(57)【要約】本発明は、哺乳類の臍帯血幹細胞、好ましくは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のＴＶＥＭＦ−増殖、ＴＶＥＭＦ−増殖した細胞の結果としての組成物、及び、該組成物によって疾病を治療する方法又は組織を治療する方法に関する。本発明の組成物の様々な利益及び利点が説明されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類からの臍帯血幹細胞であって、該臍帯血幹細胞の体積当たりの数が、少なくとも天然臍帯血の７倍であり、該臍帯血幹細胞が、天然臍帯血の幹細胞と基本的に同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を有することを特徴とする臍帯血幹細胞。
【請求項２】
請求項１の臍帯血幹細胞及び許容しうる担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項３】
前記許容しうる担体が、血漿、血液、アルブミン、細胞培養液、増殖因子、銅キレート剤、ホルモン、バッファ及び凍結保存剤からなる群の少なくとも１つであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記増殖因子が、Ｇ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物の温度が、前記臍帯血幹細胞を低温で保存するのに十分な温度であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞の凍結保存に十分な量の凍結保存剤を有し、前記組成物の温度が、約−１２０℃〜約−１９６℃であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記温度が約−１３０℃〜約−１５０℃であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
更に、医薬上許容しうる担体を含むことを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、６０〜８０％アミノ酸−グルコース溶液中の２０〜４０％ジメチルスルホキシド溶液；１５〜２５％ヒドロキシエチルでんぷん溶液；４〜６％グリセロール、３〜５％グルコース及び６〜１０％デキストランＴ１０；１５〜２５％ポリエチレングリコール；及び７５〜８５％アミノ酸−グルコース溶液からなる群より選択される凍結保存剤を含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、有毒物質を含まないことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
哺乳類からの臍帯血幹細胞であって、該臍帯血幹細胞が、ＴＶＥＭＦ−増殖であることを特徴とする臍帯血幹細胞。
【請求項１２】
ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞であって、体積当たりのＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の数が、少なくともＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞から誘導される臍帯血の体積当たりの幹細胞の数の２倍であることを特徴とする請求項１１に記載の臍帯血幹細胞。
【請求項１３】
ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞であって、体積当たりのＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の数が、少なくとも７倍であることを特徴とする請求項１２に記載の臍帯血幹細胞。
【請求項１４】
請求項１３の臍帯血幹細胞及び許容しうる担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞を含む組成物であって、更に、血漿、血液、アルブミン、細胞培養液、増殖因子、銅キレート剤、ホルモン、バッファ及び凍結保存剤からなる群の少なくとも１つを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
前記増殖因子が、Ｇ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、更に、６０〜８０％アミノ酸−グルコース溶液中の２０〜４０％ジメチルスルホキシド溶液；１５〜２５％ヒドロキシエチルでんぷん溶液；４〜６％グリセロール、３〜５％グルコース及び６〜１０％デキストランＴ１０；１５〜２５％ポリエチレングリコール；及び７５〜８５％アミノ酸−グルコース溶液からなる群より選択される凍結保存剤を含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物の温度が、前記臍帯血幹細胞を低温で保存するのに十分な温度であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
凍結保存剤を含み、前記組成物の温度が約−１２０℃〜約−１９６℃であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記温度が約−１３０℃〜約−１５０℃であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、有毒物質を含まないことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
ａ）臍帯血混合液をＴＶＥＭＦ−生物反応器の培養チャンバーに配置する工程、及び、
ｂ）該臍帯血混合液をＴＶＥＭＦさせ、該臍帯血幹細胞をＴＶＥＭＦ−増殖させ、臍帯血幹細胞組成物を調製する工程を含むことを特徴とする臍帯血幹細胞組成物の調製方法。
【請求項２３】
前記ＴＶＥＭＦが、約０．０５〜約６．０ガウスであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＶＥＭＦ−増殖が、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の体積当たりの数がＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置した臍帯血幹細胞の体積当たりの数と比べて７倍を超えるまで連続することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
更に、前記臍帯血混合液をＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置する工程の前に、哺乳類から臍帯血を採集する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
更に、前記臍帯血を前記臍帯血混合液に添加する工程の前に、臍帯血貯蔵施設から解凍された凍結保存臍帯血を採集する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
更に、前記ＴＶＥＭＦ−増殖の前に、臍帯血混合液から有毒物質を除去する工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＶＥＭＦ−生物反応器が、一体ＴＶＥＭＦ源を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＴＶＥＭＦ−生物反応器が、隣接ＴＶＥＭＦ源を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記臍帯血混合液が、他の臍帯血成分から分離されたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−臍帯血幹細胞を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記臍帯血混合液が、他の臍帯血成分から分離された軟膜を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記臍帯血混合液が、赤血球を含まない臍帯血を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
更に、臍帯血幹細胞組成物のＴＶＥＭＦ−増殖した細胞を、熱がある低温容器へ移動し、該低温容器の温度を制御された速度で−１２０℃〜−１９６℃に低下させる工程を含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
更に、前記温度を−１２０℃〜−１９６℃に制御された速度で低下させる工程の前に、前記臍帯血幹細胞組成物から有毒物質を除去する工程を含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
更に、温度を低下させる工程の後に、前記低温容器の温度を−１２０℃〜−１９６℃に一定期間維持する工程を含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記一定期間が、少なくとも１年であることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
更に、前記温度を低下させる工程及び前記温度を維持する工程の後、前記低温容器の温度を、制御された速度で、前記臍帯血幹細胞組成物を哺乳類に導入するのに適した温度に、上昇させる工程を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
有毒物質が、前記上昇させた温度の臍帯血幹細胞組成物から除去されていることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
更に、前記臍帯血幹細胞組成物のＴＶＥＭＦ−増殖した細胞に凍結保存剤を添加する工程を含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２２の方法によって調製される臍帯血幹細胞、及び、許容しうる担体を含むことを特徴とする組成物。
【請求項４２】
治療効果のある量の、請求項１の臍帯血幹細胞及び医薬上許容しうる担体を含む組成物を、前記哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳類の組織を治療する方法。
【請求項４３】
治療効果のある量の、請求項１１のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞及び医薬上許容しうる担体を含む組成物を、前記哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳類の組織を治療する方法。
【請求項４４】
前記治療される組織が、ヒト組織であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記治療される組織が、重要臓器であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記治療される組織が、少なくとも肝組織、心臓組織、造血組織、血管、皮膚組織、筋肉組織、消化器組織、膵臓組織、中枢神経系、骨組織、軟骨組織、結合組織、肺組織、脾臓組織及び頭脳組織からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳類に投与されるＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の量が、少なくとも１０７〜１０９の幹細胞／ｍｌを有する組成物の２０ｍｌであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
治療効果のある量の、請求項１の臍帯血幹細胞及び医薬上許容しうる担体を含む組成物を、前記哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳類の病気を治療する方法。
【請求項４９】
治療効果のある量の、請求項１１のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞及び医薬上許容しうる担体を含む組成物を、前記哺乳類に投与する工程を含むことを特徴とする哺乳類の病気を治療する方法。
【請求項５０】
