(57)【要約】【課題】骨原性成長ペプチド融合タンパク質【解決手段】例えば治療的タンパク質のような、骨原性成長ペプチド(OGP)のC-末端に融合されるタンパク質を含む融合タンパク質。該融合タンパク質は、延長された循環時間を有する。【選択図】      なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意にリンカーを介して、OGP又はその変異体のC-末端に融合した第一のタンパク質を含む融合タンパク質、但し、前記第一のタンパク質がOGPに融合している場合に、前記第一のタンパク質がサケのカルシトニンではなく、また、前記融合タンパク質はOGPではないことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記リンカーが存在しないことを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーがOGP、OGP-OGP、OGP(1-9)、OGP(1-9)-OGP(1-9)又はNDEMPADLPSである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、OGPに対する解離定数の値の10倍までの解離定数でα2Mに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記OGP変異体が、OGPのC-末端の５までのアミノ酸残基の欠失によってOGPと相違する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記OGP変異体がOGP（1-9）である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質が、成長ホルモン、成長ホルモン化合物、又はヒト成長ホルモンを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、以下からなる一覧から選択される融合タンパク質：
OGP-hGH, (配列番号1);
OGP(1-9)-hGH, (配列番号2);
OGP-OGP-hGH,  (配列番号3);
OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH (配列番号4);
OGP(1-9)-OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH (配列番号17);
OGP-OGP-OGP-hGH (配列番号18);
OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGH (配列番号19); 及び
OGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGH (配列番号20)
ここで、hGHはヒト成長ホルモンを示す。
【請求項９】
タンパク質の循環時間を増大させる方法であって、該方法は、任意にリンカーを介して、前記タンパク質をOGP又はその変異体のC-末端に融合させることを含む方法。
【請求項１０】
前記リンカーが存在しないことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーが、OGP、OGP-OGP、OGP(1-9)、OGP(1-9)-OGP(1-9)又はNDEMPADLPSである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記OGP変異体が、OGPに対する解離定数の値の10倍までの解離定数でα2Mに結合する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記OGP変異体が、OGPのC-末端の５までのアミノ酸残基の欠失によってOGPと相違する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記OGP変異体がOGP(1-9)である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、成長ホルモン、成長ホルモン化合物又はヒト成長ホルモンである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
OGP変異体であって、OGPに対する解離定数の値の10倍までの解離定数でα2Mに結合することを特徴とするOGP変異体。
【請求項１７】
OGP変異体であって、OGPのC-末端から５までのアミノ酸を欠失させることによって達成されるOGP変異体。
【請求項１８】
OGP(1-9)である、請求項16に記載のOGP変異体。
【請求項１９】
請求項１〜８又は１６〜１８のいずれか一項のタンパク質をコードする塩基配列を含む、核酸構築物。
【請求項２０】
請求項１９の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０のベクター又は請求項１９の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２２】
治療における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
成長ホルモン欠損症(GHD)；ターナー症候群；プラダーウィリー症候群(PWS)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎疾患、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、小児が受けたHAART治療(HIV/HALS小児)におけるHIV-感染；短い在胎期間(SGA)で出産された小児（short children）；極低出生体重(VLBW)ではあるがSGAではなく出産された小児の低身長；骨系統疾患；軟骨低形成症；軟骨無形成症；特発性低身長症(ISS)；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、手骨（matacarpea）、足骨（matatarsea）、及び指のような長骨中におけるか又はその骨折；スカル（scull）、手の基部、及び食物の基部のような、海綿質骨（spongious bones）内又は海綿質骨の骨折；例えば手、膝、又は肩部における腱又は靭帯手術後の患者；骨形成伸延を有するか又はそうしている患者；臀部又は円板の置換術、半月板修復、脊髄性癒合又は膝、臀部、肩部、肘、手首又は下顎におけるような人工関節固定法の後の患者；爪、らせん及び板状のような、骨接合物質が固定された患者；骨折の非-癒合又は多（mal）-癒合の患者；例えば脛骨又は足の第一指からの骨切り術（osteatomia）後の患者；移植片埋め込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する、膝の関節軟骨の変性；ターナー症候群を伴う患者の骨粗鬆症；男性の骨粗鬆症；慢性透析(APCD)における成人患者；APCDにおける多栄養性（malnutritional）関連循環器病；APCDにおける悪液質の逆転；APCDにおける癌；APCDにおける慢性抽出肺疾患（chronic abstractive pulmonal disease）；APCDにおけるHIV；APCDを伴う高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；障害性肝機能；HIVに感染した男性；短小腸症候群；中心性の肥満症（central obesity）；HIV-関連脂肪異栄養症候群(HALS)；男性不妊；待期的大手術、アルコール/薬物の解毒又は神経性外傷後の患者；老化；要介護老人；骨-関節炎；外傷性傷害性軟骨；勃起機能障害；線維筋痛；記憶障害；うつ病；外傷性脳傷害；クモ膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；糖質コルチコイド筋障害；又は、子供時代の糖質コルチコイド治療に起因する低身長；を治療する方法であって、該方法は、請求項７に記載のOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２５】
週１回か又はより長い間隔での非経口投与を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が治療的である、請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
以下から選択される疾病の治療のための薬剤の製造における、請求項７のいずれかのOGP融合タンパク質の使用：
成長ホルモン欠損症(GHD)；ターナー症候群；プラダーウィリー症候群(PWS)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎疾患、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、小児が受けたHAART治療(HIV/HALS小児)におけるHIV-感染；短い在胎期間(SGA)で出産された小児（short children）；極低出生体重(VLBW)ではあるがSGAではなく出産された小児の低身長；骨系統疾患；軟骨低形成症；軟骨無形成症；特発性低身長(ISS)；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、手骨（matacarpea）、足骨（matatarsea）、及び指のような、長骨中におけるか又はその骨折；スカル（scull）、手の基部、及び食物の基部のような、海綿質骨（spongious bones）内又は海綿質骨の骨折；例えば手、膝、又は肩部における腱又は靭帯手術後の患者；骨形成伸延を有するか又はそうしている患者；臀部又は円板の置換術、半月板修復、脊髄性癒合又は膝、臀部、肩部、肘、手首又は下顎におけるような人工関節固定法の後の患者；、らせん及び板状のような、骨接合物質が固定された患者；骨折の非-癒合又は多（mal）-癒合の患者；例えば脛骨又は足の第一指からの骨切り術（osteatomia）後の患者；移植片埋め込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する、膝の関節軟骨の変性；ターナー症候群を伴う患者における骨粗鬆症；男性の骨粗鬆症; 慢性透析(APCD)における成人患者; APCDにおける多栄養性（malnutritional）関連循環器病；APCDにおける悪液質の逆転；APCDにおける癌；APCDにおける慢性抽出肺疾患（chronic abstractive pulmonal disease）；APCDにおけるHIV；APCDを伴う高齢者; APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群; クローン病；障害性肝機能;HIVに感染した男性；短小腸症候群；中心性の肥満症；HIV-関連脂肪異栄養症候群(HALS)；男性不妊；待期的大手術後、アルコール/薬物の解毒又は神経性外傷の患者；老化；要介護老人；骨-関節炎；外傷性傷害性軟骨；勃起機能障害；線維筋痛；記憶障害；うつ病；外傷性脳傷害；クモ膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；糖質コルチコイド筋障害；又は、子供時代のグルココルチコイド治療に起因する低身長。
【請求項２８】
前記薬剤が、週１回又はより長い間隔での投与のために意図される、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨原性成長ペプチド(OGP)融合タンパク質に関する。また、本発明は、治療的タンパク質の循環時間を、それらをOGP又はその変異体と融合させることによって増大させる方法、及び、OGP融合タンパク質の投与を含む治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨原性成長ペプチド(OGP)は、ヒストンH4のC-末端アミノ酸配列89-102と同一のテトラデカペプチドである。OGPのアミノ酸配列は、Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (配列番号33)である。OGPは、局所的な骨髄傷害に対する全身的な骨原性応答のメカニズムにおいて鍵となる因子である。OGPの血漿レベルは、例えば年齢に依存するが、極めて大量に480-4460 μMまで存在する。しかしながら、OGPの80-90%は、他の血漿タンパク質に非共有結合しており、その最も重要なものはα2-マクログロブリン(α2M) [Biochem., 36, 14883-14888, 1997]である。
【０００３】
結合したOGPは不活性であるが、しかしα2Mから解離しタンパク分解的に切断されれば生物学的に活性であり、骨原性OGP(10-14)が形成される。これは、成長促進活性が、C-末端断片OGP(10-14)に含まれることを示し、一方N-末端断片、OGP(1-9)がα2M結合の原因であることを示す。
【０００４】
タンパク質、特に治療に関係するタンパク質の循環時間を増大させる多くの試みがなされている。古典的には、タンパク質は例えば脂肪酸に接合され、これはアルブミンに結合するか、又は分子サイズを増大させて腎クリアランスを減少させるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような大きな分子に結合すると思われている[J.Pharm.Sci., 86, 1365-1368, 1997; US 4,179,337]。他のアプローチは、所望のタンパク質をアルブミンのような他のタンパク質に融合させることである[US 5,045,312; WO 97/24445; WO 01/79271]。
【０００５】
サケカルシトニン及びOGPの融合タンパク質は、「Zhongguo Shengwu Gongcheng Zazhi (2002), 22(4), 84-88」に開示されており、この融合タンパク質は骨芽細胞及び線維芽細胞の増殖を上昇させ、ＡＬＰ活性を刺激し、ならびにインビトロ及びインビボでの血清カルシウムのレベルを減少させることができると報告されている。
【０００６】
生物学的に又は治療的に所望の活性を有する多くの既知のタンパク質が、ヒトゲノムプロジェクトの結果とりわけ急速に発展した。しかしながら、それらの新規のタンパク質ならびに「旧来の」よく確立されたタンパク質の治療的な可能性は、循環系におけるきわめて短い半減期によってしばしば制限される。よって、循環系におけるタンパク質の循環時間を増大させる方法、及び他の利点又は選択的特性（alternative characteristics）（改善されたか又は代替の生理化学的な性質のような）をそのようなタンパク質に与えることが依然として要求されている。
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、任意にリンカーを介して、OGP又はその変異体（「OGP変異体」）のC-末端に融合した第一のタンパク質を含むOGP融合タンパク質に関する。但し、前記OGP又はその変異体がOGPである場合には前記タンパク質はサケカルシトニンではなく、また、前記融合タンパク質はOGP自体ではない。
【０００８】
他の態様において、本発明は、循環系におけるOGPタンパク質の循環時間を増大する方法に関し、該方法は、タンパク質（「融合パートナー」）をOGPのC-末端又はOGPの変異体のC-末端に融合させることを含む。
【０００９】
他の態様において、本発明は、タンパク質の生理化学的性質を改善する方法に関し、該方法は、前記タンパク質を任意にリンカーを介してOGPのC-末端又はOGP変異体のC-末端に融合することを含む。
【００１０】
他の態様において、本発明はOGPの変異体に関する。  
他の態様において、本発明はOGP融合タンパク質又は本発明のOGP変異体をコードする核酸構築物に関し、該核酸構築物を含有するベクターに関し、該ベクターで形質転換された宿主細胞に関し、また、本発明のOGP融合タンパク質及びOGP変異体を（但し前記OGP融合タンパク質はサケカルシトニンがOGPに直接融合したもの又はOGP自体ではない）、それらの核酸構築物、ベクター及び／又は宿主細胞を用いて製造する方法に関する。
【００１１】
他の態様において、本発明は、治療におけるOGP融合タンパク質の使用に関し、但し該OGP融合タンパク質はOGPに直接融合したサケカルシトニンではなく、またOGPではない。
【００１２】
他の態様において、本発明は、OGP融合タンパク質を含む薬学的組成物に関する。但し、該OGP融合タンパク質はOGPに直接融合したサケカルシトニンではなく、又はOGP自体でない。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸構築物を含み、OGP融合タンパク質又はOGP変異体を発現するよう改変された遺伝子組換え生物に関する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、OGP融合タンパク質の治療的有効量をそれらを必要とする患者に投与（又は送達、例えば組換え核酸からの発現による）することを含む治療方法に関し、但し前記OGP融合タンパク質はOGPに直接融合したサケカルシトニンではなく、OGP自体でもない。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、薬剤の製造におけるOGP融合タンパク質の使用に関する。但し、該OGP融合タンパク質はOGPに直接融合したサケカルシトニンではなく、OGP自体でもない。
【定義】
【００１６】
本発明の状況において、「OGP融合タンパク質」という用語は、例えば治療的タンパク質のような第一のタンパク質の、OGP又はその変異体である第二のタンパク質のC-末端への融合によって形成される。前記融合は、OGP又はその変異体のC-末端が上記第一のタンパク質のＮ-又はC-末端に直接結合するという意味に向けられることが理解されるであろう。融合は、リンカーを介してもよく、ここで該リンカーは、その一端でOGP又はその変異体のC-末端に結合され、その他端で上記第一のタンパク質に結合される。上記第一のタンパク質における付着点は、前記タンパク質を構成する任意のアミノ酸残基であってよく、即ち、C-末端、N-末端又はその間の任意のアミノ酸残基であってよい。他に言及しない限り、「融合」という用語は、前記融合タンパク質が任意の特定の方法によって生成されることを意味するようには意図されない。  
本発明の状況において、「リンカー」とは、OGP融合タンパク質の二つの部分、例えばOGP部分と上記第一のタンパク質部分を結合するのに役立つ部分である。ひとつの態様において、前記リンカーは、直鎖又は分枝鎖のC1-50-アルキレン、直鎖又は分枝鎖のC2-50-アルケニレン、直鎖又は分枝鎖のC2-50-アルキニレン、炭素及び少なくとも一つのN、O又はS原子を鎖中に含む1〜50-員の直鎖又は分枝鎖；C3-8 シクロアルキレン；炭素及び少なくとも一つのN、O又はS原子を環中に含む3〜8-員の環；アリーレン；ヘテロアリーレン；又はアミノ酸ビラジカル、以下の基の一以上で任意に置換されたビラジカル：H、ヒドロキシ、フェニル、フェノキシ、ベンジル、チエニル、オキソ、アミノ、C1-4-アルキル、-CONH2 、-CSNH2 、C1-4 モノアルキルアミノ、C1-4 ジアルキルアミノ、アシルアミノ、スルホニル、カルボキシ、カルボキサミド、ハロゲン、C1-6 アルコキシ、C1-6 アルキルチオ、トリフルオロアルコキシ、アルコキシカルボニル、及びハロアルキルから選択されるビラジカルである。他の態様において、前記リンカーは、50までのアミノ酸残基、例えば40、30、20又は10までのようなアミノ酸残基を含む、ポリペプチドジラジカルを表す。例えば酵素的加水分解のためのような切断サイトがリンカー中に含まれうる場合、OGP融合タンパク質をいくつかのポイントで切断することが望ましい。
