(57)【要約】【課題】本発明は、感光性保護基を含む化合物、及び固体支持体の官能化のためのカップリング剤としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、前記化合物により官能化された固体支持体、及び核酸分子のような関心のある生物分子の固定のための同じものの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｐｒｏｃ            （Ｉ）：
（ここで：
−  Ａは固体支持体に付着するための官能基を表し、前記官能基は、アミン、ホスホルアミダイト、シラン及び活性エステル型の官能基から選択され；
−  Ｘはスペーサーアームを表し；
−  Ｂは、光脱保護の後、オキシアミン（−ＯＮＨ２）型及び誘導体、或いはヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）及び誘導体の官能基を生じる基から選択される反応性官能基であり、前記官能基ＢはＰｒｏｃ基で保護されている；
−Ｐｒｏｃは以下の式（ＩＩ）：
【化１】
2008508239.tif 000027
（ここで：
−  Ｒ１及びＲ２は同じでも異なってもよく、水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基を表す）
の感光性保護基である）
のカップリング剤。
【請求項２】
該スペーサーアームＸが、無電荷疎水性鎖または無電荷親水性鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のカップリング剤。
【請求項３】
該スペーサーアームＸが、１〜１３炭素原子を含む飽和炭化水素ベース鎖、ならびに炭素ベース鎖が４〜１２炭素原子を含むグリコールエーテルから選択されることを特徴とする、請求項２に記載のカップリング剤。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２が互いに独立して、メチル及びエチル基から選択されるアルキル基を表すことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のカップリング剤。
【請求項５】
ｉ）−  Ａはホスホルアミダイト官能基を表し、
−  Ｘは６炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、
及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す；
ｉｉ）−  Ａはトリ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシシランを表し、
−  Ｘは２〜１２炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す；
ｉｉｉ）−  ＡはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはペンタフルオロベンゼンでエステル化されたカルボキシリック官能基を表し、
−  Ｘは−ＣＨ２−を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す、
ものから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のカップリング剤。
【請求項６】
該化合物ｉｉｉ）が、該官能基Ａがトリエトキシシランであり、そしてＸが３または１１炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖である化合物から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のカップリング剤。
【請求項７】
固体支持体の官能化のための、請求項１〜６のいずれかに定義された少なくとも一つの式（Ｉ）のカップリング剤の使用。
【請求項８】
少なくとも一つの固体支持体の表面を、請求項１〜６のいずれかに記載の少なくとも一つの式（Ｉ）のカップリング剤の溶液と、有機溶媒中で、接触させる少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、官能化された固体支持体の製造方法。
【請求項９】
式（Ｉ）のカップリング剤の溶液と該固体支持体との接触が、４〜８０℃間の温度で１〜４８時間実施されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該固体支持体が、ガラス、セラミック、シリコンまたはプラスチックから作製される支持体から選択され、前記支持体が、少なくとも一つの水和された、ヒドロキシル化された、シラン化されたまたはアミノ化された表面、あるいは活性エステル型の表面を有することを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該支持体が、少なくとも一つの平面または平面ではない、平滑または構造化された表面を有し、ガラススライド、平面のプラスチックプレートまたはウェルを備えたプラスチックプレート、キャピラリーチューブあるいはポーラスまたは非ポーラスビーズの形態にあることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに定義された１以上の式（Ｉ）のカップリング剤で官能化された少なくとも一つの表面を有することを特徴とする固体支持体。
【請求項１３】
前記固体支持体の表面に存在する式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂに対して相補的である化学官能基を含む関心のある生物分子を共有結合で固定化するための、請求項１２に記載の少なくとも一つの固体支持体の使用。
【請求項１４】
関心のある生物分子が核酸分子であることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
固体支持体の表面の少なくとも一部の露光による式（Ｉ）の化合物の反応性官能基Ｂの光−脱保護、続いて、このように活性化された固体支持体を関心のある生物分子の溶液と接触させる第１工程を少なくとも含み、その結果、前記固体支持体上で前記分子に保有され、そして前記式（Ｉ）の化合物の反応性官能基Ｂに対して反応性を有する、少なくとも一つの化学官能基間の共有結合の形成を介する前記分子の固定化を生じさせ、そしてこれらの２つの工程を必要に応じて繰り返すことを特徴とする、請求項１４に記載の固体支持体への関心のある生物分子の固定化方法。
【請求項１６】
該光−脱保護工程が、該固体支持体の官能化された表面の一部のみに局在されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該固定化工程が、式（Ｉ）の化合物のオキシアミン官能基Ｂと、関心ある生物分子のカルボニル化官能基との間のオキシム結合の形成を通して実施されることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
該固定化工程が４と７の間のｐＨで実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
露光波長が３００〜４００ｎｍ間であることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法に従い得られ、及び請求項１〜６のいずれかに記載の式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂと形成された共有結合により関心のある前記生物分子が固定された少なくとも一つの表面を有することを特徴とする固体支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感光性保護基を含むカップリング剤及び固体支持体の官能化のためのその使用に関する。本発明はまたこれらのカップリング剤で官能化された固体支持体にも関し、並びに関心のある生物分子、特に核酸分子の固定化のためのその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関心のある生物分子の、特にオリゴヌクレオチド（ＯＮ）のような核酸の固体支持体への共有結合的なグラフティングのための様々な方法が既に提案されている。ＯＮｓの結合という特定の関係において、これらの方法は２つの主なカテゴリーに分けられ得る：
１）Ｉｎ  ｓｉｔｕ合成、これはホスホルアミダイト経路を介する合成原理を利用して固体支持体にＯＮ分子を段階的に構築することからなる。特に国際出願WO 97/39151に記載されるこの方法は、高密度のＯＮｓを備えた表面の製造を可能にする。さらに、ブランキングプレート（blanking plate）と感光性保護基のセットの使用により、それは該支持体上での様々なＯＮｓの標的化を可能にする。しかしながら、この方法は、幾つかの大きな欠点を有する。特に、該支持体に結合されるＯＮｓを特徴付けることができず、また、修飾を伴うＯＮｓ（ONs carrying modifications）を取り込むことが非常に困難である。
