(57)【要約】本発明は、抗菌性活性を有する一群のペプチド様化合物に関する。該化合物は、毒、特に細菌の毒、例えばリポポリサッカライド又はリポテイコン酸に対して親和性をもまた有する。該化合物は、細菌又は真菌感染症の治療に有用な医薬を製造するために使用されることができる。該医薬は全身的に又は局所的に投与され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の細菌又は真菌感染症の予防処置又は治療処置のための医薬の製造のためにペプチド様化合物を使用する方法において、
該化合物がアミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６を含み、
ここで
Ｘ１はＮ末端部分を表す、
Ｘ２はＫ又はＥである、
Ｘ３はＱ又はＥである、
Ｘ４はＤ又はＲである、
Ｘ５はＮ又はＥである、
Ｘ６はＣ末端部分を表す、
コア配列の１つ以上のアミノ酸は場合によって誘導体化されていてもよく、かつ
（ａ）Ｎ末端部分はアセチル化されている、及び／又は
（ｂ）Ｃ末端部分はアミデート化されている、及び／又は
（ｃ）アミノ酸配列はＸ１ＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＸ６と異なっている、
方法。
【請求項２】
Ｎ末端部分Ｘ１がアミノ酸Ｉ及び／又はＧを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ末端部分Ｘ６が、少なくとも４つのアミノ酸又はアミノ酸誘導体の配列を含む、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ末端部分Ｘ６が、ＰＲＴＥ及びＲＰＬＲから選択されたアミノ酸配列を含み、前記配列のアミノ酸の１つ以上が場合により誘導体化されていてもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
化合物が、２４個のアミノ酸又はその誘導体の配列を有するペプチドに類似しており、前記配列はＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥ及びＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲから選択され、かつ１つ以上のアミノ酸が場合により誘導体化されていてもよい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｎ末端がアセチル化されており、かつＣ末端がアミデート化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細菌又は真菌感染症がプランクトン性の微生物により引き起こされているところの、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細菌又は真菌感染症が、急性又は慢性の全身感染症であるところの、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
全身感染症が敗血症ショックと結びついているところの、請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物の免疫系が病気又は投薬により抑制されているところの、請求項７又は８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細菌又は真菌感染症が、固着性であることができかつバイオフィルムを形成することのできる微生物により引き起こされているところの、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細菌又は真菌感染症が急性又は慢性の、局所的又は局部的な感染症であるところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
局所的又は局部的感染症が、中耳炎、気管支炎、肺炎、又は副鼻腔炎、又はその他の下気道若しくは上気道又は呼吸器系の感染症であるところの、請求項１２に記載に方法。
【請求項１４】
哺乳動物が嚢胞性線維症に罹患しているところの、請求項１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物の免疫系が病気又は投薬により抑制されているところの、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
局所的又は局部的感染症が、肝臓、脾臓、歯周組織、目、腎臓、皮膚、膣、尿道、又は心臓の感染症であるところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
局所的又は局部的感染症が、心臓弁、静脈カテーテル、導尿カテーテル、コンタクトレンズ、スピーチボタン、中耳腔換気用チューブ、子宮内デバイス、又は人工骨、その他の医療用デバイスの哺乳動物への移植又は挿入に関連するところの、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物が、アミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６を含むペプチド様化合物以外のさらなる抗菌剤又は抗真菌剤で同時に治療されるところの、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法、ここで
Ｘ１はＮ末端部分を表す、
Ｘ２はＫ又はＥである、
Ｘ３はＱ又はＥである、
Ｘ４はＤ又はＲである、
Ｘ５はＮ又はＥである、
Ｘ６は、Ｃ末端部分を表す、
コア配列の１以上のアミノ酸が場合により誘導体化されていてもよい。
【請求項１９】
さらなる抗菌剤又は抗真菌剤が、一つの医薬の中でペプチド様化合物と組み合わされているところの、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
細菌又は真菌感染症が、アミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６を含むペプチド様化合物ではない活性成分を含む医薬で同時に治療されないところの、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法、ここで
Ｘ１はＮ末端部分を表す、
Ｘ２はＫ又はＥである、
Ｘ３はＱ又はＥである、
Ｘ４はＤ又はＲである、
Ｘ５はＮ又はＥである、
Ｘ６は、Ｃ末端部分を表す、
コア配列の１以上のアミノ酸が場合により誘導体化されていてもよい。
【請求項２１】
医薬が１以上の薬学的に許容される担体又は添加剤を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
医薬が、非経口的投与、好ましくは血管注射、筋肉注射、皮下注射、又は病巣内注射、のために、配合され、加工され、及び適合されているところの、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
医薬が、感染された部位又は組織の粘膜への局所的投与のために、灌注液体、点耳剤、点鼻剤、エアロゾル、粉末アエロゾル、噴霧用液体、ゲル、懸濁物、又は粘膜付着性投与形態、又はその他の形で配合され、加工され、及び適合されているところの、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
医薬がドラッグターゲッティング剤、生物学的利用能増強剤、及び／又は制御されたデリバリー剤をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
医薬が少なくとも１の保存剤をさらに含み、かつ該保存剤の含有量が対応する偽薬組成物を有効に保存するために必要とされる含有量より低いところの、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
医薬が実質的に保存剤を含まないところの、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性細菌及び真菌を含む微生物を抑制する又は殺す抗菌性化合物に関する。さらに、該化合物は毒、特に真菌及び細菌の毒、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はリポテイコ酸（ＬＴＡ）に対して親和性を有し、該化合物はそのような毒を抑制する又は中和することができる。さらに、本発明は該化合物の治療的及び診断的使用に関し、そして該化合物を含む薬学的組成物、及びその投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近代薬学は、全世紀の半ばまでは早死の主な原因の一つであった細菌感染と戦うことにおいて非常に成功してきた。しかし、より最近では、細菌耐性の安定した増加のために、非常に効果的な抗生物質の広く普及した使用に関しますます関心が集まっている。実際、過去２５年に渡って、抗生物質耐性、特に広い範囲に抗生物質化合物に対して重ねて耐性であるもの、が調査されたほとんどすべての細菌の種で増加した。一般的な耐性メカニズムによっては冒されない最も進んだタイプの抗菌剤は、その使用が多剤耐性突然変異体を選択するように見える化合物であると現在考えられている。
【０００３】
この発展に基づいて、農業及びヒトの医薬の両者において専門家は過去におけるよりずっとより制限的に、抗生物質を使用することを勧める。例えば軽症の感染症、特に、典型的には細菌によるものではないもの、例えば一般的な風邪、は抗生物質で治療されるべきではなく、むしろ抗生物質はもっと深刻な状態のためにとっておくべきである。さらに、完全に異なるタイプの薬学活性、好ましくは一般的な抗生物質に対する細菌耐性から独立しているなんらかの活性を有する、細菌感染を治療するための新規な化合物を開発することが必要である。
【０００４】
抗生物質の広まった使用が論争的に議論された状態の一つは、急性の形態、又はその慢性の状態にある中耳炎である。滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、すなわち、急性の感染の症状なしに中耳における液体の存在を特徴とする中耳炎のタイプ、の患者の数が、初期の急性中耳炎（ＡＯＭ）に対して抗生物質治療の導入後に劇的に増加したが、このことは抗生物質自身がＯＭＥにおいて一つの役割を果たしていることを示唆している（Limら，Laryngoscope第９２巻，２７８〜２８６ページ，１９８２年）。ペニシリンのような抗生物質は、局所的な免疫反応の発現（development）、例えば中耳における局所ＩｇＭの生産を妨げると考えられている（Howieら，Ann. Otol. Rhinol. Laryngol.，第８５巻、補遺第２５巻，１８〜１９ページ，１９７６年）。従来の抗生物質治療の別の欠点は、細菌は殺されるが、その毒はまだ活性であることである。
【０００５】
