(57)【要約】  本発明は、サンプル（１０）中の占有結合位置（１５）の検出のための、好ましくは、固体面上のプローブに結合される蛍光ラベリング素子の検出のための方法及び装置に関する。本方法は、レーザ光（２２）のスポット（２６）を用いてサンプル（１０）を走査するステップと、検出ユニット（３０）を用いて標的特定応答、例えば、蛍光（３２）を検出するステップとを含む。走査スポット（２６）のサイズは、１つの占有結合位置（１５）のみが同時に照射されるよう十分に小さく選択される。もし標的特定応答がある場所の反復的な走査中に観察されるならば、前記場所（１１）は占有結合位置（１５）として分類される。そのような反復走査は、特定結合及び非特定結合との間を識別するのを特に可能にする。
2008514950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの内部の占有結合位置を検出する方法であって、前記占有結合位置は、少なくとも１つのラベリング素子を含み、当該方法は、
ａ）  放射線のスポットを用いて前記サンプルを走査するステップを含み、前記スポットの広がり及び走査速度は、ほぼ常に、最大で１つの占有結合位置が、対応する検査期間、現在検査されているスポット地域内に存在するようであり、
ｂ）  もし標的特定応答が前記放射線のスポットによって検査される各場所から観察されるならば、前記場所を占有結合位置のための候補地として記憶するステップを含み、
ｃ）  少なくとももう一回、前記候補地の前記場所を走査するステップを含み、
ｄ）  前記候補地が前記反復的な走査中に所定の応答挙動を示すならば、前記候補地を検出される占有結合位置として分類するステップを含む、
方法。
【請求項２】
前記サンプルは、好ましくは、標的物質の事前結合を介して、ラベリング素子を直接的に或いは間接的に結合し得る分配プローブをその上に備える固体表面を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルの前記表面は、走査手続きの前又は間に、ラベリング素子及び／又は標的物質を含む溶液に晒されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶液中の前記ラベリング素子及び／又は標的物質の濃度は、前記サンプルの前記表面上の検出される占有結合位置の分布から決定されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ラベリング素子の少なくとも１つは、単一の分子、複数の分子の集まり、好ましくは、複数の１０１〜１０８の間の分子、及び／又は、半導体粒子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的特定応答は、蛍光又は化学ルミネセンスに起因する光の発光を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記走査スポットの放射線の強度は、蛍光ラベルの飽和レベルの約１０％〜９０％、好ましくは、約３０％〜８０％に対応することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的特定応答の定義は、走査場所の測定応答に基づいて適合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記走査サンプルのサイズ及び総検査期間は、約１００〜１０００の占有結合位置が検出されるよう選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルの内部の占有結合位置を検出するための装置であって、前記占有結合位置は、少なくとも１つのラベリング素子を含み、当該装置は、
前記サンプルを放射線のスポットで走査するよう構成される走査ユニットを含み、前記スポットの広がり及び走査速度は、ほぼ常に、最大１つの占有結合位置が、対応する検査期間中、現在検査されているスポット地域内に存在するようであり、
前記走査ユニットによって生成される放射線のスポットによって検査される場所からの標的特定応答を検出するよう構成される検出ユニットを含み、
標的特定応答を備える場所を占有結合位置のための候補地として記憶し、且つ、もしそれが２回又はそれよりも多くの走査において所定の応答挙動を示すならば、そのような候補地を検出される占有結合位置として分類するよう構成される評価ユニットを含む、
装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのラベリング素子を含むサンプル中の占有結合位置を検出するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許代６，３２７，０３１Ｂ１号は、回転するディスク上の生物学的、化学的、又は、生化学的サンプルを検査するよう構成されるコンパクトディスク（ＣＤ）読取り及び書込み装置から導出される光学装置を開示している。装置は、前記ディスク上に分配される標的物質の不透明な、反射性の、或いは、蛍光性のスポットの標的特異的応答を検出し、それらは、前記スポットがレーザ光のビームで照射されるときに生成される。ディスクは、さらに、その表面上にコードを有し得る。それはディスク上の特定位置を（再）位置付けすることを可能にする。
【０００３】
