(57)【要約】本発明は、酸素に対して透過性であって水分に対しては不透過性である半透過性障壁層；および障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成された足場繊維層を含む複合物に関する。2008514341.tif 000008
2008514341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素に対して透過性であって微生物に対しては不透過性である半透過性障壁層；および
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成された足場繊維層；
を含む複合物。
【請求項２】
少なくとも1つの細胞が足場繊維層内に提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項３】
少なくとも1つの細胞が皮膚細胞である、請求項2記載の複合物。
【請求項４】
皮膚細胞がヒト皮膚線維芽細胞である、請求項3記載の複合物。
【請求項５】
少なくとも1つの細胞が半透過性障壁層の上に提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項６】
半透過性障壁層がポリマーで構成されている、請求項1記載の複合物。
【請求項７】
ポリマーが、ポリセルロース、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアミド、樹脂、ナイロン、ポリシリコン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシリコーン、コポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項6記載の複合物。
【請求項８】
半透過性障壁層が、テガダーム(Tegaderm)(商標)、ダーマグラフト(Dermagraft)(商標)、トランスサイト(TransCyte)(商標)、インテグラ(Integra)(商標)およびバイオブレン(Biobrane)(商標)からなる群より選択される少なくとも1つの材料で構成されている、請求項1記載の複合物。
【請求項９】
半透過性材料が足場繊維層から脱着可能である、請求項1記載の複合物。
【請求項１０】
動物またはヒトの皮膚に対する接着を可能にするために半透過性障壁層の上に接着剤が提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項１１】
接着剤が、ゼラチン接着剤、樹脂を基剤にした接着剤、フェノールを基剤にした接着剤、アルデヒドを基剤にした接着剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項10記載の複合物。
【請求項１２】
半透過性障壁層の平均孔径が、1μm〜50μm、2μm〜40μm、3μm〜30μm、4μm〜20μm、および5μm〜10μmからなる群より選択される範囲にある、請求項1記載の複合物。
【請求項１３】
足場繊維層が、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される材料で構成される、請求項1記載の複合物。
【請求項１４】
足場繊維層の繊維が同軸繊維である、請求項1記載の複合物。
【請求項１５】
足場繊維層の繊維のサイズが、マイクロサイズの繊維およびナノサイズの繊維のうち少なくとも1つである、請求項1記載の複合物。
【請求項１６】
足場繊維層の厚さが、約0.05mm〜約5mm、約0.05mm〜約4mm、約0.05mm〜約3mm、約0.05mm〜約2mm、約0.05mm〜約1.5mm、約0.08mm〜約1.5mm、約0.1mm〜約1.5mm、約0.2mm〜約1.5mm, 約0.5mm〜約1.5mm、約0.8mm〜約1.5mmからなる群より選択される、請求項1記載の複合物。
【請求項１７】
少なくとも1つの細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、胎児性組織由来上皮細胞、間葉細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄由来間葉幹/前駆細胞、臍帯血由来間葉幹/前駆細胞、脂肪組織由来間葉幹/前駆細胞、毛包表皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、爪床胚細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、腱細胞、頬粘膜および口腔粘膜のケラチノサイト、ならびに線維芽細胞、靱帯線維芽細胞、および歯周靱帯線維芽細胞からなる群より選択される、請求項2記載の複合物。
【請求項１８】
足場繊維層がゼラチンを含む、請求項1記載の複合物。
【請求項１９】
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層上への繊維のエレクトロスピニングを行う段階を含む、複合物の製造方法。
【請求項２０】
エレクトロスピニングが融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーを用いる段階を含み、ポリマーの濃度が該エレクトロスピニングの間、繊維を形成するのに十分に高い、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
溶液の溶媒が有機溶媒である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
有機溶媒が、アルコール、ケトン、アルデヒド、およびハロゲン化アルキルからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
エレクトロスピニングが：5kV〜25kV、5kV〜20kV、5kV〜15kV、5kV〜10kV、6kV〜15kV、6kV〜14kVおよび8kV〜12kvVからなる群より選択される範囲にある強度を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
エレクトロスピニングが：約5cm〜約25cm、約5cm〜約20cm、約5cm〜約15cm、約5cm〜約10cm、約5cm〜約25cm、約10cm〜約25cm、および約10cm〜約15cmからなる群より選択される範囲にある距離を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
エレクトロスピニングが：繊維を形成するためにシリンジ針を用いる段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
約0.1mm〜約2mm、約0.1mm〜約1mm、約0.1mm〜約0.5mm、約0.1mm〜約0.3mm、約0.2mm〜約2mm、および約0.2mm〜約1.2mmからなる群より選択される範囲にある半径を有するシリンジを選択する段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
酸素に対して透過性であって微生物に対して実質的に不透過性である半透過性障壁層を選択する段階を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層；
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層；および
該足場繊維層内に提供される皮膚細胞；
を含む、接着性パッチ。
【請求項３０】
半透過性障壁層；
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層である、少なくとも2つの足場繊維層；および
異なる細胞型または同一の細胞型を含む足場繊維層である、該少なくとも2つの足場繊維層のそれぞれに提供される少なくとも1つの細胞；
を含む複合物。
【請求項３１】
半透過性障壁層に対する繊維のエレクトロスピニングを行って足場繊維層を形成する段階；および
少なくとも1つの細胞を該足場繊維層に播種する段階；
を含む、複合物を製造する方法。
【請求項３２】
動物の皮膚状態を処置するための、請求項29記載の接着性パッチの使用。
【請求項３３】
皮膚状態が熱傷である、請求項32記載の接着性パッチの使用。
【請求項３４】
請求項29記載の接着性パッチを、該皮膚状態を有する動物の皮膚に対して接着性パッチを適用するための説明書とともに含む、動物の皮膚状態を処置するためのキット。
【請求項３５】
請求項29記載の接着性パッチを動物の皮膚に対して適用する段階を含む、動物の皮膚状態を処置する方法。
【請求項３６】
皮膚状態が真皮熱傷である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
その上で増殖する1つまたは複数の細胞を含む、ポリウレタン膜。
【請求項３８】
ポリウレタン膜がテガダーム(商標)である、請求項37記載のポリウレタン膜。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は一般に、複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法に関する。本発明はまた、複合物を含むキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