細菌又は真菌感染から生じるこれらの、又は他の病気の治療のために、微生物又は病原菌そのものを殺さずにむしろ、それらの毒を中和し、自然なホストの防御機構が感染の拡大を制御することを許す化合物を使用することが有利であり得ることが示唆された（ネル，「滲出性中耳炎の病因におけるエンドトキシンの役割（The Role of Endotoxin in the Pathogenesis of Otitis Media with Effusion）」，博士論文、ライデン、１９９９年）。同時に、この戦略は損傷された粘膜機能の速い回復を支持する。
【０００６】
たくさんの感染症の状態、例えば中耳炎に含まれる微生物の毒，例えば真菌の毒、特に細菌の毒、の中での主な役割は、非常に毒性の強い脂質部分、リピッドＡと共役された多糖類からなる、グラム陰性細菌の細胞壁に見出されるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の群であるエンドトキシンによって演じられる。ＯＭＥを治療するための最近の治療アプローチは、エンドトキシン又はＬＰＳを中和する化合物を投与することである（ネル、同上）。
【０００７】
エンドトキシン、すなわちＬＰＳを中和することのできる種々の化合物が、現在公知である。例えば、いくつかの抗−エンドトキシン抗体、例えばＨＡ−ＩＡ及びＥ５、ヒト及び壁在性のモノクロナールＩｇＭ抗体、がそれぞれ開発されている。これらの抗体はいくつかの重度な状態、例えば敗血症ショックのある患者の生存率を改善することが示された（Ziegler等，New Engl. J. Med.，第３２４巻，４２９〜４３６ページ，１９９１年）。しかしその活性及び特異性は不十分であると考えられる。
【０００８】
エンドトキシンに対して活性な物質の別の群が、好中球のアズール顆粒に蓄積されている細菌透過性増強タンパク（bacterial permeability-increasing protein）（ＢＰＩ）と命名されたヒトの内因性タンパクから誘導されている（Gazzano-Santoro等，「感染と免疫（Infectionand Immunity）」第６０巻，第１１号，４７５４〜４７６１ページ，１９９２年）。ＢＰＩは強いカチオン性タンパクであり、遊離のエンドトキシンを中和するだけでなく、細菌の外側の膜の透過性を高めることにより細菌細胞自体を抑制する、又は殺す。ＢＰＩは実際は効能のある天然の抗体であり、ＬＰＳ及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む他の引き金の存在により誘起される。しかし、その活性のほとんどはそれを合成する免疫細胞、すなわち多形核マクロファージと関連している。
【０００９】
ＢＰＩから誘導されるいくつかの組み換えタンパクもまた開発されている。例えばＢＰｌ２３（Kohn等，１９９３）及びｒＢＰＩ２１（Horwitz等，１９９６）である。それらはそれぞれ２３及び２１ｋＤａの分子量を有するＢＰＩのＮ末端部分を主に表す。ＯＭＥの治療におけるＢＰＩ及びＢＰＩに由来する化合物の使用は、例えば国際公開第００／７１１４９号パンフレットに記載されている。
【００１０】
抗菌性活性を有する天然化合物の別の族は、カセリシジンである。カセリシジンは呼吸器上皮細胞、胞状マクロファージ、及び他の組織により生産されるペプチドの種類である。その本来の形態では、これらの化合物は直線状、αらせん状、システインフリーのペプチド又はタンパクである。カセリシジンは、カチオンであり、非常に一定に保たれた信号配列及びプロリージョン、カセリンを含む。しかし、成熟ペプチドをエンコードするそのＣ末端領域は、かなりの不均一性を示す。該ペプチドは１２〜８０のアミノ酸を有し得る。
【００１１】
最も有名なヒトカセリシジンは、１８ｋＤａのカチオン性抗菌性タンパク、ＣＡＰ１８である。ＣＡＰ１８の３７Ｃ末端アミノ酸、すなわちペプチドＬＬ−３７は、ＬＰＳに対する高い親和性と中和能力の原因となる領域に相当する（Sawa等，Antimicr．Agents．Chemother．第４２巻，第１２号，３２６９〜３２７５ページ，１９９８年）。ＣＡＰ１８又はＬＬ−３７から誘導されたいくつかの切断されたペプチドが開発され、試験された。例えばSawa（Sawa等，同上），Gutsmann（Gutsmann等，Biophys．J．第８０巻，２９３５〜２９４５ページ，２００１年）により開示されたもの、及び米国特許第６，０４０，２９１号において開示されているものである。一般的に、相対的に小さなペプチド、例えばＣＡＰ１８が、いくつかの理由から治療効果のある化合物の有力な候補として大きなタンパクより好ましい。第一にそれらはより容易に最適化され、適合され、変性されて、それらの所望される活性及び特異性を保つ、又は増大させることができる。第二に、それらは、得ること又は合成することがより容易であり、従ってより利用しやすい。第三に、それらは配合すること及びデリバリーすることがより容易である。なぜならタンパクは、非経口的な投与後にしばしば不安定であり生物学的に利用可能ではないからである。
【００１２】
同時係属中の国際特許出願
ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００６０は、参照することにより取り込まれ、細菌及び真菌の毒、例えばＬＰＳ及びＬＴＡに親和性を有するペプチド性の化合物を開示する。該化合物はアミノ酸配列、Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６（以下において核アミノ酸配列と呼ばれる）を含む。ここでＸ１は該配列のＮ末端部分を表す，Ｘ２はＫ又はＥである、Ｘ３はＱ又はＥである、Ｘ４はＤ又はＲである、Ｘ５はＮ又はＥである、そしてＸ６はＣ末端部分を表す；ここでコア配列の１以上のアミノ酸は誘導体化されていてもよい。配列は、Ｎ末端部分がアセチル化されている、及び／又はＣ末端部分がアミデート化されている、及び／又はアミノ酸配列がＸ１ＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＸ６とは異なることをさらに特徴とする。
【００１３】
該特許出願はそのような化合物の製造方法についてさらに記載する。その方法は、該化合物を構成するための、アミノ酸モノマー又はオリゴマーの化学的及び酵素的ライゲーションを含む。それらは、ホスト細胞に核酸配列をトランスフェクトするためのベクターを使用してホスト細胞の化合物をエンコードする核酸配列の発現をもまた含む。アミノ酸モノマー、アミノ酸オリゴマー、又はアミノ酸類縁体又は模擬体（mimetic）のモノマー又はオリゴマーが化学的又は酵素的ライゲーション（液相中、及び／又は官能化された固相への界面において行われる）により構築されるところの、上述の請求項のいずれか１項に従う化合物の合成方法。
【００１４】
これらの化合物は、感染に関連する、又は感染から生じる状態の管理に有用であることが見出された。それらは、ある種の慢性感染症、例えば中耳炎の治療において慣用の抗生物質より治療的に有用であり得ることは示されていた。しかし、重度な急性の感染症の場合、抗体の投与により達成される、微生物の成長の効果的なコントロールはまだ必須と考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先行技術における努力にもかかわらず、全身又は局所的な細菌及び真菌感染を含む、感染疾患の予防処置又は治療的処置における改良に対する需要がある。本発明の目的の一つは、安全、効果的であり、かつ伝染性の微生物の効果的なコントロールをもたらす新規な治療法を提供することである。微生物耐性を容易にはもたらさない治療法を提供することは、別の目的である。
【００１６】
さらに、慣用の抗菌性治療法の望ましくない効果、例えば微生物が体内で抗菌性化合物により殺菌されたときに放出される微生物の毒の毒効果をも減少させる治療法を提供することは、本発明の目的である。本発明のこれら、及び他の目的は、以下の説明に基づいて明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
第一の特徴において、本発明は哺乳動物の細菌又は真菌感染症の予防、又は治療の処置のための医薬の製造のためにペプチド様化合物を使用する方法において、該化合物がアミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６、ここでＸ１はＮ末端部分を表す、Ｘ２はＫ又はＥである、Ｘ３はＱ又はＥである、Ｘ４はＤ又はＲである、Ｘ５はＮ又はＥである、かつＸ６は、Ｃ末端部分を表す、を含むところの方法を提供する。コア配列のアミノ酸の１以上は場合によっては誘導化されていてもよい。さらに、Ｎ末端部分はアセチル化されている、及び／又はＣ末端部分はアミデート化されている、及び／又は酸配列は本来のアミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＸ６と異なっている。
【００１８】
そのような化合物は驚いたことにリポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はリポテイコン酸（ＬＴＡ）に親和性を有するだけでなく、抗菌性又は殺菌性活性をもまた導くことが見出された。すなわち、これらの化合物は細菌及び真菌を殺す医薬の製造において使用されることができる。該化合物は殺細菌活性及び殺真菌活性を有する。この活性のために、該化合物は、微生物毒のみを中和できる化合物で治療され得なかった病気及び状態においてさえ、抗生物質として治療的に使用されることができる。そのような病気の例は、急性の細菌性又は真菌性感染症、例えば敗血症ショック、目、肝臓、腎臓、肺、気管支、鼻若しくは前頭洞、耳、膣、尿道、皮膚、中枢神経系、心筋、脾臓、及び他の器官又は組織の急性感染症である。
【００１９】
さらなる特徴において、本発明は、細菌性又は真菌性の感染症に似ている、又は細菌性又は真菌性の感染症と関連のある病気及び状態の予防及び／又は治療に適する医薬に関する。
【００２０】
本発明のさらなる特徴は、下の詳細な説明及び添付の請求の範囲において述べられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
驚いたことに、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ２００４／０００６０に開示されているペプチド様化合物は、細菌及び真菌の毒、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）及びリポテイコン酸（ＬＴＡ）を中和するだけでなく、顕著な抗菌活性を有することが見出された。これらの化合物は核アミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６を含む。ここでＸ１は配列のＮ末端部分を表し、Ｘ２はＫ又はＥであり、Ｘ３はＱ又はＥであり、Ｘ４はＤ又はＲであり、Ｘ５はＮ又はＥであり、Ｘ６はC末端部分を表す；かつここで、該コア配列のアミノ酸の１以上が誘導体化されていてもよい。さらに配列のＮ末端部分はアセチル化されている、及び／又はＣ末端部分アミデート化されている、及び／又はアミノ酸配列はＸ１ＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＸ６と異なる。微生物の毒に対する親和性のために、該化合物は体内におけるそのような毒の存在と関連する状態を管理するために治療的に使用されることができる。しかし、その直接的な抗菌活性のためにそれらは抗生物質として又はその代わりに使用されることもできる。二元的な活性は、単独で投与されたとき、及び所望されない副作用、例えば耐性のある微生物の発生、又は体内でたくさんの細菌が殺されたときに体内に放出される微生物毒の毒効果が抑制される、又は軽減され得る他の抗生物質と組み合わせて投与されるときの両方において、これらの化合物を非常に有用にする。
