(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）：    【化１】2008523141.tif 000074を有する、γ−セクレターゼ酵素の特徴付け、検出、位置確認および単離に有用な新規の分子プローブに関する。
2008523141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008523141.tif 000068
［式中：
Ｒ1は、ｍ−ベンゾイル、ｐ−ベンゾイル、または、ｐ−アジドから選択され；
Ｒ2は、独立して、Ｈ、−ＣＨ3、
【化２】
2008523141.tif 000069
から選択され；
Ｒ3は、独立して、Ｈ、または、
【化３】
2008523141.tif 000070
から選択され、
ここにおいて、ｎは２または３であり、そして、Ｒ4は、
【化４】
2008523141.tif 000071
から選択される］
で示される化合物。
【請求項２】
【化５】
2008523141.tif 000072
【化６】
2008523141.tif 000073
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下：
Ｎ−［５−（｛［（２Ｒ,３Ｒ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−２−フェニル−３,４−ジヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−５（２Ｈ）−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−［（２Ｒ,３Ｒ）−５−（２−オキソ−２−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］アミノ｝エチル）−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル］−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−［５−（｛［（２Ｓ,３Ｓ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−２−フェニル−３,４−ジヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−５（２Ｈ）−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−［（２Ｓ,３Ｓ）−５−（２−オキソ−２−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］アミノ｝エチル）−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル］−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−（５−｛［（２Ｒ,３Ｒ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−５−メチル−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−７−イル］オキシ｝ペンチル）−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−（（２Ｒ,３Ｒ）−５−メチル−７−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］オキシ｝−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル）−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−（５−｛［（２Ｓ,３Ｓ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−５−メチル−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−７−イル］オキシ｝ペンチル）−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−（（２Ｓ,３Ｓ）−５−メチル−７−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］オキシ｝−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル）−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−セクレターゼ酵素の検出、特徴付け、位置確認および単離に有用な新規の分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）とは、進行性の神経変性疾患であり、臨床的には、進行性の記憶喪失、認知、推理、判断および情緒の安定性を特徴とする。ＡＤは、ヒトにおける認知症の共通の原因であり、さらに米国では主要な死因の一つである。ＡＤは、世界中の人種や民族で観察されており、世界中で公衆衛生に関する主要問題となっている。現在のところ、ＡＤを効果的に予防する、または、臨床症状を回復させるような治療や根本的な病態生理学はわかっておらず、現在のところ、この病気は、専門家の間では治療不能とみなされている。
【０００３】
ＡＤの病理組織学的所見は、アミロイドプラーク（または老人斑）や神経原線維変化として知られている特徴的な病変であり、これらは、記憶、推理および認知に関連する脳の領域に見出される。トリソミー２１（ダウン症候群）、および、オランダ型のアミロイド症を伴う遺伝性の脳内出血を患っている患者においても、同様の変化が観察される。
【０００４】
アミロイドプラークの主成分は、アミロイドβタンパク質である。アミロイドβタンパク質は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解的切断から誘導される。ＡＰＰのアミロイドβタンパク質やその他のＡＰＰフラグメントへのプロセシングは、セクレターゼとして知られている酵素群に支配されている。セクレターゼの一種であるγ−セクレターゼは、タンパク質を切断してアミロイドβタンパク質を生産することに関与する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでは、γ−セクレターゼ複合体の性質は、部分的にしか特徴付けられていない。これは、少なくとも４種のタンパク質：プレセニリン１（ＰＳ１）（これは、全長ポリペプチドの細胞内タンパク質分解によって生成する、ＮおよびＣ末端フラグメントのヘテロ二量体として生じる）、ニカストリン、ＡＰＨ−１、および、ＰＥＮ−２の複合体と考えられている。現在のところ、γ−セクレターゼ酵素の生化学的な同一性の研究に有用な、信頼でき、かつ強健な分子プローブを開発し、さらに、酵素複合体内での相互作用を特徴付ける必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願人は、γ−セクレターゼ酵素の分子メカニズムを解明するのに有用な新規の分子プローブを開発することによってこの必要性を満たした。
【０００７】
発明の説明
従って、本発明の第一の実施態様において、式Ｉで示される化合物が提供される：
【化１】
2008523141.tif 000003
【０００８】
式中：
Ｒ1は、ｍ−ベンゾイル、ｐ−ベンゾイル、または、ｐ−アジドから選択され；
Ｒ2は、独立して、Ｈ、−ＣＨ3、
【化２】
2008523141.tif 000004
から選択され、
Ｒ3は、独立して、Ｈ、または、
【化３】
2008523141.tif 000005
から選択され、ここにおいて、ｎは、２または３であり；および、Ｒ4は：
【化４】
2008523141.tif 000006
から選択される。
【０００９】
本発明のその他の実施態様において、化合物は、以下から選択される：
【化５】
2008523141.tif 000007
【化６】
2008523141.tif 000008
【００１０】
本発明のその他の実施態様において、化合物は、以下から選択される：
Ｎ−［５−（｛［（２Ｒ,３Ｒ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−２−フェニル−３,４−ジヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−５（２Ｈ）−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−［（２Ｒ,３Ｒ）−５−（２−オキソ−２−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］アミノ｝エチル）−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル］−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−［５−（｛［（２Ｓ,３Ｓ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−２−フェニル−３,４−ジヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−５（２Ｈ）−イル］アセチル｝アミノ）ペンチル］−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−［（２Ｓ,３Ｓ）−５−（２−オキソ−２−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］アミノ｝エチル）−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル］−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−（５−｛［（２Ｒ,３Ｒ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−５−メチル−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−７−イル］オキシ｝ペンチル）−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−（（２Ｒ,３Ｒ）−５−メチル−７−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］オキシ｝−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル）−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド；
Ｎ−（５−｛［（２Ｓ,３Ｓ）−３−（｛Ｎ−［（３−ベンゾイルフェニル）アセチル
］−Ｌ−アラニル｝アミノ）−５−メチル−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−７−イル］オキシ｝ペンチル）−４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタンアミド；
Ｎ1−（（２Ｓ,３Ｓ）−５−メチル−７−｛［５−（｛４−［（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル］ブタノイル｝アミノ）ペンチル］オキシ｝−２−フェニル−２,３,４,５−テトラヒドロ−１,５−ベンゾキシアゼピン−３−イル）−Ｎ2−［（４−トリアザ−１,２−ジエン−２−イウム−１−イルフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニンアミド。
【００１１】
この章に記載の定義は、本願において用いられる用語を明確にすることを目的とする。用語「本明細書において」は、出願全体を意味する。
【００１２】
化合物に関するあらゆる成分または式において、いずれかの変数（例えば、Ｒ1、Ｒ7、Ｒa、Ｒeなど）が２回以上出現する場合、それぞれの出現におけるその定義は、一つ一つの出現ごとに独立して定義される。従って、例えば、ある基が０〜３個のＲ1で置換されていることが示されている場合、前記基は、場合により０、１、２または３個のＲ1基で置換される可能性があり、さらに、それぞれの出現ごとのＲeは、独立して、Ｒeの定義から選択される。また、置換基および／または変数の組み合わせは、そのような組み合わせによって安定な化合物が生じる場合にのみ許容できる。
【００１３】
本明細書で説明されている化合物は、不斉中心を有していてもよい。非対称的に置換された原子を含む本発明の化合物は、光学的に活性な形態、または、ラセミ体の形態で単離してもよい。光学的に活性の形態をどのように製造するかは当業界周知であり、例えば、ラセミ体の形態の分解、または、光学的に活性な出発原料からの合成によってなされる。必要な場合、ラセミ体材料の分離は、当業界既知の方法によって達成できる。また、本明細書で説明されている化合物には、様々なオレフィンの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合などが存在していてもよく、このような安定な異性体はいずれも本発明で考慮される。本発明の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が説明されており、異性体の混合物として、または、分離した異性体の形態として単離してもよい。特定の立体化学的または異性体の形態が具体的に既定されていない限り、全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ体の形態、および、全ての構造の幾何異性体の形態を対象とする。
【００１４】
置換基への結合が、環中の２個の原子を連結する結合と交差するように記載されている場合、このような置換基は、環のどの原子に結合していてもよい。置換基が、提示された式で示される化合物中の原子を介して、その化合物の残りの部分に結合している場合で、このような置換基が、その原子を示さないで列挙されている場合、このような置換基は、このような置換基中のどの原子を介して結合していてもよい。置換基および／または変数の組み合わせは、そのような組み合わせによって安定な化合物が生じる場合にのみ許容できる。
【００１５】
本発明の化合物は、有機合成に関する当業者周知の多数の方法で製造することができる。本発明の化合物は、以下で説明されている方法を、合成有機化学に関する当業界既知の合成方法、または、当業者によって認められているようなそれらの改変法と共に用いて合成することができる。このような方法としては、これらに限定されないが、以下で説明されている方法が挙げられる。本明細書で引用された全ての参考文献は、それらの全体を参照により本発明に含める。
【００１６】
本発明の新規の化合物は、本願で説明されている反応および技術を用いて製造してもよい。この反応は、用いられる試薬および材料に適切な溶媒中で行われ、実行される変換に適している。また、以下で説明される合成方法の説明においても当然ながら、溶媒の選択、反応の雰囲気、反応温度、実験時間、および、後処理法などの提唱される全ての反応条件は、その反応に標準的な条件になるように選択され、これらは、当業者によって容易に認識されると予想される。有機合成の当業者であれば当然と思われるが、上記分子の様々な部分に存在する官能性は、提唱されている試薬および反応に適していなければならない。このような反応条件に適する置換基への制限は当業者には容易に理解できると思われ、その場合は、その代わりの方法を用いなければならない。
【００１７】
以下の実施例で、本発明を説明する（ただしこれらに限定されない）。
【００１８】
略語
溶媒／試薬の略語：
ＤＣＭ      ジクロロメタン
ＨＡＴＵ    Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＡＯＰ  ｛７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ    ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｅｎｅｔｒｉａｚｏｌｅ）
Ｅｔ3Ｎ     トリエチルアミン
ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ    ジイソプロピルエチルアミン
ＮＭＭ      Ｎ−メチルモルホリン
ＭｅＣＮ    アセトニトリル
ＤＭＦ      Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
Ｅｔ2Ｏ     ジエチルエーテル
ＴＨＦ      テトラヒドロフラン
ＴＦＡ      トリフルオロ酢酸
ＢＯＣ      Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＢＺ      カルボベンジルオキシ
ＤＢＵ      １,８−ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデカ−７−エン
ＤＩＥＡ    Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＡＣ−ＨＣｌ    １−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＮＭＭ  ”は、Ｎ−メチルモルホリンを意味する
ｐ−ＴＳＡ  ｐ−トルエンスルホン酸
ＴＢＡＢ    臭化テトラブチルアンモニウム
エーテル    エチルエーテル
Ｔｏｓ−Ｃｌ    塩化ｐ−トルエンスルホニル
「ｍｉｎ」は分を意味し；「ｈ」は時間を意味し；「ＲＴ」は、室温を意味する。
【実施例】
【００１９】
実験手法
特に他の注記がない限り、有機溶液は、無水硫酸ナトリウム上で「乾燥させた」。
【００２０】
ＨＰＬＣの方法Ａ：フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）のルナ（Ｌｕｎａ）３μＣ１８（２）、４.６×７５ｍｍのカラム。溶媒：Ａ＝０.１％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速は２.０ｍＬ／分。０.５分まで２０％Ｂ、次に、３分で９５％Ｂまで直線的な濃度勾配。９５％Ｂで６分まで維持。
【００２１】
ＨＰＬＣの方法Ｂ：フェノメネックスのルナ３μＣ１８（２）、４.６×７５ｍｍのカラム。溶媒：Ａ＝０.１％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速は２.０ｍＬ／分。５分で１０％〜９５％Ｂの直線的な濃度勾配。７分まで９５％Ｂで維持。
【００２２】
ＨＰＬＣの方法Ｃ：５μＳＢ−Ｃ８カラム２.１ｍｍ×５ｃｍ。溶媒：Ａ＝０.０５％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝１０％Ｈ2Ｏ、９０％アセトニトリル、０.０５％ＴＦＡ。流速は１.４ｍＬ／分。勾配：（５分かけて５〜９０％Ｂ、９０％Ｂで２分間維持）。
【００２３】
ＨＰＬＣの方法Ｄ：アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）のゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）５μＳＢ−Ｃ８カラム２.１ｍｍ×５ｃｍ。溶媒：Ａ＝０.１％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝０.１％ＴＦＡを含むアセトニトリル。流速は１.４ｍＬ／分。３分で９％〜８１％Ｂの直線的な濃度勾配。続いて、９５％Ｂまで４分で直線的な濃度勾配。４.５分まで９５％Ｂを維持。
【００２４】
ＨＰＬＣの方法Ｅ：アジレントのゾルバックス５μＳＢ−Ｃ８カラム２.１ｍｍ×５ｃｍ。溶媒：Ａ＝０.０５％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝９０％アセトニトリル、１０％水、０.０５％ＴＦＡ。流速は１.４ｍＬ／分。１２分以内で１５％〜９０％Ｂの直線的な濃度勾配。
【００２５】
