(57)【要約】  本発明は、深部静脈血栓症の高いリスクを示し、図５Ａに示すフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）である遺伝マーカーがゲノム中に存在するかについて個人をスクリーニングする方法に関する。前記遺伝マーカーはフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中の一組の１〜４つの突然変異を含み、前記突然変異は１２９Ａ／Ｔ（ｒｓ２０６６８５４）、７８７４Ｇ／Ａ（ｒｓ２０６６８６１）、９６１５Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６４）及び１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）からなる群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示し、図５Ａに示すフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）（配列番号２１）の少なくとも一部である遺伝マーカーが個人のゲノム中に存在するかを調べることを含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを有しているかについて個人をスクリーニングする方法。
【請求項２】
ＦＧＧ−Ｈ２の存在はフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中の１、２、３または４つの突然変異の一組の存在に関連しており、前記突然変異は１２９Ａ／Ｔ（ｒｓ２０６６８５４）、７８７４Ｇ／Ａ（ｒｓ２０６６８６１）、９６１５Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６４）及び１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
突然変異の一組が下表
【表１】
2008533999.tif 000047
2008533999.tif 000048
にリストした組から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
突然変異の一組が請求項３の表中にリストした組５、６、７、８、１１、１２、１４及び１５から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＧＧ−Ｈ２の存在はフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中の突然変異１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）の存在に関連する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
マーカーを、前記突然変異の一組を含む核酸材料のストレッチの標的核酸増幅反応を実施し、および増幅させた標的核酸を突然変異の組の存在について分析することにより検出する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
増幅反応をＮＡＳＢＡ、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＲＣＲ、３ＳＲ及びＴＭＡから選択する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
増幅核酸の各々が相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
相補的オリゴヌクレオチドを固相、好ましくは磁性粒子に固定させ、検出可能な複合体の各々を標識反応物質と反応させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
相補的オリゴヌクレオチドを固相に固定し、検出可能な複合体の各々を別々に標識させた反応物質と反応させる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
別個の増幅核酸が別個の相補的オリゴヌクレオチドと検出可能な複合体を形成する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記別個の相補的オリゴヌクレオチドの各々を固相上の異なるスポットで固定させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも１つ含む標的核酸の少なくとも１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする少なくとも１対の増幅プライマー及び前記突然変異の存在について増幅標的核酸を検出する手段を含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを有しているかについて個人をスクリーニングするための請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１４】
増幅させようとする標的核酸の１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする１対の増幅プライマー及び前記突然変異の存在について増幅標的核酸を検出するための少なくとも１つのプローブを含み、前記標的核酸はフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも１つ含むフィブリノーゲンγ遺伝子の少なくとも一部に相当する請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
増幅させようとする標的核酸の１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識しおよびハイブリダイズする１対の増幅プライマー及び増幅標的核酸中の当該突然変異の各々を検出するための少なくとも１つのプローブを含み、前記標的核酸は１２９Ａ／Ｔ、７８７４Ｇ／Ａ、９６１５Ｃ／Ｔ及び１００３４Ｃ／Ｔからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含むフィブリノーゲンγ遺伝子の少なくとも一部に相当する請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化１】
2008533999.tif 000049
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第１オリゴヌクレオチド；
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化２】
2008533999.tif 000050
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第２オリゴヌクレオチド
を含む請求項１３から１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化３】
2008533999.tif 000051
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第１オリゴヌクレオチド；
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化４】
2008533999.tif 000052
または少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第２オリゴヌクレオチド
を含む突然変異１２９Ａ／Ｔを検出するための請求項１３から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１０：ＧＴＧＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＣまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含む請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化５】
2008533999.tif 000053
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第１オリゴヌクレオチド；
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化６】
2008533999.tif 000054
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第２オリゴヌクレオチド
を含む突然変異７８７４Ｇ／Ａを検出するための請求項１３から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号６：ＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＡＣＧまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１６：ＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含む請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化７】
2008533999.tif 000055
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第１オリゴヌクレオチド；
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化８】
2008533999.tif 000056
2008533999.tif 000057
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第２オリゴヌクレオチド
を含む突然変異９６１５Ｃ／Ｔを検出するための請求項１３から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号７：ＧＴＡＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＣＴＴＣＧまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１６：ＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含む請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化９】
2008533999.tif 000058
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第１オリゴヌクレオチド；
１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【化１０】
2008533999.tif 000059
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む第２オリゴヌクレオチド
を含む突然変異１００３４Ｃ／Ｔを検出するための請求項１３から１６のいずれかに記載のキット。
【請求項２４】
第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、
【化１１】
2008533999.tif 000060
または少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長である請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
増幅標的核酸中の当該突然変異（１２９Ａ／Ｔ、７８７４Ｇ／Ａ、９６１５Ｃ／Ｔまたは１００３４Ｃ／Ｔ）の各々を検出するための１つのプローブを含み、前記プローブは非突然変異アナライト核酸と識別するために突然変異したアナライト核酸に相当する核酸配列を含む請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項２６】
プローブは分子ビーコンである請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
１００３４Ｔ対立遺伝子（突然変異１００３４Ｃ／Ｔ）に結合させることによりＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出するためのプローブは配列番号１９：ＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡであるか、または１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜２６ヌクレオチド長であり、および配列番号１９：ＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含むオリゴヌクレオチドを含む請求項２５または２６に記載のキット。
【請求項２８】
更に、配列番号２０：ＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡであるか、または１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜２６ヌクレオチド長であり、および配列番号２０：ＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片を含むオリゴヌクレオチドを含む１００３４Ｃ対立遺伝子に結合させることによりＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出するためのプローブを含む請求項２５から２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
