(57)【要約】  本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の二つの弱毒化株並びに弱毒化ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の一つ以上の株を含む免疫原性組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群によって引き起こされる疾病に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であり、
弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１、弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される弱毒化ＰＲＲＳウイルスの有効量と、及び
医薬として許容される担体又は希釈剤と、
を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記ウイルスが弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ウイルスが弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群によって引き起こされる疾病に対する免疫応答を誘導するための多価免疫原性組成物であり、ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１及びＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２を含む二つ以上の弱毒化ウイルスの有効量を含む、前記組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
ＡＴＣＣ寄託された番号ＰＴＡ−６２８２によって表される弱毒化ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスＰＰ５。
【請求項７】
ＡＴＣＣ寄託された番号ＰＴＡ−６２８１によって表される弱毒化ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスＬＣ１３。
【請求項８】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群に対してブタを保護する方法であり、弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１、弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される弱毒化ＰＲＲＳウイルスの有効量を、前記ブタに接種することを含み、前記弱毒化ＰＲＲＳウイルスが医薬として許容される担体又は希釈剤中に調合される、前記方法。
【請求項９】
前記ウイルスが弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが弱毒化ＰＲＲＳウイルスＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記製剤がアジュバントをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１又は配列番号２によって表されるＯＲＦ５を有する弱毒化ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ；ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）の二つの弱毒化株並びに弱毒化ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の一つ以上の株を含む免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＲＲＳは、１９８７年に、アメリカで初めて認められた。ＰＲＲＳは、北アメリカの全ての主なブタ生産地域全体に、急速に広がった。次に、ＰＲＲＳはヨーロッパに出現し、今日では、ＰＲＲＳＶは、ほぼ世界全土に分布している。多くのブタ生産者、政府職員及び獣医師は、ＰＲＲＳが、現在、世界のブタ産業が直面している最も深刻な経済的脅威の一つであると考えている。
【０００３】
