(57)【要約】本発明は、異種の分泌性ポリペプチドの産生に有用なリーダー配列；異種の分泌ポリペプチド；このようなリーダー配列および異種の分泌ポリヌクレチドをコードする核酸構築体；このような核酸構築体を含有するベクター；このような核酸構築体、ベクターおよびポリペプチドを含有する組換え宿主細胞；ならびにこのような異種のリーダー配列を伴うこのような分泌ポリペプチドを作製する方法およびこのような分泌ポリペプチドを使用する方法を、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌リーダーおよび第２ポリペプチドを含む異種ポリペプチドであって、該分泌リーダーが、該第２ポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結しており、ここで、該分泌リーダーは、天然において該第２ポリペプチドにそのように連結しておらず、そして分泌性タンパク質のリーダー配列を含む、異種ポリペプチド。
【請求項２】
前記第２ポリペプチドが、ＩＸ型コラーゲンα１鎖、長鎖スプライシング型、α−２−抗プラスミン前駆体（α−２−プラスミンインヒビター）、５含有トリヌクレオチドリピート、ＡＲＭＥＴタンパク質、カルメニン、ＣＯＬ９Ａ１タンパク質、ＮＢＬ１、ＰＡＣＡＰタンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（α−１−Ｂ糖タンパク質）、脳特異的血管新生インヒビター２前駆体に類似、ＳＰＯＣＫ２、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ５３４１）ＥＲ６０前駆体、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１）、ＧＭ２ガングリオシドアクチベーター前駆体、凝固因子Ｘ前駆体、分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、骨シアロタンパク質１）、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体、インターロイキン６（インターフェロン、β２）、オロソムコイド１前駆体、ヘモペキシン、糖タンパク質ホルモン、αポリペプチド前駆体、キニノーゲン１、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、βサブユニット、プロオピオメラノコルチン、プロスタグランジンＤ２合成酵素２１ｋＤａ、α−２−糖タンパク質１、亜鉛、クロモグラニンＡ、シスタチンＭ前駆体、クラステリンアイソフォーム１、インターα（グロブリン）インヒビターＨ１、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、ルミカン、セクレトグロビン、ファミリー２Ａ、メンバー２、ｎｏｖ前駆体、レチクロカルビン１前駆体、レチクロカルビン２、ＥＦハンドカルシウム結合ドメイン、胃内因子（ビタミンＢ合成）、ケルベロス１、リポカリン２（癌遺伝子２４ｐ３）、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＣ前駆体、ＥＦハンドドメインを有する細胞増殖制御因子１、白血球免疫クロブリン様受容体、サブファミリーＡ、スポンジン２、細胞外マトリックスタンパク質、膜貫通タンパク質４、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン、ρＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２５アイソフォームｂ、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３、アメロブラスチン前駆体、絨毛性ゴナドトロピン、βポリペプチド８前駆体、多発性凝固因子欠乏症２、共通唾液タンパク質１に類似、機能未知タンパク質ＦＬＪ３２１１５、腫瘍性タンパク質誘導転写物３、機能未知タンパク質ＭＧＣ４０４９９、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＡ前駆体、インターロイキン１受容体アンタゴニストアイソフォーム１前駆体、ＷＦＩＫＫＮ２タンパク質、機能未知タンパク質９３３０１４０Ｇ２３に類似、ならびに配列番号２〜３、９、１９、２２、２６、２８、３１、３７、４１、４７、５４、５７、６２、６８、７５、７９、８２、８６、８８、９４、９７、１０２、１０４、１０７、１１１、１１６、１２０、１２７、１３１、１３７、１４０、１４５、１４７、１５３、１５９、１６７、１７５、１７７、１８１、１８５、１８９、１９１、１９６、２００、２０７、２０９、２１５、２１８、２２２、２２７、２３２、２３５、２３９、２４１、２４５、２４８および２５４から選択される分泌タンパク質である、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項３】
前記分泌リーダーが、配列番号２０〜２１、２３〜２５、２７、３２〜３６、３８〜４０、４８〜５３、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、９５〜９６、１０３、１０８〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１７８〜１８０、１８６〜１８８、１９７〜１９９、２１０〜２１４、２２３〜２２６、２３３〜２３４、２４０および２４６〜２４７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項４】
前記第２ポリペプチドが、分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項５】
前記分泌性ポリペプチドが、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン、刺激因子、抑制因子、可溶性受容体、およびそのスプライスバリアントから選択される、請求項４に記載の異種ポリペプチド。
【請求項６】
表１の分泌性ポリペプチドのリーダー配列、および表２に記載の分泌リーダーから選択される、リーダーアミノ酸配列を含む分泌リーダー。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が付表Ａのアミノ酸配列、配列番号１、４〜８、１０〜１８、２０〜２１、２３〜２５、２７、２９〜３０、３２〜３６、３８〜４０、４２〜４６、４８〜５３、５５〜５６、５８〜６１、６３〜６７、６９〜７４、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、８９〜９３、９５〜９６、９８〜１０１、１０３、１０５〜１０６、１０９〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１４６、１４８〜１５２、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１６８〜１７４、１７６、１７８〜１８０、１８２〜１８４、１８６〜１８８、１９０、１９２〜１９５、１９７〜１９９、２０１〜２０６、２０８、２１０〜２１４、２１６〜２１７、２１９〜２２１、２２３〜２２６、２２８〜２３１、２３３〜２３４、２３６〜２３８、２４０、２４２〜２４４、２４６〜２４７、２４９〜２５３および２５５〜２５６のアミノ酸残基から選択される、請求項６に記載の分泌リーダー。
【請求項８】
融合パートナーをさらに含む、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合パートナーがポリマーである、請求項８に記載の異種ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリマーが該第３分子であり、第３分子がポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分、フェチュインＡ、フェチュインＢ、およびＦｃから選択される、請求項９に記載の異種ポリペプチド。
【請求項１１】
（１）請求項１から５および請求項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および（２）請求項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１２】
請求項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーをコードする第１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含む異種ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該第１ポリヌクレオチドおよび該第２ポリヌクレオチドが、細胞からの該異種ポリペプチドの分泌を容易にするように作動可能に連結しており、ここで、該第１ポリヌクレオチドおよび該第２ポリヌクレオチドが天然においてそのように連結していない核酸分子。
【請求項１３】
前記第２ポリペプチドが分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
コザック配列またはその５’末端に位置するその断片である第３ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
制限酵素切断可能な配列をその３’末端に含む第４ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
タグをコードする第５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記タグが精製タグである、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記タグがＶ５、ＨｉｓＸ６、ＨｉｓＸ８、アビジン分子、およびビオチン分子から選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１９】
第２酵素によって切断することができる酵素切断可能な第２配列をコードする第６ポリヌクレオチドをさらに含み、該切断可能な第２配列が、前記タグが異種のポリペプチドのＣ末端に位置している場合、該タグの上流に位置しており、または該タグが異種ポリペプチドのＮ末端に位置している場合、該タグの下流に位置している、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記第２酵素がトロンビンまたはタバコウイルス由来のＴＥＶである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
複製起点および選択マーカーをさらに含む、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
前記複製起点がＳＶ４０  ｏｒｉ、Ｐｏｌ  ｏｒｉ、ＥＢＮＡ  ｏｒｉ、およびｐＭＢ１  ｏｒｉから選択される、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
前記抗生物質耐性がピューロマイシン耐性、カナマイシン耐性、およびアンピシリン耐性から選択される、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
細胞、ならびに請求項１から４および請求項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチド、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項２１から２４のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２６】
真核細胞細胞である、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
ヒト細胞である、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、および
（ｂ）該核酸分子を発現系において発現させること
を含む方法。
【請求項２９】
前記発現系が細胞発現系または無細胞発現系である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現系が細胞発現系であり、前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞が２９３細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系、およびＣＨＯ細胞系から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記２９３細胞が２９３−Ｔ細胞または２９３−６Ｅ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年１月２７日に米国特許商標庁に出願された仮出願第６０／６４７，０１３号の特典を主張するものであり（米国特許法第１１９条（ｅ）項に従う）、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、異種の分泌性ポリペプチドの産生に有用なリーダー配列；異種の分泌ポリペプチド；このようなリーダー配列をコードする核酸構築体；このような異種の分泌性ポリペプチドをコードする核酸構築体；このような核酸構築体を含有するベクター；このような核酸構築体、ベクターおよびポリペプチドを含有する組換え宿主細胞；ならびにこのような異種のリーダー配列を伴うこのような分泌性ポリペプチドを作製する方法；およびこのような分泌性ポリペプチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
タンパク質は、生物において最も重要な生体分子である。タンパク質は、構造成分および触媒であることに加えて、調節過程において重大な役割を果たしている。多数の細胞タンパク質および細胞外タンパク質の協力により、細胞の増殖および代謝の調節が制御され、影響を受ける。例えば、生理反応に影響を及ぼす多くのシグナル伝達経路は、タンパク質を介して分子間相互作用により作動する。
【０００４】
細胞外タンパク質は、本明細書で「分泌タンパク質」または「分泌性タンパク質」と称することがあるが、細胞間のシグナル伝達物質として機能することが多い。細胞外タンパク質は、この役割においてリガンドとして働く。リガンド／受容体結合事象が細胞表面上で起こる場合、細胞外タンパク質の対応物である、細胞外、細胞内または細胞質ドメインを有する膜結合受容体が細胞外シグナルを細胞中に伝達する。
【０００５】
受容体が潜在的に重要な治療標的となることが多いが、分泌性タンパク質は治療薬として特に興味深い。受容体は、シグナル伝達経路またはホルモン経路に頻繁に関与するので、分泌性タンパク質は、高く特異的な生物活性を示す傾向がある（非特許文献１）。例えば、分泌性タンパク質は、分化および増殖、血液凝固および血栓溶解、体細胞増殖および細胞死、ならびに様々な免疫応答などの生理的過程を制御または調節することが報告されている（同上）。新たな分泌性タンパク質を発見し、その調節機能を調査するために重要な資源および研究努力が費やされてきた。サイトカインおよびペプチドホルモンを含めたこうした分泌性タンパク質の一部は、治療薬として製造および使用されているが（非特許文献２）、分泌され、潜在的に治療上有効であることが期待される何千ものタンパク質の中で少数派を構成している。
【０００６】
通常、分泌性タンパク質は、「タンパク質前駆体」と称されることがある完全長ポリペプチドとして発現され、次いで翻訳後段階で小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体においてプロセシングされる。この段階で、シグナルペプチダーゼが、「シグナルペプチド」（ＳＰ）または「分泌リーダー配列」と一般に称される配列である特有の疎水性アミノ酸配列をＮ末端で切断する。通常のＳＰは、約１６〜３０アミノ酸残基長である。次いで、ＳＰなしの生じたポリペプチドは細胞外に輸送される。生じたポリペプチドは、「成熟タンパク質」または「分泌ポリペプチド」と呼ばれる。また、元の分泌性タンパク質と比べて、この成熟タンパク質はシグナルペプチド配列を欠いている。線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーの一部など、ＳＰをＮ末端に有していないタンパク質もある。
【非特許文献１】Ｓｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，「Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．」，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９４年
【非特許文献２】Ｚａｖｙａｌｏｖら，ＡＰ，第１０５巻，第３号，ｐ．１６１−１８６，１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然に存在する分泌性タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその生理的役割に依存して様々な量で発現される。こうした分泌性タンパク質の大部分は、商業的に使用するには、その天然の、または内因性ＳＰの調節下で発現される量が少なすぎる。したがって、治療への応用に対する製造の必要性に応えるために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分泌タンパク質の産生を可能にする核酸構築体および方法が発明されれば有利であるはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質を、その内因性のシグナルペプチドを含む配列から産生する場合よりも高い収量でこのようなタンパク質を産生するための核酸およびポリペプチド構築体を提供する。本発明はまた、タンパク質を、その内因性のシグナルペプチドを伴う、または内因性のシグナルペプチドなしのタンパク質をコードするＤＮＡ配列から産生する場合よりも高い収量でこのようなタンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、および方法を提供し、このより高い収量は、内因性の分泌リーダー配列を本発明の異種の分泌リーダー配列に置き換えることか、または本発明の異種の分泌リーダー配列に、リーダー配列をそうでなければ含有しないタンパク質を付加することのいずれかによって達成される。したがって、本発明は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド構築体を提供し、このポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、融合パートナーと融合分子を形成するように修飾される。本発明の融合分子は、従来の任意の技法によって調製することができる。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の実施形態を含む。
【００１０】
１．分泌リーダーおよび第２ポリペプチドを含む異種ポリペプチドであって、分泌リーダーが、第２ポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結しており、ここで、分泌リーダーは、天然において第２ポリペプチドにそのように連結しておらず、そして分泌性タンパク質のリーダー配列を含む異種ポリペプチド。
【００１１】
２．第２ポリペプチドが、ＩＸ型コラーゲンα１鎖、長鎖スプライシング型、α−２−抗プラスミン前駆体（α−２−プラスミンインヒビター）、５含有トリヌクレオチドリピート、ＡＲＭＥＴタンパク質、カルメニン、ＣＯＬ９Ａ１タンパク質、ＮＢＬ１、ＰＡＣＡＰタンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（α−１−Ｂ糖タンパク質）、脳特異的血管新生インヒビター２前駆体に類似、ＳＰＯＣＫ２、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ５３４１）ＥＲ６０前駆体、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１）、ＧＭ２ガングリオシドアクチベーター前駆体、凝固因子Ｘ前駆体、分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、骨シアロタンパク質１）、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体、インターロイキン６（インターフェロン、β２）、オロソムコイド１前駆体、ヘモペキシン、糖タンパク質ホルモン、αポリペプチド前駆体、キニノーゲン１、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、βサブユニット、プロオピオメラノコルチン、プロスタグランジンＤ２合成酵素２１ｋＤａ、α−２−糖タンパク質１、亜鉛、クロモグラニンＡ、シスタチンＭ前駆体、クラステリンアイソフォーム１、インターα（グロブリン）インヒビターＨ１、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、ルミカン、セクレトグロビン、ファミリー２Ａ、メンバー２、ｎｏｖ前駆体、レチクロカルビン１前駆体、レチクロカルビン２、ＥＦハンドカルシウム結合ドメイン、胃内因子（ビタミンＢ合成）、ケルベロス１、リポカリン２（癌遺伝子２４ｐ３）、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＣ前駆体、ＥＦハンドドメインを有する細胞増殖制御因子１、白血球免疫クロブリン様受容体、サブファミリーＡ、スポンジン２、細胞外マトリックスタンパク質、膜貫通タンパク質４、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン、ρＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２５アイソフォームｂ、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３、アメロブラスチン前駆体、絨毛性ゴナドトロピン、βポリペプチド８前駆体、多発性凝固因子欠乏症２、共通唾液タンパク質１に類似、機能未知タンパク質ＦＬＪ３２１１５、腫瘍性タンパク質誘導転写物３、機能未知タンパク質ＭＧＣ４０４９９、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＡ前駆体、インターロイキン１受容体アンタゴニストアイソフォーム１前駆体、ＷＦＩＫＫＮ２タンパク質、機能未知タンパク質９３３０１４０Ｇ２３に類似、ならびに配列番号２〜３、９、１９、２２、２６、２８、３１、３７、４１、４７、５４、５７、６２、６８、７５、７９、８２、８６、８８、９４、９７、１０２、１０４、１０７、１１１、１１６、１２０、１２７、１３１、１３７、１４０、１４５、１４７、１５３、１５９、１６７、１７５、１７７、１８１、１８５、１８９、１９１、１９６、２００、２０７、２０９、２１５、２１８、２２２、２２７、２３２、２３５、２３９、２４１、２４５、２４８および２５４からなる群から選択される分泌タンパク質である、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１２】
３．分泌リーダーが、配列番号２０〜２１、２３〜２５、２７、３２〜３６、３８〜４０、４８〜５３、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、９５〜９６、１０３、１０８〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１７８〜１８０、１８６〜１８８、１９７〜１９９、２１０〜２１４、２２３〜２２６、２３３〜２３４、２４０および２４６〜２４７から選択されるアミノ酸配列を含む、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１３】
４．第２ポリペプチドが、分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１４】
５．分泌性ポリペプチドが、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン、刺激因子、抑制因子、可溶性受容体、およびそのスプライスバリアントから選択される、項４に記載の異種ポリペプチド。
【００１５】
６．表１の分泌性ポリペプチドのリーダー配列、および表２に記載の分泌リーダーから選択される、リーダーアミノ酸配列を含む分泌リーダー。
【００１６】
７．アミノ酸配列が付表Ａのアミノ酸配列、配列番号１、４〜８、１０〜１８、２０〜２１、２３〜２５、２７、２９〜３０、３２〜３６、３８〜４０、４２〜４６、４８〜５３、５５〜５６、５８〜６１、６３〜６７、６９〜７４、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、８９〜９３、９５〜９６、９８〜１０１、１０３、１０５〜１０６、１０９〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１４６、１４８〜１５２、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１６８〜１７４、１７６、１７８〜１８０、１８２〜１８４、１８６〜１８８、１９０、１９２〜１９５、１９７〜１９９、２０１〜２０６、２０８、２１０〜２１４、２１６〜２１７、２１９〜２２１、２２３〜２２６、２２８〜２３１、２３３〜２３４、２３６〜２３８、２４０、２４２〜２４４、２４６〜２４７、２４９〜２５３および２５５〜２５６のアミノ酸残基から選択される、項６に記載の分泌リーダー。
【００１７】
８．融合パートナーをさらに含む、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１８】
９．融合パートナーがポリマーである、項８に記載の異種ポリペプチド。
【００１９】
１０．ポリマーが第３分子であり、第３分子がポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分、フェチュインＡ、フェチュインＢ、およびＦｃから選択される、項９に記載の異種ポリペプチド。
【００２０】
１１．（１）項１から５および項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および（２）項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【００２１】
１２．項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーをコードする第１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含む異種ポリペプチドをコードする核酸分子であって、第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドが、細胞からの異種ポリペプチドの分泌を容易にするように作動可能に連結しており、第１および第２ポリヌクレオチドが天然においてそのように連結していない核酸分子。
【００２２】
１３．第２ポリペプチドが分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【００２３】
１４．コザック配列またはその５’末端に位置するその断片である第３ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【００２４】
１５．制限酵素切断可能な配列をその３’末端に含む第４ポリヌクレオチドをさらに含む、項１４に記載の核酸分子。
【００２５】
１６．タグをコードする第５ポリヌクレオチドをさらに含む、項１５に記載の核酸分子。
【００２６】
１７．タグが精製タグである、項１６に記載の核酸分子。
【００２７】
１８．タグがＶ５、ＨｉｓＸ６、ＨｉｓＸ８、アビジン分子、およびビオチン分子から選択される、項１６に記載の核酸分子。
【００２８】
１９．第２酵素によって切断することができる酵素切断可能な第２配列をコードする第６ポリヌクレオチドをさらに含み、この切断可能な第２配列が、タグが異種ポリペプチドのＣ末端に位置している場合、タグの上流に位置しており、またはタグが異種ポリペプチドのＮ末端に位置している場合、タグの下流に位置している、項１６に記載の核酸分子。
【００２９】
２０．第２酵素がトロンビンまたはタバコウイルス由来のＴＥＶである、項１９に記載の核酸分子。
【００３０】
２１．複製起点および選択マーカーをさらに含む、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【００３１】
２２．複製起点がＳＶ４０  ｏｒｉ、Ｐｏｌ  ｏｒｉ、ＥＢＮＡ  ｏｒ、およびｐＭＢ１  ｏｒｉから選択される、項２１に記載のベクター。
【００３２】
２３．選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、項２１に記載のベクター。
【００３３】
２４．抗生物質耐性がピューロマイシン耐性、カナマイシン耐性、およびアンピシリン耐性から選択される、項２３に記載のベクター。
【００３４】
２５．細胞、ならびに項１から４および項８から１０のいずれかに記載の異種ポリペプチド、項１１から２０のいずれかに記載の核酸分子、または項２１から２４のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【００３５】
２６．真核細胞細胞である、項２５に記載の組換え宿主細胞。
【００３６】
２７．ヒト細胞である、項２６に記載の組換え宿主細胞。
【００３７】
２８．分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）項１１から２０のいずれかに記載の核酸分子を提供すること、および
（ｂ）核酸分子を発現系において発現させること
を含む方法。
【００３８】
２９．発現系が細胞発現系または無細胞発現系である、項２８に記載の方法。
【００３９】
３０．発現系が細胞発現系であり、この細胞が哺乳動物細胞である、項２８に記載の方法。
【００４０】
３１．哺乳動物細胞が２９３細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系、およびＣＨＯ細胞系から選択される、項３０に記載の方法。
【００４１】
３２．２９３細胞が２９３−Ｔ細胞または２９３−６Ｅ細胞である、項３１に記載の方法。
【００４２】
表１は、本発明のリーダー配列が由来する分泌性タンパク質に関する情報を記載している。列１は、内部名称識別番号を記載し、列２は、参照識別番号を記載し、列３は、分泌性タンパク質の識別情報を記載している。
【００４３】
表２は、本発明のリーダー配列に関する情報を記載している。列１は、内部名称識別番号を記載し、列２は、リーダー配列の配列番号（Ｐ１）を記載し、列３は、参照識別番号を記載し、列４は、リーダー配列のタイプ、すなわち完全長対選択的なリーダー配列を記載し、列５は、リーダー配列が由来する分泌性タンパク質を記載している。
【００４４】
表３は、本発明のリーダー配列によって得られた結果を要約する。列１は、クローン名称識別番号を記載し、列２は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥから検出および測定したマイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）でのタンパク質濃度を記載し、列３は、各構築体の、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはＶ５−タグ付きの精製タンパク質標準液と比較した、抗Ｖ５抗体を使用した定量的ウェスタンブロットによって測定した発現レベルを最低の５６から最高の１まで１〜５６の段階でランク付けし、列４は、銀染色で発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してバンドが検出されるかどうかを記載し、列５は、試験された分泌性タンパク質の分子量をダルトンで記載し、列６は、図８〜９に対応するゲル番号およびレーン番号を記載し、列７は、分泌性タンパク質の内部名称を記載し、列８は、タンパク質識別番号を記載し、列９は、内部名称識別番号を記載し、列１０は、ソース識別番号を記載し、列１１は、分泌性タンパク質を識別している。
【００４５】
付表Ａ／配列表は、表２におけるリーダー配列のアミノ酸配列（Ｐ１）を記載している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
対象のタンパク質を、その全長アミノ酸配列をコードし、その内因性のシグナルペプチドを含有するＤＮＡ配列から発現され分泌される場合に得られるタンパク質の量よりも多く（例えば、約１０％、２０％、または３０％以上高い割合）発現させ分泌させるために、本発明者らは、その内因性の分泌リーダー配列を別の、すなわち異なる、または異種の分泌性タンパク質の配列で置き換えた。後者の対象の分泌性タンパク質は通常、タンパク質の発現および分泌を試験するための典型的な条件下で、高いレベルで（「高発現型タンパク質」または「高分泌型タンパク質」）、または中程度に高いレベルで（「中程度発現型タンパク質」または「中程度分泌型タンパク質」）発現および／または分泌されるものであり、このタンパク質は、それだけに限らないが、本発明の実施例で詳細に記載する。換言すれば、一団のタンパク質（それだけに限らないが、本明細書に記載のもの、付表Ａ、表１〜３に記載のものを含む）を発現させ、すべてを同じ試験条件下で発現させれば、一部のタンパク質は、他のタンパク質よりも高いレベルで発現および／または分泌することが判明するはずである。したがって、本発明のタンパク質の中で発現および分泌レベルの差を認識し、こうした認識された差を利用して、リーダー配列から、そうしなければ低発現型であるタンパク質、または望ましいレベルで分泌されないタンパク質の分泌および／または発現を改善するのに有用なものであるとさらに同定することが本発明の態様である。
【００４７】
異種の分泌リーダー配列を使用することは、分泌リーダー配列は小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体において除去されるので、分泌性ポリペプチドの得られた成熟アミノ酸配列が分泌過程で改変されない点でさらに有利である。本発明の分泌リーダー配列は、あるタンパク質をＥＲに導くように働く。ＥＲは、リーダー配列を含むタンパク質の中、膜結合タンパク質をすべての他の種類のタンパク質から分離する。次いで、各群を別々にゴルジ装置に移動させる。次いで、ゴルジ装置は、タンパク質を分泌小胞などの小胞、細胞膜、リポソーム、または他の細胞小器官に分配する。
【００４８】
さらに、異種の分泌リーダーを追加することにより、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの発現および分泌が容易になる。このような膜貫通タンパク質の一例は、ＩＩ型の一回膜貫通タンパク質（ＳＴＭ）であり、その分泌リーダーも、タンパク質が可溶性および分泌性となる前に除去されるに違いない膜貫通ドメインである。
【００４９】
したがって、タンパク質の分泌および発現を、内因性のリーダー配列によって達成されるものよりも増強または改善し、分泌性タンパク質を作製するのに場合によって、広く使用することができる、１種（複数）の強力な分泌リーダー配列を同定するために、多くの様々な分泌性タンパク質が、本明細書に記載の通り、クローニングされ、発現されている。クローニングされ、発現されたタンパク質の、哺乳動物２９３細胞の上清における発現および分泌レベルが測定されており、その結果は、例えば、実施例１、図８〜９、および表３に示す。いくつかの高発現型および高分泌型タンパク質が認められた。高発現型タンパク質は、本発明の目的のためには、高分泌型タンパク質と同一である場合もそうでない場合もある。
【００５０】
一実施形態では、分泌性タンパク質ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型の一部である分泌リーダー配列を同定した。この特定のリーダー配列を、異種および／または共通の分泌リーダー配列として使用する場合、発現および分泌を促進することができるかどうかをさらに調査するために選択した。分泌性タンパク質ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型の部分であるこの分泌リーダーのアミノ酸配列は、ＭＫＴＣＷＫＩＰＶＦＦＦＶＣＳＦＬＥＰＷＡＳＡ（配列番号１）であることが予測される。本明細書でさらに記載する通り、この特定の分泌リーダーを含むようにベクターを構築した。こうしたベクターを使用して、それ自体の天然に存在する分泌リーダーなしのいくつかのタンパク質をクローニングして、異種の分泌リーダー配列を伴う分泌性タンパク質を得た。こうした融合タンパク質の発現および分泌レベルは、その非融合対応物で認められる発現または分泌レベルよりも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％以上高いことが判明した。
【００５１】
本発明は、以下の定義に照らしてより明確に理解することができる。一般に、本明細書で使用される用語は、その通常の意味、および以下で具体的に示される意味を有する。
【００５２】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド分子」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、同義的に使用して、任意の長さのヌクレオチドが重合した形を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログもしくは誘導体を含むことができる。例えば、核酸は、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡ、または当技術分野で知られている、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡの合成アナログとすることができる。この用語はまた、ゲノムＤＮＡ；遺伝子；遺伝子断片；エキソン；イントロン；プロモーター、エンハンサー、開始および終結領域、他の制御領域、発現調節因子、発現制御などの制御配列または調節エレメント；単離ＤＮＡ；ならびにｃＤＮＡを包含する。さらに、この用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンス複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、および単離ＲＮＡを包含する。この用語はまた、組換えポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、標識ポリヌクレオチド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ポリヌクレオチド構築体、対象の核酸を含むベクター、核酸プローブ、プライマー、およびプライマー対を包含する。この用語は、骨格、糖、または複素環塩基が改変されているプリンおよびピリミジンのアナログなどの修飾核酸分子、例えばメチル化核酸分子；ペプチド核酸；および核酸分子アナログを含み、これらは、試験条件下で優れた安定性および／または結合親和性を示す場合、例えば、プローブとして適当であり得る。放射性標識アナログおよび蛍光アナログを含めた、プリンおよびピリミジンのアナログは、当技術分野で知られている。このポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができる。この用語はまた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡであり、完全長の遺伝子またはその生物活性断片をコードすることができる一本鎖分子、二本鎖分子、および三重らせん分子を包含する。ポリヌクレオチドの生物活性断片は、本明細書のポリペプチド、ならびにアンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡｉ分子をコードすることができる。したがって、例えば、本明細書の完全長ポリヌクレオチドは、ダイサーなどの酵素で処理して、短鎖のＲＮＡｉ断片のライブラリーを作製することができ、これはまた、本発明の範囲内にある。