キットは更に適当な増幅試薬を含む請求項１３から２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法とフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比（γ’／γ比）の測定を組み合わせた静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示す遺伝マーカーが個人のゲノム中に存在するかを調べることにより静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクについて個人をスクリーニングする方法。
【請求項３１】
深部静脈血栓症の高いリスクを有するにはγ’／γ比は０．６９未満でなければならない請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈血栓症、特に深部静脈血栓症に関連する遺伝子欠陥の存在についてスクリーニングする方法に関する。本発明は更に、前記方法に使用するための診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
静脈血栓症（ＶＴ）は、静脈中に局所的に形成された血塊または他の所で血栓から遊離した血塊（塞栓形成）による血行の閉塞である。血栓が形成される通常部位は脚の表面及び深部静脈であるが、血栓は脳、網膜、肝臓及び腸間膜中の静脈でも生じ得る。主要合併症は血栓後症候群及び肺塞栓症による死亡であり、それぞれ患者の２０〜４０％及び１〜２％で起こっている。先進国でのＶＴの年間頻度は約１／１０００である。
【０００３】
静脈血栓症は多原因疾患である。非移動、最近の手術または外傷、妊娠及び産褥、並びに経口避妊薬の現在の使用のような公知の後天的リスクファクターの他に、ＶＴに対する幾つかの遺伝的リスクファクター、例えばＶ因子ライデン及びプロトロンビン２０２１０Ａ突然変異がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、個人における静脈血栓症、特に深部静脈血栓症に対する遺伝的リスクファクターの存在を調べることができるスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、低い血漿フィブリノーゲンγ’レベル、低いフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比（γ’／γ）及び深部静脈血栓症（ＤＶＴ）の高いリスクに関連しているフィブリノーゲンγハプロタイプ（本明細書中では、まとめて遺伝する一連の一塩基多型（ＳＮＰ）と定義される）を同定することにより解決された。
【０００６】
フィブリノーゲンは止血系の必須成分であり、凝固カスケードの最終産物であるフィブリンの前駆体である。フィブリノーゲンはトロンビンによる限定タンパク質分解によりフィブリンに変換され、フィブリンモノマー上の重合部位は露呈する。これらのモノマーは自然と会合して、不溶性フィブリンを形成する。活性化因子ＸＩＩＩは隣接するフィブリンモノマー間で共有結合を形成する。こうした架橋により、フィブリン血塊が強化され、線維素溶解系による分解に対する耐性が高まる。
【０００７】
Ｆｉｏｎａ  Ｇｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／〜ｆｉｏｎａｇ／ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ．ｓｈｔｍｌ）が図１に示したフィブリノーゲンは分子量が３４０ｋＤａの血漿糖タンパク質であり、主に肝細胞により合成される。フィブリノーゲンは約９μＭ（３ｇ／Ｌ）の濃度で血漿中を循環している。フィブリノーゲン分子は、２つの外Ｄドメインがコイルドコイルセグメントにより中心Ｅドメインに結合している細長い４５ｎｍ構造物である。フィブリノーゲン分子は２つの対称半分子から構成され、各々は１組のＡα、Ｂβ及びγと称される３つの異なるポリペプチド鎖を含んでいる。３本の鎖はフィブリノーゲンα（ＦＧＡ）、フィブリノーゲンβ（ＦＧＢ）及びフィブリノーゲンγ（ＦＧＧ）をコード化する３つの別々の遺伝子によりコード化され、これらは染色体４ｑ３１．３上の約５０ｋｂの領域にクラスター形成されている。
【０００８】
ＦＧＧ遺伝子は１０エクソンを含み、６エクソンを含むＦＧＡ遺伝子と縦に並んで配位している。これらの遺伝子は、ＦＧＡ遺伝子の下流に位置し且つ８エクソンを含むＦＧＢ遺伝子と反対方向に転写される。
【０００９】
選択的スプライシングはＦＧＡ遺伝子及びＦＧＧ遺伝子で起こり得る。循環フィブリノーゲンの主Ａα鎖は６０アミノ酸残基を含み、副Ａα鎖は８４６アミノ酸残基を含む。Ｂβ鎖は４６１アミノ酸から構成されている。γ鎖の最も豊富な形態のγＡは４１１アミノ酸残基から構成されている。変異体γ’（γＢ）は４２７アミノ酸残基を含む。
【００１０】
フィブリノーゲンの異常が深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のリスクに影響を及ぼすことは公知である。Ｋｏｓｔｅｒら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７１：７１９−７２２（１９９４））は、血漿フィブリノーゲンのレベルが高い（＞５ｇ／Ｌ）とＤＶＴのリスクが増すことを記載している。この影響のメカニズムは知られていない。フィブリノーゲン濃度はインビトロ実験においてフィブリン血塊構造に対して大きな影響を有する。フィブリノペプチドＡの放出速度はフィブリノーゲンレベルの上昇に伴って増加し、これはより溶解耐性であり且つより高密度で密着したフィブリンネットワークの形成に関連している（Ｂｌｏｍｂａｃｋ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，７５：３２７−３２８（１９９４）；Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ及びＭｏｓｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，６８：３１５−３２０（１９９４））。
【００１１】
高フィブリノーゲンレベルが血栓症リスクに寄与し得る別のメカニズムは血液粘度の増加による。加えて、フィブリノーゲンの遺伝的変異体（異常フィブリノーゲン血症）が血栓症及び長いトロンビン時間を持つ患者で見つかった（Ｍｏｓｅｓｓｏｎ，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．，２５：３１１−３１９（１９９９）；Ｈａｎｓｓ及びＢｉｏｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．，９３６：８９−９０（２００１）により検討）。これらの患者の大部分ではＦＧＡまたはＦＧＧ遺伝子が突然変異しているが、前記突然変異のキャリア集団と静脈血栓症の間の正確な関係は十分に記載されていない（Ｈａｖｅｒｋａｔｅら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７３：１５１−１６１（１９９５））。
【００１２】
よって、本発明者らは、静脈血栓症、特に深部静脈血栓症のリスクに影響を及ぼすフィブリノーゲン遺伝子中の比較的一般的な変異が存在し得ると仮定した。これらの変異がフィブリノーゲンレベル、フィブリンネットワーク構造物の形成または線維素溶解系に対するフィブリン血塊の感受性に影響を与える恐れがある。
【００１３】
本発明につながる研究において、本発明者らは静脈血栓症のリスクファクターに関する大集団ベースの症例−対照研究のライデン血栓性素因研究（ＬＥＴＳ）でフィブリノーゲンクラスターの３遺伝子中の１５個のハプロタイプ−タギング一塩基多型（ｈｔＳＮＰ；ハプロタイプに特異的なＳＮＰである）を類別した。更に、すべての被験者でフィブリノーゲンγ鎖（γ’）の選択的にスプライシングした変異体を含有するフィブリノーゲンイソフォームの合計レベルγＡ／γ’及びγ’／γ’を測定した。
【００１４】
ＦＧＢ−Ｈ２、ＦＧＡ−Ｈ２またはＦＧＧ−Ｈに対してホモ接合性の個人のすべてが静脈血栓症に対して高いリスクを有していたことが判明した（ＦＧＢ−Ｈ２：ＯＲ＝１．９，９５％ＣＩ：１．１−３．４；ＦＧＡ−Ｈ２：ＯＲ＝２．０，９５％ＣＩ：１．３−３．２；ＦＧＧ−Ｈ２：ＯＲ＝２．４，９５％ＣＩ：１．５−３．９）。３つのフィブリノーゲン遺伝子は５０ｋｂのＤＮＡの単ストレッチ上に位置しているので、遺伝子間の連鎖不平衡を調整するために多重ロジスティック回帰分析を使用した。調整後、ＦＧＧ−Ｈ２に対してホモ接合性である個人でのみ高リスクのままであった。フィブリノーゲンハプロタイプのいずれもがＣｌａｕｓｓ方法で測定した全フィブリノーゲンレベルと関連していなかった。ＦＧＧ−Ｈ２は低いフィブリノーゲンγ’レベル及び低いフィブリノーゲンγ’／γ比にも関連していた。ロジスティック回帰分析から、低いフィブリノーゲンγ’レベルと高い全フィブリノーゲンレベルの両者はＦＧＧ−Ｈ２について調整した後でもＤＶＴの３倍高いリスクと関連していたことが判明した。
【００１５】
この所見に基づいて、ＦＧＧ−Ｈ２は低いフィブリノーゲンγ’レベルに関連しており、多変量解析で低いフィブリノーゲンγ’レベルは３倍高いＤＶＴを発症するリスクに関連しているとの結論が得られ、ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプが低いフィブリノーゲンγ’レベルの表現型により血栓症のリスクに作用することが立証された。
【００１６】
フィブリノーゲンγ’及び全フィブリノーゲンの血漿濃度の両方が血栓症リスクに影響を及ぼし、フィブリノーゲンγ’レベルが常に全フィブリノーゲンレベルに依存しているので、本発明者らは静脈血栓症のリスクに及ぼすフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比（γ’／γ比）の影響も分析した。本発明者らは、対照被験者で測定した１０パーセント点（Ｐ１０）に相当する０．６９未満のγ’／γ比を有する個人はγ’／γ比が≧０．６９の個人に比して静脈血栓症のリスクが高い（ＯＲ＝２．４，９５％ＣＩ：１．７−３．５）ことを知見した。ＦＧＧ−Ｈ２は低いフィブリノーゲンγ’レベルにも低いγ’／γ比にも関連していたので、ＦＧＧ−Ｈ２をγ’／γ比のＰ１０と一緒に同一のロジスティック回帰分析モデルに入れた。低いγ’／γ比（＜０．６９）に関連するリスクはそのままで（ＯＲ＝２．２，９５％ＣＩ：１．３−３．５）、ＦＧＧ−Ｈ２ホモ接合性に関連するリスクは大きく消失した（ＯＲ＝１．２，９５％ＣＩ：０．６−２．３）。このことから、ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプがγ’／γ比の減少により静脈血栓症のリスクに作用することが示される。対照の８２％及びγ’／γ比が＜０．６９の症例の９１％がＦＧＧ−Ｈ２対立遺伝子のホモ接合性キャリアであった。
【００１７】
更なる研究から、ＦＧＧ−Ｈ２転写物中のポリアデニル化信号２（ｐＡ２）の使用を増やすことにより（図２及び図８参照）、１００３４Ｃ＞Ｔはγ’形成の低い効率の原因であり、従って静脈血栓症のリスクに関連することが判明している低いγ’含量の原因であることが判明した。更に、１００３４Ｃが機能的切断刺激因子（ＣｓｔＦ）コンセンサス２ａ配列の一部であることが判明した。このために、ＦＧＧ遺伝子のエクソン９、イントロン９、エクソン１０及び３’−ＵＴＲを含むミニ遺伝子構築物を作成し、この構築物にＦＧＧ−Ｈ２特異的ＳＮＰを一緒に、別個に導入した。１００３４Ｃ＞Ｔが存在すると、ｐＡ２の使用が増え、従ってｐＡ１／ｐＡ２比が低下した（図１０）。加えて、突然変異をＣｓｔＦ部位に導入すると、コンセンサス配列が改善され、少なくなり、実際この部位が機能性ＣｓｔＦ部位であることを立証している。このことから、１００３４Ｃ／Ｔ突然変異が静脈血栓症（ＶＴ）、特に深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のリスクをもたらすことが分かる。
【００１８】
これらの所見に基づいて、本発明は、静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示す遺伝マーカーが個人のゲノム中に存在するかを調べることを含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示す遺伝マーカーがゲノム中に存在するかについて個人をスクリーニングする方法を提供し、前記遺伝マーカーは図５に示すフィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
表１Ａに示すように、フィブリノーゲンγ遺伝子（ＦＧＧ）のハプロタイプ２（Ｈ２）は、ＦＧＧの基準配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）と比較して一組の突然変異が遺伝子中に存在することにより具体的に同定され得る。ヌクレオチドはシアトル・データベース（Ｄ．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，ＳｅａｔｔｌｅＳＮＰｓ．ＮＨＬＢＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ワシントン州シアトルに所在のＵＷ−ＦＨＣＲＣ；ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ  １５−４−２００３）に従ってナンバリングする。前記した組は、フィブリノーゲンγをコード化する核酸材料、特に図５Ｂ（配列番号２２）に示すＦＧＧ遺伝子中の１２９Ａ／Ｔ（ｒｓ２０６６８５４）、７８７４Ｇ／Ａ（ｒｓ２０６６８６１）、９６１５Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６４）及び１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）からなる群から選択される１〜４つの突然変異を含む。ナンバリングは図５に示すフィブリノーゲンγ遺伝子のヌクレオチドの位置を指す。ｒｓ番号はｄｂＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからアクセス可能）に従ってＳＮＰを同定する。
