(57)【要約】【課題】血液中または血漿中のトロンビンの最大活性化能を測定する方法を提供する。【解決手段】高度に特異的で不可逆的でない一定量のトロンビン阻害剤を血液または血漿の試料に加え、血液または血漿の試料の凝固を誘発し、一定時間経過後に、加えたトロンビン阻害剤の消費量を、それ自体公知の方法で測定することを特徴とする血液または血漿の試料の総凝固活性の測定方法、及び血液試料の凝固状態に関する情報を得るためのキット。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度に特異的で不可逆的でない所定量のトロンビン阻害剤を血液または血漿の試料に加え、血液または血漿の試料の凝固を誘発し、所定時間経過後に、加えたトロンビン阻害剤の消費量を、それ自体公知の方法で測定することを特徴とする血液または血漿の試料の総凝固活性の測定方法。
【請求項２】
トロンビン阻害剤がトロンビンの活性部位およびアニオン結合エキソサイト１（ＡＢＥ１）に作用することを特徴とする請求項１による方法。
【請求項３】
トロンビン阻害剤が、合成、天然もしくは天然と同一の阻害剤であることを特徴とする請求項１または２による方法。
【請求項４】
トロンビン阻害剤が、ジペタロガスチンＩ、ジペタロガスチンII、ロドニイン、ヒルジンから選ばれることを特徴とする請求項１から３のいずれか一つによる方法。
【請求項５】
凝固の誘発が外因子および内因子の添加によって生じることを特徴とする請求項１から４のいずれか一つによる方法。
【請求項６】
凝固の誘発がエラグ酸とリン脂質との混合物および組織因子によって生じることを特徴とする請求項５による方法。
【請求項７】
血液試料の総凝固活性を測定するためのキットであって、１)高度に特異的で不可逆的でないトロンビン阻害剤、２）該トロンビン阻害剤の外的および内的活性因子、３）トロンビン阻害剤を測定するための試薬およびアジュバントからなる試薬およびアジュバント、からなることを特徴とするキット。
【請求項８】
血液試料の凝固状態に関する情報を得るための請求項７によるキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液または血漿の試料の総凝固活性を測定する方法に関する。さらに、本発明はこの方法を行うためのキット、および、患者の血液凝固状態についての情報を得るための方法に使用するキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや動物の血液凝固は、病理学的および生理学的プロセスによって引き起こされる複雑な過程であり、生体で止血の役割を果たしている。血液凝固では、１５種以上の異なった血液凝固因子が、それぞれ活性化されて次の不活性前駆体を活性化していく多段階（凝固カスケード）プロセスによって、血漿中に存在する可溶性フィブリノーゲンが繊維性−ゼラチン性血餅物質フィブリンに変換される。
【０００３】
セリンプロテアーゼは血漿凝固システムが活性化する際の最も重要な酵素である。血漿凝固システムでは、カルシウムイオンと補因子（ＦＶａ、ＦVIIIａ）を媒介としてセリンプロテアーゼ前駆体が負に帯電したリン脂質に特定の結合構造（γ−カルボキシル基）を介して固定され、数段階を経て活性複合体を形成し、その複合体によってセリンプロテアーゼ（ＦXI、ＦIX、ＦＸ）が準固相様に活性化される。この複雑な凝血活性化過程の最終生成物である酵素トロンビンは、活性複合体を残す唯一のプロテアーゼであり、そのため血液循環では遊離した状態で得られる。この遊離トロンビンは凝固タンパクフィブリノーゲンと細胞の両方に関係する全く異なる複数のトロンビン基質と結合する。従って、トロンビンは血漿凝固と細胞単位、特に、血小板との橋渡しをする機能があり、それゆえ最強の凝集開始因子に相当する。凝集した血小板のリン脂質表面には多量の活性複合体が存在していて、そこでトロンビンが生成される。患者の全体的な血液凝固状態は、血液および血漿中にあるトロンビンの最大生成可能量で見積もることができる。この、いわゆるトロンビン生成ポテンシャルによって血液の凝固能異常亢進（栓友病）の徴候を得ることができ、さらにトロンビン生成の機能低下（血友病、出血傾向）をも検知することもできる。
