(57)【要約】  本発明は、２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−ビタミンＤ類似体、具体的には、２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３、およびそれらの薬学的使用を開示する。この化合物は、未分化の細胞の増殖を阻止し且つ単球へのそれらの分化を誘導する場合に顕著な活性を示すので、抗癌剤としての、および乾癬などの皮膚疾患、更には、しわ、たるんだ皮膚、乾燥皮膚および不十分な皮脂分泌などの皮膚状態の処置のための使用が示される。この化合物は、更に、カルシウム血症活性（calcemic activity）を、あったとしてもほとんど有していないので、ヒトの自己免疫障害または炎症性疾患、更には、腎性骨ジストロフィを処置するのに用いることができる。この化合物は、更に、肥満症の処置または予防に用いることができる。【選択図】図１
2008520691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008520691.tif 000020
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物。
【請求項２】
Ｘ２が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１およびＸ２が双方ともｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
医薬組成物であって、有効量の少なくとも一つの請求項１に記載の化合物を、薬学的に許容しうる賦形剤と一緒に含有する医薬組成物。
【請求項６】
前記有効量が、１グラムの組成物につき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを構成する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記有効量が、１グラムの組成物につき約０．１μｇ〜約５００μｇを構成する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
式：
【化２】
2008520691.tif 000021
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３。
【請求項９】
医薬組成物であって、有効量の２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３を、薬学的に許容しうる賦形剤と一緒に含有する医薬組成物。
【請求項１０】
前記有効量が、１グラムの組成物につき約０．０１μｇ〜約１０００μｇを構成する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記有効量が、１グラムの組成物につき約０．１μｇ〜約５００μｇを構成する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
乾癬を処置する方法であって、乾癬を有する対象に、有効量の式：
【化３】
2008520691.tif 000022
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
化合物を経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物を非経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
化合物を経皮投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
化合物を局所投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
化合物を直腸投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
化合物を鼻腔内投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
化合物を舌下投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、式：
【化４】
2008520691.tif 000023
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌または前立腺癌から成る群より選択される疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に、有効量の式：
【化５】
2008520691.tif 000024
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項２３】
化合物を経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
化合物を非経口投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
化合物を経皮投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
化合物を直腸投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
化合物を鼻腔内投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
化合物を舌下投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
化合物が、式：
【化６】
2008520691.tif 000025
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応および臓器移植拒絶反応から成る群より選択される自己免疫疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に、有効量の式：
【化７】
2008520691.tif 000026
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項３２】
化合物を経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物を非経口投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
化合物を経皮投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物を直腸投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
化合物を鼻腔内投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
化合物を舌下投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
化合物が、式：
【化８】
2008520691.tif 000027
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
関節リウマチ、喘息および炎症性腸疾患から成る群より選択される炎症性疾患を処置する方法であって、該疾患を有する対象に、有効量の式：
【化９】
2008520691.tif 000028
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項４１】
化合物を経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
化合物を非経口投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
化合物を経皮投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
化合物を直腸投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
化合物を舌下投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
化合物が、式：
【化１０】
2008520691.tif 000029
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
しわ、適切な皮膚引き締めの欠如、適切な皮膚水和の欠如および不十分な皮脂分泌から成る群より選択される皮膚状態を処置する方法であって、該皮膚状態を有する対象に、有効量の式：
【化１１】
2008520691.tif 000030
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項５０】
化合物を経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