一般的に、バイオセンサの目的は、検体内の標的物質の存在及び／又は濃度を検出することである。この検出は、基板上に固定される「結合位置」又は捕捉プローブへの特定結合に基づく。この結合を検出可能にするために、ラベル素子（又は簡潔に「ラベル」）が標的に取り付けられる。ラベルの信号は、最大可能な感度で検出されなければならない。そのような捕捉プローブ−標的−ラベルの組立体を構築する異なるアプローチがある（例えば、先ず標的にラベルを取り付け、次に、その対を捕捉プローブに結合させることができるし、或いは、先ず標的を捕捉プローブに結合し、第二ステップにおいて、固定された標的にラベル付けし得る）。もし結合反応が依然として継続する間に測定することを望むならば、或いは、溶液からのバックグラウンド信号の問題並びに非特定的に結合された標的及び／又はラベルを取り除く所要洗浄ステップのために、これは関連する。ラベルの存在は測定されるが、基板上の捕捉プローブによって固定される標的に取り付けられるラベルにのみ関心がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この状況に基づいて、高い感度及び信頼性を備えるサンプル内の標的物質又はラベリング素子の検出及び定量化のための手段を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、請求項１に従う方法及び請求項１０に従う装置によって達成される。好適実施態様が、従属請求項に開示される。
【０００６】
本発明に従った方法は、サンプル中の占有結合位置の検出を可能にし、ここで、結合位置の「占有」は、定義上、結合位置が少なくとも１つのラベリング素子（例えば、特定の蛍光分子）を含むことを意味する。最も単純な場合には、「結合位置」は、単にサンプル中の特定の場所であり得るし、「結合」は前記場所でのラベリング素子の存在である。（占有）結合位置の他の例は、本発明の好適実施態様と関連して議論される。本方法は、以下のステップを含む。
ａ）  （好ましくは電磁気的）放射線のスポットを用いた前記サンプルの走査、ここで、スポットの有効な広がり及びスポットの有効走査速度は、ほぼ常に、最大で１つの占有結合位置が、対応する検査期間中、現在検査されているスポット地域内に存在するようである。
【０００７】
放射線のスポットは、例えば、サンプルとの機械的接触なしにサンプルの上で走査される光学ピックアップユニット（ＯＰＵ）によって生成される（レーザ）光ビームの焦点であり得る。「スポットの広がり」は、例えば、（単に円形のスポットの場合における普通の直径に対応する）スポットの最大又は平均直径として、スポットの形状に関して合理的に定められるべきである。同様に、「走査速度」は、例えば、スポットがサンプルを通じて移動する平均空間速度（ｍ／ｓ）として、走査の特定の方法に関して合理的に定められるべきである。最後に、サンプル中のスポット地域の「対応する検査期間」は、この地域の地点がスポットによって間断なく照射される（平均）時間として定められる。もし、例えば、放射線の地点がサンプルを通じて段階的に移動するならば、「対応する検査期間」は２つのジャンプ間の時間である。もしスポットが連続的に移動するならば、「対応する検査期間」は、サンプル中のスポット地域の平均照射時間（即ち、全てのその地点に亘る平均）として定められ得る。
【０００８】
スポットの広がり及び走査速度のための前提条件は、ほぼ常に（即ち、９０％よりも多くの、好ましくは、９９％よりも多くの時間において）、０又は最大で１つの占有結合位置が、スポットによって一度に照射されることを意味し、走査速度の検討は、占有結合位置の現れが動的プロセスであり得ることを考慮する。よって、サンプル中の１つの場所には実質的に２つの可能な測定結果、即ち、「空」又は「単一占有」だけがあるので、提案される走査を「デジタル」と呼び得る。
【０００９】
スポットの有効な広がりが占有結合位置間の平均距離よりも（例えば、約１０−１〜１０−５の因数だけ）小さい特別な場合には、前提条件は走査速度と無関係に充足される。これは隔離された占有結合位置の疎らな分散の状況に対応し、その場合には、希な例外は別として、最大で１つの占有結合位置が一度にスポットによって照射される。
【００１０】
ｂ）  もし標的特定応答が前記場所から観察されるならば、占有結合位置のための「候補地」としての、前記放射線のスポットによって検査される各場所の記憶。「標的特定応答」の具体的な定義は、結合位置及び検査されるラベリング素子の種類に依存する。もしラベリング素子が例えば金属粒子を含むならば、スポットの放射線に対する標的特定応答は、走査光の反射であり得る。蛍光ラベリング素子の場合には、特定応答は、蛍光の刺激発光であり得るし、化学ルミネセンスの場合には、標的特定応答は、スポット地域内に観察される自然発生光であり得る。
【００１１】
ｃ）  前記候補地の場所の少なくとも１回の反復走査。これは、潜在的な結合位置の一時的展開を観察し得るよう、候補地の各場所が少なくとも２回測定されることを意味する。反復的な走査間に、例えば、特定結合及び非特定結合との間をより良好に識別する厳重試験として、洗浄ステップ及び／又は温度変化のような特定処理を遂行し得る。
【００１２】
ｄ）  もし候補地が前記反復的な走査中に所定の応答挙動を示すならば、「検出された」（或いは「実」）占有結合位置としての候補地の分類。候補地が反復的な走査の全て、或いは、例えば、９０％よりも多くにおいて標的特定応答を示すならば、候補地を、例えば、検出された占有結合位置として分類し得る。本発明の好適実施態様との関連でより詳細に議論されるように、そのような分類は、（生）化学サンプル中の特定結合及び非特定結合間の識別を可能にする。
【００１３】
上記に記載された方法は、サンプル内の占有結合位置の極めて感応的且つ信頼性のある決定をもたらす。何故ならば、１つの結合位置のみが一度に測定されるからであり、検出された占有結合位置としての場所の分類が反復的な測定に基づくからである。本方法は、選択的に、１つの種類よりも多くの占有結合位置の、例えば、異なるラベリング素子（例えば、２つの異なる蛍光体）を含む結合位置の検出を含むことが留意されるべきである。
【００１４】
測定が行われるサンプルは、（ほぼ）二次元又は三次元であり得る。
【００１５】
