(57)【要約】  本発明は、疾患、特にガンなどの増殖性疾患の処置において使用するため、及び増殖性疾患の処置で使用する薬剤の製造において使用するための式（I）の化合物を提供する。また本発明は、かかる化合物の製造プロセス並びに活性成分としてこれらを含む医薬組成物を提供する。2008542345.tif 000020
2008542345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
【化１】
2008542345.tif 000017
{式中、R1は水素またはメチルであり、且つXは結合または酸素である}の化合物またはその塩。
【請求項２】
式中、Xが結合である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(2R)-ピロリジン-2-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミドである、請求項２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-{[(2R)-1-メチルピロリジン-2-イル]メトキシ}キナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドである、請求項２に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
Xが酸素である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(3R)-モルホリン-3-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミドである、請求項５に記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-{[(3R)-4-メチルモルホリン-3-イル]メトキシ}キナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドである、請求項５に記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
請求項１に記載の式（I）の化合物またはその塩と、医薬的に許容可能な希釈剤若しくはキャリヤとを関連して含む、医薬組成物。
【請求項９】
薬剤として使用するための、請求項１に記載の式（I）の化合物、または医薬的に許容可能なその塩。
【請求項１０】
過剰増殖性疾患の処置用薬剤の製造における、請求項１に記載の式（I）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項１１】
前記過剰増殖性疾患がガンである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記過剰増殖性疾患が、結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺癌ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガンまたは白血病若しくはリンパ腫のうちのいずれか一つまたは任意の組み合わせである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
過剰増殖性疾患に罹患しているヒトの処置法であって、式（I）の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の治療的有効量をかかる処置の必要なヒトに投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１４】
前記過剰増殖性疾患がガンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記過剰増殖性疾患が、結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺癌ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガンまたは白血病若しくはリンパ腫のうちのいずれか一つまたは任意の組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式（I）｛式中、R1はメチルである｝の化合物の製造プロセスであって、式（I）{式中、R1は水素である}の化合物とホルムアルデヒドとを、蟻酸中50℃〜100℃などの高温で、30分〜２時間の時間反応させ、その後、必要により
i)  全ての保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む前記方法。
【請求項１７】
式（I）｛式中、R1は水素である｝の化合物の製造プロセスであって、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドと、式(II)：
【化２】
2008542345.tif 000018
｛式中、PGはtert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基である｝のアルコールと反応させ、その後、必要により
i)  保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む前記方法。
【請求項１８】
式（I）{式中、R1は水素である}の化合物の製造プロセスであって、式(III)：
【化３】
2008542345.tif 000019
｛式中、PGはtert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基であり、Lはクロロなどの好適な離脱基である｝の化合物と2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドとを反応させ、その後、必要により
i)  保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、疾病、特にガンなどの増殖性疾患の処置、増殖性疾患の処置で使用するための薬剤の製造において使用するためのキナゾリン誘導体、及びその製造プロセス、並びに活性成分としてこれらを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
ガン(及び他の過剰増殖性疾患(hyperproliferative  disease))は、制御のできない細胞増殖を特徴とする。細胞増殖の正常な制御が損なわれると、細胞周期によって進展を制御する細胞経路に遺伝子損傷を与えることが多い。
【０００３】
真核生物において、タンパク質リン酸化の規則正しいカスケードが細胞周期を制御すると考えられている。このカスケードで重要な役割をはたすプロテインキナーゼの幾つかのファミリーが同定されてきている。正常な組織と比較したときに、これらのキナーゼの多くの活性が、ヒト腫瘍では高い。これは(たとえば遺伝子増幅の結果として)タンパク質の高い発現レベル、またはコアクチベータ若しくは阻害タンパク質の発現における変化によって起きることがある。
【０００４】
これらの周期調節剤の最初に同定され、且つ最も広く研究されたものは、サイクリン依存性キナーゼ(即ちCDK)であった。近年、CDKファミリーと構造的に区別されるプロテインキナーゼが、細胞周期の制御に重要な役割を果たすことが同定されてきた。これらのキナーゼは腫瘍形成で重要であるように思われ、ドロソフィラ・オーロラ(Drosophila  aurora)及びサッカロマイセス・セレヴィシエ(S.cerevisiae）Ipl1タンパク質のヒト相同体がある。これらの遺伝子オーロラA、オーロラB及びオーロラC(それぞれオーロラ２、オーロラ１及びオーロラ３としても公知)の三種類のヒト相同体は、細胞周期調節セリン−スレオニンプロテインキナーゼ(Adamsら、2001、Trends  in  Cell  Biology，11(2)：49-54に要約されている)をコードし、これはG2及び有糸分裂を通してキナーゼ活性及び発現のピークを示す。幾つかの観察結果から、ヒトオーロラタンパク質がガンに関与しているとされている。
【０００５】
オーロラA遺伝子は、染色体20q13、乳ガン及び結腸ガンの両方を含むヒト腫瘍で増幅されることが多い領域に位置する。オーロラAのDNAは増幅され、mRNAは原発性ヒト結腸直腸ガン(primary  human  colorectal  cancer)の50％を上回って過剰発現するので、オーロラAはこの単位複製配列の主なターゲット遺伝子かもしれない。これらの腫瘍において、オーロラAタンパク質レベルは、隣接する正常組織と比較して非常に高いようである。さらにヒトオーロラAをもつ齧歯類線維芽細胞をトランスフェクションすると、トランスフォーメーションをおこし、軟寒天中で増殖する能力を与え、ヌードマウスで腫瘍を形成する(Bischoffら、1998、The  EMBO  Journal．17(11)：3052-3065)。他の研究(Zhouら、1998、Nature  Genetics．20(2)：189-93)から、オーロラAの人為的な過剰発現によって、ガンの進行で公知事象である、異数性(aneuploidy)の増大及び中心体の増大を引き起こすことが明らかになった。
【０００６】
正常細胞と比較したときに、腫瘍細胞ではオーロラB(Adamsら、2001、Chromsoma．110(2)：65-74)とオーロラC(Kimuraら、1999、Journal  of  Biological  Chemistry，274(11)：7334-40)の発現が増加することも明らかになった。オーロラBはガン細胞でも過剰発現され、高レベルのオーロラBは、結腸直腸ガンの進行段階と相関することが示された(Katayamaら、(1999)J  Natl  Cancer  Inst．91：1160)。さらにある報告では、オーロラBの過剰発現によって、セリン10におけるヒストンH3の高いリン酸化による異数性を誘発し、オーロラBを過剰発現する細胞は転移を進行させるもより攻撃的な腫瘍を形成すると示唆している(Ota，T.ら、2002、Cancer  res  62：5168-5177)。オーロラBは、少なくとも三つの他のパッセンジャータンパク質(passenger  protein)、スルビビン(Survivin)、INCENP及びボレアリン(Borealin）と安定な複合体を形成して存在する染色体パッセンジャータンパク質である(Carmena  Mら、2003、Nat．Rev．Mol．Cell  Biol．4：842-854)。スルビビンはガンでもアップレギュレーションされ、BIR(アポトーシスタンパク質のバキュロウイルス阻害剤(IAP)リピート：Baculovirus  Inhibitor  of  apoptosis  protein(IAP)Repeat)ドメインを含むので、アポトーシス及び／または有糸分裂の異常由来の腫瘍細胞の保護に関与しているかもしれない。
【０００７】
オーロラCに関しては、その発現は種々のガン株(cancer  line)で過剰発現していることが知見されているが、精巣に限定されていると考えられている(Katayama  Hら、2003、Cancer  and  Metastasis  Reviews  22：451-464)。
【０００８】
重要なことには、オーロラAの発現の停止及びヒト腫瘍細胞系でのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置(PCT国際公開第WO97/22702号及び同第WO99/37788号)から、細胞周期を阻み、これらの腫瘍細胞系で抗増殖効果を発揮することが示された。さらに、オーロラAとオーロラBの小分子阻害剤は、siRNA処置によってオーロラBの発現だけが選択的に停止される(Ditchfieldら、2003、Journal  of  Cell  Biology，161(2)：267-280)ように、ヒト腫瘍細胞中で抗増殖作用を持つことが示された(Keenら、2001、Poster  #2455、American  Association  of  Cancer  research  annual  meeting)。このことは、オーロラA及び／またはオーロラBの機能を阻害すると、ヒト腫瘍及び他の過剰増殖性疾患の処置で役立ちそうな抗増殖作用をもつことを示す。これらの疾患に対する治療的アプローチとして一種以上のオーロラキナーゼを阻害すると、細胞周期のシグナリング経路上流を対象とする(EGFR)または他のレセプターなどの増殖因子レセプターチロシンキナーゼによって活性化されるもの)よりも非常に有利であろう(たとえば、上皮増殖因子レセプター。
【０００９】
細胞周期は、これらの種々のシグナリング事象全ての下流であるので、一種以上のオーロラキナーゼの阻害などの細胞周期に向けて行われる治療は、全ての増殖性腫瘍細胞で活性であると予測されるが、特定のシグナリング分子(たとえばEGFR)に向けて行われるアプローチは、これらの受容体を発現する腫瘍細胞の小集団(subset)でのみ活性であると考えられる。これらのシグナリング経路の間には重要なクロストークが存在しており、このことは一方の成分を阻害すると他方によって補われるかもしれないことを意味する。
【００１０】
多くのキナゾリン誘導体は一種以上のオーロラキナーゼの阻害で使用するために既に提案されてきている。PCT国際公開第WO04/94410号は、ピラゾール環で弛緩されたキナゾリン誘導体について開示する。これらの化合物は、一種以上のオーロラキナーゼを阻害し、且つヒト腫瘍細胞系SW620由来の細胞の成長を阻害することが可能である。そのような化合物の一例としては、以下のものがある。
【００１１】
【化１】
2008542345.tif 000003
【００１２】
この活性をもつさらに強力な化合物が必要であり、そのような化合物が化学療法薬に耐性であることが公知の細胞で、特に排出系トランスポーター(efflux  transporter)を過剰発現する細胞で活性であれば、好都合であろう。排出系トランスポーターの例としては、p-糖タンパク質、多剤耐性に関連するタンパク質(multidrug  resistance  associated  protein)１、２、３、４及び５、BCRP、BSEP並びにsPgpが挙げられる。
【００１３】
本出願人は、細胞中で、特に耐性細胞中でより強力であり、且つオーロラキナーゼ酵素に対して高い活性をもつ、PCT国際公開第WO04/94410号に開示されたような小規模に選択された化合物群、一般に、選択されたサブグループを意外にも知見した。
【００１４】
この化合物は特に、オーロラAキナーゼ及び／またはオーロラBキナーゼの作用を阻害するので、ガンなどの過剰増殖性疾患の処置で有用である。特に、本化合物は、充実性または血液の腫瘍、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫の任意の一種またはその任意の組み合わせを処置するのに使用し得る。
【００１５】
従って、本発明の一つの側面は、式(I)：
【００１６】
【化２】
2008542345.tif 000004
【００１７】
の化合物またはその塩を提供することであり、式中、R1は水素またはメチルであり、Xは結合であるか、または酸素である。
さらなる側面として、式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００１８】
本発明の化合物は、コンピューターソフトウェア(ACD/Nameバージョン8.0)を使用して名付けた。
本発明において、本発明の化合物は、互変異性体の現象を示すことができ、且つ本明細書内の図式は、可能な互変異性形のたった一つを示すにすぎないことを理解すべきである。本発明は、オーロラキナーゼ阻害活性、特にオーロラA及び／またはオーロラBキナーゼ阻害活性をもつ全ての互変異性形を包含し、且つ図式で使用された任意の一つの互変異性形に限定されないものと理解すべきである。
【００１９】
