(57)【要約】  本発明は、GLP-1アゴニストの二量体化およびその治療学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二官能性架橋リンカーを介して互いに連結された二つのGLP-1アゴニストを含む化合物。
【請求項２】
前記二つのGLP-1アゴニストが、同一である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記二つのGLP-1アゴニストが、同じアミノ酸残基上で二官能性架橋リンカーに連結された請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記GLP-1アゴニストが、GLP1またはその類似体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記GLP-1アゴニストが、エキセンジン-4またはその類似体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
二官能性の親水性スペーサー W-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-を介して連結された二つのGLP-1アゴニストを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物：
式中、
l、mおよびnは独立して1〜20であり、pは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内の整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および -P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5、およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-または -NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択される。
【請求項７】
式（I）：「GLP-1化合物」-Y-B-Y-「GLP-1化合物＊」（I）を有する請求項６に記載の化合物：
式中、
Bは、Wq-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-である親水性スペーサーであり、式中、
l、mおよびnは独立して、1〜20、ｐは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内の整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および -P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O- または-NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択され、
Yは、BおよびGLP-1アゴニストを連結する化学基であり、
「GLP-1化合物」および「GLP-1化合物＊」は、GLP-1アゴニストである。
【請求項８】
式（II）：「GLP-1化合物」-Y-B-B'-Y'-「GLP-1化合物＊」（II）を有する請求項６に記載の化合物：
式中、
BおよびB’は、-Wq -(CH2)lD [(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-から独立して選択された親水性スペーサーであり、式中、
l、mおよびnは独立して、1〜20であり、pは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内における整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および-P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O- または -NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択され、
Yは、BおよびGLP-1アゴニストを連結させる化学基であり、および
Y’は、B´およびGLP-1アゴニストを連結させる化学基であり、および
「GLP-1化合物」および「GLP-1化合物＊」は、GLP-1アゴニストである。
【請求項９】
前記YおよびY'が、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)- および -C(O)NH- （式中、sは0または1である）からなる群から選択される請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記lが1または2であり、nおよびmが独立して1〜10であり、pが0〜10である請求項６〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記Dが、-O-である請求項６〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記Eが、-O-である請求項６〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記親水性スペーサーが-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-であり、mが1〜10であり、pが1〜3であり、およびQが-Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-である請求項６〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ｑが、0である請求項６〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ｑが、1である請求項６〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記Gが、-O-である請求項６〜１１および１３〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記Zが、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、および-OC(O)NH-からなる群から選択される請求項６〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記Iが、2である請求項６〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記nが、2である請求項６〜１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
親水性スペーサーBが、-[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-である請求項６〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記GLP-1化合物が、式Iのアミノ酸配列を含む請求項１〜２０のいずれか一項に記載の化合物：
Xaa1- Xaa2- His- Gly- Xaa5-Phe- Xaa7- Xaa8- Xaa9-Xaa10- Xaa11- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Xaa15- Xaa16- Xaa17- Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe- Xaa23- Xaa24- Trp- Xaa26- Xaa27- Xaa28- Xaa29- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39- Xaa40- Xaa41- Xaa42 
式 (I)  (配列番号１)
式中、
Xaa1は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-3-(2-アミノイミダゾール-4-イル) プロピオン酸、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニン；またはL-チロシンである；
Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa5は、ThrまたはSerである；
Xaa7は、ThrまたはSerである；
Xaa8は、SerまたはAspである；
Xaa9は、GluまたはAspである；
Xaa10は、Val、Met、LeuまたはTyrである；
Xaa11は、SerまたはAsnである；
Xaa12は、Ser、ThrまたはLysまたはIleである；
Xaa13は、Tyr、Ile、AlaまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa15は、AspまたはGluである；
Xaa16は、Gly、Asn、GluまたはLysである；
Xaa17は、Leu、Gln、GluまたはIleである；
Xaa18は、AlaまたはHisである；
Xaa19は、Ala、GlnまたはValである；
Xaa20は、Lys、ArgまたはGlnである；
Xaa21は、Asp、GluまたはLeuである；
Xaa23は、IleまたはValである；
Xaa24は、Ala、AsnまたはGluである；
Xaa26は、LeuまたはIleである；
Xaa27は、Val、Ile、Leu、ArgまたはLysである；
Xaa28は、Lys、Gln、AlaまたはAsnである；
Xaa29は、Gly、ThrまたはGlnである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Ile、Gly、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Thr、Lys、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Asp、Lys、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Arg、Asn、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Asp、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Trp、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa37は、Lys、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa38は、His、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Asn、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa40は、Ile、アミドまたは欠失である；
Xaa41は、Thr、アミドまたは欠失である；
Xaa42は、Gln、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、またはXaa42が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列が、式２に記載されたものである請求項２１に記載の化合物：
His- Xaa2- His- Gly- Xaa5- Phe- Xaa7- Xaa8- Xaa9- Xaa10- Xaa11- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Xaa15- Xaa16- Xaa17- Ala- Xaa19- Xaa20- Xaa21- Phe- Ile- Xaa24- Trp- Leu- Xaa27- Xaa28- Xaa29- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39
式(2) (配列番号2)
式中、
Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa5は、ThrまたはSerである；
Xaa7は、ThrまたはSerである；
Xaa8は、SerまたはAspである；
Xaa9は、GluまたはAspである；
Xaa10は、Val、Met、またはLeuである；
Xaa11は、SerまたはAsnである；
Xaa12は、Ser、ThrまたはLysである；
Xaa13は、Tyr、IleまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa15は、AspまたはGluである；
Xaa16は、Gly、AsnまたはGluである；
Xaa17は、Leu、GlnまたはGluである；
Xaa19は、AlaまたはValである；
Xaa20は、LysまたはArgである；
Xaa21は、Asp、GluまたはLeuである；
Xaa24は、Ala、AsnまたはGluである；
Xaa27は、Val、IleまたはLysである；
Xaa28は、Lys、GlnまたはAsnである；
Xaa29は、GlyまたはThrである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Ile、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Thr、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Asp、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Arg、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa37は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa38は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、またはXaa39が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【請求項２３】
前記アミノ酸配列が、式３に記載されたものである請求項２１または２２に記載の化合物：
His- Xaa2- His- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Xaa10- Ser- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Glu- Xaa16- Xaa17- Ala- Xaa19- Xaa20- Xaa21- Phe- Ile- Xaa24- Trp- Leu- Xaa27- Xaa28- Gly- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39
式 (3) (配列番号:3)
Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa10は、ValまたはLeuである；
Xaa12は、SerまたはLysである；
Xaa13は、TyrまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa16は、GlyまたはGluである；
Xaa17は、GlnまたはGluである；
Xaa19は、AlaまたはValである；
Xaa20は、LysまたはArgである；
Xaa21は、GluまたはLeuである；
Xaa24は、AlaまたはGluである；
Xaa27は、ValまたはLysである；
Xaa28は、LysまたはAsnである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa37は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa38は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、またはXaa39が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【請求項２４】
前記2つのGLP-1アゴニストが、以下の位置の一つでアミノ酸残基を介して二量体化される請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物：
GLP-1：残基番号18、22、26、34、36、37または38
エキセンジン-4：残基番号12、16、20、27、32、33または34。
【請求項２５】
以下の群から選択される請求項１〜２４のいずれか一項に記載の化合物