それは、好ましくは、少なくとも１つのラベリング素子を直接的或いは間接的に結合し得る「結合位置」としてプローブを分配する固体表面を含み得る。固体表面は、例えば、（生物学的）捕捉分子が、典型的にはｍ２当たり１〜１０６の間、好ましくはｍ２当たり１０〜１０４の間の表面密度を備えて付着されるポリマーキャリアによって実現され得る。そこでは、前記分子は、検出されるべきラベリング素子を特に結合する。ラベリング素子の間接的な結合が、標的物質の事前の特定結合を介して特に起こり得る。前記標的物質は、例えば、溶液中の関心のある生物学的分子から成る。次に、これらの生物学的分子は、プローブを用いてそれらを捕捉することによって、固体表面上に固定される。捕捉が起きたか否かを見るために、標的の存在からの信号が必要とされる。これはラベリング素子（例えば、蛍光分子）を各占有結合位置に付着することによって達成される。この場合には、測定の感度は、ラベル素子に依存する（蛍光の場合には、ラベル内の分子の数に依存する、即ち、染料分子が多ければ多いほど、信号がより高い）。プローブに対する標的物質の生物学的結合は、ｃＤＮＡのストランドの混成に起因し得るし、或いは、抗体に対するタンパク質の認識等により得る。ラベル素子は、（例えば、蛍光染料分子を含むＰＳ球の表面上に）実ラベルに付着される特定分子間の類似の生物学的相互作用によって標的に結合され得る。標的物質のラベリングは、（ラベル素子中で混合し且つ培養することによって）プローブへの結合前に、溶液中で遂行され得るし、或いは、（ラベルを含む溶液を標的分子が既に結合された固体表面に塗布することによって）プローブへの標的分子の結合後に、別個のステップで遂行され得る。例えば、もし標的物質が核酸が付着された染料分子を備えるＰＣＲ（単一ＤＮＡストランドの増倍）の産物であるならば、ラベルは標的物質内にも含まれ得る。後者の場合には、ラベルと標的物質との化合物は、本発明の意味では「ラベリング素子」として正式に考えられ得る。
【００１６】
前述の実施態様のさらなる展開において、サンプルの固体表面は、サンプルが放射線のスポットで走査される前或いは間に、少なくとも１つの標的物質及び／又はラベリング素子を潜在的に含む溶液に晒される。「標的物質」という用語は、広義には、関心のある如何なる材料物体、例えば、原子、イオン、分子、複合体、又は、細胞若しくは微生物のような生物系をも含むべきである。標的物質及び／又はラベリング素子は、溶液を出て、固体表面上でプローブに結合し、それによって、後続の測定のために特定場所に固定され得る。生物学的結合の特異性を向上するために、（サンドウィッチ型の検定において）追加的な洗浄及びラベリングステップが遂行され得る。
【００１７】
前述の方法において、サンプルの固体表面上の検出される占有結合位置の測定分布から、前記溶液中の少なくとも１つの標的物質及び／又はラベリング素子の濃度を決定することが特に可能である。よって、標的物質及び／又はラベリング素子の単なる存在を検出するのが可能であるのみならず、その量及び空間分布を定量化することも可能である。この定量化は、固体表面上のプローブへの溶解された標的物質及び／又はラベリング素子の結合が動力学プロセス又は熱力学平衡のいずれかであるという効果に基づき、それによって、特定時間での占有結合位置の密度は、溶液中の標的物質及び／又はラベリング素子の濃度に比例する。従って、占有結合位置の検出密度又は分布は、溶液中の標的物質及び／又はラベリング素子の濃度を推論することを可能にする。提案される方法は極めて高感度であり、単一占有結合位置の検出に基づくので、このように、極めて低い濃度（典型的にはｆＭ）を測定することが可能である。より低い検出限界は、とりわけ、走査時間を犠牲にして捕捉プローブで被覆される表面の地域によって決定される−表面が大きければ大きいほど、単一標的を探す可能性はより高い。雑音又はバックグラウンドに影響を与えることなしに、表面地域、よって、検出限界を増大し得ることが、このアプローチの重要な利点である。
【００１８】
ラベリング素子は、原理上、機械的に、電気的に、化学的に、或いは、その他の方法で結合位置に結合し得る如何なる実体でもあり得る。好ましくは、ラベリング素子は、単一分子（特に、タンパク質又は単一ストランドＤＮＡ）、複数の（同一又は異なる）分子の集まり、好ましくは、１０〜１０８の間の集まり、及び／又は、半導体粒子を含む。もしラベリング素子が幾つかの分子の集まりであるならば、相応してより強力な照射に対する応答及びより良好な信号対雑音比を達成し得る。
【００１９】
標的特定応答は、原理上、適切な手段を用いて検出され得るスポットの場所での如何なる事象又はプロセスでもあり得る。好適実施態様において、標的特定応答は、化学ルミネセンスによって生成されるスポット及び／又は光の放射線によって刺激される蛍光の発光を含む。この場合には、走査スポットの放射線及び蛍光又は化学ルミネセンスからの光の応答の両方が、サンプルに対する機械的な接触なしに光学系によって処理され得る。記載の方法の他の利点は、それが蛍光又は化学ルミネセンスからの光強度の絶対的な測定値を必要とせず、前記強度が所与の閾値の上にあるか下にあるかの検出のみを必要とし、それはバックグラウンドから占有結合位置を識別することである。蛍光は、例えば、ラベリング素子を結合するプローブに、ラベリング素子に、或いは、ラベリング素子に付着される蛍光マーカーに起源し得る。その上、蛍光は、ラベリング素子が結合されるときに抑制され或いは減少されるプローブの「通常」挙動であり得る。この場合には、標的特定応答は、蛍光内の観察される減少である。化学ルミネセンスが観察されるとき、光の生成が化学的に誘発され、現在検査されている場所の座標を決定するために、放射線のスポットが必要とされるだけである。
【００２０】
前述の実施態様において、方法全体の感度は、蛍光を検出し、且つ、それをバックグラウンド放射から識別する能力に依存する。従って、蛍光物質を過度に漂白せずに強い傾向信号を生成するために、蛍光の飽和レベルの約１０％〜９０％、好ましくは、約３０％〜８０％が生成されるよう、検査のパラメータ、具体的には、走査スポットにおける放射線の強度を調節することが好ましい。前記飽和レベルは、励起放射線のより高い強度によって増大され得ない最大達成可能な蛍光の強度として定められる。走査光のスポットは提案される方法において極めて小さいので（何故ならば、単一の結合位置が検出されなければならないからである）、蛍光の所望量を刺激する所要の高い強度を生成することは一般的に問題でない。
【００２１】
