(57)【要約】シアニドを含まない溶解試薬組成物、および血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度および白血球を測定するための使用方法が、開示される。この溶解試薬組成物は、第四級アンモニウム界面活性剤を含み、赤血球を溶解してヘモグロビンおよびリガンドを遊離させ、ヘモグロビンとの安定な色原体を形成する。この溶解試薬組成物は、３〜１０の範囲内にあるｐＨを有する。この溶解試薬組成物はまた、第２の第四級アンモニウム界面活性剤を含み得る。
2008541046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアニドを含まない溶解試薬組成物であって：
（ｉ）以下の分子構造：
【化１】
2008541046.tif 000005
によって表される、第四級アンモニウム界面活性剤であって、
Ｒ１は、１０個〜１８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ−は、塩化物イオンまたは臭化物イオンであり；該第四級アンモニウム界面活性剤は、赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させるために十分な量である、第四級アンモニウム界面活性剤と；
（ｉｉ）
（ａ）シュウ酸、
（ｂ）リンゴ酸、
（ｃ）マロン酸、
（ｄ）エチレンジアミン、
（ｅ）Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、
（ｆ）Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン
（ｈ）ジエチレントリアミン、
（ｉ）テトラエチレンペンタアミン、
（ｊ）１，６−ヘキサンジアミン、
（ｋ）１，３−ペンタンジアミン、
（ｌ）２−メチルペンタメチレンジアミン、
（ｍ）１，２−ジアミノシクロヘキサン、
（ｎ）４−アミノアセトフェノン、
（ｏ）ビス−ヘキサメチレントリアミン、
（ｐ）ピリダジン、および
（ｒ）３，６−ジヒドロキシピリダジン、
からなる群から選択されるリガンドであって、該ヘモグロビンと安定な色原体を形成するために十分な量のリガンドと；
の水溶液を含み、
該溶解試薬組成物のｐＨは、約３〜約１０の範囲内にある、溶解試薬組成物。
【請求項２】
前記第四級アンモニウム界面活性剤が、約４ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの範囲内にある濃度を有する、請求項１に記載の溶解試薬組成物。
【請求項３】
前記リガンドが、約０．３ｇ／Ｌ〜約２５．０ｇ／Ｌの範囲の濃度にある、請求項１に記載の溶解試薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の溶解試薬組成物を用いて血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を測定する方法であって：
（ａ）該血液サンプルを血液希釈剤で希釈して、希釈されたサンプルを形成する工程；
（ｂ）該希釈されたサンプルを請求項１に記載の該溶解試薬組成物と混合してサンプル混合物を形成する工程であって、該溶解試薬組成物は、赤血球を溶解して該サンプル混合物中で安定なヘモグロビン色原体を形成するために十分な量である、工程；
（ｃ）該サンプル混合物のヘモグロビン色原体の吸光度を所定の波長で測定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた吸光度から該血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を決定する工程；ならびに
（ｅ）該血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を報告する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
前記吸光度が、約５１０ｎｍと約５６０ｎｍとの間で測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１のＤＣインピーダンス測定を用いて自動血液分析器中で前記サンプル混合物中の白血球の数を計数する工程；ならびに
該血液サンプルの白血球の数を報告する工程、
をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
シアニドを含まない溶解試薬組成物であって：
（ｉ）以下の分子構造：
【化２】
2008541046.tif 000006
によって表される、２種の第四級アンモニウム界面活性剤であって、
Ｒ１は、１０個〜１８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ−は、塩化物イオンまたは臭化物イオンである、２種の第四級アンモニウム界面活性剤と；
（ｉｉ）
（ａ）シュウ酸、
（ｂ）リンゴ酸、
（ｃ）マロン酸、
（ｄ）エチレンジアミン、
（ｅ）Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、