ＬＣ／ＭＳ：ＨＰＬＣの方法：アジレントのゾルバックス５μＳＢ−Ｃ８カラム２.１ｍｍ×５ｃｍ。溶媒：Ａ＝０.０５％のＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝１０％Ｈ2Ｏ、９０％アセトニトリル、０.０５％ＴＦＡ。勾配：３分かけて１０〜９０％Ｂ、４分間９０％Ｂで保持、５分で１０％Ｂ、６分まで１０％Ｂで保持）。
【００２６】
フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｆｃｃ＝フラッシュカラムクロマトグラフィー）は、１０グラムの充填済みポリプロピレンカートリッジ（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）部品番号５７１３４Ａ）を用いて行い、これは、特に他の注記がない限り、ＤＣＭ：ＭｅＯＨの段階的な勾配（溶出液−ＤＣＭから開始し、その後、ＭｅＯＨを、１００：１、続いて５０：１、続いて２０：１の割合で添加）を利用した。
【００２７】
ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）の分取用クロマトグラフィーシステムを用いて、分取用逆相液体クロマトグラフィー−調査サンプルを精製した*。ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）のＣｏｍｂｉＨＴ  ＳＢ−Ｃ１８半分取用カラム（５μｍ,２１.２ｍｍ×１５０ｍｍ；部品番号８７０１５０〜９０２  ＫＪ１０１８）、または、Ｍｏｄｃｏｌ  Ｃ１８分取用カラム（１０μｍ,５０.８ｍｍ×２５０ｍｍ；部品番号ＰＡ０００〜０５００２５）のいずれかを用いて、サンプルを精製した。流速；半分取用カラム（２０ｍＬ／分）、分取用カラム（５０〜８０ｍＬ／分）。溶出液は、ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ改変ｗ／０.１％ＴＦＡの混合物からなる。
【００２８】
典型的な順序は以下の通りに構成される：
ａ）平衡（開始時の勾配濃度で３分間）、
ｂ）勾配（４０〜５０％ＭｅＣＮで開始し、７〜１５分間かけて９０％ＭｅＣＮまで流した）、
ｃ）フラッシング（９０％ＭｅＣＮで５分間）。
【００２９】
＊  アミンが存在する場合、生成物を、精製の後に遊離塩基に変換した（特に他の注記がない限り）。残留したＴＦＡを除去するために、精製産物を２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液に溶解させ、ＤＣＭで抽出した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。生成物を、高真空下で１８時間ポンプで吸引した。
【００３０】
ＬＣ／ＭＳ：ＨＰＬＣの方法：アジレントのゾルバックス５μＳＢ−Ｃ８カラム（２.１ｍｍ×５ｃｍ）。溶媒：Ａ＝０.０５％ＴＦＡを含むＨ2Ｏ、Ｂ＝１０％Ｈ2Ｏ、９０％アセトニトリル、０.０５％ＴＦＡ。勾配：３分間かけて１０〜９０％Ｂ、９０％Ｂで４分間保持、５分で１０％Ｂ、１０％Ｂで６分まで保持）。分子状のイオンはＭ＋とするか、または、別の方法で表記した。ＬＣ／ＭＳ保持時間（分）は、各化合物に関する実験の章の最後に、特徴を示すデータの一部として示す。
【００３１】
分子プローブ
【化７】
2008523141.tif 000009
実施例１：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−ａｚａ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（１）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の、５−（（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタン酸（５−｛２−［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−アセチルアミノ｝−ペンチル）−アミド（１ｈ）（６６ｍｇ，０.０９６ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、Ｎ2下で、ｍ−ベンゾイルフェニル酢酸（Ｊ．Ａ．Ｚｄｅｒｉｃ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.，１９６１，２６，１６３５で説明されている手順に類似した手順を用いて、ｍ−メチルベンゾフェノンから製造された）（２４ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１９ｍｇ，０.１４０ｍｍｏｌ）、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（４０μＬ，０.２３０ｍｍｏｌ）、および、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（２７ｍｇ，０.１４１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で一晩撹拌し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、次に、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液、Ｈ2Ｏ（３×２０ｍＬ）およびブラインで抽出した。この有機溶液を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させた。残留物を、分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、４６ｍｇ（５２％）のオフホワイト色の固体を得た。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 8.06 - 7.03(m, 18H), 5.63(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.21 - 5.09(m, 1H), 4.65および4.38(AB, J = 16 Hz, 2H), 4.45(dd, J = 7.7, 4.7 Hz, 1H),
4.26(dd, J = 7.9, 4.4 Hz, 1H), 4.21(q, J = 6.9 Hz, 1H), 3.55(s, 2H), 3.26 - 3.04(m, 5H), 2.89(dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.15(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81 - 1.25(m, 12H), 1.20(d, J = 7.2 Hz, 3H). MS APCI, m/z = 916(M+). LC/MS: 2.33分. HRMS(TOF ES+)計算値：C50H57N7O8S(M+H)916.4067, 実測値：916.4061。
【００３２】
出発原料（１ｈ）を以下のように製造した：
【００３３】
【化８】
2008523141.tif 000010
（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン塩酸塩（１ａ）
特許ＡＺ  ＷＯ２００４０３１１５４Ａ１で説明されたようにして製造した。
【００３４】
【化９】
2008523141.tif 000011
（（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｂ）
０℃に冷却したＤＣＭ（４０ｍＬ）中の（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（１ａ）（７４５ｍｇ，２.５６ｍｍｏｌ）のスラリーに、Ｅｔ3Ｎ（７２０μＬ，５.１７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（５６０ｍｇ，２.５６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応液を周囲温度で一晩撹拌し、６０ｍＬのＤＣＭで希釈し、Ｈ2Ｏ（２×５０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液およびブラインで抽出した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、溶媒を真空中で除去し、固体を得た（８７０ｍｇ，９６％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.57(s, 1H), 7.49 - 7.31(m, 4H), 7.31 - 7.11(m, 4H), 7.09 - 7.01(m, 1H), 5.76(d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.01(t, J = 7.3 Hz, 1H), 4.94(d,
J = 7.7 Hz, 1H), 1.39(s, 9H); MS ES+, m/z = 377(M+Na+). LC/MS: 2.34分。
【００３５】
【化１０】
2008523141.tif 000012
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１ｃ）
（（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｂ）（３４９ｍｇ，０.９８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）中の溶液を、粉末化したＣｓ2ＣＯ3と共に１５分間撹拌した。これに、メチルブロモアセタート（１１０μＬ，１.１６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。この時点で、この反応液をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（４×５０ｍＬ）、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液およびブラインで抽出した。有機層を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、溶媒を真空中で除去した。粗生成物（透明な油）をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、白色の発泡体を得た（３８３ｍｇ，９１％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.50 - 7.31(m, 5H), 7.31 - 7.15(m, 4H), 5.70(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.02(t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.92(d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.69および4.54(AB, J = 17.2 Hz, 2H), 3.79(s, 3H), 1.38(s, 9H); MS ES+, m/z = 327(M+H-100). LC/MS: 2.51分。
【００３６】
【化１１】
2008523141.tif 000013
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１ｄ）
ＴＨＦ（２７ｍＬ）中の、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１ｃ）（１.１０ｇ，２.５７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水酸化リチウム水溶液（０.６Ｍ、９ｍＬ）を添加し、続いて３ｍＬのＭｅＯＨを添加した。この混合物を室温で１時間撹拌し、０.５ｍＬのＨＯＡｃでクエンチし、ＴＨＦを蒸発させ、水性の残留物を２〜３滴の１ＮのＨＣｌで酸性化し、次に、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機相を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、溶媒を真空中で除去し、白色の発泡体を得て（１.０８ｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 9.14(br s, 1H), 7.52 - 7.13(m, 9H), 5.70(d, J=6.9 Hz, 1H), 5.03(t, J=7.4 Hz, 1H), 4.94(d, J=7.8 Hz, 1H), 4.72(d, J=17.5 Hz, 1H), 4.54(d, J=17.5 Hz, 1H), 1.41 - 1.33(m, 9H); MS APCI, m/z=413(M+H)。LC/MS: 2.24分。
【００３７】
【化１２】
2008523141.tif 000014
［（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｅ）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１ｄ）（４４５ｍｇ，１.０８ｍｍｏｌ）、および、５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸（５−アミノ−ペンチル）−アミド（１ｊ）（３５５ｍｇ，１.０８ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、Ｎ2下で、ＨＯＢｔ（１７８ｍｇ，１.３２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１７０μＬ，１.５６ｍｍｏｌ）、および、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（２６０ｍｇ，１.３６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で５時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液、Ｈ2Ｏおよびブラインで抽出した。有機溶液を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させ、固体生成物を得て、これをシリカを用いたｆｃｃによって精製した（１９８ｍｇ，２５％）。1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.50 - 7.18(m, 9H), 6.94 - 6.76(m, 1H), 6.09 - 5.98(m, 1H), 5.96(s, 1H), 5.67(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.21(s, 1H), 5.00(t, J = 7.7 Hz, 1H), 4.84(d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.62および4.48(AB, J = 16.2 Hz, 2H), 4.55 - 4.41(m, 1H), 4.35 - 4.23(m, 1H), 3.37 - 3.02(m, 6H), 2.89(dd, J = 12.8, 4.8 Hz, 1H), 2.70(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.11(t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.80 - 1.55(m, 6H), 1.53 - 1.15(m, 3H), 1.36(s, 9H); MS APCI, m/z = 723(M+). LC/MS: 2.12分。
【００３８】
【化１３】
2008523141.tif 000015
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（１ｆ）
出発原料として、［（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｅ）（１９８ｍｇ，０.２７４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｈ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１ｆ）（１５８ｍｇ，９３％）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 7.98(t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.69(t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.52 - 7.16(m, 9H), 6.38(s, 1H), 6.32(s, 1H), 5.38(d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.57および4.25(AB, J = 16.2 Hz, 2H), 4.34 - 4.24(m, 1H), 4.17 - 4.08(m, 1H), 4.05 - 3.94(m, 1H), 3.17 - 2.91(m, 5H), 2.81(dd, J = 12.4, 5.0 Hz, 1H), 2.57(d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.03(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.70 - 1.07(m, 14H); MS APCI, m/z = 623(M+). LC/MS: 1.44分。
【００３９】
【化１４】
2008523141.tif 000016
｛（Ｓ）−１−［（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｇ）
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の、５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（１ｆ）（１４１ｍｇ，０.２２７ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、Ｎ2下で、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（４４ｍｇ，０.２３４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４０ｍｇ，０.２９７ｍｍｏｌ）、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（１３０μＬ，０.７４６ｍｍｏｌ）、および、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（５０ｍｇ，０.２５８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で一晩撹拌し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、次に、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液、Ｈ2Ｏおよびブラインで抽出した。この有機溶液を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させ、白色の固体を得た（１３８ｍｇ，７７％）。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 8.08(t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.70(t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.49 - 7.24(m, 9H), 7.14(d, J = 5.9 Hz, 1H), 6.96(d, J = 5.4 Hz, 1H), 6.38(s, 1H), 6.38(s, 1H), 5.58(d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.98(t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.56(d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.41 - 4.20(m, 2H), 4.18 - 4.04(m, 1H), 3.85(t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.14 - 2.93(m, 5H), 2.81(dd, J = 12.4, 5.0 Hz, 1H), 2.57(d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.04(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.72 - 1.13(m, 11H), 1.32(s, 9H), 1.06(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 794(M+). LC/MS: 1.99分。
