(57)【要約】  血液試料中の白血球の体積計数のための試料獲得デバイスは、血液試料を受け取るための計測空洞を含む。この計測空洞は、固定された所定の厚さを有する。この試料獲得デバイスはさらに、計測空洞を画定する表面上に乾燥した形態で配置された試薬を含む。この試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤と、血液試料中の白血球を選択的に染色する染色剤とを含む。システムは、試料獲得デバイスと計測装置とを含む。計測装置は、試料獲得デバイスホルダと、光源と、試料の拡大像のディジタル画像を獲得するための画像化システムとを含む。この計測装置はさらに、獲得されたディジタル画像を解析して、血液試料中の白血球数を決定するように構成された画像解析機を含む。
2008533466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中の白血球の体積当たりの計数（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を行うための試料獲得デバイスにおいて、
血液試料を受け取るための計測空洞であって、固定された所定の厚さを有する計測空洞と、
該計測空洞を画定する表面上に乾燥した形態で配置された試薬であって、該血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤、及び該血液試料中の白血球を選択的に染色する染色剤を含む試薬と
を含む試料獲得デバイス。
【請求項２】
前記計測空洞を画定する２つの平面を有する胴体部材を含む、請求項１に記載の試料獲得デバイス。
【請求項３】
前記平面が、互いから所定の距離のところに配置されて、光学計測のための試料厚さが決定されている、請求項２に記載の試料獲得デバイス。
【請求項４】
前記計測空洞が５０〜１７０マイクロメートルの均一な厚さを有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項５】
前記計測空洞が少なくとも１００マイクロメートルの均一な厚さを有する、請求項４に記載の試料獲得デバイス。
【請求項６】
前記計測空洞が１５０マイクロメートル以下の均一な厚さを有する、請求項４又は５に記載の試料獲得デバイス。
【請求項７】
揮発性の液体に溶解させた前記試薬が前記表面に供給され、前記揮発性液体が蒸発して、前記試薬が乾燥した形態で残っている、請求項１から６までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項８】
前記染色剤が、白血球の核を選択的に染色するように構成された、請求項１から７までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項９】
前記染色剤が、ヘマトキシリン、メチレンブルー、メチレングリーン、メチレンアズール、酢酸クレシルバイオレット、トルイジンブルー、ゲンチアナバイオレット、スダン類似体、ガロシアニン及びフクシン類似体の群のうちのいずれか１つ、又はこれらの任意の組合せである、請求項１から８までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項１０】
前記溶血剤が、第四級アンモニウム塩、サポニン、胆汁酸、ジギトキシン、ヘビ毒、グルコピラノシド又はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）型の非イオン性界面活性剤である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項１１】
前記計測空洞を試料獲得デバイスの外部に連絡する試料入口をさらに含み、前記入口が、血液試料を獲得するように構成された、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項１２】
使い捨てである、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイス。
【請求項１３】
血液試料中の白血球の体積当たりの計数を行うための方法において、
試料獲得デバイスの計測空洞の中に血液試料を獲得すること
を含み、該計測空洞が、溶血剤、及び白血球が染色されるように該試料と反応する染色剤を含む試薬を保持し、さらに、
染色された該白血球を含む該試料に照射し、
該計測空洞の中の照射された該試料の拡大像のディジタル画像を獲得すること
を含み、該白血球が、該染色剤の選択的な染色によって区別され、さらに、
該ディジタル画像をディジタル方式で解析して、該白血球を識別し、該試料中の白血球数を決定すること
を含む方法。
【請求項１４】
前記血液試料が、前記計測空洞内の前記試薬と混合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記計測空洞が５０〜１７０マイクロメートルの厚さを有し、前記ディジタル画像が、少なくとも該計測空洞の厚さに対応する被写界深度で獲得される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
