(57)【要約】本発明は、粒子径が１０〜９５ｎｍであり、蛍光色素を含むナノスケールメラミン・ホルムアルデヒド粒子、その製造方法、およびバイオマーカー、インクジェットインクの調製のための支持材料としての使用および／またはクロマトグラフィ分離のための吸着材料としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子径が１０〜９５ｎｍであることを特徴とする、ナノスケールメラミン・ホルムアルデヒド粒子（ＭＦ粒子）。
【請求項２】
粒子径が３０〜５０ｎｍであり、単分散であることを特徴とする、請求項１に記載のナノスケールＭＦ粒子。
【請求項３】
１種または２種以上の親水性の有機金属色素または有機蛍光色素を含むことを特徴とする、請求項１および／または２に記載のナノスケールＭＦ粒子。
【請求項４】
存在する親水性の蛍光色素が８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸ナトリウム塩であることを特徴とする、請求項３に記載のナノスケールＭＦ粒子。
【請求項５】
ストレプトアビジンに結合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のナノスケールＭＦ粒子。
【請求項６】
ギ酸のメラミン・ホルムアルデヒド樹脂との水性媒体中における反応によるナノスケールＭＦ粒子の製造方法であって、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂の攪拌を十分に大量の水中において、６０〜８０℃の範囲の温度において行い、続いて９８〜１００％のギ酸を添加し、直径が１０〜９５ｎｍである粒子を生成せしめることを特徴とする、前記製造方法。
【請求項７】
粒子径が３０〜５０ｎｍである単分散ＭＦ粒子が生成されることを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
１５〜２０重量％の濃縮ギ酸を添加することを特徴とする、請求項６および／または７に記載の製造方法。
【請求項９】
親水性の有機金属色素または有機蛍光色素を、ギ酸との反応の前にＭＦ粒子に添加することを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
用いられる親水性の蛍光色素が８-ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸ナトリウム塩であることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
ストレプトアビジンがナノスケールＭＦ粒子の表面に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）による活性化により一段階反応を経て結合されることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１２】
ストレプトアビジンがナノスケールＭＦ粒子の表面に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドによる活性化により二段階反応を経て結合されることを特徴とする、請求項６〜１０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のナノスケールＭＦ粒子の使用であって、バイオマーカー、インクジェットインクの調製のための支持材料としての使用、文書および／または紙幣のような使用物品の中および上における蛍光ラベルとしての使用、および／またはクロマトグラフィ分離のための吸着材料としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノスケールメラミン・ホルムアルデヒド粒子（ＭＦ粒子）であって、粒子径が１０〜９５ｎｍであり、蛍光色素を含んでよく、好ましくは単分散であるもの、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光物質は数多くの適用分野を有し、とくに生化学においてである。蛍光化学基を化学反応によって生体分子に付着せしめ、この分子の非常に感受性の高いラベルとして使用することができる。免疫学において、抗体は蛍光化学基とともに与えられるところ、これは抗体の結合箇所の確認が蛍光によって可能となることを意味する。それによって抗原の濃度を定量的に決定することすら可能である。蛍光ラベルによって、異なる生体分子を細胞内において検出することができる。ラベルは異なる色を蛍光発光するため、例えば組織内における蛍光の分布を蛍光顕微鏡によって観察することができる。
