(57)【要約】  本発明は、１つ以上の不純物を含むロード流体からの産物の精製のための、弱分配クロマトグラフィーを使用する方法に関する。さらに本発明は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件によって規定されるか、あるいは少なくとも部分係数０．１によって規定される、弱分配クロマトグラフィー方法に関する。他の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物を媒体に結合させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項２】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項３】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項４】
前記作動条件がスクリーニング工程において識別される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記作動条件がｐＨレベルおよびイオン強度を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記作動条件が塩濃度をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記作動条件が添加物濃度をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記作動条件が、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記作動条件がカウンターリガンドレベルおよびｐＨレベルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記作動条件がイミダゾール濃度をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニング工程がバッチ結合調査を使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記スクリーニング工程がカラム結合調査を使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記カラム結合調査が勾配溶出調査である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記カラム結合調査が無勾配溶出調査である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも２０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも３０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも４０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも５０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記作動条件が媒体１ｍＬあたり少なくとも６０ｍｇの産物を前記媒体に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記分配係数の値が約０．２〜約２０．０の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記分配係数の値が約０．２〜約１０．０の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分配係数の値が約１．０〜約５．０の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記分配係数の値が約０．５〜約５．０の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記分配係数の値が約０．５〜約１．５の範囲にある、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
前記産物が、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫結合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、および治療酵素からなる群より選択されるタンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｆｃ含有タンパク質が抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記媒体が荷電したイオン交換媒体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記荷電したイオン交換媒体が陰イオン交換樹脂である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記荷電したイオン交換媒体が陽イオン交換樹脂である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記媒体が疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記媒体がヒドロキシアパタイト樹脂である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記媒体が固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ以上の不純物が、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素およびプロテインＡからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記不純物がウイルスをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記不純物が、前記精製産物中に宿主細胞タンパク質を、産物１ｍｇあたり約１００ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質の濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記不純物が、前記精製産物中に宿主細胞タンパク質を、産物１ｍｇあたり約２５０ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質の濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記不純物が、前記精製産物中に宿主細胞タンパク質を、産物１ｍｇあたり約５００ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質の濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記不純物が、前記精製産物中にプロテインＡを、産物１ｍｇあたり約１００ｎｇ以下のプロテインＡの濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記不純物が、前記精製産物中にプロテインＡを、産物１ｍｇあたり約５０ｎｇ以下のプロテインＡの濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記不純物が、前記精製産物中にプロテインＡを、産物１ｍｇあたり約１０ｎｇ以下のプロテインＡの濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記不純物が、前記精製産物中に核酸を、産物１ｍｇあたり約１ｎｇ以下の核酸濃度で含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記精製産物中の産物変異体濃度が約０．５％以下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記精製産物中の産物変異体濃度が約２％以下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記精製産物中の産物変異体濃度が約５％以下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記精製産物中の産物変異体濃度が約１０％以下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスの対数除去値が１．０より大きい、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルスの対数除去値が２．０より大きい、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスの対数除去値が３．０より大きい、請求項３６に記載の方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞タンパク質の対数除去値が少なくとも１．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞タンパク質の対数除去値が少なくとも２．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
前記宿主細胞タンパク質の対数除去値が少なくとも３．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテインＡの対数除去値が少なくとも１．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記プロテインＡの対数除去値が少なくとも２．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
前記プロテインＡの対数除去値が少なくとも３．０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
産物含有流体が、低イオン強度の溶出緩衝液を使用してプロテインＡカラムから溶出され；
該産物含有流体のｐＨおよび電導度が、該産物含有流体のイオン強度２０ｍＭ以下を生じる中和緩衝液を使用して調節されて、前記ロード流体を生じ；
そしてここで、該ロード流体がイオン交換媒体を通される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ロード流体がダイアフィルトレーションの必要なしに陰イオン交換媒体を通される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記産物含有流体のｐＨおよび電導度が、該産物含有流体のイオン強度４０ｍＭ以下を生じる中和緩衝液を使用して調節される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記産物含有流体のｐＨおよび電導度が、該産物含有流体のイオン強度６０ｍＭ以下を生じる中和緩衝液を使用して調節される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記産物含有流体のｐＨおよび電導度が、該産物含有流体のイオン強度８０ｍＭ以下を生じる中和緩衝液を使用して調節される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記溶出緩衝液がｐＫａ２〜５の荷電陰イオン基を有する分子を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記溶出緩衝液がｐＫａ６．５〜１０の荷電陽イオン基を有する分子を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記溶出緩衝液がｐＨ４〜９の間で双生イオンである分子を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記双生イオンが、グリシン；１，４−ピペラジンビス−（エタンスルホン酸）；グリシルグリシン；シクロペンタンテトラ−１，２，３，４−カルボン酸；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸；２−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン；グリシンアミド；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸；およびＮ−グリシル−グリシンからなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記双生イオンがグリシンを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ロード流体のイオン強度が１００ｍＭ以下である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
前記ロード流体のイオン強度が５０ｍＭ以下である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ロード流体のイオン強度が２５ｍＭ以下である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ロード流体のイオン強度が１０ｍＭ以下である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
前記媒体が、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素、およびプロテインＡからなる群より選択される不純物の少なくとも９０％を除去する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記媒体が、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素、およびプロテインＡからなる群より選択される不純物の少なくとも９９％を除去する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記媒体が、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素、およびプロテインＡからなる群より選択される不純物の少なくとも９９．９％を除去する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記媒体に結合した産物の総質量が、前記媒体に対してロードされた産物の総質量の少なくとも１０％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記媒体に結合した産物の総質量が、前記媒体に対してロードされた産物の総質量の少なくとも２０％である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記媒体に結合した産物の総質量が、前記媒体に対してロードされた産物の総質量の少なくとも３０％である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記媒体への前記産物のローディングが、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記媒体への前記産物のローディングが、媒体１ｍＬあたり少なくとも５０ｍｇの産物である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記媒体への前記産物のローディングが、媒体１ｍＬあたり少なくとも１００ｍｇの産物である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記媒体への前記産物のローディングが、媒体１ｍＬあたり少なくとも５００ｍｇの産物である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記媒体への前記産物のローディングが、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０００ｍｇの産物である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ロード流体中の産物濃度が、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ロード流体中の産物濃度が、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記ロード流体中の産物濃度が、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ロード流体中の産物濃度が、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも５０ｍｇの産物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ロード流体中の産物濃度が、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも約１００ｍｇの産物である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
請求項１に記載の方法により調製される、精製産物。
【請求項８８】
請求項２に記載の方法により調製される、精製産物。
【請求項８９】
請求項３に記載の方法により調製される、精製産物。
【請求項９０】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇのタンパク質を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９１】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程；
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９２】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇのタンパク質を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９３】
請求項９０に記載の方法により調製される、精製タンパク質。
【請求項９４】
請求項９１に記載の方法により調製される、精製タンパク質。
【請求項９５】
請求項９２に記載の方法により調製される、精製タンパク質。
【請求項９６】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９７】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９８】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させる工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項９９】
請求項９６に記載の方法により調製される、精製抗体。
【請求項１００】
請求項９７に記載の方法により調製される、精製抗体。
【請求項１０１】
請求項９８に記載の方法により調製される、精製抗体。