分析される試料の体積が、前記計測空洞の厚さ及び画像化される前記試料の面積によって明確に画定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、前記染色剤の吸光度のピークに対応する波長の光によって照射される、請求項１３から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記照射がレーザ源によって実行される、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記照射が発光ダイオードによって実行される、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ディジタル画像が、３〜２００倍、より好ましくは３〜１０倍の倍率を使用して獲得される、請求項１３から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記解析が、前記ディジタル画像内の高吸光度の領域を識別することを含む、請求項１３から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記解析が、前記ディジタル画像内の黒いドットを識別することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記解析が、前記獲得されたディジタル画像を電子的に拡大することを含む、請求項１３から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
血液試料中の白血球の体積当たりの計数を行うためのシステムにおいて、
請求項１から１２までのいずれか一項に記載の試料獲得デバイスと、
計測装置と
を含み、該計測装置が、
計測空洞の中に血液試料を保持する該試料獲得デバイスを受け取るように構成された試料獲得デバイスホルダと、
該血液試料に照射するように構成された光源と、
拡大システム、及び該計測空洞の中の照射された前記試料の拡大像のディジタル画像を獲得するためのディジタル画像獲得手段を含む画像化システムであって、染色剤の選択的な染色によって、ディジタル画像内の白血球が区別される画像化システムと、
獲得されたディジタル画像を解析して、血液試料中の白血球を識別し、白血球数を決定するように構成された画像解析機と
を含む、システム。
【請求項２５】
前記拡大システムが、少なくとも試料獲得デバイスの計測空洞の厚さの被写界深度を有するように構成された、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
分析される試料の体積が、前記計測空洞の厚さ及び画像化される前記試料の面積によって明確に画定される、請求項２４又は２５に記載のシステム。
【請求項２７】
前記光源が、前記染色剤の吸光度のピークに対応する波長の光を照射するように構成された、請求項２４から２６までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２８】
前記光源がレーザ源を含む、請求項２４から２７までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２９】
前記光源が発光ダイオードを含む、請求項２４から２７までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３０】
前記拡大システムが、３〜２００倍、より好ましくは３〜１０倍の倍率を有する、請求項２４から２９までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３１】
前記画像解析機が、ディジタル画像の高吸光度の領域を識別するように構成された、請求項２４から３０までのいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３２】
前記画像解析機が、ディジタル画像内の黒いドットを識別するように構成された、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記画像解析機が、獲得されたディジタル画像を電子的に拡大するように構成された、請求項２４から３２までのいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中の白血球の体積当たりの計数（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を行うための試料獲得デバイス（ｓａｍｐｌｅ  ａｃｑｕｉｒｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）、方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球数の決定は、患者の治療との関連においてしばしば重要である。この分析は、例えば白血病又は感染性若しくは炎症性疾患を診断するために、或いは治療を監視するために必要となることがある。患者の待ち時間をできるだけ短くするために、並びに患者の最初の診察のときに医師が治療及び診断の決定を直ちに下すことを可能にするために、分析結果をできるだけ速く得ることを可能にすることが望まれる。したがって、医師又は看護士が迅速に実行することができ、検査室に検査に出す必要のない分析法を提供することは好ましいであろう。
【０００３】
現在、白血球数は通常、血液試料を染色し、この試料を、特殊な計算盤、例えばバーカー（Ｂａｒｋｅｒ）計算盤に入れて顕微鏡で見ることにより、手作業で得られている。この計算盤は、計算盤を、明確に画定された複数の小体積に区切る格子を含む。計算盤内の全ての細胞に顕微鏡の焦点を合わせることを可能にして、計数を容易にするため、白血球を計算盤の底に沈降させる。従って、計数を実行する前に、試料を数分間静置する必要がある。その後、格子中の１枡あたりの血球数を計数することによって白血球数を決定することができる。白血球数は分析者の手作業によって得られており、分析者が信頼できる分析を実行することができるためには、その分析者が分析を実行する経験を多く積む必要がある。
【０００４】
この分析には時間がかかる。また、この分析は手作業で実行されるため、分析を実行する人によって分析結果が異なる可能性がある。