世界の統計によれば、毎年50億米国ドルという驚くほどの金額が熱傷ケアのために費やされている。英国(UK)では、約6億ポンドが慢性下肢潰瘍の処置のために毎年費やされている。米国(USA)では、創傷ケア製品に対する出費の推計値は約90億米国ドルである。創傷治癒の平均コストは、褥瘡に対する約27,000米国ドルから糖尿病性創傷に対する約36,000米国ドルまでの範囲にわたる。シンガポールでは、慢性創傷に対して費やされる推定金額は約1億8000万米国ドルである。
【０００３】
ヒトの皮膚は比較的軟らかい組織であるが、それでも大きな剪断ストレスに耐えなければならない。熱、化学物質、電気、紫外線または核エネルギーは、皮膚に対する損傷を引き起こし、さまざまな程度の皮膚障害を生じさせる恐れがある。皮膚に対する最も軽い程度の損傷は、皮膚の最外層である上皮で起こる。このような場合には、傷ついた上皮は一般に再上皮化を経て治癒し、皮膚移植は必要でない。しかし、皮膚に対するより重大な障害は、真皮および真皮下組織の両方の部分的または完全な障害につながる可能性がある[4]。このような場合には、身体は自らを治癒することはできない。皮膚はヒト身体を取り囲む防御障壁をなしており、真皮に対する障害は、急速な高度の脱水および種々の形態の感染といった差し迫った脅威となる。
【０００４】
このような脅威が起こるのを予防するために、容易に適用し得る手段が少数提唱されている。第1のは、皮膚の切片を身体の別の部分から切除し、その後に創傷部に上から移植する自己移植の手段である。しかし、その欠点は、真皮および表皮の切除が重大な手術であり、もし熱傷が広範性であれば熱傷箇所のすべてに移植するために入手し得る健常な皮膚が不十分な恐れがあることである。摘出箇所では深部瘢痕化が目立ちやすいと考えられる。
【０００５】
第2の選択肢は、永続的な皮膚代替製品を用いることであり、これらは現在広く販売されていて、これには例えば、インテグラ(Integra)(Integra Life Sciences, Plainsboro, New Jersy, USA)がある。インテグラは、ウシコラーゲンを基にした皮膚類似物およびシリコーン製の一時的な表皮代用層からなる二層積層膜から構成されている。インテグラの真皮代替層は、サメの軟骨から抽出されたコンドロイチン-6-硫酸およびグリコサミノグリカン(GAG)と架橋したウシI型コラーゲンの繊維による多孔性マトリックスからなる。
【０００６】
インテグラは、新生真皮(neodermis)が形成されるまで、切除がなされた創傷の上に配置される。新生真皮が形成された後に、シリコーン層を除去し、0.005インチ前後の薄い表皮自己移植片を適用する。配置から表皮自己移植までの間の期間中は、インテグラ移植片を機械的ずれから守らなければならず、感染の徴候および症状がないか毎日観察しなければならない。インテグラ適用の短所は、極めて薄い表皮自己移植片を作製するのが困難なことである。さらに、インテグラはサイズが小さく、製造に伴うコストが高いことから、一般大衆では負担しきれない。
【０００７】
販売されているもう1つの創傷ドレッシング材は、ダーマグラフト(Dermagraft)(登録商標)(Advanced Tissue Sciences, La Jolla, California, USA)であり、これは、線維芽細胞、ECM、および生体吸収性足場を含む、凍結保存されたヒト同種移植用の線維芽細胞由来の真皮代用物である。
【０００８】
ダーマグラフト(登録商標)の短所は、それを臨床的な感染または瘻孔の徴候のある潰瘍には使用できないことである。同様に、腱、筋肉、関節包、または骨にまで及ぶ創傷におけるダーマグラフト(登録商標)の有用性も試験されていない。
【０００９】
販売されているもう1つの創傷ドレッシング材は、トランスサイト(TransCyte)(登録商標)(Advanced Tissue Sciences, La Jolla, California, USA)であり、これはポリマー膜、およびブタコラーゲンがコーティングされたナイロンメッシュ上で無菌条件下においてインビトロで培養されたヒト新生児線維芽細胞細胞からなる。これは外科的切除がなされた全層および分層創傷を被覆する一時的な創傷被覆物として作用し、創傷を環境性傷害から保護する。さらに、この膜は半透過性であり、それ故に液体および気体の交換を可能にする。
【００１０】
トランスサイト(登録商標)の短所は、ブタ皮膚コラーゲンに対して敏感な患者に対してはそれを適用できないことである。トランスサイト(登録商標)はまた、製造工程における曝露、および同様にブタ皮膚コラーゲンによるナイロンメッシュのプレコーティングにおける曝露に起因する、ごく微量の動物タンパク質も含み得る。微量の動物タンパク質はプリオンの供給源となり得る。ブタ皮膚コラーゲンの使用にかかかるいくつかの倫理的な問題もまたある。さらに、トランスサイト(登録商標)は、患者による免疫拒絶を引き起こし得る、長期的な適用には適していない。これはまた、頭部もしくは手の熱傷、または自己移植の前に外科的切除がなされた全層および深部分層創傷への適用についても実証されていない。また、トランスサイト(登録商標)に用いられるナイロンメッシュは生分解性ではない[12]。
【００１１】
このため、費用対効果が高く、感染に対してより優れた防御を与え、深部創傷への適用に適し、生体吸収性である創傷ドレッシング材に対して需要がある。上記の短所の1つまたは複数を克服するか、少なくとも改善することに対してもまた需要がある。
【発明の開示】
【００１２】
概要
第1の局面によれば、
酸素に対して透過性であって微生物に対しては不透過性である半透過性障壁層；および
前記半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層；
を含む複合物が提供される。
【００１３】
1つの態様において、1つまたは複数の細胞、好ましくは皮膚細胞が前記足場繊維層内に提供される。
【００１４】
1つの態様において、前記足場繊維層はゼラチンを含む。
【００１５】
第2の局面によれば、酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層上への繊維のエレクトロスピニングを行う段階を含む、複合物の製造方法が提供される。
【００１６】
1つの態様において、本方法は、1つまたは複数の細胞、好ましくは皮膚細胞を前記足場層に播種する段階を含む。
【００１７】
1つの態様において、本方法は、前記足場層にゼラチンを与える段階を含む。
【００１８】
第3の局面によれば、
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層；
前記半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層である、少なくとも2つの足場繊維層；および
異なる細胞型を含む足場繊維層である、前記少なくとも2つの足場繊維層のそれぞれに提供される少なくとも1つの細胞、
を含む複合物が提供される。
【００１９】
第4の局面によれば、
半透過性障壁層上に繊維のエレクトロスピニングを行って足場繊維層を形成する段階；および
少なくとも1つの細胞を前記足場繊維層に播種する段階；
を含む、複合物を製造する方法が提供される。
【００２０】
第5の局面によれば、動物の皮膚状態を処置するための、第1の局面または第3の局面による複合物の使用方法が提供される。
【００２１】
第6の局面によれば、動物の皮膚状態を処置するための方法であって、動物の皮膚に対して、第1の局面または第3の局面に定義された複合物を適用する段階を含む方法が提供される。
【００２２】
第7の局面によれば、動物の皮膚状態を処置するためのキットであって、第1の局面に定義された複合物を、前記皮膚状態を有する動物の皮膚に対して複合物を適用するための説明書とともに含むキットが提供される。
【００２３】
定義
本明細書で用いられる以下の単語および用語は、指示された意味を有するものとする。
【００２４】
「ナノファイバー」は、平均直径が約1,000ナノメートル(nm)未満である、例えば500nm未満、好ましくは約1nm〜100nmである、1本のフィラメントまたはフィラメント束を指す。
【００２５】
「同軸ナノファイバー」という用語は、ナノファイバーのコアおよびシェルが異なる材料でできている、複数の材料から構成されるナノファイバーを指す。
【００２６】
「導電性液体」という用語は、電流を伝えることができる液体を指す。これは純粋な液体、ゲルまたは溶液であってよい。これは適した溶媒中にある繊維形成性材料であってもよい。
【００２７】
別に指定する場合を除き、「含む(comprising)」および「含む(comprise)」ならびにそれらの文法的変形物は、それらが列挙された要素を含むだけでなく、列挙されていない別の要素を含むことも許容されるように、「排他的でない(open)」または「包括的な(inclusive)」用語を表すことを意図している。
【００２８】
本明細書で用いる場合、配合物の成分の濃度の文脈における「約」という用語は、典型的には、提示された値の+/-5％、より典型的には提示された値の+/-4％、より典型的には提示された値の+/-3％、より典型的には提示された値の+/-2％、さらにより典型的には提示された値の+/-1％、さらにより典型的には提示された値の+/-0.5％であることを意味する。
【００２９】
本開示の全体を通じて、ある種の態様は範囲の形式で開示される。範囲の形式での記述は単に便宜上および簡略化のためであると解釈されるべきであり、開示された範囲の適用範囲に対する柔軟性のない限定であるとみなされるべきではない。したがって、範囲の記述は、具体的に開示された全ての可能な部分的範囲の他に、その範囲内の個別的な数値も有するとみなされるべきである。例えば、1から6までといった範囲の記述は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどのように具体的に開示された部分的範囲のほかに、その範囲内の個別的な数、例えば、1、2、3、4、5、および6も有すると考えれるべきである。