【０００３】
２）デポジションによる、またはｅｘ  ｓｉｔｕ合成、これは第一に従来のようにＯＮを製造すること、そして第二に好適な化学反応を利用して固体支持体にそれを結合させることからなる。この第二の方法は特に、固体支持体に結合される前に特徴付けられ得るＯＮ分子を使用するという利点を有する。
【０００４】
これ以降に記載する本発明は、より詳細には付着による合成方法のコンテクスト内にある。
【０００５】
様々なタイプの付着による合成方法が先行技術において、特にＯＮのグラフティングを配置させる様々な技術に関して既に記載されている。
【０００６】
第一に、電気化学経路を使用する方法が挙げられ、これは、ピロール残基の電解重合を介して、例えばピロール基のような導電性基で予め官能化されたＯＮを取り付けることからなる。このタイプの電気化学的ＯＮ堆積方法は、特に特許FR2 703 359に記載されている。これにもかかわらず、これは導電性支持体の使用を必要とする欠点を有し、これは最終成分を複雑化する。さらに、「Lab on a Chip」タイプのコンポーネントにおいて、様々な二次加工工程が電極の質を、ゆえにそれらの機能を損ない得る。
【０００７】
第二に、光化学経路が挙げられ、これは表面及び使用される化学溶液の管理が外面化される（externalized）ため、より有望なようである。２つのアプローチが開発された：
ｉ）表面と標的分子の間の直接的フォトグラフティング。この場合、該フォトグラフティングはあまり選択性のないフリーラジカル反応を伴うという欠点を有する；
ｉｉ）支持体上での感光性保護基で保護された官能基の遊離、これは標的ＯＮとの引き続く反応を可能にして、それらの結合を生じる。この場合、使用される支持体は一般的には、その一端が該支持体の表面と結合するための官能基と、他端が相補的な化学官能基を有する標的分子と反応する官能基を有する二官能性化合物であるカップリング剤で官能化されており、該カップリング剤の前記反応性官能基は感光性基で保護される。しかし、競合するために、後者のアプローチは幾つかの基準を満たさなければならない。これらの基準は以下である：
−活性化された支持体と標的分子との間の反応が迅速でなければならない；この反応は、カップリング剤の反応性官能基がそれらの保護基から遊離される時にのみ起こり得る（活性化反応）。
【０００８】
−この反応による収率は高くなければならない；
−カップリング剤を製造するための合成方法は、できる限り少ない工程を含み、実施されるように簡単でなければならない；
−穏やかな反応条件の使用（例えば、水）；
−カップリング剤と標的分子との間で生じる反応は、このように官能化された支持体の非常にフレキシブルな使用を可能にするために、様々な温度及びｐＨ条件下で安定でなければならない。
【０００９】
現在、今日までに提案された様々な方法が、特に使用される様々なカップリング剤の特性のために、全てのこれらの基準を完全に十分に満たしていないことは明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この理由のために、本発明者は、少ない工程を含む方法に従い容易に合成され、そして穏やかな条件下で実施できる、感光性基で保護された反応性官能基を有する新規の二官能性カップリング剤を提供するという目的を自分自身に与えており、これらのカップリング剤は、そこに標的生物分子を続いて結合することを目的とする固体支持体を官能化するために有利に使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このように、本発明の第一の主題は、以下の式（Ｉ）：
Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｐｒｏｃ            （Ｉ）：
（ここで：
−  Ａは固体支持体に結合するための官能基を表し、前記官能基は、アミン、ホスホルアミダイト、シラン及び活性エステル型の官能基から選択され；
−  Ｘはスペーサーアームを表し；
−  Ｂは、光脱保護の後、オキシアミン（−ＯＮＨ２）型及び誘導体、或いはヒドラジド（−ＮＨ−ＮＨ２）及び誘導体の官能基を生じる基から選択される反応性官能基であり、前記官能基ＢはＰｒｏｃ基で保護されている；
−Ｐｒｏｃは以下の式（ＩＩ）：
【００１２】
【化１】
2008508239.tif 000002
【００１３】
（ここで：
−  Ｒ１及びＲ２は同じでも異なってもよく、水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキル基をで表す）
の感光性保護基である）
のカップリング剤である。
【００１４】
本発明に従うと、官能基Ａは、式（Ｉ）のカップリング剤が結合することを目的とする支持体の性質に従って選択される。活性エステル型の官能基は、好ましくＮ−ヒドロキシスクシンイミドで、または当業者に知られた任意の他の好適な活性化試薬、例えばペンタフルオロベンゼンでエステル化されたカルボン酸官能基である。
【００１５】
スペーサーアームＸは、所望の最終特性に応じて、長さ及び極性が変化し得る。例えば、それは無電荷疎水性鎖（飽和炭化水素ベース鎖など）またはグリセロールエーテルのような無電荷親水性鎖であり得る。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態に従うと、スペーサーアームＸは、１〜１３炭素原子を含む飽和炭化水素ベース鎖、ならびにトリエチレングリコール（ＴＥＧ）及びヘキサメチレングリコール（ＨＥＧ）のような炭素ベース鎖が４〜１２炭素原子を含むグリコールエーテルから選択される。
【００１７】
反応性官能基Ｂは、光脱保護の後に、少なくとも一つの相補的な化学官能基を備えた標的分子の共有結合を可能にする官能基である。これらの反応性官能基Ｂは、アミン官能基、アルコール、チオール、カルボキシルまたはカルボニルのような前記標的分子により保有される相補的な官能基と相互作用できる。相補的な官能基のペアのさらに網羅的なリストは、任意の有機化学モノグラフに容易に見られ得る。
【００１８】
上記の式（ＩＩ）の保護基について、そして、それらがアルキル基を表すとき、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して、好ましくはメチル及びエチル基から選択され；該メチル基が最も特に好ましい。
【００１９】
上記の式（Ｉ）のカップリング剤において、好ましくは特に以下のものが挙げられる：
ｉ）−  Ａはホスホルアミダイト官能基を表し、
−  Ｘは６炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す；
ｉｉ）−  Ａはトリ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシシランを表し、
−  Ｘは２〜１２炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す；
ｉｉｉ）−  ＡはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはペンタフルオロベンゼンでエステル化されたカルボキシリック官能基を表し、
−  Ｘは−ＣＨ２−を表し、
−  Ｂはオキシアミン官能基（−ＯＮＨ−）を表し、及び
−  Ｒ１及びＲ２は水素原子またはメチル基を表す。
【００２０】
上記のポイントｉｉｉ）で定義された化合物のうち、好ましくは、特に官能基Ａがトリエトキシシランであり、そしてＸが３または１１炭素原子を有する飽和炭化水素ベース鎖である化合物である。上記の式（Ｉ）のカップリング剤は当業者によく知られた有機合成の原理に従い、また官能基Ａ及びＢの性質に依存して、容易に製造され得る。
【００２１】
本発明の第一の実施形態に従い、そしてカップリング剤が式（Ｉ）の化合物（ここで結合官能基Ａが例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態で活性化されたカルボン酸型であり、そして官能基Ｂがオキシアミン官能基である）であるとき、以下のスキーム１に対応する製造方法が好ましく使用される：
【００２２】
【化２】
2008508239.tif 000003
【００２３】
このスキームにおいて、Ｐｒｏｃは上記で定義された式（ＩＩ）の感光性保護基であり、そしてＸは上記で示したものと同じ意味を有し得るスペーサーアームである。
【００２４】
このスキームに従い、カルボキシリック官能基及びオキシアミン官能基を有する式（ＩＩＩ）の化合物は、第一工程において、選択された式（ＩＩ）のＰｒｏｃ感光性保護基で保護され、式（ＩＶ）の化合物を生成し、次いで、第二工程において、式（ＩＶ）の化合物のカルボン酸官能基はＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化され、式（Ｉ）の予期した化合物を生成する。