O,O’-Bis-(2-((Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン ,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34,Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys- Nイプシロンイル)カルボニル)エチル) テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys- Nイプシロンイル)カルボニル)エチル) テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys- Nイプシロン イル)カルボニル)エチル) テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル) オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル) オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys22-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,22イル)カルボニル)エチル) オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys18-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,18イル)カルボニル)エチル) オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys34-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,34イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys36-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,36イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34,Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34, Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34, Lys37-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,37イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Gly8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys- Nイプシロンイル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Aib8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys- Nイプシロンイル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Val8, Arg26, Arg34 -GLP-1(7-37)-Lys-Nイプシロン イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Arg27, Lys34- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,34イル) カルボニル)エチル)- テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-(( Leu14, Arg27- エキセンジン-4 (1-39)-Nイプシロン,12イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-(( Leu14, Arg27- エキセンジン-4 (1-39)-Nイプシロン,12イル)カルボニル)エチル)-テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Arg27, Lys34- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,34イル) カルボニル)エチル)-オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Lys20, Arg27- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,20イル) カルボニル)エチル)-テトラエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Lys20, Arg27- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,20イル) カルボニル)エチル)-オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,27イル) カルボニル)エチル)-オクタエチレングリコール
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,27イル) カルボニル)エチル)-テトラエチレングリコール
N,N’-ビス((((S)-5-([Aib,8,22,35]GLP-1(1-37)イル)-5-カルバモイルペンチル)カルバモイル)メトキシ)ヘキサン-1,6-ジイミン
N,N’-ビス((((S)-5-( N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ] エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37) イル)-5-カルバモイルペンチル)カルバモイル)メトキシ)エタン-1,2-ジイミン。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物を生成するために、二官能性架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において特徴づけられた、GLP-1アゴニストの患者における肺性の生物学的利用能を増加させる方法。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物を生成するために、二官能性架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において特徴づけられた、GLP-1アゴニストの患者における作用強度に対する肺性の生物学的利用能の割合を増加させる方法。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２９】
肺性投与に適した請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
薬剤の調製のための請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３１】
高血糖症、２型糖尿病、障害性グルコース耐性、１型糖尿病、肥満症、高血圧症、Ｘ症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、冠性心疾患および他の心臓血管障害、炎症性腸症候群、消化不良および胃潰瘍を治療または予防する薬剤の調製のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３２】
２型糖尿病の疾患進行を遅延または予防する薬剤の調製のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３３】
食物摂取を減少させ、β細胞のアポトーシスを減少させ、β細胞の機能およびβ細胞の量を増加させ、および／またはβ細胞に対するグルコース感受性を回復させる薬剤の調製のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３４】
二量体GLP-1アゴニストのいずれか一方または両方に共有結合した延長基を含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３５】
二量体GLP-1アゴニストのいずれか一方または両方に共有結合した延長基を含み、かつ前記アゴニストがGLP-1またはその類似体である請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
二量体GLP-1アゴニストのいずれか一方または両方に共有結合した延長基を含み、かつ前記アゴニストがエキセンジン-4またはその類似体である請求項１〜２５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
前記延長基が、アルブミンに結合することができる請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
前記延長基が、ポリエチレングリコールである請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物を生成するために、二官能性架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において特徴づけられた、GLP-1アゴニストの患者における作用強度に対する肺性の生物学的利用能の割合を増加させる方法。
【請求項４０】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
肺性投与に適した請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
薬剤の調製のための請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項４３】
高血糖症、２型糖尿病、障害性グルコース耐性、１型糖尿病、肥満症、高血圧症、Ｘ症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、冠性心疾患および他の心臓血管障害、炎症性腸症候群、消化不良および胃潰瘍を治療または予防する薬剤の調製のための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項４４】
２型糖尿病の疾患進行を遅延または予防する薬剤の調製のための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、治療学的ペプチドの分野、特に、新規なGLP-1アゴニストに関する。
【発明の背景】
【０００２】
真性糖尿病は、グルコースを利用する能力が部分的にまたは完全に失われる代謝障害である。 すべての人の約5%が糖尿病に罹患しており、この障害はもはや伝染病的勢いとなっている。1920年代のインスリンの導入以来、真性糖尿病の治療を向上させる継続的努力がなされてきた。
【０００３】
糖尿病の治療に非常に重要になると予想される一つのペプチドは、グルカゴン様ペプチド-１(GLP-1)である。 ヒトGLP-1は、遠位回腸におけるL細胞、膵臓および脳において合成されるプレプログルカゴンから生じる37アミノ酸残基のペプチドである。GLP-1は、グルコース代謝および胃腸分泌および代謝における制御機能を備えた重要な消化管ホルモンである。GLP-1は、グルコース依存的様式においてインスリン分泌を刺激し、インスリン生合成を刺激し、β細胞の活動を促進させ、グルカゴンの分泌を減少させ、胃内容排出および食物摂取量を減少させる。 ヒトGLP-1は、GLP-1(7-37)およびGLP-1(7-36)-アミドに加水分解され、両方ともにインスリン分泌性ペプチドになる。単純な方式が、このペプチドの断片および類似体を記載するために使用される。したがって、例えば、[Gly8]GLP-1(7-37)は、位置8において天然に存在するアミノ酸残基(Ala)をGlyで置換したGLP-1(7-37)から形式的に誘導されたGLP-1(7-37)の類似体を示す。同様に、(Nε34-テトラデカノイル)[Lys34]GLP-1(7-37)は、位置34のLys残基のε-アミノ基がテトラデカノイル化されたGLP-1(7-37)を示す。PCT公報WO 98/08871およびWO 99/43706は、親油性置換基を有するGLP-1類似体の安定した誘導体を開示する。GLP-1類似体のこれらの安定した誘導体は、対応するGLP-1類似体と比較して作用の遅延性プロファイルを示す。
【０００４】
1992年以来、多くのペプチドが、アメリカドクトカゲ (Heloderma suspectum and Heloderma horridum)の毒液から単離されてきた。エキセンジン-4は、アメリカドクトカゲの毒液から単離された39アミノ酸残基ペプチドであり、このペプチドは、オーバーラップ領域においてGLP-1(7-37)と52%の相同性を共有する。エキセンジン-4は、インスリン放出を刺激することが解っている強力なGLP-1受容体アゴニストであり、イヌに注入されたときに血中グルコース値の低下を保障する。エキセンジン-4(1-39)、その断片、その類似体およびその誘導体の群は、強力なインスリン分泌性薬剤である。特に、エキセンジン-4(1-39)、そのインスリン分泌性断片、そのインスリン分泌性類似体およびそのインスリン分泌性誘導体の群が最も重要である。
【０００５】
GLP-1およびエキセンジン-4から誘導されたインスリン分泌性ペプチドは、血漿グルコース値が高い場合にのみ放出され、低血糖状態の危険性を軽減する。したがって、このペプチドは、OHA(経口高血糖剤)が効かず、厳密な医学的視点からインスリンが投与されるべきである糖尿病患者に特に有効である。患者およびある程度まで医者は、おそらくは低血糖状態の恐怖および注射／針の恐怖のために、これが絶対的に必要になる前にインスリン治療を開始しないことが多い。したがって、十分に強力であり、かつ肺経路によって投与可能なインスリン分泌性ペプチドに対する要求がある。 
GLP-1ペプチドの肺投与は、WO 01/51071およびWO 00/12116において開示されている。
【０００６】
従って、本発明の目的は、非経口投与のためのペプチドに対する代替薬剤として役立つ十分な肺性の生物学的利用能を有するインスリン分泌性ペプチドを提供することである。肺性の生物学的利用能を有するインスリン分泌性ペプチドは、作用強度と生物学的利用能との間のバランスをとる。本発明の目的はまた、グルカゴン様ペプチドに関連した周知の問題である凝集傾向の弱いインスリン分泌性ペプチドを提供することである。凝集傾向の弱さは、経済的製造プロセスを容易にし、化合物を医療輸液ポンプによって投与することを可能にする。
【０００７】
さらなる本発明の目的は、血漿半減期が延長され、一日一回未満で投与され得るインスリン分泌性薬剤を提供することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、二官能性架橋リンカーを介して互いに連結された2つのGLP-1アゴニストを含む化合物を提供する。
【０００９】
一実施態様において、2つのGLP-1アゴニストは同一である。
【００１０】
他の実施態様において、2つのGLP-1アゴニストは同じアミノ酸残基上で二官能性の架橋リンカーに連結される。
【００１１】
他の実施態様において、前記GLP-1アゴニストは、GLP-1またはその類似体である。 
他の実施態様において、前記GLP-1アゴニストは、エキセンジン-4またはその類似体である。
【００１２】
他の側面において、本発明は、本発明による化合物を生成するための二官能性の架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において特徴づけられた、GLP-1アゴニストの患者における肺性の生物学的利用能を増加させる方法を提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、本発明による化合物を生成するための二官能性の架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において特徴づけられた、GLP-1アゴニストの患者における作用強度に対する肺性の生物学的利用能の割合を増加させる方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、本発明による化合物を含む薬学的組成物、および疾患を治療する薬剤を調製するための本発明による化合物の使用を提供する。
【定義】
【００１５】
本明細書中において、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書中に使用された用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された少なくとも5つの構成アミノ酸で構成された化合物を意味する。構成アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされた一群のアミノ酸であってもよいし、また、これらは、遺伝子コードによってコードされていない天然のアミノ酸および合成アミノ酸であってもよい。遺伝子コードによってコードされない天然のアミノ酸には、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンがある。 合成アミノ酸には、化学合成によって製造されたアミノ酸、すなわち、D-アラニンおよびD-ロイシンのような遺伝子コードによってコードされたアミノ酸のD-異性体、Aib（α-アミノイソブチル酸）、Abu(α-アミノブチル酸)、Tle（tert-ブチルグリシン）、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸が含まれる。
【００１６】