本発明のさらなる展開によれば、「標的特定応答」の定義は、走査場所から測定される応答に基づいて適合される。蛍光を使用する実施態様の場合には、標的特定応答の定義は、典型的に、それよりも上の応答が「標的特定」として分類される測定強度の閾値の設定を含む。この閾値の最適値は、存在し且つ占有結合位置の適切な応答から識別されなければならないバックグラウンド放射線のレベルに依存する。従って、占有結合位置を備えない「空の」場所から来る強度が連続的に測定され、且つ、バックグラウンド放射線のレベルの表示として取られるのが好ましい。
【００２２】
提案される方法は、僅か１つの単一結合位置の検出（又は不在）に基づいてサンプルについての結論を引き出すことを可能にする。しかしながら、測定の信頼性及び統計を向上するために、全検査期間中に約１００〜１０００の占有結合位置がサンプル内に検出されるよう測定を設計するのが好ましい。これらの数を達成するために調節され得る好適なパラメータは、サンプルのサイズ、例えば、捕捉プローブで被覆される表面の地域である。もし例えば溶液中のラベリング素子の濃度及び固体表面上のプローブの濃度が付与されるならば、表面と溶液との間の接触後に、表面のユニット地域及びユニット時間当たりの占有結合位置の特定数が生じる。測定中に所望数の占有結合位置を達成するために、従って、固体表面の（走査）地域が適切に選択されなければならない。
【００２３】
本発明は、さらに、サンプル内の占有結合位置の検出のための装置に関し、前記占有結合位置は、少なくとも１つのラベリング素子を有し、装置は以下を含む。
−  放射線のスポットを用いてサンプルを走査するよう構成される走査ユニットであり、スポットの広がり及び走査速度は、対応する検査期間中に、現在検査されているスポット地域内に、ほぼ常に最大で１つの占有結合位置が存在するよう調節され得る。走査ユニットは、具体的には、光ビームを発生し、それを約０．１〜１０μｍ直径の円形スポットに集束するためのレーザを含み得る。
−  前述のスポットによて検査されるサンプル中の場所から標的特定応答を検出するよう構成される検出ユニット。検出ユニットは、具体的には、サンプルから出現する（反射、透過、ルミネセンス．．．）光を集光するための光学系と、その強度を測定する検出器とを含み得る。検出ユニット及び走査ユニットは、好ましくは、サンプルの上で走査される光学ピックアップユニット内に一体にされる。その上、それらのユニットは、典型的には、放射線のスポットを生成する光ビームを集束し且つトラッキングするための手段（光学ピックアップユニット内のような、サンプル上の構造、適切な信号処理及び制御を含むが、好ましくは、回転しないサンプルを備える）を含む。
−  標的特定応答が占有結合位置のための候補地として観察される場所を記憶し、もしそれが反復的な走査中に所定の応答挙動を示すならば、そのような候補地を検出される占有結合位置として分類するよう構成される評価ユニット。評価ユニットは、具体的には、普通の構成素子（マイクロプロセッサ、メモリ、Ｉ／Ｏインターフェース等）及び所要の処理ステップを実行する適切なソフトウェアを備えるデータ処理ユニットを含み得る。
【００２４】
上述の装置は、上記に記載される種類の方法の全てのステップを実行し得る。従って、その装置の詳細、利点、及び、改良に関するより多くの情報のためには、先行の記載が参照される。装置の具体的な実施態様も、図面を参照して以下により詳細に記載される。
【００２５】
装置は、特に、コンパクトディスクプレーヤー／読取り装置から導出され得る。その上、装置は、サンプル中の場所を十分な空間解像度及び再現性で特定することを可能にする、サンプルのための具体的なキャリアを含み得る。そのようなキャリアは、例えば、従来的なコンパクトディスク（ＣＤ、ＤＶＤ及び類似物のような派生物を含む）に類似し得る、即ち、ＤＶＤや類似の光路上に見い出されるような類似の機能を使用し得る。ＣＤ／ＤＶＤと対照的に、キャリアは回転されず、円形でなく（具体的には約１２ｃｍの直径を備えず）、むしろビームの位置情報及び自動焦点のための予溝（及びウォブル）を備えるクレジットカード形態を有するのが好ましい。
【００２６】
スポットを用いたサンプルの走査のために、走査ユニット又はその一部を固定のサンプルに対して移動し、サンプルを固定の走査ユニットに対して移動し、サンプル及び走査ユニットを（例えば横方向に）移動し、多角形ミラーを移動／回転することによって、サンプルに亘って光ビームを案内したり等することが可能である。
【００２７】
本発明のこれらの並びに他の特徴は、以下に記載される実施態様を参照して明瞭に解明されよう。
【００２８】
以下において、本発明は、添付図面の助けを得て、例示によって記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
今やより詳細に記載される本発明の実施態様は、液体混合物中の生物学的成分（「標的物質」）の濃度の定量的且つ感応的な測定の挑戦に関する。これは、通常、固体面へ付着される捕捉プローブへの標的の選択的な結合の発生を検出することによって行われる。結合の発生は、標的に付着されるか、或いは、被結合標的（又は標的−プローブ複合体）に選択的に結合する第二（又は第三）プローブ上に存在する、ラベル素子（又は単に「ラベル」）の存在によって検出される。この種類の分析における黄金標準は、光を用いたラベルの照射によって刺激される蛍光、及び、化学的又は酸素的な反応によって刺激される化学ルミネセンスである。主要な挑戦の１つは、極めて低い検出限界を有することである。所定試験のこの検出限界は、生物学的相互作用（交叉反応性、非特定吸収、結合定数等）の親和性及び選択性、並びに、センサ又は検出器の感応性（顕著な信号をもたらすために、どのぐらい多くの事象が必要とされるか）によって決定される。典型的には、検出器は、表面から発光される蛍光強度を測定すると同時に、励起ビームによって（例えば、生体分子プローブが付着される光ガイドのエバネセント場によって）照射される。この強度は、ダイオードによって検出され得るし、或いは、生体分子の場合には、ＣＣＤカメラによってパターン状（複合化されて）に付着される。サンプル中の標的分子の低濃度のために、表面上の占有結合位置を表示するラベルの密度は、測定密度が基板の蛍光及び光路内の全ての他の材料のような他の源によって影響されるよう低い。より低い検出限界は、バックグラウンド測定及びその減算の正確性によって決定される。顕著なバックグラウンド信号が、非特定結合から表面又は表面と近接近するそのようなラベルの存在に予期され得る。後者は「実時間」を測定することを困難にし、反応ステップ及び厳重洗浄の完了後というよりもむしろ結合反応が発生している間を意味する。