【０００５】
白血球数を決定する既存の自動分析法がいくつかある。白血球数は、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の原理によって決定することができ、この原理は、インピーダンスを感知することによって細胞サイズを決定し、それによって細胞タイプを決定することに基づく。コールターの原理によって白血球を計数する方法が米国特許第５２６２３０２号に記載されている。
【０００６】
コールターの原理は、現在使用されている支配的な自動分析法である。しかし、他の方法もいくつか記述されている。白血球数を決定するこのような方法の１つが、米国特許第５５８５２４６号に開示されている。この方法では、血液試料を、白血球を標識する蛍光染料とリガンドとの複合体と混合することによって、血液試料を調製しなければならない。この試料を毛細管に導入し、毛細管内の試料の上をスキャンするレーザ源によって試料にレーザを照射する。蛍光を測定して白血球数を決定する。蛍光染料と毛細管の上をスキャンするレーザ源とを使用する同様の方法がＷＯ９７／０２４８２に開示されている。この方法は、少数の白血球を含むアフェレーシス製品中の白血球の計数に対して適合されている。この方法では毛細管がかなり太く、毛細管をスキャンする前に毛細管の底に白血球が沈むのを待つ必要がある。
【０００７】
ＷＯ９９／４５３８４には、試料を含み、厚さが変化する室が示されている。この変化する厚さは、血液のさまざまな化合物を分離する。この血液試料を着色剤で染色して、血液試料中の少なくとも３種の異なる白血球型を示差的に際立たせる。光学スキャニング機器を使用してこの室の一部を見ることによって、白血球を計数することができる。
【０００８】
治療の現場で（ａｔ  ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）分析を提供できるように、白血球数を決定する既存の自動分析法をスピードアップし、単純にすることが依然として求められている。さらに、白血球数は、このように一般的に実行されている分析であるため、この分析法に対する改良はどんなものであれ、患者治療に対して大きな影響を有するであろう。患者治療の現場で結果を得る可能性を提供する分析法は特に有利であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、白血球の体積当たりの計数値を決定する簡易な分析を提供することにある。本発明の他の目的は、複雑な装置又は大掛かりな試料調製を必要としない迅速な分析を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これらの目的は、独立請求項に基づく試料獲得デバイス、方法及びシステムによって部分的に又は完全に達成される。好ましい実施形態は従属請求項から明白である。
【００１１】
かくして、血液試料中の白血球の体積当たりの計数のための試料獲得デバイスを提供する。この試料獲得デバイスは、血液試料を受け取るための計測空洞を含む。この計測空洞は、固定された所定の厚さを有する。この試料獲得デバイスはさらに、計測空洞を画定する表面上に乾燥した形態で配置された試薬を含み、この試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤と、血液試料中の白血球を選択的に染色する染色剤とを含む。
【００１２】
この試料獲得デバイスは、計測空洞の中に全血試料を直接に獲得し、それを分析に供する可能性を提供する。試料調製の必要はない。実際、刺し傷をつけた患者の指から計測空洞の中へ血液試料を直接に吸い上げることができる。この試料獲得デバイスに試薬を加えることは、試料を分析の準備が整った状態にする試料獲得デバイス内での反応を可能にする。この反応は、血液試料が試薬と接触したときに開始される。したがって、試料を手作業で調製する必要がなく、これにより、この分析は、患者が待っている間に診察室で直接に実行するのに特に適したものとなる。
【００１３】
この試薬は乾燥した形態で提供されるため、試料獲得デバイスのユーザビリティ（ｕｓａｂｉｌｉｔｙ）に影響を及ぼすことなく試料獲得デバイスを輸送し、長期にわたって貯蔵することができる。したがって、試薬を含む試料獲得デバイスは、血液試料の分析を実施するはるか以前に製造し、調製することができる。
【００１４】
多くの既存の方法が、異なる血球を計数し、血球のサブグループまでも計数することができるが、本発明に基づく試料獲得デバイスは特に、白血球の体積計数を実行するように適合されている。前記試薬は、血液試料中の赤血球を溶解させる溶血剤を含む。これは、試料中の赤血球を計数する可能性を排除する。他方で、赤血球の溶解は、血液試料中の白血球の区別及び識別を単純にする。
【００１５】
染色剤は、個々の白血球の標識付けを提供する。これは、白血球を個別に見、又は検出することを可能にする。白血球は例えば、計測空洞をスキャンし、又は計測空洞の画像を得ることによって検出することができる。したがって、画定された体積中の個別に検出された白血球の数を合計することによって白血球数を得ることができる。
【００１６】
本発明はさらに、血液試料中の白血球の体積当たりの計数のための方法を提供する。この方法は、試料獲得デバイスの計測空洞であって、溶血剤と染色剤とを含む試薬を保持する計測空洞の中に血液試料を獲得し、試料を反応させて、白血球を染色し、染色された白血球を含む試料に照射し、計測空洞の中の照射された試料の拡大像のディジタル画像を獲得して、白血球を、染色剤の選択的な染色によって区別し、ディジタル画像をディジタル方式で解析して、白血球を識別し、試料中の白血球数を決定することを含む。
【００１７】
