(57)【要約】低分子量分子が提供され、これらとしては、異常に折り畳まれてかつ障害されたタンパク質の凝集を安定化させかつ防止する、ペプチド、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。このペプチド、ペプチドアナログもしくはペプチド模倣物を利用するか、またはこのペプチドをコードする核酸を利用する、疾患の処置のための方法が提供される。本発明は、分子シャペロン活性を有する約５０アミノ酸長までのポリペプチドをその必要な被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物に検体において疾患を処置するためのポリペプチド組成物生物、機能的改変体およびそのペプチド模倣物、ならびに方法を提供する。
2008520555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、
各々のＸ１、Ｘ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、ポリペプチドまたはその機能的な改変体もしくは模倣物。
【請求項２】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、またはＸ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドＸ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、
各々のＸ１、Ｘ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、ポリペプチドまたはその機能的な改変体もしくは模倣物。
【請求項５】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記機能的改変体がＸ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドＸ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、
各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、ポリペプチドまたはその機能的な改変体もしくは模倣物。
【請求項８】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記機能的改変体がＸ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、
各々のＸ１、Ｘ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、ポリペプチドまたはその機能的な改変体もしくは模倣物。
【請求項１１】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記機能的改変体がＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記機能的改変体がＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖのアミノ酸モチーフを含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
哺乳動物被験体においてタンパク質高次構造疾患を処置するための方法であって、該処置を必要とする被験体にポリペプチドを投与する工程を包含し、該ポリペプチドが、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、方法。
【請求項１５】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドの前記機能的改変体がＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が加齢性筋障害である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が心虚血である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物被験体におけるタンパク質高次構造疾患を処置するための方法であって、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２またはその機能的な改変体もしくは模倣物をコードする核酸を投与する工程を包含し、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、方法。
【請求項２２】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドの前記機能的改変体がＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患が加齢性筋障害である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患が心虚血である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質を安定化するための方法であって、該タンパク質と、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物とを接触させる工程を包含し、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる、方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が治療タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療タンパク質が、ワクチン、インスリン、成長因子または抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物被験体における疾患状態を処置するために治療タンパク質の安定性を増大する工程をさらに包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が組換え産生されるタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質の誤まった折り畳みを阻害する工程、またはタンパク質凝集を軽減する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質に対する正確な折り畳みまたは天然の折り畳みを回復する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドがＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物被験体におけるタンパク質高次構造疾患を診断するための方法であって：
該哺乳動物被験体由来の組織サンプルとポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物とを接触させる工程であって、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる工程と、
誤まって折り畳まれたタンパク質、折り畳まれていないタンパク質、または凝集されたタンパク質の該ポリペプチドに対する結合を検出する工程と、
該哺乳動物被験体における該疾患の有無を決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記疾患の有無がタンパク質の誤まった折り畳み、折り畳まれていないこと、または凝集の段階によって検出される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質高次構造疾患が、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が加齢性筋障害である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患が心虚血である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドがＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
タンパク質の誤まった折り畳み、タンパク質が折り畳まれないこと、またはタンパク質の凝集の活性の調節因子についてスクリーニングするインビトロの方法であって：
標的タンパク質と、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物とを接触させる工程であって、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる工程と、
タンパク質凝集活性の量の減少を検出する工程であって；これによってタンパク質の誤まった折り畳み、タンパク質が折り畳まれないこと、またはタンパク質凝集活性の調節因子として該ポリペプチドを同定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記標的タンパク質が、アミロイドβ、β／γクリスタリン、アクチン、デスミン、ビメンチン、インスリン、クエン酸シンターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、αラクトアルブミン、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子β、神経成長因子β、上皮細胞成長因子、血管内皮増殖因子、βカテニン、腫瘍壊死因子α、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−Ｘ１またはカスパーゼである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドがＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
タンパク質の誤まった折り畳み、タンパク質が折り畳まれないこと、またはタンパク質の凝集の活性の調節因子についてスクリーニングするインビボの方法であって：
標的タンパク質を発現する細胞または細胞株と、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物をコードする試験化合物とを接触させる工程であって、各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる工程と、
タンパク質凝集活性の量の減少を該細胞株中で検出する工程であって、これによってタンパク質の誤まった折り畳み、タンパク質が折り畳まれないこと、またはタンパク質凝集活性の調節因子として該ポリペプチドを同定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記標的タンパク質が、アミロイドβ、β／γクリスタリン、アクチン、デスミン、ビメンチン、インスリン、クエン酸シンターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、αラクトアルブミン、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子β、神経成長因子β、上皮細胞成長因子、血管内皮増殖因子、βカテニン、腫瘍壊死因子α、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−Ｘ１またはカスパーゼである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記機能的改変体がＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドがＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国仮特許出願第６０／６２５，３６４号（２００４年１１月４日出願）および米国仮特許出願第６０／７２４，９６１号（２００５年１０月７日出願）に関連し、これらの仮特許出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府支援の言明）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金番号ＥＹ０４５４２による政府支援によって行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（分野）
本発明は、限定はしないが、タンパク質の天然ではない状態を安定化させ、かつ折り畳まれないか、異常に折り畳まれるかまたは誤まって折り畳まれたタンパク質の凝集を防止する、ペプチド、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物を包含する低分子量分子に関する。本発明はさらに、このペプチド、ペプチドアナログもしくはペプチド模倣物、またはこのペプチドをコードする核酸を利用する、タンパク質高次構造疾患の処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
タンパク質は、遺伝子によってコードされるアミノ酸の配列から構成される、そして細胞のタンパク質合成機構によって合成される、大きいポリペプチド鎖である。タンパク質の合成に引き続いて機能的な３次元構造に折り畳まれ、これにはしばしば分子シャペロンと呼ばれる別々のタンパク質の関与を必要とする。分子シャペロンは、合成されたポリペプチドのその機能的な形態への正常な折り畳みを補助する内因性の専門的なタンパク質である。正確に折り畳まれたタンパク質は、その目的地に輸送され、そこでそれらの機能（単数または複数）を果たす。
【０００５】
変異、分子および環境的なストレス、翻訳後改変、タンパク質分解および加齢は、タンパク質の構造を変更し得、これが機能の変更された折り畳まれていないタンパク質または誤まって折り畳まれたタンパク質をもたらす。この変更された機能は、限定はしないが、重要な細胞プロセスの破壊、凝集に起因する毒性および細胞死の応答を含む多数の機構を通じて罹患率の増大をもたらし得る。
【０００６】
分子シャペロンと部分的に折り畳まれたポリペプチドとの間の相互作用は、タンパク質未折り畳みおよび凝集の疾患に対する天然の防御である。タンパク質高次構造の疾患は、身体の天然のタンパク質が、構造的不安定性に起因して機能を得るかまたは失う時に生じる。タンパク質凝集疾患は、折り畳まれていないタンパク質または誤まって折り畳まれたタンパク質が細胞に毒性である凝集を形成するタンパク質高次構造疾患のサブタイプである。多数のタンパク質高次構造疾患は、加齢の天然の結果である。年齢とともに、タンパク質未折り畳みおよび凝集の致死的な効果から細胞が細胞自体を防御する能力は大きく低下する。タンパク質未折り畳みおよび誤まった折り畳みに対する天然の防御分子である分子シャペロンの能力は、年齢とともに劇的に低下し、一方で未折り畳みおよび誤まった折り畳みのタンパク質の数は劇的に増大する。結果として、再折り畳みおよび分解のような防御経路が無効になり、細胞および／または組織から非機能的な構造的に損なわれたタンパク質を除去することができない場合、この結果は、タンパク質未折り畳みおよび凝集の疾患である（表１）。非特許文献１。
【０００７】
表１：タンパク質高次構造疾患およびそれらの疾患に関連しているそれぞれの病因タンパク質のリスト
【０００８】
【表１−１】
2008520555.tif 000003
分子シャペロンは、数千のペプチドから構成され得るが、タンパク質高次構造疾患に対するそれらの機能に必須であるのはこのペプチドのごくわずかな部分のみである。非特許文献２。タンパク質分子シャペロンはインビボでは極めて効率的であるが、それらのサイズの膨大さによって、治療適用でのそれらのバイオアベイラビリティは制限される。
【非特許文献１】ＳａｎｄｅｒｓおよびＭｙｅｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３３：２５〜５１，２００４．
【非特許文献２】ＳａｎｔｈｏｓｈｋｕｍａｒおよびＳｈａｒｍａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：１４７〜１５５，２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、分子シャペロンの機能的特徴を有するペプチドについて当該分野では明確かつ満たされていない必要性が存在しており、これは、さらに容易に生成され、そして種々の治療および製造の適用で用いられる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
本発明は一般に、折り畳まれないか、異常に折り畳まれるか、または誤って折り畳まれたタンパク質の凝集を安定化させかつ軽減させる、ポリペプチド、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物に関する。従って、本発明は、タンパク質の誤まった折り畳みおよび／または凝集を阻害し、従って種々の治療適用および製造適用、例えば、タンパク質の誤まった折り畳みおよび／または凝集に関連する疾患および障害の処置ならびに組換えタンパク質の製造および生成のための方法を含む適用において有用である、ペプチドに基づく組成物、ペプチド改変体組成物、またはペプチド模倣組成物を提供する。本発明は、分子シャペロン活性を有する約５０アミノ酸長までのポリペプチドをその必要な被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物に検体において疾患を処置するためのポリペプチド組成物生物、機能的改変体およびそのペプチド模倣物、ならびに方法を提供する。この方法は、疾患、例えば、タンパク質凝集に関する疾患、ならびに加齢性筋障害および心虚血のような疾患を処置するために有用である。タンパク質を安定化するための方法が提供され、この方法は、分子シャペロン活性を有する約５０アミノ酸長までのポリペプチドとこのタンパク質とを接触させる工程を包含する。治療タンパク質が疾患を処置する有効性を増大するための方法が提供される。組換え生成タンパク質の生成を増大する方法が提供される。この方法は、タンパク質凝集を制限する約５０アミノ酸長までのポリペプチドを提供し、そして組換えタンパク質に活性なタンパク質組成物生物としてポリペプチドの正確な折り畳みを提供する。
【００１１】
ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物が提供され、ここで各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である。ある詳細な局面では、この機能的改変体は、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、またはＸ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１２】
ポリペプチドＸ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物が提供され、ここで各々のＸ１、Ｘ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である。ある詳細な局面では、この機能的改変体はＸ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１３】
ポリペプチドＸ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物が提供され、ここで各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である。ある詳細な局面では、この機能的改変体は、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１４】
ポリペプチドＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２またはその機能的な改変体もしくは模倣物が提供され、ここで各々のＸ１、Ｘ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物が、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換である。ある詳細な局面では、この機能的改変体はＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。この機能的改変体は、Ｉ−Ｘ−Ｉ／Ｖのアミノ酸モチーフを含む。
【００１５】
哺乳動物被験体においてタンパク質高次構造疾患を処置するための方法が提供され、この方法は、その必要な被験体にポリペプチドを投与する工程を包含し、このポリペプチドは、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物であって、ここで各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む。ある詳細な局面では、この機能的改変体はＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる詳細な局面では、Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドの上記機能的改変体は、Ｉ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む。この疾患としては、限定はしないが、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病が挙げられる。この疾患としてはさらに、限定はしないが、加齢性筋障害または心虚血が挙げられる。
【００１６】
哺乳動物被験体におけるタンパク質高次構造疾患を処置するための方法が提供され、この方法は、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２またはその機能的な改変体もしくは模倣物をコードする核酸を投与する工程を包含し、ここで各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む。ある詳細な局面では、この機能的改変体は、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる詳細な局面では、Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドの上記機能的改変体は、Ｉ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む。この疾患としては、限定はしないが、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病が挙げられる。この疾患としてはさらに、加齢性筋障害または心虚血が挙げられる。
【００１７】
タンパク質を安定化するための方法が提供され、この方法は、このタンパク質と、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物とを接触させる工程を包含し、ここで各々のＸ１およびＸ２はお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎは０〜５０にわたって変化し、かつｎはＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣物を含む。詳細な局面では、この機能的改変体は、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる詳細な局面では、Ｘ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドは、Ｉ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む。
【００１８】
治療タンパク質であるタンパク質を安定化するための方法がさらに提供される。この治療タンパク質としては、限定はしないが、ワクチン、インスリン、成長因子または抗体が挙げられる。さらなる局面では、このタンパク質は、組換え産生されたタンパク質である。タンパク質を安定化するための方法はさらに、哺乳動物被験体において疾患状態を処置するために治療タンパク質の安定性を増大する工程を包含する。この方法はさらに、タンパク質の誤まった折り畳みを阻害する工程、またはタンパク質の凝集を軽減する工程を包含する。この方法はさらに、タンパク質に対する正確な折り畳みまたは天然の折り畳みを回復する工程を包含する。
【００１９】
哺乳動物被験体におけるタンパク質高次構造疾患を診断するための方法が提供され、この方法は、この哺乳動物被験体由来の組織サンプルと、ポリペプチドＸ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、もしくはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２、またはその機能的な改変体もしくは模倣物とを接触させる工程であって、ここで各々のＸ１およびＸ２がお互いに独立して、ｎアミノ酸の任意のアミノ酸配列に相当し、ｎが０〜５０にわたって変化し、かつｎがＸ１およびＸ２において同一であるかまたは異なる工程と、誤まって折り畳まれたタンパク質、折り畳まれていないタンパク質、または凝集されたタンパク質のこのポリペプチドに対する結合を検出する工程と、この哺乳動物被験体におけるこの疾患の有無を検出する工程と、を包含する。さらなる局面では、この疾患の有無は、タンパク質の誤まった折り畳み、折り畳まれていないこと、または凝集の段階によって検出される。さらなる局面では、この機能的改変体または模倣物は、保存的アミノ酸置換またはペプチド模倣置換を含む。詳細な局面では、この機能的改変体は、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＷＩＲＲＰＦＦＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＦＦＰＦＨＳＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＰＦＨＳＰＳＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＤＱＦＦＧＥＨＬ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＦＧＥＨＬＬＥ−Ｘ２、Ｘ１−ＩＡＩＨＨＰＷＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＰＦＹＬＲＰＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＬＳＰＦＹＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＹＬＲＰＰＳＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＰＰＳＦＬＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＰＰＳＦＬＲＡＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＦＬＲＡＰＳＷ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＲＡＰＳＷＦＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＲＬＥＫＤＲＦＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＳＶＮＬＤＶＫ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＫＶＫＶＬＧＤ−Ｘ２、Ｘ１−ＦＩＳＲＥＦＨＲ−Ｘ２、Ｘ１−ＨＧＦＩＳＲＥＦ−Ｘ２、Ｘ１−ＫＹＲＩＰＡＤＶ−Ｘ２、Ｘ１−ＥＦＨＲＫＹＲＩ−Ｘ２、Ｘ１−ＳＲＥＦＨＲＫＹ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＩＴＳＳＬＳ−Ｘ２、Ｘ１−ＧＶＬＴＶＮＧＰ−Ｘ２、Ｘ１−ＬＴＶＮＧＰＲＫ−Ｘ２、またはＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２に対して約７０％以上のアミノ酸配列同一性を含む。さらなる詳細な局面では、このＸ１−ＲＴＩＰＩＴＲＥ−Ｘ２ポリペプチドは、Ｉ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む。この疾患としては、限定はしないが、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン病、ハンチントン病、白内障、網膜色素変性症、プリオン病または狂牛病が挙げられる。この疾患としてはさらに、限定はしないが加齢性筋障害または心虚血が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な説明）
本発明は、タンパク質の天然でない状態を模倣し、かつ未折り畳み、異常な折り畳みまたは誤まって折り畳まれたタンパク質の凝集を防止するポリペプチド、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物を提供する。従って、本発明は、タンパク質の誤まった折り畳み、異常な折り畳み、および／または凝集を阻害し、従って、例えば、タンパク質の誤まった折り畳み、異常な折り畳みおよび／または凝集に関連する疾患および障害の処置を含む、種々の治療および製造の適用において、そして組換えタンパク質の製造および精製のための方法において有用である、ペプチドに基づく組成物を提供する。
【００２１】
図１は、誤まって折り畳まれたタンパク質を安定化するか、および／またはタンパク質の凝集を防止するインテリペプチド（Ｉｎｔｅｌｌｉｐｅｐｔｉｄｅ）のための治療適用を示す図である。新しく合成されたタンパク質（Ｕ）、部分的に折り畳まれた中間体（Ｉ）および完全に折り畳まれた天然のタンパク質（Ｎ）の正常な経路の図を、太字の連続的な矢印を用いて示す。図の細い矢印は、タンパク質凝集および分解の代表的な経路を示す。タンパク質の誤まった折り畳みおよび凝集疾患の病理を妨げるためにインテリペプチドが介入できる治療介入の可能性のある部位は、稲妻で示す。
【００２２】
天然のレンズタンパク質βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンを用いるヒトαＢクリスタリンにおける、そしてインビトロのシャペロン標的タンパク質、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼおよびクエン酸シンターゼにおける、シャペロン活性のための相互作用的なポリペプチド配列を、タンパク質ピンアレイによって同定した。誤まって折り畳まれたタンパク質の凝集を安定化させかつ凝集を減少させる活性を有するポリペプチドフラグメントは、ヒトαＢクリスタリンタンパク質のＮ末端ドメイン、αクリスタリンコアドメイン、またはＣ末端ドメイン由来のポリペプチド配列を含む。Ｎ末端ドメインは、シャペロン活性を有する相互作用的なポリペプチド配列、９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０および４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８を含んだ。Ｎ末端ドメインはまた、シャペロン活性を有する以下の相互作用的ポリペプチド配列を含んだ：ＷＩＲＲＰＦＦＰ、ＰＦＦＰＦＨＳＰ、ＦＰＦＨＳＰＳＲ、ＤＱＦＦＧＥＨＬ、ＦＦＧＥＨＬＬＥまたはＩＡＩＨＨＰＷＩ、ＳＰＦＹＬＲＰＰ、−ＳＬＳＰＦＹＬＲ、ＦＹＬＲＰＰＳＦ、ＬＲＰＰＳＦＬＲ、ＰＰＳＦＬＲＡＰ、ＳＦＬＲＡＰＳＷ、ＬＲＡＰＳＷＦＤ。αクリスタリンコアドメインは、シャペロン活性を有する相互作用的なタンパク質配列、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）を含んだ。αクリスタリンコアドメインはまた、シャペロン活性を有する相互作用的なタンパク質配列：ＲＬＥＫＤＲＦＳ、ＬＫＶＫＶＬＧＤ、ＨＧＦＩＳＲＥＦ、ＫＹＲＩＰＡＤＶ、ＥＦＨＲＫＹＲＩ、ＳＲＥＦＨＲＫＹまたはＬＴＶＮＧＰＲＫを含んだ。Ｃ末端ドメインは、高度に保存されたＩ−Ｘ−Ｉ−Ｖアミノ酸モチーフを含んだ相互作用的な１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４を含んだ。αクリスタリンコアドメインに属する２つの相互作用配列、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１をペプチドとして合成して、インビトロにおけるシャペロン活性についてアッセイした。両方の合成ペプチドが、インビトロにおけるβＨクリスタリン、アルコールデヒドロゲナーゼおよびクエン酸シンターゼの熱凝集を阻害した。ピンアレイによって同定された７つのシャペロン配列のうち５つが、ヒトαＢクリスタリンにおけるサブユニット−サブユニット相互作用の配列として以前に同定された配列と重複した。この結果、ヒトαＢクリスタリンにおける相互作用的な配列が、サブユニット−サブユニットのアセンブリにおいておよびシャペロン活性において二重の役割を有することが示唆された。
【００２３】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物学的な系には限定されず、当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであって、限定を意図するものではないことがまた理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形、「ある、１つの（「ａ」、「ａｎ」）」および「この、その（「ｔｈｅ」）」とは、文脈が明確に他を示すので無い限り、複数の言及を包含する。従って、例えば、「ある細胞、１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という言及は、２つ以上の細胞の組み合わせなどを包含する。
【００２４】
量、時間間隔などのような測定可能な値について言及する場合、本明細書において用いられる「約、およそ、ほぼ（ａｂｏｕｔ）」とは、特定の値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、それよりさらに好ましくは±１％、そしてなおさらに好ましくは±０．１％という変動を包含することを意味しており、従ってこのような変動は、開示された方法を行うのに適切である。
【００２５】
他に規定しない限り、本明細書において用いられる全ての技術および化学的用語は、本発明が関与する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるのと同様であるかまたは等価である任意の方法および物質が、本発明の試験のための実施において用いられ得るが、好ましい物質および方法が本明細書において記載される。本発明を記載および特許請求するのにおいて、以下の用語を用いる。
【００２６】
（ペプチド）
本発明のペプチド、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物は、本明細書において、総称して、「インテリペプチド（Ｉｎｔｅｌｌｉｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、「凝集阻害ペプチド（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、「異常なタンパク質の折り畳み、タンパク質の未折り畳み、タンパク質の誤まった折り畳み、またはタンパク質凝集を阻害するペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ，ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ，ｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。インテリペプチドは、タンパク質ピンアレイ、コンピューターモデリング、構造的にかつ機能的に類似のタンパク質のマルチ配列アラインメント分析、分光学的なインビトロシャペロンアッセイ、および／またはインビボの細胞殺傷アッセイを用いて同定される。
【００２７】
インテリペプチドは、限定はしないが、アミロイドβ、β／γクリスタリン、アクチン、デスミン、ビメンチン、インスリン、クエン酸シンターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、αラクトアルブミン、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子β、神経成長因子β、上皮細胞成長因子、血管内皮増殖因子、βカテニン、腫瘍壊死因子α、Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−Ｘ１およびカスパーゼを含む広範な種々の標的タンパク質のタンパク質未折り畳み、誤まった折り畳みまたは凝集を安定化して防止する。
【００２８】