【００４０】
【化１５】
2008523141.tif 000017
５−（（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタン酸（５−｛２−［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−アセチルアミノ｝−ペンチル）−アミド（１ｈ）
０℃に冷却したＤＣＭ（１０ｍＬ）中の、｛（Ｓ）−１−［（６Ｒ,７Ｓ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｇ）の溶液に、ＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。この混合物を室温に温め、３０分間撹拌し、溶媒／ＴＦＡを蒸発させ、残留物を２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液と混合し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（２５：１，３回）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させ、白色の固体を得た（１２０ｍｇ，９９％）。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 8.14(t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.86 - 7.58(m, 2H), 7.51 -
7.21(m, 9H), 6.43(s, 1H), 6.36(s, 1H), 5.58(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.08 - 4.83(m, 1H), 4.61(d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.37 - 4.20(m, 2H), 4.18 - 4.06(m, 2H), 3.25 - 2.91(m, 6H), 2.81(dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.56(d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.04(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.74 - 1.11(m, 14H), 1.04(d, J = 6.8 Hz, 3H). MS APCI, m/z = 694(M+). LC/MS: 1.48分。
【００４１】
ビオチン化したペンチルアミン
【化１６】
2008523141.tif 000018
｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｉ）
これは、Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｋ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０００，５６，９００３）によって説明された方法で製造された。
【００４２】
【化１７】
2008523141.tif 000019
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸（５−アミノ−ペンチル）−アミド（１ｊ）
｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｉ）（８６０ｍｇ，２.００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２５ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。この混合物を２時間撹拌し、溶媒／ＴＦＡを蒸発させ、残留物を高真空下で１時間ポンプで吸引した。粗生成物を、３０ｍＬの５：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨに溶解させ、４.６５ｇ（２.３４ｍｍｏｌ）Ｓｉ−アミン（シリサイクル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）で誘導体化したシリカゲル，部品番号Ｒ５２０３０Ｂ，ローディングは１.９９ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。この混合物をろ過し、シリカをＤＣＭで洗浄し、ろ液を真空中で濃縮し、半固体を得た。この生成物を１０ｍＬのＭｅＣＮと混合し、１時間放置し、この間に結晶化が起こった。生成物を、ろ過によって回収し、冷たいＭｅＣＮ（３×５ｍＬ）で洗浄し、白色の固体を得た（５８３ｍｇ，８９％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.94(s, 1H), 4.49(dd, J = 7.9, 4.9 Hz, 1H), 4.30(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.26 - 3.13(m, 3H), 2.99 - 2.86(m, 3H), 2.70(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.81 - 1.32(m, 12H); MS ES+, m/z = 329(M+H). LC/MS: 0.57分。
【００４３】
【化１８】
2008523141.tif 000020
実施例２：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（２）
酸成分として、ｐ−ベンゾイルフェニル酢酸（Ｊ．Ａ．Ｚｄｅｒｉｃ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.，１９６１，２６，１６３５によって説明された手順を用いて、ｐ−メチルベンゾフェノンから製造された）（２４ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１）で説明されている手順に類似した手順を用いて、さらに、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、オフホワイト色の固形状の表題の化合物（２）を得た（４８ｍｇ，５３％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.76(d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.72(d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.64(t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.52(t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.47 - 7.26(m, 10H), 7.21(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.66(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.27 - 5.07(m, 1H), 4.67(d, J = 16.4 Hz,
1H), 4.45(dd, J = 7.8, 5.0 Hz, 1H), 4.38(d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.31 - 4.18(m, 2H), 3.58(s, 2H), 3.21(t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.17 - 3.09(m, 3H), 2.90(dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.16(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81 - 1.18(m, 12H), 1.23(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 916(M+). LC/MS: 2.31分. HRMS(TOF ES+)計算値：C50H57N7O8S(M+H)916.4067, 実測値：916.4069。
【００４４】
【化１９】
2008523141.tif 000021
実施例３：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−アジド−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（３）
酸成分として、ｐ−アジドフェニル酢酸（Ｒ．Ｓｅｙｅｒ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ.，１９９４，３７，１８４１によって説明された手順を用いて、ｐ−アミノフェニル酢酸から製造された）（２０ｍｇ，０.１１３ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１）で説明されている手順に類似した手順を用いて、さらに、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、オフホワイト色の固形状の表題の化合物（３）を得た（６８ｍｇ，７４％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.47 - 7.30(m, 9H), 7.27(d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.99(d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.65(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.16(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.69および4.39(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.46(dd, J = 7.8, 4.8 Hz, 1H), 4.27(dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.20(q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.45(s, 2H), 3.30 - 3.05(m, 6H), 2.90(dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.68(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.16(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82 - 1.26(m, 14H), 1.20(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 853(M+). LC/MS: 2.25分. HRMS(TOF ES+)計算値：C43H52N10O7S(M+H)853.3819, 実測値：853.3823。
【００４５】
【化２０】
2008523141.tif 000022
実施例４：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｓ,７Ｒ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（４）
７.５ｍＬのＤＣＭ：ＭｅＣＮ（２：１）中の、５−（（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタン酸（５−｛２−［（６Ｓ,７Ｒ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−アセチルアミノ｝−ペンチル）−アミド（４ｋ）（７６ｍｇ，０.１０９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ2下で、ｍ−ベンゾイルフェニル酢酸（２５.９ｍｇ，０.１０８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１１８ｍｇ，０.３１０ｍｍｏｌ）、および、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（１０５μＬ，０.６０３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を、分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、５４ｍｇ（５４％）のオフホワイト色の固体を得た。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.83 - 7.71(m, 2H), 7.69 - 7.58(m, 3H), 7.56 - 7.26(m, 13H), 7.11(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.64(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.23 - 5.15(m, 1H), 4.68および4.36(AB, J = 16.4 Hz, 1H), 4.45(dd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1H), 4.31 - 4.20(m, 2H), 3.51(s, 2H), 3.22(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.19 - 3.14(m, 1H), 3.13(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.89(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.15(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81 - 1.24(m, 12H), 1.16(t, J = 3.6 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 916(M+). LC/MS: 2.36分. HRMS(TOF ES+)計算値:C50H57N7O8S(M+H)916.4067, 実測値:916.4093。
【００４６】
出発原料（４ｋ）を以下のように製造した：
【００４７】
【化２１】
2008523141.tif 000023
（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニル−オキシラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−フェニル）−アミド（４ａ）
窒素下で氷水の槽中で冷却した乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の、カリウム（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニルオキシラン−２−カルボキシレート（特許ＡＺ  ＷＯ２００４０３１１５４Ａ１で説明されたようにして製造した）（６.４５ｇ,３１.９ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、注射器によってイソブチルクロロホルメート（４.２ｍＬ、３２ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。ＮＭＭ（０.８０ｍＬ、７.３０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を、７５分間かけて１０℃に徐々に温めながら撹拌した。この混合物を０℃に冷却し、２−アミノフェノールを添加し、次に冷却槽を除去し、この反応液を周囲温度で４２ｈ撹拌した。この反応液を、Ｅｔ2Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、次に、セライトでろ過し、懸濁された固体を除去した。この溶液をロータリーエバポレーションにかけて、オレンジ色の固体を得て、これをジエチルエーテル（２００ｍＬ）で粉砕し、ろ過によって回収した。この固体をフィルター上で追加のジエチルエーテルでリンスし、純粋な表題の化合物をオフホワイト色の固体として得た（６.７６ｇ，８３％）。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 9.98(s, 1H), 9.28(s, 1H), 7.96(d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.46 - 7.31(m, 5H), 7.01 - 6.93(m, 1H), 6.92 - 6.86(m, 1H), 6.84 - 6.75(m, 1H), 4.22(d, J = 1.6 Hz, 1H), 4.00(d, J = 1.6 Hz, 1H); MS APCI, m/z = 256(M+H). LC/MS: 2.22分。
【００４８】
【化２２】
2008523141.tif 000024
（６Ｓ,７Ｓ）−７−ヒドロキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（４ｂ）
（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニル−オキシラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−フェニル）−アミド（４ａ）（５.２３ｇ，２０.５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ １００ｍＬ中の溶液に、Ｓｃ（ＯＴｆ）3（０.９５ｇ，１.９２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を６６℃で７５分間加熱し、次に室温に冷却した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、オフホワイト色の発泡体を得た（２.７７ｇ，５３％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 8.30(s, 1H), 7.51 - 7.31(m, 5H), 7.18 - 7.00(m, 3H), 6.94 - 6.82(m, 1H), 5.29(d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.64(dd, J = 9.8, 5.0 Hz, 1H), 3.75(d, J = 5.0 Hz, 1H); MS APCI, m/z = 256(M+H). LC/MS: 1.95分。