【００２２】
本明細書、及び添付の特許請求の範囲において、用語「ここでＮ末端部分はアセチル化されている」は、以下の意味を有する。Ｎ末端部分が、アミドが結合した、安定化させる基、又は保護する基をえるためのカルボン酸との反応により保護されている。例えば、ペプチドをフミン酸（fumic acid）と反応させてホルミルで安定化されたペプチドを得ること；酢酸と反応させてアセチルで保護されたペプチドを得ることが可能である。さらに、ペプチドは、プロピオン酸、及び炭化水素部分Ｒに６までの炭素原子、さらに１０まですらの炭素原子を有する他の有機酸と反応されることができる。これらの有機酸において、炭水化物基は、１０までの炭素原子を有するＲであり、直鎖、又は分岐、又は環状であり得、及び／又は１以上の不飽和を含み得る。さらに、アルキル鎖は例えばヒドロキシル、ハロゲン、アミノ、メルカプト、及びスルホキシド基で置換されていることができる。従って、Ｎ末端部分に、以下の基、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’が存在することができる。又は、カルボン酸との反応の代わりに、反応はスルホン酸と行われて、対応するスルホンアミド結合を得ることもできる。従って、Ｎ末端部分に、基−ＳＯ２−Ｒが存在し得る。又は該用語はアルキル化及びジアルキル化をもまた含むので、Ｎ末端部分には二級又は三級のアミン基−Ｎ−（Ｒ）１又はＮ−（Ｒ）２が存在し得、ここで各Ｒは上記の意味を有する。
【００２３】
さらなる実施態様において、「アセチル化」は、ペプチドとイソシアネート又はイソチオシアネートとの反応を含む。その場合、ウレア又はチオウレア、それぞれＲ−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−又はＲ−Ｎ−Ｃ（Ｓ）−、が形成される。Ｒは上記で定義された通りである。
【００２４】
最後に、Ｎ−末端は、ペプチド合成において慣用的に導入されているが、今、除去されないところの、酸に安定なブロック基で保護されることができる。周知のブロック基はＦｍｏｃ及びＺ基である。
【００２５】
用語「Ｃ末端部分がアミデート化されている」の意味について、以下が留意される。用語「アミデート化」は、Ｃ末端として天然に存在する−ＯＨが基―Ｘにより置換されることを意味する、ここでＸは、（ｉ）−ＮＹ２基，Ｙは独立してＨ又はＲ、ここでＲは上記で定義された通りである、又は２つのＹ−基は一緒になって、それらが結合しているＮ−基と共に環状部分であり得、好ましくは１つのＲが存在する、（ｉｉ）−ＯＲ基、ここでＲは上記で定義された通りである、又は（ｉｉｉ）−Ｒ基である。ペプチドアミドが好ましい、なぜならこれらは最も高い安定性を有するからである。
【００２６】
本発明のペプチド様化合物は、請求項１から除外された本来のアミノ酸配列に比較して、最適化された安定性を有することが見出された。
【００２７】
ペプチド様化合物はペプチド、例えばオリゴ又はポリペプチド、タンパク、又はペプチドから誘導された物質である。ペプチド自身を越えて、ペプチド様化合物は、ペプチドの類縁体、ペプチド誘導体、変性されたペプチド、及びペプチドコンジュゲートをもまた含む。ペプチドは、それらがアミノ酸配列を含むことを共通して有する。より正確には、ペプチドは、２以上のアミノ酸から、一の酸のアミノ基と別の酸のカルボキシル基の組み合わせにより誘導されるアミドとして定義される（メリアムウェブスター医学辞書（Merriam Webster Medical Dictionary）２００１）。それに反して、ペプチド様化合物は、分子中のペプチド構造をもまた呼ぶ。典型的には、ペプチドは天然の（Ｌ−）α−アミノ酸，特にアラニン（Ａｌａ又はＡ），アルギニン（Ａｒｇ又はＲ），アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ），アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ），システイン（Ｃｙｓ又はＣ），グルタミン（ＧＩｎ又はＱ），グルタミン酸（ＧＩｕ又はＥ），グリシン（ＧＩｙ又はＧ），ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ），イソロイシン（Iｌｅ又はＩ），ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ），リシン（Ｌｙｓ又はＫ），メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ），フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ），プロリン（Ｐｒｏ又はＰ），セリン（Ｓｅｒ又はＳ），トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ），トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ），チロシン（Ｔｙｒ又はＹ），及びバリン（ＶａＩ又はＶ）からなる。
【００２８】
ペプチドの類縁体又は機能的に同等なものはペプチド様分子であり、種類においては同じであるが、量においては必ずしも同じではない活性、特に微生物、特に細菌の毒に対する親和性を有する。例えば変性されたペプチド、ペプトイド、ペプチド類縁体又はペプチド模擬体でありえる。
【００２９】
変性されたペプチドは、一般的に天然物のアミノ酸に存在しない置換基又は官能基の導入によりペプチドから誘導された分子である。該用語は、分子が天然物であるか否かにかかわらず、ペプチドと他の化学的カテゴリーからの分子との反応により得られる化合物をもまた含む。例えば、ホスホリレート化、スルホネート化、及びビオチニル化されたペプチド、グリコプロテイン、及びリポプロテインはしばしば天然に見出されるが、ポリエチレングリコールで変性されたペプチドはペプチドの性質の全部ではなく一部を変化させるように設計された化学的に変性されたペプチドの例である。
【００３０】
ペプトイドもまた、ペプチドのようにペプチド様化合物である。それらは典型的には２以上のアミノ酸のアミドである。しかし、それらはしばしば天然のアミノ酸から直接誘導されず、むしろ化学的に合成されたＬ−及び／又はＤ−アミノ酸の種々のタイプから誘導される。
【００３１】
ペプチド模擬体は、その最も広い範囲では、その機能的な構造では多かれ少なかれペプチドに似ているが、その骨格に非ペプチド様結合又はＤ−アミノ酸をもまた含む。一般に、ペプチド模擬体は受容体と酵素との相互作用において本来のペプチドの代替品として作用する（「薬学的バイオテクノロジー（Pharmaceutical Biotechnology）」，D. J. A. Crommelin及びR. D. Sindelar編集，Harwood Academic Publishers，１９９７年，１３８ページ）。ペプチド模擬体の一種である擬似ペプチド（pseudopeptide）は、アミド結合の代わりにアミド結合等電子体を含む化合物である（同上１３７〜１４０ページ）。
【００３２】
本発明を実施するために使用される化合物は、ペプチド又は機能性等価物の塩、例えば薬学的に許容される酸又は塩基添加塩、及び付加物をもまた含む。それらはペプチド又は機能性等価物のマルチマー（multimer）をもまた含む。
【００３３】
さらに、該化合物は少なくとも１の毒、特に細菌の毒に親和性を有する。多くの感染性疾患において細菌毒、例えばグラム陰性細菌の場合リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の種類、及びグラム陽性細菌の場合リポテイコン酸が、該疾患の顕現に含まれる。これらの毒は顕著な炎症反応を誘発することができる。例えば上気道感染において、炎症は中耳又は洞の上皮の粘膜の損傷を引き起こし得、上気道の主要な防御系の一つであるところの粘膜絨毛クリアランス系（ＭＣＳ）の機能障害をもたらす。真菌の又は細菌の毒への親和性は、いかなる中和能力にとっても必要条件であり、好ましくは本発明の化合物はＬＰＳ及び他の  毒に結合するだけでなく、これらの毒を中和する、又は抑制し、又はさもなければ該毒の効果を減少させる能力もまた有する。
【００３４】
ペプチド様化合物が、化合物がアミノ酸配列Ｘ１ＫＥＦＸ２ＲＩＶＸ３ＲＩＫＸ４ＦＬＲＸ５ＬＶＸ６，ここでＸ１は配列のＮ末端部分を表す、Ｘ２はＫ又はＥである，Ｘ３はＱ又はＥである，Ｘ４はＤ又はＲである，Ｘ５はＮ又はＥである，かつＸ６はＣ末端部分を表す、を含む請求項１に記載される構造上の必要要件を満足するとき、細菌及び真菌、及び細菌の毒及び真菌の毒に対する所望されるタイプの活性が観察される。この基本的なモチーフは、天然の抗菌性タンパクＣＡＰ１８又はそれ自身がＣＡＰ１８から誘導されたペプチドＬＬ−３７から誘導される。
【００３５】
本明細書において使用されるように、Ｎ末端部分は、化合物のＮ末端部分又は領域を現す基、原子、又は配列、すなわち配列の中のアミド結合に含まれないコア配列の末端α−アミノ基に結合されている構造である。Ｎ末端部分は、遊離のα−アミノ基の場合単純に水素原子であり得る；又は末端のα−アミノ窒素原子に結合された化学基、例えばアシル基からなっていてもよい。それはより大きな基、例えば２以上のアミノ酸の配列、又はアミノ酸から構成されていない、又はアミノ酸のみから構成されていない化学構造を表してもよい。Ｃ末端部分は、同様に定義される。
【００３６】
好ましくは、該化合物は、合計で１８超の、核のモチーフを規定するアミノ酸を含む。一つの実施態様において、Ｎ末端部分は、２以上のアミノ酸の配列を含む。この配列の適するメンバーであるアミノ酸の中には、Ｉ及びＧがあり、好ましいＮ末端部分はＩＧである。
【００３７】
別の実施態様において、Ｃ末端部分もまたアミノ酸配列を含む。配列は１，２，３，４，又は４超のアミノ酸を含み得る。一つの実施態様において、Ｃ末端部分は４つのアミノ酸を含む。４つのアミノ酸の該Ｃ末端部分のＣ−末端終点は、ペプチドＬＬ−３７内の等価の位置におけるようにＥであり得る。しかし、このＣ−末端終点は、Ｒによってもまた定義され得る。Ｃ−末端アミノ酸の隣に位置するアミノ酸は、ＬＬ−３７におけるようにＴであり得、又はそれはＬであり得る。Ｐ及びＲは、２つの残っている位置のいずれかにおけるＣ末端部分の４つのアミノ酸配列の２つの他の好ましいメンバーである。最も好ましくは、Ｃ末端部分は、配列ＰＲＴＥ及びＲＰＬＲから選択される。
