(57)【要約】本発明は、ラクトバチルス・アシドフィルスの核酸分子及びポリペプチド、その断片又は変異体を開示する。本発明には、融合タンパク質、抗原性ペプチド、及び抗体も包含される。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、及びかかる発現ベクターを含む細胞を提供する。本発明のポリペプチドの作製方法及びその使用方法についても提供される。
2008517628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）〜ｅ）からなる群から選択される単離された核酸分子。
ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、或いは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
ｃ）配列番号１又は３に示されるヌクレオチド配列のうち、少なくとも５０の連続するヌクレオチドを含む核酸分子であって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、或いは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９に示されるヌクレオチド配列のうち、少なくとも５０の連続するヌクレオチドを含む核酸分子であって、生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
ｅ）ａ）〜ｄ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３】
異種核酸分子を含む細胞であって、異種核酸分子が請求項１記載の核酸分子であることを特徴とする細胞。
【請求項４】
細胞がバクテリア細胞であることを特徴とする請求項３記載の細胞。
【請求項５】
以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択される単離されたポリペプチド。
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチド、或いは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、生物活性を有するポリペプチド；及び
ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、或いは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むポリペプチド
【請求項６】
請求項５記載のポリペプチドに選択的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項７】
以下のａ）及びｂ）を含むバクテリアであって、
ａ）以下のｉ）〜ｖ）からなる群から選択される一番目の核酸分子：
ｉ） 配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ii） 配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がシュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
iii）配列番号１に示されるヌクレオチド配列のうち、少なくとも５０の連続するヌクレオチドを有する断片を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がシュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
iv） 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
ｖ)ｉ）〜iv）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がシュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）以下のｉ）〜ｖ）からなる群から選択される二番目の核酸分子：
ｉ） 配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ii） 配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がシュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
iii）配列番号３に示されるヌクレオチド配列のうち、５０の連続するヌクレオチドを有する断片を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列がシュウ酸分解活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
iv） 配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
ｖ)ｉ）〜iv）のいずれかとストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸分子；
前記一番目の核酸分子又は前記二番目の核酸分子のうち少なくとも一つが、バクテリアに対して異種であり、前記一番目の核酸分子又は前記二番目の核酸分子がバクテリアの活性プロモーターに作動可能に連結しているバクテリア。
【請求項８】
一番目の核酸分子又は二番目の核酸分子の両方が、バクテリア細胞に対して異種であることを特徴とする請求項７記載のバクテリア。
【請求項９】
バクテリアがプロバイオティックバクテリアであることを特徴とする請求項４、７、又は８記載のバクテリア。
【請求項１０】
バクテリアが乳酸菌であることを特徴とする請求項４、７、又は８記載のバクテリア。
【請求項１１】
乳酸菌がラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガゼリ、ラクトバチルス・ジョンソニー、及びラクトバチルス・プランタルムからなる群から選択される乳酸菌であることを特徴とする請求項１０記載のバクテリア。
【請求項１２】
以下のａ）及びｂ）のステップを含む細胞のシュウ酸分解活性を調節する方法。
ａ）少なくとも一つの請求項１記載の核酸分子を細胞に導入するステップ；及び
ｂ）核酸分子の発現を可能とする条件下で細胞を培養するステップであって、
前記核酸分子の発現が細胞のシュウ酸分解活性を調節するステップ
【請求項１３】
細胞がバクテリア細胞であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
効果的な濃度の請求項４、７、８、９、１０又は１１記載のバクテリアを、対象に導入することを含むことを特徴とする、対象内でシュウ酸分解を増強させる方法。
【請求項１５】
効果的な濃度の少なくとも一つの請求項５記載のポリペプチドを、対象に導入することを含むことを特徴とする、対象内でシュウ酸分解を増強させる方法。
【請求項１６】
ポリペプチドをコードする核酸分子が発現する条件下で、請求項３記載の細胞を培養することを含むポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドが、以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択される方法。
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチド、或いは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、生物活性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、或いは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むポリペプチド
【請求項１７】
ポリペプチドと選択的に結合する化合物と試料を接触させるステップと、化合物が、試料中のポリペプチドと結合するか否かを判定するステップとを含む、試料中のポリペプチドの存在の有無を検出する方法であって、前記ポリペプチドが、以下のａ）〜ｃ）からなる群から選択される方法。
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、シュウ酸分解活性を有するポリペプチド、或いは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列のうち、少なくとも５０の連続するアミノ酸を有する断片を含むポリペプチドであって、生物活性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド、或いは配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を含むポリペプチド
【請求項１８】
ポリペプチドに結合する化合物が抗体であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法に使用される化合物と使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項２０】
試料中の、請求項１記載の核酸分子の存在の有無を検出する方法であって、以下のａ）及びｂ）のステップを含む方法。
ａ）核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ又はプライマーと試料とを接触させるステップ；と
ｂ）核酸プローブ又はプライマーが、試料中の核酸分子に結合するか否かを判定するステップ
【請求項２１】
試料が、ｍＲＮＡ分子を含み、かつ核酸プローブと接触していることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物と使用説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項２３】
バクテリア細胞の機能的特性を改変する方法であって、以下のａ）及びｂ）のステップを含む方法であって、
ａ）異種ポリペプチド又はその断片をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結している請求項１記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子を用いて、バクテリアの細胞を形質転換するステップ；と
ｂ）核酸分子の発現を可能とする条件下でバクテリアの細胞を培養するステップ；
とを含み、
異種ペプチド又はその断片が前記バクテリア上又はバクテリア内で発現し、野生型のバクテリア細胞に存在しない機能を提供する方法。
【請求項２４】
バクテリア中でラクトバチルス・アシドフィルス由来の少なくとも一つのポリペプチドを過剰発現させることと、乳製品を発酵させるために前記バクテリアを使用することとを含む発酵乳製品のフレーバーを改変する方法であって、前記ポリペプチドが、以下のａ）〜ｄ）からなる群から選択される方法。
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、生物活性を保持するポリペプチド；
ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０に示されるアミノ酸配列の断片を含むポリペプチドであって、前記断片が生物活性を保持するポリペプチド；及び
ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
【請求項２５】
請求項３、４、７、８、９，１０又は１１記載の細胞を含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２６】
請求項５記載のポリペプチドを含むことを特徴とする医薬品組成物。
【請求項２７】
細胞のシュウ酸分解活性を調節する薬剤を製造するための、請求項２５又は２６記載の医薬品組成物の使用。
【請求項２８】
細胞のシュウ酸分解活性を調節するための、請求項２５又は２６記載の医薬品組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス・アシドフィルスの核酸によって、コードされるポリヌクレオチド及びポリペプチドと、かかるポリペプチド及びそれらを発現する微生物を使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）は、グラム陽性、桿状、非胞子形成性、ホモ発酵性のバクテリアであり、胃腸管及び尿生殖路における常住菌である。Moroが最初に幼児の糞便から単離（１９００年）して以来、この「酸を好む（acid loving）」生物は、ヒト、母乳で育った乳幼児、及び乳、ラクトース、若しくはデキストリンを多く含有する食物を摂取する人々の腸管で観察されてきた。ラクトバチルス・アシドフィルスは、腸管の微生物叢（microflora）に有益な効果をもたらすことができる腸内プロバイオティックであるとされてきたラクトバチルス種である（Klaenhammer and Russell (2000) "Species of the Lactobacillus acidophilus Complex," Encyclopedia of Food Microbiology, Volume 2, ed. Robinson et al., (Academic Press, San Diego,  California), pp. 1151-1157）。ラクトバチルス・アシドフィルスは、ラクトースやより複雑なオリゴサッカライドを含むヘキソースを発酵し（Kaplan and Hutkins (2000) Appl. Environ. Microbiol.66:2682-2684）、乳酸を産生し、生物（organism）が培養されている環境のｐＨを低下させることができる。酸性環境（例えば、食品、膣、及び胃腸管の内側の部位）は、望ましくないバクテリア、病原体、及び酵母の発育を妨げることができる。生物は、その耐酸性、培養乳製品中での生存性、並びに、胃や胃腸管を通過する際の生存能についてよく知られている。ラクトバチルス及び他の共生バクテリアは、そのいくつかは「生命を好む（favor life）」プロバイオティック細菌であると考えられており、ヒトの健康に対する影響について、特に腸内感染及び下痢性疾患の予防又は治療、ガンの予防、並びに免疫システムの刺激について広範囲にわたって研究されてきた。
【０００３】
微生物由来のエステラーゼ及びリパーゼは、食品加工、界面活性剤組成物、洗剤、紙、製油、診断法、及び光学活性医薬等のバイオテクノロジーへの適用の可能性ゆえに現在興味の対象となっている（Jaeger et al. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53:315-351, Jaeger and Reetz(1998) Trends Biotech. 16:396-403）。乳脂肪を改変する酵素は、リパーゼ(トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ３．１．１．３）及びエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）である。エステラーゼは、定義によれば、短鎖脂肪酸エステル（≦Ｃ１０）を有するエステル基質を加水分解することができる酵素であり、それに対してリパーゼは、長鎖アシルグリセロール（≧Ｃ１０）を加水分解する（Verger (1997) Trends Biotech. 15:32-38）。これらの酵素の基質と生成物は、熟成中のチーズ、発酵乳製品、塩漬けベーコン(cured bacon)、及び発酵ソーセージの多様なフレーバー組成物の生成に関連するものである。乳製品業界では、チーズの調製と加工における熟成期間を短くすることで、固定費（inherent cost）を削減し、様々なチーズのフレーバーの強度を増強することに関心がもたれてきた。乳脂肪にリパーゼとエステラーゼが作用することにより遊離した遊離脂肪酸は、独特のフレーバーの特性を乳製品に付与する。さらに脂肪酸が分解した場合、様々なフレーバー組成物の生成に寄与する熟成中のチーズ及び発酵乳製品の他の組成物との反応が起こる可能性が高い（Stead (1986) J.Dairy Sci. 53:481-505）。
【０００４】
シュウ酸は、強酸のジカルボン酸（ｐＫａ１＝１．２３；ｐＫａ２＝３．８３）であり、細胞組織を刺激する毒性化合物である。この効果は１８世紀に認識されており、洗濯及び漂白に使用されていた。特に高濃度のシュウ酸は、ヒトや動物を死に至らしめ、高シュウ酸尿症（正常範囲を超えたシュウ酸レベル）、ピリドキシン欠乏症、尿路結石症（urolithiasis）(結石(calculi)や尿路結石（uroliths）の形成)、及び腎不全(renal failure)、その他の疾病をもたらす（Hatch et al.(1995) Scanning Microsc 9:1121-1126）。シュウ酸の毒性は、過酸化水素との相互作用でヒドロキシルラジカル又は炭酸ラジカル(carbonate radicals)という活性酸素種を産生する能力（フェントン反応による）に関連したものであった(Park et al. (1997) Free Rad Res 27:447-458 and Urzua et al. (1998) Appl． Envirn． Microbiol． 64：68−73)。シュウ酸は、茹でた人参（１．８８ｍｇ／ｇ）、トマト（０．０４ｍｇ／ｇ）、セロリ（０．１７ｍｇ／ｇ）、ポテト（０．０２ｍｇ／ｇ）、とうもろこし（０．０３ｍｇ／ｇ）、及び紅茶（０．１１ｍｇ／ｍＬ）、コーヒー（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、チョコレート１．１７ｍｇ／ｇ）などの他の食品など、広く自然界に存在し、様々な食品に存在する。シュウ酸は、非酵素的分解や、腸管微生物叢のによるいくつかの代謝前駆体（アスコルビン酸などの）から産生される（Ogawa et al. (2000) World J. Surg. 24:1154-1159）。腸内で、シュウ酸は、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、又はカリウムと結合して、溶解度が小さい塩を産生するが、鉄と結合した場合は、溶解度が大きい塩を産生する。シュウ酸を特異的に分解するバクテリアの存在が、吸収を妨げることと、遊離のシュウ酸を異化することと、血液循環（circulation）からのシュウ酸の分泌を促進することとにより、宿主のシュウ酸のホメオスタシスを調節するのだろうということが提案されてきた。近年の臨床研究により、特にオキサロバクター・ホルミゲンス（Oxalobacter formigenes）といった、シュウ酸分解バクテリアの腸内コロニー形成の割合が低いと、尿のシュウ酸濃度の増加による高シュウ酸尿症の危険性が高まるという関係があることが示された（Troxel et al.(2003) J. Endourol. 17:173-176）。したがって、シュウ酸分解を改変する組成物と方法が必要とされている。
【非特許文献１】Klaenhammer and Russell (2000) "Species of the Lactobacillus acidophilus Complex," Encyclopedia of Food Microbiology, Volume 2, ed. Robinson et al., (Academic Press, San Diego, California), pp. 1151-1157
【非特許文献２】Kaplan and Hutkins (2000) Appl. Environ. Microbiol.66:2682-2684
【非特許文献３】Jaeger et al. (1999) Annu. Rev. Microbiol. 53:315-351,
【非特許文献４】Jaeger and Reetz(1998) Trends Biotech. 16:396-403
【非特許文献５】Verger(1997)Trends Biotech. 15:32-38
【非特許文献６】Stead (1986) J.Dairy Sci. 53:481-505
【非特許文献７】Hatch et al.(1995) Scanning Microsc 9:1121-1126
【非特許文献８】Park et al. (1997) Free Rad Res 27:447-458
【非特許文献９】Urzua et al. (1998) Appl． Envirn． Microbiol． 64：68−73
【非特許文献１０】Ogawa et al. (2000) World J. Surg. 24:1154-1159
【非特許文献１１】Troxel et al.(2003) J. Endourol. 17:173-176
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（総説）
具体的には、本発明は、配列番号１〜３６で示された配列のうち、奇数番号で示されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、かかる配列から原則としてなる単離された核酸分子、及び／又はかかる配列からなる単離された核酸分子と、配列番号１〜３６で示された配列のうち、偶数番号で示された配列を含むアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子とを提供する。また、本明細書に記述のある核酸分子にコードされた単離されたポリペプチド、若しくは組換えポリペプチドと、配列番号１〜３６の偶数番号に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、かかる配列から原則としてなるポリペプチド、及び／又はかかる配列からなるポリペプチドとを提供する。配列表に示されたヌクレオチド配列とアミノ酸配列と十分に同一性を有する様々な核酸分子とポリペプチドは、本発明に包含される。さらにヌクレオチド配列とアミノ酸配列の断片と、この２つに十分同一な断片も包含される。本発明のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本発明の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も包含される。
【０００６】
組成物には、さらに本明細書に記載されている核酸分子の組換え発現のためのベクター及び細胞、並びにかかるベクターを含む遺伝子組換え（transgenic）微生物群及び又は細胞群が含まれる。本発明のポリペプチドの組換え体（recombinant）作製の方法及びその使用方法についても含まれる。さらに、試料における本発明の核酸若しくはポリペプチド配列の有無、及び本発明のポリペプチドに結合する抗体の有無を検出するための方法やキットも含まれる。
【０００７】
前述の配列の少なくとも一つを有するベクター、細胞、及び微生物もまた提供される。これらの配列は、細胞又は生物のシュウ酸分解活性を改変するために使用される。さらに対象内でシュウ酸分解を改変する方法も提供される。一実施形態では、対象内のシュウ酸分解は、本発明の少なくとも一つのシュウ酸分解配列を効果的な濃度で対象に投与することにより増加する。別の実施形態では、本発明の少なくとも一つのシュウ酸分解配列を有する微生物を効果的な濃度で対象に投与することにより増加する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、これよりいくつかの具体例について、添付の図表を用いてより詳細に説明されるが、すべての本発明の具体例が示されているわけではない。実際、本発明は、多様な形態において具体化されうるものであるが、本明細書に示される具体例に限定されるものとして解釈されるべきものではない。かかる具体例は、明細書中の開示が法的要件を満たすのに適切なものとなるように記載されている。本明細書全体を通じ、同一の数字を用いて同一の要素が示される。
【０００９】
本明細書に示される本発明の多様な改変及び別の実施形態は、当業者が後述の記載と関連図に示される教示の利益を得て到達できるものである。それゆえ、本発明は、開示されている具体的な態様に限定されず、改変やその他の態様も添付の請求の範囲に包含されるものであると理解されたい。特定の用語が本明細書では用いられているが、それらは、総称的な（generic）及び記述的な(descriptive)意味でのみ用いられるものであり、限定のために使用されているものではない。本明細書における「a」、「an」は、１又は２以上のいずれの意味にもなり得る。例えば、「a cell」は、１個の細胞又は複数の細胞のいずれの意味にもなり得る。