ポリペプチドに言及する本明細書中で使用される用語「類似体」は、ペプチドの一以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換された、および／または一以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失した、および／または一以上のアミノ酸残基がペプチドから欠失した、および／または、一以上のアミノ酸残基がペプチドに付加された、修飾されたペプチドを意味する。アミノ酸残基のこのような付加または欠失は、ペプチドのN末端および／またはペプチドのC末端で起こり得る。単純な方式が、類似体を記載するためにしばしば使用される：例えば、[Arg34]GLP-1(7-37)Lysは、位置34において天然に存在するリシンがアルギニンで置換され、リシンが末端アミノ酸残基（すなわちGly37）に付加されたGLP-1(7-37)類似体を示す。光学異性体が存在しないすべてのアミノ酸は、L-異性体を意味するものと理解される。
【００１７】
ペプチドに関連して本明細書中で使用される用語「誘導体」は、少なくとも一つの置換基が未修飾のペプチドまたはその類似体内に存在しない、化学的に修飾されたペプチドまたはその類似体、すなわち、共有結合的に修飾されたペプチドを意味する。典型的な修飾には、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルおよびこれらに類するものがある。GLP-1(7-37)の誘導体の例には、Nε26-((4S)-4-(ヘキサデカノイルアミノ)-ブタノイル)[Arg34, Lys26]GLP-1-(7-37)がある。
【００１８】
本明細書中に使用された用語「インスリン分泌性薬剤」は、ヒトGLP-1受容体のアゴニストである化合物、すなわち、ヒトGLP-1受容体を含む適切な溶媒（以下に開示された一つのこのような媒体) においてcAMPの形成を刺激する化合物を意味する。インスリン分泌性薬剤の作用強度は、以下に記載された投与量-反応曲線からEC50値を計算することによって決定される。
【００１９】
ヒトGLP-1受容体(BHK-467-12A)を発現するベビーハムスターの腎臓（BHK）細胞を、100 IU/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、5%ウシ胎仔血清および0.5mg/mL Geneticin G-418 (Life Technologies)を添加したDMEM培養液において増殖した。細胞を、リン酸塩緩衝生理食塩水中で２回洗浄し、Verseneで回収した。原形質膜を、緩衝液１(20 mM HEPES-Na, 10 mM EDTA, pH 7.4)中Ultraturraxでの均質化によって細胞から調製した。ホモジネートを、4℃で15分間にわたって48,000×gで遠心処理した。ペレットを、緩衝液２(20 mM HEPES-Na, 0.1 mM EDTA, pH 7.4)における均質化によって縣濁し、その後に4℃で15分間にわたって48,000×gで遠心処理した。洗浄手順をもう一回繰り返した。最終ペレットを緩衝液２中において縣濁し、アッセイのために直ちに使用するかまたは-80℃で貯蔵した。
【００２０】
機能的受容体のアッセイを、インスリン分泌性薬剤による刺激に対する反応として環状AMP(cAMP)を測定することによって行った。形成されたcAMPを、AlphaScreenTM cAMP キット(Perkin Elmer Life Sciences)によって定量化した。インキュベーションを、50μLの緩衝液３ (50mM トリスHCI、5mM HEPES、10mM MgCl2、pH 7.4)の全容積においてハーフエリア96ウェルマイクロタイタープレート中で行った。以下の添加がなされた：1mM ATP、1μM GTP、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.01% Tween-20、0.1% BSA、6μg 膜製剤、15μg/mL 受容体ビーズ、20μg/mL供与体ビーズ（6nM ビオチニル-cAMPでプレインキュベート）。アゴニスト活性について試験された化合物を、緩衝液３に溶解および稀釈した。GTPを各実験ごとに新たに調製した。 プレートを室温で3時間にわたって緩やかに撹拌しながら暗所中においてインキュベートし、その後に、FusionTM装置(Perkin Elmer Life Sciences)においてカウントした。濃度-反応曲線を、個々の化合物ごとにプロットし、EC50値を、Prism v. 4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA)の4つのパラメーターロジスティックモデルを使用して評価した。 
本明細書中に使用された用語「GLP-1ペプチド」は、GLP-1(7-37)（配列番号１）、GLP-1(7-37)類似体、GLP-1(7-37)誘導体またはGLP-1(7-37)類似体の誘導体を意味する。一実施態様において、GLP-1ペプチドは、インスリン分泌性薬剤である。
【００２１】
本明細書中に使用された用語「エキセンジン-4ペプチド」は、エキセンジン-4(1-39)（配列番号２）、エキセンジン-4(1-39)類似体、エキセンジン-4(1-39)誘導体またはエキセンジン-4(1-39)類似体の誘導体を意味する。一実施態様において、エキセンジン-4ペプチドは、インスリン分泌性薬剤である。
【００２２】
ポリペプチドに言及する本明細書中に使用された用語「保護されたDPP-IV」は、化学的に修飾されたポリペプチドを意味し、血漿ペプチダーゼ・ジペプチジルアミノペプチターゼ-4(DPP-IV)に耐性を示す前記化合物を与える。血漿におけるDPP-IV酵素は、いくつかのペプチドホルモン、例えばGLP-1、GLP-2、エキセンジン-4などの分解に関与することが知られている。従って、DPP-IV媒介加水分解に対して感受性を示すポリペプチドの類似体および誘導体を開発するための相当な努力がなされている。一実施態様において、DPP-IV保護ペプチドは、GLP-1(7-37)またはエキセンジン-4(1-39)よりもDPP-IVに対して強い耐性を示す。
【００２３】
ジペプチジルアミノペプチターゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解アッセイによって決定される：
ペプチドのアリコート(5 nmol)を、100μLの0.1Mトリエチルアミン-HCl緩衝液、pH 7.4中において10〜180分間にわたって5 mUの酵素活性に対応する1μLの精製ジペプチジルアミノペプチターゼIVと37℃でインキュベートする。酵素反応を、5μLの10%トリフルオロ酢酸の添加によって終了させ、ペプチド分解産物をHPLC分析を使用して単離および定量する。この分析を行うための一つ方法は以下のとおりである：前記混合液を、Vydac C18 ワイドポア(30nmポア、5μm粒子) 250×4.6mmのカラム上に加え、Siegel et al., Regul. Pept. 1999;79:93-102 and Mentlein et al. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35による、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線的な段階的勾配(3分間0％アセトニトリル、17分間0〜24%アセトニトリル、1分間24〜48%アセトニトリル)で1ml/分の流速で溶出した。ペプチドおよびその分解産物を、220nm(ペプチド結合)または280nm(芳香族アミノ酸)でのこれらの吸光度によってモニターし、これらの標準に関連したピーク領域の積分によって定量する。ジペプチジルアミノペプチターゼIVによるペプチドの加水分解の比率は、10％未満のペプチドが加水分解されるインキュベーションの時間で評価する。
【００２４】
本明細書中に使用された用語「C1-6-アルキル」は、飽和した、分枝した、直鎖または環状の1〜6の炭素原子を有する炭化水素基を意味する。代表的な例には、以下のものに限定されないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキサンおよびこれらの類似体が含まれる。
【００２５】
本明細書中に使用された用語「薬学的に許容可能な」は、正常な薬学的適用に適していること、すなわち、患者等が有害状態に陥らないことを意味する。
【００２６】
本明細書中に使用された用語「賦形剤」は、薬学的組成物に一般的に加えられる化学的化合物（例えば、バッファー、等張剤、保存剤およびこれらに類するもの）を意味する。
【００２７】
本明細書中に使用された用語「有効量」は、治療をしない場合と比較して患者の治療を有効にする十分な投与量を意味する。 
本明細書中に使用された用語「薬学的組成物」は、薬学的賦形剤、例えば緩衝液、保存剤、および任意的には張度修飾剤および／または安定剤と一緒に、活性化合物またはその塩を含む生成物を意味する。したがって、薬学的組成物はまた、薬学的処方として当該技術分野において知られている。
【００２８】
本明細書中に使用された用語「疾患の治療」は、疾病、状態または障害の進行した患者の管理およびケアを意味する。治療の目的は、疾病、状態または障害と戦うことである。治療には、疾病、状態または障害を除去するための、および疾病、状態または障害に関連した症状または合併症を軽減するための、活性化合物の投与が含まれる。
【発明の説明】
【００２９】
一側面において、本発明は、二官能性の架橋リンカーを介して互いに連結された２つのGLP-1アゴニストを含む化合物に関する。
【００３０】
一実施態様において、2つのGLP-1アゴニストは同一である。
【００３１】
他の実施態様において、2つのGLP-1アゴニストは、同じアミノ酸残基上で二官能性架橋リンカーに連結される。
【００３２】
他の実施態様において、前記GLP-1アゴニストは、GLP-1またはその類似体である。
【００３３】
他の実施態様において、前記GLP-1アゴニストは、エキセンジン-4またはその類似体である。
【００３４】
他の実施態様において、前記２つのGLP-1アゴニストは、二官能性の親水性スペーサー W-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-である；式中、
l、mおよびnは独立して1〜20であり、pは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内の整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および -P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5、およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-または -NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択される。 
さらなる側面において、本発明は、式(I)の化合物「GLP-1化合物-Y-B-Y-GLP-1化合物＊」(I)に関する；式中、
Bは、Wq-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-である親水性スペーサーであり、式中、
l、mおよびnは独立して、1〜20、ｐは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内の整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および -P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、 
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O- または-NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択され、
Yは、BおよびGLP-1アゴニストを連結する化学基であり、
「GLP-1化合物」および「GLP-1化合物＊」は、GLP-1アゴニストである。
【００３５】
さらなる側面において、本発明は、処方(II)の化合物「GLP-1化合物-Y-B-B'-Y'-GLP-1化合物＊」(II)に関する；式中、
BおよびB’は、-Wq -(CH2)lD [(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-から独立して選択された親水性スペーサーであり；式中、
l、mおよびnは独立して、1〜20であり、pは0〜10であり、
Qは、-Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-であり、
Wは、-(CH2)p[(CH2)nG]mD(CH2)l-Z-であり、
qは、0〜5の範囲内における整数であり、
各D、EおよびGは独立して、-O-、-NR3-、-N(COR4)-、-PR5(O)-、および-P(OR6)(O)- （式中、R3、R4、R5およびR6は独立して、水素またはC16-アルキルを表わす）から選択され、 
Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、-OC(O)NH -、-C(O)NHCH2CH2-、-C(O)CH2-、-C(O)CH=CH-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O- または -NHC(O)- （式中、sは0または1である）から選択され、
Yは、BおよびGLP-1アゴニストを連結させる化学基であり、および
Y’は、B´およびGLP-1アゴニストを連結させる化学基であり、および
「GLP-1化合物」および「GLP-1化合物＊」は、GLP-1アゴニストである。
【００３６】
上述した実施態様において、2つのGLP-1化合物は、同一であっても異なっていてもよい。
【００３７】
他の実施態様において、YおよびY'は、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NHCH2-、-CH2NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)NHCH2-、CH2NHC(O)-、-C(O)CH2-、-CH2C(O)-、-C(O)CH=CH-、-CH=CHC(O)-、-(CH2)s-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-NHC(O)- および -C(O)NH- （式中、sは0または1である）からなる群から選択される。
【００３８】
他の実施態様lにおいて、I は1または2、nおよびmは独立して1〜10、pは0〜10である。
【００３９】
他の実施態様において、Dは-O-である。
【００４０】
他の実施態様において、Eは-O-である。
【００４１】
他の実施態様において、親水性スペーサーは、
-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-、式中、mは1〜10、pは1〜3、およびQは、-Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-である。
【００４２】
他の実施態様において、ｑは0である。
【００４３】
他の実施態様において、ｑは1である。
【００４４】
他の実施態様において、Gは-O-である。
【００４５】
他の実施態様において、Zは、-C(O)NH-、-C(O)NHCH2-、および -OC(O)NH-からなる群から選択される。
【００４６】
他の実施態様lにおいて、I は2である。
【００４７】
他の実施態様において、n は2である。
【００４８】
他の実施態様において、親水性スペーサーBは、-[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-である。
【００４９】
一実施態様において、前述の実施態様のいずれかによる化合物は、以下の式Iのアミノ酸配列を含むGLP-1化合物である：
Xaa1- Xaa2- His- Gly- Xaa5-Phe- Xaa7- Xaa8- Xaa9-Xaa10- Xaa11- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Xaa15- Xaa16- Xaa17- Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe- Xaa23- Xaa24- Trp- Xaa26- Xaa27- Xaa28- Xaa29- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39- Xaa40- Xaa41- Xaa42 
式 (I)  (配列番号１)
【００５０】
式中、Xaa1は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-3-(2-アミノイミダゾール-4-イル) プロピオン酸、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2- ピリジルアラニンまたは4-ピリジルアラニンまたはL-チロシンである；
Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa5は、ThrまたはSerである；
Xaa7は、ThrまたはSerである；
Xaa8は、SerまたはAspである；
Xaa9は、GluまたはAspである；
Xaa10は、Val、Met、LeuまたはTyrである；
Xaa11は、SerまたはAsnである；
Xaa12は、Ser、ThrまたはLysまたはIleである；
