(57)【要約】本発明は、最初に糖類をアルコール（たとえば、エタノール）および金属陽イオン（たとえばカルシウム塩として）の水性混合物で処理し、次いで陽イオン界面活性剤（たとえば、ＣＴＡＢ）で沈殿させる精製方法を基本とする。該方法は、細菌から糖類を遊離した後、３日未満で完了でき、収率は約６０％である。ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよび／またはプロテアーゼ処理の必要がない。該方法の糖類は、タンパク質の混入が非常に少なく、２８０ｎｍでの吸光度が非常に低い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロコッカス・アガラクティエの莢膜多糖類を精製する方法であって、（ａ）連鎖球菌性タンパク質と、核酸と、莢膜多糖類とを含む懸濁液を、核酸およびタンパク質を沈殿させるために、水性金属カチオンおよびアルコールで処理する工程と、（ｂ）沈殿物質を該水性物質から分離する工程と、（ｃ）莢膜多糖類を沈殿させるために、該水性物質を陽イオン界面活性剤で処理する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記多糖類がＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩから選択されるＳ．アガラクティエ血清型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記血清型がＩａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶから選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記多糖類が実質的に完全長莢膜多糖類である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記多糖類の分子量が＞３０ｋＤａである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記糖類が、部分的にまたは完全にＯ−脱アセチル化されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記糖類が、部分的にまたは完全にＮ−脱アセチル化されている、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記懸濁液が、遠心分離されたＳ．アガラクティエ培養液からの上清である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記莢膜糖類が遊離するように、Ｓ．アガラクティエを処理することにより、前記懸濁液を調製する、請求項１〜７のいずれか１に記載された方法。
【請求項１０】
前記莢膜糖類を化学的または酵素的処理によって遊離する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記莢膜糖類を塩基抽出によって遊離する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記莢膜糖類を、ムタノリシンおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理することによって遊離する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記莢膜糖類を、ＩＩ型ホスホジエステラーゼで処理することによって遊離する、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記アルコールが低級アルコールである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールが、エタノールまたはイソプロパノールである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記アルコールを懸濁液に添加し、１０％と５０％との間の最終アルコール濃度を得る、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記水性金属陽イオンが、１価または２価である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記陽イオンがＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋またはＣａ＋＋である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｃａ＋＋イオンが、１０ｍＭと５００ｍＭとの間の最終濃度で使用され、および存在する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）が、遠心分離を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
遠心分離後の前記上清を、精密ろ過処理に供する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）の後、工程（ｃ）の前に透析ろ過の工程を行う、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）における陽イオン性工程が、ＣＴＡＢ等の、テトラブチルアンモニウムまたはセチルトリメチルアンモニウム塩である、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
さらに、前記糖類を水性媒質またはアルコール媒質に再可溶化することを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
水性媒質が前記糖類を再可溶化するために使用され、該水性媒質はＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋またはＣａ＋＋を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
アルコール媒質が前記糖類を再可溶化するために使用され、該アルコールの最終濃度は、７０％と９５％との間である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載の方法によって得られるステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を含む、組成物。
【請求項２８】
２８０ｎｍでのＵＶ吸光度が０．２０未満である、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
２６０ｎｍでの組成物のＵＶ吸光度に対する２８０ｎｍでの組成物のＵＶ吸光度の比が０．８５を超える、請求項２７記載の組成物。
【請求項３０】
２２０ｎｍと３００ｎｍとの間の組成物のＵＶ吸光度スペクトルが、２７０ｎｍ付近でショルダーあるいはピークのいずれかを示す、請求項２７記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物のＵＶスペクトルが、２５０ｎｍと２７５ｎｍとの間で、最高点も変曲点も持たない、請求項２７記載の組成物。
【請求項３２】
前記糖類の純度が、前記組成物中の糖類、タンパク質および核酸の総重量に対して少なくとも８９％である、請求項２７記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細菌の莢膜多糖類、特にストレプトコッカス・アガラクティエの莢膜多糖類を精製する分野、およびワクチンの製造における用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌の莢膜糖類は、莢膜細菌に対するワクチンにおいて長年使用されてきた。しかし、糖類はＴ細胞非依存性抗原であり、免疫抗原性が低い。キャリアへの結合によって、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原に変換し、それによってメモリー応答を増強し、保護免疫を発現させることができる。したがって、最も効果的な糖類ワクチンは、糖結合体に基づき、プロトタイプ結合型ワクチンは、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型菌（「Ηｉｂ’」）に対するものであった［たとえば、参考文献７９の第１４章参照］。
【０００４】
結合型ワクチンで記載された他の細菌は、ステロコッカス・アガラクティエであり、「Ｂ群ステロコッカス」または単に「ＧＢＳ」としても知られている。この研究に関する多くのことがＤｅｎｎｉｓ  Ｋａｓｐｅｒおよびその仲間によってなされ、それは、たとえば、非特許文献１〜９（参考文献１〜９）等の文献に記載されている。
【０００５】
糖類ベースのワクチンの出発点は糖類それ自身であり、これは一般的に標的細菌から精製される。ＧＢＳ糖類を精製するカスパー法は、参考文献２および１０に詳細に記載され、細菌の培養後、以下の基本的な工程を含む：１０ｋＤａカットオフ膜を使用する限外ろ過；ろ過による細菌の除去；エタノールを加えて３０％とし、混入物を沈殿；エタノールを増やして８０％とし、一晩でＧＢＳ糖類を沈殿；沈殿物の収集および乾燥；ＲＮａｓｅ、次いでＤＮａｓｅ、次いでプロナーゼでの処理；水酸化ナトリウムでの処理；透析；ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）イオン交換クロマトグラフィー；透析；凍結乾燥；無水酢酸処理；コンコナヴィリン（ｃｏｎｃｏｎａｖｉｌｉｎ）アフィニティクロマトグラフィーによるマンナンの除去；ウルトラゲルサイズ排除クロマトグラフィー；および最終凍結乾燥を含む。
【０００６】
それぞれ一晩を費やすＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼおよび水酸化ナトリウム処理のため、この方法は非常に遅く、完了するのに１週間を要するのは十分ありえる。さらに、収率は、５０％をはるかに下回る。したがって、ＧＢＳ莢膜多糖類を精製する改良された方法、特に、高い収率を有するより早い方法がさらに必要である。
【非特許文献１】Ｐａｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１８２７８−８３
【非特許文献２】Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８６：１４２８−３３
【非特許文献３】Ｐａｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６０：４００９−１４
