(57)【要約】  本発明は、一方の性の集団を生成させるように誘発することができて、かつ、組織特異的に発現される関心のある異種遺伝子、好ましくは、神経変性疾患遺伝子を含むことができる、雄および雌の非ヒト動物の集団に関する。本発明はまた、非ヒト動物の胚および／または幼虫の混合集団を選別して、一方の性の集団にする方法にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雄の動物が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、かつ前記調節性プロモーターは熱ショックプロモーターではない集団。
【請求項２】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ（head involution defective）、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１に記載の集団。
【請求項３】
前記動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカフライ（medakafly）、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項１に記載の集団。
【請求項４】
前記動物がショウジョウバエである請求項１に記載の集団。
【請求項５】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雄の動物が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記集団が、前記雄および雌の非ヒト動物のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする配列をさらに含む集団。
【請求項６】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項５に記載の集団。
【請求項７】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項５に記載の集団。
【請求項８】
前記動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカフライ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項５に記載の集団。
【請求項９】
前記動物がショウジョウバエである請求項５に記載の集団。
【請求項１０】
雄および雌の昆虫を含む昆虫の集団であって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記集団が、前記雄および雌の昆虫のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む集団。
【請求項１１】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１０に記載の集団。
【請求項１２】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項１０に記載の集団。
【請求項１３】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項１０に記載の集団。
【請求項１４】
前記昆虫がショウジョウバエである請求項１０に記載の集団。
【請求項１５】
雄および雌のショウジョウバエを含むショウジョウバエの集団であって、前記雄のショウジョウバエが、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記集団が、前記雄および雌のショウジョウバエのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む集団。
【請求項１６】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１５に記載の集団。
【請求項１７】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項１５に記載の集団。
【請求項１８】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雌の非ヒト動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれた集団。
【請求項１９】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１８に記載の集団。
【請求項２０】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項１８に記載の集団。
【請求項２１】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項２１に記載の集団。
【請求項２２】
前記集団の前記雄の非ヒト動物が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む請求項１８に記載の集団。
【請求項２３】
前記動物が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項１８に記載の集団。
【請求項２４】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項２３に記載の集団。
【請求項２５】
前記非ヒト動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ（medaka）、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項１８に記載の集団。
【請求項２６】
前記雄および雌の非ヒト動物が、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む請求項１８に記載の集団。
【請求項２７】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記雄および雌の非ヒト動物が、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む集団。
【請求項２８】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項２７に記載の集団。
【請求項２９】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項２７に記載の集団。
【請求項３０】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項２９に記載の集団。
【請求項３１】
前記集団の前記雄の動物が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む請求項２７に記載の集団。
【請求項３２】
前記動物が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項２７に記載の集団。
【請求項３３】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項３２に記載の集団。
【請求項３４】
前記動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項２７に記載の集団。
【請求項３５】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記雄および雌の非ヒト動物が、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、前記雄および雌の動物が、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む集団。
【請求項３６】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項３５に記載の集団。
【請求項３７】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項３５に記載の集団。
【請求項３８】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項３７に記載の集団。
【請求項３９】
前記動物が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項３５に記載の集団。
【請求項４０】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項３９に記載の集団。
【請求項４１】
前記動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項３５に記載の集団。
【請求項４２】
雄および雌の非ヒト動物の集団であって、前記雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記雄および雌の動物が、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、前記雄および雌の動物が、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含み、かつ非ヒト動物の前記集団がＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む集団。
【請求項４３】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項４２に記載の集団。
【請求項４４】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項４２に記載の集団。
【請求項４５】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項４４に記載の集団。
【請求項４６】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項４２に記載の集団。
【請求項４７】
前記動物が、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される請求項４２に記載の集団。
【請求項４８】
雄および雌の昆虫を含む昆虫の集団であって、前記雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれた集団。
【請求項４９】
前記雄の昆虫がＸ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む請求項４８に記載の集団。
【請求項５０】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項４８に記載の集団。
【請求項５１】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項４８に記載の集団。
【請求項５２】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項５１に記載の集団。
【請求項５３】
前記昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項４８に記載の集団。
【請求項５４】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項５３に記載の集団。
【請求項５５】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項４８に記載の集団。
【請求項５６】
前記雄および雌の昆虫が、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結した上流活性化配列をさらに含む請求項４８に記載の集団。
【請求項５７】
雄および雌のショウジョウバエを含むショウジョウバエの集団であって、前記雌のショウジョウバエが付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれた集団。
【請求項５８】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項５７に記載の集団。
【請求項５９】
前記アポトーシス促進遺伝子が、調節性プロモーターに作動可能に連結された請求項５７に記載の集団。
【請求項６０】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項５９に記載の集団。
【請求項６１】
前記ショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項５７に記載の集団。
【請求項６２】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項６１に記載の集団。
【請求項６３】
前記雄のショウジョウバエがＸ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む請求項５７に記載の集団。
【請求項６４】
前記雄および雌の昆虫が、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結した上流活性化配列をさらに含む請求項５７に記載の集団。
【請求項６５】
雌の昆虫集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫がＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記第２集団の前記雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする核酸配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記第１および第２昆虫集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５昆虫集団から雌の昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項６６】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫の集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫がＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記第２集団の前記雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記第１および第２昆虫集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５昆虫集団から前記関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項６８】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第１集団の前記雄および雌の昆虫が、酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記第２集団の前記雄および雌の昆虫が、前記関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記第５集団の前記昆虫が昆虫の胚である請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記第５集団の前記雌の昆虫が前記蛍光性タンパク質を発現する請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ｅ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記ステップ（ｅ）が、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
前記フローサイトメトリーが、複合目的パラメトリック分析機／選別機（Complex object parametric analyzer and sorter）を使用して実施される請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項７７】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項７８】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする、請求項６７に記載の方法。
【請求項７９】
前記関心のある異種遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項６７に記載の方法。
【請求項８０】
前記第２集団の前記昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項６７に記載の方法。
【請求項８１】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第５昆虫集団が１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育培地と接触して置かれる請求項６７に記載の方法。
【請求項８３】
関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエの集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌のショウジョウバエを含む第１ショウジョウバエ集団を調製するステップであって、前記雄のショウジョウバエがＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含むステップ、
（ｂ）雄および雌のショウジョウバエを含む第２ショウジョウバエ集団を調製するステップであって、前記雌のショウジョウバエが付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記第２集団の前記雄のショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌のショウジョウバエを含む第３ショウジョウバエ集団が生成され、前記第２集団の雄のショウジョウバエを含む第４ショウジョウバエ集団が生成されるように、前記第１および第２ショウジョウバエ集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３ショウジョウバエ集団と第４ショウジョウバエ集団とを交配させて、雄および雌のショウジョウバエを含む第５ショウジョウバエ集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５ショウジョウバエ集団から前記関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップ
を含む方法。
【請求項８４】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第１集団の前記雄および雌のショウジョウバエが、酵母Ｇａｌ４をコードする配列を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２集団の前記雄および雌のショウジョウバエが、前記関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記第５集団の前記昆虫がショウジョウバエの胚である請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記第５集団の前記雌のショウジョウバエが前記蛍光性タンパク質を発現する請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
ステップ（ｅ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雌のショウジョウバエを選択することを含む請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記ステップ（ｅ）が、フローサイトメトリーを使用してショウジョウバエ昆虫を選択することを含む請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記フローサイトメトリーが複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
前記関心のある異種遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項８３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２集団の前記ショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項８３に記載の方法。
【請求項９６】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記第５ショウジョウバエ集団が１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育培地と接触して置かれる請求項８３に記載の方法。
【請求項９８】
関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫の集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄および雌の昆虫が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が調節性プロモーターに作動可能に連結され、前記雄および雌の昆虫が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、前記第２集団の前記雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記第１および第２集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５昆虫集団から前記関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項９９】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第５集団の前記昆虫が昆虫の胚である請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第５集団の前記雌の昆虫が前記蛍光性タンパク質を発現する請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
ステップ（ｅ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ステップ（ｅ）が、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記フローサイトメトリーが複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項９８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項９８に記載の方法。
【請求項１０７】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項９８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記関心のある異種遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項９８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第２集団の前記昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項９８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記第５昆虫集団が１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育培地と接触して置かれる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１１２】