【００１７】
本発明の状況において、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸の配列を示すように意図される。好ましくは、タンパク質は20よりも多いアミノ酸残基を含み、ここで該アミノ酸は、コード可能であるか又はコード可能でないものである。該用語は、他に言及しない限り、例えば新油性基又はPFG基の連結によるようなさらに誘導体化されたタンパク質をも含むことを意図するように理解されるべきである。
【００１８】
本明細書で用いるように、化合物の「治療的有効量」は、与えられた疾患及び／又はその合併症の臨床的な症状を治療し、軽減又は部分的に軽減するのに十分な量を意味する。それぞれの疾患についての有効量は、例えば、その疾患又は傷害の重篤度、ならびに治療される対象の体重、性別、年齢及び一般的な状態に依存する。適切な投与量の決定が、値のマトリックスを構築し、そのマトリックスの異なる点で試験することによる（それらはすべて熟練した医師又は獣医師の従来技術内である）日常的な実験を用いて達成されうることは理解されるであろう。
【００１９】
本明細書で用いられるように「治療（treatment）」及び「治療する（treating）」という用語は、疾患や障害のような状態と闘う目的のための、患者の管理及び／又は治療（care）を意味する。該用語は、症状又は合併症の軽減のため、疾患、障害又は状態の進行を遅らせるため、症状及び合併症を軽減又は開放するため、及び／又は疾病、障害又は状態を治療又は除去するため、ならびに、他に言及しない限り、状態の予防のため（ここにおいて予防は、疾病、状態、又は障害と闘う目的のための患者管理及び治療として理解されるべきである）の活性化合物の投与のような、患者が受けている与えられた状態の治療の完全な範囲を含み、また、症状又は合併症の発症の予防のための活性化合物の投与を含む。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトであるが、イヌ、ネコ、雌牛、羊及び豚のような動物も含んでよい。治療的措置及び予防的な（予防性の）措置は本発明の別の側面であると理解されるであろう。
【００２０】
「治療的タンパク質」という用語は、インビボ（通常は脊索動物、及び典型的には哺乳動物、例えばヒトなどの霊長類のような動物において）で一以上の治療的及び／又は生物学的活性を有するタンパク質を示すように意図される。治療的タンパク質は、疾患、状態又は障害の治療又は寛解のために有用である。治療的タンパク質の活性は最後にはインビボで及ぼされるべきであるが、治療的活性が測定できるインビトロアッセイが当該分野の技術者には多く知られている。
【発明の説明】
【００２１】
本発明は部分的に、OGP又はその変異体が例えば治療的タンパク質のようなタンパク質に融合したとき、該タンパク質が循環系における該タンパク質の循環時間を延長するという発見に基づいている。融合タンパク質におけるOGP又はその変異体がα2Mに結合する能力を維持し、また、融合タンパク質のα2Mへのこの結合が、該融合タンパク質の例えば分解又は腎クリアランスに対する感受性を少なくさせることは、何らかの特定の理論と結び付けられることを必要としていない。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、OGP又はその変異体のC-末端に融合した第1のタンパク質を含むOGP融合タンパク質を提供する。本発明は、該OGP融合タンパク質の薬学的に許容される塩を含むよう意図される。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、OGP又はその変異体のC-末端に融合した第1のタンパク質を含むOGP融合タンパク質を提供する。
【００２４】
一つの態様において、前記第1のタンパク質は、治療的なタンパク質である。さらに特定の側面において、該第1のタンパク質は、哺乳動物（例えばヒト）又は合成起源／組成物の治療的タンパク質である。
【００２５】
一つの態様において、前記第1のタンパク質は、少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【００２６】
本発明の内容において、「OGPの変異体」とは、好ましくはα2Mに結合する変異体であると理解される。「α2Mに結合する」とは、OGP変異体に融合しているタンパク質の循環時間と比較して、該融合タンパク質の循環時間の範囲が増大するように、該変異体がα2Mに結合することを意味する。結合は、次のように定義される解離定数KDの点から定量化され得る：
【数１】
2008505614.tif 000002
【００２７】
一つの態様において、OGP変異体-α2M結合のKD は、OGP-α2M結合のものと等しい。他の態様において、OGP変異体-α2M結合のKDはOGP-α2M結合のものよりも大きく、例えば、２倍まで、又は例えば５倍まで、又は例えば１０倍まで、又は例えば２０倍まで、又は例えば５０倍まで、又は例えば１００倍まで大きい。他の態様において、OGP変異体-α2M結合のKD は、OGP-α2M結合のものより小さく、OGP-α2M結合のKD の例えば90%に低下し、又は例えば80%に低下し、又は例えば70%に低下し、又は例えば50%に低下し、又は例えば20%に低下し、又は例えば10%に低下し、又は例えば1%に低下する。この内容において、解離定数(Kd)は、「Yang et al. J Biol Chem 269, 18977-18984, 1994; Murai et al J Biol Chem., 270, 19957-19993, 1995; Kawaura et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 869-876, 2003」に開示されているように測定され得る。α2Mへの結合は、他の血漿タンパク質への結合を除外する。
【００２８】
一つの態様において、OGP融合タンパク質-α2M結合の KD は、OGP-α2M結合のものと等しい。他の態様において、OGP融合タンパク質-α2M結合のKD は、OGP-α2M結合のものより大きく、例えば2倍まで、又は例えば5倍まで、又は例えば10倍まで、又は例えば20倍まで、又は例えば50倍まで、又は例えば100倍まで大きい。他の態様において、OGP融合タンパク質-α2M結合のKD は、OGP-α2M結合のものより小さく、OGP-α2M結合のKD の例えば90%まで低下し、又は例えば80%まで低下し、又は例えば70%まで低下し、又は例えば50%まで低下し、又は例えば20%まで低下し、又は例えば10%まで低下し、又は例えば1%まで低下する。
【００２９】
一つの態様において、OGP変異体は、OGP配列からの一以上のアミノ酸残基の挿入、置換、及び／又は欠失によって得られる。特に、そのような置換は典型的に、一つのアミノ酸残基が同じアミノ酸グループの他のアミノ酸残基、即ち、同じ生理化学的性質を有する他のアミノ酸残基によって置換されるという意味において保存的である。アミノ酸は、それらの性質に基づいて便宜的に以下のグループに分けられる：塩基性アミノ酸(アルギニン、リシン、ヒスチジンなど)、酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸など)、極性アミノ酸(グルタミン及びアスパラギンなど)、疎水性アミノ酸 (ロイシン、イソロイシン、バリンなど)、芳香族アミノ酸 (フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど)及び小アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニンなど)。OGP中のアミノ酸残基は、コードされない（non-codable）アミノ酸残基で置換されることもでき、これは本発明の一部を形成する。
【００３０】
一つの態様において、例えば1, 2, 3, 4又は5アミノ酸のような５までのアミノ酸が置換される。
【００３１】
一つの態様において、前記変異体は、OGPのC-末端から、例えば1, 2, 3, 4又は5アミノ酸残基のような５までのアミノ酸残基の欠失によって形成される。特に、前記変異体は、OGP(1-9)である。
【００３２】
一つの態様において、30までのアミノ酸残基で作られたリンカーが、第1のタンパク質とOGP又はその変異体の間に挿入される。特に、このリンカーは、25までのアミノ酸残基、例えば20までのアミノ酸残基、例えば15までのアミノ酸残基、例えば10までのアミノ酸残基、例えば5までのアミノ酸残基、例えば1, 2, 3又は4のアミノ酸残基で作られる。特にはOGP、OGP-OGP、OGP(1-9)及びOGP(1-9)-OGP(1-9)がリンカーとして上げられる。
【００３３】
OGPは、いくつかの帯電した残基を含み、OGP又はその変異体の第1のタンパク質への融合は、そのため、融合したタンパク質のｐｌを第1のタンパク質のものと比較して変化させる可能性がある。ｐｌがタンパク質のｐＨ−溶解性プロフィールの決定要因であるために、融合タンパク質は第1のタンパク質と異なるｐＨ-溶解性プロフィールを有しうる。得られたｐＨ-溶解性プロフィールが特定の処理に関して好ましくない場合、ｐｌはリンカーを注意深く選択することによって変化できる。適切に帯電したリンカーの選択によって、融合タンパク質のｐｌは有用な領域内に変化されることができ、例えば第1のタンパク質に対して帯電していないままにされることができる。一つの態様において、本発明はそれ故、リンカーを含む融合タンパク質を提供し、ここで該融合タンパク質は、参照タンパク質（参照タンパク質は前記リンカーなしの融合タンパク質である）と比較して変化された溶解性、例えば上昇した溶解性を有する。
【００３４】
一つの態様において、前記リンカーは前記融合タンパク質によって刺激されたいずれかの免疫学的応答を最小化するように選択される。これは、例えば人体においてすでに存在しているタンパク質配列を用いることによって達成できると考えられる。アルブミンは、そのようなタンパク質の一つの例であり、特にそのアミノ酸番号295-304からなる配列(NDEMPADLPS (配列番号34))、（これは多くの帯電した残基を含んでいる）が、有用なリンカーである。
【００３５】
一つの態様において、本発明は上記のようなOGP変異体に関する。
【００３６】
一つの態様において、本発明はタンパク質の循環時間を増大させる方法を提供する。該方法は、前記タンパク質をOGP又はその変異体のC-末端に融合させることを含む。一つの態様において、前記第1のタンパク質はサケのカルシトニンではない。
【００３７】
循環時間の増大は、クリアランス（ＣＬ）の減少かまたは平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大として定量化され得る。ＣＬが75％未満、例えば50％未満に減少し、或いはOGP又はその変異体が融合したタンパク質のＣＬ未満である本発明の融合タンパク質は、増大した循環時間を有するとされる。MRTが、OGP又はその変異体に融合したタンパク質のMRTの120％以上、例えば150％かそれ以上である本発明の融合タンパク質は、増大した循環時間を有するとされる。クリアランス及び平均滞留時間は、適切な試験動物、例えば正常な、Sprague-Dawley オスのラット、マウス又はカニクイザルを用いた標準的な薬物動態学的調査において評価されることができる。典型的には、マウス及びラットに単回皮下大量瞬時投与が注射され、一方サルは単回皮下大量瞬時投与又は単回静脈内投与で注射される。注射の量は試験動物に依存する。続いて、血液サンプルを、ＣＬ及びＭＲＴの評価に適切な１〜５日間の期間で採取する。血液サンプルはELISA技術によって便利に分析される。
【００３８】
一つの態様において、本発明は、以下から選択される融合タンパク質を提供する： OGP-hGH, (配列番号1 );
OGP(1-9)-hGH, (配列番号2 );
OGP-OGP-hGH,  (配列番号3);
OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH (配列番号4 );
OGP(1-9)-OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH (配列番号17);
OGP-OGP-OGP-hGH (配列番号18);
OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGH (配列番号19)；及び
OGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGH (配列番号20)
ここで、hGHはヒト成長ホルモンを示す。
【００３９】
一つの態様において、本発明は本発明のタンパク質をコードする核酸構築物を提供する。本発明の融合タンパク質は、多数の異なる方法において調製され得る。それらは、当該分野の技術者に周知のタンパク質合成方法を用いて合成され得る。また、OGP又はその変異体に融合されるべきタンパク質と、OGP又はOGP変異体が適切な宿主中で別々に発現され、続いてその二つのタンパク質を融合することも可能である。しかしながら、具体的な態様において、OGP融合タンパク質は、適切な核酸構築物の前記宿主への取り込みの後に、そのような適切な宿主中で発現される。
【００４０】
ここで用いられるように、「核酸構築物」という語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNA起源の任意の核酸分子を指すように意図される。「構築物」という用語は、単鎖又は二本鎖であり、また、所望のタンパク質をコードする完全な又は部分的な天然の塩基配列に基づく、核酸セグメントを指すように意図される。該構築物は、他の核酸セグメントを任意に含んでもよい。
【００４１】
本発明のタンパク質をコードする本発明の核酸構築物は、適切にはゲノム又はcDNA起源のものであり、例えば、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば Sambrook et al., supra)に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、該タンパク質の全て又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得られる。本発明の目的のために、前記タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、好ましくはヒト起源のものであり、即ち、ヒトゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーに由来するものである。特に、ＤＮＡ配列は、ヒト起源のものであり、例えば特定のヒト臓器又は細胞タイプからのｃＤＮＡ又はヒトゲノムＤＮＡに由来する遺伝子であってよい。
【００４２】
タンパク質をコードする本発明の核酸構築物は、確立された標準的な方法、例えば
「Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869」に記載されたホスホアミジト方法、或いは、「Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805」に記載された方法によって、合成的に調製されることもできる。ホスホアミジト方法に従って、オリゴヌクレオチドは例えば自動ＤＮＡ合成器で合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローン化される。
【００４３】
さらにその上、該核酸構築物は、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源（適切には）の断片をライゲーティングすることによって調製された、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びｃＤＮＡ又は混合されたゲノム及びｃＤＮＡ起源（該断片は核酸構築物全体の種々の部分に対応する）であってよい。
【００４４】
核酸構築物は、例えばUS 4,683,202又は「Saiki et al., Science 239 (1988), 487-491」に開示されているように特異的なプライマーを用いたポリメラーゼチェーンリアクションによって調製されてもよい。
【００４５】
核酸構築物は、好ましくは、もっぱら以下で用いられる用語であるＤＮＡ構築物である。
【００４６】
組換えベクター
さらなる側面において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含む組換えベクターに関する。本発明のＤＮＡ構築物が挿入される組換えベクターは、組換えＤＮＡ方法に供するのに便利な任意のベクターであってよく、ベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存する。従って、該ベクターは、自己複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製と独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。或いは、該ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってよい。
【００４７】
該ベクターは、好ましくは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要なさらなるセグメントに作動可能に結合された発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来し、或いは両方の要素を含みうる。「作動可能に連結された」という用語は、該セグメントが、例えばプロモーターにおける転写惹起及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列を通した進行などの、それらの意図された目的のために協調してそれらが機能するように配列されることを示す。
【００４８】
該プロモーターは、宿主細胞の選択において転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列であってよく、また、宿主細胞に同種性又は異種性のいずれのタンパク質をコードする遺伝子に由来するものであってよい。
【００４９】
哺乳類細胞における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写を指示するための適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864)、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809-814)又はアデノウイルス2メジャー・レート・プロモーターである。
【００５０】