【非特許文献４】Ｐａｏｌｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８９：２０３−９
【非特許文献５】Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：９１７０−４
【非特許文献６】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：１１１２−７
【非特許文献７】Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６１：４７６０−６
【非特許文献８】Ｗｅｓｓｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １７１：８７９−８４
【非特許文献９】Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８９：１１０３−１２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、最初に糖類をアルコール（たとえば、エタノール）および金属陽イオン（たとえばカルシウム塩として）の水性混合物で処理し、次いで陽イオン界面活性剤（たとえば、ＣＴＡＢ）で沈殿させる精製方法を基本とする。該方法は、細菌から糖類を遊離した後、３日未満で完了でき、収率は約６０％である。
【０００８】
本発明は、ステロコッカス・アガラクティエの莢膜多糖類を精製する方法であって、（ａ）連鎖球菌性タンパク質と、核酸と、莢膜多糖類とを含む懸濁液を、核酸およびタンパク質を沈殿させるために、水性金属カチオンおよびアルコールで処理する工程と、（ｂ）沈殿物質を該水性物質から分離する工程と、（ｃ）莢膜多糖類を沈殿させるために、該水性物質を陽イオン界面活性剤で処理する工程とを含む方法を提供する。次いで、沈殿多糖類は分離され、その後のワクチン生成のために再可溶化することができる。該方法には、他の加工工程、たとえば、低分子量混入物（たとえば、群特異炭水化物のフラグメント）を除去する限外ろ過工程、追加の沈殿工程および再可溶化工程および／または乾燥工程を含んでもよい。
【０００９】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエの莢膜多糖類を精製する方法であって、陽イオン界面活性剤を使用して糖類を沈殿させる工程を含む方法も提供する。同様に、本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法において、糖類を沈殿させるために、陽イオン界面活性剤を使用することからなる改良を提供する。陽イオン界面活性剤を用いる沈殿は、存在する他の糖類、たとえば群特異糖類等からの莢膜糖類の分離を簡略化する。
【００１０】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法であって、沈殿を使用することによって汚染核酸および／またはタンパク質を取り除く工程を含む方法も提供する。同様に、本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法において、汚染核酸を取り除くために、沈殿を使用することからなる改良を提供する。沈殿はＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ酵素的処理の必要性を回避する。
【００１１】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法であって、ＤＮａｓｅ処理の工程を含まない方法も提供する。同様に、本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法であって、ＲＮａｓｅ処理の工程を含まない方法も提供する。同様に、本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を精製する方法であって、プロテアーゼ処理の工程を含まない方法も提供する。本発明の方法は、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅおよび／またはプロテアーゼの２または３の使用を含まない、たとえば３つのどれも使用しないことが好ましい。
【００１２】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ細菌から莢膜糖類を精製する方法であって、該方法の収率（細菌で始まり莢膜多糖類で終わる）が、少なくとも４０％（たとえば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％）である方法も提供する。実用上の限界は、収率が９０％を超えない（たとえば、＜９０％、＜８０％、＜７０％など）ことを意味する。
【００１３】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ細菌から莢膜糖類を精製する方法であって、純度が、組成物中の糖類、タンパク質および核酸の総重量に対して少なくとも８９％（たとえば、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％など）である糖類を含む組成物を提供する方法も提供する。
【００１４】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ細菌から莢膜糖類を精製する方法であって、（ａ）方法の収率が少なくとも４０％（先に記載したように）であり、（ｂ）糖類の純度が少なくとも８９％（先に記載したように）である方法も提供する。
【００１５】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ細菌から莢膜多糖類を遊離する方法であって、細菌をＩＩ型ホスホジエステラーゼで処理する工程を含む方法も提供する。これらの酵素は、同じリン酸塩を水酸化ナトリウムとして開裂することができるが、水酸化ナトリウムの脱アセチル化反応性は持たないという利点を提供する。
【００１６】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を含む組成物であって、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度が０．２０未満である組成物も提供する。＜０．１５あるいはさらに＜０．１０の吸光度が好ましい。本発明の方法は、タンパク質混入が非常に少ない組成物を与え、これにより２８０ｎｍでの吸光度を非常に小さくなることが見出された。これは従来技術の方法に対して特に有利な効果であり、〜２８０ｎｍでの吸光度ピークを示す物質を与える。
【００１７】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を含む組成物であって、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に対する２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の比が０．８５を超える組成物を提供する。＞０．９０、＞０．９５、またはさらに＞１．０の比が好ましい。該比は、普通１．２未満である。１．０±０．１の比が好ましい。
【００１８】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を含む組成物であって、２２０ｎｍと３００ｎｍとの間の組成物のＵＶ吸光度スペクトルが２７０ｎｍ付近でショルダーあるいはピークのいずれかを示す組成物も提供する。また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型Ｉａまたは血清型ＩＩＩ莢膜多糖類を含む組成物であって、２５０ｎｍと２７５ｎｍとの間のＵＶ吸光度スペクトルが増加しない組成物も提供する。また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜多糖類を含む組成物であって、２５０ｎｍと２７５ｎｍとの間の組成物のＵＶスペクトルが最高点も変曲点も持たない組成物も提供する。
【００１９】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類の純度が、組成物中の糖類、タンパク質および核酸の総重量に対して、少なくとも８９％（たとえば、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％など）である組成物も提供する。
【００２０】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型Ｉａ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類が単糖類サブユニットを有し、９３％以下（たとえば、≦９２％、≦９０％、≦８５％、≦８０％、≦７５％、≦７０％、≦６５％、≦６０％、≦５５％、≦５０％、≦４５％、≦４０％など）の単糖類サブユニットがＮ−アセチル基を有する組成物も提供する。
【００２１】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型Ｉｂ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類が単糖類サブユニットを有し、少なくとも７８％（たとえば、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９２％、≧９４％、≧９６％、≧９８％など）の単糖類サブユニットがＮ−アセチル基を有する組成物も提供する。
【００２２】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型ＩＩＩ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類が単糖類サブユニットを有し、７６％以下（たとえば、≦７４％、≦７２％、≦７０％、≦６５％、≦６０％、≦５５％、≦５０％、≦４５％、≦４０％など）の単糖類サブユニットがＮ−アセチル基を有する組成物も提供する。
【００２３】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型Ｉａ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類の分子量が少なくとも１００ｋＤａである組成物も提供する。
