(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体内に取り込まれうる、柔軟な塩基スタッキング単量体、ならびに柔軟な塩基スタッキング単量体を含む三重鎖形成オリゴヌクレオチドを記載する。本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、二本鎖ターゲット核酸に配列特異的に結合可能であり、そしてしたがって、ターゲット核酸の活性調節およびまたターゲット核酸の検出に関して関心が持たれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般構造
Ｘ−Ｌ−Ｉ１−Ｃ−Ｉ２
式中、Ｘは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、あるいはＰＮＡ、またはＰＮＡ類似体の主鎖内に取り込まれうる主鎖単量体単位であり、Ｌはリンカーであり、Ｉ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能な、本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第一のインターカレーターであり、Ｃは共役剤であり、そしてＩ２は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能な、本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第二のインターカレーターである
を持つ、柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項２】
Ｘが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＡＮ、ＩＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、２’−ＡＥ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、ならびにそれらの組み合わせおよびそれらの修飾のオリゴヌクレオチド内に取り込まれることが可能である、請求項１記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項３】
主鎖単量体単位Ｘが、場合によって、グリコンなどの環系内に部分的に含まれるアルキレンジオールを有する、エチレングリコールまたは１−Ｏ−メチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む、請求項１および２のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項４】
Ｌが０〜６０原子を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項５】
Ｌが、鎖または環あるいはそれらの組み合わせおよび／またはそれらの置換を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項６】
Ｌが、アルキル鎖またはオキサアルキル鎖またはアザアルキル鎖またはチアアルキル鎖またはカルボキサミド基またはチオカルボキサミド基またはスルホンアミド基あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項７】
Ｉ１が、場合によってベンゼン、ナフタレン、アズレン、二環式芳香族複素環系およびそれらの置換の群より選択される、単環式または多環式芳香族環系である、請求項１〜６のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項８】
Ｃが、１〜１２炭素のアルキル、２〜１２炭素のアルケニル、２〜２５炭素のアルキニル、またはジアゾ、あるいは２５炭素または／および窒素原子より長くない長さを持つそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項９】
アルキニルがアセチレンまたは反復アセチレンである、請求項８記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１０】
Ｃが直鎖または分枝鎖または単環式芳香族環およびそれらの置換からなる群より選択される、請求項１および８のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１１】
主鎖単量体単位Ｘの単位の長さが６原子未満である、請求項１〜１０のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１２】
Ｌの長さが少なくとも２原子である、請求項１〜１１のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１３】
Ｉ２が、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系ならびにそれらの複素環式芳香族類似体およびそれらの置換の群より選択される、請求項１〜１２のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応した、請求項１〜１３のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体であって、該単量体が、ホスホロアミダイト、ホスホロジアミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、Ｈ−ホスホネート、ホスファイト、クロロホスファイト、クロロホスホロアミダイト、ホスホンアミダイト、ホスホンクロリダイト、トリホスフェート、ジホスフェートの群より選択される、前記柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１５】
式：
【化１】
2008541708.tif 000018
｛式中、Ｒはアリールエチニルの群より選択される｝
の、請求項１〜１４のいずれかに記載の柔軟な塩基スタッキング単量体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかの柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
柔軟な塩基スタッキング単量体の前駆体を提供する工程
｛ここで前記前駆体は、ハロゲンで置換されたかまたはＣで置換されたかまたはアジドで置換されたＩ１を含む柔軟な塩基スタッキング単量体である｝、
工程ａの前駆体のハロゲンまたはＣ置換基またはアジド置換基をＣ−Ｉ２で置換する工程、
柔軟な塩基スタッキング単量体のＣ−Ｉ２置換した前駆体を、オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応可能にする工程
を含む、柔軟な塩基スタッキング単量体の調製法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応した柔軟な塩基スタッキング単量体を提供する工程
オリゴヌクレオチド合成用の標準的試薬を提供する工程
オリゴヌクレオチド合成中に、１以上の柔軟な塩基スタッキング単量体をオリゴヌクレオチド内に取り込む工程
それによって、柔軟な主鎖単量体を含むオリゴヌクレオチドを生じる工程
を含む、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドの調製法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応した柔軟な単量体の前駆体を提供する工程
｛ここで前記前駆体は、ハロゲンで置換されたかまたはＣで置換されたかまたはアジドで置換されたＩ１を含む柔軟な塩基スタッキング単量体である｝、
オリゴヌクレオチド合成用の標準的試薬を提供する工程
オリゴヌクレオチド合成中に、柔軟な塩基スタッキング単量体の１以上の前駆体をオリゴヌクレオチド内に取り込む工程
オリゴヌクレオチドの合成後、Ｉ１上のハロゲン置換基またはＣ置換基またはアジド置換基をＣ−Ｉ２で置換する工程
それによって、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドを生じる工程
を含む、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドの調製法。
【請求項２０】
二本鎖核酸構造または三重鎖核酸構造の形成のための、請求項１６記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２１】
請求項１６記載のオリゴヌクレオチドを提供する工程
一本鎖または二本鎖ターゲット核酸を提供する工程
工程ａのオリゴヌクレオチドと、工程ｂの一本鎖または二本鎖ターゲット核酸を、二重鎖または三重鎖形成の条件下でインキュベーションする工程
それによって、二本鎖核酸または三重鎖核酸構造を形成する工程
を含む、二本鎖核酸および三重鎖核酸を形成する方法。
【請求項２２】
二重鎖または三重鎖核酸構造の形成が、ターゲット核酸の活性の配列特異的調節に用いられる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ターゲット核酸が、染色体遺伝子、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびマイクロＲＮＡの群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
二重鎖または三重鎖核酸構造の形成が、ターゲット核酸の配列特異的検出に用いられる、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
薬剤として使用するための、請求項１６のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
薬剤の調製のための、請求項１６のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の概要
本発明は、例えば三重鎖を形成する能力、ならびに検出、診断および／または治療に関する適切さ等の、改善された特性を持つオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、新規の柔軟な塩基スタッキング単量体であって、オリゴヌクレオチド内に取り込まれて、ターゲット二本鎖または一本鎖核酸と配列特異的に結合し、熱安定性が非常に高い三重らせんを形成することが可能な、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（triplex forming oligonucleotides: ＴＦＯs）を提供しうる、前記単量体を提供する。他の側面は、ＴＦＯ(s)を合成するための方法、ならびに検出、診断および治療におけるそれらの使用である。
【背景技術】
【０００３】
ＷＯ２００５０８３０８４は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の主鎖内に取り込まれることが可能な、インターカレーター・シュードヌクレオチドを記載した。インターカレーター・シュードヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、三重鎖形成能が減少していたが、ＤＮＡとＲＮＡを区別する能力を有した、すなわち、これらは、ＲＮＡとよりもＤＮＡと、より安定な複合体を形成する。
【０００４】
Ｍａｌａｋｈｏｖら、２００４（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４，  １２９８−１３０７）は、オリゴヌクレオチド内に取り込むための単量体またはオリゴヌクレオチドを開示した。当該研究の目的は、天然存在塩基のいずれとも対照的に、天然塩基、すなわちワトソン−クリックらせんに適合しうる、どの塩基とも結合可能な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基を提供することであった。三重鎖形成に関する研究は、まったく報告されなかった。
【０００５】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の配列特異的認識は、分子生物学、療法学およびバイオナノテクノロジーにおいて、オリゴヌクレオチドに基づくツールの開発で、かなり関心が持たれるトピックである。三重らせんは、一本鎖の三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）が、特異的主溝相互作用を通じて、ｄｓＤＮＡに結合する際に形成され、そしてこれは、遺伝子ターゲティングのための集中的な研究主題であった。このアプローチは、転写調節、遺伝子ノックアウト、および突然変異または組換え遺伝子を狙う、ゲノムＤＮＡの配列特異的処理を可能にする。
【０００６】
ターゲットに対するＴＦＯの第三鎖親和性は、ｄｓＤＮＡのホモプリン配列に対する認識が必要であり、そして平行（ピリミジン）結合モチーフにおいて、生理学的条件で、ｐＨ感受性Ｃ＋・Ｇ−Ｃフーグスティーン塩基トリプルが好ましくなく形成されるため、一般的に問題である。過去１０年の間、ｄｓＤＮＡ配列の制限を軽減しうる三重鎖核酸塩基の設計とともに、ＴＦＯを修飾して、ターゲットに対する結合親和性を改善するための、多くの努力がなされてきた。結合親和性増加を誘導する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’−アミノエチル−オリゴリボヌクレオチド（２’−ＡＥ−ＲＮＡ）およびＮ３’−＞Ｐ５’ホスホロアミダイトなどの修飾核酸を所持するオリゴヌクレオチドが、最も成功する化学的修飾ＴＦＯの中にある。３つのオリゴヌクレオチド配列すべてを含有する水溶液への、正に荷電した側鎖を時に所持する、複素環式化合物（インターカレーター）の添加に際してもまた、三重鎖構造の安定化が観察されてきた。ＴＦＯの３’端または５’端に共有結合したインターカレーターが、リンカーの長さおよびインターカレーターの種類に応じて、＋３．０〜＋１６．１℃の範囲内で、平行三重鎖の熱安定化を導くこともまた示されている。しかし、ＴＦＯ中央の膨らみ（ｂｕｌｇｅ）として挿入された、共有結合したインターカレーターには、限られた注意しか払われてこなかった。