関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエの集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌のショウジョウバエを含む第１ショウジョウバエ集団を調製するステップであって、前記雄のショウジョウバエが、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄および雌のショウジョウバエが酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含むステップ、
（ｂ）雄および雌のショウジョウバエを含む第２ショウジョウバエ集団を調製するステップであって、前記雌のショウジョウバエが付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記雄および雌のショウジョウバエが関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、前記第２集団の前記雄のショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌のショウジョウバエを含む第３ショウジョウバエ集団が生成され、前記第２集団の雄のショウジョウバエを含む第４ショウジョウバエ集団が生成されるように、前記第１および第２ショウジョウバエ集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３ショウジョウバエ集団と第４ショウジョウバエ集団とを交配させて、雄および雌のショウジョウバエを含む第５ショウジョウバエ集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５ショウジョウバエ集団から前記関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップ
を含む方法。
【請求項１１３】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記第５集団の前記昆虫がショウジョウバエの胚である請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記第５集団の前記雌のショウジョウバエが前記蛍光性タンパク質を発現する請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
ステップ（ｅ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雌のショウジョウバエを選択することを含む請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ステップ（ｅ）が、フローサイトメトリーを使用してショウジョウバエ昆虫を選択することを含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記フローサイトメトリーが、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２０】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２１】
前記関心のある異種遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２２】
前記第２集団の前記ショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２３】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第５ショウジョウバエ集団が１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育培地と接触して置かれる請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２５】
雄の昆虫の集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成されるように、前記第１集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を前記第２集団から選択するステップ、
（ｅ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｆ）前記第５昆虫集団から雄の昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１２６】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫の集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄および雌の昆虫が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含むステップ、
（ｂ）前記雄の昆虫がＹ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含み、前記雄および雌の昆虫が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成されるように、前記第１集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を前記第２集団から選択するステップ、
（ｅ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｆ）前記第５昆虫集団から前記関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１２８】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第５集団の前記昆虫が昆虫の胚である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第５集団の前記雄の昆虫が前記蛍光性タンパク質を発現する請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
ステップ（ｆ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択することを含む請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ステップ（ｆ）が、フローサイトメトリーを使用して雄の昆虫を選択することを含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記フローサイトメトリーが複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３５】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３６】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３７】
前記関心のある異種遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３８】
ヒト化雌昆虫の集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄および雌の昆虫が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されていて、前記雄および雌の昆虫が関心のあるヒト遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、前記第２集団の前記雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記第１および第２集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｅ）前記第５昆虫集団から前記関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雌昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１３９】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第５集団の前記昆虫が昆虫の胚である請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第５集団の前記雌の昆虫が前記蛍光性タンパク質を発現する請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
ステップ（ｅ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ステップ（ｅ）が、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記フローサイトメトリーが複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４６】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４７】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４８】
前記関心のあるヒト遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第２集団の前記昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記雌不妊突然変異が、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
ヒト化雄昆虫集団を生成させる方法であって、
（ａ）雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄および雌の昆虫が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含むステップ、
（ｂ）雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップであって、前記雄の昆虫がＹ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含み、前記雄および雌の昆虫が関心のあるヒト遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含むステップ、
（ｃ）前記第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成されるように、前記第１集団において前記調節性プロモーターを誘発するステップ、
（ｄ）前記第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、前記第２集団から、前記蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択するステップ、
（ｅ）前記第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
（ｆ）前記第５昆虫集団から前記関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雄昆虫を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１５２】
前記調節性プロモーターが、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第５集団の前記昆虫が昆虫の胚である請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記第５集団の前記雄の昆虫が前記蛍光性タンパク質を発現する請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
ステップ（ｆ）が、前記蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択することを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ステップ（ｆ）が、フローサイトメトリーを使用して雄の昆虫を選択することを含む請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記フローサイトメトリーが複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記昆虫が、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５９】
前記アポトーシス促進遺伝子が、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される請求項１５１に記載の方法。
【請求項１６０】
蛍光性タンパク質をコードする前記配列が緑色蛍光性タンパク質をコードする請求項１５１に記載の方法。
【請求項１６１】
前記関心のあるヒト遺伝子が神経変性疾患遺伝子である請求項１５１に記載の方法。
【請求項１６２】
Ｙ染色体に組み込まれた、熱ショックプロモーターではない調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む雄の非ヒト動物。
【請求項１６３】
Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、そのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む雄の非ヒト動物。
【請求項１６４】
雄の昆虫であって、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄の昆虫のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む昆虫。
【請求項１６５】
雄のショウジョウバエであって、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記雄のショウジョウバエのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含むショウジョウバエ。
【請求項１６６】
付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれた雌の非ヒト動物。
【請求項１６７】
付着Ｘ染色体を含む雌の非ヒト動物であって、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む動物。
【請求項１６８】
付着Ｘ染色体を含む雌の非ヒト動物集団であって、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれており、前記雌の動物が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、かつ性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む集団。
【請求項１６９】
付着Ｘ染色体を含む雌の非ヒト動物であって、アポトーシス促進遺伝子が前記付着Ｘ染色体に組み込まれ、前記雌の動物が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含み、かつＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む動物。
【請求項１７０】
アポトーシス促進遺伝子が組み込まれた付着Ｘ染色体を含む雌の昆虫。
【請求項１７１】
アポトーシス促進遺伝子が組み込まれた付着Ｘ染色体を含む雌のショウジョウバエ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
神経変性疾患は、ヒトが罹患するいくつかの最も重篤な疾患に入る。神経変性疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）が挙げられる。しかしながら、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患、特に神経変性疾患のための治療法の発見および開発は、歴史的に非常に困難であった。
【０００２】
ショウジョウバエでは遺伝学的研究を容易にかつ速やかに遂行できるので、これらのモデルは、疾患を改善する遺伝子を同定する際に特別に有用であった。神経変性疾患における病因機構の研究は、ショウジョウバエにおける疾患モデルの最近の発展により容易になってきた。優性の機能獲得型変異を有するヒト疾患の遺伝子をショウジョウバエに導入することにより、ハンチントン病および脊髄小脳性運動失調モデルを含む多くの神経変性疾患が発生させられた（例えば、Chanら、（２０００年）Cell Death Differ. ７：１０７５〜１０８０頁；Feanyら、（２０００年）Nature ４０４：３９４〜３９８頁；Fernandez-Funezら、（２０００年）Nature ４０８：１０１〜１０６頁；Fortinら、（２０００年）Trends Genet.１６：１６１〜１６７頁；Jacksonら、（１９９８年）Neuron ２１：６３３〜６４２頁；Kazemi-Esfarjaniら、（２０００年）Science ２８７：１８３７〜１８４０頁；Warrickら、（１９９８年）Cell ９３：９３９〜９４９頁参照）。トランスジェニック技法がショウジョウバエにおいて進歩して、その結果、ヒト遺伝子を、酵母由来のＧＡＬ４／ＵＡＳ転写活性化系の制御のもとに置くことにより、細胞または組織特異的発現を達成できるようになった（Brandら、（１９９３年）Development １１８：４０１〜４１５頁）。
【０００３】
ある場合には、導入遺伝子の発現が１つまたは２つ以上のヒト疾患の神経病理的特徴を再現する。例えば、ヒトの変異したα−シヌクレインの神経細胞での発現により生じたパーキンソン病のためのショウジョウバエモデルにおいては、α−シヌクレインに対する免疫反応性および電子顕微鏡での外観の両者によりヒトのこの疾患で見られるものと類似しているレビー小体の存在を伴って、ドーパミン含有細胞の年齢依存性、進行性変性が見られる（Feanyら、（２０００年））。ＳＣＡ１８２Ｑハエにおいて、変異したヒトアタキシン−１（ＳＣＡと関連している）の発現は、変性タンパク質ならびにユビキチン、Ｈｓｐ７０およびプロテオソーム成分に免疫学的に陽性な核封入のある神経細胞の成人発症変性を伴う（Fernandez-Funezら、（２０００年））。ハンチントン病の場合、伸長ポリグルタミンリピートを含むハンチンチンのエクソン−１の発現が進行性変性を惹起し、その発症時期および重症度は、ヒトの疾患で見られるように、リピートの長さに結びついている（Marshら、（２０００年）、Hum.Mol.Genet. ９：１３〜２５頁）。
【０００４】
神経疾患の生物学的基礎を理解することにおいて大きい進歩がなされたとはいえ、この科学上の進歩は、これらの重篤な疾患のための新規で有効な治療に未だ移されていない。ＣＮＳ疾患、特に神経変性疾患のための医薬発見の新規な方法に対する多大な必要性が依然として存在する。
【０００５】
神経変性の研究のためのショウジョウバエの一方の性の集団の発生のための高処理方法のための技術にも必要性がある。例えば、ショウジョウバエでの神経変性病理学の多くの研究は、クライミングアッセイ（すなわち、負の走地性アッセイ）などのアッセイで雄または雌のハエに限って利用している。そのような研究のために一方の性の生物集団を発生させる伝統的な方法は、雄または雌の生物（例えば、ハエ）を手動で選別することであり、それは労働集約的で多大な時間を必要とし、高処理アッセイに容易に適合させられない。
【０００６】
熱ショック応答性の、ｈｉｄ（head involution defective）媒介のショウジョウバエの性選択的死を誘発する方法が、当技術において教えられている（Gretherら、１９９５年、Genes and Development ９：１６９４頁；Mooreら、１９９８年、Development １２５：６６７頁；米国特許第６，２３５，５２４号；および国際特許公開ＷＯ９４／１６０７１）。しかしながら、当技術における教示と対照的に、本発明は、アポトーシス促進遺伝子（例えば、ｈｉｄ）の使用を他の遺伝因子と統合して、関心のある異種遺伝子を発現する非ヒト動物の選別可能な集団を提供する方法を提供した。本発明の一実施形態では、純粋な一方の性の集団を単離するために、ＣＯＰＡＳフローサイトメトリー選別が利用される。本明細書で記載するＣＯＰＡＳ技法は、当技術において知られており、ＧＦＰ発現に基づくショウジョウバエの蛍光による選別のために記載されている（Union Biometrica; 45th Annual Drosophila Research Conference（２００４年））。しかし、Union Biometricaは、性特異的プロモーター（ＳｘｌＰＥ）の制御下におけるＸ染色体に連結したＧＦＰの発現を述べている。本発明は、多大な時間を必要とする可能性があり、追加的遺伝子操作を必要とする性特異的プロモーター系の使用を本発明は、必要としないということにおいて、Union Biometricaの教える選別に対する優位性を有する。その代わりに、本発明は、非ヒト動物集団の性特異的アポトーシス誘発淘汰と遺伝的に修飾した蛍光性マーカー因子の遺伝的選別との組合せを使用して、非ヒト動物の一方の性の集団を生成させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は一部において、神経変性疾患の治療に有用な化合物の確認のためにその後のアッセイで使用することができるショウジョウバエ、特にショウジョウバエ胚の一方の性の集団を発生させるための誘発性アポトーシス促進遺伝子の使用に関する。本発明は、フローサイトメトリーを使用する、ショウジョウバエの一方の性の集団を生成させるための方法も提供し、その結果、性に基づくハエの隔離のための高処理方法を提供する。性特異的選別のために本明細書に記載する方法は、ショウジョウバエに限定されず、非ヒト動物が、直径で５０μｍを越え、好ましくは少なくとも７０と５００μｍの間またはそれを越える寸法を有する胚または幼虫サイズを有するならば、関心のある他の非ヒト動物の選別に使用することができるということも考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、雄の動物が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、かつ調節性プロモーターは熱ショックプロモーターではない、雄および雌の非ヒト動物の集団を包含する。
【０００９】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００１０】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカフライ（medakafly）、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００１１】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエである。
【００１２】
本発明は、雄の動物がＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、さらに、雄および雌の非ヒト動物のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする配列を含む、雄および雌の非ヒト動物の集団を包含する。
【００１３】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００１４】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００１５】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカフライ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００１６】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエである。
【００１７】
本発明は、雄の昆虫がＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、さらに、雄および雌の昆虫のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫の集団を包含する。
【００１８】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００１９】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００２０】