【００３８】
さらなる実施態様において、Ｎ末端部分及びＣ末端部分は、合計で２４個のアミノ酸を有するペプチド様構造を生み出すための上述の選択から選ばれる。現在、最も好まれる化合物の中には、ペプチド自身として、又は変性されたペプチド又は誘導化されたペプチドとして、ペプチドＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥ及びＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲがある。
【００３９】
好ましい変形の中には、アミデート化された及び／又はアセチル化されたペプチドがある。アミデート化が特に有利であるような位置の一つは、ペプチドのＣ−末端である。一方、アセチル化は、好ましくはＮ−末端アミノ酸において行われる。現在好まれる実施態様の一つにおいて、ペプチドＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥ及びＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲは共にＮ−末端がアセチル化され、Ｃ−末端がアミデート化されている。予備試験は、これらの変性はエクソペプチダーゼの存在下、増加された安定性を有することを示した。
【００４０】
該化合物は、ペプチダーゼ及び類似の化合物の製造にとって公知である方法により一般的に製造されることができる。２〜３のアミノ酸又は類似の単位、好ましくは３０〜５０単位以下のみを含むより小さな化合物は、反応が溶液又は懸濁物で行われる古典的なアプローチを使用するか、又は固体表面、例えばポリマー状ビーズに固定されている間にペプチドが作られるところのより近代的な固相アプローチを用いる、化学的又は酵素的ライゲーション技術により製造されることができる。より大きな化合物は、典型的には自動固相ペプチド合成装置により合成される。
【００４１】
あるいは化合物は公知の遺伝子工学技術により製造されることができる。もし化合物が実はペプチド又は少し変性されたペプチドであるならば、このアプローチは、特に有効である。例えば、該化合物をエンコードするＤＮＡ配列が、細胞をトランスフェクトすることのできる発現ベクトルと関連付けられる、又は組み合わされることができる。該方法の別の工程において、トランスフェクションを許す条件下、細胞をベクター及びベクター関連ＤＮＡと接触させることにより、ホスト細胞又はターゲット細胞は該ＤＮＡをトランスフェクトされる。さらなる工程において、ホスト又はターゲット細胞は該化合物の発現を許す条件下で培養される。次に、該化合物は単離されることができる。もし化合物自身がエンコード又は発現されることができないが、エンコード又は発現されることのできるペプチドと非常に類似しているならば、該方法が適用されて、該化合物が類似しているペプチドを製造し、続いて該ペプチドが化学的又は酵素的技術により変性されて該化合物を製造する１以上の工程が行われることができる。
【００４２】
種々のタイプのベクター、例えばウィルスベクター、リポプレックス、ポリプレックス、ミクロスフィア、ナノスフィア、デンドリマー、裸ＤＮＡ、ペプチドデリバリーシステム、脂質、特にカチオン性脂質、又はそれから作られているリポソーム、ポリマー状ベクター、特にポリカチオン性ポリマーから作られているものが、この目的のために使用される。好ましいウィルスベクターの中には、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ−関連ウィルス、単純ヘルペスウィルス、及びウィロソーム（virosome）がある。好ましい非ウィルスベクターは、キトサン、ＳＰＬＰ、ＰＬＧＡに基づくポリマーシステム、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリホスホアミデート、ポリ（メタ）アクリレート、ポリホスファゼン、ＤＯＰＥ，ＤＯＴＡＰ，及びＤＯＴＭＡを含む。
【００４３】
本発明の化合物の製造において使用されることのできる方法のより包括的な概要は以下に記載されている。W. F. Anderson，ネイチャー、第３９２巻、補遺，１９９８年４月３０日，２５〜３０ページ；薬学的バイオテクノロジー（Pharmaceutical Biotechnology），D. J. A.Crommelin及びR. D. Sindelar編集，ハーウッドアカデミック出版（Harwood Academic Publishers），１９９７年，５３〜７０ページ，１６７〜１８０ページ，１２３〜１５２ページ，８〜２０ページ；タンパク合成：方法とプロトコル（Protein Synthesis: Methodsand Protocols），R.Martin編集，フマナ（Humana）出版，１９９８年，１〜４４２ページ；固相ペプチド合成（Solid-Phase Peptide Synthesis），G.B. Fields編集，アカデミック出版（Academic Press），１９９７年，１〜７８０ページ；アミノ酸及びペプチド合成（Amino Acid and Peptide Synthesis），オックスフォード大学出版，１９９７年，１〜８９ページ。
【００４４】
ペプチド又は機能的等価物の塩は、公知の方法により製造され、該方法はペプチド又はペプトイドを薬学的に許容される酸と混合して酸添加塩を形成するか、又は薬学的に許容される塩基と混合して塩基添加塩を形成するかのいずれかを含む。酸又は塩基が薬学的に許容されるか否かは、化合物の特定の意図された使用を考慮に入れたのちに、当業者により容易に決定されることができる。例えば、インビトロでの診断組成物に許容されるすべての酸及び塩基が治療用組成物に使用されることができるわけではない。意図された用途に依存して、薬学的に許容される酸は有機酸及び無機酸、例えば蟻酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、グリコール酸、シュウ酸、ピルビン酸、コハク酸、マレイン酸、マロン酸、桂皮酸、硫酸、塩酸、臭酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、及びチオシアン酸であり、これらはペプチド及び機能的等価物の遊離のアミノ基とアンモニウム塩を形成する。ペプチド及びその機能的等価物の遊離のカルボキシル基とカルボン酸塩を形成する薬学的に許容される塩基は、エチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、及び他のモノ−、ジ−、及びトリアルキルアミン、並びにアリールアミンを含む。さらに、薬学的に許容される溶媒和物、錯体、又は付加物、例えば水和物又はエーテラート（ethurate）が含まれる。
【００４５】
ペプチドの好ましい変性のあるものは、合成の間、又は合成の終わりに容易に導入され得る。例えばペプチドが固相テクニックを使用して合成されるとき、Ｎ−末端アセチル化はまだ樹脂に結合されているアミノ酸配列を別のアミノ酸の代わりに酢酸と反応させることにより最後に行われることができる。
【００４６】
一方、Ｃ−末端のアミデート化は、固相ペプチド合成における特定の種類の樹脂、例えば市販入手可能なＴｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＡＭ（ラップ（Rapp）製，チュビンゲン，ドイツ）を用いて行われることができる。これらの樹脂は化学的な「手」を有しており、該手からアミデート化されたペプチドが開裂の間に放出される。これら及びペプチドを変性させるさらなる方法は当業者に公知である。
【００４７】
上述されたように、化合物は微生物毒、特に細菌の毒、例えばリポポリサッカライド（ＬＰＳ）例えばリポテイコン酸（ＬＴＡ）に親和性を有する。従って、該化合物はこれらの毒の存在が関与する状態及び病気において、予防、治療、及び診断の目的のために有利に使用されることができる。結合能力は典型的に毒の中和をもたらし、そのために該化合物はアンタゴニスト又は部分的なアンタゴニストと考えられ得る。さらに、それらは、毒を中和でき、かつ該化合物との共有又は非共有ライゲーションを通して、又は薬の担体、例えばリポソーム、ナノ又はマイクロ粒子、ナノ又はマイクロカプセル、脂質複合体、又はミセルの表面に共有結合で又は非共有結合で結合されていることを通して、これらの毒にとって特異的に標的とされ得る他の化合物のターゲッティング剤又はリガンドとして使用され得る。
【００４８】
診断において、該化合物は、生理学的流動体、例えば血液、血漿、血清、粘膜上皮、例えば呼吸管をライニングする粘液の中、又はその存在が病理学的な状態から生じる流動体、例えば滲出性中耳炎において中耳にみられる液体中に存在する細菌の毒の検出又は量の定量に使用され得る。この使用のために、該化合物は、インビトロで使用されるべき診断キット又は患者に投与され得る診断組成物に取り込まれ得る。この使用のために、選択肢は、本発明の化合物をキレート化剤と結合させ、次に適切な管視システムにより検出可能な同位体ラベルと複合化されることである。
【００４９】
好ましい使用において、該化合物は活性医薬物質として投与されて、真菌及び細菌の感染症、及び体内における真菌及び細菌の毒の存在に関連する病気及び状態を予防する又は治療する。上述されたように、急性又は慢性の感染症の治療には、慣用の抗生物質のある種の欠点及び制限、例えば耐性の誘起、及び耐性細菌の変種の選択、患者の自然な防御系の機能低下、元々粘膜に棲みついている細菌の機能低下、細菌が殺されたとき大量の細菌の毒の放出等がある。さらに、毒、特に細菌の毒の存在、及び微生物自体の存在しないことがおもな原因である症状及び病気があり得る。例えばＯＭＥにおいては、中耳における毒の局所的鬱滞が、急性感染症の症状の不存在においてさえ、病気の発現にかなり貢献し得る。
【００５０】
しかし、該化合物は、顕著な抗菌活性をもまた有するので、該化合物は体を感染させている微生物の数を実際に減らすことが本質的である症状、例えば重度な急性感染症においてさえ使用されることができる。この点において、微生物の毒のみを中和することができる化合物で治療されることのできなかった病気及び状態においてさえ、該化合物は他の抗生物質に取って変わり又は補完することができる、そのような病気の例は、急性の細菌性又は真菌性の感染症、例えば敗血症ショック、目、肝臓、腎臓、肺、気管支、鼻又は前頭洞、耳、膣、尿道、皮膚、中枢神経系、心筋、脾臓、又は他の組織及び器官の急性感染症である。感染に関連する特に重度な症状は敗血症ショックである。
【００５１】