【０００７】
この設計は、いくつかの利点を有しうる。第一に、糖修飾された核酸に関して必要とされる、少なくとも４つのヌクレオチド単量体の合成に比較して、インターカレーティング・シュードヌクレオチドの１つのホスホロアミダイトの合成しか必要とされない。第二に、配列内へのインターカレーター単量体のいくつかの膨らんだ挿入は、単一の挿入に比較して、二重鎖および三重鎖の安定性をかなり増加させうる。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の２’−ＯＨの非存在または存在を伴う、ワトソン−クリックおよびフーグスティーン結合様式の間の構造相違は、多様な種類のらせんに関して、異なる特性を生じる。したがって、リンカーの膨らんだ挿入およびインターカレーターによるらせんの破壊は、適切に選択されたらせんに対する、ユニークな特性を生じると予期される。これは、異なる種類の一本鎖核酸間を区別しうる、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドにつながった。
【発明の開示】
【０００８】
発明の詳細な説明
合成後の薗頭（Sonogashira）カップリング反応を介して得られる、（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロールのホモピリミジン・オリゴデオキシヌクレオチドの中央への膨らんだ（bulge）挿入（ねじれたインターカレーティング核酸、ＴＩＮＡ）は、フーグスティーン型三重鎖および二重鎖の非常に高い熱安定性をもたらす一方、同じヌクレオチド内容のワトソン−クリック型二重鎖は不安定化される。
【０００９】
第一の側面において、本発明は、一般構造：
Ｘ−Ｌ−Ｉ１−Ｃ−Ｉ２
を持つ、柔軟な塩基スタッキング単量体を提供し、式中、Ｘは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体、あるいはＰＮＡ、またはＰＮＡ類似体の主鎖内に取り込まれうる主鎖単量体単位であり、Ｌはリンカーであり、Ｉ１は本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第一のインターカレーターであり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能であり、Ｃは共役剤であり、そしてＩ２は本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第二のインターカレーターであり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能である。
【００１０】
柔軟な塩基スタッキング単量体は、少なくとも２つのインターカレーティング系、Ｉ１およびＩ２からなり、これらは、必要な構造的剛性およびねじれ柔軟性を提供する、共役剤Ｃによって連結される。後者は、インターカレーターがそれ自体を核酸らせん内の適切な位置に調整するのを補助するのに重要であると考えられる。
【００１１】
好ましい態様において、主鎖Ｘは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＡＮ、ＩＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、２’−ＡＥ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、ならびにそれらの組み合わせおよびそれらの修飾のオリゴヌクレオチド内に取り込まれることが可能である。
【００１２】
核酸およびそれらの類似体は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーンまたは逆フーグスティーン塩基対形成を介して相補的核酸に結合可能なオリゴヌクレオチドを提供している。Ｘは、３’端および／または５’端および／または配列中央に取り込まれてもよい。修飾核酸塩基、炭水化物、ペプチド鎖、磁気ビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラス、プラスチック表面、重金属およびチップ表面が、核酸のさらなる修飾として用いられると考えられる。
【００１３】
別の態様において、主鎖単量体単位Ｘは、場合によって、グリコンなどの環系内に部分的に含まれるアルキレンジオールを有する、エチレングリコールまたは１−Ｏ−メチレングリセロールなどのアルキレンジオールを含む。例えば、主鎖単量体Ｘは、四員、五員、または六員環の一部であってもよく、これは最終的に、窒素、イオウ、リン、および酸素から選択されるヘテロ原子を有する。
【００１４】
１つの態様において、柔軟な塩基スタッキング単量体のリンカーＬは、０〜６０原子を含む。
別の態様において、Ｌは、鎖または環あるいはそれらの組み合わせおよび／またはそれらの置換を含む。
【００１５】
さらに別の態様において、Ｌは、アルキル鎖またはオキサアルキル鎖またはアザアルキル鎖またはチアアルキル鎖またはカルボキサミド基またはチオカルボキサミド基またはスルホンアミド基あるいはそれらの組み合わせを含む。
【００１６】
ＸおよびＬの組み合わせは、核酸塩基とスタッキングする能力を持つ、核酸らせんのコアにＩ１−Ｃ−Ｉ２のインターカレーティング系を配置する系を提供する。
本発明の柔軟な塩基スタッキング単量体のＩ１は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能な、本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第一のインターカレーターである。
【００１７】
好ましい態様において、Ｉ１は、場合によってベンゼン、ナフタレン、アズレン、二環式芳香族複素環系およびそれらの置換の群より選択される、単環式または多環式芳香族環系である。
【００１８】
本発明の柔軟な塩基スタッキング単量体のＣは共役剤である。好ましい態様において、Ｃは、１〜１２炭素のアルキル、２〜１２炭素のアルケニル、２〜２５炭素のアルキニル、またはジアゾ、あるいは２５炭素または／および窒素原子より長くない長さを持つそれらの組み合わせの群より選択される。
【００１９】
別の態様において、Ｃは直鎖または分枝鎖または単環式芳香族環およびそれらの置換からなる群より選択され、最終的に、窒素、イオウ、リン、および酸素から選択されるヘテロ原子を有する。さらに別の態様において、Ｃのアルケニルはアセチレンまたは反復アセチレンである。好ましい態様において、リン原子を含む主鎖単量体単位Ｘの単位の長さは６原子未満であり、主鎖単位の長さは、１つの単量体から次への最短距離である。
【００２０】
好ましい態様において、連結部分Ｌは、少なくとも２原子の長さを有し、そして最終的に、窒素、イオウ、リン、および酸素から選択されるヘテロ原子を所持する。
柔軟な塩基スタッキング単量体のＩ２は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体の核酸塩基と同時スタッキング可能な、本質的に平面の少なくとも１つの共役系を含む第二のインターカレーターである。
【００２１】
好ましい態様において、Ｉ２は、二環式芳香族環系、三環式芳香族環系、四環式芳香族環系、五環式芳香族環系ならびにそれらの複素環式芳香族類似体およびそれらの置換の群より選択される。
【００２２】
好ましい態様において、柔軟な塩基スタッキング単量体は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の一部である。
別の好ましい態様において、柔軟な塩基スタッキング単量体は、オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応している。
【００２３】
好ましい態様において、オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応している柔軟な塩基スタッキング単量体は、ホスホロアミダイト、ホスホロジアミダイト、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホネート、Ｈ−ホスホネート、ホスファイト、クロロホスファイト、クロロホスホロアミダイト、ホスホンアミダイト、ホスホンクロリダイト、トリホスフェート、ジホスフェートの群より選択される。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明の柔軟な塩基スタッキング単量体は、式：
【００２５】
【化１】
2008541708.tif 000002
【００２６】
式中、Ｒはアリールエチニルの群より選択される
によって記載可能である。
本発明の別の側面は、本発明の柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成および逆フーグスティーン塩基対形成が可能ないかなるオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドに重要な点は、これらが、ワトソン−クリック塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成および逆フーグスティーン塩基対形成することが可能である点である。したがって、本発明の柔軟な塩基スタッキング単量体をオリゴヌクレオチド内に取り込むと、オリゴヌクレオチドは、三重鎖形成することが可能になる。
【００２７】
本発明の別の側面は、柔軟な塩基スタッキング単量体の調製法であり、該方法は、
柔軟な塩基スタッキング単量体の前駆体を提供する工程｛ここで前記前駆体は、ハロゲンで置換されたかまたはＣで置換されたかまたはアジドで置換されたＩ１を含む柔軟な塩基スタッキング単量体である｝；
工程ａの前駆体のハロゲンまたはＣ置換基またはアジド置換基をＣ−Ｉ２で置換する工程；
柔軟な塩基スタッキング単量体のＣ−Ｉ２置換した前駆体を、オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応可能にする工程、を含む。
【００２８】
本発明のさらに別の側面は、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドの調製法であり、該方法は：
オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応した柔軟な塩基スタッキング単量体を提供する工程；
オリゴヌクレオチド合成用の標準的試薬を提供する工程；
オリゴヌクレオチド合成中に、１以上の柔軟な塩基スタッキング単量体をオリゴヌクレオチド内に取り込む工程；
それによって、柔軟な主鎖単量体を含むオリゴヌクレオチドを生じる工程、を含む。
【００２９】
さらに別の側面は柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドの調製法であり、該方法は：
オリゴヌクレオチド内への取り込みに適応した柔軟な単量体の前駆体を提供する工程｛ここで前記前駆体は、ハロゲンで置換されたかまたはＣで置換されたかまたはアジドで置換されたＩ１を含む柔軟な塩基スタッキング単量体である｝；
オリゴヌクレオチド合成用の標準的試薬を提供する工程；
オリゴヌクレオチド合成中に、柔軟な塩基スタッキング単量体の１以上の前駆体をオリゴヌクレオチド内に取り込む工程；
オリゴヌクレオチドの合成後、Ｉ１上のハロゲン置換基またはＣ置換基またはアジド置換基をＣ−Ｉ２で置換する工程；
それによって、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドを生じる工程、を含む。
【００３０】
本発明のさらなる側面は、三重鎖核酸構造の形成のための、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドの使用である。ハイブリダイゼーションによる伝統的な検出に比較して、ＴＦＯでの検出は、変性工程を必要としない。
【００３１】
したがって、本発明のさらなる側面は、二重鎖または三重鎖核酸を形成する方法であり、該方法は：
請求項１６記載のオリゴヌクレオチドを提供する工程；
一本鎖または二本鎖ターゲット核酸を提供する工程；
工程ａのオリゴヌクレオチドと、工程ｂの一本鎖または二本鎖ターゲット核酸を、二重鎖または三重鎖形成の条件下でインキュベーションする工程；
それによって、二本鎖核酸または三重鎖核酸構造を形成する工程、を含む。
【００３２】
重要なことに、本発明のＴＦＯは、実施例セクションから明らかであるように、およそ７のｐＨで三重鎖形成が可能である。この特徴は、多様な適用に、例えば薬剤としての使用に、非常に重要である。
【００３３】
好ましい態様において、三重鎖核酸の形成を、ターゲット核酸の活性の配列特異的調節に用いる。
好ましい態様において、ターゲット核酸は、染色体遺伝子、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびマイクロＲＮＡまたはそれらの前駆体いずれかの群より選択される。したがって、三重鎖核酸構造は、ｍＲＮＡの翻訳、ｒＲＮＡまたはｔＲＮＡの機能、あるいはプレｍｉＲＮＡから成熟マイクロＲＮＡへのプロセシングを阻害しうる。
【００３４】
他の好ましい態様において、三重鎖核酸構造の形成を、ターゲット核酸の配列特異的検出に用いる。
したがって、これは、特定の前駆体マイクロＲＮＡの検出または特定の遺伝子アレルの検出であってもよい。こうした検出法は、例えば、診断目的のために関心が持たれる。
【００３５】
別の態様において、柔軟な塩基スタッキング単量体を含むオリゴヌクレオチドを薬剤として用いる。こうした薬剤の作用機構は、特定の遺伝子の発現阻害、すなわち抗遺伝子性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ）機構によってもよい。これはまた、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡレベルの阻害であってもよい。