【００３０】
態様の詳細な開示
複合物、複合物の調製方法、および複合物の使用方法の例示的で非限定的な態様を本明細書において開示する。本明細書に開示された態様は、皮膚再建の改善、感染に対する抵抗性の高さ、細胞増殖の増強および費用対効果の点で、先行技術の創傷ドレッシング材ならびに先行技術の組織工学的足場に比べて改善されている。
【００３１】
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層；および、障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層；を含む複合物が提供される。
【００３２】
半透過性障壁層
本複合物は、酸素に対しては透過性であるが、微生物および粉塵に対しては不透過性である半透過性障壁層を含む。半透過性障壁層は、生体材料、合成材料。または混合材料から構成され得る。
【００３３】
半透過性層は、酢酸セルロース、リン脂質、綿、およびそれらの混合物からなる群より選択される生体材料で構成されてもよい。
【００３４】
1つの態様において、半透過性障壁層はポリマーを含む。半透過性障壁層は、ポリセルロース、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアミド、樹脂、ナイロン、シリコン、ポリエステル、ポリオレフィン(ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン)、ポリアミド、ポリシリコーン、コポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択される材料で構成されてもよい。
【００３５】
半透過性障壁層は、生体材料および合成材料の複合物または混合物である混合材料で構成されてもよい。
【００３６】
半透過性障壁層が、3M Health Care Ltd製のテガダーム(Tegaderm)(商標)、Smith & Nephew製のダーマグラフト(商標)、Smith & Nephew製のトランスサイト(商標)、Integra LifeSciences Holdings Corporation製のインテグラ(商標)パッチ、およびBertek Pharmaceuticals Inc製のバイオブレン(Biobrane)(商標)接着性パッチなどの市販の創傷ドレッシング膜で構成されてもよい。
【００３７】
1つの態様において、半透過性障壁層はテガダーム(商標)である。
【００３８】
半透過性材料は、接着剤を用いて、足場繊維層に対して脱着可能なように接着される。半透過性障壁層を部分的または完全に接着性材料でコーティングしてもよい。接着性材料のコーティングは、半透過性障壁層の片面に存在しても両面に存在してもよい。接着性材料は、微生物の増殖を許容せず、しかも対象の動物またはヒトに対して非毒性である任意の材料であってよい。接着性材料は、生体材料、合成材料、または混合材料から構成され得る。
【００３９】
接着性材料は、ゼラチン材料、樹脂を基剤にした接着剤、フェノールを基剤にした接着剤、アルデヒドを基剤にした接着剤、およびそれらの混合物からなる群より選択され得る。
【００４０】
好ましくは、前記半透過性障壁層は、アクリル接着剤を実質的に有さないテガダーム(商標)である。テガダーム(商標)が、アクリル接着剤を以前に有していたものでもよい。
【００４１】
半透過性障壁層の厚さおよび平均孔径は、酸素の透過が許容され、微生物の透過が制限されるように、適切に選択することができる。
【００４２】
半透過性障壁層の平均孔径は、1μm〜50μm、2μm〜40μm、3μm〜30μm、4μm〜20μm、および5μm〜10μmからなる群より選択される範囲にあってよい。
【００４３】
1つの態様において、半透過性障壁層の平均孔径は5μm〜10μmの範囲にある。半透過性障壁層の厚さは、約0.005mm〜約2mm、約0.005mm〜約1mm、約0.005mm〜約0.5mm、約0.005mm〜約0.1mm、約0.005mm〜約0.05mm、約0.005mm〜約0.02mm、約0.01mm〜約0.02mm、および約0.015mm〜約0.02mmからなる群より選択される範囲にあってよい。1つの態様において、半透過性障壁層の厚さは0.018mmである。
【００４４】
足場繊維層
本複合物は、半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層を含む。足場繊維層は、図1の装置を用いて製造され得る。
【００４５】
エレクトロスピニング工程に用いられる導電性液体は、適した溶媒中にある繊維形成性材料の溶液であってよい。溶媒は、アルコール、ケトン、アルデヒドおよびハロゲン化アルキルからなる群より選択され得る。例示的な溶媒には、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、グリセロール、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、2,2,2-トリフルオロエタノール、およびそれらの混合物が含まれる。それぞれに適した溶媒は、用いる溶質の種類によって異なると考えられる。平易な総説は、Z.M. Huang et al. Composite Science and Technology 63(2003 2223-2253］から得ることができ、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。1つの態様において、溶媒は、クロロホルム3に対してメタノール1という比にあるクロロホルムおよびメタノールの混合物である。
【００４６】
足場繊維層は、対象動物に対して毒性のない任意の材料で構成され得る。足場繊維層は、繊維として紡ぐことのできる任意の生体材料、合成材料または混合材料で構成され得る。足場繊維層が、生分解性で生体吸収性のある材料で構成されてもよい。
【００４７】
足場繊維層は、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される材料で構成され得る。
【００４８】
1つの態様において、足場繊維層はポリ-ε-カプロラクトンで構成される。足場繊維層のためのその他の適した材料は、Z.M. Huang et al. Composite Science and Technology 63(2003 2223-2253)に開示されている。
【００４９】
1つの態様において、足場繊維層はゼラチンで構成される。ゼラチンは、ウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ヒツジコラーゲン、ウマコラーゲン、合成コラーゲン、寒天、合成ゼラチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
【００５０】
もう1つの態様において、足場繊維層は、材料の混合物のエレクトロスピニングによって形成される繊維で構成される。1つの態様において、繊維形成性材料の1つが薬用物質であってもよい。
【００５１】
さらにもう1つの態様において、足場繊維層は、第1の材料が繊維のシェルを形成して第2の材料がコアを形成する、2つの材料を含む繊維で構成される。このような繊維は同軸繊維と呼ぶことができる。同軸ナノファイバーを含む足場繊維層は、図1の装置を図2のシリンジ針とともに用いることによって製造し得る。
【００５２】
1つの態様において、同軸ナノファイバーを製造するために用いられる繊維形成性材料の少なくとも1つは医用薬剤であってよい。
【００５３】
同軸ナノファイバーにおけるコアおよびシェルの直径は、導電性液体中の繊維形成性材料の濃度に依存し得る。
【００５４】
足場層の繊維は、マクロファイバー、マイクロファイバー、ナノファイバー、または混合繊維であってよい。足場層は、各々のサブレイヤーがマクロファイバー、マイクロファイバー、およびナノファイバーからなる群より選択される、多数のサブレイヤーを含み得る。
【００５５】
1つの態様において、足場繊維層はナノファイバー層である。
【００５６】
足場繊維層の厚さは、用途に応じて適切に選択することができる。足場層の厚さは、約0.05mm〜約5mm、約0.05mm〜約4mm、約0.05mm〜約3mm、約0.05mm〜約2mm、約0.05mm〜約1.5mm、約0.08mm〜約1.5mm、約0.1mm〜約1.5mm、約0.2mm〜約1.5mm、約0.5mm〜約1.5mm、約0.8mm〜約1.5mmからなる群より選択され得る。1つの態様において、足場繊維層の厚さは約1mmである。
【００５７】
足場繊維層の平均孔径および孔径分布は、用途に応じて適切に選択することができる。例えば、足場を組織工学の用途に用いる場合には、平均孔径は、足場上で培養しようとする細胞のサイズに基づいて選択される。
【００５８】