【請求項１０２】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０３】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０４】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製産物を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０５】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０６】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０７】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製タンパク質を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇのタンパク質を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製タンパク質を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０８】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１０９】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１０】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がスクリーニング工程において識別される、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１１】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を荷電したイオン交換媒体に結合させる作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベルおよびイオン強度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１２】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を荷電したイオン交換媒体に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベルおよびイオン強度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１３】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体を荷電したイオン交換媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該媒体に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベルおよびイオン強度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１４】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
樹脂１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度および塩濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１５】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度および塩濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１６】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度および塩濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１７】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
樹脂１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１８】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１１９】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がｐＨレベル、イオン強度、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度を含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１２０】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程；
樹脂１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの抗体を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がカウンターリガンドレベルおよびｐＨレベルを含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１２１】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、該ロード流体を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させ；ここで該作動条件がカウンターリガンドレベルおよびｐＨレベルを含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【請求項１２２】
１つ以上の不純物を含むロード流体から精製抗体を回収する方法であって、以下の工程：
媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの抗体を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、該ロード流体を該樹脂に通過させ；ここで該作動条件がカウンターリガンドレベルおよびｐＨレベルを含む、工程；ならびに
ロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の該精製抗体を回収する工程；
を包含する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法に関する。本発明の特定の実施形態において、本方法は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件において、ロード流体を媒体に通過させる工程、ならびにロードサイクルおよび本質的に無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）の任意の洗浄の間のカラム溶出物中の精製産物を回収する工程、を包含する。本発明の他の実施形態において、本方法は、少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、ロードを媒体に通過させる工程を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
バイオテクノロジー産業において、商用規模でのタンパク質の精製は、治療目的および診断目的の組換えタンパク質の開発に向けた重要な課題である。問題は、収率、純度、および製造部門の処理能力の災害に関する。組換えタンパク質技術の出現に伴い、目的のタンパク質が、そのタンパク質をコードする遺伝子を発現するように操作された、培養した真核細胞または原核細胞の宿主細胞株を使用して生産され得る。しかしながら、宿主細胞の培養プロセスより生じるものは、所望のタンパク質と、そのタンパク質自体に由来する不純物（例えば、タンパク質変異体）または宿主細胞に由来する不純物（例えば、宿主細胞のタンパク質）のいずれかと一緒になった混合物である。薬学的利用のための所望の組換えタンパク質の使用は、これらの不純物から適切なレベルでそのタンパク質を確実に回収できることにかかっている。
【０００３】
従来のタンパク質精製方法は、サイズ、電荷、溶解度および疎水性の程度における差異に基づき、不純物から目的のタンパク質を分離するように設計される。このような方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが挙げられる。これらの方法はしばしば、目的のタンパク質または不純物のいずれかを選択的に接着するように設計され得る分離媒体を使用する。結合−溶出様式において、所望のタンパク質は選択的に分離媒体に結合し、そして異なる溶媒によってその媒体から示差的に溶出される。フロースルー様式において、不純物は分離媒体に特異的に結合し、一方、目的のタンパク質は結合せず、これによって「フロースルー」中での所望のタンパク質の回収を可能にする。
【０００４】
タンパク質（例えば、抗体）の精製のための現在の方法としては、２つ以上のクロマトグラフィー工程が挙げられる。例えば、タンパク質精製プロトコルにおける第一工程は、しばしば、目的のタンパク質と固定化された捕捉試薬との間の特異的相互作用を利用する、アフィニティークロマトグラフィー工程を含む。プロテインＡ吸着体はＦｃ領域を含むタンパク質（例えば、抗体）のアフィニティー捕捉に特に有用である。しかしながら、タンパク質精製のためにプロテインＡクロマトグラフィーを使用することの欠点としては、プロテインＡ捕捉因子の漏れが挙げられ、溶出されるタンパク質産物の混入を導く。さらに、アフィニティー捕捉は、目的のタンパク質からタンパク質変異体（例えばタンパク質の凝集形態）を分離しない。
【０００５】
研究者は、培養プロセスから生じる不純物および精製プロセス自体の可能性ある前工程から生じる不純物を両方とも含まないタンパク質を回収するために苦心して、結合−溶出方法、フロースルー方法および置換方法を使用してきた。アフィニティー捕捉工程の後にタンパク質を精製することに関する代表的な第二工程として結合−溶出工程を使用する群の例としては、以下が挙げられる：特許文献１（混合物からプロテインＡを低減させる結合−溶出イオン交換方法を記載する）；特許文献２（プロテインＡ不純物を含む混合物からＩｇＧ抗体を精製するための結合−溶出疎水性相互作用クロマトグラフィー方法を記載する）；および特許文献３（精製ＩｇＧ抗体調製物を得るための３工程プロセス（プロテインＡ工程、結合−溶出イオン交換工程、およびサイズ排除工程を包含する）を記載する）。他の群は、アフィニティークロマトグラフィー工程の後にフロースルー工程を使用している。例えば、特許文献４は、プロテインＡ工程クロマトグラフィー工程、その後のフロースルーイオン交換工程によって精製された抗体から、漏れたプロテインＡを除去するための方法を記載する。特許文献５は、アフィニティークロマトグラフィーの後、フロースルーヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程にサンプルを供する工程を含む、サンプル中のタンパク質を精製するための方法を記載する。
【０００６】
他の群は、精製工程前に関係する問題を避けるため、単回の仕上げ工程の精製スキームを使用している。例えば、特許文献６は、生物学的サンプルから凝集物を除去するため、単回工程のフロースルーイオン交換方法を記載し、ここで、サンプルのｐＨがその生物学的サンプルの等電点より低い０．２  ｌｏｇに調整される。特許文献７は、単回工程の結合−溶出イオン交換方法を記載し、ここで、タンパク質粗混合物のｐＨが分離されるべきタンパク質画分の等電点の範囲の間の１点に調整される。特許文献８は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する、抗体調製物からの高分子量凝集物の除去のための、単回の置換方法を記載する。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，９８３，７２２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４２９，７４６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４４，０３６号明細書
【特許文献４】国際公開第０４／０７６４８５号明細書
【特許文献５】国際公開第０３／０５９９３５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１７７，５４８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，４５１，６６２号明細書
【特許文献８】国際公開第０５／０４４８５６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来技術における既往の結合−溶出用法またはフロースルー方法は、いずれも、スループット、収率および生成物の純度の全ての要望の点で、バイオテクノロジー産業の要求に合致し得ない。結合−溶出方法および置換方法は、とりわけ、所望のタンパク質に対する分離媒体の吸収力限界によって制限される。一方、フロースルー方法は、結合−溶出方法よりも高いロードチャレンジを実際に可能にするが、不純物に対する媒体の分離能力により制限される。フロースルー方法に関して、カラムに対するタンパク質の結合は実質的に発生しない；産物の実質的な結合はいずれも産物の回収に負に影響するとみなされる。治療利用および診断利用に必要な純度および収率に対する必要性に合致する、ハイスループットで精製タンパク質を回収する方法の必要性が依然として存在する。さらに、商用の製造プロセスは、安定性、大規模かつコストに効果的な精製スキームに対する必要性を加える。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件において、ロード流体を媒体に通過させる工程、ならびにロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の精製産物を回収する工程によって、１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法に関する。他の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物を媒体に結合させる。別の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物を媒体に結合させる。他の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇまたは６０ｍｇの産物を媒体に結合させる。
【００１０】
本発明はまた、少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件においてロード流体を媒体に通過させる工程、ならびにロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の精製産物を回収する工程によって、１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法に関する。１実施形態において、分配係数は約０．２〜約２０．０の範囲である。別の実施形態において、分配係数は約０．２〜約１０．０の範囲である。別の実施形態において、分配係数は約１．０〜約５．０の範囲である。別の実施形態において、分配係数は約０．５〜約５．０の範囲である。さらなる実施形態において、分配係数は約０．５〜約１．５の範囲である。
【００１１】
本発明はまた、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件において、ロード流体を媒体に通過させる工程、ならびにロードサイクルの間のカラム溶出物および本質的に無勾配の任意の洗浄物中の精製産物を回収する工程によって、１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収する方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、スクリーニング工程において、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件、あるいは少なくとも分配係数０．１によって規定される作動条件を識別することをもたらす。スクリーニング工程は、バッチの結合調査（batch binding studies）またはカラム結合調査（column binding studies）（例えば、勾配溶出調査または無勾配溶出調査）を使用し得る。
【００１３】
作動条件としては、媒体の選択に依存して、ｐＨレベル、イオン強度、塩濃度、添加物（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）濃度（例えば、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度、およびＨＥＰＥＳ濃度）、およびカウンターリガンド濃度（例えば、イミダゾール濃度）が挙げられる。
媒体は、任意の型のクロマトグラフィー樹脂または分離媒体であり得、荷電したイオン交換媒体、（例えば、陰イオン交換媒体または陽イオン交換媒体）、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、ヒドロキシアパタイト樹脂、または固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂が挙げられる。
本発明を使用して回収され得る精製産物としては、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫結合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモンおよび治療酵素が挙げられる。
本発明を使用して除去され得る不純物としては、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素、プロテインＡ、およびウイルスが挙げられる。
【００１４】
１実施形態において、媒体は、宿主細胞タンパク質、核酸、産物変異体、内毒素、およびプロテインＡを含むロード流体中の不純物のうち少なくとも９９．９％を除去する。
別の実施形態において、精製産物中の産物変異体の濃度は約２％以下である。
さらなる実施形態において、媒体上へのロードは、媒体１ｍＬあたり少なくとも５００ｍｇまたは少なくとも１０００ｍｇの産物のロードチャレンジであり得る。
本発明の１局面において、精製産物は、荷電したイオン交換媒体に媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇを結合させるｐＨレベルおよびイオン強度を含む作動条件、あるいは少なくとも０．１の分配係数により規定される作動条件において、その媒体にロードを通過させることによって、１つ以上の不純物を含むロード流体から回収される。
【００１５】
本発明の別の局面において、精製産物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂に媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を結合させるｐＨレベル、イオン強度および塩濃度を含む作動条件、あるいは少なくとも０．１の分配係数によって規定される作動条件において、ロード流体をその媒体に通過させることによって、１つ以上の不純物を含むロード流体から回収される。
本発明の別の局面において、精製産物は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂に媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を結合させるｐＨレベル、イオン強度、リン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度、ＨＥＰＥＳ濃度およびイミダゾール濃度を含む作動条件、あるいは少なくとも０．１の分配係数によって規定される作動条件において、ロード流体をその媒体に通過させることによって、１つ以上の不純物を含むロード流体から回収される。
【００１６】
本発明のなお別の局面において、精製産物は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂に媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を結合させるカウンターリガンドレベルおよびｐＨレベルを含む作動条件、あるいは少なくとも０．１の分配係数によって規定される作動条件において、ロード流体をその媒体に通過させることによって、１つ以上の不純物を含むロード流体から回収される。
本発明の方法は、必要に応じて、１つ以上の精製工程と組み合わされ得る。任意の工程が、本発明の方法の実施の前または後のいずれかに実施され得る。例えば、本発明の方法は、必要に応じて、初期工程としてプロテインＡクロマトグラフィー工程と組み合わされ得る。
【００１７】
本発明の１実施形態において、産物含有流体は、低イオン強度の溶出緩衝液を使用して、プロテインＡカラムから溶出され；産物含有流体のｐＨおよび電導度は、中和緩衝液を使用して調整されてその産物含有流体のイオン強度２０ｍＭ以下を生じてロード流体を生じ；そしてロード流体は、本発明の作動条件下で陰イオン交換媒体に通される。
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＫａ６．５〜１０を有する荷電した陽イオン基を有する分子を含む。他の実施形態において、溶出緩衝液はさらに、ｐＫａ２〜５を有する荷電した陰イオン基を有する分子を含む。特定の実施形態において、溶出緩衝液は、ｐＨ７〜９の間の双生イオンである分子を含む。