前記治療される組織が、ヒト組織であることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記治療される組織が、重要臓器であることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記治療される組織が、少なくとも肝組織、心臓組織、造血組織、血管、皮膚組織、筋肉組織、消化器組織、膵臓組織、中枢神経系、骨組織、軟骨組織、結合組織、肺組織、脾臓組織及び頭脳組織からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳類に投与されるＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の量が、少なくとも１０７〜１０９幹細胞／ｍｌを有する組成物の２０ｍｌであることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器で調製される臍帯血幹細胞、及びその調製方法、その組成物、及び、該細胞又は該組成物で哺乳類を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
長い間、医学界においてヒト組織の再生が望まれていた。これまで、ヒト組織の治療の多くは、ドナーからの同じ組織の移植によって行われてきた。元々は、ヘリック双子の一方から他方への生体腎臓の移植から始まり、その後、南アフリカのクリスチャン・バーナード医師が１９６７年１２月３日に行ったデニス・ダルバル氏からルイス・ワシュカンズキ氏への心臓移植により世界的に有名になり、組織移植は、末期患者の延命方法として広く受け入れられるようになった。
【０００３】
ヒト組織の移植は、最初に使用した時から、重大な問題に直面した。第一に身体の自然な免疫システムによる組織の拒絶反応である。このため、組織移植はしばしば限られた寿命の延長にしか用いられなかった（ワシュカンズキ氏は術後１８日しか生きられなかった）。
【０００４】
身体の免疫システムの問題を克服するために、免疫システムを抑制して、拒絶反応が発生するまでの組織の使用を長くすべく、多くの拒絶反応抑制剤（例えば、イムラン、シクロスポリン）が直ぐに開発された。しかしながら、拒絶反応の問題は解決せず、組織移植の代わりになるものが求められるようになった。
【０００５】
骨髄移植も使用された。そして今でも白血病のような病気の治療にとっては、骨髄のような組織を治療する処置の選択肢となっている。しかしながら、骨髄移植にも問題がある。骨髄移植には適合するドナーが必要であり（見つかる確率はほぼ５０％未満）、苦痛を伴い、高価で、リスクが高い。その結果、骨髄移植の代わりになるものが大いに望まれている。米国特許第６，１２９，９１１号に記載の肝臓の幹細胞の移植のような組織の幹細胞の移植は、同様の限界があるため普及させるには問題が多い。
【０００６】
近年、研究者らは多能性胚幹細胞を組織移植の代替として使用する実験を行っている。胚幹細胞の使用の理論としては、理論的には胚幹細胞は、事実上身体のいかなる組織の再生にも利用することができる。しかしながら、組織再生に胚幹細胞を使用することには、いくつかの問題もある。これらの問題の中でもより深刻なものは、移植された胚幹細胞の可制御性は限られ、時には成長して腫瘍になることがあり、研究に使用可能であるヒト胚幹細胞が患者の免疫システムに拒絶されることがある（ネイチャー（Nature）、６月１７日、２００２年、ピアソン（Pearson）著、「幹細胞は２つを望む（Stem Cell Hopes Double）」、news@nature.com、オンライン発行：２００２年６月２１日）。さらに、胚幹細胞使用の普及には、倫理的、道徳的、及び政治的問題という重荷があり、その普及には依然として問題が多い。
【０００７】
臍帯血はいくつかの研究分野において焦点とされていた。幹細胞の多能性は、最初、骨髄中の成人幹細胞から発見された。ヴェルフェイユ，ＣＭら（Verfaille, CM. et al.）、「成人骨髄由来の間葉幹細胞の多能性（Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow）」。ネイチャー（Nature）４１７、オンライン発行６月２０日；doi:10.1038/nature00900、（２００２年）であって、ピアソン，Ｈ（Pearson, H）が、「幹細胞は２つを望む（Stem Cell Hopes Double）」、news@nature.com、オンライン発行：２００３年６月２１日、doi:10.1038/news020617-11において引用。多能性ＣＤ３４＋幹細胞及び分化能の低い（oligopotent）リンパ前駆細胞が臍帯血から発見され、リンパ系ナチュラルキラー細胞などに細胞の種類が分化された。ペレＳ．Ａ．ら（Perez S．A. et al.）、「ヒトの臍帯血における新規の脊髄様ＮＫ細胞の前駆細胞（A novel myeloid-like NK cell progenitor in human umbilical cord blood）」、血液１０１（９）：３４４４−５０（２００３年５月１日）。更に、Ｂ前駆細胞が骨髄だけでなく、臍帯血にも存在することが発見された。サンズＥ．ら（Sanz E．）著、「ヒト臍帯血ＣＤ３４＋Ｐａｘ−５＋  Ｂ−前駆細胞：遺伝子発現プロファイルの単一細胞解析（Human cord blood CD34+Pax-5+ B-cell progenitors: single-cell analyses of their gene expression profiles）」、血液１０１（９）：４３２４−３０（２００３年５月１日）。
【０００８】
ボイズら（Boyse et al.）の米国特許第６，５６９，４２７号には、貧血症、悪性腫瘍、自己免疫疾患などの様々な疾病及び疾患、及び様々な免疫機能障害及び欠損症についての治療又は予防における、凍結保存、及び、凍結保存された胎児又は新生児の血液の実用性が開示されている。また、ボイズは、異種遺伝子配列を用いた遺伝子治療における造血再構成の使用を開示している。しかしながら、ボイズの開示は治療的使用のための細胞増殖にまでは至らない。臍帯血バンクであるコルセル（CorCell）は、増殖、凍結保存及び臍帯血幹細胞移植に関する統計を提供する。「臍帯血幹細胞の増殖（Expansion of Umbilical 臍帯 Blood Stem Cells）」、情報シート  臍帯血、コールセル株式会社（２００３年）。ある増殖工程は、バイオリアクターを中央コラーゲンベースのマトリックスに利用することを開示する。ユーリッヒ研究所（Research Center Julich）、「バイオリアクターからの血液幹細胞（Blood Stem Cells from the Bioreactor）」、プレスリリース２００１年５月１７日。さらに、臍帯血細胞を増殖前又は後に凍結することは、幹細胞の増殖能力に影響を及ぼさないことが示されている。ラッツァーリら（Lazzari, L. et al.）、「臍帯血からの造血系幹細胞の生体外増殖に対する凍結保存の効果に関する評価（Evaluation of the effect of cryopreservation ex vivo expansion of hematopoitic progenitors from cord blood）」、骨髄移植、２８：６９３−６９８（２００１年）。
【０００９】
骨髄と比較して、臍帯血はよりよい造血貯留部の再構成をもたらすことが分かった。フラッソーニら（Frassoni F. et al.）「骨髄移植と比較して、臍帯血移植はよりよい造血貯留部の再構成をもたらす（Cord blood transplantation provides better reconstitution of hematopoeitic reservoir as compared to bone marrow transplantation）」、血液（２００３年４月３日）。１９９８年１２月アトランタで行われた最初の非相関幹細胞移植−1年アップデートも参照。骨髄及び臍帯血幹細胞移植、鎌状細胞情報センター（１９９９）。
【００１０】
幹細胞の増殖に関係する分子機構を解明するために研究が続けられた。例えば、コールセルの記事は、デルタ１というシグナル分子が臍帯血幹細胞の開発を助けることを開示している。オーイシ  Ｋ．ら（Ohishi K. et al.）、「デルタ１はヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３８−臍帯血細胞の骨髄及び胸線の複製能を促進する（Delta-1 enhances marrow and thymus repopulating ability of human CD34+/38- cord blood cells）」、クリン  インベスト（Clin. Invest.）１１０、１１６５−１１７４（２００２年）。
【００１１】
本明細書中、「臍帯血細胞」は胎児又は乳児の臍帯及び／又は胎盤由来の血球を意味する。
【００１２】
臍帯血細胞は、成人又は身体の幹細胞と定義されるが、いくつかの要因によって臍帯血細胞、特に臍帯血幹細胞は他と異なるようになる。
【００１３】
第１に、臍帯血は原始的である。臍帯血幹細胞は若いため、古い細胞よりも柔軟性を有することが多く、これは該細胞がより多くの種類の特殊化した細胞を生じさせることを意味する。また、ＤＮＡに変化をもたらすような損害を与える環境有害物質に影響される機会が少ないため、前記臍帯血幹細胞は、より健康な細胞である傾向がある。さらに、前記臍帯血幹細胞は若いため、移植患者により統合されやすく、移植片対宿主（ＧｖＨＤ）又は細胞拒絶反応を引き起こしにくい。また、前記臍帯血幹細胞は若いため、成人の・古い末梢血幹細胞よりも安定ではないと考えられることがある。これは、例えば、臍帯血幹細胞が比較的まだ新しく、非常に守られた環境にあるからである。したがって、古い幹細胞に比べて、臍帯血幹細胞は、例えば凍結保存から、よりダメージを受けやすい。
【００１４】
第２に、臍帯血は幹細胞に富んでいる。臍帯血には、白血球（単核球を含む。本発明の目的において、単核球は１つしか核を有しない細胞である。）及び赤血球が含まれる。典型的には、臍帯血の約１から２％が幹細胞である。これより、臍帯血は最も幹細胞が豊富な供給源の一つである。普通分娩直後に収集された臍帯血と比べて、帝王切開から収集された臍帯血は、典型的にもう少し幹細胞が豊富である。また、他の組織と比べて、幹細胞は臍帯血からの分離が容易である。成人幹細胞が非常に多くの成熟した細胞において見つかるのに対して、幹細胞は見つかる量が少なく、見つけることが困難である。
【００１５】
第３に、そして最後に、臍帯血は利用できる幹細胞の供給源である。骨髄などの身体組織からの成人幹細胞移植は、直ちに利用可能ではない。臍帯血の貯蔵によって、直ちに利用可能な幹細胞の供給源が提供される。生後間もない典型的なヒトの乳児からの臍帯血からは、一般的に５０殻１００ｍｌの臍帯血が採集することができる。
【００１６】
臍帯血を含有する臍帯は、胎児を胎盤子宮部に繋ぐへその緒であり、栄養素を供給し、排泄物を除去する。臍帯はひも状で約２２インチ（５６ｃｍ）の長さを有し、胎児の腹壁から胎盤子宮部へ延在している。
【００１７】
臍帯の主要機能は、胎盤から胎児へ栄養及び酸素を移送すること、及び、胎児から胎盤へ排泄物を戻すことである。原則的に、臍帯はひも状であって、胎児の細胞膜で形成され、一端で胎児の細胞膜と一体化し、他端は胎盤で終止している。臍帯には、酸素を含んだ血液を胎児へ移送する１本の静脈、及び、酸素を含まない血液を胎児から搬出する２本の動脈を収容する粘液状のゼリーが含まれる。
【００１８】
血液は、胎児から臍帯に沿って胎盤へ移送される。生体内の胎盤において、酸素、栄養素及び抗体が母親の血液から臍帯血へ拡散するとなるように臍帯血は母親の血液と近接される。胎児からの排泄物は、２本の酸素を含まない動脈を経由して母親の血液へ入る。そして、栄養素を豊富に含み、酸素を含み、排泄物が除去された臍帯血は、酸素を含んだ血液を含む静脈によって、臍帯を通り、胎児に戻される。
【００１９】
生後、臍帯は固定及び切断される。臍帯を切断した後、乳児に付着した基部は、やがて萎んで無くなり、へそとして知られる傷跡が残る。
【００２０】
臍帯血が特に豊富に幹細胞を有するため、臍帯血を特別な臍帯血バンクに保管する親がいる。臍帯血に含まれる臍帯血幹細胞は、骨髄に代わる移植として将来必要になった場合に用いることができる。研究から、臍帯血ドナーに関係しない人（遺伝子的に適合しない）でさえ、白血病及び他の悪性腫瘍との闘いにおいて、臍帯血細胞を拒絶する免疫反応を引き起こすことなく、臍帯血の移植から恩恵を受けることができるかもしれないということが分かってきた。
【００２１】
典型的な臍帯血を採取する方法は２つある。血液バッグ採集と注射器採集である。血液バッグ採集においては、医療提供者が針を臍静脈に刺し、重力を活用して血液をバッグに徐々に排出させる。血液の流出が終わると、医療提供者がバッグを封止し、ラベルを貼る。この方法は通常、胎盤が排出される前に行われる。