【００１０】
本明細書で使用される、「遺伝子（gene）」及び「組換え遺伝子（recombinant gene）」という用語は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を指す。本発明の単離された核酸分子には、配列番号１〜３６に示された配列番号のうち、偶数の番号のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、配列番号１〜３６に示される配列番号のうち、奇数の番号の核酸配列（核酸は、奇数番号の配列のみであり、アミノ酸配列は、偶数番号で示されるということが理解できるであろう）と、これらの変異体（variant）及び断片とが含まれる。本発明には、後述するようにアンチセンス核酸分子も含まれる。別の実施形態では、核酸の発現を促進するためにプロモーター及び／又は制御核酸配列（promoter and/or regulatory nucleic acid sequences）を提供する。
【００１１】
加えて、示されたＯＲＦによりコードされる単離されたポリペプチド及びタンパク質、並びにそれらの変異体及び断片、及びかかるポリペプチドを生成する方法も包含される。本発明では、「タンパク質（protein）」と「ポリペプチド（polypeptide）」という用語は、相互的に使用される。
【００１２】
本発明に包含される核酸組成物及びタンパク質組成物は、単離されるか、実質的に精製される。「単離される（isolated）」又は「実質的に精製される（substantially purified）」とは、核酸分子若しくはタンパク質分子、又はそれらの生物学的に活性のある断片若しくは変異体が、自然状態において核酸又はタンパク質が通常関連している成分を、実質的に又は本質的に含んでいないことを意味する。かかる成分には、他の細胞物質、組換え体作成に伴う培養培地、及びタンパク質又は核酸を化学合成するのに用いる様々な化学物質が含まれる。本発明における「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、目的とする核酸に隣接する核酸配列を含まないことが好ましい（例えば５´又は３´末端に存在するコード配列）。しかしながら、分子が、組成物の基本的特性に悪影響を与えることのない塩基や部分をさらに含むことがある。例えば様々な実施形態において、単離された核酸は、それが由来する細胞のゲノムＤＮＡで通常関連している５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂより小さい核酸配列を含む。同様に、実質的に精製されたタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％未満（乾燥重量）の夾雑タンパク質を含む。タンパク質を組換え法により作製した場合は、培養培地は、タンパク質調製物の容積の３０％、２０％、１０％、又は５％未満であることが好ましく、タンパク質を化学的に作製した場合は、調製物は、原料となる化学前駆物質の約３０％、２０％、１０％、又は５％未満（乾燥重量）であることが好ましい。
【００１３】
本発明の組成物及び方法は、分子の機能を調節するために使用することができる。「調節する（modulate）」、「変化させる（alter）」、又は「改変する（modify）」とは、標的活性のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを意味する。本発明によると、本発明の配列の（発現）レベル又は活性は、調節（modulate）（即ち、過剰発現若しくは過小発現）されており、適当な対照（control）での同じ配列のレベル又は活性よりも配列のレベル又は活性が、統計的にみてより低いか、より高い。濃度及び／又は活性は、適当な対照と比較して、少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％増減させることができる。本発明のタンパク質は、プロバイオティクスや乳酸菌を含む様々なバクテリアの能力を改変するのに有用であり、かかるバクテリアによって発酵された食品の栄養又は健康促進特性を改変するのにも有用である。本発明のヌクレオチド分子は、タンパク質の発現を調節するのに有用である。本発明のポリヌクレオチドからの発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションも包含される。アップレギュレーションは、多数の遺伝子コピーを提供することにより、調節エレメントを改変して発現を調節することにより、転写又は翻訳の機構を促進することにより、或いは他の方法により実現することができる。ダウンレギュレーションは、公知のアンチセンス技法及び遺伝子サイレンシング技法を用いることによって実現することができる。
【００１４】
「乳酸菌（lactic acid bacteria）」とは、エロコッカス（Aerococcus）、カルノバクテリウム（Carnobacterium）、エンテロコッカス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック（Leuconostoc）、エノコッカス（Oenococcus）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ストレプトコッカス、メリソコッカス（Melissococcus）、アロイオコッカス（Alloiococcus）、ドロシグラニュラム（Dolosigranulum）、ラクトスフェラ（Lactosphaera）、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）、バゴコッカス（Vagococcus）、及びワイセーラ（Weissella）から選択される属のバクテリアを意味する（Holzapfel et al. (2001) Am. J. Clin. Nutr. 73: 365S-373S; Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. 1986. Williams and Wilkins, Baltimore. pp 1075-1079）。
【００１５】
「ラクトバチルス」とは、ラクトバチルス属に属する任意のバクテリアを意味し、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ガゼリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ブルガリカス、及びWoodら（Holzapfel, W.H.N. The Genera of Lactic Acid Bacteria, Vol. 2. 1995. Brian J.B. Wood, Ed. Aspen Publishers, Inc.）によって概説された他の多数の種によって例示されるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明のポリペプチド、又はかかるポリペプチドを産出する微生物（microbes）は、栄養添加剤又はサプリメントとして有用であり、乳製品及び発酵工程における添加剤としても有用である。ポリヌクレオチド配列、コードされたポリペプチド、及びそれらを発現する微生物は、チーズ、ヨーグルト、発酵乳製品、サワーミルク、バターミルクなどの乳由来製品の製造に有用である。本発明のポリペプチドを発現する微生物は、プロバイオティック生物でありうる。「プロバイオティック」とは、胃腸管を通過しても生存し、対象に健康効果をもたらす生きた微生物を意味する。「対象（subject）」とは、植物、微生物、ヒト、動物（家畜用、農業用、又は外来種）、その他を含む生物のことをいう。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、乳から作られる製品を改変するのに有用である。これらの使用には、バクテリアの増殖速度を改変することと、発酵乳製品のフレーバーを改変することと、乳酸菌により発酵された乳製品の酸性化速度を改変することと、発酵中に生産される製品を変化させることとが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
別の実施形態では、本発明の組成物には、シュウ酸を分解する、ポリペプチドとポリヌクレオチドとが含まれる。かかる配列には、配列番号１、２、３、及び４に示される配列が含まれる。配列には、シュウ酸分解を調節するために用いることができる配列番号５〜３６に示される配列もさらに含まれる。後述のように、かかる配列は、様々な細胞の型、微生物、及び対象のシュウ酸分解能を調節するために用いることができる。本発明に含まれる特定のタンパク質は、表１に示されている。
【００１９】
様々な実施形態において、本発明の核酸分子は、タンパク質をコードする。かかる核酸分子は、配列番号１若しくは３、又は配列番号５〜３６に示される配列のうち奇数番号で示されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ配列を包含するｍＲＮＡ転写物もコードできる。
【００２０】
本明細書に開示されているヌクレオチド配列とその断片と変異体に加えて、本発明の単離された核酸分子には、本明細書に開示されているヌクレオチド配列、又はその変異体及び断片から得た配列の全体若しくは一部とハイブリダイゼーションをすることで他の生物又は細胞から同定し、単離した相同のＤＮＡ配列が含まれる。
【００２１】
（断片と変異体）
本発明には、タンパク質又はその変異体及び断片を調節並びにコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子と、かかる配列にコードされているタンパク質とが含まれる。「タンパク質」という用語は、配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列と、配列番号５〜３６に示される配列のうち偶数番号に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。断片（生物学的に活性のある部分）及び／又はこれらのヌクレオチド配列の変異体とコードされているタンパク質もまた提供される。ヌクレオチド配列又はタンパク質の「断片（fragment）」とは、ヌクレオチド配列又はタンパク質全体よりも短い、ヌクレオチド配列又はタンパク質の一部分を意味する。
【００２２】
本明細書において開示されている核酸分子の断片は、本発明の核酸分子と様々な程度で相同性を有する試料中で、他の配列を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして、或いはＰＣＲ増幅プロトコール又は配列を変異させるためのプライマーとして用いることができる。本発明の核酸分子の断片は、マクロアレイ又はマイクロアレイとみなされるものを含む、物理的な基質に結合することもできる（例えば、米国特許第５，８３７，８３２号、米国特許第５，８６１，２４２号、米国特許第６，３０９，８２３号、国際公開第８９／１０９７７号パンフレット、国際公開第８９／１１５４８号パンフレット、国際公開第９３／１７１２６号パンフレットを参照のこと）。核酸のかかるアレイは、遺伝子発現を研究するため、又は標的配列に十分な同一性を有する核酸分子を同定するために用いることができる。
【００２３】
「核酸分子（nucleic acid molecule）」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチドアナログを用いて作製されるＤＮＡアナログ又はＲＮＡアナログを意味する。核酸分子は、一本鎖でも、二本鎖でもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。タンパク質のヌクレオチド断片は、生物学的に活性のあるタンパク質断片をコードすることができ、また、本明細書で記述されているハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして用いることもできる。生物学的に活性のあるヌクレオチド断片は、本発明のヌクレオチド配列のうちの一部分を単離し、コードされている部分のタンパク質を産生させるためにヌクレオチド配列を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、タンパク質がコードされている部分の活性を評価して調製することができる。核酸分子の断片には、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２５００、２７００、３０００、３２００、３５００、３７００、４０００、４２００、又は４５００長の連続するヌクレオチド（本明細書で列挙していない５から４５００の間の任意の数を含む）、或いは、最大で本明細書に開示されている、完全長ヌクレオチド配列に存在するヌクレオチドの総数が含まれる。
【００２４】
アミノ酸配列の断片には、抗体を産生させる免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片が含まれる。断片には、本発明のタンパク質又はその部分長タンパク質のアミノ酸配列に、十分に同一であるか、又はそれらに由来するアミノ酸配列を含むペプチドで、タンパク質の少なくとも１つの活性を示すが、本明細書に開示されている完全長のタンパク質より少ないアミノ酸を含むペプチドが含まれる。通常、生物学的に活性のある断片は、タンパク質の活性の少なくとも１つを有するドメイン又はモチーフを含む。タンパク質の生物学的に活性のある断片は、ポリペプチドで、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００長の連続するアミノ酸（本明細書で列挙していない５から５００の間の任意の数を含む）、或いは、最大で本発明の完全長タンパク質に存在するアミノ酸の総数までの長さのポリペプチドが含まれる。そのような生物学的に活性のある断片は、例えば、組換え技術によって調製することができ、１又は２以上の天然タンパク質の免疫原性活性及び／又は機能活性について評価することができる。本明細書で使用する場合、断片には、配列番号１〜３６に示される配列のうち偶数番号で示される少なくとも５つの連続するアミノ酸が含まれる。本発明には、別の断片も包含するが、タンパク質のかかる断片はいずれも６、７、８、若しくは９アミノ酸よりも大きい。
【００２５】
本発明の一実施形態では、配列番号５〜３６に示されるポリヌクレオチド又はポリペプチドの断片を提供する。配列番号５〜３６に示されるポリペプチド又はポリヌクレオチドの生物学的に活性のある断片には、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００長の連続するアミノ酸又はヌクレオチド、（本明細書で列挙していない５から５００の間の任意の数を含む）、或いは、最大で本発明の完全長タンパク質又はポリヌクレオチドに存在するアミノ酸若しくはヌクレオチドの総数が含まれる。かかる生物学的に活性な断片は、生物学的に活性であり続けることができる(即ち、シュウ酸分解活性又は本明細書に開示されている他の任意の活性を調整する)。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、配列番号１、２、３、若しくは４のポリヌクレオチド又はポリペプチドの断片を提供する。配列番号１、２、３、若しくは４のポリペプチドとポリヌクレオチドの生物学的に活性のある断片には、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００長の連続するアミノ酸又はヌクレオチド（本明細書で列挙していない５から５００の間の任意の数を含む）を含み、或いは、最大で、本発明の、完全長タンパク質、又はポリヌクレオチドに存在するアミノ酸又はヌクレオチドの総数が含まれる。かかる生物学的に活性な断片は、生物学的に活性であり続けることができる(即ち、シュウ酸分解活性又は本明細書に開示されている他の任意の活性を有する)。
【００２７】
ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の変異体も本発明に包含される。「変異体（variant）」という用語は、十分に同一な配列を意味する。したがって、本発明には、配列番号１〜３６に示される配列のうち偶数番号で示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と十分に同一である単離された核酸分子と、配列番号１〜３６に示される配列のうち奇数番号で示されているヌクレオチド配列、又はその相補体を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子とが含まれる。また、変異体には、本発明のヌクレオチド配列がコードするポリペプチドが含まれる。さらに、本発明のポリペプチドには、配列番号１〜３６に示される配列のうち偶数番号で示されるアミノ酸配列と十分に同一なアミノ酸配列が含まれる。「十分に同一(sufficiently identical)」とは、一つのアミノ酸配列若しくはヌクレオチド配列が、二番目のアミノ酸配列やヌクレオチド配列と比較して、十分な数又は最小限の数の、同等若しくは同一のアミノ酸残基やヌクレオチドを含み、それゆえ、共通の構造的ドメインを提供し、及び／又は共通の機能的活性を示唆することを意味する。保存（conservative）ヌクレオチド配列の変異体には、遺伝子コードの縮重により相違するこれらのヌクレオチド配列が含まれる。
【００２８】
一般的に、配列番号１〜３６に示される配列のうち偶数番号で示されるアミノ酸配列のいずれか、又は配列番号１〜３６に示される配列のうち奇数番号で示されるヌクレオチド配列のいずれかのそれぞれと少なくとも４５％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が、本明細書では、十分に同一であると定義される。本発明に包含される変異体タンパク質は生物学的に活性があり、天然タンパク質の所望の生物学的な活性、つまり本明細書中に記載の活性を保持し続ける。本発明のタンパク質の生物学的に活性のある変異体においては、１〜１５個のアミノ酸残基、１〜１０個、例えば６〜１０個、５個、４個、３個、２個、又は単に１個のみのアミノ酸残基が、そのタンパク質と異なっていてもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態では、配列番号１、２、３若しくは４のポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体を提供する。配列番号１、２、３若しくは４のポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体は、一般に、配列番号２若しくは４のアミノ酸配列のいずれか、又は配列番号１、３のヌクレオチド配列のいずれかのそれぞれと少なくとも約４５％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含んでもよい。生物学的に活性のある変異体は、生物学的に活性であり続けることができる(即ち、シュウ酸分解活性)。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、配列番号５〜３６に示されるポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体を提供する。配列番号５〜３６のポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体は、一般に、配列番号５〜３６に示される配列のうち偶数番号で示されるアミノ酸配列のいずれか、又は配列番号５〜３６に示される配列のうち奇数番号で示されるヌクレオチド配列のいずれかのそれぞれと少なくとも約４５％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、若しくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列の同一性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含む。生物学的に活性のある変異体は、生物学的に活性であり続けることができる(即ち、シュウ酸分解活性又は本明細書に開示されている他の任意の活性)。
【００３１】
個体群（population）（例えば、ラクトバチルス・アシドフィルスの個体群）内には、自然発生の変異体も存在しうる。かかる変異体は、本明細書で記述されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーションなどのよく知られた分子生物学的手法を用いて同定することができる。合成されたヌクレオチド配列、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲによる変異誘発によって作製され、その後も依然としてタンパク質をコードする配列もまた変異体として含まれる。本明細書に開示するヌクレオチド又はアミノ酸の配列に、１若しくは２以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、付加、又は欠失を導入して、それによりコードしているタンパク質に置換、付加、又は欠失を導入することができる。付加（挿入）又は欠失（切断truncation）は、天然タンパク質のＮ末端又はＣ末端で、又は天然タンパク質内の１又は２以上の部位で行われることもある。同様に、天然タンパク質内の１又は２以上の部位で、１若しくは２以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換を行うこともできる。
【００３２】
例えば、保存アミノ酸の置換を、１又は２以上の予測される、好ましくは非必須アミノ酸残基において行うことができる。「非必須（nonessential）」アミノ酸残基とは、生物学的な活性を変化させないで、タンパク質の野生型配列を変化させることのできる残基であるが、生物学的な活性には、「必須」アミノ酸は必要である。「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置換されることである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界に公知である。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。保存アミノ酸残基、又は保存モチーフ内にあるアミノ酸残基については、それらの残基がタンパク質活性に不可欠である場合には置換が行われることはない。
【００３３】
或いは、飽和変異誘発（saturation mutagenesis）などにより、コード配列長の全体又は一部について、任意に変異させることができる。ミュータント（mutant）は、組換えを行って発現させることができ、標準的なアッセイ法を用いて活性を分析して、生物学的に活性を保持しているミュータントをスクリーニングすることができる。変異誘発及びヌクレオチド配列変異のための方法は当業界で公知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492、Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)、及びこれらの文献に引用されている参考文献を参照のこと。変異体をコードするＤＮＡ内で行われる変異は、読み枠（reading frame）をずらすものであってはならず、また、二次的に、ｍＲＮＡ構造を産生する可能性のある相補的領域を生じるものではないことが好ましいのは明らかである。欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。目的タンパク質の生物学的な活性に影響を及ぼすことのない適切なアミノ酸置換についての指針は、参照により本明細書に援用されるDayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington,  D.C.)のモデルに見い出すことができる。
【００３４】
本発明に包含されるアミノ酸配列の欠失、挿入、及び置換により、タンパク質の特徴における根本的な変更がもたらされることが期待されているわけではない。しかしながら、置換、欠失、又は挿入による正確な効果を前もって予測することが困難である場合には、通常のスクリーニングアッセイによってその効果が評価されることを当業者なら期待するであろう。
【００３５】