哺乳動物被験体においてタンパク質立体配置疾患を処置するための方法では、インテリペプチドは、広範な種々の標的タンパク質のタンパク質未折り畳み、誤まった折り畳みまたは凝集を安定化およびまたは防止するのに有用である。タンパク質を標的にする疾患としては限定はしないが、神経変性疾患：アルツハイマー病（アミロイドβ、τ）；パーキンソン病（αシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、τ）；クロイツフェルト・ヤコブ病（アミロイドタンパク質）；クル病（アミロイドタンパク質）；ＧＳＳ病（アミロイドタンパク質）；ハンチントン病（ハンチントン）；ポリグルタミン病（アトロピン−１、アタキン（ａｔａｘｉｎｓ））；プリオン病（プリオンタンパク質）；牛海綿状脳症（ＢＳＥ）（プリオンタンパク質）；筋萎縮性側索硬化症（スーペーオキシド・ディスムターゼ）；アレグサンダー病（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）；原発性全身性アミロイドーシス（免疫グロブリン軽鎖またはフラグメント）；二次性全身性アミロイドーシス（血清アミロイドＡのフラグメント）；老人性全身性アミロイドーシス（トランスサイレチンおよびフラグメント）；老化のアミロイドーシス（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ）；眼の病気；白内障（クリスタリン、フィラメント）；網膜色素変性症（ロドプシン）；黄斑変性症（アミロイドβ、クリスタリン）；および他の疾病；膵島アミロイド（インスリン）；甲状腺の髄様癌（カルシトニン）；遺伝性腎アミロイドーシス（フィブリノーゲン）；血液透析関連アミロイドーシス（β２ミクログロブリン）；デスミン関連心筋症（デスミン）；シャルコー・マリー・ツース病（ＰＭＰ−２２）；尿崩症（アクアポリン）；尿崩症（バソプレッシン受容体）；シャルコー・マリー・ツース病（コネキシン３２）；嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）。例えば、ＳａｎｄｅｒｓおよびＭｙｅｒｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，３３：２５〜５１，２００４を参照のこと。
【００２９】
一実施形態では、本発明のインテリペプチドは、αＢクリスタンのフラグメントを含むかまたはそのフラグメントから構成される。別の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、限定はしないが、図６、７、８、９、１０および１１ならびに表４に提供されるペプチドを含むαＢクリスタリンから同定されたペプチド配列の親のセットと構造的にかつ機能的に類似であるペプチドを含むか、またはそれから構成される。本発明は、これらの配列の親のセットおよび親のセットのペプチドアナログおよびペプチド模倣物が、誤まって折り畳まれたまたは未折り畳みのサブユニットとの間の相互作用を妨げて、タンパク質凝集の形成を阻害することを実証する。さらに、インテリペプチドは、再折り畳みを招く防御環境を提供することによって、誤まった折り畳みまたは未折り畳み中間物を安定化する。
【００３０】
特定の実施形態では、インテリペプチドは、ペプチドアナログおよびペプチド模倣物を含む。実際、インテリペプチドは、本明細書に記載されるものを含む、任意の種々の異なる改変を有するペプチドを包含する。
【００３１】
インテリペプチドアナログは一般に、以下の配列のいずれかのような、例えば、本明細書に記載される任意の特定のペプチドを含むリードペプチドの化学的修飾によって、設計および生成される：ｉ）ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ；ｉｉ）ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ；ｉｉｉ）ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫ；ｉｖ）ＳＴＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ；ｖ）ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＳＰ；ｖｉ）ＧＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉ）ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉｉ）ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ；ｉｘ）ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲまたはその機能的な改変体もしくはペプチド模倣物。分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンタンパク質の例示的なポリペプチドフラグメントは、例えば、Ｎ末端ドメインポリペプチドフラグメントが、９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０もしくは４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８であり、αクリスタリンコアドメインポリペプチドフラグメントが７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５もしくは１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１であり、またはＣ末端ドメインポリペプチドフラグメントが１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４で、またはその機能的な改変体である。本発明は、それらのペプチドがその全体としてそして構成的アミノ酸の任意の側鎖を改変することによって作成される誘導体が、タンパク質の凝集を妨げ、タンパク質を正確に折り畳み、そしてタンパク質を安定化する能力を有することを明確に確認する。本発明はさらに、本明細書に記載される配列のアミノ酸配列および機能的改変体またはペプチド模倣物を含む、約５０アミノ酸長までのポリペプチドを包含する。
【００３２】
一実施形態では、本発明のインテリペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端修飾を含む。Ｎ末端アセチル化または脱アミノによって、アミドの存在下での多数のアミノペプチダーゼによる消化に対する防御が付与されるか、またはＣ末端カルボキシル基のアルコール置換は、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢを含むいくつかのカルボキシペプチダーゼによる開裂を妨げる。
【００３３】
別の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、側鎖改変を包含する。天然でないアミノ酸の存在は一般に、ペプチド安定性を増大する。さらに、これらのアミノ酸の少なくとも１つ（αアミノイソ酪酸またはＡｉｂ）は、モデルのペプチドに対して大きな制約を課し、それらの立体配置の可塑性を低下させる。従って、Ａｉｂの導入は、ペプチド安定性および阻害活性を同時に増強すると期待される。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明のインテリペプチドは、α炭素に修飾を含む。ペプチド安定性を改善するために最も一般的に用いられるα炭素修飾は、αメチル化である。さらに、Ｐｈｅ、ＶａｌまたはＬｅｕのα炭素に結合された水素原子の置き換えは、βプリーツシート構造の形成に適したβバンド立体配置の採用を支持する。本発明によれば、インヒビターペプチドにおけるそれらの残基のメチル化は、安定性および力価を増強すると期待される。
【００３５】
別の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、キラリティーの変化を包含する。Ｄエナンチオマーによる天然のＬ残基の置換は、タンパク質分解性の変性に対する耐性を劇的に増大する。Ｄエナンチオマーを含む凝集インヒビターは、凝集の防止において、凝集阻害親ペプチドのＬエナンチオマー型と同程度に有効である。
【００３６】
別の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、環状ペプチドである。立体配置が拘束された環状ペプチドは、それらの立体配置の可塑性の減少およびエキソペプチダーゼ切断に対する耐性の改善に起因して直線のペプチドよりも良好な薬物候補物である。直線の配列を環状の構造に変換するためには２つの別のストラテジーが用いられ得る。１つはジスルフィド架橋の形成を通じて環化を達成するシステイン残基の導入であり、もう１つは、樹脂結合したヘッド−ツー−テール（頭−尾）環化に関与する側鎖結合ストラテジーである。ペプチダーゼ配列の改変を回避するために、後者のアプローチを用いる、凝集阻害ペプチドは、大環化を容易にするための理想的な配列を含む。なぜなら、プロリンは、ターンおよびループを促進するその能力に起因して、多くの天然に存在するまたは人工的に合成された環状ペプチドの構成であるからである。
【００３７】
別の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、シュードペプチドである。シュードペプチドまたはアミド結合した代用物とは、ペプチド結合のいくつか（または全て）の化学的改変体を含むペプチドをいう。アミド結合代用物の導入は、ペプチド分解を減少するだけでなく、ペプチドの生化学的特性のいくつか、詳細には、立体配置の可塑性および疎水性も有意に改変し得る。立体配置の増大は、結合部位に対してインヒビターをドッキングするために有益であると考えられる。他方では、凝集し易いタンパク質とインヒビターとの間の相互作用は、疎水性相互作用に大きく依存するので、疎水性を増大するアミド結合置換は、親和性を、従ってインヒビターの力価を増強し得ると考えられる。さらに、疎水性の増大はまた、膜を横切るペプチドの輸送を増強し、従って、障壁（血液脳関門および腸内障壁）透過性を改善し得る。置換するアミド結合は、エキソプロテアーゼ分解を妨げるためにペプチドの末端に、そして各々のプロリンの後に位置する結合である。なぜなら、頻繁なエンドペプチダーゼ切断部位が、プロリンエンドペプチダーゼとして公知の酵素によってこの残基の後ろに存在することが記載されているからである。
【００３８】
本発明のポリペプチドの特徴を改善または変更するために、タンパク質工学を使用してもよい。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規な変異タンパク質またはムテインを作成してもよい。このような改変ポリペプチドは、例えば、増大／減少した生物学的活性または増大／減少した安定性を示し得る。さらに、それらは、高収率で生成され得、そして、少なくとも特定の精製および保管条件下では、対応する天然のポリペプチドよりも優れた安定性を示す。さらに、本発明のポリペプチドは、ダイマー、トリマーおよびテトラマーを含むマルチマーとして生成され得る。多量体化は、リンカーまたは組換えによって、Ｆｃ領域のような異種ポリペプチドでも容易にされ得る。
【００３９】
１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失なしにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９８４〜２９８８、１９９３を参照のこと。従って、本発明は、アミノ末端から１つ以上の残基が欠失されているポリペプチドを提供する。同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失変異体の多くの例が公知である（例えば、Ｄｏｂｅｌｉら、１９８８を参照のこと）。従って、本発明は、カルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。本発明はまた、下記のようにアミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失しているポリペプチドを提供する。
【００４０】
上記で考察されたタンパク質のＮ末端およびＣ末端欠失型に加えて、本発明には他の変異体が含まれる。従って、本発明はさらに、実質的なシャペロンポリペプチド活性を示す種々のポリペプチドを包含する。このような変異体としては、活性に対して効果をほとんど有さない、当該分野で公知の一般的規則に従って選択される、欠失、挿入、反転、繰り返しおよび置換が挙げられる。
【００４１】
変化に対するアミノ酸配列の寛容度を研究するためには２つのアプローチが存在する。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６〜１３１０，１９９４を参照のこと。第一の方法は、進化の過程に依存し、ここでは、変異は受容されるか、または天然の選択によって拒絶される。第二のアプローチは、クローニングされた遺伝子の特定の位置でのアミノ酸変化を導入するような遺伝的操作、および機能性を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを使用する。これらの結果によって、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど耐性であることを明らかになった。
【００４２】
代表的には、保存的置換として示されるのは、１つの別のもの、とりわけ脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＰｈｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。従って、本発明のポリペプチドは、例えば、以下であり得る：（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存されるかまたは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされるものであってもなくてもよいポリペプチド；あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチド；あるいは（ｉｉｉ）ＰＥＤＦ−Ｒポリペプチドが別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と縮合されるポリペプチド；またはさらなるアミノ酸が、上記の形態のポリペプチド、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または上記の形態のポリペプチドの精製のために使用される配列もしくはプロタンパク質配列、に縮合されるポリペプチド。
【００４３】
従って、本発明のポリペプチドは、天然の変異体またはヒトの操作のいずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含んでもよい。示されるとおり、変化は、好ましくは、わずかな性質のもの、例えば、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換である。以下の群のアミノ酸が等価な変化である：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ，Ｔｒｐ、Ｈｉｓ。
【００４４】
さらに、本発明のポリペプチドは、改変アミノ酸を模倣する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。このタイプの置換の例としては、リン酸化されたアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の陰性の荷電を模倣する負に荷電されたアミノ酸を用いて、リン酸化され得るアミノ酸（例えば、セリン、トレオニンまたはチロシン）を置換することが挙げられる。また、トリプトファンまたはフェニルアラニンのようなかさのある疎水性側鎖を担持するアミノ酸での、疎水性基によって改変され得るアミノ酸（例えば、アルギニン）の置換である。従って、本発明の特定の実施形態としては、改変され得るアミノ酸が正常に位置する位置で、改変されたアミノ酸を模倣する１つ以上のアミノ酸置換を含むシャペロンポリペプチドが挙げられる。さらに、改変可能なアミノ酸の任意のサブセットが置換されるシャペロンポリペプチドが含まれる。例えば、３つのセリン残基を含むシャペロンポリペプチドは、このようなセリンのいずれか１つ、いずれか２つ、または３つ全てで置換され得る。さらに、改変され得る任意のシャペロンポリペプチドアミノ酸は、改変模倣アミノ酸での置換から排除され得る。
【００４５】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのフラグメントに関する。さらに詳細には、本発明は、構成的アミノ酸残基のうち６〜５０４（またはこの長さが１０００未満の場合はポリペプチドアミノ酸残基の長さ引く１）の少なくとも１つの任意の整数を含む、精製、単離および組換えのポリペプチドを具体化する。好ましくは、このフラグメントは、本発明のポリペプチドの少なくとも６、好ましくは少なくとも８〜１０、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３６０以上の保存的アミノ酸である。
【００４６】
本発明はまた、５’および３’位置によって特定される本発明のポリペプチドフラグメントの任意の種類、または上記のようなアミノ酸においてサイズによって特定される亜属のポリペプチドの排除を提供する。上記のような、５’および３’位置によって、またはアミノ酸のサイズによって特定される多数のフラグメントが排除され得る。
【００４７】
さらに、特定の実施形態では、本発明のインテリペプチドは、本明細書に記載される改変を含むがこれに限定されない、２つ以上の改変を含むことが理解されるべきである。市場にあるかまたは現在開発中のペプチド薬物の特徴を考慮することによって、タンパク質分解に対して首尾よく安定化されたペプチドのほとんどが、上記の改変のいくつかのタイプの混合物からなることが明らかである。この結論は、多くの異なる酵素がペプチド分解に関わっているという知識に照らして理解される。
【００４８】
本発明は、インテリペプチドのライブラリーを含む。このようなライブラリーとしては、ペプチドライブラリーおよびインテリペプチドを発現し得る核酸構築物のライブラリーの両方が挙げられる。１実施形態では、本発明のライブラリーは、ｉ）ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ；ｉｉ）ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ、ｉｉｉ）ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫ；ｉｖ）ＳＴＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ；ｖ）ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳ；ｖｉ）ＧＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉ）ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉｉ）ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ；ｉｘ）ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲまたはその機能的な等価物もしくは模倣物に関連する配列からなる。特定の実施形態では、本発明のライブラリーは、２つ以上のインテリペプチド、または例えば、図６、７、８、９、１０および１１、ならびに表４に提供される配列を含む、コード配列からなる。
【００４９】
（ペプチド、ペプチド改変体およびペプチド模倣物）
本発明は、少なくとも約１０、５０、１００、１５０もしくは２００以上の残基の領域にまたがってαＢクリスタリンタンパク質のＮ末端ドメイン、αクリスタリンコアドメインまたはＣ末端ドメインのポリペプチドフラグメントに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されるかまたは組換え体のポリペプチド、あるいは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する。１局面では、このポリペプチドは、αＢクリスタリンタンパク質のＮ末端ドメイン、αクリスタリンコアドメインまたはＣ末端ドメインのポリペプチドフラグメントに示されるような配列を含む。本発明は、αＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメント、例えば、本発明のポリペプチドを投与することによって哺乳動物被験体におけるタンパク質凝集を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、αＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメント、例えば、本発明のポリペプチドをスクリーニングすることによって、シャペロン活性を有するか、またはタンパク質凝集を阻害する組成物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００５０】
一局面では、本発明は、αＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメントにおけるアミノ酸の１つ、いくつかまたは全てが置換アミノ酸での置換を含むαＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメント（およびそれらをコードする核酸）を提供する。１局面では、本発明は、分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメントと、未折り畳みタンパク質、変性タンパク質または天然の立体構造のタンパク質との相互作用を増強する方法を提供する。
【００５１】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記のように、核酸の投与後インビボで組換え発現され得てもよいし、またはそれらは、例えば、薬学的組成物として直接投与されてもよい。それらは、分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメントについて、そして疾患、例えば、タンパク質凝集疾患、加齢性筋障害または心虚血を緩和し得る因子について、スクリーニングするためにインビトロまたはインビボで発現されてもよい。
【００５２】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然の供給源から単離されてもよく、合成されてもよく、または組換え生成されたポリペプチドであってもよい。ペプチドおよびタンパク質は、インビトロまたはインビボで組換え発現され得る。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で公知の任意の方法を用いて作成および単離され得る。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当該分野で周知の化学的方法を用いて、全体または一部が合成されてもよい。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３，１９８０；Ｈｏｒｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２，１９８０；Ｂａｎｇａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９９５を参照のこと。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２，１９９５；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３〜１３，１９９７）を用いて合成されてもよく、そして自動化合成は、製造業者によって提供される説明書に従って、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、達成されてもよい。
【００５３】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記で規定されるとおり、全ての「模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）」および「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）」の形態を包含する。「模倣物」および「ペプチド模倣物」という用語は、本発明のポリペプチドの実質的に同じ構造および／または機能的な特徴を有する合成化合物を指す。この模倣物は全体として、アミノ酸の合成の天然ではないアナログから構成されてもよいし、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に天然ではないアミノ酸のアナログのキメラ分子である。この模倣物はまた、このような置換基がまた、模倣物の構造および／または活性を実質的に変更しない限り、天然のアミノ酸の保存的置換の任意の量を組み込んでもよい。保存的改変体である本発明のポリペプチドと同様に、慣用的な実験で、模倣物が本発明の範囲内であるか否か、すなわちその構造および／または機能が実質的に変更されていないかを決定する。従って、模倣組成物は、投与されるかまたは細胞中で発現されるとき、例えば、分子シャペロン活性を有するαＢシャペロンタンパク質のポリペプチドフラグメントである場合、本発明の範囲内である。模倣組成物はまた、タンパク質凝集疾患を有する細胞中でまたは哺乳動物被験体中で分子シャペロン活性を刺激する場合、本発明の範囲内であり得る。
【００５４】
図４は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）におけるアミロイドーシスおよびインテリペプチドを用いて可能な介入の模式図を示す。アミロイドフィブリルおよびプラークは、ＡＤ神経病理学の特徴であるが、レヴィー小体は、パーキンソン病神経病理の特徴である。ＡＤでは、アミロイド形成的であるＡβペプチドが凝集してＡβプラークを形成する。インテリペプチドは、アミロイドβに結合し、細胞毒性アミロイドプラークの凝集および形成を妨げ、そしてＡＤを防止する。ＰＤでは、αシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）は凝集してレヴィー小体を形成する。インテリペプチドは、αシヌクレインを結合して、レヴィー小体の凝集および形成を妨げて、ＰＤを予防する。
【００５５】
図５は、ポリペプチドの特徴を有する合成分子を設計するために静電気面の分子モデルを用いてポリペプチド模倣物を設計するための方法を示す。分子モデリングを用いて、当業者は、目的のペプチドのアミノ酸マップを構築し得る。このアミノ酸マップから、当業者はこのペプチドの周囲の静電気的表面を計算し得る。静電気的表面マップからアミノ酸マップを除去することによって、当業者は静電気的表面を用いて、あるポリペプチドと同じ形状、サイズおよび電荷特徴を有する合成分子を設計し得る。
【００５６】
異常なタンパク質折り畳み、タンパク質未折り畳み、タンパク質の誤まった折り畳み、またはタンパク質凝集を阻害するインテリペプチドまたはペプチドとしては、限定はしないが、インテリペプチド、ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳ、ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲ、ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ、およびＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫが挙げられる。図６は、インテリペプチドＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳ、ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲ、ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ、およびＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫの機能的な改変体およびペプチド模倣物をまとめている。図７は、インテリペプチド配列ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。図８は、インテリペプチド配列ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ由来の一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。図９は、インテリペプチド配列ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲ由来の一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。図１０は、インテリペプチド配列ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ由来の一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。図１１は、インテリペプチド配列ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ由来の一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００５７】
ポリペプチド模倣物組成物は、以下の３つの構造的な群に代表的には由来する、天然ではない構造成分の任意の組み合わせを含んでもよい：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）」）結合以外の残基結合；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の位置の天然ではない残基；またはｃ）二次構造模倣を誘導する、すなわち、二次構造、例えば、βターン、γターン、βシート、αらせん立体配置などを誘導するかまたは安定化する、残基。例えば、ポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが、天然のペプチド結合以外の化学的手段によって連結される場合、模倣物として特徴づけされ得る。個々のペプチド模倣物残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、またはカップリング手段、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）によって連結されてもよい。伝統的なアミド結合（「ペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｏｎｄ）」）連結に対して代替的であり得る連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−ｆｏｒ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ−ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが挙げられる（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第７巻、２６７〜３５７頁、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹを参照のこと）。
【００５８】
ポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の位置に全てのまたはいくつかの天然ではない残基を含むことによって模倣物として特徴付けされ得る。天然ではない残基は、科学的文献および特許文献において十分に記載されている；天然のアミノ酸残基の模倣物として有用な２〜３の例示的な天然でない組成物およびガイドラインは下に記載される。芳香族アミノ酸の模倣物は、例えば、Ｄ−またはＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−またはＬ−１、−２、３−または４−ピレネイルアラニン；Ｄ−またはＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−またはＬ−アルキルアラニンによって置換することによって生成され得；ここでアルキルは、置換または未置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチル、または非酸性のアミノ酸であってもよい。天然でないアミノ酸の芳香族環としては、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香族環が挙げられる。
【００５９】
酸性アミノ酸の模倣物は、置換によって、例えば、負の荷電を維持したまま非カルボキシレートアミノ酸：（ホスホノ）アラニン：硫酸化トレオニンによって生成され得る。カルボキシル側鎖基（例えば、アスパルチルまたはグルタミル）はまた、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリン−イル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトルペンチル）カルボジイミドなどとの反応によって選択的に改変され得る。アスパルチルまたはグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換され得る。
【００６０】
塩基性アミノ酸の模倣物は、例えば（リジンおよびアルギニンに加えて）アミノ酸オルニチン、シトルリン、または‘ａｄｉｏｉｍｍｕ−酢酸、または’ａｄｉｏｉｍｍｕアルキル−酢酸での置換によって生成され得、ここでアルキルは上で規定される。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの位置にＣＮ部分を含む）は、‘ａｄｉｏｉｍｕｎｏまたはグルタミンで置換され得る。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基に脱アミノ化され得る。
【００６１】
アルギニン残基模倣物は、好ましくはアルカリ条件下で、例えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンまたはニンヒドリンを含む、例えば、１つ以上の従来の試薬と、アルギニルとを反応させることによって生成され得る。チロシン残基模倣物は、チロシルと、例えば、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって生成され得る。Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成し得る。システイン残基模倣物は、システイニル残基と、例えば、α−ハロアセテート、例えば、２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドおよび対応するアミンとを反応させることによって生成され得；カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイン残基模倣物はまた、システイニル残基と、例えば、ブロモ−トリフルオロアセトン、α−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロ水銀安息香酸；２−クロロ水銀−４ニトロフェノール；または、クロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって生成され得る。リジン模倣物は、リジニルと、例えば、無水コハク酸または他のカルボン酸無水物との反応によって、生成され得る（そしてアミノ末端残基が変更され得る）。リジンおよび他のαアミノ含有残基模倣物はまた、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミダート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４，ペンタンジオンとの反応、およびグリオキシレートとのトランスアミダーゼ−触媒反応によって生成され得る。メチオニンの模倣物は、例えば、メチオニンスルホキシドとの反応によって生成され得る。‘ａｄｉｏｉｎの模倣物としては、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−または４−ヒドロキシ’ａｄｉｏｉｍ、デヒドロプロリン、３−または４−メチルプロリン、または３，３−ジメチルプロリンが挙げられる。ヒスチジン残基模倣物は、ヒスチジルと、例えば、ジエチルプロカルボナート、またはパラ−ブロモフェナシルブロミドとの反応によって生成され得る。他の模倣としては、例えば、‘ａｄｉｏｉｍおよびリジンのヒドロキシル化；セリルもしくはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのαアミノ基のメチル化；Ｎ末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化もしくはＮ−メチルアミノ酸での置換；またはＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００６２】
本発明のポリペプチドの成分はまた、反対のキラリティーのアミノ酸（またはペプチド模倣残基）によって置換されてもよい。従って、Ｌ立体配置で天然に存在する任意のアミノ酸（これはまた、化学部分の構造に依存して、ＲまたはＳと呼ばれてもよい）は、同じ化学構造のタイプのアミノ酸またはペプチド模倣物であって、ただしＤアミノ酸と呼ばれる反対のキラリティーであるもので置換されてもよいが、これはさらにＲ型またはＳ型と呼ばれ得る。
【００６３】
