(57)【要約】本発明は、鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物および安定な（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態、これらの変態の製造方法、および医薬製造のための構成要素としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項２】
結晶（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項３】
１２．６、１９．５、２０．２、２１．５および２５．２の２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項４】
６．５、１２．６、１３．４、１９．５、２０．２、２１．５、２５．２および２９．８の２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項５】
図１（タイプＩ）に示されたスペクトルを有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項６】
３．３、４．９、１９．３、２０．０および２３．５の２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項７】
３．３、４．９、１５．１、１６．２、１９．３、２０．０、２３．５および２４．３の ２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項８】
図２（タイプＩＩ）に示されたスペクトルを有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項９】
２．８、５．８、２０．０、２１．２および２５．１の２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１０】
２．８、５．８、１２．９、１５．９、２０．０、２１．２、２５．１および２９．４の２θ値を有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１１】
図３（タイプＩＩＩ）に示されたスペクトルを有する、請求項２に記載の（２Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１２】
（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１３】
結晶（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１４】
１２．８、１９．４、１９．８、２０．２、および２１．５の２θ値を有する、請求項１３に記載の（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１５】
６．５、１２．８、１９．４、１９．８、２０．２、２０．７、２１．５および２５．３の２θ値を有する、請求項１３に記載の（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１６】
図４（タイプＩＶ）に示されたスペクトルを有する、請求項１３に記載の（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物。
【請求項１７】
１種または２種以上の非プロトン性溶媒から結晶化することを特徴とする、（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の調製方法。
【請求項１８】
使用する非プロトン性溶媒が、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテルおよびメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの群から選択されるエーテル、またはこれらのエーテルの混合物であることを特徴とする、請求項１７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の調製方法。
【請求項１９】
使用する非プロトン性溶媒が、アセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトンおよびメチルイソプロピルケトンの群から選択されるケトン、またはこれらのケトンの混合物であることを特徴とする、請求項１７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の調製方法。
【請求項２０】
非プロトン性溶媒がアセトニトリルであることを特徴とする、請求項１７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の調製方法。
【請求項２１】
使用する溶媒が、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチルおよび１，３−ジオキソリジン−２−オンの群から選択されるエステル、またはこれらのエステルの混合物であることを特徴とする、請求項１７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の調製方法。
【請求項２２】
非プロトン性媒体が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチレングリコール、メトキシエタノールおよびエトキシエタノール、またはそれらの混合物を用いる、混合物の形態で使用することを特徴とする、請求項１７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