本発明の特定の化合物及びその塩は、溶媒和形並びに非溶媒和形、たとえば水和形で存在し得るものと理解すべきである。本発明は、オーロラキナーゼ阻害活性、特にオーロラA及び／またはオーロラBキナーゼ阻害活性をもつそのような全ての溶媒和形を包含するものと理解すべきである。
【００２０】
本発明は、本明細書中に定義の式(I)の化合物並びにその塩に関する。医薬組成物中で使用するための塩は、医薬的に許容可能な塩であるが、他の塩も式(I)の化合物及びその医薬的に許容可能な塩の製造で有用であるかもしれない。本発明の医薬的に許容可能な塩としては、たとえばそのような塩を形成するのに十分に塩基性である、本明細書中に定義された式(I)の化合物の酸付加塩が挙げられる。そのような酸付加塩としては、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、及びマレイン酸塩並びにリン酸及び硫酸と形成した塩が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、式(I)の化合物が十分に酸性である場合、塩は塩基塩であり、ナトリウム若しくはカリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム若しくはマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、またはトリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、N-メチルピペリジン、N-エチルピペリジン、ジベンジルアミンまたはリジンなどのアミノ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
式(I)の化合物は、式（I）の化合物を提供するためにヒトまたは動物の体内で分解するプロドラッグの形態でも投与することができる。従って、本発明は式(I)の化合物のプロドラッグも提供する。プロドラッグの種々の形態は公知である。そのようなプロドラッグ誘導体の例としては、以下のものを参照されたい。
【００２２】
a)  Design  of  Prodrugs，H．Bundgaard編(Elsevier，1985)及びMethods  in  Enzymology，第42巻，309-396頁，K．Widder編(Academic  Press，1985)；
b)  A  Textbook  of  Drug  Design  and  Development，Krogsgaard-Larsen及びH．Bundgaard編，第５章，“Design  and  Application  of  Prodrugs”，H．Bundgaard，113-191頁(1991)；
c)  H．Bundgaard，Advanced  Drug  Delivery  Reviews，8，1-38(1992)；
d)  H．Bundgaardら、Journal  of  Pharmaceutical  Sciences，77，285(1988)；及び
e)  N．Kakeyaら、Chem  Pharm  Bull，32，692(1984)。
【００２３】
本発明の一つの側面において、Xは結合である。Xが結合であるとき、本発明は、式(IA)：
【００２４】
【化３】
2008542345.tif 000005
【００２５】
｛式中、R1は水素またはメチルである｝の化合物またはその塩を提供する。
Xが結合であり、且つR1が水素であるとき、式(I)の化合物は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(2R)-ピロリジン-2-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミドである。Xが結合であり、且つR1がメチルであるとき、式(I)の化合物は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-{[(2R)-1-メチルピロリジン-2-イル]メトキシ}キナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドである。
【００２６】
本発明の別の側面では、Xは酸素である。Xが酸素であるとき、本発明は、式(IB)：
【００２７】
【化４】
2008542345.tif 000006
【００２８】
｛式中、R1は水素またはメチルである｝の化合物またはその塩を提供する。
Xが酸素であり、且つR1が水素であるとき、式(I)の化合物は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(3R)-モルホリン-3-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミドである。Xが酸素であり、且つR1がメチルであるとき、式(I)の化合物は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-{[(3R)-4-メチルモルホリン-3-イル]メトキシ}キナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドである。
【００２９】
本発明の化合物は、式(I)｛式中、R1はメチルである｝の化合物の製造プロセスも提供し、そのプロセスは、式(I)｛式中、R1は水素である｝の化合物とホルムアルデヒドとを、50℃〜100℃などの高温で、蟻酸中、30分〜２時間反応させ、その後必要により、
i)  全ての保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む。
【００３０】
式(I)｛式中、R1は水素である｝の化合物の製造プロセスは、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドと、式(II)：
【００３１】
【化５】
2008542345.tif 000007
【００３２】
｛式中、PGは、tert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基である｝のアルコールとを反応させ、その後、必要により：
i)  全ての保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む。
【００３３】
この反応は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドと、式(II)のアルコールとを、ジ-tert-ブチルアゾジカルボキシレートなどの好適なカップリング剤及び、トリフェニルホスフィンなどの好適なホスフィンの存在下、テトラヒドロフランなどの溶媒中、20〜60℃の温度で１〜５時間カップリングするなど、文献記載の条件の範囲下で実施することができる。
【００３４】
あるいは、式(I)｛式中、R1は水素である｝の化合物は、式(III)：
【００３５】
【化６】
2008542345.tif 000008
【００３６】
｛式中、PGは、tert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基であり、Lはクロロなどの好適な離脱基である｝の化合物と、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドとを反応させ、その後、必要により：
i)  全ての保護基を除去する；及び／または
ii)  その塩を形成する、各段階を含む。
【００３７】
この反応は、式(III)の化合物と、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドとを、イソプロパノールまたはジメチルアセトアミドなどの溶媒中、塩酸などの酸触媒を任意に使用して、２０〜１００℃の温度で30分〜２４時間反応させるなど、文献記載の条件の範囲下で実施することができる。
【００３８】
本発明は、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドの製造プロセスも提供し、このプロセスは、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドと、ピリジン塩酸塩または臭化マグネシウムなどの好適な脱メチル化剤との、ピリジンまたはテトラヒドロフランなどの溶媒中、60〜120℃で５〜48時間の反応を含む。
【００３９】
前記プロセスはさらに、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドの製造プロセスを含み、このプロセスは、式(IV)：
【００４０】
【化７】
2008542345.tif 000009
【００４１】
｛式中、Lはクロロなどの好適な離脱基である｝の化合物と、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドとの反応を含む。そのような反応は、式(IV)の化合物と、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドとを、イソプロパノールまたはジメチルアセトアミドなどの溶媒中、塩酸などの酸触媒を任意に使用して、20〜100℃の温度で30分〜24時間の加熱するなどの文献記載の条件の範囲下で実施することができる。
【００４２】
式(IV)の化合物は、慣用法によって製造することができる。特に式(IV)の化合物は、ジ-イソ-プロピルエチルアミンなどの好適な塩基の存在下、1,2-ジクロロエタンまたはアセトニトリルなどの好適な溶媒中、7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4(3H)-オンとオキシ塩化リンなどの好適な塩素化剤と、０〜80℃で２〜24時間の反応によって製造することができる。
【００４３】
7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4(3H)-オンなどの化合物は、慣用法によって製造することができる。特に7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4(3H)-オンは、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、または1-メチル-2-ピロリジノンなどの好適な溶媒中、5,7-ジエトキシキナゾリン-4(3H)-オンとナトリウムメトキシドとの、90〜110℃の温度で６〜24時間の反応によって製造することができる。
【００４４】
5,7-ジエトキシキナゾリン-4(3H)-オンなどの化合物は、慣用法によって製造することができる。特に5,7-ジエトキシキナゾリン-4(3H)-オンは、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、または1-メチル-2-ピロリジンなどの溶媒中、5,7-ジフルオロキナゾリン-4(3H)-オンとナトリウムメトキシドとの、90〜110℃の温度で２〜１２時間の反応によって製造することができる。
【００４５】
5,7-ジフルオロキナゾリン-4(3H)-オンは公知である。
本発明は、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドの製造プロセスも提供し、このプロセスは、塩酸などの濃縮水性の酸の存在下、酢酸エチルなどの好適な溶媒中でのN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(ジフェニルメチレン)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドの加水分解を含む。
【００４６】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(ジフェニルメチレン)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミドは、式(V)：
【００４７】
【化８】
2008542345.tif 000010
【００４８】
｛式中、Xはブロモまたはヨードなどのハロゲンである｝の化合物とベンゾフェノンイミンとの反応を含む。この反応は、1,4-ジオキサンなどの溶媒中、ナトリウムtert-ブトキシド、炭酸セシウム、炭酸カリウムまたはリン酸カリウムなどの好適な塩基触媒の存在下、(9,9-ジメチル-9H-キサンテン-4,5-ジイル)ビス(ジフェニルホスフィン)、1,1’-ビナフタレン-2,2’-ジイルビス(ジフェニルホスフィン)または1,1’-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセンなどの好適なリガンドの存在下、及びトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)または酢酸パラジウムなどの好適な触媒の存在下、90℃などの温度で30分〜６時間、式(V)の化合物とベンゾフェノンイミンとを加熱するなどの文献記載の条件の範囲下で実施することができる。
【００４９】
このプロセスは、式(V)の化合物の製造プロセスをさらに含み、このプロセスは、式(VI)：
【００５０】
【化９】
2008542345.tif 000011
【００５１】
｛式中、Xはブロモまたはヨードなどのハロゲンである｝の化合物と、式(VII)：
【００５２】
【化１０】
2008542345.tif 000012
【００５３】
｛式中、Lはクロロまたはブロモなどの離脱基である｝の化合物との反応を含む。この反応は、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、ジメチルアセトアミドなどの溶媒中、式(VI)の化合物と式(VII)の化合物とを20℃などの温度で14〜48時間反応させるなど文献に記載の条件範囲で実施することができる。
【００５４】
式(VI)及び(VII)の化合物は公知であるか、文献より明らかになるであろう慣用法によって公知の他の化合物から誘導することができる。
あるいは、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドは、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)アセトアミドの還元によって製造することができる。この反応は、１〜５バールの水素雰囲気下、酸化プラチナまたは炭素に担持させたパラジウムなどの好適な触媒の存在下、エタノール及び／または酢酸エチルなどの好適な溶媒中、20℃などの好適な温度で、0.5〜５時間、N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)アセトアミドを還元するなどの文献記載の条件範囲下で実施することができる。
【００５５】
N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)アセトアミドは、(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸と2,3-ジフルオロアニリンとの反応によって製造することができる。この反応は、ジクロロメタンなどの溶媒中で０〜20℃で２〜３時間、(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸と2,3-ジフルオロアニリンとをカップリングするなどの文献記載の条件範囲下で製造することができる。
【００５６】
(4-ニトロ-1H-ピラゾール-1-イル)酢酸と2,3-ジフルオロアニリンは公知である。
本発明はさらに、式(III)の化合物の製造プロセスを提供し、このプロセスは、式(VIII)：
【００５７】
【化１１】
2008542345.tif 000013
【００５８】
｛式中、PGはtert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基である｝の化合物と、オキシ塩化リンなどの好適な塩素化剤との、1,2-ジクロロメタンまたはアセトニトリルなどの好適な溶媒中、ジ-イソ-プロピルエチルアミンなどの好適な塩基の存在下、０〜80℃で２〜24時間の反応を含む。