【０００３】
本発明の目的は、蛍光ラベルナノ粒子として可能な限り小さい直径（＜１００ｎｍ）を有するものを製造することであった。かかる目的は、次にストレプトアビジンをこれらの分子上に固定し、次にビオチンラベルタンパク質を検出することであった。かかる目的はナノ粒子が十分に小さく、マイクロアレイに用い得ることであった。大きさの分布が高度に単分散していることおよび蛍光が極力大きいことが、当該粒子合成における目的であるといえる。
【０００４】
蛍光色素でラベルしたストレプトアビジンは既に存在するが、得られる測定シグナルは非常に小さい。対照的に、ナノ粒子（＜１００ｎｍ）には数多くの蛍光色素分子を含有せしめることができる。したがって、極めて鋭敏な蛋白質の検出方法が可能となる。ビオチン／ストレプトアビジン系はそのような測定にとくに適しているが、その理由は研究が大変精力的に行われ、ビオチン（ビタミンＨ）とストレプトアビジンとの親和性は極めて高いからである。ビオチンとストレプトアビジンとの結合は極めて強固であるところ、それは結合の相手方の解離は測定が終了するまで生じないことを意味する。
【０００５】
蛍光メラミン・ホルムアルデヒド粒子は、既に述べたように、診断における支持材料として用いられるとともに、数多くの会社によって上市されている。例えばSigma-AldrichまたはMicroParticlesによってである。市販されているＭＦ粒子は、１〜１５μｍの範囲のものである。ＭＦ粒子のうち粒径が１μｍより有意に小さいものは今日まで知られていない。０．１〜３μｍの範囲については、ポリスチレンベースが優占的な蛍光微小球体が知られているが（例えばMerck  Estaporから）、これらの欠点は、最小の直径である約０．１μｍが単分散でないことである。
【０００６】
これに対して、メラミンベースナノ粒子は、ポリスチレンベース材料に対して他にいくつかの有利な点を有している。例えば、密度が大きく（１．５１ｇ／ｃｍ３）、非常に安定であり、無制限の時間にわたる保存が可能であり、水中において再懸濁が可能であり、２００℃までの熱に安定であり、水中において単分散を取る。また、蛍光色素のＭＦ粒子への取り込みは容易に行い得る（WO  03/074614を参照）。洗い流されることもない。色素は、例えばシリカ粒子のような粒子中においては共有結合しているのではなく、その中に埋め込まれている（embedded）と考えられている。
【０００７】
DD-224  602には単分散メラミン・ホルムアルデヒドラテックスであって粒子径が０．１〜１５μｍの範囲にあるものの製造方法が開示されている。ＭＦ粒子の製造は、メラミンとホルムアルデヒドの重縮合を、低濃度（０．８７％）のホルムアルデヒドを含む水性媒体中において行うことによって行われている。さらに、これらのラテックス粒子の機能化および色素（特に蛍光色素）の導入についても記載されている。
【０００８】
ＭＦ粒子の機能化は２つのルートによって行うことができる。まず、所望の機能性を有する親水性物質を重縮合の間に添加することが可能である。これは粒子群（particles）中に一体化される。機能性基は表面に位置することとなるが、物質の中には粒子の内部に封入（include）されるものもある。このタイプの機能化においては、表面の被覆程度（coverage）を制御することは困難である。
第２に、粒子群の機能化を続いて行うことができる。反応基をメラミン樹脂粒子の表面上に位置せしめる。これらの検出は、例えば長鎖カルボン酸クロリドによって表面を修飾し、その後に粒子を疎水性とすることによって行うことができる。
【発明の開示】
【０００９】
驚くべきことに、ここにナノスケールのＭＦ粒子として粒子径が１０〜９５ｎｍであり、１種または２種以上の親水性の有機金属色素または有機蛍光色素を含むものの開発が可能となった。当該ＭＦ粒子は、好ましくは、粒子径が３０〜５０ｎｍであり、単分散である。
【００１０】
メラミン樹脂は１，３，５−トリアミノ−２，４，６−トリアジン骨格上に基礎を置く。メチロール化メラミンの調製は、２〜６ｍｏｌのホルムアルデヒドをモルあたりのメラミンに対して用いることによって行うことができる。メチロール化メラミンは水中における安定性が低いため、市販の製品によってエーテル化する。メタノールによってエーテル化したメラミンは容易に水溶性となるのに対し、ブタノールによってエーテル化したものは有機溶媒中に容易に溶解する。