【０００４】
血漿中のトロンビン生成を測定する方法は従来から知られている。血漿中のトロンビン生成は、一般に、ａＰＴＴ、プロトロンビン時間、クイック値、レプチラーゼ時間、バトロキソビン時間などの総凝固テスト法によって測定される。しかしながら、これらのテスト法では凝固の活性化の面だけに注目している。ほとんどの場合、これらのテストは原則として体外で主に患者の「保管血漿」（Plasmaasservaten）に一定量の凝血誘発剤を加えることで行われる。そうすることで一定量のα−トロンビンが活性化されるので、検出システムを介して凝血の徴候、通常は試料中のフィブリノーゲンを経時的に測定する。このとき、１ｍｌの凝血反応液あたり原則的には５−８ＮＩＨ単位のトロンビンしか活性化されない。
【０００５】
血漿中のトロンビン生成を測定する方法としては、ヘンカーらによる方法（特許文献１）がある。実用的には、数カ所の変更を加えたヘンカーの方法によって、凝血誘発後、色素形成物質（特許文献２、３、４）を用いて連続的に測定しながらトロンビン生成を検知する。この測定では色素生成物質の開裂量を短い間隔で面積積分として積算し、色素生成物質の開裂速度と開裂総量によってトロンビン生成を測定する。この方法で抗凝血薬の影響や凝血異常をトロンビンの同時生成によって測定することが可能になった。しかしながら、この方法の欠点は測定原理が色素および蛍光生成物質を用いた光学的方法であるため、半透明な試料（血漿または血小板を多く含む血漿）にしか使用できないことである。さらに、測定のためには血漿をかなり希釈しなければならないため、天然に存在する阻害物質の影響を受けるという欠点もある。さらに、このような測定では、本来の凝固作用のためトロンビンが非生理学的に豊富になり、そのため血液中に存在する遅効性反応阻害物質（例えば、α２−マクログロブリン）によって反応が非生理学的に自己限定的になる。生体内では、このような大量のトロンビンが働くことはない。希釈していない血液中では、大量のトロンビン基質（フィブリノーゲン、Ｖ、VIIIおよびXI因子、プロトロンビン）があっても、適当量のトロンビンに対応する抗トロンビン（抗トロンビンII、ヘパリン補因子II、その他）も存在しており、それによって効果的にブロックされるからである。また、従来の方法ではトロンビンの動的な活性は測定できるものの、凝固活性の終点を測定することは出来なかった。従って、トロンビンの最大活性能、すなわち凝固活性の終点を測定するための、さらに信頼できる方法が必要とされている。
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第０４２０３３２号明細書
【特許文献２】国際公開第００／０５２１９９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０９３８３１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９６／２１７４０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、血液または血漿中のトロンビンの最大活性能を測定する方法を提供するとの目的に基づく。本発明による方法では、反応温度や反応時間といった変化する可能性がある外部の影響を受けず、高い確度で、トロンビンの活性化反応を終点まで導く。さらに、本発明の方法は全血もしくは、ほとんど希釈していない血液試料に適用できる。さらにまた、本発明の方法によって血液試料の凝固状態に関する信頼のおける情報を簡単に得ることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、上記の目的は、高度に特異的で不可逆的でない一定量のトロンビン阻害剤を血液試料に加え、凝固の誘発後、加えたトロンビン阻害剤の消費量を測定することで達成できることが判明した。
【０００９】
すなわち、本発明は、高度に特異的で不可逆的でない所定量のトロンビン阻害剤を血液または血漿の試料に加え、血液または血漿の試料の凝固を誘発し、所定時間経過後に、加えたトロンビン阻害剤の消費量を、それ自体公知の方法で測定することを特徴とする血液または血漿の試料の総凝固活性の測定方法に関するものである。さらに、本発明は、この総凝固活性を測定する方法を実施するためのキット、および、患者の凝血状態に関する情報を得るための方法に用いるキットにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