他の実施形態において、昆虫は、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【００２１】
他の実施形態において、昆虫は、ショウジョウバエである。
【００２２】
本発明は、雄のショウジョウバエがＹ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、さらに、雄および雌のショウジョウバエのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする配列を含む雄および雌のショウジョウバエを含むショウジョウバエの集団を包含する。
【００２３】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００２４】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００２５】
本発明は、雌の非ヒト動物が付着Ｘ染色体を含み、前記付着Ｘ染色体にアポトーシス促進遺伝子が組み込まれた雄および雌の非ヒト動物の集団も包含する。
【００２６】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００２７】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００２８】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００２９】
他の実施形態において、集団の雄の非ヒト動物は、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む。
【００３０】
他の実施形態において、動物はＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００３１】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００３２】
他の実施形態において、非ヒト動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ（medaka）、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００３３】
他の実施形態において、雄および雌の非ヒト動物は、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む。
【００３４】
本発明は、雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記Ｘ染色体に組み込まれており、雄および雌の動物が、問題の異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む、雄および雌の非ヒト動物の集団も包含する。
【００３５】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００３６】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００３７】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００３８】
他の実施形態において、集団の雄の動物は、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む。
【００３９】
他の実施形態において、動物は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００４０】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００４１】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００４２】
本発明は、雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記Ｘ染色体に組み込まれており、雄および雌の動物が、問題の異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む雄および雌の非ヒト動物の集団も包含する。
【００４３】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００４４】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００４５】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００４６】
他の実施形態において、動物は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００４７】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００４８】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００４９】
本発明は、雌の動物が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記Ｘ染色体に組み込まれており、雄および雌の動物が、問題の異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含み、かつ、非ヒト動物の集団がＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む、雄および雌の非ヒト動物の集団も包含する。
【００５０】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００５１】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００５２】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００５３】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００５４】
他の実施形態において、動物は、ショウジョウバエ、カイコ、C. elegans、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、およびアフリカツメガエルからなる群から選択される。
【００５５】
本発明は、雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が前記Ｘ染色体に組み込まれた、雄および雌の昆虫を含む昆虫の集団も包含する。
【００５６】
一実施形態において、雄の昆虫は、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む。
【００５７】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００５８】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００５９】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００６０】
他の実施形態において、昆虫は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００６１】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００６２】
他の実施形態において、昆虫は、ショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【００６３】
他の実施形態において、雄および雌の昆虫は、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む。
【００６４】
本発明は、雌のショウジョウバエが付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれた雄および雌のショウジョウバエを含むショウジョウバエの集団も包含する。
【００６５】
一実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００６６】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。
【００６７】
他の実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００６８】
他の実施形態において、ショウジョウバエは、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００６９】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００７０】
他の実施形態において、雄のショウジョウバエは、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む。
【００７１】
他の実施形態において、雄および雌の昆虫は、神経変性疾患遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む。
【００７２】
本発明は、
雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、第２集団の雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２昆虫集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から雌の昆虫を選択するステップ
を含む雌の昆虫の集団を生成させる方法を包含する。
【００７３】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００７４】
本発明は、
雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、第２集団の雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２昆虫集団における調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【００７５】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００７６】
他の実施形態において、第１集団の雄および雌の昆虫は、酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む。
【００７７】
他の実施形態において、第２集団の雄および雌の昆虫は、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む。
【００７８】
他の実施形態において、第５集団の昆虫は昆虫の胚である。
【００７９】
他の実施形態において、第５集団の雌の昆虫は蛍光性タンパク質を発現する。
【００８０】
他の実施形態において、昆虫の第５集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む。
【００８１】
他の実施形態において、昆虫の第５集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップは、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む。
【００８２】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機（Complex object parametric analyzer and sorter）を使用して実施される。
【００８３】
他の実施形態において、昆虫はショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【００８４】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【００８５】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【００８６】
他の実施形態において、関心のある異種遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【００８７】
他の実施形態において、第２集団の昆虫は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【００８８】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【００８９】
他の実施形態において、昆虫の第５集団は、１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育媒体と接触させて置かれる。
【００９０】
本発明は、
雄のショウジョウバエが、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む雄および雌のショウジョウバエを含む第１ショウジョウバエ集団を調製するステップ、
雌のショウジョウバエが付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、第２集団の雄のショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌のショウジョウバエを含む第２のショウジョウバエ集団を調製するステップ、
第１集団の雌のショウジョウバエを含む第３ショウジョウバエ集団が生成され、第２集団の雄のショウジョウバエを含む第４ショウジョウバエ集団が生成されるように、第１および第２ショウジョウバエ集団における調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３ショウジョウバエ集団と第４ショウジョウバエ集団とを交配させて、雄および雌のショウジョウバエを含む第５ショウジョウバエ集団を生成させるステップ、および
第５ショウジョウバエ集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエの集団を生成させる方法も包含する。
【００９１】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【００９２】
他の実施形態において、第１集団の雄および雌のショウジョウバエは、酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む。
【００９３】
他の実施形態において、第２集団の雄および雌のショウジョウバエは、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む。
【００９４】
他の実施形態において、第５集団の昆虫はショウジョウバエの胚である。
【００９５】
他の実施形態において、第５集団の雌のショウジョウバエは蛍光性タンパク質を発現する。
【００９６】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雌のショウジョウバエを選択することを含む。
【００９７】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップは、フローサイトメトリーを使用してショウジョウバエ昆虫を選択することを含む。
【００９８】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【００９９】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１００】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１０１】
他の実施形態において、関心のある異種遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１０２】
他の実施形態において、第２集団のショウジョウバエは、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【０１０３】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【０１０４】
他の実施形態において、第５ショウジョウバエ集団は、１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育媒体と接触させて置かれる。
【０１０５】
本発明は、
雄の昆虫が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、雄および雌の昆虫が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、第２集団の雄の昆虫が、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２昆虫集団における調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１０６】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１０７】
他の実施形態において、第５集団の昆虫は昆虫の胚である。
【０１０８】
他の実施形態において、第５集団の雌の昆虫は蛍光性タンパク質を発現する。
【０１０９】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む。
【０１１０】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雌の昆虫を選択するステップは、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む。
【０１１１】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１１２】
他の実施形態において、昆虫はショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【０１１３】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１１４】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１１５】
他の実施形態において、関心のある異種遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１１６】
他の実施形態において、第２集団の昆虫は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【０１１７】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【０１１８】
他の実施形態において、第５昆虫集団は、１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育媒体と接触させて置かれる。
【０１１９】
本発明は、
雄のショウジョウバエの各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌のショウジョウバエの各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む雄および雌のショウジョウバエを含む第１ショウジョウバエ集団を調製するステップ；
雌のショウジョウバエの各々が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、雄および雌のショウジョウバエの各々が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、第２集団の雄のショウジョウバエが、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌のショウジョウバエを含む第２ショウジョウバエ集団を調製するステップ；
第１集団の雌のショウジョウバエを含む第３ショウジョウバエ集団が生成され、第２集団の雄のショウジョウバエを含む第４ショウジョウバエ集団が生成されるように、第１および第２ショウジョウバエ集団における調節性プロモーターを誘発するステップ；
第３ショウジョウバエ集団と第４ショウジョウバエ集団とを交配させて、雄および雌のショウジョウバエを含む第５ショウジョウバエ集団を生成させるステップ；および
第５ショウジョウバエ集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエの集団を生成させる方法も包含する。
【０１２０】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１２１】
他の実施形態において、第５集団の昆虫はショウジョウバエの胚である。
【０１２２】
他の実施形態において、第５集団の雌のショウジョウバエは蛍光性タンパク質を発現する。
【０１２３】
他の実施形態において、第５ショウジョウバエ集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雌のショウジョウバエを選択することを含む。
【０１２４】
他の実施形態において、第５ショウジョウバエ集団から関心のある異種遺伝子を含む雌のショウジョウバエを選択するステップは、フローサイトメトリーを使用してショウジョウバエを選択することを含む。
【０１２５】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１２６】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１２７】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１２８】
他の実施形態において、関心のある異種遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１２９】
他の実施形態において、第２集団のショウジョウバエは、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【０１３０】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【０１３１】
他の実施形態において、ショウジョウバエの第５集団は、１つまたは２つ以上の試験化合物を含む飼育媒体と接触させて置かれる。
【０１３２】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ；
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成されるように、第１集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、蛍光性タンパク質を発現する第２集団から雄の昆虫を選択するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から雄の昆虫を選択するステップ
を含む、雄の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１３３】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１３４】
一実施形態において、蛍光性タンパク質を発現する第２集団の雄の昆虫は、フローサイトメトリーを使用して選択される。
【０１３５】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１３６】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫の集団を調製するステップ、
雌の昆虫の各々が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、第２昆虫集団は、Ｙ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２の集団の各々において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から雄の昆虫を選択するステップ