【００５９】
このプロセスは、式(VIII)｛式中、PGは、tert-ブトキシカルボニル(BOC)、ベンジルオキシカルボニル(Z)または9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)などの好適な保護基である｝の化合物の製造プロセスもさらに含み、このプロセスは、7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オンと式(II)の化合物とを反応させ、続いて保護基を変換することを含む。7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オンを式(II)の化合物と反応させる場合、PGは水素であるか、ベンジルなどの好適な保護基である。この反応は、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、または1-メチル-2-ピロリジノンなどの溶媒中、7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オンと式(II)｛式中、PGは水素またはベンジルなどの好適な保護基である｝の化合物と、水素化ナトリウムまたはカリウムtert-ブトキシドなどの塩基と共に、20〜100℃の温度で、２〜24時間反応させるなどの文献記載の条件範囲下で実施することができる。
【００６０】
式(II)｛式中、PGは水素または、ベンジルなどの好適な保護基である｝の化合物は公知であるか、文献から明らかになるだろう慣用法により当業者に公知の他の化合物から誘導することができる。
【００６１】
7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オンは、2-アミノ-4-エトキシ-6-フルオロベンゾニトリルと蟻酸とを、硫酸などの触媒量の鋼酸と、100℃などの温度で２〜24時間の反応により製造することができる。
【００６２】
2-アミノ-4-エトキシ-6-フルオロベンゾニトリルなどの化合物は、公知であるか、公知であるか、文献から明らかになるだろう慣用法により当業者に公知の他の化合物から誘導することができる。
【００６３】
本発明の化合物の種々の環置換基の幾つかは、上記プロセスの前または直後に標準的な芳香族置換反応によって導入するか、または慣用の官能基変形によって生成することができ、それ自体本発明のプロセス側面に含まれる。そのような反応及び変形としては、芳香族置換反応による置換基の導入、置換基の還元、置換基のアルキル化及び置換基の酸化が挙げられる。そのような手順の試薬及び反応条件は、化学業界で公知である。芳香族置換反応の特別な例としては、濃硝酸を使用するニトロ基の導入、フリーデルクラフツ条件下、ハロゲン化アシル及びルイス酸(たとえば三塩化アルミニウム)などを使用するアシル基の導入；フリーデルクラフツ条件下、ハロゲン化アシル及びルイス酸(たとえば三塩化アルミニウム)を使用するアルキル基の導入；並びにハロゲン基の導入が挙げられる。変形の特別な例としては、ニッケル触媒を使用する接触水素化、加熱しながら、塩酸の存在下での鉄との処理によるニトロ基のアミノ基への還元；アルキルチオのアルキルスルフィニルまたはアルキルスルホニルへの酸化が挙げられる。
【００６４】
本明細書に記載の反応によっては、化合物中の感受性の基を保護するのが必要/好ましいことも理解されよう。保護が必要であるか、望ましい場合及び保護法は、当業者には公知である。慣用の保護基は、標準的な技法(T．W．Green、Protective  Groups  in  Organic  Synthesis，John  Wiley  and  Sons，1991)に従って使用することができる。かくして、反応体がアミノ、カルボキシまたはヒドロキシなどの基を含む場合、本明細書中の反応によってはこの基を保護することが望ましい場合もある。
【００６５】
アミノまたはアルキルアミノの好適な保護基は、たとえばアシル基、たとえばアセチルなどのアルカノイル基、アルコキシカルボニル基、たとえばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、若しくはtert-ブトキシカルボニル、アリールメトキシカルボニル基、たとえばベンジルオキシカルボニル、またはアロイル基、たとえばベンゾイルがある。上記保護基の脱保護条件は、保護基の選択によって必然的に変動する。かくして、アシル基たとえばアルカノイル、またはアルコキシカルボニル基若しくはアロイル基は、アルカリ金属の水酸化物、たとえば水酸化リチウムまたはナトリウムなどの好適な塩基との加水分解により除去することができる。あるいは、tert-ブトキシカルボニル基などのアシル基は、塩酸、硫酸若しくはリン酸、またはトリフルオロ酢酸などの好適な酸との処理により除去することができ、またベンジルオキシカルボニル基などのアリールメトキシカルボニル基は、炭素上に担持させたパラジウムなどの触媒上での水素化、若しくはホウ素トリス(トリフルオロアセテート)などのルイス酸との処置により除去することができる。一級アミノ基の好適な別の保護基は、たとえばアルキルアミン、たとえばジメチルアミノプロピルアミン、またはヒドラジンとの処理によって除去することができる、フタロイル基がある。
【００６６】
ヒドロキシ基の好適な保護基は、たとえばアシル基、たとえばアセチルなどのアルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンジルなどのアリールメチル基がある。上記保護基の脱保護は、保護基の選択によって必然的に変動する。かくして、アルカノイル若しくはアロイル基などのアシル基は、アルカリ金属の水酸化物、たとえば水酸化リチウムまたはナトリウムなどの好適な塩基との加水分解によって除去することができる。あるいはベンジル基などのアリールメチル基は、炭素上に担持させたパラジウムなどの触媒上での水素化によって除去することができる。
【００６７】
カルボキシ基の好適な保護基は、たとえばエステル形成基、たとえば水酸化ナトリウムなどの塩基との加水分解によって除去し得るメチル若しくはエチル基、または酸、たとえばトリフルオロ酢酸などの有機酸との処理によって除去し得るtert-ブチル基、または炭素上に担持させたパラジウムなどの触媒上の水素化によって除去し得るベンジル基がある。
【００６８】
保護基は、化学業界で公知の慣用法を使用して合成の任意の慣用段階で除去することができる。
本発明のさらなる側面にしたがって、本発明は、医薬的に許容可能な希釈剤またはキャリヤと共同して、上記定義の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩を含む医薬組成物も提供する。
【００６９】
本発明の組成物は、経口用途(たとえば、錠剤、ロゼンジ、ハード若しくはソフトカプセル、水性若しくは油性懸濁液、エマルション、分散性粉末若しくは粒子、シロップまたはエリキシル)、局所用(たとえばクリーム、軟膏、ゲル、または水性若しくは油性溶液若しくは懸濁液)、吸入投与用(たとえば微粉末若しくは液体エーロゾル)、吸入投与用(insufflation)(たとえば微粉末)または非経口投与用(たとえば静脈内、皮下、筋肉内または筋肉内投与用の滅菌水性若しくは油性溶液、あるいは直腸投与用の座薬)に好適な形態であってもよい。
【００７０】
本発明の組成物は、当業界で公知の慣用の医薬賦形剤を使用して慣用手順にて得ることができる。かくして、経口用途用の組成物は、たとえば一種以上の着色剤、甘味料、フレーバー剤及び／または防腐剤を含むことができる。
【００７１】
錠剤の製剤に好適な医薬的に許容可能な賦形剤としては、たとえば不活性希釈剤、たとえばラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム若しくは炭酸カルシウム、造粒剤及び崩壊剤、たとえばコーンスターチ若しくはアルギン酸；結合剤、たとえばスターチ；潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク；防腐剤、たとえばエチル若しくはプロピルp-ヒドロキシ安息香酸及び酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸が挙げられる。錠剤は、崩壊性を変えて、続いて胃腸管の中で活性成分が吸収されるように、または当業界で公知の慣用のコーティング剤及び手順を使用して、どちらの場合でもその安定性及び／または外観を改善するために、コーティングしてもしなくてもよい。
【００７２】
経口用途用組成物は、活性成分を不活性固体希釈剤、たとえば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合するハードゼラチンカプセル、または活性成分を水や、ピーナッツ油、液体パラフィン、大豆油、ヤシ油、好ましくはオリーブ油などの油、または他の許容可能なビヒクルと混合するソフトゼラチンカプセルなどの形態であってもよい。
【００７３】
水性懸濁液は通常、一種以上の懸濁化剤、たとえばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム；分散剤または湿潤剤、たとえばレシチンまたは、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物(たとえばポリオキシエチレンステアレート)、若しくはエチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタノール、若しくはエチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトールから誘導した部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシエタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトールから誘導した部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導した部分エステルとの縮合生成物、たとえばポリエチレンソルビタンモノオレエートと一緒に微粉末形の活性成分を含む。水性懸濁液は、一種以上の防腐剤(たとえばエチルまたはプロピルp-ヒドロキシベンゾエート、酸化防止剤(たとえばアスコルビン酸)、着色剤、フレーバー剤及び／または甘味料(たとえば蔗糖、サッカリン若しくはアスパルテーム)も含むことができる。
【００７４】
油性懸濁液は、植物油(たとえば落花生油、オリーブ油、ごま油若しくはヤシ油)または鉱油(たとえば液体パラフィン)中に活性成分を懸濁することによって配合することができる。油性懸濁液は蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤も含むことができる。上記のような甘味料及びフレーバー剤を添加して、口当たりのよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤を添加することによって保存することができる。
【００７５】
水を添加することによって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び凍結乾燥粉末並びに顆粒は、通常、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤及び一種以上の保存料と一緒に活性成分を含む。好適な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤は、既に記載済みである。甘味料、フレーバー剤及び着色剤などの追加の賦形剤も配合することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態であってもよい。この油相は植物油、たとえばオリーブ油若しくは落花生油、または鉱油、たとえば液体パラフィンあるいはこれらの任意のものの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、たとえば天然ゴム、たとえばアカシアゴム若しくはトラガカントゴム、天然リン脂質、たとえば大豆、レシチン、脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導したエステル若しくは部分エステル(たとえばソルビタンモノオレエート)及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。エマルションは甘味料、フレーバー剤及び防腐剤も含むことができる。
【００７７】
シロップ及びエリキシルは、甘味料、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたは蔗糖と一緒に配合することができ、粘滑薬(demulcent)、保存料、フレーバー剤及び／または着色剤も含むことができる。
【００７８】
医薬組成物は、滅菌の注射可能な水性または油性懸濁液、溶液、エマルションまたは、上記した好適な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁化剤の一種以上を使用する公知手順にしたがって配合し得る形状であってもよい。滅菌注射製剤は、ポリエチレングリコールなどの非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌の注射溶液または懸濁液であってもよい。
【００７９】
座薬用製剤は、活性成分と、通常の温度では固体であるが、直腸内では液体であるので、直腸内で溶けて薬剤を放出する、好適な非刺激性賦形剤とを混合することによって製造することができる。好適な賦形剤としては、ココアバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８０】
局所用製剤、たとえばクリーム、軟膏、ゲル及び水性若しくは油性溶液または懸濁液は、通常、活性成分と局所適用可能な賦形剤若しくは希釈剤とを、当業界で公知の慣用法を使用して配合することによって得ることができる。
【００８１】
吸入投与用組成物は、平均粒径約30μｍ以下、好ましくは５μｍ以下、より好ましくは５μｍ〜１μｍの粒子を含む微粉末の形状であってもよく、この粉末は活性成分単独を含むか、またはラクトースなどの一種以上の生理学的に許容可能なキャリヤで希釈する。次いで吸入用粉末は、公知薬剤であるクロモグリク酸ナトリウムの吸入で使用するような、ターボ-吸入器で使用するために活性成分１〜５０mgを含むカプセルに保持すると好都合である。
【００８２】
吸入投与用薬剤は、微粉砕固体を含むエーロゾルまたは液滴として活性成分を分配するようにした慣用の加圧エーロゾルの形状であってもよい。揮発性フッ化炭化水素及び炭化水素などの慣用のエーロゾル噴射剤を使用し、このエーロゾル装置は活性成分の計量した分を分配するように準備すると好都合である。
【００８３】
製剤に関する詳細な情報に関しては、Comprehensive  Medicinal  Chemistry(Corwin  Hansch；Chairman  of  Editorial  Board)，Pergamon  Press，1990の第5巻、第25.2章を参照されたい。
【００８４】
従って、本発明のさらなる側面では、治療で使用するための式(I)の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。さらに、薬剤として使用するための式(I)の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。本発明の別の側面では、ガンなどの過剰増殖性疾患の処置、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫などのいずれか一つまたは任意の組み合わせの処置で薬剤として使用するための、式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００８５】