化合物を非経口投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
化合物を経皮投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
化合物を局所投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
化合物を直腸投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
化合物を鼻腔内投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
化合物を舌下投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
化合物が、式：
【化１２】
2008520691.tif 000031
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
腎性骨ジストロフィを処置する方法であって、腎性骨ジストロフィを有する対象に、有効量の式：
【化１３】
2008520691.tif 000032
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項６０】
化合物を経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
化合物を非経口投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
化合物を経皮投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
化合物を直腸投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
化合物を鼻腔内投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
化合物を舌下投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
化合物が、式：
【化１４】
2008520691.tif 000033
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
動物の肥満症を処置するまたは予防する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害するおよび／または動物の体脂肪を減少させる方法であって、それを必要としている動物に、有効量の式：
【化１５】
2008520691.tif 000034
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を有する化合物を投与することを含む方法。
【請求項６９】
化合物を経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
化合物を非経口投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
化合物を経皮投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
化合物を直腸投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
化合物を鼻腔内投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
化合物を舌下投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
化合物を、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投薬量で投与する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
化合物が、式：
【化１６】
2008520691.tif 000035
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
動物がヒトである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７８】
動物が家畜である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
動物が農産物用動物である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
式：
【化１７】
2008520691.tif 000036
を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ビタミンＤ化合物、より具体的には、２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３およびその薬学的使用に関する。
【０００２】
天然ホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３およびそのエルゴステロール系列の類似体、すなわち、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２は、動物およびヒトのカルシウムホメオスタシスのきわめて強力な調節因子であることが知られているが、細胞分化におけるそれらの活性も確かめられた（Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987)）。これら代謝産物の多数の構造類似体が、製造され且つ調べられており、１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、種々の側鎖同族ビタミンおよびフッ素化類似体が含まれる。若干のこれら化合物は、細胞分化およびカルシウム調節において興味深い活性の分離を示す。この活性の相違は、腎性骨ジストロフィ、ビタミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬およびある種の悪性疾患などのいろいろな疾患の処置に有用でありうる。
【０００３】
別のクラスのビタミンＤ類似体、すなわち、いわゆる１９−ノルビタミンＤ化合物は、ビタミンＤ系に典型的なＡ環環外メチレン基（炭素１９）が２個の水素原子で置換されていることを特徴とする。このような１９−ノル類似体（例えば、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノルビタミンＤ３）の生物学的試験は、細胞分化を誘導する場合に高力価を有する選択的活性プロフィールと、きわめて低いカルシウム動員活性を示した。したがって、これら化合物は、悪性疾患の処置またはいろいろな皮膚障害の処置のための治療薬として潜在的に有用である。このような１９−ノルビタミンＤ類似体について二つの異なった合成方法が記載された（Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991)および DeLuca et al., 米国特許第５，０８６，１９１号）。
【０００４】
米国特許第４，６６６，６３４号には、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の２β−ヒドロキシおよびアルコキシ（例えば、ＥＤ−７１）類似体が記載されており、中外グループにより、骨粗鬆症に可能性がある薬物としておよび抗腫瘍薬として検討された。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989) も参照されたい。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の他の２−置換（ヒドロキシアルキル基で、例えば、ＥＤ−１２０、およびフルオロアルキル基で）Ａ環類似体も、製造され且つ調べられた（Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), and J. Org. Chem. 60, 4617 (1995)）。
【０００５】