を含む、雄の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１３７】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫の各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雄の昆虫の各々がＹ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含み、雄および雌の昆虫の各々が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む、第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成されるように、第１昆虫集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第２集団の雌の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、蛍光性タンパク質を発現する第２集団から雄の昆虫を選択するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫を選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１３８】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１３９】
他の実施形態において、第５集団の昆虫は昆虫の胚である。
【０１４０】
第５集団の雄の昆虫が蛍光性タンパク質を発現する請求項１２７の方法。
【０１４１】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫を選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択することを含む。
【０１４２】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫を選択するステップは、フローサイトメトリーを使用して、雄の昆虫を選択することを含む。
【０１４３】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１４４】
他の実施形態において、昆虫はショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【０１４５】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１４６】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１４７】
他の実施形態において、関心のある異種遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１４８】
一実施形態において、蛍光性タンパク質を発現する第２集団の雄の昆虫は、フローサイトメトリーを使用して選択される。
【０１４９】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１５０】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫の各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫の各々が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、雄および雌の昆虫の各々が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、第２昆虫集団は、Ｙ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫を選択するステップ
を含む、関心のある異種遺伝子を含む雄の昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１５１】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫の各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫の各々が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、雄および雌の昆虫の各々が関心のあるヒト遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、第２集団の雄の昆虫がＸ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雌昆虫を選択するステップ
を含む、ヒト化雌昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１５２】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１５３】
他の実施形態において、第５集団の昆虫は昆虫の胚である。
【０１５４】
他の実施形態において、第５集団の雌の昆虫は蛍光性タンパク質を発現する。
【０１５５】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雌昆虫を選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雌の昆虫を選択することを含む。
【０１５６】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雌昆虫を選択するステップは、フローサイトメトリーを使用して雌の昆虫を選択することを含む。
【０１５７】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１５８】
他の実施形態において、昆虫はショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【０１５９】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１６０】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１６１】
他の実施形態において、関心のあるヒト遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１６２】
他の実施形態において、第２集団の昆虫は、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む。
【０１６３】
他の実施形態において、雌不妊突然変異はｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘからなる群から選択される。
【０１６４】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫の各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雄の昆虫の各々がＹ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列を含み、雄および雌の昆虫の各々が関心のあるヒト遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む、第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む昆虫の第３集団が生成されるように、第１集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第２集団から、蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雄昆虫を選択するステップ
を含む、ヒト化雄昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１６５】
一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーター、Ｇａｌ４０、Ｇａｌ８０、Ｔｅｔ、およびＲＵ４８６からなる群から選択される。
【０１６６】
他の実施形態において、第５集団の昆虫は昆虫の胚である。
【０１６７】
他の実施形態において、第５集団の雄の昆虫は蛍光性タンパク質を発現する。
【０１６８】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雄昆虫を選択するステップは、蛍光性タンパク質を発現する雄の昆虫を選択することを含む。
【０１６９】
他の実施形態において、第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雄昆虫を選択するステップは、フローサイトメトリーを使用して雄の昆虫を選択することを含む。
【０１７０】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１７１】
他の実施形態において、昆虫はショウジョウバエ、カイコ、およびカからなる群から選択される。
【０１７２】
他の実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、ｈｉｄ、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ−ａｌａ、ＩＣＥ、およびｃｅｄ−３からなる群から選択される。
【０１７３】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質をコードする配列は緑色蛍光性タンパク質をコードする。
【０１７４】
他の実施形態において、関心のあるヒト遺伝子は神経変性疾患遺伝子である。
【０１７５】
他の実施形態において、蛍光性タンパク質を発現する第２集団の雄の昆虫は、フローサイトメトリーを使用して選択される。
【０１７６】
他の実施形態において、フローサイトメトリーは、複合目的パラメトリック分析機／選別機を使用して実施される。
【０１７７】
本発明は、
雄の昆虫の各々が、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄および雌の昆虫の各々が酵母Ｇａｌ４をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第１昆虫集団を調製するステップ、
雌の昆虫の各々が付着Ｘ染色体を含み、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれ、雄および雌の昆虫の各々が関心のあるヒト遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、第２昆虫集団がＹ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む、雄および雌の昆虫を含む第２昆虫集団を調製するステップ、
第１集団の雌の昆虫を含む第３昆虫集団が生成され、第２集団の雄の昆虫を含む第４昆虫集団が生成されるように、第１および第２集団において調節性プロモーターを誘発するステップ、
第３昆虫集団と第４昆虫集団とを交配させて、雄および雌の昆虫を含む第５昆虫集団を生成させるステップ、および
第５昆虫集団から関心のあるヒト遺伝子を含むヒト化雄昆虫を選択するステップ
を含む、ヒト化雄昆虫の集団を生成させる方法も包含する。
【０１７８】
本発明は、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、前記調節性プロモーターは熱ショックプロモーターではない雄の非ヒト動物も包含する。
【０１７９】
本発明は、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、そのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む、雄の非ヒト動物も包含する。
【０１８０】
本発明は、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄の昆虫のゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む、雄の昆虫も包含する。
【０１８１】
本発明は、Ｙ染色体に組み込まれた調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含み、雄のショウジョウバエのゲノムに組み込まれた、神経細胞または膠細胞に特異的なプロモーターに作動可能に連結されたＧａｌ４をコードする核酸配列をさらに含む、雄のショウジョウバエも包含する。
【０１８２】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれた雌の非ヒト動物も包含する。
【０１８３】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれており、雌の動物が関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含む雌の非ヒト動物も包含する。
【０１８４】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれており、雌の動物が、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、かつ性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含む雌の非ヒト動物の集団も包含する。
【０１８５】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれており、雌の動物が、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列をさらに含み、性染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質をコードする配列をさらに含み、かつ雌の動物が、Ｘ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異をさらに含む雌の非ヒト動物も包含する。
【０１８６】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれた雌の昆虫も包含する。
【０１８７】
本発明は、付着Ｘ染色体を含み、アポトーシス促進遺伝子が付着Ｘ染色体に組み込まれた雌のショウジョウバエも包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８８】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、性に特異的な様式で誘発アポトーシス促進遺伝子を利用することにより（それが細胞死を惹起する）、生物、特にショウジョウバエの一方の性の集団を調製する方法を提供する。本発明は、より具体的には、フローサイトメトリーおよび関心のある特定の性の昆虫にのみ発現する蛍光標識を利用することによる、非ヒト動物の胚、好ましくは昆虫の胚の性特異的選別に関する。さらに、本発明は、試験化合物を、特定の疾患、好ましくは神経変性疾患に作用する能力について評価する方法を提供し、その方法では、化合物が、本発明の方法により性選別された動物で評価される。
【０１８９】
定義
本明細書で使用する用語「アポトーシス促進遺伝子」は、その発現が、アポトーシス、すなわちプログラム細胞死を制御および／または執行する遺伝子を指し、さらに、アポトーシスと関連する遺伝子を指す。アポトーシスは動物界を通じて正常な発生の顕著な特徴であり、形態学的に特徴的で再現性のある様式で起こる。アポトーシスの間、細胞の原形質および細胞核は凝縮し、一方細胞小器官の形態は本質的に完全なままである。細胞断片は、最終的には食細胞により貪食される。アポトーシスは能動的な細胞プログラムの結果であると理解されており、ある「アポトーシス促進遺伝子」の活性がプログラム細胞死を制御および／または執行するために必要とされると考えられる。本明細書で使用する「アポトーシス促進遺伝子」は、ショウジョウバエ由来のｈｉｄ（head involution defective）、ｒｅａｐｅｒ、ｇｒｉｍ、ｈｉｄ／ａｌａ遺伝子、C. elegans由来のｃｅｄ−３遺伝子、および哺乳動物のｉｃｅ遺伝子を含むいくつかの遺伝子を指すことができる。本発明による「アポトーシス促進遺伝子」は、同族体または変種がアポトーシスと関連しているならば、前述のものの同族体およびそれらの変種も指す。
【０１９０】
本明細書で使用する「調節性プロモーター」は、外因性または内因性の化学物質もしくは刺激薬（例えば、アルコール、ホルモン、または増殖因子）の存在で、または発達上の変化に応答して、または分化の特定の段階で、または特定の組織もしくは細胞で、または温度などの刺激に応答してのみ発現するプロモーターを指す。本明細書で使用する「調節性プロモーター」は、高温側への変化（より具体的には、少なくとも１０〜１５分間に約１８〜２５℃から少なくとも３７℃への変化）に応答して発現される熱ショックプロモーターを、好ましくは指す。本発明において有用な熱ショックプロモーターの例には、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ２２、ｈｓｐ２３、ｈｓｐ２６、ｈｓｐ２７、ｈｓｐ６７ｂ、ｈｓｐ８３、Ｈｓｃ７０−１、Ｈｓｃ７０−２、Ｈｓｃ７０−３、Ｈｓｃ７０−４、Ｈｓｃ７０−５、およびＨｓｃ７０−６の発現を調節するプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で使用する「調節性プロモーター」は、遺伝子の発現の調節に有用であると知られている他の遺伝学的要素を指し、Ｇａｌ８０、Ｇａｌ−ＥＲ、ｔｅｔおよびＲｕ４８６を含むが（例えば、それぞれ、McGuireら（２００４年、SciSTKE ２２０：１６頁）、Brasselmanら（１９９３年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：１６５７頁）、GossenおよびBujard（Proc.Natl.Acad.Sci.USA（１９９２年）８９：５５４７頁）、ならびにOsterwalderら（２００１年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ２３：１２５９６頁）に記載されている）、これらに限定はされない。
【０１９１】
本明細書で使用する用語「Ｘ−染色体」は、哺乳類、昆虫および両生類などの動物の異種性染色体の１つを指す。本明細書で使用する用語「Ｘ−染色体」は、複数の逆位および／または転座を含むＸ−染色体バランサーを含むと意味づけされ、相同染色体間の組み換え事象を最小化するのに利用される。これはヘテロ接合原種の維持の手段を提供する。バランサー染色体の使用は、当技術において知られていて、記載は、例えば、Greenspan,R.J.（１９９７年）フライ・プッシング：ショウジョウバエ遺伝学の理論と実践（Fly Pushing:The Theory and Practice of Drosophila Genetics）、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに見出すことができる。本明細書で使用する用語「性染色体」は、ＸもしくはＹ染色体、またはバランサーＸもしくはＹ染色体を指す。
【０１９２】
本明細書で使用する用語「雌不妊突然変異」は、変異を有する雌の生物を不妊にする、雌の生物のＸ染色体中の変異を指す。本明細書で使用する用語「雌不妊突然変異」は、前記変異を有する生物が妊性になることを防止する遺伝的変異を指す。例えば、劣性の雌不妊突然変異についてホモ接合である雌の動物は、卵を産むことができない可能性があって、その子孫は、その後胚または幼虫のまま死ぬであろう。多数の「雌不妊突然変異」が当業者に知られていて、ｆｓ（１）Ｋ１０、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘ（Perrimonら、１９８４年、Genetics, １０８：５５９頁参照）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９３】
本明細書で使用する「異種遺伝子」は、あるタンパク質を最終的に発現する生物のゲノム以外の１つまたは２つ以上の供給源から得られた、そのタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントである。供給源は天然であってもよく、例えば、遺伝子は細菌、ウィルス、酵母、カビ、昆虫、ヒト等などの他の生命体供給源から得ることができる。供給源は合成的なものでもよく、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントはｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学合成によって調製することができる。本明細書で使用する「異種遺伝子」は、その遺伝子が最終的に発現させる生物である、異なる種に由来する遺伝子を指すことができる。本発明で有用な「異種遺伝子」は、ヒトの遺伝子であってよく、疾患の遺伝子であってよく、またはヒト疾患の遺伝子であってよく、さらに、ヒトの神経変性疾患の遺伝子であってよい。「異種の」は、遺伝子フラグメントの供給源が、それが最終的に発現させられる生物のゲノム中のどこか他の場所である（例えば、異なる位置に由来する）状況においても使用することができる。
【０１９４】
本明細書で使用する「神経変性疾患遺伝子」は、遺伝子の正常な発現、異常な発現、または変異が神経変性疾患の発症に関連している遺伝子を指す。本明細書で使用する「神経変性疾患」は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、ツレット症候群、脳卒中、虚血性脳損傷、および外傷性脳損傷を、これらに限定することなく含む中枢または末梢神経系（神経細胞および／または膠細胞を含む）を冒す変性疾患を指す。本明細書で使用する「神経変性疾患」は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）、加齢性記憶障害、銀親和性（agyrophilic）顆粒認知症、グアムのパーキンソン症候群−認知症複合症、自己免疫状態（例えば、ギランバレー症候群、ループス）、ビンスワンガー（Biswanger’s）病、脳および精髄の腫瘍（神経線維腫症を含む）、脳アミロイド血管症（Journal of Alzheimer’s Disease 第３巻、６５〜７３頁（２００１年））、脳性麻痺、慢性疲労症候群、大脳皮質基底核変性症、ＣＮＳ実質の発達機能不全に基づく状態、大脳血管構造発達機能不全に基づく状態、多発脳梗塞性認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）認知症、明確な病理組織学的検査所見を欠く認知症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化、神経変性を伴う眼、耳および前庭系の疾患（黄斑変性および緑内障を含む）、ダウン症候群、運動異常症候群（発作性）、筋失調症、本態性振戦、ファール症候群、第１７染色体に関係する前頭側頭型痴呆パーキンソン症候群（ＦＴＤＰ−１７）、前頭側頭葉変性、前頭葉認知症、肝性脳症、遺伝性痙性対麻痺、水頭症、ＣＳＦ機能不全を伴う偽脳腫瘍および他の状態、ゴーシェ病、ハラーフォルデン・シュパッツ病、コルサコフ症候群、軽度認知障害、単肢筋委縮症、運動神経細胞疾患、多系統萎縮症、多発性硬化症および他の脱髄状態（例えば、白質萎縮症）、筋痛性脳脊髄炎、筋クローヌス、化学物質、薬物および毒素により誘発された神経変性、ＡＩＤＳ認知症を含むＡＩＤＳの神経症状、細菌および／またはウィルス（エンテロウィルスを含むが、これに限定されない）感染の神経／認知症状および予後、ニーマン・ピック病、神経原線維変化を伴う非グアム型運動神経細胞疾患、非ケトーシス型高グリシン血症、オリーブ橋小脳萎縮症、眼咽頭型筋ジストロフィー、非麻痺性ポリオおよびポリオ後症候群を含む灰白髄炎の神経症状、原発性側索硬化症、プリオン疾患（クロイツフェルト・ヤコブ病（変形種を含む）、クールー病、致死的家族性不眠症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病、および他の伝染性海綿状脳症、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症を含む）、脳炎後パーキンソン症候群、進行性筋委縮症、進行性球麻痺、進行性皮質下神経膠症、進行性核上性麻痺、下肢静止不能症候群、レット症候群、ザントホフ病、痙縮性、散発性前頭側頭認知症、線条体黒質変性症、亜急性硬化性全脳炎、亜硫酸酸化酵素欠損症、シドナム舞踏病、タングルオンリー認知症（tangle only dementia）、テイ・サックス病、ツレット症候群、血管性認知症、ならびにウィルソン病を、これらに限定することなく含む１つまたは２つ以上の疾患を指す���本明細書で使用する「神経変性疾患遺伝子」は、したがって、上記疾患の１つまたは２つ以上の発症、維持、および病態に関連する１つまたは２つ以上の遺伝子を指す。本発明の「神経変性疾患遺伝子」は当業者に知られていて、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、ＡＰＨ−１ａ、ＡＰＨ−１ｂ、ＰＥＮ−２、Ｔａｕ（および以下に記載するその変異体および変形種）、ＡＢ４２［野生型］、ＡＢ４２［フランドル変異］、ＡＢ４２［イタリア変異］、ＡＢ４２［極寒地帯変異］、ＡＢ４２［ダッチ変異］、ＡＢ４２［アイオワ変異］、ＡＰＰ［野生型］、ＡＰＰ［ロンドン変異］、ＡＰＰ［スウェーデン変異］、ＡＰＰ［フランス変異］、ＡＰＰ［ドイツ変異］、ＳｉｒＴ１−５、ＳＣＡ１、ハンチントン、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、およびＰＩＮＫ−１が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９５】