ここで用いる市販のメラミン・ホルムアルデヒド樹脂（Surface  Specialties製のMadurit  SMW  818）は７５％の水溶液である。メラミン：ホルムアルデヒドは、モル比で１：２．８〜１：３．８であり、全メチロール基のうち４５〜５５％はメタノールによってエーテル化されている。
【００１１】
単分散メラミン粒子の製造については、例えばDD-224  602に記載されている。既に述べたとおり、その機能化は重縮合中に容易に行うことが可能であり、かかる重縮合は酸性媒体中において行う。粒子サイズは、用いるメチロール化メラミンの性質および濃度、ｐＨおよび酸の添加中の温度による影響を受ける場合があり得る。昇温、低いｐＨ、メラミン樹脂が数多くのメチロール基を含有していること、および低い樹脂濃度のそれぞれによって、反応は、より小さい粒子の方向にシフトする。
酸性媒体中における重縮合については、DE  4019844においても記載され、ここでの酸触媒は硫酸である。
【００１２】
本発明のナノスケールＭＦ粒子の製造は、ＭＦ樹脂を、十分に大量の水中において、温度６０〜８０℃の範囲にて攪拌した後、９８〜１００％のギ酸を添加して１０〜９５ｎｍの直径を有する粒子を生成せしめることによって行われる。ギ酸は好適な縮合開始剤であることが立証されている。それを用いた結果に再現性があるからである。対照的に、塩酸を用いると、高いｐＫＡ値を有するため、再現性のある結果が得られない。好ましくは、濃ギ酸（すなわち９８〜１００％の）を１５〜２０重量％添加する。
【００１３】
蛍光ナノスケールＭＦ粒子を得るために、親水性の有機金属色素または有機蛍光色素のＭＦ粒子群への添加を、濃ギ酸との反応の前に行う。
前記色素を事前に修飾してはいけない。それらは粒子群中に組み込まれる（embedded）のであって、その中に共有結合するのではないからである。ＭＦ粒子群に一体化するためには、色素は親水性でありさえすればよい。
【００１４】
用いることができる親水性の有機色素は、例えば蛍光色素であり、例えばローダミンＢおよびローダミン誘導体（赤色）、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体（黄色）、アミノエチルクマリンおよびクマリン誘導体（青色）等である。用いることができる有機金属色素は、例えばテルビウム３＋タイロン複合体（緑色）およびユーロピウムトリスジピコリナート（trisdipicolinate、赤色）である。
８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩の使用は好ましく、この場合粒子は暗緑色の蛍光を発する。粒子径が小さいほどその相対表面積は大きくなる。この表面が機能性基によって密に覆われていない場合、原理的には大量のストレプトアビジンが微小なＭＦ群に結合される。
【００１５】
ストレプトアビジンをナノスケールＭＦ粒子に結合せしめるに際して重要なことは、ストレプトアビジンのビオチン結合能を維持することである。ストレプトアビジンの粒子への結合は、一段階反応でも二段階反応でも可能である（G.T. Hermanson et al., Immobilised Affinity ligand Techniques (1992)を参照）。ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）はタンパク質を他の分子に結合せしめるのに通常用いられる試薬である。前記一段階反応において、ＥＤＣはカルボキシル基と反応してエステル中間体を生成するところ、それは第一級アミンと反応し得るものである。ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド）を用いると、より安定なエステル中間体が二段階反応で生成され、続いてタンパク質と反応せしめる。
【００１６】
ＥＤＣはＭＦ粒子上のカルボキシル基と反応することも、ストレプトアビジン上のカルボキシル基と反応することもできる。したがって、理論的には２個または３個以上のストレプトアビジン分子を相互に架橋せしめ、これらをＭＦ粒子表面との反応に用い得ないものとすることも可能である。この生じ得る架橋を回避するために、上記のとおり二段階反応を実施することができる。この場合、まず本ナノスケールＭＦ粒子をＥＤＣおよびＮＨＳと反応せしめ、過剰の試薬を洗い流すことによって、ＥＤＣがストレプトアビジンと反応できないようになる。その後初めてストレプトアビジン溶液を添加する。粒子表面のみが活性化されているため、ストレプトアビジン分子が反応し得るのも後者のみとである。