【００３６】
したがって、本発明のオリゴヌクレオチドを、薬剤調製に用いてもよい。
項目：
１．式１からの一般構造を有する、天然または修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ三重鎖、二重鎖およびそれらのハイブリッドを安定化させるためのインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００３７】
【化２】
2008541708.tif 000003
【００３８】
式中
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立に、単環式または多環式芳香族環系であり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立に、置換されていてもよく
オリゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＡＮ、ＩＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、２’−ＡＥ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ、およびそれらの修飾のサブユニットからなるオリゴヌクレオチドである。サブユニットは、修飾核酸塩基、炭水化物、ペプチド鎖を含有してもよい。オリゴヌクレオチド主鎖は修飾されていてもよい。
【００３９】
リンカーは、１〜６０の原子を含み、そして非芳香族環領域を含有してもよく、ここでオリゴは、連結リンカーを介して、芳香族環系Ｒ１に連結され、このＲ１が次に、単環式および／または多環式芳香族環系および／またはアルキル、アルケニルおよび／またはアルキニルを含む共役系を定義する共役剤１を介して、芳香族環系Ｒ２に連結され、このＲ２が次に、単環式および／または多環式芳香族環系および／またはアルキル、アルケニルおよび／またはアルキニルを含む共役系を定義する共役剤２によって、芳香族環系Ｒ３に連結され、ここでリンカーは、リン酸部分、または糖部分、または核酸塩基、または修飾オリゴ主鎖を介して、核酸または核酸類似体の主鎖内に挿入されることが可能な、主鎖単量体単位である。
【００４０】
Ｒ１、共役剤１、Ｒ２、共役剤２およびＲ３を含む共役系は、非平面系を採用することも可能である。
共役剤１および共役剤２が互いに独立である、請求項１記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。共役剤１は、ｘの単結合、ｎの二重結合および／またはｍの三重結合を介してＲ１に連結され、そしてｙの単結合、ｋの二重結合および／またはｌの三重結合を介してＲ２に連結される、アリール、Ｒ４からなり、ここで、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｘおよびｙは、互いに独立に、０〜５の整数である。共役剤２は、ｚの単結合、ｐの二重結合および／またはｒの三重結合を介してＲ２に連結され、そしてｖの単結合、ｓの二重結合および／またはｔの三重結合を介してＲ３に連結される、アリール、Ｒ５からなり、ここで、ｐ、ｒ、ｓ、ｔ、ｖおよびｚは、互いに独立に、０〜５の整数である。こうして形成された共役系は、非平面系を形成することも可能である。
【００４１】
アリールがヘテロ原子を含有する、項目２記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
Ｒ３が、式２に記載するように、単一原子で置換されている、項目２および３のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。Ｒ１、共役剤１、Ｒ２および共役剤２を含む共役系は、非平面系を採用することも可能である。
【００４２】
【化３】
2008541708.tif 000004
【００４３】
共役剤１および／または共役剤２が、独立に、１〜１２炭素のアルキル、２〜１２炭素のアルケニル、２〜２５炭素のアルキニルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２〜４のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００４４】
アルキニル基が反復アセチレンである、項目２〜５のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
アルキニル基がアセチレンである、項目２〜５のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００４５】
式３記載の、Ｒ３および共役剤２を含有しない、項目２〜７のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００４６】
【化４】
2008541708.tif 000005
【００４７】
リンカーが、直鎖または分枝鎖または環状基からなる群より選択される、先行する項目のいずれか１項記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
直鎖または分枝鎖または環状基が、窒素、イオウ、リン、および酸素から選択されるヘテロ原子を有する、項目９記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００４８】
主鎖単量体が、エチレングリコールを含む、先行する項目のいずれか１項に記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド（式４）：
【００４９】
【化５】
2008541708.tif 000006
【００５０】
式中、Ｘは直鎖または分枝鎖または環状基からなり、そしてオリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２は、互いに独立に、項目１のオリゴのように定義される。
直鎖または分枝鎖または環状基が、窒素、イオウ、リン、および酸素から選択されるヘテロ原子を有する、項目１１記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００５１】
主鎖単量体が、１−Ｏ−メチレングリセロールを含む、先行する項目のいずれか１項記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド（式５）：
【００５２】
【化６】
2008541708.tif 000007
【００５３】
Ｒ１が、メタ、オルト、またはパラ置換フェニル環からなる、項目１３記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド（式６）：
【００５４】
【化７】
2008541708.tif 000008
【００５５】
Ｒ２が、Ｒ３および共役剤２を含有しない、式７記載のピレンである、項目１４記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００５６】
【化８】
2008541708.tif 000009
【００５７】
共役剤１が、反復アセチレンまたはアセチレンまたはアリールからなる、項目１５記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
アリールがヘテロ原子を含有する、項目１６記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００５８】
置換エチレングリセロールが純粋な立体異性体（Ｒ）または（Ｓ）である、項目１１〜１７のいずれかに記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２が、互いに独立に、項目１のオリゴのように定義される、式８に定義するようなインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００５９】
【化９】
2008541708.tif 000010
【００６０】
オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド２が、一本鎖ピリミジン・リッチ・オリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドである、項目１〜１９記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
【００６１】
項目１〜２０記載のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド中の共役剤１および／または共役剤２は、最終共役系の一部のみを所持するオリゴヌクレオチド（前駆体インターカレーティング・オリゴヌクレオチド）の合成後合成によって、例えば薗頭カップリング反応（Ｐｄ触媒および／またはＣｕＩの存在下での、末端アセチレンを有するアリールおよびハロゲン−アリール間の反応）によって、またはグレーザー反応（銅イオンの存在下での、末端アセチレンを所持するアリール間の反応）によって、またはクリック化学（銅イオンの存在下での、有機アジドおよび末端アセチレンを所持する有機分子間の反応）によって、組み立てられる。
【００６２】
酸および／または塩基不安定性（ｌａｂｉａｌ）保護基を所持する前駆体インターカレーティング・オリゴヌクレオチドに対して、項目２１記載の合成を行う。
非保護前駆体インターカレーティング・オリゴヌクレオチドに対して、項目２１記載の合成を行ってもよい。
【００６３】
項目２２および２３に記載の前駆体インターカレーティング・オリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させる。
固体支持体が活性化表面である、項目２４記載の方法。
【００６４】
固体支持体が、磁気ビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラス、プラスチック表面、重金属およびチップ表面からなる群より選択される、項目２４記載の方法。
最終共役系に、または最終共役系の一部に連結されたリンカーの単量体を用いて、項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを、段階的オリゴヌクレオチド合成によって得る。リンカーは、少なくとも２つの反応基を所持し、前記反応基は、場合によって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の成長しつつある鎖と反応してもよい。前記単量体は、支持体に結合したヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレオチド類似体の成長しつつある鎖と反応可能であり、そして場合によって、１以上のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体を、所望の配列で、オリゴヌクレオチド類似体に付加することによって、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体をさらに伸長させ；そして前記固体支持体から前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を切断し；そして塩基／酸不安定性保護基を切断して、それによってインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを得る。
【００６５】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖またはそれらのハイブリッドである二重鎖の１つと、フーグスティーン三重鎖または逆フーグスティーン三重鎖を形成可能である。項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドのオリゴ部分は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドである一本鎖の１つと、フーグスティーン二重鎖、または逆フーグスティーン二重鎖またはワトソン−クリック二重鎖を形成可能である。
【００６６】
フーグスティーン三重鎖およびフーグスティーン二重鎖は、項目１〜２０記載のＲ１、共役剤１、およびＲ２、ならびに最終的に共役剤２およびＲ３を含む単量体が、膨らみを形成すると、熱安定性増加を示す。
【００６７】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ反応剤に共役させる。ＤＮＡ反応剤は、突然変異誘発を導くことが可能な突然変異誘発剤であるか、または光誘導可能架橋剤であるか、または放射性剤であるか、またはアルキル化基であるか、またはＤＮＡ損傷性細胞酵素を補充可能な分子である。
【００６８】
インターカレーティング・オリゴヌクレオチドとして項目１〜２０を含有する、アンチセンス療法および抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）療法で用いるのに適した薬剤組成物。
治療が必要な被験体に、項目１〜２０のオリゴヌクレオチドまたはその薬剤組成物の有効量を投与することを含む、望ましくない二重鎖オリゴヌクレオチドの存在によって仲介される疾患または状態を治療する方法。
【００６９】
ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドを含むテンプレート上のＤＮＡ反応基に共役された項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを用いて、化学選択連結を行う方法。ＤＮＡ反応基は、適切な条件下で、他の化学基と反応することが可能な化学基である。
【００７０】
化学選択連結が生体オルソゴナル（ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）である、項目３３記載の方法。
ＤＮＡ反応基の１つがアジドまたは末端アセチレンまたはホスファンである、項目３４記載の方法。
