(57)【要約】  宿主系としての高等植物以外の宿主真核細胞および生物において組換えタンパク粒様会合体として発現される融合タンパク質を形成するための方法を開示する。さらに詳しくは、ペプチドおよびタンパク質を、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）形成の誘導を媒介するタンパク質配列と融合し、適当なベクターでの形質転換後に安定的に発現させ、これらの宿主細胞に蓄積させる。その融合タンパク質を調製するための方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）内に組換え融合タンパク質を含む非高等植物真核性宿主細胞であって、前記融合タンパク質が、１つの配列が宿主細胞とは異種のタンパク粒誘導配列であり、もう１つの配列が目的産物の配列である、互いに連結している２つの配列を含む、宿主細胞。
【請求項２】
ＲＰＢＬＡの密度が、約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、タンパク粒誘導配列と目的産物の配列との間にリンカー配列をさらに含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
タンパク粒誘導配列が、プロラミンまたは修飾プロラミンを含んでなる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項５】
タンパク粒誘導配列が、プロラミン配列である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、またはイネプロラミンである、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
融合タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）非高等植物真核性宿主細胞を、（ii）目的ポリペプチド産物をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列、にインフレームで作動可能に連結された（ｉ）タンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）をコードする第１の核酸、を含んでなる核酸配列で形質転換する工程；および
（ｂ）該形質転換宿主細胞を、ある期間、融合タンパク質の発現およびその発現融合タンパク質の組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）への会合に適した培養条件下で維持する工程
を含む、方法。
【請求項８】
第１の核酸配列（ｉ）の３’末端が、第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、ＰＢＩＳと目的ポリペプチド産物との間のリンカー配列をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、真菌細胞、特に酵母細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、藻類細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、動物細胞、特に哺乳類細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
発現融合タンパク質を回収するさらなる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク粒誘導配列が、プロラミンまたは修飾プロラミンを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
プロラミン配列が、（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）タンパク質γ−ゼインの繰り返しドメインヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬ（配列番号１）の１以上のコピーからなる配列、および（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインの全部または一部からなる配列、を含む修飾プロラミンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
プロラミン配列が、γ−ゼイン、α−ゼイン、またはイネプロラミンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞の形質転換に使用される核酸配列が、１以上の調節配列を含む発現ベクター内に存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記１以上の調節配列が、プロモーターを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ii）目的ポリペプチド産物、に連結された（ｉ）タンパク粒誘導配列、を含む融合タンパク質をコードする遺伝子を定義する外因性核酸セグメントに作動可能に連結された１以上の調節配列を含むベクターを含んでなる、組換え核酸分子。
【請求項２０】
前記ベクターの前記１以上の調節配列が、適合する真核性宿主細胞における遺伝子発現の駆動に好適なプロモーターを含む、請求項１９に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主系としての高等植物以外の真核細胞および生物における組換えペプチドおよびタンパク質の生産を意図する。さらに詳しくは、ペプチドおよびタンパク質を、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）形成の誘導を媒介するタンパク質配列と融合し、適当なベクターでの形質転換後に安定的に発現させ、これらの宿主細胞に蓄積させる。
【背景技術】
【０００２】
治療用、栄養補給用または工業用の組換えタンパク質の生産では、過去１０年間に大きな成功を享受してきた。様々な真核細胞および生物が活性タンパク質に基づく治療用物質を産生できることが証明されている。残念なことに、組換えタンパク質の産生レベルが低いこと、かつ／またはタンパク質単離および精製手順により高コストであることが多いために、それらの工業への応用の妥当性を実証することができない。異なるアプローチにより産生レベルおよび精製手順の両方を改善するために、活発な研究がなされている。
【０００３】
高等植物における組換えタンパク質の安定性および蓄積を増加させるために、植物種子貯蔵タンパク質ドメインと目的のタンパク質の融合に基づく新しい技術（ＷＯ２００４／００３２０７）が開発された。これらの貯蔵タンパク質は植物種子に特異的であり、植物種子では貯蔵タンパク質がタンパク粒に安定的に蓄積する(Galili et al., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442)。
【０００４】
貯蔵タンパク質は、シグナルペプチドを介して小胞体（ＥＲ）内腔に入り、ＥＲ由来のタンパク粒（ＥＲ−ＰＢ）と呼ばれる特異的細胞小器官を発生する小胞体またはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）のいずれかにおいて会合する(Okita and Rogers 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-50；Herman and Larkins 1999 Plant Cell 11:601-613；Sanderfoot and Raikel 1999 Plant Cell 11:629-642)。
【０００５】
組換え貯蔵タンパク質は、アフリカツメガエル卵母細胞および酵母のような、非植物宿主系のＰＢ様細胞小器官において会合することも記載されている。
【０００６】
穀類プロラミン類（最も豊富な穀類貯蔵タンパク質）の発現は、対応するｍＲＮＡの注射後のアフリカツメガエル卵母細胞において記載されている。この系は、これらの貯蔵タンパク質のターゲッティング特性を研究するため(Simon et al., 1990, Plant Cell 2:941-950；Altschuler et al., 1993, Plant Cell 5:443-450；Torrent et al., 1994, Planta 192:512-518)およびトウモロコシプロラミンである１９ｋＤａ  α−ゼインを修飾する可能性を、その安定性を変更しないで、必須アミノ酸リジンおよびトリプトファンをその配列に導入することにより、検証するためのモデルとして使用されている(Wallace et al, 1988, Science 240:662-664)。