【００２０】
【表２】
2008533999.tif 000002
【００２１】
ハプロタイプ２を同定するために使用される突然変異の組は表１Ｂにリストされている組から選択される。突然変異１００３４Ｃ／Ｔが少なくとも存在することが好ましい。従って、突然変異の組が表１Ｂにリストした組５〜８、１１、１２、１４及び１５から選択されることが好ましい。具体的には、ＦＧＧ−Ｈ２の存在がフィブリノーゲンγをコード化する核酸材料中に突然変異１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）が存在することと関連している。本明細書中、「組」は１〜４つの突然変異を含み得る。
【００２２】
【表３】
2008533999.tif 000003
2008533999.tif 000004
【００２３】
本発明の方法において、遺伝マーカーは、前記組の突然変異を含むＤＮＡのストレッチの標的核酸増幅反応を実施し、増幅した標的核酸を突然変異の組の存在について分析することにより検出される。
【００２４】
核酸を増幅させるための各種方法、例えば
米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，８００，１５９号に記載されているＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びそのＲＴ−ＰＣＲ代替法（逆転写ＰＣＲ）、特に欧州特許第０．５６９．２７２号に開示されている１ステップフォーマットでのＰＣＲ；
例えば欧州特許出願公開第０．２０１．１８４号に記載されているＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）；
国際特許出願公開第９０／０１０６９号に特許請求されているＲＣＲ（修復連鎖反応）；
国際特許出願公開第９０／０６９９５号に記載されている３ＳＲ（自立配列複製）；
例えば欧州特許第０．３９７．２６９号または米国特許第５，４６６，５８６号に開示されている鋳型として二本鎖ＤＮＡを用いるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベース増幅）；及び
ＴＭＡ（転写媒介性増幅）、例えば米国特許第５，３９９，４９１号明細書参照；
が当業界で公知である。
【００２５】
ＤＮＡ標的セグメントの特異的増幅の技術の１例は所謂「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」である。ＰＣＲ技術を用いると、特定標的セグメントのコピー数はサイクル数に応じて指数的に増加する。１対のプライマーを使用し、各サイクルにおいてＤＮＡプライマーを二本鎖ＤＮＡ標的配列の２本の鎖の各々の３’末端にアニーリングする。プライマーを各種モノヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させて、再び二本鎖ＤＮＡを生成する。二本鎖ＤＮＡの鎖を熱変性により相互に分離させ、各鎖は後続サイクルでのプライマーアニーリング及びその後の伸長のための鋳型として役立つ。ＰＣＲ方法はＳａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５（１９８５）、欧州特許第０．２００．３６２号及び欧州特許出願公開第０．２０１．１８４号にも記載されている。
【００２６】
増幅産物中の１つ以上の突然変異の存在の検出は当業界で公知の各種方法、例えば
制限酵素の使用；
対立遺伝子特異的増幅；
ペプチド核酸（ＰＮＡ）媒介ＰＣＲクランピング；
コンフォメーションの違いの検出、例えば一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）及び変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）；
標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる膜での検出ステップ（ドットブロット）を有するアッセイ；
微量測定プレートにおける検出ステップを有するアッセイ、例えば逆ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ、ＭＬＰＡ）、第１ヌクレオチド変化（ＦＮＣ）テクノロジー、架橋テクノロジー；
迅速サイクルＰＣＲ及び同時蛍光分析（例えば、５’ヌクレアーゼ／Ｔａｑｍａｎ）；
ＰＣＲ、その後質量分析またはキャピラリー電気泳動を用いるミニ配列決定；
により実施され得る。
【００２７】
更に、本発明は、フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも１つ含む核酸の少なくとも１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識し、ハイブリダイズする少なくとも１対のプライマー；及び増幅標的核酸を前記突然変異の存在について検出するための手段を含む静脈血栓症、特に深部静脈血栓症の高いリスクを示す方法を実施するためのキットに関する。
【００２８】
より具体的には、前記キットは、フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２（ＦＧＧ−Ｈ２）の遺伝マーカーである突然変異を少なくとも１つ含む核酸の１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識し、ハイブリダイズする１対のプライマー；及び増幅標的核酸を前記突然変異の存在について検出するための手段を含む。特に、核酸の１つのストレッチを囲む核酸ストレッチを認識し、ハイブリダイズする１対のプライマーは、１２９Ａ／Ｔ、７８７４Ｇ／Ａ、９６１５Ｃ／Ｔ及び１００３４Ｃ／Ｔからなる群から選択される突然変異の少なくとも１つを含み、少なくとも１つのプローブは増幅標的核酸中の当該突然変異の各々を検出する。
【００２９】
第１実施態様で、キットは第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、前記第１オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００３０】
【化１２】
2008533999.tif 000005
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００３１】
【化１３】
2008533999.tif 000006
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む。
【００３２】
適当な組合せは、配列番号１及び１０、１及び１１、１及び１２、１及び１３、１及び１４、１及び１５、１及び１６、１及び１７、１及び１８、２及び１０、２及び１１、２及び１２、２及び１３、２及び１４、２及び１５、２及び１６、２及び１７、２及び１８、３及び１０、３及び１１、３及び１２、３及び１３、３及び１４、３及び１５、３及び１６、３及び１７、３及び１８、４及び１０、４及び１１、４及び１２、４及び１３、４及び１４、４及び１５、４及び１６、４及び１７、４及び１８、５及び１０、５及び１１、５及び１２、５及び１３、５及び１４、５及び１５、５及び１６、５及び１７、５及び１８、６及び１０、６及び１１、６及び１２、６及び１３、６及び１４、６及び１５、６及び１６、６及び１７、６及び１８、６及び１０、６及び１１、６及び１２、６及び１３、６及び１４、６及び１５、６及び１６、６及び１７、６及び１８、７及び１０、７及び１１、７及び１２、７及び１３、７及び１４、７及び１５、７及び１６，７及び１７、７及び１８、８及び１０、８及び１１、８及び１２、８及び１３、８及び１４、８及び１５、８及び１６、８及び１７、８及び１８、９及び１０、９及び１１、９及び１２、９及び１３、９及び１４、９及び１５、９及び１６、９及び１７、９及び１８の組合せである。
【００３３】
更なる実施態様で、突然変異１２９Ａ／Ｔを検出するためのキットは第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、前記第１オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００３４】
【化１４】
2008533999.tif 000007
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００３５】
【化１５】
2008533999.tif 000008
または少なくとも１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む。
【００３６】
適当な組合せは、配列番号１及び２、１及び３、１及び４、１及び５、１及び６、１及び７、１及び８、１及び９、１及び１０、１及び１１、１及び１２、１及び１３、１及び１４、１及び１５、１及び１６、１及び１７、１及び１８の組合せである。
【００３７】
好ましくは、突然変異１２９Ａ／Ｔを検出するためのキットは１対のリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１０：ＧＴＧＴＣＡＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＡＧＧＣまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００３８】
【化１６】
2008533999.tif 000009
を含む。
【００３９】
突然変異７８７４Ｇ／Ａを検出するために、キットは第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、前記第１オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００４０】
【化１７】
2008533999.tif 000010
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００４１】
【化１８】
2008533999.tif 000011
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む。
【００４２】
適当な組合せは、配列番号１及び７、１及び８、１及び９、１及び１６、１及び１７、１及び１８、２及び７、２及び８、２及び９、２及び１６、２及び１７、２及び１８、３及び７、３及び８、３及び９、３及び１６、３及び１７、３及び１８、４及び７、４及び８、４及び９、４及び１６、４及び１７、４及び１８、５及び７、５及び８、５及び９、５及び１６、５及び１７、５及び１８、６及び７、６及び８、６及び９、６及び１６、６及び１７、６及び１８、１０及び７、１０及び８、１０及び９、１０及び１６、１０及び１７、１０及び１８、１１及び７、１１及び８、１１及び９、１１及び１６、１１及び１７、１１及び１８、１２及び７、１２及び８、１２及び９、１２及び１６、１２及び１７、１２及び１８、１３及び７、１３及び８、１３及び９、１３及び１６、１３及び１７、１３及び１８、１４及び７、１４及び８、１４及び９、１４及び１６、１４及び１７、１４及び１８、１５及び７、１５及び８、１５及び９、１５及び１６、１５及び１７、１５及び１８の組合せである。
【００４３】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号６：ＴＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＡＣＧまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００４４】
【化１９】
2008533999.tif 000012
を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、少なくとも
【００４５】
【化２０】
2008533999.tif 000013
の１０連続ヌクレオチドの断片を含む。
【００４６】
突然変異９６１５Ｃ／Ｔを検出するために、キットは第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、前記第１オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００４７】
【化２１】
2008533999.tif 000014
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００４８】
【化２２】
2008533999.tif 000015
の１つまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む。
【００４９】