１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノルビタミンＤ３の２−置換類似体、すなわち、２位にヒドロキシ基またはアルコキシ基で（DeLuca et al., 米国特許第５，５３６，７１３号）、２−アルキル基で（DeLuca et al., 米国特許第５，９４５，４１０号）および２−アルキリデン基で（DeLuca et al., 米国特許第５，８４３，９２８号）置換された化合物も合成されたが、それらは、興味深い且つ選択的な活性プロフィールを示す。これら研究は総て、ビタミンＤ受容体中の結合部位が、合成されたビタミンＤ類似体のＣ−２位の異なった置換基を収容しうるということを示している。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンＤ化合物の１９−ノルクラスを探求し続ける努力において、炭素２（Ｃ−２）にメチレン置換基、炭素１（Ｃ−１）にヒドロキシル基、および炭素２０（Ｃ−２０）へ結合した短い側鎖の存在を特徴とする類似体も、合成され且つ調べられた。１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノルプレグナカルシフェロールは、米国特許第６，５６６，３５２号に記載され、１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノルホモプレグナカルシフェロールは、米国特許第６，５７９，８６１号に記載され、そして１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノルビスホモプレグナカルシフェロールは、米国特許第６，６２７，６２２号に記載されている。３種類のこれら化合物は総て、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、ビタミンＤ受容体への比較的高い結合活性および比較的高い細胞分化活性を有するが、カルシウム血症活性（calcemic activity）は、あったとしても僅かしかない。それらの生物学的活性は、第６，５６６，３５２号、第６，５７９，８６１号および第６，６２７，６２２号特許に示されるように、これら化合物を、いろいろな薬学的使用のための優れた候補にする。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−ビタミンＤ類似体、より具体的には、２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３、それらの生物学的活性、およびこれら化合物のいろいろな薬学的使用に関する。
【０００８】
構造的には、これら類似体は、下に示される一般式Ｉ：
【０００９】
【化１】
2008520691.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであってよいしまたは異なっていてよく、各々、水素またはヒドロキシ保護基より選択される）
を特徴とする。好ましい類似体は、次の式Ｉａ：
【００１１】
【化２】
2008520691.tif 000004
【００１２】
を有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３である。
【００１３】
式Ｉを有する上の化合物、特に、式Ｉａを有する化合物は、望ましい且つきわめて好都合な生物学的活性パターンを示す。これら化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の場合と比較したところ、ビタミンＤ受容体への比較的高い結合を特徴とするが、きわめて低い腸管カルシウム輸送活性を特徴とし、そして１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、カルシウムを骨から動員する能力がきわめて低い。したがって、これら化合物は、カルシウム血症活性があったとしても僅かしかないと特性決定することができる。プレプロ副甲状腺ホルモン遺伝子（Darwish & DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999）および副甲状腺増殖を抑制する場合、血清カルシウムを超生理学的レベルへと上昇させることは望ましくない。カルシウム血症活性を全くまたはほとんど有していないが、分化にはきわめて活性であるこれら類似体は、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の抑制のための療法として有用であると考えられる。
【００１４】
本発明の化合物Ｉ、特に、Ｉａは、更に、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応および臓器移植拒絶反応を含めた自己免疫疾患の場合のヒトの不調の処置および予防に；そして更に、関節リウマチ、喘息、およびセリアック病、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患のような炎症性疾患の処置に特に適していることが発見された。ざ瘡、脱毛症および高血圧症は、本発明の化合物で処置することができる他の状態である。
【００１５】
上の化合物Ｉ、特に、Ｉａは、更に、比較的高い細胞分化活性を特徴とする。したがって、これら化合物は、更に、乾癬の処置用に、または抗癌剤として、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対して、治療薬を提供する。更に、それらの比較的高い細胞分化活性ゆえに、これら化合物は、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、および不十分な皮脂分泌を含めたいろいろな皮膚状態の処置用の治療薬を提供する。したがって、これら化合物の使用は、皮膚に湿気を与える結果となるのみならず、皮膚のバリア機能も改善する。
【００１６】
式Ｉ、特に、式Ｉａを有する本発明の化合物は、更に、動物対象の肥満症を予防するまたは処置する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害するおよび／または体脂肪を減少させる場合に有用である。したがって、若干の態様において、動物対象の肥満症を予防するまたは処置する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害するおよび／または体脂肪を減少させる方法は、その動物対象に、式Ｉを有する一つまたはそれを超える化合物、または一つまたはそれを超える化合物を包含する医薬組成物の有効量を投与することを包含する。一つまたはそれを超える化合物または医薬組成物の対象への投与は、動物対象の脂肪細胞分化を阻害する、遺伝子転写を阻害する、および／または体脂肪を減少させる。
【００１７】
一つまたはそれを超える化合物は、上述の疾患および不調を処置するための組成物中に、組成物１グラムあたり約０．０１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは、約０．１μｇ〜約５００μｇの量で存在してよく、そして局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下にまたは非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の投薬量で投与することができる。
【００１８】
図１〜６は、以下、「ＯＭ」と称される２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３の、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、以下、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と比較したところの種々の生物学的活性を示す。
【００１９】
発明の詳細な説明
２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３（本明細書中において、ＯＭと称される）を、合成し且つ調べた。構造的には、この１９−ノル類似体およびその（保護されたヒドロキシの形の）プロドラッグは、本明細書中の前に示された一般式Ｉを特徴とし、類似体ＯＭ自体は、式Ｉａを特徴とする。
【００２０】
構造Ｉａを有する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３並びに化合物Ｉの製造は、共通の一般的な方法、すなわち、二環式 Windaus-Grundmann 型ケトンIIとアリルホスフィンオキシドIIIとを対応する２−メチレン−１９，２６，２７−トリノルビタミンＤ類似体IVへと縮合後、この化合物のＣ−１およびＣ−３における脱保護によって達成することができる。
【００２１】
【化３】
2008520691.tif 000005
【００２２】
構造IIIおよびIVにおいて、基Ｘ１およびＸ２は、ヒドロキシ保護基、好ましくは、ｔ−ブチルジメチルシリルであるが、当該技術分野において周知であるように、感受性であるかもしれないまたは縮合反応の妨げになるいずれかの官能基は、適当に保護されるということも理解される。上に示された方法は、ビタミンＤ化合物の製造に有効に適用された収束的合成概念の応用である［例えば、Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590(1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449(1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414(1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098(1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264(1986); J. Org. Chem. 51, 1269(1986); DeLuca et al., 米国特許第５，０８６，１９１号；DeLuca et al., 米国特許第５，５３６，７１３号］。
