(57)【要約】  本発明は、哺乳類ＥＡＧ１イオンチャネルの細胞外または細胞内ドメインの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合／相互作用するのに特に有利な抗体、抗体断片またはその誘導体、およびそれらをコードする核酸分子、ならびに該核酸分子を含有するベクターに関する。本発明は、さらに該抗体、抗体断片またはその誘導体の調製のための方法、およびそれらを含有する医薬組成物に関する。さらに本明細書では、該抗体、抗体断片またはその誘導体の使用および該成分を含有する診断用組成物も開示される。本発明は、ＥＡＧ１発現細胞の存在について評価する方法および該細胞内でのＥＡＧ１機能を遮断する方法にも関する。本発明は、さらに該抗体または抗体断片またはその誘導体を活用して疾患を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体、抗体断片またはその誘導体であって、前記ＣＤＲを決定するアミノ酸配列が、（ＶＬ）配列番号１６０〜１６２、１６６〜１６８、１７２〜１７４、および１７８〜１８０からなる群から選択され、かつ（ＶＨ）配列番号１６３〜１６５、１６９〜１７１、１７５〜１７７、および１８１〜１８３からなる群から選択される、抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項２】
前記抗体、抗体断片またはその誘導体が、哺乳類ＥＡＧ１イオンチャネルの細胞外または細胞内ドメインの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合／相互作用し、かつ哺乳類ＥＡＧ２イオンチャネルと結合／相互作用しない、請求項１に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体断片またはその誘導体が、Ｆａｂ−断片、Ｆ（ａｂ２）’−断片、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二価抗体−コンストラクト、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成抗体、その化学的に修飾された誘導体、多特異的抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、またはＦｖ−断片あるいは別タイプの組換え抗体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体断片またはその誘導体。
【請求項５】
前記ＶＨ鎖および前記ＶＬ鎖の各々のうちの少なくとも１つのＣＤＲを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項６】
前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項７】
前記軽鎖（ＶＬ）が配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４３および４７からなる群から選択され、かつ前記重鎖（ＶＨ）が配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４および４８からなる群から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項８】
前記抗体、断片またはその誘導体がラベル基に結合される請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９の核酸分子を含有するベクター。
【請求項１１】
前記核酸分子が、原核生物および／または真核細胞の宿主細胞における前記転写および場合によって発現を可能にする１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結される発現ベクターである請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のベクターを含む宿主。
【請求項１３】
細菌、真菌、植物、両生類または動物細胞である、請求項１２に記載の宿主。
【請求項１４】
ヒト細胞またはヒト細胞系である請求項１３に記載の宿主。
【請求項１５】
抗体、抗体断片またはその誘導体の合成を可能にする条件下で請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の宿主を培養するステップと、前記培養物から前記抗体、抗体断片またはその誘導体を回収するステップとを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体の調製のための方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に定義された抗体、抗体断片またはその誘導体、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０または１１に記載のベクター、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の宿主あるいは請求項１５に定義された方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
少なくとも１種の抗腫瘍剤をさらに含有する請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
高増殖性疾患、炎症性疾患、乾癬、または神経変性疾患の予防または治療のための医薬組成物の調製を目的とする、請求項１〜８のいずれか一項に定義された抗体、抗体断片またはその誘導体、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０または１１に記載のベクター、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の宿主あるいは請求項１５に定義された方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体の使用。
【請求項１９】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記高増殖性疾患が、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、リンパ腫、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、バレット癌、胃癌、膀胱癌、頚癌、肝臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、増殖性疾患または腫瘍性疾患あるいは他のＥＡＧを発現または過剰発現する高増殖性疾患である請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記炎症性疾患が膵炎または肝炎である請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか一項に定義された抗体、抗体断片またはその誘導体、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０または１１に記載のベクター、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の宿主あるいは請求項１５で定義された方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体、および場合によって医薬的に許容できる担体を含む診断用組成物。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片またはその誘導体を自身の表面上にＥＡＧ１を担持すると見られる細胞または組織と接触させるステップを含む、ＥＡＧ１発現細胞の存在について評価する方法。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片またはその誘導体を自身の表面上にＥＡＧ１を担持すると見られる細胞または組織と接触させるステップを含む、ＥＡＧ１の機能を遮断する方法。
【請求項２５】
前記接触させるステップがインビトロで行われる請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触させるステップがインビボで行われる請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片またはその誘導体の適切な用量を治療を必要とする患者に投与するステップを含む、高増殖性疾患、炎症性疾患、乾癬、または神経変性疾患から選択される疾患を治療する方法。
【請求項２８】
前記神経変性疾患がアルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記高増殖性疾患が、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、リンパ腫、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、バレット癌、胃癌、膀胱癌、頚癌、肝臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、増殖性疾患または腫瘍性疾患あるいは他のＥＡＧを発現または過剰発現する高増殖性疾患である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症性疾患が膵炎または肝炎である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体、抗体断片またはその誘導体、請求項９に記載の核酸分子および／あるいは請求項１０または１１に記載のベクターを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類ＥＡＧ１イオンチャネルの細胞外または細胞内ドメインの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合／相互作用するのに特に有利な抗体、抗体断片またはその誘導体、およびこれらをコードする核酸分子、ならびに該核酸分子を含有するベクターに関する。本発明は、さらに該抗体、抗体断片またはその誘導体の調製のための方法、およびそれらを含有する医薬組成物に関する。さらに本明細書では、該抗体、抗体断片またはその誘導体の使用および該成分を含有する診断用組成物も開示される。本発明は、ＥＡＧ１発現細胞の存在について評価する方法および該細胞内でのＥＡＧ１機能を遮断する方法にも関する。本発明は、さらに該抗体または抗体断片またはその誘導体を活用して疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書では、多数の文書が引用される。これにより、製造業者の使用説明書を含むこれらの文書の開示内容は、その全体が参照により援用される。
【０００３】
カリウムチャネルは細胞内に遍在する。これについての１つの理由は、チャネルがそれらの主要な役割として見られている細胞の静止電位の調節に関与することであると推定される。しかし、上記の如く異なる細胞タイプ内でチャネルが遍在すると仮定すると、それらが「ハウスキーピング（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ）」機能などのより一般的な機能にも関与する可能性があると推測されている。特に、それらが癌発症に関与する可能性を示唆する細胞分裂周期へのそれらの関与を示唆する実験的証拠が提示されている（非特許文献１）。事実、ｅａｇファミリーＥＡＧ１のメンバー、およびｈｅｒｇが癌細胞内で優先的に発現されることが提示されている（非特許文献２、非特許文献３）。該チャネルが様々な細胞タイプ内および特に腫瘍細胞などの癌細胞を含む分裂細胞内でも発現されることから、該カリウムチャネルに関連した治療用途および／または診断用途において使用可能であると思われるツールを提供することへの医学的関心は高い。
【０００４】
ヒトＥＡＧ１イオンチャネルに特異的な抗体は先行技術において既知であった。例えば、特許文献１では、ＥＡＧ１イオンチャネルならびに該チャネルに特異的な抗体が記載されている。
【特許文献１】ＥＰ第１０７３７３８号明細書
【非特許文献１】ウアディ・アヒダッチ  Ｈ．（Ｏｕａｄｉｄ−Ａｈｉｄｏｕｃｈ  Ｈ．）ら、２００１年
【非特許文献２】メイヤー  Ｒ．（Ｍｅｙｅｒ  Ｒ．）ら、１９９９年
【非特許文献３】ビアンキ  Ｉ（Ｂｉａｎｃｈｉ  Ｉ）ら、１９９８年
【発明の開示】
【０００５】
診断用途および／または治療用途をさらに拡張するため、哺乳類、特にヒトにおけるＥＡＧ１とＥＡＧ２を特異的に識別する一方で他の哺乳類のＥＡＧ１チャネルも認識する抗体を有することが望ましかった。
【０００６】
したがって、本発明に内在する技術的課題は、異なる哺乳類種由来のＥＡＧ１と相互に関連性がある障害および／または疾患に対するさらなる特定の試験、診断、予防ならびに治療のために利用可能なかかる抗体を提供することであった。
【０００７】
特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態を提供することにより、該技術的課題に対する解決策が得られる。
【０００８】
したがって、本発明は、ＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体、抗体断片またはその誘導体に関し、該ＣＤＲを決定するアミノ酸配列は、（ＶＬ）配列番号１６０〜１６２、１６６〜１６８、１７２〜１７４、および１７８〜１８０からなる群から選択され、かつ（ＶＨ）配列番号１６３〜１６５、１６９〜１７１、１７５〜１７７、および１８１〜１８３からなる群から選択される。
【０００９】
本発明に記載の「抗体断片またはその誘導体」という用語は、抗体断片と、本発明の抗体および本発明の抗体断片の誘導体とに関する。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片を含む。抗体の誘導体は、ＥＡＧ１への望ましい結合能を示す限り、ｓｃＦｖコンストラクト、キメラ抗体またはヒト化もしくはヒト抗体を含む。
【００１０】
治療目的の抗体は、場合によって脱免疫化される。脱免疫化（ヒト化）抗体の作製方法に関する例を、米国特許第６，０５４，２９７号明細書、同第５，８８６，１５２号明細書および同第５，８７７，２９３号明細書において見出すことが可能である。診断を目的として、抗体、断片またはその誘導体は優先的に標識される。適切な標識として、放射性標識および蛍光標識が含まれる。
【００１１】
「相補性決定領域」という用語は、当該技術では明示的であり（例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、１９８８年を参照）、一次的に抗原と接触する抗体の可変領域内のアミノ酸ストレッチを示す。
【００１２】
上記の如く、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体は、哺乳類、特にヒトにおけるＥＡＧ１とＥＡＧ２を特異的に識別する一方で他の哺乳類のＥＡＧ１チャネルも認識する。マウスＥＡＧ２に対してはやはり識別する一方で齧歯類のＥＡＧ１に対して認識不能であるとしたら抗体調製における有効性およびより重要には安全性を試験するのに動物モデルの利用可能性が制限されることから、もし臨床シナリオ上、抗体の特性を利用する必要がある場合、このことは重大である。
【００１３】
上で示しているように、抗体、抗体断片またはその誘導体の特異性は相補性決定領域のアミノ酸配列内に存在し、これは当該技術において既知の現象である。抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）は、４つの相対的に保持されたフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」によって隣接される、超可変領域と呼ばれることがある３つの相補性決定領域を含む。抗体の特異性は、ＶＨ鎖のＣＤＲなどのＣＤＲによって決定されるかまたは主に決定されることが多い。当業者は、さらに改善された特異性および生物学的機能を有する抗体の構築においては上記ＣＤＲを有する抗体、抗体断片またはその誘導体の可変ドメインを使用可能であることを容易に理解するであろう。その限りにおいて、本発明は、上記可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ有利にも添付の実施例に記載の抗体と同一の、類似のまたは改善された結合特性を実質的に有する抗体、抗体断片またはその誘導体を包含する。当業者であれば、添付の配列リストに列挙されかつ本発明の主な実施形態によって必要とされる少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体をはじめ、さらに特異性および／もしくは親和性を高めた、最初に同定されたモノクローナル抗体または異なる抗体を由来とするＣＤＲを組み合わせることができる。ＣＤＲ移植は当該技術で周知であり、元の特異性が保持される限り、これを用いて、本発明の抗体、断片またはその誘導体の他の特性の中でも特異的親和性を微調整してもよい。抗体、断片または誘導体が、元のマウス抗体のうちの少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは、少なくとも５つを例とする少なくとも４つ、および特に好ましくは全部で６つのＣＤＲを含むことは有利である。本発明のさらなる選択肢として、最初に同定された異なるモノクローナル抗体由来のＣＤＲを実体の新規抗体において組み合わせることが可能である。これらの場合、重鎖の３つのＣＤＲが同一抗体に由来する一方、軽鎖の３つのＣＤＲ全部が異なる抗体に由来する（同一抗体に由来するすべてのものを除く）ことが好ましい。当該技術で既知の従来の技術を用い、例えば、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当該技術で既知の任意の他の修飾を単独でもしくは組み合わせて用いることにより、本発明の抗体またはそれらに対応する免疫グロブリン鎖をさらに修飾してもよい。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列に内在するＤＮＡ配列においてかかる修飾を導入するための方法は当業者にとって周知であり、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００１４】
さらに、本発明の抗体は、その結合特異性および生物学的活性に関連した有利な特性を示す。特に、本発明の抗体がヒトＥＡＧ１イオンチャネルを認識するだけでなく、他の哺乳類種のＥＡＧ１イオンチャネルも認識可能であることが示されうると思われる。該種は、ラット、マウス、非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
好ましくは、本発明のＥＡＧ１抗体は、
・会合（assembly）領域における三次元または線形エピトープへの結合
・細胞外ドメインに結合する細胞外ポアドメインにおける線形または三次元エピトープへの結合
・Ｃ末端の細胞内ドメインに対する結合
・高親和性を有する結合
といった特性の少なくとも１つを示す。
【００１６】
したがって、これらの抗体は広範な実験動物ならびにヒト組織におけるＥＡＧ１の特異的検出において使用可能であるという利点を有する。このように、異なる種においてＥＡＧ１を認識する抗体の産生にかかるコストを低減することが可能である。
【００１７】
本発明の抗体は、インビトロとインビボの双方において哺乳類ＥＡＧ１カリウムチャネルの特異的な認識を可能にする。
【００１８】
好ましくは、本発明の抗体のＥＡＧ１に対する結合は、
・Ｋ＋チャネル媒介性電流を阻害する
・イオンチャネルの内在化をもたらす
・イオンチャネルのサブユニット会合を阻害する
・二次メッセンジャーの放出または活性化を低下させる
・細胞成長を低減するかまたは阻害する
・イオンチャネルのホモ／ヘテロ多量体の形成を阻害する
といった諸特性のうちの少なくとも１つを示す。
【００１９】
細胞表面上の本発明の抗体に結合しているＥＡＧ１発現細胞は、補体系または細胞媒介性の細胞毒性などの免疫系機能によって最終的に攻撃される。
【００２０】
上記の如く、さらに言い換えると、本発明の抗体は、その結合特異性および生物学的活性に関連する、特に異なる哺乳動物におけるＥＡＧ１イオンチャネルのエピトープに対するその認識能およびそれが細胞成長を低減する能力に関連する有利な特性を示す。本発明の抗体の医薬用途および／または診断用途にはヒトが含まれる（がこれに限定されない）ことから、本発明の一部の抗体（抗体ＩｍＡｂ３およびＩｍＡｂ４）はヒト化され（配列番号９〜４０）、さらにヒトにおいて使用される場合、潜在的な負の免疫原的副作用を最小にするように開発された。
【００２１】
マウスにおいて、本発明の一部を形成し、本発明のさらに好ましい実施形態をもたらす最初のモノクローナル抗体が産生された。遺伝子操作によってヒトでの免疫原性を低下させるため、マウス抗体をヒト抗体配列に適応させた。そのように設計された抗体では、サブタイプＩｇＧ１（重鎖）およびカッパ（軽鎖）を選択することで免疫活性化が最大限に惹起された。
【００２２】
実験的にモノクローナル抗体を産生する場合、Ｅａｇ１のポア領域（第５および第６の膜貫通セグメントの間のループ、位置３６９〜４３３；領域Ａ）およびＥａｇ１のＣ末端セグメント（位置８５０〜９２０；領域Ｂ）を含有する融合タンパク質が抗原として使用された。それらの領域におけるＥａｇ１とＥａｇ２の間の類似性は、それぞれ６９％と６２％である。領域Ａは細胞外であり、領域Ｂは認められたトポグラフィック（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ）モデルの下では細胞内である。
【００２３】
産生抗体におけるＥａｇ１とＥａｇ２の間の選択性については、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅによって確認された。それらの中で定性化されかつサブクローニングされたのは極めて少数に過ぎなかった。これらの中の５種が維持されている。それらの中の４種が領域Ａ内のエピトープを認識し、１種だけが領域Ｂ内のエピトープを認識する。４種の「Ａ型」抗体全部が線形エピトープを認識し、それらの中の３種はそれらのＣＤＲが異なる可能性があっても単一のエピトープを共有する。「Ｂ型」抗体は三次元エピトープを認識する。
【００２４】
産生抗体の諸特性が、それらの結合親和性（図２）、特異性（図３）、それらが認識しかつ結合するエピトープ（図４）およびＥＡＧ１イオンチャネルの阻害（図６）と関連して特徴づけられた。イオンチャネルの内在化を誘発するための本発明の抗体の諸特性は、免疫蛍光（図５）によって検討された。さらに、細胞増殖アッセイ（図７、８ａ、８ｂ）および軟寒天アッセイ（図９）では、抗体の細胞成長に対する阻害能が特徴づけられた。これらの実験結果は、抗体が想定外の生物学的特異性を確かに保有することを示した。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、該抗体、抗体断片またはその誘導体は、哺乳類ＥＡＧ１イオンチャネルの細胞外または細胞内ドメインの少なくとも１つのエピトープと特異的に結合／相互作用し、かつ哺乳類ＥＡＧ２イオンチャネルと結合／相互作用することはない。
【００２６】
本発明に記載の「細胞外ドメイン」という用語は、当該技術では周知の用語であり、細胞外環境内に延びるＥＡＧ１チャネルの一部に関する。このドメインは、数ある中で哺乳類ＥＡＧ１分子のアミノ酸３７４〜４５２を含有する。
【００２７】
本発明と関連して用いられる「細胞内ドメイン」という用語は、細胞質内に延びる哺乳類ＥＡＧ１チャネルの一部を意味する。同ドメインはアミノ酸８７２〜９３２を含有する。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００２９】
例えば、マウス骨髄腫細胞と人工的に開発された修飾を伴う免疫された哺乳類由来の脾臓細胞との融合を含む、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５年）、４９５頁、ならびにガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１年）、３頁に最初に記載された定着技術により、モノクローナル抗体を調製することが可能である。
【００３０】
腫瘍の発生機構の発見に基づく、腫瘍細胞を標的にするために有効な戦略は、モノクローナル抗体の使用である。例えば、チロシンキナーゼＨＥＲ２受容体に特異的な抗体のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）は、化学療法単独の場合と比べて乳癌患者の平均生存率を約２５％改善し、かつ極めて軽度の副作用を有するに過ぎない。腫瘍治療においてモノクローナル抗体を使用するための他の戦略には、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）のような免疫毒素、カリケアマイシンに抱合された組換えＩｇＧ４カッパ抗体、および例えばＺｅｖａｌｉｎ（商標）のような放射性同位体で標識された抗体が含まれる。