【００３０】
通常、被結合ラベルの積分だけが（ユニット地域当たり強度又は集積光学密度、即ち、地域によって乗じられたユニット地域当たり強度として）検出される。このようにして、局所的変化、特定対非特定結合間で区別は可能ではなく、較正は多くのパラメータに依存するので較正は困難であり、それらは一体でバックグラウンド信号を決定する。これは以下に記載されるような単一事象の「デジタル検出」によって克服される。本発明は、極めて便利で費用効率的な検出技術ももたらす。実施例が光学ピックアップユニットに類似する走査レーザビームを用いて与えられる。何故ならば、それは光学データ記憶システムのために使用されるからである。そのような構成は、被結合ラベル（占有結合位置）の数及び座標の測定を許容する。このようにして、バックグラウンド減算はもはや重大ではなくなり、結合事象の寿命は、特定及び非特定結合間の区別を可能にし、このようにして、条件表面で継続する生化学的反応に関するより一層正確で詳細な情報をもたらす。また、それは結合及び解離の測定を同時に許容し、それは生化学検定の特性付けにとって極めて重要である。
【００３１】
既存の解決策は、選択性を増大するために、ラベルの表面選択照明を使用する。これはエバネセント場照明（例えば、ＷＯ２００４／０２３１４３Ａ２、Ｄｕｖｅｎｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ，ｖｏｌ．２９２８（１９９６））によってなされる。これらの方法の達成可能な強度は、色素分子の飽和限界よりかなり下にある。他の既存の解決策は、照明のために共焦点走査ビームを使用する。このようにして、照明地域は限定され、その結果、バックグラウンド放射及び漏話が減少される。高い空間分解能及び感応測定は、極めて長い「走査」時間を招く。代替として、光路の配列（源、光学素子、及び、検出器を含む）の使用が、米国特許第６，４３７，３４５Ｂ１において提案されている。しかしながら、これは比較的高価な解決策であり、カートリッジと読取り装置との精密な整列を要求する。
【００３２】
基板又は他の素子からのバックグラウンド蛍光を減少する他の方法は、光の発光を刺激する電気的、化学的、又は、酸素的トリガの使用である。これらのプロセスは、エレクトロルミネセンス又は化学ルミネセンスと呼ばれ、照射光ビームを用いた刺激を必要としない。その代わり、光の発生をもたらす反応を引き起こし得る少なくとも１つの基板が加えられる。
【００３３】
ここで提案される根本的に異なるアプローチは、（積分／平均）ルミネセンス強度の検出よりもむしろ、単一事象又は「占有結合位置」及び各事象の座標の検出に基づく。単一結合事象の検出のための基礎は十分に強い信号であり、それはバックグラウンド強度から明白に区別され得る。結合事象が極めて希な（走査速度及びスポット直径に依存して１ｐｐｍ未満）表面を走査することによって、バックグラウンドの信号レベルを極めて正確に検出し得る。何故ならば、測定の大部分はバックグランドだからである。雑音源の殆どは、高い空間的な或いは適時の変化を有さない。信号が特定閾値よりも上にあるときだけ、それは（潜在的な）結合事象として特定され、その地点の座標は、占有結合位置の候補として記録される。このようにして、潜在的占有結合位置のマップを構成し得るし、走査を反復し得る。継続的にマップを比較することによって、結合位置の寿命を決定し得るし、長寿命のものを特定結合事象又は占有結合位置として特定し得る。短寿命のものを雑音又は非特定結合として廃棄し得る。よって、このアプローチは、より多くの情報及び測定結合の一層の確実性をもたらす。これは走査スポットのサイズ及び照明ラベルの輝度を調節することによって達成される。走査速度及びラベルサイズは関連し、各用途のために最適化され得る。
【００３４】
上記に議論された原理を使用するアプローチの１つの実施態様は、ＤＶＤ光学ピックアップユニットに基づき、図１に概略的に示されている。それは「二次元」サンプル１０（その小さな断片のみが図示されている）内の占有結合位置１５から来る蛍光を検出するよう構成されている。
【００３５】
装置は、レーザ源２１を備える走査ユニット２０と、レーザ源２１から出現するレーザビーム２２を平行光束に平行化する第一レンズ２３（「レンズ」という用語は、ここで並びに以下において、幾つかの個々のレンズを備える光学系も含む）と、レーザビーム２２を直角にサンプル１０の表面に向かって反射する二色性ビームスプリッタ２４と、レーザビーム２２をサンプル１０中のスポット２６に集束する第二レンズ２５（対物レンズ）とを含む。
【００３６】
サンプル１０から来る蛍光の検出のために、装置は、以下の構成素子を備える検出ユニット３０を含む。即ち、サンプル１０から出現する蛍光を収集し、それをビームスプリッタ２４を通じて送られる平行ビームに平行化する既述のレンズ２５と、入射蛍（光）の強度を測定し、対応する電気信号を生成するよう構成される検出器３１上にビーム３２を集束する第三レンズ３３とである。
【００３７】
最後に、装置は、例えば、従来的なコンピュータによって実現され得る評価ユニット４０を含む。評価ユニット４０は、以下により詳細に記載される測定データの全ての要求される処理を実行する。その上、評価ユニット４０は、装置を制御する、即ち、所定場所にある且つ／或いは所定パラメータを備える測定値に指令するよう構成され得る。
【００３８】
