(57)【要約】【解決手段】固相ペプチド合成のための活性固相およびペプチドに共役した固着部分の使用であって、固着部分は活性固相に配位結合で可逆的に結合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体、固体支持体に共有結合する金属キレート配位子、および該金属キレート配位子に配位結合する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含む活性固相に結合するための固着部分を有するペプチドの、固相ペプチド合成、該ペプチドのリフォールディング／凝集分解または精製のための使用であって、該活性固相がペプチドの固着部分の配位および可逆的結合のための配位部位を提供し、ペプチドが式Ｉのものであることを特徴とする、使用。
I                 P-X-L
式中、Pは、任意にさらなる非ペプチド部分または保護基を含んでもよいペプチジル部分であり、Xはリンカーまたはアミノ酸保護基であるが、アミノ酸モノマーまたはペプチドではなく、Lは金属キレート基である。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、Xがリンカーまたはアミノ酸保護基であり、リンカーは塩基に不安定ではなく、酸に不安定であり、かつ、または光開裂可能であることを特徴とする、使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、アミノ酸保護基が直交保護基であることを特徴とする、使用。
【請求項４】
請求項２に記載の使用であって、リンカーがＣ末端に結合することを特徴とする、使用。
【請求項５】
請求項２に記載の使用であって、アミノ酸保護基がＮ末端、即ちＮαに結合することを特徴とする、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、ペプチドが伸長ペプチド鎖であることを特徴とする、使用。
【請求項７】
請求項１で定義された通りの式P-X-Lのペプチドであって、Xがアミノ酸保護基であることを特徴とする、ペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のペプチドであって、Xが酸に不安定でない直交保護基、好ましくはＤｄｅ型保護基であることを特徴とする、ペプチド。
【請求項９】
式ＩＶの化合物X-L。
【化１】
2008520616.tif 000014
式中、n=1〜30である。
【請求項１０】
請求項１で定義された通りの式P-X-Lのペプチドであって、X-Lが請求項９の通りに定義される、ペプチド。
【請求項１１】
固体支持体、固体支持体に共有結合する金属キレート配位子、および該金属キレート配位子に配位結合する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含む活性固相の使用であって、該活性固相は、固相ペプチド合成、ペプチドリフォールディング／凝集分解またはペプチド精製のため、ペプチドの固着部分の配位および可逆的結合のための配位部位を提供し、該金属キレート配位子が式Ｖのメチレン−アミノピリジン基であることを特徴とする、使用。
【化２】
2008520616.tif 000015
式中、Mは固体支持体であり、YはHまたはC1-C4アルキルであり、Qは、(i)-CH2-、-NH-または-C2H4-であるか、または(ii)-(C2H3R'NR')x-CH2-であって、それぞれのR'はHまたはCH3であり、かつxは1または2であるか、または(iii)窒素がピリジル部分に直接結合するように無視され、さらに、Qと無関係に、R基は、(a)H、C1-C4アルキルまたはC2-C4ヒドロキシアルキルであり、Qが-CH2-の場合、R基は、加えて、(b.)アリル、ベンジルまたはo-ヒドロキシベンジルであるか、または(c.)-(C2H3R'NR')y-CH2-ピリジル-Yであって、それぞれのR'はHまたはCH3であり、yは0または 1であるか、または(d.)-(CH2)m-OYであって、mは2または3であるか、または(e.)-C2H3R'NR1R2であって、R'はHまたはCH3であり、R1はH、C1-C4アルキル、C2-C4ヒドロキシアルキル、フェニルまたはベンジルであり、R2はH、C1-C4アルキルまたはC2-C4ヒドロキシアルキルであるか、または(f.)C3H4SR'''であって、R'''はC1-C4アルキルであるか、または(g.)-CnH2nCOOYであって、n=1または2であるか、または(h.)-CnH2nSO3-  であって、n=1または2であるか、または(i.)-CH2Zであって、Zは-CONH2または-NHCONH2であり得る。
【請求項１２】
請求項１１の使用であって、ペプチドが「伸長ペプチド」であり、ペプチド延長法に付されることを特徴とする、使用。
【請求項１３】
請求項１１または１２の使用であって、固体支持体が、シリカ、ガラスまたはセルロース、または、ポリスチレン樹脂、好ましくはジビニルベンゼン架橋樹脂、メラミン樹脂、好ましくはカルボキシル化メラミン樹脂、およびポリビニルアルコール樹脂からなる群より選択されるポリマーを基礎とすることを特徴とし、任意に組み合わせて、ポリマー性固体支持体マトリックスは強磁性粒子を含有し、磁性粒子分離技術に適用され得る、使用。
【請求項１４】
請求項１１〜１３の使用であって、式ＩＩのピコリルアミン基が固体支持体Ｍに結合されることを特徴とする、使用。
【化３】
2008520616.tif 000016
式中、n=1または2であって、R=Hである。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれかの使用であって、金属Mn+は、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+ およびランタニドイオンよりなる群から選択され、特に好ましくはMn+はCu2+、Ni2+、Co2+であり、最も好ましくはCu2+である、使用。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のうちの一項の使用であって、さらに、請求項１で定義された通りの活性固相の配位部位に配位結合するペプチドの固着部分を、該活性固相から、競合配位子を添加することによって脱着する工程を含む、使用。
【請求項１７】
請求項１５の使用であって、競合配位子が、金属イオンをキレートする能力のある少なくとも１つの部分、好ましくは、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、アミノプリン、フェナントロリン、ビピリジン、テルピリジン、トリアザシクロノナン、テトラアザシクロドデカン、イミノ二酢酸部分、ニトリロ三酢酸部分およびエチレンジアミン四酢酸部分より成る群から選択される窒素含有部分を含有する、使用。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のうちの一項の使用であって、ペプチドが固着部分によって金属イオンに結合する伸長ペプチドであり、金属イオンは、固体支持体に結合する金属キレート配位子に結合し、ペプチド延長法に付されることを特徴とする、使用。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のうちの一項の使用であって、メリフィールド型連続反応スキームにおいて、モノ−またはオリゴマーアミノ酸を伸長ペプチドのC-またはN-末端に付加することを特徴とする、使用。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のうちの一項の使用であって、ペプチドの固着部分が少なくとも１つの金属イオン錯化部分を含有し、該部分はそれぞれ、活性固相の金属イオンに配位する能力のある、少なくとも１つの窒素、酸素、リンまたは硫黄含有基を含む、使用。
【請求項２１】
請求項１の使用であって、活性固相が、活性固相の金属イオンに配位する能力があり、かつ、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メルカプト、イミダゾリル、N-メチルイミダゾリル、アミノプリニル部分、フェナントロリル部分、ピリジル部分、ビピリジル部分、テルピリジニル部分、トリアザシクロノナノニル部分、テトラアザシクロドデカニル部分、イミノ二酢酸部分、ニトリロ三酢酸部分およびエチレンジアミン四酢酸部分よりなる群から選択される基を含み、好ましくは、窒素を含む基が、１個のヒスチジンであるか、または本質的に少なくとも２個のヒスチジンまたは１個のヒスチジン誘導体または１個のホモヒスチジンより成る、好ましくは本質的に６個以上のヒスチジン残基、より好ましくは 窒素を含む基が６〜１０個のヒスチジン残基を含む、より成る、オリゴマーペプチドである、使用。
【請求項２２】
請求項１１〜２０のいずれかの使用であって、ペプチド鎖の固着部分が、ペプチドのC-末端および／または少なくとも１つのアミノ酸側鎖中に位置することを特徴とする、使用。
【請求項２３】
請求項１１〜２０のいずれかの使用であって、ペプチドの固着部分が、特異的プロテアーゼの認識部位を与えるアミノ酸配列によって、N-末端で延長される、使用。
【請求項２４】
請求項１１〜１３のいずれかの使用であって、競合配位子を含むメリフィールド型反応工程の反応混合物を希釈することによって活性固相から脱着した後、および任意にその後のペプチドのプロセシングの後、ペプチドを活性固相に再結合させる、使用。
【請求項２５】
固着部分を含む、任意に保護されたペプチドの精製方法であって、第一に、請求項１１に定義された通りの活性固相の金属イオン配位部位に固着部分を配位結合する工程、第二に、ペプチド合成の保護基の残留物および捕捉剤または望まない副生物等の汚染物質を洗い流すためのリンス工程、および好ましくは第三に、ペプチドから固着部分を開裂するか、または、好ましくは競合配位子で、配位結合を妨害することによって、固相からペプチドを脱着する工程を含む、方法。
【請求項２６】
活性固相への伸長ペプチド鎖の非共有結合による、ペプチドの固相合成方法であって、固着部分がキレート特性をも有する伸長ペプチドの固着部分による、請求項１１に定義された通りの活性固相への伸長ペプチド鎖の非共有結合のための、遊離の配位部位を有する金属キレート錯体によって、各固相の活性成分が形成される、方法。
【請求項２７】