昆虫細胞で用いるのに適したプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター（US 4,745,051；Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11）、P10プロモーター（J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776）、オウトグラファ・カリフォルニカ・ポリヘドロシス（Autographa californica polyhedrosis）ウイルス・ベーシック・タンパク質プロモーター（EP 397 485）、バキュロウイルス最初期（immediate early）遺伝子１プロモーター（US 5,155,037；US 5,162,222）、又はバキュロウイルス39K後発性（delayed）-初期（early）遺伝子プロモーター（US 5,155,037；US 5,162,222）である。
【００５１】
酵母宿主細胞中で用いるのに適したプロモーターの例は、酵母解糖遺伝子（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080；Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419-434)又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982) からのプロモーター、又はTPI1 (US 4,599,311)又はADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654)プロモーターを含む。
【００５２】
糸状菌宿主細胞中で用いるのに適したプロモーターの例は、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093-2099)又はtpiA プロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A.オリザエ（oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロテイナーゼ、A. ニガー天然α-アミラーゼ、A. ニガー酸安定性α-アミラーゼ、A.ニガー又はA. アワモリグルコアミラーゼ(gluA)、リゾムコル・ミエイ・リパーゼ、A. オリザエ・アルカリ性プロテアーゼ、A. オリザエ・トリオースリン酸イソメラーゼ又はA. ニデュランス（nidulans）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。TAKA-アミラーゼ及びgluAプロモーターが好ましい。
【００５３】
細菌宿主細胞において用いるのに適したプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィラス・マルトジェニック（stearothermophilus maltogenic）アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミス・アルファ-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（amyloliquefaciens）BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチルス・アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミルス・キシロシダーゼ（pumilus xylosidase）遺伝子のプロモーターを含み、或いは、ラムダファージPR 又は PL プロモーター又は大腸菌lac、trp 又はtacプロモーターによる。
【００５４】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、必要であれば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)又は(真菌宿主用)TPI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.)又はADH3 (McKnight et al., op. cit.)ターミネーターのような、適切なターミネーターに作動可能に結合されてもよい。ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナル(例えばSV40又はアデノウイルス5 Elb領域から)、転写エンハンサー配列(例えばSV40エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスVA RNAsをコードするもの）のような要素を含んでもよい。
【００５５】
本発明の組換えベクターは、さらに、該ベクターを問題の宿主細胞内で複製させることができるＤＮＡ配列を含んでもよい。そのような配列の例は、(該宿主細胞が哺乳類細胞である場合)SV40複製開始点である。
【００５６】
宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターを複製させることができる適切な配列は、酵母プラスミド 2μ 複製遺伝子 REP 1-3 及び複製開始点である。
【００５７】
宿主細胞が細菌細胞である場合、該ベクターを複製させることができる配列は、DNAポリメラーゼIII複合体コード化遺伝子及び複製開始点である。
【００５８】
また、ベクターは、選択可能マーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)又は分裂酵母ポンベ（Schizosaccharomyses pombe） TPI 遺伝子（described by P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130）をコードする遺伝子のような宿主細胞中の欠陥を補完する産物の遺伝子、或いは、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に対する抵抗性を与える産物の遺伝子を含んでよい。糸状菌のための選択可能マーカーは、amdS, pyrG, argB, niaD 及び sCを含む。
【００５９】
本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌性経路に向けるために分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる）を組換えベクター中に与えてもよい。この分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームでタンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、通常、５’がタンパク質をコードするＤＮＡ配列に配置される。分泌シグナル配列は、通常はタンパク質に結合しているか又は他の分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からのものである。
【００６０】
酵母細胞からの分泌のために、分泌シグナル配列は、発現されたタンパク質を細胞の分泌経路へ効率的に配向することを保証する任意のシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、天然のシグナルペプチドであってよく、又はその機能的部分であってよく、或いは、合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド（US 4,870,008を参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646を参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897を参照）、酵母BAR1 シグナルペプチド（WO 87/02670を参照）、又は酵母アスパラギン酸プロテアーゼ (YAP3)シグナルペプチド（M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137を参照）であることが分かっている。
【００６１】
酵母における効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列は、シグナル配列の下流及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入されてよい。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を、小胞体からゴルジ体へ、及びさらに培養培地中への分泌のための分泌性小胞へ配向されることを可能にする（即ち、細胞壁を横切り、又は少なくとも細胞膜を通る、酵母細胞の細胞膜周辺腔へのタンパク質の輸出）。リーダーペプチドは、酵母α-因子リーダー（その使用が、例えばUS 4,546,082, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544及びEP 163 529に開示されている）であってよい。或いは、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチドであってよく、即ち、天然に発見されないリーダーペプチドであってよい。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463 又はWO 92/11378に開示されているように作成され得る。
【００６２】
真菌で用いるためのシグナルペプチドは、アスペルギルス属のアミラーゼ又はグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコア・ミエイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ又はプロテアーゼ又はヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼをコードする遺伝子に由来するものが都合よい。シグナルペプチドは、好ましくはA.オリザエ（oryzae）TAKAアミラーゼ、A.ニガー（niger）天然α-アミラーゼ、A.ニガー（niger）酸安定アミラーゼ、又はA.ニガー・グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するものである。
【００６３】
昆虫細胞で用いるためのシグナルペプチドは、レピドプテラン・マンドュカ・セクタ・アヂポカイネティック（lepidopteran Manduca sexta adipokinetic）ホルモンプレカーサシグナルペプチド（US 5,023,328を参照）のような、昆虫遺伝子（WO 90/05783を参照）に由来するものが都合よい。
【００６４】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び任意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列のそれぞれをライゲートするために、また、複製に必要な情報を含有する適切なベクター中にそれらを挿入するために用いられる方法は、当業者には周知である（例えば、Sambrook et al., op.cit.を参照）。
【００６５】
宿主細胞
本発明のＤＮＡ構築物又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明のタンパク質を生産することができる任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞を含む。
【００６６】
培養において本発明のタンパク質を生産することができる細菌宿主細胞の例は、B.サブチルスの菌株、B.リケニフォルミス（licheniformis）、B.レンタス（lentus）、B.ブレビス（brevis）、B.ステアロサーモフィラス（stearothermophilus）、B.アルカロフィラス（alkalophilus）、B.アミロリグエファシエンス（amyloliquefaciens）、B.コアグランス（coagulans）、B.サーキュランス（circulans）、B.ラウタス（lautus）、B.メガセリウム（megatherium）又はB.サウリンジエンシス（thuringiensis）の菌株のような、バチルスの菌株のようなグラム陽性細菌、或いは、S.リビダンス（lividans）又はS.ムリナス（murinus）のようなストレプトマイセスの菌株、或いは大腸菌のようなグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換によって、又はそれ自体周知の方法（Sambrook et al., supraを参照）でのコンピテント細胞を用いて行うことができる。
【００６７】
大腸菌のような細菌中でタンパク質を発現する場合は、該タンパク質は細胞質内に、典型的には不溶性顆粒（封入体として知られる）として保持され、或いは、細菌分泌配列により細胞膜周辺腔に配向され得る。前者の場合は、細胞が溶解し、顆粒が回収され、タンパク質が変性剤を希釈することによって再折りたたみされた後に変性される。後者の場合は、タンパク質は、細胞膜周辺腔の含有物を放出するために、例えば超音波処理又は浸透圧衝撃によって細胞を破壊させてタンパク質を回収することによって、細胞膜周辺腔から回収される。
【００６８】
適切な哺乳類細胞株の例は、COS (ATCC CRL 1650)、BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10)、CHL (ATCC CCL39)又はCHO (ATCC CCL 61)細胞株である。哺乳類細胞の形質移入及び細胞中に導入されたＤＮＡ配列の発現のための方法は、例えば、「Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621」；「Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341」；「Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426」；「Wigler et al., Cell 14 (1978), 725」；「Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456」；及び「Neumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841-845」に開示されている。
【００６９】
適切な酵母細胞の例は、サッカロマイセス（Saccharomyces）spp.又はシゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）spp.の細胞を含み、特に、サッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）又はサッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）の株の細胞を含む。酵母細胞を異種性ＤＮＡで形質転換する方法、及びそれから異種性タンパク質を生産する方法は、例えばUS 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743、及びUS 4,845,075に開示されており、それらの全ては参照によって本明細書に援用される。形質転換細胞は、一般には薬剤耐性、又は例えばロイシンなどの特定の栄養の欠如の下での成長能力のような、選択可能マーカーによって測定された表現型によって選択される。酵母で用いるのに好ましいベクターは、US 4,931,373に開示されているPOT1ベクターである。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列及び任意に上記のようなリーダー配列に先行されてよい。適切な酵母細胞のさらなる例は、K.ラクティス（lactis）のようなクルイベロマイセス（Kluyveromyces）の株、H.ポリモルファ（polymorpha）のようなハンセヌラ（Hansenula）、或いはP.パストリス（pastoris）のようなピチア（Pichia）である（Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465；US 4,882,279を参照）。
【００７０】
他の真菌細胞の例は、糸状真菌の細胞、例えばアスペルギルス（Aspergillus）spp.、ニューロスポラ（Neurospora）spp.、フサリウム（Fusarium）spp.又はトリコデルマ（Trichoderma）spp.、特にA.オリザエ（oryzae）、A.ニデュランス（nidulans）又はA.ニガー（niger）の株である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス（Aspergillus）spp.の使用は、例えばEP 272 277 及びEP 230 023に開示されている。F.オキスポルム（oxysporum）の形質転換は、例えば、「Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156」によって開示されているように実行されてよい。
【００７１】
糸状菌を宿主細胞として用いる場合、それは本発明のＤＮＡ構築物で形質転換され、ＤＮＡ構築物を宿主染色体中に組み込むことによって都合よく組換え宿主細胞が得られる。この組み込みは、一般に、ＤＮＡ配列が細胞中でより安定に維持されやすいために有利であると考えられる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、従来の方法、例えば相同性又は異種性組換えによる方法に従って行われる。
【００７２】
昆虫細胞の形質転換及びその中における異種性タンパク質の生産は、US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397,485（そのすべてが本明細書に参照によって援用される）に開示されているように行われる。宿主として用いられる昆虫細胞株は、適切には、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞又はトリコプルシア・ニー（Trichoplusia ni）細胞のようなレピドプテラ（Lepidoptera）細胞株である（US 5,077,214を参照）。培養条件は、適切には、例えばWO 89/01029 又はWO 89/01028、又は上記参考文献の何れかに開示されているものである。
【００７３】
上記の形質転換又は形質移入された宿主細胞は、次いで、本発明のタンパク質の発現が可能な条件化で、適切な栄養培地中で培養され、その後、得られたタンパク質が培地から回収される。
【００７４】
細胞を培養するために用いられる培地は、最小培地又は適切なサプリメントを含有する複合培地のような、宿主細胞の成長に適した任意の従来の培地であってよい。適切な培地は、商業的な供給者から入手可能であり、或いは、公開された処方（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中）に従って調製することもできる。該細胞によって生産されるタンパク質は、次いで、問題のタンパク質のタイプに依存して、遠心分離又はろ過による宿主細胞の培地からの分離、例えば硫酸アンモニウムなどの塩による上清又はろ液のタンパク質成分の沈殿、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー方法による精製を含む従来の方法によって培養培地から回収される。