【００２３】
一般的な構造IIを有するヒドロインダノンは、知られていない。それは、スキーム１およびスキーム２に示される方法によって製造することができる（化合物ＯＭの製造を参照されたい）。
【００２４】
一般的な構造IIIを有する必要なホスフィンオキシドの製造について、Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663(1991)およびDeLuca et al.,米国特許第５，０８６，１９１号に記載のように、市販の（１Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−（−）−キナ酸より容易に得られるメチルキニケート（methyl quinicate）誘導体から出発する合成経路が開発された。
【００２５】
化合物ＩおよびＩａの合成方法全体は、本明細書中にその明細書が具体的に援用される、「2-Alkylidene-19-Nor-Vitamine D Compounds」という表題の米国特許第５，８４３，９２８号に示され、より完全に記載されている。
【００２６】
本明細書中および請求の範囲中で用いられる「ヒドロキシ保護基」という用語は、ヒドロキシ官能基の一時的保護に一般的に用いられるいずれかの基、例えば、アルコキシカルボニル基、アシル基、アルキルシリル基またはアルキルアリールシリル基（以下、簡単に「シリル」基と称される）およびアルコキシアルキル基などを意味する。アルコキシカルボニル保護基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルなどのアルキル−Ｏ−ＣＯ−群である。「アシル」という用語は、１〜６個の炭素を有するアルカノイル基であって、その総ての異性体の形；またはオキサリル基、マロニル基、スクシニル基、グルタリル基のような、１〜６個の炭素を有するカルボキシアルカノイル基；またはベンゾイル基、またはハロ、ニトロまたはアルキルで置換されたベンゾイル基などの芳香族アシル基を意味する。本明細書または請求の範囲中で用いられる「アルキル」という語は、１〜１０個の炭素を有する直鎖または分岐状アルキル基であって、その総ての異性体の形を意味する。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチルまたはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルなどの群である。好ましいシリル保護基は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ジブチルメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、フェニルジメチルシリル基、ジフェニル−ｔ−ブチルシリル基および類似のアルキル化シリル基である。「アリール」という用語は、フェニル基、またはアルキル、ニトロまたはハロで置換されたフェニル基を示している。
【００２７】
「保護されたヒドロキシ」基は、ヒドロキシ官能基の一時的または永久的保護に一般的に用いられる上のいずれかの基、例えば、前に定義のシリル基、アルコキシアルキル基、アシル基またはアルコキシカルボニル基によって保護されたまたは誘導体化されたヒドロキシ基である。「ヒドロキシアルキル」、「ジュウテロアルキル」および「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ、１個またはそれを超えるヒドロキシ基、ジュウテリウム基またはフルオロ基で置換されたアルキル基を意味する。
【００２８】
より具体的には、化合物ＯＭの製造の詳細な説明については、次の説明並びに本明細書中のスキーム１、２および３を参照されたい。
【００２９】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−（ヒドロキシメチル）プレグナン（２）の製造。
【００３０】
メタノール（２５０ｍＬ）およびピリジン（２．４４ｇ，２．５ｍＬ，３１ｍｍｏｌ）中のビタミンＤ２（３ｇ，７．６ｍｍｏｌ）の溶液に、オゾンを−７８℃で５０分間通過させた。次に、その反応混合物を、酸素で１５分間フラッシして、残留するオゾンを除去し、その溶液をＮａＢＨ４（０．７５ｇ，２０ｍｍｏｌ）で処理した。２０分後、第二部分のＮａＢＨ４（０．７５ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温に暖めた。次に、第三部分のＮａＢＨ４（０．７５ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１８時間撹拌した。その反応を、水（４０ｍＬ）でクエンチし、溶液を減圧下で濃縮した。残留物を、酢酸エチル（３ｘ８０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を、１ＭＨＣｌ水溶液、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（７５：２５）でクロマトグラフィー分離して、（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−２０−（ヒドロキシメチル）プレグナン−８β−オール１（１．２１ｇ，７５％収率）を白色結晶として得た。
【００３１】
tert−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（３．２４ｍＬ，３．７２ｇ，１４．１ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の８β，２０−ジオール１（１ｇ，４．７ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（１．６４ｍＬ，１．５１ｇ，１４．１ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。その混合物を、アルゴン下において０℃で１時間、次に室温で１８時間撹拌した。その反応を、水（５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中に溶解させ、トリエチルアミン（３ｍＬ，２．１７ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）およびフッ化テトラブチルアンモニウム溶液（ＴＨＦ中の１Ｍ，６．５ｍＬ，６．５ｍｍｏｌ）を加えた後、新たに活性化されたモレキュラーシーブ４Ａ（３ｇ）を加えた。その反応混合物を、アルゴン下において室温で４時間撹拌後、短層のCeliteを介して濾過し、蒸発させた。残留物を、酢酸エチル（３０ｍＬ）中に溶解させ、ブラインで、水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。純粋なアルコール２（１．４２ｇ，９３％収率）を、シリカゲル上のクロマトグラフィーによりヘキサン／酢酸エチル（９７．５：２．５→９５：５）で、無色油状物として単離した。
【００３２】
【化４】
2008520691.tif 000006
【００３３】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−ホルミルプレグナン（３）の製造。
【００３４】
三酸化硫黄ピリジン錯体（１．３２ｇ，８．２８ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン（２０ｍＬ）および無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中のアルコール２（４５１ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（９６０μＬ，６９７ｍｇ，６．９ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。その反応混合物を、アルゴン下において０℃で２０分間撹拌後、濃縮した。残留物を、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによりヘキサン／酢酸エチル（９５：５）で精製して、アルデヒド３（３６４ｍｇ，８１％収率）を油状物として得た。
【００３５】
【化５】
2008520691.tif 000007
【００３６】
（２０Ｒ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−（ヒドロキシメチル）プレグナン（４）の製造。
【００３７】
アルデヒド３（３６４ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（１５ｍＬ）中に溶解させ、４０％ｎ−Ｂｕ４ＮＯＨ水溶液（１．４７ｍＬ，１．４５ｇ，２．２４ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、アルゴン下において室温で１６時間撹拌し、塩化メチレン（２０ｍＬ）で希釈し、水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（９５：５）でクロマトグラフィー分離して、（１Ｈ  ＮＭＲで）約１：２の比率のアルデヒド３とその２０−エピマー（２９２ｍｇ，８０％収率）の混合物を与えた。