（ｆ）Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン
（ｈ）ジエチレントリアミン、
（ｉ）テトラエチレンペンタアミン、
（ｊ）１，６−ヘキサンジアミン、
（ｋ）１，３−ペンタンジアミン、
（ｌ）２−メチルペンタメチレンジアミン、
（ｍ）１，２−ジアミノシクロヘキサン、
（ｎ）４−アミノアセトフェノン、
（ｏ）ビス−ヘキサメチレントリアミン、
（ｐ）ピリダジン、および
（ｒ）３，６−ジヒドロキシピリダジン、
からなる群から選択されるリガンドであって、ヘモグロビンと安定な色原体を形成するために十分な量のリガンドと；
の水溶液を含み、
該溶解試薬組成物のｐＨは、約３〜約１０の範囲にあり；該界面活性剤は、赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させるが計数および識別分析のために白血球は保存するために十分な量である、溶解試薬組成物。
【請求項８】
前記リガンドが、約０．３ｇ／Ｌ〜約２５．０ｇ／Ｌの範囲の濃度にある、請求項７に記載の溶解試薬組成物。
【請求項９】
第１の第四級アンモニウム界面活性剤が、塩化ドデシルトリメチルアンモニウムである、請求項７に記載の溶解試薬組成物。
【請求項１０】
前記塩化ドデシルトリメチルアンモニウムが、約３０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの範囲の濃度にある、請求項９に記載の溶解試薬組成物。
【請求項１１】
第２の第四級アンモニウム界面活性剤が、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムである、請求項７に記載の溶解試薬組成物。
【請求項１２】
第２の面活性剤が、臭化セチルジメチルエチルアンモニウムである、請求項７に記載の溶解試薬組成物。
【請求項１３】
請求項７に記載の溶解試薬組成物を用いて血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を測定する方法であって：
（ａ）該血液サンプルを血液希釈剤で希釈して、希釈されたサンプルを形成する工程；
（ｂ）該希釈されたサンプルを請求項７に記載の該溶解試薬組成物と混合してサンプル混合物を形成する工程であって、該溶解試薬組成物は、赤血球を溶解して該サンプル混合物中で安定なヘモグロビン色原体を形成するために十分な量である、工程；
（ｃ）該サンプル混合物のヘモグロビン色原体の吸光度を所定の波長で測定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で得られた吸光度から該血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を決定する工程；ならびに
（ｅ）該血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を報告する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記吸光度が、約５１０ｎｍと約５６０ｎｍとの間で測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１のＤＣインピーダンス測定を用いて自動血液分析器中で前記サンプル混合物中の白血球の数を計数する工程；ならびに
該血液サンプルの白血球の数を報告する工程、
をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記自動血液分析器において第２のＤＣインピーダンス測定により前記サンプル混合物中の白血球のサイズを測定して該白血球のサイズ分布ヒストグラムを得る工程；
該分布ヒストグラムに従って、白血球部分集団を識別する工程；ならびに
白血球部分集団を報告する工程、
をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記白血球部分集団が、リンパ球、単球および顆粒球からなる群から選択される２つ以上の集団である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
シアニドを含まない溶解試薬組成物であって：
（ｉ）以下の分子構造：
【化３】
2008541046.tif 000007
によって表される、２種の第四級アンモニウム界面活性剤であって、
Ｒ１は、１０個〜１８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ−は、塩化物イオンまたは臭化物イオンである、２種の第四級アンモニウム界面活性剤と；
（ｉｉ）１，２−ジアミノシクロヘキサン、および３，６−ジヒドロキシピリダジンからなる群から選択されるリガンドであって、ヘモグロビンと安定な色原体を形成するために十分な量のリガンドと；
の水溶液を含み、
該溶解試薬組成物のｐＨは、約３〜約１０の範囲にあり；該界面活性剤は、赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させるが計数および識別分析のために白血球は保存するために十分な量である、溶解試薬組成物。