【００７１】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡプラスミド（二本鎖ＤＮＡ）の精製に用いてもよい。
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドは転写を阻害可能である。
【００７２】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびこの方法の類似法、例えば多重（多色）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）、慣用的ＦＩＳＨ、ＣＯＭＢＯ−ＦＩＳＨ等に用いてもよい。
【００７３】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを遺伝子修復に用いてもよい。
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを、二重鎖−三重鎖遷移に基づく核酸ナノマシンに用いてもよく、ここで核酸は項目１のオリゴのように定義される。
【００７４】
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドを、平行二重鎖−逆平行二重鎖遷移に基づく核酸ナノマシンに用いてもよく、ここで核酸は項目１のオリゴのように定義される。
【００７５】
対応するＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体へのハイブリダイゼーションに際して、蛍光特性が改変される、項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチド。
項目１〜２０のインターカレーティング・オリゴヌクレオチドが、固体支持体に付着した系。
【００７６】
固体支持体が活性化表面である、項目４３記載の系。
固体支持体が、磁気ビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、ガラス、プラスチック表面、重金属およびチップ表面からなる群より選択される、項目４３記載の系。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
【実施例１】
【００７８】
近年、本発明者らは、ワトソン−クリック型二重鎖用に設計した、いくつかのインターカレーティング核酸の合成および特性を報告した（スキーム１）［９］。オリゴデオキシヌクレオチドの中央の（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ピレニルメチル）グリセロールの膨らんだ挿入（ＩＮＡ（登録商標））は、相補的ｓｓＤＮＡに対する親和性の有意な増加を生じ、一方、ＩＮＡ／ＲＮＡ二重鎖およびフーグスティーン型三重鎖および二重鎖は不安定化された［９ａ、ｅ］。オリゴデオキシヌクレオチド内へのインターカレーターの膨らんだ挿入に際して、二重鎖形成に関するミスマッチ感度が維持されたことにもまた言及しなければならない［９ｂ］。リン酸主鎖を歪める柔軟で短いグリセロールリンカー、および脱溶媒和によって、そして核酸塩基とのスタッキングによって、ＩＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を安定化させる適切なインターカレーターのユニークな組み合わせは、核酸化学生物学において、現在用いられる、価値ある分子につながった。
【００７９】
本発明者らは、ＴＦＯの設計のため、この種のインターカレーターを調べることに決めた。短くそして柔軟なリンカーを用いて、ＴＦＯの安定性を増進するため、インターカレーターの芳香族構造は、三重らせんのｄｓＤＮＡ部分内にインターカレーターを配置するのに十分に長くなければならない。したがって、（Ｒ）−１−Ｏ−（４−ポリアリール−フェニル）メチルグリセロールは、フェニルがまた、三重らせんのＴＦＯ部分において、核酸塩基を模倣可能でもあるため、優れた選択肢でありうる。必要な構造剛性およびねじれ柔軟性を提供し、そしてなお芳香族構造を一体化させるアセチレン架橋を介して、ポリアリール・インターカレーターもまたこのフェニルに付着させてもよい。アセチレン結合はそれ自体、インターカレーティング特性を改善すると考えられる。ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ  ８．０による（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）−フェニルメチル］グリセロールの分子モデリングによれば、ねじれ角１５．３°で、三重結合の周りに１−ピレニルおよびフェニル残基のねじれがある。このねじれ能は、インターカレーターが、それ自体をｄｓＤＮＡ内部の適切な位置に調整するのを助けることも可能であると考えられる。したがって、本発明者らは、この種の核酸を、ねじれたインターカレーティング核酸（ＴＩＮＡ、スキーム１）と呼ぶ。ここで、本発明者らは、異なるＴＩＮＡにつながる、オリゴデオキシヌクレオチドの合成後薗頭型オンカラム誘導体化を報告し、これらのＴＩＮＡは、フーグスティーン型二重鎖および三重鎖において、非常に高い親和性を有することが見出された。ワトソン−クリックまたはフーグスティーン結合様式のいずれかにしたがって形成された、膨らみとしてのＴＩＮＡの挿入を含む核酸らせんの熱安定性および蛍光研究もまた提示する。
【００８０】
【化１０】
2008541708.tif 000011
【００８１】
合成後オリゴヌクレオチド修飾は、ＴＩＮＡのための正しい候補を選択するのに必要な、いくつかのシュード−ヌクレオシド・ホスホロアミダイトの、ルーチンでそして時間がかかる調製より優れた代替法である。固相合成中のオリゴヌクレオチドのパラジウム（０）触媒修飾に取り組んだ、いくつかの報告がある。薗頭カップリング条件は、ＤＮＡ合成に適合することが見出され、そして保護基を所持する核酸塩基に関して、副反応はまったく観察されなかった。既知のプロトコルにしたがって、配列の５’端に５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−５−ヨードウリジンを取り込んだ後、ＤＮＡ合成を停止し、その後、薗頭条件下で、オリゴヌクレオチド支持体を処理する。その後、オリゴ合成を最後まで続ける。しかし、続けたオリゴヌクレオチド合成中、すべての官能基が、挿入後に存続可能であるわけではない。標準的ホスホロアミダイトのカップリング効率が、オンカラム誘導体化後、低下するリスクがあり、本発明者らもまた、以下に記載する実験において、これを観察した。いくつかの有機金属カップリングが合成後オリゴヌクレオチド修飾に適用されたという事実にも関わらず、配列中央に位置する、変換可能なヌクレオシド２’−デオキシ−５−ヨードウリジンに対する合成後薗頭型反応は、成功しないと報告された。その代わり、本発明者らは、薗頭型反応において、オリゴ中央に取り込まれた後の（Ｒ）−１−Ｏ−（４−ヨードベンジル）グリセロールを用いてみた。これに関連して、末端三重結合（２−５）を伴ういくつかの芳香族構造を用いた（スキーム１）。
【００８２】
４−ヨードベンジルブロミドおよび（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールから、４工程で、必要なホスホロアミダイト８を、全収率４７％で合成した（スキーム２、実験詳細に関しては、補助情報を参照されたい）。標準的ヌクレオチドカップリング条件（２分間カップリング、活性化剤として４，５−ジシアノイミダゾール）および増加した脱保護時間（１００秒間）を用いて、０．２μｍｏｌスケールでのＤＮＡ合成中、化合物８のカップリング効率は、９９％を超えると概算された。ＤＮＡ合成後、４−ヨードフェニル部分を所持するＤＭＴオン・オリゴヌクレオチドを伴うＣＰＧ支持体を、１ｍｌシリンジ中、乾燥条件下、室温で、乾燥ＤＭＦ／Ｅｔ３Ｎ（３．５／１．５、５００μｌ）中、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４またはＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（７．５ｍＭ）、末端アセチレンを所持する芳香族構造（２２．５ｍＭ）、およびＣｕＩ（７．５ｍＭ）を含有する薗頭カップリング試薬混合物で処理した。グレーザー酸化二量体化を回避するため、カップリング反応前に、窒素の代わりにアルゴンで支持体およびシリンジをフラッシュすることが重要であった。薗頭反応混合物が、いくつかのカップリング反応の大部分として調製されるのでなく、各個々のオリゴに関して、プラスチックシリンジ内に直接調製された場合に、変換がより優れていることが見出された。カップリング反応（３〜４時間）後、ＣＰＧをＤＭＦ（２ｘ０．５ｍｌ）およびＣＨ３ＣＮ（２ｘ１ｍｌ）でフラッシュし、そして乾燥させた。次いで、３２％ＮＨ４ＯＨ（２時間）でＣＰＧ支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、そして５５℃で脱保護した（一晩）。異なる親油性能により、Ｃ１８カラム上、半調製ＨＰＬＣによって、未反応オリゴマーおよびターゲットＴＩＮＡを分離した。ピークが重複した場合（構造２）、より長いＨＰＬＣプログラムを適用した（補助情報を参照されたい）。第一の分離後、ＤＭＴオン・オリゴヌクレオチドを１０％ＡｃＯＨで処理し、ＨＰＬＣ上で再び精製し、そしてエタノールから沈殿させた。最終ＴＦＯの純度は、イオン交換ＨＰＬＣによって判断した際、純粋なピリミジン含有オリゴデオキシヌクレオチドに関しては９０％を超え、そしてプリンを持つオリゴデオキシヌクレオチドに関しては８５〜８８％であることが見出された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって組成物を検証した。
【００８３】
【化１１】
2008541708.tif 000012
【００８４】
薗頭カップリング中の変換は、アセチレンの反応性およびオリゴ配列に依存した。１−エチニルピレンを用いたいくつかの実験から判断可能であるように、新鮮な反応混合物でもう一度処理するほうが、反応時間を長くする（４〜１６時間）より効率的であった。１−エチニルピレンの場合、触媒として、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２よりもＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いる方が、難溶性グレーザー副産物がより少ない量で形成され、そしてより優れたオリゴ誘導体化が観察された。配列中にプリンが存在すると、単一の処理後のホモピリミジン配列（８０〜８５％）に比較して、１−エチニルピレンを含有する薗頭カップリング反応混合物による、オリゴヌクレオチドを含む支持体の二重処理後であってさえ、ターゲットＴＩＮＡへのより低い変換を生じた（５０〜６０％）。試験したアセチレンの中で、最も反応性でない化合物であることが見出された４−エチニルビフェニルを用いると、プリン含有配列では、ターゲット・オリゴヌクレオチドがまったく得られなかったため、これはまた、他の芳香族アセチレンに関しても当てはまるようである。ＯＮ１４の合成において、本発明者らは、１−エチニルピレンを含む薗頭反応混合物で完全オリゴヌクレオチドを処理すると、８の第二の挿入後にＤＮＡ合成を中断し、その後、薗頭反応を行い、そしてＤＮＡ合成を続けるよりも、より多くの純粋なオリゴマーが生じることを経験した。後者の場合、イオン交換ＨＰＬＣによって判断すると、ピレンを所有する短いオリゴマーが最終ＴＩＮＡに混入した。
【００８５】
ごく最近、ピロリジンの存在下、水中でＰｄＣｌ２を用いた、銅不含薗頭カップリング反応が報告された。水との適合性、有酸素条件およびホモカップリング産物が微量であることがこの方法の非常に大きな利点である。本発明者らは、完全に脱保護されたＯＮ２に対して、類似の条件を適用した。しかし、ＯＮ２を、水／ピロリジン（１：１）中、１−エチニルナフタレンおよびＰｄＣｌ２で、５０℃または２０℃で一晩処理した後、ＨＰＬＣ精製後、所望の核酸の痕跡はまったく観察されなかった。
【００８６】
合成オリゴヌクレオチドを伴う三重鎖、ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の熱安定性を、熱変性実験によって評価した。融解曲線の一次導関数として決定した融点（Ｔｍ、℃）を表１〜４に列挙する。二重鎖Ｄ１に対する平行三重鎖およびＯＮ１５に対する平行ｄｓＤＮＡの両方における、ｐＨ依存性フーグスティーン型塩基対形成で、異なるＴＩＮＡを所持する配列を研究した（表１）。ＯＮ１６に対するワトソン−クリックＤＮＡ／ＤＮＡ逆平行二重鎖に、同じ配列（ＯＮ１〜１４）を用いた。二重鎖の後者の種類に関して、ＩＮＡに関して先に記載したものと類似の混合ピリミジン／プリン配列もまた、ｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡとのハイブリダイゼーション用のＴＩＮＡオリゴヌクレオチドに用いた（表４）。
【００８７】
表１のＴｍデータからわかるように、ｐＨ６．０で、野生型複合体に比較して、配列中央に膨らみとして（Ｒ）−１−Ｏ−（４−ヨードフェニルメチル）グリセロールを持つＯＮ２で、フーグスティーン型三重鎖および二重鎖のかなりの不安定化が観察された（Ｄ１およびＯＮ１５に対するＯＮ１）。アリール置換基でのヨウ素の置換は、より安定な三重鎖を生じた（Ｄ１に対するＯＮ３〜ＯＮ６、ｐＨ６．０）。１−ピレニルエチニル置換基に関して、最高のＴｍ値４６．０℃が観察され、これは、野生型三重鎖に比較した際、ΔＴｍ＝１９．０℃に対応する。ｐＨ７．２であっても、５の単一の取り込みは、高いシトシン含量（３６％）にもかかわらず、三重鎖（ＯＮ６／Ｄ１）のかなりの安定化につながった。このｐＨでは、野生型三重鎖に関して、ハイブリダイゼーションは検出不能であった（図１）。ｐＨ６．０での平行二重鎖に関して、１−ナフタレニルエチニル（ＯＮ５）および１−ピレニルエチニル（ＯＮ６）で、それぞれ、修飾あたり、３．０℃および１４．５℃の安定化が検出された。予期されるように、より低いｐＨ（ｐＨ＝５．０）では、平行二重鎖は、シトシンのプロトン付加のため、より安定であることが見出された。（Ｒ）−１−Ｏ−（フェニルメチル）グリセロール中のフェニル環の４位での、芳香族構造の付着は、フーグスティーン型らせんにおいてハイブリダイゼーション親和性増加を生じると結論付け可能であった。興味深いことに、ナフタレンおよびピレン環は、４−ビフェニルおよびベンゼンよりもかなりより優れた安定化を生じた。これは、フーグスティーン型らせんにおいて優れた結合を達成するためには、小さい芳香族構造よりも、ピレンなど、広い表面を持つ芳香族構造が、（Ｒ）−１−Ｏ−（４−置換フェニルメチル）グリセロールへの付着に好ましいという考えを支持する。