これらのすべての症状において、抗生物質薬ではなく、細菌の毒を中和できる物質で治療することが勧められる。この目的のために、本発明の化合物は特に有利である、なぜならそれらは最も関連のある微生物毒、例えばグラム陰性細菌の場合はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を、そしてグラム陽性細菌の場合は、リポテイコン酸（ＬＴＡ）に対して高い結合及び中和活性を示すからである。その治療のために、本発明の化合物が特に好ましい上気道の感染において、これらの細菌の生産物は中耳又は洞における炎症反応を誘起し、上気道の上皮の粘膜損傷を誘発することができる。含まれる毒を中和することは、粘膜絨毛クリアランス系（ＭＣＳ）の損傷を含む粘膜の損傷が予防され、コントロールされ、又は減らされ、このようにして自然の防御系を強くすることを許す。ＯＭＥを含むそれらの症状においては、生きている細菌の細胞の顕著な数がない場合でさえ、細菌の毒が主な問題であり、本発明の化合物の例えば直接中耳への投与に依存する治療が主要な治療アプローチであり得る。しかし、他の気道の感染症、例えば急性又は慢性の副鼻腔炎、又は急性又は慢性の耳炎において、該化合物は正常な粘膜機能、及びその天然の防御系の回復に非常に有用であり得る。
【００５２】
より一般的に言うと、本発明の化合物は、ストレプトコッカス  ニューモニア（Streptococcus pneumoniae），ヘモフィルス  インフルエンザ（Haemophilus influenzae），モラクセラカタラーリス（Moraxella catarrhalis）、Ａ群β−ヘモリティック  ストレプトコッチ（A β-hemolytic streptococci）、スタフィロコッカス  アウレウス（Staphylococcus aureus）、グラム陰性エンテリック  バシリ（gram-negative enteric bacilli）、ストレプトコッカス  パイロジェンス（Streptococcus pyrogenes）、大腸菌、グラム陰性菌、土壌細菌（Pseudomonas sp）を含む感染性細菌にある、及びそれらから発生する症状の予防及び治療において有用な剤である。
【００５３】
本発明の化合物で予防される、又は処理される感染症は、本当はプランクトン性、すなわちその習慣行動が個々の微生物有機体のものであるところの微生物により引き起こされ得る。もしプランクトン性の微生物が、例えば哺乳動物の生理学的流動体、例えば血液を感染させるならば、それらは該哺乳動物の体中を血流で輸送され得る。
【００５４】
少なくとも部分的にプランクトン性の微生物により引き起こされ得る全身的又は全身化した感染症は、急性又は慢性の真菌の感染症、例えば放線菌症、分芽菌症、ノカルジア症、酵母菌症、スポロトリクム病、スポロトリクム病、コクシジオイデス病、及びアスペルギルス症、並びに急性又は慢性の細菌感染症、例えば炭疽，破傷風，壊疽、ボツリヌス中毒、リステリア症、チフス、在郷軍人病、コレラ、黄熱病等を含む。急性の重度の全身感染症は、敗血症ショックと関連する。敗血症ショックは生命を脅かす敗血症の重篤な形態であり、血流中におけるたくさんのグラム陰性細菌及びその毒の存在から通常生じ、さらに器官及び組織への減少された血流、低血圧、臓器機能不全、損傷された精神状態、そしてしばしば複数の器官の機能停止を特徴とし、しばしば免疫無防備状態の人間を冒す。
【００５５】
しかし、より最近、多くの感染症の病気及び状態もまた、通常バイオフィルムと呼ばれる固着性のコミュニティ（sessile community）を形成する微生物により少なくとも部分的に引き起こされることが見出された。これは、多くの全身的、特に、たくさんのより局所化された感染症の両方にとって正しい。本明細書において使用されるように、バイオフィルムは、微生物的に誘導された固着性のコミュニティであって、基層又は界面に、又は互いに結合され、それらが生産した細胞外ポリマー状物質のマトリックスに埋め込まれており、成長速度及び遺伝子転写に関して変化された表現型を示す細胞を特徴とする固着性コミュニティである。通常、細胞外のマトリックスは、非常に水和された、主にアニオン性のマトリックスポリマーを含む。バイオフィルムは、表面及び界面に接着することができる；実際、接着は細胞外マトリックスの生産及び前にプランクトン性微生物であったものの、その固着性の発現型への転化をコントロールする遺伝子の発現の引き金となり得る。
【００５６】
固着性の微生物及びそのバイオフィルムは多くの感染性病気において主要な役割を果たしており、それらのいくつかについては、このことはたくさんの証拠により支持されていると信じられている。これらの病気の中には、例えば歯周炎、自然弁心内膜炎、嚢胞、慢性の細菌前立腺、気管支炎、肺炎、副鼻腔炎、虫歯、慢性扁桃腺炎、心内膜炎、壊死性筋膜炎、筋骨格系感染症、髄膜炎、急性胆管炎、腎臓結石感染症、及び中耳炎がある。多分、多くの他の、特に体の特定領域又は器管を含む局所的な感染症、例えば肝臓、脾臓、歯周組織、目、腎臓、皮膚、膣、尿道、又は心臓の感染症、もまた固着の微生物を含む。
【００５７】
請求項１で定義されたペプチド様化合物の活性の研究において、こららの化合物もまた固着性バイオフィルム形成性微生物に対して活性であることが今見出された。すなわち、それらはそのような微生物に関連する、又は微生物の固着状態を含む病気の予防又は治療に有用な化合物である。例えば、ある種の表面、例えばＰＶＣにバイオフィルムを形成できるある種の微生物、例えばシュードモナス  プチーダ（Pseudomonas putida）は、標準のバイオフィルムアッセイにおいてバイオフィルムを形成することを抑制し、予防されることができた。
【００５８】
本発明の化合物が少なくとも約０．００１μＭ、より好ましくは少なくとも約０．０１μＭ、さらにより好ましくは少なくとも約０．１μＭの濃度で存在しているとき、抑制効果が達成され得る。さらに好ましい実施態様において、該化合物の濃度は約０．１〜約１００μＭである。しかし、バイオフィルムに接触する流動体のタイプ及び量、及び関与する特定の微生物に依存して、これらの濃度は適合され得る。
【００５９】
さらに、本発明の化合物は、そうでなければマイクロフィルム形成を形成できる微生物によるバイオフィルムの形成を防ぐだけでなく、すでに形成されたマイクロフィルムに対しても活性であることが見出された。その濃度に依存して、本発明の化合物は、例えば標準のバイオフィルムアッセイにおいて検出可能であるように、バイオフィルムを分断させる、又は分解することができる。繰り返しになるが、該化合物の濃度は、バイオフィルムと接触する流動体のタイプ及び量、及び関与する特定の微生物を考慮に入れて選択されるべきである。例えば、約０．００１μＭもの低い濃度は、前もって形成されたバイオフィルムへの破壊的影響を有し得ることが見出された。すなわち、該化合物の濃度は、少なくとも約０．００１μＭであるように選択されることが好ましい。他の好ましい濃度はそれぞれ少なくとも約０．０１μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ及び１００μＭである。
【００６０】
バイオフィルム感染からの特定のリスクは、診断又は治療の目的に関わらず、ヒト又は他の哺乳動物の体への医療機器の挿入又は移植から生じる。例えば、バイオフィルムの関与は、コンタクトレンズ、心臓弁、静脈カテーテル、泌尿器カテーテル、子宮内デバイス、縫合糸、代用血管（vascular graft）、血管短絡（vascular shunt）、腹膜透析デバイス、人工陰茎、及び整形外科の人工器官からの感染に対して示された。すなわち、そのようなデバイスからの感染を防ぐ又は管理するために、本発明の化合物を使用することは別の好ましい実施態様である。
【００６１】
本発明の化合物が由来するところの天然のタンパク及びペプチド、例えばＣＡＰ１８及びＬＬ−３７に対して、本発明の化合物の特に有利な点は、所望されない抗炎症性活性の低い程度である。この活性は、例えば増殖、分化、及びサイトカイニンのような抗炎症媒体をエンコードする遺伝子の発現を含む種々の細胞過程に関連する。サイトカイニンは、炎症の直接の媒体であり、多くの免疫学的反応の進行及び方向に影響を与える。サイトカイニン生産における収支の混乱は、いくつかの病気の状態における決定的な因子として広く認識されている。滲出性中耳炎又は副鼻腔炎のような状態において、この収支は既に乱されている。Ｔ細胞の増殖もまたこの状況では好ましくない。なぜならこの状態において、これは、すでに制御不能である免疫反応をさらに刺激するからである。
【００６２】
すなわち、該化合物は薬学的組成物において有利に使用される。本発明に従うと、そのような薬学的組成物は、該化合物自身としてもまた提供される。本明細書において使用されるように、用語「薬学的組成物」は、治療効果のある、及び診断上の組成物、並びにそのような組成物を含む医薬品及び診断法を意味する。治療効果のある組成物及び医薬品は、改良が所望される哺乳動物の病気及び他の症状の予防又は治療に使用される。診断法及び診断上の組成物は、そのような病気の診断にインビボ及びインビトロで使用される。
【００６３】
典型的には、そのような医薬品又は組成物は、活性成分として少なくとも１つの本発明の化合物及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は添加物を含む。
【００６４】
一つの実施態様において、医薬品は、請求項１に記載された化合物の同じ群から選択され得る別の活性成分を含む。又は、他の化合物は他の群に属する。それは例えば抗生物活性又は抗真菌活性を有するが、異なる作用の機構を有することが公知である化合物であり得る。さらなる実施態様においては、他の化合物は同じ医薬品に取り込まれないが、別の配合物として一緒に投与される。
【００６５】
さらに、該化合物はヒト又は動物に投与されることができるように加工され、成形される。本明細書において使用されるように、担体又は添加剤は、投与するのに安定であって、適する投与形態に化合物を配合するためのビヒクル又は助剤物質として使用されることができる任意の薬学的に許容される物質、又は実質的な薬学的活性を有しない物質の混合物である。薬学的に許容される添加剤の例は、当業者に公知であり、主要な薬局方のモノグラフに見られることができる。
【００６６】
一つの実施態様において、該組成物は、非経口的な注射、点滴、灌注、好ましくは血管注射、例えば静脈注射、又は動脈内注射のためだけでなく、筋肉内の、皮下の、病巣内の、腹腔内の、局所領域の、又は非経口的な投与の他のルートのためにもまた配合され加工される。別の好ましい実施態様において、組成物は、上気道、例えば中耳の感染した粘膜に直接投与される。これらの投与ルートのための他の医薬品の配合を支配する同じ原理が、そのような組成物の調製方法を当業者に教示する。例えば、非経口投与形態の必要条件の一つが、その無菌性である。他の必要条件はすべての主要な薬局方、例えばＵＳＰ２４のモノグラフ「試験及びアッセイのための一般的必要条件。１．注射」、１７７５〜１７７７ページに記載されている。非経口的な配合の安定性を高めるために、乾燥された投薬形態を提供することが必要であり得、該投薬形態は、投与されることができる前に再構築されなければならない。そのような投薬形態の例は、凍結乾燥された又は凍結乾燥された配合物である。適切には、本発明の組成物は、ムコ多糖類加水分解性の溶媒（mucolytic solvent）をもまた含み得る。