本発明はさらに、血液試料中の白血球の体積計数のためのシステムを提供する。このシステムは、上述の試料獲得デバイスを含む。このシステムはさらに計測装置を含み、この計測装置は、計測空洞の中に血液試料を保持した試料獲得デバイスを受けるように構成された試料獲得デバイスホルダと、血液試料に照射するように構成された光源とを含む。この計測装置はさらに、拡大システムと、計測空洞の中の照射された試料の拡大像のディジタル画像を獲得するためのディジタル画像獲得手段とを含む画像化システムであって、染色剤の選択的な染色によって、ディジタル画像で白血球が区別される画像化システムを含む。この計測装置はさらに、獲得されたディジタル画像を解析して、血液試料中の白血球を識別し、白血球数を決定するように構成された画像解析機を含む。
【００１８】
本発明のこれらの方法及びシステムは、白血球数を決定する血液試料の非常に単純な分析を提供する。この分析は、複雑な計測装置を必要とせず、又は先進のステップを操作者が実行することを要求しない。したがって、この分析は、患者の診察に関連して直ちに実行することができ、資格を持つ技術者を必要としない。この計測装置は、試料獲得デバイスのこれらの特性を利用して、計測空洞の中に直接に獲得された無希釈の全血試料の分析を実行する。この計測装置は、ある体積の試料を画像化して、その１つの画像から白血球の体積当たりの計数を実行するように構成される。
【００１９】
この血液試料を、計測空洞内の試薬と混合させることができる。数分のうちに、血液試料と試薬の反応によって赤血球が溶血し、白血球が染色され、その結果、試料を光学計測に供する準備が整う。血液試料は、例えば血液試料中への試薬の分散又は拡散によって、或いは、試料獲得デバイスを能動的に振動又は移動させて計測空洞内で撹拌が起こるようにすることによって、試薬と混合することができる。
【００２０】
この試料獲得デバイスは、前記計測空洞を画定する２つの平面を有する胴体部材を含むことができる。これらの平面は、光学計測のための試料厚さを決定するために、互いから所定の距離のところに配置することができる。このことは、試料獲得デバイスが、血液試料の単位体積あたりの白血球数を正確に決定するために使用することができる明確に画定された厚さを光学計測に提供することを意味する。分析される試料の体積は、計測空洞の厚さ及び画像化される試料の面積によって明確に画定される。したがって、この明確に画定された体積を使用して白血球数を血液試料の体積に関連付け、体積当たりの白血球数を決定することができる。
【００２１】
この計測空洞は、５０〜１７０マイクロメートルの均一な厚さを有することが好ましい。少なくとも５０マイクロメートルの厚さは、計測空洞が、血液試料を単一層として拡散することを強制しないことを意味し、このことは、小さな断面積でより大きな体積の血液を分析することを可能にする。したがって、信頼できる白血球数値を与える十分に大きな体積の血液試料を、比較的に小さな血液試料画像を使用して分析することができる。この厚さは、少なくとも１００マイクロメートルであることがより好ましく、この厚さは、よりいっそう小さな断面積を分析し、又はより大きな試料体積を分析することを可能にする。さらに、少なくとも５０マイクロメートル、より好ましくは少なくとも１００マイクロメートルの厚さはまた、２つの平面間の明確に画定された厚さを有する計測空洞の製造を単純化する。
【００２２】
１７０マイクロメートル以下の厚さを有する空洞内に配置された大部分の試料では、白血球数が非常に少なく、そのため、互いに重なり合って配置されている白血球に起因する偏差はわずかでしかない。しかし、このような偏差の影響は白血球数に関連するだろう。したがって、少なくとも大きな白血球数値については、この影響を、結果を統計的に補正することによって、少なくてもある程度までは、処理することができる。この統計的補正は計測装置の較正に基づくことができる。この偏差は、厚さ１５０マイクロメートル以下の計測空洞ではよりいっそう小さく、それにより、より単純な較正を使用することができる。この厚さでは、重なり合った血球に対する較正を必要としない可能性さえある。
【００２３】
さらに、計測空洞の深さ全体を同時に分析することができるディジタル画像を計測装置が得ることができる程に、計測空洞のこの厚さは十分に小さい。この計測装置では拡大システムが使用されるため、大きな被写界深度を得ることは単純ではない。したがって、１つのディジタル画像内で計測空洞の厚さ全体を同時に分析するためには、計測空洞の厚さが、１５０マイクロメートルを超えないことが好ましいといえる。被写界深度は、１７０マイクロメートルの計測空洞厚を処理するように構成することができる。
【００２４】
このディジタル画像は、少なくとも計測空洞の厚さに対応する被写界深度で獲得することができる。このことは、試料の厚さ全体の十分な焦点合わせが得られ、その結果、試料の１つのディジタル画像内で計測空洞の厚さ全体を同時に分析することができることを意味する。したがって、計測空洞内で白血球が沈降するのを待つ必要はなく、それによって分析を実施する時間が低減される。試料の特定の部分にあまりシャープに焦点を合わせないことを選択することによって、試料中の白血球数を識別することを可能にする試料の厚さ全体の十分な焦点合わせが得られる。このことは、白血球がいくぶんかぼやける可能性があるが、それでも、その被写界深度で焦点が合っているとみなすことができることを意味する。
【００２５】
この試料獲得デバイスは、揮発性の液体に溶解した状態で表面に供給され、蒸発して乾燥した形態の試薬を残す試薬を含むことができる。
【００２６】