【００５３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合した形を指す。このアミノ酸には、天然に存在するアミノ酸；コードアミノ酸および非コードアミノ酸；化学修飾もしくは生化学修飾されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、またはデザイナーアミノ酸；アミノ酸アナログ；ペプチド模倣体およびデプシペプチド；ならびに修飾、環状、二環式、デプシ環状、またはデプシ二環式ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語はまた、複合タンパク質；それだけに限らないが、ＧＳＴ融合タンパク質、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種のリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない融合タンパク質を含めた融合タンパク質；ペグ化タンパク質；ならびに免疫標識したタンパク質を指すことができる。また、この用語には、天然に存在するタンパク質の変異（このような変異は、同種であるか、または天然に存在するタンパク質に実質的に類似している）、ならびに異なる種に由来するその対応するホモログが含まれる。ポリペプチド配列の変異体は、元のポリペプチドと比較すると、挿入、付加、欠失、または置換を含むが、それにもかかわらず、レベルが異なる可能性があるが同様の生物活性を保持している。この用語はまた、ペプチドアプタマーが含まれる。
【００５４】
「分泌リーダー」、「シグナルペプチド」、または「リーダー配列」は、それが一部であるポリペプチドの細胞内輸送を導く、アミノ酸残基を含む配列を含有する。ポリペプチドは、通常そのＮ末端に分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列を含有する。こうしたポリペプチドはまた、切断可能部位を含有し、この分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列は、シグナルエンドペプチダーゼによりポリペプチドの残りから切断することができる。このようなポリペプチドは、切断可能部位で切断された後、成熟ポリペプチドを生成する。切断は通常、分泌中に、または完全なポリペプチドが適切な細胞内コンパートメントに導かれた後に起こる。
【００５５】
本発明によれば、「高分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、少なくとも約５倍に増大させることができるものである。
【００５６】
また、本発明によれば、「中程度分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、約２〜５倍に増大させることができるものである。
【００５７】
さらに、本発明によれば、「低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、約２倍未満に増大させることができる、または増大させないものである。
【００５８】
さらに、本発明の分泌リーダーはまた、そうでなければＥＲ−ゴルジ体によって分泌されると予測されず、内因性のシグナルペプチドを有してないタンパク質に付加することができる。この場合、「高／中程度／低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」という上記の定義は、比較目的に使用することができるタンパク質のベースライン分泌レベルが存在しないので適用できない。この場合、シグナルペプチド／分泌リーダー配列の付加が、そうでなければ非分泌性であるタンパク質の分泌に対して及ぼす影響は、生じた異種タンパク質の間で比較される。
【００５９】
本発明の目的のために、「高／中程度／低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」の上記の定義は、シグナルペプチド（または分泌リーダー配列）のみに関する。これは、「高分泌型タンパク質」、「中程度分泌型タンパク質」または「低分泌型タンパク質」に関するものではない。タンパク質自体は、本発明のタンパク質（表１〜３および付表Ａ）をすべて、コムギ胚芽エキスまたは哺乳動物細胞（詳細な説明については実施例１〜３を参照されたい）のいずれかにおけるそれ自体の発現および分泌レベルに関して互いを比較してランク付けする働きをする相対的な段階に基づいてそのようにランク付けされた。
【００６０】
「分泌性」タンパク質は、分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列によりＥＲ、分泌小胞、または細胞外間隙に導くことができるタンパク質である。このタンパク質はまた、シグナル配列を必ずしも含むことなく細胞外間隙中に放出されるタンパク質であってもよい。分泌性タンパク質は、細胞外間隙中に放出されるタンパク質である場合、プロセシングを受けて「成熟」ポリペプチドを生成することができる。膜貫通ドメインを含有し、原形質膜中に通常挿入されたままであるタンパク質は、また、ＥＲ−ゴルジ体において合成され、このようなタンパク質の一部の断片または部分は、例えば、タンパク質分解性の切断により細胞外コンパートメント中に放出され得るので、本発明の目的のために、分泌性タンパク質と考える。したがって、細胞外間隙への放出は、例えば、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解性の切断を含めた複数の形で起こり得る。
【００６１】
「成熟タンパク質」および「分泌タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、細胞の外部に（例えば、培養細胞によって馴化された培地中に）分泌された後の分泌性タンパク質の１種（複数）の形を指す。通常、成熟タンパク質は、シグナルペプチドなしの分泌性タンパク質のアミノ酸配列を有する。しかし、タンパク質を天然において、または組換えによって発現させる場合、シグナルペプチドの一部は除去されないことが多く、様々な長さのシグナルペプチドに結合した多数の形の成熟タンパク質を含み得る成熟タンパク質混合物が得られる。したがって、シグナルエンドペプチダーゼによって切断される特定のアミノ酸によって、１種の分泌性タンパク質に対して複数の「成熟型」が存在することができる。また、他のプロテアーゼも、その「成熟タンパク質」の異種性にさらに加えて、分泌性タンパク質からアミノ酸を切断することができる。特定のタンパク質試料からシグナルペプチドが除去される正確な場所は、Ｎ末端タンパク質のシークエンシングによって、またはそうでなければ当分野の技術者に知られている標準的な方法によって求めることができる。
【００６２】
「生物活性」実体、または「生物活性」を有する実体は、天然に存在する分子の構造的、調節的もしくは生化学的機能を有するものであるか、または代謝過程もしくは生理的過程に関係または関連した機能を有するものである。本発明による生物活性ポリヌクレオチド断片またはポリペプチド断片は、この断片がその一部である対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性と同一とは限らないがそれに類似している活性を示すものである。生物活性には、それだけに限らないが、改善された所望の活性および減少した望ましくない活性が含まれ得る。例えば、ある実体は、他の分子との分子間相互作用に関与すると生物活性を示す。このような相互作用の一例がハイブリダイゼーションである。このような相互作用の他の例は、疾患状態を軽減する上での治療効果、または分子に対する免疫応答を誘導する上での予防効果の表れであってよい。このような相互作用の他の例は、分子の存在を判定する上での診断用ツールとしての潜在的可能な使用の実証であってよく、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性断片が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特有である場合、断片を検出することによりポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出を可能にする。生物活性を有するポリペプチドまたはその断片には、生物反応関与することができるもの、例えば、それだけに限らないが抗体の産生が含まれる、エピトープまたは免疫原として働いて免疫応答を刺激することができるもの；または受容体、タンパク質、もしくは核酸に結合することによりシグナル伝達経路に関与するもの；または酵素もしくは基質を活性化するものが含まれる。このような相互作用のさらに別の例は、ＰＣＲにおけるプライマーとして使用するポリヌクレオチド分子の適合性であってよい。
【００６３】
「単離された」または「実質的に単離された」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは「実質的に純粋」な、「実質的に精製」された、または「単離体」としてのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、天然においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドが関連している配列、あるいは対象のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列または断片を含まない他の核酸配列を実質的に含んでいないものである。「実質的に含んでいない」は、組成の約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が所望でない物質で構成されることを意味する。
【００６４】
「作動可能に連結した」は、そのように表現した成分がその所望の機能を実行するように構成されているエレメントの整列を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適正な転写因子および転写条件が存在する場合、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されるイントロンが存在するので、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、このプロモーター配列は、やはりコード配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【００６５】
「組換え」は、核酸分子を表現するのに使用する場合、天然においてポリヌクレオチドが関連しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部に、その起源または操作に基づいて関連していないゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルスまたは合成由来のポリヌクレオチドを意味する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを表現するのに使用する場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。
【００６６】
「制御エレメント」は、それが連結しているコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供するプロモーター、転写終結配列、上流の調節領域、ポリアデニル化シグナル、適切な場合はリーダー配列、およびエンハンサーを指すことができる。
【００６７】
本明細書で使用される「プロモーター」は、哺乳動物細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合させ、作動可能に連結した下流の（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域を指す。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドより大きい検出可能なレベルで対象の遺伝子の転写を開始させるのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、必ずしもそうとは限らないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むことが多い。プロモーターにはさらに、核酸分子に天然に隣接しているもの、および核酸分子に天然に隣接していないものが含まれる。さらに、プロモーターには、誘導性プロモーター；ｃｒｅ−ｌｏｘプロモーターなどの条件付きで活性なプロモーター；構成的プロモーター；および組織特異的プロモーターが含まれ得る。
【００６８】
「選択マーカー」は、マーカーに関連している表現型が明白であり観察可能である適切な条件で細胞を同定できるように、マーカーを発現する細胞に１種または複数の表現型を与える遺伝子を指す。通常、選択マーカーは、必須の細胞機能を阻害する１種または複数の化学物質および／または他の作用物質の存在下または非存在下で増殖できるかどうかに基づいて形質転換細胞の選択を可能にする。したがって、適当なマーカーには、トランスフェクトした細胞が適切な選択培地中で増殖する場合に、薬物耐性または薬物感受性をそれに与える、選択マーカーをコードする分子をトランスフェクトしたこのような細胞に色を与える、またはその抗原特性を変化させる、タンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、選択マーカーには、細胞が、細胞毒または薬物の１種または複数を含有する培地で増殖できるかどうかによって選択される細胞傷害性マーカーおよび薬物耐性マーカー；細胞が、チミジン、ヒポキサンチンなどの特定の栄養物質または補充物質を含むまたは含まない特定培地で増殖できるかどうかによって選択される栄養要求性マーカー；細胞が、唯一の炭素供給源として適切な糖を含有する特定培地で増殖できるかどうかなどの表現型に関して選択される代謝マーカー；または発色基質で着色コロニーを形成できるようにする、または蛍光発光できるようにするマーカーが含まれる。
【００６９】
本明細書で使用される「形質転換」は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染などであってよい挿入に使用する方法にかかわらず宿主細胞へのポリヌクレオチドの挿入を指す。導入したポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター、例えば、エピソームとして維持されるか、あるいは、宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００７０】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに調節配列領域が、転写することができるまたはできないコード配列に隣接しているかどうかにかかわらず遺伝子産物の産生を調節するこのようなすべてのＤＮＡ配列領域を含む。したがって、遺伝子は、例えば、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位または内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメント、複製起点、マトリックス結合部位、または遺伝子座制御領域であってよい。
【００７１】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれている情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡを翻訳することによって産生されるタンパク質とすることができる。遺伝子産物は、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、もしくはエディティングなどの過程によって修飾されたＲＮＡ、または例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質とすることもできる。
【００７２】
「コード配列」または分泌ポリペプチド「をコードする」配列は、配列が、１種または複数の適切な調節配列の制御下に位置する場合、転写され（ＤＮＡの場合）、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列は、５’（アミノ）末端の開始コドンで始まり、３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンで終わる。コード配列は、例えば、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ；ゲノムＤＮＡウイルス配列（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）；原核生物ＤＮＡ；または合成ＤＮＡ配列とすることができる。転写終結配列は、コード配列の３’側の位置にあってよい。
【００７３】
「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列および構造の一部のみを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチド断片は、完全なポリペプチドからのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／または内部欠失を含むことができる。ポリヌクレオチド断片は、完全なポリヌクレオチドからの５’欠失、３’欠失、および／または内部欠失を含むことができる。タンパク質の断片は通常、完全長分子のうちの少なくとも約５〜１０の隣接するアミノ酸残基、完全長分子のうちの少なくとも約１５〜２５の隣接するアミノ酸残基、完全長分子のうちの少なくとも約２０〜５０またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基を含む。ポリヌクレオチドの断片は通常、完全長分子のうちの少なくとも約１５〜３０の隣接するヌクレオチド、完全長分子のうちの少なくとも約４５〜７５の隣接するヌクレオチド、完全長分子のうちの少なくとも約６０〜１５０またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含む。ある実施形態では、断片中のアミノ酸残基の数は、５から完全長分子中のアミノ酸残基の総数までの任意の整数であってよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチド断片中のヌクレオチドの数は、１５から完全長分子中のヌクレオチドの総数までの任意の整数であってよい。
【００７４】
「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は、例えば、組換えベクター、単離ポリヌクレオチド、抗体、または融合タンパク質であってよい、本発明の１種または複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの受容株となり得る、またはなっている個別の細胞、細胞系、細胞培養物、またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞を指す。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫であってよく、この子孫は、天然の、偶発の、または意図的な変異および／または変化の結果として、形態もしくは生理機能、全ＤＮＡもしくは全ＲＮＡ、またはポリペプチド補体が元の受容細胞と必ずしも同一でなくてよい。宿主細胞は、それだけには限らないが、哺乳動物、昆虫、両生類、爬虫類、甲殻類、鳥類、魚類、植物、および真菌の細胞を含めた原核細胞または真核細胞とすることができる。宿主細胞は、組換えベクターなどの本発明のポリヌクレオチドでｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換、トランスフェクト、形質導入、または感染した細胞であってよい。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ぶことができる。
【００７５】
「受容体」という用語は、特定の細胞外分子に結合するポリペプチドを指し、この結合は細胞応答を開始することができる。
【００７６】
「リガンド」という用語は、別の分子上の特定の部位に結合する分子を指す。
【００７７】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、例示的および説明的なものにすぎず、請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。さらに、本実施形態は当然変化するので、本発明は、記載した特定の実施形態に限定されないことも理解すべきである。さらに、本発明の範囲は、その特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特定の実施形態を記載するのに使用される用語は限定的なものではない。
【００７８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものである。当分野の技術者であれば、本明細書に記載するものに類似または相当する任意の方法および材料を使用して本発明を実施または試験できることも理解されよう。
【００７９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「または（ｏｒ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他のことを明確に指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの対象のポリペプチド」への言及は、複数のこのようなポリペプチドを含み、「その作用物質」への言及は、１種または複数の作用物質ならびに当分野の技術者に知られているその均等物を含む。
【００８０】
さらに、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件、％純度、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さなどを表現するすべての数は、別段の指示がない限り、「約」という用語によって加減される。したがって、本明細書および特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明の所望の特性によって変わり得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲への均等物の原則の適用を限定する意図としてではなく、各数値パラメータは、通常の丸め手法を適用した報告される有効数字の数を考慮して解釈すべきである。
【００８１】
それにもかかわらず、特定の実施例に記載の数値は可能な限り正確に報告する。しかし、どの数値も、その実験測定値の標準偏差からのある誤差を本質的に含む。
【００８２】
引用するすべての刊行物は、その全体を参照によりさらに組み込むこのような刊行物中で引用される参考文献を含めて、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００８３】
リーダー配列
本明細書に記載の通り、分泌性タンパク質から同定される分泌リーダー配列は、タンパク質を、このようなタンパク質が、そのタンパク質の内因性の分泌リーダー配列を含むＤＮＡ配列から同一の条件下で産生される場合よりも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％以上高い量で産生するのに有用であることが実証される。本明細書で同定および記載された分泌リーダー配列には、例えば、以下の分泌性タンパク質に由来するものが含まれる：インターロイキン９前駆体、Ｔ細胞増殖因子Ｐ４０、Ｐ４０サイトカイン、トリアシルグリセロールリパーゼ、膵臓前駆体、ソマトリベリン前駆体、バソプレシン−ニューロフィジン２−コペプチン前駆体、β−ネオエンドルフィン−ダイノルフィン前駆体、補体Ｃ２前駆体、低分子誘導性サイトカインＡ１４前駆体、エラスターゼ２Ａ前駆体、血漿セリンプロテアーゼインヒビター前駆体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子前駆体、インターロイキン２前駆体、インターロイキン３前駆体、α−フェトプロテイン前駆体、α−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体、血清アルブミン前駆体、インター−α−トリプシンインヒビター軽鎖、血清アミロイドＰ成分前駆体、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ前駆体、アポリポタンパク質Ｄ前駆体、コリパーゼ前駆体、カルボキシペプチダーゼＡ１前駆体、α−ｓ１カゼイン前駆体、βカゼイン前駆体、シスタチンＳＡ前駆体、フォリトロピンβ鎖前駆体、グルカゴン前駆体、補体因子Ｈ前駆体、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、インターロイキン５前駆体、α−ラクトアルブミン前駆体、エブネル腺タンパク質前駆体、マトリックスＧｌａタンパク質前駆体、α−１−酸性糖タンパク質２前駆体、ホスホリパーゼＡ２前駆体、樹状細胞ケモカイン１、スタセリン前駆体、トランスチレチン前駆体、アポリポタンパク質Ａ−１前駆体、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体、アポリポタンパク質Ｅ前駆体、補体成分Ｃ８γ鎖前駆体、セロトランスフェリン前駆体、β−２−ミクログロブリン前駆体、好中球デフェンシン１前駆体、トリアシルグリセロールリパーゼ胃前駆体、ハプトグロビン前駆体、好中球デフェンシン３前駆体、神経芽細胞、腫瘍形成能の抑制因子１前駆体、低分子誘導性サイトカインＡ１３前駆体、ＣＤ５抗原様前駆体、リン脂質輸送タンパク質前駆体、ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質４前駆体、エラスターゼ２Ｂ前駆体、α−１−酸性糖タンパク質１前駆体、β−２−糖タンパク質１前駆体、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン前駆体、Ｃ反応性タンパク質前駆体、インターフェロンγ前駆体、κカゼイン前駆体、血漿レチノール結合タンパク質前駆体、インターロイキン１３前駆体、および表１〜３に記載の任意の分泌性タンパク質。
【００８４】
上記で同定される分泌リーダー配列は、本発明のベクターおよび方法とともに、例えば、分泌性ポリペプチド、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、および可溶性受容体などの受容体を含めた多種多様なポリペプチドを発現させる上で有用である。このようなポリペプチドの例には、サイトカインおよび増殖因子、例えば、インターロイキン１〜１８；インターフェロン；リンホカイン；ホルモン；ＲＡＮＴＥＳ；リンホトキシンβ；Ｆａｓリガンド；ｆｌｔ−３リガンド；ＮＦ−κＢの活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；ＣＤ４０リガンド；Ｏｘ４０リガンド；４−１ＢＢリガンドおよびＴＮＦファミリーの他のメンバー；胸腺間質由来リンホポエチン；例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの刺激因子；抑制因子；肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮成長因子、成長ホルモン、腫瘍壊死因子；白血病抑制因子；オンコスタチンＭ；スプライスバリアント；ならびにエリスロポエチン、トロンボポエチンなどの造血因子が含まれる。
【００８５】
本発明によって発現させることができるタンパク質の一部に関する記述は、例えば、ＨＵＭＡＮ  ＣＹＴＯＫＩＮＥＳ：ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＦＯＲ  ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ  （ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、１９９８）；ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９３）；およびＴＨＥ  ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  （Ａ．  Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９１）において見出すことができる。
【００８６】
前述のどのタンパク質の受容体も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。この受容体には、例えば、腫瘍壊死因子受容体の両方の型（ｐ５５およびｐ７５と称される）、インターロイキン１受容体（１型および２型）、インターロイキン４受容体、インターロイキン１５受容体、インターロイキン１７受容体、インターロイキン１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチンＭおよび白血病抑制因子の受容体、ＮＦ−κＢの活性化受容体（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬ受容体、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が含まれ得る。
【００８７】
他のタンパク質も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。こうしたタンパク質には、例えば、分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）（「ＣＤタンパク質」または「ＣＤ分子」と称される）、例えば、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら編；神戸、１９９６）、または後のワークショップの予稿集に開示されているものが含まれる。ＣＤ分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ならびにそのリガンド、例えば、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、およびＣＤ４０リガンドが含まれる。これらの分子のいくつかは、４−１ＢＢおよびＯＸ４０を含めたＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであり、４−１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドを含めたそのリガンドもＴＮＦファミリーのメンバーであることが多い。したがって、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーは、本発明の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。
【００８８】
酵素であるタンパク質も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。こうした酵素には、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー；ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンキリンリピート含有細胞死関連キナーゼ、ＩＫＲ１、またはＩＫＲ２などの様々なキナーゼ；ＴＮＦ−α変換酵素；および多数の他の酵素が含まれ得る。酵素のリガンドも、本明細書の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を適用することによって発現させることができる。
【００８９】
本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法は、他の種類の組換えタンパク質を発現させるのにも有用である。こうした組換えタンパク質には、例えば、免疫クロブリン分子またはその部分、ならびにキメラ抗体（例えば、ヒト定常領域がマウス抗原結合領域と繋がっている抗体）またはその断片が含まれ得る。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作して、単鎖抗体、親和性を増強した抗体、または他の抗体ベースのポリペプチドなどの組換えタンパク質をコードすることが可能なＤＮＡを得ることができる多数の手法が知られている（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９を参照のこと）。
【００９０】
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生
本発明は、例えば、対象の１種または複数の分泌リーダー配列、または分泌リーダー配列であるとは限らない対象の選択された異種ポリペプチドをコードする核酸構築体を含む組換えベクター、および遺伝子操作してこの組換えベクターを取り込んだ宿主細胞を提供する。
【００９１】
本発明のベクターは、宿主中で増殖させるための選択マーカーおよび分泌リーダー配列、例えば表１に記載の配列のうちの１つを含むものであってよい。このような選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素；Ｇ４１８；真核細胞培養物用のネオマイシン耐性もしくはピューロマイシン耐性；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌培養物用のテトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、ピューロマイシン耐性、もしくはアンピシリン耐性であってよい。
【００９２】
本発明のベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスのベクターであってよい。通常、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿など沈殿の形で、または荷電脂質を含む複合体として導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターを、適切なパッケージング用細胞系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、次いで、形質導入によって宿主細胞中に組み込むことができる。レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損性であってよい。また、このベクターが複製欠損性である場合、ウイルス増殖は通常、補完する宿主細胞でしか起こらない。
【００９３】
本発明において有用なベクターの中には、ｐＴＴベクターのバックボーンを使用した本明細書に記載のベクターがある（例えば、図３〜７を参照のこと）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２）。簡単に言えば、ｐＴＴベクターバックボーンは、以下の方法によって調製することができる：（１）ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ／ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ）ベースのベクターおよびｐＳＥＡＰベースのベクターをＣＬＯＮＥＴＥＣＨ（登録商標）（カリフォルニア州パロアルト）から入手し、（２）ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６、およびｐＣＥＰ４ベクターをＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手し、（３）ＳＵＰＥＲＧＬＯ（商標）ＧＦＰ変異体（「ｓｇＧＦＰ」）をＱ−ＢＩＯＧＥＮＥ（登録商標）（カリフォルニア州カールズバッド）から入手し、（４）（ａ）ＳａｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素を使用した連続消化およびセルフライゲーションにより、ｐＣＥＰ４のＣＭＶプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを除去して、ｐＣＥＰ４Δプラスミドを得るステップ、および（ｂ）ＣＭＶ５−ポリ（Ａ）発現カセットをコードするｐＡｄＣＭＶ５（Ｍａｓｓｉｅら、１９９８）由来のＢｇｌＩＩ断片を、ＢｇｌＩＩによって直鎖化されたｐＣＥＰ４Δにライゲートして、ｐＣＥＰ５ベクターを得るステップによりｐＣＥＰ５を調製し、（５）ハイグロマイシンおよびＥＢＮＡ１発現カセットを除去することによりｐＴＴベクターを作製し（前者の除去は、ＢｓｍＩおよびＳａｌＩによる切除、続く充填およびライゲーションによって達成され、後者の除去は、ＣｌａＩおよびＮｓｉＩによる切除、続く充填およびライゲーションによって達成される）、（６）β−ラクタマーゼＯＲＦの３’末端を含んだＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片を含むＣｏｌＥＩ起点を、ｐＭＢＩ起点およびｐｃＤＮＡ３．１由来のβ−ラクタマーゼＯＲＦの同じ３’末端を含むＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片で置き換え、（７）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓにインフレームでライゲートし、（８）Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６Ｃ末端融合タグを、ｐＳＥＡＰベース由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片であるＳＥＡＰに付加する。次いで、ＬＢ培地において増殖した大腸菌（ＤＨ５α）中でプラスミドを増幅させる。ＱＩＡＧＥＮ（商標）（カナダオンタリオ州ミシソーガ）のＭＡＸＩ−ＰＲＥＰ（商標）カラムを使用してこの培地からプラスミドを精製する。プラスミドを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に希釈し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、このようにして作製したプラスミドの量を測定する。本発明の目的のために、Ａ２６０／Ａ２８０比が約１．７５から約２．００までのプラスミド調製物を使用する。
【００９４】