トロンビンの最大生成能は、抗凝血化処理された希釈していない血液および／または血漿中の総量として本発明の方法で定量できる。高度に特異的で不可逆的でないトロンビン阻害剤は、比較的高濃度で存在する高い親和性を持つトロンビン基質やトロンビン受容体と競争関係にあるので、比較的高濃度で加えなければならない。一般的に、血液または血漿１ｍｌ当たり１０から３０μｇの高度に特異的なトロンビン阻害剤を用いれば十分である。血液に対する阻害剤の正確な比率は、簡単なルーチン実験で容易に実験的に決定することができる。
【００１１】
高度に特異的で不可逆的でないトロンビン阻害剤は、実質的には、トロンビンの活性部位と重要な認識構造であるアニオン結合エキソサイト(exosite)１（ＡＢＥ１）との両方に親和性を持つ阻害剤である。さらに、高度に特異的なトロンビン阻害剤は、凝血システムにおいて活性化前相反応および活性化主相反応で沈澱する他のセリンプロテアーゼ（VIIａ、IXａ、Ｘａ、XIａ因子）に影響を与えないものでなければならない。このような阻害剤は公知である。トロンビン阻害剤の例としては、ヒルジン、ジペタロガスチンＩおよびII、ジペタロガスチン類から得られるトロンビン特異性セリンプロテアーゼ阻害剤、熱帯サシカメムシ、ロードニウスプロリキウス（サシカメムシ）から得られるロドニインおよびそこから誘導されるジペタルジンのようなキメラ、およびヒルジンと同様の結合特異性と高い親和性を有するジペタロガスチンとヒルジンとの部分変性阻害剤などが挙げられる。また、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー(European Journal Biochemistry). 265, 598-605. 1999に記載されているような二官能性遅効強結合阻害剤も本発明に好適である。さらに、天然阻害剤に相当する遺伝子組替え阻害剤も使用できる。加えて、上記の性質を有する限り、天然阻害剤を変性もしくは修飾したものも使用可能である。
【００１２】
加えられた阻害剤の消費量は、きわめて精密に測定できることが好ましい。原理的には、上記のようなトロンビン直接阻害剤、特に強結合阻害剤はエカリン凝固時間法あるいは、その変法であるエカリン色素形成法（国際公開第００／０４６６０２号パンフレット）を用いて非常に精密に測定でき、広範囲にわたって正確に直線的な測定ができる。好ましいトロンビン阻害剤はヒルジンである。ヒルジンは血液／血漿１ｍｌあたり１５μｇ使用することが好ましい。
【００１３】
試験すべき血液試料／血漿試料は希釈しても希釈しなくてもよい。血液試料や血漿試料はそれぞれ公知の方法によって得ることができる。通常、血液試料は市販の器具で採取する。本発明の方法では、クエン酸ナトリウム０．３ｍｌを含むサルステッド−モノベテス（Sarstedt-Monovettes）［登録商標］２．７ｍｌを用いて肘静脈から血液を採取することが好ましい。得られたクエン酸塩添加血液を二等分し、一方をすぐに遠心分離器に３８００ｒｐｍで１０分間かける。上澄みの血小板を含まない血漿をピペットで取り出して、手順に従って用いる。このクエン酸塩を含んだ血液および血漿の検査は、血液採取から２〜３時間以内に行うことが好ましい。ただし、血漿は冷蔵庫中で２４時間まで保存してもよい。
【００１４】