【００３１】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗体断片またはその誘導体は、Ｆａｂ−断片、Ｆ（ａｂ２）’−断片、一本鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二価抗体−コンストラクト、ヒト化抗体、ヒト、合成抗体、またはこれらの化学的に修飾された誘導体、多特異的抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆｖ−断片、または別タイプの組換え抗体である。
【００３２】
例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年に記載の方法を用いることにより、上記エピトープに特異的な上記抗体の断片または誘導体を得ることが可能である。該抗体の誘導体がファージディスプレイ技術によって得られる場合、ＢＩＡｃｏｒｅ系において利用される表面プラスモン共鳴を利用することでファージ抗体のＥＡＧ１のエピトープに結合する効率を増大させることが可能である（シアー（Ｓｃｈｉｅｒ）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６年）、９７−１０５頁；マルムボルグ（Ｍａｌｍｂｏｒｇ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５年）、７−１３頁）。
【００３３】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を使用して変異ＥＡＧ１抗体を作製することが可能である。抗体は重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて突然変異を受け、抗体の結合特性が変化する可能性がある。例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内で突然変異が誘発されることで、ＥＡＧ１に対する抗体のＫｄが増減するかまたは抗体の結合特異性が変化する可能性がある。部位特異的な突然変異誘発における技術は当該技術で周知である。例えば、上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らおよびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らを参照のこと。さらに、ＥＡＧ１抗体の可変領域における生殖細胞系と比べて変化を受けることで知られるアミノ酸残基で突然変異が誘発される。別の態様では、核酸分子は１つもしくは複数のフレームワーク領域内で突然変異を受ける。フレームワーク領域内または定常ドメイン内で突然変異が誘発されることで、ＥＡＧ抗体の半減期が増大する可能性がある。例えば、２０００年２月２４日に公表された国際公開第００／０９５６０号パンフレットを参照のこと。フレームワーク領域内または定常ドメイン内で突然変異が誘発されることで、抗体の免疫原性が変化するか、別の分子との共有結合もしくは非共有結合における部位が得られるか、または補体結合などの特性が変化する可能性もある。単一の変異抗体におけるフレームワーク領域、定常ドメインおよび可変領域の各々では、突然変異が誘発されうる。あるいは、単一の変異抗体におけるフレームワーク領域、可変領域または定常ドメインの中の一箇所に限り、突然変異が誘発されうる。
【００３４】
キメラ抗体の産生については、例えば国際公開第８９／０９６２２号パンフレットに記載されている。ヒト化抗体の産生のための方法については、例えばＥＰ第Ａ１０２３９４００号明細書および国際公開第９０／０７８６１号パンフレットに記載されている。本発明に従って利用されるべき抗体のさらなる供給源はいわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体などの異種抗体の産生のための一般的原理については、例えば、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレットおよび国際公開第９６／３３７３５号パンフレットに記載されている。上で考察した如く、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む、完全抗体以外の種々の形態、ならびに一本鎖で存在しうる。例えば国際公開第８８／０９３４４号パンフレットを参照のこと。
【００３５】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、抗体、抗体断片またはその誘導体は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の各々における少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００３６】
本発明のより好ましい実施形態では、該ＣＤＲはＣＤＲ３である。
【００３７】
本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体のさらに好ましい実施形態では、軽鎖（ＶＬ）は配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４３および４７からなる群から選択され、かつ重鎖（ＶＨ）は配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４および４８からなる群から選択される。
【００３８】
本発明は、さらに本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体をコードする核酸分子に関する。上記の抗体、抗体断片またはその誘導体をコードする本発明の核酸分子は、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成的に生成されたＤＮＡもしくはＲＮＡあるいはこれらの核酸分子のいずれかを単独でもしくは組み合わせて含有する組換え的に生成されたキメラ核酸分子でありうる。核酸分子は、遺伝子全体またはそれらの実質的部分または断片およびその誘導体に対応するゲノムＤＮＡでもありうる。ヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチド配列に対応するかあるいは単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失または付加を含みうる。
【００３９】
本発明の特定の好ましい実施形態では、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。
【００４０】
本発明は、本発明の核酸分子を含有するベクターにも関する。該ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターでありうる。レトロウイルスベクターは、複製能力を有するかまたは複製能力に欠陥がある場合がある。後者の場合、一般に宿主／細胞を補充する場合に限ってウイルスの増殖が起こることになる。
【００４１】
本発明の核酸分子を、宿主内での増殖を目的とする選択可能マーカーを含有するベクターに連結することが可能である。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物または塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物、あるいは帯電脂質を有する複合体またはフラーレンなどの炭素に基づくクラスタに導入される。ベクターがウイルスである必要がある場合、宿主細胞への適用に先立ち、それを適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロでパッケージングすることが可能である。
【００４２】
好ましくは、本発明のベクターは、核酸分子が原核生物および／もしくは真核生物の宿主細胞における転写ならびに場合によって発現を可能にする１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結される場合の発現ベクターである。該核酸分子の発現には、核酸分子の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写が含まれる。真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を保証する調節因子は当業者に周知である。通常、それらは転写の開始を保証する調節配列および場合によって転写の終了および転写産物の安定化を保証するｐｏｌｙ−Ａシグナルを含む。さらなる調節因子として、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーが含まれる場合がある。原核生物宿主細胞における発現を可能にする考えられる調節因子には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターが含まれ、真核細胞の宿主細胞における発現を可能にする調節因子の例として、酵母内のＡＯＸＩもしくはＧＡＬ１プロモーターまたは哺乳類および他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーもしくはグロビンイントロンが挙げられる。調節因子などの転写の開始を担う因子以外に、ポリヌクレオチドの下流にあたるＳＶ４０−ポリ−Ａ部位もしくはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終結シグナルも含まれる場合がある。これに関連し、適切な発現ベクターは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）−ベルグ（Ｂｅｒｇ）のｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ））、ｐＳＰＯＲＴＩ（ギブコ  ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））などの当該技術において既知である。好ましくは、該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくはターゲティングベクターである。レトロウイルス、種痘ウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的細胞集団への送達において使用することが可能である。組換えウイルスベクターを構築するのに当業者にとって周知の方法を用いてもよい。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年、第３版）Ｎ．Ｙ．およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４年）に記載の技術を参照のこと。あるいは、標的細胞への送達のために本発明の核酸分子をリポソーム内に再構成してもよい。
【００４３】
本発明は、さらに本発明のベクターを含有する宿主に関する。該宿主は、原核生物または真核生物の細胞でありうる。宿主細胞内に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるかまたは染色体外に維持されうる。これに関連し、突然変異遺伝子を修復するかまたは相同組換えを介して突然変異遺伝子を創出することを目的とした「遺伝子ターゲティング」および／または「遺伝子置換」のために本発明の核酸分子を使用可能であることも理解されるべきであり、例えば、ムエリック（Ｍｏｕｅｌｌｉｃ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７（１９９０年）、４７１２−４７１６頁；ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００４４】
宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳類など、任意の原核細胞または真核細胞、あるいは好ましくはヒト細胞でありうる。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞、特にサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の細胞である。「原核生物」という用語は、本発明の変異ポリペプチドの発現を目的とする、ポリヌクレオチドによって形質転換されうるかまたはトランスフェクトされうるすべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主は、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、レイ菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など、グラム陰性およびグラム陽性細菌を含みうる。本発明の変異ポリペプチドの突然変異形態をコードするポリヌクレオチドを使用することで、当業者に周知の技術のいずれかを用いて宿主を形質転換するかまたはトランスフェクトしてもよい。融合され作動可能に連結される遺伝子を調製し、細菌または動物細胞においてそれらを発現するための方法は、当該技術において周知である（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１年、第３版））。遺伝子コンストラクトおよびそれに記載の方法を、例えば原核生物宿主において、本発明の変異抗体、抗体断片またはその誘導体を発現するのに用いてもよい。一般に、挿入された核酸分子の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターが宿主との関連において使用される。発現ベクターは、典型的には複製起点、プロモーター、およびターミネーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択をもたらすことが可能な特異的遺伝子を含有する。形質転換原核生物宿主を培養槽内で成長させかつ当該技術で既知の技術によって培養することで最適な細胞成長を得ることが可能である。次いで、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体を成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離することが可能である。微生物的にまたはそれ以外により発現された本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体の単離および精製を、例えば、分取クロマトグラフィー分離や、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む分離などの免疫学的分離を例とする任意の従来の手段によって実施しうる。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態では、宿主は細菌、真菌、植物、両生類または動物細胞である。好ましい動物細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、３Ｔ３細胞、ＮＳＯ細胞および多数の他の細胞系が含まれるがこれらに限定されない。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、該動物細胞は昆虫細胞である。好ましい昆虫細胞にはＳＦ９細胞系の細胞が含まれるがこれに限定されない。
【００４７】
本発明のより好ましい実施形態では、該宿主はヒト細胞またはヒト細胞系である。該ヒト細胞にはヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、２９３フリースタイル）が含まれるがこれらに限定されない。さらに、該ヒト細胞系には、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞、ヒト肝細胞の癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【００４８】
いずれの細胞系が高い発現レベルを有するかについての判定を通じて、特に好ましい細胞系が選択される。
【００４９】
異なる細胞系によりまたはトランスジェニック動物において発現される抗体が異なるグリコシル化状態を有することになりそうである。しかし、本明細書において提供される核酸分子によってコードされるかまたは本明細書において提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、抗体のグリコシル化状態に関係なく本発明の一部である。
【００５０】
本発明は、本発明の抗体を産生するのに使用可能な本発明の１種もしくは複数種の核酸分子を含有するトランスジェニック非ヒト動物も提供する。抗体は、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターもしくは他の哺乳類の組織あるいは乳、血液または尿などの体液の中で産生され、かつそれらから回収されうる。例えば、米国特許第５，８２７，６９０号明細書、同第５，７５６，６８７号明細書、同第５，７５０，１７２号明細書、および同第５，７４１，９５７号明細書を参照のこと。上記の如く、ＥＡＧ１またはその一部で免疫することにより、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物の生成が可能である。
【００５１】
さらに本発明は、該抗体、抗体断片またはその誘導体の合成を可能にする条件下で本発明の宿主を培養するステップと、該抗体、抗体断片またはその誘導体を該培養物から回収するステップとを含む、抗体、抗体断片またはその誘導体を調製するための方法に関する。
【００５２】
形質転換宿主を培養槽内で成長させかつ当該技術で既知の技術によって培養することで、最適な細胞成長を得ることが可能である。全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または本発明の他の免疫グロブリン形態は、一旦発現されると、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該技術の標準手順に従って精製可能である。スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）を参照のこと。次いで、本発明の抗体またはそれに対応する免疫グロブリン鎖を成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離することが可能である。例えば、本発明の微生物によって発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製を、分取クロマトグラフィー分離や、例えば本発明の抗体の定常領域に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む分離などの免疫学的分離を例とする任意の従来の手段によって実施しうる。
【００５３】
例えば薬物ターゲティングおよびイメージングの用途において、本発明の抗体を他の成分とさらに結合させることが可能であることが当業者には明らかであろう。抗体または抗原の付着部位への発現後にかかる結合を化学的に行うかあるいは結合産物を本発明の抗体または抗原にＤＮＡレベルで設計することが可能である。次いで、適切な宿主系においてＤＮＡが発現され、必要に応じて発現されたタンパク質が回収および再生される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、抗体、抗体断片またはその誘導体は、カリケアマイシン、アウリスタチンＥまたはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などのエフェクター、放射性同位体あるいはゲルダナマイシンおよびメイタンシンなどの毒性のある化学療法剤と結合される。好ましくは、これらの抗体抱合体は、ＥＡＧ１を発現する癌細胞を例とする細胞を除去を目的に標的にする場合に有用である。さらに、本発明の抗体／抗体断片の放射性同位体などへの連結は、腫瘍治療に対する利点を提示する。化学療法や他の形態の癌治療と異なり、放射免疫治療または放射性同位体−抗体の併用投与は癌細胞を直接標的にしても周囲の正常で健全な組織への損傷は最小限である。好ましい放射性同位体として、例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられる。
【００５５】
さらに、本発明の抗体をゲルダナマイシン（マンドラー（Ｍａｎｄｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、９２（１９）、１５４９−５１頁（２０００年））およびメイタンシノイド薬ＤＭ１を例とするメイタンシン（リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：８６１８−８６２３頁（１９９６年））およびアウリスタチンＥ（ドローニナ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ）ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８−７８４頁（２００３年））などの毒性のある化学療法剤と抱合した状態で使用することで、癌を治療することが可能である。この技術では、酸性または還元条件下でまたは特異的なプロテアーゼへの暴露時に薬剤を放出する異なるリンカーが利用される。当該技術に記載の如く、本発明の抗体は抱合可能である。
【００５６】
しかし、本発明はさらに、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体、核酸分子、ベクター、宿主あるいは本発明の方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体を含む医薬組成物に関する。
【００５７】
本明細書で用いられる「組成物」という用語は、本発明の少なくとも１種の化合物を含む。好ましくは、かかる組成物は医薬組成物または診断用組成物である。
【００５８】
組成物は、固体、液体または気体の形態、特に粉末、錠剤、溶液またはエアロゾルの形態でありうる。該組成物は、本発明の少なくとも２種、好ましくは３種、より好ましくは４種、最も好ましくは５種の化合物または該化合物をコードする核酸分子を含有しうる。該組成物は、本発明の方法によって得られる最適化された抗体、抗体断片またはその誘導体も含有しうる。
【００５９】
該医薬組成物は、場合によって医薬的に許容できる担体および／または希釈剤を含有することが好ましい。本明細書で開示の医薬組成物は、高増殖性疾患、皮膚疾患、炎症性疾患または神経変性疾患の治療にとって部分的に有用でありうる。該障害は、乾癬、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、リンパ腫、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、バレット癌、胃癌、膀胱癌、頚癌、肝臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、増殖性疾患または腫瘍性疾患または他のＥＡＧを発現または過剰発現する高増殖性疾患を含むがこれらに限定されない。
【００６０】
本発明は、ＥＡＧ１の発現または過剰発現に関連した疾患／障害の治療に使用されるべき本発明の化合物を含有する医薬組成物を提供する。
【００６１】
適切な医薬担体、賦形剤および／または希釈剤の例は当該技術において周知であり、リン酸塩緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々の浸潤剤、無菌溶液などを含有する。周知の従来の方法により、かかる担体を含有する組成物を調製してもよい。これらの医薬組成物を適切な用量で被験者に投与してもよい。例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮、鼻腔内または気管支内投与といった異なる方法により、適切な組成物の投与を行うことが可能である。例えば、脳のような外部または内部標的部位へのバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な送達により、本発明の組成物を標的部位に直接投与することも可能である。担当医および臨床的因子によって投与計画が決定されることになる。医術では周知の如く、任意の一患者への用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、および並行投与中の他の薬剤を含む多数の因子に依存する。タンパク様医薬活性物質が１用量当たり１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在しうる。しかし、特に上記の因子を考慮すると、用量がこの典型的範囲から上下することも想定される。もしレジメンが連続注入である場合、それはさらに、１分当たり、体重のキログラム当たりで１ｐｇ〜１００ｍｇの範囲内にある必要がある。