ペプチド合成中の各合成サイクルのための請求項２６の方法であって、構築された金属錯体が、固相、式Iの金属キレート・メチレンアミノピリジン配位子、金属イオンであって、金属キレート配位子とペプチド鎖の固着部分のキレート基との間に置かれるもの、およびモノまたはオリゴマーアミノ酸のN-またはC-末端および／または側鎖に存在するキレート基であって、各合成サイクルによる段階的方法において伸長するペプチド鎖の固着部分を形成するものを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２８】
請求項２６〜２７のうちの１項に記載の方法であって、固体支持体の金属キレート配位子への金属イオンの非共有および配位結合が、キレート特性をも有するペプチド上の固着基への結合よりも強いことを特長とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相ペプチド合成法およびそのような方法に使用することができる化合物に関する。特に、本発明は、金属キレート部分を含むペプチド化合物に言及する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの化学合成は、既に確立されている。原理上、２つの異なる方法を認め得る。溶液中の合成は、しばしば非常に時間がかかり、従って科学的研究には有用ではなく、一方、固体支持体上での合成により、反応サイクルの迅速な最適化が可能になる。固相ペプチド合成(SPPS)に使用可能なプロトコルは、不溶性固体支持体上で確定した配列を用いてペプチドを合成するメリフィールドの技術(メリフィールド(Merrifield)、R.B.、米国化学会誌(J. Amer. Chem. Soc.) 85巻、1963年、2149頁)に基づいている。支持体によって、簡単な濾過で可溶性の試薬からの分離がより容易に操作されるという利点が得られる。SPPSは非常に迅速に発展し、多数の改良型がある（以下、メリフィールド型合成またはSPPSと一般的に記す）。
【０００３】
小さなペプチド（30mere以下）の合成は通常SPPS技術で問題はないが、40〜120（またはそれ以上）個のアミノ酸の大きさのペプチドでは制限がある。それらの特性は、「大きなペプチド」という用語より、「小さなタンパク質」という用語にかなりよく合致する：
【０００４】
ａ）そのように大きなサイズのペプチドは、通常、線状アミノ酸配列の合成を越えて構築される、二次構造（例えば、らせん、βシート）および三次構造（例えば、ロイシンジッパー、ドメインのジスルフィド架橋）をも有する。現在知られているSPPS技術の改良型は、単に一次構造の構築を目的とするが、好適な方法で二次および三次構造の分子内構造を制御する、いずれのツールをも提供しない。そのことから、樹脂から全生成物を同時に脱着し、保護基を除去する際に、しばしば、所望の生物活性をいずれも示さない機能的に無益な高分子凝集体が得られる。
【０００５】
ｂ）大きなペプチドの合成の場合、合成されるペプチドの全体の長さにわたって、固相上で、一個のアミノ酸残基の環状結合の代わりに、（保護した、部分的に保護した、または保護しない）ペプチド断片を合成し、連結することは、通常好ましい。通常、小さな断片は、連結反応によって結合されるか、または、溶液中の断片濃縮連結（カップリング）技術によって結合される。古典的なSPPSでは、溶液中に反応の両パートナーが与えられ、さらにサイクルの次の工程の間に両パートナーが再結合する、簡単なアプローチは提供されない。
【０００６】
ｃ）高分子支持体上の出発残余物を所望の濃度に制御することは、しばしば困難であり、第一アミノ酸を用いた樹脂の負荷は、しばしばラセミ化を伴う。予め負荷された樹脂が多く市販されているが、これらは全ての負荷をカバーしておらず、所与のペプチド合成の問題に対する最良値は、しばしば見い出すのが困難である。
【０００７】
金属親和性は、今のところ、ペプチド合成においては基本的な活用のみであり、カムリー(Comely)、Aらの出版物に記載されている(化学会誌(Journal of the Chemical Society)、2001年、2526-2531頁、固相合成のためのリンカーとしての、遷移金属錯体：アレーンのリンカーとしてのクロムカルボニル錯体(Transition metal complexes as linkers for solid phase synthesis: chromium carbonyl complexes as linkers for arenas))。これらの著者らは、例えば誘導体化したフェニルアラニンの側鎖に存在するような、芳香性π電子系を用いて、アミノ酸をクロムと錯化した。これらの錯体は、溶液中で製造され、その後、先在のクロム錯体を固相に固着して、一回の合成サイクルの実施に成功した。固相へ固着する金属錯体の基本的適用性が実証されたが、手順はここで提示される本発明と以下の様相において異なる。
【０００８】
カムリー(Comely)らは、第一に金属イオンを系の可溶性部分に結合し、その後第二工程において錯体を固相に固着する。カムリーらは芳香性πドナー系によって形成される錯体を使用し、使用する試薬のいくつかを保護するため、不活性雰囲気を必要とする。この技術には多数の不利点がある：このように結合されたペプチドには漏損があり、一回のアミノ酸連結工程当りの収率は90％を超えない。故に、最大で10量体が技術的に許容される収率で合成され得る。クロムは固相よりペプチドにより強く配位結合するという事実により、競合物での錯体の希釈は、最終的には、常にペプチドに結合する化学量論的量のクロムでペプチド錯体を希釈することになる。ペプチドの薬学的使用のため、このことは容認できない。これを回避するため、カムリーは、過酷な開裂方法を用いるが、この方法は遅く、樹脂が破壊されてペプチドが遊離型になる（DCM中、白色光下、空気中で、接地したポリマーを48時間酸化する）。
【０００９】
ペプチドの化学合成の分野においては、これまでのところ、金属錯体は他には使用されなかったが、金属親和性樹脂自体は、生物工学的に製造された組み換え生体分子の後処理プロセスの領域で知られている。金属アフィニティークロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー等の従来の同等の技術と平行して、自然発生タンパク質の粗生物学的混合物または液体からのクロマトグラフィー精製のツールとして普及してきた。このような精製方法は、例えば、イミノ二酢酸およびニトリロ三酢酸を含有するアガロース誘導体を用いる、欧州特許EP-A-253303号および米国特許US-A-4877830号に記載されている。さらに、金属親和性側鎖を含有するペプチドが、所与のペプチドに対する蛍光標識試薬として、側鎖固定遷移金属錯体を使用する意向で設計された（例えば、国際特許WO-A-9603651A1号；欧州特許EPA-A-0178450号）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、好ましくは、制限されないが、アミノ酸が30、60または100個を超えるペプチドを含む、小型および大型のペプチドの固相合成、精製およびリフォールディング／凝集分解のための、別の適応性のある方法を確立することである。この課題は、独立項による方法または生成物によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
固相ペプチド合成、ペプチドのリフォールディング／凝集分解または精製のための本発明の方法によれば、固着（アンカリング）部分を有する該ペプチドは、固体支持体、固体支持体に共有結合する金属キレート配位子、および該金属キレート配位子に配位結合する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含む活性固相に結合し、該活性固相が該ペプチドの固着部分の配位および可逆的結合のための配位部位を提供し、該ペプチドが式Iのものであることを特徴とする。
I                 P-X-L
式中、Pは、任意にさらなる非ペプチド部分または保護基を含んでもよいペプチジル部分であり、Xはリンカーまたはアミノ酸保護基であるが、アミノ酸モノマーまたはペプチドではなく、Lは金属キレート基であり、XおよびLは共に固着部分を構成する。さらに、このような固着部分は、本発明では、分子「TAG」と称する場合がある。
【００１２】
誤解を予防するため、式Iは、線状ペプチドへのC-末端結合に言及するとは解釈されず、このようなペプチドへのN-末端（N-）、C-末端（C-）または側鎖結合のあらゆる種類に言及することを意味する。
【００１３】
活性固相は、本発明の文脈においては、「金属親和性樹脂」とも言及および解釈される。
【００１４】
本発明のさらなる課題は、そのような式Iのペプチド、およびその固着部分X-Lのそれぞれである。このようなペプチドに関連する本発明の方法および使用は、該固着部分に同様に適用される。
【００１５】
端的に言えば、本発明は、SPPS、精製またはリフォールディングの間、好ましくはSPPSの間、ペプチド構造、好ましくは伸長ペプチドを、適当な固体支持体または樹脂に結合するための金属錯体に依存する。このような金属錯体は、反復的な合成工程の間に使用することができ、例えば、断片濃縮の合間の連結（カップリング）工程の間に伸長ペプチド鎖を脱着すること、および、その後の慣用のSPPS工程の前、再度それを再結合することを可能にする。さらに、固体支持体にペプチド鎖を可逆的に固着する同一の原理を、合成後、精製されたペプチド生成物の制御および保持に使用することができる。この目的のため、生成物を精製し、樹脂表面に対する多数の生成物分子の好適な希釈相関で生成物を金属親和性樹脂に再結合させるが、任意に、pH／温度を変性する、例えばカオトロピック塩、特に尿素、洗浄剤等の、変性剤または影響、および／または好適な溶媒の存在下で再結合する。正しく選択されれば、生成物分子が互いに出会うことが統計的に回避され、故に分子間の折り畳み（フォールディング）（凝集）より分子内の折り畳みが優先されるであろう。結合および精製した後、生成物は、分子の段階的リフォールディングを可能にし、ペプチド鎖の正しい分子内配置を支える、多くの溶媒で処理する。折り畳み（フォールディング）工程は、正しい位置において、例えばジスルフィド結合の形成によって確定することができる。この方法の終点において、安定化された生成物が−通常は水性の−環境中に、正確に折り畳まれて放出される。この一般的な原理を実施することによって、本発明はTAGまたは固着部分を開示するが、これらは、好適なリンカーと組み合わさって共にペプチドの固着部分を補う、有機金属キレート基として理解されなければならない。このようなTAGは、所与のペプチドのアミノ酸側鎖、カルボキシまたはアミノ基に結合し、結合した部分に金属キレート特性を導入することができる。このようなTAGの導入方法、使用および化学的開裂が開示され、ペプチド合成法に組み込まれるが、この合成法は、ペプチド配列の合成工程、化学的開裂による金属親和性樹脂からの脱着工程、金属親和性樹脂での精製工程、金属親和性樹脂でのリフォールディング工程、および方法の最後にTAGのないペプチドの化学的放出工程を含む。