本発明はまた、本発明の例示的なポリペプチドに対して「実質的に同一である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」ポリペプチドを提供する。「実質的に同一な」アミノ酸配列とは、１つ以上の保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入によって参照配列とは異なっている配列であって、詳細には、このような置換が分子の活性部位ではない部位で生じる場合で、かつこのポリペプチドがその機能的特性を本質的に保持するという条件である、配列である。保存的なアミノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸で同じクラスの別のアミノ酸を置換（例えば、１つの疎水性アミノ酸、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンを別のものに置換、または１つの極性アミノ酸の別のアミノ酸での置換、例えば、アルギニンのリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸または、グルタミンの‘ａｄｉｏｉｍｍｎｏの置換）。１つ以上のアミノ酸が、例えば、本発明の分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンポリペプチドから欠失されてもよく、これによってその生物学的活性を有意に変更することなく、ポリペプチドの構造の改変が生じる。例えば、アミノ末端もしくはカルボキシル末端、または内部のアミノ酸で、αＢクリスタリンタンパク質の分子シャペロン活性に必要で無いものは除去されてもよい。
【００６４】
当業者は、個々の合成残基およびこれらの模倣物を組み込んでいるポリペプチドが、化学論文および特許文献、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，ら（編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹに十分に記載される種々の手順および方法論を用いて合成され得ることを理解する。本発明のペプチドおよびペプチド模倣物はまた、コンビナトリアル方法論を用いて合成されてもよい。ペプチドおよびペプチド模倣物ライブラリーの生成のための種々の技術は周知であって、そしてこれには、例えば、マルチピン（ｍｕｌｔｉｐｉｎ）、ティーバッグ（ｔｅａ  ｂａｇ）、およびスプリット・カップル・ミックス（ｓｐｌｉｔ−ｃｏｕｐｌｅ−ｍｉｘ）技術が挙げられる；例えば、ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５〜２２３，１９９８；Ｈｒｕｂｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１１４〜１１９，１９９７；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：１７〜２７，１９９７；Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２２０〜２３４，１９９６を参照のこと。本発明の改変ペプチドは、化学修飾方法によってさらに生成されてもよい。例えば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３４４０〜３４４４，１９９７；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３〜３８０，１９９５；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６〜７８９６，１９９４を参照のこと。
【００６５】
本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、例えば、より免疫原性のペプチドを生成するために、組換え合成されたペプチドをさらに容易に単離するために、抗体および抗体発現Ｂ細胞を同定および単離するために、などのために、そこに結合された１つ以上のさらなるドメインを有する融合タンパク質として合成および発現されてもよい。検出および生成を容易にするドメインとしては、例えば、金属キレートペプチド、例えば、固定された金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ａｍｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）において利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインと、モチーフ含有ポリペプチドまたはポリペプチドとの間の第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のような切断可能なリンカー配列の包含によって精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、６つのヒスチジン残基に連結されたエピトープコード核酸配列、続いてチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位を含んでもよい（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１７８７〜１７９７，１９９５；Ｄｏｂｅｌｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２：４０４〜１４，１９９８を参照のこと）。ヒスチジン残基によって、検出および精製が容易になるが、エンテロキナーゼ切断部位によって、融合タンパク質の残りに由来するエピトープの精製のための手段が提供される。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関与する技術は、科学論文および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｋｒｏｌｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：４４１〜５３，１９９３を参照のこと。
【００６６】
本明細書において用いる場合、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、そのもとの環境（例えば、それが天然に存在している場合は天然の環境）から取り出された物質を意味する。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、生きている動物に存在し、単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、天然の系に同時に存在している物質のある程度または全てが分離されているものは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であってもよく、そしてこのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部ではないという点でやはり単離されている。本明細書において用いる場合、単離された物質または組成物はまた、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」組成物であってもよく、すなわちこれは絶対的な純度は必要とせず；むしろ、相対的な定義とみなされる。ライブラリーから得られる個々の核酸は従来、電気泳動上の同質まで精製され得る。別の局面では、本発明は、ゲノムＤＮＡから、またはライブラリーもしくは他の環境中の他の配列から、少なくとも１、２、３、４、５またはそれ以上の倍数程度まで精製された核酸を提供する。
【００６７】
分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンタンパク質のポリペプチドフラグメントである、インテリペプチドアナログは一般に、リードペプチド、例えば、以下の配列のいずれかのような、本明細書に記載される任意の特定のペプチドを含むペプチドの化学的修飾によって設計および生成される：ｉ）ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ；ｉｉ）ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ；ｉｉｉ）ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫ；ｉｖ）ＳＴＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ；ｖ）ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳ；ｖｉ）ＧＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉ）ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ；ｖｉｉｉ）ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ；ｉｘ）ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲまたはその機能的な改変体もしくはペプチド模倣物。分子シャペロン活性を有するαＢクリスタリンタンパク質の例示的なポリペプチドフラグメントは、例えば、Ｎ末端ドメインポリペプチドフラグメントが、９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０もしくは４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８であり、αクリスタリンコアドメインポリペプチドフラグメントが７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５もしくは１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１であり、またはＣ末端ドメインポリペプチドフラグメントが１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４で、またはその機能的な改変体である。
【００６８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」パーセントという用語は、２つ以上の配列もしくは小配列であって下に記載するデフォールトパラメーターでのＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、または手技によるアラインメントおよび視覚的検査によって測定した場合、同じであるか、または同じ（すなわち、比較ウインドウまたは指定された領域にわたる最大対応について比較および整列した場合、特定の領域（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列、または本明細書に記載される抗体のアミノ酸配列）にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性）であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列もしくは小配列をいう。次いで、このような配列は、「実質的に同一である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」と言われる。この用語はまた、試験配列のコンプリメント（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）と呼ばれても、またはそれに適用されてもよい。この用語はまた、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列を包含する。下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどについて説明し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、またはより好ましくは、５０〜１００のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００６９】
配列比較のために、代表的には、１つの配列は、参照配列として機能し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力して、必要であれば、配列の座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を設計し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを設計する。好ましくは、デフォールトプログラムパラメーターを用いてもよく、または別のパラメーターを設計してもよい。次いで、この配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００７０】
「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）とは、本明細書において用いる場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置の数のうちの任意の１つのセグメントに対する言及を包含し、ここでは配列は、２つの配列が最適に整列された後に同じ数の連続位置の参照配列に比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピューター化された実行によって、または手技によるアラインメントおよび視覚検査によって（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９５補遺を参照のこと）行われてもよい。
【００７１】
アラインメントを検索するプログラム、例えばＢＬＡＳＴなどは当該分野で周知である。例えば、標的種がヒトである場合、このようなアミノ酸配列または遺伝子配列の供給源（生殖系列または再配列された抗体配列）は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＣＢＩタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ・ＢＬＡＳＴ／）、ＶＢＡＳＥ、ヒト抗体遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ．−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）および免疫グロブリンのＫａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）のような任意の適切な参照データベース、またはその翻訳産物に見出され得る。アラインメントが、ヌクレオチド配列に基づいて行なわれるならば、選択された遺伝子を分析して、そのサブセットのどの遺伝子が、起源の種の抗体に対して最も近いアミノ酸相同性を有するかを決定すべきである。このデータベースにおける他の配列に比較した場合より高い程度の相同性に達するアミノ酸配列または遺伝子配列が本明細書に記載の手順に従って利用および操作され得ることが、意図される。さらに、相同性の程度が小さいアミノ酸配列または遺伝子は、それらが、本明細書に記載の手順に従って操作および選択されるとき、予め決定された標的抗原に特異性を示す産物をコードする場合に、利用され得る。特定の実施形態では、相同性の受容可能な範囲は、約５０％より大きい。標的種はヒト以外であってもよいことが理解されるべきである。
【００７２】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであって、これは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２，１９９７およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載されるパラメーターとともに用いて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中で同じ長さのワードと配列した場合いくつかの正の値の閾値スコアＴに適合するかまたはそれを満たす、クエリー配列における長さＷのショートワードを同定することによって高いスコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定する工程を包含する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限りは、各々の配列にそって両方の方向に伸ばされる。累積的なスコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチする残基の対についてリウォードスコア；常に０より大きい）およびＮ（ミスマッチする残基についてのペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて、累積的スコアを算出する。各々の方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止される：累積的アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘまで落ち込むか；累積スコアが、１つ以上の負のスコアリングの残基アラインメントの蓄積に起因して０以下になるか；またはいずれかの配列の端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォールトとして１１というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォールトとして３のワード長、１０の期待値（Ｅ）および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５，１９８９）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。
【００７３】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、本明細書において交換可能に用いて、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的なキメラ模倣物であるアミノ酸ポリマーに、そして天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然には存在しないアミノ酸ポリマーにあてはまる。「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」および「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」とはさらに、ペプチド結合または改変ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによってお互いに対して結合されたアミノ酸をいい、そして２０の遺伝子コードアミノ酸以外の改変アミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語はまた、ペプチドおよびポリペプチドのフラグメント、モチーフなどを包含する。この用語はまた、グリコシル化ポリペプチドを包含する。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、下にさらに詳細に記載されるような、全ての「模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）」および「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）」を包含する。
【００７４】
ポリペプチドの「アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）」または「機能的な改変体または模倣物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｒ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」とは、天然に存在するそして合成のアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後に改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち水素に結合されるα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の方式で機能する化合物をいう。
【００７５】
アミノ酸は本明細書において、その一般に公知の３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって言及され得る。ヌクレオチドは同様に、その一般に受容される一文字コードによって言及され得る。
【００７６】
「保存的に改変された改変体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、アミノ酸および核酸の配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、本質的に同一の配列に対して、同一のまたは本質的に同一なアミノ酸の配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない核酸をいう。遺伝子コードの縮重のおかげで多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てが、アミノ酸アラニンをコードする。従って、コドンによってアラニンが特定されるあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸の変動は、「サイレント変動（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）」であって、これは、保存的に改変されたバリエーションの１つの種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能性のあるサイレント変動を記載する。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、そして通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して機能的に同一の分子を得ることができることを理解する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレントなバリエーションは、発現産物に関して各々の記載される配列において暗示されるが、正確なプローブ配列に関しては暗示されない。
【００７７】
アミノ酸配列に関しては、当業者は、コードされた配列においてアミノ酸の単一のアミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、追加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または追加が「保存的に改変された改変体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ）」であって、この変更が化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じることを理解する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該分野で周知である。このような保存的に改変された改変体は、本発明の多形性の改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えられ、そしてそれらを排除しない。
【００７８】
以下の８つの群は各々、お互いについての保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１９８４を参照のこと）。
【００７９】
ポリペプチド構造のような高分子構造は、種々のレベルの機構に関して記載され得る。この機構の一般的な考察に関しては、例えば、Ａｌｂｅｒｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）およびＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＰａｒｔＩ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９８０を参照のこと。「一次構造（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」とは、ポリペプチド内の局所的に整列された三次元構造をいう。これらの構造は共通して、例えば、酵素的ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメインおよび細胞質尾部ドメインのようなドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの一部であり、これはポリペプチドのコンパクトな単位を形成し、代表的には１５〜３５０アミノ酸長である。例示的なドメインとしては、酵素活性を有するドメイン、例えば、キナーゼドメインが挙げられる。代表的なドメインは、βシートのストレッチおよびαらせんのような組織化の程度の小さいセクションから構成される。「ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（三次構造）」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」とは、独立した三次単位の非共有的な結合によって形成される三次元構造をいう。異方性条項とはまた、エネルギー条項としても公知である。
【００８０】
特定の核酸配列はまた暗黙のうちに、「スプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ）」を包含する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントによってコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライスバリアント」は、名称として、遺伝子の別のスプライシングの生成物であることを示唆する。転写後に、最初の核酸転写物がスプライシングされ得、その結果、異なる（別の）核酸スプライス生成物が異なるポリペプチドをコードする。スプライスバリアントの生成のための機構は変化するが、エキソンの別のスプライシングを包含する。リード・スルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写物による同じ核酸に由来する別のポリペプチドがまた、この定義によって包含される。スプライシング産物の組換え型を含む、スプライシング反応の任意の産物は、この定義に含まれる。
【００８１】
これらの遺伝子および遺伝子産物のポリペプチドの機能的な改変体は、本発明において有用である。「機能的な改変体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、非限定的な例では、単離された核酸もしくはタンパク質の配列であっても、または２つ以上の関連核酸もしくはタンパク質の比較によって誘導されるコンセンサス配列であっても、または所定の核酸もしくはタンパク質のアイソフォームの群であってもよい、参照配列に対して「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」、「本質的に同一である（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」、「実質的に同一である（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」、「相同な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「同様である（ｓｉｍｉｌａｒ）」（下記されるとおり）、それぞれ、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する核酸またはタンパク質をいう。アイソフォームのタイプの非限定的な例としては、例えば、別のＲＮＡスプライシングまたはタンパク質分解切断から生じる異なる分子量のアイソフォーム；ならびにグリコシル化のような種々の翻訳後修飾を有するアイソフォーム；などが挙げられる。
【００８２】
２つの配列は、この２つの配列が、お互いと整列されるとき、ギャップ、置換、挿入または欠失がなく正確に同じである場合に、「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」であるといわれる。
【００８３】
２つの配列は、以下の基準が満たされる場合に、「本質的に同一である（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」といわれる。２つのアミノ酸配列は、この２つの配列が、お互いと整列されるとき、ギャップ、置換、挿入または欠失がなく正確に同じであり、かつこの配列が保存的アミノ酸置換のみを有する場合に、「本質的に同一（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」である。保存的なアミノ酸置換は、表３に記載されるとおりである。
【００８４】
表３：保存的アミノ酸置換
【００８５】
【表１−２】
2008520555.tif 000004
２つのヌクレオチド配列は、それらが同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする場合に、「本質的に同一」である。当該分野で公知のとおり、遺伝子コードの性質に起因して、いくつかのアミノ酸は、いくつかの異なる３つの塩基コドンにょってコードされ、従ってこれらのコドンは、あるアミノ酸配列でその位置でアミノ酸を変更することなく、お互いに置換され得る。遺伝子コードでは、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧがＬｅｕをコードし、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡおよびＣＧＧがＡｒｇをコードし；ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡおよびＧＣＧがＡｌａをコードし；ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡおよびＧＧＧがＧｌｙをコードし；ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡおよびＡＣＧがＴｈｒをコードし；ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡおよびＧＴＧがＶａｌをコードし；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡおよびＴＣＧがＳｅｒをコードし；ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡおよびＣＣＧがＰｒｏをコードし；ＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＡがＩｌｅをコードし；ＧＡＡおよびＧＡＧがＧｌｕをコードし；ＣＡＡおよびＣＡＧがＧｌｎをコードし、ＧＡＴおよびＧＡＣがＡｓｐをコードし；ＡＡＴおよびＡＡＣがＡｓｎをコードし；ＡＧＴおよびＡＧＣがＳｅｒをコードし；ＴＡＴおよびＴＡＣがＴｙｒをコードし；ＴＧＴおよびＴＧＣがＣｙｓをコードし；ＡＡＡおよびＡＡＧがＬｙｓをコードし；ＣＡＴおよびＣＡＣがＨｉｓをコードし；ＴＴＴおよびＴＴＣがＰｈｅをコードし、ＴＧＧがＴｒｐをコードし；ＡＴＧがＭｅｔをコードし；そしてＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧは翻訳終止コドンである。
【００８６】
２つのアミノ酸配列は、配列させた時、この２つの配列が（ｉ）アミノ酸残基の同一性の３０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、最も好ましくは１０％未満がこの２つの配列の間で異なる場合；（ｉｉ）欠失および／または置換における間のまたは挿入のギャップの数が、この２つの整列された配列のうち最短の長さにわたって生じるアミノ酸残基の数のうち、１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、最も好ましくは１％未満である場合に、「実質的に同一」である。
【００８７】
以下の基準のいずれかが満たされる場合、この２つの配列は「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」であるといわれる。「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」という用語は、限定はしないが、オルトログ（共通の祖先を共有し、かつ異なる種で同じ機能を有するタンパク質をコードするという結果として遺伝的類似性を有するホモログ）およびパラログ（オルトログと同様であるが、遺伝子およびタンパク質類似性が遺伝子複製の結果である）を包含する。
【００８８】
ヌクレオチド配列が相同である１つの指標は、２つの核酸分子がストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズするか否かである。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なる環境では異なる。一般には、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いことが選択される。このＴｍは、完全にマッチするプローブに対して（規定のイオン強度およびｐＨ下で）標的配列のうち５０％がハイブリダイズする温度である。代表的にはストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７で約０．０２Ｍであり、かつこの温度が少なくとも約６０℃である条件である。
【００８９】
２つの配列が相同であるか否かを決定し得る別の方法は、実質的に同一な配列であるための上記の基準が満たされるか否かを決定するために適切なアルゴリズムを用いることによる。２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は代表的には、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムのようなアルゴリズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索方法（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ）によって；そしてこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のコンピューター化された実行によって；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０）；または視覚検査によって行われる。
【００９０】
最適アラインメントは、ギャップを挿入することによって、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムを用いてマッチの数を最大化するためにギャップを挿入することによって見出される。「ギャップ（ｇａｐ）」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０のアルゴリズムを用いて、マッチの数を最大化して、かつギャップの数を最小化する２つの完全な配列のアラインメントを見出す。このようなアルゴリズムでは、各々のギャップについて約３．０〜約２０という「ペナルティー（ｐｅｎａｌｔｙ）」を用い、そしてエンドギャップについてはペナルティーを用いない。
【００９１】
相同なタンパク質としてはまた、完全なゲノムにコードされるタンパク質の系統発生的分類によって生成される、タンパク質のオルトログ群のクラスター（ＣＯＧ）のメンバーが挙げられる。今日まで、ＣＯＧは、３０の主要な系統発生系列に相当する、４３の完全なゲノムにコードされるタンパク質配列を比較することによって描写されている。各々のＣＯＧは、少なくとも３つの系統由来の個々のタンパク質またはパラログの群からなり、従って古い保存ドメインに相当する（Ｔａｔｕｓｏｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：６３１〜６３７，１９９７；Ｔａｔｕｓｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２２〜２８，２００１；Ｃｈｅｒｖｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０２２〜２０２８，１９９８およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＣＯＧ／を参照のこと）。
【００９２】
２つの配列全体は、同一であっても、本質的に同一であっても、実質的に同一であっても、またはお互いに相同であってもよく、あるいはこのような配列の部分が、他の配列における類似の長さの配列と同一であってもまたは実質的に同一であってもよい。いずれかの場合には、このような配列はお互いに類似である。代表的には、同様の配列内の同一または本質的に同一のストレッチは、１２より長い、好ましくは２４より長い、さらに好ましくは４８より長い、そして最も好ましくは９６より長い長さを有する。
【００９３】
（ポリペプチドおよびその機能的な改変体）
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」としては、ペプチド模倣物が本明細書において低分子であるとみなされることを除いて、タンパク質、融合タンパク質、オリゴペプチドおよびポリペプチド誘導体が挙げられる。それらは、ポリペプチド、抗体およびその誘導体であるが、別のセクションに記載される。抗体および抗体誘導体は、別のセクションに記載されるが、抗体および抗体誘導体は、本発明の目的のためには、ポリペプチドおよび誘導体のサブクラスとして処理される。