適当な組合せは、配列番号１及び８、１及び９、１及び１６、１及び１７、１及び１８、２及び８、２及び９、２及び１６、２及び１７、２及び１８、３及び８、３及び９、３及び１６、３及び１７、３及び１８、４及び８、４及び９、４及び１６、４及び１７、４及び１８、５及び８、５及び９、５及び１６、５及び１７、５及び１８、６及び８、６及び９、６及び１６、６及び１７、６及び１８、７及び８、７及び９、７及び１６、７及び１７、７及び１８、１０及び８、１０及び９、１０及び１６、１０及び１７、１０及び１８、１１及び８、１１及び９、１１及び１６、１１及び１７、１１及び１８、１２及び８、１２及び９、１２及び１６、１２及び１７、１２及び１８、１３及び８、１３及び９、１３及び１６、１３及び１７、１３及び１８、１４及び８、１４及び９、１４及び１６、１４及び１７、１４及び１８、１５及び８、１５及び９、１５及び１６、１５及び１７、１５及び１８の組合せである。
【００５０】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号７：ＧＴＡＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＣＴＴＣＧまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００５１】
【化２３】
2008533999.tif 000016
を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１６：ＧＣＴＴＴＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＴＧＴＣＣまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００５２】
【化２４】
2008533999.tif 000017
を含む。
【００５３】
突然変異１００３４Ｃ／Ｔを検出するために、キットは第１オリゴヌクレオチド及び第２オリゴヌクレオチドを含み、前記第１オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００５４】
【化２５】
2008533999.tif 000018
2008533999.tif 000019
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含み、前記第２オリゴヌクレオチドは１０〜５０ヌクレオチド長であり、以下のヌクレオチド配列
【００５５】
【化２６】
2008533999.tif 000020
の１つまたは少なくともその１０ヌクレオチドの断片、或いはその相補的配列を含む。
【００５６】
適当な組合せは、配列番号１及び１７、１及び１８、２及び１７、２及び１８、３及び１７、３及び１８、４及び１７、４及び１８、５及び１７、５及び１８、６及び１７、６及び１８、７及び１７、７及び１８、８及び１７、８及び１８、９及び１７、９及び１８、１０及び１７、１０及び１８、１１及び１７、１１及び１８、１２及び１７、１２及び１８、１３及び１７、１３及び１８、１４及び１７、１４及び１８、１５及び１７、１５及び１８、１６及び１７、１６及び１８の組合せである。
【００５７】
好ましくは、第１オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号８：ＧＡＧＡＡＣＡＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＣ、特に断片
【００５８】
【化２７】
2008533999.tif 000021
を含み、または配列番号９：ＡＣＡＴＧＣＡＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴ、特に断片
【００５９】
【化２８】
2008533999.tif 000022
または少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片を含み、第２オリゴヌクレオチドは１０〜２６ヌクレオチド長である。
【００６０】
特に有利な実施態様で、キットは増幅標的核酸中の当該突然変異（１２９Ａ／Ｔ、７８７４Ｇ／Ａ、９６１５Ｃ／Ｔまたは１００３４Ｃ／Ｔ）の各々を検出するための１つのプローブを含み、前記プローブは非突然変異アナライト核酸と識別するために突然変異アナライト核酸に対応する核酸配列を含む。好ましくは、プローブは分子ビーコンである。
【００６１】
１００３４Ｔ対立遺伝子（突然変異１００３４Ｃ／Ｔ）に結合させることによりＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出するためのプローブは、１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号１９：ＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００６２】
【化２９】
2008533999.tif 000023
を含むオリゴヌクレオチドであるかまたは含む。前記キットは更に１００３４Ｃ対立遺伝子に結合させることによりＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出するためのプローブを含み、前記プローブは１０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜２６ヌクレオチド長であり、配列番号２０：ＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡまたは少なくともその１０連続ヌクレオチドの断片、特に断片
【００６３】
【化３０】
2008533999.tif 000024
を含むオリゴヌクレオチドであるかまたは含む。
【００６４】
各キットは、更に適当な増幅試薬を含み得る。しかしながら、前記試薬は別に用意してもよいので、前記試薬はキットの必須部分ではない。
【００６５】
多くの生物学的分析方法において、固相を液相から分離し、その後洗浄しなければならない。固相を洗浄するためには、限定量のバッファー溶液を固相を収容している反応容器にピペットで移して、固相をバッファー溶液中に懸濁させる。次いで、固相及び液相を分離する。次いで、液相を吸引（アスピレーション）により除去し、新しい洗浄プロセスを開始する。通常、洗浄サイクルを複数回実施し、各サイクルは懸濁、分離及びアスピレーションプロセスを含む。
【００６６】
固相としての磁性粒子の使用及び永久磁石を用いる分離は原則としては公知である。永久磁石は粒子を反応容器の壁に引きつけ、そこに保持する。
【００６７】
磁性粒子は分離方法においてしばしば使用されている。磁性粒子を使用する生物学的アッセイ方法及び精製方法は多数ある。例えば、イムノアッセイ方法、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ等である。磁性粒子は、粒状成分、タンパク質、核酸を含んでいる材料から粒状成分、タンパク質、核酸を分離するための精製方法でも使用され得る。磁性粒子は例えば成分に対して特異的アフィニティーを有する試薬でコーティングされているので、該粒子が混合物から特定の成分を分離するために使用され得る。磁性粒子は、例えば磁性粒子と共に流体が収容されている容器の壁に引き寄せられ、流体は除去され得、場合により別の流体と交換され得る。よって、粒子を除去しようとする特定の成分を含む流体と混合し、前記成分は磁性粒子に結合し、磁気が流体中の混合物の残りから成分及び粒子を分離するために使用され得る。場合により、磁性粒子は洗浄され得、別の流体中で分離され得る。或いは、成分を粒子から除去して別の流体に導入してもよい。増幅し、アンプリコンをサンプルの残りから分離した後に検出を実施するので、磁性粒子の使用は不均一手順である。
【００６８】
均一手順では、増幅及び検出を反応成分を分離することなく実施する。アンプリコンは増幅過程で検出される。よって、アンプリコンの生成はリアルタイムでモニターされ得、こうして得たデータを使用してアンプリコンの存在または不在、或いはその量を測定することができる。均一技術において非常に有用であるプローブの１タイプは分子ビーコンである。
【００６９】
分子ビーコンは、ステム・ループ構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ループ部分は標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補的な配列を含む。ステムは３’末端の相補的配列を５’末端とハイブリダイズするために形成される。ステムは標的と無関係であり得、二本鎖である。ステムの１つの腕を蛍光染料（蛍光体）を用いて標識し、他方の腕はクエンチング分子にカップリングさせる。ステム・ループ状態では、蛍光体のエネルギーがクエンチング分子に移動するのでプローブは蛍光を発しない。分子ビーコンが標的にハイブリダイズすると、ステム・ループ構造が失われ、クエンチャー及び蛍光体が分離する。この段階で蛍光体より発された蛍光が検出され、定量され得る。
【００７０】
用語「アナライト」、「アンプリコン」、及び「標的」または「標的配列」は本明細書中で互換可能に使用され得る。アナライトは検出しようとするオリジナル核酸分子である。標的配列はプライマーを用いて増幅されるアナライトの一部である。増幅させると、アンプリコンが形成される。アンプリコンはプローブにハイブリダイズすることにより物理的に検出される核酸分子である。アンプリコンの配列はアナライト内の標的配列と同一であるかまたは相補的である。
【００７１】
本発明を添付図面を参照して下記実施例において更に説明する。
【実施例１】
【００７２】
フィブリノーゲンハプロタイプ及び静脈血栓症のリスク
１．方法
（１．１）研究集団
ライデン血栓性素因研究の設計はＫｏｓｔｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ，３４２：１５０３−１５０６（１９９３）及びＶａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７８：６３１−６３５（１９９７）に詳記されている。
【００７３】
本研究には、全部で深部静脈血栓症の最初のエピソードが客観的に確認された４７４人の患者及びこれらと性別及び年齢で頻度整合されている４７４人の対照を加えた。活動的な癌を有する個人は排除した。対照被験者は患者の知人またはパートナーであり、癌を患ってはいなかった。両群の平均年齢は４５才（患者の年齢は１５〜６９才、対照の年齢は１５〜７２才）であった。両群は２７２人（５７．４％）の女性及び２０２人（４２．６％）の男性から構成されていた。
【００７４】
静脈血を０．１容量の０．１０６モル／Ｌ  クエン酸トリナトリウム中に集めた。室温で２０００ｇで１０分間遠心することにより血漿を作成し、−７０℃で保存した。高分子量ＤＮＡを標準的方法により白血球から単離し、−２０℃で保存した。ＤＮＡサンプルを４７１人の患者及び４７１人の対照から入手した。血漿サンプルは４７３人の患者及び４７４人の対照から入手した。
【００７５】
（１．２）遺伝子分析
ＦＧＧ遺伝子には５個のハプロタイプ、ＦＧＡ遺伝子には７個のハプロタイプ、ＦＧＢ遺伝子には７個のハプロタイプが公知である（図３）。これらのハプロタイプをタギングするために、すべての被験者を１５個のハプロタイプタギング（ｈｔ）ＳＮＰ、すなわちＦＧＧ中４個、ＦＧＡ中６個のハプロタイプタギング（ｈｔ）ＳＮＰについて遺伝子同定した（表２）。ＦＧＢの遺伝子同定はポリメラーゼ連鎖反応及び制限断片長多型分析により実施した。
【００７６】
【表４】
2008533999.tif 000025
【００７７】
ＦＧＡ及びＦＧＧの遺伝子同定は５’ヌクレアーゼ／ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４：１４３−１４９（１９９９））を用いて実施した。
【００７８】
蛍光対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ／Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ，米国フォスターシティに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応をＰＴＣ−２２５（ドイツ国Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆに所在のＢｉｏｚｙｍ）を用いて実施し、対立遺伝子識別のための蛍光終点読取りはＡＢＩ  ７９００  ＨＴ（米国フォスターシティに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。失われたＤＮＡ、遺伝子同定の失敗、または遺伝子内の組換えのために１０人の患者及び９人の対照ではハプロタイプを帰属できなかった。ハプロタイプ及びＬＤ分析のためにＡｒｌｅｑｕｉｎ集団遺伝ソフトウェア（バージョン２）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ａｒｌｅｑｕｉｎ：ａ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ（２０００），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｔｒｙ  Ｌａｂ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｒｏｐｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｖａ）及びＨａｐｌｏｖｉｅｗソフトウェアｖ２．０５３０を使用した。
【００７９】
（１．３）配列決定
選択した個人において、３つのフィブリノーゲン遺伝子のすべてのプロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン／エクソン境界及び３’ＵＴＲをＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０遺伝アナライザー（米国ボストンに所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。反応はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅターミネーター・サイクル配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。プライマーを以下にリストする。