本発明はまた、本発明の方法によって調製される精製産物（精製タンパク質、および精製抗体が挙げられる）をもたらす。
【００１８】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の説明に部分的に記されておりこの記載から部分的に明らかであるか、または本発明の実施によって学ばれ得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘される要素および組み合わせによって、実現され、達成される。
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方は、例示であって説明のみのためであり、特許請求される本発明について限定的ではないことが理解されるべきである。
添付の図面は、本明細書に組み込まれかつ本明細書の一部を形成し、そしてその説明と一緒に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な説明全体にわたって記載される。
用語「フロースルー様式」とは、産物の調製の分離技術を指し、ここで、調製物中に含まれる少なくとも１つの産物がクロマトグラフィー樹脂または媒体を通って流れることが意図され、一方、少なくとも１つの可能性ある混入物または不純物はそのクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する。一般的に、フロースルー様式に関する産物の分配係数は０．１未満であり、結合する産物濃度は１ｍｇ／ｍＬ未満である。「フロースルー様式」は、無勾配の作動である。
用語「結合−溶出様式」とは、産物の調製の分離技術を指し、ここで、調製物中に含まれる少なくとも１つの産物がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する。一般的に、結合−溶出様式に関する産物の分配係数は２０より大きく、結合する産物濃度は１〜２０ｍｇ／ｍＬの間である。この様式で結合する産物は、溶出期間の間に溶出される。
【００２０】
用語「弱分配様式」とは、産物の調製の分離技術を指し、ここで、調製物中に含まれる少なくとも１つの産物と、少なくとも１つの混入物または不純物との両方がクロマトグラフィー樹脂または媒体に結合する。弱分配様式での産物の結合は、クロマトグラフィー樹脂または媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物である。一般的に、弱分配様式に関する産物分配係数は、少なくとも０．１である。「弱分配様式」は無勾配の作動である。
用語「分配係数（Ｋｐ）」とは、ｐＨおよび溶液組成の特定の条件下での、樹脂に吸収される産物の濃度（Ｑ）  対  溶液中の産物の濃度（Ｃ）の平衡の割合を指す。分配係数Ｋｐはまた、図１に示されるように産物の吸着等温線に関係する。分配係数Ｋｐは、非常に低い溶液濃度での産物の吸着等温線の傾きに対応する。これは、以下のような最大の吸収力に関する：
【００２１】
【数１】
2008533473.tif 000002
ここで、Ｑmaxは産物に対する樹脂の最大吸収力であり、ｋdは「樹脂−産物」相互作用に関する解離定数である。分配係数は、代表的にバッチ結合技術により測定されるが、他の技術（例えば、無勾配クロマトグラフィー）が使用され得る。
【００２２】
用語「結合産物」（Ｑ）とは、供給流と平衡である場合に樹脂に結合する産物の量を指す。
用語「抗体」とは、任意の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを指し、そして抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単価（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、多価（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異導入された抗体、グラフト抗体、およびインビトロで作製された抗体を含むが、これらに限定されない。用語「抗体」はまた抗体フラグメントを含み、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントである。代表的に、このようなフラグメントは抗原結合ドメインを含む。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、抗体はＣH２／ＣH３領域を含むものであり、従ってプロテインＡクロマトグラフィーによる精製が可能である。用語「ＣH２／ＣH３領域」とは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域中のアミノ酸残基を指し、これがプロテインＡと相互作用する。いくつかの実施形態において、ＣH２／ＣH３領域は、完全なＣH２領域の後に完全なＣH３領域を含み、そして他の実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。ＣH２／ＣH領域含有タンパク質の例としては、抗体、免疫接着物（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）およびＣH２／ＣH３領域と融合または結合体化された目的のタンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。
【００２４】
用語「ロード」とは、清澄にされた細胞培養物もしくは培養器の馴化培地のいずれかに由来する産物、またはクロマトグラフィー工程より導かれる部分的に精製された中間体を含む、任意のロード材料を指す。用語「ロード流体」とは、本発明の作動条件下で媒体を通過するための、ロード材料を含む液体を指す。
用語「不純物」は、任意の外部分子または障害性（ｏｂｊｅｃｔｉｏｎａｂｌｅ）分子を指し、精製される目的タンパク質のサンプル中にも存在する、精製される目的タンパク質以外の生物学的高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）が挙げられる。不純物としては、例えば、タンパク質変異体（例えば、凝集タンパク質、高分子量種、低分子量種およびフラグメント、ならびに脱アミド化種）；精製されるタンパク質を分泌する宿主細胞由来の他のタンパク質（宿主細胞タンパク質）；先の精製工程の間にサンプル中に混入し得る、アフィニティークロマトグラフィーのために使用される吸収物の一部（例えば、プロテインＡ）；内毒素；およびウイルス、が挙げられる。
【００２５】
用語「本質的に無勾配の洗浄」とは、組成またはｐＨに関してロード流体から僅かにのみ変化する溶液を指す。
用語「カラム溶出物」とは、ロードサイクルまたはロードが投入されている期間の間に媒体またはカラムから出る液体を指す。
用語「ロードチャレンジ」とは、クロマトグラフィー工程のロードサイクル中にカラム上にロードされるか、またはバッチ結合において樹脂に適用される産物の総質量を指し、樹脂の単位容量あたりの産物の質量の単位で測定される。
用語「対数除去値（ＬＲＶ）」とは、精製工程のロード中の不純物の質量  対  産物プール中の不純物の質量の比を、対数（底１０）指す。
用語「無勾配クロマトグラフィー」とは、目的の期間の間に強度を変更しない溶媒を用いた、クロマトグラフィーカラムの作動を指す。
【００２６】
（Ｂ．方法の説明）
本発明は、１つ以上の不純物を含むロード流体から精製産物を回収するための方法を提供する。本方法は、治療目的および診断目的のためのタンパク質の大規模分離への利用を有する。
（１．弱分配様式）
発明者らは、驚くべきことに、従来の結合−溶出様式およびフロースルー様式の間の領域に位置するクロマトグラフィー様式において操作することによって、高度の不純物低減ならびに産物の高いロードチャレンジおよび産物の回収率が得られ得ることを見出した。発明者らは、この中間の産物結合様式を「弱分配様式」と名付けた。
【００２７】
弱分配様式において、目的の産物と１つ以上の不純物とを含むロード流体は、クロマトグラフィー媒体を通され、その産物と１つ以上の不純物との両方がその媒体に結合する。しかしながら、不純物はその媒体に産物よりもより強固に結合し、ローディングが続くにつれて、未結合の産物は媒体を通過し、カラム溶出物から回収される。媒体は、必要に応じてその後、無勾配条件下で洗浄され、弱く結合した産物をその媒体からさらに回収し、本質的に無勾配の任意の洗浄物から精製された産物が、ロードサイクルの間のカラム溶出物からの精製産物と共にプールされる。
【００２８】
本発明に従って、弱分配様式は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件によって定義される。１実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物を媒体に結合させる。別の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物を媒体に結合させる。別の実施形態において、作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも２０ｍｇの産物を媒体に結合させる。
本発明の特定の実施形態において、媒体に結合した産物の総質量は、媒体にロードされた産物の総質量の少なくとも１０％である。いくつかの実施形態において、媒体に結合した産物の総質量は、媒体にロードされた産物の総質量の少なくとも２０％である。他の実施形態において、媒体に結合した産物の総質量は、媒体にロードされた産物の総質量の少なくとも３０％である。
【００２９】
本発明に従って、弱分配様式はまた、少なくとも０．１の分配係数によって定義される。いくつかの実施形態において、弱分配様式における作動は、約０．２〜約２０．０の範囲の分配係数によって定義される条件下で作動することを含む。特定の実施形態において、弱分配様式における作動は、約０．２〜約１０．０の範囲の分配係数によって定義される条件下で作動することを含む。他の実施形態において、弱分配作動における作動は、約１．０〜約５．０の範囲の分配係数によって定義される条件下で作動することを含む。他の実施形態において、弱分配作動における作動は、約０．５〜約５．０の範囲の分配係数によって定義される条件下で作動することを含む。なお他の実施形態において、弱分配作動における作動は、約０．５〜約１．５の範囲の分配係数によって定義される条件下で作動することを含む。
【００３０】
本発明の少なくとも１つの実施形態は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの産物を媒体に結合させ、そして０．３〜２０の分配係数によって定義される、弱分配様式の作動条件を提供する。
図１は、結合−溶出様式、フロースルー様式、および弱分配様式についての産物の吸着等温線を示し、弱分配様式についての産物の結合が、結合−溶出様式およびフロースルー様式と比較して明らかに中間にある。産物の分配係数（Ｋｐ）の値は吸着した産物濃度  対  溶液中の産物濃度の比であるので、弱分配様式についてのＫｐもまた、結合−溶出様式およびフロースルー様式についての値に対して中間にある。
【００３１】
図２Ａは、結合−溶出についての分配領域、弱分配様式についての分配領域、およびフロースルー様式についての分配領域を、イオン強度の関数として示し、Ｋimpがフロースルー様式よりも弱分配様式においてより高いことを示す。弱分配様式のよりストリンジェントな結合条件下で、より高い産物の吸収力が達成され得、フロースルー様式よりも高く（不純物はより強固に結合するため）、そして結合−溶出様式よりも高い（産物は不純物と比較して非常に弱く結合し、そして樹脂の収容の大部分を占めないため）。不純物の分配係数（Ｋｉｍｐ）は、よりストリンジェントな結合条件においてより高い。このことは、フロースルー様式の産物プールと比較して、弱分配様式の産物プール中により低濃度の残留不純物を生じる。ヒドロキシアパタイトにおけるフロースルー領域、弱分配領域、および結合−溶出領域は、リン酸濃度およびＮａＣｌ濃度の関数として、図２Ｂに示される。
表Ａは、３つの結合様式：結合−溶出様式（Ｂ−Ｅ）、弱分配様式（ＷＰ）およびフロースルー様式（ＦＴ）の間の特徴の差異をまとめる。
【００３２】
【表Ａ】
2008533473.tif 000003
【００３３】
弱分配様式はまた、図３に示されるように、結合−溶出様式およびフロースルー様式から、クロマトグラムによって区別され得る。第一に、フロースルー様式および弱分配様式についてのクロマトグラムはかなり類似であるように見られ得る。産物は、無勾配条件下でカラム溶出物および洗浄物中から回収される。しかしながら、図４に示されるように、これらの様式を区別するために使用され得る、僅かではあるが明確な差異がクロマトグラム中に存在する。フロースルー様式と比較した弱分配様式について、最初のブレークスループロフィール（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｆｉｌｅ）において遅延が存在する（０．１未満のカラム容量（すなわちＣＶ））。弱分配様式について、より遅延した洗い落とし（ｗａｓｈｏｕｔ）のプロフィールが存在する。産物を含む小さなストリップ（ｓｔｒｉｐ）のピークが存在し得（これは、洗浄段階後にロードの産物濃度１０〜５０％を依然として結合する樹脂に対応する）、これは、ロードサイクルの間、カラム溶出物の回収に続いて、無勾配条件下でロードの後１〜５ＣＶの洗浄を適用することによって、樹脂から回収され得る。
【００３４】
図５Ａは、種々のレベルの産物分配係数の値に対する混入物ＬＲＶ中の一般的な傾向を示す。混入物ＬＲＶは、フロースルー作動に対応するＫｐ条件において比較的低い。漸増性のＫｐの条件下での作動は、混入物のブレークスルーより前のカラム溶出画分中のＬＲＶを有意に増加させる。例に示すように、より高いＫｐ値における作動は、標準的なフロースルー条件に対応する値から、混入ＬＲＶを２ｌｏｇほど改善する。
Ｋｐを増加させることは、代表的に、樹脂に結合する産物および混入物の両方を増加させる。より高いＫｐにおける混入物のより強固な結合は、混入物のブレークスルーより前のカラム溶出物画分中のＬＲＶをより大きくすることに繋がる。しかしながら、混入物のブレークスルー時点におけるロードチャレンジは、Ｋｐの増加に伴って減少する。なせなら、図５Ａにおいて高いＫｐカーブによって模式的に示されるように、産物は樹脂上の結合部位に対して混入物と競合し始めるからである。従って、弱分配領域は、混入物ＬＲＶにおける改善と、所定の分離に対するカラム吸収力の要求とのバランスをとる操作ウインドウに対応する。
【００３５】
弱分配クロマトグラフィーに対する上限のＫｐはまた、図５Ｂに示されるようにカラムロードチャレンジに依存する。分配係数は、フロースルー条件と境界を画す値では産物回収率に影響しない。産物の回収は、高いＫｐ値において落ち込み始め、このＫｐ値では、無勾配洗浄は、妥当な数の洗浄容量においてカラムから結合産物を洗い落とすには効果的でない。非効率的な洗い落としに起因する産物損失の範囲はロードチャレンジ、ならびにロード中の混入物の性質および割合に敏感である。従って、ＷＰ領域の下限は、混入物の除去の必要性によって規定され、一方、所定のロードチャレンジの上限は産物の回収率または吸収力の制約によって規定される。
【００３６】
本発明の１実施形態において、最適な弱分配条件は、図６に示されるように、以下の一連の実験を使用して識別される：
（ｉ）ＨＴＳスクリーニング（または標準的なバッチ結合実験）を実施して、産物分配係数Ｋｐを作動条件の関数として決定する。これらの実験から、弱分配領域（０．１＜Ｋｐ＜２０）に対応する操作ウインドウを識別する。
（ｉｉ）好ましくは、弱分配領域の識別の後、標準的なフロースルー作動（約５０ｍｇ／ｍＬ）について使用したものと同様のロードチャレンジにて、小規模のカラムにおいて探索の実行を実施し得る。さらに、これらの実験からの混入物除去値および回収率の値に基づき、弱分配操作ウインドウをさらに洗練し得る。
（ｉｉｉ）より好ましくは、次いで、弱分配領域内でいくつかのＫｐ条件についての混入物ブレークスルーのデータを作成し得る。これらの結果に基づき、許容可能なロードチャレンジにおいて混入物の最高の除去をもたらす最適な分配係数を、弱分配領域において選択する。
（ｉｖ）次いで最も好ましくは、最適なＫｐ条件下で弱分配クロマトグラフィーの実行を実施し得、最適な回収率および混入物除去を得ることが必要とされる場合、ロードチャレンジおよび洗浄容量をさらに洗練し得る。
【００３７】
当業者は、これらのガイドラインまたはそのバリデーションを使用して、カラム作動の標準的なフロースルー様式または結合／溶出様式に匹敵するかまたはそれよりも高いロードチャレンジにおける混入物の増強を提供する、弱分配クロマトグラフィー工程を容易に規定する。上記に考察された一般的な骨子は、場合によって僅かな調節を伴い、イオン交換系、疎水性相互作用系、ヒドロキシアパタイト系またはこれらの相互作用の任意または全ての要素を組み合わせた多様式系における精製工程を開発するために適用され得る。
【００３８】
（２．分離技術）
弱分配様式は、不純物からの産物の分離のため、任意のクロマトグラフィー樹脂または媒体と組み合わせて使用され得る。１実施形態において、媒体は荷電したイオン交換媒体である。イオン交換は、正味の電荷に従って分離するクロマトグラフィーの形態である。分子の分離は、目的の荷電した産物と反対に荷電したリガンド基に対するカウンターイオンとの間の競合の結果として、イオン交換媒体上で起こる。産物とイオン交換媒体との間の結合相互作用は、その産物の正味の電荷に依存する。正味の電荷は、媒体のｐＨおよびイオン強度に依存し、このことは、目的の産物分子の表面上に晒されたアミノ酸または他成分の異なる荷電特徴に影響を与える。
【００３９】
本発明において使用され得るイオン交換樹脂としては、陰イオン交換樹脂および陽イオン交換樹脂が挙げられる。陰イオン交換樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、トリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）基、四級化アミノエチル（ＱＡＥ）基、および四級化アミン（Ｑ）基のような置換基を使用し得る。陽イオン交換は、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）、およびスルホン酸（Ｓ）のような置換基を使用し得る。セルロースイオン交換樹脂（例えば、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２およびＣＭ−５２）は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．より入手可能である。セファデックスベースのイオン交換体および架橋イオン交換体もまた公知である。例えば、ＤＥＡＥ−セファデックス、ＱＡＥ−セファデックス、ＣＭ−セファデックスおよびＳＰ−セファデックス、ならびにＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ＣＭ−セファロースおよびＳ−セファロース、ならびにセファロースは全て、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪより入手可能である。さらに、ＤＥＡＥとＣＭとの両方より誘導されたエチレングリコールメタクリル酸コポリマー（例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）  ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＤＥＡＥ−６５０Ｍ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）  ＣＭ−６５０ＳまたはＣＭ−６５０Ｍは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡより入手可能である。
【００４０】
本発明の特定の実施形態において、弱分配様式は、産物の精製のため、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を用いて使用される。ＨＩＣは、疎水性に基づき分子を分離するための技術である。一般的に、高塩緩衝液中のサンプル分子はがＨＩＣ樹脂にロードされる。緩衝液中の塩は水分子と相互作用して、溶液中の分子の溶解度を低下させ、これによってサンプル分子中の疎水性領域が露出され、この分子は結果としてＨＩＣ媒体によって吸収される。分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要とされる塩はより少ない。従って、産物分子とＨＩＣ媒体との間の結合相互作用は、媒体のｐＨ、イオン強度、および塩濃度のような条件に依存する。
