(57)【要約】  本発明は、自家移植において細胞をエキソビボで除去するための新規方法であって、移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに、採取した細胞試料をFasL可溶部分の多量体型の充分量で処理して悪性細胞を死滅させる、方法に関する。放射線治療を伴うまたは伴わない、高用量化学療法後の自家幹細胞移植(ASCT)は、大細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫および難治性/再発性ホジキン病を発症した患者の大多数に対しての標準的治療法になっている。昨今において、この治療法は、低悪性度リンパ腫(慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫)を発症した特定の患者および急性骨髄性白血病(AML)を発症した患者に対しても検討されている。細胞除去のための現在の治療法としては化学療法および抗体のカクテルが含まれる。これらの治療法は、しばしば幹細胞にとっては毒性がある一方、癌細胞を除去するのに有効ではない。このように、ASCTにおける細胞除去の医学的ニーズは満たされておらず、このプロジェクトにより解決されるであろう。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自家移植において細胞をエキソビボで除去するための方法であって、移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに、悪性細胞を死滅させるために採取された細胞試料を可溶型Fas-1分子、好ましくは、FasL可溶型部分の多量体型の充分量で処理する、方法。
【請求項２】
移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに、悪性細胞を死滅させるために採取された細胞試料を可溶型Fas-1分子、好ましくは、FasL可溶型部分の多量体型の充分量で処理する工程を含む、実質的に悪性細胞が除かれた採取細胞の調製方法。
【請求項３】
溶液中の可溶型Fas-L分子の量が、１から４００ng/mlの間に含まれる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
採取された細胞が、１から１２時間の間に含まれる期間にわたり処理される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
可溶型Fas-L分子で処理後、残った生存細胞が広汎洗浄により処理される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
可溶型FasL分子がFasL分子、より詳しくは、可溶型である、該リガンドの細胞外ドメインの単量体、オリゴマーおよび多量体を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
可溶型FasL分子が、多量体化FasL分子の中から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
多量体化FasL分子が、少なくとも４つ、Fasリガンドの球状可溶型細胞外部分を含み、好ましくは、少なくとも５つ、より好ましくは、少なくとも６つ、より一層好ましくは、６つ、多量体化部位に結合したFasリガンドの球状可溶型細胞外部分を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
採取された細胞が幹細胞、好ましくは造血幹細胞である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法での処理後に得られる採取された細胞。
【請求項１１】
強化化学療法前に患者から細胞を採取する工程、及び該採取された細胞を患者に再輸注することを含む、細胞の自家移植の方法であって、再輸注前に該採取された細胞が請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で処理される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自家移植において細胞をエキソビボで除去するための新規方法であって、移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに、採取された細胞試料をFasL可溶部分の多量体型の充分量で処理して悪性細胞を死滅させる、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線治療を伴うまたは伴わない、高用量化学療法後の自家幹細胞移植(ASCT)は、大細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫および難治性/再発性ホジキン病を発症した患者の大多数に対しての標準的治療法になっている。昨今において、この治療法は、低悪性度リンパ腫(慢性リンパ球性白血病、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫)を発症した特定の患者および急性骨髄性白血病(AML)を発症した患者に対しても検討されている。細胞除去のための現在の治療法としては化学療法および抗体のカクテルが含まれる。これらの治療法は、しばしば幹細胞にとっては毒性がある一方、癌細胞を除去するのに有効ではない。このように、ASCTにおける細胞除去の医学的ニーズは満たされておらず、このプロジェクトにより解決されるであろう。