対象の核酸構築体は、適切なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡであってよい。この適切なプロモーターは、例えば、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、またはレトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターのうちの１つであってよい。このプロモーターは、例えば、哺乳動物細胞のゲノムに由来するメタロチオネインプロモーターであってもよい。あるいは、このプロモーターは、哺乳動物ウイルスに由来するアデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターであってもよい。他の適当なプロモーターは当分野の技術者に知られている。
【００９５】
この発現構築体は、転写領域における転写開始および転写終結のための部位、およびリボソーム結合部位をさらに含む。この構築体によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの最初に、適切に位置付けられた翻訳開始コドン、およびその最後に終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。ポリヌクレオチドによってコードされる異種ポリペプチドには、例えば、分泌性タンパク質の細胞外断片、Ｉ型膜タンパク質、ＩＩ型膜タンパク質、多重膜タンパク質、および可溶性受容体が含まれ得る。
【００９６】
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランの媒介によるトランスフェクション、カチオン性脂質の媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または当分野の技術者によって知られている任意の他の方法により、構築体を宿主細胞中に導入することができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）など、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。適切な宿主の代表例には、それだけには限らないが、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３（２９３−６Ｅおよび２９３−Ｔを含む）、およびボーズメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞；ならびに植物細胞が含まれる。こうした代表的な宿主細胞を増殖させるのに適した培地および条件は、当技術分野で知られている。
【００９７】
種々の宿主発現ベクター系を使用して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。このような宿主発現系は、対象のコード配列を産生し、続いて精製する媒体である。こうした系は、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトすると、本発明のポリペプチドを発現する細胞とすることもできる。こうした系には、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、組換えプラスミドＤＮＡ、または組換えコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換される微生物、例えば、大腸菌または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌が含まれ得る。こうした系には、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換されるサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母が含まれ得る。こうした系は、ポリペプチドをコードする配列を含む、バキュロウイルスなどの組換えウイルス発現ベクターを感染させる昆虫細胞であってもよい。こうした系は、ポリペプチドをコードする配列を含む、カリフラワーモザイクウイルス（「ＣａＭＶ」）もしくはタバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）などの組換えウイルス発現ベクターを感染させるか、またはＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換される植物細胞であってもよい。こうした系にはさらに、プロモーターを含む組換え発現構築体を有する、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３−６Ｅ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、２９３Ｔ、または３Ｔ３などの哺乳動物細胞が含まれ得る。
【００９８】
宿主細胞に、対象のポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ構築体をトランスフェクトした後、次いでこの細胞を、本発明のポリペプチド産生するのに適した培地および条件で増殖させる。
【００９９】
通常、異種ポリペプチドは、融合タンパク質として発現させることもできる。ポリペプチドはさらに、１種または複数の分泌シグナルだけでなく、表１で例示される１種または複数の分泌リーダー配列を含むことができる。本発明によるこのような融合タンパク質の発現については以下で詳細に記載する。
【０１００】
さらに、ペプチド部分および／または精製タグをポリペプチドに付加して、精製を容易にし、安定性を改善し、分泌または排出を引き起こすことができる。この部分および／またはタグは、精製の最終段階の前に除去することができる。この技法は、当分野の技術者によく知られており、常用されている。ある実施形態では、このようなタグは、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、ｐＱＥ（商標）ベクター（ＱＩＡＧＥＮ（商標）社、カリフォルニア州チャッツワース）において提供されるタグとすることができる。別のペプチドタグ、すなわちインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープである「ＨＡ」タグを本発明のポリペプチドと融合することもできる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４を参照のこと）。他の適当な精製タグは、例えば、Ｖ５、ＨＩＳＸ８、アビジン、またはビオチンであってもよい。
【０１０１】
ある実施形態では、この融合タンパク質は、免疫グロブリン由来の異種領域を含み、この領域の存在は、精製を容易にし、精製タンパク質の安定化に寄与することができる。例えば、欧州特許出願公開第０４６４５３３号およびその対応するカナダ特許出願公開第２０４５８６９号は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の様々な部分と、ヒトタンパク質またはその部分とを含む融合タンパク質を記載している。欧州特許出願公開第０２３２２６２号によれば、融合タンパク質におけるＦｃ領域は、薬物動態特性の改善をもたらす傾向があるので、治療および診断において使用するのに有利であると考えられる。他に使用することがなければ、融合タンパク質を発現、検出、および精製した後に、特にＦｃ領域が、治療および診断において融合しているポリペプチドの使用を妨げる場合に、Ｆｃ領域を除去することが望ましいであろう。例えば、Ｆｃ領域の除去は、融合タンパク質を免疫化の抗原として使用する場合に必要であるはずである。
【０１０２】
精製タグは、創薬に使用することもできる。例えば、ヒトタンパク質ｈＩＬ−５をＦｃ領域と融合して、ハイスループットのスクリーニングアッセイを使用したｈＩＬ−５アンタゴニストの同定を容易にした（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、１９９５）。
【０１０３】
本発明の異種ポリペプチドは、周知の方法により組換え細胞培養物から精製することができ、この方法には、例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。特定の実施形態では、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。本発明のポリペプチドには、例えば、直接に単離した、または培養した、体液、組織、および細胞などの天然の供給源から精製された産物；化学合成操作による産物；組換え技術により細菌細胞、酵母、高等植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの原核生物または真核生物宿主から産生された産物；または組換え技術により無細胞発現系から産生された産物が含まれ得る。
【０１０４】
修飾
本発明は、翻訳中または翻訳後に、例えば、既知の保護基／ブロック基、タンパク質分解性の切断、または抗体分子もしくは他の細胞リガンドとの結合による、グリコシル化、アセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化により示差的に修飾されたポリペプチドを包含する。こうした化学修飾はいずれも、臭化シアンによる特異的な化学切断；トリプシン、キモトリプシン、パパイン、またはＶ８プロテアーゼによる消化；ＮＡＢＨ４による処理；アセチル化；ホルミル化；酸化；還元；およびツニカマイシンの存在下での代謝合成を含めた既知の技法によって実行することができる。
【０１０５】
組換え産生操作において使用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドをグリコシル化してもグリコシル化しなくてもよい。本発明のポリペプチドには、通常宿主の媒介による過程の結果としての、修飾されたＮ末端開始メチオニン残基も含まれ得る。翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは通常、真核生物細胞において翻訳後に高効率で除去できることが当技術分野で知られている。Ｎ末端メチオニンは、大部分の原核生物タンパク質から効率的に除去することができるが、原核生物においてはこの除去過程は効率的であるとは限らない。この効率は、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質および種類に依存する。
【０１０６】
本発明による追加の翻訳後修飾には、例えば、宿主の原核細胞における発現の結果としての、Ｎ結合型もしくはＯ結合型糖鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型糖鎖の化学修飾、またはＮ末端メチオニンの付加もしくは除去が含まれる。タンパク質の検出および単離を容易にするために、ポリペプチドは、１種または複数の検出可能な標識で修飾することもでき、この標識は、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、またはアフィニティー標識であってよい。
【０１０７】
本発明の追加の実施形態は、本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体であってよく、この誘導体は、ポリペプチドの溶解性、安定性、および循環時間の増大、または生物系における免疫原性の低下など、追加の利点を提供することができる（米国特許第４，１７９，３３７号）。誘導体化に使用される化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。ポリペプチドは、分子内の無作為の位置または所定の位置で修飾することができ、１個、２個、または３個以上の結合した化学的部分を含むことができる。反応条件は、当技術分野で知られている条件および後に開発された条件のいずれかから選択することができるが、厳しい温度、溶媒、およびｐＨの条件によって、修飾されるタンパク質の活性が喪失されない、または限定的にしか活性の喪失を受けないように選択すべきである。一般に、ポリペプチド複合体に対するポリマーの割合が大きくなるほど、複合産物の割合が大きくなる。反応の効率によって測定された最適の割合は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、分岐の程度、および反応条件などの要素によって決定することができる。ポリマー対ポリペプチドの比は通常、１：１から１００：１の範囲にある。１種または複数の精製された複合体は、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含めた標準的な精製技術により各混合物から調製することができる。
【０１０８】
ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐または非分岐であってよい。ある実施形態では、本発明のポリペプチドをポリエチレングリコールによって修飾する場合、ポリエチレングリコールの分子量は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａまでである。「約」という用語は、ポリエチレングリコールの記載で使用する場合、ポリエチレングリコールの調製中に、述べられた分子量よりも大きい分子もあれば小さい分子もあることを示唆するものとする。修飾に使用されるポリエチレングリコールのサイズは、例えば、所望の持続放出時間；あるとすれば生物活性に対する効果；操作の容易さ；抗原性の程度または欠如；ならびに治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の作用などの所望の治療プロファイルに依存する。
【０１０９】
いくつかの結合方法が当分野の技術者に利用可能である。例えば、欧州特許出願公開第０４０１３８４号は、Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧの結合を記載している。Ｍａｌｉｋらは、トレシルクロリド法を使用したＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告した（Ｍａｌｉｋら、１９９２）。ポリエチレングリコールは、例えば、遊離アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基であってよいアミノ酸残基の反応性基に共有結合していてよい。ポリエチレングリコール部分を分子に結合することを意味するペグ化の文脈において、反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合することができる基として定義される。
【０１１０】
Ｎ末端が化学修飾されたタンパク質が特に望まれる場合がある。これは、誘導体化に利用可能な内部リジン、Ｎ末端アミノ酸などの第一級アミノ基の様々な反応性を利用した還元アルキル化によって達成することができる。例えば、反応をあるｐＨで実施することによりポリマーをタンパク質のＮ末端に選択的に結合することができ、この場合、ε−アミノ残基ではなくＮ末端残基のα−アミノ基だけが反応の影響を受けやすいはずであり、したがってこうした種類のアミノ基の間のｐＫａの違いが利用される。還元アルキル化に使用されるポリマーは通常、単一の反応性アルデヒドを有する。Ｎ末端を化学修飾したタンパク質は必要に応じて、Ｎ末端を修飾したタンパク質を、他の場所が修飾されているタンパク質分子の一団から精製することにより他のモノ誘導体化した部分から分離することができる。
【０１１１】
本発明の融合分子
本発明のさらなる実施形態では、異種ポリペプチドは、１種または複数の融合パートナーと組み合わせて融合分子を形成することができる。このような融合分子は、有利には、その修飾していない非融合対応物と比較して改善された薬物動態特性を提供することができる。本発明の異種ポリペプチドを含むこうした融合分子は、本明細書の開示内容を認識している当分野の技術者によって調製することができる。この点で異種ポリペプチドの誘導体化に適した化学的部分は、例えば、水溶性ポリマーなどのポリマー；ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分；フェチュインＡ；フェチュインＢ；またはＦｃ領域であってよい。
【０１１２】
具体的には、本発明の修飾された異種ポリペプチドは、１種または複数のポリアミノ酸、ペプチド部分、または分岐点アミノ酸をポリペプチドに結合することによって調製することができる。ポリアミノ酸は、市販されており、薬物送達技術および遺伝子治療などの他の新たな技術において広く使用されている。上記の融合分子で達成することができる利点に加えて、ポリアミノ酸は、ポリペプチドの血中半減期を延長する働きをする担体とすることができる。本発明の治療上の目的のために、このようなポリアミノ酸は理想的には、中和抗原反応または他の有害反応を生じないものであるべきである。本明細書に記載の通り、ポリアミノ酸がポリペプチドまたは融合ポリペプチドに結合する位置は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその間の任意の他の位置であってよい。ポリアミノ酸は、選択されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドのいずれかの末端に化学的「リンカー」部分によって接続することもできる。
【０１１３】
水溶性ポリマーなどの１種または複数のポリマーと複合した融合分子を調製する方法はすでに記載している。
【０１１４】
さらに、本発明の異種ポリペプチドおよびエピトープを有するその断片は、免疫グロブリン定常ドメインの部分と組み合わせることができ、その結果キメラポリペプチドが得られる。こうした特定の融合分子により、そのプレ融合対応物と比較して、精製が容易になり、延長したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を示す傾向がある。こうしたキメラポリペプチドの例には、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブリン定常領域の様々なドメインを含むキメラタンパク質が含まれる（欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９８８）。ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合分子は、例えば、単量体ポリペプチドまたは断片よりも、他の分子を結合し中和する上で効率的である傾向がある（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、１９９５）。
【０１１５】
別の実施形態では、ヒト血清アルブミン融合分子は、本明細書に記載の通り、またその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第６，６８６，１７９でさらに記載されている通り調製することもできる。
【０１１６】
さらに、本発明のポリペプチドは、精製タグが一部であるポリペプチドの精製を容易にするはずであるペプチド領域である精製タグと融合することもできる。このタグを対象のポリペプチドと融合する方法は本明細書に記載されている。
【０１１７】
本明細書の前述の説明および実施例で特に記載されているもの以外の形で本発明を実施してよいことは当分野の技術者には明らかであろう。本発明の多くの変更形態および変形形態は、本明細書の教示に照らして可能であり、したがって、添付の特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
無細胞系を使用する生物学的活性がある成熟分泌タンパク質の発現
組換え技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の発現を可能にする。タンパク質発現用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の例には、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽エキスなどの無細胞系、および細菌、昆虫細胞、酵母菌細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、およびヒト胚網膜細胞ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ、オランダ））などの細胞系が含まれる。例えば１種（複数）のトランス遺伝子が、例えば、緑色蛍光タンパク質およびその変異体またはβ−ガラクトシダーゼなどのマーカーをタグ付けした１種（複数）のタンパク質をコードするトランスジェニック動物の作製において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えタンパク質の発現は有用である。このようなタグは、タグ付きタンパク質が発現される細胞の視覚化、追跡および／または単離を容易にする。ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えタンパク質の発現の他の例は、トランスジェニックマウス、または分泌性タンパク質を発現させるために遺伝的に改変したマウスに移植した細胞の使用である。後者は例えば、腫瘍の発達を促進し、ホルモン、成長因子、および／または生存因子として働くと考えられるタンパク質であってよい。この状況では、様々なレベル（低、中程度、高）のタンパク質分泌を得て、特定の結果（例えば、腫瘍の増大）を得ることが重要である可能性がある。組換えの状況で発現される場合、多くのタンパク質は効率よく分泌されない。その場合、組換え法によって、その内因性リーダー配列をその有効な分泌を駆動することができるリーダー配列で置き換え可能であることは有用である。
【０１１９】
所与の単離ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡを使用してそのタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる前に、そのヌクレオチド配列がコードするタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現を支持できることを確認することが有用であることが多い。このプロセスは例えば、特定の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）においてタンパク質が受ける翻訳後修飾、およびタンパク質の活性に関するさらなる情報を得るのにも役立てることができる。分泌性タンパク質の場合、ｃＤＮＡ配列はその完全長型、その成熟型（すなわち、リーダー配列を含まないタンパク質）、または特定のドメインなどのタンパク質の任意の他の部分のいずれかをコードする可能性がある。
【０１２０】
無細胞系における組換えタンパク質の発現用のプラスミド鋳型の調製
成熟型の対象の任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡを組換えによって発現させるために、ｃＤＮＡを修飾してコード配列以外に、翻訳開始部位／翻訳エンハンサー（例えば、コザック配列、オメガ配列、非オメガ配列）を含めることは、有用であることが多い。この実施例では成熟型は、シグナルペプチドを含まないタンパク質である最も典型的な分泌産物を指す。さらに、対象のタンパク質に関する抗体が存在しない場合、検出と精製プロセスの両方を容易にするタグを付加することもできる。このようなタグの例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびエピトープＶ５、ＨｉｓＸ６、およびＨｉｓＸ８（Ｈ８）である。対象のタンパク質をコードするｃＤＮＡへのこれらの特徴の付加は、様々なクローニング法によって行うことができる。対象のｃＤＮＡ中に適切な制限酵素部位が存在しない場合、以下に記載した方法などのＰＣＲ増幅法をクローニングプロセス中に使用することもできる。３つのＰＣＲステップを含み、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼでタグ付けした成熟ＯＲＦが得られる、クローニングプロセスを以下に例示する。
【０１２１】
最初に、対象の成熟オープンリーディングフレーム（成熟ＯＲＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む第１プラスミドを、第１ＰＣＲに提供した。翻訳開始部位／翻訳エンハンサーを成熟ＯＲＦのコード配列の５’領域に付加するために、ヌクレオチドプライマー（フォワードプライマーＦＰ１）を設計および合成し、これは５’ＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣ３’、次に対象の成熟分泌性タンパク質のアミノ末端をコードすることが予測される第１の１９ヌクレオチドを含んでいた。発現させるｃＤＮＡのコード配列（成熟ＯＲＦ）から約１０００ヌクレオチド下流のプラスミドの領域に基づいて、第２プライマー（リバースプライマーＲＰ１）を設計および合成した。実際ＲＰ１プライマーは、ＲＰ１をＰＣＲでＦＰ１とともに使用して成熟ＯＲＦを増幅させることができるように、この領域中のベクター配列の逆相補配列として設計した。ＲＰ１の正確な配列は開始プラスミドに応じて変わり得るが、典型的には約５５〜６５℃のＴｍで１７〜２３ヌクレオチド長であった。
【０１２２】
次いで、成熟ＯＲＦとして発現されるｃＤＮＡを含む精製した開始プラスミド、または精製プラスミドを含む大腸菌細胞を鋳型として、すでに記載した２つのプライマー（ＦＰ１およびＲＰ１）、標準ＰＣＲ試薬、およびＤＮＡポリメラーゼを含む標準ＰＣＲに加えた。次いで、反応混合物を、１５〜３０サイクルのＰＣＲ増幅にかけた。この第１ＰＣＲの産物は、本願明細書の目的のために「ＰＣＲ１コード鋳型」と呼ぶ。
【０１２３】
別のＰＣＲを実施して「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」を調製し、その目的は第２ＰＣＲステップにおいて、最終的なＧＳＴ成熟ＯＲＦ発現鋳型のＧＳＴ部分を提供することであった。この目的のために、異なる開始プラスミド鋳型、例えば非オメガ翻訳開始配列の下流にＧＳＴコード配列を含むプラスミド鋳型を使用し、これは本明細書で「鋳型２」と称する。ＧＳＴ融合タンパク質が切断可能な架橋によって成熟ＯＲＦと連結していることが、有用であることが多い。この目的のために、鋳型は、トロンビン、または市販のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）に感受性がある配列などのプロテアーゼにより切断可能な配列を含むように修飾されたＧＳＴタンパク質を有することが可能である。これによって、プロテアーゼの媒介による切断によって精製操作の最後に、２種のタンパク質、成熟ＯＲＦとＧＳＴを分離させることができる。したがって、２つのプライマー：配列５’ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＡ３’のＦＰ２；および配列５’ＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＣ３’のＲＰ２を使用して、「鋳型２」を増幅させるためにＰＣＲを準備した。鋳型２、すでに記載した２つのプライマー（ＦＰ２およびＲＰ２）、標準ＰＣＲ試薬、およびＤＮＡポリメラーゼを含む標準的なＰＣＲ混合物において増幅を１５〜３０サイクル行った。ＰＣＲが終了した後、増幅産物を３７℃で３０分間エクソヌクレアーゼＩを用いて処理し、次いで８０℃で３０分間熱失活させた。次いで、この産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲル精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）を使用して抽出し、「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」を生成した。実際「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」は、ＧＳＴ−融合発現鋳型を生成する第２ＰＣＲにおいて使用した２つの鋳型の１つであった。最終反応混合物の他の鋳型は、すでに記載した通り調製した「ＰＣＲ１コード鋳型」であった。
【０１２４】
成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ融合発現鋳型であった最終構築体は、以下の通り調製した。２つの鋳型「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」と「ＰＣＲ１コード鋳型」を、成熟ＯＲＦを含む第２ＰＣＲによって組み合わせた。このＰＣＲ反応混合物は、（ｉ）標準ＰＣＲ試薬、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）「ＰＣＲ１コード鋳型」の等分試料（例えば０．５μｌ）、（ｉｖ）「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」の等分試料（例えば１μｌ）、（ｉｖ）ＳＰ６プロモーター配列の一部分を含み、（下線部の配列と比較して）その共通の３’末端を介して「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」の５’末端とアニーリングした、第５のプライマー、配列５’ＧＣＧＴＡＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ３’のＦＰ３、および（ｖ）ＲＰ１と同じベクターの同じ領域であるが、ＲＰ１の３ヌクレオチド上流で始まり、完全長ＰＣＲ１コード鋳型のみと特異的にアニーリングする、領域中ベクター配列の逆相補配列として設計した、第６のプライマーＲＰ３であって、通常、１７〜２３ヌクレオチド長であり、Ｔｍが約５５〜６５℃であり、「ＰＣＲ１コード鋳型」を増幅させる際に使用することができるＲＰ３を含んでいた。１５〜３０サイクルのＰＣＲ増幅の後、「成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ融合発現鋳型」をこのようにして作製した。
【０１２５】
コムギ胚芽エキスにおけるＧＳＴ−融合発現鋳型の発現
無細胞系において対象の成熟タンパク質を発現させるために、ｍＲＮＡを同じ反応または別々の反応において「成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ−融合発現鋳型」から転写および翻訳することができる。別のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応混合物（５０μｌ）は、以下のバッファー：８０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１６ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、１単位のＳＰ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）および１単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）中で、５μｌの「ＧＳＴ−融合発現鋳型」を用いて調製することができる。反応混合物は３７℃で３時間インキュベートする。生成したｍＲＮＡは、２００μｌのＲＮａｓｅフリーの水、３７．５μｌの５Ｍ酢酸アンモニウム、および８６２μｌの９９％エタノールを含む溶液中でエタノール沈殿に施す。エタノール沈殿は、ボルテックス攪拌によって混合するステップ、および４℃で１０分間の１５，０００×ｇでの遠心分離によってペレット化するステップを含む。次いで、ｍＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で５分間の１５，０００×ｇでの遠心分離によって再度ペレット状にし、そのステップの後、ペレット状のｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳用に調製する。
【０１２６】
コムギ胚芽エキスはｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に使用することができ、すでに記載した通り別々に調製することができる。最初に、２×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒのストック溶液を、２つの別個のアミノ酸ストックを混合させることにより調製した。第１ストックは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．８、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５．４ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、０．８ｍＭのスペルミジン、１００μＭのＤＴＴ、２．４ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＧＴＰ、３２ｍＭのクレアチンリン酸、０．０２％のＮａＮ３、およびアスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンを含まなかった０．６ｍＭのアミノ酸混合物を含んでいた。第２ストックは、１ＮのＨＣｌ中にアミノ酸アスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、イソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンの８０ｍＭ混合物を含んでいた。第２ストック中のすべてのアミノ酸が溶解した後、アミノ酸の第２ストックの最終濃度が０．６ｍＭであるように、２つのストックを混合した。２×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒのストックを、次いで５ＮのＫＯＨを使用してｐＨ７．６に調整し、濾過滅菌し、等分試料として−８０℃で凍結保存した。
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ（すでに記載した通り別々に調製）を再懸濁させるために、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中で調製した６０の最終ＯＤ２６０ｎｍで、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を含む５０μｌの「翻訳混合物」を調製した。沈殿したｍＲＮＡから上清（エタノール）を除去した後、５０μｌの「翻訳混合物」を沈殿に加え、５〜１０分間放置した後、ｍＲＮＡを翻訳混合物に再懸濁させた。次いで、再懸濁させたｍＲＮＡを含む完全な翻訳混合物を、二層反応を設定するために９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートの１つのウェルにすでに加えた、２５０μｌの１×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒの下で層状にした。次いで、プレートをプレートシールを用いて手作業で密封し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応混合物は２６℃で２０時間インキュベートした。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応期の最後に、かつＧＳＴ融合体として発現された組換え成熟ＯＲＦタンパク質を回収するために、翻訳混合物をチューブに移し、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて５倍希釈した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が結合する、１０マイクロリットルのグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮＪ）を次いで混合物に加え、混合を確実にするために絶えず攪拌しながら、次いで４℃で３時間インキュベートした。結合ＧＳＴ−融合タンパク質を含むＧＳＨ−セファロースビーズは、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ中で次いで３回洗浄した。成熟ＯＲＦとＧＳＴを組換えにより遺伝子工学処理して、プロテアーゼ切断型架橋を介して融合させる場合、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、および０．２５Ｍスクロースを含むプロテアーゼ切断型バッファー中において、次いで４回目の洗浄を実施した。この洗浄バッファーは「最終洗浄バッファー」とも呼ばれた。洗浄バッファーをビーズ混合物から注意深く除去した後、最終ステップから回収した１０μｌの最終洗浄バッファーをビーズと混合させ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）などの０．４μｌの適切なプロテアーゼを混合物に加えた。次いでピペットを使用してビーズを軽く懸濁させた。このビーズ混合物／懸濁液を、次いで一晩４℃で放置した。切断した成熟ＯＲＦタンパク質産物を回収するために、２０μｌの最終洗浄バッファーを加え、（ビーズを沈殿させた後に）ピペッティングによって、あるいは焼結フリットを介した濾過によって、全液体分画（ビーズを含まない）を回収した。
【０１２９】
回収した液体分画（精製した成熟タンパク質を含む）の等分試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＥＬＩＳＡおよび／またはクーマシー／銀染色によって分析して、成熟タンパク質の発現のレベルを定量した。
【０１３０】
回収した成熟ＯＲＦタンパク質を安定化させるために、ＰＢＳに溶かした１０ｍｇ／ｍｌの精製ＢＳＡの溶液を、ＢＳＡの最終濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるように精製タンパク質溶液に加えた。次いでタンパク質サンプルはＰＢＳ中で透析し、保存用に濾過滅菌した。ウェスタンブロット分析は、様々なステップおよび精製操作中に回収した等分試料から行って、例えばタンパク質の発現のレベルを評価すること、翻訳されるタンパク質がその長さとその配列の両方の点で、対象のｃＤＮＡによってコードされると予想されるタンパク質に対応するかどうか決定することができる。生物活性測定、質量分析、および翻訳後修飾アッセイなどの先の特徴付け試験において、タンパク質を使用することもできる。同じｍＲＮＡ鋳型からさらなるタンパク質を生成させるために、１つの二層反応を多数回繰り返すことができ、精製および配合はそれに応じて調節することができる。
【０１３１】
典型的には、１６の二層反応（すでに記載した通り設定した）は、生物活性アッセイなどの大部分の典型的なアッセイにおいて試験するための、十分な生物活性を有するタンパク質を産生するはずである。これらの反応は９６ウェルプレート中で行うので、多数の対象のｃＤＮＡを別のウェル中で同時に翻訳することができるハイスループットアッセイに、この発現系は適している。ｃＤＮＡが、コムギ胚芽エキス中の対象の特定のタンパク質をコードすることができることが示されると、この発現系で通常得られるタンパク質よりも多い量のタンパク質を発現させることが、望ましい可能性がある。異なる細胞系において所与のタンパク質が受ける翻訳後修飾、例えばコムギ胚芽溶解物などの植物ベースの系に存在する翻訳後修飾と、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）に存在する翻訳後修飾を比較することも、望ましい可能性がある。
【０１３２】
様々なシグナルペプチド−未熟タンパク質の発現レベルの評価