【００１６】
ここで本発明によって形成される金属配位錯体は、固相への金属イオンのキレート化が強力であること、およびペプチド鎖とのキレート化の可逆性が大きいことが特徴であり、ここで可逆性とはキレート化がより弱いことを意味する。従って、カムリーら（上記）とは対照的に、金属イオンは最初に固相に結合し、次に伸長ペプチド鎖が固相に固着する。このことから、結果的には、結合している相当量の金属イオンを溶出することなく、ペプチドが溶出される。
【００１７】
例えば、金属イオンの配位結合のためのN.O.P等の、ヘテロ原子から自由電子軌道を供与する金属キレート部分を用いることによる、非共有結合性樹脂結合の基本的方法論は、既に記載され、同一の出願人から未公開出願であるPCT特許PCT/EP2004/00568号において一般的に特許請求されている。活性固相は「金属親和性樹脂」とも言及され、解釈される。
【００１８】
好ましい態様において、ペプチドは「伸長ペプチド」であり、好ましくはFMOC化学反応によって、ペプチド延長反応に付す。このことは、ペプチドが感受性側鎖およびN-末端の両方（および要すれば、最終的にはC-末端）で保護される意味を含む。アミノ酸保護基、特にアミノ酸側鎖保護基の使用は当該技術においてよく知られており、例えば、ボダンスキ(Bodansky)M.のペプチド合成の原理(Prinicples of Peptide Synthesis)、第二版、ズプリンゲル・ヴェルラッハ(Springer Verlag)、ベルリン／ハイデルベルグ、1993年に記載されており；さらにメリフィールド型合成、連結（カップリング）試薬、連結（カップリング）添加物および反応条件の詳細をその出版物から探すことができる。本発明の文脈では、「アミノ酸」という用語は、常に「α-アミノ酸」の意味として、アミノ酸またはアミノ酸誘導体についてのペプチドの「骨格」、「α-アミノ」基および「側鎖」は、各々IUPAC-IUBの定義に従って使用される（国際純正応用化学連合(International Union of Pure and Applied Chemistry)および国際生化学連合(International Union of Biochemistry)／生化学命名法合同委員会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature)、「アミノ酸およびペプチドの命名法および記号体系(Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides)」、Pure Appl. Chem, 56巻, 595-624頁(1984年)）。
【００１９】
好ましくは、「伸長」ペプチドは、少なくとも1個のアミノ酸からなり、それにはさらに、該ペプチドを延長する周期的または逐次反応の様式またはスキームにおいて、好適に保護したアミノ酸またはオリゴペプチド、好ましくはhmb-および偽プロリンジペプチドまたはジペプチド誘導体を含む保護したジまたはトリペプチドが加えられる。このような逐次スキームは普通「メリフィールド型」固相合成と称する。別の好ましい態様では、メリフィールド型逐次反応計画において、好ましくは厳密な(C→N)メリフィールド型逐次反応計画またはスキーム、好ましくはN-末端のFmoc保護基の化学反応に基づくメリフィールド反応計画において、モノまたはオリゴマーアミノ酸が「伸長ペプチド」のN-末端(N)に加えられる。さらに好ましい態様においては、モノまたはオリゴマーアミノ酸は、例えばD-アミノ酸またはL-Nor-リシン等の、天然および／または非天然のアミノ酸を含む。さらに、メリフィールド型逐次反応計画のそれぞれのサイクルにおいて結合される、適当に保護されたアミノ酸誘導体またはオリゴマー断片は、自由に選択することができる。
【００２０】
ペプチド化学の技術において当業者に知られたあらゆる裏付を、本発明に用いてもよい。好ましくは、固体支持体は、シリカ、ガラスまたはセルロース、またはジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂、メラミン樹脂およびポリビニルアルコール系樹脂よりなる群から選択されるポリマーを基礎とする。本発明の該支持体は、好適な金属キレート配位子によって共有結合で誘導体化されて、本発明に従って金属イオンの存在により活性化される能力のある固相を構成する。
【００２１】
さらに好ましい態様において、好適な重合体の固体支持体は、強磁性粒子を含有する。
【００２２】
さらに好ましい態様において、合成サイクルの間の液相および活性固相の分離は、例えば、ふるい分け、大きさに基づく分離、遠心分離または磁性粒子分離技術によって達成される。反応性官能基は、固体支持体の既存部分を用いた反応によって、または、−ポリマーの場合は−好適に誘導体化されたコポリマーによる共重合によっても、固体支持体に導入することができる。
【００２３】
好ましい態様において、固体支持体上の各金属キレート配位子およびペプチド上のキレート基Lは、配位結合性の配位子−金属結合を構築する能力のある、少なくとも１個の窒素、酸素、リンまたは硫黄原子を含む。固相の金属キレート配位子は、直接またはリンカー基によって、固体支持体に共有結合する。好適なリンカー基は、例えば、アミノ、カルボキシ、メチレン、オキシ、メチレンジオキシ、ポリメチレンジオキシ、エチレンジオキシおよびポリエチレンジオキシ基である。
【００２４】
本発明による、ペプチドと固相との錯体形成のための好適な弱い／強い錯体化対（ペアリング）を提供するという様相を越えて、本質的に「キレート配位子」および「キレート基」という用語は、同一分類のキレート剤に化学的に関連する。
【００２５】
本発明の教示および骨格に従って、例えば、金属キレート配位子の適宜の金属キレート部分を探し出すために使用することができるデータベースから、金属イオンに配位結合する能力のある多数の有機部分を認識することは、当業者には実行可能である。各データの例を、以下の表１に示される公的にアクセス可能なデータベースから選択された、ここで記載された通りの本発明を実施するのに好適な基の例示的データと共に示す。
【００２６】
【表１】
2008520616.tif 000002
【００２７】
このように、種々の金属イオンのキレート分子との錯体形成についてのデータは知られており、基礎的な文献およびデータベースから探し出すことができる。キレート錯体形成反応は、通常迅速で、有機または水性溶媒の存在下、数分以内に結合が完了する。
【００２８】
より好ましくは、キレート配位子またはキレート基は、1〜10個の前述のN、O、PまたはS原子を含む。例として、カルボキシ、アミノ、ホスホリル、スルホニル、ヘテロ環状窒素、アザ、ヒドロキシル、メルカプトが挙げられる。好ましくは、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メルカプト、イミダゾリル、N-メチルイミダゾリル、アミノプリニル部分、フェナントロリル部分、ピリジル部分、ビスピリジル部分、テルピリジル部分、トリアザシクロノナノニル部分、テトラアザシクロドデカニル部分、イミノ二酢酸部分、ニトリロ三酢酸部分およびエチレンジアミン四酢酸部分よりなる群から選択される、窒素を含む基または部分である。
【００２９】
本発明による、キレート基と配位子との結合が許容されると考えられる、キレート基または配位子のさらに好ましい例は、トリフェニルホスフィン部分、アミノプリン部分、好ましくは6アミノプリン部分、フタロシアニン部分、1,10-フェナントロリン部分、好ましくは5-アミノ-1,10-フェナントロリン部分、テルピリジン部分、好ましくは4'-アミノ-[2,2';6',2'']テルピリジン部分、トリアザシクロノナン部分、好ましくは[1,4,7]トリアザシクロノナン部分、およびテトラアザシクロドデカニル部分、好ましくは[1,4,7,10]テトラアザシクロドデカン部分である。
【００３０】
好ましくは、活性固相は、固体支持体、固体支持体に結合する金属キレート配位子、および該金属キレート配位子に配位結合する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含んでおり、該活性固相は、ペプチドの固着部分の配位および可逆的結合のための配位部位を提供し、該金属キレート配位子は式Ｖのメチレン−アミノピリジン基である。
【化１】
2008520616.tif 000003
式中、Mは固体支持体であり、YはHまたはC1-C4アルキルであり、Qは、(i)-CH2-、-NH-または-C2H4-であるか、または(ii)-(C2H3R'NR')x-CH2-であって、それぞれのR'がHまたはCH3であり、かつxが1または2であるか、または(iii)窒素がピリジル部分に直接結合するように無視され、さらに、Qと無関係に、R基は、(a)H、C1-C4アルキルまたはC2-C4ヒドロキシアルキルであり、Qが-CH2-の場合、R基は、加えて、(b.)アリル、ベンジルまたはo-ヒドロキシベンジルであるか、または(c.)-(C2H3R'NR')y-CH2-ピリジル-Yであって、それぞれのR'はHまたはCH3であり、yは0または1であるか、または(d.)-(CH2)m-OYであって、mは2または3であるか、または(e.)-C2H3R'NR1R2であって、R'はHまたはCH3であり、R1はH、C1-C4アルキル、C2-C4ヒドロキシアルキル、フェニルまたはベンジルであり、R2はH、C1-C4アルキルまたはC2-C4ヒドロキシアルキルであるか、または(f.)C3H4SR'''であって、R'''はC1-C4アルキルであるか、または(g.)-CnH2nCOOYであって、n=1または2であるか、または(h.)-CnH2nSO3-  であって、n=1または2であるか、または(i.)-CH2Zであって、Zは-CONH2または-NHCONH2であり得る。
【００３１】
固体支持体Mに共有結合する好適な金属キレート配位子の、さらに積極的に好ましい例は、式IIのピコリルアミン基である。
【化２】
2008520616.tif 000004