【００４９】
【化２３】
2008523141.tif 000025
（６Ｓ,７Ｒ）−７−アジド−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（４ｃ）
トリフルオロメタンスルホニル塩化物（４.５ｍＬ，４２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（２７ｍＬ）中の（６Ｓ,７Ｓ）−７−ヒドロキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（４ｂ）（２.６６ｇ，１０.４ｍｍｏｌ）、および、Ｅｔ3Ｎ（５.８ｍＬ，４２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、窒素下、−１８℃で、注射器によって添加した。この混合物を−１８℃で一晩維持した。追加のトリフルオロメタンスルホニル塩化物（１.２ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）、および、トリエチルアミン（１.５ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を−１８℃でさらに１時間維持した。この反応液を−１８℃で真空中で濃縮し、即座に得られた残留物を、−１８℃で、窒素下でＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解させた。この溶液に、アジ化ナトリウム（３.８６ｇ，５９.０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を３０分間かけて周囲温度に温めた。さらに２時間たった後、この反応液をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（４×８０ｍＬ）、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×８０ｍＬ）およびブラインで抽出した。有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、蒸発させた。粗生成物（茶色の固体）をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、表題の化合物を泡沫状の白色の固体として得た（１.２０ｇ，４１％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.67(br s, 1H), 7.60 - 7.51(m, 2H), 7.47 - 7.37(m,
3H), 7.29 - 7.12(m, 3H), 7.07 - 6.99(m, 1H), 5.56(d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.46(d, J
= 6.0 Hz, 1H); MS APCI, m/z = 280(M+H). LC/MS: 2.14分。
【００５０】
【化２４】
2008523141.tif 000026
（６Ｓ,７Ｒ）−７−アミノ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン塩酸塩（４ｄ）
パール（Ｐａｒｒ(R)）の水素フラスコに、５％Ｐｄ／Ｃ（１８５ｍｇ）を添加し、続いて７０ｍＬの無水ＥｔＯＨを添加した。続いてこれに、（６Ｓ,７Ｒ）−７−アジド−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（４ｃ）（１.２０ｇ，４.２８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をヒートガンで穏やかに温め、アジ化物を溶解させた。１ＮのＨＣｌ水溶液（１５ｍＬ）を添加し、フラスコをパール（Ｐａｒｒ(R)）振盪機に置き、水素で排気／充填した（４サイクル）。この混合物を、５０ｐｓｉの水素下で２時間振盪し（室温は３℃）、セライトでろ過し、ＥｔＯＨを蒸発させた。残留物を２５０ｍＬのＥｔ2Ｏで２時間撹拌し、沈殿した生成物をろ過し、洗浄し（Ｅｔ2Ｏ）、高真空下で１８時間乾燥させた。これにより、１.０５ｇ（８４％）の白色の粉末を得た。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 10.65(s, 1H), 8.36(s, 3H), 7.61 - 7.39(m, 5H), 7.35
- 7.14(m, 4H), 5.88(d, J = 6.1 Hz, 1H), 4.54(d, J = 6.5 Hz, 3H); MS APCI, m/z =
255(M+H). LC/MS: 1.32分。
【００５１】
【化２５】
2008523141.tif 000027
（（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｅ）
出発原料として、（６Ｓ,７Ｒ）−７−アミノ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン塩酸塩（４ｄ）（１.０３ｇ，３.５４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｂ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（４ｅ）（１.２６ｇ，９７％）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.94(s, 1H), 7.49 - 7.11(m, 8H), 7.10 - 6.99(m, 1H), 5.76(d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.09 - 4.87(m, 2H), 1.40(s, 9H); MS APCI, m/z = 418(M+Na++MeCN). LC/MS: 2.56分。
【００５２】
【化２６】
2008523141.tif 000028
（（６Ｓ,７Ｒ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（４ｆ）
出発原料として、（（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｅ）（１.２６ｇ，３.５４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｃ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、ｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（４ｆ）（１.４６ｇ，９７％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.52 - 7.31(m, 5H), 7.31 - 7.15(m, 4H), 5.70(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.02(t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.92(d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.68および4.54(AB, J = 17.2 Hz, 2H), 3.79(s, 3H), 1.38(s, 9H); MS APCI, m/z = 449(M+Na+). LC/MS: 2.74分。
【００５３】
【化２７】
2008523141.tif 000029
（（６Ｓ,７Ｒ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（４ｇ）
出発原料として、（（６Ｓ,７Ｒ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（４ｆ）（９５４ｍｇ，２.２４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｄ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（４ｇ）（９４０ｍｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.48 - 7.32(m, 5H), 7.32 - 7.18(m, 4H), 5.70(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.03(t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.92(d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.73および4.56(AB, J = 17.5 Hz, 2H), 1.38(s, 9H); MS ES+, m/z = 413(M+H). LC/MS: 2.25分。
【００５４】
【化２８】
2008523141.tif 000030
［（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｈ）
（（６Ｓ,７Ｒ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（４ｇ）（３８５ｍｇ，０.９３３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ ３０ｍＬ中の溶液に、Ｎ2下で、５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸（５−アミノ−ペンチル）−アミド（１ｊ）（３０８ｍｇ，０.９３８ｍｍｏｌ）、ＰｙＡＯＰ（５７７ｍｇ，１.１１ｍｍｏｌ）、および、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（４８０μＬ,２.７６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を周囲温度で７０時間撹拌し、溶媒を蒸発させ、残留物を、２００ｍＬのＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（２０：１）に溶解させた。これを、Ｈ2Ｏ（３×５０ｍＬ）、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液およびブラインで抽出した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、４８０ｍｇ（７１％）の白色の固体を得た。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.52 - 7.24(m, 9H), 5.62(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.95(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.67(d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.47(dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 4.40(d, J = 16.4 Hz, 1H), 4.28(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 3.28 - 3.10(m, 6H), 2.91(dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.69(d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.16(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78 - 1.27(m, 12H), 1.37(s, 9H); MS APCI, m/z = 723(M+). LC/MS: 2.38分。
【００５５】
【化２９】
2008523141.tif 000031
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｓ,７Ｒ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（４ｉ）
ｂｏｃで保護されたアミン成分として、［（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｈ）（４８０ｍｇ，０.６６４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４ｋ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、、表題の化合物（４ｉ）を単離し、オフホワイト色の固体を得た（４１３ｍｇ，実質的に定量的な量）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.66 - 7.30(m, 9H), 5.71(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.80および4.44(AB, J = 16.2 Hz, 2H), 4.69(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.51 - 4.43(m, 1H), 4.28(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.30 - 3.09(m, 6H), 2.92(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.69(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.18(t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.79 - 1.22(m, 13H)
MS APCI, m/z = 623(M+). LC/MS: 1.72分。
【００５６】
【化３０】
2008523141.tif 000032
｛（Ｓ）−１−［（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｊ）
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｓ,７Ｒ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（４ｉ）（４１３ｍｇ，０.６６４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ ３５ｍＬ中の溶液に、Ｎ2下で、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−アラニン（１３３ｍｇ，０.７０３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３８２ｍｇ，１.００ｍｍｏｌ）、および、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（３００μＬ，１.７２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を周囲温度で７時間撹拌し、溶媒を蒸発させ、残留物を、２００ｍＬのＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（２０：１）に溶解させた。これを、Ｈ2Ｏ（３×５０ｍＬ）、２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液およびブラインで抽出した。溶媒を真空中で除去し、残留物を、分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、５１０ｍｇ（９７％）の白色の固体を得た。1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.53 - 7.23(m, 9H), 7.09(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.65(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.27 - 5.14(m, 1H), 4.69および4.40(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.47(dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 4.28(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.99(q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.24(t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.23 - 3.16(m, 1H), 3.15(t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.91(dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.69(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.17(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81 - 1.26(m, 11H), 1.37(s, 9H), 1.13(d, J = 7.1 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 795(M+H). LC/MS: 2.25分。
【００５７】
【化３１】
2008523141.tif 000033
５−（（３ａＳ,４Ｓ,６ａＲ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−４−イル）−ペンタン酸（５−｛２−［（６Ｓ,７Ｒ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−アセチルアミノ｝−ペンチル）−アミド（４ｋ）
｛（Ｓ）−１−［（６Ｓ,７Ｒ）−８−オキソ−９−（｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルカルバモイル｝−メチル）−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル］−エチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４ｊ）（５００ｍｇ，０.６３０ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。この混合物を２時間撹拌し、溶媒／ＴＦＡを蒸発させ、残留物を高真空下で１時間ポンプで吸引した。粗生成物を、３０ｍＬの５：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨに溶解させ、１.９２ｇ（１.３０ｍｍｏｌ）Ｓｉ−アミン（シリサイクル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）で誘導体化したシリカゲル，部品番号Ｒ５２０３０Ｂ，ローディングは１.４６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、混合物を２時間撹拌した。この混合物をろ過し、シリカをＤＣＭで洗浄し、ろ液を真空中で濃縮し、固体を得た（４９０ｍｇ，実質的に定量的な量）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.55 - 7.21(m, 9H), 5.66(d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.27(d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.77および4.34(AB, J = 16.3 Hz, 2H), 4.47(dd, J = 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.28(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.89(q, J = 6.9 Hz, 1H), 3.30 - 3.10(m, 6H), 2.92(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.69(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.17(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.81 - 1.26(m, 13H), 1.22(d, J = 7.0 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 694(M+). LC/MS: 1.75分。