【００２２】
注射器採集は、血液バッグ採集と類似しているが、臍帯血が抗凝血剤（血液が凝固するのを防ぐ物質）を含む注射器に排出される点が異なる。血液は、血液バッグの代わりに注射器に保存される。この方法は、胎盤が排出される前又は後に行われる。注射器採集は、血液バッグ採集よりも信頼性の高い血液採取方法であると考えられている。また、注射器採集においては、血液バッグ採集よりもより多くの血液を採集することができる。いずれの方法が用いられているかに関わらず、又は、その他の臍帯血採集方法が用いられているかに関わらず、採集の全工程には、５分以下しか要しない。臍帯血は、出産後１０〜１５分以内に採集されることが好ましい。これ以上待つと、採集される臍帯血量が減り、したがって、採集される臍帯血幹細胞が少なくなってしまう。
【００２３】
臍帯血を貯蔵又は保存する場合には、貯蔵施設に臍帯血が到着すると、臍帯血が、肝炎、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、白血病又は免疫障害など感染性又は遺伝的疾患を有していないか確認する検査が行われる。臍帯血にそのような問題がある時は、保存に適さないと判断されるか、場合によっては、リスクの記録を伴って血液が保存される。将来血液が必要になった時には、親は、前記臍帯血のリスクが、臍帯血幹細胞の必要性を上回るか否かを判断することができる。
【００２４】
保存される臍帯血は、典型的には、貯蔵される前に一連の工程を経る。第１に、臍帯血は、白血球、赤血球、及び血漿に分離される。これは、遠心分離機（血液の容器を血液が分離されるまで回転させる機器）又は沈澱作用（沈殿物を血液の容器に投入して血液を分離させる方法）によって行われる。第２に、臍帯血が底部に赤血球（ＲＢＣ）、中間部に白血球（ＷＢＣ）、及び上部に血漿というように分離されると、白血球は保存のために除去される。「軟膜」としても知られる中間層には、興味のある臍帯血幹細胞が含まれる。血液の他の部分は不要である。いくつかのバンクにおいては、これが処理する範囲である。しかしながら、他のバンクは、続いて、ＷＢＣから単核球（この場合、白血球のサブセット）を除去することによって軟膜を処理する。皆がこの方法に賛成ではないが、保存する量を低減することができ、細胞を保存するため必要な低温窒素を低減することができる。
【００２５】
臍帯血サンプルからＲＢＣを除去することが好ましい。人は同じＨＬＡ型を有するかもしれないが（幹細胞の移植に必要である）、同じ血液型ではないかもしれない。ＲＢＣを除去することによって、幹細胞移植に不都合な反応を最小限と留めることができる。したがって、ＲＢＣを除去することによって、幹細胞サンプルがより多くの人と適合する機会が多くなる。ＲＢＣは解凍された時に破裂することがあり、遊離ヘモグロビンを放出する。このタイプのヘモグロビンは、移植を受ける人の腎臓に深刻な影響を及ぼすことがある。さらに、幹細胞の生存能力は、ＲＢＣが破裂した時に低下する。
【００２６】
細胞が凍結される前に、増殖することがある膨張する（すなわち、数の増加であって、サイズの増大ではない）。
【００２７】
ＲＢＣが除去されると、細胞は保存され始め、長期保存のために凍結される。しかしながら、これは幹細胞にダメージを与えないように、ゆっくりと注意深く行わなければならない。血球を凍結する前に、凍結中のダメージを防ぐために、まず溶液と混合する。この溶液は凍結保存剤、凍結保存溶剤又は抗凍結剤といわれる。増殖した細胞は、凍結保存剤に入れられると、ダメージから細胞を守るためにゆっくりと凍結する。
【００２８】
凍結すると（一般的な温度は約−１９６℃）、細胞を永久保存フリーザに移送する。フリーザにおいては、細胞は液体又は気体の窒素の中で凍結されたままである。臍帯血幹細胞の保存には様々なタイプのフリーザが通常用いられる。１つのタイプとして、「バイオアーカイブ（BioArchive）」フリーザがある。この装置は、血液を凍結するだけでなく、血液の目録を作成し、３，６２６個まで血液バッグを管理する。この装置は求められた特定の血液サンプルを取り出すロボットアームを有する。これにより、他のサンプルが乱れたり、温かい温度に曝されないようにすることができる。他のタイプの現在商業的に入手可能な装置は、これらに限定されないが、サンヨー製のモデルＭＤＦ−１１５５  ＡＴＮ−１５２Ｃ及びモデルＭＤＦ−２１３６  ＡＴＮ−１３５Ｃ、及びプリンストンクリオテック製（Princeton CryoTech）ＴＥＣ  ２０００がある。
【００２９】
臍帯血幹細胞の増殖には数日かかる。生死に関わる事態のような、早急な臍帯血幹細胞の供給が重要である場合、又は、外傷の場合、特に細胞の再導入の前に調査を伴う必要がある場合、臍帯血幹細胞の増殖を待つのに数日もとれないことがある。したがって、１分の処置の遅れが生と死の違いを意味するところでは、緊急の事態に備えて、生まれた時からこのような増殖した臍帯血幹細胞を用意しておくことが特に望まれている。
【００３０】
したがって、数日ではなく数時間のうちに使用するために、臓器移植、骨髄移植又は胚幹細胞に基づかないが、それでも免疫反応を誘発しにくい増殖した臍帯血幹細胞の組成物を提供する、ヒト組織を治療する方法及びプロセスを提供することが求め得られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明は、一つには、哺乳類の、好ましくヒトの臍帯血幹細胞であって、ＴＶＥＭＦ増殖した臍帯血幹細胞に関する。また、本発明は、哺乳類の、好ましくはヒトの臍帯血幹細胞であって、該臍帯血幹細胞の体積当たりの数が、少なくとも天然臍帯血の７倍であり、該臍帯血幹細胞が、天然臍帯血の幹細胞と基本的に同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を有する臍帯血幹細胞に関する。このような細胞は、好ましくは本明細書に説明するＴＶＥＭＦ−増殖プロセスによって作製される。また、本発明は、これらの細胞、及び、必要であれば、医薬上許容しうる担体、凍結保存剤、及び細胞培養基など他の成分を含む組成物に関する。
【００３２】
また、本発明は、臍帯血混合液をＴＶＥＭＦ−生物反応器の培養チャンバーに配置する工程、及び、該臍帯血混合液をＴＶＥＭＦさせ、該臍帯血幹細胞をＴＶＥＭＦ−増殖させ、臍帯血幹細胞組成物を調製する工程を含むことを特徴とする臍帯血幹細胞及び臍帯血幹細胞組成物の調製方法に関する。前記細胞に適用されるＴＶＥＭＦは、約０．０５〜約６．０ガウスであることが好ましい。
【００３３】
また、本発明は、本発明の臍帯血幹細胞及び臍帯血幹細胞組成物で哺乳類を治療する方法に関する。このような治療は、疾病を治療するために、組織の治療及び再生に用いられる、又は、本明細書に説明している他の用途に用いられる。また、本発明には、組成物及び本明細書に定義された疾病のいずれかを治療する方法、又は本発明の臍帯血幹細胞組成物を含む組織又は臓器を治療する方法が含まれる。また、本発明には、本発明の組成物を本明細書に定義された疾病のいずれかを治療する、又は、本明細書に記載したような組織を治療又は再生する薬剤の調製に用いる使用が含まれる。
【本発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
［図面の詳細な説明］
簡単に言うと、回転ＴＶＥＭＦ−生物反応器には、細胞培養チャンバー及び時間変動する電磁気力の供給源が含まれる。実施においては、臍帯血混合液を細胞培養チャンバーに配置する。時間変動する電磁気力の供給源によって、チャンバー内で時間変動する電磁気力が発生するまで細胞培養チャンバーを回転させる。その期間が終了すると、増殖された臍帯血混合液をチャンバーから取り出す。より複雑なＴＶＥＭＦ−生物反応器システムにおいては、図２〜５に示すように、時間変動する電磁気力の供給源をＴＶＥＭＦ−生物反応器と一体化することができるが、図６〜８のように、バイオリアクターと隣接させてもよい。さらに、栄養を細胞にもたらす流動性キャリアは、定期的に新しくする及び除去する。好ましいＴＶＥＭＦ−生物反応器をここで説明する。
【００３５】
まず、図１を参照する。図１は、細胞培養チャンバー１９、好ましくは回転細胞培養チャンバー、酸素供給器２１、培養キャリアの方向性のある流れを助ける装置、好ましくは主ポンプ１５を用いて、及び、これに限定されないが、栄養素３、バッファ５、新しい培地７、サイトカイン９、増殖因子１１、及びホルモン１３など培養キャリアの要求の選択的な入力のための供給マニホールド１７を有する哺乳類細胞を培養するための全体的なバイオリアクター培養系における培養キャリアフローループ１の好ましい実施形態を示す。この好ましい実施形態において、主ポンプ１５は、新しい流動性キャリアを、流動性キャリアが酸素で処理され、細胞培養チャンバー１９を通過する酸素供給器２１へ供給する。細胞培養チャンバー１９からの使用済みの流動性キャリア中の排出物は除去され、排出物１８へ移送され、残りの細胞培養キャリアは、マニホールド１７へ戻される。該マニホールド１７は、必要であれば、再利用の前に、ポンプ１５で酸素供給器２１を経て細胞培養チャンバー１９に、新しい供給を受ける。
【００３６】
培養キャリアフローループ１においては、図１に示すように、チャンバー１９中の生きた細胞培養を通り、培養キャリアフローループ１を周って、培養キャリアは循環する。ループ１においては、細胞培養リアクターチャンバー１９内を一定条件に維持する化学センサー（図示せず）に応じて調整が行われる。二酸化炭素の調整によって圧力を与え、酸又は塩基の導入によってｐＨを補正する。酸素、窒素及び二酸化炭素は、細胞呼吸をサポートするために、ガス交換システム（図示せず）に溶解されている。閉じたループ１には、循環ガスキャパシタンスから酸素が添加され、二酸化炭素を除去する。図１は、本発明で用いることができる培養キャリアフローループの１つの好ましい実施形態であるが、本発明はこれに限定されるものではない。バイオリアクターへの、これに限定されないが、酸素、栄養素、バッファ、新しい培地、サイトカイン、増殖因子、及び ホルモンなど培養キャリアの要求の入力は、排出物及び二酸化炭素を制御及び除去することができるのであれば、手動、自動又は他の調整手段で行ってもよい。
【００３７】
図２および３に、一体の時間変動する電磁気力の供給源を有するＴＶＥＭＦ−生物反応器１０の好ましい実施形態を示す。図４は、本発明で用いられる好ましい形態における回転可能なＴＶＥＭＦ−生物反応器１０の断面図である。図４のＴＶＥＭＦ−生物反応器１０は、一体の時間変動する電磁気力の供給源を有する状態で示されている。また、図５も一体の時間変動する電磁気力の供給源を有するＴＶＥＭＦ−生物反応器の好ましい実施形態を示す。図６〜８には、隣接する時間変動する電磁気力の供給源を有する回転バイオリアクターが示されている。
【００３８】
ここで図２を参照する。図２には、本発明のＴＶＥＭＦ−生物反応器１０の好ましい実施形態の持ち上げた側面図が示されている。図２には、ベース１１２に支持されたモータハウジング１１１が含まれる。モータ１１３はモータハウジング１１１内に取り付けられ、第１ワイヤー１１４及び第２ワイヤー１１５によって、制御つまみ１１７を回転することによってモータ１１３の速度を増加的に制御することができる制御手段を有するコントロールボックス１１６へ接続されている。モータハウジング１１１は、モータシャフト１１８がハウジング１１１を通って延在するように、内部にモータ１１３を有し、該モータシャフト１１８は、縦のチャンバー１１９において、シャフト１１８の中心が地面と平行になるように、長手方向にあり、これに限定されないが、プラスチックなど透明の材料で形成されていることが好ましい。
【００３９】
この好ましい実施形態において、縦のチャンバー１１９は、チャンバー１１９が、縦軸が地面と平行の状態で、自身の縦軸の周りを回転するように、シャフト１１８と連結されている。チャンバー１１９には、ワイヤーコイル１２０が捲回されている。ワイヤーコイル１２０のサイズ及び捲回数は以下のとおりである。好ましくは０．１ｍＡ〜１０００ｍＡの方形波電流がワイヤーコイル１２０へ供給されるされる時、チャンバー１１９で、好ましくは０．０５ガウス〜６ガウスの時間変動する電磁気力が発生する。ワイヤーコイル１２０は、シャフト１１８の端部において、ワイヤー１２３及び１２４によって第１リング１２１及び第２リング１２２と連結されている。そして、これらのリング１２１及び１２２は、電流がコイル１２０に絶えず供給されながらチャンバー１１９が回転できるように、第１電磁気供給ワイヤー１２５及び第２電磁気供給ワイヤー１２８によって接続されている。電磁気発生装置１２６は、ワイヤー１２５及び１２８と連結されている。電磁気発生装置１２６は、電磁気発生装置ノブ１２７を回すことによって出力を調整することで、方形波をワイヤー１２５及び１２８、及びコイル１２０に供給する。
