をベースとする処置と放射線をベースとする処置の両方を用いる様々な併用療法も含まれる。併用される化学療法薬としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラノキシフェン、エストロゲン受容体結合因子、タキソール、ジェムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランシフェラーゼ阻害因子、トランスプラチン、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、または上記の任意のアナログもしくは誘導変異体が挙げられる。
【０１６８】
Ｂ．放射線治療
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線として一般的に知られているもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接の送達が挙げられる。マイクロ波およびＵＶ線のような、ＤＮＡ損傷因子の他の形態もまた意図される。おそらく、これらの因子は全て、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復に対して、そして染色体のアセンブリおよび維持に対して、広い範囲に損傷を与える。投与量は、Ｘ線については、長期（３週間から４週間）について、１日に５０から２００レントゲンの線量から、２０００から６０００レントゲンの１回の線量までの範囲である。放射性同位元素の投与量範囲は広く変化し、そして、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞によるその取り込みに応じて様々である。
【０１６９】
用語「接触させられた」および「曝される」は、細胞に対して適用される場合は、それによって治療用構築物と化学療法薬または放射線治療薬が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並べて配置されるプロセスを記載するように本明細書中で使用される。細胞を死滅または静止させるためには、両方の因子が、細胞を死滅させるかまたはそれが分裂することを防ぐために有効な合計量で、細胞に送達される。
【０１７０】
Ｃ．免疫療法
免疫療法は、通常、免疫エフェクター細胞と、ガン細胞を標的化して破壊する分子の使用による。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で、治療のエフェクターとしての役割を担う場合があり、また、実際に細胞を死滅させる他の細胞を動員する場合もある。抗体はまた、薬剤または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、破傷風毒素など）に結合させることもでき、そして単に標的化剤としての役割しか担っていない場合がある。あるいは、エフェクターは、それが直接または間接のいずれかで、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有しているリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞としては、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１７１】
したがって、免疫療法は、遺伝子治療と組み合わせて、併用療法の一部として使用することができる。併用療法の一般的なアプローチは、以下で議論される。一般的には、腫瘍細胞は標的化しやすい、すなわち、大部分の他の細胞上には存在しないいくつかのマーカーを有しているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのいずれかは、本発明の状況での標的化に適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーとしては、ガン胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７），ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアル化ルイス抗原（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が挙げられる。
【０１７２】
Ｄ．遺伝子
なお別の実施形態においては、第２の処置は、治療用ポリペプチドが本発明の結合ポリペプチドの前に、その後に、またはそれと同時に投与される遺伝子治療である。以下の遺伝子産物の１つをコードする第２のベクターと組み合わせた結合ポリペプチドの送達は、標的組織に対して複合的な抗過増殖効果を有しているであろう。あるいは、両方の遺伝子をコードする１つのベクターが使用される場合がある。様々なタンパク質が本発明に含まれ、そのいくつかは以下で議論される。
【０１７３】
１．細胞増殖のインデューサー
細胞増殖を誘導するタンパク質は、さらに、機能に応じて様々なカテゴリーに入れられる。これらのタンパク質の全ての共通点は、細胞増殖を調節するそれらの能力である。例えば、ＰＤＧＦの１つの形態である、ｓｉｓオンコジーンは、分泌型の成長因子である。オンコジーンは、成長因子をコードする遺伝子から生じることは滅多になく、現在は、ｓｉｓは、唯一知られている自然界に存在している発ガン性成長因子である。本発明の１つの実施形態においては、細胞増殖の特定のインデューサーに対して指向させられたアンチセンスｍＲＮＡが、細胞増殖のインデューサーの発現を妨げるために使用されることが意図される。
【０１７４】
タンパク質ＦＭＳ、ＥｒｂＡ、ＥｒｂＢ、およびｎｅｕは成長因子受容体である。これらの受容体に対する突然変異により、調節機能の喪失が生じる。例えば、Ｎｅｕ受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響を与える点変異によっては、ｎｅｕオンコジーンが生じる。ｅｒｂＡオンコジーンは、甲状腺ホルモンの細胞内受容体に由来する。修飾された発ガン性ＥｒｂＡ受容体は、内因性の甲状腺ホルモン受容体と競合すると考えられ、これにより、制御されていない増殖が引き起こされる。
【０１７５】
オンコジーンの最も大きなクラスとしては、シグナル伝達タンパク質（例えば、Ｓｒｃ、Ａｂｌ、およびＲａｓ）が挙げられる。タンパク質Ｓｒｃは、細胞質タンパク質−チロシンキナーゼであり、いくつかの場合には、５２７位のチロシン残基での変異により、プロト−オンコジーンからオンコジーンへのその転換が生じる。対照的に、ＧＴＰａｓｅタンパク質ｒａｓの、プロト−オンコジーンからオンコジーンへの転換は、一つの例においては、配列中の１２位のアミノ酸でのバリンからグリシンへの変異によって生じ、これにより、ｒａｓのＧＴＰａｓｅ活性が低下する。
【０１７６】
タンパク質Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、およびＭｙｃは、転写因子としての核機能に対してそれらの影響を直接発揮するタンパク質である。
【０１７７】
２．細胞増殖の阻害因子
腫瘍サプレッサーオンコジーンは、過剰な細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子の不活化によりそれらの阻害活性が破壊され、これによって制御されていない（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）増殖が生じる。腫瘍サプレッサーｐ５３、ｐ１６、およびＣ−ＣＡＭが以下に記載される。
【０１７８】
高レベルの変異体ｐ５３は、化学的な発癌ガン質、紫外線照射、およびいくつかのウイルスによって形質転換された多くの細胞の中で見られる。ｐ５３遺伝子は、多種多様なヒト腫瘍において、頻繁に、変異による不活化の標的となり、そして一般的なヒトのガンにおいては最も頻繁に変異している遺伝子であることがすでに報告されている。ヒトＮＳＣＬＣにおいては５０％を上回って変異しており（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、そして多種多様な他の腫瘍においても変異している。
【０１７９】
ｐ５３遺伝子は、ラージＴ抗原およびＥ１Ｂのような宿主タンパク質と複合体を形成することができる、３９３アミノ酸のリンタンパク質をコードする。このタンパク質は、正常な組織および細胞の中で見られるが、その濃度は、形質転換された細胞または腫瘍組織と比較するとわずかである。
【０１８０】
野生型ｐ５３は、多くの細胞タイプにおいて重要な増殖調節因子として認識されている。ミッセンス変異がｐ５３遺伝子については一般的であり、そしてオンコジーンの形質転換能力について不可欠である。点変異によって促される１つの遺伝子の変化によって、発ガン性のｐ５３が作成される可能性がある。しかし、他のオンコジーンとは異なり、ｐ５３点変異は、少なくとも３０個の異なるコドンにおいて生じることが知られており、多くの場合は、これによって、細胞の表現形において、ホモ接合型の減少を伴うことのないシフトを生じる優性対立遺伝子が生じる。加えて、これらの優性陰性対立遺伝子の多くは、生物体において寛容化され、そして生殖系で受け継がれるようである。様々な変異体対立遺伝子は、最も小さい機能不全から、強い浸透性の優性陰性対立遺伝子までの範囲にあるようである（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）。
【０１８１】
細胞増殖の別の阻害因子はｐ１６である。真核生物の細胞周期の主要な移行は、サイクリン依存性キナーゼ、すなわち、ＣＤＫによって引き起こされる。１つのＣＤＫであるサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、Ｇ１からの進行を調節する。この酵素の活性は、Ｇ１後期でＲｂをリン酸化することであり得る。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニットであるＤ型サイクリンによって、および阻害性サブユニットであるｐ１６ＩＮＫ４（ＣＤＫ４に特異的に結合してこれを阻害し、したがって、Ｒｂのリン酸化を調節することができるタンパク質として生化学的に特性決定されている）によって制御される。（Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ｐ１６ＩＮＫ４タンパク質はＣＤＫ４阻害因子である（Ｓｅｒｒａｎｏ，１９９３）ので、この遺伝子の欠失によってＣＤＫ４の活性化が高まり、これにより、Ｒｂタンパク質の過剰なリン酸化が生じる場合がある。ｐ１６はまた、ＣＤＫ１６の機能を調節することも知られている。
【０１８２】
ｐ１６ＩＮＫ４は、ＣＤＫ阻害性タンパク質の新しく記載されたクラスに属する。これには、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１、およびｐ２７ＫＩＰ１も含まれる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、多くのタイプの腫瘍において頻繁に欠失している染色体領域である９ｐ２１にマップされる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合型欠失変異は、ヒト腫瘍細胞株の中に頻繁に存在する。この証拠は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子であることを示唆している。しかし、この解釈は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子の変化の頻度が、培養された細胞株の中よりも初代の培養されていない腫瘍においてははるかに低いという観察によって、疑問視されている（Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｎｏｂｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｏｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。プラスミド発現ベクターでのトランスフェクションによる野生型ｐ１６ＩＮＫ４機能の修復によって、いくつかのヒトのガン細胞株によるコロニーの形成が減少した（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ａｒａｐ，１９９５）。
【０１８３】
本発明に従って使用することができる他の遺伝子としては、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１，ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓性遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、血管形成に関係している遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはそれらの受容体）、およびＭＭＣが挙げられる。
【０１８４】
３．プログラムされた細胞死の調節因子
アポトーシス、すなわち、プログラムされた細胞死は、正常な胚発生、成体組織における恒常性の維持、および発ガン性を抑制するために不可欠なプロセスである（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーとＩＣＥ−様プロテアーゼは、他のシステムでのアポトーシスの重要な調節因子でありエフェクターであることが明らかにされている。Ｂｃｌ２タンパク質は濾胞性リンパ腫と関係していることが発見されており、これは、様々なアポトーシスの刺激に応答してアポトーシスを制御し、細胞の生存性を高めることにおいて突出した役割を担っている（Ｂａｋｈｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｋｌａｒ，１９８５；Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｃｒｏｃｅ，１９８６）。進化的に保存されたＢｃｌ２タンパク質は、現在は、関連するタンパク質のファミリーのメンバーであると考えられており、これは、「死アゴニスト（ｄｅａｔｈ  ａｇｏｎｉｓｔ）」または「死アンタゴニスト（ｄｅａｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として分類することができる。
【０１８５】
その発見に続いて、Ｂｃｌ２は、様々な刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示されている。また、Ｂｃｌ２細胞死調節タンパク質のファミリー（これは、共通する構造と配列相同性を有している）が存在することが、現在明らかである。これらの様々なファミリーのメンバーは、Ｂｃｌ２と同様の機能を有しているか（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）、またはＢｃｌ２の機能と反対に作用して、細胞死を促進するかのいずれかである（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが示されている。
【０１８６】
Ｅ．外科手術