【００２４】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型Ｉｂ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類の分子量が少なくとも４０ｋＤａである組成物も提供する。
【００２５】
また本発明は、ステロコッカス・アガラクティエ血清型ＩＩＩ莢膜糖類を含む組成物であって、糖類の分子量が少なくとも４０ｋＤａである組成物も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本明細書で挙げられた全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
莢膜糖類
Ｓ．アガラクティエ莢膜多糖類は、細菌のペプチドグリカン骨格中のＧｌｃＮＡｃ残基に共有結合し、Ｂ群抗原から区別され、同じペプチドグリカン骨格上のＭｕｒＮＡｃ残基に結合する糖類とは別のものである（図１［１２］）。異なる血清型の莢膜多糖類は、化学的に関連するが、抗原性が非常に異なる。ＧＢＳ莢膜多糖類は、全て、以下の三糖類コア：
β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ（１→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ（１→４）β−Ｄ−Ｇｌｃｐ
を共有する。
【００２８】
種々のＧＢＳ血清型は、このコアを修飾する方法によって異なる。たとえば、血清型ＩａとＩＩＩとの間の相違は、このコアにおいて、連続する三糖類コアを結合するために、ＧｌｃＮＡｃ（Ｉａ）あるいはＧａｌ（ＩＩＩ）のどちらを使用するかによって起こる（図３）。血清型ＩおよびＩｂは両方とも、コア中にＧｌｃＮＡｃに結合する［α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ（２→３）β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→］二糖類をもつが、結合は、１→４（Ｉａ）または１→３（Ｉｂ）のどちらかである。
【００２９】
ＧＢＳ関連疾患は、主に、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩに起因し、９０％を超えるものが５つの血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶによって起こされる。本発明は、好ましくは、これらの５つの血清型の１つからの糖類を使用する。図２に示すように、これらの血清型のそれぞれの莢膜糖類は、（ａ）全ての場合においてガラクトース残基に２→３結合する、末端Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ΝｅｕΝＡｃ）残基（商業的にはシアル酸と言われる）および（ｂ）三糖類コア内にＮ−アセチル−グルコサミン残基（ＧｌｃΝＡｃ）を含む。
【００３０】
５つの糖類は全て、三糖類コア内にガラクトース残基を含むが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＩＩＩは、各繰返し単位中に、繰返し単位１個につき３個のガラクトース残基を含む血清型ＩＩ糖類を持つ、付加的なガラクトース残基も含む。本発明に従って精製された糖類は、普通、その本来の形態であるが、修飾されてもよい。たとえば、糖類は、原型莢膜糖類より短くてもよく、または化学的修飾されてもよい。
【００３１】
したがって、本発明に従って使用される糖類は、実際発見されたままの完全長莢膜多糖類であってもよいし、自然長より短くてもよい。完全長多糖類は、たとえば、弱酸での加水分解によって、加熱によって、サイズクロマトグラフィーなどによって、解重合し、本発明による使用のために、たとえば、より短いフラグメントを提供する。鎖長は、ウサギにおいて、ＧＢＳ糖類の免疫抗原性に影響することが報告されている［４］。
【００３２】
エンド−β−ガラクトシダーゼによる血清型ＩＩＩ莢膜糖類の解重合が報告されている［１および４〜６を参照］。ＧＢＳ血清型ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩＩＩからの莢膜多糖類のオゾン分解も解重合に使用される［１３］。ＭＷ＞３０ｋＤａを有する糖類を使用することが好ましく、実質的な完全長莢膜多糖類を使用することができる。血清型Ｉａに関して、ＭＷが１４５ｋＤａまでの多糖類を使用することが好ましい。血清型Ｉｂに関しては、ＭＷが５０ｋＤａまでの多糖類を使用することが好ましい。血清型ＩＩＩに関しては、ＭＷが５０ｋＤａまでの多糖類を使用するのが好ましい。これらの分子質量は、デキストリン標準に対するゲルろ過、たとえば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ社から入手できるろ過によって測定することができる［１４］。
【００３３】
糖類は、事実上発見されたままの莢膜糖類に対して化学的に修飾されてもよい。たとえば、糖類を、たとえば、Ｏ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−脱アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオン化（部分的にまたは完全に）してもよい。特定の糖類に依るが、脱アセチル化は、免疫抗原性に影響をすることもしないこともあり、たとえばＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ（商標）ワクチンはＯ−脱アセチル化糖類を使用し、一方、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（商標）はアセチル化されているが、両ワクチンとも効果がある。種々の血清型におけるＧＢＳ糖類上のＯ−アセチル化の関連性については、参考文献１５で検討され、たとえば、糖類および／または細菌不活性化物を抽出するためにホルムアルデヒドを使用することによって、保護／脱保護、再アセチルル化などによって、精製の前、間および後で、７位、８位および／または９位でシアル酸残基のＯ−アセチル化を保つことが好ましい。脱アセチル化などの効果は、日常のアッセイによって評価することができる。
【００３４】
出発物質
本発明の方法は、水性形態の莢膜糖類、一般的には連鎖球菌性タンパク質、核酸および莢膜多糖類を含む懸濁液から出発する。
【００３５】
細菌の成長の間、少量の莢膜多糖類を培養液の媒体中に遊離し、したがって、汚染タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿のための出発物質は、遠心分離された細菌の培養液の上清であってよい。しかし、より一般的には、出発物質は、莢膜細菌それ自身（または細菌ペプチドグリカンを含む物質）を、莢膜糖類が遊離するように処理することによって調製されるであろう。参考文献１０は、これらの２種の原料の両方から調製された糖類の特性を示す。
【００３６】
莢膜多糖類は、化学的、物理的または酵素的処理を始めとする種々の方法によって細菌から遊離することができる。したがって、最初のタンパク質／核酸沈殿反応の前に、多糖類の水性調製物を処理することができる。
【００３７】
代表的な化学的処理は、塩基抽出［１６］（たとえば、水酸化ナトリウムを使用する）であり、これは、莢膜糖類とペプチドグリカン骨格との間のホスホジエステル結合を開裂することができる。塩基抽出は細菌には不活性で、同時に莢膜多糖類を遊離するので、有利である。さらに、塩基処理は、無傷の多糖類を遊離し、その複数のホスホジエステル結合によって、Ｂ群抗原の広範な開裂を起こし（図４［１２］）、莢膜および群特異糖類抗原の後の分離を促進する。したがって、水酸化ナトリウム処理は、莢膜多糖類を遊離する好ましい方法である。しかし、水酸化処理は莢膜糖類を脱Ｎ−アセチル化するので、後で、再Ｎ−アセチル化が必要となるだろう。
【００３８】
代表的な酵素的処理は、ムタノリシンおよびβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの両方の使用を含む［１２］。これらは、ＧＢＳペプチドグリカン上で、本発明のために使用される莢膜糖類を遊離するように作用するが、群特異炭水化物抗原の遊離も起こす。代わりの酵素的処理は、ＩＩ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ２）による処理を含む。ＰＤＥ２酵素は、同じリン酸塩を水酸化ナトリウム（前記参照）として開裂することができ、群特異炭水化物抗原を開裂することなく、および莢膜糖類を脱Ｎ−アセチル化することなく、莢膜糖類を遊離することができ、これにより、下流の工程を簡素化することができる。したがって、ＰＤＥ２酵素は、本発明の方法において使用するためのＧＢＳ莢膜糖類を調製する好ましい選択肢である。
【００３９】
したがって、本発明の方法のために好ましい出発物質は、Ｎ−脱アセチル化莢膜多糖類であり、これは、参考文献１６に記載するように、塩基抽出によって得ることができる。他の好ましい出発物質は、ＧＢＳのＰＤＥ２処理の生成物である。そのような物質は、本発明の方法による沈殿の前に、濃縮（たとえば、限外ろ過）することができる。
【００４０】
アルコール沈殿および陽イオン交換
培養後得られたＧＢＳ莢膜糖類は、普通、不純であり、細菌の核酸およびタンパク質で汚染されている。従来技術では、これらの混入物をＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅおよびプロテアーゼを使用する連続的終夜処理によって除去していた。対照的に、本発明の全精製方法は、従来技術からこれらの個々の工程より短い時間で行うことができる。これらの混入物を酵素的に除去するのではなく、本発明の方法では、アルコール沈殿を利用する。必要であれば（たとえば、塩基抽出後）、物質を通常は沈殿反応の前に中性化する。
【００４１】
汚染核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用されるアルコールは、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどの低級アルコールが好ましい。適正なアルコールの選択は、過度の負担なしに経験的に試験することができるが、フェノール等のアルコール類よりエタノールおよびイソプロパノール（プロパン−２−オール）等のアルコール類が好ましい。
【００４２】
アルコールは、多糖類懸濁液に添加し、最終アルコール濃度を１０％と５０％との間（たとえば、約３０％）とするのが好ましい。最も有用な濃度は、多糖類をまた沈殿することなく、混入物の十分な沈殿を達成する濃度である。最適な最終アルコール濃度は、多糖類が得られるＧＢＳ血清型に依るが、過度の負担なしに、日常の実験によって決定することができる。多糖類の沈殿は、＞５０％のエタノール濃度が観察されている。