【０００７】
ゼインは、複合群のトウモロコシプロラミンであり、様々な目的で酵母でも産生されている。Coraggio et al., 1988, Eur J Cell Biol 47:165-172では、このタンパク質のターゲッティング決定因子を研究するために、酵母における天然および修飾α−ゼインについて示されている。Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672では、タンパク粒形成を誘導する可能性のあるα−、β−、γ−およびδ−ゼイン相互作用について研究されている。この問題に取り組むために、酵母細胞をこれらのタンパク質をコードするｃＤＮＡで形質転換している。さらに、その著者らは、酵母細胞におけるゼインタンパク質の細胞内局在性を確認するためにゼイン−ＧＦＰ融合タンパク質を構築した。そして、その酵母細胞は、ゼイン特性を研究するためのモデル発現系として使用された。注目されるのは、Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672で、ゼインは、援助なしでは形質転換酵母での蓄積が不十分であるため、酵母がゼイン相互作用を研究するための優れたモデルではないと結論付けられたことである。酵母細胞は、グリアジンと呼ばれるコムギ貯蔵タンパク質の輸送およびタンパク粒蓄積を制御する機構を研究するためのモデルとしても使用された(Rosenberg et al., 1993, Plant Physiol 102:61-69)。
【０００８】
本明細書において、本発明者らは、例えば、プロラミン類またはプロラミンドメインのように、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）の誘導を媒介するタンパク質配列と目的のペプチドまたはタンパク質（標的）との融合が真菌類（酵母を含む）、藻類および動物などの生物の細胞におけるＲＰＢＬＡの蓄積を媒介することを示す。興味深いことに、これらの融合タンパク質は動物細胞に、タンパク粒様細胞小器官構造内部に安定的に蓄積される。
【０００９】
発明の概要
本発明は、動物、真菌類および藻類などの高等植物以外の真核細胞、ならびに培養動物細胞、培養真菌細胞および培養藻類細胞において、タンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）と目的のペプチドまたはタンパク質（本明細書ではまとめてポリペプチドということが多い）とを含む融合タンパク質を生産するための系および方法を提供する。この系および方法では、目的のペプチドまたはタンパク質を含む融合タンパク質は組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）として安定的に蓄積する。ＰＢＩＳは、例えば、目的のペプチドまたはタンパク質（標的）を含む天然および修飾貯蔵タンパク質配列のように、これらの細胞小器官におけるＲＰＢＬＡ形成ならびにタンパク質の侵入および／または蓄積の誘導を媒介することができる。
【００１０】
本発明は、とりわけ、ＰＢＩＳをコードする核酸部分と目的ポリペプチド産物をコードする核酸部分を含んでなる核酸配列で形質転換された、宿主系としての高等植物以外の真核細胞において目的産物を融合タンパク質形態で生産するための方法を提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、形質転換に使用される核酸配列は、（ｉ）ＰＢＩＳをコードする核酸配列と（ii）目的産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列、を含んでなる。一実施形態では、核酸配列（ｉ）の３’末端は前記核酸配列（ii）の５’末端に連結されている。もう１つの実施形態では、核酸配列（ｉ）の５’末端は核酸配列（ii）の３’末端に連結されている。よって、ＰＢＩＳ配列は融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に存在し得る。
【００１２】
もう１つの特定の実施形態では、形質転換に使用される核酸配列は、先に記載した核酸配列（ｉ）および（ii）の他に、スペーサーアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含んでなる。そのスペーサーアミノ酸配列は、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、核酸配列（iii）は、核酸配列（ｉ）と（ii）の間に位置しており、例えば、核酸配列（iii）の３’末端は前記核酸配列（ii）の５’末端に連結されている。もう１つの実施形態では、前記核酸配列（iii）の５’末端は核酸配列（ii）の３’末端に連結されている。
【００１３】
また、特定の実施形態では、形質転換目的に使用される核酸配列は、特異的に切断可能な配列をコードし、本願と同時譲渡されるＷＯ２００４００３２０７によって定義されるとおりである。さらに、もう１つの実施形態では、核酸は、ＷＯ２００４００３２０７と一致しているが、酵素的または化学的手段により特異的に切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列は存在しない。さらなる実施形態では、融合タンパク質はＰＢＩＳと目的のペプチドまたはタンパク質との直接融合物であり得る。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は融合タンパク質の単離および精製をさらに含む。
【００１５】
さらにもう１つの実施形態では、目的のタンパク質は、例えば、天然または修飾プロラミン類またはプロラミンドメインのような、天然または修飾貯蔵タンパク質と融合される。目的のタンパク質の例としては、治療用途、栄養補給用途、生物防除用途または工業的用途を有するいずれものタンパク質が挙げられる。例示的なタンパク質およびペプチドとしては、例えば、ホルモン（例えば、カルシトニン、成長ホルモンなど）、抗体（例えば、モノクローナル抗体およびそのフラグメント）、抗原（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎表面またはコアタンパク質、胃腸炎、コロナウイルスなどに対するワクチンとして有用なもの）、プロテアーゼ阻害薬、抗生物質、コラーゲン、ヒトラクトフェリン、サイトカイン類、工業用酵素（例えば、ヒドロラーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼなど）が挙げられる。
【００１６】
本発明はいくつかの利益と利点を有する。
【００１７】
１つの利益は、本発明を用いることによって最適な非高等植物真核細胞においての所望の組換えタンパク質の比較的単純かつ迅速な発現が可能になるということである。
【００１８】
本発明の利点は、本発明が、ＲＰＢＬＡにおいて発現させることから、容易に入手可能であり、かつ精製可能である組換えタンパク質の供給源を提供するということである。
【００１９】
さらなる利益および利点については、当業者ならば、以下の考察から明らかであろう。
【００２０】
発明の詳細な説明
意図される組換えタンパク質は融合タンパク質であり、それらの融合タンパク質はそれらが発現される宿主細胞において組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）を形成する。ＲＰＢＬＡ形成は貯蔵タンパク質ドメインにより誘導され、それにより細胞内に高密度蓄積物が生じる。これらの高密度蓄積物はサイトゾル、エンドメンブレン系細胞小器官、ミトコンドリア、プラチド(platids)に蓄積するかまたは分泌される。組換えタンパク粒様会合体は、異なる融合タンパク質によって違った所定の密度を有するが、調製した特定の融合タンパク質に関しては分かっている。ＲＰＢＬＡのその所定の密度は、一般に、ホモジネート中に存在する内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものより高く、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。新規ＲＰＢＬＡの高密度は、組換え融合タンパク質の、多重体として会合し、蓄積する一般能力によるものである。意図されるＲＰＢＬＡは、非高等植物真核生物において発現され、一般に、上述のようにそれらの密度により特徴付けられる。動物細胞で発現させた場合、ＲＰＢＬＡは、一般に、膜で囲まれた直径約１ミクロン（μ）の球形である。