予め精製することなく、反応溶液から直接結晶化することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
非結晶質または結晶（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の再結晶化を行うことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
医薬調製のための構成要素としての（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の使用。
【請求項２６】
医薬調製のための構成要素としての（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の使用。
【請求項２７】
（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態を薬学的活性化合物、補助薬または溶媒とともに含有する、医薬組成物。
【請求項２８】
使用する薬学的活性化合物が、ぺプチド、ヌクレオチド、ワクチンおよび細胞増殖抑制剤の群から選択される活性化合物であることを特徴とする、請求項２７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含有する医薬組成物。
【請求項２９】
リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子またはマイクロエマルジョンを有することを特徴とする、請求項２７に記載の（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態を含有する医薬組成物。
【請求項３０】
（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を薬学的活性化合物、補助薬または溶媒とともに含有する、医薬組成物。
【請求項３１】
使用する薬学的活性化合物が、ぺプチド、ヌクレオチド、ワクチンおよび細胞増殖抑制剤の群から選択される活性化合物であることを特徴とする、請求項３０に記載の（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含有する医薬組成物。
【請求項３２】
リポソーム、リポプレックス、ナノ粒子またはマイクロエマルジョンを有することを特徴とする、請求項３０に記載の（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物ならびにラセミ体および鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態（crystal modification）、それらの調製方法、および医薬組成物の調製についてのそれらの使用に関する。
【０００２】
上記および下記のＤＯＴＡＰ塩化物は、（Ｚ，Ｚ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス［（１−オキソ−９−オクタデセニル）オキシ］−１−プロパナミニウムクロライドまたは１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン塩化物としても知られている、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−２，３−ビス［［（９Ｚ）−１−オキソ−９−オクタデセニル］オキシ］−１−プロパナミニウムクロライドおよびそれらの水和物を表す。
【０００３】
【化１】
2008521757.tif 000002
ＣＡＳナンバー：１３２１７２−６１−３および４７７２７４−３９−８（ラセミ化合物）
１９７９７４−７３−５８（ラセミ化合物、一水和物）
４２８５０６−５１−８（２Ｓ形態）、３２８２５０（２Ｒ形態）
【背景技術】
【０００４】
リポソームは両親媒性（ambiphilic）物質、通常天然脂質、を含有する合成多層小胞（球状内臓型膜）であり、親水性物質を水性の内部にカプセル化することができ、かつ親油性物質を脂質膜の内側に組み込むことができる。
【０００５】
それらは、具体的には化粧品および医薬品、特に皮膚科学において用いられる。ここで、具体的にはビタミン、補酵素、スキンケア剤、および日焼け防止剤が組み込まれる。リポソームは一般に局所的に適用される。
【０００６】
しかし、リポソームの非経口による使用は、活性化合物を自由に溶解した形態と比較し、達成すべきより特異的な臓器分配を可能にするため、リポソームは製薬技術においてさらに重要性を増大させている。ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質が組み込まれると、リポプレックス（lipoplex）が得られる。
【０００７】
オイルの添加および高圧ホモジナイザーの使用により、リポソームから強制的に生じるいわゆるナノ粒子（nanoparts）を形成することができる。これらはリポソームとほぼ同じサイズの粒子であるが水相を有さず、代わりにそれらの内部に油相を有する。それらは親油性物質のカプセル化に特に適している。
【０００８】
マイクロエマルジョンは、コロイド様に分散し、水性、油様および界面活性剤成分を含有する単相システムである。それらは１〜５００ｎｍの粒子サイズを有し、液体に近似した挙動を示す。
【０００９】
特に、ぺプチド活性化合物、ヌクレオチド、ワクチンおよび他のバイオ医薬品、これらは一般に溶解性に乏しい、と関連して、可溶化効果は上記のアプリケーションにおいて非常に重要である。加えて、体内での活性化合物の分解速度を遅くすることが可能であり、このようにして達成される持続放出効果を得ることができる。
【００１０】