【００５８】
【化３２】
2008523141.tif 000034
実施例５：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｓ,７Ｒ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（５）
酸成分としてｐ−ベンゾイルフェニル酢酸（２６.４ｍｇ，０.１１０ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４）で説明されている手順に類似した手順を用いて、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、オフホワイト色の固形状の表題の化合物（５）を得た（４９ｍｇ，５１％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.82 - 7.59(m, 5H), 7.58 - 7.48(m, 2H), 7.45 - 7.27(m, 12H), 7.13(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.65(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.26 - 5.14(m, 1H), 4.70および4.36(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.45(dd, J = 7.7, 4.3 Hz, 1H), 4.32 - 4.23(m, 1H), 3.55(s, 2H), 3.22(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.13(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.20 - 3.13(mH), 2.89(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.15(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78 - 1.25(m, 13H), 1.19(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 916(M+)。
LC/MS:2.36分. HRMS(TOF ES+)計算値:C50H57N7O8S(M+H)916.4067, 実測値:916.4080。
【００５９】
【化３３】
2008523141.tif 000035
実施例６：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［２−（（６Ｓ,７Ｒ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−アジド−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−アミド（６）
酸成分としてｐ−アジドフェニル酢酸（２２.０ｍｇ，０.１２４ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４）で説明されている手順に類似した手順を用いて、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、オフホワイト色の固形状の表題の化合物（６）を得た（４９ｍｇ，５１％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.47 - 7.27(m, 10H), 7.21(d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.10(d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.96(d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.64(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.26 - 5.14(m, 1H), 4.70および4.37(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.46(dd, J = 7.7, 4.8 Hz, 1H), 4.32 - 4.21(m, 2H), 3.41(s, 1H), 3.24(t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.22 - 3.15(m, 1H), 3.14(t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.90(dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.68(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.16(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.80 - 1.25(m, 13H), 1.17(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 853(M+). LC/MS:2.28分. HRMS(TOF ES+)計算値:C43H52N10O7S(M+H)853.3819, 実測値:853.3836。
【００６０】
【化３４】
2008523141.tif 000036
実施例７：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［５−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ）−ペンチル］−アミド（７）
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ］−ペンチル｝−アミド（７ｐ）（７０.７ｍｇ，０.１０６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ ７ｍＬ中の溶液に、Ｎ2下で、ｍ−ベンゾイルフェニル酢酸（３５.０ｍｇ，０.１４６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２１.２ｍｇ，０.１５７ｍｍｏｌ）、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（６０μＬ，０.３４０ｍｍｏｌ）、および、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（３３.２ｍｇ，０.１７３ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で一晩撹拌し、ＤＭＦを蒸発させ、残留物を、分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、５２ｍｇ（５６％）の白色の固体を得た。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.87 - 7.41(m, 10H), 7.41 - 7.23(m, 5H), 7.17(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.12(d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.93(d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.85(dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 5.54(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.08 - 4.98(m, 1H), 4.43(dd, J = 7.6, 4.6 Hz, 1H), 4.26(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.18(q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.02(t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.56(s, 2H), 3.42(s, 3H), 3.27 - 3.12(m, 2H), 2.93 - 2.79(m, 1H), 2.65(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.89 - 1.35(m, 12H), 1.20(d, J = 7.2 Hz, 12H); MS APCI, m/z = 889(M+). LC/MS:2.29分. HRMS(TOF ES+)計算値:C49H56N6O8S(M+H)889.3953, 実測値:889.3952。
【００６１】
出発原料（７ｐ）を、以下で説明されているように製造した：
【００６２】
【化３５】
2008523141.tif 000037
２−アミノ−４−メトキシ−フェノール（７ａ）
Ｌｏｋ，Ｒ．ｉｎ  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ.，１９９６，６１，３２８９に記載の方法によって製造された。
【００６３】
【化３６】
2008523141.tif 000038
（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニル−オキシラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−フェニル）−アミド（７ｂ）
酸成分として、カリウム（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニルオキシラン−２−カルボキシレート（４.０３ｇ,１９.９ｍｍｏｌ）を用い、アミン成分として、２−アミノ−４−メトキシ−フェノール（２.８１ｇ，２０.２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４ａ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を単離し（７ｂ）黄褐色の固体（４.１２ｍｇ，７２％）を得た。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 9.51(s, 1H), 9.25(s, 1H), 7.68(d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.45 - 7.33(m, 5H), 6.81(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.56(dd, J = 8.7, 3.0 Hz, 1H), 4.23(d, J = 1.5 Hz, 1H), 4.01(d, J = 1.5 Hz, 1H), 3.67(s, 3H); MS APCI, m/z = 286(M+H). LC/MS:2.02分。
【００６４】
【化３７】
2008523141.tif 000039
（６Ｒ,７Ｒ）−７−ヒドロキシ−２−メトキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（７ｃ）
出発原料として、（２Ｒ,３Ｓ）−３−フェニル−オキシラン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−メトキシ−フェニル）−アミド（７ｂ）（８６０ｍｇ，３.０２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４ｂ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得た（７ｃ）（５００ｍｇ，５８％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 8.03(s, 1H), 7.49 - 7.32(m, 5H), 6.76(d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.66 - 6.55(m, 2H), 5.25(d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.65(dd, J = 9.8, 5.3 Hz, 1H), 3.78(s, 3H), 3.70(d, J = 5.3 Hz, 1H); MS APCI, m/z = 286(M+H). LC/MS:1.77分。
【００６５】
【化３８】
2008523141.tif 000040
（６Ｒ,７Ｓ）−７−アジド−２−メトキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（７ｄ）
出発原料として、（６Ｒ,７Ｒ）−７−ヒドロキシ−２−メトキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（７ｃ）（２.４９ｇ，８.７２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４ｃ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、ｆｃｃシリカで精製した後に（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、表題の化合物を得た（７ｄ）（１.７３ｇ，６４％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 8.27(s, 1H), 7.59 - 7.50(m, 2H), 7.44 - 7.36(m, 3H), 7.15(d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.72(dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 6.59(d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.52(d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.45(d, J = 6.3 Hz, 1H), 3.77(s, 3H); MS ES+, m/z = 311(M+H). LC/MS:2.18分。
【００６６】
【化３９】
2008523141.tif 000041
（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−２−メトキシ−９−メチル−６−フェニル−６,−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン塩酸塩（７ｅ）
出発原料として、（６Ｒ,７Ｓ）−７−アジド−２−メトキシ−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン（７ｄ）（１.１９ｇ,３.８３ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（４ｄ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得た（７ｅ）（１.１２ｇ，９１％）。唯一の例外は、Ｅｔ2Ｏ粉砕を行わなかった点だけであった。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 10.60(s, 1H), 8.34(br s, 3H), 7.60 - 7.39(m, 5H), 7.23(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.82(dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 6.71(d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.80(d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.50(d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.77(s, 3H); MS APCI, m/z = 285(M+H). LC/MS:1.26分。
【００６７】
【化４０】
2008523141.tif 000042
（（６Ｒ,７Ｓ）−２−メトキシ−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｆ）
出発原料として、（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−２−メトキシ−９−メチル−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン塩酸塩（７ｅ）（４２０ｍｇ，１.２９ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｂ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、ｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（７ｆ）（４２５ｍｇ，８６％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.54(s, 1H), 7.48 - 7.31(m, 5H), 7.17(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.74(dd, J = 8.8, 2.9 Hz, 1H), 6.59(d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.69(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.00(t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.88(d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.80(s, 3H), 1.39(s, 9H); MS ES+, m/z = 407(M+Na+). LC/MS:2.38分。
【００６８】
【化４１】
2008523141.tif 000043
（（６Ｒ,７Ｓ）−２−メトキシ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｇ）