本発明の方法では、一定量のトロンビン阻害剤を血液または血漿の試料に加える。試料中では、内的および／または外的活性化物質、さらに適切なカルシウムイオン濃度によって凝固が最大限に誘発される。外的および／または内的血漿凝固経路を経て誘起される凝血ポテンシャルすべてを反映して、不活性な前駆体プロトロンビンは最終的にセリンプロテアーゼトロンビンに変換される。プロトロンビナーゼ複合体で生成され、そこから放出されるトロンビンは高度に特異的な阻害剤によって即座に捕獲され不活性化される。一定時間に活性化の後、ＥＤＴＡによって活性化反応を停止する。その後、試料中の未反応の遊離阻害剤を精密で効果的な決定法によって測定する。トロンビンが生成されればされるほど、試料中の阻害剤はより多く消費される。このようにして、血液または血漿の試料中の最大トロンビン活性化ポテンシャルを極めて精密に記録することができる。加えられた阻害剤は恒久的に活性化されたトロンビンと独占的に結合するので、いわば唯一の凝血最終生成物であり、凝血以前に起こったことに全く影響しない。トロンビンによる通常の凝血で活性化されるＦＶａ、ＦVIIIａなどの補酵素もまたＦＸａによって活性化されるので、実際の生理学的もしくは病理学的な凝血が本発明の方法によって再現される。
【００１５】
本発明の方法では、現在知られている活性化経路、いわゆる外的および内的経路の両方を同様に考慮している。外的もしくは内的経路単独による活性化も可能であるが、それは細胞内での特定の凝固因子欠乏（例えば、遺伝性の凝血疾患による）についての知見を得るような場合でのみ有用である。それ以外の場合、このテストは「異常凝血」または「正常凝血」を判定する「総量試験」である。従って、本発明の方法における正常値は血液についての値と血漿についての値とがある。個々の患者の値が正常値から外れていれば、それは凝血疾患を示すものである。この点に関して驚くべきことに、最適な活性化を行うためには、上記の二つの活性化をする物質の混合比率を最適にしなければならないことが判明した。そのようにするだけで、トロンビンの最大可能生成能力を測定することができる。原則として市場で入手可能な公知の凝血誘発物質を用いることができる。外的活性化剤は、通常、動物やヒトの様々な細胞／器官成分から得られた組織因子である。いわゆる「トロンボプラスチン類」や「トロンボキナーゼ類」はウサギの脳、肺あるいは肝臓から得られるが、一般に、ほとんど標準化できない。そのため、バッチごとの活性に大きな変動のない遺伝子組み換え製品を用いることが好ましい。内的活性化剤についても同様のことが言える。動物性、植物性いずれのリン脂質も使用でき、エラグ酸などの開始剤を加えても良い。同様の製品は市場で入手可能であり、当業者には公知である。本発明によって、最適に組み合わせたイノビン（Innovin）とアクチンＦＳ（Action FS）（両製品ともにデイド・ベーリング社（Dade Behring company）製）が二つのトロンビン活性化経路に関与することが分かった。イノビンは遺伝子組み換え組織因子であり、外的活性化経路に対応する。内的活性化経路に必要なアクチンＦＳは、いわゆる活性ＰＴＴ試薬であり、この内的凝血活性化ではリン脂質とエラグ酸の両方が関与する。また、試験液には一定かつ適当量のカルシウムイオンが含まれていなければならない。カルシウムイオンはクエン酸塩によって抗凝血化処理された血液を再びもとに戻すとともに、生体内では活性化のために血液中のカルシウムを必要としている凝固因子を最適なイオン環境のもとにおく働きがある。さらにまた、試験液にはアルブミン（好ましくはウシ・アルブミン）が含まれていなければならない。アルブミンは脂質様物質、特に、内的活性化経路に関与する脂質様物質の均一化に有効である。なお、ちなみに本発明の方法は「ＴＨＲＯＧＡ（thrombin generation assay）法」と命名された。
【００１６】
また、本発明は、血液試料の総凝固活性を測定するためのキットにも関する。このキットは、トロンビン阻害剤、トロンビンの外的および内的活性化因子、および適切な副次的試薬からなっている。このキットは、それ自体公知で従来の方法で製造できるパッケージに納められる。
【００１７】
本発明の方法および本発明のキットによって、血液もしくは血漿試料のトロンビン最大活性化可能量を正確に、高い信頼性で測定することができる。さらに、血液中のトロンビン基礎量も、この方法で測定できる。血漿中では、少量ながら一定量のトロンビンが常に検出できる。しかし、これとは異なり、血液中で検出されるトロンビン濃度は減少することも増加することもある（「ブラインド・トロンビン」）。
【００１８】