【請求項１９】
第１の第四級アンモニウム界面活性剤が、塩化ドデシルトリメチルアンモニウムである、請求項１８に記載の溶解試薬組成物。
【請求項２０】
第２の第四級アンモニウム界面活性剤が、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムまたは臭化セチルジメチルエチルアンモニウムである、請求項１９に記載の溶解試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、溶解試薬組成物；ならびに血液サンプルの総ヘモグロビン濃度および白血球を測定するために用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
総ヘモグロビンの決定は、全血の酸素運搬能力の指標である。臨床症状をもつ患者の検査に際して、および臨床的に正常な集団の電気泳動による調査によって、３００を超える異常ヘモグロビンが発見されている。これらの異常の多くは、改変されたヘモグロビンレベルを有する臨床病状、または酸素を結合する改変された能力を有するヘモグロビンを有する臨床病状を生じる。これらの疾患には、鎌状赤血球貧血、αサラセミアおよびβサラセミアの両方、ならびにヘモグロビンＭがある。
【０００３】
血液サンプル中のヘモグロビン（Ｈｇｂ）を測定する能力は、診断分析の最重要部分である。この能力はまた、ヘモグロビンに影響する疾患を取り扱う治療、およびヘモグロビンレベルに対する有害な副作用を有し得るその他の疾患を取り扱う治療に対する、応答性をモニターするために重要である。
【０００４】
健常被験体の末梢血中の白血球は、５つの型（すなわち、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）からなる。後者の３つの型の白血球は、集合的に顆粒球と称される。血液サンプル中で種々の型の白血球を計数および識別することは、臨床診断のために価値のある情報を提供する。
【０００５】
白血球の分類および計数は、最も一般的には、手動法とも称される識別分析法によって実施されている。自動血液分析器もまた、白血球を計数するために一般的に用いられ、赤血球を溶解するために溶解試薬を使用し、次いで、残りの白血球を測定する。単球、リンパ球および顆粒球を含む異なる型の白血球を計数する（識別分析）、より精緻な装置が開発されている。理想的には、単一の自動化ステップで、複数の診断分析（例えば、ヘモグロビン測定、および白血球の数を計数することまたは白血球部分集団の識別分析）を達成し得ることが所望される。
【０００６】
ヘモグロビン決定のための多くの周知の方法の中で、シアニドヘモグロビン法が、国際血液学標準協議会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）によって標準して推奨されている。ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＯｋｕｚｏｎｏによるこの方法の改変が、臨床実験室におけるその広範な使用に至った。この方法では、赤血球のヘモグロビンのすべての形態中のヘム基の鉄イオンが、フェリシアン化カリウムによってメトヘモグロビンに酸化される。このメトヘモグロビンは、次いで、このヘム基の鉄イオンに対して非常に高い親和性を有するシアニドアニオンで錯体化され、そしてシアンメトヘモグロビン色原体を形成する。この極度に安定な色原体は、５４０ｎｍに最大吸収を有し、これは、分光光度計によって手動で測定される。
【０００７】
標準的なシアンメトヘモグロビン法およびその改変された自動化法によって形成される安定な色原体にもかかわらず、この試薬の廃棄物は、用いられるシアン化カリウムが原因で、莫大な環境懸念を引き起こした。過去２０年間に、多大な努力が、シアニドを利用することのない自動化ヘモグロビン分析法を開発するために行われている。
【０００８】
非特許文献１は、中性ｐＨ（７．２）にあるラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（非イオン性界面活性剤）を含む、ヘモグロビン分析のための試薬の使用を教示する。このＳＬＳは、赤血球を溶解するために用いられる。このＳＬＳは、５３９ｎｍで最大吸収および５７２ｎｍでショルダーを有するＳＬＳ−ヘモグロビン複合体をさらに生成すると考えられている。この反応は、５〜１０分以内に終了して総ヘモグロビン測定は定量的である。しかし特許文献１（Ｓａｋａｔａ）で後に教示されたように、Ｏｓｈｉｒｏの方法では、ヘモグロビン測定と同時に白血球を分析することは可能ではない。
【０００９】