【００３８】
このアルデヒド混合物（２９２ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させ、ＮａＢＨ４（６４ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）を加えた後、エタノール（５ｍＬ）を滴下した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、そしてそれを、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でクエンチした。その混合物を、エーテル（３ｘ２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を、水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（９６：４→８０：２０）でクロマトグラフィー分離して、所望の純粋な（２０Ｒ）−アルコール４（１６０ｍｇ，５５％収率）を油状物として得、そして（１Ｈ  ＮＭＲで）約１：３の比率の４とその２０−エピマー２（１２６ｍｇ，４３％収率）の混合物を得た。
【００３９】
【化６】
2008520691.tif 000008
【００４０】
（２０Ｒ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−（ヨードメチル）プレグナン（５）の製造。
【００４１】
塩化メチレン（３０ｍＬ）中のヨウ素（４７１ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）の溶液を、塩化メチレン（１５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（４８２ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（２５０ｍｇ，３．６８ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で徐々に加えた。１５分後、塩化メチレン（３ｍＬ）中のアルコール４（１４９ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を、その混合物中に加えた。０℃で２０分間、次に室温で１８時間撹拌した後、反応混合物を水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（９７：３）でクロマトグラフィー分離して、所望のヨウ化物５（２０１ｍｇ，１００％）を得た。
【００４２】
【化７】
2008520691.tif 000009
【００４３】
Ｃ１９Ｈ３７ＯＳｉＩ（Ｍ＋）の正確な理論質量４３６．１６５８，実測値４３６．１６７２。
【００４４】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−（３−イソプロポキシカルボニル）プロピルプレグナン（６）の製造。
【００４５】
亜鉛粉末（１２４ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（４ｍＬ）およびアクリル酸イソプロピル（２３５μＬ，２１７ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）の混合物を、５０℃に加温後、塩化ニッケル（II）六水和物（１０９ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、６５℃に加温し、そしてその緑色が帯赤褐色に変わるまで２時間撹拌した。０℃に冷却後、無水ピリジン（３ｍＬ）中のヨウ化物５（２２２ｍｇ，０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。その混合物を酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、そして得られた沈殿を、Celiteパッドを介して濾去した。その濾液を、５％ＨＣｌ水溶液およびブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサンおよびヘキサン／酢酸エチル（９５：５）でクロマトグラフィー分離して、エステル６（１７７ｍｇ，８２％）を得た。
【００４６】
【化８】
2008520691.tif 000010
【００４７】
Ｃ２５Ｈ４８Ｏ３Ｓｉ（Ｍ＋）の正確な理論質量４２４．３３７３，実測値４２４．３３７１。
【００４８】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−（４−ヒドロキシ）ブチルプレグナン（７）の製造。
【００４９】
水素化アルミニウムリチウム（２０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中のエステル６（１８８ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌後、冷却浴を除去し、そして撹拌を室温で更に１９時間続けた。過剰の水素化物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液の注意深い逐次的添加によってクエンチした。塩化メチレン（１５ｍＬ）およびCelite（０．５ｇ）を加え、そのスラリーを２０分間撹拌した。Celite パッドを介してスラリーを真空濾過することにより、アルミニウム塩を分離した。その塩を、塩化メチレンで繰り返し洗浄した。濾液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（９０：１０）でクロマトグラフィー分離して、アルコール７（９６ｍｇ，９３％収率）を無色油状物として与えた。
【００５０】
【化９】
2008520691.tif 000011
【００５１】
Ｃ１８Ｈ３５Ｏ２Ｓｉ（Ｍ＋−Ｃ４Ｈ９）の正確な理論質量３１１．２４０６，実測値３１１．２３９７。
【００５２】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−８β−（tert−ブチルジメチルシリル）オキシ−２０−ブチルプレグナン（８）の製造。
【００５３】
無水塩化メチレン（５ｍＬ）中のアルコール７（９５ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４５μＬ，１０５ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（６８ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。冷却浴を除去し、撹拌を２２時間続けた。塩化メチレン（２０ｍＬ）を加え、その混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解させ、その溶液に０℃で、水素化アルミニウムリチウム（３２ｍｇ，０．８４ｍｍｏｌ）を加えた。冷却浴を除去し、混合物を室温で１８時間撹拌した。過剰の水素化物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液の注意深い逐次的添加によってクエンチした。塩化メチレン（１５ｍＬ）およびCelite（０．５ｇ）を加え、そのスラリーを２０分間撹拌した。Celiteパッドを介してスラリーを真空濾過することにより、アルミニウム塩を分離した。その塩を、塩化メチレンで繰り返し洗浄した。濾液を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル上においてヘキサン／酢酸エチル（９７：３）でクロマトグラフィー分離して、生成物８（８５ｍｇ，９３％収率）を得た。
【００５４】
【化１０】
2008520691.tif 000012
【００５５】
Ｃ１８Ｈ３５ＯＳｉ（Ｍ＋−Ｃ４Ｈ９）の正確な理論質量２９５．２４５７，実測値２９５．２４５４。
【００５６】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−２０−ブチルプレグナン−８β−オール（９）の製造。
【００５７】
保護されたアルコール８（８４ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（５ｍＬ）および無水メタノール（５ｍＬ）中に溶解させた。フッ化水素−ピリジン錯体（４ｍＬ）を加えて室温にし、その混合物を１９時間撹拌した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、そして有機相を、ブラインおよび水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物をヘキサンで希釈し、そしてシリカゲル上においてヘキサンでクロマトグラフィー分離して、生成物９（１７ｍｇ，３０％収率）を無色油状物として得た。
【００５８】