【０００３】
今日現在では、670,000人を越えるアメリカ人が血液癌を発症している。アメリカでは、５分毎に誰かが血液癌であると診断されており、それは今年、106,000人を越える人が新患として診断されるであろうことを意味している。アメリカでは、９分毎に誰かが血液癌で死亡しており、それは推定58,000人が死亡（２００３年）していることを意味している。全自家移植片の３０％超は癌細胞で汚染されていると推定されるが、高用量化学療法後のASCTは、多くの種類の悪性腫瘍に対する治療様式として広範に適用されている。今日現在では、ASCTは同種移植の数を大きく上回っている。
【０００４】
2002年には、10,500件のASCTがアメリカで実施され、それは頻度にして人口の3.7/100,000にあたる。比較すると、ヨーロッパ（EU１２）では、2001年に3.1/100,000の頻度に当たる、11,500件のASCTが実施された。結果として、これらの頻度の数字は、2004年にヨーロッパおよびアメリカの間で、少なくとも20,000件のASCTが実施されるだろうことを示す。最近１０年間の間に、ASCTは非常に活発に増加してきた。例えば、1990年には、ヨーロッパ（EU35）ではたった2,097件のASCTが記録されているに過ぎない。1999年には、ASCTの件数は12,841に達し、１０年足らずで600%に増加したことになる。1999年に実施されたASCTの件数から考えると、その傾向はわずかに退行しているが、最近のデータは、実施されたASCTの件数において、1999年後半以来一定の増加傾向があることを明瞭に示している。
【０００５】
自家造血幹細胞移植（ASCT）は、血液リンパ系（白血病、リンパ腫）悪性腫瘍を含む、悪性腫瘍の治療に次第に用いられるようになっている方法である。この方法では、強化化学療法前の患者から造血幹細胞（HSC）を採取し、HSC機能をレスキューするために当該HSCを患者に再輸注する。自家移植の目的は、HSCへの化学療法の毒性を迂回し、化学療法のより高用量の投与を可能にし、腫瘍細胞を根絶せしめるより高い治療効果を実現することである。そのような方法として、腫瘍細胞で潜在的に汚染されたHSC移植片の再輸注が検討される。実際、遺伝子マーキング実験は、リンパ系腫瘍／骨髄性白血病由来の移植片が、ASCT後に再発させることを示しており、移植片細胞除去のコンセプトを支持している。更に、分子生物学的研究により、自家HSTを実施後に腫瘍細胞が検知されない患者の全生存率および無病生存率が上昇していることが実証されている。実際、除去は濾胞性リンパ腫を発症した患者の全生存率を上昇させる効果を実証している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
除去方法には、CD34+（HSCが豊富な細胞分画）の正の選択、腫瘍性CD20+の負の選択、化学療法またはパック中への毒性分子の投与が含まれる。このような方法の欠点は、それらが「煩雑であり、高価である」(Dalton WS and al., Hematology 2001, pp. 157)ことであり、しばしば移植片のHSC活性を劇的に減少させてしまうこと、および除去、おそらくは移植片中の免疫細胞の除去毒性に関連して造血回復が遅延するにより、移植患者の感染症の罹患率が高まることである(Crippa and al. Bone Marrow transplant 8: 281, 2002)。結果として、自家HSTにおいては、適度な毒性プロファイルを持つ腫瘍細胞に対してはエキソビボ除去の医学的ニーズが満たされていない。
【０００７】
現在の治療法
移植片中における残余の腫瘍細胞の危険性を最小限にするため、様々な除去方法が用いられてきた。広く引用された除去方法は、以下の使用を含む：
・エキソビボ化学療法（例えば、シクロホスファミド誘導体）
・毒素と結合された、または免疫カラムで選択された腫瘍標的モノクローナル抗体
・CD34+の正の選択
【０００８】
最も近年における発達は光力学処理に関するものである（例  CELMED company）。
【０００９】
今日までに、残余腫瘍細胞を完全に枯渇させる一方で、自家移植片の造血およびリンパ球活性を維持する点において申し分ないことが示された上記方法はない。
【発明の効果】
【００１０】
腫瘍細胞を根絶させる有効性、およびHSC、リンパ球に対する低い毒性から、可溶型Fas-1分子、より詳しくは、強力なMegaFasLのようなFasL可溶部分の多量体型は、ASCTにおける理想的な除却剤の基準を満たす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、自家移植において細胞をエキソビボで除去するための新規方法であって、移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに、採取した細胞試料を可溶型Fas-L分子、好ましくはFasLの可溶部分の多量体型の充分量で処理して悪性細胞を死滅させる、方法に関する。
【００１２】
好適な実施形態においては、患者に再輸注する直前に解凍および処理する前は、患者から採取した細胞試料は凍結保存される。
【００１３】