【００２１】
これらの融合タンパク質は、ペプチド結合により直接または間接的に互いに結合している２つのポリペプチド配列を含み、それらの配列において、１つの配列は目的のポリペプチド産物（例えば、ペプチドまたはタンパク質）（標的）に連結されたタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のものである。ＰＢＩＳは、細胞小器官におけるＲＰＢＬＡ形成ならびにタンパク質の侵入および／または蓄積の誘導を媒介するタンパク質またはペプチドアミノ酸配列である。ＰＢＩＳと宿主細胞は、異なる生物門のものが好ましい。よって、ＰＢＩＳは、一般に、高等植物、種子植物由来のものであり、一方、宿主細胞は、種子植物以外の、例えば、哺乳類もしくは昆虫細胞のような動物細胞、真菌／酵母、または藻類細胞であり得る（それらの総ては種子植物とは異なる門のものである）真核生物である。ＰＢＩＳの例示的な、限定されない例としては、例えば、プロラミン類または修飾プロラミン類、プロラミンドメインまたは修飾プロラミンドメインのような貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質が挙げられる。プロラミン類については、Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370) :947-958に概説されている。好ましいＰＢＩＳは、プロラミン化合物のもの、例えば、下記のγ−ゼイン、α−ゼインまたはイネプロラミンである。
【００２２】
トウモロコシ貯蔵タンパク質であるγ−ゼイン（このＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は以下に示す）は、４種類のトウモロコシプロラミンの１つであり、トウモロコシ胚乳における総タンパク質の１０〜１５％である。他の穀類プロラミンとしてのα−およびγ−ゼインは、粗面ＥＲの細胞質側の膜結合ポリソームで生合成され、内腔内に集められた後、ＥＲ由来のタンパク粒内に隔離される(Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613；Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234；Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403)。
【００２３】
γ−ゼインは、４つの特徴的などメイン、ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ii）ヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬの８個の単位を含む繰り返しドメイン（配列番号１）（５３ａａ）、iii）プロリン残基が他のアミノ酸に代わるＰｒｏＸドメイン（２９ａａ）およびｉｖ）疎水性システインリッチＣ末端ドメイン（１１１ａａ）、で構成されている。
【００２４】
γ−ゼインがＥＲ由来のＲＰＢＬＡに会合する能力は、種子に限定されない。実際に、γ−ゼイン遺伝子がトランスジェニックシロイヌナズナ(Arabidopsis)植物で構成的に発現されると、貯蔵タンパク質は葉肉細胞のＥＲ由来のＰＢＬＳ内に蓄積した(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。ＥＲ由来のタンパク粒へのγ−ゼインの蓄積に関与するシグナル（プロラミン類にはＫＤＥＬシグナルはない）を探した際に、タンデムリピートドメインを含むプロリンリッチＮ末端ドメインがＥＲ保持に必要であり、Ｃ末端ドメインがタンパク粒形成に関与することが示された。しかしながら、これらのドメインがタンパク粒会合を促進する機構はまだ分かっていない。
【００２５】
タンパク粒と呼ぶのが適切なのは種子においてのみであり、他の植物器官および非高等植物で生産される類似構造物は、一般に、組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）と呼ばれる。
例示的な、他の有用なプロラミンタイプの配列をそれらのＧｅｎＢａｎｋＩＤとともに以下の表に示す。
【００２６】
【表１】
2008521391.tif 000002
【００２７】
さらに有用な配列は、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおりに、以下に示すものなどのクエリーを用いて、all non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF（環境サンプルを除く）データベース内のＢＬＡＳＴ検索を行うことによって得られる：
ＲＸ３クエリー配列番号２；α−ゼイン配列番号３およびイネプロラミンクエリー配列番号４。
【００２８】
例示的な修飾プロラミンは、（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）タンパク質γ−ゼインの繰り返しドメインヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬ（配列番号１）の１以上のコピーからなる配列（全ドメインには８個のヘキサペプチド単位が含まれる）；および（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインの全部または一部からなる配列、を含む。例示的な特異的修飾プロラミンとしては、以下でＲ３、ＲＸ３およびＰ４と表示されるポリペプチド（これらのＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列も以下に示す）が挙げられる。
【００２９】
特に好ましいプロラミンとしては、ＷＯ２００４００３２０７に開示されているようなγ−ゼインおよびその構成部分、イネｒＰ１３タンパク質ならびに２２ｋＤａトウモロコシα−ゼインおよびそのＮ末端断片が挙げられる。γ−ゼイン（２７ｋＤ）、イネおよびα−ゼインタンパク質のＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列は、配列番号５（ＤＮＡ配列）および配列番号６（タンパク質配列）；配列番号７（ＲＸ３  ＤＮＡ配列）および配列番号８（タンパク質配列）；配列番号９（Ｒ３  ＤＮＡ配列）および配列番号１０（タンパク質配列）；配列番号１１（Ｐ４  ＤＮＡ配列）および配列番号１２（タンパク質配列）；配列番号１３（Ｘ１０  ＤＮＡ配列）および配列番号１４（タンパク質配列）において示す。
【００３０】
ｒＰ１３：（タンパク質配列配列番号１５およびＤＮＡ配列配列番号１６）−クローンと相同の１３ｋＤのイネプロラミン−ＡＢ０１６５０４  Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol . Biochem. 60(2):335-337；Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116；Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153；Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246；Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol . Biochem. 63(11):1851-1858
【００３１】
２２ａＺｔ（タンパク質配列全長配列番号１７およびＤＮＡ配列全長配列番号１８）  ２２ｋＤのトウモロコシα−ゼインＮ末端断片−Ｖ０１４７５  Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672；Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317；Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22；Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833。
【００３２】
