(57)【要約】本発明は、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、一つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチド(例えば、分析物特異的プローブオリゴヌクレオチド)の使用を通じて、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるための方法およびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：
a)増幅産物を生成するために2つの異なるレベルの増幅で標的核酸を増幅する段階；
b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブとハイブリダイズする段階であって、ここで、該第一プローブは、該第二プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階。
【請求項２】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
少なくとも2つのプローブが同一配列へ結合する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
以下の段階を含む、幅広いダイナミックレンジにわたって複数の試料中で標的核酸を検出するための方法であって：
標的核酸の10^3未満のコピーを有する第一試料および標的核酸の10^5より多いコピーを有する第二試料を、該第一試料および該第二試料中の該標的核酸が検出されるような条件下で試薬のセットへ曝露する段階を含み、
該第一試料および第二試料の各々を、第一プローブおよび第二プローブへ曝露する段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該標的核酸とハイブリダイズする段階を含む、方法。
【請求項５】
第一および第二試料中の標的核酸が定量化される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第二プローブが第一プローブよりも10倍低い濃度で存在する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が検出前に2つまたはそれ以上の異なる増幅条件下で処理される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
標的核酸のどんな増幅もなしで実施される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が、直線的増幅によって、指数関数的増幅によって、または直線的および指数関数的増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸が2つの異なるレベルの増幅によって増幅される、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法：a)増幅産物を生成させるために標的核酸を増幅する段階；b)該増幅産物を第一プローブおよび第二プローブと接触させる段階であって、該第二プローブは、該第一プローブとは異なる頻度で該増幅産物とハイブリダイズする、段階；c)該第一プローブおよび第二プローブを切断する段階；ならびにd)該第一プローブおよび第二プローブの切断を検出する段階。
【請求項１２】
以下を含むキット：ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および標的核酸の分析物特異的領域とハイブリダイズするよう形成されている2つのプローブであって、第二プローブは、第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該分析物特異的領域とハイブリダイズし、かつ、第一プローブおよび第二プローブは、該標的核酸の存在下で検出可能シグナルを直接的にまたは間接的にの両方で生成させるよう形成されている、プローブ。
【請求項１３】
第一および第二プローブが同じタイプの検出可能シグナルを生成する、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
第一および第二プローブが標識を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１５】
第一および第二プローブが各々、FRETカセットと相補的なフラップ配列を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１６】
第一プローブのフラップが第二プローブのフラップと同一である、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズするか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列と、異なる頻度でハイブリダイズする、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項１８】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、以下のように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって：
i)第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む該標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または該第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；および
ii)該標的核酸の第二領域は、第二プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の該第二レベルは、増幅の該第一レベルよりも大きい、段階；ならびに
b)該試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって：
i)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該標的核酸の該第一領域および産生される場合には該第一産物配列上で該第一プローブハイブリダイゼーション部位を異なる頻度で占有するか；または
ii)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第二産物配列上の該第二プローブハイブリダイゼーション部位を、異なる頻度で占有する、段階；ならびに
c)該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより該試料中の該標的核酸を検出する段階。
【請求項２３】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第二産物配列が、標的核酸よりも、または産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10,000倍高い濃度のレベルで存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
以下の段階をさらに含む、請求項22記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；ならびに該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２８】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；ならびに該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項２９】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；および該第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項29記載の方法：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第二頻度は第一頻度とは異なる、段階；および該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【請求項３１】
第三プローブオリゴヌクレオチドが第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
増幅の第一レベルが直線的増幅によって達成され、および第二レベルが対数的増幅で達成される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
増幅の第一レベルが非対数的であり、および増幅の第二レベルが対数的である、請求項22記載の方法。
【請求項３４】
測定が、試料中の標的核酸の量を検出する、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約108分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３６】
標的核酸が、最初に試料中に約101〜約1010分子の量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３７】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に103個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に105個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３８】
2つの試料に関して実施され、標的核酸が、最初に1つの試料中に101個未満の量で存在し、および最初に第二試料中に107個を超える量で存在する、請求項22記載の方法。
【請求項３９】
インキュベートする段階および測定する段階が単一容器中で実施される、請求項22記載の方法。
【請求項４０】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1つが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項22記載の方法。
【請求項４２】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階が、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する段階を含む、請求項22記載の方法。
【請求項４３】
ハイブリダイゼーションアッセイがリアルタイム増幅である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ハイブリダイゼーションアッセイが、TAQMANである、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
ハイブリダイゼーションアッセイが、NASBA、TMAおよびマイクロアレイより選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
ハイブリダイゼーションアッセイが侵入型切断アッセイである、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
侵入型切断アッセイがINVADERアッセイである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
標的核酸がミクロRNAである、請求項22記載の方法。
【請求項４９】
第一および第二オリゴヌクレオチドプローブが、同じ標識を有する、請求項22記載の方法。
【請求項５０】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸における多型座の遺伝子型を同定するための方法；
a)該標的核酸が存在する場合、該多型座を含有する該標的核酸の領域が増幅されて、複数の増幅配列を生成するように、該標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階であって、該増幅は飽和するまで実施される、段階；
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとインキュベートする段階であって、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該多型座で第一対立遺伝子を検出するよう形成されている第一分析特異的領域、およびii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、かつ、該第二プローブオリゴヌクレオチドは、i)該多型座で第二対立遺伝子を検出するよう形成されている第二分析物特異的領域、ii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成されるよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該増幅配列上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており、かつここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドからの検出可能シグナルのタイプが同一である、段階；
c)生成された該検出可能シグナルの強度を測定し、それにより該標的核酸中の該第一対立遺伝子、該第二対立遺伝子、または該第一および第二対立遺伝子の両方の存在を決定する段階。
【請求項５１】
多型座が単一ヌクレオチド多型性である、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
多型座が反復配列である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、第二非分析物特異的領域を含み、第二非分析物特異的領域は第一非分析物特異的領域と同一ではなく、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該標的核酸上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成させるよう、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項５４】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが同じである、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルが異なる、請求項53記載の方法。
【請求項５７】
上流オリゴヌクレオチドが5'部分および3'部分を含み、該5'部分が標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位と連続する領域とハイブリダイズするよう形成され、かつ該3'部分が該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている、請求項53記載の方法。
【請求項５８】
試料を第一および第二標識化配列とともにインキュベートする段階であって、第一非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第一標識化配列が第一検出可能シグナルを生成するよう形成され、第二非標的切断産物とハイブリダイズされる場合、該第二標識化配列が第二検出可能シグナルを生成するよう形成されている、段階をさらに含む請求項53記載の方法。
【請求項５９】
第一および第二検出可能シグナルが同じである、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
第一および第二標識化配列がFRETカセットを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
複数の上流オリゴヌクレオチドが試料中で生成される、請求項53記載の方法。
【請求項６２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の第一上流オリゴヌクレオチド、複数の第二上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階であって、
ここで、該第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第一プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびに
ここで、該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)該標的核酸上の第二プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二非分析物特異的領域であって、該第二プローブハイブリダイゼーション部位は該第一プローブハイブリダイゼーション部位と同一ではない領域、およびii)該標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている該第一非分析物特異的領域と同一ではない第二非分析物特異的領域を含み、、かつ、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在し；
ここで、i)該第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)該第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成するために、該切断剤によって該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断をもたらす侵入型切断構造が形成されるような条件下にある、段階；ならびに
b)該第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸を検出する段階。
【請求項６３】
以下を含む、試料中の標的核酸の定量化のためのキット：
a)各々が第一分析物特異的領域を含む、複数の第一プローブオリゴヌクレオチド；
b)各々が第二分析物特異的領域を含み、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、複数の第二プローブオリゴヌクレオチド；および
c)該複数の該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを使用して、侵入型切断アッセイを実施するための試薬。
【請求項６４】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項63記載のキット。
【請求項６５】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６６】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する、請求項63記載のキット。
【請求項６７】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第一標識化配列は、第一検出可能シグナルを生成するように形成され、かつ、該第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、第二標識化配列は、第二検出可能シグナルを生成するように形成されている、第一および第二標識化配列。
【請求項６８】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項６９】
第一3'領域および第二3'領域が同一の配列を有さない、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７０】
第二プローブオリゴヌクレオチドが、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７１】
第一および第二プローブオリゴヌクレオチドが非標識である、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７２】
標的、および切断剤によって切断可能な上流オリゴヌクレオチドとともに侵入型切断構造を形成しない、第三5'領域および第三3'領域を含む第三プローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項67記載のキットまたは組成物。
【請求項７３】
以下を含むキットまたは組成物：
a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドであって、該第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ該第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、該第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも同じ切断剤によって切断されて第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成し、ここで、該第二5'領域産物は該第一5'領域産物と同一であり、かつここで、該第一3'領域は該第二3'領域と同一ではない、オリゴヌクレオチド、ならびに
b)該第一または第二5'領域産物とハイブリダイズされる場合には、検出可能シグナルを生成するよう形成されている第一標識化配列。
【請求項７４】
以下を含む、キット：
a)複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドを含む第一容器であって、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは分析物特異的領域を含み、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、第一容器；
b)ポリメラーゼおよびFEN酵素を含む第二容器；ならびに
c)緩衝剤を含む第三容器。
【請求項７５】
第一および第二オリゴヌクレオチドが非標識である、請求項74記載のキット。
【請求項７６】
プローブハイブリダイゼーション部位を含むコントロール標的配列をさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７７】
第一容器が増幅のためのプライマーをさらに含む、請求項74記載のキット。
【請求項７８】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドと同じ親和性を有する標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するように形成されており、かつここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する、段階；ならびに
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項７９】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法：
a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の非標識第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の非標識第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を検出する段階。
【請求項８０】
以下の段階を含む、標的核酸の最初の量を増幅せずに試料中の標的核酸の最初の量を検出するための方法：
a)最初に300コピーまたはそれ未満の標的核酸を含有する試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で該標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
b)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、300コピーまたはそれ未満の該標的核酸は、測定段階前に増幅されていない、段階。
【請求項８１】
300コピーまたはそれ未満が、200〜100コピーである、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
以下の段階を含む、試料中の標的核酸の量を検出するための方法：
a)該標的核酸が存在する場合、プローブハイブリダイゼーション部位を含有する該標的核酸の領域が複数の増幅配列を生成するように増幅されるように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階、
b)該試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階であって、該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、該複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、該複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、該増幅配列上の該プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、段階；
c)該第一および該第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより該標的核酸の量を測定する段階であって、該標的核酸が最初に該試料中に約1分子〜約107分子の量で存在する場合、該測定する段階が可能である、段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、一つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチドの使用を通じて、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるための方法およびキットを提供する。なお、本発明は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、2005年1月21日出願の米国特許出願番号第60/645,696号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
検出されている標的または生成されているシグナルのいずれかの増幅に頼る核酸検出システムは全て、それらの有用性を限定するダイナミックレンジを本質的に有する。検出されている標的の低濃度で生成したシグナルは、あまりに低すぎて検出できないか、またはあまりに低すぎて背景レベルを上回って点数化できず、それゆえ、検出の限界を下回り、すなわち、検出システムのダイナミックレンジの外側にある。対照的に、生成している標的の非常に高いレベルで、検出システムの構成要素は、シグナルが飽和しているといわれるように、すなわち、さらにより多くの標的の添加が、シグナルにおいてなんら増大を生じないようにして、消耗される。これらの場合において、標的の数は、検出の限界を上回るといわれ、すなわち、検出システムのダイナミックレンジの外側にあるといわれている。
【０００３】
生物検体から標的を検出するのに使用されている検出システムの現実世界の場合において、検出されている試料中に存在する標的の範囲は、極めて大きくあり得、使用時にシステムの検出の限界をしばしば下回るかまたは上回るかのいずれかである。それゆえ、標的濃度のより大きな範囲をカバーする先行試行は、個別に使用され、所与のダイナミックレンジについて最適化される1つより多くの検出システムの生成を必要としてきた。検体中の標的核酸の数量は、当然なことながら未知の数量であるので、このことは、連続する複数の検出システムの使用を非常に頻繁に必要とし、最終的には検討下にある検体についての適切なダイナミックレンジを有する適切な検出システムを使用する。
【０００４】
このように、より広範なダイナミックレンジを有する単一検出システムは、それが利用可能であった場合、経費を有意に削減し、労働時間を低下させ、検討されている検体の消費を低下させるであろう。よりさらには、存在する検出システムのダイナミックレンジを増大させる方法が一般的に、生物検体内の標的の検出の分野を大いに補助するであろう。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、一つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチド(例えば、分析物特異的プローブオリゴヌクレオチド)の使用を通じて、試料中の標的核酸検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。
【０００６】
例えば、幾つかの態様において、本発明は、異なる強度で標的核酸へ結合する複数のプローブを使用して核酸標的(例えば、ウイルス性病原体)を定量化する組成物、キットおよび方法を提供する。幾つかの態様において、各プローブが標的配列に対する異なる結合親和性を呈するプローブの群が使用される(例えば、相補性、長さ、濃度、添加物等を変化させることによって)。異なる特性を有する複数のプローブの使用は、検出アッセイのダイナミックレンジの増大を可能にする。幾つかの態様において、複数のプローブが侵入型切断アッセイに使用される。
【０００７】
したがって、幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸の存在、非存在、または量を検出するための方法を提供する：第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの各々が分析物特異的領域を含み、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドが複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている、標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；ならびに第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を測定する段階。幾つかの態様において、複数の第三、第四、第五等のプローブオリゴヌクレオチドが使用される。これらの付加的なオリゴヌクレオチドは、標的核酸の同じ分析物特異的領域へ結合するよう形成されてもよくまたは同じもしくは異なる標的核酸の異なる分析物特異的領域へ結合してもよい(例えば、第三および第四プローブは、第三プローブが第四プローブとは異なる頻度でハイブリダイゼーション部位を占有するように、同じ標的核酸の第二分析物特異的領域へハイブリダイズするよう形成されている)。
【０００８】
幾つかの態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と完全に相補的である。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と部分的に相補的である(例えば、単一ミスマッチを含有する)。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも長さが短い(例えば、1、2、3もしくは4つまたはそれ以上のヌクレオチド)。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で、好ましくは少なくとも10倍低い濃度で存在する。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも20倍(例えば、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも100倍、500倍、1000倍、10,000倍等の低い濃度)で存在する。3つまたはそれ以上の異なる濃度のプローブが使用される場合、各プローブは、お互いから少なくとも5倍(10倍、20倍、100倍等)の濃度で分離され得る(例えば、第三プローブは、第一プローブよりも10000倍多く、第二プローブは、第一プローブよりも100倍多い)。幾つかの態様において、混合物の1つは、ハイブリダイゼーションの効率を増大させるかまたは低下させることが公知である薬剤を含む(例えば、電荷タグ、副溝結合剤または挿入剤)。他の態様において、プローブの一つは、一つまたは複数の改変された塩基(例えば、アミノT、インドール、またはニトロピロール)を含む。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域よりも短い(例えば、一つまたは複数のヌクレオチドだけ)。他の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域と比較して増大した二次構造を含む。ある態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドは、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、標的核酸と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、標的核酸と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、試料を第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階は、試料を競合因子オリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階を含み、ここで、競合因子オリゴヌクレオチドは各々、第二プローブオリゴヌクレオチドの非分析物特異的領域と相補的な領域を含む。本発明は、競合因子の性質によって限定されない。競合因子は、第二標的核酸または第一オリゴヌクレオチドの異なる領域であってよく、例えば、競合因子に対する第二プローブの非分析物特異的領域のハイブリダイゼーションが、検出可能な事象を生成しないか、または分析物特異的領域とハイブリダイズする第一および/または第二プローブによって生成する検出可能な事象と区別できる検出可能な事象を生成する。
【０００９】
幾つかの態様において、試料を第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階は、試料を競合因子オリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階を含み、ここで、競合因子オリゴヌクレオチド各々は、第二プローブオリゴヌクレオチドの非分析物特異的領域と相補的な領域を含む。ある態様において、混合物の1つは、プローブのハイブリダイゼーション効率を変化させる変化した反応条件(例えば、変化したpH、緩衝剤、イオン強度または付加的な組成物(例えば、クラウディング剤(crowding agent)))を含む。
【００１０】
幾つかの態様において、試料は、標的核酸(例えば、ウイルスまたは細菌)を含むことが公知の、または含むと思われる血液、血清、糞、尿またはリンパ液を含む、動物(例えば、ヒト)からの試料である。幾つかの態様において、試料は、核酸(例えば、組織、体液または細胞由来の総DNAまたはRNA；ゲノムDNA；等)の精製された試料を含む。幾つかの態様において、標的核酸は、ウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)および他のレトロウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、バクテリオファージ(例えば、ラムダファージ)、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルス)または細菌(例えば、クラミジア種(Chlamydia sp.)、N.ゴノレア(N. gonorrhea)、またはストレプトコッカス(streptococcus)B群)由来である。他の態様において、試料は植物由来である。例えば、幾つかの態様において、植物は、病原性微生物(例えば、菌、ウイルス、または細菌)に感染しているかまたは感染していると思われる。
【００１１】
幾つかの態様において、試料を第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする方法は、同一反応容器中で行われる(例えば、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを、同一反応容器中の溶液中で混合する)。幾つかの態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、標識を含む。幾つかの態様において、第一および第二標識は互いに異なる。幾つかの態様において、第一および第二標識は同じ標識である。幾つかの態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階は、侵入型切断構造タイプアッセイ(例えば、INVADERアッセイ)を実施する段階を含む。幾つかのこのような態様において、プローブは、非標識であるが、侵入型切断アッセイ中の切断に際しプローブから除去されるフラップ配列を含む。幾つかの態様において、除去されたフラップは、検出反応を引き起こすためにFRETカセットとハイブリダイズするよう形成されている。幾つかの態様において、第一および第二プローブは、同じFRETカセットへ報告する(例えば、第一および第二プローブは、一次侵入型切断反応における切断に際し、同一のフラップを生じる)。他の態様において、標的核酸の量を決定する段階は、ハイブリダイゼーションアッセイ、ハイブリダイゼーション、TAQMANアッセイ、SNP-ITアッセイ、サザンブロット、リガーゼアッセイ、マイクロアレイアッセイ、FULLVELOCITYアッセイ、周期性プローブアッセイ、NASBA、分岐鎖DNAアッセイ、TMA、分子ビーコンを用いる方法、毛細管電気泳動検出方法、微量流体検出方法、および同等物を包含する任意のリアルタイム増幅アッセイを含むがそれに限定されない検出アッセイを実施する段階を含む。
【００１２】
他の態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸の存在、非存在または量を検出するための方法を提供する：標的核酸を含有するかまたは含有すると思われる試料；分析物特異的領域および第一標識を含む第一プローブオリゴヌクレオチド(ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と完全に相補的である)；および分析物特異的領域および第二標識を含む第二プローブオリゴヌクレオチド(ここで、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と部分的に相補的である)を提供する段階；ならびに試料を第一および第二プローブオリゴヌクレオチドへ曝露する段階；ならびに、幾つかの態様において、試料中の標的核酸の量を決定する段階。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の検出アッセイを実施するために、試薬および、幾つかの態様において、使用説明書を含むキットを提供する。例えば、幾つかの態様において、本発明は、以下を含む、試料中の標的核酸の存在、非存在または定量化を検出するためのキットを提供する：第一分析物特異的領域、および、任意で、第一標識を含む複数の第一プローブオリゴヌクレオチド、ならびに第二分析物特異的領域、および、任意で第二標識を含み、プローブオリゴヌクレオチドの第一混合物とは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている複数の第二プローブオリゴヌクレオチド；ならびに第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを使用してINVADERアッセイを実施するための試薬。幾つかの態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と完全に相補的である。他の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、標的核酸と部分的に相補的である(例えば、標的核酸との一つまたは複数のミスマッチを含有する)。なおさらなる態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも低い濃度で存在する。幾つかの態様において、キットはさらに、核酸検出アッセイを実施するためのキットを使用するための使用説明書を含む。幾つかの態様において、キットは、一つまたは複数の異なる検出アッセイ技術(例えば、侵入型切断アッセイ(例えば、INVADERアッセイ)、TAQMANアッセイ、SNP-ITアッセイ等))による本発明の方法の使用のための試薬および/または使用説明書を含む。
【００１４】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する：a)増幅産物を生成するために2つの異なるレベルの増幅で標的核酸を増幅する段階；b)増幅産物を第一プローブおよび第二プローブとハイブリダイズさせる段階、ここで、第一プローブは、第二プローブとは異なる頻度で増幅産物とハイブリダイズする。ある態様において、第二プローブは、第一プローブより10倍低い濃度で存在する。他の態様において、少なくとも2つのプローブは同じ配列へ結合する。
【００１５】
付加的な態様において、本発明は、幅広いダイナミックレンジにわたって複数の試料中で標的核酸を検出するための方法であって、第一および第二試料中の標的核酸が検出されるような条件下で、標的核酸の10^3未満のコピーを有する第一試料および標的核酸の10^5より多いコピーを有する第二試料を試薬のセットへ曝露する段階を含む方法を提供し、ここで、方法は、第一および第二試料の各々を第一プローブおよび第二プローブへ曝露する段階を含み、ここで、第二プローブは、第一プローブとは異なる頻度で標的核酸へハイブリダイズする。特定の態様において、第一および第二試料中の標的核酸が定量化される。さらなる態様において、第二プローブは、第一プローブより10倍低い濃度で存在する。幾つかの態様において、標的核酸は、検出前に二つまたはそれ以上の異なる増幅条件下で処理される。他の態様において、方法は、標的核酸の任意の増幅なしで実施される。