このような適切な凍結方法と培地は、該分野においてよく知られている。例えば、幹細胞は採取されて、ACD-A溶液（Laboratoriul Dr. G Bischeeel AG, Interlaken Switzerland販売）のような抗凝固溶液中で維持されてもよい。上記の採取した細胞を、CryoSure-DMSO溶液（WAK- Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany販売）およびAlbumin ZLB 5%のようなDMSOおよびアルブミンを含む特別な凍結培地中に凍結するために、移してもよい。
【００１４】
採取された細胞を含む溶液中の可溶型Fas-L分子の最終処理濃度は、通常１から400ng/mlの間に含まれ、好ましくは、10から50ng/mlの間に含まれる。
【００１５】
採取された細胞は、１から１２時間の間に含まれる期間にわたり処理することが好ましい。具体的な実施形態においては、細胞を約５時間処理する。
【００１６】
可溶型Fas-L分子で処理後、培地中の残余FAsL分子を除去するために、残った生存細胞を広汎洗浄処理することが好ましい。このような洗浄方法においては、生理学的に容認できる食塩水が通常用いられる。自家移植前には、最終洗浄上清液をELISAにより調べることで微量なMegaFasLの存在を検査する。
【００１７】
本発明に係る処理後における採取された細胞の精製／洗浄方法は該分野においてよく知られている。
【００１８】
可溶型FasL分子はFasL分子、より詳しくは、可溶型である、該リガンドの細胞外ドメインの単量体、オリゴマー、および多量体を含む。好適な実施形態においては、可溶型Fas-L分子は、多量体化FasL分子の中から選択される。
【００１９】
本発明に係る多量体化FasL分子は、少なくとも４つ、Fasリガンドの球状可溶型細胞外部分を含み、好ましくは、少なくとも５つ、より好ましくは、少なくとも６つ、より一層好ましくは、６つ、多量体化部位に結合したFasリガンドの球状可溶型細胞外部分を含む。
【００２０】
多量体化FasL分子は、最終的には凝集してドデカマー（２つの６量体）またはオクトデカマー（３つの６量体）を含む、より高次の多量体を形成してもよい。
【００２１】
本発明の好適な実施形態においては、Fasリガンドの多量体型は、一緒に集合された６つの単量体を含む６量体であり、それぞれの単量体は式(I)のポリペプチドを含む：
【００２２】
H-L                                      (I)
【００２３】
式中、Lは、Fasリガンドの可溶型細胞外部分を含む、FasリガンドのC末部分を表し、Hは、N末の６量体化部分を表している。
【００２４】
本発明によれば、リガンド部分Lは、Fasリガンドの可溶型細胞外部分の「全長」および同部分の生物学的活性断片を含んでいる。「生物学的活性断片」とは、同じレセプターに実質的に同じ親和性で結合する能力を保存している、TNFファミリーのリガンドの可溶型細胞外部分の断片をいう。
【００２５】
Lは、好ましくは上記リガンドの全長細胞外可溶型部分を含む。
【００２６】
本発明の実施形態によれば、Lは、hFasL の139番目Gluから281番目leuまでのアミノ酸を含んだ、ヒトFasリガンド(hFasL)の細胞外ドメインを含む。
【００２７】
本発明に係る６量体は、「真の」６量体、３量体の２量体、または２量体の３量体の何れかである。第一の場合、Hは６量体化ポリペプチド(HP)である。後者の場合、Hは２つの部分、即ち２量体化ポリペプチド(DP)から構成される第一部分、及び３量体化ポリペプチド(TP)から構成される第二部分を含む。
【００２８】
本発明に係るポリペプチドは、以下の式(Ia)、(Ib)および(Ic)の１つによって表されるポリペプチドを含む：
【００２９】
HP - L                                (Ia) (「真の」６量体)
DP-TP - L                             (Ib) (２量体の３量体) 
TP-DP - L                             (Ic) (３量体の２量体)
【００３０】
式中、L、HP、DPおよびTPは上記および下記で定義される。
【００３１】
HP、TPおよびDPの例は、該分野においてよく知られており、天然の６量体、３量体または２量体ポリペプチドの単離されたペプチド断片を含み、該単離された断片は当該天然の６量体、２量体または３量体の６量体化、２量体化または３量体化に責を負う。
【００３２】
このような分子は該分野においてよく知られており、ACRP30またはACRP30様タンパク質(WO96/39429号、WO99/10492号、WO99/59618号、WO99/59619号、WO99/64629号、WO00/26363号、WO00/48625号、WO00/63376号、WO00/63377号、WO00/73446号、WO00/73448号またはWO01/32868号)、apMl (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221: 286-9, 1996)、Clq (Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991)またはコラーゲンリピートGly-Xaa-Xaa'に存在する「コラーゲンドメイン」を含むタンパク質であるClq様タンパク質(WO01/02565号)のような、コレクチンファミリーのポリペプチドを含む。
【００３３】