特許文献１（Ｓａｋａｔａ）は、白血球を計数するため、および血液サンプル中のヘモグロビン濃度を測定するための、シアニドを含まない溶解試薬を開示している。この溶解試薬は、第四級アンモニウム塩である少なくとも１種の第１の界面活性剤、カチオン性界面活性剤および両性界面活性剤を含む少なくとも１種の第２の界面活性、ならびに少なくとも１種のヘモグロビン安定化剤（Ｔｉｒｏｎ、８−ヒドロキシキノリン、ビピリジン、１−１０−フェナントロリン、フェノール化合物、ビスフェノール、ピラゾールおよび誘導体、第２フェニル５−ピラゾロンおよび誘導体、フェニル３−ピラゾロン、およびイミダゾールおよびその誘導体を含む群から選択される）を含む。Ｓａｋａｒａは、リンパ球凝集体、単球と好酸球と好塩基球との凝集体、および好中球凝集体を含む２つまたは３つのグループへの白血球の分画は、少なくとも２種の適切な界面活性剤を用いることにより、およびこの界面活性剤の濃度を厳格に制御することによってのみ達成され得ることを教示している。Ｓａｋａｔａはまた、この溶解試薬の好ましいｐＨ範囲は、５．０〜８．０であることを教示している。ｐＨ値が３．０以下である場合、白血球に対する損傷が増加し、それ故、白血球の測定を困難にする。ｐＨが９．０以上である場合、ヘモグロビンの安定性は、経時的に低下する。
【００１０】
ＫｉｍによるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２８９７は、全血サンプル中のヘモグロビンを決定するためのシアニドを含まない試薬を開示している。この試薬は、イミダゾールおよび誘導体、Ｎ−ヒドロキシアセトアミド、Ｈ−ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリンおよびイソキノリンからなる群から選択されるリガンドと；ラウリルジメチルアミンオキシドおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールからなる群から選択される強力な赤血球溶解能力を備えた界面活性剤と；を含む。この分析法は迅速であり、１０秒間未満である。しかし、この試薬は、極度のアルカリ条件下（ｐＨ  １１〜１４）でのみ機能する。さらに、Ｋｉｍによっては、白血球を計数する能力、または白血球部分集団を識別する能力は、教示されていない。
【００１１】
Ｌｉらによる特許文献２および特許文献３は、血液サンプル中のヘモグロビンおよび白血球の測定のための、有機リガンドを含むがシアニドを含まない試薬を開示している。この有機リガンドは、トリアゾールおよびその誘導体、テトラゾールおよびその誘導体、オキソン酸のアルカリ金属塩、メラミン、アニリン−２−スルホン酸、キナルジン酸、２−アミノ−１，３，４−チアジアゾール、トリアジンおよびその誘導体、ウラゾール、ＤＬ−ピペコリン酸、イソニコチンアミド、アントラニロニトリル、６−アザ−２−チオチミン、アデニン、３−（２−チオエニル）アクリル酸、安息香酸、安息香酸のアルカリ金属塩もしくはアンモニウム塩、またはピラジンもしくはその誘導体であり得る。
【００１２】
Ｗｏｎｇらによる特許文献４は、血液サンプル中のヘモグロビンおよび白血球の測定のための、シアニドを含まない試薬を開示する。この試薬は、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および他の酸塩から選択される、少なくとも１種のヒドロキシルアミン塩を含む。
【特許文献１】米国特許第５，２４２，８３２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７６３，２８０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８８２，９３４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７４０，５２７号明細書
【非特許文献１】Ｏｓｈｉｒｏら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１５８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
慣用の血液学分析器における比較的大きな消費のために安価でかつ環境にやさしいリガンドを含む、シアニドを含まない試薬に対する必要性がなお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、シアニドを含まない溶解試薬組成物に関する。このシアニドを含まない溶解試薬組成物は、
以下の分子構造：
【００１５】
【化４】
2008541046.tif 000003
によって表される、第四級アンモニウム界面活性剤であって、
Ｒ１は、１０個〜１８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ−は、塩化物イオンまたは臭化物イオンであり；上記第四級アンモニウム界面活性剤は、赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させるために十分な量である、第四級アンモニウム界面活性剤と；
シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタアミン、１，６−ヘキサンジアミン、１，３−ペンタンジアミン、２−メチルペンタメチレンジアミン、１，２−ジアミノシクロヘキサン、４−アミノアセトフェノン、ビス−ヘキサメチレントリアミン、ピリダジン、および３，６−ジヒドロキシピリダジンからなる群から選択されるリガンドであって、ヘモグロビンと安定な色原体を形成するために十分な量のリガンドと；
