(57)【要約】  本発明は、生体内で標的遺伝子の発現を弱めるための方法及び組成物を提供する。概して、該方法は、特定のｍＲＮＡ配列を標的とするＲＮＡｉ構築物（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（即ちｓｉＲＮＡ）又は細胞内でｓｉＲＮＡを生成することができる核酸材料を、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を弱めるのに十分な量で投与することを含む。特に、該ＲＮＡｉ構築物は、血清安定性、細胞取り込みを改善させる及び／又は非特異的な影響を回避するために１個以上の修飾を有することができる。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、アプタマー部分を有する。該アプタマーは、ヒト血清アルブミンに結合して血中半減期を改善させることができる。また、該アプタマーは、該構築物の取り込みを改善させる細胞表面蛋白質に結合することもできる。
2008528037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現をＲＮＡ干渉機構によって阻害するための二重鎖核酸であって、
（ａ）１個以上の修飾又は１個以上の修飾ヌクレオチドを有するセンスポリヌクレオチド鎖；
（ｂ）随意に１個以上の修飾を有し、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列を有し、しかも該標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な、アンチセンスポリヌクレオチド鎖;及び
（ｃ）予め選択された標的に結合するアプタマー
を有する前記二重鎖核酸。
【請求項２】
前記センスポリヌクレオチドが１個以上の修飾を有する、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項３】
前記アンチセンスポリヌクレオチドが１個以上の修飾を有する、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項４】
前記１個以上の修飾が、前記二重鎖核酸の等電点ｐＨ（ｐＩ）を、前記指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して少なくとも０．５単位増加させる、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項５】
前記センス鎖が少なくとも５０％の修飾ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項６】
前記アンチセンスポリヌクレオチドのヌクレオチドのうち５０％以下が修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項７】
前記１個以上の修飾が、前記二重鎖核酸の疎水性を、前記指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して増大させる、請求項２に記載の二重鎖核酸。
【請求項８】
前記１個以上の修飾が、前記二重鎖核酸の疎水性を、前記指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して増大させる、請求項３に記載の二重鎖核酸。
【請求項９】
前記二重鎖核酸が細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸であり、該ヘアピン核酸が二本鎖部分と、ループ部分と、随意に３’及び／又は５’テイル部分とを有する、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１０】
前記核酸の前記二本鎖部分が１９〜１００塩基対の長さである、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１１】
前記二重鎖核酸が、１０％血清の存在下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸の少なくとも２倍の定常状態レベルにまで培養細胞によって内部に取り入れられる、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１２】
前記二重鎖核酸が、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸の少なくとも２倍のヒト又はマウスにおける血中半減期を有する、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１３】
前記アプタマーが前記センス鎖と会合した、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１４】
前記アプタマーが前記センス鎖の５’末端で会合した、請求項１３に記載の二重鎖核酸。
【請求項１５】
前記アプタマーが、二本鎖部分、ループ部分、３’テイル又は５’テイルよりなる群から選択される部分内に位置した、請求項９に記載の二重鎖核酸。
【請求項１６】
前記予め選択された標的が、血清蛋白質、膜蛋白質及び細胞表面蛋白質よりなる群から選択される、請求項１に記載の二重鎖核酸。
【請求項１７】
前記予め選択された標的が細胞によって内部に取り入れられる、請求項１６に記載の二重鎖核酸。
【請求項１８】
前記血清蛋白質がヒト血清アルブミンである、請求項１６に記載の二重鎖核酸。
【請求項１９】
ＲＮＡｉ核酸を生物に送達するための医薬品であって、薬学的に許容できる塩と、
（ａ）糖−燐酸骨格に１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖及び
（ｂ）標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な指定配列を有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖
を有する二重鎖核酸とを含み、
該糖−燐酸骨格への１個以上の修飾が、該二重鎖核酸と１種以上の蛋白質種との非共有的会合を、該指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させる、前記医薬品。
【請求項２０】
前記センスポリヌクレオチドが、前記糖−燐酸骨格に１個以上のホスホロチオエート修飾を有する、請求項１９に記載の医薬品。
【請求項２１】
前記センスポリヌクレオチドが５０％以上のホスホロチオエート修飾を有する、請求項２０に記載の医薬品。
【請求項２２】
前記センスポリヌクレオチドが１００％のホスホロチオエート修飾を有する、請求項２１に記載の医薬品。
【請求項２３】
前記センスポリヌクレオチドが、センスポリヌクレオチド鎖及びアンチセンスポリヌクレオチド鎖よりなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬品。
【請求項２４】
前記医薬品がポリペプチドをさらに含む、請求項１９に記載の医薬品。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが血清ポリペプチド及び細胞標的指向化ポリペプチドよりなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬品。
【請求項２６】
前記細胞標的指向化ポリペプチドが、複数のガラクトース部分を有するポリペプチドである、請求項２５に記載の医薬品。
【請求項２７】
前記二重鎖核酸がアプタマーをさらに有する、請求項１９に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００３年７月１５日に出願された米国仮出願第６０／４８７，５７０号及び２００３年１２月８日に出願された米国仮出願６０／５２８，１４３号の出願日の利益を主張する２００４年７月１５に出願された米国特許出願第１０／８９２，５２７号の一部継続出願である、２００５年１月２７日に出願された米国特許出願第１１／０４４，６７７号を基礎とする優先権を主張する。これらの明細書は、参照によって援用するものとする。
【０００２】
本発明は、新規なＲＮＡｉ構築物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
細胞の構造と生物学的挙動は、該細胞内における所定時間での遺伝子発現のパターンによって大部分が決まる。長い期間を経て、遺伝子発現の摂動が癌形成、血管疾患、神経疾患及び内分泌疾患を含めた多数の疾患の原因となることが認識されてきた。今のところ、例えば、増幅、欠失、遺伝子再配列及び機能喪失型又は機能獲得型の突然変異によって生じる異常な発現パターンによって疾患細胞の異常な挙動がもたらされることが分かっている。また、異常な遺伝子発現は、病原体の脅威を避けるための所定の生物の防御機構としても注目されている。
【０００４】
医学の大きな挑戦の一つは、幅広い生理反応に関与する標的遺伝子の発現を調節することであった。外因的に導入された導入遺伝子を真核細胞内で過剰発現させることは比較的容易であるが、特定遺伝子の標的阻害は、達成するのがさらに困難であった。部位特異的遺伝子破壊、アンチセンスＲＮＡ又は同時抑制を含め、遺伝子発現を抑制するための従来型のアプロ−チでは、複雑な遺伝子操作や、宿主細胞の毒性許容レベルをしばしば超過する大量のサプレッサーが必要であった。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存型の遺伝子特異的転写後サイレンシングを表す現象である。ほ乳類細胞の実験的操作のためにこの現象を利用する初期の試みは、長いｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化される強固で非特異的な抗ウイルス防御機構によって失敗に終わった（Ｇｉｌ外，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２０００，５：１０７−１１４）。この分野は、２１ヌクレオチドＲＮＡの合成二本鎖が、一般的な抗ウイルス防御機構を引き起こすことなく、ほ乳類細胞内で遺伝子特異的ＲＮＡｉを仲介することができたという実証に基づき、大きく前進した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ外，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１：４９４−４９８；Ｃａｐｌｅｎ外，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００１，９８：９７４２−９７４７）。結果として、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子機能を詳しく分析するための強力なツ−ルとなった。小分子ＲＮＡの化学合成は、有望な結果が得られている一手段である。
【非特許文献１】Ｇｉｌ外，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２０００，５：１０７−１１４
【非特許文献２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ外，Ｎａｔｕｒｅ  ２００１，４１１：４９４−４９８
【非特許文献３】Ｃａｐｌｅｎ外，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００１，９８：９７４２−９７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＮＡｉ核酸を生体内で搬送するための方法は、開発するのが困難であった。ＲＮＡｉ分子をある種の臨床的条件で投与するための方法及び組成物を改善することが望ましいであろう。さらに具体的に言えば、望ましくない非特異的な副作用を誘発しない改良型ｓｉＲＮＡ分子を獲得することが望ましい。また、血清中での安定性が改善し且つ動物細胞による取り込みの増加を示すｓｉＲＮＡ分子を得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概略
本発明は、一部において、新規なＲＮＡｉ構築物を提供する。所定の態様では、本発明は、随意に１個以上の修飾を有する核酸ＲＮＡｉ構築物を提供する。所定の態様では、ここに開示する新規な構築物は、例えば、血清安定性の改善又は細胞の取り込みの改善を含めて、従来のＲＮＡ：ＲＮＡのＲＮＡｉ構築物に対して一以上の質の改善を有する。所定の態様では、ＲＮＡｉ構築物は、例えば、血清蛋白質又は標的細胞上に位置した蛋白質への結合能力を含めて望ましい特性及び／又は機能性を与えるアプタマーに結合している。さらに別の態様では、ここで開示する構築物は、ミスマッチ又は変性剤のような、二本鎖についての融点を低下させる成分を含むことができる。
【０００８】
本発明は、一部において、該構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを向上させる１個以上の化学的修飾を有するＲＮＡｉ構築物を提供する。所定の実施形態では、ここで開示するＲＮＡｉ構築物は、非修飾ＲＮＡｉ構築物に比べて、生体内での細胞取り込みが改善されている。所定の実施形態では、ここで開示するＲＮＡｉ構築物は、非修飾ＲＮＡｉ構築物に比べて血中半減期が長い。所定の態様では、該化学的修飾は、ＲＮＡｉ構築物と１種以上の蛋白質との非共有的会合を増大させるように選択できる。一般に、ＲＮＡｉ構築物の全体的な負電荷を減少させ及び／又はその疎水性を増大させる修飾は、蛋白質との非共有的会合を増大させる傾向にあるであろう。好ましい実施形態では、該修飾は、二重鎖ＲＮＡｉ構築物のセンス鎖に取り込まれる。修飾は、該ＲＮＡｉ構築物の核酸に結合する、疎水性部分のような化学的部分の形態にあることができる。また、修飾は、核酸自身に対する変化、例えば、糖−燐酸骨格又は塩基部分に対する変化の形であることもできる。
【０００９】
所定の実施形態では、本発明は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害するための指定配列を有する二重鎖核酸であって、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列を有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖を有する二重鎖核酸を提供する。該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の１個以上の修飾は、該二重鎖核酸と蛋白質の１種以上の種との非共有的会合を、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させることができる。修飾は、糖−燐酸骨格の修飾であることができる。また、修飾は、ヌクレオシド部分の修飾であることもできる。随意に、該センス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ又はＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、１個以上の修飾デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、複数の修飾リボヌクレオチドを有するＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）鎖又はロック核酸（ＬＮＡ）鎖のようなＸＮＡ鎖である。随意に、該ＲＮＡアンチセンス鎖は、１個以上の修飾を有する。例えば、該ＲＮＡアンチセンス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は７５％以下の修飾ヌクレオチドしか有しなくてもよい。該１個以上の修飾は、該二重鎖核酸の疎水性及び／又は安定性（例えば、ヌクレアーゼに対する）を、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させるように選択できる。
【００１０】
所定の実施形態では、本発明は、１種以上の標的蛋白質に結合するＲＮＡｉ構築物及び処方物を提供する。例えば、ＲＮＡｉ構築物は、標的蛋白質に結合する１種以上の蛋白質（例えば抗体）と共に処方でき、又は当該蛋白質に結合できる。別の例として、ＲＮＡｉ構築物は、１種以上のアプタマーを有していてもよいし、１種以上のアプタマーと共に非共有的に処方されていてもよい。アプタマーとは、対象の標的と相互作用してアプタマー：標的複合体を形成する核酸である。該アプタマーは、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかに取り入れられ又は結合することができ、且つ、いずれかの鎖の３’末端か５’末端のいずれかで生じ得るが、センス鎖の５’末端に位置するアプタマーは、該構築物のＲＮＡｉ活性に悪影響が少ない傾向を有することが予期される。該アプタマーのセンス鎖又はアンチセンス鎖への取り込み又は結合によって、それぞれの成分がその活性を保持するのが可能になる；即ち、該アプタマー成分は、特異的な標的と相互作用する能力を保持し、また、該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害する能力を保持する。いくつかの実施形態では、該アプタマーは、特定の標的への結合のような、該系に有益な特性を転嫁させるようにスクリ−ニング及び／又は最適化できた複数のアプタマーから（例えば、核酸ライブラリーから）選択できる。本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸスクリ−ニング方法によって試験管内で化学的に合成及び作製できる。該アプタマーは、標的と優先的に相互作用し及び／又はそれに結合するように選択できる。このような標的の好適なカテゴリ−には、有機小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド及び蛋白質のような分子が包含される。他の標的としては、細胞小器官、ウイルス及び細胞のような、さらに大きな構造体が挙げられる。好適な蛋白質の例としては、細胞外蛋白質、膜蛋白質、細胞表面蛋白質又は血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン）が挙げられる。このような標的分子は、細胞によって内部に取り入れられ得る。該アプタマーと標的蛋白質（例えば、ペプチド、蛋白質など）との相互作用は、該アプタマー及び／又はポリヌクレオチドの生物学的利用率及び／又は細胞取り込みを改善させることができる。該アプタマー及び／又はポリヌクレオチドは、細胞によって内部に取り込まれることができ、また、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質のような標的分子への該アプタマーの結合によって、該ポリヌクレオチドの該細胞への内部移行が促進され得る。また、本発明のポリヌクレオチドになし得る修飾を１種以上のアプタマーになしてもよい。ＲＮＡｉ構築物は、ＲＮＡｉ構築物のセンス又はアンチセンス部分も標的結合活性に関与する状況でアプタマーを有することができることが理解されるであろう。言い換えれば、本発明は、ＲＮＡｉ構築物の「アプタマー」又は標的結合部分が該構築物のセンス又はアンチセンス部分と部分的に重なるＲＮＡｉ構築物をさらに提供する。
【００１１】
所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも０．５ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも１、２、３又はさらに４ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有する。１個以上の修飾は、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して、該二重鎖核酸の正電荷を増加させる（又は負電荷を減少させる）ように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．５、１又はさらに２単位高い等電点ｐＨを有する。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート部分、ホスホラミデート部分、ホスホジチオエート部分、ＰＮＡ部分、ＬＮＡ部分、２'−Ｏ−メチル部分及び２'−デオキシ−２'−フルオリド部分よりなる群から選択される燐酸−糖骨格への修飾を有する。随意に、該センスポリヌクレオチドは、例えば、３’若しくは５’末端又は糖−燐酸骨格又はヌクレオシド部分に結合できる疎水性部分に共有結合できる。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、所定の細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸である。該二重鎖核酸のそれぞれの鎖の長さは、臨床的に許容できない炎症反応を誘発しないように選択できる。随意に、該二重鎖核酸のそれぞれの鎖は、１９〜１００塩基対の長さ、好ましくは、１９〜５０又は１９〜３０塩基対の長さ（アプタマー修飾を含まない）であることができる。一般に、２９塩基以下のヌクレオチドは、炎症反応を誘発しないと予想されるが、それよりも長いヌクレオチドは、ケースバイケースで炎症効果について評価する必要があるかもしれない。
【００１２】
所定の実施形態では、ここで開示する二重鎖ＲＮＡｉ構築物は、１０％血清の存在下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸の少なくとも２倍の定常状態レベルにまで培養細胞によって内部に取り入れられるが、好ましくは、内部移行修飾ＲＮＡｉ構築物のレベルは、非修飾形態よりも３倍、５倍又は約１０倍高い。
【００１３】
所定の実施形態では、ここで開示する二重鎖ＲＮＡｉ構築物は、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸の少なくとも２倍のヒト又はマウスにおける血中半減期を有し、また、随意に、修飾ＲＮＡｉ構築物の血中半減期は、非修飾形態よりも少なくとも３倍又は５倍高い。
【００１４】
所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、選択された蛋白質について、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のＫDよりも少なくとも０．２ｌｏｇ単位少ないＫDを有し、好ましくは、同一の選択蛋白質について、他の部分では同様の非修飾構築物のＫDよりも少なくとも０．５又は１．０単位少ないＫDを有する。言い換えれば、該ＲＮＡｉ構築物は、選択蛋白質に対する親和性が増大するようにデザインできる。
【００１５】
所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、臨床反応を生じさせるために、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のＥＤ５０よりも少なくとも２倍少ない、さらに好ましくは少なくとも５又は１０倍少ないＥＤ５０を有する。言い換えれば、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、さらに低い投与量レベルで治療効果を得ることができる。