表３の列３（「最高発現型」）は、その内因性シグナルペプチドを含まない標準条件下での本発明の様々なタンパク質の発現のレベルの比較を目的とする、ハイスループットの発現実験の結果を要約する。表１および付録Ａに挙げる完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む一組のｃＤＮＡで始めて、成熟ＯＲＦ鋳型を前段落で詳細に記載した通り調製して、成熟型の各タンパク質（すなわち、その内因性シグナルペプチドを含まないタンパク質）を発現させた。精製後、精製Ｖ５タグ付きタンパク質標準に対する抗Ｖ５抗体を使用して、発現のレベルをクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または定量ウェスタンブロットによって定量し、５６の「最高発現型」を、互いに比較したそれらの発現レベルに基づいて１（高）から５６（低）までランク付けした。これらの標準条件下、列３／表３の「最高発現型」中では、非常に高い発現型（ランク１）は成熟型のプロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユニットであり（ＣＬＮ００５１７７９０）；中程度発現型（ランク２０）は成熟型の長鎖型のαＩコラーゲンＩＸ型であり（ＣＬＮ００５１７６４８）；最低の発現型（ランク５６）はＷＦＩＫＫＮ関連タンパク質（ＣＬＮ００４６３４７４）であった。
【０１３３】
（実施例２）
哺乳動物細胞から高レベルで分泌されるリーダー配列含有タンパク質の同定
次のアッセイセットは、馴化培地から回収することができた量に基づいて（すなわち、「分泌」に基づいて）タンパク質を比較することを目指した。表１および表２の実施例１で用いたｃＤＮＡをｐＴＴ哺乳動物発現ベクターの修飾バージョンにサブクローニングして、哺乳動物細胞において、そのタンパク質をそれらの内因性のシグナルペプチド／リーダー配列で発現させた。馴化培地に存在する生成タンパク質のレベルを定量した後に、今度は「高分泌型」から「中程度分泌型」に、さらに「低分泌型」にタンパク質をランク付けした。
【０１３４】
後に、この情報は、そのシグナル配列／リーダー配列をリエンジニアリングすることによってタンパク質の分泌を改善することができるかどうかを判断するためのベースラインの役目を果たした。この「リエンジニアリング」は、「低分泌型」タンパク質の内因性シグナルペプチドを、「中程度」または「高分泌型」のそれで置換することによって実施された。
【０１３５】
上記のリエンジニアリングを進めるために、本発明の各タンパク質のシグナルペプチド／リーダー配列に対応するアミノ酸配列をまず特定する必要があった（付録Ａ、表１および２）。定義済みの属性セットに基づき、既存のライブラリーからのｃＤＮＡは、分泌性タンパク質をコードするとバイオイニフォマティクスにより予測することができる。例えば、シグナルペプチドは一般にＯＲＦの最初の６〜２７のアミノ酸コドン（１８〜８１ヌクレオチド）によってコードされ、それは通常１〜４の極性アミノ酸から開始し、その後一続きの疎水性アミノ酸が、次に、分泌関連の切断が起こる部位の直前に荷電アミノ酸の短い領域が続く。他の物理学的性質とともにこれらの属性を使って、ｃＤＮＡは分泌性タンパク質をコードすると予測することができるが、タンパク質の識別情報は不明のままである。完全なｃＤＮＡライブラリーで実行されたそのような分析の１つの結果を、付録Ａと表１および２で要約する。現在の限界は依然、推定上のシグナルペプチド／リーダー配列の存在が、前記リーダー配列を含むタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの分泌を可能にするかどうか、および、この方法の効率はどの程度であるかを予測することができないことである。
【０１３６】
リーダー配列のハイスループットスクリーニングのための発現ベクターの調製
高レベルのタンパク質分泌を生成するシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を特定するために、分泌性タンパク質をコードすると予測された（手持ちのｃＤＮＡライブラリーおよび上述の方法を用いて）ｃＤＮＡセットを、実施例１で詳述したものと類似したサブクローニング手法を用いてｐＴＴ５発現ベクター（図３）のいくつかの修飾バージョンの１つにサブクローニングした。修飾ベクターのいくつかは、切断可能なタグ（ベクターＡおよびＣ、図４および５）をＣ末端Ｖ５およびＨｉｓＸ８エピトープタグとインフレームで（ベクターＡ、ＢおよびＣ、図４および５）、またはＦｃドメイン配列とインフレームで含んでいた（ベクターＤおよびＥ、図６）。ＨｉｓＸ８タグ（８Ｈｉｓ残基の群からなる）の存在は、当分野の技術者に周知であり、市販されている（例えばＱｉａｇｅｎ社、ＣＡ）標準のニッケルカラムベースの技術を用いることによる、組換えで発現するタンパク質の精製を可能にする。安定したトランスフェクタントのために長期の選択が必要な場合、タンパク質は図７に示すｐＴＴ２ｐベクターなどのベクターでも発現させた。
【０１３７】
ｐＴＴ５へ挿入した各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドＤＮＡは、９６ウェルプレートでＱＩＡＧＥＮ（商標）ＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮＡシステムを使って精製した。各クローンのＤＮＡ濃度は２６０ｎｍでの吸光度で測定して、その後、例えば適当な緩衝液で５０μｇ／ｍｌの濃度に調節した。生じたｐＴＴ５ベースの構築体をハイスループット９６ウェルシステムを使って２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＶＡ）に一過性にトランスフェクトした後、発現／分泌アッセイを行った。これらの工程は、次に記載する。
【０１３８】
９６ウェルプレートでのハイスループットトランスフェクション
１０の９６ウェルプレートの一過性のトランスフェクションのために、各ｃＤＮＡプラスミドの１０μｌを５０μｌのＧＩＢＣＯ（登録商標）ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）（ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ番号３１９−８５−０７０）と丸底９６ウェルポリスチレンプレートの別々のウェル（各ｃＤＮＡのために１つ）内で組み合わせた。このプレートを、「マスタートランスフェクションプレート」と命名した。その後、各ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）／ｃＤＮＡ混合物の３７．５μｌを、２．５μｌのＦＵＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、カタログ番号１９８８３８７）と別の丸底９６ウェルポリスチレンプレートの別々のウェル（各ｃＤＮＡのために１つ）内で５分間プレインキュベートした。次に混合物を室温で約３０分間インキュベートして、ｃＤＮＡにつき１つの「トランスフェクション複合体」を得た。
【０１３９】
各トランスフェクション複合体はその後１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）を加えて希釈し、反復ピペット操作によって数回混合し、次に、一度に２０μｌを１０の別々のウェルに移した。トランスフェクションの後の最高１０の異なるアッセイのための試料収集を促進するために、各ウェルは、別々の９６ウェル平底ポリリジンコートプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号３５６４６１）上にあった。各プレートは、最大で９６の異なるｃＤＮＡを含んでいた。
【０１４０】
次に、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む）中の２９３Ｔ細胞の２×１０５細胞／ｍｌの懸濁液の２００マイクロリットルを、各ウェルに加えた。細胞および希釈したトランスフェクション複合体の各種混合物は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。約４０時間後に、培地を吸引によってウェルから取り出し、細胞を１５０μｌのＰＢＳで短時間洗浄して、予熱処理をした新たな培地を加えた。
【０１４１】
各タンパク質の発現および分泌のレベルを分析する目的のために用いるトランスフェクション細胞のセットを調製するために、新鮮なＨＹＱ−ＰＦ（商標）ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、カタログ番号ＳＨ３０３５９．０２）の１５０μｌを各ウェルに加えた。
【０１４２】
分泌されたタンパク質の活性を分析する目的のために用いるトランスフェクション細胞のセットを調製するために、ＨＹＱ−ＰＦ（商標）ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙの代わりに５％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新鮮な１５０μｌのＤＭＥＭ培地をウェルに加え、生じた混合物を３７℃の５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１４３】
様々なｃＤＮＡがそれらの分泌性タンパク質をそれぞれ発現してさらに４８時間後、１０枚すべての９６ウェルプレートからの培養液上清を収集し、適当な場合は単一の滅菌深底ウェルプレートに混ぜ入れて、滅菌蓋で覆った。深底ウェルプレートは、遊離細胞または細胞片をペレット化するために、１，４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。馴化培地に放出されたタンパク質（すなわち分泌されたタンパク質）のレベルを測定することができるように、上清を新しい滅菌深底ウェルプレートへ移した。このことは、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロット、および、捕捉工程として抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体を使い、発現を検出して精製されたＶ５Ｈｉｓ標準と比較した発現レベルを測定するために抗Ｖ５−ＨＲＰを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって達成された。プレートに結合したままの細胞の層は、０．２％ＳＤＳ、０．５％ＮＰ−４０を含むＰＢＳで可溶化した。生じた細胞溶解物は、ＥＬＩＳＡによる細胞溶解物中のタンパク質レベルの分析のために用いた。
【０１４４】
スクリーニングアッセイの最初のセットにおいて、それらが属するタンパク質の高い分泌レベルと相関することが示されたリーダー配列のサブセットが同定された。直前に記載した工程に従って実施したハイスループット分泌アッセイの結果は、図８および９に示す。２９３Ｔ細胞におけるｃＤＮＡのハイスループット発現を使って、高い分泌レベルをもたらすいくつかのｃＤＮＡを同定した。合計５６のｃＤＮＡ（以前、分泌性タンパク質のための我々の完全なｃＤＮＡライブラリーの中で最高発現型と評価された）を、このアッセイでスクリーニングした。それらの同一性、各レーンにおけるそれぞれの位置、および馴化培地における相対発現レベルは、表３、カラム２および４ですべて要約する。カラム２は、隣接したレーンに分離された１つまたは複数の標準の濃度と比較して、馴化培地に分泌された各タンパク質の濃度を定量した（図８および９のＢＳＡ）。一般的に、分泌レベルは発現レベルと常にではないが相関する（カラム２とカラム２とを比較する）。例えば、「最高発現型」（カラム３で１番にランクされる）は、表３によると「最高分泌型」（分泌タンパク質濃度３２μｇ／ｍＬ）でもある。これらの結果は、完全長タンパク質ベータサブユニットプロリル４−ヒドロキシラーゼ（カラム１１）に対応する。他方、いくつかのタンパク質は約４μｇ／ｍＬのレベル（カラム２）で分泌されたが、発現では１６および２１の間にランクされた（カラム３）。αＩコラーゲン型ＩＸのロング形態（ＣＬＮ００５１７６４８によってコードされる）は、後者の１つである。
【０１４５】
（実施例３）
高分泌型からのリーダー配列セットは、低分泌型から高分泌型への変換に役立つ
実施例２で詳述したハイスループットアッセイは、「低分泌型タンパク質」から「高分泌型タンパク質」までの異なる分泌レベルを有する「最高発現型」タンパク質からの一群のｃＤＮＡを提供した。それらの同一性および特性については、表１、２および３を参照。次の問題は、高分泌型のシグナルペプチド／リーダー配列が他のタンパク質に移動可能かどうかということであった。より重要なことは、「低分泌型タンパク質」の分泌が、それらの内因性リーダー配列を本発明の「高分泌型タンパク質」のいずれか１つからのもので置換することによって改善することができるかどうかという疑問であった。このために、基本的に実施例１および２で詳述したような標準のサブクローニング手法、トランスフェクション方法および発現方法を使って、一連の実験を実施した。これらの実験の１つを次に例示する。
【０１４６】
ハイスループット発現およびハイスループット分泌アッセイの初期セットにおいて、低発現タンパク質、低分泌タンパク質またはその両方であることが示された一群のタンパク質のシグナルペプチド／リーダー配列を置換するために、ＣＬＮ００５１７６４８からのシグナルペプチド／リーダー配列を用いた。それら自身の内因性リーダー配列の代わりに高分泌型クローンＣＬＮ００５１７６４８の異種リーダー配列を有する、得られたリエンジニアリングによるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、さもなければ低発現型／低分泌型タンパク質であったものから高分泌型タンパク質に変わったことがわかった。実際、ＣＬＮ００５１７６４８のシグナルペプチド／リーダー配列は、Ｉ型ＴＭタンパク質およびＩＩ型タンパク質の分泌を増強することができる。その分泌がこの過程によって改善されたタンパク質のいくつかの特定の例には、以下のタンパク質をコードするｃＤＮＡ構築体が含まれる。ヒトＣＤ３０リガンド、ＳＣＤＦＲ１、Ｏｘ４０リガンドであり、そのすべてが、実施例１および２で記載されている方法によってそれらの内因性シグナルペプチド／リーダー配列がＣＬＮ００５１７６４８の配列で置換されるように操作された。さらに、修飾されたタンパク質の総発現レベルも、この置換によって増加した。これはどちらも、細胞溶解物および馴化培地における総タンパク質レベルの両方の定量によって決定された。したがって、ＣＬＮ００５１７６４８からのシグナルペプチド／リーダー配列は、低発現型タンパク質の発現および分泌をどちらも増強することができる。
【０１４７】
それらの内因性リーダー配列を、ＣＬＮ００５１７６４８または「最高発現型」（表３、カラム３を参照）のリストから選択された他のタンパク質の配列（異種リーダー配列）で置換することによる、低分泌型および／または低発現型の分泌および／または発現のレベルの改善を示す上記のハイスループット結果は、実施例４に記載のスケールアップ方法を使用してさらに確認された。
【０１４８】
（実施例４）
２９３−６Ｅ細胞におけるリーダー配列含有タンパク質の発現のためのスケールアップ方法
９６ウェルハイスループットトランスフェクション−発現アッセイの代替手段は、トランスフェクションおよび発現の両方が、より大規模のプロトコルで行われるものである。これらは、例えば、９６ウェルプレートではなく振とうフラスコ中で増殖した、Ｙ．  Ｄｕｒｏｃｈｅｒによって提供される２９３−６Ｅ細胞を使用し得る。ハイスループット方法のために、Ｆｕｇｅｎｅ  ６の代わりに振とうフラスコ中でのＤＮＡトランスフェクションのためにＰＥＩを使用する以外は、２９３−６Ｅ細胞を、２９３Ｔ細胞に使用するものと同じ試薬で処理し、同じ条件に供することができる。
【０１４９】
スケールアップ方法のために、２９３−６Ｅ細胞を、ベントスクリューキャップ付きポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ中で増殖させ、５％ＣＯ２中３７℃、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド）中１００ＲＰＭで、卓上用シェイカーで回転させた。これらのフラスコ中の細胞密度を０．５〜３×１０６細胞／ｍｌの範囲に維持した。典型的には、５０ｍｌの培養物を２５０ｍｌのフラスコ中で増殖させた。トランスフェクションの前日に、２９３−６Ｅ細胞を、約０．６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで、新鮮なＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）培地中に希釈した。トランスフェクションの日に、細胞は、０．８〜１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度範囲によって特徴付けられる対数期にあると予想された。対数期の細胞培養物の体積を、それらの細胞密度が約１０６細胞／ｍｌになるように調節した。
【０１５０】
各ｃＤＮＡについて、異なるトランスフェクションミックスを調製した。各トランスフェクションミックスを調製するために、２．５ｍｌの無菌ＰＢＳを、２つの１５ｍｌチューブに加えた。第１チューブはまた、５０μｇのＤＮＡを含んだ。第２チューブはまた、直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミンの１ｍｇ／ｍｌの無菌ストック溶液、ｐＨ７．０（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製、ウィスコンシン州ウォリントン）を含む１００μｌのＰＥＩ溶液を含んだ。次いで２つのチューブ中の溶液を組み合わせ、室温で１５分間、ともにインキュベートし、トランスフェクション複合体を生じた。次いでトランスフェクション複合体を２９３−６Ｅ浮遊培養物に移し、５％ＣＯ２中３７℃で４〜６日間増殖させた。この方法を各ｃＤＮＡについて繰り返した。
【０１５１】
タンパク質分泌レベルを測定するために、ウェスタンブロットによって培養物上清を解析した。試料（ｃＤＮＡにつき１５μｌ）を、２６レーンのＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜をブロックし、クローニング工程で導入された特異的エピトープに対する抗体でプローブした。例えば、Ｖ５および／またはＨｉｓＸ８エピトープタグ付きタンパク質には、ＨＲＰ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド）に複合した抗Ｖ５または抗ＨｉｓＸ８エピトープ抗体のいずれかを使用した。標準的なＨＲＰ化学発光基質（ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＨＲＰシグナルを発生させた。
【０１５２】
各分泌タンパク質について得られたシグナルの強度を、同じゲルの別々のレーンにローディングした３つの精製された質量標準液のうちの１つのもの（例えば、８、３３、および１３３ｎｇ／ｍｌで１５μｌの標準液）と比較することによって、分泌レベルを測定した。比較は、クーマシー染色ゲル、銀染色ゲル、またはウェスタンブロットのいずれかに存在するバンドの面積を測定することを含んだ。この方法は、画像スキャナ、およびＳｃｉｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎウェブサイトからダウンロードできるＮＩＨイメージフリーウェアで行った。様々なタンパク質標準液を使用した。例としては、Ｖ５−ＨｉｓＸ６タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質、Ｖ５−ＨｉｓＸ６タグ付きのＣＳＦ−１受容体細胞外ドメイン、および／またはＶ５−ＨｉｓＸ６タグを含むＰＯＳＩＴＯＰＥ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド、カタログ番号Ｒ９００−５０）が挙げられる。例えばバキュロウイルス発現系を用いてこれらの標準液を別々に発現させ、９０％より高い純度に精製することができる。
【０１５３】
図２は、２０個のクローンのｃＤＮＡ（Ｖ５Ｈ８エピトープを含む）をｐＴＴ５ベクターにサブクローニングした、大規模発現実験の結果を例示する（図５）。本明細書中に記載される方法を用いて、得られたクローンを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。馴化培地中の１５μｌの試料中の分泌タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって評価した。各標準液において２つのＶ５  Ｈｉｓ標準液を混合し、以下の濃度に従って、右端のレーンにローディングした。（１）１６、６６および２６６ｎｇ／ｍｌでローディングした、高い方の分子量の、Ｖ５−Ｈｉｓｘ５タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質、ならびに（２）８、３３、および１３３ｎｇ／ｍｌでローディングした、低い方の分子量の、Ｖ５−Ｈｉｓｘ６タグ付きのＣＳＦ−１細胞外ドメイン。抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）をウェスタンブロットのために使用した。このウェスタンブロット実験から、ＣＬＮ００７１７６４８によってコードされるタンパク質を発現するクローンが、馴化培地中で最高レベルの分泌タンパク質を産生した。これらの結果は、２９３−６Ｅ細胞における大規模発現によって確認された。
【０１５４】
（実施例５）
本発明のシグナルペプチド／リーダー配列の、それらが異種タンパク質の分泌および／または発現を増強できるかどうかに基づく分類
実施例１〜４で述べた実験を組み合わせた結果から、本発明のリーダー配列の、異種リーダー配列としてのそれらの役割における、それらが挿入されたタンパク質の分泌および／または発現を改善する能力に従った分類が示唆される。したがって、リーダー配列は、「高分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」、「中程度分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」、または「低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」等の種類に分類される。
【０１５５】
分泌レベルおよび本発明の異種ポリペプチドによって引き起こされた分泌の増大は、得られたポリペプチドの発現レベルと別々であり、異なっているので、得られたポリペプチドはまた、互いに関して本発明のタンパク質をすべて（表１〜３および付表Ａ）ランク付けするように働く相対的な段階に関して、それらの発現レベルに基づいてランク付けした。これらのランク付けは、コムギ胚芽エキス、または哺乳動物細胞のいずれかにおける、発現および分泌レベルについて行った（実施例１〜３参照）。
【０１５６】
さらに、上記の分類はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることから得られた結果に基づくが、分類は、本発明のタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させながら得ることができる結果まで広がり得る。実施例１ですでに述べたように、本発明のシグナルペプチド／リーダー配列は、それらが結合している異種タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を改善するのに使用できるかどうかについてアッセイすることができる。例えば、本質的に実施例１および２に記載されるようなクローニング方法を用いて、表２に記載されるリーダー配列のいずれかを、適切に作用するように異種タンパク質に作動可能に連結することができる。次いで、得られたｃＤＮＡ構築体を、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスまたはブタＥＳ細胞）にエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションすることができ、次いでそれを、当業者に公知の標準的な方法に従って、トランスジェニック動物（例えばマウスまたはブタ）の作製に使用する。タンパク質、およびｃＤＮＡ構築体の他の特性（例えば、組換えタンパク質の発現を駆動するのに使用する特定のプロモーター）に依存して、分泌組換えタンパク質を、例えば血液、乳汁、唾液等の体液からアッセイすることができ、その発現レベルを定量することができる。アッセイは、シグナルペプチドによってのみ異なる２つの組換えタンパク質が発現されるように行うことができる（すなわち、内因性のシグナルペプチドと本発明の異種のシグナルペプチドとを比較する）。
【０１５７】
本発明のシグナルペプチド／リーダー配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現に使用する代わりにｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現に使用する場合には同一の範疇に分類されない可能性がある。しかし、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイから得られた結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で所望のレベルのタンパク質発現を達成するためにどの特定のシグナルペプチド／リーダー配列を使用することができるかを選択するための指針として役立つに違いない。
【０１５８】
本明細書は、以下の参考文献に照らして最も徹底的に理解され、これはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、上記で引用した特許および他の参考文献の開示も参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
【数１−１】
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【０１６０】
【数１−２】
2008528033.tif 000003
【０１６１】
【数１−３】
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【０１６２】
【数１−４】
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配列表
出願人らは、付表Ａとして電子フォーマットおよびペーパーフォーマットの両方で用意した配列表を添付する。
【０１６３】
産業上の利用可能性
リーダー配列、異種の分泌ポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製する方法により、多くの研究、診断、および治療用途における使用法が発見される。
【０１６４】
【表１−１】
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【０１６５】
【表１−２】
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【０１６６】
【表１−３】
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【０１６７】
【表１−４】
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【０１６８】
【表１−５】
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【０１６９】
【表１−６】
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【０１７０】
【表２−１】
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【０１７１】
【表２−２】
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【０１７２】
【表２−３】
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【０１７３】
【表２−４】
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【０１７４】
【表２−５】
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【０１７５】
【表２−６】
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【０１７６】
【表３−１】
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【０１７７】
【表３−２】
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【０１７８】
【表３−３】
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【０１７９】
【表３−４】
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【０１８０】
【数２−１】
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【０１８１】
【数２−２】
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【０１８２】
【数２−３】
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【０１８３】
【数２−４】
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【０１８４】
【数２−５】
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【０１８５】
【数２−６】
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【０１８６】
【数２−７】
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【０１８７】
【数２−８】
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【０１８８】
【数２−９】
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【０１８９】
【数２−１０】
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【０１９０】
【数２−１１】
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【０１９１】
【数２−１２】
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【０１９２】
【数２−１３】
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【０１９３】
【数２−１４】
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【０１９４】
【数２−１５】
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【０１９５】
【数２−１６】
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【０１９６】
【数２−１７】
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【０１９７】
【数２−１８】
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【０１９８】
【数２−１９】
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【０１９９】
【数２−２０】
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【０２００】
【数２−２１】
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【０２０１】
【数２−２２】
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【０２０２】
【数２−２３】
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【０２０３】
【数２−２４】
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【０２０４】
【数２−２５】
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【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、（ａ）本発明のリーダー配列（「ｃｏｌｌａｇｅｎ＿ｌｅａｄｅｒ」）、（ｂ）未知のタンパク質のアノテーションを有するＭＧＣ：２１９５５としてすでに示されており、ＣＬＮ００５１７６４８として本明細書で示されるｃＤＮＡクローン、および（ｃ）ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型（ヒト）に相当する、公にアクセス可能な配列ＮＰ＿００１８４２＿ＮＭ＿００１８５１からなるアミノ酸配列のアラインメントである。こうした配列はすべて、Ｎ末端がアミノ酸残基１としてメチオニン（「Ｍ」）で開始する。このクローンＣＬＮ００５１７６４８＿５ｐｖ１は、その配列を決定し、２５３のアミノ酸残基を含むことが判明した。
【図２】図２は、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトし、ｐＴＴ５ベクター中にサブクローニングした（実施例２〜４においてさらに詳細に記載する通り）培養２９３−Ｔ細胞によって馴化された培地における本発明のいくつかの分泌性ポリペプチドの発現を示したウェスタンブロットである。クローンＣＬＮ００５１７６４８によってコードされる分泌性タンパク質を発現する構築体が最高のレベルで馴化培地においてタンパク質を分泌することが実証された。馴化培地中に分泌されたタンパク質の量は、２種の標準液：（１）Ｖ５−Ｈｉｓｘ６タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質（１６、６６および２６６ｎｇ／ｍｌで１５μｌ）、および（２）Ｖ５−Ｈｉｓｘ６タグ付きのＣＳＦ−１受容体細胞外ドメイン（８、３３および１３３ｎｇ／ｍｌで１５μｌ）と比較した。こうした標準液は混合し、右端の３つのレーンに示した濃度でローディングした。
【図３】図３は、Ｄｒ．Ｙｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒによって提供された始動ベクターｐＴＴ５（４３９８ｂｐ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、２００２）の概略図である。
【図４】図４は、本発明の目的のために「ｃｃｄｂ」領域を置き換えるようにｐＴＴ５ベクター中に挿入したベクターＡの配列を示す。ベクターＡは、左から右に、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、トロンビン切断可能部位をコードする配列によって例示した切断可能配列、Ｖ５Ｈ８によって例示したタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。
【図５】図５は、ベクターＢおよびベクターＣの配列を示す。ベクターＢは、左から右に、コザック配列、本発明のコラーゲンリーダー配列などのリーダー配列（「ＳＰ」）、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、Ｖ５Ｈ８などのタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。ベクターＣは、左から右に、コザック配列、本発明のコラーゲンリーダー配列によって例示したリーダー配列（「ＳＰ」）、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、トロンビンをコードする配列によって例示した切断可能配列、Ｖ５Ｈ８などのタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。
【図６】図６は、ベクターＤおよびベクターＥの配列を示す。ベクターＤは、左から右に、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、およびＦｃドメイン配列、続いて終止コドンを含む。ベクターＥは、左から右に、コザック配列（「ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ」）、本発明のシグナルペプチド／リーダー配列、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、およびＦｃドメイン配列、続いて終止コドンを含む。
【図７】図７は、適当なピューロマイシン耐性細系を作製するためのｐＴＴ２ｐベクターの一例である。具体的には、ｐＴＴ２ｐベクターは、とりわけ、エピソーム性のｐＴＴ２−ゲートウェイベクターを作製するためのマウスポリオーマシグナルを含む。
【図８】図８は、本明細書に記載の２８の分泌性タンパク質を使用したＣＨＯ  ＳＯＹ培地におけるタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上２つの図は、クーマシー染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、下２つの図は、銀染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。表３の列６〜１１は、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンに表される特定のリーダー配列を識別する。右端の３つのレーンでは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準液を、それぞれ８、１６および３２マイクログラム／リットル（ｍｇ／Ｌ）の対応する発現レベルを反映する濃度で流した。
【図９】図９は、本明細書に記載の２９〜５６の分泌性タンパク質を使用したＣＨＯ  ＳＯＹ培地におけるタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上２つの図は、クーマシー染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、下２つの図は、銀染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。表３の列６〜１１は、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンに表される特定のリーダー配列を識別する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準液を、８、１６および３２マイクログラム／リットル（ｍｇ／Ｌ）の対応する発現レベルを反映する濃度で流した。
【図１】
2008528033.tif 000047
2008528033.tif 000048
【図２】
2008528033.tif 000049
【図３】