【００８０】
【表５】
2008533999.tif 000026
【００８１】
（１．４）フィブリノーゲン測定
全フィブリノーゲンをＤａｄｅ（登録商標）トロンビン試薬（米国フロリダ州のマイアミに所在のＢａｘｔｅｒ）を用いてクラウス法に従って測定した。試験はＥｌｅｃｔｒａ  １０００（米国プレザントビルに所在のＭＬＡ）を用いて実施した。全フィブリノーゲンレベルはＵ／ｄＬ（ここで、１００Ｕ／ｄＬは２．８  ｇ／Ｌに相当する）で表示した。クラウス法により測定した全フィブリノーゲンは、市販の家兎抗フィブリノーゲン抗体（デンマーク国グロストルップに所在のＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）を用いるＥＬＩＳＡにより測定した全フィブリノーゲンにうまく一致した（Ｒ２＝０．９０２；ｎ＝６０）。
【００８２】
（１．５）フィブリノーゲンγ’抗原測定
フィブリノーゲンγ’（すなわち、γＡ／γ’及びγ’／γ’フィブリノーゲン）抗原レベルを、米国特許出願公開第２００３／０００３５１５号に開示されている（オランダ国フェーネンダールに所在のＣａｍｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能な）γ’鎖のカルボキシ末端配列（ＶＲＰＥＨＰＡＥＴＥＹＤＳＬＹＰＥＤＤＬ（配列番号２８）から構成されるペプチドに対する抗体２．Ｇ２．Ｈ９を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。この抗体はトロンビンに対する高アフィニティー結合部位を含むエピトープを認識し、γ’鎖に対して特異的である。
【００８３】
プラスチック製９６ウェル微量測定プレート（オランダ国Ａｌｐｈｅｎ  ａ／ｄ  Ｒｉｊｎに所在のＧｒｅｉｎｅｒ）に２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトγ’フィブリノーゲンをコーティングし（１１０μ１／ウェル）、４℃で一晩インキュベートした。プレートを１１０μ１の洗浄バッファー（５０ｍＭ  トリエタノールアミン，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  トゥイーン２０，ｐＨ７．５）中１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロックした。希釈バッファー（５０ｍＭ  トリエタノールアミン，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  トゥイーン２０，１０ｍＭ  ベンズアミジン，ｐＨ７．５）で希釈した１００μｌの血漿サンプルをウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。サンプル希釈物は室温で少なくとも３時間安定であった。
【００８４】
結合フィブリノーゲンγ’（γＡ／γ’＋γ’／γ’）は、１００μｌの１：２０，０００希釈したＨＲＰ−コンジュゲート家兎抗ヒトフィブリノーゲン（オランダ国グロストルップに所在のＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）を用いて検出した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを１００μｌ／ウェルの基質バッファー（０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０），０．１ｍｇ／ｍｌ  テトラメチルベンジジン，０．０１％  Ｈ２Ｏ２）とインキュベートした。１５分後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（５０μ１／ウェル）を添加することにより反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を分光光度計を用いて測定した。すべてのインキュベーションステップの間、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄した。
【００８５】
定義上１００Ｕ／ｄＬのフィブリノーゲンγ’（γＡ／γ’＋γ’／γ’）を含有しているプールした正常血漿の１：２，０００〜１：１２８，０００希釈物を用いて検量線を作成した。血漿サンプルのフィブリノーゲンγ’抗原を２つの異なる独立した希釈物（１：８，０００、１：１６，０００）の測定の平均結果として計算した。結果をＵ／ｄＬで表示した。平均変動係数（ＣＶ）は９．３％であった。アッセイ内変動は４．５％であった。
【００８６】
（１．７）統計分析
健康な対照において、各ｈｔＳＮＰに対するハーディ・ワインバーグ平衡をＸ２分析により試験した。フィブリノーゲンのハプロタイプが血栓症に関連していたかどうかを調べるために、Ｗｏｏｌｆ（Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：２５１−２５３（１９５５））に従ってオッズ比（ＯＲ）及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を相対リスクの尺度として計算した。これは、基準カテゴリー（例えば、非ハプロタイプ２キャリア）に対する罹患カテゴリー（例えば、ハプロタイプ２キャリア）における血栓症の発現リスクを示す。
【００８７】
３つのフィブリノーゲン遺伝子はＤＮＡの５０ｋｂの単一ストレッチ上に位置している。このために高度の連鎖不均衡（ＬＤ）が生ずる。これを調整するために、各遺伝子のリスクハプロタイプのオッズ比を多重ロジスティック回帰分析を用いて計算した。
【００８８】
症例−対照研究における関連の主な尺度はオッズ比により推定される相対リスクである。このオッズ比は、リスクファクターを持たない被験者（すなわち、リスクファクターの基準カテゴリー）における疾患が発現リスクに対するリスクファクターを持つ被験者（すなわち、リスクファクターカテゴリー）において疾患が発現するリスクを示す。症例−対照研究において、このオッズ比は罹患オッズ比、すなわち対照における罹患オッズに対する症例における罹患オッズの比として計算する。このオッズ比は、疾患の無関係行列式が研究中のリスクファクターカテゴリーにわたり不均一分布を有しているときに生ずる交絡のためにバイアスされることがある。この場合、オッズ比を調整しなければならず、これは交絡因子のカテゴリーに基づく層を用いる階層化分析からの共通推定値を計算することにより実施される。同時に多段交絡子を調整するための主分析技術は無条件ロジスティック回帰分析である。簡単に説明すると、
ｌｏｇ（ｐ／（１−ｐ））＝ｂ０＋ｂ１ｘ１＋ｂｋｘｋ
ｐ＝症例の場合は１、対照の場合は０；
ｂ０＝切片；
ｂ１＝当該変数の回帰分析係数；
ｘ１＝当該変数のカテゴリー；
ｂｋ＝潜在交絡子（ｋ＝２，３，４…）に対する当てはめロジスティック回帰分析係数；
ｘｋ＝交絡変数（ｋ＝２，３，４…）のカテゴリー。
【００８９】
このモデルにおいて、真数（ｂ１）は当該変数のオッズ比である。ロジスティック回帰分析アルゴリズムは反復手順により係数を推定し、標準偏差はゆう度関数から誘導する。標準偏差は９５％信頼限界を構築するために役立つ。
【００９０】
各種フィブリノーゲンハプロタイプ、血漿フィブリノーゲンレベル及びフィブリノーゲンγ’レベル間の関連を調べるために、９５％ＣＩでの平均レベルを計算した。対照被験者で測定したフィブリノーゲンγ’レベルの四分位数を低フィブリノーゲンγ’レベルが静脈血栓症のリスクと関連していたかどうかを評価するためのカットオフポイントとして使用した。多重ロジスティック回帰分析を、高レベルの全フィブリノーゲン（四分位数）に対するフィブリノーゲンγ’レベル（四分位数）及びリスクゲノタイプ／ハプロタイプ（ＦＧＧ−Ｈ２）を調整するために使用した。対照被験者で測定したγ’／γ比の１０パーセント点（Ｐ１０）を、低γ’／γ比が静脈血栓症のリスクに関連していたかどうかを評価するためのカットオフポイントとして使用した。
【００９１】
結果
９４２人の全被験者の遺伝子同定から、１５の選択ｈｔＳＮＰはＦＧＧの４つのハプロタイプ、ＦＧＡの５つのハプロタイプ、ＦＧＢの６タイプに同定された（図３参照）ことが示された。すべてのｈｔＳＮＰについて、対照被験者におけるゲノタイプの分布はハーディ・ワインバーグ平衡にあった。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗによる遺伝子同定データの精査から、予想通り３つの異なるフィブリノーゲン遺伝子のＳＮＰ間の高度の連鎖非平衡が判明した（データ示さず）。Ａｒｌｅｑｕｉｎ出力は、ハプロタイプが遺伝子クラスター全体で連続していることを示していた。表３に、対照被験者における＞１％の対立遺伝子頻度を有する連続ハプロタイプが示されている。多くの組換えがＦＧＢ及びＦＧＡ遺伝子間に存在していた。
【００９２】
【表６】
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【００９３】
３つすべての遺伝子において、Ｈ２と呼称するハプロタイプの１つに対してホモ接合性の被験者は他の被験者に比して高い血栓症リスクを有していた（表４ａ）。
【００９４】
【表７】
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【００９５】
これらの遺伝子中のハプロタイプは独立して遺伝されないので、血栓症に対する影響に関与する遺伝子（及びその後ＳＮＰ）を同定することは困難である。従って、各遺伝子のリスクハプロタイプ（Ｈ２）及び防護ハプロタイプ（Ｈ３）の両方のＯＲ及び９５％ＣＩを多重ロジスティック回帰分析により計算した。連続ハプロタイプの３つの別々のハプロタイプ（例えば、ＦＧＧ−Ｈ２、ＦＧＡ−Ｈ２及びＦＧＢ−Ｈ２）を１つのモデルに挿入することにより、他の２つの遺伝子のハプロタイプの影響について１つの遺伝子のハプロタイプの影響を補正することができる。ＦＧＡ−Ｈ２Ｈ２（ＯＲ＝０．５，９５％ＣＩ：０．２−１．９）及びＦＧＢ−Ｈ２Ｈ２（ＣＲ＝１．３，９５％ＣＩ：０．６−２．８）に関連するリスクはほぼ完全に消失したが、ＦＧＧ−Ｈ２Ｈ２に関連するリスクはそのままであった（ＯＲ＝３．５，９５ａＣＩ：１．０−１２．５）。このことから、我々はＨ２の原因突然変異がＦＧＧ遺伝子中のどこかに存在していなければならないと結論づける。Ｈ３の場合、ＦＧＧ−Ｈ３Ｈ３ではリスクの低下のみがそのままであった（表４ｂ）。
【００９６】
【表８】
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【００９７】
高いフィブリノーゲンレベルはＤＶＴのリスクに関連しているので、まず対照被験者においてＦＧＧ、ＦＧＡ及びＦＧＢのハプロタイプがフィブリノーゲンの血漿レベルに関連していたかどうかを調べた。各種ハプロタイプのホモ接合性キャリアの平均フィブリノーゲンレベルを表５に示す。いずれのハプロタイプも血漿フィブリノーゲンレベルに関連していなかった。
【００９８】
【表９】
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【００９９】
ＦＧＡ、ＦＧＢ及びＦＧＧハプロタイプの血漿フィブリノーゲンレベルに対する定量的影響が観察されなかったので、（血栓症のリスクを高める）ＦＧＧ−Ｈ２は定性的欠陥、すなわちアミノ酸配列を変化させ、よってフィブリノーゲンγ鎖の幾つかの機能特性を変化させるＳＮＰを含んでいなければならない。ＦＧＧ遺伝子中で測定された４つのＦＧＧ  Ｈ２タギングＳＮＰのいずれもがアミノ酸配列を変化させなかったので、ＦＧＧ−Ｈ２キャリアの一部がＦＧＧ遺伝子のコード領域中に別の変異を有していた可能性が考えられた。従って、ＦＧＧ−Ｈ２にホモ接合性の１０人のＤＶＴ患者の遺伝子（２０  ＦＧＧ−Ｈ２対立遺伝子）をプロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン／エクソン境界及び３’ＵＴＲを含めた完全遺伝子−クラスターにわたり配列決定したが、新規な変異は発見されなかった。このことは、本研究においてＦＧＧ−Ｈ２に特異的である４つのＳＮＰの１つがリスク増強ＳＮＰであることを示した。
【０１００】
これら４つのＦＧＧ−Ｈ２特異的ＳＮＰの１つがプロモーター（１２９Ａ／Ｔ［ｒｓ２０６６８５４］）中、１つがイントロン８（７８７４Ｇ／Ａ［ｒｓ２０６６８６１］）中、１つがイントロン９（９６１５Ｃ／Ｔ［ｒｓ２０６６８６４］）中、１つが３’非翻訳領域（１００３４Ｃ／Ｔ［ｒｓ２０６６８６５］）の下流に位置している。本発明者らは、これら最後の２つのＳＮＰ（９６１５Ｃ／Ｔまたは１００３４Ｃ／Ｔ）がそれぞれフィブリノーゲンγ’及びγＡ転写物のポリアデニル化部位に近接し、よってフィブリノーゲンγ’発現を変化させることによりＦＧＧプレｍＲＮＡの選択的スプライシングの効率に影響を与えたと推論した（図２）。
【０１０１】
γ鎖は２つの形態、すなわちγＡ及びγ’で存在している（図２）。γＡ鎖は、プレｍＲＮＡの９つすべてのイントロンが除去されているｍＲＮＡから翻訳される。対照的に、γ’鎖はＦＧＧプレｍＲＮＡの選択的プロセシングにより生ずる。イントロン９はスプライシングされず、このイントロン内でポリアデニル化が起こる。こうすると、エクソン１０によりコード化されるカルボキシ末端の４つのアミノ酸が置換したイントロン９によりコード化されるユニークな２０−アミノ酸延長部を有するポリペプチドが翻訳される。この変異鎖は血漿中に存在するフィブリノーゲンγ鎖の約７〜１５％を含んでいる。γ’タンパク質の殆どすべてがインビボでは１つのＤ領域がγ’カルボキシル末端を含み、他の領域がγＡカルボキシル末端を含むγＡ変異体とのヘテロダイマーとして存在している。