ガンを有しているヒトのおよそ６０％は、いくつかのタイプの外科手術を受けるであろう。これには、予防目的、診断目的、または、病期診断目的の、根治目的の、および苦痛緩和目的の外科手術が含まれる。根治目的の外科手術は、他の治療法（例えば、本発明の処置、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および／または別の治療方法）と組み合わせて使用することができるガンの処置である。本発明のキメラ分子は、新補助術前療法として、例えば、切除の前に腫瘍の大きさを縮小させるために使用することができ、また、これは、補助術後療法として、例えば、腫瘍の一部または全体の除去後に手術台を滅菌するために使用することができる。
【０１８７】
根治目的の外科手術としては、ガン性の組織全体またはその一部が物理的に切除される、摘出される、および／または破壊される切除術が挙げられる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を意味する。腫瘍の切除に加えて、外科手術による処置には、レーザー手術、凍結外科手術、電気外科手術、および顕微鏡下手術（Ｍｏｈｓ’手術）が含まれる。本発明を、表在性腫瘍、前ガン状態、または付随する量の正常組織の除去と組み合わせて使用することができることが、さらに意図される。
【０１８８】
ガン性細胞、組織、または腫瘍の一部または全ての切除の際には、体内に空洞が形成される場合がある。処置には、潅流、直接の注射、または別の抗ガン治療でのその領域への局所適用が付随する場合がある。このような処置は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、もしくは７日ごとに、または１週間、２週間、３週間、４週間、および５週間ごと、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、もしくは１２ヶ月ごとに繰り返して行うことができる。なおさらに、これらの処置は様々な投与量であり得る。
【０１８９】
Ｆ．他の薬剤
他の薬剤を、処置の治療効力を改善させるために本発明と組み合わせて使用することができることが意図される。これらのさらなる薬剤としては、免疫調節因子、細胞表面受容体およびＧＡＰ結合部位のアップレギュレーションに影響を与える因子、細胞増殖抑制因子および細胞分化因子、細胞接着の阻害因子、またはアポトーシスのインデューサーに対する過増殖性細胞の感度を高める薬剤が挙げられる。免疫調節因子としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが挙げられる。細胞表面受容体またはそれらのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）のアップレギュレーションは、過増殖性細胞に対する自己分泌作用または傍分泌作用の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能力を高めることが、さらに意図される。ＧＡＰ結合部位の数を増やすことによる細胞内シグナル伝達の増加は、近くにある過増殖性細胞の集団に対する抗過増殖効果を高める。他の実施形態においては、細胞増殖抑制因子または細胞分化因子を、処置の抗過増殖効力を改善するために本発明と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害因子は、本発明の効力を改善することが意図される。細胞接着阻害因子の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害因子およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過増殖性の細胞の感度を高める他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５）を、処置の効力を改善するために本発明と組み合わせて使用できることがさらに意図される。
【０１９０】
ホルモン療法もまた、本発明と組み合わせて、または上記に記載された任意の他のガン治療と組み合わせて使用することができる。ホルモンは、乳ガン、前立腺ガン、卵巣ガン、または子宮頸ガンのような特定のガンの処置においては、特定のホルモン（例えば、テストステロンまたはエストロゲン）のレベルを下げるまたはその効果をブロックするために使用することができる。この処置は、多くの場合は、処置のオプションとして、または転移のリスクを下げるために、少なくとも１つの他のガン治療と組み合わせて使用される。
【０１９１】
ＸＩＩ．薬学的組成物および投与経路
本発明により、融合タンパク質をコードする核酸分子が意図される。いくつかの実施形態においては、薬学的組成物は被験体に投与される。本発明の様々な態様には、有効量の水性組成物を投与する工程が含まれる。このような組成物は、通常、薬学的に許容される担体または水性媒体の中に溶解させられるかまたは分散させられるであろう。加えて、このような化合物は、処置される疾患または症状に応じて、別の処置と組み合わせて投与することができる。リンパ腫の処置としては、化学療法薬、放射線治療薬、免疫療法薬、またはホルモンの投与を挙げることができる。
【０１９２】
当業者は、インビボおよびエキソビボの状況で遺伝子送達を行う方法を十分に理解している。ウイルスベクターについては、当業者は、ウイルスベクターストックを調製できるであろう。ウイルスの種類と、得ることができる力価の種類に応じて、１から１００、１０から５０、１００から１０００、または１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個までの感染性ウイルス粒子が患者に送達される。同様の数量を、相対的な取り込み効率を比較することによって、リポソームまたは他の非ウイルス処方物について想定することができる。薬学的に許容される組成物としての処方物が以下で議論される。
【０１９３】
表現「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じることのない分子的実体および組成物を意味する。本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容される担体」としては、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的活性のある物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は当業者に周知である。任意の通常の媒体または薬剤が有効成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物の中でのその使用が意図される。補助的な有効成分（例えば、他の抗ガン剤）もまた、組成物に取り込ませることができる。
【０１９４】
本発明の活性のある化合物は、非経口投与のために処方することができ、例えば、静脈内、筋肉内、胸腔内、皮下、またはさらには腹腔内経路からの注射のために処方することができる。ＭＨＣクラスＩ分子の発現を増大させる化合物（単数または複数）を含む水性組成物の調製は、本発明の開示を参照して当業者に公知であろう。通常、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能なものとして調製することができる。注射の前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するための使用に適している固体形態もまた調製することができる。また、調製物は乳化させることもできる。
【０１９５】
遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性のある化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水の中に調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物の中に、さらには、油の中に調製することができる。通常の保存および使用の条件下では、これらの調製物には微生物の増殖を防ぐ保存剤が含まれる。
【０１９６】
注射による使用に適している薬学的形態としては、滅菌の水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、もしくは水性のプロピレングリコールを含む処方物；ならびに、滅菌の注射可能な溶液または分散液を即座に調製するための滅菌の粉末が挙げられる。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、そしてそれを容易に注射できる程度に流動性でなければならない。これはまた、製造および保存の条件下でも安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）による汚染作用から守られなければならない。
【０１９７】
活性のある化合物は、中性の形態または塩の形態で組成物の中に処方することができる。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基とともに形成される）が挙げられる。これは、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）と共に形成される。また、遊離のカルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニム、カルシウム、水酸化第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することができる。
【０１９８】
担体はまた、溶媒または分散媒体でもあり得る。これには例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物性油が含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合には必要な粒子の大きさの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用を防ぐことは、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合には、等張化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物の中で使用することによってもたらされ得る。
【０１９９】
滅菌の注射可能な溶液は、上記に記載された様々な他の成分と共に適切な溶媒の中に必要な量の活性のある化合物を取り込ませること、必要に応じて、その後、濾過滅菌することによって調製される。通常、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、塩基性分散媒体と上記のもののうち必要な他の成分を含む滅菌の媒体に取り込ませることによって調製される。滅菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は減圧乾燥技術および凍結乾燥技術である。これによって、有効成分と、任意のさらなる所望される成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【０２００】
本発明の治療用組成物の投与は、標的組織がその経路から利用できる限りは、任意の一般的な経路を介して行われるであろう。本発明がウイルスベクターとして使用される場合には、最初の考慮は、ベクターが有している異種配列の所望される位置であろう。投与経路としては、経口、鼻腔、舌下、直腸、膣、または局所が挙げられる。あるいは、投与は、同所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射によって行うことができる。このような組成物は通常、生理学的に許容される単体、緩衝液、または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。肺の症状の処置については、肺へのエアゾール投与が意図される。エアゾールの容量は、約０．０１ｍｌから０．５ｍｌの間である。同様に、結腸関連疾患の処置に好ましい方法は浣腸による。浣腸の容量は約１ｍｌから１００ｍｌの間である。直接の腫瘍内注射が好ましい形式であり、連続する腫瘍内潅流はより特異的な実施形態である。
【０２０１】
特定の実施形態においては、患者への治療用組成物の連続的な供給を提供することが所望される場合がある。静脈内または動脈内経路については、点滴システムによってこれが行われる。局所塗布については、塗布の繰り返しが行われる。様々なアプローチについて、長期間にわたって、限られた、しかし一定量の治療薬を提供する遅延放出型処方物を使用することができる。内服用については、目的の領域の（例えば、異種核酸セグメントを有しているウイルスベクターでの）持続的な潅流が好ましい場合がある。これは、いくつかの場合には手術後の、カテーテル法、その後の治療薬の持続的な投与によって行うことができる。潅流時間は、特定の患者および状況について医師によって選択されるが、時間は、約１〜２時間、２〜６時間、約６〜１０時間、約１０〜２４時間、約１〜２日間、約１〜２週間、またはそれ以上の範囲であり得る。一般的には、持続的な潅流による治療用組成物の用量は、注射が投与される時間について調整された、１回の注射または複数回の注射によって投与される用量と同様であろう。しかし、より多い用量が潅流によって投与される場合があると考えられる。
【０２０２】
水溶液中での非経口投与については、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝化させられるべきであり、そして液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張性にさせられる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌の水性媒体は、本発明の開示を参照して当業者に公知であろう。例えば、１投与量を１ｍＬの等張性ＮａＣｌ溶液の中に溶解させることができ、１０００ｍＬの皮下注入用の流体に添加されるか、または提案される注入部位に注射されるかのいずれかである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０を参照のこと）。投与量のいくつかのバリエーションは、処置される被験体の症状に応じて必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれにしても、個々の被験体について適している用量を決定するであろう。
【０２０３】
治療用組成物の有効量は、意図される目的に基づいて決定される。用語「単位用量」または「投与量」は、被験体での使用に適している物理的に不連続な単位を意味し、個々の単位には、その投与（すなわち、適切な経路および処置レジュメ）と組み合わせて上記で議論された所望される応答を生じるように計算された、予め決定された量の治療用組成物が含まれる。処置回数および単位用量の両方にしたがう投与される量は、所望される防御に応じて様々である。
【０２０４】
治療用組成物の正確な量はまた医師の判断によっても様々であり、そして個々の個体について固有である。用量に影響を与える要因としては、患者の健康状態および臨床状態、投与経路、意図される処置の目的（症状の緩和対治癒）、ならびに、特定の治療用物質の効力、安定性、および毒性が挙げられる。
【０２０５】
処方の際には、溶液は、投与処方物と適合する様式で、そして治療上有効であるそのような量で投与されるであろう。処方物は、様々な投与量形態（例えば、上記の注射可能な溶液のタイプ）で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなどもまた使用することができる。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合は、インビトロでの投与は、動物から取り出された細胞（培養物中の細胞を含むが、これに限定はされない）に対して行われる操作を意味する。用語エキソビボ投与は、インビトロで操作され、続いて生存している動物に投与される細胞を意味する。用語インビボ投与には、動物の中の細胞に対して行われる全ての操作が含まれる。