【００２５】
本発明の第二の実施形態に従うと、カップリング剤が式（Ｉ）の化合物（ここで結合官能基Ａはホスホルアミダイト官能基であり、そして官能基Ｂはオキシアミン官能基である）であるとき、以下のスキーム２に応じた製造方法が好ましく使用される：
【００２６】
【化３】
2008508239.tif 000004
【００２７】
このスキームにおいて、Ｘ及びＰｒｏｃは上記で示したものと同じ意味を有し、Ｂはオキシアミン官能基を表し、そしてＡは以下の基：
【００２８】
【化４】
2008508239.tif 000005
【００２９】
（ここで、Ｒ及びＲ’は同じでも異なってもよく、１〜１３炭素原子を有するアルキル基を表す）
を示す。
【００３０】
このスキームに従うと、第一工程において、式（Ｖ）のハロゲン化アルコール（ここでＨａｌｏは臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素のようなハロゲン原子を表す）はＮ−ヒドロキシフタルイミドと反応して（ハロゲン原子の求核置換）式（ＶＩ）の化合物を得、これは、第二工程で、ヒドラジン分解を受け、選択された式（ＩＩ）の感光性Ｐｒｏｃ保護基で続いて保護されるオキシアミン官能基を遊離して式（ＶＩＩ）の化合物を生成し、これは、第三工程において、ホスフィチル化を受け、予期される式（Ｉ）の化合物が生成される。
【００３１】
本発明の第三の実施形態に従うと、カップリング剤が式（Ｉ）の化合物（ここで結合官能基Ａがシラン型であり、そして官能基Ｂがオキシアミン官能基である）であるとき、以下のスキーム３に応じた製造方法が好ましく使用される：
【００３２】
【化５】
2008508239.tif 000006
【００３３】
この方法に従うと、式（ＩＸ）のアルケン化合物のオキシアミン官能基（ここで、Ｘは式（Ｉ）のカップリング剤に関して上記で示したものと同じ意味を有し得るスペーサーアームを表す）が保護されて、式（Ｘ）の化合物を得、これは続いてヒドロシリル化を受け、式（Ｉ）の化合物が生成される（ここで結合官能基Ａはトリ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシシラン官能基である）。
【００３４】
本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤は固体支持体の官能化のために使用され得る。ゆえに、本発明の主題は、固体支持体の官能化のための上記の定義した式（Ｉ）の少なくとも一つのカップリング剤の使用である。
【００３５】
式（Ｉ）のカップリング剤の使用は、有利には光脱保護により容易に進み得る反応性官能基を備えた安定層で固体支持体の表面をすばやく修飾することを可能にする。
【００３６】
このように、本発明の主題はまた、官能化された固体支持体の製造方法であり、これは、少なくとも一つの固体支持体の表面を、有機溶媒中の少なくとも一つの式（Ｉ）のカップリング剤の溶液と接触させる少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする。
【００３７】
該有機溶媒は、好ましくは、例えばトリクロロエチレン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びシクロヘキサンのような非極性溶媒から選択される。
【００３８】
式（Ｉ）のカップリング剤の溶液と固体支持体との接触は、好ましくは約４℃と８０℃の間の温度で、約１〜４８時間行われる。
【００３９】
該支持体（substrate）は続いて１以上の溶媒、好ましくは連続して反応溶媒、無水エタノール及び／またはクロロホルムで洗浄し、そして好ましくは窒素で乾燥される。
【００４０】
この方法は容易に実施できるという利点を有し、そして良好な密度の層を得ることを可能にする。特に、式（Ｉ）の化合物の自己組織化単層（ＳＡＭ）で官能化された少なくとも一つの表面を有する固体支持体を得ることを可能にする。ＳＡＭｓは、分子が組織化された分子の集合体であると定義され、ここで組織化は該分子の鎖の間の相互作用のためであり、安定した、単分子の、そして規則正しい異方性フィルムを生じる（A. ULMAN, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554）。特に固体支持体の表面が、好ましくはトリクロロエチレンのような溶媒中で約１０ｍＭの溶液の、本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤（ここで結合官能基Ａはシラン型）で官能化されるとき、そして接触が約４℃の温度で約２４時間実施されるとき、このようなＳＡＭｓが得られ得る。
【００４１】
さらに、本発明に従う方法を実施することにより得た表面は、固体支持体の表面に存在するカップリング剤の反応性官能基Ｂに対して相補的である化学官能基を含む関心のある生物分子を共有結合で固定化するための時間及び空間的に、選択的に容易に除去される感光性保護基で保護された多数の反応性官能基を直接提示する。
【００４２】
本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤で官能化され得る固体支持体は、好ましくはガラス、セラミック（酸化物型）、シリコンまたはプラスチックから作製される支持体から選択され、前記支持体は少なくとも一つの水和された、ヒドロキシル化された、シラン化されたまたはアミン化表面、あるいは活性エステル型の表面を有する。このような表面は、よく知られた先行技術に従い容易に調製され得る。例えば、表面のヒドロキシル官能基を遊離するための酸加水分解を続いて受けるシランエポキシドによるシラン化によりヒドロキシル化された表面を含む固体支持体を製造することが可能である。
【００４３】
これらの固体支持体は、少なくとも一つの平面または平面ではない、平滑なまたは構造化された表面を有し、例えばガラススライド、平面のプラスチックプレートまたはウェルを備えたプラスチックプレート、キャピラリーチューブあるいはポーラスまたは非ポーラスビーズの形態であり得る。
【００４４】
上記のように、式（Ｉ）のカップリング剤の結合官能基Ａは、前記カップリング剤が結合されることを意図する支持体の表面の性質に応じて選択される。
【００４５】
このように、これらが少なくとも一つの活性エステル型の表面を有する支持体であるとき、官能基Ａが好ましくはアミン官能基であり；そして、これらが少なくとも一つのヒドロキシル型の表面を有する支持体であるとき、官能基Ａは好ましくはホスホルアミダイトまたはシラン官能基であり；これらが少なくとも一つのヒドリド型の表面を有する支持体であるとき、官能基Ａは好ましくはシラン官能基であり、そして、これらがアミノ化表面を有する支持体であるとき、官能基Ａは好ましくは活性エステル官能基である。
【００４６】
ゆえに、本発明の主題はまた、上記で定義した１以上の式（Ｉ）のカップリング剤で官能化された少なくとも一つの表面を有する固体支持体である。
【００４７】
このような支持体は、それらが脱保護された後の前記固体支持体の表面に存在する式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂに対して相補的である、化学官能基を含む関心のある生物分子の固定化のために、そして特にＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドのような核酸分子の共有結合的な固定化のために、有利に使用され得る。
【００４８】
このように、本発明の主題はまた、前記固体支持体の表面に存在する式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂに対して相補的である化学官能基を含む関心ある生物分子の、そして特にアミド結合（ペプチド）の形成を介した核酸（ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド）の、共有結合的な固定のための、上記の固体支持体の使用である。
【００４９】
本発明の主題はまた、上記の固体支持体への、関心ある生物分子、特に核酸分子の固定化方法であり、これは該固体支持体の表面の少なくとも一部分の露光による式（Ｉ）の化合物の反応性官能基Ｂの光−脱保護、続いて、このように活性化された固体支持体を関心のある生物分子、特に核酸分子の溶液と接触させる第１工程を少なくとも含み、その結果、前記分子に備えられた、そして本発明に従う前記式（Ｉ）の化合物の反応性官能基Ｂに対して反応性を有する、少なくとも一つの化学官能基との間の共有結合の形成を介する前記分子の前記支持体への固定化を生じさせ、そしてこれらの２つの工程を必要に応じて繰り返すことを特徴とする。