本発明の変異体ヌクレオチド及び変異体アミノ酸の配列には、ＤＮＡシャッフルなどの、変異原性（mutagenic）及び組換え誘導（recombinogenic procedures）の手順により得られた配列も含まれる。そのような手順においては、所望の特性を保持する新規のタンパク質を作製するために、１又は２以上の異なるタンパク質のコード領域を用いることができる。この方法では、組換えポリヌクレオチドのライブラリーが、関連配列ポリヌクレオチドの集団から作製されるが、かかるポリヌクレオチドは、実質的な配列同一性があって、インビトロ又はインビボで相同組換えができる配列領域を含んでいる。例えば、このアプローチを用いることにより、本発明の遺伝子と、他の公知の遺伝子との間で、目的のドメインをコードする配列モチーフがシャッフルされ、酵素の場合であればＫｍの増大等、目的とする特性が改良されたタンパク質をコードする新規遺伝子を得ることができる。そのようなＤＮＡシャッフルのストラテジーは当業界で公知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751、Stemmer (1994) Nature 370:389-391、Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438、Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347、Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509、Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291、並びに、米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照のこと。
【００３６】
本発明のタンパク質の変異体は、アゴニスト（ミメティック）として、又はアンタゴニストとして機能することができる。タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態でのタンパク質の実質的に同一若しくは一部の生物学的な活性を保持することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流又は上流のメンバーと競合的に結合することにより、１又は２以上の、天然に存在する形態でのタンパク質の活性を阻害することができる。
【００３７】
アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして機能するタンパク質の変異体は、変異体、例えば切断した変異体のコンビナトリアルライブラリー、又はタンパク質のアゴニスト又はアンタゴニスト活性をスクリーニングして得ることができる。一実施形態では、変化に富んだ変異体のライブラリーが、核酸レベルにおいてコンビナトリアル変異によって作製され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによりコードされる。変化に富んだ変異体のライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結して、潜在的配列の縮重のセットが個別のポリペプチドとして、或いは、その中に配列のセットを含有するより大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ）のセットとして発現できるように作製することができる。潜在的変異体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製する方法はいろいろある。ＤＮＡ自動合成機で縮重遺伝子配列の化学合成を行い、合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを使用することによって、潜在的配列の所望のセットをコードする全ての配列を単一の混合物として提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に公知である（例えば、Narang (1983) Tetrahedron 39:3；Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura et al. (1984) Science 198:1056；Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照のこと）。
【００３８】
さらに、タンパク質の変異体のスクリーニング及びその後の選別のため、タンパク質をコードする配列の断片のライブラリーを、変化に富んだ断片群（population）を作製するために用いることもできる。一実施形態では、コード配列断片のライブラリーは以下のように行われる。即ちニック（nicking）が１分子あたりほぼ一個だけおこるような条件下で、コード配列の二本鎖のＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し、かかる二本鎖ＤＮＡを変性し、異なるニックの入ったセンス／アンチセンス対を含む二本鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡを再生し、再生された二本鎖からＳ１ヌクレアーゼ処理により一本鎖部分を除去し、この結果得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結をする。この方法により、様々なサイズのタンパク質のＮ末端断片及び内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【００３９】
点変異又は切断により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技術、及び選択された特性を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術のいくつかは、当業界で公知である。かかる技術は、タンパク質のコンビナトリアルな変異誘発によって作製される遺伝子ライブラリーを高速スクリーニングすることに適用することができる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に使用されている手法は、ハイスループット分析に従ったものであり、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換（transforming）し、検出された遺伝子産物をコードするベクターの単離を促進する所望の活性を検出する条件下でコンビナトリアルな遺伝子を発現させることを含む。再帰的アンサンブル変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis）（ＲＥＭ）は、ライブラリー中の機能的な変異体の頻度を増大させる技術であり、変異体を同定するために、スクリーニングアッセイと組み合わせて用いることができる（Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815；Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００４０】
（配列同一性）
配列は、保存された機能的特徴を有する分子の複数の（multiple）ファミリーのメンバーである。「ファミリー」とは、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が十分に同一である、２以上のタンパク質又は核酸分子を意味する。グループが多くのグループを含む場合は、サブファミリーに分類できる。族（clan）とは、共通の祖先を有すると考えられるファミリーのグループである。族のメンバーは、多くの場合三次構造が類似する。
【００４１】
「配列同一性（sequence identity）」とは、特定の比較ウインドウにおいて対応の一致度が最大となるように２つの配列をアラインした場合に同一であるヌクレオチド残基又はアミノ酸残基を意味する。「比較ウインドウ（comparison window）」とは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の最適なアラインメントための連続セグメントを意味し、第２の配列は、第１の配列と比較して付加又は欠失（即ちギャップ）を含むことができる。一般に、ヌクレオチド配列のアラインメントのためには、比較ウインドウは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの長さであり、３０、４０、５０、１００、又はさらに長くてもよい。アミノ酸配列のアラインメントのためには、比較ウインドウは、少なくとも６個の連続するアミノ酸の長さであり、１０、１５、２０、３０、又はさらに長くてもよい。当業者であれば、ギャップを含むことにより類似性が高くなることを避けるため、通常ギャップペナルティが導入されており、マッチする数から差し引かれていることを理解するものである。
【００４２】
ファミリーメンバーは、種が同一又は異なってもよく、相同物のみならず異なるタンパク質も含んでもよい。多くの場合、ファミリーメンバーは共通の機能的特徴を示す。相同物は、本明細書に開示されている核酸配列との同一性に基づき、ｃＤＮＡ又はその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、以下に開示するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション法により単離できる。
【００４３】
２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の一致度（percent identity）を決定するためにアライメントが行われる。２つの配列の一致度は、比較ウインドウ中の２つの配列によって共有されている同一残基数の関数である（即ち、一致度（％）＝同一残基の数／残基の総数Ｘ１００）。一実施形態では、配列は同じ長さである。２つの配列間における一致度（％）の決定には以下に記述されるものと同様の方法を用いることができる。これらの方法は、ギャップを考慮しても、しなくても用いることができる。検証により、手動でアラインメントを行うこともできる。
【００４４】
アミノ酸配列が保存的な置換において異なる場合、一致度（％）は置換による保存的な性質があるため上方修正して調整することができる。この調整を行う方法は当業界で公知である。通常、保存的な置換は、完全なミスマッチとしてよりも部分的なミスマッチとして記録されるので、配列一致度（％）が高くなる。
【００４５】
２つの配列の一致度（％）を決定するのに数学的アルゴリズムを用いることができる。数学的アルゴリズムの例としては、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において修正されている、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズム、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453の相同性アライメントアルゴリズム、及びPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448の相同性検索方法（search-for-similarity-method）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
これらの数学的アルゴリズムに基づく様々なコンピューターインプリメンテーションが、配列同一性を決定できるように設計されてきた。Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のＢＬＡＳＴプログラムは、上記のKarlin and Altschul (1990)のアルゴリズムに基づいている。本発明のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得るための検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、スコア＝１００、語長（wordlength）＝１２で行うことができる。本発明のタンパク質又はポリペプチドをコードする配列に相同なアミノ酸配列を得るためには、スコア＝５０、語長＝３で、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いることができる。Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されているＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを用いることにより、ギャップを考慮したアライメントを得ることができる。分子間の遠い関連性（distant relationships）を検出するにはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いることができる。上記のAltschul et al. (1997)を参照のこと。すべてのＢＬＡＳＴプログラムに、各プログラムのデフォルトパラメータを用いることができる。
【００４７】
配列の一致度（％）を決定するために用いられる別のプログラムには、上記のMyers and Miller (1988) の数学的アルゴリズムを用いたＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）がある。アミノ酸配列を比較する場合にこのプログラムとともに、ＰＡＭ１２０の重み残基表（weight residue table）と、１２のギャップ長ペナルティと、４のギャップペナルティとを、用いることができる。
【００４８】
ＡＬＩＧＮ及びＢＬＡＳＴプログラムに加えて、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡプログラムが、ウィスコンシン遺伝子ソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社製、Madison, Wisconsin, USA）の一部として存在し、配列アラインメントを行うために使用できる。好ましいプログラムは、ＧＡＰバージョン１０であり、上記Needleman and Wunsch(1970)のアルゴリズムを用いている。特に明記のない限り、本明細書に記載する配列の同一性／類似性の値は、以下のパラメータでＧＡＰバージョン１０を用いて得られた値である：即ち、ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％には、ギャップウエイト５０と、長さ（length）ウエイト３と、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリツクスとを用いており、アミノ酸配列の同一性％及び類似性％には、ギャップウエイト８、長さ（length）ウエイト２と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリツクスとを用いるものであり、或いは、これらと同等のプログラムを用いてもよい。「同等のプログラム（equivalent program）」とは、対象となるあらゆる２つの配列が、ＧＡＰバージョン１０で作製した相当アライメントと比較して、同一のヌクレオチド又はアミノ酸の残基が適合し（match）、また配列の一致度（％）が同一であるアラインメントを作製するあらゆる配列比較プログラムを意味する。
【００４９】
（相同配列の同定と単離）
本明細書に示されているヌクレオチド配列との配列同一性、又はそれらの断片及び変異体との配列同一性に基づき同定されたヌクレオチド配列も、本発明に包含される。ｃＤＮＡ又はゲノムのライブラリーから、配列、例えば本発明の配列に実質的に同一な配列を同定するためにＰＣＲ又はハイブリダイゼーションなどの方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  NY)、及びInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)を参照のこと。そのようなｃＤＮＡ及びゲノムのライブラリーの構築方法は、当業界で一般に知られており、さらに、上記の参考文献においても開示されている。
【００５０】
ハイブリダイゼーション法において、ハイブリダイゼーションプローブとしては、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、又は他のオリゴヌクレオチドでよく、本明細書に開示されている公知のヌクレオチド配列の全体又は一部から構成されてもよい。さらに、３２Ｐなどの検出可能な基、或いは、他の放射性同位体、蛍光化合物、酵素、若しくは酵素補助因子などの検出可能なマーカーで、プローブを標識することができる。ハイブリダイゼーションのためのプローブは、本明細書に開示されている公知のヌクレオチド配列に基づいた合成オリゴヌクレオチドを標識することによって作製できる。公知のヌクレオチド配列、又はコードされているアミノ酸配列中で保存されているヌクレオチド残基やアミノ酸残基に基づき設計された縮重プライマーもさらに使用することができる。ハイブリダイゼーションプローブには、ストリンジェントな条件下で、少なくとも約１０、好ましくは約２０、より好ましくは、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続する本発明の核酸のヌクレオチド、又はその断片若しくは変異体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことができる。様々な条件下で特定のハイブリダイゼーションを行うためには、そのようなプローブには、コードされているアミノ酸配列に関して特徴のある配列を含むことができる。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製は、当業界で一般に知られており、開示されているSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  New York)は、参照により本明細書に援用される。
【００５１】
一実施態様においては、タンパク質をコードする全ヌクレオチド配列は、新規の核酸配列及びメッセンジャーＲＮＡを同定するプローブとして用いることができる。別の実施態様では、プローブは、本明細書に開示されているヌクレオチド配列の断片である。いくつかの実施態様では、ストリンジェントな条件下でプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列は、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、又はそれ以上の長さのヌクレオチドであってもよい。
【００５２】
実質的に同一な配列は、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。「ストリンジェントな条件（stringent conditions）」とは、プローブが、他の配列にハイブリダイズするよりも、高いレベルで標的配列にハイブリダイズする（例えば、少なくともバックグランドの２倍）条件を意味する。一般に、ストリンジェントな条件とは、少なくとも約６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列が、互いにハイブリダイズしたままの状態にあるハイブリダイゼーションと洗浄の条件が包含される。ストリンジェントな条件は、当業界で公知であり、Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (1989))、 6.3.1-6.3.6.に記載されている。
【００５３】
ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況においては、異ったものになる。本発明に包含されるホモログとオルソログを得るためには、完全長の、又は一部分の核酸配列を用いることができる。「オルソログ（orthologs）」とは、共通の祖先遺伝子に由来し、種分化（speciation）の結果、異なる種で見い出される遺伝子を意味する。異なる種で見い出される遺伝子は、それらのヌクレオチド配列、及び／又はそれらにコードされているタンパク質配列が、本明細書中で定義する実質的な同一性を有する場合にオルソログであると考えられる。オルソログの機能は、多くの場合、種間で高度に保存されている。
【００５４】
プローブを用いる場合、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が約１．５ＭＮａイオン未満、通常はｐＨ７．０〜８．３において、Ｎａイオンの濃度（又は他の塩）が約０．０１〜１．０Ｍであり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、そして、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド超）については少なくとも約６０℃である条件をいう。
【００５５】
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、特異性を制御する手段である。最終洗浄溶液のイオン強度及び温度が、２つの重要なファクターである。完全長、若しくはほぼ完全長の標的配列にハイブリダイズする配列を検出するためには、ストリンジェントな条件下での温度は、所定のイオン強度及びｐＨにおける、特定の配列の融解温度（thermal melting point）（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかしながら、ストリンジェントな条件には、本明細書において別途条件をつける所望のストリンジェンシーの程度次第で、Ｔｍより１℃から２０℃低い温度範囲が包含される。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の方程式、即ちＴｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌを用いてＴｍを決定することができ、式中、Ｍは一価陽イオンのモル濃度（molarity）であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合(％)であり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの割合(％)であり、Ｌはハイブリッドした塩基対の長さである。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度及びｐＨにおいて）である。
【００５６】
ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを変更することにより、様々な程度の相同性を有する配列を検出することができる。１００％同一の配列（相同（homologous）プロービング）を標的にするためには、ミスマッチを許さぬストリンジェンシーな条件で行わなければならない。ヌクレオチド残基にミスマッチがおこることを認めることにより、類似性の程度がより低い配列を検出できる（異種(heterologous)プロービング）。ミスマッチが１％増えると、Ｔｍを約１℃低くし、したがって、標的とする一致度（％）で、配列がハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件を操作することができる。例えば、９０％以上の配列同一性を有する配列が好ましい場合は、Ｔｍを１０℃低下させればよい。２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、実質的に同一であるが、ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズできない。このような状況は、例えば、遺伝子コードのコドン縮重を最大限に用いて核酸のコピーを作製した場合に起こりうる。
【００５７】