【００７５】
遺伝子組換え動物
本発明のタンパク質を生産するために遺伝子組換え動物技術を用いることも、本発明の範囲内のことである。遺伝子組換え動物は、そのゲノムに異種性ＤＮＡ配列が導入されたものである。特に、本発明のタンパク質は、非ヒトメス動物、特に、多量の乳を生成するとして知られる動物の乳腺において発現されうるものである。好ましい動物の例は、ヤギ、ヒツジ及びウシのような家畜であるが、マウス、ウサギ、又はラットのようなより小さい哺乳動物でも用いることができる。
【００７６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、その目的のために上記した方法の何れか一つによって動物に導入されることができる。例えば、哺乳動物の乳腺での発現を得るために、乳タンパク質遺伝子からの転写プロモーターを用いる。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン（US 5,304,489を参照）、ベータ-ラクトグロブリン、アルファ-ラクトグロブリン及び乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子を含む。現在好ましいプロモーターは、ベータ-ラクトグロブリンプロモーターである（Whitelaw et al., Biochem J. 286, 1992, pp. 31-39を参照）。
【００７７】
イントロンを欠いたＤＮＡ配列は、イントロンを含むものと比較して遺伝子組換え動物中で十分に発現されないということは、当該分野では一般に認識されていることである（Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, pp. 836-840; Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, pp. 478-482; Whitelaw et al., Transgenic Res. 1, 1991, pp. 3-13; WO 89/01343; WO 91/02318を参照）。遺伝子組換え動物中での発現のためには、それ故、可能であれば、所望のタンパク質をコードする遺伝子の全て又はその天然のイントロンのいくつかを含むゲノム配列を用いることが好ましい。例えばベータ-ラクトグロブリン遺伝子の少なくともいくつかのイントロンを含むことも好ましい。そのような領域の一つは、スプライシング及びヒツジのベータ-ラクトグロブリン遺伝子の３’非-コーディング領域からのＲＮＡポリアデニル化をイントロンに与えるＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然の３’非-コーディング配列に対して置換される場合、このセグメントは、所望のタンパク質の発現レベルを増強し安定化し得る。本発明のタンパク質の開始コドンを囲む領域を、乳タンパク質遺伝子の対応する配列で置換することも可能である。そのような置換は、増強発現のための推定上の組織特異的開始環境を提供する（putative tissue-specific initiation environment）。
【００７８】
遺伝子組換え動物における本発明のタンパク質の発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、その発現に必要なさらなるＤＮＡ配列に作動可能に連結されて、発現ユニットを生産する。そのようなさらなるＤＮＡ配列は、上記のようなプロモーター、並びに、ｍＲＮＡの転写及びポリアデニル化の終結のために用意される配列を含む。該発現ユニットは、さらに、タンパク質をコードする配列に作動可能に結合された分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む。該分泌シグナル配列は、そのタンパク質に天然のものであってよく、或いは、乳タンパク質のような他のタンパク質のものであってもよい（von Heijne et al., Nucl. Acids Res. 14, 1986, pp. 4683-4690；及びUS 4,873,316を参照）。
【００７９】
遺伝子組換え動物で用いるための発現ユニットの構築は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をさらなるＤＮＡ配列を含有するベクター中に挿入することによって行うことができるが、該発現ユニットは、必須な任の配列のライゲーションによって構成されることができる。乳タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターの提供、及び乳たんぱく質のコーディング領域を本発明のタンパク質をコーディングするＤＮＡ配列で置換することは、特に都合よく、それによって、乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む融合体を作成することができる。
【００８０】
次いで、発現ユニットを、選択された宿主種の受精卵又は初期胚中に導入する。異種性ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション(US 4,873,191を参照)、レトロウイルス感染(Jaenisch, Science 240, 1988, pp. 1468-1474を参照)又は胚幹細胞を用いた部位特異的な組込み(Bradley et al., Bio/Technology 10, 1992, pp. 534-539により概説されている)を含む多くの方法において実行されることができる。卵は次いで、偽妊娠のメスの卵管又は子宮に移植されて一定期間発育される。それらの生殖系列中に導入されたＤＮＡを保持する子孫は、それらの子孫に該ＤＮＡを継代することができ、遺伝子組換え家畜の発展を可能にする。
【００８１】
遺伝子組換え動物を生成する一般的な方法は、当該分野で周知であり、例えば、「Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986」；「Simons et al., Bio/Technology 6, 1988, pp. 179-183」；「Wall et al., Biol. Reprod. 32, 1985, pp. 645-651」；「Buhler et al., Bio/Technology 8, 1990, pp. 140-143」；「Ebert et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988」；「Krimpenfort et al., Bio/Tecnology 9: 844-847, 1991, Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992」；US 4,873,191、US 4,873,316；WO 88/00239、WO 90/05188；WO 92/11757及びGB 87/00458を参照されたい。異種性ＤＮＡ配列を哺乳類及びその胚細胞に導入する技術は、もともとマウスで発達した。例えば、「Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980, Gordon and Ruddle, Science 214: 1244-1246, 1981」；「Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345, 1985」；「Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985」；及び「Hogan et al. (ibid.)」を参照されたい。これらの技術は、続いて家畜種を含むより大きな動物で用いるように適応された（例えば、WO 88/00239, WO 90/01588及びWO 92/11757；及びSimons et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988を参照されたい）。概要を述べると、遺伝子組換えマウス又は家畜の発生において現在まで使用されている最も効率的な経路において、所望のＤＮＡの数百の直線的な分子（linear molecules）が、当該分野で標準的になった技術にしたがって受精卵の前核の一つの中へ注入される。接合体の細胞質へのＤＮＡの注入も使用されることができる。
【００８２】
他の態様において、OGP又はその変異体と融合されるタンパク質及びOGP又はその変異体は、別々に発現される。上記タンパク質は、次いで、二機能性リンカーと反応し（活性化）、該リンカーは第1の官能基を介して該タンパク質に結合する。活性化されたタンパク質は、続いて、OGP又はその変異体と反応され、OGP又はその変異体はその第二の官能基を介してリンカーと結合される。反応の順序が逆転してよく、最初にリンカーがOGP又はその変異体と反応され、続いて融合されるタンパク質と反応されてもよいことは、当業者には明らかである。
【００８３】
タンパク質とリンカーの間の結合を形成するのに有用な多くの官能基が、文献に開示されている。関連する参考文献は、例えば、WO 03/044056 及び「Biomaterials, 22, 405-417, 2001」である。典型的に、結合の有用な点であるタンパク質中の基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、アルデヒド及びケトンであり、それは天然のタンパク質中に存在しうるものであり、又は、例えば酸化によって生じうる。OGP又はその変異体に融合されるタンパク質及びOGP又はその変異体がリンカーを介して融合される場合、リンカーは、OGP又はその変異体に融合されるタンパク質の任意のアミノ酸残基と原理的には結合し得る。
【００８４】
OGP又はその変異体に融合されるタンパク質は、さらに、例えば、親油性基又はＰＥＧ基の結合によって誘導体化されてさらに性質を改変されてもよい。また、OGP又はその変異体に融合された上で、得られた融合タンパク質は、さらに、例えば、親油性基又はＰＥＧ基の結合によって誘導体化されて融合タンパク質の性質をさらに改変されてもよい。任意のタンパク質が、原理的には、本発明の方法に従ってOGP又はOGP変異体に融合されてよい。そのようなタンパク質は、酵素、ペプチドホルモン、成長因子、抗体、サイトカイン、受容体、リンフォカイン、及びワクチン抗原、並びに、特に言及されるのは、治療的タンパク質、例えばインスリン、グルカゴン様ペプチド1 (GLP-1)、グルカゴン様ペプチド2 (GLP-2)、成長ホルモン、サイトカイン、トレフォイル因子ペプチド(TTF)、ペプチドメラノコルチン受容体修飾因子、IL-20、IL-21、IL-28a、IL-29、IL-31及びVII因子化合物を含む。一つの態様において、本発明は、OGP融合タンパク質、続くOGP又はOGP変異体がさらに、例えば親油性基によって誘導体化されてタンパク質の性質のさらなる改変を得ることに関連する。
【００８５】
特に適用可能なインスリンは、ヒトインスリンである。本発明の内容において、「ヒトインスリン」という用語は、天然に生じたインスリン又は組替え的に生成されたインスリンを称する。組換えヒトインスリンは、任意の適切な宿主細胞において生成されることができ、例えば、宿主細胞は細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物又は植物の細胞であってよい。多くのインスリン化合物が、文献に開示されており、それらもまた本発明の方法において特に有用である。「インスリン化合物」（及び関連する表現）は、一以上のアミノ酸が、欠失及び／又はコード化されないアミノ酸を含む他のアミノ酸で置換されたヒトインスリン、及び／又は追加のアミノ酸を含むヒトインスリン、即ち、５１より多いアミノ酸のヒトインスリン、及び／又は少なくとも一つの有機置換基がアミノ酸の一以上に結合したヒトインスリンを意味する。
【００８６】
本発明の方法に適用可能なGLP-1の例は、ヒトGLP-1及びGLP-1化合物を含む。ヒトGLP-1は、回腸末端、膵臓及び脳におけるＬ-細胞において動脈内で合成された、プレプログルカゴンから生ずる37アミノ酸残基ペプチドである。GLP-1は、糖代謝及び消化管の分泌及び代謝において調節機能を有する重要な腸ホルモンである。GLP-1(7-36)-アミドを与えるプレプログルカゴンの処理において、GLP-1(7-37)及びGLP-2は主にＬ−細胞中に生じる。GLP-1(7-36)-アミド及びGLP-1(7-37)の断片は、いずれもグルコース依存性インスリン分泌性剤である。過去数十年の間、GLP-1の多くの構造類似体がアメリカドクトカゲの毒液から単離された(Heloderma suspectum and Heloderma horridum)。エクセンディン（Exendin ）-4は、ドクトカゲ属ホリダム（Heloderma horridum）の毒液から単離された39アミノ酸残基のペプチドであり、このペプチドは、GLP-1と52％の相同性を共有する。エクセンディン-4は、インスリン放出を刺激することが示されている強力なGLP-1受容体アゴニストであり、イヌに注射したとき、血中グルコースレベルの低下を確実にする。GLP-1(1-37)及びエクセンディン-4(1-39)及びある種の断片、それらの類似体及び誘導体のグループ（ここでは、GLP-1化合物と称する）は、強力なインスリン分泌性剤であり、それらは全て本発明の方法に適用可能である。GLP-1(1-37)のインスリン分泌性断片は、その全配列がGLP-1(1-37)の配列中に見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失した、インスリン分泌性ペプチドである。GLP-1(1-37)のインスリン分泌性断片の例は、GLP-1(1-37)の位置１〜６のアミノ酸残基が欠失したGLP-1(7-37)、及びGLP-1(1-37)の位置1-6 及び37のアミノ酸残基が欠失したGLP-1(7-36)である。エクセンディン-4(1-39)のインスリン分泌性断片の例は、エクセンディン-4(1-38)及びエクセンディン-4(1-31)である。化合物のインスリン分泌性性質は、当該分野で周知のインビボ又はインビトロアッセイによって測定することができる。
【００８７】
例えば、該化合物が動物に投与され、そして時間経過によるインスリン濃度がモニタリングされる。GLP-1(1-37)及びエクセンディン-4(1-39)のインスリン分泌性類似体は、一以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で交換され、及び／又は、一以上のアミノ酸残基が欠失され、及び／又は一以上のアミノ酸残基が挿入された、それぞれの分子を指すが、但し、前記類似体はいずれもインスリン分泌性であるか又はインスリン分泌性化合物のプロドラッグである。
【００８８】
GLP-2及びGLP-2化合物は、本発明によって提供される方法により改変されてもよい。本発明の内容において、GLP-2化合物は、GLP-2 受容体に、好ましくは1 μM未満、例えば100 nM未満の親和性定数(KD) 又は力価(EC50)で結合する。「GLP-2化合物」という用語は、一以上のアミノ酸残基が欠失及び／又は天然又は非天然の他のアミノ酸残基によって置換されたヒトGLP-2、及び／又は追加のアミノ酸残基を含むヒトGLP-2、及び／又は少なくとも一つの有機置換基が一以上のアミノ酸残基に結合したヒトGLP-2を示すように意図される。特に、アミノ酸配列が、ヒトGLP-2のアミノ酸配列の60％より多い33の連続したアミノ酸の任意の配列を示すペプチドが考慮される。また、４までのアミノ酸がアミノ酸配列から欠失した場合、アミノ酸配列が、ヒトGLP-2のアミノ酸配列の60％より多い37の連続したアミノ酸の任意の配列を示すペプチドが考慮される。また、２つのアミノ酸がそれらのアミノ酸配列に追加された場合、アミノ酸配列が、GLP-2のアミノ酸配列の60％より多い31の連続したアミノ酸の任意の配列を示すペプチドが考慮される。また、「GLP化合物」という用語は、一つの個体と他とから存在し生じる天然の対立遺伝子変異体を含む。また、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択された宿主細胞と該宿主細胞の環境の性質に依存して変化する。本発明に従って使用できるGLP-2化合物の候補は、WO 96/32414、WO 97/39031、WO 98/03547、WO 96/29342、WO 97/31943、WO 98/08872（それらは全て参照によって本明細書に援用される）に記載されているGLP-2化合物を含む。
【００８９】
本発明の方法において適用可能なVII因子化合物は、野生型VII因子（即ち、米国特許第4,784,950に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド)、並びに野生型VII因子と比較して実質的に同じか又は改変された生物学的活性を示すVII因子変異体、VII因子関連ポリペプチド並びにVII因子誘導体及びVII因子接合体を包含する。「VII因子化合物」という用語は、未切断（チモーゲン）形態にあるVII因子ポリペプチド、並びにタンパク分解的に処理されてそれぞれの生理活性形態（これはVIIa因子と称される）を産するものを包含する。典型的には、VII因子は、152と153の残基の間で切断されてVIIa因子を産する。そのようなVII因子の変異体は、安定性、リン脂質結合、変化した比活性などを含め、ヒトVII因子と比較して異なる性質を示しうる。
【００９０】
本明細書におけるように、「VII因子関連ポリペプチド」は、VIIa因子生物学的活性が野生型VIIa因子の活性と比較して実質的に改変されたか又は減少された変異体を含むポリペプチドを包含する。それらのポリペプチドは、これらに限定されないが、ポリペプチドの生理活性を改変するか乱す特異的アミノ酸配列変化が導入されたVII因子又はVIIa因子を含む。
【００９１】
ここで用いられるように、「VII因子誘導体」という用語は、野生型VII因子、野生型VII因子と比較して実質的に同じか又は改変された生物学的活性を示すVII因子の変異体及び、親ペプチドの一以上のアミノ酸が化学的に修飾され、例えばアルキル化、PEG化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって修飾された、VII因子関連ポリペプチドを称するように意図される。これは、これらに限定されないが、PEG化ヒトVIIa因子、システイン-PEG化ヒトVIIa因子及びそれらの変異体を含む。
【００９２】
「PEG化（PEGylated）ヒトVIIa因子」という用語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに接合したPEG分子を有する、ヒトVIIa因子を意味する。PEG分子が、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖部分を含むVIIa因子ポリペプチドの任意の部分に結合可能であることは理解されるであろう。「システイン-PEG化ヒトVIIa因子」という用語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に接合したPEG分子を有するVIIa因子を意味する。