【００９４】
「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、ペプチド結合によってお互いに対して直線の分子に結合されるアミノ酸の配列を有する分子である。タンパク質という用語は、天然の供給源から単離されるか、または組換えＤＮＡ技術を用いて、単離されたｃＤＮＡから生成され；そして少なくとも約２００アミノ酸の長さを有するアミノ酸の配列を有する、ポリペプチドをいう。
【００９５】
「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、２つ以上の通常は別のポリペプチドのアミノ酸配列の連結から生じるアミノ酸配列を有するタイプの組換えタンパク質である。
【００９６】
「タンパク質フラグメント（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、タンパク質であっても融合タンパク質であってもよい、より大きいポリペプチドのタンパク質分解性フラグメントである。タンパク質分解性フラグメントは、より大きいポリペプチドのインビボまたはインビトロのタンパク質分解性切断によって調製されてもよく、そして一般には、化学的合成によっいて調製されるには大きすぎる。タンパク質分解性フラグメントは、約２００〜約１，０００アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を有する。
【００９７】
「オリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、短いアミノ酸配列（すなわち、２〜約２００アミノ酸）を有するポリペプチドである。オリゴヌクレオチドは一般に、化学合成によって調製される。
【００９８】
オリゴペプチドおよびタンパク質フラグメントは、他に調製されてもよいが、組換えＤＮＡ技術および／またはインビトロの生化学的操作を用いることが可能である。例えば、アミノ酸配列をコードする核酸は、インビトロの転写／翻訳反応のためのテンプレートとして調製されて用いられてもよい。このような反応では、事前に選択されたポリペプチドをコードする外因性の核酸を、転写および翻訳に必要な細胞成分の全てを含む、外因性の核酸が本質的に枯渇されている混合物に導入する。１つ以上の放射性標識アミノ酸を、外因性のＤＮＡの前にまたはそれとともに添加して、転写および翻訳を進行させる。反応混合物に存在する唯一の核酸はこの反応物に添加された外因性の核酸であるので、これらによってコードされるポリペプチドのみが生成され、そして放射性標識されたアミノ酸（単数または複数）を組み込む。この方式では、事前に選択された外因性の核酸によってコードされるポリペプチドを放射性標識する。他のタンパク質が反応混合物に存在するが、予め選択されたポリペプチドが、放射性標識されたアミノ酸の存在下で生成される唯一のペプチドであり、従って特有に標識される。
【００９９】
下に詳細に説明されるとおり、「ポリペプチド誘導体（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」とは、限定はしないが、変異ポリペプチド、化学的に修飾されたポリペプチド、およびペプチド模倣物を包含する。
【０１００】
アナログおよび他の改変された改変体を含む本発明のポリペプチドは一般に、公知の技術に従って調製され得る。好ましくは、本発明のポリペプチドの合成的な生成は、固相合成法に従ってもよい。例えば、固相合成は、十分理解されており、そしてポリペプチドの調製のための共通の方法であり、従ってその技術の種々の変法がある。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９，１９６４；ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｃ  Ｐｈａｓｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．，１９８４；ＢｏｄａｎｓｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］。また、下の実施例１に記載される特定の方法も参照のこと。
【０１０１】
あるいは、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を用いて組換え系において調製され得る。例えば、融合タンパク質は代表的には、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される。
【０１０２】
（機能的なポリペプチド改変体）ポリペプチドの「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「機能的改変体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」は、定義によれば、ポリペプチドではない化合物であって、すなわち、これは、ペプチド結合でない少なくとも１つの化学結合を含む。従って、ポリペプチド誘導体としては、限定はしないが、例えば、グリコシル化のような翻訳後修飾を通常受ける制限タンパク質が挙げられる。本発明のポリペプチドは、同じポリペプチド内で以下の改変の２つ以上を含み得ることが理解される。好ましいポリペプチド誘導体は、生物学的な活性であってもよい望ましい特性を保持する；さらに好ましくは、ポリペプチド誘導体は、１つ以上の所望の特性に関して増強されるか、または親のポリペプチドでは見いだされない１つ以上の所望の特性を有する。それらは、このセクションに記載されるが、ペプチド模倣物は、本開示では小分子ととられる。
【０１０３】
天然の供給源から調製されたタンパク質で見出される配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、「野性型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）」ポリペプチドである。ポリペプチドの機能的改変体は、限定はしないが、コンビナトリアル合成を含む化学的合成によって調製され得る。
【０１０４】
オリゴペプチドより大きいポリペプチドの機能的改変体は、ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列を変更することによって組換えＤＮＡ技術を用いて調製され得る。ヌクレオチド配列におけるいくつかの変更は、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない（「サイレント」変異）であるが、多くは、親の配列に対して変更されている、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生じる。このような変更されたアミノ酸配列は、このようなアミノ酸が天然に存在するアミノ酸である条件では、アミノ酸の置換、欠失および付加を含んでもよい。
【０１０５】
従って、ポリペプチドをコードする核酸を突然変異誘発に供することは、ポリペプチドの機能的改変体であって、詳細にはアミノ酸の置換を有するが、その欠失も挿入もないポリペプチドを調製するために用いられ得る１技術である。インビトロまたはインビボで用いられ得る種々の突然変異誘発技術が公知であって、これには、限定はしないが、化学的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発が挙げられる。このような突然変異は、無作為に標的化されてもよい（すなわち、変異は、核酸内のいずれに生じてもよい）し、または特定の目的物のアミノ酸のストレッチをコードする核酸の選択に向けられてもよい。このような技術を用いて、無作為の、コンビナトリアルの、または集中された化合物のライブラリー、プールおよび混合物を調製することが可能である。
【０１０６】
天然に存在するアミノ酸の欠失または挿入があるポリペプチドは、親のポリペプチドのアミノ酸配列に基づくアミノ酸配列の化学的合成から生じるが、その親ポリペプチドの配列に対して１つ以上のアミノ酸挿入または欠失がある、合成オリゴペプチドであってもよい。より長いアミノ酸配列を有するポリペプチドにおけるアミノ酸残基の挿入および欠失は、指向性の突然変異誘発によって調製され得る。
【０１０７】
（化学的に改変されたポリペプチド）本発明によって意図されるとおり、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、別のポリペプチドに対する１つ以上の化学的修飾を有するポリペプチド、すなわち、化学的に修飾されたポリペプチドを包含する。化学的に修飾されたポリペプチドが由来するポリペプチドは、野性型タンパク質であっても、機能的な改変タンパク質であっても、または機能的な改変ポリペプチドであっても、またはそのポリペプチドフラグメント；限定はしないが、単鎖抗体、クリスタリンタンパク質およびそのポリペプチド誘導体を含む本発明に従う抗体もしくは他のポリペプチドリガンド；またはその開示に従って調製されるポリペプチドリガンドであってもよい。好ましくは、化学的修飾（単数または複数）は、ポリペプチドの所望の特性を付与または改善するが、その生物学的活性を実質的に変更も障害もしない。所望の特性としては、限定はしないが、半減期の延長；血清または他のインビボの安定性の向上；プロテアーゼ耐性などが挙げられる。このような改変としては、非限定的な例として、Ｎ末端アセチル化、グリコシル化およびビオチニル化が挙げられる。
【０１０８】
（Ｎ末端またはＣ末端化学基を有するポリペプチド）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基に対するペプチダーゼの作用に対して耐性を付与するための有効なアプローチは、修飾されたポリペプチドがもはやペプチダーゼの基質ではなくなるように、ポリペプチド末端に化学基を付加することである。このような化学的修飾の１つは、いずれかまたは両方の末端でのポリペプチドのグリコシル化である。特定の化学的修飾、詳細にはＮ末端グリコシル化は、ヒト血清におけるポリペプチドの安定性を増大することが示されている（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１０：１２６８〜１２７３、１９９３）。血清安定性を強化する他の化学的修飾としては、限定はしないが、アセチル基のような、１〜２０個の炭素の低級アルキルからなるＮ末端アルキル基の付加、および／またはＣ末端アミド、もしくは置換アミド基の付加が挙げられる。
【０１０９】
（末端Ｄアミノ酸を有するポリペプチド）Ｎ末端Ｄ−アミノ酸の存在は、そうでなければＬアミノ酸を含むポリペプチドの血清安定性を増大する。なぜなら、Ｎ末端残基に対して作用するエキソペプチダーゼは、Ｄアミノ酸を基質として利用できないからである。同様に、Ｃ末端Ｄアミノ酸の存在はまた、ポリペプチドを安定化する。なぜなら、Ｃ末端残基に作用する血清エキソペプチダーゼは、基質としてＤアミノ酸を利用できないからである。これらの末端修飾を除いて、Ｎ末端および／またはＣ末端のＤアミノ酸を有するアミノ酸配列は通常、親のＬアミノ酸ポリペプチドの配列と同一である。
【０１１０】
（天然でないアミノ酸による天然のアミノ酸の置換があるポリペプチド）ポリペプチドの小配列における天然のアミノ酸の天然ではないアミノ酸の置換は、生物学的活性を含む所望の特性を付与または増強し得る。このような置換は、例えば、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を付与し得る。天然でないアミノ酸を有するポリペプチドの合成は、慣用的であって、当該分野で公知である（例えば、Ｃｏｌｌｅｒら、１９９３，上記、を参照のこと）。
【０１１１】
（翻訳後化学改変）種々の宿主細胞は、融合タンパク質の特定のタイプの翻訳後修飾を提供し得る種々の翻訳後修飾を、もしこのような修飾に必要なアミノ酸配列が融合タンパク質に存在する場合は含む。多数（約１００）の翻訳後修飾が記載されており、その２〜３が本明細書に考察されている。当業者は、適切な宿主細胞を選択し、そして特定のタイプの修飾に必要なアミノ酸配列を含むタンパク質メンバーをコードするキメラ遺伝子を設計し得る。
【０１１２】
グリコシル化は、多くの真核生物系に存在する翻訳後化学修飾の１タイプであり、そしてタンパク質の活性、安定性、薬理遺伝学、免疫原性および／または抗原性に影響し得る。しかし、特定のアミノ酸が、適切なグリコシル化機構を補充するためにこのような部位に存在しなければならず、そして全ての宿主細胞が適切な分子機構を有するとは限らない。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、昆虫細胞を利用する発現系と同じく、グリコシル化タンパク質の生成を提供するが、グリコシル化のパターンは、融合タンパク質を生成するためにどの宿主細胞が用いられる化合物に依存して変化し得る。
【０１１３】
別のタイプの翻訳後修飾は、１つ以上のＳｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒ残基の側鎖の遊離のヒドロキシル基のリン酸化であり、タンパク質キナーゼがこのような反応を触媒する。リン酸化はしばしば、アミノ酸残基の脱リン酸を触媒する酵素であるタンパク質ホスファターゼの作用に起因して可逆性である。
【０１１４】
アミノ末端残基の化学構造の相違は、種々の宿主細胞であって、各々が出発コドンによってコードされるメチオニン残基の種々の化学バージョンを有し得る宿主細胞から生じ、そしてこれらは、種々の化学修飾を有するアミノ末端を生じる。
【０１１５】
例えば、多くのまたはほとんどの細菌タンパク質は、メチオニンの改変型であるアミノ末端アミノ酸、すなわち、Ｎ−ホルミル−メチオニン（ｆＭｅｔ）で合成される。全ての細菌タンパク質がｆＭｅｔ開始アミノ酸で合成されるという言及がしばしば行われるが；これはＥ．ｃｏｌｉについては真実であるかもしれないが、最近の研究では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのような他の細菌の場合には真実ではないことが示されている（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２１４３〜２２１４６，１９９９）。任意の事象では、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｆＭｅｔのホルミル基は一般に翻訳後に酵素的に除去されて、アミノ末端メチオニン残基が得られるが、ｆＭｅｔ残基全体が時には除去される（Ｈｅｒｓｈｅｙ，第４０章、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃ．，編集長、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８７，第１巻、第６１３〜６４７頁、そしてそこに引用される引用文献を参照のこと）。このような翻訳後修飾を触媒する酵素（例えば、ホルミラーゼなど）を欠くＥ．ｃｏｌｉ変異体は、アミノ末端ｆＭｅｔ残基を有するタンパク質を生成する（Ｇｕｉｌｌｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：４２９４〜４３０１，１９９２）。
【０１１６】
真核生物では、開始メチオニン残基、または最後から２番目の残基のアセチル化は、この開始メチオニンが除去されている場合、代表的には翻訳と同時にまたは翻訳後に生じる。アセチル化反応は、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ、ａ．ｋ．ａ．Ｎ−α−アセチルトランスフェラーゼ）によって触媒されるが、開始メチオニン残基の除去は、メチオニンアミノペプチダーゼによって触媒される（概説については、Ｂｒａｄｓｈａｗら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：２６３〜２６７，１９９８；ならびにＤｒｉｅｓｓｅｎら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：２８１〜３２５，１９８５を参照のこと）。アミノ末端でアセチル化されたタンパク質は、「Ｎ−アセチル化（Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）」、「Ｎαアセチル化（Ｎ  ａｌｐｈａ  ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）」、または単に「アセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）」されているといわれる。
【０１１７】
真核生物に存在する別の宿主翻訳プロセスは、カルボキシ末端のαアミド化である。概説については、Ｅｉｐｐｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０：３３３〜３４４，１９８８およびＢｒａｄｕｒｙら、Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：２３９〜２５１，１９９６を参照のこと。公知の内分泌および神経内分泌ペプチドホルモンの約５０％がαアミド化される（Ｔｒｅｓｔｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．４：９１１〜９２０，１９９３）。ほとんどの場合、カルボキシαアミド化が、これらのペプチダーゼホルモンを活性化するのに必要である。
【０１１８】
（ポリペプチド模倣物）
一般には、ポリペプチド模倣物（「ペプチド模倣物」）は、ポリペプチドの生物学的活性を模倣するが、もはや化学的性質はペプチドではない分子である。厳密な定義では、ペプチド模倣物は、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸間のアミド結合）を含まない分子である。しかし、ペプチド模倣物という用語は時に、自然にはもはや完全にペプチドではない分子、例えば、シュード・ペプチド（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ）、セミ・ペプチド（ｓｅｍｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ）およびペプトイドを記載するために用いられる。より広義の定義によるいくつかのペプチド模倣物の例（ポリペプチドの一部が、ペプチド結合を欠く構造で置換されている）は下に記載される。完全にまたは部分的にペプチドでなくても、本発明に従うペプチド模倣物は、このペプチド模倣物が基づくポリペプチド中の活性基の三次元配置を密接に模倣する反応性化学部分の空間的配置を提供する。この類似の活性部位の幾何形状の結果として、ペプチド模倣物は、このポリペプチドの生物学的活性と類似である生物学的系に影響を有する。
【０１１９】
所定のポリペプチド自体ではなく、その所定のポリペプチドの模倣物を用いるのはいくつかの潜在的な利点がある。例えば、ポリペプチドは、２つの所望されない特性、すなわち、劣ったバイオアベイラビリティおよび短い作用期間を示し得る。ペプチド模倣物はしばしば、経口活性であるために、そして長い作用期間を有するために十分小さい。ペプチド模倣物で経験されないポリペプチドについての安定性、貯蔵および免疫活性に関連する問題もある。
【０１２０】
所望の生物学的活性を有する候補物、リードおよび他のポリペプチドが、同様の生物学的活性を有するペプチド模倣物の開発に用いられてもよい。ポリペプチドからペプチド模倣物を開発する技術は公知である。ペプチド結合は、ペプチド模倣物が、もとのポリペプチドに対して同様の構造、従って生物学的活性を採用することを可能にする非ペプチド結合によって置換されてもよい。さらなる改変がまた、アミノ酸の化学基を同様の構造の他の化学基で置き換えることによって作成され得る。ペプチド模倣物の開発は、リガンドに対して遊離であるかまたは結合されている、もとのポリペプチドの三次元構造を、ＮＭＲ分光計、結晶学および／またはコンピューター補助分子モデリングによって決定することによって補助され得る。これらの技術は、もとのポリペプチドよりも高い力価および／またはより大きいバイオアベイラビリティおよび／またはより大きい安定性の新規な組成物の開発を補助する（Ｄｅａｎ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１６：６８３〜６８７，１９９４；ＣｏｈｅｎおよびＳｈａｔｚｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．，１１：１６６〜１７３，１９９３；ＷｉｌｅｙおよびＲｉｃｈ，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７〜３８４，１９９３；Ｍｏｏｒｅ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１５：１２４〜１２９，１９９４；Ｈｒｕｂｙ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３：１０７３〜１０８２，１９９３；Ｂｕｇｇら、Ｓｃｉ．Ａｍ．２６９：９２〜９８，１９９３ｓ、全て、参照によって本明細書に援用される］。
【０１２１】
従って、上記の方法の使用を通じて、本発明は、上記のポリペプチドに比較して治療活性の増強を示す化合物を提供する。上記の方法によって得られるペプチド模倣化合物であって、上記で名付けられたポリペプチドの生物学的活性および同様の三次元構造を有する化合物は本発明によって包含される。ペプチド模倣物が、前のセクションに記載される任意の改変ポリペプチドから、または前のセクションから記載される改変の２つ以上を保有するポリペプチドから生成され得ることは当業者に容易に明らかである。さらに、本発明のペプチド模倣物は、治療化合物としてのその有用性に加えて、さらに強力な非ペプチド化合物の開発のためにさらに用いられ得ることが、明らかである。
【０１２２】
前のセクションで記載されたポリペプチドに由来するペプチド模倣物の特定の例は下に示される。これらの例は、例示的であって、他のまたはさらなる改変に関する限定ではない。
【０１２３】
（減少したアイソスターシュードペプチド結合を有するペプチド）プロテアーゼは、ペプチド結合に作用する。従って、シュードペプチドによるペプチド結合の置換は、タンパク質分解に対する耐性を付与することが解る。多数のシュードペプチド結合は、一般的には、ポリペプチド構造および生物学的活性に影響しないことが記載されている。アイソスターシュードペプチド結合の減少は、適切なシュードペプチド結合であり、生物学的活性がないかまたは損失のほとんどない、酵素切断に対する安定性を増強することが公知である（参照によって本明細書に援用される、Ｃｏｕｄｅｒ、ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：１８１〜１８４，１９９３）。従って、これらの化合物のアミノ酸配列は、ペプチド結合の１つ以上が、アイソスターシュードペプチド結合によって置換されること以外は、親のＬアミノ酸ポリペプチドの配列と同一であってもよい。好ましくは、ほとんどのＮ末端ペプチド結合は置換される。なぜならこのような置換は、Ｎ末端で作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対して耐性を付与するからである。
【０１２４】
（レトロ・インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型シュードペプチド結合を有するペプチド）タンパク質分解に対する耐性を付与するために、ペプチド結合はまた、レトロ・インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）型シュードペプチド結合によって置換されてもよい（本明細書において参照によって援用される、Ｄａｌｐｏｚｚｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４１：５６１〜５６６）。この改変によれば、化合物のアミノ酸配列は、ペプチド結合の１つ以上が、レトロ・インベルソ型シュードペプチド結合によって置換されること以外は、そのＬアミノ酸親ポリペプチドの配列と同一であってもよい。好ましくは、ほとんどのＮ末端ペプチド結合が置換される。なぜなら、このような置換は、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を付与するからである。
【０１２５】
（ペプトイド誘導体）。ポリペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性について重要な構造的決定基を保持する別の型の改変ポリペプチドであり、ペプチド結合を排除し、それによってタンパク質分解に対する耐性を付与する（Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７〜９３７１，１９９２、そして参照によって本明細書に援用される）。ペプトイドは、Ｎ置換グリシンのオリゴマーである。多数のＮアルキル基が記載されており、その各々が天然のアミノ酸の側鎖に相当する。
【０１２６】
（コンビナトリアルタンパク質設計）
改変体は代表的に、同じ定量的な生物学的活性を示すが、シャペロン活性は、必要に応じて、もとの候補改変体タンパク質の活性から変更されてもよい。あるいは、改変体は、候補改変体タンパク質の生物学的活性が変更されるように設計されてもよい。例えば、グリコシル化部位は、変更されても、または除去されてもよい。同様に、生物学的機能が変更されてもよい。
【０１２７】
さらに、ある実施形態では、標的タンパク質に結合する変更されたシャペロン活性を有する候補改変体タンパク質を有することが所望される。好ましくは、酸化安定性、アルカリ安定性および熱安定性を示すタンパク質を有することが所望される。
【０１２８】
酸化的安定性の変化は、野性型タンパク質の活性に比較した場合、種々の酸化条件に曝露されたときの改変タンパク質の活性の少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％の増大によって証明される。酸化的安定性は、公知の手順によって測定される。
【０１２９】
アルカリ安定性の変化は、野性型タンパク質の活性の半減期に比較した場合、増加または減少するｐＨ条件に曝したときの改変タンパク質の活性の半減期における少なくとも約５％以上の増大または減少（好ましくは増大）によって証明される。一般的にはアルカリ安定性は、公知の手順によって測定される。
【０１３０】
熱安定性の変化は、野性型タンパク質の活性の半減期に比較した場合、比較的高温かつ自然のｐＨに曝したときの改変タンパク質の活性の半減期における少なくとも約５％以上の増大または減少（好ましくは増大）によって証明される。一般的には熱安定性は、公知の手順によって測定される。
【０１３１】
本発明の候補改変タンパク質および核酸は、多数の方法で作成され得る。個々の核酸およびタンパク質は、当該分野で公知であって、下に概説されるように作成され得る。あるいは、候補改変タンパク質のライブラリーが、試験のために作成され得る。
【０１３２】
好ましい実施形態では、候補改変タンパク質のライブラリーは、確率分布表から作成される。本明細書に概説されるとおり、確率分布表を生成する種々の方法があり、これは、ＰＤＡＴＭ技術、配列アラインメント、セルフ・コンシステント・メント・フィールド（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｍｅａｎｔ  ｆｉｅｌｄ）（ＳＣＭＦ）計算のような力場計算（ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）を用いる工程を包含する。さらに、確率分布を用いて、このライブラリーで観察される変異の頻度の尺度として、各々の位置について情報エントロピースコアを作成してもよい。
【０１３３】
この実施形態では、リスト中の各々の可変の位置での各々のアミノ酸残基の頻度が同定される。頻度は閾値であり得、カットオフより低い任意の改変体頻度はゼロに設定される。このカットオフは好ましくは、約１％、２％、５％、１０％または２０％であり、約１０％が特に好ましい。次いで、これらの頻度は、候補改変体タンパク質のライブラリーに構築される。すなわち、上記のとおり、これらの改変位置は、収集されて、全ての可能な組み合わせが生成され、ただし候補改変体タンパク質のライブラリーを「満たす（ｆｉｌｌ）」アミノ酸残基が、頻度に基づいて利用される。従って、候補改変体タンパク質の頻度に基づかないライブラリーでは、５つの可能な残基を有する改変タンパク質は、第一の潜在的な残基でその可変位置を含むタンパク質の約２０％を有し、第二で２０％などである。しかし、候補改変体タンパク質の頻度に基づくライブラリーでは、それぞれ約１０％、１５％、２５％，３０％および２０％の頻度を有する５つの可能性のある残基を有する可変位置が、第一の可能性のある残基でその可変位置を含むタンパク質の１０％を有し、第二の残基でタンパク質の１５％を、第三の残基で２５％を有するなどである。当業者によって理解されるとおり、現実の頻度は、タンパク質を実際に生成するために用いられる方法に依存し得る；例えば、正確な頻度は、タンパク質が合成されるときに可能になり得る。しかし、下に概説される頻度に基づくプライマーシステムを用いる場合、各々の位置での正確な頻度は、下にまとめられるように変化する。
【０１３４】
当業者によって理解され、そして本明細書に概説されるとおり、確率分布表は、種々の方法で作成され得る。本明細書に概説される方法に加えて、セルフ・コンシステント・ミーン：フィールド（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｍｅａｎ  ｆｉｅｌｄ）（ＳＣＭＦ）法が、確率表の直接の生成に用いられ得る。ＳＣＭＦは、エネルギーを算出するための回転異性体相互作用の平均場（ｍｅａｎ  ｆｉｅｌｄ）説明を使用する決定論的計算法である。この方法で作成される確率表を用いて、本明細書に上記されるような候補改変体タンパク質のライブラリーを作製してもよい。ＳＣＭＦは、以下の３つの方法で用いられ得る：アミノ酸の頻度および各々のアミノ酸の回転異性体が各々の位置に列挙される；確率がＳＣＭＦから直接決定される（参照によって明確に援用される、Ｄｅｌａｒｕｅら、Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１０９〜２１（１９９７）を参照のこと）。さらに、可変位置および非可変位置が同定され得る。あるいは、別の方法を用いて、配列スペースの検索の間に何の配列がジャンプされるかを決定する；ＳＣＭＦを用いてその配列についての正確なエネルギーを得る；次いでこのエネルギーを用いて、それをランク付けして、配列の序列リスト（Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏの配列表と類似）を作製する。次いで、各々の位置でアミノ酸の頻度を示す確率表はこのリストから計算され得る。Ｋｏｅｈｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９：２４９（１９９４）；Ｋｏｅｈｌら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．２：１６３（１９９５）；Ｋｏｅｈｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２２２（１９９６）；Ｋｏｅｈｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２９３：１１８３（１９９９）；Ｋｏｅｈｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１１６１（１９９９）；Ｌｅｅ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６：９１８、１９９４；およびＶａｓｑｕｅｚ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３６：５３７０、１９９５；その全てが参照によって明確に援用される。同様の方法としては、限定はしないが、ＯＰＬＳ−ＡＡ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８、１１２２５〜１１２３６，１９９６；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｗ．Ｌ．；ＢＯＳＳ、Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１；Ｙａｌｅ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ，１９９９）；ＯＰＬＳ（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８、１１０、１６５７ｆｆ，１９８８；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ｊ  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２、４７６８ｆｆ，１９９０）；ＵＮＲＥＳ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ；Ｌｉｗｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：１６９７〜１７１４，１９９３；Ｌｉｗｏら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２：１７１５〜１７３１，１９９３；Ｌｉｗｏら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１８：８４９〜８７３，１９９７；Ｌｉｗｏら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１８：８７４〜８８４，１９９７；Ｌｉｗｏら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９、２５９〜２７６，１９９８；Ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（Ｌｉｗｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、��６、５４８２〜５４８５，１９９９）；ＥＣＥＰＰ／３（Ｌｉｗｏら、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １３（４）：３７５〜８０，１９９４）；ＡＭＢＥＲ  １．１  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６、７６５〜７８４，１９９４）；ＡＭＢＥＲ  ３．０  ｆｏｒｃｅ  ｆｉｅｌｄ（Ｕ．Ｃ．Ｓｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：７５５〜７５９，１９９４）；ＣＨＡＲＭＭおよびＣＨＡＲＭＭ２２（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．ｖ４：１８７〜２１７）；ｃｖｆｆ３．０（Ｄａｕｂｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ、ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４：３１〜４７，１９８８）；ｃｆｆ９１（Ｍａｐｌｅ、ら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１５、１６２〜１８２，１９８８）が挙げられる；また、ＤＩＳＣＯＶＥＲ（ｃｖｆｆおよびｃｆｆ９１）およびＡＭＢＥＲ力場（ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄｓ）が、ＩＮＳＩＧＨＴ分子モデリングパッケージ（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で用いられ、そしてＨＡＲＭＭが、ＱＵＡＮＴＡ分子モデリングパッケージ（Ｂｉｏｓｙｍ／ＭＳＩ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）で用いられる；全ての引用文献は、その全体が参照によって明らかに援用される。
【０１３５】
さらに、確率分布表を作成する方法は、配列アラインメントプログラムの使用を通じる。さらに、確率表は、配列アラインメントおよび計算アプローチの組み合わせによって得ることができる。例えば、当業者は、相同な配列のアラインメントで見出されるアミノ酸を、計算結果に加えてもよい。好ましくは、当業者は、計算で見出されない場合は、野性型アミノ酸同一性を確率表に対して加えてもよい。
【０１３６】
必要である場合、可変位置および／または可変位置での残基を組換えることによって作成される候補改変タンパク質のライブラリーは、序列リストにはなくてもよい。ある実施形態では、全体的なリストがまさに作成されて試験され得る。あるいは、好ましい実施形態では、二次ライブラリーはまた、序列リストの形態である。これは、二次ライブラリーのサイズが実験的に生成するにはまだ大きすぎることを含むいくつかの理由のために、または予測目的のために行われ得る。これはいくつかの方法で行われ得る。１実施形態では、二次ライブラリーは、ライブラリーのメンバーをランク付けまたはフィルタリングするために、ＰＤＡＴＭのスコアリング機能を用いてランク付けまたはフィルタリングされる。あるいは、統計学的方法が用いられてもよい。例えば、二次ライブラリーは、頻度スコアによってランク付けまたはフィルタリングされてもよい；すなわち、最も高頻度の残基を含むタンパク質がより高位にランク付けされ得るなど。これは、数値的なスコアを作成するために各々の可変位置で頻度を加えるかまたは掛けることによって行われ得る。同様に、二次ライブラリーの異なる位置を重み付けし、次いでタンパク質をスコア付けする；例えば、特定の残基を含むタンパク質を任意にランク付けするか、またはフィルタリングしてもよい。