さらに、治療によりヒトなどの温血動物の処置法で使用するための式(I)の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。本発明の別の側面では、ガンなどの過剰増殖性疾患の処置、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫などのいずれか一つまたは任意の組み合わせの処置法で使用するための、式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００８６】
本発明の別の側面では、一種以上の(単数または複数の)オーロラキナーゼの阻害が有益な疾患の処置における薬剤の製造における、式(I)の化合物、またはその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。特に、オーロラA及び／またはオーロラBキナーゼの阻害が有益であると予想される。好ましくは、オーロラBキナーゼの阻害が有益である。本発明の別の側面では、ガンなどの過剰増殖性疾患の処置、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫などのいずれか一つまたは任意の組み合わせの処置用薬剤の製造における、式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００８７】
本発明の別の側面にしたがって、一種以上のオーロラキナーゼの阻害が有益である疾患の処置の必要なヒトに式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の治療的有効量を投与することを含む、一種以上のオーロラキナーゼの阻害が有益である疾患に罹患しているヒトの処置法で使用するための式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩を提供する。特に、オーロラAキナーゼ及び／またはオーロラBキナーゼの阻害が有益であると予想される。好ましくはオーロラBキナーゼの阻害が有益である。さらに、ガンなどの過剰増殖性疾患、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫などのいずれか一つまたは任意の組み合わせに罹患しているヒトの処置法における式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩であって、かかる疾患の処置の必要なヒトに式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の治療的有効量を投与する段階を含む、前記化合物を提供する。上記ヒトの処置法のいずれかにおける式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の使用は、本発明の側面も形成する。
【００８８】
本発明のさらなる側面において、一種以上のオーロラキナーゼの阻害が有益である疾患に罹患しているヒトなどの処置法であって、かかる疾患の処置の必要なヒトに式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の治療的有効量を投与する段階を含む、前記方法を提供する。
【００８９】
特に、オーロラAキナーゼ及び／またはオーロラBキナーゼの阻害が有益であると予想される。好ましくはオーロラBキナーゼの阻害が有益である。ガンなどの過剰増殖性疾患、特に結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン若しくは膵臓ガン、または白血病若しくはリンパ腫などのいずれか一つまたは任意の組み合わせに罹患しているヒトの処置法であって、かかる疾患の処置の必要なヒトに、式(I)の化合物またはその医薬的に許容可能な塩の治療的有効量を投与する段階を含む前記方法を提供する。
【００９０】
上記治療用途に関しては、投与量は使用する化合物、投与経路、所望の処置、疾患、動物またはヒトの年齢及び性別に依存して変動する。かくして投与サイズは、薬剤の公知原則に従って計算する。
【００９１】
治療または予防目的に関して式(I)の化合物を使用する際、分割した用量が必要な場合でも、たとえば0.05mg/kg〜50mg/kg体重の範囲の一日分の用量となるように投与する。通常、非経口経路を使用する場合には、少ない容量を投与する。かくして、たとえば静脈投与の場合、通常、たとえば0.05mg/kg〜25mg/kg体重の投与範囲(特に0.05mg/kg〜15mg/kg体重)を使用する。同様に、吸入により投与する場合、たとえば0.05mg/kg〜25mg/kg体重の投与範囲(特に0.05mg/kg〜10mg/kg体重)を使用する。
【００９２】
上記定義の処置は、単独治療として適用することができ、また本発明の化合物に加えて、慣用の外科手術若しくは放射線治療若しくは化学療法を含むことができる。そのような化学療法としては、以下の抗腫瘍剤のカテゴリーの一つ以上を含むことができる。
【００９３】
(i)  医学腫瘍学において使用される他の抗増殖/抗新生物薬及びその組み合わせてあって、アルキル化剤(たとえばシスプラチン、オキサプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド及びニトロソ尿素)；代謝拮抗物質(たとえばゲンタマイシン、並びに5-フルオロウラシル及びテガフルのようなフルオロピリジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド及びヒドロキシル尿素などの葉酸拮抗剤)；抗腫瘍抗生物質(たとえばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、ダクチノマイシン及びミトラマイシンのようなアントラサイクリン)；抗有糸分裂薬(たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びビノレルビンのようなビンカアルカロイド、並びにタキソール及びタキソテールのようなタキソイド並びにポロキナーゼ阻害剤)；並びにトポイソメラーゼ阻害剤(たとえばエトポシド及びテニポシドのようなエピポドフィロキシン、アムサクリン、トポテカン及びカンプトテシン)など；
(ii)  細胞増殖抑制薬であって、抗エストロゲン(たとえばタモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン及びヨードキシフェン)、エストロゲンレセプター・ダウンレギュレーター(たとえばフルベストラント)、抗アンドロゲン(たとえばビカルタミド、フルタミド、ニルタミド及び酢酸シプロテロン)、LHRHアンタゴニストまたはLHRHアゴニスト(たとえばゴセレリン、ロイプレリン及びブセレリン)、プロゲストゲン(たとえば酢酸メゲストロール)、アロマターゼ阻害剤(たとえばアナストロゾール、レトラゾール、ボラゾール及びエクセメスタン)並びにフィナステリドなどの5α-レダクターゼの阻害剤など；
(iii)  抗侵害活性薬(たとえば4-(6-クロロ-2,3-メチレンジオキシアニリノ)-7-[2-(4-メチルピペラジン-1-イル)エトキシ]-5-テトラヒドロピラン-4-イルオキシキナゾリン(AZD0530；国際特許出願国際公開第WO01/94341号)及びN-(2-クロロ-6-メチルフェニル)-2-{6-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]-2-メチルピリミジン-4-イルアミノ}チアゾール-5-カルボキサミド(ダサチニブ、BMS-354825；J.Med.Chem.，2004年、47、6658-6661)のようなc-Srcキナーゼファミリー阻害剤、マリマスタットのようなメタロプロテイナーゼ阻害剤並びにウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベータ機能の阻害剤またはヘパラナーゼに対する抗体など)；
(iv)  増殖因子機能の阻害剤：たとえばこのような増殖因子には、増殖因子抗体及び増殖因子レセプター抗体(たとえば抗-erbB2抗体タラツズマブ[Herceptin（商標）]、抗EGFR抗体パニツムマブ、抗-erbB1抗体セツキシマブ[C225])並びにSternらにより開示された任意の増殖因子または増殖因子レセプター抗体(oncology/haematology，2005，第54巻、11〜29頁)が挙げられ；そのような阻害剤としては、たとえばチロシンキナーゼ阻害剤、上皮増殖因子ファミリーの阻害剤(たとえばEGFRファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、たとえばN-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-メトキシ-6-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(ゲフィニチブ、ZD1839)、N-(3-エチニルフェニル)-6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)キナゾリン-4-アミン(エロチニブ、OSI-774)及び6-アクリルアミド-N-(3-クロロ-4-フルオロフェニル)-7-(3-モルホリノプロポキシ)キナゾリン-4-アミン(CI  1033)並びにerbB2チロシンキナーゼ阻害剤、たとえばラパチニブ)、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、たとえばイマチニブ、セリン/トレオニンキナーゼの阻害剤(たとえばRas/Rafシグナリング阻害剤、たとえばファルネシル・トランスフェラーゼ阻害剤、たとえばソラフェニブ(BAY  43-9006))並びにMEK、AKT及び／またはPI3Kキナーゼを介する細胞シグナリングの阻害剤、肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤、c-kit阻害剤、ablキナーゼ阻害剤、IGF受容体(インスリン様増殖因子)キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤(たとえばPH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528及びAX39459)並びにサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、たとえばCDK2及び／またはCDK4阻害剤；
(v)  他の抗血管形成薬、たとえば血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの[たとえば抗-血管内皮細胞増殖因子抗体ベバチツマブ(Avastin(商標))及びVEGFレセプターチロシンキナーゼ阻害剤、たとえば4-(4-ブロモ-2-フルオロアニリノ)-6-メトキシ-7-(1-メチルピペリジン-4-イルメトキシ)キナゾリン(ZD6474；PCT国際特許出願国際公開第WO01/32651号の実施例２)、4-(4-フルオロ-2-メチルインドール-5-イルオキシ)-6-メトキシ-7-(3-ピロリジン-1-イルプロポキシ)キナゾリン(AZD2171；PCT国際特許出願国際公開第WO00/47212号の実施例240)、バタラニブ(PTK787；PCT国際特許出願国際公開第WO98/35985号)及びSU11248(スニチニブ；国際特許出願国際公開第WO01/60814号)、PCT国際特許出願国際公開第WO97/22596号、同第WO97/30035号、同第WO97/32856号及びWO98/13354号並びに他のメカニズムによって作用する化合物(たとえばリノミド、インテグリンαvβ3機能の阻害剤及びアンジオスタチン)]；
(vi)  血管損傷剤、たとえばコンブレスタチン(Combretastatin)A4並びに国際特許出願国際公開第WO99/02166号、同第WO00/40529号、同第WO00/41669号、同第WO01/92224号、同第WO02/04434号及び同第WO02/08213号に開示される化合物；
(vii)  アンチセンス治療、たとえば上記の標的、たとえばISIS  2503、抗rasアンチセンスなどに指向されるもの；
(viii)  遺伝子治療アプローチ、たとえば異常p53または異常BRCA1若しくはBRCA2、GDEPT(遺伝子指向型酵素プロドラッグ療法)のような異常遺伝子を置換するアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌の窒素レダクターゼ酵素を使用するようなアプローチ、及び多剤耐性遺伝子治療のような化学療法または放射線療法への患者の耐性を高めるアプローチ；並びに
(ix)  免疫療法アプローチ、たとえばインターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のようなサイトカインを用いたトランスフェクションのような患者腫瘍細胞の免疫原性を高めるためのex-vivo及びin-vivoアプローチ、T-細胞アネルギーを減少させるアプローチ、サイトカインにトランスフェクトされた樹状細胞のようなトランスフェクトされた免疫細胞を使用するアプローチ、サイトカインにトランスフェクトされた腫瘍細胞系を使用するアプローチ及び抗-イディオタイプ抗体を使用するアプローチ。
【００９４】
さらに本発明の化合物またはその医薬的に許容可能な塩は、一つ以上の細胞周期阻害剤と組み合わせて使用することができる。特にbub1、bubR1またはCDKを阻害する細胞周期阻害剤と一緒に使用することができる。
【００９５】
こうした併用処置は、治療の個別成分の同時、連続、または個別の投薬により達成することができる。そのような組合せ製品は、上記投与量範囲内にある本発明の化合物と、承認された投与量範囲内にある他の医薬活性剤を利用する。
【００９６】
治療的薬剤におけるこれらの使用に加えて、式(I)の化合物及びその医薬的に許容可能な塩は、新規治療薬の研究の一部として、ネコ、イヌ、ウサギ、サル、ラット及びマウスなどの実験動物における細胞周期活性の阻害効果の評価用のin-vitro及びin-vivo試験系の開発及び標準化における薬理学ツールとしても有用である。
【００９７】
上記他の医薬的組成物、プロセス、方法、使用及び薬剤製造の特徴において、本明細書に記載の本発明の化合物の別の及び特定の態様もあてはまる。
本発明の化合物は、オーロラキナーゼ、特にオーロラAキナーゼ及び／またはオーロラBキナーゼのセリン−スレオニンキナーゼ活性を阻害するので、細胞周期及び細胞増殖を阻害する。オーロラBキナーゼを阻害する化合物は特に重要である。本化合物は耐性細胞でも活性なので、有利な物理的特性をもつ。これらの特性は、以下に記載の一つ以上の手順を使用して評価することができる。
【００９８】
(a)  in-vitroオーロラAキナーゼ阻害試験
このアッセイは、試験化合物のセリン−スレオニンキナーゼ活性を阻害能力を測定する。オーロラAをコードするDNAは、全遺伝子合成(total  gene  synthesis)またはクローニングによって得ることができる。このDNAを好適な発現系で発現させて、セリン−スレオニンキナーゼ活性をもつポリペプチドを得る。オーロラAの場合、コード配列をポリメラーゼ鎖反応(PCR)によってｃDNAから単離し、バキュロウイルス発現ベクターpFastBac  HTc(GibcoBRL/Life  technologies)のBamH1及びNot1制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングした。5’PCRプライマーは、オーロラAコード配列に対する制限エンドヌクレアーゼBamH1  5’の認識配列を含んでいた。これによってpFastBac  HTcベクターによってコードされた6ヒスチジン残基、スペーサ領域及びrTEVプロテアーゼ開裂部位をもつフレームにオーロラA遺伝子を挿入できた。3’PCRプライマーは、オーロラA停止コドンを追加のコード配列、続いて停止コドンと制限エンドヌクレアーゼNot1の認識配列を置き換えた。この追加のコード配列(5’TAC  CCA  TAC  GAT  GTT  CCA  GAT  TAC  GCT  TCT  TAA3’)は、ポリペプチド配列YPYDVPDYASをコードした。インフルエンザヘマグルチン(hemagglutin)タンパク質から誘導したこの配列は、特異的モノクローナル抗体を使用して識別できるタグエピトープ配列として頻繁に使用される。従って組み換えpFastBacベクターはN-末端6hisタグ化、C末端インフルエンザ・ヘマグルチン・エピトープタグ化オーロラ-Aタンパク質をコードした。組み換えDNA分子アセンブリ法の詳細は、標準的なテキスト、たとえばSambrookらの1989年、Molecular  Cloning−A  Laboratory  Manual、第二版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  press及びAusubelらの、1999年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons  Inc.に知見することができる。