【００９３】
血液凝固におけるVIIa因子の生物学的活性は、(i) 組織因子(TF)に結合する能力、及び(ii) IX因子又はX因子をタンパク分解的に切断して、活性化されたIX因子又はX因子 (それぞれ、IXa因子又はXa因子)の生成を触媒するその能力に由来する。本発明の目的のために、VIIa因子の生物学的活性は、例えば米国特許第5,997,864に開示されているように、VII因子欠損血漿及びトロンボプラスチンを用いて、血液凝固を促進させる製剤の脳職を測定することによって定量化することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロールサンプルと比較した凝固時間の減少として表現され、1 unit/mlのVII因子活性を含むプールされたヒト血清標準と比較することによって「VII因子ユニット」に変換される。或いは、VIIa因子の生物学的活性は、(i) 脂質膜に包埋されたＴＦ及びX因子を含む系において、Xa因子を生成するVIIa因子の能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)； (ii) 水系においてX因子加水分解を測定すること； (iii) 表面プラスモン共鳴に基づく機器を用いてTFへの物理的結合を測定すること(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) ；及び (iv) 合成基質の加水分解を測定すること；によって定量化され得る。
【００９４】
野生型VIIa因子と比較して実質的に同じであるか又は改変された生物学的活性を有するVII因子変異体は、上記のような凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はTF結合アッセイの一以上で試験した場合に、同じ細胞タイプで生成されたVIIa因子の比活性の少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%及び最も好ましくは少なくとも約90%を示すものを包含する。野生型VIIa因子と比較して実質的に減少した生物学的活性を示すVII因子変異体は、上記のような凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はTF結合アッセイの一以上で試験した場合に、同じ細胞タイプで生成された野生型VIIa因子の比活性の約25%より低く、好ましくは約10%より低く、より好ましくは約5%より低く、最も好ましくは約1%より低い比活性を示すものである。野生型VII因子と比較して実質的に改変された生物学的活性を有するVII因子変異体は、これらに限定されないが、ＴＦ−非依存的X因子タンパク分解活性を示すVII因子変異体及びＴＦに結合するがＸ因子を切断しないものを含む。
【００９５】
VII因子の変異体は、野生型VII因子と比較して実質的に同じであるか又はよりよい生理活性を示すか、或いは、野生型VII因子と比較して実質的に改変されたか又は減少された生理活性を示すかに関わらず、これらに限定されないが、一以上のアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって野生型VII因子の配列と相違するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００９６】
「変異体」という用語は、本明細書において用いられているように、親タンパク質の一以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、及び／又は親タンパク質の一以上のアミノ酸が欠失され、及び／又はタンパク質中に一以上のアミノ酸が挿入され、及び／又は一以上のアミノ酸が親タンパク質に付加された、野生型VII因子の配列を有するVII因子を称するように意図される。そのような付加は、親タンパク質のＮ-末端又はC-末端の何れか又は両方において生じうる。この定義の範囲内の「変異体」は、その活性化形態においてFVII活性をなお有している。一つの態様において、変異体は野生型VII因子の配列と70％同一である。一つの態様において、変異体は野生型VII因子の配列と80 %同一である。他の態様において、変異体は野生型VII因子の配列と90 %同一である。さらなる態様において、変異体は野生型VII因子の配列と95 %同一である。
【００９７】
本発明の方法において適用可能な成長ホルモンは、配列及び特徴が例えば「Hormone Drugs, Gueriguian, U.S.P. Covention, Rockvill, 1982」に定義された、ヒト成長ホルモン(hGH)、及び成長ホルモン化合物を含む。「成長ホルモン化合物」という用語は、一以上のアミノ酸残基が欠失、及び／又は他のアミノ酸残基（天然又は非天然の）で置換されたヒト成長ホルモン（hGH）、及び／又は、付加アミノ酸残基（天然又は非天然の）を含むhGH、及び／又は少なくとも一つの有機置換基が一以上の有機置換基に結合したhGHを示すように意図される。特に言及されるべきは、191天然アミノ酸配列（ソマトロピン）及び192アミノ酸Ｎ-末端メチオニン種（ソマトレン(somatrem)）である。本発明の方法を用いて改変されることができるサイトカインの例は、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン、INF-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、インターロイキン-1β(IL-1-β)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-24、IL-28a、IL-29、IL-31、グラノライト（grannolyte）コロニー-刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、及びケモキネシス、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質-1 (MIP-1) ガンマインターフェロン誘導性タンパク質及びIFNγ(MIG)によって誘導されたモノカインを含む。
【００９８】
本発明の方法において適用可能なIL-19の具体的な例は、WO 98/08870 (Human Genome Science)（参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。
【００９９】
適用可能なIL-20の具体的な例は、WO 99/27103 (Zymogenetics)（参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。本発明の内容において、IL-20はIL-20自体及びその断片並びにIL-20又はその断片に少なくとも90％同一であるポリペプチドを示すように意図される。
【０１００】
本発明の方法において適用可能なIL-21の例は、WO 00/53761 (Zymogenetics) （参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。
【０１０１】
本発明の方法において適用可能なIL-28aの例は、WO 02/92762 及び WO 02/86087 （いずれも参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。
【０１０２】
本発明の方法において適用可能なIL-29の例は、WO 02/02627 及び WO 02/092762 （いずれも参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。
【０１０３】
本発明の方法において適用可能なIL-31の例は、WO 02/03/060090（参照によって本明細書に援用される）に開示されているものを含む。
【０１０４】
TTFは本発明の方法において適用可能である。TTFペプチドは、主に消化管と関連することが知られているペプチドファミリーである。特に言及されるべきは、乳がん関連pS2ペプチド(TFF-1)（これはヒト、マウス、ラットに知られている）、スパスモリティカル（spasmolytical）ポリペプチド(TFF-2)（これはヒト、ブタ、ラット及びマウスで知られている）、及び腸トレフォイル因子(TFF-3)（ヒト、ラット、及びマウスで知られている）である。
【０１０５】
本発明の方法において適用可能なTFFファミリーの他のペプチドは、WO 02/46226 (Novo Nordisk)（参照によって本明細書に含まれる）に開示されたものを含む。
【０１０６】
TFFファミリーの他のペプチドは、WO 96/06861 (Novo Nordisk) （参照によって本明細書に含まれる）に開示されたTFF-1及びTFF-3ダイマーを含む。
【０１０７】
メラノコルチン（melanorcortin）受容体はいくつか知られており、本発明の方法に適用可能なペプチドで特に言及すべきは、メラノコルチン-4受容体GLP-1アゴニストであり、これは食欲抑制効果を有すると知られている。特に言及すべきペプチド又はタンパク質は、以下の特許公報（すべて参照によって本明細書に援用される）に開示されている：US 6,054,556 (Hruby)、WO 00/05263 (William Harvey Research)、WO 00/35952 (Melacure)、WO 00/35952 (Melacure)、WO 00/58361 (Procter & Gamble)、WO 01/52880 (Merck)、WO 02/26774 (Procter ＆ Gamble)、WO 03/06620 (Palatin)、WO 98/27113 (Rudolf Magnus Institute) 及び WO 99/21571 (Trega)。
【０１０８】
本発明の方法に適用可能な、他のクラスのペプチド又はタンパク質は酵素を含む。多くの酵素が、種々の工業的な目的のために用いられ、特に言及されるべきは、加水分解酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、エステラーゼ）、酸化還元酵素（ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ（peroxidaxes）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、リポキシゲナーゼ）、転移酵素及び異性化酵素である。
【０１０９】
本発明の方法に適用可能な他のペプチド又はタンパク質は、ACTH、コルチコトロピン放出因子、アンジオテンシン、カルシトニン、グルカゴン、IGF-1、IGF-2、エンテロガストリン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、上皮細胞成長因子、セクレチン、神経成長因子、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポイエチン、エリスロポイエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド（opiods）及びその類似体、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ（deaminase）、アデノシンデアミナーゼ及びリボヌクレアーゼを含む。
【０１１０】
インスリンは、糖尿病の治療又は予防に用いられ、一つの態様において、本発明は１型又は２型の糖尿病の治療方法を提供し、該方法は、本発明のインスリン又はインスリン化合物を含むOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１１１】
他の態様において、本発明は、１型又は２型の糖尿病の治療に用いる薬剤の製造における、本発明のインスリン又はインスリン化合物を含むOGP融合タンパク質の使用を提供する。
【０１１２】
GLP-1は、高血糖、２型糖尿病、糖耐性障害、１型糖尿病、肥満症、高血圧症、Xシンドローム、異脂肪血症、β-細胞アポトーシス、β-細胞欠乏、炎症性腸シンドローム、消化不良、認知障害（cognitive disorders）、例えば認知亢進（cognitive enhancing）、神経保護、アテローム性動脈硬化症（atheroschlerosis）、冠状動脈の心疾患及び他の心血管性障害の治療において使用され得る。一つの態様において、本発明は、前記疾患を治療する方法を提供し、該方法は、本発明に従うGLP-1又はGLP-1化合物を含有するOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１１３】
他の態様において、本発明は、上記疾患の治療に用いられる薬剤の製造における、本発明に従うGLP-1又はGLP-1化合物を含有するOGP融合タンパク質の使用を提供する。
【０１１４】
GLP-2は、腸における栄養の吸収不良をもたらす腸不全の治療において用いることができ、特に、GLP-2は、小腸症候群、炎症性腸症候群、クローン病、colitis including コラーゲン大腸炎、放射線大腸炎、照射後萎縮症、非熱帯性（グルテン不耐性）及び熱帯性下痢、血管閉塞又は外傷後の損傷組織、観光客の下痢、脱水症、菌血症、敗血症、拒食症、化学療法後の損傷組織、早産児、強皮症（schleroderma）、萎縮性胃炎、幽門洞切除術後萎縮性胃炎及びヘリコバクターピロリ性胃炎を含む胃炎、潰瘍、腸炎、盲嚢（cul-de-sac）、リンパ閉塞、血管性疾患及び移植片対宿主、外科的方法後の治癒、放射後萎縮症及び化学療法、及び骨粗鬆症の治療において用いることができる。本発明が上記疾患の治療の方法を提供することを内包することから、該方法は、本発明のGLP-2又はGLP-2化合物を含むOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１１５】
他の態様において、本発明は、上記疾患の治療において用いられる薬剤の製造における、本発明のGLP-2又はGLP-2接合体を含むOGP融合タンパク質の使用を提供する。
【０１１６】
成長ホルモンは、循環している成長ホルモンの量を上昇させることが有益である疾患又は状態の治療において用いられる。特に、本発明は、成長ホルモン欠損症(GHD)；ターナー症候群；プラダーウィリー症候群(PWS)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎疾患、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、小児が受けたHAART治療(HIV/HALS小児)におけるHIV-感染；短い在胎期間(SGA)で出産された小児（short children）；極低出生体重(VLBW)ではあるがSGAではなく出産された小児の低身長；骨系統疾患；軟骨低形成症；軟骨無形成症；特発性低身長症(ISS)；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、手骨（matacarpea）、足骨（matatarsea）、及び指のような、長骨中におけるか又はその骨折; スカル（scull）、手の基部、及び食物の基部のような、海綿質骨（spongious bones）内又は海綿質骨の骨折; 例えば手、膝、又は肩部における腱又は靭帯手術後の患者; 骨形成伸延を有するか又はそうしている患者; 臀部又は円板の置換術、半月板修復、脊髄性癒合又は膝、臀部、肩部、肘、手首又は下顎におけるような人工関節固定法の後の患者; 爪、らせん及び板状のような、骨接合物質が固定された患者; 骨折の非-癒合又は多（mal）-癒合の患者; 例えば脛骨又は足の第一指からの骨切り術（osteatomia）後の患者；移植片埋め込み後の患者；外傷又は関節炎に起因する、膝の関節軟骨の変性；ターナー症候群を伴う患者における骨粗鬆症；男性の骨粗鬆症；慢性透析(APCD)における成人患者；APCDにおける多栄養性（malnutritional）関連循環器病；APCDにおける悪液質の逆転；APCDにおける癌；APCDにおける慢性抽出肺疾患；APCDにおけるHIV；APCDを伴う高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；障害性肝機能；HIVに感染した男性；短小腸症候群；中心性の肥満症；HIV-関連 脂肪異栄養症候群(HALS)；男性不妊；待期的大手術後の患者、アルコール/薬物の解毒又は神経性外傷；老化；要介護老人；骨-関節炎；外傷性傷害性軟骨；勃起機能障害；線維筋痛；記憶障害；うつ病；外傷性脳傷害；クモ膜下出血；極低出生体重；メタボリックシンドローム；糖質コルチコイド筋障害；又は、子供時代のグルココルチコイド治療に起因する低身長の治療のための方法を提供し、該方法は、本発明の成長ホルモン又は成長ホルモン化合物を含むOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする患者に投与することを含む。
【０１１７】
一つの側面において、本発明は、筋組織、神経組織又は創傷の治癒を促進する方法；損傷組織への血流を促進又は改善する方法；又は損傷組織における感染の割合を減少させる方法を提供し、該方法は、本発明の成長ホルモン又は成長ホルモン化合物を含むOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする患者に投与することを含む。
【０１１８】
一つの態様において、本発明は、上記の疾患のような、成長ホルモン血漿レベルの上昇が有益である疾患の治療のための薬剤の製造における、本発明の成長ホルモン又は成長ホルモン化合物を含むOGP融合タンパク胃の使用に関する。
【０１１９】
サイトカインは、免疫システムに関わる宿主の疾患の原因に結び付けられる。特に、IL-20は乾癬及びその治療に関与することができ、I-21は癌に関与し、この疾患の治療の構成要素となりうると考えられている。一つの態様において、本発明は、例えば本発明に従うIL-20接合体を含むような、OGP融合タンパク質の投与を含む乾癬の治療方法を提供する。他の態様において、本発明は、乾癬の治療において用いられる薬剤の製造における本発明のIL-20を含有するOGP融合タンパク質の使用に関する。
【０１２０】
他の態様において、本発明は、癌の治療方法に関し、該方法は、本発明のIL-21接合体を含むOGP融合タンパク質を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１２１】
他の態様において、本発明は、癌の治療に用いられる薬剤の製造における、本発明のIL-21を含有するOGP融合タンパク質の使用に関する。
【０１２２】
TTFペプチドは、被検者の粘膜（musucus）層の粘度を上昇させるため、例えばサルビア分泌の上昇が照射治療、抗コリン作用薬による治療、又はシェーグレン症候群に起因するものの場合にサルビアの分泌を減少させるため、アレルギー性鼻炎、外傷、ショック、大手術、腎疾患又は肝疾患、ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン、ステロイド又はアルコールによる治療に二次的なストレス誘導性胃潰瘍の治療のために用いられうる。TTFペプチドは、クローン病、潰瘍性結腸炎、乾性角結膜炎、慢性膀胱感染、腸膀胱炎、乳頭腫及び膀胱癌の治療のためにも用いられる。一つの態様において、本発明は、上記の疾患又は状態を治療する方法に関し、該方法は、本発明に従うTTFを含有するOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検患者に投与することを含む。