足場繊維層が、細胞の接着およびその中での増殖を支持することが可能であり得る。足場繊維層に対して、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、胎児性組織由来上皮細胞、間葉細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄由来間葉幹/前駆細胞、臍帯血由来間葉幹/前駆細胞、脂肪組織由来間葉幹/前駆細胞、毛包表皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、爪床胚細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、腱細胞、頬粘膜および口腔粘膜のケラチノサイト、ならびに線維芽細胞、靱帯線維芽細胞、および歯周靱帯線維芽細胞からなる群より選択される細胞を播種することができる。
【００５９】
1つの態様において、細胞は、ケラチノサイト、皮膚線維芽細胞、メラノサイト、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される皮膚細胞である。
【００６０】
1つの態様において、足場層にはヒト皮膚線維芽細胞が播種される。
【００６１】
エレクトロスピニング
複合物の足場繊維層は、半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって調製される。
【００６２】
足場繊維層の構造は、電界強度、電界の距離、シリンジ針の長さおよび半径ならびに繊維形成溶液の流速といったエレクトロスピニングのパラメーターに依存し得る。
【００６３】
足場形成溶液に対して印加される電界の強度は、5kV〜25kV、5kV〜20kV、5kV〜15kV、5kV〜10kV、6kV〜15kV、6kV〜14kVおよび8kV〜12kVからなる群より選択される範囲にあってよい。足場形成溶液に対して印加される電界の距離は、約5cm〜約25cm、約5cm〜約20cm、約5cm〜約15cm、約5cm〜約10cm、約5cm〜約25cm、約10cm〜約25cm、および約10cm〜約15cmからなる群より選択される範囲にあってよい。
【００６４】
足場繊維障壁のエレクトロスピニングのために用いられるシリンジ針の半径は、約0.1mm〜約2mm、約0.1mm〜約1mm、約0.1mm〜約0.5mm、約0.1mm〜約0.3mm、約0.2mm〜約2mm、約0.2mm〜約1.2mmからなる群より選択される範囲にあってよい。1つの態様において、足場繊維障壁のエレクトロスピニングのために用いられるシリンジ針の半径は、約0.21mmである。
【００６５】
足場繊維層の構造は、溶液の濃度、溶液の密度、溶液の粘度、溶液のイオン強度、溶液の抵抗率、および溶液の電導度といった繊維形成溶液のパラメーターにも依存し得る。
【００６６】
濃度、粘度などの繊維形成溶液の特性は、用いる溶媒に依存すると考えられる。エレクトロスピニング用溶液の特性は、S.H Tan et al. Polymer 46 (2005) 6128-6134に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
複合物の使用方法
動物の皮膚状態を処置するための複合物の使用方法が提供される。皮膚状態を処置するために用いられる複合物は、細胞が播種された複合物であってよい。1つの態様において、HDF細胞が播種された複合物が、皮膚状態を処置するために用いられる。
【００６８】
皮膚状態が、動物の皮膚上の熱傷であってもよい。複合物は、動物の皮膚の少なくとも表皮に及ぶ熱傷を処置するために用いることができる。また、複合物を、動物の皮膚の真皮または皮下脂肪領域に及ぶ熱傷を処置するために用いることもできる。
【００６９】
動物の皮膚状態を処置するための方法であって、細胞が播種された複合物の多数の層を創傷に対して適用する段階を含み、それらの層が2つの連続した層の適用の間に適した時間間隔をおいて1つずつ適用される方法が提供される。罹患部に対して適用される、細胞が播種された複合物の層の数は、創傷の深さに依存し得る。
【００７０】
2つの連続した複合物の層の適用の間の時間間隔は、1日〜30日、7日〜21日、7日〜14日、14日〜17日からなる群より選択してよい。
【００７１】
1つの態様においては、HDF細胞が播種された第1の層の複合物を創傷に対して適用し、その位置に15日間保持する。15日後に複合物の半透過性障壁層を剥離して取り除き、HDFが播種された複合物のもう1つの層を、創傷部に対して、第1の複合物の層の足場層の上面に適用する。このプロセスを真皮の75％の再建が達成されるまで繰り返す。続いて自己皮膚移植片を創傷部に適用する。この方法を自己層状皮膚再建術(ALDR)と呼ぶこともできる。
【００７２】
また、薬物送達用途のための複合物の使用方法も提供される。医用化合物を足場繊維層に埋め込むことができる。医用化合物は体液中への溶解性があってもよく、または磁気的もしくは電気的に足場層から離脱させ得るものであってもよい。複合物は、薬物送達のために適した部位に対して適用することができる。半透過性障壁層に対する接着剤のコーティングは、複合物に対して物理的安定性を提供し得る。
【００７３】
複合物を、細胞送達用途のために用いることもできる。関心対象の細胞を複合物の足場繊維層の上で培養することができる。細胞を含む複合物を、細胞を送達する必要のある部位に適用することができる。
【００７４】
詳細な説明
図1は、ナノファイバー足場層を製造するために用いたエレクトロスピニング装置の概略図である。エレクトロスピニングシステム300は、シリンジポンプ10、高圧電源20、可動性多重紡糸口金システム30およびナノファイバー収集器25を含む。シリンジポンプ10は、ナノファイバーを形成するために用いられる導電性液体を、一連の管(12a、12b、12c)を通して多重紡糸口金システム30へと送る。
【００７５】
3つのシリンジ針(3la、31b、31c)を含む複数の紡糸口金は、多重紡糸口金システム30上に装着される。3つのシリンジ針(31a、31b、31c)のそれぞれは、各々のプラグ(32a、32b、32c)によって紡糸口金保持器38に装着される。
【００７６】
使用時には、導電性液体がポンプ10から、一連の管(12a、12b、12c)を通って、プラグ(32a、32b、32c)を介して3つのシリンジ針(31a、31b、31c)のそれぞれへと流れる。多重紡糸口金システム30は、例えば、矢印(35aおよび35b)によって示されているように左から右へというような往復運動様式で動いて動作し得る。
【００７７】
接地された収集器25はシリンジ針(31a、31b、31c)の下方に配置され、帯電したシリンジ針(31a、31b、31c)と収集器25との間に電界を作り出す。この電界は、導電性液体のごく小さな噴流34を、各シリンジ針(31a、31b、31c)の先端から噴出させる。噴流34は収集器25上に付着し、収集器25上にナノファイバーの足場を形成する。半透過性障壁層50を収集器25上に配置して、半透過性障壁層50上に足場繊維層を形成することもできる。
【００７８】
図1の装置の構造および働きは、シンガポール特許出願第SG 200403355-1号にさらに詳細に記載されている。
【００７９】
図2は、シリンジ針31のもう1つの態様を表している。図2は、図1のエレクトロスピニング装置においてシリンジ針31の代わりに用い得るシリンジ針431の概略図を示している。
【００８０】
シリンジ針431は、同心円状に配列された2つの毛細管406および408を含む。毛細管(406、408)はステンレス鋼でできている。シリンジ針431には、第1の導電性液体および第2の導電性液体をシリンジ針431に供給するための2つの入口412および414が備えられている。毛細管(406、408)の同心円状配列は、各々の入口(412、414)からシリンジ431の先端への第1の導電性液体および第2の導電性液体の通過のための2つの別個の流路402および404を形成する。
【００８１】
入口(412、414)は、テフロン管(図示されていない)によって2つの異なるシリンジポンプ(図示されていない)と連結される。この態様で用いられるシリンジポンプは図1のシリンジポンプ10と同一であり、この態様で用いられる管は図1の管12と同一である。シリンジ431は銅線420によって電源20と接続される。
【００８２】
使用時には、2つの異なる導電性液体が、各々のポンプによってシリンジ針431の中に送り込まれる。電界をシリンジ針431に印加すると、導電性液体の噴流が針から噴出し、接地された収集器上にナノファイバーの形態で付着する。
【００８３】
図3は、図2のシリンジ針431を用いることによって製造されるナノファイバー430の概略図を示している。シリンジ針431を用いることによって製造されるナノファイバーは、2つの繊維形成性材料から構成される。第1の材料は第1の導電性液体に対応し、第2の材料は第2の導電性液体に対応する。第1の材料はナノファイバー430のコア420を形成し、第2の材料はナノファイバー430のシェル422を形成する。
【００８４】
複合物の使用方法
上記のようにして製造された複合物は、皮膚状態を処置するために用いられる。図13を参照すると、自己層状皮膚再建(ALDR)法の諸段階が示されている。
【００８５】
段階1では、テガダーム(商標)創傷ドレッシングの層12に対するエレクトロスピニングが行われたポリ-ε-カプロラクトン(PCL)の足場14を含む第1のTG-NF複合物10を、患者の熱傷性皮膚創傷8の上に配置する。TG-NF複合物10の足場層14には、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)が播種されている。
【００８６】
段階2では、HDF細胞が播種されたTG-NF複合物10を、それらがインサイチューで足場14の内部で増殖するのに伴い、HDF細胞によって支援される皮膚治癒が可能となる期間にわたって皮膚8の上に置いたままにする。
【００８７】