【００４３】
アルコールは、純粋な形態で添加してもよいし、混和性溶媒（たとえば水）で希釈された形態で添加してもよい。好ましい溶媒混合物は、エタノール：水の混合物であり、好ましい比は、約７０：３０と約９５：５との間（たとえば、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）である。
【００４４】
糖類も、水性金属カチオンで処理される。１価および２価の金属陽イオンが好ましく、複合体形成においてより効率的であるので、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋などの２価の陽イオンが特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用で、したがって、アルコール混合物は、溶解性カルシウムイオンを含むのが好ましい。これらは、カルシウム塩の形態で、固体としてあるいは水性形態で、糖類／アルコール混合物に加えてもよい。カルシウムイオンは塩化カルシウムを使用して提供されるのが好ましい。
【００４５】
カルシウムイオンは、１０ｍＭと５００ｍＭとの間の最終濃度、たとえば約０．１Ｍで存在するのが好ましい。最適最終Ｃａ＋＋濃度は、多糖類を得るＧＢＳ血清型に依るが、過度の負担なしに日常の実験によって決定することができる。
【００４６】
アルコールおよび陽イオンは、異なる役割を果たす（アルコールは混入物に沈殿させるために使用され、一方、陽イオンは溶解性形態で糖類を安定化および複合体化する）が、併用効果を生み出す。目的は、糖類、アルコールおよび陽イオンの混合物を調製することであるが、これら３成分は、同時に一緒に混合される必要はない。したがって、アルコールおよび陽イオンは、順次または同時に使用することができる。順次処理が好ましく、特に好ましい方法は、糖類に陽イオンを添加し、次いで、陽イオン／糖類混合物にアルコールを添加するが、所望の場合は、アルコールを陽イオンの前に使用することができる。
【００４７】
汚染タンパク質および／または核酸のアルコール沈殿後、ＧＢＳ莢膜多糖類は溶液中に残る。沈殿物質は、適切な方法、たとえば遠心分離によって多糖類から分離することができる。後の工程でフィルターを詰まらせるかもしれない粒子（たとえば、直径が０．２２μｍを超える沈殿粒子）を取り除くために、上清を、精密ろ過処理、特に全量ろ過（垂直方向のろ過）に供することができる。代わりの全量ろ過法に代わるものとして、接線精密ろ過処理を使用することができる。
【００４８】
透析ろ過
本発明の方法は、タンパク質および／または核酸の沈殿の後であって界面活性剤介在沈殿の前に、透析ろ過の工程を含んでもよい。この透析ろ過工程は、群特異糖類も加水分解され、無処理の莢膜糖類に加えて、非常に小さくするので、塩基抽出またはホスホジエステラーゼを莢膜糖類の遊離のために使用する場合、特に有利である。これらの小フラグメントは、透析ろ過工程によって除去することができる。
【００４９】
接線流透析ろ過が一般的ある。したがって、ろ過膜は、群特異性抗原の加水分解生成物の通過を可能にする一方、莢膜多糖類は保持する膜である。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲の切断片が一般的である。群特異性抗原の加水分解フラグメントは約１ｋＤａ（５−ｍｅｒ、８−ｍｅｒおよび１１−ｍｅｒ糖類）であるので、より小さな切断片サイズを使用することができるが、より高い切断片は、莢膜糖類が損失することなく他の混入物を有利に除去する。
【００５０】
通常、フロー透析ろ過は、少なくとも５サイクル、たとえば、６、７、８、９、１０、１１またはそれ以上のサイクルで行う。
【００５１】
陽イオン界面活性剤処理
溶解性多糖類を沈殿する多くの技術が業界で公知である。本発明によれば、１種以上の陽イオン界面活性剤を使用して、ＧＢＳ糖類を沈殿させる。発明者らは、陽イオン界面活性剤を用いてＧＢＳ莢膜糖類および群特異糖類の混合物を処理すると、莢膜糖類の沈殿が優先的に起こり、これによって、有利に且つ簡単に群特異糖類の混入を最小限にするということを見出した。
【００５２】
陽イオン界面活性剤は、好ましくは、以下の一般式：
【００５３】
【化１】
2008528052.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同じまたは異なり、それぞれ、アルキルまたはアリールであり、あるいはＲ１およびＲ２は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５または６員環飽和複素環を形成し、Ｒ３は、アルキルまたはアリールを示し、あるいはＲ１、Ｒ２およびＲ３は、これらが結合する窒素原子と一緒になって、窒素原子にて不飽和である、５−または６−員環複素環を形成し、
Ｒ４は、アルキルまたはアリールを示し、
Ｘ−は陰イオンを示す）を有する。
【００５４】
本発明の方法で使用される、特に好ましい界面活性剤は、テトラブチルアンモニウムおよびセチルトリメチルアンモニウム塩類（たとえば、臭化物塩類）である。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）が特に好ましい［１７］。ＣＴＡＢはまた、ヘキサデシルトリメチルアミノミウムブロミド、セトリモニウムブロミド、ＣｅｔａｖｌｏｎおよびＣｅｎｔｉｍｉｄｅとしても知られている。他の界面活性剤として、ヘキサジメトリンブロミドおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩類が挙げられる。
【００５５】
界面活性剤媒介沈殿工程は、莢膜多糖類に関し好ましい選択性がある。本発明では、糖類中で、たとえばシアル酸中のカルボキシル基を介して、シアル酸残基と相互反応する、ＣＴＡＢ等の界面活性剤を使用するのが有利である。したがって、界面活性剤は、混合種個体群の中でシアル酸含有莢膜糖類、特により長い糖類を優先的に沈殿させ、その結果、抗原的に重要なシアル酸がより早い処理工程で損傷を受け得た糖類による混入を最小限にする。ＧＢＳに関して、より長い糖類は、より短い糖類より免疫抗原性がより強い傾向があり［１８］、したがって、本発明は、より短い解重合糖類をもたらすという従来技術の方法に優る利点を提供する。
【００５６】
沈殿後、莢膜糖類は遠心分離によって分離することができる。本発明者らは、ＣＴＡＢ介在沈殿後の遠心分離から単一のペレットは得られないが、その代わりに、２相を有するようなペレットが得られることを見出した。通常、これらの下部を本発明によるさらなる使用のために選択する。
【００５７】
再可溶化
沈殿後、多糖類（通常、陽イオン界面活性剤との結合体の形態で）を、水性媒質中あるいはアルコール媒質中に再可溶化することができる。水性再可溶化では、通常、沈殿物中のＣＴＡ−陽イオンは金属陽イオンによって置き換わり、アルコール性再可溶化では、通常、ＣＴＡ−陽イオンは残る。水性またはアルコール性再可溶化の選択は、多糖類が得られるＧＢＳ血清型およびこの段階でまだ存在する任意の混入物に依存し得る。たとえば、顔料が沈殿ペレット中に存在する場合があり、これらはアルコール性再可溶化、次いで炭素ろ過によって効率的に除去することができる。
【００５８】
再可溶化用の代表的な水性媒質には、金属陽イオンが含まれる。１価および２価の金属陽イオンが好ましく、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃａ＋＋などの２価の陽イオンが特に好ましい。カルシウムイオンは特に有用であり、再可溶化は、好ましくは、塩化カルシウムの使用によって提供されるＣａ＋＋を、好ましくは使用する。Ｃａ＋＋濃度は、１０ｍＭと５００ｍＭとの間（たとえば約０．１Ｍ）が好ましい。最適最終Ｃａ＋＋濃度は、多糖類が得られるＧＢＳ血清型に依存し得、過度の負担なしに日常の実験によって決定することができる。
【００５９】
再可溶化用の代表的なアルコール媒質は、エタノールに基づく。核酸および／またはタンパク質の沈殿に使用したのと同じアルコールを使用することができるが、莢膜糖類の沈殿に必要な濃度は、一般的に、より高く、たとえば、アルコールを添加して、最終アルコール濃度が７０％と９５％との間（たとえば、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）とするのが好ましい。最適最終アルコール濃度は、多糖類が得られるＧＢＳ血清型に依存し得る。高いアルコール濃度を得るためには、低含水率のアルコール、たとえば９６％エタノールを添加するのが好ましい。
【００６０】
再可溶化は、通常、室温で行われる。酸性条件を避けるのが好ましく、再可溶化は、通常、約ｐＨ７で行われる。
【００６１】
再可溶化物質は、再沈殿懸濁液と比較してかなり精製される。
【００６２】
莢膜多糖類のさらなる処理
再可溶化後、混入物を除去するために多糖類をさらに処理してもよい。微量の混入でさえゆるされない状況において（たとえば、ヒトワクチン製造において）は、これは特に重要である。
【００６３】
好ましい追加の工程の１つは、追加の沈殿である。水性再可溶化を行なった場合、この沈殿は、通常、先の項で記載したように、アルコールを使用し、逆に、アルコール性再可溶化を行った場合、この沈殿は、通常、先の項で記載したように、陽イオン水溶液を使用する。次いで、沈殿糖類は、たとえば遠心分離によって、残存する水性混入物のいかなるものからも分離することができる。沈殿物質は安定で、さらなる用途のために保存することができる。
【００６４】
沈殿物質は、真空乾燥に供してもよい。この処理は、通常、保存のために糖類を安定化するために使用されるのではなく、糖類を乾燥し、いかなる残存アルコールも除去するために使用される。
【００６５】
また、沈殿およびろ過の追加のラウンドを行うこともできる。深層ろ過も、たとえば遠心分離の代わりに行うことができる。深層ろ過は、通常、アルコールでの可溶化の後に使用される。
【００６６】
多糖類を解重合してオリゴ糖類を形成してもよい。オリゴ糖類は、ワクチンにおける使用に関し、多糖類より好ましく、鎖長は、ウサギにおいて、ＧＢＳ糖類の免疫抗原性に影響すると報告されている［４］。多糖類からオリゴ糖類への解重合は、界面活性剤介在沈殿の前または後で起こり得る。解重合を実施した場合、短い長さのオリゴ糖類を除去するために、一般的に、生成物を寸法規制する。これは、限外ろ過の後、イオン交換クロマトグラフィーを行うなど、種々の方法で達成することができる。本発明の組成物が解重合された糖類を含む場合、解重合がいかなる結合処理よりも先行するのが好ましい。
【００６７】