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【図４】
2008528033.tif 000051
【図５】
2008528033.tif 000052
【図６】
2008528033.tif 000053
【図７】
2008528033.tif 000054
【図８】
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【図９】
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【配列表】
2008528033000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月13日(2007.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分泌リーダーおよび第２ポリペプチドを含む異種ポリペプチドであって、該分泌リーダーが、該第２ポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結しており、ここで、該分泌リーダーは、天然において該第２ポリペプチドにそのように連結しておらず、そして分泌性タンパク質のリーダー配列を含む、異種ポリペプチド。
【請求項２】
前記第２ポリペプチドが、ＩＸ型コラーゲンα１鎖、長鎖スプライシング型、α−２−抗プラスミン前駆体（α−２−プラスミンインヒビター）、５含有トリヌクレオチドリピート、ＡＲＭＥＴタンパク質、カルメニン、ＣＯＬ９Ａ１タンパク質、ＮＢＬ１、ＰＡＣＡＰタンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（α−１−Ｂ糖タンパク質）、脳特異的血管新生インヒビター２前駆体に類似、ＳＰＯＣＫ２、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ５３４１）ＥＲ６０前駆体、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１）、ＧＭ２ガングリオシドアクチベーター前駆体、凝固因子Ｘ前駆体、分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、骨シアロタンパク質１）、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体、インターロイキン６（インターフェロン、β２）、オロソムコイド１前駆体、ヘモペキシン、糖タンパク質ホルモン、αポリペプチド前駆体、キニノーゲン１、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、βサブユニット、プロオピオメラノコルチン、プロスタグランジンＤ２合成酵素２１ｋＤａ、α−２−糖タンパク質１、亜鉛、クロモグラニンＡ、シスタチンＭ前駆体、クラステリンアイソフォーム１、インターα（グロブリン）インヒビターＨ１、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、ルミカン、セクレトグロビン、ファミリー２Ａ、メンバー２、ｎｏｖ前駆体、レチクロカルビン１前駆体、レチクロカルビン２、ＥＦハンドカルシウム結合ドメイン、胃内因子（ビタミンＢ合成）、ケルベロス１、リポカリン２（癌遺伝子２４ｐ３）、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＣ前駆体、ＥＦハンドドメインを有する細胞増殖制御因子１、白血球免疫クロブリン様受容体、サブファミリーＡ、スポンジン２、細胞外マトリックスタンパク質、膜貫通タンパク質４、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン、ρＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２５アイソフォームｂ、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３、アメロブラスチン前駆体、絨毛性ゴナドトロピン、βポリペプチド８前駆体、多発性凝固因子欠乏症２、共通唾液タンパク質１に類似、機能未知タンパク質ＦＬＪ３２１１５、腫瘍性タンパク質誘導転写物３、機能未知タンパク質ＭＧＣ４０４９９、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＡ前駆体、インターロイキン１受容体アンタゴニストアイソフォーム１前駆体、ＷＦＩＫＫＮ２タンパク質、機能未知タンパク質９３３０１４０Ｇ２３に類似、ならびに配列番号２〜３、９、１９、２２、２６、２８、３１、３７、４１、４７、５４、５７、６２、６８、７５、７９、８２、８６、８８、９４、９７、１０２、１０４、１０７、１１１、１１６、１２０、１２７、１３１、１３７、１４０、１４５、１４７、１５３、１５９、１６７、１７５、１７７、１８１、１８５、１８９、１９１、１９６、２００、２０７、２０９、２１５、２１８、２２２、２２７、２３２、２３５、２３９、２４１、２４５、２４８および２５４から選択される分泌タンパク質である、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項３】
前記分泌リーダーが、配列番号２０〜２１、２３〜２５、２７、３２〜３６、３８〜４０、４８〜５３、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、９５〜９６、１０３、１０８〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１７８〜１８０、１８６〜１８８、１９７〜１９９、２１０〜２１４、２２３〜２２６、２３３〜２３４、２４０および２４６〜２４７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項４】
前記第２ポリペプチドが、分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項５】
前記分泌性ポリペプチドが、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン、刺激因子、抑制因子、可溶性受容体、およびそのスプライスバリアントから選択される、請求項４に記載の異種ポリペプチド。
【請求項６】
表１の分泌性ポリペプチドのリーダー配列、および表２に記載の分泌リーダーから選択される、リーダーアミノ酸配列を含む分泌リーダー。
【請求項７】
前記アミノ酸配列が付表Ａのアミノ酸配列、配列番号１、４〜８、１０〜１８、２０〜２１、２３〜２５、２７、２９〜３０、３２〜３６、３８〜４０、４２〜４６、４８〜５３、５５〜５６、５８〜６１、６３〜６７、６９〜７４、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、８９〜９３、９５〜９６、９８〜１０１、１０３、１０５〜１０６、１０９〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１４６、１４８〜１５２、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１６８〜１７４、１７６、１７８〜１８０、１８２〜１８４、１８６〜１８８、１９０、１９２〜１９５、１９７〜１９９、２０１〜２０６、２０８、２１０〜２１４、２１６〜２１７、２１９〜２２１、２２３〜２２６、２２８〜２３１、２３３〜２３４、２３６〜２３８、２４０、２４２〜２４４、２４６〜２４７、２４９〜２５３および２５５〜２５６のアミノ酸残基から選択される、請求項６に記載の分泌リーダー。
【請求項８】
融合パートナーをさらに含む、請求項１に記載の異種ポリペプチド。
【請求項９】
前記融合パートナーがポリマーである、請求項８に記載の異種ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリマーが該第３分子であり、第３分子がポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分、フェチュインＡ、フェチュインＢ、およびＦｃから選択される、請求項９に記載の異種ポリペプチド。
【請求項１１】
（１）請求項１から５および請求項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および（２）請求項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１２】
請求項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーをコードする第１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含む異種ポリペプチドをコードする核酸分子であって、該第１ポリヌクレオチドおよび該第２ポリヌクレオチドが、細胞からの該異種ポリペプチドの分泌を容易にするように作動可能に連結しており、ここで、該第１ポリヌクレオチドおよび該第２ポリヌクレオチドが天然においてそのように連結していない核酸分子。
【請求項１３】
前記第２ポリペプチドが分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
コザック配列またはその５’末端に位置するその断片である第３ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
制限酵素切断可能な配列をその３’末端に含む第４ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
タグをコードする第５ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記タグが精製タグである、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記タグがＶ５、ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）、ＨｉｓＸ８（配列番号２５８）、アビジン分子、およびビオチン分子から選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１９】
第２酵素によって切断することができる酵素切断可能な第２配列をコードする第６ポリヌクレオチドをさらに含み、該切断可能な第２配列が、前記タグが異種のポリペプチドのＣ末端に位置している場合、該タグの上流に位置しており、または該タグが異種ポリペプチドのＮ末端に位置している場合、該タグの下流に位置している、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記第２酵素がトロンビンまたはタバコウイルス由来のＴＥＶである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
複製起点および選択マーカーをさらに含む、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
前記複製起点がＳＶ４０  ｏｒｉ、Ｐｏｌ  ｏｒｉ、ＥＢＮＡ  ｏｒｉ、およびｐＭＢ１  ｏｒｉから選択される、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
前記抗生物質耐性がピューロマイシン耐性、カナマイシン耐性、およびアンピシリン耐性から選択される、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
細胞、ならびに請求項１から４および請求項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチド、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項２１から２４のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項２６】
真核細胞細胞である、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
ヒト細胞である、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、および
（ｂ）該核酸分子を発現系において発現させること
を含む方法。
【請求項２９】
前記発現系が細胞発現系または無細胞発現系である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現系が細胞発現系であり、前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物細胞が２９３細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系、およびＣＨＯ細胞系から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記２９３細胞が２９３−Ｔ細胞または２９３−６Ｅ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年１月２７日に米国特許商標庁に出願された仮出願第６０／６４７，０１３号の特典を主張するものであり（米国特許法第１１９条（ｅ）項に従う）、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、異種の分泌性ポリペプチドの産生に有用なリーダー配列；異種の分泌ポリペプチド；このようなリーダー配列をコードする核酸構築体；このような異種の分泌性ポリペプチドをコードする核酸構築体；このような核酸構築体を含有するベクター；このような核酸構築体、ベクターおよびポリペプチドを含有する組換え宿主細胞；ならびにこのような異種のリーダー配列を伴うこのような分泌性ポリペプチドを作製する方法；およびこのような分泌性ポリペプチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
タンパク質は、生物において最も重要な生体分子である。タンパク質は、構造成分および触媒であることに加えて、調節過程において重大な役割を果たしている。多数の細胞タンパク質および細胞外タンパク質の協力により、細胞の増殖および代謝の調節が制御され、影響を受ける。例えば、生理反応に影響を及ぼす多くのシグナル伝達経路は、タンパク質を介して分子間相互作用により作動する。
【０００４】
細胞外タンパク質は、本明細書で「分泌タンパク質」または「分泌性タンパク質」と称することがあるが、細胞間のシグナル伝達物質として機能することが多い。細胞外タンパク質は、この役割においてリガンドとして働く。リガンド／受容体結合事象が細胞表面上で起こる場合、細胞外タンパク質の対応物である、細胞外、細胞内または細胞質ドメインを有する膜結合受容体が細胞外シグナルを細胞中に伝達する。
【０００５】
受容体が潜在的に重要な治療標的となることが多いが、分泌性タンパク質は治療薬として特に興味深い。受容体は、シグナル伝達経路またはホルモン経路に頻繁に関与するので、分泌性タンパク質は、高く特異的な生物活性を示す傾向がある（非特許文献１）。例えば、分泌性タンパク質は、分化および増殖、血液凝固および血栓溶解、体細胞増殖および細胞死、ならびに様々な免疫応答などの生理的過程を制御または調節することが報告されている（同上）。新たな分泌性タンパク質を発見し、その調節機能を調査するために重要な資源および研究努力が費やされてきた。サイトカインおよびペプチドホルモンを含めたこうした分泌性タンパク質の一部は、治療薬として製造および使用されているが（非特許文献２）、分泌され、潜在的に治療上有効であることが期待される何千ものタンパク質の中で少数派を構成している。
【０００６】
通常、分泌性タンパク質は、「タンパク質前駆体」と称されることがある完全長ポリペプチドとして発現され、次いで翻訳後段階で小胞体（ＥＲ）およびゴルジ体においてプロセシングされる。この段階で、シグナルペプチダーゼが、「シグナルペプチド」（ＳＰ）または「分泌リーダー配列」と一般に称される配列である特有の疎水性アミノ酸配列をＮ末端で切断する。通常のＳＰは、約１６〜３０アミノ酸残基長である。次いで、ＳＰなしの生じたポリペプチドは細胞外に輸送される。生じたポリペプチドは、「成熟タンパク質」または「分泌ポリペプチド」と呼ばれる。また、元の分泌性タンパク質と比べて、この成熟タンパク質はシグナルペプチド配列を欠いている。線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーの一部など、ＳＰをＮ末端に有していないタンパク質もある。
【非特許文献１】Ｓｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，「Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ．」，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１９９４年
【非特許文献２】Ｚａｖｙａｌｏｖら，ＡＰ，第１０５巻，第３号，ｐ．１６１−１８６，１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然に存在する分泌性タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその生理的役割に依存して様々な量で発現される。こうした分泌性タンパク質の大部分は、商業的に使用するには、その天然の、または内因性ＳＰの調節下で発現される量が少なすぎる。したがって、治療への応用に対する製造の必要性に応えるために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分泌タンパク質の産生を可能にする核酸構築体および方法が発明されれば有利であるはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質を、その内因性のシグナルペプチドを含む配列から産生する場合よりも高い収量でこのようなタンパク質を産生するための核酸およびポリペプチド構築体を提供する。本発明はまた、タンパク質を、その内因性のシグナルペプチドを伴う、または内因性のシグナルペプチドなしのタンパク質をコードするＤＮＡ配列から産生する場合よりも高い収量でこのようなタンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、および方法を提供し、このより高い収量は、内因性の分泌リーダー配列を本発明の異種の分泌リーダー配列に置き換えることか、または本発明の異種の分泌リーダー配列に、リーダー配列をそうでなければ含有しないタンパク質を付加することのいずれかによって達成される。したがって、本発明は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド構築体を提供し、このポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、例えば、融合パートナーと融合分子を形成するように修飾される。本発明の融合分子は、従来の任意の技法によって調製することができる。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の実施形態を含む。
【００１０】
１．分泌リーダーおよび第２ポリペプチドを含む異種ポリペプチドであって、分泌リーダーが、第２ポリペプチドのＮ末端に作動可能に連結しており、ここで、分泌リーダーは、天然において第２ポリペプチドにそのように連結しておらず、そして分泌性タンパク質のリーダー配列を含む異種ポリペプチド。
【００１１】
２．第２ポリペプチドが、ＩＸ型コラーゲンα１鎖、長鎖スプライシング型、α−２−抗プラスミン前駆体（α−２−プラスミンインヒビター）、５含有トリヌクレオチドリピート、ＡＲＭＥＴタンパク質、カルメニン、ＣＯＬ９Ａ１タンパク質、ＮＢＬ１、ＰＡＣＡＰタンパク質、α−１Ｂ−糖タンパク質前駆体（α−１−Ｂ糖タンパク質）、脳特異的血管新生インヒビター２前駆体に類似、ＳＰＯＣＫ２、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＥＣ５３４１）ＥＲ６０前駆体、セリン（またはシステイン）プロテイナーゼインヒビター、クレードＡ（α−１）、ＧＭ２ガングリオシドアクチベーター前駆体、凝固因子Ｘ前駆体、分泌リンタンパク質１（オステオポンチン、骨シアロタンパク質１）、ビタミンＤ結合タンパク質前駆体、インターロイキン６（インターフェロン、β２）、オロソムコイド１前駆体、ヘモペキシン、糖タンパク質ホルモン、αポリペプチド前駆体、キニノーゲン１、プロリル４−ヒドロキシラーゼ、βサブユニット、プロオピオメラノコルチン、プロスタグランジンＤ２合成酵素２１ｋＤａ、α−２−糖タンパク質１、亜鉛、クロモグラニンＡ、シスタチンＭ前駆体、クラステリンアイソフォーム１、インターα（グロブリン）インヒビターＨ１、白血病抑制因子（コリン作動性分化因子）、ルミカン、セクレトグロビン、ファミリー２Ａ、メンバー２、ｎｏｖ前駆体、レチクロカルビン１前駆体、レチクロカルビン２、ＥＦハンドカルシウム結合ドメイン、胃内因子（ビタミンＢ合成）、ケルベロス１、リポカリン２（癌遺伝子２４ｐ３）、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＣ前駆体、ＥＦハンドドメインを有する細胞増殖制御因子１、白血球免疫クロブリン様受容体、サブファミリーＡ、スポンジン２、細胞外マトリックスタンパク質、膜貫通タンパク質４、ｓｐａｒｃ／オステオネクチン、ｃｗｃｖおよびｋａｚａｌ様ドメインプロテオグリカン、ρＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質２５アイソフォームｂ、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３、アメロブラスチン前駆体、絨毛性ゴナドトロピン、βポリペプチド８前駆体、多発性凝固因子欠乏症２、共通唾液タンパク質１に類似、機能未知タンパク質ＦＬＪ３２１１５、腫瘍性タンパク質誘導転写物３、機能未知タンパク質ＭＧＣ４０４９９、インターロイキン１８結合タンパク質アイソフォームＡ前駆体、インターロイキン１受容体アンタゴニストアイソフォーム１前駆体、ＷＦＩＫＫＮ２タンパク質、機能未知タンパク質９３３０１４０Ｇ２３に類似、ならびに配列番号２〜３、９、１９、２２、２６、２８、３１、３７、４１、４７、５４、５７、６２、６８、７５、７９、８２、８６、８８、９４、９７、１０２、１０４、１０７、１１１、１１６、１２０、１２７、１３１、１３７、１４０、１４５、１４７、１５３、１５９、１６７、１７５、１７７、１８１、１８５、１８９、１９１、１９６、２００、２０７、２０９、２１５、２１８、２２２、２２７、２３２、２３５、２３９、２４１、２４５、２４８および２５４からなる群から選択される分泌タンパク質である、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１２】
３．分泌リーダーが、配列番号２０〜２１、２３〜２５、２７、３２〜３６、３８〜４０、４８〜５３、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、９５〜９６、１０３、１０８〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１７８〜１８０、１８６〜１８８、１９７〜１９９、２１０〜２１４、２２３〜２２６、２３３〜２３４、２４０および２４６〜２４７から選択されるアミノ酸配列を含む、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１３】
４．第２ポリペプチドが、分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１４】
５．分泌性ポリペプチドが、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、ホルモン、刺激因子、抑制因子、可溶性受容体、およびそのスプライスバリアントから選択される、項４に記載の異種ポリペプチド。
【００１５】
６．表１の分泌性ポリペプチドのリーダー配列、および表２に記載の分泌リーダーから選択される、リーダーアミノ酸配列を含む分泌リーダー。
【００１６】
７．アミノ酸配列が付表Ａのアミノ酸配列、配列番号１、４〜８、１０〜１８、２０〜２１、２３〜２５、２７、２９〜３０、３２〜３６、３８〜４０、４２〜４６、４８〜５３、５５〜５６、５８〜６１、６３〜６７、６９〜７４、７６〜７８、８０〜８１、８３〜８５、８７、８９〜９３、９５〜９６、９８〜１０１、１０３、１０５〜１０６、１０９〜１１０、１１２〜１１５、１１７〜１１９、１２１〜１２６、１２８〜１３０、１３２〜１３６、１３８〜１３９、１４１〜１４４、１４６、１４８〜１５２、１５４〜１５８、１６０〜１６６、１６８〜１７４、１７６、１７８〜１８０、１８２〜１８４、１８６〜１８８、１９０、１９２〜１９５、１９７〜１９９、２０１〜２０６、２０８、２１０〜２１４、２１６〜２１７、２１９〜２２１、２２３〜２２６、２２８〜２３１、２３３〜２３４、２３６〜２３８、２４０、２４２〜２４４、２４６〜２４７、２４９〜２５３および２５５〜２５６のアミノ酸残基から選択される、項６に記載の分泌リーダー。
【００１７】
８．融合パートナーをさらに含む、項１に記載の異種ポリペプチド。
【００１８】
９．融合パートナーがポリマーである、項８に記載の異種ポリペプチド。
【００１９】
１０．ポリマーが第３分子であり、第３分子がポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分、フェチュインＡ、フェチュインＢ、およびＦｃから選択される、項９に記載の異種ポリペプチド。
【００２０】
１１．（１）項１から５および項８から１０のいずれか一項に記載の異種ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、および（２）項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【００２１】
１２．項６から７のいずれか一項に記載の分泌リーダーをコードする第１ポリヌクレオチドと、第２ポリペプチドをコードする第２ポリヌクレオチドとを含む異種ポリペプチドをコードする核酸分子であって、第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドが、細胞からの異種ポリペプチドの分泌を容易にするように作動可能に連結しており、第１および第２ポリヌクレオチドが天然においてそのように連結していない核酸分子。
【００２２】
１３．第２ポリペプチドが分泌性ポリペプチド、膜貫通タンパク質の細胞外部分、および可溶性受容体から選択される、請求項１２に記載の核酸。
【００２３】
１４．コザック配列またはその５’末端に位置するその断片である第３ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【００２４】
１５．制限酵素切断可能な配列をその３’末端に含む第４ポリヌクレオチドをさらに含む、項１４に記載の核酸分子。
【００２５】
１６．タグをコードする第５ポリヌクレオチドをさらに含む、項１５に記載の核酸分子。
【００２６】
１７．タグが精製タグである、項１６に記載の核酸分子。
【００２７】
１８．タグがＶ５、ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）、ＨｉｓＸ８（配列番号２５８）、アビジン分子、およびビオチン分子から選択される、項１６に記載の核酸分子。
【００２８】
１９．第２酵素によって切断することができる酵素切断可能な第２配列をコードする第６ポリヌクレオチドをさらに含み、この切断可能な第２配列が、タグが異種ポリペプチドのＣ末端に位置している場合、タグの上流に位置しており、またはタグが異種ポリペプチドのＮ末端に位置している場合、タグの下流に位置している、項１６に記載の核酸分子。
【００２９】
２０．第２酵素がトロンビンまたはタバコウイルス由来のＴＥＶである、項１９に記載の核酸分子。
【００３０】
２１．複製起点および選択マーカーをさらに含む、請求項１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【００３１】
２２．複製起点がＳＶ４０  ｏｒｉ、Ｐｏｌ  ｏｒｉ、ＥＢＮＡ  ｏｒ、およびｐＭＢ１  ｏｒｉから選択される、項２１に記載のベクター。
【００３２】
２３．選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、項２１に記載のベクター。
【００３３】
２４．抗生物質耐性がピューロマイシン耐性、カナマイシン耐性、およびアンピシリン耐性から選択される、項２３に記載のベクター。
【００３４】
２５．細胞、ならびに項１から４および項８から１０のいずれかに記載の異種ポリペプチド、項１１から２０のいずれかに記載の核酸分子、または項２１から２４のいずれか一項に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【００３５】
２６．真核細胞細胞である、項２５に記載の組換え宿主細胞。
【００３６】
２７．ヒト細胞である、項２６に記載の組換え宿主細胞。
【００３７】
２８．分泌ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）項１１から２０のいずれかに記載の核酸分子を提供すること、および
（ｂ）核酸分子を発現系において発現させること
を含む方法。
【００３８】
２９．発現系が細胞発現系または無細胞発現系である、項２８に記載の方法。
【００３９】
３０．発現系が細胞発現系であり、この細胞が哺乳動物細胞である、項２８に記載の方法。
【００４０】
３１．哺乳動物細胞が２９３細胞系、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系、およびＣＨＯ細胞系から選択される、項３０に記載の方法。
【００４１】
３２．２９３細胞が２９３−Ｔ細胞または２９３−６Ｅ細胞である、項３１に記載の方法。
【００４２】
表１は、本発明のリーダー配列が由来する分泌性タンパク質に関する情報を記載している。列１は、内部名称識別番号を記載し、列２は、参照識別番号を記載し、列３は、分泌性タンパク質の識別情報を記載している。
【００４３】
表２は、本発明のリーダー配列に関する情報を記載している。列１は、内部名称識別番号を記載し、列２は、リーダー配列の配列番号（Ｐ１）を記載し、列３は、参照識別番号を記載し、列４は、リーダー配列のタイプ、すなわち完全長対選択的なリーダー配列を記載し、列５は、リーダー配列が由来する分泌性タンパク質を記載している。
【００４４】
表３は、本発明のリーダー配列によって得られた結果を要約する。列１は、クローン名称識別番号を記載し、列２は、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥから検出および測定したマイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）でのタンパク質濃度を記載し、列３は、各構築体の、クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはＶ５−タグ付きの精製タンパク質標準液と比較した、抗Ｖ５抗体を使用した定量的ウェスタンブロットによって測定した発現レベルを最低の５６から最高の１まで１〜５６の段階でランク付けし、列４は、銀染色で発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してバンドが検出されるかどうかを記載し、列５は、試験された分泌性タンパク質の分子量をダルトンで記載し、列６は、図８〜９に対応するゲル番号およびレーン番号を記載し、列７は、分泌性タンパク質の内部名称を記載し、列８は、タンパク質識別番号を記載し、列９は、内部名称識別番号を記載し、列１０は、ソース識別番号を記載し、列１１は、分泌性タンパク質を識別している。
【００４５】
付表Ａ／配列表は、表２におけるリーダー配列のアミノ酸配列（Ｐ１）を記載している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
対象のタンパク質を、その全長アミノ酸配列をコードし、その内因性のシグナルペプチドを含有するＤＮＡ配列から発現され分泌される場合に得られるタンパク質の量よりも多く（例えば、約１０％、２０％、または３０％以上高い割合）発現させ分泌させるために、本発明者らは、その内因性の分泌リーダー配列を別の、すなわち異なる、または異種の分泌性タンパク質の配列で置き換えた。後者の対象の分泌性タンパク質は通常、タンパク質の発現および分泌を試験するための典型的な条件下で、高いレベルで（「高発現型タンパク質」または「高分泌型タンパク質」）、または中程度に高いレベルで（「中程度発現型タンパク質」または「中程度分泌型タンパク質」）発現および／または分泌されるものであり、このタンパク質は、それだけに限らないが、本発明の実施例で詳細に記載する。換言すれば、一団のタンパク質（それだけに限らないが、本明細書に記載のもの、付表Ａ、表１〜３に記載のものを含む）を発現させ、すべてを同じ試験条件下で発現させれば、一部のタンパク質は、他のタンパク質よりも高いレベルで発現および／または分泌することが判明するはずである。したがって、本発明のタンパク質の中で発現および分泌レベルの差を認識し、こうした認識された差を利用して、リーダー配列から、そうしなければ低発現型であるタンパク質、または望ましいレベルで分泌されないタンパク質の分泌および／または発現を改善するのに有用なものであるとさらに同定することが本発明の態様である。
【００４７】
異種の分泌リーダー配列を使用することは、分泌リーダー配列は小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体において除去されるので、分泌性ポリペプチドの得られた成熟アミノ酸配列が分泌過程で改変されない点でさらに有利である。本発明の分泌リーダー配列は、あるタンパク質をＥＲに導くように働く。ＥＲは、リーダー配列を含むタンパク質の中、膜結合タンパク質をすべての他の種類のタンパク質から分離する。次いで、各群を別々にゴルジ装置に移動させる。次いで、ゴルジ装置は、タンパク質を分泌小胞などの小胞、細胞膜、リポソーム、または他の細胞小器官に分配する。
【００４８】
さらに、異種の分泌リーダーを追加することにより、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの発現および分泌が容易になる。このような膜貫通タンパク質の一例は、ＩＩ型の一回膜貫通タンパク質（ＳＴＭ）であり、その分泌リーダーも、タンパク質が可溶性および分泌性となる前に除去されるに違いない膜貫通ドメインである。
【００４９】
したがって、タンパク質の分泌および発現を、内因性のリーダー配列によって達成されるものよりも増強または改善し、分泌性タンパク質を作製するのに場合によって、広く使用することができる、１種（複数）の強力な分泌リーダー配列を同定するために、多くの様々な分泌性タンパク質が、本明細書に記載の通り、クローニングされ、発現されている。クローニングされ、発現されたタンパク質の、哺乳動物２９３細胞の上清における発現および分泌レベルが測定されており、その結果は、例えば、実施例１、図８〜９、および表３に示す。いくつかの高発現型および高分泌型タンパク質が認められた。高発現型タンパク質は、本発明の目的のためには、高分泌型タンパク質と同一である場合もそうでない場合もある。
【００５０】
一実施形態では、分泌性タンパク質ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型の一部である分泌リーダー配列を同定した。この特定のリーダー配列を、異種および／または共通の分泌リーダー配列として使用する場合、発現および分泌を促進することができるかどうかをさらに調査するために選択した。分泌性タンパク質ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型の部分であるこの分泌リーダーのアミノ酸配列は、ＭＫＴＣＷＫＩＰＶＦＦＦＶＣＳＦＬＥＰＷＡＳＡ（配列番号１）であることが予測される。本明細書でさらに記載する通り、この特定の分泌リーダーを含むようにベクターを構築した。こうしたベクターを使用して、それ自体の天然に存在する分泌リーダーなしのいくつかのタンパク質をクローニングして、異種の分泌リーダー配列を伴う分泌性タンパク質を得た。こうした融合タンパク質の発現および分泌レベルは、その非融合対応物で認められる発現または分泌レベルよりも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、または約７０％以上高いことが判明した。
【００５１】
本発明は、以下の定義に照らしてより明確に理解することができる。一般に、本明細書で使用される用語は、その通常の意味、および以下で具体的に示される意味を有する。
【００５２】
本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド分子」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、同義的に使用して、任意の長さのヌクレオチドが重合した形を指す。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログもしくは誘導体を含むことができる。例えば、核酸は、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡ、または当技術分野で知られている、天然に存在するＤＮＡもしくはＲＮＡの合成アナログとすることができる。この用語はまた、ゲノムＤＮＡ；遺伝子；遺伝子断片；エキソン；イントロン；プロモーター、エンハンサー、開始および終結領域、他の制御領域、発現調節因子、発現制御などの制御配列または調節エレメント；単離ＤＮＡ；ならびにｃＤＮＡを包含する。さらに、この用語は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンス複合体、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、および単離ＲＮＡを包含する。この用語はまた、組換えポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、標識ポリヌクレオチド、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ポリヌクレオチド構築体、対象の核酸を含むベクター、核酸プローブ、プライマー、およびプライマー対を包含する。この用語は、骨格、糖、または複素環塩基が改変されているプリンおよびピリミジンのアナログなどの修飾核酸分子、例えばメチル化核酸分子；ペプチド核酸；および核酸分子アナログを含み、これらは、試験条件下で優れた安定性および／または結合親和性を示す場合、例えば、プローブとして適当であり得る。放射性標識アナログおよび蛍光アナログを含めた、プリンおよびピリミジンのアナログは、当技術分野で知られている。このポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができる。この用語はまた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡであり、完全長の遺伝子またはその生物活性断片をコードすることができる一本鎖分子、二本鎖分子、および三重らせん分子を包含する。ポリヌクレオチドの生物活性断片は、本明細書のポリペプチド、ならびにアンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡｉ分子をコードすることができる。したがって、例えば、本明細書の完全長ポリヌクレオチドは、ダイサーなどの酵素で処理して、短鎖のＲＮＡｉ断片のライブラリーを作製することができ、これはまた、本発明の範囲内にある。