段階3では、テガダーム(商標)の層12を足場層14から剥離する。
【００８８】
段階3のすぐ後の段階4では、テガダーム(商標)創傷ドレッシングの12Aに対するエレクトロスピニングが行われたポリ-ε-カプロラクトン(PCL)の足場14Aを含む第2のTG-NF複合物10Aを、第2の足場14Aがインサイチューの足場14と直接接触するように、第1の足場層14の上に配置する。
【００８９】
元の皮膚の厚さの70〜80％が患者の皮膚8の上に再建されるまで段階3および4を繰り返すことにより、皮膚の上にさらに別の層を配置することもできる。
【００９０】
最後に、任意の段階8において、皮膚移植片16を、残っている一番後の足場14Aの上に配置する。
【００９１】
実施例
ここで、本発明の非限定的な実施例および比較の例を、具体的な実施例を参照することによってさらに詳細に記載するが、それらは本発明の範囲を少しでも限定するものとはみなされるべきでない。
【００９２】
実施例1−ケラチノサイト-テガダーム(商標)
テガダーム(商標)などのポリウレタン材料中の接着剤は細胞死を招くと長い間推定されてきた。しかし、本発明者らは、驚いたことに、ケラチノサイト細胞がテガダーム(商標)上で生存し得るだけでなく、その上で実際に直接増殖し得ることを見いだした。
【００９３】
ヒト表皮ケラチノサイト細胞をテガダーム(商標)の層の上に直接播種し、T.T. Phan[33]に記載された通りのアッセイにおいて培養した。
【００９４】
図5は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で直接培養したヒト表皮ケラチノサイト細胞のSEM像を示している。画像は1311倍の分解能で撮影した。
【００９５】
図7は、T.T. Phanらにおける開示の通りにテガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト表皮ケラチノサイトの増殖と組織培養プラスチックの上での増殖との違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。図7は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上での細胞増殖が、組織培養下で培養した細胞と同等であることを示している。したがって、本発明者らは、テガダーム(商標)膜材料が、細胞増殖を支持するために使用可能であり、皮膚状態を処置するための複合物中に用いるのに適した材料であることを見いだした。
【００９６】
実施例2−ヒト皮膚線維芽細胞-テガダーム(商標)
本実施例では、テガダーム(商標)の層の上にケラチノサイト細胞ではなくヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を直接播種する形で実施例1と同じことを行った。図6は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト皮膚線維芽細胞のSEM像を示している。画像は1106倍の分解能で撮影した。図8は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したHDF細胞の増殖と、組織培養プラスチック容器上での増殖の違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。ここでもまた、本発明者らは、テガダーム(商標)膜材料が、HDF細胞の増殖を支持するために使用可能であり、皮膚状態を処置するための複合物中に用いるのに適した材料であることを見いだした。
【００９７】
実施例3−テガダーム(商標)-PCL複合物の製造
開示された態様に従って複合物を作製した。この複合物では、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材を半透過性障壁層として用いた。図1の装置を用いて、テガダーム(商標)材料に対してナノファイバー足場層のエレクトロスピニングを行った。電界強度10kVを用い、針半径は0.21mm、スピニング溶液の流速は0.8ml/hrおよび電界距離は12cmとした。ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)を繊維形成性材料として用いた。導電性溶液は、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)をクロロホルムおよびメタノールの混合溶媒(クロロホルムの容積3：メタノールの容積1)中に溶解させ、10wt％のPCL溶液を作ることによって調製した。この導電性溶液を用いて、テガダーム(商標)材料の上にナノファイバーを形成させた。このようにして作製された複合物をTG-NF複合物と呼ぶ。
【００９８】
SEM(走査型電子顕微鏡)を用いて、複合物の足場繊維層の画像をさまざまな分解能で撮影した。図4aは、形成された複合物の足場繊維層のSEM(走査型電子顕微鏡)像である。画像は3600倍の分解能で撮影した。図4bは、複合物の足場繊維層の別のSEM像である。画像は14400倍の分解能で撮影した。
【００９９】
実施例4−複合物上へのヒト皮膚線維芽細胞の播種
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を、実施例3のTG-NF複合物の足場繊維層の上に播種した。細胞を21日間にわたって増殖させた。HDF細胞は、8カ月齢の中国人乳児(Cell Research Corporation)から入手した。HDFを単層として播き、10％FBS(ウシ胎仔血清)および1％抗生物質溶液(ペニシリン-ストレプトマイシン)を含むDMEM中でコンフルエントになるまで培養した。培地は 3日毎に交換し、培養物は5％CO2を含む加湿インキュベーター内で37℃で維持した。培地および試薬はすべてResearch Biolabs(Sigma, St Louis, MO, USA)から購入した。
【０１００】
足場層の上での細胞の増殖は、標準的なMTS(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル-テトラゾリウム分子内塩)アッセイおよび標準的な細胞数算定法によって評価した。基質上での細胞増殖を調べるためには、比色MTSアッセイ(CellTiter 96(登録商標)AQueous Assay, Madison, WI, USA)を用いることによって生細胞を評価した。このアッセイの背景にあるメカニズムは、代謝活性のある細胞はMTS試薬中のテトラゾリウム塩と反応し、492nmを吸収し得る可溶性のホルマザン色素を生成すると考えられるというものである。基質をPBSですすぎ洗った後に、無血清培地中にて20％MTS試薬とともに3時間インキュベートした。その後に、アリコートを96ウェルプレートにピペットで注ぎ入れた。続いて96ウェルプレートを分光光度プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA, BMG Lab technologies, Germany)の中に入れ、各ウェルの内容物の492nmでの吸光度を測定した。PCL足場およびTG-NF構築物に接着した生細胞の数を算定するためには、基質を収集し、非接着細胞を除去するためにPBSで洗浄した後に、0.5mlの1×トリプシン中にて37℃で5分間インキュベートした。トリプシン処理の過程は0.5mlのDMEMを各試料に添加することによって停止させた。続いて、血球計数器および顕微鏡を用いて細胞数を算定した。
【０１０１】
図9は、実施例1のテガダーム(商標)ナノファイバー(「TG-NF」)複合物の上で培養したHDF細胞の増殖と、テガダーム(商標)を伴わないPCL足場(「PCLナノファイバー」)の上で培養したHDF細胞の増殖との比較を示している。増殖は、上記の実施例2で概説したように、MTSアッセイによって評価した。PCLナノファイバー足場およびTG-NF構築物の上でのHDF増殖を、第1日、第3日、第5日、第7日、第9日、第11日、第14日、第16日、第18日および第21日に調べ、その結果を図9および10に示した。細胞の光学密度および数はいずれも21日の期間のうちに有意に増加することが認められ、このことは細胞増殖がどちらの種類の基質でも首尾良く起こったこと、および細胞増殖がテガダーム(商標)創傷ドレッシング材料の存在によって有害な影響を受けなかったことを示している。
【０１０２】
図9では、PCLナノファイバーおよびTG-NFの内部のHDFの密度が第16日までは増加し続け、それ以後は減少することが観察された。これはHDFが第16日にコンフルエントに達するまでは増殖し、その時点で構築物がさらに増殖するための空間がなくなったためであった。
【０１０３】
これらの結果は、実施例1のTG-NF複合物の上で培養したHDF細胞の増殖と、PCLナノファイバー足場の上で培養した細胞の増殖との比較を示した図10でなされた観察によって実証された。増殖は細胞数算定によって評価した。
【０１０４】
図10は、細胞数が第16日からはプラトーに達したことが認められたことを示している。細胞数算定の結果は、MTSアッセイによる評価と一致した。すべての時点で、PCLナノファイバー足場およびTG-NF構築物の上に存在する細胞の数は同等であり、このことは細胞増殖が両方の基質で同等であったことを示している。このことから、TG-NF構築物は細胞の成長および増殖のために適した非毒性基質であると結論付けることができる。
【０１０５】
走査型電子顕微鏡撮像のためのプロトコール