ＧＢＳ莢膜糖類中のシアル酸残基がＮ−脱アセチル化されている場合、本発明の方法は、再Ｎ−アセチル化工程を含んでもよい。制御された再Ｎ−アセチル化を、無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏ等の試薬を、たとえば５％炭酸水素アンモニウム中で使用して簡単に行うことができる［１０］。
【００６８】
これら追加の工程は、一般的に室温で行うことができる。
【００６９】
結合化
本発明の最終精製莢膜多糖類は、さらに修飾することなく、インビトロ診断アッセイ、免疫化などの用途のために、抗原として使用することができる。
【００７０】
しかし、免疫化目的のためには、タンパク質等のキャリア分子に糖類を結合化するのが好ましい。一般的に、糖類のキャリアへの共役結合によって、それらはＴ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原に変換するので、糖類の免疫抗原性が増強され、免疫系の記憶のための準備を可能にする。結合化は、小児科ワクチン用に特に有用［たとえば、参考文献１９］であり、よく知られた技術である［たとえば、参考文献２０〜２８に評価されている］。したがって、本発明の方法は、精製糖類をキャリア分子に結合化するさらなる工程を含んでもよい。
【００７１】
ＧＢＳ糖類の結合化は、広く報告されている。たとえば、参考文献１〜９を参照されたい。代表的な従来技術のＧＢＳ糖類結合化方法は、代表的には、精製糖類の破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＣＲＭ１９７等のキャリアタンパク質への還元アミノ化を含む［２］。還元アミノ化物は、キャリア中のアミノ酸の側鎖上のアミン基と、糖類中のアルデヒド基とを含む。ＧＢＳ莢膜糖類はそれらの自然形態ではアルデヒド基を含まないので、これを、結合化の前に、糖類のシアル酸残基の一部（たとえば、５％と１５％との間、好ましくは約１０％）の過ヨウ素酸塩を用いる酸化によって生成する［２，２９］。この方法で生成された結合型ワクチンは、ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶのそれぞれに関してヒトにおいて安全かつ免疫抗原性であることが示されている［３０］。結合方法の代替例として、参考文献３１に記載されているように、二官能性結合とともに、糖類（脱Ｎ−アセチル化から、またはアミンの導入後のいずれか）中の−ＮＨ２基の使用を含む。
【００７２】
好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド等の細菌のトキシンまたはトキソイドである。ジフテリアトキソイドのように、ジフテリアトキシンのＣＲＭ１９７変異体［３２−３４］も特に好ましいキャリアである。他の適切なキャリアタンパク質として、Ｎ．髄膜炎菌外膜タンパク質［３５］、合成ペプチド［３６，３７］、熱ショックタンパク質［３８，３９］、百日咳タンパク質［４０，４１］、サイトカイン［４２］、リンホカイン［４２］、ホルモン［４２］、成長因子［４２］、ヒト血清アルブミン（好ましくは組換体）、Ｎ１９［４４］等の種々の病原菌由来抗原［４３］からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質、Ｈ．インフルエンザ［４５，４６］からのタンパク質Ｄ、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［４７］、肺炎球菌溶血素［４８］、鉄取込みタンパク質［４９］、Ｃ．ディフィシレからの毒素ＡまたはＢ［５０］、ＧＢＳタンパク質［１０９］などが挙げられる。
【００７３】
たとえば、キャリアタンパク質中のまたはアルギニン残基のリジン残基の側鎖にある−ＮＨ２基を介して、キャリアへ結合するのが好ましい。また、結合は、たとえば、システイン残基の側鎖の−ＳＨ基を介してもよい。
【００７４】
複数のキャリアタンパク質を、たとえば、キャリア抑制の危険性を減少させるために使用することが可能である。したがって、たとえば、血清型Ｉａ糖類をＣＲＭ１９７に結合し、血清型Ｉｂ糖類を破傷風トキソイドに結合化するように、異なるキャリアタンパク質を異なるＧＢＳ血清型のために使用することができる。また、たとえば、血清型ＩＩＩ糖類を２つのグループとし、あるものはＣＲＭ１９７に結合し、他は破傷風トキソイドに結合するように、複数のキャリアタンパク質を特定の糖類抗原に使用することもできる。しかし、一般的には、同じキャリアタンパク質を全ての糖類に使用するのが好ましい。
【００７５】
単一キャリアタンパク質が、複数の糖類抗原を持ってもよい［５１，５２］。たとえば、単一キャリアタンパク質は、血清型ＩａおよびＩｂからの糖類に結合化していてもよい。この目的を達成するために、結合化反応の前に異なる糖類を混合することができる。しかし、一般的に、各血清型グループについて別々の結合体を持ち、異なる糖類は結合化後混合されるのが好ましい。別々の結合体は、同じキャリアに基づいてもよい。
【００７６】
糖類：タンパク質の結合体比（ｗ／ｗ）は、１：５（すなわち過剰のタンパク質）と５：１（すなわち過剰の糖類）との間が好ましい。１：１．２５と１：２．５との間の比と同様に、１：２と５：１との間の比も好ましい。
【００７７】
結合体は、キャリアを伴わずに使用してもよい［５３］。本発明の組成物におけるキャリアのないあるいはそれに結合する形態において、所定のキャリアタンパク質が存在する場合、結合化していない形態は、組成物全体のキャリアタンパク質の総量の５％以下が好ましく、２重量％未満で存在するのがさらに好ましい。
【００７８】
結合化後、フリーまたは結合化糖類を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、接線限外ろ過、透析ろ過など［参考文献５４および５５も参照］を含む多くの適切な方法がある。
【００７９】
一般的に、図５に示すように、結合体の２つのタイプ、すなわち、（ａ）個々の糖類が、たとえば、その還元末端を介して単一キャリアに結合する結合体と、（ｂ）たとえば、数種の単糖類サブユニットは反応性であるので、個々の糖類が複数のキャリアに結合する結合体を作ることができる。両状況において、複数の露出したリジン側鎖を持ちうるので、キャリアタンパク質は複数の糖類分子に結合することができる。タイプ（ｂ）の結合体は、本発明の修飾シアル酸またはガラクトース残基は単一糖類に沿った複数の部位で起こるので、本発明においてより一般的である［５６］。したがって、好ましい結合体では、単一糖類分子は、複数のキャリア分子と平均してカップリングするのが好ましい。
【００８０】
結合体と他の抗原との組合せ
本発明の方法によって生成される糖類（特に、先に記載したように、結合化後）は、たとえば、各他の抗原および／または他の抗原と混合することができる。したがって、本発明の方法は、糖類を１種以上の別の抗原と混合するさらなる工程を含んでもよい。
【００８１】
複数の異なるＧＢＳ結合体を混合する場合、同じＧＢＳ血清型からの異なるタイプの結合体および／または異なるＧＢＳ血清型からの結合体を含んでもよい。たとえば、結合体は、血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩの２または３種からのものでもよい。組成物は、別々の結合体（たとえば、各血清型が異なる結合体）を生成し、次いでこれらを組み合わせることによって生成する。
【００８２】
さらなる抗原（複数を含む）は、以下に規定するＧＢＳアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８３】
さらなる抗原（複数を含む）は、非ＧＢＳ病原菌からの抗原を含んでもよい。従って本発明の組成物は、さらに、付加的な細菌、ウィルスまたは寄生虫抗原を含む非ＧＢＳ抗原の１種以上を含んでもよい。これらは、以下から選択してもよい。
-Ｎ．髄膜炎菌血清群Ｂからのタンパク質抗原、たとえば、タンパク質「２８７」を有する参考文献５７〜６３中の抗原（以下を参照）および誘導体（たとえば「ΔＧ２８７」）は特に好ましい。
−Ｎ．髄膜炎菌血清群Ｂからの外膜小胞（ＯＭＶ）製剤、たとえば、参考文献６４、６５、６６、６７などに記載されているもの
−Ｎ．髄膜炎菌血清群Ａ，Ｃ，Ｗ１３５および／またはＹからの糖類抗原、たとえば、血清群Ｃからの参考文献６８に記載のオリゴ糖類または参考文献６９のオリゴ糖類
−ステロコッカス・ニューモニエからの糖類抗原［たとえば、参考文献７０〜７２；参考文献７９の第２２および２３章］
−Ａ型肝炎ウィルスからの抗原、たとえば、不活性化ウィルス［たとえば、７３、７４；参考文献７９の第１５章］
−Ｂ型肝炎ウィルスからの抗原、たとえば、表面および／またはコア抗原［たとえば、７４、７５；参考文献７９の第１６章］
−Ｃ型肝炎ウィルスからの抗原［たとえば、７６］
−ボルデテラ百日咳からの抗原、たとえば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ．百日咳からの線維状血球凝集素（ＦＨＡ）、場合によっては、ペルタクチンおよび／または凝集原２および３と組み合わせる場合もある［たとえば、参考文献７７および７８；参考文献７９の第２１章］
−ジフテリア抗原、たとえばジフテリアトキソイド［たとえば、参考文献７９の第１３章］
−破傷風抗原、たとえば破傷風トキソイド［たとえば、参考文献７９の第２７章］
−ヘモフィルス・インフルエンザＢ型菌からの糖類抗原［たとえば、参考文献７９の第１４章］
−Ｎ．ゴノレエからの抗原［たとえば、５７、５８、５９］
−クラミディア・ニューモニエからの抗原［たとえば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６］
−クラミディア・トラコーマからの抗原［たとえば、８７］
−ポリフィロモナス・ジンジバリスからの抗原［たとえば、８８］
−ポリオ抗原（複数を含む）［たとえば、８９、９０；参考文献７９の第２４章］、たとえば、ＩＰＶ
−狂犬病抗原（複数を含む）［たとえば、９１］たとえば、凍結乾燥不活性化ウィルス［たとえば、９２、ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］
−麻疹、マンプス／または風疹抗原［たとえば、参考文献７９の第１９、２０および２６章］
−インフルエンザ抗原（複数を含む）［たとえば、参考文献７９の第１７および１８章］、たとえば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質
−モラクセラ・カタラーリスからの抗原（たとえば９３）
−ステロコッカス・ピオゲネス（Ａ群ステロコッカス）からの抗原［たとえば、９４、９５、９６］。
【００８４】
