(57)【要約】【課題】【解決手段】  開示の内容は、哺乳動物の炎症性疾患を治療し、哺乳動物における腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生を阻害する薬剤の製造において、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む製剤を使用することである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生を阻害することによって、哺乳動物における炎症性疾患を治療する薬剤の製造において、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具えることを特徴とする製剤の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記炎症性疾患が、全身性疾患であることを特徴とする製剤の使用。
【請求項３】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記炎症性疾患が、関節リウマチであることを特徴とする製剤の使用。
【請求項４】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記製剤が、哺乳動物の血液循環に投与されることを特徴とする製剤の使用。
【請求項５】
請求項４に記載の製剤の使用において、前記製剤が、静脈内投与されることを特徴とする製剤の使用。
【請求項６】
請求項４に記載の製剤の使用において、ｓｉＲＮＡが、血液の白血球に送達されることを特徴とする製剤の使用。
【請求項７】
請求項６に記載の製剤の使用において、前記白血球が、単核白血球であることを特徴とする製剤の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記製剤の投与が、前記哺乳動物の前記血液循環におけるＴＮＦ−αのレベルを低下させることを特徴とする製剤の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする製剤の使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記製剤が、送達促進ペプチドを更に含むことを特徴とする製剤の使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の製剤の使用において、前記ペプチドが、
ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）；
ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）；
ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）；
ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）；
ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）；
ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）；
ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）；
ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）；
ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）；
ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）；及び
ＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。  
【請求項１２】
請求項１に記載の製剤の使用において、前記ｄｓＲＮＡが、
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；
ＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；
ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；  
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
ＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；
ＡＧＧＣＧＧＵＧＣＵＵＧＵＵＣＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；
ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＵＣＵＵＣＵＧＣＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；
ＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；
ＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡＧＣＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；
ＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；
ＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）；
ＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）；
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）；
ＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）；
ＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）；
ＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）；
ＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）；
ＧＣＡＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）；
ＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）；
ＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）；
ＣＣＡＧＡＡＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）；
ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）；
ＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）；
ＣＣＡＧＡＵＧＵＵＵＣＣＡＧＡＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）；
ＣＵＡＵＵＵＡＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）；
ＵＣＵＡＡＡＣＡＡＵＧＣＵＧＡＵＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）；及び
ＧＡＣＣＡＡＣＵＧＵＣＡＣＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。
【請求項１３】
請求項７に記載の製剤の使用において、前記ｄｓＲＮＡが、
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；  
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；及び
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。
【請求項１４】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を具え、前記ｄｓＲＮＡが、前記哺乳動物の細胞における腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を阻害することができることを特徴とする医薬製剤。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製剤において、前記製剤が、送達促進ペプチドを更に具えることを特徴とする製剤。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製剤において、前記ペプチドが、
ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）；
ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）；
ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）；
ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）；
ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）；
ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）；
ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）；
ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）；
ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）；
ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）及び
ＹＫＶＬＫＱ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を具えることを特徴とする製剤。
【請求項１７】
請求項１４に記載の製剤において、前記ｄｓＲＮＡが、
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；
ＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；
ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；  
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
ＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；
ＡＧＧＣＧＧＵＧＣＵＵＧＵＵＣＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；
ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＵＣＵＵＣＵＧＣＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；
ＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；
ＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡＧＣＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；
ＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；
ＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）；
ＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）；
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）；
ＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）；
ＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）；
ＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）；
ＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）；
ＧＣＡＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）；
ＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）；
ＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）；
ＣＣＡＧＡＡＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）；
ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）；
ＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）；
ＣＣＡＧＡＵＧＵＵＵＣＣＡＧＡＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）；
ＣＵＡＵＵＵＡＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）；
ＵＣＵＡＡＡＣＡＡＵＧＣＵＧＡＵＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）；及び
ＧＡＣＣＡＡＣＵＧＵＣＡＣＵＣＡＵＵ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を具えることを特徴とする製剤。
【請求項１８】
請求項１７に記載の製剤において、前記ｄｓＲＮＡが、
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；  
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；  
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；及び
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を具えることを特徴とする製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞に送達する方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、標的遺伝子の発現を変更して、細胞の疾患状態又は疾患可能性等の表現型を改変するために、二本鎖ポリヌクレオチドを細胞に送達する手順及び調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の主な役割は、様々な疾患につながる炎症過程の開始及び／又は持続の際に特定され、又は、その開始及び／又は持続に関わっている。これらの疾患には、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病（ＣＤ）、乾癬、強直性脊椎炎、スティル病、多発性筋炎、皮膚筋炎（ｄｅｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、及び、（ベーチェット病及びヴェグナー肉芽腫症を含む）血管炎が挙げられる（Ｌｏｒｅｎｚ  ａｎｄ  Ｋａｌｄｅｎ（２００２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ１７−２４）。脂肪組織によるＴＮＦ−αの産生は、糖尿病及び肥満にも関わっている（Ｒｕａｎ  ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ（２００３）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．１４：４４７−５５）。
【０００３】
（メトトレキサートを含む）確立された療法の限界によって、代替療法の治療標的としての一部の炎症性メディエーターが特定されることとなった。この関連から、モノクローナル抗体、サイトカイン受容体−ヒトＩｇ構築物（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）及び組み換えヒトタンパク質を含む、新規の治療剤が開発され、現在テスト中である。この分野の疾患を治療するための有効な治療方法に対する需要にはまだ応じられていないままである。
【０００４】
エンドトキシン、腫瘍細胞、（ＨＩＶを含む）数種のウイルス、他のサイトカイン、様々なストレス関連の反応を含む、ＴＮＦ−αの産生を誘導する様々な刺激が知られている。クローン病患者治療用のレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）のラベリングに支援を提供するとして、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した非臨床試験のための動物モデルが開発されている。マウスモデル（Ｔｇ１９７、Ｔｇ２１１、及びＴｇ５４５３マウス）は、ヒトＴＮＦ−αを構造的に発現するトランスジェニックマウスの開発に由来する（Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ等（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ４６：８６−９７）。幾つかの他の抗ＴＮＦ−α抗体療法が、成功裡にこの動物モデルに適用され、効力を評価し、有効性を証明した。（ＨＵＭＩＲＡＴＭ，Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ，Ａｄａｌｉｍｕｎａｂ，Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ，Ａｂｇｅｎｉｘ  ＡＢＸ１０１３１）。
【０００５】
動物細胞及び植物細胞に核酸を送達することは、長い間、分子生物学の研究開発の重要な目的であった。遺伝子療法、アンチセンス療法及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）療法の分野における最近の開発によって、核酸を細胞に導入するより効率的な手段を開発する需要が生まれた。
【０００６】
多様な配列のプラスミドや他の核酸「ベクター」が、大きいポリヌクレオチド分子を細胞に送達するために開発されてきた。通常、これらのベクターは、標的細胞を変化させて科学的利益、又は治療的利益のある遺伝子を発現させる目的で、インタクトな遺伝子を含む大きいＤＮＡ分子を組み込む。
【０００７】
外因性核酸が人工的に細胞に送達される過程は、一般的に、トランスフェクションと呼ばれる。様々な技術と物質を用いて、外因性の機能的核酸を取り込むよう細胞をトランスフェクトすることができる。最も多用されるトランスフェクション方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションと、エレクトロポレーションとである。外因性ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を送達するために、ウイルス媒介の形質導入、カチオン脂質又はリポソーム送達、及び、（例えば、界面活性剤、マイクロインジェクション、又はパーティクルガンを用いて）機械的又は生物化学的な膜破壊／貫通を標的とする多数の方法を含む、細胞に形質導入する様々な他の方法が開発されてきた。
【０００８】
ＲＮＡ干渉は、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の一部の配列において同族である二本鎖ポリヌクレオチド、通常はｄｓＲＮＡによって開始される、細胞における配列特異的な転写後レベルでの遺伝子サイレンシングの過程である。適切なｄｓＲＮＡを細胞に導入すると、内因性、同族のｍＲＮＡ（すなわち、導入されたｄｓＲＮＡと実質的な配列ＩＤを共有するｍＲＮＡ）を破壊する。ｄｓＲＮＡ分子は、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ族ヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  ｆａｍｉｌｙ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）によって、長さ１９から２３ヌクレオチド（ｎｔ）の短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）に切断される。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体又は「ＲＩＳＣ］として知られる多成分ヌクレアーゼ複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡへの同族性を通してｍＲＮＡ基質を特定し、標的ｍＲＮＡに結合して破壊することによって、遺伝子発現のサイレンシングを達成する。
【０００９】
ＲＮＡ干渉は、植物細胞及び動物細胞において特異的に遺伝子発現を変更する有望な技術として浮上しており、内因性遺伝子発現の変更による治療に反応しやすい広範な疾患及び不調を治療する有益な手段を提供すると期待されている。
【００１０】
当技術分野においては、特に、核酸を細胞に送達する既存の技術が、非効率及び／又は送達試薬の毒性の高さによる限界があるという事実を受けて、ｓｉＲＮＡ及び他の小さい阻害核酸（ｓｉＮＡ）を細胞に送達するためのより良い手段及び方法に対する長年にわたる需要がある。標的細胞の表現型又は疾患状態を改変するように遺伝子発現の調節を媒介するために、有効量、活性・持続的な状態で、且つ、毒性のない送達ビヒクルを用いて、ｓｉＮＡを選択した細胞、組織又はコンパートメントに送達する方法及び製剤の向上に対する関連需要がある。
【００１１】
本発明の概要
本発明の一態様は、哺乳動物の炎症性疾患を治療し、哺乳動物の腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の産生を阻害する薬剤の製造に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む製剤を使用することである。好ましくは、炎症性疾患は、全身性疾患である。より好ましくは、炎症性疾患は、関節リウマチである。本発明の実施形態においては、製剤は、哺乳動物の血液循環に、好ましくは静脈投与によって投与される。別の実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、白血球、好ましくは単核白血球に送達される。別の実施形態においては、製剤の投与により、哺乳動物の血液循環におけるＴＮＦ−αが低下する。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【００１２】
本発明の別の態様は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、哺乳動物の炎症性疾患を治療する医薬製剤である。この態様では、ｄｓＲＮＡは、哺乳動物の細胞における腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を変更することができる。好ましい実施形態においては、ペプチドは：
ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）；
ＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）；
ＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）；
ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）；
ＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）；
ＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）；
ＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）；
ＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）；
ＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）；
ＶＹＶＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）；及び
ＹＫＶＬＫＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）；
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。関連する好ましい実施形態においては、ｄｓＲＮＡは：
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；
ＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；
ＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
ＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；
ＡＧＧＣＧＧＵＧＣＵＵＧＵＵＣＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；
ＣＣＡＣＣＡＣＧＣＵＣＵＵＣＵＧＣＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；
ＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；
ＵＧＡＣＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；
ＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；
ＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡＧＣＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；
ＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；
ＣＣＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）；
ＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）；
ＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）；
ＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＣＡＵＣＵＡＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）；
ＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）；
ＧＧＵＡＵＧＡＧＣＣＣＡＵＣＵＡＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）；
ＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）；
ＧＡＧＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）；
ＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）；
ＧＣＡＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）；
ＧＧＵＣＵＡＣＵＵＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）；
ＵＧＧＧＡＵＣＡＵＵＧＣＣＣＵＧＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）；
ＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）；
ＣＣＡＧＡＡＵＧＣＵＧＣＡＧＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）；
ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）；
ＧＡＡＧＡＣＣＵＣＡＣＣＵＡＧＡＡＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）；
ＣＣＡＧＡＵＧＵＵＵＣＣＡＧＡＣＵＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）；
ＣＵＡＵＵＵＡＵＧＵＵＵＧＣＡＣＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）；
ＵＣＵＡＡＡＣＡＡＵＧＣＵＧＡＵＵＵＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）；及び
ＧＡＣＣＡＡＣＵＧＵＣＡＣＵＣＡＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含む。最も好ましくは、ｄｓＲＮＡは：
ＡＡＵＣＧＧＣＣＣＧＡＣＵＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；  
ＡＡＵＧＧＣＧＵＧＧＡＧＣＵＧＡＧＡＧＡＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；
ＡＡＣＣＵＣＣＵＣＵＣＵＧＣＣＡＵＣＡＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；
ＡＡＣＵＧＡＡＡＧＣＡＵＧＡＵＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；
ＡＡＵＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＣＣＧＡＧＵＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；
ＡＡＧＧＧＵＧＡＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；
ＡＡＵＣＡＧＣＣＧＣＡＵＣＧＣＣＧＵＣＵＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；
ＡＡＣＣＣＡＵＧＵＧＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；
ＡＡＧＣＵＣＣＡＧＵＧＧＣＵＧＡＡＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；
ＡＡＧＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＵＵＣＵＣＧＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；
ＡＡＧＧＧＡＣＣＵＣＵＣＵＣＵＡＡＵＣＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；
ＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；
ＡＡＵＣＣＵＣＡＧＣＣＵＣＵＵＣＵＣＣＵＵ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；
ＡＡＣＣＡＡＵＧＣＣＣＵＣＣＵＧＧＣＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；
ＣＵＧＡＵＵＡＡＧＵＵＧＵＣＵＡＡＡＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；
ＣＣＧＡＣＵＣＡＧＣＧＣＵＧＡＧＡＵＣＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；
ＣＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；
ＡＡＧＣＣＵＧＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；及び
ＵＡＧＧＧＵＣＧＧＡＡＣＣＣＡＡＧＣＵＵＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含む。
【００１３】
本発明の例示的態様の記載
本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと組み合わせて、短干渉核酸（ｓｉＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）又はその前駆体を用いる新規の組成物及び方法を提供することによって、これらの需要を満足し、更なる目的及び利点を実現させる。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ｓｉＮＡ及びその前駆体を含むポリヌクレオチドの、細胞内送達又は取り込みを促進する能力のために選択した天然又は人工のポリペプチドである。
【００１４】
本発明の新規組成物の範囲内で、ｓｉＮＡを、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに、混合、複合、又は共役して、標的細胞を裸のｓｉＮＡ（すなわち、送達促進ポリペプチドが存在しないｓｉＮＡ）に接触させる結果として生じる送達と比較して、ｓｉＮＡの細胞内送達を促進する組成物を形成してもよい。
【００１５】
エンハンサー・ペプチド
本明細書では、「細胞」という用語は、通常の生物学的意味で使用され、完全な多細胞生物、例えば、詳細にはヒトを指すものではない。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物、並びに、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、犬及びネコなどの哺乳動物に存在することができる。細胞は、原核細胞（例えば、細菌細胞）であってもよく、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞又は植物細胞）であってもよい。細胞は、体細胞系又は生殖細胞系、全脳細胞又は多能性細胞、分裂性又は非分裂性であってよい。細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来してもよく、それらを含んでもよい。
【００１６】
「ベクター」は、所望の核酸を送達するのに用いられる、任意の核酸系及び／又はウイルス系手法を意味する。
【００１７】
「含む」は、「含む」という語に続くものは全て含めることを意味するが、それらに限定されない。従って、「含む」と言う用語を使用することによって、リストした要素は必要又は不可欠であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを表す。「から成る」は、「から成る」という句に続くものは全て含めることを意味し、それらに限定される。従って、「から成る」と言う句は、リストした要素は必要又は不可欠であり、且つ、その他の要素は存在しないことを表す。「基本的に〜から成る」は、その句の後にリストされたいずれの要素も含むことを意味し、且つ、リストされた要素の開示で明記された活性若しくは働きに干渉しない、又は活性若しくは働きに貢献する他の要素に限定される。従って、句「基本的に〜から成る」は、リストした要素は必要で不可欠であるが、他の要素は任意であり、それらの要素がリストした要素の活性又は働きに影響を与えるか否かに応じて、存在してもしなくてもよいことを表す。  
【００１８】
本明細書で用いられる「生物分解性」という用語は、例えば、酵素分解や化学分解等の、生物系における分解を指す。
【００１９】
本明細書で用いられる「生物学的に活性な分子」という用語は、系の生物学的反応を引き出す又は修飾することができる化合物又は分子を指す。単独で、又は本発明によって検討されている他の分子との組み合わせで、生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の例には、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス薬、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、小分子、ビタミン、補助因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖（ｔｒｉｐｌｅｘ）形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ（ｄｅｃｏｙ）及びそれらの類縁体等の、治療的に活性な分子が含まれるが、これらに限定されない。本発明による生物学的に活性な分子には、他の生物学的に活性な分子、例えば、脂質、並びに、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテル等のポリマーなどの薬物動態及び／又は薬力学的効果を調節できる分子も含まれる。
【００２０】
本明細書で用いられる「リン脂質」という用語は、リン基を少なくとも１つ含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リンを含む基と、飽和又は不飽和アルキル基を含むことができ、アルキル基は任意でＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、置換アリール基、又は非置換アリール基で置換することができる。
【００２１】
「配位子」という用語は、受容体等の他の化合物と直接的又は間接的に相互作用できる、薬物、ペプチド、ホルモン又は神経伝達物質等の化合物又は分子を指す。配位子と相互作用する受容体は、細胞の表面に存在してもよいし、細胞内受容体であってもよい。配位子と受容体の相互作用は、結果として生化学反応を生じる場合もあり、単に物理的相互作用若しくは物理的関係である場合もある。
【００２２】
「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／又はリン酸置換を含む、１つ又はそれ以上のヌクレオチド単位に代わって核酸鎖に組み込むことができ、残留塩基が酵素活性を呈することを可能にする、任意の基又は化合物を意味する。その基又は化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミン等の、広く知られているヌクレオチド塩基を含まず、従って、１’位に塩基を持たないという点で、脱塩基である。
【００２３】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、天然の塩基（標準）と、当技術分野で公知の修飾塩基とを含むとして当技術分野においては認識されている。このような塩基は、一般的にヌクレオチド糖部分の１’位にある。ヌクレオチドは、一般的に塩基、糖、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基部分で、修飾されていなくてもよく、修飾されていてもよい。（ヌクレオチド類縁体、修飾ヌクレオチド、非天然産ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも呼ばれる。例えば、本明細書に参照により組み込む、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，ｓｕｐｒａ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，ｓｕｐｒａを参照）。Ｌｉｍｂａｃｈ等，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３によってまとめられた、当技術分野で公知の修飾核酸塩基の例が幾つかある。核酸分子に導入することができる塩基修飾の例には、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、擬似ウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン若しくは６−アルキルピリミジン（例、６−メチルウリジン）、プロピン、及びその他が含まれるが、これらに限定されない（Ｂｕｒｇｉｎ等，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ，ｓｕｐｒａ）。本態様における「修飾塩基」は、アデニン、グアシン及びウラシル以外の１’位のヌクレオチド塩基、又はそれらの等価物を意味する。
【００２４】
「標的部位」は、アンチセンス領域内に標的配列に相補的な配列を含むｓｉＮＡ構築物が媒介する切断の「標的となる」標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
【００２５】
「検知可能なレベルの切断」は、標的ＲＮＡの無作為な分解によって生産されるＲＮＡのバックグラウンドを超えた、切断産物を見分けるのに十分な程度までの標的ＲＮＡの切断（及び切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１％から５％の切断産物を生産すると、大抵の検知方法に対するバックグラウンド以上の検知を行うのに十分である。
【００２６】
「生物系」は、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウイルス、又はその他の生物源を含むが、それらに限定されない生物源由来の純粋又は純粋でない形態の物質を意味する。生物系は、ＲＮＡｉ活性に必要な構成要素を含む。「生物系」という用語は、例えば、細胞、組織若しくは生物、又は、それらの抽出物を含む。生物系という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定で用いることができる再構成されたＲＮＡｉ系も含む。
【００２７】
本明細書で使用される「生物分解性リンカー」という用語は、ある分子を別の分子に結び付ける、例えば、生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖に結び付ける生物分解性リンカーとして設計された核酸又は非核酸系のリンカー分子を指す。生物分解性リンカーは、その安定性を、特定の組織又は細胞型への送達等の特定の目的に合わせて調節できるように設計される。核酸系生物分解性リンカー分子の安定性は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクリオチドと、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び他の２’−修飾、又は塩基修飾のヌクレオチド等、の化学修飾されたヌクレオチドとの組み合わせなどの様々な化学的性質を用いて調節することができる。生物分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体、又は、例えば、長さが、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、等のより長い核酸分子であってもよく、例えば、ホスホロアミデート又はホスホジエステル結合等のリン系結合を伴う単一のヌクレオチドを含んでもよい。生物分解性核酸リンカー分子は、核酸のバックボーン、核酸糖、又は核酸塩基修飾を含んでもよい。
【００２８】
本発明の一実施形態においては、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ヒストンタンパク質であってもよく、ポリペプチド又はペプチドのフラグメント、誘導体、類縁体若しくはそれらの共役体であってもよい。これらの実施形態の範囲においては、ｓｉＮＡは、１つ又はそれ以上の全長ヒストンタンパク質、又は、ヒストンＨＩ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３若しくはヒストンＨ４の１つ又はそれ以上等のヒストンタンパク質の一部の配列に少なくとも部分的に対応しているポリペプチド、又は、ヒストンタンパク質の少なくとも一部の配列、通常は天然ヒストンタンパク質の少なくとも５から１０若しくは１０から２０の隣接する残基を含む１つ又はそれ以上のポリペプチドフラグメント若しくはその誘導体と、混合、複合又は共役している。より詳細な実施形態においては、ｓｉＲＮＡ／ヒストンの混合物、複合体又は共役体は、両親媒性化合物を実質的に含まない。他の詳細な実施形態においては、ヒストンタンパク質又はポリペプチドと混合、複合又は共役しているｓｉＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、例えば、３０未満のヌクレオチドを有する二本鎖ＲＮＡを含む。これは、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。例示の実施形態においては、ヒストンポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、後述のＰＮ７３と表すポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって例示されているように、ヒストンＨ２Ｂのフラグメントを含む。更に追加の詳細な実施形態においては、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ペグ化して、特にｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与のコンテキストにおいて、安定性及び／又は有効性を向上させてもよい。
【００２９】
本発明の更なる実施形態の範囲において、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを、両親媒性アミノ酸配列を含むように選択してもよく、合理的に設計してもよい。例えば、疎水性配列ドメイン又はモチーフを形成する複数の非極性又は疎水性のアミノ酸残基を含む、有用なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択して、荷電配列ドメイン又はモチーフを形成する複数の荷電アミノ酸残基に結合させて、両親媒性ペプチドを生み出してもよい。
【００３０】
他の実施形態においては、タンパク質導入ドメイン又はモチーフと、融合ペプチドドメイン又はモチーフとを含むポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを選択する。タンパク質導入ドメインは、細胞膜に入り、好ましくは細胞膜を通過することができるペプチド配列である。融合ペプチドは、例えば、原形質膜や、エンドソームを取り囲む膜などの脂質膜を不安定にするペプチドであり、低いｐＨで促進される。例示の融合ドメイン又はモチーフは、多様なウイルス融合タンパク質、及び、例えば、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）などの他のタンパク質において見出される。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計するために、核酸が原形質膜を通って細胞に入ることを容易にするモチーフとしてタンパク質導入ドメインを用いる。一実施形態においては、輸送された核酸は、エンドソームの中に包まれる。エンドソームの内部はｐＨが低いので、融合ペプチドモチーフがエンドソームの膜を不安定にする。エンドソーム膜の不安定化及び崩壊によって、ｓｉＮＡの細胞質への放出が可能になり、細胞質でｓｉＮＡは、ＲＩＳＣ複合体と結びついて、その標的ｍＲＮＡに向けられることができる。
【００３２】
本発明の範囲の例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、次のペプチドから選択することができる：
ＷＷＥＴＷＫＰＦＱＣＭＣＭＲＮＦＳＴＲＱＡＲＲＮＨＲＲＲＨＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）；ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８），ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９），ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０），ＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１），Ｐｏｌｙ  Ｌｙｓ−Ｔｒｐ，４：１，ＭＷ２０，０００−５０，０００；及びＰｏｌｙ  Ｏｒｎ−Ｔｒｐ，４：１，ＭＷ２０，０００−５０，０００。
本明細書の組成物及び方法の範囲で有用な追加のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、メリチンタンパク質配列の全て又は一部を含む。
【００３３】
更に、他の例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを、以下の例で明らかにする。これらのペプチドの任意の１つ又は任意の組み合わせを選択又は組み合わせて、本発明の方法及び組成物の範囲内でｓｉＮＡの細胞内送達を誘導又は容易にする有効なポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド試薬を生み出してもよい。
【００３４】
本発明のより詳細な態様においては、ｓｉＲＮＡと、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとを含む混合物、複合体又は共役体は、任意で、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）等のカチオン脂質と組み合わせてもよい（例えば、混合してもよく、複合してもよい）。このコンテキストにおいて、本明細書で予想外の開示となるのは、ｓｉＲＮＡ単独と複合又は共役されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングを媒介するのに十分なｓｉＮＡの送達を達成することである。しかしながら、本明細書の更なる予想外の開示は、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体又は共役体は、リポフェクチン等のカチオン脂質と混合又は複合すると、ｓｉＮＡ送達及び遺伝子サイレンシングを媒介する活性がより大きくなることである。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ及びカチオン脂質から構成されるこれらの組成物を作るためには、ｓｉＲＮＡ及びペプチドを、細胞培養培地等の適切な培地で最初に混合し、その後、カチオン脂質をその混合物に加えて、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン脂質組成物を形成する。任意で、ペプチド及びカチオン脂質を、細胞培養培地等の適切な培地で最初に混合し、そこに、後で、ｓｉＲＮＡを加えて、ｓｉＲＮＡ／送達ペプチド／カチオン脂質組成物を形成してもよい。
【００３５】
本発明のこれらの態様の範囲の有用なカチオン脂質の例には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−３（トリメチルアンモニウム）プロパン、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｌ−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔａｔｅ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド、テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン、テトラメチルテトラオレイルスペルミン、テトラメチルテトララウリルスペルミン、テトラメチルテトラミリスチルスペルミン、テトラメチルジオレイルスペルミン、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニウム）プロパン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、又はＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）が挙げられる。多価カチオン脂質は、リポスペルミン、具体的には、限定はされないが、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ−アセテート）及びＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシスペルミル）−プロピル−アミド（ｌ，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−２−（６ｃａｒｂｏｘｙ  ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ−ａｍｉｄ）、及び、ＴＭＴＰＳ（テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン）、ＴＭＴＯＳ（テトラメチルテトラオレイルスペルミン）、ＴＭＴＬＳ（テトラメチルテトララウリルスペルミン）、ＴＭＴＭＳ（テトラメチルテトラミリスチルスペルミン）、並びにＴＭＤＯＳ（テトラメチルジオレイルスペルミン）ＤＯＧＳ（ジオクタデシル−アミドグリシルスペルミン（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標））を含むジ−及びテトラ−アルキル−テトラ−メチルスペルミンである。他の有用なカチオン脂質については、例えば、米国特許第６，７３３，７７７号、米国特許第６，３７６，２４８号、米国特許第５，７３６，３９２号、米国特許第５，６８６，９５８号、米国特許第５，３３４，７６１号、及び米国特許第５，４５９，１２７等に記載されている。  