特性決定のために、PCLナノファイバー構築物およびTG-NF構築物に、金をスパッターコーティングした(BAL-TEC；SCD 005 Sputter Coater；Germany)。構築物の形態画像の撮影は、加速電圧15kVで電界放射型走査電子顕微鏡(FEI Co.；XL30 FEG SEM；USA)を用いて行った。
【０１０６】
分析：
PCL足場構築物およびTG-構築物の上での細胞の形態を第3日、第7日および第21日にFESEMにより調べた。第3日(図11aおよび11bを参照)の時点では、HDFは集密度約10％にようやく達したことが認められた。これは、21日の期間にわたる増殖を観察するために、この検討に用いたHDF播種密度が低いことに起因した。細胞は特徴的な紡錘形をしていて、増殖の過程でナノファイバー性基質にまたがって引き伸ばされていることが認められた。
【０１０７】
その後の第7日(図11cおよび11d)では、両方の基質の上でHDFの数が増加し、集密度が約30％に達したことが観察された。HDFの増殖および成長は漸進的に続き、第21日(図11eおよび11f)の時点では、HDF増殖はほぼ100％の集密度に達した。PCL足場およびTG-NF構築物はいずれも、連続したHDFの単層によってほぼ完全に覆われた。この時点の顕微鏡写真からは亀裂が観察された。これは、線維芽細胞が定着した基質を、エタノール溶液のグレードを高めながら脱水して一晩風乾させるというFESEM用の試料調製の段階で、HDF単層が及ぼした収縮力に起因すると考えられる。
【０１０８】
図11のFESEM顕微鏡写真から、両方のナノファイバー性基質上でHDFの増殖および接着が首尾良く起こったことが確かめられた。PCL足場構築物およびTG-NF構築物の両方に関して、それぞれの時点で撮影したFESEM顕微鏡写真を比較することにより、両方の基質上でのHDFの密度が常に同等であること、および細胞がそれぞれほぼ等しい速度でほぼ100％の集密度に達したことが観察された。
【０１０９】
この実験データから、TG-NF構築物を線維芽細胞集団に対する適した宿主基質と考えることができ、細胞増殖の結果はPCLナノファイバー性足場のそれと高度に同等であると考えられ得る。
【０１１０】
組織切片作製および撮像のためのプロトコール
PCLナノファイバー足場構築物およびTG-NF構築物を4％ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色した。その後、個別に染色した基質を、構造物全体を液体窒素中に浸漬することにより、二層のOCT包埋媒質(Leica；Germany)の間に包埋した。クリオスタット(Leica CM3050S；Germany)を用いて連続切片(5μm)を切り出し、倒置光学顕微鏡(Leica DM IRB；Germany)により観察した。
【０１１１】
分析
線維芽細胞は足場依存性細胞であるため、エレクトロスピニングを行ったナノファイバー性構築物の高度に特異的な表面特性および多孔性は、基質内部での細胞およびその細胞外マトリックス(ECM)の接着ならびに移動を補助するのではないかと推測した。
【０１１２】
組織学的検査により、第1日、第7日および第21日にH&E染色したPCL足場構築物ならびにTG-NF構築物の内側に、ECMの組込み(淡橙色の染色)が明らかに示された(図12を参照されたい)。
【０１１３】
個々の基質に関して、形成されたHDFの密度は4つの時点を通じて増加していることが観察された。このことにより、HDFはそれ自体が基質の表面に接着するだけでなく、それらのECMもその基質内に首尾良く移動させるように働くことを説明している。これにより、PCLナノファイバー足場およびTG-NF構築物の両方を、HDFの成長および集団に対する有効な三次元足場としてさらに調査し得ることが立証された。しかし、エレクトロスピニング法によって製造される足場および構築物は不織性である。このため、多孔度および孔径は一般に不規則であり、基質全体にわたってランダムに分布している。このことは、ECMの移動および組込みがなぜ主として基質の全体ではなく特定の部位のみで観察されるかについて、より良い理解を与える。しかしながら、多孔度および孔径を容易に制御することが可能な、整列されたナノファイバーを足場の製作に用いる最近の進展により、この欠点は是正することができる。
【０１１４】
指摘すべきもう1つの興味深い点は、すべての時点で、両方の基質におけるHDFの密度が比較的同等であったことである。このことは、TG-NF構築物の内部でのHDF ECMの成長および移動が、代用皮膚のために適した生分解性足場であると見なし得るPCLナノファイバー足場と同等であることを示している。
【０１１５】
実施例5−ゼラチン/PCL複合物ナノファイバー性足場の製作
Y.Z. Zhangら[26]を参照すれば、骨髄ストロマ細胞(BMSC)が、ゼラチン/PCL複合物足場内部で、深さ114μmまで増殖し得ることが認められている。本発明者らは、細胞の増殖および浸透のために適した足場材料としての、ゼラチンおよびPCLポリマーの使用方法について調べた。ゼラチンには数多くの長所があり、これには生物由来であること、生分解能、生体適合性および比較的低コストで販売されていることが含まれる。ゼラチンはまた、創傷ドレッシング、薬物送達のための担体および密封剤として薬学および生物医学の分野で広く用いられるものとしてそれ自体確立している[26-27]。
【０１１６】
複合物の材料を、ブタ皮膚由来の粉末状のゼラチンA型(300ブルーム、Sigma, St. Louis, MO)、PCL(Mn 80,000、Aldrich)を、溶媒2,2,2-トリフルオロエタノール(TFE)(純度≧99.0％、Fluka, Buchs, Switzerland)とともに用いて製作した。
【０１１７】
ゼラチン/TFE混合物およびPCL/TFE混合物の溶液を10％wt濃度で調製し、その後50：50の比でゆっくりと攪拌しながら混合してゼラチン/TFE/PCL溶液を得、これを上記の実施例3と同じ動作パラメーターの下で、図1の装置を用いて複合物繊維性足場を製作するために用いて、ゼラチン/TFEおよびPCL/TFEテガダーム(商標)複合物(「ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物」)を製造した。
【０１１８】
寸法上の特性の決定
画像解析ソフトウエア(ImageJ, National Institute of Health, USA)を用いて、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物ナノファイバーの直径は300〜700nmの範囲にあり(ナノファイバーの80％)、平均直径は500±120nmであることが認められた。3時間のエレクトロスピニングにより、厚さが約30μmであるナノファイバー性マットを得た。かさ密度が公知であることから(1.34g/cm3)、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物ナノファイバー足場の多孔度は、式：
多孔度＝(1-d/D)×100％
によって得ることができ、式中、dおよびDはそれぞれ見かけ上の密度およびかさ密度を表す[28]。
【０１１９】
図14は、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物の倍率(a)3,000倍、(b)8,000倍、(c)12,000倍、および(b)20,000倍でのFESEM形態画像を示している。図15は、凍結割断法による倍率(a)750倍および(b)1,500倍での、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物のFESEM断面図を示している。
【０１２０】
結果の詳細は以下の表1に示されている。
【０１２１】
【表１】
2008514341.tif 000003
【０１２２】
力学的な特性の決定
エレクトロスピニングが行われたゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物の力学的特性を、卓上一軸性試験機(INSTRON 3345)を用いて測定した。これは10-N荷重計をクロスヘッド速度10mm/分として周囲条件下で用いて行った。すべての試料は、足場構築物から寸法20×10mmの長方形の形状として調製し、デジタル式マイクロメーターを用いた測定で平均の厚さは120μmであった。この特性決定手順に大して4つの試料を試験した。具体的な試料の調製方法は、Z.M. Huangら[27]に記述された通りである。
【０１２３】
図16は、テガダーム(商標)創傷ドレッシングの剥離の前および後の、ゼラチン/TFE/PCL足場の応力-歪み挙動を示している。興味深いことに、引張荷重グラフから2つの異なる相が認められた。引張荷重グラフからの第1の相は、テガダーム(商標)創傷ドレッシングを伴う無傷の状態のゼラチン/PCL足場に関して得られた。第2の相は、足場が断裂した後の、引張荷重がテガダーム(商標)創傷ドレッシングのみに対して継続されている時点で生じた。この結果を外挿し、図17に示した。
【０１２４】
ゼラチン/PCLの複合ポリマーは、引張特性および伸長特性が低いことが分かっている。同様に、テガダーム(商標)創傷ドレッシングはほぼ弾性的なゴム様の引張特性を有することが把握されていることから、ナノファイバー性足場は創傷ドレッシングが断裂する前に断裂すると予想された。しかし、ナノファイバー性足場およびテガダーム(商標)創傷ドレッシングの複合構築物は、ゼラチン/PCL単独のみを基にした構築物よりも引張特性の改善をもたらした。