目的のタンパク質の例としては、治療用途、栄養補給用途、生物防除用途または工業的用途を有するいずれものタンパク質、例えば、モノクローナル抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどのようなｍＡｂ）およびそのフラグメント、ワクチン用の抗原（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ；Ｂ型肝炎プレ−表面、表面およびコア抗原、胃腸炎コロナウイルスなど）、ホルモン類（カルシトニン、成長ホルモンなど）、プロテアーゼ阻害薬、抗生物質、コラーゲン、ヒトラクトフェリン、サイトカイン類、工業用酵素（ヒドロラーゼ、グリコシダーゼ、オキシドレダクターゼなど）などが挙げられる。例示的な目的タンパク質の例示的なＤＮＡ配列およびアミノ酸残基配列を示す：サケカルシトニンＢＡＣ５７４１７（タンパク質配列配列番号１９およびＤＮＡ配列配列番号２０）
【００３３】
ｈＥＧＦ−ＡＡＦ８５７９０に基づくシグナルペプチドを含まない構築物（タンパク質配列配列番号２１およびＤＮＡ配列配列番号２２）
【００３４】
ｈＧＨ−Ｐ０１２４１に基づくシグナルペプチドを含まない構築物（タンパク質配列配列番号２３およびＤＮＡ配列配列番号２４）。
【００３５】
もう１つの実施形態では、組換え融合タンパク質は、ＰＢＩＳの配列および目的産物の配列の他に、スペーサーアミノ酸配列をさらに含んでなる。そのスペーサーアミノ酸配列は、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、そのスペーサーアミノ酸配列はＰＢＩＳと目的産物の間に置かれる。例示的なアミノ酸配列は、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ−−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−−Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子などのようなプロテアーゼにより切断可能である。あるいは、例えば、メチオニン残基で切断する臭化シアンのような化学試薬により特異的に切断可能なアミノ酸配列がコードされる。
【００３６】
さらなる実施形態では、形質転換目的に使用される核酸配列は、同時譲渡されるＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりである。さらに、もう１つの実施形態では、その核酸配列は、ＷＯ２００４００３２０７によって開示されるとおりであるが、切断可能なアミノ酸配列をコードする核酸配列は存在しない。
【００３７】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、非高等植物真核性宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、真菌類／酵母、昆虫または藻類など）を、（ii）目的ポリペプチド産物をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで作動可能に連結された（ｉ）ＰＢＩＳをコードする第１の核酸を含んでなる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列（すなわち、両方のポリペプチドがそれらの適切なリーディングフレームから発現されるように、ＰＢＩＳをコードする核酸配列は目的のポリペプチドをコードする配列と化学結合（ペプチド結合）されている）で形質転換することを含む方法によって調製される。その宿主細胞は、ある期間、その融合タンパク質の発現およびその発現融合タンパク質の組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）における会合に適した培養条件下で維持される。発現によって、生じた融合タンパク質は、形質転換した宿主系に高密度組換えタンパク粒様会合体として蓄積する。その融合タンパク質は、宿主細胞から回収することができ、あるいはその融合タンパク質を含む宿主細胞を、所望により、追加栄養素または栄養補給物を含む動物食に関して使用することができる。その融合タンパク質は、ＲＰＢＬＡの一部として単離することができるし、またはＲＰＢＬＡを伴わないこともある。
【００３８】
融合タンパク質の発現に適した培養条件は、一般に、宿主細胞のタイプごとに異なる。しかしながら、それらの条件については、当業者には公知であり、容易に決められる。同様に、維持期間も、宿主細胞や調製することが望まれる融合タンパク質の量によって異なる。これについても、それらの条件は周知であり、特定の状況において容易に決めることができる。さらに、特定の培養条件は、本明細書における引例からも得られる。
【００３９】
一実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結（結合）されている。他の実施形態では、第１の核酸配列（ｉ）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結（結合）されている。もう１つの実施形態では、ＰＢＩＳは貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質、その断片または修飾断片を含んでなる。
【００４０】
もう１つの特定の実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞系（動物、動物細胞培養物、真菌類／酵母または藻類など）を、既述の核酸配列（ｉ）および（ii）に加えて、スペーサーアミノ酸配列をコードするインフレーム核酸配列（iii）を含んでなる核酸配列で形質転換することを含む方法によって調製される。そのスペーサーアミノ酸配列は、先に述べたように、酵素的または化学的手段により切断可能であるか、または切断されないアミノ酸配列であり得る。１つの特定の実施形態では、核酸配列（iii）は、前記核酸配列（ｉ）と（ii）の間に位置しており、例えば、第３の核酸配列（iii）の３’末端は第２の核酸配列（ii）の５’末端に連結されている。もう１つの実施形態では、第３の核酸配列（iii）の５’末端は第２の核酸配列（ii）の３’末端に連結されている。
【００４１】
前述の融合タンパク質分子をコードする核酸配列（セグメント）またはそのコード配列の相補体も、本明細書において意図される。そのような核酸セグメントは、いくつかの好ましい実施形態では、単離し、精製された形態で存在する。
【００４２】
生体において、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝子コードによってそのタンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に直接関係している。よって、周知の遺伝子コード縮重を通じて、所望により、同じ融合タンパク質アミノ酸残基配列をコードするが、先に述べた遺伝子配列とは十分に異なり、２配列が高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが、中ストリンジェンシーでハイブリダイズするさらなるＤＮＡ配列および対応するＲＮＡ配列（核酸）を調製することができる。
【００４３】
高ストリンジェンシー条件は、温度約５０℃〜５５℃にて６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションおよび温度６８℃にて１〜３×ＳＳＣによる最終洗浄を含むと定義することができる。中ストリンジェンシー条件は、温度約５０℃〜約６５℃にて０．２〜０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのハイブリダイゼーション、続いて、約５０℃〜約５５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）による洗浄を含む。
【００４４】
核酸配列（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）（１）それ自体かまたはその相補体がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）および目的のポリペプチドを含む融合タンパク質コードするといった核酸配列も、本明細書において意図される。周知のように、意図される核酸配列のような核酸配列は、本明細書の他の場所で述べたように、適当な発現系の適当なプロモーターに作動可能に連結されている場合に発現される。