【００６２】
定期評価により進行を監視してもよい。本発明の組成物は局所または全身への投与が可能である。非経口的投与用の調合物には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体には、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または固定油が含まれる。静脈内賦形剤には、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤もありうる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的によってさらなる作用物質を含有しうる。医薬組成物が、例えば追加の抗腫瘍剤、小分子阻害剤、抗癌剤または化学療法剤のようなさらなる作用物質を含有することが特に好ましい。
【００６３】
本発明は、少なくとも１種の抗腫瘍剤と併用した本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体を含有する医薬組成物にも関する。該併用は、例えば異常な細胞成長を阻害する場合に有効である。
【００６４】
現在、多数の抗腫瘍剤が当該技術で既知である。一実施形態では、抗腫瘍剤は、抗体または免疫調節タンパク質を含むがこれらに限定されない治療用タンパク質の群から選択される。別の実施形態では、抗腫瘍剤は、有糸分裂阻害剤、キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗代謝産物、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、抗生存作用物質（ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｇｅｎｔｓ）、生物学的応答修飾因子、抗アンドロゲンを例とする抗ホルモン、および抗血管形成剤からなる小分子阻害剤または化学療法剤の群から選択される。
【００６５】
さらに、獣医目的においても本発明の医薬組成物を使用してもよい。
【００６６】
さらに、本発明は、高増殖性疾患、炎症性疾患、乾癬、もしくは神経変性疾患の予防または治療を目的とした医薬組成物を調製するための、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体、核酸分子、ベクター、本発明の宿主あるいは本発明の方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体の使用に関する。
【００６７】
本発明の使用の好ましい実施形態では、該神経変性疾患は、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である。
【００６８】
本発明の使用の別の好ましい実施形態では、該高増殖性疾患は、特に、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、リンパ腫、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、バレット癌、胃癌、膀胱癌、頚癌、肝臓癌、甲状腺癌、メラノーマ、増殖性疾患または腫瘍性疾患あるいは他のＥＡＧ１を発現または過剰発現する高増殖性疾患である。
【００６９】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体、核酸分子、ベクター、本発明の宿主あるいは本発明の方法によって得られる抗体、抗体断片またはその誘導体、および場合によって医薬的に許容できる担体を含む診断用組成物に関する。
【００７０】
本発明の診断用組成物は、試料を本発明の抗体と接触させるステップと、試料中のＥＡＧ１の存在を検出するステップとを含む、異なる細胞、組織または別の適切な試料における哺乳類ＥＡＧ１カリウムチャネルの好ましくない発現または過剰発現の検出において有用である。したがって、高増殖性疾患の徴候または疾患状態を評価するために、本発明の診断用組成物を使用することが可能である。さらに、ＥＡＧ１を発現する癌細胞などの悪性細胞を本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体で標的にすることが可能である。したがって、本発明の抗体に結合している細胞であれば補体系などの免疫系機能または細胞媒介性の細胞毒性によって攻撃される可能性があり、それ故、癌細胞の数が減少するかまたは同細胞は根絶される。これらの検討事項は、腫瘍の転移や再発に関する診断に等しく適用される。
【００７１】
本発明の別の態様では、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体は標識基に結合される。かかる抗体は診断への応用に特に適する。本明細書で用いられる如く、「標識基」という用語は、検出可能なマーカー、例えば標識されたアビジンによって検出可能な放射性標識化されたアミノ酸またはビオチニル部分を示す。抗体などのポリペプチドおよび糖タンパク質を標識するための様々な方法は、当該技術で既知であり、本発明を実施する場合に使用されうる。適切な標識基の例として、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、酵素群（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体における結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
特定の態様では、標識基が潜在的な立体障害を低下させるのに様々な長さのスペーサーアームによって付着されることが望ましい場合がある。
【００７３】
本発明の上記の実施形態は特に重要である。本発明の抗体は、治療可能な異なる哺乳類種に対して広範な適用性を示すことから、本発明の診断用組成物も異なる哺乳類種において有用でかつ適用可能である。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体または抗体断片またはその誘導体を、ＥＡＧ１を自身の表面上に担持すると見られる細胞または組織と接触させるステップを含む、ＥＡＧ１発現細胞の存在について評価する方法に関する。
【００７５】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体または抗体断片またはその誘導体を、ＥＡＧ１を自身の表面に担持すると見られる細胞または組織と接触させるステップを含む、ＥＡＧ１の機能を遮断する方法に関する。
【００７６】
本発明の方法の好ましい実施形態では、該接触させるステップはインビトロで行われる。
【００７７】
本発明の方法の好ましい実施形態では、該接触させるステップはインビボで行われる。
【００７８】
本発明は、治療を必要とする患者に本発明の抗体または抗体断片またはその誘導体の適切な用量を投与するステップを含む、高増殖性疾患、炎症性疾患、乾癬、または神経変性疾患から選択される疾患を治療する方法にも関する。
【００７９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、該神経変性疾患は、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症またはパーキンソン病である。
【００８０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、該過剰増殖疾患は、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、リンパ腫、皮膚癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、バレット癌、胃癌、膀胱癌、頚癌、肝臓癌、甲状腺癌、ならびに増殖性疾患および腫瘍性疾患または他のＥＡＧを発現または過剰発現する高増殖性疾患である。
【００８１】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、該炎症性疾患は膵炎または肝炎である。
【００８２】
本発明は、最終的に疾患を治療する方法に関し、ここで本発明の抗体は哺乳動物に投与され、該疾患はＥＡＧ１の発現の異常レベルと直接的または間接的に相関する。
【００８３】
最終的に、本発明は、本発明の抗体、抗体断片またはその誘導体、該成分をコードする核酸分子および／または本発明のベクターを含むキットに関する。
【００８４】
本明細書で開示される化合物を網羅するすべての実施形態を、単一の化合物としてまたは薬剤の調製のために組み合わせて使用してもよい。
図は以下を示す：
図１は、マウスクローンＩｍＡｂ１、３、４および５の軽鎖および重鎖のＣＤＲ１、２および３のＣＤＲペプチド配列を示す。
図２は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３の結合特異性／選択性を示す。該抗体はＥａｇ１を選択的に認識しかつＥａｇ２抗原に結合しない。さらにＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析では、ＩｍＡｂ１がＥａｇ１のＣ末端に結合する一方、ＩｍＡｂ３がＥａｇ１のポアドメインを認識することが示される。
図３は、ラット海馬およびラット小脳を含むラット脳切片における抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ４による免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＩＨＣ試験は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体のラットとの交差反応について示す。
図４は、抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体とＳＰＯＴセルロース膜上のペプチドとの結合パターンを示す。
図５は、Ｅａｇ１を過剰発現する生きているＣＨＯ  Ｋ１細胞に対してＣｙ３標識抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３を用いた免疫蛍光実験を示す。結果は、異なるエピトープを認識する本発明のＣｙ３標識抗−Ｅａｇ１抗体が生きているＣＨＯ−Ｅａｇ１細胞上のＥａｇ１抗原に結合しかつ細胞内に内在化することを示す。
図６は、マウスモノクローナル抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３のハイブリドーマ上清を用いた処理によるＥａｇ１を発現する卵母細胞内でのＥａｇ１電流の阻害およびＩｍＡｂ３におけるＥａｇ１発現ＣＨＯ細胞内でのＥａｇ１電流に対する遮断能を示す。
図７は、本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞増殖の阻害を示す。該抗体はヒト癌細胞における基底細胞の成長を阻害する。
図８ａおよび８ｂは、二次免疫毒素とともに（と組み合わせて）標識されたマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞増殖の阻害を示す。結果は、抗−Ｅａｇ１抗体が内在化する能力を有しかつ本発明のアームが付着した抗体がヒト癌細胞の成長を特異的に阻害することを示す。該抗体は、一次免疫毒素としての抱合に適しかつヒト癌細胞成長の阻害において有効である。
図９は、二次免疫毒素の存在下での抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞の足場非依存性細胞成長の阻害を示す。
図１０ａは、抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４を使用し、ヒト腫瘍細胞内でのＥａｇ１タンパク質の免疫蛍光を示す。結果は、発明の抗体がヒト癌細胞内で内因性Ｅａｇ１タンパク質に対する結合能を有することを示す。図１０ｂは、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体を使用したＥａｇ１−ＥＬＩＳＡの実施結果を示す（該抗体はヒト癌細胞の溶解物中でのＥａｇ１タンパク質に対する結合能および検出能を有する）。
図１１は、ＣＨＯ  Ｋ１細胞内での組換えｈｕ−ＩｍＡｂ３の発現を示す。
図１２は、本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体による数種のヒト癌細胞のコロニー形成の阻害を示す。抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３は、乳癌細胞（図１２ａ）、卵巣癌細胞（図１２ｂ、ｃ）、メラノーマ細胞（図１２ｄ）、膵臓癌細胞（図１２ｅ）、線維肉腫細胞（図１２ｆ）および肺扁平上皮癌細胞（図１２ｇ）の足場非依存性細胞成長を阻害する。抗−ＥＡＧ１抗体ｉＭａｂ５は、卵巣癌細胞（図１２ｂ）の足場非依存性細胞成長を阻害する。図１２ｃは、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３による卵巣癌細胞のコロニー形成の用量依存的阻害を示す。
図１３は、本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３卵巣癌細胞増殖の阻害を示す。該抗体はヒト癌細胞内での基底細胞の成長を示す。
図１４は、本発明の抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３による雌ＳＣＩＤマウスにおけるヒト腫瘍成長の低下を示す。該抗体は、ヒト乳癌細胞のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞のインビボでの成長を阻害する。
図１５は、治療用モノクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体エルビタックスと併用したヒト抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるヒト卵巣癌およびヒト膵臓癌細胞の足場非依存性細胞成長の阻害を示す（図１５ａおよび１５ｂ）。図１５ｃは、ヒト卵巣癌細胞のＩｍＡｂ３と抗腫瘍剤タキソールとの併用治療によってこの細胞株のコロニー形成が極めて効率的に阻害されることを示す。抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３を抗腫瘍剤シスプラチンと併用した細胞治療によるヒト卵巣癌およびメラノーマ細胞のコロニー形成の阻害については図１５ｄおよび１５ｅに示される。
図１６は、強力な抗腫瘍剤タキソールと併用した本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３卵巣癌細胞の増殖の阻害を示す。ヒト卵巣癌細胞に対するＩｍＡｂ３とタキソールとの併用治療により、ヒト癌細胞内での基底細胞の成長が各抗癌剤単独の場合よりも効率的に阻害される。
図１７は、免疫毒素サポリンと抱合された本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３による種々の癌細胞株の細胞増殖の阻害について示す。結果は、毒素と抱合された抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３がヒト癌細胞株の幅広いスペクトルの細胞増殖を極めて効率的に阻害することを示す。サポリンと抱合された抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３は、メラノーマ細胞（図１７ａ）、卵巣および膵臓癌細胞（図１７ｂ）、線維肉腫細胞（図１７ｂ）、乳癌および結腸癌細胞（図１７ｃ）の細胞増殖を阻害する。
図１８は、ＩｍＡｂ３抗体の細胞外適用によるＥＡＧ１電流の阻害を示す。同適用の０および１０分の時点での代表的トレースは、ＩｍＡｂ３を適用するだけで電流振幅が見事に低下することを示す。１０〜１５分後には、電流阻害が全振幅の約３５％に至る（図１８ａ）。図１８ｂは、ＩｍＡｂ３の技術的に到達可能な時間範囲および濃度においてＨＥＲＧ電流に対する作用が失われることを示す。
図１９は、人工的に移植された、ＥＡＧ１を発現する腫瘍および先に検出されなかった転移性の移植片を担持するマウスから得られる疑似カラー像（矢印）を示す。イメージングの２４時間前に標識抗体１００μｇが静脈内注射された。図１９Ａは色分けされた蛍光強度を示す一方、図１９Ｂは陽性領域においてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６８０に対応する蛍光寿命を示す。
【００８５】
実施例は本発明を例示する。
【実施例】
【００８６】
行われた実験および得られた結果を含む以下の実施例は、単に図示目的で提供されるものであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００８７】
実施例１：ＥＡＧ１抗原の調製
ｈ１ｚをコードするベクターで形質転換した大腸菌（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ）細胞の単一のコロニーを、３１℃、１４０ｒｐｍでクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌおよびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを補充した５００ｍｌのＬＢ培地に接種した。インキュベーションの１５時間後、培養物を、必要な抗生物質を補充したＬＢ−培地で１／１０に希釈し、振とう下（１４０ｒｐｍ）、３１℃で２時間インキュベートした。ＩＰＴＧの添加（最終濃度１ｍＭ）により、融合タンパク質の過剰発現を誘発した。培養物を６時間インキュベートし、次いで２１００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。ペレットをＨｉｓ−再懸濁緩衝液に再懸濁し、３，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した。ペレットを液体窒素中で急速冷凍し、−７０℃で保存した。
【００８８】
冷凍した細菌細胞ペレットを、約１ｍｇ／ｍｌ以下のリゾチームを補充した５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ１５ｍｌ、ｐＨ７．９、２ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁し、室温で１５分間振とうした。尿素を最終濃度が８Ｍに至るまで添加し、試料に超音波処理を施した。溶液を４℃で回転させながら一晩変性させておき、その後、１４，０００×ｇで３０分間遠心した。上清を１×結合緩衝液中、６Ｍの尿素に調節し、０．４５μｍのフィルタで濾過した。１００％の結合緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、５ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素）から１００％の溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１Ｍのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ、６Ｍの尿素）への線形勾配を用いたＢｉｏＣＡＤクロマトグラフィー系を使用してアフィニティー精製を行った。２５０ｍＭのＮｉＳＯ４で帯電させ、結合緩衝液で予備平衡化したＨｉｓ−タグ樹脂ピークカラム上に上清を負荷した。適切な画分を、ＰＢＳ中の３Ｍの尿素で３回、３回の１Ｍの尿素、３回のＰＢＳおよび３回の０．５倍のＰＢＳに対して４℃で２４時間透析した。透析した融合タンパク質を凍結乾燥し、使用するまで−２０Ｃで保存した。
【００８９】
実施例２：本発明のＥＡＧ１抗体
Ａ．抗体の調製
免疫化
マウス（８週齢）２匹を、完全アジュバント（バイオジーンズ・ゲーエムベーハー（Ｂｉｏｇｅｎｅｓ  ＧｍｂＨ））中で乳化した５０ｎｇの抗原を注射することによってプライミングし、融合の１２０日前に腹膜内注射した。以下の日程により、あらゆる他の腹膜内および静脈内注射を行った。
【００９０】
【表１】
2008520186.tif 000002
【００９１】
使用した骨髄腫細胞株はＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓから入手したＳＰ２／０−Ａｇ１４であった。細胞を、２０ｐｇ／ｍｌのアザグアニンに耐性を示す免疫グロブリン鎖を合成しないかまたは分泌し、かつＨＡＴ培地で成長しないものとした。２０Ｎｇ／ｍｌの８−ＡＺＧを補充した標準培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清）、組織培養フラスコ内でＳＰ２／０細胞を定期的に維持し、ＨＡＴ培地で成長可能な任意のＨＰＲＴ＋復帰変異体を殺した。ＳＰ２／０細胞を融合の１週間前に８−ＡＺＧを含まない標準培地で維持した。
【００９２】
免疫したマウスから脾臓を無菌状態で摘出し、単一の細胞懸濁液を調製した。ポリエチレングリコール４０００の存在下で脾臓リンパ球をＳＰ２／０骨髄腫細胞株と融合した（リンパ球／ＳＰ２／０の比が１０／１）。次いで、そのようにして産生した細胞を、ＨＡＴ（ヒポキサンチン１０−４Ｍ、アミノプテリン１０−５Ｍおよびチミジン４×１０−５Ｍ）および２０％の予備選択したウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭに再懸濁した。次いで、フィーダー層として腹膜滲出細胞を含有する５つの９６ウェルの組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）に細胞を蒔いた。プレートを、５％の二酸化炭素を含有する湿潤大気中、３７℃で２週間インキュベートした。この期間にわたり細胞にＨＡＴ培地を２回、ＨＴ培地を２回供給した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用い、細胞成長が進んだウェルにおける特異的な免疫グロブリン含量についてスクリーニングした。
【００９３】
培養上清をスクリーニングするために、間接ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。アッセイを、以下の如く調製した９６ウェルの平底のポリスチレンマイクロタイタープレートにおいて行った。すなわち、５μｇ／ｍｌの濃度で免疫原（陽性対照として）またはＥａｇ２に対応する等価な融合タンパク質（陰性対照として）を含有するｐＨ９．６の０．１Ｍの炭酸塩／重炭酸塩緩衝溶液からの一定分量１００μｌをプレート上のウェルに添加した。プレートを、湿ったチャンバ内、４℃で一晩インキュベートした後、０．０１％トリトンＸ−１００を含有するＴＢＳで４回洗浄し、ＴＢＳ中、２２％の冷水魚由来のゼラチンを用いて室温で１時間ブロッキングした。
【００９４】
ハイブリドーマ上清からの一定分量１００μｌを適切なアッセイウェルに添加した。２つの陰性対照ウェルを、一方が新鮮培地を含有し他方が非融合ＳＰ２／０骨髄腫細胞を含有するウェルからの上清を含有する各プレート上でインキュベートした。アッセイプレートを、湿ったチャンバ内、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、それを０．０１％トリトンＸ−１００を含有するトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．８、１５０ｍＭの塩化ナトリウム）で４回洗浄した。結合抗体の測定には、多数のアルカリホスファターゼ抱合体：ヤギ抗−マウスＩｇＧ（ＩｇＧ産生株の検出にとって特異的なＦｃ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（ＩｇＭとＩｇＧの双方の産生株の検出にとって特異的なＦａｂ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ａ−２４２９およびＡ−２１７９）を含めた。バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製Ｍｏｄｅｌ４５０マイクロプレートリーダーにおいて、パラニトロフェノールを含有する基質緩衝液を活用して結合酵素の定量を行った。
【００９５】
陽性ＩｇＧ産生株のウェルからの細胞を２４ウェルプレートのウェルに移し、１週間培養した。安定な抗体産生株のさらなる選択を意図して、この期間経過しても依然として陽性であったウェルからの細胞にプレクローナル（ｐｒｅｃｌｏｎａｌ）な分布を施した（フィーダー層として腹膜滲出細胞を含有する５つの９６ウェルの組織培養プレートに細胞を１ウェル当たり１０個の細胞の濃度で蒔いた）。ランダムな染色体の欠失が原因で目的の抗体を分泌する細胞を有するウェルの抗体産生能が徐々に低下する可能性があることから、この方法は最も安定な細胞サブポピュレーションの選択を可能にする。