【０２０７】
本発明の特定の態様においては、組成物は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボのいずれかで投与することができる。特定のインビトロでの実施形態においては、修飾されたタンパク質をコードする発現構築物を宿主細胞に形質導入することができる。形質導入された細胞は、その後、インビトロでの分析のために、あるいは、インビボでの投与ンために使用することができる。
【０２０８】
米国特許第４，６９０，９１５号および同第５，１９９，９４２号（いずれも引用により本明細書中に組み入れられる）には、治療用途での使用のための、血液単核細胞および骨髄細胞のエキソビボでの操作のための方法が開示されている。
【０２０９】
本発明の組成物のインビボでの投与もまた意図される。例としては、膀胱への膀胱内カテーテルによる本発明の形質導入用組成物の投与による膀胱上皮組織への形質導入（Ｂａｓｓ，１９９５）、およびカテーテルによる門脈からの適切な形質導入用組成物の注入による肝細胞の形質導入（Ｂａｏ，１９９６）が挙げられるが、これらに限定はされない。さらなる例としては、簡単な形質導入用組成物と、肺細胞の形質導入を行うための形質導入用組成物の鼻腔内または気管内（Ｄｏｎｇ，１９９６）吸入のいずれかを用いた、腫瘍の直接的な注射が含まれる。
【０２１０】
本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、膀胱内、粘膜、心膜内、経口、局所、局部に、および／またはエアゾール、注射、注入、点滴、標的細胞を直接またはカテーテルを介してバシング（ｂａｔｈｉｎｇ）する局所潅流、ならびに／あるいは、洗浄を使用して、投与することができる。
【０２１１】
ＸＩＩＩ．本発明のキット
本明細書中に記載される組成物の任意のものがキットに含まれ得る。限定ではない例においては、ＢＬｙＳ結合体、および状況に応じた別の薬剤がキットに含まれ得る。したがって、このキットには、本発明のＢＬｙＳ結合体と状況に応じた別の薬剤が、適切な容器手段の中に含まれる。
【０２１２】
キットには、適切にアリコートされた本発明のＢＬｙＳ結合体と状況に応じた別の薬剤組成物が、ラベルされているかまたはラベルされていないかにはかかわらず、含まれ得る。キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージすることができる。キットの容器手段には、一般的には、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の容器手段が含まれ、その中には、１つの成分を入れることができ、そして好ましくは、適切にアリコートされる。２つ以上の成分がキットの中に存在している場合には、キットには通常、第２、第３、または他の別の容器が含まれるであろう。その中には、別の成分を別々に入れることができる。しかし、様々な成分の組み合わせをバイアルに含めることができる。本発明のキットにはまた、通常、ＢＬｙＳ結合体、別の薬剤、および任意の他の試薬容器を含めるための手段が、市販用の閉じ込められた容器の中に含まれるであろう。このような容器には、その中に所望されるバイアルが保持される、射出成型または吹き込み成型されたプラスチック容器が含まれる場合がある。
【０２１３】
本発明の治療用キットは、ＢＬｙＳ結合体を含むキットであり、これには通常、適切な容器手段の中に、その薬学的に許容される処方物が含まれるであろう。キットには、１つの容器手段が含まれる場合があり、そして／また、これには、個々の化合物についての別の容器手段が含まれる場合もある。
【０２１４】
キットの成分が１つおよび／またはそれ以上の液体溶液中に提供される場合は、液体溶液は水溶液であり、滅菌の水溶液が特に好ましい。ＢＬｙＳ結合体組成物（単数または複数）はまた、注入することができる組成物に処方することもできる。この場合、容器手段は、それ自体が注射器、ピペット、および／または他の同様の装置であり得、それから処方物が体の感染している領域に塗布される場合も、動物に注射される場合も、そして／あるいは、キットの他の成分に加えられるおよび／または他の成分と混合される場合もある。
【０２１５】
しかし、キットの成分は、乾燥粉末（単数または複数）として提供される場合もある。試薬および／または組成物が乾燥粉末として提供される場合は、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。溶媒はまた、別の容器手段の中に提供される場合もあることが想定される。キットにはまた、滅菌の薬学的に許容される緩衝液および／または他の希釈剤を含むための第２の容器手段も含まれ得る。
【０２１６】
本発明のキットにはまた、通常は、市販用の閉じ込められた容器の中にバイアルを含めるための手段（例えば、その中に所望されるバイアルが保持される、射出成型または吹き込み成型されたプラスチック容器）が含まれるであろう。
【０２１７】
容器の数および／またはタイプにはかかわらず、本発明のキットには、動物の体へのおよび／または動物の体内での最終的な組成物の注射／投与および／または配置を助けるための装置もまた含まれる場合も、そして／またそのような装置とともにパッケージされる場合もある。このような装置は、注射器、ピペット、鉗子、および／または任意のそのような医学的に承認されている送達媒体であり得る。
【０２１８】
したがって、本発明の特異的な実施形態においては、組成物は薬学的に許容される担体の中に含まれ、そして／また、個体への送達のために適切にアリコートされる。
【実施例】
【０２１９】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含められる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を示すこと、したがって、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることは、当業者に明らかなはずである。しかし、本発明の開示を参照して、多くの変更を開示される特異的な実施形態において行うことができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果をなおも得ることができることは、当業者に明らかなはずである。
【０２２０】
（実施例１）
ｒゲロニン／ＢＬｙＳポリペプチドの設計
ヒトＢＬｙｓと組み換え体ゲロニンをコードするｃＤＮＡを、鋳型としてのＢＬｙｓと組み換え体ゲロニンＤＮＡとともにスプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）法（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を使用することによって、互いに融合させた。方向Ａ（ＢＬｙｓ−ｒＧｅｌ）融合タンパク質または方向Ｂ（ｒＧｅｌ−ＢＬｙｓ）融合タンパク質を、個々の遺伝子断片を増幅させるためのＤＮＡ鋳型としてＢＬｙｓのコード領域全体と組み換え体ゲロニンを使用してＯＥ−ＰＣＲ法によって作成した。ＢＬｙｓ−ｒＧｅｌを構築するために、エンテロキナーゼ消化部位と制限酵素ＫＰＮ  Ｉをコードする上流のＯＥ−ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴ  ＢＬｙＳ  Ｆｏｒ（５’−ＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡ−３’：配列番号１２）とＢＬｙｓ  Ｂａｃ  Ｌｉｎｋ（５’−ＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’：配列番号１３）を使用してＢＬｙｓ遺伝子のＮ末端部分から増幅させた。Ｇ４Ｓリンカーと制限酵素ＸｈｏＩをコードする隣接している下流のＯＥ−ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＬｉｎｋ  ＲＧｅｌ（５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧ−３’：配列番号１４）とＲＧｅｌ  Ｂａｃ（５’−ＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣ−３’：配列番号１５）を使用して組み換え体ゲロニンから増幅させた。その後、上流のＯＥ−ＰＣＲ断片と下流のＯＥ−ＰＣＲ断片を、融合タンパク質をコードする全長の融合ＢＬｙｓ−ｒＧｅｌ遺伝子として、５’末端と３’末端に隣接しているオリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴ  ＢＬｙｓ  ＦｏｒとＲＧｅｌ  Ｂａｃ（上記を参照のこと）の対を使用するさらなるＰＣＲ工程によって、再度アセンブリさせた。最終的なＰＣＲ断片を精製し、ＫＰＮ  ＩとＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、その後、挿入された融合遺伝子の転写制御のためにＴ７プロモーターを利用するＮｏｖａｇｅｎ発現ベクターｐＥＴ−３２ａにクローニングした。融合ＢＬｙｓ−ｒＧｅｌ遺伝子構築物を、タンパク質の発現の前にＤＮＡ配列決定によって確認した。方向ＢのＲＧｅｌ−ＢＬｙｓについては、上記の手順を、上流の断片については、オリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴ  Ｇｅｌ  Ｆｏｒ（５’−ＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣ−３’：配列番号１６）とＲＧｅｌ  Ｂａｃ  Ｌｉｎｋ（５’−ＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴ−３’：配列番号１７）を、そして下流の断片については、ＢＬｙｓ  Ｆｏｒ（５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡ−３’：配列番号１８）とＢＬｙｓ  Ｒｅｖ（５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’：配列番号１９）を使用するＤＮＡ操作において使用した。最終的な遺伝子融合断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴ  Ｇｅｌ  ＦｏｒとＢＬｙｓ  Ｒｅｖを使用してさらなるＰＣＲ工程によっ���増幅させた。その後、融合タンパク質の発現のために、構築物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換した。
【０２２１】
（実施例２）
ｒゲロニンに対するＢＬｙＳの化学結合とＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ化学的結合体の精製
部位特異的結合のためのさらなるシステイン残基を含む組み換え体ゲロニン（ｒＧｅｌ）を上記のように作成し、上記のＳＰＤＰを使用してＢＬｙＳに結合させた（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｍｕｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。化学的結合体ＢＬｙＳ／ｒＧｅｌを、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）をゲル浸透クロマトグラフィー（Ｓ−２００）とアフィニティークロマトグラフィー（Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と組み合わせて使用して精製した。ＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ結合体の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロット分析によって評価した。
【０２２２】
（実施例３）
細胞傷害性試験
以下の表４に、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合タンパク質を用いて行った様々な細胞傷害性試験の結果をまとめる。
【０２２３】
【化７】
2008528633.tif 000009
標的化指数は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのｒＧｅｌ／ＩＣ５０のＩＣ５０を示す。
【０２２４】
Ｎ．Ｄ．は決定しなかったことを示す。
【０２２５】
図１に、ＢＬｙＳおよびｒＧｅｌの方向の図を提供する。図２は、例示的なＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ融合毒素の例示的なＤＮＡ配列（配列番号９）とタンパク質配列（配列番号８）を示し、図３は、例示的なｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の例示的なＤＮＡ配列（配列番号１１）とタンパク質配列（配列番号１０）を示す。図４は、例示的な融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの構築を示す。
【０２２６】
図５は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の精製を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に示されるように、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの分子量は４５ｋＤａであり、これは、ＢＬｙＳとｒＧｅｌの１：１の分子比を示している（左側のパネル）。抗ゲロニン抗体または抗ＢＬｙＳ抗体を使用したウェスタンブロット分析は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素には、融合毒素の中に毒素とＢＬｙＳ成分が含まれていることを示していた（右側のパネル）。
【０２２７】
図７は、ＪＥＫＯマントル細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素とＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ融合毒素の細胞傷害活性の比較である。ＪＥＫＯマントル細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そしてｒＧｅｌ、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ、またはＢＬｙＳ／ｒＧｅｌを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２２８】
図８Ａ〜８Ｍは、様々な腫瘍細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を示す。Ｊｕｒｋａｔ（８Ａ）、ＫＢＭ−５（８Ｂ）、ＴＨＰ−１（８Ｃ）、ＨＬ−６０（８Ｄ）、ＩＭ−９（８Ｅ）、ＭＭ１．Ｓ（８Ｆ）、ＭＭ１．Ｒ（８Ｇ）、ＲＰＭＩ８２２６（８Ｈ）、８２２６／ＬＲ−５（８Ｉ）、ＪＥＫＯ（８Ｊ）、ＳＰ５３（８Ｋ）、Ｍｉｎｏ（８Ｌ）、およびＧｒａｎｔａ（８Ｍ）。１３種類の腫瘍細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２２９】