低ストリンジェンシーの条件の例としては、３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーションや、１Ｘ〜２ＸＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における５０〜５５℃での洗浄が含まれる。中程度のストリンジェンシー条件との例としては、４０％〜４５％ホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５Ｘ〜１ＸＳＳＣにおける５５〜６０℃での洗浄が含まれる。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳにおける３７℃でのハイブリダイゼーションや、０．１×ＳＳＣにおける６０〜６５℃での洗浄が含まれる。洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％ＳＤＳを任意に含むことができる。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般的には約２４時間未満であり、通常は約４〜約１２時間である。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な手引書としては、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) を挙げることができる。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  New York)を参照のこと。
【００５８】
ＰＣＲによるアプローチのような増幅プロトコールにおいて、目的となるあらゆる生物から抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来の対応ＤＮＡ配列を増幅するためにＰＣＲ反応で用いるオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。ＰＣＲプライマーは、長さが少なくとも約１０〜１５ヌクレオチドであることが好ましく、また、長さが少なくとも約２０、２５、３０ヌクレオチドであることが最も好ましい。ＰＣＲプライマーの設計及びＰＣＲクローニングの方法は、当業界で一般に知られており、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  New York) に開示されている。Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)、Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)、及びInnis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)も参照のこと。公知のＰＣＲ法には、プライマーペア、ネストプライマー（nested primer）、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的なミスマッチを有するプライマー等を用いた方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
（アッセイ）
試料内で、本明細書で開示されているポリペプチド及び／又は核酸分子の発現、並びに開示されている活性を検出するためのアッセイを本発明で提供する。試料内において開示されている核酸、又は開示されているポリペプチドを含むタンパク質の有無を検出する方法は、例えば、食品／乳製品／飼料（feed product）、スターターカルチャー（母菌、種菌、バルク／セット、濃縮、乾燥、凍結乾燥、冷凍）、培養された食物製品／乳製品／飼料、栄養補助食品、バイオプロセスした発酵物質、又はプロバイオティック物質を摂取した対象から試料を得るステップと、この試料と、開示されているポリペプチド又は核酸（例えば、開示されている核酸、若しくはその断片を含むｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）と相互作用することができる化合物又は作用物質（agent）とを接触させ、試料内に開示されて核酸やタンパク質の配列の有無を検出するステップとを含む。食品、サプリメント、培養物、産物、又は対象から得た試料からの結果と、対照、食品、サプリメント培地、製品若しくは対象から得た結果とを比較できる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明で開示されているヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための作用物質（agent）の１つは、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの開示されているヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、開示された核酸分子でよく、配列番号１若しくは３に示されるヌクレオチド配列、又はそれらの断片若しくは変異体、或いは配列番号５〜３６に示される配列のうち奇数番号で示されるヌクレオチド配列、又はそれらの変異体若しくは断片で、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、又は５００ヌクレオチド長であり、本明細書で列挙していない５から５００の間の任意の数（例えば１６、３４、１７２）のヌクレオチドを含んでもよい核酸分子であり、開示されたヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分な核酸分子である。本発明のアッセイに用いるため適切な他のプローブについては、本明細書に記載されている。
【００６１】
別の実施形態においては、開示されているアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する作用物質の１つは、開示されているポリペプチドに結合できる抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する、若しくは検出されることが可能である抗体である。抗体は、ポリクローナルであってもよいが、より好ましくはモノクローナルである。インタクトな抗体、又はその断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブ又は抗体に関して、「標識された（labeled）」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリングさせる（即ち、物理的に連結させる）ことによって、プローブ又は抗体を直接標識することを含む意味であると同時に、直接標識されている別の（即ち二次的な）試薬との反応性により、プローブ又は抗体を間接標識することも含む意味である。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出と、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるように、ビオチンで末端標識したＤＮＡプローブを用いる検出とが含まれる。
【００６２】
「試料（sample）」という用語は、対象に存在するか、又は対象から単離された組織、細胞、及び体液のみならず、スターターカルチャーから得た細胞、かかるカルチャーを運搬する食品、或いはそのようなカルチャーを用いて得られる食品も含む意味である。即ち、本発明の検出方法は、インビトロ及びインビボの両方で試料中の、本発明の核酸又はタンパク質を検出するために用いることができる。開示されている配列を含むｍＲＮＡを検出するインビトロ法には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイチューでのハイブリダイゼーションが含まれる。開示されているアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するためのインビトロ法には、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降反応法（immunoprecipitations）、及び免疫蛍光測定法（immunofluorescence）が含まれる。開示されているヌクレオチド配列を含むＤＮＡを検出するためのインビトロでの方法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、開示されているアミノ酸配列を含むタンパク質を検出するためのインビボでの方法には、開示されているポリペプチドに対する標識抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識し、かかる抗体の対象中の存在及び位置は、標準的なイメージング技術によって検出することができる。
【００６３】
一実施形態では、試料は、プロバイオティック物質を摂取した被検対象からのタンパク質分子を含む。或いは、試料は、スターターカルチャー由来のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを含むことがある。
【００６４】
本発明には、開示されている核酸又はタンパク質が試料内に存在しているかどうかを検出するためのキットも含まれる。かかるキットは、本発明の特定のポリペプチドを発現する微生物（microbe）が、食品若しくはスターターカルチャー、又はプロバイオティック物質を摂取した対象の中に存在しているかどうかを判定するために用いることができる。例えば、キットは、試料中の開示されたポリペプチド若しくは核酸を検出できる標識された化合物又は作用物質と、試料中の開示されたポリペプチドと核酸を定量する手段とを含んでもよい（例えば、開示されたポリペプチドを認識する抗体、又は、例えば配列番号２若しくは４、又は配列番号５〜３６に示される開示されているポリペプチドをコードするＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）。キットには、かかる化合物の使用についての詳細な説明書が含まれていてもよい。
【００６５】
抗体に基づくキットは、例えば、（１）開示されているポリペプチドに結合する一次抗体（例えば、固相支持体に結合している）と、任意で（２）開示されているポリペプチド又は一次抗体に結合し、検出可能な作用物質に結合する、一次抗体とは異なる二次抗体とを含むこともできる。オリゴヌクレオチドに基づくキットは、例えば、（１）検出可能なように標識されているオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドで、開示されている核酸配列にハイブリダイズするもの、又は（２）開示されている核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマー、及び任意にではあるが、増幅された物質を検出するためのプローブとを含むことができる。
【００６６】
キットには、例えば、緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤を含むこともできる。キットはさらに検出可能な作用物質（例えば酵素又は基質）を検出するのに必要な構成要素（component）を含むことができる。キットは、アッセイに供して、含まれている試験試料を比較することができる対照試料又は一連の対照試料も含むことができる。キットの各構成要素は、通常、別個の容器に収められ、これらの容器は、使用説明書が付された１つのパッケージにまとめて入っている。
【００６７】
一実施形態でキットは、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，４１２，０８７号及び第５，５４５，５３１号、並びに国際公開第９５／００５３０号パンフレットに記載のものなど、アレイフォーマットでの複数のプローブを含む。アレイで使用するためのプローブは、国際公開ＷＯ９５／００５３０号パンフレットに開示されているように、アレイの表面で直接、又はアレイの表面に固定する前のいずれかに合成することができる(Gait, ed., Oligonucleotide synthesis a practical approach, IRL Press: Oxford, England, 1984)。プローブは、米国特許第５，４１２，０８７号に記載されているものなど、当業者に公知である技術を用いて表面に固定することができる。プローブは、核酸配列若しくはペプチド配列で好ましくは精製されたもの、又は抗体である。
【００６８】
アレイは、生物、試料、又は産物（products）について、それらのゲノム、ｃＤＮＡ、含まれるポリペプチド又は抗体、並びに特定の配列やタンパク質の存在の有無、及びそれらの物質の濃度の相違をスクリーニングするために用いることができる。キャプチャープローブに対する結合は、例えば、開示された核酸配列を含む核酸分子、開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は抗体に結合した標識から生成されるシグナルによって検出される。この方法は、開示された核酸、ポリペプチド又は抗体を含む分子と、複数のキャプチャープローブを有する第１のアレイと、別の複数のキャプチャープローブを有する第２のアレイとを接触させることが含まれる。それぞれのハイブリダイゼーションの結果を比較して、第１の試料と第２の試料との発現の相違を分析することができる。第１の複数のキャプチャープローブは、野生型乳酸菌等の対照試料、又は食品、栄養サプリメント、スターターカルチャー試料、又は体液等の対照となる対象から得られたものでよい。第２の複数のキャプチャープローブは、例えば変異型乳酸菌等の実験試料、或いはスターターカルチャー試料又は体液等プロバイオティック物質を摂取した対象から得られたものでもよい。
【００６９】
これらのアッセイは、微生物の選択と、好ましからざる物質を検出することが必要不可欠である品質管理施策において特に有用である。特定のヌクレオチド配列又はポリペプチドの検出は、食物、発酵産物若しくは工業用微生物、プロバイオティクスを摂取した動物若しくはヒトの消化器系に存在する微生物の遺伝子組成の決定にも有用である。
【００７０】
（アンチセンスヌクレオチド配列）
本発明には、アンチセンス核酸分子、即ち二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であったり、ｍＲＮＡ配列に相補的であるなど、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的な分子も包含される。したがって、アンチセンス核酸分子はセンス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は、例えばタンパク質コード領域（又はオープンリーディングフレーム）の全体又は一部というように、コード鎖の全体或いはその一部だけに相補的であってもよい。アンチセンス核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスであってもよい。非コード領域は、コード領域に隣接する５’及び３’の配列であり、アミノ酸に翻訳されない領域である。アンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子の発現を阻害するのに有用である。対応する配列に対して７０％又は７５％、好ましくは８０％、及びより好ましくは８５％又は９０％の配列同一性を有するアンチセンス構築物を用いることができる。
【００７１】
本明細書に開示する、ポリペプチドをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号２若しくは４、又は配列番号５〜３６のうち偶数番号で示される配列番号）に基づき、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック型塩基対の法則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的なものであってよいが、ｍＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部のみについてアンチセンスであるオリゴヌクレオチドがより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００ヌクレオチド長であり、或いは１００、２００ヌクレオチド長、又はさらに長い場合もありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当業界で公知の化学合成法、及び酵素的連結の手順を用いて構築することができる。
【００７２】
例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大、若しくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いることによって化学合成することができる。かかる改変されたヌクレオチドとしては、例えばホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。或いは、核酸がアンチセンスの方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて、生物学的にアンチセンス核酸を作製することもできる（即ち、挿入された核酸を転写したＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンスの方向になる）。
【００７３】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は、相補ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、かかる二本鎖では、通常のβ−ユニットとは異なり鎖が互いに平行関係にある (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641)。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330）を含むこともできる。
【００７４】
本発明には、リボザイムも包含されるが、リボザイムとは、ｍＲＮＡなどの、相補領域を有する一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。リボザイム（例えばハンマーヘッド型リボザイム（Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591に記述がある））は、ｍＲＮＡ転写物を触媒作用的に切断し、それによって、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために用いられることができる。コード核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されているヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば配列番号１〜２５５６に示される配列のうち奇数番号で示される配列）に基づいて設計することができる。例えば、Cech et al. に付与された米国特許第４，９８７，０７１号、及びCech et al. に付与された米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。或いはｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために用いることができる。例えば、Bartel and Szostak (1993) Science 261:1411-1418を参照のこと。
【００７５】
本発明には、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含される。例えば、遺伝子発現は、タンパク質の調節領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞における遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することにより、阻害される。一般的にはHelene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569、Helene (1992) Ann. N Y. Acad Sci. 660:27、及びMaher (1992) Bioassays 14(12):807を参照のこと。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、若しくは溶解性を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格を改変される。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を作製するために改変できる（Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5を参照のこと）。本明細書で使用される「ペプチド核酸（peptide nucleic acids）」、又は「ＰＮＡ」という用語は、核酸のデオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド（pseudopeptide）骨格によって置換され、４つの天然核酸塩基のみが保持されている、ＤＮＡミミックなどの核酸ミミックである。ＰＮＡの中性骨格により、低イオン強度の条件下でのＤＮＡ及びＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションが可能であることが示されてきた。ＰＮＡオリゴマーの合成は、例えば、上記のHyrup et al.(1996)、Perry-O'Keefe et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670に記載されている標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
【００７７】
ＰＮＡは、例えば転写若しくは翻訳の停止を誘導すること、又は複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的な調節をするときにアンチセンス若しくはアンチジーンの作用物質として用いることができる。本発明のＰＮＡは、例えば、ＰＮＡ・ＰＣＲクランプ法（PNA-directed PCR clamping)による、例えば、遺伝子の単一の塩基対変異の分析に用いることができ、Ｓ１ヌクレアーゼのような他の酵素を組み合わせて使用した場合の人工制限酵素として（上記Hyrup (1996)）、又はＤＮＡ配列及びハイブリダイゼーション用のプローブ若しくはプライマーとして（上記Hyrup (1996)；上記Perry-O'Keefe et al. (1996)）用いることができる。
【００７８】
別の実施形態では、親油基又は別のヘルパー基（helper group）をＰＮＡに結合させること、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成すること、若しくはリポソーム若しくは当業界で公知の他の薬物送達技術を使用することにより、その安定性、特異性、又は細胞取込みを高めるために、分子のＰＮＡを改変できる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上記Hyrup (1996)；Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63；Mag et al.(1989) Nucleic Acids Res. 17:5973；及びPeterson et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119に記載されているとおりに実施できる。
【００７９】
（融合タンパク質）
本発明には、キメラタンパク質又は融合タンパク質も含まれる。「キメラタンパク質（chimeric protein）」又は「融合タンパク質（fusion protein）」には、第二のポリペプチドに作用可能に連結した（例えば、インフレームに融合した）第一のポリペプチドが含まれる。「第一のポリペプチド（first polypeptide）」とは、第一のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことであり、一方、「第二のポリペプチド（second polypeptide）」とは、第一のタンパク質と実質的に同一でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有し、同じ生物又は異なる生物に由来するポリペプチドのことである。融合タンパク質の内部で、ポリペプチドは、タンパク質のすべて、又は一部分に対応してもよいが、タンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性のある部分が含まれることが好ましい。融合タンパク質における、「作用可能に連結した（operably linked）」という用語は、第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドとが、インフレームに互いに融合していることを意味する。第二のポリペプチドは、第一のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合できる。