式中、n=1または2であって、R=Hである。これは、n=2の場合、式IIは第２級アミンを包含することを意味する。アラルキル部分はメチルピリジルのあらゆる立体異性体であってもよく、-2-ピコリル、-3-ピコリルまたは-4-ピコリル等のピコリルであり、また通常はそれぞれα-、β-およびγ-ピコリルとも言う。より好ましくは、キレート配位子は、2-ピコリルアミン樹脂であり、最も好ましくは二座ビス（2-ピコリルアミン）(n=2)である。このような樹脂の例は、米国特許US4,098,867号に記載されている。特に、Cu2+およびNi2+イオンを用いた場合、ピコリルアミン、および特にビス-ピコリルアミン配位子は、金属イオンを非常に強固に結合し、固体支持体上のこのようなキレート配位子と、それでも比較上は弱いが絶対的には非常に強いペプチド上のキレート基Lとの結合を可能にし、活性固相へのペプチドの可逆的であるが強固な結合を可能にする。このような樹脂の一例は、ダウエックス(Dowex)M-4195（ダウ・ケミカルズ(Dow Chemicals)、米国）であり、これはスチレン-ジビニルベンゼンポリマーマトリックスに結合する、ビス-2-ピコリルアミン官能基よりなる、多孔性キレート樹脂である。ダウエックスM-4195は、多数の第三周期の遷移金属カチオン(Ni,Co,Fe)を除去することが可能であるが、特に銅に対して親和性を示す（ディニズ(Diniz)ら、「酸性塩化マンガン溶液からのキレート樹脂による重金属の取り込み(Uptake of heavy metals by chelating resins from acidic manganese chloride solution)」、鉱物および金属処理(Minerals and Metallurgical Processing)17、217頁、2000年）。
【００３２】
強／弱の用語は、勿論、錯体の安定度定数に言及するものである。固相Mを装飾する好ましいピコリルアミン配位子、特にビス-（ピコリルアミン）配位子および最も好ましくはビス-（2-ピコリルアミン）配位子との結合に特に好適なものは、ペプチド側鎖上の5-アミノ-、グリシン-5-アミノ-または5-アミド-1,10-フェナントロリンである。このような組み合わせは、図１に例示した通り、本発明において特に好ましい。好ましくは、このような組み合わせにおける錯体金属カチオンM2+はNi2+またはCu2+であり、最も好ましくはCu2+である。
【００３３】
好ましい態様において、ペプチドの固着部分は、1〜10個の、該窒素、ヘテロ環状窒素、アザ、アジド、酸素、リンまたは硫黄含有キレート基Lを含んでもよく、後者は好ましくは鎖状化され(concatemerized)、場合により、例えばアルキルまたはポリエチレングリコール鎖等の好適なスペーサーを有する。また、本発明によれば、ペプチドが１個より多く、好ましくは２個の異なる固着部分を含み得ることも可能である。
【００３４】
本発明の別の態様において、活性固相の金属キレート配位子の金属イオンへの配位結合は、錯体安定度定数の点から見ると、キレート基Lであるペプチドの固着部分の該金属イオンへの配位結合よりも強い。
【００３５】
より好ましくは、キレート基Lは、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メルカプト、イミダゾリル、N-メチルイミダゾリル、アミノプリニル部分、フェナントロリル部分、ピリジル部分、ビスピリジル部分、テルピリジル部分、トリアザシクロノナノニル部分、テトラアザシクロドデカニル部分、イミノ二酢酸部分、ニトリロ三酢酸部分およびエチレンジアミン四酢酸部分よりなる群から選択される。
【００３６】
好ましくは、金属Mn+は、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+およびランタニドイオンよりなる群から選択され、特に好ましくはMn+はCu2+、Ni2+、Co2+およびZn2+であり、最も好ましくはCu2+またはNi2+である。
【００３７】
本発明によれば、活性固相からペプチドの固着部分を競合的に脱着するため、競合試薬を固着（アンカリング）されたペプチドに添加することができる。好ましくは、競合試薬は、メリフィールド型反応計画の連結工程の試薬混合物に添加される。
【００３８】
好適な競合キレート剤または配位子は、活性固相における遊離の配位部位へのペプチドの固着部分の、個々の金属イオンキレート部位と比べて、該配位部位に対してほぼ同等かより弱い親和性を有する。脱着は、溶媒に結合したペプチドと比較して、大過剰の競合配位子（代表的には、結合した配位子に関して、102〜106モル過剰の競合配位子）を添加することによって達成される。
【００３９】
好ましい態様において、競合試薬は、連結（カップリング）工程の試薬混合物に可溶性であり、試薬混合物の成分と反応しない。
【００４０】
脱着とは対照的に、ペプチドの固着部分の活性固相への再結合は、例えば、活性固相、競合試薬および非結合ペプチドを含有する混合物を希釈することによって、可能である。
【００４１】
さらに好ましい態様において、競合配位子は、金属イオンをキレートする能力がある少なくとも１つの部分、好ましくは窒素含有部分であって、イミダゾリル、N-メチル-イミダゾリル、アミノプリン、フェナントロリン、ビピリジン、テルピリジン、トリアザシクロノナンおよびテトラアザシクロドデカン、イミノ二酢酸部分、ニトリロ三酢酸部分およびエチレンジアミン四酢酸部分よりなる群から選択されるものを含有する。
【００４２】
別の好ましい態様において、競合配位子は、トリフェニルホスフィン部分、6-アミノプリン部分またはフタロシアニン部分等の、配位結合のための電子対を有する構造部分を含有する。
【００４３】
競合配位子の具体例は、グルタチオン、エチレンジアミノ四酢酸、イミダゾール、N-メチルイミダゾール、フェナントロリン類、好ましくは5-アミノ-1,10-フェナントロリン類、アミノテルピリジン類、トリアザシクロノナン類またはテトラアザシクロドデカン類である。好ましい態様において、競合試薬は、固相合成の連結／洗浄工程の溶媒および試薬混合物に可溶性であり、それらは代表的には、ジクロロメタン、N-メチルピロリドンまたはジメチルホルムアミドであり、試薬混合物の成分と反応しない。このような溶媒のみが保護したペプチドおよび樹脂を可溶化することに注目すべきであり、適合するように、それらは通常、親水性または両親媒性ではない。
【００４４】
好ましくは、ペプチドは、少なくとも25個、より好ましくは少なくとも30個、より好ましくは少なくとも60個、最も好ましくは少なくとも100個のアミノ酸を含む。
【００４５】
別の可能な態様において、ペプチジル部分は、少なくとも１個の任意に保護された非天然アミノ酸を含むが、ここで非天然としての特徴は、保護されていないアミノ酸が本来は存在しないことに関する。一例は、例えばD-Pheである。
【００４６】
先の競合配位子による活性固体支持体からのペプチドの脱着の後か、または活性固体支持体からペプチドを脱着する手段として即座に、ペプチドのペプチジル部分から固着部分を選択的に除去／開裂できることは、勿論有利である。薬学的装置には、ペプチド上のキレート基は、勿論、望ましくない免疫原（イムノゲン）または生物学的機能の阻害物質である。
【００４７】
好ましくは、リンカーは酸に不安定および／または光開裂可能なリンカーである（例えば、米国特許US5739386号に記載）。リンカーは、脱保護のための標準的な20%Fmoc20%ピペリジンの化学反応に関しては、塩基に不安定ではない。このようなリンカーは、例えばノヴァバイオケム(Novabiochem)（メルク・バイオサイエンシーズ(Merck Biosciences)、英国）より、商業的に容易に入手できるが；このようなリンカーは通常は、固相合成の出発アミノ酸またはペプチド断片が結合するための樹脂の取っ掛かり（ハンドル）を提供するため、固相支持体の誘導体化に使用され；ここでは、ペプチドまたは出発アミノ酸をキレート基で誘導体化するために使用されるが、誘導体化には後処理でペプチド全長からの選択的除去が必要である。また、そのようなリンカーは、開裂に際して、ペプチジル部分のC-末端へ、C-末端カルボキサミド類を導入するために使用してもよい（例えば、Fmocリンク(Rink)リンカー、欧州特許EP-322348号）。さらなる例は以下の通りである。
【００４８】
3-(4-ヒドロキシメチルフェノキシ)プロピオン酸；
[3-([エチル-Fmoc-アミノ]-メチル)-インドール-1-イル]-酢酸；
4-(2-ブロモプロピオニル)フェノキシ酢酸；
4-(4-[ビス-(4-クロロフェニル)ヒドロキシメチル]フェノキシ)酪酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩；
4-[4-(2,4-ジメトキシベンゾイル)フェノキシ]酪酸；
4-[4-(ジフェニルヒドロキシメチル)フェノキシ]酪酸ジシクロヘキシルアンモニウム塩；
4-[4-(1-(Fmoc-アミノ)エチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]ブタン酸；
p-[(R,S)-α-[1-(9H-フルオレン-9-イル)-メトキシホルムアミド]-2,4-ジメトキシベンジル]-フェノキシ酢酸；
4-ヒドロキシメチル安息香酸；
4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸；
4-(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシ)-酪酸；
4-[4-(1-ヒドロキシエチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]ブタン酸；
4-[4-ヒドロキシメチル-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]ブタン酸；
N-Fmoc-N-メトキシ-3-アミノプロピオン酸；
4-[4-(1-Fmoc-アミノ)エチル]-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ]ブタン酸。
【００４９】
より好ましくは、そのようなリンカー部分は酸に不安定であり、開裂に少なくとも50%以上のトリフルオロ酢酸を要する。より好ましくは、そのようなリンカーは、N-メチルピロリドンまたはジクロロメタン等の非プロトン性極性有機溶媒中の、3-10%のトリフルオロ酢酸でも酸に不安定である。
【００５０】