図９は、ＢＬｙＳ受容体を発現しているＪＥＫＯマントル細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の特異性を示す。ＪＥＫＯマントル細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ＢＬｙＳ、ｒＧｅｌ、ＣＴＰ／ｒＧｅｌ、およびｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２３０】
図６は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の無細胞タンパク質合成阻害活性を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素のｒＧｅｌ成分のｎ−グリコシド活性を試験するために、この材料を、単離されたウサギ網状赤血球による［３Ｈ］−ロイシンの取り込みを使用するインビトロでのタンパク質の翻訳アッセイに添加した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素と自然界に存在しているｒＧｅｌについての阻害曲線を比較した。
【０２３１】
図１０は、デキサメタゾン感受性多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ１．Ｓ）およびデキサメタゾン耐性多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ１．Ｒ）に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線である。ＭＭ１．ＳとＭＭ１．Ｒ細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌ、Ｄｅｘ、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２３２】
図１１は、ｒＧＥＬ／ＢＬｙＳの最大耐用量（ＭＴＤ）を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＭＴＤを得るために、様々な濃度のｒＧｅｌ／ＢＬｙＳをＢａｌｂ／Ｃマウスに、５日間連続してｉ．ｖ．で尾静脈に注射し、体重と生存しているマウスの数を測定した。
【０２３３】
（実施例５）
融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの構築、発現、および精製
本発明者らは、Ｎ末端にｒＧｅｌ、続いて、ＢＬｙＳ分子に繋がれたＧ４Ｓペプチドの方向のｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合構築物を、スプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲ法（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を使用して構築した（図４）。その後、融合構築物をｐＥＴ−３２ａ（＋）ベクターのＫｐｎＩとＸｈｏＩ部位に連結させ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＤ４９４（ＤＥ３）株に形質転換した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを発現させ、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。２０ｋＤａのＨｉｓタグを酵素によって除去した後、精製したｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、還元条件下で４５．５ｋＤａの予想される分子量で単量体としてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、ＢＬｙＳに対する抗体ともｒＧｅｌに対する抗体とも免疫反応性であり、したがって、これは、融合構築物中の毒素成分とＢＬｙＳ成分の両方の存在を示している（図５）。
【０２３４】
（実施例６）
融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのｒＧｅｌ成分の生物学的活性
毒素の生物学的活性は、他のタンパク質に結合させられるかまたは融合させられると、大きく損なわれる可能性がある。融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのｒＧｅｌ成分のｎ−グリコシド活性を試験するために、この材料を、ルシフェラーゼの生産を使用する無細胞タンパク質合成アッセイに添加した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳと自然界に存在しているｒＧｅｌについての阻害曲線を比較した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳとｒＧｅｌについて計算したＩＣ５０値は、それぞれ、１０ｐＭおよび６１ｐＭであることが明らかになった。したがって、これらの結果は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのｒＧｅｌ成分の酵素活性が、遊離のｒＧｅｌの酵素活性よりもわずかにより活性であることを示唆している（図６）。同様の知見が、ＶＥＧＦ１２１およびｒＧｅｌの融合構築物についても報告された。ＶＥＧＦ１２１／ｒＧｅｌホモ二量体は、ｒＧｅｌ毒素自体と比較すると高い比活性を有していることが示されている（Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これらのデータは、ｒＧｅｌ成分の重合によって、本発明の特定の実施形態においては、隣接している複数の毒素分子の間での共同作用が可能になり得ることを示している。
【０２３５】
（実施例７）
ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＡＭの発現と、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する応答
本発明者らは、ＢＬｙＳリガンドとその３種類の受容体の発現プロフィールを、白血病、骨髄腫、およびマントル細胞リンパ腫細胞株のパネルを使用してＲＴ−ＰＣＲ分析によって試験した。１３種類の細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＫＢＭ−５、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、ＩＭ−９、ＭＭ１．Ｓ、ＭＭ１．Ｒ、ＲＰＭＩ  ８２２６、８２２６／ＬＲ−５、ＪｅＫｏ−１、ＳＰ５３、Ｍｉｎｏ、およびＧｒａｎｔａ５１９）は、ＢＬｙＳとＢＡＦＦ−Ｒを発現していたが、ＴＡＣＩとＢＣＭＡが、４種類の白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＫＢＭ−５、ＴＨＰ−１、およびＨＬ−６０）を除く試験した９種類の例示的な細胞株において発現されていた。
【０２３６】
ＢＬｙＳ受容体（単数または複数）の発現レベルとｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する感度の間に相関関係が存在しているかどうかを、次に試験した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの競合ＩＣ５０値を、白血病、骨髄腫、およびマントル細胞リンパ腫を含む１３種類の例示的な細胞株に対して試験した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対するｒＧｅｌのＩＣ５０値の比をそれぞれの細胞タイプについて計算した。この比（標的化指数）は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＢＬｙＳ成分の、標的細胞の細胞質への毒素成分の送達を媒介する能力を示す。表４にまとめるように、Ｊｕｒｋａｔ、ＫＢＭ−５、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、ＩＭ−９、ＭＭ１．Ｓ、ＭＭ１．Ｒ、８２２６／ＬＲ−５、およびＧｒａｎｔａ５１９は、２から４の間の標的化指数を示し、一方、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡを発現している３種類のＭＣＬ細胞株（ＪｅＫｏ−１、ＳＰ５３、およびＭｉｎｏ）はｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対してより感度が高く、７，０００から１００，０００の間の標的化指数を示した。ＭＣＬ細胞株であるＪｅＫｏ−１がｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対して最も感度が高いことが明らかになった（標的化指数＝１００，０００）。本発明者らは、ＢＬｙＳ受容体（単数または複数）とｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの感度の間には直接的な相関関係を見ることはできなかった。
【０２３７】
（実施例８）
ｒＧｅｌ／ＢｌｙＳの結合活性
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＢＬｙＳ成分の細胞結合活性を、完全なＪｅＫｏ−１とＨＬ−６０細胞株を使用して比較した。融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、３種類のＢＬｙＳ受容体の全てを発現しているＪｅＫｏ−１細胞に対して特異的な結合活性を示したが、ｒＧｅｌは、ＪｅＫｏ−１細胞とＨＬ−６０細胞には結合しなかった。興味深いことに、ｒＧｅｌ／ＢｌｙＳは、ＰＣＲによって評価した場合には、ＢＡＦＦ−Ｒしか発現していないＨＬ−６０細胞に対しては結合しなかった（図１２）。
【０２３８】
（実施例９）
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの特異性
ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの特異性を評価するために、本発明者らは、ＪｅＫｏ−１細胞を、ＢＬｙＳ自体、遊離のｒＧｅｌ、ＣＴＰ／ｒＧｅｌ（非Ｂ細胞標的化化学的結合体）、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。ＢＬｙＳ自体は細胞増殖を激増させ、一方、非Ｂ細胞標的化結合体ＣＴＰ／ｒＧｅｌは、遊離のｒＧｅｌと同様のＩＣ５０を示した。しかし、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、３種類のＢＬｙＳ受容体を発現しているＪｅＫｏ−１細胞に対しては極めて細胞傷害性が高かった（図９）。
【０２３９】
ＢＬｙＳでの前処理は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理したＪｅＫｏ−１細胞においては用量応答曲線のシフトを示したが、ｒＧｅｌで処理したＪｅＫｏ−１細胞においては示さなかった（図１３Ａ）。加えて、ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ、ＴＡＣＩ：Ｆｃ、またはＢＡＣＭ：Ｆｃでの前処理によっては、ＪｅＫｏ−１細胞中のｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの細胞傷害活性はブロックされたが、ｒＧｅｌ−１で処理したＪｅＫｏ−１細胞とＢＬｙＳで処理したＪｅＫｏ−１細胞においてはブロックされなかった（図１３Ｂ）。これらのデータは、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの細胞傷害作用がＢＬｙＳ受容体によって媒介されるようであることを示している。加えて、３種類の受容体のいずれか１つが、融合毒素の細胞傷害作用を媒介することに有効であり得ることが明らかである。
【０２４０】
（実施例１０）
ＪｅＫｏ−１マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株へのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのインターナライゼーション
インターナライズしたｒＧｅｌ／ＢＬｙＳをウサギ抗ｒＧｅｌ抗体を使用して検出した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのｒＧｅｌ部分は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳへの暴露の１時間後に、細胞質と核の中で観察された。したがって、これは、融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳが、ＪｅＫｏ−１細胞の細胞質および核への迅速なインターナライゼーションおよびそれらのへのｒＧｅｌ毒素の送達のために、ＢＬｙＳ受容体に対するＢｌｙＳの結合を介して効率よく細胞に結合できることを示している。
【０２４１】
（実施例１１）
アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの細胞傷害作用がアポトーシス機構に関係しているかどうかを決定するために、ＪｅＫｏ−１細胞を１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。９６時間後、ＪｅＫｏ−１細胞をＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスについてアッセイした。ｒＧｅｌ／ＢｌｙＳで処理したＪｅＫｏ−１細胞は、３４％のアポトーシスによる細胞死を示したが、ｒＧｅｌ処理によってはアポトーシスは誘導されなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０２４２】
カスパーゼシリーズのタンパク質は、細胞のアポトーシスのプロセスの中心的な媒介因子であることが知られている。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳによって誘導される細胞死の間にカスパーゼ−３がＪｅＫｏ−１細胞の中で活性化されるかどうかを決定するために、本発明者らは、カスパーゼ−３とその基質であるポリ（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を試験した。ＢＬｙＳまたはｒＧｅｌでの処理はカスパーゼ−３とＰＡＲＰの切断には影響を与えなかったが、ｒＧｅｌ／ＢｌｙＳでの処理によっては、９６時間でカスパーゼ−３とＰＡＲＰの切断が生じた（図１４Ｃ）。
【０２４３】
（実施例１２）
本発明の有意性