【００４５】
異なる宿主には、特定のアミノ酸残基のコード化に使用される特定のコドンが好ましい場合が多い。そのようなコドン選択については周知であり、in vitro突然変異誘発を用いて、例えば、宿主に好ましいコドンが融合タンパク質を発現させる特定の宿主に利用されるように、所望の融合タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を変更することができる。
【００４６】
上述のように、意図される融合タンパク質をコードする遺伝子を定義する外因性核酸セグメント（例えば、ＤＮＡセグメントまたは配列）に作動可能に連結された、適合する真核性宿主生物細胞における遺伝子の発現の駆動に適したプロモーターなどの１以上の調節配列（制御エレメント）を含むベクターを含んでなるＤＮＡ分子のような組換え核酸分子も、本発明において意図される。さらに詳しくは、目的のポリペプチドに連結されたタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）をコードする遺伝子を定義するＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、宿主生物細胞において融合タンパク質の発現を駆動するためのプロモーターを含むベクターを含んでなる組換えＤＮＡ分子も意図される。その組換えＤＮＡ分子は、宿主真核細胞における適切なトランスフェクションおよび発現により、意図される融合タンパク質をＲＰＢＬＡとして提供する。
【００４７】
当技術分野で周知のように、必要な核酸、例示的には、ＤＮＡ配列が存在する限り、（開始および終結シグナルを含む）さらなる塩基対が、通常、そのＤＮＡセグメントのいずれかの末端に存在し得、それでもまだそのセグメントを利用して、そのタンパク質を発現させることができる。このことにより、当然ながら、発現を抑えるか、発現させることが望ましい融合タンパク質を消費するさらなる産物を発現させるか、その所望の融合タンパク質によって産生される求める反応産物を消費する産物を発現させるか、あるいはそのＤＮＡセグメントの遺伝子の発現を妨げる、作動可能に連結されたＤＮＡ配列のセグメントは存在しないと推測される。
【００４８】
よって、ＤＮＡセグメントが前述のように干渉するＤＮＡ配列を含んでいない限り、本発明のＤＮＡセグメントは約５００〜約１５，０００塩基対長であり得る。複製および発現に必要な最小ＤＮＡ配列が総て、所望により、存在するならば、組換えＤＮＡ分子、特に、発現ベクターの最大サイズは、主として便宜性と宿主細胞が受け入れることができるベクターサイズに従う。最小ベクターサイズについては周知である。前述のような長いＤＮＡセグメントは好ましくはないが、使用することができる。
【００４９】
先に記載した融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、化学技術、例えば、Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185のホスホトリエステル法により合成することができる。当然ながら、そのコード配列を化学合成することによって、天然アミノ酸残基配列をコードするものについて適当な塩基を置換することにより、任意の所望の修飾を簡単に行うことができる。しかしながら、本明細書において具体的に記述した配列を含むＤＮＡセグメントが好ましい。
【００５０】
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントは、その遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（プラスミドベクター）から得ることが好ましい。宿主細胞における融合タンパク質遺伝子の発現を指示するベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【００５１】
発現ベクターは、プロモーターををはじめとする発現制御エレメントを含む。融合タンパク質をコードする遺伝子は、発現ベクターに作動可能に連結されており、プロモーター配列がその融合タンパク質をコードする遺伝子のＲＮＡポリメラーゼ結合および発現を指示することを可能にする。Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3:2719およびOdell et al. (1985) Nature, 313:810により記載されているように、誘導プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、ならびにChua et al. (1989) Science, 244:174-181に記載されているように、時間的に調節されるプロモーター、空間的に調節されるプロモーター、および時空的に調節されるプロモーターがポリペプチドをコードする遺伝子の発現に有用である。
【００５２】
真核細胞に適合する発現ベクター、例えば、酵母細胞に適合するものまたは哺乳類、藻類もしくは昆虫などの細胞に適合するものが、本明細書において意図される。そのような発現ベクターは、本発明の組換えＤＮＡ分子の形成にも使用することができる。Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)またはピキア・パストリス(Pichia pastoris)のような酵母に用いるベクターは、周知であるように、エピソーム型であるか、または組み込み型である。真核細胞発現ベクターは、当技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給源から入手することができる。通常、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントおよびプロモーター配列を挿入するための１以上の便宜な制限部位を含む。所望により、そのようなベクターは、真核細胞での使用に特異的な選択マーカーを含む。Ｓ．セレビシエに用いる典型的なプロモーターとしては、Ｓ．セレビシエホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターや分岐プロモーターＧＡＬ１０およびＧＡＬ１が含まれ、一方、ピキア・パストリスに有用なプロモーターはアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）である。Ｓ．セレビシエおよびピキア・パストリスにおける融合タンパク質の例示的な発現は、以下に示す。
【００５３】
哺乳類細胞における組換えＤＮＡ発現による融合タンパク質産生については、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、Ｃｏｓ１サル宿主細胞およびヒト２９３Ｔ宿主細胞において融合タンパク質遺伝子を発現させる組換えＤＮＡベクターを用いて以下に示す。これは当技術分野で周知であり、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratories (1989)でより詳細に記載されている手法を用いて実現できる。
【００５４】
意図される融合タンパク質を発現させるのに、昆虫細胞系を使用することもできる。例えば、１つのそのような系では、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)幼虫において外来遺伝子を発現させるために、ベクターとしてオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）またはバキュロウイルスを使用する。融合タンパク質をコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。融合タンパク質配列の挿入の成功によりポリヘドリン遺伝子が不活性となりコートタンパク質が欠損した組換えウイルスが産生する。その組換えウイルスを用いて、例えば、融合タンパク質を発現させ得るＳ．フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼虫に感染させることができる。E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227；およびV. Luckow, Insect Cell Expression Technology, pp. 183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J. L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996)。オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、多くの場合、感染後期中に高レベルで発現される。