（（６Ｒ,７Ｓ）−２−メトキシ−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｆ）（４２５ｍｇ，１.１１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）中の溶液に、Ｃｓ2ＣＯ3（８９４ｍｇ，２.７４ｍｍｏｌ）、および、ＭｅＩ（０.２ｍＬ，３.２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を周囲温度で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、白色の発泡体を得た（３９２ｍｇ，８９％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.46 - 7.30(m, 5H), 7.20 - 7.11(m, 1H), 6.84 - 6.70(m, 2H), 5.70 - 5.52(m, 1H), 5.04 - 4.85(m, 2H), 3.83(s, 3H), 3.46(s, 3H); MS APCI, m/z = 299(M+H-100). LC/MS:2.77分。
【００６９】
【化４２】
2008523141.tif 000044
（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−２−ヒドロキシ−９−メチル−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン臭化水素酸塩（７ｈ）
（（６Ｒ,７Ｓ）−２−メトキシ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｇ）（５８０ｍｇ，１.３４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（４０ｍＬ）中の溶液に、ＢＢｒ3（１ＭのＤＣＭ溶液２ｍＬ）を添加した。この混合物を周囲温度で１時間撹拌し、次に、追加のＢＢｒ3（１ＭのＤＣＭ溶液２ｍＬ）を添加した。この混合物をさらに２時間撹拌し、次に、２ｍＬのＨ2Ｏでクエンチした。ＤＣＭ／Ｈ2Ｏを真空中で蒸発させ、粗生成物をシリカを用いたｆｃｃによって精製し、表題の化合物を黄褐色の固体として得た（４０９ｍｇ，８３％）。
1H NMR(300.132 MHz, DMSO) δ 9.74(br s, 1H), 8.09(br s, 3H), 7.52 - 7.34(m, 5H),
7.15(d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.88(d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.73(dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 1H), 5.60(d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.58(d, J = 6.7 Hz, 1H), 3.41(s, 3H); MS APCI, m/z = 285(M+H). LC/MS:1.43分。
【００７０】
【化４３】
2008523141.tif 000045
炭酸ベンジルエステル（６Ｒ,７Ｓ）−７−ベンジルオキシカルボニルアミノ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルエステル（７ｉ）
冷却した（０℃）６０ｍＬのＤＣＭ中の（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−２−ヒドロキシ−９−メチル−６−フェニル−６,７−ジヒドロ−９Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−８−オン臭化水素酸塩（７ｈ）（４０４ｍｇ，１.１１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｅｔ3Ｎ（０.７ｍＬ、５.０ｍｍｏｌ）、続いてジベンジルジカーボネート（７７０ｍｇ，２.６９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を０℃で１５分間撹拌し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（１００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させた。粗生成物をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、表題の化合物を透明な油として得た（４１９ｍｇ，６８％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.53 - 7.18(m, 16H), 7.14 - 7.03(m, 2H), 5.65(d, J
= 7.0 Hz, 1H), 5.29(s, 2H), 5.19(d, J = 7.7 Hz, 1H), 5.07および4.99(AB, J = 12.2 Hz, 2H), 4.99(t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.44(s, 3H); MS ES+, m/z = 553(M+). LC/MS:3.08分。
【００７１】
【化４４】
2008523141.tif 000046
（（６Ｒ,７Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｊ）
出発原料として、炭酸ベンジルエステル（６Ｒ,７Ｓ）−７−ベンジルオキシカルボニルアミノ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルエステル（７ｉ）（４１７ｍｇ，０.７５５ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｄ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、残留したベンジルアルコールを含む表題の化合物（７ｊ）（３１６ｍｇ，実質的に定量的な量）を得て、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.43 - 7.21(m, 10H), 7.09(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.70
- 6.62(m, 2H), 5.86(s, 1H), 5.59(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.22(d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.08(d, J = 12.3 Hz, 1H), 5.01(d, J = 13.0 Hz, 1H), 4.96(t, J = 7.8 Hz, 1H), 3.42(s, 3H); MS ES+, m/z = 419(M+). LC/MS:2.29分。
【００７２】
【化４５】
2008523141.tif 000047
［（６Ｒ,７Ｓ）−２−（５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ペンチルオキシ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｋ）
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＫ2ＣＯ3（７２１ｍｇ，５.２２ｍｍｏｌ）の撹拌したスラリーに、（（６Ｒ,７Ｓ）−２−ヒドロキシ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｊ）（３１５ｍｇ，０.７５５ｍｍｏｌ）および（５−ブロモ−ペンチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４０３ｍｇ，１.５１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。追加のＫ2ＣＯ3（５８４ｍｇ，４.２３ｍｍｏｌ）および（５−ブロモ−ペンチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３３３ｍｇ，１.２５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５日間撹拌した。この反応物を、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、Ｈ2Ｏ（４×５０ｍＬ）およびブラインで抽出した。有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させた。粗生成物をシリカを用いたｆｃｃによって精製し（溶出液はＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ）、表題の化合物を透明な油として得た（４２９ｍｇ，９４％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.42 - 7.21(m, 10H), 7.14(d, J = 9.3 Hz, 1H), 6.80
- 6.69(m, 2H), 5.58(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.16(d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.07および4.99(AB, J = 12.2 Hz, 2H), 5.02 - 4.94(m, 1H), 4.53(br s, 1H), 3.96(t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.46(s, 3H), 3.16(q, J = 6.0 Hz, 2H), 1.83(五重項, J = 6.7 Hz, 2H), 1.64 - 1.49(m, 4H), 1.45(s, 9H); MS ES+, m/z = 604(M+). LC/MS:2.91分。
【００７３】
【化４６】
2008523141.tif 000048
［（６Ｒ,７Ｓ）−２−（５−アミノ−ペンチルオキシ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｌ）
［（６Ｒ,７Ｓ）−２−（５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ペンチルオキシ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｋ）（４２７ｍｇ，０.７０７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中の溶液に、ＴＦＡ（１.２ｍＬ）を添加した。この混合物を２時間撹拌し、溶媒／ＴＦＡを蒸発させ、残留物を２０％Ｋ2ＣＯ3（３０ｍＬ）水溶液と混合し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、蒸発させ、油を得た（３５７ｍｇ，９９％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.41 - 7.22(m, 10H), 7.14(d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.81
- 6.69(m, 2H), 5.54(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.18(d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.05および4.97(AB, J = 12.2 Hz, 2H), 5.00 - 4.91(m, 1H), 3.97(t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.44(s, 3H),
3.05 - 2.91(m, 2H), 1.90 - 1.67(m, 4H), 1.65 - 1.49(m, 2H); MS APCI, m/z = 504(M+). LC/MS:2.00分。
【００７４】
【化４７】
2008523141.tif 000049
（（６Ｒ,７Ｓ）−９−メチル−８−オキソ−２−｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルオキシ｝−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｍ）
実施例（７）で説明されている手順に類似した手順を用いた。アミン成分［（６Ｒ,７Ｓ）−２−（５−アミノ−ペンチルオキシ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル］−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｌ）（３５７ｍｇ，０.７０７ｍｍｏｌ）を、Ｄ−ビオチン（１７７ｍｇ，０.７２５ｍｍｏｌ）と混合し、分取用ＲＰＨＰＬＣの後に、表題の化合物をオフホワイト色の固体として得た（２９１ｍｇ，５６％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.41 - 7.22(m, 10H), 7.19(d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.97(d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.86(dd, J = 8.9, 2.9 Hz, 1H), 5.52(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.09および4.98(AB, J = 12.7 Hz, 2H), 4.92(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.44(dd, J = 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.27(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.03(t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.45(s, 3H), 3.26 - 3.13(m, 3H), 2.88(dd, J = 12.8, 4.3 Hz, 1H), 2.66(d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82(五重項, J = 8.0 Hz, 2H), 1.76 - 1.35(m, 10H); MS APCI, m/z = 730(M+). LC/MS:2.38分。
【００７５】
【化４８】
2008523141.tif 000050
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［５−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ）−ペンチル］−アミド（７ｎ）
（（６Ｒ,７Ｓ）−９−メチル−８−オキソ−２−｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルオキシ｝−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル）−カルバミン酸ベンジルエステル（７ｍ）（２７９ｍｇ，０.３８２ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。この混合物を、５０℃で３時間加熱した。ＴＦＡを減圧下で蒸発させ、残留物を２０％Ｋ2ＣＯ3水溶液（５０ｍＬ）と混合し、５０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、ろ過し、減圧下で蒸発させ、固体を得た（２０１ｍｇ，７６％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.51 - 7.25(m, 5H), 7.16(d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.94(d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.83(dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 5.38(d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.46(dd, J = 7.1, 4.3 Hz, 1H), 4.28(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.22(d, J = 5.6 Hz, 1H), 4.13 - 3.96(m, 3H), 3.45(s, 3H), 3.27 - 3.14(m, 3H), 2.90(dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.68(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.91 - 1.24(m, 12H); MS APCI, m/z = 596(M+). LC/MS:1.63分。
【００７６】
【化４９】
2008523141.tif 000051
［（Ｓ）−１−（（６Ｒ,７Ｓ）−９−メチル−８−オキソ−２−｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルオキシ｝−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル）−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｏ）
アミン成分として、５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［５−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ）−ペンチル］−アミド（７ｎ）（２２８ｍｇ，０.３８２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、分取用ＲＰＨＰＬＣで精製した後に表題の化合物を得た（７ｏ）（１６３ｍｇ，５５％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.45 - 7.27(m, 5H), 7.20(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.12 -
7.01(m, 1H), 6.97(d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.87(dd, J = 8.7, 2.5 Hz, 1H), 5.59(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.04(t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.45(dd, J = 7.5, 4.5 Hz, 1H), 4.28(dd, J = 7.6, 4.3 Hz, 1H), 4.03(t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.88(q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.46(s, 3H), 3.26 - 3.14(m, 3H), 2.87(dd, J = 12.7, 4.7 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.90 - 1.32(m, 12H), 1.39(s, 9H), 1.15(d, J = 7.1 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 767(M+). LC/MS:2.19分。
【００７７】
【化５０】
2008523141.tif 000052