【００９９】
組み換えウイルスの産生は、以下の製造業者のプロトコル(GibcoBRL)にしたがって実施することができる。手短に言えば、オーロラ-A遺伝子を保持するpFastBac-1ベクターを、バキュロウイルスゲノム(bacmid  DNA)を含む大腸菌(E.coli)DH10Bac細胞に形質転換し、細胞内の転移イベントを介して、ゲンタマイシン耐性遺伝子と、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターを含むオーロラA遺伝子を含むpFastBacベクターの領域をバクミドDNAに直接転置した。ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン及びX-gal上で選択することによって、得られた白色コロニーはオーロラAをコードする組み換えバクミドDNAを含むはずである。バクミドDNAを幾つかのBH10Bac白色コロニーの小スケール培地から抽出し、製造業者のインストラクションに従ってCellFECTIN試薬(GibcoBRL)を使用する10％血清を含むTC100培地(GibcoBRL)中で成長させたスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera  frugiperda)Sf21細胞にトランスフェクトした。ウイルス粒子を、トランスフェクト後72時間で、細胞培地から集めた。培地0.5mlを使用して、1×107個/mlを含むSF21sの100ml懸濁培地を感染させた。感染48時間後で細胞培地を回収し、標準的なプラークアッセイ手順を使用してウイルス滴定した。ウイルスストックを使用して、感染の多重度（multiplicity  of  infection：MOI）３でSf9と“High  5“細胞を感染させて、組み換えオーロラAタンパク質を確実に発現させた。
【０１００】
オーロラAキナーゼ活性をラージスケールで発現させるために、Sf21昆虫細胞をWheatonローラーリグ上、３r.p.mで10％ウシ胎児血清(Viralex)と0.2%F68  Pluronic(Sigma)を補ったTC100培地中、28℃で成長させた。細胞密度が1.2×106個ml-1に到達したら、感染の多重度１でプラーク-ピュア(plaque-pure)オーロラA組み換えウイルスで感染させ、48時間後に集めた。続く全ての精製段階を４℃で行った。全部で2.0×108個を含む凍結昆虫細胞ペレットを溶かし、溶解緩衝液(lysis  buffer)(25mM  HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N’-[2-エタンスルホン酸])、pH7.4、４℃、100mM  KCl、25mM  NaF、1mM  Na3VO4、1mM  PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)、2mM  2-メルカプトエタノール、2mMイミダゾール、1μg/mlアプロチニン(aprotinin)、1μg/mlペプスタチン(pepstatin)、1μg/mlロイペプチン(leupeptin)で、1.0ml/3×107個で希釈した。溶解は、Dounceホモジェナイザーを使用して、その後、溶解物を41,000gで35分間、遠心分離した。吸い取った上清を、溶解緩衝液中で平衡させておいた、500μl  Ni  NTA(ニトリロ-三酢酸)アガロース(Qiagen、プロダクト番号30250)を含む５mm径のクロマトグラフィー上にくみ上げた。溶離液用にUV吸収のベースラインレベルは、溶離緩衝液12ml、続いて洗浄緩衝液７ml(25mM  HEPES、pH7.4、４℃、100mM  KCl、20mMイミダゾール、2mM  2-メルカプトエタノール)でカラムを洗浄した。結合したオーロラAタンパク質を溶離緩衝液(25mM  HEPES、pH7.4、４℃、100mM  KCl、400mMイミダゾール、2mM  2-メルカプトエタノール)でカラムから溶離した。UV吸収でピークに対応する溶離画分(2.5ml)を集めた。活性オーロラAキナーゼを含む溶離画分を、透析緩衝液(25mM  HEPES、pH7.4、4℃、45%グリセロール(v/v)、100mM  KCl、0.25%Nonidet  P40(v/v)、1mMジチオスレイトール)に対して徹底的に透析した。
【０１０１】
オーロラA酵素のそれぞれの新しいバッチを、酵素希釈液(25mM  Tris-HCl、pH7.5、12.5mM  KCl、0.6mM  DTT)で希釈してアッセイ中で滴定した。典型的なバッチ(Upstate)に関しては、ストック酵素を酵素希釈液で１μｍ/mlに希釈し、希釈酵素20μlを各アッセイウエルに使用する。試験化合物(ジメチルスルホキシド(DMSO)中10mM)を水で希釈し、希釈した化合物10μlをアッセイプレートのウエルに移した。「全」と「ブランク」対照ウエルは、化合物の代わりに2.5%DMSOを含んでいた。新しく希釈した酵素20マイクロリットルを、「ブランク」ウエル以外の全てのウエルに添加した。酵素希釈液20マイクロリットルを「ブランク」ウエルに添加した。0.2μCi[γ33P]ATP(Amersham  Pharmacia、比活性＜2500Ci/mmol)を含む反応混合物20マイクロリットル(25mM  Tris-HCl、78.4mM  KCl、2.5mM  NaF、0.6mMジチオスレイトール、6.25mM  MnCl2、25mM  ATP、7.5μMペプチド基質[ビオチン-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])を全ての試験ウエルに添加して、反応を開始した。プレートを室温で60分間培養した。反応を停止するために、100μl  20%v/vオルトリン酸を全てのウエルに添加した。ペプチド基質を、96-ウエルプレートハーベスター(TomTek)を使用して、正に帯電させたニトロセルロースP30フィルターマット(Whatman)上に捕捉し、次いでベータプレートカウンターで33Pの取り込みをアッセイした。「ブランク」(酵素なし)及び「全」(化合物なし)対照値を使用して、酵素活性50％阻害率(IC50値)を与える試験化合物の希釈範囲を決定した。本発明の化合物は、通常、0.1nM〜５μＭのIC50値である。
【０１０２】
(b)  in-vitroオーロラBキナーゼ阻害試験
このアッセイは、試験化合物のセリン−スレオニンキナーゼ活性の阻害能力を評価する。オーロラBをコードするDNAは全遺伝子合成またはクローニングによって得ることができる。次いでこのDNAを好適な発現系で発現させて、セリン−スレオニンキナーゼ活性をもつポリペプチドを得ることができる。オーロラBの場合、コード配列をポリメラーゼ鎖反応(PCR)によってcDNAから単離し、オーロラAに関して上記したものと同様の方法でpFastBac系にクローニングした(すなわち、6-ヒスチジンタグ化オーロラBタンパク質を直接発現させた)。
【０１０３】
オーロラBキナーゼ活性をラージスケール発現させるために、Sf21昆虫細胞をWheatonローラーリング上、３r.p.mで10％ウシ胎児血清(Viralex)と0.2％F68  Pluronic(Sigma)を補ったTC100培地中、28℃で成長させた。細胞密度が1.2×106個ml-1に到達したら、感染の多重度１でプラーク-ピュア(plaque-pure)オーロラB組み換えウイルスで感染させ、48時間後に集めた。続く全ての精製段階を４℃で行った。全部で2.0×108個を含む凍結昆虫細胞ペレットを溶かし、溶解緩衝液(lysis  buffer)(25mM  HEPES(N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N’-[2-エタンスルホン酸])、pH7.4、４℃、1mM  Na3VO4、1mM  PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)、１mM  ジチオスレイトール、1μg/mlアプロチニン(aprotinin)、1μg/mlペプスタチン(pepstatin)、1μg/mlロイペプチン(leupeptin))で、1.0ml/2×107個で希釈した。溶解は、超音波ホモジェナイザーを使用して、その後、溶解物を41,000gで35分間、遠心分離した。吸い取った上清を、溶解緩衝液中で平衡させておいた、1.0ml  CMセファロース  Fast  Flow(Amersham  Pharmacia  Biotech)を含む５mm径のクロマトグラフィー上にくみ上げた。溶離液用にUV吸収のベースラインレベルは、溶離緩衝液12ml、続いて洗浄緩衝液７ml(25mM  HEPES、pH7.4、４℃、1ｍMジチオスレイトール)でカラムを洗浄した。結合したオーロラBタンパク質を溶離緩衝液(50mM  HEPES、pH7.4、４℃、0.6M  NaCl、１mMジチオスレイトール、０％溶離緩衝液から0.5ml/分の流速で15分かけて100％溶離緩衝液にする)でカラムから溶離した。UV吸収でピークに対応する溶離画分(1.0ml)を集めた。溶離画分を、透析緩衝液(25mM  HEPES、pH7.4、4℃、45%グリセロール(v/v)、100mM  KCl、0.5%IGEPAL  CA630(Sigma  Aldrich)、1mMジチオスレイトール)に対して徹底的に透析した。
【０１０４】
オーロラB-INCENP酵素(Upstate製)は、0.1mg/ml  GST-INCENP[826-919]を含んだ50mM  Tris-HCl、pH7.5、0.1mM  EGTA、0.1%2-メルカプトエタノール、0.1mMバナジウム酸ナトリウム(sodium  vandate)、10mM酢酸マグネシウム、0.1mM  ATP中でオーロラB(５μM)を30℃で30分間活性化することにより調製した。
【０１０５】
オーロラB−INCENP酵素のそれぞれの新しいバッチを、酵素希釈液(25mM  Tris-HCl、pH7.5、12.5mM  KCl、0.6mM  DTT)で希釈してアッセイ中で滴定した。典型的なバッチに関しては、ストック酵素を酵素希釈液で１：40に希釈し、希釈酵素20μlを各アッセイウエルに使用する。試験化合物(ジメチルスルホキシド(DMSO)中10mM)を水で希釈し、希釈した化合物10μlをアッセイプレートのウエルに移した。「全」と「ブランク」対照ウエルは、化合物の代わりに2.5%DMSOを含んでいた。新しく希釈した酵素20マイクロリットルを、「ブランク」ウエル以外の全てのウエルに添加した。酵素希釈液20マイクロリットルを「ブランク」ウエルに添加した。0.2μCi[γ33P]ATP(Amersham  Pharmacia、比活性＞2500Ci/mmol)を含む反応混合物20マイクロリットル(25mM  Tris-HCl、12.7mM  KCl、2.5mM  NaF、0.6mMジチオスレイトール、6.25mM  MnCl2、15mM  ATP、6.25μMペプチド基質[ビオチン-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG])を全ての試験ウエルに添加して、反応を開始した。プレートを室温で60分間培養した。反応を停止するために、100μl  20%v/vオルトリン酸を全てのウエルに添加した。ペプチド基質を、96-ウエルプレートハーベスター(TomTek)を使用して、正に帯電させたニトロセルロースP30フィルターマット(Whatman)上に捕捉し、次いでベータプレートカウンターで33Pの取り込みをアッセイした。「ブランク」(酵素なし)及び「全」(化合物なし)対照値を使用して、酵素活性50％阻害率(IC50値)を与える試験化合物の希釈範囲を決定した。本発明の化合物は、通常、0.0.5nM〜10μＭのIC50値である。特に、化合物１はIC50が0.5nMであり、化合物２は0.5nMであり、化合物３は0.1nMであった。
【０１０６】
(c)  in-vitro細胞表現型及び基質リン酸化アッセイ
このアッセイを使用して、試験化合物のSW620ヒト直腸腫瘍のin-vitroでの細胞効果を測定する。化合物は通常、ホスホヒストン(phosphohistone)H3のレベルで阻害し、細胞の核領域を増加させる。
【０１０７】
ウエルあたり104個のSW620細胞を、コスター(costar)96ウエルプレート中、100μl  DMEM培地(10%FCSと１%グルタミンを含む)(DMEMはダルベッコの変性イーグル培地である(Sigma  D6546))中にプレーティングし、37℃、5%CO2中で一晩放置して付着させた。ついで細胞を培地中に希釈した化合物(50μlをそれぞれのウエルに添加して、化合物0.00015μ〜1μM濃度にする)で希釈して、化合物で処置してから24時間後、細胞を固定した。
【０１０８】
細胞は、最初に光学式顕微鏡を使用して測定し、モルフォロジーの細胞変化を全て記録した。3.7％ホルムアルデヒド100μlをそれぞれのウエルに添加し、プレートを室温で少なくとも30分間放置した。デカンテーションして、プレートをペーパータオルの上でたたいて定着剤を除去し、プレートを自動プレート洗浄機を使用して、PBS(ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水(Sigma  D8537))で洗浄した。100μlのPBSと0.5%triton  X-100を添加し、プレートを震蘯器に５分間設置した。このプレートを100μlのPBSで洗浄し、溶液を捨てた。一次抗体50μl、PBS１％BSA(ウシ血清アルブミン)中の1：500ウサギ抗-ホスホヒストンH3及び0.5%tweenを添加した。抗-ホスホヒストンH3ウサギポリクローナル06-750をUpstate  Biotechnologyから購入した。このプレートを室温で震蘯器中、１時間放置した。
【０１０９】
翌日、抗体を捨てて、プレートをPBS中で２度洗浄した。ついていない領域(unlit  area)に、二次抗体50μl、PBS１％BSA中の1：10,000Hoechst及び1：200  Alexa  Fluor  488ヤギ抗ウサギIgGA(カタログ番号11008モレキュラープローブ)、0.5%tweenを添加した。プレートをスズホイルで包み、室温で１時間震蘯した。抗体を捨て、プレートをPBSで二度洗浄した。200μlのPBSをそれぞれのウエルに添加し、抗体を10分間震蘯し、PBSを除去した。100μlのPBSをそれぞれのウエルに添加し、プレートを分析の用意ができるまでシールした。Arrayscan  Target  Activationアルゴリズムを使用して分析を実施し、ホスホヒストンH3の細胞レベルと核領域における変化を測定した。ホスホヒストンH3レベルの50％阻害と、細胞の核領域の50％増加(EC50値)を与えるのに必要な有効濃度として報告した。本発明の化合物は、通常、ホスホヒストンH3レベルの阻害のEC値が0.5nM〜0.1μＭである。特に化合物２は、IC50が5.5nMであり、化合物２は２nMであり、化合物３は２nMである。