【０１２３】
他の態様において、本発明は、上記疾患又は状態の治療のための薬剤の製造における、本発明のTTFを含有するOGP融合タンパク質の使用に関する。
【０１２４】
メラノコルチン受容体修飾因子、及び特に、メラノコルチン4受容体アゴニストは、肥満症及び関連疾患の治療及び予防に関連している。一つの態様において、本発明は、糖耐性障害(IGT)の非インスリン要求性２型糖尿病への進行を予防又は遅延させる方法、非インスリン要求性２型糖尿病のインスリン要求性糖尿病への進行を予防又は遅延させる方法、肥満症を治療する方法及び食欲を制御する方法を提供する。メラノコルチン４受容体アゴニストは、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、糖尿病、2型糖尿病、耐糖障害(IGT)、異脂肪血症、冠状動脈心疾患、胆嚢疾患、胆石、骨関節炎、癌、性的機能不全及び早死のリスクから選択される疾患の治療にも関係する。一つの態様において、本発明は、このように、上記疾患又は状態の治療の方法を提供し、該方法は、本発明のメラノコルチン４受容体アゴニストを含むOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１２５】
さらに他の態様において、本発明は、上記疾患又は状態の治療のための薬剤の製造における、本発明のメラノコルチン４受容体アゴニストを含むOGP融合タンパク質の使用に関する。
【０１２６】
VII因子化合物は、凝固に関連する疾患の治療に関し、VII因子化合物の生物学的活性は、特に、血友病者、VIII因子及びIX因子に対する阻害を有する血友病者、血小板減少症の患者、グランツマン血小板無力症  血小板放出欠損及び貯蔵プール（strorage pool）欠損のような血小板病の患者、フォンウィルブランド病の患者、肝疾患及び外傷又は手術に伴う出血問題を有する患者の治療に関連する。生物学的に不活性なVII因子化合物は、敗血症、深静脈血栓症の患者のような凝固性亢進状態にある患者、心筋感染又は血栓性脳卒中のリスクのある患者、肺塞栓症、急性冠状動脈症候群の患者、冠状動脈心疾患（cardiac）を起こしている患者の治療、心臓性事象及び血管形成術を受けている患者に対する再狭窄の予防に関連する。一つの態様において、本発明は、上記疾患又は状態を治療する方法を提供し、該方法は、本発明のVII因子化合物を含有するOGP融合タンパク質の治療的有効量を、それらを必要とする被検者に投与することを含む。
【０１２７】
他の態様において、本発明は、上記疾患又は状態の治療において用いられる薬剤の製造における、本発明のVII因子化合物を含有するOGP融合タンパク質の使用を提供する。
【０１２８】
多くの疾患が、治療で二以上の薬剤を同時に投与されるか又は連続的に投与されるかして用いて治療される。それ故、上記の疾患の一つの治療のための治療方法において、本発明のペプチド接合体を、該疾患の治療に通常用いられる他の一以上の治療的活性化合物と組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。同様に、本発明のペプチド接合体を、前記疾患のための薬剤の製造において上記疾患の一つの治療において通常用いられる他の治療的活性化合物と組み合わせて用いることは、本発明の範囲内である。
【０１２９】
上記治療方法は、経口、直腸、経鼻、肺、局所的(頬側、舌下を含む)、経皮、大槽内、腹腔内、膣、非経口的(皮下、筋肉内、くも膜下腔内、静脈内及び皮内を含む)経路のような任意の適切な経路を介した投与を含み、非経口的経路が好ましい。
【０１３０】
典型的な非経口的な投与量は、各投与につき10-9 mg/kg体重から約100 mg/kg体重の範囲である。典型的な投与量は、各投与につき、約0.0000001〜約10 mg/kg体重である。正確な投与量は、例えば化合物の活性、投与の頻度及び様式、性別、年齢及び治療を受ける対象の一般的な状態、治療されるべき疾患又は状態の性質及び重篤度、治療の望まれる効果、及び当該分野の技術者には明らかである他の要因に依存する。
【０１３１】
典型的な投与頻度は、１日２回、１日１回、２日に1回（bi-daily）、週に２回、週に１回又はより長い投与間隔である。本発明の融合タンパク質の半減期が延長されているために、週に２回、週に1回、又はより長い期間の間隔のような、長い投与間隔による投与措置は、本発明のある特定の態様である。
【０１３２】
薬学的組成物
本発明の他の目的は、10-15 mg/ml〜200 mg/ml、例えば10-10 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在するOGP融合タンパク質化合物を含有する薬学的製剤を提供することであり、ここで、該製剤は、2.0〜10.0のｐＨを有する。該製剤は、さらに、バッファー系、保存剤、張度剤（tonicity agent）、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤を含んでよい。本発明の一つの態様において、該薬学的製剤は、水性製剤である、即ち、水を含有する製剤である。そのような製剤は、典型的には、溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる態様において、該薬学的製剤は、水溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも50 %w/w の水を含有する製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも50 %w/w の水を含有する溶液として定義され、また、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50 %w/w の水を含有する懸濁液として定義される。
【０１３３】
他の態様において、該薬学的製剤は凍結乾燥製剤であり、使用の前に医師又は患者が溶媒及び／又は希釈液を添加するものである。
【０１３４】
他の態様において、該薬学的製剤は、先に溶解することなしに使用の用意ができる乾燥製剤形態（例えば凍結乾燥又はスプレー乾燥された）である。
【０１３５】
さらなる側面において、本発明は、OGP融合タンパク質の水溶液、及びバッファーを含む薬学的製剤であり、前記OGPタンパク質は、0.1-100 mg/mlの濃度で存在し、ここで前記製剤は、約2.0〜約10.0のｐＨを有する。
【０１３６】
本発明の他の態様において、該製剤のｐＨは、以下から成る一覧から選択される：2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9及び10.0。
【０１３７】
本発明のさらなる態様において、前記バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン,リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン（bicine）、トリシン（tricine）、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物からなる群から選択される。それらの具体的なバッファーはそれぞれ、本発明の代替の態様を構成する。
【０１３８】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらに、薬学的に許容される保存剤を含む。本発明のさらなる態様において、該保存剤は、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、 p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシベンゾエート、プロピルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾエート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサル（thiomerosal）、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア（imidurea）、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシベンゾエート、ベンゼトニウムクロリド、クロロフェネシン(3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択される。本発明のさらなる態様において、該保存剤は、0.1 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該保存剤は、0.1 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該保存剤は、5 mg/ml〜10 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該保存剤は、10 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。それらの具体的な保存剤はそれぞれ、本発明の代替の態様を構成する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者には周知である。便宜的には「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000」が参考にされる。
【０１３９】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらに等張剤を含む。本発明の皿夏態様において、該等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又はそれらの混合物から成る群から選択される。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性のスターチ、ヒドロキシエチルスターチ及びカルボキシメチルセルロース-Naを含む、モノ-、ジ-、又はポリサッカリド、又は水溶性グルカンのような任意の糖を用いることができる。一つの態様において、該糖添加物はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一つの--OH 基を有するC4-C8炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一つの態様において、該糖アルコール添加物はマンニトールである。上記の糖又は糖アルコールは、個別に又は組み合わせて用いることができる。該糖又は糖アルコールが、液体製剤中に溶解する限り、及び、本発明の方法を用いて達成される安定化効果に不利に影響しない限り、用いる量に固定された制限はない。一つの態様において、該糖又は糖アルコールの濃度は、約1 mg/ml〜約150 mg/mlである。本発明のさらなる態様において、該等張剤は、1 mg/ml〜50 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該等張剤は、1 mg/ml〜7 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該等張剤は8 mg/ml〜24 mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該等張剤は、25 mg/ml〜50 mg/mlの濃度で存在する。それらの具体的な等張剤はそれぞれ、本発明の代替の態様を構成する。薬学的組成物における等張剤の使用は、当業者には周知である。便宜的には「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000」が参考にされる。
【０１４０】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらにキレート剤を含む。本発明のさらなる態様において、該キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択される。本発明のさらなる態様において、該キレート剤は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該キレート剤は、0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度で存在する。本発明のさらなる態様において、該キレート剤は、2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。それらの具体的なキレート剤はそれぞれ、本発明の代替の態様を構成する。薬学的組成物におけるキレート剤の使用は、当業者には周知である。便宜的には「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000」が参考にされる。
【０１４１】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらに安定化剤を含む。薬学的組成物における安定化剤の使用は、当業者には周知である。便宜的には「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000」が参考にされる。
【０１４２】
さらに特に、本発明の組成物はその治療的活性成分が、液体薬学的製剤での貯蔵の間に凝集形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む安定化された液体薬学的組成物である。「凝集体形成」は、オリゴマーの形成をもたらすポリペプチド分子間の物理的な相互作用を意図するものであり、可溶性のままであるか、又は溶液から沈殿する巨大な可視凝集体であり得る。「貯蔵の間」とは、一旦調製された液体薬学的組成物又は製剤が、直ちに被検者に投与されないことを意図する。むしろ、調製に続いて、液体形態であるか又は凍結状態の何れかで、或いは、後に液体形態又は他の被検者への投与に適する形態に再構築される乾燥形態で、貯蔵のためにパッケージに入れられる。「乾燥形態」とは、液体薬学的組成物又は製剤が、凍結乾燥(dried form)（即ち、凍結乾燥(lyophilization)；例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照）、スプレー乾燥（Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照）、又はエアドライ（Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53）の何れかにより乾燥されることを意図する。液体薬学的組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に不利に影響し、薬学的組成物の治療的な有効性の損失をもたらし得る。さらにその上、凝集体形成は、該ポリペプチドを含有する薬学的組成物が注入系を用いて投与される場合に、チューブ、膜、又はポンプの妨害のような他の問題を引き起こしうる。
【０１４３】
本発明の薬学的組成物は、該組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基をさらに含む。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組み合わせを意図し、ここで任意の与えられたアミノ酸は、遊離塩基形態で又はその塩形態の何れかで存在する。アミノ酸の組み合わせが用いられる場合、全てのアミノ酸はそれらの遊離塩基形態で存在してよく、全てがその塩形態で存在してよく、或いは、その遊離塩基形態で存在するものもあれば、その塩形態で存在するものもあってよい。一つの態様において、本発明の組成物を調製するために用いられるアミノ酸は、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸のような、帯電した側鎖を保有するものである。特定のアミノ酸（例えば、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（即ち、Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物）又はそれらの立体異性体の組み合わせは、該特定のアミノ酸がその遊離塩基形態で又はその塩形態の何れかで存在する限り、本発明の薬学的組成物中に存在してよい。一つの態様において、Ｌ-立体異性体が用いられる。本発明の組成物は、それらのアミノ酸の類似体を配合され得る。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させる所望の効果をもたらす、天然のアミノ酸の誘導体を意図する。適切なアルギニン類似体は、例えば、アミノグアニジン、オルニチン及びN-モノエチルL-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体はエチオニン及びブチオニン（buthionine）を含み、及び適切なシステイン類似体は、S-メチル-L システインを含む。他のアミノ酸のように、アミノ酸類似体は、それらの遊離塩基形態か又はそれらの塩形態の何れかで該組成物中に取り込まれる。本発明のさらなる態様において、該アミノ酸又はアミノ酸類似体は、濃縮されて使用され、これはタンパク質の凝集を予防又は遅延させるのに十分である。
【０１４４】
本発明のさらなる態様において、メチオニン（又は他の硫黄含有アミノ酸又はアミノ酸類似体）は、治療的薬剤として作用するポリペプチドが酸化され易いメチオニン残基を少なくとも一つ含むポリペプチドである場合に、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために加えられてよい。「阻害」とは、時間経過による、メチオニン酸化種の最小の蓄積を意図する。メチオニン酸化を阻害することによって、その適切な分子形態にあるポリペプチドをより大きく保持することができる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物）又はそれらの組み合わせを用いることができる。加えられる量は、メチオニン残基の酸化を、メチオニンスルホキシドの量が、調節作用（regulatory agencies）に許容可能なように、阻害するのに十分な量であるべきである。これは典型的には、該組成物は、約10％〜約30％程度のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。これは一般に、メチオニン残基に添加されるメチオニンの割合が約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１であるようにメチオニンを添加することによって達成される。