【化１１】
2008520691.tif 000013
【００５９】
（２０Ｓ）−デ−Ａ，Ｂ−２０−ブチルプレグナン−８−オン（II）の製造。
【００６０】
二クロム酸ピリジニウム（１１８ｍｇ，３１４μｍｏｌ）を、無水塩化メチレン（５ｍＬ）中のアルコール９（１５ｍｇ，６３μｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（２ｍｇ，８μｍｏｌ）の溶液に加えた。得られた懸濁液を、室温で２時間撹拌した。反応混合物を、Waters シリカ Sep-Pak カートリッジ（５ｇ）を介して濾過し、それを、ヘキサン／酢酸エチル（９５：５）で更に洗浄した。溶媒を除去後、ケトンII（１２ｍｇ，８１％収率）を無色油状物として得た。
【００６１】
【化１２】
2008520691.tif 000014
【００６２】
（２０Ｓ）−２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−１α−ヒドロキシカルシフェロール（Ｉ）の製造。
【００６３】
無水ＴＨＦ（６００μＬ）中のホスフィンオキシド１１（６０ｍｇ，１０３μｍｏｌ）の溶液に−２０℃で、ＰｈＬｉ（シクロヘキサン−エーテル中の１．８Ｍ，６０μＬ，１０８μｍｏｌ）を、アルゴン下において撹拌しながら徐々に加えた。その溶液は深橙色に変わった。３０分後、混合物を−７８℃に冷却し、そして無水ＴＨＦ（２００μＬ）中のケトンII（１２ｍｇ，５１μｍｏｌ）の予め冷却された（−７８℃）溶液を徐々に加えた。その混合物を、アルゴン下において−７８℃で３時間、そして０℃で１８時間撹拌した。酢酸エチルを加え、有機相をブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させた。残留物をヘキサン中に溶解させ、そして Waters シリカ Sep-Pak カートリッジ（２ｇ）に適用した。そのカートリッジを、ヘキサンおよびヘキサン／酢酸エチル（９９．５：０．５）で洗浄して、１９−ノルビタミン誘導体１２（１３ｍｇ）を得た。次に、Sep-Pak をヘキサン／酢酸エチル（９６：４）で洗浄して、未変化のＣ，Ｄ−環ケトンII（６ｍｇ，２５μｍｏｌ）を回収し、そして酢酸エチルで洗浄して、ジフェニルホスフィンオキシド１１（５６ｍｇ）を回収した。保護されたビタミン１２を、ＨＰＬＣ（９．４ｘ２５０ｍｍ Zorbax-Silica カラム，４ｍＬ／分）により、ヘキサン／２−プロパノール（９９．９：０．１）溶媒系を用いて更に精製した。純粋な化合物１２（８．３ｍｇ，５３％収率）を、Ｒｔ＝３．２分で無色油状物として溶離した。
【００６４】
【化１３】
2008520691.tif 000015
【００６５】
Ｃ３７Ｈ６８Ｏ２Ｓｉ２（Ｍ＋）の正確な理論質量６００．４７５８，実測値６００．４７４２。
【００６６】
保護されたビタミン１２（８ｍｇ，１３μｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解させ、そしてフッ化テトラブチルアンモニウム溶液（ＴＨＦ中の１Ｍ，１００μＬ，１００μｍｏｌ）を加えた後、新たに活性化されたモレキュラーシーブ４Ａ（３００ｍｇ）を加えた。その混合物を、アルゴン下において室温で４時間撹拌後、２ｍＬのヘキサン／酢酸エチル（９：１）で希釈し、そして Waters シリカ Sep-Pak カートリッジ（２ｇ）に適用した。同溶媒系での溶離は、粗生成物Ｉを生じ、それを、ＨＰＬＣ（９．４ｘ２５０ｍｍ Zorbax-Silica カラム，４ｍＬ／分）により、ヘキサン／２−プロパノール（９：１）溶媒系を用いて更に精製した。分析的に純粋な２−メチレン−１９−ノルビタミンＩ（３．５９ｍｇ，７４％収率）を、Ｒｔ＝６．４分で無色油状物として集めた。
【００６７】
ＵＶ（ＥｔＯＨ中）λｍａｘ＝２６１，２５１，２４３ｎｍ；
【００６８】
【化１４】
2008520691.tif 000016
【００６９】
Ｃ２５Ｈ４０Ｏ２（Ｍ＋）の正確な理論質量３７２．３０２８，実測値３７２．３０３９。
【００７０】
【化１５】
2008520691.tif 000017
【００７１】
【化１６】
2008520691.tif 000018
【００７２】
【化１７】
2008520691.tif 000019
【００７３】
２−メチレン−１９，２６，２７−トリノル−（２０Ｓ）−１α−ヒドロキシビタミンＤ３の生物学的活性
１α−ヒドロキシ−１９−ノル−（２０Ｓ）−ビタミンＤ３の２位へのメチレン基の導入、およびその側鎖中の２６位および２７位における２個のメチル基の除去は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較したところ、完全長リコンビナントラットビタミンＤ受容体への結合にほとんどまたは全く影響しなかった。化合物ＯＭは、標準の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３と比較したところ、受容体へ同等に十分に結合した（図１）。これら結果から、化合物ＯＭは、同等の生物学的活性を有するであろうと考えられうる。しかしながら、驚くべきことに、化合物ＯＭは、独特の生物学的活性を有するきわめて選択的な類似体である。
【００７４】
図６は、ＯＭが、腸管カルシウム輸送を刺激することにおいて、天然ホルモンである１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）の場合と比較したところ、活性をほとんど有していないということを示している。
【００７５】
図４および図５は、ＯＭが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較したところ、骨カルシウム動員活性をほとんど有していないということを示している。
【００７６】
したがって、図４〜６は、ＯＭが、カルシウム血症活性を、あったとしてもほとんど有していないと特性決定することができるということを示している。
【００７７】
図２は、ＯＭが、ＨＬ−６０細胞分化について、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とほぼ同程度に強力であるということを示しており、それを、乾癬および癌の処置のための、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対して優れた候補としている。更に、その比較的高い細胞分化活性ゆえに、この化合物は、しわ、適切な皮膚水和の欠如、すなわち、乾燥皮膚、適切な皮膚引き締めの欠如、すなわち、たるんだ皮膚、および不十分な皮脂分泌を含めたいろいろな皮膚状態の処置用の治療薬を与える。したがって、この化合物の使用は、皮膚に湿気を与える結果となるのみならず、皮膚のバリア機能も改善する。
【００７８】
図３は、化合物ＯＭが、骨細胞中において転写活性を有するが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３ほどではないということを示している。この結果は、図２の細胞分化活性とともに、ＯＭは、細胞分化を引き起こす場合におよび細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有することから、それが乾癬にきわめて有効であろうということを示唆している。これらデータは、更に、ＯＭが、抗癌剤として、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対して、有意の活性を有することがありうるということを示している。ＨＬ−６０分化へのＯＭの強い活性は、それが、副甲状腺の増殖を抑制する場合におよびプレプロ副甲状腺遺伝子の抑制において活性であろうということを示唆している。
【００７９】
実験方法
ビタミンＤ受容体結合
試験材料
タンパク質源
完全長リコンビナントラット受容体は、大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）Codon Plus ＲＩＬ細胞中で発現させ、そして二つの異なったカラムクロマトグラフィーシステムを用いて精製して均一にした。最初のシステムは、このタンパク質上のＣ末端ヒスチジン標識を利用するニッケルアフィニティー樹脂であった。この樹脂から溶離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−Sepharose Fast Flow）を用いて更に精製した。精製されたタンパク質のアリコートを、液体窒素中で急速冷凍し、そして−８０℃で使用まで貯蔵した。結合検定において用いるために、そのタンパク質を、０．１％ Chaps洗浄剤を含むＴＥＤＫ５０（５０ｍＭ Tris，１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４，５ｍＭ  ＤＴＴ，１５０ｍＭ  ＫＣｌ）中で希釈した。受容体タンパク質およびリガンド濃度を最適化して、２０％以下の加えられた放射性標識リガンドが受容体に結合するようにした。
【００８０】
研究用薬物
