(57)【要約】【課題】  テガフールと実質的に交差反応しない抗体を提供することによって、５−ＦＵで治療されている患者の治療管理用の５−ＦＵのレベルを正確にモニターすることができる５−ＦＵ免疫測定法を提供すること。【解決手段】  一般式  【化７８】2008530528.tif 000081  （式中、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘはポリアミンポリマーに結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）  の化合物を有する免疫原のポリアミンポリマーの共役である免疫原の使用により、５−ＦＵに特異で、ウラシル、シトシンといった他のピリミジン塩基と同様に、テガフールと実質的に反応しない、又は結合しない抗体を生産することが見出された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試料と、
ｂ）テガフールに実質的に交差反応しない５−フルオロ−ウラシルに選択的に反応する抗体と、
ｃ）一般式
【化１】
2008530528.tif 000028
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物、
一般式
【化２】
2008530528.tif 000029
（式中、Ｘ、Ｙ及びｐは前記のとおり）
の化合物、
又は、それの混合物を伴う担体の共役と
の混合物を用意することを含む試料中の５−フルオロ−ウラシルを検出するための免疫測定法であって、
試料中の５−フルオロ−ウラシル及び前記抗体に結合する前記共役を生じさせ、その後、試料中の５−フルオロ−ウラシルの存在を測定可能とすることによって前記抗体に結合又は未結合の前記混合物中の前記共役量を測定することを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、前記試料はヒトの試料であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項３】
請求項２記載の免疫測定法であって、前記抗体は、
一般式
【化３】
2008530528.tif 000030
（式中ｐ、Ｘ及びＹは前記のとおり）
の化合物と共役するポリアミンポリマーを含む免疫原担体を有する免疫原から生じることを特徴とする免疫測定法。
【請求項４】
請求項２記載の免疫測定法であって、前記抗体は固形支持体に付着していることを特徴とする免疫測定法。
【請求項５】
請求項４記載の免疫測定法であって、前記固形支持体はマイクロタイタープレートであることを特徴とする免疫測定法。
【請求項６】
請求項４記載の免疫測定法であって、前記固形支持体は微小粒子であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項７】
選択的に５−フルオローウラシルに結合し、実質的にテガフールに結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項８】
請求項７記載の抗体であって、前記抗体はモノクロナール抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項８記載の抗体であって、前記抗体はマウス、ウサギ又はラット由来のものであることを特徴とする抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の抗体であって、前記抗体は実質的にウラシル及びシトシンと交差反応しないことを特徴とする抗体。
【請求項１１】
請求項７記載の抗体であって、前記抗体は、
一般式
【化４】
2008530528.tif 000031
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘはポリアミンポリマーに結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物に共役したポリアミンポリマーを含む免疫原担体由来のものであることを特徴とする抗体。
【請求項１２】
請求項１１記載の抗体であって、前記抗体はモノクロナール抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１３】
請求項１１記載の抗体であって、前記抗体は、マウス、ウサギ又はラット由来のものであることを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項１３記載の抗体であって、前記抗体は実質的にウラシル及びシトシンと交差反応しないことを特徴とする抗体。
【請求項１５】
一般式
【化５】
2008530528.tif 000032
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物。
【請求項１６】
請求項１５記載の化合物であって、ｐは０であることを特徴とする化合物。
【請求項１７】
請求項１６記載の化合物であって、Ｘは、
【化６】
2008530528.tif 000033
、
【化７】
2008530528.tif 000034
、又は
【化８】
2008530528.tif 000035
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項１８】
請求項１７記載の化合物であって、Ｘは、
【化９】
2008530528.tif 000036
であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする化合物。
【請求項１９】
請求項１７記載の化合物であって、Ｘは、
【化１０】
2008530528.tif 000037
であり、Ｒ３は反応エステルであることを特徴とする化合物。
【請求項２０】
請求項１９記載の化合物であって、前記形成されるエステルは低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルであることを特徴とする化合物。
【請求項２１】
請求項１５記載の化合物であって、ｐは１であることを特徴とする化合物。
【請求項２２】
請求項２１記載の化合物であって、Ｙは、
１〜１０の炭素原子を有するアルキレン、
【化１１】
2008530528.tif 000038
、
【化１２】
2008530528.tif 000039
、又は
【化１３】
2008530528.tif 000040
（式中、ｎ及びｏは０〜６の整数、ｍは１〜６の整数）
であることを特徴とする化合物。
【請求項２３】
一般式
【化１４】
2008530528.tif 000041
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物又はその混合物。
【請求項２４】
請求項２３記載の化合物であって、ｐは０であることを特徴とする化合物。
【請求項２５】
請求項２４記載の化合物であって、Ｘは、
【化１５】
2008530528.tif 000042
、
【化１６】
2008530528.tif 000043
、又は
【化１７】
2008530528.tif 000044
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄）
であることを特徴とする化合物。
【請求項２６】
請求項２５記載の化合物であって、Ｘは、
【化１８】
2008530528.tif 000045
であり、
Ｒ３は水素であることを特徴とする化合物。
【請求項２７】
請求項２６記載の化合物であって、Ｘは、
【化１９】
2008530528.tif 000046
であり、
Ｒ３は反応エステルを形成することを特徴とする化合物。
【請求項２８】
請求項２７記載の化合物であって、前記形成されるエステルは低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルであることを特徴とする化合物。
【請求項２９】
請求項２３記載の化合物であって、ｐは１であることを特徴とする化合物。
【請求項３０】
請求項２９記載の化合物であって、Ｘは、
【化２０】
2008530528.tif 000047
、
【化２１】
2008530528.tif 000048
、又は
【化２２】
2008530528.tif 000049
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項３１】
請求項３０記載の化合物であって、Ｙは、
１〜１０の炭素原子を有するアルキレン、
【化２３】
2008530528.tif 000050
、
【化２４】
2008530528.tif 000051
又は
【化２５】
2008530528.tif 000052
（式中、ｎ及びｏは０〜６の整数、ｍは１〜６の整数）
であることを特徴とする化合物。
【請求項３２】
一般式
【化２６】
2008530528.tif 000053
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物を伴う担体の共役。
【請求項３３】
請求項３２記載の共役であって、ｐは０であることを特徴とする共役。
【請求項３４】
請求項３３記載の共役であって、Ｘは、
【化２７】
2008530528.tif 000054
、
【化２８】
2008530528.tif 000055