本明細書で使用する用語「蛍光性タンパク質」は、適当な電磁波照射で励起されたときに蛍光を発する任意のタンパク質を指す。これには、アミノ酸配列が天然のまたは操作されたタンパク質が含まれる。本明細書で使用する「蛍光性タンパク質」には、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、増強蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ（シアン蛍光性タンパク質）、およびＥＹＦＰ（黄色蛍光性タンパク質）を含む）、サンゴ蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、ＤｓＲｅｄ、およびヒト化されたもしくは変異した蛍光性タンパク質を含む、操作された他の形態のＧＦＰからなる群から選択される任意のタンパク質が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１９６】
本明細書で使用する用語「上流活性化配列」は、転写活性化因子、例えば、酵母転写活性化因子Ｇａｌ４が結合した遺伝子配列を指す。Ｇａｌ４活性化系との関連で使用される「上流活性化配列」（ＵＡＳ）を、本明細書ではＧａｌ４／ＵＡＳ系と称する。Ｇａｌ４／ＵＡＳ系においては、関心のある異種遺伝子を、酵母転写活性化因子Ｇａｌ４が結合した上流活性化配列（ＵＡＳ）の１つまたは２つ以上のコピーを有するプロモーターの構築物下流にクローン化する。導入遺伝子は、生物、例えば、昆虫に、標準的手段によって導入される（例えば、導入遺伝子として発現させることができ、または昆虫の染色体に組み込むことができる）。関心のある異種遺伝子を誘発することを望むときには、Ｇａｌ４が発現する組織中でＧａｌ４がＵＡＳ連結導入遺伝子の転写を活性化するように、ＵＡＳに作動可能に連結された異種遺伝子を含むトランスジェニック生物と、普通に、または、組織もしくは発達段階に特異的な、または化学的にもしくは環境的に誘発可能なプロモーターの制御下に酵母Ｇａｌ４分子を発現する株とを交配させる。この系は、限られた組織でのみＧａｌ４を発現するＧａｌ４トランスジェニック体を生ずる能力に基づき、異種遺伝子の高度に時間的、空間的に制限された特異的発現を達成するために使用することができる。Ｇａｌ４／ＵＡＳに加えて、他の転写活性化因子およびそれらそれぞれの結合活性化ドメインを、本発明にしたがって使用することができ、そのような活性化因子は当業者に知られている。
【０１９７】
本明細書で使用する用語「非ヒト動物」は、胚または幼虫のサイズが直径５０μｍを越え、好ましくは、少なくとも１方向の長さが７０と５００μｍの間の範囲にあり、またはそれを越える、非ヒト多細胞生物を指す。本明細書で使用する非ヒト動物は、直径が少なくとも１００μｍかつ最大１ｍｍの単一液滴内に含まれることができる胚または幼虫段階を有する多細胞生物である。本発明の「非ヒト動物」には、刺胞動物門、有櫛動物門、扁形動物門、線形動物門、環形動物門、軟体動物門、鋏角亜門、単肢動物門、甲殻綱および脊索動物門の動物が含まれるが、これらに限定はされない。単肢動物門には、有翅昆虫などの昆虫を含む六脚類亜門が含まれる。脊索動物には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類などの脊椎動物群が含まれる。本明細書に記載した遺伝因子を含むトランスジェニック動物を生成させる、本発明の方法で使用することができる技法は、当技術において周知である。この主題についての有用な一般的テキストは、Houdebine、トランスジェニック動物−生成と使用（Transgenic animals-Generation and Use）（Harwood Academic、１９９７年）で、トランスジェニック動物の生成に使用される技法の詳細な総説である。
【０１９８】
本明細書で使用する用語「表現型」は、本発明において有用な非ヒト動物（例えば、ハエ）の観察可能なおよび／または測定可能な身体的、行動的、または生化学的特徴を指す。本明細書で使用する用語「変質表現型」は、野生型動物の表現型に比較して、変化した表現型を指す。変質表現型の例には、対照動物（ここで、「対照動物」は関心のある異種遺伝子を発現しないか、または候補化合物に曝露されたことがない動物を指す）の表現型に比較して測定可能な量だけ、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、またはより好ましくは５０％だけ変化した、食欲、配偶行動、および／または寿命などの行動的表現型、あるいは観察可能なように変化した形態的表現型、例えば、動物の異なる成長速度、あるいは、対照動物で観察された臓器もしくは付属器の形状、サイズ、色、もしくは配置、または組織の分布もしくは特徴に比較して、臓器もしくは付属器の異なる形状、サイズ、色、もしくは配置、または組織の異なる分布および／もしくは特徴が挙げられる。本明細書で使用する「表現型の変化」または「変質表現型の変化」、または「表現型の相違」は、対照の非ヒト動物、昆虫またはハエの表現型との比較における表現型での測定可能なおよび／または観察可能な変化を意味する。本明細書で使用する用語「表現型の変化」または「表現型の相違」は、関心のある表現型の特徴の増加または減少をさらに指す。したがって、表現型が、例えば、低下した、または変質したクライミング行動である場合は、表現型における増加はクライミングにおけるより誇張された変質であるが、表現型における減少は変質したクライミングの重症度における減少（すなわちクライミングにおける増加）である。本発明にしたがって測定することができる表現型の特性は、２００４年１月２２日公開の国際特許出願公開ＷＯ０４／００６８５４（その全体を本明細書に組み込む）に挙げられているが、それらに限定はされない。
【０１９９】
本明細書で使用する用語「昆虫」は、昆虫綱に分類される生物を指し、好ましくは双翅目に入る生物を指す。多くの実施形態で特に有用な昆虫はハエである。そのようなハエの例には、有翅昆虫などの昆虫を含む六脚亜門を含む単肢動物門の構成員が含まれ、好ましくは、キイロショウジョウバエを含むショウジョウバエ科の構成員が含まれる。ある実施形態において、ハエはトランスジェニックハエ、例えば、トランスジェニックキイロショウジョウバエである。トランスジェニック動物は、その染色体に組み込まれた異種ＤＮＡ（例えば、異なる種由来の）を含む動物である。他の実施形態において、動物は、内因性ポリペプチドの発現レベルの変化（例えば、機能の獲得または機能の結果の喪失を生ずる変質）を生ずる遺伝的変質を含む。動物またはトランスジェニック動物という用語は、発生の任意の段階の動物、例えば、成体、受精卵、胚、幼虫等を指すことができる。
【０２００】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結された」は、コード配列が正確に転写され、スプライスされ、かつ翻訳されて、他の構造的特徴がそれらそれぞれの機能を遂行できるように、プロモーター、エンハンサー、終止配列等に融合したそれぞれのコード配列を指す。
【０２０１】
本発明は、アポトーシス促進遺伝子を調節性プロモーターと連結して使用することができるという発見、および非ヒト胚および／または幼虫（例えば、ショウジョウバエ幼虫）の一方の性集団の高処理、自動選別を可能にする、染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質に、一部は基づいている。
【０２０２】
生成型集団
本発明は、後で配偶させ、次に性に基づいて選別することができる非ヒト動物の一方の性の集団を生成させるために、２つの生成型集団を利用する。
【０２０３】
雌の生成型集団
第１の実施形態において、本発明は、雌の生成型集団（集団１、図１〜５）を提供する。すなわち、純粋な雌集団（集団３、図１〜５）を生成させるために使用する非ヒト動物（例えば、ショウジョウバエ）の性混合集団である。本明細書に記載した遺伝的操作が可能な、当技術において知られている全ての非ヒト動物は、本発明にしたがって使用することができる。本発明において有用な非ヒト動物には、直径が５０μｍを越える、好ましくは、少なくとも一方の長さが７０と５００μｍの間の範囲にあり、またはそれを越える胚または幼虫サイズを有する非ヒト多細胞生物が当てはまる。本明細書で使用する非ヒト動物は、直径が少なくとも１００μｍかつ最大１ｍｍの単一液滴内に含まれることができる胚または幼虫段階を有する多細胞生物である。本発明の好ましい非ヒト動物は、昆虫、線虫、および両生類である。刺胞動物門、有櫛動物門、扁形動物門、線形動物門、環形動物門、軟体動物門、鋏角類、単肢動物門、甲殻綱および脊索動物門の動物である。単肢動物門には、有翅昆虫などの昆虫を含む六脚類亜門が含まれる。脊索動物門には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、および両生類などの脊椎動物群が含まれる。好ましい実施形態において、動物は昆虫である。本発明の方法で使用することができるトランスジェニック昆虫を生成させる方法は周知である（例えば、Loukerisら、（１９９５年）、Science ２７０、２００２〜２００５頁；およびO’BrochtaおよびAtkinson（１９９８年）、Scientific American ２７９、６０〜６５頁参照）。
【０２０４】
より好ましくは、本発明の非ヒト動物は、ショウジョウバエ、カイコ、線虫、線虫C. elegans、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、および他のハエの１つまたは２つ以上である。
【０２０５】
雌生成型集団の動物を遺伝的に改変して、調節性プロモーターが活性化されたときに、雄の動物がアポトーシスを経て雌の動物の純粋集団が生ずるように、アポトーシス促進遺伝子を調節性プロモーターの制御下に置き、Ｙ染色体に組み込む。アポトーシスは、典型的には、雌の生成型集団の子孫で誘発され、その結果、その原種を維持することが可能で、無垢の雌だけを単離することができる。
【０２０６】
調節性プロモーター／アポトーシス促進遺伝子のＹ染色体への組み込みの方法は、当技術において知られている。調節性プロモーター／アポトーシス促進遺伝子をゲノムに組み込んで既に含んでいるハエの原種は、Bloomington stock center（インディアナ大学）などの市場の供給源から入手することができる。あるいは、ハエの原種は、当技術において知られている方法を使用して生成させてもよい。調節性プロモーター／アポトーシス促進遺伝子配列をＹ染色体に組み込むために使用することができる技法は、例えば、RubinおよびSpradling（１９８２年）、「転位因子ベクターを用いたショウジョウバエの形質転換（Genetic Transformation of Drosophila with Transposable Element Vectors）」、Science、２１８：３４８頁に見出される。簡単に述べると、その方法は、関心のあるＤＮＡ（例えば、調節性プロモーター／アポトーシス促進遺伝子）を、内部に欠失のあるＰ因子に連結させることを含む。すなわち、Ｐ因子は、内因性トランスポザーゼ活性を欠くが、その末端リピートは保持しているものである。次に、標的化ベクターを第２の「ヘルパー」Ｐ因子（それは、活性なトランスポザーゼを有するが、乱れた末端リピートしか有しない）とともに共注入することにより、関心のあるＤＮＡを連結しているがヘルパー因子は含まない標的化ベクターの安定な組み込みを達成することができる。RubinおよびSpradlingの文献で教えている方法は、本明細書に記載したショウジョウバエ系統の生成を可能にするために必要に応じて、当業者により容易に改良することができる。
【０２０７】
（アポトーシス促進遺伝子）
本発明の一実施形態において、雌生成型集団の雄の動物は、Ｙ染色体に組み込まれた、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を含むように、改変されている。本発明によるアポトーシス促進遺伝子は、それらの発現に応答してアポトーシスを誘発または促進することが当技術において知られている如何なる遺伝子をも含む。したがって、本発明において有用なアポトーシス促進遺伝子には、発現がアポトーシス、すなわちプログラム細胞死を制御および／または執行する遺伝子が当てはまり、アポトーシスに関連する遺伝子がさらに当てはまる。アポトーシスは動物界を通じて正常な発生の顕著な特徴であり、形態学的に特徴的で再現性のある様式で起こる。アポトーシスの間、細胞の原形質および細胞核は凝縮し、一方細胞小器官の形態は本質的に完全なままである。その後、細胞は断片化して食細胞により貪食される。アポトーシスは能動的な細胞プログラムの結果であると理解されており、あるアポトーシス促進遺伝子の活性がプログラム細胞死を制御および／または執行するために必要とされると考えられる。本発明において有用なアポトーシス促進遺伝子には、ショウジョウバエ由来の遺伝子であるｈｉｄ（head involution defective）（Gretherら、１９９５年、Genes and Development ９：１６９４頁）、ｒｅａｐｅｒ（Whiteら、１９９４年、Drosophila Science ２６４：６７７頁）、ｇｒｉｍ（Chenら、１９９６年、Genes.Devel. １０：１７７３頁）、ｈｉｄ／ａｌａ（Luqueら、２００２年、Biochemistry １９：１３６６３頁）、C. elegans由来の遺伝子ｃｅｄ−３（Ellisら、１９９１年、Annu.Rev.Cell biol. ７：６６３頁）、および哺乳動物の遺伝子ｉｃｅ（Whyte、１９９６年 Trends Cell Biol. ６：２４５頁）が挙げられるが、これらに限定はされない。本発明により有用なアポトーシス促進遺伝子は、前述のものの同族体および変種がアポトーシスを制御し、執行し、および／またはそれに関連しているならば、それらの同族体および変種を含む。
【０２０８】
（調節性プロモーター）
本発明の一実施形態において、雌生成型集団のＹ染色体に組み込まれたアポトーシス促進遺伝子は、調節性プロモーターに作動可能に連結されている。調節性プロモーターとアポトーシス促進遺伝子の間の作動可能な連結は、そのプロモーター配列の活性化（例えば、調節性プロモーターを調節するための適当な何らかの刺激に応答して）が、その結果として必然的に、アポトーシス促進遺伝子の転写を必ず起こすことを意味するということを、当業者は理解するであろう。
【０２０９】
本発明において有用な調節性プロモーターは、外因性または内因性の化学物質または刺激（例えば、アルコール、ホルモン、または増殖因子）の存在で、または発生上の変化に応答して、または分化の特定の段階で、または特定の組織もしくは細胞で、または温度などの刺激に応答してのみ発現するプロモーターを含む。好ましい実施形態において、調節性プロモーターは、高温側への変化（通常、少なくとも１０〜１５分間、最大で２時間またはそれを越える時間に約１８〜２５℃から少なくとも３７℃への温度変化）に応答して発現される熱ショックプロモーターである。本発明において有用な熱ショックプロモーターの例には、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ２２、ｈｓｐ２３、ｈｓｐ２６、ｈｓｐ２７、ｈｓｐ６７ｂ、ｈｓｐ８３、Ｈｓｃ７０−１、Ｈｓｃ７０−２、Ｈｓｃ７０−３、Ｈｓｃ７０−４、Ｈｓｃ７０−５、およびＨｓｃ７０−６の発現を調節するプロモーター（IngoliaおよびCraig、Nucleic Acids Res. １９８０年、８（１９）：４４４１〜５７頁；Araiら、１９９５年、Japn J.Genetics ７０：４２３頁）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２１０】
本発明の一実施形態において、調節性プロモーターは熱ショックプロモーターではなくて、本明細書に記載した任意の他の調節性プロモーターであってもよい。
【０２１１】
他の調節性プロモーターには、例えば、低分子誘発性遺伝子発現（遺伝子スイッチ）を記載しているCrabtreeらによる米国特許第５，８６９，３３７号および第５，８３０，４６２号（引用により本明細書に組み込む）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１７号、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０５９１号、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８号（引用により本明細書に組み込む）等に記載されているような転写因子、ならびに、Bujardらにより報告されたテトラサイクリンによる調節を含むもの等、GossenおよびBujard（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（１９９２年）８９：５５４７頁）、およびBujardらによる米国特許第５，４６４，７５８号、第５，６５０，２９８号および第５，５８９，３６２号（引用により本明細書に組み込む）中に記載されている一般的にアロステリック「オフスイッチ」と称される他の異種の転写系の転写因子の誘発性結合すなわち活性化により制御されるものが含まれる。他の調節性転写系には、ステロイドまたは他のホルモンによる調節が含まれる。変異体、変種、および／または同族体を含む、当業者に知られている他の調節性プロモーターは、本発明のアポトーシス促進遺伝子の発現を調節するように、本発明により同様に適合させることができる。
【０２１２】
本発明において有用な調節性プロモーターには、Ｇａ１８０、Ｇａｌ−ＥＲ、ｔｅｔ  およびＲｕ４８６（例えばMcGuireら、（２００４年、ＳｃｉＳＴＫＥ  ２２０；１６頁）、Brasselmanら、１９９３年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：１６５７頁）、GossenおよびBujard（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（１９９２年）、８９：５５４７頁）、Osterwalderら、（２００１年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ２３：１２５９６頁）にそれぞれ記載されている）を含むが、これらに限定はされない、遺伝子発現の調節に有用であると当業者に知られている他の遺伝因子が含まれる。これらは以下でさらに詳細に説明する。
【０２１３】
好ましい実施形態において、調節性プロモーターは、熱ショックプロモーターであり、ショウジョウバエのｈｉｄ遺伝子に作動可能に連結されている。この組合せを本明細書においてはｈｓ−ｈｉｄ因子と称する。ｈｓ−ｈｉｄ因子に加えて、アポトーシス促進遺伝子と調節性プロモーターとの他の組合せを本発明にしたがって使用することができることは、当業者により理解されるであろう。
【０２１４】
（雄生成型集団）
第２の実施形態において、本発明は、雄生成型集団（すなわち、図１〜５中の集団２）すなわち、純粋な雄集団（すなわち、図１〜５中の集団４）を生成させるために使用される非ヒト動物（例えば、ショウジョウバエ）の混合性集団を提供する。本明細書に記載した遺伝的操作が可能な、当技術において知られている全ての非ヒト動物は、本発明にしたがって使用することができる。本発明において有用な非ヒト動物には、直径が５０μｍを越える、好ましくは、少なくとも一方の長さが７０と５００μｍの間の範囲にあり、またはそれを越える胚または幼虫サイズを有する非ヒト多細胞生物が当てはまる。本明細書で使用する非ヒト動物は、直径が少なくとも１００μｍ最大１ｍｍの単一液滴内に含まれることができる胚または幼虫段階を有する多細胞生物である。本発明の好ましい非ヒト動物は、昆虫、線虫、および両生類である。より好ましくは、本発明の非ヒト動物は、ショウジョウバエ、カイコ、線虫、C. elegans、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ、動物プランクトン、メダカ、蚊、および他のハエの１つまたは２つ以上である。さらにより好ましくは、本発明の非ヒト動物はショウジョウバエである。
【０２１５】
本発明の雄生成型集団は、付着Ｘ染色体と称せられる遺伝現象を活用する。Ｘ染色体が末端動原体である生物（例えば、ショウジョウバエ）において、ある場合には、２つのＸ染色体が動原体性領域に連結して、その結果それらは減数分裂中に単一の中部動原体染色体として機能することができる。トリプルＸ染色体生物は、低い生存能を示すので（しかも生き残る者は不妊である）、付着Ｘ染色体動物の正常雄との配偶の成功による子孫のみがＸ＾ＸＹ雌子孫およびＸＹ雄となるであろう。すなわち、付着Ｘ染色体は雌親からその娘だけを選び出し、またＸ染色体は雄親からその息子だけを選び出す（例えば、ハエ）。この異常な遺伝様式を活用して、本発明は、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を付着Ｘ染色体中に組み込むことにより、付着Ｘ染色体を利用する。このようにして、上に述べたように、調節性アポトーシス促進遺伝子は、Ｘ＾Ｘ染色体上で雌の動物によってのみ伝えられ、雄の動物には存在しないであろう。次に、雄生成型原種中のアポトーシス促進遺伝子を活性化することにより、雌は排除されて、雄のみが回収される。アポトーシス促進遺伝子の活性化は、その原種を不滅化できるように、雄生成型原種の子孫で通常は実施する。
【０２１６】
（アポトーシス促進性遺伝子および調節性プロモーター）
雄生成型集団で使用することができるアポトーシス促進性遺伝子および調節性プロモーターは、上で述べた雌生成型集団で利用することができるものと同じである。しかしながら、好ましい実施形態において、アポトーシス促進遺伝子は、調節性熱ショックプロモーターに作動可能に連結されたｈｉｄ遺伝子（すなわち、ｈｓ−ｈｉｄ因子）である。
【０２１７】
（雌不妊突然変異）
本発明の一実施形態において、雄生成型集団は、Ｘ染色体（例えば、雄生成型集団の動物に含まれる）に組み込まれた劣性雌不妊突然変異をさらに含む。付着Ｘ染色体遺伝子型を雄生成型集団のために使用することに付随して、雄で接合異常がないという事象が生じ、妊性で付着Ｘ染色体を有しない雌の生成という結果になる。そのような接合異常がないという事象は稀で、１／２０００から１／５０００の頻度でのみ起こる。しかし、それにも拘らず、雄生成型集団中のそのような妊性雌の稀な出現は、これらの雌がアポトーシス促進遺伝子を有しないので、純粋雄集団を生成させる能力を損なうであろう。したがって、一実施形態においては、雄における如何なる接合異常でない事象においても、劣性の雌不妊突然変異を担うＸ染色体が、Ｆｌ雌動物に隔離されるように、劣性の雌不妊突然変異をＸ染色体に組み込んで、接合異常でない事象から生ずる雌が、劣性の雌不妊突然変異に対してホモ接合であり、その結果不妊になって、集団を汚染することができないことを確実にする。本発明にしたがって使用することができる雌不妊突然変異は、ｆｓ（１）Ｋ１０変異、原腸形成欠損変異、ＪＡ１２７、ＪＣ１０５、ＥＣ２０５、ＥＡ１３０、ＲＣ６３、ＶＡ２９６  ＤＦ９４２、ＤＣ７７６、ＨＡ９０、Ｌ２７１、ＶＡ１７２、ＪＣ１５５、ＤＣ７９８、ＨＦ３３０、ＨＦ３１１、ＥＤ２２６、ＥＦ４６２、Ｄ６２、Ｄ７２、ＥＡ７５、ｇｔｘ１１、およびｆｓ（１）ｐｃｘを含むが、これらに限定はされない（例えば、Perrimonら、１９８４年、Genetics、１０８：５５９頁参照）。
【０２１８】
雌不妊突然変異は、当技術において知られている方法を使用して、Ｘ染色体に組み込むことができる。不妊突然変異を含むハエの原原種は、Bloomington Stock Center（インディアナ大学）などの市場の供給源から得ることができ、当技術において知られている方法を使用して、Ｘ結合雌不妊突然変異を染色体に挿入することができる（例えば、前掲のRubinおよびSpradling参照）。
【０２１９】
（蛍光性タンパク質）