ＢＬｙＳは、末梢Ｂ細胞の発生を促進する不可欠な増殖因子であり、ＢＬｙＳの増殖刺激作用は、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡと命名された３種類の細胞表面受容体によって媒介される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ｖｏｎ  Ｂｕｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂｒａｍ，１９９７；Ｌａａｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。これらの報告では、ＢＬｙＳがＢ−ＣＬＬ種の中で様々なパターンで発現されているようであることが示唆されており、そして治療薬に対して生まれつき抵抗性がある患者のサブセットが記載され得る。したがって、本発明者らは、１つ以上のＢＬｙＳ受容体を発現している腫瘍細胞に対するｒＧｅｌ毒素の特異的な送達のための標的リガンドとして、ＢＬｙＳを選択した。本発明者らは、ＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ方向の融合構築物ではなくｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ方向の融合構築物を選択した。なぜなら、未公開のデータが、ＢＬｙＳ分子の妨げられていないＣ末端が３量体化および受容体の認識に重要であることを示していたからである。不活性なＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ融合構築物を用いたさらなる実験によって、これに関する観察を確認した。
【０２４４】
ＢＬｙＳ受容体の細胞での発現レベルとｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する感度の間での可能性のある相関関係を見出すために、本発明者らは、ＢＬｙＳの発現レベルとその３種類の受容体を試験し、そして、様々なヒト細胞株（白血病、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、およびマウスＢ細胞リンパ腫細胞株を含む）に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳおよびｒＧｅｌの競合ＩＣ５０値を試験した。ＢＣＬ−１マウスＢリンパ腫細胞株は、最も高い標的化指数（１８７，５００）を示した。Ｋａｎａｋａｒａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）には、ＢＣＬ−１細胞が４，８００個の結合部位／細胞を有しており、一方、ＩＭ−９細胞は３，２００個の結合部位／細胞を有していることが報告された。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対するＢＣＬ−１細胞の応答性もまた、ＢＬｙＳ受容体の総数に関係している可能性がある。ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡを発現している３種類のＭＣＬ細胞株（ＪｅＫｏ−１、ＳＰ５３、およびＭｉｎｏ）はｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する感度が高く、７，０００から１００，０００の間の標的化指数を示したが、一方、Ｇｒａｎｔａ  ５１９細胞が、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した場合にＪｅＫｏ−１細胞上での発現に近いレベルでＢＬｙＳの３種類の受容体をすべて発現しているにもかかわらず、Ｇｒａｎｔａ  ５１９  ＭＣＬ細胞株は、２から４の間の標的化指数しか示さなかった。ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ細胞株は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対して最も感度が高いことが明らかになった（標的化指数＝１００，０００）。ＭＣＬ細胞株のうち、Ｇｒａｎｔａ  ５１９細胞は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳおよびｒＧｅｌ自体に対して最も耐性があった。本発明者らは、ＢＬｙＳ受容体（単数または複数）の発現レベルとｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する感度の間に直接的な相関関係を検出することはできなかった。そして、相違する細胞傷害性作用を担っている可能性がある機構を同定するために、これらの２つのＭＣＬ細胞株の中でのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの異なる細胞傷害性機構を試験した。本発明者らは、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳが最も感度の高い細胞株であるＪｅＫｏ−１の中では迅速にインターナライズすることができるが、Ｇｒａｎｔａ  ５１９の中ではできないことを観察した（データは示さない）。この結果は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、ＢＬｙＳ受容体への結合の後にＪｅＫｏ−１細胞にインターナライズでき、そして３種類のＢＬｙＳ受容体を発現しているＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ細胞株に対してｒＧｅｌ毒素を送達できることを示している。
【０２４５】
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の別のタイプである。これは、様々な形態形成特徴、免疫表現形特徴、および細胞遺伝学的特徴を特徴とし、サイクリンＤ１を過剰発現している。従来の細胞傷害性療法は効果がなく、全体的な予後は不良である（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＭＣＬは、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の最大治療抵抗性を保持している（Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。現在の化学療法のレジュメに対するＭＣＬの抵抗性は、ＭＣＬに対する新しい治療アプローチが明らかに必要であることを示している。結果は、融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳが、少なくとも、ほとんどの現在の化学療法のレジュメに対して難治性であるリンパ腫であるマントル細胞リンパ腫について優れた治療薬であることを示している。
【０２４６】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、通常の高用量での治療でもなお、骨髄中の血漿細胞のクローン発現を特徴とし、依然として治療が不可能であるＢ細胞新生物である。Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）によって、ＭＭの病因、化学療法薬の効果、および臨床的な抵抗性の発生を研究するための３種類のＭＭ１．Ｓ（デキサメタゾン感受性細胞）、ＭＭ１ＲＥ（デキサメタゾン耐性ＭＭ１．Ｒ細胞の初期形態）、およびＭＭ１．ＲＬ（デキサメタゾン耐性ＭＭ１．Ｒ細胞の後期形態）が確立されている。興味深いことに、本発明者らは、デキサメタゾン感受性細胞株（ＭＭ１．Ｓ）とデキサメタゾン耐性細胞株（ＭＭ１．Ｒ）がｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対して同等の感度があることを見出した（ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳについて３００ｎＭのＩＣ５０値）。本発明者らはまた、もとのメルファラン感受性多発性骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ８２２６）とメルファラン耐性多発性骨髄腫細胞（８２２６／ＬＲ−５）は、ｒＧｅｌに対して同等の感度があった（それぞれ、２００対２８０）が、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対しては同等ではなかった（それぞれ、１０対１１０）ことも見出した（表４）。これは、デキサメタゾンに対する細胞の抵抗性は、融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳに対する交差抵抗性の発生を生じることはないようであるが、メルファランに対する細胞の抵抗性は、メルファランに対して交差抵抗性を生じるようであることを示している。薬剤感受性細胞株と薬剤耐性細胞株の両方におけるｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの細胞傷害性機構を理解するためのシグナル伝達の研究は進行中である。
【０２４７】
まとめると、データは、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳが、少なくともマントル細胞リンパ腫の処置については良好な候補であること、そして、特異的な実施形態においては、ＢＬｙＳは、ＢＬｙＳの受容体の１つ以上を発現しているＢ細胞に対する毒素の特異的な送達のための標的化リガンドとしての役割を担っていることを示している。
【０２４８】
（実施例１３）
例示的な材料と方法
本実施例では、本発明で使用される例示的な材料と方法を提供する。
【０２４９】
材料
ＰＣＲ試薬、ＲＮＡ単離キット、および逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲキットは全て、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した。制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ＲＮＡ精製キットおよびＤＮＡ精製キットは、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から入手した。細菌株、ｐＥＴ細菌発現プラスミド、および組み換え体エンテロキナーゼ（ｒＥＫ）は、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。Ｈｉ−Ｔｒａｐキレート化ＨＰ樹脂と他のクロマトグラフィー樹脂は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。マウスモノクローナル抗ＰＡＲＰ抗体（Ａｂ）、ウサギ抗サイクリンＤ１  Ａｂ、およびヤギ抗β−アクチンＡｂは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。ウサギポリクローナル抗活性カスパーゼ−３  ＡｂはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入した。
【０２５０】
細胞株および細胞培養物
多発性骨髄腫ドキソルビシン感受性細胞株（ＭＭ１．Ｓ）と多発性骨髄腫ドキソルビシン抵抗性細胞株（ＭＭ１．Ｒ）はＶａｒｓｈａ  Ｇａｎｄｈｉ博士（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から懇意により譲り受けた。形質細胞腫骨髄腫メルファラン耐性細胞株（８２２６／ＬＲ−５）は、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｄａｌｔｏｎ博士（Ａｒｉｚｏｎａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｕｃｓｏｎ）から懇意により譲り受けた（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。４種類のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株（ＪｅＫｏ−１、ＳＰ５３、Ｍｉｎｏ、およびＧｒａｎｔａ−５１９）は、Ｈｅｓｈａｍ  Ａｍｉｎ博士（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から懇意によって譲り受けた（Ｋａｎａｋａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｊｕｒｋａｔ、ＫＢＭ−５、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、ＩＭ−９、ＲＰＭＩ  ８２２６、ＭＭ１．Ｓ、ＭＭ１．Ｒ、およびＪｅＫｏ−１細胞株は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）の中で増殖させた。ＲＰＭＩ８２２６／ＬＲ−５細胞株については、５μＭのメルファランがＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ））の中に含まれた。Ｇｒａｎｔａ  ５１９細胞株は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の中で増殖させた。ＳＰ５３細胞株とＭｉｎｏ細胞株は、２０％の熱不活化ＦＢＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣ）の中で増殖させた。
【０２５１】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の構築
ＪｅＫｏ−１細胞からＲＮＡを単離し、ヒトＢＬｙＳをコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって増幅した：ＢＬｙＳｆ：（５’→３’）：ＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡＣ（配列番号２２）とＢｌｙＳｒ（５’→３’）：ＧＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧ（配列番号２３）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合ＤＮＡ構築物は、個々の遺伝子断片を増幅するためのＤＮＡ鋳型としてＢＬｙＳのコード領域全体と組み換え体ゲロニンを使用して、スプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）法（Ｗｅｉｓｅｎｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）によって作成した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合ＤＮＡ構築物を構築するために、エンテロキナーゼと制限酵素ＫｐｎＩ消化部位をコードする上流のＯＥ−ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴｇｅｌｆｏｒ（５’−ＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣ−３’：配列番号１６）とｒＧｅｌｂａｃｌｉｎｋ（５’−ＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＴＴ−３’：配列番号１７）を使用して、組み換え体ゲロニンのＮ末端部分から増幅した。Ｇ４Ｓリンカーと制限酵素ＸｈｏＩ部位をコードする隣接する下流のＯＥ−ＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドプライマーＢＬｙＳｆｏｒ（５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡ−３’：配列番号１８）とＢＬｙＳｒｅｖ（５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’：配列番号１９）を使用して、ＢＬｙＳ遺伝子から増幅した。上流のＯＥ−ＰＣＲ断片と下流のＯＥ−ＰＣＲ断片を、その後、全長のｒＧｅｌ／ＢｌｙＳ融合遺伝子として、５’末端と３’末端に隣接しているオリゴヌクレオチドプライマーＰＥＴｇｅｌｆｏｒとＢＬｙＳｒｅｖ（上記を参照のこと）の対を使用して、さらなるＰＣＲ工程によって、再度アセンブリさせた。最終的なＰＣＲ断片を精製し、ＫｐｎＩとＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、その後、挿入された融合遺伝子の転写制御のためにＴ７プロモーターを利用する発現ベクターｐＥＴ−３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙｓ遺伝子構築物を配列決定によって確認し、正確な融合構築物を、融合毒素のタンパク質の発現のために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＡＤ４９４（ＤＥ３）株に形質転換した。