【００１６】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する：a)増幅産物を生成させるために標的核酸を増幅する段階；b)増幅産物を、第一プローブおよび第二プローブと接触させる段階、ここで、第二プローブは、第一プローブとは異なる頻度で増幅産物とハイブリダイズする；c)第一および第二プローブを切断する段階；ならびにd)第一および第二プローブの切断を検出する段階。
【００１７】
他の態様において、本発明は、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および標的核酸の分析物特異的領域とハイブリダイズするよう形成されている2つのプローブを含むキットを提供し、ここで、第二プローブは、第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で分析物特異的領域とハイブリダイズし、かつここで、第一および第二プローブは、標的核酸の存在下で検出可能シグナルを直接的又は間接的の両方で生成するよう形成されている。幾つかの態様において、第一および第二プローブは、同一タイプの検出可能シグナルを生成する。ある態様において、第一および第二プローブは各々、FRETカセットと相補的なフラップ配列を含む。他の態様において、第一プローブのフラップは、第二プローブのフラップと同一である。
【００１８】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する：a)標的核酸が存在する場合、下記のようにして標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階：i)標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または複数の第一産物配列を生成するために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；およびii)標的核酸の第二領域は、複数の第二産物配列を生成するために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の第二レベルは、増幅の第一レベルよりも大きい(例えば、標的核酸よりもまたは産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に少なくとも10倍...100倍...1000倍...10,000倍...または100,000倍高い濃度のレベルで第二産物配列が存在するように)、；ならびにb)試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで：i)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、標的核酸の第一領域、および産生される場合には第一産物配列と異なる頻度でハイブリダイズするか；またはii)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二産物配列と異なる頻度でハイブリダイズする；ならびにc)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより試料中の標的核酸を検出する段階。特定の態様において、第二産物配列は、標的核酸よりもまたは産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後に100倍〜100,000倍高い濃度のレベルで存在する。ある態様において、標的核酸はミクロRNAである。
【００１９】
ある態様において、本発明は、以下の段階を含む、幅広いダイナミックレンジにわたって複数の試料中で標的核酸を検出するための方法を提供する：第一および第二試料中の標的核酸が検出されるような条件下で、標的核酸の103未満のコピーを有する第一試料および標的核酸の105より多いコピーを有する第二試料を、試薬のセットへ曝露する段階、ここで、方法は、第一および第二試料の各々を第一プローブおよび第二プローブへ曝露する段階を含み、ここで、第二プローブは、異なる頻度で標的核酸へハイブリダイズする。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する：a)直線的に増幅される増幅産物を生成させるために、標的核酸の第一領域を直線的に増幅する段階；b)指数関数的に増幅される増幅産物を生成させるために、標的核酸の第二領域を指数関数的に増幅する段階；c)直線的に増幅された増幅産物をプローブの第一セットと、および指数関数的に増幅された増幅産物をプローブの第二セットとハイブリダイズさせる段階、ここで、プローブの第一または第二セットのいずれかは、増幅された標的核酸とハイブリダイズする複数の第一プローブ、および複数の第一プローブとは異なる頻度で増幅された標的核酸とハイブリダイズする複数の第二プローブを含む。ある態様において、プローブの第一セットおよび第二セットの両方とも、増幅された標的核酸とハイブリダイズする複数の第一プローブ、ならびに複数の第一プローブとは異なる頻度で増幅された標的核酸とハイブリダイズする複数の第二プローブを含む。
【００２１】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、標的核酸を検出するための方法を提供する：a)増幅産物を生成するために標的核酸を直線的および指数関数的の両方で増幅する段階；b)増幅産物を少なくとも2つのプローブとハイブリダイズさせる段階、ここで、第一プローブは、第二プローブとは異なる頻度で、増幅された標的核酸とハイブリダイズする。ある態様において、第一および第二プローブは両方とも、標的核酸上の同じプローブ結合部位とハイブリダイズする。
【００２２】
ある態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する：a)標的核酸が存在する場合、下記のようにして、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階：i)第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む標的核酸の第一領域は、増幅されないか、または第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第一産物配列を生成させるために第一レベルで増幅されるかのいずれかである；およびii)標的核酸の第二領域は、第二プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の第二産物配列を生成させるために第二レベルで増幅され、ここで、増幅の第二レベルは、増幅の第一レベルよりも大きい(例えば、標的核酸よりもまたは産生される場合には第一産物配列よりも、増幅後少なくとも10倍...100倍...1000倍...10,000倍...または100,000倍高い濃度のレベルで第二産物配列が存在するように)；ならびにb)試料を複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、i)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を異なる頻度で占有するか、またはii)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を、異なる頻度で占有する；ならびにc)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより試料中の標的核酸を検出する段階。特定の態様において、第二産物配列は、増幅後、標的核酸よりもまたは産生される場合には第一産物配列よりも100倍〜100,000倍高い濃度のレベルで存在する。
【００２３】
他の態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；ならびに第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。幾つかの態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：試料を、標的核酸の第一領域および産生される場合には第一産物配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を、第二頻度で占有する第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第二頻度は第一頻度とは異なる；ならびに第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【００２４】
ある態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有する、第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階；および第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。特定の態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：試料を、第二産物配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を第二頻度で占有する、第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第二頻度は第一頻度とは異なる；および該第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階。
【００２５】
幾つかの態様において、増幅の第一レベルは直線的増幅によって達成され、および第二レベルは対数的増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)で達成される。さらなる態様において、増幅の第一レベルは、妥協した増幅で(例えば、非効率的なプライマーおよび/または非効率的なポリメラーゼを使用して)達成される。他の態様において、増幅の第二レベルは、増幅なしよりもまたは増幅の第一レベルよりも少なくとも10倍大きい。ある態様において、標的核酸はミクロRNAである。
【００２６】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する；a)標的核酸が存在する場合、下記のようにして標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階：i)第一プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の非対数的に増幅される配列を生成させるために、標的核酸の第一領域が非対数的に増幅され、およびii)第二プローブハイブリダイゼーション部位を含む複数の対数的に増幅される配列を生成させるために、標的核酸の第二領域が対数的に増幅される；b)試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチド、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第三プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第一、第二および第三プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で対数的に増幅される配列上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成され、かつここで、第三プローブオリゴヌクレオチドは、非対数的に増幅される配列上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を第一頻度で占有するよう形成されている；ならびにc)第一、第二および第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより試料中の標的核酸を検出する段階。他の態様において、標的核酸は、最初に試料中に約101〜約108分子の量で存在する(例えば、方法のダイナミックレンジは、少なくとも約7桁以上に及ぶ)。ある態様において、標的核酸はミクロRNAである。
【００２７】
ある態様において、測定する段階は、試料中の標的核酸の量を検出する。他の態様において、測定する段階は経時的に実施される。さらなる態様において、複数の対数的に増幅される配列は、第一プローブハイブリダイゼーション部位を含有しない。
【００２８】
特定の態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)の第二プローブハイブリダイゼーション部位と完全に相補的である。他の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)の第二プローブハイブリダイゼーション部位と部分的に相補的である。
【００２９】
ある態様において、方法は、以下の段階をさらに含む：試料を、分析物特異的領域を含む複数の第四プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第四プローブオリゴヌクレオチドは、第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)上の第一プローブハイブリダイゼーション部位を、第三プローブオリゴヌクレオチドの第一頻度とは異なる第二頻度で占有するよう形成されている。さらなる態様において、標的核酸は、最初に試料中に約101〜約1010分子の量で存在する(例えば、方法のダイナミックレンジは、少なくとも約9桁以上に及ぶ)。
【００３０】
さらなる態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)の第一プローブハイブリダイゼーションと完全に相補的である。他の態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)の第一プローブハイブリダイゼーション部位と部分的に相補的である。付加的な態様において、第三オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第四オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域と同一である。
【００３１】
幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する(例えば、5倍、6倍、7倍、8倍または9倍低い濃度)。ある態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する(例えば、10倍...15倍...25倍...50倍...75倍...または95倍低い濃度、あるいは10倍〜100倍の任意の範囲)。特定の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する(例えば、100倍...125倍...150倍...250倍...500倍...750倍...または900倍低い濃度、あるいは100倍〜1000倍の任意の範囲)。さらなる態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも1000倍低い濃度で存在する(例えば、1000倍...1100倍...1300倍...1500倍...10,000倍...15,000倍...25,000倍...100,000倍...500,000倍...または1,000,000倍、あるいは1000倍〜1,000,000倍の任意の範囲)。
【００３２】
幾つかの態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは、第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する(例えば、5倍、6倍、7倍、8倍または9倍低い濃度)。ある態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは、第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍低い濃度で存在する(例えば、10倍...15倍...25倍...50倍...75倍...または95倍低い濃度、あるいは10〜100倍の任意の範囲)。特定の態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは、第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも100倍低い濃度で存在する(例えば、100倍...125倍...150倍...250倍...500倍...750倍...または900倍低い濃度、あるいは100倍〜1000倍の任意の範囲)。さらなる態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは、第四プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも1000倍低い濃度で存在する(例えば、1000倍...1100倍...1300倍...1500倍...10,000倍...15,000倍...25,000倍...100,000倍...500,000倍...または1,000,000倍、あるいは1000倍〜1,000,000倍の任意の範囲)。
【００３３】
ある態様において、標的核酸は、最初に試料中に約101〜約103分子の量で存在し、標的核酸の量は、第一プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階によって決定される。他の態様において、標的核酸は、最初に試料中に約103〜約106分子の量で存在し、標的核酸の量は、第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階によって決定される。幾つかの態様において、標的核酸は、最初に試料中に約106〜約108分子の量で存在し、標的核酸の量は、第三プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階によって決定される。
【００３４】
ある態様において、方法は、2つの試料に関して実施され、標的核酸は、最初に1つの試料中に103個未満の量で存在し、最初に第二試料中に105個を超える量で存在する。他の態様において、方法は、2つの試料に関して実施され、標的核酸は、最初に1つの試料中に102個未満の量で存在し、最初に第二試料中に106個を超える量で存在する。さらなる態様において、方法は、2つの試料に関して実施され、標的核酸は、最初に1つの試料中に101個未満の量で存在し、最初に第二試料中に107個を超えるか、または108個を超えるか、または109個を超える量で存在する。
【００３５】
特定の態様において、複数の第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)は、第二プローブハイブリダイゼーション部位をさらに含む。他の態様において、複数の第二産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)は、第二プローブハイブリダイゼーション部位を含有しない。ある態様において、第一領域の非対数的増幅は、一本鎖PCRまたは妥協したPCRを含む。
【００３６】
幾つかの態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドは、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。他の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。他の態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。さらなる態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドは、非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、第一産物配列(例えば、非対数的に増幅される配列)と相補的ではない一つまたは複数のヌクレオチドを含む。
【００３７】
ある態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第一プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域よりも短い。他の態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第三プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域よりも短い。
【００３８】
幾つかの態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一標識を含み、およびここで、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二標識を含む。他の態様において、第三プローブオリゴヌクレオチドは第三標識を含み、および第四プローブオリゴヌクレオチドは第四標識を含む。特定の態様において、第一、第二または第三オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは非標識である。付加的な態様において、第一、第二および第三プローブオリゴヌクレオチドは非標識である。幾つかの態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドは非標識である。ある態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドは標識を含む。他の態様において、第一、第二、および第三標識は互いに異なるかまたは互いに同じである。ある態様において、増幅試薬は、第一および第二プライマーおよびポリメラーゼを含む。
【００３９】
幾つかの態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)の第二プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズしないよう形成されている非分析物特異的領域をさらに含み、ここで、非分析物特異的領域は、分析物特異的領域の5'である。ある態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、上流オリゴヌクレオチドとともに侵入型切断構造を形成し、ここで、上流ヌクレオチドは、5'部分および3'部分を含み、5'部分は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)上の第二プローブハイブリダイゼーション部位と連続した領域とハイブリダイズするよう形成され、かつここで、3'部分は、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)とハイブリダイズしないよう形成されている。他の態様において、方法は、試料を、分析物特異的領域を含む複数の付加的なプローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階をさらに含み、ここで、付加的なプローブオリゴヌクレオチドは、第二産物配列(例えば、対数的に増幅される配列)上の第二プローブハイブリダイゼーション部位を、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で占有するよう形成されている。
【００４０】
特定の態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する；a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドと同じ親和性を有する標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており、かつここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する；ならびにb)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を検出する段階。幾つかの態様において、第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一非分析物特異的領域をさらに含み、および第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一非分析物特異的領域と同一ではない第二非分析物特異的領域をさらに含む。他の態様において、第一および第二オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、同一配列を有する。
【００４１】
付加的な態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する；a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の非標識第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の非標識第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている；ならびにb)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を検出する段階。
【００４２】
さらなる態様において、本発明は、以下の段階を含む、標的核酸の最初の量を増幅せずに、試料中の標的核酸の最初の量を検出するための方法を提供する；a)最初に300コピーまたはそれ未満の標的核酸を含有する試料を、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする段階、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている；b)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を測定する段階、ここで、300コピーまたはそれ未満の標的核酸は、測定する段階前に増幅されていない。特定の態様において、300コピーまたはそれ未満は、100〜300コピーまたは100〜200コピーである。
【００４３】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸の量を検出するための方法を提供する；a)標的核酸が存在する場合、プローブハイブリダイゼーション部位を含有する標的核酸の領域が複数の増幅される配列を生成するために増幅されるように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階；b)試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとインキュベートする段階、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、増幅配列上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている；c)第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を測定する段階、ここで、標的核酸が最初に試料中に約1〜約107分子の量で存在するとき、測定は可能である。
【００４４】
ある態様において、インキュベートする段階および測定する段階は、単一容器中で実施される。他の態様において、接触させる段階、インキュベートする段階および測定する段階は、単一容器中で実施される。さらなる態様において、第一オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、第二オリゴヌクレオチドの分析物特異的領域と同一である。幾つかの態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドの分析物特異的領域は、対数的に増幅される配列との単一ミスマッチを含有する。
【００４５】
幾つかの態様において、第二または第四プローブオリゴヌクレオチドは、電荷タグを含有する。他の態様において、第二または第四プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの改変されたヌクレオチドを含有する。さらなる態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも、第二プローブハイブリダイゼーション部位に対して、より低いかまたはより高い親和性を有する。特定の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも、第二プローブハイブリダイゼーション部位と、より低いかまたはより高いTmを有する。付加的な態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドは、第三プローブオリゴヌクレオチドよりも、第一プローブハイブリダイゼーション部位に対して、より低いかまたはより高い親和性を有する。他の態様において、第四プローブオリゴヌクレオチドは、第三プローブオリゴヌクレオチドよりも、第一プローブハイブリダイゼーション部位と、より低いかまたはより高いTmを有する。
【００４６】
幾つかの態様において、第一、第二、および/または第三、および/または第四プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する段階は、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する段階を含む。特定の態様において、ハイブリダイゼーションアッセイは、TAQMANアッセイ、SNP-ITアッセイ、侵入型切断アッセイ、サザンブロットおよびマイクロアレイアッセイからなる群より選択される。さらなる態様において、侵入型切断アッセイは、INVADERアッセイである。
【００４７】
ある態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸における多型座の遺伝子型を同定するための方法を提供する；a)標的核酸が存在する場合、多型座を含有する標的核酸の領域が、複数の増幅される配列を生成するために増幅されるように、標的核酸を含有すると思われる試料を増幅試薬と接触させる段階、ここで、増幅は飽和するまで実施される；b)試料を複数の第一プローブオリゴヌクレオチドおよび複数の第二プローブオリゴヌクレオチドとインキュベートする段階、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)多型座で第一対立遺伝子を検出するよう形成されている第一分析特異的領域、およびii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成するよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、かつここで、第二プローブオリゴヌクレオチドは、i)多型座で第二対立遺伝子を検出するよう形成されている第二分析物特異的領域、ii)検出可能シグナルまたは検出可能シグナルが生成するよう形成されている切断可能な部分を生成することができる標識を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で増幅配列上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており、かつここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドからの検出可能シグナルのタイプが同一である；c)生成した検出可能シグナルの強度を測定し、それにより標的核酸中の第一対立遺伝子、第二対立遺伝子、または第一および第二対立遺伝子の両方の存在を決定する段階。ある態様において、多型座は、単一ヌクレオチド多型性である。他の態様において、多型座は反復配列である。
【００４８】
幾つかの態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する；a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、ここで、該第一非分析物特異的領域は、該第一分析物特異的領域の5'であり；ならびにここで、第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二分析物特異的領域、およびii)標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第二非分析物特異的領域を含み、ここで、第二非分析物特異的領域は第一非分析物特異的領域と同一ではなく、かつここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており；ここで、インキュベートする段階は、i)第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成するよう、切断剤によって第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断を生じる侵入型切断構造が形成されるような条件下にある段階；ならびにb)第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定し、それにより標的核酸を検出する段階。幾つかの態様において、標的の量が検出される。
【００４９】
ある態様において、本発明は、以下の段階を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する：a)標的核酸を含有すると思われる試料を、複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、複数の第一上流オリゴヌクレオチド、複数の第二上流オリゴヌクレオチドおよび切断剤とともにインキュベートする段階、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)標的核酸上の第一プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第一分析物特異的領域、およびii)標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第一非分析物特異的領域を含み、ここで、第一非分析物特異的領域は、第一分析物特異的領域の5'であり、ならびにここで、第二プローブオリゴヌクレオチドの各々は、i)標的核酸上の第二プローブハイブリダイゼーション部位とハイブリダイズするよう形成されている第二非分析物特異的領域を含み、ここで、第二プローブハイブリダイゼーション部位は第一プローブハイブリダイゼーション部位と同一ではなく、およびii)標的核酸とハイブリダイズしないよう形成されている第二非分析物特異的領域を含み、ここで、第二非分析物特異的領域は、第一非分析物特異的領域と同一ではなく、かつここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在し；ここで、インキュベートする段階は、i)第一非分析物特異的領域を含む第一非標的切断産物、およびii)第二非分析物特異的領域を含む第二非標的切断産物を生成するために、切断剤によって第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方の切断を結果として生じる侵入型切断構造が形成されるような条件下にあり；ならびにb)第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルを検出することによって第一および第二プローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを経時的に測定し、それにより標的核酸の量を測定する段階。ある態様において、標的核酸はミクロRNAである。幾つかの態様において、標的の量が検出される。
【００５０】
ある態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍、100倍、または1000倍低い濃度で存在する。さらなる態様において、第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルは同じである。他の態様において、第一および第二非標的切断産物によって生成されるシグナルは異なる。幾つかの態様において、上流オリゴヌクレオチドは、5'部分および3'部分を含み、ここで、該5'部分は、標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位と連続する領域とハイブリダイズするよう形成され、かつここで、該3'部分は、標的核酸とハイブリダイズしないよう形成される。さらなる態様において、方法は、試料を第一および第二標識化配列とともにインキュベートする段階をさらに含み、ここで、第一標識化配列は、第一非標的切断産物とハイブリダイズするとき、第一検出可能シグナルを生成するよう形成されており、かつここで、第二標識化配列は、第二非標的切断産物とハイブリダイズするとき、第二検出可能シグナルを生成するよう形成されている。特定の態様において、第一および第二検出可能シグナルは同じである。付加的な態様において、第一および第二標識化配列は、FRETカセットを含む。他の態様において、複数の上流オリゴヌクレオチドは、試料中で生成される(例えば、ポリメラーゼによって)。幾つかの態様において、上流オリゴヌクレオチドは、あらかじめ合成されて供給される。
【００５１】
ある態様において、本発明は、以下を含む、試料中の標的核酸の定量化のためのキットを提供する：a)各々が第一分析物特異的領域を含む、複数の第一プローブオリゴヌクレオチド、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドは非標識であるか、または標識を含み、b)各々が第二分析物特異的領域を含む、複数の第二プローブオリゴヌクレオチド、ここで、第二プローブオリゴヌクレオチドは非標識であるか、または標識を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されており；およびc)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチドを使用して、INVADERアッセイを実施するための試薬。
【００５２】
ある態様において、本発明は、以下を含むキットまたは組成物を提供する：i)複数の第一オリゴヌクレオチド、およびii)複数の第二プローブオリゴヌクレオチド、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で、侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成するために同一切断剤によって切断されると考えられ、ここで、第二5'領域産物は第一5'領域産物と同一ではない。幾つかの態様において、キットまたは組成物は、iii)第一および第二標識化配列をさらに含み、ここで、第一標識化配列は、第一5’領域産物とハイブリダイズするとき、第一検出可能シグナルを生成するよう形成されており、かつここで、第二標識化配列は、第二5’領域産物とハイブリダイズするとき、第二検出可能シグナルを生成するよう形成されている。幾つかの態様において、キットは、標的配列をコントロールとしてさらに含む。
【００５３】
特定の態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一容器中に提供される。さらなる態様において、キットは、ポリメラーゼおよびFEN酵素を含有する第二容器をさらに含む。付加的な態様において、キットは、緩衝剤を含有する第三容器をさらに含む。
【００５４】
幾つかの態様において、第一3'領域および第二3'領域は、同一の配列を有する。他の態様において、第一3'領域および第二3'領域は、同一の配列を有さない。特定の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも5倍低い濃度で存在する。他の態様において、第二プローブオリゴヌクレオチドは、第一プローブオリゴヌクレオチドよりも少なくとも10倍...100倍...1000倍...10,000倍...または500,000低い濃度で存在する。幾つかの態様において、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは非標識である。
【００５５】
さらなる態様において、キットまたは組成物は、第三5'領域および第三3'領域を含む第三プローブオリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、第三プローブオリゴヌクレオチドは、標的、および切断剤によって切断可能な上流オリゴヌクレオチドとともに侵入型切断構造を形成しないと考えられる。幾つかの態様において、第一および第二検出可能シグナルは同じであるか、またはそれらは異なる。
【００５６】
幾つかの態様において、本発明は、i)複数の非標識第一プローブオリゴヌクレオチド、およびii)複数の非標識第二プローブオリゴヌクレオチドを含むキットを提供し、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で、標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている。さらなる態様において、キットは、ポリメラーゼおよび/またはFEN酵素をさらに含む。他の態様において、キットは緩衝剤をさらに含む。
【００５７】