【００１６】
所定の実施形態では、本発明は、二重鎖核酸を有するＲＮＡｉ構築物であって、そのセンス鎖又はアンチセンス鎖が１個以上の修飾を有するものを提供する。好ましい実施形態では、センス鎖は、１個以上の修飾、随意に５０％以上、８０％以上又はさらに１００％の修飾ヌクレオチドを有するが、アンチセンス鎖は非修飾ヌクレオチドしか有しない。センス鎖の修飾は、ＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを向上させるように選択できる。例えば、該センス鎖は、ホスホロチオエート修飾を、随意に、このような修飾のために利用できる位置の５０％以上、８０％以上又はさらに１００％で有することができる。本願明細書の実施例でも分かるように、センス鎖が１００％のホスホロチオエート部分を有するＲＮＡ：ＲＮＡ構築物は、生体内での送達に極めて効果的である。所定の実施形態では、該二重鎖核酸は、不適正塩基対を有する。所定の実施形態では、ＲＮＡｉ核酸は、完全に対応したセンス鎖によって補完される同一のアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸のＴｍよりも低いＴｍを有する。このＴｍの比較は、同一のイオン強度、好ましくは生理的イオン強度下での核酸のＴｍに基づく。該Ｔｍは、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃又は２０℃低くてもよい。
【００１７】
所定の態様では、本発明は、１個以上の修飾核酸を有するＲＮＡｉ構築物を含む、被験者への送達用の医薬品を提供する。いくつかの実施形態では、医薬品は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害するための指定配列を有する二重鎖核酸であって、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖を有する二重鎖核酸を含む。該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の１個以上の修飾は、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して、該二重鎖核酸と蛋白質の１種以上の種との非共有的会合を増加させる。修飾は、ホスホロチオエート修飾のような糖−燐酸骨格の修飾であることができる。また、修飾は、ヌクレオシド部分の修飾であることもできる。随意に、該センス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ又はＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、１個以上の修飾デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、複数の修飾リボヌクレオチドを有するＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）鎖又はロック核酸（ＬＮＡ）鎖のようなＸＮＡ鎖である。随意に、該ＲＮＡセンス鎖は、１個以上の修飾を有する。例えば、該ＲＮＡアンチセンス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は７５％以下の修飾ヌクレオチドしか有しなくてもよい。該１個以上の修飾は、該二重鎖核酸の疎水性及び／又は安定性（例えば、ヌクレアーゼに対する）を、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させるように選択できる。
【００１８】
ＲＮＡｉ構築物がアプタマーを有する場合には、該ＲＮＡｉ構築物のポリヌクレオチド鎖の修飾は、アプタマー部分の内部に位置することができる。例えば、ＲＮＡｉ構築物の疎水性を増大させる又はその電荷を減少させる修飾は、当該修飾が標的結合活性と一致さえすれば、アプタマー部分の内部に位置することができる。
【００１９】
所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも０．５ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも１、２、３又はさらに４ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有する。１個以上の修飾は、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して、該二重鎖核酸の正電荷を増加させる（又は負電荷を減少させる）ように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．５、１又はさらに２単位高い等電点ｐＨを有する。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート部分、ホスホラミデート部分、ホスホジチオエート部分、ＰＮＡ部分、ＬＮＡ部分、２'−Ｏ−メチル部分及び２'−デオキシ−２'−フルオリド部分よりなる群から選択される燐酸−糖骨格への修飾を有する。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、所定の細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸である。随意に、該二重鎖核酸のそれぞれの鎖は、１９〜１００塩基対の長さ、好ましくは、１９〜５０又は１９〜３０塩基対の長さ（アプタマー修飾を含まない）であることができる。
【００２０】
所定の実施形態では、本発明は、ここで開示するＲＮＡｉ構築物を含む医薬品を提供する。医薬品は、血清ポリペプチド、細胞標的指向化ポリペプチド及び細胞内部移行性ポリペプチドの中から選択されるポリペプチドのようなポリペプチドをさらに含むことができる。細胞標的指向化ポリペプチドの例としては、肝細胞への標的指向化のための複数のガラクトース部分を有するポリペプチド（例えば、アシアロフェチュインのようなアシアロ糖蛋白質）、腫瘍性細胞への標的指向化のためのトランスフェリンポリペプチド及び目標の細胞に選択的に結合する抗体が挙げられる。ポリペプチドは、ＲＮＡｉ構築物に共有的又は非共有的に会合できる。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の医薬品は、二重鎖核酸を有するＲＮＡｉ構築物であって、そのセンス鎖が１個以上の修飾を有し、そのアンチセンス鎖がＲＮＡ鎖であるものを含む。センス鎖の修飾は、ＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを向上させるように選択できる。所定の実施形態では、該二重鎖核酸は、不適正塩基対を有する。所定の実施形態では、ＲＮＡｉ核酸は、生理的イオン強度下で、生理的イオン強度下で完全に対応したセンス鎖によって補完される同一のＲＮＡアンチセンス鎖を有する二重鎖核酸のＴｍよりも低いＴｍを有する。
【００２２】
所定の実施形態では、被験者への送達用の医薬品は、本発明のＲＮＡｉ構築物と、薬学的に許容できるキャリアとを含むことができる。随意に、該薬学的に許容できるキャリアは、薬学的に許容できる塩、エステル及びこのようなエステルの塩から選択される。医薬品は、ヒト患者又は他の動物の患畜で使用するための説明書と共にパッケ−ジ化できる。
【００２３】
所定の実施形態では、当該開示は、所定の細胞内での標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、該細胞と二重鎖核酸を含む組成物とを接触させることを含み、ここで、該二重鎖核酸は、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖を有するものとし、しかも、該１個以上の修飾は、ＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを、該指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して増大させる、前記方法を提供する。
【００２４】
随意に、該細胞を、少なくとも０．１ミリグラム／ミリリットルの蛋白質、好ましくは、１ミリリットル当たり少なくとも０．５、１、２又は３ミリグラムの蛋白質の存在下で、二重鎖核酸と接触させる。随意に、該細胞を、少なくとも１％、５％、１０％又は１５％の血清のような血清の存在下で二重鎖核酸と接触させる。随意に、該細胞を、生理的濃度を模倣する蛋白質濃度の存在下で、二重鎖核酸と接触させる。
【００２５】
所定の実施形態では、当該開示は、被験者の１以上の細胞内で標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、該被験者に二重鎖核酸を含む組成物を投与することを含み、ここで、該二重鎖核酸は、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖を有し、しかも、該１個以上の修飾は、該指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対してＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを増大させる、前記方法を提供する。所定の実施形態では、該二重鎖核酸は、不適正塩基対を有する。所定の実施形態では、該二重鎖核酸は、生理的イオン強度で、完全に対応したセンス鎖によって補完される同一のＲＮＡアンチセンス鎖を有する二重鎖核酸のＴｍよりも低いＴｍを有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ここに開示する方法は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害するための指定配列を有する二重鎖核酸であって、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖、を有するものを使用する。該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の１個以上の修飾は、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して、該二重鎖核酸と蛋白質の１種以上の種との非共有的会合を増加させるように選択できる。修飾は、細胞取り込み及び／又は血清安定性を増強させるように、実験的に又は別の方法で選択できる。修飾は、糖−燐酸骨格の修飾であることができる。また、修飾は、ヌクレオシド部分の修飾であることもできる。随意に、該センス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ又はＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、１個以上の修飾デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、複数の修飾リボヌクレオチドを有するＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）鎖又はロック核酸（ＬＮＡ）鎖のようなＸＮＡ鎖である。随意に、該ＲＮＡセンス鎖は、１個以上の修飾を有する。例えば、該ＲＮＡアンチセンス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は７５％以下の修飾ヌクレオチドしか有しなくてもよい。該１個以上の修飾は、該二重鎖核酸の疎水性及び／又は安定性（例えば、ヌクレアーゼに対する）を、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させるように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも０．５ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも１、２、３又はさらに４ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有する。１個以上の修飾は、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して該二重鎖核酸の正電荷を増加（又は負電荷を増加）させるように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．５、１又はさらに２単位高い等電点ｐＨを有する。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート部分、ホスホラミデート部分、ホスホジチオエート部分、ＰＮＡ部分、ＬＮＡ部分、２'−Ｏ−メチル部分及び２'−デオキシ−２'−フルオリド部分よりなる群から選択される燐酸−糖骨格への修飾を有する。所定の実施形態では、該二重鎖は、所定の細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸である。随意に、該二重鎖核酸のそれぞれの鎖は、１９〜１００塩基対の長さ、好ましくは、１９〜５０又は１９〜３０塩基対の長さ（アプタマー修飾を含まない）であることができる。随意に、該二重鎖核酸は、アプタマーを有する。
【００２７】
所定の実施形態では、開示された方法で使用される組成物は、血清ポリペプチド、細胞標的指向化ポリペプチド及び細胞内部移行性ポリペプチドの中から選択されるポリペプチドのようなポリペプチドをさらに含む。細胞標的指向化ポリペプチドの例としては、肝細胞への標的指向化のための複数のガラクトース部分を有するポリペプチド、腫瘍性細胞への標的指向化のためのトランスフェリンポリペプチド及び目標の細胞に選択的に結合する抗体が挙げられる。
【００２８】
所定の実施形態では、当該開示は、医療装置の表面に使用するための被覆剤を提供する。被覆剤は、ＲＮＡｉ構築物を中に分散させた重合体マトリックスを含むことができ、ここで、該ＲＮＡｉ構築物は、患者の体内に埋め込まれたときにマトリックスから溶出し、そして、この埋め込まれた装置の近傍における細胞の成長、生存又は分化を改変させる。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物の少なくとも一つは、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖を有し、しかも、該１個以上の修飾が、前記指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対してＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを増大させる、二重鎖核酸である。被覆剤は、ポリペプチドをさらに含むことができる。被覆剤は、例えば、ネジ、プレート、洗浄器、縫合糸、プロテーゼアンカ−、ビョウ、ステ−プル、導線、弁、膜、カテーテル、移植可能血管アクセスポート、血液保存用バッグ、血液チューブ、中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、代用血管、大動脈内バルーンポンプ、心臓弁、心臓血管縫合糸、人工心臓、ペースメーカー、心室補助ポンプ、体外装置、血液フィルタ、血液透析ユニット、血液吸着ユニット、プラスマフェレーシスユニット及び血管への配置に適したフィルタ−を含め、様々な医療装置の表面に設置できる。好ましくは、該被覆剤は、ステントの表面上にある。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ここで開示する被覆剤は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害するための指定配列を有する二重鎖核酸であって、１個以上の修飾を有するセンスポリヌクレオチド鎖；及び随意に１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドと、該標的遺伝子の転写物の少なくとも一部分にハイブリダイズする指定配列であって該標的遺伝子をサイレンシングするのに十分な指定配列とを有するＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド鎖、を有するものを含む。該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の１個以上の修飾は、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して、該二重鎖核酸と蛋白質の１種以上の種との非共有的会合を増加させる。修飾は、血清安定性及び／又は細胞取り込みを増大させるように選択できる。修飾は、糖−燐酸骨格の修飾であることができる。また、修飾は、ヌクレオシド部分の修飾であることもできる。随意に、該センス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ又はＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、１個以上の修飾デオキシリボヌクレオチドを有するＤＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、複数の修飾リボヌクレオチドを有するＲＮＡ鎖である。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）鎖又はロック核酸（ＬＮＡ）鎖のようなＸＮＡ鎖である。随意に、該ＲＮＡセンス鎖は、１個以上の修飾を有する。例えば、該ＲＮＡアンチセンス鎖は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は７５％以下の修飾ヌクレオチドしか有しなくてもよい。該１個以上の修飾は、該二重鎖核酸の疎水性及び／又は安定性（例えば、ヌクレアーゼに対する）を、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸と比較して増大させるように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも０．５ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも、少なくとも１、２、３又はさらに４ｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有する。１個以上の修飾は、生理的条件下で、同一の指定配列を有する非修飾二重鎖核酸に対して該二重鎖核酸の正電荷を増加（又は負電荷を増加）させるように選択できる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．５、１又はさらに２単位高い等電点ｐＨを有する。随意に、該センスポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート部分、ホスホラミデート部分、ホスホジチオエート部分、ＰＮＡ部分、ＬＮＡ部分、２'−Ｏ−メチル部分及び２'−デオキシ−２'−フルオリド部分よりなる群から選択される燐酸−糖骨格への修飾を有する。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、所定の細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされるヘアピン核酸である。随意に、該二重鎖核酸のそれぞれの鎖は、１９〜１００塩基対の長さ、好ましくは、１９〜５０又は１９〜３０塩基対の長さ（アプタマー修飾を含まない）であることができる。
【００３０】
所定の実施形態では、ここで開示する被覆剤は、ＲＮＡｉ構築物と会合するポリペプチド、例えば、血清ポリペプチド、細胞標的指向化ポリペプチド及び細胞内部移行性ポリペプチドの中から選択されるポリペプチドを含むことができる。細胞標的指向化ポリペプチドの例としては、肝細胞への標的指向化のための複数のガラクトース部分を有するポリペプチド、腫瘍性細胞への標的指向化のためのトランスフェリンポリペプチド及び目標の細胞に選択的に結合する抗体が挙げられる。
【００３１】
所定の態様では、当該開示は、製薬学的用途のためにＲＮＡｉ構築物を最適化させる方法であって、１個以上の修飾核酸を有するＲＮＡｉ構築物の細胞取り込み及び／又は薬物速度論的特性（例えば、血中半減期）を評価することを含む方法を提供する。所定の実施形態では、製薬学的用途のためにＲＮＡｉ構築物を最適化させる方法は、生体内での標的遺伝子の発現を阻害し且つ病気の影響を低減させる指定配列を有するＲＮＡｉ構築物を同定し；該指定配列及び１個以上の修飾核酸を有する１種以上の修飾ＲＮＡｉ構築物をデザインし；該１種以上の修飾ＲＮＡｉ構築物を細胞内取り込み及び／又は血中半減期について検査し；該修飾及び／又はは非修飾ＲＮＡｉ構築物の動物における効能及び毒性についての治療プロファイリングを実施し；望ましい取り込み特性及び望ましい治療特性を有する１種以上の修飾ＲＮＡｉ構築物を選択することを含む。所定の実施形態では、該方法は、同定されたＲＮＡｉ構築物のセンス鎖を１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドを有することができるセンス鎖で置き換えることを含む。所定の実施形態では、製薬学的用途のためにＲＮＡｉ構築物を最適化させる方法は、二重鎖核酸を有する複数の試験ＲＮＡｉ構築物を生成し、そして、これらの試験構築物によって遺伝子サイレンシング効果について検査することを含む。該核酸のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、１個以上の修飾又は修飾ヌクレオチドを有することができる。該二重鎖核酸は、１個以上の不適正塩基対を含むことができる。該方法は、試験ＲＮＡｉ構築物の血清安定性及び／又は細胞取り込みを決定し、そして該試験ＲＮＡｉ構築物の治療プロファイリングを実施することをさらに含むことができる。
【００３２】
製薬学的用途のためにＲＮＡｉ構築物を最適化させる方法は、選択されたＲＮＡｉ構築物の１種以上を含む医薬品を処方することをさらに含むことができる。随意に、該方法は、次のいずれか：該医薬品を流通させるための販売流通システムを確立すること、流通を実行させるために別の企業体と提携すること、該医薬品をマ−ケティングするためのセ−ルスグル−プを設立すること、及び１以上の民間又は国営の保健医療保険業者と共に採算の取れる償還プログラムを確立することをさらに含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
図面の簡単な説明
図１は、次の通りの条件下での核酸量を示すゲルの写真である：
レ−ン１  ｓｉＦＡＳ２、Ｈ２Ｏ
レ−ン２  ｓｉＦＡＳ２、血清（ｔ＝０）
レ−ン３  ｓｉＦＡＳ２、血清（ｔ＝４ｈ）
レ−ン４  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸なし
レ−ン５  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸
レ−ン６  ［ハイブリッド］、Ｈ２Ｏ 
レ−ン７  ［ハイブリッド］、血清（ｔ＝０）
レ−ン８  ［ハイブリッド］、血清（ｔ＝４ｈ）
レ−ン９  ＣＤＰ／［ハイブリッド］  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸なし
レ−ン１０  ＣＤＰ／［ハイブリッド］  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸
（ここで、［ハイブリッド］＝ＪＨ−１：ＥＧＦＰｂ抗＝ＤＮＡ（ＰＳ）−３’ＴＡＭＲＡ：ＲＮＡａである。）。
【００３４】
図２は、次の通りの条件下での核酸量を示すゲルの写真である：
レ−ン１   １０ｂｐＤＮＡラダー
レ−ン２  ｓｉＦＡＳ２、血清Ｈ２Ｏ
レ−ン３  ｓｉＦＡＳ２、血清（ｔ＝０）
レ−ン４  ｓｉＦＡＳ２、血清（ｔ＝４ｈ）
レ−ン５  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸なし
レ−ン６  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ５＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸
レ−ン７  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  １０＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸なし
レ−ン８  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  １０＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸
レ−ン９  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ２０＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸なし
レ−ン１０  ＣＤＰ／ｓｉＦＡＳ２  ２０＋／−、血清（ｔ＝４ｈ）、ヘパラン硫酸。
【００３５】
図３Ａ〜３Ｄは、核酸構築物の生体内取り込みを実証する共焦点顕微鏡法の結果を示す。
【００３６】
図４は、動物モデル実験についての模式図を示す。
【００３７】
図５Ａ〜Ｂは、マウスにおける修飾ｓｉＲＮＡの送達の結果を示す。
【００３８】
図６は、ｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）についての予想二次構造を示す。
【００３９】
図７Ａ〜Ｂは、ｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ＳｉＧＬ３アプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）についての最も熱力学的に有利な２種の予想二次構造を示す。
【００４０】
発明の詳細な説明
Ｉ．概説
所定の態様では、本発明は、所定の修飾が血清安定性を改善し且つＲＮＡｉ構築物の細胞取り込みを促進させるという知見に関する。本発明の別の態様は、非特異的な「オフターゲット」効果、例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡｓｉＲＮＡ分子のセンスＲＮＡ鎖によって誘導される効果又はおそらくＲＮＡ活性化蛋白質キナーゼ（「ＰＫＲ」）とインターフェロンの応答に関わる効果を回避するようにＲＮＡｉ構築物を最適化することに関する。従って、所定の態様では、本発明は、細胞内、特に生体内での標的遺伝子の発現を減少させるのに使用するための修飾二重鎖ＲＮＡｉ構築物を提供する。従来の裸のアンチセンス分子は、動物及びヒトに効果的に投与できる。しかしながら、短い二重鎖ＲＮＡのような典型的なＲＮＡｉ構築物は、そう簡単には投与されない。さらに、試験管内実験における細胞へのＲＮＡｉ送達の有効性と生体内実験におけるそれとの間には矛盾が観察されている。ここで実証するように、ＲＮＡｉ構築物の化学的又は生物学的修飾によって、ＲＮＡｉ構築物の血清安定性が改善する。さらに、この修飾によって細胞によるＲＮＡｉ構築物の取り込みが促進される。一部分において、本発明は、非修飾ＲＮＡｉ構築物が血清安定性に乏しく、また不十分に取り込まれるという傾向を有することを実証する。添付した実施例に示すように、本発明の構築物によって、血清安定性が増大し、生体内での取り込みが改善することを実証する。特定の学説にとらわれることを望まないが、二重鎖ＲＮＡ：ＲＮＡｓｉＲＮＡのないＲＮＡｉ構築物の改善によって、二重鎖ＲＮＡ：ＲＮＡｓｉＲＮＡによって誘導される非特異的な効果、例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖ＲＮＡによって誘導されるオフターゲット効果を回避することができる。従って、本発明は、不適正塩基対を有する核酸を含む二重鎖核酸ＲＮＡｉ構築物を提供する。
【００４１】
従って、本発明は、一部において、その血清安定性及び／又は細胞取り込みを増大させるように修飾された核酸を有するＲＮＡｉ構築物を提供する。この核酸は、非特異的な効果を回避するようにさらに改善できる。
【００４２】
II．定義
便宜上、明細書、実施例及び添付した請求の範囲で用いた所定の用語をここにまとめる。
【００４３】
用語「アプタマー」には、所定の標的と特異的に相互作用することができる任意の核酸配列が含まれる。アプタマーは、天然型の核酸配列でも天然型ではない核酸配列でもよい。アプタマーは、どのようなタイプの核酸であってもよく（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸アナログ）、また一本鎖又は二重鎖であることができる。ここに記載する特定の実施形態では、アプタマーは一本鎖ＲＮＡである。
【００４４】
「アプタマー：標的複合体」又は「アプタマー：標的分子複合体」とは、アプタマー及びそれと相互作用する標的又は標的分子を有する複合体である。該アプタマー及び該標的又は標的分子は、互いに直接結合している必要はない。
【００４５】
開示した方法によって治療される「患者」又は「被験者」とは、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを意味することができる。
【００４６】
遺伝子配列について、用語「発現」とは、該遺伝子の転写及び、必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物の蛋白質への翻訳をいう。従って、文脈から明らかなように、蛋白質コード配列の発現は、該コード配列の転写と翻訳によって生じる。ある遺伝子の発現を減少させる方法は、例えば、該遺伝子の転写を阻害すること、ｍＲＮＡの安定性を低下させること及び該ｍＲＮＡの翻訳を減少させることを含めて、様々な方法（そのいずれも相互排他的ではない）で行うことができる。特定のメカニズムにとらわれることを望まないが、一般的に、ｓｉＲＮＡ技術は、標的ｍＲＮＡ種の分解を刺激することによって遺伝子発現を減少させると考えられている。
【００４７】
ここで、ある種の標的遺伝子を「サイレンシング」させるとは、該標的遺伝子の発現を減少又は減弱させることを意味する。
【００４８】
ここで使用するときに、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドをいう。また、当該用語は、記載した実施形態に規定した通り、一本鎖（例えば、センス又はアンチセンス）ポリヌクレオチド及び二重鎖ポリヌクレオチドを包含するものと理解すべきである。「基準」ヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）であり、また、リボース−燐酸骨格を包含するが、用語「核酸」とは、基準ヌクレオチドのみを有するポリヌクレオチド並びに糖−燐酸骨格又はヌクレオシドに１個以上の修飾を有するポリヌクレオチドを含むものとする。ＤＮＡ及びＲＮＡは、リボースの２’位でのヒドロキシル基の有無のため化学的に異なるものである。直ちにＤＮＡ又はＲＮＡとは呼べない修飾核酸（例えば全体的に異なる部分が２’位に位置したもの）及びリボースをベースとした骨格を有しない核酸は、ＸＮＡと呼ぶことができる。ＸＮＡの例は、骨格がペプチド骨格であるペプチド核酸（ＰＮＡ）及びリボースの２’位と４’位との間にメチレン結合を有するロック核酸（ＬＮＡ）である。「非修飾」核酸とは、基準ヌクレオチド及びＤＮＡ又はＲＮＡ骨格のみを有する核酸である。わかりやすく言うと、核酸は、多くの場合、一本鎖部分及び二重鎖部分の両方を有すること、及び、このような部分は、様々な条件で形成したり解離したりすることができることは、当業者には明らかであろう。ここで使用するときに、用語「二重鎖」核酸とは、生理的条件下で二重らせん部分を有する任意の核酸である。
【００４９】
「核酸ライブラリー」とは、複数の核酸種（様々な配列を有する核酸）の任意の集合体である。ライブラリーの核酸は、多くの場合（常にではない）、ベクター内に位置し、１個のベクター当たり１種の核酸種（又は「挿入物」）を有する。
【００５０】
用語「薬学的に許容できる塩」とは、本発明の化合物の生理的及び薬学的に許容できる塩、即ち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し且つそれに望ましくない毒性効果を与えない塩をいう。
【００５１】
用語「ポリペプチド」及び「蛋白質」は、ここでは同じ意味で使用する。
【００５２】
用語「肺送達」及び「呼吸器送達」とは、口を介した吸入及び肺への吸入によって、患者にＲＮＡｉ構築物を全身的に送達することをいう。
【００５３】
ここで使用するときに、用語「ＲＮＡｉ構築物」は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ及び生体内で開裂してｓｉＲＮＡを形成できる他のＲＮＡ種を含むように、明細書全体にわたって使用する一般的な用語である。随意に、ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ及びＸＮＡ：ＲＮＡ二重鎖核酸を含めて一本鎖又は二本鎖を有する。
【００５４】
用語「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、およそ１９〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長の核酸をいう。該ｓｉＲＮＡは二重鎖であり、且つ、各末端に短いオーバーハングを有することができる。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、好ましくはＲＮＡであるが、そのセンス鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＸＮＡ並びに修飾及びそれらの混合物であることができる。好ましくは、オーバーハングは、３’末端で１〜６ヌクレオチドの長さである。当該技術分野においては、このｓｉＲＮＡが化学的に合成できることや、さらに長い二重鎖ＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡから誘導できることが知られている。このｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対してかなりの配列類似性を有するため、このｓｉＲＮＡは、該標的ＲＮＡに対合することができ、且つ、ＲＮＡ干渉機構によって該標的ＲＮＡの配列特異的分解を生じさせることができる。随意に、このｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を有する。
【００５５】
「標的分子」は、ポリペプチド、小分子、イオン、有機高分子（例えば、様々な重合体及び共重合体）並びに１種以上の分子種を有する複合体を含めて、興味のある任意の化合物である。
【００５６】
III．代表的なＲＮＡｉ構築物
所定の実施形態では、当該開示は、ＲＮＡｉ構築物が改善された細胞取り込みを有するように１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物を提供する。ここで開示するＲＮＡｉ構築物は、望ましい薬物速度論的特性、例えば、低下したクリアランス速度及び長い血中半減期を有することができる。該修飾は、血清安定性及び／又は細胞取り込みを増大させるように選択できる。該修飾は、ＲＮＡｉ構築物と蛋白質との非共有的会合を増加させるように選択できる。例えば、ＲＮＡｉ構築物の全体的な負電荷を減少させる及び／又はその疎水性を増大させる修飾は、蛋白質との非共有的会合を増加させる傾向にあるであろう。
【００５７】
ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理的条件下で、阻害される遺伝子（即ち、「標的」遺伝子）についてのｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分のヌクレオチド配列にハイブリダイズし、且つ、該標的遺伝子をサイレンシングさせるのに十分なヌクレオチド配列を含有するようにデザインできる。該ＲＮＡｉ構築物は、ＲＮＡｉを仲介することができる天然ＲＮＡに十分に類似することしか必要としない。従って、遺伝子突然変異、菌株多形又は進化的分岐のために予期され得る配列多様性が容認できる。随意に、標的配列とＲＮＡｉ構築物配列との間の容認されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１個、又は１０塩基対中１個、又は２０塩基対中１個、又は５０塩基対中１個を超えない。このｓｉＲＮＡ二本鎖の中心でのミスマッチが最も重要であり、該標的ＲＮＡの開裂を基本的に無効にすることができる。対照的に、標的ＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡ鎖の３’末端のヌクレオチドは、該標的認識の特異性にはさほど寄与しない。
【００５８】
配列相同性は、当該分野において知られている配列比較及び整列アルゴリズム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１及びそこで引用された論文を参照）によって、及び、例えば、デフォルトパラメータ（例えば、ウィスコンシン大学ジェネティック・コンピューティング・グループ）を使用してＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムにより実行されるようなスミス・ウォーターマンアルゴリズムによりヌクレオチド配列間の差のパーセンテージを計算することによって最適化できる。抑制性ＲＮＡと標的遺伝子のその部分との間で９０％を超える配列相同性又はさらに１００％の配列相同性が好ましい。或いは、ＲＮＡの二本鎖領域は、機能上、標的遺伝子転写物の部分とハイブリダイズできる（例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ，４０ｍＭのＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．４，１ｍＭのＥＤＴＡ，５０℃又は７０℃で１２〜１６時間のハイブリダイゼーション；その後洗浄）ヌクレオチド配列と定義できる。
【００５９】
所定の実施形態では、二重鎖ＲＮＡｉ構築物は、不適正塩基対を有することができる。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ核酸は、完全に対応したセンス鎖によって補完される同一のＲＮＡアンチセンス鎖を有する二重鎖核酸のＴｍよりも低いＴｍを有する。このＴｍの比較は、同一のイオン強度、好ましくは、生理的イオン強度（例えば、約１５０ｍＭのＮａＣｌに等しい）下での該核酸のＴｍを基準にする。該Ｔｍは、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、１５℃又は２０℃低くてもよい。生理的塩溶液の例としては、カエルのリンガー液、クレブス液、タイロード液、リンガー・ロッケ液、Ｄｅ  Ｊａｌｅｎ液及び人工脳脊髄液が挙げられる（「Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅ」を参照）。Ｔｍは、一般に認められた式によって計算できる。例えば：
Ｔｍ計算式
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６×Ｌｏｇ１０［Ｎａ+］＋０．４１（％ＧＣ）−６００／サイズ
［Ｎａ+］を１００ｍＭに設定する。［Ｎａ+］は０．４Ｍまでである。
例：５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧ−Ｓ’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）２０塩基長；ＧＣ＝５０％；ＡＴ＝５０％
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６×Ｌｏｇ１０［０．１００］＋０．４１×５０−６００／２０Ｔｍ＝８１．５−１６．６＋０．４１×５０−６００／２０＝５５．４℃
２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｃ＋Ｇ）を使用した同一オリゴのＴｍ＝６０℃
（２５ｂｐよりも短いオリゴのＴｍ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｃ＋Ｇ））。
【００６０】
ミスマッチは、二重鎖核酸の二本鎖を不安定化することが当該技術分野に知られている。ミスマッチは、所定の化学的修飾に対する二本鎖の感受性を測定することを含めて様々な方法で検出できる（例えば、それぞれの鎖の必要な屈折率及び空間）（例えば、Ｊｏｈｎ及びＷｅｅｋｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：６８６６−７４を参照）。また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖におけるミスマッチは、ＲＮアーゼＡ分析を使用することによっても決定できる。ＲＮアーゼＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドにおける単一塩基対ミスマッチ部位でＲＮＡを分解するからである。
【００６１】
特定の学説にとらわれることを望まないが、二重鎖ＲＮＡｉ構築物におけるミスマッチは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドと共通点を有するように二本鎖の解離を誘導し得るが、二重鎖ＲＮＡｉ構築物がこれを誘導するときに非特異的な効果を誘導しない。
【００６２】
所定の実施形態では、二重鎖ＲＮＡｉ構築物は、ＤＮＡ：ＲＮＡ構築物、ＲＮＡ：ＲＮＡ構築物又はＸＮＡ：ＲＮＡ構築物であることができる。ＤＮＡ：ＲＮＡ構築物は、そのセンス鎖が少なくとも５０％のデオキシリボ核酸又はその修飾を有すると共に、そのアンチセンス鎖が少なくとも５０％のリボ核酸又はその修飾を有するものである。ＲＮＡ：ＲＮＡ構築物は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が少なくとも５０％のリボ核酸又はその修飾を有するものである。ここで説明するように、二重鎖核酸は、ヘアピンその他の折りたたみコンフォメーションを採用する単一の核酸鎖から、該単一核酸の２つの部分がハイブリダイズし、そして二重らせんのセンス鎖とアンチセンス鎖を形成するように形成できる。ＤＮＡ：ＲＮＡ構築物とＲＮＡ：ＲＮＡ構築物の両方は、ヘアピン又は他の折りたたまれた一本鎖の形態で説明できる。用語「デオキシリボ核酸」及び「リボ核酸」は、特定のリボース基礎骨格を暗示する化学名である。所定の修飾核酸、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）はリボース基礎骨格を有しない。他の修飾核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡとしての分類が不可能であるように、リボースの２’位が修飾されている。これらのタイプの核酸は、「ＸＮＡ」と呼ぶことができる。所定の実施形態では、当該開示は、ＸＮＡ：ＲＮＡ構築物を包含することを意図するものであり、ここで、「ＸＮＡ」は、そのセンス鎖の主なヌクレオチドがＤＮＡ骨格又はＲＮＡ骨格を有しないものを示す。例えば、該センス鎖が５０％以上ペプチド核酸又はその修飾を有する場合に、該二重鎖構築物は、ＰＮＡ：ＲＮＡ構築物と呼ぶことができる。上記定義に従えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＸＮＡとは呼ぶことはできない、ＤＮＡと、ＲＮＡと、ＸＮＡとの混合重合体が着想できることが分かる（例えば、３０％のＤＮＡ、３０％のＲＮＡ及び４０％のＸＮＡを有する核酸）。このような混合核酸鎖は、用語「核酸」に明確に包含され、また、核酸は、０、５、１０、２０、２５、３０、４０又は５０％以上のＤＮＡ；０、５、１０、２０、２５、３０、４０又は５０％以上のＲＮＡ；及び０、５、１０、２０、２５、３０、４０又は５０％以上のＸＮＡを有することができるものとする。５０％のＲＮＡ及び５０％のＤＮＡ又はＸＮＡを有する核酸は、ＲＮＡ鎖とみなされ、５０％のＤＮＡ及び５０％のＸＮＡを有する核酸はＤＮＡ鎖とみなされる。
【００６３】
ＲＮＡｉ構築物の作製は、化学合成方法又は組換え核酸技術によって実施できる。処理細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼは、生体内での転写を仲介することができ、又はクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、試験管内での転写のために使用できる。
【００６４】
ＲＮＡｉ構築物の１つの鎖又は２つの鎖は、燐酸−糖骨格及び／又はヌクレオシドに修飾を有するであろう。一般に、該センス鎖は、導入できる修飾の量とタイプにほとんど制約を受けない。該センス鎖は、アンチセンス鎖とハイブリダイズできる能力を保持すべきであり、さらに長い核酸の場合には、低分子の活性ｓｉＲＮＡを生じさせるように長い二重鎖構築物を開裂させることに関与する、ダイサーのようなＲＮアーゼの活性を妨害すべきではない。該アンチセンス鎖は、該センス鎖及び標的転写物の両方とハイブリダイズできる能力と、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる能力とを保持すべきである。所定の好ましい実施形態では、センス鎖は、全体的に修飾された核酸を有するが、アンチセンス鎖は、せいぜい０％、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％の修飾核酸を有するＲＮＡである。所定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、ＲＮＡ（センス）：ＲＮＡ（アンチセンス）構築物であって該ＲＮＡ（センス）部分が１個以上の修飾を有するものである。所定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、ＤＮＡ（センス）：ＲＮＡ（アンチセンス）構築物であって該ＤＮＡ（センス）部分が１個以上の修飾を有するものである。随意に、ＲＮＡ（アンチセンス）部分も１個以上の修飾を有する。修飾は、該構築物の取り込みを改善させるため及び／又は血中半減期を長くするために有用であろう。さらに、同一の修飾又は追加の修飾によって、さらなる利益、例えば、細胞性ヌクレアーゼ感受性の低減、生物学的利用率の改善、処方物特性の改善及び／又は薬物速度論的特性の変化を得ることができる。