糖類または炭水化物抗原を使用する場合、免疫抗原性を促進するために、キャリアに結合するのが好ましい。Ｈ．インフルエンザＢ、髄膜炎菌性および肺炎球菌糖類抗原の結合体がよく知られている。
【００８５】
必要であれば、毒性タンパク質抗原を解毒してもよい（たとえば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳トキシンの解毒［７８］）。
【００８６】
組成物中にジフテリア抗原が含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含まれるのが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび百日咳抗原も含まれるのが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリアおよび破傷風抗原も含まれるのが好ましい。
【００８７】
抗原は、アルミニウム塩に吸着されてもよい。
【００８８】
組成物中の抗原は、典型的には、それぞれの濃度が少なくとも１μｇ／ｍｌで存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対して免疫応答を発現するのに十分なものである。
【００８９】
本発明の組成物においてタンパク質抗原を使用する代わりに、抗原をエンコードする核酸を使用してもよい［たとえば、参考文献９７〜１０５］。したがって、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をエンコードする核酸（好ましくは、たとえばプラスミドの形態のＤＮＡ）によって置き換えられてもよい。
【００９０】
実際の条件では、本発明の組成物に含まれる抗原の数に対する上限がある。本発明の組成物における抗原（ＧＢＳ抗原を含む）の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、または３未満である。本発明の組成物中のＧＢＳ抗原の数は、６未満、５未満、または４未満である。
【００９１】
医薬組成物および方法
本発明は、医薬組成物を製造する方法であって、（ａ）本発明の糖類（場合により結合体の形態）と（ｂ）医薬的に許容しうるキャリアとを混合する工程を含む方法を提供する。代表的な「医薬的に許容しうるキャリア」として、それ自身が組成物を受け取る個々に有害である抗体の生成を誘発しないキャリアであればいかなるものも含む。適切なキャリアとして、通常、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリメリックアミノ酸、アミノ酸共重合体、ラクトースおよび脂質凝集物（たとえば、油滴またはリポソーム）等の、大きく、ゆっくりと代謝されるマクロ分子が挙げられる。そのようなキャリアは、当業者によく知られている。また、ワクチンは、水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含む。さらに、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤が存在してもよい。発熱性物質除去食塩水、リン酸緩衝生理食塩水は代表的なキャリアである。参考文献１０６に、医薬的に許容しうる賦形剤の十分な検討がされている。
【００９２】
医薬組成物は、バイアルまたはシリンジに収納される。シリンジは、針が付けられて供給されてもまたは付けられずに供給されてもよい。シリンジは、組成物の１回投与分を含み、一方バイアルは一回投与または複数回投与を含んでもよい。
【００９３】
本発明の糖類の水性組成物は、凍結乾燥された形態から他のワクチンを再調製するのに適している。本発明の組成物を、即時調合再調製のために使用する場合、本発明は、そのような凍結乾燥ワクチンを再調製する方法であって、凍結乾燥材料と本発明の水性組成物とを混合する工程を含む方法を提供する。再調製材料は、注射のために使用することができる。
【００９４】
ＧＢＳタンパク質抗原
先に記載したように、ＧＢＳタンパク質を本発明の組成物に含ませることができる。これらは、本発明の結合体のためのキャリアタンパク質として、他の結合体のためのキャリアタンパク質として、または結合化していないタンパク質抗原として使用してもよい。
【００９５】
本発明による使用のためのＧＢＳタンパク質抗原として、参考文献９４および１０７〜１０９に開示されているものが挙げられる。本発明による使用のための５種の好ましいＧＢＳタンパク質抗原は、ＧＢＳ６７；ＧＢＳ８０；ＧＢＳ１０４；ＧＢＳ２７６；およびＧＢＳ３２２として知られている［参考文献９４を参照］。これら５種の抗原の詳細を以下に示す。
【００９６】
これら５種のＧＢＳタンパク質の完全長配列は、本明細書における配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１〜５である。したがって、本発明の組成物は、（ａ）配列番号：１〜５から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／または（ｂ）（ｉ）配列番号：１〜５の１以上と配列同一性を有するアミノ酸配列および／または（ｉｉ）配列番号：１〜５のフラグメントを含むポリペプチドを含んでもよい。
【００９７】
特定の配列番号に依っては、配列同一性の程度は、（ｉ）では、５０％を超える（たとえば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）のが好ましい。これらのポリペプチドは、ホモローグ、オルソローグ、アレリック変異体、および機能的変異体を含む。通常、２種のポリペプチド配列の間の５０％同一性またはそれ以上が、機能等価の指標であると考えられる。ポリペプチド間の同一性は、好ましくは、パラメーターがギャップ開始＝１２およびギャップ伸張＝１でアフィンギャップサーチを使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に導入されているような、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）相同性検索アルゴリズムによって決定するのが好ましい。
【００９８】
特定の配列番号に依るが、（ｉｉ）のフラグメントは、少なくともｎ個の連続する配列からのアミノ酸を含むべきで、特定の配列に依って、ｎは７またはそれ以上（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。フラグメントは、少なくとも１個のＴ−細胞エピトープ、または好ましくは、配列のＢ−細胞エピトープを含む。Ｔ−およびＢ−細胞エピトープは、経験的に同定することができ（たとえば、ＥＰＳＣＡＮ［１１０、１１１］を使用して、または類似の方法）、あるいはこれらは予測することができる（たとえば、ジェムソン−ウォルフ（Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ）抗原インデックス［１１２］、マトリックスベースアプローチ［１１３］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１１４］、神経回路網［１１５］、オプティマーおよびエピマー（ＯｐｔｉＭｅｒ  ＆  ＥｐｉＭｅｒ）［１１６、１１７］、ＡＤＥＰＴ［１１８］、Ｔサイト［１１９］、親水性［１２０］、抗原インデックス［１２１］または参考文献１２２に開示される方法などを用いて）。他の好ましいフラグメントは、Ｎ−末端アミノ酸残基のない、またはＮ−末端シグナルペプチドのない配列番号：１〜５である。１以上のドメイン、たとえば、リーダー配列またはシグナル配列領域、トランスメンブラン領域、細胞質領域、または細胞壁固定モチーフの除去を用いることができる。好ましいフラグメントを以下に示す（配列番号：６〜１９）。
【００９９】
これらのポリペプチドは、配列番号：１〜５と比べて、１以上の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）保存的アミノ酸置換、すなわち、１個のアミノ酸の、関連する側鎖を持つ他のものとの置換を含む。遺伝子的にエンコードされているアミノ酸は、一般的に４つのファミリー、すなわち、（１）酸性、すなわち、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプロファン；および（４）荷電されていない極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類される場合もある。一般的に、これらのファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物活性に大きな影響を持たない。また、ポリペプチドは、配列番号：１〜５に対して１以上の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一アミノ酸の欠損を含む。また、ポリペプチドは、配列番号：１〜５に対して、１以上（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（たとえば、１、２、３、４または５個のアミノ酸のそれぞれ）を含む。
【０１００】
本発明のポリペプチドは、多くの方法、たとえば、化学的合成（全体または部分）によって、プロテアーゼを使用して、より長いポリペプチドを分解することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養液（たとえば、組換体発現から）から、微生物それ自身（たとえば、細菌の培養の後または親から直接）からの精製などによって生成することができる。ペプチド＜４０アミノ酸長さの好ましい製造法として、インビトロ化学的合成［１２３、１２４］が挙げられる。固相ペプチド合成は特に好ましく、そのような方法は、ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［１２５］化学に基礎を置く。酵素的合成［１２６］を部分的にあるいは全体に使用してもよい。化学的合成に代わるものとして、生物学的合成を使用してもよく、たとえば、ポリペプチドを翻訳によって生成してもよい。これはインビトロで行っても、インビボで行ってもよい。生物学的方法は、一般的に、ポリペプチドベースのＬ−アミノ酸の精製に限定されるが、翻訳装置の処置（たとえば、アミノアシルｔＲＮＡ分子の）を使用し、Ｄ−アミノ酸（またはヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなどの他の天然でないアミノ酸）の導入を可能とする［１２７］。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合は、化学的合成を使用するのが好ましい。本発明のポリペプチドは、Ｃ−末端および／またはＮ−末端で共有修飾を有してもよい。