Xaa13は、Tyr、Ile、AlaまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa15は、AspまたはGluである；
Xaa16は、Gly、Asn、GluまたはLysである；
Xaa17は、Leu、Gln、GluまたはIleである；
Xaa18は、AlaまたはHisである；
Xaa19は、Ala、GlnまたはValである；
Xaa20は、Lys、ArgまたはGlnである；
Xaa21は、Asp、GluまたはLeuである；
Xaa23は、IleまたはValである；
Xaa24は、Ala、AsnまたはGluである；
Xaa26は、LeuまたはIleである；
Xaa27は、Val、Ile、Leu、ArgまたはLysである；
Xaa28は、Lys、Gln、AlaまたはAsnである；
Xaa29は、Gly、ThrまたはGlnである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Ile、Gly、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Thr、Lys、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Asp、Lys、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Arg、Asn、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Asp、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Trp、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa37は、Lys、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa38は、His、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Asn、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa40は、Ile、アミドまたは欠失である；
Xaa41は、Thr、アミドまたは欠失である；
Xaa42は、Gln、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、またはXaa42が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【００５１】
一実施態様において、アミノ酸配列は、以下の式２によるものである：
His- Xaa2- His- Gly- Xaa5- Phe- Xaa7- Xaa8- Xaa9- Xaa10- Xaa11- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Xaa15- Xaa16- Xaa17- Ala- Xaa19- Xaa20- Xaa21- Phe- Ile- Xaa24- Trp- Leu- Xaa27- Xaa28- Xaa29- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39
式(2) (配列番号2)
【００５２】
式中、Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa5は、ThrまたはSerである；
Xaa7は、ThrまたはSerである；
Xaa8は、SerまたはAspである；
Xaa9は、GluまたはAspである；
Xaa10は、Val、Met、またはLeuである；
Xaa11は、SerまたはAsnである；
Xaa12は、Ser、ThrまたはLysである；
Xaa13は、Tyr、IleまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa15は、AspまたはGluである；
Xaa16は、Gly、AsnまたはGluである；
Xaa17は、Leu、GlnまたはGluである；
Xaa19は、AlaまたはValである；
Xaa20は、LysまたはArgである；
Xaa21は、Asp、GluまたはLeuである；
Xaa24は、Ala、AsnまたはGluである；
Xaa27は、Val、IleまたはLysである；
Xaa28は、Lys、GlnまたはAsnである；
Xaa29は、GlyまたはThrである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Ile、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Thr、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Asp、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Arg、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa37は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa38は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、またはXaa39が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【００５３】
一実施態様において、アミノ酸配列は、以下の式３によるものである：
His- Xaa2- His- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Xaa10- Ser- Xaa12- Xaa13- Xaa14- Glu- Xaa16- Xaa17- Ala- Xaa19- Xaa20- Xaa21- Phe- Ile- Xaa24- Trp- Leu- Xaa27- Xaa28- Gly- Xaa30- Xaa31- Xaa32- Xaa33- Xaa34- Xaa35- Xaa36- Xaa37- Xaa38- Xaa39
式 (3) (配列番号:3)
【００５４】
Xaa2は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、1-アミノシクロプロパンカルボン酸、1-アミノシクロブタンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロヘプタンカルボン酸、または1-アミノシクロオクタンカルボン酸である；
Xaa10は、ValまたはLeuである；
Xaa12は、SerまたはLysである；
Xaa13は、TyrまたはGlnである；
Xaa14は、LeuまたはMetである；
Xaa16は、GlyまたはGluである；
Xaa17は、GlnまたはGluである；
Xaa19は、AlaまたはValである；
Xaa20は、LysまたはArgである；
Xaa21は、GluまたはLeuである；
Xaa24は、AlaまたはGluである；
Xaa27は、ValまたはLysである；
Xaa28は、LysまたはAsnである；
Xaa30は、Arg、LysまたはGlyである；
Xaa31は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa32は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa33は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa34は、Gly、アミドまたは欠失である；
Xaa35は、Ala、アミドまたは欠失である；
Xaa36は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa37は、Pro、アミドまたは欠失である； 
Xaa38は、Pro、アミドまたは欠失である；
Xaa39は、Ser、アミドまたは欠失である；
Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37、Xaa38、またはXaa39が欠失であるという条件で、各アミノ酸残基の下流もまた欠失である。
【００５５】
他の実施態様において、2つのGLP-1アゴニストは、以下の位置の一つでアミノ酸残基を介して二量体化される：
GLP-1：残基番号18、22、26、34、36、37または38
エキセンジン-4：残基番号12、16、20、32、33または34。
【００５６】
他の実施態様において、本発明は、以下のものから選択される前述のクレームのいずれか一つに記載の化合物に関する。
【００５７】
N,N'-Bis-[イプシロン(26-デスアミノArg34, Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
N,N'-Bis-[イプシロン, 26-デスアミノArg34,Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,14-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
【化１】
2008533104.tif 000002
【００５８】
N,N'-Bis-[イプシロン, 34-デスアミノ {Arg12, Leu14, Arg27, Lys34} エキセンジン-4 (1-39)-アミド-イプシロン, 34-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
N,N'-Bis-[イプシロン, 26-デスアミノArg34,Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,14-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド)
【化２】
2008533104.tif 000003
【００５９】
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ Arg26、Arg34、Lys20-GLP-1(7-37)-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、38-デスアミノ Arg26、Arg34、Lys38-GLP-1(7-37)-イプシロン, 38-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、18-デスアミノ Arg26、Arg34、Lys16-GLP-1(7-37)-イプシロン, 18-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、39-デスアミノ{Arg12、Leu14、Arg27、Lys39}エキセンジン-4(1-39)-アミド-イプシロン, 39-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、および
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ{Arg12、Leu14、Arg27、Lys20}エキセンジン-4(1-39)-アミド-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド。
【００６０】
N,N'-Bis-[イプシロン、26-デスアミノ デスアミノ-His7、Arg34、Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ デスアミノ-His7、Arg26、Arg34、Lys20-GLP-1(7-37)-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、38-デスアミノ デスアミノ-His7、Arg26、Arg34、Lys38-GLP-1(7-37)-イプシロン, 38-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、18-デスアミノ デスアミノ-His7、Arg26、Arg34、Lys16-GLP-1(7-37)-イプシロン, 18-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、26-デスアミノ Aib8、Arg34、Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ Aib8、Arg26、Arg34、Lys20-GLP-1(7-37)-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、38-デスアミノ Aib8、Arg26、Arg34、Lys38-GLP-1(7-37)-イプシロン, 38-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、18-デスアミノ Aib8、Arg26、Arg34、Lys16-GLP-1(7-37)-イプシロン, 18-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、26-デスアミノ Gly8、Arg34、Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ Gly8、Arg26、Arg34、Lys20-GLP-1(7-37)-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、38-デスアミノ Gly8、Arg26、Arg34、Lys38-GLP-1(7-37)-イプシロン, 38-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、18-デスアミノ Gly8、Arg26、Arg34、Lys16-GLP-1(7-37)-イプシロン, 18-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン(26-デスアミノ Val8、Arg34、Lys26-GLP-1(7-37)-イプシロン, 26-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、20-デスアミノ Val8、Arg26、Arg34、Lys20-GLP-1(7-37)-イプシロン, 20-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、38-デスアミノ Val8、Arg26、Arg34、Lys38-GLP-1(7-37)-イプシロン, 38-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-Bis-[イプシロン、18-デスアミノ Val8、Arg26、Arg34、Lys16-GLP-1(7-37)-イプシロン, 18-イル]-O,O'-1,13-ジデオキシ-テトラエチレングリコール-ヒドロアクリルアミド、
N,N'-ビス((((S)-5-([Aib,8,22,35]GLP-1(1-37)イル)-5-カルバモイルペンチル)カルバモイル)メトキシ)へキサン-1,6-ジイミン
N,N'ビス((((S)-5-(N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37) イル)-5-カルバモイルペンチル) カルバモイル)メトキシ)エタン-1,2-ジイミン。
【００６１】
他の側面において、本発明は、GLP-1アゴニストによる患者の肺性生物学的利用能を増加させる方法であって、二官能性の架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において、本発明による化合物を生成することを特徴とする方法に関する。
【００６２】
他の側面において、本発明は、GLP-1アゴニストの患者における作用強度に対する肺性生物学的利用能の割合を増加させる方法であって、二官能性の架橋リンカーを介した前記GLP-1アゴニストの二量体化において、本発明による化合物を生成することを特徴とする方法に関する。
【００６３】
本発明の他の対象は、0.1mg/ml〜25mg/mlの濃度中に存在する本発明による化合物を含む薬学的処方であって、3.0〜9.0のpHを有する処方を提供することである。前記処方にはさらに、緩衝液系、保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤が含まれる。本発明の一実施態様において、薬学的処方は、水性処方、すなわち、処方含有水である。このような処方は、典型的には溶液または縣濁液である。本発明のさらなる実施態様において、薬学的処方が水性溶液である。用語「水性処方」は、少なくとも50％w/w水を含む処方として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも50％w/w水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも50％w/w水を含む懸濁液として定義される。
【００６４】
他の実施態様において、薬学的処方は凍結乾燥された処方であり、医師または患者は、使用する前に溶媒および／または希釈剤を加える。
【００６５】
他の実施態様において、薬学的処方は、事前の溶解処理をしないで使用状態にある乾燥処方（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥処方）である。
【００６６】