他のオリゴマー化ポリペプチドが該分野でよく知られており、軟骨基質タンパク質(CMP) (Beck & al., 1996, J. Mol. Biol., 256, 909-923)のような、「コイルドコイル」ドメイン(Kammerer RA, Matrix Biol1997 Mar;15(8-9):555-65;
discussion 567-8; Lombardi & al., Biopolymers 1996;40(5):495-504; http://mdl.ipc.pku.edu.cn/scop/data/scop.1.008.001.html)を有するポリペプチド、またはロイシン・ジッパーもしくはオステオプロテグリン(Yamaguchi & al. 1998)を有するポリペプチドのような、２量体化ドメインを有するポリペプチドを含む。
【００３４】
本発明の具体的な実施形態においては、HPはClqファミリーのポリペプチドのA鎖、B鎖またはC鎖の６量体化ドメインを含む。
【００３５】
TPは該分野において公知であり、CMPの３量体化ドメイン(C末部分) (例 GeneBank 115555, アミノ酸 451-493)またはACRP30およびACRP30様分子の３量体化ドメインを含む。本発明の好適な実施形態では、TPは一続きのコラーゲンリピートを含む。
【００３６】
本発明では、「一続きのコラーゲンリピート」は式(II)の一連の隣接したコラーゲンリピート中に存在する：
【００３７】
-(Gly-Xaa-Xaa')n-                                      (II)
【００３８】
式中、XaaおよびXaa'は、独立してアミノ酸残基を示しており、nは10から40の整数である。
【００３９】
XaaおよびXaa'は、好ましくはAla、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、TyrまたはValのような天然アミノ酸の中から独立して選択される。
【００４０】
Xaaは、好ましくはAla、Arg、Asp、Glu、GIy、His、Ile、Leu、Met、ProまたはThr、より好ましくはArg、Asp、Glu、Gly、HisまたはThrの中から選択されたアミノ酸残基を独立に表す。
【００４１】
Xaa'は、好ましくはAla、Asn、Asp、Glu、Leu、Lys、Phe、Pro、ThrまたはVal、より好ましくはAsp、Lys、ProまたはThrの中から選択されたアミノ酸残基を独立に表す。
【００４２】
Xaa'がPro残基を表す場合、コラーゲンリピートGly-Xaa-Proは「完全な」コラーゲンリピートとなるように設計されており、それ以外のコラーゲンリピートは「不完全な」コラーゲンリピートとなるように設計されたものである。
【００４３】
本発明の好適な実施形態においては、一続きのコラーゲンリピートは少なくとも１つの完全なコラーゲンリピートを含み、より好ましくは少なくとも５つのコラーゲンリピートを含む。
【００４４】
本発明の好適な実施形態においては、nは15から35の整数であり、より好ましくは20から30であり、最も好ましくは21、22、23または24である。
【００４５】
本発明では、一続きのコラーゲンリピートは２つの隣接したコラーゲンリピート間に挿入された３つまでの「非コラーゲン残基」を含んでいてもよい。これら「非コラーゲン残基」は、１、２または３つのアミノ酸残基に存在し、「非コラーゲン残基」が３つのアミノ酸残基中に存在するときは、最初のアミノ酸はGlyではない。
【００４６】
本発明の好適な実施形態においては、TPは途切れの無い連続した２２個のコラーゲンリピート中に存在する。より好ましくは、TPは、WO96/39429号の配列番号２：
【００４７】
【化１】
2008514218.tif 000002
【００４８】
に示されているように、mACRP30の４５番目から１１０番目のアミノ酸に相当する、配列番号１の一続きの２２個のコラーゲンリピート中に存在する。
【００４９】
本発明のもう一つの好適な実施形態においては、TPは、WO96/39429号の配列番号７に示されているように、hACRP30の４２番目から１１０７番目のアミノ酸に相当する、一続きの２２個のコラーゲンリピート中に存在する。
【００５０】
DPは、該分野において公知であり、免疫グロブリンの二量体化フラグメント(Fcフラグメント)、オステオプロテグリンのC末側二量体化ドメイン(レセプター:δN-OPG;アミノ酸 187-401)または少なくとも６個、好ましくは８個から３０個のアミノ酸を含み、且つ二量体化が可能なポリペプチド配列を含む。これらのペプチドは少なくとも、通常は、ジスルフィド結合形成を可能にするシステイン残基を含む。本発明に係るDPとして用いることができる他のポリペプチドには、７残基毎に存在するロイシン残基を含む、「ロイシンジッパー」と呼ばれるペプチドがある。
【００５１】
少なくともシステイン残基を含む、そのようなペプチドの例は、以下のペプチドを含む：
【００５２】
【化２】
2008514218.tif 000003
【００５３】
上記の２番目の配列は、WO96/39429号の配列番号２に示されるように、mACRP30の１７番目から４４番目のアミノ酸に相当し、上記の３番目の配列は、WO96/39429号パンフレットの配列番号７の１５番目から４１番目のアミノ酸に相当する。
【００５４】