、又は
【化２９】
2008530528.tif 000056
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄である）
であることを特徴とする共役。
【請求項３５】
請求項３２記載の共役であって、ｐは１、Ｙは、
１〜１０の整数の炭素原子を有するアルキレン、
【化３０】
2008530528.tif 000057
、
【化３１】
2008530528.tif 000058
又は
【化３２】
2008530528.tif 000059
（式中、ｎ及びｏは０〜６の整数、ｍは１〜６の整数）
であることを特徴とする共役。
【請求項３６】
請求項３５記載の共役であって、担体は、
【化３３】
2008530528.tif 000060
又は
【化３４】
2008530528.tif 000061
（式中、Ｒ４は酸素又は硫黄）
によって結合された１つ以上のアミノ基を含むことを特徴とする共役。
【請求項３７】
一般式
【化３５】
2008530528.tif 000062
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物を伴う担体の共役。
【請求項３８】
請求項３７記載の共役であって、ｐは０であることを特徴とする共役。
【請求項３９】
請求項３８記載の共役であって、Ｘは、
【化３６】
2008530528.tif 000063
、
【化３７】
2008530528.tif 000064
、又は
【化３８】
2008530528.tif 000065
（式中、Ｒ３は、水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄）
であることを特徴とする共役。
【請求項４０】
請求項３７記載の共役であって、ｐは１であることを特徴とする共役。
【請求項４１】
請求項４０記載の共役であって、Ｙは、
１〜１０の整数の炭素原子を有するアルキレン、
【化３９】
2008530528.tif 000066
、
【化４０】
2008530528.tif 000067
又は
【化４１】
2008530528.tif 000068
（式中、ｎ及びｏは０〜６の整数、ｍは１〜６の整数）
であることを特徴とする共役。
【請求項４２】
請求項４１記載の共役であって、Ｘは、
【化４２】
2008530528.tif 000069
、
【化４３】
2008530528.tif 000070
、又は
【化４４】
2008530528.tif 000071
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄）
であることを特徴とする共役。
【請求項４３】
一般式
【化４５】
2008530528.tif 000072
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘはポリアミンポリマーに結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物に結合するポリアミンポリマーを含む免疫原担体を含む免疫原。
【請求項４４】
請求項４３記載の免疫原であって、ｐは０であることを特徴とする免疫原。
【請求項４５】
請求項４３記載の免疫原であって、ｐは１であることを特徴とする免疫原。
【請求項４６】
請求項４５記載の免疫原であって、Ｙは、
１〜１０の整数の炭素原子を有するアルキレン、
【化４６】
2008530528.tif 000073
、
【化４７】
2008530528.tif 000074
又は
【化４８】
2008530528.tif 000075
（式中、ｎ及びｏは０〜６の整数、ｍは１〜６の整数）
であることを特徴とする免疫原。
【請求項４７】
請求項４６記載の免疫原であって、免疫原ポリマーは、
【化４９】
2008530528.tif 000076
又は
【化５０】
2008530528.tif 000077
（式中、Ｒ４は酸素又は硫黄）
によって結合される１つ以上のアミノ基を含むことを特徴とする免疫原。
【請求項４８】
分離した容器に試薬を含み、患者試料中の５−フルオローウラシルの存在を検出するキットであって、
試薬の１つは、一般式
【化５１】
2008530528.tif 000078
（式中、Ｙは有機スペーシング基、Ｘは担体に結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物に伴う担体の共役、
又は、一般式
【化５２】
2008530528.tif 000079
（式中、Ｘ，Ｙ及びｐは上述のとおり）
又は、それらの混合物であり、
第２の容器は、５−フルオロ−ウラシルに実質的に選択的に反応し、テガフール又はウラシルに実質的に交差反応しない抗体を含むことを特徴とするキット。
【請求項４９】
請求項４８記載のキットであって、前記共役は前記第１の容器に予め決められた量存在することを特徴とするキット。
【請求項５０】
請求項４９記載のキットであって、前記キットは前記試料中の５−フルオロ−ウラシルの量を測定するのに用いられることを特徴とするキット。
【請求項５１】
請求項４８記載のキットであって、前記抗体は、
一般式
【化５３】
2008530528.tif 000080
（式中、ｐ、Ｘ及びＹは上述のとおり）
の化合物に結合する免疫原ポリアミンポリマーの免疫原から生じることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、存在を決定し及び／又は化学療法中に急速に最適な薬物濃度を決定するために、ヒトの生体試料中の５−フルオロ−ウラシル（５−ＦＵ）の存在の決定及び／又はその量を定量化するための免疫学の評価の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、身体の一部の細胞がコントロールできずに成長し始める場合に発展するという共通の特性をすべて共有する一群の悪性腫瘍について記述するために使用される用語である。ほとんどの癌は腫物として生ずるが、血液にも同様に現れ、それらが成長する他の組織を通して循環することもある。癌悪性腫瘍には、外科、化学療法、放射線治療、及びこれらの組み合わせが最も一般に扱われる。特定の癌を治療するために使用される治療のタイプは、癌悪性のタイプ、およびそれが診断された段階を含むいくつかの要因に依存する。
【０００３】
５−ＦＵは、胸と結腸直腸癌の治療に使用される、より一般に使用された細胞毒性薬のうちの１つである。この化学療法薬は下記一般式で表わされる。
【０００４】
【化５４】
2008530528.tif 000002
【０００５】
この化合物は、骨髄密度ロス、粘膜炎、吐き気および嘔吐のような衰弱させる副作用に関係している。身体中の５−Ｆのレベルのモニタリング及び服用量の調節によって、これらの副作用を、患者の中で一層よく調整し制限することができる。
【０００６】
同時に、多くの場合５−ＦＵの服用量と、治療効果に影響する血清薬物濃度の結果との間に非常に可変関係がある。個人間での５−ＦＵの薬物動能学の可変性の程度は１０倍にもなることがあり（非特許文献１参照）、次のものを含む多くの要因によって強い影響が生じる。
・器官機能
・遺伝子調節
・病状
・年齢
・薬物間相互作用
・薬物接摂取時間
・投薬の方法
・投薬に関するテクニック
この可変性の結果、異なる個人が同じ薬を等しい量で服用して、結果的に劇的に異なる臨床結果をもたらされることもある（非特許文献２参照）。同じ５−ＦＵ投薬の有効性は、個々の薬物クリアランスおよび患者の中の最終の血清薬物濃度に基づいて著しく変わる。治療薬管理によって、臨床医に経口薬の投与および静脈注射用薬の投与の両方で患者の個々の変化を洞察することができるだろう。治療薬管理によって、患者への投薬を個別的に取り扱うことができるかもしれない。また、望まない副作用なしで癌を有効に治療する見込みは、はるかに高いだろう（非特許文献３）。
【０００７】
さらに、５−ＦＵの治療薬管理は、実際に処方された投薬及び効果的効な血清濃度レベルの達成を備えた投薬化学療法を施す際にコンプライアンスを保証する優れたツールとして役立つだろう。血清濃度での可変性は生理学の要因によるだけでなく、投薬技術および身体が５−ＦＵを吸収する能力における変化にさらに起因することがあることが分かった。化学療法薬として、５−ＦＵは以下に表わされる構造を有するテガフールとしてそのプロドラッグ形式で投薬することができる。
【０００８】
【化５５】
2008530528.tif 000003
【０００９】
テガフールは、患者に投薬されると、異なる割合で患者に５−ＦＵへ通常吸収され代謝される。したがって、免疫測定法による患者の中の５−ＦＵのレベルをモニタリングする際、免疫測定法が、不活性物質であるテガフールと、テガフールが代謝してなる活性物質である５−ＦＵとを識別することができる、ということが重要である。５−ＦＵの抗体に関する問題は、それらがこれらの免疫測定法を有用でなくするテガフールと交差反応し得るということである。  
【非特許文献１】Diasio  et. al. J. Clin. Invest.８１：pp４７−５１，１９８８，Ｗei  et. al. J. Clin. Invest．９８：pp６１０−６１５，１９９６
【非特許文献２】Hon  et. al.  Clinical Chemistry ４４、pp ３８８−４００，１９９８