【００４０】
図３は、本発明において用いることができる図２に示すＴＶＥＭＦ−生物反応器１０の側面斜視図である。
【００４１】
ここで、図４に示す回転ＴＶＥＭＦ−生物反応器１０を参照する。回転ＴＶＥＭＦ−生物反応器１０は、好ましくは透明の培養チャンバー２３０であって、臍帯血混合液を含有するように構成されており、さらに内側円筒状ガラス部材２９３及び外側円筒状ガラス部材２９４を受け入れるように配置された、対向する第１及び第２端面２２８、２２９を有する第１及び第２円筒状横端キャップ部材２９０及び２９１を含む外側ハウジング２２０を含む。適切な圧力シールが付与される。内側及び外側円筒状部材２９３、２９４の間は、細胞の成長に適切な培養温度の確保に用いられる環状ワイヤーヒーター２９６である。ワイヤーヒーター２９６は、時間変動する電場を培養チャンバー２３０に供給するための、時間変動する電磁気力装置として用いることもできる。または、図５に示すように、別のワイヤーコイル１４４を時間変動する電磁気力の供給に使用することができる。第１端キャップ部材２９０及び第２端キャップ部材２９１は、チャンバー２３０内でより円滑な混合液の流れを促進するために、端面２２８、２２９を隣接する内側曲面を有する。第１端キャップ部材２９０、及び第２端キャップ部材２９１は、それぞれ、入力軸２２３及び出力軸２２５に回転自在に受け入れられる第１中央液移送軸頸２９２及び第２中央液移送軸頸２９５を有する。各移送軸頸２９４、２９５は、フランジを有し、端キャップ部材２９０、２９１の埋め込み式対の孔に設けられ、シャフト２２３、２２５との相対的な長手方向の動きに対して第１ロックワッシャ及びリング２９７及び第２ロックワッシャ及びリング２９８で取り付けられる。各軸顎２９４、２９５は、長手方向に延在し、周辺に配置された流路と連結されている中間環状凹部を有する。軸顎２９２、２９５の各環状凹部はそれぞれ、端キャップ部材２９０及び２９１の第１放射状流路２７８及び第２放射状流路２７９によって、第１入力カップリング２０３及び第２入力カップリング２０４と対になっている。放射状流路２７８又は２７９中のキャリアは、軸顎２９４又は２９５の第１環状凹部及び縦流路を通って流れ、キャリアは軸顎２９２、２９５を通じて、シャフト２２３、２２５の周囲で各軸顎２９２、２９５の端に接近することができる。
【００４２】
端キャップ部材２９０及び２９１には、入力軸２２３及び出力軸２２５において外側ハウジング２２０を相対的に支持するボールベアリングを含む第１管状ベアリングハウジング２０５及び第２管状ベアリングハウジング２０６が取り付けられている。第1ベアリングハウジング２０５には、外側ハウジング２２０に入力軸２２３及び出力軸２２５及び縦軸２２１の周囲における回転方向で回転する動きを与えるための、第１スプロケットギア２１０が取り付けられている。第1ベアリングハウジング２０５及び第２ベアリングハウジング２０６は、ワイヤーヒーター２９６の電気的取り出し設備、及び他のセンサーも有する。
【００４３】
内部フィルターアッセンブリ２３５には、長さに沿って穿孔又は開口を有する内側及び外側円筒状部材２１５、２１６が含まれ、穿孔を有する第１及び第２内部フィルターアッセンブリ端キャップ部材２１７、２１８を有する。The 内側円筒状部材２１５は、互いに係合する中央に位置する対の部分を有する２つの部材として形成され、各部分は、端キャップ２１７又は２１８に取り付けられている。外側円筒状部材２１６は、第１及び第２内部フィルターアッセンブリ端キャップ２１７の間に設けられている。
【００４４】
端キャップ部材２１７、２１８は、それぞれ、入力軸２２３及び出力軸２２５において回転可能に支持されている。内側部材２１５はピン及び嵌合溝２１９によって、出力軸２２５に回転可能に取り付けられている。１０ミクロ織のポリエステル布２２４が、外側部材２１６の外面の上に配置され、両端でＯリングに取り付けられている。内側部材２１５は、連結ピンで出力駆動軸２２５のスロットに取り付けられているため、出力駆動軸２２５は内側部材２１５を回転させることができる。内側部材２１５は、外側部材２１６を支持する第１及び第２端キャップ２１７、２１８で連結されている。出力軸２２５は、第１固定ハウジング２４０のベアリングを通って延在し、第１スプロケットギア２４１に連結している。図示されているように、出力軸２２５は、シールの間に位置する第１固定ハウジング２４０の第１ポート又は流路２８９から内側部材２１５へ、流動性キャリアの流れが内側部材２１５から固定ハウジング２４０を通って延在できるように、延在する管状ボア２２２を有する。
【００４５】
内部部材２３５のための第１及び第２端キャップ２１７、２１８の間、及び外側ハウジング２２０中の軸頸２９２、２９５の間には、ブレード部材５０ａ及び５０ｂのための第１及び第２ハブ２２７、２２６がある。入力軸２２３の第２ハブ２２６は、第２ハブ２２６が入力軸２２３と回転するように、ピン２３１で、入力軸２２３に連結されている。各ハブ２２７、２２６は、軸方向に延在する、ハブを通じてキャリアを伝送するための流路を有する。
【００４６】
入力軸２２３は、入力軸２２３の回転可能な支持のために、第２固定ハウジング２６０のベアリングを通って延在する。第２縦流路２６７は、入力軸２２３を通って、面板とハウジング２６０の間の第２環状凹部２３２に設けられたリテーニングワッシャ及びリングの中間地点へと延在する。第２端キャップ部材２９１の第３放射状流路２７２によって、凹部の流動性キャリアは、第２端キャップ部材２９１から流出することができる。図示されていないが、第３流路２７２は、パイピング及びＹ分岐接続部を通じて各流路２７８及び２７９に接続している。
【００４７】
図４に、第１軸に沿って延在する第１ボア２３７がチャンバー２３０の隅部２３３と交差し、制限のある開口部２３４が形成されたサンプルポートを示す。ボア２３７は、逆のボア及びネジ式リングを一端に有し、ネジ廻して円筒状のバルブ部材２３６を受け入れる。バルブ部材２３６には、開口部２３４を係合し、チャンバー２３０の内部へ少し突出するための先端が補助的に形成される。バルブ部材２３６のＯリング２４３は封をする。第２軸に沿った第２ボア２４４は、Ｏリング２４３と開口部２３４との間で、第１ボア２３７と交差する。エラストマー又はプラスチックのストッパー２４５によって、第２ボア２４４は閉じられ、サンプルを取り除く皮下注射器で入ることができる。サンプルを取り除くには、バルブ部材２３６を後へ引き、開口部２３４及びボア２４４に近づく。そして、注射器を用いてサンプルを抽出し、開口部２３４は再び封止することができる。外部の汚染物質は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器１０の内部に届かない。
【００４８】
実施において、キャリアは第２ポート又は流路２６６、シャフト流路、第３放射状流路２７２を介して第１放射状流路２７８及び第２放射状流路２７９へ、投入される。キャリアが軸頸２９２、２９４の縦流路を介してチャンバー２３０に入ると、キャリアはハブ２２７、２２６の端面２２８、２２９に突きあたり、放射状及び軸方向に、ハブ２２７、２２６の流路を通って分散する。ハブ２２７、２２６を通るキャリアは、端キャップ部材２１７、２１８に突きあたり、放射状に分散する。したがって、流入される流動性キャリアの流れは、放射状に縦軸２２１から外へ向かい、ドーナツ状に各端部から流れ、ポリエステル布２２４及びフィルターアッセンブリ２３５の開口部を通って流出し、流路２６６及び２８９を介して流出する。外側ハウジング２２０、チャンバー２３０、及び内部フィルターアッセンブリ２３５の回転速度及び回転方向を制御することによって、いかなる要望のタイプのキャリアの動きも得ることができる。しかしながら、主として重要なのは、絶え間ない新しい流動性キャリアの供給と共に、植物回転器の運転を得ることができるという事実である。
【００４９】
一体の環状ワイヤーヒーター２９６を用いて時間変動する電磁気力が付与されていない場合には、他の好ましい時間変動する電磁気力の供給源で付与することができる。例えば、図６〜８に、バイオリアクターの細胞培養に電磁力を供給する時間変動する電磁気力装置１４０であって、一体の時間変動する電磁気力ではなく、隣接する時間変動する電磁気力装置を有するものを示す。具体的に、図６は、時間変動する電磁気力装置１４０の好ましい実施形態である。図６は、装置１４０の持ち上げた側面図斜視図であって支持基盤１４５、基盤１４５上に支持されたシリンダーコイル支持体１４６であって、支持体１４６の周囲に捲回されたワイヤーコイル１４７を有するものを含む。図７は、図６に示された時間変動する電磁気力装置１４０の正面斜視図である。図８は時間変動する電磁気力装置１４０の正面斜視図であって、実施において、支持基盤１４５に支持され、ワイヤーコイル１４７が捲回されたシリンダーコイル支持体１４６に、バイオリアクター１４８全体が挿入されたものが示されている。時間変動する電磁気力装置１４０がバイオリアクター１４８と隣接しているため、時間変動する電磁気力装置１４０は再利用することができ、さらに、時間変動する電磁気力装置１４０がバイオリアクター１４８に隣接しているため、装置１４０は、いかなる種類のバイオリアクター、好ましくは回転式においても、電磁力の発生に用いることができる。
【００５０】
実施において、ＴＶＥＭＦ−増殖中、本発明のＴＶＥＭＦ−生物反応器１０は、細胞培養チャンバーに臍帯血混合液を含有する。ＴＶＥＭＦ−増殖中、臍帯血混合液含有チャンバーの回転速度を評価して調整することができ、これにより臍帯血混合液は実質的に縦軸又はその周囲に残る。回転速度の増加は、壁の衝撃の予防に値する。例えば、臍帯血混合液中の臍帯血幹細胞が、回転円の下方側に、非常に内に向って且つ下に向って落下する場合、及び、回転円の上方側に、非常に外に向って且つ非効率的に上に向かって落下する場合には、回転の増加が好ましい。最適には、好ましくは操作者が、臍帯血幹細胞の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状が維持されるように、最小壁衝突回数及び強度を促進する回転速度を選択するとよい。本発明の好ましい速度は５〜１２０ＲＰＭであり、より好ましくは１０〜３０ＲＰＭである。
【００５１】
臍帯血混合液は、好ましくは透明の培養チャンバーを通して目視で評価し、手動で調整されることが好ましい。また、臍帯血混合液の評価及び調整は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器１０における臍帯血幹細胞の位置を監視するセンサー（例えば、レーザー）で自動に行われてもよい。細胞の動きを表示しすぎるセンサー信号は、自動的に回転速度を適宜に調整するメカニズムを引き起こす。
【００５２】
さらに、実施において、本発明は、電磁発生装置が作動され、方形波出力が臍帯血混合液含有チャンバーに所望の電磁場を生じさせ、好ましくは０．０５ガウス〜６ガウスの範囲となるように調整されることを意図する。
【００５３】
本発明で意図する時間変動する電磁気力に適用される回転バイオリアクターに対しては、本発明の範囲から逸脱しない範囲で、様々な変更を加えることができるため、上述した明細書に含まれる全ての事項は、限定としてではなく、説明として解釈される。
【００５４】
［発明を実施するための最良の形態］
以下の定義は、本発明の文脈において定義された言葉の説明及び理解を助けるものである。定義はこれらの言葉を本明細書を通じた記載以下に限定するものではない。さらに、いくつかの定義がＴＶＥＭＦに関してふくまれるが、これに関する全ての定義は、互いに補完するように考えられるべきであり、互いに反するように解釈すべきでない。
【００５５】
本願において、「成人幹細胞」は、未分化で、より分化された細胞を生じさせる多能性細胞を意味する。本発明に関して、成人幹細胞は、好ましくはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−である。
【００５６】
本願において、「臍帯血」は、胎児又は乳児の臍帯及び/又は胎盤からの血液を意味する。臍帯血は、知られる限りでは幹細胞の最も豊富な供給源である。「臍帯」は、本発明の「臍帯血」を臍帯からの血液に限定するものではない。本願において、胎児又は乳児の胎盤の血液は、臍帯の血液と合流する。本発明の目的において、同じ循環ループにある異なる部分に位置する血液を区別する必要はない。本願において、「臍帯血細胞」は、臍帯血からの細胞を意味する。複製可能な臍帯血細胞は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器でＴＶＥＭＦ−増殖を行い、本発明の組成物に存在することができる。
【００５７】