【００５３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合した形を指す。このアミノ酸には、天然に存在するアミノ酸；コードアミノ酸および非コードアミノ酸；化学修飾もしくは生化学修飾されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、またはデザイナーアミノ酸；アミノ酸アナログ；ペプチド模倣体およびデプシペプチド；ならびに修飾、環状、二環式、デプシ環状、またはデプシ二環式ペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語はまた、複合タンパク質；それだけに限らないが、ＧＳＴ融合タンパク質、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種のリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない融合タンパク質を含めた融合タンパク質；ペグ化タンパク質；ならびに免疫標識したタンパク質を指すことができる。また、この用語には、天然に存在するタンパク質の変異（このような変異は、同種であるか、または天然に存在するタンパク質に実質的に類似している）、ならびに異なる種に由来するその対応するホモログが含まれる。ポリペプチド配列の変異体は、元のポリペプチドと比較すると、挿入、付加、欠失、または置換を含むが、それにもかかわらず、レベルが異なる可能性があるが同様の生物活性を保持している。この用語はまた、ペプチドアプタマーが含まれる。
【００５４】
「分泌リーダー」、「シグナルペプチド」、または「リーダー配列」は、それが一部であるポリペプチドの細胞内輸送を導く、アミノ酸残基を含む配列を含有する。ポリペプチドは、通常そのＮ末端に分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列を含有する。こうしたポリペプチドはまた、切断可能部位を含有し、この分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列は、シグナルエンドペプチダーゼによりポリペプチドの残りから切断することができる。このようなポリペプチドは、切断可能部位で切断された後、成熟ポリペプチドを生成する。切断は通常、分泌中に、または完全なポリペプチドが適切な細胞内コンパートメントに導かれた後に起こる。
【００５５】
本発明によれば、「高分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、少なくとも約５倍に増大させることができるものである。
【００５６】
また、本発明によれば、「中程度分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、約２〜５倍に増大させることができるものである。
【００５７】
さらに、本発明によれば、「低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」は、（ｉ）タンパク質に異種配列として作動可能に連結することができ、それによりその内因性のシグナルペプチドを置き換え、（ｉｉ）タンパク質の分泌レベルを、その内因性ＳＰを有する場合にタンパク質が示す分泌レベルと比較して、約２倍未満に増大させることができる、または増大させないものである。
【００５８】
さらに、本発明の分泌リーダーはまた、そうでなければＥＲ−ゴルジ体によって分泌されると予測されず、内因性のシグナルペプチドを有してないタンパク質に付加することができる。この場合、「高／中程度／低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」という上記の定義は、比較目的に使用することができるタンパク質のベースライン分泌レベルが存在しないので適用できない。この場合、シグナルペプチド／分泌リーダー配列の付加が、そうでなければ非分泌性であるタンパク質の分泌に対して及ぼす影響は、生じた異種タンパク質の間で比較される。
【００５９】
本発明の目的のために、「高／中程度／低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」の上記の定義は、シグナルペプチド（または分泌リーダー配列）のみに関する。これは、「高分泌型タンパク質」、「中程度分泌型タンパク質」または「低分泌型タンパク質」に関するものではない。タンパク質自体は、本発明のタンパク質（表１〜３および付表Ａ）をすべて、コムギ胚芽エキスまたは哺乳動物細胞（詳細な説明については実施例１〜３を参照されたい）のいずれかにおけるそれ自体の発現および分泌レベルに関して互いを比較してランク付けする働きをする相対的な段階に基づいてそのようにランク付けされた。
【００６０】
「分泌性」タンパク質は、分泌リーダー、シグナルペプチド、またはリーダー配列によりＥＲ、分泌小胞、または細胞外間隙に導くことができるタンパク質である。このタンパク質はまた、シグナル配列を必ずしも含むことなく細胞外間隙中に放出されるタンパク質であってもよい。分泌性タンパク質は、細胞外間隙中に放出されるタンパク質である場合、プロセシングを受けて「成熟」ポリペプチドを生成することができる。膜貫通ドメインを含有し、原形質膜中に通常挿入されたままであるタンパク質は、また、ＥＲ−ゴルジ体において合成され、このようなタンパク質の一部の断片または部分は、例えば、タンパク質分解性の切断により細胞外コンパートメント中に放出され得るので、本発明の目的のために、分泌性タンパク質と考える。したがって、細胞外間隙への放出は、例えば、エキソサイトーシスおよびタンパク質分解性の切断を含めた複数の形で起こり得る。
【００６１】
「成熟タンパク質」および「分泌タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用され、細胞の外部に（例えば、培養細胞によって馴化された培地中に）分泌された後の分泌性タンパク質の１種（複数）の形を指す。通常、成熟タンパク質は、シグナルペプチドなしの分泌性タンパク質のアミノ酸配列を有する。しかし、タンパク質を天然において、または組換えによって発現させる場合、シグナルペプチドの一部は除去されないことが多く、様々な長さのシグナルペプチドに結合した多数の形の成熟タンパク質を含み得る成熟タンパク質混合物が得られる。したがって、シグナルエンドペプチダーゼによって切断される特定のアミノ酸によって、１種の分泌性タンパク質に対して複数の「成熟型」が存在することができる。また、他のプロテアーゼも、その「成熟タンパク質」の異種性にさらに加えて、分泌性タンパク質からアミノ酸を切断することができる。特定のタンパク質試料からシグナルペプチドが除去される正確な場所は、Ｎ末端タンパク質のシークエンシングによって、またはそうでなければ当分野の技術者に知られている標準的な方法によって求めることができる。
【００６２】
「生物活性」実体、または「生物活性」を有する実体は、天然に存在する分子の構造的、調節的もしくは生化学的機能を有するものであるか、または代謝過程もしくは生理的過程に関係または関連した機能を有するものである。本発明による生物活性ポリヌクレオチド断片またはポリペプチド断片は、この断片がその一部である対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性と同一とは限らないがそれに類似している活性を示すものである。生物活性には、それだけに限らないが、改善された所望の活性および減少した望ましくない活性が含まれ得る。例えば、ある実体は、他の分子との分子間相互作用に関与すると生物活性を示す。このような相互作用の一例がハイブリダイゼーションである。このような相互作用の他の例は、疾患状態を軽減する上での治療効果、または分子に対する免疫応答を誘導する上での予防効果の表れであってよい。このような相互作用の他の例は、分子の存在を判定する上での診断用ツールとしての潜在的可能な使用の実証であってよく、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性断片が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特有である場合、断片を検出することによりポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出を可能にする。生物活性を有するポリペプチドまたはその断片には、生物反応関与することができるもの、例えば、それだけに限らないが抗体の産生が含まれる、エピトープまたは免疫原として働いて免疫応答を刺激することができるもの；または受容体、タンパク質、もしくは核酸に結合することによりシグナル伝達経路に関与するもの；または酵素もしくは基質を活性化するものが含まれる。このような相互作用のさらに別の例は、ＰＣＲにおけるプライマーとして使用するポリヌクレオチド分子の適合性であってよい。
【００６３】
「単離された」または「実質的に単離された」ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいは「実質的に純粋」な、「実質的に精製」された、または「単離体」としてのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、天然においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドが関連している配列、あるいは対象のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列または断片を含まない他の核酸配列を実質的に含んでいないものである。「実質的に含んでいない」は、組成の約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が所望でない物質で構成されることを意味する。
【００６４】
「作動可能に連結した」は、そのように表現した成分がその所望の機能を実行するように構成されているエレメントの整列を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結した所与のプロモーターは、適正な転写因子および転写条件が存在する場合、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターは、その発現を導くように機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されるイントロンが存在するので、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列の間に存在することができ、このプロモーター配列は、やはりコード配列に「作動可能に連結している」と考えることができる。
【００６５】
「組換え」は、核酸分子を表現するのに使用する場合、天然においてポリヌクレオチドが関連しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部に、その起源または操作に基づいて関連していないゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルスまたは合成由来のポリヌクレオチドを意味する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドを表現するのに使用する場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。
【００６６】
「制御エレメント」は、それが連結しているコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列を指す。この用語は、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供するプロモーター、転写終結配列、上流の調節領域、ポリアデニル化シグナル、適切な場合はリーダー配列、およびエンハンサーを指すことができる。
【００６７】
本明細書で使用される「プロモーター」は、哺乳動物細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合させ、作動可能に連結した下流の（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域を指す。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドより大きい検出可能なレベルで対象の遺伝子の転写を開始させるのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、必ずしもそうとは限らないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むことが多い。プロモーターにはさらに、核酸分子に天然に隣接しているもの、および核酸分子に天然に隣接していないものが含まれる。さらに、プロモーターには、誘導性プロモーター；ｃｒｅ−ｌｏｘプロモーターなどの条件付きで活性なプロモーター；構成的プロモーター；および組織特異的プロモーターが含まれ得る。
【００６８】
「選択マーカー」は、マーカーに関連している表現型が明白であり観察可能である適切な条件で細胞を同定できるように、マーカーを発現する細胞に１種または複数の表現型を与える遺伝子を指す。通常、選択マーカーは、必須の細胞機能を阻害する１種または複数の化学物質および／または他の作用物質の存在下または非存在下で増殖できるかどうかに基づいて形質転換細胞の選択を可能にする。したがって、適当なマーカーには、トランスフェクトした細胞が適切な選択培地中で増殖する場合に、薬物耐性または薬物感受性をそれに与える、選択マーカーをコードする分子をトランスフェクトしたこのような細胞に色を与える、またはその抗原特性を変化させる、タンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、選択マーカーには、細胞が、細胞毒または薬物の１種または複数を含有する培地で増殖できるかどうかによって選択される細胞傷害性マーカーおよび薬物耐性マーカー；細胞が、チミジン、ヒポキサンチンなどの特定の栄養物質または補充物質を含むまたは含まない特定培地で増殖できるかどうかによって選択される栄養要求性マーカー；細胞が、唯一の炭素供給源として適切な糖を含有する特定培地で増殖できるかどうかなどの表現型に関して選択される代謝マーカー；または発色基質で着色コロニーを形成できるようにする、または蛍光発光できるようにするマーカーが含まれる。
【００６９】
本明細書で使用される「形質転換」は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染などであってよい挿入に使用する方法にかかわらず宿主細胞へのポリヌクレオチドの挿入を指す。導入したポリヌクレオチドは、非組込み型ベクター、例えば、エピソームとして維持されるか、あるいは、宿主ゲノムに組み込むことができる。
【００７０】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに調節配列領域が、転写することができるまたはできないコード配列に隣接しているかどうかにかかわらず遺伝子産物の産生を調節するこのようなすべてのＤＮＡ配列領域を含む。したがって、遺伝子は、例えば、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位または内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメント、複製起点、マトリックス結合部位、または遺伝子座制御領域であってよい。
【００７１】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれている情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡを翻訳することによって産生されるタンパク質とすることができる。遺伝子産物は、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、もしくはエディティングなどの過程によって修飾されたＲＮＡ、または例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質とすることもできる。
【００７２】
「コード配列」または分泌ポリペプチド「をコードする」配列は、配列が、１種または複数の適切な調節配列の制御下に位置する場合、転写され（ＤＮＡの場合）、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列は、５’（アミノ）末端の開始コドンで始まり、３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンで終わる。コード配列は、例えば、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ；ゲノムＤＮＡウイルス配列（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）；原核生物ＤＮＡ；または合成ＤＮＡ配列とすることができる。転写終結配列は、コード配列の３’側の位置にあってよい。
【００７３】
「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列および構造の一部のみを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチド断片は、完全なポリペプチドからのＣ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／または内部欠失を含むことができる。ポリヌクレオチド断片は、完全なポリヌクレオチドからの５’欠失、３’欠失、および／または内部欠失を含むことができる。タンパク質の断片は通常、完全長分子のうちの少なくとも約５〜１０の隣接するアミノ酸残基、完全長分子のうちの少なくとも約１５〜２５の隣接するアミノ酸残基、完全長分子のうちの少なくとも約２０〜５０またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基を含む。ポリヌクレオチドの断片は通常、完全長分子のうちの少なくとも約１５〜３０の隣接するヌクレオチド、完全長分子のうちの少なくとも約４５〜７５の隣接するヌクレオチド、完全長分子のうちの少なくとも約６０〜１５０またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含む。ある実施形態では、断片中のアミノ酸残基の数は、５から完全長分子中のアミノ酸残基の総数までの任意の整数であってよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチド断片中のヌクレオチドの数は、１５から完全長分子中のヌクレオチドの総数までの任意の整数であってよい。
【００７４】
「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」という用語は、例えば、組換えベクター、単離ポリヌクレオチド、抗体、または融合タンパク質であってよい、本発明の１種または複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの受容株となり得る、またはなっている個別の細胞、細胞系、細胞培養物、またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞を指す。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫であってよく、この子孫は、天然の、偶発の、または意図的な変異および／または変化の結果として、形態もしくは生理機能、全ＤＮＡもしくは全ＲＮＡ、またはポリペプチド補体が元の受容細胞と必ずしも同一でなくてよい。宿主細胞は、それだけには限らないが、哺乳動物、昆虫、両生類、爬虫類、甲殻類、鳥類、魚類、植物、および真菌の細胞を含めた原核細胞または真核細胞とすることができる。宿主細胞は、組換えベクターなどの本発明のポリヌクレオチドでｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換、トランスフェクト、形質導入、または感染した細胞であってよい。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ぶことができる。
【００７５】
「受容体」という用語は、特定の細胞外分子に結合するポリペプチドを指し、この結合は細胞応答を開始することができる。
【００７６】
「リガンド」という用語は、別の分子上の特定の部位に結合する分子を指す。
【００７７】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも、例示的および説明的なものにすぎず、請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。さらに、本実施形態は当然変化するので、本発明は、記載した特定の実施形態に限定されないことも理解すべきである。さらに、本発明の範囲は、その特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特定の実施形態を記載するのに使用される用語は限定的なものではない。
【００７８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する分野の技術者によって通常理解されるものである。当分野の技術者であれば、本明細書に記載するものに類似または相当する任意の方法および材料を使用して本発明を実施または試験できることも理解されよう。
【００７９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「または（ｏｒ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他のことを明確に指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの対象のポリペプチド」への言及は、複数のこのようなポリペプチドを含み、「その作用物質」への言及は、１種または複数の作用物質ならびに当分野の技術者に知られているその均等物を含む。
【００８０】
さらに、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件、％純度、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さなどを表現するすべての数は、別段の指示がない限り、「約」という用語によって加減される。したがって、本明細書および特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明の所望の特性によって変わり得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲への均等物の原則の適用を限定する意図としてではなく、各数値パラメータは、通常の丸め手法を適用した報告される有効数字の数を考慮して解釈すべきである。
【００８１】
それにもかかわらず、特定の実施例に記載の数値は可能な限り正確に報告する。しかし、どの数値も、その実験測定値の標準偏差からのある誤差を本質的に含む。
【００８２】
引用するすべての刊行物は、その全体を参照によりさらに組み込むこのような刊行物中で引用される参考文献を含めて、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００８３】
リーダー配列
本明細書に記載の通り、分泌性タンパク質から同定される分泌リーダー配列は、タンパク質を、このようなタンパク質が、そのタンパク質の内因性の分泌リーダー配列を含むＤＮＡ配列から同一の条件下で産生される場合よりも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％以上高い量で産生するのに有用であることが実証される。本明細書で同定および記載された分泌リーダー配列には、例えば、以下の分泌性タンパク質に由来するものが含まれる：インターロイキン９前駆体、Ｔ細胞増殖因子Ｐ４０、Ｐ４０サイトカイン、トリアシルグリセロールリパーゼ、膵臓前駆体、ソマトリベリン前駆体、バソプレシン−ニューロフィジン２−コペプチン前駆体、β−ネオエンドルフィン−ダイノルフィン前駆体、補体Ｃ２前駆体、低分子誘導性サイトカインＡ１４前駆体、エラスターゼ２Ａ前駆体、血漿セリンプロテアーゼインヒビター前駆体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子前駆体、インターロイキン２前駆体、インターロイキン３前駆体、α−フェトプロテイン前駆体、α−２−ＨＳ−糖タンパク質前駆体、血清アルブミン前駆体、インター−α−トリプシンインヒビター軽鎖、血清アミロイドＰ成分前駆体、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ前駆体、アポリポタンパク質Ｄ前駆体、コリパーゼ前駆体、カルボキシペプチダーゼＡ１前駆体、α−ｓ１カゼイン前駆体、βカゼイン前駆体、シスタチンＳＡ前駆体、フォリトロピンβ鎖前駆体、グルカゴン前駆体、補体因子Ｈ前駆体、ヒスチジンリッチ糖タンパク質前駆体、インターロイキン５前駆体、α−ラクトアルブミン前駆体、エブネル腺タンパク質前駆体、マトリックスＧｌａタンパク質前駆体、α−１−酸性糖タンパク質２前駆体、ホスホリパーゼＡ２前駆体、樹状細胞ケモカイン１、スタセリン前駆体、トランスチレチン前駆体、アポリポタンパク質Ａ−１前駆体、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ前駆体、アポリポタンパク質Ｅ前駆体、補体成分Ｃ８γ鎖前駆体、セロトランスフェリン前駆体、β−２−ミクログロブリン前駆体、好中球デフェンシン１前駆体、トリアシルグリセロールリパーゼ胃前駆体、ハプトグロビン前駆体、好中球デフェンシン３前駆体、神経芽細胞、腫瘍形成能の抑制因子１前駆体、低分子誘導性サイトカインＡ１３前駆体、ＣＤ５抗原様前駆体、リン脂質輸送タンパク質前駆体、ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質４前駆体、エラスターゼ２Ｂ前駆体、α−１−酸性糖タンパク質１前駆体、β−２−糖タンパク質１前駆体、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン前駆体、Ｃ反応性タンパク質前駆体、インターフェロンγ前駆体、κカゼイン前駆体、血漿レチノール結合タンパク質前駆体、インターロイキン１３前駆体、および表１〜３に記載の任意の分泌性タンパク質。
【００８４】
上記で同定される分泌リーダー配列は、本発明のベクターおよび方法とともに、例えば、分泌性ポリペプチド、細胞外タンパク質、膜貫通タンパク質、および可溶性受容体などの受容体を含めた多種多様なポリペプチドを発現させる上で有用である。このようなポリペプチドの例には、サイトカインおよび増殖因子、例えば、インターロイキン１〜１８；インターフェロン；リンホカイン；ホルモン；ＲＡＮＴＥＳ；リンホトキシンβ；Ｆａｓリガンド；ｆｌｔ−３リガンド；ＮＦ−κＢの活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；ＣＤ４０リガンド；Ｏｘ４０リガンド；４−１ＢＢリガンドおよびＴＮＦファミリーの他のメンバー；胸腺間質由来リンホポエチン；例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などの刺激因子；抑制因子；肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮成長因子、成長ホルモン、腫瘍壊死因子；白血病抑制因子；オンコスタチンＭ；スプライスバリアント；ならびにエリスロポエチン、トロンボポエチンなどの造血因子が含まれる。
【００８５】
本発明によって発現させることができるタンパク質の一部に関する記述は、例えば、ＨＵＭＡＮ  ＣＹＴＯＫＩＮＥＳ：ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＦＯＲ  ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，  Ｖｏｌ．  ＩＩ  （ＡｇｇａｒｗａｌおよびＧｕｔｔｅｒｍａｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ケンブリッジ、１９９８）；ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  （ＭｃＫａｙおよびＬｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９３）；およびＴＨＥ  ＣＹＴＯＫＩＮＥ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  （Ａ．  Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９１）において見出すことができる。
【００８６】
前述のどのタンパク質の受容体も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。この受容体には、例えば、腫瘍壊死因子受容体の両方の型（ｐ５５およびｐ７５と称される）、インターロイキン１受容体（１型および２型）、インターロイキン４受容体、インターロイキン１５受容体、インターロイキン１７受容体、インターロイキン１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチンＭおよび白血病抑制因子の受容体、ＮＦ−κＢの活性化受容体（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬ受容体、ならびにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などのデスドメインを含む受容体が含まれ得る。
【００８７】
他のタンパク質も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。こうしたタンパク質には、例えば、分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）（「ＣＤタンパク質」または「ＣＤ分子」と称される）、例えば、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら編；神戸、１９９６）、または後のワークショップの予稿集に開示されているものが含まれる。ＣＤ分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ならびにそのリガンド、例えば、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、およびＣＤ４０リガンドが含まれる。これらの分子のいくつかは、４−１ＢＢおよびＯＸ４０を含めたＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーであり、４−１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドを含めたそのリガンドもＴＮＦファミリーのメンバーであることが多い。したがって、ＴＮＦおよびＴＮＦＲファミリーのメンバーは、本発明の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。
【００８８】
酵素であるタンパク質も、本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を使用して発現させることができる。こうした酵素には、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー；ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アンキリンリピート含有細胞死関連キナーゼ、ＩＫＲ１、またはＩＫＲ２などの様々なキナーゼ；ＴＮＦ−α変換酵素；および多数の他の酵素が含まれ得る。酵素のリガンドも、本明細書の分泌リーダー配列、ベクター、および方法を適用することによって発現させることができる。
【００８９】
本明細書に記載の分泌リーダー配列、ベクター、および方法は、他の種類の組換えタンパク質を発現させるのにも有用である。こうした組換えタンパク質には、例えば、免疫クロブリン分子またはその部分、ならびにキメラ抗体（例えば、ヒト定常領域がマウス抗原結合領域と繋がっている抗体）またはその断片が含まれ得る。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作して、単鎖抗体、親和性を増強した抗体、または他の抗体ベースのポリペプチドなどの組換えタンパク質をコードすることが可能なＤＮＡを得ることができる多数の手法が知られている（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、１９８９；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９を参照のこと）。
【００９０】
ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生
本発明は、例えば、対象の１種または複数の分泌リーダー配列、または分泌リーダー配列であるとは限らない対象の選択された異種ポリペプチドをコードする核酸構築体を含む組換えベクター、および遺伝子操作してこの組換えベクターを取り込んだ宿主細胞を提供する。
【００９１】
本発明のベクターは、宿主中で増殖させるための選択マーカーおよび分泌リーダー配列、例えば表１に記載の配列のうちの１つを含むものであってよい。このような選択マーカーは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素；Ｇ４１８；真核細胞培養物用のネオマイシン耐性もしくはピューロマイシン耐性；または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌培養物用のテトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、ピューロマイシン耐性、もしくはアンピシリン耐性であってよい。
【００９２】
本発明のベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスのベクターであってよい。通常、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿など沈殿の形で、または荷電脂質を含む複合体として導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターを、適切なパッケージング用細胞系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、次いで、形質導入によって宿主細胞中に組み込むことができる。レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損性であってよい。また、このベクターが複製欠損性である場合、ウイルス増殖は通常、補完する宿主細胞でしか起こらない。
【００９３】
本発明において有用なベクターの中には、ｐＴＴベクターのバックボーンを使用した本明細書に記載のベクターがある（例えば、図３〜７を参照のこと）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２）。簡単に言えば、ｐＴＴベクターバックボーンは、以下の方法によって調製することができる：（１）ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ／ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ）ベースのベクターおよびｐＳＥＡＰベースのベクターをＣＬＯＮＥＴＥＣＨ（登録商標）（カリフォルニア州パロアルト）から入手し、（２）ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６、およびｐＣＥＰ４ベクターをＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手し、（３）ＳＵＰＥＲＧＬＯ（商標）ＧＦＰ変異体（「ｓｇＧＦＰ」）をＱ−ＢＩＯＧＥＮＥ（登録商標）（カリフォルニア州カールズバッド）から入手し、（４）（ａ）ＳａｌＩおよびＸｂａＩ制限酵素を使用した連続消化およびセルフライゲーションにより、ｐＣＥＰ４のＣＭＶプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを除去して、ｐＣＥＰ４Δプラスミドを得るステップ、および（ｂ）ＣＭＶ５−ポリ（Ａ）発現カセットをコードするｐＡｄＣＭＶ５（Ｍａｓｓｉｅら、１９９８）由来のＢｇｌＩＩ断片を、ＢｇｌＩＩによって直鎖化されたｐＣＥＰ４Δにライゲートして、ｐＣＥＰ５ベクターを得るステップによりｐＣＥＰ５を調製し、（５）ハイグロマイシンおよびＥＢＮＡ１発現カセットを除去することによりｐＴＴベクターを作製し（前者の除去は、ＢｓｍＩおよびＳａｌＩによる切除、続く充填およびライゲーションによって達成され、後者の除去は、ＣｌａＩおよびＮｓｉＩによる切除、続く充填およびライゲーションによって達成される）、（６）β−ラクタマーゼＯＲＦの３’末端を含んだＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片を含むＣｏｌＥＩ起点を、ｐＭＢＩ起点およびｐｃＤＮＡ３．１由来のβ−ラクタマーゼＯＲＦの同じ３’末端を含むＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片で置き換え、（７）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓにインフレームでライゲートし、（８）Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６Ｃ末端融合タグを、ｐＳＥＡＰベース由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片であるＳＥＡＰに付加する。次いで、ＬＢ培地において増殖した大腸菌（ＤＨ５α）中でプラスミドを増幅させる。ＱＩＡＧＥＮ（商標）（カナダオンタリオ州ミシソーガ）のＭＡＸＩ−ＰＲＥＰ（商標）カラムを使用してこの培地からプラスミドを精製する。プラスミドを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に希釈し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、このようにして作製したプラスミドの量を測定する。本発明の目的のために、Ａ２６０／Ａ２８０比が約１．７５から約２．００までのプラスミド調製物を使用する。
【００９４】
対象の核酸構築体は、適切なプロモーターに作動可能に連結したＤＮＡであってよい。この適切なプロモーターは、例えば、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、またはレトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターのうちの１つであってよい。このプロモーターは、例えば、哺乳動物細胞のゲノムに由来するメタロチオネインプロモーターであってもよい。あるいは、このプロモーターは、哺乳動物ウイルスに由来するアデノウイルス後期プロモーターまたはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターであってもよい。他の適当なプロモーターは当分野の技術者に知られている。