【０１０１】
これらのＧＢＳタンパク質が本発明の組成物に含まれる場合、それらは、種々の形態（たとえば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体、粒子、変性など）を取り得る。これらを、純粋な、あるいは実質的に純粋な形態、すなわち、実質的に他のポリペプチドのない（たとえば、天然に発生するポリペプチドのない）、特に他のＧＢＳまたは宿主細胞ポリペプチドのない形態で使用するのが好ましい。
【０１０２】
ＧＢＳ６７
血清型Ｖ株２６０３Ｖ／Ｒから配列決定したＧＢＳ６７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参考文献９４で配列番号：３７４５および３７４６と規定される。該アミノ酸配列は、本明細書では配列番号：１である。
【０１０３】
【化２】
2008528052.tif 000003
ＧＢＳ６７は、前記配列番号：１のＣ−末端に近い下線部によって示される、Ｃ−末端トランスメンブラン領域を含む。トランスメンブラン領域からの１種以上のアミノ酸が除去されてもよく、あるいはアミノ酸は、トランスメンブラン領域の前で切り詰められてもよい。そのようなＧＢＳ６７フラグメントの例を配列番号：１８として以下に規定する。
【０１０４】
【化３】
2008528052.tif 000004
ＧＢＳ６７は、前記配列番号：１中のイタリック体で表される、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含む。組換体宿主細胞系の中には、宿主細胞からの組換体ＧＢＳ６７タンパク質の分泌を促進するため、このモチーフを除去するのが好ましいものもある。したがって、本発明で使用するためのＧＢＳ６７の好ましいフラグメントの１つは、トランスメンブランおよび細胞壁アンカーモチーフがＧＢＳ６７から除去されている。そのようなＧＢＳ６７フラグメントの例を配列番号：１９として以下に規定する。
【０１０５】
【化４】
2008528052.tif 000005
【０１０６】
ＧＢＳ８０
ＧＢＳ８０は、推定細胞壁表面アンカーファミリータンパク質に関する。血清型Ｖ単離株２６０３Ｖ／Ｒから配列決定したＧＢＳ８０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参考文献９４で配列番号：８７７９および８７８０として規定される。アミノ酸配列を配列番号：２として以下に規定する。
【０１０７】
【化５】
2008528052.tif 000006
ＧＢＳ８０は、前記下線を付けた配列によって示される、Ｎ−末端リーダーまたはシグナル配列領域を含む。ＧＢＳ８０のリーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸を除去することができる。そのようなＧＢＳ８０フラグメントの例を、配列番号：６として以下に規定する。
【０１０８】
【化６】
2008528052.tif 000007
ＧＢＳ８０は、前記配列番号：２の末端に近い下線を付けた配列によって表される、Ｃ−末端トランスメンブラン領域を含む。トランスメンブラン領域および／または細胞質領域からの１以上のアミノ酸を除去してもよい。そのようなフラグメントの例を配列番号：７として以下に規定する。
【０１０９】
【化７】
2008528052.tif 000008
ＧＢＳ８０は、前記配列番号：２中のイタリック体で表される、細胞壁アンカーを示すアミノ酸モチーフを含む。組換体宿主細胞系の中には、宿主細胞からの組換体ＧＢＳ８０タンパク質の分泌を促進するため、このモチーフを除去するのが好ましいものもある。したがって、トランスメンブランおよび／または細胞質領域、および細胞壁アンカーモチーフは、ＧＢＳ８０から除去されてもよい。そのようなフラグメントの例を配列番号：８として以下に規定する。
【０１１０】
【化８】
2008528052.tif 000009
あるいは、組換体宿主細胞系の中には、細胞壁アンカーモチーフをアンカーに、組換発現タンパク質を細胞壁に使用するのが好ましいものもある。発現タンパク質の細胞外ドメインを精製中に開裂させてもよく、あるいは組換タンパク質を、最終組成物中の不活性化宿主細胞または細胞膜に結合して残してもよい。
【０１１１】
１実施形態では、リーダーまたはシグナル配列領域、トランスメンブランおよび細胞質領域、ならびに細胞壁アンカーモチーフをＧＢＳ８０配列から除去する。そのようなＧＢＳ８０フラグメントの例を配列番号：９として以下に規定する。
【０１１２】
【化９】
2008528052.tif 000010
ＧＢＳ８０の特定の免疫抗原性フラグメントは、タンパク質のＮ−末端に対向して位置し、本明細書ではこれを配列番号：１０として規定する。
【０１１３】
【化１０】
2008528052.tif 000011
【０１１４】
ＧＢＳ１０４
ＧＢＳ１０４は、推定細胞壁表面アンカーファミリータンパク質に関する。ｅｍａＡと言われていた。血清型Ｖ単離株２６０３Ｖ／Ｒから配列決定したＧＢＳ１０４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参考文献９４で配列番号：８７７７および配列番号：８７７８として規定される。アミノ酸配列は、本明細書では配列番号：３である。
【０１１５】
【化１１】
2008528052.tif 000012
ＧＢＳ１０４は、前記配列番号：３の始まりの下線を付けた配列によって示される、Ｎ−末端リーダーまたはシグナル配列領域を含む。ＧＢＳ１０４のリーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸を除去してもよい。そのようなＧＢＳ１０４フラグメントの例を配列番号：１１として以下に規定する。
【０１１６】
【化１２】
2008528052.tif 000013
ＧＢＳ１０４は、前記配列番号：３の末端に近い下線領域によって示されるＣ−末端トランスメンブランおよび／または細胞質領域を含む。トランスメンブランまたは細胞質領域からの１以上のアミノ酸を除去してもよい。そのようなＧＢＳ１０４フラグメントの例を配列番号：１２として以下に規定する。
【０１１７】
【化１３】
2008528052.tif 000014
リーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸、およびトランスメンブランまたは細胞質領域からの１以上のアミノ酸を除去してもよい。そのようなＧＢＳ１０４フラグメントの例を配列番号：１３として以下に規定する。
【０１１８】
【化１４】
2008528052.tif 000015
さらに、ＧＢＳ１０４のフラグメントは、アミノ酸２８〜８５８個のＧＢＳ１０４の８３０アミノ酸フラグメント（配列番号：３と付けられている）、アミノ酸２８〜３８７個のＧＢＳ１０４の３５９アミノ酸フラグメント、アミノ酸２８〜６０９個のＧＢＳ１０４の５８１アミノ酸フラグメントまたはアミノ酸２８〜７６８個のＧＢＳ１０４の７４０アミノ酸フラグメントを含む。
【０１１９】
ＧＢＳ２７６
ＧＢＳ２７６は、Ｃ５ａペプチダーゼに関する。さらに、ＧＢＳ２７６の記載は、参考文献１２８〜１３１に見出すことができる。血清型Ｖ単離株２６０３Ｖ／Ｒから配列決定したＧＢＳ２７６配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参考文献９４で配列番号：８９４１および８９４２として規定される。アミノ酸配列は、本明細書では配列番号：４である。
【０１２０】
【化１５】
2008528052.tif 000016
ＧＢＳ２７６は、前記配列番号：４の始まりの下線を付けた配列によって示されるＮ−末端リーダーまたはシグナル配列領域を含む。ＧＢＳ２７６のリーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸は、除去されてもよい。そのようなＧＢＳ２７６フラグメント例を配列番号：１４として以下に規定する。
【０１２１】
【化１６】
2008528052.tif 000017
ＧＢＳ２７６は、前記配列番号：４の末端に近い下線を付けた配列によって示される、Ｃ−末端トランスメンブランおよび／または細胞質領域を含む。ＧＢＳ２７６のトランスメンブランまたは細胞質領域からの１以上のアミノ酸は除去されてもよい。そのようなＧＢＳ２７６フラグメントの例を配列番号：１５として以下に規定する。
【０１２２】
【化１７】
2008528052.tif 000018
ＧＢＳ２７６の、リーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸およびトランスメンブランまたは細胞質領域からの１以上のアミノ酸は除去されてもよい。そのようなＧＢＳ２７６フラグメントの例を配列番号：１６として以下に規定する。
【０１２３】
【化１８】
2008528052.tif 000019
【０１２４】
ＧＢＳ３２２
ＧＢＳ３２２は表面免疫抗原性タンパク質に関し、「ｓｉｐ」とも言われる。血清型Ｖ単離株２６０３Ｖ／Ｒから配列決定したＧＢＳ３２２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参考文献９４で配列番号：８５３９および８５４０と規定される。該アミノ酸配列は、本明細書では、配列番号：５である。
【０１２５】
【化１９】
2008528052.tif 000020
ＧＢＳ３２２は、前記配列番号：５の始まりの下線を付けた配列によって示される、Ｎ−末端リーダーまたはシグナル配列領域を含む。ＧＢＳ３２２のリーダーまたはシグナル配列領域からの１以上のアミノ酸を除去してもよい。そのようなＧＢＳ３２２フラグメントの例を配列番号：１７として以下に規定する。
【０１２６】
【化２０】
2008528052.tif 000021
【０１２７】
一般論
用語「含む」は、「含有する」も「からなる」も含むものであり、たとえば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘだけからなるものでもよく、あるいは何か付加的なものを含む、たとえば、Ｘ＋Ｙであってもよい。
【０１２８】
数値ｘに関連して用語「約」は、たとえば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２９】
語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、たとえば、「実質的にＹがない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合は、語「実質的に」を本発明の定義からは除外してもよい。