【０２５２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中でのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの発現および誘導
ｒＧｅｌ／ＢｌｙＳ挿入断片を有しているプラスミドで形質転換した細菌コロニーを、４００μｇ／ｍｌのアンピシリンと３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ液体培養液の中で、２３５ｒｐｍの震盪インキュベーターの中で３７℃で一晩培養した。細菌培養物を、その後、抗生物質を含む新しいＬＢ培地で１：１００に稀釈し、そして３７℃でＡ６００＝０．８まで増殖させた。その後、培養物を、４００μｇ／ｍｌのアンピシリンと３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む新しいＬＢ培地で１：１に稀釈し、増殖因子融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの発現を、１００μＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって、２３℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の中に再懸濁し、凍結させた（−８０℃）。
【０２５３】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの精製
凍結させた細菌細胞を融解させ、その後、４℃で物理的な破壊によって溶解させた（Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｅｒ，Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）。細菌溶解物を、４０，０００×ｇで１．５時間超遠心分離させた。上清中のＮａＣｌの最終濃度を５００ｍＭのＮａＣｌとなるように調整し、その後、２００ｍＭのＮｉ２ＳＯ４でチャージしたＨｉ−Ｔｒａｐキレート化ＨＰ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にロードした。カラムを４０ｍＭのＴｉｒｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、および３０ｍＭのイミダゾールを含む５００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と３００ｍＭのイミダゾールを含む５００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを含む画分をプールし、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む透析緩衝液中に透析した。ヒスチジンタグを除去するために、ヒスチジンタグを含むｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素を、室温で一晩、組み換え体エンテロキナーゼ（ｒＥＫ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で消化した。非特異的タンパク質および２０ｋＤａのヒスチジンタグを、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を通じたイオン交換クロマトグラフィー、およびＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を通じたアフィニティークロマトグラフィーによって除去した。精製したｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ試料を滅菌濾過し、アリコートし、そして４℃で保存した。
【０２５４】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの分析
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素中のｒＧｅｌ毒素とＢＬｙＳ成分の存在を評価するために、最終的な試料を、還元条件下での１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製したｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ（５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１５％）によって分離させ、トランスファー緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９０ｍＭのグリシン、２０％のメタノール）中で４℃で一晩かけてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に電気泳動的に移した。ＰＶＤＦ膜を、５％の無脂肪乳を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で１時間ブロックし、その後、ウサギ抗ゲロニンＡｂまたはヤギ抗ＢＬｙＳ  Ａｂでプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に結合させたヤギ抗ウサギまたはｓｗａｉｎ抗ヤギ抗体を使用して、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して１：４０００希釈で、免疫反応性タンパク質を視覚化させた。ＢＬｙＳまたは組み換え体ゲロニンをポジティブ対照として使用した。データは、β−アクチンに対して正規化したタンパク質バンドの相対的強度として示す。バンドの強度を、柱状グラフを使用して定量した。
【０２５５】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの無細胞タンパク質合成阻害活性
組み換え体ｒＧｅｌ毒素のｎ−グリコシド阻害活性を、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の阻害活性と比較して評価した。毒素によって誘導されたタンパク質生産の阻害を、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって指定されており、そして以前に記載されている（Ｈａｌｅ、２００１）とおりにウサギ網状赤血球溶解物アッセイを使用して評価した。
【０２５６】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＢＬｙＳ受容体結合活性
融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＢＬｙＳ受容体結合活性を評価するために、ＪｅＫｏ−１細胞およびＨＬ−６０細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）上に、１×１０５細胞／ウェルの密度で固定した。プレートを再水和し、３％のＢＳＡでブロックし、その後、稀釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．１％のＢＳＡ）中の様々な濃度のｒＧｅｌ／ＢＬｙＳまたはｒＧｅｌと共に、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ウサギ抗ゲロニンポリクローナル抗体と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０、０．１％のＢＳＡ）で４回洗浄し、その後、１００μｌのペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（稀釈緩衝液中１μｇ／ｍｌ：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。４５０ｎｍでの吸収を、Ｓｐｅｎｔｒａ  Ｍａｘ  ３０００装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した。
【０２５７】
様々な細胞株上でのＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＭＣＡの発現の検出
ＢＬｙＳ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＭＣＡの発現を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって１３種類の細胞株の中で評価した。１３種類の細胞株から単離したＲＮＡを全て、第１鎖のｃＤＮＡを合成するために使用した。第１鎖のｃＤＮＡは、次いで、ヒトＢＬｙＳ（３１３ｂｐ）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、ＢＡＦＦ−Ｒ（２５６ｂｐ）（Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ＴＡＣＩ（１９６ｂｐ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、およびＢＣＭＡ（２８５ｂｐ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を増幅させるために設計した特異的プライマーを使用したＰＣＲによって増幅させた。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。
【０２５８】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの細胞傷害活性、および遊離のＢＬｙＳまたはデコイ受容体による競合的阻害
１３種類の細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢｌｙＳの競合ＩＣ５０値を試験するために、１３種類の細胞株を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に播種し（５×１０３細胞／ウェル）、そしてｒＧｅｌ自体、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞を一晩インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して４５０ｎｍで測定した。
【０２５９】
ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの特異性を評価するために、本発明者らは、ＪｅＫｏ−１細胞をＢＬｙＳ自体、遊離のｒＧｅｌ、ＣＴＰ−ｒＧｅｌ（非Ｂ細胞標的化化学的結合体）、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理したか、あるいは、培地を４連のウェルに添加した。競合阻害アッセイのために、ＪｅＫｏ−１細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に播種し（５×１０３細胞／ウェル）、そして１ｎＭのＢＬｙＳ、５０ｎＭのＢＬｙＳ、１０μｇ／ｍｌのＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ、１０μｇ／ｍｌのＴＡＣＩ：Ｆｃ、または１０μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ：Ｆｃで２時間処理し、その後、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳまたはｒＧｅｌ自体を、４連のウェルに添加した。
【０２６０】
ＪｅＫｏ−１マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株へのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのインターナライゼーション
ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ細胞株を、ポリリジンでコーティングした１６ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、１×１０４細胞／ウェルで添加し、１００ｎＭのｒＧｅｌまたは１００ｎＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで様々なタイミングで処理した。その後、細胞を、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を使用してスライド上に置き、次いで、細胞表面に結合したタンパク質を、グリシン緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌおよび０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５））とともに１０分間インキュベートすることによって剥がし、０．５ＭのＴｉｒｓ（ｐＨ７．４）で５分間中和し、ＰＢＳで軽く洗浄し、その後、３．７％のホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で室温で２０分間固定し、続いてＰＢＳで軽くリンスした。その後、細胞を、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で１０分間透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で、室温で１時間ブロックした。ＰＢＳでの簡単な洗浄の後、細胞を、０．１％のＴｗｅｅｎ２０と０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：５００に稀釈したウサギ抗ｒＧｅｌポリクローナル抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞を、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中で１５分間、３回洗浄し、そして１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）の１：１００稀釈物と共にインキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳでの３回の洗浄のあと、細胞を、ＰＢＳ中で１回、１０分間洗浄し、そしてＤＡＢＣＯマウント培地中にマウントした。その後、スライドをＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザースキャン顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【０２６１】