【００３６】
カチオン脂質は、任意で、非カチオン脂質、特に、中性脂質、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＰｈＰＥ（ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン）又はコレステロール等の脂質と組み合わせてもよい。ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥを３：１（ｗ／ｗ）の割合で混合した物で構成したカチオン脂質、又は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを１：１（ｗ／ｗ）の割合で混合した物で構成したカチオン脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）が、一般的に、本発明の組成物をトランスフェクトするのに有用である。好ましいトランスフェクション用組成物は、より高度な真核細胞株の実質的なトランスフェクションを誘導する組成物である。
【００３７】
二本鎖ｓｉＲＮＡ分子
本明細書で使用される「非対称ヘアピン」という用語は、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができるループ部と、センス領域とを含む線形のｓｉＮＡ分子を意味する。ここで、センス領域は、アンチセンス領域より少ないがアンチセンス領域との塩基対に十分な相補的ヌクレオチドを有して、ループ部と二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成する程度のヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、Ｔ細胞内のＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１９から約２２（例えば、約１９，２０，２１又は２２）のヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約４から約８（例えば、約４，５，６，７又は８）のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域を相補する約３から約１８（例えば、約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８）のヌクレオチドを有するセンス領域とを含むことができる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾することができる５’末端リン酸基を含むこともできる。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、又は共役分子含むことができる。
【００３８】
本明細書で用いられている「非対称二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」は、センス領域と、アンチセンス領域とを含む２つの分かれた鎖を有するｓｉＮＡ分子を意味し、そこでは、センス領域は、アンチセンス領域より少ないがアンチセンス領域と塩基対になり、二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成するのに十分な相補的ヌクレオチドを有する。例えば、本発明の非対称二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）ｓｉＮＡ分子は、Ｔ細胞内のＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１９から約２２（例えば、約１９，２０，２１又は２２）のヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、アンチセンス領域を相補する約３から約１８（例えば、約３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７又は１８）のヌクレオチドを有するセンス領域とを含むことができる。
【００３９】
「遺伝子発現を調節する」とは、標的遺伝子の発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることを意味し、標的遺伝子がコードする、細胞に存在するｍＲＮＡレベル、ｍＲＮＡ翻訳、又は、タンパク質若しくはタンパク質のサブユニットの合成、のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを含むことができる。標的遺伝子がコードする１つ又はそれ以上のタンパク質又はタンパク質サブユニットの、存在、数量又は活性についても、遺伝子発現をアップレギュレートするか又はダウンレギュレートするかのモジュレーションを決定することができる。その結果、対象タンパク質又はサブユニットの発現、レベル又は活性は、モジュレーター（例えばｓｉＲＮＡ）が存在しない場合に観察されるより、多く又は少なくなる。例えば、「調節する」という用語は、「阻害する」を意味することもできるが、単語「ｍｏｄｕｌａｔｅ」の使用は、その定義に限定されない。
【００４０】
発現を「阻害する」、「ダウンレギュレートする」又は「低減する」は、遺伝子、１つ又はそれ以上のタンパク質、又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子の同等物のレベル、又は、標的遺伝子がコードする１つ又はそれ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性のレベルの発現を、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）が存在しない場合に観察されるより下に低減することを意味する。一実施形態においては、ｓｉＮＡ分子を用いての阻害、ダウンレギュレーション又は低減は、非活性又は弱められた分子が存在する場合に観察されるレベル以下である。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子を用いての阻害、ダウンレギュレーション又は低減は、例えば、スクランブル配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子が存在する場合に観察されるレベル以下である。別の実施形態においては、本発明の核酸分子を用いての阻害、ダウンレギュレーション又は低減は、その核酸分子が存在しない場合よりも存在する場合のほうが大きい。
【００４１】
遺伝子「サイレンシング」は、細胞の遺伝子発現の標的阻害を通して部分的又は完全な機能の喪失を指し、「ノックダウン」とも呼ばれる。状況と、取り組むべき生物学的問題に応じて、遺伝子発現を一部低減することが好ましい場合がある。或いは、遺伝子発現をできる限り低減するのが望ましい場合もある。サイレンシングの程度は、当技術分野で公知の方法で決定することができ、その方法の一部は、国際公開番号ＷＯ９９／３２６１９にまとめられている。アッセイに応じて、遺伝子発現の定量化によって、予防的方法及び治療的方法を含む、本発明の一実施形態で所望される様々な量の阻害の検知が可能になる。それによって、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベル若しくは活性という点で、治療の標的となる特定の疾患状態又は他の状態に関連するように、発現レベルを上げることを含めて、例えば、ベースライン（すなわち通常）又は他の対照群レベルの１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、９５％又は９９％以上に標的遺伝子発現をノックダウンすることが可能になる。
【００４２】
「標的遺伝子の発現を阻害する」という句は、本発明のｓｉＮＡの標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを開始する能力を指す。遺伝子サイレンシングの程度を調べるために、特定の構築物を発現する目的の生物又は培養中の細胞を、その構築物を発現しない対照試料と比較する。（構築物を発現しない）対照試料に１００％の相対値を割り当てる。対照群との相対的なテスト値が、約９０％、しばしば５０％、一の実施形態においては２５％〜０％のとき、標的遺伝子の発現の阻害が達成される。適切なアッセイには、当業者に公知の表現型アッセイだけでなく、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能等の当業者に公知の技術を用いるタンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルの試験が含まれる。
【００４３】
「対象」は、生物、組織又は細胞を意味し、移植細胞の対象、又はドナー若しくはレシピエントとしての生物と、又は、それ自体がｓｉＮＡ送達の対象である細胞とを含んでもよい。従って、「対象」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの器官、組織又は細胞対象を含む、生物、器官、組織又は細胞を指してもよく、それらに、本発明の核酸分子を投与することができ、本明細書に記載のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進することができる。例示の対象は、哺乳動物の個体又は細胞、例えば、ヒト患者又は細胞を含む。  
【００４４】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。
【００４５】
「リボヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボ−フラノース部分の２’位にヒドロキシ基を有するヌクレオチドを意味する。その用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製したＲＮＡ等の単離ＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって生産されたＲＮＡを含み、１つ又はそれ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換及び／又は改変による、天然産ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡを含む。このような改変は、例えば、ＲＮＡの１つ又はそれ以上のヌクレオチドで、ｓｉＮＡの端（単数又は複数）に、又は、内部に、非ヌクレオチド物質の追加を含んでもよい。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然産ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド等の、非標準ヌクレオチドを含んでもよい。これらの改変ＲＮＡは、類縁体、又は天然産ＲＮＡの類縁体と呼ぶことができる。
【００４６】
「高度に保存された配列領域」は、標的遺伝子の１つ又はそれ以上の領域のヌクレオチド配列が、ある世代から次の世代で、又は、ある生物系から次の生物系で、有意に変化しないことを意味する。
【００４７】
「センス領域」は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。更に、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むことができる。
【００４８】
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列への相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。更に、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意で、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を含むことができる。
【００４９】
「標的核酸」は、その発現又は活性を調節する任意の核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
【００５０】
「相補性」は、核酸が、従来のワトソンクリック型又は他の従来型ではない型によって、別の核酸配列と水素結合を形成することができることを意味する。本発明の核酸分子を参照すると、相補的配列を有する核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能が、ＲＮＡｉ活性等の進行を可能にするのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野では公知である（Ｔｕｒｎｅｒ等，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ等，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ等，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５等を参照）。相補性パーセントは、核酸分子内の、第２核酸配列との水素結合（例えば、ワトソンクリック塩基対）を形成できる隣接する残基のパーセンテージを表す。（例えば、第１オリゴヌクレオチドの総数１０個のヌクレオチドのうちの５，６，７，８，９，又は１０個のヌクレオチドが、１０個のヌクレオチドを有する第２核酸配列と塩基対になる場合は、それぞれ、５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，１００％の相補性を表す。）「完全に相補的」とは、核酸配列の隣接する残基が全て、第２核酸配列の同数の隣接する残基と水素結合することを意味する。
【００５１】
本明細書で使用されている用語「ユニバーサル塩基」は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と、それらの間での差異はほとんどなく、塩基対を形成するヌクレオチド塩基の類縁体を指す。ユニバーサル塩基の例には、当技術分野で公知のＣ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、及び、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール等のニトロアゾール誘導体が含まれるが、それらに限定されない（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）。
【００５２】
本明細書で使用されている「非環状ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素（Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４又はＣ５）のいずれかが、独立して、又はヌクレオチドに入っていない組み合わせである、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。
【００５３】
「脱塩基」は、１’位の塩基の代わりに、塩基を欠く、又は他の化学基を有する糖部分を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃ等，米国特許第５，９９８，２０３号を参照）。
【００５４】
「非修飾ヌクレオチド」は、ベータ−Ｄ−リボーフラノースの１’位の炭素に結合したアデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシル塩基の１つを意味する。
【００５５】
「修飾ヌクレオチド」は、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造の修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの例を、一般式ＩからＶＩＩ、及び／又は本明細書に記載の他の修飾によって示すが、それらに限定されない。
【００５６】
「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれた化学修飾を意味する（例えば、本明細書に参照により組み込まれたＡｄａｍｉｃ等，米国特許第５，９９８，２０３号を参照）。これらの末端の修飾により、核酸分子がエクソヌクレアーゼによって分解されることを防ぎ、細胞内の送達及び／又は局在化を支援する。キャップは、５’末端に存在してもよく（５’キャップ）、３’末端に存在してもよく（３’キャップ）、又はその両方の末端に存在してもよい。５’キャップの例には、グリセリル，インバーテッドデオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド，４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド（ａｃｙｃｌｉｃ３’，４’−ｓｅｃｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−インバーテッドヌクレオチド部分（３’−３’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）；３’−３’インバーテッド脱塩基部分（３’−３’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）；３’−２’−インバーテッドヌクレオチド部分（３’−２’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）；３’−２’−インバーテッド脱塩基部分（３’−２’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホラミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は、架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート部分が含まれるが、それらに限定されない。
【００５７】
３’キャップの例には、グリセリル，インバーテッドデオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド（ａｃｙｃｌｉｃ３’，４’−ｓｅｃｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’−５’−インバーテッドヌクレオチド部分（５’−５’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｉｅｔｙ）；５’−５’−インバーテッド脱塩基部分（５’−５’−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）；５’−ホスホラミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋の５’−ホスホラミデート，ホスホロチオエート及び／又はホスロジチオエート、架橋又は非架橋のメチルホスホネート及び５’−メルカプト部分が含まれるが、それらに限定されない（より詳細については、本明細書に参照により組み込んだＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｌｙｅｒ  １９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照）。
【００５８】
本発明のために記載した２’−修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」は、２’−ＮＨ２又は２’−０−−ＮＨ２を意味し、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。このような修飾基については、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等による米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ等よる米国特許第６，２４８，８７８号に記載されている。
【００５９】
ｓｉＮＡ分子は、カチオン脂質と複合する、リポソーム内に包み込む、又は、標的細胞若しくは組織に送達することができる。核酸又は核酸複合体は、バイオポリマー内に組み込んで、又は組み込まずに、注射、輸液ポンプ、又はステントを通して局所投与することができる。別の実施形態においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、共有結合によって、本発明のｓｉＮＡ化合物、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、又は、その両方に結合することができる。結合したＰＥＧは、任意の分子量を取ることができるが、約２０００から約５０００ダルトン（Ｄａ）の間であることが好ましい。
【００６０】
センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子によって、アンチセンス領域に結び付くことができる。
【００６１】
「インバーテッドリピート」は、センス要素及びアンセンス要素を含み、反復を転写すると、それらが二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができるよう位置されている核酸配列を指す。逆位反復は、反復の２つの要素間に、リンカー又は自己切断リボザイム等の非相同配列を任意で含んでもよい。逆位反復の要素は、二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分な長さを有する。通常、逆位反復の各要素は、長さ約１５から約１００ヌクレオチドであるが、長さ約２０から３０塩基ヌクレオチド、約２０から２５ヌクレオチド、例えば、長さ２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであることが好ましい。  
【００６２】
「核酸」は、デオキシリボ核酸又はリボ核酸、及び、一本鎖又は二本鎖の形態のそれらのポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類縁体、又は修飾されたバックボーンの残基若しくは結合を含む、合成、天然産、及び非天然産の基準核酸と類似の結合特性を有する、基準ヌクレオチドと類似の方法で代謝される核酸を包含する。このような類縁体の例には、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
「大きい二本鎖ＲＮＡ」は、約４０塩基対（ｂｐ）より大きいサイズ、例えば、１００ｂｐ、特に、３００ｂｐより大きいサイズを有する任意の二本鎖ＲＮＡを指す。大きいｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメント又はｍＲＮＡ全体を表してもよい。大きいｄｓＲＮＡの最大サイズは、本明細書では制限していない。二本鎖ＲＮＡは、リン酸糖バックボーン又はヌクレオチドを修飾している修飾塩基を含む。このような修飾には、窒素若しくは硫黄のヘテロ原子、又は当技術分野で公知の任意の他の修飾を含む。
【００６４】
二本鎖構造は、ヘアピン又はマイクロＲＮＡに対して生じるような自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成してもよく、２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖のアニーリングによって形成してもよい。
【００６５】
「重複」は、２つのＲＮＡフラグメントが、１本の鎖上で、複数のヌクレオチドが重複する配列を有するときを指す。この場合、重複する複数のヌクレオチド（ｎｔ）の数は、少なくて２から５ヌクレオチド、又は５から１０ヌクレオチド又はそれ以上である。
【００６６】
「１つ又はそれ以上のｄｓＲＮＡ」は、配列を基に、互いに異なるｄｓＲＮＡを指す。
【００６７】
「標的遺伝子又はｍＲＮＡ」は、目的の任意の遺伝子又はｍＲＮＡを指す。実際に、遺伝学又は配列決定によって特定された任意の遺伝子を標的としてよい。標的遺伝子又はｍＲＮＡは、発生遺伝子及び調節遺伝子を含み、代謝若しくは構造遺伝子、又は遺伝子がコードする酵素を含む。標的遺伝子は、表現型を調査中の細胞において発現させてもよいし、直接的又は間接的に表現型の特性に影響を与える方法で生物体において発現させてもよい。標的遺伝子は、内因性であっても外因性であってもよい。このような細胞には、配偶子、又は、不死化細胞株若しくは初代細胞培養で発生する任意の単利離細胞を含む、動物の成体、植物の成体、動物胚又は植物胚の体の、任意の細胞が含まれる。
【００６８】
例示の実施形態においては、本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混合、複合、又は共役された、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の小核酸分子を含む組成物を特徴とする。
【００６９】
本明細書で用いられる「短干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短干渉核酸分子」、「短干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学修飾された短干渉核酸分子」という用語は、例えば、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」を媒介することによって、又は配列特異的方法で遺伝子サイレンシングを行うことによって、遺伝子発現又はウイルスの複製を、阻害又はダウンレギュレートすることができる任意の核酸分子を指す。例示の実施形態の範囲では、ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、アンチセンス領域は、発現をダウンレギュレートする標的核酸分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は、その一部を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応する（すなわち、実質的に同じ配列である）ヌクレオチド配列を含む。  
【００７０】
「ｓｉＮＡ」は、短い長さの二本鎖核酸（又は任意で、その長い前駆体）である、例えばｓｉＲＮＡ等の小さい干渉核酸を意味し、標的細胞において容認できないほどの毒性はない。本発明の範囲内で有用なｓｉＮＡの長さは、一実施形態においては、約２１から２３ｂｐで最適となる。しかしながら、ｓｉＲＮＡを含めて、有用なｓｉＮＡの長さに特別な制限はない。例えば、ｓｉＮＡは、最初、前駆体の形態で細胞に与えることができる。前駆体の形態は、ｓｉＮＡの最終又は処理後の形態とは実質的に異なる。ｓｉＮＡの最終又は処理後の形態とは、送達時又は送達後に存在し、標的細胞に対して遺伝子サイレンシング活性を発揮するものである。例えば、ｓｉＮＡの前駆体の形態は前駆体配列要素を含み、前駆体配列要素は、送達時又は送達後に、処理、分解、改変、又は切断されて、細胞内で活性なｓｉＮＡを産し、遺伝子サイレンシングを媒介する。従って、一実施形態においては、本発明の範囲内での有用なｓｉＮＡは、例えば、約１００から２００の塩基対、５０から１００の塩基対、又は約５０未満の塩基対等の、前駆体の長さを有することになり、標的細胞内で活性を呈する処理されたｓｉＮＡを産することになる。他の実施形態においては、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＮＡ前駆体は、長さ約１０から４９ｂｐ、１５から３５ｂｐ、又は約２１から３０ｂｐである。