ＤＯＴＡＰ塩化物はカチオン性脂質の種に属する。天然に生成するリン脂質とは対照的に、これらは両性イオンの性質を有しない。カチオン性脂質を含有するリポソームは、単独またはリン脂質もしくは他の脂質様化合物と組み合わされて、正に荷電した表面を有する。これは、負に荷電した外部表面を有する細胞、例えば内皮細胞に対し高度な親和性をもたらす。
【００１１】
しかし、特に重要なことは、ＤＯＴＡＰに基づいたおよび他のカチオン性リポソームおよびリポプレックスの細胞内に貫通する能力であり、こうして活性化合物を組み込んで細胞内部に移送する能力である（トランスフェクション）。
【００１２】
これらの特性のすべてがＤＯＴＡＰ塩化物を癌の治療に対しても非常に興味深いものにしている。これらの特性は、従来のカチオン性ＤＯＴＡＰリポソームに組み込まれた細胞増殖抑制剤の適用を可能にする。
【００１３】
ＤＯＴＡＰ塩化物および他のＤＯＴＡＰ塩、例えば酢酸塩、臭化物、リン酸二水素塩、硫酸水素塩、ヨウ化物、メシラート、硫酸メチル、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩または二硫酸塩およびトリフラート（triflate）は文献から適切であることが知られている。
【００１４】
ＤＯＴＡＰリン酸二水素塩およびＤＯＴＡＰメシラートは文献にはラセミ化合物としてのみ記載されている。上記の他のすべての塩はそれぞれラセミ化合物および２Ｓ−エナンチオマーとして記載され、さらに塩化物および硫酸メチルの２Ｒ−エナンチオマーが記載されている。いくつかのインビトロ（in-vitro）研究において、例えばＤＯＴＡＰ硫酸メチル等の他の塩は、ＤＯＴＡＰ塩化物に比べてより良いトランスフェクション率を達成した。
【００１５】
しかし、インビボ（in-vivo）において使用すると、生体内のリポソーム表面でアニオンが交換され、他の塩の利点が生じないことを意味する。特にヒトの医療用途、具体的には非経口的使用において、生理学的に許容されるアニオンを有するＤＯＴＡＰ塩、例えば対応する塩化物または酢酸塩が好ましい。
【００１６】
医学的、具体的には非経口的使用は、使用する活性化合物および補助剤について最高の品質および純度を必要とする。したがって、これらの化合物の製造、製造の再現性、および副生成物プロファイルに関して当局における非常に厳重な規制が存在する。非経口的に使用される物質の場合、病原性微生物およびエンドトキシンによる微生物汚染は、さらに厳重に回避され、制御されなければならない。
【００１７】
ＤＯＴＡＰ塩化物および他のＤＯＴＡＰ塩は極端に不安定であり、従って医薬製剤の調製に用いるのに適した、それ自身許容される純度で製造するのが困難である。
【００１８】
例えば、天然のリン脂質ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ等のオレイン酸基を運搬するすべての脂質のように、すべてのＤＯＴＡＰ塩は酸化に対して非常に敏感である。しかし、不飽和脂肪酸誘導体の酸化生成物は一般に高い毒性を有する。ここでは適切な調製方法および精製方法が必要とされる。例えば、ＤＯＴＡＰ酢酸塩は高沸点オイル形態であり、従って工業的に適切な品質で得ることが非常に困難である。
【００１９】
不安定さを克服する従来の方法、例えば、アスコルビン酸または還元型Ｌ−グルタチオンの形態の抗酸化剤を添加することは、後で組み込まれる活性化合物との相互作用を除くことができないため、ＤＯＴＡＰ塩化物の汎用性を大きく制限する。調製、貯蔵および使用中に酸素を完全に排除することは実質的に不可能であるか、または多大な努力によってのみ可能となる。ＤＯＴＡＰ塩化物は、商業的にはクロロホルム溶液または非結晶質の固体としてのみ入手することができる。
【００２０】
酸化感受性に加え、非結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物は極端な吸湿性があり、かつ通常の大気中の湿度においてごく短時間で潮解し、ぬるぬるした（greasy）フィルムとなる。このことはこの化合物の取り扱いをさらに困難にする。したがって、非結晶質ＤＯＴＡＰ塩化物の製造業者は、一般に保護ガス下において−２０℃で貯蔵することを推奨し、約６ヵ月の有効期間を保証するのみである。
【００２１】
文献は非結晶質、ラセミ体のＤＯＴＡＰ塩化物についての種々の合成経路を開示するのみである。ＥｉｂｅｌおよびＵｎｇｅｒによるＤＥ４０１３６３２Ａ１は、クロロホルム／メタノール／水性ＨＣｌ溶媒システムにおけるイオン交換、それに続くクロマトグラフィーによる精製により、ＤＯＴＡＰ臭化物からＤＯＴＡＰ塩化物を合成する概要を示す。ＤＯＴＡＰ臭化物は、予め１−ブロモ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンからそのまま（in situ）得られる。
【００２２】
ＬｅｖｅｎｔｉｓおよびＳｉｌｖｉｕｓによるＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０２３（１９９０）１２４−１３２は、２相溶媒／ＮａＣｌ溶液システムにおけるイオン交換による、ＤＯＴＡＰヨウ化物からのＤＯＴＡＰ塩化物の合成について報告する。ＤＯＴＡＰヨウ化物は予め対応するジメチルアミノ化合物のヨウ化メチルによるメチル化により得られる。
【００２３】
Ｎａｎｔｚ等による、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２９９（１９９６）２８１−２８３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（１９９７）４０６９−４０７８は、非水イオン交換クロマトグラフィーによるＤＯＴＡＰ塩化物の合成を記載する。所望の化合物は溶出液の蒸発により得られる。