【００９５】
この発現構築体は、転写領域における転写開始および転写終結のための部位、およびリボソーム結合部位をさらに含む。この構築体によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの最初に、適切に位置付けられた翻訳開始コドン、およびその最後に終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）を含む。ポリヌクレオチドによってコードされる異種ポリペプチドには、例えば、分泌性タンパク質の細胞外断片、Ｉ型膜タンパク質、ＩＩ型膜タンパク質、多重膜タンパク質、および可溶性受容体が含まれ得る。
【００９６】
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランの媒介によるトランスフェクション、カチオン性脂質の媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または当分野の技術者によって知られている任意の他の方法により、構築体を宿主細胞中に導入することができる。このような方法は、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）など、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。適切な宿主の代表例には、それだけには限らないが、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３（２９３−６Ｅおよび２９３−Ｔを含む）、およびボーズメラノーマ（Ｂｏｗｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ）細胞；ならびに植物細胞が含まれる。こうした代表的な宿主細胞を増殖させるのに適した培地および条件は、当技術分野で知られている。
【００９７】
種々の宿主発現ベクター系を使用して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。このような宿主発現系は、対象のコード配列を産生し、続いて精製する媒体である。こうした系は、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトすると、本発明のポリペプチドを発現する細胞とすることもできる。こうした系には、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、組換えプラスミドＤＮＡ、または組換えコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換される微生物、例えば、大腸菌または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌が含まれ得る。こうした系には、例えば、ポリペプチドをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換されるサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）などの酵母が含まれ得る。こうした系は、ポリペプチドをコードする配列を含む、バキュロウイルスなどの組換えウイルス発現ベクターを感染させる昆虫細胞であってもよい。こうした系は、ポリペプチドをコードする配列を含む、カリフラワーモザイクウイルス（「ＣａＭＶ」）もしくはタバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）などの組換えウイルス発現ベクターを感染させるか、またはＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターで形質転換される植物細胞であってもよい。こうした系にはさらに、プロモーターを含む組換え発現構築体を有する、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３−６Ｅ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、２９３Ｔ、または３Ｔ３などの哺乳動物細胞が含まれ得る。
【００９８】
宿主細胞に、対象のポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ構築体をトランスフェクトした後、次いでこの細胞を、本発明のポリペプチド産生するのに適した培地および条件で増殖させる。
【００９９】
通常、異種ポリペプチドは、融合タンパク質として発現させることもできる。ポリペプチドはさらに、１種または複数の分泌シグナルだけでなく、表１で例示される１種または複数の分泌リーダー配列を含むことができる。本発明によるこのような融合タンパク質の発現については以下で詳細に記載する。
【０１００】
さらに、ペプチド部分および／または精製タグをポリペプチドに付加して、精製を容易にし、安定性を改善し、分泌または排出を引き起こすことができる。この部分および／またはタグは、精製の最終段階の前に除去することができる。この技法は、当分野の技術者によく知られており、常用されている。ある実施形態では、このようなタグは、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、ｐＱＥ（商標）ベクター（ＱＩＡＧＥＮ（商標）社、カリフォルニア州チャッツワース）において提供されるタグとすることができる。別のペプチドタグ、すなわちインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープである「ＨＡ」タグを本発明のポリペプチドと融合することもできる（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４を参照のこと）。他の適当な精製タグは、例えば、Ｖ５、ＨＩＳＸ８（配列番号２５８）、アビジン、またはビオチンであってもよい。
【０１０１】
ある実施形態では、この融合タンパク質は、免疫グロブリン由来の異種領域を含み、この領域の存在は、精製を容易にし、精製タンパク質の安定化に寄与することができる。例えば、欧州特許出願公開第０４６４５３３号およびその対応するカナダ特許出願公開第２０４５８６９号は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の様々な部分と、ヒトタンパク質またはその部分とを含む融合タンパク質を記載している。欧州特許出願公開第０２３２２６２号によれば、融合タンパク質におけるＦｃ領域は、薬物動態特性の改善をもたらす傾向があるので、治療および診断において使用するのに有利であると考えられる。他に使用することがなければ、融合タンパク質を発現、検出、および精製した後に、特にＦｃ領域が、治療および診断において融合しているポリペプチドの使用を妨げる場合に、Ｆｃ領域を除去することが望ましいであろう。例えば、Ｆｃ領域の除去は、融合タンパク質を免疫化の抗原として使用する場合に必要であるはずである。
【０１０２】
精製タグは、創薬に使用することもできる。例えば、ヒトタンパク質ｈＩＬ−５をＦｃ領域と融合して、ハイスループットのスクリーニングアッセイを使用したｈＩＬ−５アンタゴニストの同定を容易にした（Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９５；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、１９９５）。
【０１０３】
本発明の異種ポリペプチドは、周知の方法により組換え細胞培養物から精製することができ、この方法には、例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる。特定の実施形態では、高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に使用される。本発明のポリペプチドには、例えば、直接に単離した、または培養した、体液、組織、および細胞などの天然の供給源から精製された産物；化学合成操作による産物；組換え技術により細菌細胞、酵母、高等植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの原核生物または真核生物宿主から産生された産物；または組換え技術により無細胞発現系から産生された産物が含まれ得る。
【０１０４】
修飾
本発明は、翻訳中または翻訳後に、例えば、既知の保護基／ブロック基、タンパク質分解性の切断、または抗体分子もしくは他の細胞リガンドとの結合による、グリコシル化、アセチル化、メチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化により示差的に修飾されたポリペプチドを包含する。こうした化学修飾はいずれも、臭化シアンによる特異的な化学切断；トリプシン、キモトリプシン、パパイン、またはＶ８プロテアーゼによる消化；ＮＡＢＨ４による処理；アセチル化；ホルミル化；酸化；還元；およびツニカマイシンの存在下での代謝合成を含めた既知の技法によって実行することができる。
【０１０５】
組換え産生操作において使用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドをグリコシル化してもグリコシル化しなくてもよい。本発明のポリペプチドには、通常宿主の媒介による過程の結果としての、修飾されたＮ末端開始メチオニン残基も含まれ得る。翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンは通常、真核生物細胞において翻訳後に高効率で除去できることが当技術分野で知られている。Ｎ末端メチオニンは、大部分の原核生物タンパク質から効率的に除去することができるが、原核生物においてはこの除去過程は効率的であるとは限らない。この効率は、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質および種類に依存する。
【０１０６】
本発明による追加の翻訳後修飾には、例えば、宿主の原核細胞における発現の結果としての、Ｎ結合型もしくはＯ結合型糖鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型糖鎖の化学修飾、またはＮ末端メチオニンの付加もしくは除去が含まれる。タンパク質の検出および単離を容易にするために、ポリペプチドは、１種または複数の検出可能な標識で修飾することもでき、この標識は、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、またはアフィニティー標識であってよい。
【０１０７】
本発明の追加の実施形態は、本発明のポリペプチドの化学修飾された誘導体であってよく、この誘導体は、ポリペプチドの溶解性、安定性、および循環時間の増大、または生物系における免疫原性の低下など、追加の利点を提供することができる（米国特許第４，１７９，３３７号）。誘導体化に使用される化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。ポリペプチドは、分子内の無作為の位置または所定の位置で修飾することができ、１個、２個、または３個以上の結合した化学的部分を含むことができる。反応条件は、当技術分野で知られている条件および後に開発された条件のいずれかから選択することができるが、厳しい温度、溶媒、およびｐＨの条件によって、修飾されるタンパク質の活性が喪失されない、または限定的にしか活性の喪失を受けないように選択すべきである。一般に、ポリペプチド複合体に対するポリマーの割合が大きくなるほど、複合産物の割合が大きくなる。反応の効率によって測定された最適の割合は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択されたポリマーの分子量、分岐の程度、および反応条件などの要素によって決定することができる。ポリマー対ポリペプチドの比は通常、１：１から１００：１の範囲にある。１種または複数の精製された複合体は、例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含めた標準的な精製技術により各混合物から調製することができる。
【０１０８】
ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐または非分岐であってよい。ある実施形態では、本発明のポリペプチドをポリエチレングリコールによって修飾する場合、ポリエチレングリコールの分子量は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａまでである。「約」という用語は、ポリエチレングリコールの記載で使用する場合、ポリエチレングリコールの調製中に、述べられた分子量よりも大きい分子もあれば小さい分子もあることを示唆するものとする。修飾に使用されるポリエチレングリコールのサイズは、例えば、所望の持続放出時間；あるとすれば生物活性に対する効果；操作の容易さ；抗原性の程度または欠如；ならびに治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールの他の既知の作用などの所望の治療プロファイルに依存する。
【０１０９】
いくつかの結合方法が当分野の技術者に利用可能である。例えば、欧州特許出願公開第０４０１３８４号は、Ｇ−ＣＳＦに対するＰＥＧの結合を記載している。Ｍａｌｉｋらは、トレシルクロリド法を使用したＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告した（Ｍａｌｉｋら、１９９２）。ポリエチレングリコールは、例えば、遊離アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基であってよいアミノ酸残基の反応性基に共有結合していてよい。ポリエチレングリコール部分を分子に結合することを意味するペグ化の文脈において、反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合することができる基として定義される。
【０１１０】
Ｎ末端が化学修飾されたタンパク質が特に望まれる場合がある。これは、誘導体化に利用可能な内部リジン、Ｎ末端アミノ酸などの第一級アミノ基の様々な反応性を利用した還元アルキル化によって達成することができる。例えば、反応をあるｐＨで実施することによりポリマーをタンパク質のＮ末端に選択的に結合することができ、この場合、ε−アミノ残基ではなくＮ末端残基のα−アミノ基だけが反応の影響を受けやすいはずであり、したがってこうした種類のアミノ基の間のｐＫａの違いが利用される。還元アルキル化に使用されるポリマーは通常、単一の反応性アルデヒドを有する。Ｎ末端を化学修飾したタンパク質は必要に応じて、Ｎ末端を修飾したタンパク質を、他の場所が修飾されているタンパク質分子の一団から精製することにより他のモノ誘導体化した部分から分離することができる。
【０１１１】
本発明の融合分子
本発明のさらなる実施形態では、異種ポリペプチドは、１種または複数の融合パートナーと組み合わせて融合分子を形成することができる。このような融合分子は、有利には、その修飾していない非融合対応物と比較して改善された薬物動態特性を提供することができる。本発明の異種ポリペプチドを含むこうした融合分子は、本明細書の開示内容を認識している当分野の技術者によって調製することができる。この点で異種ポリペプチドの誘導体化に適した化学的部分は、例えば、水溶性ポリマーなどのポリマー；ヒト血清アルブミンのすべてまたは部分；フェチュインＡ；フェチュインＢ；またはＦｃ領域であってよい。
【０１１２】
具体的には、本発明の修飾された異種ポリペプチドは、１種または複数のポリアミノ酸、ペプチド部分、または分岐点アミノ酸をポリペプチドに結合することによって調製することができる。ポリアミノ酸は、市販されており、薬物送達技術および遺伝子治療などの他の新たな技術において広く使用されている。上記の融合分子で達成することができる利点に加えて、ポリアミノ酸は、ポリペプチドの血中半減期を延長する働きをする担体とすることができる。本発明の治療上の目的のために、このようなポリアミノ酸は理想的には、中和抗原反応または他の有害反応を生じないものであるべきである。本明細書に記載の通り、ポリアミノ酸がポリペプチドまたは融合ポリペプチドに結合する位置は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその間の任意の他の位置であってよい。ポリアミノ酸は、選択されたポリペプチドまたは融合ポリペプチドのいずれかの末端に化学的「リンカー」部分によって接続することもできる。
【０１１３】
水溶性ポリマーなどの１種または複数のポリマーと複合した融合分子を調製する方法はすでに記載している。
【０１１４】
さらに、本発明の異種ポリペプチドおよびエピトープを有するその断片は、免疫グロブリン定常ドメインの部分と組み合わせることができ、その結果キメラポリペプチドが得られる。こうした特定の融合分子により、そのプレ融合対応物と比較して、精製が容易になり、延長したｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を示す傾向がある。こうしたキメラポリペプチドの例には、例えば、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物免疫グロブリン定常領域の様々なドメインを含むキメラタンパク質が含まれる（欧州特許出願公開第３９４，８２７号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９８８）。ジスルフィド結合した二量体構造を有する融合分子は、例えば、単量体ポリペプチドまたは断片よりも、他の分子を結合し中和する上で効率的である傾向がある（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、１９９５）。
【０１１５】
別の実施形態では、ヒト血清アルブミン融合分子は、本明細書に記載の通り、またその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許第６，６８６，１７９でさらに記載されている通り調製することもできる。
【０１１６】
さらに、本発明のポリペプチドは、精製タグが一部であるポリペプチドの精製を容易にするはずであるペプチド領域である精製タグと融合することもできる。このタグを対象のポリペプチドと融合する方法は本明細書に記載されている。
【０１１７】
本明細書の前述の説明および実施例で特に記載されているもの以外の形で本発明を実施してよいことは当分野の技術者には明らかであろう。本発明の多くの変更形態および変形形態は、本明細書の教示に照らして可能であり、したがって、添付の特許請求の範囲内にある。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
無細胞系を使用する生物学的活性がある成熟分泌タンパク質の発現
組換え技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の発現を可能にする。タンパク質発現用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の例には、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽エキスなどの無細胞系、および細菌、昆虫細胞、酵母菌細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、およびヒト胚網膜細胞ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ、オランダ））などの細胞系が含まれる。例えば１種（複数）のトランス遺伝子が、例えば、緑色蛍光タンパク質およびその変異体またはβ−ガラクトシダーゼなどのマーカーをタグ付けした１種（複数）のタンパク質をコードするトランスジェニック動物の作製において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えタンパク質の発現は有用である。このようなタグは、タグ付きタンパク質が発現される細胞の視覚化、追跡および／または単離を容易にする。ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えタンパク質の発現の他の例は、トランスジェニックマウス、または分泌性タンパク質を発現させるために遺伝的に改変したマウスに移植した細胞の使用である。後者は例えば、腫瘍の発達を促進し、ホルモン、成長因子、および／または生存因子として働くと考えられるタンパク質であってよい。この状況では、様々なレベル（低、中程度、高）のタンパク質分泌を得て、特定の結果（例えば、腫瘍の増大）を得ることが重要である可能性がある。組換えの状況で発現される場合、多くのタンパク質は効率よく分泌されない。その場合、組換え法によって、その内因性リーダー配列をその有効な分泌を駆動することができるリーダー配列で置き換え可能であることは有用である。
【０１１９】
所与の単離ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡを使用してそのタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる前に、そのヌクレオチド配列がコードするタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現を支持できることを確認することが有用であることが多い。このプロセスは例えば、特定の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）においてタンパク質が受ける翻訳後修飾、およびタンパク質の活性に関するさらなる情報を得るのにも役立てることができる。分泌性タンパク質の場合、ｃＤＮＡ配列はその完全長型、その成熟型
（すなわち、リーダー配列を含まないタンパク質）、または特定のドメインなどのタンパク質の任意の他の部分のいずれかをコードする可能性がある。
【０１２０】
無細胞系における組換えタンパク質の発現用のプラスミド鋳型の調製
成熟型の対象の任意のタンパク質をコードするｃＤＮＡを組換えによって発現させるために、ｃＤＮＡを修飾してコード配列以外に、翻訳開始部位／翻訳エンハンサー（例えば、コザック配列、オメガ配列、非オメガ配列）を含めることは、有用であることが多い。この実施例では成熟型は、シグナルペプチドを含まないタンパク質である最も典型的な分泌産物を指す。さらに、対象のタンパク質に関する抗体が存在しない場合、検出と精製プロセスの両方を容易にするタグを付加することもできる。このようなタグの例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびエピトープＶ５、ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）、およびＨｉｓＸ８（Ｈ８）（配列番号２５８）である。対象のタンパク質をコードするｃＤＮＡへのこれらの特徴の付加は、様々なクローニング法によって行うことができる。対象のｃＤＮＡ中に適切な制限酵素部位が存在しない場合、以下に記載した方法などのＰＣＲ増幅法をクローニングプロセス中に使用することもできる。３つのＰＣＲステップを含み、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼでタグ付けした成熟ＯＲＦが得られる、クローニングプロセスを以下に例示する。
【０１２１】
最初に、対象の成熟オープンリーディングフレーム（成熟ＯＲＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む第１プラスミドを、第１ＰＣＲに提供した。翻訳開始部位／翻訳エンハンサーを成熟ＯＲＦのコード配列の５’領域に付加するために、ヌクレオチドプライマー（フォワードプライマーＦＰ１）を設計および合成し、これは５’ＧＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣ３’（配列番号２５９）、次に対象の成熟分泌性タンパク質のアミノ末端をコードすることが予測される第１の１９ヌクレオチドを含んでいた。発現させるｃＤＮＡのコード配列（成熟ＯＲＦ）から約１０００ヌクレオチド下流のプラスミドの領域に基づいて、第２プライマー（リバースプライマーＲＰ１）を設計および合成した。実際ＲＰ１プライマーは、ＲＰ１をＰＣＲでＦＰ１とともに使用して成熟ＯＲＦを増幅させることができるように、この領域中のベクター配列の逆相補配列として設計した。ＲＰ１の正確な配列は開始プラスミドに応じて変わり得るが、典型的には約５５〜６５℃のＴｍで１７〜２３ヌクレオチド長であった。
【０１２２】
次いで、成熟ＯＲＦとして発現されるｃＤＮＡを含む精製した開始プラスミド、または精製プラスミドを含む大腸菌細胞を鋳型として、すでに記載した２つのプライマー（ＦＰ１およびＲＰ１）、標準ＰＣＲ試薬、およびＤＮＡポリメラーゼを含む標準ＰＣＲに加えた。次いで、反応混合物を、１５〜３０サイクルのＰＣＲ増幅にかけた。この第１ＰＣＲの産物は、本願明細書の目的のために「ＰＣＲ１コード鋳型」と呼ぶ。
【０１２３】
別のＰＣＲを実施して「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」を調製し、その目的は第２ＰＣＲステップにおいて、最終的なＧＳＴ成熟ＯＲＦ発現鋳型のＧＳＴ部分を提供することであった。この目的のために、異なる開始プラスミド鋳型、例えば非オメガ翻訳開始配列の下流にＧＳＴコード配列を含むプラスミド鋳型を使用し、これは本明細書で「鋳型２」と称する。ＧＳＴ融合タンパク質が切断可能な架橋によって成熟ＯＲＦと連結していることが、有用であることが多い。この目的のために、鋳型は、トロンビン、または市販のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）に感受性がある配列などのプロテアーゼにより切断可能な配列を含むように修飾されたＧＳＴタンパク質を有することが可能である。これによって、プロテアーゼの媒介による切断によって精製操作の最後に、２種のタンパク質、成熟ＯＲＦとＧＳＴを分離させることができる。したがって、２つのプライマー：配列５’ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＴＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＡ３’（配列番号２６０）のＦＰ２；および配列５’ＧＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＣ３’（配列番号２６１）のＲＰ２を使用して、「鋳型２」を増幅させるためにＰＣＲを準備した。鋳型２、すでに記載した２つのプライマー（ＦＰ２およびＲＰ２）、標準ＰＣＲ試薬、およびＤＮＡポリメラーゼを含む標準的なＰＣＲ混合物において増幅を１５〜３０サイクル行った。ＰＣＲが終了した後、増幅産物を３７℃で３０分間エクソヌクレアーゼＩを用いて処理し、次いで８０℃で３０分間熱失活させた。次いで、この産物をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ゲル精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）を使用して抽出し、「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」を生成した。実際「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」は、ＧＳＴ−融合発現鋳型を生成する第２ＰＣＲにおいて使用した２つの鋳型の１つであった。最終反応混合物の他の鋳型は、すでに記載した通り調製した「ＰＣＲ１コード鋳型」であった。
【０１２４】
成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ融合発現鋳型であった最終構築体は、以下の通り調製した。２つの鋳型「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」と「ＰＣＲ１コード鋳型」を、成熟ＯＲＦを含む第２ＰＣＲによって組み合わせた。このＰＣＲ反応混合物は、（ｉ）標準ＰＣＲ試薬、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）「ＰＣＲ１コード鋳型」の等分試料（例えば０．５μｌ）、（ｉｖ）「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」の等分試料（例えば１μｌ）、（ｉｖ）ＳＰ６プロモーター配列の一部分を含み、（下線部の配列と比較して）その共通の３’末端を介して「ＧＳＴ−Ｍｅｇａプライマー」の５’末端とアニーリングした、第５のプライマー、配列５’ＧＣＧＴＡＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴ３’（配列番号２６２）のＦＰ３、および（ｖ）ＲＰ１と同じベクターの同じ領域であるが、ＲＰ１の３ヌクレオチド上流で始まり、完全長ＰＣＲ１コード鋳型のみと特異的にアニーリングする、領域中ベクター配列の逆相補配列として設計した、第６のプライマーＲＰ３であって、通常、１７〜２３ヌクレオチド長であり、Ｔｍが約５５〜６５℃であり、「ＰＣＲ１コード鋳型」を増幅させる際に使用することができるＲＰ３を含んでいた。１５〜３０サイクルのＰＣＲ増幅の後、「成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ融合発現鋳型」をこのようにして作製した。
【０１２５】
コムギ胚芽エキスにおけるＧＳＴ−融合発現鋳型の発現
無細胞系において対象の成熟タンパク質を発現させるために、ｍＲＮＡを同じ反応または別々の反応において「成熟ＯＲＦ／ＧＳＴ−融合発現鋳型」から転写および翻訳することができる。別のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応混合物（５０μｌ）は、以下のバッファー：８０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＫＯＨ  ｐＨ７．８、１６ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、２ｍＭのスペルミジン、１０ｍＭのＤＴＴ、１単位のＳＰ６（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）および１単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）中で、５μｌの「ＧＳＴ−融合発現鋳型」を用いて調製することができる。反応混合物は３７℃で３時間インキュベートする。生成したｍＲＮＡは、２００μｌのＲＮａｓｅフリーの水、３７．５μｌの５Ｍ酢酸アンモニウム、および８６２μｌの９９％エタノールを含む溶液中でエタノール沈殿に施す。エタノール沈殿は、ボルテックス攪拌によって混合するステップ、および４℃で１０分間の１５，０００×ｇでの遠心分離によってペレット化するステップを含む。次いで、ｍＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、４℃で５分間の１５，０００×ｇでの遠心分離によって再度ペレット状にし、そのステップの後、ペレット状のｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳用に調製する。
【０１２６】
コムギ胚芽エキスはｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に使用することができ、すでに記載した通り別々に調製することができる。最初に、２×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒのストック溶液を、２つの別個のアミノ酸ストックを混合させることにより調製した。第１ストックは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＫＯＨバッファー、ｐＨ７．８、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５．４ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、０．８ｍＭのスペルミジン、１００μＭのＤＴＴ、２．４ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍＭのＧＴＰ、３２ｍＭのクレアチンリン酸、０．０２％のＮａＮ３、およびアスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンを含まなかった０．６ｍＭのアミノ酸混合物を含んでいた。第２ストックは、１ＮのＨＣｌ中にアミノ酸アスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、イソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンの８０ｍＭ混合物を含んでいた。第２ストック中のすべてのアミノ酸が溶解した後、アミノ酸の第２ストックの最終濃度が０．６ｍＭであるように、２つのストックを混合した。２×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒのストックを、次いで５ＮのＫＯＨを使用してｐＨ７．６に調整し、濾過滅菌し、等分試料として−８０℃で凍結保存した。
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡ（すでに記載した通り別々に調製）を再懸濁させるために、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中で調製した６０の最終ＯＤ２６０ｎｍで、Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）を含む５０μｌの「翻訳混合物」を調製した。沈殿したｍＲＮＡから上清（エタノール）を除去した後、５０μｌの「翻訳混合物」を沈殿に加え、５〜１０分間放置した後、ｍＲＮＡを翻訳混合物に再懸濁させた。次いで、再懸濁させたｍＲＮＡを含む完全な翻訳混合物を、二層反応を設定するために９６ウェルの丸底マイクロタイタープレートの１つのウェルにすでに加えた、２５０μｌの１×Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒの下で層状にした。次いで、プレートをプレートシールを用いて手作業で密封し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応混合物は２６℃で２０時間インキュベートした。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応期の最後に、かつＧＳＴ融合体として発現された組換え成熟ＯＲＦタンパク質を回収するために、翻訳混合物をチューブに移し、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭのＤＴＴを含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて５倍希釈した。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が結合する、１０マイクロリットルのグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮＪ）を次いで混合物に加え、混合を確実にするために絶えず攪拌しながら、次いで４℃で３時間インキュベートした。結合ＧＳＴ−融合タンパク質を含むＧＳＨ−セファロースビーズは、０．２５Ｍスクロースおよび２ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ中で次いで３回洗浄した。成熟ＯＲＦとＧＳＴを組換えにより遺伝子工学処理して、プロテアーゼ切断型架橋を介して融合させる場合、５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、および０．２５Ｍスクロースを含むプロテアーゼ切断型バッファー中において、次いで４回目の洗浄を実施した。この洗浄バッファーは「最終洗浄バッファー」とも呼ばれた。洗浄バッファーをビーズ混合物から注意深く除去した後、最終ステップから回収した１０μｌの最終洗浄バッファーをビーズと混合させ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＮＪ）などの０．４μｌの適切なプロテアーゼを混合物に加えた。次いでピペットを使用してビーズを軽く懸濁させた。このビーズ混合物／懸濁液を、次いで一晩４℃で放置した。切断した成熟ＯＲＦタンパク質産物を回収するために、２０μｌの最終洗浄バッファーを加え、（ビーズを沈殿させた後に）ピペッティングによって、あるいは焼結フリットを介した濾過によって、全液体分画（ビーズを含まない）を回収した。
【０１２９】
回収した液体分画（精製した成熟タンパク質を含む）の等分試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＥＬＩＳＡおよび／またはクーマシー／銀染色によって分析して、成熟タンパク質の発現のレベルを定量した。
【０１３０】
回収した成熟ＯＲＦタンパク質を安定化させるために、ＰＢＳに溶かした１０ｍｇ／ｍｌの精製ＢＳＡの溶液を、ＢＳＡの最終濃度が約１ｍｇ／ｍｌになるように精製タンパク質溶液に加えた。次いでタンパク質サンプルはＰＢＳ中で透析し、保存用に濾過滅菌した。ウェスタンブロット分析は、様々なステップおよび精製操作中に回収した等分試料から行って、例えばタンパク質の発現のレベルを評価すること、翻訳されるタンパク質がその長さとその配列の両方の点で、対象のｃＤＮＡによってコードされると予想されるタンパク質に対応するかどうか決定することができる。生物活性測定、質量分析、および翻訳後修飾アッセイなどの先の特徴付け試験において、タンパク質を使用することもできる。同じｍＲＮＡ鋳型からさらなるタンパク質を生成させるために、１つの二層反応を多数回繰り返すことができ、精製および配合はそれに応じて調節することができる。
【０１３１】
典型的には、１６の二層反応（すでに記載した通り設定した）は、生物活性アッセイなどの大部分の典型的なアッセイにおいて試験するための、十分な生物活性を有するタンパク質を産生するはずである。これらの反応は９６ウェルプレート中で行うので、多数の対象のｃＤＮＡを別のウェル中で同時に翻訳することができるハイスループットアッセイに、この発現系は適している。ｃＤＮＡが、コムギ胚芽エキス中の対象の特定のタンパク質をコードすることができることが示されると、この発現系で通常得られるタンパク質よりも多い量のタンパク質を発現させることが、望ましい可能性がある。異なる細胞系において所与のタンパク質が受ける翻訳後修飾、例えばコムギ胚芽溶解物などの植物ベースの系に存在する翻訳後修飾と、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）に存在する翻訳後修飾を比較することも、望ましい可能性がある。
【０１３２】
様々なシグナルペプチド−未熟タンパク質の発現レベルの評価