５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸｛５−［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ］−ペンチル｝−アミド（７ｐ）
出発原料として、［（Ｓ）−１−（（６Ｒ,７Ｓ）−９−メチル−８−オキソ−２−｛５−［５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタノイルアミノ］−ペンチルオキシ｝−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イルカルバモイル）−エチル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７ｏ）（１６３ｍｇ，０.２１３ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｈ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（７ｐ）（１４５ｍｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.46 - 7.28(m, 5H), 7.21(d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.98(d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.87(dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 1H), 5.57(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.09(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.46(dd, J = 7.6, 4.4 Hz, 1H), 4.45(dd, J = 7.3, 5.3 Hz, 1H), 4.22(d, J = 5.2 Hz, 1H), 4.09(q, J = 6.2 Hz, 1H), 4.03(t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.47(s, 3H), 3.26 - 3.14(m, 2H), 2.89(dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.67(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.90 - 1.18(m, 10H), 1.24(t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.13(d, J = 6.8 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 667(M+). LC/MS:1.64分。
【００７８】
【化５１】
2008523141.tif 000053
実施例８：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［５−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ）−ペンチル］−アミド（８）
酸成分としてｐ−ベンゾイルフェニル酢酸（３３.５ｍｇ，０.１３９ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（７）で説明されている手順に類似した手順を用いて、分取用ＲＰＨＰＬＣで単離して、白色の固体である表題の化合物（８）を得た（６７ｍｇ，７１％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.82 - 7.58(m, 4H), 7.52(t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.43(d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.39 - 7.25(m, 4H), 7.19(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.12(d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.95(d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.86(dd, J = 8.7, 2.7 Hz, 1H), 5.56(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.04(t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.43(dd, J = 7.7, 5.0 Hz, 1H), 4.26(dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.20(q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.02(t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.59(s, 2H), 3.44(s, 3H), 3.27 - 3.12(m, 4H), 2.85(dd, J = 12.7, 5.3 Hz, 1H), 2.64(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.90 - 1.35(m, 12H), 1.22(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 889(M+). LC/MS:2.28分. HRMS(TOF ES+)計算値:C49H56N6O8S(M+H)889.3953, 実測値:889.3980。
【００７９】
【化５２】
2008523141.tif 000054
実施例９：５−（（３ａＲ,６Ｓ,６ａＳ）−２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３,４−ｄ］イミダゾール−６−イル）−ペンタン酸［５−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−アジド−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−９−メチル−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−２−イルオキシ）−ペンチル］−アミド（９）
酸成分として、ｐ−アジドフェニル酢酸（２４.２ｍｇ，０.１３７ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（７）で説明されている手順に類似した手順を用いて、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、明るいオレンジ色の固体である表題の化合物（９）を得た（２４ｍｇ，３８％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.42 - 7.23(m, 6H), 7.19(d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.12(d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.00(d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.96(d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.86(dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 5.56(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.04(t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.43(dd, J = 7.7, 4.9 Hz, 1H), 4.27(dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.16(q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.03(t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.46(s, 3H), 3.27 - 3.11(m, 4H), 2.86(dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.64(d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.20(t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.90 - 1.36(m, 12H), 1.20(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 826(M+). LC/MS:2.22分. HRMS(TOF ES+)計算値:C42H51N9O7S(M+H)826.3710, 実測値:826.3748。
【００８０】
実施例１０：
【化５３】
2008523141.tif 000055
（Ｓ）−Ｎ−｛（６Ｒ,７Ｓ）−９−［（５−アミノ−ペンチルカルバモイル）−メチル］−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル｝−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオンアミド（１０ｇ）（１１ｍｇ，１６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１.５ｍＬ）中の溶液に、Ｎ2下で、３−（２−｛［１−（ジフルオロボリル）−３,５−ジメチル−１Ｈ−ピロール−２−イル］メチレン｝−２Ｈ−ピロール−５−イル）プロパン酸（ＢＯＤＩＰＹ(R)ＦＬ）（５.０ｍｇ，１７μｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６.０ｍｇ，４５μｍｏｌ）、ｉ−Ｐｒ2ＥｔＮ（５μＬ，２９μｍｏｌ）、および、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（８.０ｍｇ，４２μｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を周囲温度で３.５時間撹拌し、溶媒を蒸発させ、残留物を、分取用ＲＰＨＰＬＣによって精製し、９.０ｍｇ（５５％）の明るい赤色の固体を得た。
1H NMR(300.132 MHz, CD3CN) δ 7.84 - 7.74(m, 2H), 7.72 - 7.60(m, 2H), 7.59 - 7.26(m, 15H), 7.00(d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.83(d, J = 6.9 Hz, 1H), 6.77 - 6.66(m, 1H), 6.62(d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.56 - 6.43(m, 1H), 6.31(d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.23(s, 1H), 5.64(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.04(t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.52および4.36(AB, J = 16.3 Hz, 2H), 4.18(五重項, J = 7.1 Hz, 1H), 3.50および3.44(AB, J = 14.9 Hz, 2H), 3.27 - 3.03(m, 6H), 2.51(s, 3H), 2.26(s, 3H), 1.55 - 1.19(m, 8H), 1.16(d, J = 7.1 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 987(M+Na+). LC/MS:2.83分. HRMS(TOF ES+)計算値:C54H56N7O7BF2(M+H)964.4380, 実測値:964.4369。
【００８１】
出発原料（１０ｇ）を説明されているようにして製造した：
【００８２】
【化５４】
2008523141.tif 000056
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１０ａ）
出発原料として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１ｃ）（３８３ｍｇ,０.８９８ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｈ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１０ａ）（２７５ｍｇ，９４％）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.55 - 7.46(m, 2H), 7.43 - 7.34(m, 3H), 7.30 - 7.19(m, 4H), 5.48(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.80および4.42(AB, J = 17.3 Hz, 2H), 4.17(d, J = 7.1 Hz, 1H), 3.81(s, 3H), 1.15(s, 2H); MS APCI, m/z = 327(M+H). LC/MS:1.54分。
【００８３】
【化５５】
2008523141.tif 000057
［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−酢酸メチルエステル（１０ｂ）
アミン成分として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−アミノ−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１０ａ）（２７０ｍｇ，０.８２７ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１０ｂ）（４１２ｍｇ，実質的に定量的な量）、これを精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.45 - 7.34(m, 5H), 7.32 - 7.19(m, 4H), 6.37(d, J = 6.5 Hz, 1H), 5.78(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.18(t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.77 - 4.60(m, 1H), 4.68および4.54(AB, J = 17.2 Hz, 2H), 4.05 - 3.88(m, 1H), 3.79(s, 3H), 1.40(s, 9H), 1.21(d, J = 7.1 Hz, 3H); MS ES+, m/z = 498(M+H). LC/MS:2.30分。
【００８４】
【化５６】
2008523141.tif 000058
［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−酢酸メチルエステル（１０ｃ）
出発原料として、［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−酢酸メチルエステル（１０ｂ）（４１１ｍｇ、０.８２７ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（７ｎ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１０ｃ）（３３２ｍｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.56 - 7.17(m, 9H), 5.74(d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.22(t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.72および4.51(AB, J = 17.2 Hz, 2H), 4.47(s, 3H), 3.33(q, J = 6.8 Hz, 1H), 1.18(d, J = 7.0 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 398(M+H). LC/MS:1.65分。
【００８５】
【化５７】
2008523141.tif 000059
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１０ｄ）
ＤＣＭ中で、アミン成分として、［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−酢酸メチルエステル（１０ｃ）（１６６ｍｇ，０.４１４ｍｍｏｌ）を用い、酸成分として、ｐ−ベンゾイルフェニル酢酸（１０８ｍｇ，０.４５０ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、シリカを用いたｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（１０ｄ）（２３３ｍｇ，９１％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.89 - 7.72(m, 4H), 7.66 - 7.18(m, 14H), 6.17(d, J
= 6.8 Hz, 1H), 5.85(d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.72(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.17(t, J = 7.
2 Hz, 1H), 4.67および4.55(AB, J = 17.3 Hz, 2H), 4.33 - 4.19(m, 1H), 3.79(s, 3H),
3.59(s, 2H), 1.21(d, J = 7.0 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 620(M+). LC/MS:2.39分。
【００８６】
【化５８】
2008523141.tif 000060
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１０ｅ）
出発原料として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１０ｄ）（２３３ｍｇ，０.３７６ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｄ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１０ｅ）（２２４ｍｇ，９８％）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.89 - 7.71(m, 4H), 7.68 - 7.12(m, 14H), 6.70(br s, 1H), 5.60(d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.30 - 5.07(m, 1H), 4.49および3.96(AB, J = 17.1 Hz, 2H), 4.19 - 3.85(m, 2H), 3.67(s, 2H), 0.92(d, J = 6.6 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 606(M+). LC/MS:2.42分。