【００７１】
上述のように、本発明の一実施形態においては、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを使用して、ｓｉＮＡの大きい核酸前駆体を含む、従来のｓｉＮＡより大きい核酸分子の送達を容易にしている。例えば、本明細書の方法及び組成物を、所望のｓｉＮＡの「前駆体」である大きい核酸分子の送達を促進するために用いてもよく、その場合、前駆体アミノ酸は、標的細胞に送達前、送達中、又は送達後に、切断又は処理されて、標的細胞内で遺伝子発現を調節する活性なｓｉＮＡを形成する。例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリヌクレオチドを、３つ以上のループ構造と、自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を含むステム（ｓｔｅｍ）とを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドとして選択してもよく、その場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子のヌクレオチド配列、又はその一部に相補的な核酸配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応する核酸配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理されて、ＲＮＡｉを媒介することができる活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。
【００７２】
哺乳動物細胞において、３０塩基より長いｄｓＲＮＡは、通常、インターフェロンによって誘導された、ｄｓＲＮＡ依存キナーゼＰＫＲ及び２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（２’−５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を活性化することができる。活性化されたＰＫＲは、翻訳因子真核細胞開始因子２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化反応によって通常の翻訳を阻害し、２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（２’−５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）は、ＲＮａｓｅ  Ｌの活性によって非特異的ｍＲＮＡ分解を引き起こす。本発明のｓｉＮＡは、通常、３０塩基対未満、最もよく見られるのは、約１７から１９、１９から２１、又は２１から２３塩基対というように、サイズが小さい（特に前駆体でない形態）ことによって、インターフェロン応答の活性化を回避する。
【００７３】
長いｄｓＲＮＡの非特異的効果とは対照的に、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物系における選択的遺伝子サイレンシングを媒介する。ステム（ｓｔｅｍ）に短いループと１９から２７の塩基対とを有するヘアピンＲＮＡも、二本鎖ステム（ｓｔｅｍ）における配列と相同の遺伝子の発現を選択的にサイレンシング（抑制）する。哺乳動物細胞は、短ヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに転換して、選択的遺伝子サイレンシングを媒介する。
【００７４】
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）のアンチセンス鎖に相補的な領域の真ん中で起こる。２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）は、２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含むとき、最も活性であることが研究によって明らかになった。更に、ｓｉＲＮＡ鎖の一方又は両方を、２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換すると、ＲＮＡｉ活性を取り除くが、３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）での置換は、許容されると報告されている。
【００７５】
２つのヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１−ｍｅｒｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）の３’オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置き換えることは、ＲＮＡｉ活性に有害影響を与えないことが、研究によって明らかになった。ｓｉＲＮＡの各端で最大４ヌクレオチドまでデオキシリボヌクレオチドと交換することは、十分に許容されると報告されているが、デオキシリボヌクレオチドとの完全な置換は、ＲＮＡｉを不活性にする。
【００７６】
或いは、単一又は複数のｓｉＮＡをコードし、且つ標的細胞内での発現を指示するポリヌクレオチドベクターによって発現される単一又は複数の転写産物として、ｓｉＮＡを送達することができる。これらの実施形態において、標的細胞内で発現されるｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分は、例えば、１５から４９ｂｐ、１５から３５ｂｐ、又は、約２１から３０ｂｐの長さである。例示の実施形態の範囲内で、２本の鎖が対になった、ｓｉＮＡの二本鎖部分は、完全に対になったヌクレオチドセグメントに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する相補的ヌクレオチドがない）、オーバーハング等により対になっていない部分を含んでもよい。ｓｉＮＡ形成に干渉しない程度まで、対にならない部分を含んでもよい。より詳細な実施形態においては、「バルジ」は、１から２の対になっていないヌクレオチドを含んでもよく、２つの鎖が対になっているｓｉＮＡの二本鎖領域は、約１から７、又は約１から５のバルジを含んでもよい。更に、ｓｉＮＡの二本鎖領域に含まれる「ミスマッチ」は、約１から７、又は約１から５の数で存在してもよい。ミスマッチの場合に最も多いのは、ヌクレオチドの１つがグアニンで、他方がウラシルの場合である。このようなミスマッチは、例えば、センスＲＮＡをコードする対応するＤＮＡにおける、ＣからＴへの変異、ＧからＡへの変異、又はそれらの混合に起因する場合があるが、他の原因も考えられる。更に、本発明においては、２本の鎖が対になっているｓｉＮＡの二本鎖領域は、およその規定する数の範囲内で、バルジ及びミスマッチ部分を含んでもよい。
【００７７】
本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡが標的遺伝子の発現をサイレンシングする活性を保持する限り、平滑でもよく、突出して（オーバーハングして）いてもよい。突出（オーバーハング）端の構造は、他によって報告されているように、３’オーバーハングに限定されない。５’オーバーハング構造がＲＮＡｉ等によって遺伝子サイレンシング効果を誘導することができる限り、５’オーバーハング構造を含んでもよい。更に、オーバーハングヌクレオチドの数は、報告された２つ又は３つのヌクレオチドの制限に限定されず、オーバーハングがｓｉＮＡの遺伝子サイレンシング活性を損なわない限り、任意の数でよい。例えば、オーバーハングは、約１から８のヌクレオチドを含んでもよく、約２から４のヌクレオチドを含むことが多い。突出した端構造を有するｓｉＮＡの全長は、対になった二本鎖部分の長さと、両端でオーバーハングしている一本鎖を含む対の長さとを合計したもので表される。例えば、  ４つのヌクレオチドオーバーハングを両端に有する１９ｂｐの二本鎖ＲＮＡという例示の場合においては、全長は、２３ｂｐで表される。更に、オーバーハング配列は、標的遺伝子に対する特異性が低いので、標的遺伝子配列に対して、必ずしも、相補的（アンチセンス）又は同一（センス）ではない。更に、ｓｉＮＡが標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング効果を維持することができる限り、例えば、一方の端のオーバーハング部分に、低分子量構造（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ若しくはウイルスＲＮＡ等の天然のＲＮＡ分子、又は人工のＲＮＡ分子）を含んでもよい。
【００７８】
更に、ｓｉＮＡの末端構造は、二本鎖核酸の片側の端同士を、例えばリンカーＲＮＡ等のリンカー核酸によって結び付けるステム（ｓｔｅｍ）−ループ構造を有してもよい。二本鎖の領域（ステム（ｓｔｅｍ）−ループ部分）の長さは、例えば、１５から４９ｂｐ、しばしば１５から３５ｂｐ、より多く見られるのは約２１から３０ｂｐである。或いは、標的細胞で発現されｓｉＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば、約１５から４９ｂｐ、１５から３５ｂｐ、又は約２１から３０ｂｐであってよい。リンカーセグメントを用いると、リンカーの長さが、ステム（ｓｔｅｍ）部分が対になるのを妨げない限り、リンカーの長さに特別な制限はない。例えば、ステム（ｓｔｅｍ）部分を安定して対にするために、及び、この部分をコードするＤＮＡ間の組み換えを抑制するために、リンカー部分は、クローバーの葉型のｔＲＮＡ構造を有してもよい。リンカーが、ステム（ｓｔｅｍ）部分が対になるのを妨げる長さを有するとしても、例えば、イントロンを含むようにリンカー部分を構築し、前駆体ＲＮＡを成熟ＲＮＡに処理中にイントロンを除去することによって、ステム（ｓｔｅｍ）部分を対にすることを可能にすることができる。ステム（ｓｔｅｍ）−ループｓｉＲＮＡの場合には、ループ構造を持たないＲＮＡのどちらかの端（頭又は尾）は、低分子量のＲＮＡを有してもよい。上述のように、この低分子量のＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ  若しくはウイルスＲＮＡ等の天然のＲＮＡ分子を含んでもよく、人工のＲＮＡ分子を含んでもよい。
【００７９】
ｓｉＮＡは、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に補完的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含むことができ、（例えば、このようなｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はその一部に対応する核酸配列のｓｉＮＡ分子内にその存在を必要としない）、この場合、一本鎖ポリヌクレオチドは、更に５’リン酸塩（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ等，Ｃｅｌｌ．，１１０：５６３−５７４（２００２）ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，１０：５３７−５６８（２００２）を参照）又は５’，３’−２リン酸塩等の末端リン酸基を含むことができる。
【００８０】
本明細書で使用されているｓｉＮＡ分子という用語は、天然産ＲＮＡ又はＤＮＡのみを含む分子に限定されず、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをも包含する。一実施形態においては、本発明の短干渉核酸分子は、ヌクレオチドを含む２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）を欠いている。一実施形態においては、短干渉核酸は、ＲＮＡｉを媒介するために、２’ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、従って、本発明の短干渉核酸分子は、任意で、全くリボヌクレオチド（例えば２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。ｓｉＮＡ分子内にＲＮＡｉを支援するリボヌクレオチドの存在を必要としない、このようなｓｉＮＡ分子は、しかしながら、２’−ＯＨ基を有する１つ又はそれ以上のヌクレオチド基を含む、結合されたリンカー（単数又は複数）、又は他の結合された若しくは関連付けられた基、部分若しくは鎖を有することができる。任意で、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５，１０，２０，３０，４０又は５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。
【００８１】
本明細書で使用されているｓｉＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子を表すのに使用される他の用語、例えば、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後ジーンサイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等と等価物であることを意味する。
【００８２】
他の実施形態においては、本明細書の範囲内で使用されるｓｉＮＡ分子は、個別のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含んでもよく、センス及びアンチセンス領域は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合で結合しているか、或いは、イオンの相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、及び／又はスタッキング相互作用を介して、非共有結合で結合している。
【００８３】
「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子ｍＲＮＡに結合することによって、ＲＮＡｉを誘導すると考えられている。「センスＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡに相補的な配列を有し、その相補的アンチセンスＲＮＡにアニーリングされてｓｉＲＮＡを形成する。これらのアンチセンス及びセンスＲＮＡは、従来、ＲＮＡ合成酵素を用いて合成されてきた。
【００８４】
本明細書で使用されている「ＲＮＡｉ構築物」という用語は、本明細書を通じて使用される総称的な用語で、小さい干渉のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されてｓｉＲＮＡを形成することができる他のＲＮＡ種を含む。本明細書のＲＮＡｉ構築物は、細胞内のｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写、及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを産生することができる転写を引き起こすことができる発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも呼ばれる）も含む。任意で、ｓｉＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖のｓｉＲＮＡを含む。
【００８５】
ｓｉハイブリッド分子は、ｓｉＲＮＡと類似の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖のＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉハイブリッドは、１本のＲＮＡ鎖と１本のＤＮＡ鎖で構成されている。ＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡに結合する鎖であるアンチセンス鎖であることが好ましい。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションによって作られたｓｉハイブリッドは、ハイブリダイゼーションされた相補部分と、好ましくは少なくとも１つの３’オーバーハング端とを有する。
【００８６】
本発明の範囲内で使用されるｓｉＮＡは、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組立てることができ、１本の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、自己相補的である（すなわち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖が二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）又は二本鎖構造を形成し、二本鎖領域は、約１９塩基対である）。アンチセンス鎖は、標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよく、センス鎖は、標的核酸又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含んでもよい。或いは、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから組立てることができる。その場合は、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は、核酸系の又は非核酸系のリンカー（単数又は複数）によって結合する。
【００８７】
更なる実施形態の範囲で、本発明の方法及び組成物による細胞内送達のためのｓｉＮＡは、二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）、非対称二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）、ヘアピン又は非対称ヘアピン２次構造を有し、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを有するポリヌクレオチドであってよい。その場合は、アンチセンス領域は、個別の標的核酸分子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
ｓｉＮＡで行うことができる化学修飾の例は、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び、末端のグリセリル及び／又はインバーテッドデオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙ  ａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込みを含むが、これらに限定されない。これらの化学修飾は、様々なｓｉＮＡ構築物で使用されると、細胞のＲＮＡｉ活性を維持すると同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に向上させる。
【００８９】
非限定的な例において、化学修飾ヌクレオチドの核酸分子へ導入は、外因的に送達される天然のＲＮＡ分子に生来備わっているｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性及びバイオアベイラビリティの潜在的な限界に克服する強力な手段を提供する。例えば、核酸分子を化学修飾すると、血清内での半減期が長くなる傾向があるので、化学修飾核酸分子を使用することによって、所与の治療効果を得るために特定の核酸分子の用量を減らすことを可能にすることができる。更に、ある化学修飾は、特定の細胞又は組織を標的にし、及び／又は核酸分子の細胞への取り込みを向上させることによって、核酸分子のバイオアベイラビリティを向上させることができる。従って、例えば、全てＲＮＡの核酸分子と比較すると、化学修飾核酸分子の活性が、天然の核酸分子と比較して低減されていても、修飾核酸分子全体としての活性は、分子の安定性及び／又は送達の向上により天然の分子の活性よりも大きくなり得る。天然の非修飾ｓｉＮＡと異なり、化学修飾ｓｉＮＡは、ヒトのインターフェロン活性を活性化する可能性を最小化することもできる。
【００９０】
本明細書に記載のｓｉＮＡ分子において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、アンチセンス領域の５’端に約１個から約５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基又はバックボーンに、化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ又はそれ以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ又はそれ以上の非環状ヌクレオチドを含むことができる。
【００９１】
例えば、非限定的な例において、本発明は、１本のｓｉＮＡ鎖に、約１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。また、別の実施形態においては、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖に、各々、約１、２、３、４、５、６、７、８又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学修飾短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）のオリゴヌクレオチド鎖の１本又は両方に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖又はその両方の鎖の、３’端、５’端又はその両方に、１つ又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、本発明の例示のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の鎖の５’端に、約１から約５又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５又はそれ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的な例において、本発明の例示のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の鎖に、１つ又はそれ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。更に別の非限定的な例においては、本発明の例示のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方の鎖に、１つ又はそれ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
【００９２】
ｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子で構成されていてもよく、その場合、ｓｉＮＡは、約１８から約２３の（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）の塩基対を有する、長さ約３８から約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチドであり、環状オリゴヌクレオチドが、約１９の塩基対と２つのループとを有するダンベル形構造を形成する。
【００９３】
環状ｓｉＮＡ分子は、２つのループモチーフを含み、ｓｉＮＡ分子の１つ又は両方のループ部分は、生物分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のｉｎ  ｖｉｖｏにおける分解によって約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチドオーバーハング等の３’末端オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成できるように、設計される。
【００９４】
ｓｉＮＡ分子に存在する、好ましくはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在する、しかしまた任意でセンス鎖、及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方に存在する、修飾ヌクレオチドは、天然産リボヌクレオチドと類似の属性又は特性を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザン立体配置（例えば、ノーザン擬回転サイクル、例えばＳａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ｅｄ．，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。従って、本発明のｓｉＮＡ分子に存在し、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが、また選択的にセンス鎖、及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方に存在し、化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド分解に耐性があると同時に、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。ノーザン立体配置を有するヌクレオチドの例には、ロックされた核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ヌクレオチド（例えば２’−０，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル，２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、センス鎖の３’端、５’端、又は、３’端及び５’端の両方に、インバーテッドデオキシ塩基部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）等の末端キャップ部分を有してもよい。
【００９６】