の水溶液を含む。上記溶解試薬組成物のｐＨは、約３〜約１０の範囲内にある。好ましくは、上記第四級アンモニウム界面活性剤は、塩化ドデシルトリメチルアンモニウムである。
【００１６】
別の実施形態では、上記溶解試薬組成物は、第２の第四級アンモニウム界面活性剤をさらに含む。好ましくは、上記第２の第四級アンモニウム界面活性剤は、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムまたは臭化セチルジメチルエチルアンモニウムである。
【００１７】
さらなる局面では、本発明は、上記溶解試薬組成物を用いて血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を測定する方法に関する。上記方法は、上記血液サンプルを血液希釈剤で希釈して、希釈されたサンプルを形成する工程；上記希釈されたサンプルを上記溶解試薬組成物と混合してサンプル混合物を形成する工程であって、上記溶解試薬組成物は、赤血球を溶解して上記サンプル混合物中で安定なヘモグロビン色原体を形成するために十分な量である、工程；上記サンプル混合物のヘモグロビン色原体の吸光度を所定の波長で測定する工程；上記吸光度から上記血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を決定する工程；ならびに上記血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を報告する工程、を包含する。好ましくは、上記吸光度は、約５１０ｎｍと約５６０ｎｍとの間で測定される。
【００１８】
さらに、上記方法は、第１のＤＣインピーダンス測定を用いて自動血液分析器中で上記サンプル混合物中の白血球の数を計数する工程；ならびに上記血液サンプルの白血球の数を報告する工程、をさらに包含する。さらに、上記方法は、上記自動血液分析器において第２のＤＣインピーダンス測定により上記サンプル混合物中の白血球のサイズを測定して上記白血球のサイズ分布ヒストグラムを得る工程；上記分布ヒストグラムに従って、白血球部分集団を識別する工程；ならびに白血球部分集団を報告する工程；をさらに包含し得る。
【００１９】
本発明およびその種々の利点は、添付の図面に参照がなされる以下の好ましい実施形態から、より良好に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
１つの実施形態では、本発明は、血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度の測定のため、そしてさらに上記血液サンプルの白血球の測定のための、シアニドを含まない溶解試薬組成物を提供する。上記シアニドを含まない溶解試薬組成物は、
（ｉ）以下の分子構造：
【００２１】
【化５】
2008541046.tif 000004
によって表される、第四級アンモニウム界面活性剤であって、
Ｒ１は、１０個〜１８個の炭素原子を有するアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、１個〜４個の炭素原子を有するアルキル基であり、そしてＸ−は、塩化物イオンまたは臭化物イオンである、第四級アンモニウム界面活性剤と；
（ｉｉ）
（ａ）シュウ酸、
（ｂ）リンゴ酸、
（ｃ）マロン酸、
（ｄ）エチレンジアミン、
（ｅ）Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、
（ｆ）Ｎ，Ｎ’−ジエチルエチレンジアミン
（ｈ）ジエチレントリアミン、
（ｉ）テトラエチレンペンタアミン、
（ｊ）１，６−ヘキサンジアミン、
（ｋ）１，３−ペンタンジアミン、
（ｌ）２−メチルペンタメチレンジアミン、
（ｍ）１，２−ジアミノシクロヘキサン、
（ｎ）４−アミノアセトフェノン、
（ｏ）ビス−ヘキサメチレントリアミン、
（ｐ）ピリダジン、および
（ｒ）３，６−ジヒドロキシピリダジン、
からなる群から選択されるリガンドであって、ヘモグロビンと安定な色原体を形成するために十分な量のリガンドと；
の水溶液を含む。
【００２２】
上記溶解試薬組成物のｐＨは、約３〜約１０の範囲内にある。
【００２３】
上記溶解試薬組成物は、上記の記載の分子構造によって表されるような第２の第四級アンモニウム界面活性剤をさらに含み得る。１つの好ましい実施形態では、上記溶解試薬組成物は、塩化ドデシルトリメチルアンモニウムと臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムとの組み合わせを含む。別の好ましい実施形態では、上記溶解試薬組成物は、塩化ドデシルトリメチルアンモニウムと臭化セチルジメチルエチルアンモニウムとの組み合わせを含む。
【００２４】
上記溶解試薬組成物中の界面活性剤またはその組み合わせの濃度は、赤血球を溶解してヘモグロビンを遊離させるが白血球の計数およびそのサイズもしくは容量の測定のために白血球を保存するために、十分な量である。上記溶解試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、約２ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、好ましくは、約４ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌの範囲内にある。