（約３．６μｍのスポットの直径に対応する）〜１０μｍ２の表面地域を備えるスポット２６を得るために、例えば、６５０ｎｍ励起で０．２の対物レンズ２５の開口数（ＮＡ）を使用し得る。もし０．１×０．１ｍｍ２の地域を備えるサンプルのあらゆる部分が、１つのラベルを用いて統計的にラベル付けされるならば、それは前記レーザスポット２６によって別個に走査され得る３．３×３．３μｍ２の１０００の仮想サブパーティション１１，１２，．．．に分割され得る。標的分子（例えば、タンパク質）の１ｐＭの濃度のために、計算有効結合又は「ヒット率」は、μｍ２当たり及び１秒当たり１０−４事象である。１０００秒の期間の間、もし１秒当たり１つのサブパーティションが走査されるならば、平均１特定結合事象が測定される。
【００３９】
上記された方法及び装置の感度は、事象（即ち、検出占有結合位置）の数に依存せず、単一事象がそのように特定され得る確実性に依存する。測定の期間の合理的な時間尺度を除き、検出され得る濃度のための下限はない。特定の光学構成のために、非結合ラベルが感知面の上の溶液中に依然として存在するのに、結合反応中に測定することさえも可能である。これらの特徴を以下に詳細に説明する。
【００４０】
提案されているアプローチの基礎は、走査光学構成における単一事象検出である。単一事象検出は、センサによって検出されるべき放射された放射線の特定の最小出力及びエネルギーを必要とする。この点に関する第一の特徴として、蛍光飽和強度及び出力が考慮されなければならない。蛍光体の平均蛍光寿命τｆｌｕｏｒは、２ｎｓのオーダである（Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｗｉｃｈｍａｎｎ，  Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．１９，７８０（１９９４）を参照）。これらの試験体の吸収σａｂｓのための断面の典型値は、１０−１６〜１０−１７ｃｍ２の間に亘る。飽和蛍光刺激強度は、
【数１】
2008514950.tif 000003
であり、プランク定数であるｈ、光の速度であるｃ、及び、吸収光の波長であるλを備える。λは６５０ｎｍであり、σａｂｓは１０−１６ｃｍ２であり、τｆｌｕｏｒは２ｎｓであるので、１．５ＭＷ／ｃｍ２又は１５ｋＷ／ｍｍ２の飽和蛍光刺激強度Ｉｓが得られる（Ｍ．Ａ．Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．Ｒ．Ｔｏｍｐｋｉｎ，Ｒ．Ｗ．Ｂｏｙｄ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ａ３４，２０２６（１９８６））。ラベル付けされた生物学的試験体が、最適な蛍光発光、よって、最適な信号対雑音比（ＳＮＲ）に近接するがそれよりも下で励起されなければならない。保存励起レベルは、飽和レベルの６０％から７０％である。２ｍＷ、１００ｍＷ、及び、１０ｋＷの生物学的試験体のための最適な励起電力が、それぞれ０．２μｍ２、１０μｍ２、及び、１ｍｍ２表面地域上に得られ、ここで、０．２μｍ２の表面地域は、ＤＶＤ光学ピックアップユニット（０．６ＮＡ、６５０ｎｍ）の光学スポットサイズに対応する。蛍光多層記憶技術評価（ＷＯ０１／０６５０１Ａ１を参照）では、ＤＶＤ光学ピックアップユニット（０．６ＮＡ、６５０ｎｍ）を使用して色素分子からの蛍光発光を最適化するために、２ｍＷの励起電力が使用される。
【００４１】
最大ＳＮＲが得られ、レーザ出力を増大することはＳＮＲをもはや向上しない。有機蛍光体のための励起周期の最大数は、それが漂白される前に、平均１０５であることが留意されるべきである。有機蛍光体の平均総寿命は、
【数２】
2008514950.tif 000004
であり、励起周期の最大数であるＮ、及び、励起強度Ｉでの１つの励起周期の寿命であるτｅｘｃを備える。１つの励起周期の寿命は、励起強度と反比例し、飽和強度
【数３】
2008514950.tif 000005
で蛍光寿命と等しい。飽和レベルで有機蛍光体の平均総寿命は、２ｎｓのオーダの蛍光体の平均総寿命τｆｌｏｕｒのために０．２ｍｓである。
【００４２】
典型的な染料は、可視スペクトルに亘る励起及び発光特性を有するキサンテン族及びシアニン族からのものである。これらの染料は、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ、及び、Ｃｙ−ｄｙｅｓのような幾つかの名前で取引されている（適用される商品名は染料の正確な化学組成に依存する）。レーザ励起に特に適した染料はも既知である。例えば、オレンジグリーン４８８及び５１４は、それぞれ４８８及び５１４ｎｍで励起され得るし、格別に光安定的である。
【００４３】
多くの商業的な染料の量子効率は、０．１〜１の間である。しかしながら、多くの非置換フルオレセイン及びローダミン（例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）が、比較的速く漂白する（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄに関しては飽和強度で１０秒内に１％）。テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）のような置換染料は、より高い光安定性を有するが、ＴＭＲの蛍光量子効率は、フルオレセイン共役と比べより低い。
【００４４】
（例えばバックグラウンド蛍光発光を減少するために）燐光発光が好ましいこともある。比較的遅い発光を伴う典型的な染料は、エオシン及びエリトロシンである。これらの燐光体の量子効率はより低く、典型的には、フルオレセインの量子効率の１０％〜２０％である。
【００４５】
他の適切な染料は、Ｅｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｓｍ、Ｙｂ、Ｎｄ、Ｅｒ、Ｈｏ、Ｇｄ、及び、Ｃｅからの金属複合体のような、金属複合体を含む。Ｒｕ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｄ、Ｒｅに基づくようなランタニド複合体も、適切な発光特性を有する。
【００４６】