【００８８】
野生型ｄｓＤＮＡ（ＯＮ１／ＯＮ１６、表１）と比較した際、研究した修飾オリゴデオキシヌクレオチドすべてに関して、インターカレーター５を５’端に配置した場合（ＯＮ１０／ＯＮ１６）を除いて、逆平行ｄｓＤＮＡの不安定化が観察された。後者の場合の安定化効果は、隣接する核酸塩基上の芳香族多環系のスタッキングに帰することが可能であり（ふたとしての効果）、一方、非環リンカーの効果は最低限であった。ハイブリダイゼーション親和性はまた、ＴＩＮＡの構造にも依存した。最も不安定化されていない二重鎖が、４および５で形成され、一方、ｄｓＤＮＡの不安定化は、配列中央の膨らみとして取り込まれた構造１〜３でより大きかった。この段階ですでに、らせん内へ膨らみとして取り込まれたＴＩＮＡは、フーグスティーン型らせんの安定性を改善し、そしてワトソン−クリック型二重鎖の安定性を改善しなかった。したがって、ｐＨ６．０で、より安定でない平行三重鎖（ＯＮ６／Ｄ１）中に膨らみとして（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロールを単一挿入すると、三重鎖が、同じヌクレオチド内容のワトソン−クリック二重鎖（ＯＮ６／ＯＮ１６）のレベルまで安定化された。異なるＴＩＮＡの熱安定性から、本発明者らは、１−ピレニルエチニル含有ＴＩＮＡの特性をより詳しく調べることにした。
【００８９】
ＴＦＯの異なる位に１−ピレニルエチニルを配置すると、フーグスティーンの三重鎖および二重鎖の熱安定性のある程度の変動が見られた。シトシンが、５’または３’側のいずれかに隣接している場合（ＯＮ７〜ＯＮ９）、平行三重鎖および平行二重鎖はどちらも、ｐＨ６．０で、５が２つのチミジンの間に配置されている場合（ＯＮ６）より、より不安定化された。これは、Ｃ＋・Ｇの陽性荷電対と芳香族構造の相互作用の結果でありうる。興味深いことに、ｐＨ７．２で、シトシンがプロトン付加されていない場合、１−ピレニルエチニルの単一の挿入を持つ試験したＴＦＯ（ＯＮ６〜ＯＮ１０）の中では、５’懸垂端で５を持つＴＦＯ（ＯＮ１０）で、最低の三重鎖ハイブリダイゼーション親和性が検出された。ここではふた効果が存在しない点は驚くべきことであった。これは、生理学的条件下で、ターゲットｄｓＤＮＡを伴うＴＦＯのＣリッチ領域が、一般的により低い安定性である結果でありうる。しかし、中性媒体中、Ｃリッチ領域の中央に５を配置する（ＯＮ９）ことによって、効率的なハイブリダイゼーション親和性が達成可能であることは、重要な観察である。インターカレーターが、陽性荷電トリプルの２つを分離しているため、生理学的ｐＨで、インターカレーションが、三重鎖構造において、プロトン付加の可能性をより高くするであろうことが推測される。
【００９０】
ＯＮ１１〜ＯＮ１４を用いて、熱安定性に対するピレン・インターカレーター５の多数の膨らんだ挿入間の距離の依存性を調べた（表１）。重複三重鎖および二重鎖遷移の場合、３７３ｎｍで、融解実験を行った。しかし、時には、３７３ｎｍでは、それほどよく明示された遷移は観察されなかった。これらの場合、二重鎖のものに近い温度での、三重鎖のｐＨ６．０での融解に関する仮定は、２６０ｎｍで測定したｐＨ７．２での融解との比較に基づいた。インターカレーター５を次に最も近い隣として挿入した場合（ＯＮ１２）、フーグスティーン三重鎖および二重鎖は、ｐＨ６．０で、非修飾ＯＮ１に比較して安定化された。しかし、どちらの場合の安定性も、５の単一の挿入（ＯＮ６）より低く、そしてｐＨ７．２では三重鎖形成はまったく観察されなかった。これは、互いに非常に近くに配置された、２つの膨らんだ（Ｒ）−１−Ｏ−メチルグリセロール・リンカーによって、二重らせんおよび三重らせんが大きく中断されたことによる可能性もある。５の２つの挿入が、２つまたは３つの核酸塩基によって離れている場合（それぞれ、ＯＮ１３およびＯＮ１４）、Ｄ１およびＯＮ１５との複合体は、単一の挿入を持つものより安定であった。ｐＨ７．２では、三重鎖のＴｍは、生理学的温度３７℃よりさらにより高かった（図１のＯＮ１４／Ｄ１を参照されたい）。中央の５の二重挿入同様、挿入間に６塩基対を持ち、５’端での１つの挿入を持つ二重挿入（ＯＮ１１）は、ｐＨ６．０で、フーグスティーン型二重鎖および三重鎖をかなり安定化させた。フーグスティーンらせんと対照的に、５の二重挿入を持つ逆平行二重鎖（ＯＮ１２〜１４／ＯＮ１６）は、特に２つの挿入間に１つまたは３つの核酸塩基があった場合、野生型二重鎖ＯＮ１／ＯＮ１６に比較して、減少した安定性を示した。ｐＨ５．０で、５の二重挿入と平行および逆平行二重鎖の熱安定性を比較すると、フーグスティーン二重鎖ＯＮ１１／ＯＮ１５およびＯＮ１４／ＯＮ１５は、対応するワトソン−クリック二重鎖（ＯＮ１１／ＯＮ１６およびＯＮ１４／ＯＮ１６）よりさらになお安定であった。インターカレーターの付加に際しての平行三重鎖および平行二重鎖の安定化は、ベンゾピリドインドール（ＢＰＩ）誘導体に関して、最初に報告された。不完全にマッチしたワトソン−クリックＤＮＡ二重鎖の、完全にマッチしたフーグスティーン対ＤＮＡ二重鎖への再編成が、ＢＰＩをオリゴデオキシヌクレオチドの水溶液に添加した際に検出されている。５をオリゴデオキシヌクレオチド内に挿入した際、完全マッチ二重鎖を支持する、類似の効果が予期される。
【００９１】
ｐＨ５．０で、平行三重鎖の並外れた安定化が観察された。ＴＦＯ中の高い含量のシトシンは、非修飾三重鎖の融解（Ｔｍ＝５５．０℃）を二重鎖の融解近くにシフトさせた。しかし、この値は、ｐＨ５．０での二重鎖融解よりなお低かった（Ｔｍ（Ｄ１）＝５６．５℃）。ＴＦＯ中の１−ナフタレニルエチニル誘導体４の単一の膨らんだ挿入は、三重鎖安定性をわずかに増加させた（ΔＴｍ（ＯＮ５／Ｄ１−ＯＮ１／Ｄ１）＝２．０℃）。しかし、すべての場合で、５の膨らんだ挿入は、ｄｓＤＮＡ（Ｄ１）のＴｍよりも高い温度で、全複合体の解離につながった。２６０ｎｍと同じ温度の３７３ｎｍで、ＯＮ１１の明らかな遷移状態が観察され、これは、三重鎖および二重鎖が一緒に融解することを裏付けた。ＴＦＯ中の５の二重挿入に関する熱安定性の、ｐＨ６．０と同じ依存性が、ｐＨ５．０で観察された。したがって、次に最も近い隣としての５の二重挿入（ＯＮ１２）ならびに中央および５端での５の挿入（ＯＮ１１）は、それぞれ、最も安定化されない、および最も安定化された三重鎖であった。ｐＨ５．０で、三重鎖ＯＮ１４／Ｄ１は、それぞれ、対応する平行および逆平行二重鎖より、１６．５℃および２０．５℃、より安定であった。重要なことに、ｐＨ７．２であっても、オリゴヌクレオチドＯＮ１４は、対応するワトソン・クリックｄｓＤＮＡ（Ｔｍ＝３８．０℃、ＯＮ１４／ＯＮ１６）よりも、より安定なフーグスティーン型三重鎖を形成する（Ｔｍ＝４３．０℃、ＯＮ１４／Ｄ１）。ｐＨ７．２で、平行二重鎖（ＯＮ１４／ＯＮ１５）の融点は、この二重鎖がｐＨ感受性であるため、ｐＨ６．０で観察された３８．０℃より低いと推定される。このデータは、３塩基離れて、配列中央に５の多数の挿入を持つオリゴヌクレオチドが、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの間をよく区別する能力を明らかに立証する。
【００９２】
配列の中央および５’端に、５の膨らんだ挿入を伴う、平行三重鎖および二重鎖に関して、ミスマッチに対する感受性を研究した（表２）。三重鎖の場合、ミスマッチに対する感受性は、インターカレーターの挿入部位に依存した。インターカレーターの３’部位で、プリン鎖中のアデニンをグアニンによって置換した場合、マッチおよびミスマッチ三重鎖の間のΔＴｍ＝１１．５℃の最小の値が検出された（ＯＮ６／Ｄ３およびＯＮ１１／Ｄ３、表２）。すべての他の場合で、Ｔｍの低下は、１４．０〜２２．０℃の範囲内であった。５の単一挿入を持つミスマッチ平行二重鎖は、８．０〜１３．０℃の範囲内で不安定化され、これはミスマッチ野生型平行二重鎖と同じ範囲内であった。比較のため、最も感受性でないミスマッチ非修飾二重鎖は、ｐＨ６．０で、９℃のΔＴｍを示した（Ｔｍ（ＯＮ１／ＯＮ１５）−Ｔｍ（ＯＮ１／ＯＮ１８））。
【００９３】
本発明者らは、三重鎖を形成し、そして二重鎖に対するミスマッチを区別するのに最も有効なＴＩＮＡである、（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（５）を所持するＴＦＯの発光特性を研究した。オリゴヌクレオチド内に５を導入すると、特徴的な単量体蛍光スペクトルが生じ、３７３ｎｍでの励起に際して、４００および４２１ｎｍで最大であり（図２、黒い曲線）、これは、ＤＮＡ内に挿入された４−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニル］−１，３−ブタンジオールに関して先に公表されたデータと同様であった［１８］。すべての場合で、三重鎖または二重鎖の形成に際して、単量体蛍光の４ｎｍのシフトが検出された。完全マッチ三重鎖の形成は、一本鎖ＯＮ６に比較して、およそ１．５倍増加した単量体蛍光につながった（図２、ＯＮ６／Ｄ１）。不完全マッチ三重鎖に関しては、蛍光強度は、ｄｓＤＮＡの配列に依存した。したがって、ＯＮ６に比較して、ＴＡ反転部位（ＯＮ６／Ｄ２）に関して、ほぼ２倍の増加が検出された。対照的に、ｄｓＤＮＡにおいて、シトシンまたはグアニン塩基が、ＴＦＯに対して、５の挿入近くでミスマッチである場合（Ｄ３およびＤ４）、完全にマッチした三重鎖と比較して、単量体蛍光の減少が見られた（図２）。特に、グアニンが大きな影響を生じ、ミスマッチ三重鎖ＯＮ６／Ｄ３に関しては、２倍低い蛍光強度であった。
【００９４】
興味深いことに、逆平行二重鎖（ＯＮ６／ＯＮ１６、図４）の形成に際して、単量体蛍光におけるかなりの増加が検出され、一方、平行二重鎖（ＯＮ６／ＯＮ１５）の形成は、一本鎖蛍光と比較した際、わずかに増加した蛍光を生じたのみであった（図４）。第二の４−（１−ピレニルエチニル）フェニル残基が、ＯＮ１２において、次に最も近い隣として現れた場合、一本鎖の単量体蛍光は、およそ３倍減少し（図４、ＯＮ６およびＯＮ１２の比較）、そして５００ｎｍで最大であり、そして単量体強度のものの半分の強度である、エキシマー蛍光が観察可能であった（図３）。マッチした三重鎖中の同じオリゴに関して、単量体蛍光のかなりの減少およびエキシマーバンドの消失が観察された（図３、ＯＮ１２／Ｄ１）。これは、ピレン部分が、三重らせんの環境において、ｄｓＤＮＡに結合した際、互いに連絡不能であることを意味する。同様に、ＯＮ１２が、ＯＮ１５とフーグスティーン対形成ｄｓＤＮＡを形成した際、エキシマーバンドが消失した（図３）。対照的に、一本鎖ＯＮ１２の蛍光強度と比較した際、逆平行二重鎖（ＯＮ１２／ＯＮ１６）に関して、非常に高い単量体蛍光強度およびエキシマー蛍光増加が観察された（図４）。これは、同じ鎖中の２つのピレニルが、ワトソン−クリックｄｓＤＮＡの形成後、なお互いに緊密に接触したままであることを示すが、これはフーグスティーン型ｄｓＤＮＡには当てはまらないようである。この方式で、ワトソン−クリックおよびフーグスティーン型らせんに対するＴＩＮＡの異なる特性は、ハイブリダイゼーションおよび蛍光特性の両方によって、反映された。さらに、ピリミジン・リッチ鎖中の、次に最も近い膨らんだ隣としての、（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（５）の蛍光データを以下のように要約してもよい：一本鎖ＯＮ１２：４００および４２１ｎｍで中程度の単量体蛍光ならびに５００ｎｍでのエキシマーバンド；平行三重鎖ＯＮ１２／Ｄ１：低い単量体蛍光およびエキシマーバンドなし；平行二重鎖ＯＮ１２／ＯＮ１５：中程度の単量体蛍光およびエキシマーバンドなし；逆平行二重鎖ＯＮ１２／ＯＮ１６：高い単量体蛍光およびエキシマーバンド。
【００９５】
構造５が、三重鎖のワトソン−クリック二重鎖部分内への取り込みに際して、平行三重らせんの安定性に影響を及ぼす能力を表３に示す。三重鎖は、非修飾三重鎖（ＯＮ１／Ｄ１）に比較した際、５が二重鎖のピリミジン鎖中の膨らみとして挿入されたすべての場合（Ｄ５に対するＯＮ１、ＯＮ６およびＯＮ９）で安定化された。３７３ｎｍ［５のλｍａｘ］での熱変性実験において、三重鎖ＯＮ１／Ｄ１に関して、２つの遷移状態（Ｔｍ＝３６．５℃および５５．５℃）が検出され、これはそれぞれ、三重鎖および二重鎖融解に対応した。３７３ｎｍ吸光度による融解の検出は、インターカレーターが、二重鎖および三重鎖形成の両方に関与することを示した。互いに反対のワトソン−クリックおよびフーグスティーン・ピリミジン鎖の両方の中の膨らみとして５を挿入しても（ＯＮ６／Ｄ５）、三重鎖の二重鎖部分のみにインターカレーターを持つ三重鎖（ＯＮ１／Ｄ５）と比較した際、三重鎖の融解を変化させなかった。２つのピレン部分５を、ピリミジン鎖の各々に１つずつ、３塩基対離れた膨らみとして配置した場合（ＯＮ９／Ｄ５）、三重鎖融解は、二重鎖遷移状態に非常に近く、これはまた、ＴＦＯ内への５の二重取り込みに関しても、上で観察された。非修飾複合体に比較して、減少した三重鎖および平行二重鎖安定性が、膨らみとして、プリン鎖に化合物５を挿入した際に観察された（Ｄ６に対するおよびＯＮ２１に対するＯＮ１）。
【００９６】