少なくとも１つのシステイン残基を含む他のペプチドは、WO99/10492号、WO99/59618号、WO99/59619号、WO99/64629号、WO00/26363号、WO00/48625号、WO00/63376号、WO00/63377号、WO00/73446号、WO00/73448号またはWO01/32868号において開示されているACRP30 (ACRP30様)に類似した構造を有する分子の一続きのコラーゲンリピートの上流に位置するアミノ酸配列中に見出され得る。
【００５５】
ロイシンジッパーは該分野においてよく知られており、天然タンパク質中において見出され、ひいては当業者であれば用いることができる生物情報学ツールとして見なされている(http://www.bioinf.man.ac.uk/zip/faq.shtml; http://2zip.molgen.mpg.de/; Hirst, J.D., Vieth, M., Skolnick, J. & Brooks, CL. III, Predicting Leucine Zipper Structures from Sequence, Protein Engineering, 9, 657-662 (1996))。
【００５６】
本発明の式I、Ia、Ib、またはIcのポリペプチド中の構成要素であるL、H、HP、TPおよび／またはDPは、ペプチド結合によって集合している。それらは、本発明のポリペプチドの機能性、６量体を形成し、かつリガンドLに対応するレセプターと結合する能力に影響を与えないだろう「リンカー」によって隔てられていてもよい。このようなリンカーは分子生物学の該分野においてよく知られている。
【００５７】
本発明のポリペプチドはまた、そのN末端および／またはC末端上に、本発明のポリペプチドの機能性に影響を与えないだろうペプチド配列を含んでもよい。これらのペプチドは、本発明のポリペプチドを精製または検出することを目的として、アフィニティータグを含んでいてもよい。このようなアフィニティータグは該分野においてよく知られており、FLAGペプチド(Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988))またはMyc-Hisタグを含む。
【００５８】
本発明の好適な実施形態においては、Hが２量体化ポリペプチド(DP)および３量体化ポリペプチド(TP)を含み、最も好ましくは以下の式で表される：
【００５９】
DP-TP - L                                     (Ib)
【００６０】
式中、R、DPおよびTPは上記および下記で定義される。
【００６１】
より好ましくは、DPおよびTPは共に、WO96/39429号の配列番号２に示されるように、mACRP30の１７番目から１１０番目のアミノ酸、またはWO96/39429号の配列番号７に示されるように、hACRP30の１５番目から１０７番目のアミノ酸を意味する。
【００６２】
本発明の好適な実施形態として、ポリペプチドにはmまたはhACRP30:hFasL (MegafasL)の融合ポリペプチド、より具体的には、言及することにより内容が本明細書中に組み込まれるところのWO01/49866号に開示されているmまたはhACRP30:hFasLが含まれる。
【００６３】
本発明の別の実施形態においては、６量体化部分は、PCT出願番号PCT/EP02/09354において開示されているように、gi2765420の２４８番目から４７３番目のアミノ酸を含んだIgGのFc部分を含み、言及することにより本明細書中にその内容が組み込まれる。
【００６４】
本発明の方法では、可溶型Fas-L分子は、他の既知の処理方法と組み合わせて使用され得る。このような「処理方法」は、腫瘍学において用いられる他の分子または組成物を含む。そのような他の適切な分子または組成物は、該分野においてよく知られており、ドキソルビシン、シスプラチンのような白金塩およびベルケードを含む、Dictionaire Vidal (2003 ed.)、メルクインデックス（the MerkIndex）または医師用卓上参考書（the Physician Desk Reference）において「癌腫学(Cancerologie)」の表題でリストされている分子または組成物のいずれであってもよい。
【００６５】
本発明はまた、可溶型Fas-1分子、好ましくは上述したように、移植される細胞の生存度に実質的に影響を与えずに採取された細胞の試料をFasL可溶型部分の多量体型の充分量で処理して、悪性細胞を死滅させる工程を含む、悪性細胞が実質的に除かれた採取された細胞の調製方法に関する。
【００６６】
本発明はまた上記方法を介して得られた採取された細胞を含む。
【００６７】
本発明はまた、強化化学療法前に患者から細胞を採取する工程、及び該採取された細胞を患者に再輸注することを含む、細胞の自家移植の新規方法であって、再輸注前に該採取された細胞が上記開示方法で処理される方法に関する。
【実施例】
【００６８】
以下の試験は、実施済みまたは実施予定である。
【００６９】
１．造血系癌細胞および細胞株に対するMegaFasLの細胞傷害性試験
造血系癌細胞および細胞株群のMegaFasLに対する感受性の判定を目的とする。細胞および細胞株には、好ましくは多発性骨髄腫(MM)、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、びまん性大細胞型リンパ腫 (DLCL)および急性骨髄性白血病 (AML)を発症した患者由来の細胞が含まれるであろう。これらの細胞を選ぶ選択基準は、その患者の治療に現行の自家移植が適用されるか否かに基づく。