【００９６】
限界希釈によるクローニングを行うため、ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ産生株）において最強の陽性シグナルを与えるウェルからの細胞を選択した。各陽性ウェルからの細胞を２つの９６ウェルプレートに分布させた。８〜１０日以内に全プレートでのモノクローナルな成長の検出について顕微鏡検査を行い、ＥＬＩＳＡにより、かかるウェルからの培養上清における特異的な免疫グロブリン含量をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡにて最適なシグナルを生成した６つのウェルからの細胞を２４ウェルプレートのウェルに移し、さらに１週間培養した。次いでアッセイ手順を繰り返し、各一次集団由来の１つの最適なクローンに第２の限界希釈クローニングを施した。第１のクローニング後に得られたすべての手順を第２のクローニング後に繰り返した。
【００９７】
２回クローニングしたモノクローナル細胞株を、任意のさらなる成長刺激因子を含まない、１５％のウシ胎仔血清を有する培地での成長に適応させ、３×１０６個の細胞／ｍｌで凍結している９０％ウシ胎仔血清、１０％ＤＭＳＯ中で凍結させた。
【００９８】
ウエスタンブロットおよびＢＩＡｃｏｒｅ実験において、全抗体のＥａｇ１に対する特異性について試験した。ＥＬＩＳＡもしくはＢＩＡＣｏｒｅ試験においてＥａｇ２を認識するかまたは心筋製剤に対して免疫染色を示す（ＨＥＲＧとの交差反応を示す）抗体をＥａｇ１に非特異的なものとして廃棄した。
【００９９】
マウス抗体遺伝子のクローニング
免疫組織学的方法によってマウス抗体のサブタイプを同定した。すべてのハイブリドーマがサブタイプＩｇＧ２ｂ重鎖およびカッパ軽鎖の分泌抗体を発現した。ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から調製した。ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して全ＲＮＡ１μｇをｃＤＮＡに翻訳した。ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のロングディスタンス（Ｌｏｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）ポリメラーゼ連鎖反応を利用し、２０サイクル間に一次ｃＤＮＡを増幅した。次いで特異的プライマーおよび校正ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用したＰＣＲによって、ハイブリドーマによって発現された軽鎖および重鎖の遺伝子を増幅した。
【０１００】
重鎖遺伝子を増幅するため、プライマーＰ１およびＰ２を使用した。Ｐ１はＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔによって生成される全ｃＤＮＡの５’プライム配列に特異的である。Ｐ２はマウスＩｇＧ２ｂの定常領域の３’プライム領域に特異的なプライマーである。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ６：ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣＧ  Ｇ（配列番号５０）
【０１０１】
軽鎖遺伝子を増幅するため、プライマーＰ１およびＰ３を使用した。Ｐ１はＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔによって生成される全ｃＤＮＡの５’プライム配列に特異的である。Ｐ３はマウスカッパ軽鎖の定常領域の３’プライム領域に特異的なプライマーである。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ４：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  Ｃ（配列番号５１）
【０１０２】
第１の鎖反応ｃＤＮＡ１００μｌのうちの１μｌ、Ｐｗｏ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））用１×ＰＣＲ緩衝液、２００μＭの各ヌクレオチド（ｄＮＴＰ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、各プライマー０.６μＭ、２．５ＵのＰｗｏ校正ポリメラーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、最終容量５０μｌを、以下のようにサーマルサイクラーでインキュベートした。
９４℃  ３分
９４℃  ２５秒
６５℃  ３０秒
７２℃  軽鎖に対して４０秒および重鎖に対して６０秒
１０サイクル
９４℃  ２５秒
６５℃  ３０秒
７２℃  軽鎖に対して４０秒＋２秒／サイクルおよび重鎖に対して６０秒＋４秒／サイクル
２０サイクル
７２℃  ５分
【０１０３】
１％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を分析した。軽鎖においては７５０ｂｐの１本のバンドおよび重鎖においては１６００ｂｐのバンドを認めた。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））によって精製し、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を使用してリン酸化した。１０ｐモルのＤＮＡ二本鎖（５μｇの軽鎖ＤＮＡまたは１０μｇの重鎖ＤＮＡ）を、１００μＭのＡＴＰを含む、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのスペルミジン、ｐｈ８．２、および５０ＵのＰＮＫで、３７℃で３０分間インキュベートした。リン酸化したＤＮＡを、ゲル溶出によりアガロースゲルから精製し、制限酵素ＥｃｏＲＶ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で切断して子牛腸アルカリホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターにライゲートした。クローニングしたＤＮＡの配列を、Ｔ３およびＴ７プライマー（セクラブ・ゲーエムベーハー（Ｓｅｑｌａｂ  ＧｍｂＨ）、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）を使用したＤＮＡシークエンシングによって決定した。
【０１０４】
マウス軽鎖ＩｍＡｂ４のＤＮＡ配列を配列番号１に示す
マウス軽鎖ＩｍＡｂ４のタンパク質配列を配列番号２に示す
【０１０５】
抗体の分泌に必要なシグナルペプチドなどのタンパク質ドメインおよび抗体のその標的に対する特異的な結合に必要な相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）（チョチア  Ｃ．（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．）、ノボトニ  Ｊ．（Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ．））、ブルッコレリ  Ｒ．（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  Ｒ．）、カープラス  Ｍ．（Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８６（３）：６５１−６３頁、１９８５年）に準じ、抗体配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）および定常領域を規定した。
シグナルペプチド    １．〜１９．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ１      ４３．〜５８．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ２      ７４．〜８０．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ３      １１３．〜１２１．アミノ酸
定常領域：          １２２．〜２３８．アミノ酸
【０１０６】
マウス重鎖ＩｍＡｂ４のＤＮＡ配列を配列番号３に示す
重鎖ＩｍＡｂ４のタンパク質配列を配列番号４に示す
【０１０７】
抗体の分泌に必要なシグナルペプチドなどのタンパク質ドメインおよび抗体のその標的に対する特異的な結合に必要な相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）（チョチア  Ｃ．（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．）、ノボトニ  Ｊ．（Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ．））、ブルッコレリ  Ｒ．（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  Ｒ．）、カープラス  Ｍ．（Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８６（３）：６５１−６３頁、１９８５年）に準じ、抗体配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）および定常領域を規定した。
シグナルペプチド    １．〜１８．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ１      ４４．〜５４．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ２      ６９．〜８４．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ３      １１７．〜１２６．アミノ酸
定常領域：          １２７．〜４７３．アミノ酸
【０１０８】
軽鎖クローンＩｍＡｂ３：
マウス軽鎖ＩｍＡｂ３のＤＮＡ配列を配列番号５に示す
マウス軽鎖ＩｍＡｂ３のタンパク質配列を配列番号６に示す
【０１０９】
抗体の分泌に必要なシグナルペプチドなどのタンパク質ドメインおよび抗体のその標的に対する特異的な結合に必要な相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）（チョチア  Ｃ．（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．）、ノボトニ  Ｊ．（Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ．））、ブルッコレリ  Ｒ．（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  Ｒ．）、カープラス  Ｍ．（Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８６（３）：６５１−６３頁、１９８５年）に準じ、抗体配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）および定常領域を規定した。
シグナルペプチド    １．〜２０．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ１      ４４．〜６０．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ２      ７６．〜８２．アミノ酸
ＬＣ−ＣＤＲ３      １１５．〜１２２．アミノ酸
定常領域：          １２３．〜２３９．アミノ酸
【０１１０】
マウス重鎖ＩｍＡｂ３のＤＮＡ配列を配列番号７に示す
マウス重鎖ＩｍＡｂ３のタンパク質配列を配列番号８に示す
【０１１１】
抗体の分泌に必要なシグナルペプチドなどのタンパク質ドメインおよび抗体のその標的への特異的結合に必要な相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）（チョチア  Ｃ．（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．）、ノボトニ  Ｊ．（Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ．））、ブルッコレリ  Ｒ．（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  Ｒ．）、カープラス  Ｍ．（Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８６（３）：６５１−６３頁、１９８５年）に準じ、抗体配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）および定常領域を規定した。
シグナルペプチド    １．〜１９．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ１      ４５．〜５４．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ２      ６９．〜８７．アミノ酸
ＨＣ−ＣＤＲ３      １２０．〜１２９．アミノ酸
定常領域            １３０．〜４７６．アミノ酸
【０１１２】
キメラ抗体の産生：
マウス抗体の定常領域をヒト定常領域によって置き換えた。マウス抗体の場合と同じアプローチを用い、ヒトボランティアの血球からヒト軽鎖カッパおよび重鎖ＩｇＧ１をクローニングしたが、特異的ヒトプライマーは以下の通りである。
【０１１３】
ヒト重鎖遺伝子を増幅するため、以下のプライマーを使用した。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１６：ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣ（配列番号５２）
【０１１４】
ヒト軽鎖遺伝子を増幅するため、以下のプライマーを使用した。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
【０１１５】
マウス可変領域をヒト定常領域と融合するため、以下のＰＣＲを行った。まずヒト定常領域を、マウスおよびヒト配列を含むキメラ３’プライマー（プライマーＰ７）の使用によってマウス可変領域の３’末端と融合した。鋳型としての両ＤＮＡ断片および各ＤＮＡ断片に対する１つの特異的プライマーを使用した最終ＰＣＲにより、ヒト定常領域とマウス可変領域の双方を融合した。
【０１１６】
キメラ抗体ＩｍＡｂ３：
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１１１：ＣＧＴ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＴＡ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣ（配列番号５３）
のプライマーを使用してマウス軽鎖ＩｍＡｂ３の可変領域（４０９ｂｐ）を増幅した。
【０１１７】
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
Ｐ１１３：ＧＣＡ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＧ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  Ｇ（配列番号５５）
を使用してヒト軽鎖定常領域（３７６ｂｐ）を増幅した。
【０１１８】
それにより、マウス軽鎖可変領域を有する重なり配列を導入した。
【０１１９】
ＰＣＲにより両断片を融合し、キメラＤＮＡ断片（７６２ｂｐ）を生成した。
Ｐ９：ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号５６）
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
【０１２０】
ＤＮＡ断片の両末端に特有の制限部位（ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ）を導入するため、
Ｐ２１６：ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号５７）
Ｐ２１７：ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧ（配列番号５８）
のプライマーを使用して再びＰＣＲ（Ｐｗｏ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を行った。
【０１２１】
ＤＮＡ産物をリン酸化し、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋にクローニングした。ＤＮＡを配列決定し、制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩによって切断し、真核生物発現ベクターｐＢｕｄＣＥ４．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖ５３２−２０）にライゲートした。
【０１２２】
ＰＣＲによりマウス重鎖ＩｍＡｂ３の可変領域をヒトＩｇＧ１の定常領域と融合した。まず、マウス重鎖ＩｍＡｂ３の可変領域（４８８ｂｐ）を
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１１９：ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣＴ  ＡＣＣ（配列番号５９）
のプライマーで増幅した。
【０１２３】
Ｐ１２１：ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣ（配列番号６０）
Ｐ１２２：ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ（配列番号６１）
を使用してヒト重鎖定常領域（１０４８ｂｐ）を増幅した。
【０１２４】
ＰＣＲにより両断片を融合し、再びＰＣＲにより特有の制限部位（５’プライムでＨｉｎｄＩＩＩおよび３’プライムでＸｂａＩ）を導入した。
Ｐ２２０：ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＴＡＴ  Ｇ
Ｐ２２１：ＡＴＣ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣ
【０１２５】
最終断片（１５１３ｂｐ）を、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋に平滑末端でクローニングし、配列決定し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶでの消化後、ｐＢｕｄ  ＣＥ４．１にクローニングした。
【０１２６】
キメラ軽鎖ＩｍＡｂ３のＤＮＡ配列を配列番号９に示す
キメラ軽鎖ＩｍＡｂ３のタンパク質配列を配列番号１０に示す
キメラ重鎖ＩｍＡｂ３のＤＮＡ配列を配列番号１１に示す
キメラ重鎖ＩｍＡｂ３のタンパク質配列を配列番号１２に示す
【０１２７】
キメラ抗体ＩｍＡｂ４：
ヒト重鎖遺伝子を増幅するため、以下のプライマーを使用した。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１６：ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣ（配列番号５２）
【０１２８】
軽鎖遺伝子を増幅するため、以下のプライマーを使用した。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
【０１２９】
特異的プライマーによりヒト定常領域を増幅し、以下のＰＣＲによりマウス可変領域と融合した。
【０１３０】
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１１８：ＣＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＧＣ（配列番号６４）
のプライマーを使用してマウス軽鎖ＩｍＡｂ４の可変領域（４３２ｂｐ）を増幅した。
【０１３１】
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
Ｐ１１４：ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＧＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ（配列番号６５）
を使用してヒト軽鎖定常領域（３７７ｂｐ）を増幅した。
【０１３２】
それにより、マウス軽鎖可変領域を有する重なり配列を導入した。
【０１３３】
ＰＣＲにより両断片を融合した。
Ｐ９：ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号５６）
Ｐ１５：ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号５４）
【０１３４】
Ｐ１１６：ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号６６）
Ｐ１１７：ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＡＧ（配列番号６７）
のプライマーを使用したＰＣＲにより、ＤＮＡ断片（７８５ｂｐ）の両末端で特有の制限部位を導入した。
【０１３５】
ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（ＥｃｏＲＶ消化）にクローニングし、配列決定した。
【０１３６】
ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩでの消化後、ＤＮＡをｐＢｕｄ  ＣＥ４．１にクローニングした。
Ｐ８：ＧＴＡ  ＡＣＡ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  Ｇ（配列番号４９）
Ｐ１２０：ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＡＣＣ（配列番号６８）
のプライマーを使用してマウス重鎖ＩｍＡｂ４の可変領域（４５５ｂｐ）を増幅した。
【０１３７】
Ｐ１２１：ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣ（配列番号６０）
Ｐ１２３：ＧＧＴ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ（配列番号６９）
を使用してヒト重鎖定常領域（１０５４ｂｐ）を増幅した。
【０１３８】
ＰＣＲにより両断片を融合し、特有の制限部位（５’プライムでＨｉｎｄＩＩＩおよび３’プライムでＸｂａＩ）を導入した。
Ｐ２４８：ａａａ  ｇｃｔ  ｔＡＣ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＧＧＧ（配列番号７０）
Ｐ２４９：ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  Ｇ（配列番号７１）
【０１３９】
最終断片（１４８９ｂｐ）を、ＥｃｏＲＶで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋に平滑末端でクローニングし、配列決定し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの消化後、ｐＢｕｄ  ＣＥ４．１にクローニングした。
【０１４０】
キメラ軽鎖ＩｍＡｂ４のＤＮＡ配列を配列番号１３に示す
キメラ軽鎖ＩｍＡｂ４のタンパク質配列を配列番号１４に示す
キメラ重鎖ＩｍＡｂ４のＤＮＡ配列を配列番号１５に示す
キメラ重鎖ＩｍＡｂ４のタンパク質配列を配列番号１６に示す
【０１４１】
ヒト化：
最も近いヒト可変フレームワークへの適応：
タンパク質レベルで、キメラ抗体の可変領域とヒト抗体の可変領域とを比較した（Ｇｅｎｂａｎｋ）。コンセンサスのヒトゲノム内の最も近いヒト対応部分を同定した。ＤＮＡレベルでの点突然変異の導入により、マウス可変領域の配列を相補性決定領域の外部でヒト配列に変化させた。
ＬＣ−ＩｍＡｂ３からヒトＢ３へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ３からヒトＶＨ３−７２へ
ＬＣ−ＩｍＡｂ４からヒトＡ１７へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ４からヒトＶＨ４−５９へ
【０１４２】
特異的なＤＮＡプライマーを使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ＃２００５１８）を使用して点突然変異を導入した。以下のプライマーをその相補性プライマーと併用し、単一の突然変異を導入した。