従って、本発明の方法は、血液凝固の正常、亢進、減退（栓友病、血友病、出血傾向）に関する情報を提供するものである。さらに、本発明の方法によって、クマリンもしくはジクマロール系経口抗凝血薬による治療の進み具合を測定、管理することができる。本発明による方法（ＴＨＲＯＧＡ法）は、今日まで用いられてきたクイック値法に比べて、経口抗凝血薬の全血中での凝固阻害能を記録できるという利点がある。そのため、本発明の方法によって患者の出血傾向を初期段階で把握することが可能になる。研究では、経口抗凝血薬による治療を受けている患者については良好な結果が得られた。経口抗凝血薬治療では、凝固システムで重要なセリンプロテアーゼの前駆体、とくに鍵となる酵素トロンビンの前駆体、すなわちプロトロンビンは不活性な状態にあるので、血液中のトロンビン生成を記録することで患者の体内に潜在している凝血ポテンシャルを直接に測定でき、出血傾向の有無などの情報を得ることができる。さらに、本発明の方法によって他の凝固阻害剤による治療も長期間にわたって検証することができる。実験によれば、レフルダン（refludan）、メラガトラン（melagatran）あるいはアルガトロバン（argatroban）などの直接抗トロンビン物質による治療を受けている患者の血栓形成状況をモニターすることもできる。従って、本発明の方法は患者の複雑な凝血状態に関する情報を即座に得ることができる「正確な方法」あるいは「迅速な方法」である。本発明の方法によって、血液凝固状態における異常を迅速に検出することができ、それによって適切な治療を早期に開始することが可能になる。
【００１９】
以下の実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【００２０】
［テストを実施するための一般的手順］
トロンビンを最大限に生成するために、抗凝血化処理した少量の血液もしくは血漿を用いる。そのためには、クエン酸塩や他のあらゆる抗凝血剤を使用することができる。０．１ｍｌのクエン酸塩添加血液もしくは血漿を、参照用試験管（ＮａＣｌ）および一定量のヒルジンが入れてある活性化用試験管（組織因子＋エラグ酸とリン脂質との混合物）のそれぞれに入れる。この二つの反応容器に蓋をして、ミニ・シェイカーを用いて５５０ｒｐｍ、室温で２５分間混合する。次にＥＤＴＡを含有する停止液で凝血活性化を終了させ、消費されずに残った遊離ヒルジンを精密測定によって定量する。反応容器中のヒルジン量を正確に測定するために、色素形成物質を用いた市販の色素形成ヒルジン測定法（ＥＣＡエカリン色素形成法（Ecarin Chromogenic Assay）、国際公開第００／０４６６０２号パンフレット）を用いる。
【実施例２】
【００２１】
［ＴＨＲＯＧＡキットの例］
ＴＨＲＯＧＡキットの構成例を以下に示す。
２５×  凍結乾燥試薬を入れた活性化用試験管、赤ラベルで標識
２５×  凍結乾燥試薬を入れた参照用試験管
１×  参照曲線のための凍結乾燥試薬を入れた参照用試験管、赤点のついた蓋で標識
１×  １０倍濃度の停止試薬、６ｍｌ
２×  ＴＨＲＯＧＡコントロール、凍結乾燥、１．５ｍｌ用
２×  ＥＣＡプロトロンビン緩衝剤、凍結乾燥、６ｍｌ用
１×  ＥＣＡ−Ｈ−基質、即時使用可能溶液、３ｍｌ
２×  ＥＣＡ−エカリン試薬、凍結乾燥、３ｍｌ用
ＥＣＡプロトロンビン緩衝剤、ＥＣＡ−Ｈ−基質、ＥＣＡ−エカリン試薬：７日間使用
（毎日、３７℃で３時間調製、測定の間は２−８℃で保存）
それぞれ２−８℃で密閉保存したＥＣＡプロトロンビン緩衝剤、ＥＣＡ−Ｈ−基質、ＥＣＡ−エカリン試薬：２８日間
【００２２】
試薬類は測定装置内で３７℃に保つ一方で、それぞれの試薬は使用したら、蒸発を避けるために容器は密閉しなければならない。操作を終了したら、試薬類は２−８℃の密閉状態で保存しなければならない。
【実施例３】
【００２３】
クエン酸塩添加血液および／または血漿中の最大トロンビン生成量の測定
［試薬の調製］
試料試験管を装着する少なくとも３０分前には、プリセット・シェイカーのスイッチを入れておかねばならない。１０倍濃度の停止試薬は、個々の必要とされる量に応じて蒸留水で１０倍に希釈する必要がある。ＥＣＡ−Ｈ−基質はすぐに使用できる。ＥＣＡ−エカリン試薬、ＥＣＡプロトロンビン緩衝剤およびＴＨＲＯＧＡコントロールは、ラベルに示されている量の蒸留水に溶解し、十分に、しかし注意深く、容器をひっくり返して混合する。試薬類とコントロールは室温で４５分間かけて水で戻さなくてはならない。少なくとも一回の、この戻し時間の間または後に、容器をひっくり返して試薬類を注意深く混合する。