【０１４５】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらに、高分子量ポリマー又は低分子量化合物の群から選択される安定化剤を含む。本発明のさらなる態様において、該安定化剤は、ポリエチレングリコール（例えば、PEG 3350）、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体（例えば、HPC、HPC-SL、HPC-L及びHPMC）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸及び2-メチルチオエタノールのような硫黄含有物質、及び異なる塩（例えば、塩化ナトリウム）から選択される。
【０１４６】
薬学的組成物は、治療的に活性なポリペプチドの安定化の点をさらに増強する、さらなる安定化剤を含んでもよい。本発明で特に所望の安定化剤は、これらに限定されないが、メチオニン及びEDTA（メチオニン酸化に対してポリペプチドを保護する）、及び非イオン性界面活性剤（凍結-解凍又は機械的剪断に付随した凝集に対してポリペプチドを保護する）を含む。
【０１４７】
本発明のさらなる態様において、該製剤はさらに界面活性剤を含む。本発明のさらなる態様において、該界面活性剤は、洗浄剤（detergent）、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、Pluronic（登録商標）F68のようなポロキサマー、ポロキサマー188及び407、トリトンX-100)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アルキル化及びアルコキシル化誘導体のようなポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体(トゥイーン、例えば、Tween-20、Tween-40、Tween-80 及び Brij-35)、モノグリセリド又はそれらのエトキシ化誘導体、ジグリセリド又はそれらのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)及びリゾリン脂質(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)の誘導体、及びリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、及び極性頭基、即ちコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾、及びグリセロリン脂質(例えば、ケファリン)、グリセロ糖脂質(例えば、ガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えば、セラミド、ガングリオシド)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-（例えば、タウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウムなど）、長鎖脂肪酸及びそれらの塩C6-C12（例えば、オレイン酸及びオクタン酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リシン、アルギニン又はヒスチジンのNα-アシル化誘導体、又はリシン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リシン、アルギニン又はヒスチジン及び中性又は酸性アミノ酸の任意の組み合わせを含有するジペプチドのNα-アシル化誘導体、中性アミノ酸及び二つの帯電アミノ酸の任意の組み合わせを含有するトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS (ドクセート（docusate）ナトリウム、CAS登録番号[577-11-7])、ドクセートカルシウム、CAS登録番号[128-49-4])、ドクセートカリウム、CAS登録番号[7491-09-0])、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシン又はタウリン接合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸、陰イオン性(アルキル-アリール-スルホン酸)一価の界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸、3-コルアミド（cholamido）-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホン酸）、陽イオン性界面活性剤（四級アンモニウム塩基）（例えば、セチル-トリメチル臭化アンモニウム、塩化セチルピリジニウム)、非イオン性界面活性剤（例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド）、ポロキサミン（例えば、テトロニクス（Tetronic’s）（これはプロピレンオキシド及びエチレンオキシドのエチレンジアミンへの逐次添加に由来する四官能性ブロックコポリマー誘導体である）から選択され、或いは界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されてよい。それらの具体的な界面活性剤のそれぞれは、本発明の代替の態様を構成する。
【０１４８】
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者には周知である。便宜的には「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000」が参考にされる。
【０１４９】
他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在することも可能である。そのようなさらなる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性溶媒、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンのようなアミノ酸)が含まれる。そのようなさらなる成分は、もちろん、本発明の薬学的製剤の全体的な安定性に不利に影響すべきではない。
【０１５０】
本発明に従うOGP融合タンパク質を含有する薬学的組成物は、そのような治療を必要とする患者にいくつかの部位、例えば局所的な部位、例えば皮膚及び粘膜部位で、バイパス吸収の部位、例えば、動脈中、静脈中、心臓中における投与で、及び関与（involve）吸収の部位、例えば、皮膚中、皮下、筋肉又は含むにおける投与で、投与されることができる。
【０１５１】
本発明に従う薬学的組成物の投与は、例えば、舌、舌下、頬側、口中、経口、胃及び腸中、鼻、肺、例えば、気管支梢及び肺胞を通して、又はそれらの組み合わせ、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球、例えば結膜を通して、尿管（uretal）、及び非経口的のようないくつかの経路を通してそのような治療を必要とする患者に投与することができる。
【０１５２】
本発明の組成物は、いくつかの剤形で、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロエマルジョン、複数のエマルジョン（multiple emulsion）、気泡、軟膏、糊状剤、硬膏剤（plasters）、軟膏剤（ointments）、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば、硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸カプセル、液滴、ゲル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入剤、点眼、眼軟膏剤、眼リンス、膣坐薬、腟リンス、膣軟膏、注射溶液、インサイチュー形質転換溶液、例えば、インサイチューゲル化、インサイチュー硬化（setting）、インサイチュー沈殿、インサイチュー結晶化、注入溶液、及び植込錠として投与されることができる。
【０１５３】
本発明の組成物はさらに、OGP融合タンパク質の安定性のさらなる増強、生物学的利用能の増大、溶解性の増大、不利な影響の低減、当該分野の技術者に周知の時間治療の達成、及び患者の服薬率の増大又はそれらの任意に組み合わせのために、例えば、共有結合、疎水性及び静電気的相互作用を介して、薬物担体、薬物送達システム及び高度な薬物送達システム中に、或いはそれに付属して配合されてよい。担体、薬物送達システム、及び高度な薬物送達システムの例には、これらに限定されないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、ポリサッカリド、例えばデキストラン及び誘導体、スターチ及び誘導体、ポリ（ビニルアルコール）、アクリレート及びメタクリレートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸及びそれらのブロックコポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えば、アルブミン、ゲル、例えば、温度ゲル化系（thermogelling systems）、例えば当該分野の技術者に周知のブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノ微粒子、液晶及びその分散系、脂質-水系における相挙動が当該分野の技術者には周知である、L2相及びその分散系、重合体ミセル、複数エマルジョン、自己-乳化、自己-マイクロ乳化、シクロデキストリン及びその誘導体、及びデンドリマー（dendrimers）が含まれる。
【０１５４】
本発明の組成物は、例えば、計量された（metered）用量の吸入器、乾燥粉末吸入器及び噴霧器（これらは全て当該分野の技術者には周知のデバイスである）を用いた、OGP融合タンパク質の肺投与のための、固体、半固体、粉末及び溶液の製剤中において有用である。
【０１５５】
本発明の組成物は、制御され、持続され、遅延され(protracting)、遅延された(retarded)、緩徐な放出の薬物送達システムの製剤において特に有用である。より具体的には、これらに限定されないが、組成物は、当該分野の技術者に周知である、非経口的な制御された放出システム及び持続性の放出システム（いずれのシステムも投与の数を数倍減少させる）の製剤において有用である。さらにより好ましくは、制御された放出システム及び持続性の放出システムは、皮下投与される。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御された放出システム及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、高分子ミセル、微粒子、ナノ粒子である。
【０１５６】
本発明の組成物に有用な制御された放出システムを生産する方法は、これらに限定されないが、結晶化、濃縮、共-結晶化、沈殿、共-沈殿、乳化、分散、高圧均質化、被包、スプレー乾燥、マイクロ被包、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアを生産するための溶媒蒸発、抽出及び超臨界流体方法を含む。一般的には、薬学的制御放出のハンドブック（Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000）及び「Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99」：「Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)」を参照されたい。
【０１５７】
非経口的な投与は、シリンジ、任意にペン様シリンジによって、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射によって行われてよい。或いは、非経口投与は、注入ポンプによって行うことができる。さらなる選択肢は、経鼻又は肺性スプレーの形態でOGP融合タンパク質の投与のための溶液又は懸濁液であってよい組成物である。さらなる選択肢として、本発明のOGP融合タンパク質を含む薬学的組成物は、経皮性投与、例えば無針注射又はパッチ、任意にイオントフォレーシスパッチ、又は経粘膜投与、例えば頬側（buccal）投与による投与に適応されることができる。
【０１５８】
「安定化された製剤」という用語は、増大した物理的安定性、増大した化学的安定性、又は増大した物理的及び化学的安定性を有する製剤を指す。
【０１５９】
タンパク質製剤の「物理的安定性」という用語は、ここで用いられるように、タンパク質を温度−機械的ストレスに暴露した結果として、及び／又は不安定化している界面及び表面、例えば疎水性表面及び界面のような相互作用の結果として、生物学的に不活性及び／又は不溶性のタンパク質の凝集体を形成する、タンパク質の傾向を指す。水溶性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器（例えばカートリッジ又はバイアル）に充填した該製剤を機械的／物理的ストレス（例えば撹拌）に異なる温度、種々の時間で暴露した後に、視覚的検査及び／又は濁度測定によって評価する。該製剤の視覚的な検査は、暗い背景で鋭く焦点を合わせた光の中で行われる。製剤の濁度は、例えば０〜３のスケールで、濁度の程度の視覚的スコアランキングによって特徴付けられる（濁度が見られない製剤は視覚的スコア０に相当し、日光中で視覚的濁度が見られる製剤が視覚的スコア３に相当する）。製剤は、日光で視覚的濁度を示す場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。或いは、製剤の濁度は、当業者に周知の簡単な濁度測定によって評価することもできる。水溶性タンパク質製剤の物理的安定性は、分光学的薬剤を用いるか又はタンパク質の高次構造状態のプローブを用いることによって評価されることができる。プローブは好ましくは、タンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光学的プローブの一つの例は、チオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイドフィブリルの検出のために広く用いられている蛍光色素である。フィブリルの存在下において、そして恐らく他のタンパク質立体配置も同様に、チオフラビンＴは、フィブリルタンパク質形態に結合したとき、約450 nmで新しい最大励起を、約482 nmで増強された発光を生じる。未結合チオフラビンＴは、該波長で本質的に非蛍光である。
【０１６０】
他の小分子は、天然から非天然状態へのタンパク質構造変化のプローブとして用いることができる。例えば「疎水性パッチ」プローブは、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合するプローブである。疎水性パッチは、一般に、天然状態にあるタンパク質の三次構造内に包埋され、しかしタンパク質が非折りたたみ又は変性を始めるとともに暴露される。それらの小分子の例は、分光学的プローブは、アントラセン、アクリジン、フェナントロリンなどのような芳香族の、疎水性色素である。他の分光学的プローブは、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン及びバリンなどのような、疎水性アミノ酸のコバルト金属複合体のような金属−アミノ酸複合体である。
【０１６１】
ここで用いられるように、タンパク質製剤の「化学的安定性」という用語は、天然のタンパク質構造と比較して低い生物学的効力のポテンシャル及び／又は増大した免疫原生性質のポテンシャルを有する化学的分解産物の形成を導く、タンパク質構造内の化学的共有結合変化を称する。種々の化学的分解産物は、天然のタンパク質のタイプ及び性質、及び該タンパク質が暴露される環境に依存して形成されることが出来る。化学的分解の排除は、完全に避けることは恐らくできず、化学的分解産物の量の増大は、当該分野の技術者に周知のように、しばしば貯蔵期間中及びタンパク質製剤の使用の間に見られる。ほとんどのタンパク質が脱アミド傾向であり、その過程でグルタミニル又はアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は、高分子量トランスフォーメーション産物の形成に関与し、ここで、２以上のタンパク質分子は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して高いに共有結合し、共有結合したダイマー、オリゴマー及びポリマー分解産物の形成をもたらす（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992）。酸化（例えばメチオニン残基の）は、化学的分解の他の変種として言及することができる。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境条件（分解産物の形成は、例えば温度上昇によってしばしば促進され得る）への暴露の後に、種々の時間点で化学的分解産物の量を測定することによって評価することができる。それぞれの個別の分解産物の量は、多くの場合、種々のクロマトグラフィー技術（例えば、SEC-HPLC 及び／又は RP-HPLC）を用いて、分子サイズ及び／又は電荷に依存して分解産物を分別することによって測定される。
【０１６２】
従って、上記に概要を述べたように、「安定化された製剤」は、増大した物理的安定性、増大した化学的安定性、又は増大した物理的及び化学的安定性を有する製剤を指す。一般に、製剤は、使用期限に達するまでは、使用及び貯蔵（推奨された使用及び貯蔵条件に従って）の間は安定でなければならない。
【０１６３】
本発明の一つの態様において、OGP融合タンパク質を含む薬学的製剤は、６週間を超える使用及び３年を超える貯蔵の間安定である。  
本発明の一つの態様において、OGP融合タンパク質を含む薬学的製剤は、４週間を超える使用及び３年を超える貯蔵の間安定である。  
本発明のさらなる態様において、OGP融合タンパク質を含む薬学的製剤は、４週間を超える使用及び２年を超える貯蔵の間安定である。  
本発明のさらなる態様において、OGP融合タンパク質を含む薬学的製剤は、２週間を超える使用及び２年を超える貯蔵の間安定である。
【実施例】
【０１６４】
クローニング
以下の構築物を作成した：OGP-hGH (pNNC37)OGP(1-9)-hGH(pNNC37.1)、OGP-OGP-hGH (pNNC38)、OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH (pNNC38.1)、OGP-OGP-OGP-hGH (pNNC38.2)、OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGH (pNNC39)及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGH (pNNC39.1)。
【０１６５】