【００５５】
融合タンパク質遺伝子を含む組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ□バキュロウイルス発現系として販売されている(Life Technologies)バキュロウイルスシャトルベクター系を用いて構築される(Luckow et al. (1993) J. Virol., 67:4566-4579)。標準的なプロトコールによって、組換えウイルスのストックを調製し、その組換えタンパク質の発現をモニタリングする(O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992；およびKing et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992)。
【００５６】
融合タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結される発現ベクターの選択、最終的にプロモーターの選択は、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現の場所および時期、ならびに形質転換する宿主細胞に直接依存する。これらは、組換えＤＮＡ分子構築技術に内在する周知の制限である。しかしながら、本発明の実施において有用なベクターは、そのベクターが作動可能に連結されたＤＮＡセグメントに含まれる融合タンパク質遺伝子の複製と、好ましくは、発現も（発現ベクターの場合）指示することができる。
【００５７】
発現ＲＰＢＬＡおよびそれらの融合タンパク質は、発現している宿主細胞から生化学的または生物学的回収に利用される通常の手段により得ることができる。ＲＰＢＬＡは宿主細胞中に存在する他のタンパク質と比べて密度が高いため、ＲＰＢＬＡは、細胞ホモジネートの遠心分離により集めるのが特に適している。集めたＲＰＢＬＡから、２−メルカプトエタノールなどの還元剤を含有するバッファーで周囲膜を溶解することにより融合タンパク質を得ることができる。
【００５８】
さらに詳述しなくとも、当業者ならば、これまでの説明と次の詳細な実施例から本発明を最大限に利用することができると思われる。よって、次の好ましい具体的な実施形態は、単に例示に過ぎず、開示内容の残りの部分を制限するものと決して解釈してはならない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：トランスフェクトした哺乳類細胞における融合タンパク質の蓄積
成熟カルシトニン（Ｃｔ）配列およびＥＧＦ配列に対応する合成遺伝子、ならびにｈＧＨ配列をコードするｃＤＮＡを、Ｎ末端γ−ゼインコード配列ＲＸ３（ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、それらをベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen)に導入して、構築物ｐ３．１ＲＸ３Ｃｔ、ｐ３．１ＲＸ３ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３ｈＧＨを得た。融合タンパク質ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨをコードするこれらの構築物を、リポフェクタミンに基づくトランスフェクション法(Invitrogen)により２９３Ｔ、Ｃｏｓ１およびＣＨＯ哺乳類培養細胞に導入した。高活性シアン蛍光修飾ＧＦＰの遺伝子配列を含むプラスミドｐＥＣＦＰ−Ｎ１(Clontech)でトランスフェクトした２９３ＴおよびＣｏｓ１細胞を対照として使用した。
【００６０】
一過性にトランスフェクトした細胞における融合タンパク質の蓄積を、γ−ゼインに対して作製された抗体を用いて、ウエスタンブロット法により解析した。トランスフェクションの４４時間後に、総可溶性タンパク質をバッファーＡ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％２−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼ阻害薬）で抽出した。細胞インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。等量のトランスフェクト細胞から抽出したタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースシートに移した。
【００６１】
図１に示した結果から分かるように、解析した３つの融合タンパク質ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨは、発現用に選択した培養細胞種に関係なく、非常に効率的に蓄積した：２９３ＴおよびＣＨＯ培養細胞の両方において蓄積したＲＸ３−ｈＧＨのパターンと、ＣＨＯおよびＣｏｓ１細胞におけるＲＸ３−ＥＧＦのパターンを比較。それらの融合タンパク質をトランスフェクト細胞に対応するタンパク質抽出物において観察し（レーンｃ）、細胞培養培地では免疫反応バンドは検出されなかった（レーンｍ）。この観察により、ＲＸ３ドメインが会合し、エンドメンブレン区画中に融合タンパク質を保持することができることが示唆される。
【００６２】
これらの結果は、解析した３種類の哺乳類細胞（ヒト２９３Ｔ細胞、サルＣｏｓ１細胞およびハムスターＣＨＯ細胞）においてＲＸ３由来の融合タンパク質がいかにして会合し、エンドメンブレン系に蓄積するのかを示している。これにより、所望のタンパク質の効率的な蓄積は、どんな哺乳類細胞または生物を選択しようとも、ＲＸ３ドメインとの融合によって実現し得ることが示唆される。
【００６３】
実施例２：トランスフェクトした哺乳類細胞における融合タンパク質の細胞内局在性
Ｎ末端γ−ゼイン配列ＲＸ３が哺乳類細胞において組換えタンパク粒様会合体を誘導することができるかを確認するために、ＲＸ３−Ｃｔ融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質の局在性を、共焦点顕微鏡を使用して免疫細胞化学により解析した。トランスフェクト細胞を３．７％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、γ−ゼイン抗血清（希釈１／７００）とともに１時間インキュベートした。非免疫血清を対照として使用した。一次抗体を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５色素(Molecular probes)とコンジュゲートした抗ウサギ抗体を用いて検出した。
【００６４】
トランスフェクト細胞の顕微鏡写真は、発光バンド波長選択のために分光光度計を取り付けた共焦点レーザー走査型顕微鏡(Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ, Heidelberg, Germany)を使用することにより得た。緑色蛍光画像は、４９５〜５３５ｎｍに設定した発光窓を使用することによりアルゴンイオンレーザーによる４８８ｎｍの励起でを採取した。赤色蛍光画像は、ＨｅＮｅレーザーおよび発光窓５５０〜６００を用いて５４３ｎｍ励起後に採取した。光学切片は０．５μｍ厚であった。デジタル画像および映像は、共焦点顕微鏡ソフトウェアを使用することにより記録した。
【００６５】
図２は、ｐ３．１Ｃｔ−およびｐ３．１ＲＸ３ＥＧＦ−トランスフェクト細胞の共焦点映像を示している。図で示されるように、小胞体（ＥＲ、図２Ａ中の矢印）において対応する融合タンパク質、ＲＸ３−ＣｔおよびＲＸ３ＥＧＦが検出され、γ−ゼインシグナルペプチドが哺乳類細胞において機能し、その哺乳類細胞においてそのγ−ゼインシグナルペプチドが融合タンパク質のＥＲへの移動を媒介するということを示している。対照として使用した非免疫血清とともにインキュベートしたサンプルは有意な蛍光を示さなかった（図示せず）。
【００６６】