特定サイズの蛍光ビードを使用するときにも、蛍光発光の増大を達成し得る。これらのビードは、通常、蛍光体が分散されるか或いは化学的に結合されるポリマーから成る。適用される典型的なポリマーは、ポリスチレン及びデキストランである。これらのビードは、高い光安定性を示す。励起が同一の波長で遂行され得るが、発光は選択波長で起こるよう、異なる染料を選択することも可能である。染料の注意深い選択によって、所望の波長を得るために、染料間の蛍光共鳴エネルギー移転（ＦＲＥＴ）を使用し得る。ビードサイズは２０ｎｍから数ミクロンに及ぶ。典型的には、２０ｎｍのポリスチレンビードは、約１８０の低分子重量蛍光体、２００ｎｍビード約１．１×１０５蛍光体、及び、１ミクロンビード約１．３×１０７蛍光体を含む。原理上、高い信号振幅を得ることができる。
【００４７】
小さな半導体粒子（「量子ドット及びロッド」）も適切なラベルである。何故ならば、それらは漂白が起こる前に高いレーザ出力に耐え得るからである。量子ドットサイズは、典型的には、１〜５ｎｍ（直径）の範囲である。発光波長は、粒子サイズ（青から赤に増大する直径を伴う）の関数であるのに対し、吸収スペクトルはそれほど変化しない。量子ドットのための典型的な材料は、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ等である。コアシェル型量子ドット、例えば、ＣｄＳｅコア及びＺｎＳシェルを備える粒子も記載される。量子ドットは、電気的に或いは化学的にも励起され得る。量子ロッドは特別な関心であり得る。何故ならば、それらの空間的及び／又は回転的動作が妨害されるとき（例えば、結合後）、それらは線形偏光を発光し得るからである。
【００４８】
レーザスポット２６のサイズに関して、適用の標的濃度範囲は重要である。標的分子（例えば、タンパク質）の１ｐＭの濃度のために、有効結合率／ヒット率が、μｍ２当たり並びに秒当たり１０−４事象（占有結合位置）未満であることを予期し得る。合理的な検定確度のために、（信頼性のある統計及び動的範囲のために）１００〜１０００事象を有することが望ましい。１００×１００のセンサ地域を備えて、１秒当たり１事象が合理的に思われる。これは、１００〜１０００秒後、検体が完了されることを意味する。１００〜１０００結合ラベルは、１０４μｍ２の地域上で検出される必要があり、それはμｍ２当たり０．０１〜０．１の密度に対応する。これは、１μｍ２のビーム地域を用いることで、ビーム内に統計的に単一な事象の限界が達成される。このアプローチの力は、それがより低い濃度又はより短い時間に容易に拡張され得ることである。単一事象感度の故に、同一時間に同一表面地域上で既に１ｆＭを測定することが可能である（これは１０００秒内に１０４μｍ２上の１結合事象に対応する）。
【００４９】
増大された検出限界のために、より大きな地域が受容体で被覆され得る。このようにして、１０００事象のための時間が、比例して減少される。走査時間は増大する。これはスポットサイズ及びスポットの出力の増大によって補償され得る。従って、検出速度は影響されず、読出しの感度も影響されない。
【００５０】
従来的な蛍光体に基づくバイオセンサは、伝搬波励起又はエバネセント波励起を使用して、サンプル表面全体、例えば、１ｍｍ２を照明する。伝搬波及びエバネセント波励起のための最大ＳＮＲは、〜１０ｋＷ及び〜２Ｗの励起電力をそれぞれ使用して得られる。これらの所要電力は、商業的なバイオセンサでは実行可能でなく、よって、より低い励起電力が使用され、その結果、バイオセンサのより低い潜在的感度が得られる。
【００５１】
走査特徴に関して、多くの光学走査解決策が光学記録技術に存在する。一例として、連続的な溝が、分析するために混合物と接触する基板表面内に存在し得る。溝は位置（所謂「ウォブル」）についての情報を含む。走査は、液体又はガス状混合物及び受容体表面の（生）化学反応が生じるカートリッジが取り付けられるステージを移動することによって、或いは、代替的に、（上記されたような光源、光学素子、及び、検出器を含む）光学ピックアップユニットを移動することによって達成される。後者は、２Ｄ変換ステージによって、或いは、代替的に、活性化されたミラー及び固定的な光源及び検出器によって達成され得る。動作は、ページを読むような線形走査、又は、コンパクトディスクにおけるような連続的トレースであり得る。光ビームの動作は、カートリッジの動作よりも好ましい。何故ならば、後者の場合には、加速及び減速がセンサ内の流体動作に影響を与えるからである。
【００５２】
図１に示されるＤＶＤ光学ピックアップユニットに基づく提案された走査蛍光体バイオセンサの実施態様において、サンプル内の予溝は、集束及びトラッキングのためにＤＶＤプレーヤーに使用されるような従来的なサーボ時報を使用して、スポット２６を案内するよう使用され得る。図２及び３は、トラッキングのためのそのような予溝１６を拡大斜視図及び断面図でそれぞれ示している。サンプル１０は、占有結合位置１５を含む下層１３と、予溝１６を含む上層１４とから成る。予溝１６は、励起及び蛍光のために透明でなければならない。溝の深さは集束及びトラッキング信号を最適化するよう同調されなければならない。
【００５３】
１０００秒の期間中のｐＭ濃度のために、平均１特定結合事象が、１０μｍ２のサイズを備えるスポット２６内に典型的に起こる。走査スポットは、１つの特定結合（占有結合位置）の局所的検出を許容する。さらに、数日の特定結合の長い寿命は、１０５サブパーティション１１，１２に沿って光学スポットの速い走査を許容し、局所的な測定のみならず、時間分解測定も可能にする。例えば、図１のサンプル１０全体は、１０００秒の総測定期間中に１００回走査され得る。これは０．３ｍ／ｓ（１×ＤＶＤの速度は４．８ｍ／ｓである）の走査速度に対応する。数日の寿命を有する特定結合事象と、秒のオーダのより短い寿命を有する非特定結合事象との間を区別するために、時間分解を使用し得る。局所化され且つ時間分解された測定の故に、より高いＳＮＲ及び感度が得られる。結合事象が起こらないサブパーティション１２，．．．からのバックグラウンド寄与は、測定値から減算され得る。局所化された測定に起因するこのバックグラウンド寄与は、ＳＮＲを向上する。非特定又は無作為事象からのバックグラウンド寄与も、測定値から識別され得る。時間分解測定に起因するバックグラウンド減少は、分正規の感度をさらに向上し、結合動力学に関する追加的な情報をもたらす。〜１００ｍＷの励起電力を使用して最大ＳＮＲが得られ、それは商業的なバイオセンサのための実現可能な電力要件である（６５０ｎｍＤＶＤ記録レーザダイオードは、２０〜２００ｍＷの間の電力を有する）。従って、提案されている走査蛍光バイオセンサのための電力要件は、伝搬波及びエバネセント波励起に基づく従来技術のバイオセンサに比べより一層小さい。