本願において、「臍帯血幹細胞」は、臍帯血からの成人幹細胞を意味する。胎児に直接由来する胚幹細胞ではない。好ましくは、本発明の臍帯血幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞である。
【００５８】
本願において、「臍帯血幹細胞組成物」は、本発明の臍帯血幹細胞であって、該臍帯血幹細胞の体積当たりの数が、少なくとも天然臍帯血の７倍であり、該臍帯血幹細胞が、天然臍帯血の幹細胞と同一又は類似の三次元形状及び細胞間形状及び細胞間支持を有するもの、又は、ＴＶＥＭＦ−増殖を行いながら上記形状及び支持を維持しているものを意味する。臍帯血幹細胞には、医薬上許容しうる担体、血漿、血液、アルブミン、細胞培養液、増殖因子、銅キレート剤、ホルモン、バッファ、凍結保存剤、又は他の物質など、いくつかの種類のキャリアが伴う。天然臍帯血の参照は、好ましくは本発明の臍帯血幹細胞を、元来の臍帯血の源と比較するためである。しかしながら、そのような比較が利用できない場合には、本発明の臍帯血幹細胞の情報源として、天然臍帯血を臍帯血、好ましくは同じ哺乳類の臍帯血の平均的又は典型的な性質とする。  
【００５９】
本願において、「臍帯血混合液」は、臍帯血細胞の、ＴＶＥＭＦ−生物反応器（例えば、細胞培養チャンバー）に配置される細胞成長のための培地のような細胞増殖を可能とする物質との混合液を意味する。臍帯血細胞は、単に臍帯血全体を細胞培養液などの物質と混合することによって、臍帯血混合液に存在させてもよい。また、臍帯血混合液は、本明細書に記載されているように、臍帯血幹細胞を含有する臍帯血からの細胞を調製することによって作製することができる。臍帯血混合液は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−臍帯血幹細胞及びダルベッコの培地（ＤＭＥＭ）含むことが好ましい。少なくとも臍帯血混合液の半分がＤＭＥＭなどの細胞培養液であることが好ましい。
【００６０】
本願において、「ＴＶＥＭＦ」は、「時間変動する電磁気力」を意味する。
【００６１】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−生物反応器」は、ＴＶＥＭＦが適用された回転バイオリアクターを意味し、上述した図面の詳細な説明により十分に説明されている。バイオリアクターに適用されるＴＶＥＭＦは、好ましくは０．０５〜６．０ガウス、好ましくは０．０５〜０．５ガウスの範囲である。例えば、図２、３、４及び５のＴＶＥＭＦ−生物反応器の例（限定するわけではなく）を参照。単純な実施形態において、本発明のＴＶＥＭＦ−生物反応器は、含有する臍帯血混合液を、適切なガウスレベルで回転させ（ＴＶＥＭＦを付与して）、その中の臍帯血細胞（幹細胞を含む）を増殖させる。好ましくは、ＴＶＥＭＦ−生物反応器において成長培地（好ましくは添加剤と共に）を交換することができ、臍帯血混合液に酸素を含ませることができる。ＴＶＥＭＦ−生物反応器は、細胞を数日以上で成長させる機構を提供する。ＴＶＥＭＦ−生物反応器では、ＴＶＥＭＦするために細胞をバイオリアクターに投入し、ＴＶＥＭＦが細胞を通過し、このようにしてＴＶＥＭＦ−増殖が行われる。
【００６２】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血細胞」は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置され、約０．０５〜６．０のＴＶＥＭＦが適用された後の体積当たり数が増加した臍帯血細胞（すなわち濃度）を意味する。体積当たりの細胞の数の増加は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器における細胞複製の結果であり、バイオリアクター中の細胞の合計数は増加する。体積当たりの細胞の数の増加は、明確に、単なる流動体の体積の低減、例えば、血液の体積を７０ｍｌから１０ｍｌへ低減し、それによりｍｌごとの細胞の数を増加することによるものではない。
【００６３】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞」は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置され、約０．０５〜６．０のＴＶＥＭＦが適用された後の体積当たり数が増加した臍帯血幹細胞（すなわち濃度）を意味する。体積当たりの幹細胞の数の増加は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器における細胞複製の結果であり、バイオリアクター中の幹細胞の合計数は増加する。体積当たりの幹細胞の数の増加は、明確に、単なる流動体の体積の低減、例えば、血液の体積を７０ｍｌから１０ｍｌへ低減し、それによりｍｌごとの幹細胞の数を増加することによるものではない。
【００６４】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−増殖」は、ＴＶＥＭＦ−（回転）バイオリアクターでＴＶＥＭＦの存在下、複製（分裂及び成長）する、ＴＶＥＭＦ−生物反応器における細胞の段階を意味する。臍帯血幹細胞（好ましくはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−幹細胞）は、好ましくは、さらなる分化を行わずに複製する。
【００６５】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−増殖」は、細胞を約０．０５〜約６．０ガウスのＴＶＥＭＦにさらして、ＴＶＥＭＦ−生物反応器中の臍帯血細胞、好ましくは臍帯血幹細胞、の数を増加するプロセスを意味する。臍帯血細胞、好ましくは臍帯血幹細胞、の数の増加は、少なくとも体積当たりの数（すなわち濃度）が元の臍帯血源の７倍であることが好ましい。本発明のＴＶＥＭＦ−生物反応器における臍帯血幹細胞の増殖は、ＴＶＥＭＦ−増殖前の臍帯血幹細胞と基本的に同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を維持する又は有する臍帯血幹細胞をもたらす。ＴＶＥＭＦ−増殖の他の側面のいては、本発明の臍帯血幹細胞の優れた性質をもたらす。理論に固執することなく、ＴＶＥＭＦ−増殖は、三次元形状及び細胞間支持を維持する高濃度の臍帯血幹細胞を提供するだけでない。理論に固執することなく、ＴＶＥＭＦＴＶＥＭＦ−増殖中のいくつかの幹細胞の性質に影響を与えることができる。例えば、遺伝子の成長促進する上向き調整、又は、遺伝子の成長を妨げる下向き調整である。全体として、ＴＶＥＭＦ−増殖は、全体の分化ではなく、成長を促進する結果となる。
【００６６】
本願において、「ＴＶＥＭＦ−増殖した細胞」、ＴＶＥＭＦ−増殖のプロセスに提供された細胞を意味する。
【００６７】
本願において、「有害物質」又は関係用語は、細胞、好ましくは臍帯血幹細胞、又は患者に有害な物質を意味する。特に、「有害物質」は、を意味する死細胞、マクロファージ、臍帯血において他とは異なる又は通常ではない物質（例えば、鎌状細胞、母体血、母体の尿、又は他の組織又は排出物）。他の有害物質は、本明細書中で説明されている。血液からのこれらの物質の除去は、従来技術において知られている。
【００６８】
上述したように定義した用語又は本明細書で使用されている他の用語を参照する他の記述は、上記定義に限定されるものではなく、上記定義に寄与するものである。本発明の様々な側面に関係する情報は、本願において提供され、それが含まれる部分にのみ限定されるものではなく、本発明全体を理解するのに寄与するものである。
【００６９】
本発明は、ヒトの組織を治療、補充、再生のための、早期に利用可能なＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の供給源に関する。本発明は、後述する好ましい実施形態においてより十分に説明されているが、それに限定されるものではない。
【００７０】
操作方法−ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物の調製、及び、該組成物の使用
本発明の好ましい実施形態において、組織の治療、交換及び再生において身体を助けることができ、又は、研究に有用であるＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞を調製する方法が説明されている。
【００７１】
例えば本願に記載されたように、好ましくは、シリンジ方法によって、臍帯血は哺乳類、好ましくは霊長類哺乳類、より好ましくはヒトから採集される。臍帯血は胎内で採集することもできる。例えば、妊娠第３期に欠損（例えば耳欠損）が明らかである場合など生命に関わる事態又は究極状況において、臍帯血幹細胞を増殖させ、出産又は乳児が産まれた直後に、必要であれば直ぐに利用可能なようにする。胎内で臍帯血を取るのは、生まれていない乳児を脅かさない量だけである。本発明における臍帯血の採集は、限定されないが、例えば、その他の哺乳類の臍帯血を直接採集する手段、又は、例えば「血液バンク」からの凍結保存血液など商業的又は他の供給源からの血液を得ることによって、間接的に血液を収集する手段などが含まれる。
【００７２】
臍帯血から赤血が除去され、臍帯血幹細胞を含む残りの細胞を、本明細書で説明するＴＶＥＭＦ−生物反応器（「臍帯血混合液」参照）の適切な培地に配置することが好ましい。本発明のより好ましい実施形態においては、上述した「軟膜」（本明細書で説明する臍帯血幹細胞を含む）のみをＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置する。他の実施形態には、他の非幹細胞及び臍帯血の成分を除き、異なる臍帯血調製液を調製することが含まれる。そのような臍帯血調製液は、ただ１つの臍帯血成分として、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−臍帯血幹細胞を有する。臍帯血細胞の非幹細胞タイプの除去は、これに限定されないが、沈殿及び遠心分離など消極的な分離技術で行うことができる。多くの消極的な分離技術は、従来技術として知られている。しかし、積極的な分離技術を用いてもよく、本発明においては好ましい。血液の様々な成分を除去する方法及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８−のための積極的な分離は、従来技術として知られており、所望の臍帯血幹細胞を溶解させる又は不可逆的に傷つけない限り使用してもよい。例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−を分離するアフィニティー法を用いてもよい。好ましくは、上記「軟膜」を臍帯血から調製し、その中のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞は、ＴＶＥＭＦ−増殖のために軟膜から分離される。
【００７３】
採集された臍帯血、又は上述した所望の細胞部分は、ＴＶＥＭＦ−増殖が起こるように、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置しなければならない。上述したように、「臍帯血混合液」には、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置される、臍帯血（又は所望の細胞部分、例えば赤血球のない臍帯血、又は好ましくは臍帯血から分離されたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−臍帯血幹細胞）と、細胞の成長のための培地など細胞を増殖させる物質との混合液が含まれる。細胞培養基、細胞を成長及び増殖させる培地は従来技術として知られている。好ましくは、細胞増殖させる物質は細胞培養基であり、より好ましくはダルベッコの培地である。細胞培地の成分は、当然細胞を殺したり、ダメージを与えないものでなくてはならない。他の成分を、ＴＶＥＭＦ−増殖前又はその最中に、臍帯血混合液に添加してもよい。例えば、臍帯血はダルベッコの培地と共にバイオリアクターに配置され、さらに５％（また、他の所望の量、例えば約１％〜約１０％の範囲で）のヒト血清アルブミンが補充される。バイオリアクターに配置される前に、バイオリアクターの外又は中で、これらに限定されないが、増殖因子、銅キレート剤、サイトカイン、ホルモン及び他の物質ＴＶＥＭＦ−増殖を促進する他の物質など臍帯血混合液への他の添加剤を臍帯血に添加してもよい。好ましくは、一人の個人から採集した臍帯血の全量（好ましくは約１０ｍｌ〜約１００ｍｌの量のヒト臍帯血、より好ましくは５０ｍｌ〜約１００ｍｌの臍帯血）に、約２５ｍｌ〜約１００ｍｌのダルベッコの培地（ＤＭＥＭ）、及び補助される５％ヒト血清アルブミンが混合され、臍帯血混合液の全量は、バイオリアクターに配置された時に約７５〜約２００ｍｌである。一般的な規則として、収集する臍帯血は多いほどよい。一人の個人からの採集が１００ｍｌを超える場合には、その価値ある臍帯血の全てを使用することが好ましい。例えば、臍帯血を溜めることによって、より大きい体積が利用できる場合には、１ダースを超えることが好ましい。臍帯血の採集を溜め、一緒にＴＶＥＭＦ−増殖を行う時に、かん流ＴＶＥＭＦ−生物反応器の使用は特に便利である。