驚くべきことに、融合タンパク質が見かけ上膜に囲まれた大きなスポットに特異的に蓄積して見える（図２Ａ中の挿入写真参照）ことに留意することが重要である。これらの構造は、非トランスフェクト細胞には存在せず、大きさは直径およそ１ミクロンの植物タンパク粒と同程度である（ＡおよびＣ中の挿入写真）。この結果は、動物細胞において植物で記載されているＰＢ貯蔵細胞小器官が再生され得るという事実だけでなく、総てのトランスフェクト細胞において多数のＲＰＢＬＡが観察されたことも驚きであり、これらの細胞の効率的な蓄積能力が示される。さらに、異なるトランスフェクト細胞種は、同程度の、融合タンパク質の局在性および蓄積パターンを示し（図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｄ参照）、このパターンは、ＰＢＩＳと融合する標的とは無関係であるように見える（図２Ｂおよび図２Ｃ）。
【００６７】
誘導されたＰＢＬＳの細胞内起源を解析するために、ＥＲマーカーとして使用される蛍光タンパク質についての配列を含むプラスミドｐＤｓＲｅｄ２−ＥＲ(Clontech)で細胞を同時トランスフェクトした。興味深いことに、図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆの両方より分かるように、ＲＸ３−ＣｔとＥＲマーカーは、ＥＲ内およびＰＢ様会合体内に共局在し、植物細胞において生じるのと同じ、哺乳類細胞において誘導されたＲＰＢＬＡのＥＲ起源を示している。
【００６８】
実施例３：形質転換した酵母細胞における融合タンパク質の蓄積
ＥＧＦおよびｈＧＨをコードする配列をＮ末端γ−ゼインコード配列ＲＸ３（ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、それらをベクターｐＹＸ２４３(R&D systems)に導入して、構築物ｃ１１７およびｃ１１８を得た。融合タンパク質ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ−ｈＧＨをコードするこれらの構築物をサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に導入した。
【００６９】
発現解析は、それらの形質転換体をガラクトース含有培地で増殖させることにより行い、細胞および培地のいずれもを等量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび組換え発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。図３Ａより分かるように、酵母細胞にＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質（レーンｃ１１７）もＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質（レーンｃ１１８）も蓄積したが、培地ではタンパク質の痕跡は検出されなかった。
【００７０】
構築物ｃ１３５およびｃ１２１（融合ＲＸ３−ｈＧＨタンパク質をコードする）およびｃ１３６（ｈＧＨタンパク質をコードする、図３Ｂ中の模式図参照）で形質転換した酵母ピキア・パストリスにおいてｈＧＨおよびｈＧＨ由来の融合物の蓄積も研究した。組換えタンパク質の蓄積レベルが最も高い形質転換体を選択した。
【００７１】
２つの異なるシグナルペプチド、γ−ゼインシグナルペプチド（図３Ｂ、ＳＰｇ）および酵母α因子プレプロペプチド（図３Ｂ、Ａｆプレプロ）を用いて、融合タンパク質を発現させた。さらに、ｈＧＨと直接融合した酵母α因子プレプロペプチドを用いることにより分泌の制御も解析した（図３Ｂ、ｃ１３６）。細胞および培地からの総タンパク質を、ウサギで惹起したｈＧＨに対する特異的抗体を用いることによりウエスタンブロット法により解析した。
【００７２】
予想どおりに、Ａｆプレプロペプチドを用いた場合には培地にｈＧＨが分泌された（図３Ｂ、レーンｃ１３６／ｍ）。これに対して、融合タンパク質ＲＸ３−ｈＧＨは、用いたシグナルペプチドには関係なく酵母細胞内に蓄積した。図３Ｂより分かるように、酵母Ａｆプレプロペプチドを用いた場合（レーンｃ１３５／ｙ）とγ−ゼインシグナルペプチドを用いた場合（レーンｃ１２１／ｙ）のどちらにおいても細胞内に融合タンパク質が存在したが、培地ではタンパク質の痕跡は検出されなかった（図示せず）。このように、γ−ゼインのＮ末端プロリンリッチドメインは、酵母細胞のエンドメンブレン区画内、さらに詳しくは、遠心分離によって分離することができるＰＢ様構造に対応する高密度画分内でのタンパク質保持を媒介するのに十分であった。
【００７３】
サッカロミセス・セレビシエおよびピキア・パストリスで得られた結果は、種子貯蔵タンパク質を含む融合タンパク質が会合し、ＰＢ様構造内で効率的に蓄積する、動植物界とは異なる他の真核生物の例である。
【００７４】
試験手順
哺乳類トランスフェクションのためのプラスミド構築物
成熟カルシトニン配列（Ｃｔ）に対応する合成遺伝子は、記載されているように得た（ＷＯ２００４００３２０７）。
【００７５】
活性ｈＥＧＦの５３アミノ酸をコードする合成遺伝子は、プライマーオーバーラップ伸長ＰＣＲ法により、２０個の重複塩基を含む約６０個の塩基からなる４オリゴヌクレオチドを用いて得た。合成ｈＥＧＦ  ｃＤＮＡには、第Ｘａ因子特異的切断部位に対応する５’リンカー配列を含めた。オリゴヌクレオチド（ＥＧＦ１配列番号２５；ＥＧＦ２配列番号２６；ＥＧＦ３配列番号２７；ＥＧＦ４配列番号２８）は、ポリアクリルアミド変性ゲルにより精製した。
【００７６】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の１９１アミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列は、ヒト下垂体ｃＤＮＡ(Clontech, BDBiosciences)から、ＰＣＲにより、エンテロキナーゼ切断部位に対応する配列を含むオリゴヌクレオチドＧＨ５（配列番号２９）およびＧＨ３（配列番号３０）を用いて得た。
【００７７】
成熟カルシトニン配列（Ｃｔ、ＷＯ２００４００３２０７）およびｈＥＧＦ配列に対応する合成遺伝子、ならびにｈＧＨをコードするｃＤＮＡを、ＲＸ３  Ｎ末端γ−ゼインコード配列（ＷＯ２００４００３２０７）と融合し、それらをｐＵＣ１８に導入した。ｐＵＣ１８由来プラスミドｐＵＣ１８ＲＸ３Ｃｔ、ｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ｇＨＧ（対応する融合タンパク質ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩで制限したベクターｐｃＤＮＡ３．１−(Invitrogen)に導入した。得られた構築物をｐ３．１ＲＸ３ＣＴ、ｐ３．１ＲＸ３ＥＧＦおよびｐ３．１ＲＸ３ｈＧＨと名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列はＣＭＶプロモーターとターミネーターｐＡ  ＢＧＨ下に存在した。
【００７８】
酵母形質転換のためのプラスミド構築物
宿主株およびベクター：
サッカロミセス・セレビシエ株（遺伝子型Ｍａｔａ  ｈｉｓ３  ｌｅｕ２  ｍｅｔ１５  ｕｒａ３  ｂａｒ１：：ＵＲＡ３）は、ベクターｐＹＸ２４３（ＧＡＬプロモーター、ＬＥＵ２、ＡｍｐＲ、R&D Systems製）由来の構築物を用いることにより形質転換した。ピキア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）とベクターｐＰＩＣ９およびｐＰＩＣ３．５Ｋ［ＡＯＸ１プロモーター、ＨＩＳ４、ＡｍｐＲ］は、Invitrogen life tech製であった。
【００７９】
プラスミド構築物：
上記のｐＵＣ１８由来のプラスミドｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨ（対応する融合タンパク質ＲＸ３−ＥＧＦおよびＲＸ３−ｈＧＨ配列を含む）のＳａｌＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ制限断片を、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）−Ｂａｍ  ＨＩで制限したベクターｐＹＸ２４３(R&D Systems)に導入した。得られた構築物をそれぞれ、ｃ１１７およびｃ１１８と名づけ、それらの構築物では融合タンパク質配列は誘導ＧＡＬプロモーター下に存在した。
【００８０】