【００４１】
本発明において使用され得る種々の市販のＨＩＣ樹脂としては、疎水性リガンド（例えば、アルキル基またはアリール基）が結合された基材マトリクス（例えば、架橋アガロースまたは合成コポリマー物質）を含む樹脂が挙げられる。例としては、以下が挙げられる：Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ、スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）  ＥＭＤ  ＰｒｏｐｙｌまたはＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（商標）  ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；ＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）  Ｍｅｔｙｌ  ＳｕｐｐｏｒｔまたはＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）  ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ3）（商標）  （Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＮＪ）；およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）エーテル、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）フェニルまたはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ブチル（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）。
【００４２】
本発明の他の実施形態において、弱分配様式は、生成物の精製のため、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて使用される。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、マトリクスおよびリガンドの両方として、式［Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを利用する技術である。官能基は、正に荷電したカルシウムイオン（Ｃ部位）と負に荷電したリン酸基（Ｐ部位）との対からなる。産物とヒドロキシアパタイト媒体との間の結合相互作用は、ｐＨ、イオン強度および補助剤濃度（例えば、媒体のリン酸濃度、カルシウム濃度、アルギニン濃度、グリシン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度）のような条件に依存する。種々のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されており、本発明において使用され得る。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、弱分配様式は、産物の精製のため、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を用いて使用され得る。ＩＭＡＣは、樹脂上に固定化したキレート化遷移金属イオンと、タグ付けされた目的産物上のヒスチジン残基のイミダゾール側鎖とのあいだの相互作用に基づく。分子の分離は、タグ付けされた目的産物とＩＭＡＣ樹脂上の金属基に対するカウンターリガンドとの間の競合の結果として起こる。産物と金属が荷電したＩＭＡＣ媒体との間の結合相互作用は、カウンターリガンドのレベル（例えば、イミダゾール濃度）、および媒体のイオン強度のような条件に依存する。種々のＩＭＡＣ樹脂が利用可能であり、本発明において使用され得る。
【００４４】
（３．精製のための産物）
本発明は、種々の目的産物（天然に存在するタンパク質、融合タンパク質、Ｆｃ含有タンパク質、免疫結合体、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、および治療酵素が挙げられる）の商用規模の精製のために使用され得る。１実施形態において、精製を受けるタンパク質は、抗体免疫グロブリンの定常ドメインを１つ以上含み得る。１実施形態において、タンパク質はまた、抗体免疫グロブリンの可変領域を１つまたは複数含み得る。別の実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、抗体を含み得る。タンパク質は、種々の供給源に由来し得、培養の組換えの原核細胞生物または真核細胞生物の宿主細胞株が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗体調製物は、多くの供給源から単離され得、免疫動物の血清、腹水流体、ハイブリドーマまたはミエローマの上清、抗体分子を発現する組換え細胞株を培養することから導かれる馴化培地および抗体産生細胞の細胞抽出物全てから導かれる馴化培地が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の１実施形態において、抗体を産生する種々の組換え細胞株の馴化培養物の培地由来の抗体が精製される。本明細書中の開示に基づき、細胞株毎の変異型および種々の抗体間の変異型がいくつか考えられ得るが、抗体タンパク質と産生細胞株との特定の組み合わせに対して本明細書中の発明を適合させることは、十分に当業者の技量内である。
例示のみの目的のため、本発明はＩｇＧアイソタイプのいくつかの抗体の精製に適用された。より具体的には、本発明は、ヒト化抗Ａβモノクローナル抗体、抗ＧＤＦ−８抗体、およびヒト化抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体の精製に適用された。
【００４６】
（４．ローディング条件および吸収力）
産物および不純物を含む流体を媒体にロードする前に、その媒体に媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇの産物を結合させる作動条件を見出すことによって弱分配領域を識別する必要があり得る。１実施形態において、見出された作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇの産物を媒体に結合させる。別の実施形態において、見出された作動条件は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物を媒体に結合させる。他の実施形態において、見出された媒体１ｍＬあたり少なくとも２０ｍｇの産物を媒体に結合させる。あるいは、弱分配領域は、少なくとも０．１の分配係数によって規定される作動条件を見出すことによって識別される。特定の実施形態において、見出された作動条件は、約０．２〜約２０．０の範囲の分解係数によって規定される。他の実施形態において、見出された作動条件は、約０．２〜約１０．０の範囲の分解係数によって規定される。なお他の実施形態において、見出された作動条件は、約１．０〜約５．０の範囲、約０．５〜約５．０の範囲、または約０．５〜１．５の範囲の分解係数によって規定される。さらなる実施形態において、弱分配領域は、媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇ〜約７０ｍｇの産物を媒体に結合させる作動条件、および０．３〜２０の分配係数によって規定される作動条件を見出すことによって識別される。
【００４７】
当業者は、適切な作動条件が産物の精製のために選択される媒体の選択に依存することを理解する。、特定の実施形態において、作動条件はｐＨレベルおよびイオン強度を含む。他の実施形態において、作動条件はさらに、塩濃度を含む。なお他の実施形態において、作動条件はさらに補助剤のレベル（例えば、リン酸濃度、およびカルシウム濃度）を含む。いくつかの実施形態において、作動条件は、カウンターリガンドレベル（例えば、イミダゾール濃度）およびｐＨレベルを含む。
【００４８】
スクリーニング工程は、弱分配様式のための作動条件を識別するために使用され得る。このようなスクリーニング工程としては、バッチ結合調査またはカラム結合調査が挙げられ得る。カラム結合調査としては、勾配溶出調査または無勾配溶出調査が挙げられ得る。例えば、当業者は、精製される特定のタンパク質に対して、そして識別される作動条件に対して、どの溶媒またはどの塩が適当であるかを決定し得る。次いで、選択された緩衝液または塩の最適濃度が、例えば、選択された緩衝液または塩の勾配を、カラムを通して流す（ｒｕｎ）ことによって決定され得、このカラムに対して精製されるべき産物および不純物を含むロード流体が注がれる。カラムの溶出物の画分を収集しそして分析して、産物の結合が媒体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇであるか、あるいは産物の分配係数が少なくとも０．１である、緩衝液濃度または塩濃度を決定し得る。本発明の特定の実施形態において、分配係数は、１〜１０ｍｇ／ｍＬの間のロードチャレンジに測定され、バッチ結合実験におけるその相の比（液量  対  樹脂量）は、３：６である。
【００４９】
一旦、作動条件が決定されると、ロード流体および／または媒体の条件がそれによって調節され得る。例えば、媒体は、弱分配様式に必要な作動条件にさせる溶液を用いて洗浄することによって、平衡化され得る。ロード流体はまた、弱分配様式のため、調製して適切な緩衝液またはロード緩衝液に交換された、緩衝液であり得る。ロード緩衝液は、平衡化緩衝液と同じ緩衝液であっても異なる緩衝液であってもよい。
【００５０】
１実施形態において、ロード流体のイオン強度は、１００ｍＭ以下である。別の実施形態において、ロード流体のイオン強度は５０ｍＭ以下である。別の実施形態において、ロード流体のイオン強度は２５ｍＭ以下である。なお別の実施形態において、ロード流体のイオン強度は１０ｍＭ以下である。
ロード流体は、カラム床にパックされる分離媒体を通過され得、固体相マトリクスを含んで流動化／拡大されたカラム床にパックされる分離媒体を通過され得、そして／または固相マトリクスが一定時間ロード流体と混合されるバッチ形式で分離媒体を通過され得る。ロード流体がその媒体を通過した後、媒体は必要に応じて、本質的に無勾配の洗浄物１容量により洗浄される。精製産物は、本質的に無勾配の任意の洗浄物から得られ得、そしてロードサイクルの間のカラム溶出物からの精製産物と共にプールされ得る。任意の洗浄工程の後、媒体は必要に応じてストリップおよび再生され得る。この手順は代表的に、固相表面上の不純物の形成を最小にするため、および／または微生物による産物の混入を避けるための媒体の滅菌のため、規則的に実施される。
【００５１】
高いロード濃度およびロード容量は、弱分配様式を用いて可能である。１実施形態において、ロード流体中の産物濃度はロード流体１ｍＬあたり少なくとも１ｍｇであり、別の実施形態において、ロード流体中の産物濃度はロード流体１ｍＬあたり少なくとも５ｍｇであり、別の実施形態において、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも５０ｍｇであり、そして別の実施形態において、ロード流体１ｍＬあたり少なくとも１００ｍｇである。精製産物は、媒体を通されるロード流体５０ＣＶ以下から回収され得る。
高いロードチャレンジもまた弱分配様式を用いて可能である。１実施形態において、媒体上へのロードは、媒体１ｍＬあたり少なくとも１０ｍｇの産物のロードチャレンジであり得る。他の実施形態において、媒体への産物のローディングは、媒体１ｍＬあたり少なくとも５０ｍｇの産物である。特定の実施形態において、媒体上への産物のローディングは、媒体１ｍＬあたり少なくとも１００ｍｇの産物である。他の実施形態において、媒体上へのロードは、媒体１ｍＬあたり少なくとも５００ｍｇの産物のロードチャレンジであり得る。なお他の実施形態において、媒体上へのロードは、媒体１ｍＬ当たり少なくとも１０００ｍｇの産物のロードチャレンジであり得る。
【００５２】
（５．不純物の除去）
弱分配様式は、産物調製物から全ての方の不純物（宿主細胞タンパク質の混入、核酸の混入、産物の変異体（凝集産物および高分子量種が挙げられる）の混入、内毒素の混入、ウイルスの混入、および先の精製工程からのプロテインＡの混入が挙げられる）を除去するのに有用であることが示されている。
本発明の１実施形態において、精製産物中に存在する宿主細胞タンパク質の濃度は、産物１ｍｇあたり約５００ｎｇ以下の宿主細胞タンパク質である。他の実施形態において、宿主細胞タンパク質濃度は、産物１ｍｇあたり２５０ｎｇ以下に、そして他の実施形態において、産物１ｍｇあたり１００ｎｇ以下に、低減され得る。特定の実施形態において、宿主細胞タンパク質の対数除去値は少なくとも１．０であり、他の実施形態において、宿主細胞タンパク質の対数除去値は少なくとも２．０であり、そして他の実施形態において、宿主細胞タンパク質の対数除去値は少なくとも３．０である。
【００５３】
本発明の１実施形態において、精製産物中に存在するプロテインＡの濃度は、産物１ｍｇあたり約１００ｎｇ以下のプロテインＡである。いくつかの実施形態において、プロテインＡの濃度は、産物１ｍｇあたり５０ｎｇ以下に低減され得、そして他の実施形態において、産物１ｍあたり１０ｎｇ以下に低減され得る。特定の実施形態において、プロテインＡの対数除去値は、少なくとも１．０であり、そして他の実施形態において、プロテインＡの対数除去値は少なくとも２．０であり、そして他の実施形態において、プロテインＡの対数除去値は少なくとも３．０である。
本発明の別の実施形態において、ウイルス不純物が精製産物から除去される。特定の実施形態において、ウイルスの対数除去値は１．０より大きく、他の実施形態において２．０より大きく、そして他の実施形態において３．０より大きい。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態において、核酸不純物が精製産物から除去され得る。特定の実施形態において、精製産物中に存在する核酸の量は、産物１ｍｇあたり１ｎｇ以下の核酸に低減され得る。
さらなる実施形態において、精製産物中のタンパク質変異体の濃度は、約１０％以下である。いくつかの実施形態において、タンパク質変異体の濃度は約５％以下に低減され得、いくつかの実施形態において２％以下に低減され得、そしていくつかの実施形態において０．５％以下に低減され得る。
弱分配様式のストリンジェントな結合条件下で、分離媒体は、宿主細胞タンパク質不純物、核酸不純物、変異体不純物、内毒素不純物、およびプロテインＡ不純物のうちの少なくとも９０％を除去する。いくつかの実施形態において、媒体は少なくとも９９％の不純物を除去し、そして他の実施形態において、媒体は少なくとも９９．９％の不純物を除去する。
【００５５】
（６．さらなる任意の工程）
本発明の精製方法は、他のタンパク質精製工程と組み合わせて使用され得る。本発明の１実施形態において、弱分配工程に先行する１つ以上の工程が、ロードチャレンジを低減するために所望され得る。本発明の別の実施形態において、弱分配工程の後に１つ以上の精製工程が、さらなる混入物または不純物を除去するために所望され得る。
記載される弱分配精製手順は、必要に応じて、他の精製工程と組み合わされ得、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、ウイルス除去ろ過および／またはイオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。弱分配工程の前および／またはその後の任意の精製工程もまた、弱分配様式または他の様式（例えば、結合−溶出様式またはフロースルー様式）で作動され得る。
【００５６】
１実施形態において、弱分配精製工程の前に、収集した培地は必要に応じて、最初にプロテインＡクロマトグラフィー工程により精製され得る。例えば、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）（これは、制御された孔のガラスに共有結合したプロテインＡからなる）が使用され得る。他の有用なプロテインＡ処方物としては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）  ６５０Ｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）およびＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【００５７】
（７．プロテインＡクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーとのタンデムにおいて使用される双生イオン緩衝液）
特定の実施形態において、産物含有流体は、低イオン強度の溶出緩衝液を使用してプロテインＡカラムから溶出される。次いで、産物含有流体のｐＨおよび電導度は中和緩衝液を使用して調節され、この緩衝液は、その産物含有流体のイオン強度を２０ｍＭ以下にする。次いで、得られたロード流体は、弱分配様式の条件下で作動して、陰イオン交換媒体またはヒドロキシアパタイト媒体に通される。特定の実施形態において、ロード流体は、ダイアフィルトレーションの必要なしに陰イオン交換媒体に通される。いくつかの実施形態において、産物含有流体のｐＨおよび電導度は中和緩衝液を使用して調節され、この緩衝液はその産物含有流体のイオン強度を４０ｍＭ以下にする。他の実施形態において、産物含有流体のｐＨおよび電導度は中和緩衝液を使用して調節され、この緩衝液はその産物含有流体のイオン強度を６０ｍＭ以下にする。なお他の実施形態において、産物含有流体のｐＨおよび電導度は中和緩衝液を使用して調節され、この緩衝液はその産物含有流体のイオン強度を８０ｍＭ以下にする。
【００５８】
プロテインＡカラムからの溶出物に対して使用され得る緩衝液としては、ｐＫａ２〜５に荷電した陰イオン基を有する分子を含む緩衝液が挙げられる。このような溶出緩衝液はさらに、ｐＫａ６．５〜１０に荷電した陽イオン基を有する分子を含み得る。１実施形態において、溶出緩衝液はｐＨ４〜９の間の双生イオンである分子を含み、例えば、グリシン；１，４−ピペラジンビス−（エタンスルホン酸）；グリシルグリシン；シクロペンタンテトラ−１，２，３，４−カルボン酸；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸；２−（Ｎ−モルホリノ）プロパン−スルホン酸；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸；４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン；グリシンアミド；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸；またはＮ−グリシル−グリシンである。
【００５９】
双生イオン緩衝液を用いたプロテインＡの溶出は、ある程度の中和の際に低イオン強度の利点をもたらす。低イオン強度の緩衝液は、その後のイオン交換カラム（ヒドロキシアパタイトカラムを含む）の作動に対して悪影響しない。高レベルのイオン強度は、イオン交換カラムへの不純物の結合を低下させ、このことは精製の最終効率を低下させ得る。より低イオン強度の溶液がイオン交換カラムへのロードに対して好ましい。なぜなら、イオン強度は濃縮した塩緩衝液の添加により容易に上昇され、溶液のイオン強度を低下させることは容易ではないからである。驚くべきことに、プロテインＡ溶出工程において有用な低ｐＨレベルでの使用を可能にする低いｐＫａを有するが、イオン交換クロマトグラフィーにおいて有用なより高いｐＨレベルでの使用を可能にする第二のｐＫａもまた有する緩衝液が存在する；これらの緩衝液は、適切な第二のｐＨにおいて使用される場合、プロテインＡ工程の後のイオン交換工程の作動の間にはほとんど効果的でない電荷を有する。
【００６０】