さらなる側面において、本発明は、本発明による化合物の水溶液を含む薬学的処方、および緩衝液に関する。前記化合物は0.1mg/ml以上の濃度で存在し、前記処方は約3.0〜約9.0までのpHを示す。
【００６７】
本発明の他の実施態様において、処方のpHは約7.0〜約9.5である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約3.0〜約7.0である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約5.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約7.5〜約9.0である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約7.5〜約8.5である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約6.0〜約7.5である。本発明の他の実施態様において、処方のpHは約6.0〜約7.0である。
【００６８】
本発明のさらなる実施態様において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、ナトリウム二水素リン酸塩、二ナトリウム水素リン酸塩、リン酸ナトリウムおよびtris(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝液の各々は、本発明の代替の実施態様を構成する。
【００６９】
本発明のさらなる実施態様において、処方には、薬学的に許容可能な保存剤が含まれる。本発明のさらなる実施態様において、保存剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシ安息香酸塩、プロピルp-ヒドロキシ安息香酸塩、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシ安息香酸塩、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロオキシ安息香酸塩、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)またはこれらの混合物からなる群から選択される。本発明のさらなる実施態様において、保存剤は0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、保存剤は0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、保存剤は5mg/ml〜10mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、保存剤は10mg/ml〜20mg/mlの濃度にある。これらの特定の保存剤の各々は、本発明の代替の実施態様を構成する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者にとって周知である。便宜上、参照文献には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.がある。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様において、処方はさらに等張剤を含む。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール(アミノ酸(例えばグリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばPEG400)、またはこれらの混合物からなる群から選択される。任意の糖、例えば単糖、二糖、または多糖、または水溶性グルカン、  フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性スターチ、ヒドロキシエチルスターチおよびカルボキシメチルセルロース-Naが使用されてもよい。一実施態様において、糖添加物はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの-OH基を有するC4-C8炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールを含む。一実施態様において、糖アルコール添加物はマンニトールである。上述した糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用されてもよい。糖または糖アルコールが液体製剤中において可溶性であり、かつ本発明の方法を使用して達成される安定効果に悪影響を与えない限り、使用される量に制限はない。一実施態様において、糖または糖アルコール濃度は、約1mg/ml〜約150mg/mlである。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は1mg/ml〜50mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は1mg/ml〜7mg/mlの濃度の濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は8mg/ml〜24mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、等張剤は25mg/ml〜50mg/mlの濃度にある。これらの特定の等張剤の各々は、本発明の代替の実施態様を構成する。薬学的組成物における等張剤の使用は、当業者にとって周知である。便宜上、参照文献には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.がある。
【００７１】
本発明のさらなる実施態様において、処方はさらにキレート剤を含む。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸の塩およびこれらの混合物から選択される。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度にある。本発明のさらなる実施態様において、キレート剤は2mg/ml〜5mg/mlの濃度にある。これらの特定のキレート剤は各々、本発明の代替の実施態様を構成する。薬学的組成物におけるキレート剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、参照文献には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.がある。
【００７２】
本発明のさらなる実施態様において、処方はさらに安定剤を含む。薬学的組成物における安定剤の使用は当業者に周知である。便宜上、参照文献には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.がある。
【００７３】
より具体的には、本発明の組成物は、治療学的活性成分が液体薬学的処方における貯蔵中に凝集形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む、安定した液体薬学的組成物である。「凝集形成」とは、可溶性のままであってもよいが、オリゴマーの形成をもたらすか、あるいは溶液から沈殿する大きな可視的凝集塊をもたらすポリペプチド分子間の物理的相互作用を意味する。「貯蔵中」とは、患者に直ちには投与されない、予め調製された液体薬学的組成物または処方を意味する。むしろ、調製後、それは貯蔵のために液体形態、凍結状態、または液体形態への後の再構成のための乾燥形態または患者への投与に適した他の形態においてパッケージされる。「乾燥形態」とは、凍結乾燥(すなわち、凍結乾燥(lyophilisation); 例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; および Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照)、または空気乾燥 (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; および Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)によって乾燥された液体薬学的組成物または処方を意味する。液体薬学的組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成は、薬学的組成物の治療の効果の喪失をもたらす、そのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼしうる。さらに、凝集形成は、他の問題、例えば、ポリペプチド含有の薬学的組成物を注入システムを使用して投与するとき、管、膜またはポンプの目詰まりを引き起こしうる。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含んでいてもよい。「アミノ酸塩基」とは、任意の所与のアミノ酸がその遊離塩基の形態またはその塩の形態において存在する、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを意味する。アミノ酸の組み合わせが使用される場合、全てのアミノ酸は、その遊離塩基の形態において存在していてもよいし、全てがその塩の形態において存在していてもよいし、あるいはいくつかがその遊離塩基の形態において存在している一方、他のものがその塩の形態において存在していてもよい。一実施態様において、本発明の組成物を調製するのに使用するアミノ酸は、荷電側鎖を有するもの、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。特定のアミノ酸（例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびこれらの混合物）の任意の立体異性体（すなわち、L、D、またはこれらの混合物）またはこれらの立体異性体の組み合わせは、その特定のアミノ酸がその遊離塩基の形態またはその塩の形態において存在する限り、本発明の薬学的組成物中に存在していてもよい。一実施態様において、L-立体異性体が使用される。本発明の組成物はまた、これらのアミノ酸の類似体で処方されてもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成を減少させる所望の効果をもたらす、天然に生ずるアミノ酸の誘導体を意味する。適切なアルギニン類似体には、例えば、アミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニンおよびブチオニンが含まれ、適切なシステイン類似体には、S-メチル-L-システインが含まれる。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、その遊離塩基の形態またはその塩の形態において組成物中に組み込まれる。本発明のさらなる実施態様において、アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止または遅延させるのに十分な濃度において使用される。
【００７５】
本発明のさらなる実施態様において、メチオニン(または他の硫黄アミノ酸またはアミノ酸類似体)は、治療学的薬剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも一つのメチオニン残基を含むポリペプチドであるとき、メチオニンスルホキシドのメチオニン残基の酸化を阻害するために添加されてもよい。「阻害する」とは、経時にわたるメチオニン酸化種の最小の蓄積を意味する。メチオニン酸化の阻害は、その適切な分子の形態におけるポリペプチドのより大きな保持をもたらす。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が通常の薬剤に対して許容可能である、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきである。典型的には、これは組成物が約10％〜約30%以下のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般的には、これは添加されるメチオニン対メチオニン残基の割合が、1：1〜1000：1、例えば10：1〜100：1の範囲に入るメチオニンを添加することによって達成され得る。
【００７６】
本発明のさらなる実施態様において、処方は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物の群から選択された安定剤をさらに含む。本発明のさらなる実施態様において、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはこれらの類似体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールおよび異なる塩（例えば、塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各々は、本発明の代替の実施態様を構成する。
【００７７】
薬学的組成物はまた、治療学的活性のあるポリペプチドの安定性をさらに増強する、追加の安定剤を含んでもよい。本発明に特定に適した安定剤には、これらに制限されないが、メチオニンおよびEDTA（メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護）、および非イオン性界面活性剤（凍結-解凍または機械的せん断と関連した凝集に対してポリペプチドを保護）が含まれる。
【００７８】
本発明のさらなる実施態様において、処方はさらに界面活性剤を含む。本発明のさらなる実施態様において、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化されたヒマシ油、多糖化されたグリセリド、アセチル化されたモノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、ポロキサマー、例えばPluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188および407、TritonX-100）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えばアルキル化およびアルコキシル化された誘導体（トゥイーン、例えばTween-20、Tween-40、Tween-80、Brij-35）、モノグリセリドまたはそのエトキシル化された誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン）、リン脂質の誘導体（例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリソリン脂質（例えば、パルミトイルリソホスファチジル-L-セリンおよび1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸塩、エタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンのエステル）およびアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)- リソホスファチジルおよびホスファチジルコリンの誘導体、例えばリソホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、および極性頭基の修飾体、すなわち、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、および正に帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リソホスファチジルセリンおよびリソホスファチジルスレオニン、およびグリセロリン脂質(例えば、セファリン)、グリセロ糖脂質(例えば、ガラクトピランソイド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、セラミド、ガングリオシド)、ドデシルホスホコリン、雌卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体- （例えばナトリウムtauro-ジヒドロフシジン酸塩など)、 長鎖脂肪酸およびその塩  C6-C12(例えば、オレイン酸およびカプリル酸)、アシルカルニチンおよび誘導体、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体、またはリシンまたはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシンまたはアルギニンまたはヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含むジペプチドのNα-アシル化誘導体、中性アミノ酸および二電荷のアミノ酸の任意の組み合わせを含むトリペプチド、DSS (ドキュセートナトリウム、CAS登録番号[577-11-7])、ドキュセートカルシウム、CAS登録番号[128-49-4]、ドキュセートカリウム、CAS登録番号[7491-09-0]、SDS(ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸またはこれらの誘導体、胆汁酸およびその塩、およびグリシンまたはタウリン抱合体、ウルソデオキシコール酸、ナトリウムコール酸塩、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、ナトリウムグリココール酸塩、 N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、陰イオン（アルキル-アリール-スルホン酸塩)の一価の界面活性剤��両性イオンの界面活性剤（例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、3-コルアミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸塩、陽イオン界面活性剤(第四級アンモニウム塩基)(例えば、セチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤（例えば、ドデシルβ-グルコピラノシド)、ポロキサミン(例えば、Tetronic製)から選択される。これらは、プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドのエチレンジアミンに対する連続的付加から誘導された四官能性ブロックコポリマーである。界面活性剤はまた、イミダゾリン誘導体またはこれらの混合物の群から選択されてもよい。これらの特定の界面活性剤は各々、本発明の他の実施態様を構成する。