【００２４】
［必要ではあるが含まれていない材料および機器］
−  ＥＣＡ−Ｈに適応する色素形成反応を測定するための手動式凝血測定機器コアトロン（Coatron）Ｍ２、その付属消耗品および操作マニュアル（ヘモシス社（HaemoSys GmbH）の供給に関する情報）
−  プリセット・シェイカー（約５００ｒｐｍ）
−  ストップウオッチ
−  脱イオン水または蒸留水
−  先端チップを装着した適切な検量ずみピペット
−  血液試料を採取するための機材
【００２５】
［標本／試験材料］
−  クエン酸塩添加血液のクエン酸塩添加血漿、出来るだけ早く、少なくとも１０分間、１５００ｘｇで遠心分離して得られた血漿
−  ９重量部の静脈血と１重量部のクエン酸ナトリウム溶液（０．１１ｍｏｌ／ｌ）とを泡を立てないように、注意深く混合したクエン酸塩添加血液
−  １５−２５℃における試料の安定性：４時間
【００２６】
［方法］
［トロンビン生成］
一回の測定ごとに、参照用試験管と活性化用試験管のそれぞれに１００μｌのクエン酸塩添加血液または血漿を入れる。蒸発を避けるために、それぞれの試験管は溶解させた後に蓋をしなくてはならない。続いて、試験管をシェイカーに３０から６０分間かける。その後、反応を終了させるために、１０００μｌの停止溶液をそれぞれの試験管に加え、ピペットで慎重に混合する。
【００２７】
────────────────────────────────────────
参照用試験管                        活性化用試験管
────────────────────────────────────────
１００μｌの血漿                    １００μｌの血漿
３０分間シェイカーにかける
１０００μｌの停止溶液               １０００μｌの停止溶液
────────────────────────────────────────
【００２８】
［ＥＣＡ−Ｈによる抗トロンビン単位（ＡＴＵ）の測定］
次に、両ＴＨＲＯＧＡ試料（参照用試験管と活性化用試験管）について、ＥＣＡ−Ｈを用いて抗トロンビン単位（ＡＴＵ）を測定する。
【００２９】
ＥＣＡ−Ｈは、光学測定用付属品を備えた多くの自動および手動凝血測定機器で用いることができる。
【００３０】
［ＥＣＡ−Ｈに適応するコアトロン（Coatron）Ｍ２凝血測定機器を用いる方法の試験手順］
コアトロンＭ２の操作マニュアルを参照する。血液試料のＴＨＲＯＧＡを測定する際は、機器の「オートスタート」は切っておかなくてはならない。
【００３１】
測定機器は予め３７℃に温めておく。容器も測定機器内の容器収納ブロックで予め温めておく。ＥＣＡプロトロンビン緩衝剤、ＥＣＡ−エカリン試薬および、もし可能ならば、ＥＣＡ−Ｈ−基質も機器内で少なくとも１５分間は予め温めておく。
【００３２】
蒸発を防ぐために、試薬類は測定中、蓋をして密閉しておかねばならない。
【００３３】
コアトロンＭ２によるテストを実施するための詳細な情報は操作マニュアルの付録（ＥＣＡ−Ｈの応用）から得ることができる。
【００３４】
試薬類やＴＨＲＯＧＡ試料は、以下のようにしてピペットで容器内に導入する。
【００３５】
ピペットによる導入：ＥＣＡ−Ｈ
────────────────────────────────────────
３７℃に予熱した容器にピペットで導入
ＥＣＡプロトロンビン緩衝剤            １００μｌ
ＴＨＲＯＧＡ試料                      ２５μｌ
ＥＣＡ−Ｈ−基質                      ２５μｌ
混合し、１分間３７℃に保温
ＥＣＡ−エカリン試薬                  ５０μｌ
ＥＣＡ−エカリン試薬を最初にピペットで導入しなかった場合、時間の測定は導入の１５秒後から自動的に開始する。
────────────────────────────────────────
【００３６】
［評価］
測定結果は、測定時間（秒）と抗トロンビン単位（Ｕ、ＡＴＵ）として得られる。測定機器内に保存された参照曲線を使って結果の評価が行われる。