プロテインＡに好ましい溶出ｐＨ（ｐＨ２〜５の間、好ましくはｐＨ２．５〜４．０の間）のｐＫａに近いｐＫａを有する双生イオン緩衝液は、使用される緩衝液がその緩衝液のｐＩに近いｐＨを維持すること、およびカラムから溶出することを可能にする。その後のイオン交換カラムの作動のｐＫａ（ｐＨ５．５〜１１）に近いｐＫａもまた有する双生イオン緩衝液は、この緩衝液が、そのｐＨ範囲およびプロテインＡの溶出ｐＨ範囲内でｐＨを制御することを可能にする。低ｐＨにおけるプロテインＡカラムの溶出とイオン交換クロマトグラフィーに有用なより高いｐＨの維持との両方のために単一の化合物を使用することは、両工程の作動を単純化し、そして中和後の産物プールの組成も単純化する。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態において、ｐＫａ１とｐＫａ２とを有する双生イオン緩衝液は、１つのｐＨ単位ｐＫａ１以内のｐＨレベルでプロテインＡカラムを溶出させ得る。さらに、その双生イオン緩衝液の塩基性溶液を用いて、プロテインＡのプールが１つのｐＨ単位ｐＫａ２以内の第二のｐＨに中和される。その双生イオン緩衝液は、溶液のこのｐＨを維持し得る。第二のｐＨがｐＫａ２のものより低い場合、緩衝液は双生イオンのままであり、その溶液の総イオン強度にほとんど寄与しない。例えば、ｐＫａ２に等しいｐＨにおいて濃度ｘを有する双生イオン緩衝液は、総イオン強度に対してｘ／２のみ寄与する。緩衝液のｐＫａ２より低い１ｐＨ単位において濃度ｘを有する双生イオン緩衝液は、ｘの１／１０のイオン強度を有する。イオン強度のこの低減は、イオン交換クロマトグラフィーの作動に大いに有用である。
【００６２】
プロテインＡカラムの溶出に有用なｐＫａ１と、イオン交換クロマトグラフィーの作動に有用なｐＫａ２とを有する緩衝液の存在は、明らかでない。なぜなら、これらの緩衝液のｐＫａ１が一般には報告されないからである。緩衝液は一般に、ｐＫａ２のｐＨレベルに近いｐＨレベルで使用され、プロテインＡカラムからの溶出物に有用ではないとクロマトグラフィーの当業者に公知である。さらに、プロテインＡクロマトグラフィーカラムからの溶出物のためのこれら緩衝液の利用は一般的に実現されず、一方、これら双生イオン緩衝液がプロテインＡカラムの後のイオン交換カラムのための緩衝液としてさらなる利用を有することもまた実現されない。なぜなら、これら双生イオン緩衝液は中和されるプロテインＡプールに、より低いイオン強度を与えるからである。
【実施例】
【００６３】
（Ｃ．実施例）
以下の実施例は、例示の目的のみのために提供される。
実施例は、３つの異なるモノクローナル抗体を使用して、３つの様式のクロマトグラフィー（陰イオン交換、疎水性相互作用、およびヒドロキシアパタイト）に対して提供される。４つの別々の一連の実験が記載され、各々は、クロマトグラフィー様式と精製されるモノクローナル抗体との異なる対の形成を表す。初期のスクリーニング調査が最初に提供され、これは、分配係数、および／または種々の溶液条件下で樹脂に結合した産物の濃度を決定し、これによって弱分配（ＷＰ）様式およびフロースルー（ＦＴ）様式の作動範囲を規定する。次いで、産物の回収および不純物の除去に関して、いくつかのカラム調査がまとめられる。産物の回収は、ＷＰカラムの実行については優れており、対応するＦＴ調査よりも不純物レベルが低い。ＷＰの実行は、樹脂に対してＦＴ調査よりも高いロードチャレンジで行われた。
【００６４】
試験サンプル中のプロテインＡの残分のレベルを、プロテインＡの固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。高分子量凝集物の量を、分析型サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）アッセイを使用して測定した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡを使用して測定した。すべてのスクリーニング調査およびカラム調査は、室温で行った。
【００６５】
（シリーズ１−ＴＭＡＥ−ＨｉＣＡＰ（Ｍ）およびＭａｂ−ＡＡＢを用いた陰イオン交換）
（実験１．１−ＷＰ条件およびＦＴ条件を確立するための高スループットスクリーニング）
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施して、ＴＭＡＥ−ＨｉＣＡＰ（Ｍ）媒体を用いたＭａｂ−ＡＡＢについての弱分配条件およびフロースルー条件を識別した。このスクリーニングは、塩化ナトリウム濃度およびｐＨを変動させ、ＭＡＢ−ＡＡＢの結合の程度、およびＴＭＡＥ媒体に対するプロセス関連不純物（プロテインＡおよびＨＣＰ）に対するそれらの効果を決定した。
５０μＬのＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ媒体を、９６ウェルフィルタープレートの各ウェルに添加した。各ウェルを、５０ｍＭ  グリシンおよびＴｒｉｓ緩衝液の変動量（表１．１．１に特定されるｐＨに対する中和に必要とされる量に依存する）および塩化ナトリウム（表１．１．２に特定される）から作製される溶液で平衡化した。ｐＨは７．６〜９．０の範囲であり、塩化ナトリウムは０ｍＭ〜８０ｍＭの範囲であった。
【００６６】
各行にて使用される緩衝溶液を、自動化ピペッティングシステム（Ｔｅｃａｎ  １００ＲＳＴ）にて希釈した。緩衝液のためのストック溶液を、ＨＣｌによりｐＨ３．０に酸性化し、続いて表１．１．１に示されるｐＨレベルに２Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基により中和した、５００ｍＭグリシンから作製した。この滴定は、緩衝液のｐＨに依存するＴｒｉｓレベルを生じた。緩衝液のｐＨを、ストック緩衝液濃度の１〜１０倍希釈で測定した。これらは、自動化ピペッティングシステムにより作製した希釈物に対応した。ｐＨ３．０へのグリシンの酸性化の結果、緩衝液は最終溶液に約１０ｍＭのイオン強度を与えた。２つのロードチャレンジをその樹脂に対して行った：分配係数Ｋを測定するための５ｍｇ／ｍＬ、およびカラムロード濃度にほぼ等しい濃度においてタンパク質溶液と平衡した結合産物と不純物との除去についての樹脂の吸収力Ｑを測定するための１２２ｍｇ／ｍＬ。
【００６７】
【表１．１．１】
2008533473.tif 000004
【００６８】
【表１．１．２】
2008533473.tif 000005
【００６９】
ＨＴＳ実験の第１段階において、各ウェルを、表１．１．１および１．１．２に記載されるＮａＣｌおよびｐＨの条件で、相の容量比６：１（３００μＬの溶液：５０μＬの樹脂）において平衡化した。プレートを２０分間振盪して、平衡化に到達させた。次いで、フィルタープレートを遠心分離することによりこの溶液を除いた。この平衡化サイクルを３回繰り返した。
【００７０】
第２段階において、各ウェルの樹脂を、適切なＮａＣｌ濃度およびｐＨにおいて、濃縮したＭＡｂ−ＡＡＢ溶液  対  ５ｍｇ／ｍＬの樹脂を容量比６：１（３００μＬの溶液：５０μＬの樹脂）にて用いて、チャレンジした。３００ｐｐｍのプロテインＡを添加した１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中のＭａｂ−ＡＡＢの３６ｍｇ／ｍＬ溶液を、ストック溶液として使用した。ロードしたプレートを２０分間振盪して、樹脂と溶液とを平衡化させた。遠心分離によってフィルタープレートから上清を除去し、収集プレートに収集した。各ウェルの上清中のタンパク質濃度を、Ａ２８０ｎｍにおける吸収により決定した。
【００７１】
第３段階において、樹脂を、表１．１．２に列挙される特定のＮａＣｌ条件およびｐＨ条件の溶液を添加することによって洗浄した。２０分間振盪した後、上清を除去した。第４段階において、２Ｍ  ＮａＣｌを添加して、樹脂に結合する残留タンパク質を除去した。段階３および段階４から溶出された質量と、二段階からの産物濃度とを使用して、各ウェルに対して分配係数を計算し、表１．１．３に示す。分配係数の対数の等高線プロットを、ｐＨおよび塩化物の関数として、図７に示す。
【００７２】
【表１．１．３】
2008533473.tif 000006
【００７３】
表１．１．３に示されるように、Ｋｐ値を使用して、ＭＡＢ−ＡＡＢが異なる強度でＴＭＡＥ媒体に結合する領域を記載し得る。これらの領域は、図７により明確に視認される。ＭＡＢ−ＡＡＢがＴＭＡＥ媒体に結合する強度は、ｐＨ条件と、フロースルー域への塩化物濃度条件（Ｋ≦０．１）、弱分配域への塩化物濃度条件（０．１＜Ｋ＜２０）、および結合域への塩化物濃度条件（Ｋ≧２０）とを変動させることによって作動し得る。
【００７４】
各域からの全てのウェルのロード段階からの上清をサンプリングして、プロテインＡ分析に供した。これらのサンプルのアッセイ結果は、表１．１．４に要約される。ｐＨおよび電導度について、ＴＭＡＥクロマトグラフィー工程が、樹脂に対して損失タンパク質を制限しながら、プロテインＡの非常に有意な除去をもたらす領域が、存在する。この領域は、分配係数値Ｋｐと密に相関しており、特定のｐＨにも塩化物濃度に相関しないことが見出された（図８を参照のこと）。
【００７５】
【表１．１．４】
2008533473.tif 000007
【００７６】
（実験１．２−フロースルー条件下でのカラムの実行）
以下の実験を、フロースルー（ＦＴ）様式において実施した。ここで、Ｍａｂ−ＡＡＢはカラムとは非常に弱く相互作用するのみである。１１０ｍｇ／ｍｌのロードチャレンジおよび２００ｍｇ／ｍｌの樹脂を用いて、２つの実行を実施した。
【００７７】
シリーズ１の実験に記載した全てのＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐＭ）陰イオン交換クロマトグラフィーの実行について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の記載中に注記される）。
作動流速  −  １５０〜３００ｃｍ／時
平衡化１  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
平衡化２  −  記載されるとおりであり、ロードのｐＨおよび塩化物含量とほぼ同値
ロード後の洗浄  −  記載されるとおりであり、ロードのｐＨおよび塩化物含量とほぼ同値
ストリップ緩衝液  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）。
【００７８】
（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  プロテインＡクロマトグラフィー）
モノクローナル抗体を含む培養物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｋ−ｐｒｉｍｅ  ４００クロマトグラフィーシステムに接続したＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（２，３８９ｍＬ）を使用して、パイロットスケールにおいて精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを、５カラム容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて、流速３００ｃｍ／時にて平衡化した。次いで、樹脂１ｍｌあたり産物約４０ｍｇのロードにてこのカラムにロードした。このカラムに、５ＣＶの洗浄（１Ｍ  ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓｓ、ｐＨ７．５）、および５ＣＶの洗浄（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を続けた。次いで、５０ｍＭ  グリシン、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を使用してカラムを溶出させた。産物のプールを、２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を使用してｐＨ７．６に中和した。中和したピーク物は、塩化物濃度約９０ｍＭを有した。
【００７９】
（ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）クロマトグラフィー）
中和したプロテインＡプールをさらに、ｐＨ７．５の平衡化溶液、ロード溶液および洗浄溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび７５ｍＭ  ＮａＣｌ）をおいて用いて、ＴＭＡＥにより精製した。５カラム容量の洗浄を使用した。これら２つの調査のカラムの寸法およびロードチャレンジは：実行１：直径７．０ｃｍ×床高さ２０．６ｃｍ（容量７９３ｍＬ）およびロード濃度１１．９ｍｇ／ｍＬ、ならびに実行２：直径７．０ｃｍ×床高さ１３ｃｍ（容量５００ｍＬ）およびロード濃度１７．６ｍｇ／ｍＬ。
【００８０】
これらのロード条件は、フロースルー（ＦＴ）領域（表２．１．１）中である。バッチ結合調査を使用して分配係数（Ｋｐ）を測定し、そして結合産物を、ＵＶ吸収を使用することによるカラムストリップ中のタンパク質によって決定した。結合産物を決定するこの方法は、代表的に、洗浄の間の産物の無勾配溶出のため、ロードの間に結合した産物の量を過小に評価する。ロード中のおよび産物プール中のプロテインＡレベル、ＨＣＰレベルおよびＨＭＷレベルを測定し、そして除去の程度を計算した。結果を表１．２．１に示す。プロテインＡおよびＨＭＷについてはほとんど除去されず、ＨＣＰレベルについて僅かな低下である。
【００８１】
【表１．２．１】
2008533473.tif 000008
＊不純物レベルは、３８．５ｐｐｍ  ＰｒｏＡおよび５１，９４３ｐｐｍ  ＨＣＰ（実行１）、８．８ｐｐｍ  ＰｒｏＡおよび２５，３９８ｐｐｍ  ＨＣＰ（実行２）であった。
【００８２】
（実験１．３−弱分配条件下でのカラムの実行（高い産物チャレンジ））
（ＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐＭ）陰イオン交換クロマトグラフィー）
ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡのいくつかの実行を、これらの実行のためのロード材料を作製するため、本質的に実験１．２に示されるように実施した。プロテインＡ工程からの部分精製された抗体プールをさらにＴＭＡＥカラムにて精製した。ＴＭＡＥカラムへのロードは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）であった。カラム径は０．５ｃｍであり、床高さは１０ｃｍ（容量２．０ｍＬ）の床高さであった。このカラムに、樹脂１ｍＬあたり５００ｍｌのロードを、ロード濃度２７．７ｍｇ／ｍＬをチャレンジした。
【００８３】
このカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む５カラム容量の溶液、その後の別の平衡化工程（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）の溶液を含む）により平衡化した。次いで、このカラムに、樹脂１ｍｌあたり産物５００ｍｇ、および先の工程からの中和したプロテインＡピーク物をロードし、そして産物を、ロードサイクル間のカラム溶出物中および数カラム容量の洗浄画分中に回収した。
これらのロード条件は、弱分配領域に存在する。バッチ結合調査を使用して、高タンパク質濃度における分配係数（Ｋｐ）および結合する産物を測定した。ｐＨ８．２および１２ｍＭの適切な塩化物含量において、分配係数Ｋｐは１．９であると見積もられる（ＨＴＳスクリーンからのデータ集合の中間補正より）。
【００８４】
ローディング段階の間の３つの画分において、ＨＣＰレベルおよびプロテインＡレベルを測定し、樹脂１ｍｌあたり約２５０ｍｇ、約３７５ｍｇおよび約５００ｍｇのロードチャレンジを示す。実験１．３からの結果を表１．３．１に示す。これらの結果は、非常に高いチャレンジが弱分配様式において不純物のブレークスルーなしに達成され得ることを実証する。ＨＭＷ含量を５０％低減させながら、ＨＣＰおよびプロテインＡのすばらしい低減を達成した。表１．２．１のフロースルー様式における作動についての結果と比較して、不純物の除去は、弱分配様式においてずっと良好であった。
【００８５】
【表１．３．１】
2008533473.tif 000009
＊ロード中の不純物は、２５，３９８ｐｐｍのＨＣＰ、９９．５ｐｐｍのプロテインＡおよび２．３％のＨＭＷであった。
【００８６】
（実験１．４−弱分配条件でのカラムの実行（強固さの調査））
弱分配領域におけるＴＭＡＥカラムの性能をさらに確認するため、ロード中のｐＨおよびＮａＣｌ濃度を変動させるいくつかの実行を設計して、プロセスの強固さを試験した。全ての実行は、樹脂１ｍｌあたり２５０ｍｇのロードチャレンジにおいて実施した。ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡのいくつかの実行を、これらの実行のためのロード材料を作製するため、本質的に実験１．２に記載されるように実施した。これらの実行において変化した唯一の要因は、プロテインＡ溶出物中の塩化ナトリウム濃度であった。この濃度は変化して、特定の実験についてのＴＭＡＥへのロード中のＮａＣｌ濃度と一致した。カラムを平衡化２緩衝液により平衡化し、そしてロードとほぼ同じｐＨおよび塩化ナトリウム濃度を有した洗浄緩衝液で洗浄した。
【００８７】
これらのロード条件は、弱分配領域に存在する。バッチ結合調査を使用して、分配係数（Ｋｐ）を測定した。これらの実行は、表１．４．１に列挙される分配係数により並べられる。結合産物は、ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することによって決定し、７．８〜２５．３ｍｇ／ｍＬの範囲であった。これらの実験からのプロテインＡ、ＨＣＰおよびＨＭＷの結果もまた表１．４．１に示される。全ての不純物の除去は、総塩化物１３．５〜３８．８ｍＭおよびｐＨ７．８〜８．４に広がる作動範囲において強固であることを見出された。
【００８８】
【表１．４．１】
2008533473.tif 000010
＊不純物レベルは、３８．５ｐｐｍ  ＰｒｏＡおよび５１，９４３ｐｐｍ  ＨＣＰ（実行１）、８．８ｐｐｍ  ＰｒｏＡおよび２５，３９８ｐｐｍ  ＨＣＰ（実行２）であった。
＋ＮａＣｌ、緩衝液および滴定物（ｔｉｔｒａｎｔ）からのＣｌ−イオンの寄与を含む。
【００８９】
（要約）
この調査から、プロテインＡの除去（ＬＲＶ）がＫｐにより強く変動し、一方でＨＣＰ  ＬＲＶはＫｐ２．６以上の値全てで優れているが、Ｋｐ＝０．１７（フロースルー条件下）において大きく低減することが認められ得る。宿主細胞タンパク質の除去は、低いロードチャレンジについても、弱分配条件と比較すると、フロースルー条件について１ｌｏｇ超低い。樹脂およびモノクローナル抗体のこの組み合わせにおけるこれらの弱分配条件に対して、結合産物は７．８〜２５ｍｇ／ｍＬの範囲である。分配係数は、０．４１＜Ｋｐ＜５．４の間で最適であるようである。これは、Ｋｐ＝０．１７および１．４〜３．３ｍｇ／ｍＬの結合産物（実験１．２の条件）においては最適ではないようである。
【００９０】
（シリーズ２−ＴＭＡＥ−ＨｉＣａｐＭおよびＭａｂ−ＩＭＡを用いる陰イオン交換）
（実験２．１−ＷＰおよびＦＴ条件を確立するための高スループットスクリーニング）
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を、ＴＭＡＥ−ＨｉＣＡＰ（Ｍ）媒体を用いたＭａｂ−ＩＭＡについての弱分配条件およびフロースルー条件を識別するために実施した。このスクリーニングは、塩化ナトリウム濃度およびｐＨを変動させ、ＭＡＢ−ＩＭＡの結合の程度、およびＴＭＡＥ媒体に対するプロセス関連不純物（プロテインＡおよびＨＣＰ）に対するそれらの効果を決定した。１００μＬのＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ媒体を、９６ウェルフィルタープレートの各ウェルに添加した。各ウェルを、２５ｍＭの緩衝液（その緩衝液のｐＫａから１ｐＨ単位以下離れている：表２．１．１）および適切なレベルの塩化ナトリウム（表２．１．２）から作製された溶液中で平衡化した。ｐＨは７．００〜８．７５の範囲であり、塩化ナトリウム濃度は１ｍＭ〜１９０ｍＭの範囲であった。
【００９１】
全ての緩衝液を、１２Ｍ  ＨＣｌを使用して標的ｐＨに滴定した。異なるレベルの滴定物に必要とされる異なる緩衝種の結果として、塩化物濃度は、そのウェルにどの緩衝液が使用されかに依存して、ウェル毎に変動した。標的ｐＨに緩衝液を滴定するために必要とされるＣｌ−量を、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの方程式を使用して計算し、そしてロード材料中のＮａＣｌおよびその量の両方から寄与される総Ｃｌ−に加算した。この実験における全てのウェルに対して計算されるＣｌ−レベルを、表２．１．３に列挙する。
【００９２】
【表２．１．１】
2008533473.tif 000011