本発明によれば、以下で詳細に説明するように、雄および雌生成型集団を利用して、動物（例えば、ショウジョウバエ）の純粋な一方の性の集団を生成させ、次にそれを交配させ、それに続いて性に基づいて選別することができる。一実施形態において、選別事象は、雄生成型集団の動物の性染色体に組み込まれて、構成的、組織特異的、または調節性プロモーターの制御下に置かれた配列によりコードされた蛍光性タンパク質または他のマーカータンパク質を利用する。好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターである。蛍光性タンパク質をコードする配列が組み込まれる特定の性染色体は、選別されるべき動物の特定の性によって決定される（正または負の選別のいずれにしても）。例えば、当業者が雌（図１）の動物を選別することを欲するなら、そのときは、蛍光性タンパク質をコードする配列が、雄生成型集団の野生型Ｘ染色体に組み込まれるであろう。上記のように、雄生成型集団中の付着Ｘ染色体の遺伝の性質のために、蛍光標識されたＸ染色体は雄動物にのみ存在するであろう。このように、雄生成型集団における調節性プロモーターの導入およびそれに続くＸＧＥＰＹ雄の回収に続く、正常ＸＸ雌との交配は、標識Ｘ染色体が雌の子だけに担われる子孫を生ずるであろう。雄生成元集団のＸまたはＹ染色体に蛍光性タンパク質をコードする配列を組み込む方法は、当技術において知られていて、上記のRubinおよびSpradlingの一般的教示から容易に適合させることができる。
【０２２０】
本発明において有用な蛍光性タンパク質は、適当な電磁波照射で励起されたときに蛍光を発する如何なるタンパク質も含む。これは、天然のタンパク質をベースとするが、例えば、特別のスペクトル移動、または他の蛍光特性を有するように改変された変異蛍光性タンパク質など、アミノ酸配列が天然のもしくは操作したまたはそれらの組合せのものであるタンパク質を含む。本明細書において使用する蛍光性タンパク質は、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、増強蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ（シアン蛍光性タンパク質）、およびＥＹＦＰ（黄色蛍光性タンパク質）を含む）、サンゴ蛍光性タンパク質、青色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、ＤｓＲｅｄ、およびヒト化または変異した蛍光性タンパク質を含むＧＦＰの他の操作した形態からなる群から選択された任意のタンパク質を含むが、これらに限定はされない。本発明において有用な蛍光性タンパク質は、限定されることなく、Molecular Probes,Inc.（Eugene、オレゴン州所在）を含むいくつかの市場の供給源から得ることができる。蛍光性タンパク質をコードする配列に関する情報は、ワールドワイドウェブのmolecularprobes.comで見出すことができる。
【０２２１】
本明細書に記載した蛍光性マーカーに加えて、当技術において知られている他の検出可能なマーカーを本発明で使用することができるということは、当業者に理解されるであろう。本明細書で使用するために適当な他の検出可能なマーカーは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物を含む。本発明における有用な標識は、標識ストレプトアビジン複合体で染色するためのビオチン、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで普通に使用される他の酵素）、および金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスその他）ビーズなどの比色標識を含む。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０２２２】
そのような標識を検出する方法は、当業者には周知である。したがって、例えば、蛍光性マーカーは、発光を検出するために光検知器を使用して検出することができる。酵素標識は、通常、酵素に基質を供給して、基質に対する酵素の作用により生成した反応生成物を検出することにより検出され、比色標識は、着色した標識を単に視覚化することにより検出される。本発明における特別の使用の他の検出方法は、下でより詳細に記述するフローサイトメトリーを含む。
【０２２３】
（異種遺伝子）
本発明の一実施形態において、雄および雌生成型集団は、それらから生じた純粋雄および雌集団の子が交配されたときに、関心のある異種遺伝子を、好ましくは、組織特異的に発現するように、遺伝的に改変されている。本発明で使用するように適合させることができる、当技術において知られている多くの遺伝子発現系がある。本発明の誘発性遺伝子発現系の好ましい例は、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系である。Ｇａｌ４／ＵＡＳは、関心のある異種遺伝子の調節された発現のための系である。この系において、関心のある異種遺伝子は、酵母転写活性化因子Ｇａｌ４により活性化され得る上流活性化配列（ＵＡＳ）の１つまたは２つ以上のコピーを担うプロモーターの構築下流にクローン化される。関心のある異種遺伝子は、非ヒト動物、例えば、昆虫に、標準的方法により導入される。関心のある異種遺伝子を誘発することを望むときは、生じたトランスジェニック生物と、普通に、または、組織もしくは発生段階に特異的なプロモーターの制御下に、酵母Ｇａｌ４分子を発現する株とを交配させ、その結果、Ｇａｌ４が発現する組織中で、Ｇａｌ４がＵＡＳ連結異種遺伝子の転写を活性化する。この系は、BrandおよびPerrimon（１９９３年、Development １１８：４０１〜４１５頁）およびRothら（１９９８年、Development １２５：１０４９〜１０５７頁）に記載されているように十分に確立されている。上記文献の教示は全体を本明細書に組み込む。さらに、組織特異的Ｇａｌ４トランスジェニックハエ系統のライブラリーは、ワールドワイドウェブの、例えば、fly-trap.orgおよびflymap.lab.nig.ac.jp/〜dclust/getdb.htmlで入手可能である。
【０２２４】
より具体的には、雌生成型集団は遺伝的に改変されていて、その結果、その集団は、関心のある細胞中での発現を提供する内因性プロモーター配列、または同様に関心のある細胞中でのみ、もしくは、時間的調節性プロモーターの場合には関心のある時間に、発現を提供する外因性プロモーター（例えば、異種のプロモーター）のいずれかに作動可能に連結されるように、ゲノムに安定に組み込まれた、Ｇａｌ４をコードする配列を含む。Ｇａｌ４の発現をドライブするために使用されるプロモーターは、当技術において知られていて、本明細書に記載されている調節性プロモーターの代替形態であってよく、化学的にまたは温度に感受性のプロモーターを含む。好ましい実施形態において、Ｇａｌ４をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター因子は、神経細胞に、または膠細胞に特異的なプロモーター、すなわち、神経細胞または膠細胞で選択的に活性化されるプロモーターである。本明細書で使用する「神経細胞」は、中枢または末梢神経系のいずれかの任意の神経細胞を指し、感覚神経細胞、運動神経細胞、介在神経細胞、自律性神経細胞、および神経細胞始原細胞すなわち前駆体を含むが、これらに限定されることはない。本明細書で使用する「膠細胞」は、中枢または末梢神経系の膠細胞を指し、星状細胞、乏突起膠細胞（oligodentrocyte）、シュワン細胞、小膠細胞、放射状神経膠細胞（radial glia）を含み、およびさらにグリオーマまたは星細胞腫などの異常な膠細胞構造を含むが、これらに限定はされない。本発明において有用な神経細胞特異的プロモーターは、ＥＬＡＶ、α−アノラーゼ、β−アクチン、ｔａｕプロモーター、ｐ３５プロモーター、ネスチンプロモーター、ＧＡＢＡプロモーター、Ｄｄｃ、ナーヴァナ（nervana）、スカベラス（scaberous）、ａｃｅ−１、ａｃｒ−５、ａｅｘ−３、ａｐｌ−１、ａｌｔ−１、ｃａｔ−１、ｃａｔ−２、ｃｃｈ−１、ｃｄｈ−３、ｃｅｈ−２、ｃｅｈ−２、ｃｅｈ−６、ｃｅｈ−１０、ｃｅｈ−１４、ｃｅｈ−１７、ｃｅｈ−２３、ｃｅｈ−２８、ｃｅｈ−２４、ｃｅｈ−３６、ｃｈｅ−１、ｃｈｅ−３、ｃｇｋ−１、ｃｈａ−１、ｃｎｄ−１、ｃｏｄ−５、ｄａｆ−１、ｄａｆ−４、ｄａｆ−７、ｄａｆ−１９、ｄｂｌ−１、ｄｅｓ−２、ｄｅｇ−１、ｄｅｇ−３、ｄｅｌ−１、ｅａｔ−４、ｅａｔ−１６、ｅｈｓ−１、ｅｇｌ−  １０、ｅｇｌ−１７、ｅｇｌ−１９、ｅｇｌ−２、ｅｇｌ−３６、ｅｇｌ−５、ｅｇｌ−８、ｆａｘ−１、ｆｌｐ−１、ｆｌｐ−１、ｆｌｐ−３、ｆｌｐ−５、ｆｌｐ−６、ｆｌｐ−８、ｆｌｐ−１２、ｆｌｐ−１５、ｆｌｐ−３、ｆｌｒ−４、ｇｃｙ−１０、ｇｃｙ−１２、ｇｃｙ−３２、ｇｃｙ−３３、ｇｃｙ−５、ｇｃｙ−６、ｇｃｙ−７、ｇｃｙ−８、ｇｇｒ−１、ｇｇｒ−２、ｇｇｒ−３、ｇｌｒ−１、ｇｌｒ−５、ｇｌｒ−７、ｇｌｔ−１、ｇｏａ−１、ｇｐａ−１、ｇｐａ−１、ｇｐａ−２、ｇｐａ−３、ｇｐａ−４、ｇｐａ−５、ｇｐａ−６、ｇｐａ−７、ｇｐａ−８、ｇｐａ−９、ｇｐａ−１０、ｇｐａ−１１、ｇｐａ−１３、ｇｐａ−１４、ｇｐａ−１５、ｇｐａ−１６、ｇｐｂ−２、ｇｓａ−１、ｈａｍ−２、ｈｅｒ−１、ｉｄａ−１、ｉｎａ−１、ｌｉｍ−４、ｌｉｍ−６、ｌｉｍ−６、ｌｉｍ−７、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−４、ｌｉｎ−４５、ｍａｂ−１８、ｍｅｃ−３、ｍｅｃ−７、ｍｅｃ−８、ｍｅｃ−９、ｍｅｃ−１８、ｍｇｌ−１、ｍｇｌ−２、ｍｉｇ−１、ｍｉｇ−１３、ｍｕｓ−１、ｎｃｓ−１、ｎｈｒ−２２、ｎｈｒ−３８、ｎｈｒ−７９、ｎｍｒ−１、ｏｃｒ−１、ｏｃｒ−２、ｏｄｒ−１、ｏｄｒ−２、ｏｄｒ−２、ｏｄｒ−１０、ｏｄｒ−３、ｏｄｒ−３、ｏｄｒ−７、ｏｐｔ−３、ｏｓｍ−１０、ｏｓｍ−３、ｏｓｍ−９、ｐａｇ−３、ｐｈａ−１、ｐｉｎ−２、ｒａｂ−３、ｒｉｃ−１９、ｓａｋ−１、ｓｄｆ−１３、ｓｅｋ−１、ｓｅｋ−２、ｓｇｓ−１、ｓｎｂ−１、ｓｎｔ−１、ｓｒａ−１、ｓｒａ−１０、ｓｒａ−１１、ｓｒａ−６、ｓｒａ−７、ｓｒａ−９、ｓｒｂ−６、ｓｒｇ−２、ｓｒｇ−８、ｓｒｄ−１、ｓｒｅ−１、ｓｒｇ−１３、ｓｒｏ−１、ｓｔｒ−１、ｓｔｒ−２、ｓｔｒ−３、ｓｙｎ−２、ｔａｂ−１、ｔａｘ−２、ｔａｘ−４、ｔｉｇ−２、ｔｐｈ−１、ｔｔｘ−３、ｔｔｘ−３、ｕｎｃ−３、ｕｎｃ−４、ｕｎｃ−５、ｕｎｃ−８、ｕｎｃ−８、ｕｎｃ−１１、ｕｎｃ−１７、ｕｎｃ−１８、ｕｎｃ−２５、ｕｎｃ−２９、ｕｎｃ−３０、ｕｎｃ−３７、ｕｎｃ−４０、ｕｎｃ−４３、ｕｎｃ−４７、ｕｎｃ−５５、ｕｎｃ−６４、ｕｎｃ−８６、ｕｎｃ−９７、ｕｎｃ−１０３、ｕｎｃ−１１５、ｕｎｃ−１１６、ｕｎｃ−１１９、ｕｎｃ−１２９、ｖａｂ−７を含むが、これらに限定はされない。本明細書で使用され得る膠細胞特異的プロモーターの例には、膠細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＭＥ−１、ＧＣＭ、Ｒｅｐｏ（逆極性）、およびｄＥＥＡＴ１および２が挙げられるが、これらに限定はされない。組織またはその他の調節可能なプロモーターを使用するＧａｌ４発現の制御に加えて、他の発現調節因子が当技術において知られており、本発明にしたがって使用することができる。例えば、雌生成型集団は、限定されることなく、Ｇａ１８０、Ｇａｌ−ＥＲ、ｔｅｔ  およびＲｕ４８６（例えば、McGuireら、（２００４年、SciSTKE ２２０：１６頁）、Braselmannら（１９９３年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：１６５７頁）、GossenおよびBujard（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（１９９２年）８９：５５４７頁）、およびOsterwalderら、（２００１年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ２３：１２５９６頁）にそれぞれ記載されている）から選択された遺伝因子を、その染色体に組み込んで含むようにさらに改変することができる。これらの遺伝因子の各々は、Ｇａｌ４と協力して、その活性を抑制するかまたはＧａｌ４活性を刺激するように機能することができ（例えば、化学的または環境的刺激により誘発可能な、Ｇａｌ４に対する転写因子として作用する）、その際、Ｇａｌ４の抑制は１つまたは２つ以上の化学的または環境的刺激により回復される。例えば、Ｇａｌ８０は、ある温度でＧａｌ４活性を抑制することが知られている。したがって、雌生成型集団にＧａｌ８０を含めることにより（その場合、Ｇａｌ４も、例えば、組織特異的プロモーターの制御下に組み込まれる）、Ｇａｌ４活性化が望まれるまで、ある温度に集団を保つことにより、Ｇａｌ４誘発を遅らすことができる。それから、Ｇａｌ８０がもはやＧａｌ４を抑制しない温度に、集団を曝して、ＵＡＳの活性化および関心のある異種遺伝子の発現を可能にすることができる。Ｇａｌ４とＧａｌ４抑制因子のこの組合せは、当業者が異種遺伝子発現の空間的および時間的様相の両方を調節することを可能にする。
【０２２５】
同様に、雄生成型集団は、ゲノムに安定に組み込んだ、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結された上流活性化配列（ＵＡＳ）を含むように遺伝的に改変されている（例えば、図２〜５）。下に述べるプロトコルにしたがって、アポトーシス促進遺伝子に作動可能に連結された調節性プロモーターが一旦誘発されると、その結果生ずる純粋雄集団はＵＡＳ標的構築物を含むであろう（また、生ずる純粋雌集団は、組織特異的な様式で発現されるＧａｌ４ドライバー構築物を含むであろう）。
【０２２６】
２つの一方の性の集団（それぞれ図１〜５中の集団３および４）の交配は、子孫における関心のある異種遺伝子の誘発を生ずるが、その遺伝子の発現はＧａｌ４が発現される特定の組織に限定される（組織特異的プロモーターの制御下のＧａｌ４の場合）。例えば、Ｇａｌ４が神経細胞特異的プロモーターの制御下にある場合、関心のある異種遺伝子はＧａｌ４を発現する神経細胞中におけるＧａｌ４／ＵＡＳ相互作用により、トランス活性化されるだけであろう。
【０２２７】
本発明の異種遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子または遺伝子フラグメントであり、それが最終的に発現させられる生物のゲノム以外の１つまたは２つ以上の供給源から得られる。供給源は天然でもよく、例えば、細菌、ウィルス、酵母、カビ、昆虫、ヒト等などの他の生命体供給源から遺伝子を得ることができる。好ましくは、異種遺伝子はヒト起源のものである。供給源は合成的でもよく、例えば、遺伝子または遺伝子フラグメントを化学合成によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。異種遺伝子は、それが最終的に発現される生物である、異なる種に由来する遺伝子であってよい。本発明において有用な異種遺伝子は、疾患遺伝子、またはヒト疾患遺伝子であってよく、さらに、ヒトの神経変性疾患遺伝子であってよい。異種遺伝子は、遺伝子フラグメントの供給源が、それが最終的に発現させられる生物のゲノム中の他の場所である（例えば、異なる位置に由来する）状況で使用することもできる。
【０２２８】
一実施形態において、関心のある異種遺伝子は疾患遺伝子、すなわち動物における与えられた疾患状態を開始し、調節し、または維持する遺伝子である。好ましい実施形態において、本発明における有用な異種遺伝子は、神経変性疾患遺伝子、好ましくは、ヒトの神経変性疾患遺伝子である。神経変性疾患遺伝子は、当技術において知られており、例えば、２００４年４月２２日公開の米国特許出願第２００４００７６９９９号（内容を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。本発明において使用する好ましい神経変性疾患遺伝子には、プレセニリン１、プレセニリン２、ニカストリン、ＡＰＨ−１ａ、ＡＰＨ−１ｂ、ＰＥＮ−２、Ｔａｕ（および以下に記載するその変異体および変種）、ＡＢ４２［野生型］、ＡＢ４２［フランドル変異］、ＡＢ４２［イタリア変異］、ＡＢ４２［極寒地帯変異］、ＡＢ４２［ダッチ変異］、ＡＢ４２［アイオワ変異］、ＡＰＰ［野生型］、ＡＰＰ［ロンドン変異］、ＡＰＰ［スウェーデン変異］、ＡＰＰ［フランス変異］、ＡＰＰ［ドイツ変異］、ＳｉｒＴ１−５、アタキシン−１、ハンチンチン、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、およびＰＩＮＫ−１が含まれるが、これらに限定はされない。
【０２２９】
前述のことに基づいて、本発明は、このように、Ｇａｌ４ドライバーおよびＵＡＳ／異種遺伝子（標的）をそれぞれ含む非ヒト動物の一方の性の集団２つ（図１中の集団３および４）を生成させるために使用することができる非ヒト動物の集団を提供する。したがって、集団３と集団４とを交配させることは、生ずる子のゲノム中のドライバー／標的系の組み込みを、それらが関心のある異種遺伝子を、組織、時間、または刺激特異的な様式で発現させる、すなわち、どこでもおよび／またはいつでもＧａｌ４が発現されるように制御する便利な方法を提供する。
【０２３０】
性特異的選別方法
先に述べたように、本発明は、動物、より具体的には、胚および／または幼虫を、例えば、表現型を変調する化合物または物質を同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる一方の性の集団に性特異的に選別する方法を提供する。本発明の一実施形態において、性特異的選別は２段階を含み、第１段階は、調節性プロモーターの制御下のアポトーシス促進遺伝子の性特異的発現に基づく１つの性の性特異的淘汰である。この第１段階選別で使用される動物集団は、雌（第１集団）および雄（第２集団）生成型集団として上で説明した。その結果生ずる動物の純粋雌（第３集団）および純粋雄（第４集団）集団を、引き続き、混合子孫集団（第５集団）を生成させるために交配させる。次に、選別の第２段階を、蛍光性タンパク質または他のマーカーの発現に基づいて実施するが、その際、マーカーの発現は第５集団の一方の性に限定される。蛍光性マーカーを発現する第５集団から一方の性の動物を選択し、このようにして一方の性の集団を生成させる。上で特に言及したように、蛍光性マーカーをコードする配列を性染色体のいずれに組み込むかを変えることにより、純粋雄または純粋雌集団のいずれも、選別の第２段階で得ることができる。例えば、雄の動物（例えば、ショウジョウバエ）の純粋集団が所望の場合、当技術において知られていて本明細書に記載した方法を使用して、蛍光性タンパク質をコードする配列を、雄生成型集団（第２集団）のＹ染色体に組み込む。反対に、純粋雌集団を第５集団から選択すべき場合は、蛍光性タンパク質をコードする配列を、雄生成型集団（第２集団）のＸ染色体に組み込み、このようにして、第５集団内に含まれる雌の子にのみ選別される。
【０２３１】
（アポトーシス促進遺伝子の誘発）
本明細書に記載したように、雄および雌生成型集団株は、調節性プロモーターに作動可能に連結されたアポトーシス促進遺伝子を、Ｘ＾ＸおよびＹ染色体それぞれに組み込んで含む。したがって、雄および雌生成型系統の発生中の胚でアポトーシスを誘発するように、適当な刺激を与えてアポトーシス促進遺伝子の転写を媒介する調節性プロモーターを誘発しなければならない。上記のように、調節性プロモーターは、外因性または内因性の化学物質または刺激（例えば、アルコール、ホルモン、または増殖因子）の存在で、または発生上の変化に応答して、または分化の特定の段階で、または組織もしくは細胞で、または温度などの刺激に応答してのみ、発現するプロモーターであってよい。したがって、調節性プロモーターの活性化には、当業者が本発明で使用される特別の調節性プロモーターに適当な刺激を与えることが必要である。例えば、調節性プロモーターがホルモンに応答して活性化される場合、当業者は、改変された性染色体（ＹまたはＸ＾Ｘのいずれか）を発現する動物に、適当なホルモンを、プロモーターを活性化させるのに適当な濃度で与えることにより、調節性プロモーターを活性化するであろう（また、このようにして、アポトーシス促進遺伝子の発現を誘発するであろう）。
【０２３２】
好ましい実施形態において、調節性プロモーターは、高温側への変化（一般的には、少なくとも１０〜１５分間、最大２時間またはそれを越える時間に約１８〜２５℃から少なくとも３７℃への温度変化）に応答して活性化される熱ショックプロモーターである。本発明において有用な熱ショックプロモーターの例には、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ２２、ｈｓｐ２３、ｈｓｐ２６、ｈｓｐ２７、ｈｓｐ６７ｂ、ｈｓｐ８３、Ｈｓｃ７０−１、Ｈｓｃ７０−２、Ｈｓｃ７０−３、Ｈｓｃ７０−４、Ｈｓｃ７０−５、およびＨｓｃ７０−６（IngoliaおよびCraig、Nucleic Acids Res. １９８０年、８（１９）：４４４１〜５７頁；Araiら、１９９５年、Japn J.Genetics ７０：４２３頁）の発現を調節するプロモーターが挙げられるが、これらに限定はされない。熱ショックプロモーターを誘発する方法は、当技術において理解されている。本発明の一実施形態において、本発明の動物はショウジョウバエであり、次のプロトコルを熱ショックプロモーターを誘発させるために使用することができ、そのようにして染色体に結合したアポトーシス促進遺伝子を活性化させる。簡単にいえば、ショウジョウバエの胚を寒天プレート上に終夜で収集する（例えば、雄または雌生成型集団のいずれかに由来する胚）。これを第０日と見なす。例えば、０．７％ＮａＣｌおよび０．０３％トリトンＸ−１００を含む胚洗浄溶液中で、胚を一連の篩（８５０μｍ、４２５μｍ、および１２５μｍ）を通して篩い、最後に５０ｍｌのコニカルチューブに集める。胚は重力でペレット化し、例えば、１４．４％ｗ／ｖスクロース、０．７％ｗ／ｖＮａＣｌ、および０．０５％トリトンＸ−１００を含む無菌接種溶液中に再懸濁させる。次に、胚を８オンス（２５２ｍｌ）貯蔵ビンに１ビン当たり６００〜７００胚の溶液中濃度にしてピペットで移す。これを第１日とする。それから、第３および第４日に、幼虫に、循環水浴中３７℃で２時間熱ショックを与える。ｈｓ−ｈｉｄ因子を含まない幼虫は第１０日に孵化するはずである。
【０２３３】
アポトーシス促進遺伝子の誘発は、遺伝子が活性化された動物（例えば、胚および／または幼虫）におけるアポトーシスを検出することにより確認することができる。アポトーシスを受けている細胞は、形態的および生化学的特徴を示す。これらの特徴は、染色質の凝集、核および細胞質の凝縮、ならびに、リボソーム、形態的に完全なミトコンドリアおよび核材料を含む膜結合小胞（アポトーシス小体）になる細胞質および核の分割を含む。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これらのアポトーシス小体は、膠細胞、マクロファージ、または隣接する上皮細胞のいずれかに、速やかに認識され貪食される。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアポトーシスする細胞の除去のためのこの効率的な機構により、炎症応答は誘発されない。前述の１つまたは２つ以上のいずれの検出も、本発明の胚および／または幼虫におけるアポトーシスを示すものである。本発明のアポトーシス促進遺伝子の活性化を示すために検出することができる、アポトーシスの他の形態的および生化学的様相は、完全性喪失のないものを除く膜小疱形成、核膜における染色質の凝集、細胞質の収縮および核の凝縮、細胞の小体への断片化、膜結合小胞の形成（アポトーシス小体）、ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質を含む細孔形成により、ミトコンドリアが漏出性になる、エネルギー（ＡＴＰ）依存性（能動過程が４℃で起こらない）、ＤＮＡの非ランダムモノおよびオリゴヌクレオソーム長断片化（アガロースゲル電気泳動後の梯子状パターン）、溶解前の（prelytic）ＤＮＡ断片化、ミトコンドリアによる種々の因子（チトクロームＣ、ＡＩＦ）の細胞質への放出、カスパーゼカスケードの活性化、膜非対称の変化（すなわち、ホスファチジルセリンの細胞質から細胞の外側への移行）を含むが、これらに限定はされない。
【０２３４】
（動物の交配）
雄および雌生成型集団の各々におけるアポトーシス促進遺伝子の活性化に続いて、純粋雌または純粋雌動物の集団が得られ、例外として、雄生成型集団のＸ染色体に雌不妊突然変異の封入により修復された、雄生成型集団における接合異常でない稀な事象がある。一実施形態において、第３および第４の一方の性の集団の生成に続いて、一方の性のこれらの集団を育て、混合性集団を生成させる。種々の動物（例えば、ショウジョウバエ）を交配させる方法は、当技術において知られている。ショウジョウバエを交配させて培養する方法は、例えば、Ashburner、キイロショウジョウバエ：実験室マニュアル(Drosophila melanogaster: A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）、およびGreenspan、フライ・プッシング：ショウジョウバエ遺伝学の理論と実践、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９９７年）に見出すことができる。