【００７４】
「ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置する」は、限定されるものではなく、臍帯血混合液はバイオリアクターの全く外で作成され、そして該混合液はバイオリアクター内に配置されてもよい。また、臍帯血混合液はバイオリアクター内で完全に混合されてもよい。例えば、臍帯血は、ダルベッコの培地と共にバイオリアクターに配置され、バイオリアクターの中で、バイオリアクターで同時に添加して、又は臍帯血のとにバイオリアクターに添加するのいずれかで、５％ヒト血清アルブミンが補充される。
【００７５】
本発明の好ましい臍帯血混合液には、以下が含まれる。帝王切開の乳児から採集した臍帯血サンプルの軟膜から分離されたＣＤ３４＋／ＣＤ３８−幹細胞、及び、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞と共に、全量で約２００ｍｌであるダルベッコの培地。さらに好ましくは、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）が臍帯血混合液に含まれる。好ましくは、Ｇ−ＣＳＦは、臍帯血幹細胞のＴＶＥＭＦ−増殖を刺激するのに充分な量存在する。より好ましくは、ＴＶＥＭＦ−増殖前の臍帯血混合液のＧ−ＣＳＦの量は、約２５〜約２００ｎｇ／ｍｌの混合液であり、より好ましくは約５０〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７６】
ＴＶＥＭＦ−生物反応器の容器（臍帯血幹細胞を含む臍帯血混合液を含有する）は、三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を維持するために臍帯血幹細胞が懸濁液となる速度で回転される。好ましくは、回転速度は５〜１２０ｒｐｍ、より好ましくは、１０〜３０ｒｐｍである。細胞がＴＶＥＭＦ−生物反応器にある間、細胞には、栄養素及び新しい培地（ＤＭＥＭ及び５％ヒト血清アルブミン）を与えること、ホルモン、サイトカイン、及び／又は増殖因子（好ましくはＧ−ＣＳＦ）に触れさせること、有毒物質を除去することが好ましい。ＴＶＥＭＦ−生物反応器の臍帯血細胞から除去される有毒物質としては、死にかけの細胞の有毒な顆粒物質、顆粒球の有毒物質、及びマクロファージが含まれる。細胞のＴＶＥＭＦ−増殖は、好ましくは細胞が充分な期間に少なくとも７倍に増殖する（体積当たりの数の増加又は濃度）ように制御されている。好ましくは、臍帯血幹細胞（もし存在するのであれば、他の細胞も）は、少なくとも４日間、好ましくは約７〜約１４日間、より好ましくは約７〜約１０日間、さらに好ましくは約７日間、ＴＶＥＭＦ−増殖を行う。ＴＶＥＭＦ−増殖はＴＶＥＭＦ−生物反応器で１６０日間まで継続するかもしれない。ＴＶＥＭＦ−増殖は１６０日間よりも更に長く行われるかもしれないが、そのような長い増殖は、本発明の好ましい実施形態ではない。
【００７７】
好ましくは、ＴＶＥＭＦ−増殖は、約２６℃〜約４１℃、より好ましくは約３７℃のＴＶＥＭＦ−生物反応器で行われる。
【００７８】
ＴＶＥＭＦ−増殖を行う細胞の増殖全体を監視する方法の１つとして、目視観察がある。臍帯血幹細胞は、典型的には濃い赤色をしている。臍帯血混合液の作製に用いられた培地の色は、薄い又は透明であることが好ましい。バイオリアクターが回転し始め、ＴＶＥＭＦが付与されると、細胞は、好ましくはバイオリアクター容器の中央に群がり、培地は色のついた細胞の塊を囲む。酸素を含有させること及び他の栄養素を添加することによっては、バイオリアクターに設けられた視覚化する窓（典型的には透明なプラスチック）を通じて、しばしば細胞集合を視覚化する能力を弱めない。塊の形成は、幹細胞が三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を維持することを助けるのに重要である。塊が散乱しているようであったり、細胞がバイオリアクター容器の壁面に接触し始めた場合には、回転速度を上げ（手動で又は自動的に）、中央に細胞集合が再び形成されるようにする。形成直後に行われる、目に見えるようにできる細胞集合の直径の測定は、後の塊の直径と比較し、ＴＶＥＭＦ−生物反応器の細胞のおよその増加数を示すことができる。また、ＴＶＥＭＦ増殖中の細胞の増加数の測定は、従来技術に知られているように様々な方法で行うことができる。自動センサーをＴＶＥＭＦ−生物反応器に設け、監視及び塊のサイズの増大を測定することができる。
【００７９】
ＴＶＥＭＦ−増殖のプロセスは、例えば、細胞がバイオリアクター中で群がり続けるように細胞集合の形成を確認し、細胞集合が散乱し始めたらバイオリアクターの回転を増やす検査の専門家によって、注意深く監視される。バイオリアクター中の細胞集団及び臍帯血混合液の粘度を監視する自動システムによって、細胞集合が監視されてもよい。細胞集合の粘度の変化は、ＴＶＥＭＦ−増殖プロセスを開始してから約２日後に見られ、ＴＶＥＭＦ−生物反応器の回転速度は、その時期くらいに増大されてもよい。ＴＶＥＭＦ−生物反応器の速度は、ＴＶＥＭＦ−増殖を通じて様々であってよい。ＴＶＥＭＦ−増殖中の細胞がＴＶＥＭＦ−生物反応器の容器の側面に接触しないように、回転速度は適時に調整されることが好ましい。
【００８０】
また、検査の専門家は、例えば１日１回、２日に１回又は３日に１回、手動で（例えば注射器を用いて）新しい培地及び好ましくは上述したような栄養素及び増殖因子など他の所望の添加剤をバイオリアクターに投入し、細胞の排泄物及び毒素を含有する古い培地を取り除いてもよい。また、新しい培地及び他の添加剤は、ＴＶＥＭＦ−増殖中、自動的にＴＶＥＭＦ−生物反応器に汲み上げ、排泄物は自動的に除去されてもよい。
【００８１】
臍帯血幹細胞は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置され、ＴＶＥＭＦ−増殖してから約７〜約１４で、元々の数より少なくとも７倍に増加してもよい。好ましくは、ＴＶＥＭＦ−増殖は約７〜１０日続き、より好ましくは約７日続く。したがって、幹細胞の数の測定は、ＴＶＥＭＦ−増殖中に行われなくてもよい。上述及び本願を通して記載されているように、ＴＶＥＭＦ−増殖した本発明の臍帯血幹細胞は、天然のＴＶＥＭＦ−増殖していない臍帯血幹細胞と基本的に同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を有する。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、組織、例えば、本願に記載したような組織を治療、補充及び再生するために、体組織又は組織を助けるように機能する生体外の哺乳類の臍帯血幹細胞組成物に関する。組成物には、好ましくは、元々の臍帯血の体積当たりの臍帯血幹細胞の少なくとも７倍の体積当たりの数のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞が含まれる。例えば、好ましくは、Ｘ個の臍帯血幹細胞がＴＶＥＭＦ−生物反応器にある体積で配置された場合、ＴＶＥＭＦ−増殖後、ＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置された同じ体積からの臍帯血幹細胞の臍帯血幹細胞の数は、少なくとも７Ｘ個である。少なくとも７倍であることは、本発明の実施に必要ではないが、この増殖は特に治療目的に好ましい。例えば、ＴＶＥＭＦ−増殖した細胞は、必要であれば、天然臍帯血の臍帯血幹細胞の数の２倍でしかない。ＴＶＥＭＦ−増殖した細胞は、天然臍帯血の臍帯血幹細胞の体積当たりの約４倍〜約２５倍であることが好ましい。また、本発明は哺乳類の臍帯血幹細胞を含む組成物に関し、該臍帯血幹細胞の体積当たりの数が哺乳類の天然臍帯血よりも少なくとも７倍であり、臍帯血幹細胞が天然臍帯血の幹細胞と基本的な同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を有する。本発明の組成物には、医薬上許容しうる担体、例えば、血漿、血液、アルブミン、細胞培養液、増殖因子、銅キレート剤、ホルモン、バッファ又は凍結保存剤が含まれる。「医薬上許容しうる担体」は、哺乳類、好ましくはヒトに幹細胞を導入することができる薬剤である。そのようなキャリアには、ここで記載した物質、特に輸血に用いられるいかなる物質、例えば血液、血漿、アルブミン、好ましくは組成物が導入される哺乳類からのものが含まれる。哺乳類に組成物を「導入」することは、動物に組成物を「投与」することを意味する。「許容しうる担体」は、一般的に、ＴＶＥＭＦ−増殖後、凍結保存前又は後、又は哺乳類への導入（投与）前の、本発明の臍帯血幹細胞が生きられる物質、すなわち細胞に有毒ではない物質を意味する。そのようなキャリアは従来技術において知られており、本願でそのような目的のために記載された物質など様々な物質を含んでよい。例えば、血漿、血液、アルブミン、細胞培養液、バッファ及び凍結保存剤は全て、本発明の許容しうる担体である。所望のキャリアは、ある程度所望の利用方法による。
【００８３】
従来の他の増殖方法（いずれもＴＶＥＭＦを使用しない）は、臍帯血幹細胞の三次元形状及び細胞間支持を維持しながら、天然臍帯血の臍帯血幹細胞の量の少なくと７倍となる臍帯血幹細胞の増殖は提供していない。ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞は、元々の臍帯血と基本的に同一の三次元形状及び細胞間支持及び細胞間形状を有する又は維持する。前記組成物には、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞、好ましくはダルベッコの培地又は直ぐに凍結保存できる溶液の懸濁液の状態のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞が含まれる。前記組成物には、例えば、死にかけの細胞及び有毒物質、顆粒球の中身及びマクロファージなど有毒な顆粒物質が含まれないことが好ましい。前記組成物は、−１２０℃〜−１９６℃に組成物の温度を低減し、治療又は他の用途に必要となるまで凍結保存組成物をその温度に維持することによって、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞を含む凍結保存組成物としてもよい。後述するように、凍結保存前に組成物から有毒物質をできる限り除去することが好ましい。
【００８４】
本発明の別の実施形態は、凍結保存を行った又はＴＶＥＭＦ−増殖直後のＴＶＥＭＦ−臍帯血幹細胞の組成物で、組織を再生する及び/又は自己免疫疾患（上述したように）などの疾病を治療する方法に関する。前記細胞は、哺乳類の身体、好ましくはヒトの身体に導入され、例えば静脈内に又は直接治療される組織へ注射され、身体の自然システムに組織を治療及び再生させる。哺乳類の身体に導入される前記組成物には有毒物質、及び、投与されたＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞に対して不利な反応をする可能性がある他の材料が含まれないことが好ましい。前記方法（及び組成物）は、潜在的に、哺乳類、好ましくはヒトの重要臓器及び他の組織の治療に使用することができ、可能性の有る用途としては、これらに限定されないが、肝組織、心臓組織、造血組織、血管、皮膚組織、筋肉組織、消化器組織、膵臓組織、中枢神経系、骨組織、軟骨組織、結合組織、肺組織、脾臓組織、頭脳組織及び他の身体組織が含まれる。前記細胞は、特に、疾病が発生し、疾病にかかっていない細胞が必要である場合に、個人の血球が必要である治療又は研究において、治療又は研究に直ぐに利用可能である。
【００８５】
操作方法−凍結保存
上述したように、臍帯血は、例えば哺乳類の子供、好ましくはヒトの乳児の出産中（より好ましくは帝王切開において）に採集される。赤血球は臍帯血から除去されることが好ましい。臍帯血幹細胞（必要であれば、他の細胞及び中膜と共に）はＴＶＥＭＦ−生物反応器に配置され、時間変動する電磁気力が付与されて、増殖する。増殖後、前記細胞は低温で保存される。ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物の凍結保存に関する詳細は、本明細書において、特に以下に示す。