その名前が示唆するとおり、ＰＲＲＳは、とりわけ、まず妊娠後期に感染したときに妊娠した雌に生殖不全を引き起こす能力及び全ての年齢（但し、若いブタにおいて最も一般的で、重症である。）のブタに気道の病気を引き起こす能力によって、臨床的に特徴付けられる。ＰＲＲＳＶ感染は、他のブタ病原体の効果を強化するとも考えられる。遡及的な血清学的研究に基づいて、ＰＲＲＳＶによるブタの感染の多くは、無症状であるか、より不明確な臨床徴候をもたらすことも明らかとなっている。従って、ＰＲＲＳＶは、しばしば、その存在が最初に検出される以前に、群れに接近して、広範に広がる。
【０００４】
ウイルスは、少なくとも数ヶ月間、感染した宿主中で存続することが可能である。このような「担体」は、感染を持続させ、疾病の管理を極めて困難とする。結果として、ＰＲＲＳＶの経済的影響を軽減するための最も有効な手段は、ブタが毒性野外ウイルスに曝露される前に、感受性を有する可能性があるブタにワクチン接種する（免疫する）ことである。
【０００５】
ＰＲＲＳＶの単一株から調製された弱毒化ワクチン（Ｂｏｅｈｉｎｇｈｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍによって製造）が、市販されている。一つは、気道疾患の予防のために、３週齢と１８週齢の間のブタでの使用に対して許可が与えられている（Ｇｏｒｃｙｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。一つは、繁殖前に対して許可が与えられている。
【０００６】
別の弱毒化ワクチンは、生殖障害の予防に関して記載されている（Ｈｅｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。これは、ＰＲＲＳＶの単一株から調製され、ＰＲＲＳＶの単一株に対して検査されているに過ぎない。誘発株は、誘発後における、ワクチン接種を受けた雌ブタの既往反応に基づいて、異種性であると記載されているが、二つの株（すなわち、ワクチンのために使用される株と免疫の誘発のために使用される株）は遺伝的に又は抗原的に異なることを確立するための他の証拠は全く提示されていない。
【０００７】
ＰＲＲＳＶの二つの公知の主要な血清型が存在する（Ｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。一つ（原型Ｌｅｌｙｓｔａｄ）は、西欧で単離された少なくともほとんどの株を代表する。他方（原型ＡＴＣＣ２３３２）は、北アメリカ及びアジアで単離された少なくともほとんどの株を代表する。原型内には抗原性バリアントも存在し（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、北アメリカで単離された株間での塩基配列の差異によって、それらの区別が可能となった（Ｗｅｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、ＰＲＲＳＶによって引き起こされる臨床疾患に対してブタを保護する免疫原性組成物を提供することである。免疫原性組成物は、ＰＲＲＳＶに罹患したブタから、アメリカで単離されたＰＲＲＳＶの二つの株から得られた。
【０００９】
本発明の別の目的は、ＰＲＲＳに対する多価ワクチンにおいて有用であり得るＰＲＲＳＶの弱毒化株を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点が後続する記載から容易に明らかになるように、本発明は、上に明示されている課題に限定されるものではない。
【００１１】
生物材料の寄託
弱毒化株ＰＰ５及びＬＣ１３は、ブダペスト条約の規定に基づき、２００４年１１月４日に、バージニア州マナサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、それぞれ、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８２及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６２８１が付与された。米国特許法施行規則§１．８０８に従い、生物材料は、二つの条件下で作製されている。第一に、米国特許法施行規則§１．１４及び米国特許法第１２２条に基づいて、特許庁長官によって権限を付与されることが決定された者に対して寄託物を照会することにより、特許出願の係属中、寄託物の入手が可能となり、第二に、寄託された材料の公衆への利用可能性に関して寄託者によって課された制約は、一つの例外を除き、特許が付与された時点で、取り消し不能に解除される。
【００１２】
本明細書において、「免疫原性組成物」は、動物中の免疫応答を刺激することができる投与可能な形態の生物学的因子のあらゆる種類を表すために、その広義で定義される。本発明において、免疫原性組成物は、ウイルスそのもの又はウイルスの免疫原性（抗原性）成分の何れをも、ウイルス因子として含み得る。