【０１２５】
このテガダーム-ゼラチン/PCL複合構築物は、はるかに優れた引張強度、変形性および柔軟性を提供することが示されており、これは皮膚の再生手順においては特に重要である。
【０１２６】
細胞生存度試験
図18からの細胞生存度による細胞活性の光学密度から示されるように、HDF細胞の生存度は、ゼラチン/PCLナノファイバー足場上では7日間にわたり、PCL足場と比較して大きく増加することが認められた。この結果は、図18からの細胞数算定試験によって立証され得る。ゼラチン/PCL複合物足場上の細胞数は、通常のPCL足場上でのそれと比較して約80％増加することが観察されている。興味深いことに、図18からは、ゼラチン/PCL複合物足場について、細胞培養第7日までに光学密度が停滞し始めたことが認められる。これは細胞増殖が停止したことを意味するのではなく、その速度が遅くなったことを意味する。それについて考えられる理由は、この時期には、細胞は細胞増殖または細胞外マトリックスの成長を通じて複合物足場中への浸透に働いているということである。
【０１２７】
図19からの結果は、足場細胞であるHDF細胞がゼラチン/PCL複合物足場に対してより良好に接着し、TCPSのそれとほぼ同等な結果を実現したことを示している。PCLポリマー溶液に生体ポリマーであるゼラチンを含めることにより、足場構造に対するHDFの親和性が大きく高まったと結論付けることができる。
【０１２８】
図20は、TCPS、PCL NFM、およびPCL-ゼラチンNFM上でのHDFの細胞数を示している。細胞を1.5×104個/ウェルの密度で播種し、7日間にわたって培養した。
【０１２９】
図20は、ゼラチン/PCL複合物足場上でのHDF増殖に関するFESEM形態図を示している：(a)第1日、(b)第3日、(c)第5日、(d)初期時点でのHDFの足場構造内への浸透。
【０１３０】
応用
開示された複合物が、皮膚熱傷などの皮膚状態の処置のために非常に有用であることが理解されるであろう。足場層の中に播種された皮膚細胞が皮膚の治癒を補助することが理解されるであろう。さらに、本複合物は、特に身体が自らを修復することができない状況下で、皮膚の上に防御障壁を形成し、皮膚、皮下、および表皮組織の感染を防ぐ。
【０１３１】
また、足場層の中に播種された皮膚細胞が、皮膚移植に対する有用な代替的または補完的な選択肢であることも理解されるであろう。さらに、本発明者らが驚いたことに、テガダーム(商標)などの市販のポリマー性硬膏剤中の接着剤が、皮膚細胞の増殖を死滅させることも阻害することもないことを見いだしたことにより、本複合物は真皮および表皮の修復に用いることができる。
【０１３２】
複合物はさらに、永続的な皮膚代替製品の使用に代わる有用な選択肢も提供する。さらに、半透過性障壁に対する繊維のエレクトロスピニングは、複合物を製造するための比較的低コストな手段を提供する。さらに、本複合物は、臨床的な感染または瘻孔の徴候を有する潰瘍にも用いることができる。
【０１３３】
参考文献：
2008514341.tif 000004
2008514341.tif 000005
2008514341.tif 000006
2008514341.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
ここで、諸態様を以下の図面を参照しながら説明する。
【図１】開示される態様に従ったナノファイバー足場層を製造するために用いられるエレクトロスピニング装置の概略図である。
【図２】開示される態様に従った同軸ナノファイバーを製造するために用いられるシリンジ針の概略図である。
【図３】開示される態様に従った同軸ナノファイバーの断面の概略図である。
【図４】図4aは、開示される態様に従って作製された複合物のナノファイバー足場層のSEM(走査型電子顕微鏡)像である。画像は3600倍の分解能で撮影した。図4bは、開示される態様に従って作製された複合物のナノファイバー足場層のSEM像である。画像は14400倍の分解能で撮影した。
【図５】テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト表皮ケラチノサイト細胞のSEM像である。画像は1311倍の分解能で撮影した。
【図６】テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト皮膚線維芽細胞のSEM像である。画像は1106倍の分解能で撮影した。
【図７】テガダーム(商標)の上で培養したヒト表皮ケラチノサイトの増殖と、組織培養用プラスチックの上での増殖との違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。
【図８】テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト皮膚線維芽細胞の増殖と、組織培養用プラスチックの上での増殖との違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。
【図９】開示された態様に従ってテガダーム(商標)-ナノファイバー(TG-NF)複合物の上で培養したヒト皮膚線維芽細胞(HDF)の増殖と、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)足場の上での増殖との違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。
【図１０】開示された態様に従ってTG-NF複合物の上で培養したHDF細胞の増殖と、PCL足場上での増殖との違いを図示した棒グラフである。増殖は細胞数算定によって評価した。
【図１１】図11aは、PCL足場上での培養第3日のHDF細胞のFESEM(電界放射型走査電子顕微鏡)像である。図11bは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第3日のHDF細胞のFESEM像である。図11cは、PCL足場上での培養第7日のHDF細胞のFESEM像である。図11dは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第7日のHDF細胞のFESEM像である。図11eは、PCL足場上での培養第21日のHDF細胞のFESEM像である。図11fは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第21日のHDF細胞のFESEM像である。
【図１２】図12aは、PCL足場上での培養第1日のHDF細胞の光顕像である。図12bは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第1日のHDF細胞の光顕像である。図12cは、PCL足場上での培養第7日のHDF細胞の光顕像である。図12dは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第7日のHDF細胞の光顕像である。図12eは、PCL足場上での培養第21日のHDF細胞の光顕像である。図12fは、開示された態様に従ったTG-NF複合物上での培養第21日のHDF細胞の光顕像である。
【図１３】開示された態様に従った自己層状皮膚再建(ALDR)法の諸段階を図示している。
【図１４】ゼラチン/PCL複合物ナノファイバー足場の、倍率(a)3,000倍、(b)8,000倍、(c)12,000倍、および(d)20,000倍でのFESEM形態画像である。
【図１５】図15(A)は、PCL-ゼラチンナノファイバー足場の凍結割断法による倍率750倍でのFESEM断面図を示している。図15(B)は、PCL-ゼラチンナノファイバー足場の凍結割断法による倍率1500倍でのFESEM断面図を示している。
【図１６】テガダーム(商標)創傷ドレッシングの剥離の前および後の、ゼラチン/PCLナノファイバー性足場の引張荷重下での応力-歪み曲線を示している。
【図１７】テガダーム(商標)創傷ドレッシングを伴う無傷の状態のゼラチン/PCLナノファイバー性足場の応力-歪みグラフを示している。
【図１８】TCPS、PCL NFM、およびPCL-ゼラチンNFM上でのHDFの生存度のグラフを示している。細胞を1.5×104個/ウェルの密度で播種し、7日間にわたって培養した。
【図１９】TCPS、PCL NFM、およびPCL-ゼラチンNFM上でのHDFの接着を示したグラフである。細胞は3×104個/ウェルの密度で播種した。
【図２０】TCPS、PCL NFM、およびPCL-ゼラチンNFM上でのHDFの細胞数を示している。細胞を1.5×104個/ウェルの密度で播種し、7日間にわたって培養した。
【図２１】ゼラチン/PCL複合物足場上でのHDF増殖に関するFESEM形態図を示している：(a)第1日、(b)第3日、(c)第5日、(d)初期時点でのHDFの足場構造内への浸透。
【図１】
2008514341.tif 000009
【図２】
2008514341.tif 000010
【図３】
2008514341.tif 000011
【図４】
2008514341.tif 000012
【図５】
2008514341.tif 000013
【図６】
2008514341.tif 000014
【図７】
2008514341.tif 000015
【図８】
2008514341.tif 000016
【図９】
2008514341.tif 000017
【図１０】
2008514341.tif 000018
【図１１】
2008514341.tif 000019
【図１２】
2008514341.tif 000020