共役体の例には、図面を含めて、その全体を本明細書に参照により組み込んだ、２００３年４月３０日出願のＶａｒｇｅｅｓｅ等の米国特許出願第１０／４２７，１６０号に記載の共役体及び配位子が含まれるが、それに限定されない。別の実施形態においては、共役体は、化学修飾ｓｉＮＡ分子に生物分解性リンカーを介して共有結合されている。一実施形態においては、共役分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’端で結合している。別の実施形態においては、共役分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’端で結合している。更に別の実施形態においては、共役分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、若しくは両方の鎖の３’端及び５’端、又はその組み合わせで結合している。一実施形態においては、本発明の共役分子は、化学修飾ｓｉＮＡ分子の、細胞等の生物系への送達を容易にする分子を含む。別の実施形態においては、化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合した共役分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は、細胞への取り込みを媒介することができる細胞受容体の配位子である。本発明で検討されている、化学修飾ｓｉＮＡ分子に結合することができる特異的共役分子の例は、２００３年７月１０日に公開されたＶａｒｇｅｅｓｅ等の米国特許出願第２００３０１３０１８６号及び２００４年６月１０日に公開された米国特許出願第２００４０１１０２９６号に記載されている。本発明で用いられている共役体の型及びｓｉＮＡ分子の共役の程度を、薬物動態プロフィール、バイオアベイラビリティ及び／又はｓｉＮＡ構築物の安定性の向上と、同時にＲＮＡｉ活性を媒介するｓｉＮＡの能力を維持するために評価することができる。従って、当業者は、様々な共役体で修飾されたｓｉＮＡ構築物をスクリーニングして、そのｓｉＮＡ共役複合体が、例えば当技術分野で一般に知られている動物モデルにおいて、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しつつ、向上した属性を保有するかどうかを決定することができる。
【００９７】
ｓｉＮＡは、また、ｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域に結合する、ヌクレオチドリンカー、非ヌクレオチドリンカー、又は、ヌクレオチド／非ヌクレオチド混合リンカーで構成してもよい。一実施形態においては、ヌクレオチドリンカーは、２ヌクレオチドより長い、例えば、長さ約３，４，５，６，７，８，９又は１０ヌクレオチドであってよい。別の実施形態においては、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってよい。本明細書で使用される「アプタマー」又は「核酸アプタマー」は、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味する。その場合、核酸分子は、天然の設定において標的分子が認識する配列を含む配列を有する。或いは、アプタマーは、天然では核酸に結合しない標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は、目的の任意の分子であってよい。例えば、アプタマーを使用して、タンパク質の配位子結合ドメインに結合することができ、それによって、天然産配位子とタンパク質との相互作用を防ぐ。これは非限定的な例で、当業者は、当技術分野で一般に知られている技術を用いて他の実施形態を容易に作成できることを認識するであろう。（例えば、Ｇｏｌｄ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：７６３（１９９５）；Ｂｒｏｄｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４：５（２０００）；Ｓｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．，２：１００（２０００）；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４：２７（２０００）；Ｈｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２０（２０００）；ａｎｄ  Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５：１６２８．（１９９９）を参照）
【００９８】
非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他の高分子化合物（例えば、２から１００の間のエチレングリコールユニットを有するポリエチレングリコール等のポリエチレングリコール）で構成されてもよい。具体的な例には、Ｓｅｅｌａ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：６３５３（１９９０）ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５：３１１３（１９８７）；Ｃｌｏａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１３：６３２４（１９９１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏα，１１３：５１０９（１９９１）；Ｍａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２５８５（１９９３）ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１７５１（１９９３）；Ｄｕｒａｎｄ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：６３５３（１９９０）；ＭｃＣｕｒｄｙ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１０：２８７（１９９１）；Ｊｓｃｈｋｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４：３０１（１９９３）；Ｏｎｏ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：９９１４（１９９１）；Ａｒｎｏｌｄ等，国際公開番号ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ等，国際公開番号ＷＯ９５／０６７３１；Ｄｕｄｙｃｚ等，国際公開番号ＷＯ９５／１１９１０、及びＦｅｒｅｎｔｚ  ａｎｄ  Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１３：４０００（１９９１）に記載されているものが含まれる。「非ヌクレオチド」は、更に、糖及び／又はリン酸置換基のいずれかを含む、１つ又はそれ以上のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖に組み込むことができ、且つ残留塩基が酵素活性を呈することを可能にする、任意の基又は化合物を意味する。基又は化合物は、例えば、糖のＣ１位に、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミジン等の広く知られているヌクレオチド塩基を含まないという点で、脱塩基であることができる。
【００９９】
本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、化学修飾することができ：（ａ）ｓｉＮＡ分子の２本の相補的鎖の合成と；（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適切な条件のもとで、２本の相補的鎖を一緒にアニーリングすることと；を含む。別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２本の相補的鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。更に別の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２本の相補的鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。
【０１００】
オリゴヌクレオチド（例えば、特定の修飾オリゴヌクレオチド又はリボ核酸を欠くオリゴヌクレオチドの部分）を、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／５４４５９、Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ等，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載の当技術分野において公知のプロトコルを用いて合成する。本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成は、例えば、Ｕｓｍａｎ等，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３；及びＷｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏ．，７４，５９に記載の一般的な手順に従う。
【０１０１】
本発明の範囲における使用のための核酸分子の送達に対する補助的な又は相補的な方法は、例えば、Ａｋｈｔａｒ等，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９（１９９２）；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ等，ＭｏＩ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２９−１４０（１９９９）；Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７：１６５−１９２（１９９９）；及びＬｅｅ等，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２：１８４−１９２（２０００）に記載されている。Ｓｕｌｌｉｖａｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／０２５９５号には、更に、酵素核酸分子の送達に関する一般的な方法が記載されている。これらのプロトコルを利用して、本発明の範囲で検討される任意の核酸分子のほとんどの送達を補助又は相補することができる。  
【０１０２】
医薬組成物
核酸分子及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、当業者に公知の様々な方法で細胞に投与することができる。それらの方法には、ｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのみを含む製剤、又は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、保存剤等の、１つ又はそれ以上の追加の成分を更に含む製剤での投与が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態においては、ｓｉＮＡ及び／又はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、リポソームに包む、イオントフォレーゼにより投与する、又は、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア若しくはタンパク性ベクター等の他のビヒクルに組み込むことができる（例えばＯ’Ｈａｒｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／５３７２２号を参照）。或いは、核酸／ペプチド／ビヒクルの組み合わせを、直接注射することによって、又は輸液ポンプを用いることによって局所的に送達することができる。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉注射、皮内注射のいずれにおいても、標準的な針とシリンジの方法によって、又は、Ｃｏｒｎｙ等，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：２３３０−２３３７（１９９９）ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／３１２６２に記載の技術等の針を使わない技術によって、行うことができる。
【０１０３】
本発明の組成物は、薬剤として有効に用いることができる。薬剤は、患者の疾患状態又は他の好ましくない状態を予防、その状態の発生若しくは重篤度を調節、又は、その状態を治療する（検出又は測定可能な程度にまで１つ又はそれ以上の症状を緩和する）。
【０１０４】
従って、更なる実施形態の範囲で、本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとの組み合わせ、複合、又は共役され、選択的に、希釈剤、安定剤、緩衝剤等の薬剤的に許容可能な担体と調剤された、１つ又はそれ以上のポリ核酸、通常は、１つ又はそれ以上のｓｉＮＡ、の存在又は投与を特徴とする医薬組成物及び方法を提供する。
【０１０５】
本発明は、対象の特定の疾患状態又は他の好ましくない状態に関連する遺伝子の発現を調節する短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供することによって、更なる目的及び利点を満たす。通常、ｓｉＮＡは、対象の疾患状態又は好ましくない状態に関連する一時的又は原因となる因子として、発現レベルが上昇する遺伝子を標的とする。このコンテキストにおいて、ｓｉＮＡは、１つ又はそれ以上の関連する疾患症状の重篤度又は再発を予防、緩和、低減するレベルまで、有効に遺伝子の発現をダウンレギュレートする。或いは、疾患又は他の好ましくない状態の結果又は帰結として、標的遺伝子の発現が必ずしも上昇しない様々な明確な疾患モデルに関しては、標的遺伝子のダウンレギュレーションは、それでもなお、遺伝子発現を低下させることによって治療結果（すわなち、選択したｍＲＮＡ及び／又は標的遺伝子のタンパク質産物のレベルを低減する）をもたらす。或いは、本発明のｓｉＮＡを標的として、１つの遺伝子の発現を低下させることもでき、そうすると、結果として、標的遺伝子の産物又は活性によって発現をマイナスに調節される「下流」遺伝子をアップレギュレートすることができる。
【０１０６】
例示の実施形態の範囲で、本発明の組成物及び方法は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現を調節して、関節リウマチ（ＲＡ）の症状を治療又は予防する治療手段として有用である。このコンテキストにおいて、本発明は、小核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＴＮＦ−αの発現及び活性を調節するのに有用な化合物、組成物及び方法を更に提供する。より詳細な実施形態において、本発明は、ＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−α遺伝子の発現を調節して、哺乳動物類対象のＲＡの症状を予防又は緩和するのに有効な、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子、マイクロ−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸分子と、関連方法とを提供する。これらの及び関連する治療組成物及び方法の範囲で、化学修飾ｓｉＮＡの使用は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヌクレアーゼによる分解への耐性を向上させることによって、及び／又は、細胞への取り込みを向上させることによって、天然のｓｉＮＡ分子の属性と比較して、修飾ｓｉＮＡの属性を向上させることが多い。本明細書の開示に従って容易に判断できるように、複数の化学修飾を有する有用なｓｉＮＡは、ＲＮＡｉ活性を保持している。従って、本発明のｓｉＮＡ分子は、治療、診断、標的評価、ゲノム発見、遺伝子工学、及び薬理ゲノム学用途に、有用な試薬及び方法を提供する。
【０１０７】
本発明のこのｓｉＮＡは、例えば、経皮的に、又は局所注射（例えば、乾癬を治療するために乾癬斑の部位に局所注射、又は、乾癬性関節炎若しくはＲＡの患者の関節に局所注射）によって等、任意の形態で投与してよい。より詳細な実施形態においては、本発明は、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡに対して向けられる治療的に有効量のｓｉＮＡを投与するための製剤及び方法を提供して、ＴＮＦ−αＲＮＡを有効にダウンレギュレートし、それによって、１つ又はそれ以上のＴＮＦ−α関連の炎症状態を低減又は防止する。動物対象における選択した疾患状態に関連する、その疾患状態に関連して一時的又は原因となる因子として発現が異常に増加することが知られている多数の遺伝子のいずれかを含む、１つ又はそれ以上の異なる遺伝子の発現を標的にする比較例の方法及び組成物を提供する。
【０１０８】
本発明のｓｉＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物は、標的疾患状態に対する他の標準的な治療と併せて、例えば、ＲＡ又は乾癬等の炎症性疾患に有効な治療薬と併せて投与することができる。このコンテキストにおいて、組み合わせて有用且つ有効な薬剤の例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、メトトレキサート、金化合物、Ｄ−ペニシラミン、抗マラリア薬、スルファサラジン、グルココルチコイド、並びに、インフリキシマブ及びエントラセプト（ｅｎｔｒａｃｅｐｔ）等の他のＴＮＦ−α中和剤が挙げられる。
【０１０９】
本発明の負に帯電したポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）は、安定剤、緩衝剤等を用いて、又は用いずに医薬組成物を形成する任意の標準的手段によって、患者に投与することができる。リポソーム送達機構の使用を望む場合、リポソーム形成のための標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物は、経口投与用の錠剤、カプセル又はエリキシル剤、直腸投与用の坐薬、滅菌溶液、注射投与用懸濁剤、及び、当技術分野で公知の他の組成物として、調剤及び使用してもよい。
【０１１０】
本発明は、本明細書に記載の組成物の薬剤的に許容可能な製剤も含む。これらの製剤には、前述の化合物の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩及びベンゼンスルホン酸塩等の酸付加塩も含まれる。
【０１１１】
薬理組成物又は製剤は、例えば、ヒトを含む細胞又は患者への、全身投与などの、投与に適切な形態の組成物又は製剤を指す。適切な形態は、ある程度は、例えば、経口、経皮、又は注射によって等、使用又は製剤が入る経路に応じて決まる。このような形態は、組成物又は製剤が標的細胞（すなわち、負に帯電した核酸の送達に望ましい細胞）に到達するのを妨げてはならない。例えば、血流に注射された薬理組成物は、可溶性でなければならない。他の因子は当技術分野では公知であり、他の因子には、毒性等の考慮が含まれる。  
【０１１２】
「全身投与」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血流への薬物の全身吸収、又は蓄積とその後に続く全身への分布を意味する。全身吸収につながる投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が含まれるが、これらに限定されない。これらの投与経路は各々、例えば、核酸等の望ましい負に帯電したポリマーを接近可能な疾患組織に曝露する。薬物が血液循環に入る率は、分子量又は分子サイズの関数で表されてきた。リポソーム又は本発明の化合物を含む他の薬物担体を使用することによって、薬物を、例えば、網膜内皮系（ＲＥＳ）の組織等、特定の組織型に局在化できる可能性がある。薬物がリンパ球やマクロファージ等の細胞の表面に会合するのを容易にすることができるリポソーム製剤も有用である。この方法を用いて、癌細胞等の異常細胞のマクロファージ及びリンパ球の免疫認識の特異性を利用することによって、薬物の標的細胞への送達を促進してもよい。
【０１１３】
「薬学的に許容可能な製剤」は、所望の活性を得るのに最適な身体箇所に、本発明の核酸分子を有効に分布することを可能にする組成物又は製剤を意味する。本発明の核酸分子を有する製剤に適切な薬剤の例には：ＣＮＳに薬物が入るのを促進することができる（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ８５等の）Ｐ−糖タンパク阻害剤［Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ  ａｎｄ  Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３：１６−２６（１９９９）］；脳内移植後の徐放性送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェア等の生物分解性ポリマー（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆ等，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８：４７−５８（１９９９）］（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）；及び、薬物を血液脳関門を越えて送達することができ、且つ、ニューロンへの取り込みメカニズムを変えることができるポリブチルシアノアクリレートでできたもの等のロードしたナノ粒子（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３：９４１−９４９，（１９９９）］が含まれるが、それらに限定されない。本発明の核酸分子の他の送達戦略の例には、Ｂｏａｄｏ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ，８７：１３０８−１３１５（１９９８）；Ｔｙｌｅｒ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２１：２８０−２８４（１９９９）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９２：５５９２−５５９６（１９９５）；Ｂｏａｄｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５：７３−１０７（１９９５）；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：４９１０−４９１６（１９９８）；及びＴｙｌｅｒ等，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６：７０５３−７０５８（１９９９）に記載されている物質が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１４】
本発明には、保管又は投与の目的で調製された組成物も含まれる。その組成物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤に所望の化合物の薬剤として有効な量を含む。治療のための使用に許容可能な担体又は希釈剤は、薬剤分野では公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素及び香料を含んでもよい。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。更に、酸化防止剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【０１１５】
薬学的有効量は、疾患状態の予防、疾患状態の発生の阻害、又は疾患状態の治療（症状のある程度までの緩和、好ましくは症状の全ての緩和）に必要な用量である。薬学的有効量は、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、治療される哺乳動物の種類、治療を検討している具体的な哺乳動物の身体的特性、併用薬剤、及び、医療分野の当業者が認識する他の要因によって決まる。一般的に、活性成分の０．１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の量を、負に帯電したポリマーの効力に依存して投与する。
【０１１６】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤との混合物の形で活性物質を含む。このような賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、トラガカントゴム及びアカシアゴム等の懸濁化剤である。分散剤及び湿潤剤は、例えばレシチン等の天然産リン脂質、又は、例えばポリオキシエチレンステアレート等のアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、又は、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール等のエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、又は、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート等のエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレエート等のエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物であってよい。水性懸濁剤は更に、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート等の１つ又はそれ以上の保存剤と、１つ又はそれ以上の着色剤と、１つ又はそれ以上の矯味剤と、例えばスクロース又はサッカリン等の１つ又はそれ以上の甘味剤とを含んでもよい。  
【０１１７】
油性懸濁剤は、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナツ油等の植物油、又は、液状パラフィン等の鉱油に、活性成分を懸濁することによって調剤することができる。油性懸濁剤は、例えば、蜜蝋、硬質パラフィン又はセチルアルコール等の増粘剤を含むことができる。甘味剤及び矯味剤を加えて、味の良い経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤を添加して保存することができる。
【０１１８】
水を加えて水性懸濁剤を調製するのに適した分散性散剤及び顆粒剤は、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤、及び、１つ又はそれ以上の保存剤と混合した形で活性成分を提供する。適切な分散剤若しくは湿潤剤、又は懸濁化剤の例は前述のものである。更に、例えば、甘味剤、矯味剤及び着色剤等の賦形剤が存在してもよい。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は水中油型乳剤の形態であってもよい。油性相は、植物油、鉱油、又は、それらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム等の天然産ゴム、例えば大豆、レシチン等の天然産リン脂質、例えばソルビタンモノオレエート等の脂肪酸及びヘキシトール無水物由来のエステル又は部分エステル、並びに、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物であってよい。乳剤は、甘味剤及び矯味剤を更に含んでもよい。
【０１２０】