【非特許文献３】Nieto，Current  Drug  Metabolism２：pp５３−６６，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
５−ＦＵの型通りの治療薬管理では、一般的な実験装置に適応可能な単純な自動テストに利用できることが要求されるだろう。最もこれらの基準に適合するテストは免疫測定法である。現在、利用可能な５−ＦＵの免疫測定法はなく、この薬のモニタリングレベルは、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Escoriaza et．al．J. of Chromatography B: Biomedical Sciences and applications, 736(1+2): pp 97-102,1999）のような物理的方法によって導かれる。薬のレベルをモニタリングするにあたって最も有効にするために、抗体は５−ＦＵに最も特異的であるべきであり、関連するピリミジン塩基、特にテガフールへの非交差反応性に対して非常に低い交差反応性を示すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、他の妨害ピリミジン塩基、ウラシル及びシトシンと同様にテガフールに実質的に交差反応することなく５−ＦＵに結合するために、５−ＦＵに実質的に選択的に反応する新しい抗体クラスが生産される。選択的反応とは、本抗体が５−ＦＵ分子と反応し、５−ＦＵの類似化合物のような他の妨害ピリミジン塩基と実質的に反応しないことを意味する。最も重要な妨害ピリミジン塩基はテガフールである。テガフールと実質的に交差反応しない抗体を提供することによって、５−ＦＵで治療されている患者の治療管理用の５−ＦＵのレベルを正確にモニターすることができる５−ＦＵ免疫測定法を提供することが可能となる。
【００１２】
一般式
【００１３】
【化５６】
2008530528.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｙは有機スぺーシング基（organic  spacing  group）、Ｘはポリアミンポリマーに結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物を有する免疫原のポリアミンポリマーの共役である免疫原の使用により、５−ＦＵに特異で、ウラシル、シトシンといった他のピリミジン塩基と同様に、テガフールと実質的に反応しない、又は結合しない抗体を生産することが見出された。
【００１５】
５−ＦＵと本質的に選択的に反応し、テガフールと交差反応しないこれらの抗体が供給されることによって、５−ＦＵで治療されている患者の流動性の試料中に５−ＦＵを特に検出しモニターすることができる免疫測定法を提供することが可能となる。さらに、前記免疫測定法用の試薬およびキットが本発明内に含まれている。テガフールの存在は、不適当な５−ＦＵ免疫測定法で偽陽性判断を生じさせる主な原因である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明によれば、５−ＦＵに実質的に選択的に反応し、ウラシル及びシトシンといった他の妨害ピリミジン塩基と同様に、テガフールと実質的に反応しない又は交差反応しない新しいクラスの抗体が提供される。免疫原として一般式ＩＩ−Ａの３位置換５−ＦＵ誘導体を使用することを通じて、本発明の新しいクラスの抗体が提供されることが発見された。これらの抗体の使用を通じて、血液、血漿あるいは他の体液試料中の５−ＦＵの検出及び／又は定量のためのそのような免疫測定法用の試薬及びキットを含む免疫測定法が開発された。この免疫測定法の使用によって、体液試料（好ましくは血液または血漿の試料）中の５−ＦＵの存在および量を検知しかつ／または定量することができる。このように、５−ＦＵで治療されている患者は治療の間モニターされ、前記モニタリングに従って治療を調整することができる。本発明によって、化学療法薬として５−ＦＵが取り扱われている癌患者での５−ＦＵの治療上の薬管理が成し遂げられる。
【００１７】
本発明の免疫測定法の中で利用される試薬は、一般式
【００１８】
【化５７】
2008530528.tif 000005
【００１９】
（ｐ、Ｘ及びＹは上述のとおり）
の１位置換５−ＦＵ化合物を備えた担体の共役、又は
【００２０】
【化５８】
2008530528.tif 000006
【００２１】
（式中、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘはポリアミンポリマーに結合可能な末端官能基、ｐは０〜１の整数）
の化合物、又はそれの混合物である。
【００２２】
一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの試薬では、担体は、免疫測定法を実行する際に利用された従来の試薬担体のいずれかであってもよく、好ましくは、これらの担体には検出のために標識が付けられる。検定中で用いられる試薬を形成する際に利用される一般式ＩＩ−Ａの化合物では、Ｘは担体に結合することができる任意の官能基になりえる。好ましい担体は、反応性アミノ基を有する重合体のポリアミンポリマーを含んでおり、Ｘはポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である。
【００２３】
本発明の免疫測定法では、これらの共役は、本発明の抗体と結合するための試料中に存在する５−ＦＵとの競合的結合パートナーである。したがって、抗体に結合する共役試薬の量は、試料中の５−ＦＵの量に反比例するだろう。本発明に従って、測定法は、抗体に結合する又は結合していない前記共役の量を検出および測定するためにどんな従来の測定手段でも利用する。
【００２４】
前記手段の使用を通じて、結合又は結合していない共役の量を測定することができる。一般に、試料中の５−ＦＵの量は、試料中の５−ＦＵによって生じた結合または結合していない共役の測定量と、既知量の５−ＦＵを含むスタンダードまたは較正曲線の資料から測定された結合又は結合してない共役値とを相互に関連付けることによって測定される。その既知量は試料としてテストされる推定範囲にある。較正曲線を作るためのこれらの研究は試料に使用されるのと同じ免疫測定法手続きを用いて測定される。
【００２５】
共役は一般式ＩＩ−ＡおよびＩＩ−Ｂの化合物から生成される一方、免疫原は一般式ＩＩＩ−Ａの化合物から生成される。本発明に従って免疫測定法を行なう際に、一般式ＩＩ−ＡあるいはＩＩ−Ｂの化合物から共役が形成され、免疫原が一般式ＩＩ−Ａの化合物から形成されることは重要である。免疫原を含む共役では、ポリアミンポリマーは、一般式。
【００２６】
【化５９】
2008530528.tif 000007
【００２７】
（式中、Ｙとｐは上述のとおりであり、Ｘ´は−ＣＨ２−又は官能結鎖グループ）
からなる配位子部分と共役し、
一般式ＩＩ−Ｂの化合物の官能結鎖部分は次に示す一般式からなる。
【００２８】
【化６０】
2008530528.tif 000008
【００２９】
（式中、Ｘ´、Ｙ及びｐは上述のとおり）
これらの配位子部分は、共役の担体上で１つ以上の活性部位であってもよい。
【００３０】
（定義）
この記述の全体にわたって、次の定義の意に解釈される。
【００３１】
「免疫原」、「免疫原の」という用語は、有機体中の免疫反応を誘発する、作り出す、又は生じさせることが可能な物質を指す。
【００３２】
「共役」という用語は、2つの部分をともに結合することから形成された物質を指す。本発明に従う代表的な共役は、一般式ＩＩ―Ｂの化合物のような小さな分子と、担体やポリアミン・ポリマー（特にタンパク質）のような大きな分子とがともに結合することによって作られたものを含む。共役では、小さな分子は大きな分子の１つ以上の活性部位と結合されてもよい。
【００３３】
「ハプテン」は部分的または不完全な抗原である。それらは、抗体形成を刺激することができないが、抗体と反応する、タンパク質なしの物質（ほとんど低い分子量物質）である。後者は、高い分子量の免疫原担体にハプテンが結合し、この結合物、例えば免疫原、を人間または動物の被験者に注射することによって形成される。本発明のハプテンは、５−ＦＵである。
【００３４】
ここで使用されるように、「スぺーシング基」あるいは「スペーサ」は、ＣＨ２あるいは官能結鎖基により、ハプテン、担体、免疫原、標識あるいはトレーサのような２つ以上の下部構造を接続する化学構造の一部を指す。これらのスペーサ基は、本出願で後述で列挙する。スぺーシング基の原子及びスぺーシング基内の鎖の原子は、化学結合によってそれら自身接続される。好ましいスペーサは、直鎖か分岐鎖か、飽和か不飽和の炭素鎖である。これらの炭素鎖は、さらに鎖内で、あるいは鎖の末端で、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。「ヘテロ原子」は、酸素、窒素および硫黄からなる基から選ばれる、炭素以外の原子を意味する。スぺーシング基は、さらに鎖の一部又は鎖内の原子のうちの１つと置換して、環式又は芳香族基を含んでいてもよい。
【００３５】