【０１１０】
(d)  in-vitro薬剤耐性細胞表現型及び基質リン酸化アッセイ
このアッセイを使用して化合物の薬剤耐性MCF7-ADRヒト乳ガン細胞のin-vitroにおける細胞効果(cellular  effect)を測定する。
【０１１１】
MCF7細胞は、アドリオマイシン(Dr.Hickinson，Molecular  Oncology  lab，ICRF，University  of  Oxford  Institute  of  Molecular  Medicine，Headington，Oxford)の複数回投与、細胞によって薬剤耐性タンパク質の過剰発現で得られた手順で処理した。化合物は通常、ホスホヒストンH3レベルの阻害をもたらし、処理細胞の核領域を増やす。しかしながら、化合物が過剰発現流出タンパク質(efflux  protein)基質である場合、先のSW620アッセイよりもこのアッセイでは活性がやや低いだろう。
【０１１２】
0.8×104MCF7-ADR細胞/ウエルをコースター96ウエルプレート中の100μl  DMEM培地(10%FCS(ウシ胎児血清及び1%グルタミンを含む)にプレーティングし、37℃、5%CO2で一晩放置して接着させた。
【０１１３】
他の全ての手順は、SW620細胞を使用する上記アッセイと同一である。
本発明の化合物は、通常、ホスホヒストンH3の阻害のEC50値が0.5nM〜0.1μMである。特に、化合物１は、IC50が17nMであり、化合物２は20nMであり、化合物３は４nMである。
【０１１４】
本発明を以下の実施例で説明する。この実施例において、当業者に公知の標準的な手順及びこれらの実施例で記載されるものと類似の方法は、必要に応じて使用することができる。ここで他に記載しない限り、以下の通りである。
【０１１５】
(i)蒸発は、真空中、ロータリーエバポレーションで実施し、仕上げ手順は、濾過によって乾燥剤などの残渣固体を除去した後に実施した。
(ii)操作は、通常18〜25℃の周囲温度、他に記載しない限り空気中で実施したが、但し当業者はアルゴンなどの不活性雰囲気中で操作するだろう。
【０１１６】
(iii)カラムクロマトグラフィー(フラッシュ手順による)及び中圧液体クロマトグラフィー(MPLC)は、Merck  Kieselgelシリカ(Art．9385)で実施した。
(iv)収率は説明のためだけに示したものであり、必ずしも達成し得る最大値ではない。
【０１１７】
(v)式(I)の最終生成物の構造は通常、核(通常プロトン)磁気共鳴(NMR)及びマススペクトル法により確認した。プロトン磁気共鳴のケミカルシフト値は、以下の４つの装置を使用して、デルタスケール(テトラメチルシランからppm低磁場)で(他に記載しない限り)重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO-d6)中で測定した。
【０１１８】
Varian  Gemini  2000分光計、磁場強度300MHzで操作。
Bruker  DPX300分光計、磁場強度300MHzで操作。
JEOL  EX400分光計、磁場強度400MHzで操作。
【０１１９】
Bruker  Avance  500分光計、磁場強度500MHzで操作。
ピーク多重度は、以下の通りである：s，一重線；d，二重線；dd，二重線の二重線；t，三重線；q，四重線；qu，五重線；m，多重線；br  s，ブロード一重線。
【０１２０】
(vi)ロボット合成は、Zymate  XPロボットを使用して実施し、溶液の添加は、Zymate  Master  Laboratory  Stationによって行い、Stem  RS5000  Reacto-Stationで25℃で攪拌した。
【０１２１】
(vii)ロボット合成からの反応混合物の仕上げ及び精製は、以下の通りに実施した。蒸発は、Genevac  HT  4を使用して真空中で実施した。カラムクロマトグラフィーはMerckシリカ(60μm，25g)を充填した27mm径のカラムを使用するAnachem  Sympur  MPLC系で実施した。最終生成物の構造は、以下のものを使用するWaters  2890/ZMDマイクロマスシステム上、LCMS(液体クロマトグラフィー質量分光分析)で確認し、保持時間(RT)を分で示す。
カラム：ウォータースシンメトリーC18，3.5μm，4.6×50mm。
溶媒A：H2O。
溶媒B：CH3CN。
溶媒C：MeOH+5%HCOOH。
流速：2.5ml/分。
実行時間：5分、4.5分勾配液0〜100%C。
波長：254nm、バンド幅10nm。
質量検出器：ZMD  マイクロマス。
注入容積：0.005ml。
【０１２２】
(viii)ロボット合成で製造しなかった化合物の分取LCMSは、以下のものを使用するWaters  Alliance  HT系で実施し、保持時間(RT)を分で示す。
カラム：2.0mm×5cm，Phenomenex  Max-RP  80A。
溶媒A：水。
溶媒B：アセトニトリル。
溶媒C：メタノール/1%蟻酸または水/1%蟻酸。
流速：1.1ml/分。
実行時間：５分、4.5分、勾配液0〜95%B＋一定5%溶媒C。
波長：254nm，バンド幅10nm。
注入容積：0.005ml。
質量検出器：Micromass  ZMD。
【０１２３】
(ix)分取高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、以下のいずれかで実施した。
Waters分取LCMS装置、保持時間(RT)は分で測定。
カラム：β-塩基性Hypercil(21×100mm)，５μm。
溶媒A：水/0.1%炭酸アンモニウム。
溶媒B：アセトニトリル。
流速：25ml/分。
実行時間：10分、7.5分勾配液0〜100%B。
波長：254nm、バンド幅10nm。
注入容積：1〜1.5ml。
質量検出器：Micromass  ZMD。
【０１２４】
Gilson分取HPLC装置、保持時間(RT)は分で測定。
カラム：21mm×15cm  Phenomenex  Luna2  C18。
溶媒A：水+0.1%トリフルオロ酢酸。
溶媒B：アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸。
流速：21ml/分。
実行時間：20分、10分勾配液5〜100%B。
波長：254nm，バンド幅10nm。
注入容積：0.1〜4.0ml。
【０１２５】
(x)中間体は通常、完全にキャラクタリゼーションせず、純度は薄層クロマトグラフィー(TLC)、HPLC、赤外(IR)、MSまたはNMR分析により評価した。
【０１２６】
【化１２】
2008542345.tif 000014
【０１２７】
【表１】
2008542345.tif 000015
【０１２８】
実施例１：表１の化合物１の製造  N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-{[(2R)-1-メチルピロリジン-2-イル]メトキシ}キナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド
蟻酸(30ml)中のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(2R)-ピロリジン-2-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミド(0.800g，1.53mmol)とホルムアルデヒド(水中37％溶液15ml)の混合物を90℃で2.5時間加熱した。得られた溶液を室温に放冷し、次いで真空下で蒸発させた。残渣を水(40ml)中の炭酸ナトリウム溶液(5%wt/v)で処理し、次いでジクロロメタン中10％メタノールの混合物で２回抽出した。
【０１２９】
あわせた混合物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させると、薄茶色固体が残り、これをジクロロメタン中２〜５％メタノールの混合物で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状の表１の化合物１が得られた(0.624g，76%収率)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.28(s，1H)，10.11(s，1H)，8.45(s，1H)，8.28(s，1H)，7.72(m，1H)，7.57(s，1H)，7.20(m，2H)，6.75(d，1H)，6.52(d，1H)，5.16(s，2H)，4.43(dd，1H)，4.24(dd，1H)，4.18(q，2H)，3.16(m，1H)，2.56(m，1H)，2.37(s，3H)，2.27(q，1H)，2.02-1.93(m，1H)，1.85-1.62(m，3H)，1.39(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：538(M+H)+。
【０１３０】
実施例２i：表１の化合物の製造  N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(2R)-ピロリジン-2-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミド
トリフルオロ酢酸(８ml)を、ジクロロメタン(30ml)中のtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレート(2.0g，3.21mmol)の攪拌混合物に室温で一度に添加した。得られた溶液を室温で１時間攪拌し、次いで蒸発させた。残渣を水(30ml)中の炭酸ナトリウム溶液(5%wt/v)で処理し、ジクロロメタン中10%メタノールの混合物で２回抽出した。あわせた有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させるとオフホワイト固体が残り、これを０〜２％メタノール性アンモニアを含むジクロロメタン中の５％メタノールの混合物で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状の表１の化合物２が得られた(1.35g，80%収率)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.43(s，1H)，10.27(s，1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.77(s，1H)，7.72(m，1H)，7.19(m，2H)，6.74(d，1H)，6.70(d，1H)，5.15(s，2H)，4.31(dd，1H)，4.17(q，2H)，3.93(t，1H)，3.63-3.57(m，1H)，2.96-2.81(m，3H)，1.91-1.83(m，1H)，1.80-1.63(m，2H)，1.50-1.42(m，1H)，1.38(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：524(M+H)+。
【０１３１】
出発物質として使用したtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレートは以下のようにして製造した。
【０１３２】
a)  ジメチルホルムアミド中、5,7-ジフルオロキナゾリン-4(3H)-オン(2.0g，11.0mmol)(Hennequin，Laurent  Francois  Andre；Ple，Patrick．Preparation  of  4-anilinoquinazoline  derivatives  for  the  treatment  of  tumors．PCT国際特許出願第WO01/094341号を参照されたい)とナトリウムエトキシド(3.7g，54.4mmol)の溶液を90℃で６時間加熱した。この混合物を室温に放冷し、塩化アンモニウム溶液(100ml)に注いだ。得られた沈殿を濾過し、水洗し、次いで高真空で乾燥すると5,7-ジエトキシキナゾリン-4(3H)-オン(1.36g，53%収率)が得られた：
MS(+ve  ESI)：235(M+H)+。
【０１３３】
b)  ジメチルホルムアミド(７ml）中の5,7-ジエトキシキナゾリン-4(3H)-オン(0.700g，2.99mmol)とナトリウムメトキシド(メタノール中28％w/v溶液2.66ml，13.8mmol)の溶液を110℃で18時間加熱した。混合物を室温に放冷し、次いで濃塩酸を添加して酸性にし、次いで水(0.2％トリフルオロ酢酸)中のアセトニトリル(0.2％トリフルオロ酢酸)の勾配液で溶離する分取hplc(C18シリカカラム)により精製した。生成物を含む画分をあわせ、重炭酸ナトリウム固体を添加して塩基性にし、次いで真空中で濃縮した。得られた沈殿を濾過し、水洗し、次いでアセトニトリル洗浄し、ジエチルエーテル洗浄し、最後に風乾すると、7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4(3H)-オン(0.198g，30%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.94(s，1H)，6.64(s，1H)，6.53(s，1H)，4.15(q，2H)，3.83(s，3H)，1.37(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：221(M+H)+。
【０１３４】
c)  オキシ塩化リン(4.76g，31.0mmol)を1,2-ジクロロエタン(50ml)中の7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4(3H)-オン(2.0g，9.1mmol)とジ-イソ-プロピルエチルアミン(4.26g，33.0mmol)の混合物に添加した。この混合物を80℃で６時間加熱した。混合物を室温に放冷し、真空中で蒸発させた。残渣をジクロロメタンと重炭酸ナトリウムの飽和溶液との間で分配した。
【０１３５】
有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで真空中で蒸発させた。粗な生成物をアセトンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製すると、4-クロロ-7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン(2.0g，92%収率)が得られた。
MS(+ve  ESI)：239/241(M+H)+。
【０１３６】
d)  2-プロパノール(70ml)中の4-クロロ-7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン(1.90g，7.97mmol)と2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド(2.02g，8.01mmol)の混合物を90℃で45分間加熱した。反応物を室温に放冷し、次いでメチルtert-ブチルエーテルで希釈した。この混合物を濾過すると、薄黄色固体状のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド塩酸塩が残った(3.91g，100%収率)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.63(s，1H)，10.44(s，1H)，8.81(s，1H)，8.35(s，1H)，7.95(s，1H)，7.69(m，1H)，7.22(m，2H)，6.95(d，1H)，6.90(d，1H)，5.21(s，2H)，4.24(q，2H)，4.14(s，3H)，1.43(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：455(M+H)+。
【０１３７】