【００１３】
本発明の免疫原性組成物は、ＰＲＲＳＶ：ＰＰ５及びＬＣ１３の二つの弱毒化株のあらゆる一つ以上から調製された。各株は、安全性及び免疫応答を誘導する能力について、個別に検査され、二つの株から構成される多価ワクチンが、それぞれの一価組成物と少なくとも同程度に安全且つ有効であり、ＰＲＲＳＶの毒性野外株に対して、ずっと広い免疫を提供し得ると想定されている。
【００１４】
免疫原性組成物及びワクチンを開発するために、ＰＲＲＳＶの二つの株（株ＰＰ５及びＬＣ１３）が選択された。
【００１５】
ＰＲＲＳＶ株ＰＰ５
ＰＲＲＳウイルスの毒性単離株が、病気に罹患したブタから得た組織試料から得られた。病気に罹患したブタから得られた組織ホモジネートを、初代肺胞マクロファージ上に接種し、接種された培養物に対する細胞変性効果によってウイルスの存在が検出されたが、対照培養物では検出されなかった。続いて、単離されたウイルスは、間接的な免疫蛍光により、ＰＲＲＳウイルスに対する特異的なモノクローナル抗体との反応性によって示された。ウイルスによる感染から２日後に、８０％のアセトンで、１０分間、集密なＭａｒｃ１４５細胞の９６ウェルプレートを固定した。次いで、ＳＤＯＷ１７又はＶ０１７モノクローナル抗体とともに、単層をインキュベートした。洗浄後、フルオレセインイソチオシアナート結合抗マウスＩｇＧとのインキュベーション後、洗浄及び顕微鏡による蛍光の検査によって、各ウイルスとのモノクローナル抗体の反応性を検出した。ＰＰ５ウイルスに対する両モノクローナル抗体に、陽性蛍光が顕著であった。組織培養中での連続継代によって、ＰＰ５ウイルスを弱毒化した。まず、初代ブタ肺胞マクロファージ（ＳＡＭ）培養物の接種によって（第一の継代のために）ウイルスを継代した後、計８１代にわたって、Ｍａｒｃ１４５細胞に対する連続継代によってウイルスを継代した。この過程の間、溶菌斑精製によってウイルスクローンを単離し、表現型特性について特徴を決定した。ブタ肺胞マクロファージ上での弱い生育並びに子ブタ及び妊娠した雌ブタ中での疾病誘導の欠如の故に、免疫原性組成物クローンＰＰ５が選択された。Ｍａｒｃ１４５細胞上でＰＰ５を増殖させ、原種ウイルスとして凍結した。
【００１６】
ＰＰ５は、その配列のＯＲＦ５領域によって、他の単離された弱毒化ＰＲＲＳＶ株から区別することができる。ＰＰ５  ＯＲＦ５配列は、配列番号１によって表されている。
【００１７】
ＰＲＲＳＶ株ＬＣ１３
ＰＲＲＳウイルスの毒性単離株が、病気に罹患したブタから得た組織試料から得られた。病気に罹患したブタから得られた組織ホモジネートを、初代肺胞マクロファージ上に接種し、接種された培養物に対する細胞変性効果によってウイルスの存在が検出されたが、対照培養物では検出されなかった。続いて、単離されたウイルスは、間接的な免疫蛍光により、ＰＲＲＳウイルスに対して特異的なモノクローナル抗体との反応性であることが示された。ウイルスによる感染から２日後に、８０％のアセトンで、１０分間、集密なＭａｒｃ１４５細胞の９６ウェルプレートを固定した。次いで、ＳＤＯＷ１７又はＶＯ１７モノクローナル抗体とともに、単層をインキュベートした。洗浄後、フルオレセインイソチオシアナート結合抗マウスＩｇＧとのインキュベーション後、洗浄及び顕微鏡による蛍光の検査によって、各ウイルスとのモノクローナル抗体の反応性を検出した。ＬＣ１３ウイルスに対する両モノクローナル抗体に、陽性蛍光が顕著であった。組織培養中での連続継代によって、ＬＣ１３ウイルスを弱毒化した。まず、初代ブタ肺胞マクロファージ培養物中でウイルスを単離し、次いで、計６７代にわたって、Ｍａｒｃ１４５細胞に対して連続継代を行った。この過程の間、溶菌斑精製によってウイルスクローンを単離し、表現型特性について特徴を決定した。ブタ肺胞マクロファージ上での弱い生育並びに子ブタ及び妊娠した雌ブタ中での疾病誘導の欠如の故に、免疫原性組成物クローン（ＬＣ１３）が選択された。Ｍａｒｃ１４５細胞上でＬＣ１３を増殖させ、原種ウイルスとして凍結した。
【００１８】
ＬＣ１３は、その配列のＯＲＦ５領域によって、他の単離された弱毒化ＰＲＲＳＶ株から区別することができる。ＬＣ１３  ＯＲＦ５配列は、配列番号２によって表されている。
【００１９】
組成物ウイルスが、生理的食塩水又は組織培地などの医薬として許容される担体又は希釈剤とともに、効果的な免疫化用量の製剤により投与するために調製された。「有効量」という表現は、ＰＲＲＳＶの毒性株による誘発に対してブタに免疫を誘導する量として定義される。実際の投薬量の決定は、完全に、当業者の技術の範疇に属する。以下に記載されている実施例に基づいて、一実施形態は、約１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬの単回用量であると想定される。