スぺーシング基中の原子の数は水素以外の原子を数えることにより決定される。スぺーシング基内の鎖中の原子の数は、接続している下部構造間の最短のルートに沿った水素以外の原子の数を数えることにより決定される。官能結鎖基は、ハプテンと標識又は担体又はポリアミンポリマーとの共役を合成するためのハプテン又はスぺーシング基を活性化する、例えば、利用可能な官能部をオンする、ために使用されてもよい。
【００３６】
ここで使用される「免疫原の担体」という用語は、免疫原物質（一般にタンパク質）であり、それはハプテンと結合することができ、この場合５−ＦＵあるいは記述された一般式ＩＩ−Ａの５−ＦＵ誘導体であり、それによってこれらのハプテン誘導体が免疫反応を引き起こすことができるようにし、これらのハプテンと特異的に結合する抗体の生成を誘発する。免疫原担体及び結鎖基は、本明細書で後述して列挙されるだろう。免疫原の担体物質は、宿主から異物として認識され、それによって免疫原反応を誘発する、タンパク質、糖タンパク質、複合ポリアミノ−多糖類、粒子、及び核酸である。ポリアミノ−多糖類は、この生成で知られている従来の手段を使用して、多糖から生成されてもよい。さらに様々なタンパク質タイプが、ポリ（アミノ酸）免疫原担体として使用されてもよい。これらのタイプは、アルブミン、血清蛋白質、リポタンパク質などを含んでいる。実例となるタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、牛のチログロブリン（ＢＴＧ）などを含んでいる。あるいは、合成ポリ（アミノ酸）を利用してもよい。
【００３７】
免疫原担体はさらにポリアミノ多糖類を含んでもよい。それは、単糖の繰り返しの縮合によって作られた高分子量ポリマーである。多糖類の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴムのような炭水化物ガム、寒天などである。多糖類はさらにポリアミノ酸残基および／または脂肪酸残基を含んでいる。
【００３８】
免疫原の担体は、さらに単独または上述のポリ（アミノ酸）又は多糖類の内の１つに共役するポリ（核酸）であってもよい。
【００３９】
免疫原担体はさらに固形粒子を含んでいてもよい。粒子は、大体少なくとも約０．０２ミクロン(μm)で約１００μm以下であり、そして通常およそ０．０５〜１０μｍの直径である。粒子は有機又は無機であってもよく、膨張可能又は膨張不可能であってもよく、多孔性又は非多孔性であってもよく、水に近い最適密度が通常約０．７〜１．５ｇ／ｍＬであり、透明な、又は部分的に透明な、又は不透明な物質から構成されている。粒子は、赤血球、白血球、リンパ細胞、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌およびウィルスのような例に制限されない細胞及び微生物のような生体物質であってもよい。粒子は、更に有機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞あるいはリポタンパク質で構成されていてもよい。
【００４０】
「ポリ（アミノ酸）」あるいは「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されたポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、約２，０００分子量から、分子量の上限はなく、通常１０，０００，０００未満、通常多くても約６００，０００ダルトンの範囲にある。免疫原担体あるいは酵素が含まれているかどうかに依存して、通常範囲が異なるだろう。
【００４１】
「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２つ以上のアミノ酸の結合によって形成された化合物であり、通常α―アミノ酸のポリマーであり、各アミノ酸残基（ＮＨ２末端を除く）のα―アミノ基が線鎖中の隣の残基のα―カルボキシ基に結合している。ここでは、ペプチド、ポリペプチドおよびポリ（アミノ酸）という用語を、サイズに関する制限なく、この種の化合物を現すために同じ意味で使用する。この種の最大の部分はタンパク質と言う。
【００４２】
「標識」、「検出分子」あるいは「トレーサ」は、検出信号を作る、あるいは作ることを引き起こすことができるあらゆる分子である。標識は、分析物、免疫源、抗体、又は、受容体や配位子（特にハプテン）のような受容体に結合し得る分子のような他の分子に、共役することができる。標識の制限されない例は、放射性同位体および酵素、酵素破片、酵素基質、酵素阻害物、補酵素、触媒、蛍光物質、染料、化学ルミネセンス、ルミネセンス、又は感光剤を含み、磁性がない又は磁性のある粒子、固形支持体、リポソーム、配位子あるいは受容体を含む。
【００４３】
用語「抗体」は、抗原の結合パートナーである特異タンパク質を指し、他の物質を除外して抗原に対して特異結合親和力を持つ物質又は物質のグループである。一般的な用語の抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体および抗体断片を包含する。
【００４４】
用語「誘導体」は、１つ以上の化学反応によって母化合物から作られた化合物か分子を指す。
【００４５】
一般式ＩＩ−Ｂの共役の形成のための用語「担体」は、上述したような免疫原ポリマーのような固形粒子及び／又は重合体ポリマーを指す。担体が固形粒子である場合、固形粒子は、一般式ＩＩ−Ｂの化合物中の末端官能基Ｘに結合するための１つ以上の反応部位を提供するためのポリアミンポリマーに結合される、覆われる、あるいは付着されていてもよい。
【００４６】
用語「試薬キット」又は「テストキット」は、測定を行うのに使われる用具一式を指す。試薬は、それらの交差反応性および安定性、液中かあるいは凍結乾燥状態下であるかによって、同じ又は個別の容器の中に化合物がパッケージされた状態で提供することができる。キット中に供給される試薬の量および割合は、個々の用途に最適の結果がでるように選択することができる。本発明の特徴を具体化する試薬キットは、５−ＦＵに特異な抗体を含んでいる。キットは、さらに分析物の配位子及び較正制御物質を含んでいてもよい。試薬は液体の形態で残ってもよいし、凍結乾燥されていてもよい。「較正制御物質」という表現は、測定される薬の既知量を含んでいる任意の標準あるいは参照物質を指す。薬の濃縮は、標準に対して得られた結果と未知の資料に対して得られた結果との比較により計算される。これは、較正曲線を描くことにより一般に行われる。
【００４７】
用語「生体試料」は、生き物あるいは以前は生きているものからの物質の任意の量を含むが、これに限定されるものではない。そのような生き物は、人間、マウス、猿、ラット、ウサギ、馬、及び他の動物を含むが、これらに限定されるものではない。そのような物質は、血液、血清、血漿、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ液、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、骨膜マクロファージ、内皮細胞、及び皮膚を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
（試薬と免疫原）
免疫測定法を構築する際、５−ＦＵの共役は、本発明の抗体上の結合部位に対して試料中の５−ＦＵと競合するために構築される。本発明の免疫測定法では、本発明の抗体を生産するための免疫原は、一般式ＩＩＩ−Ａの化合物の３位置換５−ＦＵ誘導体である。また、試薬は、一般式ＩＩＩ−ＡまたはＩＩＩ-Ｂの１位置換５−ＦＵ誘導体である。一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物では、リンカースペーサは、この分子の−ＣＨ２−（Ｙ）ｐ−Ｘ´−部分を構成する。リンカーＸ´及びスペーサ−ＣＨ２−（Ｙ）ｐ−は、共役と免疫原の生成において一般的である。免疫測定法のための共役と免疫原を生成するために利用された従来のスペーサ結鎖基のうちのどれでも、一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物で利用することができる。そのような従来のリンカーおよびスペーサは米国特許５，５０１，９８７および米国特許５．１０１，０１５に開示されている。
【００４９】
好ましいスペーサ基の中に、上述したスペーサ基が含まれている。特に好ましいスぺーシング基は、１〜１０の炭素原子を含むアルキレン、
【００５０】
【化６１】
2008530528.tif 000009
【００５１】
【化６２】
2008530528.tif 000010
【００５２】
、又は
【００５３】
【化６３】
2008530528.tif 000011
【００５４】
（式中、ｎとoは０から６までの整数、ｍは１から６までの整数であり、特に好ましいスぺーシング基であるアルキレンを伴う。）
【００５５】
Ｙによって表わされる上記の構造に関して、それらの末端で構造の右側、例えば（ＣＨ2）ｏ又は（ＣＨ２）ｍによってあらわされる端部、で末端官能基Ｘはこれらの置換基に結合する。
【００５６】
一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物では、Ｘ´は、−ＣＨ２−又はスペーサ、好ましくはポリマーや担体上のアミン基と連結する官能基である。基Ｘ´は、担体か免疫原のいずれかとして使用されたポリアミンポリマー中のアミノ基に結合可能な一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中の末端官能基Ｘの結末である。アミンと反応可能などんな末端官能基も、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中の官能基Ｘとして利用することができる。好ましくはＸ中に含まれたこれらの末端官能基は、