幾つかの態様において、本発明は、以下を含むを、キットを提供する：a)複数の第一プローブオリゴヌクレオチド(例えば、非標識)および複数の第二プローブオリゴヌクレオチド(例えば、非標識)を含む第一容器、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドは分析物特異的領域を含み、ここで、複数の第二プローブオリゴヌクレオチドは、複数の第一プローブオリゴヌクレオチドとは異なる頻度で標的核酸上のプローブハイブリダイゼーション部位を占有するよう形成されている；b)ポリメラーゼおよび/またはFEN酵素を含む第二容器；ならびにc)緩衝剤を含む第三容器。ある態様において、キットは、d)プローブハイブリダイゼーション部位を含むコントロール標的配列をさらに含む。
【００５８】
特定の態様において、本発明は、以下を含む、キットおよび組成物を提供する：a)複数の第一および第二プローブオリゴヌクレオチド、ここで、第一プローブオリゴヌクレオチドは、第一5'領域および第一3'領域を含み、かつ第二プローブオリゴヌクレオチドは、第二5'領域および第二3'領域を含み、ここで、第一および第二プローブオリゴヌクレオチドの両方は、同じ上流オリゴヌクレオチドおよび標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成し、かつ両方とも、第一5'領域産物および第二5'領域産物を形成するために同じ切断剤によって切断されると考えられ、ここで、第二5'領域産物は第一5'領域産物と同一であり、ここで、第一3'領域は第二3'領域と同一ではない；ならびにb)第一標識化配列、ここで、第一または第二5'領域産物とハイブリダイズする場合には、第一標識化配列は、検出可能シグナルを生成するよう形成されている。
【００５９】
本発明の他の態様は、発明の詳細な説明および実施例において記載される。
【００６０】
定義
本発明の理解を容易にするため、多くの用語および句は以下に定義される。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「ダイナミックレンジ」は、検出アッセイ(例えば、核酸検出アッセイ)における有用性の定量的範囲を指す。例えば、ウイルス検出アッセイのダイナミックレンジは、アッセイが識別できるウイルス粒子の最小数(例えば、コピー数)〜ウイルス粒子の最大数の範囲である。
【００６２】
本明細書で使用されるように、用語「対象」および「患者」は、植物、微生物および動物(例えば、イヌ、ネコ、家畜、およびヒトなどの哺乳動物)を含む任意の生物体を指す。
【００６３】
用語「プライマー」は、プライマー伸長法が開始される条件下に置かれるとき、合成の開始の点として作用できるオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、精製された制限消化物中など天然に存在するか、または合成的に生じ得る。
【００６４】
本明細書で使用される用語「切断構造」は、二本鎖を含む構造を形成する、少なくとも一つのプローブオリゴヌクレオチドおよび標的核酸の相互作用によって形成され、結果として生じる構造が、酵素を含むがそれに限定されない切断手段によって切断可能である構造を指す。切断構造は、二次構造にかかわらず(すなわち、二本鎖構造の形成が必要とされない)核酸分子を切断するホスホジエステラーゼなどの薬剤による非特異的な切断についての基質である核酸分子とは対照的に、切断手段による特異的な切断のための基質である。
【００６５】
本明細書で使用される用語「侵入型切断構造」は、i)標的核酸、ii)上流核酸(例えば、INVADERオリゴヌクレオチド)、およびiii)下流核酸(例えば、プローブ)を含む切断構造を指し、ここで、上流および下流核酸は、標的核酸の連続的な領域とアニールし、およびここで、上流核酸と、下流核酸と標的核酸との間に形成されている二本鎖との間に重複が形成されている。上流核酸の重複している塩基が標的核酸と相補的であろうとなかろうと、およびそれらの塩基が天然の塩基または非天然の塩基であろうとなかろうと、上流および下流核酸からの一つまたは複数の塩基が標的核酸塩基に関して同じ位置を占有する重複が生じる。幾つかの態様において、下流二本鎖と重複する上流核酸の3'部分は、例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,090,543号に開示されるように、例えば芳香環構造などの非塩基化学部分である。幾つかの態様において、一つまたは複数の核酸は、例えば核酸ステムループなどの共有結合を通じて、または非核酸化学結合(例えば、多重炭素鎖)を通じて、互いに結合され得る。
【００６６】
本明細書で使用される用語「切断手段」または「切断剤」は、酵素を含むがそれに限定されない、切断構造を切断できる任意の手段を指す。「構造特異的ヌクレアーゼ」または「構造特異的酵素」は、核分子において特異的な二次構造を認識し、およびこれらの構造を切断する酵素である。本発明の切断手段は、切断構造の形成に反応して核酸分子を切断する；切断手段が切断構造内の任意の特定の位置で切断構造を切断することは必要ではない。
【００６７】
切断手段は、CLEAVASE酵素、FEN-1エンドヌクレアーゼ(RAD2およびXPGタンパク質を含む)、TaqDNAポリメラーゼおよび大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIを含む多様な源から提供されるヌクレアーゼ活性を含み得る。切断手段は、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を含み得る(例えば、TaqDNAポリメラーゼ(DNAP)および大腸菌DNAポリメラーゼI)。切断手段は、5'ヌクレアーゼ活性を有するが合成活性を欠失する改変されたDNAポリメラーゼも含み得る。本発明の方法およびキットにおいて使用するのに適した切断手段の例は、米国特許第5,614,402号；第5,795,763号；第5,843,669号；PCT出願番号第WO98/23774号；第WO02/070755A2号；および第WO0190337A2号において提供され、それらの各々は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
用語「耐熱性の」は、5’ヌクレアーゼなどの酵素に対する参照において使用されるとき、上昇した温度で、すなわち約55℃またはそれ以上で酵素が機能的であるかまたは活性である(すなわち、触媒作用を実施できる)ことを示す。幾つかの態様において、酵素は、65℃またはそれ以上の上昇した温度(例えば、75℃、85℃、95℃等)で機能的であるかまたは活性である。
【００６９】
本明細書で使用される用語「切断産物」は、切断手段の切断構造との反応(すなわち、切断構造の切断手段による処理)によって生成される産物を指す。
【００７０】
「増幅」は、テンプレート特異性を含む核酸複製の特殊な場合である。それは、非特異的テンプレート複製(すなわち、テンプレート依存的であるが、特異的テンプレートには依存しない複製)とは対照的である。テンプレート特異性はここでは、複製の忠実度(すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成)および(リボ−またはデボキシリボ−)ヌクレオチド特異性とは区別される。テンプレート特異性は、「標的」特異性に関して頻繁に記載される。標的配列は、他の核酸から区別されるべきであると要求されるという意味で「標的」である。増幅技術は、この区別のために主として設計されてきた。
【００７１】
テンプレート特異性は、ほとんどの増幅技術において、酵素の選択によって達成される。増幅酵素は、それらが使用される条件下で、核酸の異質性混合物における核酸の特異的配列のみを処理する。例えば、Qβレプリカーゼの場合、MDV-1 RNAは、レプリカーゼについての特異的テンプレートである(D.L. Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972])。他の核酸は、この増幅酵素によって複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素は、それ自体のプロモーターについてのストリンジェントな特異性を有する(Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970])。T4 DNAリガーゼの場合、酵素は、連結接合部でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間のミスマッチがある、2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない(D.Y. Wu and R. B. Wallace, Genomics 4:560 [1989])。最後に、TaqポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼは、高温で機能するそれらの能力の長所によって、プライマーが結合し、そのように定義される配列についての高い特異性を示すことが見出される；高温は、標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利であり、非標的配列とのハイブリダイゼーションに有利でない熱力学的条件を生じる(H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989])。
【００７２】
本明細書で使用されるように、用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅方法によって増幅され得る核酸に対する参照において使用される。「増幅可能な核酸」は、「試料テンプレート」を通常含むことが企図される。
【００７３】
本明細書で使用されるように、用語「試料テンプレート」は、「標的」の存在について分析される試料から生じる核酸を指す。対照的に、「背景テンプレート」は、試料中に存在し得るかまたは存在し得ない試料テンプレート以外の核酸に対する参照において使用される。背景テンプレートはほとんどしばしば不注意である。それは、持ち越し汚染の結果であり得るか、または試料から精製して除くように努められる核酸夾雑物質の存在に因り得る。例えば、検出されるべき生物体以外の生物体からの核酸は、検査試料中で背景として存在し得る。
【００７４】
プローブオリゴヌクレオチドまたはINVADERオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドに対する参照において使用される用語「分析物特異的領域」は、標的核酸における特異的配列または標的核酸のセットとハイブリダイズするよう選択されるオリゴヌクレオチドの領域を指す。幾つかの態様において、分析物特異的領域は、それがハイブリダイズする標的核酸のセグメントと完全に相補的であり得るのに対し、他の態様において、分析物特異的領域は、それがハイブリダイズする標的核酸のセグメントに対する一つまたは複数のミスマッチを含み得る。さらに他の態様において、分析物特異的領域は、一つまたは複数の塩基アナログ、例えば標的鎖における塩基との水素結合を変化させた、または該塩基と水素結合しない化合物を含み得る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの完全な配列は分析物特異的領域であるのに対し、他の態様において、オリゴヌクレオチドは、分析物特異的領域および、標的配列と相補的ではない一つまたは複数の領域(例えば、非相補的フラップ領域)を含む。
【００７５】
核酸のハイブリダイゼーションに対する参照において本明細書で使用される用語「頻度」は、一つの特定の核酸(例えば、プローブオリゴヌクレオチド)が、特定のハイブリダイゼーション条件下で、相補的な核酸(例えば、標的核酸)と塩基対形成するであろう可能性を指す。ハイブリダイゼーションの頻度は、相補的な配列が特定の条件下で二本鎖を形成するであろう可能性(例えば、遭遇および二本鎖形成の成功する見込み)、および一度形成されると、二本鎖の安定性を含むがそれに限定されない多くの因子によって影響される。プローブと標的との間の最初の二本鎖形成の見込みを増大させる反応条件(例えば、一つまたは両方の核酸の増大した濃度、標的との結合のためのプローブと競合できるか、またはプローブへ結合できる配列を有する他の核酸などの競合因子の欠如)は、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの頻度を増大させる(すなわち、プローブオリゴヌクレオチドが相補的な標的鎖を占有するか、またはそれとハイブリダイズする頻度を増大させる)といえる。同様に、オリゴヌクレオチドと別の核酸鎖との間のハイブリッドの安定性を増大させるか(または、例えば、低下した反応温度、増大した塩または二価の陽イオン条件、相補性領域の増大した長さ、より少ないミスマッチ、ハイブリダイゼーションを好む荷電した部分の使用などの鎖の解離を遅延させる)反応条件およびプローブ特性も、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの頻度を増大させるといえる。逆に、ハイブリダイゼーションの見込みを低下させる(例えば、1つまたは両方の核酸の濃度における低下、プローブまたは標的鎖の効果的な濃度を低下させる競合因子または他の添加物の存在)か、または形成されているハイブリッドの安定性および/または寿命を減少させる反応条件およびプローブ特性(例えば、増大した反応温度、低下した塩または二価の陽イオン条件、相補的領域の低下した長さ、より多くのミスマッチ、ハイブリダイゼーションを好まない荷電した部分の使用)は、ハイブリダイゼーションまたは占有の頻度を低下させるといわれている。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「標的」は、検出されるかまたは特徴付けられるべき核酸配列または構造を指す。したがって、「標的」は、他の核酸配列とは区別されることが要求される。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域として定義される。
【００７７】
用語「実質的に一本鎖の」は、核酸基質に対する参照において使用される場合、鎖間塩基対形成相互作用によって互いに保持される核酸の2つの鎖として存在する二本鎖基質とは対照的に、基質分子が主として核酸の単一鎖として存在することを意味する。
【００７８】
本明細書で使用されるように、句「増幅されないオリゴヌクレオチド検出アッセイ」は、標的配列のコピーを作製せずに、増幅されなかった(例えば、PCRによって)特定の標的配列(例えば、ゲノムDNAまたはウイルスDNAもしくはRNA)の存在または非存在を検出するよう形成された検出アッセイを指す。「増幅されないオリゴヌクレオチド検出アッセイ」は、例えば、標的配列がコピーされない限りは、標的配列における特定の多型性の存在または非存在を示すのに使用されるシグナルを増幅し得る。
【００７９】
本明細書で使用される用語「遊離する段階」は、放出された断片がもはや、オリゴヌクレオチドの残りと共有結合しないよう、例えば5'ヌクレアーゼの作用によって、オリゴヌクレオチドなどの、より大きな核酸断片からの核酸断片の放出を指す。
【００８０】
本明細書で使用される用語「微生物」は、肉眼で観察するには小さすぎる生物体を意味し、細菌、ウイルス、原虫、真菌および繊毛虫類を含むが、それらに限定されない。
【００８１】
用語「微生物遺伝子配列」は、微生物由来の遺伝子配列を指す。
【００８２】
用語「細菌」は、真正細菌種および古細菌種を含む任意の細菌種を指す。
【００８３】
用語「ウイルス」は、自律増殖できない(すなわち、複製が宿主細胞の機構の使用を必要とする)絶対、限外顕微鏡的、細胞内寄生体を指す。
【００８４】
用語「多剤耐性のある」または「多重薬物耐性のある」は、該微生物の処理において使用される一つよりも多くの抗生物質または抗菌剤に対する耐性のある微生物を指す。
【００８５】
用語「標的核酸の供給源」は、核酸(RNAまたはDNA)を含有する任意の試料を指す。標的核酸の特定の好ましい供給源は、血液、唾液、大脳髄液、胸水、乳、リンパ液、痰および精液を含むがそれらに限定されない生物試料である。
【００８６】
第一および第二標的核酸を「含有すると思われる」試料は、いずれかの標的核酸分子、両方の標的核酸分子を含有し得るかまたはいずれの標的核酸分子も含有し得ない。
【００８７】
用語「反応物」は、本明細書においてその最も幅広い意味において使用される。反応物は、例えば、酵素反応物、化学反応物または光(例えば、紫外線光、特に短い波長の紫外線光はオリゴヌクレオチド鎖を破壊することが公知である)を含むことができる。該オリゴヌクレオチドを短縮する(すなわち、切断する)かまたは伸長するかのいずれかのためにオリゴヌクレオチドと反応できる任意の薬剤は、用語「反応物」内に包含される。
【００８８】
本明細書で使用されるように、用語「部分」は、タンパク質に対する参照におけるとき(「所与のタンパク質の部分」におけるように)、該タンパク質の断片を指す。該断片は、4つのアミノ酸残基から、完全なアミノ酸配列から1つのアミノ酸を減じたものまでのサイズ(例えば、4、5、6、...、n-1)の範囲であり得る。
【００８９】
本明細書で使用される用語「核酸の連続的な鎖」は、ニックまたは他の破損を有さない連続的な、共有結合した、主鎖構造を有する核酸の鎖を意味する。各ヌクレオチドの塩基部分の配置は、塩基対形成された、一本鎖であろうとまたはミスマッチであろうと、連続した鎖の定義における要素ではない。連続した鎖の主鎖は、天然に存在する、改変されていない核酸に見出されるリボースリン酸塩またはデオキシリボースリン酸塩組成物に限定されない。本発明の核酸は、主鎖の構造における改変を含み得、ホスホロチオエート残基、ホスホン酸塩残基、2’置換されたリボース残基(例えば、2'-O-メチルリボース)および代替的な糖(例えば、アラビノース)含有残基を含むがそれらに限定されない。
【００９０】
本明細書で使用される用語「連続的な二本鎖」は、二本鎖内での塩基対の進行において破損のない(すなわち、二本鎖に沿った塩基対が、連続した二本鎖の領域の範囲内で、間隙、ふくらみまたはミスマッチを収容するためにゆがんでいない)二本鎖核酸の領域を指す。本明細書で使用されるように、用語は、核酸鎖の主鎖部分における連続性を意味せずに、該二本鎖内の塩基対の配置のみを指す。破損されていない塩基対形成を有するが、一つまたは両方の鎖にニックを有する二本鎖核酸は、連続的な二本鎖の定義内である。
【００９１】
用語「二本鎖」は、一つの鎖上のヌクレオチドの塩基部分が、第二鎖上に配列されるそれらの相補的な塩基と水素結合することを通じて結合する核酸の状態を指す。二本鎖形態にある状態は、核酸の塩基の状態に反映される。塩基対形成のために、核酸の鎖は、主溝および副溝を有する二本鎖の三次構造も一般に想定する。その螺旋形態の想定は、二本鎖になる作用に内在する。
【００９２】
用語「テンプレート」は、相補的なコピーが温度依存性核酸ポリメラーゼの活性を通じてヌクレオシド三リン酸塩から作製される核酸の鎖を指す。二本鎖内でテンプレート鎖は、慣習によって「下部」鎖として図示され記載される。同様に、非テンプレート鎖はしばしば、「上部」鎖として図示され記載される。
【００９３】
本明細書で使用されるように、用語「試料」は、その最も幅広い意味において使用される。例えば、幾つかの態様において、検体または培養物(例えば、微生物培養物)を包含することが意味されるのに対し、他の態様において、生物試料および環境試料の両方(例えば、標的配列、遺伝子またはテンプレートを含むと思われる)を含むことが意味される。幾つかの態様において、試料は、合成供給源の検体を含み得る。
【００９４】
本発明は、使用されるかまたは分析される生物試料のタイプによって限定されない。本発明は、ヒト(例えば、成人、乳幼児または胎児)または動物(例えば、ウシ、家禽、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ネコ、ウマ、およびそれらの同等物)から得られる組織(例えば、器官(例えば、心臓、肝臓、脳、肺、胃、腸、脾臓、腎臓、膵臓および生殖(例えば、卵巣)器官)、腺、皮膚、および筋肉組織)、細胞(例えば、血液細胞(例えば、リンパ球または赤血球)、筋細胞、腫瘍細胞および皮膚細胞)、ガス、体液(例えば、血液またはその部分、血清、血漿、尿、精液、唾液等)、または固体(例えば、大便)試料を含むがそれに限定されない多様な生物試料で有用である。幾つかの態様において、生物試料は、乳製品、野菜、食肉および食肉副産物、および廃棄物などの固体食品および/または飼料産物および/または成分であり得る。生物試料は、有蹄動物、クマ、魚類、ウサギ、げっ歯類等などを含むがそれらに限定されない、家畜の様々なファミリーの全て、および野生化したまたは野生の動物から得られ得る。
【００９５】
生物試料は、生検および組織切片(例えば、腫瘍、増殖、発疹、感染の生検または切片、またはパラフィン包埋切片)、医学または病院試料(例えば、血液試料、唾液、頬側スワブ、脳脊髄液、胸水、乳、初乳、リンパ液、痰、嘔吐物、胆汁、精液、卵母細胞、頸部細胞、羊水、尿、大便、毛髪および汗を含むがそれらに限定されない)、実験室試料(例えば、細胞内画分)、および法医学的試料(例えば、核酸を含有する血液または組織(例えば、少量または残渣)、毛髪および皮膚細胞)、および考古学的試料(例えば、化石化した生物体、組織、または細胞)も含む。
【００９６】
環境試料は、地表物質、土壌、水(例えば、真水または海水)、藻類、地衣類、地質学的試料、核酸を含有する空気含有材料、結晶、および産業試料、ならびに食品および乳の加工機器、装置、装備、用具、使い捨て可能なおよび使い捨て不可能な部品から得られる試料を含むが、それらに限定されない。
【００９７】
生物試料の他のタイプは、細菌(例えば、放線菌門(例えば、アクチノミセス属(Actinomyces)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)(例えば、ジフテリア菌(C. diphtheriae)))、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)(例えば、結核菌(M. tuberculosis)およびライ菌(M. leprae))、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)(例えば、アクネ菌(P. acnes))、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、クラミジア門(例えば、クラミジアトラコマチス(C. trachomatis)および肺炎クラミジア(C. pneumoniae))、ラン藻類(Cyanobacteria)、ディノコッカス属(Deinococcus)(例えば、テルムス属(Thermus)(例えば、テルムスアクアティカス(T. aquaticus)))、グラム陽性細菌門(Firmicutes)(例えば、桿菌(Bacilli)(例えば、炭疽菌(B. anthracis)、セレウス菌(B. cereus)、バチルスチューリンゲンシス(B. thuringiensis)、および枯草菌(B. subtilis)))、リステリア属(Listeria)(例えば、リステリアモノサイトジェネス(L. monocytogenes))、ブドウ球菌属(Staphylococcus)(例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、表皮ブドウ球菌(S. epidermidis)、およびブドウ球菌ヘモリチカス(S. haemolyticus))、フソバクテリウム門(Fusobacteria)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)(例えば、リケッチア目(Rickettsiales)、スフィンゴモナス目(Sphingomonadales)、ボルデテラ属(例えば、百日咳菌(B. pertussis))、ネイッセリザレス(Neisserisales)(例えば、淋菌(N. gonorrhoeae)および髄膜炎菌(N. meningitidis))、腸内細菌目(Enterobacteriales)(例えば、大腸菌属(Escherichia)(例えば、大腸菌)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プレジオモナス属(Plesiomonas)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、赤痢菌属(Shigella)、およびエルシニア属(Yersinia))、レジオネラ目(Legionellales)、パスツレラ目(Pasteurellales)(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae))、シュードモナス属(Pseudomonas)、ビブリオ属(Vibrio)(例えば、コレラ菌(V. cholerae)およびビブリオバルニフィカス(V. vulnificus))、カンピロバクター目(Campylobacterales)(例えば、カンピロバクテリア(Campylobacteria)(例えば、カンピロバクテリアジェジュニ(C. jejuni))、およびヘリコバクター属(例えば、ピロリ菌(H. pylori)))、およびスピロヘータ門(Spirochaetes)(例えば、レプトスピラ属(Leptospira)、ライム病菌、および梅毒トレポネーマ(T. pallidum)))；古細菌(例えば、好塩菌(Halobacteria)およびメタノバクテリウム綱(Methanobacteria))；真核生物(Eucarya)(例えば、動物界(Animalia)(例えば、環形動物門、節足動物門(Arthropoda)(例えば、鋏角亜門(Chelicerata)、多足下門(Myriapoda)、昆虫綱(Insecta)、および甲殻綱(Crustacea))、軟体動物門(Mollusca)、線形動物門(Nematoda)(例えば、線虫(C. elegans)、および旋毛虫(T. spiralis))および脊索動物門(Chordata)(例えば、条鰭綱(Actinopterygii)、両性綱(Amphibia)、鳥類(Aves)、軟骨魚綱(Chondrichthyes)、爬虫類(Reptilia)、および哺乳綱(Mammalia)(例えば、霊長目(Primates)、げっ歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、および食肉目(Carnivora)))))；真菌(例えば、皮膚糸状菌(Dermatophytes)、フサリウム属(Fusarium)、ペニシリウム属、および酵母菌属(Saccharomyces))；植物界(Plantae)(例えば、被子植物上綱(Magnoliophyta)(例えば、双子葉植物綱(Magnoliopsida)および単子葉植物綱(Liliopsida)))、および原生生物界(Protista)(例えば、アピコンプレックス門(Apicomplexa)(例えば、クリプトスポリジウム属(Cryptosporidium)、プラスモディウム属(Plasmodium)(例えば、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、およびトキソプラズマ属(Toxoplasma))、およびメ���モナス門(Metamonada)(例えば、ランブル鞭毛虫)))；およびウイルス(例えば、dsDNAウイルス(例えば、バクテリオファージ(Bacteriophage)、アデノウイルス科(Adenoviridae)、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、ポリオーマウイルス科(Polyomaviridae)、およびポックスウイルス科(Poxviridae))、ssDNAウイルス(例えば、パルボウイルス科(Parvoviridae))、dsRNAウイルス(レオウイルス科(Reoviridae)を包含する)、(+)ssRNAウイルス(例えば、コロナウイルス科(Coronaviridae)、アストロウイルス科(Astroviridae)、ブロモウイルス科(Bromoviridae)、コモウイルス科(Comoviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、およびトガウイルス科(Togaviridae))、(-)ssRNAウイルス(例えば、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)、およびオルトミクソウイルス科)、ssRNA逆転写ウイルス(例えば、レトロウイルス科(Retroviridae))、およびdsDNA逆転写ウイルス(例えば、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)およびカウロモウイルス科(Caulomoviridae)))を含む。
【００９８】
試料は、任意の望ましいまたは適切な方法によって調製され得る。幾つかの態様において、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許公報番号第20050186588号に記載の方法を使用して、核酸は、体液または他の試料から直接分析される。
【００９９】
しかしながら、上述の例は、本発明へ適用可能な(例えば、標的配列、遺伝子またはテンプレート(例えば、その存在または非存在が本発明の組成物および方法を使用して決定できる)を含むと思われる)試料のタイプを限定するとして解釈されるべきではない。
【０１００】
本明細書で使用される用語「核酸配列」および「核酸分子」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片または部分を指す。用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソドウラシル、キューオシン、2-チオシトシンおよび2,6-ジアミノプリンを含むがそれらに限定されない、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。
【０１０１】
核酸配列または分子は、一本鎖または二本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を呈し得る、ゲノム由来または合成由来のいずれかの、DNAまたはRNAであり得る。したがって、核酸配列は、dsDNA、ssDNA、混合ssDNA、混合dsDNA、ssDNAにされたdsDNA(例えば、融解、変性、ヘリカーゼ等を通じて)、A-、B-またはZ-DNA、三本鎖DNA、RNA、ssRNA、dsRNA、混合ssおよびdsRNA、ssRNAにされたdsRNA(例えば、融解、変性、ヘリカーゼ等を介して)、メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)、触媒RNA、snRNAまたはタンパク質核酸(PNA)であり得る。
【０１０２】
本発明は、利用される核酸(例えば、配列または分子(例えば、標的配列および/またはオリゴヌクレオチド))のタイプまたは供給源によって限定されない。例えば、核酸配列は、増幅されるかまたは作製される配列であり得る(例えば、合成(例えば、重合(例えば、プライマー伸長法(例えば、RNA-DNAハイブリッドプライマー技術))および逆転写(例えば、RNAのDNAへの))および/または増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、回転周期増幅(RCA)、核酸配列に基づいた増幅(NASBA)、転写により仲介される増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、サイクリングプローブ技術、Q-ベータレプリカーゼ、鎖置換増幅(SDA)、分岐鎖DNAシグナル増幅(bDNA)、ハイブリッド捕捉、およびヘリカーゼ依存性増幅)を介する核酸配列の増幅または作製)。
【０１０３】
用語「ヌクレオチド」および「塩基」は、本明細書で別段の記載がなければ、核酸配列に対する参照において使用されるとき、互換的に使用される。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「ヌクレオチドアナログ」は、7-デアザプリンなどの積み重なり相互作用の変化したアナログ(すなわち、7-デアザ-dATPおよび7-デアザ-dGTP)；代替的な水素結合立体配置を有する塩基アナログ(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,001,983号に記載のIso-CおよびIso-Gおよび他の非標準塩基対)；非水素結合アナログ(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられるB.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Org. Chem., 1994, 59, 7238-7242; B.A. Schweitzer and E.T. Kool, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 1863-1872によって記載されている2,4-ジフルオロトルエンなどの非極性芳香族ヌクレオシドアナログ)；5-ニトロインドールおよび3-ニトロピロールなどの「普遍的な」塩基；ならびに普遍的なプリンおよびピリミジン(例えば、それぞれ「K」および「P」ヌクレオチド；例えば、P. Kong, et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 10373-10383; P. Kong et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20, 5149-5152参照)を含むがそれらに限定されない、改変されたかまたは非天然のヌクレオチドを指す。さらに他のヌクレオチドアナログは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの改変された形態を含む。本発明のさまざまなオリゴヌクレオチド(例えば、一次プローブまたはINVADERオリゴ)は、ヌクレオチドアナログを含有し得る。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、二つまたはそれ以上のヌクレオチド(例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド)、好ましくは少なくとも5つのヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約10〜15個のヌクレオチドおよびより好ましくは少なくとも約15〜30個またはそれ以上のヌクレオチドを含む分子として定義される(例えば、オリゴヌクレオチドは典型的に200残基長よりも少ない(例えば、15〜100個のヌクレオチド)が、しかしながら、本明細書で使用されるように、用語はより長いポリヌクレオチド鎖を包含するようにも意図される)。実際の大きさは、多くの因子に依存するであろうし、それらは順に、オリゴヌクレオチドの究極的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドはしばしば、それらの長さによって参照される。例えば、24残基のオリゴヌクレオチドは、「24塩基長」として参照される。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることによって、または他のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることによって、二次および三次構造を形成できる。このような構造は、二本鎖、へアピン、十字部、屈曲、および三本鎖を含むことができるが、それらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、逆転写、PCR、またはそれらの組み合わせを含む任意の方法で作成し得る。幾つかの態様において、侵入型切断構造を形成するオリゴヌクレオチドは、反応において作成される(例えば、酵素的伸長反応におけるプライマーの伸長による)。
【０１０６】
1つのモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向にあるその隣接物の3'酸素へ結合するような方法で、モノヌクレオチドがオリゴヌクレオチドを生じるよう反応するため、オリゴヌクレオチドの末端は、その5'リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の3'酸素へ結合しない場合、「5'末端」と呼ばれ、その3'酸素がその後のモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸塩と結合しない場合、「3'末端」と呼ばれる。本明細書で使用されるように、核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチドに対して内部であっても、5'末端および3'末端を有するともいわれ得る。核酸鎖に沿った第一領域は、核酸の鎖に沿って5'から3'の方向に移動するとき、第一領域の3'末端が第二領域の5'末端の前である場合、別の領域の上流であるといわれる。
【０１０７】
2つの異なる重なっていないオリゴヌクレオチドが、同じ直線的な相補的核酸配列の異なる領域とアニールするとき、一つのオリゴヌクレオチドの3'末端は、他の5'末端へ向き、前者は「上流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ、後者は「下流」ヌクレオチドと呼ばれ得る。同様に、2つの重なっているオリゴヌクレオチドが同じ直線的な相補的核酸配列とハイブリダイズされ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端が第二オリゴヌクレオチドの5'末端の上流であり、第一オリゴヌクレオチドの3'末端が第二オリゴヌクレオチドの3'末端の上流であるように、第一オリゴヌクレオチドが配置されるとき、第一オリゴヌクレオチドは「上流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得、第二オリゴヌクレオチドは「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。
【０１０８】
本明細書で使用されるように、用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対形成則によって関連付けられるポリヌクレオチド(例えば、二つまたはそれ以上のヌクレオチドの配列(例えば、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸))に対する参照において使用される。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は、配列「3'-T-C-A-5'」と相補的である。相補性は、「部分的」であり得、その中で、核酸塩基の幾つかのみが塩基対形成則にしたがって符合する。または、核酸塩基間の「完全な」または「合計の」相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に及ぼす有意な効果を有する。このことは、二つまたはそれ以上の核酸鎖の会合に依存する検出方法と同様に、増幅反応において特に重要である。いずれかの用語は、個々のヌクレオチドに対する参照において、特にポリヌクレオチドの脈絡内でも使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの残りと核酸配列との相補性とは対照的にまたはそれと比較して、別の核酸配列(例えば、標的配列)内でのヌクレオチドとのその相補性、またはその欠失について記載され得る。
【０１０９】
本明細書で使用される核酸配列の相補体は、ある配列の5'末端が他の3'末端と対形成されるような核酸配列と整列されるとき、「逆平行会合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。天然アミノ酸において共通して見出されないある塩基は、本発明の核酸に含まれ得、例えば、イノシンおよび7-デアザグアニンを含む。相補性は完全である必要はない；安定した二本鎖は、ミスマッチした塩基対または符合していない塩基を含有し得る。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、ミスマッチした塩基対のイオン強度および発生率を含む様々な変数を経験的に考慮して二本鎖の安定性を決定できる。
【０１１０】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性(すなわち同一性)があり得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と100%未満同一であるものである。「実質的に相同」である部分的に相補的な配列は、完全に相補的な核酸分子を標的核酸とハイブリダイズすることから少なくとも部分的に阻害する核酸分子である。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、サザンブロットまたはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションおよび同等物)を使用して検討され得る。実質的に相同的な配列またはプローブは、低いストリンジェンシーの条件下での完全に相同的な核酸分子の標的への結合(例えば、ハイブリダイゼーション)について競合しかつ阻害すると考えられる。このことは、非特異的結合が許されるような低いストリンジェンシーの条件がある(例えば、2つの配列の互いへの結合が特異的(例えば、選択的)相互作用であるような低いストリンジェンシー条件であり得る)といっているわけではない。非特異的結合の欠如は、実質的に非相補的である(例えば、約30%未満の同一性である)第二標的の使用によって試験され得る；非特異的結合の非存在下において、プローブは第二非相補性標的とハイブリダイズしないと考えられる。
【０１１１】
cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に対する参照において使用されるとき、用語「実質的に相同な」は、上述のような低いストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列のいずれかまたは両方の鎖とハイブリダイズできる任意のプローブを指す。
【０１１２】
一本鎖核酸配列に対する参照において使用されるとき、用語「実質的に相同な」は、上述のような低いストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列をハイブリダイズできる(例えば、相補的である)任意のプローブを指す。