e)  ピリジン(60ml)中のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-メトキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド(5.0g，10.2mmol)とピリジン塩酸塩(7.2g，62.3mmol)の混合物を120℃で18時間加熱した。さらにピリジン塩酸塩(4.0g，34.6mmol)を添加し、さらに24時間加熱し続けた。得られた溶液を室温に放冷し、水(150ml)でクエンチした。得られた沈殿を濾過し、水洗し、次いで高真空中で乾燥すると、薄黄色固体状のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド(4.16g，93%収率)が得られた。
MS(+ve  ESI)：441(M+H)+。
【０１３８】
f)  ジ-tert-ブチルアゾジカルボキシレート(1.25g，5.44mmol)を、テトラヒドロフラン(30ml)中のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(7-エトキシ-5-ヒドロキシキナゾリン-4-イル)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド(2.0g，4.54mmol)、tert-ブチル(2R)-2-(ヒドロキシメチル)ピロリジン-1-カルボキシレート(1.28g，6.37mmol)及びトリフェニルホスフィン(1.43g，5.46mmol)の攪拌懸濁液に少しずつ添加した。この混合物を室温で２時間攪拌し、次いでさらにトリフェニルホスフィン(0.700g，2.67mmol)とジ-tert-ブチルアゾジカルボキシレート(0.600g，2.61mmol)を添加した。混合物を室温で３時間攪拌し、次いで混合物を蒸発させた。残渣をジクロロメタン中２〜５％メタノールで溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状のtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレート(2.25g，79%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.26(s，1H)，9.82(s)&9.52(s)(1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.86(s，1H)，7.73(m，1H)，7.20(m，2H)，6.76(s，2H)，5.14(s，2H)，4.50-4.31(m，2H)，4.30-4.08(m，1H)，4.17(q，2H)，3.42-3.26(m，2H)，2.16-2.03(m，1H)，2.03-1.77(m，3H)，1.38(s，9H)，1.38(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：624(M+H)+。
【０１３９】
出発物質として使用した2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドは以下のようにして製造した。
a)  ジエチルエーテル(100ml)中の2,3-ジフルオロアニリン(12.9g，100mmol)の溶液を1M水酸化ナトリウム溶液(98ml，98mmol)で処理し、激しく攪拌しながら、ジエチルエーテル(100ml)中のクロロアセチルクロリド(13.3g，117mmol)の溶液を５℃で20分かけて滴下添加した。この混合物を１時間かけて20℃に放置して温め、次いで酢酸エチル(100ml)を添加した。有機相を分離し、20%炭酸水素カリウム水溶液で洗浄し、乾燥し、蒸発させると、白色固体が残った。この固体を沸騰テトラヒドロフラン(20ml)中に溶解し、次いでシクロヘキサン(300ml)とイソヘキサン(100ml)で希釈した。この混合物を濃縮すると約250mlになり、冷却し、濾過すると、白色結晶状の2-クロロ-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドが得られた(8.48g，90%収率)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.26(br  s，1H)，7.67(m，1H)，7.19(m，2H)，4.36(s，2H)。
MS(+ve  ESI)：206，204(M+H)+。
【０１４０】
b)  ジメチルアセトアミド(20ml)中の2-クロロ-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド(10.28g，50mmol)と4-ブロモピラゾール(7.35g，50mmol)の溶液を炭酸カリウム(8.29g，60mmol)で処理し、20℃、窒素下で18時間攪拌した。この混合物を水(300ml)に注ぎ、濾過し、固体を水洗(500ml)し、風乾した。この固体を沸騰テトラヒドロフラン(80ml)に溶解し、濾過し、シクロヘキサン(100ml)で希釈し、次いで蒸発させると約100mlとなった。得られたスラリーをイソヘキサン(100ml)で希釈し、冷却し、濾過すると、白色固体状の2-(4-ブロモ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド(13.09g，83%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.32(br  s，1H)，8.00(s，1H)，7.70(m，1H)，7.59(s，1H)，7.19(m，2H)，5.14(s，2H)。
MS(+ve  ESI)：316，318(M+H)+。
【０１４１】
c)  無水1,4-ジオキサン(50ml)中の2-(4-ブロモ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド(9.48g，30mmol)と(9,9-ジメチル-9H-キサンテン-4,5-ジイル)ビス(ジフェニルホスフィン)(1.74g，3mmol)の溶液をトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)(1.37g，1.5mmol)で処理し、この混合物を窒素下で５分間攪拌した。ベンゾフェノンイミン(5.7g，31.5mmol)を一度に添加し、続いてナトリウムtert-ブトキシド(8.64g，90mmol)を添加した。この混合物を窒素で脱気し、次いで90℃、窒素下で４時間加熱した。混合物を冷却し、ジエチルエーテル(100ml)で希釈し、次いで塩化アンモニウム水溶液(100ml)に注いだ。この混合物をセライトで濾過し、次いで層を分離した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮すると油状物となり、これを沸騰シクロヘキサン(200ml，100ml)で二回抽出した。このシクロヘキサン溶液を蒸発させるとガム状となり、これをイソヘキサン：ジエチルエーテル（1：1）で結晶化させると、薄黄色固体状のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(ジフェニルメチレン)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド(5.50g，44%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.21(br  s，1H)，7.66(m，3H)，7.56(m，3H)，7.44(m，3H)，7.35(s，1H)，7.24(m，2H)，7.18(m，2H)，6.48(s，1H)，4.98(s，2H)。
MS(+ve  ESI)：417(M+H)+。
【０１４２】
d)  酢酸エチル(25ml)中のN-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-{4-[(ジフェニルメチレン)アミノ]-1H-ピラゾール-1-イル}アセトアミド(2.08g，5mmol)のよく攪拌した溶液を、室温で１分かけて、37%塩酸水溶液(0.496ml，6mmol)で滴下処理した。この混合物を１時間攪拌し、次いで濾過した。残渣を酢酸エチルとジエチルエーテルで洗浄し、次いで風乾すると、白色粉末状の2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド塩酸塩(1.35g，93%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.48(s，1H)；10.22(br  s，3H)；8.03(s，1H)；7.68(m，1H)；7.60(s，1H)；7.19(m，2H)；5.20(s，2H)。
MS(+ve  ESI)：253(M+H)+。
【０１４３】
e)  2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド塩酸塩(1.685g，5.84mmol)を酢酸エチル(70ml)と飽和重炭酸ナトリウム水溶液(35ml)の混合物中に懸濁した。この透明な層を分離し、水性相を酢酸エチル(4×30ml)で洗浄した。あわせた有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させると固体となり、これをジエチルエーテルで洗浄すると、2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミドが桃色固体状で得られた(1.377g，94%)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.06(br  s，1H)；7.70(m，1H)；7.17(m，2H)；7.08(s，1H)；6.98(s，1H)；4.90(s，2H)；3.84(br  s，2H)。
MS(+ve  ESI)：253(M+H)+。
【０１４４】
表１の化合物２も以下のようにして製造した。
実施例２ii：表１の化合物２の製造  N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(2R)-ピロリジン-2-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミド
トリフルオロ酢酸(5ml)を、ジクロロメタン(20ml)中のtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレート塩酸塩(0.800g，1.21mmol)の攪拌懸濁液に一度に添加した。この混合物を室温で30分間攪拌し、次いで蒸発させた。残渣を水(40ml)中の炭酸ナトリウム溶液(5%wt/v)で処理し、次いでジクロロメタン中10%メタノールの混合物で抽出した。あわせた有機画分を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させると薄黄色固体が残り、これを０〜２％メタノール性アンモニア(7M)を含むジクロロメタン中の５％メタノール混合物で溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状の表１の化合物２が得られた(0.591g，93%)。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.43(s，1H)，10.27(s，1H)，8.45(s，1H)，8.38(s，1H)，7.77(s，1H)，7.72(m，1H)，7.19(m，2H)，6.74(d，1H)，6.70(d，1H)，5.15(s，2H)，4.31(dd，1H)，4.17(q，2H)，3.93(t，1H)，3.63-3.57(m，1H)，2.96-2.81(m，3H)，1.91-1.83(m，1H)，1.80-1.63(m，2H)，1.50-1.42(m，1H)，1.38(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：524(M+H)+。
【０１４５】
出発物質として使用したtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレート塩酸塩は以下のようにして製造した。
【０１４６】
a)  氷/水浴中で冷却したジメチルホルムアミド(200ml)中の3,5-ジフルオロフェノール(13.0g，0.10mol)と炭酸カリウム(20.9g，0.15mol)の溶液に、ジエチルサルフェート(13.1ml，0.10mol)を添加した。この混合物を80℃に1.5時間加熱した。さらにジエチルサルフェート(3.3ml，25mmol)と炭酸カリウム(5.2g，37.5mmol)を添加し、混合物をさらに２時間加熱した。得られた溶液を室温に放冷し、次いで水に注ぎ、次いでジエチルエーテルで２回抽出した。合わせたジエチルエーテル抽出物を水洗し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させると黄色油状の1-エトキシ-3,5-ジフルオロベンゼン(13.59g，86%収率)が残った。
1H-NMR(DMSO-d6)：6.77-6.65(m，3H)，4.06(q，2H)，1.32(t，3H)。
MS(+ve  EI)：158(M+)。
【０１４７】
b)  n-ブチルリチウム(ヘキサン中1.6M溶液の13.5ml，21.6mmol)を、窒素雰囲気下、−78℃でテトラヒドロフラン(30ml)中の1-エトキシ-3,5-ジフルオロベンゼン(3.42g，21.6mmol)の攪拌溶液に滴下添加した。この混合物を−78℃で２時間攪拌し、次いで過剰の二酸化炭素固体ペレットを添加した。この反応混合物を放置して室温に温め、得られた溶液を水に注いだ。混合物は、水酸化ナトリウム水溶液を添加して塩基性とし、次いでジエチルエーテルで抽出した。混合物を分離し、水性層は希塩酸を添加して酸性にした。この混合物をジエチルエーテルで二回抽出した。あわせたジエチルエーテル抽出物を水洗し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させると無色固体状の4-エトキシ-2,6-ジフルオロ安息香酸(3.87g，89%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：13.36(br  s，1H)，6.82-6.76(m，2H)，4.11(q，2H)，1.33(t，3H)。
MS(+ve  CI)：203(M+H)+。
【０１４８】
c)  塩化オキサリル(3.17ml，36.4mmol)を、ジクロロメタン(50ml)中の4-エトキシ-2,6-ジフルオロ安息香酸(3.5g，17.3mmol)とジメチルホルムアミド(5滴)の攪拌懸濁液に滴下添加した。得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで蒸発させた。残渣をテトラヒドロフランに溶解し、次いで激しく攪拌している35％アンモニア水溶液(60ml)中に滴下添加した。この混合物を濾過し、残渣を氷冷水で洗浄し、次いで真空乾燥すると、無色固体状の4-エトキシ-2,6-ジフルオロベンズアミド(3.23g，93%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.91(br  s，1H)，7.65(br  s，1H)，6.78-6.71(m，2H)，4.08(q，2H)，1.32(t，3H)。
MS(+ve  EI)：201(M+)。
【０１４９】
d)  ジクロロメタン(25ml)中の4-エトキシ-2,6-ジフルオロベンズアミド(3.18g，15.8mmol)とトリエチルアミン(4.44ml，31.6mmol)の攪拌懸濁液に、０〜５℃でトリクロロアセチルクロリド(1.94ml，17.4mmol)を添加した。この混合物を０〜５℃で５分間攪拌した。得られた溶液を順に水、希塩酸、希水酸化ナトリウム、希塩酸、最後に水で洗浄した。有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させると、薄黄色固体状の4-エトキシ-2,6-ジフルオロベンゾニトリル(2.56g，89%収率)が残った。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.06-7.03(m，2H)，4.17(q，2H)，1.34(t，3H)。