【００５７】
【化６４】
2008530528.tif 000012
【００５８】
【化６５】
2008530528.tif 000013
又は
【００５９】
【化６６】
2008530528.tif 000014
【００６０】
（式中、Ｒ３は水素又は反応エステルをなす酸素原子と結合して得られ、Ｒ４は酸素または硫黄である）
である。基
【００６１】
【化６７】
2008530528.tif 000015
は、イソシアン酸塩、あるいはイソチオシアン酸塩とすることができる。ＯＲ３によって形成された活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、１位置換ヒドロキシベンゾトリアゾール及びp-ニトロフェニルエステルのようなイミドエステルを含んでいる。しかしながら、アミン基と反応することができるどんな活性エステルも使用することができる。カルボキシル基及び活性エステルは、担体又は免疫原ポリマーに従来の手段によって結合される。タンパク質のようなポリアミンポリマー上のアミン基は、ポリマー、免疫原又は担体、及び／又は本発明の共役にスペーサを接続するアミド基を生成する。
【００６２】
本発明の免疫原及び共役では、５−ＦＵハプテンを含むカルボキシル基と、担体または免疫原上のポリアミンポリマー上のアミノ基との間の化学結合は、当業者に既知の様々な方法を使用して確立することができる。アミド結合を形成することはしばしば望ましい。アミド結合は、脱離試薬（例えばＮ―ヒドロキシスクシンイミド、１位置換ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノールなど）でカルボキシル基を反応させることにより、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中の５−ＦＵハプテンのカルボン酸半分を最初に活性化することにより形成される。ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどのような活性化試薬を使用することができる。その後、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの５−ＦＵハプテン中のカルボキシル基の活性形態を、タンパク質担体を含んでいる緩衝液に反応させる。
【００６３】
一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの５―ＦＵ誘導体が、カルボキシル基と同様に第１又は第２アミノ基を含んでいる場合、共役がそれら自身と反応するのを防ぐために、活性化とカップリング反応の間に、アミン保護基を使用することが必要である。典型的には、共役上のアミンは、対応するＮ−トリフルオロアセトアミド、Ｎ−第三ブチルオキシカルボニルウレタン（Ｎ−ｔ−ＢＯＣウレタン）、Ｎ-カルボベンジルオキシウレタンあるいは同様の構造物の生成によって保護される。上述のように、一旦免疫原ポリマー又は担体へのカップリング反応が遂行されたならば、アミン保護基を、免疫原あるいは共役の構造を別なふうに変更しない試薬を使用して削除することができる。そのような試薬および方法は、当業者に知られており、弱い又は強い水性か無水の酸、弱い又は強い水性か無水の塩基、水素化ホウ素ナトリウムや水素化シアノホウ素ナトリウムのような水素化物を含む試薬、および触媒的水素添加手法がある。ハプテンと担体を共役する様々な方法もまた、米国特許３，９９６，３４４および米国特許４．０１６，１４６に開示されていおり、それらは参照としてここに含まれている。
【００６４】
他方、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物においてＸが末端イソシアン酸塩かチオイソシアン酸塩である場合、ポリアミンポリマーのフリーアミンと反応した時、これらの遊離基は、一般式ＩＩ−Ｂの共役又はＸ´が次式で表わされる免疫原を生成する。
【００６５】
【化６８】
2008530528.tif 000016
【００６６】
（式中、Ｒ４は上記のとおりであり、担体又は免疫原ポリペプチドに機能的に結合する。）
【００６７】
一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物におけるＸがアルデヒド基である場合、これらの化合物は、還元アミノ化によるアミン結合によって、ポリアミンポリペプチドか担体のアミン基に連結していてもよい。還元アミノ化によってのようなアミンを備えたアルデヒドを濃縮するどんな従来方法も、この結合を形成するために使用することができる。この場合、一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの配位子部分中のＸ´は−ＣＨ２−である。
【００６８】
一般式
【００６９】
【化６９】
2008530528.tif 000017
【００７０】
の化合物を生成するために、一般式Ｉの化合物中の１位置換窒素原子は、５−ＦＵと一般式
【００７１】
【化７０】
2008530528.tif 000018
【００７２】
（式中、Ｒ１は塩素又は臭素、Ｙ、ｐ及びＸは上述のとおり）
のハロゲン化物とが反応することによって、一般式ＩＩ−Ｂの化合物を生成するために結合させることができる。
【００７３】
一般式Ｉの化合物は、アミン基を備えたハロゲン化物を縮合する従来方法によって一般式ＩＩ−Ｂの化合物を生成するために、一般式Ｖ−Ａのハロゲン化物とその環状結合の１位置置換窒素原子で反応させる。この縮合反応は塩基がある状態で行なわれる。この反応では、一般式Ｉの化合物の１位の位置にある環状結合の窒素原子は、３位の位置にある環状結合の窒素原子よりも反応性に富んでいる。したがって、１位の位置での環状結合の窒素原子が、むしろハロゲン化物と縮合するだろう。一般式Ｖ−Ａの化合物が反応性アミノ又は他の官能置換基を含んでいる場合、これらの置換基を一般式Ｖ−Ａを伴う５−ＦＵの反応に先立って従来の保護基と反応させることができる。一般式ＶＩ−Ａの化合物が生成された後、これらの保護基を、一般式ＩＩ−Ｂの化合物中のアミンを保持する間にそのような保護基を除去するために当業者によく知られている手順によって除去することができる。
【００７４】
一般式ＩＩ−Ａの３位置換５―ＦＵは、最初に５−ＦＵを一般式
【００７５】
【化７１】
2008530528.tif 000019
のジクロロ化合物に変換することによって５−ＦＵから生成することができる。
【００７６】
これは、オキシ塩化リンのような塩素化剤で一般式Ｉの化合物を処理することにより成し遂げられる。これらの塩素化剤の利用において、従来の条件が、この反応を行なうのに使用することができる。次のステップで、一般式ＶＩＩの化合物は一般式
【００７７】
【化７２】
2008530528.tif 000020
の化合物に転化される。これは、次式の一般式の化合物へエノール化する。
【００７８】
【化７３】
2008530528.tif 000021
【００７９】
この転化は、３５℃から５０℃までの温度下で水性の媒体で水酸化ナトリウムと供に一般式ＶＩＩの化合物を処理することによって行なわれる。一般式ＶＩＩＩ−Ｂの化合物は、次式の一般式の化合物に転化することができる。
【００８０】
【化７４】
2008530528.tif 000022
【００８１】
（式中、Ｒ２はベンジルである。）
【００８２】
一般式ＩＸの化合物を生成する際、一般式ＶＩＩＩ−Ｂの化合物を、固形水酸化ナトリウム存在の有機溶媒下でベンジルアルコールと反応させる。次のステップで、一般式ＩＸの化合物は、一般式Ｖ−Ａのハロゲン化物を備えた一般式Ｉの化合物の縮合を伴う結合に関して前述された方法で、一般式Ｖ−Ａのハロゲン化物と一般式ＩＸの化合物とを反応させることによって一般式ＩＩ−Ａの化合物に転化される。
【００８３】
一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物は、これらの化合物とポリアミン、ポリペプチドあるいは担体とを反応させることによって、本発明の共役担体試薬に転化することができる。ポリアミン又はポリペプチドを免疫学的に活性化させる本発明の一般式ＩＩ−Ｂの化合物中の担体として、及び、一般式ＩＩ−Ａの免疫原中の免疫原ポリマーとして、同じポリペプチドを利用することができる。しかしながら、共役を生成するために、これらのポリマーは、免疫原に求められるような免疫反応を生じる必要はない。本発明によれば、一般式ＩＩ−ＡおよびＩＩ−Ｂの化合物中のＸによって表わされる様々な官能基は、ポリマー内に含まれているアミン基に官能基を付ける従来の方法によって重合体物質に共役することができる。好ましい実施例によれば、一般式ＩＩ−ＡおよびＩＩ−Ｂの化合物では、Ｘはそれのカルボン酸基か活性エステルである。
【００８４】
（抗体）