【００９３】
【表２．１．２】
2008533473.tif 000012
【００９４】
【表２．１．３】
2008533473.tif 000013
【００９５】
ＨＴＳ実験の第１段階において、各ウェルを、表２．１．１および２．１．２に記載されるＮａＣｌおよびｐＨの条件で、相の容量比３：１（３００μＬの溶液：１００μＬの樹脂）にて平衡化した。プレートを２０分間振盪して、平衡化に到達させた。次いで、フィルタープレートを遠心分離することによりこの溶液を除いた。この平衡化サイクルを３回繰り返した。
【００９６】
第２段階において、各ウェルの樹脂を、適切なＮａＣｌ濃度およびｐＨにおいて、濃縮したＭＡｂ−ＩＭＡ溶液  対  樹脂１ｍＬあたり３ｍｇを容量比３：１（３００μＬの溶液：１００μＬの樹脂）にて用いて、チャレンジした。３００ｐｐｍのプロテインＡを添加した１ｍＭ  Ｍｅｓ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中のＭａｂ−ＩＭＡの３０ｍｇ／ｍＬ溶液を、ストック溶液として使用した。ロードしたプレートを２０分間振盪して、樹脂と溶液とを平衡化させた。遠心分離によってフィルタープレートから上清を除去し、収集プレートに収集した。各ウェルの上清中のタンパク質濃度を、Ａ２８０ｎｍにおける吸収により決定した。プロテインＡレベルおよび／またはＨＣＰレベルにおける減少はいずれも精製に対する状態電導度を示す。
【００９７】
第３段階において、樹脂を、表２．１．２に列挙される特定のＮａＣｌ条件およびｐＨ条件の溶液を添加することによって洗浄した。２０分間振盪した後、上清を除去した。第４段階において、２Ｍ  ＮａＣｌを添加して、樹脂に結合する残留タンパク質を除去した。段階３および段階４から溶出された質量と、段階２からの産物濃度とを使用して、各ウェルに対して分配係数を計算し、表２．１．４に示す。分配係数の対数の等高線プロットを、ｐＨおよび塩化物の関数として、図９に示す。
【００９８】
【表２．１．４】
2008533473.tif 000014
【００９９】
表２．１．４に示されるように、Ｋｐ値を使用して、ＭＡＢ−ＩＭＡが異なる強度でＴＭＡＥ媒体に結合する領域を記載し得る。これらの領域は、図９により明確に視認される。ＭＡｂ−ＩＭＡがＴＭＡＥ媒体に結合する強度は、ｐＨ条件と、フロースルー域への塩化物濃度条件（Ｋｐ≦０．１）、弱分配域への塩化物濃度条件（０．１＜Ｋｐ＜２０）、および結合域への塩化物濃度（Ｋｐ≧２０）とを変動させることによって作動し得る。
【０１００】
各域からの全てのウェルのロード段階からの上清をサンプリングして、プロテインＡ分析に供した。ロードは３００ｐｐｍのプロテインＡを有した。これらのサンプルのアッセイ結果は、表２．１．５に要約される。ｐＨおよび電導度の領域が存在し、ここで、ＴＭＡＥクロマトグラフィー工程は、樹脂に対して損失タンパク質を制限しながら、ほぼかなりの量のプロテインＡの除去をもたらす。この領域は、分配係数値Ｋｐと密に相関しており、特定のｐＨにも塩化物濃度にも相関しないことが見出された。
【０１０１】
【表２．１．５】
2008533473.tif 000015
予想されるＫｐ値は、ＨＴＳスクリーニングに対する応答面近似から導かれ、その後、この回帰モデルに基づきＫｐが予想される。
【０１０２】
（実験２．２−ＴＭＡＥ−ＨｉＣａｐＭおよびＭａｂ−ＩＭＡを使用するＦＴ条件下でのカラムの実行）
以下の実験を、フロースルー（ＦＴ）様式において実施した。ここで、Ｍａｂ−ＩＭＡはカラムとは非常に弱く相互作用するのみである。樹脂１ｍｌあたり１０９〜２７５ｍｇの産物チャレンジを用いて、４つの実行を実施した。
【０１０３】
（ＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐＭ）陰イオン交換クロマトグラフィー）
実験２のシリーズに記載した全てのＴＭＡＥ（ＨｉＣａｐＭ）陰イオン交換クロマトグラフィー工程の実行について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の記載中に注記した）。
作動流速  −  １５０〜３００ｃｍ／時
平衡化１  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５または８．０（５カラム容量）
平衡化２  −  ７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（実行３および実行４は５０ｍＭ  グリシンを含んだ）
ロード後の洗浄  −  ７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（実行３および実行４は５０ｍＭ  グリシンを含んだ）
ストリップ緩衝液  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５または８．０（５カラム容量）。
【０１０４】
ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡのいくつかの実行を、これらの実行のためのロード材料を作製するため、本質的に実験１．２に示されるように実施した。先に記載したプロテインＡ工程からの部分精製された抗体プールをさらに陰イオン交換カラムにてフロースルー（ＦＴ）様式で精製した。カラム径は１．０〜３．２ｃｍであり、カラム高さは７．２〜８．５ｃｍであった。
このカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む５カラム容量の溶液、その後の別の平衡化工程（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５の溶液を含む）により平衡化した。次いで、このカラムに、部分精製したプロテインＡピーク物を１０９ｍｇ／ｍＬ〜２７５ｍｇ／ｍＬの間でロードし、そして産物を、ロードサイクル間のカラム溶出物中および数カラム容量の洗浄画分中に回収した。
【０１０５】
これらのロード条件は、フロースルー（ＦＴ）領域に存在する。実験２．１に記載される高スループットスクリーニングは、ｐＨおよび塩化物濃度のこれらの条件下での分配係数（Ｋｐ）の値についての見積もりを提供する。これらの実行を、表２．２．１に列挙される分配係数によって並べた。結合産物を、ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することにって、決定した。結合産物の量を決定するこの方法は、代表的に、洗浄物中の産物の無勾配溶出のため、結合した産物の量を過小に評価する。これらの実験からのプロテインＡ除去の結果、ＨＣＰ除去の結果、ＨＭＷ除去の結果、およびＬＭＷ除去の結果もまた、表２．２．１に示される。ＨＣＰについては比較的弱くかつ変動性のある除去があり、プロテインＡおよび産物異性体（ＨＭＷ種およびＬＭＷ種）については除去が全くない。
【０１０６】
【表２．２．１】
2008533473.tif 000016
【０１０７】
（実験２．３−Ｍａｂ−ＩＭＡに対する弱分配条件下でのカラムの実行）
以下のカラム実験を、ＨＴＳスクリーニング（実験２．１）により識別された条件下で弱分配様式において実施した。部分精製したプロテインＡプールから、ＴＭＡＥカラムにて７種の実行を実施した。
【０１０８】
（ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ（Ｍ）クロマトグラフィー）
本質的に先に記載した工程と同じプロテインＡ工程から部分精製した抗体を、以下に記載されるｐＨおよび塩化物含量の弱分配（ＷＰ）条件下でＴＭＡＥ工程にてさらに精製した。カラム径は０．５〜３．２ｃｍの範囲であり、カラム高さは９．４〜９．５ｃｍであった。
このカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５または８．０を含む５カラム容量の溶液、その後の別の平衡化工程（５０ｍＭ  グリシン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５または８．０の溶液を含む）により平衡化した。次いで、このカラムに、部分精製したプロテインＡピーク物を１２４ｍｇ／ｍＬ〜３０３ｍｇ／ｍＬの間でロードし、そして産物を、ロードサイクル間のカラム溶出物中および数カラム容量の洗浄画分中に回収した。この実験からの結果を表２．３．１に示す。
【０１０９】
これらのロード条件は、弱分配（ＷＰ）領域に存在する。実験２．１に記載される高スループットスクリーニングは、分配係数（Ｋｐ）の値についての見積もりを提供する。これらの実行を、表２．３．１に列挙される分配係数によって並べた。結合産物を、ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することによって、決定した。結合産物の量を決定するこの方法は、代表的に、洗浄中の産物の無勾配溶出のため、結合産物の総量を過小評価する。これらの実験からのプロテインＡの結果、ＨＣＰの結果、ＨＭＷの結果、およびＬＭＷの結果もまた、表２．２．１に示される。ＨＣＰについては一貫した高い除去があり、プロテインＡについては優れた除去があり、そして産物異性体（ＨＭＷ種およびＬＭＷ種）については有益な低減がある。
表２．２．１と表２．３．１に示されるデータの比較は、フロースルー様式の条件下（Ｋｐ値０．３以下）でのＨＣＰ、プロテインＡ、ＨＭＷおよびＬＭＷの除去が、ロードチャレンジが３００ｍｇ／ｍＬを超える場合であっても、弱分配条件下（Ｋｐ値０．３超）で達成され得る除去よりもずっと低いことを確認する。
【０１１０】
【表２．３．１】
2008533473.tif 000017
【０１１１】
（実験２．４：パイロットスケールおよび臨床製造スケールにおける弱分配カラム実行の性能）
弱分配領域において作動されるＭａｂ−ＩＭＡ精製のＴＭＡＥプロセス工程を、パイロットプラントおよび臨床製造までスケールアップした。モノクローナル抗体を含む培養物を、最初に、パイロットにおいて３Ｌまたは５ＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを使用して、臨床製造の間では２８ＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを使用して精製した。このＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを、本質的に実験１．２に記載されるように作動した。これらの実行からの中和したプロテインＡピーク物プールを、パイロットにおいては１．５ＬのＴＭＡＥカラムにて、臨床製造設備においては７ＬのＴＭＡＥカラムにて、さらに精製した。３つのパイロットでの実行の結果および９つの臨床製造での実行の結果を、それぞれ表２．４．１および表２．４．２にまとめる。工程の性能は実行にわたって一貫しており、ＨＣＰ、プロテインＡについての優れた低減、産物関連のＨＭＷ種およびＬＭＷ種については良好な除去があった。産物回収率は全ての実行で８７％超であった。パイロット実行の間に樹脂に結合した産物の見積もりをカラムストリップ中の産物から取得し、これは樹脂１ｍＬあたり６〜１４ｍｇの範囲であった。
【０１１２】
【表２．４．１】
2008533473.tif 000018
【０１１３】
【表２．４．２】
2008533473.tif 000019
＊ＴＭＡＥのピーク物プール中のＨＣＰレベルおよびプロテインＡレベルは、定量限界未満であった。
【０１１４】
（要約）
ＨＴＳはＷＰ作動およびＦＴ作動に対する条件を識別した。ＦＴ様式は、ＨＣＰおよびＬＭＷ種の僅かな低減のみをもたらし、プロテインＡ残留物もＨＭＷ種の低減をもたらさなかった。ＷＰ様式における作動は、産物収率を犠牲にすることなく全ての不純物の除去を改善した。このプロセス工程をパイロットプラントにスケールアップし、３回の実行の間に一貫して作動し、ＨＣＰおよびプロテインＡについては非常に高いＬＲＶがあり、ＨＭＷ種およびＬＭＷ種については良好な低減があった。
【０１１５】
（シリーズ３−ＴＭＡＥ−ＨｉＣａｐＭおよびＭａｂ−ＡＡＢを使用する陰イオン交換）
（実験３．１−ＷＰ条件およびＦＴ条件を確立するための高スループットスクリーニング）
実験３．１を、実験１．１に記載されるような手順を使用して実施した。
【０１１６】
（実験３．２−変動性の分配係数に対応する条件下でのカラム吸収力の実行）
５つのクロマトグラフィー実験を、ＨＴＳスクリーニング（実験３．１）により識別される分配係数の範囲に対応する条件下で実施した。ＴＭＡＥカラムに高ロードチャレンジ（１０００ｇ／Ｌ超）をロードし、弱分配条件下でのＡＥＸ工程の優れた性能を特に強調させた。
【０１１７】
以下の条件を、シリーズ３において実施されたＡＥＸ実行に使用した（例外は個々の実験の記載中に注記される）。
作動流速  −  １５０〜３００ｃｍ／時
平衡化１  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）
平衡化２  −  記載されるとおりであり、ロードのｐＨおよび塩化物含量とほぼ同値
ロード後の洗浄  −  記載されるとおりであり、ロードのｐＨおよび塩化物含量とほぼ同値
ストリップ緩衝液  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（５カラム容量）。
【０１１８】
このカラムを、５カラム容量の平衡化１緩衝液、その後５カラム容量の平衡化２の工程によって平衡化した。次いで、適切な平衡化２緩衝液に調節したプロテインＡピーク物プール（シリーズ１、実験１．１を参照のこと）を樹脂１ｍｌあたり産物９４０〜２１４４ｍｇの間で、このカラムにロードした。
カラム溶出画分を収集し、続いてＨＣＰレベルおよび残留のプロテインＡレベルについてアッセイした。これらの実験に使用したロード条件は、フロースルー領域および弱分配（ＷＰ）領域におよぶ漸増性の分配係数に対応する。実験３．１に記載される高スループットスクリーニングは、分配係数（Ｋｐ）の値の見積もりを提供する。この例における結合産物の値を、ストリップ中に溶出された産物に基づき計算した。これらの実験からの結果を、表３．２．１ならびに図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
【０１１９】
【表３．２．１】
2008533473.tif 000020
＊質量の収支計算に基づく。
【０１２０】
Ｋｐ０．１に対応する実行の結合産物値は０に近かった。これは代表的なフロースルー作動にて予想されるとおりである。弱分配領域において実施された実験の結合産物の値は、全ての場合で１２．０ｍｇ／ｍｌ超であった。実際に、Ｋｐ７に対応する実行の産物結合値は、７１ｍｇ／ｍｌほどであった。しかしながら、全ての場合において、ロード溶出物および洗浄画分の組み合わせにおける産物回収率は９３％超であった。
ＨＣＰおよびプロテインＡの除去を、ロードチャレンジの関数として、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。以前に考察したように、ＨＣＰ除去は、フロースルーから弱分配へと条件を移動させるにつれて、有意に増加する。フロースルー条件下での作動は、約１．５ｌｏｇのＨＣＰクリアランスを提供し、一方、ＨＣＰの対数除去値は、弱分配領域においてＫｐ７で作動した場合、樹脂１ｍあたり４５０ｍｇより多いロードチャレンジにおいて３．８ｌｏｇほどであった。弱分配領域におけるＫｐ０．８において、２．８ｌｏｇのＨＣＰクリアランスを樹脂１ｍあたり１０００ｍｇ以下のロードチャレンジについて得、そして弱分配領域におけるＫｐ２．７において、３ｌｏｇ超のＨＣＰクリアランスを樹脂１ｍあたり８００ｍｇまでのロードチャレンジについて得た。
【０１２１】
ＨＣＰの場合に関して、プロテインＡの除去は、条件をフロースルーから弱分配条件へと移動させるにつれて、有意に増加する。図１０Ａおよび図１０Ｂに示される結果はまた、フロースルー領域から分配領域への作動によりＫｐを増加させることは、混入のブレークスルーより前に得られるＨＣＰの対数クリアランス値とプロテインＡ対数クリアランス値との両方、およびブレークスルー点に対応するロードチャレンジを増加させる、という事実を強調する。Ｋｐのさらなる増加は、混入のブレークスルーより前のＨＣＰおよびプロテインＡのＬＲＶを増加し続ける。しかしながら、ブレークスルー点は比較的低いロードチャレンジにおいて発生する。なぜならこの時、結合産物がその結合部位について混入物と競合するからである。それにもかかわらず、ここに示される実行についてのカラム吸収力は、高いＫｐの実行に対してすら非常に高かった。
【０１２２】
（要約）
この例において、プロテインＡおよびＨＣＰの除去が、弱分配条件下でＡＥＸ工程を作動することによって、そして樹脂１ｍあたり１０００ｍｇを超えるロードチャレンジにおいて、有意に改善され得る。この例は、弱分配クロマトグラフィーと結合条件下での標準的な作動との間の１つの根本的な差異を強調する。弱分配条件は、産物回収率およびロードチャレンジが依然高いまま、混入物クリアランスが有意に改善される点以下でのみ産物の結合の制限を推し進める。結合条件に対応するＫｐ値は、ＡＥＸにおいて２０超である；これらの条件下で、産物と混入物との間の競合効果は非常に強力であり、弱分配クロマトグラフィーと比較して低減した吸収力を導く。
【０１２３】
（シリーズ４−Ｐｈｅｎｙｌ  ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＭａｂ−ＡＡＢを使用する疎水性相互作用）
（実験４．１−ＷＰ条件およびＦＴ条件を確立するバッチ結合調査）
Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＰｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ媒体を用いてＭａｂ−ＡＡＢに対する弱分配条件およびフロースルー条件を識別するため、バッチ結合調査を行った。産物と樹脂との相互作用の強度を調節する塩はＮａ2ＳＯ4であり、これを０．２０〜０．９０Ｍまで変動させた。この溶液を、ｐＨ７．５に制御するために緩衝化した。４５μｍのフィルタープレートを使用して、この樹脂と液体とをインキュベートし、そして遠心分離を介して上清をデカントした。８つのＴｒｉｓ／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液を、異なる濃度（０．２Ｍ〜０．９Ｍ）のＮａ2ＳＯ4を用いて作製した。プロテインＡクロマトグラフィーにより部分精製されたＭａｂ−ＡＡＢを、終濃度０．８７ｍｇ／ｍｌにＴｒｉｓ／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液中に希釈した。５０μｌの樹脂を、緩衝液３００μｌを用いて平衡化し、次いで各Ｔｒｉｓ／Ｎａ2ＳＯ4緩衝液条件について上清をデカントした；この平衡化を３回繰り返した。平衡化の後、同じ塩濃度およびｐＨにおいてデカントした樹脂を産物と混合し、そして穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。ロードチャレンジは、全ての条件に対して樹脂１ｍあたり産物５．２ｍｇであった。次いでＵＶプレートをフィルタープレートの底に固定して、遠心分離により上清を収集した。続いて、３００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の緩衝液を樹脂に注ぎ、結合産物をストリップした。２０分のインキュベーション後、遠心分離を介してストリップ物を別のＵＶプレートに収集した。各画分中の産物濃度を、ＵＶ吸収およびこのＭＡｂについての消衰係数により測定した。この計算を、段階間の持ち越し容量２９μｌ（これは、別の組の実験を介して決定した）について調節した。この実験を、各塩条件下で４回繰り返し、平均の分配係数を報告する。
表４．２．１は、この実験からの分配係数を要約する。最も高濃度のＮａ2ＳＯ4は、強力な産物の結合を引き起こし、一方、０．４０〜０．５５の範囲の塩濃度は、弱分配条件を示した。
【０１２４】
（実験４．２−弱分配条件、フロースルー条件および結合条件の下でのカラムの実行（高い産物チャレンジの調査））
カラムの実行を、フロースルー条件、弱分配条件および強結合条件の下で実施した。シリーズ４の実験に記載したＰｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌの疎水性相互作用クロマトグラフィーのすべての実行について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の記載中に注記される）。
カラム寸法：直径０．５ｃｍ、床高さ９．５〜１０．５ｃｍ