【００２５】
血液サンプルが、上記の溶解試薬組成物と混合された場合、赤血球は完全に溶解され、そしてヘモグロビンがサンプル混合物中に遊離され、このヘモグロビンは、この溶解試薬組成物中のリガンドと接触する際に、安定な色原体を形成する。このヘモグロビン色原体は、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度法によって所定の波長で測定され得る。その一方、この溶解試薬組成物との混合に際し、白血球の細胞膜は透過処理され、そして細胞質は実質的に遊離されるが、核は保存される。残りの白血球は、計数または白血球部分集団の識別分析の目的のために、直流（ＤＣ）インピーダンス測定によって測定され得る。
【００２６】
赤血球を溶解するに際して遊離されるヘモグロビンは、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、カルボキシヘモグロビンなどの種々の形態を含む。定量的および正確であるべき測定には、形成される色原体は、測定期間の間に安定である必要がある。ヘモグロビンを安定な色原体に変換する最も効率的な方法は、ヘム鉄に対する高い親和性を有しかつ安定ヘモグロビン複合体を形成する、リガンドを提供することである。これは、シアンメトヘモグロビン法によって首尾良く示されており、この方法において、シアニドアニオンは、ヘム鉄に対して極度に高い親和性を有する。用語「ヘモグロビン複合体」および「ヘモグロビン色原体」は、本願明細書では交換可能に用いられる。通常、高親和性リガンドの不在下では、形成されるヘモグロビン色原体は、十分に安定ではないかも知れない。この色原体の吸収は、変動し、ほとんどの場合では、時間とともに減衰する。この状態の下では、この分析の方法は、たとえ、この反応の動力学が良好にモニターされそして補正されたとしても、信頼性はない。なぜなら、この色原体は、温度条件およびサンプル調製条件などの種々の環境因子に非常に感受性であり得るからである。適切なヘモグロビンリガンドが提供される場合、ヘモグロビン変換は定量的であり得、そして血液サンプルの総ヘモグロビン濃度の信頼性ある測定は、形成されたヘモグロビン色原体の安定性によって確実にされ得る。
【００２７】
上記のリガンドは、血液分析器において一般的に用いられる時間の間に、ヘモグロビンを安定な色原体に効率的に変換し得ることが見出された。上記溶解試薬組成物中のリガンドの濃度は、安定なヘモグロビン色原体を形成するために十分な量である。この濃度は、用いられる特定のリガンドによって、このリガンドのヘモグロビンに対する親和性に依存して変動する。この溶解試薬組成物中のリガンドの量が十分ではない場合、形成されたヘモグロビン色原体は不安定であり得る。本発明の溶解試薬組成物中のリガンドの濃度は、約０．３ｇ／Ｌ〜約２５．０ｇ／Ｌ、好ましくは約５．０ｇ／Ｌ〜約２０．０ｇ／Ｌの範囲内にある。
【００２８】
上記の溶解試薬組成物の界面活性剤およびリガンドの濃度は、ヘモグロビンおよび白血球の測定が、サンプル調製物における適切な血液希釈剤の使用により達成される濃度である。しかし、上記のこれら成分の濃度は、溶解試薬組成物と、上記サンプル混合物を調製するために用いた希釈剤との間の容量比に依存して、調整され得る。
【００２９】
さらに、血液分析器が、血液希釈剤による予備希釈なくして、単一の溶解試薬組成物を使用する場合、溶解試薬組成物の界面活性剤およびリガンドの濃度を減少し、インピーダンス測定のためのその使用を可能にするようにこの溶解試薬組成物の導電率を調整し得る。この導電率は、適切な量のアルカリ金属塩の添加によって調整され得る。この型の単一試薬法では、上記溶解試薬組成物中の界面活性剤およびリガンドの濃度は、希釈剤および溶解試薬組成物の両方が用いられる場合に最終サンプル混合物中に含まれる濃度と、同じである。
【００３０】
必要に応じた添加物もまた、本発明の溶解試薬組成物中に、それらの存在が、上記溶解試薬組成物の主要な機能的成分と適合する濃度で含まれ得る。これら添加剤の中には、上記組成物の貯蔵寿命を増加する抗酸化性質を有しかつ抗微生物性質を有する、保存剤がある。
【００３１】
実施例１は、本発明のシアニドを含まない溶解試薬組成物の２つの例を示す。
【００３２】
さらなる実施形態では、本発明は、血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度を測定するために上記のシアニドを含まない溶解試薬組成物を用いる方法を提供する。この方法は：血液サンプルを血液希釈剤で希釈して、希釈されたサンプルを形成する工程；この希釈されたサンプルを上記溶解試薬組成物と混合し、サンプル混合物を形成して赤血球を溶解して上記サンプル混合物中に安定なヘモグロビン色原体を形成する工程；上記サンプル混合物のヘモグロビン色原体の吸光度を所定の波長において測定する工程；得られた吸光度から上記血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を決定する工程；ならびに上記血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を報告する工程、を包含する。上記血液サンプルの吸光度は、約５１０ｎｍと約５６０ｎｍとの間で測定される。