未標識リガンドを、エタノール中に溶解させ、そしてＵＶ分光光度法を用いて、濃度を決定した（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３：モル吸光係数＝１８，２００およびλｍａｘ＝２６５ｎｍ；類似体：モル吸光係数＝４２，０００およびλｍａｘ＝２５２ｎｍ）。放射性標識リガンド（３Ｈ−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３，約１５９Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を、エタノール中において１ｎＭの最終濃度で加えた。
【００８１】
検定条件
放射性標識リガンドおよび未標識リガンドを、≦１０％の最終エタノール濃度で希釈された１００ｍｃｌのタンパク質に加え、混合し、そして氷上で一晩インキュベートして、結合平衡に達しさせた。翌日、１００ｍｃｌのヒドロキシルアパタイトスラリー（５０％）を、各々の試験管に加え、１０分間隔で３０分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを、遠心分離によって集めた後、０．５％ Titron Ｘ−１００を含有するTris−ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭ Tris，１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した。最後の洗浄後、ペレットを、４ｍｌのBiosafe IIシンチレーション混合物が入っているシンチレーションバイアルに移し、混合し、そしてシンチレーション計数計に入れた。放射性標識リガンドのみが入っている試験管から、全結合を決定した。
【００８２】
ＨＬ−６０分化
試験材料
研究用薬物
研究用薬物を、エタノール中に溶解させ、そしてＵＶ分光光度法を用いて、濃度を決定した。連続希釈を作成して、一定範囲の薬物濃度を、細胞培養物中に存在するエタノールの最終濃度（≦０．２％）を変更することなく調べうるようにした。
【００８３】
細胞
ヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。それら細胞を、５％ＣＯ２の存在下において３７℃でインキュベートした。
【００８４】
検定条件
ＨＬ６０細胞を、１．２ｘ１０５個／ｍｌでプレーティングした。プレーティングから１８時間後、二重反復試験における細胞を薬物で処理した。４日後、それら細胞を採取し、ニトロブルーテトラゾリウム還元検定を行った（Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974）。分化した細胞の百分率を、全２００個の細胞を計数し且つ細胞内に黒〜青色ホルマザン沈着物を含有した数を記録することによって決定した。単球細胞への分化の確認は、食細胞活性を測定することによって決定した（データは示されていない）。
【００８５】
in vitro転写検定
転写活性は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に２４−ヒドロキシラーゼ（２４Ｏｈａｓｅ）遺伝子プロモーターで安定してトランスフェクションされたＲＯＳ１７／２．８（骨）細胞中で測定した（Arbour et al., 1998）。細胞を、一定範囲の用量で与えた。投与から１６時間後、細胞を採取し、そしてルミノメーターを用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８６】
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位。
【００８７】
腸管カルシウム輸送および骨カルシウム動員
雄の離乳したSprague-Dawleyラットを、Diet １１（０．４７％Ｃａ）飼料＋ＡＥＫで１週間、次に、Diet １１（０．０２％Ｃａ）＋ＡＥＫで３週間の下に置いた。次に、それらラットを、０．４７％Ｃａを含有する飼料を１週間、次に、０．０２％Ｃａを含有する飼料で２週間へと切り換えた。用量投与は、０．０２％カルシウム飼料での最終週の間に開始した。４回連続したｉｐ用量を、約２４時間隔てて与えた。最後の用量から２４時間後、切断された頸部から血液を集め、血清カルシウム濃度を、骨カルシウム動員の尺度として決定した。最初の１０ｃｍの腸管も、反転腸管法（everted gut sac method）を用いた腸管カルシウム輸送分析のために集めた。
【００８８】
データの解釈
ＶＤＲ結合、ＨＬ６０細胞分化および転写活性。
【００８９】
ＯＭ（Ｋｉ＝７．７ｘ１０−１１Ｍ）は、完全長リコンビナントラットビタミンＤ受容体への結合について［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３と競合する能力が、天然ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｋｉ＝４．４ｘ１０−１１Ｍ）とほぼ同等である（図１）。更に、ＨＬ６０分化を促進する能力（効力または力価）には、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝２．９ｘ１０−９Ｍ）と比較したところ、ＯＭ（ＥＣ５０＝４．７ｘ１０−９Ｍ）との間にほとんど差がない（図２を参照されたい）。化合物ＯＭ（ＥＣ５０＝３．２ｘ１０−９Ｍ）は、骨細胞中で転写活性を有するが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝１．９ｘ１０−１０Ｍ）ほどではない（図３を参照されたい）。これら結果は、ＯＭが、細胞分化を引き起こす場合におよび細胞増殖を抑制する場合に直接的な細胞活性を有することから、それが、乾癬にきわめて有効であろうということを示唆している。これらデータは、更に、ＯＭが、抗癌剤として、特に、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対して、更には、乾燥皮膚（皮膚水和の欠如）、過度の皮膚たるみ（不十分な皮膚引き締め）、不十分な皮脂分泌およびしわなどの皮膚状態に対して、有意の活性を有するであろうということを示している。それは、更に、続発性副甲状腺機能亢進を抑制する場合にきわめて活性であると考えられる。
【００９０】
ビタミンＤ欠乏動物における骨からのカルシウム動員および腸管カルシウム吸収。
【００９１】
低カルシウム飼料（０．０２％）を与えられているビタミンＤ欠乏ラットを用いて、腸管および骨におけるＯＭおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性を調べた。予想されるように、天然ホルモン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）は、総ての投薬量で血清カルシウムレベルを増加させた（図４）。図４および図５は、ＯＭが、骨からカルシウムを動員する場合の活性を、あったとしてもほとんど有していないということを示している。ＯＭの８７ｐｍｏｌ／日で連続４日間の投与は、骨カルシウムの動員を引き起こさなかったし、そしてＯＭの量を７８０ｐｍｏｌ／日へ、次に７０２０ｐｍｏｌ／日へと増加させることも、実質的な影響を全く伴わなかった。
【００９２】
腸管カルシウム輸送は、同じ動物群において、反転腸管法を用いて評価した（図６）。これら結果は、化合物ＯＭは、８７ｐｍｏｌ／日かまたは７８０ｐｍｏｌ／日で投与された場合、腸管カルシウム輸送を促進することはないが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、８７ｐｍｏｌ／日および７８０ｐｍｏｌ／日の用量で有意の増加を促進するということを示している。有意の腸管カルシウム輸送が記録されたのは、７０２０ｐｍｏｌ／日のＯＭが投与された場合のみであったが、それは、７８０ｐｍｏｌ／日の用量を上回るほぼ１０倍の投薬量増加である。したがって、ＯＭは、推奨されるより少ない用量において腸管カルシウム輸送活性を本質的に欠いていると結論することができる。
【００９３】
これら結果は、ＯＭが、本明細書中に記載の多数のヒト療法の優れた候補であるということ、およびそれが、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の抑制、自己免疫疾患、癌および乾癬などの多数の状況において特に有用でありうるということを示している。ＯＭは、（１）有意のＶＤＲ結合、転写活性および細胞分化活性を有する；（２）１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とは異なり、高カルシウム血症への傾向を欠いている；そして（３）容易に合成されるという理由で、それは、乾癬を処置するための優れた候補である。ＯＭは、ビタミンＤ受容体への有意の結合活性を有するが、血清カルシウムを上昇させる能力をほとんど有していないので、それは、更に、腎性骨ジストロフィの続発性副甲状腺機能亢進の処置に特に有用でありうる。
【００９４】