【００８７】
【化５９】
2008523141.tif 000061
｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０ｆ）
アミン成分として、（５−アミノ−ペンチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９５ｍｇ，０.４７ｍｍｏｌ）を用い、酸成分として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１０ｅ）（２２０ｍｇ，０.３６０ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、シリカを用いたｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（１０ｆ）（１９１ｍｇ，６７％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.85 - 7.72(m, 4H), 7.60(t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.49(t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.44 - 7.23(m, 11H), 6.68 - 6.38(m, 1H), 6.22(br s, 0.5H), 5.99(br s, 0.5H), 5.70(d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.13(t, J = 7.3 Hz, 1H), 4.70 - 4.11(m, 3H), 3.73 - 2.82(m, 6H), 1.56 - 1.11(m, 9H), 1.42(s, 9H); MS ES+, m/z = 790(M+). LC/MS:2.51分。
【００８８】
【化６０】
2008523141.tif 000062
（Ｓ）−Ｎ−｛（６Ｒ,７Ｓ）−９−［（５−アミノ−ペンチルカルバモイル）−メチル］−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル｝−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオンアミド（１０ｇ）
出発原料として、｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（４−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０ｆ）（１９２ｍｇ，０.２４２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｈ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１０ｇ）（１６８ｍｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.82 - 7.59(m, 5H), 7.52(t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.47 -
7.25(m, 11H), 5.66(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.17(d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.67および4.40(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.23(q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.58(s, 2H), 3.28 - 3.13(m, 2H), 2.68(t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.62 - 1.42(m, 4H), 1.41 - 1.15(m, 5H); MS APCI, m/z = 690(M+). LC/MS:2.09分。
【００８９】
実施例１１
【化６１】
2008523141.tif 000063
アミン成分として、（Ｓ）−Ｎ−｛（６Ｒ,７Ｓ）−９−［（５−アミノ−ペンチルカルバモイル）−メチル］−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル｝−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオンアミド（１１ｄ）（２７ｍｇ，３９μｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１０）で説明されている手順に類似した手順を用いて、、分取用ＲＰＨＰＬＣで表題の化合物を単離することによって、明るい赤色の固体である表題の化合物（１１）を得た（１３ｍｇ，４０％、純度〜８３％）。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.81 - 7.58(m, 5H), 7.51(t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 -
7.26(m, 11H), 7.19(d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.98(d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.29(d, J = 4.1
Hz, 1H), 6.18(s, 1H), 5.66(d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.16(t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.66および4.37(AB, J = 16.4 Hz, 2H), 4.22(q, J = 7.4 Hz, 1H), 3.57(s, 2H), 3.24 - 3.09(m, 6H), 2.49(s, 3H), 2.25(s, 3H), 1.57 - 1.27(m, 8H), 1.22(d, J = 7.2 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 987(M+Na+). LC/MS:2.82分. HRMS(TOF ES+)計算値:C54H56N7O7BF2(M+H)964.4380, 実測値:964.4376。
【００９０】
出発原料（１１ｄ）を説明されているようにして製造した：
【００９１】
【化６２】
2008523141.tif 000064
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１１ａ）
ＤＣＭ中で、アミン成分として、［（６Ｒ,７Ｓ）−７−（（Ｓ）−２−アミノ−プロピオニルアミノ）−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル］−酢酸メチルエステル（１０ｃ）（１６６ｍｇ，０.４１４ｍｍｏｌ）を用い、酸成分として、ｍ−ベンゾイルフェニル酢酸（１０３ｍｇ，０.４２９ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、シリカを用いたｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（１１ａ）（２４５ｍｇ，９５％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.87 - 7.66(m, 4H), 7.63 - 7.18(m, 14H), 6.16(d, J
= 7.1 Hz, 1H), 5.85(d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.71(d, J = 7.1 Hz, 1H), 5.17(t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.67および4.54(AB, J = 17.3 Hz, 2H), 4.24(五重項, J = 7.0 Hz, 1H), 3.80(s, 3H), 3.56(s, 2H), 1.20(d, J = 6.9 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 620(M+). LC/MS:2.39分。
【００９２】
【化６３】
2008523141.tif 000065
（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１１ｂ）
出発原料として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸メチルエステル（１１ａ）（２４５ｍｇ，０.３９５ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｄ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１１ｂ）（２３４ｍｇ，９７％）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.90 - 7.38(m, 15H), 7.37 - 7.11(m, 3H), 6.70(d, J
= 6.8 Hz, 1H), 5.57(d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.23(t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.45および3.93(d, J = 17.1 Hz, 2H), 4.08 - 3.93(m, 1H), 3.81 - 3.62(m, 1H), 3.67(s, 2H), 0.94(d, J = 6.8 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 606(M+). LC/MS:2.42分。
【００９３】
【化６４】
2008523141.tif 000066
５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１ｃ）
アミン成分として、（５−アミノ−ペンチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９５ｍｇ，０.４７ｍｍｏｌ）を用い、酸成分として、（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−酢酸（１１ｂ）（２３０ｍｇ，０.３８０ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｇ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、シリカを用いたｆｃｃで精製した後に表題の化合物を得た（１１ｃ）（２３１ｍｇ，７７％）。
1H NMR(300.132 MHz, CDCl3) δ 7.80(d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.73 - 7.55(m, 3H), 7.51 - 7.21(m, 13H), 6.62 - 6.31(m, 1H), 6.25(br s, 0.5H), 5.95(br s, 0.5H), 5.69(d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.20 - 5.06(m, 1H), 4.68 - 4.11(m, 3H), 3.54(s, 2H), 3.39 - 3.11(m, 2H), 2.99(q, J = 6.1 Hz, 2H), 1.57 - 1.14(m, 6H), 1.42(s, 9H), 1.18(d, J = 6.9 Hz, 3H); MS ES+, m/z = 790(M+). LC/MS:2.52分。
【００９４】
【化６５】
2008523141.tif 000067
実施例１１：（Ｓ）−Ｎ−｛（６Ｒ,７Ｓ）−９−［（５−アミノ−ペンチルカルバモイル）−メチル］−８−オキソ−６−フェニル−６,７,８,９−テトラヒドロ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−７−イル｝−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオンアミド（１１ｄ）
出発原料として、｛５−［２−（（６Ｒ,７Ｓ）−７−｛（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−フェニル）−アセチルアミノ］−プロピオニルアミノ｝−８−オキソ−６−フェニル−７,８−ジヒドロ−６Ｈ−５−オキサ−９−アザ−ベンゾシクロヘプテン−９−イル）−アセチルアミノ］−ペンチル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１ｃ）（２３１ｍｇ，０.２９２ｍｍｏｌ）を用いたことを除き、実施例（１ｈ）で説明されている手順に類似した手順を用いて、表題の化合物を得て（１１ｄ）（２１１ｍｇ，実質的に定量的な量）、これをそれ以上精製しないで用いた。
1H NMR(300.132 MHz, MeOH) δ 7.83 - 7.73(m, 2H), 7.72 - 7.59(m, 3H), 7.58 - 7.23(m, 13H), 5.63(d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.14(d, J = 7.1 Hz, 1H), 4.64および4.40(AB, J
= 16.4 Hz, 2H), 4.21(q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.54(s, 2H), 3.28 - 3.16(m, 2H), 2.66(t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.60 - 1.42(m, 4H), 1.40 - 1.26(m, 2H), 1.20(d, J = 7.3 Hz, 3H); MS APCI, m/z = 690(M+). LC/MS:2.10分。
【００９５】
実施例１２：γ−セクレターゼの界面活性剤抽出物分析
γ−セクレターゼ酵素分析では、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）のトランケーションされた形態であるＣ１００の切断によって生成した、アミロイドβ（Ａβ）４０生成物の量を測定した。このＣ１００基質は、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から精製された組換えタンパク質である。γセクレターゼ酵素複合体は、ＨｅＬａ  ８Ａ８細胞膜からの界面活性剤による抽出によって製造される。この酵素反応液は、ＤＭＳＯストックから希釈した規定された濃度の阻害剤１０μｌを９６−ウェルマイクロプレートに含む（ＤＭＳＯの最終濃度は５％に維持した）。このプレートに、反応緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ,ｐＨ６.５，これは、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０.２５％Ｃｈａｐｓｏ、０.０１％ＰＥ、０.０１％ＰＣ、および、プロテアーゼカクテルを含む）、中のＣ１００基質２０μｌ（最終濃度６００ｎＭ）を添加した。ストックから２０倍希釈した酵素１０μｌの添加によって反応を開始させた。それぞれの分析で、この反応緩衝液とＣ１００との混合液中で希釈したＡβ４０の標準曲線を作製した。プレートを３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート時間の後に、抗体混合物５０μｌ：０.５％ウシ血清アルブミン、０.５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）を含むＤＰＢＳ（フィッシャー番号ＭＴ２１０３１ＣＶ）中、０.１６μｇ／ｍｌのウサギ抗Ａβ４０抗体（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）番号４４〜３４８１）、および、０.２５μｇ／ｍｌのビオチン化４Ｇ８（セネテック（Ｓｅｎｅｔｅｋ）番号２４０〜１０）、を添加した。次に、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次の朝、同じＤＰＢＳ緩衝液で希釈した０.０６２５ｍｇ／ｍｌのルテニウム標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（社内で標識された）と、１２５μｇ／ｍｌのストレプトアバジンビーズ（アイジェン（Ｉｇｅｎ）番号Ｍ２８０）との混合物５０μｌを添加して、切断生成物を検出した。室温で１時間インキュベートした後に、アイジェンＭシリーズ機器を用いて、電気化学発光によって結果を定量した。
【００９６】
実施例１３：γ−セクレターゼ全細胞分析（ＧＳＷＣ）
分析用細胞の製造：ヒトアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリンＩを安定して発現するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（フィッシャー番号ＭＴ１３５０１１ＣＶ）、０.２ｍｇ／ｍｌのｇ４１８（フィッシャー番号ＭＴ３０２３４ＣＲ）、および、１×濃度の抗生物質／抗真菌剤混合物（フィッシャー番号ＭＴ３０００４ＣＩ）を含むＤＭＥＭ培地（フィッシャーＭＴ１００１３ＣＶ）中で増殖させた。組織培養フラスコ中で細胞を増殖させ、１週間毎に１：３０の比率で継代させた。
【００９７】
試験化合物とインキュベートする３０分前に、細胞を、３ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ（フィッシャー番号ＭＴ２１０３１ＣＶ）で単分子層を処理することによって回収した。細胞を、完全増殖培地に２０００,０００細胞／ｍＬの密度に再懸濁した。
【００９８】
試験化合物をＤＭＳＯ中で３.３ｍＭの濃度で溶解させた。このストック溶液から、細胞の完全増殖培地で一連の希釈液を製造した。次に、一連の希釈液を、９６ウェルの分析プレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）番号３５９５）に、各ウェル１００μｌで移した。試験化合物を含む各ウェルに細胞（１００μｌ）を添加した。２種のコントロール、すなわち細胞のみを含むコントロール（全体）と、増殖培地のみを含むコントロール（バックグラウンド）も作製した。細胞培養インキュベーター中で、細胞を化合物と１４〜１６時間インキュベートした。
【００９９】
１４〜１６時間のインキュベートの最後に、各ウェルから、上清１００μｌをポリプロピレン製の９６ウェルプレートに移した。この上清を、０.５％ウシ血清アルブミン、０.５％トゥイーン（またはそれに相当するもの）、２０、０.２５μｇ／ｍＬのビオチン化４Ｇ８（セネテック番号２４０〜１０）、０.１８μｇ／ｍＬのウサギ抗Ａβ４０抗体（バイオソース番号４４〜３４８１）、０.０４５μｇ／ｍＬのルテニウム標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（社内で標識された）、および、６０μｇ／ｍＬのストレプトアバジンビーズ（アイジェン番号Ｍ２８０）を含むＤＰＢＳ（フィッシャー番号ＭＴ２１０３１ＣＶ）１００μＬと混合した。この混合物を、プレート振盪機で、４℃で４〜６時間インキュベートした。
【０１００】
４〜６時間のインキュベートが完了した後、プレートを室温にし、アイジェンＭ８解析器を用いて生成したＡβ４０を検出した。生データをマイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）ソフトウェアにインポートした。エクセル−フィット（Ｅｘｃｅｌ−Ｆｉｔ）を用いて、試験化合物によるＡβ４０生成阻害に関するＩＣ50値を計算した。
【国際調査報告】
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