平衡化  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）およびロードとほぼ等価の［Ｎａ2ＳＯ4］
ロード  −  以下に記載される［Ｎａ2ＳＯ4］
洗浄  −  ロードと等しい［Ｎａ2ＳＯ4］（以下に例外を注記する）
ストリップ  −  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）。
【０１２５】
２つの異なるロードを使用した：ｉ）先に記載した実行と本質的に同じプロテインＡ工程の実行から部分精製された抗体プール、またはｉｉ）ＦＴ様式作動からのより高純度のＴＭＡＥ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ産物プール。
【０１２６】
（実験４．２．１−ロードとしてプロテインＡピーク物プールを使用するカラムの実行）
ここに論じられる実験を実施して、弱分配条件下でのＨＩＣの優れた性能を強調する。フロースルー条件、弱分配条件および強結合条件に対応する分配係数の範囲を含む変動性の塩濃度の下で、カラムの実行を実施した。実験４．１に記載されるバッチ結合スクリーニングは、分配係数（Ｋｐ）の値についての見積もりを提供する。カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）および適切な特定濃度の［Ｎａ2ＳＯ4］を含む溶液５カラム容量により平衡化した。最初に、プロテインＡのピークを１０倍濃縮し、続いて適切な塩濃度で１４．７７ｍｇ／ｍｌに希釈した。ロード材料中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）レベルおよび残留のプロテインＡレベルは、それぞれ３０９１１ｐｐｍおよび１７．１ｐｐｍであった。全てのカラムの実行を、樹脂１ｍあたり１００ｍｇのロードチャレンジにて実施した。ロードサイクル分画の間のカラム溶出物中の産物を収集した。産物が流れ抜けた後、ロードと同じ塩濃度の洗浄緩衝液１０カラム容量をカラムに注ぎ、続いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を含むストリップ緩衝液５カラム容量を注いだ。続いて、ロード溶出物および洗浄サンプル中のＨＣＰ含量およびプロテインＡ含量をＥＬＩＳＡにより分析した。ロード溶出物と洗浄画分との両方における合わせた不純物レベルを、表４．２．１に報告される。
【０１２７】
これらの実行を分配係数によって並べた。ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することによって結合産物を決定した。結合産物を決定するこの方法は、代表的に、洗浄間の産物の漸次の脱着のため、ロードの間に結合した産物の量を過小評価する。
【０１２８】
【表４．２．１】
2008533473.tif 000021
（分配係数Ｋｐは、５０μｌの樹脂および３００μｌの溶液から相容量比６について計算する）
【０１２９】
表４．２．１に示されるデータから明らかであるように、混入物の低減に関してＨＩＣ工程の性能は、フロースルー条件から弱分配条件へと移動させるにつれて、産物回収率は同等のまま、有意に改善する。作動塩濃度のさらなる増加は、強結合条件に対応する分配係数を導く。繰り返すと、表４．２．１に示されるデータから、混入物の低減および産物回収率の両方に関して、弱分配条件から強結合条件へと移動させる場合にＨＩＣ工程の性能が低下することが明らかである。従って、この分離の最適な操作ウインドウは、弱分配クロマトグラフィーのものに対応する。弱分配条件下で、ＨＩＣ工程は、ＨＣＰの１ｌｏｇの低減およびプロテインＡの３．４倍の低減をもたらす。この例において、弱分配条件下での結合産物レベルは、樹脂１ｍあたり２．８〜５ｍｇの間であった。
【０１３０】
（実験４．２．２−ロードとしてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのピーク物プールを使用するカラムの実行）
これらの実験の組においてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦピーク物プールを使用して、最適な弱分配クロマトグラフィー条件下でのＨＩＣ工程の性能が、クリーナー供給ストックを用いてさらに改善され得るという事実を強調した。この場合のロード材料は、２８８０ｐｐｍのＨＣＰを含んでおり、そしてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムにてプロテインＡピーク物プールを精製することによって作製された。２つの実験（一方は弱分配条件下、他方は代表的なフロースルー条件下）を行って、不純物の除去に関してカラムの性能を比較した。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのピーク物を、５５０ｍＭのＮａ2ＳＯ4にて３．２７ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして弱分配条件下での作動のため、樹脂１ｍあたり１００ｍｇのロードチャレンジをカラムにロードした。続いてこのカラムを、ロードと同じ塩濃度を含む緩衝液の１０ＣＶにより洗浄し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）の６ＣＶによりストリップした。第二の実験をフロースルー条件下で行った。ロードを、２００のＮａ2ＳＯ4中で３．０３ｍｇ／ｍｌに調節し、そして樹脂１ｍあたり９０ｍｇのロードチャレンジをカラムにロードした。次いでこのカラムを、ロードと同じ塩濃度を含む緩衝液６ＣＶにより洗浄し、続いて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）の６ＣＶによりストリップした。両方の実行において、フロースルー画分および洗浄画分を、回収率および不純物の分析のために収集した。これらの実行からの結果を表４．２．２に報告する。
【０１３１】
【表４．２．２】
2008533473.tif 000022
【０１３２】
弱分配条件下での産物回収率の値は、フロースルー作動に匹敵し、そしてまたこれらの実験において使用した供給ストックには依存しなかった。ＨＣＰの除去に関するこれらの工程の性能は、フロースルー作動と比較すると、弱分配条件下では有意により高かった。
いずれかの供給ストックを用いたＨＩＣ工程にわたって、ＨＣＰ  ＬＲＶはフロースルー条件下で同等であった（約０．４〜０．５ＬＲＶ）。しかしながら、弱分配条件下で実施した実験についてのＨＣＰ  ＬＲＶ値は、プロテインＡロード材料を用いた１ＬＲＶから、プロテインＡおよびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを通して精製されたロード材料を用いた２ＬＲＶ超へと増加した。
【０１３３】
（要約）
別の様式のクロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、弱分配様式において首尾よく作動することを示された。弱分配条件下でのＨＩＣ工程の性能は、産物の回収率およびＨＣＰ／プロテインＡの除去に関して、フロースルー条件とより強固な結合条件下での作動の両方よりも優れていることを示された。樹脂１ｍあたり１００ｍｇについての高ロードチャレンジの吸収力は、弱分配条件下で良好に保持された。ここで、（ロード濃度が３．２７ｍｇ／ｍＬであったとしても）３ｍｇ／ｍＬ超の産物が樹脂に結合していた。最適な弱分配条件に対応する分配係数は、陰イオン交換クロマトグラフィーの分配係数よりも僅かに高いようである。
【０１３４】
（シリーズ５−セラミックヒドロキシアパタイトＩ型およびＭａｂ−ＭＹＡを使用するヒドロキシアパタイト）
（実験５．１−ＷＰ条件およびＦＴ条件を確立するための高スループットスクリーニング）
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施して、セラミックヒドロキシアパタイト媒体を用いたＭａｂ−ＭＹＡについての弱分配条件およびフロースルー条件を識別した。このスクリーニングは、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムの濃度を変動させて、ヒドロキシアパタイト媒体に対するＭＡＢ−ＭＹＡの結合の程度についての効率を決定した。
【０１３５】
５０μＬのセラミックヒドロキシアパタイト媒体を、９６ウェルフィルタープレートの３０ウェルに添加した。各々のウェルを、１００ｍＭのアルギニンを含むｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の適切な塩化ナトリウム濃度および適切なリン酸ナトリウム濃度から作製された溶液中で、平衡化した。この溶液中の２つの塩濃度を、表５．１．１および表５．１．２に示す。各々の条件は２連で実施した。これらの各ウェルにおけるＭＡＢ−ＭＹＡのロードチャレンジは、樹脂１ｍＬあたり５．０ｍｇであった。
【０１３６】
【表５．１．１】
2008533473.tif 000023
【０１３７】
【表５．１．２】
2008533473.tif 000024
【０１３８】
ＨＴＳ実験の第１段階において、表５．１．１および表５．１．２に記載される塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムの条件で、相容量比６：１（溶液３００μＬ：樹脂５０μＬ）にて、各ウェルを平衡化した。プレートを２０分間振盪し、平衡に到達させた。次いで、このフィルタープレートを遠心分離することによって溶液を除いた。この平衡化サイクルを３回繰り返した。
【０１３９】
第２段階において、各ウェルの樹脂を、適切な塩化ナトリウム濃度およびリン酸ナトリウム濃度にて、容量比６：１（溶液３００μＬ：樹脂５０μＬ）での適切なタンパク質ロードチャレンジに濃縮されたＭＡｂ−ＭＹＡ溶液を用いて、チャレンジした。５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  アルギニン（ｐＨ７．２）中のＭａｂ−ＭＹＡの７．０ｍｇ／ｍＬ溶液を、ストック溶液として使用した。ロードしたプレートを２０分間振盪し、樹脂と溶液とを平衡化させた。遠心分離によりフィルタープレートから上清を除去し、収集プレートに収集した。各ウェルの上清中のタンパク質濃度を、Ａ２８０ｎｍにおける吸収により決定した。
【０１４０】
第３段階において、表５．１．１および表５．１．２に列挙される特定の塩化ナトリウム条件およびリン酸ナトリウム条件の溶液を添加することによって、樹脂を洗浄した。２０分間振盪した後、上清を除去した。
第４段階において、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を含む緩衝液を添加して、樹脂に結合した残留タンパク質を除去した。
段階４において溶出された質量および段階２からのタンパク質濃度を使用して、各ウェルについて分配係数を計算し、表５．１．３に示す。
【０１４１】
【表５．１．３】
2008533473.tif 000025
【０１４２】
表５．１．３に示されるように、Ｋｐ値を使用して、ＭＡＢ−ＭＹＡが異なる強度でヒドロキシアパタイト媒体に結合する領域を説明し得る。セラミックヒドロキシアパタイト媒体へのＭＡＢ−ＭＹＡの結合強度を、塩化物濃度およびリン酸濃度の条件をフロースルー区域（Ｋｐ≦０．１）、弱分配区域（０．１＜Ｋｐ＜２０）、および結合区域（Ｋｐ≧２０）へと変動させることによって、作動し得る。
【０１４３】
（実験５．２−ＷＰ条件下でのカラムの実行）
ここに論じられる実験を特に実行して、弱分配条件下でのｃＨＡ工程の優れた性能を強調した。従って、これらの実験は、ＨＴＳスクリーニング（実験５．１）によって識別される分配係数の範囲に対応する条件下で実施した。１２種の実行を行い、樹脂１ｍｌあたり１００ｍｇの産物ロードチャレンジを用いた。
【０１４４】
（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔタンパク質Ａクロマトグラフィー）
モノクローナル抗体を含む培養物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを使用して精製した。ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）の５カラム容量を用いて流速３００ｃｍ／時にて平衡化した。次いで、樹脂１ｍｌあたり産物約４０ｍｇのロードにてこのカラムをロードした。これに、１Ｍ  アルギニン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の１０ＣＶの洗浄、および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む５ＣＶの洗浄を続けた。次いで、１００ｍＭ  アルギニン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を使用して、カラムを溶出させた。産物のプールを、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を使用してｐＨ７．２に中和した。
【０１４５】
（セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
プロテインＡ工程から部分精製された抗体プールを、ヒドロキシアパタイトにてさらに精製した。カラム径は０．５ｃｍであり、カラム高さは１０ｃｍであった。
実験５のシリーズに記載される全てのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の説明に注記される）。
作動流速  −  １５０〜２４０ｃｍ／時
平衡化１  ３００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（３カラム容量）
平衡化２  ５〜３０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０〜７６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ａｒｇ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２（５カラム容量）
洗浄  ５〜３０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０〜７６０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ａｒｇ、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２（５〜１０カラム容量）。
【０１４６】
このカラムを、５カラム容量の平衡化緩衝液１、その後別の平衡化２の工程により、平衡化した。次いで、このカラムに先の工程からのプロテインＡピーク物（適切な平衡化２緩衝液に調節した）を樹脂１ｍｌあたり産物１００ｍｇにてロードし、そしてロードサイクルの間のカラム溶出物および数カラム容量の洗浄画分中の産物を、回収した。これらの実験からの結果を表５．２．１および図１１に示す。
これらのロード条件は、フロースルー領域、弱分配（ＷＰ）領域および結合領域に存在した。実験５．１に記載される高スループットスクリーニングは、塩化物濃度およびリン酸濃度についてのこれらの条件下での、分配係数（Ｋｐ）および結合産物（樹脂１ｍＬあたりのｍｇ）の値についての見積もりを提供する。結合産物を、カラムの実行からの産物ブレークスルー容量から決定した。これらの実験からのＨＣＰおよびプロテインＡの結果を、表５．２．１および図１１に示す。
【０１４７】
【表５．２．１】
2008533473.tif 000026
【０１４８】
表５．２．１および図１１に示されるデータから、ｃＨＡ工程の性能が、フロースルー条件から弱分配条件へと移動させた場合、産物の回収率が同等のまま、混入物の低減に関して有意に改善することが明らかである。分配係数のさらなる増加に対応する条件下での作動（すなわち、結合領域での作動）は、混入物の除去に関してさらなる利益はもたらさない。しかしながら、この工程にわたる産物回収率は、強結合条件下では落ち込み始める。従って、この分離についての最適な操作ウインドウは、弱分配クロマトグラフィーのものと一致する。これらの条件下で、プロテインＡの２ｌｏｇ超の低減および宿主細胞タンパク質の１．２ｌｏｇ超の低減を、樹脂１ｍｌあたり産物１００ｍｇのチャレンジにおいて得た。この例において、弱分配条件下での結合産物レベルは、樹脂１ｍＬあたり３．０〜１０．２ｍｇであった。
【０１４９】
（要約）
第三形態のクロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイト）が、弱分配様式において首尾よく作動することを示す。プロテインＡおよびＨＣＰは、セラミック樹脂に対して産物抗体よりも強固に結合することを示し、そしてＷＰ条件下でより強く保持される。ＷＰ領域においてより高いＫｐ値は、いくつかの場合１０〜２０の間であり、これは依然として良好な回収率（９０％超）をもたらす。従って、より低いレベルのＫｐはより高い回収率をもたらす。
【０１５０】
この例において、カラムを実行するのに使用される分配係数の選択を主として介して、カラム工程の性能が最適化され得ることを示した。ヒドロキシアパタイトにおける分配係数は、ｐＨ、塩（型および濃度）、リン酸および緩衝液組成の複雑な関数である。これら全ての変数は一般に、カラム工程の性能に影響する。ここに示されたアプローチは、カラム性能に対するこれら変数のいずれか１つを変更することの影響に関係する、単純な手段を提供する。この例において示される統合的な「分配係数」アプローチは、以前になされてきたものよりも、このクロマトグラフィー様式のより広い作動空間における作動の可能性を広げる。最適な性能のための弱分配条件は、上記のＨＴＳ方法を使用して容易に識別され得る。
【０１５１】
（シリーズ６−セラミックヒドロキシアパタイトＩ型およびＭａｂ−Ａ５Ｔを使用するヒドロキシアパタイト）
（実験６．１−ＷＰ条件およびＦＴ条件を確立するための高スループットスクリーニング）
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施して、セラミックヒドロキシアパタイト媒体を用いたＭａｂ−Ａ５Ｔについての弱分配条件およびフロースルー条件を識別した。このスクリーニングは、ｐＨ、塩化ナトリウム濃度およびリン酸ナトリウム濃度を変動させて、ヒドロキシアパタイト媒体に対するＭＡＢ−Ａ５Ｔの結合の程度についての効率を決定した。
【０１５２】
５０μＬのセラミックヒドロキシアパタイト媒体を、９６ウェルフィルタープレートの３６ウェルに添加した。各々のウェルを、５０ｍＭのアルギニンを含むｐＨ７．０またはｐＨ８．０いずれかの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の適切な塩化ナトリウム濃度および適切なリン酸ナトリウム濃度から作製された溶液中で、平衡化した。この溶液中の２つの塩濃度を、表６．１．１および表６．１．２に示す。１〜３行に示される条件をｐＨ７．０において実施し、４〜６行に示される条件をｐＨ８．０において実施した。これらの各ウェルにおけるＭＡＢ−Ａ５Ｔのロードチャレンジは、樹脂１ｍＬあたり５．０ｍｇであった。
【０１５３】
【表６．１．１】
2008533473.tif 000027
【０１５４】
【表６．１．２】
2008533473.tif 000028
【０１５５】
ＨＴＳ実験の第１段階において、表６．１．１および表６．１．２に記載される塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびｐＨの条件で、相容量比６：１（溶液３００μＬ：樹脂５０μＬ）にて、各ウェルを平衡化した。プレートを２０分間振盪し、平衡に到達させた。次いで、このフィルタープレートを遠心分離することによって溶液を除いた。この平衡化サイクルを３回繰り返した。
第２段階において、各ウェルの樹脂を、適切なｐＨおよび塩化ナトリウム濃度およびリン酸ナトリウム濃度にて、容量比６：１（溶液３００μＬ：樹脂５０μＬ）での適切なタンパク質ロードチャレンジに濃縮されたＭＡｂ−Ａ５Ｔ溶液を用いて、チャレンジした。１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中のＭａｂ−Ａ５Ｔの６．９ｍｇ／ｍＬ溶液を、ストック溶液として使用した。ロードしたプレートを２０分間振盪し、樹脂と溶液とを平衡化させた。遠心分離によりフィルタープレートから上清を除去し、収集プレートに収集した。各ウェルの上清中のタンパク質濃度を、Ａ２８０ｎｍにおける吸収により決定した。
【０１５６】