この試薬は、計測空洞に挿入する前に揮発性液体に溶解すると有利なことが認識された。このことは、試料獲得デバイスの製造及び調製中に計測空洞の幅の狭い空間から揮発性液体が効果的に蒸発することができることを意味する。
【００２７】
この試薬は、好ましくは有機溶媒に溶解することができ、より好ましくはメタノールに溶解することができる。このような溶媒は揮発性であり、このような溶媒を適当に使用して、計測空洞の表面で試薬を乾燥させることができる。
【００２８】
染色剤は、白血球の核を選択的に染色するように構成することができる。このことは、白血球を、着色されたドットとして識別することができ、したがってディジタル画像内で容易に計数できることを意味する。
【００２９】
この染色剤は、ヘマトキシリン、メチレンブルー、メチレングリーン、メチレンアズール、酢酸クレシルバイオレット、トルイジンブルー、ゲンチアナバイオレット、スダン類似体、ガロシアニン及びフクシン類似体のグループのうちのいずれか１つ、又はこれらの任意の組合せとすることができる。しかし、染色剤はこのグループに限定されず、多くの他の物質を企図することができることを理解されたい。
【００３０】
溶血剤は、第四級アンモニウム塩、サポニン、デオキシコール酸などの胆汁酸、ジギトキシン、ヘビ毒、グルコピラノシド又はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）型の非イオン性界面活性剤とすることができる。しかし、溶血剤はこのグループに限定されず、多くの他の物質を企図することができることを理解されたい。
【００３１】
この試料獲得デバイスはさらに、計測空洞を試料獲得デバイスの外部に連絡する試料入口を含み、この入口は、血液試料を獲得するように構成されている。試料入口は、毛管力によって血液試料を引き上げるように構成することができ、さらに、計測空洞は、この入口から空洞内に血液を引き入れることができる。その結果、この試料入口を血液と接触するように単純に移動させることによって、計測空洞の中に血液試料を容易に獲得することができる。次いで、試料入口及び計測空洞の毛管力が、明確に画定された量の血液を計測空洞の中へ引き上げる。或いは、試料獲得デバイスに外部からポンピング力を加えることによって、計測空洞の中へ血液試料を吸い込み又は引き入れることができる。他の代替法によれば、血液試料をピペットの中へ獲得し、次いで、このピペットによって血液試料を計測空洞の中に導入することもできる。
【００３２】
この試料獲得デバイスは使い捨てとすることができる。すなわち、１度しか使用されないように構成される。この試料獲得デバイスは血液試料を受け取ることができ、試料を細胞の計数に供するのに必要な全ての試薬を保持しているので、この試料獲得デバイスは、白血球の計数を実行するためのキットを構成する。このことが可能なのは特に、この試料獲得デバイスは１度しか使用されないように適合され、試料獲得デバイスをクリーニングし、試薬を再び与える可能性を考慮せずに形成することができるためである。さらに、この試料獲得デバイスはプラスチック材料から成形することができ、それによって安い価格レートで製造することができる。したがって、使い捨ての試料獲得デバイスを使用することはそれでもなお、費用面から効率的である可能性がある。
【００３３】
この試料は、染色剤の吸光度のピークに対応する波長の光によって照射することができる。その結果、光の低い透過率によって、染色剤の蓄積を含む染色された白血球が検出される。
【００３４】
この照射はレーザ源によって実行することができる。このレーザ源は、染色剤の吸光度に適合した明確に画定された波長の光を提供することができる。さらに、このレーザ源は平行光を提供し、迷光の外乱を最小限に抑え、その結果、光の透過率が低い点がシャープに区別される。
【００３５】
この照射は或いは、発光ダイオードによって実行することもできる。この光源もやはり、試料中の他の物質から白血球を適切に区別する十分な照射条件を提供することができる。
【００３６】
このディジタル画像は、３〜２００倍、より好ましくは３〜１０倍の倍率を使用して獲得することができる。これらの倍率範囲において、白血球は十分に検出されるように拡大され、被写界深度は、試料の厚さをカバーするように構成することができる。低い倍率は、大きな被写界深度を得ることができることを意味する。しかし、低い倍率が使用される場合、白血球が検出されにくくなる可能性がある。獲得された画像内の画素数を増大させることによって、すなわちディジタル画像の分解能を向上させることによって、より低い倍率を使用することができる。このようにして、３〜４倍の倍率を使用し、なおかつ白血球を検出することができた。
【００３７】
この解析は、ディジタル画像内の高吸光度の領域を識別することを含む。この解析はさらに、ディジタル画像内の黒いドット又は暗いドットを識別することを含むことができる。染色剤は白血球の核内に蓄積することができるため、光の吸光度は、分離した別々の点にピークを有することができる。これらの点は、ディジタル画像上に黒いドットを形成する。
【００３８】
この解析はさらに、獲得されたディジタル画像を電子的に拡大することを含むことができる。試料の拡大されたディジタル画像を獲得するために試料を拡大し、その一方で、獲得されたディジタル画像内で互いの非常に近くに画像化された物体間の区別を単純化するために、獲得されたディジタル画像を電子的に拡大することができる。
【００３９】
次に、添付図面を参照して、本発明を例を挙げてより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