【０１０２】
９６１５Ｔ及び１００３４Ｔの両方を含むＦＧＧ−Ｈ２はγ’形成に関連し、γ’形成は血栓症リスクに影響を与える。Ｈ２特異的ＳＮＰ  ７８７４Ｇ／Ａ及び１００３４Ｃ／Ｔ間の可能性ある組換えを同定するために、すべての被験者をＳＮＰ  １００３４Ｃ／Ｔについて分類した。１００３４Ｃ／Ｔが７８７４Ｇ／Ａに完全にリンクしていた所見から、ＳＮＰ  ７８７４Ｇ／Ａと１００３４Ｃ／Ｔ間の組換えの可能性が除外された。
【０１０３】
４７３人の患者及び４７４人の対照のフィブリノーゲンγ’（すなわち、γＡ／γ’及びγ’γ’）レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。本発明者らがリスクハプロタイプと同定したＦＧＧ−Ｈ２は低いフィブリノーゲンγ’レベルと強く関連していた（表６）。１つのＨ２対立遺伝子のキャリアに関して最低レベル及び中間の値を有するホモ接合性Ｈ２キャリアでフィブリノーゲンγ’レベルに対するＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプの明確な対立遺伝子特異的且つ用量依存性効果があった。更に、ＦＧＧ−Ｈ３対立遺伝子は高いフィブリノーゲンγ’レベルと関連していた。
【０１０４】
【表１０】
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【０１０５】
患者（平均：１１１Ｕ／ｄＬ，９５％ＣＩ：１０７−１１５）と対照（平均：１１１Ｕ／ｄＬ，９５％ＣＩ：１０８−１１４）の間のフィブリノーゲンγ’レベルに差はなかった。低いフィブリノーゲンγ’レベルが静脈血栓症の高いリスクと関連していたかどうかを評価するために、対照被験者で測定した四分位数をカットオフポイントとして使用した。低いフィブリノーゲンγ’レベル（最低四分位数）は、最高四分位数と比較して僅かに高いリスク（ＯＲ＝１．３，９５％ＣＩ：０．９−１．８）と関連していた（表７ａ）。しかしながら、フィブリノーゲンγ’レベルは、ＦＧＧプレｍＲＮＡのスプライシング及びポリアデニル化効率によっても、フィブリノーゲン合成、消費及びクリアランスの程度によっても測定されない。実際、全フィブリノーゲンレベルとフィブリノーゲンγ’レベルの間の良好な相関関係が見られた（図４）。
【０１０６】
【表１１】
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【０１０７】
従って、本発明者らは（対照で測定した）フィブリノーゲンγ’レベルの四分位数及び全フィブリノーゲンレベルの四分位数について階層化した静脈血栓症のリスクを計算した（表８）。全フィブリノーゲン四分位数の各々ではフィブリノーゲンγ’レベルが低下すると静脈血栓症のリスクが高まり、フィブリノーゲンγ’四分位数の各々では全フィブリノーゲンレベルが上昇すると血栓症のリスクが高まる。このことは、低いフィブリノーゲンγ’レベル及び高いフィブリノーゲンレベルが静脈血栓症に対する２つの別々のリスクファクターであったことが判明した。この所見を確認するために、我々はフィブリノーゲンγ’レベルの四分位数及び全フィブリノーゲンレベルの四分位数に対する静脈血栓症のリスクを計算するためにロジスティック回帰分析を使用した。この分析から、低いフィブリノーゲンγ’レベル及び高い全フィブリノーゲンレベルの両方が静脈血栓症の高いリスクに関連していたことが判明した（表７ａ，Ｂ列）。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
ＦＧＧ−Ｈ２が低いフィブリノーゲンγレベル及びＤＶＴの高いリスクに関連していたので、ＦＧＧ−Ｈ２をフィブリノーゲンγ’の四分位数及びフィブリノーゲンの四分位数と一緒に同一モデルに加えた（表７ａ，Ｃ列）。低いフィブリノーゲンγ’レベル及び高い全フィブリノーゲンレベルに関連するリスクは変化しなかったが、ＦＧＧ−Ｈ２ホモ接合性に関連するリスクはほぼ完全に消失した（ＯＲ＝１．４，９５％ＣＩ：０．８−２．５）。このことは、ＦＧＧ−Ｈ２の効果がフィブリノーゲンγ’レベルに対するその作用により媒介されることを示している。
【０１１０】
フィブリノーゲンγ’及び全フィブリノーゲンの血漿濃度が血栓症リスクに影響を及ぼし、フィブリノーゲンγ’レベルが常に全フィブリノーゲンレベルに依存しているので、静脈血栓症のリスクに対するフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比（γ’／γ比）の影響も分析した。γ’／γ比は対照（平均：０．９５，９５％ＣＩ：０．９３−０．９７）に比して患者（平均：０．８９，９５％ＣＩ：０．８７−０．９２）では低かった。対照被験者で測定した１０パーセント点（Ｐ１０）に相当するγ’／γ比が０．６９未満の個人は、γ’／γ比が≧０．６９の個人に比して静脈血栓症の高いリスクを有している（ＯＲ＝２．４，９５％ＣＩ：１．７−３．５）（表７ｂ）。ＦＧＧ−Ｈ２は低いフィブリノーゲンγ’レベルに関連しているだけでなく、低いγ’／γ比にも関連していた（表６）。ＦＧＧ−Ｈ２を同一ロジスティック回帰分析モデルにγ’／γ比のＰ１０と一緒に加えた。低いγ’／γ比（＜０．６９）に関連するリスクはそのままであり（ＯＲ＝２．２，９５％ＣＩ：１．３−３．５）、ＦＧＧ−Ｈ２ホモ接合性に関連するリスクはかなり消失した（ＯＲ＝１．２，９５％ＣＩ：０．６−２−３）。このことは、ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプがγ’／γ比を低下させることにより静脈血栓症のリスクに作用することが分かる。
【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
検討
ＦＧＧ、ＦＧＡ及びＦＧＢ遺伝子の最も一般的なハプロタイプの静脈血栓症のリスクに対する影響を大集団をベースとする症例−コントロール研究であるライデン血栓性素因研究で調べた。血栓症のリスクを高める３つのハプロタイプ、すなわちＥＧＧ−Ｈ２、ＦＧＡ−Ｈ２及びＦＧＢ−Ｈ２が見つかった。３つの遺伝子間の連鎖不平衡を調整した後、ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプのみが静脈血栓症の高いリスクに関連したままであった。ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプのホモ接合性キャリア（集団の５．９％）では、最初の静脈血栓イベントを発現するリスクが２．４倍高かった（９５％ＣＩ：１．５−３．９）。ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプも低い血漿フィブリノーゲンγ’レベル（γＡ／γ’プラスγ’／γ’フィブリノーゲン）及び低いフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比（γ’／γ比）に関連していることが判明した。
【０１１３】
更に、静脈血栓症のリスクは、たとえＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプの存在について調整した後でも高いフィブリノーゲンレベル及び低いフィブリノーゲンγ’レベルに応じて増加することも知見された。ＦＧＧ−２ハプロタイプがフィブリノーゲンγ’の血漿レベルを低下させることにより静脈血栓症のリスクを高めるとの結論が得られた。フィブリノーゲンγ’レベルがフィブリノーゲンレベルに関連し（図５）、高いフィブリノーゲンレベルが静脈血栓症の高いリスクにも関連しているので、リスク決定要素としてγ’／γ比を使用することがより実際的であると見なされる。γ’／γ比が健康被験者（０．６９）で測定した分布のＰ１０未満である個人では、たとえＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプについて調整した後であっても静脈血栓症のリスクが２．４倍高かった。対照の８２％及びγ’／γ比が＜０．６９の症例の９１％がＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプのホモ接合性キャリアであった。
【０１１４】
リスクハプロタイプＦＧＧ−Ｈ２は、そのレア対立遺伝子が前記ハプロタイプに対してユニークである４つの完全にリンクしている多形、すなわち１２９Ａ／Ｔ（ｒｓ２０６６８５４）、７８７４Ｇ／Ａ（ｒｓ２０６６８６１）、９６１５Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６４）及び１００３４Ｃ／Ｔ（ｒｓ２０６６８６５）により定義される。ｒｓ番号はｄｂＳＮＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを介してアクセス可能）に従ってＳＮＰを同定する。また、９４０個人集団の本研究では、７８７４Ｇ／Ａと１００３４Ｃ／Ｔ多型の間の組換えは見られなかった。本発明者らは、１００３４Ｃ＞Ｔ変化があり、この結果ＣｓｔＦコンセンサス部位が改善されるので血漿フィブリノーゲンγ’が低くなり、γ’／γ比が低くなる。
【０１１５】
ＦＧＧ−Ｈ２は静脈血栓症の高いリスクに関連する唯一のハプロタイプとして同定され、ＦＧＧ、ＦＧＡまたはＦＧＢハプロタイプのいずれもが健康な対照被験者の血漿フィブリノーゲンレベルに関連していなかった。よって、ＦＧＧ−Ｈ２の検査が診断ツールとして使用され得る。
【実施例２】
【０１１６】
フィブリノーゲンγ１００３４Ｃ＞Ｔ多型のＴ対立遺伝子は、ＦＧＧ遺伝子中のヌクレオチド１００３０−１００４７のＣｓｔＦ部位に対するコンセンサスを強化することによりフィブリノーゲンγ遺伝子の選択的スプライシングの効率を低下させる。
【０１１７】
序
実施例１において、フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ（ＦＧＧ−Ｈ２）が深部静脈血栓症の高いリスク及び低いフィブリノーゲンγ’レベルに関連していたことを報告した。このハプロタイプ中に存在するハプロタイプタギング一塩基多型（ｈｔＳＮＰ）についてＦＧＧ−Ｈ２を調べた後、１００３４Ｃ＞Ｔ多型のＴ対立遺伝子［ｒｓ２０６６８６５］（ＳｅａｔｔｌｅＳＮＰｓ（Ｄ．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，ＳｅａｔｔｌｅＳＮＰｓ．ＮＨＬＢＩ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ワシントン州シアトルに所在のＵＷ−ＦＨＣＲＣ，ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｇｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ．１５−４−２００３）に従ってナンバリング；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４）がフィブリノーゲンγ遺伝子の選択的スプライシングの効率に影響を及ぼすことによるフィブリノーゲンγ’レベルの低下に関与していたと仮定された。
【０１１８】
１００３４Ｃ＞Ｔ多型は、第２ポリアデニル化（ｐＡ）シグナル（ｎｔ  ９９９７−１０００２（ｐＡ２）のすぐ下流の切断刺激因子（ＣｓｔＦ）コンセンサス２ａ（Ｋ．Ｂｅｙｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２６７６９−２６７７９（１９９７））配列（ｎｔ  １００３０−１００４７のＹＧＴＧＴＹＴＴＹＡＹＴＧＮＮＹＧＴ）中に位置している；図８参照。このポリアデニル化シグナルを使用して、フィブリノーゲンγＡ鎖をコード化するｍＲＮＡを形成する。フィブリノーゲンγ’鎖をコード化するｍＲＮＡを形成するために使用されるポリアデニル化シグナル（ｐＡ１）はイントロン９中のｎｔ  ９５５８−９５６３に位置している。ヌクレオチド１００３４にＴ（ＣｓｔＦコンセンサス配列に下線を付している）を含むＦＧＧ−Ｈ２では、ＣｓｔＦ配列はいずれも１００３４位にＣを有する他の一般的ＦＧＧハプロタイプ（Ｈ１、Ｈ３及びＨ４）に比して強化されている。
【０１１９】
このＣｓｔＦコンセンサスの改善によりＦＧＧ−Ｈ２対立遺伝子に由来するプレｍＲＮＡ中のｎｔ  ９９９７−１０００２のポリアデニル化シグナル（ｐＡ２）がより頻繁に使用され、コンセンサスｐＡ１（γ’特異的ポリアデニル化）として余り頻繁に使用されないと仮定された。従って、ＦＧＧ−Ｈ２は（ｐＡ２を用いて）比較的より多くのγＡ転写物及び（ｐＡ１を用いて）比較的より少ないγ’転写物を産生し、インビボでＦＧＧ−Ｈ２のホモ接合性キャリアにおいて観察される低いフィブリノーゲンγ’レベル及びフィブリノーゲンγ’／全フィブリノーゲン比に相当するであろうと予想される。
【０１２０】
イントロン９中に、ＦＧＧ−Ｈに特異的であり且つその位置に基づいてフィブリノーゲンγ遺伝子の選択的スプライシングの効率に影響を及ぼす別の多型が１つある。９６１５Ｃ＞Ｔ［ｒｓ２０６６８６４］多型はイントロン９中のｎｔ  ９５５８−９５６３の第１ポリアデニル化シグナルから３’の位置にあり、フィブリノーゲンγ’特異的転写物がもたらされる。
【０１２１】
多型９６１５Ｃ＞Ｔ及び１００３４Ｃ＞ＴのフィブリノーゲンγプレｍＲＮＡの選択的スプライシングの効率に対する役割を調べるために、各種ＦＧＧミニ遺伝子構築物（表９参照）を作成し、肝由来ＨｅｐＧ２細胞に形質移入した。トラクスフェクション後、ｍＲＮＡを細胞から単離し、各種構築物の各々について選択的スプライシングの効率の尺度としてｐＡ１及びｐＡ２の相対使用をリアルタイムＰＣＲにより推定した。ＦＧＧプレｍＲＮＡの選択的スプライシングの効率を測定する際のｎｔ  １００３０−１００４７のＣｓｔＦコンセンサス配列の重要性を確認するために、ｎｔ  １００３０−１００４７のＣｓｔＦコンセンサスを同一コンセンサス配列に基づいて他の位置に突然変異を導入することにより更に強化、弱化させた（表１０参照）。