【０１４３】
キメラ抗体ＩｍＡｂ３の最も近いヒト配列への適応
軽鎖ＩｍＡｂ３ヒトＢ３用プライマーの一覧
Ｐ６１：ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  Ｇ（配列番号７２）
Ｐ７１：ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＧ（配列番号７３）
Ｐ７２：ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＧ（配列番号７４）
Ｐ７３：ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＧＣ  ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＡ（配列番号７５）
Ｐ７４：ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ（配列番号７６）
Ｐ９１：ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  Ｃ（配列番号７７）
Ｐ９２：ＡＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣ（配列番号７８）
【０１４４】
重鎖ＩｍＡｂ３ヒトＶＨ３−７２用プライマーの一覧
Ｐ６３：ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  Ｃ（配列番号７９）
Ｐ７５：ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ（配列番号８０）
Ｐ７６：ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＴ（配列番号８１）
Ｐ７７：ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＡＡＣ（配列番号８２）
Ｐ７８：ＴＡＴ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧ（配列番号８３）
Ｐ９３：ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＧ（配列番号８４）
Ｐ９４：ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＣＧ（配列番号８５）
【０１４５】
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＢ３のＤＮＡ配列を配列番号１７に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＢ３のタンパク質配列を配列番号１８に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３−７２のＤＮＡ配列を配列番号１９に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３−７２のタンパク質配列を配列番号２０に示す
【０１４６】
キメラ抗体ＩｍＡｂ４のｃｌｏｓｅｔヒト配列への適応
軽鎖ＩｍＡｂ４ヒトＡ１７用プライマーの一覧
Ｐ６７：ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  Ｇ（配列番号８６）
Ｐ８２：ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ（配列番号８７）
Ｐ８３：ＡＡＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ（配列番号８８）
Ｐ８４：ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＡＣ  ＡＣ（配列番号８９）
Ｐ９７：ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＧＧＣ（配列番号９０）
Ｐ９８：ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＡＴＧ（配列番号９１）
【０１４７】
重鎖ＩｍＡｂ４ヒトＶＨ４−５９用プライマーの一覧
Ｐ６５：ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＣＣ（配列番号９２）
Ｐ７９：ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  Ｃ（配列番号９３）
Ｐ８０：ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＧＣ（配列番号９４）
Ｐ８１：ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＧＡＧ（配列番号９５）
Ｐ９５：ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＡＣ（配列番号９６）
Ｐ９６：ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  ＴＧＧ（配列番号９７）
Ｐ９９：ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ（配列番号９８）
Ｐ１００：ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  Ｇ（配列番号９９）
Ｐ１０１：ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧ（配列番号１００）
【０１４８】
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ１７のＤＮＡ配列を配列番号２１に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ１７のタンパク質配列を配列番号２２に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−５９のＤＮＡ配列を配列番号２３に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−５９のタンパク質配列を配列番号２４に示す
【０１４９】
ヒト可変フレームワークへの適応：
相同性が低下した、マウス１抗体当たり２つのさらなるヒト化抗体を産生した。それらの開始配列は事前にヒト化した抗体のＩｍＡｂ３およびＩｍＡｂ４である。
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＢ３からヒトＡ３へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３−７２からヒトＶＨ３−２３へ
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＢ３からヒトＡ１７へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３−２３からヒトＶＨ２−２６へ
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ１７からヒトＡ５−１へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−５９からヒトＶＨ１−３へ
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ１７からヒトＯ１へ
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−５９からヒトＶＨ４−３１へ
【０１５０】
ＩｍＡｂ３抗体用
軽鎖ＩｍＡｂ３ヒトＡ３用プライマーの一覧
Ｐ１４６：ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣ（配列番号１０１）
Ｐ１５１：ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  Ｃ（配列番号１０２）
Ｐ１５２：ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ（配列番号１０３）
Ｐ１５５：ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣ（配列番号１０４）
Ｐ２０５：ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＣ（配列番号１０５）
Ｐ２０６：ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＴＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣ（配列番号１０６）
Ｐ２０７：ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＣ（配列番号１０７）
Ｐ２４２：ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ（配列番号１０８）
【０１５１】
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＡ３のＤＮＡ配列を配列番号２５に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＡ３のタンパク質配列を配列番号２６に示す
【０１５２】
重鎖ＩｍＡｂ３ヒトＶＨ３−２３用プライマーの一覧
Ｐ１６８：ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＣ（配列番号１０９）
Ｐ１６９：ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  Ｃ（配列番号１１０）
Ｐ１７０：ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  Ｇ（配列番号１１１）
Ｐ１７１：ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＧ（配列番号１１２）
Ｐ２３１：ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＡｇ  ＧＡＴ  ＴＴｔ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ（配列番号１１３）
【０１５３】
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３_２３のＤＮＡ配列を配列番号２７に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ３_２３のタンパク質配列を配列番号２８に示す
【０１５４】
軽鎖ＩｍＡｂ３ヒトＡ１７用プライマーの一覧
Ｐ１４５：ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣ（配列番号１１４）
Ｐ１４６：ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＣＡＣ（配列番号１１５）
Ｐ１４８：ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ（配列番号１１６）
Ｐ１５１：ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  Ｃ（配列番号１１７）
Ｐ１５２：ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＡＧＣ（配列番号１１８）
Ｐ２０２：ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  Ｇ（配列番号１１９）
Ｐ２０３：ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＴＣＣ（配列番号１２０）
Ｐ２０４：ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  Ｃ（配列番号２０４）
【０１５５】
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＡ１７のＤＮＡ配列を配列番号２９に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＡ１７のタンパク質配列を配列番号３０に示す
【０１５６】
重鎖ＩｍＡｂ３ヒトＶＨ２−２６用プライマーの一覧
Ｐ１７３：ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＧＣ（配列番号１２２）
Ｐ１７５：ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  Ｇ（配列番号１２３）
Ｐ１７６：ＣＴＡ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＴＣ（配列番号１２４）
Ｐ１７７：ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＣＴＴ  Ｇ（配列番号１２５）
Ｐ１７８：ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＣ（配列番号１２６）
Ｐ１７９：ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  Ｃ（配列番号１２７）
Ｐ１８１：ＣＧＴ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１２８）
Ｐ１８２：ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＡＧ（配列番号１２９）
Ｐ２４６：ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＧＧＴ（配列番号１３０）
Ｐ２７６：ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  Ｇ（配列番号１３１）
【０１５７】
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ２_２６のＤＮＡ配列を配列番号３１に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ３−ｈｕｍＶＨ２_２６のタンパク質配列を配列番号３２に示す
【０１５８】
ＩｍＡｂ４抗体用
軽鎖ＩｍＡｂ４ヒトＡ５−１用プライマーの一覧
Ｐ１６０：ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＣＣ（配列番号１３２）
Ｐ１６２：ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＣＴＣ（配列番号１３３）
Ｐ１６４：ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  Ｃ（配列番号１３４）
Ｐ１６７：ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ（配列番号１３５）
Ｐ１９８：ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＣＴＧ  ＴＣ（配列番号１３６）
Ｐ１９９：ＴＣＴ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ（配列番号１３７）
Ｐ２００：ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＧＣ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ（配列番号１３８）
Ｐ２０１：ＣＣＡ  ＣＧＣ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ（配列番号１３９）
【０１５９】
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ５−１のＤＮＡ配列を配列番号３３に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＡ５−１のタンパク質配列を配列番号３４に示す
【０１６０】
重鎖ＩｍＡｂ４ヒトＶＨ１−３用プライマーの一覧
Ｐ１８３：ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  Ｇ（配列番号１４０）
Ｐ１８６：ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＧＧ（配列番号１４１）
Ｐ１８７：ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  ＧＡＡ（配列番号１４２）
Ｐ１８９：ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＡＴＣ（配列番号１４３）
Ｐ１９０：ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  Ｃ（配列番号１４４）
Ｐ１９１：ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＧ（配列番号１４５）
Ｐ１９２：ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＴＡＡ  ＧＣＴ  ＡＣ（配列番号１４６）
Ｐ１９３：ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＡＧＡ  ＡＣＣ（配列番号１４７）
Ｐ１９４：ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＧＣＧ  ＡＧＣ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＡＧ（配列番号１４８）
Ｐ１９５：ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＧ（配列番号１４９）
Ｐ１９６：ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  ＴＴ（配列番号１５０）
Ｐ１９７：ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＡＣＴ  Ｇ（配列番号１５１）
Ｐ２４４：ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＧＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＴＧ（配列番号１５２）
【０１６１】
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ１−３のＤＮＡ配列を配列番号３５に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ１−３のタンパク質配列を配列番号３６に示す
【０１６２】
軽鎖ＩｍＡｂ４ヒトＯ１用プライマーの一覧
Ｐ１５６：ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  Ｃ（配列番号１５３）
Ｐ１５７：ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＧＣ（配列番号１５４）
Ｐ１５８：ＣＣＴ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  Ｃ（配列番号１５５）
Ｐ１５９：ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＣＣ（配列番号１５６）
【０１６３】
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＯ１のＤＮＡ配列を配列番号３７に示す
ＬＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＯ１のタンパク質配列を配列番号３８に示す
【０１６４】
重鎖ＩｍＡｂ４ヒトＶＨ４−３１用プライマーの一覧
Ｐ１８３：ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  Ｇ（配列番号１５７）
Ｐ１８４：ＧＴＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＣ（配列番号１５８）
Ｐ１８５：ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧ（配列番号１５９）
【０１６５】
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−３１のＤＮＡ配列を配列番号３９に示す
ＨＣ−ＩｍＡｂ４−ｈｕｍＶＨ４−３１のタンパク質配列を配列番号４０に示す
【０１６６】
重鎖ＩｍＡｂ１用プライマー
Ｐ２２：ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  Ｃ（配列番号２６２）
Ｐ１８：ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＣＡＧ  Ａ（配列番号２６３）
【０１６７】
重鎖ＩｍＡｂ１のＤＮＡ配列、ＶＨ
ＨＣ  ＩｍＡｂ１  ＶＨのＤＮＡ配列を配列番号４２に示す。
重鎖ＩｍＡｂ１のタンパク質配列、ＶＨ
ＨＣ  ＩｍＡｂ１  ＶＨのタンパク質配列を配列番号４４に示す。
【０１６８】
シグナルペプチド：  １〜１９
可変鎖：            ２０〜１３３
ＣＤＲ１            ４５〜５４
ＣＤＲ２            ６９〜８４
ＣＤＲ３            １１７〜１２２
【０１６９】
軽鎖ＩｍＡｂ１用プライマー
Ｐ２５：ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  Ｃ（配列番号２６０）
Ｐ２８：ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  Ｃ（配列番号２６１）
【０１７０】
軽鎖ＩｍＡｂ１のＤＮＡ配列、ＶＬ
該軽鎖のＤＮＡ配列を配列番号４１に示す
軽鎖ＩｍＡｂ１のタンパク質配列、ＶＬ
該軽鎖のタンパク質配列を配列番号４３に示す
【０１７１】
シグナルペプチド：  １〜１７
可変カッパ鎖：      １８〜１２８
ＣＤＲ１            ４６〜５６
ＣＤＲ２            ７２〜７８
ＣＤＲ３            １１１〜１１９
【０１７２】
重鎖ＩｍＡｂ５用プライマー
Ｐ２１：ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＧＴ  Ｇ（配列番号２６６）
Ｐ２４：ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧ（配列番号２６７）
【０１７３】
重鎖ＩｍＡｂ５のＤＮＡ配列、ＶＨ
該重鎖のＤＮＡ配列を配列番号４６に示す。
重鎖ＩｍＡｂ５のタンパク質配列、ＶＨ
該重鎖のタンパク質配列を配列番号４８に示す。
【０１７４】
シグナルペプチド：  １〜１９
可変鎖：            ２０〜１４０
ＣＤＲ１            ４５〜５４
ＣＤＲ２            ６９〜８７
ＣＤＲ３            １２０〜１２９
【０１７５】
軽鎖ＩｍＡｂ５用プライマー
Ｐ２６：ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣ（配列番号２６４）
Ｐ２９：ＧＧＣ  ＣＴＡ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  Ｇ（配列番号２６５）
【０１７６】
軽鎖ＩｍＡｂ５のＤＮＡ配列、ＶＬ
該軽鎖のＤＮＡ配列を配列番号４５に示す。
軽鎖ＩｍＡｂ５のタンパク質配列、ＶＬ
該軽鎖のタンパク質配列を配列番号４７に示す。
【０１７７】
シグナルペプチド：  １〜２０
可変カッパ鎖：      ２１〜１３３
ＣＤＲ１            ４４〜６０
ＣＤＲ２            ７６〜８２
ＣＤＲ３            １１５〜１２２
【０１７８】
変異抗体のＤＮＡコンストラクトに対して完全に配列決定を行い、それらをＰｖｕＩ消化によって遊離させた。フェノール／クロロホルムで抽出しかつエタノール沈殿させたアガロースゲルからＤＮＡを精製した。ＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、アフィニティー精製により抗体を上清から精製した。
【０１７９】
Ｂ．抗体の特異性（他のファミリーメンバー；異種との交差反応についての試験）
ｉ．他のファミリーメンバーとの交差反応