医薬組成物は、滅菌注射可能な水性又は油性懸濁剤の形態であってよい。この懸濁剤は、上述の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて公知の技術に従って調剤することができる。滅菌注射可能製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液等の、非経口投与可能な無毒性の希釈剤又は溶媒中の滅菌注射可能な溶液又は懸濁剤であってもよい。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液及び生理食塩水である。更に、滅菌不揮発性油が、溶媒又は懸濁化媒体として、従来用いられている。このためには、合成モノ−又はジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油を用いることができる。また、オレイン酸等の脂肪酸も注射剤の調製に用いられている。
【０１２１】
ｓｉＮＡは、例えば薬物を直腸投与するために、坐薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸温では液体であり、従って直腸内で融解して薬物を放出する適切な無剌激性賦形剤と混合することによって調製することができる。そのような物質には、ココアバター及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０１２２】
ｓｉＮＡは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ等のヌクレアーゼ耐性基を用いて修飾することによって安定性を大きく促進することができる（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，  ＴＩＢＳ  １７：  ３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３（１９９４）を参照）。ＳｉＮＡ構築物は、ゲル電気泳動によって一般的方法を用いて精製してもよく、高圧液体クロマトグラフィーを用いて精製してもよく、水に再懸濁する。
【０１２３】
修飾（塩基、糖、及び／又はリン酸）を有する核酸分子を化学的に合成することによって、その核酸分子が血清リボヌクレアーゼによって分解されるのを防ぐことができ、核酸分子の効力を高めることができる。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３，３１４（１９９１）；Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎ等，国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ等，国際公開番号ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｇｏｌｄ等，米国特許第６，３００，０７４号を参照。上述の参照文献は全て、本明細書に記載の塩基、リン酸及び／又は糖の部分に行うことのできる様々な化学修飾について記載している。
【０１２４】
核酸分子のヌクレアーゼに対する安定性と、有効性とを有意に促進しながら、核酸分子に導入することのできる糖、塩基及びリン酸修飾を記載する、当技術分野における幾つの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドを、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾等のヌクレアーゼ耐性基を用いた修飾によって、修飾して安定性及び／又は生物活性を促進する。Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ．，ＴＩＢＳ．１７：３４（１９９２）；Ｕｓｍａｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３（１９９４）；Ｂｕｒｇｉｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：１４０９０（１９９６）を参照。核酸分子の糖の修飾は、当技術分野では幅広く記載されている。Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ等，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，５６５−５６８（１９９０）；Ｐｉｅｋｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｕｓｍａｔｉ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ，１７：３３４−３３９（１９９２）；Ｕｓｍａｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／２６２７０；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，米国特許第５，７１６，８２４号；Ｕｓｍａｎ等，米国特許第５，６２７，０５３号；Ｗｏｏｌｆ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９８／１３５２６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９：１１３１（１９９８）；Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８：３９−５５（１９９８）；Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：９９−１３４（１９９８）；及びＢｕｒｌｉｎａ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５：１９９９−２０１０（１９９７）を参照。このような出版物は、触媒作用を調節することなしに、糖、塩基及び／又はリン酸修飾等を核酸分子に組み込む位置を決定する一般的な方法及び戦略を記載している。これらの教示を考慮して、ｓｉＮＡの細胞のＲＮＡｉを促す能力が有意に阻害されない限り、本明細書に記載する同様の修飾を用いて、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０１２５】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートを有するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合、及び／又は５’−メチルホスホネート結合の化学修飾は、安定性を向上させる一方、過剰な修飾によって、毒性を引き起こしたり、活性を減じることがある。従って、核酸分子を設計するときは、ヌクレオチド間結合の量を最小化しなければならない。これらの結合の濃度を低減することで、毒性を低下させ、これら分子の有効性を向上させ、特異性を高めることができる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、モルホリノ、アミデートカルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）、ポリアミド、スルフォン酸塩、スルフォンアミド、スルファミン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリル、の置換基を含むリン酸バックボーン修飾した、修飾ｓｉＮＡ分子を特徴とする。オリゴヌクレオチドバックボーン修飾に関しては、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７（１９９５）及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ等，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ５  ２４−３９（１９９４）を参照。
【０１２７】
核酸分子の送達方法については、Ａｋｈｔａｒ等，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９（１９９２）；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，（１９９５），Ｍａｕｒｅｒ等，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：１２９−１４０（１９９９）；Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７：１６５−１９２（１９９９）；及びＬｅｅ等，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２：１８４−１９２（２０００）に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等，米国特許第６，３９５，７１３号及びＳｕｌｌｉｖａｎ等，ＰＣＴ番号ＷＯ９４／０２５９５には、更に核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。任意の核酸分子のほとんどの送達に、これらのプロトコルを利用することができる。核酸分子は、当業者に公知の様々な方法で細胞に投与することができる。それらの方法には、リポソームカプセル化、イオントフォレーゼ、又は生物分解姓ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン等の他のビヒクルへの組み込み（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：１０６８−１０７４（１９９９）；Ｗａｎｇ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０３／４７５１８及びＷＯ０３／４６１８５を参照）、ポリ（ラクティック−ｃｏ−グリコリック）酸（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号及び米国特許出願第ＵＳ２００２１３０４３０号を参照）、生物分解性ナノカプセル及び生体接着性マイクロスフェア、又はタンパク質性ベクター（Ｏ’Ηａｒｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／５３７２２）が含まれるが、これらに限定されない。或いは、核酸／ビヒクルの組み合わせを、直接注射することにより、又は輸液ポンプを用いることにより、局所的に送達する。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉内注射又は皮内注射のいずれであっても、標準的な針とシリンジの方法を用いて行ってもよく、Ｃｏｎｒｙ等．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５：２３３０−２３３７（１９９９）ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ等，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／３１２６２に記載されている技術等の針を使わない技術で行ってもよい。本発明の分子は、薬剤として使用することができる。薬剤は、対象の疾患状態の予防、疾患状態の発生の調節、又は疾患状態の治療（症状をある程度まで、好ましくは症状の全てを緩和）を行う。
【０１２８】
本明細書及び請求項において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」の単数形は複数形を含む。但し、コンテキストにより明らかに複数形を含まない場合は、この限りではない。
【０１２９】
実施例
実施例１
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合したｓｉＲＮＡを含む組成物の生産及び特徴
本発明の候補ｓｉＲＮＡとポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとの複合体を形成するためには、十分な量のｓｉＲＮＡを、例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）において、規定の割合で、所定の量のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混ぜ合わせ、室温で約１０分から３０分培養する。次に、この混合物を、選択した体積、例えば５０μｌを標的細胞に接触させ、その細胞を、所定の培養時間、本実施例においては約２時間培養した。ｓｉＲＮＡ／ペプチド混合物は、任意で、細胞培養培地、又は、ウシ胎仔血清等の他の添加剤を含んでもよい。Ｈ３，Ｈ４及びＨ２ｂに関しては、これらのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドをｓｉＲＮＡと異なった割合で複合する一連の実験を行った。一般的に、これは、ｓｉＲＮＡ／ヒストン割合が、１：０．０１から１：５０で開始した。９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに、４０ｐｍのｓｉＲＮＡを加えた。各ウエルは、５０％の密集度でｂｅｔａ−ｇａｌ細胞を含んでいた。トランスフェクション効率の例示の最適化割合を次の表２に示す。
【０１３０】
トランスフェクションは、通常のｓｉＲＮＡ又は上に特定したヒストンタンパク質の１つと複合したｓｉＲＮＡを用いて、９Ｌ／ｂｅｔａ−ｇａｌ細胞で行った。ｓｉＲＮＡは、ベータガラクトシダーゼｍＲＮＡを特異的にノックダウンするよう設計した。活性は、対照群のｂｅｔａ−ｇａｌ活性のパーセンテージとして表した。（対照細胞は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いずに、リポフェクタミンを用いて、トランスフェクトした。）
【０１３１】
ｓｉＲＮＡ送達の効率を検出及び／又は定量化するアッセイは、例えば、ベータガラクトシダーゼアッセイ又はフローサイトメトリー法等、従来の方法を用いて行う。
【０１３２】
ベータガラクトシダーゼアッセイに関しては、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞、ベータガラクトシダーゼを構成的に発現する細胞株を用いた。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞は、ＬａｃＺを構成的に発現するラット神経膠肉腫線維芽細胞で、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−２２００）から得た。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞は、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）において、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び２０％ウシ胎仔血清を添加して成長させた。細胞は、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び０．２５ｍｇ／ｍｌファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む抗生物質の混合物を添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。ｂｅｔａ−ｇａｌｍＲＮＡに対抗して設計されたｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を化学的に合成し、ノックダウン効率を評価するために送達試薬と共に用いる。
【０１３３】
ｓｉＲＮＡ合成及び調製
オリゴヌクレオチドの合成を、標準的な２−シアノエチルフォスフォアミダイト法を用いて、最適な５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−スクシニルリボヌクレオシド又は、適用できる場合には５’−Ｏ−ジメチルトリチル−２’−デオキシ−３’−Ｏ−スクシニルチミジン支持体で誘導体化された長鎖アルキルアミン細孔性ガラス上で行った。全てのオリゴヌクレオチドを、０．２又は１μｍｏｌスケールでＡＢＩ３４００ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを用いて合成し、濃縮ＮＨ４ＯＨを用いて固体支持体から切断し、５５℃で、ＮＨ４ＯＨ：ＥｔＯＨ  ３：１の混合物を用いて、脱保護した。２’−ＴＢＤＭＳ保護基の脱保護は、塩基脱保護ＲＮＡをＮ−メチルピロリドン／トリエチルアミン／トリエチルアミントリス（フッ化水素塩）（体積比６：３：４）の溶液（６００μＬ／μｍｏｌ）を用いて６５℃で２．５時間、培養することによって達成した。対応するビルディングブロックである、Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧの５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−（ｔａｃ）−２’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−フォスフォアミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｂｏｕｌｄｅｒ社）、及び修飾フォスフォアミダイトである、５’ＤＭＴｒ−５−メチル−Ｕ−ＴＯＭ−ＣＥ−フォスフォアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ａｃ−Ｃ−ＣＥフォスフォアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥフォスフォアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＣＥフォスフォアミダイト、５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−Ａ−ＣＥフォスフォアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）は、供給業者から直接購入した。トリエチルアミン−三フッ化水素塩、Ｎ−メチルピロリジノン及び濃縮水酸化アンモニウムは、Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。全てのＨＰＬＣ分析及び精製は、Ｘｔｅｒｒａ（登録商標）カラムを用いて、Ｗａｔｅｒｓ  ２６９０で行った。他の試薬は全て、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。オリゴヌクレオチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣ判定で９７％以上の純度に精製した。マウス注射用ｓｉＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社から購入し、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射に許容可能なエンドトキシンのレベルでアニーリングした後、ＨＰＬＣ精製した。
【０１３４】
トランスフェクション手順
トランスフェクション手順の第１日目に、飽和９Ｌ／ＬａｃＺ培養液をＴ７５フラスコから取り出し、細胞を分離し、１０ｍｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１×ＰＳ、１×ピルビン酸Ｎａ、１×ＮＥＡＡ）に希釈する。細胞を、更に１：１５まで希釈し、この調製物１００μｌを９６ウエルプレートのウエルに等分すると、翌日までにトランスフェクション用に一般的に約５０％コンフルエントな細胞密度を産出する。ウエルの端を空にして、２５０μｌの水で満たし、プレートを培養器（５％ＣＯ２培養器）中に、３７℃で一晩、積み重ねずに置く。
【０１３５】
第２日目に、各ウエル５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭでトランスフェクション複合体を調製する。培地をプレートから取り除き、ウエルを２００μｌのＰＢＳ又はＯｐｔｉ−ＭＥＭで一度洗う。プレートを逆さにしてティッシュでふき取り、完全に乾かす。次に、トランスフェクション混合物を、各ウエルに加え（５０μｌ／ウエル）、それらのウエルの乾燥を防ぐために、２５０μｌの水をウエルの端に加える。次に、細胞を３７℃（５％ＣＯ２培養器）で少なくとも３時間培養する。トランスフェクション混合物を取り除き、１００μｌの完全培地（ＤＭＥＭ、１×ＰＳ、１×ピルビン酸Ｎａ、１×ＮＥＡＡ）で置き換える。細胞を、所定の時間培養し、次に酵素アッセイのために収穫する。
【０１３６】
ベータガラクトシダーゼｍＲＮＡをサイレンシングするために用いたｓｉＲＮＡ配列は、次の配列であった。
Ｃ．Ｕ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ｃ．Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．ｄＴ．ｄＴ（センス）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
Ａ．Ａ．Ａ．Ｕ．Ｃ．Ｇ．Ｃ．Ｕ．Ｇ．Ａ．Ｕ．Ｕ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ｇ．Ｕ．Ａ．Ｇ．ｄＴ．ｄＴ（アンチセンス）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
【０１３７】
本実施例に関するデータを表２に示す。トランスフェクション効率は、細胞溶解物から測定したベータガラクトシダーゼ活性の量と逆相関する。トランスフェクション時に、測定されたベータガラクトシダーゼ活性の減少は、トランスフェクションの成功を示す。従って、トランスフェクションが起こっていない場合は、測定されたベータガラクトシダーゼ活性は１００％であり、トランスフェクション効率０％である。ベータガラクトシダーゼ活性が減少すると、トランスフェクション効率が増加する。例えば、表２において、ヒストンＨ２ＢプラスｓｉＲＮＡは、６２．０３％のトランスフェクション効率となり、測定されたベータガラクトシダーゼ活性は３７．９７％に減少したことを示す。表３に示したデータに関しても、トランスフェクション効率の決定に同じ方法を用いた。
【０１３８】
表２：
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【０１３９】
ｓｉＲＮＡ／ペプチド／脂質
カチオン脂質を、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物、複合体又は共役体に加える効果を評価するために、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、製造元の指示（０．２μｌ／１００μｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）に従って、一定の濃度でｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達製剤に加えた以外は、上記手順に従った。
【０１４０】
ＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、ｓｉＲＮＡ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）から構成される組成物を生産するために、最初に、ｓｉＲＮＡとペプチドを、室温で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地において混ぜ、その後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を室温で、その混合物に加えて、ｓｉＲＮＡ／ペプチド／カチオン脂質組成物を形成した。  
【０１４１】
ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ｓｉＲＮＡ及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）から構成される組成物を生産するために、最初に、ペプチドとＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地において混ぜ、その混合物にｓｉＲＮＡを加えて、ｓｉＲＮＡ／ペプチド／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）組成物を形成した。
【０１４２】
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）又はＧＥＱＩＡＱＬＩＡＧＹＩＤＩＩＬＫＫＫＫＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を用いて、ｓｉＲＮＡ／ペプチド／カチオン脂質組成物を生産するためには、成分を加える順番は問題ではない。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡ／メリチン／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を生産するために、最初にｓｉＲＮＡとメリチンをＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地において混ぜ、その後、その混合物にＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を加えた。
【０１４４】
ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の組成物を生産するためには、最初にヒストンＨ１及びＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ細胞培養培地に一緒に加えて、完全に混ぜ、その後、ｓｉＲＮＡを加えて、ヒストンとＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の混合物と完全に混ぜ、ｓｉＲＮＡ／ヒストンＨ１／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）組成物を形成した。
【０１４５】
表３：
2008514647.tif 000003
【０１４６】
前述の結果に基づいて、本発明の例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドが、ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みを実質的に促進することができること、また、本発明の一部のｓｉＲＮＡ／ポリペプチド混合物に任意でカチオン脂質を加えると、ｓｉＲＮＡの送達効率を実質的に向上させることがあるのは明らかである。
【０１４７】
実施例２
ＴＡＴ−ＨＡポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したｓｉＲＮＡを含む組成物の生産と特徴
本実施例は、ｓｉＲＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）の１本の鎖に共有結合により共役した特異的ペプチドの合成と取り込み活性を記載する。これらの共役体は効率的にｓｉＲＮＡを細胞質に送達する。
【０１４８】
ペプチド及びＲＮＡを、標準的な固体相合成方法を用いて調製する。
【０１４９】