【００６５】
所定の実施形態では、本発明は、１種以上のアプタマーを有するＲＮＡｉ構築物のポリヌクレオチド鎖の修飾を提供する。アプタマーとは、対象の標的と相互作用してアプタマー：標的複合体を形成する核酸である。該アプタマーは該センス又はアンチセンス鎖のいずれかで生じ得、且つ、いずれかの鎖の３’末端か５’末端のいずれかで生じ得るが、センス鎖の５’末端に位置するアプタマーは、該構築物のＲＮＡｉ活性に悪影響が少ない傾向を有することが予期される。該アプタマーのセンス鎖又はアンチセンス鎖への取り込み又は結合によって、それぞれの成分がその活性を保持するのが可能になる；即ち、該アプタマー成分は、特異的な標的と相互作用する能力を保持し、また、該センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉ機構によって標的遺伝子発現を阻害する能力を保持する。該アプタマーのセンス鎖又はアンチセンス鎖への取り込み又は結合に関して、これらの成分は、取り込み又は結合の前に保持していた二次構造又は三次構造のような所定の構造要素を保持することもできる。通常、アプタマーはＲＮＡｉ構築物の直鎖核酸骨格に取り込まれるが、アプタマーは、別の結合処理によってＲＮＡｉ構築物の核酸に結合できる。例えば、アプタマーをヌクレオチドの反応性基に結合させて分岐骨格核酸を創り出すことができるが、ここで、１個の分岐が該アプタマーに相当する。いくつかの実施形態では、該アプタマーは、特定の標的への結合のような、該系に有益な特性を転嫁させるようにスクリ−ニング及び／又は最適化することができた複数のアプタマーから（例えば、核酸ライブラリーから）選択できる。本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸ方法によって、試験管内で化学的に合成及び作製できる。該アプタマーは、標的と優先的に相互作用し及び／又はそれに結合するように選択できる。このような標的の好適な例としては、有機小分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド及び蛋白質のような分子が挙げられる。他の標的としては、細胞小器官、ウイルス及び細胞のような、さらに大きな構造体が挙げられる。好適な蛋白質の例としては、細胞外蛋白質、膜蛋白質、細胞表面蛋白質又は血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン）が挙げられる。このような標的分子は、細胞によって内部に取り入れられ得る。該アプタマーと標的蛋白質（例えば、ペプチド、蛋白質など）との相互作用は、該アプタマー及び／又はポリヌクレオチドの生物学的利用率及び／又は細胞取り込みを改善させることができる。該アプタマー及び／又はポリヌクレオチドは、細胞によって内部に取り込まれることができ、また、ペプチド、ポリペプチド又は蛋白質のような標的分子への該アプタマーの結合によって、該ポリヌクレオチドの該細胞への内部移行が促進され得る。また、本発明のポリヌクレオチドになし得る修飾を１種以上のアプタマーになしてもよい。
【００６６】
本発明の様々な実施形態に使用するためのアプタマーとしては、標的又は標的分子と相互作用する任意の核酸配列が挙げられる。この相互作用は、直接的又は間接的な結合を伴うことができ、好ましくは特異的相互作用であろう。アプタマーは、天然型核酸配列又は試験管内で生成される核酸配列であることができる。また、試験管内で生成される多くの配列は、偶然に又はその反対に、自然界においても見出される。この技術は、一本鎖核酸及び二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び核酸アナログを有する重合体を含め、あらゆるタイプの核酸のアプタマーを生成するために利用できるが、ここで説明する多くの実施形態は、好ましくは一本鎖ＲＮＡアプタマーを使用する。
【００６７】
好ましい実施形態では、該アプタマーは、標的分子と特異的に相互作用する任意のＲＮＡ配列である。ＲＮＡアプタマー配列は、多くの標的分子に対して知られており、小分子を高い親和性と特異性で結合するアプタマーとして知られているＲＮＡ配列を生成することも可能である（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．；Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，６８，６１１−６４７）。例えば、抗生物質に結合するアプタマーを生成させるための方法が確立されている。例えば、Ｗａｌｌａｃｅ  ＳＴ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  Ｒ「抗生物質に対して高い親和性を有するＲＮＡのインビトロセレクション及びキャラクタリゼーション」ＲＮＡ−リガンド相互作用，ＰａｒｔＢ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３１８：２１４−２２９，２０００を参照されたい。このような技術は、カナマイシンＢに対してアプタマーを選択するために使用されてきた（Ｋｗｏｎ  Ｍ，Ｃｈｕｎ  ＳＭ，Ｊｅｏｎｇ  Ｓ，Ｙｕ  Ｊ（２００１）「カナマイシンＢに対するＲＮＡのインビトロセレクション」，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  １１：（３）３０３−３１１）。
【００６８】
また、アプタマー配列は、例えば、次の文献：米国特許第５４７５０９６号；同５５９５８７７号；同５６７０６３７号；同５６９６２４９号；同５７７３５９８号；同５８１７７８５号に記載されたＳＥＬＥＸ方法を含めて、当業者に知られている方法に従って生成することもできる。このＳＥＬＥＸ方法を以下に要約する。多様なＤＮＡ分子のプールを、ランダム化した又はしていない可変配列が定常配列に隣接するように化学的に合成する。定常配列に隣接する可変配列を有するＤＮＡ分子は、例えば、別々のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）を成長しつつあるポリヌクレオチドに定常領域の合成中に添加し且つヌクレオチドの混合物（例えば、Ａ／Ｔ混合物、Ａ／Ｔ／Ｇ混合物又はＡ／Ｔ／Ｇ／Ｃ混合物）を成長しつつあるポリヌクレオチドに可変領域の合成中に添加するようにＤＮＡ合成装置をプログラミングすることによって作製できる。Ａ／Ｔ混合物を成長しつつあるポリヌクレオチドに添加すると、ポリヌクレオチドの混合物、即ち、新たに合成された位置にＡを有するもの及び新たに合成された位置にＴを有するものが生じるであろう。定常領域の一つは、一般に、可変配列の転写を可能とするように位置したＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と、随意に、隣接定常配列の一方又は両方の一部又は全てとを含む。次いで、該ＲＮＡ分子を標的分子への結合能のような所望の特性に従って分離する。例えば、標的分子を樹脂に固定し、そしてクロマトグラフィーカラムに注ぐことができる。次いで、このＲＮＡ分子を該カラムに通す。結合しないものを捨てる。該標的分子カラムに結合するＲＮＡを溶出させることができる（例えば、該標的分子又はグアニジニウム−ＨＣｌ若しくは尿素溶液の過剰量で）。次いで、これらの結合ＲＮＡを、逆転写酵素を使用して再度ＤＮＡに変換し、ポリメラーゼ連鎖反応（必要なら、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを回復させるプライマーの使用を伴うことができる）で増幅させる。次いで、このサイクルを連続的に繰り返し、該標的分子に対する潜在的親和性を有するアプタマーを濃縮する。標的分子には結合するが、別の化合物（例えば、構造的に類似する前駆体分子）には結合しないアプタマーを得ることが望ましい場合には、さらなる選択を実行して非標的分子に結合するアプタマーを除去することができる。例えば、アプタマーが標的分子に結合したカラムを非標的分子でフラッシュして非標的分子との相互作用が著しいアプタマーを除去することができる。これらの方法は、一本鎖又は二本鎖アプタマーを生成させるために調節可能である（Ｔｈｉｅｓｅｎ  Ｈ−Ｊ，Ｂａｃｈ  Ｃ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３２０３−０９；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ，Ｓｚｏｓｔａｋ  ＪＷ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−５２）。当業者であれば、ＳＥＬＥＸのような技術を使用して、標的分子と相互作用することができるアプタマー配列を生成させることができ、また、結合特異性の程度（即ち、他の化合物への結合の欠落）を選択することもできる。
【００６９】
また、特異的結合特性を有する多くの天然配列も知られており、そしてこのような配列をコードする核酸を本発明の配列をコードするアプタマーとして使用できる。例えば、標的分子が補酵素Ｂ１２である場合には、Ｅ．ｃｏｌｉのｂｔｕＢ遺伝子の５’非翻訳領域をアプタマーとして使用することができる（Ｎａｈｖｉ外，２００２，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１０４３−４９）。また、予想される標的分子に結合する他の天然型核酸も知られている（例えば、Ｍｉｒａｎｄａ−Ｒｉｏｓ外，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７３６−４１参照）。
【００７０】
ここで説明する方法で使用するのに好適なアプタマーは、実験的に選択できる。一連の候補アプタマーを、標的への結合についてこれらの候補を検査することによってスクリーニングできる。該標的結合活性は、全体的に、遺伝子発現の阻害を仲介するＲＮＡｉ構築物のアンチセンス部分及びセンス部分と重複していないアプタマー部分の内部に位置し得る。また、該標的結合活性は、ＲＮＡｉ構築物のセンス部分及び／又はアンチセンス部分の内部に部分的に又は特殊の場合には全体的に位置することもできる。言い換えれば、一つのアプローチでは、アプタマーは、これと組み合わせることができるＲＮＡｉ構築物を考慮することなく、標的結合のために選択される。このような場合には、該アプタマーは、ＲＮＡｉ構築物に取り込まれた場合でも標的結合を保持し、しかも、該ＲＮＡｉ構築物の他の部分は、標的結合にほとんど又は全く関与を示さないことが予期される。このような場合には、スクリーニング用のアプタマーライブラリーは、基本的に、適当な長さの多様な配列を有するどのようなライブラリーであってもよい。別の場合には、標的結合（アプタマー）活性部分が遺伝子発現の抑圧に関与することができるＲＮＡｉ構築物部分の内部に位置したＲＮＡｉ構築物を構築することが望ましいかもしれない。これは、不変部分又は比較的不変の部分として、ＲＮＡｉ構築物のセンス部分又はアンチセンス部分や、全二重鎖ＲＮＡｉ構築物（特にヘアピンＲＮＡｉ構築物の場合）を有するアプタマースクリーニングライブラリーを作製することによって達成できる。アプタマー又はアプタマー含有核酸と標的分子との相互作用の親和性及び／又は特異性を測定することができるが、このような情報は、特定の課題に好適なアプタマーを選択し又は説明するために有用であり得る。
【００７１】
上記のように、標的分子に対する結合親和性が変化するアプタマーを作製することも可能である。標的分子に対する親和性が高い又は低いアプタマーを使用する重要性は、該構築物の使用目的の性質に依存し、また、上で議論したように、その親和性の重要性は、多くの場合、アプタマー含有ＲＮＡｉ構築物が遺伝子発現を阻害することができる能力のような他の特性に対しては二次的なものである。ここで使用するときに、用語「低親和性」とは、１０-4Ｍ以上の解離定数（ＫD）を有するアプタマーをいう。ここで使用するときに、用語「中親和性」とは、１０-6Ｍ〜１０-4ＭのＫDを有するアプタマーをいう。ここで使用するときに、用語「高親和性」とは、１０-6Ｍ未満のＫDを有するアプタマーをいう。標的蛋白質が、血清アルブミンのように非常に豊富にある場合には、低親和性又は中親和性アプタマーでも十分であることが予期される。標的蛋白質が、存在量の少ない細胞型特異的受容体のような希少な蛋白質である場合には、それよりも高い親和性のアプタマーが効果的であるかもしれない。また、タンデム型のアプタマーも使用できる。タンデム型アプタマーは、同一の標的で標的指向化できるが、この場合には、一般に、タンデム型アプタマーは、単一アプタマーよりもオフレートが低いことや、別個の標的に標的指向化されることが予期されるが、これは、例えば両方の標的を有する細胞への特異的送達を増加させることができる。
【００７２】
上記のように、標的分子に対して広範囲の異なる特異性を有するアプタマーを作製することが可能である。ここで使用するときに、用語「特異性」は、特定の非標的分子を基準にして定義される。ここでは、特異性は、標的分子を結合させるためのアプタマーのＫD対特定の非標的分子を結合させるためのアプタマーのＫDの比であると定義される。例えば、アプタマーが標的分子について１０-6ＭのＫDを有し且つ非標的分子について１０-5ＭのＫDを有する場合には、特異性は１０（１０-6/１０-5）である。特定の非標的分子と比較して標的分子に対する特異性が高い又は低いアプタマーを使用する重要度は、使用目的の性質に依存するであろう。
【００７３】
当業者であればこの開示を検討したときに分かるであろうが、本発明の方法は、様々な標的分子について使用できる。一つの望ましい標的カテゴリーは、結合した物質の細胞への内部移行を促進させる蛋白質である。標的分子が細胞透過性でない場合には、該標的分子を、アジュバント、キャリア又は細胞透過を促進させる他の材料と共に宿主細胞に適用することができる。好適な薬剤としては、脂質、リポソーム、ポリシクロデキストリン化合物を含めた重合体などが挙げられる。
【００７４】
また、当業者であれば、ここで議論するＲＮＡｉ構築物のヌクレオチドへの修飾を本発明のアプタマーにも適用できることが容易に分かるであろう。例えば、１種以上のアプタマーのホスホジエステル結合を、１個以上の窒素又は硫黄ヘテロ原子を含むように修飾することができる；該アプタマーを、スホロチオエート修飾を含むように修飾することができる。該アプタマーの糖−燐酸骨格への修飾のほかに、存在するならば、例えば非天然塩基を含むように該アプタマーのヌクレオシド部分に修飾を作製することもできる。また、当該分野に知られているあらゆるヌクレオチド修飾も本発明のアプタマーに適用できる。さらに、該アプタマーは、主として、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＸＮＡ又はこれらのいずれかの混合物から構成されるかもしれない。
【００７５】
さらに、この明細書を考慮すれば、ＲＮＡｉ構築物の負電荷を減少させる及び／又は疎水性を増大させる修飾の多くの例が明らかであろう。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を、窒素又は硫黄ヘテロ原子のうち少なくとも１個を含むように修飾できる。修飾について、生体内で使用する前に細胞に及ぼす毒性効果を検査することができる。例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖における５０％以上のホスホロチオエート修飾が細胞毒性効果を有し得る。ＲＮＡ構造における修飾は、特異的遺伝子阻害を可能にする一方でｄｓＲＮＡに対する通常の応答を回避するように調節できる。同様に、塩基を、アデノシンデアミナーゼ活性をブロックするように修飾できる。該ＲＮＡｉ構築物は、酵素によって又は部分的な／完全な有機合成によって作製でき、どのような修飾リボヌクレオチドでも試験管内酵素合成又は有機合成によって導入できる。疎水性はｌｏｇＰの分析によって評価できる。「ｌｏｇＰ」とは、Ｐ（分離係数）の対数をいう。Ｐは、脂質（油）と水との間の物質分離がどの程度かという基準である。Ｐ自体は一定である。これは、中性分子としての、水性相中の化合物濃度対非混和性溶媒中の化合物濃度の比であると定義される。
【００７６】
分離係数Ｐ＝［有機］／ 水性］（ここで、［］＝濃度である）
ｌｏｇＰ＝ｌｏｇ10（分配係数）＝ｌｏｇ10Ｐ。
【００７７】
実際には、ｌｏｇＰ値は、測定条件及び分配溶媒の選択によって変化するであろう。１のｌｏｇＰ値とは、該化合物濃度が、水性相よりも有機相で１０倍大きいことを意味する。１のｌｏｇＰ値の増加は、水性相と比較して有機相の化合物濃度が１０倍増加することを示す。従って、３のｌｏｇＰ値を有する化合物は、４のｌｏｇＰ値を有する化合物よりも１０倍水に可溶であり、３のｌｏｇＰ値を有する化合物は、５のｌｏｇＰ値を有する化合物よりも１００倍水に可溶である。一般に、７〜１０のｌｏｇＰ値を有する化合物は、低い溶解度の化合物であるとみなされる。
【００７８】
所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも少なくとも１のｌｏｇＰ単位、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物のｌｏｇＰ値よりも少なくとも２、３又は４のｌｏｇＰ単位少ないｌｏｇＰ値を有する。
【００７９】
電荷は、ＲＮＡｉ構築物の等電点（ｐＩ）を測定することによって決定でき、この測定は、例えば、等電点分離分析を実行することによって行うことができる。所定の実施形態では、１個以上の修飾を有するＲＮＡｉ構築物は、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．２５単位高い等電点ｐＨ（ｐＩ）を有し、好ましくは、他の部分では同様の非修飾ＲＮＡｉ構築物よりも少なくとも０．５、１又はさらに２単位高い等電点ｐＨを有する。
【００８０】
ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法を、ＲＮＡｉ構築物を修飾する方法に適応させることができる（例えば、Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ外，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：７７６−７８０；Ｗｉｌｓｏｎ外，（１９９４）Ｊ  ＭｏＩ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８；Ｃｈｅｎ外，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎ外，（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照）。単に例示すると、ＲＮＡｉ構築物の骨格をホスホロチオエート、ホスホラミデート、ホスホジチオエート、キメラホスホン酸メチル−ホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニルピリミジン含有オリゴマー又は糖修飾（例えば、２'置換 リボヌクレオシド、ａ−立体配置）で修飾することができる。追加の修飾ヌクレオチドは次の通りである（このリストは、骨格若しくはヌクレオシド又はその両方が修飾された形態を含み、且つ、包括的であることを意図しない）：２'−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン；２'−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン；２'−Ｏ−メチルアデノシン；２'−Ｏ−メチルシチジン；２'−Ｏ−メチルグアノシン；２'−Ｏ−メチルウリジン；２−アミノ−２'−デオキシアデノシン；２−アミノアデノシン；２−アミノプリン−２'−デオキシリボシド；４−チオチミジン；４−チオウリジン；５−メチル−２'−デオキシシチジン；５−メチルシチジン；５−メチルウリジン；５−プロピニル−２'−デオキシシチジン；５−プロピニル−２'−デオキシウリジン；Ｎ１−メチルアデノシン；Ｎ１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチル−２'−デオキシグアノシン；Ｎ６−メチル−２'−デオキシアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｏ６−メチル−２'−デオキシグアノシン；及びＯ６−メチルグアノシン。様々な化学合成アプローチを、核酸への追加部分の抱合に利用できる。例えば、核酸−脂質、核酸−糖抱合体（例えば、Ａｎｎｏ外、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２００３  ５月〜８月；２２（５−８）：１４５１−３；Ｗａｔａｌ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ．２０００；（４４）：１７９−８０参照）、核酸−ステロール抱合体又はビタミンＥ、ドデカノール、アラキドン酸、葉酸及びレチノイン酸のような比較的脂溶性の疎水性部分の抱合体（例えば、Ｓｐｉｌｌｅｒ外、Ｂｌｏｏｄ. １９９８年６月１５；９１（１２）：４７３８−４６；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９８年３月〜４月；９（２）：２８３−９１；Ｌｏｒｅｎｚ外，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００４年１０月  ４；１４（１９）：４９７５−７；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ外，Ｎａｔｕｒｅ．２００４年１１月  １１；４３２（７０１４）：１７３−８）を合成することができる。また、ＭａｎｏｈａｒａｎのＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２００２年４月；１２（２）：１０３−２８の核酸抱合体のレビューも参照されたい。また、上記修飾も本発明のアプタマーに適用できる。
【００８１】
二重鎖構造は、単一の自己相補的核酸鎖又は２つの相補的核酸鎖によって形成できる。二本鎖形成は、細胞内又は細胞外のいずれかで開始できる。ＲＮＡｉ構築物は、細胞当たり少なくとも１コピーの送達を可能にする量で導入できる。二重鎖物質の投与量がそれよりも多い（例えば、細胞当たり少なくとも５、１０、１００、５００又は１０００コピー）と、さらに有効な阻害を生じさせることができる一方で、それよりも少ない投与量は、特定の用途には有用かもしれない。ここで開示する修飾ＲＮＡｉ核酸の取り込みがさらに多い場合には、従来のＲＮＡｉ構築物で一般的に使用されるよりも少ない投与量を使用することができると考えられる。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が遺伝子阻害を標的とする点で配列特異的である。
【００８２】