【００８０】
連結したコード配列の発現により、融合タンパク質を形成する、２種類の異種結合アミノ酸配列が生じる。担体（carrier）配列（第二のポリペプチド）は、例えば、バクテリアの宿主における融合タンパク質の発現を可能にし、又は増大させる担体ポリペプチドをコードする。担体配列によってコードされている融合タンパク質における部分、即ち担体ポリペプチドは、タンパク質断片、機能的部分の全体、又はタンパク質配列の全体であってもよい。さらに担体領域若しくはポリペプチドは、その担体ポリペプチドに特異的な抗体による精製又はアフィニティー精製のいずれかによる、融合タンパク質の精製において用いるために設計できる。同様に、融合タンパク質の選択的な精製を可能にするために、担体ポリペプチドの物理学的特性を活用することもできる。
【００８１】
目的の担体ポリペプチドには特に、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｎ末端ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ等が含まれるが、これらに限定されるものではなく、タンパク質の発現を可能にするあらゆる担体ポリペプチドを融合タンパク質として本発明の方法で用いることができる。
【００８２】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列が、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合している、ＧＳＴ融合タンパク質である。別の実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質の全部又は一部が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合している、免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫原（immunogens）として、対象の体内で抗体を産出するため、リガンドを精製するためや、リガンドとのタンパク質の相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイにおいて用いられることができる。
【００８３】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質は、バクテリア細胞の機能的特性を改変する能力を有する。「機能的特性（functional properties）」とは、例えば、接着、免疫刺激、又は溶菌（lysis）に関連する、ある種の外来機能を発揮できるバクテリアの能力を意味する。タンパク質には、抗体、酵素、抗原、殺菌作用を有するタンパク質、又はレセプター結合活性を有するタンパク質が含まれるが、これらに制限されない。「殺菌作用（bactericidal activity）」とは、１又は２以上のバクテリアを殺菌する能力を意味する。「レセプター結合活性（receptor-binding activity）」とは、細胞膜上や細胞表面上に、又は溶液中でレセプターと結合する能力を意味する。ワクチンとして使用されるグラム陽性菌の表面に発現した融合タンパク質の能力を調べる方法は、当業界に公知である。（例えば、Fischetti et al. (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7:659-666; Pouwels et al.(1998) Int. J. Food Microbiol. 41:155-167を参照のこと。）
【００８４】
特定の担体ポリペプチドは、精製スキームを念頭におきつつ選択されることを当業者は理解するであろう。例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ、及びマルトース結合タンパク質は、結合、溶出が可能なすぐに利用できるアフィニティーカラムを有する担体ポリペプチドを代表するものである。それゆえ、担体ポリペプチドがヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６タグ）などのＮ末端Ｈｉｓタグである場合、融合タンパク質は、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）、ニッケルイミノ二酢酸（Ｎｉ−ＩＤＡ）、及びコバルト含有樹脂（Ｃｏ樹脂）などの金属キレート樹脂を含むマトリックスを用いて精製できる。例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Steinert et al. (1997) QIAGEN News 4:11-15を参照のこと。担体ポリペプチドがＧＳＴである場合、融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズ（Sigma社若しくはPharmacia Biotech社製）を含むマトリックスを用いて精製でき、担体ポリペプチドがマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である場合、融合タンパク質は、アミロースで誘導体化されたアガロース樹脂を含むマトリックスを用いて精製できる。
【００８５】
本発明のキメラタンパク質又は融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により作製されることが好ましい。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片をインフレームで一緒に連結でき、自動ＤＮＡ合成装置などで融合ヌクレオチド配列を合成できる。或いは、核酸断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて行うことができ、アンカープライマーは、２つの連続する核酸断片の間に相補的な突出（overhang）を引き起こすので、引き続きアニーリングし、さらに再増幅して、キメラ核酸配列を作製できる（例えば、Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY)を参照のこと）。さらに、ＦＯＳ関連タンパク質をコードする核酸は、既存の融合部分にインフレームで連結するように、市販の発現ベクターにクローニングできる。
【００８６】
融合タンパク質発現ベクターは、タンパク質が、その天然の生物学的な活性を保持できるよう、担体ポリペプチドを容易に除去できるように設計されるのが一般的である。融合タンパク質を切断する方法は当業界で公知である。例えば、Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.)を参照のこと。融合タンパク質は、臭化シアン、２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチル−３’−ブロモインドレニン、ヒドロキシルアミン等の試薬、又は低ｐＨ下で化学的に切断できる。化学的切断は、切断しないと不溶性の融合タンパク質となるタンパク質を切断するために、変性条件下で多く行われる。
【００８７】
ポリペプチドを担体ポリペプチドから分離することが望まれ、これらの融合ポリペプチドの間の接合部（junction）の切断部位が自然発生しない場合、担体ポリペプチドの酵素的切断及び除去を容易にするために、特異的なプロテアーゼ切断部位を含むように、融合コンストラクト（fusion construct）を設計できる。このように、所望の酵素に特異的な切断部位を有するペプチドのコード配列を含むリンカー配列を、担体ポリペプチド（例えば、ＭＢＰ、ＧＳＴ、ＳＯＤ、又はＮ末端Ｈｉｓタグ）のコード配列と、ポリペプチドのコード配列との間にインフレームに融合させることができる。切断部位に対して特異性を有する適当な酵素には、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ、レミン（remin）、コラゲナーゼ、及びタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されることはない。これらの酵素の切断部位は当業界で公知である。したがって、例えば、Ｘａ因子が、ポリペプチドから担体ポリペプチドを切断するために用いられた場合、例えばＩＥＧＲ配列などの、Ｘａ因子に感受性の切断部位をコードするリンカー配列を含むように融合コンストラクトを設計できる（例えば、参照により本明細書に援用される、Nagai and Thogersen (1984) Nature 309:810-812, Nagai and Thogersen (1987) Meth. Enzymol. 153:461-481；及びPryor and Leiting (1997) Protein Expr. Purif. 10(3):309-319を参照のこと）。担体ポリペプチドを、ポリペプチドから切断するためにトロンビンが用いられる場合には、、例えば、ＬＶＰＲＧＳ又はＶＩＡＧＲなどの配列などのトロンビンに感受性の切断部位をコードするリンカー配列を含むように融合コンストラクトを設計できる（例えば、Pryor and Leiting (1997) Protein Expr. Purif. 10(3):309-319、及び参照により本明細書に援用されるHong et al. (1997) Chin. Med. Sci. J. 12(3):143-147をそれぞれ参照のこと）。ＴＥＶプロテアーゼの切断部位は当業界で公知である。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３２，１４２号に記載されている切断部位を参照のこと。Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 16の論考（discussion）の項も参照のこと。
【００８８】
（抗体）
本発明の単離されたポリペプチドは、タンパク質に特異的に結合する抗体を作製するため、又はインビボでの抗体産生を刺激するための免疫原として使用することができる。タンパク質の完全長は、免疫原として用いることができ、或いは、本明細書に記載されているタンパク質の抗原性ペプチド断片を用いることもできる。タンパク質の抗原性ペプチドには、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０のアミノ酸残基、又は本明細書で列挙していない（例えば１２、２７、４３）５から５０の間の任意の数のアミノ酸残基、或いは、配列番号２若しくは４、又は配列番号５〜３６に示されるアミノ酸配列のうち偶数番号で示されるアミノ酸配列、又はそれらの変異体及び断片が含まれ、かかるペプチドに対して産生された抗体が、タンパク質との特異的免疫複合体を形成するようなタンパク質のエピトープが包含される。抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、例えば親水性領域などのタンパク質の表面に存在するタンパク質の領域である。
【００８９】
（組換え体の発現ベクター）
本発明の核酸分子は、ベクター、好ましくは発現ベクターに含まれることもある。「ベクター（vector）」は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。発現ベクターは、１又は２以上の制御配列を含み、作用可能に連結した核酸分子の発現を指示する。「作用可能に連結されている(operably linked)」とは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現が可能になるように（例えば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて、又はベクターが細胞に導入される場合には、細胞において）、制御配列に連結されていることを意味する。本明細書において、配列に関して「異種（heterologous）」とは、外来種由来の配列、又は同種由来であっても、人間の介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座の天然型が実質的に改変された配列をいう。例えば、異種のポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種由来のプロモーターであるか、或いは、同種／類似種由来である場合には、その一又は双方が、実質的に元の形態及び／又は遺伝子座から実質的に改変されたものであるか、或いは、プロモーターは、作用可能に連結したポリヌクレオチドのための天然プロモーターではない。「制御配列（regulatory sequence）」という用語には、制御可能な転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、転写ターミネーター、及び／又は翻訳制御配列などの他の発現制御エレメントが含まれるものとする（例えば、シャイン・ダルガーノコンセンサス配列、開始コドン、終止コドン）。これらの制御配列は、例えば用いられる宿主細胞により相違するものである。
【００９０】
ベクターは、細胞内で自律的に複製できる場合もあり、（エピソームベクター）、細胞のゲノムに組み込まれて細胞のゲノムと一緒に複製される場合もある（非エピソーム哺乳類ベクター）。組込み型ベクター（integrating vector）は、ベクターの染色体とバクテリアの染色体の相同ＤＮＡの間で組換えを可能にするバクテリアの染色体と相同な配列を少なくとも１つ含むことが一般的である。組込み型ベクターには、バクテリオファージ又はトランスポゾンの配列も含まれてもよい。エピソームベクター又はプラスミドは、環状二本鎖ＤＮＡループであり、その中にＤＮＡ断片を追加して連結できる。組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、宿主内での安定保持が可能であるプラスミドが、一般的に発現ベクターの好ましい形態である。
【００９１】
本発明に包含される発現コンストラクト又はベクターには、細胞内の核酸の発現に適した形態での本発明の核酸コンストラクトが包含される。原核細胞での発現も、本発明に包含される。発現ベクターのデザインは、形質転換される細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存するものであることは、当業者が認識するところである。本発明の発現ベクターは細胞に導入でき、それによって、本明細書に記載されている核酸によりコードされている、融合タンパク質若しくは融合ペプチドを含む、タンパク質又はペプチド（例えば、タンパク質、タンパク質の変異体、融合タンパク質等）を産生するものである。
【００９２】
制御配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現（constitutive expression）を指示する配列と、ある条件下でのみヌクレオチド配列の誘導性発現を指示する配列とが含まれる。バクテリアのプロモーターとは、バクテリアのＲＮＡポリメラーゼに結合でき、コード配列（例えば構造遺伝子）の下流（３’）方向へ、ｍＲＮＡへの転写を開始することができる、あらゆるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、通常コード配列の５’末端に近接する位置に、転写開始領域を有する。かかる転写開始領域には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と、転写開始部位とが通常含まれる。バクテリアのプロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有する場合もあり、オペレーターは、ＲＮＡ合成が開始される、近傍のＲＮＡポリメラーゼ結合部位とオーバーラップする場合もある。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合して、特定の遺伝子の転写を阻害する場合には、オペレーターは、（誘導性）転写を負に調節することになる。構成的発現は、オペレーターなどの負の調節エレメントが欠如している場合に起こりうる。さらに、遺伝子活性化タンパク質結合配列が存在する場合は、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近傍（５’）にあり、正の調節が行うことができる。
【００９３】
遺伝子活性化タンパク質の例として、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）を挙げることができるが、これは、大腸菌（Escherichia coli）のｌａｃオペロンの転写開始を促進する(Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173)。発現の調節はそれゆえ、正若しくは負のいずれの場合もあり、それにしたがって転写は促進又は抑制される。正及び負の調節エレメントの他の例は当業界で周知である。タンパク質発現系に含まれる様々なプロモーターには、Ｔ７／ＬａｃＯハイブリッドプロモーター、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、及びバクテリオファージラムダプロモーターが包含されるがこれらに限定されない。天然のプロモーター又は異種プロモーターを含む適当なプロモーターはいずれも、本発明の実施に用いることができる。異種プロモーターは、構成的活性型である場合も、誘導性である場合もある。異種プロモーターは、Kullen及びKlaenhammerに付与された米国特許第６、２４２、１９４号に示されているが、これらに限定されない。
【００９４】
代謝経路に関わる酵素をコードする配列では、特に有用なプロモーター配列を提供する。例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）(Chang et al. (1987) Nature 198:1056)、及びマルトースなどの、糖代謝酵素由来のプロモーター配列を挙げることができる。さらに、例えばトリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素由来のプロモーター配列（Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731、米国特許第４，７３８，９２１号、欧州特許公開第３６，７７６号及び第１２１，７７５号）を挙げることができる。ベータラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーターシステム（Weissmann (1981) “The Cloning of Interferon and Other Mistakes,” in Interferon 3 (ed. I. Gresser)）、バクテリオファージラムダＰＬ（Shimatake et al. (1981) Nature 292:128）、アラビノース誘導性ａｒａＢプロモーター（米国特許第５，０２８，５３０号）、及びＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーターシステムも有用なプロモーター配列を提供する。大腸菌（E.coli）の発現システムについて論じているBalbas (2001) Mol. Biotech. 19:251-267も参照のこと。
【００９５】
さらに、天然には存在しない合成プロモーターも、バクテリアのプロモーターとして機能する。例えば、あるバクテリア若しくはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列を、別のバクテリア若しくはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列に連結して、合成のハイブリッドプロモーターを作製できる（米国特許第４,５５１,４３３号）。例えば、ｔａｃ（Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21）とｔｒｃ（Brosius et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:3539-3541）のプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列との両方により構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである。ｔａｃプロモーターは、さらに誘導性制御配列であるという特徴も有する。したがって、例えばｔａｃプロモーターに作用可能に連結しているコード配列の発現は、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して細胞培養を行うことにより誘導できる。さらに、バクテリアのプロモーターには、バクテリアのＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる、バクテリア由来ではない天然に存在するプロモーターをも含めることができる。バクテリア由来ではない天然に存在するプロモーターを適合性があるＲＮＡポリメラーゼと連結して、原核生物において、何らかの遺伝子が高レベルで発現するようにすることもできる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーターシステムは、連結プロモーターシステムの例である（Stadier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074）。加えて、ハイブリッドプロモーターは、バクテリオファージプロモーターと大腸菌オペレーター領域とから構成されることもある（欧州特許第２６７,８５１号）。
【００９６】
ベクターは、当該プロモーターのリプレッサー（若しくは誘導物質）をコードする遺伝子をさらに含むこともある。例えば、本発明の誘導性ベクターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする核酸を発現させることにより、Ｌａｃオペレーター（ＬａｃＯ）からの転写を調節することができる。別の例としては、ｐＲｅｃＡの発現を調節するｌｅｘＡ遺伝子の使用、及びｐｔｒｐを調節するｔｒｐＯの使用を挙げることができる。抑制の程度を高める遺伝子（例えば、ｌａｃＩｑ）、又は誘導様式を改変する遺伝子（例えば、λｐＬを熱誘導性にするλＣＩ８５７、又はλｐＬを化学誘導性（chemo-inducible）にするλＣＩ＋）などのアレルを利用できる。
【００９７】
プロモーター配列を機能させることに加えて、効率的なリボソーム結合部位もまた、融合コンストラクトの発現に有用である。原核生物では、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれており、開始コドン（ＡＴＧ）と、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列とを含む(Shine et al. (1975) Nature 254:34)。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とバクテリア１６ＳｒＲＮＡの３’末端との間に塩基対を形成することで、リボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Steitz et al. (1979) “Genetic Signals and Nucleotide Sequences in Messenger RNA,” in Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger, Plenum Press, NY）。
【００９８】