【００５０】
特に、光−脱保護工程は、該固体支持体の官能化された表面の一部のみに局在され得、例えばマスクを介して実施され得る。
【００５１】
露光後、式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂは脱保護（活性化）状態にあり、これは、該固体支持体の表面に存在する前記活性化反応性官能基Ｂに対して反応性を有する化学官能基を含む溶液中の任意の分子を捕獲し得るフリーな反応性官能基を有する領域を生み出す。
【００５２】
特に、固定化工程は、式（Ｉ）の化合物のオキシアミン官能基Ｂと、関心ある生物分子、特に核酸分子のカルボニル化官能基との間のオキシム結合の形成を通して実施される。この反応は、穏やかな条件下、特に４と７の間のｐＨで実施できるという利点を有する。さらに、形成された結合（オキシム）は非常に良い安定性を示し、そして、更なる還元工程により、それを安定化させる必要がない。
【００５３】
露光波長は好ましくは３００〜４００ｎｍ間にある。
【００５４】
関心のある生物分子の溶液は、単純な水溶液または緩衝作用のある水溶液中のこれらの分子の溶液であり得る。
【００５５】
接触を実施する期間は、好ましくは約５〜６０分間であり、また好ましくは約４〜６０℃間の温度で実施される。
【００５６】
最後に、本発明の主題はまた、上記した、また本発明に従う固定化方法を実施することにより得られる、すなわち本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤の反応性官能基Ｂで形成された共有結合により関心のある前記生物分子、特に核酸分子が固定化された少なくとも一つの表面を有する、固体支持体（特に核酸チップ）である。
【００５７】
上記アレンジメントの他に、本発明はまた、以下の記載から明らかになる他のアレンジメントも含有し、これは、式（Ｉ）のカップリング剤の製造の例、本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤によるキャピラリーチューブ型のガラス固体支持体または平面の固体支持体の官能化の例、オリゴヌクレオチドの固定化のためのこれらの官能化支持体の使用、ならびに添付の図１及び２
（ここで：
−  図１は、非官能化キャピラリーチューブ（タイプｂ／のキャピラリーチューブ）と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従うキャピラリーチューブ型（タイプａ／のキャピラリーチューブ）の固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す；
−図２は、非官能化支持体（タイプｂ／の支持体）と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従う平面の固体支持体（タイプａ／の支持体）に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す
に関する。
【００５８】
実施例１：式（Ｉ）に従うホスホルアミダイト誘導体の製造
【００５９】
【化６】
2008508239.tif 000007
【００６０】
１）第一工程：化合物（１）の製造：オキシアミンの導入
【００６１】
【化７】
2008508239.tif 000008
【００６２】
１５０ｍｌのジメチルホルムアミド（DMF）中のＮ−ヒドロキシフタルイミド（２．７０ｇ；１６．６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（４．６ｇ；２３．６ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌しながらアルゴン下、１時間５０℃の温度に加熱した。続いて６−ブロモヘキサノール（３ｇ；１６．６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで反応混合液を再び５０℃の温度で一晩攪拌した。ろ過後、該溶媒を減圧下で蒸発させた。続いて５０ｍｌの酢酸エチルを、このようにして得られた残渣に添加し、次いで有機相を０．１Ｎ  水酸化ナトリウムで、次いで塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。続いて該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで蒸発させた。生成物（１）は８５℃と８８℃の間の融点を有する白色粉末の形態で得た（３．２８ｇ；１２．５ｍｍｏｌ；収率７５％）。
【００６３】
ＣＤＣｌ３中、周波数２００ＭＨｚで実施したプロトン核磁気共鳴（1H-NMR）分析は以下の通りである：
δ ppm = 1.30-1.90 (8H, m, 4CH2), 3.60 (2H, t, J = 13 Hz, CH2O), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH2ON), 7.70-7.90 (4H, m, Ar-H).
MS (DCI, positive mode): Mcalc- 263 (C14H17NO4), m/z = 281 [M+NH4]+.
２）第二工程：化合物（２）を製造するための化合物（１）のトリチル化
【００６４】
【化８】
2008508239.tif 000009
【００６５】
塩化トリチル（４．２ｇ；１５ｍｍｏｌ）を、７５ｍｌの無水ピリジン中の上記の前記工程で得た化合物（１）（３．２ｇ；１２．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。該溶液をアルゴン下、一晩、周囲温度で攪拌した。続いて５ｍｌのメタノールをゆっくり添加し、次いで該溶媒を減圧下で蒸発させた。続いて得られた残渣を１００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、次いで有機相を水で、次いで塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。続いて該有機相を無水硫酸ナトリウム下で乾燥させ、次いで蒸発させた。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤  ジクロロメタン／シクロヘキサン：７５／２５、ｖ／ｖ）で精製した。生成物（２）は１０６−１０７℃で融解する白色粉末の形態で得た（６．２７ｇ；１２．４ｍｍｏｌ；収率９９％）。
【００６６】
1H-NMR分析（200 MHz, CDCl3）は以下の通りである：
δ ppm = 1.30-1.90 (8H, m, 4 CH2), 3.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH-2O), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH2ON), 7.70-7.90 (4HAr, m, Ar-H-フタルイミド), 7.20-7.40 (15H, m, Ar-H-トリチル).
MS (ESI, positive mode): MCalc = 505 (C33H-31NO4), m/z = 528 [M+Na]+, m/z = 544 [M+K]+.
３）第三工程：化合物（３）を得るための化合物（２）のヒドラジン分解
【００６７】
【化９】
2008508239.tif 000010
【００６８】
上記の第二工程において得られた化合物（２）（６．２７ｇ；１２．４ｍｍｏｌ）を、５０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次いで７８０ｍｇのヒドラジン（２４．８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を１時間半還流させ、次いでろ過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物を、溶離剤がジクロロメタン、次いでジクロロメタンとメタノールが９５／５（ｖ／ｖ）の混合液である、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。化合物（３）は収率９０％でオイルの形態で得た（４．２０ｇ；１１２．２ｍｍｏｌ）。
【００６９】
1H-NMR（200 MHz, CDCl3）：δ ppm = 1.30-1.80 (8H, m, 4 CH2), 3.10 (2H, t, J = 13 Hz, CH2O-Tri), 3.60 (2H, t, J = 13 Hz, CH2ON), 7.70-7.90 (15H, m, Ar-H--トリチル).
MS (ESI, positive mode): Mcalc= 375 (C25H29NO2), m/z = 376 [M+H]+, m/z = 398 [M+Na]+, m/z = 414 [M+K]+.