【０１１３】
用語「標的核酸」および「標的配列」は、侵入型切断反応に対する参照において使用されるとき、少なくとも第一核酸分子(例えば、プローブオリゴヌクレオチド)と少なくとも部分的な相補性を有し、第二核酸分子(例えば、INVADERオリゴヌクレオチド)と少なくとも部分的な相補性も有し得る配列を含有する核酸分子を指す。一般的に、標的核酸(例えば、試料(例えば、生物試料または環境試料)内に存在するか、試料から単離されるか、試料から濃縮されるか、または試料から増幅されるかまたは試料内にある)は、標的領域内に位置し、切断剤によって切断可能である第一および第二核酸分子(例えば、プローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチド)との組み合わせで侵入型切断構造の成功裏の形成を介して同定可能である。生物体由来の標的核酸は、ゲノムDNAおよびRNAに限定されない。生物体由来の標的核酸は、ゲノムDNAおよびRNA、メッセンジャーRNA、構造RNA、リボソームおよびｔRNA、ならびにsnRNA、siRNAおよびミクロRNA miRNAなどの低分子RNAを含むが、それらに限定されない任意の核酸種を含み得る。例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる2003年12月18日出願の同時係属中の米国特許出願番号第10/740,256号を参照されたい。
【０１１４】
本明細書で使用されるように、用語「プローブオリゴヌクレオチド」は、侵入型切断反応に対する参照において使用されるとき、INVADERオリゴヌクレオチドの存在または非存在のもとで切断構造を形成する、標的核酸と相互作用するオリゴヌクレオチドを指す。標的核酸とアニールされるとき、プローブオリゴヌクレオチドおよび標的が切断構造を形成し、切断がプローブオリゴヌクレオチド内で生じる。
【０１１５】
用語「INVADERオリゴヌクレオチド」は、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの領域近くの位置で標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、ここで、INVADERオリゴヌクレオチドは、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの領域と重複する部分(例えば、化学的部分、またはその標的と相補的であろうとなかろうと、ヌクレオチド)を含む。幾つかの態様において、INVADERオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドの5'末端に配置する配列と実質的に同じであるその3'末端に配列を含有する。
【０１１６】
用語「カセット」は、侵入型切断反応に対する参照において使用されるとき、本明細書で使用されるように、INVADERアッセイにおいてプローブオリゴヌクレオチドの切断に応答して、検出可能シグナルを生成するよう形成されている、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせを指す。好ましい態様において、カセットは、第二侵入型切断構造を形成するためにプローブオリゴヌクレオチドの切断からの切断産物とハイブリダイズし、そのようにしてカセットは、その後切断できる。
【０１１７】
幾つかの態様において、カセットは、ヘアピン部分(すなわち、二本鎖を形成するためにカセットオリゴヌクレオチドが反応条件下で同じオリゴヌクレオチドの第二部分とハイブリダイズする領域)を含む単一オリゴヌクレオチドである。他の態様において、カセットは、反応条件下で二本鎖を形成できる相補的な部分を含む、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい態様において、カセットは標識を含む。特に好ましい態様において、カセットは、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)効果を生じる標識された部分を含む。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドが他方のオリゴヌクレオチド(または標的核酸配列)よりも高いモル濃度で存在する場合、別のオリゴヌクレオチド(または標的核酸)に対して「過剰量」で存在するといわれる。プローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドが、相補的な標的核酸配列の濃度に対して過剰量で切断反応中に存在するとき、反応は、存在する標的核酸の量を示すのに使用され得る。典型的には、過剰量で存在するとき、プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも100倍のモル過剰量で存在する；典型的には、該標的核酸配列が約10fmolまたはそれ未満で存在したとき、各プローブオリゴヌクレオチドの少なくとも1pmolが使用される。
【０１１９】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体またはRNA(例えば、rRNA、tRNA)の産生に必要なコード化配列を含む核酸(例えば、DNA)配列を指す。ポリペプチドは、全長または断片の所望の活性または機能的特性(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等)が保持される限り、全長のコード化配列によって、またはコード化配列の任意の部分によってコード化できる。該用語は、構造遺伝子のコード化領域および遺伝子が全長mRNAに対応するよう、いずれかの末端で約1kbまたはそれ以上の距離について、5'および3'末端の両方上のコード化領域近くに配置される配列も包含する。コード化領域の5'に配置され、mRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ばれる。コード化領域の3'または下流に配置され、mRNA上に存在する配列は、3'非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のcDNAおよびゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と名づけられる非コード化配列で中断されるコード化領域を含有する。イントロンは、核RNA(例えば、hnRNA)へと転写される遺伝子の断片である；イントロンは、調節エレメント(例えば、エンハンサー)を含有し得る。イントロンは、核転写産物または一次転写産物から除去されるかまたは「切り出される」；イントロンはそれゆえ、メッセンジャーRNA(mRNA)転写産物において欠如している。mRNAは、翻訳中に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定するために機能する。
【０１２０】
本明細書で使用されるように、用語「異種遺伝子」は、その自然環境にはない遺伝子を指す。例えば、異種遺伝子は、別の種へ導入されたある種由来の遺伝子(例えば、ヒト宿主内に存在するウイルスまたは細菌の遺伝子(例えば、染色体外にまたは宿主のDNAへと統合された))を含む。異種遺伝子は、ある方法(例えば、突然変異される、複数のコピーにおいて付加される、外来の調節配列へ結合される等)で変質された生物体に対して自然な遺伝子も含む。幾つかの態様において、異種遺伝子は、染色体における遺伝子配列と自然に結合することがわかっていないかまたは天然に見つかっていない染色体の部分(例えば、遺伝子が正常に発現しない座に発現する遺伝子)と結合するDNA配列へ異種遺伝子配列が典型的に結合するという点において、内因性遺伝子と区別できる。
【０１２１】
本明細書で使用されるように、用語「遺伝子発現」は、遺伝子においてコード化される遺伝情報を、遺伝子の「転写」(例えば、RNAポリメラーゼの酵素作用を介する)を通じてRNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNAまたはsnRNA)へと変換するプロセスを指し、およびタンパク質をコード化する遺伝子については、mRNAの「翻訳」を通じてタンパク質へと変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、該プロセスにおける多くの段階で制御できる。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物(例えば、RNAまたはタンパク質)の産生を増大させる制御を指すのに対し、「下方制御」または「抑制」は、産生を低下させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子(例えば、転写因子)はしばしば、それぞれ「活性化因子」および「抑制因子」と呼ばれる。
【０１２２】
イントロンを含有することに加えて、遺伝子のゲノム形態は、RNA転写産物に存在する配列の5'および3'末端の両方に配置される配列も含み得る。これらの配列は、「隣接」配列または領域と呼ばれる(例えば、これらの隣接配列は、mRNA転写産物に存在する非翻訳配列に対して5'または3'に配置できる)。5'隣接領域は、遺伝子の転写を調節するかまたは遺伝子の転写に影響するプロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含有し得る。3'隣接領域は、転写の終止、転写後切断およびポリアデニル化を導く配列を含有し得る。
【０１２３】
用語「野生型」は、天然供給源から単離される遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、したがって遺伝子の「正常な」または「野生型の」形態を任意に設計される。対照的に、用語「改変された」または「突然変異体」は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較するとき、配列における改変およびまたは機能的特性(例えば、変化した特徴)を表す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の突然変異体が単離できる(例えば、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較するとき、変化した特徴(例えば、変化した核酸配列)を有するという事実によって同定される)ことは注目される。
【０１２４】
用語「単離された」は、核酸と関連して使用されるとき(例えば、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」または「単離された核酸配列」)、その天然供給源において通常会合する少なくとも1つの構成要素または夾雑物質から分離されている核酸配列を指す。したがって、単離された核酸は、自然において見出されるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸は、それらが自然において存在する状態で見出されるDNAおよびRNAなどの核酸である。例えば、所与のDNA配列(例えば、遺伝子)は、隣り合う遺伝子近くで宿主細胞染色体上に見出される；特定のタンパク質をコード化する特定のmRNA配列などのRNA配列は、多数のタンパク質をコード化する数多くの他のmRNAとの混合物として細胞中に見出される。しかしながら、所与のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然細胞のそれとは異なる染色体上の配置にあるか、またはさもなくば天然に見出されるものとは異なる核酸配列が隣接する所与のタンパク質を普通に発現する細胞におけるこのような核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用するとき、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、センス鎖またはコード化鎖を少なくとも含有する(例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る)が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有し得る(例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る)。
【０１２５】
本明細書で使用されるように、用語「精製された」または「精製すること」は、試料(例えば、分子(例えば、核酸配列またはアミノ酸配列))に対する参照において使用されるとき、試料のその自然環境からの摘出(例えば、単離および/または分離)を指す。用語「実質的に精製された」は、試料の自然環境から摘出された(例えば、単離されたおよび/または精製された)試料(例えば、分子(例えば、核酸配列またはアミノ酸配列))を指し、該試料が本来会合する他の構成要素を少なくとも60%、好ましくは75%、または最も好ましくは90%またはそれ以上含まない。「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」はそれゆえ、それが本来会合する他の構成要素を(例えば、60%、75%またはより好ましくは90%またはそれ以上)含ませない場合、実質的に精製され得る。
【０１２６】
本発明は、精製の任意の特定の手段に制限されるわけではない(例えば、精製されるかまたは実質的に精製される分子(例えば、核酸配列)を成すための)。実際、遠心分離(例えば、等密度遠心法、沈降速度法、勾配遠心法および分画遠心法)、電気泳動(例えば、ゲル電気泳動および毛細管電気泳動)、ゲルろ過、マトリクス捕捉、電荷捕捉、質量捕捉、抗体捕捉、磁気分離、フローサイトメトリーおよび配列特異的ハイブリダイゼーションアレイ捕捉を含むがそれらに限定されない多様な精製技術が利用され得る。
【０１２７】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対形成に対する参照において使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(例えば、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されているハイブリッドのTm、核酸内でのG:C比などの因子によって影響される。単一分子の構造内の相補的な核酸の対形成を含有する単一分子は、「自己ハイブリダイズされる」といわれる。
【０１２８】
本明細書で使用されるように、用語「Tm」は、「融解温度」に対する参照において使用される。融解温度は、二本鎖の核酸分子の集団が一本鎖へと半分、解離する温度である。核酸のTmを算出するための幾つもの等式が、当技術分野において周知である。標準的な参照によって示されるように、Tm値の単純な概算は、核酸が1M NaClでの水溶液中にあるとき、等式：Tm = 81.5 + 0.41(% G + C)によって算出され得る(例えば、Young and Anderson, (1985) in Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach (Hames & Higgins, Eds.) pp 47-71, IRL Press, Oxford参照)。Tmを算出するための他の計算は、当技術分野において公知であり、構造的および環境的特徴、および配列特徴を考慮に入れる(例えば、Allawi, H.T. and SantaLucia, J., Jr. Biochemistry 36, 10581-94 (1997)参照)。
【０１２９】
本明細書で使用されるように、用語「INVADERアッセイ試薬」は、標的配列を検出するための一つまたは複数の試薬を指し、該試薬は、標的配列の存在下で侵入型切断構造を形成できる核酸分子を含む。幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬は、侵入型切断構造の存在を検出するための薬剤(例えば、切断剤)をさらに含む。幾つかの態様において、核酸分子は、第一オリゴヌクレオチドおよび第二オリゴヌクレオチドを含み、該第一オリゴヌクレオチドは、標的核酸の第一領域と相補的な5'部分を含み、該第二オリゴヌクレオチドは、3'部分および5'部分を含み、該5'部分は、第一部分の下流で第一部分と連続した標的核酸の第二領域と相補的である。幾つかの態様において第二オリゴヌクレオチドの3'部分は、標的核酸と相補的ではない3'末端ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、第二オリゴヌクレオチドの3'部分は、標的核酸と相補的ではない単一ヌクレオチドからなる。INVADERアッセイ試薬は、例えば、米国特許第5,846,717号；第5,985,557号；第5,994,069号；第6,001,567号；第6,913,881号；および第6,090,543号、第WO97/27214号、第WO98/42873号、米国特許公報第20050014163号、第20050074788号、第2005016596号、第20050186588号、第20040203035号、第20040018489号、および第20050164177号；米国特許出願番号第11/266,723号；およびLyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999)、Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000)において見出され得、それらの各々は、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３０】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬は、二本鎖領域を含む介在領域によって分離される第一および第二非連続的一本鎖領域を含む標的核酸配列を検出するため形成されている。ある態様において、INVADERアッセイ試薬は、標的核酸配列の該第一および第二非連続的一本鎖領域へ結合できる架橋性オリゴヌクレオチドを含む。特に好ましい態様において、該INVADERアッセイ試薬の該第一および/または該第二オリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方は、架橋性オリゴヌクレオチドである。
【０１３１】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬は、固体支持体をさらに含む。例えば、幾つかの態様において、アッセイ試薬の一つまたは複数のオリゴヌクレオチド(例えば、架橋性であろうと非架橋性であろうと、第一および/または第二オリゴヌクレオチド)は、該固体支持体へ結合される。アッセイ試薬の一つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、(例えば、スペーサー分子(例えば、オリゴヌクレオチド)を介して)直接的または間接的に固体支持体へ連結され得る。例示的な固相侵入型切断反応は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許公報第20050164177号および第20030143585号に記載されている。
【０１３２】
本明細書で使用されるように、「固体支持体」は、アッセイ条件下でその形状を維持し、液相から分離できる任意の材料である。本発明は、利用される固体支持体のタイプによって制限されるわけではない。実際、ビーズ、平らな表面、調節済み多孔質ガラス(CPG)、ウェーハ、ガラス、シリコン、プラスチック、常磁性ビーズ、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、超常磁性ビーズ、複数のビーズ、微少流体チップ、シリコンチップ、顕微鏡スライド、マイクロプレートウェル、シリカゲル、ポリマー膜、粒子、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナジゲル、多糖類、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ナイロン、セファロース、ポリ(アクリル酸塩)、ポリスチレン、ポリ(アクリルアミド)、ポリオール、アガロース、アガー、セルロース、デキストラン、デンプン、FICOLL、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロースまたはデンプン、ポリマー微粒子、ポリマー膜、ポリマーゲル、ガラススライド、スチレン、多重ウェルプレート、カラム、マイクロアレイ、ラテックス、ヒドロゲル、多孔性3D親水性ポリマーマトリクス(例えば、HYDROGEL、Packard Instrument Company, Meriden, Conn.)、光ファイバー束およびビーズ(例えば、米国特許出願第20050164177号に記載されているBEADARRAY (Illumina, San Diego, Calif.))、小粒子、膜、フリット、スライド、ミクロ機械加工したチップ、アルカンチオール金層、非多孔性表面、配向可能なアレイ、およびポリヌクレオチドを固定する媒体(例えば、米国特許出願第20050191660号に記載されている)を含むが、それらに限定されない様々な固体支持体が本発明において有用であると企図される。幾つかの態様において、固体支持体は、結合層または材料(例えば、金またはストレプトアビジン)でコーティングされる。
【０１３３】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬は緩衝溶液をさらに含む。幾つかの好ましい態様において、該緩衝溶液は、二価の陽イオン(例えば、Mn2+および/またはMg2+イオン)の供給源を含む。INVADERアッセイ試薬を集約的に作り上げる個々の成分(例えば、オリゴヌクレオチド、酵素、緩衝剤、標的核酸)は、「INVADERアッセイ試薬構成要素」と名づけられる。
【０１３４】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬はさらに、第一標的核酸(例えば、スタッカーオリゴヌクレオチド)の第一部分の上流の標的核酸の第三部分と相補的な第三オリゴヌクレオチドをさらに含む。さらに他の態様において、INVADERアッセイ試薬は、標的核酸をさらに含む。幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬は、第二標的核酸をさらに含む。さらに他の態様において、INVADERアッセイ試薬は、第二標的核酸の第一領域と相補的な5'部分を含む第三オリゴヌクレオチドをさらに含む。幾つかの特異的な態様において、第三オリゴヌクレオチドの3'部分は、第二標的核酸と共有結合する。他の特異的な態様において、第二標的核酸は5'部分をさらに含み、ここで、第二標的核酸の5'部分は、第三オリゴヌクレオチドである。さらに他の態様において、INVADERアッセイ試薬は、ARRESTOR分子(例えば、ARRESTORオリゴヌクレオチド)をさらに含む。
【０１３５】
幾つかの態様において、一つまたは複数のINVADERアッセイ試薬は、あらかじめ分注されたフォーマット(例えば、再測定または再分注せずに手法のある段階において使用するためにあらかじめ測定された)において提供され得る。幾つかの態様において、選択されたINVADERアッセイ試薬構成要素は、互いに混合されあらかじめ分注される。好ましい態様において、あらかじめ分注されたアッセイ試薬構成要素は、反応容器の中にあらかじめ分注され提供される(例えば、反応チューブまたはウェル(例えば、マイクロタイタープレート)を含むがそれらに限定されない)。ある好ましい態様において、INVADERアッセイ試薬は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,627,159号；第6,720,187号；第6,734,401号；および第6,814,935号および米国特許公報第2002/0064885号に記載されているものなどの微小流体装置において提供される。特に好ましい態様において、あらかじめ分注されたINVADERアッセイ試薬構成要素は、反応容器中で乾燥される(例えば、完全乾燥するかまたは凍結乾燥される)。
【０１３６】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬はキットとして提供される。本明細書で使用されるように、用語「キット」は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの脈絡において、このような送達システムは、反応試薬(例えば、適切な容器の中のオリゴヌクレオチド、酵素等)および/またはある配置から別の配置までの支持材料(例えば、アッセイを実施するための説明書に書かれている緩衝剤等)の保存、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および/または支持材料を含有する一つまたは複数の包装材(例えば、箱)を含む。本明細書で使用されるように、用語「断片化したキット」は、全キット構成要素の副部分を各々が含有する二つまたはそれ以上の個別の容器を含む送達システムを指す。容器は、意図されるレシピエントへ一緒にまたは個別に送達され得る。例えば、第一容器は、アッセイにおいて使用するための酵素を含有し得るのに対し、第二容器は、オリゴヌクレオチドを含有する。用語「断片化したキット」は、連邦食品薬品化粧品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)のセクション520(e)の下で規制される分析物特異的試薬(Analyte specific reagents)(ASR)を含有するキットを包含するよう意図されるが、それに限定されない。実際、全キット構成要素の副部分を各々が含有する二つまたはそれ以上の個別の容器を含む任意の送達システムは、用語「断片化されたキット」に含まれる。対照的に、「組み合わさったキット」は、単一容器において(例えば、望ましい構成要素の各々を収容する単一の箱において)反応アッセイの構成要素の全てを含有する送達システムを指す。用語「キット」は、断片化されたおよび組み合わさったキットの両方を含む。
【０１３７】
幾つかの態様において、本発明は、本発明を実施するのに必要な構成要素の一つまたは複数を含むINVADERアッセイ試薬キットを提供する。例えば、本発明は、INVADERアッセイを実施するのに必要な酵素および/または反応構成要素を保存するかまたは送達するためのキットを提供する。該キットは、試薬自体、緩衝剤、コントロール試薬(例えば、組織試料、ポジティブおよびネガティブコントロール標的オリゴヌクレオチド等)、固体支持体、標識、記載されたおよび/または絵入りの説明書および産物情報、阻害剤、標識および/または検出試薬、包装環境調節物(例えば、氷、乾燥剤等)、および同等物を含むがそれらに限定されない、アッセイに必要なまたは望ましい任意のおよび全ての構成要素を含む。幾つかの態様において、キットは、必要な構成要素の副セットを提供し、ここで、ユーザーが残りの構成要素を供給するであろうと期待される。幾つかの態様において、キットは、二つまたはそれ以上の個別の容器を含み、ここで、各容器は、送達されるべき構成要素の副セットを収容する。例えば、第一容器(例えば、箱)は、酵素(例えば、適切な保存緩衝剤および容器中の構造特異的切断酵素)を含有し得るのに対し、第二箱は、オリゴヌクレオチド(例えば、INVADERオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、コントロール標的オリゴヌクレオチド等)を含有し得る。
【０１３８】
幾つかの好ましい態様において、INVADERアッセイ試薬は、核酸切断産物を検出するための試薬をさらに含む。幾つかの態様において、INVADERアッセイ試薬中の一つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、標識を含む。幾つかの好ましい態様において、該第一オリゴヌクレオチドは標識を含む。他の好ましい態様において、該第三オリゴヌクレオチドは標識を含む。特に好ましい態様において、試薬は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)効果を産生する部分で標識された第一および/または第三オリゴヌクレオチドを含む。
【０１３９】
本明細書で使用されるように、用語「標識」は、検出可能な反応を検出できるかまたは検出可能な反応に至り得る任意の部分(例えば、化学種)を指す。幾つかの好ましい態様において、標識の検出は、定量可能な情報を提供する。標識は、例えば放射性標識(例えば、放射性核種)、リガンド(例えば、ビオチンまたはアビジン)、発色団(例えば、検出可能な色を付与する色素または粒子)、ハプテン(例えば、ジゴキシゲニン)、質量標識、ラテックスビーズ、金属粒子、常磁性標識、発光化合物(例えば、生物発光標識、リン光標識または化学発光標識)または蛍光化合物などの任意の公知の検出可能な部分であり得る。
【０１４０】
標識は、オリゴヌクレオチドまたは他の生物分子へ直接または間接的に結合され得る。直接的な標識化は、共有結合または、水素結合、疎水性およびイオン性相互作用などの非共有結合を含む、オリゴヌクレオチドへ標識を連結させる結合または相互作用を通じて、あるいはキレートまたは配位複合体の形成により生じるさせることができる。間接的な標識化は、直接的または間接的のいずれかで標識される抗体またはさらなるオリゴヌクレオチドなどの架橋部分または「リンカー」の使用により生じるさせることができる。
【０１４１】
標識は、単独でまたは、標識(例えば、発光標識)の発光スペクトル(例えば、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET))を抑制(例えば、消光)、励起、または転移(例えば、移行)できる部分との組み合わせで使用できる。
【０１４２】
本明細書で使用されるように、用語「FRET」は、プロセスにおいて、部分(例えば、フルオロフォア)が、エネルギーを転送させる(それら自体の間で、またはフルオロフォアから非フルオロフォア(例えば、消光剤分子)へ)蛍光共鳴エネルギー転移を指す。幾つかの状況において、FRETは、短い範囲(例えば、約10nmまたはそれ以下)の双極子−双極子相互作用を介したより低いエネルギーの受容体フルオロフォアへエネルギーを転移させる励起された供与体フルオロフォアを含む。他の状況において、FRETは、供与体からの蛍光エネルギーの損失および受容体フルオロフォアにおける蛍光における増大を含む。FRETのさらに他の形態において、エネルギーは、励起された供与体フルオロフォアから非蛍光分子(例えば、消光分子)へと入れ替えることができる。FRETは、当業者に公知であり、すでに記載されている(例えば、Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzymol., 246:300; Orpana, 2004 Biomol Eng 21, 45-50; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110参照、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる)。
【０１４３】
用語「供与体」は、第一波長で吸収し、第二のより長い波長で放射する部分(例えば、フルオロフォア)を指す。用語「受容体」は、フルオロフォア、発色団または消光剤などの部分を指し、供与体基近くにあるとき(典型的に1〜100nm)、供与体からの放射エネルギーの幾らかまたはほとんどを吸収できる。受容体は、供与体の放射スペクトルに重複する吸収スペクトルを有し得る。一般的に、受容体がフルオロフォアである場合、その後第三のさらにより長い波長で再放射する；受容体が発色団または消光剤である場合、光子を放射せずに供与体から吸収されるエネルギーを放出する。幾つかの好ましい態様において、供与体および/または受容体部分のエネルギーレベルにおける変化が、検出される(例えば、供与体および/または受容体部分の間の、または供与体および/または受容体部分からのエネルギー転移を、(例えば、光の放射を検出することによって)測定することを介して)。幾つかの好ましい態様において、受容体部分の放射スペクトルは、該部分からの放射(例えば、光および/またはエネルギーの)が互いから区別できる(例えば、スペクトル的に解像できる)よう、供与体部分の放射スペクトルとは別個である。
【０１４４】
幾つかの態様において、供与体部分は、複数の受容体部分と組み合わせて使用される。好ましい態様において、供与体部分は、非蛍光の消光剤部分と、および受容体部分との組み合わせで使用され、それにより供与体部分が該消光剤に近いとき(例えば、1〜100nm、またはより好ましくは1〜25nm、またはさらにより好ましくは約10nmまたはそれ未満)、その励起は該受容体部分よりもむしろ該消光剤部分へ転移され、該消光剤部分が除去される(例えば、プローブの切断によって)とき、供与体部分の励起は受容体部分へ転移される。幾つかの好ましい態様において、該受容体部分からの放出が検出される(例えば、波長移行する分子ビーコンを使用して)(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられるTyagi, et al., Nature Biotechnology 18:1191 (2000); Mhlanga and Malmberg, 2001 Methods 25, 463-471; Olivier, 2005 Mutant Res 573, 103-110, および米国特許出願第20030228703号参照)。
【０１４５】
標識または検出可能な反応の検出(例えば、標識によって提供される)は、当技術分野で公知の多数の技術、システムおよび方法を使用して測定できる。例えば、標識が検出可能な蛍光(例えば、単純な蛍光、FRET、時間分解型蛍光、蛍光消光、蛍光偏光等)、放射能、化学発光、電気化学発光、RAMAN、比色分析、重量分析、ハイブリダイゼーション(例えば、ハイブリダイゼーション保護アッセイにおける配列との)、X線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量または質量によって影響される挙動の特徴(例えば、MALDI飛行時間質量分析)および同等物を提供するため、該標識が検出され得る。
【０１４６】
標識は、荷電された部分(正または負の電荷)であり得るか、または、中性の電荷であり得る。標識は、該標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質の配列を含むことができるか、またはそれらからなることができる。幾つかの態様において、該標識は核酸またはタンパク質ではない。
【０１４７】
幾つかの態様において、標識は検出のための粒子を含む。例えば、幾つかの態様において、該粒子は蛍リン光体粒子である。蛍リン光体粒子の例は、アップコンバートする蛍リン光体粒子(例えば、Ostermayer, Preparation and properties of infrared-to-visible conversion phosphors. Metall. Trans. 752, 747-755 (1971)参照)を含むが、それに限定されない。幾つかの態様において、希土類によりドープ処理されたセラミック粒子が蛍リン光体粒子として使用される。蛍リン光体粒子は、アップコンバートする蛍リン光体が低エネルギー赤外線(IR)照射を高エネルギー可視光へ転移させる、アップコンバートする蛍リン光体技術(UPT)を含むが、それに限定されない任意の適切な方法によって検出され得る。機構の理解は本発明を実施するのに必要ではなく、かつ本発明は任意の特定の作用機構に限定されないが、幾つかの態様において、UPTは、多重光子吸収およびその後のドーパント依存性リン光の放射によって赤外線光を可視光へとアップコンバートする(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,399,397号; van De Rijke, et al., Nature Biotechnol. 19(3):273-6 (2001); Corstjens, et al., IEE Proc. Nanobiotechnol. 152(2):64 (2005)参照)。
【０１４８】
本明細書で使用されるように、シグナルに対する参照における用語「別個の」(例えば、一つまたは複数の標識の)は、例えば蛍光放射波長、色、吸収、質量、サイズ、蛍光偏光特性、電荷等などのスペクトル特性によって、または化学試薬、酵素、抗体等などの別の部分との相互作用の能力によって、あるものを別のものと区別できるシグナルを指す。
【０１４９】
核酸配列(例えば、遺伝子(例えば、野生型、(一つまたは複数の位置で一つまたは複数の変異体ヌクレオチドを含む)突然変異体)、非相同的等))の存在または非存在を検出するのに使用され得る多数の方法(例えば、分析手法)があることは、当業者に明らかである。このような方法は、核酸識別技術、増幅反応および/またはシグナル生成システムを含むがそれらに限定されない。このような方法は、DNA配列決定、ハイブリダイゼーション配列決定、タンパク質トランケーション検査、一本鎖コンフォメーション多型性分析(SSCP)、変性勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動、ヘテロ二本鎖分析、化学的ミスマッチ切断、制限酵素消化、および酵素的ミスマッチ切断、固相ハイブリダイゼーション、ドットブロット、多重対立遺伝子特異的診断アッセイ、逆ドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ(例えば、DNAチップ)、溶液相ハイブリダイゼーション(例えば、TAQMAN (例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第5,210,015号および第5,487,972号参照)および分子ビーコン(例えば、参照により本明細書に組み入れられるTyagi et al. 1996 Nature Biotech, 14, 303および国際出願第WO 95/13399号)、伸長に基づいた増幅(例えば、増幅抵抗性突然変異システム、増幅抵抗性突然変異システム直線的伸長(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる欧州特許第332435号参照)、競合的オリゴヌクレオチドプライミングシステム(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるGibbs et al., 1989 Nucleic Acids Research 17, 2347参照)、ミニ配列決定、制限断片長多型性、制限部位生成PCR、オリゴヌクレオチド連結アッセイならびに本明細書および他のどこかに記載されている多くのその他を含むがそれらに限定されない。
【０１５０】
発明の説明
本発明は、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるためのシステム、方法およびキットを提供する。特に、本発明は、一つまたは複数のプローブオリゴヌクレオチド(例えば、分析物特異的プローブオリゴヌクレオチド)の使用を通じて、試料中の標的核酸の検出のダイナミックレンジを増大させるための方法およびキットを提供する。
【０１５１】
幾つかの態様において、本発明は、標的核酸の領域の増幅の差次的レベルの使用を通じて検出のより大きなダイナミックレンジを達成する(例えば、増幅なし、一つまたは複数の効率での直線的な増幅および/または一つまたは複数の効率での指数関数的増幅)。幾つかの態様において、本発明は、標的核酸の一つまたは複数の分析物特異的領域に対する異なるハイブリダイゼーション特性を有するプローブの使用を通じて検出のより大きなダイナミックレンジを達成する。幾つかの態様において、本発明は、異なるシグナル生成方法の使用を通じて、検出のより大きなダイナミックレンジを達成する。幾つかの態様において、本発明は、異なるシグナル検出方法の使用を通じて、検出のより大きなダイナミックレンジを達成する。好ましい態様において、該方法の二つまたはそれ以上の組み合わせが採用される。例えば、幾つかの好ましい態様において、2つまたはそれ以上のプローブ(例えば、3つ、4つ等)は、増幅の異なるレベルを介して得られる第一および第二アンプリコンと接触される。幾つかのこのような態様において、各プローブは、反応によって生成される合計のシグナルを単純に検出するよう、同じタイプのシグナルを生成する。集約的なシグナルは、幅広いダイナミックレンジにわたって標的核酸の検出を可能にする。例えば、本発明の開発中に実施された実験は、試料中に元来存在する標的核酸のコピー数が8対数にわたって異なっている試料から標的核酸を検出する能力を示している。
【０１５２】
ある態様において、本発明は、連続的侵入型切断アッセイなどのハイブリダイゼーションアッセイのダイナミックレンジの拡大のための方法論を提供する。幾つかの態様において、ダイナミックレンジの上限は、別のプローブよりも低い濃度で反応において存在するさらなるプローブの使用によって拡大され得る。幾つかの態様において、この付加的プローブは、標的の同じ領域とハイブリダイズすると考えられる。侵入型切断反応について、このプローブは、切断後に放出される異なるアーム、またはフラップ、配列を含有し得る。侵入型切断アッセイと関連したある態様において、第二FRETカセットは、さらなるプローブから切断されたフラップを検出するために、適切な配列との反応へも添加される。一般的に、第二FRETカセットの濃度は、第一FRETカセットとほぼ同じである。例えば、ある態様において、プローブBがプローブAよりも100倍低い濃度で反応に存在する場合、これは、プローブAの検出の上限を上回る濃度で存在するとき、標的核酸の検出を可能にする。この方法で、100倍低い濃度で存在するさらなる各プローブは、さらに2桁のプローブ濃度の検出を可能にするであろう。この方法論は、2つの一次プローブに限定されるわけではなく、3つまたはそれ以上まで拡大され得る。好ましくは、該方法は、標的の一部分が標的の第二部分とは異なるレベルへ増幅される増幅方法と組み合わされる。
【０１５３】