【００８６】
ＴＶＥＭＦ−増殖後、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞を含むＴＶＥＭＦ−増殖した細胞は、少なくとも１つの凍結保護剤を含有する少なくとも１つの凍結保存容器に移送されることが好ましい。ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞は、まず好ましくは溶液（例えば、バッファ溶液又は所望の凍結保存剤の溶液）で洗浄してＴＶＥＭＦ−増殖中に存在した中膜及び他の成分を除去し、そして細胞を凍結保存することができる溶液に入れる。前記細胞は適切な低温容器に移され、該容器の温度は通常−１２０℃〜−１９６℃、好ましくは約−１３０〜約−１５０℃に低減され、その温度が維持される。必要であれば、細胞の温度（すなわち低温容器の温度）は、ヒトの身体への導入に適合する温度（通常およそ室温からおよそ体温）に上昇され、ＴＶＥＭＦ−増殖した細胞は、例えば上述したように哺乳類の身体、好ましくはヒトの身体に導入される。
【００８７】
凍結した細胞は通常有害である。冷却において、細胞中の水が凍る。すると、細胞膜における浸透圧効果、細胞内脱水、溶質濃度、及び氷晶生成によって損傷が生じる。細胞の外側が結氷するため、やがて細胞の破壊に至る浸透脱水及び溶質濃度の上昇を引き起こす、水を溶液から除去及び細胞から取り出す（内容の詳細はマズールＰ．（Mazur, P.）、１９７７年、クリオバイオロジー（Cryobiology）１４、２５１〜２７２参照）。
【００８８】
異なる材料は異なる氷点を有する。結晶化及び凍結工程における細胞壁のダメージを最小限に抑えるために、直ちに凍結保存できる臍帯血幹細胞組成物には、可能な限り汚染物質が含まれていないことが好ましい。
【００８９】
これらの有害な影響は、次の方法で回避することができる。（ａ）凍結保護剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、及び（ｃ）分解反応を最小限に留める十分に低い温度での保存。
【００９０】
本発明においては、凍結保存剤を含有させることが好ましい。使用可能な凍結保護剤には、これに限定されないが、十分な量ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ラブロックＪ．Ｅ．（Lovelock, J. E.）及びビショップＭ．Ｗ．Ｈ（Bishop, M. W. H.）、１９５９、ネイチャー（Nature）１８３、１３９４〜１３９５；アッシュウッド−スミスＭ．Ｊ．（Ashwood-Smith, M. J.）、１９６１、ネイチャー（Nature）１９０、１２０４〜１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリジン（フィンフレットＡ．Ｐ．（Rinfret, A. P.）、１９６０、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、５７６）、ポリエチレングリコール（スロビターＨ．Ａ．（Sloviter, H. A.）及びラドビンＲ．Ｇ．（Ravdin, R. G.）、１９６２、ネイチャー（Nature）１９６、５４８）、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マニトール（ロウェＡ．Ｗ．ら（Rowe, A. W. et al.）、１９６２、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．２１、１５７）、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン（ベンダーＭ．Ａ．ら（Bender, M. A., et al.）、１９６０、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５、５２０）、アミノ酸−グルコース溶液又はアミノ酸（Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ．Ａ．、１９６０、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０、６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセリンモノアセタート（ラブロックＪ．Ｅ．（Lovelock, J. E.）、１９５４、バイオケミ．Ｊ．（Biochem. J.）５６、２６５）、及び無機塩（Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ．Ａ．、１９６０、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０４、３８８；Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ、Ｍ．Ａ．、１９６１、放射線生物学、放射線生学に関する第３回オーストラリア会議の手続き（Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology）、イルベリーＰ．Ｌ．Ｔ．（Ilbery, P. L. T.）編、バッターウォルス（Butterworth）、ロンドン、p．５９）。好ましい実施形態においては、ＤＭＳＯが用いられている。液体のＤＭＳＯは低濃度では細胞に害はない。小さい分子であるため、ＤＭＳＯは自由に細胞を通り抜け、凍結性を緩和するために水と結合して細胞内の細胞小器官を保護し、結氷からのダメージを防止する。血漿の添加（すなわち２０〜２５％の濃度まで）によって、ＤＭＳＯの保護効果を増大させることができる。４０℃を超えるとＤＭＳＯ濃度が約１％であると有害であるため、ＤＭＳＯの添加後、細胞は凍結まで０℃に保たれていなければならない。好ましい凍結保護剤は、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞との組み合わせで、６０〜８０％アミノ酸−グルコース溶液中の２０〜４０％ジメチルスルホキシド溶液、１５〜２５％ヒドロキシエチルでんぷん溶液、４〜６％グリセロール、３〜５％グルコース、６〜１０％デキストランＴ１０、１５〜２５％ポリエチレングリコール、又は７５〜８５％アミノ酸−グルコース溶液である。
【００９１】
本発明に臍帯血細胞以外の他の物質及び凍結保護剤が含まれてもよいが、例えば上述した凍結のメカニズムにおいて述べた理由により、凍本発明のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物の凍結保存においては、可能な限り他の物質が少ないことが好ましい。
【００９２】
本発明のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物は、約−１２０℃〜約−１９６℃、好ましくは約−１３０℃〜約−１９６℃、より好ましくは約−１３０℃〜約−１５０℃の範囲の温度に冷却することが好ましい。
【００９３】
ゆっくりな冷却速度に制御することは重要である。異なる凍結保護剤（ラパズＧ．ら（Rapatz, G., et al.）、１９６８、低温生物学（Cryobiology）５（１）、１８〜２５）及び異なる細胞タイプは、最適な冷却速度が異なる（例えば、冷却速度の体皮細胞の生存に対する影響（及びそれらの移植の可能製）について、ロウＡ．Ｗ．（Rowe, A. W.）及びリンフレットＡ．Ｐ．（Rinfret，A. P.）、１９６２、血液２０、６３６；ロウＡ．Ｗ．（Rowe, A. W.）、１９６６、低温生物学（Cryobiology）３（１）、１２〜１８；ルイスＪ．Ｐ．ら（Lewis, J. P., et al.）、１９６７、輸血（Transfusion）７（１）、１７〜３２；及びマズールＰ．（Mazur, P.）、１９７０、サイエンス（Science）１６８、９３９〜９４９を参照）。水が氷に変る融解熱は最小限にすべきである。冷却工程は、例えば、プログラムで制御できる凍結装置又はメタノールバス手法を用いて行うことができる。
【００９４】
プログラムで制御できる凍結装置によって、最適な冷却速度を決定することができ、再現可能な標準的な冷却を促進することができる。クリオメッド（Cryomed）又はプラナー（Planar）などのプログラムで制御された速度の冷蔵庫は、凍結管理を、望ましい冷却速度曲線に調整することができる。その他の条件を満たした冷凍庫は、例えば、サンヨー製Ｍｏｄｌ  ＭＤＦ−１１５５ＡＴＮ−１５２Ｃ及びＭｏｄｅｌ  ＭＤＦ−２１３６ＡＴＮ−１３５Ｃ、プリンストン（Princeton）製ＣｒｙｏＴｅｃｈ  ＴＥＣ  ２０００が挙げられる。例えば、末梢血液細胞、又は、１０％ＤＭＳＯ及び２０％血漿のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞において、最適な速度は１〜３℃／分で０℃〜−２００℃である。
【００９５】
好ましい実施形態においては、この冷却速度は本発明の細胞に用いることができる。細胞を有する低温容器は、低温で安定していなければならず、冷却及び解凍のシールの効果的な制御のために速い熱伝導が可能である。複数の少量（１〜２ｍｌ）に、封止されたプラスチックの小瓶（例えば、ヌンク（Nunc）、ウィートン  クリウレ（Wheaton cryules）又はガラスアンプルを用いることができる。一方、より大きい容量（１００〜２００ｍｌ）は、冷却時のよりよい熱交換のために金属板で挟まれたポリオレフィンバッグの中で（例えば、デルメッド（Delmed））凍結することができる（骨髄細胞のバッグは、骨髄細胞のバッグを、冷却速度約３℃／分である−８０℃の冷凍庫に置くことによって思いがけずうまく凍結することができる）。
【００９６】
別の実施形態においては、メタノールバスの冷却手法を用いることができる。メタノールバス手法は、大規模に複数の少量を繰り返し凍結保存する場合に非常に適している。この方法には、凍結速度の手動制御も速度を監視するレコーダーも必要ない。好ましい側面においては、ＤＭＳＯ-処理された細胞は、予め氷で冷却され、冷却したメタノールを含むトレーに、次に、メタノールバスの熱電対測定で−１３０℃の機械冷蔵庫（例えば、ハリス（Harris）又はレボコ（Revco））に移送され、サンプルは望ましい冷却速度１〜３℃／分を示す。少なくとも２時間後、検査サンプルの温度は−８０℃に達し、永久保存のために液体窒素（−１９６℃）に直接配置してもよい。
【００９７】
凍結後、ＴＶＥＭＦ−増殖した幹細胞は、直ぐに長期凍結保存容器に移される。好ましい実施形態において、サンプルは、液体窒素（−１９６℃）又はその気体（−１６５℃）の中に低温で保存することができる。保存温度は、−１２０℃未満、好ましくは−１３０℃未満とすべきである。このような保存は、高効率な液体窒素冷蔵庫の利用によってより促進される。該液体窒素冷蔵庫は、大きな魔法瓶容器のようであり、熱もれ及び窒素のもれが極めて最小限に維持されるように、非常に低い真空で、優れた内部断熱材を有する。
【００９８】
細胞の凍結保存のための好ましい装置及び手段は、テルモジェネシス（Thermogenesis Corp.）（ランチョ  コルドボ（Rancho Cordovo、カリフォルニア州）で製造されているものであり、彼らの細胞の温度を−１３０℃未満に低減する手順を利用する。細胞は、凍結及び保存中、テルモジェネシス社の血漿バッグに保持される。
【００９９】
ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物の温度が−１２０℃未満、好ましくは−１３０℃未満に降下された後、テルモジェネシス社の冷凍庫などの装置に保持される。温度は約−１２０℃〜−１９６℃、好ましくは−１３０℃〜−１５０℃に維持される。本発明の凍結保存ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物の温度は、長期間約−１２０℃であるべきではない。
【０１００】
本発明の凍結保存したＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物は、不定期間、凍結することができ、必要な時に解凍することができる。例えば、組成物は１８年まで凍結することができる。さらに長い期間は可能であり、おそらく乳児ドナーの一生と同じくらいの期間が可能である。
【０１０１】