これらデータは、更に、本発明の化合物ＯＭが、免疫系の不均衡を特徴とする、例えば、多発性硬化症、狼瘡、真性糖尿病、宿主対移植片拒絶反応および臓器移植拒絶反応を含めた自己免疫疾患の場合のヒトの疾患の処置および予防に；そして更に、関節リウマチ、喘息、およびセリアック病、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患のような炎症性疾患の処置に特に適していることがありうるということを示している。ざ瘡、脱毛症および高血圧症は、本発明の化合物ＯＭで処置することができる他の状態である。
【００９５】
式Ｉ、特に、式Ｉａを有する本発明の化合物は、更に、動物対象の肥満症を予防するまたは処置する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害するおよび／または体脂肪を減少させる場合に有用である。したがって、若干の態様において、動物対象の肥満症を予防するまたは処置する、脂肪細胞分化を阻害する、ＳＣＤ−１遺伝子転写を阻害するおよび／または体脂肪を減少させる方法は、その動物対象に、式Ｉを有する一つまたはそれを超える化合物、または一つまたはそれを超える化合物を包含する医薬組成物の有効量を投与することを包含する。化合物または医薬組成物の対象への投与は、動物対象の脂肪細胞分化を阻害する、遺伝子転写を阻害する、および／または体脂肪を減少させる。その動物は、ヒト、イヌまたはネコなどの家畜、または農産物用動物、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、キジまたはウズラのような家禽、並びに、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはブタなどの、ヒト消費用食肉を提供する動物であってよい。
【００９６】
予防および／または処置目的のために、式Ｉで定義される本発明の化合物は、薬学的用途のために、無害な溶媒中の溶液剤として、または適する溶媒または担体中のエマルジョン剤、懸濁剤または分散剤として、または固形担体と一緒の丸剤、錠剤またはカプセル剤として、当該技術分野において知られている慣用法にしたがって製剤化することができる。このような製剤はいずれも、安定化剤、酸化防止剤、結合剤、着色剤または乳化剤または風味調節剤などの他の薬学的に許容しうる且つ無毒性の賦形剤も含有してよい。
【００９７】
式Ｉの化合物、特に、ＯＭは、経口で、局所に、非経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下にまたは経皮で投与することができる。それら化合物は、好都合には、注射によってまたは静脈内注入または適する滅菌液剤によって、または消化管を経る液状または固形用量の形で、またはクリーム剤、軟膏剤、貼付剤、または経皮用途に適する類似のビヒクルの形で投与することができる。０．０１μｇ／日〜１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の用量の化合物Ｉ、特に、化合物ＯＭは、予防および／または処置目的に適当であり、このような用量は、当該技術分野において十分に理解されるように、処置される疾患、その重症度および対象の応答にしたがって調整される。その化合物は、作用特異性を示すので、各々、好適には、いろいろな度合いの骨無機質動員およびカルシウム輸送刺激が好都合であると判明している状況において、単独で、または勾配用量の別の活性なビタミンＤ化合物、例えば、１α−ヒドロキシビタミンＤ２またはＤ３、または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と一緒に投与することができる。
【００９８】
上述の処置に用いるための組成物は、上の式Ｉおよび式Ｉａで定義される化合物、特に、化合物ＯＭの活性成分としての有効量と、適する担体を含む。本発明によって用いるためのこのような化合物の有効量は、１ｇｍの組成物につき約０．０１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは、１グラムの組成物につき約０．１μｇ〜約５００μｇであり、そして局所に、経皮で、経口で、直腸に、鼻腔内に、舌下にまたは非経口で、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは、約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の投薬量で投与することができる。
【００９９】
化合物Ｉ、特に、化合物ＯＭは、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、局所貼付剤、丸剤、カプセル剤または錠剤、坐剤、エアゾル剤として、または薬学的に無害な且つ許容しうる溶媒または油中の液剤、乳剤、分散剤または懸濁剤として液体で製剤化することができるが、このような製剤は、更に、安定化剤、酸化防止剤、乳化剤、着色剤、結合剤または風味調節剤などの他の薬学的に無害なまたは有益な成分を含有してよい。
【０１００】
化合物Ｉ、特に、化合物ＯＭは、好都合には、前骨髄球を正常マクロファージへと分化させるのに十分な量で投与される。上記の投薬量は適しているが、与えられる量は、当該技術分野において十分に理解されるように、疾患の重症度と、対象の状態および応答にしたがって調整されるべきであるということは理解される。
【０１０１】
本発明の製剤は、活性成分を、薬学的に許容しうる担体と一緒に、したがって且つ場合により、他の治療的成分と一緒に含む。その担体は、製剤の他の成分と相溶性であり且つそのレシピエントに有害でないという意味で、「許容しうる」べきである。
【０１０２】
経口投与に適する本発明の製剤は、所定量の活性成分を各々含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはロゼンジとして個別の単位の形；粉末または顆粒剤の形；水性液または非水性液中の溶液または懸濁液の形；または水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンの形であってよい。
【０１０３】
直腸投与用の製剤は、活性成分と、カカオ脂などの担体を包含する坐剤の形、または浣腸剤の形であってよい。
【０１０４】
非経口投与に適する製剤は、好都合には、活性成分の滅菌油状または水性製剤を含むが、それは、好ましくは、レシピエントの血液と等張である。
【０１０５】
局所投与に適する製剤には、液状または半液状製剤であって、リニメント剤、ローション剤、外用薬（applicants）など、水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンであって、クリーム剤、軟膏剤またはペースト剤など；滴剤などの液剤または懸濁剤；または噴霧剤が含まれる。
【０１０６】
鼻腔内投与用には、スプレー缶、ネブライザーまたはアトマイザーで計量分配される粉末製剤、自己推進性製剤または噴霧製剤の吸入を用いることができる。それら製剤は、計量分配される場合、好ましくは、１０〜１００μの範囲内の粒度を有する。
【０１０７】
それら製剤は、好都合には、投薬単位の形で与えることができるし、薬学技術分野において周知のいずれかの方法によって製造することができる。「投薬単位」という用語により、活性成分を、それ自体でかまたは、それと固形または液状の医薬希釈剤または担体との混合物として含む、物理的且つ化学的に適する単位用量として患者に投与することができる単一の、すなわち、単回の用量を意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、完全長リコンビナントラットビタミンＤ受容体への結合について［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３と競合するＯＭおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の相対活性を示すグラフである。
【図２】図２は、ＯＭおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度の関数としてのＨＬ−６０細胞分化パーセントを示すグラフである。
【図３】図３は、ＯＭと比較したところの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のin vitro転写活性を示す棒グラフである。
【図４】図４は、ＯＭと比較したところの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。各々のグラフは、別々のバッチのビタミンＤ欠乏動物を示している。
【図５】図５は、ＯＭと比較したところの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。各々のグラフは、別々のバッチのビタミンＤ欠乏動物を示している。図５に示された結果は、ビヒクルを対照としていないが、被験動物から投与前と後に採血したことから、各々の被験動物がそれ自体の対照となる。
【図６】図６は、ＯＭと比較したところの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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