【００２４】
Ｆｅｌｇｎｅｒ等による米国特許第５，２６４，６１８号は、塩化メチルによるメチル化により対応するジメチルアミノ化合物を直接ＤＯＴＡＰとする。それらは−２０℃においてアセトニトリルから結晶化することにより黄色のワックスを明らかに得る。しかし、ＤＯＴＡＰ塩化物は室温においてアセトニトリルに実質的に不溶である。このいわゆる結晶化を再現する試みは、高温溶液を冷却することにより得られる油状物質の固体化により非結晶質の物質のみを与えた。これが結晶化でないという事実は、本発明者らが明らかに精製効果を得ず、クロマトグラフィーにより該物質を精製しなければならないという事実からも明らかである。
【００２５】
このため、２つの鏡像異性ＤＯＴＡＰ塩化物の合成経路もそれらの特性も今日まで知られていない。ケミカルアブストラクツ（Chemical Abstracts）は２つのエナンチオマーに対する番号を規定するが、対応する刊行物は専らラセミ体のＤＯＴＡＰ塩化物を用いた研究のみを記載している。
【００２６】
特に、該化合物が非経口的使用を目的とする場合、イオン交換樹脂を用いる処理を含む製造は、対応する樹脂が微生物の理想的な栄養媒体であり、かつそれらが殺菌された後でもエンドトキシンによる汚染の危険性が残るため、起こり得る微生物汚染を考慮すると大きな問題を有する。
【発明の開示】
【００２７】
従って、本発明の目的は高度に純粋で、適度な化学的および物理的安定性を有するＤＯＴＡＰ塩化物の塩および水和物を提供することである。本発明のさらなる目的は、医薬製剤の製造に用いることが可能な長期間の有効期限を有するこれらの塩を提供することである。ＤＯＴＡＰ塩化物の塩および水和物の安定な形態を調製するための、工業的規模で行うことのできる再現可能な方法が引き続き大いに求められている。
【００２８】
鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物は、ラセミ化合物に対して記載された方法と同様にして、鏡像異性体の純粋な出発物質から得ることができる、すなわち、（ＲまたはＳ）−１−クロロ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンを経て、（ＲまたはＳ）−１−ＬＧ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンおよびイオン交換（ＬＧ＝脱離基）を経て、または（ＲまたはＳ）−１−ジメチルアミノ−２，３−ジオレオイルオキシプロパンを経て得ることができる。
【００２９】
記載することのできる別の製造方法はラセミ体のＤＯＴＡＰ塩化物のラセミ体分割である。実験により、驚くべきことに、ラセミ体として純粋な、および鏡像異性体としても純粋な結晶ＤＯＴＡＰ塩化物を高い化学的純度で、かつ良好な安定性により簡単な方法で得ることができることが見出された。この方法により得られる結晶産物は、保護ガス下の室温において実質的に制限のない安定性を有する。したがって、それらは医薬品製造のための構成成分としてまたは出発物質として好適である。
【００３０】
このように本発明は鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物、並びにラセミ体および鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の安定な結晶変態に関する。
【００３１】
安定な結晶変態は結晶形態においておよび部分的な結晶形態において存在することができる。それらはこれまで得られたことのない９８％＜の純度とともに、２５℃および６０％の相対大気湿度で空気を排除して１２ヵ月貯蔵後、初期値に関しこれまで得られたことのない９８％＜の安定性を有する（この点に関し表１参照）。ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態は、ＤＯＴＡＰ塩化物の１当量当りの結晶化の水または溶媒を１当量未満含有する。
【００３２】
ラセミ体のＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態は、例えば異なる３つの結晶変態（タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩ）を有し、粉末Ｘ線回折測定において中等度の鋭いバンドを示す（この点に関し図１〜図３および表２参照）。種々の結晶変態について選択された２θ値は、１２．６、１９．５、２０．２、２１．５および２５．２（タイプＩ）；または３．３、４．９、１９．３、２０．０および２３．５（タイプＩＩ）；または２．８、５．８、２０．０、２１．２および２５．１（タイプＩＩＩ）である。
【００３３】
鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物は同様に結晶形態として得られる。結晶変態について選択された２θ値は１２．８、１９．４、１９．８、２０．２および２１．５（タイプＩＶ、この点において図４参照）である。
【００３４】
鏡像異性体は光学的に活性である。したがって、（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は−２．１２°の旋光度を有し、（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物は＋２．１２°の旋光度を有する（２０℃における［α］Ｄ、１％ジクロロメタン溶液）。
【００３５】
本発明はさらにＤＯＴＡＰ塩化物が非プロトン性の媒体から結晶化されることを特徴とする、ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態の製造方法に関する。この目的のために用いられる非プロトン性媒体は非プロトン性溶媒またはそれらの混合物であってもよい。