次に、図１を参照して、本発明の一実施形態に基づく試料獲得デバイス１０を説明する。試料獲得デバイス１０は使い捨てであり、分析に使用された後は廃棄される。このことは、試料獲得デバイス１０が複雑な取扱いを要求しないことを意味する。試料獲得デバイス１０はプラスチック材料から形成されることが好ましく、射出成形によって製造することができる。このことは、試料獲得デバイス１０の製造を単純且つ安価にし、それによって試料獲得デバイス１０の費用を抑制することができる。
【００４１】
試料獲得デバイス１０は胴体部材１２を含み、胴体部材１２は、分析結果に影響を及ぼすことなく操作する者が触れることができるベース１４を有する。ベース１４はさらに、分析装置のホルダにぴったり合うことができる突起１６を有することができる。突起１６は、試料獲得デバイス１０が分析装置内に正確に配置されるように構成することができる。
【００４２】
試料獲得デバイス１０はさらに試料入口１８を含む。試料入口１８は、試料獲得デバイス１０内の対向した壁と壁の間に画定され、これらの壁は、互いにごく近くに配置され、その結果、試料入口１８において毛管力を生み出すことができる。試料獲得デバイス１０内に血液を引き入れることを可能にするため、試料入口１８は試料獲得デバイス１０の外部と連絡している。試料獲得デバイス１０はさらに、試料獲得デバイス１０内の対向した壁と壁の間に配置された計測空洞２０の形態の白血球を計数するための室を含む。計測空洞２０は、試料入口１８と連絡するように構成される。試料入口１８から計測空洞２０内へ毛管力によって血液を引き入れることができるように、計測空洞２０を画定する壁は、試料入口１８の壁よりも互いにより近くに配置される。
【００４３】
計測空洞２０の壁は、互いから５０〜１７０マイクロメートルの距離に配置される。計測空洞２０の厚さが少なくとも１００マイクロメートルであるとより好ましい。さらに、計測空洞２０の厚さが１５０マイクロメートル以下であるとより好ましい。この距離は、計測空洞２０の全体にわたって均一である。この計測空洞２０の厚さが、検査される血液の体積を画定する。分析結果は、検査される血液試料の体積と比較されるので、計測空洞２０の厚さは非常に正確である必要があり、すなわち、同じ計測空洞２０内の厚さの変動、及び異なる試料獲得デバイス１０の計測空洞２０間の厚さの変動はごくわずかしか許されない。この厚さは、この小面積の空洞の中で比較的に大きな試料体積を分析することを可能にする。理論的にこの厚さは、計測空洞２０内で白血球が互いに重なり合って配置されることを可能にする。しかし、血液中の白血球の量は非常に小さく、そのため、このことが起こる確率は非常に低い。
【００４４】
試料獲得デバイス１０は一般に、０．５×１０９細胞／リットル（血液）を超える白血球数を計測するように適合される。白血球数がこれよりも少ないと、試料体積が小さすぎて、統計学的に有意な白血球量を計数することができない。さらに、白血球数が１２×１０９細胞／リットル（血液）を超えるときには、血球が互いに重なり合って配置されている影響が、計測される白血球数に対して意味を持ち始める。この白血球数では、計測空洞の厚さが１４０マイクロメートルである場合、白血球が、照射されている試料の断面積の約８％をカバーする。したがって、正確な白血球数を得るためには、この影響を考慮する必要がある。したがって、１２×１０９細胞／リットル（血液）を超える白血球数値の統計的補正を使用することができる。白血球数が大きいほど、血球の重なり合いの影響も大きいため、この統計的補正は、白血球数が大きいほど大きくなる。この統計的補正は、計測装置の較正によって決定することができる。或いはこの統計的補正は、試料獲得デバイス１０に関連して使用される計測装置をセットアップする全般的なレベルで決定することもできる。この統計的補正の大きさは、コールターの原理を使用する分析装置において現在実行されている統計的補正と同様の大きさである。試料獲得デバイス１０を使用して、５０×１０９細胞／リットル（血液）もの大きな白血球数を分析することができることも企図される。
【００４５】
計測空洞２０の壁の表面は、少なくとも部分的に試薬２２で覆われている。試薬２２は、凍結乾燥、加熱乾燥又は真空乾燥させ、計測空洞２０の表面に付着させることができる。計測空洞２０の中に血液試料が獲得されると、血液は乾燥試薬２２と接触し、試薬２２と血液の間の反応を開始する。
【００４６】
試薬２２は、ピペット又はディスペンサを使用して計測空洞２０内に試薬２２を注入することによって供給される。計測空洞２０内に注入されるとき、試薬２２は、揮発性の液体、例えばメタノールなどの有機溶媒に溶解される。試薬２２を含むこの溶媒を計測空洞２０に満たすことができる。次いで、溶媒が蒸発し、試薬２２が計測空洞２０の表面に付着するように、乾燥を実行する。
【００４７】
この試薬は幅の狭い空間の表面で乾燥されるため、周囲の大気と接触したこの液体試薬の表面は非常に小さく、それにより液体試薬の蒸発はより難しくなる。したがって、計測空洞の幅の狭い空間から液体試薬が効果的に蒸発することを可能にするメタノールなどの揮発性液体を使用したほうが有利である。
【００４８】
代替製造法によれば、２片を互いに張り合わせ、それによって一方の片が計測空洞２０の底面壁を形成し、もう一方の片が計測空洞２０の上面壁を形成するようにすることによって、試料獲得デバイス１０が形成される。こうすることによって、これらの２片を互いに張り合わせる前に、開放表面上で試薬２２を乾燥させることができる。したがって、溶媒が揮発性である必要がないため、試薬２２を水に溶解することができる。
【００４９】