ところで、ＥＤＣとの反応（一段階反応）と、ＥＤＣ／ＮＨＳとの反応（二段階反応）との間に、実質的に差はないことを銘記するべきである。いずれの方法を用いても、およそ同量のストレプトアビジンが本ナノスケールＭＦ粒子の表面に結合する。
【００１７】
ストレプトアビジンが粒子上において固定化されていることを確認するためには、フルオレセイン／ビオチンを粒子の懸濁液に添加する。結合していないフルオレセイン／ビオチンの定量的測定は蛍光スペクトロメータによって行うことができる。
【００１８】
本ナノスケールＭＦ粒子、好ましくは単分散であり蛍光のＭＦ粒子の使用は、バイオマーカー、インクジェットインクの調製のための支持材料として、あらゆる種類の使用物品（例えば文書および／または紙幣）の中および上における蛍光ラベルとして、および／またはクロマトグラフィ分離のための吸着材料として、使用可能である。クロマトグラフィにおける適用については、非蛍光ＭＦ粒子も許容し得る。
【００１９】
以下の例は本発明をより詳細に説明するためのものであって、限定するものではない。
【００２０】
例１：
無色ナノスケールメラミン・ホルムアルデヒド粒子
４５０ｇの水を７０℃に温める。メラミン・ホルムアルデヒド樹脂（１５ｇのMadurit  SMW818）を５０ｇの水の中において攪拌し、７０℃にて添加する。溶液は澄明なままである。温度が再び７０℃に上げ、２ｍｌの９８〜１００％ギ酸を添加し、混合物の攪拌をこの温度にてさらに２０分間行う。濁りは実質的にないが、当技術分野の当業者に知られているチンダル効果が閃光を用いて容易に観察される。
限外濾過（３０キロダルトンのメンブラン）による生成の後に得られた粒子の平均粒子径は約４０ｎｍであることが、走査電子顕微鏡によって測定された。
【００２１】
例２：
蛍光ナノスケールメラミン・ホルムアルデヒド粒子
４５０ ｇの水と８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸ナトリウム塩とを７０℃に温める。樹脂（１５ｇのMadurit SMW818）を５０ｇの水中において攪拌し、７０℃にて添加する。溶液は澄明なままである。温度を再び７０℃に上げ、２ｍｌの９８〜１００％ギ酸を添加し、混合物の攪拌をこの温度にてさらに２０分間行う。約１分の後、バッチは僅かな濁りを示す。
限外濾過（３０キロダルトンのメンブラン）による生成の後に得られた粒子群の平均粒子径は約４６ｎｍであることが、走査電子顕微鏡によって測定された。
【００２２】
例３：
ＥＤＣ溶液を用いたナノ粒子のストレプトアビジンとの結合（一段階反応）
１ｍｌの懸濁液であって１０％のメラミン粒子群を含むもの（＝１００ｍｇの固体）をエッペンドルフキャップに計量して入れ、１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（２−モルホリンエタンスルホン酸（Ｍｅｒｃｋ）ｐＨ５．５）に懸濁せしめ、続いて超遠心器によって６０，０００ｍｉｎ−１にて遠心分離する。上清を廃棄し、洗浄操作を繰り返す。次に粒子群を１ｍｌのタンパク質溶液（ＭＥＳバッファ中に１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン）中に再懸濁せしめ、密封可能なガラス管に移す。粒子群の懸濁状態を、３０分間回転させて保つ。次に１００μｌのＥＤＣ溶液（蒸留水中またはＭＥＳバッファ中に１０ｍｇ／ｍｌのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（Ｍｅｒｃｋ）、使用直前に調製する）を添加する。粒子群を、バッファ中で懸濁して室温に一晩保つ。この間、ＥＤＣは粒子表面上のカルボキシル基と反応し、ストレプトアビジンは結合形態のものと反応する。サンプルを再遠心し、上清を廃棄する。１ｍｌのエタノールアミン溶液（１Ｍ  エタノールアミン（Ｍｅｒｃｋ）、ｐＨ  ９．０、２５ｍＭ  二リン酸四ナトリウム十水和物（Ｍｅｒｃｋ））を添加した後、サンプルの回転をさらに１時間行い再遠心に付す。エタノールアミンが残存している活性化エステルと反応し、アミドを生成する。次に混合物の洗浄を、１ｍｌのＰＢＳバッファ（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｍｅｒｃｋ）、ｐＨ  ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ））をその都度用いて３回行う。最後に粒子群をＰＢＳバッファに再懸濁せしめ、冷蔵庫中に４℃にて保存可能にする。