タンパク質は、バクテリア内でポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチド配列を含むタンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌されることもある（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列断片は、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードしているのが一般的である。タンパク質は、増殖培地（グラム陽性菌）か、細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔（グラム陰性菌）のいずれかに分泌される。シグナルペプチド配列と、タンパク質との間にコードされている、インビボ又はインビトロのいずれかで切断することができるプロセシング部位であることが好ましい。
【００９９】
適当なシグナル配列をコードするＤＮＡは、大腸菌の外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Masui et al. (1983) FEBS Lett. 151(1):159-164; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437-2442）、及び大腸菌アルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212）などのバクテリア分泌タンパク質の遺伝子から得ることができる。他の原核細胞シグナルには、例えば、ペニシリナーゼ、ＩＰＰ、又は熱安定性エンテロトキシンIIのリーダー配列からのシグナル配列が含まれる。
【０１００】
バクテリアが認識する転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、したがって、プロモーターと一緒にコード配列に隣接するのが一般的である。これらの配列は、ＤＮＡがコードするポリペプチドに翻訳することができるｍＲＮＡの転写を指示する。転写終結配列には、多くの場合、転写停止を補佐するステムループ構造を形成することができるＤＮＡ配列（約５０ヌクレオチド）が含まれる。例としては、大腸菌のｔｒｐ遺伝子及び別の生合成遺伝子などの強いプロモーターを有する遺伝子に由来する転写終結配列を挙げることができる。
【０１０１】
発現ベクターは、調節領域で転写調節されるように、配列を挿入するための制限部位を複数有する。細胞内のベクターの保持を確実にするための選択的マーカー遺伝子も、発現ベクターに含めることができる。選択的マーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、及びテトラサイクリンなどに対する薬剤耐性能を与えるものを挙げることができる(Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469)。選択的マーカーはまた、最小培地上で又は毒性代謝物の存在下で、細胞を増殖することもでき、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシン生合成経路における遺伝子などの生合成遺伝子を含んでもよい。
【０１０２】
本明細書において、配列に関して「異種（heterologous）」とは、外来種由来の配列、又は同種由来であっても、人間の故意による介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座の天然型から実質的に改変された配列をいう。例えば、異種のポリヌクレオチドに作用可能に連結されたプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種由来のプロモーターであるか、或いは、同種／類似種由来である場合には、その一又は双方が、実質的に元の形態及び／又は遺伝子座からプロモーターを実質的に改変されたものであるか、或いは、プロモーターは、作用可能に連結したポリヌクレオチドのための天然プロモーターではない。
【０１０３】
調節領域は、本発明の細胞及び／又はヌクレオチド配列にとって、未変性（同種（homologous））のものでも、外来（異種(hetelogous)）のものでもよい。調節領域は、天然若しくは合成のいずれでもよい。その領域が、本発明のヌクレオチド配列に対して「外来」、若しくは「異種」である場合、作用可能に連結している本発明のヌクレオチド配列にとって、未変性又は天然に生じる領域ではないことを意味する。例えばそのような領域は、ファージに由来する場合もある。異種調節領域を用いて配列を発現させることもできるが、天然の領域を用いることもできる。かかるコンストラクトが、細胞内のタンパク質の発現レベルを変化させる場合もあるであろう。ゆえに、細胞の表現型が変化しうる。
【０１０４】
発現カセットを調製する際には、ＤＮＡ配列を正しい方向、また必要に応じては正しい読み枠（reading frame）内に提供することができるように、様々なＤＮＡ断片を操作してもよい。そのためにＤＮＡ断片を結合させるためにアダプター又はリンカーを利用することができ、都合の良い制限部位を提供すること、過剰なＤＮＡを除去すること、制限部位を除くこと等の別の操作を行うこともできる。これを目的として、インビトロでの変異誘発、プライマー修復、制限(restriction)、アニーリングや、例えば転位(transitions)や塩基転換(transversions)などの再置換(resubstitutions)を行ってもよい。
【０１０５】
本発明では、さらにその発現ベクターにアンチセンスの方向にクローニングされている本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、このＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）が可能になるように、制御配列に作用可能に連結している。アンチセンスの方向にクローニングされた核酸に作用可能に連結している制御配列は、アンチセンスＲＮＡ分子の継続的又は誘導性の発現を指示するように選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド若しくはファージミドの形態をとりうるものであり、この形態においては、高効率の調節領域の制御下に作製され、アンチセンス核酸の活性はベクターが導入された細胞のタイプによって決定されうる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節についての論述は、Weintraub et al. (1986) Reviews Trends in Genetics, Vol. 1(1)を参照のこと。
【０１０６】
或いは、上述の構成要素のいくつかを、形質転換(transformation)ベクターにまとめて入れることもできる。形質転換ベクターは、通常、選択可能なマーカーで構成され、上述のように、レプリコンによって保持されるか、組込み型ベクターが開発される。
【０１０７】
（微生物細胞又はバクテリア細胞）
本発明の核酸配列やタンパク質を含むバクテリアの作製、かかるバクテリアのスターターカルチャーの調製、及び特にミルク等の食品基質等の基質を発酵する方法は、公知技術により行うことができる（例えば、Gilliland,S.E.(ed) Bacterial Starter Cultures for Food, CRC press, 1985, 205pp.; Read, G. (Ed) Prescott and Dunn's Industrial Microbiology, 4th Ed., AVI Publishing Company, Inc. 1982, 883pp.; Peppler, J. J. and Perlman, D. (Eds.) Microbial Technology, VolumeII, Fermentation Technology, Academic Press, 1979, 536pp.）。
【０１０８】
「発酵すること（fermenting）」とは、通常嫌気的条件下で、ガスの発生を伴いながら進行する微生物による有機化合物の代謝分解やエネルギー生成を意味する。
【０１０９】
核酸分子に関連した「導入する（introducing）」とは、従来の形質転換若しくは遺伝子導入技術による、又はファージを介した感染による、細胞（例えば原核細胞）への導入を意味する。本明細書では、「形質転換（transformation）」、「トランスダクション（transduction）」、「接合（conjugation）」及び「プロトプラスト融合（protoplast fusion）」という用語は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を細胞に導入するための当業界で認識されている様々な手法を意味し、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウムによる共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる。細胞を形質転換（transforming）し、形質移入（transfecting）する適切な方法は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  NY)、及び他の実験マニュアルに記載がある。本発明のポリペプチド又は微生物に関連する「導入する(introducing)」とは、摂取（ingestion）、局所使用(topical application)、鼻腔、尿生殖器(urogenital)、座薬(suppository)、又は口腔適用によるポリペプチド又は微生物のホストへの導入を意味する。
【０１１０】
本発明のポリペプチドの作製に用いるバクテリア細胞は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview,  NY)に記載されているような適切な培地で培養される。
【０１１１】
（シュウ酸分解の調節）
シュウ酸分解のための方法と組成物が提供される。シュウ酸は、一連の酵素反応を通じて異化される。シュウ酸分解の２つの一般的なメカニズムには、ギ酸と二酸化炭素を生じる脱炭酸と、過酸化水素と二酸化炭素を生じる酸化とが含まれる。脱炭酸プロセスは、好気的又は嫌気的いずれにおいても行われてもよいが、酸化プロセスは、厳密に嫌気的に行われる。脱炭酸反応では、シュウ酸は、ホルミルコエンザイムＡトランスフェラーゼ（ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．８．３）により還元され、ホルミルＣｏＡのＣｏＡ部分を環化することにより、シュウ酸分子を活性化する。次に、オキサリルコエンザイムＡデカルボキシラーゼ（オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ、Ｅ．Ｃ．４．１．１．８）が、活性シュウ酸分子を脱炭酸する。本明細書で示されるように、シュウ酸のこの分解経路は、現在のところ、ラクトバチルス・アシドフィルスにおいて同定されている。図２において、シュウ酸の分解経路のスキームが示されている。したがって、本発明では、シュウ酸分解の調節に関連する方法及び組成物を提供する。
【０１１２】
配列番号１と２に示されるシュウ酸分解ポリヌクレオチドとシュウ酸分解ポリペプチドを含む組成物が提供される。配列番号１と２は、ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼファミリーのメンバーをコードする。本明細書で使用される「ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ活性」は、ホルミルＣｏＡからＣｏＡをシュウ酸若しくコハク酸（succinate）のいずれかへの転移を触媒するものである。この活性のアッセイ法については公知である。例えば、参照により本明細書に援用されるBaetz et al.(1990) Journal of Bacteriology 172:3537-3540 を参照のこと。これらの配列は、その変異体及びその断片と共に、目的の微生物のシュウ酸分解活性を改変するために使用できるものである。
【０１１３】
さらにシュウ酸分解するポリヌクレオチド及び配列番号３及び４に示されるポリペプチドを含む組成物が提供される。配列番号３及び４は、オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼをコードする。本明細書で使用されているように、「オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ活性」を有するポリペプチドは、活性化されたシュウ酸分子を脱炭酸する。この活性のアッセイ法については公知である。例えば、オキサリルＣｏＡの分解（consumption）と、ホルミルＣｏＡの生成は、キャピラリー電気泳動法により測定できる。例えば、それぞれが参照により本明細書に援用される、Federici et al. (2004) Applied and Environmental Microbiology 70:5066-5073 and Lung et al. (1994)Journal of Bacteriology 176:2468-2472を参照のこと。これらの配列は、その変異形及びその断片と共に、目的の微生物のシュウ酸分解活性を改変するために使用できるものである。
【０１１４】
本発明の組成物には、ｐＨ６．８にて１％シュウ酸アンモニウムの存在下で、ラクトバチルス・アシドフィルスでの多様な発現を行う様々なポリヌクレオチドとポリペプチドがさらに含まれる。かかるポリペプチドとポリヌクレオチドは、配列番号５〜３６に示される。一実施形態では、かかる配列は、シュウ酸分解の改変、又は本明細書で開示されている別の方法で使用することができる。
【０１１５】
本明細書における「シュウ酸分解（oxalate degrading）」及び「シュウ酸還元（oxalate reducing）」活性という用語は、相互的に使用され、双方ともシュウ酸の還元又は分解を意味する。シュウ酸分解活性には、ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ活性、オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ活性、又は試料中で、シュウ酸のレベルを減少する酵素的経路で用いられるいずれかの活性が含まれる。本明細書で定義される「シュウ酸の分解を改変する(modulating oxalate degradation)」とは、適切な対照と比較した場合に、試料中のシュウ酸レベルのなんらかの統計学的に有意な増減を意味するものである。それゆえ、シュウ酸を分解する配列又は微生物の効果的な濃度とは、シュウ酸分解を調節するのに十分な濃度である。シュウ酸分解を測定するためのアッセイには、ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ活性について上述したアッセイ法が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、シュウ酸分解のアッセイ法にはシュウ酸の濃度を直接に測定することが含まれる。参照により本明細書に援用される、Duncan et al.(2002) Applied and Environmental Microbiology 68:3841-3847を参照のこと。
【０１１６】
一実施形態では、適当な宿主細胞は、本発明のシュウ酸分解配列をコードするポリヌクレオチド、またはその生物学的に活性のある変異体若しくは断片のうち、少なくとも一つを用いて形質転換されたものであり、それゆえ適切な対照宿主よりも調節されたシュウ酸分解活性（即ちシュウ酸分解活性の増減）が形質転換された宿主細胞に付与される。宿主には、例えば、経口摂取及び／又は腸でのコロニー形成に特によく適している微生物が含まれる。或いは、形質転換されると所望のシュウ酸分解ポリペプチドを産生し、植物物質が摂取されたときには、腸内でのかかる活性の利用を可能とする植物又は植物細胞であってもよい。或いは、形質転換された植物は、形質転換時のポリペプチドの作用により、シュウ酸の含有量が少なくなる場合もあり、それゆえ摂取時に、植物が形質転換されていない植物と同様の量のシュウ酸を食物にもたらすことはない。シュウ酸分解ポリヌクレオチドを、合成又はエクスビボのシステムにおいて、シュウ酸分解活性を有するタンパク質を提供するために用いてもよい。
【０１１７】
組成物には、シュウ酸分解できる微生物がさらに含まれる。一実施形態では、かかる微生物は、配列番号１で示される核酸又はその生物学的に活性のある変異体若しくは断片を含む一番目の核酸と、配列番号３で示される核酸又はその生物学的に活性のある変異体若しくは断片を含む二番目の核酸分子とを有するバクテリアであって、一番目と二番目の核酸分子の少なくとも一つが、バクテリアに対して異種であり、一番目と二番目の核酸分子がバクテリア内の活性プロモーターに作用可能に連結しているバクテリアを含む。特定の実施形態では、両方の核酸が、その微生物にとって異種である。
【０１１８】
本発明の方法や組成物に用いられる微生物には、プロバイオティックバクテリアや、ラクトバチルス、ラクトバチルス・アシドフィルスといった乳酸菌を含んでいてもよい。目標の微生物としては他に、オキサロバクター・ホルミゲンス、シュードモナス、クロストリジウム、ビフィドバクテリアを挙げることができるが、これらに限定されることはない。用いられている未変性の微生物は、シュウ酸を分解することができるということだけでなく、バクテリア若しくは真菌などで、シュウ酸を分解することができない微生物もまた含み、かかる微生物は本発明の異種のシュウ酸分解ポリヌクレオチドを用いて形質転換されたときにはシュウ酸分解能が付与されるということが認識されている。シュウ酸分解ポリペプチドの発現方法及び単離方法、又は微生物にこれらの配列を導入する様々な方法については当業者に公知であり、本明細書中にも詳細が記されている。
【０１１９】
本発明の組成物には、調節されたシュウ酸分解活性を有する対象（即ちヒト、及び家畜化された、農耕用の、又は外来種などヒト以外の動物を含む動物）が含まれる。特定の実施形態では、かかる対象は、シュウ酸を減少させる能力が増強されている。増強されたシュウ酸分解能を有するこれらの動物は、シュウ酸関連病を研究するためのインビボモデルとして用いることができる。
【０１２０】
細胞又は微生物のシュウ酸分解能を調節する方法も提供される。一つの方法では、本発明のシュウ酸分解配列は、細胞のシュウ酸分解能を増強又は抑制するために細胞に導入される。別の方法では、本発明のシュウ酸分解配列及び／又は本発明のシュウ酸分解配列を発現するシュウ酸分解微生物を含む組成物は、植物又は動物のシュウ酸レベルを変更するために植物や動物に投与される。方法には、食品中のシュウ酸レベル若しくは食品消化中のシュウ酸レベルを変更するように、本発明の組成物を食品中に若しくは食品と同時に動物に投与する食事補給方法が含まれる。
【０１２１】
さらに、シュウ酸関連病を治療又は予防するために、シュウ酸レベルを減少させる方法が提供される。「シュウ酸関連病（oxalate−related condition）」とは、対象内のシュウ酸レベルの増加をもたらすいずれかの状況を意味するものである。予防的処置による利益を得ることができる対象としては、抗生物質の投与や術後状況などによってシュウ酸分解バクテリアが激減したヒトや動物を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の方法は、シュウ酸分解バクテリアのコロニーを保持しながらも、例えばシュウ酸感受性及び／又は内因性シュウ酸の過剰産生などにより、シュウ酸が不健康なレベルにまで達しているヒトや動物を治療するためにも用いることができる。シュウ酸関連病としては、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、特発性(idiopathic)カルシウム−シュウ酸塩結石症（尿路結石症）、腸内高シュウ酸尿症、外陰部痛（vulvodynla）、シュウ酸関連末期腎疾患、心臓性コンダクタンス疾患（cardiac conductance disorders）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２２】
「治療（treatment）」とは、シュウ酸関連病に罹患している対象での何らかの改善をいう。改善とは、対象における統計学的に有意なシュウ酸レベルの減少として特徴づけることができる。したがって、「肯定的な治療反応（positive therapeutic response）」には、全体反応(即ち、通常のシュウ酸レベルへの減少)、及び部分反応(即ちシュウ酸レベルの何らかの統計学的に有意な減少)の双方が含まれる。腸、腎臓、排出物、或いは様々な細胞液、又は血液、若しくは尿などの体液のシュウ酸レベルを測定するために、各種のアッセイを用いることができる。Duncan et al.(2002) Applied and Environmental Microbiology 68:3841-3847を参照のこと。
【０１２３】
シュウ酸関連病を治療する方法には、本発明の１又は２以上のシュウ酸分解微生物及び／又はシュウ酸分解ポリペプチドを含む組成物を投与することが含まれる。本発明の方法により投与されるシュウ酸分解ポリペプチドは、単離でき、又は細胞溶解物として投与できる。細胞溶解物は、本発明のシュウ酸分解配列、又はその生物学的に活性のある変異体若しくは断片を発現するいずれかの宿主細胞から作製することができる。一実施形態では、細胞溶解物は、ラクトバチルス・アシドフィルス由来である。ある特定の実施形態では、投与されるシュウ酸分解配列には、１又は２以上の、配列番号１、２、３若しくは４に示される配列、或いは生物学的に活性のあるそれらの変異体又は断片などの本発明のシュウ酸分解配列が含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、投与された配列には、１又は２以上の配列番号５〜３６で示される配列、或いは生物学的に活性のあるそれらの変異体又は断片が含まれる。シュウ酸分解活性を改善する追加的なファクターもまた投与することができる。
【０１２４】
さらに、薬剤として使用される本発明の１又は２以上のシュウ酸分解微生物及び／又はシュウ酸分解ポリペプチド及び／又は細胞溶解物が提供される。シュウ酸関連病の治療に用いられる薬剤の製造における本発明の１又は２以上のシュウ酸分解微生物及び／又はシュウ酸分解ポリペプチドを含む組成物の使用が提供される。
【０１２５】
本発明はさらに以下から選択される１又は２以上のシュウ酸関連病の治療で用いられる薬剤の製造における本発明の１又は２以上のシュウ酸分解微生物及び／又はシュウ酸分解ポリペプチド及び／又は細胞溶解物を含む組成物の使用を提供する。シュウ酸関連病としては、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、特発性カルシウム−シュウ酸塩結石症（尿路結石症）、腸内高シュウ酸尿症、外陰部痛、シュウ酸関連末期腎疾患、心臓性コンダクタンス疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
少なくとも一つの本発明のシュウ酸分解ポリヌクレオチドを発現する、シュウ酸分解微生物が用いられる場合、微生物及びその子孫は、対象の腸内で複製して、腸管からシュウ酸を除去し、それゆえ吸収に利用できるシュウ酸の量が減少するので、血液から腸へのシュウ酸排出が増加する。
【０１２７】
かかる組成物は、シュウ酸関連病の重症度、或いはヒト又は動物の消化管若しくは体液のシュウ酸量によって、一日又は複数の日数にわたり、一日に1回又は複数回投与される。治療は、ヒト又は動物に存在するシュウ酸が好ましくないレベルである限り続けられる。別の実施形態ではさらに、組成物は、腸管内でシュウ酸量を減少させてシュウ酸関連病の発症リスクを減少させるために投与される。腸管内での減少は、全身の（systemic）シュウ酸レベルの減少をもたらし、それゆえ健康を増進する。
【０１２８】
シュウ酸関連病を治療又は予防するために、治療効果のある量のシュウ酸分解ポリペプチド、シュウ酸を減少させるポリペプチドを含むシュウ酸分解微生物、シュウ酸分解ポリペプチド由来の溶解物を含む細胞が投与される。「治療効果のある量（therapeutically effective amount）」とは、治療効果を引き出すのに十分な、本発明のシュウ酸分解微生物及び／又はポリペプチドの濃度を意味する。それゆえ、投与されるユニットの本発明のシュウ酸分解微生物及び／又はポリペプチドの濃度は、シュウ酸関連病の治療又は予防に効果的である。治療効果のある量は、例えば、シュウ酸関連病の重症度、患者の応答性、患者の体重などの個体差、投与方法、及びシュウ酸分解微生物及び／又はポリペプチドの用いられている処方などの多様な要因によって決まるものである。シュウ酸分解組成物は、それゆえ、個人の必要に応じて決定された間隔を持って投与される。一回の投与、又は断続的若しくは定期的な投与が必要な場合がある。一日に２回以上、一日に３回以上、一日に４回以上、及び一日に１回から１５回の範囲で組成物を投与する方法が含まれる。このような投与は数日、数週間、数ヶ月、若しくは数年というように継続的に行われることもあり、又はシュウ酸関連病を治療又は予防するための特定の時期に行われることもある。