【０１３７】
一実施形態では、候補改変体ライブラリーの異なるタンパク質メンバーが化学的に合成され得る。これは、設計されたタンパク質が短い、好ましくは１５０アミノ酸長未満である場合に特に有用であり、１００アミノ酸未満が好ましく、５０アミノ酸未満が特に好ましいが、当該分野で公知のとおり、より長いタンパク質が化学的にまたは酵素的に作成され得る。例えば、参照によって本明細書に明確に援用される、Ｗｉｌｋｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４１２〜６，１９９８を参照のこと。
【０１３８】
別の実施形態では、詳細には、より長いタンパク質、またはより大きいサンプルが所望されるタンパク質については、候補改変体配列を用いて、メンバー配列をコードし、次いで、必要に応じて、宿主細胞にクローニングされて、発現され、アッセイされ得る、ＤＮＡのような核酸を作成してもよい。従って、各々のメンバーのタンパク質配列をコードする、核酸および詳細にはＤＮＡが作成され得る。これは、周知の手順を用いて行われる。コドン、適切な発現ベクター、および適切な宿主細胞の選択は、多数の要因に依存して変化し、そして必要に応じて容易に最適化され得る。
【０１３９】
さらなる実施形態では、プールされたオリゴヌクレオチドでの複数のＰＣＲ反応を行う。この実施形態では、全長遺伝子に対応する重複するオリゴヌクレオチドを合成する。ここでも、これらのオリゴヌクレオチドは、各々の改変位置またはサブセットにおける、異なるアミノ酸の全てに相当し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、等しい割合でプールされ得、そして複数のＰＣＲ反応を行って、二次ライブラリーによって規定される変異の組み合わせを含む全長配列を作製する。さらに、これは、エラー・プローンＰＣＲ法を用いて行われてもよい。種々のオリゴヌクレオチドを、確率分布表に相当する相対量で添加してもよい。従って複数のＰＣＲ反応によって、変異の所望の組み合わせを所望の割合で有する全長配列が生じる。
【０１４０】
必要なオリゴヌクレオチドの総数は、変異される位置の数およびこれらの位置で考えられる変異の数の関数である：（定常位置のオリゴの数）＋Ｍ１＋Ｍ２＋Ｍ３＋．．．Ｍｎ＝（必要なオリゴの総数）、ここでＭｎは、配列のｎ位で考えられる変異の数である。
【０１４１】
さらなる局面では、各々の重複するオリゴヌクレオチドは、改変される位置を１つしか含まない；別の実施形態では、改変位置は、これを可能にするには一緒に近接し過ぎ、そして１オリゴヌクレオチドあたり複数の改変体が、全ての可能性の完全な組み合わせを可能にするために用いられる。すなわち、各々のオリゴは、変異されている単一の位置について、または変異されている２つ以上の位置についてコドンを含み得る。変異されている複数の位置は、オリゴの長さが実用的でないことを防ぐために配列中で近くなければならない。オリゴヌクレオチド上の複数の変異位置について、変異の特定の組み合わせは、その組み合わせをコードするオリゴヌクレオチドを含むこと、または排除することによってライブラリーに含まれてもまたは排除されてもよい。例えば、本明細書に考察されるとおり、可変領域の間には相関があり得る；すなわち、Ｘ位置は特定の残基であり、Ｙ位置は、特定の残基でなければならない（または特定の残基であってはならない）。可変位置のこれらのセットは、時に、本明細書において「クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）」と呼ばれる。クラスターが、一緒に近接している残基からなり、従って１つのオリゴヌクレオチドプライマー上に存在し得る場合、このクラスターは、「良好な（ｇｏｏｄ）」相関に設定され得、そしてライブラリーの有効性を減少し得る悪い組み合わせを排除する。しかし、クラスターの残基は、配列中でかなり離れており、従って、合成のための異なるオリゴヌクレオチド上に存在する場合、その残基を「良好な」相関に設定するか、または可変残基として全体を排除することが所望され得る。別の実施形態では、ライブラリーは、いくつかの工程で生成され得、その結果、クラスター変異のみが一緒に出現する。この手順、すなわち、変異クラスターを同定する手順、およびそれらを同じオリゴヌクレオチド上に置くか、またはそれらをクラスターを保存するいくつかの工程でライブラリーもしくはライブラリー生成から排除する手順は、適切に折り畳まれたタンパク質で実験的ライブラリーをかなり富化し得る。クラスターの同定は、多数の方法によって、例えば、公知のパターン認識方法、変異の出現の頻度の比較を用いることによって、または実験的に生成されるべき配列のエネルギー分析（例えば、相互作用のエネルギーが高い場合、位置が相関する）を用いることによって行われ得る。これらの相関は、位置的な相関（例えば、可変位置１および２が常に、一緒に変化するか、または決して一緒に変化しない）であっても、または配列相関（例えば、残基Ａが位置１に存在する場合、残基Ｂは常に位置２に存在する）であってもよい。以下を参照のこと：Ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄａｔａ：Ｔｏｏｌｓ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊａｓｏｎ  Ｔ．Ｌ．Ｗａｎｇ、Ｂｒｕｃｅ  Ａ．Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｓｈａｓｈａ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｖｉｅｒｓｉｔｙ、１９９９；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｈａｒｒｙ  Ｃ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔ���ｏｎ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９７２；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ；編者、Ｋ．Ｓ．Ｆｕ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２；Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ；Ｓａｎｋａｒ  Ｋ．Ｐａｌ、Ｐａｕｌ  Ｐ．Ｗａｎｇ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎによる編集：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、ｃ１９９６；Ｐａｎｄｙａ、Ａｂｈｉｊｉｔ  Ｓ．、Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  Ｃ＋＋／Ａｂｈｉｊｉｔ  Ｓ．Ｐａｎｄｙａ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂ．Ｍａｃｙ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｖｉｓｉｏｎ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｆ．Ｐａｕ、Ｐ．Ｓ．Ｐ．Ｗａｎｇ．第２版．Ｓｉｇｎａｐｏｒｅ；Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．：Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃ１９９９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ、Ｎｅｕｒａｌ、ａｎｄ  Ｆｕｚｚｙ  Ｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ；Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．：Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃ１９９９、Ｓｅｒｉｅｓ  ｔｉｔｌｅ  ：Ｓｅｒｉｅｎ  ａ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ；ｖｏｌ．３２；その全てが、参照によって明確に援用される。さらに、コンセンサスモチーフについて検索するために用いられるプログラムが同様に用いられ得る。
【０１４２】
さらに、相関およびシャッフリングは、オリゴヌクレオチドの設計を変更することによって；すなわち、オリゴヌクレオチド（プライマー）がどこで開始および停止するか（例えば、どの配列が「カット（ｃｕｔ）」であるか）を決定することによって、固定または最適化され得る。オリゴの開始部位および停止部位は、単一のオリゴヌクレオチドに出現するクラスターの数を最大化するように設定され得、これによってより高いスコアリング配列を有するライブラリーを富化する。種々のオリゴヌクレオチドの開始および停止部位の選択肢は、コンピューターでモデル化されてもよく、そして単一のオリゴ上に提示されるクラスターの数、または配列の予想されるライブラリーと一致する得られた配列の割合に従ってランク付けもしくはフィルタリングされる。
【０１４３】
複数の変わりやすい位置が単一のオリゴヌクレオチドによってコードされる場合、必要なオリゴヌクレオチドの総数は増大する。アニーリングされる領域とは、定常を保持する、すなわち、参照配列の配列を有する領域である。
【０１４４】
コドンの挿入または欠失を有するオリゴヌクレオチドを用いて、異なる長さのタンパク質を発現するライブラリーを作成してもよい。詳細には、挿入または欠失のためのコンピューターによる配列スクリーニングは、種々の長さのタンパク質を規定する二次ライブラリーを生じ得、これは、異なる長さのプールされたオリゴヌクレオチドのライブラリーによって発現され得る。
【０１４５】
さらなる局面では、二次ライブラリーは、ファミリー（例えば、改変体のセット）をシャッフリングすることによって行われる；すなわち、トップの配列のいくつかのセット（序列リストを用いる場合）を、エラー・プローンＰＣＲの有無のいずれかで、シャッフリングし得る。「シャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」とは、この文脈では、一般にはランダムな方法での、関連の配列の組換えを意味する。これは、その全てが、その全体として参照によって明確に援用される、米国特許第５，８３０，７２１号；同第５，８１１，２３８号；同第５，６０５，７９３号；同第５，８３７，４５８号およびＰＣＴＵＳ／１９２５６に規定されかつ例示されるような「シャッフリング」を含んでもよい。配列のこのセットはまた、人工的なセットであってもよい；例えば、確率表（例えば、ＳＣＭＦを用いて生成される）、またはＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏセットから。同様に、「ファミリー（ｆａｍｉｌｙ）」は、トップの１０および最後の１０の配列、トップの１００の配列などであってもよい。これはまた、エラー・プローンＰＣＲを用いて行われ得る。
【０１４６】
従って、さらなる局面では、本明細書に記載のコンピューター方法を用いてインシリコシャッフリングを行う。すなわち、２つのライブラリーまたは２つの配列のいずれかで開始して、配列のランダムな組換えが生成および評価され得る。
【０１４７】
エラー・プローンＰＣＲを行って、二次ライブラリーを生成してもよい。その全てが、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号および同第５，８３０，７２１号を参照のこと。これは、最適の配列上でもしくはライブラリーのトップのメンバー上で、またはいくつかの他の人工的なセットもしくはファミリーで行ってもよい。この実施形態では、一次ライブラリーのコンピュータースクリーニングに見出される最適配列の遺伝子が合成され得る。次いで、エラー・プローンＰＣＲを、二次ライブラリーの改変位置で変異をコードするオリゴヌクレオチド（バイアスオリゴヌクレオチド）の存在下で最適配列遺伝子上で行う。オリゴヌクレオチドの付加によって、二次ライブラリー中の変異の組み込みを支持するバイアスが作成される。あるいは、特定の変異のための唯一のオリゴヌクレオチドを用いて、ライブラリーをバイアスし得る。
【０１４８】
エラー・プローンＰＣＲでの遺伝子シャッフリングを、バイアスオリゴヌクレオチドの存在下で、最適配列について遺伝子上で行なって、二次ライブラリーに見出される変異の割合を反映するＤＮＡ配列ライブラリーを作成してもよい。バイアスオリゴヌクレオチドの選択は、種々の方法で行われ得る；それらは、それらの頻度に基づいて選択され得る、すなわち、高い変異頻度の位置をコードするオリゴヌクレオチドが用いられ得る；あるいは、多様性が増大するように、最も可変の位置を含むオリゴヌクレオチドを用いてもよい；二次ライブラリーがランク付けまたはフィルタリングされる場合、トップのスコアリング位置のいくつかの数を用いてバイアスオリゴヌクレオチドを生成し得る；ランダムな位置を選択してもよい；２〜３のトップのスコアリングおよび２〜３の低いスコアリングのものを選択してもよい；など。重要なことは、好ましい可変位置および配列に基づいて新規な配列を生成することである。
【０１４９】
野性型遺伝子またはポリペプチド配列を用いるＰＣＲを用いてもよい。この実施形態では、出発遺伝子を用いる；一般には、これは必要ではないが、遺伝子は、野性型遺伝子である。ある場合には、これは、全体的な最適化された配列をコードする遺伝子であってもよいし、またはリストの任意の他の配列であってもよい。この実施形態では、改変位置に相当し、そして二次ライブラリーの異なるアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドが用いられる。ＰＣＲは、当該分野で公知のとおり、末端でＰＣＲプライマーを用いて行われる。これは、２つの利点を提供する；第一は、これには一般に必要なオリゴヌクレオチドが少なく、かつ生じる誤差が少なくてすむということである。さらに、これは、野性型遺伝子を用いる場合、これが合成される必要がないという点で実験上の利点を有する。ＰＣＲ産物の連結を行ってもよい。
【０１５０】
１つ以上の候補改変体二次ライブラリーに対して、種々のさらなる工程を行ってもよい；例えば、さらなるコンピューター処理プロセスを行ってもよく、候補改変体二次ライブラリーを組換えてもよく、または種々の候補改変体二次ライブラリー由来のカットオフを組み合わせてもよい。好ましい実施形態では、候補改変体二次ライブラリーをコンピューターで再操作して、さらなる二次ライブラリー（時には、本明細書において、「三次ライブラリー（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）」と呼ばれる）を形成してもよい。例えば、任意の候補改変体二次ライブラリー配列は、第一の二次ライブラリーにおける変化した位置のいくつかまたは全てを凍結または固定することによって、２回目のＰＤＡＴＭに選択され得る。あるいは、最後の確率分布表にみられる変化のみが許される。あるいは、確率表のストリンジェンシーは、包含のカットオフを増大または減少させることによって変化されてもよい。同様に、候補改変体二次ライブラリーは、初回の後に実験的に組換えられてもよい；例えば、第一のスクリーニングから最高の遺伝子（単数または複数）をとり、そして遺伝子アセンブリをやり直してもよい（例えば、下に概説される技術、マルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）ＰＣＲ、エラー・プローンＰＣＲまたはシャッフリングを用いて）。あるいは、いくつかの位置で確率を変化させるための１つ以上の良好な遺伝子（単数または複数）由来のフラグメント。これは、初回のコンピュータースクリーニングおよび実験的スクリーニングで見出される配列スペースの領域に対して検索をバイアスする。
【０１５１】
（低分子化学組成）
「低分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、生物学的プロセスに影響するように機能し得る任意の化学部分または他の部分を包含する。低分子は、現在公知でかつ用いられている多数の治療因子を含んでもよいし、または生物学的機能（単数または複数）をスクリーニングする目的のためにこのような分子のライブラリー中で合成された低分子であってもよい。低分子は、サイズによって高分子から識別される。本発明の低分子は一般に、約５，０００ダルトン（Ｄａ）未満、好ましくは、約２，５００Ｄａ未満、さらに好ましくは、１，０００Ｄａ未満、最も好ましくは、約５００Ｄａ未満の分子量を有する。
【０１５２】
低分子としては、限定はしないが、有機化合物、ペプチド模倣物およびその結合体が挙げられる。本明細書において用いる場合、「有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という用語は、核酸およびポリペプチドのような高分子以外の任意の炭素に基づく化合物をいう。炭素に加えて、有機化合物は、カルシウム、塩素、フッ素、銅、水素、鉄、カリウム、窒素、酸素、イオウおよび他の元素を含んでもよい。有機化合物は、芳香族または脂肪族の形態であってもよい。有機化合物の非限定的な例としては、アセトン、アルコール、アニリン、炭水化物、炭糖類、オリゴ糖類、多糖類、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、プロテオグリカン、ケトン、アルデヒド、飽和、不飽和および多価不飽和の脂肪、油状物およびワックス、アルケン、エステル、エーテル、チオール、スルフィド、環状化合物、複素環化合物、イミジゾールおよびフェノールが挙げられる。本明細書において用いられる有機化合物としてはまた、ニトロ化有機化合物およびハロゲン化（例えば、塩素化）有機化合物が挙げられる。ペプチド模倣物を調製するための方法は、下に記載される。低分子のコレクション、ならびに本発明に従って同定された低分子は、加速器質量分析（ＡＭＳ；Ｔｕｒｔｅｌｔａｕｂら、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ６（１０）：９９１〜１００７，２０００，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ；およびＥｎｊａｌｂａｌら、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ  １９（３）：１３９〜６１，２０００，Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照のこと）のような技術によって特徴づけられる。
【０１５３】
好ましい低分子は、比較的容易にかつ安価に製造され、処方されるかそうでなければ調製される。好ましい低分子は、種々の保管条件下で安定である。好ましい低分子は、生物学的に活性であり、薬学的特性が改善されている分子を形成するために高分子と緊密に会合されて配置され得る。改善された薬学的な特性としては、所望の生物学的活性に有益である、循環時間、分布、代謝、修飾、排出、分泌、排泄および安定性の変化が挙げられる。改善された薬学的な特性としては、化合物の毒性学および有効性の特徴における変化が挙げられる。
【０１５４】
（使用方法）
本発明のインテリペプチドは、限定はしないが、例えば、タンパク質の凝集または誤まった折り畳みに関連する疾患および障害を処置するための治療用途を含む、種々の適用において、そして組換え生成ポリペプチドを含む、ポリペプチドの製造および精製において有用であり得る。候補の治療化合物がインビトロにおいてタンパク質の未折り畳みおよび凝集を防止する能力は、その化合物がインビボにおいてタンパク質の未折り畳みおよび凝集を阻害する能力と相関し得ると考えられる。さらに、候補の治療化合物がインビトロでタンパク質の機能的な構造を安定化する能力は、この化合物がインビボにおいてそのタンパク質がその機能を果たすことを補助する能力と相関し得ると考えられる。
【０１５５】
本明細書で提示されるペプチドは、疾患に関与するタンパク質凝集またはタンパク質の誤まった折り畳みを防止する治療ペプチドとしての使用のためにカスタマイズされ得る薬物分子の多様なセットを提供する。タンパク質の凝集またはタンパク質の誤まった折り畳みに関連する疾患の例としては、限定はしないが、アルツハイマー病のアミロイドβ、白内障のβ／γクリスタリンおよびフィラメント、パーキンソン病のαシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、ハンチントン病のハンチントン、網膜色素変性症のロドプシン、狂牛病のプリオンなどが挙げられる。タンパク質配列における単一のアミノ酸変化をもたらすミスセンス変異はヒトの疾患に関連している。約１６，００００の同定されたミスセンス変異のほとんどが、タンパク質の機能に特定に影響するのではなく、タンパク質の折り畳みまたは輸送に影響する。内在性膜タンパク質における疾患関連のミスセンス変異は、膜タンパク質の誤まったアセンブリを生じる、例えば、シャルコー・マリー・ツース病のＰＭＰ−２２、尿崩症におけるアクアポリン、尿崩症におけるバソプレッシン受容体、網膜色素変性症のロドプシン、シャルコー・マリー・ツース病におけるコネキシン３２、嚢胞性線維症におけるＣＦＴＲ。
【０１５６】
さらなるペプチドをワクチン、インスリン、成長因子、モノクローナル抗体のような治療タンパク質の安定化のために用い得る。インテリペプチドをタンパク質の精製に用いて、タンパク質の折り畳みをその機能的な３Ｄ高次構造に補助してもよい。
【０１５７】
従って、本発明は、インテリペプチドの使用に関する種々の方法を記載する。一実施形態では、本発明は、このようなタンパク質を含む細胞または溶液に対してインテリペプチドを提供することによって、タンパク質未折り畳みを阻害するかまたはタンパク質凝集を軽減させる方法を提供する。関連の実施形態では、本発明は、このようなタンパク質を含む細胞または溶液に対してインテリペプチドを提供することによって、正確なまたは適切なタンパク質の折り畳みを回復する方法を包含する。さらに、本発明は、組換え生成ポリペプチドの生成および／または単離を、このようなポリペプチドを含む細胞または溶液に対してインテリペプチドを提供することによって増強する方法をさらに提供する。
【０１５８】
インテリペプチドは、当該分野で利用可能な種々の手段によって細胞または溶液に提供され得る。例えば、合成インテリペプチドは、溶液にまたは細胞内に直接提供されてもよい。さらに、インテリペプチドは、インテリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、細胞中でこのインテリペプチドの発現を駆動する調節性エレメントとともに導入することによって、細胞または溶液に提供され得る。ポリヌクレオチド配列はさらに、さらなるコード領域を含んでもよく、これは、例えばインテリペプチドが細胞から分泌されるような分泌シグナル、および／またはコードされたインテリペプチドの発現を調節するさらなるエレメントを含み、その大きい多様性が当該分野で公知であってかつ利用可能であり、これは、ペプチドおよびポリペプチドの誘導性発現のために用いられるものを含む。従って、本発明はさらに、インテリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびこれを含む発現ベクターを包含し、これには例えば、ウイルスベクターが挙げられる。
【０１５９】
インテリペプチドは、限定はしないが、タンパク質凝集疾患のための治療剤として用いられ得、この疾患としては、アルツハイマー病、白内障、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）、牛海綿状脳症（狂牛病）、プリオン病、黄斑変性症、および網膜色素変性症が挙げられる。さらに、インテリペプチドは、限定はしないが、ワクチン、インスリン、成長因子およびモノクローナル抗体を含む、治療剤として用いられるタンパク質および／またはペプチドを安定化し得る。インテリペプチドは、精製の間、タンパク質の三次元構造の折り畳みを補助し、そして安定化する。従って、本発明は、インテリペプチドのその必要な患者への投与を包含する、疾患または障害を処置する方法を提供する。インテリペプチドの治療適用に関するダイアグラムは、図１に提供される。
【０１６０】
一実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を有する患者に対してインテリペプチドを提供することによる、アルツハイマー病の処置のための方法を提供する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、短期記憶の喪失、失見当識、ならびに判断および推論の障害によって特徴付けられる荒廃的な神経変性状態である。ＡＤは、高齢者集団では最も一般的な認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）であって、それは、世界で２５００万を超える人にある程度は影響すると推定される。ＡＤにおける特徴的な事象は、脳の実質および脳血管壁における、アミロイドとして公知の不溶性タンパク質凝集物の沈着である。アミロイドの主な成分は、かなり長い前駆タンパク質（ＡＰＰ）の一部として第２１染色体にコードされる、アミロイドβペプチド（Ａｍｙｌｏｉｄ−β）と名付けられた、４．３ｋＤａの疎水性ペプチドである（Ｓｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６３０〜６３１，１９９７）。過去１０年間に蓄積された遺伝的、生化学的および神経病理学的な証拠によって、アミロイドはＡＤの初期の病理には重要な役割を果たし、そしておそらく疾患を誘発することが強く示唆される（Ｓｅｌｋｏｅ，１９９７）。アルツハイマー病の場合、タンパク質であるアミロイドβおよびτの凝集は、神経細胞および神経突起の変性に関連している。アミロイドβ凝集は神経細胞死を生じる毒性プラークの形成をもたらす、τは、他方では、神経突起の構造には重要な役割を果たす。τは、チューブリンと呼ばれる細胞骨格フィラメントと会合して、神経突起のコアである微小管を形成する。翻訳後改変、詳細には、τの過剰リン酸化は、τ−チューブリン相互作用の不安定化をもたらす。微小管の不安定化は、神経突起の変性をもたらす。最終的にはτ−チューブリン相互作用は、極度に不安定化されて、その結果チューブリンからτが解離して自由になる。未結合のタウは、凝集して神経原線維濃縮体を形成する傾向を有する。神経原線維濃縮体は、神経毒性であって、神経変性をもたらす。アミロイドβプラークおよび神経原線維濃縮体は、アルツハイマー病の特徴である。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明は、糖尿病を有する患者にインテリペプチドを提供することによる糖尿病の処置のための方法を提供する。特定の実施形態では、インテリペプチドは、糖尿病のためのインスリンの経口およびまたは経鼻送達のための安定化分子として患者に提供される。従って、本発明は、糖尿病を処置する方法を包含し、この方法は、インスリンをインテリペプチドと組み合わせて、その必要な患者に投与する工程を包含する。
【０１６２】
インスリンの経口および経鼻の送達方法は簡便でかつ疼痛がなく、近年ヒトでの使用についてＦＤＡに承認されているが、現在、Ｉ型糖尿病へのインスリン送達のための最も広範に用いられる方法は、注射による。多くの糖尿病は、１日に複数回の注射を必要とし、それは疼痛がありかつ不便なことであり得る。インスリンはペプチド薬物であって、室温では不安定で、胃腸（ＧＩ）膜を通じて吸収できず、そしてＧＩ管の酵素によってタンパク質分解されやすい。温度、ｐＨおよびタンパク質分解酵素を含む過酷な環境条件からインスリンを保護することによってインスリンを安定化し得る分子によって、経口または経鼻の経路を介するインスリンの送達が可能になる。ｐＨおよびタンパク質分解酵素からインスリンを保護する低分子およびポリマーが存在するが、既存のポリマーでも低分子でも、長期間にわたってインスリンの構造的統合性を保持し得るものはない。インテリペプチドは、インスリンに結合してその構造を安定化し得、その機能を維持し得、そして温度、ｐＨおよびタンパク質分解酵素からインスリンを保護し得る。１つ以上のインテリペプチドでのインスリンの処方によって、限定はしないが、経口、経鼻のデバイスおよびパッチの方法を含む経路を介するインスリンを送達が可能になる。
【０１６３】
別の実施形態では、本発明は、ペプチドまたはタンパク質の製造および／または精製の方法であって、このようなペプチドまたはタンパク質を含む細胞または溶液へのインテリペプチドの導入による方法を包含する。現在の薬学的な発見の過程は、特定の分子標的に対する薬物を開発することにますます集中しており、そして組換えタンパク質の生成のための産業において必要性が大きく増大している。高い品質のタンパク質の発現は、薬物の発見および薬物の治療に必須である。多数の潜在的な薬物標的およびタンパク質およびペプチド薬物が増大しているので、組換えタンパク質の必要性が増大しているようである。標的タンパク質を可溶性型で、かつ大量に生成するしっかりした方法の開発は、現代の薬物発見の本質的な要件である。インテリペプチドは、細菌または哺乳動物発現系のようなバイオテクノロジーの方法を用いて合成されるタンパク質を折り畳むための折り畳み補助として機能し得る。
【０１６４】
インテリペプチドは、タンパク質の誤まった折り畳みおよび凝集の疾患の経路において１つ以上の中間体を標的する分子の多様なセットである。１実施形態では、インテリペプチドは、立体配置が損なわれたタンパク質の天然ではない中間体を結合および安定化するように設計され、例えば、インテリペプチドは、アミロイドβに結合して安定化し、そしてその凝集を妨げる。
【実施例】
【０１６５】
（例示的な実施形態）
（実施例１）
（βアミロイドに結合するαＢクリスタリンペプチドの同定）
標的タンパク質βアミロイドに結合するαＢクリスタリンペプチドは、αＢクリスタリンタンパク質ピンアレイをスクリーニングすることによって同定され、これによってヒトαＢクリスタリンの１〜１７５残基に相当するペプチドと選択された標的タンパク質との間の相互作用を平行かつ同時の方式で評価するための体系的な方法が提供される。
【０１６６】
ペプチドは、マイクロタイタープレート形式で配列された誘導体化されたポリエチレンピンで合成した。各々のペプチドは、８アミノ酸長であって、連続的ペプチドは２アミノ酸ごとにオフセットされた。全てのペプチドは表面プラスチックピンに共有結合された。最初の固定されたペプチドは、１ＭＤＩＡＩＨＨＰ８であり、そして最後のペプチドはヒトαＢクリスタリンの１６８ＰＡＶＴＡＡＰＫ１７５であった。
【０１６７】
合成後、ピンを、室温で２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％アジ化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いて１時間、事前コーティングして、各々１０ｍＭ  ＰＢＳを用いて１０分間３回洗浄した。ペプチドに対する結合についてスクリーニングするために、標的タンパク質βアミロイドの固定濃度を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ中で希釈して、各々のウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。ピンアレイを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭのＰＢＳを各々用いて１０分間３回洗浄した。標的タンパク質βアミロイドについてのモノクローナルまたはポリクローナルの一次抗体を、ＰＢＳ希釈液中で希釈して、各々のウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。引き続き、ピンアレイを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭのＰＢＳを各々用いて１０分間３回洗浄した。抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体二次抗体をＰＢＳ緩衝液に希釈して、各々のウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。このピンアレイを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１０ｍＭのＰＢＳを各々用いて１０分間３回洗浄した。無色である西洋ワサビペルオキシダーゼ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）発色性基質（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加して、反応を４５分間行った。
【０１６８】
正の結果を示すピンは、青色の形成を生じた。この反応を、６Ｎ硫酸を添加することによって停止させ、これは青から黄色に色を変化する。４５０ｎｍでの吸収をＥＬＩＳＡリーダーによって測定した（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）。
【０１６９】
全てにおいて、ヒトαＢクリスタリンの全体的な一次配列に相当する８４ペプチドを、標的タンパク質βアミロイドに対する結合についてスクリーニングした（表２）。８４ペプチドのうち３６ペプチドが、標的タンパク質βアミロイドに結合した。
【０１７０】
ピンアレイは、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．１％の２−メルカプトエタノールを含有する、１００ｍＭ  ＰＢＳを用いて、水槽中で超音波（ＶＷＲ  Ａｑｕａｓｏｎｉｃ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって、６０℃で１０分間、再作成した。次に、ピンアレイを、脱イオン水中で３回リンスして、各時間３０秒間６０℃に事前加熱して、事前加熱した水中で３０分間６０℃で振盪した。次いで、ピンアレイを、メタノールを用いて６０℃で１５秒間洗浄して、風乾して、後の使用のために−２０℃で保管した。各々の標的タンパク質を、ヒトαＢクリスタリンタンパク質ピンアレイペプチドに対して２〜５回アッセイして、結果の再現性を確認した。表２におけるペプチドで５、７、８、９、１３、１９、２２、２３、２４、２７、３５、３８、４５、５１、５２、５６、５７、６１、６６、７１、７２および７９の番号は、タンパク質ピンアレイにおいて再現性に陽性と試験された。
【０１７１】
表２：タンパク質ピンアレイ形式で合成したヒトαＢクリスタリンの連続的な８マーのペプチドのリスト。第２列および第６列はペプチド配列を列挙している。第３および７列は、製造業者によって提供される疎水性を列挙している。第４および８列は、製造業者（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって提供される計算された分子量を挙げている。
【０１７２】
【表２−１】
2008520555.tif 000005
【０１７３】
【表２−２】
2008520555.tif 000006
【０１７４】
【表２−３】
2008520555.tif 000007
（実施例２）
（インビトロにおけるアミロイドβのｐＨ誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果）
インビトロアッセイを行って、実施例１において同定されたヒトαＢクリスタリン由来ペプチドがｐＨ誘発性アミロイドβ（１−４２）凝集の凝集を阻害する能力を測定した。アルツハイマー病に関与するペプチドである、アミロイドβ（１−４２）を酸性条件（ｐＨ５．２）下で凝集させる。実施例１に同定された合成ペプチドの有無において、５．２という酸性のｐＨで慣用的な手順を用いて、凝集アッセイを行った。３６０ｎｍの波長で、凝集を光散乱として分光測定的に測定した。他のペプチドの非存在下で凝集したアミロイドβを、１００％凝集という値に割り当て、そして合成ペプチドの存在下で凝集を正規化するために用いた。
【０１７５】
タンパク質ピンアレイを用いて同定され、そしてアミロイドβのｐＨ誘発性凝集を防止するのにおけるその有効性について試験された配列を含有する同定された３つのペプチドは、インビトロにおけるアミロイドβの凝集を再現性に防止できた。これらのペプチドの配列は、それぞれ、ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、またはＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ、またはＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥである。図２は、βアミロイド凝集の凝集に対する各々のペプチドの効果を示すグラフを提供する。ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ（４％凝集）は、ｐＨ５．２でアミロイドβのｐＨ誘発性凝集を防止するのにおいて最も有効であった。ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ（１５％凝集）（バー４）およびＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ（３０％凝集）（バー５）は、ｐＨ５．２でのアミロイドβのｐＨ誘発性凝集を防止した。これらのデータによって、αＢクリスタリンタンパク質ピンアレイをスクリーニングすることによって同定されたペプチドは、タンパク質アミロイドβ凝集を軽減させる能力を有することが実証された。
【０１７６】