【００２３】
例４：
ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を用いたナノ粒子のストレプトアビジンとの結合（二段階反応）
１ｍｌの懸濁液として１０％のメラミン粒子群を含むもの（＝１００ｍｇの固体）をエッペンドルフキャップに計量して入れ、１ｍｌの５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ（２−モルホリンエタンスルホン酸（Ｍｅｒｃｋ）ｐＨ５．５）に懸濁せしめ、続いて超遠心器によって６０，０００ｍｉｎ−１にて遠心分離する。上清を廃棄し、洗浄操作を繰り返す。次に粒子群を１ｍｌのＭＥＳバッファ中に再懸濁せしめ、密封可能なガラス管に移す。１００μｌのＥＤＣ／ＮＨＳ溶液（１００ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ、１６ ｍｇ／ｍｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｍｅｒｃｋ）がＭＥＳバッファ中に）を添加する。粒子群の懸濁状態を、室温にて１時間回転させて保つ。この間にＮＨＳが粒子表面上のカルボキシル基とカップリングする。サンプルを再遠心し、上清を廃棄する。混合物の洗浄を、１ｍｌのＭＥＳバッファを用いて再度行う。
【００２４】
粒子群を１ｍｌのタンパク質溶液中に再懸濁せしめ、室温にて一晩回転する。対応するサンプルを１ｍｌのＭＥＳバッファ（ＥＤＣ／ＮＨＳおよびタンパク質溶液を添加しない）中に再懸濁せしめ、室温にて一晩回転する。サンプルを遠心分離にかけ、１ｍｌのエタノールアミン溶液を添加した後、サンプルをさらに１時間回転し、再遠心に付する。エタノールアミンが残存している活性化エステルと反応し、アミドを生成する。次に混合物の洗浄を、１ｍｌのＰＢＳバッファを都度用いて３回行う。最後に粒子群をＰＢＳバッファに再懸濁せしめ、冷蔵庫中に４℃にて保存可能にする。
【００２５】
例５：
ストレタビジンのナノ粒子への結合の、フルオレセイン／ビオチンを用いた検出
ストレタビジンが粒子群上に固定化されているかをチェックするために、フルオレセイン／ビオチンを粒子懸濁液に添加する。ストレタビジン１分子はビオチン４分子と結合することができる。一定量のビオチン（Ｍ＝４４．３１ｇ／ｍｏｌ）をストレタビジンと反応せしめた粒子群に添加するため、結合したストレタビジンの量の計算はそれから行うことができて、この因数４までとなる。
１０μｌの懸濁液（これは１ｍｇの粒子群に相当する）を各サンプルからフレッシュなエッペンドルフキャップにピペッティングする。次に２００μｌのビオチン／フルオレセイン溶液（１ｇｍｏｌ／μｌ、ＰＢＳバッファ中）の添加をサンプルのそれぞれに行う。それらを室温にて１５分間振盪し、続いて遠心分離にかける。
【００２６】
ここでサンプルをマイクロタイタープレートに移し、蛍光スペクトロメータによる計測を行い得るようにする。この目的のために、まず１２５μｌのＰＢＳバッファを各ウェルに導入し、次に７５μｌの上清をエッペンドルフキャップから添加する。各サンプルにつき二重の決定を行う。２００μｌのＰＢＳバッファの測定をブランク値として行い、７５μｌのビオチン／フルオレセイン溶液として１２５μｌのＰＢＳバッファ中のものを最大値とする。このようにして結合していないビオチンの定量を行う。結合したビオチンの量の計算はこの値から行い得る。ビオチンのサンプルへの添加量は前記最大値から知ることができるからである。
【００２７】
ビオチンのバックグラウンド結合の程度を調べるために、ビオチン被覆粒子群の再度の洗浄を２００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを用いて前記測定の後に行い、遠心分離にかける。２回にわたり、７５μｌの上清の再度の測定を、１２５μｌのＰＢＳバッファ中にて行う。この値を結合したビオチンの値から減じて評価しなければならない。１Ｍ  ＮａＣｌを用いて再溶解し得るビオチンは、表面に非特異的に吸着していたにすぎないものである。
【国際調査報告】
2008543982.tif 000002
2008543982.tif 000003
2008543982.tif 000004
2008543982.tif 000005
2008543982.tif 000006
2008543982.tif 000007