【０１２２】
方法
１．  ＦＧＧハプロタイプミニ遺伝子構築物
本研究で使用したミニ遺伝子は強力ＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づいていた。フィブリノーゲンγ遺伝子のエクソン９、イントロン９、エクソン１０及び３’ＵＴＲを含有する１０９０ｂｐ遺伝子を、ＦＧＧ−Ｈ１及びＦＧＧ−Ｈ２に対してホモ接合性のゲノムＤＮＡサンプルに高忠実度ポリメラーゼ（Ｔａｑ／Ｔｇｏ混合物，Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲすることにより増幅させた。前進プライマー（５’−ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＴＣＴ ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  Ｃ−３’（配列番号２９））が翻訳開始部位（イタリック）及びＸｂａＩに対する導入制限部位（下線）を有するコザック配列を含んでいた。スプライシングされたｍＲＮＡのナンセンス仲介崩壊を伴う潜在的問題を防止するめために、エクソン９の天然リーディングフレームとインフレームにある出発コドンを導入した。逆行プライマー（５’−ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＧＣ ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  Ａ−３’（配列番号３０）をＢｓｍＩに対する導入制限部位（下線）を含んでいた。
【０１２３】
ＰＣＲ産物及びベクターをＸｂａＩ及びＢｓｍＩで二重消化し、ＰＣＲ産物をベクターのＸｂａＩ及びＢｓｍＩにクローニングした。実験の干渉を防止するために、ＸｂａＩ及びＢｓｍＩで二重消化することによりウシ成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化部位をベクターから除外した。
【０１２４】
７つの異なるＦＧＧミニ遺伝子構築物を作成した（表９）。構築物１（９６１５Ｃ，１００３４Ｃ（ＦＧＧ−Ｈ１））及び構築物２（９６１５Ｔ，１００３４Ｔ（ＦＧＧ−Ｈ２））は各々ＦＧＧのハプロタイプを有していた。構築物３（９６１５Ｃ，１００３４Ｔ）及び構築物４（９６１５Ｔ，１００３４Ｃ）はベクター中の断片の上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位及びインサートのｎｔ  ９９０８−９９１３の内部ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて構築物１及び２の間のＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を交換することにより誘導した。
【０１２５】
【表１４】
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【０１２６】
すべての構築物を多型部位の同一性を確認するため、ＰＣＲ人工産物が導入されなかったことを確認するために、すべての構築物を配列決定することにより分析した。配列決定は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。反応はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。プライマー配列を下表にリストする。
【０１２７】
【表１５】
2008533999.tif 000039
【０１２８】
２．  ＣｓｔＦコンセンサス突然変異
部位特異的突然変異は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）部位特異的突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて製造業者のプロトコルに従って実施した。全体として、４つのＣｓｔＦコンセンサス変異体を作成した（表１０）。ＣｓｔＦ変異体１では１００３１ＧがＡに突然変異された。ＣｓｔＦ変異体２では１００３１Ｇ及び１００４２Ｇの両方がＡに突然変異された。ＣｓｔＦ変異体３では１００３３ＡがＧに突然変異され、ＣｓｔＦ変異体４では１００３３Ａ及び１００４６Ａの両方がＧに突然変異された。
【０１２９】
【表１６】
2008533999.tif 000040
【０１３０】
以下の変異体オリゴを使用した（突然変異ヌクレオチドには下線が付されている）：
ＣｓｔＦ変異体１：５’−ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号３８）及び逆相補鎖、
ＣｓｔＦ変異体２：５’−ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号３９）及び逆相補鎖、
ＣｓｔＦ変異体３：５’−ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号４０）及び逆相補鎖、
ＣｓｔＦ変異体４：５’−ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号４１）及び逆相補鎖。
突然変異を確認するために、すべての突然変異構築物を配列決定により分析した。
【０１３１】
３．  トラクスフェクション条件
構築物をＨｅｐＧ２細胞にトラクスフェクトした。内因性フィブリノーゲンを産生する白人ハプロタイプ肝細胞肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＥＣＡＣＣ，＃８５０１１４３０）をＥＣＡＣの指示に従って培養した。細胞を１２ウェルプレートにおいて培養し、２４時間後トランスフェクションをＴｆｘ−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造業者のプロトコルに従って６０〜８０％集密度で実施した。１μｇの各構築物を全容量４００μｌの増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）  ウシ胎児アルブミン、６０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン及び０．１ｍＭ  非必須アミノ酸を補充したＭＥＭ）において３μ１のＴｆｘ−２０試薬を用いて形質移入した。各構築物は両方の転写物（γＡ及びγ’）を産生するので、トランスフェクション効率の差を補正する必要はなかった。独立のトランスフェクション実験を２つの別々の構築物調製物を用いて実施した。
【０１３２】
４．  全ＲＮＡ単離
トリプシン処理により細胞を収集した後、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いて単離した。各ＲＮＡサンプルを１０単位のＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）と３７℃で１５分間インキュベートした後６５℃で１５分間不活性化した。全ＲＮＡサンプルの各々の量をアガロースゲル電気泳動によりチェックした。
【０１３３】
５．  ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡ合成は、逆転写酵素（ＲＴ）用一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μｇのＨｅｐＧ２細胞由来のＲＮＡを用いてプロトコルに従って実施した。ただし、改変したオリゴｄ（Ｔ）プライマー（５’−ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＡ（Ｔ）１６−３’（配列番号４２））を使用した。このプライマーを用いて、ｍＲＮＡのみがｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用することができる。
【０１３４】
６．  リアルタイムＰＣＲ分析
各サンプルについて、選択的スプライシングの効率を蛍光標識したプローブを用いてリアルタイムＰＣＲにより測定した。ヘテロ二本鎖の形成を防止するために、２つの別々のＰＣＲ反応においてｐＡ１及びｐＡ２転写物の濃度を分析した。両反応において、内因性フィブリノーゲンｍＲＮＡを増幅させることなく構築物転写物に由来するｃＤＮＡのみを増幅させるために前進プライマー（５’−ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ−３’（配列番号４３））をベクター上に配置した。
【０１３５】
ｐＡ２転写物を調べるために、逆行プライマー（５’−ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号４４））をＦＧＧの３’ＵＴＲに配置した（図９参照）。ｐＡ２転写物に対して特異的なプローブ（５’−ＦＡＭ−ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＡＡ−ＢＨＱ−３’（配列番号４５））をエクソン１０及び３’ＵＴＲの境界に配置した（図９）。ｐＡ１転写物を調べるために、逆行プライマー（５’−ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  ＧＡＧ  ＴＣ−３’（配列番号４６））をγ’鎖カルボキシ末端の２０追加アミノ酸をコードするイントロン９の部分に配置した（図９）。ｐＡ１転写物に特異的なプローブ（５’−ＴＥＴ−ＡＧＧ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＣＴ−ＢＨＱ−３’（配列番号：４７））をエクソン９及びγ’鎖カルボキシ末端の２０追加アミノ酸の境界上に配置した（図９）。産物の大きさは３４０ｂｐ（γＡ）及び２８０ｂｐ（γ’）であった。
【０１３６】
リアルタイムＰＣＲ効率は、連続希釈したｃＤＮＡ調製物の勾配から計算した。対数期の１サイクルの対応リアルタイムＰＣＲ効率（Ｅ）は式：
Ｅ＝１０［−１／勾配］
（Ｍ．Ｗ．Ｐｆａｆｆｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：ｅ４５（２００１））に従って計算した。ｐＡ２−及びｐＡ１−転写物はいずれも未希釈〜１０−５希釈ｃＤＮＡ入力（ｎ＝６）の範囲で高直線性で２．１４のリアルタイムＰＣＲ効率を示した（ピアソン相関係数ｒ＞０．９８）。
【０１３７】
定量値は、反応内で発生した蛍光が閾値を横切る閾値サイクル数から得た（Ｃｔ値）。両反応において、増幅が対数期にある点で固定閾値を選択した（γＡ反応では０．２５、γ’反応では０．１０）。ｐＡ１転写物／ｐＡ２転写物の比の尺度として関数２−Δｃｔ（ここで、ΔｃｔはＣｔｐＡ１及びＣｔｐＡ２の差である）を使用した。
【０１３８】
リアルタイムＰＣＲの正確さ及び再現性を確認するために、各ｃＤＮＡサンプルを１ランの間に３回、４つの異なるランで分析した。アッセイ内ＣＶが＜１％のときにＣｔ値が認められた。アッセイ間ＣＶは＜４％であった。すべての構築物の２つの異なるＤＮＡ調製物を３つの独立トランスフェクション実験で比較した。
【０１３９】
７．  統計分析
構築物間のｐＡ１及びｐＡ２転写物の発現の差を分析するために、ハプロタイプ１を有する構築物のｐＡ１転写物／ｐＡ２転写物の相対的発現（ｐＡ１／ｐＡ２比）を１００％（野生型構築物）に設定した。このようにして、ｐＡ２の使用が多い構築物についてのｐＡ１／ｐＡ２は１００％未満である。逆に、ｐＡ２の使用が少ない構築物についてのｐＡ１／ｐＡ２比は１００％より高い。すべての構築物の平均相対的ｐＡ１／ｐＡ２比を野生型構築物との差について両側ステューデントｔ−検定を用いて試験した。
【０１４０】
結果
１．  ＦＧＧハプロタイプミニ遺伝子構築物
各種ＦＧＧミニ遺伝子構築物の野生型構築物（構築物１，ＦＧＧ−Ｈ１）と比較したｐＡ１及びｐＡ２転写物の平均相対使用（ｐＡ１／ｐＡ２比）を図１０に示す。構築物２（ＦＧＧ−Ｈ２）のｐＡ１／ｐＡ２比は野生型構築物について得た値と比較して低下していた（７１．５  １２％，ｐ＜０．００１）。これは、ＦＧＧ−Ｈ２がインビボでの低いフィブリノーゲンγ’レベルと関連しているという我々の先の所見に一致した。ＦＧＧ−Ｈ２は選択的スプライシングの領域に２つのＳＮＰ（９６１５Ｃ＞Ｔ及び１００３４Ｃ＞Ｔ）１を含んでいるので、交換構築物３（９６１５Ｃ，１００３４Ｔ）及び４（９６１５Ｔ，１００３４Ｃ）が作成された。これらのハプロタイプはインビボで存在しないが、これらの構築物は２つのＦＧＧ−Ｈ２特異的ＳＮＰのいずれか１つがフィブリノーゲンγ’発現を低下させるかを調べるために作成した。
【０１４１】
構築物３のｐＡ１／ｐＡ２比は野生型構築物について得た値に比して低下し（８５．３  ３．３％，ｐ＝０．００７）、構築物４の比は野生型構築物について得た値と有意な差はなかった（１０１．６  １８．４％，ｐ＝０．８８１）。このことは、１００３４位のＴがこの位置のＣに比してｐＡ１の相対使用を低下させたことを示していた。
【０１４２】
これらのデータから、１００３４Ｃ＞Ｔ変化がｐＡ２を比較的多く使用し、ｐＡ１を少なくしか使用しないことに関与し、よって低下したγ’含量に関与することが立証される。これは静脈血栓症のリスクに関与していると我々が知見したことである。
【０１４３】
２．  ＣｓｔＦコンセンサス変異構築物