所定の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、「低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。これらの核酸としては、ほぼ１９〜３０ヌクレオチド長、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長、例えば、長い二重鎖ＲＮＡのヌクレアーゼ「ダイシング」によって生じるフラグメントに相当する長さのアンチセンスＲＮＡ鎖が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＸＮＡであるセンス鎖を含むことができる。このｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を補充し、そして特異的な配列への対合によって該標的ｍＲＮＡに該複合体をガイドすると考えられる。結果として、該標的ｍＲＮＡは、蛋白質複合体中のヌクレアーゼによって分解する。特定の実施形態では、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡアンチセンス分子は、３’ヒドロキシル基を有する。随意に、該センス鎖は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の修飾核酸を有するが、該アンチセンス鎖は非修飾ＲＮＡである。随意に、該センス鎖は、１００％の修飾核酸（例えば、全ての可能な位置にホスホロチオエート修飾を有するＤＮＡ又はＲＮＡ ）を有するが、該アンチセンス鎖は、修飾核酸を有しないか、又は１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％以下の修飾ＲＮＡ核酸を有するＲＮＡ鎖である。
【００８３】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、当業者に知られている多数の技術を使用して得ることができる。例えば、このｓｉＲＮＡは、当該技術分野において知られている方法を使用して化学的に合成でき又は組換えによって作製できる。例えば、短鎖センス及びアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡ又はＸＮＡオリゴマーを合成し、そしてアニーリングさせて各末端に２−ヌクレオチドオーバーハングを有する二重鎖構造を形成させることができる（Ｃａｐｌｅｎ外，（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９８：９７４２−９７４７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ外，（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ，２０：６８７７−８８）。次いで、以下に説明するように、これらの二重鎖ｓｉＲＮＡ構造を、受動的取り込み又は送達系のいずれかを選択することによって導入できる。
【００８４】
所定の実施形態では、このｓｉＲＮＡ構築物は、長い二重鎖ＲＮＡを、例えば、酵素ダイサーの存在下で加工することによって生成できる。一実施形態では、ショウジョウバエ試験管内系を使用する。この実施形態では、ｄｓＲＮＡをショウジョウバエの胚から得られた可溶性抽出物と混合し、それによって組換えを生じさせる。組換えを、該ｄｓＲＮＡが約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子にまでプロセシングされる条件下で維持する。この実施形態では、修飾は、該ＲＮアーゼの活性を妨害しないように選択すべきである。
【００８５】
このｓｉＲＮＡ分子は、当業者に知られている多数の技術を使用して精製できる。例えば、ゲル電気泳動を使用してｓｉＲＮＡを精製することができる。或いは、非変性カラムクロマトグラフィーのような非変性方法を使用してこのｓｉＲＮＡを精製することができる。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセリン勾配遠心分離、抗体による親和性精製を使用してｓｉＲＮＡを精製することができる。
【００８６】
好ましい実施形態では、このｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、約１〜約６ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有するが、２〜４ヌクレオチド長であってもよい。より好ましくは、該３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である。所定の実施形態では、一方の鎖が３’オーバーハングを有し、他方の鎖が平滑末端化されているか又はオーバーハングをも有する。該オーバーハングの長さは、それぞれの鎖について同一であっても異なっていてもよい。このｓｉＲＮＡの安定性をさらに向上させるために、該３’オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。一実施形態では、ＲＮＡアンチセンス鎖は、アデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含ませることによって安定化する。或いは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログによる置換、例えば、ウリジンヌクレオチド３’オーバーハングの２'−デオキシチミジンによる置換は許容され、且つ、ＲＮＡｉの効率に影響を及ぼさない。２'ヒドロキシルが存在しないと、細胞培養培地中における該オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が有意に向上するが、これは生体内でも有利であろう。
【００８７】
他の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、長い二重鎖ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド又はＸＮＡ：ＲＮＡ：の形態にある。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００又は４００塩基である。所定の実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は４００〜８００塩基の長さである。該二重鎖核酸を細胞内で消化し、例えば、該細胞内でｓｉＲＮＡ配列を生じさせる。しかしながら、長い二重鎖核酸を生体内で使用することは、おそらく配列非依存性ｄｓＲＮＡ応答によって生じ得る有害な影響のため、常に現実的であるわけではない。このような実施形態では、局所的送達系及び／又はインターフェロン若しくはＰＫＲの影響を低減させる薬剤を使用することが好ましい。
【００８８】
所定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構造の形態にある。このヘアピンは、外因的に合成でき、又はＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーターから生体内で転写させることによって形成できる。ほ乳類細胞における遺伝子サイレンシングのためにこのようなヘアピンＲＮＡを作製し且つ使用する例は、例えば、Ｐａｄｄｉｓｏｎ外，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００２，１６：９４８−５８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ外，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：３８−９；ＭｃＭａｎｕｓ外，ＲＮＡ，２００２，８：８４２−５０；Ｙｕ外，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２，９９：６０４７−５２に記載されている。好ましくは、このようなヘアピンＲＮＡを細胞内で又は動物内で操作して所望の遺伝子の連続的且つ安定な制御を確実にする。ｓｉＲＮＡが細胞内でヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによって作製できることが当該技術分野に知られている。ヘアピンは、センス鎖がＲＮＡ、ＤＮＡ又はＸＮＡを有する一方、アンチセンス鎖がＲＮＡを有するように化学的に合成できる。このような実施形態では、ループ部分と呼ばれることもあるセンス部分とアンチセンス部分とを連結する一本鎖部分は、生体内でヌクレアーゼにより開裂できるようにデザインすべきであり、また、任意の二本鎖部分は、ダイサーのようなヌクレアーゼによるプロセシングに感受性があるべきである。
【００８９】
１種以上のアプタマーを有するＲＮＡｉ構築物に１個以上の修飾を含む所定の実施形態では、このようなアプタマーは、ＲＮＡｉ構築物のヘアピン構造と両立できる。該アプタマーは、該二本鎖のセンス部分若しくはアンチセンス部分又は該ヘアピンの二重鎖部分と会合し得る。また、該アプタマーは、該ヘアピンのループ部分とも会合し得る。
【００９０】
IV．代表的な処方物
また、本発明のＲＮＡｉ構築物は、他の分子、分子構造又は化合物の混合物、例として、取り込み、分配及び／又は吸収を補助するためのリポソーム、重合体、受容体標的分子、経口、直腸内、局所又はその他の処方物と混合、カプセル化、抱合又は会合できる。主題のＲＮＡｉ構築物は、浸透向上剤、キャリア化合物及び／又はトランスフェクション剤も含む処方物で提供できる。
【００９１】
所定の実施形態では、ここで開示するＲＮＡｉ構築物の会合の増加を用いてＲＮＡｉ構築物と蛋白質とを有する予備会合混合物を作製することができる。例えば、被験者への送達用の組成物は、アルブミン（好ましくは、送達用の種にマッチしたもの、例えばヒトへの送達用のヒト血清アルブミン）のような１種以上の血清蛋白質と、ＲＮＡｉ構築物とを含むことができる。従って、ＲＮＡｉ構築物のパーセンテージが著しいと、被験者への送達時に蛋白質と会合するであろう。蛋白質は、送達態様にとって好適であるように選択できる。血清蛋白質は、血液で潅流された身体のいずれかの部分への送達に特に好適であり、また、静脈内投与に特に好適である。ムコイド蛋白質又はプロテオグリカンは、気道、直腸、眼又は生殖器のような粘膜表面への投与のために望ましいかもしれない。
【００９２】
蛋白質は、該ＲＮＡｉ構築物を特定の組織又は細胞型に標的指向化するために選択できる。例えば、トランスフェリン蛋白質を使用してＲＮＡｉ構築物を腫瘍細胞（「腫瘍性細胞」）に標的指向化させることができる。別の例として、１以上のガラクトース部分を有する蛋白質を使用してＲＮＡｉ構築物を肝細胞に標的指向化させることができる。ＲＮＡｉ構築物は、標的の細胞型又は組織型に対して親和性を有する抗体と予備混合できる。標的指向化抗体の作製方法は、当該分野に周知である。抗体は、例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、単鎖抗体を含むポリペプチド、Ｆｖフラグメント、Ｆｃフラグメント（例えば、Ｆｃ結合細胞への標的指向化のための）、キメラ又はヒト化抗体、完全ヒト抗体、あらゆるタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ若しくはＩｇＤ又はそれらの部分であることができる。標的指向化ポリペプチドの追加の例を以下の表に列挙する。
【００９３】
【表１】
2008528037.tif 000003
【００９４】
また、ポリペプチドは、細胞内取り込みを特に促進させるように選択された内部移行性ポリペプチドであることもできる。一実施形態では、該内部移行性ペプチドは、ドロソフィラ・アンテペネペディア（Drosophila antepennepedia）蛋白質やそのホモログから誘導される。ホメオ蛋白質であるａｎｔｅｐｅｎｎｅｐｅｄｉａの６０アミノ酸長ホメオドメインは、生体膜を介して転位置することが実証されており、且つ、対となる非相同ポリペプチドの転位置を促進させることができる。例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉ外，（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１０４４４−１０４５０；及びＰｅｒｅｚ外，（１９９２）Ｊ  ＣｅＩｌ  Ｓｃｉ  １０２：７１７−７２２を参照されたい。近年、１６アミノ酸長と小さい当該蛋白質フラグメントが内部移行を作動させるのに十分であることが実証された。Ｄｅｒｏｓｓｉ外，（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８１８８−１８１９３を参照されたい。内部移行性ペプチドの別の例は、ＨＩＶトランス活性因子（ＴＡＴ）蛋白質である。この蛋白質は、４つのドメインに分けられると思われる（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ外，（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３５５１−３５６１）。精製されたＴＡＴ蛋白質は、細胞培養中に細胞によって取り込まれ（Ｆｒａｎｋｅｌ及びＰａｂｏ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３）、そして、ＴＡＴの３７〜６２残基に相当するフラグメントのようなペプチドは、試験管内で細胞によって迅速に取り込まれる（Ｇｒｅｅｎ及びＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８）。この高度に塩基性の領域は、内部移行と、内部移行性部分の核への標的指向化とを仲介する（Ｒｕｂｅｎ外，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１−８）。ＣＦＩＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のような高塩基性領域に存在する配列を含むペプチド又はアナログを重合体に結合させると、内部移行及び該複合体を細胞内の核に標的指向化させることに役立つ。他の代表的な経細胞ポリペプチドを、十分なマストパラン部分を含むように生成（Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ外，（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４１７６）させてＲＮＡｉ複合体の膜貫通輸送を増加させることができる。
【００９５】
他の好適な内部移行性ペプチドは、例えば、ヒストン、インスリン、トランスフェリン、塩基性アルブミン、プロラクチン及びインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子II（ＩＧＦ−II）又は他の増殖因子の全て又は一部分を使用して生成できる。例えば、毛細血管細胞上のインスリン受容体に対して親和性を示し且つ血糖値の減少の点でインスリンよりも効果が少ないインスリンフラグメントは、受容体仲介経細胞輸送により膜貫通輸送が可能であり、そのため対象の経細胞ポリペプチドのための内部移行性ペプチドとしての機能を果たすことができることが分かっている。好ましい増殖因子由来内部移行性ペプチドとしては、ＥＧＦ（上皮増殖因子）由来ペプチド、例えば、ＣＭＨＩＥＳＬＤＳＹＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及びＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；ＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）由来ペプチド；ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）又はＰＤＧＦ−２由来のペプチド；ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子）又はＩＧＦ−II由来のペプチド；及びＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）由来ペプチドが挙げられる。
【００９６】
さらに別の好ましい内部移行性ペプチドとしては、アポリポ蛋白Ａ−１及びＢのペプチド；ペプチド毒素、例えば、メリチン、ボンボリチン、デルタヘモリシン及びパルダキシン；ペプチド系抗生物質、例えば、アラメチシン；ペプチドホルモン、例えば、カルシトニン、コルチコトロピン放出因子、β−エンドルフィン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵臓ポリペプチド；及び多数の分泌蛋白質のシグナル配列に相当するペプチドが挙げられる。さらに、代表的な内部移行性ペプチドは、酸性ｐＨで該内部移行性ペプチドのα−ヘリックスの性状を増強させる置換基の結合によって修飾できる。
【００９７】
本発明のアプタマーは、上で議論した内部移行性ペプチドとの相互作用（例えば結合）のために選択でき及び／又は最適化できる。このような相互作用は、アプタマー及び／又はＲＮＡｉ構築物の細胞取り込みを促進させることができる。
【００９８】
また、ポリペプチドは、ＲＮＡｉ構築物との相互作用のために選択又はデザインされる第１ドメインと、標的指向化、内部移行又は他の所望の機能性のために選択又はデザインされる第２ドメインとを有する融合蛋白質であることもできる。
【００９９】
ＲＮＡｉ構築物は、随意に異なる数種のタイプの複数のポリペプチド（例えば、血清蛋白質及び標的指向化蛋白質）と予備混合できる。以下で説明するような追加の物質も同様に包含できる。
【０１００】
ＲＮＡｉ構築物の送達に適し得る、取り込み、分配及び／又は吸収を助ける処方物の製造を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５１０８９２１号；５３５４８４４号；５４１６０１６号；５４５９１２７号；５５２１２９１号；５１５４３１５８号；５５４７９３２号；５５８３０２０号；５５９１７２１号；４４２６３３０号；４５３４８９９号；５０１３５５６号；５１０８９２１号；５２１３８０４号；５２２７１７０号；５２６４２２１号；５３５６６３３号；５３９５６１９号；５４１６０１６号；５４１７９７８号；５４６２８５４号；５４６９８５４号；５５１２２９５号；５５２７５２８号；５５３４２５９号；５５４３１５２号；５５５６９４８号；５５８０５７５号；及び５５９５７５６号が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のＲＮＡｉ構築物は、任意の薬学的に許容できる塩、エステル若しくはこのようなエステルの塩又はヒトを含めた動物への投与により生物学的に活性な代謝産物若しくはその残分を与える（直接的若しくは間接的に）ことができる任意の他の化合物をも包含する。従って、例えば、当該開示は、ＲＮＡｉ構築物、該ｓｉＲＮＡの薬学的に許容できる塩、当該ＲＮＡｉ構築物の薬学的に許容できる塩及び他の生物学的同等物に関するものでもある。
【０１０１】
薬学的に許容できる塩基付加塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属又は有機アミンのような金属又はアミンにより形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。好適なアミンの例は、Ｎ，ＮＩ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン及びプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ外，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ  １９７７，６６，１−１９）。該酸性化合物の塩基付加塩は、当該遊離酸の形態にあるものと十分な量の所望の塩基とを従来の態様で接触させて塩を生成させることによって製造される。該遊離酸形態は、該塩形態と酸とを接触させ、そして慣用の態様で該遊離酸を単離することによって再度生成できる。これらの遊離酸形態は、極性溶媒への溶解性のような所定の物性が幾分それらの各塩形態とは相違するが、本発明の目的上、他の点では、該塩はそれらの各遊離酸と同等である。ここで使用するときに、「薬学的付加塩」には、本発明の組成物の成分のうちの一つの酸形態の薬学的に許容できる塩が含まれる。これらには、アミンの有機酸塩又は無機酸塩がある。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及び燐酸塩である。他の好適な薬学的に許容できる塩は、当業者には周知であり、様々な無機酸及び有機酸の塩基性塩がある。
【０１０２】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドについて、薬学的に許容できる塩の好ましい例としては、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミン及びスペルミジンのようなポリアミンなどの陽イオンで形成された塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸などで形成された酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタリンスルホン酸、メタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ナフタリンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸で形成された塩；及び（ｄ）塩素、臭素及び沃素のような元素陰イオンから形成された塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明の別の態様は、ＲＮＡｉ構築物を気道に送達するためのエアロゾルを提供する。この気道には、中咽頭及び喉頭を含めた上気道と、気管に続く気管支及び細気管支への二分岐を含む下気管とが含まれる。上気管及び下気管は、伝導性気道と呼ばれている。終端細気管支は、その後、最終的な呼吸器領域、即ち肺胞又は肺深部に至る呼吸細気管支に分離する。
【０１０４】
ここで、吸入による投与は、経口及び／又は経鼻であることができる。エアロゾル送達用の医療装置の例としては、定量吸入器（ＭＤＩ）、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、及びエアジェット噴霧器が挙げられる。主題のＲＮＡｉ構築物の送達に容易に適応できる吸入による代表的な核酸送達系は、例えば、米国特許第５７５６３５３号；５８５８７８４号；及び国際公開第（ＷＯ）９８／３１３４６号；ＷＯ９８／１０７９６号；ＷＯ００／２７３５９号；ＷＯ０１／５４６６４号；ＷＯ０２／０６０４１２号に記載されている。二重鎖ＲＮＡを送達するために使用できる他のエアロゾル処方物は、米国特許第６２９４１５３号；６３４４１９４号；６０７１４９７号及び国際公開第（ＷＯ）０２／０６６０７８号；ＷＯ０２／０５３１９０号；ＷＯ０１／６０４２０号；ＷＯ００／６６２０６号に記載されている。さらに、ＲＮＡｉ構築物を送達するための方法は、他のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を吸入によって送達する際に使用される方法、例えば、Ｔｅｍｐｌｉｎ外，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．２０００，１０：３５９−６８；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａ外，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００１，１：９７９−８３；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａ外，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，２００２，１２：１７７−８１に記載されるような方法から適応できる。