上述のように、ある態様において、濃度の幅広い範囲にわたって同じ標的核酸分子を検出する異なる濃度で存在する2つのプローブが採用される。侵入型切断反応に関与する幾つかの態様において、2つの一次プローブの各々は、同じ分析物特異的領域(ASR)を含有するが、異なるフラップ領域を有する。これら2つのフラップ領域の各々は、切断されるとき、異なるFRETカセットまたは他のレポーター配列またはシステムへ報告する。幾つかの態様において、2つのFRETカセットは両方とも、同じフルオロフォア分子を含有する。このシステムにおいて、ダイナミックレンジにおける増大は、複数の異なるフルオロフォアを使用せずに達成される。このシステムは、それゆえ複数のフルオロフォアシステムを上回る経費上の利点を提供する。さらに、単一フルオロフォアによるダイナミックレンジの拡大は、すでに実行可能であったよりも幅広いダイナミックレンジにわたって、同じ容器中での異なる標的の検出について複数のフルオロフォアを用いて多重化することが可能である。
【０１５４】
ある態様において、各一次プローブの濃度は、互いに対して100倍の差で存在し、2つのFRETカセットの濃度は、当量濃度で存在する。ある態様において、例として、ここに存在する一次プローブの各々によるダイナミックレンジは、それぞれ10^4〜10^6および10^6〜10^8であり得るのに対し、両方が必要な異なる濃度で存在するときのアッセイのダイナミックレンジは、10^4〜10^8であり得る。連続的侵入型切断アッセイのダイナミックレンジは、異なる濃度で各々存在するさらなる付加的な一次プローブによってさらに拡大され得る。この方法で、同じASRおよび異なるフラップを各々有する3つ、4つ、5つまたはそれ以上の一次プローブは、同じ色または検出フォーマットを各々報告する同数の異なるFRETカセットへ報告し得る。一次プローブのこのような組み合わせは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15桁にわたるダイナミックレンジの拡大を可能にする。
【０１５５】
本発明の方法は、標的核酸のタイプによって限定されない。例えば、標的核酸は、例えばRNAゲノムを有するウイルスから調製される核酸材料を含み得る。典型的に、RNA標的配列は、逆転写酵素の作用を通じてcDNA分子へと変換された後、核酸検出アッセイによって検出される。本発明の方法の組み込みは、これまでは実行可能ではなかった幅までRNA標的配列の検出のダイナミックレンジを増大させると考えられる。
【０１５６】
本発明の方法は、反応容器あたり約1コピーの、増幅の理論的限界まで検出の下限を拡大するために、増幅方法(例えば、PCR)と組み合され得る。このアプローチを使用して、核酸検出アッセイのダイナミックレンジは、例えば、比較される各反応容器中で単一セットの反応条件およびプローブの組み合わせを使用して、1〜10^7コピーであり得る。
【０１５７】
付加的に、本発明の方法は、検出アッセイ前の標的種の特異的な前増幅を含む。ある態様において、異なる融解温度のプライマーを使用する差次的なセミネステッドPCRの使用は、検出アッセイによって検出される標的領域を各々含有する異なる種の混合された集団を生じる。この段階後の試料中により高い数で存在する種は、そのダイナミックレンジ内でのより低い濃度で存在するプローブによって検出でき、試料中により低い数で存在する種は、上述に説明されるように、そのダイナミックレンジ内でのより高い濃度で存在する一次プローブによって検出できる。加えて、異なる濃度で存在する標的分子の集団は、直線的および指数関数的増幅(または増幅の異なるレベルに至る増幅の他のタイプ)を同時に組み合わせることによっても生成できる。例えば、核酸検出アッセイによって検出される標的領域を両方とも含有する2つの標的由来アンプリコンは、単一PCRプライマー(直線的増幅のための)で1つを産生し、2つのPCRプライマー(指数関数的増幅のための)でもう1つのものを産生することによって生成されると考えられる。上述のように、標的の異なる濃度は、それらのダイナミックレンジ内で該濃度を検出するために仕立てられた複数の一次プローブで検出できる。さらに、増幅されていないおよび増幅されたDNAは、プローブの上述の組み合わせを使用して同時に検出することもできる。
【０１５８】
差次的な前増幅は、拡大したダイナミックレンジを可能にするよう、異なる効率で実施される複数の同様の増幅(例えば、指数関数的増幅)も含み得る。例としておよび任意の特定の態様または機構に限定されるわけではなく、標的配列は、増幅されるある領域が、選択されたヌクレオチドをほとんど含まないのに対し、増幅される別の領域が多数の同一のヌクレオチドを含むよう選択され得る。選択されたヌクレオチドを複製するのに要するdNTPが限定されるかまたは省略される条件下での前増幅は、限定するヌクレオチドがほとんどない配列の増幅に有利である。条件は、例えば塩基を誤組み込みすることによって他の配列が非効率的に増幅できるよう選択できる。しかしこのことは、差次的な前増幅が可能であるよう構成できる一つの方法にすぎない。
【０１５９】
幾つかの態様において、付加的なプローブは、ダイナミックレンジをさらに拡大するのに使用される(例えば、同一の分析物特異的領域へ各々結合する異なる濃度の3つのプローブ)。幾つかの態様において、方法は、3つの異なる増幅条件の各々の下で一つまたは複数のプローブを検出する：例えば、指数関数的に増幅された標的核酸を検出する1つのプローブまたはプローブセット；直線的に増幅される標的核酸を検出する1つのプローブまたはプローブのセット；および増幅されていない標的核酸を検出する1つのプローブまたはプローブセット。付加的な増幅条件も使用され得る(例えば、プライマーを使用する指数関数的増幅または周期あたり異なる増幅効率を提供する他の反応条件―例、周期あたり90%の効率的である第一セットおよび周期あたり70%効率的である第二セット)。
【０１６０】
PCRまたは他の増幅技術が使用される場合、個々の増幅技術の限界を最小化する緩衝剤および他の薬剤および反応条件を使用することが望まれ得る。例えば、PCRが使用される場合、幾つかの態様において、短いアンプリコンが使用される。幾つかの態様において、アンプリコンは、長さにおいて1キロベース未満であるが、本発明は、このようなアンプリコンに限定されない。幾つかの態様において、標的核酸がRNAである場合、アンプリコンは100ベース未満であるが、本発明はそのように限定されない。
【０１６１】
したがって、幾つかの態様において、本発明は、プローブハイブリダイゼーションアッセイを実施するための方法および組成物を提供する。幾つかの態様において、方法は、一次または第一プローブ、および好ましくは標的配列に関して一次プローブとは異なるハイブリダイゼーション特徴を有する少なくとも1つの付加的なプローブを利用する。幾つかの態様において、増強されたダイナミックレンジを提供する単一プローブが利用される。好ましい態様において、本発明の組成物および方法は、試料中に存在する標的核酸の量の検出のダイナミックレンジを増大させるための二つまたはそれ以上のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせを利用する。好ましい態様において、二つまたはそれ以上のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせは、標的核酸とのハイブリダイゼーションの変動する程度(例えば、ハイブリダイゼーション部位の占有の頻度)を有するプローブオリゴヌクレオチドの混合物を含む。本発明の例示的なプローブオリゴヌクレオチドは、以下により詳細に記載される。
【０１６２】
幾つかの態様において、三つまたはそれ以上のプローブが使用される(例えば、4つ、5つ、6つ等)。二つまたはそれ以上のプローブは、標的核酸の同一領域とハイブリダイズするよう形成され得る。しかしながら、一つまたは複数のプローブは、標的核酸の第二領域または異なる標的核酸とハイブリダイズするよう形成され得る。幾つかの態様において、複数の異なるプローブは、直接的または間接的に検出可能シグナルを生成するよう形成される。幾つかの態様において、異なるプローブは、検出されたシグナルが、第一および第二プローブからのシグナルの相加的な蓄積であるよう、同じタイプの標識を使用する。幾つかのこのような態様において、該方法のユーザーは、各タイプまたはプローブによって提供される寄与を知ることなくまたは知る必要なく、より幅広いダイナミックレンジを通じてシグナルを観察する。
【０１６３】
このようなシステムおよび方法を使用して、標的核酸の検出は、非常に広範なダイナミックレンジを通じて達成できる。幾つかの態様において、このことは、標的核酸を増幅する必要なく、または標的核酸を広範に増幅する必要なく、標的核酸の検出を可能にする。しかしながら、システムおよび方法は、望まれる場合、増幅方法とともにさらに採用され得る。本明細書に記載されるように、本発明のシステムおよび方法は、ポリメラーゼ連鎖拡大増幅および侵入型切断に基づいた検出の組み合わせで例示されている。このような方法は、開始濃度において8対数差を上回って有する標的核酸の良好な検出を実験的に示した。したがって、本発明のシステムおよび方法は、試料ごとに劇的に濃度が異なる標的核酸の検出に例外的に十分適合する。例えば、HCVおよびHIVなどのウイルスに感染した患者は、試料(例えば、血液)中に非常に低いコピー(わずか1コピー)から非常に高いコピー(数百万から数十億またはそれ以上のコピー)まで存在するウイルス標的核酸のコピー数が大きく異なる。この範囲を通じてウイルス標的核酸を同時に検出する単一検出システムの能力が非常に望まれる。本発明は、このような検出のための使用を見出すシステムおよび方法を提供する。
【０１６４】
組成物および方法は、幅広く多様な核酸標的の検出および定量化に有用である。本発明の組成物および方法は、ウイルス標的核酸(例えば、ウイルス性病原体)の定量化に特に有用である。ウイルス濃度(例えば、ウイルス負荷)の大きな範囲の検出についての臨床的または研究上の必要性のある例示的なウイルス核酸は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)および他のレトロウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、バクテリオファージ(例えば、ラムダファージ)、アデノウイルスおよびレンチウイルスを含むが、それらに限定されない。他の態様において、本発明の組成物および方法は、細菌(例えば、商業上および研究上の適用において重要な病原体または細菌)の検出における使用を見出す。例は、クラミジア種、N.ゴノレア、またはストレプトコッカスB群を含むが、それらに限定されない。
【０１６５】
幾つかの態様において、標的配列は合成配列である。例えば、酵素反応において生成される断片(例えば、制限断片、侵入型切断反応から切断したフラップ等)は、標的配列と見なすことができる。幾つかのこのような態様において、このような分子の検出は、合成配列が生成した個別の標的核酸を間接的に検出する。例えば、侵入型切断反応において、一次反応から切断されたフラップは、FRETカセットである第一および第二プローブで検出され得る。FRETカセットは、切断されたフラップが第一および第二プローブと特異的にハイブリダイズするよう、幾つかの特徴(例えば、長さ等)において異なる。両方のFRETカセット(または第三、第四等)を使用することによって、反応のダイナミックレンジは改善される。
【０１６６】
本発明の方法および組成物を使用する標的核酸の定量化は、多様な臨床および研究上の適用において利用される。例えば、幾つかの態様において、本発明の増大したダイナミックレンジを有する検出アッセイは、ヒト試料中のウイルス病原体の検出および定量化において利用される。本発明の検出アッセイは、尿、大便、リンパ液、全血および血清を含むがそれらに限定されない精製されたおよび精製されていない多様な試料で使用するのに適している。好ましい態様において、本発明の検出アッセイは、宿主細胞の存在下での使用に適している。
【０１６７】
他の態様において、本発明の検出アッセイは、薬物スクリーニング(例えば、ウイルス病原体に対する薬物についての)、疾病の動物モデル、および標的核酸(細菌核酸、ウイルス核酸またはゲノム核酸)のインビトロ定量化を含むがそれらに限定されない研究上の適用における使用を見出す。
【０１６８】
本発明のプローブオリゴヌクレオチドは、以下に記載されるものを含むがそれに限定されない多様な核酸検出アッセイにおける使用を見出す。ハイブリダイゼーションを採用する任意の核酸検出方法が、本発明のシステムおよび方法から恩恵を受けることができることは理解されるべきである。
【０１６９】
I. プローブオリゴヌクレオチド
幾つかの態様において、本発明は、プローブオリゴヌクレオチドを変化させることによって核酸検出アッセイのダイナミックレンジを変化させる(例えば、増大させる)ための方法を提供する。幾つかの態様において、本発明は、同じ検出アッセイにおける使用のための二つまたはそれ以上のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供する。本発明は、ハイブリダイゼーション特徴を変化させるためにプローブが改変される方法によって限定されない。ある例示的な態様が以下に提供される。
【０１７０】
A. ミスマッチプローブ
幾つかの態様において、本発明は、標的配列との一つまたは複数の(好ましくは1つの)ミスマッチを有するプローブを提供する。本発明は、特定の機構に限定されない。実際、該機構に関する理解は、本発明を実施するのに必要ではない。それにもかかわらず、一つまたは複数のミスマッチの存在がプローブを標的へ結合できるが、対応するプローブ欠失ミスマッチと比較して低下した親和性を有することが企図される。このことは、ミスマッチプローブが標的部位を占有する時間のパーセントを低下させ、したがって生成したシグナルを低下させる(かまたは使用される検出システムに依存してシグナルを増大させる)。シグナルにおける低下は、検出アッセイが、より高い標的濃度での定量のために直線的または正確のままであることを可能にする。
【０１７１】
幾つかの態様において、ミスマッチプローブは、完全に相補的なプローブとの組み合わせて利用される。完全に相補的なプローブは、ミスマッチプローブよりも高い時間のパーセントで標的結合部位を占有し、したがってより多くのシグナルを生成させる。より高いシグナルは、標的核酸のより低い濃度の検出を可能にする。両方のプローブの使用は、検出アッセイのダイナミックレンジを増大させる。特に、上述のように、そのことは、標的分子のより幅広い濃度を通じて直線性を増大させる。
【０１７２】
実施例1ならびに図1および2は、ミスマッチプローブの使用がアッセイのダイナミックレンジをどれだけ増大できるかを示す。標的核酸を検出するため、マッチおよびミスマッチプローブの組み合わせをINVADERアッセイにおいて使用した。ミスマッチプローブは、単一の完全に相補的なプローブの使用を上回って16倍までダイナミックレンジを増大させた。
【０１７３】
B. より低いプローブ濃度
他の態様において、本発明は、検出アッセイのダイナミックレンジを増大させるためのプローブ濃度の組み合わせを提供する。幾つかの態様において、各々が異なる濃度にある二つまたはそれ以上のプローブオリゴヌクレオチドの組み合わせが利用される。より低い濃度で存在するプローブは、より低いシグナルを生成し、したがって、より高い標的濃度を検出するのに適している。より高い濃度で存在するプローブは、より高いシグナルを生成し、したがって、より低い標的濃度を検出するのに適している。濃度のある範囲で二つまたはそれ以上のプローブを利用することによって、より幅広いダイナミックレンジの標的濃度が検出できる。
【０１７４】
プローブが固体表面へ結合されている場合、幾つかの態様において、固体表面上の特定の検出区域へ結合するプローブの異なる密度の使用を通じて、より低いプローブ濃度が達成できる。例えば、第一プローブ検出区域はプローブの第一密度を有し、第二プローブ検出区域はプローブのより低い密度を有する。2つの検出区域での検出は、増強されたダイナミックレンジを提供する。幾つかの態様において、両方の検出区域は同じタイプのシグナルを生成し、拡大されたダイナミックレンジを通じて標的核酸を検出するため、固体表面からの合計のシグナルが検出される(例えば、リアルタイムで)。
【０１７５】
実施例1ならびに図1および2は、異なる濃度で存在する複数のプローブの使用がアッセイのダイナミックレンジをどれだけ増大できるかを示す。標的核酸を検出するため、プローブの濃度の組み合わせをINVADERアッセイにおいて使用した。複数濃度のプローブの使用は、単一プローブの使用を超えてアッセイのダイナミックレンジを増大させた。
【０１７６】
C. 電荷の改変されたプローブ
他の態様において、本発明は、プローブの結合効率を変化させるために、電荷の改変されたプローブを利用する(例えば、全ての理由のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,780,982号参照)。幾つかの態様において、電荷の改変されたプローブは「電荷タグ」を含む。正に荷電された部分は、正の電荷を常に運搬する必要はない。本明細書で使用されるように、用語「正に荷電した部分」は、その意図される使用の反応条件下で(例えば、望まれる反応条件のpHの下で関心対象の分子へ結合するとき)、正味の正の電荷を有する化学構造を指す。実際、本発明の幾つかの好ましい態様において、正に荷電した部分は、適切な反応条件へ導入されるまで正の電荷を運搬しない：このことは、「pH依存的」および「pH非依存的」な正の電荷としても考えられ得る。pH依存的電荷は、あるpH条件下でのみ電荷を有するものであるのに対し、pH非依存的電荷は、pH条件にかかわらず電荷を有するものである。
【０１７７】
正に荷電した部分、または「電荷タグ」は、別の実体へ結合するとき、
式：X-Y
によって表されることができ、式中、Xは、実体(例えば、固体支持体、核酸分子等)であり、Yは、電荷タグである。電荷タグは、直接的にまたは中間体を通じて(例えば、連結基を通じて)のいずれかの任意の適切な手段(例えば、共有結合、イオン相互作用等)を通じて他の実体へ結合できる。好ましい態様において、Xが核酸分子である場合、電荷タグは、核酸分子の3'末端または5'末端のいずれかへ結合される。
【０１７８】
電荷タグは、多様な構成要素を含有し得る。例えば、電荷タグYは、
式：Y1-Y2
によって表されることができ、式中、Y1は、正の電荷を電荷タグへ提供する化学的構成要素を含み、Y2は、別の望ましい構成要素である。Y2は、例えば、色素、正の電荷を電化タグへ提供する別の化学的構成要素、他の分子の電荷タグへの結合のための官能基、ヌクレオチド等であり得る。このような構造が別の実体Xへ結合する場合、Y1またはY2のいずれかがXへ結合し得る。
X-Y1-Y2またはX-Y2-Y1
【０１７９】
電荷タグは、2つの構成要素に限定されない。電荷タグは、任意の数の望ましい構成要素を含み得る。例えば、電荷タグは、
式：Y1-Y2-Y3-Yn (n＝任意の正の整数)
によって表されることができ、式中、任意のYX基は、正の電荷を電荷タグへ提供する化学的構成要素を含み、他のY基は任意の他の望ましい構成要素である。例えば、幾つかの態様において、本発明は、
構造：X-Y1-Y2-Y3-Y4
の組成物を提供し、式中、Xは、電荷タグへ結合する実体(例えば、固体支持体、核酸分子等)であり、Y1は、色素であり、Y2は、正の電荷を電荷へ提供する化学的構成要素であり、Y3は、他の分子の結合を可能にする官能基を含有する構成要素であり、およびY4は正の電荷を提供する第二化学的構成要素である。Y1〜Y4の各々の同一性は互換的であり得る(すなわち、本発明は、構成要素の順序によって限定されない)。
【０１８０】
本発明は、正の電荷を電荷タグへ提供する化学的構成要素の性質によって限定されない。このような化学的構成要素は、アミン(第一級、第二級および第三級アミン)、アンモニウム、およびホスホニウムを含むが、それらに限定されない。化学的構成要素は、一つまたは複数の正に荷電した金属イオンを閉じ込めるかまたはそうでなければ該金属イオンと会合する化学的複合体も含みうる。
【０１８１】
本発明の好ましい態様において、電荷タグは、核酸分子(例えば、DNA分子)へ結合する。電荷タグは、核酸分子上へと直接合成され得るか、または例えば固体支持体または液相において合成された後、核酸分子または任意の他の望ましい分子へ結合し得る。本発明の幾つかの好ましい態様において、核酸分子へ結合する電荷タグは、H-ホスホン酸塩化学物質によって、新規のホスホラミダイトの組み込みによって、または両方の組み合わせによって合成される一つまたは複数の構成要素を含む。例えば、本発明の組成物は、
[X]-[Y1-Y2-Y3-Y4]
などの構造を含み、式中、[X]は、核酸分子であり、[Y...]は、電荷タグである。幾つかの態様において、Y1は、色素であり、Y2は、H-ホスホン酸塩化学物質を使用して合成されており、正の電荷を電荷タグへ提供する化学的構成要素を含み、Y3は正に荷電したホスホラミダイトであり、およびY4は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。任意のY構成要素は、互いに互換的である。
【０１８２】
上述のように、電荷タグの一つまたは複数の構成要素は、H-ホスホン酸塩化学物質を使用して合成できる。本明細書に記載される方法を使用する電荷タグの産生は、電荷タグの幅広い多様性のデザインのための簡便かつ順応性のある規格に沿ったアプローチを提供する。その導入以来、固相H-ホスホン酸塩化学物質(B.C. Froehler, Methods in Molecular Biology, 20:33, S. Agrawal, Ed. Humana Press; Totowa, New Jersey [1993])は、天然の、改変されたおよび標識化されたオリゴヌクレオチドおよびDNAプローブの化学合成における効率的な道具として認識されてきた。当業者は、このアプローチが、完全に改変されたホスホジエステル主鎖を有するオリゴヌクレオチド断片(例えば、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート；Froechler [1993]、前記)の合成、またはホスホジエステル主鎖の特異的な位置のみが改変されるオリゴヌクレオチド断片の合成を可能にすることを知っている(Agrawal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:7079 [1988], Froehler, Tetrahedron Lett. 27:5575 [1986], Froehler, et al., Nucl.Acids Res. 16:4831 [1988])。H-ホスホン酸塩化学物質の使用は、異なるタイプの改変のオリゴヌクレオチド分子への導入を可能にする(Agrawal, et al., Froehler [1986], 上述、Letsinger, et al., J.Am. Chem. Soc, 110:4470 [1988], Agrawal and Zamecnik, Nucl. Acid Res. 18:5419 [1990], Handong, et al., Bioconjugate Chem. 8:49 [1997], Vinogradov, et al., Bioconjugate Chem. 7:3 [1995], Schultz, et al., Tetrachedron Lett. 36:8407 [1995])が、しかしながら、ホスホラミダート連結によるホスホジエステル連結の置換は、その有効性および合成順応性のため、最も頻繁な変化のうちの1つである。FroehlerおよびLetsingerは、ホスホジエステル連結が、正に荷電した基(例えば、第三級アミノ基；Froehler [1986], Froehler, et al., [1988], and Letsinger, et al., 前記)を保持するホスホラミダート連結によって完全にまたは部分的に置換された改変されたオリゴヌクレオチドの合成において、このアプローチを最初に使用した。
【０１８３】
本発明の幾つかの態様において、電荷タグは、H-ホスホン酸塩化学物質を使用して生成される。電荷タグは、核酸分子の末端で重合され得るか、または個別に合成され、核酸分子へ結合され得る。任意の適切なリン酸化剤が、電荷タグの合成において使用され得る。例えば、添加されるべき構成要素は、
構造：A-B-P
を含有し得、式中、Aは、保護基であり、Bは、任意の望ましい官能基(例えば、正の電荷を電荷タグへ提供する官能基)であり、およびPは、リンを含有する化学基である。好ましい態様において、Bは、正の電荷を電荷タグへ提供できる化学基を含む。しかしながら、幾つかの態様において、Bは、正に荷電した基を電荷タグへ合成後に結合できる官能基である。
【０１８４】
他の態様において、正に荷電したホスホラミダイト(PCP)および中性ホスホラミダイト(NP)は、正の電荷および構造修飾の両方を、合成され電荷平衡されたCREプローブへと導入するのに利用される(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,780,982号参照)。
【０１８５】
ホスホラミダイト試薬(オリゴヌクレオチドの化学合成と適合性のある)を使用する標準的な結合プロトコールは、ホスホジエステル連結の形成のため、各々実施される結合段階あたり1つの負の電荷の、伸長中の分子への導入と関連する。
【０１８６】
D. 核酸修飾剤
本発明は、プローブハイブリダイゼーション効率の修飾因子としての電荷タグの使用に限定されない。プローブ結合のハイブリダイゼーション強度を変化させる任意の内部(例えば、プローブに対して)のまたは外部の薬剤が、本発明の方法および組成物による使用に適している。
【０１８７】
幾つかの態様において、本発明は、挿入剤を含むプローブを提供する。挿入剤は、DNA中の連続する塩基間にそれ自体を挿入できる薬剤である。幾つかの態様において、挿入剤は、核酸プローブの結合特性を変化させる。
【０１８８】
挿入剤の例は、当技術分野で公知であり、臭化エチジウム、ソラレンおよびその誘導体、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオルクマニン(fluorcoumanin)、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンD、クロモマイシン、ホモジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジルおよびアントラマイシンを含むが、それらに限定されない。
【０１８９】
他の態様において、副溝DNA結合剤は、プローブのハイブリダイゼーション効率を改変する(例えば、増大させるかまたは低下させる)ために利用される。副溝結合剤の例は、融合されていない芳香族システムに基づいて(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,613,787号参照)、デュオカルマイシン(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるBoger, Pure & Appl. Chem., Vol. 66, No. 4, pp. 837-844参照)、ネトロプシン、ビスベンジミダゾール、芳香族ジアミジン、レキシトロプシン、ジスタマイシン、および有機物の二価の陽イオンを含むが、それらに限定されない。
【０１９０】
なおもさらなる態様において、修飾された塩基は、プローブのハイブリダイゼーション効率を変化させるのに利用される。例えば、幾つかの態様において、荷電された基を含む修飾された塩基が利用される。例は、プローブおよび他の修飾されたヌクレオチドにおける「t」ヌクレオチドの「アミノ-T」との置換を含むが、それに限定されない。
【０１９１】
さらに他の態様において、一つまたは複数のプローブヌクレオチドは、プローブのハイブリダイゼーション特性を変化させる基の共有結合によって修飾される。例は、アミノ酸のヌクレオチドへの結合を含むが、それに限定されない。
【０１９２】
さらに他の態様において、塩基アナログを有するプローブオリゴヌクレオチドは、プローブのハイブリダイゼーション特徴を変化させるために利用される。例えば、幾つかの態様において、水素結合を形成しないが、塩基の積み重なりになおも参加するヌクレオチドが利用される。例は、2,4-ジフルオロトルエンなどの非極性芳香族ヌクレオシドアナログ、および5-ニトロインドールおよび3-ニトロピロールなどの「普遍的な」塩基を含むが、それらに限定されない。他の態様において、水素結合能力を保持する塩基アナログが利用される(例えば、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許出願第US20040106108A1号およびWO04/065550A3参照)。
【０１９３】
E. プローブの長さ
さらに他の態様において、プローブの長さは、プローブのハイブリダイゼーション特徴を変化させるために変化される。例えば、幾つかの態様において、同じ標的配列とハイブリダイズし、同じ配列を共有する二つまたはそれ以上のプローブが利用される。幾つかの態様において、プローブの1つは、1つ、2つ、3つもしくは4つまたはそれ以上の塩基分短い。プローブが片方または両方の末端からトランケートされることが好ましい。したがって、プローブは、トランケートされた3'末端または5'末端を除く全ての領域において配列を共有する。より短いプローブが、低下したハイブリダイゼーション効率でアニールし、したがって全長のプローブよりも標的配列のより高いコピー数の検出において有用であろうことが企図される。好ましい態様において、標的濃度検出の最大範囲を付与するために、全長およびトランケートされたプローブの組み合わせが利用される。幾つかの態様において、同じ長さが採用されるが、プローブは、リンカーによって接続される二つまたはそれ以上の部分へと分岐される。このようなプローブは、プローブまたはプローブ断片がハイブリダイズする領域における標的核酸の二次構造を含む多様な因子に依存する異なる親和性でハイブリダイズする。
【０１９４】
F. 二次構造
幾つかの態様において、二次構造を含むプローブは、プローブのハイブリダイゼーション効率を変化させるために利用される。例えば、幾つかの態様において、二つまたはそれ以上のプローブが同一の標的配列にハイブリダイズするよう設計される。プローブの1つは、最小の二次構造を有するよう設計される。標的配列認識を保持するが、二次構造を有する付加的なプローブが設計される。二次構造を有するプローブが、低下したハイブリダイゼーション特性を示し、したがって標的配列の大きなコピー数の検出に適しているであろうことが企図される。二次構造を欠失および含有するプローブの組み合わせは、単一プローブよりも標的核酸の大きなダイナミックレンジを検出するよう機能する。同様に、二次構造において異なる標的核酸の領域とハイブリダイズするプローブが使用され得る。例えば、直線的な標的核酸と結合する18塩基のうちの18を有するプローブは、プローブの末端にある2つの塩基が、内部ヘアピン構造または他の二次構造において占有される標的核酸の領域と対応するよう、標的核酸上で2つの塩基の移行した同様のプローブとは異なってハイブリダイズするであろう。
【０１９５】
G. コンペティターオリゴヌクレオチド
さらに他の態様において、付加的なオリゴヌクレオチドは、プローブのハイブリダイゼーション効率を改変するために利用される。例えば、幾つかの態様において、同じ標的配列を認識する2つのプローブが設計される。プローブの1つは、標的配列とハイブリダイズしない付加的な核酸配列(例えば、3'末端または5'末端で)をさらに含む。コンペティターオリゴヌクレオチドは、余分な領域とハイブリダイズするよう設計される。コンペティターオリゴヌクレオチドの結合は、プローブの標的とのハイブリダイゼーション効率を低下させる。コンペティター結合配列を有するおよび有さないプローブの組み合わせは、単一プローブよりも標的核酸の大きなダイナミックレンジを検出するよう機能する。
【０１９６】
H. 反応条件
なおもさらなる態様において、反応条件は、プローブハイブリダイゼーション特徴を変化させるために改変される。例えば、幾つかの態様において、同一のプローブが個別の反応容器、チャンバーまたはウェルにおいて利用される。1つの反応容器は、検出アッセイのための「標準的な」反応条件を利用する(例えば、製造者によって供給されるかまたは当技術分野において公知のもの)。他の反応容器は、プローブのハイブリダイゼーション効率を増大させるかまたは低下させる、変化した反応条件を含む。核酸ハイブリダイゼーション条件に影響する因子の例は、イオン強度、緩衝剤組成物、pH、および添加物(例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、タンパク質)を含むが、それらに限定されない。
【０１９７】
I. 積み重なるオリゴヌクレオチド
なおもさらなる態様において、オリゴヌクレオチドが近接してハイブリダイズすることを使用して、プローブハイブリダイゼーション特徴を変化させる。核酸の短鎖がより長い鎖に沿って連続的に整列するとき、主鎖が、中断されなかったかのように、実際もそうであるが、塩基対が螺旋に沿って積み重なることができるため、各々のハイブリダイゼーションは、隣り合う断片のハイブリダイゼーションによって安定化される。結合のこの協同性は、より長い核酸単独へハイブリダイズするセグメントについて期待される以上の、各セグメントに相互作用の安定性を付与できる。例えば、連続する二本鎖間の接合部またはその近くでのミスマッチによる協調的結合における混乱の事象において、この協調性は低下されるかまたは排除され得る。本発明の幾つかの態様において、プローブは、異なるハイブリダイゼーション特徴を有するプローブを提供するよう、近接してハイブリダイズする一つまたは複数のオリゴヌクレオチドと別個の方法で協調するよう形成される。幾つかの態様において、プローブは、ミスマッチを欠失するプローブと比較して、結合の協調性を変化させるかまたは混乱させるよう、近接するオリゴヌクレオチドとの接合部近くに一つまたは複数のミスマッチした塩基を含む。他の態様において、プローブは、近接する塩基との積み重なり相互作用を低下させるよう選択される一つまたは複数の塩基アナログを含む。さらに他の態様において、一つまたは複数のヌクレオチドの間隙(トランケートされたプローブの使用による)が、協調性を変化させ、したがってハイブリダイゼーション特徴を変化させるのに使用されることが構想される。近接してハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドと結合する協調性の範囲を有し、したがって標的上での異なるハイブリダイゼーション安定性の範囲を有するプローブの組み合わせの使用は、単一プローブよりも大きなダイナミックレンジの標的核酸を検出するよう機能する。
【０１９８】
J. 多重アッセイ
複数の核酸プローブを利用する幾つかの態様において、プローブは、複数のプローブが同一の反応容器に含まれる二重または多重アッセイにおいて利用される。幾つかの態様において、二重アッセイにおける各プローブは、異なって検出可能な標識を含む。例えば、幾つかの態様において、セットにおける各プローブは異なる波長で蛍光を発する異なる蛍光標識を含む。多くの公知のプローブ結合アッセイは、多重フォーマットにおける使用に適している。特定のアッセイフォーマットに対して独特である多重アッセイを実施するための方法は、以下に記載される。
【０１９９】
K. その他
プローブの特徴のハイブリダイゼーションを変化させるための任意の他の方法は、本発明とともに使用され得る。他の例は、以下を含むがそれらに限定されない:緩衝剤条件(例えば、グアノシン-カルテットの使用)またはタンパク質/核酸相互作用(例えば、核酸配列を結合させるかまたは変化させる核酸結合タンパク質または酵素についての結合部位を作製することによる)に反応して特異なハイブリダイゼーション挙動に対して配列を影響されやすくするプローブまたは標的における配列の使用；ダングリングエンド(dangling end)の使用(ダングリングエンドの安定化および積み重なりのための)；磁場において核酸の濃縮を可能にする鉄または他の磁気薬剤の結合；特異的プローブを滴定する薬剤の使用；および同等物。
【０２００】
プローブのハイブリダイゼーション特性とは無関係に、シグナルの差異検出を達成する異なる標識化技術も使用され得る。例えば、FRET検出システムにおける標識および消光剤の配置は、プローブから検出されるシグナルの量を変化させるために、第一プローブと第二プローブとの間で変化され得る。FRETシグナル伝達は、消光の量およびプローブにおける二次構造の使用に影響する付加的な化学部分の使用を含むがそれに限定されない多くの他の因子によっても影響され得る。シグナル検出を変化させるための付加的な方法は、本発明のプローブによって占有される標的へ結合するとき、波長を変化させるかまたはさもなくばプローブの検出可能な局面を変化させる、低い濃度で提供されるヘルパーオリゴヌクレオチドの使用を含む。ヘルパーの濃度は、プローブの特定の閾値レベルが標的とハイブリダイズされるときの変化を検出できるのみであるよう形成できる。ハイブリダイゼーション事象の差次的検出を可能にする任意の方法またはシステムは、本発明のシステムおよび方法において使用され得る。
【０２０１】
II. 検出アッセイ
本発明は、特定の検出アッセイに限定されない。多数の適切な検出アッセイが利用され得る。幾つかの態様において、本発明は、DNAまたはRNA(例えば、ウイルスRNA)の検出のための方法および組成物を提供する。幾つかの態様において、以下に記載される検出アッセイは、RNAの直接的な検出に適している。他の態様において、RNAは、DNAへと逆転写され(例えば、AMVまたはMMLVなどの逆転写酵素を使用して)、検出アッセイは、対応するDNAに関して実施される。逆転写のための方法は、当技術分野において公知である。幾つかの態様において、逆転写酵素およびポリメラーゼの両方の活性を有する単一の酵素が使用される。
【０２０２】
本発明の方法での使用を見出す例示的なアッセイが以下に記載される。
【０２０３】
A. Invaderアッセイ
幾つかの態様において、本発明の方法および組成物は、INVADERアッセイのダイナミックレンジを増大させるために使用される。INVADERアッセイは、別個の切断産物を放出するために、標的核酸の存在に依存する核酸切断構造を形成し、および核酸切断構造を切断するための手段を提供する。例えば、5'ヌクレアーゼ活性は、標的依存性切断構造を切断するのに使用され、結果として生じる切断産物は、試料中の特異的な標的核酸配列の存在を示す。核酸またはオリゴヌクレオチドの2つの鎖の両方が、以下に記載されるように、重なっている侵入型切断構造を形成するよう、標的核酸鎖とハイブリダイズするとき、侵入型切断が生じ得る。切断剤(例えば、5'ヌクレアーゼ)および上流オリゴヌクレオチドの相互作用を通じて、切断剤は、別個の断片が生じるような方法で、内部部位で下流オリゴヌクレオチドを切断するよう調製することができる。このような態様は、INVADERアッセイ(Third Wave Technologies, Madison, WI)と名づけられており、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許出願第5,846,717号、第5,985,557号、第5,994,069号、第6,001,567号および第6,090,543号、第WO97/27214号、第WO98/42873号、Lyamichev et al., Nat. Biotech., 17:292 (1999)、Hall et al., PNAS, USA, 97:8272 (2000)に記載されている。
【０２０４】
INVADERアッセイは、構造特異的酵素による特異的構造の酵素切断によって、プローブの標的とのハイブリダイゼーションを検出する(INVADER assays, Third Wave Technologies参照；例えば、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第5,846,717号；第6,090,543号；第6,001,567号；第5,985,557号；第6,090,543号；第5,994,069号；Lyamichevら、Nat. Biotech., 17:292 (1999), Hallら、PNAS, USA, 97:8272 (2000), 第WO97/27214号および第WO98/42873号参照)。
【０２０５】
INVADERアッセイは、重複しているオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成されている複合体を切断させるために、構造特異的酵素(例えば、FENエンドヌクレアーゼ)を使用することによって、特異的DNAおよびRNA配列を検出する。上昇した温度および1つのプローブの過剰量は、温度周期なしで、存在する各標的配列について複数のプローブが切断されることを可能にする。幾つかの態様において、これらの切断されたプローブはその後、第二の標識化したプローブの切断を導く。二次プローブオリゴヌクレオチドは、内部色素によって消光される蛍光剤で標識化した5'末端であり得る。切断に際し、脱消光した蛍光で標識化された産物は、標準的な蛍光プレートリーダーを使用して検出され得る。
【０２０６】
INVADERアッセイは、増幅されていない、および増幅された、RNAおよびゲノムDNAを含むDNAにおける特異的標的配列を検出する。図3に模式的に示される態様において、INVADERアッセイは、標的特異的シグナルを生成した後増幅させる両方のために、2つのカスケード段階(一次および二次反応)を使用する。簡便さのため、以下の論議における対立遺伝子は、野生型(WT)および突然変異体(MT)として記載されるが、この用語法は、全ての遺伝子変異または標的配列へ適用しない。一次反応(図3、パネルA)において、WT一次プローブおよびINVADERオリゴヌクレオチドは、重複している構造を形成するため、標的核酸と直列にハイブリダイズする。対形成されていない「フラップ」は、WT一次プローブの5'末端に含まれる。構造特異的酵素(例えば、CLEAVASE酵素、Third Wave Technologies)は、重複を認識し、対形成されていないフラップを切断し、それを標的特異的産物として放出する。二次反応において、この切断された産物は、構造特異的酵素によって認識される構造を再度作製するために、WT蛍光共鳴エネルギー転移(WT-FRET)におけるINVADERオリゴヌクレオチドとして機能する(パネルA)。単一FRETプローブにおける2つの色素が、切断によって分離されるとき(図3における矢印によって示される)、背景の蛍光の上に検出可能な蛍光シグナルが産生される。結果的に、この第二構造の切断は、蛍光における増大を結果として生じ、WT対立遺伝子(または検出可能シグナルを生成するために突然変異対立遺伝子についてアッセイが形成されている場合、突然変異体対立遺伝子)の存在を示す。幾つかの態様において、異なる標識を有するFRETプローブ(例えば、放射波長または励起波長における差によって分解可能な、または時間分解型蛍光検出によって分解可能な)が、検出されるべき各対立遺伝子または座について提供され、それにより異なる対立遺伝子または座が単一反応において検出できる。このような態様において、一次プローブセットおよび異なるFRETプローブは、単一アッセイにおいて組み合され得、同一試料中の各対立遺伝子または座からのシグナルの比較を可能にする。