【０１３０】
本発明が複数の連続する工程を含む方法を提供する場合、本発明は、工程の総数未満の工程を含む方法も提供することができる。たとえば、汚染核酸および／またはタンパク質を除去することによって、糖類がすでに部分的に精製されている場合、この工程は、本発明の方法から除外することができる。同様に、混入物を除去する工程を行い、界面活性剤介在沈殿用の物質を得ることができるが、沈殿を行う必要はない。予備沈殿物質は糖類調製において中間体として有用性を持つので、本発明の範囲内に入れるために沈殿工程を行う必要はなく、後の使用のため、たとえば後の沈殿のために、使用し、保存し、輸出してもよい。これらの異なる工程を全く異なる時に、異なる人によって異なる場所（たとえば異なる国）で行ってもよい。
【０１３１】
糖環は、開環形態でも閉環形態でも存在することができ、本明細書での構造式では閉環形式を示しているが、開環形式も本発明に包含されることは認められるであろう。同様に、糖類は、ピラノース形態でもフラノース形態でも存在することができ、本明細書での構造式ではピラノース形態を示しているが、フラノース形態も包含されることも認められるであろう。糖類の異なるアノマー型も包含される。
【０１３２】
本発明の実施形態
Ａ．ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩからの莢膜糖類の精製
Ｂ群ステロコッカス培養の上清を、遠心分離後収集し、水酸化ナトリウム（最終濃度：０．８Ｍ）で、３７℃３６時間処理した。得られた懸濁液をＨＣｌの添加によって中性化した。エタノール水溶液（３０％）およびＣａＣＬ２（０．１Ｍ）の混合物を、中性化した混合物に添加した。沈殿が急速に形成され、これを遠心分離によって除去した。シアル酸アッセイは、上清中に莢膜糖類が残存することを示した。上清を、再生セルロースフィルター（０．２２μｍ切断片）で全量精密ろ過処理に供し、次いで、３０ｋＤａ切断片セルロース膜を使用し、接線流透析ろ過を約２時間行った。莢膜糖類は限外ろ過保持液中にあった。保持液を、沈殿が形成するまで（数分以内）、１０％ＣＴＡＢ界面活性剤を添加して処理した。沈殿物質（莢膜多糖類を含む）を、遠心分離によって分離した。ペレットを０．１ＭのＣａＣｌ２水溶液の添加により再可溶化した。さらなる沈殿工程を、９６％エタノールを添加することにより行い、８０％の最終エタノール濃度を得た。沈殿物を再び、遠心分離により除去し、ペレットを真空乾燥で乾燥した。
【０１３３】
方法全体（図６に示す）で、２〜３日かかり、収率は約６０％であった。最終乾燥物質に関し、以下のパラメーター、すなわち、総重量、莢膜糖類の重量およびシアル酸含量を試験した。３種の血清型の結果は以下の通りである。
【０１３４】
【化２１】
2008528052.tif 000022
各場合の純度は、従来技術の方法により達成されるものより良好であり、特に血清型ＩＩＩ物質に関して良好であった（８９％対７４％）。しかし、従来技術とは対照的に、方法は２〜３日（１５〜２０日と比較）かかり、収率は約６０％（約２０％と比較）であった。
【０１３５】
タンパク質および核酸の混入を、ＵＶ吸収によって評価した。従来技術の方法によって生成された糖類も比較のために試験した。スペクトルを図７に示す。従来技術の物質は、３種の血清群のそれぞれに関し、２７０ｎｍ付近で明らかなピークを持つ。一方、本発明の方法により精製した物質は、この領域ではフラットなスペクトルを持つ。２８０ｎｍおよび２６０ｎｍでの吸光度の比は以下の通りである。
【０１３６】
【化２２】
2008528052.tif 000023
これらの比は、本発明の方法によって生成した物質は、従来技術の方法によって調製した物質より汚染が少なくことを示す。
【０１３７】
ＮＭＲは、糖類の試験するために、特に、Ｎ−アセチル化の度合いを評価するために使用した。ＮＭＲスペクトルを図８〜１０に示す。従来技術の方法および本発明の方法のスペクトルを重ね合わせる。低い方のスペクトルが従来技術の物質である。Ｎ−アセチル化率％計算値は、以下の通りであった。
【０１３８】
【化２３】
2008528052.tif 000024
【０１３９】
Ｂ．精製莢膜糖類の結合化
ＧＢＳ血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩのそれぞれからの莢膜糖類を精製し、再アセチル化した。次いで、糖類を、直接還元アミノ化によって、モノマー破傷風トキソイド（ＴＴ）あるいはＣＲＭｌ９７キャリアタンパク質に共有結合した。結果は以下の通りである。
【０１４０】
【化２４】
2008528052.tif 000025
【０１４１】
Ｃ．結合体による負荷試験
血清型Ｉａ株からの莢膜糖類を従来技術の方法あるいは本発明の方法を使用して精製した。結合化に関し、５％と１５％の間の標的で、糖類中のシアル酸残基のフラクションを酸化させた。
【０１４２】
従来技術の方法によって精製した物質の２ロットの酸化率は５４．５％および１７．６％であった。本発明に従って精製した物質は、６．６％酸化された。
【０１４３】
糖類を還元アミノ化によって破傷風トキソイドに結合化させた。マウスの感作を、３種の結合体を用い、平行して、０日および２１日に１用量当たり１μｇの糖類で行った。ＣＤ−Ｉ非近交系メスのマウス、６〜７週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群に、２５０μｌのＰＢＳ中に懸濁した結合体および水酸化アルミミウムアジュバント（２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を含む同容積のＰＢＳを腹腔内注射によって与えた。次いで、マウスを３種の異なる血清型で負荷を与えた。生存率は以下の通りである。
【０１４４】
【化２５】
2008528052.tif 000026
このように、本発明の方法によって精製された糖類は、従来技術の方法によって精製されたものより、免疫学的に優れている。
【０１４５】
オプソニン化食作用試験
血清型Ｉａ、ＩｂおよびＩＩＩからのＴＴ−結合糖類を従来技術の方法［１−９］または本発明の方法によって生成した。４匹のＣＤ−１非近交系メスのマウス、６〜７週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群を、２５０μｌのＰＢＳに懸濁した結合体（用量：１μｇの糖類）および水酸化アルミニウムアジュバント（２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を含む同容積のＰＢＳで免疫化した。それぞれの群は、０および２１日に腹腔内注射によって２回の投与を受けた。また、各感作スキームで、陰性コントロールおよび陽性コントロールも使用した。
【０１４６】
免疫応答を、０日および３６日に採取した血清サンプルから測定した。血清を、「５１５」（Ｉａ型；ＭＬＳＴ型ＳＴ２３）、「ＣＯＨ１」（ＩＩＩ型；ＭＬＳＴ型ＳＴ１７）および「Ｈ３６Ｂ」（Ｉｂ型；ＭＬＳＴ型ＳＴ６）を含む７種の異なるＧＢＳ株に対して、マウスの各群からのプールとして分析した。予防およびオプソニン力価を測定した。結果を以下に示す。
【０１４７】
【化２６】
2008528052.tif 000027
データは、本発明の方法によって精製された糖類が、従来技術の方法によって精製された物質と比べ、同等または改良された予防効果を与えることを示す。さらに、予防効果を比較すると、本発明の方法によって精製された物質は、向上したオプソニン力価を与える。
【０１４８】
本発明を例示のためだけに記載し、本発明の範囲および精神に入る限り、変形がなされてもよいことは理解されるであろう。
【０１４９】
【化２７】
2008528052.tif 000028
【０１５０】
【化２８】
2008528052.tif 000029
【０１５１】
【化２９】
2008528052.tif 000030
【０１５２】
【化３０】
2008528052.tif 000031
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ＧＢＳのペプチドグリカンに結合する莢膜多糖類（左）および群特異多糖類（右）を示す。
【図２】ＧＢＳ血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶにおける莢膜糖類の繰返し構造を示す。
【図３】ＧＢＳ血清型ＩａおよびＩＩＩにおける繰返し構造間の違いを示す。
【図４】Ｂ群抗原のテトラアンテナリー構造を示す。Ａ〜Ｄは主成分オリゴ糖類を示し、Ｐはリン酸塩を示す［１２］。
【図５】調製することができる２つのタイプの結合体を示す。
【図６】本発明の方法全体を示すフローチャート。
【図７】６種のＧＢＳ莢膜多糖類部のＵＶ吸光度スペクトル。ピークまたはショルダーは、２７５ｎｍ付近に見える。その点で、上の３つのスペクトルは、従来技術の方法によって精製した物質に関するもので、下の３つのスペクトルは、本発明に従って精製した物質に関するものである。２７５ｎｍ付近のポイントで上から下へ順番に、Ｉｂ、Ｉａ、ＩＩＩ、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩＩである。
【図８】異なる血清型：（８）Ｉａ、（９）Ｉｂ、（１０）ＩＩＩに関するＮＭＲスペクトルである。
【図９】異なる血清型：（８）Ｉａ、（９）Ｉｂ、（１０）ＩＩＩに関するＮＭＲスペクトルである。
【図１０】異なる血清型：（８）Ｉａ、（９）Ｉｂ、（１０）ＩＩＩに関するＮＭＲスペクトルである。
【図１】
2008528052.tif 000032
【図２】
2008528052.tif 000033
【図３】
2008528052.tif 000034
【図４】
2008528052.tif 000035
【図５】
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【図６】
2008528052.tif 000037
【図７】
2008528052.tif 000038
【図８】
2008528052.tif 000039
【図９】
2008528052.tif 000040
【図１０】
2008528052.tif 000041
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月4日(2008.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008528052000001.app
【国際調査報告】
2008528052.tif 000042
2008528052.tif 000043
2008528052.tif 000044