【０１０５】
ヒトの肺は、加水分解によって開裂できる沈着エアロゾルを数分〜数時間の範囲の期間で除去又は迅速に分解できる。上気道内で、線毛上皮は、粒子が気道から口に向かって掃引される「粘膜毛様体エスカレーター」に寄与する。Ｐａｖｉａ，D.，「ＬｕｎｇＭｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ」ｉｎ  Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．及びＰａｖｉａ，Ｄ．，著，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，ロンドン、１９８４。肺深部において、肺胞マクロファージは、それらの沈着後すぐに粒子を貪食することができる。Ｗａｒｈｅｉｔ外，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，２６：４１２−４２２（１９９３）；及びＢｒａｉｎ，Ｊ．  Ｄ．，「Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ」ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓ．Ｍ．  Ｒｅｉｃｈａｒｄ及びＪ．  Ｆｉｌｋｉｎｓ著，Ｐｌｅｎｕｍ，ニューヨーク，ｐｐ．  ３１５−３２７，１９８５。肺深部又は肺胞は、ＲＮＡｉ構築物の全身的な送達用の吸入治療用エアロゾルの主な標的である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、特に、ＲＮＡｉ構築物の全身投与が望ましい場合に、エアロゾル化ＲＮＡｉ構築物は、微粒子として処方される。０．５〜１０ミクロンの直径を有する微粒子は、天然バリアのほとんどを通過して肺に浸透することができる。咽喉を迂回するには１０ミクロン未満の直径が必要である；吐き出されるのを防ぐためには０．５ミクロン以上の直径が必要である。
【０１０７】
本発明の別の態様は、被覆医療装置に関する。例えば、所定の実施形態では、主題の発明は、少なくとも一つの表面に被膜を付着させた医療装置であって、該被膜が主題の重合体マトリックスと、ここで開示するような修飾を有するＲＮＡｉ構築物とを含むものを提供する。随意に、該被膜は、該ＲＮＡｉ構築物と非共有的に会合する（又は、該被膜からの放出により該ＲＮＡｉ構築物と相互作用するように選択される）蛋白質をさらに含む。このような被膜は、ネジ、プレート、洗浄器、縫合糸、プロテーゼアンカー、ビョウ、ステープル、導線、弁、膜のような手術器具に適用できる。該装置は、カテーテル、移植可能血管アクセスポート、血液保存用バッグ、血液チューブ、中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、代用血管、大動脈内バルーンポンプ、心臓弁、心臓血管縫合糸、人工心臓、ペースメーカー、心室補助ポンプ、体外装置、血液フィルタ、血液透析ユニット、血液潅流ユニット、プラスマフェレーシスユニット及び血管への配置に適合したフィルターであることができる。
【０１０８】
本発明に従ういくつかの実施形態では、重合体を形成するための単量体とＲＮＡｉ構築物とを一緒にし、そして混合して該ＲＮＡｉ構築物の単量体溶液への均質な分散液を作製する。次いで、該分散液を従来技術の被覆方法に従ってステントその他の装置に塗布し、その後、慣用の開始剤、例えばＵＶ光によって架橋プロセスを起こさせる。本発明に従う他の実施形態では、重合体組成物とＲＮＡｉ構築物とを混合して分散液を形成させる。次いで、該分散液を医療装置の表面に塗布し、そして該重合体を架橋させて固形化被膜を形成させる。本発明に従う他の実施形態では、重合体及びＲＮＡｉ構築物と好適な溶媒とを混合して分散液を形成させ、次いで、これを慣用の態様でステントに塗布する。次いで、該溶媒を加熱蒸発のような慣用方法で除去し、その結果、該重合体及びＲＮＡｉ構築物（共に持続放出性薬物送達系を形成する）は、該ステントに被膜として残る。該ＲＮＡｉ構築物を重合体組成物に溶解させる同様の方法を使用してもよい。該ＲＮＡｉを蛋白質と予備混合しようとする場合には、溶媒は、好ましくは、該蛋白質の三次構造を失わないように選択される。
【０１０９】
本発明に従ういくつかの実施形態では、該系は、比較的硬質の重合体を含む。他の実施形態では、該系は、柔軟で展性のある重合体を含む。さらに別の実施形態では、該系は、接着特性を有する重合体を含む。重合体の硬さ、弾性、粘着性及び他の特性は、以下でさらに詳細に議論するように、該系の最終的な特定の物理的形状によって幅広く変更できる。
【０１１０】
本発明に従う系の実施形態は、多くの異なる形状をとる。いくつかの実施形態では、該系は、重合体に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物からなる。他の所定の実施形態では、該系は、ＲＮＡｉ構築物及び半硬質又はゲル状重合体からなるが、これは、体内にシリンジによって注入するのに適する。本発明に従う他の実施形態では、該系は、ＲＮＡｉ構築物及び軟質可撓性重合体からなるが、これは、好適な外科的方法によって体内に挿入又は移植するのに適する。本発明に従うさらなる実施形態では、該系は、硬質の固体重合体からなるが、これは、好適な外科的方法によって体内に挿入又は移植するのに適する。さらなる実施形態では、該系は、ＲＮＡｉ構築物を懸濁又は分散した重合体を含み、ここで、該ＲＮＡｉ構築物及び重合体混合物は、ネジ、ステント、ペースメーカーなどのような手術器具上に被膜を形成する。本発明に従う特定の実施形態では、該装置は、手術用ネジ、プレート、ステントなど又はそれらの部品のような手術器具の形に成形された硬質固体重合体からなる。本発明に従う他の実施形態では、該系は、ＲＮＡｉ構築物を中に分散又は懸濁した縫合糸の形の重合体を含む。
【０１１１】
本発明に従ういくつかの実施形態では、提供するのは、外面のような表面を有する基材と、該外面上にある被膜とを備える医療装置である。該被膜は、重合体及び該重合体中に分散されたＲＮＡｉ構築物を含み、ここで、該重合体は、ＲＮＡｉ構築物に対して透過性であるか、又は該ＲＮＡｉ構築物を放出するように生物分解する。随意に、該被膜は、該ＲＮＡｉ構築物と会合する蛋白質をさらに含む。本発明に従う所定の実施形態では、該装置は、好適な重合体中に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物を有し、ここで、該ＲＮＡｉ構築物及び重合体は、基材、例えば、手術器具全体に被覆されている。このような被覆は、吹き付け被覆又は浸漬被覆で達成できる。
【０１１２】
本発明に従う他の実施形態では、該装置は、ＲＮＡｉ構築物及び重合体懸濁液又は分散液を有し、ここで、該重合体は硬質であり、且つ、体内に挿入又は移植される装置の構成部分をなす。随意に、該懸濁液又は分散液は、ＲＮＡｉ構築物と非共有的に相互作用するポリペプチドをさらに含む。例えば、本発明に従う特定の実施形態では、該装置は、重合体に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物で被覆された手術用ネジ、ステント、ペースメーカーなどである。本発明に従う他の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物を懸濁させる重合体は、手術用ネジの先端若しくは頭又はその部分を構成する。本発明に従う他の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物を懸濁又は分散させる重合体は、手術用チューブ（人工肛門、腹膜洗浄、カテーテル及び静脈注射用のチューブ）のような手術器具上に被覆される。本発明に従うさらなる実施形態では、該装置は、重合体及びＲＮＡｉ構築物が被覆された静脈注射用の針である。
【０１１３】
上で議論したように、本発明に従う被膜は、生体内分解性又は非生体内分解性である重合体を含む。生体内分解性重合体か非生体内分解性重合体かの選択は、該系又は装置の最終的な使用目的に基づいてなされる。本発明に従ういくつかの実施形態では、重合体は、生体内分解性であることが好都合である。例えば、該系が外科的に移植可能な装置、例えば、ネジ、ステント、ペースメーカーなどに被覆される場合には、該重合体は、生体内分解性であることが好都合である。重合体が生体内分解性であることが好都合である本発明に従う他の実施形態としては、ＲＮＡｉ構築物の移植可能、吸入可能又は注入可能な重合体懸濁系又は分散系である装置であって、さらなる要素（例えば、ネジ又はアンカー）を使用しないものが挙げられる。
【０１１４】
重合体が透過性及び生体内分解性に乏しい本発明に従ういくつかの実施形態では、該重合体の生体内分解速度は、好都合には、ＲＮＡｉ構築物の放出速度よりも十分に低く、そのため、該重合体は、該ＲＮＡｉ構築物が放出された後のかなりの時間にわたって配置されたままであるが、最終的には生体内分解され、そして周辺組織に再吸収される。例えば、該装置が生体内分解性重合体に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物を含む生体内分解性縫合糸である場合に、該重合体の生体内分解速度は、該ＲＮＡｉ構築物が約３日〜約１４日にわたって直線的に放出される程度に緩やかであることが好都合であるが、該縫合糸は、約３週間〜約６週間にわたって存続する。本発明に従う同様の装置としては、生体内分解性重合体に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物を含む外科的ステープルが挙げられる。
【０１１５】
本発明に従う他の実施形態では、該重合体の生体内分解速度は、ＲＮＡｉ構築物の放出速度と同一のオーダーであることが好都合である。例えば、該系が整形外科用ネジ、ステント、ペースメーカー又は非生体内分解性縫合糸のような手術器具に被覆される重合体中に懸濁又は分散されたＲＮＡｉ構築物を含む場合には、該重合体は、周辺の生体組織に直接さらされるＲＮＡｉ構築物の表面積が経時的に実質上一定のままであるような速度で生体内分解するのが好都合である。
【０１１６】
本発明に従う他の実施形態では、該重合体媒体は、周辺組織、例えば血漿中の水に対して透過性である。このような場合には、水溶液は、該重合体を透過することができ、それによって該ＲＮＡｉ構築物を接触させることができる。その溶解速度は、重合体の透過性、ＲＮＡｉ構築物の溶解性、生理液のｐＨ、イオン強度及び蛋白質組成物などのような一連の複合的な変動要素によって支配され得る。
【０１１７】
本発明に従ういくつかの実施形態では、重合体は非生体内分解性である。非生体内分解性重合体は、該系が、体内に永久的に又は半永久的に挿入又は移植されることに適した手術器具上に被覆することや、該器具の構成部分をなすことを目的とした重合体を含む場合に特に有用である。該重合体が手術器具上に永久的な皮膜を形成することが好都合である代表的な装置としては、整形外科用ネジ、ステント、人工関節、人工弁、永久縫合糸、ペースメーカーなどが挙げられる。
【０１１８】
経皮経管冠動脈形成術に従って使用できる非常に多数の様々なステントがある。あらゆるステントを本発明に従って使用することができるが、便宜上、本発明の代表的な実施形態では限られたステントしか説明しない。当業者であれば、あらゆるステントを本発明に関連して使用できることを認識するであろう。さらに、上述のように、他の医療装置を使用することができる。
【０１１９】
ステントは、一般的に、閉塞を開放するために管腔内に放置される管状構造体として使用される。一般に、ステントは、膨張していない形態で内腔に挿入され、その後、その場で自発的に又は第２の装置を用いて膨張する。典型的な膨張方法は、血管壁の成分と会合した妨害物をはぎ取り且つ破壊し、そして拡大した管腔を得るために狭窄血管又は体内通路内で膨張する、カテーテルに装着された血管形成術用バルーンを使用して行う。
【０１２０】
本発明のステントは、あらゆる方法を使用して製造できる。例えば、ステントは、レーザー、放電研削、化学エッチングその他の手段を使用して加工できるステンレス製の中空管又は成形管から製造できる。該ステントは、膨張していない形態で体内に挿入され、そして所定の部位に置かれる。代表的な一実施形態では、膨張は、バルーンカテーテルによって血管内で達成でき、この場合、該ステントの最終直径は、使用されるバルーンカテーテルの直径の関数である。
【０１２１】
本発明に従うステントは、例えば、好適なニッケル・チタン合金又はステンレス鋼を含めて、形状記憶材料で具現化できることを理解すべきである。
【０１２２】
ステンレス鋼から成形された構造体は、該ステンレス鋼を予め決められた方法で構成することによって、例えば、このものを編み上げられた形状に編むことによって自己膨張することができる。この実施形態では、該ステントが形成された後に、このものは、挿入手段によって血管又は他の組織に挿入することを可能にするため、十分に小さい空間を専有するように圧縮できるが、ここで、該挿入手段としては、好適なカテーテル又は可撓性の棒が挙げられる。
【０１２３】
該カテーテルから出てくるときに、該ステントは、所望の形状に膨張するように配置できるが、ここで、この膨張は自動的であり、又は圧力、温度若しくは電気的刺激の変化によって誘発される。
【０１２４】
ステントのデザインに関わらず、ＲＮＡｉ構築物及び蛋白質（適切な場合）を、障害領域に有効な投与量を与えるのに十分な特異性及び十分な濃度で適用することが好ましい。この点に関して、被膜における「貯留層サイズ」は、好ましくは、該ＲＮＡｉ構築物を所望の位置に及び所望の量で適切に適用するように変更される。
【０１２５】
別の代表的な実施形態では、該ステントの内面及び外面の全てを、治療用量のＲＮＡｉ構築物及び随意に蛋白質で被覆することができる。しかしながら、この被覆技術は、ＲＮＡｉ構築物及び含まれる任意の蛋白質に応じて変更できることに注意することが重要である。また、該被覆技術は、ステント又は他の腔内医療装置を含む材料に応じて変更できる。
【０１２６】
該腔内医療装置は、持続放出性薬物送達被膜を有する。該ＲＮＡｉ構築物被膜は、含浸被覆、吹き付け被覆及び浸漬被覆のような従来技術の被覆方法によってステントに適用できる。
【０１２７】
一実施形態では、腔内医療装置は、内腔の内部表面と、ステントの縦軸に沿って延在する反対側の外部表面とを有する細長い易膨張性管状ステントを備える。ステントとしては、移植可能永久ステント、移植可能グラフトステント又は一時的ステントを挙げることができ、ここで、該一時的ステントは、脈管内で膨張でき、そしてその後該脈管から撤収できるステントと定義される。このステント構造体は、コイルステント、記憶コイルステント、ニチノールステント、メッシュステント、骨格ステント、スリーブステント、透過性ステント、温度センサーを有するステント、多孔質ステントなどを含むことができる。該ステントは、慣用法に従って、例えば、インフレータブルバルーンカテーテル、自己配置機構（カテーテルから離れた後）、又は他の好適な手段によって配置できる。細長い易膨張性管状ステントはグラフトステントであることができ、ここで、このグラフトステントとは、所定の移植片の内部又は外部にステントを有する複合装置である。該移植片は、ｅＰＴＦＥ移植片、生物学的移植片又は編物移植片のような代用血管であることができる。
【０１２８】
ＲＮＡｉ構築物及び関連する任意の蛋白質は、該ステントに多数の方法で取り入れることができ、又は固定することができる。代表的な実施形態では、該ＲＮＡｉ構築物は、重合体マトリックスに直接取り入れられ、該ステントの外部表面にスプレーされる。該ＲＮＡｉ構築物は、該重合体マトリックスから経時的に溶出し、そして周辺組織に入る。該ＲＮＡｉ構築物は、好ましくは、少なくとも３日からおよそ６月、より好ましくは７〜３０日間にわたって該ステント上にとどまる。
【０１２９】
所定の実施形態では、本発明に従う重合体は、該ＲＮＡｉ構築物に対して透過性ではあるものの、該重合体からの該ＲＮＡｉ構築物の放出速度における主な速度決定要因ではないような透過性を有する、生物学的に耐性の任意の重合体を含む。
【０１３０】
本発明に従ういくつかの実施形態では、重合体は非生体内分解性である。本発明に有用な非生体内分解性重合体の例としては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）（ＥＶＡ）、ポリビニルアルコール及びポリウレタン、例えば、ポリカーボネート系ポリウレタンが挙げられる。本発明の他の実施形態では、該重合体は、生体内分解性である。本発明に有用な生体内分解性重合体の例としては、ポリ無水物、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリアルキルシアノアクリレート又はそれらの誘導体及び共重合体が挙げられる。当業者であれば、重合体の生体内分解性か非生体内分解性かの選択は、以下に詳しく説明するように、該系の最終的な物理的形状に依存することが分かるであろう。他の代表的な重合体としては、ポリシリコーン及びヒアルロン酸から誘導される重合体が挙げられる。当業者であれば、本発明に従う重合体は、該重合体からのＲＮＡｉ構築物の放出における主な速度決定要因ではないような透過性を付与するのに好適な条件下で調製されることを理解するであろう。
【０１３１】
さらに、好適な重合体としては、体液及びほ乳類組織と生物学的に適合し、且つ、該重合体と接触することになる体液には基本的に不溶である天然型材料（コラーゲン、ヒアルロン酸など）又は合成材料が挙げられる。さらに、該好適な重合体は、基本的に、該重合体に中に分散／懸濁されたＲＮＡｉ構築物と体液中の蛋白質成分との相互作用を妨害する。素早く溶解する重合体又は体液によく溶解する重合体若しくはＲＮＡｉ構築物と内在性蛋白質成分との相互作用を可能する重合体は、該重合体の溶解又は蛋白質成分との相互作用が薬物放出の定常性に影響を及ぼす可能性があるため、所定の場合には使用を避けるべきである。重合体の選択は、ＲＮＡｉ構築物が該被膜において蛋白質と予備会合する場合には、異なってもよい。
【０１３２】
他の好適な重合体としては、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレンビニルアセテート（ＰＶＡ又はＥＶＡ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレンオキシド、ポリカルボン酸、ポリアルキルアクリレート、セルロースエーテル、シリコーン、ポリ（ｄｌ−ラクチド−コグリコリド）、様々なＥｕｄｒａｇｒｉｔ（例えば、ＮＥ３０Ｄ、ＲＳ  ＰＯ及びＲＬ  ＰＯ）、ポリアルキル−アルキルアクリレート共重合体、ポリエステル−ポリウレタンブロック共重合体、ポリエーテル−ポリウレタンブロック共重合体、ポリジオキサン、ポリ−（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸及びＰＥＯ−ＰＬＡ共重合体が挙げられる。
【０１３３】
本発明の被覆剤は、１種以上の好適な単量体と好適なＲＮＡｉ構築物とを混合させ、次いで、該単量体を重合させて該重合体系を形成させることによって形成できる。この方法では、該ＲＮＡｉ構築物及び会合する任意の蛋白質を該重合体に溶解又は分散させる。他の実施形態では、ＲＮＡｉ構築物及び会合する任意の蛋白質を液状重合体又は重合体分散液に混合し、次いで、該重合体をさらに処理加工して本発明の被覆剤を形成させる。好適なさらなる処理加工としては、好適な架橋性ＲＮＡｉ構築物による架橋、該液状重合体又は重合体分散液のさらなる重合、好適な単量体との共重合、好適な重合体ブロックとのブロック共重合などを挙げることができる。このさらなる処理は、ＲＮＡｉ構築物が重合体媒体中に懸濁又は分散させるように該ＲＮＡｉ構築物を該重合体中に閉じ込める。
【０１３４】
あらゆる非分解性重合体をＲＮＡｉ構築物と共に使用することができる。本願における被覆剤のために使用できる皮膜形成重合体は、吸収性であっても非吸収性であってもよいが、血管壁への刺激を最小化させるように生体適合性でなければならない。この重合体は、所望の放出速度又は所望の重合体安定度に応じて、生体安定性であるか又は生体吸収性であるかのいずれかであることができるが、ただし、生体吸収性重合体が好ましいかもしれない。というのは、生体安定性重合体とは異なり、該生体吸収性重合体は、移植後に、何らかの有害な慢性的局所応答を生じさせるほどに長くは存在しないからである。さらに、生体吸収性重合体は、ステントが組織内に封入された後であっても皮膜を取り除きかねず且つさらに問題を生じかねない、生物環境のストレスが原因のステントと被覆剤との付着性の喪失が長期間にわたって生じ得るというリスクを与えない。
【０１３５】