試薬２２は、溶血剤及び染色剤を含む。溶血剤は、第四級アンモニウム塩、サポニン、デオキシコール酸などの胆汁酸、ジギトキシン、ヘビ毒、グルコピラノシド又はトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）型の非イオン性界面活性剤とすることができる。染色剤は、ヘマトキシリン、メチレンブルー、メチレングリーン、メチレンアズール、酢酸クレシルバイオレット、トルイジンブルー、ゲンチアナバイオレット、スダン類似体、ガロシアニン又はフクシン類似体、或いはこれらの任意の組合せとすることができる。血液試料が試薬２２と接触すると、溶血剤は、赤血球を溶解するように作用し、その結果、溶解した赤血球が血漿と混合される。さらに、白血球の核内に染色剤が蓄積する。試薬２２は、白血球の全ての核をはっきりと染色する十分な量の染色剤を含んでいなければならない。したがって、しばしば過剰な染色剤が存在し、それらは血漿中に混在する。この過剰の染色剤は、血漿中の染色剤の均質で低いバックグラウンドレベルを与える。白血球内に蓄積した染色剤は、この染色剤のバックグラウンドレベルを上回り、区別可能である。
【００５０】
試薬２２は他の成分を含むこともでき、それらは活性でも、すなわち血液試料との化学反応に参加しても、又は不活性でも、すなわち血液試料との化学反応に参加しなくてもよい。活性成分は例えば、溶血作用又は染色作用を触媒するように構成することができる。不活性成分は例えば、計測空洞２０の壁面への試薬２２の付着を改善するように構成することができる。
【００５１】
血液試料は数分のうちに試薬２２と反応し、その結果、赤血球が溶解し、白血球の核内に染色剤が蓄積する。
【００５２】
図２を参照して、試料獲得デバイスの他の実施形態を説明する。試料獲得デバイス１１０は、計測空洞を形成する室１２０を含む。試料獲得デバイス１１０は、室１２０内に血液を運ぶための室１２０内へ通じる入口１１８を有する。室１２０は、吸引管１２１を介してポンプ（図示せず）に接続されている。このポンプは、吸引管１２１を介して室１２０内に吸引力を加えることができ、その結果、入口１１８を通して室１２０の中に血液を吸い込むことができる。計測を実行する前にポンプから試料獲得デバイス１１０を分離することができる。第１の実施形態に基づく試料獲得デバイス１０の計測空洞２０と同様に、室１２０は、検査される試料の厚さを画定する明確に画定された厚さを有する。さらに、室１２０の壁には、血液試料と反応させるための試薬１２２が付着される。
【００５３】
次に図３を参照して、白血球の体積計数のための装置３０を説明する。装置３０は、血液試料を含む試料獲得デバイス１０を受け取るための試料ホルダ３２を含む。試料ホルダ３２は、試料獲得デバイス１０の計測空洞２０が装置３０内に正確に配置されるように試料獲得デバイス１０を受け取るよう構成される。装置３０は、試料獲得デバイス１０内の血液試料を照明するための光源３４を含む。光源３４は、可視スペクトル全体の光を照射する白熱電球とすることができる。白血球の核内に蓄積した染色剤は、特定の波長の光を吸収し、その結果、試料のディジタル画像中に白血球の核が出現する。カラー画像を獲得する場合、白血球は、特定の色に着色されたドット（ｄｏｔ）として現れる。白黒画像を獲得する場合、白血球は、より明るい背景の中の暗いドットとして現れる。
【００５４】
或いは、光源３４をレーザ又は発光ダイオードとすることもできる。これを使用して、画像のコントラストを増大させ、その結果、白血球をより検出しやすくすることができる。この場合、光源３４は、染色剤の吸収ピークに対応する波長の電磁放射を放射するように構成される。この波長はさらに、この血液化合物の吸収が比較的に低いように選択されなければならない。さらに、試料獲得デバイス１０の壁は、その波長に対して実質上透過性でなければならない。例えば、メチレンブルーを染色剤として使用する場合には、波長６６７ｎｍの光を照射するように光源３４を構成することができる。
【００５５】
装置３０はさらに、光源３４に関して試料ホルダ３２の反対側に配置された画像化システム３６を含む。したがって、画像化システム３６は、血液試料を透過した放射を受け取るように配置される。画像化システム３６は、拡大システム３８及び画像獲得手段４０を含む。拡大システム３８は、３〜２００倍、より好ましくは３〜１００倍、最も好ましくは３〜４倍の倍率を提供するように構成される。これらの倍率範囲では白血球を区別することが可能である。より低い倍率を使用することを可能にするために、この画像を、分解能を高めて獲得することができる。さらに、それにもかかわらず、拡大システム３８の被写界深度を、少なくとも計測空洞２０の厚さに一致するように構成することができる。
【００５６】
拡大システム３８は、試料ホルダ３２の近くに配置された対物レンズ又は対物レンズ系４２、及び対物レンズ４２からある距離を置いて配置された接眼レンズ又は接眼レンズ系４４を含む。対物レンズ４２は、試料の最初の拡大像を提供し、これはさらに接眼レンズ４４によって拡大される。拡大システム３８は、試料の適当な拡大及び画像化を達成するための追加のレンズを含むことができる。拡大システム３８は、試料ホルダ３２の中に配置されたときに計測空洞２０内の試料が、画像獲得手段４０の画像平面上で像を結ぶように構成される。
【００５７】
画像獲得手段４０は、試料のディジタル画像を獲得するように構成される。画像獲得手段４０は、ＣＣＤカメラなどの任意の種類のディジタルカメラとすることができる。ディジタルカメラの画素サイズは、被写界深度内において画像平面内の錯乱円が画素サイズを超えることができないという制約を画像化システム３６に課す。しかし、たとえいくらかぼやけるとしても、白血球は依然として検出することができ、したがって、被写界深度内で考える限り、錯乱円が画素サイズを超えることを許すことができる。ディジタルカメラ４０は、計測空洞２０内の試料のディジタル画像を獲得し、このディジタル画像内では、白血球を計数するために試料の厚さ全体に十分に焦点が合っている。画像化システム３６は、ディジタル画像内に画像化される計測空洞２０の面積を画定する。画像化される面積は、計測空洞２０の厚さとともに、画像化される試料の体積を画定する。画像化システム３６は、試料獲得デバイス１０内の血液試料の画像化に適合するようにセットアップされる。画像化システム３６のこのセットアップを変更する必要はない。このセットアップが偶然に変更されないように、画像化システム３６はハウジングの中に配置されることが好ましい。