本発明は、さらに前述の免疫原の使用により生成された５−ＦＵに対するモノクロナール抗体を含む新規の抗体に関する。本発明によれば、本発明に従って生成されたこれらの抗体は、５−ＦＵに選択的に反応し、５−ＦＵの免疫測定を邪魔する化合物を含んでいるテガフールあるいは他のピリミジンに反応しないことが分かった。本発明は５−ＦＵに対する新規の抗体およびモノクロナール抗体に関する。発明の抗血清は、本発明の免疫原を備えた宿主動物を免疫することにより好都合に生成することができる。適切な宿主動物は、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびその他同種のものといったげっ歯動物、あるいはヤギ、羊、馬およびその他同種のものといった高等哺乳動物を含んでいる。初回量、出血および追加免疫注射は、動物中の免疫反応を誘発するために認められた試験計画書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に従って与えることができる。例えば、好ましい実施例では、マウスは、初回量として１００μｇの免疫原を腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で受け、また後に６か月の期間にわたって２回以上、１００μｇの免疫原の追加免疫注射を受けた。周期的な出血によって、免疫されたマウスの血液試料は、従来の免疫測定を利用する５−ＦＵ結合に対する免疫反応を発生させることが観察された。これらの方法は、望ましい活性を有する抗血清を生成している宿主に関して調べるための便利な方法を提供する。
【００８５】
モノクロナール抗体は、上記スケジュールの後に細胞融合に先立って３日のスタートを切る連続３日に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）又は静脈内投与（ｉ．ｖ．）で免疫原１００μｇをマウスに注射して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫することにより好都合に生成される。抗体技術でよく知られている他の試験計画書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）をもちろん同様に利用してもよい。ここに詳述された全部の免疫化試験計画書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）は、５−ＦＵの抗体用の血清抗体反応に最適の試験計画書（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を提供した。
【００８６】
宿主の脾臓、末梢血、リンパ節あるいは他の組織から得られたＢリンパ球は、モノクロール抗体生産細胞として使用してもよい。最も好ましいのは、脾臓から得られたＢリンパ球である。発明の望ましいモノクロール抗体を生成することができるハイブリドーマは、無限増殖できる細胞系を備えたそのようなＢリンパ球を融合させることにより得られ、それはハイブリッド細胞上の長期的な組織培養安定を与える細胞系である。発明の好ましい実施形態では、無限増殖できる細胞は、それ自体が細胞を生成するだけでなく悪性である骨髄腫細胞のようなリンパ芽球状細胞あるいはプラズマ細胞腫細胞でもよい。５−ＦＵモノクロール抗体を生成するマウスのハイブリドーマは、５−ＦＵタンパク質共役に対して免疫されたハツカマウスから、マウス骨髄腫細胞および脾臓細胞の融合によって生成される。キメラ及びヒトモノクロナール抗体は、ハイブリドーマ細胞から遺伝子を発現させる抗体をクローン化し、ヒトの定常部領域にマウス可変領域の続きを結合するか、あるいは、ドナーマウスかラットの免疫グロブリンから相補性決定領域（ＣＤＲの）とヒトのフレームワーク領域を組み合わせる現在当業者によって知られている組み換えＤＮＡ方法を使用することによって生成することができる。親和力が高められた抗体を提供するマウスのモノクロナール抗体をヒトに適用するための改良方法は、国際特許出願ＷＯ９２／１１０１８に述べられる。一次抗体構造の一部だけを含むポリペプチド断片を生成してもよく、その断片は1つ以上の免疫グロブリン活性を有している。これらのポリペプチド断片は、当業者によって知られている方法によって手をつけていない抗体のタンパク質分解開裂によって、又は、Ｆａｂ断片又は（Ｆａｂ´）２断片を生成するために部位特異的突然変異誘発を用いる抗体遺伝子を含んでいる発現ベクターに望ましい位置に終止コドンを挿入することによって、生成されてもよい。単鎖抗体は、ＤＮＡリンカーにＶＬとＶＨの部位を結合することによって生成してもよい（ヒューストンら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,８５：５８７９−５８８３（１９８３）及びバードら、Science, ２４２：４２３−４２６（１９８８）参照）。本発明の抗体は、５−ＦＵに選択的で、ウラシル、シトシン、テガフールなどのようなそのようなピリミジン塩基に対して実質的に交差反応性を有さない。実質的な交差反応性を有さないことによって、本発明の抗体は、１２％未満、好ましくは５％未満の代謝産物を備えた５−ＦＵに関係する交差反応を有していることを意味している。
【００８７】
（免疫測定法）
本発明によれば、一般式ＩＩ−Ａのこれらの化合物の免疫原から生じた前述の共役および抗体は、患者試料中の５−ＦＵの測定試薬として利用することができる。この測定は免疫測定法によって行なわれる。一般式ＩＩ−Ｂの化合物から形成された試薬共役が、本発明に従って生じた抗体中の結合部位のために試料中の５−ＦＵと競合するどんな免疫測定法も、患者試料中の５−ＦＵの存在を決定するために使用することができる。５−ＦＵを含んでいるという疑いをかけられた試料中の５−ＦＵの測定を行うための方法は、（ａ）水性媒質試料、（ｂ）本発明に従って生成された５−ＦＵの抗体、（ｃ）一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役を、混合することを含む。試料中の５−ＦＵ量は、試料と抗体との混合物に既知量で加えられた共役の特異抗体への結合の阻害を測定することにより決定することができる。未知の試料による既知量の共役のそのような結合の阻害の結果は、５−ＦＵの既知の標準溶液を使用して同じ測定で得られた結果と比較される。未知の試料中の５−ＦＵの量を測定する際、試料、一般式ＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役、および抗体は、任意の順に加えられてもよい。
【００８８】
抗体に結合した一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役量を測定するために、様々手段を使用することができる。１つの方法は、抗体への共役の結合が蛍光団共役の回転率の減少を引き起こす点である。液体混合物中の蛍光団の回転率の減少量は、米国特許４，２６９，５１１及び米国特許４，４２０，５６８に開示されているような蛍光性の極性化技術によって検出することができる。
【００８９】
他方で、粒子が一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された５−ＦＵ共役と反応する場合、これらの微粒子が集合体を形成するように、抗体は微粒子上を覆うか吸収してもよい。しかしながら、微粒子を覆う或いは吸収した抗体が試料中の５−ＦＵと反応するとき、これらの微粒子に結合する試料からの５―ＦＵは、抗体微粒子の集合を生じさせない。集合または凝集の量は、吸光度による混合測定で測定することができる。
【００９０】
他方、これらの測定は、マイクロタイタープレートのような固形支持体あるいは固形微粒子を含む他の従来の固形支持体に、抗体あるいは５−ＦＵ共役のいずれかを付着することにより実行することができる。そのような固形微粒子に抗体とタンパク質を付着することは当業者によって知られている。どんな従来方法もそのような付着を行うために使用することができる。多くの場合では、測定を促進するために、放射性標識や酵素標識のような標識を、抗体と結合または結合していない一般式ＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役量の検出を助けるものとして、抗体、共役あるいは固形微粒子に配置してもよい。他の適切な標識としては、発色団、蛍光団などがある。
【００９１】
便宜の問題として、本発明の測定コンポーネントは、５−ＦＵを測定するのに使用される所定量の新しい試薬を備えた化合物がパッケージされた状態でキットとして提供することができる。これらの試薬は、本発明の抗体を含むんでいることに加え、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から生成された共役も含んでいる。
【００９２】
これらの必要な試薬に加えて、補助試薬のような添加物、例えば安定剤、緩衝材などが含まれていてもよい。様々な試薬の相対量は、実質的に測定の感度を最適化するような試薬の溶液濃度を提供するために、広く変わってもよい。試薬は、溶液又は乾燥パウダー（通常は凍結乾燥されたもの）として供給され、溶解して測定を行うのに適した濃度の試薬溶液を提供する補形薬を含んでいる。
【００９３】
（例）
例において、次の略語は、下記に指し示すように使用される。
ＴＨＦ      テトラヒドロフラン
ＥＡ        エチルアルコール
ＤＣＭ      ジクロロメタン
ＤＭＡＰ    ジメチルアミノピリジン