【００３３】
好ましい実施形態では、上記方法は、白血球の数を計数する工程、および自動血液分析器においてＤＣインピーダンス測定を用いて上記サンプル混合物中の白血球部分集団を識別する工程；をさらに包含する。
【００３４】
ＤＣインピーダンス測定デバイスを装備した血液分析器によって白血球を計数するために用いられる検出方法は、一般に、米国特許第２，６５６，５０８号に記載され、この特許は、その全体が本明細書によって参考として援用される。ＤＣインピーダンス測定を用いて白血球部分集団を識別する方法は、米国特許第４，４８５，１７５号および同第４，５２８，２７４号に記載され、これらの特許は、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。
【００３５】
本発明の溶解試薬組成物を用いて血液サンプルの総ヘモグロビンを測定するプロセスは、一般に本明細書に記載され、これは、本明細書で以後実施例２で詳細にさらに説明される。抗凝固処理された血液サンプルは、適切な血液希釈剤によって希釈され、次いで、十分な量の上記される溶解試薬組成物が、この希釈されたサンプルと、手動混合または機械的混合により混合されて、サンプル混合物を形成する。血液の希釈率は、総試薬容量  対  血液サンプルで、約１２５：１〜約５００：１である。このサンプル混合物は、分光光度計において、または光検出器を装備した自動血液分析器において、上記溶解試薬組成物の添加の後に約１０秒間〜約６０秒間、所定の吸収波長で測光法により測定される。この血液分析器は、白血球の数を計数するため、または得られる集団分布ヒストグラムに基づいて、白血球部分集団をさらに識別するために、さらにＤＣインピーダンス測定デバイスが装備されても良い。後者の事例では、白血球は、リンパ球、単球および顆粒球を含む、２つ以上の部分集団に区別される。
【００３６】
本発明の溶解試薬組成物とともに用いられ得る血液希釈剤は、等張性希釈剤であり、これは、血液サンプルを希釈するために市販の血液学分析器において一般に用いられている。適切な例としては、米国特許第４，５２１，５１８号、同第４，５２８，２７４号、同第５，９３５，８５７号および同６，７０６，５２６号に記載される希釈剤が挙げられる。これらの特許は、これらの全体の内容が本明細書によって参考として援用される。
【００３７】
図１は、実施例２の処方Ｃの溶解試薬組成物、および希釈剤としてＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＩＳＯＴＯＮ（登録商標）３Ｅ（Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ））によって製造される市販の血液希釈剤）を用いて、実施例２の手順に従って処理された血液サンプルの一連の吸収スペクトルを示す。図１は、上記溶解試薬組成物の添加の後、１０秒間隔で、１２秒から１３２秒まで獲得した、合計１２個のスペクトルを示す。ヘモグロビン色原体のスペクトルは、非常に安定であり、そして１２０秒の試験期間の間にシフトも崩壊も示さない。
【００３８】
本発明の溶解試薬組成物を上記のリガンドとともに用いることにより形成される大部分の色原体は、約５１０ｎｍと約５６０ｎｍとの間にそれらの最大吸収を有する。従って、これら色原体は、特定の色原体の吸収係数の組み込みを備えた大部分の市販の血液分析器によって測定され得る。
【００３９】
本発明の溶解試薬組成物およびそれを用いる方法は、正確なヘモグロビン測定および白血球の正確な計数を提供する。図２は、従来の溶解試薬を用いてＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＬＨ７５０血液学分析器（Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ）の製品）において得られたヘモグロビン濃度と、実施例１の処方Ａを用いて得たヘモグロビン濃度との間の、優れた線形相関関係を示す。図３は、従来の溶解試薬を用いてＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＬＨ７５０血液学分析器において得られた白血球数と、同器具において実施例１の処方Ａを用いて得た結果との間の、優れた線形相関関係を示す。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の例示である。以下の実施例は、いかなる様式においても、特許請求の範囲において規定されるような本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
以下の溶解試薬組成物を調製した。
・処方Ａ
１，２−ジアミノシクロヘキサン                                  １０．０ｇ
塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（５０％溶液）                ３５．６ｇ