ｐＵＣ１８由来のプラスミドｐＵＣ１８ＲＸ３ＥＧＦおよびｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨのＳａｌＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）制限断片を、ＮｏｔＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）で制限したベクターｐＰＩＣ３．５Ｋ(Invitrogen)に導入して、ピキア・パストリスを形質転換するためのプラスミドｃ１２０およびｃ１２１を得た。
【００８１】
プラスミドｐＰＩＣ９(Invitrogen)を用いて、酵母シグナルペプチド、すなわち、サッカロミセス属(Saccharomyces)のαプレプロペプチドを用いる融合タンパク質発現を解析した。ＲＸ３−ｈＧＨタンパク質およびｈＧＨタンパク質をコードするＸｈｏＩ−ＮｏｔＩがフランキングする配列は、ＰＣＲにより、鋳型としてのｐＵＣ１８ＲＸ３ｈＧＨと、オリゴヌクレオチドａｆ０６（配列番号３１）、ａｆＲＸ（配列番号３２）および０６Ｎｏｔ（配列番号３３）を用いて得た。
【００８２】
これらの配列には、αプレプロペプチドの効率的切断に必要な部位ＫＥＸ２をコードする配列を含めた（Invitrogen、Ｐｉｃｈｉａ発現キット）。それらのＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩで制限したｐＰＩＣ９にクローニングして、α因子プレプロペプチドと融合されたＲＸ３−ｈＧＨタンパク質配列およびｈＧＨタンパク質配列それぞれを含むプラスミドｃ１３５およびｃ１３６を得た。
酵母の形質転換
【００８３】
サッカロミセス・セレビシエ株（ｌｅｕ２）は、ＬｉＡｃ法(Ito et al. 1983, J. Bacteriol. 153:163-168)によりプラスミド構築物ｃ１１７およびｃ１１８で形質転換し、Ｌｅｕ−プレート上で形質転換体を選択した。発現解析は、それらの形質転換体をガラクトース含有培地(demanar composicio..)で増殖させることにより行った。
【００８４】
ピキア・パストリス株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）は、Ｐｉｃｈｉａ  ＥａｓｙＣｏｍｐキット(Invitrogen life tech.)により、ＳａｃＩ線状化ｃ１２０プラスミドおよびｃ１２１プラスミドで形質転換し、ＲＤＢ  Ｈｉｓ−培地にプレーティングした。Ｍｕｔ表現型は、コロニーをＭＤおよびＭＭ寒天平板上に線条接種することにより決定した。発現試験は、それらの形質転換体をＹＰＤ培地で２日間増殖させることにより実施した。その後、細胞を沈降させ、ＭＭ培地にさらに４８時間懸濁し、２４時間おきに終濃度０．５％までメタノールを加えた。組換えタンパク質の蓄積レベルが最も高い形質転換体を選択した。培地処方は、Invitrogen（Ｐｉｃｈｉａ発現キット）によって記載されているとおりとした。
【００８５】
酵母タンパク質の抽出およびウエスタンブロット法
組換え融合タンパク質を発現しているＳ．セレビシエおよびＰ．パストリスをペレット化した。解析するために、各インキュベーション培地のアリコートを沈殿させ、−２０℃にて保存した。細胞ペレットも冷凍し、解凍後、ガラスビーズと培地Ｈ（５０ｍＭ  ＨＣｌ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害薬）を用いる標準的な方法により細胞を破壊した。細胞および培地をいずれも等量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび組換え発現タンパク質に対する特異的抗体を用いることによる免疫ブロット法により解析した。
【００８６】
本明細書において引用する特許および論文はそれぞれ、引用することにより一部とされる。冠詞「ａ」または「ａｎ」の使用は、１以上を含むものとする。
【００８７】
上述の説明および実施例は、例示を目的としており、制限するものと解釈してはならない。本発明の精神および範囲内でさらに他の変形が可能であり、当業者ならば容易に分かるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】トランスフェクトした哺乳類細胞におけるγ−ゼイン由来のＲＸ３タンパク粒誘導配列に連結された各目的タンパク質としてカルシトニン（Ｃｔ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む融合タンパク質の蓄積を示すＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析の写真である。トランスフェクトした２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＣｏｓ１培養哺乳類細胞に蓄積された融合タンパク質ＲＸ３−Ｃｔ、ＲＸ３−ｈＧＨおよびＲＸ３−ＥＧＦが示されている。トランスフェクションの４４時間後に等量のトランスフェクト哺乳類細胞を抽出し、対応する総可溶性タンパク質を電気泳動および抗γ−ゼイン抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した。ＲＸ３−Ｃｔ融合タンパク質、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質をコードする構築物の模式図も含めている、「ｃ」＝細胞；「ＲＸ３」＝シグナルペプチドを含まないＮ末端プロリンリッチγ−ゼイン配列  「ｍ」＝培地。左側に分子量マーカー（単位ｋＤａ）を示している。
【図２】トランスフェクトした細胞内のＲＰＢＬＡにおける融合タンパク質の局在性を示す写真、６パネル（Ａ〜Ｆ）である。共焦点顕微鏡を使用して、ＲＸ３−ＣＴを発現しているＣｏｓ１細胞（図２Ａ）、ＲＸ３−Ｃｔ（図２Ｂ）およびＲＸ３−ＥＧＦ（図２Ｃ）を発現しているＣＨＯ細胞、ならびにＲＸ３−ＣｔおよびＤｓＲｅｄ２−ＥＲマーカータンパク質を同時発現している２９３Ｔ細胞（図２Ｄ、図２Ｅおよび図２Ｆ）を示した。抗γ−ゼイン血清を用いて、タンパク粒様構造（図２Ａ〜図２Ｄ）および小胞体（図２Ａ中の矢印参照）におけるＲＸ３由来の融合タンパク質の免疫局在を確認した。図２Ｅは、赤色蛍光ＤｓＲｅｄ２−ＥＲタンパク質マーカーで染色したＥＲを示す図である。図２Ｆは、ＥＲ内およびＰＢＬＳ内でのＲＸ３−ＣｔとＤｓＲｅｄ２の共局在を示す図２Ｄおよび図２Ｅの重ね合わせを示す図である。図２Ａおよび図２Ｃ中の挿入写真はＰＢＬＳの高倍率画像を示す。バー：１ミクロン。
【図３】２つのパネル（ＡおよびＢ）により形質転換した酵母細胞における融合タンパク質の蓄積を示している。図３Ａは、形質転換したサッカロミセス属におけるＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質（レーンｃ１１７）およびＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質（レーンｃ１１８）の蓄積を示す図である。細胞および培地からの総タンパク質抽出物の等量を特異的抗体を用いた免疫ブロット法により解析した。挿入物を含まないｐＹＸ２４３プラスミドで形質転換した細胞を対照（Ｃ）として使用した。各パネルの下部に、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質およびＲＸ３−ＥＧＦ融合タンパク質をコードする構築物の模式図を含めている。図３Ｂは、２つの異なるシグナルペプチドを用いることによりピキア・パストリスにおけるｈＧＨ含有融合タンパク質とＲＸ３−ｈＧＨ含有融合タンパク質の蓄積を示す図である。形質転換した細胞および培地からの総タンパク質抽出物の等量を特異的抗体を用いた免疫ブロット法により解析した。Ｃ１およびＣ２は、対照として使用したｐＰＩＣ９プラスミドおよびｐＰＩＣ３．５Ｋプラスミドそれぞれで形質転換した細胞を示している。パネルの下部に、ＲＸ３−ｈＧＨ融合タンパク質をコードする構築物ｃ１３５およびｃ１２１とｈＧＨをコードする構築物ｃ１３６の模式図を示している。図の左側に分子量マーカー（単位ｋＤａ）を示している、「ｙ」＝酵母細胞；「ｍ」＝培地；「ＳＰｇ」＝γ−ゼイン由来のシグナルペプチド；「ＲＸ３」＝シグナルペプチドを含まないＮ末端プロリンリッチγ−ゼイン配列；「ＥＧＦ」＝上皮成長因子；「ｈＧＨ」＝ヒト成長ホルモン；「Ａｆプレプロ」＝α因子プレプロペプチド。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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