【００２０】
この組成物は、経口、口鼻又は注射によって投与することが可能である。本分野において公知の適切なアジュバントは、組成物製剤中に含め得る。先述したように、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチンは個別に使用してもよく、又は多価組成物の製剤において、あらゆる組み合わせで一緒に組み合わせてもよい。
【００２１】
以下の実施例は、本発明の目的を首尾よく達成することを例示するために使用される。何れも、本発明の適用可能性の範囲を限定することを意図したものではない。
【００２２】
実施例
ＭＡＲＣ１４５を基本材料として使用して、免疫原性組成物を調製した（但し、ＭＡ１０４細胞など、ＰＲＲＳウイルスの増殖を支持する別の細胞株も使用することが可能である。）。５〜１０％のウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン及び抗生物質（３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンなど）を含有するイーグルの基礎培地（ＥＭＥＭ）を用いて、適切な組織培養容器（すなわち、８５０ｃｍ２のローラー瓶）中で、集密状態になるまで、ＭＡＲＣ１４５細胞を増殖させた。ダルベッコの改変基礎培地［ＤＭＥＭ］、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９又はその他など、ＭＡＲＣ１４５細胞の増殖を支持することが可能な別の組織培地を使用することも可能である。ＭＡＲＣ１４５細胞の集密単層に、１：１０の感染効率（ＭＯＩ）で（１：５〜１：１０００の範囲のＭＯＩを使用することが可能である。）、ＰＰ５又はＬＣ１３を接種した。３７℃で３〜５日間、インキュベーションを行った後、デカンテーションによって培養上清液を採集した。
【００２３】
上述のように補充されたＥＭＥＭ中に系列希釈を作製し、９６ウェル組織培養プレート中の集密ＭＡＲＣ１４５又はＭＡ１０４細胞の少なくとも４つの反復ウェル中に、０．２ｍＬ／ウェルの接種を行うことによって、ウイルス液の力価を測定し、湿気のあるチャンバー中、３〜５％ＣＯ２、３７℃で５日間、培養物をインキュベートし、細胞変性効果について観察した。Ｓｐｅａｒｍａｎ及びＫａｒｂｅｒの方法に従って、力価（５０％終末点）を算出した。
【００２４】
死滅した免疫原性組成物又は死滅したワクチン製剤の調製のために、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、二元エチレンイミン又はβ−プロピオラクトンなどの化学的不活化剤とともに、ウイルス液をインキュベートした。次いで、免疫原性組成物へと調合するまで、ウイルス液を４℃で保存した。ウイルス液（ウイルスの１０５〜１０９ＴＣＩＤ５０を含有する。前不活化力価に基づく。）を生理的に許容される希釈剤（ＥＭＥＭ、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ）、リン酸緩衝化された生理的食塩水など）及び免疫刺激アジュバント（単独で、又は組み合わせて使用される、鉱物油、植物油、水酸化アルミニウム、サポニン、非イオン性界面活性剤、スクアレン又は本分野において公知の他の化合物など）と混合することによって、免疫原性組成物を調製した。免疫原性組成物の用量は、典型的には、１ｍＬと５ｍＬの間にあった。
【００２５】
生免疫原性組成物又は生ワクチン製剤の場合、ウイルス液（弱毒化ウイルス）は、使用まで、−５０℃以下で凍結して保存される。ウイルス液（１０３．０と１０７．０ＴＣＩＤ５０／用量の範囲内であるが、典型的には、１０６．０ＴＣＩＤ５０／用量を含有する。）を、生理的に適切な希釈剤（ＥＭＥＭ、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒ）、リン酸緩衝化された生理的食塩水）と、ウイルスを安定化するために設計された化合物の生理的に適切な混合物で希釈した。ウイルスを安定化させるために、単独で又は組み合わせて使用することが可能な本分野で公知の化合物には、スクロース、ラクトース、Ｎ−Ｚアミン、グルタチオン、ネオペプトン、ゼラチン、デキストラン及びトリプトンが含まれる。ワクチンは、使用まで、凍結して（−５０℃以下）保存するか、又は凍結乾燥して４℃で保存する。免疫原性組成物又はワクチンは、典型的には、２ｍＬの用量サイズを有する（１〜５ｍＬの範囲）。
【００２６】