【００７０】
Fas発現は、患者由来の細胞株および初代細胞群上の、FACSによって判定する。Fasが介在する細胞死に対する感受性は、PMS/MTSアッセイを用いた用量反応解析および経時的解析で判定される。アポトーシスはDNA断片化だけでなく、FACSによるTUNELおよびannexin Vアッセイによっても追跡される。
【００７１】
２．PBPCおよび免疫細胞に対するMegaFasLの細胞傷害性試験
第１に、末梢血前駆体細胞(PBPC)および免疫細胞上のFas発現を、特に前駆体細胞用マーカーとしてCD34を用い、免疫T細胞およびB細胞用マーカーとして、それぞれCD3およびCD20を用いて、FACSにより判定する。Fasが介在する死滅に対する感受性を、抗体コーティングされた電磁ビーズで精製されたPBPCおよび免疫細胞群を用いてPMS/MTSアッセイにより判定する。あるいは、精製PBPCは造血系細胞集団中のPBPCとは異なった挙動を示すリスクがあるため、後者のPBPC細胞の感受性もまたアポトーシスおよび細胞系統に特異的多重染色を用いて調べ、FACSにより解析する。アポトーシスはDNA断片化だけでなく、FACSによるTUNELおよびannexin Vアッセイによっても引き起こされる。Fasが介在する細胞死に対するPBPCおよび免疫細胞の感受性を、癌細胞のそれと比較する。
【００７２】
第２に、MegaFasLで処理されたPBPCが多能性細胞を生み出すための能力をインビトロで判定する。後期前駆体および初期前駆体の両者が、それぞれコロニー形成単位および長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイによって実証される。必要ならば、アッセイ結果細胞はCFUによって実証された細胞よりも早い分化段階にある細胞を実証するような、二次的CFUを測る。これら全てのアッセイは有用であり、研究室において日常的に実施されているものである。LTC-ICアッセイは、PBPCを間質細胞上で共培養した後に、分化因子を含む半固形アガロースゲル上でのコロニー形成単位(CFU)数の判定を含む。MegaFasLで処理された免疫(T)細胞の健全性は、同種異系反応アッセイにおける増殖、および（破傷風トキソイドに対する抗体のように）胸腺依存的な特異的抗体の産生を測定することによって判定する。後者の能力は、採取前１ヶ月に破傷風トキソイドを接種したドナー由来のPBMC、および１４日間抗原存在下で、インビトロ培養した該PBMCについて評価する。
【００７３】
最後に、MegaFasLで処理されたPBPCの移植能力をNOD/SCIDネズミでインビボ検定する。ヒトPBPC移植および発現の後に以下が続く：
a)免疫組織化学、FACSおよび骨髄のPCR増幅b)骨髄細胞中の、ヒトCFUも存在。抗体産生へと向かう免疫細胞の健全性は、SCIDマウスにヒトPBPCを輸注した後に判定する。該モデル動物は、研究室としての長期的経験があり、革新的であった（実験者の添付物CV参照）。
【００７４】
３．癌細胞およびPBPCの混合群に対するMegaFasLの細胞傷害性試験
造血系癌細胞およびPBPCのMegaFasLに対する感受性を、上述したように、癌細胞を検知するためにPCR、ならびにPBPCおよび免疫細胞を検知するためにモノクローナル抗体を用いて、混合群でインビトロ試験する。更に、MegaFasLで処理したPBPCの健全性を、LTC-ICアッセイで判定する。インビボ研究を目的として、PBPCおよび免疫細胞の生着能力を、NOD/SCIDおよびSCIDマウスを用いてそれぞれ試験する。読み出しは上記と同様だろう。造血系癌細胞および幹細胞の混合物は、MegaFasLによりまたは既存のプロトコルに従って処理されるだろう。処理効果はインビトロ（LTC-ICアッセイ）およびインビボ（NOD/SCIDマウス中でのコロニー形成）で測定されるだろう。
【００７５】
MegaFasLが造血系悪性腫瘍の高レベルアポトーシスを誘導する。
図３で示されているように、PESMTSアッセイからIC50を判定する。値は３回の独立した実験の平均値（±標準誤差）で表される。ND=データが得られていない;耐性= Fasアゴニスト濃度10,000 ng/mlまでIC50が至らなかった。
【００７６】
【表１】
2008514218.tif 000004
【００７７】
免疫細胞に対するMegaFasLのアポトーシス効果。
免疫細胞群の中の特定の集団を同定するための様々なマーカー、およびアポトーシスのレベルを判定するためのannexin-Vで末梢血単核細胞(PBMC)を染色した。３回の独立した実験からannexin-V染色された平均的割合（±標準誤差）を示す。MegaFasLは、複数のPBMCのサブタイプにアポトーシス効果を有していたが、重要なことに、マクロファージ／単球／顆粒球を除き、どの特定の細胞も完全に除去されるわけではなかった（データ非表示）。従って、MegaFasLで培養した免疫細胞は、いくらかの機能的能力を維持することが可能でありそうである。結果を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2008514218.tif 000005
【００７９】
臨床上での悪性細胞の除去方法。