アポトーシスの検出
アポトーシスは、ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって検出した。アポトーシスを評価するために、ＪｅＫｏ−１細胞をポリリジンでコーティングした１６ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）に、５×１０３細胞／ウェルで添加し、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ、または培地で４日間処理した。その後、浮遊している細胞を回収し、サイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ）を使用してスライド上に固定し、乾燥させ、次いで、室温で２０分間、３．７％のホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）中に固定し、続いてＰＢＳで軽くリンスした。その後、細胞を、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．１％のクエン酸ナトリウムを含むＰＢＳ中で１０分間透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で、室温で１時間ブロックした。固定した細胞をインサイチュ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で染色した。最後の洗浄工程の後、スライドをマウント培地の中にマウントし、蛍光顕微鏡下で分析した。
【０２６２】
ウェスタンブロット分析
切断されたカスパーゼ−３およびＰＡＲＰの発現に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を試験するために、ＪｅＫｏ−１細胞を５×１０５細胞／２４ウェルプレートで播種し、その後、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ、または培地で処理した。９６時間後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、０．３ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、６０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２％のＮＰ−４０）中で、氷上で２０分間溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１５％）によって分離させ、そして、トランスファー緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９０ｍＭのグリシン、２０％のメタノール）中で４℃で一晩かけてＰＶＤＦ膜に（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）電気泳動的に移した。ＰＶＤＦ膜を、５％の無脂肪乳を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中で１時間ブロックし、その後、マウスモノクローナル抗ＰＡＲＰ抗体（Ａｂ）、ウサギポリクローナル抗活性カスパーゼ−３  Ａｂ、またはヤギ抗β−アクチンでプローブした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に結合させたヤギ抗マウス／抗ウサギまたはｓｗａｉｎ抗ヤギ抗体を使用して、ＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して１：４０００希釈で、免疫反応性タンパク質を視覚化させた。データは、β−アクチンに対して正規化したタンパク質バンドの相対的強度として示す。バンドの強度を、柱状グラフを使用して定量した。
【０２６３】
参考文献
本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルの指標である。全ての特許および刊行物は、あたかもそれぞれの個々の刊行物が具体的に、そして個別に示されているかのように、同じ程度に引用により本明細書中に組み入れられる。
【０２６４】
【化８】
2008528633.tif 000010
【０２６５】
【化９】
2008528633.tif 000011
【０２６６】
【化１０】
2008528633.tif 000012
【０２６７】
【化１１】
2008528633.tif 000013
【０２６８】
【化１２】
2008528633.tif 000014
【０２６９】
【化１３】
2008528633.tif 000015
本発明およびその利点は詳細に記載されているが、様々な変更、代用、および改良を、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中で行うことができることが理解されるはずである。さらに、本出願の範囲は、明細書中に記載されるプロセス、機構、製造、物質の組成、手段、方法、および工程の特定の実施形態に限定されるようには意図されない。本発明の開示から当業者には容易に明らかであるように、本明細書中に記載された対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うかまたは実質的に同じ結果を生じる、既存のまたは後に開発されるプロセス、機構、製造、物質の組成、手段、方法、または工程を本発明にしたがって利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機構、製造、物質の組成、手段、方法、または工程をそれらの範囲に含むように意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
本発明のより完全な理解のために、ここでは、添付の図面と組み合わせて以下の記載について参照が行われる。
【図１】図１は、ＢＬｙＳおよびｒＧｅｌの例示的な位置を示す。
【図２】図２は、ＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ融合毒素の例示的なＤＮＡ配列（配列番号９）およびタンパク質配列（配列番号８）を示す。
【図３】図３は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の例示的なＤＮＡ配列（配列番号１１）およびタンパク質配列（配列番号１０）を示す。
【図４】図４は、例示的な融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの構築を示す。スプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲ法を使用して、Ｎ末端のｒＧｅｌ、その後に、ＢＬｙＳ分子につながれたＧ４Ｓペプチドを含む、融合毒素ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを作成した。組み換え体ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ  ＤＮＡ構築物を、ｐＥＴ−３２ａベクターのＫｐｎＩとＸｈｏＩ制限酵素部位に導入して、発現ベクターｐＥＴ３２ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを構築した。
【図５】図５は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の精製を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素のクマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に示されるように、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの分子量は４５ｋＤａであり、これは、ＢＬｙＳとｒＧｅｌの１：１の分子比を示している（左側のパネル）。抗ゲロニン抗体または抗ＢＬｙＳ抗体を使用したウェスタンブロット分析は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素には、融合毒素の中に毒素とＢＬｙＳ成分が含まれていることを示していた（右側のパネル）。
【図６】図６は、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の無細胞タンパク質合成阻害活性を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素のｒＧｅｌ成分のｎ−グリコシド活性を試験するために、この材料を、単離されたウサギ網状赤血球による［３Ｈ］−ロイシンの取り込みを使用するインビトロでのタンパク質の翻訳アッセイに添加した。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素と自然界に存在しているｒＧｅｌについての阻害曲線を比較した。
【図７】図７は、ＪＥＫＯマントル細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳとＢＬｙＳ／ｒＧｅｌ融合毒素の細胞傷害活性の比較である。ＪＥＫＯマントル細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そしてｒＧｅｌ、ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ、またはＢＬｙＳ／ｒＧｅｌを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｍは、様々な腫瘍細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を示す。Ｊｕｒｋａｔ（８Ａ）、ＫＢＭ−５（８Ｂ）、ＴＨＰ−１（８Ｃ）、ＨＬ−６０（８Ｄ）、ＩＭ−９（８Ｅ）、ＭＭ１．Ｓ（８Ｆ）、ＭＭ１．Ｒ（８Ｇ）、ＲＰＭＩ８２２６（８Ｈ）、８２２６／ＬＲ−５（８Ｉ）、ＪＥＫＯ（８Ｊ）、ＳＰ５３（８Ｋ）、Ｍｉｎｏ（８Ｌ）、およびＧｒａｎｔａ（８Ｍ）。１３種類の腫瘍細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｍは、様々な腫瘍細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を示す。Ｊｕｒｋａｔ（８Ａ）、ＫＢＭ−５（８Ｂ）、ＴＨＰ−１（８Ｃ）、ＨＬ−６０（８Ｄ）、ＩＭ−９（８Ｅ）、ＭＭ１．Ｓ（８Ｆ）、ＭＭ１．Ｒ（８Ｇ）、ＲＰＭＩ８２２６（８Ｈ）、８２２６／ＬＲ−５（８Ｉ）、ＪＥＫＯ（８Ｊ）、ＳＰ５３（８Ｋ）、Ｍｉｎｏ（８Ｌ）、およびＧｒａｎｔａ（８Ｍ）。１３種類の腫瘍細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図８−３】図８Ａ〜８Ｍは、様々な腫瘍細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を示す。Ｊｕｒｋａｔ（８Ａ）、ＫＢＭ−５（８Ｂ）、ＴＨＰ−１（８Ｃ）、ＨＬ−６０（８Ｄ）、ＩＭ−９（８Ｅ）、ＭＭ１．Ｓ（８Ｆ）、ＭＭ１．Ｒ（８Ｇ）、ＲＰＭＩ８２２６（８Ｈ）、８２２６／ＬＲ−５（８Ｉ）、ＪＥＫＯ（８Ｊ）、ＳＰ５３（８Ｋ）、Ｍｉｎｏ（８Ｌ）、およびＧｒａｎｔａ（８Ｍ）。１３種類の腫瘍細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図８−４】図８Ａ〜８Ｍは、様々な腫瘍細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を示す。Ｊｕｒｋａｔ（８Ａ）、ＫＢＭ−５（８Ｂ）、ＴＨＰ−１（８Ｃ）、ＨＬ−６０（８Ｄ）、ＩＭ−９（８Ｅ）、ＭＭ１．Ｓ（８Ｆ）、ＭＭ１．Ｒ（８Ｇ）、ＲＰＭＩ８２２６（８Ｈ）、８２２６／ＬＲ−５（８Ｉ）、ＪＥＫＯ（８Ｊ）、ＳＰ５３（８Ｋ）、Ｍｉｎｏ（８Ｌ）、およびＧｒａｎｔａ（８Ｍ）。１３種類の腫瘍細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌまたはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図９】図９は、ＢＬｙＳ受容体を発現しているＪＥＫＯマントル細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の特異性を示す。ＪＥＫＯマントル細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ＢＬｙＳ、ｒＧｅｌ、ＣＴＰ／ｒＧｅｌ、およびｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図１０】図１０は、デキサメタゾン感受性多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ１．Ｓ）およびデキサメタゾン耐性多発性骨髄腫細胞株（ＭＭ１．Ｒ）に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳ融合毒素の用量応答曲線を提供する。ＭＭ１．ＳとＭＭ１．Ｒ細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ｒＧｅｌ、Ｄｅｘ、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、７５μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図１１】図１１は、ｒＧＥＬ／ＢＬｙＳの最大耐用量（ＭＴＤ）を示す。ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＭＴＤを得るために、様々な濃度のｒＧｅｌ／ＢＬｙＳをＢａｌｂ／Ｃマウスに、５日間連続してｉ．ｖ．で尾静脈に注射し、体重と生存しているマウスの数を測定した。