４）第四工程：化合物（４）を得るための化合物（３）のオキシアミンの保護
【００７０】
【化１０】
2008508239.tif 000011
【００７１】
上記の第三工程で製造した化合物（３）（４．２０ｇ；１１．２ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのピリジンに溶解した。続いて５．４０ｇ（２２．４ｍｍｏｌ）の２−（２−ニトロフェニル）プロピルクロロホルメート（Ｃｌ−ＮＰＰＯＣ）を含有する５０ｍｌのジクロロメタン溶液を滴下した。該反応混合液を暗所で１時間攪拌し、次いで減圧下で蒸発させた。続いて得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、次いで有機相を塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム下で乾燥させ、次いで蒸発させた。粗生成物を溶離剤としてジクロロメタンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物（４）は収率８９％でオレンジ色のオイル（５．８０ｇ；９．９ｍｍｏｌ）の形態で得た。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH3), 1.50-1.80 (8H, m, 4 CH2), 3.0 (2H, t, J = 13 Hz, CH2O-Tri), 3.70 (2H, m, CH2ON, 1H, m CH), 4.20 (2H, t, J = 13 Hz, CH2OCO), 7.10-7.50 (15H, m, Ar-H-トリチル), 7.50-7.80 (4H, m, Ar-H- NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 582 (C35H38N2O6), m/z = 605 [M+Na]+, m/z = 621 [M+K]+.
MS (ESI, negative mode): m/z = 581 [M-H]-.
５）化合物（５）を得るための化合物（４）の脱トリチル化
【００７２】
【化１１】
2008508239.tif 000012
【００７３】
上記の前記工程で得た５．８０ｇ（９．９０ｍｍｏｌ）の化合物（４）を、ジクロロメタン中、２０％のトリフルオロ酢酸溶液５０ｍｌに溶解した。該混合液を３〜４時間周囲温度で攪拌し、次いで減圧下で蒸発させた。得られた残渣を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次いで有機相をＮａＣｌの飽和水溶液で洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで蒸発させた。粗生成物を、溶離剤としてジクロロメタン、次いで９５／５（ｖ／ｖ）のジクロロメタン／メタノールを使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。化合物（５）は収率９０％でオレンジ色のオイル（３．０ｇ；８．９ｍｍｏｌ）の形態で得た。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH3), 1.50-1.80 (8H, m, 4 CH2), 3.70 (2H, m, CH2ON, 1H, m, CH), 4.30 (2H, t, CH2OCO, 2H, t, CH2OH), 7.50-7.80 (4H, m, Ar-H NPPOC).
MS(DVI, positive mode): Mcalc = 340 (C16H24N2O6), m/z = 454 [M+TFA]+.
６）第六工程：化合物（６）を製造するための化合物（５）のホスフィチル化
【００７４】
【化１２】
2008508239.tif 000013
【００７５】
上記の前記工程で得た化合物（５）（０．９０ｇ；２．７ｍｍｏｌ）をアルゴン気流下、１５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次いでジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．５６ｍｌ，３．２ｍｍｏｌ）を添加し、そして０．７２ｍｌの２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（３．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合液を、周囲温度で４時間、出発生成物がなくなるまで攪拌した。４０ｍｌのジクロロメタンを次いで添加し、そして有機相を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で、次いでＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム下で乾燥させ、次いで蒸発させた。粗生成物を、溶離剤としてジクロロメタンを、次いで９７／３（ｖ／ｖ）のジクロロメタン／メタノール混合液を使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。化合物（６）は収率３８％で黄色オイル（０．５０ｇ；１．０ｍｍｏｌ）の形態で得た。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.20-1.50 (15H, m, 4 CH3), 1.50-1.85 (8H, m, 4 CH2), 2.65 (2H, t, CH2CN), 3.80 (2H, m, CH2OH, 1H, m, CH, 4 H, m, 2 CH2OP), 4.30 (2H, m, CH2OCO, 2H, m, 2 CHN, 7.10-7.70 (4H Ar-H NPPOC).
31P-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 120 (2 diastereoisomers).
実施例２：式（Ｉ）に従う活性エステル誘導体（化合物（８））の製造
【００７６】
【化１３】
2008508239.tif 000014
【００７７】
１）第一工程：前駆体酸（precursor acid）の製造
【００７８】
【化１４】
2008508239.tif 000015
【００７９】
カルボキシメトキシルアミンハイドロクロライド（１ｇ；４．５７ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの１０％炭酸ナトリウム水溶液に溶解した。該溶液を０℃に冷却し、次いで、２．２０ｇ（９．１ｍｍｏｌ）の２−（２−ニトロフェニル）プロピルクロロホルメート（Ｃｌ−ＮＰＰＯＣ）を含有する２０ｍｌのジオキサン溶液を攪拌しながら滴下した。攪拌は、周囲温度で２〜３時間続けた。反応メディウムを蒸発させて、乾燥させた。２５０ｍｌの水をこのようにして得た残渣に添加し、次いで水相を２００ｍｌのジエチルエーテルで洗浄した。次いで、該水相を１Ｎの塩酸溶液で酸性化してｐＨ３とし、次いで２５０ｍｌのジクロロメタンで３回抽出した。有機相を合わせ、そして無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。粗生成物を溶離剤としてジクロロメタン、次いで９７／３（ｖ／ｖ）のジクロロメタン／メタノール混合液を使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。化合物（７）は収率９０％で８８〜９２℃間で融解する白色粉末の形態で得た（１．２０ｇ；４．０ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.40 (3H, d, J = 16 Hz, CH3), 3.70 (1H, m, CH), 4.30 (2H, m, CH2O) 4.40 (s, 2H, COCH2O), 7.30-7.60 (4H, m, Ar-H NPPOC).
13C-NMR (300 MHz, CDCl3): δ ppm = 18 (CH2), 33 (CH2), 67 (CH3), 70 (CH3), 75 (CH3), 123 (quat), 137 (quat), 138 (quat), 133 (quat), 136 (CH), 151 (CH), 159 (CH), 172 (CH), 173 (CH).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 298 (C12H14N2O7), m/z = 321 [M+Na]+, m/z = 337 [M+K]+.
MS (ESI, negative mode): m/z = 297 [M-H]-, m/z = 595 [2M-H]-.
2)第二工程：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル（８）の製造
【００８０】
【化１５】
2008508239.tif 000016
【００８１】
上記の前記工程で得た酸（７）（１．２０ｇ；４．０ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解し、次いでジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．８２ｇ；４．４ｍｍｏｌ）を、続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４５７ｇ；４．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応メディウムを一晩攪拌した。ろ過後、該溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を溶離剤として酢酸エチルを使用して速いシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。化合物（８）は収率６７％で黄色粉末の形態で得た（１．０ｇ；２．６８ｍｍｏｌ）。
実施例３：ペンタフルオロフェノール（９）により活性化された式（Ｉ）のエステル誘導体の製造
【００８２】
【化１６】
2008508239.tif 000017
【００８３】
上記の実施例２の第一工程で得た化合物（７）５００ｍｇ（１．６ｍｍｏｌ）を５ｍｌのジクロロメタンに溶解し、次いで３７２ｍｇ（１．９ｍｍｏｌ）のペンタフルオロフェノールを添加し、そしてジクロロメタン中、１ｍｌのＤＣＣ（３６０ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）溶液を滴下した。混合液を４時間攪拌し、次いで形成したジシクロウレア（dicyclourea、ＤＣＵ）沈殿物をろ過により除いた。溶媒蒸発後、化合物（９）は収率１００％でオイルの形態で得た（７４０ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.30 (3H, d, J = 16 Hz, CH3, 3.70 (1H, m, CH), 4.30 (2 H, m, CH2O), 4.70 (s, 2H, COCH2O), 7.30-7.70, (4H, m, Ar-H NPPOC).