必要である時には、テルモジェネシス社（Thermogenesis）の血漿解凍器、又は、テルモリン社（Thermoline）の解凍器シリーズなど他の装置などの解凍システムに、細胞の入ったバッグを置いてもよい。凍結保存組成物の温度は、室温に上昇される。凍結保護剤と混合した細胞の解凍の他の好ましい方法において、液体窒素中で凍結保存した本発明のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物を有するバッグを、１５分間液体窒素の気相に放置し、５分間外気室温にさらし、最後に３７℃のウォーターバスで可能な限り素早く解凍してもよい。解凍されたバッグは、直ちに同量の２．５％（重量/体積）ヒト血清アルブミン及び５％（重量/体積）デキストラン４０（ソルプレックス４０（Solplex 40）、シフラ（Sifra）、ヴェロナ（Verona）、イタリア）を含むアイソトニック塩溶液を含有する溶液で希釈され、続いて４００ｇで１０分間、遠心分離機にかけられる。浮遊物は除去され、沈殿した細胞は、アルブミン/デキストラン溶液で再度沈澱される。高圧力の抗凍結剤の除去については、ルビンスタインＰ．ら（Rubinstein, P. et al.）、「無関係な骨髄の再構成のための胎盤/臍帯血の処理及び凍結保存」（Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ９２、１０１１９〜１０１２（１９９５）を参照。細胞の解凍の好ましい方法のバリエーションについては、ラザッリＬら（Lazzari, L. et al.）、「臍帯血からの造血系幹細胞の生体外増殖における凍結保存の効果の向上（Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansion of hematopoetic progenitors from cord blood）。骨髄移植２８、６９３〜６９８（２００１）を参照。
【０１０２】
細胞の温度が室温に上げられた後は、細胞は研究又は再生治療に利用可能である。解凍されたＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物は、直接哺乳類、好ましくはヒトに導入することができ、又は、解凍された状態で所望の研究に用いることができる。哺乳類の身体に導入する前に、好ましくはそのような導入の直前に、種々の添加剤を解凍された組成物に添加することができる（又は、非凍結保存のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物に）。そのような添加剤としては、これらに限られないが、増殖因子、銅キレート剤、サイトカイン、ホルモン、好適なバッファ又は希釈剤が含まれる。好ましくは、Ｇ−ＣＳＦが添加される。より好ましくは、ヒトにおいて、約２０〜約４０μｇ／ｋｇ体重の量、より好ましくは約３０μｇ／ｋｇ体重の量のＧ−ＣＳＦが添加される。また、導入の前に、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物は、哺乳類自身の又は適合するドナーの血漿、血液又はアルブミン、又は輸血に付随する他の材料と混合してもよい。解凍された臍帯血幹細胞は、例えば、治療に用いることが望ましい又は治療に用いることができる薬剤に不利な反応がないか確認する試験に用いることができる。
【０１０３】
アメリカ合衆国ではＦＤＳが増殖した臍帯血幹細胞の組織の再生への使用を認めていないが、そのような認可は間近であると思われる。臍帯血の採集が出産の短期間にのみ行うことができるため、将来的な利用のために臍帯血幹細胞が採集されるのであれば、今後の研究及び可能性のある今後の利用のために、臍帯血幹細胞は採集及び増殖及び保存されるべきである。増殖された臍帯血幹細胞の十分な量の直接注射は、再生する心臓、肝臓、膵臓、皮膚、筋肉、腸、脾臓、脳などの重要臓器の再生に用いることができる。
【０１０４】
本発明のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物は、哺乳類、好ましくはヒトに、組織の治療又は再生の達成、又は、所望の疾病又は状態の治療に十分な量を導入すべきである。好ましくは、少なくとも２０ｍｌの、ｍｌ当たり１０７〜１０９の幹細胞を有するＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物が様々な治療に用いられ、特に外傷が発生し早急な組織の治療が必要である場合に、一度に用いることが好ましい。この量は特に７５〜８０ｋｇの人間において好ましい。供給源の哺乳類に導入される組成物におけるＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の量は、本質的に供給源の臍帯血材料に存在する細胞の数（例えば、１人の乳児の臍帯血に存在する幹細胞の量）に関係する。患者に導入されるＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の好ましい範囲は、例えば、ｍｌ当たり１０７〜１０９の幹細胞を有するＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞組成物を約１０ｍｌ〜約５０ｍｌ、又は潜在的にそれ以上である。哺乳類に投与されるいかなる物質が高濃度であることは、有害又は致命的であると理解されているが、哺乳類の臍帯血幹細胞の全てを導入することが、例えばＴＶＥＭＦ−増殖後に少なくとも７倍、ＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の投与のし過ぎとはなりにくい。数人のドナーの臍帯血が用いられる場合には、哺乳類に導入される臍帯血幹細胞の数は増加してもよい。また、患者に導入してもよいＴＶＥＭＦ−細胞の量は、１人の個体から採集した臍帯血の量に限定されない。複数の投与、例えば１日１回、１日２回、１週間に１回、又はその他の回数の投与は、より容易に用いることができる。また、組織が治療される時には、組織の種が、利用可能なＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の使用を保証する。例えば、肝臓が最も治療しやすい。
【０１０５】
上記実施例は、広くＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞の凍結保存に関し、凍結保存された、又は、増殖されていない、又は、非ＴＶＥＭＦ−増殖の臍帯血幹細胞の解凍後に、ＴＶＥＭＦ−増殖を行ってもよい。例えば、多くの臍帯血バンクは、必要な時に備えて、凍結保存された臍帯血幹細胞を含む凍結保存組成物を有する。そのような組成物は従来の方法で解凍され、その後、本明細書に記載のようにＴＶＥＭＦ−増殖されてもよく、本明細書に記載のＴＶＥＭＦ-処理のバリエーションを含む。その後、そのようなＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞は、上述したように、本発明の組成物と考えられる。例えば外傷が生じた時に、患者の臍帯血幹細胞が既に増殖され、調製にさらに貴重な日を要しないために、凍結保存前のＴＶＥＭＦ−増殖が好ましい。
【０１０６】
また、好ましくはないが、ＴＶＥＭＦ−増殖した本発明の臍帯血幹細胞は、凍結保存、及びその後解凍され、その後使用しなければ、再度凍結保存してもよい。
【０１０７】
また、本願のＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞は、ＴＶＥＭＦ−増殖後、凍結保存を行って又は行わないで、哺乳類、好ましくは供給源の哺乳類（臍帯血の供給源である哺乳類）に導入してもよい。
【０１０８】
解凍されたＴＶＥＭＦ−増殖した臍帯血幹細胞は、以下の疾病のための可能性のある治療の研究に用いることができる。
Ｉ．  正常な血液細胞の生成の障害又は機能障害、化膿、過剰増殖性幹細胞疾患、再生不良性貧血症、汎血球減少症、血小板減少症、赤芽球癆、薬物、放射線、感染又は特発性のブラックファン・ダイアモンド症候群に起因する疾病。
ＩＩ．  造血悪性腫瘍、急性リンパ性（リンパ球の）白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性悪性骨髄硬化症、多発性骨髄腫、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。
ＩＩＩ．  悪性を有する患者の免疫抑制、充実性腫瘍、悪性 黒色腫、腹部の癌腫、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、上皮性悪性腫瘍、網膜芽細胞腫、精巣癌、グリア芽腫、横紋筋肉腫、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、リンパ腫。
ＩＶ．  自己免疫性疾病、関節リウマチ、糖尿病タイプＩ、慢性 肝炎、多発性硬化症、及び全身性エリテマトーデス。
【０１０９】
Ｖ．  遺伝的（先天性）疾患、貧血症、家族性再生不良性、ファンコニ症候群、ブルーム症候群、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、先天性角化異常症、ブラックファン・ダイアモンド症候群、先天性赤血球異形成症候群Ｉ〜ＩＶ、チャウマン・ダイアモンド症候群（Chwachmann-Diamond syndrome）、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損症、フォルマミノ  トランスフェラーゼ欠損症（formamino transferase deficiency）、レッシュ・ナイハン症候群、先天性球状赤血球症、先天性楕円赤血球症、先天性ストマトサイト増加症、先天性Ｒｈゼロ疾病（confenital Rh null disease）、発作性夜間血色素尿症、Ｇ６ＰＤ（ブドウ糖-6-リン酸脱水素酵素欠損症）、変異体１、２、３、ピルビン酸キナーゼ欠損症、先天性エリスロポエチン過敏症、欠損症、鎌状細胞疾病及び形質、サラセミアα、β、γメト−ヘモグロビン血症（met-hemoglobinemia）、免疫の先天性疾患、重症複合型免疫不全症、（ＳＣＩＤ）、不全リンパ球症候群、イオノフォア反応複合型免疫不全症（ionophore-responsive combined, immunodeficiency）、キャッピング異常の複合型免疫不全症、ヌクレオシド・ホスホリラーゼ欠損症、顆粒球アクチン欠損症、乳児無顆粒球症、ゴーシェ病、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、コストマン症候群、細網異形成症、先天性白血球機能障害症候群。
【０１１０】
ＶＩ．  上記以外のもの。大理石骨病、骨髄硬化症、後天性溶血性貧血、後天性免疫不全症、原発性免疫不全症又は続発性免疫不全症を引き起こす感染性疾患、細菌感染（例えば、ブルセラ症、リステリア症、結核、ハンセン病）、寄生虫感染症（例えば、マラリア、リーシュマニア症）、真菌感染症、老化食細胞疾患（aging phagocyte disorders）によるリンパ球様細胞セットの不均衡及び免疫機能低下を含む疾患、コストマン無顆粒球症、慢性肉芽腫性疾病、チェディアック・東症候群、好中球アクチン欠損症、好中球細胞膜ＧＰ−１８０欠損症、代謝性蓄積症、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、及び、ウィスコット・アルドリッチ症候群、α１−抗トリプシン欠乏症を含む種々の疾患。
【０１１１】
増殖、保存、及び解凍の一連の工程の間、本発明の臍帯血幹細胞は、三次元形状、細胞間支持、及び細胞間形状を維持する。
【０１１２】
本願において好ましい実施形態を説明したが、いわゆる当業者は、種々の変更及び改良が含まれることを理解するであろう。本発明の範囲は、上述した実施形態に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、バイオリアクターの培養キャリアフローループの好ましい実施形態を模式的に示す。
【図２】図２は、本発明のＴＶＥＭＦ−生物反応器の好ましい実施形態の持ち上げた側面図である。
【図３】図３は、図２のＴＶＥＭＦ−生物反応器の好ましい実施形態の側面斜視図である。
【図４】図４は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器の好ましい実施形態の垂直断面図である。
【図５】図５は、ＴＶＥＭＦ−生物反応器の垂直断面図である。
【図６】図６は、バイオリアクターを収容することが可能で、バイオリアクターに時間変動する電磁気力を提供することができる時間変動する電磁気力装置の持ち上げた側面図図である。
【図７】図７は、図６の装置の正面図である。
【図８】図８は、図６の装置の正面図であって、さらにその中のバイオリアクターを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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