本発明者らはまた、ＩＮＡに関して記載したのと同じ配列および条件を用いて、ワトソン−クリック型二重鎖中のｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡの混合プリン／ピリミジン配列に対する、５を所持するＴＩＮＡのハイブリダイゼーション親和性も研究した（表４）。野生型二重鎖に比較した際、配列中央の膨らみとしての５に関して、ＴＩＮＡ／ＤＮＡ（−８．０℃〜−１５．５℃の範囲内のΔＴｍ）およびＴＩＮＡ／ＲＮＡ（Ｔｍ＝−１０．０℃）のかなりの不安定化が観察された。次に最も近い隣として第二のインターカレーター５をＤＮＡ内に挿入すると（ＯＮ２４）、二重鎖のさらなる不安定化につながった（ＯＮ２４／ＯＮ２５およびＯＮ２４／ＯＮ２７）。複合体ＯＮ２３／ＯＮ２６として、２つの相補的混合プリン−ピリミジン鎖内に、互いに反対に５を取り込むと、３６．０℃のＴｍ値を生じ、これはＴＩＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（ＯＮ２３／ＯＮ２５およびＯＮ２２／ＯＮ２６）と同じ度合いのレベルであった。しかし、ＩＮＡをＩＮＡ／ＩＮＡ二重鎖の同じ位置に挿入すると、これらは、ＩＮＡ／ＤＮＡ（Ｔｍ＝５１．５℃）より不安定であった（Ｔｍ＝４３．６℃）。
【００９７】
二重鎖単独としてそして三重鎖の一部としてのワトソン−クリックｄｓＤＮＡ中の４−（１−ピレニルエチニル）フェニル部分を持つ複合体の蛍光特性を図４〜６に示す。単量体蛍光は、ピリミジン鎖内への挿入（ｓｓＯＮ６、図５）に比較して、プリン鎖内に５を挿入した場合（ｓｓＯＮ２１）に、かなり増加した。非修飾ＤＮＡおよびｓｓＯＮ２１を用いて三重鎖および二重鎖を組み立てた際、わずかに減少した蛍光強度が見られた（データ未提示）。逆平行二重鎖の形成に際しての、ホモピリミジン配列中の４−（１−ピレニルエチニル）フェニル部分の単量体蛍光の強い感度が、混合配列（ＯＮ２３／ＯＮ２５、ＯＮ２３／ＯＮ２７、図６）で完全に消失することは驚くべき発見であった。これはまた、同じ配列を用いた、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ピレニルメチル）グリセロールの膨らんだ挿入に関して報告された先の結果とも異なる。
【００９８】
２つのプレニル・インターカレーター５が１塩基対離れている場合、ｓｓＯＮ２４に関して観察されるエキシマーバンド（図６）は、逆平行二重鎖（ＯＮ２４／ＯＮ２５およびＯＮ２４／ＯＮ２７、図６）の形成に際して消失しなかった。この観察は、ＴＩＮＡを含む平行三重鎖および平行二重鎖での上記観察とは対照的であり、そしてまた、ＩＮＡに関して先に得られた結果とも反対であった［９ｂ］。次に最も近い隣としての膨らんだ５を含む、ホモピリミジンおよび混合ピリミジン／プリン鎖両方における逆平行二重鎖（それぞれ、ＯＮ１２／ＯＮ１６およびＯＮ２４／ＯＮ２５）の形成に際してのエキシマーバンドの存在は、２つのピレニル残基が、非常に近くに配置され、そして互いに連絡して、そして隣のワトソン−クリック塩基対とのスタッキング相互作用内に完全には包埋されなかったことを示す。これはまた、膨らみとしての５の取り込みに際しての、逆平行二重鎖安定性の減少も説明しうる。
【００９９】
次いで、本発明者らは、それらの相補鎖各々において、２つまたは３つの色素が、互いに反対に配置された場合、二重鎖および三重鎖に関して、エキシマー結合が形成可能であるかどうかも検査した。平行二重鎖ＯＮ２１／ＯＮ６（図５）または逆平行二重鎖ＯＮ２０／ＯＮ２１（図５）およびＯＮ２３／ＯＮ２６（図６）いずれでも、エキシマーバンドはまったく観察されなかった。この結果は、４−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニル］−１，３−ブタンジオールを、混合配列を持つ逆平行ｄｓＤＮＡの相補鎖中に、互いに反対に配置した場合に示された研究と相関した。３つの４−（１−ピレニルエチニル）フェニル部分を３つの鎖すべてにおいて、互いに反対に配置した場合にのみ、５００ｎｍで弱いエキシマーバンドが検出された（ＯＮ６／Ｄ７、図５）。結論は、平行および逆平行二重鎖および平行三重鎖の異なる鎖中に配置された４−（１−ピレニルエチニル）フェニル部分の連絡が妨げられ、これが、ＩＮＡで見られるものとは対照的に、エキシマー形成を伴うインターカレーターのジッピングの可能性を低くするというものである。したがって、二重鎖の互いに反対に位置するＩＮＡの２つのピレン部分のジッピングが、ＮＭＲ構造で観察されており、そしてこの二重鎖構造は、３４３ｎｍでの励起に際して、定常状態蛍光スペクトル中の４８０ｎｍでのエキシマーバンドの形成につながった（未公表データ）。
【０１００】
ワトソン−クリック型二重鎖中の２つの異なるピレン・インターカレーティング核酸ＩＮＡおよびＴＩＮＡの蛍光スペクトルおよびハイブリダイゼーション特性の相違は、（Ｒ）−１−Ｏ−（１−ピレニルメチル）グリセロール（ＩＮＡ）の芳香族部分に、過剰な１−フェニルエチニル部分を付加した結果を明らかに例示する。フーグスティーン型三重鎖中にピレンを適切に配置することに成功したため、この研究によって、本発明者らはまた、三重鎖へのピレンの弱い親和性に共通する意味が、一般的な特徴でないことも示した。インターカレーターが平行三重鎖構造を安定化させる能力があるが、ｄｓＤＮＡの安定性にはわずかしか影響がないことが知られる。したがって、２−（２−ナフチル）キノリン−４−アミンおよびその類似体の付加は、三重鎖ＤＮＡのかなりの安定化につながり［２−（２−ナフチル）キノリン−４−アミンでは、ΔＴｍ＝３５．６℃］、二重鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション親和性はわずかにしか増加させない（ΔＴｍ＝５．５℃）。同様の研究によって、２’−デオキシリボース残基のアノマー位に、直接またはプロピルリンカーを介してのいずれかでカップリングしたペリレンを含むオリゴデオキシヌクレオチドの合成およびハイブリダイゼーション特性が報告された。単量体性三重鎖特異的インターカレーターに勝る、多環部分を含むＴＩＮＡの１つの利点は、溶液中の過剰なインターカレーターを用いるのではなく、配列の所望の位置に、ＴＩＮＡを数回挿入可能であることである。さらに、ＴＩＮＡに関して本明細書に記載するように、逆平行二重鎖の不安定化を伴う、平行三重鎖および二重鎖の高い安定化は、オリゴデオキシヌクレオチドに共有結合した、他のインターカレーティング系では、これまでに観察されてこなかった。これに関連して、オリゴデオキシヌクレオチド内に、多数の膨らみ挿入として取り込まれたＴＩＮＡは、ｓｓＤＮＡとｄｓＤＮＡを区別する能力を持つユニークな分子である。この特徴は、ｐＨ６．０およびｐＨ５．０で三重鎖および逆平行二重鎖安定性を比較した際に、ＯＮ１３およびＯＮ１４で、明らかに見られる（表１）。これは、平行三重鎖形成を検出しようとする際、二重鎖形成から生じる偽陽性の数を減少させる可能性を広げる。これは、例えば、非変性条件下のゲノムに対する蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に、そしてｐＨ６．０またはｐＨ５．０で実行可能な三重らせんアフィニティークロマトグラフィーまたは三重らせんアフィニティー沈降を用いたプラスミドＤＮＡの精製に、当てはまりうる。二重鎖形成と平行三重鎖形成のこの種の区別は、逆平行二重鎖を安定化させることがやはり知られるＰＮＡ、ＬＮＡまたはＮ３’−＞Ｐ５’ホスホロアミダイトのような三重鎖形成オリゴでは達成不能である。
【０１０１】
（Ｒ）−１−Ｏ−（４−ヨードフェニル）メチルグリセロールを所持するオリゴヌクレオチドの薗頭型合成後修飾を用いて、本発明者らは、フーグスティーン対形成二重鎖および三重鎖の熱安定性を増加させる能力に関して、いくつかのねじれたインターカレーティング核酸（ＴＩＮＡ）をスクリーニングした。オリゴデオキシヌクレオチド中の膨らみとしての（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（５）の挿入は、マッチおよびミスマッチ配列間を区別する優れた特性を持つ、最も有効なＴＩＮＡであることが見出された。ワトソン−クリック型ＤＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、天然二重鎖に比較して、配列中央のＴＩＮＡの挿入に際して不安定化された。本発明者らは、ＴＩＮＡが、フーグスティーン型塩基対形成に対する親和性増加およびワトソン−クリック型らせんに対する親和性減少を示す、オリゴデオキシヌクレオチドに共有結合した膨らみとしての、最初のインターカレーティング系であると考えている。ホスホロアミダイト８への短い合成経路およびオリゴヌクレオチドの合成後薗頭修飾は、他の三重鎖安定化核酸に勝る、ＴＩＮＡの優位な利点である。１つの鎖におけるＴＩＮＡ（５）の二重挿入の研究から、２つの膨らんだ（Ｒ）−１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール間の３つの核酸塩基の配置は、フーグスティーンＤＮＡらせんの高い熱安定性に関して、最適でありうると結論付け可能である。一方、ピリミジンＤＮＡ配列中の次に最も近い膨らんだ隣としての５の挿入に際しての異なる発光特性（エキシマーバンド形成）を、平行三重鎖、平行ｄｓＤＮＡおよび逆平行ｄｓＤＮＡの形成の検出に用いてもよい。５の単一の膨らんだ挿入を持つＴＩＮＡに関して、１２〜１９℃の範囲内での熱安定性増加を適用して、ＴＦＯの必要な長さを減少させてもよい。さらに、配列中にいくつかのシトシンが存在している場合であっても（本研究では最高３６％）、ｐＨ７．０で、フーグスティーン型二重鎖および三重鎖の優れた熱安定性を得ることも可能である。５の多数の挿入を用いて、より安定でないフーグスティーン二重鎖の融点を、適切な条件下（配列、ｐＨ、塩濃度等）で、同じ長さのワトソン−クリック二重鎖のレベルまで増加させてもよい。別の鎖形成の三重鎖とともに、ｄｓＤＮＡ中のＣ−ＧおよびＴ−Ａ反転部位に関して高い親和性を持つ修飾核酸塩基の開発を考慮して、本発明者らは、三重鎖形成のこうした改善が、ＴＩＮＡの適用可能性を拡大すると考えている。環状オリゴデオキシヌクレオチドのピリミジン鎖内への５の挿入に際して、三重鎖を安定化させる能力、またはターゲットｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡに対するクランプもまた、明らかな可能性である。次の段階として、古典的ワトソン−クリックおよびフーグスティーン複合体と異なる核酸らせんの安定性に対するＴＩＮＡおよびＩＮＡの挿入の影響の研究に取り組んだ。このように、逆フーグスティーン塩基対形成、ｉモチーフ（Ｃ−Ｃ＋塩基対）または四重鎖（Ｇリッチ配列）を安定化可能な核酸類似体は、なお限られた入手可能性でしかない。本発明者らは、ワトソン−クリック型核酸らせんとフーグスティーンとの区別とともに、ＴＩＮＡが平行三重鎖および二重鎖を安定化させる能力は、特異的認識、高い熱安定性および自己編成または再編成が不可欠である、バイオテクノロジーおよびナノテクノロジーにおける、ＤＮＡに基づくツールの設計において、ＴＩＮＡを非常に有用なものとしうると考えている。
【０１０２】
【表１】
2008541708.tif 000013
【０１０３】
［ａ］ｃ＝２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０および７．２中の１．５μＭのＯＮ１〜１４および各鎖１．０μＭのｄｓＤＮＡ（Ｄ１）；二重鎖Ｔｍ＝５６．５（ｐＨ５．０）、５８．５℃（ｐＨ６．０）および５７．０℃（ｐＨ７．２）；［ｂ］ｃ＝２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０中の各鎖１．０μＭ；［ｃ］ｃ＝２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０またはｐＨ５．０中の各鎖１．０μＭ；［ｄ］第三の鎖および二重鎖融解重ね合わせ。３７３ｎｍでＴｍ＝５４．５℃の遷移状態を決定した；［ｅ］第三の鎖および二重鎖融解重ね合わせ；［ｆ］薗頭反応混合物によって調製：Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（７．５ｍＭ）、対応するアセチレン（２２．５ｍＭ）、ＣｕＩ（７．５ｍＭ）、乾燥ＤＭＦ／Ｅｔ３Ｎ（３．５／１．５、５００μｌ）、３時間；［ｇ］薗頭反応混合物によって調製：Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７．５ｍＭ）、対応するアセチレン（２２．５ｍＭ）、ＣｕＩ（７．５ｍＭ）、乾燥ＤＭＦ／Ｅｔ３Ｎ（３．５／１．５、５００μｌ）３時間；［ｋ］薗頭反応混合物での二重処理によって調製：Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７．５ｍＭ）、１−エチニルピレン（２２．５ｍＭ）、ＣｕＩ（７．５ｍＭ）、乾燥ＤＭＦ／Ｅｔ３Ｎ（３．５／１．５、５００μｌ）、３時間；［ｌ］未測定。
【０１０４】
【表２】
2008541708.tif 000014
【０１０５】
【表３】
2008541708.tif 000015
【０１０６】
【表４】
2008541708.tif 000016
【０１０７】
１Ｈの３００ＭＨｚおよび１３Ｃの７５ＭＨｚで、Ｖａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ  ２０００分光計上でＮＭＲスペクトルを記録した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルで用いた内部標準は、ＣＤＣｌ３でＴＭＳ（δ：０．００）；１３Ｃ  ＮＭＲはＣＤＣｌ３（δ：７７．０）であった。４．７テスラＵｌｔｉｍａフーリエ変換（ＦＴ）質量分析計（Ｉｏｎ  Ｓｐｅｃ、カリフォルニア州アービン）を用いて、正確なイオン質量測定を行った。２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックスから得たイオンを用いて、［Ｍ＋Ｎａ］＋イオンピークをマッチさせた。Ｍｅｒｃｋから購入したＴＬＣプレート６０Ｆ２５４を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析を行い、そしてＵＶ光（２５４ｎｍ）中で視覚化した。カラムクロマトグラフィーで用いたシリカゲル（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）は、Ｍｅｒｃｋから購入した。カラムクロマトグラフィーで用いる溶媒を使用前に蒸留し、一方、試薬は購入したまま用いた。