19F-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = -166.0 (1F, t), -164.0 (1F, d), -162.0 (1F, t), -157.0 (1F, t), -152.50 (1F, d).
実施例４：式（Ｉ）のトリエトキシシラン誘導体の製造
【００８４】
【化１７】
2008508239.tif 000018
【００８５】
１）第一工程：Ｎ−ニトロフェニルプロピルオキシカルボニルアリルオキシアミン（１０）の製造
【００８６】
【化１８】
2008508239.tif 000019
【００８７】
０℃の温度に冷却された２５ｍｌの無水ピリジン中、３．２５０ｇ（２９．６ｍｍｏｌ；１．１当量）の市販のアリルオキシアミン溶液に、６ｇ（２７ｍｍｏｌ）の２−（２−ニトロフェニル）プロピルクロロホルメート（Ｃｌ−ＮＰＰＯＣ）を含有するジクロロメタン溶液１５ｍｌを滴下した。３０分攪拌後、該溶媒を蒸発させ、次いでトルエンとともに蒸発させた。反応粗生成物を酢酸エチルに溶解した。有機相を洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで減圧下で蒸発させた。溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン：１／４（ｖ／ｖ）の混合液を使用したシリカゲルクロマトグラフィーによる精製後、化合物（１０）を収率７２％（５．７６ｇ）で得た。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.40 (d, 6H, Si-CH2-CH3), 3.70 (q, 1H, Ar-CH-CH3), 4.30 (m, 4H, CH2O, OCH2), 5.30 (dd, 2H, CH2), 5.90 (m, 1H, CH), 7.20 (s, 1H, NH), 7.30-7.80 (m, 4H, H-Ar).
２）第二工程：化合物（１１）を製造するためのヒドロシリル化
８ｍｌのトリエトキシシラン中、上記の前工程で得た１．６７ｇ（５．６ｍｍｏｌ）の化合物（１０）の溶液に、２０μｌのカールステッド触媒を滴下した。６０℃で一晩攪拌後、溶媒を真空下、蒸留により蒸発させた。反応粗生成物を溶離剤として１／４（ｖ／ｖ）酢酸エチル／ヘキサン混合液を使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、収率６０％で予期した化合物（１１）を得た（１．３３ｇ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 0.65 (m, 2H, CH2Si), 1.20 (t, 3H, CH3-CH2-O), 1.40 (d, 3H, CH3-CH), 1.70 (m, 3H, CH2, CH-CH3), 3.80 (m, 4H, O-CH2-CH3, CH2O), 4.30 (m, 2H, CH2-O-CO), 7.30-7.80 (m, 5H, NH, H-Ar).
MS (エレクトロスプレー, positive mode): Mcalc = 444, m/e = 44.7 [M+H]+.
以下の固体支持体の製造例は、キャピラリーチューブの形態（長さ３ｃｍ及び直径１００μｍのガラスキャピラリーチューブ）において本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤を使用して実施した。しかしながら、これらの例は他のタイプの支持体の平面の形態に置き換えられるということを明確に理解すべきである。
【００８８】
実施例５：シラン型の結合官能基Ａを含む式（Ｉ）のカップリング剤で官能化された固体支持体の製造
この例において、上記の実施例４で製造した化合物（１１）を式（Ｉ）のカップリング剤として使用した。
【００８９】
化合物（１１）により官能化された固体支持体は、以下の反応スキーム：
【００９０】
【化１９】
2008508239.tif 000020
【００９１】
に従う無機固体支持体（mineral solid support）（ガラスキャピラリーチューブ）の表面のシラン化に関する工程による場合、単一工程で得られる。
【００９２】
これを行うために、キャピラリーチューブは１／１  水／エタノール混合液中、６Ｍ水酸化ナトリウム溶液で満たされ、そして溶液を周囲温度で２時間該キャピラリーチューブに残す。
【００９３】
続いて、該キャピラリーチューブを水で徹底的に洗浄し、次いで窒素で乾燥させる。
【００９４】
続いて、該キャピラリーチューブをトリクロロエチレン中、１０ｍＭの化合物（１１）の溶液で満たし、そして周囲温度で一晩作用させ続けた。
【００９５】
続いて、該キャピラリーチューブをトリクロロエチレン、無水エタノール、次いでクロロホルムで徹底的に洗浄し、最終的に窒素で乾燥させる。
【００９６】
そして、その内表面が化合物（１１）の相で官能化された、すなわち光感受性オキシアミン表面のガラスキャピラリーチューブを得た。
【００９７】
実施例６：活性エステル型の結合官能基Ａを含む式（Ｉ）のカップリング剤で官能化された固体支持体の製造
この実施例において、ＮＨＳ−活性エステル型の結合官能基Ａを含む、上記の実施例２で製造した化合物（８）を式（Ｉ）のカップリング剤として使用した。
【００９８】
ＮＨＳ−活性エステルカップリング剤により官能化された固体支持体は以下の反応スキーム：
【００９９】
【化２０】
2008508239.tif 000021
【０１００】
に従う、２つの工程で得る。
【０１０１】
これに従うと、第一工程では、固体支持体の無機表面がアミン官能基を含む表面に変換され、そして第二工程では、前記表面アミン官能基が化合物（８）と反応する。
【０１０２】
１）第一工程：アミン官能基を含む表面の製造
ガラスキャピラリーチューブを１／１  水／エタノール混合液中、６Ｍ  水酸化ナトリウム溶液で満たし、次いで該溶液を周囲温度で２時間該キャピラリーチューブに残した。
【０１０３】
続いて、該キャピラリーチューブを水で徹底的に洗浄し、次いで窒素で乾燥させた。
【０１０４】
続いて、該キャピラリーチューブを、９５°エタノール中、１０％のトリエトキシアミノプロピルシラン溶液で満たし、該溶液を周囲温度で一晩、該キャピラリーチューブに残した。続いて、該キャピラリーチューブをエタノールで洗浄し、そして窒素で乾燥させた。
【０１０５】
その内表面がアミン官能基で被覆されたキャピラリーチューブを得た。
【０１０６】
２）第二工程：化合物（８）による該支持体の官能化
上記の第一工程で得たキャピラリーチューブを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、１０ｍＭの化合物（８）の溶液で満たし、そして該溶液を周囲温度で一晩、該キャピラリーチューブに残した。
【０１０７】
続いて、該キャピラリーチューブをＤＭＦで、次いでエタノールで洗浄し、そして最終的に窒素で乾燥させた。
【０１０８】
その内表面が化合物（８）の層で官能化された、すなわち光感受性オキシアミン表面のガラスキャピラリーチューブをこのようにして得た。
【０１０９】
実施例７：関心ある生物分子の固定化のための官能化された支持体の使用
この実施例において、上記実施例５で得た固体支持体をオリゴヌクレオチド（ＯＮｓ）の固定化のために使用した。しかしながら、これらの支持体の他の関心ある生物分子の固定化のための使用もまた妥当であると明確に理解すべきである。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドの場合、該固体支持体の表面でのこれらの分子のグラフティング及びこれらの存在の確認は、４つの工程を含む：