ＮＨＳ      Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミド
ＥＤＣ      １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＴＬＣ      薄層クロマトグラフィ
ＡＮＳ      ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
i.p.        腹腔内の
ＨＲＰ      西洋わさびペルオキシダーゼ
ＴＭＢ      ３，３´，５，５´―テトラメチルベンチジン
ＴＲＩＳ    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
ＢＴＧ      ウシチログロブリン
ＰＢＳ      リン酸塩緩衝生理的食塩水
ｄｉ        脱イオン水
例において、図式１、図式２、図式３ａ、図式３ｂ及び図式４は、例の番号に従って生成され言及された特異化合物を下記に示す。図式は以下の通りである。
【００９４】
【化７５】
2008530528.tif 000023
【００９５】
【化７６】
2008530528.tif 000024
【００９６】
【化７７】
2008530528.tif 000025
【００９７】
（例１）
図式１、１位置換５−ＦＵ活性化エステル［４］の生成
ＤＭＦ（１００ｍｌ）中にフルオロウラシル（５０ｇ）［１］を溶解した溶液に、トリエチルアミン（７８ｇ）を３０℃下で攪拌しながら加えた。その後、エチル−４−ブロモ酪酸塩（８８．５ｇ）を滴下方法で加えた。添加が終わった後、生じた反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応混合物をろ過し、溶剤を減圧下で取り除いた。残留物を酢酸エチル中で結晶化し、２６ｇ（２９％）の化合物［２］を得た。
【００９８】
［２］（２０ｇ）をメタノール（１００ｍＬ）中に溶解した溶液に、２０％水酸化カリウム水溶液（２７ｍＬ）を加えた。得た溶液を室温下で3時間攪拌し、その後、混合物を減圧下で濃縮した。残留物をアセトン（５０−１００ｍＬ）に溶解し、濃縮塩酸でｐＨ２〜３に調整した。その後、それをろ過し、アセトンで洗浄した。固形生成物をアセトン（５０ｍＬ）に加熱して溶解した。室温まで冷却した後、固形物を酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えることによって沈澱させた。固形生成物をろ過によって収集し、乾燥して１０ｇの［３］を入手した。エステルのためのＴＬＣ条件は、酢酸エチ：エーテルが３：１であった。酸のためのＴＬＣ条件は、酢酸２滴を加えたクロロホルム:メタノールが１５：１であった。
【００９９】
０℃で６００ｍＬのジクロロメタン中に６．３ｇの化合物［３］が入ったものに、ＮＨＳを加えた。この溶液に、ジクロロメタンにＤＣＣ（４．８ｇ）を溶解した溶液を滴下方法で加えた。０℃で２時間攪拌した後、生じる反応混合物を室温で１５時間攪拌した。反応混合物を濃縮した。加工していない生成物を得るために、残留物をアセトン中で結晶化した。加工していない生成物をシリカゲルカラム（酢酸エチル：エーテルが３：１の溶液で抽出）で精製し、４ｇの化合物［４］を得た。
【０１００】
（例２）
図式２、１位置換５−ＦＵ酸［５］の生成
アセトニトリル（３００ｍＬ）に化合物［４］（３．２ｇ）を溶解した溶液に水（９００ｍＬ）を加え、１．２当量のｐ−メチルアミノ安息香酸を加えた。得られる反応混合物を２０時間室温で攪拌した。アセトニトリルを除去するために減圧下で混合物を濃縮した。沈澱が生じ、濾過によって収集した。その後、アセトン中で２．８ｇの加工していない生成物を結晶化した。加工していない生成物をシリカゲルカラム（１〜２滴の酢酸を加えたクロロホルム：メタノールが１５：１の溶液で抽出）で精製し、２ｇの化合物［５］を得た。
【０１０１】
（例３ａ）
図式３ａ、３位置換５−ＦＵ酸誘導体［１２］、［１４］の生成
８０ｍＬのＰＯＣｌ３と１５．６ｇの５−ＦＵ［１］の混合物を、４０℃で凝縮器、温度計および滴下漏斗を装備した三つ口フラスコの中で撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン２５ｍＬを滴下方法で加え、得られる混合物を還流するため３時間加熱した。過剰ＰＯＣｌ３を減圧下で蒸発させた。混合物を室温まで冷やし、７５ｇの砕いた氷の中へ注いだ。その後、クロロホルム（５０ｍＬで３回）で抽出した。化合した抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮して約５０％の収率で黄色っぽい固形の化合物［７］を得た。
【０１０２】
オキシ塩化物［７］１６ｇと２規定の水酸化ナトリウム４８ｍＬとの混合物を４５℃下で１時間攪拌した。反応混合物のｐＨは７まで減った。別の２規定の水酸化ナトリウム４８ｍＬを加え、油状の物質が反応混合物中に観察されなくなるまで攪拌を続けた。混合物を室温まで冷やした後、濃縮塩酸でｐＨ３までｐＨを調整した。冷却し、生成物［８］を沈澱させた。オキシ塩化化合物［８］を収集し、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した。収率は５５％であった。
【０１０３】
凝縮器、温度計およびディーンスターク装置を装備した三つ口フラスコにトルエン２０ｍＬ、ベンジルアルコール５２ｍＬおよび固形水酸化ナトリウム２．４４ｇを加えた。得られる混合物が乾燥するまで還流した。その後、化合物［８］を３ｇ加え、３時間還流を続けた。反応混合物を室温まで冷却し、水５０ｍＬを加えた。有機相を、水で２度（それぞれ５０ｍＬ）洗浄した。水相を混合し、トルエンとベンジルアルコールの残留物を減圧下で除去した。溶液を濃縮塩酸でｐＨ３まで調整し、冷却し、生成された沈殿物を収集した。エタノール中で再結晶化し、約６０％の収率で化合物［９］を得た。
【０１０４】
ベンゼン２０ｍＬ、水２０ｍＬ及びテトラブチルアモンモニウム臭化物０．５ｇの混合物を５５℃まで加熱した後、溶液Ａ（１規定水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬ中に２ｇの［９］を溶解したもの）と溶液Ｂ（２０ｍＬベンゼン中に１．９ｇの４−ブロモ酪酸エチル１．９ｇを溶解したもの）を滴下方法で交互に混合物に加えた。反応混合物のｐＨをｐＨ８−１０に調整した。添加終了後、反応混合物を２時間半還流した。有機相を分離し、５％水酸化ナトリウム及び水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。有機溶媒は減圧下で除去された。残留物をシリカゲルカラムで精製し（エーテル：酢酸エチルが１０：１のもので溶出）、４０％の収率で油状生成物の化合物［１０］を得た。
【０１０５】
化合物［１０］３ｇと、メタノール５０ｍＬ中に１０％Ｐｄ／Ｃ０．３ｇを混合したものとの混合物を、約２４時間水素ガス（１５ｐｓｉ）下で撹拌した。触媒はろ過によって除去した。［１０］を含む濾液に、２ｇの水酸化ナトリウムと５０ｍＬの水を加えた。得られる混合物を、室温で８時間撹拌した。メタノールを減圧下で除去した。混合物を濃縮塩酸でｐＨ３まで調整した。冷却後、沈殿物が生じ、ろ過によって収集した。沈殿物をエタノールで再結晶化し、５０％の収率で［１２］を得た。
【０１０６】
１ｇの乾燥［１２］、０．７４ｇのＮＨＳ、及びクロロホルム５０ｍＬ中に１．４７ｇのＤＣＣを混合したものとの混合物を、室温で夜通し（約２４時間）攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をシリカゲルカラムで精製し（酢酸エチル：メタノールが１０：１のもので溶出）、約４０％の収率で化合物［１３］を得た。
【０１０７】
化合物［１３］１ｇと、及び３０ｍＬのＤＭＦ中に０．５ｇの４−（アミノメチル）安息香酸を混合したものとの混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物に水１５０ｍＬの一部を加えた。反応混合物を酢酸エチル１００ｍＬで洗浄した。水相を４℃の状態にし、溶液中にゆっくりと沈澱させた生成物［１４］をろ過によって収集し、Ｐ２Ｏ５の存在下で室温で真空下で乾燥し、収率約６５％で［１４］を得た。
【０１０８】
（例３ｂ）
図式３ｂ、３位置換５−ＦＵ酸誘導体［６］の生成
ベンゼン２０ｍＬ、水２０ｍＬおよび0.5gのテトラブチルアンモウニウム臭化物の混合物を５５℃に加熱した後、溶液Ａ（１規定水酸化ナトリウム水溶液２０ｍＬ中に２ｇの［９］を混合したもの）及び溶液Ｂ（２０ｍＬのベンゼン中に２．０５ｇの４−ブロモ酪酸エチルを混合したもの）を交互に混合物にくわえた。反応混合物のｐＨはｐＨ８−１０に調整した。添加終了後、反応混合物を２時間半還流した。有機相を分離し、５％水酸化ナトリウムと水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。有機溶媒は減圧下で除去した。残留物をシリカゲルカラムで精製し（エーテル：酢酸エチルが１０：１のもので溶出）、化合物［１５］を３８％の収率で油状の生成物として得た。
【０１０９】