ＳＮＰ  １００３４のＴ対立遺伝子の機能性を予測するために使用されるＣｓｔＦコンセンサスを裏付けるために、ＣｓｔＦコンセンサスを他の位置で突然変異させた構築物を作成した（表１０参照）。ＣｓｔＦ変異体１では１００３１ＧをＡに突然変異させた。仮定上、この突然変異がＣｓｔＦコンセンサスを弱らせるので、このヌクレオチド変化によりｐＡ２の使用を減らすことによりｐＡ１の使用が有利となるのであろう。このことは、１００３１Ｇ及び１００４２Ｇの両方がＡに突然変異されているＣｓｔＦ変異体２にも当てはまる。ＣｓｔＦ変異体３及び４では、ＣｓｔＦコンセンサスが１つまたは２つのヌクレオチドにより強化されたので、フィブリノーゲンγ’発現におけるｐＡ２の使用の増加及び結果としてのｐＡ１の使用の低下が予想される。ＣｓｔＦ変異体３では１００３３ＡがＧに突然変異され、ＣｓｔＦ変異体４では１００３３Ａ及び１００４６Ａの両方がＧに突然変異された。
【０１４４】
図１１は、野生型構築物（９６１５０，１００３４Ｃ）と比較したＣｓｔＦ変異構築物についてのｐＡ１及びｐＡ２の平均相対使用を示す。ＣｓｔＦ変異体１（１４２．４％）及び２（１６０．７％）では、ｐＡ１が野生型構築物の場合よりも比較的より頻繁に使用された（１：ｐ＝０．００８，２：ｐ＜０．００１）。対照的に、ＣｓｔＦ変異体３（６６．２％）及び４（５９．７％）では、ｐＡ１の相対使用が野生型構築物に比して低下している（３：ｐ＜０．００１，４：ｐ＜０．００１）。これらのデータから、１００３４Ｃが機能的ＣｓｔＦコンセンサス部位の一部であることが立証される。
【実施例３】
【０１４５】
被験者中のハプロタイプＦＧＧ−Ｈ２の存在の測定方法
個人中のＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプの存在を調べるために使用され得る１つの方法は前記個人を５’ヌクレアーゼ／ＴａｇＭａｎアッセイを用いてＦＧＧ−Ｈ２タギング多型１００３４Ｃ／Ｔを遺伝子同定することである。
【０１４６】
典型的なアッセイでは、９０個のＤＮＡサンプル及び６個のブランクを９６ウェルプレートにおいて分析する。ＦＧＧ  ＳＮＰ  １００３４Ｃ／Ｔを遺伝子同定するために、ＰＣＲを２２μ１の最終容量で１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、ＰＣＲバッファー（ＫＣｌ，トリスＨＣ１）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４９０ｎＭの各プライマー、１０９ｎＭの各プローブ及び０．５ＵのＨｏｔ  Ｇｏｌｄｓｔａｒポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）を用いて実施した。反応バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス及びＧｏｌｄｓｔａｒポリメラーゼはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ（ｑＰＣＲ（商標）コアキット，カタログ番号ＲＴ−ＱＰ７３−０５）からのものであった。
【０１４７】
プライマー及びプローブは米国フォスターシティーに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｘ  Ａｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄとして入手した。熱サイクリングを、９５℃で１０分間インキュベートした後９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル実施し、６０℃で１分間アニーニング／延長することにより実施した。熱反応はドイツ国Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆに所在のＢｉｏｚｙｍ社製ＰＴＣ−２２５サーマルサイクラーを用いて実施し、対立遺伝子識別のための蛍光終点読取りは米国フォスターシティーに所在のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＡＢＩ  ７９００  ＨＴを用いて実施した。
【０１４８】
得られ得る結果の典型例を図６及び７に示す。ここで、対立遺伝子ＸはＦＧＧ  １００３４Ｃであり、対立遺伝子ＹはＦＧＧ  １００３４Ｔである。ゲノタイプ１００３４ＣＣを有する個人は赤色（下方右）、ゲノタイプ１００３４ＣＴを有する個人は緑色（中央右）、リスクゲノタイプ１００３４ＴＴを有する個人は青色（下方左）である。ブランクは黒色（下方左）である。ＤＮＡサンプルをライデン血栓性素因研究から患者／対照状態の情報なしにランダムに選択した。
【０１４９】
以下のプライマー及びプローブを使用した：
【０１５０】
【化３１】
2008533999.tif 000041
【０１５１】
ＶＩＣ及びＦＡＭはプローブの３’末端で結合させた蛍光基であった。ＴＡＭＲＡはプローブの５’末端に結合させたクエンチャーとして使用した。プローブ２はレア１００３４Ｔ対立遺伝子に結合させることによりＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出する。プローブ１は１００３４Ｃ対立遺伝子に結合させることによりＦＧＧのすべての非ＦＧＧ−Ｈ２ハプロタイプを検出する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】フィブリノーゲンの構造を示す。
【図２】γ鎖ｍＲＮＡの選択的ｍＲＮＡプロセシングを示す。γＡ鎖はプレｍＲＮＡの９イントロンのすべてが除去されているｍＲＮＡから翻訳され、ポリアデニル化はエクソン１０の下流で起こった。対照的に、γ’鎖はＦＧＧプレｍＲＮＡの選択的プロセシングにより生ずる。イントロン９は除去されず、ポリアデニル化はこのイントロン中にある第２部位で起こる。こうすると、ユニークな２０アミノ酸延長を有し、イントロン９によりコード化され、エクソン１０によりコード化されるγ鎖のカルボキシ末端４アミノ酸が置換されているポリペプチドが翻訳される。この変異鎖は血漿中に存在するフィブリノーゲンγ鎖の約７〜１５％を含んでいる。γ’タンパク質のほぼ全部がγＡ変異体とのヘテロダイマーとしてインビボで生じ、１つのＤ領域はγ’カルボキシ末端を含み、他方はγＡカルボキシ末端を含む（γＡ／γ’フィブリノーゲン）。
【図３】ライデン血栓性素因研究を遺伝子同定するために使用されるフィブリノーゲン遺伝子クラスターにおけるｈｔＳＮＰを示す。ヌクレオチドのナンバリングはシアトルＳＮＰ（ＧｅｎＢａｎｋにＡＴ３５０２５４（ＦＧＧ）、ＡＦ３６１１０４（ＦＧＡ）、ＡＥ３８８０２６（ＦＧＢ）として寄託されている）に従っている。３つのフィブリノーゲン遺伝子（ＦＧＧ、ＦＧＡ、ＦＧＢ）中のハプロタイプのナンバリングは任意である。Ｆ：ライデン血栓性素因研究の対照集団におけるハプロタイプ頻度。
【図４】対照被験者（ｎ＝４７１）における全フィブリノーゲンレベル（Ｕ／ｄＬ）とフィブリノーゲンγ’レベル（Ｕ／ｄＬ）のＦＧＧハプロタイプ依存性相関関係を示す。◆（破線）ＦＧＧ  ＨｘＨｘ、□（点線）ＦＧＧ  Ｈ２Ｈｘ、▲（一点破線）ＦＧＧ  Ｈ２Ｈ２、（実線）すべて。
【図５Ａ−１】フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２対立遺伝子の配列を示す。突然変異はボールドの大文字で示す。
【図５Ａ−２】フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２対立遺伝子の配列を示す。突然変異はボールドの大文字で示す。
【図５Ａ−３】フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２対立遺伝子の配列を示す。突然変異はボールドの大文字で示す。
【図５Ａ−４】フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２対立遺伝子の配列を示す。突然変異はボールドの大文字で示す。
【図５Ａ−５】フィブリノーゲンγ遺伝子のハプロタイプ２対立遺伝子の配列を示す。突然変異はボールドの大文字で示す。
【図５Ｂ−１】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４のＦＧＧ配列の基準配列を示す。
【図５Ｂ−２】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４のＦＧＧ配列の基準配列を示す。
【図５Ｂ−３】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４のＦＧＧ配列の基準配列を示す。
【図５Ｂ−４】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４のＦＧＧ配列の基準配列を示す。
【図５Ｂ−５】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３５０２５４のＦＧＧ配列の基準配列を示す。
【図６】実施例２の結果を示す。
【図７】実施例２の結果を示す
【図８】ミニ遺伝子構築物のインサートの概略図を示す。このインサートは多型９６１５Ｃ＞Ｔ及び１００３４０＞Ｔを含むＦＧＧ遺伝子のエクソン９、イントロン９、エクソン１０及び３’ＵＴＲを含んでいる。インサートの詳細については、図９のファイルを参照されたい。ＣｓｔＦコンセンサス配列とＣｓｔＦ変異体とアラインさせてＳＮＰ  １００３４Ｃ＞Ｔ（下線を付した）を含む構築物配列の一部を拡大して示す。ＣｓｔＦ変異構築物の突然変異ヌクレオチドはボールドで下線が付されている。縦線はアラインさせている構築物配列とＣｓｔＦコンセンサス配列の間のヌクレオチドを示す（１８中１４）。
【図９Ａ】ミニ遺伝子構築物中のインサートのヌクレオチド配列を示す。インサート配列：ＦＧＧ  ｎｔ．９０９０〜ｎｔ．１０１５１、ボールド二重下線：ＤＮＡ由来のインサートを得るために使用したプライマー、点線下線：エクソン９及びエクソン１０、標準：イントロン９、破線下線：３’ＵＴＲ、イタリック：γ’鎖の２０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列、ボールド下線：逆プライマーリアルタイムＰＣＲ、ボールド：プローブリアルタイムＰＣＲ、中央のＣ＊：ＳＮＰ  ９６１５末端のＣ＊＊：ＳＮＰ  １００３４。
【図９Ｂ】同一の図を色つきで示す。ピンク色：ＤＮＡ由来のインサートを得るために使用したプライマー、青色：エクソン９及びエクソン１０、黒色：イントロン９、緑色：３’ＵＴＲ、茶色イタリック：γ’鎖の２０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列、橙色：逆プライマーリアルタイムＰＣＲ、ボールド：プローブリアルタイムＰＣＲ、中央の赤色Ｃ：ＳＮＰ  ９６１５、末端の赤色Ｃ：ＳＮＰ  １００３４。  プライマー及びプローブリアルタイムＰＣＲ：構築物上前進方向：
【０１５３】
【化３２】
2008533999.tif 000042
逆ｐＡ１−転写物：
【０１５４】
【化３３】
2008533999.tif 000043
逆ｐＡ２−転写物：
【０１５５】
【化３４】
2008533999.tif 000044
プローブｐＡ１−転写物：
【０１５６】
【化３５】
2008533999.tif 000045
プローブｐＡ２−転写物：
【０１５７】
【化３６】
2008533999.tif 000046
【図１０】２つの別々の構築物調製物を用いた３つの独立トランスフェクション実験後のｐＡ１及びｐＡ２の相対使用（ｐＡ１／ｐＡ２比（％））を示す。４つのリアルタイムＰＣＲを各ｃＤＮＡサンプルを用いて３回実施した。基準構築物ＣＣ（９６１５Ｃ及び１００３４Ｃ）；１００％に設定、平均±標準偏差ＴＴ（９６１５Ｔ及び１００３４Ｔ）：７１．５％±１２、ＣＴ（９６１５Ｃ及び１００３４Ｔ）：８５．３％±３．３、ＴＣ（９６１５Ｔ及び１００３４Ｃ）：１０１．６％±１８。
【図１１】２つの別々の構築物調製物を用いる３つの独立トランスフェクション実験後の各種ＣｓｔＦ変異ミニ遺伝子構築物についてのｐＡ１及びｐＡ２の相対使用（ｐＡ１／ｐＡ２比（％））を示す。３つのリアルタイムＰＣＲを各ｃＤＮＡサンプルを用いて３回実施した。基準構築物ＣｓｔＦＣ：１００％に設定平均±標準偏差ＣｓｔＦｍｕｔ１：１４２．４％±２６、ＣｓｔＦｍｕｔ２：１６０．７％±２３、ＣｓｔＦｍｕｔ３：６６．２％±６、ＣｓｔＦｍｕｔ４：５９．７％±７。
【図１】
2008533999.tif 000061
【図２】
2008533999.tif 000062
【図３】
2008533999.tif 000063
【図４】
2008533999.tif 000064
【図５Ａ−１】
2008533999.tif 000065
【図５Ａ−２】
2008533999.tif 000066
【図５Ａ−３】
2008533999.tif 000067
【図５Ａ−４】
2008533999.tif 000068
【図５Ａ−５】
2008533999.tif 000069
【図５Ｂ−１】
2008533999.tif 000070
【図５Ｂ−２】
2008533999.tif 000071
【図５Ｂ−３】
2008533999.tif 000072
【図５Ｂ−４】
2008533999.tif 000073
【図５Ｂ−５】
2008533999.tif 000074
【図６】
2008533999.tif 000075
【図７】
2008533999.tif 000076
【図８】
2008533999.tif 000077
【図９Ａ】
2008533999.tif 000078
【図９Ｂ】
2008533999.tif 000079
【図１０】
2008533999.tif 000080
【図１１】
2008533999.tif 000081
【配列表】
2008533999000001.app
【国際調査報告】
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2008533999.tif 000083
2008533999.tif 000084
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