図２は、インビトロでのアミロイドβのｐＨ誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果を示す棒グラフを示す。凝集は、二重の実験について標準誤差をともなう棒グラフとしてプロットした。１番目の垂直のバーは、ｐＨ５．２で可溶性のアミロイドβについて測定した散乱である。２番目の垂直のバーは、任意の他のペプチドまたはタンパク質の非存在下でｐＨ５．２で凝集したアミロイドβに相当する（１００％凝集）。３番目から５番目の垂直のバーは、それぞれ、ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、またはＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ、またはＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥのいずれかの存在下におけるｐＨ５．２のアミロイドβに相当する。ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳは、ｐＨ５．２でアミロイドβのｐＨ誘発性凝集（４％凝集）を予防するのに最も有効である。ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ（１５％凝集）（バー４）およびＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ（３０％凝集）（バー５）は、ｐＨ５．２でのアミロイドβのｐＨ誘発性凝集を阻害した。
【０１７７】
（実施例３）
（インビトロにおけるアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果）
インビトロアッセイをまた行って、実施例１において同定されたヒトαＢクリスタリン由来ペプチドがＣｕ＋＋＋誘発性アミロイドβ（１−４２）凝集の凝集を阻害する能力を測定した。１００ｍＭのＣｕ＋＋＋の存在下で、実施例１において同定された合成ペプチドの有無において、慣用的な手順を用いて、凝集アッセイを行った。３６０ｎｍの波長で、凝集を光散乱として分光測定的に測定した。凝集したアミロイドβを、１００％凝集という値に割り当て、そして合成ペプチドの存在下で凝集を正規化するために用いた。
【０１７８】
タンパク質ピンアレイを用いて同定され、そしてアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集を防止するのにおけるその有効性について試験された配列を含有する３つのペプチドは、図３に示されるように、インビトロにおけるアミロイドβの凝集を再現性に防止できた。ペプチドＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ、ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥは、アミロイドβ対野性型αＢクリスタリンまたはそのペプチドの１：１および１：１０のモル比でアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集を防止するのに等しく有効であった。合成ペプチド、ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ、およびＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥは、アミロイドβ対野性型αＢクリスタリンまたはそのペプチドのいずれかの１０：１のモル比でアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集を防止するのには有効性が少なかった。これらのデータによって、αＢクリスタリンタンパク質ピンアレイをスクリーニングすることによって同定されたペプチドは、タンパク質アミロイドβ凝集を軽減させる能力を有することが実証され、このことはアルツハイマー病の治療処置におけるその用途を強力に支持している。
【０１７９】
図３は、インビトロでのアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果を示す棒グラフを示す。凝集は、３６０ｎｍの波長での光散乱として分光測定的に測定した。凝集したアミロイドβを１００％凝集の値に割り当て、そして合成ペプチドの存在下での凝集を正規化するために用いた。凝集は、二重の実験について標準誤差をともなう棒グラフとしてプロットした。１番目の垂直のバーは、１００ｍＭのＣｕ＋＋＋の存在下で凝集したアミロイドβ（１００％凝集）について測定した散乱である。２番目から４番目のバーは、野性型組換えヒトαＢクリスタリンの存在下におけるアミロイドβからの散乱である。５番目から１３番目の垂直のバーは、合成ペプチド、ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、またはＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ、またはＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥの選択された濃度での存在下におけるアミロイドβの散乱である。１０×という接頭語は、野性型αＢクリスタリンまたはそのペプチドのいずれかに対するアミロイドβの１０：１のモル濃度に相当する。１×という接頭語は、野性型αＢクリスタリンまたはそのペプチドのいずれかに対するアミロイドβの１：１のモル濃度に相当する。０．１×という接頭語は、野性型αＢクリスタリンまたはそのペプチドのいずれかに対するアミロイドβの１：１０のモル濃度に相当する。
【０１８０】
（実施例４）
（インテリペプチドライブラリーの生成）
タンパク質凝集を軽減する能力について実施例２および３で同定されたペプチドの配列を用いて、ヒトαＢクリスタリンの分子モデリングに基づいて、関連インテリペプチドのライブラリーを生成した。
【０１８１】
相同性モデリングプログラムＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、テンプレートとしてコムギｓＨＳＰ  １６．９の結晶構造を用いてヒトαＢクリスタリンの３Ｄ相同性モデルを構築した。ＭＯＥは、限定はしないが、複数の配列アラインメント、構造の重層、コンタクト・アナライザーおよび折り畳み同定（ｆｏｌｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む多数の技術を使用して、テンプレートのタンパク質分子の利用可能な高解像度の結晶および／またはＮＭＲ構造に基づいて相同性を明らかにさせる。ヒトαＢクリスタリンの相同性モデルを構築するのにおいて、ヒトαＢクリスタリンの一次配列は、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて、テンプレートタンパク質、コムギｓＨＳＰ１６．９一次配列の配列と最初に粗く整列された。次いで、ヒトαＢクリスタリンの予想される二次構造を得て（ＪＰｒｅｄ）、構造的エレメントについての利用可能なスピン標識情報で確認した。ヒトαＢクリスタリン３次元構造を、ＰｒｏｃｈｅｃｋおよびＭＯＥのＭｏｄｅｌＥｖａｌモジュールを用いて評価した。
【０１８２】
ペプチド配列の表面疎水性パーセントを、ヒトαＢクリスタリンの３Ｄ構造に対して静電気的な電位を用いて計算した。
【０１８３】
ヒトαＢクリスタリンホロタンパク質の一次配列および推定二次構造を、配列が公知である小型の熱ショックタンパク質ファミリーにおける全てのタンパク質の一次配列および推定二次構造と配列させた。構造的に保存されており、かつヒトαＢクリスタリンペプチドと同様の一次配列を有する相同なペプチドを選択した。ｉ）ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、またはｉｉ）ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫに関連しており、かつそれに由来する配列を有するペプチドのライブラリーを調製した。選択されたペプチドのアミノ酸配列を図５および６に示す。
【０１８４】
（実施例５）
（小型の熱ショックタンパク質、ヒトαＢクリスタリンにおけるシャペロン活性の相互作用的なドメイン）
タンパク質ピンアレイは、天然のレンズタンパク質、βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリン、およびインビトロのシャペロン標的タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼおよびクエン酸シンターゼを用いて、ヒトαＢクリスタリンにおけるシャペロン活性について７つの相互作用的配列を同定した。Ｎ末端ドメインは、２つの相互作用的配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０および４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８を含んだ。αクリスタリンコアドメインは、４つの相互作用的配列、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）を含んだ。Ｃ末端ドメインは、高度に保存されたＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む１つの相互作用的配列１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４を含んだ。αクリスタリンコアドメインに属する２つの相互作用的配列、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１を、ペプチドとして合成して、インビトロでシャペロン活性についてアッセイした。両方の合成ペプチドが、インビトロにおけるβＨクリスタリン、アルコールデヒドロゲナーゼおよびクエン酸シンターゼの熱凝集を阻害した。ピンアレイによって同定された７つのシャペロン配列のうち５つが、ヒトαＢクリスタリンにおけるサブユニット−サブユニット相互作用の配列として以前に同定された配列と重複した。この結果、ヒトαＢクリスタリンにおける相互作用的な配列が、サブユニット−サブユニットのアセンブリにおいておよびシャペロン活性において二重の役割を有することが示唆された。
【０１８５】
ヒトαＢクリスタリンは、小型の熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）および分子シャペロンである。ｓＨＳＰは、４３ｋＤａ未満の分子量、低い配列類似性、環境ストレスに応答する上方制御、および分子シャペロンとしての活性を通じたタンパク質の未折り畳みおよび凝集に対して防御する能力によって特徴付けられる。ＩｎｇｏｌｉａおよびＣｒａｉｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：２３６０〜４，１９８２；Ｋｌｅｍｅｎｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：３６５２〜６，１９９１；Ｍｅｒｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：１０４６〜５２，１９９３；ｄｅ  Ｊｏｎｇら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １０：１０３〜２６，１９９３；Ｇｒｏｅｎｅｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２５：１〜１９，１９９４；ｄｅ  Ｊｏｎｇら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：１５１〜６２，１９９８；Ｂｌｏｅｍｅｎｄａら、Ｐｒｏｇ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８６：４０７〜８５，２００４。ｓＨＳＰは、植物界および動物界を通じて細胞および組織に偏在性であって、加齢性筋障害、心虚血ならびに、アレグザンダー病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病およびパーキンソン病を含む種々のタンパク質凝集疾患において上方制御される。Ｉｗａｋｉら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１〜８，１９８９；Ｉｗａｋｉら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４０：３４５〜５６，１９９２；Ｋａｔｏら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）８４；４４３〜８，１９９２；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １１９：２０３〜８，１９９３；ＧｏｅｂｅｌおよびＢｏｒｎｅｍａｎｎ，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｉｎｃｌ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ６４：１２７〜３５，１９９３；ｖａｎ  Ｎｏｏｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７９８〜８０１，１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２１：１８〜２６，１９９５；Ｌｏｂｒｉｎｕｓら，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ８：７７〜８６，１９９８；Ｒｅｎｋａｗｅｋら，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  １０：２２７３〜６，１９９９；ｖａｎ  ＲｉｊｋおよびＢｌｏｅｍｅｎｄａｌ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２１４：７〜１２，２０００；ＹｅｂｏａｈおよびＷｈｉｔｅ，Ｃｒｏａｔ  Ｍｅｄ  Ｊ  ４２：５２３〜６，２００１。αクリスタリンが総タンパク質含量の約３３％を含むレンズでは、翻訳後修飾の蓄積は、タンパク質と光散乱および白内障を生じるのに十分大きい凝集物の形成との間の誘因性の相互作用を支持するタンパク質未折り畳みと関連する。Ｇａｒｌａｎｄら、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ４９：３４７〜５２，１９８８；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｌｅｎｓ  Ｅｙｅ  Ｔｏｘｉｃ  Ｒｅｓ  ８：２４５〜５０，１９９１；Ｍｉｅｓｂａｕｅｒら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１２４９４〜５０２，１９９４；Ｇｏｏｄｅ  ａｎｄ  Ｃｒａｂｂｅ，Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  １９：６５〜７４，１９９５；Ｌｕｎｄら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ６３：６６１〜７２，１９９６；Ｈａｎｓｏｎら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ６７：３０１〜１２，１９９８；ＹａｎおよびＨｕ���，Ｙａｎ  Ｋｅ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  １６：９１〜６，２０００；Ｆｅｎｇら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：１１５８５〜９０，２０００；Ｇａｒｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４７６：２６５〜７８，２０００；Ｌａｐｋｏら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １０：１１３０〜６，２００１；Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１４０７６〜８４，２００２；Ｕｅｄａら，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４３：２０５〜１５，２００２。理論的には、レンズの細胞質における高濃度のαクリスタリンは、未折り畳みのβ／γクリスタリンタンパク質に結合し得、透明な細胞構造を安定化させ、そして分子シャペロンとしてのそれらの機能を通じて凝集および不透明化に対して防御する。ＦｕおよびＬｉａｎｇ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４４：１１５５〜９，２００３；ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ９：１１０〜８，２００３；ｄｅｌ  Ｖａｌｌｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６０１：１００〜９，２００２；ＳｌｉｎｇｓｂｙおよびＣｌｏｕｔ，Ｅｙｅ  １３  Ｐｔ  ３ｂ：３９５〜４０２，１９９９；Ｈｏｏｋ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：２９５〜３０６，１９９８；ＴａｋｅｍｏｔｏおよびＢｏｙｌｅ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：３３１−７，１９９８。正常なレンズでは、αＢクリスタリンは、β／γクリスタリンと弱く相互作用し、フィラメント網目状構造と密接に会合する構造タンパク質である。ＦｕおよびＬｉａｎｇ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４２５５〜６０，２００２；Ｎｉｃｈｏｌｌ  ａｎｄ  Ｑｕｉｎｌａｎ，Ｅｍｂｏ  Ｊ  １３：９４５〜５３，１９９４。
【０１８６】
Ｘ線結晶構造がβおよびγクリスタリンに存在するが、αＢクリスタリンの構造は、分光学的データおよび相同性モデルに基づく。Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５９５〜９，１９９８；Ｂａｓａｋら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２８：１１３７〜４７，２００３；Ｐｕｒｋｉｓｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４１９９〜２０５，２００２；Ｓｅｒｇｅｅｖら，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ４：９，１９９８；Ｈｅｊｔｍａｎｃｉｋら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０：１３４７〜５２，１９９７；Ｎｏｒｌｅｄｇｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：１６１２〜２０，１９９７；ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｒｔら，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８：１０２５〜３０，２００１；Ｃａｒｖｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：１９７〜２０９，１９９８；ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。２つの相同なｓＨＳＰである、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ（Ｍｊ）ｓＨＳＰ１６．５およびコムギｓＨＳＰ１６．９の分光学的データ、二次構造予測およびＸ線結晶構造によって、ｓＨＳＰが３つの構造的なドメイン、一次配列を変化させるＮ−末端ドメイン、一次配列および二次構造において保存されるαクリスタリンコアドメイン、ならびに配列中で可変性であるＣ末端伸長によって特徴付けられることが示された。Ｍｊ  ｓＨＳＰ１６．５およびコムギｓＨＳＰ１６．９の結晶構造では、Ｎ末端ドメインは、大きくらせんであるか、または構造化されておらず、αクリスタリンコアドメインは、免疫グロブリン様の折り畳みであって、Ｃ末端伸長ドメインは、αクリスタリンコアドメインから突出して、構造化されておらずかつ可塑性である。ＣａｒｖｅｒおよびＬｉｎｄｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：１９７〜２０９，１９９８。αクリスタリンコアドメインによって採用される免疫グロブリン様折り畳みは、可変の長さのループによって接続される６〜９つのβ鎖によって形成される２つの反平行βシートからなるβサンドイッチである。コムギｓＨＳＰ１６．９における二量体の形成は、１つの単量体のβ２およびβ３鎖と、別の単量体のβ５およびβ７を接続するループ中に含まれるβ６鎖との間の相互作用に起因する。Ｃ末端伸長は、保存されたＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含み、ここでＩはイソロイシンであり、Ｖはバリンであり、そしてＸは任意の天然のアミノ酸である。コムギのｓＨＳＰ１６．９では、１つの単量体のＩ−Ｘ−Ｉモチーフは、別の単量体のβ４およびβ８鎖の残基と相互作用して、結晶構造で観察される高次の十二量体の四次構造を形成する。αＢクリスタリンは、ＭｊｓＨＳＰ１６．５およびコムギｓＨＳＰ１６．９において見出される同じ三次元構造ドメインを含むが、ヒトαＢクリスタリンの複雑なアセンブリはより大きく、結晶化されている２つのＨＳＰよりも多分散系である。これによってαＢクリスタリンにおける二量体界面およびオリゴマー形成の界面が、より小さい相同なｓＨＳＰとは異なり得ることが示唆される。αＢクリスタリンおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のＳＨＳＰ１２．２のタンパク質分解お��びドメイン交換のキメラ変異体によって、ｓＨＳＰの３つの構造ドメイン全てにおける配列が複雑なアセンブリおよびシャペロン活性に重要であることが示された。Ｋｏｋｋｅら、，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ６：３６０〜７，２００１；ＳａｈａおよびＤａｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５７：６１０〜７，２００４。αＢクリスタリンおよび他の低分子熱ショックタンパク質の複雑なアセンブリおよびシャペロン活性に重要な各々のドメインにおける特定の残基または配列の同一性は、決定されているままである。
【０１８７】
ヒトαＢクリスタリンの連続のおよび重複する８マーのペプチドのタンパク質ピンアレイを用いる以前の研究では、ヒトαＢクリスタリンにおけるサブユニット間の相互作用および複雑なアセンブリに必要な相互作用的ドメインが同定された。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。Ｎ末端配列３７ＬＦＰＴＳＴＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦ５４、３つのαクリスタリンコアドメイン配列、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、Ｉ３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）およびＣ末端配列１５５ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ１６６は、αＢクリスタリンにおけるサブユニット間の相互作用として同定された。ピンアレイ研究によって、分光学的観察において、変異研究、タンパク質分解実験およびツー・ハイブリッドスクリーニングが確認されて、拡大され、これによってｓＨＳＰにおける相互作用的ドメインが特徴付けられた。ピンアレイによって同定されたサブユニット間の相互作用的ドメインは、１つを例外として、Ｍｊ  ｓＨＳＰ１６．５およびコムギのＳＨＳＰ１６．９の結晶構造において同定された二量体および複合体の界面（β３、β８、β９およびＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフ）と一致していた。ピンアレイで、β５およびβ７を接続するループ領域における配列は、αＢクリスタリンの二量体化のための相互作用的配列とは特定されなかった。Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５９５〜９，１９９８；ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｒｔら，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８：１０２５〜３０，２００１；Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。ペプチドスキャニング技術を用いる別の報告では、サブユニット間アセンブリおよびシャペロン機能についての配列を、ピンアレイによって同定された配列と一致する、αＢクリスタリンおよび低分子熱ショックタンパク質ｓＨＳＰＢ中で同定した。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５；Ｓｒｅｅｌａｋｓｈｍｉら、，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５７８５〜９５，２００４；Ｌｅｎｔｚｅ  ａｎｄ  Ｎａｒｂｅｒｈａｕｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２５：４０１〜７，２００４。ヒトαＢクリスタリンのαクリスタリンコアドメイン由来の配列７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２に相同である、αＡクリスタリンのαクリスタリンコアドメインにおける配列ＫＦＶＩＦＬＤＶＫＨＦＳＰＥＤＬＴＶＫは、インビトロでシャペロン様活性を有することが報告された。Ｓｈａｒｍａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３７６７〜７１，２０００。
【０１８８】
この報告では、タンパク質ピンアレイによって、３Ｄ構造モデルにマッピングされた相互作用的配列を同定して特徴付けた。ヒトαＢクリスタリンにおけるシャペロン機能の７つの相互作用的ドメインは、変性βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、アルコールデヒドロゲナーゼおよびクエン酸シンターゼと相互作用する配列として同定された。２つの相互作用的ペプチド７３ＤＲＦＳ  ＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１を合成して、インビトロにおいてβＨクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの熱凝集に対してシャペロン活性を有することを観察した。ピンアレイによって同定されたシャペロン機能の７つの相互作用的配列は、前に同定されたサブユニット間相互作用および複雑なアセンブリについての相互作用ドメインと重複した。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。まとめると、これらのデータによって、αＢクリスタリンにおける相互作用的ドメインが、シャペロン活性およびサブユニット間のアセンブリという二重の機能を媒介することが示唆される。
【０１８９】
（実施例６）
（材料および方法）
（ピンの合成、結合およびリガンドタンパク質に対するペプチド結合の検出）
αＢクリスタリンタンパク質ピンアレイを用いて、ペプチドと、上記のように、ウシβＨクリスタリン、ヒトγＤクリスタリン、ウマのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびブタのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を含むシャペロン標的タンパク質との間の相互作用を測定した（図１２）。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。
【０１９０】
図１２は、タンパク質ピンアレイアッセイの模式図を示す。詳細なプロトコールについては方法の節で言及する。各々のウェルにおける青の呈色に相当する吸光度をλ＝４５０ｎｍで測定し、そしてそのウェルにおける相当するペプチドのアミノ酸配列に対してプロットした（図１３および１４）。標的タンパク質と強力な相互作用を有するペプチドを含有するウェルは、濃い青であって、標的タンパク質と弱い相互作用を有するかまたは相互作用を全く有さないペプチドを含むウェルは、明るい青または透明である。
【０１９１】
ピンアレイアッセイにおいて用いられる標的タンパク質、ウシβＨクリスタリン、ヒトγＤクリスタリン、ウマアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびブタクエン酸シンターゼ（ＣＳ）の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％より大きいことを確認した。さらに、各々の標的タンパク質の一次抗体は、その標的タンパク質に特異的であって、結果として、このペプチドに結合し得る混入するタンパク質は検出されない。ヒトαＢクリスタリンの残基１〜１７５に相当する８４の連続するそして重複するペプチドフラグメントは、マルチピン・ペプチド合成（Ｍｕｌｔｉｐｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれる、Ｇｅｙｓｅｎによって開発された、同時のペプチド合成ストラテジーを使用して合成された。Ｇｅｙｓｅｎ，Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ２１：５２３〜３３，１９９０；Ｃｈｉｎら、，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６２：５３８〜５３９，１９９７。ペプチドを、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート形式に配列した誘導体化ポリエチレンピン上に固定した。各々のペプチドは、８アミノ酸長であって、連続するペプチドを、２アミノ酸ごとにオフセットした。全てのペプチドを、プラスチックのピンの表面に共有結合させた。ヒトαＢクリスタリンについて、最初のペプチドは１ＭＤＩＡＩＨＨＰ８であって、最後のペプチドは１６８ＰＡＶＴＡＡＰＫ１７５であった。全てのタンパク質および抗体は、表３に列挙する供給業者から購入した。
【０１９２】
表３：タンパク質ピンアレイアッセイにおいて用いられるタンパク質および抗体のリスト
【０１９３】
【表３】
2008520555.tif 000008
第１列は、購入または合成されたタンパク質または抗体の名称を列挙しており、第２列は、購入または合成されたタンパク質または抗体のカタログ番号を列挙しており、第３列は、購入されたタンパク質または抗体の供給業者を列挙しており、そして第４列は、ピンアレイアッセイにおいて用いられるタンパク質または抗体の濃度を列挙している。
【０１９４】
ヒトミオグロビンは、αＢクリスタリンペプチドと相互作用せず、そしてタンパク質ピンアレイアッセイの陰性のコントロールであった。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。陽性の相互作用は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル中で青色を生じた。ウェル中の青色の強度は、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４５０ｎｍで測定した。青色の強度（Ｘ軸にプロットした）は、αＢクリスタリンペプチド（Ｙ軸にプロットした）と標的タンパク質との間の相互作用の尺度であった。相互作用ペプチドと標的タンパク質との間の相互作用に対する温度の影響を測定するために、標的タンパク質を水槽中で４５℃で１５分間使用前に加熱した。ピンアレイは、溶液中に存在する標的タンパク質の単量体、二量体またはオリゴマーの間を識別できない、代わりに、ピンアレイは、特定の条件下で溶液に存在し得る特定の標的タンパク質の個々のペプチドと全体的な集団（単量体、二量体またはオリゴマー）との間の相互作用の極めて鋭敏な検出器である。各々の標的タンパク質を、２〜５回アッセイした。全ての実験に単一ピンアレイを用いて、３０回を超える繰り返し後に相互作用の変化は観察されなかった。タンパク質ピンアレイの最後の３つのペプチドである１６３ＲＥＥＫＰＡＶＴ１７０、１６５ＥＫＰＡＶＴＡＡ１７２、１６７ＰＡＶＴＡＡＰＫ１７４は、ヒトαＢクリスタリンの一次抗体によって認識されるエピトープ（１６３ＲＥＥＫＰＡＶＴＡＡＰＫＫ１７５）に相当した。これらの３つのペプチドに対する抗ヒトαＢクリスタリン抗体の直接結合に起因して、リガンドとしてのヒトαＢクリスタリンの非存在下で、これらの３つのペプチドについて陽性の反応が観察される。ピンアレイの有効性の損失はこのアッセイを用いて測定された。ピンアレイについての有効性の損失は、３０を超えるアッセイ後に５％未満であることが確認された。
【０１９５】
（ヒトαＢクリスタリンの分子モデリング）。相同性モデリングプログラム分子操作環境（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（ＭＯＥ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、前に記載されたとおり、ヒトαＢクリスタリンの３次元相同性モデルを構築した。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。このソフトウェアは、マルチ配列アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、構造重層（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎ）、コンタクト分析（ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、折り畳み同定（ｆｏｌｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、予測モデルの立体化学的な質の分析のためのモジュールを含んでおり、これは、平面性、キラリティー、Ψ／ψ優先度、χアングル、非結合接触距離、不飽和ドナーおよびアクセプターのようなパラメーターを考慮する。Ｆｅｃｈｔｅｌｅｒら、，Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２５３：１１４〜３１，１９９５。コムギｓＨＳＰ１６．９の結晶構造を、ヒトαＢクリスタリンの相同性モデリングのテンプレートとして選択した。なぜなら、コムギｓＨＳＰ１６．９は、ｓＨＳＰの全ての利用可能な結晶構造のヒトαＢクリスタリンと最高程度の配列類似性を有する（αクリスタリンコアドメインで４０％、そして全体で２５．４％）からである。ヒトαＢクリスタリンの相同性モデルの構築においては、ヒトαＢクリスタリンの一次配列を、テンプレートタンパク質、コムギｓＨＳＰ１６．９一次配列とＣｌｕｓｔａｌＸを用いて配列させた。Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎら、，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２３：４０３〜５，１９９８；Ａｉｙａｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １３２：２２１〜４１，２０００。次いで、ヒトαＢクリスタリンの予想二次構造を得て（ＪＰｒｅｄ）、構造的エレメントの利用可能なスピンラベリング情報で確認した。ＫｏｔｅｉｃｈｅおよびＭｃＨａｏｕｒａｂ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４：５６１〜７７，１９９９。次いでヒトαＢクリスタリンの二次構造を、コムギｓＨＳＰ１６．９の観察された二次構造と構造的に配列させた。このアラインメントを用いて、一連の１０エネルギー最小化モデルをＭＯＥで作成した。各々のモデルをＭＯＥのＭｏｄｅｌＥｖａｌモジュールを用いて評価して、そのベストフィットを最終モデルとして選択して、Ｐｒｏｃｈｅｃｋによって確認した。Ｍｏｒｒｉｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １２：３４５〜６４，１９９２。コムギｓＨＳＰ１６．９およびＭｊ  ｓＨＳＰ１６．５のＸ線結晶構造に基づいて計算したαＢクリスタリン３Ｄモデルは、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）データおよびαＢクリスタリンの以前の相同性モデルと一致した。ＫｏｔｅｉｃｈｅおよびＭｃＨａｏｕｒａｂ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４：５６１〜７７，１９９９；ＧｕｒｕｐｒａｓａｄおよびＫｕｍａｒｉ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ３３：１０７〜１２，２００３；Ｂｅｒｅｎｇｉａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：９９５１〜７，１９９７；Ｋｏｔｅｉｃｈｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２６８１〜８，１９９８；Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉら、，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８９：３９７〜４１１，１９９９。αＢクリスタリンの３Ｄ相同性モデルを、コムギｓＨＳＰ１６．９およびＭｊ  ｓＨＳＰ１６．５の結晶構造上に重層した場合、フィットのＣα二乗平均平方根偏差は３．２５Åであった。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。３つの構造の保存されたαクリスタリンコアドメインの重ねあわせによって、２．０６ÅというＣα二乗平均平方根偏差が生じた。シャペロン配列によって形成された疎水性表面積は、製造業者（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）によって得られるカスタムスクリプトによって計算した。ヒトαＢクリスタリンに対するグラフ提示は、ＰｙＭｏＩおよびＭＯＥを用いて行った。