【００６７】
本発明の化合物を非経口的にコントロールされた放出投与形態として投与して、頻繁な注射を回避し、治療の有効性及び簡便性を改善することが所望され得る。そのような蓄積配合（depot formulation）を調製するための種々の方法が公知である。徐放（prolonged release）は固体インプラント、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロカプセル、エマルジョン、懸濁物、油性溶液、リポソーム、又は類似の構造により提供され得る。
【００６８】
感染した粘膜に局所的に投与されるべき組成物の場合、投与のサイトにおける延長された局所的保持時間を提供する性質を有する配合物を付与して、医薬品の有効性を増加させることが有用であり得る。この目的を達成するために、粘膜付着性の添加剤が配合物に取り込まれ得る。そのような機能性添加剤は当業者に公知である。それらは、ポリマー例えばポリアクリル酸及びその誘導体、ポリメタクリル酸及びその誘導体、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースを含むセルロースエーテル、澱粉、キトサン等を含む。適切に又は、本発明の組成物はムコ多糖類分解性の溶媒をもまた含み得る。特にムコ多糖類分解性の溶媒は、本発明のペプチド様化合物の粘膜、例えば気道への透過性に影響を与えるために使用される。適切な溶媒は、公知のムコ制御又はムコ多糖類分解性の剤、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、ブロモヘキシン、アンブロキシル、ＤＮＡ分解酵素、エルドシュタイン（erdosteine）、食塩水溶液、及びネソシュタイン（nesosteine）を含み得る。好ましくは、ブロモヘキシンが使用される。
【００６９】
最も広い定義において非経口的な配合物の調製に特に有用であるさらなる添加剤は、溶媒、共溶媒、及び液体又は半固体の担体、例えば無菌水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ブタンジオール、脂肪族オイル、短及び中ぐらいの鎖のトリグリセリド、レシチン、ポリオキシエチレンひまし油誘導体；オスモル及びｐＨを調節するための物質、例えば糖、特にグルコース、糖アルコール、特にマンニトール、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、アセテート、ホスフェート、リン酸、塩酸、水酸化ナトリウム等；安定化剤、抗酸化剤、及び保存剤、例えばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素ナトリウム、ＥＤＴＡ、ベンジルアルコール等；他の添加剤及び凍結乾燥の助剤、例えばアルブミン、デキストラン等である。
【００７０】
同様に、本発明の化合物を経粘膜的な投与形態で投与することが有利であり得る。投与のこのルートは非侵襲（noninvasive）であり、患者にやさしく、同時に、特に本発明の化合物が消化器系の液体中で安定ではない、又は胃から効果的に吸収されるには大きすぎるならば、経口投与と比較して一般的に、本発明の化合物の改善された生物学的利用能（bioavailability）をもたらす。経粘膜的な投与は例えば鼻、頬、舌下腺、歯肉、又は膣の投与形態により可能である。これらの投与形態は、公知の技術により調製されることができる；それらは配合されて、点鼻剤又はスプレー、インサート、フィルム、パッチ、ゲル、軟膏、又はタブレットであることができる。好ましくは、経粘膜投与形態に使用される添加剤は、粘膜付着性を付与する１以上の物質をもまた含み、すなわち投与形態と吸着のサイトとの接触時間を長くし、そのことにより吸着の度合いを潜在的に増加させる。
【００７１】
又は、薬学的組成物は経口投与のために設計され、それに応じて加工されていてもよい。適する経口の投与形態は、タブレット、ハードカプセル、ソフトカプセル、粉末、顆粒、経口的に崩れる投与形態、シロップ、点滴薬、懸濁物、発泡性タブレット、噛み砕けるタブレット、オーラルフィルム、凍結乾燥された投与形態、徐放性投与形態、制御された放出の投与形態を含む。好ましい実施態様の一つにおいて、経口投与形態は、胃の酸性でありかつタンパク質分解性の環境からの化合物の保護を付与する、経腸的に被覆された固体投与形態である。
【００７２】
さらなる実施態様において、化合物は、定量噴霧吸入器（metered dose inhaler）、ネブライザー、エアゾールスプレー、又は乾燥粉末吸入器を使用して、肺ルートを経て投与される。適切な配合物は、公知の方法及び技術により製造されることができる。経皮的、直腸、又は眼球投与も、ある場合には実行可能であり得る。
【００７３】
進んだドラッグデリバリー、又は本発明の化合物をより効果的にデリバリーすることを目標とする方法を使用することが有利であることができる。例えば、投与の経口的なルートが選択されるならば、適切な投与形態は、該化合物の利用性を高める任意の物質又は物質の混合物であり得る生物学的利用能を高める剤を含み得る。これは、例えば酵素阻害剤又は抗酸化剤による、例えば分解からの化合物の保護により行われ得る。より好ましくは、該高める剤は、典型的には粘膜であるところの吸収障壁の透過性を高めることにより、該化合物の生物学的利用能の増加させる。透過促進剤は、種々の機構により作用することができる；あるものは粘膜の流動性を高め、他は、粘膜細胞間の溝の連結点を開ける、又は広くする。さらに他は、粘膜細胞層を被覆する粘膜の粘度を下げる。好ましい生物学的利用能の増加剤には、両親媒性物質、例えばコリン酸誘導体、リン脂質、エタノール、脂肪酸、オレイン酸、脂肪酸誘導体、ＥＤＴＡ、カーボマー、ポリカルボフィル、及びキトサンがある。
【００７４】
該化合物の抗菌活性及び抗真菌活性を利用すると、保存剤を含まないか、又は減らされた量においてのみ含む医薬品の製造のためにそれらを使用することが選択肢である。「減らされた量」により、活性成分以外の同じ成分を含む組成物である、対応する偽薬組成物を効果的に保存するために必要とされる保存剤の含有量より保存剤の含有量が低いことが意味される。
【００７５】
組成物が効果的に保存されているかは、適切な試験、例えば保存有効性のための試験（例えばＵＳＰ＜５１＞）で決められることができる。該試験では、生成物のカテゴリーに依存して５つの攻撃微生物が規定された時間間隔で試験される。適切なシリーズで行われれば、そのような試験は、ある組成物、例えば上述のような、ある組成物に対応する医薬なしの組成物、に特異的な保存剤の最小の有効濃度を決めるためにもまた行われることができる。
【００７６】
例えば、特定の偽薬組成物をソルビン酸で効果的に保存するために、保存剤は少なくとも約０．１％（重量／体積）の濃度で存在しなければならないことが見出され得る。この場合、請求項１に記載された化合物を含む参照組成物は、かなりより低い濃度、例えば約０．０５％（重量／体積）以下でソルビン酸を含むことができた。別の実施態様において、保存剤の濃度は、対応する偽薬組成物を効果的に保存するために必要とされる濃度の約５分の１以下、より好ましくは約１０分の１以下であるように選択される。
【００７７】
以下の実施例は、本明細書に提示された実施態様にその範囲を制限することではなく、本発明をさらに説明することを意図されている。
【実施例】
【００７８】
実施例１：化合物の合成
それぞれが２４のアミノ酸を含む以下のペプチド様化合物、本明細書においてＰ６０，Ｐ６０．４，Ｐ６０．Ａｃ，及びＰ６０．４Ａｃとコード化される、は、自動マルチプルペプチドシンセサイザー（SyroII，MultiSyntech，ウィッテン、ドイツ）で固相方法により合成された。Ｐ６０及びＰ６０．４については、ポリエチレングリコールとポリスチレンのグラフトポリマーであるTentagel S AC（Rapp製，チュビンゲン、ドイツ）が樹脂として使用された（０．２ｍ当量搭載、粒子サイズ９０μｍ）。Ｐ６０．Ａｃ及びＰ６０．４Ａｃについては、Tentagel S AMが使用され、それはＣ末端がアミデート化されたペプチドを生産する。繰り返しのカップリングは、６倍モル過剰（樹脂搭載に基づいて）のＮＭＰ中の適当なＦｍｏｃアミノ酸の０．６０Ｍ溶液、６倍モル過剰のＮＭＰ中の０．６７ＭのＰｙＢＯＰ、及び１２倍モル過剰のＮＭＰ中のＮＭＭ２／１（体積／体積）を反応容器に添加することにより行われる。側鎖の保護は以下のように行われた：Ｄ，Ｅ，Ｓ，ＴについてはｔＢｕ；ＫについてはＢｏｃ；Ｎ，ＱについてはＴｒｔ、及びＲについてはＰｍｃである。Ｆｍｏｃの脱保護は、３倍のピペリジン／ＮＭＰ１／４（体積／体積）を各反応容器に添加することにより行われた。カップリング及び脱保護の時間はそれぞれ４５分及び３回３分であった。カップリング及びＦｍｏｃ脱保護後の洗浄はＮＭＰで６回行われた。
【００７９】
Ｐ６０．Ａｃ及びＰ６０．４Ａｃについては、ペプチドが樹脂にまだ結合されている間に、Ｎ−末端アセチル化が酢酸で行われた。合成後、ペプチド化樹脂は、ＮＭＰ，ジクロロメタン、ジクロロメタン／エーテル１／１（体積／体積）及びエーテルでそれぞれ十分洗浄され、空気乾燥された。ペプチド化樹脂は、次に切断され、側鎖はＴＦＡ／水９５／５（体積／体積）中（１０μモルのペプチドにつき１．５ｍｌ）、２．５時間、脱保護化され、樹脂は濾過により除去され、ペプチドはＴＦＡ溶液からエーテル／ペンタン１／１（体積／体積）（１０μモルのペプチドにつき１０ｍｌ）で沈殿化された。溶液は１時間、−２０℃において冷却され、沈殿されたペプチドは遠心分離により単離された（−２０℃、２，５００ｇ、１０分）。錠剤の粉末化、１０ｍｌのエーテル／ペンタン１／１（体積／体積）でのボルテックス、及び同じ方法による単離の後、ペプチドは室温において１時間空気乾燥された。ペプチドは２ｍｌの水又は２ｍｌの１０体積％の酢酸に溶解され、溶液は液体窒素中で約５分間凍結され、次に遠心分離されている間に凍結乾燥された（１，３００ｒｐｍ，８〜１６時間）。ペプチドの分析はＲＰ−ＨＰＬＣ及びＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ質量分光計で行われた。
【００８０】
化合物のアミノ酸配列は以下の通りであった
Ｐ６０            ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥ
Ｐ６０．Ａｃ＊    ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥ
Ｐ６０．４        ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲ
Ｐ６０．４Ａｃ＊  ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＥＲＩＫＲＦＬＲＥＬＶＲＰＬＲ