本発明の抗−Ｅａｇ１抗体と、最も相同性の高いＥａｇファミリーメンバーＥａｇ２との交差反応を分析するため、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）結合分析を行った。ＢＩＡｃｏｒｅチップをＥａｇ１のＣ末端（アミノ酸６９４〜９６２）、Ｈ５領域（アミノ酸３７４〜４５２）またはＥａｇ２（単一のコンストラクト内での融合に相当する領域）でコーティングした。流速２０μｌ／分の１０μｇ／ｍｌの抗体を使用し、抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３との相互作用を分析した。図２に示す結果は、本発明の両方の抗−Ｅａｇ１抗体がＥａｇ１抗原に対して選択的であり、Ｅａｇ２と交差反応を示さないことを示す。さらに同結果は、ＩｍＡｂ１がＥａｇ１抗原のＣ末端に特異的に結合する一方、ＩｍＡｂ３がＥａｇ１のポアドメインを特異的に認識することを示す。
【０１８０】
ｉｉ．異種との交差反応
さらに、ラットの小脳および海馬の脳切片に関する免疫組織化学的試験によって本発明の抗−Ｅａｇ１抗体の交差反応を分析した。ＩＨＣにおいて、出生２１日後のスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット２匹に、ケタミンＨＣｌ（Ｋｅｔａｓｅｔ；１００ｍｇ／ｍｌ；フォートドッジ・ラボラトリーズ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国）とキシラジン（ロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）；２０ｍｇ／ｍｌ；マイル（Ｍｉｌｅ，Ｉｎｃ．）、米国）の混合物を０．１ｍｌ／１００ｇ体重で麻酔した。動物に対し、０．１２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中、４％のｐ−ホルムアルデヒドからなる固定液を経心腔的に潅流させた。灌流後、脳を摘出し、４℃でさらに１時間固定し、ＰＢＳで３回すすぎ、４℃で一晩保存した。ビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）（ライカ（Ｌｅｉｃａ）、Ｖｉｅｎｎａ、オーストリア）を使用し、冷ＰＢＳ中で冠状および矢状切片（４０〜５０μｍ）を切断した。切片を、ＰＢＳ中、１０％正常ヤギ血清とともに１時間、次いでＰＢＳ中、抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ１（４μｇ／ｍｌ）およびＩｍＡｂ４（２μｇ／ｍｌ）とともに４℃で一晩インキュベートし、アビジン／ビオチン−ペルオキシダーゼ系（ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）キット、ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）を使用して処理した。３’−３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ；ペルオキシダーゼ用ＤＡＢ基質キット、ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して抗体結合を画像化した。一次抗体を省略するかまたは一次抗体と対応する融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）との４℃で２４時間の予備インキュベーションを行い、次いで上記の手順に従うことによって制御を行った。ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）製Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡で切片を分析した。図３に示した結果は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体がヒトＥａｇ１を認識するだけでなく、ラットなどの他の哺乳類種と交差反応することを示す。
【０１８１】
実施例３：エピトープのマッピング
７６種の重なりペプチド（各々が１３ｍｅｒの長さ；２つシフトさせたアミノ酸；免疫原の組換えタンパク質と同じａａの範囲）を合成し、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製の５０のセルロース支持体（カスタム合成したＳＰＯＴ膜、ジェリニ・エージー（Ｊｅｒｉｎｉ  ＡＧ））と共有結合させた。
【０１８２】
ペプチド配列は、１．ＭＨＨＨＨＨＨＳＳＧＭＧＤ、２．ＨＨＨＨＨＳＳＧＭＧＤＹＥ、３．ＨＨＨＳＳＧＭＧＤＹＥＩＦ、４．ＨＳＳＧＭＧＤＹＥＩＦＤＥ、５．ＳＧＭＧＤＹＥＩＦＤＥＤＴ、６．ＭＧＤＹＥＩＦＤＥＤＴＫＴ、７．ＤＹＥＩＦＤＥＤＴＫＴＩＲ、８．ＥＩＦＤＥＤＴＫＴＩＲＮＮ、９．ＦＤＥＤＴＫＴＩＲＮＮＳＷ、１０．ＥＤＴＫＴＩＲＮＮＳＷＬＹ、１１．ＴＫＴＩＲＮＮＳＷＬＹＱＬ、１２．ＴＩＲＮＮＳＷＬＹＱＬＡＭ、１３．ＲＮＮＳＷＬＹＱＬＡＭＤＩ、１４．ＮＳＷＬＹＱＬＡＭＤＩＧＴ、１５．ＷＬＹＱＬＡＭＤＩＧＴＰＹ、１６．ＹＱＬＡＭＤＩＧＴＰＹＱＦ、１７．ＬＡＭＤＩＧＴＰＹＱＦＮＧ、１８．ＭＤＩＧＴＰＹＱＦＮＧＳＧ、１９．ＩＧＴＰＹＱＦＮＧＳＧＳＧ、２０．ＴＰＹＱＦＮＧＳＧＳＧＫＷ、２１．ＹＱＦＮＧＳＧＳＧＫＷＥＧ、２２．ＦＮＧＳＧＳＧＫＷＥＧＧＰ、２３．ＧＳＧＳＧＫＷＥＧＧＰＳＫ、２４．ＧＳＧＫＷＥＧＧＰＳＫＮＳ、２５．ＧＫＷＥＧＧＰＳＫＮＳＶＹ、２６．ＷＥＧＧＰＳＫＮＳＶＹＩＳ、２７．ＧＧＰＳＫＮＳＶＹＩＳＳＬ、２８．ＰＳＫＮＳＶＹＩＳＳＬＹＦ、２９．ＫＮＳＶＹＩＳＳＬＹＦＴＭ、３０．ＳＶＹＩＳＳＬＹＦＴＭＴＳ、３１．ＹＩＳＳＬＹＦＴＭＴＳＬＴ、３２．ＳＳＬＹＦＴＭＴＳＬＴＳＶ、３３．ＬＹＦＴＭＴＳＬＴＳＶＧＦ、３４．ＦＴＭＴＳＬＴＳＶＧＦＧＮ、３５．ＭＴＳＬＴＳＶＧＦＧＮＩＡ、３６．ＳＬＴＳＶＧＦＧＮＩＡＰＳ、３７．ＴＳＶＧＦＧＮＩＡＰＳＴＤ、３８．ＶＧＦＧＮＩＡＰＳＴＤＥＩ、３９．ＦＧＮＩＡＰＳＴＤＩＥＫＩ、４０．ＮＩＡＰＳＴＤＩＥＫＩＦＬ、４１．ＡＰＳＴＤＩＥＫＩＦＬＥＳ、４２．ＳＴＤＩＥＫＩＦＬＥＳＰＱ、４３．ＤＩＥＫＩＦＬＥＳＰＫＤＲ、４４．ＥＫＩＦＬＥＳＰＫＤＲＳＰ、４５．ＩＦＬＥＳＰＫＤＲＳＰＩＬ、４６．ＬＥＳＰＫＤＲＳＰＩＬＡＥ、４７．ＳＰＱＤＲＳＰＩＬＡＥＶＫ、４８．ＱＤＲＳＰＩＬＡＥＶＫＨＳ、４９．ＲＳＰＩＬＡＥＶＫＨＳＦＹ、５０．ＰＩＬＡＥＶＫＨＳＦＹＰＩ、５１．ＬＡＥＶＫＨＳＦＹＰＩＰＥ、５２．ＥＶＫＨＳＦＹＰＩＰＥＱＴ、５３．ＫＨＳＦＹＰＩＰＥＱＴＬＱ、５４．ＳＦＹＰＩＰＥＱＴＬＱＡＴ、５５．ＹＰＩＰＥＱＴＬＱＡＴＶＬ、５６．ＩＰＥＱＴＬＱＡＴＶＬＥＶ、５７．ＥＱＴＬＱＡＴＶＬＥＶＲＨ、５８．ＴＬＱＡＴＶＬＥＶＲＨＥＬ、５９．ＱＡＴＶＬＥＶＲＨＥＬＫＥ、６０．ＴＶＬＥＶＲＨＥＬＫＥＤＩ、６１．ＬＥＶＲＨＥＬＫＥＤＩＫＡ、６２．ＶＲＨＥＬＫＥＤＩＫＡＬＮ、６３．ＨＥＬＫＥＤＩＫＡＬＮＡＫ、６４．ＬＫＥＤＩＫＡＬＮＡＫＭＴ、６５．ＥＤＩＫＡＬＮＡＫＭＴＮＩ、６６．ＩＫＡＬＮＡＫＭＴＮＩＥＫ、６７．ＡＬＮＡＫＭＴＮＩＥＫＱＬ、６８．ＮＡＫＭＴＮＩＥＫＱＬＳＥ、６９．ＫＭＴＮＩＥＫＱＬＳＥＩＬ、７０．ＴＮＩＥＫＱＬＳＥＩＬＲＩ、７１．ＩＥＫＱＬＳＥＩＬＲＩＬＴ、７２．ＫＱＬＳＥＩＬＲＩＬＴＳＬ、７３．ＬＳＥＩＬＲＩＬＴＳＬＥＨ、７４．ＥＩＬＲＩＬＴＳＬＥＨＨＨ、７５．ＬＲＩＬＴＳＬＥＨＨＨＨＨ、７６．ＲＩＬＴＳＬＥＨＨＨＨＨＨであった。
【０１８３】
上記ペプチドの各々を配列番号１８４〜２５９で列挙する配列において示す。
【０１８４】
膜をエタノールですすぎ、ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳ中、３％ＢＳＡで、振とう下、室温で一晩ブロッキングした。次いで、膜を等容量のＴ−ＴＢＳで１０分、１回洗浄し、所望の一次抗−Ｅａｇ１抗体とともに振とう下で３時間インキュベートした。ＩｍＡｂ１〜５を（ＰＢＳ中、１ｍｇ／ｍｌのストック溶液から）１：２０００に希釈した。次いで、一次抗体を廃棄し、膜をＴＢＳＴで１０分、３回洗浄した。
【０１８５】
次いで、膜を適切な容量のＨＲＰと抱合した二次抗体溶液とともに振とう下で２時間インキュベートした。抗−マウスＨＲＰ抗体を、ブロッキング用緩衝液で１：５０００に希釈し、等容量のＴ−ＴＢＳで１０分、３回洗浄し、検出試薬のＥＣＬ溶液とともに軽い振とう下で１分間インキュベートし、発現させた。
【０１８６】
膜上に出現した多数の暗スポットは、各スポットが７６種のうちの１種のペプチドに相当する場合の陽性シグナルを示した。
・スポット３〜８で結合されたＩｍＡｂ４
・同等な挙動を示し、スポット２１〜２４（強いシグナル）およびスポット３〜７（弱いシグナル）に結合されたＩｍＡｂ３およびＩｍＡｂ２
・スポット２１〜２４に結合されたＩｍＡｂ５（図４）
【０１８７】
これらの各ペプチドをＥａｇ１のポアドメイン領域内に局在化させる。
・ペプチド２１〜２４（ポアドメイン；図４）に弱く結合されたＩｍＡｂ１。しかし、ＩｍＡｂ１がＥａｇ１のＣＡＤドメイン部分を含有する融合タンパク質に対して産生されたことから、この抗体は主にＣＡＤドメイン領域を認識するはずである。それに対応するエピトープの不連続な（３−Ｄ）性質に起因し、これが観察されなかったということは大いにありうる。
【０１８８】
表１にあらゆる結果についてまとめる。それらに対応する抗体がＥＡＧ１の一部分のみを含有する同融合タンパク質を使用して産生されたことから、ＩｍＡｂ２、３および５の間でエピトープに類似性があることは意外なことではなかった。ＩｍＡｂ１で得られる結果のみが意外であり、これは上で考察した如く、おそらくはエピトープの三次元の性質に起因するものであった。
【０１８９】
実施例４：本発明の抗−ＥＡＧ１抗体の内在化に関する測定
本発明の抗−Ｅａｇ１抗体の内在化特性を分析するため、ＣＨＯ細胞をカバースリップ上で成長させ、標準培地（ハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２、１０％ＦＣＳ）で、Ｃｙ３（１００μｇ）で直接標識した抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ４とともに一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、培養物を約２μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２とともに１０分間インキュベートした。洗浄後、標準の蛍光顕微鏡（ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）  Ａｘｉｏｐｈｏｔ）における６３倍水浸対物を使用して細胞をインビボで観察した。図５に示した結果は、本発明の両方の抗−Ｅａｇ１抗体が抗原を発現する生体細胞上のＥａｇ１抗原に結合しかつ２４時間以内に細胞内に内在化されることを示す。細胞外コアドメインを認識するＩｍＡｂ４ならびにＥａｇ１抗原のＣ末端で細胞内エピトープに結合するＩｍＡｂ１がいずれもＥａｇ１発現細胞内に内在化されることが示される。
【０１９０】
実施例５：本発明の抗−ＥＡＧ１抗体の遮断特性に関する測定
本発明の抗−Ｅａｇ１抗体の機能特性を分析するため、２電極の電圧クランプ実験による分析を行った。したがって、ストゥマー  Ｗ．（Ｓｔｕｅｈｍｅｒ  Ｗ．）、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０７に記載の如く、卵母細胞の調製および電気生理学的記録を行った。卵母細胞にＥａｇ１をコードする合成ｍＲＮＡを注射し、４８時間インキュベートし、安定なトレースが記録されるまでＮＦＲ（１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．８  ＣａＣｌ２、２．５  ＫＣｌ、１０  ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）  ｐＨ７．２）にて記録した。次いで、ＩｍＡｂ１またはＩｍＡｂ３を産生する１０％の対応するハイブリドーマ上清をチャンバに添加し、電流振幅をさらに監視した。図６（左）に示した結果は、マウスモノクローナル抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３のハイブリドーマ上清がＥａｇ１を発現する卵母細胞内でＥａｇ１電流に対する遮断能を有することを示す。ＩｍＡｂ１のハイブリドーマ上清を使用してもＥａｇ１電流の阻害が全く検出されなかった。
【０１９１】
さらに、４０ｍＭのＫＣｌの存在下で１００μｇのＩｍＡｂ３とともに３時間インキュベートした、Ｅａｇ１を安定的に発現するＣＨＯ細胞を使用して２電極の電圧クランプ実験を行った。次いで、細胞を記録し、ＥＰＣ９増幅器の自動能力補正を使用し、細胞表面における全電流振幅を正規化した。図６（右）に示した結果は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体がＥａｇ１を過剰発現するＣＨＯ細胞内でＥａｇ１電流を阻害することを示す。
【０１９２】
実施例６：本発明の抗−ＥＡＧ１抗体によるＩＰＣ−２９８細胞増殖の阻害
本発明の抗体における癌細胞の増殖に対する阻害能を測定するため、インビトロで実験を行った。１０００  ＩＰＣ−２９８細胞を、９６−ウェルプレート上の６０μｌ／ウェルの１０％ＦＣＳを含有する培地（ＤＭＥＭ４５００ｍｇ／ｍｌグルコース）に一晩播種した。細胞を、４０ｍＭのＫＣｌを有するＦＣＳを含有する培地で、５％ＣＯ２中、３７℃で１時間希釈した、５μｇ／ｍｌの抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３とともに４通りに予備インキュベートした。４０ｍＭのＫＣｌによる細胞の処理によってイオンチャネルＥａｇ１の開いた高次構造が保証され、その場合、モノクローナル抗−ＥＡＧ１抗体のその対応するエピトープへの結合が加速される可能性がある。１時間のインキュベーション後、上清を取り除き、５μｇ／ｍｌの抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３を有する１００μｌ／ウェルのＦＣＳを含有する培地と交換した。次いで、細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で７日間インキュベートした。増殖および細胞生存度を評価するため、１０μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（バイオソース（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ））を添加し、暗所、３７℃でインキュベートした。３０分ごとに５９０ｎｍでの分光蛍光光度計を使用して吸光度を測定した。図７に示した結果は、本発明の抗体がヒト癌細胞の成長を阻害することを示す。
【０１９３】
実施例７：二次免疫毒素で標識した本発明の抗−ＥＡＧ１抗体によるＩＰＣ−２９８細胞増殖の阻害
抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体の一次免疫毒素としての抱合に対する特異的な適応性および有効性を評価するため、サポリンに抱合した二次抗体、宿根草（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の植物種由来のリボソーム不活化タンパク質と併用し、抗−Ｅａｇ１抗体の存在下でインビトロでの細胞増殖アッセイを行った。二次免疫毒素は抗−Ｅａｇ１抗体に結合し、一次抗体とともに細胞内に内在化される。一旦免疫毒素が内在化されると、サポリンは、ターゲティング物質から遊離し、リボソームを不活化し、これによりタンパク質の阻害および最終的には細胞死が引き起こされる。
【０１９４】
アッセイ（図８ａ）において、３０００  ＩＰＣ−２９８細胞を、９６−ウェルプレート上の６０μｌ／ウェルのＦＣＳを含有する培地に一晩播種した。１００ｎｇ／ウェル（１ｎｇ／μｌ）のＭａｂ−ＺＡＰを、４０μｌのＦＣＳを含有する培地内の１０ｎｇ／μｌのマウスモノクローナル抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ１またはＩｍＡｂ４と３７℃で１時間混合し、次いで４通りに細胞に直接添加した。対照としてＭａｂ−ＺＡＰをマウスモノクローナル対照抗体とともに添加するか、あるいはＩｇＧ−ＳＡＰを単独使用するかまたはＩｍＡｂ１と併用した。次いで、５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間にわたり細胞を成長させておいた。増殖および細胞生存度を評価するため、テトラゾリウム塩ＭＴＳおよび電子共役用試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を含有する２０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を添加し、色の生成のために３７℃でインキュベートし、１〜４時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、４９０ｎｍの吸光量によってホルマザン生成物の量を測定した。
【０１９５】
図８ｂに示すアッセイにおいて、３０００  ＩＰＣ−２９８細胞を、９６−ウェルプレート上の６０μｌ／ウェルのＦＣＳを含有する培地に一晩播種した。アフィニティー精製したヤギ抗−マウスＩｇＧとサポリンの化学抱合体である１００ｎｇ／ウェル（１ｎｇ／μｌ）のＭａｂ−ＺＡＰ（アドバンスド・ターゲティング・システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ））を、４０μｌのＦＣＳを含有する培地内の異なる濃度のマウスモノクローナル抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４（１０ｎｇ／μｌ、５ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、０．５ｎｇ／μｌ、０．１ｎｇ／μｌ）とともに３７℃で１時間予備インキュベートし、次いで４通りに細胞に直接添加した。対照としてサポリンに抱合した免疫前ヤギＩｇＧ抗体（ＩｇＧ−ＳＡＰ、アドバンスド・ターゲティング・システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を単独使用するかまたはＩｍＡｂ４と併用した。次いで、５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間にわたり細胞を成長させておいた。増殖および細胞生存度を評価するため、１０μｌ／ウェルのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（バイオソース（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ））を添加し、暗所、３７℃でインキュベートした。３０分ごとに５９０ｎｍでの分光蛍光光度計を使用して吸光度を測定した。
【０１９６】
図８ａおよびｂに示した結果は、本発明の抗体が細胞内に内在化され、二次免疫毒素で標識した（「ピギーバックした（ｐｉｇｇｙｂａｃｋｅｄ）」）本発明の抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体がヒト癌細胞の成長を阻害することを示す。細胞成長阻害の効力は、一次抗体と二次免疫毒素の関係に左右される。つまり、この結果はアームが付着した（ａｒｍｅｄ）本発明の抗−Ｅａｇ１抗体がヒト癌細胞の成長を阻害するツールを提供することを示す。
【０１９７】
実施例８：二次免疫毒素で標識した本発明の抗−ＥＡＧ１抗体による癌細胞の足場非依存性成長の阻害
免疫毒素で標識した本発明の抗体における足場非依存性細胞成長に対する阻害能について検討するため、軟寒天アッセイを行った。アフィニティー精製したヤギ抗−マウスＩｇＧとサポリンの化学抱合体である１００ｐｇのＭａｂ−ＺＡＰ（アドバンスド・ターゲティング・システム（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ））を、２０ｍＭのＫＣｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））内の２．５ｎｇ抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４とともに４℃で３０分間予備インキュベートした。比較のためにＭａｂ−ＺＡＰを２．５ｎｇの対照ＩｇＧとともに予備インキュベートした。３０分の予備インキュベーション後、２０ｍＭのＫＣｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ内の２０００  ＩＰＣ−２９８細胞を添加し、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。免疫毒素で標識した抗−ＥＡＧ１抗体とともに予備インキュベートしたＩＰＣ−２９８細胞を、０．５％ＦＣＳを有するＯｐｔｉＭＥＭを含有する５０μｌ／ウェルの０．２５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天に再懸濁し、０．５％ＦＣＳを有するＯｐｔｉＭＥＭを含有する５０μｌ／ウェルの０．５％アガロース下層上に４通りに蒔いた。さらに、０．５％ＦＣＳを有するＯｐｔｉＭＥＭを含有する５０μｌ／ウェルの０．２５％供給寒天（ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｇａｒ）を蒔いた。１０日間でコロニーの形成を可能にし、それらを５０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）で１．５時間染色した。エプソン（Ｅｐｓｏｎ）製スキャナーを使用してウェルを走査し、シオン（Ｓｃｉｏｎ）製画像ソフトウェアを使用してコロニーを計数した。図９に示した結果は、二次免疫毒素で標識した（「ピギーバックした」）抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４が足場非依存性腫瘍細胞の成長を阻害することを示す。
【０１９８】
実施例９：診断用物質としての本発明の抗−ＥＡＧ１抗体の使用
免疫蛍光による試料中でのＥａｇ１抗原の検出
ヒト腫瘍細胞内でのＥａｇ１抗原の検出において、免疫蛍光染色プロトコルを確立した。ガラスチャンバスライド（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））を、１０％ＦＣＳを含有する３００μｌの培地で３７℃で３０分間予備コーティングした。４００００  ＭＣＦ７乳癌細胞／ウェルおよび４００００  ＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞／ウェルを予備コーティングしたガラスチャンバスライド上に播種し、５％  ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養した。チャンバを取り出した後、スライドをＰＢＳで洗浄し、細胞を（１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．５に調節したＰＢＳ中）４％パラホルムアルデヒドで２５℃で１０分間固定した。スライドを風乾し、ＰＢＳで３分間再水和した（３回）。細胞を、ＰＢＳ中、０．５％トリトン−Ｘ１００によって２５℃で１０分間透過させ、スライドをＰＢＳで３分間洗浄し（３回）、各ウェルを１００μｌのブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ中、５％ＦＣＳ、２．５％ＢＳＡ）で２５℃で１時間ブロッキングした。４０μｌのブロッキング用緩衝液／ウェルで希釈した２μｇ／ｍｌの抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ４を２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌのアレクサ（Ａｌｅｘａ）の５４６ヤギ抗−マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；希釈緩衝液で１：２００に希釈）を検出抗体として２５℃で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し（３回）、５０μｌのＤＡＰＩ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）；ＰＢＳで１：１０００に希釈）を各ウェルに添加し、２５℃で５分間インキュベートした。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（サザン・バイオテクノロジー・アソシエイツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で処理したＨ２Ｏでスライドを洗浄し、暗所、４℃で保存した。蛍光顕微鏡を５７３ｎｍで使用し、抗−ＥＡＧ１抗原のＩｍＡｂ４による染色について分析した。