【０２０７】
一次プローブオリゴヌクレオチドおよび標的ヌクレオチド配列が、切断部位で完全にマッチしない場合(例えば、MT一次プローブおよびWT標的などと、図3、パネルB)、重複構造は形成せず、切断は抑制される。使用される構造特異的酵素(例えば、CLEAVASE VIII酵素、Third Wave Technologies)は、重複構造を非重複構造よりも(例えば、少なくとも340倍)効率よく切断し、対立遺伝子の優れた識別を可能にする。
【０２０８】
プローブは、標的あたり多くのシグナルを産生するために、温度周期なしで代謝回転する(すなわち、直線的なシグナル増幅)。同様に、各標的特異的産物は、多くのFRETプローブの切断を可能にできる。
【０２０９】
一次INVADERアッセイ反応は、検出される標的DNAまたはRNAに対して向けられる。INVADERおよび一次プローブが過剰モル濃度で供給されるため、標的DNAは第一侵入型切断において限定している構成要素である。第二侵入型切断において、標的DNAは、限定している放出されたフラップである。これら2つの切断反応が連続して実施されるとき、混成反応からの蛍光シグナルは、標的DNA量に関して直線的に蓄積する。
【０２１０】
ある態様において、INVADERアッセイ、または他のヌクレオチド検出アッセイは、アクセス可能な部位により設計されるオリゴヌクレオチドおよび/または架橋しているオリゴヌクレオチドで実施される。このような方法、手法および組成物は、その全ての内容が全体として参照により全て特異的に組み入れられる米国特許第6,194,149号、第WO9850403号、および第WO0198537号に記載されている。
【０２１１】
ある態様において、標的核酸配列は、検出前に増幅される(例えば、合成核酸が生成されるように)。幾つかの態様において、標的核酸はゲノムDNAを含む。他の態様において、標的核酸は、合成DNAまたはRNAを含む。幾つかの好ましい態様において、試料内での合成DNAは、精製されたポリメラーゼを使用して作製される。幾つかの好ましい態様において、精製されたポリメラーゼを使用する合成DNAの作製は、PCRの使用を含む。他の好ましい態様において、本発明の方法での使用に適した、精製されたDNAポリメラーゼを使用する合成DNAの作製は、回転周期増幅の使用(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,210,884号、第6,183,960号および第6,235,502号にあるように)を含む。他の好ましい態様において、合成DNAの作製は、ゲノムDNA試料における複数の部位からのプライミングによってゲノムDNAをコピーする段階を含む。幾つかの態様において、ゲノムDNA試料における複数の部位からのプライミングは、短い(例えば、約8個未満のヌクレオチド)オリゴヌクレオチドプライマーを使用する段階を含む。他の態様において、ゲノムDNAにおける複数の部位からのプライミングは、ニックを入れられた二本鎖のゲノムDNAにおける3'末端の伸長を含む(すなわち、3'ヒドロキシル基が、DNAの二本鎖領域の片方の鎖の破壊または切断によって伸長のために利用可能にされた場合)。本発明の方法および組成物での使用に適した、ニックを入れられたゲノムDNAにおいて精製されたポリメラーゼを使用して合成DNAを作製する幾つかの例は、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる、2000年9月12日発行の米国特許第6,117,634号、および2001年3月6日発行の第6,197,557号、およびPCT出願第WO 98/39485号において提供される。
【０２１２】
幾つかの態様において、本発明の方法および組成物での使用に適した合成DNAは、例えば、全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,291,187号、および第6,323,009号、ならびにPCT出願第WO01/88190号および第WO02/00934号において提供されるように、多重に刺激されたゲノムDNAまたは他のDNAにおいて精製されたポリメラーゼを使用して作製される。これらの態様において、ゲノムDNAなどのDNAの増幅は、六量体などのエキソヌクレアーゼ耐性直列プライマーとの組み合わせで、(全ての目的のためにその全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる、例えば米国特許第5,198,543号および第5,001,050号において記載されているような)高度に連続移動的なΦ29ポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼを使用して達成される。
【０２１３】
本発明は、標的核酸が、複数回のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションおよび温度サイクリング(すなわち標的核酸鎖の周期的変性のための)または核酸合成(すなわち、標的またはプローブ核酸鎖の重合化に基づいた置換のための)を使用する必要性のないプローブの切断の間に再使用されるかまたはリサイクルされるアッセイをさらに提供する。プローブが標的鎖において連続的に置換される条件下で、切断反応が実施されるとき(例えば、プローブ−プローブ置換を通じてまたはプローブ/標的の会合と脱会合との間の平衡を通じて、またはこれらの機構を含む組み合わせを通じて(Reynaldo et al., J. Mol. Biol. 97: 511-520 (2000)))、複数のプローブは同じ標的とハイブリダイズでき、複数の切断および複数の切断産物の生成を可能にする。
【０２１４】
上述のように、幾つかの態様において、本発明は、試料中に存在する標的核酸の量を定量するためのINVADERアッセイを利用する方法を提供する。幾つかの態様において、INVADERアッセイのダイナミックレンジは、ミスマッチプローブを単独でまたは完全に相同的なプローブとの組み合わせで使用することによって増大する。ミスマッチが切断酵素による切断の部位に存在しないことが好ましい。他の態様において、INVADERアッセイのダイナミックレンジは、複数の濃度のプローブを使用することによって増大する。好ましい態様において、複数のプローブのINVADERアッセイにおける各プローブは、異なる標識を含み、反応容器の同一ウェルまたはチューブの中で反応が実施され、同時検出されるのを可能にする。しかしながら、プローブは、1つの検出事象として解釈される組み合わさったシグナルを許容する同じ標識も共有し得る。幾つかの好ましい態様において、シグナルが連続してまたは一定の時間間隔で測定されるリアルタイムアッセイが利用される。他の態様において、単一の終点検出は、望まれる時点で実施される。さらに他の態様において、二つまたはそれ以上の時点の読み取りが実施される。
【０２１５】
他の態様において、混成または分割プローブオリゴヌクレオチドは、INVADERによる切断アッセイにおいて利用されるダイナミックレンジを増大させるために利用される。例えば、プローブオリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドに沿って連続的に近接した様式でアニールする2つのオリゴヌクレオチドへと分割され得る。プローブオリゴヌクレオチドは、2つのより小さな小片から組み立てられる：検出反応の経過において切断される6〜10ntの短いセグメント(「ミニプローブ」と名づけられる)、およびプローブのハイブリダイゼーションを安定化させるよう機能するミニプローブ(「スタッカー」と名づけられる)のすぐ下流をハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。切断構造を形成するため、上流オリゴヌクレオチド(INVADERオリゴヌクレオチド)は、ミニプローブの望ましい領域へ切断活性を導くよう提供される。核酸の連結されていないピースからのプローブ(すなわちミニプローブおよびスタッカー)の組み立ては、証明された配列全体の再合成を必要とせずに、配列の領域が変化するのを可能にし、したがって検出システムの経費および順応性を改善する。さらに、連結されていない混成オリゴヌクレオチドの使用は、シグナル生成を達成するために完全にマッチしたハイブリダイゼーションに関する該オリゴヌクレオチドの必要性においてシステムをよりストリンジェントにし、これが標的核酸配列における突然変異または変化を検出する鋭敏な手段として使用されるのを可能にする。幾つかの態様において、2つのプローブ/スタッカーデザインは、アッセイのダイナミックレンジを増大させるために利用される。プローブとスタッカーとの間隙のない第一立体配置が利用される。この立体配置は、高頻度で標的部位を占有し、より高いシグナルを生成するよう機能する(例えば、低濃度の標的の存在下で)。プローブとスタッカーオリゴヌクレオチドとの間の単一ヌクレオチド間隙が導入される第二立体配置は、高濃度の標的の検出のために利用される。間隙のあいた立体配置のプローブオリゴヌクレオチドおよびスタッカーオリゴヌクレオチドは、より低い強度ではハイブリダイズし、したがってより低い頻度で標的を占有する。このことは、多量の標的配列の検出において有用なより低いシグナルを生成する。
【０２１６】
INVADERアッセイを実施するための付加的な考慮が、以下により詳細に論議される。
【０２１７】
INVADERアッセイのためのオリゴヌクレオチドデザイン
オリゴヌクレオチドが標的核酸を検出するためのINVADERアッセイにおける使用のために設計される幾つかの態様において、関心対象の配列は、INVADER CREATORプログラム(Third Wave Technologies, Madison, WI)へと入力される。配列は、INVADERCREATORプログラムをホストするコンピュータへ直接的に、または通信ネットワーク(例えば、LAN、イントラネットまたはインターネットネットワーク)を通じて連結される遠隔コンピュータを介してのいずれかで、分析のために多数の供給源から入力され得る。プログラムは、センスおよびアンチセンスの両方の鎖についてプローブを設計する。鎖の選択は一般的に、合成の簡便さ、二次構造形成の最小化および製造可能性に基づいている。幾つかの態様において、ユーザーは、設計される配列について鎖を選択する。他の態様において、ソフトウェアは鎖を自動的に選択する。最適なプローブサイクリングおよびシグナル生成のための熱力学的因子(Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997])を組み込むことによって、オリゴヌクレオチドプローブは、あらかじめ選択されたアッセイ温度(例えば、63℃)で作動するよう設計され得る。これらの基準に基づいて、最終的なプローブセット(例えば、マッチおよびミスマッチプローブならびにINVADERオリゴヌクレオチド)が選択される。
【０２１８】
幾つかの態様において、INVADERCREATORシステムは、BLAST(the National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health ウェブサイトで利用可能)へのリンクを含有し、エムフォールド(mfold) (Zuker, Science, 244:48 [1989])を組み込むソフトウェアプログラムである、RNAstructure(Mathews et al., RNA 5:1458 [1999])へ連結できる安全なサイトへのアクセスを有するウェブに基づいたプログラムである。RNAstructureは、可能性のある一分子および二分子複合体形成のためのINVADERCREATORによって生成される提唱されたオリゴヌクレオチドデザインを検査する。INVADERCREATORは、オープンデータベース接続性(ODBC)に順応しており、輸送/統合のためのオラクルデータベースを使用する。INVADERCREATORは、ほとんどのゲノム中心がUNIXベースであるため、UNIXシステムとともに十分に作動するようオラクルで形成される。
【０２１９】
幾つかの態様において、INVADERCREATOR分析は、大きなバッチジョブの分析を取り扱えるよう、個別のサーバー(例えば、Sunサーバー)に提供される。例えば、顧客は、1つの電子メールにおいて2,000までのSNP配列を提出できる。サーバーは、INVADERCREATORソフトウェアへ一群の配列を通過させ、開始されるとき、プログラムは検出アッセイオリゴヌクレオチドセットを設計する。幾つかの態様において、プローブセットデザインは、配列の受信から24時間以内にユーザーへ戻される。
【０２２０】
各INVADER反応は、一次反応のための少なくとも2つの標的配列特異的である非標識オリゴヌクレオチドを含む：上流INVADERオリゴヌクレオチドおよび下流プローブオリゴヌクレオチド。INVADERオリゴヌクレオチドは一般的に、反応温度で安定して結合するよう設計されるのに対し、プローブは、標的鎖と自由に会合および脱会合するよう設計され、切断されていないプローブが、重複しているINVADERオリゴヌクレオチド近くでハイブリダイズするときにのみ切断が生じる。幾つかの態様において、プローブは、標的と相補的ではない5'フラップまたは「アーム」を含み、このフラップは、切断が生じるときにプローブから放出される。幾つかの態様において、放出されたフラップは、二次反応においてINVADERオリゴヌクレオチドとして参加する。
【０２２１】
以下の論議は、INVADERCREATORプログラムのためのユーザーインターフェイスがどのように形成され得るかの一例を提供する。
【０２２２】
ユーザーは、例えばコンピュータ(例えば、Windowsデスクトップ)のデスクトップ画面上のアイコンをクリックすることによって、作業スクリーンを開く。ユーザーは、アッセイが設計される標的配列に関連する情報を入力する。幾つかの態様において、ユーザーは標的配列を入力する。他の態様において、ユーザーは、データベースからの配列の検索を生じるコードまたは数を入力する。なおも他の態様において、ユーザーの氏名、標的配列と関連する識別番号、および/または注文番号などの付加的な情報が提供され得る。好ましい態様において、ユーザーは、標的核酸がDNAまたはRNAであることを(例えば、チェックボックスまたはドロップダウンメニューを介して)示す。他の好ましい態様において、ユーザーは、核酸が由来する種を示す。特に好ましい態様において、ユーザーは、デザインが一重(すなわち、反応あたり1つの標的配列または対立遺伝子)または多重(すなわち、反応あたり複数の標的配列または対立遺伝子)の検出のためであるかどうかを示す。必須の選択および入力が完了されると、ユーザーは、分析処理を開始する。一つの態様において、ユーザーは、続行するために「設計しなさい("Go Design It")」ボタンをクリックする。
【０２２３】
幾つかの態様において、ソフトウェアは、続行する前に入力欄を認証する。幾つかの態様において、ソフトウェアは、任意の必要な欄が、適切な情報のタイプで記入完了されていることを検証する。他の態様において、ソフトウェアは、入力された配列が選択された必要条件(例えば、最小または最大の長さ、DNAまたはRNA含有量)に合うことを検証する。任意の欄における入力が妥当であることが見出されない場合、エラーメッセージまたはダイアログボックスが現れ得る。好ましい態様において、エラーメッセージは、欄が未完成であるかおよび/または不正確であることを示す。一度配列入力が検証されると、ソフトウェアはアッセイデザインを続行する。
【０２２４】
幾つかの態様において、指令入力欄において供給される情報は、どのタイプのデザインが作製されるかを指定する。好ましい態様において、標的配列および多重チェックボックスは、作製されるデザインのタイプを指定する。デザインオプションは、SNPアッセイ、多重SNPアッセイ(例えば、異なる対立遺伝子についてのプローブセットが単一反応において組み合わされる)、複数のSNPアッセイ(例えば、プローブセットがデザインされるべき複数の変異の部位を入力配列が有する)、および複数のプローブアームアッセイを含むが、それらに限定されない。
【０２２５】
幾つかの態様において、INVADERCREATORソフトウェアは、Web Order Entry (WebOE)プロセスを介して(すなわち、イントラ/インターネットブラウザインターフェイスを通じて)開始され、これらのパラメータは、メニューまたはチェックボックスを通じて入力されるよりもむしろアプレット<param>タグを介してWebOEから転送される。
【０２２６】
複数のSNPデザインの場合、ユーザーは、作業する二つまたはそれ以上のデザインを選択する。幾つかの態様において、この選択は、新たなスクリーンビュー(例えば、複数のSNPデザイン選択ビュー)を開く。幾つかの態様において、ソフトウェアは、標的配列における各座についてのデザインを作成し、各々を評価し、それらをユーザーへこのスクリーンビューにおいて呈示する。ユーザーはその後、作業するための任意の2つのデザインを選択する。幾つかの態様において、ユーザーは、第一および第二デザインを(例えば、メニューまたはボタンを介して)選択し、続行するために「設計しなさい」ボタンをクリックする。
【０２２７】
あらかじめ選択された反応温度で最適に実施されるであろうプローブ配列を選択するために、検出されるべきSNPの融解温度(Tm)が最近傍モデルおよび発表されているDNA二本鎖形成のための因子を使用して算出される(Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997])。標的鎖がRNAである態様において、RNA/DNAへテロ二本鎖の形成に適した因子が使用され得る。アッセイの塩濃度が、最近傍パラメータが得られる溶液条件(1M NaClおよび二価金属なし)とはしばしば異なるため、および酵素の存在および濃度が最適な反応温度に影響するため、反応を実施するための最適温度を決定するため、算出されたTmに対して調整がなされるべきである。これらの因子を補正する1つの方法は、融解温度算出内での塩濃度について提供される値を変動させることである。この調整は、「塩補正」と名づけられる。本明細書で使用されるように、用語「塩補正」は、該二本鎖に影響する塩を含まない因子または条件に関する核酸二本鎖についてのTmに及ぼす効果を反映する目的のために、塩濃度について提供される値においてなされる変動を指す。鎖濃度について提供される値の変動は、これらの算出の結果にも影響するであろう。0.5M NaClの値(SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 1460 [1998])および約1mMのプローブおよび1fM標的の鎖濃度を使用することによって、プローブ−標的融解温度を算出するのに使用されるためのアルゴリズムが、最適なINVADERアッセイ反応温度を予測する上での使用に適合されている。30プローブのセットについて、この方法によって算出される最適アッセイ温度と実験的に決定されるアッセイ温度との間の平均偏差は、約1.5℃である。
【０２２８】
所与の標的配列に対して下流のプローブの長さは、反応を実施するために選択された温度(例えば、63℃)によって定義される。標的DNA上の変異体ヌクレオチドの位置から開始し(意図される切断部位のプローブヌクレオチド5'と対形成されている標的塩基)、および3'末端に付加することで、望ましい反応温度に符合する算出された最適反応温度(酵素効果を補償するTmプラス塩補正)に到達するまで、プローブの標的結合領域の長さが一度に1塩基対だけ増大する反復性の手法が使用される。プローブの非相補的アームは、同じ反応温度で二次反応が回ることのできるよう好ましく選択される。全体のプローブオリゴヌクレオチドは、反応に干渉し得る二量体複合体または二次構造の可能な形成のためにエムフォールド(Zuker, Science, 244: 48 [1989])またはOligo 5.0 (Rychlik and Rhoads, Nucleic Acids Res, 17: 8543 [1989])などのプログラムを使用してスクリーニングされる。同じ原理は、INVADERオリゴヌクレオチドデザインのためにも追随される。簡潔には、標的DNA上の位置Nから開始し、INVADERオリゴヌクレオチドの3’末端が、検査されるべき試料中に含有されると思われるいずれかの対立遺伝子と相補的ではないヌクレオチドを有するよう設計される。ミスマッチは切断に悪影響は与えず(Lyamichev et al., Nature Biotechnology, 17: 292 [1999])、およびミスマッチは、2つのプローブ間の共軸の安定化効果をおそらく最小化することによって、プローブサイクリングを増強できる。残基N-1から開始する標的DNAと相補的な付加的な残基はその後、INVADERオリゴヌクレオチド−標的ハイブリッドの安定性がプローブの安定性(およびそれゆえ計画されたアッセイ反応温度)を超過するまで、一般的に15〜20℃まで、5'方向において付加される。
【０２２９】
一次および二次反応が同じ最適温度で生じることを可能にするようプローブ配列の全てが選択され得、それにより反応段階が同時に実施できることは、アッセイデザインの一つの局面である。代替的な態様において、プローブは、異なる最適温度で作動するよう設計され得、それにより反応段階は、それらの最適温度で同時ではない。
【０２３０】
幾つかの態様において、ソフトウェアは、ユーザーへ、以下のものを含むがそれらに限定されないデザインの様々な局面を変化させる機会を提供する：プローブ、標的およびINVADERオリゴヌクレオチドの最適温度および濃度；ブロッキング基；プローブアーム；色素、キャッピング基および他の添加物；プローブおよび標的の個々の塩基(例えば、塩基を付加する段階または標的および/またはプローブから欠失させる段階、またはINVADERおよび/またはプローブおよび/または標的オリゴヌクレオチドにおいて内部塩基を変化させる段階)。幾つかの態様において、変化は、メニューからの選択によってなされる。他の態様において、変化は、テキストボックスまたはダイアログボックスへと入力される。好ましい態様において、このオプションは、新しいスクリーン(例えば、デザイナーワークシートビュー)を開く。
【０２３１】
幾つかの態様において、ソフトウェアは、アッセイデザインの品質(例えば、性能の見込み)を示すために、評価システムを提供する。一つの態様において、評価システムは、点の開始スコア(例えば、100点)を含み、ここで、開始スコアは理想のデザインを示し、ここで、アッセイ性能に及ぼす負の効果を有することが公知のまたは有すると思われるデザイン特徴は、ペナルティ値を割り当てられる。ペナルティ値は、デザインが意図されるアッセイのタイプ(例えば、一重、多重)およびアッセイ反応が実施されるであろう温度を含むがそれらに限定されない配列以外のアッセイパラメータに依存して変動し得る。次の例は、実験によって定義される理解に基づいたINVADERアッセイの幾つかの態様による使用のための実例となるスコアリング基準を提供する。スコアペナルティを被り得るデザイン特徴の例は、以下を含むがそれに限定されない［ペナルティ値は、括弧の中に示されており、第一数はより低い温度アッセイ(例えば、62〜64℃)のためのものであり、第二はより高い温度アッセイ(例えば、65〜66℃)のためのものである］：
1. [100:100] INVADERオリゴヌクレオチドの3’末端はプローブアームに類似する：
2008533974.tif 000002
2. [70:70] プローブは、多型性を含有する5-塩基ストレッチ(すなわち連続的な5つの同一塩基)を有する；
3. [60:60] プローブは、多型性近くに5-塩基ストレッチを有する。
4. [50:50] プローブは、多型性から1塩基の5-塩基ストレッチを有する；
5. [40:40] プローブは、多型性から2塩基の5-塩基ストレッチを有する；
6. [50:50] プローブ5-塩基ストレッチは、Gsに属する−付加的なペナルティ；
7. [100:100] プローブは、6-塩基ストレッチをどこかに有する；
8. [90:90] 2つまたは3つの塩基配列は、少なくとも4回反復する；
9. [100:100] 変性塩基が、プローブ中に存在する。
10. [60:90] プローブとハイブリダイズする領域は短い(デザイン65〜67℃について13塩基以下；デザイン62〜64℃について12塩基以下)
11. [40:90] プローブとハイブリダイズする領域は長い(デザイン65〜67℃について29塩基またはそれ以上、デザイン62〜64℃について28塩基またはそれ以上)
12. [5:5] プローブとハイブリダイズする領域の長さ−塩基あたりの付加的なペナルティ
13. [80:80] プローブアーム後の最初の3塩基における乏しい識別を有する挿入/欠失デザイン
14. [100:100] プローブ標的Tmの7.5℃内で算出されたINVADERオリゴヌクレオチドTm (INVADERオリゴヌクレオチド?70.5℃未満でのデザイン65〜67℃、INVADERオリゴヌクレオチド?69.5℃でのデザイン62〜64℃)
15. [20:20] 算出されたプローブTmは、2.0℃超だけ異なる
16. [100:100] プローブは、その標的Tmよりも2℃低い算出されたTmを有する
17. [10:10]他の鎖よりも8塩基長いある鎖の標的
18. [30:30] INVADERオリゴヌクレオチドは、6塩基ストレッチをどこかに有する−最初のペナルティ
19. [70:70] INVADERオリゴヌクレオチド6塩基ストレッチは、Gsに属する−付加的なペナルティ
20. [15:15] プローブとハイブリダイズする領域は、14、15または24〜28塩基長(65〜67℃)または13、14または26、27塩基長(62〜64℃)である。
21. [15:15] プローブは、多型性を含有するGsの4塩基ストレッチを有する 
【０２３２】
特に好ましい態様において、デザインにおけるオリゴヌクレオチドの各々についての温度が再計算され、スコアは変化がなされるにつれ再計算される。幾つかの態様において、スコア記載は、「記載("descriptions")」ボタンをクリックすることによって見られる。幾つかの態様において、BLAST検索オプションが提供される。好ましい態様において、BLAST検索は、「BLASTデザイン("BLAST Design")」ボタンをクリックすることによってなされる。幾つかの態様において、この動作は、BLAST処理を記載するダイアログボックスをもたらす。好ましい態様において、BLAST検索結果は、デザイナーワークシート上の強調されたデザインとして表示される。
【０２３３】
幾つかの態様において、ユーザーは、「受理("Accept")」ボタンをクリックすることによってデザインを受理する。他の態様において、プログラムは、ユーザーの介在なしでデザインを承認する。好ましい態様において、プログラムは、承認されたデザインを次の処理段階へ(例えば、産生へ；ファイルまたはデータベースへ)送信する。幾つかの態様において、プログラムは、作成された最終的なデザインの概説を可能にし、デザインへ付記される注釈を可能にするスクリーンビュー(例えば、出力ページ)を提供する。好ましい態様において、ユーザーは、デザイナーワークシートへ(例えば、「戻る("Go Back")」ボタンをクリックすることによって)戻ることができるか、(例えば、「保存する("Save It")」ボタンをクリックすることによって)デザインを保存でき、続行できる(例えば、産生のために設計されるオリゴヌクレオチドを提出するよう)。
【０２３４】
幾つかの態様において、プログラムは、印刷(例えば、テキストのみのビュー)または他のエクスポート(例えば、出力ビュー)のために最適化されたデザインのスクリーンビューを作製するためにオプションを提供する。好ましい態様において、出力ビューは、印刷または別の適用へのエクスポートするのに特に適したデザインの記載を提供する(例えば、別の適用へのコピーおよびペーストによって)。特に好ましい態様において、出力ビューは、個別のウィンドウにおいて開く。
【０２３５】
本発明は、INVADERCREATORソフトウェアの使用に制限されるわけではない。実際、ソフトウェアプログラムの多様性が企図され、市販されており、GCG Wisconsinパッケージ(Genetics computer Group, Madison, WI)およびVector NTI (Informax, Rockville, Maryland)を含むがそれらに限定されない。他の検出アッセイは、本発明において使用され得る。
【０２３６】
多重反応
1988年のその導入(Chamberlain, et al. Nucleic Acids Res., 16:11141 (1988))以来、多重PCRは、単一反応における複数の遺伝子座を増幅するルーチンの手段になってきた。このアプローチは、多くの研究、および臨床上の適用における有用性を見出してきた。多重PCRは、とりわけ、診断用ウイルス学(Elnifro, et al. Clinical Microbiology Reviews, 13: 559 (2000))、父系性検査(Hidding and Schmitt, Forensic Sci. Int., 113: 47 (2000); Bauer et al., Int. J. Legal Med. 116: 39 (2002))、移植前遺伝子診断(Ouhibi, et al., Curr Womens Health Rep. 1 : 138 (2001))、環境試料および食品試料における微生物分析(Rudi et al., Int J Food Microbiology, 78: 171 (2002))、および獣医学(Zarlenga and Higgins, Vet Parasitol. 101: 215 (2001))における使用について記載されてきた。最近、全ゲノムレベルに対する、特に単一ヌクレオチド多型性、またはSNPについての遺伝子分析の拡大が、高度に多重化されているPCR能力の必要性を作り出してきた。比較ゲノム全体の関係性および候補遺伝子の研究は、個体あたり100,000〜500,000SNPの遺伝子型に対する能力を必要とする(Kwok, Molecular Medicine Today, 5: 538-5435 (1999); Kwok, Pharmacogenomics, 1:231 (2000); Risch and Merikangas, Science, 273: 1516 (1996))。さらに、コード化または制御領域におけるSNPは、重要な方法において遺伝子機能を変化させ(Cargill et al. Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka et al., Nature Genetics, 22: 239 (1999))、個人化された医学においてこれらのSNPを有用な診断道具にする(Hagmann, Science, 285: 21 (1999); Cargill et al. Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka et al., Nature Genetics, 22: 239 (1999))。同様に、診断パネルの一部としてのSNPセットの有用な臨床上の関連性についてすでに同定された該セットの医学的関係性を確証することは、一度に何千ものマーカーについて何千もの個体を検査することを意味する。
【０２３７】
その幅広い魅力および有用性にもかかわらず、幾つもの因子が多重PCR増幅を複雑にする。これらのうちの主なものは、PCRまたは増幅の現象であり、その中である座が他よりも多くの程度まで増幅される。増幅バイアスの2つのクラスが記載されてきた。1つは、PCRドリフトと呼ばれ、反応の初期段階中にアニールするプライマーのような段階における確率的変異に起因し(Polz and Cavanaugh, Applied and Environmental Microbiology, 64: 3724 (1998))、再生可能ではなく、標的分子の非常に少量が増幅されているとき、より有力であり得る(Walsh et al., PCR Methods and Applications, 1: 241 (1992))。もう一方は、PCR選択と呼ばれ、プライマーの特徴、アンプリコンの長さ、G-C含有量、およびゲノムの他の特性に基づいて幾つかの座の優先的な増幅に属する(Polz、前記)。
【０２３８】
PCR反応が多重化できる程度に影響する別の因子は、プラトー相に到達するPCR反応の固有の傾向である。プラトー相は、より後期のPCR周期において見られ、アンプリコン生成が指数関数的蓄積から偽直線的蓄積まで移動した後、結果として増大を停止させるという知見を反映する。この効果は、DNAポリメラーゼと二本鎖産物自体との間の非特異的相互作用によるらしい。プラトー相における産物と酵素とのモル比は、酵素の異なる量が反応に含まれ、約30:1の産物：酵素であるときでさえ、いくつものDNAポリメラーゼについて典型的に一致する。したがって、この効果は、増幅される異なる座の数がその後の分析について、例えばゲル電気泳動プライマー伸長等によって望まれる各アンプリコンの合計量に対して平衡化されなければならないように、PCR反応において生成できる二本鎖産物の合計量を限定する。
【０２３９】
これらおよび他の考慮のため、50の座を含む多重化されているPCRが報告されている(Lindblad-Toh et al., Nature Genet. 4: 381 (2000))ものの、多重化は典型的に、10未満の別個の産物に限定される。しかしながら、単一ゲノム試料から100,000〜450,000SNPと同じくらい多くを分析する必要性を付与されると、PCR反応の多重化能力を拡大する手段についての明確な必要性がある。
【０２４０】
本発明は、例えばINVADERアッセイを多重PCR増幅と組み合わせることによって、PCR反応の実質的な多重化のための方法を提供する。INVADERアッセイは、検出段階および、標的の非常に多数が多重反応において検出されることを可能にするシグナル増幅を提供する。望まれるように、何百〜何千〜何十万もの標的が多重反応において検出され得る。
【０２４１】
INVADERアッセイによる直接的な遺伝子型同定は典型的に、検出プラットフォームに依存して、SNPあたりのヒトゲノムDNAの5〜100ngを使用する。少数のアッセイについて、反応は、標的前増幅なしでゲノムDNAにより直接実施できるが、しかしながら高度に多重の反応については、試料DNAの量は限定因子になり得る。
【０２４２】
INVADERアッセイは、シグナルの106〜107倍増幅を提供するため、INVADERアッセイと組み合わせた多重化されているPCRは、典型的なPCRと比較して、限定された標的増幅のみを使用すると考えられる。結果的に、低い標的増幅レベルは、混合物中の個々の反応間の干渉を緩和し、その産物のその蓄積によってPCRの阻害を低下させ、したがってより広範な多重化を提供する。加えて、低い増幅レベルが標的交差夾雑の確率を低下させ、PCRにより導入される突然変異の数を低下させることが企図される。
【０２４３】
異なる座の均質でない増幅は、多重化されているPCRの開発における最大の挑戦の1つを表す。2つの座間の増幅因子における差は、ゆっくり増幅する座とのINVADER反応によって生成されるシグナルがアッセイの検出の限界を下回る状況を生じ得るのに対し、速く増幅する座からのシグナルは、アッセイの飽和レベルを超える。この問題は、幾つかの方法で対処できる。幾つかの態様において、INVADER反応は、異なる時点で、例えばリアルタイムで読み取れ、したがって、検出のダイナミックレンジを有意に拡大させる。他の態様において、多重PCRは、異なる座が増幅のより同様のレベルに到達するのを可能にする条件下で実施できる。例えば、プライマー濃度は限定でき、それにより各座が増幅のより均一なレベルに到達するのを可能にする。さらに他の態様において、PCRプライマーの濃度は、異なる座の増幅因子を平衡化するよう調整できる。
【０２４４】
本発明は、単一反応における産物の何百〜何千もを含む高度に多重のPCRのデザインおよび特徴を提供する。例えば、百重PCRによって提供される標的前増幅は、アッセイあたり0.1ng未満に対するINVADERに基づいたSNP遺伝子型同定に必要なヒトゲノムDNAの量を低下させる。高度に多重のPCR最適化およびプライマーデザインのためのコンピュータプログラムの詳細は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願番号第10/967,711号および第10/321,039号に記載されている。
【０２４５】
高度に多重のPCRについて方法を提供することに加え、本発明は、その後の操作も初期反応セットアップを超える試薬添加も有さない単一反応容器における逆転写ならびに標的およびシグナル増幅反応を実施する方法をさらに提供する。このような組み合わされた反応は、非常に短い反応時間において標的量を限定する定量的な分析に適している。このような反応を実施するための方法は、その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願番号第11/266,723号に記載されている。
【０２４６】
B. 他の検出アッセイ
本発明は、INVADERアッセイによる標的配列の検出に限定されない。本発明の方法および組成物は、以下に記載されるのもを含むがそれに限定されない多数の検出アッセイのダイナミックレンジを増大させる上での使用を見出す。
【０２４７】
1. ハイブリダイゼーションアッセイ
幾つかの態様において、本発明の方法および組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイのダイナミックレンジを増大させる上での使用を見出す。ハイブリダイゼーションおよび検出のためのさまざまな技術を使用するさまざまなハイブリダイゼーションアッセイが利用可能である。アッセイの選択の記載は、以下に提供される。
【０２４８】
a. ハイブリダイゼーションの直接的な検出
幾つかの態様において、プローブの関心対象の配列とのハイブリダイゼーションは、結合したプローブを可視化することによって直接検出される(例えば、ノーザンアッセイまたはサザンアッセイ；例えば、Ausabel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY [1991]参照)。これらのアッセイにおいて、ゲノムDNA (サザン)またはRNA (ノーザン)が対象から単離される。DNAまたはRNAはその後、ゲノムにおいてまれに切断する一連の制限酵素で切断され、任意のマーカーの近くではないところがアッセイされる。DNAまたはRNAはその後分離され(例えば、アガロースゲル上で)、膜へ転移される。検出される標的配列に特異的な標識化された(例えば、放射性ヌクレオチドを組み込むことによって)プローブは、ある条件あるいは低い、中程度の、または高いストリンジェンシー条件下で膜と接触させられる。結合していないプローブは除去され、結合の存在は、標識化したプローブを可視化することによって検出される。
【０２４９】
b. 「DNAチップ」アッセイを使用するハイブリダイゼーションの検出
本発明の幾つかの態様において、変異体配列は、DNAチップ(例えば、アレイ)ハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出される。本アッセイにおいて、一連のオリゴヌクレオチドプローブが固体支持体へ固定される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、所与の標的配列に対して特有であるよう設計される。好ましい態様において、アレイは、アッセイのダイナミックレンジを増大させるために、複数のプローブ(例えば、完全に相補的なプローブのミスマッチまたは異なる量)を含む。関心対象のDNA試料は、DNA「チップ」と接触され、ハイブリダイゼーションが検出される。
【０２５０】
幾つかの態様において、DNAチップアッセイは、GeneChip(Affymetrix, Santa Clara, CA；例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,045,996号；第5,925,525号；および第5,858,659号参照)アッセイである。ジーンチップ技術は、「チップ」へ固定されたオリゴヌクレオチドプローブの小型化した高密度アレイを使用する。プローブアレイは、固相化学合成を半導体産業において採用されるフォトリソグラフィー作製技術と組み合わせるAffymetrixの光配向性化学合成プロセスによって製造される。チップ露光部位を定義するために一連のフォトリソグラフィーマスクの後に特異的化学合成段階を使用して、プロセスは、アレイにおけるあらかじめ定義された位置にある各プローブにより、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを構築する。複数のプローブアレイは、大きなガラスウェーハー上に同時に合成される。ウェーハーはその後さいの目にされ、個々のプローブアレイは、環境から該プローブアレイを保護し、ハイブリダイゼーションのためのチャンバーとして機能する注入成形されたプラスチックカートリッジに包装される。
【０２５１】
分析される核酸が単離され、PCRによって増幅され、蛍光レポーター基で標識化される。標識化されたDNAはその後、流体工学ステーションを使用してアレイとともにインキュベートされる。アレイはその後スキャナへ挿入され、そこでハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションデータは、プローブアレイへ結合する標的へすでに組み込まれた蛍光レポーター基から放射される光として回収される。標的と完全に符合するプローブは一般的に、ミスマッチを有するものよりも強いシグナルを産生する。アレイ上の各プローブの配列および位置が既知であるため、相補性によって、プローブアレイへ供給される標的核酸の同一性が決定できる。