現在、臨床的には、HSCは増殖因子を注入した後の末梢血から得られ、そのような増殖因子としては、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が挙げられ、モビリゼーションと呼ばれる過程である、骨髄から末梢血へのHSCの移行を刺激する。HSCが豊富な末梢造血細胞をパックに採取するために成される手法は、白血球搬出法と呼ばれる。得られた細胞パックは、−１９６℃の液体窒素で凍結する前に、４℃にまで下げられる。患者に移植の準備が整ったとき、細胞を３７℃で解凍し、DMSOを洗って除き、即座に患者に移植する。MegaFasLは、白血球搬出法と患者に細胞を再輸注する間の臨床試験計画書に組み込まれるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】造血系癌細胞上のFas発現。(A.)造血系癌細胞株群を、蛍光色素標識抗ヒトFas抗体で染色し、Fas発現をFACSによって評価した。数字はアイソタイプコントロールと比較した平均蛍光強度の倍率を示す。
【図１Ｂ】(B.)初代造血系癌細胞を分析した点を除いて、(A.)と同様である。
【図２】MegaFasLはFasレセプターに特異的に結合し、カスパーゼを活性化する。A. ARH-77細胞をMegaFasL-FLAG(filled area)、ZB4およびMegaFasL- FLAG (実線)、ZB4 (破線)と共に、または単独 (点線)で培養した。細胞をFITC標識抗FLAGモノクローナル抗体で染色した。B. 野生型Jurkat細胞とFADD(FADD欠損)またはcaspase 8(casp 8欠損)が欠損したその細胞とをlOOOng/ml MegaFasLと共に５時間培養した。野生型Jurkat細胞をまた、Z-VAD (100μM)存在下、lOOOng/ml MegaFasLと共に５時間培養した。FACSを用いて、細胞上のannexinおよび7AAD染色を測定することにより、アポトーシスを観察した。annexin+ 7AAD+の細胞の割合を黒実線バーとして示し、annexin+ 7 AAD-細胞の割合を斜線バーとして示した。AおよびBにおいて示されたデータは少なくとも３回の独立した実験の代表的なものを表している。
【図３】PESMTS解析は、MegaFasLが他のFasアゴニストよりも強力な細胞殺傷剤であることを示している。多発性骨髄腫細胞株である、ARH-77のMegaFasLに対する感受性を他のFasアゴニストと比較して試験した。１０％血清を含む培地で培養した細胞を、１５時間Fasアゴニストで処理し、PESMTSアッセイを用いて生存率を評価した。OD490nmが生存率に対応する。
【図４】他のFasアゴニストと比較した、MegaFasLで処理した造血系癌細胞株のannexin VおよびPI染色。表示したng/mlのMegaFasL、CHl 1またはsFasL M2と共に、１５時間細胞を培養した。細胞をannexinおよびPIで染色し、FACSにより解析して、アポトーシスの程度を判定した。A.Jurkat細胞で得られたFACSデータの一例を示しており、数値はannexin+ PI+およびannexin+ PI-の細胞の割合を示している。B.異なる造血系悪性腫瘍の細胞株が、MegaFasL、CHl 1およびsFasL M2により誘導されたアポトーシスのグラフ表示。annexin+ PI+（黒実線バー）、annexin+ PI-（斜線バー）。
【図５】ヒト造血系悪性腫瘍の初代細胞のMegaFasLに対する感受性。初代細胞を様々な濃度のMegaFasLと共に培養した。アポトーシスを起こした細胞を、FACSを用いてannexinおよび7AAD染色陽性細胞を測定することにより判定した。annexin+ 7AAD+を黒実線バーとして示し、annexin+ 7 AAD-を斜線バーとして示した。MM、多発性骨髄腫; AML、急性骨髄性白血病; ALL、急性リンパ性白血病; CLL、慢性リンパ性白血病; MCL、マントル細胞リンパ腫。
【図６】他のFasアゴニストと比較した、MegaFasLで処理した初代多発性骨髄腫細胞(IgA λ+、 CD38+)のannexin V+/7AAD+染色。様々な濃度(0、10、40、80、200ng/ml)のMegaFasL、sFas M2およびCHI lで、５時間細胞を処理した。遅発性アポトーシスを起こした細胞の割合(annexinV+/7AAD+)をFACSで判定した。
【図７】CD34+造血幹細胞は、細胞表面に低レベルのFasを発現している。A. 造血系幹細胞の代表的一例から、本研究で用いられた試料がほとんど１００％CD34+細胞を含むことをFACS解析によって示している。B.発現量は異なるが、CD34+細胞表面にFasを低レベルで発現していることを示している。
【図８】造血系の再生に責を負う造血幹細胞は、MegaFasLに対して抵抗性である。A.表示した濃度のMegaFasLと共に、５時間、３７℃で細胞を培養した。抗CD34抗体で細胞を染色し、CD34+でゲートされた細胞をFACSによりアポトーシス解析(annexin- Vおよび7AAD染色)した。annexin+ 7AAD+を黒実線バーとして示し、annexin+ 7 AAD-を斜線バーとして示した。代表的実験例を示している。B およびC.CD34+ CD33- およびCD34+ CD38低発現細胞をannexinおよび7AAD染色で解析している点を除き、A.と同様である。代表的実験例を示す。