【００５４】
結合反応の間、溶液内の非結合ラベルの蛍光も測定され、結合反応後に測定値が得られる。しかしながら、共焦点構成のために、結合反応中に測定することさえ可能であるが、非結合ラベルは感知表面より下で溶液内に依然として存在する。図４は、図１の走査蛍光バイオセンサの変更の光学素子を示しており、変更は共焦点ＤＶＤ光学ピックアップユニットに基づいている。焦点外地域１７からの光を遮断するために、検出器３１の前のピンホール３４が使用される。焦点内平面１８からの光のみがピンホールを通過し、その結果、より小さな焦点深さ又は焦点深さ分解能が得られる。検出容積の小さな浸透を用いてさえ、液体内のラベルは（ブラウン運動、拡散、又は、対流の故に）速く移動する。反復走査において、それらの座標は異なる。異なる走査を相関することによって、それらを非結合として排除し得る。
【００５５】
上記に記載される走査蛍光バイオセンサの実施態様のさらなる変更は、例えば、以下の通りである。
−  蛍光の励起及び収集のために０．２のＮＡが上で使用されているが、同一のレンズを使用する励起のために、蛍光を収集するよう、より大きなＮＡ、例えば、０．８５ＮＡ、より小さなＮＡ、例えば、０．２ＮＡを使用することも可能である。因数
【数４】
2008514950.tif 000006
を備える蛍光収集効率の向上は、ＳＮＲ、よって、バイオセンサの感度のさらなる改良をもたらす。このアプローチに関するより詳細は、本明細書に参照として引用されるＷＯ２００４／０２３４５９Ａ２に見い出され得る。
−  記載された実施態様において、ＯＰＵ全体は固定サンプルの上で走査される。変換構成素子を具備しない走査蛍光バイオセンサは、非変換傾斜ミラー、例えば、ガルバノミラーを使用することによって得られるのに対し、ＯＰＵ及びサンプルは固定される。
−  漂白効果を減少し、同一周波数で測定し、それによって、他の周波数で起こるプロセスをフィルタリングするために、レーザのパルス動作を使用し得る。
−  サンプルを通じた照明、及び、受容体表面への反射体（例えば、Ａｕ）の塗布によって、反射の測定を行い得る。蛍光（分子ビーコン）の消光するために、Ａｕ反射器を直接的に使用し得る。さもなければ、如何なる他の不活性金属又は誘電体表面も使用し得る。
−  センサの動的範囲を増大するために、同一チップ上で異なるスポットサイズを使用し得る。
−  結合（例えば、分子ビーコン）後の蛍光のオン−オフトリガリングを備えるスマート蛍光プローブを使用し得る。
−  蛍光のみを示す、あるいは、もし特定ラベルが結合されるなら、標的物質の結合後に蛍光を停止し或いは減少するプローブを使用し得る。この場合には、検出されるべき標的特定応答は、概ね蛍光サンプル中の蛍光の「孔」である。
【００５６】
ここで提案される走査蛍光バイオセンサは、以下の利点を有する。
−  飽和レベルに近い生物学的試験体の最適蛍光励起の故に、特定結合事象の局所的測定の故に、並びに、特定及び非特定結合事象の時間（及び場所）分解測定の故に、従来技術のバイオセンサと比べＳＮＲは向上する。
−  本方法は、結合動力学の検出を許容する。
−  本方法は、「簡単」且つ安価な読出しシステム（高価な共焦点スキャナの代わりのＤＶＤ）を許容する。
【００５７】
記載された装置及び方法の重要な用途は、分子診断（臨床診断、関心点診断）、バイオセンサ、ＤＮＡ及びタンパク質配列（例えば、分子診断又はスクリーニングのためのタンパク質又は遺伝子順序の検出）、細胞分析、薬物スクリーニング、環境センサ、食品品質センサ等の領域、特に、極めて高い感度及びスループットが要求される場所であり得る。
【００５８】
最後に、本出願において、「含む」という用語は他の素子又はステップを排除せず、不定冠詞は複数を排除せず、単一のプロセッサ又は他のユニットは幾つかの手段の機能を充足し得ることが指摘される。その上、請求項中の参照符号はそれらの範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】サンプル中の占有結合位置を検出するための装置を概略的に示す斜視図である。
【図２】レーザビームをトラッキングするための予溝を含むサンプルの表面を示す拡大斜視図である。
【図３】図２の線III−IIIを横断して示す断面図である。
【図４】共焦点測定の光学素子を示す概略図である。
【符号の説明】
【００６０】
１０  サンプル(sample)
１１  サブパーティション
１２  サブパーティション
１３  下層
１４  上層
１５  占有結合位置(occupied  binding  site)
１６  予溝(pre-groove)
１７  焦点外地域
２０  走査ユニット
２１  レーザ源
２２  レーザビーム
２３  第一レンズ
２４  ビームスプリッタ
２５  第二レンズ（対物レンズ）
２６  スポット
３０  検出ユニット
３１  検出器
３２  ビーム
３４  ピンホール
４０  評価ユニット
【図１】
2008514950.tif 000007
【図２】
2008514950.tif 000008
【図３】
2008514950.tif 000009
【図４】
2008514950.tif 000010
【国際調査報告】
2008514950.tif 000011
2008514950.tif 000012
2008514950.tif 000013