【００８１】
添え字Ａｃは、ペプチドがＮ−末端的にアセチル化されていること、及びＣ−末端的にアミデート化されていることを表す。
【００８２】
実施例２：毒の中和
実施例１に従って製造された化合物は、細菌の毒ＬＰＳを中和するその能力についてリムルスアメーバー細胞ライセート（ＬＡＬ）アッセイ及び全血液アッセイ（WB assay）で試験された。ＬＴＡ中和もまた、全血アッセイで測定された。ペプチドＬＬ−３７は、陽性コントロールとして使用された。それによって５０％ＬＰＳが中和されるところのペプチド濃度がペプチドの活性の尺度として使用された。これらの濃度値は、表１の通りであった。各アッセイにおける化合物間の相違は統計的に有意ではなかった。まとめると、本発明の試験された化合物はネイティブの抗菌性ペプチドＬＬ−３７とおよそ同じ程度の抗毒活性を示した。
【００８３】
【表１】
2008508265.tif 000002
【００８４】
実施例３：化合物による免疫学的細胞活性
実施例１に従って製造された化合物が、エリスポット、Ｔ−細胞増殖、ＥＲＫ−活性化及び好中球遊走性アッセイを用いることにより、治療的に所望されない免疫学的活性について試験された。エリスポットアッセイは、医薬品、化学物質又は他の化合物のインビトロでのサイトカイニン分泌の効果を測定して、そうすることによりインビボでの免疫機能へのその推定上の修飾作用効果についてのデータを提供するために使用される。アッセイの結果はＩＦＮ−ガンマに対する陽性反応のフラクションとして与えられる。ＥＲＫ−（細胞外シグナル関連キナーゼ（extracellular signal-related kinases））−１／２はＭＡＰ−キナーゼシグナル経路の一部である。ＭＡＰ−キナーゼシグナル経路は、増殖、分化、及び抗炎症性媒体、例えばサイトカイニンをエンコードする遺伝子の発現を含む種々の細胞過程に含まれることが示されている。サイトカイニンは、抗炎症の直接的な媒体であり、多くの免疫学的反応の進行及び方向に影響を与える。サイトカイニン生産におけるバランスの混乱は、いくつかの病気の状態における決定的な因子として広く認識されている。滲出性中耳炎及び副鼻腔炎のような症状の場合には、既にこのバランスが乱されている。Ｔ細胞の増殖もまた、この状況において有利ではない、なぜならこれはすでに制御不能である免疫反応をもまた刺激するからである。従って、本発明の化合物は、サイトカイニン生産、Ｔ細胞増殖、ＥＲＫ活性化又は好中球の遊走性を刺激しないことが望ましい。
【００８５】
Ｔ細胞の増殖のために、１５０，０００の抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、１５０μｌのＩＭＤＭコンプリートの最終体積で、９６ウェルの丸底プレート（Costar Inc．ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で、１０μｇ／ｍｌの本化合物の存在下又は不存在下で５日間培養された。陽性コントロールとして、ＰＢＭＣが２５Ｕ／ｍｌの組み換えＩＬ−２の存在下培養された。培養の最終の２０時間の間、ＰＢＭＣが［３Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）でパルス標識され、その後、３Ｈの取り込みが液体シンチレーション計数により測定された。エリスポット分析によるＴ細胞サイトカイニンＩＦＮ及びＩＬ−１０の検出のために、１．５×１０６ＰＢＭＣが、種々の濃度の合成ペプチドの不存在下、又は存在下、０．５ｍｌのＩＭＤＭコンプリート（complete）中で培養された。陽性コントロールとして、ＰＢＭＣは１０μｇ／ｍｌのポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）により刺激された。培養の４８時間後、ＰＢＭＣはウェルを暖かいＩＭＤＭで静かにすすいで、非付着性の細胞を集めることにより採取された。該非付着性細胞は大量のＩＭＤＭ中で洗浄された。次に、ＰＢＭＣは、抗体で予め被覆されたＥＬＩＳＡプレート上で平板培養され、２％のプールされたヒトＡＢ血清を補強されたＩＭＤＭ中で３７℃、５％ＣＯ２において５時間培養された。その後、プレートは製造業者（Ｕ−ＣｙＴｅｃｈ，ユトレヒト，オランダ）のプロトコルに従って発現された（developed）。スポットがオリンパスの顕微鏡で数えられ、オリンパスマイクロイメージ４．０ソフトウェア（パエス（Paes）ネダーランド、ゼーターブード（Zoeterwoude），オランダ）で分析された。最終結果は陽性刺激インデックスのフラクションとして表される（陽性：＞２）
【００８６】
ＥＲＫ−１／２活性化は、粘表皮肺腫瘍細胞線ＮＣＩ−Ｈ２９２（ＡＴＣＣ，ロックビル，メリーランド州）からの細胞で試験された。該細胞線は２４又は６ウェル組織培養プレートで、２ｍＭのＬ−グルタミン（Bio Wittaker，ウォーカーズビル，メリーランド州）、２００Ｕ／ｍｌペニシリン（Bio Wittaker），２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Bio Wittaker）及び１０％（体積／体積）の熱不活性化されたウシ胎児血清（Gibco）を補強されたＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco，グランドアイランド，ニューヨーク州）中で培養された。コンフルエンスの近くに到達した後、細胞は血清フリーの培地で終夜培養された。次に細胞は、指示された刺激で１５分間刺激された。細胞ライセートは、ライシスバッファー（０．５％［体積／体積］トリトンＸ−１００，０．１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ７．４，１００ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＮａ３ＶＯ４，最小完全プロテアーゼインヒビターカクテル［ベーリンガー、マンハイム，ロシュ、バーゼル、スイス］）を用いて製造された。試料は１０％グリシンベースのゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付され、溶解されたタンパクはポリビニリデンジフロライド（ＰＶＤＦ）膜に移された。非特異的な結合部位はＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％カゼインによりブロックされた。ブロットが、ホスホリル化されたＥＲＫ−１／２（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ州）に対して、次にホースラディッシュ過酸化酵素が結合された抗ウサギＩｇＧ抗体に対してウサギポリクロナール抗体とインキュベートされた。エンハンストケモルミネッセント（ＥＣＬ）ウェスタンブロッティング検出システム（アメルシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、ウプサラ、スエーデン）が免疫反応性を明らかにするために使用された。
【００８７】
好中球遊走性は、抹消血から単離された好中球で、パーコル（Percoll）密度遠心分離（密度：１．０８２ｇ／ｍｌ）を用いて測定された。細胞は、遊走培地（２０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳバッファー）ＨＥＰＥＳ、１３２ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１ｍＭのＭｇＳＯ４，５．５ｍＭのグルコース，０．１ｍＭのＣａＣｌ２及び血清フリーのＲＰＭＩで１：１に希釈された０．５％（重量／体積）のヒト血清アルブミン［オランダ赤十字輸血サービス中央研究所（ＣＬＢ），アムステルダム、オランダ］）中で２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁された。該化合物の遊走活性は変形されたボイデンカマー（Boyden Camber）テクニックを用いて評価された。簡単に述べると、ＨＥＰＥＳバッファー中で希釈された２６μｌの刺激剤が、低いほうのコンパートメントのウェルに添加され、５０μｌの好中球懸濁物（２．５×ｌ０６細胞／ｍｌ）が上の方のコンパートメントに添加された。コンパートメントは２つのフィルターにより分離されている：０．４５μｍの孔サイズを有する下の方のフィルター（ミリポアプロダクツ，ベドフォード，マサチューセッツ州）及び８μｍの孔サイズを有する上の方のフィルター（ザートリウスフィルター，サンフランシスコ，カルフォルニア州）。９０分間、３７℃におけるインキュベーションの後、上のフィルターは取り除かれ、エタノール−ブタノール（（８０：２０，体積／体積）中で固定され、ウェイガート溶液で染色された。好中球遊走活性を測定するために、好中球は、６ランダムハイパワーフィールド（×４００）で数えられ、陽性コントロール（１０−８ＭのＮ−ホルミルメチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ＦＭＬＰ、シグマ）と比較した、膜上の好中球の百分率が計算された。
【００８８】
結果は表２に与えられる。まとめると、本発明の試験された化合物は、特にＰ６０．４は、非常に低い、天然のペプチドＬＬ−３７より低い免疫反応を誘起した。それらは低いＥＲＫ−活性を示し、実質的に全く好中球遊走性を示さなかった。
【００８９】
【表２】
2008508265.tif 000003
【００９０】
実施例４：インビボの許容性
化合物Ｐ６０．４Ａｃが、実施例１に従って合成され、インビボでのその許容性について試験された。より具体的には、皮膚及び目の炎症を起こす能力がウサギで評価され、耳毒性がモルモットで調べられた。さらに、その全身毒性が静脈投与後に評価された。
【００９１】
皮膚及び目の炎症試験のために、３匹のウサギが０．５ｍｌのリン酸塩でバッファーされたペプチド溶液（２ｍｇ／ｍｌ）に暴露され、半密封ドレッシング（semi-occlusive dressing）を用いて、摘まれた皮膚の上に４時間施与された。暴露から１，２４，４８，及び７２時間後に観察された。リン酸塩でバッファーされた（ｐＨ７．５）ペプチド溶液（２ｍｇ／ｍｌ）、０．１ｍｌの単独試料が３匹のウサギのそれぞれの片目の中へと点滴されて、急性目炎症／腐食の研究を行った。点滴から１，２４，４８，及び７２時間後に観察が行われた。
【００９２】
その結果、皮膚の炎症は検出可能ではなかった。ペプチド溶液の目への点滴は、結膜の赤くなることをもたらし、結膜は点滴から２４時間以内に完全に溶解した。
【００９３】