【００３７】
得られた参照用試験管および活性化用試験管のＡＴＵ値から、以下の式によって血漿もしくは血液試料内で生成されたトロンビン単位を計算する。
ＥＴＰ＝Ｒ−Ａ
ただし、
ＥＴＰ：最大内的トロンビン・ポテンシャル、１ｍｌの血液または血漿中で生成されたトロンビン単位
Ｒ：    参照用試験管中の抗トロンビン単位（ＡＴＵ／１ｍｌの血液または血漿）
Ａ：    活性化用試験管中の抗トロンビン単位（ＡＴＵ／１ｍｌの血液または血漿）
【００３８】
［参照曲線の作成］
正確な結果を得るために、新しい試薬類のバッチを使うたびに参照曲線を作成しなければならない。参照曲線を作成するためには、ＴＨＲＯＧＡ試料のかわりに以下のＴＨＲＯＧＡ標準試料を、それぞれ２５μｌ用いて４点で測定する。
【００３９】
ＴＨＲＯＧＡ標準希釈試料の調製
────────────────────────────────────────
ＴＨＲＯＧＡ標準試料                       調製
（濃度：抗トロンビン単位
／１ｍｌ血漿）
────────────────────────────────────────
２２４               参照用試験管、１１００μｌ停止溶液中に希釈
１１２               ５００μｌ標準２２５ＡＴＵ＋５００μｌ停止溶液
５６               ５００μｌ標準１１２．５ＡＴＵ＋５００μｌ停止溶液
０               停止溶液
────────────────────────────────────────
【００４０】
ＴＨＲＯＧＡ標準試料の測定は二重に行うことが好ましい。測定で得られたＥＣＡ−Ｈ反応時間の平均をとって、個々の標準試料の濃度とともに測定機器に入力する。その際、Ｕが濃度単位ＡＴＵ／１ｍｌ血液または血漿に相当することに注意しなければならない。参照曲線は測定機器内に保存される。
【００４１】
コアトロンＭ２での参照曲線の作成に関する詳細な情報は操作マニュアルの付録（ＥＣＡ−Ｈの応用）から得ることができる
【００４２】
［内部品質管理］
内部品質管理のために、ＴＨＲＯＧＡ法の血液や血漿のかわりに調製したＴＨＲＯＧＡコントロールを用いる。
【００４３】
測定したコントロール値が、ＴＨＲＯＧＡコントロールのラベルに示されたコントロール範囲外である場合、測定の信頼性は保証できない。試薬類をチェックし、そのような場合は取り替える必要がある。それでも測定したコントロール値が範囲外である場合は、測定機器の性能をチェックしなくてはならない。
【実施例４】
【００４４】
ＴＨＲＯＧＡ法による患者の検査：
ａ）対象者：Ｉ．Ｎ．、女性、３７歳
【００４５】
────────────────────────────────────────
ｒ−ヒルジン濃度（μｇ／ｍｌ）      １μｇ＝１５．８ＡＴＵ
血液                             血漿
────────────────────────────────────────
コントロール（Ａ）          １４．９                          １４．６
活性化試料（Ｂ）              ９．３                            ７．５
差（μｇ／ｍｌ）              ５．６                            ７．１
ＡＴＵ／ｍｌ；  ＴＵ／ｍｌ  ８８．５                        １１２．２
────────────────────────────────────────
評価：  Ｉ．Ｎ．の血漿中の活性化量１１２．２は正常である（正常値：１２２±１９ＴＵ／ｍｌ）。
【００４６】
対象者の血液中で、８８．５ＴＵ／ｍｌのトロンビンが生成されていることが測定できた。正常値は７８±１３ＴＵ／ｍｌである。従って、彼女はこの点でも正常範囲内にいる。
【００４７】
ｂ）患者：Ｃ．Ｒ．、女性、５５歳、大脳に外傷を受けた状態
１．クロピドグレル（clopidogrel）による血小板特異的治療の開始前（０４年１月７日）
【００４８】