MS(+ve  CI)：184(M+H)+。
【０１５０】
e)  エタノール(270ml)中のアンモニア飽和溶液中の4-エトキシ-2,6-ジフルオロベンゾニトリル(8.0g，44mmol)の混合物をオートクレーブ中、160℃に16時間加熱した。得られた溶液を蒸発させ、残渣をジクロロメタンに溶解し、次いで水洗した。有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空中で濃縮し、次いでジクロロメタンで溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状の2-アミノ-4-エトキシ-6-フルオロベンゾニトリル(6.07g，77%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：6.32(s，2H)，6.14-6.10(m，2H)，3.99(q，2H)，1.30(t，3H)。
MS(+ve  EI)：180(M+)。
【０１５１】
f)  2-アミノ-4-エトキシ-6-フルオロベンゾニトリル(2.5g，13.9mmol)を、100℃で加熱した蟻酸(20ml)と濃硫酸(5滴)の混合物に、20分で滴下添加した。この混合物を100℃で５時間加熱し、次いで室温に放冷した。この混合物氷/水(80ml)に注ぎ、得られた沈殿を濾過により集め、水洗し、続いてジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空中で濃縮すると、無色固体状の7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オン(2.02g，70%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：12.06(br.S.1H)，8.01(s，1H)，6.91-6.85(m，2H)，4.17(q，2H)，1.36(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：209(M+H)+。
【０１５２】
g)  ジメチルホルムアミド(7ml)中の[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メタノール(1.1g，57.6mmol)を、窒素雰囲気下、ジメチルホルムアミド(8ml)中の水素化ナトリウムの攪拌懸濁液(油中60％分散液0.461g，11.52mmol)に滴下添加した。得られた溶液を室温で30分間攪拌し、次いで7-エトキシ-5-フルオロキナゾリン-4(3H)-オン(1.0g，4.8mmol)を添加し、混合物を室温でさらに５時間攪拌した。さらに[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メタノール(0.220g，1.15mmol)と水素化ナトリウム(0.092g，2.3mmol)を添加し、反応混合物を60℃に１時間加熱した。混合物を室温に放冷し、次いで飽和塩化アンモニウム中に注いだ。得られた沈殿を濾過し、ジエチルエーテル洗浄し、真空下で乾燥すると、無色固体状の5-{[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メトキシ}-7-エトキシキナゾリン-4(3H)-オン(1.24g，68%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：11.61(br.s，1H)，7.89(s，1H)，7.31-7.17(m，5H)，6.63(d，1H)，6.52(d，1H)，4.49(d，1H)，4.14(q，2H)，4.05-3.94(m，2H)，3.44(d，1H)，3.12-3.00(m，1H)，2.87-2.79(m，1H)，2.31-2.20(m，1H)，2.03-1.96(m，1H)，1.69(m，3H)，1.36(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：380(M+H)+。
【０１５３】
出発物質として使用した[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メタノールは、以下のようにして製造した。
(ブロモメチル)ベンゼン(2.36ml，19.8mmol)と炭酸カリウム(8.20g，59.3mmol)を、エタノール(40ml)と水(6ml)中の(2R)-ピロリジン-2-イルメタノール(2.00g，19.8mmol)の溶液に添加した。得られた溶液を80℃に４時間加熱し、次いで蒸発させた。残渣を水(150ml)で処理し、ジエチルエーテルで２回抽出した。あわせた有機抽出物を水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させた。残渣を０〜１％メタノール性アンモニア溶液(7M)を含むジクロロメタン中５％メタノールの混合物で溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、黄色油状の[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メタノール(2.38g，63%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.33-7.27(m，4H)，7.25-7.20(m，1H)，4.37(t，1H)，4.04(d，1H)，3.48-3.43(m，1H)，3.34-3.26(m，2H)，2.78-2.74(m，1H)，2.59-2.53(m，1H)，2.17-2.11(m，1H)，1.88-1.79(m，1H)，1.65-1.53(m，3H).]。
【０１５４】
h)  ジメチルホルムアミド(15ml)中の5-{[(2R)-1-ベンジルピロリジン-2-イル]メトキシ}-7-エトキシキナゾリン-4(3H)-オン(1.2g，3.16mmol)とジ-tert-ブチルジカーボネート(0.758g，3.48mmol)の懸濁液に、炭素上に担持させた10％パラジウムを添加し、この混合物を水素雰囲気下、室温で５時間攪拌した。混合物をセライトで濾過し、蒸発させた。残渣をジクロロメタン中５％メタノールの混合物で溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、無色固体状のtert-ブチル(2R)-2-{[(7-エトキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}ピロリジン-1-カルボキシレート(1.00g，81%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.83(s，1H)，6.64(d，1H)，6.55(d，1H)，4.19-4.03(m，5H)，3.40-3.30(m，2H)，2.16-2.05(m，2H)，2.03-1.94(m，1H)，1.79-1.69(m，1H)，1.40(s，9H)，1.63(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：390(M+H)+。
【０１５５】
i)  1,2-ジクロロエタン(20ml)中のtert-ブチル(2R)-2-{[(7-エトキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}ピロリジン-1-カルボキシレート(0.950g，2.44mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.44ml，8.30mmol)とオキシ塩化リン(0.72ml，7.81mmol)の混合物を80℃で２時間加熱した。得られた溶液を室温に放冷し、次いで蒸発させた。残渣をジクロロメタンに溶解し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、次いで蒸発させた。残渣を、酢酸エチルで溶離するシリカゲルのクロマトグラフィーで精製すると、黄色固体状のtert-ブチル(2R)-2-{[(4-クロロ-7-エトキシキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}ピロリジン-1-カルボキシレート(0.621g，63%収率)が得られた。
MS(+ve  ESI)：408(M+H)+。
【０１５６】
j)  2-プロパノール(20ml)中のtert-ブチル(2R)-2-{[(4-クロロ-7-エトキシキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}ピロリジン-1-カルボキシレート(0.615g，1.51mmol)と2-(4-アミノ-1H-ピラゾール-1-イル)-N-(2,3-ジフルオロフェニル)アセトアミド(0.380g，1.51mmol)の混合物を、70℃で30分間加熱すると、粘稠な沈殿が得られた。この混合物を室温に放冷し、ジエチルエーテルで希釈し、次いで濾過した。残渣をジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空下で乾燥すると、クリーム色固体状のtert-ブチル(2R)-2-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]ピロリジン-1-カルボキシレート塩酸塩(0.832g，83%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：8.69(s，1H)，8.33(s，1H)，7.94(s，1H)，7.70-7.66(m，1H)，7.17-7.10(m，2H)，6.96(d，1H)，6.88(d，1H)，5.13(s，2H)，4.48(dd，1H)，4.42-4.37(m，1H)，4.30(dd，1H)，4.27(q，2H)，3.47-3.42(m，1H)，3.34-3.29(m，1H)，2.16-2.08(m，1H)，2.00-1.83(m，3H)，1.42(t，3H)，1.35(s，9H)。
MS(+ve  ESI)：624(M+H)+。
【０１５７】
実施例３：化合物３の製造  N-(2,3-ジフルオロフェニル)-2-[4-({7-エトキシ-5-[(3R)-モルホリン-3-イルメトキシ]キナゾリン-4-イル}アミノ)-1H-ピラゾール-1-イル]アセトアミド
【０１５８】
【化１３】
2008542345.tif 000016
【０１５９】
tert-ブチル(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]モルホリン-4-カルボキシレート塩酸塩(540mg，0.84mmol)を使用した以外には実施例２iiに記載のものと類似の反応により、化合物３(380mg，84%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.1(br  s，1H)，9.85(br  s，1H)，8.43(s，1H)，8.27(s，1H)，7.74(s，1H)，7.71-7.66(m，1H)，7.19-7.11(m，2H)，6.77(d，1H)，6.65(d，1H)，5.08(s，2H)，4.35-4.22(m，3H)，4.17(q，3H)，3.88-3.84(m，1H)，3.73-3.68(m，1H)，3.52-3.44(m，2H)，3.38-3.33(m，1H)，3.03-2.88(m，2H)，1.37(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：540(M+H)+。
【０１６０】
出発物質として使用したtert-ブチル(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]モルホリン-4-カルボキシレートは、以下のようにして製造した。
【０１６１】
a)  [(3S)-4-ベンジルモルホリン-3-イル]メタノール塩酸塩(843mg，3.46mmol)と水素化ナトリウム(油中60％分散液の392mg，9.79mmol)を使用した以外には、実施例２iiに記載のものと類似の方法により、5-{[(3R)-4-ベンジルモルホリン-3-イル]メトキシ}-7-エトキシキナゾリン-4(3H)-オンが得られ、これをさらに精製することなく次段階で使用した。
【０１６２】
出発物質として使用した[(3S)-4-ベンジルモルホリン-3-イル]メタノール塩酸塩は、G．R．Brownら、J．Chem．Soc．Perkins  Trans．I、1985年、2577〜2580に記載の通りに製造した。
【０１６３】
b)  5-{[(3R)-4-ベンジルモルホリン-3-イル]メトキシ}-7-エトキシキナゾリン-4(3H)-オン(約2.9mmol)を使用した以外には、実施例２ii.h)に記載のものと類似の反応により、tert-ブチル(3R)-3-{[(7-エトキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}モルホリン-4-カルボキシレート(570mg，49%収率、２段階で)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：7.84(s，1H)，6.65(dd，2H)，4.32(t，1H)，4.23-4.15(m，4H)，4.10-4.07(m1H)，3.82-3.79(m，1H)，3.69-3.65(m，1H)，3.51-3.47(m，1H)，3.42-3.37(m1H)，3.21-3.15(m，1H)，1.41(s，9H)，1.37(t，3H)。
MS(+ve  ESI)：406(M+H)+。
【０１６４】
c)  tert-ブチル(3R)-3-{[(7-エトキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}モルホリン-4-カルボキシレート(560mg，1.4mmol)を使用した以外には、実施例２ii.i)に記載のものと類似の反応により、tert-ブチル(3R)-3-{[(4-クロロ-7-エトキシキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}モルホリン-4-カルボキシレート(420mg，71%収率)が得られた。
MS(+ve  ESI)：424(M+H)+。
【０１６５】
d)  tert-ブチル(3R)-3-{[(4-クロロ-7-エトキシキナゾリン-5-イル)オキシ]メチル}モルホリン-4-カルボキシレート(420mg，0.99mmol)を使用した以外には、実施例２ii.ｊ）に記載のものと類似の反応により、tert-ブチル(3R)-3-[({4-[(1-{2-[(2,3-ジフルオロフェニル)アミノ]-2-オキソエチル}-1H-ピラゾール-4-イル)アミノ]-7-エトキシキナゾリン-5-イル}オキシ)メチル]モルホリン-4-カルボキシレート塩酸塩(561mg，84%収率)が得られた。
1H-NMR(DMSO-d6)：10.38(s，1H)，10.01(s，1H)，8.69(s，1H)，8.31(s，1H)，7.92(s，1H)，7.69-7.64(m，1H)，7.20-7.11(m，2H)，7.01(m，2H)，5.15(s，2H)，4.83-4.79(m，1H)，4.61-4.58(m，1H)，4.54-4.50(m，1H)，4.27(q，2H)，4.03(d，1H)，3.86-3.81(m，1H)，3.75-3.71(m，1H)，3.68-3.63(m，1H)，3.47-3.32(m，2H)，1.42(t，3H)，1.26(s，9H)。
MS(+ve  ESI)：640(M+H)+。
【国際調査報告】
2008542345.tif 000021
2008542345.tif 000022
2008542345.tif 000023