【実施例２】
【０１０８】
（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−（４−ヨードベンジルオキシ）プロパン−２−オールの調製。
（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（６、１．１７ｇ、８．９ｍｍｏｌ）および４−ヨードベンジルブロミド（２．５ｇ、８．４ｍｍｏｌ）をＫＯＨ（８．８ｇ、１５４．０ｍｍｏｌ）の存在下、トルエン（８０ｍｌ）中で、ディーン−スターク条件下で１２時間還流した。反応混合物を冷却させ、そしてＨ２Ｏ（３０ｍｌ）を添加した。相分離後、水層をトルエン（２ｘ１５ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機層をＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄し、そして真空中で濃縮した。残渣を８０％水性ＡｃＯＨ（２５ｍｌ）で、室温で４８時間処理した。溶媒を真空中で除去し、そして残渣をトルエン／ＥｔＯＨ（３０ｍｌ、５：１、ｖ／ｖ）で２回、共蒸発させた。残渣を減圧下で乾燥させて、黄色の油として（Ｒ）−３−（４−ヨードベンジルオキシ）プロパン−１，２−ジオール（７、１００％、２．３ｇ）を得て、これをさらに精製せずに次の工程に用いた。
【０１０９】
この油（２．３ｇ、８．４ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２５ｍｌ）中で溶解し、そして４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（３．５ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。２４時間後、ＭｅＯＨ（２ｍｌ）を、その後、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）を添加して、そして混合物を標準水溶液ＮａＨＣＯ３（４０ｍｌｘ２）で抽出した。水相をＥｔＯＡｃ（２０ｍｌｘ２）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、そして減圧下で蒸発させた。残渣をトルエン／ＥｔＯＨ（２５ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）で２回、共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）からシリカゲル（１．５ｇ）上に吸着させ、そして石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（０〜３０％、ｖ／ｖ）とともに乾燥カラム真空クロマトグラフィーを用いて精製して、黄色の泡としての化合物（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−（４−ヨードベンジルオキシ）プロパン−２−オール（７０％、３．６ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ２．４２（ｂｒ．ｓ．，  １Ｈ，  ＯＨ），  ３．２０（ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２），  ３．５６（ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＯＤＭＴ），  ３．７８（ｓ，  ６Ｈ，  ２×ＯＣＨ３），  ３．９７（ｍ，  １Ｈ，  ＣＨＯＨ），  ４．４３（ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ａｒ），  ６．７８（ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ＝８．５Ｈｚ，  ＤＭＴ），  ７．００（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ，  ヨードフェニル），  ７．３０−７．４５（ｍ，  ９Ｈ，  ＤＭＴ），  ７．６３（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ，  ヨードフェニル）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）５５．２（ＯＣＨ３），  ６２．２（ＣＨ２ＯＤＭＴ），  ６９．９（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２），  ７１．６（ＣＨＯＨ），  ７２．６（ＣＨ２−ヨードフェニル），  ８６．１［Ｃ（Ａｒ）３］，  ９３．１，  １２９．４，  １３７．４，  １３７．７（ヨードフェニル），  １１３．１，  １２６．７，  １２７．８，  １２８．１，  １３０．０，  １３５．９，  １４４．７，  １５８．５（ＤＭＴ）。ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｃ３１Ｈ３１ＩＯ５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］＋、計算値ｍ／ｚ  ６３３．１１０８、測定値ｍ／ｚ  ６３３．１１１６。
【実施例３】
【０１１０】
（Ｓ）−２−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（４−ヨードベンジル）グリセロール（スキーム２の化合物８）の調製。
【０１１１】
（Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルオキシ）−３−（４−ヨードベンジルオキシ）プロパン−２−オール（２．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を、窒素下で、無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）に溶解した。氷水槽で外部から冷却しながら、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．８５０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加し、その後、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加した。１６時間後、分析ＴＬＣは、もはや出発物質を示さず、そして反応をＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で停止した。層を分離し、そして有機相をＨ２Ｏ（３０ｍｌ）で洗浄した。合わせた水層をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、シリカゲル（１．５ｇ）およびピリジン（０．５ｍｌ）を添加し、そして減圧下で溶媒を除去した。ＮＥｔ３（０．５％、ｖ／ｖ）／ＥｔＯＡｃ（０〜２５％）／石油エーテルとともにシリカゲル乾燥カラム真空クロマトグラフィーを用いて、残渣を精製した。合わせたＵＶ活性分画を真空中で蒸発させて、泡としての最終化合物８（１．８ｇ、６７％）を得て、これをＯＤＮ合成に用いた。３２Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ  １４９．８，  １４９．９、１：１の比。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ、Ｃ４０Ｈ４６ＩＯ６Ｎ２ＰＬｉ［Ｍ＋Ｌｉ］＋、計算値ｍ／ｚ  ８１７．２４４９、測定値ｍ／ｚ  ８１７．２４４７。
【実施例４】
【０１１２】
（Ｒ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロールの調製。
ＤＭＦ（４０ｍｌ）中の（Ｒ）−３−（４−ヨードベンジルオキシ）プロパン−１，２−ジオール（４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５．８ｍｌ）を添加して、そしてＡｒを溶液中に３０分間バブリングした。その後、Ａｒ下で、１−エチニルピレン（１．０５ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）を溶解し、そしてＣｕＩ（５６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１２５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。反応混合物を、Ａｒ下、室温で一晩攪拌し、その後、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍｌ）を添加し、そしてＥＤＴＡのアンモニウム塩の０．３Ｍ水溶液（２ｘ７５ｍｌ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ（３ｘ７５ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、そして真空中で乾燥するまで蒸発させた。残渣をトルエン／ＥｔＯＨ（３０ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）で２回、共蒸発させ、油として１−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（３．１ｇ）を得た。該油をピリジン（２０ｍｌ）で共蒸発させ、そして次いで、無水ピリジン（５０ｍｌ）に溶解し、氷水槽によって冷却し、そして４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．４５ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）をＡｒ下で添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、そして次いで、過剰な部分の４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。２４時間後、ＴＬＣは、もはや出発物質を示さず、そしてＭｅＯＨ（２ｍｌ）によって反応混合物を停止し、そしてＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）によって希釈し、そして標準水溶液ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌｘ２）で抽出した。水相をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌｘ２）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、そして減圧下で蒸発させた。残渣をトルエン／ＥｔＯＨ（２５ｍｌ、１：１、ｖ／ｖ）で２回、共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）からシリカゲル（２．０ｇ）上に吸着させ、そしてシクロヘキサン中のＥｔＯＡｃ（０〜１００％、ｖ／ｖ）での乾燥カラム真空クロマトグラフィーを用いて精製して、黄色の泡としての（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（６０％、１．７５ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ２．４８（ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ，  ＯＨ），  ３．２４（ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２），  ３．３１（ｍ，  ２Ｈ，  ＣＨ２ＯＤＭＴ），  ３．７８（ｓ，  ６Ｈ，  ２×ＯＣＨ３），  ４．００（ｍ，  １Ｈ，  ＣＨＯＨ），  ４．５８（ｓ，  ２Ｈ，  ＣＨ２Ａｒ），  ６．８０（ｄ，  ４Ｈ，  Ｊ＝８．５Ｈｚ，  ＤＭＴ），  ７．１０−７．４５（ｍ，  １１Ｈ，  ＤＭＴ），  ７．７２（ｄ，  ２Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ，  フェニル），  ８．００−８．３０（ｍ，  ９Ｈ，  ピレン−１−イル）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  ５５．２（ＯＣＨ３），  ６４．３（ＣＨ２ＯＤＭＴ），  ７０．０（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＣＨ２），  ７１．７（ＣＨＯＨ），  ７２．９（ＣＨ２−フェニル），  ８６．１［Ｃ（Ａｒ）３］，  ８８．７，  ９４．９（Ｃ≡Ｃ），  １１７．７，  １２７．７，  １３８．５，  １３９．４（フェニル），  １１３．１，  １２４．５−１３１．８，  １３６．０，  １４４．８，  １５８．５（ＤＭＴ，  ピレン１−イル）。ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：Ｃ４９Ｈ４０Ｎａ＋Ｏ５［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｍ／ｚ計算値７３１．２７６８、測定値７３１．２７３９。
【実施例５】
【０１１３】
（Ｒ）−２−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロールの調製。
【０１１４】