【図１２】図１２は、ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの特異性を示す。（図１４Ａ）ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳのＢＬｙＳ成分の受容体結合活性部分を、完全なＪｅＫｏ−１およびＨＬ−６０細胞を使用してＥＬＩＳＡによって決定した。（図１４Ｂ）３種類のＢＬｙＳ受容体（単数または複数）を発現しているマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）細胞株に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの比活性を試験するために、ＪｅＫｏ−１  ＭＣＬ細胞株を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートに播種し（５×１０３／ウェル）、そして、ＢＬｙＳ、ｒＧｅｌ、ＣＴＰ／ｒＧｅｌ、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間、または一晩、インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＪｅＫｏ−１細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの競合的阻害を示す。競合阻害アッセイのために、ＪｅＫｏ−１細胞を、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に播種し（５×１０３／ウェル）、そして、１ｎＭのＢｌｙＳ、５０ｎＭのＢＬｙＳ（図１５Ａ）、１０μｇ／ｍｌのＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ、１０μｇ／ｍｌのＴＡＣＩ：Ｆｃ、または１０μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ：Ｆｃ（図１５Ｂ）と共に２時間、前処理し、その後、ｒＧｅｌ、ＢＬｙＳ、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間、または一晩、インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＪｅＫｏ−１細胞に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの競合的阻害を示す。競合阻害アッセイのために、ＪｅＫｏ−１細胞を、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に播種し（５×１０３／ウェル）、そして、１ｎＭのＢｌｙＳ、５０ｎＭのＢＬｙＳ（図１５Ａ）、１０μｇ／ｍｌのＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ、１０μｇ／ｍｌのＴＡＣＩ：Ｆｃ、または１０μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ：Ｆｃ（図１５Ｂ）と共に２時間、前処理し、その後、ｒＧｅｌ、ＢＬｙＳ、またはｒＧｅｌ／ＢＬｙＳを、４連のウェルに添加した。９６時間後、５０μｌのＸＴＴ標識混合物（Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれのウェルに添加し、その後、細胞をさらに４時間、または一晩、インキュベートした。分光光度計による吸光度を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎｍで測定した。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を示す。（図１４Ａ）処理後のＪｅＫｏ−１細胞の顕微鏡像。ＪｅＫｏ−１細胞を、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。９６時間後、ＪｅＫｏ−１細胞を、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスについてアッセイした。（図１４Ｂ）アポトーシス細胞を、ランダムに選択した領域（×２００）の中でカウントし、そして割合（％）として表した。アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を試験するために、ＪｅＫｏ−１細胞またはＧｒａｎｔａ  ５１９細胞を、５×１０５細胞／２４ウェルプレートで播種し、その後、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。処理後、細胞を回収し、洗浄し、そして０．２ｍｌの溶解緩衝液の中に溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）を、８〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、電気泳動によって、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜に移した。膜をブロックし、その後、様々な抗体でプローブした（図１４Ｃ）。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させられた二次抗体を使用して、ＥＣＬ検出試薬を使用して免疫反応性タンパク質を視覚化させた。アクチンを、タンパク質のローディングについての対照として使用した。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｃは、アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を示す。（図１４Ａ）処理後のＪｅＫｏ−１細胞の顕微鏡像。ＪｅＫｏ−１細胞を、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。９６時間後、ＪｅＫｏ−１細胞を、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスについてアッセイした。（図１４Ｂ）アポトーシス細胞を、ランダムに選択した領域（×２００）の中でカウントし、そして割合（％）として表した。アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を試験するために、ＪｅＫｏ−１細胞またはＧｒａｎｔａ  ５１９細胞を、５×１０５細胞／２４ウェルプレートで播種し、その後、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。処理後、細胞を回収し、洗浄し、そして０．２ｍｌの溶解緩衝液の中に溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）を、８〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、電気泳動によって、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜に移した。膜をブロックし、その後、様々な抗体でプローブした（図１４Ｃ）。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させられた二次抗体を使用して、ＥＣＬ検出試薬を使用して免疫反応性タンパク質を視覚化させた。アクチンを、タンパク質のローディングについての対照として使用した。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃは、アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を示す。（図１４Ａ）処理後のＪｅＫｏ−１細胞の顕微鏡像。ＪｅＫｏ−１細胞を、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。９６時間後、ＪｅＫｏ−１細胞を、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシスについてアッセイした。（図１４Ｂ）アポトーシス細胞を、ランダムに選択した領域（×２００）の中でカウントし、そして割合（％）として表した。アポトーシス経路に対するｒＧｅｌ／ＢＬｙＳの効果を試験するために、ＪｅＫｏ−１細胞またはＧｒａｎｔａ  ５１９細胞を、５×１０５細胞／２４ウェルプレートで播種し、その後、１００ｐＭのＢＬｙＳ、１００ｐＭのｒＧｅｌ、または１００ｐＭのｒＧｅｌ／ＢＬｙＳで処理した。処理後、細胞を回収し、洗浄し、そして０．２ｍｌの溶解緩衝液の中に溶解させた。細胞溶解物（５０μｇ）を、８〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、電気泳動によって、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐニトロセルロース膜に移した。膜をブロックし、その後、様々な抗体でプローブした（図１４Ｃ）。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させられた二次抗体を使用して、ＥＣＬ検出試薬を使用して免疫反応性タンパク質を視覚化させた。アクチンを、タンパク質のローディングについての対照として使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
2008528633.tif 000028
【図１１】
2008528633.tif 000029
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月24日(2007.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬に結合されたＢＬｙＳポリペプチドを含む結合ポリペプチドであって、該ＢＬｙＳポリペプチドは標的化ポリペプチドとして機能し、該標的化ＢＬｙＳポリペプチドは、以下：
ａ）配列番号１；
ｂ）配列番号１のアミノ酸１３４〜２８５を含む配列；
ｃ）配列番号２；
ｄ）Ｄ−Ｅ受容体認識ループ配列；
ｅ）配列番号１または配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列；および
ｆ）配列番号４、配列番号５または配列番号６を含む受容体から選択されるＢＬｙＳ受容体に結合する配列
からなる群から選択される配列を含み、
ここで、該治療薬は、該標的化ポリペプチドのＮ末端領域に結合されている、結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記治療薬が、細胞傷害性因子、化学療法薬、抗体、サイトカイン、プロ−アポトーシス因子、または脈管形成阻害剤の１つ以上としてさらに定義される、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記細胞傷害性因子が、ゲロニン分子のようなペプチド、ポリペプチド、または低分子であり、特に、該細胞傷害性因子は、リシンＡ、ジフテリア毒素、アブリン、ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン、ブリオジン、ミラビリス抗ウイルスタンパク質、オオムギリボソーム不活化タンパク質（ＢＲＩＰ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ルフィン、シュードモナスエキソトキシン、およびモモルジンからなる群より選択される、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＢＬｙＳ標的化ポリペプチドと治療薬とが化学的に結合されている、請求項２に記載の結合ポリペプチド。
【請求項５】
前記治療薬が細胞傷害性因子であり、該細胞傷害性因子は、前記ＢＬｙＳポリペプチドのＮ末端に結合されたゲロニン分子、特に組み換えゲロニン分子である、請求項４に記載の結合ポリペプチド。
【請求項６】
前記結合ポリペプチドが融合タンパク質として定義される、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項７】
前記ＢＬｙＳポリペプチドがＢ細胞標的化ドメインまたはＤ−Ｅ受容体認識ループを含む、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項８】
ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳとしてさらに定義される、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項９】
前記ｒＧｅｌ／ＢＬｙＳは、配列番号１０の配列を含む、請求項８に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１０】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の結合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の結合ポリペプチドを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
Ｂ細胞増殖性疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１に記載の結合ポリペプチドの使用。
【請求項１３】
前記Ｂ細胞増殖性疾患が以下からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用：Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫／リンパ形質細胞性リンパ腫（＋／−ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−有毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞性骨髄腫（多発性骨髄腫）、意味未確定の単クローン性免疫グロブリン血（ＭＧＵＳ）、無痛性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、形質細胞腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病（ＨＣＤ）、免疫グロブリン沈着症、全身性軽鎖病、原発性アミロイドーシス、ホジキン病、非ホジキン病、狼瘡、または関節炎。
【請求項１４】
ＢＬｙＳ受容体を発現している細胞を選択的に標的化するエキソビボの方法であって、該方法は、該細胞と、請求項１に記載の結合ポリペプチドとを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の結合ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１６】
Ｂ細胞増殖性疾患の処置のための、請求項１に記載の結合ポリペプチドを含む組成物。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞増殖性疾患が以下からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物：Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫／リンパ形質細胞性リンパ腫（＋／−ヴァルデンストレームマクログロブリン血症）、マントル細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）型の辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（＋／−有毛リンパ球）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞性骨髄腫（多発性骨髄腫）、意味未確定の単クローン性免疫グロブリン血（ＭＧＵＳ）、無痛性骨髄腫、くすぶり型骨髄腫、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、形質細胞腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病（ＨＣＤ）、免疫グロブリン沈着症、全身性軽鎖病、原発性アミロイドーシス、ホジキン病、非ホジキン病、狼瘡、または関節炎。
【国際調査報告】
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2008528633.tif 000037
2008528633.tif 000038
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