【０２３５】
上記のように、第３動物集団と第４動物集団との交配に続いて、生ずる第５集団から、同性の動物が、１つまたは２つ以上のマーカー、好ましくは１つまたは２つ以上の蛍光性タンパク質の性特異的発現に基づいて選択されるであろう。蛍光性タンパク質または他のマーカーをコードする配列が、生ずる第５集団中で一方の性だけが蛍光性タンパク質を発現するように、雄生成型集団の性染色体の１つに組み込まれた。例えば、雄の動物、好ましくは、雄の胚または幼虫が第５集団から選択されるべきならば、そのときは、蛍光性タンパク質をコードする配列をＹ染色体に組み込み、雌の動物、好ましくは、雌の胚または幼虫が第５集団から選択されるべきならば、そのときは、蛍光性タンパク質をコードする配列をＸ染色体に組み込む。Ｙ染色体結合蛍光性タンパク質は、第５集団の雄の動物またはその胚／幼虫にのみ隔離され、Ｘ染色体結合蛍光性タンパク質は、第５集団の雌の動物またはその胚／幼虫にのみ隔離されるであろう。
【０２３６】
（蛍光に基づく選別）
第５集団は、混合性集団から一方の性の動物を選択するために選別される。選別は、上記のように、一つの性または他方の性だけにある蛍光性マーカーの発現に基づいて実施される。
【０２３７】
蛍光の検知は、当技術において周知の方法を使用して実施することができる。例えば、本発明において有用な蛍光性タンパク質は、適当な波長の励起エネルギーに応答して光子を発する。所与の蛍光性タンパク質は特異的な励起スペクトル範囲を有しており、同様にある範囲の発光スペクトルで発光するであろう。当業者は、本発明において使用される特定の蛍光性タンパク質により、非ヒト動物、好ましくは、胚および／または幼虫を、適当な励起波長で励起し、当技術において知られている光子検知器およびフィルターを使用して、予測された波長における発光を検知することができる。一実施形態において、蛍光標識した非ヒト動物胚および／または幼虫は、フローサイトメトリーにより検知される。次に胚および／または幼虫は、蛍光細胞分析分離装置を使用して選別することができる（例えば、Becton Dickinson Immunocytometry Systems（米国カリフォルニア州 San Jose所在）のセルソーターを使用する。米国特許第５，６２７，０３７号、第５，０３０，００２号、および第５，１３７，８０９号参照）。胚および／または幼虫が前記蛍光細胞分析分離装置を通過するとき、レーザービームが蛍光性化合物を励起し、一方で検知器は、蛍光を検知することにより蛍光性化合物が細胞に結合しているか否か決し、それに続いて、蛍光性タンパク質を発現している胚および／または幼虫の進路を１つの収集手段に変更し、一方、蛍光性タンパク質を発現していない胚および／または幼虫の進路は第２の収集手段に変更することにより、胚および／または幼虫を選別する。本発明において有用な収集手段には、チューブ、培養ウェル、フラスコ、ペトリ皿等が挙げられるが、これらに限定はされない。上記のシステムは、選別される胚および／または幼虫を計数し、それに加えて蛍光レベルを定量化することもできる。
【０２３８】
一実施形態において、非ヒト動物の第５集団由来の胚および／または幼虫は、複合目的パラメトリック分析機／選別機（complex object parametric analyzer and sorter：ＣＯＰＡＳ）を使用して選別される。ＣＯＰＡＳによる選別は、サイズ、光学密度、および蛍光性マーカーの存在を含む物理的指標を光学的に測定するものである。分析されると、対象物は、使用者の選択基準にしたがって選別され、それから固定した受け器中に分注される（ただし、異なる対象物が異なる受け器に選別されるように、受け器を可動性プラットホームまたは台上にデザインしてもよい）。ＣＯＰＡＳに基づく選別は、米国特許第６，６５７，７１３号および第６，４００，４５３号に記載されている（両特許は、全体を本明細書に組み込む）。また、非ヒト動物のＣＯＰＡＳ選別の実施および非ヒト動物、好ましくは、本発明の胚および／または幼虫の選別のために、本発明において有用な装置は、Union Biometrica（マサチューセッツ州、Somerville所在）から入手することができる。
【０２３９】
前述の選別方法の図式的提示を、図１に示す。図１は、特に、雌の非ヒト動物の最終集団を生成させる選別方法を示す。図でわかるように、雌生成型集団（第１集団）は、Ｙ染色体に組み込まれた、熱ショックプロモーターの制御下にあるアポトーシス促進遺伝子ｈｉｄを有する雄の動物を含む。雄生成型集団（第２集団）は、雌の動物の付着Ｘ染色体（Ｘ＾Ｘ）に組み込まれたアポトーシス促進遺伝子ｈｉｄを含み、Ｘ染色体に組み込まれたＧＦＰをコードする配列をさらに含む。第１および第２集団の各々は、上記の熱ショックを受けさせ、そのようにして純粋雌の第３集団、およびＸ連結ＧＦＰを含む純粋雄の第４集団を生成させる。引き続き、第３集団と第４集団とを交配させて第５集団を生成させる。次に、第５集団を、蛍光性タンパク質（この筋書きではＧＦＰ）の雌特異的発現に基づくＣＯＰＡＳ選別にかける。本明細書で提供した記載により、図１に概略を示した選別方法は、雄生成型集団のＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異（例えば、ｆｓ（１）Ｋ１０）を、場合により含んでもよいということは理解されるであろう。さらに、図１の方法は、蛍光性タンパク質をコードする配列を、Ｘ染色体でなく、雄生成型集団のＹ染色体に組み込むことにより、第５集団から雄の動物を選別するように改変することができる。
【０２４０】
図１に示した方法は、異種遺伝子発現系を含むことにより、さらに改変することができる。図２は、最終的に選別された集団が、関心のある異種遺伝子（例えば、神経変性疾患遺伝子）を発現するように改変された図１の選別方法を示す。図２に示すように、雌生成型集団（第１集団）は、Ｙ染色体に組み込まれた、熱ショックプロモーターの制御下にあるアポトーシス促進遺伝子ｈｉｄを有する雄の動物を含む。雌生成型集団は、Ｇａｌ４をコードする配列も含み、その発現は神経細胞特異的プロモーターＥＬＡＶにより指示される（ＥＬＡＶ−Ｇａｌ４構築物は、図中では「ｅｌａｖ」と命名されている）。雄生成型集団（第２集団）は、雌の動物の付着Ｘ染色体（Ｘ＾Ｘ）に組み込まれた、アポトーシス促進遺伝子ｈｉｄを含み、Ｘ染色体に組み込まれたＧＦＰをコードする配列をさらに含む。ＨＤ／ＨＤという命名は、雄生成型集団が、その染色体に組み込まれた、関心のある異種遺伝子に作動可能に連結されたＵＡＳ活性化因子も含むことを示す。異種遺伝子は、図２では、例えばハンチントン病遺伝子（ＨＤ）として示してある。第１および第２集団の各々は、上記のように熱ショックを受け、そのようにしてＧａｌ４ドライバーを含む純粋雌の第３集団、およびＸ連結ＧＦＰ、およびＵＡＳ／ＨＤ標的を含む純粋雄の第４集団を生成させる。続いて、第３集団と第４集団とを交配させて第５集団を生成させる。次に、第５集団を蛍光性タンパク質の雌特異的発現に基づくＣＯＰＡＳ選別にかける（この筋書きにおいてはＧＦＰ）。本明細書で提供した記載により、図１に示した基本の選別方法図１と同様に、図２に該略を示した選別方法は、雄生成型集団のＸ染色体に組み込まれた雌不妊突然変異（例えば、ｆｓ（１）Ｋ１０）を、場合により含んでもよいということは理解されるであろう。
【０２４１】
上で説明し、また図１に示した主要な選別方法に加えて、本発明は、この方法の変形を考慮するが、それにも拘わらずそれは本発明の範囲および趣旨の内である。雄発生元集団が、付着Ｘ染色体へのアポトーシス促進遺伝子組み込みと活性化によるよりもむしろ、蛍光選別により選別されて雄非ヒト動物のみを生成させる、主要選別方法の変形を図３に示す。図３で見ることができるように、雄発生元集団は、雌の動物が通常のＸＸ遺伝子型を有し、雄の動物がＹ染色体にＧＦＰ（または他の蛍光性タンパク質）をコードする配列を含むように、図２に示したものから改変される。最初の蛍光による選別ステップは、Ｙ染色体に連結したＧＦＰを含む純粋雄動物集団を生成させる。最初の蛍光による選別ステップは、図３に示すように、ＣＯＰＡＳを使用して実施することができ、または別法として、蛍光性タンパク質を発現している雄の動物を選択するために当技術において知られている他のマニュアルのもしくは自動化された方法（例えば、蛍光性動物のフローサイトメトリー、または「用手の」マニュアル選択）を利用することができる。図３に示したその他の選別方法は、図２に示したものと本質的に同じで、第３集団と第４集団とを交配させて混合性第５集団を生成させ（示さしていない）、そこからＣＯＰＡＳ（または他の自動化された蛍光による選別方法）により、雄のハエを選択する。
【０２４２】
雌の非ヒト動物の選択のための、図２の基本的選択方法のさらなる変形を、図４に示す。再び、第１蛍光性タンパク質をコードする配列が、集団中の全ての動物のＸ染色体に組み込まれ（図４中のｄｓＲｅｄ）、第２の蛍光性タンパク質をコードする配列がＹ染色体（図４中の黄色蛍光性タンパク質；ＹＦＰ）に組み込まれるように、雄生成型集団が改変される。雄生成型集団を、第２の蛍光性タンパク質に対して蛍光による選別にかけ、そのようにして、Ｘ染色体に組み込まれたｄｓＲｅｄおよびＹ染色体に組み込まれたＹＦＰを含む純粋雄集団（図１中の集団４に類似）を生成させる。それに続く、雌生成型集団から生じた純粋雌集団と雄生成型集団から生じた純粋雄集団との交配の子孫を、次にＣＯＰＡＳを使用して蛍光による選別にかける。この第２のＣＯＰＡＳ選別ステップは、選別ステップがｄｓＲｅｄに陽性で選別し（すなわち、ｄｓＲｅｄ波長で発光する胚および／または幼虫を選択するであろう）、場合により、それに加えて、ＹＦＰに対して陰性で選別するように（すなわち、ＹＦＰ波長で発光する胚および／または幼虫を棄却し、すなわち廃棄集団に選別するであろう）、純粋雄集団の性染色体の各々に別々の蛍光標識を活用する。これは、ｄｓＲｅｄ選択により見落とされたかもしれないいかなる雄の動物も除く選択機構を提供し、その結果雌の動物の純粋集団を生成させる。
【０２４３】
図５は、雌の動物が選択される、図２に示した一般的選別方法のさらにもう１つの変形を示す。図５に示した方法は、雄生成型集団の付着Ｘ染色体に組み込まれたｈｓ−ｈｉｄ因子がないことを除いて、図２の方法と本質的に同一である。その代わりに、雄生成型集団は、Ｘ染色体に組み込まれた蛍光性タンパク質（例えばＧＦＰ）をコードする配列を有する雄の動物の蛍光による選択により純粋雄集団中に選別される。方法の他の部分は、図２のために説明したものと本質的に同一である。
【０２４４】
スクリーニングアッセイ
別の実施形態において、本発明の方法により生成される非ヒト動物（例えばショウジョウバエ）の一方の性の集団は、例えば集団の動物の表現型を変調または改変する作用剤をスクリーニングする、または遺伝子転写の分析のためのマイクロアレイフォーマットに適合させることができる、または集団によるあるタンパク質の発現を求めてアッセイするアッセイに使用することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は表現型を変調または改変するために使用することができる化合物を同定するための方法を包含し、その方法は本発明の方法にしたがって非ヒト動物の一方の性の集団を生成させる第１ステップを含む。
【０２４５】
一実施形態において、本発明の選別方法から生ずる純粋な一方の性の動物集団、好ましくは、動物の胚および／または幼虫は、例えば、解離し、処理して、ＤＮＡ、ＲＮＡ（これはｃＤＮＡを生じさせるために使用することができる）を抽出することができ、次にそれをマイクロアレイに配列して、集団中の関心のある遺伝子の発現を決定するために核酸プローブでスクリーニングすることができる。細胞、組織、器官、または動物全身（例えば、胚および／または幼虫）の試料からＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ試料を調製する方法は、当技術において周知であり、例えば、Sambrookら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）（第２版）、第１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory、（１９８９年）、または、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、F. Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York（１９８７年）に見出すことができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは組織のマイクロアレイを作製する方法は、基質、グリッド作製技法、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ核酸プローブでマイクロアレイをプロービングする方法を含めて、当技術において知られている（例えば、Fodorら米国特許第５，５１０，２７０号、Lockhartら、米国特許第５，５５６，７５２号、ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション（Hybridization With Polynucleotide Probes）、P. Tijssen編、Elsevier、N.Y.（１９９３年）参照）。
【０２４６】
さらなる実施形態においては、集団の動物、好ましくは集団の胚および／または幼虫における１つまたは２つ以上のタンパク質の発現を決定するためのアッセイにおいて、非ヒト動物の一方の性の選別された集団を、本発明にしたがって使用することができる。例えば、選別された性特異的集団に由来するポリペプチドの集団をスクリーニングするための基盤として抗体のアレイを使用することができる。タンパク質および抗体アレイの例は、プロテオミクス：動向ガイド（Proteomics: A Trends Guide）、Elsevier Science Ltd.、（２０００年７月）に提供されており、参照により本明細書に組み込む。プロテオミクスアッセイ技法は当技術において知られていて、本発明に容易に適合させることができる(例えば、Celisら、２０００年、FEBS Lett、４８０（１）：２〜１６頁、LockhartおよびWinzeler、２０００年、Nature ４０５（６７８８）：８２７〜８３６頁、Khanら、１９９９年、２０（２）：２２３〜９頁参照)。質量分析法、ペプチドマスフィンガープリンティング／タンパク質同定法、およびタンパク質定量法を含むプロテオミクス応用は、本発明の選別された一方の性の集団を使用して実施することもできる。
【０２４７】
好ましい実施形態において、非ヒト動物（好ましくは、ショウジョウバエ）の一方の性の選別された集団は、集団の動物の表現型を変える作用剤を求めてスクリーニングするために使用される。本発明によりアッセイすることができる表現型は、本発明に有用な非ヒト動物（例えば、ハエ）の観察可能および／または測定可能な物理的、行動的、または生化学的性質を含む。本発明により測定することができる表現型形質は、２００４年１月２２日公開の国際特許公開第０４／００６８５４号（その全体を本明細書に組み込む）に記載されているものを含むが、これらに限定はされない。したがって、試験作用剤が集団における表現型の変化を作り出せるか否かを決定するためにそれらをアッセイすることができる。変質しすなわち変化した表現型は、野生型または対照動物の表現型に比較して変化した表現型を含む。表現型における何らかの統計的に有意な相違（対照集団に比較して試験集団を測定したとき）が変質した表現型であることを示す、変質したすなわち変化した表現型の例には、食欲、配偶行動、および／または寿命など、対照動物（ここで、「対照動物」は関心のある異種遺伝子を発現しないか、または候補化合物に曝露されたことがない動物を指す）の表現型に比較して測定可能な量、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、またはより好ましくは５０％だけ変化した行動表現型、あるいは、観察可能なように変化した形態表現型、例えば、動物の異なる成長速度、または、臓器もしくは付属器の異なる形状、サイズ、色、もしくは配置、または対照動物で観察された組織の分布もしくは特徴が挙げられる。本発明によれば、神経変性疾患に関連する表現型の特徴は、１つまたは２つ以上の特徴の測定値が増加または減少していれば、変質したといわわれる。すなわち、神経変性疾患に関連して特徴的な表現型が異常な表現型（本発明の方法により定量化したときに、表現型の値が対照動物で測定された同じ表現型の値と相違していて、その差が統計的に有意である（ｐ≦０．０５）表現型）である場合に、その異常な表現型は変質したといわれ、そのとき、表現型は増加したか（より異常になった）または減少した（異常性が小さくなって対照動物で測定した表現型に近づいた）かのいずれかである。本発明によれば、特定の特徴がより重度になった場合（例えば、特徴が早死である場合、動物は死期が早くなる。特徴が核封入である場合、動物は細胞当たり多くの核封入を有するかまたはより多くの細胞が核封入を有する。特徴が運動失調である場合、動物はより重症の運動失調になる。その他）、すなわち、最初の参照点における特徴の測定と２番目の参照点におけるより重度の特徴の測定とにおいて統計的に有意な相違（ｐ≦０．０５）がある場合、異常な表現型の特徴は、「増加した」と見なされる。本発明によれば、特定の特徴がより軽度になった場合（例えば、特徴が早死である場合、動物は死期が遅くなる。特徴が核封入である場合、動物は細胞当たり少ない核封入を有するかまたはより少ない細胞が核封入を有する。特徴が運動失調である場合、動物はより軽症の運動失調になる。その他）、すなわち、最初の参照点における特徴の測定と２番目の参照点におけるより軽症の特徴の測定とにおいて統計的に有意な相違（ｐ≦０．０５）がある場合、異常な表現型の特徴は、「減少した」と見なされる。
【０２４８】
好ましい実施形態において、本発明は、神経変性疾患において有効であり得る、すなわち、作用剤と接触しなかった動物に比較して、作用剤と接触した動物において神経変性疾患の表現型に差を誘発することができる作用剤を求めてスクリーニングする方法を提供する。上記の、雌および雄生成型集団は、例えば、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系により、本明細書で定義した異種の神経変性疾患遺伝子を発現するように適合させることができる。雄および雌生成型集団に組み合わせてＧａｌ４／ＵＡＳ系を含むことの結果は、非ヒト動物の選別された最終的な一方の性の集団が、Ｇａｌ４ドライバーおよびＵＡＳ／神経変性疾患遺伝子標的の両方を発現させ、その結果、神経変性疾患遺伝子を発現させるであろうということである。この集団は、神経変性疾患遺伝子を発現する選別された集団と対照集団との間の表現型における相違を測定するために使用することができる（例えば、「差表現型（difference phenotype）」を測定する）。次に、この集団は、試験作用剤が神経変性疾患に有効であるか否かを決定するために、試験作用剤に対してスクリーニングすることができ、その場合、対照集団に比較して試験集団における差表現型に変化があれば、作用剤は神経変性疾患に有効であると思われる。
【０２４９】
変質した表現型における変化は、観察された表現型の完全な、または部分的のいずれかの復帰を含む（例えば、変質した表現型の試験作用剤に応答しての復帰）。完全な復帰は、変質した表現型のなくなること、すなわち、対照ハエで観察された表現型への表現型の１００％の復帰として定義される。変質した表現型の部分的復帰は、対照ハエで観察された表現型への５％、１０％、２０％、好ましくは３０％、より好ましくは５０％、および最も好ましくは５０％を越える復帰であってよい。例になる測定可能な指標は、眼などの器官のサイズおよび形状、組織および器官の分布、行動表現型（食欲および配偶など）、および下に記載するクライミングアッセイで観察することができるような運動能力を含むが、これらに限定はされない。
【０２５０】
好ましい実施形態において、本発明の非ヒト動物はショウジョウバエであり、変質した運動表現型はクライミングアッセイを使用して測定される。例えば、クライミングアッセイにおいて、運動能力は、ハエをバイアル中に入れて彼らをバイアルの底に突き落とし、次に所定時間中にバイアルにつけたマークを越えて登るハエの数を計数することにより評価することができる。対照ハエの１００％の運動活性は、つけたマークを越えて登るハエの数により表わされ、一方変質した運動活性を有するハエは、対照ハエ集団で観察された活性の８０％、７０％、６０％、５０％、好ましくは、５０％未満、またはより好ましくは３０％未満を有することができる。ハエの運動性すなわちクライミング行動の測定方法は、例えば、２００４年７月１日に公開され、参照により本明細書に組み込む米国特許出願第２００４０１２６３１９号に記載されている。
【０２５１】
さらなる実施形態において、本発明は、心臓機能、低酸素症、または無酸素症など、選別された集団の構成員の生理の他の様相を調節または変調する化合物のスクリーニングに使用することができる。
【０２５２】
（試験作用剤）
本明細書に記載したスクリーニングアッセイで有用な作用剤は、動物に投与されたときに、変質した表現型を改変する、例えば、表現型を部分的または完全に復帰させる能力を有する生物学的または化学的作用剤を含む。作用剤には、任意の、組み換えられたか改変されたかもしくは天然の核酸分子のライブラリー、合成されたか改変されたかもしくは天然のペプチド、合成されたか改変されたかもしくは天然のペプチドのライブラリー、有機もしくは無機化合物、または小分子を含む有機もしくは無機化合物のライブラリーが含まれる。作用剤は、治療用作用剤の回収を容易にすることができる通常のまたは独特のタグに連結することもできる。
【０２５３】
例になる作用剤供給源には、ランダムなペプチドのライブラリーならびにＤ−および／またはＬ−立体配置アミノ酸で作製されたコンビナトリアルケミストリー誘発分子ライブラリー、ホスホペプチド（ランダムなまたは部分的に変性した、定方向のホスホペプチドのライブラリーの構成員を含むが、これらに限定はされない。例えば、Songyangら、Cell ７２：７６７〜７７８頁（１９９３年）参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イデオタイプ、キメラまたは単鎖抗体、ならびにＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびにそれらのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定はされない）、ならびに有機または無機の小分子が挙げられるが、これらに限定はされない。化学的に合成されたライブラリーの例は、Fodorら、Science ２５１：７６７〜７７３頁（１９９１年）、Houghtenら、Nature ３５４：８４〜８６頁（１９９１年）、Lamら、Nature ３５４：８２〜８４頁（１９９１年）、Medyuski、Bio/Technology １２：７０９〜７１０頁（１９９４年）、Gallopら、J.Medicinal Chemistry ３７（９）：１２３３〜１２５１頁（１９９４年）、Ohlmeyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ５  ９０：１０９２２〜１０９２６頁（１９９３年）、Erbら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：１１４２２〜１１４２６頁（１９９４年）、Houghtenら、Biotechniques １３：４１２頁（１９９２年）、Jayawickremeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：１６１４〜１６１８頁（１９９４年）、Salmonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：１１７０８〜１１７１２頁（１９９３年）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２、ならびにBrennerおよびLerner、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８９：５３８１〜５３８３頁（１９９２年）に記載されている。非ペプチドのライブラリーの例として、ベンゾジアゾピン（benzodiazopine）のライブラリーを使用に適合させることができる（例えば、BuninらProc.Natl.Acad.Sc