【００７９】
薬学的組成物中における界面活性剤の使用は当業者にとって周知である。便宜上、参照文献には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.がある。
【００８０】
本発明のさらなる実施態様において、前記処方にはさらに、プロテアーゼ阻害剤、例えばEDTA（エチレンジアミン四酢酸）およびベンズアミジンHClが含まれるが、他の商業的に利用可能なプロテアーゼ阻害剤もまた使用され得る。プロテアーゼ阻害剤の使用は、自己触媒を阻害するためにプロテアーゼの酵素前駆体を含む薬学的組成物中において特に有用である。
【００８１】
可能であれば、他の成分が、本発明のペプチド薬学的処方中に存在していてもよい。このような追加の成分には、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、充填剤、張度修飾剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質)および両性イオン(例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンのようなアミノ酸)を含んでいてもよい。このような追加の成分は、当然ながら、本発明の薬学的処方の全体的安定性に悪影響を与えるべきではない。
【００８２】
本発明による化合物を含む薬学的組成物は、幾つかの部位、例えば局所的部位（例えば、皮膚および粘膜部位）、バイパス吸収部位（例えば、動脈内、静脈内、心臓内投与）、吸収に関与する部位（例えば、皮膚内、皮膚下、粘膜内または腹部内投与）で、このような治療を必要とする患者に投与され得る。
【００８３】
本発明による薬学的組成物の投与は、投与のいくつかの経路、例えば、舌、舌下、頬、口、経口、胃および腸、鼻、肺内を通して、細気管支および肺胞またはこれらの組み合わせ、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を通して、例えば、結膜、尿管、および非経口を通して、このような治療を必要とする患者に行われる。
【００８４】
本発明の組成物は、いくつかの投与形態、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、多重エマルジョン、フォーム、軟膏(salve)、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、コーティング錠、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル、および軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアロゾル、吸入剤、点眼薬、眼軟膏、眼リンス、膣ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注入溶液、in situ 形質転換溶液、例えば、in situ ゲル化、in situ 硬化、in situ 沈殿、in situ 結晶化、注入溶液、およびインプラントとして投与され得る。
【００８５】
本発明の組成物は、薬剤キャリア、薬剤送達系および高度薬剤送達系内に配合されるか、または、例えば、共有結合、疎水性結合および静電的相互作用を介して結合されてもよく、本発明の化合物の安定生をさらに増強させ、生物学的利用能を増加させ、可溶性を増加させ、悪影響を減少させ、当業者に周知の時間治療を達成し、患者のコンプライアンスを増加させ、あるいはこれらの任意の組み合わせを提供する。キャリア、薬剤送達系および高度薬剤送達系の例は、これらに限定されないが、ポリマー、例えば、セルロースおよびその誘導体、多糖、例えばデキストランおよびその誘導体、スターチおよびその誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレートおよびメタクリレートポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびこれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、キャリアタンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば、熱発生ゲル系、例えば当業者に周知のブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ粒子、液晶およびその分散媒、脂質-水系中の相挙動の当業者に周知の、L2相およびその分散媒、高分子ミセル、多重エマルジョン、自己乳化、自己マイクロ乳化、シクロデキストリンおよびその誘導体、およびデンドリマーを含む。
【００８６】
本発明の組成物は、例えば、当業者に周知の装置である計量投与吸入器、乾燥粉末吸入器および噴霧器を使用する、本発明の化合物の肺性投与のための固体、半固体、粉末および溶液の処方において有用である。
【００８７】
本発明の組成物は、特に、制御性、徐放性、長期性、遅延性、および緩やかな放出性を示す薬剤送達系の処方において有用である。より具体的には、これらに限定されないが、組成物は、非経口的な制御放出系および徐放性放出系（両系は投与の回数を何倍にも減らす）の処方において有用である。さらにより好ましくは、皮下投与の制御放出系および徐放性放出系である。本発明の範囲を制限することなしに、有用な制御放出系および組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、高分子ミセル、ミクロスフェア、ナノ粒子である。本発明の組成物に有用な制御放出系を産生する方法は、これらに限定されないが、結晶、凝集、共結晶、沈殿、共沈、乳化、分散、高圧均質化、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアをもたらす溶媒蒸発、押し出しおよび超臨界流体プロセスを含む。一般的な参照文献には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) および Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) がある。
【００８８】
非経口的投与は、シリンジ、任意的にはペン状シリンジによって皮下、筋肉内、腹腔内または静脈注射によって行なってもよい。代わりに、非経口的投与は輸液ポンプによって行なってもよい。さらなるオプションは、鼻または肺スプレーの形態において本発明の化合物の投与に適した溶液または懸濁液となり得る組成物である。また、さらなるオプションとして、本発明の化合物を含む薬学的組成物はまた、経皮的投与、例えば、無針注入またはパッチ、任意的にはイオン導入パッチ、または経粘膜、例えば頬投与に適合し得る。
【００８９】
本発明の化合物は、肺経路を介してビヒクル中において、肺薬剤送達に適した任意の周知のタイプの装置を使用する溶液、懸濁液または乾燥粉末として投与され得る。これらの例は、これらに限定されないが、肺薬剤送達のための三つの通常タイプのエアロゾル-生成を含み、かつジェットまたは超音波噴霧器、計量投与吸入器、または乾燥粉末吸入器を含み得る(Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453)。
【００９０】
標準化された試験方法に基づいて、粒子の空気力学的径(da)は、単位密度(1g/cm3)の基準ゲージの球状の粒子の幾何学的な等価直径として定義される。最も単純な場合において、球状の粒子については、daは、以下の式によって記載されるような密度比の平方根の関数として基準直径(d)と関係づけられる。
【数１】
2008533104.tif 000004
この関係に対する修正が、非球状の粒子(参照. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385)のために行なわれる。用語「MMAD」および「MMEAD」は、十分に記載されかつ当業者に周知である(参照. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R and represents a measure of the median value of an aerodynamic particle size distribution. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385)。空気動力学的粒径(MMAD)および空気動力学的有効粒径(MMEAD)は、相互交換可能に使用される統計学的パラメーターである。そして、経験的に、実際の形状、サイズまたは密度とは無関係に、肺内に堆積するその能力と関係してエアロゾル粒子のサイズを説明する(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。MMADは、空気中の粒子の慣性挙動を測定する装置である衝撃装置で算出された測定値から通常計算される。
【００９１】
さらなる実施態様において、任意の既知のエアロゾル化技術、例えば、噴霧化によって処方をエアロゾル化することができ、10μｍ未満、より好ましくは1〜5μm、および最も好ましくは1〜3μmのMMADのエアロゾル粒子を得ることができる。好ましい粒子サイズは、深部肺への薬剤の送達のために最も効果的なサイズに基づいており、この場合、タンパク質は最適に吸収される(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。
【００９２】
本発明の化合物を含む肺性処方の深部肺堆積は、任意的には、吸入技術の修飾、例えば、これに限定されないが、遅い吸入流（例えば、30L/分）、呼吸保持およびタイミングの作動によってさらに最適化されてもよい。
【００９３】
用語「安定化された処方」とは、物理的安定性の増加した、化学的安定性の増加した、または物理的および化学的安定性の増加した処方をいう。
【００９４】
本明細書中に使用されたタンパク質処方の用語「物理的安定性」とは、熱-機械的応力および／または疎水性表面および界面のような不安定な界面および表面での相互作用にタンパク質がさらされた結果として、タンパク質の生物学的に不活性および／または不溶性の凝集塊を形成するタンパク質の傾向をいう。水性タンパク質処方の物理的安定性は、適切な容器（例えば、カードリッジまたはバイアル）内に充填された処方に対し、様々な時間間隔にわたって異なる温度で機械的／物理的応力（例えば撹拌）を加えた後、可視検査および／または濁度測定によって評価される。処方の可視検査は、暗背景下で焦点を絞った光の中で行なわれる。処方の濁度は、例えば0〜3のスケールで濁度の程度をランク付けした可視スコアによって特徴づけられる（濁りが認められない処方は可視スコア0に対応し、昼光において可視的な濁りを示す処方は可視スコア3に対応する）。ある処方が昼光において可視的濁りを示すとき、その処方はタンパク質の凝集に関して物理的不安定なものとして分類される。代わりに、処方の濁度は、当業者に周知の単純な濁度測定によって評価することもできる。水性タンパク質処方の物理的安定性はまた、タンパク質の立体構造状態の分光学的薬剤またはプローブを使用することによって評価され得る。プローブは、好ましくはタンパク質の非自然的な配座異性体と優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一例には、チオフラビンTがある。チオフラビンTは、アミロイド原線維の検出のために広く使用されてきた蛍光色素である。原線維および時に他のタンパク質の立体配置の存在中において、チオフラビンTは、約450nmで新しい励起最大値を生み出し、原線維タンパク質形態に結合したとき約482nmで増強した発光を放つ。未結合のチオフラビンTは、その波長では実質的に蛍光を放たない。
【００９５】
他の小分子は、自然状態から非自然状態までのタンパク質構造の変化のプローブとして使用することができる。例えば、「疎水性パッチ」プローブは、タンパク質の露出した疎水性パッチと優先的に結合するプローブである。疎水性パッチは、通常はその自然状態におけるタンパク質の四次構造内に覆い隠されているが、タンパク質のフォールディングが崩れたり変性し始めると露出してくる。これらの小さな分子の例、分光学的プローブは、芳香族、疎水性色素、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリンまたはこれらに類するものである。他の分光学的プローブは、金属-アミノ酸複合体、例えば、疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリン）のコバルト金属複合体、またはこれに類するものである。
【００９６】
本明細書中において使用されるタンパク質処方の用語「化学安定性」とは、天然タンパク質構造と比較して潜在的に弱い生物学的作用強度および／または潜在的に増加した免疫原性質をもつ化学的分解産物の形成を導くタンパク質構造の化学的な共有結合の変化をいう。様々な化学的分解産物が、天然タンパク質の種類および性質ならびにタンパク質がさらされる環境に依存して形成され得る。化学的分解の除去はおそらく完全に避けることはできず、化学的分解産物の量の増加は、しばしば貯蔵中および当業者に周知のタンパク質処方の使用中に観察される。大部分のタンパク質は脱アミドを起しやすく、あるプロセス中において、グルタミニルまたはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基は加水分解されて遊離のカルボン酸を形成する。他の分解経路は、高分子量の形質転換産物の形成に関与し、二以上のタンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を通して互いに共有結合し、共有結合二量体、オリゴマーおよびポリマー分解産物の形成を導く(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化（例えばメチオニン残基の）は、化学的分解の他の変化として言及され得る。タンパク質処方の化学的安定性は、異なる環境条件（分解産物の形成はしばしば例えば温度の上昇によって加速され得る）にさらした後の様々な時間点で化学的分解産物の量を測定することによって評価され得る。各個々の分解産物の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術（例えば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC）を使用した、分子サイズおよび／または電荷に依存する分解産物の分離によって決定される。
【００９７】
従って、上記に概説したように、「安定した処方」とは、物理的安定性の増加、化学的安定性の増加、または物理的および化学的安定性の増加した処方をいう。一般的には、処方は、使用期限に到達するまで、使用および貯蔵中（推奨された使用および貯蔵条件に従って）に安定でなければならない。
【００９８】
本発明の一実施態様において、本発明の化合物を含む薬学的処方は、６週間以上の使用の間、および３年間以上の貯蔵の間安定である。
【００９９】
本発明の他の実施態様において、本発明の化合物を含む薬学的処方は、４週間以上の使用の間、および３年間以上の貯蔵の間安定である。
【０１００】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の化合物を含む薬学的処方は、４週間以上の使用の間、および２年以上の貯蔵の間安定である。
【０１０１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の化合物を含む薬学的処方は、２週間以上の使用の間、および２年以上の貯蔵の間安定である。
【０１０２】
他の側面において、本発明は、薬剤の調製のための本発明による化合物の使用に関する。
【０１０３】
一実施態様において、本発明による化合物は、高血糖症、２型糖尿病、障害性グルコース耐性、１型糖尿病、肥満症、高血圧症、Ｘ症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、冠性心疾患および他の心臓血管障害、炎症性腸症候群、消化不良および胃潰瘍の治療または予防のための薬剤の調製のために使用される。
【０１０４】