────────────────────────────────────────
ｒ−ヒルジン濃度（μｇ／ｍｌ）      １μｇ＝１５．８ＡＴＵ
血液                             血漿
────────────────────────────────────────
コントロール（Ａ）          １３．２                          １４．２
活性化試料（Ｂ）              ６．９                            ６．７
差（μｇ／ｍｌ）              ６．３                            ７．５
ＡＴＵ／ｍｌ；  ＴＵ／ｍｌ  ９９．５                        １１８．５
────────────────────────────────────────
【００４９】
２．毎日１．５錠のクロピドグレル（clopidogrel）による治療を８週間行った後（０４年３月４日）
【００５０】
────────────────────────────────────────
ｒ−ヒルジン濃度（μｇ／ｍｌ）      １μｇ＝１５．８ＡＴＵ
血液                             血漿
────────────────────────────────────────
コントロール（Ａ）          １４．１                          １４．３
活性化試料（Ｂ）              ８．９                            ６．９
差（μｇ／ｍｌ）              ５．２                            ７．４
ＡＴＵ／ｍｌ；  ＴＵ／ｍｌ  ８２．２                        １１６．９
────────────────────────────────────────
【００５１】
評価：  最初の検査では、患者Ｃ．Ｒ．の血液は異常なＴＨＲＯＧＡ値９９．５（正常値：７８±１３ＴＵ／ｍｌ）を示していたが、８週間の血小板特異的治療の後には正常値８２．２になった。いずれの検査においても、血漿のＴＨＲＯＧＡ値は正常範囲内にあった。クロピドグレル（clopidogrel）治療における他のすべてのコントロールで、ＴＨＲＯＧＡ値は正常であった。
【００５２】
ｃ）患者：Ｍ．Ｆ．、男性、６４歳、診断：高ガンマグロブリン血症による栓友病；患者はファリトロン（falithrom）（経口抗凝血薬）による血栓症予防を受けている。０５年２月１２日
【００５３】
キット使用
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血液（ＡＴＵ／ｍｌ）        血漿（ＡＴＵ／ｍｌ）
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コントロール（Ａ）                ２６５．４                  ２５７．５
活性化試料（Ｂ）                  ２１９．１                  ２１８．２
差（μｇ／ｍｌ）                    ４６．３                    ３９．３
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【００５４】
評価：  患者Ｍ．Ｆ．の血漿中の値３９．３ＴＵ／ｍｌは正常な血漿値の３２％であり、これは十分に「治療範囲」内である。血液中では、まだ正常なトロンビン生成可能量の６０％である４６．３ＴＵ／ｍｌが得られた。この結果、出血傾向のないことが判り、この患者は最適に治療、投薬されていることが確認できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の方法を模式的に示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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