【００３６】
非プロトン性媒体はプロトン性溶媒、例えば水等を少量含有してもよい。例外的に、２５重量％のプロトン性溶媒が適切な条件下で存在してもよい。ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶化は、事前の精製なしに反応溶液から直接行うことができる。同様に、結晶ＤＯＴＡＰ塩化物は非結晶質、部分的結晶または結晶物質の再結晶により得ることができる。
【００３７】
好適な非プロトン性溶媒は、具体的には、
エーテル、例えばテトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル等、
ケトン、例えばアセトン、２−ブタノン、メチルイソブチルケトン、メチルイソプロピルケトン、
ニトリル、例えばアセトニトリル、および
エステル、例えばギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、１，３−ジオキソリジン−２−オン
である。
【００３８】
これらの溶媒は、それぞれの場合において純粋な形態または混合物の形態で用いることができる、すなわち、種々の非プロトン性溶媒のグループを混合物の形態で用いても、もう一つ別の溶媒との混合物の形態のタイプで非プロトン性溶媒を用いてもよい。すでに上で述べたように、プロトン性溶媒を非プロトン性溶媒または溶媒混合物に添加してもよい。
【００３９】
このタイプのプロトン性溶媒の添加は、典型的には以下の溶媒：
アルコール、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、３−メチル−１−ブタノールおよびエチレングリコール、メトキシエタノール、エトキシエタノール、または
水
により構成することができる。プロトン性溶媒の添加は同様に、これらのプロトン性溶媒の純粋な溶媒または混合物の添加であってよい。
【００４０】
ＤＯＴＡＰ塩化物変態の結晶化は、具体的には調製した溶液を３０℃以下に徐々に冷却することにより一般に達成される。結晶の形成は自発的に、または対応するＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態を用いた接種により行う。
【００４１】
種々のＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態は別の結晶変態に転化することができる。転化は単離した結晶変態を高温で熱処理することにより、または結晶化条件でそれらの懸濁液の撹拌を延長することにより達成することができる。
【００４２】
再結晶用の出発物質として非結晶質または部分的な結晶ＤＯＴＡＰ塩化物を使用することは、記載した方法により、これまで達成されなかった純度とともにこれまで達成されなかった安定性を備えた本質的な結晶ＤＯＴＡＰ塩化物をもたらす。
【００４３】
結晶ＤＯＴＡＰ塩化物が上記条件下において固体形態で優れた安定性を有し、実質的に制限されない時間に対して一定で、非常に良好な品質を有することから、本発明は結晶ＤＯＴＡＰ塩化物の医薬製剤の製造への使用に関する。
【００４４】
さらに、鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物はラセミ化合物、特に、例えばリン脂質、コレステロール等のキラル化合物との組み合わせとは異なる物理的性質を有する。
【００４５】
鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物について見出された新規な特性は、単独または適切なリン脂質、コレステロールおよびそれらの誘導体との組み合わせにより有利に利用することができ、従来の形態と比較して、一方で緻密に充填した脂質を示し、他方でより単一の構造を有する、新規なリポソーム品位を提供する。このように、純粋な鏡像異性体から調製したリポソームは、ラセミ体のＤＯＴＡＰ塩化物を含有するリポソームに比べ５℃高い主相の転移温度（transition temperature）を示す。これは充填密度の測定である。したがって、鏡像異性体のＤＯＴＡＰ塩化物を含有するリポソームはそれらに組み込まれた化合物の漏出も低減した。
【００４６】
薬学的に活性な化合物を装填したリポソームは、ヒトまたは動物の体の代謝との相互作用において、活性化合物を徐々に放出する結果となる。具体的には、高感度な活性化合物をより特異的な方法により、医薬の作用が望まれる臓器の所望の部位に有利に移送することができる。
【００４７】
ＤＯＴＡＰ塩化物の鏡像異性体はまた、具体的なキラルな脂質、例えばリン脂質、コレステロールおよびそれらの誘導体との組み合わせにおいて、細胞株の特異性の異なるトランスフェクション特性を示す。
【００４８】
これらの新規なリポソームの調製について、当業者がある新規な特性を有するリポソームを調製するためにＤＯＴＡＰ塩化物の形態またはある混合比を具体的に選択することは可能である。
【００４９】
したがって、本発明はさらにクレームされたＤＯＴＡＰ塩化物の形態を使用することから得られる医薬組成物に関する。このタイプの医薬組成物は、他の医薬活性化合物および医薬製造において普通に使用される公知の補助剤、並びに１種または２種以上の溶媒とともに（２Ｒ，Ｓ）−、（２Ｓ）−および（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の結晶変態を含有することができる。
【００５０】
これらの医薬組成物は、例えば、リポソーム、リポプレックス、マイクロエマルジョンおよびナノ粒子の形態であってよく、および例えばぺプチド、ヌクレオチド、ワクチンまたは細胞増殖抑制剤の群からの活性化合物を含有してもよい。
【００５１】