他の実施態様において、本発明による化合物は、２型糖尿病の疾病進行を遅延または予防する薬剤の調製のために使用される。
【０１０５】
他の実施態様において、本発明による化合物は、食物摂取を減少させ、β細胞のアポトーシスを減少させ、β細胞の機能およびβ細胞の量を増加させ、および／またはβ細胞に対するグルコース感受性を回復させる薬剤の調製のために使用される。
【０１０６】
本発明による化合物での治療はまた、２以上の薬学的に活性な物質、例えば、抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲制御薬、血圧降下薬、糖尿病からまたは糖尿病に関連した合併症の治療および／または予防のための薬剤、ならびに肥満症からまたは肥満症に関連した合併症および疾患の治療および／または予防のための薬剤から選択されたものと組み合わされてもよい。これらの薬学的に活性な物質の例は、インスリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、グルコシダーゼ阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼ-IV）阻害剤、糖新生および／またはグリコーゲン分解の刺激に関与した肝臓酵素の阻害剤、グルコース取り込み修飾剤、脂質代謝を修飾する化合物、例えば、抗高脂血症剤、HMG CoA 阻害剤（染色）、Gastric阻害性ポリペプチド（GIPアナログ）、食物摂取を減少させる化合物、RXRアゴニストおよびβ細胞のATP依存性リン酸チャネルに作用する薬剤；コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブレート、ゲミフィブロジル、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン、ネテグリニド、レパグリニド; β-ブロッカー、例えばアルプレノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロール、ACE（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、例えばベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、アラトリオプリル、キナプリル および ラミプリル、カルシウムチャネルブロッカー、例えばニフェジピン、フェロジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、ジルチアゼム および ベラパミル、および α-ブブロッカー、例えばドキサゾシン、ウラピジル、プラゾシンおよびテルアゾシン；１ CART(コカイン アンフェタミン制御転写物)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、PYYアゴニスト、PYY2アゴニスト、PYY4アゴニスト、混合されたPPY2/PYY4アゴニスト、MC4(メラノコルチン4)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(副腎皮質刺激ホルモン放出因子)アゴニスト、CRF BP(副腎皮質刺激ホルモン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β3アゴニスト、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラノサイト濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤、混合されたセロトニンおよびノルアドレナリン作用の化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシン アゴニスト、ガラニン アンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(チレオトロピン放出ホルモン)アゴニスト、UCP 2または3(脱共役タンパク質2または3)修飾因子、レプチン アゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)修飾因子、TRβアゴニスト；ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト(GIPアナログ)、ガストリンおよびガストリン類似体である。
【０１０７】
一以上の上述した化合物および任意的に一以上のさらなる薬学的活性物質を含む本発明による化合物の任意の適切な組み合わせは、本発明の範囲内にあるとみなされる。この点を理解すべきである。
【０１０８】
本発明はさらに、以下の例によって例証されるが、保護の範囲を制限するものとして解釈されない。前述した記述および以下の例において開示された特徴は、両方別個におよびその任意の組み合わせにおいて、その多様な形態において本発明を実現させるための材料である。
【例】
【０１０９】
商業的に利用可能な化学物質について以下の頭字語が使用される：
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
DCC: N,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド
NMP: N-メチル-2-ピロリドン
TFA: トリフルオロ酢酸
THF: テトラヒドロフラン
DIEA: ジイソプロピルエチルアミン
H2O: 水
CH3CN: アセトニトリル
HBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3 テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩
Fmoc: 9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル  
Boc:  tert ブチルオキシカルボニル
OtBu: tert ブチルエステル
tBu: tert ブチル
Trt: トリフェニルメチル
Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DCM: ジクロロメタン 
TIS: トリイソプロピルシラン
Et2O: : ジエチルエーテル
H-Glu(OH)-OBut: : L-グルタミン酸α-tert-ブチル エステル
HOOC-(CH2)12-COONSu: ω-カルボキシトリデカン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル。
【０１１０】
HOOC-(CH2)14-COONSu: ω-カルボキシペンタデカン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル。
【０１１１】
HOOC-(CH2)16-COONSu: ω-カルボキシヘプタデカン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル。
【０１１２】
HOOC-(CH2)18-COONSu: ω-カルボキシノナデカン酸2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル。
【０１１３】
略語：
r.t: 室温 
PDMS: プラズマ脱離質量分析
MALDI-MS: マトリックス補助レーザ脱離/イオン化質量分析
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
amu: 原子質量単位
【０１１４】
分析：
ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性を、以下の分解アッセイによって決定する：
ペプチドのアリコートを、pH 7〜8の適切な緩衝液中において4〜22時間にわたって精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼIVのアリコートで37℃でインキュベートする（緩衝液はアルブミンではない）。酵素反応をトリフルオロ酢酸の追加によって終了させ、ペプチド分解産物を、HPLCまたはLC-MS分析を使用して分離および定量する。この分析を実行するための一つの方法は以下のとおりである：混合液を、Zorbax 300SB-C18(30nmポア、5μm粒子)150×2.1mmカラム上に入れ、0.1％トリフルオロ酢酸中の直線的な勾配のアセトニトリル（30分間にわたる0％〜100％アセトニトリル）で0.5ml/分の流速で溶出する。ペプチドおよびその分解産物を、214nm（ペプチド結合）または280nm（芳香族アミノ酸）の吸光度によってモニターしてもよく、そのピーク領域の成分によって定量化してもよい。分解パターンを、LC-MSを使用することによって決定することができる。離れたピークのMSスペクトルが決定され得る。与えられた時間での未分解(intact)／分解の割合を、ペプチドDPPIV安定性の評価のために使用する。
【０１１５】
ペプチドは、与えられた時間での未分解化合物の割合に基づいた天然ペプチドよりも10倍以上安定である安定化されたDPPIVとして定義される。従って、DPPIV安定化GLP-1化合物は、GLP-1(7-37)よりも少なくとも10倍以上安定である。
【０１１６】
一般的な合成方法
ペプチドを、Fmoc保護されたRinkアミド樹脂(Novabiochem)またはクロロトリチル樹脂または固相ペプチド合成に適した類似の樹脂上で合成してもよい。Boc化学を使用してもよいが、Applied Biosystems 433Aペプチド合成装置上で最終的にFmocプロトコルを使用することがより便利である。ここでは、N-メチルピロリドン（N-メチルピロリドン）中のHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3 テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスファート)媒介カップリング剤（HATUは障害されたカップリング剤のためにより適切である）およびFmoc保護基の脱保護のUVモニタリングを使用する。また、例えば、Current Opinion in Chemical Biology, 2004, 8:211-221に記載されたようなHBTUおよびHATUからの他のカップリング試薬を使用してもよい。使用される保護アミノ酸誘導体は、供給者、例えばBachemから購入され、かつ空のカートリッジに移される非天然アミノ酸、例えばFmoc-Aib-OH（Fmoc-アミノイソブチル酸）を除いた、ABI433A合成装置に適したプリウェイト（preweighed）カートリッジ(Applied Biosystems)中に供給された標準Fmoc-アミノ酸であってもよい。共役された最後のアミノ酸はBoc保護されてもよい。
【０１１７】
粗製の樹脂結合保護ペプチド上の特定のリシン残基に対する側鎖およびリンカーの付加を、自動合成の間、最終的にはFmoc-Lys(Dde)-OHの組み込みによって特定の位置に導入してもよい。その後、ヒドラジンでの選択的脱保護が行なわれる。他の直交性の保護基をリシン上に使用してもよい。
【０１１８】
Dde-保護の除去のための手順  樹脂（0.25 mmol）を、手動振盪装置／ろ過装置内に設置してもよい。N-メチルピロリドン中の2％ヒドラジンで処理し（20ml、2×12分）、DDE基を除去し、続いてN-メチルピロリドン（4×20ml）で洗浄する。
【０１１９】
リシン残基に対する側鎖の付加のための手順
アミノ酸（樹脂に対して４モル当量）を、N-メチルピロリドン／メチレンクロリド（1:1, 10ml）中に溶解してもよい。ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）（樹脂に対して４モル当量）およびジイソプロピルカルボジイミド（樹脂に対して４モル当量）を加え、溶液を15分間にわたって撹拌した。溶液を樹脂に加え、ジイソプロピエチルアミン（樹脂に対して４モル当量）を加えた。樹脂を室温で24時間にわたって撹拌する。樹脂を、N-メチルピロリドン（2×20ml）、N-メチルピロリドン／メチレンクロリド(1：1)(2×20ml)およびメチレンクロリド(2×20ml)で洗浄する。
【０１２０】
Fmoc-保護の除去のための手順：  樹脂（0.25 mmol）を、手動振盪装置内のろ過フラスコ中に設置し、N-メチルピロリドン／メチレンクロリド（1:1）(2×20ml)およびN-メチルピロリドン(1×20ml)、N-メチルピロリドン(3×20ml、各10分)で処理する。樹脂を、N-メチルピロリドン(2×20ml)、N-メチルピロリドン／メチレンクロリド(1:1)(2×20ml)およびメチレンクロリド(2×20ml)で洗浄する。
【０１２１】
樹脂からペプチドを開裂させるための手順：
ペプチドを、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシラン（95:2.5:2.5）の混合液において室温で180分間にわたって撹拌することによって樹脂から開裂させる。開裂混合液をろ過し、ろ液を窒素の流れによって油に濃縮させる。粗製ペプチドを45mlジメチルエーテルでこの油から沈殿させ、45mlジメチルエーテルで3回洗浄する。
【０１２２】
精製：  粗製ペプチドを、7μC-18シリカで充填された20mm×250mmカラム上で半調製用HPLCによって精製する。ペプチドに応じて一または二の精製システムを使用してもよい：
硫酸アンモニウム：カラムを、濃縮H2SO4でpH 2.5に調節された、0.05M (NH4)2SO4中の40%CH3CNで平衡化する。乾燥後、粗製ペプチドを、5ml 50％酢酸H2O中に溶解し、H2Oで20mlまで稀釈し、0.05M(NH4)2SO4 pH2.5中の40％〜60％ CH3CNの勾配で、40℃で50分間にわたり10 ml／分で溶出させるカラム上に注入する。画分を含むペプチドを収集し、3体積のH2Oで稀釈し、0.1% TFAで平衡化されたSep-Pak（登録商標）C18カードリッジ（Waters part. ♯:51910）を通過させる。その後、0.1％TFAを含む70％ CH3CNで溶出させ、精製ペプチドを水での溶出の稀釈後に凍結乾燥によって単離する。
【０１２３】
TFA：  乾燥後、天然のペプチドを、5ml 50%酢酸H2O中に溶解させ、H2Oで20mlまで稀釈し、0.1％ TFA中の40〜60℃ CH3CNの勾配で40℃で50分間にわたって10ml/分で溶出するカラム上に注入した。ペプチド含有画分を収集する。精製されたペプチドを、水を含む溶出液の稀釈後に凍結乾燥する。
【０１２４】
得られた最終生成物を、分析的なRP-HPLC(保持時間)およびLCMSによって特徴づけてもよい。
【０１２５】
実験部門において行なわれるRP-HPLC分析を、214nmでのUV検出および42℃で1ml/分で溶出するVydac218TP54 4.6mm×250mm 5μ C-18シリカカラム（Separations Group, Hesperia, USA）を使用して行った。異なる溶出条件は以下のとおりである：
A1：濃縮H2SO4でpH 2.5まで調節された、0.1M (NH4)2SO4からなる緩衝液中でのカラムの平衡と、50分間にわたる同じ緩衝液中の0%〜60% CH3CNの勾配による溶出
B1：0.1% TFA / H2Oでのカラムの平衡と、50分間にわたる0%CH3CN / 0.1% TFA / H2O〜60% CH3CN / 0.1% TFA / H2Oの勾配による溶出
B6：0.1% TFA / H2Oでのカラムの平衡と、50分間にわたる0% CH3CN / 0.1% TFA / H2O〜90% CH3CN / 0.1% TFA / H2Oの勾配にる溶出
代替のシステムは：
B4： RP-分析を、Waters 2487 二重バンド検出器に適合したAlliance Waters 2695 システムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry 300 C18 , 5μm, 3.9 mm x 150 mmカラム, 42℃を使用して収集した。1.0min/分の流速で15分間にわたって、水中の5〜95%アセトニトリル、90〜0％水、および5％トリフルオロ酢酸（1.0％）の直線的勾配での溶出を行う。
【０１２６】
LCMS方法１：
LCMSを、HP Chemstation ソフトウェアによって制御された、Hewlett Packard シリーズ 1100 G1312A Bin Pump、Hewlett Packard シリーズ 1100 カラムコンパートメント、Hewlett Packard シリーズ 1100 G1315A DAD ダイオードアレイ検出器、Hewlett Packard シリーズ 1100 MSD および Sedere 75 Evaporative Light Scattering 検出器からなるセットアップ上で行った。HPLCポンプを以下のものを含む二つの溶出リザーバに接続する。
【０１２７】
A：0.05%のTFA/水 
B：0.05%TFA/アセトニトリル。
【０１２８】
また、代わりに２つのシステムは、以下のとおりであってもよい：
A：水中10mM NH4OH
B：90%アセトニトリル中10mM NH4OH。
【０１２９】
その分析を、AおよびBの勾配で溶出されるカラム上に適切な容積のサンプル(好ましくは20μl)を注入することによって23℃で行った。
【０１３０】
使用されるHPLC条件、検知器の設定および質量分析計の設定を以下の表において与える。
【０１３１】
カラム    Waters Xterra MS C-18 (50×3mm id 5 μm)