好ましくは、単独か、または、前段落の定義および、キレート基およびペプチドの固着部分に対する好ましいキレート基についての定義と組み合わせて、そのような選択的に開裂可能なリンカーは、C-末端かまたはアミノ酸側鎖を介してペプチドに結合し、最も好ましくはC-末端に結合する。
【００５１】
同等に好ましいものは、ペプチド合成において通常使用されている通りの保護基の使用であり、標準的なメリフィールド型ペプチド合成に不活性であり、特にFmoc合成に不活性であるものの使用であるが；そのような基の広範な概説は上記のボダンスキ(Bodansky)に見い出される。要するに、本発明は、金属キレート基をペプチドに一時的に共有結合させるために、このような保護基を二官能性リンカー様部分に変換する。殆どの保護基は、ペプチドの世界的脱保護に適用される通り、50%-80%トリフルオロ酢酸の「強」酸性条件下で開裂される可能性があり、本発明の定義に、選択的化学開裂を要するかまたは塩基に不安定な特別な保護基（例えば、Fmoc；これは、固相合成の終点で、完成したペプチド鎖にN-TAGを結合する際に有用であるかもしれない）として包含される。好ましくは、保護基は、Fmocの化学構造に直交し、結果として塩基に不安定ではない（ジクロロメタンまたはN-メチルピロリドン中、20％ピペリジンの影響を受けないことを意味する）保護基である。とりわけ、前述のリンカーと対照的に、本発明の保護基は、ジクロロメタンまたはN-メチルピロリドン中の3〜10%以下のトリフルオロ酢酸の「緩やかな」酸性条件下で不安定ではないが、慣用の共有結合において、適切に影響を受ける樹脂からの（例えば、2−クロロトリチルまたはジーバー(sieber)アミド誘導体化樹脂から）緩やかな酸性開裂に不活性である。このようなものは、殆どの慣用的側鎖保護基であり、例えば、トリチルまたはBocである。最も好ましくは、このような保護基は、上記で定義した通りの「強」酸性条件下または「塩基性」条件下で不安定でないかまたは除去可能ではなく、従って、酸性および塩基性の両条件に直行する(orthogonal)が、選択的化学的開裂によって除去し得る：このようなものの例および特に好ましい具体例は、例えば、Pd(0)で触媒されるアシル基転移反応によってペプチドから選択的に除去可能な、アリル（アミノ酸側鎖またはC-末端がカルボキシ官能基である場合）および関連のアロック(Alloc)保護基（例えば、第一アミンを保護）（ゴメス-マルティネス(Gomez-Martinez)、固相ペプチド合成におけるNα-アロックの一時的保護、アリル基スカベンジャーとしてのアミン−ボラン錯体の使用(Nα-Alloc temporary protection in solid-phase peptide synthesis, use of amine-borane complexes as allyl group scavengers)、J.Chem. Soc. 、Perkin Trans. 1、1999年、2871-2874頁）、Dde基（バイクロフト(Bycroft)ら、分枝ペプチドのSPPSのための新規なリシン保護方法(A novel lysine protecting procedure for SPPS of branched peptides)、J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1993年、778-779頁）、ヒドラジン分解によって除去可能なジメドン(dimedon)誘導体、およびその機能性誘導体（N-1-(4-ニトロ-1,3-ジオキソインダン-2-イリデン)-エチルまたはNde基、ケラム(Kellam)ら、テトラヒドロン(Tetrahedron)54巻、1998年、6817-6832頁；N-1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル、チャン(Chan) 1995年）である。機能性誘導体は、上記タイプの保護基の反応性および選択的化学的除去能力を本質的に保有するか、またはそれらに実質的に影響していない、キレート基複合体を含むが；本発明の目的のため、アルキル、アリールまたはアルカノイル鎖等のスペーサー部分は、金属キレート基を結合するため、そのような保護基の末端に結合する���要があるかもしれない。BocおよびFmocの化学の両者に直交し、即ちペプチドに結合した場合に酸および塩基の両者に抵抗性である保護基は、脂肪族、芳香族、エステルまたはアミド結合においてキレート基に接合することによって全ての固着部分にこの不活性な特性を好ましく保持し；このような結合はSPPSの間、化学的に不活性である。誘導体化した保護基を含む固着部分をN-末端にまたはN-TAGとして結合することは、任意であり同様に好ましく；このようなN-TAGは、合成の間、加えられる最後のアミノ酸またはペプチド断片に結合されるか、それらと共に供給され、かつ、Ｎαまたはアミノ酸側鎖に結合してもよい。実施例の項において、例として、TAG18、10-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-10-ヒドロキシ-デカン酸[1,10]フェナントロリン-5-イルアミドヒドロアセテートが挙げられる。
【００５２】
最も好ましくは、保護基は式IIIの官能性部分を有するDde/Nde-型の保護基である。
III            (-CO)2C=C(-R)(-OH)
式中、Rは置換または非置換アルキルであり、好ましくは、２つのカルボニル基は-CH2-CR'R”-CH2-、-NR'-CO-NR”-または-CR'=CR”-骨格で連結される環構造を形成している。好ましくは、R'、R"はアルキル基であるか、または一緒になってアリール基である。
【００５３】
例えばピコリルアミンについて述べた通り、上述のキレート部分が金属イオンと共に形成される錯体の強度により支持体上のキレート配位子として使用するのみに適合する場合を除いて、このような保護基が上述のキレート部分またはキレート基と結合し得ることは当然である。
【００５４】
本発明のさらなる目的は、式Iのペプチドを得るための、その後にペプチド部分に結合される固着部分の試薬を構成する、単離された化合物X-Lである。上述の定義はこの目的にも同様に適用する。好ましくは、Xはここでは保護基であり、より好ましくは、アロック／アリル型または式IIIの保護基であり、最も好ましくは、任意に、同一または異なって、さらに置換されても非置換であってもよいC1〜C6のアルキル基でN'および／またはN"-置換されてもよい、O-1-(2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-エチル、O-1-(4-ニトロ-1,3-ジオキソインダニリデン)-エチル、 O-1-(4-ハロゲノ-1,3-ジオキソインダニリデン)-エチルまたはO-1-(2,4,6-トリオキソ-1,3-ジアジンアニリデン)-エチル型のものであり；このような、任意にさらにN-置換された、式IIIの官能基部分を含む'Dde'型の2,4,6-トリオキソ-1,3-ジアジナン誘導体が、国際特許WO 99/15510号に記載されている。最も特に好ましいものは、5-アミド-1,10-フェナントロリン部分を含む、式IVの、Ddeに基づく化合物X-Lである。
【化３】
2008520616.tif 000005
式中、n=1〜30であり、より好ましくはn=1〜20、最も好ましくはn=1-10であり、それらはヒドロキシ基によって、ペプチドの第１級アミノ基に結合可能である。活性化されたビニル性ヒドロキシ基は、反応性が酸無水物と同等である。従って、Dde、Ndeおよび関連する化合物は、非常に単純に結合され、活性連結試薬を必要としない。
【００５５】
さらに、固着部分を含有する、任意に保護されたペプチドの精製方法が提供され、該固着部分は、固体支持体、固体支持体に共有結合する金属キレート配位子、および該金属キレート配位子に対する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含む活性固相の配位部位に配位結合し、すすいで、保護基の残留物およびペプチド合成の捕捉剤または望まない副生物等の汚染物質を洗い流す。
【００５６】
本発明の別の好ましい態様は、即ち、N-末端に隣り合うアミノ酸の、最後の10個のうちの少なくとも１個、好ましくは最後の２個のうち少なくとも１個の側鎖に結合することによって、アミノ末端のNαかまたはN-末端側に近接して固着部分を有することによる、ペプチド合成の最終工程において結合するキレート基の使用である。この場合、汚染された副生物からの粗生成物の精製は、活性固相へのペプチドの配位結合を利用するクロマトグラフィーによって達成される。この原理は、それぞれの合成サイクルにおいて、遊離の非連結アミノ基の通常のエンド・キャッピングを用いることで適用することができる。この原理を適用する場合、粗生成物の精製は、一回のクロマトグラフィー操作で達成することができる。
【００５７】
脱着は、上述の通りの好適な競合試薬の添加によって、または、特に水性溶媒中、溶媒の酸性度を重大な程度まで、好ましくは少なくともpH6未満まで、より好ましくはpH5以下まで上げることによって、達成することができるが、この方法は、金属親和性樹脂から固着されたペプチドを脱着させる、別の簡潔な方法を提案する。
【００５８】
本発明に関連する別の有意点は、金属親和性樹脂がペプチド合成の後、再使用できることである。
【００５９】
さらなる目的は、上記で定義した通りの固体支持体に共有結合する、上記で定義した式Vのメチレン-アミノピリジン基、好ましくは上記の式IIで定義した通りのビス-ピコリルアミン部分、および前記金属キレート配位子に配位結合する金属イオンMn+であって、n=1〜3であるものを含む、活性固相または支持体の使用であって、該活性固相は、ペプチドの固着部分の配位および可逆的結合のため、固相ペプチド合成、ペプチドリフォールディング／凝集分解またはペプチド精製のための配位部位を提供する。上述の通りの、それぞれの定義および好ましい態様は、このような目的に同様に適用する。このような例において、式I  P-X-Lのペプチドの使用は、このような個別の目的と組み合わせて非常に好ましいが、勿論、リンカーまたは保護基Xを有する、厳格な必要性はない。従って、ペプチド部分上のキレート基Lの特徴について前述した全ては、式P-Lのペプチドに同様に関連すると理解されると考えられ、または、式中、例えばオリゴヒスチジンがペプチド配列中に存在する場合と同様に、Lは天然構造Pの不可欠の部分である。次に、イミダゾリル部分は、X、L部分の必要性がなく、従ってそれらを含まずに、ぺプチド部分P自体のキレート特性を、直接的に提供する。好ましくは、本発明のさらなる目的と併せて、ペプチド部分Pは、任意にN-末端を保護した少なくとも2つのイミダゾリル側鎖を、上記で定義したメチレンピリジル-アミンキレート配位子を含む固相または支持体と組み合わせて含む。