Ｐ６０．４Ａｃの全身毒性は、ラットにおける単独及び反復投与毒性調査において評価された。ペプチドは投与量を増加させながら、毎日静脈注射で投与された。この相において、最大対容量（Maximum Tolerated Dose（ＭＴＤ））が定められた。反復投与毒性（repeated dose toxicity）もまたＭＴＤ相において調べられた。投与量を拡大する相において、９匹のラットが３つの群に分けられ、２日間、０．４、２又は８ｍｇ／ｋｇ／日を与えられた。臨床的な兆候は投与の日、及び投与の１日後に１日２回記録され、体重は、はじめの投与の前及び投与から１日後に記録された。ＭＴＤ相において、５匹のメス及び５匹のオスのラットが続く５日間、８ｍｇ／ｋｇ／日を与えられた。臨床的な兆候は、投与の日に１日２回記録され、体重は１日目、及び６日目に記録された。検体検査調査は、検死の前に行われた。肉眼検査は、ＭＴＤ相の終わりに行われた。
【００９４】
その結果、全身的投与量拡大調査では、死亡は起きなかった。さらに臨床上の兆候及び体重に明らかな偏差は認められなかった。ＭＴＤ相の間にもまた、死亡は起きず、明らかなペプチドに関連する知見は臨床上の兆候、体重、血液学、及び臨床上の生化学的パラメーター及び肉眼による検査において認められなかった。
【００９５】
実施例５：聴器毒性（ototoxity）
ペプチドＰ６０．４−Ａｃの聴器毒性を評価するために、このペプチドはモルモット（ＨｓｄＰｏｃ：ＤＨ；ハーラン（Harlan），ホルスト（Horst），オランダ）で試験された。外因的な耳の病変のない、７匹の健康なオスのアルビノのモルモット（５００〜１２００ｇ）がこの調査において使用された。動物は４０ｍｇ／ｋｇのケタミン（ユーロベットアニマルヘルスＢ．Ｖ．，ブラデル，オランダ）及び１０ｍｇ／ｋｇのロンパン（rompun）（バイエルＡ．Ｇ．、レバークゼン、ドイツ）の腹腔内注射で麻酔をかけられた。対照の聴覚試験が行われた後、鼓胞（auditory bulla）が外科的に開けられ、スポンゴスタン（spongostan）の小片を正円窓膜（ＲＷＭ）に施与し、そして種々の溶液（約１０μｌ）がスポンゴスタン上に添加された。皮膚が縫合され、追加の聴覚試験が行われた。ＲＷＭ上の施与は右耳で行われ、左の耳は未処置のままであった。１匹の動物がＰＢＳを最初の偽薬溶液（偽薬１）として与えられ、別の動物は第二の偽薬溶液（偽薬ＩＩ）を与えられた。第二の偽薬溶液は、等張 [ＮａＣｌ]であり、かつ保存された［０．０２％ベンズアルコニウムクロライド及び０．１％Ｎａ２ＥＤＴＡ］２０ｍＭのホスフェートバッファー溶液（ｐＨ５．５）中の７％のマクロゴール１００００であった。２匹のモルモットが、試験［３９］の陽性コントロールとして機能するシスプラチン（ＰＢＳ中で０．６６ｍｇ／ｍｌ、シグマケミカルズ，ツビユンドレヒト、オランダ、から得られる）を与えられた。ペプチドＰ６０．４−Ａｃ（２ｍｇ／ｍｌ）は、１匹の動物においてＰＢＳ溶液（配合物Ｉ）において試験され、他の２匹の動物において第二の偽薬（配合物ＩＩ）に相当するバッファーにおいて試験された。
【００９６】
医薬の投与前、及び手術の直後、そして３，７，１４及び２２日後に、コンピューターに基づくシグナルアベレージングシステム（タッカー−デービステクノロジー、アラチュア、フロリダ州、米国）を使用して聴性脳幹反応（ＡＢＲ）が行われた。モルモットは麻酔にかけられ、インサートイヤホーンが外耳道に入れられた。皮下電極が、頭頂（活性）の上に、そして同じ側の胞（bulla）（参照）の上に置かれた。接地電極は首の筋肉の上に置かれた。ＡＢＲは、電気的に遮蔽された、二重壁の、電波遮蔽された音の部屋の中で、１ｋＨｚにおける１０ミリ秒のトーンバーストに対する反応において記録された。刺激の強さが測定され、ｄＢとして表された。ＡＢＲ閾値は、反復可能な、視覚的に検出可能な反応を引き出すことのできる最も低い強さと定義された。処置後のＡＢＲ閾値が、処置前のＡＢＲ閾値と比較された。
【００９７】
その結果、コントロールとして使用されたＰＢＳの正円窓施与は、手術後２２日において閾値の変化をもたらさなかった。配合バッファーは２２日後に、２ｄＢの閾値の変化をもたらした。一方、シスプラチンはそれぞれ−４９ｄＢ及び−６４ｄＢの閾値の変化を誘起したが、それは重大な聴覚の損失を意味する（表３）。実験のこの部分は聴器毒性調査の陽性コントロールとして機能した。ＰＢＳ中のペプチドＰ６０．４−Ａｃ（２ｍｇ／ｍｌ）は、手術から２２日後に−７ｄＢの閾値の変化を誘起した。Ｐ６０．４−Ａｃを配合物ＩＩとして与えられた両方の動物は１ｄＢの閾値の変化を生み出した。
【００９８】
【表３】
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値はｄＢで表した手術前とのΔを表す
ａＰＢＳ
ｂ等張［ＮａＣｌ］かつ保存された［０．０２％ベンズアルコニウムクロライド及び０．１％のＮａ２ＥＤＴＡ］２０ｍＭホスフェートバッファー溶液（ｐＨ５．５）中の７％マクロゴール１０．０００
ｃ不良配線のために、信頼できない測定
【００９９】
実施例６：抗菌性活性
化合物Ｐ６０．４Ａｃが、実施例１に従って製造され、ネジ蓋付の１０ｍｌガラス瓶へと無菌濾過により殺菌された。保存剤は添加されなかった。別途、対応する偽薬溶液、すなわち化合物Ｐ６０．４Ａｃ以外の同じ成分を有する溶液が調製された。抗菌活性のための試験を行うために２つの調製物のそれぞれから試料が引き出された。その結果、化合物Ｐ６０．４Ａｃを含む溶液は、細菌の成長を阻害する、又は細菌の数を減らしさえすることが見出されたが、対応する偽薬溶液は抗菌性活性を示さなかった。
【０１００】
実施例７：抗菌性活性
Ｐ６０．４−Ａｃ及びＬＬ−３７のインビトロでの抗細菌及び抗真菌活性は、Ｒ．Ｈａｎｃｏｃｋの「カチオン性抗菌性ペプチドのための修正されたＭＩＣ法」［１３］の修正版に従って、９６ウェルのマイクロタイタープレートで、微量希釈感受性試験（microdilution susceptibility test）による最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）として測定された。抗細菌活性は、参照株大腸菌ＡＴＣＣ８７３９，シュードモナス  アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ９０２７について試験された。抗真菌活性は、カンジダ  アルビカンス（Candida albicans）ＡＴＣＣ１０２３１及びアスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）ＡＴＣＣ１４４０６について評価された。抗菌性活性アッセイは、種々の濃度のＰ６０．４Ａｃ及びＬＬ−３７を用いて行われ、細菌又は真菌の成長への効果を比較した。抗細菌活性は３７℃においてトリプチケースソイブロスで対数期培養された細菌を使用して調べられた。培養物は１０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４で希釈されて、約５．０×Ｉ０６ＣＦＵ／ｍｌを与えた。１０μｌの希釈された試験株が９６ウェルプレートに移され、１００μｌの種々のペプチド濃度が各ウェルに添加された。プレートは３７℃において２４時間インキュベーションされ、次にライトボックス上で目視検査により成長に得点をつけた。次にそれらはさらに２４時間インキュベーションに戻され、その後成長について再評価される。酵母株Ｃアルビカンは上記のように調製された。サブローデキストロース寒天プレート上で、２０〜２５℃において、６〜１０日間、又は十分な胞子形成が起きるまで培養された糸状菌Ａ．ニガーが胞子懸濁物（spore suspension）として使用された。胞子はスクラッピングにより収穫され、もし必要であれば濃度は最終濃度５×ｌ０６ＣＦＵ／ｍｌに調節された。
【０１０１】
すなわち、Ｐ６０．４−Ａｃの抗菌性活性は、２つのグラム陰性株、及び真菌Ｃ．アルビカンス及びＡ．ニガーに対して評価され、ＬＬ−３７と比較された。各ペプチドについてのＭＩＣ値が表４に与えられる。Ｐ６０．４−Ａｃは、グラム陰性株、大腸菌、及びＰ．アエルギノーサに対して同等以上の活性を示した。ある場合には、殺菌活性もまた両方のペプチドについて測定された。Ｐ６０．４−Ａｃは、Ｃ．アルビカンスに対して６μＭのＭＩＣを示し、１８μＭにおいて十分殺菌性があるだろう。１８μＭにおけるＰ６０．４−Ａｃは、２４時間Ａニガー胞子の発芽を阻止したが、ＬＬ−３７はＡ．ニガーに対して活性を示さない。
【０１０２】
実施例８：バイオフィルム形成の阻害
化合物Ｐ６０．４Ａｃは、実施例１に従って製造され、シュードモナス  プチーダＰＣＬ１４４５のバイオフィルム形成の阻害剤としての有効性を試験された。標準的なＰＶＣバイオフィルムアッセイが使用され、該アッセイにおいてバイオフィルムはマイクロたいたープレートのウェルのポリ塩化ビニル表面上で形成される。ウェル中のＰ．プチーダ懸濁物に、Ｐ６０．４Ａｃの溶液（０．９μＭ及び９μＭ）が添加され、１０時間インキュベートされた。その結果、９μＭにおけるＰ６０．４Ａｃがバイオフィルム形成を、ペプチドなしのバッファー溶液に比較して９０％超阻害するが、０．９μＭは、約５０％の減少をもたらすことが見出された
【０１０３】
実施例９：形成されたバイオフィルムの阻害
化合物Ｐ６０．４Ａｃが実施例１に従って製造され、シュードモナス  プチーダのバイオフィルムの分解におけるその有効性が試験された。実施例７におけるように、標準的なＰＶＣバイオフィルムアッセイを使用してバイオフィルムが形成された。バイオフィルムは、７時間に渡ってＰ．プチーダＰＣＬ１４４５懸濁物からマイクロタイタープレートのウェルで形成することを許された。その後、種々の量のＰ６０．４Ａｃ、並びに対照、すなわちＤＭＳＯ、及び緩衝液処理された媒体溶液、Ｍ６３がそれぞれ，添加された。１８時間のインキュベーションの後、バイオフィルムは５９５ｎｍにおけるその光学密度（ＯＤ５９５）により評価された。その結果、ＤＭＳＯは、Ｍ６３と比較してＯＤ５９５の少しの減少しかもたらさなかったが、Ｐ６０．４Ａｃは、その濃度に依存してバイオフィルムをかなり破壊した。
【０１０４】
図１は、種々のモル濃度Ｐの６０．４Ａｃ（棒グラフ１〜５）、ＤＭＳＯ，及びＭ６３に対するＯＤ５９５値を示す。
【０１０５】
【表４】
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ａ  ＭＩＣは、３７℃における２４又は４８時間のインキュベーション後に細菌の目に見える成長を阻害したペプチドの最低濃度として定義された。結果は３つの独立した測定の平均値である。
ｂ  １８μＭにおける殺菌剤
ｃ  ６μＭにおける殺菌剤
ｄ  細菌発育抑制
ｅ  生きている微生物の回収はされなかった。すべてのウェルにおける成長は明らかに目に見えたからである。
ｆ  １８μＭにおいて殺菌可能、６μＭにおいて菌増殖抑制
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】種々のモル濃度のＰ６０．４Ａｃ（棒グラフ１〜５）、ＤＭＳＯ，及びＭ６３に対するＯＤ５９５値を示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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