勾配      1.5ml/分で6.5分中5%〜100%アセトニトリル線形
検出    210 nm (DADから放出する類似体)
ELS (ELSから放出する類似体)
MS  イオン化モード API-ES. Scan 550-1500 amu 工程 0.1 amu
LCMS方法2：
代わりに、LC-MS分析を、二つのPerkin Elmer Series 200 Micropumps、Perkin Elmer Series 200自動試料採取器、Applied Biosystems 785A UV検出器およびSedex 75 Evaporative光散乱検出器を備えたPE-Sciex API 100質量分析計上で行うことができる。Waters Xterra 3.0 mm×50 mm 5μ C-18 シリカカラムを室温で1.5 ml/分で溶出した。これを、5 % CH3CN / 0.05% TFA / H2O で平衡化し、5% CH3CN / 0.05% TFA / H2Oで1.0分間、その後に7分間にわたる90% CH3CN / 0.05% TFA / H2Oまでの線形勾配で溶出させた。検出は、214nmでのUV検出および蒸発光散乱によって検出を行った。カラム溶出液の画分を、PE-Sciex API 100 質量分析計のイオンスプレー表面に導入した。質量範囲300〜2000 amuを起動中2秒毎にスキャンした。
【０１３２】
LCMS方法3：
代わりに、LC-MS分析を、室温で1ml／分で溶出させるXTerra MS C18 5μl 3.0×50mmカラム(Waters, Milford MA, USA)で行った。HPLCシステムに、起動中2秒毎に200〜1500amuで走査するSciex API 150質量分析計を接続した。
【０１３３】
勾配：
【表１】
2008533104.tif 000005
【０１３４】
MALDI-TOF MS分析を、遅延抽出能を備えたVoyager RP装置(PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA)を使用して行い、線形モードにおいて操作した。α-シアノ-4-ヒドロキシ-ケイ皮酸をマトリックスとして使用し、質量の割り当ては、外部校正に基づいた。
【０１３５】
ヒトGLP-1受容器を発現する原形質膜に結合する放射性リガンド
結合アッセイを、ヒトGLP-1受容体を含む精製されたプラズマ膜で行った。受容体を含む原形質膜を、安定して発現するBHK tk-ts 13細胞から精製した。膜を、0.2mg/mlのタンパク質の最終濃度までAssay Buffer(50 mM HEPES, 5 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 0.005% Tween 20, pH=7.4)中に稀釈し、0.3% PEIでプレコートされた96ウェルマイクロタイタープレートに分配した。0.05 nM [125I]GLP-1、増加する濃度における未標識リガンドおよび異なるHAS濃度（0.005％、0.05％、および2％）の存在中における膜を、30℃で2時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、未結合のリガンドを真空マニホールドを通したろ過によって結合リガンドから分離し、続いて氷冷却アッセイバッファーで2×100μl 洗浄した。ろ液をRTで終夜乾燥させ、γ-カウンターにおいて打ち出し、定量した。
【０１３６】
例１．
O,O’-Bis-(2-((Arg34,Lys26-GLP-1(7-37)-Nイプシロン,26イル)カルボニル)エチル)テトラエチレングリコール
【化３】
2008533104.tif 000006
【０１３７】
二量体化：
Arg34GLP1(7-37)を、他(WO 98/08871)に記載された従来の組み換え技術によって酵母(S.cerevisiae)において発現させた。その後、発酵培養液中のArg34GLP1(7-37)を、従来の逆相クロマトグラフィーによって精製し、続けてペプチドの等電pH（すなわちpH5.4）で沈殿させた。二量体化を、1cmセルを使用して中性pH、280nmでの吸光度に基づいて約470mgの単量体Arg34GLP1(7-37)ペプチドを含む1412mgの等沈殿物を使用して行った。Trp 5560 AU/mmol/ml, Tyr 1200 AU/mmol/mlのモル吸光係数。mL当りmgペプチド中のペプチドの量は、mg/mL=（A280×DF×MF）／e として計算した。A280は、1-cmセル 280nmでの溶液の実際の吸光度である。MWはペプチドの分子量であり、ストック溶液と比較したDF（稀釈因子）および e は、280nmでのTrpまたはTyr発色団の各々の組み合わされたモル吸光係数である。Eはこの場合においてe = 1×5560 AU/mmol/ml ＋ 0×1200 AU/mmol/ml ＝ 5560AU/mmol/mlになるであろう。
【０１３８】
Quantaバイオデザイン(QBD製品番号10224)の72mg Bis-dPEG6TM NHSエステル
ペプチドを、4mL DMSO + 10 mL H2O中に入れた。230 μL DIPEAを加え、続いてQuanta biodesign (QBD製品番号10224)の72mg Bis-dPEG6TM NHSエステルを加えた。反応液を終夜にわたってランした。LC/MS方法 ペプチド1500_20.RT:11.84 ms:1414.9 (M+5/5)上で83.5％純度中において生成物を得た。
【０１３９】
ペプチドを、Gilson semi prepシステム(2cm カラム、勾配16〜46% ACN)上に直接注入した。凍結乾燥後の収量は132mgであった。
【０１４０】
LCMS方法3 (ペプチド1500_20)RT:11.82 ms:ms found.1415.0(M+5/5)。
【０１４１】
例２
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Arg27, Lys34- エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,34イル) カルボニル)エチル) -テトラエチレングリコール
【化４】
2008533104.tif 000007
【０１４２】
樹脂(Rinkアミド, 0.68 mmol/g Novabiochem 0.25 mmole)を使用して、製造業者のガイドラインに従ってABI433A機械上で一次配列を生成する。全ての保護基は酸に不安定であった。
【０１４３】
手順
GLP-1類似体アミノ酸配列を含む上記に調製した樹脂(0.25 mmole)を、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5  15ml)の混合物と室温で180分間にわたって撹拌させることによって樹脂から開裂させた。開裂混合液をろ過し、ろ液を真空中の油に濃縮した。粗製ペプチドを45mlジエチルエーテルでこの油から沈殿させ、45mlジエチルエーテルで3回洗浄した。粗製ペプチドを、7μC-18シリカで充填された20mm×250mmカラム上で調製用HPLCによって精製した。粗製ペプチドを水中5ml 50％酢酸中で溶解させ、H2Oで20mlまで稀釈し、カラム上に注入した。カラムにおいて、40〜60％の勾配（0.1％TFAを含む水中のCH3CN）40℃で50分間にわたって10ml/分で溶出させた。ペプチド含有画分を収集した。精製ペプチドを水での溶出の稀釈後に凍結乾燥した。
【０１４４】
HPLC：（方法B6）：RT=28.582分
LCMS：RT=11.29m/z = 1432.9 (M+3H)3+。
【０１４５】
ペプチドを、例１における酵母抽出物について記載された手順に従って二量体化した。
【０１４６】
LCMS方法3: RT=12.91、m/z=1483.1 (M+6H)6+、1271.6 (M+7H)7+、1112.7の(M+8H)8+、989.2(M+9H)9+。
【０１４７】
HPLC: (方法B6): RT=30.1分、m/z=8894.0(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１４８】
例３
O,O’-Bis-(2-(( Leu14, Arg27-エキセンジン-4 (1-39)-Nイプシロン,12イル)カルボニル)エチル)オクタエチレングリコール
【化５】
2008533104.tif 000008
【０１４９】
例１および２に記載された手順に従って合成した。Quanta biodesign (QBD 製造番号10246)からのBis-dPEG9M NHS エステル。
【０１５０】
HPLC: (方法B6) RT=29.8分、m/z=8871.3(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１５１】
例４
O,O’-Bis-(2-(( Leu14, Arg27-エキセンジン-4 (1-39)-Nイプシロン,12イル) カルボニル) エチル) テトラエチレングリコール
【化６】
2008533104.tif 000009
【０１５２】
例１および２に記載された手順に従って合成した。
【０１５３】
HPLC: (方法B6) RT=29.5分、m/z=8695.6(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１５４】
例５
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Arg27, Lys34-エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,34イル) カルボニル) エチル)- オクタエチレングリコール
【化７】
2008533104.tif 000010
【０１５５】
例１および２に記載された手順に従って合成した。
【０１５６】
HPLC: (方法B6) RT=30.1分、m/z=9070.1(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１５７】
例６
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Lys20, Arg27-エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,20イル) カルボニル) エチル)- テトラエチレングリコール
【化８】
2008533104.tif 000011
【０１５８】
例１および２に記載された手順に従って合成した。
【０１５９】
LCMS方法3: RT=11.73分、m/z=8695.6(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１６０】
例７
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14, Lys20, Arg27-エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,20イル) カルボニル) エチル)- オクタエチレングリコール
【化９】
2008533104.tif 000012
【０１６１】
例１および２に記載された手順に従って合成した。
【０１６２】
LCMS方法3: RT=11.77分、m/z=8871.8 (MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１６３】
例８
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14-エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,27イル) カルボニル) エチル)- オクタエチレングリコール
【化１０】
2008533104.tif 000013
【０１６４】
例１および２に記載された手順に従って合成した。
【０１６５】
HPLC: :(方法B6) RT=30.5分、m/z=8870.3(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１６６】
例９
O,O’-Bis-(2-((Arg12, Leu14-エキセンジン-4 (1-39) Nイプシロン,27イル) カルボニル) エチル)- テトラエチレングリコール
【化１１】
2008533104.tif 000014
【０１６７】
例１および２に記載された方法に従って合成した。
【０１６８】
HPLC:(方法B6) RT=30.6分のm/z=8695.6(MALDI-TOF、シナピン酸マトリックス)
【０１６９】
例１０
N,N'-ビス((((S)-5-([Aib,8,22,35]GLP-1(1-37)イル)-5-カルバモイルペンチル)カルバモイル)メトキシ)ヘキサン-1,6-ジイミン
【化１２】
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【０１７０】
Lysの側鎖に結合したオキシアミノ基を含むGLP-1の調製
【化１３】
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【０１７１】
[Aib8, 22, 35]GLP-1(1-37)Lys(2-アミノキシ アセチル)アミド
ペプチドを、標準Fmoc化学プロトコル(Fmoc-基を除去するためにNMP中 4 eq. AA, 4 eq. DIC および 4 eq. HOAt および 25% pip )を使用して、RinkアミドTentagel(0.22 mmol/g、450mg)上で調製した。 Lys残基は、Lys(Dde)として保護された側鎖であり、DCM中2%TFAおよび2%TISでDde基を除去することによってLysの側鎖のC末端にオキシアミノ基を最初に導入し、その後にBoc-NH-O-CH2-CO2Hとカップリングさせた。ペプチド配列をAdvanced ChemtechのApex348上で作製した。ペプチドを95％TFA(aq)およびTISで最終的に開裂させた。その後、ペプチドをLC-MSによって特徴づけ、50分間にわたる30%〜70%緩衝液Bの勾配を使用して調製用HPLCによって単離した。
【０１７２】
LC-MS: 3625.3． C164H254N44O49について計算: 3626.1
【０１７３】
オキシムライゲーションを使用するGLP-1の二量体化。
【０１７４】
ペプチド [Aib8, 22, 35] GLP-1(7-37)Lys(CO-CH2-ONH2)(2.2μmol)を、CHO-(CH2)4-CHO (0.5 μmol)を含む90% DMSO (aq) (30μl)に添加し、pHをNaOAcで5に調節した。溶液を2日間にわたって28℃で撹拌し、反応の過程をLC-MSによってモニターした。生成物を、50分間にわたって30％〜70%緩衝液Bの勾配を使用して調製用HPLCによって最終的に単離した。
【０１７５】
LC-MS: 7340.3． C334H514N88O98について計算: 7330.4
【０１７６】
例１１
N,N’-bis((((S)-5-(N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37) イル)-5-カルバモイルペンチル)カルバモイル)メトキシ)エタン-1,2-ジイミン
【０１７７】
オキシアミノ基とLysのその側鎖に延長された基との両方を含むGLP-1の合成
N-イプシロン26[2-(2-[2-(2-[2-(2[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル] [Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)Lys(2-アミノキシ アセチル)
上述した標準Fmoc-化学プロトコルを使用して、RinkアミドTentagel (0.22 mmol/g, 1g, 0.22 mmol)上でペプチドを調製した。先ず、樹脂にFmoc-Lys(Mtt)をカップリングさせることによってLysの側鎖のC末端にオキシアミノ基を導入し、DCM中2％TFAおよび2％TISでMtt基を除去し、Lys側鎖にBoc-NH-O-CH2 -CO2Hをカップリングさせた。その後、全ペプチド配列をAdvanced Chemtech 348合成装置上で生成した。該配列に延長された基を付加するために、Fmoc-Lys(Mtt)を合成において加えた。Lysの側鎖を、DICおよびHOAt（3等量）を使用して二単位のOEG、γ-Gluおよびオクタデカン二酸でカップリングした。ペプチドをTFA/TIS/H2O/チオアニソール(90/5/3/2)で樹脂から脱保護および開裂させ、分析HPLCおよびMALDI-MSによって特徴づけた。最終的には、ペプチドを、50分間にわたり30%〜70% 緩衝液Bの勾配を使用して調製用HPLCによって精製した。
【０１７８】
HPLC: (方法：15分間にわたる5%〜95%緩衝液B、および5分間にわたる95%緩衝液B): RT = 17.8分。MALDI-MS: 4314.3. C195H306N48O62について計算: 4314.9
例11に記載された方法による二量体化 LC-MS: 1731 (MH5 5+)。(MH5 5+)について計算：1730
HPLC: (方法: 25分間にわたる10%〜90%緩衝液B): RT = 20.42分。
【配列表】
2008533104000001.app
【国際調査報告】
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