共役体を形成するためには、ペプチドとＲＮＡ分子を、互いの共役結合を可能にするために特異的部分で官能化しなければならない。ペプチドに関しては、Ｎ末端を３−マレイミドプロピオニックアシドで官能化する。ＲＮＡ分子に関しては、センス鎖の５’端及びアンチセンス鎖の３’端を、標準的な手順を用いて、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィドリンカーで官能化する。
【０１５０】
図：
2008514647.tif 000004
【０１５１】
トランスフェクション時に、細胞が５０から８０％コンフルエントな密度になるように、細胞を１日前にプレートに置いた。複合体に関しては、ｓｉＲＮＡ及びペプチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に希釈し、その後、混合して、５分から１０分複合し、ＰＢＳで洗った細胞に加えた。ｓｉＲＮＡの最終濃度は、各ペプチド濃度（２−５０μＭ）で５００ｎＭであった。共役体も、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地で希釈し、６２．５ｎＭから５００ｎＭの最終濃度で細胞に加えた。５００ｎＭの最終濃度で、共役体を２０％ＦＢＳと混ぜてすぐに、洗った細胞に加えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間トランスフェクトした。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理した後、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｉＲＮＡの取り込みをＣｙ５蛍光強度によって測定し、細胞生存性を、プロピジウムイオダイドを添加して評価した。
【０１５２】
図１に示すように、ペプチド／ｓｉＲＮＡ共役体は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体より大きいマウス尾繊維芽細胞へのより大きいパーセントの取り込みを達成する。更に、ペプチド／ｓｉＲＮＡ共役体は、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体より高い平均蛍光強度（ＭＦＩ、図２）を達成した。従って、一実施形態においては、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドをｓｉＲＮＡ分子と共役させるのが望ましいことが、これらのデータによって示される。
【０１５３】
実施例３
９Ｌ／ＬａｃＺ細胞におけるｓｉＲＮＡの取り込みのためのｓｉＲＮＡ／送達ペプチド複合体のスクリーニング
本発明の合理的に設計したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの幅広い多様なアセンブリは、ｓｉＲＮＡと複合すると、ｓｉＲＮＡ取り込みを促進するという、追加の証拠を本実施例は提供する。
【０１５４】
取り込みは、実施例２で記載したようにトランスフェクトした９Ｌ／ｌａｃＺ細胞を用いて、測定した。細胞をＰＢＳで洗い、トリプシン処理した後、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｉＲＮＡ取り込みをＦＡＭ蛍光強度により測定し、細胞生存性を、プロピジウムイオダイドを加えて評価した。下記の表４は、各種の合理的に設計されたポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに関する９Ｌ／ＬａｃＺ細胞における細胞への取り込みをパーセントで表したデータをまとめたものである。この表に含まれるのは、用いられたペプチド及びｓｉＲＮＡの濃度である。
【０１５５】
表４：
2008514647.tif 000005
2008514647.tif 000006
【０１５６】
実施例４
ｓｉＲＮＡ／送達は、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏにおいてポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、ＬａｃＺ細胞、マウス初代繊維芽細胞及びヒト単核白血球における、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによるｓｉＲＮＡ取り込みの促進を示す。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞及びマウス初代繊維芽細胞において行われる実験に用いる物質及び方法は、一般的に上述のものと同じであるが、マウスの実験には、９Ｌ／ＬａｃＺ細胞をマウス尾繊維芽細胞に代えて使用する。マウス尾繊維芽（ＭＴＦ）細胞で行ったトランスフェクションの結果を表５にまとめている。表５は、使用したペプチド及びｓｉＲＮＡの濃度を、ｓｉＲＮＡ分子と共役した標識と共に示している。ＭＴＦ細胞及び９Ｌ／ＬａｃＺ細胞で行ったトランスフェクションの結果を表６にまとめてある。表６のデータは、異なった細胞型におけるペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体のトランスフェクション効率を比較したものである。
【０１５７】
表５：
2008514647.tif 000007
【０１５８】
表６：
2008514647.tif 000008
【０１５９】
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの、培養中の細胞をトランスフェクトする能力を更に特徴付けるために、各種の濃度のＰＮ７３、ＰＮ２５０、ＰＮ１８２、ＰＮ５８及びＰＮ１５８と複合したＦＩＴＣ標識されたｓｉＲＮＡを用いて、ヒト単核白血球を培養した。ヒト単核白血球は、関節リウマチの治療の標的細胞型なので、ＬａｃＺ細胞及びマウス繊維芽細胞に加えて用いた。
【０１６０】
単核白血球は、健康なドナーのヒト新鮮血試料から、ＦＡＣＳ分析で９５％を超える純粋度まで単離した。
【０１６１】
単核白血球を、Ｃｙ５−又はＦＡＭと共役したｓｉＲＮＡ、及びペプチドを用いて、実施例２の手順でトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡ取り込みを、細胞内Ｃｙ５又はＦＡＭ蛍光強度によって測定した。細胞生存性は、プロピジウムイオダイド（取り込み）又はＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＰＥ（染色）を用いて決定した。
【０１６２】
図３は、幾つかの異なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの、培養中のヒト単核白血球におけるｓｉＲＮＡ取り込みを促進する能力を示す。リポフェクタミンによるトランスフェクションを比較として用いた。細胞生存性も、各ペプチドに関して評価した。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド、ＰＮ７３は、関節リウマチの治療候補として理想的であることが、その結果より明らかになった。ＰＮ７３ペプチドは、ヒト単核白血球によるｓｉＲＮＡ取り込みを高い効率及び低い毒性で促進するという驚くべき予想外の発見がそのデータより明らかとなり、ＰＮ７３ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏにおける関節リウマチの治療に使用できることを示唆している。
【０１６３】
実施例５
ｓｉＲＮＡ／送達は、ペプチド−ｓｉＲＮＡ共役体により促進される。
本実施例は、ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共役体の、９Ｌ／ＬａｃＺ培養細胞株と、マウス尾からの初代繊維芽細胞とにおけるｓｉＲＮＡの取り込みを誘導又は促進する活性を評価するためのスクリーニングの結果を提供する。９Ｌ／ＬａｃＺ細胞で行ったトランスフェクションの結果を、表７にまとめる。ＭＴＦで行ったトランスフェクションの結果を、表８にまとめる。
【０１６４】
表７：
2008514647.tif 000009
【０１６５】
表８：
2008514647.tif 000010
【０１６６】
本発明のｓｉＲＮＡ／ペプチド共役体の多様なアセンブリは、異なる細胞型へのｓｉＲＮＡの送達を、高効率で媒介することが、前述のデータよりはっきりと証明される。
【０１６７】
実施例６
ｓｉＲＮＡの遺伝子発現ノックダウンは、ｓｉＲＮＡに複合したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体による標的遺伝子発現の効果的なノックダウンを示す。この研究において、ヒト及び他の哺乳動物の対象において過剰発現するとき、ＲＡの発生又は進行を媒介するとされているヒト腫瘍壊死因子−α（ｈＴＮＦ−α）遺伝子の発現を調節するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体の能力をテストした。
【０１６８】
ヒト単核白血球を、実施例４に記載のように単離し、トランスフェクトした。ｍＲＮＡ測定に関しては、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社（カリフォルニア州）のブランチＤＮＡ技術を製造業者の仕様書に従って用いた。ＬＰＳ処理したヒト単核白血球（ＣＤ１４＋）は、約２時間以内に、ＴＮＦ−α−特異的ｍＲＮＡを誘導し、２時間後に、ＴＮＦ−αタンパク質は最高レベルとなる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてｓｉＲＮＡ候補配列によって単核白血球をトランスフェクトし、ＬＰＳで感染細胞を処理し、ＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルを約１６時間後に測定することによって、ｓｉＲＮＡのノックダウン活性をスクリーニングした。活性化したヒト初代単核白血球におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをノックダウンする能力に関して、様々なｓｉＲＮＡ配列をスクリーニングした（表９）。
【０１６９】
細胞のｍＲＮＡレベルの量を計るために、ハウスキーピング遺伝子（ｃｙｐＢ）と標的遺伝子（ＴＮＦ−α）ｍＲＮＡの両方を測定し、ＴＮＦ−αの読み取りをｃｙｐＢで標準化して、相対発光単位を得た。タンパク質レベルを定量化するために、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＴＮＦ−αＥＬＩＳＡを、製造業者の仕様書に従って使用した。
【０１７０】
表９：
2008514647.tif 000011
2008514647.tif 000012
【０１７１】
表１０、１１、１２は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに複合した特異的オリゴが、ヒト単核白血球のＴＮＦ−α遺伝子の発現レベルを標的にしてノックダウンする効果を示す。
【０１７２】
表１０：
2008514647.tif 000013
【０１７３】
表１１：
2008514647.tif 000014
【０１７４】
表１２：
2008514647.tif 000015
【０１７５】
ｓｉＲＮＡ配列を代表するセットの活性は、８０％ｍＲＮＡノックダウン活性から、検知できない活性の程度の範囲であった。一般的に、ＴＮＦ−αタンパク質レベルは、ｍＲＮＡレベルより低減された。例えば、ＴＮＦ−αｍＲＮＡ（ＴＮＦ−α−１）において５０％のノックダウンでは、ＴＮＦ−αタンパク質レベルは７５％低減した。３０％から６０％のノックダウンレベルを呈する、選択したｓｉＲＮＡの用量反応曲線を得た。計算した  ＩＣ５０値は、１０ｐＭｏｌから２００ｐＭｏｌの範囲であった。評価したｓｉＲＮＡ配列をＴＮＦ−α転写を通して分布したが、識別された最も効力のあるｓｉＲＮＡは、コード領域の中央と、３’−ＵＴＲとの２つの領域に位置していた。
【０１７６】
ＴＮＦ−α遺伝子発現のノックダウンに有効なレベルは、本発明の新規ｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物を用いて哺乳動物の細胞で達成できることが、上述の結果（表１０、１１、１２）より証明される。
【０１７７】
実施例７
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンは、ｓｉＲＮＡと共役したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、本発明のペプチド−ｓｉＲＮＡ共役体による標的遺伝子発現のノックダウンを示している。これらの研究に使用された物質及び方法は、上述のものと同じである。この実施例の結果を表１３に示す。  
【０１７８】
表１３：
2008514647.tif 000016
【０１７９】
ｓｉＲＮＡと共役した本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの多様なアセンブリは、哺乳動物対象において、ｓｉＲＮＡが媒介するＴＮＦ−遺伝子発現のノックダウンを促進するように機能することは結果より明らかである。
【０１８０】
実施例８
ｓｉＲＮＡ遺伝子発現ノックダウンの時間的経過
本実施例は、ｓｉＲＮＡが媒介する遺伝子発現ノックダウンの時間的経過に関する研究を示す。ｓｉＲＮＡ効果の持続期間をテストするために、ｅＧＦＰ発現マウス由来の繊維芽細胞を使用する以外は、上述のｓｉＲＮＡトランスフェクション手順を採用した。ここで用いたトランスフェクション試薬はリポフェクタミンであった。細胞は、異常増殖のため、１８日目にプレートを変えた。第２トランスフェクションは、第１トランスフェクション後１９日目に行った。１９日目に、トランスフェクション後、ｅＧＦＰレベルを測定した。スクランブル又はナンセンスｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）を対照群として、ＧＦＰＩ  ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰＩ）及びヘアピンｓｉＲＮＡ（Ｄ＃２１）と共に使用した。ノックダウン活性は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社対照群）で較正した。
【０１８１】
表１４：
2008514647.tif 000017
【０１８２】
ｓｉＲＮＡノックダウン活性は、第３日目頃に明らかになり、第９日目まで維持され、その後、第１７日目頃に、標的遺伝子発現は、ベースラインレベルに戻ることが、前述の研究（表１４）により実証される。第１８日目の第２トランスフェクション後、ｅＧＦＰ発現の再度の減少が生じ、試薬を細胞に繰り返し投与して、繰り返し又は持続的遺伝子発現ノックダウンをもたらすことが可能であることを示している。
【０１８３】
実施例９
哺乳動物細胞のｓｉＲＮＡノックダウン効果を延長する複数回投与プロトコル
複数回投与スケジュールによって、本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物が媒介する、哺乳動物細胞における遺伝子発現ノックダウン効果は有効に延長されることを、本実施例は実証する。この研究に用いられる物質及び方法は、表示の時にトランスフェクションを繰り返した以外は、上述の物質及び方法と同じである。スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）を、比較対照群に使用した。表１５に、ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を用いる複数回のトランスフェクションのデータをまとめてある。ＴＮＦ−α遺伝子のノックダウン活性パーセントは、遺伝子発現全体に対するパーセントを表す。
【０１８４】
表１５：
2008514647.tif 000018
【０１８５】
複数回のトランスフェクションを、ちょうどよい時に（この場合は、第１トランスフェクション後、約５日目から約７日目の間）行うと、哺乳動物細胞におけるＴＮＦ−α遺伝子発現ノックダウン効果は維持又は再誘導することができることを、前述の結果は実証している。
【０１８６】
実施例１０
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを最適化する合理的設計
本実施例は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを最適化する例示の設計及びデータを提供する。対象の合理的設計操作は、ヒストンＨ２Ｂ由来のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに関して行った。
【０１８７】
この、及び他のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの機能と構造活性との関係をより良く理解するために、Ｃ−及びＮ−末端の機能と、ＰＮ７３及び他の化学的部分間の共役体の活性とを特徴付けることによって、一次構造研究を行った。
【０１８８】
ヒトヒストン２Ｂ（Ｈ２Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列を下記に示す。
【０１８９】
ＰＮ７３、ＰＮ３６０及びＰＮ３６１は、Ｈ２Ｂのペプチドフラグメントであり、そのフラグメントに相当するＨ２Ｂタンパク質の部分は、下記では、ペプチド名に続く括弧内に示されている。下記にリストしたＰＮ３６０及びＰＮ３６１のアミノ酸配列は、ＰＮ７３の対応するアミノ酸配列と同じように並んでいる。ＰＮ７３ペプチドフラグメントは、Ｈ２Ｂアミノ酸配列でアンダーラインされており、Ｈ２Ｂアミノ酸配列の１３から４８までを表す。ＰＮ７３は、また、Ｈ２Ｂアミノ酸の１２から４８までによっても表される。ＰＮ３６０は、ＰＮ７３とＮ末端を共有するが、ＰＮ７３のＣ末端を持たず、ＰＮ３６１は、ＰＮ７３とＣ末端を共有するが、ＰＮ７３のＮ末端を持たない。ＰＮ７３共役体は、１本のｓｉＲＮＡ鎖（例えば、センス鎖）に共有結合で結合している。ＰＮ４０４は、ＰＮ７３の全てのリジンがアルギニンに置き換えられたＰＮ７３の変形で、ＰＮ５０９は、Ｎ末端でペグ化された、ペグ化ＰＮ７３（ＰＥＧ分子量１Ｋダルトン）誘導体である。
【０１９０】
Ｈ２Ｂ（ヒストン２Ｂ）アミノ酸配列
ＭＰＥＰＡＫＳＡＰＡＰＫＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫ−ＫＤＳＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＶＨＰＤＴＧＩＳＳＫＡＭＧＩＭＮＳＦＶＮＤＩＦＥＲＩＡＧＥＡＳＲＬＡＨＹＮＫＲＳＴＩＴＳＲＥＩＱＴＡＶＲＬＬＬＰＧＥＬＡＫＨＡＶＳＥＧＴＫＡＶＴＫＹＴＳＳＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）
ＰＮ７３（１３から４８）
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）
ＰＮ３６０（１３から３５；ＰＮ７３のＮ末端）
ＮＨ２−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）
ＰＮ３６１（２４から４８；ＰＮ７３のＣ末端）
ＮＨ２−ＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）
ＰＮ７３（１３から４８）−ｓｉＲＮＡ（センス鎖）共役体
ｓｉＲＮＡ−ＫＧＳＫＸＡＶＴＫＡＱＫＫＴＪＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ５９）
ＰＮ４０４（ＰＮ７３の全てのリジンをアルギニンに交換）
ＮＨ２−ＲＧＳＲＲＡＶＴＲＡＱＲＲＤＧＲＲＲＲＲＳＲＲＥＳＹＳＶＹＶＹＲＶＬＲＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）
ＰＮ５０９（ペグ化したＰＮ７３）
ＰＥＧ−  ＲＧＳＲＥＡＶＴＲＡＱＲＲＤＧＲＲＲＲＲＳＲＲＥＳＹＳＶＹＶＹＲＶＬＲＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）．
【０１９１】
前述の合理的設計誘導体ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３に関する、マウス尾繊維芽細胞における取り込み効果及び生存性試験の結果を図５に示す。マウス尾繊維芽細胞における修飾ＰＮ７３の活性の変化を示す。ＰＮ４０４とは異なり、ＰＮ５０９は、毒性を増加させることなしに、取り込みを増加させる。ＰＮ７３のＮ末端の欠失部分が活性を低減させ、Ｃ末端残基を取り除くと、活性を失くす。ＰＮ７３及びＰＮ５０９は両方とも、初代細胞において、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，カリフォルニア州）よりも高い活性を示す。
【０１９２】
実施例１１
アセチル化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、ｓｉＲＮＡの安定性を向上させる。
本実施例の目的は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３を修飾すると、ポリペプチトＰＮ７３の安定性が向上し、結果としてトランスフェクション活性が促進される否かを決定することであった。ＰＮ７３の非修飾形態、Ｎ末端をペグ化した形態、及びＮ末端をアセチル化した形態の安定性を血漿中で比較した。ＰＮ７３のＣ末端はアミド化した。血漿中で培養前と後に、紫外吸光検出器と共にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＮ７３の非修飾形態及び修飾形態の安定性を特徴付けた。
【０１９３】
血漿がない場合は、ＰＮ７３の非修飾形態、ペグ化した形態、及びアセチル化した形態とは、約９分で、独特であるが、重なるＵＶトレース（ｔｒａｃｅｓ）を示した。しかしながら、血漿に４時間曝露すると、非修飾ＰＮ７３及びペグ化したＰＮ７３に特異的なＵＶトレースは、もはや存在せず、実質的な分解を示した。対照的に、アセチル化したＰＮ７３に独特のＵＶトレースは残存し、この修飾が、非修飾及びペグ化したＰＮ７３形態に比べて、実質的にプラスミド中のＰＮ７３の安定性を向上させることを示した。
【０１９４】
血漿中のＰＮ７３の安定性を、ＰＮ７３ペプチドのＮ末端のアセチル化によって促進することができるという驚くべき予想外の発見を、これらのデータは示す。アセチル化したペプチドの一次構造は次のようになる。
Ａｃ−ＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＶＹＶＹＫＶＬＫＱ−ａｍｉｄｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）
【０１９５】
実施例１４
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはインターフェロン反応を引き出さない。
本実施例の目的は、リポフェクタミン・プラス・ｓｉＲＮＡ、又は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであるＰＮ７３ペプチド・プラス・ｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトした細胞のインターフェロン反応を比較することであった。インターフェロン反応性を、ＥＬＩＳＡ（タンパク質）及びｂＤＮＡ（ｍＲＮＡレベル）によって、アッセイを行った。
【０１９６】
従来、ｓｉＲＮＡ分子は、リポソームが媒介するトランスフェクションによって細胞に送達される。しかしながら、これは、通常、送達効率が悪く、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて炎症性反応を起こし、且つ、インターフェロン遺伝子発現をアップレギュレートして細胞増殖を阻害する。結果として、標的遺伝子発現レベルの低減に限界があり、従って、ｓｉＲＮＡは、効果のない治療法となり、遺伝子発現を研究する手段としても効果のないものとなる。ＰＮ７３によるｓｉＲＮＡの送達は、この問題を克服する。
【０１９７】
幾つかの異なるｓｉＲＮＡのトランスフェクションにおいて、リポフェクタミンのインターフェロン反応性を、ＰＮ７３ペプチドに対して比較した。ｓｉＲＮＡを、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ又は２００ｎＭの濃度で、リポフェクタミン又はＰＮ７３と複合した。インターフェロン反応性を決定する分子マーカとしての役目をするインターロイキン１β（ＩＬ−１β）及びＱｎｅＧを、陰性対照として用いた。１００ｎＭ又は２００ｎＭ  ＴＮＦ−α９  ｓｉＲＮＡと複合したリポフェクタミンは、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルの有意な増加を引き起こした。更に、テストした他のｓｉＲＮＡは全て、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルの軽度の増加を引き起こした。対照的に、ＰＮ７３ペプチドと複合した同じｓｉＲＮＡは、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルを増加させなかった。
【０１９８】
リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした細胞と、ＰＮ７３を用いてトランスフェクトした細胞において、観察されるインターフェロン反応性の相違を更に特徴付けるために、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、分子マーカであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターフェロン−α（ＩＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＭＩＰ−Ｉα、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のタンパク質発現レベルを決定した。ｓｉＲＮＡと複合したリポフェクタミンを用いてトランスフェクトした細胞と、ｓｉＲＮＡと複合したＰＮ７３を用いてトランスフェクトした細胞との相対的タンパク質発現レベルを、表１６にまとめる。
【０１９９】
表１６
2008514647.tif 000019
【０２００】
ｓｉＲＮＡ  ＬＣ２０及びＬＣ１７は、両方とも、どのトランスフェクション試薬を用いたかに関わらず、インターフェロンに反応しなかったことを、その結果は示している。しかしながら、リポフェクタミンを用いたＩＦＮ−Ｉ又はＴＮＦ−α９のトランスフェクションは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及び  ＭＩＰ−１αタンパク質発現レベルの増加を引き起こした。対照的に、ＰＮ７３を用いてテストしたｓｉＲＮＡの全てのトランスフェクションは、テストしたインターフェロン反応マーカのいずれにおいても、タンパク質発現における誘導が観察できなかった。  
【０２０１】
ＰＮ７３が媒介するｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、インターフェロン反応を引き出さないという驚くべき予想外の発見をＥＬＩＳＡアッセイのこれらのデータは示している。
【０２０２】
実施例１５
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したｓｉＲＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合したｓｉＲＮＡより大きいノックダウン活性を提供する。