本発明のOGP及びその変異体は、かなり短いペプチドであるため、OGP-hGH、OGP(1-9)-hGH、OGP-OGP-hGH及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHのクローニングは、すでにヒト成長ホルモン遺伝子を含有しているpNNC19細菌発現ベクター(pNNC19は商業的に入手可能なpET11aベクターに基づく)中のNde1及びSal1部位への直接的なクローニングのために、OGPコード化DNAオリゴリンカーを利用する。OGPコード化配列は、ベクターSuit NTIプログラムを用いる大腸菌発現のために最適化されたコドンである。二量体又は三量体のOGP配列が用いられる場合、交互のコドン利用は、遺伝的な不安定性及びクロスハイブリダイゼーションを避けるために反復して利用され得る。ダイマー形態のOGPを含むオリゴは、２つのセグメントでpNNC19中にクローン化されている。OGP-OGP-OGP-hGHコード化ベクター(pNNC38.2)を作成するクローニング戦略は、前もって作成されたOGP-OGP-hGHコード化ベクターpNNC38を利用する。pNNC38ベクターは、制限酵素Xba1及びNde1で切断され、OGP(1-13)外配列を含む新たなDNAオリゴリンカーがベクターに加えられる。Nde1部位が開始コドン(OGP-OGP-hGHの)の前面の右にあるために、このコドンは続いて、部位特異的変異誘発によってグリシンコード化コドンへ変化され、付加的全長OGP(1-14)コード化配列が作成される。
【０１６６】
アルブミンスペーサー配列を含有する以下の二つの構築物が調製されている：OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGH及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGH。これらの構築物を得るために、ＰＣＲに基づくアプローチは、存在するpNNC38又はpNNC38.1をテンプレートとして利用し、NDEMPADLPSコード化配列を含むプライマーをそれぞれ利用する二つの独立的なＰＣＲ反応を利用した。二つのNDEMPADLPSコード化PCR単位複製配列はSacl1を用いて切断して突出末端を生成し、カッター部位Sph1及びBamH1を用いて親pNNC38ベクターにクローンバック（cloned back）し、OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGHをコードするpNNC39及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGHをコードするpNNC39.1を生成する。上記の全ての構築物の配列は、融合タンパク質コード化領域のＤＮＡ配列によって確認されている。
【０１６７】
ベクターを含むOGP-hGHの構築物のためのオリゴを配列番号５に示す。この配列は、付加的なＮ−末端メチオニンを伴うOGPをコードする配列、hGHにおける最初の６アミノ酸をコードする配列、及び両端の制限酵素部位を含む。
【０１６８】
OGP(1-9)-hGHの構築物のためのオリゴを配列番号6に示す。この配列は、付加的なＮ−末端メチオニン、hGHの最初の6アミノ酸をコードする配列、及び両端の制限部位を含む。
【０１６９】
OGP-OGP-hGHの構築物のためのオリゴを配列番号7に示す。ＤＮＡオリゴ合成において発生しうる突然変異を減少させるために、ライゲーションを、配列番号８〜１１に示す４つの短いオリゴの組み合わせを用いて行った。OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHの構築物のためのオリゴリンカーを配列番号12に示す。この配列は、OGP (1-9) (それらの一つはリンカーである)をコードする二つの配列、hGHの最初の６アミノ酸をコードする配列、及び両端の制限部位を含む。ＤＮＡオリゴ合成において発生しうる突然変異を減少させるために、配列番号１３〜１６に示す4つの短いオリゴの組み合わせを用いてライゲーションを行った。
【０１７０】
OGP-OGP-OGP-hGHの構築物のためのＤＮＡオリゴリンカーを配列番号21及び22に示し、部位特異的変異誘発のためのプライマーを配列番号23及び24に示す。
【０１７１】
ＤＮＡオリゴリンカーを含むOGPは、標準的なバッファー中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いてリン酸化した。NaCl及びEDTAを加え、温度を95℃まで上昇し、該混合物を室温までゆっくり冷却させた。加熱はＰＮＫを不活性化させ、オリゴのアニーリングを促進する。精製されたNde1及びSal1切断pNNC19ベクターは、OGPコード化オリゴと混合され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて一晩ライゲート（ligate）される。コンピテント細菌をライゲートされたベクターで形質転換し、そして、OGP特異的プライマーを成長ホルモン特異的プライマーと共に用いて、診断的ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いて陽性クローンを検出した（図２）。
【０１７２】
以下のＰＣＲプライマーを、OGP-OGP-NDEMPADLPS-hGHを作成するために用いた：
SphI-F GAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAA (配列番号25);
SacII-R 2OGP GCAGATCCGCGGGCATTTCATCGTT GCCACCAAAGCCATACAGCGTGCGG (配列番号26);
SacII-F AAATGCCCGCGGATCTGCCGAGC TTCCCGACCATCCCGCTGAGTCG (配列番号27)；及び
BamHI-R AGCCGGATCCCTAGAAGCCACAGCTGCCCT (配列番号28)。
【０１７３】
以下のＰＣＲプライマーを、OGP(1-9)-OGP(1-9)-NDEMPADLPS-hGHを作成するために用いた：
SphI-F GAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAA (配列番号29);
SacII-R 2OGP-D GCAGATCCGCGGGCATTTCATCGTTCAGCGTGCGGCCTTGGCGCTTCAGG (配列番号30);
SacII-F AAATGCCCGCGGATCTGCCGAGC TTCCCGACCATCCCGCTGAGTCG (配列番号31)；及び
BamHI-R AGCCGGATCCCTAGAAGCCACAGCTGCCCT (配列番号32)。
【０１７４】
発現
タンパク質の発現のために、BL21細菌を上記のプラスミドで形質転換し、約0.6のOD600まで増殖させ、0.1 mM IPTGで発現を誘導した。４時間後、該タンパク質発現をSDSページゲルで分析した（図３を参照）。
【０１７５】
精製
陰イオン交換(DEAE-セファロースFF)を、予想pI 約6.0でOGP-hGH及びOGP(1-9)-hGHのために用いることができる。陽イオン交換（S-セファロースFF)を、より高いpI約7.8を有すると予期されるOGP-OGP-hGH及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHのために用いることができる。このサンプルは、以下のようなクロマトグラフィー精製の同じルートに従うことができる：疎水性相互作用(Phenyl Sepharose 6 FF)、イオン交換、ゲルろ過(Sephadex G25)、及び凍結乾燥。
【０１７６】
OGP-hGH分解
可溶性形態のOGP−構築物の大腸菌発現のウェスタンブロットは、OGP-hGH及びOGP-OGP-hGHの分解産物が細胞溶解後に検出可能であることを示している。図４を参照されたい。しかしながら、OGP(1-9)-hGH及びOGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHについては分解が検出されず、OGP C-末端骨原性のペンタペプチド内のいくつかの分解を示した。分解産物は、ゲル中トリプシン消化に続くマススペクトロメトリによって分析され、そして、ペンタペプチド中の３つの特異的部位でその分解が生じていることが示された。細胞溶解の間の温度制御及び溶解バッファーへのプロテアーゼ阻害剤の添加は、全長OGP構築物の分解を完全に予防することはできなかった。それ故、封入体中でこれらのタンパク質を発現させることがより適切な方法である。さらに我々は、Ｎ-末端メチオニンを除去する大腸菌の内在性能力がOGP融合タンパク質を生じることを示した。
【０１７７】
OGP-hGH及びOGP(1-9)-hGHの再折りたたみ及び精製
OGP-hGH及びOGP(1-9)-hGHの封入体を、8 M 尿素、20 mM DTT、20 mM Tris、pH 9.0 中に、10 mg/mlの濃度で溶解し、20 mM Tris、pH 9.0、0.05% Tween-20中の50-折りたたみ希釈再折りたたみによって、一晩４℃で再折りたたみした。第1の精製工程は、QセファロースFFカラム（バッファーA；20 mM Tris pH 9.0、バッファーB；20 mM Tris pH 9.0、1 M NaCl)で行った。タンパク質は、勾配溶出によって溶出した。
【０１７８】
タンパク質製剤が、タンパク質のダイマー及び他のオリゴマー形態のタンパク質を含むために、前-充填HiLoad 26/60 Superdex 75プレップ・グレード・カラム(Amersham Biosciences)でのゲルろ過が、第二の及び最終的な精製工程として行われる。バッファー；50 mM NH4HCO3 pH 7.8。最終的なOGP-hGHタンパク質プールの純度は、図５に説明する。
【０１７９】
OGP-OGP-hGHの再折りたたみ及び精製
OGP-OGP-hGHは、1 M NDSB201、1 M尿素、及び20 mM Tris pH 6.0中の、50-折りたたみ希釈再折りたたみ（50-fold dilution refolding）によって再折りたたみされた。精製は、SPセファロースFFカラム(バッファー A; 50 mM Na2HPO4 50 mM NaH2PO4 pH 6.0、バッファーB; 50 mM Na2HPO4 50 mM NaH2PO4 pH 6.0, 1 M NaCl)で行った。タンパク質は、溶出工程によって溶出した。純度は図６に記載する。
【０１８０】
OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHの精製
OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHは、溶解形態で発現される。大腸菌発現に由来するペレットは、溶解バッファー(50 mM Na2HPO4 50 mM NaH2PO4 pH 6.0、5 mM EDTA、0.1% Triton X-100)中に溶解され、そして細胞は30 kpsiでの細胞破壊によって溶解される。上清はSPセファロースFFカラム(バッファーA；50 mM Na2HPO4 50 mM NaH2PO4 pH 6.0、バッファーB；50 mM Na2HPO4 50 mM NaH2PO4 pH 6.0, 1 M NaCl)での精製のために用いられる。タンパク質は、溶出工程によって溶出される。
【０１８１】
OGP-OGP-OGP-hGHの再折りたたみ及び精製
OGP-OGP-OGP-hGHは、可溶化された封入体の50-折りたたみ希釈によっては再折りたたみできず、それ故、尿素勾配(バッファーA；1 M尿素、20 mM Tris pH 7.5、バッファーB；8 M尿素、20 mM Tris pH 7.5)を用いるHiLoad 16/60 Superdex 75プレップ・グレード・カラム(Amersham Biosciences)で再折りたたみされる。カラムは、サンプルのローディングの前に、1 CV以上の0-100% バッファーBで平衡化される。さらなる精製は、HiTrap CMセファロースFF (バッファーA；25 mM K2HPO4-KH2PO4 pH 8、バッファーＢ；25 mM K2HPO4-KH2PO4  pH 7.1, 1 M NaCl)で行われる。3OGP-hGHはフロースルー中にある。図７のSDS-PAGEはOGP-OGP-OGP-hGH調製を示す。
【０１８２】
表面プラスモン共鳴分析
hGH-OGP融合タンパク質のα2-マクログロブリンへの結合は、バイアコア（Biacore）3000機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)において、基本的には他で[Biochemistry, 39(35), 10627-10633, 2000]に記載されているように、表面プラスモン共鳴によって分析した。簡単には、10 mM 酢酸ナトリウム、pH 5.0中の、20 μg/mlでのα2-マクログロブリン(American Diagnostica Inc., Stamford, CT)は、製造者の推奨に従うアミンカップリングキット(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いてEDC/NHSによる前-活性化されたCM5 バイアコア（Biacore）センサーチップのフローセル２において固定化された(5 μl/分で7 分)。タンパク質の固定化に続いて、表面を1 M エタノールアミンに5 μl/分で7分間暴露してブロックした。最終的なカップリング収率は、23 fmol/mm2であった。動態学的分析は、自動インライン参照減算のための未処置フローセル１を用いて、ランニングバッファー(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.05% Tween 20, pH 7.4）中で流速10 μl/minで行った。ランニングバッファーでのフローセルの5分間の平衡化に続いて、100 μlのタンパク質サンプルを、KINJECTコマンドを用いて注入した。解離相は９分間持続し、再生は1-分のパルス、10 mM グリシン、500 mM NaCl、20 mM EDTA、pH 6.0によって行った。SPRデータは、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いて行った。
【０１８３】
BIAevaluation 4.1 ソフトウェアを用いる1:1 ラングミュアー結合モデルに対するセンサグラム（sensorgrams）の適合は、OGP-OGP-hGH及びOGP-hGHのα2-マクログロブリンへのそれぞれの結合について、210 nM及び1 μMの見かけ上の解離定数(KD)を得た。図８を参照されたい。
【０１８４】
単回投与量のラットへのiv及びsc投与後の、3OGP-hGH及び2OGP-NDEMPADLPS-hGH 誘導体の薬物動態学
設計
実験は、体重200〜300ｇの18匹のスプラーク-ダウリー（Spraque-Dawley）のオスのラットでおこなった。動物は４つのグループに分けた。表１を参照されたい。
【表１】
2008505614.tif 000003
【０１８５】
試験物質は、25Ｇの針によって、尾部静脈に静脈内投与されるか又は頚部皮下に投与される。  
薬物動態学的な分析は、当該分野で既知の方法に従って行われる。分析は、ソフトウェアのウィンノリン・プロフェッショナル（WinNonlin Professional）、第4.1版(Pharsight Corporation, USA)を用いて、非区画化方法によって行われる。
【０１８６】
薬理学的方法
アッセイ(I)  ＢＡＦアッセイにおける増殖活性
骨髄に由来するマウスのリンパ球にクローン化されたヒト成長ホルモン受容体を形質移入した。該細胞はそれ故、成長及び生存について、成長ホルモンに依存する。細胞を２４時間、成長ホルモンについて飢餓させ、試験化合物と共に3日間インキュベートした。アラマルブルー・カラー（Alamarblue colour）シフトが、増殖を示す最終結果であった。最終結果は、成長ホルモンとの相対として算出した。OGP-hGH及びOGP-OGP-hGHの相対的な効力は、それぞれ78%及び67%であった。 
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】親のpNNC19細菌発現ベクターの特徴地図。
【図２】選択したクローンの診断的ＰＣＲ。Ｍは1 Kbマーカーを示す。レーン1は親ベクターを示し；レーン2はOGP-hGH；レーン3はOGP(1-9)-hGH；レーン4はOGP-OGP-hGH；及びレーン5はOGP(1-9)-OGP(1-9)-hGHを示す。すべての反応で同じプライマーセットを用い、予期されたサイズの相違をゲル上に反映させた（OGP-hGH：277 bp、OGP-OGP-hGH：319 bp、OGP(1-9)-hGH：262 bp、OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH：289 bp)。加えて、該プライマーセットは、親ベクターを増幅することができない。診断プライマーセット：OGPプライマー：5´-tggctctgaaacgtcagggtcgta-3´、hGHプライマー5´-atgcggagcagctctaggttggat-3´。
【図３】Ｍは、分子量マーカーを示す。レーン1-4はOGP-hGH発現ベクターで形質転換されたBL-21を示す。1 非-誘導細菌；2 IPTGによる誘導後；3 上清；及び4 ペレット画分。レーン5-8はOGP(1-9)-hGH発現ベクターで形質転換されたBL-21を示す。5 非-誘導細菌；6 IPTGによる誘導後；7 上清；及び8 ペレット画分。OGP-hGH及びOGP(1-9)-hGHの組換え発現を矢印でマークした。いずれの融合タンパク質も予測された分子量で移動した。
【図４】OGP構築物のウェスタンブロット。レーン1；分子量マーカー、レーン2；hGH標準、レーン3-5；OGP-hGH、レーン6-8；OGP(1-9)-hGH、レーン9-11；OGP-OGP-hGH、レーン12-14；2OGP(1-9)-OGP(1-9)-hGH。それぞれの構築物について、３つのレーンが誘導前及び二つの異なる希釈で超音波処理した後のタンパク質製剤を示す。
【図５】OGP-hGHのSDS-PAGE。レーン1；分子量マーカー、レーン2；hGH標準、レーン3；OGP-hGH非-減少サンプル、レーン4；OGP-hGH減少サンプル。
【図６】OGP-OGP-hGHのSDS-PAGE。レーン1-9は減少、レーン10-14は非-減少。レーン1-3；hGH標準、レーン4-5；可溶化された封入体、レーン6；リフォールディングされたOGP-OGP-hGH、レーン7；アプリケーションSPセファロースカラム、レーン8-9；精製されたOGP-OGP-hGH、レーン10；アプリケーションSPセファロースカラム、レーン11；可溶化された封入体、レーン12-14；精製されたOGP-OGP-hGH。
【図７】OGP-OGP-OGP-hGHのSDS-PAGE。レーン1；分子量マーカー、レーン2；hGH 標準、レーン3；OGP-OGP-OGP-hGH減少されたサンプル、レーン4；OGP-OGPOGP-hGH 非-減少されたサンプル。
【図８】固定化されたα2-マクログロブリンに結合したhGH (円)、OGP-hGH (四角)、及びOGP-OGP-hGH (菱形)の表面プラスモン共鳴分析。注入されたタンパク質の濃度は1500 nMであった。会合及び解離相はそれぞれ10分及び9分持続した。
【図１】
2008505614.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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