表３の列３（「最高発現型」）は、その内因性シグナルペプチドを含まない標準条件下での本発明の様々なタンパク質の発現のレベルの比較を目的とする、ハイスループットの発現実験の結果を要約する。表１および付録Ａに挙げる完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む一組のｃＤＮＡで始めて、成熟ＯＲＦ鋳型を前段落で詳細に記載した通り調製して、成熟型の各タンパク質（すなわち、その内因性シグナルペプチドを含まないタンパク質）を発現させた。精製後、精製Ｖ５タグ付きタンパク質標準に対する抗Ｖ５抗体を使用して、発現のレベルをクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または定量ウェスタンブロットによって定量し、５６の「最高発現型」を、互いに比較したそれらの発現レベルに基づいて１（高）から５６（低）までランク付けした。これらの標準条件下、列３／表３の「最高発現型」中では、非常に高い発現型（ランク１）は成熟型のプロリル４−ヒドロキシラーゼのβ−サブユニットであり（ＣＬＮ００５１７７９０）；中程度発現型（ランク２０）は成熟型の長鎖型のαＩコラーゲンＩＸ型であり（ＣＬＮ００５１７６４８）；最低の発現型（ランク５６）はＷＦＩＫＫＮ関連タンパク質（ＣＬＮ００４６３４７４）であった。
【０１３３】
（実施例２）
哺乳動物細胞から高レベルで分泌されるリーダー配列含有タンパク質の同定
次のアッセイセットは、馴化培地から回収することができた量に基づいて（すなわち、「分泌」に基づいて）タンパク質を比較することを目指した。表１および表２の実施例１で用いたｃＤＮＡをｐＴＴ哺乳動物発現ベクターの修飾バージョンにサブクローニングして、哺乳動物細胞において、そのタンパク質をそれらの内因性のシグナルペプチド／リーダー配列で発現させた。馴化培地に存在する生成タンパク質のレベルを定量した後に、今度は「高分泌型」から「中程度分泌型」に、さらに「低分泌型」にタンパク質をランク付けした。
【０１３４】
後に、この情報は、そのシグナル配列／リーダー配列をリエンジニアリングすることによってタンパク質の分泌を改善することができるかどうかを判断するためのベースラインの役目を果たした。この「リエンジニアリング」は、「低分泌型」タンパク質の内因性シグナルペプチドを、「中程度」または「高分泌型」のそれで置換することによって実施された。
【０１３５】
上記のリエンジニアリングを進めるために、本発明の各タンパク質のシグナルペプチド／リーダー配列に対応するアミノ酸配列をまず特定する必要があった（付録Ａ、表１および２）。定義済みの属性セットに基づき、既存のライブラリーからのｃＤＮＡは、分泌性タンパク質をコードするとバイオイニフォマティクスにより予測することができる。例えば、シグナルペプチドは一般にＯＲＦの最初の６〜２７のアミノ酸コドン（１８〜８１ヌクレオチド）によってコードされ、それは通常１〜４の極性アミノ酸から開始し、その後一続きの疎水性アミノ酸が、次に、分泌関連の切断が起こる部位の直前に荷電アミノ酸の短い領域が続く。他の物理学的性質とともにこれらの属性を使って、ｃＤＮＡは分泌性タンパク質をコードすると予測することができるが、タンパク質の識別情報は不明のままである。完全なｃＤＮＡライブラリーで実行されたそのような分析の１つの結果を、付録Ａと表１および２で要約する。現在の限界は依然、推定上のシグナルペプチド／リーダー配列の存在が、前記リーダー配列を含むタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの分泌を可能にするかどうか、および、この方法の効率はどの程度であるかを予測することができないことである。
【０１３６】
リーダー配列のハイスループットスクリーニングのための発現ベクターの調製
高レベルのタンパク質分泌を生成するシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を特定するために、分泌性タンパク質をコードすると予測された（手持ちのｃＤＮＡライブラリーおよび上述の方法を用いて）ｃＤＮＡセットを、実施例１で詳述したものと類似したサブクローニング手法を用いてｐＴＴ５発現ベクター（図３）のいくつかの修飾バージョンの１つにサブクローニングした。修飾ベクターのいくつかは、切断可能なタグ（ベクターＡおよびＣ、図４および５）をＣ末端Ｖ５およびＨｉｓＸ８（配列番号２５８）エピトープタグとインフレームで（ベクターＡ、ＢおよびＣ、図４および５）、またはＦｃドメイン配列とインフレームで含んでいた（ベクターＤおよびＥ、図６）。ＨｉｓＸ８（配列番号２５８）タグ（８Ｈｉｓ残基の群からなる）の存在は、当分野の技術者に周知であり、市販されている（例えばＱｉａｇｅｎ社、ＣＡ）標準のニッケルカラムベースの技術を用いることによる、組換えで発現するタンパク質の精製を可能にする。安定したトランスフェクタントのために長期の選択が必要な場合、タンパク質は図７に示すｐＴＴ２ｐベクターなどのベクターでも発現させた。
【０１３７】
ｐＴＴ５へ挿入した各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドＤＮＡは、９６ウェルプレートでＱＩＡＧＥＮ（商標）ＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮＡシステムを使って精製した。各クローンのＤＮＡ濃度は２６０ｎｍでの吸光度で測定して、その後、例えば適当な緩衝液で５０μｇ／ｍｌの濃度に調節した。生じたｐＴＴ５ベースの構築体をハイスループット９６ウェルシステムを使って２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＶＡ）に一過性にトランスフェクトした後、発現／分泌アッセイを行った。これらの工程は、次に記載する。
【０１３８】
９６ウェルプレートでのハイスループットトランスフェクション
１０の９６ウェルプレートの一過性のトランスフェクションのために、各ｃＤＮＡプラスミドの１０μｌを５０μｌのＧＩＢＣＯ（登録商標）ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）（ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、カタログ番号３１９−８５−０７０）と丸底９６ウェルポリスチレンプレートの別々のウェル（各ｃＤＮＡのために１つ）内で組み合わせた。このプレートを、「マスタートランスフェクションプレート」と命名した。その後、各ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）／ｃＤＮＡ混合物の３７．５μｌを、２．５μｌのＦＵＧＥＮＥ（商標）６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、カタログ番号１９８８３８７）と別の丸底９６ウェルポリスチレンプレートの別々のウェル（各ｃＤＮＡのために１つ）内で５分間プレインキュベートした。次に混合物を室温で約３０分間インキュベートして、ｃＤＮＡにつき１つの「トランスフェクション複合体」を得た。
【０１３９】
各トランスフェクション複合体はその後１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（商標）を加えて希釈し、反復ピペット操作によって数回混合し、次に、一度に２０μｌを１０の別々のウェルに移した。トランスフェクションの後の最高１０の異なるアッセイのための試料収集を促進するために、各ウェルは、別々の９６ウェル平底ポリリジンコートプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、カタログ番号３５６４６１）上にあった。各プレートは、最大で９６の異なるｃＤＮＡを含んでいた。
【０１４０】
次に、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む）中の２９３Ｔ細胞の２×１０５細胞／ｍｌの懸濁液の２００マイクロリットルを、各ウェルに加えた。細胞および希釈したトランスフェクション複合体の各種混合物は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。約４０時間後に、培地を吸引によってウェルから取り出し、細胞を１５０μｌのＰＢＳで短時間洗浄して、予熱処理をした新たな培地を加えた。
【０１４１】
各タンパク質の発現および分泌のレベルを分析する目的のために用いるトランスフェクション細胞のセットを調製するために、新鮮なＨＹＱ−ＰＦ（商標）ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、カタログ番号ＳＨ３０３５９．０２）の１５０μｌを各ウェルに加えた。
【０１４２】
分泌されたタンパク質の活性を分析する目的のために用いるトランスフェクション細胞のセットを調製するために、ＨＹＱ−ＰＦ（商標）ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙの代わりに５％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む新鮮な１５０μｌのＤＭＥＭ培地をウェルに加え、生じた混合物を３７℃の５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０１４３】
様々なｃＤＮＡがそれらの分泌性タンパク質をそれぞれ発現してさらに４８時間後、１０枚すべての９６ウェルプレートからの培養液上清を収集し、適当な場合は単一の滅菌深底ウェルプレートに混ぜ入れて、滅菌蓋で覆った。深底ウェルプレートは、遊離細胞または細胞片をペレット化するために、１，４００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。馴化培地に放出されたタンパク質（すなわち分泌されたタンパク質）のレベルを測定することができるように、上清を新しい滅菌深底ウェルプレートへ移した。このことは、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロット、および、捕捉工程として抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体を使い、発現を検出して精製されたＶ５Ｈｉｓ標準と比較した発現レベルを測定するために抗Ｖ５−ＨＲＰを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって達成された。プレートに結合したままの細胞の層は、０．２％ＳＤＳ、０．５％ＮＰ−４０を含むＰＢＳで可溶化した。生じた細胞溶解物は、ＥＬＩＳＡによる細胞溶解物中のタンパク質レベルの分析のために用いた。
【０１４４】
スクリーニングアッセイの最初のセットにおいて、それらが属するタンパク質の高い分泌レベルと相関することが示されたリーダー配列のサブセットが同定された。直前に記載した工程に従って実施したハイスループット分泌アッセイの結果は、図８および９に示す。２９３Ｔ細胞におけるｃＤＮＡのハイスループット発現を使って、高い分泌レベルをもたらすいくつかのｃＤＮＡを同定した。合計５６のｃＤＮＡ（以前、分泌性タンパク質のための我々の完全なｃＤＮＡライブラリーの中で最高発現型と評価された）を、このアッセイでスクリーニングした。それらの同一性、各レーンにおけるそれぞれの位置、および馴化培地における相対発現レベルは、表３、カラム２および４ですべて要約する。カラム２は、隣接したレーンに分離された１つまたは複数の標準の濃度と比較して、馴化培地に分泌された各タンパク質の濃度を定量した（図８および９のＢＳＡ）。一般的に、分泌レベルは発現レベルと常にではないが相関する（カラム２とカラム２とを比較する）。例えば、「最高発現型」（カラム３で１番にランクされる）は、表３によると「最高分泌型」（分泌タンパク質濃度３２μｇ／ｍＬ）でもある。これらの結果は、完全長タンパク質ベータサブユニットプロリル４−ヒドロキシラーゼ（カラム１１）に対応する。他方、いくつかのタンパク質は約４μｇ／ｍＬのレベル（カラム２）で分泌されたが、発現では１６および２１の間にランクされた（カラム３）。αＩコラーゲン型ＩＸのロング形態（ＣＬＮ００５１７６４８によってコードされる）は、後者の１つである。
【０１４５】
（実施例３）
高分泌型からのリーダー配列セットは、低分泌型から高分泌型への変換に役立つ
実施例２で詳述したハイスループットアッセイは、「低分泌型タンパク質」から「高分泌型タンパク質」までの異なる分泌レベルを有する「最高発現型」タンパク質からの一群のｃＤＮＡを提供した。それらの同一性および特性については、表１、２および３を参照。次の問題は、高分泌型のシグナルペプチド／リーダー配列が他のタンパク質に移動可能かどうかということであった。より重要なことは、「低分泌型タンパク質」の分泌が、それらの内因性リーダー配列を本発明の「高分泌型タンパク質」のいずれか１つからのもので置換することによって改善することができるかどうかという疑問であった。このために、基本的に実施例１および２で詳述したような標準のサブクローニング手法、トランスフェクション方法および発現方法を使って、一連の実験を実施した。これらの実験の１つを次に例示する。
【０１４６】
ハイスループット発現およびハイスループット分泌アッセイの初期セットにおいて、低発現タンパク質、低分泌タンパク質またはその両方であることが示された一群のタンパク質のシグナルペプチド／リーダー配列を置換するために、ＣＬＮ００５１７６４８からのシグナルペプチド／リーダー配列を用いた。それら自身の内因性リーダー配列の代わりに高分泌型クローンＣＬＮ００５１７６４８の異種リーダー配列を有する、得られたリエンジニアリングによるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、さもなければ低発現型／低分泌型タンパク質であったものから高分泌型タンパク質に変わったことがわかった。実際、ＣＬＮ００５１７６４８のシグナルペプチド／リーダー配列は、Ｉ型ＴＭタンパク質およびＩＩ型タンパク質の分泌を増強することができる。その分泌がこの過程によって改善されたタンパク質のいくつかの特定の例には、以下のタンパク質をコードするｃＤＮＡ構築体が含まれる。ヒトＣＤ３０リガンド、ＳＣＤＦＲ１、Ｏｘ４０リガンドであり、そのすべてが、実施例１および２で記載されている方法によってそれらの内因性シグナルペプチド／リーダー配列がＣＬＮ００５１７６４８の配列で置換されるように操作された。さらに、修飾されたタンパク質の総発現レベルも、この置換によって増加した。これはどちらも、細胞溶解物および馴化培地における総タンパク質レベルの両方の定量によって決定された。したがって、ＣＬＮ００５１７６４８からのシグナルペプチド／リーダー配列は、低発現型タンパク質の発現および分泌をどちらも増強することができる。
【０１４７】
それらの内因性リーダー配列を、ＣＬＮ００５１７６４８または「最高発現型」（表３、カラム３を参照）のリストから選択された他のタンパク質の配列（異種リーダー配列）で置換することによる、低分泌型および／または低発現型の分泌および／または発現のレベルの改善を示す上記のハイスループット結果は、実施例４に記載のスケールアップ方法を使用してさらに確認された。
【０１４８】
（実施例４）
２９３−６Ｅ細胞におけるリーダー配列含有タンパク質の発現のためのスケールアップ方法
９６ウェルハイスループットトランスフェクション−発現アッセイの代替手段は、トランスフェクションおよび発現の両方が、より大規模のプロトコルで行われるものである。これらは、例えば、９６ウェルプレートではなく振とうフラスコ中で増殖した、Ｙ．  Ｄｕｒｏｃｈｅｒによって提供される２９３−６Ｅ細胞を使用し得る。ハイスループット方法のために、Ｆｕｇｅｎｅ  ６の代わりに振とうフラスコ中でのＤＮＡトランスフェクションのためにＰＥＩを使用する以外は、２９３−６Ｅ細胞を、２９３Ｔ細胞に使用するものと同じ試薬で処理し、同じ条件に供することができる。
【０１４９】
スケールアップ方法のために、２９３−６Ｅ細胞を、ベントスクリューキャップ付きポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ中で増殖させ、５％ＣＯ２中３７℃、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド）中１００ＲＰＭで、卓上用シェイカーで回転させた。これらのフラスコ中の細胞密度を０．５〜３×１０６細胞／ｍｌの範囲に維持した。典型的には、５０ｍｌの培養物を２５０ｍｌのフラスコ中で増殖させた。トランスフェクションの前日に、２９３−６Ｅ細胞を、約０．６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度まで、新鮮なＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）培地中に希釈した。トランスフェクションの日に、細胞は、０．８〜１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度範囲によって特徴付けられる対数期にあると予想された。対数期の細胞培養物の体積を、それらの細胞密度が約１０６細胞／ｍｌになるように調節した。
【０１５０】
各ｃＤＮＡについて、異なるトランスフェクションミックスを調製した。各トランスフェクションミックスを調製するために、２．５ｍｌの無菌ＰＢＳを、２つの１５ｍｌチューブに加えた。第１チューブはまた、５０μｇのＤＮＡを含んだ。第２チューブはまた、直鎖状２５ｋＤａポリエチレンイミンの１ｍｇ／ｍｌの無菌ストック溶液、ｐＨ７．０（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ製、ウィスコンシン州ウォリントン）を含む１００μｌのＰＥＩ溶液を含んだ。次いで２つのチューブ中の溶液を組み合わせ、室温で１５分間、ともにインキュベートし、トランスフェクション複合体を生じた。次いでトランスフェクション複合体を２９３−６Ｅ浮遊培養物に移し、５％ＣＯ２中３７℃で４〜６日間増殖させた。この方法を各ｃＤＮＡについて繰り返した。
【０１５１】
タンパク質分泌レベルを測定するために、ウェスタンブロットによって培養物上清を解析した。試料（ｃＤＮＡにつき１５μｌ）を、２６レーンのＣＲＩＴＥＲＩＯＮ（商標）ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜をブロックし、クローニング工程で導入された特異的エピトープに対する抗体でプローブした。例えば、Ｖ５および／またはＨｉｓＸ８（配列番号２５８）エピトープタグ付きタンパク質には、ＨＲＰ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド）に複合した抗Ｖ５または抗ＨｉｓＸ８（配列番号２５８）エピトープ抗体のいずれかを使用した。標準的なＨＲＰ化学発光基質（ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＨＲＰシグナルを発生させた。
【０１５２】
各分泌タンパク質について得られたシグナルの強度を、同じゲルの別々のレーンにローディングした３つの精製された質量標準液のうちの１つのもの（例えば、８、３３、および１３３ｎｇ／ｍｌで１５μｌの標準液）と比較することによって、分泌レベルを測定した。比較は、クーマシー染色ゲル、銀染色ゲル、またはウェスタンブロットのいずれかに存在するバンドの面積を測定することを含んだ。この方法は、画像スキャナ、およびＳｃｉｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎウェブサイトからダウンロードできるＮＩＨイメージフリーウェアで行った。様々なタンパク質標準液を使用した。例としては、Ｖ５−ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質、Ｖ５−ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）タグ付きのＣＳＦ−１受容体細胞外ドメイン、および／またはＶ５−ＨｉｓＸ６（配列番号２５７）タグを含むＰＯＳＩＴＯＰＥ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、カリフォルニア州カールズバッド、カタログ番号Ｒ９００−５０）が挙げられる。例えばバキュロウイルス発現系を用いてこれらの標準液を別々に発現させ、９０％より高い純度に精製することができる。
【０１５３】
図２は、２０個のクローンのｃＤＮＡ（Ｖ５Ｈ８エピトープを含む）をｐＴＴ５ベクターにサブクローニングした、大規模発現実験の結果を例示する（図５）。本明細書中に記載される方法を用いて、得られたクローンを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。馴化培地中の１５μｌの試料中の分泌タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって評価した。各標準液において２つのＶ５  Ｈｉｓ標準液を混合し、以下の濃度に従って、右端のレーンにローディングした。（１）１６、６６および２６６ｎｇ／ｍｌでローディングした、高い方の分子量の、Ｖ５−Ｈｉｓｘ５（配列番号２６３）タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質、ならびに（２）８、３３、および１３３ｎｇ／ｍｌでローディングした、低い方の分子量の、Ｖ５−Ｈｉｓｘ６（配列番号２５７）タグ付きのＣＳＦ−１細胞外ドメイン。抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）をウェスタンブロットのために使用した。このウェスタンブロット実験から、ＣＬＮ００７１７６４８によってコードされるタンパク質を発現するクローンが、馴化培地中で最高レベルの分泌タンパク質を産生した。これらの結果は、２９３−６Ｅ細胞における大規模発現によって確認された。
【０１５４】
（実施例５）
本発明のシグナルペプチド／リーダー配列の、それらが異種タンパク質の分泌および／または発現を増強できるかどうかに基づく分類
実施例１〜４で述べた実験を組み合わせた結果から、本発明のリーダー配列の、異種リーダー配列としてのそれらの役割における、それらが挿入されたタンパク質の分泌および／または発現を改善する能力に従った分類が示唆される。したがって、リーダー配列は、「高分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」、「中程度分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー」、または「低分泌型シグナルペプチド／分泌リーダー配列」等の種類に分類される。
【０１５５】
分泌レベルおよび本発明の異種ポリペプチドによって引き起こされた分泌の増大は、得られたポリペプチドの発現レベルと別々であり、異なっているので、得られたポリペプチドはまた、互いに関して本発明のタンパク質をすべて（表１〜３および付表Ａ）ランク付けするように働く相対的な段階に関して、それらの発現レベルに基づいてランク付けした。これらのランク付けは、コムギ胚芽エキス、または哺乳動物細胞のいずれかにおける、発現および分泌レベルについて行った（実施例１〜３参照）。
【０１５６】
さらに、上記の分類はｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることから得られた結果に基づくが、分類は、本発明のタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させながら得ることができる結果まで広がり得る。実施例１ですでに述べたように、本発明のシグナルペプチド／リーダー配列は、それらが結合している異種タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を改善するのに使用できるかどうかについてアッセイすることができる。例えば、本質的に実施例１および２に記載されるようなクローニング方法を用いて、表２に記載されるリーダー配列のいずれかを、適切に作用するように異種タンパク質に作動可能に連結することができる。次いで、得られたｃＤＮＡ構築体を、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスまたはブタＥＳ細胞）にエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションすることができ、次いでそれを、当業者に公知の標準的な方法に従って、トランスジェニック動物（例えばマウスまたはブタ）の作製に使用する。タンパク質、およびｃＤＮＡ構築体の他の特性（例えば、組換えタンパク質の発現を駆動するのに使用する特定のプロモーター）に依存して、分泌組換えタンパク質を、例えば血液、乳汁、唾液等の体液からアッセイすることができ、その発現レベルを定量することができる。アッセイは、シグナルペプチドによってのみ異なる２つの組換えタンパク質が発現されるように行うことができる（すなわち、内因性のシグナルペプチドと本発明の異種のシグナルペプチドとを比較する）。
【０１５７】
本発明のシグナルペプチド／リーダー配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質発現に使用する代わりにｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質発現に使用する場合には同一の範疇に分類されない可能性がある。しかし、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイから得られた結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で所望のレベルのタンパク質発現を達成するためにどの特定のシグナルペプチド／リーダー配列を使用することができるかを選択するための指針として役立つに違いない。
【０１５８】
本明細書は、以下の参考文献に照らして最も徹底的に理解され、これはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、上記で引用した特許および他の参考文献の開示も参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
【数１−１】
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【０１６０】
【数１−２】
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【０１６１】
【数１−３】
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【０１６２】
【数１−４】
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配列表
出願人らは、付表Ａとして電子フォーマットおよびペーパーフォーマットの両方で用意した配列表を添付する。
【０１６３】
産業上の利用可能性
リーダー配列、異種の分泌ポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、およびこれらを作製する方法により、多くの研究、診断、および治療用途における使用法が発見される。
【０１６４】
【表１−１】
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【０１６５】
【表１−２】
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【０１６６】
【表１−３】
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【０１６７】
【表１−４】
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【０１６８】
【表１−５】
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【０１６９】
【表１−６】
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【０１７０】
【表２−１】
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【０１７１】
【表２−２】
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【０１７２】
【表２−３】
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【０１７３】
【表２−４】
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【０１７４】
【表２−５】
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【０１７５】
【表２−６】
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【０１７６】
【表３−１】
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【０１７７】
【表３−２】
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【０１７８】
【表３−３】
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【０１７９】
【表３−４】
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【０１８０】
【数２−１】
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【０１８１】
【数２−２】
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【０１８２】
【数２−３】
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【０１８３】
【数２−４】
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【０１８４】
【数２−５】
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【０１８５】
【数２−６】
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【０１８６】
【数２−７】
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【０１８７】
【数２−８】
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【０１８８】
【数２−９】
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【０１８９】
【数２−１０】
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【０１９０】
【数２−１１】
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【０１９１】
【数２−１２】
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【０１９２】
【数２−１３】
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【０１９３】
【数２−１４】
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【０１９４】
【数２−１５】
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【０１９５】
【数２−１６】
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【０１９６】
【数２−１７】
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【０１９７】
【数２−１８】
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【０１９８】
【数２−１９】
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【０１９９】
【数２−２０】
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【０２００】
【数２−２１】
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【０２０１】
【数２−２２】
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【０２０２】
【数２−２３】
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【０２０３】
【数２−２４】
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【０２０４】
【数２−２５】
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【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は、（ａ）本発明のリーダー配列（「ｃｏｌｌａｇｅｎ＿ｌｅａｄｅｒ」）（配列番号２７）、（ｂ）未知のタンパク質のアノテーションを有するＭＧＣ：２１９５５としてすでに示されており、ＣＬＮ００５１７６４８として本明細書で示されるｃＤＮＡクローン（配列番号２６４）、および（ｃ）ＩＸ型コラーゲンαＩ鎖、長鎖型（ヒト）に相当する、公にアクセス可能な配列ＮＰ＿００１８４２＿ＮＭ＿００１８５１からなるアミノ酸配列（配列番号２６５）のアラインメントである。こうした配列はすべて、Ｎ末端がアミノ酸残基１としてメチオニン（「Ｍ」）で開始する。このクローンＣＬＮ００５１７６４８＿５ｐｖ１は、その配列を決定し、２５３のアミノ酸残基を含むことが判明した。
【図２】図２は、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトし、ｐＴＴ５ベクター中にサブクローニングした（実施例２〜４においてさらに詳細に記載する通り）培養２９３−Ｔ細胞によって馴化された培地における本発明のいくつかの分泌性ポリペプチドの発現を示したウェスタンブロットである。クローンＣＬＮ００５１７６４８によってコードされる分泌性タンパク質を発現する構築体が最高のレベルで馴化培地においてタンパク質を分泌することが実証された。馴化培地中に分泌されたタンパク質の量は、２種の標準液：（１）Ｖ５−Ｈｉｓｘ６（配列番号２５７）タグ付きのδ様タンパク質１細胞外タンパク質（１６、６６および２６６ｎｇ／ｍｌで１５μｌ）、および（２）Ｖ５−Ｈｉｓｘ６（配列番号２５７）タグ付きのＣＳＦ−１受容体細胞外ドメイン（８、３３および１３３ｎｇ／ｍｌで１５μｌ）と比較した。こうした標準液は混合し、右端の３つのレーンに示した濃度でローディングした。
【図３】図３は、Ｄｒ．Ｙｖｅｓ  Ｄｕｒｏｃｈｅｒによって提供された始動ベクターｐＴＴ５（４３９８ｂｐ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、２００２）の概略図である。
【図４】図４は、本発明の目的のために「ｃｃｄｂ」領域を置き換えるようにｐＴＴ５ベクター中に挿入したベクターＡの配列（配列番号２６６）を示す。ベクターＡは、左から右に、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、トロンビン切断可能部位をコードする配列によって例示した切断可能配列、Ｖ５Ｈ８によって例示したタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。
【図５】図５は、ベクターＢ（配列番号２６７）およびベクターＣ（配列番号２６８）の配列を示す。ベクターＢは、左から右に、コザック配列、本発明のコラーゲンリーダー配列などのリーダー配列（「ＳＰ」）、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、Ｖ５Ｈ８などのタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。ベクターＣは、左から右に、コザック配列、本発明のコラーゲンリーダー配列によって例示したリーダー配列（「ＳＰ」）、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、トロンビンをコードする配列によって例示した切断可能配列、Ｖ５Ｈ８などのタグ、およびリンカー配列、続いて終止コドンを含む。
【図６】図６は、ベクターＤ（配列番号２６９）およびベクターＥ（配列番号２７０）の配列を示す。ベクターＤは、左から右に、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、およびＦｃドメイン配列、続いて終止コドンを含む。ベクターＥは、左から右に、コザック配列（「ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ」）、本発明のシグナルペプチド／リーダー配列、ＥｃｏＲＩ部位、「−−−−−−」によって表した成熟ポリペプチドをコードするＯＲＦまたは対象の遺伝子、ＢａｍＨＩ部位、およびＦｃドメイン配列、続いて終止コドンを含む。
【図７】図７は、適当なピューロマイシン耐性細系を作製するためのｐＴＴ２ｐベクターの一例である。具体的には、ｐＴＴ２ｐベクターは、とりわけ、エピソーム性のｐＴＴ２−ゲートウェイベクターを作製するためのマウスポリオーマシグナルを含む。
【図８】図８は、本明細書に記載の２８の分泌性タンパク質を使用したＣＨＯ  ＳＯＹ培地におけるタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上２つの図は、クーマシー染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、下２つの図は、銀染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。表３の列６〜１１は、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンに表される特定のリーダー配列を識別する。右端の３つのレーンでは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準液を、それぞれ８、１６および３２マイクログラム／リットル（ｍｇ／Ｌ）の対応する発現レベルを反映する濃度で流した。
【図９】図９は、本明細書に記載の２９〜５６の分泌性タンパク質を使用したＣＨＯ  ＳＯＹ培地におけるタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上２つの図は、クーマシー染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、下２つの図は、銀染色によって発色させたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。表３の列６〜１１は、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンに表される特定のリーダー配列を識別する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準液を、８、１６および３２マイクログラム／リットル（ｍｇ／Ｌ）の対応する発現レベルを反映する濃度で流した。
【国際調査報告】
2008528033.tif 000127
2008528033.tif 000128
2008528033.tif 000129
2008528033.tif 000130
2008528033.tif 000131