（ｉ）露光：これは光作用下で、該固体支持体の表面上の反応性官能基Ｂを部分的にフリーにすることを可能にする工程である。この官能基Ｂは生物分子のグラフティングを可能にする。
【０１１１】
（ｉｉ）固定化：これは露光工程後、ＯＮにより保持されるアルデヒド官能基と固体支持体の表面で光脱保護された官能基Ｂとの間での反応による、ＯＮ、それ自身の、グラフディングの工程である。
【０１１２】
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション：これは該固体支持体の表面上にグラフトされたＯＮの、フルオロフォアを備えたその相補的な配列による認識による、所望のＯＮの起こり得るグラフティングの確認工程である。
【０１１３】
（ｉｖ）スキャナーによる蛍光の検出：これは、フルオロフォアにより放たれる任意のシグナルの加工（processing）工程である。
【０１１４】
Ｉ）手順：
１）露光工程
上記実施例５で製造した化合物（１１）で官能化されたキャピラリーチューブを１／１  ピリジン／水混合液で満たした。
【０１１５】
続いて、キャピラリーチューブの露光を、波長３６５ｎｍ、スロットサイズ１６０μｍに調整した、強度４  ｍＷ／ｍｍ２の紫外線Ａ（ＵＶＡ）放射露光デバイスを使用して５秒間、前記チューブの様々な選択された部分で実施し、前記露光デバイスは１００Ｗランプを備えた。
【０１１６】
続いて、該キャピラリーチューブは水で洗浄し、次いで窒素で乾燥させた。
【０１１７】
２）ＯＮ固定化工程
このように第一工程に従い処理されたキャピラリーチューブを、水中、１０μＭの、アルデヒド官能基を有するＯＮｓ溶液とインキュベートし、次いで全体を３０分間作用させ続けた。
【０１１８】
続いて、該キャピラリーチューブを水で、次いで０．２％のラウリル硫酸ナトリウム溶液で、そして再び水で洗浄し、次いで最終的に窒素で乾燥させた。
【０１１９】
３）ハイブリダイゼーション工程
上記の工程２）に従いＯＮｓが固定化されたキャピラリーチューブを、ＣＹ３フルオロフォアを有する相補的なＯＮｓ溶液で満たし、次いで全体を４０℃の温度で１時間作用させ続けた。
【０１２０】
続いて、該キャピラリーチューブを０．２％クエン酸ナトリウム溶液で洗浄した。
【０１２１】
４）リーディング工程
フルオロフォアで標識されたＯＮｓが上記の工程３）に従いハイブリダイズしたキャピラリーチューブをガラススライド上に置き、次いでジェノミクスソリューション社（the company Genomic’s Solution）から販売されている蛍光リーダーに導入した。
【０１２２】
同じ測定はまた、式（Ｉ）のカップリング剤による官能化工程を除いては、テストキャピラリーチューブ（ｔｙｐｅ  ａ／）のための上記のものと同じ処理を行ったコントロールキャピラリーチューブ（ｔｙｐｅ  ｂ／）について実施した。
【０１２３】
ＩＩ／結果
得られた蛍光画像を添付の図１に表し、ここで露光された部分のみ蛍光していることに気付き得る。さらに、本発明に従う式（Ｉ）のカップリング剤で官能化されたキャピラリーチューブ（ｔｙｐｅ  ａ／）のみが、所望のＯＮｓの光−局所的固定化に対応する蛍光セグメントを含み、非官能化キャピラリーチューブ（ｔｙｐｅ  ｂ／）は完全に非蛍光であることが分かる。
【０１２４】
この実施例は、本発明に従う固体支持体が、特定の及び局所的な様式における関心ある分子の固定化のために有利に使用され得ることを実証する。
【０１２５】
実施例８：式（Ｉ）のトリエトキシシラン誘導体の製造（１５）
【０１２６】
【化２１】
2008508239.tif 000022
【０１２７】
１）第一工程：化合物（１２）の製造：オキシアミンの導入
【０１２８】
【化２２】
2008508239.tif 000023
【０１２９】
２５０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（３．５０ｇ；２１ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（８ｇ；４１ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌しながら１時間アルゴン下、５０℃の温度で加熱した。続いて、１１−ブロモウンデセン（５．０ｇ；２１ｍｍｏｌ）を添加し、次いで反応混合液を再び３時間、５０℃の温度で攪拌した。ろ過後、該溶媒を減圧下で蒸発させた。続いて、１００ｍｌのジクロロメタンをこのようにして得た残渣に添加し、次いで有機相を０．１Ｎ水酸化ナトリウムで、次いで塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。続いて該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで蒸発させた。生成物（１２）を３８〜４０℃間の融点を有する白色粉末の形態で得た（６．４５ｇ；２０．４ｍｍｏｌ；収率９７％）。
【０１３０】
ＣＤＣｌ３中、周波数２００ＭＨｚで実施したプロトン核磁気共鳴（1H-NMR）分析は以下の通りである：
δ ppm = 1.20-1.50 (12 H, m, 6 CH2); 1.78 (2 H, m, J = 7 Hz, C2H3CH2CH2CH2); 2.02 (2 H, m, C2H3CH2CH2); 4.18 (2 H, t, J = 6 Hz, CH2ON); 4.95 (2 H, m, CH2CHCH2); 5.79 
(1 H, m, CH2CHCH2); 7.70-7.85 (4 H, m, Ar-H).
MS (ESI, positive mode): Mcalc - 315 (C19H25NO3), m/z = 338 [M+Na]+.
２）第二工程：化合物（１３）を製造するための化合物（１２）のヒドラジン分解
【０１３１】
【化２３】
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【０１３２】
上記の第一工程で得た化合物（１２）（３．０ｇ；９．６４ｍｍｏｌ）を３０ｍｌジクロロメタンに溶解し、次いで９６６ｍｇのヒドラジン（１９，３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を３時間還流し、次いでろ過し、次いで減圧下で蒸発させた。粗生成物を溶離剤として酢酸エチルとシクロヘキサン（ｖ／ｖ：１／２）の混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。化合物（１３）を収率９３％で半透明オイルの形態で得た（１．６５ｇ；８．９４ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 1.20-1.50 (12 H, m, 4 CH2), 1.56 (2 H, m, C2H3CH2CH2CH2), 2.03 (2 H, q, C2H3CH2CH2), 3.65 (2 H, t, J = 6 Hz, CH2ON), 4.96 (2 H, m, CH2CHCH2), 5.80 (1 H, m, CH2CHCH2).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 185 (C11H23NO), m/z = 186 [M+H]+.