第３段階において、表６．１．１および表６．１．２に列挙される特定の塩化ナトリウム条件、リン酸ナトリウム条件ｐＨ条件の溶液を添加することによって、樹脂を洗浄した。２０分間振盪した後、上清を除去した。
第４段階において、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む緩衝液を添加して、樹脂に結合した残留タンパク質を除去した。段階４において溶出された質量および段階２からのタンパク質濃度を使用して、各ウェルについて分配係数を計算し、表６．１．３に示す。
【０１５７】
【表６．１．３】
2008533473.tif 000029
【０１５８】
表６．１．３に示されるように、Ｋｐ値を使用して、ＭＡＢ−Ａ５Ｔが異なる強度でヒドロキシアパタイト媒体に結合する領域を識別し得る。セラミックヒドロキシアパタイト媒体へのＭＡＢ−Ａ５Ｔの結合強度を、ＮａＣｌ、リン酸およびｐＨの条件をフロースルー区域、弱分配区域および結合区域へと変動させることによって、作動し得る。
【０１５９】
（実験６．２−ＷＰ条件下でのカラムの実行）
実験を実施して、弱分配条件下でのｃＨＡ工程の優れた性能を強調する。従って、これらの実験は、ＨＴＳスクリーニング（実験６．１）によって識別される分配係数の範囲に対応する条件下で実施した。８種の実行を行い、樹脂１ｍｌあたり１１０ｍｇの産物ロードチャレンジを用いた。
【０１６０】
（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔタンパク質Ａクロマトグラフィー）
モノクローナル抗体を含む培養物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを使用して精製した。ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５カラム容量を用いて流速３００ｃｍ／時にて平衡化した。次いで、樹脂１ｍｌあたり産物約４０ｍｇのロードにてこのカラムをロードした。これに、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）の５ＣＶの洗浄、および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含む５ＣＶの洗浄を続けた。次いで、１００ｍＭ  アルギニン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を使用して、カラムを溶出させた。産物のプールを、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を使用してｐＨ７．２に中和した。
【０１６１】
（セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）
プロテインＡ工程から部分精製された抗体プールを、ヒドロキシアパタイトにてさらに精製した。カラム径は０．５ｃｍであり、カラム高さは１０ｃｍであった。
実験６のシリーズに記載される全てのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の説明に注記される）。
作動流速  −  １５０〜２４０ｃｍ／時
平衡化１  ３００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（３カラム容量）
平衡化２  ２〜３２ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  グリシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０（５カラム容量）
洗浄  平衡化２と同じもの。
【０１６２】
このカラムを、５カラム容量の平衡化１緩衝液、その後別の平衡化２の工程により、平衡化した。次いで、このカラムに先の工程からのプロテインＡピーク物（適切な平衡化２緩衝液に調節した）を樹脂１ｍｌあたり産物１１０ｍｇにてロードし、そしてロードサイクルの間のカラム溶出物および数カラム容量の洗浄画分中の産物を、回収した。これらの実験からの結果を表６．２．１および図１２に示す。
【０１６３】
【表６．２．１】
2008533473.tif 000030
【０１６４】
これらの実験における作動条件は、フロースルー領域、弱分配（ＷＰ）領域および結合領域に対応する。実験６．１に記載されるＨＴＳ実験は、ｐＨ、塩化物濃度およびリン酸濃度についてのこれらの条件下での、分配係数（Ｋｐ）の値についての見積もりを提供する。表６．２．１における実行は、分配係数によって並べられる。結合産物を、ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することによって決定した。結合産物の量を決定するこの方法は、代表的に、洗浄の間の産物の漸進性の脱着のため、ロードの間に結合した産物の量を過小に評価する。これらの実験からのＨＣＰおよび産物に関連するＨＭＷ除去の結果、ならびに産物の回収率を、図１２に示す。
【０１６５】
図１２に示されるデータから、フロースルー条件から弱分配条件へと移動させる場合、ＨＣＰおよびＨＭＷの低減に関して、回収率を８０％超に維持したままでｃＨＡ工程の性能が有意に改善することが明らかである。分配係数のさらなる増加に対応する条件下での作動（すなわち、結合領域における作動）は、混入物の除去関してさらなる利益をもたらさない。しかしながら、この工程にわたる産物回収率は、強結合条件下では落ち込み始める。従って、この分離についての最適な操作ウインドウは、弱分配クロマトグラフィーのものと一致する。これらの条件下で、産物関連のＨＭＷ種について４分の１への低減、およびＨＣＰについて１．４ｌｏｇ超の低減を、樹脂１ｍｌあたり産物１１０ｍｇのチャレンジにおいて得た。この例において、弱分配条件下での結合産物レベルは、樹脂１ｍｌあたり１．６〜６．７ｍｇであった。
【０１６６】
（要約）
第二の例がヒドロキシアパタイトにおいて示され、この例において、弱分配クロマトグラフィーにおける作動が、ＨＣＰ低減およびＨＭＷ低減ならびに産物回収率（８０％超）に関して改善した性能をもたらすことを示された。先の例のように、この工程の性能は、カラムを実行するために使用される分配係数の選択を主として介して最適化された。ここに示されるアプローチは、カラム性能に対するいくつかの変数（ｐＨ、塩、リン酸、イミダゾール、グリシン、ＨＥＰＥＳなど）のいずれか１つを変更することの影響に関係する、単純な手段を提供する。最適な性能のための弱分配条件は、この例において示されるＨＴＳ方法を使用して、容易に識別され得る。ここに示されるアプローチは、以前になされてきたものよりも、このクロマトグラフィー様式のより広い作動空間における作動の可能性を広げる。この例における最適なＷＰ領域は、分配係数２〜２０の間と一致する。
【０１６７】
（シリーズ７−セラミックヒドロキシアパタイトＩ型およびＭａｂ−ＭＹＯを使用するヒドロキシアパタイト）
（実験７．１−ＷＰ条件、ＦＴ条件および強結合条件を確立するための高スループットスクリーニング）
高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実施して、セラミックヒドロキシアパタイト媒体を用いたＭａｂ−ＭＹＯについてのフロースルー条件、弱分配条件および結合条件を識別した。このスクリーニングは、ｐＨ、アルギニン／グリシン、ＨＥＰＥＳ、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの濃度を変動させて、ヒドロキシアパタイト媒体に対するＭＡＢ−ＭＹＯの結合の程度についての効果を決定した。
この例において使用したＨＴＳ手順は、シリーズ５およびシリーズ６に記載される手順と同様であり、ここでは論じられない。ＨＴＳデータに対する応答表面近似から導かれた予想Ｋｐ値を使用して、カラム実験についての特定の条件を選んだ。
【０１６８】
（実験７．２−ＷＰ条件下でのカラムの実行）
ここに論じられる実験を、ＨＴＳ実験により識別された分配係数の範囲に対応する条件下で実施した。これらの実験を実施して、ＨＣＰおよび産物関連のＨＭＷ種の除去に関して、弱分配条件下でのｃＨＡ工程の優れた性能を特に強調する。樹脂１ｍｌあたり５５ｍｇの産物ロードチャレンジを用いて４種の実行を行った。これらの実験において使用したロードチャレンジは、弱分配クロマトグラフィーに対しては低いが、フロースルー条件に対しては代表的である。弱分配クロマトグラフィーに対してロードチャレンジを最適化することを、これらの実験においては企図しなかった。
プロテインＡ工程から部分精製された抗体プールを、これらの実験において使用した。カラム径は０．５ｃｍであり、カラム高さは１０ｃｍであった。
【０１６９】
実験７のシリーズに記載される全てのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程について、以下の条件を使用した（例外は個々の実験の説明に注記される）。
作動流速  −  １５０〜２４０ｃｍ／時
平衡化１  ３００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（２〜５カラム容量）
平衡化２  １〜８ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０〜１７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１２〜５０ｍＭ  Ａｒｇ、２０〜５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０（５カラム容量）
洗浄  平衡化２と同じもの。
【０１７０】
このカラムを、２〜５カラム容量の平衡化緩衝液１、その後５カラム容量の平衡化２により、平衡化した。次いで、このカラムにプロテインＡピーク物（適切な平衡化２緩衝液に調節した）を樹脂１ｍｌあたり産物５５ｍｇにてロードし、そしてロードサイクルの間のカラム溶出物および数カラム容量の洗浄画分中の産物を、回収した。これらの実験からの結果を表７．２．１および図１３に示す。
【０１７１】
【表７．２．１】
2008533473.tif 000031
＊最適なＫｐ条件、図１３を参照のこと。
【０１７２】
これらの実験における作動条件は、フロースルー領域、弱分配（ＷＰ）領域および結合領域に対応する。実験７．１に記載されるＨＴＳ実験は、ｐＨ、塩化物濃度、リン酸濃度、グリシン／アルギニン濃度およびＨＥＰＥＳ濃度についてのこれらの条件下での、分配係数（Ｋｐ）の値についての見積もりを提供する。表７．２．１における実行は、分配係数によって並べられる。結合産物を、ＵＶ吸収を使用してカラムストリップ中のタンパク質を測定することによって決定した。結合産物を決定するこの方法は、代表的に、洗浄の間の産物の漸進性の脱着のため、ロードの間に結合した産物の量を過小に評価する。これらの実験からの、産物関連の高分子量（ＨＭＷ）除去の結果および産物の回収率をまた、図１３に示す。
【０１７３】
図１３に示されるデータから、フロースルー条件から弱分配条件へと移動させる場合、ＨＭＷの低減に関して、回収率を８０％超に維持したままでｃＨＡ工程の性能が有意に改善することが明らかである。分配係数のさらなる増加に対応する条件下での作動（すなわち、結合領域における作動）は、混入物の除去に関してさらなる利益をもたらさない。しかしながら、この工程にわたる産物回収率は、強結合条件下では落ち込み始める。従って、この分離についての最適な操作ウインドウは、弱分配クロマトグラフィーのものと一致する。これらの条件下で、産物関連のＨＭＷ種について２０倍の低減を得た。この例において、弱分配条件下での結合産物レベルは、樹脂１ｍｌあたり５．１〜９．５ｍｇであった。
【０１７４】
（要約）
第二の例がヒドロキシアパタイトにおいて示され、この例において、弱分配クロマトグラフィーにおける作動が、ＨＭＷの低減に関して、良好な産物回収率（８０％超）のまま改善した性能をもたらすことを繰り返し示した。産物関連のＨＭＷ種およびＨＭＷ種は、産物の抗体よりも強固にセラミック樹脂に結合し、そしてＷＰ条件下でも強いままであった。この例におけるＷＰ領域は、分配係数８〜２０の間と一致する。
カラム工程の性能が、カラムを実行するために使用される分配係数の選択を主として介して最適化され得ることを、もう一度示した。ここに示されるアプローチは、カラム性能に対するいくつかの変数（ｐＨ、塩、リン酸、アルギニン、ＨＥＰＥＳなど）のいずれか１つを変更することの影響に関係する、単純な手段を提供する。最適な性能のための弱分配条件は、この例において示されるＨＴＳ方法を使用して、容易に識別され得る。ここに示されるアプローチは、以前になされてきたものよりも、このクロマトグラフィー様式のより広い作動空間における作動の可能性を広げる。
【０１７５】
また、弱分配クロマトグラフィーの概念が電荷の相互作用単独によっては駆動されない系においてもまた機能することも、注意する価値がある。本出願に記載される一般的なアプローチは、ＨＩＣおよびヒドロキシアパタイトなどのような複雑な系に首尾よく適用され得る。例えば、ｐＨを作動することに加えて、いくつかの他の変数（例えば、ＮａＣｌ、リン酸塩、アルギニン／グリシン、緩衝化種）および樹脂の型が全てヒドロキシアパタイトにおいて工程の性能に影響を与え得る。それにもかかわらず、目的の産物単独を用いて単純なバッチの結合実験を実施することによって、ＷＰウインドウを容易に識別し得る。
【０１７６】
（シリーズ８−プロテインＡ溶出およびその後のイオン交換工程のための双生イオン緩衝液）
モノクローナル抗体を含む培養物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂を使用して精製した。ＭａｂｓｅｌｅｃｔプロテインＡカラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５カラム容量を用いて平衡化した。次いで、このカラムに樹脂１ｍｌあたり約４０ｍｇの産物のロードにてロードした。この後、１Ｍ  ＢＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５の５ＣＶの洗浄、および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の５ＣＶの洗浄を行った。次いで、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ３．１）を使用して、カラムを溶出させた。産物のプールを、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）を使用してｐＨ７．２に中和し、ＨＥＰＥＳ総濃度５５ｍＭを生じた。ｐＨ７．２において、ＨＥＰＥＳは緩衝液に１７ｍＭのイオン強度を寄与する。
【０１７７】
本明細書中に掲載される全ての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願の各々が、あらゆる目的のためにその全体が参考として援用されることを具体的かつ個別に示される場合と同程度に、その全体が参考としてかつあらゆる目的のため、本明細書中で援用される。参考として援用される刊行物および特許または特許出願が本明細書中に含まれる開示を否定するのであれば、本明細書は、そのような否定材料のいずれにも勝ること、および／または優位性をとることが、意図される。
本明細書および特許請求の範囲において使用される、成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、用語「約」によって全ての例が修飾されているように理解されるべきである。従って、反対であると説明しない限り、明細書および添付の特許請求の範囲において記載される数値パラメータは概算値であり、これは、本発明によって獲得することが求められる所望の特性に依存して、変動し得る。特許請求の範囲に対する均等論の原則の適用を制限することを少しも企図しないので、各々の数値パラメータは、有効数字の数および通常の四捨五入アプローチに照らし合わせて考慮されるべきである。
【０１７８】
当業者に明らかであるように、本発明の多くの改変および変形が、本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施形態は、単なる例として提供され、いかようにも限定するものではないように意味される。本明細書および実施例が単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲および本質が添付の特許請求の範囲によって示されることが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１−Ａ】図１は、（Ａ）分配係数と産物吸着等温線との間の関係、および（Ｂ）３つの作動様式（結合−溶出様式、弱分配様式およびフロースルー様式）に関する、樹脂に結合する産物の吸着等温線、を示す。
【図１−Ｂ】図１は、（Ａ）分配係数と産物吸着等温線との間の関係、および（Ｂ）３つの作動様式（結合−溶出様式、弱分配様式およびフロースルー様式）に関する、樹脂に結合する産物の吸着等温線、を示す。
【図２−Ａ】図２は、（Ａ）イオン交換クロマトグラフィーにおける３つの作動様式（結合−溶出様式、弱分配様式およびフロースルー様式）についての分配領域、および（Ｂ）ヒドロキシアパタイトでの３つの作動様式に関する分配領域、を示す。
【図２−Ｂ】図２は、（Ａ）イオン交換クロマトグラフィーにおける３つの作動様式（結合−溶出様式、弱分配様式およびフロースルー様式）についての分配領域、および（Ｂ）ヒドロキシアパタイトでの３つの作動様式に関する分配領域、を示す。
【図３】図３は、３つの作動様式（結合−溶出様式、弱分配様式、およびフロースルー様式）に関する模式的なクロマトグラムを示す。
【図４】図４は、弱分配クロマトグラムとフロースルークロマトグラムとの間の比較である。
【図５】図５は、（Ａ）代表的な混入物除去プロフィールをＫｐの関数として、ならびに（Ｂ）回収率をロードチャレンジおよびＫｐの関数として、示す。
【図６】図６は、弱分配クロマトグラフィー工程の開発の代表的な進行を示し、１）Ｋｐを決定するためのハイスループットスクリーン、２）低ロードチャレンジの実行、３）高チャレンジ吸収力の実行、および４）最適な弱分配クロマトグラフィーの実行、を示す。
【０１８０】
【図７】図７は、実験１．１に記載されるように、低濃度のデータ集合から、Ｋｐ  対  ｐＨおよび総塩化物濃度、の等高プロットを示す。
【図８】図８は、実験１．１に記載されるように、プロテインＡの除去を分配係数Ｋｐの関数として示す。対数除去値は、Ｋｐと共に増加する。フロースルー様式は、「ＦＴ」を付した破線のボックスにより示され、一方、弱分配様式は「ＷＰ」を付した破線のボックスにより示される。
【図９】図９は、実験２．１に記載されるように、ｌｏｇ10Ｋｐ  対  ｐＨおよび総塩化物濃度、の等高プロットを示す。
【図１０】図１０は、（Ａ）Ｍａｂ−ＡＡＢについて、イオン交換クロマトグラフィーにおける宿主細胞タンパク質のブレークスループロフィールをＫｐの関数として；そして（Ｂ）Ｍａｂ−ＡＡＢについて、イオン交換クロマトグラフィーにおけるプロテインＡのブレークスルーをＫｐの関数として、示す。
【図１１】図１１は、Ｍａｂ−ＭＹＡについて、ヒドロキシアパタイトにおける弱分配クロマトグラフィーに関する最適作動ウインドウを示す。この例における最適Ｋｐは、１．５〜２０の間である。
【図１２】図１２は、Ｍａｂ−Ａ５Ｔ４について、ヒドロキシアパタイトにおける弱分配クロマトグラフィーに関する最適作動ウインドウを示す。この例における最適Ｋｐは、２〜２０の間である。
【図１３】図１３は、Ｍａｂ−ＭＹＯについて、ヒドロキシアパタイトにおける弱分配クロマトグラフィーに関する最適作動ウインドウを示す。この例における最適Ｋｐは、５〜２０の間である。
【図１−Ａ】
2008533473.tif 000032
【図１−Ｂ】
2008533473.tif 000033
【図２−Ａ】
2008533473.tif 000034
【図２−Ｂ】
2008533473.tif 000035
【図３】
2008533473.tif 000036
【図４】
2008533473.tif 000037
【図５】
2008533473.tif 000038
【図６】
2008533473.tif 000039
【図７】
2008533473.tif 000040
【図８】
2008533473.tif 000041
【図９】
2008533473.tif 000042
【図１０】
2008533473.tif 000043
【図１１】
2008533473.tif 000044
【図１２】
2008533473.tif 000045
【図１３】
2008533473.tif 000046
【国際調査報告】
2008533473.tif 000047