本明細書の記載は当業者が本発明を包括的に使用するのを可能にする。さらに、以下の例はより良い理解および本発明の可能な変形例を提供する。したがって、これらの例はいかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【００５２】
以下の例において述べたすべての温度は摂氏温度を示す。特に記載しなければ、含量データは重量％を意味する。
【実施例】
【００５３】
例１
安定性
結晶ＤＯＴＡＰ塩化物の安定性を判定するために、該物質を２５℃および相対湿度６０％において空気を排除して対照試料とともに貯蔵する。ＤＯＴＡＰ塩化物の残存量を定期的に測定し、初期値に対する比較を示す。
【００５４】
ＤＯＴＡＰ塩化物の純度および含有量はＨＰＬＣにより測定する。タイプ１について、以下の値が得られる。安定性の判定は任意の所望の時間において繰り返すことができる。表１に示す値は再現可能である。
【００５５】
【表１】
2008521757.tif 000003
【００５６】
例２
［粉末Ｘ線ダイアグラム］
結晶ＤＯＴＡＰ塩化物の構造的特性（結晶変態）の評価のため、これらの物質の粉末Ｘ線ダイアグラム（回折スペクトル）を記録する。結晶ＤＯＴＡＰ塩化物は脂質に対して比較的良好な解像度を有する中等度に鋭いバンドを示す。スペクトルは高い結晶含量を示す。偏光顕微鏡下において非結晶質の分画は認められない。
【００５７】
スペクトルの例を図１（タイプＩ）、図２（タイプＩＩ）、図３（タイプＩＩＩ）、図４（タイプＩＶ）に示す。比較のために、商業的に入手可能なスペクトルである、非結晶質の試料のスペクトルを図５（非結晶質）に示す。
【００５８】
表２は、ラセミ体および鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の種々の結晶変態に対する選択された２θ値を挙げる。
【表２】
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【００５９】
例３
主相転移温度
示差走査熱量測定法（differential scanning caliometry：ＤＳＣ）による測定を、水中で多重膜リポソームにおいて実施する。リポソームはラセミ体または鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の計算された量から薄膜法により調製する。ここで、脂質濃度はそれぞれ０．１ｇ／ｍｌである。これらの分散の適当な量をシール可能なアルミニウムるつぼ中に導入し、２０４Ｐｈｏｅｎｉｘ熱量計（Ｎｅｔｚｓｃｈ，Ｓｅｌｂ，ドイツ）を用いて測定する。それぞれの場合において、３つの連続した加熱／冷却を−５０℃〜＋２０℃において１℃／分で行う。
【００６０】
ＤＯＴＡＰ塩化物の３つの変異体のすべてについて０℃以下の相転移温度を認める。冷却サイクルに対し、これはそれぞれにおいて−２３℃から−２４℃である。ラセミ体および鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物の間の違いは、加熱サイクルにおいてそれぞれ明らかである。（２Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物および（２Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物の両方が、−１２．５℃付近で吸熱相転移を示し、一方、ラセミ化合物に対する相転移は−１７．５℃である（図６参照）。
【００６１】
例４
ＣＯＳ−７細胞におけるトランスフェクション特性
ラセミ体および鏡像異性体の純粋なＤＯＴＡＰ塩化物ならびにラセミ体のＤＯＴＡＰメチル硫酸塩を、それぞれ同量のコレステロールを含むトランスフェクション媒体中に分散させ、超音波処理する。リポソームおよびＧＦＰプラスミド溶液を混合し、１５分間インキュベートし、６ウェル当りの量：２μｇのプラスミド／８μｇの脂質とする。５時間インキュベートした後、３７℃／５％ＣＯ２での吸引により細胞から上清を除去し、２ｍｌの新鮮な媒体を加え、混合物をさらに２０時間インキュベートする。後処理をした後のＦＡＣＳ分析は、すべてのリポプレックスについて十分なトランスフェクションを示す。個々の脂質混合物についてのトランスフェクション速度の間に顕著な違いのあることが明らかである：
（Ｒ）−ＤＯＴＡＰ塩化物／コレステロール複合体：            ３２．４％
（Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物／コレステロール複合体：            １１．０％
（Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰ塩化物／コレステロール複合体：        ２５．９％
（Ｒ，Ｓ）−ＤＯＴＡＰメチル硫酸塩／コレステロール複合体：  ２０．２％
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】回折スペクトルの一例（タイプＩ）を示す。
【図２】回折スペクトルの一例（タイプＩＩ）を示す。
【図３】回折スペクトルの一例（タイプＩＩＩ）を示す。
【図４】回折スペクトルの一例（タイプＩＶ）を示す。
【図５】非結晶質の試料の回折スペクトルを示す。
【図６】ＤＯＴＡＰ塩化物の３つの変異体の主相転移温度を示す。
【図７】回折スペクトルの一例（タイプＩＶ）を示す。
【図８】非結晶質の試料の回折スペクトルを示す。
【図９】ＤＯＴＡＰ塩化物の３つの変異体の主相転移温度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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