【００５８】
装置３０はさらに画像解析機４６を含む。画像解析機４６はディジタルカメラ４０に接続されて、ディジタルカメラ４０が獲得したディジタル画像を受け取る。画像解析機４６は、ディジタル画像中の白血球に対応するパターンを識別して、ディジタル画像中に存在する白血球の数を計数するように構成される。したがって、画像解析機４６は、より明るい背景の中の暗いドットを識別するように構成することができる。画像解析機４６は、ディジタル画像を解析する前に最初にディジタル画像を電子的に拡大するように構成することができる。このディジタル画像の電子拡大はディジタル画像をややぼやけさせはするものの、このことは、画像解析機４６が、互いの近くに画像化された白血球を区別しやすくすることができることを意味する。
【００５９】
画像解析機４６は、そのディジタル画像内で識別された白血球の数を血液試料の体積で割ることによって、血液の体積あたりの白血球数を計算することができる。血液試料の体積は前述のとおり明確に画定されている。この体積白血球数を装置３０のディスプレイ上に表示してもよい。
【００６０】
画像解析機４６は、画像解析を実行するためのコードを含む処理ユニットとして実現することができる。
【００６１】
図４を参照して、白血球の体積計数のための方法を説明する。この方法は、試料獲得デバイスの中に血液試料を獲得することを含む（ステップ１０２）。無希釈の全血試料を試料獲得デバイスの中に獲得する。この試料は、毛細管血又は静脈血から獲得することができる。毛細管血の試料は、刺し傷をつけた患者の指から計測空洞の中へ直接に引き入れることができる。この血液試料は試料獲得デバイス内の試薬と接触し、反応を開始する。赤血球が溶解し、白血球の核内に染色剤が蓄積する。血液試料の獲得から数分のうちに、試料は分析できる状態になる。分析装置の中に試料獲得デバイスを配置する（ステップ１０４）。分析装置のボタンを押すことによって分析を開始することができる。或いは、分析装置が試料獲得デバイスの存在を検出することによって、分析が自動的に開始される。
【００６２】
試料に照射し（ステップ１０６）、試料の拡大像のディジタル画像を獲得する（ステップ１０８）。試料には、染色剤の吸収ピークに対応する波長の電磁放射が照射される。このことは、ディジタル画像が、白血球の核の位置に、黒いドット又はより暗いドットを含むことを意味する。
【００６３】
獲得されたディジタル画像は画像解析機に転送され、画像解析機は、ディジタル画像中の黒いドットの数を計数するための画像解析を実行する（ステップ１１０）。
【００６４】
図５に、溶血され、染色された血液試料中の白血球を識別する可能性を指示するディジタル画像の一例を示す。このディジタル画像は、空洞厚１４０μｍの試料獲得デバイスから、倍率５０倍を使用して得られたものである。光源は白色光を照射しており、このことは、たとえ照射が染色剤の吸収ピークに厳密に適合されていなくても白血球を識別することができることを示している。使用した染色剤はメチレンブルーである。図５では、白血球を指示するはっきり識別可能な黒いドットが見える。図５に示した画像はカラー画像を白黒にしたものである。白血球と背景の間のコントラストは、この図に再現された白黒画像よりもカラー画像のほうがより明瞭に見える。これらの黒いドットは、画像解析機によって容易に計数することができる。
【００６５】
白血球を手作業で計数する方法では、血液試料の白血球数を決定するために一般に約２００個の細胞が計数される。本明細書に提示した方法及び装置は例えば、約２０００個の細胞を計数するように構成することができ、このことは、得られた結果の統計的確実性をより良好にする。普通の健康な成人の白血球数は４〜５×１０９細胞／リットル（血液）である。このことは、体積０．４〜０．５μｌの試料中に２０００個の細胞が見いだされることを意味する。例えば、厚さ１４０μｍの計測空洞内の１．５×１．５ｍｍの領域を画像化する場合、画像化される体積は０．３１５μｌである。獲得された画像の一部分を選択して分析することができる。したがって、白血球数を決定するために使用されている部分に異常が許されないように、獲得した画像を最初に粗く分析することができる。分析のために選択された獲得された画像の部分は、十分な体積の血液試料が分析されるよう適当なサイズを有するように選択することができる。
【００６６】
本明細書に記載された好ましい実施形態は決して本発明を限定するものではないこと、及び添付の特許請求の範囲によって定義された保護の範囲に含まれる多くの代替実施形態が可能であることを強調しておかなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施形態に基づく試料獲得デバイスの概略図である。
【図２】本発明の他の実施形態に基づく試料獲得デバイスの概略図である。
【図３】本発明の一実施形態に基づく計測装置の概略図である。
【図４】本発明の一実施形態に基づく方法の流れ図である。
【図５】白血球の体積計数に使用される血液試料のディジタル画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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