使用できる好適な皮膜形成生体吸収性重合体としては、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ（イミノカーボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミド基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、生体分子及びそれらのブレンドよりなる群から選択される重合体が挙げられる。本発明の目的上、脂肪族ポリエステルとしては、 ラクチド（乳酸ｄ−、ｌ−及びメソラクチド）、ε−カプロラクトン、グリコリド（グリコール酸を含む）、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、ｐ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート（及びそのアルキル誘導体）、１，４−ジオキセパン−２−オン、１，５−ジオキセパン−２−オン、６，６−ジメチル−１，４−ジオキサン−２−オンの単独重合体及び共重合体並びにそれらの重合体ブレンドが挙げられる。本発明の目的上、ポリ（イミノカーボネート）としては、Ｋｅｍｎｉｔｚｅｒ及びＫｏｈｎによる「生体内分解性重合体ハンドブック」，Ｄｏｍｂ，Ｋｏｓｔ及びＷｉｓｅｍｅｎ著，Ｈａｒｄｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．２５１−２７２に記載されたようなものが挙げられる。本発明の目的上、コポリ（エーテル−エステル）としては、Ｃｏｌｉｎ及びＹｏｕｎｅｓによるＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２２巻，ｐ．９９３−１００９，１９８８及びＣｏｈｎ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ（高分子化学のＡＣＳ部門）第３０巻（１）、ｐ．４９８，１９８９（例えばＰＥＯ／ＰＬＡ）に記載されたコポリエステル−エーテルが挙げられる。本発明の目的上、ポリアルキレンオキサレートとしては、米国特許第４２０８５１１号；４１４１０８７号；４１３０６３９号；４１４０６７８号；４１０５０３４号；及び４２０５３９９号（参照により援用）に記載されたものが挙げられる。ポリホスファゼン、共、三元及びそれよりも高次の混合単量体をベースとする重合体は、Ｌ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチド、乳酸、グリコリド、グリコール酸、ｐ−ジオキサノン、トリメチレンカーボネート及びε−カプロラクトンから作られ、例えば、Ａｌｌｃｏｃｋによる「Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」，第１３巻，ｐ．３１−４１，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，ジョンウィリーアンドソンズ，１９８８及びＶａｎｄｏｒｐｅ，Ｓｃｈａｃｈｔ，Ｄｅｊａｒｄｉｎ及びＬｅｍｍｏｕｃｈｉによる「生体内分解性重合体ハンドブック」，Ｄｏｍｂ，Ｋｏｓｔ及びＷｉｓｅｍｅｎ著，Ｈａｒｄｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．１６１−１８２（これらは参照により援用するものとする）に記載されている。ＨＯＯＣ−Ｃ6Ｈ4−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｏ−Ｃ6Ｈ4−ＣＯＯＨ（ここで、ｍは２〜８の範囲の整数である）の形態の二酸からのポリ無水物及び１２個までの炭素の脂肪族α−ω二酸とのその共重合体が挙げられる。アミン基及び／又はアミド基を含有するポリオキサエステル、ポリオキサアミド及びポリオキサエステルは、次の米国特許：第５４６４９２９号；５５９５���５１号；５５９７５７９号；５６０７６８７号；５６１８５５２号；５６２０６９８号；５６４５８５０号；５６４８０８８号；５６９８２１３号及び５７００５８３号（これらは、参照により援用するものとする）のうちの一つ以上に記載されている。Ｈｅｌｌｅｒによる「生体内分解性重合体ハンドブック」，Ｄｏｍｂ，Ｋｏｓｔ及びＷｉｓｅｍｅｎ著，Ｈａｒｄｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．９９−１１８（参照により援用）に記載されたものようなポリオルトエステルが挙げられる。本発明の目的上、皮膜形成重合体型生体分子としては、ヒト体内で酵素により分解され得る天然型材料又はヒト体内で加水分解に不安定な天然型材料、例えば、フィブリン、フィブリノゲン、コラーゲン、エラスチン及び生体適合性のある吸収性多糖類、例えば、キトサン、澱粉、脂肪酸（及びそれらのエステル）、グルコグリカン及びヒアルロン酸が挙げられる。
【０１３６】
また、慢性組織応答が比較的低い好適な皮膜形成生体安定性重合体、例えば、ポリウレタン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリエステル、ポリアルキルオキシド（ポリエチレンオキシド）、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドン並びに架橋ポリビニルピロリジノン及びポリエステルから形成されるようなヒドロゲルも使用できる。また、他の重合体も、溶解し、ステント上で硬化し又は重合することができるならば、使用できる。これらのものとしては、ポリオレフィン、ポリイソブチレン及びエチレン−αオレフィン共重合体；アクリル重合体（メタクリレートを含む）及び共重合体、ハロゲン化ビニル重合体及び共重合体、例えばポリ塩化ビニル；ポリビニルエーテル、例えば、ポリビニルメチルエーテル；ポリハロゲン化ビニリデン、例えばポリ弗化ビニリデン及びポリ塩化ビニリデン；ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン；ポリビニル芳香族、例えばポリスチレン；ポリビニルエステル、例えば、ポリ酢酸ビニル；ビニル単量体同士の共重合体及びビニル単量体とオレフィンとの共重合体、例えば、エチレン−メチルメタクリレート共重合体、アクリロニトリル−スチレン共重合体、ＡＢＳ樹脂及びエチレン−酢酸ビニル共重合体；ポリアミド、例えば、ナイロン６６及びポリカプロラクタム；アルキド樹脂；ポリカーボネート；ポリオキシメチレン；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂、ポリウレタン；レーヨン；レーヨン−トリアセテート、セルロース、酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース；セロファン；硝酸セルロース；プロピオン酸セルロース；セルロースエーテル（即ち、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース）；及びそれらの組み合わせが挙げられる。本願の目的上、ポリアミドには、式：−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯ−及びＮＨ−（ＣＨ2）x−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）y−ＣＯ（式中、ｎは、好ましくは、６〜１３の範囲の整数であり；ｘは、６〜１２の範囲の整数であり；及びｙは、４〜１６の範囲の整数である。）のポリアミドが含まれる。上記のリストは例示であり、限定ではない。
【０１３７】
被覆剤のために使用される重合体は、蝋状又は粘着性でない程度に高い分子量を有する皮膜形成重合体であることができる。また、該重合体は、ステントに付着しなければならず、且つ、ステント上に付着した後に、血流の応力によって移動できる程度には容易に変形できないものであるべきである。該重合体の分子量は十分な靭性を与える程度に高いため、該重合体は、ステントの操作又は配置中にはがれ落ちず、また、該ステントの膨張中に破損してはならない。所定の実施形態では、該重合体は、４０℃以上、好ましくは約４５℃以上、より好ましくは５０℃以上、最も好ましくは５５℃以上の溶融温度を有する。
【０１３８】
被覆剤は、治療ＲＮＡｉ構築物の１種以上と被覆剤重合体とを被覆剤混合物中で混合させることによって処方できる。該ＲＮＡｉ構築物は、液体、微粉化された固形物又は他の好適なあらゆる物理的形状として存在することができる。随意に、該混合物は、ＲＮＡｉ構築物と会合する１種以上の蛋白質を含むことができる。随意に、該混合物は、１種以上の添加剤、例えば、希釈剤、キャリア、賦形剤、安定剤などのような非毒性補助剤を含むことができる。他の好適な添加剤は、重合体及びＲＮＡｉ構築物と共に処方できる。例えば、親水性重合体は、生体適合性皮膜形成重合体の上記リストから選択される親水性重合体を生体適合性疎水性被覆剤に添加して放出特性を改変させることができる（又は疎水性重合体を親水性被覆剤に添加して放出特性を改変させることができる）。一例は、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース及びそれらの組み合わせよりなる群から選択される親水性重合体を脂肪族ポリエステル被覆剤に添加してその放出特性を改変させることであろう。好適な相対量は、治療ＲＮＡｉ構築物についての試験管内及び／又は生体内放出特性を監視することによって決定できる。
【０１３９】
被膜の厚さは、ＲＮＡｉ構築物がマトリックスから溶出する速度を決める。基本的に、該ＲＮＡｉ構築物は、重合体マトリックスを介して拡散することによって該マトリックスから溶出する。重合体は透過性であり、それによって固体、液体及び気体がそこから逃げることが可能になる。重合体マトリックスの全厚さは、約１ミクロン〜約２０ミクロンの範囲にあり又はそれを超える。重合体マトリックスを医療装置に取り付ける前に下塗層及び金属表面の処理を使用することができることに注意することが重要である。例えば、酸洗浄、アルカリ（塩基）洗浄、塩類化及びパリレン沈着を、説明した全プロセスの一部分として使用することができる。
【０１４０】
さらに例示すると、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリメタクリル酸ブチル及びＲＮＡｉ構築物溶液を多数の方法でステント上に又はステント中に導入できる。例えば、該溶液をステントに吹き付けることができ、又は該ステントを該溶液に浸漬させることができる。他の方法としては、回転塗布及びＲＦプラズマ重合が挙げられる。代表的な一実施形態では、該溶液をステントに吹き付け、次いで乾燥させる。他の代表的な実施形態では、該溶液をある種の極性に帯電させることができ、そして該ステントをそれと反対の極性に帯電させることができる。この態様では、該溶液及びステントは、互いに引かれ合うであろう。このタイプの吹き付け方法を使用することで、無駄を減らすことができ、皮膜の厚さについてさらに正確な制御が達成できる。
【０１４１】
他の代表的な実施形態では、ＲＮＡｉ構築物は、重合弗化ビニリデン及び重合テトラフルオルエチレンよりなる群から選択される第１部分の所定量及び該第１部分と共重合し、それによってポリフルオロ共重合体を生成する、第１部分以外の第２部分であって、ポリフルオロ共重合体に靭性又は弾性を与えることができるものの所定量を含む皮膜形成ポリフルオロ共重合体に導入でき、ここで、該第１部分と該第２部分との相対量は、移植可能医療装置を処理する際に使用するのに有効な特性を有する被覆剤及びそれから生成される皮膜を与えるために有効なものである。
【０１４２】
本発明に従う一実施形態では、本発明の腔内医療装置の膨張性管状ステントの外面は、本発明に従う被膜を有する。被膜を有するステントの外面は、組織接触表面であり、且つ、生体適合性である。「持続放出ＲＮＡｉ構築物送達系被覆表面」とは、表面が本発明に従う持続放出ＲＮＡｉ構築物送達系で被覆され、覆われ又は含浸された「被覆表面」と同義である。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明の腔内医療装置の細長い易膨張性管状ステントの内腔の内部表面又は表面全体（即ち、内部表面と外部表面の両方）は、被覆表面を有する。また、本発明の持続放出ＲＮＡｉ構築物送達系被膜を有する内腔内部表面は、流体接触表面でもあり、且つ、生体適合性及び血液適合性でもある。
【０１４４】
Ｖ．代表的な用途
一般に、ＲＮＡｉは、ヒトを含めた多くの生物において、基本的にあらゆる遺伝子の発現を操作するための有効な技術として実証されてきた。従って、ここで開示するＲＮＡｉ構築物及び処方物を使用して、基本的にあらゆる遺伝子の発現を減少させることができるが、ここで、このような発現の減少は、危険な状態にある個体における病気（病因及び症状を含む）の改善又は病気の予防のような所望の結果を与えることが予想される。必要なことは、この明細書において提供した指針及び技術常識に従って所望の標的遺伝子を選択し、そして好適なＲＮＡｉ構築物をデザインするだけである。このような構築物は、生存中の被験者に投与する前に、試験管内細胞培養及び組織培養で試験できる。また、構築物は、被験者と近縁関係にある生物でも試験できる（例えば、サルモデルは、ヒトにおいて構築物を使用する前に試験できる）。
【０１４５】
一態様では、主題の方法を使用して、生体内での細胞の望ましくない増殖、特に形質転換細胞の増殖を阻害し又は少なくとも低減させる。所定の実施形態では、主題の方法は、増殖調節蛋白質をコードする遺伝子の発現を選択的に阻害するためにＲＮＡｉを使用する。 例えば、主題の方法を使用して標的細胞における有糸分裂に必須の及び／又は標的細胞のアポトーシスを阻害するのに必須の遺伝子産物の発現を阻害することができる。本発明のＲＮＡｉ構築物は、標的増殖調節蛋白質をコードするｍＲＮＡのコード配列又他の部分に相当するようにデザインできる。該ＲＮＡｉ構築物で処理すると、該標的細胞を生じさせる発現欠失表現型によって、該細胞が静止状態となるか又はアポトーシスを受ける。
【０１４６】
所定の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、細胞増殖及び有糸分裂を刺激する遺伝子産物の発現を阻害するように選択される。本発明の方法の標的となることができる遺伝子の一部類は、癌遺伝子として知られているものである。ここで使用するときに、用語「癌遺伝子」とは、細胞増殖を刺激する遺伝子をいい、該細胞におけるその発現レベルが減少すると、細胞増殖速度が減少するか、又は該細胞が静止状態になる。本発明において、癌遺伝子は、細胞内蛋白質並びに自己分泌又パラ分泌機能によって細胞増殖を刺激することができる細胞外増殖因子を含む。ＲＮＡｉ構築物がデザインできるヒト癌遺伝子としていくつか挙げると、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｍｄｍ２、ＰＫＡ−Ｉ（Ｉ型蛋白質キナーゼＡ）、Ａｂｌ−１、Ｂｃｌ２、Ｒａｓ、ｃ−Ｒａｆキナーゼ、ＣＤＣ２５ホスファターゼ、サイクリン、サイクリン依存キナーゼ（ｃｄｋ）、テロメラーゼ、ＰＤＧＦ／ｓｉｓ、ｅｒｂ−Ｂ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｍｏｓ及びｓｒｃである。本発明において、癌遺伝子としては、染色体転座によって生じる融合遺伝子、例えば、Ｂｃｒ／Ａｂｌ融合癌遺伝子も挙げられる。
【０１４７】
好ましい実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、形質転換細胞、特に腫瘍細胞の増殖に必須の遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現を阻害することができる能力によって選択される。このようなＲＮＡｉ構築物は、生体内での腫瘍性、未分化性及び／又は過形成性細胞増殖の治療又は予防の一部分（腫瘍の治療の一部分を含む）として使用できる。ｃ−ｍｙｃ蛋白質は、多くの癌形態で調節解除され、発現の増加が生じる。試験管内でのｃ−ｍｙｃＲＮＡレベルの減少によってアポトーシスが誘導される。従って、ｃ−ｍｙｃに相補的なｓｉＲＮＡは、抗癌治療用の治療剤として使用できる可能性が高い。好ましくは、主題のＲＮＡｉ構築物は、慢性リンパ性白血病の治療的処理に使用できる。慢性リンパ性白血病は、多くの場合、Ｂｃｒ／Ａｂｌ融合産物を生じさせる第９及び第１２染色体の転座に起因する。得られた融合蛋白質は、癌遺伝子として作用する；従って、Ｂｃｒ／Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの特異的な除去によって、白血病細胞の細胞死が生じ得る。実際に、Ｂｃｒ／Ａｂｌ融合ｍＲＮＡに対して特異的なｓｉＲＮＡ分子を培養白血病細胞にトランスフェクションすると、融合ｍＲＮＡ及び対応する腫瘍性蛋白質が減少しただけでなく、これらの細胞のアポトーシスが誘導された（例えば、Ｗｉｌｄａ外，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２，２１：５７１６−５７２４参照）。
【０１４８】
他の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、リンパ球の活性化、例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞の増殖、特にリンパ球の抗原仲介活性化に必須の遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現を阻害することができる能力によって選択される。このようなＲＮＡｉ構築物は、免疫抑制剤として、例えば、免疫仲介炎症性疾患のための治療又は予防の一部分として使用できる。
【０１４９】
所定の実施形態では、ここで説明する方法は、自己免疫疾患の治療のために使用できる。例えば、主題のＲＮＡｉ構築物は、サイトカインをコードし又はその発現を調節する遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現を阻害することができる能力のために選択できる。従って、ＴＨＦα、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−６若しくはＩＬ−１２又はそれらの組み合わせのようなサイトカインの発現の阻害又は減少を生じさせる構築物をリウマチ性関節炎の治療又は予防の一部分として使用することができる。同様に、炎症に関与するサイトカインの発現の阻害又は減少を生じさせる構築物を炎症及び炎症関連疾患、例えば多発性硬化症の治療又は予防に使用することができる。
【０１５０】
他の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、糖尿病の発症又は進行に関与する遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現を阻害することができる能力のために選択される。例えば、実験的真性糖尿病は、ｐ２１ＷＡＦｌ／ＣＩＰｌ（ｐ２１）の発現増加に関連し、そしてＴＧＦβ１が糸球体肥大に関与していたことが発見された（例えば、ＡＬ−Ｄｏｕａｈｊｉ外，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５６：１６９１−１６９９参照）。従って、これらの蛋白質の発現の阻害又は減少を生じさせる構築物を糖尿病の治療又は予防に使用することができる。
【０１５１】
他の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、ＩＣＡＭ−１（細胞内接着分子）の発現を阻害することができる能力のために選択される。ＩＣＡＭ−１の発現を阻害するアンチセンス核酸が、乾癬のためのＩｓｉｓ薬剤学によって開発されつつある。さらに、急性腎不全及び再潅流障害を予防し且つ同系腎臓移植生存時間を延ばすために、ＩＣＡＭ−１遺伝子に対するアンチセンス核酸が提案されている（例えば、Ｈａｌｌｅｒ外，（１９９６）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０：４７３−８０；Ｄｒａｇｕｎ外，（１９９８）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．５４：５９０−６０２；Ｄｒａｇｕｎ外，（１９９８）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５４：２１１３−２２参照）。従って、本発明は、上記疾患にＲＮＡｉ構築物を使用することを意図する。
【０１５２】
他の実施形態では、主題のＲＮＡｉ構築物は、血管内皮の平滑筋細胞又他の細胞の増殖に必須の遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現を阻害することができる能力によって、例えば、新生内膜形成に関与する細胞の増殖によって選択される。このような実施形態では、主題の方法は、再狭窄の治療又は予防の一部分として使用できる。
【０１５３】
単に例示すると、血管形成術後の血管内皮細胞に適用されるＲＮＡｉ構築物は、該処置後のこれらの細胞の増殖を低減させることができる。単に例示すると、具体例は、ｃ−ｍｙｃ（癌遺伝子）に相補的なｓｉＲＮＡである。ｃ−ｍｙｃの下方制御によって細胞増殖が阻害される。従って、ｓｉＲＮＡは、次のオリゴヌクレオチド：
５’−ＵＣＣＣＧＣＧＡＣＧＡＵＧＣＣＣＣＵＣＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
３’−ＴＴＡＧＧＧＣＧＣＵＧＣＵＡＣＧＧＧＧＡＧＵ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
を合成することによって調製できる。
【０１５４】
全ての塩基は、デオキシリボース核酸（安定性を高めるため）である下線で示したチミジンを除き、リボ核酸である。二重鎖ＲＮＡは、該オリゴヌクレオチドを１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．０）及び２０ｍＭのＮａＣｌ中において等モル濃度で混合し、９５℃に加熱し、次いで３７℃にまで徐冷することによって調製できる。次いで、得られたｓｉＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてシクロデキストリン系重合体のような送達系なしで又はこれに複合させて細胞に供給することができる。試験管内実験については、このｓｉＲＮＡの効果は、ｃ−ｍｙｃ蛋白質についての成長曲線分析、ＲＴ−ＰＣＲ又はウエスタンブロット分析によって監視できる。
【０１５５】
ｃ−ｍｙｃ遺伝子に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、局所送達によって与えられると、冠血管ステントの移植後直ちに再狭窄を阻害することが実証されている（例えば、Ｋｕｔｒｙｋ外，（２００２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３９：２８１−２８７；Ｋｉｐｓｈｉｄｚｅ外，（２００２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３９：１６８６−１６９１）。従って、本発明は、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子に対するＲＮＡｉ構築物（即ち、ｃ−ＭｙｃＲＮＡｉ構築物）をステント移植部位にインフィルトレーター送達系（米国カリフォルニア州サンディエゴインターベンショナル・テクノロジーズ社）で送達することを意図する。
【０１５６】
好ましくは、該ｃ−ＭｙｃＲＮＡｉ構築物は、再狭窄を阻害するためにステントに直接被覆される。同様に、該ｃ−ＭｙｃＲＮＡｉ構築物は、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の筋内膜過形成を阻害するために局所的に送達でき、そしてこのような局所送達の代表的な方法は、例えば、Ｋｉｐｓｈｉｄｚｅ外，（２００１）Ｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｉｎｔｅｒｖ．５４：２４７−５６に見出すことができる。好ましくは、該ＲＮＡｉ構築物は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホラミデートで化学的に修飾されている。
【０１５７】
初期成長応答因子−１（即ち、Ｅｇｒ−１）は、機械的損傷の間に活性化される転写因子であり、細胞増殖及び遊走に関わる多くの遺伝子の転写を調節する。従って、この蛋白質の下方制御も再狭窄阻害の一アプローチであり得る。Ｅｇｒ−１遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、次のオリゴヌクレオチド：
５’−ＵＣＧＵＣＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＣＧＧＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
３’−ＴＴＡＧＣＡＧＧＵＣＣＵＡＣＣＧＧＣＧＣＣ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
の合成によって調製できる。
【０１５８】
また、全ての塩基はリボ核酸であるが、ただし、デオキシリボース核酸である下線で示したチミジンを除くものとする。このｓｉＲＮＡは、これらのオリゴヌクレオチドから調製でき、そして、ここで説明するように細胞に導入される。
【実施例】
【０１５９】
実施例