【００６０】
別の好ましい態様において、該P部分は、オリゴヒスチジンを含むか、または構成され得る上記したあらゆるキレート官能基Lを含有する非天然アミノ酸の短い（１〜６残基）配列を含む、P-L型の化合物であり、最も好ましくは非天然アミノ酸は側鎖にフェナントロリン部分を有し、間に少なくとも1つのさらなるアミノ酸を有し、ここでさらなるアミノ酸は、固体支持体へのキレート化を妨害しないかまたはキレート化に不活性であり、例えば、好ましくはグリシンである。また、好ましさは劣るが、いずれかの他の窒素含有基を用いることも可能である。
【００６１】
好ましくは、該オリゴヒスチジン部分は、近接しているかまたは２個以下のアミノ酸残基で隔たった、少なくとも２個を含み、より好ましくは６〜１０個のヒスチジン残基を含む。同じことが、ノル-またはホモ-ヒスチジン等の、アミノ酸を含むイミダゾリル側鎖に当てはまり、ここでホモ-ヒスチジンは、1〜10個の追加のメチレン基を含んでもよく、それらのいずれにイミダゾリル部分が結合してもよい。
【００６２】
別の好ましい態様において、該オリゴヒスチジン部分は、少なくとも2個の連続的L-またはD-ヒスチジン残基、より好ましくは6個のL-またはD-ヒスチジン残基の配列を含む。
【００６３】
本発明の目的のさらに特別好ましい態様において、ペプチドの固着部分の該モノ-またはオリゴマーアミノ酸は、少なくとも1個の、好ましくは1個から10個までの、5-アミノ-1,10-フェナントロリン部分または5-アミド-1,10-フェナントロリン部分を含有する。
【００６４】
本発明のメチレン-アミノピリジン樹脂との組み合わせにより、より好ましくは置換または非置換2-ピコリル樹脂との組み合わせにより、最も好ましくは本発明のビス-(2-ピコリルアミン)金属親和性樹脂との組み合わせにより、ペプチドは金属錯体によって固体支持体に、可逆性で、非共有結合で、なお非常に強力に結合され、同時に、固体支持体は、このような所与の連結内で、ペプチド上の固着（アンカリング）基と比べてより強力な金属キレート基を提供しなければならないという確固とした事実が順守される。「より強力なキレート化」とは、勿論、錯体安定度定数を参照するものである。
【００６５】
伸長ペプチド鎖を、繰り返し、活性固相から脱着し、活性固相に再結合することは可能である。好ましい態様において、脱着は、ペプチド合成の連結工程の間に達成され、再結合は、続く脱保護に先立つリンス工程の前に、反応混合物を希釈することによって誘導される。これらの工程を使用すると、特にフラグメント縮合法による大型ペプチド合成において、「一時的」液相合成およびその有利点を使用することが可能である。
【００６６】
固相へ共有結合させるが、最終の連結反応においてキレート基Lおよび固着部分L-Xをそれぞれ加える（例えば、Gly-フェナントロリン複合体）、CからN-末端への伝統的な方法でペプチドを合成することによるペプチド精製において、本発明の活性固相を使用することもさらに可能であり、活性化され、メチレン-ピリジル-アミン、特に本発明のピコリル-アミン型の固相をキレートする金属イオンに一時的に結合することにより、末端が未熟な鎖ではなく、全長のペプチド生成物のみが、樹脂からの開裂後に容易に精製され得る。
【実施例】
【００６７】
本発明をさらに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
略語           物質
DMF            N,N-ジメチルホルムアミド(ペプチド合成等級)
DCM            ジクロロメタン (ペプチド合成等級)
HOBT           1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(無水)
DBU            1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン、98%
PyBOP          ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウム-
ヘキサフルオロホスフェート
DIPEA          N-エチルジイソプロピルアミン、98+%
TIS            トリイソプロピルシラン、99% 
MeOH           メタノール HPLC (勾配等級)
TFE            2,2,2-トリフルオロエタノール、99.8%
EDT            エタンジチオール
注：「ジピコリル」という用語は、以下「ビスピコリル」と同義語として使用する。
【００６８】
実施例１：アミノ基の化学的開裂可能なTagの合成（N-TAGの例：10-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-10-ヒドロキシ-デカン酸[1,10]フェナントロリン-5-イルアミドヒドロアセテート(TAG18)）:
【化４】
2008520616.tif 000006
【００６９】
ａ）9-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-ノナン酸メチルエステルの合成
[1,10]フェナントロリン-5-イルアミン(9.94mmol, 1.94g)を250mlのピリジンに溶解した。9-クロロカルボニル-ノナン酸メチルエステル(12.36mmol, 2.67g)を滴下し、混合物を一晩攪拌した。ピリジンを真空蒸留で除去した。残渣をDCMに溶解し、残った固体を濾別し、有機相を飽和NaHCO3溶液で抽出した。Na2SO4で乾燥した後、溶媒を真空蒸留で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(MeOH/CHCl3 1:19)で精製した。
【００７０】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ [ppm]:
10.10 (s, 1H), 9.12 (dd, 1H, J=1.5Hz, J=4.2Hz), 9.03 (dd, 1H, J=1.6Hz, J=4.3Hz), 8.59 (dd, 1H, J=1.4Hz, J=8.4Hz), 8.45 (dd, 1H, J=1.6Hz, J=8.1Hz), 8.17 (s, 1H), 7.82 (dd, 1H, J=4.2Hz, J=8.4Hz), 7.74 (dd, 1H, J=4.3Hz, J=8.1Hz), 3.57 (s, 3H), 2.53 (t, 2H, J=7.4Hz), 2.29 (t, 2H, J=7.4Hz), 1.69 (q, 2H, J=7.1Hz), 1.53 (q, 2H, J=6.9Hz), 1.43-1.25 (m, 8H)
【００７１】
ｂ）9-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-ノナン酸の合成
9-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-ノナン酸メチルエステル(25mmol, 9.84g)およびKOH(25mmol)を150mlの1,4-ジオキサン/H2O=1:1中で数時間還流した。冷却後、NH4OAc(30mmol, 2.31g)を添加し、溶媒を除去する。残渣を15mM HClで洗浄し、P2O5で乾燥した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(MeOH/CHCl3=1:9→1:4)で精製した。
【００７２】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ [ppm]:
10.21 (s, 1H), 9.11 (dd, 1H, J=1.4Hz, J=4.2Hz), 9.02 (dd, 1H, J=1.5Hz, J=4.2Hz), 8.62 (dd, 1H, J=1.2Hz, J=8.4Hz), 8.44 (dd, 1H, J=1.5Hz, J=8.1Hz), 8.17 (s, 1H), 7.82 (dd, 1H, J=4.2Hz, J=8.4Hz), 7.73 (dd, 1H, J=4.3Hz, J=8.1Hz), 2.52 (t, 2H, J =7.7Hz), 2.13 (t, 2H, J=7.4Hz), 1.68 (q, 2H, J=7.1Hz), 1.48 (q, 2H, J=6.8Hz), 1.43-1.25 (m, 8H)
【００７３】
ｃ）10-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-10-ヒドロキシ-デカン酸 [1,10]フェナントロリン-5-イルアミドヒドロアセテートの合成
9-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-ノナン酸(18.45g, 7.00mmol)、4-ジメチルアミノピリジン(3.68mmol, 0.45g)、ジメドン(20.33mmol, 2.85g)、およびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドを、2日間、100mlのDMFに溶解する。溶媒を留去し、残渣をDCMに溶解した。N,N'-ジシクロヘキシル尿素を濾別し、溶媒を真空除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(MeOH/DCM/HOAc=1:19:+1%)で精製する。
【００７４】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ [ppm]:
18.24 (br s, 1H), 9.08 (m, 2H), 8.31 (m, 2H), 8.13 (m, 2H), 7.57 (m, 2H), 3.00 (t, J=7.4Hz, 2H), 2.55 (7.5Hz, 2H), 2.51 (s, 2H), 2.31 (s, 2H), 1.81 (m,2H), 1.61 (m,2H), 1.30-1.45 (m,8H), 1.03 (s, 6H)
HR-ESI-MS:
計算値: (C30H34N3O4):    500.25548
測定値:                  500.25523
【００７５】