臭化セチルジメチルエチルアンモニウム                            １．２５ｇ
１リットルに調整するための蒸留水
ｐＨ                                                            ５．５
・処方Ｂ
３，６−ジヒドロキシピリダシン                                  １０．０ｇ
塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（５０％溶液）                ５０．０ｇ
臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム                          ３．５ｇ
１リットルに調整するための蒸留水
ｐＨ                                                            ６．０。
【００４２】
（実施例２）
・処方Ｃ
１，２−ジアミノシクロヘキサン                                  １６．８ｇ
塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（５０％溶液）                ３５．５ｇ
臭化セチルジメチルエチルアンモニウム                            ２．０ｇ
１リットルに調整するための蒸留水
ｐＨ                                                            ５．５。
【００４３】
１１．６μｇの全血サンプルを、２５００μｌのＩＳＯＴＯＮ（登録商標）３Ｅで希釈し、次いで４０３μｌの処方Ｃの溶解試薬組成物を、上記予備希釈されたサンプルと手動で混合した。このサンプル混合物の吸収スペクトルを、直ちに、Ｂｅｃｈｍａｎ  ＤＵ７５００分光光度計において測定した。図１は、処方Ｃを用いて上記手順に従って処理された血液サンプルの合計１２個のスペクトルを示す。これらスペクトルは、上記溶解試薬組成物の添加の１２秒後から、１０秒間隔で獲得した。
【００４４】
（実施例３）
１１１個の血液サンプル、６ｇ／ｄＬ〜１７ｇ／ｄＬの範囲のそれらのヘモグロビン濃度、および１，０００／μＬ〜４０，０００／μＬの範囲の白血球数を、上記溶解試薬を処方Ａによって置換したこと以外は標準的な器具形態の下、較正済みＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＬＨ７５０器具において分析した。これらのサンプルをまた、溶解試薬としてＬＹＳＥ  Ｓ（登録商標）ＩＩＩ  ｄｉｆｆを用いた別の参照ＬＨ７５０器具において分析された。上記サンプルのうちの５０％よりも多くが、種々の臨床条件を含む臨床サンプルであった。
【００４５】
図２は、処方Ａを用いて得た結果と、参照器具において得られた結果との間での、ヘモグロビン濃度の相関関係を示す。図３は、処方Ａを用いて得た結果と、参照器具において得られた結果との間の、白血球の数（白血球（ＷＢＣ）（１０３／μＬ）として報告される）の相関関係を示す。
【００４６】
図４Ａおよび４Ｂは、処方Ａを用いる器具において得られた１つの血液サンプルの白血球分布ヒストグラム、および参照器具において得られた１つの血液サンプルの白血球分布ヒストグラムを、それぞれ示す。示されるように、処方Ａを用いると、参照試薬ＬＹＳＥ  Ｓ（登録商標）ＩＩＩ  ｄｉｆｆを用いて得た白血球分布と同様に、白血球は、リンパ球、単球および顆粒球に区別された。
【００４７】
本発明は、詳細に説明され、添付の図面中に絵で示されているが、これらは、本発明の範囲に対する限定と解釈されるべきではなく、その好ましい実施形態の例示として解釈されるべきである。しかし、種々の改変および変更が、上記明細書で説明されそして添付の特許請求の範囲およびそれらの法的な等価物において規定される、本発明の思想および範囲内でなされ得ることが、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、実施例２の処方Ｃの溶解試薬組成物を用いて実施例２の手順に従って処理された血液サンプルの一連の吸収スペクトルを示す。
【図２】図２は、処方Ａを用いて得た結果と、参照器具において得られた結果との間での、ヘモグロビン濃度の相関関係を示す。
【図３】図３は、処方Ａを用いて得た結果と、参照器具において得られた結果との間での白血球の数（白血球（ＷＢＣ）（１０３／μＬ）として報告される）の相関関係を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、処方Ａを用いる器具および参照器具において得られた、１種の血液サンプルの白血球分布ヒストグラムをそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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