（Ｒ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−［４−（１−ピレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロール（１．７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．６２０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１５０ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、、無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）を２４時間用いて、化合物８と同じ方法を用い、該化合物を調製した。泡として最終化合物を得て（１．８ｇ、８３％）、これをＯＤＮ合成に用いた。３２Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １５０．３，  １５０．５、３：２の比。ＨＲ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：Ｃ５８Ｈ５７Ｎ２Ｎａ＋Ｏ６Ｐ  ［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｍ／ｚ計算値９３１．３８４６、測定値９３１．３８１４。
【実施例６】
【０１１５】
合成後アプローチを用いたＴＩＮＡの合成および精製
乾燥ＭｅＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２の１：１混合物中、ホスホロアミダイト８の０．０７５Ｍ溶液に関して、活性化剤としての４，５−ジシアノイミダゾール、ならびに増加した保護時間（１００秒間）およびカップリング時間（２分間）を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ核酸合成システム、モデル８９０９上で、ＯＤＮを合成した。ＤＮＡ合成後、ＣＰＧ支持体を含むカラム、および４−ヨードフェニル部分を所持するＤＭＴオン・オリゴヌクレオチドを、カップリング反応前に、アルゴンでフラッシュした（２分間）。乾燥条件下、室温で、１ｍｌプラスチックシリンジ中、乾燥ＤＭＦ／Ｅｔ３Ｎ（３．５／１．５、５００μｌ）中で、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４またはＰｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（７．５ｍＭ）、末端アセチレンを所持する芳香族構造（２２．５ｍＭ）、およびＣｕＩ（７．５ｍＭ）を含有する薗頭カップリング試薬混合物を調製した。使用前に、シリンジにもまた、アルゴンをフラッシュした。薗頭カップリング試薬混合物を含むシリンジを、ＣＰＧを含むカラムにつなぎ、そして別の空のシリンジをカラムの別の側に連結した。修飾オリゴヌクレオチドを含むＣＰＧ支持体を、シリンジによって、反応混合物で数回洗浄した。４５分後ごとに最後の操作を反復した。３〜４時間後、支持体から反応混合物を除去し、そしてＤＭＦ（２ｘ０．５ｍｌ）およびＣＨ３ＣＮ（２ｘ１ｍｌ）でカラムを洗浄し、そして乾燥させた。ＯＮ１２〜ＯＮ１４、ＯＮ２１およびＯＮ２４の場合、ＣＰＧ支持体を、新鮮に調製した薗頭カップリング反応混合物でもう一度処理した。その後、５’−ＤＭＴオン・オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し（室温、２時間）、そして３２％水性アンモニアを用いて脱保護した（５５℃、一晩）。Ｗａｔｅｒｓ  ＸｔｅｒｒａＴＭ  ＭＳ  Ｃ１８カラム上で、逆相半調製ＨＰＬＣを用いて、５’−Ｏ−ＤＭＴオンＴＩＮＡの精製を達成した。１００μｌの１０％水性酢酸中、ＯＤＮをＤＭＴ脱保護し（３０分間）、３２％水性アンモニア（１ｍｌ）で希釈し、そしてＨＰＬＣ上で再び精製した。ＯＤＮを含む、対応する分画を蒸発させ、１Ｍ水性ＮａＯＡｃ（１５０μｌ）で希釈し、そしてエタノール（５５０μｌ）からＯＤＮを沈殿させた。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって、修飾ＯＤＮを確認した。ＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で、Ｍｅｒｃｋ  ＨｉｔａｃｈｉのＬａＣｈｒｏｍシステムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーによって、最終ＴＦＯの純度を確認した。
【実施例７】
【０１１６】
（Ｒ）−２−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−［４−（１−プレニルエチニル）フェニルメチル］グリセロールの合成および精製。
【０１１７】
乾燥ＭｅＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２の１：１混合物中、前記ホスホロアミダイトの０．０７５Ｍ溶液に関して、活性化因子としての４，５−ジシアノイミダゾール、ならびに増加した脱保護時間（１００秒間）およびカップリング時間（２．５分間）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＥｘｐｅｄｉｔｅＴＭ核酸合成システム、モデル８９０９上で、ＯＤＮを合成した。ＤＮＡ合成完了後、５’−ＤＭＴオン・オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し（室温、２時間）、そして３２％水性アンモニアを用いて脱保護した（５５℃、一晩）。Ｗａｔｅｒｓ  ＸｔｅｒｒａＴＭ  ＭＳ  Ｃ１８カラム上で、逆相半調製ＨＰＬＣを用いて、５’−Ｏ−ＤＭＴオンＴＩＮＡの精製を達成した。１００μｌの８０％水性酢酸中、ＯＤＮをＤＭＴ脱保護し（３０分間）、１Ｍ水性ＮａＯＡｃ（１５０μｌ）で希釈し、そしてエタノール（５５０μｌ）からＯＤＮを沈殿させた。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＶｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって、修飾ＯＤＮを確認した。ＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で、Ｍｅｒｃｋ  ＨｉｔａｃｈｉのＬａＣｈｒｏｍシステムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーによって、最終ＴＦＯの純度を確認した。
【実施例８】
【０１１８】
融点測定
ＰＴＰ−６温度プログラマーを取り付けたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＵＶ／ＶＩＳ分光計Ｌａｍｂｄａ  ３５上で、融点測定を行った。まず、対応する緩衝剤溶液中、各々１．０μＭの濃度のワトソン−クリック二重鎖の２つの鎖を混合することによって、三重鎖を形成した。溶液を８０℃で５分間加熱し、室温に冷却して、そして第三の（ＴＦＯ）鎖を添加し、そして次いで、１５℃で３０分間維持した。対応する緩衝剤溶液中、各々１．０μＭの濃度で、２つの鎖を混合し、その後、７０℃で５分間加熱して、そして次いで室温に冷却することによって、二重鎖を形成した。増加する温度（１分間あたり１．０℃）に対して、２６０ｎｍの吸光度を測定することによって得た融解曲線の一次導関数プロットの最大値として、融点（Ｔｍ、℃）を決定した。温度増加速度をより遅くしても（１分間あたり０．５℃）、同じ曲線を生じた。３７３ｎｍでもまた実験を行った。反復実験によって決定した際、すべての融点は、±１．０℃の誤差範囲内である。
【実施例９】
【０１１９】
蛍光測定
Ｊｕｌａｂｏ  Ｆ２５温度コントローラーを取り付けたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ発光分光計ＬＳ−５５上で、蛍光測定を行った。１．０μＭのＴＦＯのみを用いたことを除いて、すべての場合で、Ｔｍ測定と同じ方式で、三重鎖および二重鎖を形成した。２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０の緩衝液中、１０℃でスペクトルを記録した。
【実施例１０】
【０１２０】
合成したオリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、逆相（ＤＭＴ−オン）およびイオン交換（ＤＭＴ−オフ）ＨＰＬＣ分析
【０１２１】
【表５】
2008541708.tif 000017
【０１２２】
［ａ］Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ４０００調製クロマトグラフィーシステム。緩衝液Ａ［９５０ｍｌの０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３および５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ（ｐＨ＝９．０）］および緩衝液Ｂ［２５０ｍｌの０．１  ＮＨ４ＨＣＯ３および７５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ（ｐＨ＝９．０）］。流速２．５ｍｌ／分。勾配：４分間の１００％  Ａ、１１分間の直線勾配で１００％  Ｂ、５分間の１００％  Ｂ、次いで、２分間の直線勾配で１００％  Ａ、そして３分間の１００％  Ａ；［ｂ］Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ４０００調製クロマトグラフィーシステム、［ａ］におけるのと同じ緩衝液。流速１．０ｍｌ／分。勾配：５分間の１００％  Ａ、３０分間の直線勾配で７０％  Ｂ、２分間の７０％  Ｂ、８分間の直線勾配で１００％  Ｂ、そして次いで、１５分間の１００％  Ａ；［ｃ］Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ７００半調製クロマトグラフィーシステム、緩衝液Ａ［Ｈ２Ｏ中の０．０５Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ＝７．０）］および緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中、７５％  ＣＨ３ＣＮ）。流速２．５ｍｌ／分。勾配：２分間の１００％  Ａ、３８分間の直線勾配で７０％  Ｂ、７分間の直線勾配で１００％  Ｂ、３分間の１００％  Ｂ、そして次いで１０分間の１００％  Ａ；［ｄ］ＧｅｎＰａｋ−Ｆａｘカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上のＭｅｒｃｋ  ＨｉｔａｃｈｉのＬａＣｈｒｏｍシステム。緩衝液Ａ［Ｈ２Ｏ中の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）］および緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中の１Ｍ  ＮａＣｌ）。流速０．７５ｍｌ／分。勾配：５分間の９７％  Ａおよび３％  Ｂ、４１分間の直線勾配で３５％  Ｂ、３分間の直線勾配で、７５％  Ｂ、そして次いで、１０分間の９７％  Ａおよび３％  Ｂ。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２中、増加する温度（１℃／分）に対する、２６０ｎｍで記録する三重鎖融解の一次導関数プロット。
【図２】一本鎖逆平行および平行二重鎖、ならびに平行三重鎖の蛍光スペクトル。測定条件：１０℃で緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中の各鎖１μＭ、励起：３７３ｎｍ（励起スリット４．０ｎｍ）、発光：３８０〜６００ｎｍ（Ａ、Ｂ、Ｅに関しては、発光スリット２．５ｎｍ、ならびにＣおよびＤに関しては０．０ｎｍ）。異なる条件下で記録したスペクトルにおいて、参照として、ＯＮ６およびＯＮ１２を用いた。
【図３】一本鎖逆平行および平行二重鎖、ならびに平行三重鎖の蛍光スペクトル。測定条件：１０℃で緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中の各鎖１μＭ、励起：３７３ｎｍ（励起スリット４．０ｎｍ）、発光：３８０〜６００ｎｍ（Ａ、Ｂ、Ｅに関しては、発光スリット２．５ｎｍ、ならびにＣおよびＤに関しては０．０ｎｍ）。異なる条件下で記録したスペクトルにおいて、参照として、ＯＮ６およびＯＮ１２を用いた。
【図４】一本鎖逆平行および平行二重鎖、ならびに平行三重鎖の蛍光スペクトル。測定条件：１０℃で緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中の各鎖１μＭ、励起：３７３ｎｍ（励起スリット４．０ｎｍ）、発光：３８０〜６００ｎｍ（Ａ、Ｂ、Ｅに関しては、発光スリット２．５ｎｍ、ならびにＣおよびＤに関しては０．０ｎｍ）。異なる条件下で記録したスペクトルにおいて、参照として、ＯＮ６およびＯＮ１２を用いた。
【図５】一本鎖逆平行および平行二重鎖、ならびに平行三重鎖の蛍光スペクトル。測定条件：１０℃で緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中の各鎖１μＭ、励起：３７３ｎｍ（励起スリット４．０ｎｍ）、発光：３８０〜６００ｎｍ（Ａ、Ｂ、Ｅに関しては、発光スリット２．５ｎｍ、ならびにＣおよびＤに関しては０．０ｎｍ）。異なる条件下で記録したスペクトルにおいて、参照として、ＯＮ６およびＯＮ１２を用いた。
【図６】一本鎖逆平行および平行二重鎖、ならびに平行三重鎖の蛍光スペクトル。測定条件：１０℃で緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ６．０）中の各鎖１μＭ、励起：３７３ｎｍ（励起スリット４．０ｎｍ）、発光：３８０〜６００ｎｍ（Ａ、Ｂ、Ｅに関しては、発光スリット２．５ｎｍ、ならびにＣおよびＤに関しては０．０ｎｍ）。異なる条件下で記録したスペクトルにおいて、参照として、ＯＮ６およびＯＮ１２を用いた。
【図１】
2008541708.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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