３）第三工程：化合物（１４）を得るための化合物（１３）のオキシアミンの保護
【０１３３】
【化２４】
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【０１３４】
上記の第二工程で製造した化合物（１３）（４７０ｍｇ；２．５４ｍｍｏｌ）を２ｍｌのピリジンに溶解させた。続いて、６２０ｍｇ（５．０８ｍｍｏｌ）の２−（２−ニトロフェニル）プロピルクロロホルメート（Ｃｌ−ＮＰＰＯＣ）を含む３ｍｌのジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合液を暗所で２時間攪拌し、次いでろ過し、次いで減圧下で蒸発させた。続いて得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、次いで有機相を１０％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウム水溶液で、次いで塩酸水溶液（１Ｎ）で、最終的に塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、次いで蒸発させた。粗生成物を、溶離剤として酢酸エチルとシクロヘキサン（ｖ／ｖ：１／４）の混合液を使用して、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。化合物（１４）を収率８８％のオレンジ色オイルの形態で得た（８７３ｍｇ；２．２２ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3):δ ppm = 1.20-1.40 (12 H, m, 6 CH2), 1.35 (3 H, d, J = 7 Hz, CH3), 1.56 (2 H, m C3H3CH2CH2CH2), 2.03 (2 H, m, C2H3CH2CH2), 3.65 (2 H, m, CH2ON, 1H, m, CH), 4.28 (2H, m, CH2OCO), 4.96 (2 H, m, CH2CHCH2), 5.80 (1 H, m, CH2CHCH2), 7.20-7.80 (4 H, m, Ar-H NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc= 392 (C21H32N2O5), m/z = 415 [M+Na]+, m/z = 410 [M+NH4]+.
４）第四工程：化合物（１５）を得るための化合物（１４）のヒドロシリル化
【０１３５】
【化２５】
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【０１３６】
上記の第三工程に記載の方法に従い得た化合物（１４）１．２８ｇ（３．２ｍｍｏｌ）を、５ｍｌのトリエトキシシラン及び１４μｌ（０．２５当量）カールステッド触媒を含む溶液に添加した。反応混合液を６０℃の温度で２時間攪拌し、次いで溶媒を蒸発させ、減圧下でＤＭＦと共蒸発させた（５〜６回）。予測した化合物（１５）を収率８３％のオイルの形態で得た（１．４９ｇ；  ２．６８ｍｍｏｌ）。
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ ppm = 0.6 (2 H, m, CH2Si), 1.20-1.40 (16 H, m, 6 CH2, 9H 3 CH3CH2OSi), 1.35 (3 H, d, J = 7 Hz, CH3), 3.65 (2 H, m, CH2ON, 1H, m, CH), 4.28 (2 H, m, CH2OCO), 7.20-7.80 (4 H, m, Ar-H NPPOC).
MS (ESI, positive mode): Mcalc = 556 (C27H48N2O8Si), m/z = 579 [M+Na]+.
実施例９：シラン型の結合官能基Ａを含む式（Ｉ）のカップリング剤で官能化された平面の固体支持体の製造
この実施例において、上記の実施例８で製造した化合物（１５）を式（Ｉ）のカップリング剤として使用した。
【０１３７】
１）第一工程：表面の再水和（活性化）
不活化ＳｉＯ２官能基を有する固体の平面のケイ素支持体を、４ｍｌの水と３ｍｌのエタノールを含み、さらに水酸化ナトリウム（１ｇ  ＮａＯＨ）を含む溶液に１時間浸漬させた。続いて、該支持体を超純粋で、次いで０．２Ｎの塩酸溶液で、最終的に水で洗浄して、活性化ＳｉＯＨ官能基を含む表面を生成した。次いで、該支持体をアルゴンで乾燥させた。
【０１３８】
２）第二工程：化合物（１５）を有する支持体のシラン化
このように活性化された支持体をトルエン／トリエチルアミン（ｖ／ｖ：９７／３）中、５ｍＭの化合物（１５）（７ｍｌ）溶液に、一晩、８０℃で浸した。続いて、該支持体をトルエンで、次いでエタノールで洗浄し、最終的にアルゴン下で乾燥させた。続いて、このように化合物（１５）で官能化された支持体を１１０℃で３時間、インキュベーターに置いた。
【０１３９】
実施例１０：関心のある生物分子の固定化のための式（Ｉ）の化合物で官能化された固体平面支持体の使用
上記の実施例７でまさに述べたように、固体支持体の表面でのＯＮグラフティング及びそれらの存在の確認は４つの工程を含む：露光、固定化、ハイブリダイゼーション及び最終的にスキャナーによる蛍光の検出。
【０１４０】
Ｉ）手順：
１）第一工程：支持体の露光
上記実施例９に記載された方法に従う化合物（１５）で官能化され、その上に光の透過を可能にする１００μｍ×１００μｍの透明なスポットを含むプラスチックマスクが適用されている固体平面支持体を、１／１（ｖ／ｖ）のピリジン／水混合液の液滴で被覆した。該支持体の表面全体の、従ってマスクを通した露光を、波長３６５ｎｍ、強度４ｍＷ／ｍｍ２である紫外線Ａ（ＵＶＡ）放射露光デバイスを使用して１５秒間実施し、前記露光デバイスは１００Ｗランプを備えていた。
【０１４１】
次いで、該固体平面支持体を水で洗浄し、窒素下で乾燥させた。
【０１４２】
２）第二工程：ＯＮ固定化
このように第一工程に従い処理された平面支持体を、水中、１０μＭの、アルデヒド官能基を有するＯＮ溶液とインキュベートし、全体を３０分間作用し続けた。
【０１４３】
次いで、該支持体を水で、次いで０．２％ラウリル硫酸ナトリウム溶液で、次いで再び水で洗浄し、最終的に窒素で乾燥させた。
【０１４４】
３）第三工程：ハイブリダイゼーション
ＯＮｓが上記の工程２）に従い固定化された固体支持体を、ＣＹ３フルオロフォアを有する相補的なＯＮｓ溶液で満たし、次いで全体を４０℃の温度で１時間作用し続けた。続いて、該支持体を０．２％クエン酸ナトリウム溶液で洗浄した。
【０１４５】
４）第四工程：リーディング
フルオロフォアで標識されたＯＮｓが上記の工程３）に従いハイブリダイズした支持体をガラススライド上に置き、次いでジェノミクスソリューション社（the company Genomic’s Solution）から販売されている蛍光リーダーに導入した。
【０１４６】
同じ測定はまた、化合物（１５）による官能化工程を除いては、テストキャピラリーチューブ（ｔｙｐｅ  ｂ／）について上記のものと同じ処理を行った固体平面支持体（ｔｙｐｅ  ｂ／）について実施した。
【０１４７】
ＩＩ／結果
得られた蛍光画像を添付の図２に表し、ここで露光された部分のみ蛍光があることに気付き得る。
【０１４８】
さらに、本発明に従うカップリング剤（１５）で官能化された固体平面支持体（ｔｙｐｅ  ａ／の支持体））のみが、所望のＯＮｓの光−局所的固定化に対応する蛍光スポットを含み、非官能化支持体（ｔｙｐｅ  ｂ／の支持体））は完全に非蛍光であることが分かる。
【０１４９】
この実施例は、本発明に従う固体支持体が、特定の及び局所的な様式における関心ある分子の固定化のために有利に使用され得ることを実証する。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、非官能化キャピラリーチューブ（タイプｂ／のキャピラリーチューブ）と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従うキャピラリーチューブ型（タイプａ／のキャピラリーチューブ）の固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す。
【図２】図２は、非官能化支持体（タイプｂ／の支持体）と比較した、フルオロフォアで標識された相補的なオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション後の、本発明に従う方法に従う平面の固体支持体（タイプａ／の支持体）に結合したオリゴヌクレオチドにより放出された蛍光の写真を表す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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