【０１９６】
（実施例７）
（αＢクリスタリンにおけるβＨおよびγＤクリスタリンの相互作用部位）
タンパク質ピンアレイによって、ヒトαＢクリスタリンのシャペロン活性に必要な相互作用配列の同定が可能であった。固定された８マーのヒトαＢクリスタリンペプチドと、レンズ細胞の天然のタンパク質構成成分である、非加熱および事前加熱したβＨクリスタリンとの間の相互作用は、２３℃でλ＝４５０ｎｍの吸光度として測定された。非加熱のβＨクリスタリンが標的タンパク質であった場合、最大吸光度は、ペプチド配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰ１６、４５ＳＰＦＹＬＲＰＰ５２、４７ＦＹＬＲＰＰＳＦ５４、５１ＰＰＳＦＬＲＡＰ５８、６９ＲＬＥＫＤＲＦＳ７６、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、８９ＬＫＶＫＶＬＧＤ９６、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１２１ＫＹＲＩＰＡＤＶ１２８、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４について測定された（図１３：縞模様のバー）。同様の最大吸光度を、４５℃で１５分間事前加熱されたαＢクリスタリンペプチドとβＨクリスタリンとの間の相互作用について測定した（図１３；白抜きのバー）。非加熱および事前加熱したβＨクリスタリンとの陽性の相互作用を有したαＢクリスタリンペプチドは同一であって、観察された吸光度の大きさのみが異なった（図１３：黒塗りのバー）。ピンアレイにおける全ての配列について、８４のαＢクリスタリンペプチドのうち８０が、非加熱のβＨクリスタリンよりも事前加熱されたβＨクリスタリンと高い吸光度を有した（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃＞０）が、８４のペプチドのうち残りの４つの吸光度は、事前加熱されたそして非加熱のβＨクリスタリンについて同様であった（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃〜０）。最大の吸光度を有するペプチドには、ピークの出現を生じる、より低い吸光度を有する１つまたは２つの重複するペプチドがいずれかの側に隣接した。重複する隣接ペプチドは、最大吸収を記録するペプチドから２つのアミノ酸ごとにＮ末端またはＣ末端に向かってシフトされた。各々のピークにおける吸光度の大きさの最大の相違を有するペプチド（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を表４：第２列に列挙した。遠ＵＶＣＤ分光法によって、４５℃で１５分間加熱した際のβＨクリスタリンの二次構造の損失は、１０％未満であり、そして事前加熱されたβＨクリスタリンの近ＵＶＣＤスペクトルにおける主要な吸収ピークの楕円率は２０％未満まで減少したことが示された（図１５ａおよび図１６ａ）。
【０１９７】
図１３は、ピンに固定されたヒトαＢクリスタリンの８マーのペプチドと、２３℃の非加熱βＨクリスタリンおよび４５℃で１５分間事前加熱したβＨクリスタリンとの間の相互作用のパターンを示す。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート形式で８４ピン上に連続して固定された各々８マーのヒトαＢクリスタリンのアミノ酸配列をＹ軸上に列挙する。ＥＬＩＳＡに基づく比色方法を用いて、αＢクリシタリンペプチドと、非加熱のβＨクリスタリン（縞模様のバー）または事前加熱されたβＨクリスタリン（白抜きのバー）との間の相互作用について４５０ｎｍで測定した吸光度は、一次Ｘ軸上に列挙する。バーの長さは、そのペプチドと、非加熱または事前加熱されたヒトβＨクリスタリンとの相互作用の強度に対する割合であり、バーが長いほど、相互作用が強力である。相互作用はあらゆるペプチドで観察されず、そして非加熱および事前加熱したβＨクリスタリンとの相互作用の明確なパターンがあった。事前に加熱したβＨクリスタリンとの０．１３４未満の吸光度を、非特異的な相互作用についてのベースラインとみなした。ほとんどのペプチド（５６／８４）の相互作用は、非加熱のβＨクリスタリンとよりも事前加熱されたβＨクリスタリンとの方が大きかった。各々のペプチドについての測定された吸光度における相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴ）は、そのペプチドと、非加熱のβＨクリスタリンに対する事前加熱されたヒトβＨクリスタリンとの相互作用の増大または減少に相当する（黒塗りのバーとして右にプロットされる）。全体として、αＢクリスタリンペプチドの間の相互作用は、非加熱のβＨクリスタリンよりも事前加熱されたヒトβＨクリスタリンとの方が大きかった。
【０１９８】
βＨクリスタリンがγＤクリスタリンで置換された場合、ピンアレイにおけるリガンドとして、βクリスタリンと同じ遺伝子ファミリー由来のレンズ細胞質の天然のタンパク質成分である、１２の相互作用配列が同定された（図１４；縞模様のバー）。非加熱のγＤクリスタリンを用いてγ＝４５０ｎｍで最大吸光度を記録した１２のペプチドは、３ＩＡＩＨＨＰＷＩ１０、９ＷＩＲＲＰＦＦＰ１６、２１ＰＦＦＰＦＨＳＰ２８、２５ＤＱＦＦＧＥＨＬ３２、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲ５０、４７ＦＹＬＲＰＰＳＦ５４、５２ＳＦＬＲＡＰＳＷ５９、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１１ＨＧＦＩＳＲＥＦ１１８、１１７ＥＦＨＲＫＹＲＩ１２４、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８であった。最大吸収は、γＤクリスタリンを４５℃で１５分間事前加熱した場合、αＢクリスタリンにおいて同様のペプチド配列で測定された（図１４；白抜きのバー）。吸光度の大きさは、８４のαＢクリスタリンペプチドのうち５６で高く（図１４；黒塗りのバー）、そしてγＤクリスタリンが４５℃で１５分間事前加熱された場合、８４のペプチドのうち１６で低かった。８４のペプチドのうち残りの１２について測定された吸光度は、非加熱および事前加熱されたγＤクリスタリンの両方について同様の大きさであった。非加熱または事前加熱されたγＤクリスタリンで最高の吸光度を有したαＢクリスタリンペプチドには、ピークの出現を生じる、より低い吸光度を有する１つまたは２つの重複するペプチドがいずれかの側に隣接した。重複する隣接ペプチドは、最大吸収を記録するペプチドから２つのアミノ酸ごとにＮ末端またはＣ末端に向かってシフトされた。各々のピークにおける吸光度の大きさの最大の相違を有するペプチド（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を表４：第３列に列挙した。遠ＵＶＣＤ分光法によって、４５℃で１５分間加熱した際のγＤクリスタリンの二次構造の損失は、１０％未満であり、そして事前加熱されたγＤクリスタリンの近ＵＶＣＤスペクトルにおける主要な吸収ピークの楕円率は２５％未満まで減少したことが示された（図１５ｂおよび図１６ｂ）。
【０１９９】
図１４は、ピンに固定されたヒトαＢクリスタリンの８マーのペプチドと、２３℃の非加熱γＤクリスタリンおよび４５℃で１５分間事前加熱したγＤクリスタリンとの間の相互作用のパターンを示す。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート形式で８４ピン上に連続して固定された各々８マーのヒトαＢクリスタリンペプチドのアミノ酸配列をＹ軸上に列挙する。ＥＬＩＳＡに基づく比色方法を用いて、αＢクリシタリンペプチドと、非加熱のγＤクリスタリン（縞模様のバー）または事前加熱されたγＤクリスタリン（白抜きのバー）との間の相互作用について４５０ｎｍで測定した吸光度は、一次Ｘ軸上に列挙する。バーの長さは、そのペプチドと、非加熱または事前加熱されたヒトγＤクリスタリンとの相互作用の強度に対する割合である。相互作用はあらゆるペプチドで観察されず、そして非加熱および事前加熱したβＨクリスタリンの両方との相互作用の明確なパターンがあった。事前に加熱したγＤクリスタリンとの０．３４８未満という吸光度を、非特異的な相互作用についてのベースラインとみなした。ほとんどのペプチド（５６／８４）の相互作用は、非加熱のγＤクリスタリンとよりも事前加熱されたγＤクリスタリンとの方が大きかった。各々のペプチドについての測定された吸光度における相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴ）は、そのペプチドと、非加熱のγＤクリスタリンに対する事前加熱されたヒトγＤクリスタリンとの相互作用の増大または減少に相当する（黒塗りのバーとして右にプロットされる）。全体として、αＢクリスタリンペプチドの間の相互作用は、非加熱のγＤクリスタリンよりも事前加熱されたヒトγＤクリスタリンとの方が大きかった。
【０２００】
（実施例８）
（αＢクリスタリンにおけるＡＤＨおよびＣＳについてのシャペロン部位）
β／γクリスタリンファミリーにおける生理学的標的タンパク質との相互作用に加えて、αＢクリスタリンペプチドと、非加熱および事前加熱したシシャペロン標的タンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）との相互作用を測定した。ピンアレイアッセイにおける使用の前に、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、ＡＤＨ、およびＣＳの二次構造を、４５℃で１５分間の加熱後、および５０℃で６０分間の加熱後、２３℃で遠紫外円偏光二色性（ＵＶＣＤ）を用いて決定した（図１５）。βＨクリスタリンの最大楕円率（Θｍａｘ）は、３つの温度全てでλ＝２１４ｎｍであることが観察され、そして最大楕円率（Θｍａｘ）の大きさは、２３℃で−５５７６ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から４５℃で１５分間の加熱後の−５０４３ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ、そして５０℃で６０分間の加熱後の−４５０１ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少した（図１５ａ）。同様に、γＤクリスタリンのΘｍａｘは、３つの温度全てでλ＝２１４ｎｍであることが観察され、そしてΘｍａｘの大きさは、２３℃での−５５７１ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から４５℃で１５分間の加熱後の−５１５０ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ、そして５０℃で６０分間の加熱後の−４７１９ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少した（図１５ｂ）。ＡＤＨについてのΘｍａｘは、λ＝２１５ｎｍであって、そしてΘｍａｘの大きさは、２３℃での−５１９０ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から４５℃で１５分間の加熱後の−５１３９ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少し、これによって、４５℃での加熱の際の二次構造の損失は１％未満であることが示された（図１５ｃ）。ＡＤＨのΘｍａｘの大きさはさらに、５０℃で６０分間の加熱後の−２５２３ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少し、これによって、５０℃での加熱の際の二次構造の損失は５０％より大きいことが示された（図１５ｃ）。ＣＳについてのΘｍａｘは、λ＝２１５ｎｍであって、そしてΘｍａｘの大きさは、２３℃での−１３０７６ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から４５℃で１５分間の加熱後の−１１０７０ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少し、これによって、４５℃での加熱の際の二次構造の損失は約１５％であることが示された（図１５ｄ）。５０℃で６０分間ＣＳを加熱する際、ＣＳのΘｍａｘは、−６４８ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ減少し、これによって、５０℃での二次構造の損失は９５％より大きいことが示された（図４ｄ）。
【０２０１】
図１５は、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）の遠ＵＶＣＤを示す。スペクトルは、２３℃、４５℃および５０℃のβＨクリスタリン（Ａ：上の左）、γＤクリスタリン（Ｂ：上の右）、ＡＤＨ（Ｃ：下の左）およびＣＳ（Ｄ：下の右）について収集した。βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンのＵＶＣＤスペクトルは、２３℃〜５０℃でかなり未変化のまま残った（８３、８４）。２３℃および４５℃でのＡＤＨのスペクトルは同様であったが、５０℃では、２１５ｎｍでの楕円率の有意な減少があった。ＣＳのスペクトルは、２３℃〜５０℃の漸増温度で２１５ｎｍの楕円率の減少を示した。遠ＵＶＣＤスペクトルによって、βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンは、熱安定性であって、最大５０℃まで折り畳まれたままであった。ＡＤＨは、最大４５℃まで折り畳まれたままであったが、５０℃では折り畳まれなかった。ＣＳは、４つのシャペロン標的タンパク質のうち最小熱安定性であって、４５℃で折り畳まれなかった。温度の増大に応答する未折り畳み量は以下のとおりであった：ＣＳ＞＞＞ＡＤＨ＞βＨクリスタリン〜γＤクリスタリン。
【０２０２】
ピンアレイアッセイにおける使用の前に、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの三次構造を、４５℃で１５分間の加熱後、および５０℃で６０分間の加熱後に２３℃で近紫外円偏光二色性を用いて決定した（図１６）。βＨクリスタリンについての最大吸収ピークは２３℃でλ＝２６７ｎｍであった。λ＝２６７ｎｍでの吸収ピークの大きさは、２３℃の３０．７１ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から、４５℃での部分的未折り畳みを示す、４５℃で１５分間のβＨクリスタリン加熱の際の２４．２２ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下し、そして５０℃での実質的な未折り畳みを示す、５０℃で６０分間の加熱の際の１５．７８ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下した（図１６ａ）。γＤクリスタリンの最大吸収ピークは、２３℃でλ＝２６９ｎｍであった。λ＝２６９ｎｍでの吸収ピークの大きさは、２３℃での１７．２６ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から、４５℃での部分的未折り畳みを示す、４５℃で１５分間のγＤクリスタリン加熱の際の１２．７４ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下し、そして５０℃での実質的な未折り畳みを示す、５０℃で６０分間の加熱の際の６．７５ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下した（図１６ｂ）。ＡＤＨの最大吸収ピークは、２３℃でλ＝２７０ｎｍであった。λ＝２７０ｎｍでの吸収ピークの大きさは、２３℃での４４．２７ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から、４５℃での部分的未折り畳みを示す、４５℃で１５分間のＡＤＨ加熱の際の１４．２３ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下し、５０℃での実質的な未折り畳みを示す、５０℃で６０分間の加熱の際の−２．３７ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下した（図１６ｃ）。ＣＳの最大吸収ピークは、２３℃でλ＝２５７ｎｍであった。吸収ピークの大きさはλ＝２５７ｎｍで、２３℃での４２．５４ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１から、４５℃での部分的未折り畳みを示す、４５℃で１５分間のＣＳ加熱の際の２５．２０ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ、そして５０℃での実質的な未折り畳みを示す、５０℃で６０分間の加熱の際の２０．９５ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｅｃｉｍｏｌｅ−１へ低下した（図１６ｄ）。
【０２０３】
図１６は、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの近ＵＶＣＤを示す。スペクトルは、２３℃、４５℃および５０℃のβＨクリスタリン（Ａ：上の左）、γＤクリスタリン（Ｂ：上の右）、ＡＤＨ（Ｃ：下の左）およびＣＳ（Ｄ：下の右）について収集した。βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの近ＵＶＣＤスペクトルにおける吸収ピークの楕円率は、４５℃で１５分間の加熱の際、２０〜６０％まで減少した。
【０２０４】
λ＝４５０ｎｍでの吸光度のパターンは、αＢクリスタリンペプチドを、非加熱および事前加熱したＡＤＨでアッセイした場合、非加熱および事前加熱したβＨ／γＤクリスタリンで得られた吸収パターンと同様であった（図１７）。ＡＤＨをピンアレイアッセイにおけるリガンドとして用いた場合、αＢクリスタリンペプチド配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰ１６、１３ＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、２７ＦＦＧＥＨＬＬＥ３４、３７ＬＦＰＴＳＴＳＬ４４、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲ５０、４８ＬＲＰＰＳＦＬＲ５５、６９ＲＬＥＫＤＲＦＳ７６、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１５ＳＲＥＦＨＲＫＹ１２２、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４について最大吸収を測定した。８４のペプチドのうち３４についての吸光度は、ＡＤＨを４５℃で１５分間事前加熱した場合、増大した（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃＞０）が、８４のペプチドのうち残りの５０の吸光度は、事前加熱されたそして非加熱のＡＤＨについて同様であった（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃〜０）。事前加熱および非加熱のＡＤＨでの相対的なペプチド配列の吸光度の大きさの相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）は、そのペプチドと、非加熱の天然のＡＤＨに対する事前加熱されたＡＤＨとの相互作用の増大の尺度であった。事前に加熱したおよび非加熱のＡＤＨでの吸光度の大きさにおいて最高の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を有するαＢクリスタリンペプチドには、ピークの出現を生じる、吸光度の大きさにおいて相違がより低い１つまたは２つのペプチドがいずれかの側に隣接した。重複する隣接ペプチドは、最大吸収を記録するペプチドから２つのアミノ酸ごとにＮ末端またはＣ末端に向かってピークペプチドからシフトされた。各々のピークにおける吸光度の大きさの最大の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を有するペプチドを表４：第４列に列挙した。この結果、ヒトαＢクリスタリンの間の相互作用が、非加熱の天然のＡＤＨとよりも、事前加熱されたＡＤＨと大きかったことが確認された。
【０２０５】
図１７は、ヒトαＢクリスタリンペプチドとＡＤＨとの間の相互作用のパターンを示す。Ｙ軸には、９６ウェル形式で連続して固定される８マーのペプチドのアミノ酸配列を列挙する。事前加熱した部分的に変性されたＡＤＨおよび非加熱の天然のＡＤＨを有する各々のペプチドの測定された吸光度の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴ）は、部分的に変性されたＡＤＨおよび天然のＡＤＨを有するそのペプチドの相互作用の増大または減少に相当し、そしてＸ軸上の水平のバーとして示される。８４のうち３４のペプチドは、天然のＡＤＨよりも部分的に変性されたＡＤＨと強力な相互作用を有するが、残りの８４のうち５０は、天然または部分的に変性されたＡＤＨと同様の相互作用を有した。αＢクリスタリンペプチドの間の相互作用は、非加熱の天然のＡＤＨとよりも事前加熱した未折り畳みのＡＤＨと大きかった。吸光度の相違Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴが０．０５未満であることをベースラインとみなした。
【０２０６】
λ＝４５０ｎｍでの吸光度のパターンは、αＢクリスタリンペプチドを、非加熱および事前加熱したＣＳでアッセイした場合、非加熱および事前加熱したβＨ／γＤクリスタリンおよびＡＤＨで得られた吸収パターンと同様であった（図１８）。ヒトαＢクリスタリンにおける配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰ１６、２３ＦＰＦＨＳＰＳＲ３０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲ５０、４７ＦＹＬＲＰＰＳＦ５４、５５ＬＲＡＰＳＷＦＤ６２、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４３ＬＴＶＮＧＰＲＫ１５０および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４が、ピンアレイアッセイにおける標的タンパク質としてＣＳの存在下でそれらの最大吸収によって同定された。事前加熱および非加熱のＣＳでの吸収の大きさにおける最高の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を有するαＢクリスタリンには、ピークの出現を生じる、吸光度の大きさにおいて相違がより低い１つまたは２つのペプチドがいずれかの側に隣接した。重複する隣接ペプチドは、最大吸収を記録するペプチドから２つのアミノ酸ごとにＮ末端またはＣ末端に向かってピークペプチドからシフトされた。部分的に未折り畳みおよび天然のＣＳを有する各々のペプチドの吸光度の大きさの相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）は、非加熱の天然のＣＳに対して事前加熱された未折り畳みＣＳとそのペプチドの相互作用の増大を示した。８４のαクリスタリンペプチドのうち７２の相互作用は、ＣＳを４５℃で１５分間事前加熱した場合、増大した（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃＞０）が、８４のペプチドのうち残りの１２の吸光度は、天然および部分的に未折り畳みのＣＳの両方について同様であった（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃〜０）。各々のピークにおける吸光度の大きさの最大の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠２３℃）を有するペプチドを表４：第５列に列挙した。事前加熱したＣＳを有するペプチドの吸光度の大きさの増大によって、αＢクリスタリンペプチドが、非加熱の天然のＣＳとよりも、事前加熱された部分的に未折り畳みのＣＳと強力な相互作用を有したことが示された。
【０２０７】
図１８は、ヒトαＢクリスタリンペプチドとＣＳとの間の相互作用のパターンを示す。Ｙ軸には、９６ウェル形式で連続して固定される８マーのペプチドのアミノ酸配列を列挙する。事前加熱した部分的に変性されたＣＳおよび非加熱の天然のＣＳを有する各々のペプチドの測定された吸光度の相違（Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴ）は、事前加熱された部分的に変性されたＣＳおよび非加熱の天然のＣＳとのそのペプチドの相互作用の増大または減少に相当し、そしてＸ軸上の水平のバーとして示される。８４のうち７２のペプチドは、天然のＣＳに比較して部分的に変性されたＣＳと強力な相互作用を有するが、残りの８４のうち１２は、天然または部分的に変性されたＣＳとの間と同様の相互作用を有した。αＢクリスタリンペプチドの間の相互作用は、非加熱の天然のＣＳとよりも事前加熱した未折り畳みのＣＳと大きかった。吸光度の相違Ａ４５０ｎｍ＠４５℃−Ａ４５０ｎｍ＠ＲＴが０．１１未満であることをベースラインとみなした。
【０２０８】
表４：非加熱および事前加熱されたβＨクリスタリン、γＤクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの存在下において最高の吸光度を記録したαＢクリスタリンペプチドのリスト。
【０２０９】
【表４】
2008520555.tif 000009
第１列は、各々のシャペロン配列が位置するαＢクリスタリンの領域を挙げる。第２列は、ヒトβＨクリスタリンのαＢクリスタリンにおける相互作用的配列を列挙する。第３列は、ヒトγＤクリスタリンのαＢクリスタリンにおける相互作用的配列を列挙する。第４列は、ＡＤＨのαＢクリスタリンペプチドシャペロン配列を列挙する。第５列は、ＣＳのαＢクリスタリンペプチドシャペロン配列を列挙する。第６列は、３つ以上の事前加熱されたシャペロン標的タンパク質と相互作用することが観察された７つの共通のシャペロン配列を列挙する。
【０２１０】
αＢクリスタリンにおけるシャペロン機能の７つの相互作用的配列、９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８、および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は、４５℃で１５分間事前加熱された、シャペロン標的タンパク質ＡＤＨおよびＣＳ、ならびに生理学的タンパク質、βＨ／γＤクリスタリンと最強の相互作用を有する配列として同定された（表４：第６列）。シャペロン配列のうち２つがＮ末端領域にあり、４つが保存されたαクリスタリンコアドメインにおける重複していないシャペロン配列であり、そして単独の重複しないシャペロン配列はαＢクリスタリンのＣ末端伸長である。
【０２１１】
（実施例９）
（相互作用的配列のシャペロンアッセイ）
保存されたαクリスタリンコアドメインにあり、そしてピンアレイにおいて事前加熱された標的タンパク質との正の相互作用を有することが観察された２つのαＢクリスタリン配列７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１を合成して、インビトロにおいてそれらのシャペロン活性を確認した。ペプチドのシャペロン活性は、５０℃で行ったシャペロンアッセイにおいて３つのシャペロン標的タンパク質βＨクリスタリン、ＡＤＨ、およびＣＳの熱凝集に対するそれらの保護する能力として測定した（図１９）。非相互作用的なαＢクリスタリン配列１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０を、シャペロンアッセイにおける負のコントロールとして用いた（図１９）。近ＵＶＣＤおよび遠ＵＶＣＤに基づいて、３つの標的タンパク質は、それらが５０℃で６０分間加熱された場合、ＣＳ＞＞＞ＡＤＨ＞＞βＨクリスタリンという順序で非折り畳みであった（図１５および１６）。βＨクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの熱凝集は、各々のペプチドの有無におけるλ＝３４０ｎｍでの光散乱として測定した。各々のペプチドのシャペロン活性は、ペプチドの非存在下における各々の標的タンパク質の凝集が０％保護に設定される保護パーセントとして算出した（図１９）。相互作用的ペプチド７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１は、３つのシャペロン標的タンパク質の全ての凝集の有効なインヒビターであった。５０℃での加熱の際に最も折り畳まれなかった標的タンパク質であるＣＳで最大の保護が観察された。部分的に未折り畳みの標的タンパク質βＨクリスタリンおよびＡＤＨで観察された保護は小さかった。５０：１というモル比のペプチド：βＨクリスタリン／ＡＤＨによって、βＨクリスタリンおよびＡＤＨの両方でほぼ３０％の保護が生じたが、ペプチド：ＣＳの１０：１のモル比では、熱凝集に対するＣＳの７０％より大きい保護が生じた。コントロールのペプチド１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０では５０：１のモル比でさえ凝集に対する保護は観察されなかった。
【０２１２】
図１９は、ヒトαＢクリスタリンのαクリスタリンコアドメイン由来の２つの陽性の相互作用的配列、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１、ならびに非相互作用的配列、１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０（コントロール）のシャペロンアッセイを示す。Ａ（上の左）：ペプチドの非存在下におけるシャペロン標的タンパク質βＨクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの熱凝集は、λ＝３４０ｎｍでの光散乱として測定した。各々の標的タンパク質を、１つのペプチドの有無において５０℃で６０分間加熱した。凝集の量は、近ＵＶＣＤおよび遠ＵＶＣＤで観察された未折り畳みの量と相関した。６０分間で、３つのタンパク質のうち最も熱安定性であるβＨクリスタリンは、最も凝集せず、０．０５ＡＵという最大吸光度を有し、続いてＡＤＨで０．２３ＡＵという最大吸光度、そしてＣＳで０．７２ＡＵという最大吸光度であった（未折り畳み／凝集：ＣＳ＞ＡＤＨ＞βＨクリスタリン）。各々のペプチドのシャペロン活性は、ペプチドの非存在下における各々の標的タンパク質の凝集が０％保護で設定された保護パーセントとして算出された。βＨクリスタリン（Ｂ：上の右側）、ＡＤＨ（Ｃ：下の左）およびＣＳ（Ｄ：下の右）の熱凝集に対して、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１、および１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０が保護する能力を、インビトロで試験した（垂直のバー）。ペプチド：標的タンパク質の５０：１のモル比では、２つの陽性のペプチドによってβＨクリスタリンおよびＡＤＨの中度の保護が生じたが、コントロールペプチドは、保護能力を有さなかった。ペプチド：標的タンパク質の１０：１のモル比は、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１によるＣＳの凝集に対して有意な保護を付与するのに十分であった。コントロールペプチド１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０は、ＣＳの凝集に対して部分的な保護を付与した。
【０２１３】
（実施例１０）
（ヒトαＢクリスタリンの３Ｄ構造に対するシャペロン部位マッピング）
タンパク質ピンアレイを用いてヒトαＢクリスタリン中でシャペロン機能について相互作用的ドメインとして同定された７つの配列（表４：第６列）に、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）および相同性モデリングデータ（図２０）に基づいて二次構造を割り当てた（図２０）。Ｎ末端領域における９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、αクリスタリンコアドメインのループ領域における１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０およびＣ末端領域における１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は、未構築のモチーフであったが、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲ５０（α３）および４７ＦＹＬＲＰＰＳＦ５４（α４）は、Ｎ末端領域中でらせん−ターン−らせんのモチーフを形成した。残りのペプチド７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）は、αクリスタリンコアドメインにおいて３つのβ鎖モチーフを形成した（図２０）。
【０２１４】
図２０は、ヒトαＢクリスタリンピンアレイを用いて同定されたペプチドと、αＢクリスタリンの前に報告された相互作用的配列との比較を示す。タンパク質ピンアレイを用いてシャペロン活性について重要な相互作用的ドメインとして同定された配列は、ボックスにある。タンパク質ピンアレイによって同定されたサブユニット間の相互作用は、灰色で影付きである。αＢクリスタリンのシャペロン機能を変更した部位特異的変異は、置換または欠失された残基（単数または複数）（Δ）の下に示される。ＥＳＲおよび相同性モデリングによって推定されるαＢクリスタリンの二次構造は、〜がらせんであって、■がβ鎖に相当するという形態で示される。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５；ＧｕｒｕｐｒａｓａｄおよびＫｕｍａｒｉ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ３３：１０７〜１２，２００３；Ｋｏｔｅｉｃｈｅら、，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２６８１〜８，１９９８。αＢクリスタリンのシャペロン活性に影響を有することが観察された全ての報告された点変異は、ピンアレイアッセイによって同定されたシャペロン機能のコンセンサス配列と重複した。Ｓｒｅｅｌａｋｓｈｍｉらによって同定された配列は、イタリック体で示される。Ｓｒｅｅｌａｋｓｈｍｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５７８５〜９５，２００４。
【０２１５】
観察された相互作用的ドメインを、ヒトαＢクリスタリンのコンピューターによる３Ｄ相同性モデルにマッピングして、相互作用的なシャペロン配列の３−Ｄ構造を同定した（図２１ａ）。ヒトαＢクリスタリンの空間充填モデルを生成して、αＢクリスタリンにおけるシャペロン活性の相互作用的ドメインを見て、分析した（図２１ｂ）。３つの相互作用的配列β３、β８およびβ９は、小型熱ショックタンパク質の特徴である、免疫グロブリン様折り畳みを模倣するβサンドイッチ構造である、αクリスタリンコアドメインの外面の１つを形成すると考えられた。内部に由来するβ鎖残基は、βサンドイッチの構造を安定化した。外部に由来する側鎖は、シャペロン標的タンパク質との相互作用に寄与した。Ｎ末端およびＣ末端における残基は、αクリスタリンコアドメインの三次構造に直接関与しないようであった。コアドメイン配列１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０は、ループ領域の一部を形成し、これはコアドメインの２つのβシートを接続して、その構造的完全性に寄与した。Ｎ末端の相互作用的な配列の露出した残基のアクセス可能な表面積は、７１％疎水性であると計算され、次に６９％疎水性であるＣ末端伸長領域、そして６４％疎水性であるαクリスタリンコアドメインと漸減する順序であった。相互作用的配列にわたる疎水性表面の割合は、ｓＨＳＰ分子シャペロンによる未折り畳みタンパク質の認識における疎水性相互作用の重要性と一致した。Ｓｈａｒｍａら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３７６７〜７１，２０００；Ｓｈａｒｍａら、，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３９：２１７〜２２，１９９７；Ｓｈａｒｍａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１５４７４〜８，１９９８；Ｓｈａｒｍａら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：８９６５〜７０，１９９８；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｃｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２７：２３４〜８，２００２；Ｓｒｉｎｉｖａｓら，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ７：１１４〜９，２００１；Ｒａｊａｒａｍａｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４９７：１１８〜２３，２００１。