【０１２９】
本発明の組成物は、薬事的に容認できる処方が含まれる。例えば、本発明の方法と組成物には、所望の位置に組成物（即ち、シュウ酸分解酵素又はシュウ酸分解微生物）を提供する投与薬剤送達システム、例えば、対象の腸／粘膜領域への組成物の送達などが含まれる。医薬品組成物には、単独若しくは組み合わされるシュウ酸分解バクテリア、或いは１又は２以上のシュウ酸分解ポリペプチドと、液体又はペーストの形態に凍結乾燥又は冷凍され、ゲルカプセル、マイクロカプセル、又は他の腸溶性製剤に封入されたバクテリア若しくはポリペプチドが含まれる。腸溶性保護コーティングは、胃酸から組成物を保護するために用いることができる。かかる腸溶性コーティングには、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）の使用が含まれる。カプセル化技術については、参照により本明細書に援用される米国特許番号５，２８６，４９５号に、さらに説明されている。放出された組成物は、腸内に存在するシュウ酸を無害な物質に変換する。担体は、バクテリア又はポリペプチドと組み合わせることもできる。例えば、リン酸バッファー（saline-phosphae buffer）が含まれる。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明のシュウ酸分解組成物は様々な食品として補充することができる。かかる食品は、続けて対象に投与できる。かかる食品の製造には、本発明のシュウ酸分解組成物と食品原料を混合するなど、様々な方法を用いることができる。例えば、ヨーグルト培養、最終ヨーグルト製品、ミルク、チーズ、若しくは肉製品を、本発明のシュウ酸分解微生物と混合することができる。さらに、本発明のシュウ酸還元酵素を発現する植物を、公知の形質転換技術を用いて作製することができる。摂取に際しては、食品が消化され、腸で吸収されるとき、１又は２以上の微生物、１又は２以上のポリペプチド、又はそれらの組合せを含むシュウ酸分解組成物は、腸内に存在するシュウ酸を分解し、血流へのシュウ酸の吸収を減少させる。
【０１３１】
本発明のシュウ酸分解配列は、シュウ酸分解が改変されていることが知られている別の配列を組み合わせて用いることができることがわかっている。様々なシュウ酸分解酵素及びかかる酵素をコードしている遺伝子が公知であり、例えば、米国特許番号５，９１２，１２５号、６，０９０，６２８号、及び６，２１４，９８０号に記載されているものが含まれる。これらの特許は、全体として参照により本明細書に援用される。シュウ酸分解酵素という用語には、シュウ酸オキシダーゼ、シュウ酸デカルボキシラーゼ、オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ、及びホルミルＣｏＡトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されず、シュウ酸塩又はシュウ酸（oxalate or oxalic acid）と相互作用することができる酵素が含まれる。これらの酵素は、天然由来であるか又は当業界に公知の組換え技術により合成されたものであり、シュウ酸塩又はシュウ酸と相互作用することができる結合部位、活性部位、又は断片などのすべての断片が含まれる。この用語はまた、シュウ酸塩又はシュウ酸と相互作用する酵素に必要なすべての補因子、補酵素、金属、又は結合若しくは基質物質が含まれるが、それらに限定されない。本発明は、かかる酵素の結合パートナーもまた意味するものであり、酵素に結合し、酵素と相互作用する、抗原及び抗体の断片が含まれる。
【０１３２】
(追加の使用方法)
発酵に用いられる微生物の特性が改変され、より効果的及び／若しくはより経済的なバイオプロセスが可能となる株、又はよりよく生存し、増殖及び／若しくはコロニー形成し、又はプロバイオティックなバクテリアとして投与される宿主動物の胃腸管に存在することができる株が提供される。
【０１３３】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの発現又は過剰発現により、バクテリアの増殖速度を調節することができる。「増殖速度（growth rate）」という用語は、微生物や培養物の増殖の速度の割合（measure）のことである。微生物が、液体連続培養中に指数関数的増殖速度で増殖しているとき、細胞集団（cell mass）の増加は、特定の増殖速度定数(μ)、即ちｄＰ／ｄｔ＝μｘＰで表され、式中、Ｐは細胞集団であり、ｔは時間である。「過剰発現（overexpressing）」とは、野生型のバクテリアでの産生に比較して、改変したバクテリアでは目的のタンパク質を生産量が増加することを意味する。バクテリア増殖速度の測定のアッセイは、当業界において公知である（例えば、Bruinenberg et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58:78-84を参照のこと）。
【０１３４】
対象へのリパーゼ又はエステラーゼタンパク質の導入を含めた、対象でのシュウ酸分解を増加させる方法が提供される。一実施形態では、乳製品を発酵するために用いられる微生物でタンパク質が発現し、対象が製品を摂取する。別の実施形態では、ポリペプチド自体が食品に添加される。対象の腸管でのオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼの発現は、血液や尿のシュウ酸濃度を減少させるために役立つ（例えば、Troxel et al. (2003) J. Endourol. 17:173-176; Lung et al. (1991) Am. J. Kidney Dis. 17:381-385;Sidhu et al. (1999) J. Am Soc. Nephrol. Suppl 14:S334-S340を参照のこと）。
【０１３５】
【表１】
2008517628.tif 000003
【０１３６】
本明細書に示される本発明の多様な改変及び別の実施形態は、後述の記述と関連図に示される教示により得られる恩恵に関連するものと当業者は理解するものである。それゆえ、本発明は、添付されている特許請求の範囲の範疇に含まれる、開示されている特定の具体例、その改変、及び別の実施形態に制限されるものではない。特定の用語が本明細書では用いられているが、それらは、総称的な（generic）及び記述的な(descriptive)意味でのみ用いられるものであり、限定のために使用されているものではない。
【０１３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[実施例１]
【０１３８】
ｆｒｃ及びｏｘｃを含む染色体領域の分析
シュウ酸は、食餌（コーヒー、紅茶、チョコレートなど）に由来するか、又はいくつかの代謝前駆体（アスコルビン酸など）から、腸管微生物叢又は非酵素的分解により産生される。ヒトの腸内では、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、又はカリウムと結合して、溶解度が小さい塩を形成し、疾病（ヒトにおいては、高シュウ酸尿症、ピリドキシン欠乏症、尿路結石症、及び腎不全）を引き起こす場合もある。ホルミルコエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｆｒｃ）及びオキサリルコエンザイムＡデカルボキシラーゼ（ｏｘｃ）に相同の遺伝子を含むオペロンが、プロバイオティクスバクテリアであるラクトバチルス・アシドフィルスのゲノムにおいて同定された。ラクトバチルスにおいてはこれまで論じられたことはなかったが、これらの遺伝子は、かかる微生物において、シュウ酸の分解を司ると推定される。ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた転写解析、及び逆転写定量（reverse-transcription quantitative）ＰＣＲにより、ｆｒｃとｏｘｃの転写には、弱酸性の条件が必須であることが判明した。結果として、ラクトバチルス・アシドフィルスのこれらの遺伝子のシュウ酸依存性誘導は、前もってシュウ酸の抑制濃度以下（sub inhibitory concentrations）に順応していた細胞が、ｐＨ５．５にさらされた（exposed）場合にのみ達成された。ｆｒｃ遺伝子の欠失したバージョン（ｆｒｃ−）を有する変異体を用いた生理学的分析により、野生型株と比較して、シュウ酸の存在下のｐＨ３．５で、ｆｒｃ発現が生存率に特に作用することを確認した。ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭの遺伝子の９７．５％を含む全ゲノムマイクロアレイを、解離したシュウ酸を細胞内に組み入れるための候補遺伝子を同定するために用いた。ゲノム情報が利用できる場合には、乳酸菌の別のメンバーについて、ｆｒｃ及びｏｘｃ遺伝子の有無をスクリーニングした。ラクトバチルス・ガゼリＮＣＫ３３４、及びビフィドバクテリウム・アニマリスを除き、シュウ酸利用に関する遺伝子を有する株はなかった。
【０１３９】
ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭのゲノム配列（Altermann et al.(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:3906-3912）は、シュウ酸の異化に関与すると推定されるオペロンの存在を明らかにした（図１）。予測された（predicted）オペロンは、２つの遺伝子、即ちホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ（ＬＢＡ０３９５、ｆｒｃ）及びオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＬＢＡ０３９６、ｏｘｃ）からなり、相補鎖にコードされるものであった（図１）。高エネルギーのロー（rho）非依存性ターミネーターが、ＬＢＡ０３９７（Δ−１１．４Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及びＬＢＡ０３９５（Δ−１４．６Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の下流にあると予測できる。さらに、典型的なＲＢＳ配列（ａｇａａｇｇ）と、開始点から７ヌクレオチド（ｎｔ）と、推定(putative)プロモーターとがｏｘｃの上流に位置していた。
【０１４０】
ｆｒｃ（ＬＢＡ０３９４）の遺伝子下流もまた、相補鎖にコードされ、その推定産物は、３９５アミノ酸（ａａ）からなるタンパク質であって、ラクトバチルス・ガゼリＮＣＫ３３４（アクセッション番号ＺＰ＿０００４６０８２）由来の予測されたアシルＣｏＡトランスフェラーゼ／カルニチンデヒドラターゼと実質的に同一（９０％同一、Ｅ−バリュー０．０）である。大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２（アクセッション番号ＮＰ＿４１６８７２）由来の推定ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼと４４％の同一性、及び大腸菌由来の胆汁酸誘導オペロンの推定タンパク質Ｆ（アクセッション番号ＢＡＡ１６２４２）と４４％の同一性を示すものでもある。ＣｏＡトランスフェラーゼの新しいファミリーに属する保存されたドメイン（ｐｆａｍ０２５１５）が、このタンパク質に存在する。ＣｏＡトランスフェラーゼのほとんどは、２つの既知の酵素ファミリーに属するが、近年、ＣｏＡトランスフェラーゼの３番目のファミリーについての記述があった（Heider (2001) FEBS Lett.509: 345-349）。この酵素ファミリーのメンバーは、オキサリルＣｏＡトランスフェラーゼと、スクシニルＣｏＡ即ち（Ｒ）−ベンジルコハク酸ＣｏＡトランスフェラーゼと、（Ｅ）−シンナモイルＣｏＡ、即ち（Ｒ）−フェニルアセテート（phenyllactate）ＣｏＡトランスフェラーゼと、ブチロベタイニル（butyrobetainyl）ＣｏＡ即ち（Ｒ）カルニチンＣｏＡトランスフェラーゼである。
【０１４１】
ＬＢＡ０３９５は、４４５アミノ酸長のタンパク質をコードしており、ＬＢＡ０３９４と３０％の同一性（４８％の類似性）を有している。さらに、ＬＢＡ０３９５は、ラクトバチルス・ガゼリ由来の予測されたアシルＣｏＡトランスフェラーゼ、及び大腸菌Ｋ１２由来のホルミルＣｏＡトランスフェラーゼと極めて類似性が高い。しかしながら、ＬＢＡ０３９４とは反対に、ＬＢＡ０３９５は、ＣｏＡトランスフェラーゼのファミリーIIIにおいて、最初に特徴が明らかとなったメンバーであるオキサロバクター・ホルミゲンス（Oxalobacter formigenes）由来のホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子である、ｆｒｃにコードされているタンパク質とも４４％の同一性（６１％の類似性）を示した（Sidhu et al.(1997) J. Bacteriol.179:3378-3381）。
【０１４２】
ＬＢＡ０３９６は、５６９アミノ酸長のタンパク質をコードしており、オキサロバクター・ホルミゲンス由来のオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．８）と類似し（５３％の同一性及び７１％の類似性、Lung et al. (1994) J. Bacteriol. 176:2468-2472）、ビフィドバクテリウム・ラクティスにも類似する（４６％の同一性及び６３％の類似性、Federici et al. (2004) Appl.Environ.Microbiol.70:5066-5073）。ＬＢＡ０３９６がコードするタンパク質は、チアミンピロリン酸（thiamine pyrophosphate）（ＴＰＰ）要求性酵素（ＣＯＧ００２８）に存在する保存されたドメインを示している。このドメインは、アセトラクテートシンターゼ(acetolactate synthase）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（シトクローム）、グリオキシル酸カルボリガーゼ(glyoxylate carboligase)、ホスホノピルビン酸デカルボキシラーゼ(phosphonopyruvate decarboxylase)を含むいくつかの酵素にも存在する。さらに、ＬＢＡ０３９６において、ＴＰＰ結合ドメイン（ｐｆａｍ０２７７６）のＮ末端は、アミノ酸残基７で開始し、長さは１７１アミノ酸長であり、中央のＴＰＰドメイン（ｐｆａｍ００２０５）は、アミノ酸残基１９７で開始し、長さは１５４アミノ酸長である。
【０１４３】
ＬＢＡ０３９７は、ｏｘｃの上流にあり、６３９アミノ酸のタンパク質をコードし、保存されたドメインＣＯＧ０４８８であって、２つのＡＴＰアーゼドメインを有するＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼ構成要素に対応するＵｕｐを示すものである（Holland and Light (1999) J． Mol． Biol．293:381-399）。ラクトバチルス・ガゼリ及びラクトバチルス・ジョンソニーにコードされている相当するタンパク質と高度の同一性（７５％以上）が観察された。
【０１４４】
別の乳酸菌について、ｆｒｃとｏｘｃの関連遺伝子の有無をスクリーニングした。ラクトバチルス・ガゼリＮＣＫ３３４（アクセッション番号ＺＰ＿０００４６９９１）及びビフィドバクテリウム・アニマリス（アクセッション番号ＡＢ１６３４３２．１）を除いては、ラクトバチルス・プランタルムＷＣＦＳ１(Kleerbezem et al.(2003) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 100:1990-1995)、及び有名なプロバイオティックな培養物であるラクトバチルス・ジョンソニー（Pridmore et al. (2004) Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A.101:2512-2517）を含めた他の株において、シュウ酸利用に関する遺伝子を有する株はなかった。
[実施例２]
【０１４５】
マイクロアレイを用いたｏｘｃオペロンの転写解析
オキサロバクター・ホルミゲンスにおけるシュウ酸とギ酸の対向輸送（antiport）は、シュウ酸の脱炭酸と共役し、プロトン駆動勾配（proton-motive gradient）を作出する(Abe et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:6789-6793)。本発明者らは、ラクトバチルス・アシドフィルスのゲノムのコンピューター（in silico）解析によっては、推定シュウ酸パーミアーゼ／アンチポーターを同定することができなかったことを考慮し、細胞内へのシュウ酸の特異的な輸送に必要とされる可能性のある候補を同定するための試みとして、マイクロアレイ実験を行った。
【０１４６】
ラクトバチルス・アシドフィルスがグルコースを添加したＭＲＳ培地で増殖する間、通常、最初は６．５である培養液のｐＨは、発酵により乳酸が産生することで減少する。ＮＣＦＭは、弱酸性条件（ｐＨ≒５．５）に無理なく耐えることができる。ＮＣＦＭの存在注釈が付いている遺伝子（annotated genes）を９７．４％含む全ゲノムアレイ（ＷＧＡ）を、弱酸性条件下で異なった形で発現する遺伝子を同定するために用いた（ＧＥＯアクセッション番号ＧＰＬ１４０１（プラットフォーム）及びＧＳＥ１９７６（シリーズ）４）。ｐＨ５．５で３０分間さらした後、推定ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ（ｆｒｃ）とオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ（ｏｘｃ）とをそれぞれコードする、ＬＢＡ０３９５（３．２倍）とＬＢＡ０３９６（４．５倍）のＯＲＦの一貫性のある誘導を観察した（図２）。本研究では、ラクトバチルス・アシドフィルスのＷＧＡを、細胞がｐＨ６．８にて３０分間７０ｍＭのシュウ酸アンモニウムにさらされた後の、グローバル遺伝子発現を分析するために用いた。１６個の遺伝子が著しくアップレギュレートし（Ｐ≦０．０５及び変化率（fold change）＞２．０、表２）、３１５個の遺伝子がダウンレギュレートした（Ｐ≦０．０５及び変化率＜０．５）。ｆｒｃ及びｏｘｃ双方の遺伝子が、この条件ではダウンレギュレートした。最もアップレギュレートした遺伝子は、カドミウム／マンガン輸送ＡＴＰアーゼ（ＬＢＡ１２３４）、並びに２つの特定されていない膜タンパク質（ＬＢＡ１１１９及びＬＢＡ１６９０）であった。ＬＢＡ００３８、ＬＢＡ００３９、ＬＢＡ００４０、及びＬＢＡ００４１のＯＲＦはアップレギュレートし（１．４３倍から２．４５倍の間）、これらの４つの遺伝子は、ラギング鎖にコードされ、オペロンを形成すると考えられる。ＬＢＡ００４１は、推定アデノシルコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）依存性リボヌクレオシド三リン酸リダクターゼをコードする。ＬＢＡ００３８、ＬＢＡ００３９、及びＬＢＡ００４０のＯＲＦは、特徴があまりないが、ＬＢＡ００４０は、推定ＡＴＰ：ｃｏｂ（Ｉ）アラミン（alamin）アデノシルトランスフェラーゼに類似し(Johnson et al.(2001）J.Bacteriol 183:1577-84)、かかる酵素は、ビタミンＢ１２（シアノコバラミンＣＮＣｂｌ）から補酵素Ｂ１２（ＡｄｏＣｂｌ）への活性化における最終ステップに関わる酵素である。なぜこれらの酵素がシュウ酸アンモニウムの存在下でアップレギュレートするかについては、さらに調査が必要である。
【０１４７】
【表２】
2008517628.tif 000004
[実施例３]
【０１４８】
ＲＴＱ−ＰＣＲによるｏｘｃオペロンの転写解析
オペロンの発現インデューサーとしてのシュウ酸アンモニウムの存在下、不在下で、ｆｒｃとｏｘｃの酸による誘導を調査した。ＲＴＱ−ＰＣＲ基準に適合するプライマーを、ＬＢＡ０３９４、ＬＢＡ０３９５（ｆｒｃ）、ＬＢＡ０３９６（ｏｘｃ）、及びＬＢＡ０３９７の遺伝子について設計した。さらに、ＬＢＡ０３９４が、胆汁誘導性（bile-inducible）タンパク質（上述）といくらかの相同性を示したので、胆汁塩ヒドロラーゼＬＢＡ０８７２（ｂｓｈ１）とＬＢＡ１０７８（ｂｓｈ２）とをコードするＮＣＦＭゲノムにおける２つのＯＲＦについてのＲＴＱ−ＰＣＲプライマーも設計した。
【０１４９】
ラクトバチルス・アシドフィルスは、０．０５％のシュウ酸アンモニウム（非抑制濃度、non-inhibiting concentration）を含むＭＲＳ培養液において、３回連続して植継ぎ（transfer）を行ってシュウ酸に適応させた。この化合物に前もってさらされた、若しくはさらされなかった細胞は、その後ｐＨ５．５(乳酸で調整された）のＭＲＳ培養液に移され、試料を時間経過に応じて採取した。ＬＢＡ０３９７のＯＲＦである、ｂｓｈ１とｂｓｈ２（示されていない）は、アッセイのいずれの条件下においても発現しなかった。ＬＢＡ０３９４の発現は、定常的であり、恒常的であった。対照的に、ｆｒｃとｏｘｃの遺伝子は、ｐＨ５．５にてさらされているときに、細胞内で高度に発現した(図３Ａ)。ラクトバチルス・アシドフィルスの細胞は、シュウ酸アンモニウムの存在下で増殖し、ｐＨ５．５にてシュウ酸アンモニウムを０．５％添加したときに、ｆｒｃとｏｘｃの発現が劇的に増加した（図３Ｂ）。続いて、細胞を、シュウ酸に前もってさらし、若しくはさらさずに、０．５％のシュウ酸アンモニウムを含むＭＲＳ（ｐＨ＞６．０）に再懸濁した。しかしながら、ｐＨがより高いと、試験されたいずれの遺伝子においても誘導は観察されなかった（データは示されていない）。
[実施例４]
【０１５０】
ｐＷＶ０１由来のベクター（Law et al. (1995) J. Bacteriol.177:7011-7018）である組込み型（integrative）プラスミドｐＯＲＩ２８を用いて、ｆｒｃを、同遺伝子を欠失したバージョンに変更した。ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭの染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、ｆｒｃを含む１．４２ｋｂの断片を増殖し、ｐＯＲＩ２８でクローニングした。続いて、７２ｂｐのクローニングされた遺伝子の断片を、逆ＰＣＲ（inverted ＰＣＲ）増幅、及びその後のセルフ・ライゲーションにより除去した。その結果生じた３．０４ｋｂのプラスミドｐＴＲＫ８３７を、エレクトロポレーションによりヘルパープラスミドｐＴＲＫ６６９を含むラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭに導入した。インテグレーションを促進し、遺伝子代替を促進するその後のステップは、前述のプロトコール（Russel and Klaenhammer (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:4361−4364 及びBruno-Barcena et al.(2005) FEMS Microbiol. Lett. 246:91-101）により行った。ｆｒｃの内部断片をプローブとして用いたＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションにより、遺伝子の代替が行われたことを確認した。
【０１５１】
塩酸（ＨＣｌ）、乳酸、及びシュウ酸を用いてＭＲＳ培養液を酸性にすることで、ｐＨ４．０、３．５、及び３．０における野生型（ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭ、ｗｔ）とｆｒｃ−株の対数期の細胞の生存率（ＯＤ６００＝０．３）を比較した。培地を酸性にするために塩酸又は乳酸が用いられた場合には、野生型と変異型の間に相違はなかった。さらに、５％のシュウ酸の存在下では、ｐＨ４．０（＞５０％生存）、又は３．０（＜０．０１％生存）で、株間に相違はなかった。しかしながら、ｆｒｃ−は、ｐＨ３．５にて２時間おいた後では、５％（ｗ／ｖ）シュウ酸に対して感受性がより高かった(図４)。