【図１３】
2008514341.tif 000021
【図１４】
2008514341.tif 000022
【図１５Ａ】
2008514341.tif 000023
【図１５Ｂ】
2008514341.tif 000024
【図１６】
2008514341.tif 000025
【図１７】
2008514341.tif 000026
【図１８】
2008514341.tif 000027
【図１９】
2008514341.tif 000028
【図２０】
2008514341.tif 000029
【図２１】
2008514341.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月29日(2007.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素に対して透過性であって微生物に対しては不透過性である半透過性障壁層；および
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成された足場繊維層；
を含み、該半透過性障壁層が足場繊維層から脱着可能である、複合物。
【請求項２】
少なくとも1つの細胞が足場繊維層内に提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項３】
少なくとも1つの細胞が皮膚細胞である、請求項2記載の複合物。
【請求項４】
皮膚細胞がヒト皮膚線維芽細胞である、請求項3記載の複合物。
【請求項５】
少なくとも1つの細胞が半透過性障壁層の上に提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項６】
半透過性障壁層がポリマーで構成されている、請求項1記載の複合物。
【請求項７】
ポリマーが、ポリセルロース、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアミド、樹脂、ナイロン、ポリシリコン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシリコーン、コポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項6記載の複合物。
【請求項８】
半透過性障壁層が、テガダーム(Tegaderm)(商標)、ダーマグラフト(Dermagraft)(商標)、トランスサイト(TransCyte)(商標)、インテグラ(Integra)(商標)およびバイオブレン(Biobrane)(商標)からなる群より選択される少なくとも1つの材料で構成されている、請求項1記載の複合物。
【請求項９】
半透過性材料が足場繊維層から脱着可能である、請求項1記載の複合物。
【請求項１０】
動物またはヒトの皮膚に対する接着を可能にするために半透過性障壁層の上に接着剤が提供される、請求項1記載の複合物。
【請求項１１】
接着剤が、ゼラチン接着剤、樹脂を基剤にした接着剤、フェノールを基剤にした接着剤、アルデヒドを基剤にした接着剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項10記載の複合物。
【請求項１２】
半透過性障壁層の平均孔径が、1μm〜50μm、2μm〜40μm、3μm〜30μm、4μm〜20μm、および5μm〜10μmからなる群より選択される範囲にある、請求項1記載の複合物。
【請求項１３】
足場繊維層が、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される材料で構成される、請求項1記載の複合物。
【請求項１４】
足場繊維層の繊維が同軸繊維である、請求項1記載の複合物。
【請求項１５】
足場繊維層の繊維のサイズが、マイクロサイズの繊維およびナノサイズの繊維のうち少なくとも1つである、請求項1記載の複合物。
【請求項１６】
足場繊維層の厚さが、約0.05mm〜約5mm、約0.05mm〜約4mm、約0.05mm〜約3mm、約0.05mm〜約2mm、約0.05mm〜約1.5mm、約0.08mm〜約1.5mm、約0.1mm〜約1.5mm、約0.2mm〜約1.5mm, 約0.5mm〜約1.5mm、約0.8mm〜約1.5mmからなる群より選択される、請求項1記載の複合物。
【請求項１７】
少なくとも1つの細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、胎児性組織由来上皮細胞、間葉細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄由来間葉幹/前駆細胞、臍帯血由来間葉幹/前駆細胞、脂肪組織由来間葉幹/前駆細胞、毛包表皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、爪床胚細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、腱細胞、頬粘膜および口腔粘膜のケラチノサイト、ならびに線維芽細胞、靱帯線維芽細胞、および歯周靱帯線維芽細胞からなる群より選択される、請求項2記載の複合物。
【請求項１８】
足場繊維層がゼラチンを含む、請求項1記載の複合物。
【請求項１９】
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層上への繊維のエレクトロスピニングを行う段階を含み、該半透過性障壁層が該繊維から脱着可能である、複合物の製造方法。
【請求項２０】
エレクトロスピニングが融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーを用いる段階を含み、ポリマーの濃度が該エレクトロスピニングの間、繊維を形成するのに十分に高い、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
溶液の溶媒が有機溶媒である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
有機溶媒が、アルコール、ケトン、アルデヒド、およびハロゲン化アルキルからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
エレクトロスピニングが：5kV〜25kV、5kV〜20kV、5kV〜15kV、5kV〜10kV、6kV〜15kV、6kV〜14kVおよび8kV〜12kvVからなる群より選択される範囲にある強度を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
エレクトロスピニングが：約5cm〜約25cm、約5cm〜約20cm、約5cm〜約15cm、約5cm〜約10cm、約5cm〜約25cm、約10cm〜約25cm、および約10cm〜約15cmからなる群より選択される範囲にある距離を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
エレクトロスピニングが：繊維を形成するためにシリンジ針を用いる段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
約0.1mm〜約2mm、約0.1mm〜約1mm、約0.1mm〜約0.5mm、約0.1mm〜約0.3mm、約0.2mm〜約2mm、および約0.2mm〜約1.2mmからなる群より選択される範囲にある半径を有するシリンジを選択する段階を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
酸素に対して透過性であって微生物に対して実質的に不透過性である半透過性障壁層を選択する段階を含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層；
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層；および
該足場繊維層内に提供される皮膚細胞；
を含み、該半透過性障壁層が該足場繊維層から脱着可能である、接着性パッチ。
【請求項３０】
半透過性障壁層；
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層である、少なくとも2つの足場繊維層；および
異なる細胞型または同一の細胞型を含む足場繊維層である、該少なくとも2つの足場繊維層のそれぞれに提供される少なくとも1つの細胞；
を含み、該半透過性障壁層が該少なくとも2つの足場繊維層から脱着可能である、複合物。
【請求項３１】
半透過性障壁層に対する繊維のエレクトロスピニングを行って足場繊維層を形成する段階；および
少なくとも1つの細胞を該足場繊維層に播種する段階；
を含み、該半透過性障壁層が該足場繊維層から脱着可能である、複合物を製造する方法。
【請求項３２】
動物の皮膚状態を処置するための、請求項29記載の接着性パッチの使用。
【請求項３３】
皮膚状態が熱傷である、請求項32記載の接着性パッチの使用。
【請求項３４】
請求項29記載の接着性パッチを、該皮膚状態を有する動物の皮膚に対して接着性パッチを適用するための説明書とともに含む、動物の皮膚状態を処置するためのキット。
【請求項３５】
請求項29記載の接着性パッチを動物の皮膚に対して適用する段階を含む、動物の皮膚状態を処置する方法。
【請求項３６】
皮膚状態が真皮熱傷である、請求項35記載の方法。
【国際調査報告】
2008514341.tif 000031
2008514341.tif 000032
2008514341.tif 000033
2008514341.tif 000034