【０１９９】
図１０ａにおける免疫蛍光は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４がヒト癌細胞内の内因性Ｅａｇ１抗原に結合することを示す。結果は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体が優先的に（有糸分裂のある特定のステージで）分裂するヒト癌細胞に結合することを示し、抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４が増殖するヒト癌細胞内の抗−Ｅａｇ１抗原を検出するための診断ツールを提供することを示している。
【０２００】
実施例１０：本発明の抗−ＥＡＧ１抗体の診断物質としての使用
Ａ．ＥＬＩＳＡによる試料中のＥａｇ１抗原の検出
試料中のＥａｇ１抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発した。アッセイでは、９６−ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートのウェルにＥａｇ１抗原に特異的な２つのマウスモノクローナル抗体の混合物を数時間吸着させた。固定化抗体は、試験試料中に存在しうるＥａｇ１抗原のいずれかに対する捕捉抗体としての働きをした。ウェルをすすぎ、アルブミンなどのブロッキング剤で処理することで分析物の非特異的吸収を防止した。
【０２０１】
続いてウェルを、Ｅａｇ１抗原を含有すると見られるヒト腫瘍細胞の溶解物またはヒトＥａｇ１抗原を安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の溶解物または非トランスフェクトＣＨＯ  Ｋ１細胞の溶解物で処理した。試料を洗い流した後、ウェルを第２のウサギポリクローナル抗−Ｅａｇ１抗体とともにインキュベートした。過剰な二次抗体を洗い流した後、検出抗体としての働きをする西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に抱合したヤギ抗−ウサギ抗体とともにウェルをインキュベートした。すすいだ後、ウェルを適切な色原性基質で処理し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して色の生成について測定した。結果は、このＥＬＩＳＡアッセイが試験試料中でのＥａｇ１抗原の検出に対して高度に特異的でかつ極めて感度の高いアッセイを提供することを示す。
【０２０２】
Ｅａｇ１の検出用試料（細胞溶解物）を以下のように調製した。細胞（ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  Ｅａｇ１クローン１、ＩＰＣ−２９８メラノーマおよびＰＣ３前立腺癌細胞）を培養皿（１０ｃｍ、Ｎｕｎｃ）に播種した。１０％ＦＣＳまたは７％ＦＣＳ（ＰＣ３細胞）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を補充したそれらに対応する培地（ＣＨＯ細胞用のＤＭＥＭ  Ｆ１２培地、ＩＰＣ−２９８細胞用のＤＭＥＭ  ４５００ｍｇ／ｍｌのグルコース、ＰＣ３細胞用のハムＦ１２培地）を使用し、細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養した。培地を取り出し、７５０μｌの溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）  ｐＨ７．５）、１０％グリセリン、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１％トリトン−Ｘ１００、２０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＦ）で細胞を溶解した。遠心分離（４℃、１３０００ｒｐｍ、１０分）によって溶解物を除去した。製造業者の使用説明書に従って使用タンパク質測定キット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用してタンパク質濃度を測定した。
【０２０３】
ヒト腫瘍細胞溶解物中でのＥａｇ１の検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡを以下のように行った。ＰＢＳ中の濃度が１μｇ／ｍｌずつの、１００μｌの捕捉抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ４をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ））上にコーティングした。４℃で一晩インキュベーション後、プレートを緩やかに撹拌しながら１５０μｌのブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で、４℃で４〜６時間処理した。ＰＢＳ（洗浄用緩衝液）中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を使用してプレートを洗浄した（３回）。プレートを、細胞溶解物（１００μｇのタンパク質濃度）とともに４℃で一晩インキュベートし、洗浄用緩衝液で洗浄し（３回）、次いで希釈緩衝液（０．５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ中５ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１：１０００に希釈したウサギポリクローナル抗−ＥＡＧ１検出抗体（ｉＯｎＧｅｎ）１００μｌ／ウェルとともに２５℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ＨＲＰに抱合したヤギ−抗ウサギＩｇＧ（希釈緩衝液中０．２μｇ／ｍｌ）１００μｌとともに２５℃で３０分間インキュベートし、上記の如く洗浄し、次いで適切な色原性基質で処理し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して色の生成について測定した（図１０ｂ）。
【０２０４】
Ｂ．ＩＨＣにおけるＥＡＧ抗原の検出
本発明のＥＡＧ１抗体におけるパラフィン包埋組織内でのＥＡＧ１タンパク質に対する染色能を検討するため、免疫組織化学により組織レジスタ（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）のクリニクム・カッセル（Ｋｌｉｎｉｋｕｍ  Ｋａｓｓｅｌ）から入手した組織を分析した。固定組織の使用は、クリニクム・カッセル（Ｋｌｉｎｉｋｕｍ  Ｋａｓｓｅｌ）での審議会によって承認された。組織を４％中性緩衝化ホルマリン中で１６〜２０時間固定し、次いでパラフィン包埋した。ミクロトームで選択した組織ブロックを２〜４μｍの薄片に切断し、シラン処理したスライドガラス（シグマ（Ｓｉｇｍａ））上に載せ、６０℃で３０分間および３８℃で一晩乾燥させた。
【０２０５】
キシレン槽内で５分間を２回、アセトン中で５分間を２回、最後に蒸留水中で５分間インキュベートすることにより、切片を脱パラフィン化した。ｐＨ６．０、１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液中の切片に対し、電子レンジ２５０Ｗで３０分間、加熱前処理した後、蒸留水で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール中０．３％Ｈ２Ｏ２の新たに調製した溶液中でのインキュベーションによって室温で２０分間ブロッキングしてから、蒸留水で５分間洗浄した。ヘマトキシリンによる対比染色およびマウンティングとは別に、製造業者のＥｎＶｉｓｉｏｎ＋−染色手順（ダコ・サイトメーション（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＣｈｅｍＭａｔｅウサギ／マウス）についての手続きを進めるＴｅｃａｎ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ  ２００（ソフトウェア：Ｇｅｍｉｎｉ  ３．４０）を使用し、以下のステップを一晩実施した。スライドをＰＢＳ／０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４で２回、７分間すすぎ、抗体ｅａｇ−１（Ｕ３による提供）とともに４時間インキュベートした（抗体希釈剤（ダコ（ＤＡＫＯ））で１：２００に希釈）。１スライド当たり１００μｌのＰＢＳ／０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４の状態で反応を停止した。１４００μｌのＰＢＳ／０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４中で７分間洗浄後、スライドを二次抗体／ペルオキシダーゼ抱合体とともにインキュベートした（３０分、１５０μｌ／スライド、ダコ（ＤＡＫＯ）製ＨＲＰ／ウサギ−マウスＣｈｅｍＭａｔｅ）。上記の如く洗浄後、１２０μｌ／スライドのＤＡＢ溶液（ダコ（ＤＡＫＯ）；基質緩衝液で１：５０に希釈）で１０分間、染色反応を行った。１００μｌのＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４の状態で反応を２０分間停止してから、１４００μｌのＰＢＳ／０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４で７分間洗浄し、次いでスライドをＰＢＳ／０．０５％  ＴＷＥＥＮ  ｐＨ７．４で２時間ごとに全部で３回洗浄した。最後に、スライドを水ですすぎ、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）のヘマトキシリンで対比染色し、スライドガラスでカバーした。ＩｇＧ２ｂ分子の非特異的結合を除外するため、対照切片を、ｅａｇ−１抗体の代わりにＩｇＧ２ｂ陰性対照（ダコ（ＤＡＫＯ））とともにインキュベートした。
【０２０６】
Ｃ．患者における癌のステージング
本発明の使用を通して項目Ａ．およびＢ．の下で示されかつ考察された結果に基づき、被験者においてＥＡＧ１抗原の発現レベルに基づいて癌をステージングすることが可能である。所定のタイプの癌において、疾患の進行における様々なステージおよび／または癌の治療上の処置における様々な時点にあるものと診断された被験者から血液または生検の試料を採取した。存在する抗原の量を特異的に測定する方法を用い、試料中に存在するＥＡＧ１抗原のレベルを測定した。かかる方法には、項目Ａ．およびＢ．の下で記載された方法などのＥＬＩＳＡまたはＩＨＣ法が含まれる。進行または治療の各ステージにおいて統計的に有意な結果をもたらす試料集団を使用し、各ステージの特徴を示していると考えうるＥＡＧ１抗原の発現レベルの範囲を指定した。試験中の被験者における癌の進行をステージングするかまたは被験者の治療経過に対する応答を特徴づけるため、被験者から血液または生検の試料を採取し、試料中に存在するＥＡＧ１抗原のレベルを測定した。そのようにして得た抗原の発現レベルを用いて値が減少する濃度範囲を同定した。そのようにして同定した範囲は診断した患者の様々な集団内で同定した進行のステージまたは治療のステージと相関し、それにより試験中の被験者におけるステージが得られる。
【０２０７】
実施例１１：腫瘍治療のための本発明のＥＡＧ１抗体および抗体抱合体の使用
Ａ．本発明のＥＡＧ１抗体を用いたヒトの治療
本発明の抗−ＥＡＧ１抗体を用いたヒト患者の標的腫瘍治療において、特定の時間かけてかかるヒト患者に本発明の有効量のＥＡＧ１抗体を注射する。治療の間の数周期間、ヒト患者を監視し、それらの腫瘍が進行するか否か、特に腫瘍の成長および転移について測定する。
【０２０８】
本発明のＥＡＧ１抗体で治療した腫瘍患者における腫瘍の成長および転移のレベルは、対照抗体で治療された腫瘍患者における腫瘍の成長および腫瘍の転移のレベルよりも低い。使用されうる対照抗体は、試験される抗−ＥＡＧ１抗体と同じアイソタイプの抗体を含み、さらにＥａｇ１腫瘍抗原に対する結合能を有しない場合がある。
【０２０９】
Ｂ．本発明のＥＡＧ１抗体抱合体を用いた治療
本発明のＥＡＧ１抗体抱合体を用いた標的腫瘍治療において、特定の時間かけて腫瘍を呈するヒト患者または動物に本発明の有効量のＥＡＧ１抗体抱合体を注射する。例えば、投与したＥＡＧ１抗体抱合体は、メイタンシン−ＥＡＧ１抗体抱合体（もしくはＭＭＥＡ−ＥＡＧ１抗体抱合体）または放射性同位体−ＥＡＧ１抗体抱合体である。治療の間の数周期間、ヒト患者または動物を監視し、それらの腫瘍が進行するか否か、特に腫瘍の成長および転移について測定する。
【０２１０】
腫瘍を呈しかつメイタンシン−ＥＡＧ１抗体もしくは放射性同位体−ＥＡＧ１抗体の抱合体を用いた治療を受診するヒト患者または動物における腫瘍の成長および転移のレベルは、腫瘍を呈しかつ対照メイタンシン−抗体もしくは対照放射性同位体−抗体などの対照抗体抱合体を用いた治療を受診する対照患者または動物と比較した場合により低い。使用されうる対照メイタンシン−抗体は、本発明のＥＡＧ１抗体と同じアイソタイプの抗体に連結したメイタンシンを含有する抱合体を含むが、より詳細にはＥＡＧ１腫瘍抗原に対する結合能を有しない。使用されうる対照放射性同位体−抗体は、本発明のＥＡＧ１抗体と同じアイソタイプの抗体に連結した放射性同位体を含有する抱合体を含むが、より詳細にはＥＡＧ１腫瘍抗原に対する結合能を有しない。
【０２１１】
実施例１２：組換えヒト化抗−ＥＡＧ１抗体ＨＵ−ＩｍＡｂ３の産生
ｈｕ−ＩｍＡｂ３の産生および精製において、ヒト化抗−ＥＡＧ１抗体ｈｕ−ＩｍＡｂ３を発現するＣＨＯＫ１モノクローナル細胞株を産生している。したがって、３０００００  ＣＨＯＫ１細胞／ウェルを、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地内の６−ウェル培養皿に２４時間播種した。トランスフェクションにおいて、１μｇの各ベクターＫＫ５６ｈｕｍｐＴｒａｃｅｒ（ｈｕ−ＩｍＡｂ３軽鎖）および１μｇのＬＫ５６ｈｕｍｐｃＤＮＡ３（ｈｕ−ＩｍＡｂ３重鎖）を、全体容量５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号３１９８５−０４７）で１０μｌのリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１１６６８−０１９）とともに室温で２０分間インキュベートした。
【０２１２】
ＣＨＯＫ１細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭで２回洗浄し、１．５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを各ウェルに添加した。トランスフェクション混合物を各ウェルに慎重に添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、トランスフェクション培地を除去し、１０％ＦＣＳを含有する２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を細胞に添加した。５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間インキュベーションした後、トランスフェクトした細胞を１５ｃｍのプレート上に３つの異なる希釈係数で蒔き、Ｚｅｏｚｉｎ（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて選択した。２日ごとに（抗生物質を含有する）培地を変更した。単一の１２−ウェルプレート上の２０μｌの細胞をピペットで採取することによって単一のクローンを採取した。
【０２１３】
モノクローナル細胞株を培養し、さらに細胞が２つの６−ウェル上に蒔かれうるまで選択した。各々の場合、さらなる培養のために一方のウェルを使用する一方、ｈｕ−ＩｍＡｂ３の発現を試験するためにもう一方を使用した。
【０２１４】
したがって、２．５×１０６細胞を１０ｃｍのディッシュ上に蒔いた。２４時間後、培地を除去し、５％の低ＩｇＧを含有する５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加し、各モノクローナル細胞株を５％ＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートした。２ｍｌの上清を除去し、遠心し、４０μｌのタンパク質Ａ／Ｇ−セファローズとともに免疫沈降する（１：１）のに使用した。免疫沈降物を洗浄し、１０％ＳＤＳページで分析した。二次抗−ヒトペルオキシダーゼと抱合した抗体検出系を使用してｈｕ−ＩｍＡｂ３の発現を検出した（図１１）。
【０２１５】
ｈｕ−ＩｍＡｂ３の産生において、ＩＮＴＥＧＲＡ  ＣＥＬＬｉｎｅ  １０００系を使用してモノクローナル細胞株ＣＨＯｈｕ−ＩｍＡｂ３クローン５を培養した。
【０２１６】
したがって、４×１０７個の細胞を、最終容量１５ｍｌにおいて１０％の低ＩｇＧ  ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２で１２ｍｌのＣｙｔｏｄｅｘマイクロキャリアビーズとともにインキュベートした。２５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２をＣＥＬＬｉｎｅ  １０００の栄養−区画（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に添加し、膜を湿らせた。ＣＨＯｈｕ−ＩｍＡｂ３  ｃｌ．５の細胞を細胞の区画にピペットし、約１０分ごとに軽い振とう下で９０分間インキュベートすることで細胞のビーズへの付着を可能にした。１０％ＦＣＳを補充した５００ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２を栄養−区画に充填した。７日後、細胞を取り出し、栄養−区画内の培地を変更した。遠心分離後、細胞およびビーズを再懸濁し、細胞−区画に再び移した。ｈｕ−ＩｍＡｂ３を含有する遠心した上清を新規チューブに移し、−２０℃の状態を保った。４日ごとに細胞上清を収集した。
【０２１７】
ｈｕ−ＩｍＡｂ３抗体の精製において、細胞上清を遠心し、無菌濾過した。Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ系（プロテインＡ−セファローズ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦ；結合緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ８．８；溶出緩衝液：０．１Ｍ  グリシン；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．３）を使用して抗体を精製した。
【０２１８】
抗体を透析し（ＰＢＳ）、無菌濾過し、エンドトキシン試験を行い、かつＢＣＡの試験によって濃度を測定した。
【０２１９】
実施例１３：コロニー形成アッセイ（軟寒天アッセイ）
本発明の抗−ＥＡＧ１抗体における足場非依存性細胞成長に対する阻害能を検討するため、軟寒天アッセイを行った。軟寒天コロニー形成アッセイは、形質転換細胞のみが軟寒天で成長可能である際にかかる形質転換細胞について試験するための標準インビトロアッセイである。
【０２２０】
（細胞株に依存する）０．１％〜０．５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で、（細胞株に依存する）７５０〜１０００個の細胞を１５μｇ／ｍｌの指定の抗体とともに７５分間予備インキュベートした。次いで、（細胞株に依存する）０．１％〜０．５％ＦＣＳを含有する０．２５％〜０．３％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天で細胞を再懸濁した。細胞懸濁液を、９６−ウェルプレート内、２０％ＦＣＳを含有する０．５％〜０．６％アガロース下層上に３通りに蒔いた。７〜１２日間でのコロニーの形成を可能にし、次いで５０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）で８〜１２時間染色した。図１２ａ〜ｉは、本発明の抗−ＥＡＧ１抗体を用いて実施したこれらの実験結果を示す。これらの結果は、本発明のマウスＩｍＡｂ３が、ＮＣＩ−ＡＤＲ乳癌細胞（図１２ａ）、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞（図１２ｂ、ｃ）、ＨＴ１４４メラノーマ細胞（図１２ｄ）、ＢＸ−ＰＣ３膵臓癌細胞（図１２ｅ）、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞（図１２ｆ）およびＳＫＭｅｓ１肺扁平上皮癌細胞（図１２ｇ）の足場非依存性細胞成長を阻害することを示す。さらに、図１２ｂは、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ５もＳＫＯＶ３卵巣癌細胞のコロニー形成を低下させることを示す。ソフトウェアＳＡＷ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０を含むＳｃａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＴＳカメラシステム（レムナテック（ＬｅｍｎａＴｅｃ）、Ｗｕｅｒｓｅｌｅｎ）を使用してコロニーの数と大きさを分析した。
【０２２１】
実施例１４：本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３細胞増殖の阻害
本発明の抗−ＥＡＧ−抗体の癌細胞増殖に対する阻害能を測定するため、インビトロでの実験を行った。１０００  ＳＫＯＶ３細胞を、１０％ＦＣＳを補充した１００μｌ／ウェルの培地（ＤＭＥＭ  ４５００ｍｇ／ｍｌ  グルコース）、９６−ウェルプレート上に播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＣＳを含有する６０μｌ／ウェルの培地で２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、４０μｌ／ウェルに希釈した１５μｇ／ｍｌの抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体ＩｍＡｂ３またはそれに対応する対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）で４通りに処理した。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした。増殖および細胞生存度を評価するため、テトラゾリウム塩ＭＴＳおよび電子共役用試薬フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を含有する２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加し、３７℃で１０分から３時間以内の範囲の様々な時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用し、５９０ｎｍの吸光量によってホルマザン生成物の量を測定した。図１３に示した結果は、本発明の抗体がヒト癌細胞の増殖および／または生存度を阻害することを示す。
【０２２２】
実施例１５：抗−ＥＡＧ抗体ＩｍＡｂ３は雌ＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳癌の成長を阻害する
本発明の抗−ＥＡＧ１抗体がＳＣＩＤマウスにおけるヒト乳癌細胞の腫瘍成長を阻害するか否かを判定するため、１０７個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を雌ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。動物の背部で腫瘍が成長した。腫瘍が測定可能である場合すなわち移植の約７日後に治療を開始した。１回目の治療に先立ち、治療群にわたる腫瘍体積（平均、中央値および標準偏差）の測定を開始する場合の均一性を確保するため、マウスを無作為化して統計試験を行った。無作為化後、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を最初に移植した、１群当たり１２匹中１０匹のマウスを実際の試験に使用した。１つの群はモノクローナルマウスの抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３の投与を受け、第２の群は対照として賦形剤ＰＢＳの投与を受けた。無作為化した日に治療を開始し、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３の負荷用量として５８ｍｇ／ｋｇ、次いで週１回、２０ｍｇ／ｋｇを腹膜腔内注射した。対照群は、同じ治療スケジュールで賦形剤ＰＢＳの投与を受けた。動物を９６日間（１３週間）治療した。
【０２２３】