【０１５２】
塩を添加することによりＭＲＳ培養液に沈殿が生じたので、半合成培地（ＢＭ）で、シュウ酸の存在下での対照と変異株との、耐性及び／又は増殖能力を試験した（図４）。ＢＭ培地における増殖率は、双方のラクトバチルス・アシドフィルス株（０．１％グルコースを含むＢＭ培地中で０．７ｈ−１）で、類似していた。０．５％のシュウ酸アンモニウム（Ｃ２Ｈ８Ｎ２Ｏ４）の存在下で、双方の株の増殖率が減少したので（対照が０．４８ｈ−1、変異型が０．５２ｈ−1）、グルコースの存在下で培養物に０．１％若しくは０．５％のシュウ酸アンモニウム（Ｃ２Ｈ８Ｎ２Ｏ４）を添加すると、株間に相違はなかった。興味深いことに、グルコースを添加せずに、０．５％のＣ２Ｈ８Ｎ２Ｏ4を培地に添加した場合、７時間の誘導期(lag-phase)が観察されたが、このことは、株が成長するためにはかかる化合物を解毒化することが必要であることを示すものであった。
【０１５３】
最後に、シュウ酸含有量を、ＮＣＦＭとｆｒｃ変異体の双方について測定した（図６）。ラクトバチルス株は、１％のグルコースと３．５ｍＭのシュウ酸アンモニウムを含み、クエン酸を含まないＢＭ培養液（ＢＭｃｉｔ−）に３日間連続して植継ぎを行った。３日後、１００μＬの細胞を同じ培地に播種し、Ａ６００で０．６まで成長させて遠心分離にかけ、０．１％のグルコースと３５ｍＭのシュウ酸アンモニウム（３２ｍＭ シュウ酸）を含むＢＭｃｉｔ−培地に再懸濁した。試料を時間経過に応じて採取し、遠心分離し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを５から７に中和させ（製造者の指示による）、−２０℃で保存した。上清のシュウ酸濃度を、シュウ酸オキシダーゼによるシュウ酸の酸化に基づくシュウ酸診断キット（Trinity Biotech, Co社製、Wicklow,Ireland）を用いて３回測定した。
【０１５４】
図６に示されているように、培地の上清のシュウ酸含有量は、対照においては顕著に減少したが（２３．６％を上限として）、変異体においてはシュウ酸含有量は、５．８％しか減少しなかった。シュウ酸分解は概ね、培養増殖の最初の１６時間に起こった。この結果は、ラクトバチルス・アシドフィルスがシュウ酸を分解でき、ｆｒｃがこのプロセスに関わるということを示すものであった。
[実施例５]
【０１５５】
ラクトバチルス・アシドフィルス由来のオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼとホルミルＣｏＡトランスフェラーゼの転写及び機能解析の総説
ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭの全ゲノムマイクロアレイを用いた研究（Azcarate-Peril et al. Appl.Environ.Microbiol.（印刷中））は、弱酸性ｐＨにおける、ＬＢＡ０３９５とＬＢＡ０３９６のＯＲＦが一貫して誘導されることを示した。これらの遺伝子と、Ｇｅｎｂａｎｋで入手可能な配列を有する隣接遺伝子との比較分析を行ったところ、ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼ（ｆｒｃ）とオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ（ｏｘｃ）は、オキサロバクター・ホルミゲンス由来のｆｒｃとｏｘｃとの類似性がきわめて高いことを確認した。ラクトバチルス・アシドフィルスにおいて、ｆｒｃとｏｘｃは、オペロンを形成しているように思われ、相補鎖にコードされている。ＲＴＱ−ＰＣＲ及びマイクロアレイ実験により、シュウ酸（ｐＨ＞５．８）が、ｆｒｃとｏｘｃの発現を直接に誘導したのではなく、酸性条件下において誘導されたことを確認した。しかしながら、ラクトバチルス・アシドフィルスを繰り返して非抑制濃度のシュウ酸アンモニウムを含む培養液に植継ぎし、その後ｐＨ５．５にさらしたときには、これらの遺伝子、特にｆｒｃの発現が、飛躍的に増加した。さらに、ｆｒｃが不活性化され、変異株を酸性のｐＨにさらしたときは、ｐＨ３．５にてシュウ酸に対して、特異的により感受性があることが判明したので、ｆｒｃがラクトバチルス・アシドフィルスによるシュウ酸の解毒化に関わることが示された。さらに、ｆｒｃ−変異株は、シュウ酸を分解することはできず、シュウ酸分解活性は、２３．５６％を示した野生型の株よりも顕著に低いものであった。
【０１５６】
胃腸管に自然に生育している微生物の概念については、幾人かにより論じられてきた（概説は３３を参照のこと）。実際、Tannockは、（１）宿主との長期間の関係、（２）消化管の特定の領域における安定個体群（stable population）、（３）生態学的機能の実証、という３つの重要な特徴に基づいた簡潔な定義を提案した。シュウ酸は自然界に広く存在し、シュウ酸に富んだ食品は、食事からの、シュウ酸の重要な供給源である。シュウ酸を特異的に分解するバクテリアが存在することで、吸収を妨げることと、遊離のシュウ酸を異化することと、血液の循環からのシュウ酸除去を促進することとにより、宿主のシュウ酸のホメオスタシスを調節する可能性がある。したがって、かかる化合物を解毒化する能力は、ラクトバチルス・アシドフィルスの新しい生態学的機能を潜在的に示唆するものである。
【０１５７】
ヒトの胃腸管から単離された別のシュウ酸分解バクテリアには、ユウバクテリウム・レンタム（Ito et al．（1996）Int．J．Urol．3:31-34）と、エンテロコッカス・フェカリス（Hokama et al．（2000）Microbiol．Immunol．44: 235-240）とが含まれる。文献において、嫌気的条件下でヒトの排泄物から、シュウ酸分解能を有するエンテロコッカス・フェカリスを単離し、オキサロバクター・ホルミゲンス由来のｆｒｃとｏｘｃに対する抗体を用いてウエスタンブロットをすることにより、ホルミルＣｏＡトランスフェラーゼとオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼの酵素を同定した。Campieriらは、特発性カルシウム−シュウ酸塩結石症の患者に、８Ｘ１０１１の乳酸菌（ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、及びビフィドバクテリウム・インファンティスを含む）を投与し、シュウ酸の分解を測定した（Campieri et al. (2001) Kidney Internat. 60:1097-1105）。Campieriらは、排泄されたシュウ酸の減少と、特にラクトバチルス・アシドフィルスとストレプトコッカス・サーモフィルスにおける（その成長が、当該化合物により一部抑制されたときでも）インビトロでの減少とを観察した。しかしながら、これらの微生物によってはシュウ酸分解を司る遺伝子は同定されなかった。さらに近年、オキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ遺伝子がビフィドバクテリウム・ラクティスにおいて同定され、酵素のシュウ酸分解活性がキャピラリー電気泳動に基づく方法により確認された（Federici et al．（2004） Appl．Environ．Microbiol．70:5066-5073）。それゆえ、胃腸管におけるシュウ酸の異化は、いくつかのプロバイオティックな共生バクテリアの重要な特性といえる。
【０１５８】
オキサロバクター・ホルミゲンスのような別のシュウ酸分解生物では、シュウ酸の利用は、シュウ酸とギ酸との対向輸送により産生されるエネルギー産生と関連する。本発明者らは、コンピューター解析によって、解離したシュウ酸を細胞に組み込む推定パーミアーゼ／アンチポーターを同定することはできなかった。シュウ酸などの有機酸の非解離形態が、細胞膜を通じて自由に拡散できることは一般的に知られている。このことは、ＮＣＦＭのゲノムでは、シュウ酸のための特定のトランスポーターが見かけ上存在しないことを説明するものであるのかもしれない。細胞内に入るシュウ酸の濃度は、胃腸管の変動するｐＨ条件を通じて、細胞の通過時（passage of the cells）にもおこりうる酸性条件下で、増加するものであろう。もう１つの仮説は、膜タンパク質をコードしている３つの遺伝子の内の１つが、この化合物の細胞内への能動輸送において関わっているとするものであり、特にシュウ酸アンモニウムの存在下で、堅調にアップレギュレートしたことによる。最初に、カドミウム／マンガン輸送ＡＴＰアーゼ（ＬＢＡ１２３４）は、９．６４倍に発現が増加した。ＬＢＡ１２３４によりコードされる予測されたタンパク質は、２つの保存されたドメインである、ｐｆａｍ００１２２（Ｅ１−Ｅ２ＡＴＰアーゼ）とＣＯＧ０４７４（ＭｇｔＡ、陽イオン（cation）輸送ＡＴＰアーゼ）を示す。Ｅ１Ｅ２−ＡＴＰアーゼは、触媒サイクル中にリン酸化中間体（phospho-intermediates）を形成する主要な（primary）活性トランスポーターである。これらは一次構造と潜在的膜貫通セグメントに基づきＰ１からＰ４に分類される（Axelsen and Palmgren (1998)J Mol Evol. 46:84-101）。Ｅ１Ｅ２ＡＴＰアーゼは二価陽イオン（シュウ酸がそうであるように）を輸送し、それゆえＬＢＡ１２３４は細胞内への、シュウ酸の転座（translocation）を司るトランスポーターであるのかもしれない。別の２つの特定されていない膜タンパク質（ＬＢＡ１１１９とＬＢＡ１６９０）も発現が増加したが、同定を推定できるだけの特徴を一つも有していなかった。さらに、本発明者らは、どの実験条件においても、ｏｘｃの直ぐ下流にある遺伝子で、推定ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰアーゼサブユニットをコードする、ＬＢＡ０３９７の過剰発現を観察しなかった。
【０１５９】
ＬＢＡ０３９４の上流の遺伝子は、転写レギュレーターに類似し、ＬＢＡ０３９７の下流の遺伝子は、推定のＡＴリッチなＤＮＡ結合タンパク質である。これらの観察と発現データとの組合わせは、ラクトバチルス・アシドフィルスのｏｘｃオペロンが調節されていることを示唆している。さらに、ラクトバチルス・アシドフィルスが、オキサリルＣｏＡを脱炭酸する能力を遺伝子の水平伝播により取得したことが推測される。オペロンは相補鎖にコードされ、ｆｒｃのＧＣ含量（３８．４％）とｏｘｃのＧＣ含量（４０．２％）は、ＮＣＦＭゲノムの平均（３４．７１％）よりも著しく高い。
【０１６０】
過去２０年で、泌尿生殖器感染(urogenital infections)と再発膀胱ガン(recurrent bladder cancer)の予防及び／又は治療手段としてのプロバイオティクスの有効性については、科学的にも認められてきた（Hoesl and Altwein (2005) Eur. Urol. 47:288-296）。つい最近は、高シュウ酸尿症タイプＩ（hyperoxaluria Type I）（生命にかかわる遺伝性疾病であり、シュウ酸塩結石形成の再発、腎石灰沈着症、並びに結果として生じる肝臓及び腎臓の機能障害を特徴とする）に罹患している患者に対する、オキサロバクター・ホルミゲンスの臨床試験により、有望な結果を得ている。シュウ酸を解毒することができるプロバイオティックバクテリアのさらなる臨床研究及び送達は、腎結石形成の予防や、他の病理学的疾病（ピリドキシン欠乏症、尿路結石症（urolithiasis）、及び腎不全等）の発生率の減少に補完的な手法をもたらし、医師や需要者によるプロバイオティックスの採用を増加させるであろう。
[実施例６]
【０１６１】
配列の特徴
配列番号１４は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ００５８２と相同性を有する。ＰＦ００５８２は、普遍的な（universal）ストレスタンパク質のファミリーを含む。このファミリーの代表的なメンバーは、ＵｓｐＡ  ＵＳＡＰ＿ＥＣＯＬＩ（Sousa et al．（2001）Structure 9:1135-1141）という、細胞質低分子のバクテリアタンパク質であり、細胞がストレス物質にさらされた場合に発現が増加する。ＵｓｐＡは、かかる条件に長期間さらされたときの細胞生存率を高め、一般的な「ストレス耐性（stress endurance）」活性をもたらすことができる。インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のＵｓｐＡの結晶構造（Nystrom et al. (1994) Mol Microbiol 11:537-544）は、ＡＴＰに結合する、メタノコッカス・ヤンナシ（Metanococcus jannaschii)ＭＪ０５７７タンパク質のアルファ／ベータフォールド（alpha/beta fold)に類似するアルファ／ベータフォールドを示すが（Zarembinski et al.(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:15189-15193）、ＵｓｐＡは、ＡＴＰ結合活性を欠いている。
【０１６２】
配列番号６は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０１９２３と相同性を有する。ＰＦ０１９２３は、コバラミンアデノシルトランスフェラーゼと相同性を有するタンパク質のファミリーを含む。このファミリーは、ＰｄｕＯとＥｕｔＴ遺伝子産物で双方ともコバラミンアデノシルトランスフェラーゼであるものを含む。ＰｄｕＯはＡＴＰを有するタンパク質であり、即ちＣｏｂ（I）アラミン（alamin）アデノシルトランスフェラーゼ活性を有する。このタンパク質の主な役割は、１，２−プロパンジオールを分解するために、不活性なコバラミンをＡｄｏＣｂｌに変換することである（Kofoid et al.(1999) J Bacteriol 181:5317-5329）。ＥｕｔＴ酵素は、ＣＮＢ１２をＡｄｏＢ１２に変換するアデノシルトランスフェラーゼのように思われる（Johnson (2001) J Bacteriol 183:1577-1584）。
【０１６３】
配列番号１８は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ００１２２と相同性を有する。ＰＦ００１２２は、原核生物及び真核生物の双方に存在し、陽イオン輸送酵素のスーパーファミリーを構成する、ＡＴＰアーゼのｐタイプ（若しくはＥ1−Ｅ２タイプ）と相同性を有するタンパク質のファミリーを含む。そのメンバーは全ての周知の生物学的に関連のある陽イオンの膜流動（membrane flux）を仲介する。ＡＴＰの加水分解の過程でアスパルチルリン酸中間体を形成する酵素は、４つの主なグループに分けることができる。即ち（１）Ｃａ２＋輸送ＡＴＰアーゼ、（２）Ｎａ＋／Ｋ＋、及び胃でのＨ＋／Ｋ＋輸送ＡＴＰアーゼ、（３）植物、真菌、及び下等真核生物の原形質膜Ｈ＋輸送ＡＴＰアーゼ（プロトンポンプ）、（４）真核生物の配列により類似しているネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）のＭｇ２＋ＡＴＰアーゼを除く、すべてのバクテリアのｐ−タイプのＡＴＰアーゼ、の４つである。しかしながら、配列分析の方法が多岐にわたるため、分類については相違が生じる。
【０１６４】
配列番号２２は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０２４４９と相同性を有する。ＰＦ０２４４９は、ベータガラクトシダーゼと相同性を有するタンパク質のファミリーを含む。このベータガラクトシダーゼ酵素のグループは、グリコシルヒドロラーゼ４２ファミリーに属する。この酵素は、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ残基の非還元末端である、末端の加水分解を触媒する。
【０１６５】
配列番号２６と１８は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ００７０２と相同性を有する。ＰＦ００７０２は、ハロ酸脱ハロゲン酵素様のヒドロラーゼドメインを有するタンパク質のファミリーを含む。このファミリーには、アルファ／ベータヒドロラーゼファミリー（アブヒドロラーゼ（abhydrolase）＿１）とは、構造的に異なる。このファミリーには、Ｌ−２−ハロ酸ハロゲン酵素、エポキシドヒドロラーゼ、及びホスファターゼが含まれる。このファミリーの構造は、２つのドメインからなる。ひとつは、挿入された４つのへリックスの束であり、ＨＡＤ1＿ＰＳＥＵＣの１６残基と９６残基の間において、アラインメントが最も保存されていない領域である。残りのフォールド（fold）は、アルファ／ベータドメインの核部分を構成する。
【０１６６】
配列番号３０は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０１１８２と相同性を有する。ＰＦ０１１８２は、グルコサミン−６−リン酸イソメラーゼ／６−ホスホグルコノラクトナーゼドメインを有するタンパク質のファミリーを含む。この項目（entry）には、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ：３．１．１．３１）、グルコサミン−６−リン酸イソメラーゼ（ＥＣ：３．５．９９．６）、及びガラクトサミン−６−リン酸イソメラーゼが含まれる。６−ホスホグルコノラクトナーゼは、ペントースリン酸経路の第二ステップにおいて、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグルコン酸（phosphogluconate）に加水分解することを司る酵素である。グルコサミン−６−リン酸イソメラーゼ（又は、グルコサミン−６−リン酸デアミナーゼ）は、Ｄ−グルコサミン−６−リン酸をＤ−フルクトース−６−リン酸に変換することを司る酵素である。これは、大腸菌（遺伝子ｎａｇＢ）などのバクテリア、又はカンジダ・アルビカンス（遺伝子ＮＡＧ1）などの真菌におけるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡＣ）の代謝経路において最後の特有なステップである。グルコサミン−６−リン酸イソメラーゼの中心部分に位置する領域は、ｎａｇＢ内での触媒メカニズムにおけるピラノース環の開環ステップにとって重要であることが示された、保存されたヒスチジンを含む。
【０１６７】
配列番号３４は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０２３０２と相同性を有する。ＰＦ０２３０２には、ラクトース／セルビオース特異的IIＢサブユニットである、ＰＴＳシステムを有するタンパク質のファミリーが含まれる。バクテリアのホスホエノールピルビン酸（phosphoenol pyruvate）、即ち糖ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）は、多様な代謝及び転写の過程の調節に関わる複合タンパク質システムである。ラクトース／セルビオース特異的ファミリーは、４つの構造的及び機能的に識別できるグループであるIIＢＰＴＳシステム細胞質酵素のうちの１つである。IIＢセルビオースのフォールドは、哺乳類のチロシンホスファターゼと類似した構造を示している。
【０１６８】
配列番号３６は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０３６３２と相同性を有する。ＰＦ０３６３２には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６５の中央の触媒ドメインを有するタンパク質のファミリーが含まれる。このグリコシルヒドロラーゼのファミリーには、液胞酸性トレハラーゼとマルトースホスホリラーゼが含まれる。マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）は、二量体の酵素で、マルトースと無機リン酸から、ベータ−Ｄ−グルコース−１−リン酸とグルコースへの変換を触媒する。中心部のドメインは、高度に保存されたＧｌｕに近接したリン酸イオンに結合する触媒ドメインである。リン酸とグルタミン酸の配置により、アノマー炭素原子に対する求核攻撃が引き起こされると考えられている（Egloff et al. (2001) Structure (Camb) 9:689-697）。触媒ドメインはまた、二量体形成面（dimerisation interface）の大部分を形成する。
【０１６９】
配列番号３６は、ＰＦＡＭファミリーＰＦ０３６３６と相同性を有する。ＰＦ０３６３６には、グリコシルヒドロラーゼファミリー６５、Ｎ末端ドメインを有するタンパク質のファミリーが含まれる。グリコシルヒドロラーゼのこのファミリーには、液胞酸性トレハラーゼとマルトースホスホリラーゼが含まれる。マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）は、二量体の酵素で、マルトースと無機リン酸から、ベータ−Ｄ−グルコース−１−リン酸とグルコースへの変換を触媒する。このドメインは、触媒活性に不可欠であると信じられている（Egloff et al. (2001) Structure (Camb) 9:689-697）。
【０１７０】
本明細書中に記載される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本発明が属する分野の技術の当業者の技術水準を示すものである。本明細書で言及する全ての刊行物、特許、特許出願は、各刊行物又は特許出願は、それぞれ個別に参照することにより組み込まれるのと同様に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
本発明の理解を明確にするために、例や実施例を用いてある程度詳述したが、添付の特許請求の範囲内である程度の変更や修正を加えることは当然認められる。
【０１７２】
【表３】
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【０１７３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭ内のホルミルＣｏＡトランスフェラーゼとオキサリルＣｏＡデカルボキシラーゼ遺伝子を示す図である。推定ロー依存性ターミネーターとそれらの対応自由エネルギーが示されている。
【図２】ラクトバチルス・アシドフィルスのシュウ酸脱炭酸代謝経路案が示されている。
【図３】[図３Ａ]ｐＨ５．５でのラクトバチルス・アシドフィルス細胞内のｏｘｃオペロンの転写解析が示されている。細胞は、ｐＨ６．８のＭＲＳ培養液に最初に移された（非適応）。遺伝子誘導は、細胞がｐＨ５．５のＭＲＳ培養液に置かれた後、時間経過に応じて起こった。ＮＣＦＭのＯＲＦ番号が示されている。[図３Ｂ]ｐＨ５．５でのラクトバチルス・アシドフィルス細胞内のｏｘｃオペロンの転写解析が示されている。細胞は、シュウ酸アンモニウムの非抑制濃度を含むｐＨ６．８のＭＲＳ培養液に最初に移された（前適応）。細胞がｐＨ５．５のＭＲＳ培養液に置かれた後、遺伝子誘導が時間経過に応じて起こった。ＮＣＦＭのＯＲＦ番号が示されている。
【図４】ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭの対数期の細胞の生存率、及びｐＨ４．０、３．５及び３．０に調整されたＭＲＳ培養液に２時間ＨＣｌ、乳酸、又はシュウ酸に曝露した後のｆｒｃ−変異体が示されている。
【図５】シュウ酸アンモニウムの異なる濃度を含む準標準（semi-defined）ＢＭ培地での、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭの、増殖カーブが示されている。ＢＭ中に、０．１％グルコースを含む場合（■）、グルコース＋０．１％シュウ酸アンモニウム（▲）又はグルコース＋０．５％シュウ酸アンモニウム（▼）を含む場合、グルコースが存在しない場合（□）、又は、グルコース＋０．１％シュウ酸アンモニウムが存在しない場合（△）、グルコース＋０．５％シュウ酸アンモニウムも存在しない（▽）場合の増殖を評価した。
【図６】ラクトバチルス・アシドフィルスのシュウ酸分解活性が示されている。ＮＣＦＭ株（■）とｆｒｃ−（●）が、引き続いてシュウ酸の抑制濃度（３．５ｍＭ）を含む培養液に植え替えられ、３２ｍＭシュウ酸を含む培地に植え替えられた。試料は、時間経過に応じて採取され、上清のシュウ酸濃度が測定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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