実施例２〜５に、好適な−部分的に保護した−キレート基を含有し、実施例１ｃと同様に連結することができ、ジメドンに基づくN-末端TAGを形成する、有機化合物の合成を記載する。
【００７６】
実施例２：(ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-アミノ)-酢酸[TAG8b]の合成
ａ）(ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-アミノ)-酢酸ベンジルエステル[TAG8a]の合成
20mmolのグリシンベンジルエステル・p-トシル酸塩、40mmolのブロモ酢酸tert-ブチルエステルおよび60mmolのDIEAを、35mlの乾燥DMFに溶解する。反応混合物を4日間ボルテックスする。沈殿した塩を濾別し、溶液を250の酢酸エチルに溶解する。有機層を以下の溶液で抽出する：2x 200ml 1N NaOH、3x 1N NaOH/食塩水=1:1。溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を真空蒸留によって除去し、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1:4)で精製する。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm 7.42-7.29 (m, 5H), 5.10 (s, 2H), 3.60 (s, 2H), 3.50 (s, 4H), 1.38 (s, 18H); LC-MS (ESI): (M+H)+ = 394
【００７７】
ｂ）(ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-アミノ)-酢酸[TAG8b]の合成
17.5mmolの(ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-アミノ)-酢酸ベンジルエステルを75mlのTHFに溶解し、触媒のパラジウム／10%−炭素0.70gを加える。反応器を水素で数回フラッシュし、水素の消費が止まるまで反応混合物を水素下で攪拌する。触媒をセライトで濾別し、溶媒を真空除去する。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm, 12.2 (br s, 1H), 3.46 (s, 2H), 3.44 (s, 4H), 1.40 (s, 18H); LC-MS (ESI): (M+H)+ = 304
【００７８】
実施例４：Fmoc-Gly-5-アミノ-1,10-フェナントロリン (TAG5)の合成
2mlのDIEA、6mmolのCl-HOBtおよび12mmolのDICを、最低限のDMF中の2.56mmolのFmoc-Gly-OH溶液に添加する。この溶液を5分間ボルテックスし、最低限のDMF中の0.5gの5-アミノ-1,10-フェナントロリンを添加する。混合物を12時間インキュベートし、5倍容量の酢酸エチルで希釈する。溶液を炭酸水素ナトリウムで3回洗浄する。粗生成物を沈殿させ、濾別し、カラムクロマトグラフィーまたはLCMSで精製する。粗ペプチドをDMSOに溶解し、1000μlをクロマシル(Kromasil)RP C18カラムを用いたギルソン・ネブラ(Gilson Nebula)LCMSシステムで精製した。直線的勾配は、50分間で、5％TFA水溶液から50％アセトニトリル（0.085% TFA含有）であった。流速は20mL/分であり、吸光度は214nmでモニターした。
【００７９】
実施例５：4-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-酪酸[TAG12b]の合成
ａ）4-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-酪酸メチルエステル[TAG12a]の合成
アルゴン雰囲気中、5mmolの5-アミノ-[1,10]-フェナントロリンを25mlの乾燥DMFに溶解する。6.5mmolのDIEAを添加し、5.5mmolの4-クロロカルボニル-酪酸メチルエステルを滴下する。1時間攪拌した後、溶媒および過剰の塩基を真空蒸留で除去する。粗生成物を、逆相カラムクロマトグラフィー（メルク・ローバー(Merck Lobar)RP18カラム、溶離液：アセトニトリル／炭酸水素アンモニウム、5重量%、勾配：20%→40%）で精製する。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm 10.11 (s, 1H), 9.13 (dd, J=1.6, 4.3 Hz, 1H), 9.03 (dd, J=1.7, 4.3 Hz, 1H), 8.60 (dd, J=1.6, 8.4 Hz, 1H), 8.44 (dd, J=1.7, 8.2 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.82 (dd, J=4.2, 8.4 Hz, 1H), 7.74 (dd, J=4.3, 8.1 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 2.59 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.46 (t, J=7.4 Hz, 2H), 1.95 (p, J=7.3Hz, 2H); LC-MS (ESI): (M+H)+ = 324
【００８０】
ｂ）4-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-酪酸[TAG12b]の合成
1.5mmolの4-([1,10]フェナントロリン-5-イルカルバモイル)-酪酸メチルエステルを15mlの1,4-ジオキサンおよび15mlの蒸留水に溶解する。1.5mlの1N水酸化カリウム溶液を添加し、溶液を1時間還流する。溶媒を真空蒸留で除去し、粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（メルク・ローバー(Merck Lobar)RP18カラム、溶離液：アセトニトリル／トリフルオロ酢酸、1重量%、勾配：10%→20%）で精製する。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) as K salt: ppm 9.11 (dd, J=1.6, 4.3 Hz, 1H), 9.04 (dd, J=1.6, 4.4 Hz, 1H), 8.65 (dd, J=1.5, 8.4 Hz, 1H), 8.41 (dd, J=1.6, 8.1 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.82 (dd, J=4.4, 8.4 Hz, 1H), 7.74 (dd, J=4.4, 8.1 Hz, 1H), 2.64 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.36 (t, J=7.2 Hz, 2H), 2.10 (q, J=7.5 Hz, 2H) ); LC-MS (ESI): (M+H)+ = 310
【００８１】
さらに、グルタル酸以外のジカルボン酸誘導体を含むタグは、ここで記載したプロトコルと同様に製造することができる。
【００８２】
実施例６：ペプチドのN-末端への10-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)-10-ヒドロキシ-デカン酸 [1,10]フェナントロリン-5-イル-アミド[Tag18]の連結：
Tag18-STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN-CO-NH2
ペプチドを、標準的方法に従ってリンク(Rink)-アミド樹脂(0.2mmol)上で製造した。ピペリジン/DMF=1:4で最後のアミノ酸のFmocを脱保護した後、樹脂をそれぞれ20mlのDMFで6回洗浄した。Tag18*HOAc(0.56g, 1mmol)の20mlのDMF中の溶液およびTFA1滴を樹脂に添加し、混合物を2日間振とうした。溶液を濾過し、樹脂をDMFで6回洗浄し、その後DCMで2回洗浄し、真空で乾燥した。粗ペプチドの開裂は、不活性雰囲気下、5mlのTFA/TIS/EDT/H2O(94/1/2.5/2.5)で120分間処理することによって達成される。この溶液を40mlの冷エーテル中に濾過する。沈殿をアセトニトリル／水(1/1)に溶解し、凍結乾燥する。
TAG18のペプチドへの連結の成功は、ネブラ(Nebula)-LCMS-システム(ギルソン(Gilson))で確認した。
【００８３】
ESI-MS:
計算値: ([M+3H]3+): 1120.6
測定値:             1120.7
【００８４】
2008520616.tif 000007
【００８５】
実施例７：Tag18-STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN-CO-NH2の金属アフィニティー精製およびその後のTagのペプチド：H-STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN-CO-NH2からの化学的開裂
実施例３で得られた粗生成物をAktaFPLCシステムで精製した：
30mgの粗生成物ペプチドを、9mlのACN/iPrOH/H2O=5:4:1 + 1% DIEA + 5mM NMIに溶解し、約5.6mlのNi-負荷ビスピコリル-アミノプロピルシリカ樹脂を充填したカラムに注入した。カラムを70mlのACN/iPrOH/H2O=5:4:1 + 1% DIEA + 5mM NMIおよび60mlのACN/H2O=1:1で洗浄し、生成物を60mlのACN/H2O=1:1 + 1% 1,3-ジアミノプロパンで溶出した。
生成物含有画分を１つにし、2.5%ヒドラジン水和物を添加し、溶液を室温で30分間振とうし、凍結乾燥した。ネブラ(Nebula)-RP-LCMS-システム（ギルソン(Gilson)）での分析により、遊離ペプチドH-STKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINN-CO-NH2の質量シグナルが単独で示された。遊離体についてはUVも質量シグナルも検出できなかった。
【００８６】
計算値: ([M+3H]3+): 959.5
測定値:             959.5.