本発明を概ね説明してきたが、本発明は、本発明の所定の態様及び実施形態の単なる例示の目的で記載される次の例を参照すれば、容易に理解されるであろう。これらの例は本発明を限定することを意図するものではない。
【０１６０】
例１．修飾ＤＮＡ：ＲＮＡ構築物の血清安定性の増強
材料：
予備形成二本鎖（全てＤｈａｒｍａｃｏｎ社製）：
ｓｉＦＡＳ［ＭＷ１３３１７．２ｇ／ｍｏｌ］
５’ＧＵＧＣＡＡＧＵＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＣＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
３’ＴＴＣＡＣＧＵＵＣＡＣＧＵＵＵＧＧＵＧＵＧ５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ｓｉＦＡＳ２［ＭＷ１３４７５．１ｇ／ｍｏｌ］
５’ＰＧＵＧＣＡＡＧＵＧＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
３’ＴＴＣＡＣＧＵＵＣＡＣＧＵＵＵＧＧＵＣＵＧＰ ５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
（ここで、Ｐ＝燐酸基である）
ｓｉＥＧＦＰｂ［ＭＷ１３３２３．１ｇ／ｍｏｌ］
５’ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
３’ＣＧＣＵＧＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＵＧＵＵＣＡ５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
ＦＬ−ｐＧＬ２［ＭＷ１３８３８．５５ｇ／ｍｏｌ］
５’ＸＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
３’ＴＴＧＣＡＵＧＣＧＣＣＵＵＡＵＧＡＡＧＣＵ５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
（ここで、Ｘ＝フルオレセインである）
一本鎖
ＥＧＦＰｂ−ｓｓ−センス（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）［ＭＷ６７１９．２ｇ／ｍｏｌ］
ＲＮＡ，ホスホジエステル
５’ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
ＥＧＦＰｂ−ss−アンチセンス（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）
ＲＮＡ，ホスホジエステル
５’ＡＣＵＵＧＵＧＧＣＣＧＵＵＵＡＣＧＵＣＧＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）
ＪＨ−１（Ｃａｌｔｅｃｈ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）
ＤＮＡ、ホスホロチオエート
５’ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＸ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）
（ここで、Ｘ＝ＴＡＭＲＡである）
ｊｈＤＮＡｓ−１（Ｃａｌｔｅｃｈ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）
ＤＮＡ、ホスホジエステル
５’ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）
ｊｈＤＮＡｓ−２（Ｃａｌｔｅｃｈ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）
ＤＮＡ、ホスホジエステル 
５’ＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＸ ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
（ここで、Ｘ＝ＴＡＭＲＡである）。
【０１６１】
二本鎖形成（アニーリング）：
二本鎖を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社が推奨するプロトコールに従って形成させた。要するに、１容量の該センス鎖（５０μＭ）と、１容量の該アンチセンス鎖（５０μＭ）及び１／２容量の５×反応緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ，３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．５，１．０ｍＭのＭｇＣｌ2）とを混合した。該反応混合物を１分間９０℃に加熱して鎖を変性させ、３７℃で１時間インキュベートしてアニーリングさせ、次いで−２０℃で保存した。アニーリングした二本鎖をゲル電気泳動で確認した（１５％ＴＢＥゲル）。
【０１６２】
試験管内マウス血清安定性の結果：
マウス血清（加熱不活性化されていない）に暴露したときの二本鎖の安定性をゲル電気泳動で試験した。１０μＬの５μＭ二本鎖を等量のＤＮアーゼ・ＲＮアーゼフリーの水又は活性マウス血清（シグマ）に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。このインキュベーション後に、該容量の１／２（１０μＬ）を等量の５ｍｇ／ｍＬヘパラン硫酸（シグマ，Ｈ2Ｏ溶液）に添加し、室温で５分間インキュベートした。４μＬの添加液をそれぞれの２０μＬ溶液に添加し、そして、得られた２４μＬ溶液を１０ウェル１５％ＴＢＥゲルのウェルに添加し、そして１００Ｖで７５分間電気泳動した。電気泳動後に、ゲルを５０ｍＬの０．５μg／ｍＬ臭化エチジウム（１×ＴＢＥ緩衝液中）中で３０分間室温でインキュベートし、次いで写真撮影した。
【０１６３】
これらの結果は、ｓｉＦＡＳ２が９０％マウス血清中で４時間の接触によってほぼ完全に分解したことを示したのに対し、ハイブリッドのＪＨ−１：ＥＦＧＰｂ−ｓｓ−アンチセンスが本質的に全く分解しなかったことを示すことを表している。図１及び図２を参照されたい。
【０１６４】
例２．ＤＮＡ：ＲＮＡ構築物の生体内取り込みの改善
以下に示す通り、４匹のマウスのぞれぞれに２．５ｍｇ／Ｋｇの二本鎖をＨＰＴＶを介して注射した：
ＩＤ 二本鎖
Ｆ１       ｓｉＦＡＳ２（非標識）、裸
Ｇ１       ＦＬ−ｐＧＬ２（５’フルオレセイン）、裸
Ｍ１       ＪＨ−１ ：ＥＧＦＰｂ抗（３’ＴＡＭＲＡ）、 裸
Ｎ１       ＪＨ−１ ：ＥＧＦＰｂ抗（３’ＴＡＭＲＡ）、ＣＤＰ−Ｉｍｉｄ、２０：８０ＡｄＰＥＧＬａｃ：ＡｄＰＥＧ。
注射後２４時間でマウスを屠殺し、そして肝臓を採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．凍結保存化合物中に浸漬させ、次いで−８０℃で保存した。Ｍｏｒｇａｎ氏（Ｔｒｉｃｈｅラボ）に薄切片（固定液又は対比染色は加えていない）を調製していただき、これらを直ちに共焦点顕微鏡法で試験した。
【０１６５】
注射後２４時間では、Ｆ１及びＧ１のいずれの注射に由来する肝臓中での蛍光は存在しないが、Ｍｌの注射により肝臓内でかなりの蛍光が観察される。図３Ａ−３Ｄを参照されたい。
【０１６６】
例３．アシアロフェチュインキャリア蛋白質への結合によるホスホロチオエート修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖の生体内送達
ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ二本鎖（ＲＮＡ：ＲＮＡ）を、ホスホロチオエート修飾骨格を有するセンス鎖と非修飾アンチセンス鎖（＊を付けた鎖はホスホロチオエート修飾センス鎖を表す）とをアニーリングさせることによって作製した。
*５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’*（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
３’−ｄＴｄＴＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）。
【０１６７】
選択した配列は、ルシフェラーゼ遺伝子を特異的に標的とするようにＤｈａｒｍａｃｏｎによってデザインされたｓｉＧＬ３二本鎖と同一である。
【０１６８】
修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖及びアシアロフェチュイン（ＡＦ）蛋白質の等モル量を水中で混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＡＦのみを含有する対照の混合物を水中で作製した。インキュベーション後に、１０％グルコース水溶液をそれぞれの混合物に１：１ｖ／ｖ比で添加し、注射に好適な５％グルコース溶液を生じさせた。ｓｉＲＮＡの最終投与量は、２．５ｍｇ／Ｋｇ体重であった。この溶液を低圧尾静脈注射（体重２０ｇ当たり０．１５ｍＬ）によって、肝臓がルシフェラーゼを構成的且つ安定に発現するトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに供給した。この方法の概要については図４を参照されたい。
【０１６９】
ルシフェラーゼシグナルを連続３日間にわたって生体内ＩＶＩＳ１００バイオルミネセンス／光学画像システムを使用して監視した。ＰＢＳに溶解させたＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を腹腔内に１５０ｍｇ／Ｋｇの投与量で注射し、１０分後に発光を測定した。全身麻酔を５％イソフルランで誘導し、そしてこれを該手順中２．５％イソフルランをノーズコーンによって導入しながら続行した。シグナル強度を、それぞれのマウスからの光子束を積分するためにＩＶＩＳリビングイメージソフトウェアを使用して定量した。
【０１７０】
このデータは、該ｓｉＲＮＡ構築物が生体内で標的細胞に効率的に送達されたことを示している。図５Ａ〜Ｂを参照されたい。
【０１７１】
例４．アプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体の安定性及び構造モデリング
近年、Ｆａｒｏｋｈｚａｄ外（Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．外，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４，７６６８−７６７２（２００４））は、Ｌｕｐｏｉｄ他（Ｌｕｐｏｉｄ，Ｓ．Ｅ．，Ｈｉｃｋｅ，ＢＪ．，Ｌｉｎ，Ｙ．及びＣｏｆｆｅｙ，Ｄ．Ｓ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒｓｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，４０２９−４０３３（２００２））により開発されたＲＮＡアプタマー（ｘＰＳＭ−Ａ１０−３）によって、前立腺癌細胞に対して標的指向化された制御放出重合体ナノ粒子の使用を実証した。このアプタマーは、前立腺房上皮細胞で過剰発現する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を標的とする。Ｌｕｐｏｉｄ外によって開示されたアプタマー系を使用してこの方法を実証する。
【０１７２】
本発明の一実施形態は、アプタマーとＲＮＡｉ構築物のような治療分子との直接抱合であるため、別個の送達媒体を必要とすることなく、このようなアプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体の安定性と構造の研究に着手した。これらの実験は、ハイブリッドのアプタマー・ｓｉＲＮＡ分子がそのアプタマー及びｓｉＲＮＡ成分の活性を保持することが可能であることを示している。ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞上のＰＳＭＡを標的とするようにｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマーを選択し（その機能が試験管内で実証されているため）、そして、具体的には、２'−Ｆ修飾ピロリジンで作製して安定性を増強させた。これは、この分子が全身的に投与されるべき場合には、生体内系に移動させるときに有用である。
【０１７３】
次のものは、ｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマーの配列である：
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＡＵＧＵＵＵＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＵＵＧＵＣＡＡＵＣＣＵＣＡＵＣＧＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）。
【０１７４】
Ｍ．Ｚｕｋｅｒによって開発された核酸の折りたたみ及びハイブリダイゼーション予測用のＭｆｏｌｄウェブサーバ（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１，３４０６−３４１５（２００３））は、図６に示したようなこのアプタマーの二次構造を与えた。
【０１７５】
本発明のこの実施形態では、該アプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子からのｍＲＮＡを標的とし且つこれを分解するためにＤｈａｒｍａｃｏｎが開発したｓｉＧＬ３分子からのセンス鎖も含有する。次の配列をｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマーの３’末端に付加した：
５’−ＡＡＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）。
【０１７６】
ｘＰＳＭ−Ａ１０−３配列とｓｉＧＬ３配列との組み合わせにより、このアプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体（ｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ｓｉＧＬ３）のセンス鎖について次の配列が生じた：
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＡＵＧＵＵＵＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＵＵＧＵＣＡＡＵＣＣＵＣＡＵＣＧＧＣＡＡＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）。
【０１７７】
該アプタマー配列は５’末端にあり、ｓｉＧＬ３センス鎖は３’末端に位置している。Ｍｆｏｌｄウェブサーバで、熱力学的に最も有利な、このハイブリッド分子の２つの二次構造を計算した。これらを図７Ａ−Ｂに示している。
【０１７８】
これらの計算は、元のｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマーと同一の基本二次構造がアプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体にも採用されることを示している。ｘＰＳＭ−Ａ１０−３一本鎖分子は、ｓｉＧＬ３二本鎖のアンチセンス鎖（５’−ＡＡＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＵＵ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）にアニーリングさせる必要がある。これは、先に与えたｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ｓｉＧＬ３配列上のヌクレオチド６０−７７からの二本鎖領域に至るであろう。これらの２つの鎖と得られた二次構造との相互作用は、ＰａｉｒＦｏｌｄ（Ａｎｄｒｏｎｅｓｃｕ，Ｍ．，Ａｇｕｉｒｒｅ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｎ，Ａ．及びＨｏｏｓ，Ｈ．Ｈ．ＲＮＡｓｏｆｔ：ａ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｔｏｏｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１，３４１６−３４２２（２００３））を使用してモデル化した。次のものは、ドット−括弧表示法であって、括弧の適合ペアが塩基対を表し、ドットが不対の塩基を示すものを使用して与えられる結果である：
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＵＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＡＵＧＵＵＵＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＵＵＧＵＣＡＡＵＣＣＵＣＡＵＣＧＧＣ  ＡＡＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＵＵ  ＡＡＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧＵＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）
(((((((((..((((.....))..))...)))).))))).................((((((((((((((((((((((()))))))))))))))))))))))。
【０１７９】
この予測構造とｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ｓｉＧＬ３ 抱合体単独について図５Ａ〜Ｂに示したものとの比較から、３’末端でのｓｉＧＬ３二本鎖形成は、５’末端でのアプタマーの二次構造にいかなる影響も及ぼさないことが分かる。
【０１８０】
ｓｉＧＬ３二本鎖は、該アプタマー配列の３’末端に結合したときに機能する可能性が高いであろう。いくつかの証拠によって、アプタマーとｓｉＧＬ３二本鎖の両方が機能的なままであろうという考えが裏付けられる。第一に、上記図から分かるように、該アプタマーの予測二次構造は、その３’末端にｓｉＧＬ３センス配列が結合しているか否かに関わらず、非常に類似したままである。第二に、アプタマーは、ナノ粒子の表面上のＰＥＧ鎖に結合したときでさえもそれらの機能を保持することが既に示されている（Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．外，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４，７６６８−７６７２（２００４））。第三に、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖上の５’修飾は、二本鎖の遺伝子サイレンシング効率にいかなる影響も及ぼさないように思われる（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８，５７０−５７９（２００４））。該アプタマー配列はｓｉＧＬ３二本鎖の５’修飾とみなすことができ、また、ｓｉＧＬ３アンチセンス鎖は依然として変化していない。
【０１８１】
これらのデータは、５’末端にあるアプタマー配列の標的となり且つ３’末端にｓｉＲＮＡ二本鎖を有するＲＮＡ分子をデザインすることが可能であることを実証するものである。このような分子は、生体内送達のために血清中で安定であるように化学的に修飾できる。その小さなサイズ（〜３０ｋＤａ）によって、良好な組織浸透、血液からの迅速な排除及び尿排泄が可能になるであろう（Ｈｉｃｋｅ，ＢＪ．及びＳｔｅｐｈｅｎｓ，Ａ．Ｗ．Ｅｓｃｏｒｔ  ａｐｔａｍｅｒｓ：a  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １０６，９２３−９２８（２０００））。生体系への移動は、ルシフェラーゼを構成的に発現する２つの株細胞：ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ−ＬＵＣ細胞及びＰＳＭＡ陰性ＰＣ３−ＬＵＣ細胞間での取り込み及びルシフェラーゼの下方制御を比較することによって実行される初期の試験管内研究の後に達成できる。ルシフェラーゼの下方制御は、ｓｉＧＬ３二本鎖が細胞の細胞質に到達することができ且つセンス鎖の５’末端にアプタマーが存在するにもかかわらずなお機能できる場合にしか見られない。ＬＮＣａＰ−ＬＵＣ細胞とＰＣ３−ＬＵＣ細胞とにおけるルシフェラーゼノックダウンの比較から、該アプタマーがＰＳＭＡへの結合によってアプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体の取り込みを増加させることができることが明らかになるであろう。これらの実験は、潜在的なあらゆる蛋白質又は小分子標的にｓｉＲＮＡを送達するためにオーダーメードできる自動化システムによってこのような分子を作製することに適応できる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】核酸の量を示すゲルの写真である。
【図２】核酸の量を示すゲルの写真である。
【図３Ａ】核酸構築物の生体内取り込みを実証する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。
【図３Ｂ】核酸構築物の生体内取り込みを実証する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。
【図３Ｃ】核酸構築物の生体内取り込みを実証する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。
【図３Ｄ】核酸構築物の生体内取り込みを実証する共焦点顕微鏡法の結果を示す図である。
【図４】動物モデル実験についての模式図である。
【図５Ａ】マウスにおける修飾ｓｉＲＮＡの送達の結果を示す図である。
【図５Ｂ】マウスにおける修飾ｓｉＲＮＡの送達の結果を示す図である。
【図６】ｘＰＳＭ−Ａ１０−３アプタマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）についての予想二次構造を示す図である。
【図７Ａ】ｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ｓｉＧＬ３アプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）についての最も熱力学的に有利な予想二次構造を示す図である。
【図７Ｂ】ｘＰＳＭ−Ａ１０−３−ｓｉＧＬ３アプタマー・ｓｉＲＮＡ抱合体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）についての最も熱力学的に有利な予想二次構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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