【図９】MegaFasL処理された造血幹細胞はコロニー形成できる。A.造血幹細胞を表示された濃度のMegaFasLで５時間処理し、洗い、CFUアッセイで細胞を蒔いた。あるいは、（培養前）解凍直後に造血幹細胞を蒔いた。コロニーの数を２週間後にカウントした(CFUカウント)。B. LTC-ICアッセイで細胞を蒔いたこと、および６週間後にカウントしたことを除き、A.と同様である。代表的実験例を示す。BFU-E、赤芽球バースト形成単位; CFU-G、顆粒球コロニー形成単位; CFU-M、マクロファージコロニー形成単位。
【図１０】MegaFasL処理された造血幹細胞は、インビボ生着能力を有する。A. CD34+細胞をMegaFasLに５時間曝露し、洗い、免疫欠損NOD/SCIDマウスに移植した。あるいは、（培養前）解凍直後に造血幹細胞を蒔いた。６週間後、マウスを処分し、髄細胞におけるヒトCD45+細胞の存在をFACSにより解析した。○は、FACS解析の代表例として示しており、血液学的に異なる系統のマウスを生み出していることを示している。B. CD34+造血幹細胞を移植されたNOD/SCIDマウスの髄由来の細胞を、６週間後に単離し、10000細胞をCFUアッセイで蒔いた。データは２つの独立実験を示している。BFU-E、赤芽球バースト形成単位; CFU-G、顆粒球コロニー形成単位; CFU-M、マクロファージコロニー形成単位。
【図１１】MegaFasL処理した健常免疫細胞の機能的能力。フィコールによって全血から得られた末梢血単核細胞を、MegaFasLと共に５時間培養し、洗い、SCIDマウスに輸注した。３６日後、マウス血清中のヒトIgGの存在について、FACSで判定した。これはMegaFasL処理したヒト免疫細胞がインビボ移植できると説明できる。更に、MegaFasLで培養したヒトPBMCから破傷風トキソイドにより免疫記憶反応の誘導が依然可能である（マウス血清中のTT抗体の存在で判定される）。本調査に関する実験は現在行っているところである。エキソビボ除去薬剤としてMegaFasLを用いることは、分化した免疫細胞の生存能力と機能に対して、単に不完全な効果を発揮するにすぎないように思われる。
【図１２】MegaFasLに対する異なる造血系細胞の感受性(IC50)を示す概略図。図は、MegaFasLが造血系幹細胞の免疫系を再構築する能力に影響を与えることなく、癌細胞を効果的に死滅させ、一方で、移植片中の健常免疫細胞に不完全な効果を持つにすぎないような治療濃度領域を示している。MM、多発性骨髄腫; AML、急性リンパ性白血病; MCL、マントル細胞リンパ腫; NK、ナチュラルキラー。
【図１３】洗い工程、上清の採取およびPBMC解析の図表示。10% FBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地（完全RPMI）中でPBMCの解凍および洗いを行った。PBMCを105/mlで完全RPMI中に再懸濁し、106細胞をポリプロピレン試験管中で0、50、100、200または400 ng/ml MegaFasLと共に、５時間、３７℃で培養した。細胞が接着しないように、一時間ごとに試験管を優しく叩いた。処理の最後に、８分間、１１００rpmで細胞を遠心し、上清を集めた(SN#1)。残った上清を廃棄し、PBMCを１０ｍｌの完全RPMI中に再懸濁して、遠心し、上清を集めた(SN#2)。このような方法を繰り返して、SN#3を得た。PBMCを１mlの完全RPMI中で再懸濁し、100μl(105)のPBMCを集めた。残った900μlを遠心し、上清を集めた(SN#4)。
【図１４】洗浄は検知できる濃度のMegaFasL(APO184)を除去する。PBMCを５時間MegaFasLで培養し、洗い手順の異なる段階からの上清(SN#1、SN#2、SN#3、SN#4)およびPBMC（図１３参照）を、MegaFasLの存在についてELISAにより解析した。SN#1グラフ中の400ng/mlバーの色彩変化は、＞80ng/mlが存在していたことを示す。結論として、MegaFasLで５時間培養したPBMCを遠心して得られた上清から、検出可能な濃度のMegaFasLを除去するには、２回の洗い(SN#3)で充分である。
【図１５】洗浄作業は活性MegaFasL(APO184)を除去する。A.PBMCを５時間MegaFasLと共に培養し、洗い手順の異なる段階からの上清(SN#1、SN#2、SN#3、SN#4)およびPBMC（図１３参照）を、Orange Cell Tracker染色したJurkat細胞と共に、１８時間培養した。annexin-Vによる染色およびフローサイトメトリー分析によってアポトーシスを起こしたJurkat細胞を判定した。B. Jurkat細胞を、同時に、直接にMegaFasL (0.01、0.05、0.1または0.5 ng/ml)で１８時間処理することで、Jurkat細胞がMegaFasLに対して高感受性であることを示している。実際、0.01 ng/mlのMegaFasLにより10.7 %から21.8 %にアポトーシスが増加しており、400 ng/mlと共に培養して、２回洗いを実施したPBMCと共に培養したJurkat細胞において見られるアポトーシスを大きく上回っている。従って、400 ng/mlのMegaFasLと共に培養後、２回洗いを行った再懸濁PBMC中には、MegaFasLが0.01 ng/ml未満しか存在していないことが推察され得る。
【図１Ａ】
2008514218.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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