i.USA ９１：４７０８〜４７１２頁（１９９４年）参照）。本発明に有用な作用剤の他のライブラリーは、ペプチドのライブラリー（Simonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８９：９３６７〜９３７１頁（１９９２））、コンビナトリアルライブラリー（Ostreshetら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：１１１３８〜１１１４２頁（１９９４年）、EichlerおよびHoughten、Mol.Med.Today １：１７４〜１８０頁（１９９５年）、Dolle、Mol.Divers. ２：２２３〜２３６頁（１９９７年）、およびLam、Anticancer Drug Des. １２：１４５〜１６７頁（１９９７年））、ペプチドのライブラリーを作製することができるファージディプレイライブラリー（ScottおよびSmith、Science ２４９：３８６〜３９０頁（１９９０年）、Devlinら、Science、２４９：４０４〜４０６頁（１９９０年）、Christianら、J.Mol.Biol. ２２７：７１１〜７１８頁（１９９２年）、Lenska、J.Immunol.Meth. １５２：１４９〜１５７頁（１９９２年）、Kayら、Gene １２８：５９〜６５頁（１９９３年）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日公開））を含む。
【０２５４】
本明細書に記載した方法により試験して同定することができる作用剤は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｗ１ ５３２３３、Milwaukee所在）、Sigma Chemical（ミズーリ州、St. Louis所在）、Fluka Chemie AG（スイス、Buchs所在）、Fluka Chemical Corp.（ニューヨーク州、Ronkonkoma所在）、Eastman Chemical Company、Fine Chemicals（テネシー州、Kingsport所在）、Boehringer Mannheim GmbH（ドイツ、Mannheim所在）、Takasago（ニュージャージー州Rockleigh所）、SST Corporation（ニュージャージー州Clifton所在）、Ferro（ルイジアナ州Zachary所在）、Riedel-deHaen AG（ドイツ、Seelze所在）、PPG Industries Inc., Fine Chemicals（ペンシルバニア州Pittsburgh所在）、Specs and BioSpecs B.V.（オランダ、Rijswijk所在）、Chembridge Corporation（カリフォルニア州San Diego所在）、Contract Service Company（ロシア、Dolgoprudoy、Moscow Region所在）、Comgenex USA Inc.（ニュージャージー州Princeton所在）、Maybridge Chemicals Ltd.（英国、Cornwall所在）、およびAsinex（ロシア、Moscow所在）を含む市場の供給源から得られる化合物を含むが、これらに限定はされない。さらに、微生物、カビ、植物または動物の抽出物を含む、如何なる天然生成物も、本明細書に記載した方法を使用してスクリーニングすることができる。
【０２５５】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術において、例えば、DeWittら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９０：６９０９頁（１９９３年）、Erbら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９１：１１４２２頁（１９９４年）、Zuckermannら、J.Med.Chem. ３７：２６７８頁（１９９４年）、Choら、Science ２６１：１３０３頁（１９９３年）、Carrellら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl. ３３：２０５９頁（１９９４年）、Carellら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl. ３３：２０６１頁（１９９４年）、およびGallopら、１５ J.Med.Chem. ３７：１２３３頁（１９９４年）に見出すことができる。
【０２５６】
作用剤のライブラリーは、核酸分子のライブラリーすなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体であってもよい。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、関心のある細胞、組織、器官または生物体から収集されたｍＲＮＡから構築することができ、あるいは、適当なサイズにしたフラグメントを生成させるために、制限エンドヌクレアーゼまたはゲノムＤＮＡをランダムにフラグメント化する方法を使用して、ゲノムＤＮＡを処理することができる。ＲＮＡ分子を含むライブラリーは、例えば、細胞からＲＮＡを収集することにより、または化学的にＲＮＡ分子を合成することにより構築することができる。核酸分子の種々のライブラリーは、分子のランダム化領域の生成を容易にする固相合成を使用して行なうことができる。所望とあれば、ランダム化を偏在させて、分子のある位置に１つまたは２つ以上のヌクレオチドを特定の含有率（％）で含む核酸分子のライブラリーを生成させることができる（米国特許第５，２７０，１６３号）。
【０２５７】
候補の作用剤は、種々の方法で投与することができる。例えば、非ヒト動物がショウジョウバエなどの昆虫である場合、作用剤は、培養または飼育培地に候補作用剤を与えることにより投与することができる。あるいは、候補作用剤を１％スクロース溶液に調製して、その溶液を所定の時間、例えば、１０時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間、動物に与えることができる。
【０２５８】
線虫を含むアッセイにおいて、試験されるべき化合物はＤＭＳＯまたは他の有機溶媒に溶解し、種々の試験濃度で、細菌懸濁液、好ましくは、細菌ＯＰ５０株（Brenner、Genetics（１９７４年）１１０：４２１〜４４０頁）と混合して、線虫に餌として与える。処理されるべき線虫の集団は、この動物の同調幼虫（SulstonおよびHodgkin、線形動物Caenorhabditis elegans（The Nematode Caenorhabditis elegans）（１９８８年）（Wood, W. B.編）、Cold Spring Harbor Laboratory）または成虫または混合段階の集団であってよい。
【０２５９】
可能性のある作用剤は、経口的に（合成食餌への添加、試験動物により消費されるべき植物または餌動物への散布を含む）、局所的に（浸漬、塗布、噴霧、動物への化合物の直接適用、処理された表面に動物を接触させることを含む）、または注射を含む種々の方法で動物に投与することができる。候補作用剤はしばしば疎水性分子であり、通常、有機溶媒に溶解させなければならず、溶媒はメタノールまたはアセトンの場合には、蒸発させることが可能であり、または、取り込みを容易にするために低濃度で含有させることができる（エタノール、ジメチルスルホキシド）。
【０２６０】
候補作用剤は、受精卵、胚、幼虫および成体段階を含む動物発生のどの段階でも投与することができる。一実施形態において、候補作用剤は成体動物に投与される。他の実施形態においては、候補作用剤は胚または幼虫段階の間に投与される。
【０２６１】
作用剤は、単回投与量で、または複数回投与量で投与することができる。適当な濃度は、当業者により決定されることができ、作用剤の生物学的および化学的性質、アッセイされるべき特定の非ヒト動物、ならびに投与方法に依存するであろう。例えば、候補作用剤の濃度は、経口的にもしくは注射により送達されるときは、０．０００１μＭから２０ｍＭ、０．１μＭから２０ｍＭ、１μＭから１０ｍＭ、または１０μＭから５ｍＭの範囲であってよい。一実施形態において、試験作用剤は、約１ｎＭと１μＭとの間の濃度で飼育培地に含ませることができる。
【０２６２】
好ましい実施形態においては、候補作用剤の高処理スクリーニングが実施され、その場合、多数の作用剤、少なくとも５０作用剤、１００作用剤、または１００を越える作用剤が、複数の動物集団で併行して個々に試験される。動物集団は、少なくとも２、１０、２０、５０、１００、またはそれを越える成体または幼若動物を含む。
【０２６３】
好ましい実施形態において、本発明の非ヒト動物は、ショウジョウバエであり、各試験作用剤は、化合物組成物の有効作用剤が、集団の個々の動物の、全てでなくとも、少なくとも実質的部分に活性を作用させることができるような方法で、ハエの集団と接触させる。実質的部分は、少なくとも７５％、通常は少なくとも８０％であり、および多くの実施形態では９０％または９５％またはそれを越える高さにすることができる。一般的に、集団の構成員は、組成物の有効作用剤がハエにより内部移行されるような方法で、各化合物試験作用剤と接触させられる。ある場合には、内部移行は、化合物組成物をハエの栄養培地、例えば、水、酵母ペースト、添加栄養剤の水溶液等に導入することにより、各化合物組成物が広く複数の動物と接触させられるように、食物摂取すなわち経口によるであろう。例えば、候補作用剤は、酵母ペーストなどのハエの栄養培地に作用剤を混合して、ハエが培地上で食餌するようにハエ（幼虫または成体のいずれかのハエ）の存在するところに培地を置くことにより、通常経口的にハエに投与される。ある場合には、集団のハエは、化合物の蒸発もしくはエアロゾルによる送達または化合物を含む液体を動物にスプレイすることを含め、大気中で集団を化合物に曝露することにより、化合物と接触させられる。
【０２６４】
候補作用剤を投与すると、次に、上記のように、候補作用剤を投与されなかった対照動物により示される表現型と比較して、動物の表現型の変化をアッセイする（例えば、差表現型の変化をアッセイする）。
【０２６５】
（変異分析）
本発明のさらなる実施形態において、図１〜５のいずれに示した選別方法も、変異誘発ステップを含むように適合させることができる。より具体的には、雄生成型集団が染色体に組み込まれたＵＡＳ／異種遺伝子標的配列を含む場合、集団がアポトーシス促進遺伝子を発現するように誘発されると（または図１〜５に示したように蛍光で選別されると）、結果として生ずる純粋雄集団は、関心のある異種遺伝子の変異を誘発させることができるか、またはハエ全体にわたってランダム変異を誘発させることができる。次に、変異した集団（図１の集団４）を純粋雌Ｇａｌ４ドライバー集団（図１の集団３）と交配させ、それから、変異を含む雄または雌の動物の一方の性の集団（蛍光性タンパク質がどちらの性染色体に組み込まれるかに依存して；上参照）が得られる。次に、変異を含む最終的性特異的集団を、変異を有しない同じ異種遺伝子を発現する集団に比較して、表現型の変化をアッセイすることができる。このようにして、関心のある異種遺伝子の遺伝改変剤を同定することができる。あるいは、変異を含む集団を、変異の存在しない、同じ試験作用剤で処理された集団と比較して、表現型における変化があるか否かを決定するために、１つまたは２つ以上の試験作用剤に対してスクリーニングすることができる。このようにして、試験作用剤の細胞標的を同定することができる。
【０２６６】
変異は、当技術において知られている方法を使用して、本発明の非ヒト動物に導入することができる。例えば、動物がショウジョウバエである場合、化学物質、放射線照射または挿入（例えば、Ｐ因子変異誘発などのトランスポゾン）を使用して、動物に変異誘発を起こすことができ、適当な交配を実施して、子孫を、正常な対照と比較して、表現型の相違、例えば、走地性行動についてスクリーニングすることができる。次に、遺伝子は、例えば、挿入された因子により標的とされた遺伝子の連鎖解析または救出を含む種々の方法により同定することができる。遺伝子を変異させ、同定する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込む、Ashburner、キイロショウジョウバエ：実験室マニュアル（Drosophila melanogaster: A Laboratory Manual）（１９８９年）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Greenspan、フライ・プッシング：ショウジョウバエ遺伝学の理論と実践、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９９７年）、R. K. Herman、遺伝学：線形動物Caenorhabditis elegans（Genetics: The Nomatode Caenorhabditis elegans）（１９８８年）（Wood, W. B.編）Cold Spring Harbor Laboratory、またはゼブラフィッシュ：実践的アプローチ（Zebrafish:A Practical Approach）（２００２年）（Nusslein-VolhardおよびDahm編）、Oxford University Press）に記載されている。
【０２６７】
医薬製剤
本発明は、（ｉ）哺乳動物、例えばヒト、飼育動物、家畜、愛玩動物、農業動物、または野生動物集団の疾患の治療のための、上記のスクリーニングアッセイにより同定された作用剤の使用，（ｉｉ）上記のスクリーニングアッセイにより同定された作用剤を含む医薬組成物、および（ｉｉｉ）上記のスクリーニングアッセイにより同定された作用剤を投与することにより、疾患を有する哺乳動物、例えばヒト、飼育動物、家畜、愛玩動物、農業動物、または野生動物集団を治療する方法をさら提供する。一実施形態において、本発明は、（ａ）ハエ集団に哺乳動物の性質をもたせるステップ（例えば、ＵＡＳ因子に作動可能に連結された神経変性疾患遺伝子を発現するハエ）、（ｂ）疾患の表現型を減少させると期待される作用剤を同定するために、本明細書に記載された方法を使用するステップ、および（ｃ）哺乳動物に投与するための作用剤を剤形化するステップにより哺乳動物の疾患を治療するのに使用する医薬品の調製方法を提供する。ある場合、ステップ（ａ）におけるハエ集団の表現型は、哺乳動物の神経変性疾患の性質であってよい。ステップ（ａ）におけるハエ集団はトランスジェニックのハエであってよく、ある場合に、導入遺伝子の発現は神経変性すなわち神経変性疾患の表現型を生じ得る。哺乳動物の神経変性疾患に関連する遺伝子および導入遺伝子ならびにそのような導入遺伝子を含むハエは、本明細書に記載した。
【０２６８】
一態様において、疾患の治療に使用する医薬を調製する方法が、哺乳動物、例えば霊長類に投与するための作用剤を剤形化することを含めて提供される。例えば適当な剤形は、無菌的および／または実質的に等張の、および／または米国食品医薬品局の全てのＧＭＰ（優良製造規範）基準に完全に適合する、および／または単位用量形態のものである。Avisら（編）、レミントン薬学（Remington’s Pharmaceutical Sciences）第１７版（１９９３年）、（Mack Publishing Co.、ペンシルバニア州Easton所在）参照。
【０２６９】
ここで、本発明を実施例によってさらに説明するが、実施例は当業者が本発明を実施することを助けるために役に立つことを意図するもので、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０２７０】
実施例１  ショウジョウバエ原種の生成
（雌生成型集団）
雄のハエを淘汰して純粋雌ハエ集団を生じさせるために、雌生成型株を生成させた。雌生成型株の雄のハエは、Ｙ染色体に組み込まれた熱ショックプロモーターの制御下にあるｈｉｄ因子、および場合により、Ｘ染色体に組み込まれた組織特異的または誘発性プロモーター（すなわち、ｅｌａｖ）の制御下にあるＧａｌ４ドライバー配列を含む。Ｐｈｓ−ｈｉｄＹ：ｅｌａｖＧＡＬ４ｃ１５５原種を確立するために、ｅｌａｖＧＡＬ４ｃ１５５処女ハエをＰ［ｈｓ−ｈｉｄ，ｗ＋］Ｙ／ｙ，ｗ雄と交配させ、その結果生じた遺伝子型Ｐ［ｈｓ−ｈｉｄ，ｗ＋］Ｙ／ｅｌａｖＧＡＬ４ｃ１５５の雄Ｆ１子孫を、ｅｌａｖＧＡＬ４ｃ１５５処女ハエと戻し交配させた。ｅｌａｖＧＡＬ４ｃ１５５原種は、Bloomington Stock Centerから入手し、一方Ｐ［ｈｓ−ｈｉｄ，ｗ＋］Ｙ／ｙｗ原種はRuth Lehmann’s lab（Howard Hughes Medical Institute）から入手した。全ての交配は２５℃で実施した。
【０２７１】
雄生成型集団
雌のショウジョウバエを淘汰して純粋雄ハエ集団を生じさせるために、雄生成型株を生成させた。第３染色体バランサーからのＰ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］挿入物を付着Ｘ染色体に動員するために、転位スクリーニングを実施した。簡単に説明すれば、Ｃ（１）ＤＸ，ｙ，ｗ，ｆ／Ｙ；＋／ＴＭ３，Ｓｂ，Ｐ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］処女ハエをｙ，ｗ；Ｋｉ［Δ２−３］雄と交配させ、次に、トランスポザーゼを排除するために、Ｆ１のＣ（１）ＤＸ，ｙ，ｗ，ｆ／Ｙ；Ｋｉ［Δ２−３］／ＴＭ３，Ｓｂ，Ｐ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］雌子孫をｙｗ雄と戻し交配させた。付着Ｘ染色体へのＰ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］の転位事象を示すマーカーｗ＋が雌と共に隔離された系統を同定するために、遺伝子型Ｃ（１）ＤＸ，ｙ，ｗ，ｆ／Ｙ；＋／ＴＭ３，Ｓｂ，Ｐ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］ｘｙ，ｗの５００組のＦ２単一ペア（single pair）交配を準備した。続いて、陽性Ｃ（１）ＤＸ，ｙ，ｗｆ，Ｐ［ｗ＋，ｈｓ−ｈｉｄ］株をｙ，ｗ，Ｐ［アクチン−ＧＦＰ，ｗ＋］／Ｙまたはｙ，ｗ，Ｐ［アクチン−ＧＦＰ，ｗ＋］’ｆｓ（１）Ｋ１０雄と交配させ、最終的雄生成型株を確立した。全ての原種は、Bloomington stock center（インディアナ大学）から入手した。交配は２３℃で実施した。
【０２７２】
劣性雌不妊突然変異のＸ染色体への組み込み
雄発生元集団に対する付着Ｘ遺伝子型の使用に付随して、雄における接合異常でない事象が起り、妊性であって付着Ｘ染色体を有しない雌の集団の生成が生ずる。そのような接合異常でない事象の出現は稀で、１／２０００から１／５０００の頻度で起こるに過ぎない。しかし、稀であるにも拘わらず、雄生成型集団におけるそのような妊性雌出現は、これらの雌がアポトーシス促進性遺伝子を有しないので、純粋雄集団を生成させる能力を損なうであろう。したがって、一実施形態においては、雌不妊突然変異はＸ染色体に組み込まれ、その結果如何なる接合異常でない事象においても、劣性雌不妊突然変異を担うＸ染色体が雌動物に隔離され、接合異常でない事象から生ずる雌が不妊であって集団を汚染できないことが確実になる。雄生成型集団で使用される、ＧＦＰタグ付きの劣性雌不妊を含むＸ染色体を生成させるために、Ｐ［アクチン−ＧＦＰ，ｗ＋］をＦＭ７ｉＰ［ｗ＋，アクチン−ＧＦＰ］から、ｙ，ｗ染色体に動員した。続いて、ｙ，ｗ，Ｐ［アクチン−ＧＦＰ，ｗ＋］をｙ，ｗ，ｆｓｌ（Ｋ１０），Ｐ［ｒｙ＋，ｎｅｏＦＲＴ］と組み換えて、ｙ，ｗ，Ｐ［ｗ＋，アクチン−ＧＦＰ］，ｆｓ（ｌ）Ｋ１０／ｙ，ｗ，ｆ，Ｃ（ｌ）ＤＸ原種が確立された。次に、ｙ，ｗ，Ｐ［ｗ＋，アクチン−ＧＦＰ］，ｆｓ（１）Ｋ１Ｏ染色体を交配により雄生成型バックグラウンドに入れた。
【０２７３】
実施例２  性特異的選別
（性選別実験の概略）（例として図１参照）
ＧＡＬ４ドライバー系統（雌生成型集団）およびエフェクター系統（雄生成型集団）を、各々十数個のトレイに増幅させる。ＧＡＬ４ドライバーを含む処女ハエおよびＵＡＳエフェクターを含む雄を熱ショック事象により単離し、次に食餌を与えることができ卵の収集が容易な集団ケージ中で一緒にして交配させる。卵を収集し、ＣＯＰＡＳで選別して１６ｍｍのアッセイバイアルに入れる。卵は成長して成体ハエになり、次にそれをアッセイする。ＧＡＬ４／ＵＡＳ系の活性をモニターするために含まれる実験の対照は、ＧＡＬ４／ｙｗ陰性対照、ＧＡＬ４：ＵＡＳ−ＧＦＰ陽性対照を含む。
【０２７４】
（親株の準備および熱ショック）（第１〜７日）
（第１日）
Ｅｌａｖ−ＧＡＬ４ｃ１５５：Ｙ，Ｐ［ｈｓ−ｈｉｄ，ｗ＋］雌生成型原種（実施例１参照）の８トレイ（各２５ビン）を新鮮なビンに移す。ｙ，ｗ，ｆ，Ｃ（Ｉ）ＤＸ，Ｐ［ｈｓ−ｈｉｄ，ｗ＋］：アクチン−ＧＦＰ：ｆｓ（１）Ｋ１０：ＵＡＳエフェクター雄生成型原種（実施例２参照）の４トレイを新鮮なビンに移して２５℃で育てる。
【０２７５】
（第３日）
将来の実験のための原種を永続させるために、親を新鮮なビンに移す。
【０２７６】
（第６〜７日）
雄および雌生成型のビン（既に幼虫を含んでいる）を、第６および第７日に３７℃の循環水浴中で２時間／日ずつ熱ショック処理する。幼虫を最大限曝すことを確実にするために、ビンを「ブザー栓（buzz plug）」まで沈める。
【０２７７】
（第７〜１１日）
２５℃でさなぎが成体に成熟する。
【０２７８】
（Ｆ１交配準備およびＣＯＰＡＳ選別）（第１２日〜第２６日）
集団ケージの中で８トレイのＥｌａｖ−ＧＡＬ４ｃ１５５を含む処女ハエと４トレイのアクチン−ＧＦＰ：ｆｓ（１）Ｋ１０：ＵＡＳエフェクターを含む雄とを組み合わせる。２〜３日の間交配させてから、ＣＯＰＡＳ選別にかける胚を収集する。グレーププレート（酵母ペーストでコートされている）を１日に２回交換し、産卵を促した。ＣＯＰＡＳで１６〜２２時間胚を選別する（すなわち、胚を、ＣＯＰＡＳにかける前日の午後１時〜午後７時に収集して、夜通し熟成させてから、翌日午前１０時までにそれらを処理する）。ＣＯＰＡＳ選別に向けて胚を準備するために、５０％漂白液中で５分間胚を脱絨毛膜処理し、それらを一連の篩（８５０μｍ、４２５μｍ、１２５μｍ）にかけて、酵母粒状物および幼虫を排除する。胚を洗浄溶液（０．７％  ＮａＣｌ、０．０３％トリトンＸ−１００）中で漱ぎ、ＣＯＰＡＳに通すために、５０ｍＬの胚試料溶液（Ｐ／Ｎ３３５−５０７５−０００  Union Biometrica）中にそれらを再懸濁させた。ＣＯＰＡＳ選別は、メーカー（Union Biometrica、マサチューセッツ州Somerville所在）の説明書とガイドラインにしたがって実施する。１．５ｍＬのHarvard培地を含む商標つきＥｎＶｉｖｏ１６ｍｍバイアルの９６チューブアレイにチューブ１本当たり１２の胚を選別して入れる。それに続き、バイアルに蓋をして、胚を成熟させるために２５℃に移す。選別された胚は成熟して、例えば、運動欠陥をスクリーニングするために、負の走地性アッセイを含む多くの表現型アッセイに使用することができる。
【０２７９】
（負の走地性アッセイ）（第２７日〜第４１日）
成熟したハエを、所定のスクリーニング培地および試験化合物を含むアッセイバイアルに移す。ハエを毎日新鮮な培地／化合物にはじき落して、２週間毎日アッセイする。負の走地性アッセイ（クライミングアッセイ）においては、ハエをバイアルに入れてそれらをバイアルの底にたたき落とし、それから所定時間の間にバイアルにつけたマークを越えて登るハエの数を計数することにより、運動能力をアッセイすることができる。対照ハエの運動活性は、つけたマークを越えて登るハエの数を１００％として表わされ、一方変質した運動活性を有するハエは、対照ハエ集団で観察された活性の８０％、７０％、６０％、５０％、好ましくは、５０％未満、またはより好ましくは３０％未満を有することができる。
【０２８０】
本明細書中で引用した全ての特許、特許出願、および公開された文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。本発明をその好ましい実施形態を参照して具体的に示しかつ説明したが、形態および詳細における種々の変化は、冒頭の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の範囲内で行なうことができるということを、当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８１】
【図１】選別された一方の性のショウジョウバエ胚を発生させる本発明の方法の遺伝学の模式を示す。
【図２】図１に示した模式の変形を示す。
【図３】図１に示した模式の変形を示す。
【図４】図１に示した模式の変形を示す。
【図５】図１に示した模式の変形を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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