【０２５２】
他の態様において、電子的に捕捉されるプローブ(Nanogen, San Diego, CA)を含有するDNAマイクロチップが利用される(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,017,696号；第6,068,818号；および第6,051,380号参照)。超小型電子技術の使用を通じて、Nanogenの技術は、荷電された分子の、その半導体マイクロチップ上の指定された検査部位へのおよびそこからの活発な移動および濃縮を可能にする。所与のSNPまたは突然変異に対して特有のDNA捕捉プローブは、マイクロチップ上の特異的部位に電子的に置かれるか、または該特異的部位へ「アドレス指定される」。DNAが強い負の電荷を有するため、DNAは、正の電荷の領域へと電子的に移動できる。
【０２５３】
まず、マイクロチップ上の検査部位または検査部位の行は、正の電荷で電子的に活性化される。次に、DNAプローブを含有する溶液は、マイクロチップへと導入される。負に荷電したプローブは、正に荷電した部位へと迅速に移動し、そこで該プローブが濃縮し、マイクロチップ上の部位へと化学的に結合する。マイクロチップはその後洗浄され、特異的に結合するDNAプローブのアレイが完成するまで、別個のDNAプローブの別の溶液が添加される。
【０２５４】
検査試料はその後、DNA捕捉プローブのどれが、検査試料中の相補的なDNAとハイブリダイズするかを決定することによって、標的DNA分子の存在について分析される(例えば、関心対象のPCR増幅された遺伝子)。電子的な電荷は、マイクロチップ上の一つまたは複数の検査部位へ標的分子を移動および濃縮させるためにも使用される。各検査部位での試料DNAの電子的濃縮は、試料DNAの相補的な捕捉プローブとの迅速なハイブリダイゼーションを促進する(ハイブリダイゼーションは数分で生じ得る)。各部位からの任意の結合していないかまたは非特異的に結合したDNAを除去するため、該部位の極性または電荷は負に逆転され、それにより任意の結合していないかまたは非特異的に結合したDNAを溶液へと、捕捉プローブから離れるよう強制する。レーザーに基づいた蛍光スキャナは、結合を検出するのに使用される。
【０２５５】
なおもさらなる態様において、表面張力(ProtoGene, Palo Alto, CA)における差による平らな表面(チップ)上の液体の隔離に基づいたアレイ技術が利用される(例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,001,311号；第5,985,551号；および第5,474,796号参照)。Protogeneの技術は、化学的コーティングによって付与された表面張力における差によって液体が隔離できるという事実に基づいている。一度そのように隔離されると、オリゴヌクレオチドプローブは、試薬のインクジェット印刷によってチップ上に直接合成される。表面張力によって定義されるその反応部位を有するアレイは、1つが4つの標準的なDNA塩基の各々のためである4つの圧電性ノズルのセットの下で、X/Y翻訳ステージ上に装着される。翻訳ステージは、アレイの行の各々に添って移動し、適切な試薬が反応部位の各々へ送達される。例えば、Aアミダイトは、アミダイトAがその合成段階等の間に結合されるべき部位へのみ送達される。共通の試薬および洗浄液は、全体的な表面を被らせた後、それらを回転によって除去することによって送達される。
【０２５６】
標的核酸について特有のDNAプローブは、Protogeneの技術を使用してチップへ固定される。チップはその後、関心対象のPCR増幅された遺伝子と接触されられる。ハイブリダイゼーションの後、結合していないDNAが除去され、ハイブリダイゼーションは任意の適切な方法を使用して検出される(例えば、組み込まれた蛍光基の蛍光脱消光による)。
【０２５７】
さらに他の態様において、「ビーズアレイ(bead array)」は、多型性の検出に使用される(Illumina, San Diego, CA；例えば、参照により本明細書に各々組み入れられるPCT公報第WO 99/67641号および第WO 00/39587号参照)。Illuminaは、光ファイバー束とアレイへ自己重合するビーズとを組み合わせるBEAD ARRAY技術を使用する。各光ファイバー束は、該束の直径に依存して個々のファイバーの何千〜何百万本を含有する。ビーズは、所与の標的核酸の検出に特異的なオリゴヌクレオチドでコーティングされる。ビーズのバッチは、アレイに特異的なプールを形成するために組み合わされる。アッセイを実施するため、BEAD ARRAYは、調製される対象試料(例えば、DNA)と接触する。ハイブリダイゼーションは、任意の適切な方法を使用して検出される。
【０２５８】
他の態様において、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,410,229号および第6,344,316号に記載されているアレイ方法が利用される。
【０２５９】
c. ハイブリダイゼーションの酵素的検出
幾つかの態様において、結合したプローブのハイブリダイゼーションは、TaqManアッセイを使用して検出される(PE Biosystems, Foster City, CA；例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第5,962,233号および第5,538,848号)。該アッセイは、PCR反応中に実施される。TaqManアッセイは、AMPLITAQ DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を活用する。所与の対立遺伝子または突然変異に特異的なプローブは、該PCR反応に含まれる。プローブは、5'レポーター色素(例えば、蛍光色素)および3'-消光剤を有するオリゴヌクレオチドからなる。PCRの間、プローブがその標的へ結合する場合、AMPLITAQポリメラーゼの5'-3'核酸分解活性は、レポーターと消光剤との間でプローブを切断する。レポーター色素の消光剤からの分離は、蛍光の増大を結果として生じる。シグナルは、PCRの各周期で蓄積し、蛍光光度計でモニターできる。
【０２６０】
なおさらなる態様において、多型性は、SNP-ITプライマー伸長アッセイを使用して検出される(Orchid Biosciences, Princeton, NJ；例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第5,952,174号および第5,919,626号)。本アッセイにおいて、SNPは、推測されたSNP位置で1つの塩基によってDNA鎖を選択的に伸長するために、特異的に合成されたDNAプライマーおよびDNAポリメラーゼを使用することによって同定される。関心対象の領域にあるDNAは、増幅され変性される。ポリメラーゼ反応はその後、マイクロフルイディクスと呼ばれる小型化したシステムを使用して実施される。検出は、SNPまたは突然変異位置にあると思われるヌクレオチドへ標識を付加することによって達成される。標識のDNAの組み込みは、任意の適切な方法によって検出できる(例えば、該ヌクレオチドがビオチン標識を含む場合、検出は、ビオチンに特異的な蛍光標識化された抗体を介する)。
【０２６１】
さらに他の態様において、本発明の方法および組成物は、米国特許第6,528,254号(その全ての内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている方法とともに利用される。該方法は、プライマーおよび核酸ポリメラーゼを使用して切断構造を生成させる段階および該切断構造をFENエンドヌクレアーゼで切断する段階を含む。
【０２６２】
2. 連結アッセイ
他の態様において、リガーゼに基づいた検出アッセイは、本発明の方法および組成物とともに利用される。例えば、幾つかの態様において、米国特許第5,521,065号および第5,514,543号に記載されている方法(その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる)が利用される。簡潔には、該方法は、一本鎖核酸断片の混合物を、標的配列の第一領域と相補的な第一プローブ、および標的配列の第二領域と相補的な第二プローブと反応させる段階を包含し、ここで、第一および第二表的領域は、該2つのプローブが、それらの結合する標的領域と安定してハイブリダイズされるハイブリダイゼーション条件下で、互いに連続している。ハイブリダイゼーションの後、連続した第一および第二標的領域とハイブリダイズされた任意の第一および第二プローブが連結され、試料は、期待されるプローブ連結産物の存在について検査される。連結された産物の存在は、標的配列が試料中に存在することを示す。幾つかの態様において、連結反応は、核酸増幅反応と同時に実施される(例えば、その全ての内容が全体として参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第6,130,073号および第5,912,148号参照)。
【０２６３】
C. マイクロアレイおよび固体支持体
幾つかの態様において、本発明はマイクロアレイを提供する。マイクロアレイは、本明細書で記載される任意の検出アッセイとともに利用され得る。以下の論議は、INVADERアッセイおよびTAQMANアッセイの脈絡においてマイクロアレイを記載する。しかしながら、当業者は、マイクロアレイが多数の検出アッセイの使用に適し得ることを認識する。
【０２６４】
マイクロアレイは、検出アッセイが固体表面上で実施され得るよう、固体表面へ結合されるかあるいは固体表面上または固体表面の近くに配置されるアッセイ試薬および/または標的を含み得る(つまり、マイクロアレイスポットが形成される)。幾つかの好ましい態様において、マイクロアレイスポットは、特異的および定義された化学的および物理的特徴を有するよう生成される。他の態様において、マイクロアレイは、検出アッセイを実施するために、複数の反応チャンバー(例えば、毛細管)を含み得る。幾つかのこのような態様において、核酸または他の検出アッセイ構成要素が、反応チャンバーの表面へ結合される。他の態様において、検出アッセイ構成要素は、すべて液相にあるか、反応チャンバー中で乾燥される。
【０２６５】
本明細書で使用されるように、用語「マイクロアレイスポット」は、マイクロウェル中の非水性液体の層中で、または検出アッセイ試薬の集団を含有する反応チャンバーにおいて、固体表面上に形成されている。マイクロアレイスポットは、検出アッセイ試薬を含む試薬試料が転移手段(例えば、ピンスポッティング道具、インクジェットプリンタ等)によって固体表面(または固体表面上のフィルム)へ適用されるとき、固体表面(例えば、ガラス、TEFLON)上にあるいは非水性液体または固体表面上にある他の材料の層において形成され得る。好ましい態様において、固体基質(例えば、以下に記載されるとおり改変される)はマイクロウェルを含有し、マイクロアレイスポットはマイクロウェルに適用される。他の態様において、固体支持体は、マイクロウェルが印刷/作製され、必要な試薬がこれらのマイクロウェルへと導入されるプラットフォームとして機能し、その後の反応は全体的に溶液中で起こる。固体支持体上でのマイクロウェルの作製は、表面張力および親水性ポケットのエッチング(例えば、Protogene Corp.に帰属する特許公報において記載されるような)を含む、多くの方法において達成され得る。例えば、支持体の表面は、疎水性層でコーティングされ得、疎水性層をエッチングする化学的構成要素はその後、わずかな容積において該支持体へ印刷される(例えば、疎水性層の物理的または化学的特性における局所的な変化を生成させるために)。印刷は、親水性マイクロウェルのアレイを結果として生じる。印刷された疎水性または親水性のタワーのアレイは、マイクロアレイを作製するのに採用され得る。スライドの表面は疎水性層でコーティングされ得た後、疎水性表面の上部に親水性層を作製する支持体上に印刷される。印刷は、親水性タワーのアレイを結果として生じる。機械的マイクロウェルは、物理的遮蔽、+/-化学的遮蔽を使用して作製され得る。例えば、金の格子などのマイクログリッドは、支持体上で固定され得るか、またはマイクロウェルは、支持体へと穿孔され得る(例えば、BMLによって示されるように)。また、マイクロアレイは、TEFLONなどの親水性インクを使用して該支持体上に印刷され得る。このようなアレイは、Precision Lab Products, LLC, Middleton, WIを通じて商業的に入手可能である。さらに別の変法において、検出アッセイアレイのフォーマットに関する顧客の好みのデータが、本発明の構成要素とともに使用されるデータベースに保存されている。この情報は、顧客についての最小の同定情報、例えば氏名、アカウント番号またはパスワードに基づいた特定の顧客のために産物を自動的に形成するのに使用できる。幾つかの態様において、望ましい反応構成要素(例えば、標的核酸または検出アッセイ構成要素)がウェルへスポットまたは供給された後、毛細管などの小さな反応チャンバーへと採取される。反応はその後、該反応チャンバー内で生じる。
【０２６６】
多くのタイプの方法が望ましい試薬のマイクロアレイへの印刷に使用され得る(例えば、マイクロウェルへ印刷されるマイクロアレイスポット)。幾つかの態様において、ピン道具を使用して、アレイに機械的に(例えば、参照により本明細書に組み入れられるShalon, Genome Methods, 6:639 [1996]参照)負荷する(例えば、マイクロアレイスポットを生成する)。他の態様において、インクジェット技術は、ウェルに一つまたは複数のマイクロアレイスポットを作製するため、固体表面へオリゴヌクレオチドを印刷するのに使用される(例えば、参照により本明細書に組み入れられるO'Donnelly-Maloney et al., Genetic Analysis:Biomolecular Engineering, 13:151 [1996])。
【０２６７】
固体支持体(例えば、マイクロウェルアレイを有する)への印刷に望ましい試薬の例は、核酸検出アッセイを実施するよう設計されたINVADER反応試薬などの分子試薬(例えば、SNP検出アッセイのアレイは、ウェルに印刷され得る)；およびヒトゲノムDNA(hgDNA)などの標的核酸を含むがそれらに限定されるわけではなく、異なる試料のアレイを結果として生じる。また、望ましい試薬は、エッチング/コーティング試薬と同時に供給され得るか、またはエッチングプロセス後にマイクロウェル/タワーへ印刷され得る。機械的遮蔽とともに作製されたアレイについて、望ましい試薬は、例えば、結果として生じるウェルへと印刷される。幾つかの態様において、望ましい試薬は、マイクロウェルを十分にコーティングし、親水性の、高タンパク質溶液(例えば、BSA、無脂肪粉乳)などの反応に役立つ環境を作製する溶液中で印刷される必要があり得る。ある態様において、望ましい試薬は、試薬を固定する試薬の上に「コーティング」を作製する溶液中で印刷される必要もあり得、このことは、FICOLLまたはデキストランなどの高分子量炭水化物の添加で達成され得る。幾つかの態様において、コーティングは油である。
【０２６８】
標的溶液のマイクロアレイ(または標的が反応チャンバーに印刷されているか又は採取されている場合、反応試薬)への適用は、多くの方法において達成され得る。例えば、固体支持体は、標的を含有する溶液へまたは少なくとも2つの開口部を有するチャンバーに支持体を置いた後、表面上の溶液を真空で引っ張るかまたは毛細管作用を介し表面上に溶液を流すことを可能にすることによって浸され得る。このような方法を実施するのに有用な装置の例は、TECAN-GenePaintシステム、およびAutoGenomics AutoGene Systemを含むがそれに限定されない。さらに別の態様において、Virtek Corp.から市販されているスポット作製装置は、プレート、スライドおよび同等物へ様々な検出アッセイをスポットするのに使用される。
【０２６９】
幾つかの態様において、溶液(例えば、反応試薬または標的溶液)は、支持体の表面上でドラッグされ、回転され、またはスクィージーをかけられる。このタイプの適用に有用な装置の一つのタイプは、支持体を保持するフレームのついたホルダーである。ホルダーの片端にあるのは、正面に標的溶液の負荷のためのチャネルを有するローラー/スクィージーまたは同様のものである。表面上でローラー/スクィージーを移動させるプロセスは、標的溶液をマイクロウェルへ適用する。ホルダーの反対側の端にあるのは、使用されていない標的溶液を捕捉する(したがって、望まれる場合、別のアレイ上での再使用を可能にする)貯蔵器である。ローラー/スクィージーの後ろにあるのは蒸発遮蔽(例えば、鉱油、光学的に透明な接着テープ等)であり、ローラー/スクィージーが表面上を移動するときに適用される。
【０２７０】
標的溶液のマイクロウェルまたは反応チャンバーアレイへの適用は、マイクロウェルまたは反応チャンバーの配置の各々で溶液の析出を結果として生じる。化学的および/または機械的遮蔽は、アレイの統合性を維持し、要素間で試薬の交差夾雑を防止するであろう。幾つかの好ましい態様において、マイクロウェルまたは反応チャンバー中の材料は乾燥される。幾つかのこのような態様において、試薬は、超低容積の反応混合物を結果として生じる標的溶液(または検出アッセイ構成要素溶液)によって再水和される。幾つかの態様において、マイクロアレイ反応は、高温インキュベーションを可能にするため、鉱油または幾つかの他の適切な蒸発遮蔽または湿度チャンバーで覆われる。生成するシグナルは、蛍光顕微鏡、アレイリーダーまたは標準的な蛍光プレートリーダーを使用して、適用される蒸発遮蔽を通じて直接検出され得る。
【０２７１】
INVADERアッセイ(例えば、各ウェルにおいてINVADERアッセイ構成要素を乾燥させた)を実施するためのマイクロウェル−マイクロアレイの使用の利点は、以下を含むがそれらに限定されない：核酸検出アッセイのためのINVADER Biplexフォーマットを使用する能力；hgDNAを直接的に検出する十分な感受性、「普遍的な」FRETカセットを使用する能力；必要とされる結合化学物質のないこと(これは、すでに存在している在庫の試薬を、マイクロアレイを印刷するのに使用できるであろうことを意味する)、ハイブリダイゼーションに及ぼす表面効果をもたらすために、hgDNAを分画する必要のないこと、何万もの要求を作製するのに必要とされるhgDNAの低質量、低容積の必要性(例えば、100μmのマイクロウェルは、0.28nlの容積を有するであろうし、アレイあたり104のマイクロウェルでは2.8μlの容積がウェルを全て満たすであろう)、333ng/μl hgDNAの溶液は、マイクロウェルあたり約100コピー(これは、20μl反応において100ng hgDNAの使用よりも33倍濃縮されている)、したがって104の要求について2.8μl×333ng/μl＝670ng hgDNAまたは要求あたり0.07ngを結果として生じるであろう。他の検出アッセイもこのフォーマットにおいて表され得ることが理解される。
【０２７２】
1. マイクロアレイスポットを非水性液体で生成および使用する段階
ある好ましい態様において、本発明は、検出アッセイ試薬溶液を、非水性液体を含有するウェルへ適用することによって、ウェルにおいてマイクロアレイスポットを生成するための方法を提供する。他の好ましい態様において、本発明は、マイクロアレイスポットを覆う非水性液体の層を通じて検査試料溶液(例えば、標的核酸を含む)を噴射することによる、マイクロアレイスポットを検査試料溶液と接触させる方法を提供する。ある態様において、固体支持体は、ゾル−ゲルフィルム(以下により詳細に記載される)でコーティングされる。
【０２７３】
幾つかの態様において、本発明は、a) i)ウェルを含む固体支持体、ii)非水性液体、およびiii)検出試薬溶液を提供する段階；およびb)非水溶性液体をウェルへ添加する段階、およびc)少なくとも1つのマイクロアレイスポットがウェルに形成されるような条件下で、非水性液体を通じて検出試薬溶液をウェルへ添加する段階を含む。他の態様において、方法は、d)少なくとも1つのマイクロアレイスポットを検査試料溶液と接触させる段階をさらに含む。付加的態様において、接触させる段階は、ウェル中の非水性液体を通じて検査試料溶液を推進する段階を含む。
【０２７４】
特定の態様において、非水性液体は油である。他の態様において、固体支持体は、複数のウェルを含み、方法は複数のウェルで実施される。さらなる態様において、少なくとも2つのマイクロアレイ−スポットが、同時に形成される(例えば、該複数のウェルの少なくとも2つにおいて)。
【０２７５】
幾つかの態様において、検査試料溶液は、標的核酸分子を含む。好ましい態様において、標的溶液は、800コピー未満の標的核酸分子、または400コピー未満の標的核酸分子または200コピー未満の標的核酸分子を含む。特定の態様において、マイクロアレイ−スポットを検査試料溶液と接触させる段階は、標的核酸分子中の多型性、または検出されるべき他の望ましい特定の配列の存在または非存在を同定する。幾つかの態様において、ウェルは、ゾル−ゲルコーティングでコーティングされる(例えば、マイクロアレイ−スポット形成の前に)。
【０２７６】
他の態様において、検出試薬溶液は、以下より選択される検出アッセイとの使用のために作製される；TAQMANアッセイ、またはINVADERアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、回転周期伸長アッセイ、配列決定アッセイ、多型性と相補的なプローブを採用するハイブリダイゼーションアッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分岐型ハイブリダイゼーションアッセイ、NASBAアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイおよびサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。好ましい態様において、検出試薬溶液は、INVADERオリゴヌクレオチド、および5'プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【０２７７】
付加的な態様において、接触させる段階は、SYNQUADナノ容積ピペッティングシステム、または他の流体転移システムまたは装置で実施される。好ましい態様において、市販されているCARTESIAN SYNQUADナノ容積ピペッティングシステムが採用される。その両方とも参照により特異的に組み入れられる米国特許第6,063,339号および第6,258,103号、ならびにその全てが参照により特異的に組み入れられるPCT出願：第WO0157254号；第WO0049959号；第WO0001798号；および第WO9942804号に記載されているものを含む同様の装置も採用され得る。
【０２７８】
特定の態様において、少なくとも2つのマイクロアレイ−スポットがウェルに形成されている(または少なくとも3または4または5つのマイクロアレイ−スポットが各ウェルに形成されている)。マルチウェルフォーマットにおいて、複数のマイクロアレイ−スポットを採用することは、単一固体支持体上で実施できる反応の数を増す(例えば、4つのマイクロアレイ−スポットが1536ウェルプレートにおいて1536ウェルの各々に形成されている場合、6144個のマイクロアレイ−スポットが検出反応を実施するために利用可能であると考えられる)。さらなる態様において、本発明は、上述の方法によって形成されているウェルを有する固体支持体を提供する。
【０２７９】
幾つかの態様において、本発明は、a) i)マイクロアレイ−スポットを含む固体支持体、ii)非水性液体；およびiii)検査試料溶液を提供する段階；ならびにb)該マイクロアレイ−スポットを該非水性液体の層で覆う段階、およびc)該非水性液体の層を通じて該マイクロアレイ−スポットを該検査試料溶液と接触させる段階を含む方法を提供する。他の態様において、検査試料溶液は標的核酸分子を含む。さらなる態様において、接触させる段階は、標的核酸分子における少なくとも1つの多型性の存在または非存在を同定する。好ましい態様において、検査試料溶液は、標的核酸分子を含む。好ましい態様において、標的溶液は、800コピー未満の標的核酸分子、または400コピー未満の標的核酸分子または200コピー未満の標的核酸分子を含む。
【０２８０】
ある態様において、マイクロアレイ−スポットは、以下より選択される検出アッセイとの使用のために形成される構成要素を含む；TAQMANアッセイ、またはINVADERアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、回転周期伸長アッセイ、配列決定アッセイ、多型性と相補的なプローブを採用するハイブリダイゼーションアッセイ、ビーズアレイアッセイ、プライマー伸長アッセイ、酵素ミスマッチ切断アッセイ、分岐型ハイブリダイゼーションアッセイ、NASBAアッセイ、分子ビーコンアッセイ、サイクリングプローブアッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイおよびサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ。好ましい態様において、マイクロアレイ−スポットは、INVADERオリゴヌクレオチド、および5'プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【０２８１】
幾つかの態様において、固体支持体はウェルを含み、マイクロアレイ−スポットは該ウェルの中に配置される。ある態様において、非水性液体は油である。他の態様において、固体支持体は複数のウェルを含み、方法は該複数のウェルで実施される。特定の態様において、少なくとも2つのマイクロアレイ−スポットが同時に形成されている。幾つかの態様において、少なくとも2つのマイクロアレイ−スポットがウェルに形成されている(または少なくとも3または4または5つのマイクロアレイ−スポットが各ウェルに形成されている)。マルチウェルフォーマットにおいて、複数のマイクロアレイ−スポットを採用することは、単一固体支持体上で実施できる反応の数を増す(例えば、4つのマイクロアレイ−スポットが1536ウェルプレートにおいて1536ウェルの各々に形成されている場合、6144個のマイクロアレイ−スポットが検出反応を実施するために利用可能であると考えられる；エッチングされた3072ウェルプレートが使用される場合、付加的なスポットが形成され得る)。さらなる態様において、本発明は、上述の方法によって形成されているウェルを有する固体支持体を提供する。
【０２８２】
幾つかの態様において、接触させる段階は、ウェル中の非水性液体を通じて検査試料溶液を推進させる段階を含む。他の態様において、該非水性液体は鉱油である。付加的な態様において、非水性液体は、鉱油、種子油、および石油から派生した油より選択される。
【０２８３】
付加的な態様において、接触させる段階は、SYNQUADナノ容積ピペッティングシステム、または他の液体転移システムまたは装置で実施される。好ましい態様において、市販されているCARTESIAN SYNQUADナノ容積ピペッティングシステムが採用される。その両方とも参照により特異的に組み入れられる米国特許第6,063,339号および第6,258,103号、ならびにその全てが参照により特異的に組み入れられるPCT出願：第WO0157254号；第WO0049959号；第WO0001798号；および第WO9942804号に記載されているものを含む同様の装置も採用され得る。
【０２８４】
幾つかの態様において、本発明は、a)ナノ容積ピペッティングシステム(例えば、SYNQUAD)、およびb)マイクロアレイ−スポットを含む固体支持体を含むシステムを提供し、ここで、マイクロアレイスポットは、非水性液体の層で覆っている。他の態様において、システムは、検査試料溶液をさらに含む。
【０２８５】
D. 固体支持体上でのアッセイのためのフォーマット
幾つかの態様において、検出アッセイが固体支持体上で実施される。以下の論議は、INVADERアッセイの脈絡における固体支持体上でのアッセイを記載する。しかしながら、当業者は、本明細書に記載される方法が、任意の核酸検出アッセイ(例えば、本明細書に記載される検出アッセイ)との使用に適し得ることを認識する。
【０２８６】
本発明は、INVADERアッセイの特定の設定に限定されない。構成要素であるオリゴヌクレオチドの多数の適切な設定が利用され得る。例えば、本発明の幾つかの態様において、プローブオリゴヌクレオチドは、固体支持体へ結合され、INVADERオリゴヌクレオチドおよびゲノムDNA(またはRNA)標的が溶液中に提供される。本発明の他の態様において、INVADERオリゴヌクレオチドが支持体へ結合され、プローブおよび標的が溶液中にある。さらに他の態様において、プローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドの両方が固体支持体へ結合される。さらなる態様において、標的核酸は固体支持体へ直接または間接的に結合し(例えば、切断構造の一部ではない結合オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを通して)、プローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方が、溶液中に提供されるかまたは支持体へ結合されるかのいずれかである。なおもさらなる態様において、一次INVADERアッセイ反応が溶液中で実施され、二次反応の一つまたは複数の構成要素が固体支持体へ結合される。さらに他の態様において、切断剤を含むINVADERアッセイ反応に必要な構成要素は全て、固体支持体へ結合される。
【０２８７】
本発明は、本明細書に記載される設定に限定されない。実際、当業者は、多数の付加的な設定が利用され得ることを認識する。検出可能な侵入型切断反応を支持する任意の設定が利用され得る。付加的な設定が、本明細書で開示されるものを含むがそれに限定されない任意の適切な方法を使用して同定される。
【０２８８】
1. 結合されているプローブオリゴヌクレオチド
幾つかの態様において、プローブオリゴヌクレオチドは固体支持体へ結合される。幾つかの態様において、プローブは、標識化されたシグナルプローブオリゴヌクレオチドである。シグナルプローブは、所与の標的分子の存在を示すシグナル分子を放出するために切断される。幾つかの態様において、シグナル分子は、その放射が消光している蛍光受容体からの分離に反応して増大するエネルギー転移反応(例えば、FRET)における蛍光供与体である。他の態様において、シグナル分子は、溶液への放出に際してのみ検出される蛍光部分である。さらに他の態様において、シグナル分子は、別個の電荷を運搬することによって全長のシグナルプローブから分離される蛍光標識化された小分子である。
【０２８９】
幾つかの態様において、反応によって生成されるシグナルを可視化することを分離段階が必要としないシステムが設計される。幾つかの態様において、このことは、蛍光供与体がシグナルプローブの切断後に固体支持体へ固定されたままであるFRETシステムにおいて達成される。このデザインは、FRET反応の性質から生じる幾つもの複雑性を有する。FRETシグナル分子における消光は、97〜99%のみ有効である(すなわち、供与体によって放射されるエネルギーの全てが消光剤によって吸収されるわけではない)。切断されていないプローブの背景を上回る、消光されていない供与体の蛍光を検出するため、プローブ分子の1〜3%を切断することが必要である。100μm×100μmの面積において、結合された約108個のプローブがあると仮定すると、約106個は、該プローブによって生成される固有の背景を上回って検出可能シグナルを生成させるために切断されるべきである。単一標的分子に関するINVADERアッセイ反応におけるプローブサイクリングは、1時間あたり約1000〜2000個の切断されたプローブ分子を生成できる(15〜30事象/標的/分の代謝回転速度を仮定する)。約1000個の標的分子が、切断されたシグナルプローブのこのレベルを生成するのに必要である。1nLの反応容積を仮定すると、必要な標的濃度は1pMとなり、操作できる最大値の範囲(例えば、0.5〜2.5pM)内に十分入る。最大未満のプローブ密度では、それにもかかわらず、各々が標的を含有するであろう統計的な見込みを確実にするために、各反応面積へ少なくとも10〜20個の標的分子(すなわち、10〜20fM溶液)を供給することが必要であろう。同一の標的濃度の考察は、他のFRET以外の代替物、例えば1%未満の切断がこれらの他の方法で検出可能であろうとしても、消光フルオロフォアありでまたはなしでの単一蛍光基の溶液中への放出、および正に荷電したシグナル分子の放出へ適用する。したがって、幾つかの態様において、希釈溶液が、より長い反応時間とともに使用される(例えば、100fM溶液が適用され得、反応は10〜24時間実施する)。
【０２９０】
2. 結合されているINVADERオリゴヌクレオチド
本発明の幾つかの態様において、INVADERオリゴヌクレオチドが固体支持体へ結合し、プローブオリゴヌクレオチドが溶液中に無い。この態様において、シグナルプローブのように、INVADERオリゴヌクレオチドが標的上にあるおよび標的から離れることを循環する必要がないため、INVADERオリゴヌクレオチド−標的二本鎖の長さに制限はない。したがって、INVADERオリゴヌクレオチドが固体支持体へ結合する幾つかの態様において、INVADERオリゴヌクレオチドは、固体支持体への試料の連続的な適用を通じて溶液から固体相へと標的分子を濃縮するための「捕捉」オリゴヌクレオチドとして使用される。例えば、1mg/ml標的溶液の1mlを適用することによって、100μM×100μM面積において106〜108個の標的分子を結合することが可能である。さらに、INVADERオリゴヌクレオチド−標的相互作用が安定であるよう設計されるため、幾つかの態様において、いっそうより低い背景レベルを確実にするため、シグナルプローブ、酵素等を適用する前に、結合していない標的および望ましくない試料を除去するために、支持体が洗浄される。他の態様において、研究されている座の近くにおける別個の領域と相補的な捕捉オリゴヌクレオチドが利用される。
【０２９１】
INVADERオリゴヌクレオチドが固体支持体へ結合され、シグナルプローブオリゴヌクレオチドが溶液中に無い、切断されていないシグナルプローブ゛反応から切断されているシグナルプローブ反応の分離のための幾つかの可能性が存在する。好ましい態様において、全長プローブおよび切断されたプローブの両方が溶液中にあるため、切断されたプローブを切断されていないプローブと化学的に区別することを可能にさせる標識化戦略が利用される。例えば、幾つかの態様(例えば、FRETシグナルプローブ)において、全長プローブは消光されるが、切断産物は蛍光シグナルを生成する。他の態様(例えば、CRE)において、全長プローブは負に荷電されるが、切断されたプローブは正に荷電される。
【０２９２】
しかしながら、幾つかの好ましい態様において、CRE分離が利用される。第一に、CREアプローチによって生成される切断されたシグナルプローブが、負に荷電した電極上で活発に捕捉される。この捕捉は、程度の等級と同じくらいまで標識化され切断されたプローブの濃縮と同様、切断されていない分子からの分割を結果として生じる。第二に、切断されたプローブを捕捉するための電場の使用は、切断されたプローブの拡散を防止するためのミクロ機械の微小ウェルに対する必要性を排除する。
【０２９３】
3. 結合されていプローブおよびINVADERオリゴヌクレオチドの両方
本発明の幾つかの態様において、プローブおよびINVADERオリゴヌクレオチドの両方が、固体支持体へ結合される。好ましい態様において、プローブヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドは、標的核酸がプローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドの両方を結合し得るよう、同一の固体支持体上に近接近して配置される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、それらの接近性を改善し、オリゴヌクレオチド間の相互作用を低下させるため、スペーサー分子を介して結合される。
【０２９４】
幾つかの好ましい態様において、単一のINVADERオリゴヌクレオチドは、それを接触可能にし、複数の切断反応を開始させるために形成されている。例えば、幾つかの態様において、一つのINVADERオリゴヌクレオチドは、複数のシグナルプローブオリゴヌクレオチドによって固体支持体上で取り囲まれる。標的核酸は、INVADERオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドへ結合する。シグナルプローブは切断され(シグナルを生成し)て放出され、標的をINVADERオリゴヌクレオチドへ結合したままにする。この標的：INVADERオリゴヌクレオチド複合体はその後、別のシグナルプローブと接触し、別の切断事象を促進できる。この方法で、1つの標的および1つのINVADERオリゴヌクレオチドから生成されたシグナルが増幅される。
【０２９５】
他の態様において、プローブおよびINVADERオリゴヌクレオチドは一つの分子において組み合わされる。単一分子のプローブとINVADER部分との間の接続は核酸であり得るか、または非核酸リンカー(例えば、炭素リンカー、ペプチド鎖)であり得る。
【０２９６】
4. 結合されている二次反応
幾つかの態様において、一次INVADERアッセイ反応が溶液中で実施され、二次反応が固体支持体上で実施される。一次INVADERアッセイ反応から切断されたプローブは、二次標的核酸、二次プローブまたは二次INVADERオリゴヌクレオチドを含むがそれらに限定されない切断構造の一つまたは複数の構成要素を含有する固体支持体と接触する。好ましい態様において、構成要素は、1ピースの二次オリゴヌクレオチドであるか、または二次標的部分および二次プローブ部分の両方を含むカセットである。特に好ましい態様において、カセットは、FRETによってカセットの切断の検出を可能にするために標識化される。二次シグナルオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示されるものを含むがそれに限定されない任意の適切な方法を使用して標識化され得る。支持体上でINVADERアッセイ反応を形成するための上述の任意の態様が、支持体上での二次またはその後のINVADERアッセイ反応を形成する上で使用され得ることが認識される。
【０２９７】
5. 結合されている標的
本発明の幾つかの態様において、標的核酸(例えば、ゲノムDNA)は固体支持体へ結合する。幾つかの態様において、INVADERオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドは溶液中に無い。他の態様において、標的核酸、INVADERオリゴヌクレオチド、およびプローブ(例えば、シグナルプローブ)オリゴヌクレオチドはいずれも結合される。さらに他の態様において、二次オリゴヌクレオチド(例えば、FRETオリゴヌクレオチド)は反応に含まれる。幾つかの態様において、FRETオリゴヌクレオチドは溶液中に無い。他の態様において、FRETオリゴヌクレオチドは固体支持体へ結合される。
【０２９８】
6. 結合されている酵素
幾つかの態様において、切断手段(例えば、酵素)は固体支持体へ結合される。幾つかの態様において、標的核酸、プローブオリゴヌクレオチドおよびINVADERオリゴヌクレオチドは、溶液中に提供される。他の態様において、核酸の一つまたは複数は固体支持体へ結合される。任意の適した方法は、支持体への共有結合(例えば、Chernukhin and Klenova, Anal. Biochem., 280:178 [2000]参照)、酵素のビオチン化およびアビジンを介した結合(例えば、Suter et al., Immunol. Lett. 13:313 [1986]参照)、および抗体を介した結合(例えば、Bilkova et al., J. Chromatogr. A, 852:141 [1999]参照)を含むがそれらに限定されない切断酵素の固体支持体への結合のために使用され得る。
【０２９９】
7. スペーサー
本発明の幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スペーサーまたはリンカー分子を介して固体支持体へ結合される。本発明は、任意の1つの機構に限定されない。実際、該機構に関する理解は、本発明を実施するのに必要ではない。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチドの利用しやすさを亢進し、オリゴヌクレオチド間の相互作用を低下させることによって、スペーサー分子がINVADERアッセイ反応を増強することが企図される。オリゴヌクレオチド合成の間に組み込むことのできるリンカーの使用は、リンカーを含有しないオリゴヌクレオチドを捕捉することに対するハイブリダイゼーション効率を増大させることが示されてきた(Guo et al., Nucleic Acids Res., 22:5456 [1994]; Maskos and Southern, Nucleic Acids Res., 20:1679 [1992]; Shchepinov et al., Nucleic Acids Research 25:1155 [1997])。
【０３００】
スペーサー分子は、任意の適切な材料から構成され得る。好ましい材料は、利用される反応条件下で安定であり、INVADERアッセイの構成要素と反応しないものである。適切な材料は、炭素鎖(例えば、C18を含むがそれに限定されない)、ポリヌクレオチド(例えば、ポリI、ポリT、ポリG、ポリC、およびポリAを含むがそれに限定されない)、およびポリグリコール(例えば、ヘキサエチレングリコール)を含むがそれらに限定されない。
【０３０１】