本実施例の目的は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３と共役したｓｉＲＮＡ  ＬＣ１３及びＬＣ２０と、該ＰＮ７３と複合したｓｉＲＮＡ  ＬＣ１３及びＬＣ２０とのヒト単核白血球におけるノックダウン活性を比較することであった。ヒト単核白血球の単離及びトランスフェクションと、ノックダウン活性を測定するのに用いた方法に関しては前述した。Ｑｎｅｇは、無作為なｓｉＲＮＡ配列を表し、これらの実験の陰性対照として機能する。観察されたＱｎｅｇノックダウン活性は、１００％（１００％遺伝子発現レベル）に標準化し、ＬＣ２０及びＬＣ１３の活性は、陰性対照に対する相対的なパーセンテージとして表す。ＬＣ２０及びＬＣ１３は、ヒトＴＮＦ−α遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである。ＰＮ７３が存在しないとき、ＰＮ７３と複合したとき、又はＰＮ７３と共役したときの、ｓｉＲＮＡ  ＬＣ２０及びＬＣ１３のノックダウン活性を、０ｎＭから２．５ｎＭの濃度範囲でテストした。ＰＮ７３は、複合体及び共役体の実験において、１：１の割合とした。
【０２０３】
ＰＮ７３が存在しないとき、ＬＣ１３及びＬＣ２０は、ノックダウン活性をほとんど示さなかった（図６−Ｃ）。ＬＣ１３及びＬＣ２０は両方とも、ＰＮ７３と複合したとき、ＴＮＦ−α遺伝子発現において、Ｑｎｅｇ対照と相対的に約１５％及び３０％の減少を引き起こした（図６−Ｂ）。しかしながら、ＴＮＦ−αのノックダウン活性は、ｓｉＲＮＡをＰＮ７３と共役させると、６０％未満に低減された（図６−Ａ）。これは、ＰＮ７３／ｓｉＲＮＡ複合体と比較して、ｓｉＲＮＡノックダウン活性の有意な増加である。従って、ｓｉＲＮＡを例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３と共役すると、ｓｉＲＮＡノックダウン活性は有意に促進されるという驚くべき予想外の結果を、これらのデータは示している。
【０２０４】
実施例１６
例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失分析
本実施例の目的は、小分子及び高分子の細胞への送達を促進するＰＮ７３ペプチドの能力に必須の最小長を決定することであった。表１７に示すように、ペプチドのＮ末端から一度に３残基ずつを順次、欠失することによって、ＰＮ７３の先端を切り取った１０の形態を作成した。下記は、ＰＮ７３の１次構造と先端を切り取った形態を表しており、それらのトランスフェクション活性を調べる。本実施例でテストしたペプチドは全て、Ｃ末端ＦＩＴＣ（フルオレセイン−５−イソチオシアン酸塩）標識をつけた（すなわち、−ＧＫ［ＥＰＳＩＬＯＮ］Ｇ−ａｍｉｄｅ）。
【０２０５】
表１７
2008514647.tif 000020
【０２０６】
実施例１７
Ｉｎ  ＶｉｖｏにおけるｓｉＲＮＡ媒介遺伝子発現ノックダウン活性
Ａ．ｅＧＦＰマウス
２０ｇから２５ｇの体重のｅＧＦＰトランスジェニックマウスをジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）より購入した。ｓｉＲＮＡ注射に関しては、ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３を１：５の割合で、５ｍｇ／ｋｇの用量で用いた。処置は全て、三日間、日に一度、尾静脈注射によって行った。組織を、第４日に採取した。実験プロトコルは、Ｒ＆Ｒ  Ｒａｂｂｉｔａｒｙ（ワシントン州Ｓｔａｎｄｗｏｏｄ）で行い、その研究機関の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が承認した。
【０２０７】
動物からの組織を、すぐにＰＢＳに置き、氷の上に保管した。組織からの単離細胞に関しては、試料組織を、２枚の顕微鏡用すりガラススライドの間に、すりガラス面が組織に面するように、はさんだ。組織をすりつぶすために数回こすり合わせる。その後、すりつぶされた組織をスライドから、ＰＢＳを用いて１２−ウエルプレートのウエルに洗い流す。すりつぶした組織１ｍｌは、２Ｘコラゲナーゼ（筋肉用タイプＩ及び肝臓組織用タイプＩＩ）１ｍｌを含む１２ウエルプレートに移した。最終濃度は、１００ユニット／ｍｌである。コラゲナーゼ溶液中で、３７℃で３時間、組織を培養する。小片及び結合組織を取り除くために、分解された組織混合物を細胞濾過器を通して６ウエルプレートに濾過する。５００μｌ細胞をラベルを貼ったＦＡＣＳ管に移す。単離細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって決定した。
【０２０８】
ｅＧＦＰに特異的な二本鎖ｓｉＲＮＡの二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を化学的に合成した。ｓｉＲＮＡを、ＰＢＳ緩衝液又は、生理食塩水若しくはグルコース緩衝液に溶かした。
【０２０９】
３つの群の動物に（特異的ｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ単独、ペプチド／ｅＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ複合体、及び対照のｓｉＲＮＡ／ペプチド複合体）を、表１に示す様々な用量及び期間で静脈注射した。処置したマウスの末梢血を眼窩採血により採取し、抗凝血剤を加えて氷上で保管した。ＰＢＭＣをフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）ベースの遠心分離法によって単離した。ノックダウン活性は、フローサイトメトリーを用いて細胞のｅＧＦＰ蛍光強度を決定することによって、評価した。
【０２１０】
ＥＧＦＰトランスジェニック動物の筋細胞中のｅＧＦＰタンパク質の低減
トランスジェニックマウスは、ペプチドＰＮ７３と複合したｅＧＦＰトランスジェニックマウスのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとペプチドの割合１：５）で処置した（５ｍｇ／ｋｇ  ３日間）。ノックダウン活性の決定に関しては、方法の項で述べたコラゲナーゼ処理後、細胞を筋細胞から単離した。単離細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。
【０２１１】
対照のｓｉＲＮＡ及びＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ単独と比較すると、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ／ＰＮ５０９（ペグ化したＰＮ７３）複合体は、連続３日間の注射後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＥＧＦＰの有効なノックダウンを示した。
【０２１２】
ＥＧＦＰトランスジェニック動物の肝細胞中のｅＧＦＰタンパク質及びｍＲＮＡの低減
トランスジェニックマウスは、ペプチドＰＮ７３と複合したｅＧＦＰトランスジェニックマウスのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとペプチドの割合１：５）で処置した（５ｍｇ／ｋｇ  ３日間）。ノックダウン活性の決定に関しては、方法の項で述べたコラゲナーゼ処理後、細胞を肝臓組織から単離した。単離細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。
【０２１３】
対照のｓｉＲＮＡ／ＰＮ６０２及びＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ単独と比較すると、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ／ＰＮ５０９（ペグ化したＰＮ７３）複合体は、連続３日間の注射後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＥＧＦＰの有効なノックダウンを示した。ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのノックダウンに関しては、表１８にまとめてある。タンパク質発現のノックダウンは、同等である。
【０２１４】
表１８：
2008514647.tif 000021
【０２１５】
送達ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、効率的にｓｉＲＮＡを送達し、ＰＢＭＣ内のｅＧＦＰをノックダウンすることができる（最高５０％まで）。陰性対照と比較して、裸のｓｉＲＮＡも、ｅＧＦＰのノックダウンにおいて幾分、活性を示したが、送達ペプチドほど効率的ではない。
【０２１６】
Ｂ．タコニック社（Ｔａｃｏｎｉｃ）製マウス
ヒトＴＮＦ−α動物疾患モデルに関しては、２つのトランスジェニックモデルを使用した。ｔｇ１９７マウスは、ヘレニック・パスツール研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｈｅｌｌｅｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ギリシャ、アテネ）から取得し、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｔｇ（ＴＮＦ）Ｎ２１マウスは、タコニック社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から購入した。両方のヒトＴＮＦ−αトランスジェニックマウスモデルの遺伝子型は、供給者によって特定された。ｔｇ１９７マウスに関しては、６週令のマウスを、インフリキシマブ、ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３複合体、及び生理食塩水の３つの処置群に分けた。ＴＮＦ−α中和抗体系薬物であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ等）は、一般の薬局で購入し、１週間に一度、１０ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３を１：５の割合で、２ｍｇ／ｋｇの用量で用いた。全ての処置は、１週間に２度、尾静脈注射によって行った。実験プロトコルは、ＳｋｅｌｅＴｅｃｈ  社（ワシントン州ボセル）で行い、その研究機関の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）が承認した。類似の用法を、Ｂ６．ＳＪＬ−Ｔｇ（ＴＮＦ）Ｎ２１マウスに使用した。臨床スコアは、前述のスコアシステム（ｓｔｅｍ）（２，３）に基づいた。すなわち、０（正常）、１（足関節又は後足首関節の浮腫又は変形）、２（足関節及び後足首関節の変形）又は３（前足首関節又は後足首関節の硬直）である。１週間に２度、４肢全てを合計し、マウス一匹あたり、１２を最高スコアとする。
【０２１７】
ＴＮＦ−αレベルの決定、トランスジェニックマウスを使用する実験の分析に関しては、血漿試料を、眼窩採血により採取した全血から分離した。ｈＴＮＦ−αの血漿レベルは、製造業者（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）の指示に従って１：２希釈で、ＥＬＩＳＡにより決定した。  
【０２１８】
ｂＤＮＡアッセイ（カリフォルニア州フレモント、Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ社のＱｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ）を、製造業者の指示に従って行った。
【０２１９】
ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３複合体又はインフリキシマブを用いての処置後のトランスジェニックマウスにおけるヒトＴＮＦ−α血漿タンパク質レベル及びＲＡスコアの低減。
【０２２０】
ヒトＴＮＦ−αトランスジェニックマウスは、５週令で、インフリキシマブ（１０μｇ／ｋｇ、腹腔注射）と、ペプチドＰＮ７３と複合した抗ＴＮＦ−αｓｉＲＮＡ（ＬＣ２０）（ｓｉＲＮＡとペプチドの割合は１：５）（２ｍｇ／ｋｇ、静脈注射、１週間に２度）と、を用いて、処置を開始した。  ヘレニック製トランスジェニックマウスに関しては、次の基準を用いてＲＡスコアを決定した（盲検処置）。すなわち、０は正常、１は足関節又は後足首関節の浮腫又は変形、２は足関節及び後足首関節の変形、３は前足首関節又は後足首関節の硬直である。
【０２２１】
ＬＣ２０／ＰＮ７３処置群は、３週間の処置期間中、関節の関節炎の臨床的な進行が劇的に抑制される。
【０２２２】
ｓｉＲＮＡ／ＰＮ７３複合体又はインフリキシマブを用いての処置後のヒトＴＮＦ−α血漿タンパク質レベルの低減。
【０２２３】
タコニック社製マウスに関しては、血漿中のＴＮＦ−αレベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）によって決定し、処置スケジュールは、ヘレニック製トランスジェニックｈＴＮＦ−αトランスジェニックマウスと同じであった。
【０２２４】
Ｃ．ヘレニック製マウス
本実施例は、標的遺伝子発現を調節し、治療的方法で細胞の表現型を変更するのに有効な、ｓｉＲＮＡによる全身への送達及び治療的遺伝子ノックダウンを媒介する本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物の有効性を示すｉｎ  ｖｉｖｏにおけるデータを提供する。
【０２２５】
ヒトＮＦ−α発現マウスは、５週令のものを、ヘレニック・パスツール研究所（ギリシャ）から購入した。４匹のマウスのうち、２匹に、１週間に２度、３００μｌの生理食塩水と、１週間に一度、ＲＡ薬物レミケード（Ｒａｍｉｃａｄｅ）（５ｍｇ／ｋｇ）とを静脈内（ＩＶ）投与した。あとの２匹には、１週間に２度、３００μｌの生理食塩水と、１週間に２度、ＰＮ７３と混合したＬＣ２０ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）（ＬＣ２０ｓｉＲＮＡとＰＮ７３のモル比は１：５）と、を静脈内（ＩＶ）投与した。注射期間中、ＥＬＩＳＡテスト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ＃ＳＳＴＡ００Ｃ）のための血漿試料を採取し、ＲＡ疾患の進行と治療的有効性の認められた指標として、週に２度、足スコアを取った（表１９）。
【０２２６】
表１９
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【０２２７】
レミケード（Ｒａｍｉｃａｄｅ）又は生理食塩水（対照）処置したマウスにおけるレベルと比較して、循環血液中でのペプチド／ｓｉＲＮＡ処置したマウスのＴＮＦ−αタンパク質レベルの有効な低減を、前述の結果は示している。
【０２２８】
本発明のｓｉＲＮＡ／ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物と方法のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性の追加の証拠を、ＲＡ疾患状態と治療有効性の認められた表現型指標である足スコアを用いて上記のマウス対象から得た。開始点における相違（一部の動物は、より早い時点でスコアを示す）のために、実験では、スコアを全ての動物に対して０に調整した。次のスコア指標に従って、各足に０から３のスコアを与え、最高のスコアを１２とする。
０：  正常
１：  足関節又は後足首関節の浮腫又は変形
２：  足関節及び後足首関節の変形
３：  前足首関節又は後足首関節の硬直
【０２２９】
これらの足スコア評価の結果は、図４にグラフとして表している。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドＰＮ７３は、動物に注射すると、第８週のＲＡ進行の遅延によって分かるように、治療量のｓｉＲＮＡ（例えば、ＬＣ２０、ＴＮＦ−α２及びＴＮＦ−α９（ＵＡＧＣＣＣＡＵＧＵＵＧＵＡＧＣＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  １７５））を送達することができることを、そのデータは実証している。ＰＮ７３／ｓｉＲＮＡ処置したマウスは、レミケード（Ｒａｍｉｃａｄｅ）処置したマウスと比べて、第８週で足スコア指標が良くなった。処置後１１週まで足スコア評価を行うと、ＰＮ７３／ＬＣ２０複合体は、レミケード（Ｒａｍｉｃａｄｅ）処置マウスに匹敵する足スコア評価を達成した。ＰＮ７３ペプチド／ＬＣ２０  ｓｉＲＮＡを１：５の割合では、２ｍｇ／ｋｇＬＣ２０は、テストしたＬＣ２０より少ない用量と比較して、ＲＡ進行において最大の相対的遅延が観察された。ＰＮ７３及びｓｉＲＮＡ処置後に評価した、５つの異なる群に関する幾つかのｓｉＲＮＡの相対的有効性を下記の表２０にまとめる。
【０２３０】
表２０
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【０２３１】
本発明のｓｉＲＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物は、遺伝子発現を調節し、疾患を治療し管理する有望な新しい治療手段を提供することを、前述の結果は実証している。本発明のｓｉＲＮＡ、例えば、ヒトＴＮＦ−α特異的ｍＲＮＡの分解を標的とするｓｉＲＮＡは、現在の小分子、可溶性受容体又はＲＡ抗体療法よりも、特異性が高く、免疫原性が低く、疾患をより緩和する。ｈＴＮＦ−αを標的とし、単回投与により３０％から８５％のノックダウンを生じた５０を超える候補ｓｉＲＮＡ配列を、スクリーニングした。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて設計された２０を超えるペプチド複合体及び／又は共有結合分子を、単核白血球による蛍光ＲＮＡ取り込みに関して比較し、リポフェクタミン又はコレステロールと共役したｓｉＲＮＡよりも有意に取り込みが良いことを表す数字を得、且つ、＜１０ｐＭのＩＣ５０値を有することが分かった。ペプチド−ｓｉＲＮＡ製剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて活性化されたヒト単核白血球内で効率的にＴＮＦ−αｍＲＮＡ及びタンパク質レベルをノックダウンする。
【０２３２】
１つの例示的な候補の送達ペプチド／ｓｉＲＮＡ製剤を、ヒトＴＮＦ−αを構成的に発現する関節リウマチ（ＲＡ）の２つのトランスジェニックマウスモデルにおいて評価した。６週令で、週に２度ＩＶ注射による２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ又はインフリキシマブによって処置した動物は、疾患状態が第１０週まで持続した対照群と比較して、７週令でＲＡスコア（足及び関節の炎症）が安定化し始めた。９週令でｓｉＲＮＡ処置した動物は、ＲＡスコアにおいて匹敵する低下を示したが、インフリキシマブ処置した動物に比べて、血漿中のＴＮＦ−αタンパク質レベルが有意に低かった。
【０２３３】
本明細書での開示に基づいて、標的遺伝子、例えば、炎症等の病理学的状態において重要な役割を果たすＴＮＦ−α等のサイトカイン、の発現を阻害するｓｉＲＮＡの使用は、哺乳動物対象における、ＲＡによって例示されるような疾患の症状を緩和又は予防する有効な治療を提供する。本発明の方法及び組成物の範囲で用いた例示のペプチド／ｓｉＲＮＡ組成物は、例えば、ＴＮＦ−α等の標的遺伝子の産物に、抗体又は可溶性受容体の場合のように複合することによってではなく、標的遺伝子発現、例えばＴＮＦ−α発現を低減又は排除する能力に関して利点を提供する。
【０２３４】
本発明の教示に従った、核酸の全身への送達を向上させることは、薬物としてのｓｉＲＮＡの開発に更なる利点を提供する。本コンテキストにおける具体的な課題には、ｓｉＲＮＡの安定性を維持しながら、組織関門を通って標的細胞又は組織への送達、及び、細胞膜を通って細胞に有効量のｓｉＲＮＡを届ける細胞間送達が含まれる。本開示は、ヒトＴＮＦ−αの発現等の特異的遺伝子発現を標的とする新規のペプチド／ｓｉＲＮＡ組成物を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効な送達システム（ｓｔｅｍ）を初めて実証し、そのシステム（ｓｔｅｍ）は、ＲＮのマウスモデルを用いた研究によって例示したように、標的疾患が予測できるトランスジェニック動物モデルにおいて疾患活性を緩和する。関連研究においては、本発明の組成物及び方法は、ＲＡ患者由来の活性単核白血球においてＴＮＦ−αの発現を有効に阻害する。ＲＮＡｉ経路は、ＴＮＦ−経路への細胞内効果を通じて、細胞の表現型と、疾患の進行の改変とを有効に媒介し、且つ、循環する抗体／ＴＮＦ−α複合体による毒性効果をＲＡの現行の抗体療法を特徴付ける残留する免疫反応性と共に回避することを、これらの結果は示している。特に、これらの実施例で示したｓｉＮＡ及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの用量は、常に少なくとも８０％から９０％、又はそれ以上の細胞生存レベルと相関するように、本明細書に記載したテストは全て、関連する毒性効果を最小限にして実施した。
【０２３５】
Ｄ．マウスＬＰＳ反応
正常な（マウスタイプ）マウスを、様々なＬＰＳ濃度で腹腔内注射又は静脈注射によって処置した。ＬＰＳ反応性は、ＬＰＳ注射後、様々な時間に採取した血液中のＴＮＦ−αのレベルを測定することによって決定した。ＴＮＦ−α誘導の線形の範囲は、ＩＰ投与におけるＬＰＳ注射に関しては１０ｎｇと１００ｎｇとの間、ＩＶ注射による場合は最高２５ｎｇであった。最高ＴＮＦ−α誘導の平均時間は、ＬＰＳ注射後７０分である。これらの結果に基づいて、更なる実験のために、ＩＰ投与に関しては２５ｎｇ、ＩＶ投与に関しては１０ｎｇのＬＰＳ用量を選択した。
【０２３６】
ＴＮＦ−αのＬＰＳ誘導に対するｓｉＲＮＡの効果は、治療スケジュールごとに６匹のマウスを用いて、２ｍｇ／ｋｇｓｉＲＮＡ用量の、（１）ＬＣ１３／ＰＮ７３、（２）ＬＣ１３単独、（３）Ｑｎｅｇ／ＰＮ７３、（４）ＰＮ７３、（５）緩衝剤単独、を注射によってテストした。ＬＰＳ誘導は、最後のｓｉＲＮＡ注射後２４時間で行い、０．２μｇＬＰＳと血液をＬＰＳ注射後９０分で採取した。ＬＣ１３（試料１，２）は、陰性対照群（試料３から５）と比較して、ＬＰＳ誘導の結果、循環ＴＮＦ−αの量を低下させたことを、結果（下記）は示している。
【０２３７】
第２の実験的アプローチは、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡ用量の組成物（１）ＬＣ１３／ＰＮ７３、（２）Ｉｎｍ−２／ＰＮ７３、（３）Ｉｎｍ−４／ＰＮ７３、（４）Ｑｎｅｇ／ＰＮ７３、（５）ＰＢＳ（緩衝剤対照）を用いて、行った。３０匹の動物を用いて３つの研究を行った。各投薬スケジュールは、連続４日、連続８日、及び連続１１日であった。ｓｉＲＮＡ注射後２４時間でＬＰＳ誘導が行われた（２５ｎｇ  ＬＰＳ（ＩＰ））。ＬＰＳ注射後、７０分で採血した。Ｉｎｍ−４は、連続４日の実験（ｎ＝１テスト）において、ＬＣ１３、Ｉｎｍ−２、及びＱｎｅｇに比べて、最大のＫＤ活性を示したことを、その結果は示している。第８日及び第１１日の測定結果は、尾注射の繰り返しに一部、起因する技術的問題のために、変動的な結果となった。
【０２３８】
前述の発明を、理解を明瞭にするために、実施例を用いて詳細に記載してきたが、限定の目的ではなく例証のために提供する請求項の範囲内で、一部の変更及び修正を行ってもよいことは当業者には明らかであろう。このコンテキストにおいて、記載を簡略にするために、前述の開示において、様々な出版物及び他の参考文献を引用した。これら参考文献の各々は、あらゆる目的で、その全体を参照することによりここに組み込んだ。しかしながら、ここで論じた様々な出版物は、本出願の出願日以前の開示のためのみここに組み込むのであり、その発明者は、先行発明によって、この開示に先行する権利を有することに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】図１は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）に複合したｓｉＲＮＡ又は共役したｓｉＲＮＡのペプチド媒介取り込み及び細胞生存性への影響を示す図である。細胞への取り込み及び細胞生存性は、パーセントで表す。
【図２】図２は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）に複合したｓｉＲＮＡ又は共役したｓｉＲＮＡのペプチド媒介取り込みを更に示す図である。細胞への取り込みは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表す。
【図３】図３は、幾つかの異なるポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを用いた、ヒト単核白血球におけるｓｉＲＮＡのペプチド媒介取り込みを示す図である。
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡ／ペプチドを注射されたマウスは、レミケード治療（Ｒａｍｉｃａｄｅ−ｔｒｅａｔｅｄ）をした被検体に相当するほどＲＡの進行が遅延することを示す図である。ＲＡの進行は、足スコア指標（ｐａｗ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）によって測定した。
【図５】図５は、本発明の誘導体ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを合理的に設計したＰＮ７３の、マウス尾繊維芽細胞における、取り込み効果及び細胞生存性検査試験の結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したｓｉＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに複合したｓｉＲＮＡよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高いノックダウン活性を有することを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したｓｉＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに複合したｓｉＲＮＡよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高いノックダウン活性を有することを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したｓｉＮＡは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに複合したｓｉＲＮＡよりもｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高いノックダウン活性を有することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2008514647.tif 000030
【図６Ｃ】
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【配列表】
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