【０２１６】
図２１は、αＢクリスタリン相互作用ドメインの３次元マップを示す。ピンアレイによって同定されたヒトαＢクリスタリンの相互作用的ドメインは、赤にあるが、非相互作用的領域は青にある。Ａ（左）：リボンは、ヒトαＢクリスタリンの二次構造および三次構造の提示。配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は、二次構造を有さなかった。配列４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８は、α３−ターン−α４モチーフを形成したが、配列７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８は、それぞれβ鎖モチーフβ３、β８およびβ９を形成した。Ｂ（右）：ヒトαＢクリスタリンの３Ｄ構造の立体模型。溶媒アクセス可能である、相互作用的ドメインにおける残基の表面９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４はピンクである。αＢクリスタリンの非相互作用的領域における残基の表面は灰色である。Ｎ末端配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０および４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８の集合的なアクセス可能表面のうち７２％が疎水性であった。αクリスタリンコアドメイン配列７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）のうち集合的なアクセス可能表面積の６７％が疎水性であった。ループ領域配列１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０は６１％疎水性であって、Ｃ末端伸長配列１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は、５９％疎水性であった。
【０２１７】
（実施例１１）
（シャペロン活性を有するヒトαＢクリスタリンの相互作用的ポリペプチド配列）
小型熱ショックタンパク質であるｓＨＳＰは、ストレスタンパク質および分子シャペロンのファミリーであって、最大４３ｋＤａにおよぶ分子量を有し、長さおよび一次配列が可変のＮ末端ドメイン、保存されたαクリスタリンコアドメインならびに高度に保存されたＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含むＣ末端伸長ドメインを含む。この報告では、タンパク質ピンアレイによって、７つの相互作用的配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４を、内因性の標的タンパク質βＨ／γＤクリスタリンおよび非生理学的標的ＡＤＨおよびＣＳを用いて、ヒトαＢクリスタリンのシャペロン活性について重要であると特定した。二次構造を要する天然のβＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンとのαＢクリスタリンの相互作用は、タンパク質ピンアレイによる検出を避け得ることが可能であるが、ピンアレイでは、天然のβＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンとのαＢクリスタリンの相互作用に関与したほとんどの配列を特定したと考えられる。ピンアレイによって同定された相互作用的ペプチドは、ヒトαＢクリスタリンタンパク質ピンアレイにおける最も疎水性のペプチドではなかった。製造業者によって提供される疎水性に基づいて、相互作用ペプチド９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８は、かなり疎水性であった。ヒトαＢクリスタリンピンアレイにおける１４個の非相互作用的ペプチドは、残りの相互作用ペプチド７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４よりも疎水性であった。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。
【０２１８】
遠ＵＶＣＤ分析によって、βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンの二次構造のうち１０％未満が、それらを４５℃で１５分間加熱した場合に存在したことが示された。しかし、βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンの近ＵＶＣＤスペクトルにおける吸収ピークの大きさは、約２０〜２５％に低下し、これによって、それらのタンパク質の三次構造における高次構造の変化が示された。遠ＵＶＣＤによって決定されたβＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンの二次構造の有意な未折り畳みおよび喪失の非存在において、相互作用的なαＢクリスタリンペプチドと事前に加熱されたβＨクリスタリンとγＤクリスタリンとの間の相互作用の増大によって、αＢクリスタリンの相互作用的ドメインは、事前加熱βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリンから生じる三次構造における高次構造の変化を検出したことが示唆された。ピンアレイは、未折り畳みのタンパク質の三次構造における摂動を検出するのに近ＵＶＣＤと同様に鋭敏であると考えられた。
【０２１９】
７つのシャペロン配列のうちの２つがＮ末端に、４つが保存されたαクリスタリンコアドメインに、そして１つがＣ末端伸長にあり、ここには高度に保存されたＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖアミノ酸モチーフを含む。ピンアレイの結果によって、相互作用的ドメイン内の点変異は、αＢクリスタリンのシャペロン活性を改変することが予想され得、そして相互作用的ドメインの外側の点変異は、シャペロン活性に影響をほとんどまたは全く有さないと予想され得るということが示唆された。体系的な研究が、現在までピンアレイを用いて同定された配列モチーフについて報告されているが、文献的な結果は、ピンアレイによって同定される配列が、ヒトαＢクリスタリンのシャペロン様活性の重要なモチーフであるという示唆と一致している。Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉら、，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８９：３９７〜４１１，１９９９；ＧｕｐｔａおよびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４５：２０６〜１４，２００４；Ｌｉａｏら、，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９７：３０９〜１６，２００２；Ｋｕｍａｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２４１３７〜４１，１９９９；Ｈｏｒｗｉｔｚら、，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２２：２６３〜９，１９９８；Ｐｌａｔｅｒら、ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２８５５８〜６６，１９９６；Ｄｅｒｈａｍら、，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８：７１３〜２１，２００１。Ｃ末端伸長の欠失がアルギニン１５７を含むαＢクリスタリンの突然変異誘発によって、全長αＢクリスタリンと比較してインビトロでシャペロン活性の減少が生じた。ＴｈａｍｐｉおよびＡｂｒａｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１１８５７〜６３，２００３。アルギニン１５７は、ピンアレイによって同定される１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４ジャペロン配列に存在する。αＢクリスタリンの短縮変異体（αＢクリスタリン５７〜１５７）上でのＸ線溶液散乱によって、Ｎ末端およびＣ末端伸長の非存在下におけるαクリスタリンドメインが、二量体を形成し、そして全長αＢクリスタリンに比較してインビトロでシャペロン様活性が減少したことが示された。Ｆｅｉｌら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１２０２４〜９，２００１。αクリスタリンコアドメインに属する２つのコンセンサスなシャペロン配列７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１を合成して、シャペロン標的タンパク質βＨクリスタリン、ＡＤＨ、およびＣＳの熱未折り畳みおよび凝集に対する防御についてインビトロで試験して、実質的な防御効果を観察した。シャペロンアッセイによって、ピンアレイを用いて同定された配列は、αＢクリスタリンのシャペロン活性に重要であったことが観察され、そしてこれは、疎水性のプローブおよびシャペロンアッセイがシャペロン活性についての相互作用的配列としてαＢクリスタリン配列７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫ８２を同定した初期の研究と一致した。Ｓｈａｒｍａら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：６０２７〜３４，２００４。αクリスタリンの相互作用的な配列における選択された点変異または組み合わせ変異は、シャペロン活性を改善または軽減すること��予想され得る。両方のペプチドの濃度が高いほど、ＣＳの凝集に対して防御するよりも、βＨクリスタリンおよびＡＤＨの凝集に対して防御する必要があった。円偏光二色性分析によって、βＨクリスタリンは、部分的に未折り畳みであって、ＡＤＨおよびＣＳの両方とも５０℃ではほぼ完全に未折り畳みであったことが示された。まとめると、シャペロンアッセイおよび円偏光二色性のデータによって、このペプチドは、完全に未折り畳みのタンパク質の凝集に対する防御ではより有効であって、部分的に未折り畳みまたは天然様のタンパク質の凝集に対する防御には有効でないことが示唆された。
【０２２０】
ピンアレイを用いて同定された相互作用的配列は、シャペロン界面の構造的なトポグラフィーを分析するためαＢクリスタリンの３次元モデル上にマッピングされた。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。Ｘ線結晶構造またはＮＭＲ構造の非存在下で、ＭｊのｓＨＳＰ１６．５およびコムギｓＨＳＰ１６．９の結晶構造とのコンピューター計算のαＢクリスタリン相同性モデルの重層は、αクリスタリンコアドメインについて２．０６ÅというＣα二乗平均平方根で顕著であったことが観察された。Ｋｉｍら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５９５〜９，１９９８；ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｒｔら、，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８：１０２５〜３０，２００１。二次構造を、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）データ、ならびにヒトαＢクリスタリンとコムギのｓＨＳＰ１６．９およびＭｊのｓＨＳＰ１６．５の結晶構造の複数の配列アラインメントに基いて、ピンアレイによって同定された相互作用的配列に割り当てた。Ｋｉｍら、，Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：５９５〜９，１９９８；ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｒｔら、，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８：１０２５〜３０，２００１；Ｋｏｔｅｉｃｈｅ  ａｎｄ  ＭｃＨａｏｕｒａｂ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４：５６１〜７７，１９９９；Ｋｏｔｅｉｃｈｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２６８１〜８，１９９８。Ｎ末端シャペロン配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０は、構造化されておらず、そして７０％疎水性である表面を形成したが、配列４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦ５４は、７２％疎水性である外部表面を有し、未折り畳みタンパク質の露出した疎水性パッチに結合するのに適したらせん−ターン−らせんモチーフを形成した。αクリスタリンコアドメインにおける４つの配列のうち３つ、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）および１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）は、β鎖であって、６７％の疎水性である表面を形成した。高度に保存されたＩ−Ｘ−Ｉ／Ｖモチーフを含むＣ末端シャペロン配列１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は組織化されておらず、そして５９％疎水性である表面を形成した。この報告において同定されたシャペロン配列４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦ５４、７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４は、タンパク質ピンアレイを用いてαＢクリスタリンにおけるサブユニット−サブユニット間の相互作用部位として前に同定された配列と有意に重複した（図２０：影付きの残基）。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。ピンアレイによって同定された配列４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦ５４は、ヒトαＡクリスタリンと相互作用するαＢクリスタリンにおける相互作用的領域として以前に報告された配列４２ＴＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡ５７のサブセットである。Ｓｒｅｅｌａｋｓｈｍｉら、，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１５７８５〜９５，２００４；ＬｅｎｔｚｅおよびＮａｒｂｅｒｈａｕｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２５：４０１〜７，２００４。凝集からβＨクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳを保護した合成ペプチドの７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１の両方が、αＢクリスタリンにおけるサブユニット間相互作用の相互作用的配列として以前に同定された。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。この結果、αＢクリスタリンにおける相互作用的配列は、サブユニットアセンブリおよびシャペロン機能において二重の役割を有し得ることが示唆され、このことは、シャペロン機能の喪失がアセンブリサイズの減少をともなうという前の突然変異誘発データと一致する。ＳａｈａおよびＤａｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ５７：６１０〜７，２００４；Ｆｅｉｌ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４７：３８〜４５，１９９８。ピンアレイによるαＢクリスタリンにおけるサブユニット間相互作用およびシャペロン活性について共通の配列の同定によって、αＢクリスタリン複合体の解離が、未折り畳みのシャペロン標的タンパク質に結合し得るシャペロン配列の露出に必要であり得ることが示唆される。この仮説は、ＨＳＰ２７およびαＢクリスタリンのシャペロン活性を調節するのにおけるオリゴマー平衡の役割という以前の研究と一致している。Ｓｈａｓｈｉｄｈａｒａｍｕｒｔｈｙら、ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：５２８１〜９，２００５；Ｓｒｉｎｉｖａｓら、，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  １１：２４９〜５５，２００５。Ｓｈａｓｈｉｄｈａｒａｍｕｒｔｈｙら、は、ＨＳＰ２７オリゴマーの解離が、不安定化されたＴ４リゾチーム変異体との相互作用に必要であることを報告した。Ｓｈａｓｈｉｄｈａｒａｍｕｒｔｈｙら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：５２８１〜９，２００５。Ｓｒｉｎｉｖａｓらは、塩酸アルギニンが、そのサブユニット間動態を増大することによってαＢクリスタリンのシャペロン活性を増強したことを報告した。Ｓｒｉｎｉｖａｓら、，Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  １１：２４９〜５５，２００５。
【０２２１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｓＨＳＰ（ｓＨＳＰ１２．２，ｓＨＳＰ１２．３およびｓＨＳＰ１２．６）におけるαＢクリスタリンＮ末端およびＣ末端のシャペロン配列９ＷＩＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ２０、４３ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰ５８および１５７ＲＴＩＰＩＴＲＥ１６４に対して類似の相互作用的配列の欠失は、インビトロにおけるＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｓＨＳＰのシャペロン様活性の非存在について説明し得る。Ｋｏｋｋｅら、，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３３：２２８〜３２，１９９８。４つのシャペロン標的タンパク質の全てと相互作用すし、６７％疎水性である外面を集合的に形成するαクリスタリンコアドメインペプチド７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２（β３）、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８（β８）、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８（β９）によって形成される界面は、ピンアレイを用いてヒトαＢクリスタリンサブユニットのアセンブリについての界面として以前に同定された。ＧｈｏｓｈおよびＣｌａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：６８４〜９５，２００５。この界面が、天然のタンパク質（αＡクリスタリンおよびαＢクリスタリン）との、そして未折り畳みのシャペロン標的タンパク質（βＨクリスタリン、γＤクリスタリン）との疎水性および親水性の相互作用の両方を残基に提供する。αクリスタリンコアドメインの構造は、小型の熱ショックタンパク質ファミリーにおいて高度に保存されており、そして他の小型熱ショックタンパク質中のαＢクリスタリンシャペロン配列７５ＦＳＶＮＬＤＶＫ８２、１１３ＦＩＳＲＥＦＨＲ１２０、１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳ１３８、１４１ＧＶＬＴＶＮＧＰ１４８に対して相同な配列は、他のＨＳＰのシャペロン機能に関与することが予想される。まとめると、ピンアレイアッセイ、インビトロシャペロンアッセイおよび標的タンパク質の円偏光二色性分光学によって、ほぼ完全に未折り畳みであるタンパク質（ＡＤＨおよびＣＳ）および部分的に未折り畳みであるタンパク質（βＨクリスタリンおよびγＤクリスタリン）を含む、広範な標的タンパク質との相互作用を担う全長αＢクリスタリンにおける配列を同定した。タンパク質ピンアレイは、オリゴマーアセンブリにおいて、そして未折り畳みシャペロン標的タンパク質との相互作用において重要であるヒトαＢクリスタリンにおいてタンパク質間相互作用ドメインを同定するのに有効であった。ヒトｓＨＳＰ２７およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｓＨＳＰ１６．３を含む生理学的に関連する小型熱ショックタンパク質における相互作用的ドメインの特定の配列および３次元構造のさらなる検討によって、疾患におけるｓＨＳＰおよび分子シャペロンの機能に対する新規な情報が得られる。現在の結果によって、タンパク質未折り畳みに対するｓＨＳＰの集合的な応答がいくつかの相互作用的ドメインに関与すること、そしてｓＨＳＰがタンパク質未折り畳みに対して見事に鋭敏であることが示唆される。これらの結果は、小型の熱ショックタンパク質の選択性および感度、ならびに特定の細胞の必要性に対するそれらの適合ならびにそれらのストレスに対する応答を説明し得る。
【０２２２】
（実施例１２）
（ＡβまたはγＤクリスタリンの線維化に対するαＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの効果）
（αＢチオフラビン蛍光）Ａβフィブリルを、αＢクリスタリンおよびペプチドの有無において、αＢクリスタリンの存在について前に記載されたのと同様の条件で、成長させた。Ｂａｋｔｈｉｓａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，２００５。ペプチドを、９．１ｍＭのトリフルオロエタン（ＴＦＥ）中に９．１ｍＭまで溶解して、５０ｍＭのＰＢＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中で０．９１ｍＭのストック溶液に希釈した。３．５ｍｇのチオフラビンＴを、１００μｌの５０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ  ｐＨ８．５に溶解した。１ｍｇ／ｍｌ（０．２２ｍＭ）のＡβのストック溶液を調製した。２０μｌのＡβ、５０μｌのシャペロン、２μｌのチオフラビンＴを、２８μｌの５０ｍＭのＰＢＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４と混合した。蛍光をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｉｅｒ  ＤＴＸ  ８８０マルチモード検出器を用いて読み取った。サンプルを５０℃で７２時間加熱して、蛍光を再度読み取った。
【０２２３】
（γＤクリスタリンチオフラビンＴ蛍光）γＤクリスタリンフィブリルを、γクリスタリンのものと同様の方式で形成した。Ｍｅｅｈａｎら、，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３４１３〜３４１９，２００４。ペプチドを、ＴＦＥ中で９．１ｍＭに溶解して、１０％、ＴＦＥ、ｐＨ２．０中で０．９１ｍＭのストック溶液に希釈した。３．５ｍｇのチオフラビン（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ）Ｔを、１００μｌの５０ｍＭのグリシンｐＨ８．５に溶解した。１ｍｇ／ｍｌ（０．２２ｍＭ）Ａβのストック溶液を調製した。２０μｌのＡβ、５μｌのシャペロン、２μｌのチオフラビンＴを、７３μｌの１０％ＴＦＥ，ｐＨ２．０と混合した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｉｅｒ  ＤＴＸ  ８８０マルチモード検出器を用いて蛍光を読み取った。サンプルを５０℃で７２時間加熱して、蛍光を再度読み取った。
【０２２４】
（シャペロンアッセイ）５つのペプチドのシャペロンアッセイを、以前に確立された方法でただしわずかな変法を用いて行った。Ｍｕｃｈｏｗｓｋｉら、，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８９：３９７〜４１１，１９９９。シャペロン：標的タンパク質の１：１の単量体モル比が、最適比であることを確認し、そしてβ３変異体の全ての引き続くシャペロンアッセイを、三連で、そして９６ウェルのＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートにおけるシャペロン：標的タンパク質の１：１単量体モル比で行った。シャペロンおよびβＬクリスタリンの０．１ミリモルを総容積２００μｌの緩衝液（５ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．０）中で混合した。λ＝３４０ｎｍでの光散乱を、加熱前（時間＝０）にＭｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＣＣ／３４０プレートリーダーを用いて測定した。最初の読み取り後、プレートを５０℃で加熱して、読み取りは、１時間の間１５分の間隔で行った。
【０２２５】
表５は、野性型αＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの有無におけるＡβまたはγＤクリスタリンの蛍光を示す。
【０２２６】
表５
【０２２７】
【表５】
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図２２は、Ａβの線維化に対するαＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの効果を示す。Ａβの線維化は、Ａβ：ペプチドの１：１０の単量体モル比を含む溶液からの蛍光色素チオフラビンＴの蛍光として測定された。Ａβフィブリルの非存在下では、チオフラビンＴは、蛍光をほとんど、または全く有さなかった。７２時間後に任意の他の分子の非存在下でＡβフィブリルに結合するチオフラビンＴの蛍光を１００％に設定した。ＤＲペプチドは、最強の影響を有し、そしてＨＧペプチドは、Ａβの線維化に最弱の影響を有した。フィブリル形成＝Δ蛍光Ａβ（シャペロンあり）＊１００／Δ蛍光Ａβ（シャペロンなし）。
【０２２８】
図２３は、γＤクリスタリンの線維化に対するαＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの影響を示す。γＤクリスタリンの線維化は、１：１の単量体モル比のγＤクリスタリン：ペプチドを含有する溶液からの蛍光色素チオフラビンＴの蛍光として測定した。フィブリルの非存在下では、チオフラビンＴは、蛍光をほとんど、または全く有さなかった。７２時間後に任意の他の分子の非存在下でγＤクリスタリンフィブリルに結合するチオフラビンＴの蛍光を、１００％に設定した。ＳＴペプチドは、γＤクリスタリンの線維化に最強の影響を有し、そして野性型αＢクリスタリンが最弱の影響を有した。フィブリル形成＝Δ蛍光γＤクリスタリン（シャペロンあり）＊１００／Δ蛍光γＤクリスタリン（シャペロンなし）。
【０２２９】
図２４は、５つのαＢクリスタリン由来ペプチドのシャペロンアッセイを示す。ペプチドがβＬクリスタリンの熱凝集を抑制する能力は、１：１０の単量体モル比の標的タンパク質：ペプチドを含有する溶液からのλ＝３４０ｎｍでの光散乱として分光光度的に測定した。βＬクリスタリンの非存在下では、ペプチドの光散乱は、緩衝液単独の光散乱と同様であって、このことは加熱の際にペプチドが凝集しないことを示す。ＨＧペプチドは、βＬクリスタリンの凝集に最強の影響を有し、そしてＳＴペプチドが最弱の影響を有した。ＤＲ、ＬＴおよびＥＲペプチドのシャペロン活性を特定したところ、ＨＧペプチドよりもわずかに低かった。
【０２３０】
本発明の説明によって、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、そして本明細書において示される過度の実験なしに、広範な等価なパラメーター、濃度および条件内で当業者は実行可能である。
【０２３１】
本発明は、その特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、本発明が属する当該分野内の公知のまたは慣習上の実施内でおさまるとおり、そして添付の特許請求の範囲において以下に示される本明細書における前の本質的な特徴にあてはまり得るとおり、一般には本発明の原理に従い、かつ本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の改変、用途または適合を包含するものとする。
【０２３２】
学術論文または抄訳、公開もしくは対応する米国特許出願もしくは外国の特許出願、公開米国特許もしくは外国の特許、または任意の他の引用文献を含む、本明細書に引用される全ての引用文献は、本明細書に参照によって全体として援用され、それにはその引用文献に提示される全てのデータ、表、図およびテキストを含む。さらに、本明細書に引用される引用文献内に引用される引用文献の内容全体も参照によって全体として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】図１は、誤まって折り畳まれたタンパク質を安定化するか、および／またはタンパク質の凝集を防止するインテリペプチド（Ｉｎｔｅｌｌｉｐｅｐｔｉｄｅ）の治療適用を描写する図である。
【図２】図２は、インビトロにおけるアミロイドβのｐＨ誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、インビトロにおけるアミロイドβのＣｕ＋＋＋誘発性凝集に対するインテリペプチドの効果を示す棒グラフである。
【図４】図４は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）におけるアミロイドーシスならびにインテリペプチドを用いる可能性のある介入の模式図を示す。
【図５】図５は、ポリペプチドの特徴を有する合成分子を設計するための静電気的表面の分子モデルを用いる方法を示す。
【図６】図６は、ポリペプチドＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳ、ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ、ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲ、ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱ、およびＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫ由来のポリペプチド配列に由来する一連のポリペプチドのまとめを示す。
【図７−１】図７は、配列ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図７−２】図７は、配列ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図７−３】図７は、配列ＳＬＳＰＦＹＬＲＰＰＳＦＬＲＡＰＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図８−１】図８は、配列ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図８−２】図８は、配列ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図８−３】図８は、配列ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図８−４】図８は、配列ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９−１】図９は、配列ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９−２】図９は、配列ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９−３】図９は、配列ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲＫＹＲに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１０−１】図１０は、配列ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１０−２】図１０は、配列ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１０−３】図１０は、配列ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１０−４】図１０は、配列ＤＰＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫＱに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１−１】図１１は、配列ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１−２】図１１は、配列ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１−３】図１１は、配列ＰＥＲＴＩＰＩＴＲＥＥＫに由来する一連のペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、タンパク質ピンアレイアッセイの略図を示す。詳細なプロトコールについては方法の節を参照のこと。
【図１３】図１３は、ピン上に固定されたヒトαＢクリスタリンの８マーのペプチドと、２３℃の非加熱のβＨクリスタリンおよび４５℃で１５分間事前に加熱されたβＨクリスタリンとの間の相互作用のパターンを示す。
【図１４】図１４は、ピン上に固定されたヒトαＢクリスタリンの８マーのペプチドと、２３℃の非加熱のγＤクリスタリンおよび４５℃で１５分間事前に加熱されたγＤクリスタリンとの間の相互作用のパターンを示す。
【図１５】図１５は、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）およびクエン酸シンターゼ（ＣＳ）の遠ＵＶＣＤを示す。スペクトルは、βＨクリスタリン（Ａ：上の左）、γＤクリスタリン（Ｂ：上の右）、ＡＤＨ（Ｃ：下の左）およびＣＳ（Ｄ：下の右）、２３℃、４５℃および５０℃について収集した。
【図１６】図１６は、βＨクリスタリン、γＤクリスタリン、ＡＤＨおよびＣＳの近ＵＶＣＤを示す。スペクトルは、βＨクリスタリン（Ａ：上の左）、γＤクリスタリン（Ｂ：上の右）、ＡＤＨ（Ｃ：下の左）およびＣＳ（Ｄ：下の右）で、２３℃、４５℃および５０℃について収集した。
【図１７】図１７は、ヒトαＢクリスタリンペプチドとＡＤＨとの間の相互作用のパターンを示す。
【図１８】図１８は、ヒトαＢクリスタリンペプチドとＣＳとの間の相互作用のパターンを示す。
【図１９】図１９は、２つの正の相互作用の配列、７３ＤＲＦＳＶＮＬＤＶＫＨＦＳ８５および１３１ＬＴＩＴＳＳＬＳＤＧＶ１４１および非相互作用の配列ヒトαＢクリスタリンのαクリスタリンコアドメイン由来の１１１ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ１２０（コントロール）のシャペロンアッセイを示す。
【図２０】図２０は、ヒトαＢクリスタリンピンアレイを用いて同定されたペプチドと、αＢクリスタリンの以前に報告された相互作用配列との比較を示す。
【図２１】図２１は、αＢクリスタリン相互作用ドメインの３次元マップを示す。
【図２２】図２２は、Ａβの繊維化（ｆｉｂｒｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ）に対するαＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの効果を示す。
【図２３】図２３は、γＤクリスタリンの繊維化に対するαＢクリスタリンおよび５つのαＢクリスタリン由来ペプチドの効果を示す。
【図２４】図２４は、５つのαＢクリスタリン由来ペプチドのシャペロンアッセイを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月25日(2007.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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