スペーサー分子は任意の長さからなり得る。したがって幾つかの態様において、複数のスペーサー分子は、望ましい長さのスペーサーを達成するために、末端と末端を結合される。例えば、幾つかの態様において、複数のC18またはヘキサエチレングリコールスペーサー(例えば、5、10、または20個のスペーサー分子を含むがそれらに限定されない)が組み合わされる。最適なスペーサー長は、使用される特定の適用および固体支持体に依存する。適切な長さを決定するため、異なる長さが選択され(例えば、5、10、または20個のC18またはヘキサエチレングリコールスペーサー分子)、および反応は、どのスペーサーが最も効率的な反応を付与するかを決定するために、本明細書に記載されるとおり実施される。
【０３０２】
8. 固体支持体
本発明は、任意の1つの固体支持体に限定されない。幾つかの態様において、反応は、マイクロタイタープレート(例えば、96ウェルまたは384ウェルのいずれかを含有するポリスチレンプレート)上で実施される。例えば、幾つかの態様において、ストレプトアビジン(SA)でコーティングされた96ウェルまたは384ウェルのマイクロタイタープレート(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)が、固体支持体として使用される。このような態様において、シグナルは、標準的な蛍光、化学発光または比色マイクロタイタープレートリーダーを使用して測定できる。
【０３０３】
幾つかの態様において、INVADERアッセイ反応は、粒子またはビーズ上で実施される。粒子は、ラテックスを含むがそれに限定されない任意の適切な材料から作製され得る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの結合に適した粒子マトリクスを含有するカラムが使用される。幾つかの態様において、反応はミニカラム(例えば、DARAS, Tepnel, Cheshire, England)において実施される。カラムは、オリゴヌクレオチドが共有結合し、その後捕捉プローブとしてまたは酵素反応において使用されるミクロビーズを含有する。ミニカラムの使用は、小型化したチップフォーマットにおいて達成可能であろう結合されたオリゴヌクレオチド濃度の概算を可能にする。オリゴヌクレオチドの結合は、支持体の能力(すなわち、約1012個/cm2)によって限定される。したがって、結合されたオリゴヌクレオチド濃度は、反応容器の容積に対する表面積の比を増大させることによってのみ増大できる。例えば、約1cm2の表面積および400μlの容積を有する96ウェルのマイクロタイタープレートの1つのウェルは、約25nMの最大に結合されたオリゴヌクレオチド濃度を有する。その一方で、マイクロチップにおける100μm×100μm×100μMの容積は、104μm2の表面積および1nLの容積を有し、0.2μMの結合されたオリゴヌクレオチド濃度を結果として生じる。同様の増大した表面積：容積比は、ミクロビーズを使用することによって得ることができる。30μl容積中の1014個以上のオリゴヌクレオチドの結合能力を付与すると、これらのビーズは、0.2〜10μMの結合されたオリゴヌクレオチド濃度を可能にし、すなわち、マイクロチップについて予期されるものに匹的する。
【０３０４】
幾つかの態様において、INVADER反応は、HydroGel(Packard Instrument Company, Meriden, CT)支持体上で実施される。HydroGelは、多孔性の3D親水性ポリマーマトリクスである。該マトリクスは、顕微鏡スライド上へと重合されたポリアクリルアミドのフィルムからなる。結合部分は、還元的アミノ化によるアミノ化されたオリゴヌクレオチド分子の固定を可能にするマトリクスへ共重合される。アミン基による共有結合は、特異的結合地点(通常、核酸プローブの末端)で核酸プローブの固定を可能にし、ヒドロゲルは、固体/溶液相界面を回避するバルク溶液相を概算する3Dマトリクスを提供する。
【０３０５】
他の態様において、INVADER反応は、BEADARRAY(Illumina, San Diego, CA)技術を使用して固体支持体上で実施される。技術は、光ファイバー束およびアレイへ自己重合するビーズを組み合わせる。各光ファイバー束は、束の直径に依存して何千〜何百万本の個々のファイバーを含有する。センサーは、所与のバッチにおける各ビーズへ固定される。ビーズ上の特定の分子は、センサーとしてのビーズの機能を定義する。アレイを形成するため、光ファイバー束は、コーティングされたビーズのプールへと浸される。コーティングされたビーズは、束における各ファイバーの端で1ウェルあたり1ビーズで、ウェルへと引き出される。
【０３０６】
本発明は、上述の固体支持体に限定されない。実際、顕微鏡用ガラススライド、ガラスウェーハ、金、シリコン、マイクロチップ、および他のプラスチック、金属、セラミック、または生物表面を含むがそれらに限定されないさまざまな他の固体支持体が企図される。
【０３０７】
9. 表面コーティングおよび結合化学物質
本発明の幾つかの態様において、固体支持体は、オリゴヌクレオチドの結合において補助するための材料でコーティングされる。本発明は、任意の1つの表面コーティングに限定されない。実際、以下に記載されるものを含むがそれに限定されないさまざまなコーティングが企図される。
【０３０８】
幾つかの態様において、固体支持体INVADERアッセイ反応は、金でコーティングされた固体支持体上で実施される。金は、ミクロ粒子、ミクロビーズ、顕微鏡用スライド、およびマイクロタイタープレートを含むがそれらに限定されない任意の適切な固体支持体へ結合できる。幾つかの態様において、金は、チオール改変されたDNAと反応できるチオール反応性マレイミドで官能化される(例えば、参照により本明細書に組み入れられるFrutos et al., Nuc. Acid. Res., 25:4748 [1997]; Frey and Corn, Analytical Chem, 68:3187 [1996]; Jordan et al., Analytical Chem, 694939 [1997]; および米国特許第5,472,881号参照)。
【０３０９】
他の態様において、固体支持体INVADERアッセイ反応は、シリコンでコーティングされた固体支持体上で実施される。シリコンは、上述のものおよび以下に提供される実例となる実施例におけるものを含むがそれには限定されない任意の適切な支持体へ結合できる。
【０３１０】
付加的に、幾つかの態様において、固体支持体は、核酸の結合において補助するための分子(例えば、タンパク質)でコーティングされる。本発明は、任意の特定の表面コーティングに限定されない。ストレプトアビジンなどのタンパク質を含むがそれに限定されない任意の適切な材料が利用され得る。したがって、幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、末端ビオチンまたは、オリゴヌクレオチド合成の間に含まれるNH2により仲介される連結を介して、固体支持体へ結合される。INVADERオリゴヌクレオチドは、それらの5'末端で支持体へ結合され、シグナルプローブは、それらの3'末端で結合される。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、結合地点近くでリンカーを介して結合される。好ましい態様において、結合は、(Shchepinov et al., Nucleic Acids Research 25: 1155 [1997])に記載されているように、低い負の電荷密度を有する40原子リンカーを介する。
【０３１１】
他の態様において、オリゴヌクレオチドは、抗原：抗体相互作用を介して固体支持体へ結合される。例えば、幾つかの態様において、抗原(例えば、プロテインAまたはプロテインG)は、固体支持体へ結合され、IgGは、オリゴヌクレオチドへ結合される。他の態様において、IgGは固体支持体へ結合され、抗原(例えば、プロテインAまたはプロテインG)はオリゴヌクレオチドへ結合される。
【０３１２】
10. オリゴヌクレオチドの配向
幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、固体支持体上の特異的部位へターゲティングされる。上述のように、多重オリゴヌクレオチドが固体支持体へ結合されるとき、オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の多数の方法を使用して、表面上で直接合成され得る(例えば、参照により本明細書に各々組み入れられるPCT公報第WO 95/11995号、第WO 99/42813号および第WO 02/04597号ならびに米国特許第5,424,186号；第5,744,305号；および第6,375,903号に記載されている方法を含むがそれに限定されない)。
【０３１３】
オリゴヌクレオチドの配向のための多数の技術が利用され得る。例えば、幾つかの態様において、固体支持体表面は、特定のDNA分子(例えば、Nanogen, CA)を結合するために1つの所与の部位で電気的に偏向される。他の態様において、ピン道具は、アレイを機械的に負荷するために使用され得る(Shalon, Genome Methods, 6:639 [1996])。他の態様において、インクジェット技術は、活性表面上へオリゴヌクレオチドを印刷するのに使用される(例えば、O'Donnelly-Maloney et al., Genetic Analysis:Biomolecular Engineering, 13:151 [1996])。
【０３１４】
金表面を利用する幾つかの好ましい態様において、金表面は、親水性領域および疎水性領域を形成するために自己重合する単一層をフォトパターン形成することによって、アドレス指定が可能なDNAアレイを作製するためにさらに改変される。アルカンチオール化学物質は、自己重合する単一層を作製するために利用される(Nuzzo et al., JACS, 105:4481 [1983])。DNAは、自動ロボット装置(例えば、ピン負荷道具)を使用することによって親水性領域上に配置される。
【０３１５】
E. 反応容器
本発明の検出アッセイは、任意の適切な反応容器を使用して実施され得る。本明細書で使用されるように、用語「反応容器」は、検査チューブ、ウェル、マイクロウェル(例えば、96ウェル、384ウェルおよび1536ウェルアッセイプレートなどのマイクロタイターアッセイプレートにおけるウェル)、毛細管、光ファイバーなどのファイバーの末端、液体チップなどの微量液体装置、カートリッジおよびカード(例えば、Woudenberg, et al.への米国特許第6,126,899号、Bedingham, et al.への米国特許第6,627,159号、第6,720,187号、および第6,734,401号、Mian, et al.への米国特許第6,319,469号および第6,709,869号、Wilding, et al.への米国特許第5,587,128号および第6,660,517号に記載されているものを含むがそれらに限定されない)、または任意の表面上の検査部位(ガラス、プラスチックまたはシリコン表面、ビーズ、マイクロチップ、あるいはゲルまたはデンドリマーなどの非固体表面を含むがそれらに限定されない)を含むがそれらに限定されない反応が実施され得るシステムを指す。
【０３１６】
幾つかの好ましい態様において、反応は、3M微量流体カード(3M, St. Paul, MN)を使用して実施される。3Mカードは、8つの負荷ポートを有し、それらの各々は、カードの遠心分離の際に48個の個々の反応チャンバーへ液体試薬を供給するよう形成されている。反応チャンバーは、標的核酸の検出のためのあらかじめ分配され乾燥したアッセイ反応構成要素を含有する。これらの試薬は、それらがカードの遠心分離の際に液体試薬と接触するとき溶解する。
【０３１７】
実験用
以下の開示において、次の略語が適用する：Ex.(実施例)；Fig.(図)；℃(摂氏度)；g(重力場)；hr(時間)；min(分)；オリゴ(オリゴヌクレオチド)；rxn(反応)；vol(容積)；w/v(容積に対する重量)；v/v(容積に対する容積)；BSA(ウシ血清アルブミン)；CTAB(臭化セチルトリメチルアンモニウム)；HPLC(高速液体クロマトグラフィー)；DNA(デオキシリボ核酸)；p(プラスミド)；μl(マイクロリットル)；ml(ミリリットル)；ng(ナノグラム);μg(マイクログラム);mg(ミリグラム);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度);μM(マイクロモル濃度)；pmole(ピコモル)；amole(アトモル)；zmole(ゼプトモル)；nm(ナノメーター)；kdal(キロダルトン)；OD(光学密度)；EDTA(エチレンジアミン四酢酸)；FITC(イソチオシアン酸フルオレセイン)；FAM(フルオレセイン)；SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)；NaPO4(リン酸ナトリウム)；NP-40(Nonidet P-40)；トリス(トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン)；PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)；TBE(トリス-ホウ酸塩-EDTA、すなわちHClよりもむしろホウ酸で滴定され、EDTAを含有するトリス緩衝剤)；PBS(リン酸塩により緩衝された塩類溶液)；PPBS(1mM PMSFを含有するリン酸塩により緩衝された塩類溶液)；PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)；トゥイーン(ポリオキシエチレン-ソルビタン)；RedまたはRED (REDMOND RED色素、Epoch Biosciences, Bothell WA); Z28 (ECLIPSE消光剤, Epoch Biosciences, Bothell, WA); Promega (Promega, Corp., Madison, WI); Glen Research(Glen Research, Sterling, VA); Coriell(Coriell Cell Repositories, Camden, NJ); Third Wave Technologies (Third Wave Technologies, Madison, WI); Microsoft (Microsoft, Redmond, WA); Qiagen (Qiagen, Valencia, CA)。
【０３１８】
以下の実施例は、本発明のある好ましい態様および局面を示しおよびさらに例証するために提供され、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３１９】
実施例1：プローブ濃度の変動による標的検出のダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するためのプローブの変動の使用を記載する。本実験の実施例において、試料から標的RNAを検出するために、RT-INVADER+PCR法を使用した。RNAをまずcDNAへ逆転写し、このcDNAをPCR増幅し、この増幅したDNAをINVADERアッセイによって検出した。
【０３２０】
本実験において、FAM標識アーム(1968-24-03)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を含有するプローブを、0.67uMの標準的なINVADERアッセイ濃度で使用し、0.03uMの20倍希釈濃度でRED標識アーム(1978-13-02)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を有する別のプローブと組み合わせた。残りの反応条件は以下のとおりであった：1uMの順方向プライマー(1931-48-05)、1.067uMの逆方向プライマー/INVADERオリゴヌクレオチド(1931-48-01)、0.33uMのFRETプローブ、10mMのMOPS緩衝剤、7.5mMのMgCl2、25uMのdNTP、75単位のMMLV RT、0.5単位のTaqポリメラーゼ、100ngのCLEAVASE酵素、および水の平衡量。反応の温度サイクリング条件は、42℃で30分間；95℃で7.5分間；95℃で45秒間、58℃で30秒間および72℃で2分間を、26周期；99℃で10分間、および63℃で30分間であった。RNAテンプレートを0、156、313、625、1,250、2,500、および5,000コピーのあらかじめ決めておいた終濃度で供給した。
【０３２１】
反応の結果は次のとおりであった：完全にマッチしたプローブの組み合わさった使用が1倍および20倍希釈された濃度で実施されることによって、標的の625コピーの飽和から4倍増の2,500コピーの飽和まで、ダイナミックレンジを拡大した(図1参照)。
【０３２２】
本実験の結果は、ダイナミックレンジが、異なる濃度で同時に実施される異なる検出標識アームを保持する使用プローブによって拡大できることを示す。
【０３２３】
実施例2：ミスマッチしたプローブの使用による標的検出のダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するためのミスマッチ含有プローブの使用を記載する。本実験の実施例において、試料から標的RNAを検出するために、RT-INVADER+PCR法を使用した。RNAをまずcDNAへ逆転写し、このcDNAをPCR増幅し、この増幅したDNAをINVADERアッセイによって検出した。
【０３２４】
本実験において、FAM標識アーム(1968-24-03)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を含有するプローブを、0.67uMの標準的なINVADERアッセイ濃度で使用し、0.67uMのRED標識アーム(1978-13-01)へ結合した分析物特異的領域における単一ミスマッチを含有するプローブと組み合わせた。反応の残りの条件は次のとおりであった：1uMの順方向プライマー(1931-48-05)、1.067uMの逆方向プライマー/invaderオリゴヌクレオチド(1931-48-01)、0.33uMのFRETプローブ、10mMのMOPS緩衝剤、7.5mMのMgCl2、25uMのdNTP、75単位のMMLV RT、0.5単位のTaqポリメラーゼ、100ngのCLEAVASE酵素、および水の平衡量。反応の温度サイクリング条件は、42℃で30分間；95℃で7.5分間；95℃で45秒間、58℃で30秒間および72℃で2分間を、26周期；99℃で10分間、および63℃で30分間であった。RNAテンプレートを、0、156、313、625、1,250、2,500、および5,000コピーのあらかじめ決めておいた終濃度で供給した。
【０３２５】
反応の結果は次のとおりであった：マッチしたおよびミスマッチしたプローブの組み合わさった使用により、ダイナミックレンジを625コピーの飽和から、8倍増の5,000コピーの飽和まで拡大した(図1参照)。
【０３２６】
本実験の結果は、ダイナミックレンジが、異なる濃度で同時に実施される異なる検出標識アームを保持する使用プローブによって拡大できることを示す。
【０３２７】
実施例3：プローブ濃度の変動による標的検出のダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するためのプローブの変動の使用を記載する。本実験の実施例において、試料から第二標的RNAを検出するために、RT-INVADER+PCR法を使用した。RNAをまずcDNAへ逆転写し、このcDNAをPCRにより増幅し、この増幅したDNAをINVADERアッセイによって検出した。
【０３２８】
本実験において、FAM標識アーム(1909-92-01)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を含有するプローブを、0.67uMの標準的なINVADERアッセイ濃度で使用し、0.03uMの20倍希釈濃度でRED標識アーム(1909-62-01)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を有する別のプローブと組み合わせた。残りの反応条件は以下のとおりであった：1uMの順方向プライマー(1909-72-02)、1uMの逆方向プライマー(1909-90-06)、0.067uMのインベーダーオリゴヌクレオチド(1909-92-02)、0.33uMのFRETプローブ、10mMのMOPS緩衝剤、7.5mMのMgCl2、25uMのdNTP、75単位のMMLV RT、0.5単位のTaqポリメラーゼ、100ngのCLEAVASE酵素、および水の平衡量。反応の温度サイクリング条件は、42℃で30分間；95℃で7.5分間；95℃で45秒間、65℃で30秒間および72℃で2分間を、26周期；99℃で10分間、および63℃で30分間であった。RNAテンプレートを、0、156、313、625、1,250、2,500、および5,000コピーのあらかじめ決めておいた終濃度で供給した。
【０３２９】
反応の結果は以下のとおりであった：完全にマッチしたプローブの組み合わさった使用が1倍および20倍希釈された濃度で実施されることによって、標的の625コピーの飽和から4〜16倍増の2,500〜10,000コピーの飽和まで、ダイナミックレンジを拡大した(図2参照)。
【０３３０】
本実験の結果は、ダイナミックレンジが、異なる濃度で同時に実施される異なる検出標識アームを保持する使用プローブによって拡大できることを示す。
【０３３１】
実施例4：ミスマッチしたプローブの使用による標的検出のダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するためのミスマッチ含有プローブの使用を記載する。本実験の実施例において、試料から標的RNAを検出するために、RT-INVADER+PCR法を使用した。RNAをまずcDNAへ逆転写し、このcDNAをPCRにより増幅し、この増幅したDNAをINVADERアッセイによって検出した。
【０３３２】
本実験において、FAM標識アーム(1909-92-01)へ結合した完全にマッチした分析物特異的領域を含有するプローブを、0.67uMの標準的なINVADERアッセイ濃度で使用し、0.67uMで使用されるRED標識アーム(1909-62-02)へ結合した単一ミスマッチを含有する分析物特異的領域を有する別のプローブと組み合わせた。残りの反応条件は以下のとおりであった：1uMの順方向プライマー(1909-72-02)、1uMの逆方向プライマー(1909-90-06)、0.067uMのインベーダーオリゴヌクレオチド(1909-92-02)、0.33uMのFRETプローブ、10mMのMOPS緩衝剤、7.5mMのMgCl2、25uMのdNTP、75単位のMMLV RT、0.5単位のTaqポリメラーゼ、100ngのCLEAVASE酵素、および水の平衡量。反応の温度サイクリング条件は、42℃で30分間；95℃で7.5分間；95℃で45秒間、65℃で30秒間および72℃で2分間を、26周期；99℃で10分間、および63℃で30分間であった。RNAテンプレートを、0、156、313、625、1,250、2,500、および5,000コピーのあらかじめ決めておいた終濃度で供給した。
【０３３３】
反応の結果は以下のとおりであった：マッチしたおよびミスマッチしたプローブの組み合わさった使用により、ダイナミックレンジを625コピーの飽和から、4〜16倍増の2,500〜10,000コピーの飽和まで拡大した(図2参照)。
【０３３４】
本実験の結果は、ダイナミックレンジが、異なる濃度で同時に実施される異なる検出標識アームを保持する使用プローブによって拡大できることを示す。
【０３３５】
実施例5：2つの一次プローブ濃度および単一色素読み出しによる標的検出のダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、検出のための単一色素を使用して、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するために各々が寄与する異なる濃度での2つのプローブの使用を記載する。本実施例において、各プローブからのシグナルを蓄積するために、異なるFRETカセットを提供したが、FRETカセットは同一の色素を使用して報告した。
【０３３６】
方法
オリゴヌクレオチドを表1に示されるように調製および混合した。
【０３３７】
【表１】
2008533974.tif 000003
X＝Z28ホスホラミダイト
2＝Z35(Red色素)ホスホラミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３３８】
各反応について、333.34ng/rxnのCleavase(登録商標)VIIIおよび3.34単位/rxnの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、CMV配列
2008533974.tif 000004
を含有するプラスミド標的DNAの10〜10,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的DNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの表示された組み合わせを含有した。反応物を以下のとおりインキュベートした：95℃で15秒間および72℃で45秒間を、20周期；99℃で10分間；その後63℃で30分間。各反応容器中で生じた蛍光シグナルを、Tecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図4に示す。両方のプローブ＝混合物1、1×プローブ＝混合物3、1/150×プローブ＝混合物2
【０３３９】
結果
図4に示されるように、本実験において、InRange(商標)アッセイは、いずれかのプローブ濃度で個々に使用して達成される2〜3桁の拡大と比較して、3桁(1,000倍)〜合計6桁まで、単一反応混合物のダイナミックレンジを拡大した。
【０３４０】
実施例6：3つの一次プローブ濃度を使用するInRange(商標)アッセイによる連続的侵入型切断アッセイダイナミックレンジの拡大
以下の実施例は、検出のための単一色素を使用して、分析物の検出のダイナミックレンジを拡大するために各々が寄与する異なる濃度での3つのプローブの使用を記載する。本実施例において、各プローブからのシグナルを蓄積するために、異なるFRETカセットを提供したが、FRETカセットは同一の色素を使用して報告した。
【０３４１】
方法
オリゴヌクレオチドを表2に示されるように調製および混合した。
【０３４２】
【表２】
2008533974.tif 000005
2008533974.tif 000006
2008533974.tif 000007
X＝Z28ホスホラミダイト
2＝Z35(Red色素)ホスホラミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３４３】
各反応について、333.34ng/rxnのCleavase(登録商標)VIIIおよび3.34単位/rxnの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、CMV配列
2008533974.tif 000008
を含有するプラスミド標的DNAの10〜10,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的DNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの表示された組み合わせを含有した。反応物を以下のとおりインキュベートした：95℃で15秒間および72℃で45秒間を、20周期；99℃で10分間；その後63℃で30分間。各反応容器中で生じた蛍光シグナルをTecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図5に示す。1×プローブ＝混合物1、1/125×プローブ＝混合物2、1/1000×プローブ＝混合物3、3プローブ混合物＝混合物7。残りの混合物(非表示)は、寄与効果を検討するための、2プローブのさまざまな組み合わせである。
【０３４４】
結果
図5に示されるように、本実験において、InRange(商標)アッセイは、任意の単一プローブ濃度または2つのプローブの組み合わせによってなされる寄与と比較すると、3つのプローブ濃度を一緒に使用したとき、ダイナミックレンジおよびデータの質を亢進した。各プローブの組み合わせから個々に結果として生じるシグナルを示す線によって示されるように、これらの実験条件の各々の独立した寄与が直ちに観察できる。
【０３４５】
実施例7：侵入型切断反応のインキュベーション時間の変化を通じての連続的な侵入型切断アッセイの最適化
以下の実施例は、侵入型切断反応のインキュベーションの時間の長さの変化を通じての本発明の複数のプローブシステムの最適化を記載する。本実施例において、各プローブからのシグナルを蓄積するために、異なるFRETカセットを提供したが、FRETカセットは同一の色素を使用して報告した。
【０３４６】
方法
オリゴヌクレオチドを表3に示されるように調製および混合した。
【０３４７】
【表３】
2008533974.tif 000009
X＝Z28ホスホラミダイト
2＝Z35 (Red色素)ホスホラミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３４８】
各反応について、100ng/rxnのCleavase(登録商標)VIIIおよび3.34単位/rxnの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、CMV配列
2008533974.tif 000010
を含有するプラスミド標的DNAの100〜1,000,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的DNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの表示された組み合わせを含有した。反応物を63℃で30分〜8時間の範囲の時間インキュベートした。各反応容器中で生じた蛍光シグナルをTecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図6に示す。示されるデータは全て、異なる時点での読み取りを有する3-プローブ混合物に属する。特異的プローブ濃度での個々のプローブの寄与を検討するため、他の3つの混合物(非表示)を検査した。
【０３４９】
結果
図6に示されるように、本実験において、侵入型切断反応のインキュベーションの時間の長さの変化を通じて、混合したプローブアッセイ性能を最適化した。30分の範囲におけるより短いインキュベーション時間は、検出のより高い全般的な下限に至り、全般的なダイナミックレンジに増大はなかった。対照的に、8時間のより長いインキュベーション時間は、検出の下限に至るだけでなく、検出のより低い条件にも至った。本実験において、4時間のインキュベーション時間は、1反応物あたり10,000〜1,000,000,000コピーの標的濃度の範囲を検出する最高の全般的なダイナミックレンジを結果として生じた。
【０３５０】
実施例8：広範なダイナミックレンジにわたる単一反応容器中の2つの別個の標的の同時検出
以下の実施例は、同一反応容器中の、ダイナミックレンジの6桁におよぶ2つの異なるヒトヘルペスウイルスCMVおよびEBVの検出を記載する。各ウイルスについて、異なるプローブの各々からのシグナルを蓄積するため、異なるFRETカセットを提供したが、各ウイルス特異的FRETカセットは、同一の色素を使用して報告した。FRETカセットの各ウイルスの回収のために、異なる色素を使用した。
【０３５１】
方法
オリゴヌクレオチドを表4に示されるように調製および混合した。
【０３５２】
【表４】
2008533974.tif 000011
2008533974.tif 000012
2008533974.tif 000013
X＝Z28ホスホラミダイト
1＝6FAMアミダイト
2＝Z35 (Red色素)ホスホラミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３５３】
各反応について、333.34ng/rxnのCleavase(登録商標)VIIIおよび3.34単位/rxnの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、CMV配列
2008533974.tif 000014
およびEBV配列
2008533974.tif 000015
を含有するプラスミド標的DNAの約4〜1,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的DNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの表示された組み合わせを含有した。反応物を以下のとおりインキュベートした：95℃で15秒間および72℃で45秒間を、23周期；99℃で10分間；その後63℃で30分間。各反応容器中で生じた蛍光シグナルをTecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図7に示す。CMV＝混合物7 (FAM色素)、EBV＝混合物7(Red色素)。個々の標的について特異的なプローブ濃度で個々のプローブ寄与を検討するため検査した混合物1〜6からのデータを示していない。混合物5は、任意のEBVプローブの無いCMVであり、混合物6は、任意のCMVプローブの無いEBVである。
【０３５４】
結果
図7に示されるように、本実験において、本発明のアッセイは、同一反応容器中のダイナミックレンジの6桁におよぶ2つの異なるヒトヘルペスウイルスCMVおよびEBVを正確に検出できた。1反応物あたり約20〜1,000,000コピーの範囲にわたって、多重鎖においてCMVおよびEBVを検出した。
【０３５５】
実施例9：ダイナミックレンジをさらに増大させるための混合されたプローブアッセイと標的増幅方法との組み合わせ
以下の実施例は、一本鎖増幅(一本鎖産物の直線的蓄積のためのサイクリングプライマーの伸長)を標準的PCR(二本鎖産物の指数関数的蓄積)と組み合わせる段階を示し、両産物の検出は、ダイナミックレンジをさらに拡大するために2つのプローブの2つのセット(異なる濃度)と同時である。上述のように、各プローブからのシグナルを蓄積するために、異なるFRETカセットを提供したが、FRETカセットは同一の色素を使用して報告した。
【０３５６】
方法
オリゴヌクレオチドを表5に示されるように調製および混合した。
【０３５７】
【表５】
2008533974.tif 000016
X＝Z28ホスホラミダイト
2＝Z35(Red色素)ホスホラミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３５８】
各反応について、333.34ng/rxnのCleavase(登録商標)VIIIおよび3.34単位/rxnの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、CMV配列
2008533974.tif 000017
およびCMV配列
2008533974.tif 000018
を含有するプラスミド標的DNAの約10〜10,000,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的DNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの表示された組み合わせを含有した。反応物を以下のとおりインキュベートした：95℃で15秒間および72℃で45秒間を、23周期；99℃で10分間；その後63℃で30分間。各反応容器中で生じた蛍光シグナルをTecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図8に示す。
【０３５９】
結果
図8に示されるように、本実験において、異なる増幅手法を異なる濃度でのプローブの使用と組み合わせるアッセイは、プローブ濃度変動のみを適用したときに決定するよりも幅広い範囲の標的濃度を正確に検出できた。一本鎖増幅を標準的なPCRと組み合わせる段階および両産物を2つのプローブの2セットで同時に検出する段階は、本発明のアッセイのダイナミックレンジの可能性を、少なくとも9桁(単一反応セットアップによって検出される標的の10〜10,000,000,000コピー)まで拡大した。
【０３６０】
実施例10：均一なRT-PCR-インベーダーアッセイの増大したダイナミックレンジ
以下の実施例は、RT-PCRを、拡大されたダイナミックレンジにわたるRNA標的の検出のための複数のプローブ濃度を含むアッセイと組み合わせる段階を記載する。
【０３６１】
方法
オリゴヌクレオチドを表6に示されるように調製および混合した。
【０３６２】
【表６】
2008533974.tif 000019
X＝Z28ホスホラミダイト
1＝6FAMアミダイト
hex＝ヘキサンジオール
【０３６３】
各反応について、13.33ng/rxnのCleavase(登録商標)VIII、.033単位/μLの生のTaq DNAポリメラーゼ(Promega)、および2単位/μLのM-MLV RT(Promega)をCleavase酵素希釈緩衝剤(水中の0.02MトリスpH8.0、0.05M KCl、0.5% Tween 20、0.5% Nonidet P40、50%グリセロール、および100μg/mL BSA)の5μl中で組み合わせた。各反応について、配列
2008533974.tif 000020
を含有する標的RNA転写産物の約10〜1,000,000コピーを、tRNAの20ng/μlを含有する溶液の15μlの終容積へと希釈した。各50μlの反応物は、酵素混合物の5μl、標的RNA混合物の15μlおよび、10mM MOPS、7.5mM MgCl2、および25μM dNTPを含有する緩衝剤中のオリゴヌクレオチドの示された組み合わせを含有した。反応物を以下のとおりインキュベートした。
2008533974.tif 000021
【０３６４】
各反応容器中で生じた蛍光シグナルをTecan Genios FL蛍光プレートリーダーで定量した。結果を図9に示す。1×プローブ＝混合物1、1/125×プローブ＝混合物2、InRange＝混合物3。
【０３６５】
結果
図9に示されるように、本実験において、複数のプローブ濃度を含むアッセイは、均一なRT-PCR-インベーダーアッセイにおける標的濃度の5桁におよぶ、RNA標的を正確に検出できた。
【０３６６】
上述の明細書において記載される全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の望ましい組成物および方法のさまざまな改変および変動は、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、当業者に明白であろう。本発明は、特異的な好ましい態様と関連して記載されてきたが、本発明が、このような特異的態様に不当に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際、関連技術分野における業者に明白である、本発明を実施するために記載された様式のさまざまな改変は、前述の請求項の範囲内であるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３６７】
【図１】本発明の方法を使用する第一標的の検出のダイナミックレンジを示す。
【図２】本発明の方法を使用する第二標的の検出のダイナミックレンジを示す。
【図３】INVADERアッセイの一つの例示的な態様の概観を示す。
【図４】10〜10,000,000コピーの標的濃度の6桁におよぶ2つのプローブ濃度を使用するアッセイの結果を示すExcelグラフを示す。データポイントは以下を表す：実施例5に記載される組み合わさった反応におけるプローブの2セットおよびFRETカセットから結果として生じるシグナル(菱形)；1×プローブのみから結果として生じるシグナル(四角)；および1/150×プローブのみから結果として生じるシグナル(三角)。
【図５】実施例6に記載される10〜10,000,000コピーの標的濃度の6桁におよぶ3つのプローブ濃度を使用するアッセイの結果を示すExcelグラフを示す。3つのプローブ濃度の各々の個々の寄与は、追加線で示される。データポイントは以下を表す：3つのプローブ濃度から結果として生じるシグナル(四角)；単離における1×プローブ(菱形)；単離における1/125×プローブ(四角)；および単離における1/1000×プローブ(三角)。
【図６】実施例7に記載される侵入型切断反応のインキュベーション時間の長さを変動させる結果を示すExcelグラフを示す。データポイントは以下を表す：30分間のインキュベーションから結果として生じるシグナル(菱形)；1時間インキュベーション(四角)；2時間インキュベーション(三角)；4時間インキュベーション(丸)；および8時間インキュベーション(アスタリスク)。
【図７】実施例8に記載される本発明の方法を使用する同時多重における2つの異なる標的の検出を示すExcelグラフを示す。同一反応容器中で6桁におよぶダイナミックレンジの、CMVおよびEBVを同時に検出した。本実験において、反応あたり約20〜1,000,000コピーの範囲にわたる多重においてCMV(菱形)およびEBV(四角)を検出した。
【図８】図8は、実施例9に記載される9桁におよぶ標的濃度の検出を示すExcelグラフを示す。一本鎖増幅を標準的PCRと組み合わせ、2つのプローブの2セットで両方の産物を同時に検出することで、ダイナミックレンジが少なくとも9桁まで拡大した(10〜10,000,000,000コピーの標的が単一反応セットアップによって検出される)。表示されるように、一本鎖産物を伴なわない塩基性標的検出(二本鎖PCR産物のみを検出する；菱形)；一本鎖産物を検出するための1×プローブの添加による塩基性反応(四角)；一本鎖産物を検出するための1/125×プローブの添加による塩基性反応(三角)；ならびにPCR産物および一本鎖産物の両方を検出するための1×および1/125×プローブの添加による塩基性反応である。
【図９】実施例10に記載される複数のプローブ濃度を使用するRNAの検出を示すExcelグラフを示す。表示されるように、1×プローブ単独によるRNA標的検出(菱形)；1/125×プローブ単独(四角)によるRNA標的検出、およびRT-PCR産物を検出するための1×および1/125×プローブの両方のRNA標的検出(三角)である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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