ＰＲＲＳによって誘導された疾病に対して予防するために、ワクチンの一回用量の皮内、筋肉内、皮下、鼻内又は経口投与によって、生免疫原性組成物又は死滅した免疫原性組成物をブタにワクチン接種する。強化ワクチン接種は、初期免疫から２〜４週後に投与し得る。ＰＰＲＳに付随する疾患を予防するために、ワクチン接種の治療計画は、典型的には、出産の最長６週前に開始され、遅くて出産から１週後に与えることが可能である。子ブタにおける呼吸疾患の予防の場合、ワクチン接種は、早くも３週齢で与えることができる。
【００２７】
株弱毒化の例及び免疫応答を誘導する能力
ＰＰ５実験
妊娠８５日のＰＰＲＳ血清反応陰性の雌ブタに、原種ワクチン株ＰＰ５（１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を鼻内接種（３ｍＬ／鼻孔）した。全ての雌ブタは、予定の時間に出産した。
【００２８】
表１は、ＰＰ５  ＰＲＲＳウイルス株実験に対する結果を示している。第一群のＰＰ５−ＷＴは、野生型ウイルス又は毒性／疾病対照である。群ＰＰ５−ＭＳＶは、弱毒化されたＰＰ５株の原種ウイルスである。野生型ウイルスに対して何らかの復帰が起こっているかどうかを知るために、ＰＰ５−ＢＰは、ＰＰ５−ＭＳＶから５代復帰継代（ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）（ブタ継代）を表す。
【００２９】
ＰＰ５実験から得られた結果は、表２にまとめられている。それぞれ、ＰＰ５−ＷＴは、ＰＰ５−ＭＳＶに比べて６９％の分娩死亡率を引き起こし、ＰＰ５−ＢＰは、１６％の分娩死亡率〜１９％の分娩死亡率を引き起こすに過ぎなかった。
【００３０】
【表１】
2008520238.tif 000002
【００３１】
【表２】
2008520238.tif 000003
【００３２】
ＬＣ１３実験
妊娠８５日のＰＰＲＳ血清反応陰性の雌ブタに、原種ワクチン株ＬＣ１３（１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を鼻内接種（３ｍＬ／鼻孔）した。全ての雌ブタは、予定の時間に出産した。
【００３３】
表３は、ＬＣ１３  ＰＲＲＳウイルス株実験に対する結果を示している。第一群のＬＣ１３−ＷＴは、野生型ウイルス又は疾病／毒性対照である。群ＬＣ１３−ＭＳＶは、弱毒化されたＬＣ１３株の原種ウイルスである。野生型ウイルスに対して何らかの復帰が起こっているかどうかを知るために、ＬＣ１３−ＢＰは、ＬＣ１３−ＭＳＶから５代復帰継代（ｂａｃｋｐａｓｓａｇｅ）（ブタ継代）を表す。
【００３４】
ＬＣ１３実験から得られた結果は、表４にまとめられている。ＬＣ−ＷＴは、子ブタの８６％に分娩死亡率を引き起こしたのに対して、ＬＣ１３−ＭＣＶ及びＬＣ１３−ＢＰは、それぞれ、１２％の分娩死亡率〜１５％の分娩死亡率を引き起こすに過ぎなかった。
【００３５】
【表３】
2008520238.tif 000004
【００３６】
【表４】
2008520238.tif 000005
【００３７】
表１及び３に見出される酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｌｉｓａ）抗体データは、雌ブタに対するＥｌｉｓａ抗体から得られた結果を表している。ＥＬＩＳＡは、ＰＲＲＳに対する抗体を検出するために最も一般的に使用される検査である。ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．によって製造されているＨｅｒｄＣｈｅｋ  ＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡは、ブタ血清又は血漿から得た抗ＰＲＲＳＶヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質抗体の検出用である。検査結果は、試料／陽性（Ｓ／Ｐ）価：陽性＝Ｓ／Ｐ比＞０．４、陰性＝Ｓ／Ｐ比＜０．４に基づいて測定された。結果が表１及び３に示しているように、ＬＣ１３−ＭＳＶ及びＰＰ５−ＭＳＶは何れも、ＰＲＲＳに対する抗体を産生した。得られたこのデータは、免疫原性組成物の証拠を提供する。
【００３８】
本願に提示されたデータは、弱毒化ＰＲＲＳウイルス株ＰＰ５及びＬＣ１３が何れも安全であり、免疫応答を誘導することを明確に示している。
【配列表】
2008520238000001.app
【国際調査報告】
2008520238.tif 000006
2008520238.tif 000007
2008520238.tif 000008
2008520238.tif 000009
2008520238.tif 000010