試験期間中、週２回、腫瘍の測定値および動物の体重を得た。個々の腫瘍体積の和を群内のマウス数で除することにより、群の平均腫瘍体積を算出した。図１４にまとめたデータは、抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３の投与によって免疫不全マウスにおけるヒト乳癌成長の低下がもたらされたことを示す。
【０２２４】
実施例１６：第２の治療用モノクローナル抗体または抗腫瘍剤と併用したヒト抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３による足場非依存性細胞成長の阻害
高増殖性疾患の抗体または他の抗腫瘍剤を用いた単独治療は、一方では薬剤への耐性の発現、もう一方では細胞における抗体との非反応をもたらすと思われる抗原性における変化などの問題によって阻止される可能性が高い。これらの問題は、本発明の抗−ＥＡＧ１抗体と、受容体チロシンキナーゼに特異的な抗体などの別の治療抗体、または他の抗腫瘍剤との併用によって回避可能であると思われる。該併用治療は２種類の抗癌剤と結合し、それぞれが異なる作用機構を介して作動することで高増殖性疾患を予防または治療するための細胞毒性応答をもたらすことから、それもまた有利である。
【０２２５】
驚くべきことに、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３と抗−ＥＧＦＲ抗体エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（セツキシマブ；メルク（Ｍｅｒｃｋ））との併用治療により、ヒト癌細胞における足場非依存性成長の低下が新規のモノクローナル抗体またはＥＧＦＲ抗体の単独使用と比べて大きくなる結果になることが判明した。
【０２２６】
卵巣癌細胞の足場非依存性細胞成長の阻害に対するエルビタックスと併用したＩｍＡｂ３の有効性を試験するため、１０００  ＳＫＯＶ３細胞を、０．５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地で７．５μｇ／ｍｌのＩｍＡｂ３または対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）とともに７５分間予備インキュベートした。この予備インキュベーション後、７．５μｇ／ｍｌのエルビタックスを添加し、細胞を０．２５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天（０．５％ＦＣＳ）に再懸濁した。次いで、９６−ウェルプレート内、２０％ＦＣＳを含有する０．５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天下層上に細胞を３通りに蒔いた。
【０２２７】
膵臓癌細胞の足場非依存性細胞成長の阻害に対するエルビタックスと併用したＩｍＡｂ３の有効性を試験するため、１５００  ＢｘＰＣ３細胞を、０．５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地で１５μｇ／ｍｌのＩｍＡｂ３または対照抗体とともに７５分間予備インキュベートした。この予備インキュベーションステップ後、１５μｇ／ｍｌのエルビタックスを添加し、細胞を、０．２５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天（０．５％ＦＣＳ）に再懸濁し、９６−ウェルプレート内、２０％ＦＣＳを含有する０．５％寒天下層上に３通りに蒔いた。
【０２２８】
３７℃、５％ＣＯ２でのインキュベーションの８日後、５０μｌのＭＴＴ（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍｌ）でコロニーを一晩染色した。ソフトウェアＳＡＷ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を含むＳｃａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＴＳカメラシステム（レムナテック（ＬｅｍｎａＴｅｃ））を使用してコロニーの数と大きさについて分析した。図１５ａおよび１５ｂは、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３と抗−ＥＧＦＲ抗体エルビタックスとの併用治療によって卵巣（ＳＫＯＶ３）および膵臓（ＢｘＰＣ３）腫瘍細胞の成長が効率的に阻害されることを示す。
【０２２９】
さらに、足場非依存性細胞成長の阻害に対する化学療法剤のタキソールまたはシスプラチンと併用したＩｍＡｂ３の有効性を試験した。したがって、１０００  ＳＫＯＶ３細胞を、０．５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地で５．５μｇ／ｍｌ（タキソールと併用する場合）または７．５μｇ／ｍｌ（シスプラチンと併用する場合）のＩｍＡｂ３または対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）とともに７５分間予備インキュベートした。ＩｍＡｂ３または対照抗体との細胞の予備インキュベーション後、化学療法剤のタキソール（３ｎＭ）またはシスプラチン（５００ｎＭ）を添加し、細胞を、０．２５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天（０．５％ＦＣＳ）に再懸濁した。細胞を９６−ウェルプレート内、２０％ＦＣＳを含有する０．５％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天下層上に３通りに蒔き、８日間インキュベートした。
【０２３０】
ヒトメラノーマ細胞の足場非依存性細胞成長に対するＩｍＡｂ３とシスプラチンの併用効果を分析するため、１０００  ＨＴ１４４細胞を、０．５％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ培地で３０μｇ／ｍｌの抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３または対照抗体（マウスＩｇＧ２ｂ）とともに７５分間予備インキュベートした。次いで、５００ｎＭのシスプラチンを添加し、細胞を、０．３％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天（０．５％ＦＣＳ）に再懸濁し、９６−ウェルプレート内、２０％ＦＣＳを含有する０．６％ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）のノーブル寒天下層上に３通りに蒔き、８日間インキュベートした。
【０２３１】
図１５ｃは、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞に対する抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３と抗腫瘍剤タキソールとの併用治療の結果、ヒト癌細胞の足場非依存性成長における低下が新規のモノクローナル抗体またはタキソールの単独使用よりも大きくなることを示す。さらに図１５ｄおよび１５ｅにヒト卵巣癌およびメラノーマ細胞に対する抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３と化学療法剤シスプラチンの併用による治療の結果、ヒト癌細胞の足場非依存性成長における低下が新規のモノクローナル抗体またはシスプラチンの単独使用よりも大きくなることを示す。ソフトウェアＳＡＷ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０を含むＳｃａｎａｌｙｚｅｒ  ＨＴＳカメラシステム（レムナテック（ＬｅｍｎａＴｅｃ））を使用してコロニーの数と大きさについて分析した。
【０２３２】
実施例１７：抗腫瘍剤タキソールと併用した本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３細胞増殖の阻害
細胞増殖に対する本発明の抗−ＥＡＧ１抗体と強力な抗腫瘍剤タキソールとの併用治療の効果を測定するため、両方の抗癌剤を併用してインビトロでの細胞増殖アッセイを行った。
【０２３３】
したがって、７５０  ＳＫＯＶ３細胞を、１０％ＦＣＳを補充した１００μｌ／ウェルの培地（ＤＭＥＭ  ４５００ｍｇ／ｍｌのグルコース）、９６−ウェルプレート上に一晩播種した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＦＣＳを含有する６０μｌ／ウェルの培地で２４時間飢餓状態にした。細胞を、図１６に示す如く２０μｌ／ウェルに希釈した、３０μｇ／ｍｌの抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体ＩｍＡｂ３、ＰＢＳまたは１ｎＭのタキソールで、５％ＣＯ２中、３７℃で１時間、４通りに処理した。この予備インキュベーションステップ後、図１６に示す如く、１ｎＭのタキソール、３０μｇ／ｍｌのＩｍＡｂ３またはＤＭＳＯを２０μｌ／ウェルで添加し、次いで細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした。増殖および細胞生存度を評価するため、テトラゾリウム塩ＭＴＳおよび電子共役用試薬フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を含有する２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加し、３７℃で１０分から３時間以内の範囲の様々な時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５９０ｎｍの吸光量によってホルマザン生成物の量を測定した。図１６に示した結果は、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３と強力な抗腫瘍剤タキソールとの併用治療によってヒト卵巣癌細胞の成長が効率的に阻害されることを示す。さらに、治療順序（細胞のタキソールとそれに続くＩｍＡｂ３との予備インキュベーションまたはＩｍＡｂ３とそれに続くタキソールとの予備インキュベーション）がＩｍＡｂ３とタキソールとの併用治療によるＳＫＯＶ３細胞の細胞増殖に対する阻害作用に何も影響を与えないことを示す。
【０２３４】
実施例１８：免疫毒素サポリンに抱合した本発明のヒト抗−ＥＡＧ１抗体によるヒト癌細胞増殖の阻害
本発明の抗−Ｅａｇ１抗体における一次免疫毒素としての抱合への特異的な適応性および有効性を評価するため、宿根草の植物種由来のリボソーム不活化タンパク質であるサポリンに抱合した本発明の抗−ＥＡＧ１抗体を用いてインビトロでの細胞増殖アッセイを行った。
【０２３５】
ジスルフィド連結を介した抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３とサポリンとの抱合（ＩｍＡｂ３−ＳＡＰ）および抱合型抗体ＩｍＡｂ３−ＳＡＰの精製がアドバンスド・ターゲティング・システムズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）によって行われた。
【０２３６】
サポリンと抱合した抗−ＥＡＧ１抗体のＩｍＡｂ３−ＳＡＰにおける癌細胞増殖に対する阻害能を試験するため、癌細胞１０００個／ウェルを１０％ＦＣＳを補充した１００μｌの培地（細胞株に依存）、９６−ウェルプレート上に播種した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＣＳを含有する６０μｌ／ウェルの培地で２４時間インキュベートした。細胞を、４０μｌ／ウェルに希釈した１μｇ／ｍｌのサポリンと抱合した抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体のＩｍＡｂ３−ＳＡＰまたは対照ＩｇＧ−ＳＡＰで４通りに処理した。次いで、細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした。増殖および細胞生存度を評価するため、テトラゾリウム塩ＭＴＳおよび電子共役用試薬フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を含有する２０μｌ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各ウェルに添加し、３７℃で１０分から３時間以内の範囲の様々な時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５９０ｎｍの吸光量によってホルマザン生成物の量を測定した。
【０２３７】
これらの結果は、サポリンと抱合したＩｍＡｂ３−ＳＡＰが、メラノーマ細胞株ＨＴ１４４、ＲＰＭＩ７９５１、Ｃ８１６１およびＳｋＭｅｌ２（図１７ａ）、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３およびＩＧＲＯＶ１、膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３および線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０（図１７ｂ）、ならびに乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ、ＮＣＩ−ＡＤＲおよび結腸癌細胞株ＳＷ４８０（図１７ｃ）における細胞増殖を効率的に阻害することを示す。したがって、本発明の抗−ＥＡＧ１抗体は、一次免疫毒素としての抱合に適し、ヒト癌細胞の成長を阻害するための極めて効率的な作用物質であることが示された。
【０２３８】
実施例１９：本発明の抗体によるＥＡＧ１電流の機能的阻害
抗体の有効な親和性および特異性を特徴づけるため、パッチクランプ技術に関する細胞全体の配置においてトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞内のＩｍＡｂ３によるＥａｇ１電流の阻害を試験した。図示の（図１８ａ）パルスプロトコル（保持電位−８０ｍＶから＋４０ｍＶへの脱分極）によって電流を誘導した。一旦安定電流レベルが得られると、抗体を３００ｎＭ（約４５μｇ／ｍｌ）の濃度で槽チャンバに加えた。対照として、本発明者らは同一濃度で電流振幅に全く作用を示さない関連抗体ＩｍＡｂ４を使用した。抗体とＩｍＡｂ３に対するエピトープの配列を内在させる過剰なペプチドとのインキュベーションにより、ＩｍＡｂ３の作用を完全に失わせた。抗体およびペプチドを室温で１時間インキュベートし（１：１はペプチドが約５０倍のモル数分過剰であることを示す）、混合物を抗体単独について記載の如く使用した。ＩｍＡｂ４に対するエピトープ配列を有するペプチドの使用は、ＩｍＡｂ３の作用に影響しなかった。
【０２３９】
この阻害の特異性を試験するため、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＩｍＡｂ３のＨＥＲＧ電流に対する作用についても試験した。保持電位−８０ｍＶから＋４０ｍＶへの脱分極によって電流を誘導した。ＨＥＲＧは、通常は極めて高速な不活性化、および膜の再分極時のテール電流における電流振幅の測定を可能にするゆるやかな不活性化を示す。ＩｍＡｂ３（Ｎ＝６）の添加は、添加抗体の非存在下でも観察される電流停止の特定範囲にわたる電流振幅に作用しなかった（図１８ｂ）。
【０２４０】
実施例２０：移植した腫瘍細胞の本発明の近赤外標識抗体を使用した局在化
図１９は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏ  ６８０で標識した特異的な抗−Ｅａｇ１抗体の静脈内注射後における、マウスが担持しＥａｇ１を発現する腫瘍上での近赤外蛍光強度（Ａ）および寿命（Ｂ）を示す疑似カラー像を示す。陽性リンパ節（矢印）は臨床的に明瞭ではなかった。寿命の測定値から、シグナルの特異性について判定可能になる。各場合において着色領域のみを走査した。
【０２４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞（１０７）を雌ＳＣＩＤマウスの脇腹に皮下移植した。抗体ＩｍＡｂ４（５００μｇ）をＡｌｅｘａＦｌｕｏ  ６８０抗マウス二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。１００μｇの産生標識抗体をマウスの尾静脈に注射した。その２４時間後、マウスを麻酔し、ｅＸｐｌｏｒｅ  Ｏｐｔｉｘ２系（ジェネラル・エレクトリック（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ））を使用して走査した。全身への低解像度走査後、陽性シグナルを有する領域を高解像度（より長い暴露時間）で走査した。検視によって陽性シグナルの位置を確認した。抗体の操作を回避するため、一本鎖抗体とＤｓＲｅｄ２の間のキメラタンパク質ならびにポリリシン配列を担持する一本鎖抗体を産生することで近赤外色素（例えばＣｙ５．５）による高効率の標識化を可能にしている。
【０２４２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】マウスクローンＩｍＡｂ１、３、４および５の軽鎖および重鎖のＣＤＲ１、２および３のＣＤＲペプチド配列を示す。
【図２】本発明の抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３の結合特異性／選択性を示す。該抗体はＥａｇ１を選択的に認識しかつＥａｇ２抗原に結合しない。さらにＢＩＡｃｏｒｅ（商標）分析では、ＩｍＡｂ１がＥａｇ１のＣ末端に結合する一方、ＩｍＡｂ３がＥａｇ１のポアドメインを認識することが示される。
【図３】ラット海馬およびラット小脳を含むラット脳切片における抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ４による免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を示す。ＩＨＣ試験は、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体のラットとの交差反応について示す。
【図４】抗−Ｅａｇ１モノクローナル抗体とＳＰＯＴセルロース膜上のペプチドとの結合パターン。
【図５】Ｅａｇ１を過剰発現する生きているＣＨＯ  Ｋ１細胞に対してＣｙ３標識抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３を用いた免疫蛍光実験を示す。結果は、異なるエピトープを認識する本発明のＣｙ３標識抗−Ｅａｇ１抗体が生きているＣＨＯ−Ｅａｇ１細胞上のＥａｇ１抗原に結合しかつ細胞内に内在化することを示す。
【図６】マウスモノクローナル抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３のハイブリドーマ上清を用いた処理によるＥａｇ１を発現する卵母細胞内でのＥａｇ１電流の阻害およびＩｍＡｂ３におけるＥａｇ１発現ＣＨＯ細胞内でのＥａｇ１電流に対する遮断能を示す。
【図７】本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体のＩｍＡｂ１およびＩｍＡｂ３によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞増殖の阻害を示す。該抗体はヒト癌細胞における基底細胞の成長を阻害する。
【図８ａ】および
【図８ｂ】図８ａおよび８ｂは、二次免疫毒素とともに（と組み合わせて）標識されたマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞増殖の阻害を示す。結果は、抗−Ｅａｇ１抗体が内在化する能力を有しかつ本発明のアームが付着した抗体がヒト癌細胞の成長を特異的に阻害することを示す。該抗体は、一次免疫毒素としての抱合に適しかつヒト癌細胞成長の阻害において有効である。
【図９】二次免疫毒素の存在下での抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４によるＩＰＣ−２９８メラノーマ細胞の足場非依存性細胞成長の阻害を示す。
【図１０ａ】図１０ａは、抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ４を使用し、ヒト腫瘍細胞内でのＥａｇ１タンパク質の免疫蛍光を示す。結果は、発明の抗体がヒト癌細胞内で内因性Ｅａｇ１タンパク質に対する結合能を有することを示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、本発明の抗−Ｅａｇ１抗体を使用したＥａｇ１−ＥＬＩＳＡの実施結果を示す（該抗体はヒト癌細胞の溶解物中でのＥａｇ１タンパク質に対する結合能および検出能を有する）。
【図１１】ＣＨＯ  Ｋ１細胞内での組換えｈｕ−ＩｍＡｂ３の発現を示す。
【図１２】本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体による数種のヒト癌細胞のコロニー形成の阻害を示す。抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３は、乳癌細胞（図１２ａ）、卵巣癌細胞（図１２ｂ、ｃ）、メラノーマ細胞（図１２ｄ）、膵臓癌細胞（図１２ｅ）、線維肉腫細胞（図１２ｆ）および肺扁平上皮癌細胞（図１２ｇ）の足場非依存性細胞成長を阻害する。抗−ＥＡＧ１抗体ｉＭａｂ５は、卵巣癌細胞（図１２ｂ）の足場非依存性細胞成長を阻害する。図１２ｃは、抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３による卵巣癌細胞のコロニー形成の用量依存的阻害を示す。
【図１３】本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３卵巣癌細胞増殖の阻害を示す。該抗体はヒト癌細胞内での基底細胞の成長を示す。
【図１４】本発明の抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３による雌ＳＣＩＤマウスにおけるヒト腫瘍成長の低下を示す。該抗体は、ヒト乳癌細胞のＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ細胞のインビボでの成長を阻害する。
【図１５】治療用モノクローナル抗−ＥＧＦＲ抗体エルビタックスと併用したヒト抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるヒト卵巣癌およびヒト膵臓癌細胞の足場非依存性細胞成長の阻害を示す（図１５ａおよび１５ｂ）。図１５ｃは、ヒト卵巣癌細胞のＩｍＡｂ３と抗腫瘍剤タキソールとの併用治療によってこの細胞株のコロニー形成が極めて効率的に阻害されることを示す。抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３を抗腫瘍剤シスプラチンと併用した細胞治療によるヒト卵巣癌およびメラノーマ細胞のコロニー形成の阻害については図１５ｄおよび１５ｅに示される。
【図１６】強力な抗腫瘍剤タキソールと併用した本発明のマウス抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３によるＳＫＯＶ３卵巣癌細胞の増殖の阻害を示す。ヒト卵巣癌細胞に対するＩｍＡｂ３とタキソールとの併用治療により、ヒト癌細胞内での基底細胞の成長が各抗癌剤単独の場合よりも効率的に阻害される。
【図１７】免疫毒素サポリンと抱合された本発明のマウス抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３による種々の癌細胞株の細胞増殖の阻害について示す。結果は、毒素と抱合された抗−Ｅａｇ１抗体ＩｍＡｂ３がヒト癌細胞株の幅広いスペクトルの細胞増殖を極めて効率的に阻害することを示す。サポリンと抱合された抗−ＥＡＧ１抗体ＩｍＡｂ３は、メラノーマ細胞（図１７ａ）、卵巣および膵臓癌細胞（図１７ｂ）、線維肉腫細胞（図１７ｂ）、乳癌および結腸癌細胞（図１７ｃ）の細胞増殖を阻害する。
【図１８】ＩｍＡｂ３抗体の細胞外適用によるＥＡＧ１電流の阻害を示す。同適用の０および１０分の時点での代表的トレースは、ＩｍＡｂ３を適用するだけで電流振幅が見事に低下することを示す。１０〜１５分後には、電流阻害が全振幅の約３５％に至る（図１８ａ）。図１８ｂは、ＩｍＡｂ３の技術的に到達可能な時間範囲および濃度においてＨＥＲＧ電流に対する作用が失われることを示す。
【図１９】人工的に移植された、ＥＡＧ１を発現する腫瘍および先に検出されなかった転移性の移植片を担持するマウスから得られる疑似カラー像（矢印）を示す。イメージングの２４時間前に標識抗体１００μｇが静脈内注射された。図１９Ａは色分けされた蛍光強度を示す一方、図１９Ｂは陽性領域においてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６８０に対応する蛍光寿命を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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