【００８７】
2008520616.tif 000008
【００８８】
実施例８：ジピコリル-アミノプロピル-CLEAR-Base樹脂
1gのCLEAR-Base(HCl)樹脂（ペプタイズ・インターナショナル(Peptides International)）0,77mmol/gを20mlのDMFおよび132μlのDIEA中で20分間膨張させた。樹脂を吸引濾過し、1,964g(3,77mmol)のPyBop、520mg(3,85mmol)のHOBtおよび1,3ml(7,7mmol)のDIEAで活性化した、589mg(3,85mmol)の3-ブロモプロピオン酸の10mlのDMF中の溶液を添加した。2時間攪拌した後、樹脂を濾過し、DMF、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄した。樹脂を真空乾燥した。
【００８９】
30mlのトルエン中の、先に製造した1gの(ブロモプロピル-アミノメチル)-Clear樹脂に、164,4μlのジピコリル-アミン(0,914μmol)を添加し、反応混合物を5時間還流した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン、メタノール、水、メタノールで洗浄し、乾燥した。
【００９０】
実施例９：[(ジ-2-ピコリルアミノ)-プロピル]-アミノメチル-ポリスチレン
10mlのDMFに溶解した5当量の3-ブロモプロピオン酸(1,492g)を、4,971gのPyBop、1,316gのHOBtおよび3,3ml(19,5mmol)のDIEAを用いて1g(1,95mmol)の(アミノメチル)ポリスチレン樹脂150-300μmと連結した。12時間後、樹脂を濾別し、DMF、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄した。樹脂を真空乾燥した。
30mlのトルエン中の1gの(ブロモプロピル-アミノメチル)ポリスチレン樹脂に、164,4μlのジ-(ピコリル)アミン(0,914μmol)を添加し、反応混合物を5時間還流した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン、メタノール、水、メタノールで洗浄し、乾燥した。
【００９１】
実施例１０：ジ-2-ピコリル-アミノプロピル-シリカ
（実施例７で使用される通り）
1gの3-クロロプロピル-シリカ(3,2% Cl = 0,914mmol/g 230-400メッシュ)を30mlのトルエン中に懸濁し、164,4μlのジ-(ピコリル)アミン(0,914μmol)を添加し、反応混合物を5時間還流した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン、メタノール、水、メタノールで洗浄し、乾燥した。
【００９２】
ニッケルイオンの負荷：
pH2.5の0.1mクエン酸ナトリウム緩衝液中の樹脂のスラリーを、同一の緩衝液中の0,1m NiCl2溶液で飽和するまで平衡化および処理した小さなカラム(1,7ml)に充填した。過剰のニッケルは、緩衝液、およびこの緩衝液中の10mMのN-メチルイミダゾールおよび10mM EDTAの溶液で洗浄して除去した。
【００９３】
(ビス-tert-ブトキシカルボニルメチル-アミノ)-酢酸、TAG8の結合
カラムをアセトニトリル:50mM MES pH6,4=1:1で平衡化した。2mgのTAG8をこの溶液に溶解して注入した。TAG8は樹脂に結合した。
【００９４】
TAG8装飾ペプチドの結合：上記の結合実験を、同一条件下で繰り返すが、国際的な脱保護の後の脱保護されたTAG8を含む、完全に脱保護したペプチドを用いて行い、即ち、樹脂に負荷し結合する化合物をN,N'-ジアセチル-2-アミノ-酢酸[ペプチジル-Nα-10-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソ-シクロヘキシリデン)]-デカニルエステルとして行う。TAG8-ペプチドが樹脂に結合する。
【００９５】
実施例１１：Tag18-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-NH2の合成および精製
合成
合成には、オディッセイ・マイクロウェーブ・ペプチド・シンセサイザー(Odyssey Microwave Peptide Synthesizer)(CEM)を用いた。要すれば(S,T,Y,C,H,K)、通常使用される保護基（トリチル、tert-ブチル、Boc等）を用いて、1つのFmocで保護したアミノ酸を添加した。
【００９６】
樹脂：
・リンク(Rink)アミド樹脂(ポリマー・ラボラトリーズ(polymer laboratories))0.4mmol/g, 樹脂0.625g(0.25mmol)
試薬：
・4当量  アミノ酸誘導体（DMF中、0.2mmol/mlの溶液5ml）
・DMF中、4当量のPyBOP、3mlのDMF中、6当量のHOBt
・2mlのNMP中、4当量のDIEA
FMOC脱保護：
・DMF中、20%ピペリジン10ml
最後のFmoc脱保護工程の後、樹脂（ペプチドがなお結合している）を100mlの丸底フラスコ中に移し、DMFで数回洗浄し、吸引して「乾燥」した。
【００９７】
Tag18c*HOAcのペプチドN-末端への連結（ペプチドT18）
0.72gのTag18c*HOAc(1.28mmol, 5当量)を50mlのDMFに溶解し、240μlのDIEA（1.45mmol, 1.1当量）を添加した。この溶液の「pH値」は、pH指示紙「トリテスト(Tritest)」（カール・ロス(Carl Roth)）により約７と測定した。この溶液を樹脂（DMFで湿らせたもの）に添加し、室温で48時間振とうした。
【００９８】
ペプチドの樹脂からの開裂および脱保護
樹脂をDMFで５回、その後DCMで５回洗浄した。10mlの開裂混合物（94%TFA、1.0%トリイソプロピルシラン(TIS)、2.5%水、2.5% 3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール(DODT)）を添加し、２時間振とうした。振とうを停止する10分前に、さらに100μlのTISを添加した。
混合物を濾過し、濾液を40mlの冷tert-ブチルメチルエーテル(TBME)に滴下してペプチドを沈殿させた。混合物を遠心分離し、沈殿したペプチドをACN/H2Oに溶解し、凍結乾燥した。
粗生成物の収量：440mg
【００９９】
表２＋３：粗ペプチドT18のHPLC-UV/MSクロマトグラム
2008520616.tif 000009
標識したペプチドである、ペプチドT18のUV吸収のピークは、他の全てのシグナルを上回る。他の３つのピークは、質量分析計でシグナルをアサインすることができる（以下参照）。
【０１００】
ＨＰＬＣ−ＭＳ
2008520616.tif 000010
【０１０１】
時間   質量（検出されたイオン）            解釈
26.19  2155.4 (719.5/1078.7)            ペプチド
32.23  2638.5 (660.6/880.5/1320.4)      ペプチドT18
33.77  2694.9 (899.3)                   +56: tBu付加体
35.35  2694.9 (899.3)                   +56: tBu付加体
ＭＳシグナルの強度の相関は約１〜９である。このことは、Tag18のペプチドへの連結の収率が約90％であったことを示す。
【０１０２】
ＣＦＰＳ精製
粗ペプチドをNiNTA樹脂に結合させ、カラム中、非標識化合物を洗い流し、その後バッチでのヒドラジン分解実験によるタグの開裂によって、ＣＦＰＳ精製を実施した。
溶媒／緩衝液：
ACN/H2O=1:1
蒸留水1部をACN1部と混合し、超音波で10分間、さらに溶媒中にアルゴンを10分間バブリングして脱気した。
ACN/MES=1:1
50mmolの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸一水和物（MES）を蒸留水に溶解し、33mlの1N NaOH溶液を添加した。水を加えて、溶液の総容量が１ｌになるように希釈した（pH=6.8、ガラス電極）。緩衝液1部をACN1部と混合し、超音波で10分間、さらに溶媒中にアルゴンを10分間バブリングして脱気した。
カラム
5.6mlのオムニフィット(Omnifit)カラム（スペルコ(Supelco)）に、Ni-NTA His-結合樹脂（メルク・バイオサイエンシーズ(Merck Biosciences)を充填し、ACN/MES=1:1で平衡化した。
CFPS精製
41.35mgの粗ペプチドを、約7mlのACN/MES=1:1に溶解した。わずかに濁った溶液を手作業でカラムに注入した（クロマトグラム中に示さず、以下参照）。
流速5ml/分で、カラムを、30mlのACN/MES=1:1、ACN/MES=1:1からACN/H2O=1:1への勾配溶液30ml、および伝導度が0mS/cmになるまで(11.6ml)、ACN/H2O= 1:1で洗浄した。
【０１０３】
表４：粗ペプチドT18のCFPS精製の溶出データ
2008520616.tif 000011
（7mlのサンプルの手作業での注入は示さず）
かなり小さい注入ピークは、洗浄によって非標識化合物が除去されたことを示す。
【０１０４】
ヒドラジン分解によるTag18の開裂
樹脂を50mlのファルコンチューブに移し、6mlのACN/H2O=1:1および600μlのヒドラジン水和物を添加し、1時間振とうした。6mlのACN/H2O=1:1を添加し、樹脂を濾別し、12mlの水で洗浄した。濾液を凍結乾燥し、ACNおよび水に再溶解し、二度目の凍結乾燥をした。
収量：18.2mg
【０１０５】
膜分離による低分子化合物の除去
分子量分画500g/molの酢酸セルロース膜を備えた攪拌セルモデル8400（アミコン/ミリポア(Amicon/Millipore)）を使用して、低分子化合物を膜分離によって除去した（アミコンYC05限外濾過ディスク、酢酸セルロース、500NMWL、76mm、ミリポア）。
14.4mgのCFPS精製したペプチドを、1mlのACNおよび1mlのACN/H2O/TFA=1:9:0.1%に溶解した。この溶液をACN/H2O=5:95で総容量が50mlになるまで希釈した。この溶液を膜を備えた攪拌セルに移した。
3バールの圧力下（アルゴン）、溶液を200mlのACN/H2O=5:95（即ち、4倍容量）で6時間、膜分離した。残留物(retendate)を2回凍結乾燥した。
収量：8.9mg
【０１０６】
表５＋６：HPLC-UV/MSクロマトグラム
2008520616.tif 000012
HPLC-MS
2008520616.tif 000013
【０１０７】
時間   質量（検出されたイオン）            解釈
30.52  2187.4 (730.0/1094.7)              +28 g/mol
31.20  2155.4 (719.5/1078.7)              BB57
31.72  2168.4 (723.7/1085.2)              +14 g/mol
32.16  2153.2 (718.8/1077.6)              -2 g/mol: ジスルフィド
33.26  2210.2 (737.7/1106.1)              +56 g/mol: tBu付加体
34.94  2211.4 (738.1/1106.7)              +56 g/mol: tBu付加体
37.03  841                                同定されず
（保持時間は、技術的理由により、上記のLC-MSより+5.00分異なる）
【０１０８】
TAG18を有するペプチドは検出されない（UV、MS共）。UVのピークは全てMSシグナルに対応する。また、37.03分のピークは不確定である。他のTag分解産物は、UVまたはMSで検出されない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、ビス-2-ピコリル配位子およびキレートされた銅イオンを含む、活性固相の一例であり、銅イオンには、5-アミド-1,10-フェナントロリン金属キレート基ＬによってペプチドＰ−Ｘ−Ｌが結合する。
【図１】
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【国際調査報告】
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