２ｇの化合物［１５］と、メタノール６０ｍＬ中に０．２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃを混合したものとの混合物を、約２４時間水素ガス（１５ｐｓｉ）の下で攪拌した。触媒はろ過によって除去した。化合物［１６］を含む濾液に、水酸化ナトリウム１ｇと水２０ｍＬを加え、約２０ｍＬに濃縮した。得られる混合物を、室温で８時間撹拌した。減圧下でメタノールを除去し、混合物を濃縮塩酸でｐＨ３に調整した。冷却後、沈殿物が生じ、ろ過によって収集した。沈殿物をエタノールで再結晶化し、約６０％の収率で［６］を得た。
【０１１０】
（例４）
対応する酸［３，５，１２，１４，６］からＮＨＳ活性エステルを生成する一般的な方法
乾燥ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）２０ｍＬ中にＮＨＳ（１．３９ｍｏｌ）を攪拌して溶解した溶液に、酸（０．６９５ｍｍｏｌ）［３，５，１２，１４，または６］とＥＤＣ（２．０８５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を窒素雰囲気下の室温で１８時間攪拌した。３ｍＬの塩酸（０．３Ｎ）を加えることによって反応を止め、更に５分間攪拌した。有機相を分離し、（Ｎａ２ＳＯ４で）乾燥し、濾過し、（真空下で）蒸発させて、白い固形物を得た。
【０１１１】
（例５）
１位置換５−ＦＵ  ＫＬＨ免疫原の生成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＬＨ（３１．２ｍｇ／ｍＬ）を混合したもの５．８６ｍＬに、例１で生成した化合物［４］（ＤＭＳＯ中１２．８ｍｇ／ｍＬ）を０．６９２ｍＬ滴下法で加え、ｐＨを８．５に調整した。混合物を室温で１８時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１２】
（例６ａ）
３位置換５−ＦＵ  ＢＴＧ免疫原の生成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＢＴＧ（１６．９ｍｇ／ｍＬ）を混合したもの１１．４ｍＬに、ＤＭＳＯを１．２ｍＬ滴下法で加え、ｐＨは７．５であった。ここに、例３ａで生成された化合物［１３］（ＤＭＳＯ中に５２．５ｍｇ／ｍＬ）を０．２７７ｍＬ滴下法で加え、ｐＨは再び７．５であった。混合物を室温で１８時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１３】
（例６ｂ）
３位置換５−ＦＵ  ＫＬＨ免疫原の生成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＬＨ（２４．９ｍｇ／ｍＬ）を混合したもの８．３ｍＬに、ＤＭＳＯを０．９２２ｍＬ滴下法で加え、ｐＨは７．５であった。ここに、例３ａで生成された化合物［１３］（ＤＭＳＯ中に５２．６ｍｇ／ｍＬ）を０．２７７ｍＬ滴下法で加え、ｐＨは再び７．５であった。混合物を室温で１８時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１４】
（例７ａ）
誘導体１２を伴う３位置換５−ＦＵ  ＢＳＡ共役（１０：１比率）の生成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）を溶解した溶液１ｍＬに、ＤＭＳＯを０．１１１ｍＬ滴下法で加えた。例４（５２．５ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ溶液０．０４５ｍＬ）のように生成した化合物［１２］の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを滴下法で加えた。混合物を室温で夜通し攪拌し、３位置換５−ＦＵとＢＳＡの共役を生成した。その後、この共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１５】
（例７ｂ）
誘導体６を伴う３位置換５−ＦＵ  ＢＳＡ共役（１：１比率）の生成
５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）を溶解した溶液２０．０ｍＬに、ＤＭＳＯを２．２２２ｍＬ滴下法で加えた。ｐＨは７．５であった。ここに、例４で生成した化合物［６］（ＤＭＳＯ中に２０．０ｍｇ／ｍＬ）の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを０．２７２ｍＬ滴下法で加えた。ｐＨは再び７．５であった。混合物を室温で１８時間攪拌した。その後、この免疫原共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１６】
（例８）
誘導体５を伴う１位置換５−ＦＵ  ＢＳＡ共役（２０：１比率）の生成
氷水槽中の、５０ｍＭのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）にＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）を溶解した溶液１４ｍＬに、ＤＭＳＯを１４ｍＬ滴下法で加えた。例４で生成した化合物［５］の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５７ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液１．６５ｍＬ）を滴下法で加えた。混合物を室温で夜通し攪拌し、１位置換５−ＦＵとＢＳＡの共役を生成した。その後、この共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物（Wu  et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998）と一致した特徴をなした。
【０１１７】
（例９）
５−ＦＵ抗体の生成
１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃのマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された、例５で生成した５−ＦＵ−ＫＬＨ又は例６ａで生成した５−ＦＵ−ＢＴＧで、一匹につき１００μｇ、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で免疫した。マウスは、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき１００μｇで最初の注射の４週間後に追加免疫した。追加免疫テストの１０日後、各マウスからの出血を、眼窩出血によって得た。これらのテスト出血からの抗血清は、例１２ａ、１３及び１４で評価された５−ＦＵ抗体を含んでいた。モノクロナール抗体に対しては、１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された例６ｂで生成した３位置換５−ＦＵ−ＫＬＨを、一匹につき１００μｇ、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で免疫した。マウスは、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき１００μｇで最初の注射の４週間後に追加免疫した。追加免疫テストの１０日後、各マウスからの出血を眼窩出血によって得、これらを例１２ａ及び１５のように検査した。融合（第０日）前の４日のスタートを切るモノクロナール抗体を生成するために、マウスに、連続３日間、ＰＢＳ中の３位置換５−ＦＵ  ＫＬＨ免疫原を、４００μｇ（第３日）、２００μｇ（第２日）、２００μｇ（第１日）で、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で注射した。脾臓細胞を選択したマウスから分離し、Curent Protocols in Immunology, 2.5.1-2.5.8, (1992), Wiley&Sons, NY. Coligan，J.E.らの方法による５０％ポリエチレングリコール１５００を備えた２×１０７ＳＰ２／Ｏ細胞と融合した。融合細胞を、１０個の、２０％Fetal  Clone  I、２％Ｌ−グルタミン（１００ｍＭ）、２％５０Ｘ  ＨＡＴが加えられたＤＭＥＭ／Ｆ１２の９６ウェル形式プレートで培養した。２週間後、ハイブリドーマ上澄みをＥＬＩＳＡ（例１２ｂ）によって抗-５-ＦＵの存在のために測定した。陽性ウェルを拡大し、再び同じ方法によって測定した。陽性クローンが、競合的ＥＬＩＳＡ（例１２ａ及び１５）によって結合する５−ＦＵに対して確認された。ＥＬＩＳＡによって陽性クローンは、Coligan、J.E.et al., Current Protocols in Immunology, 2.5.8-2.5.17,(1992),Wiley & Sons, NYで開示されている限界希釈法によって、一、二度サブクローン化された。
【０１１８】
（例１０）
５−ＦＵ誘導体５―ＢＳＡ共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
５−ＦＵ濃度を測定するＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合及びプレートにつき９６ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp Ｃ８又はＦ８ Immunomodules）で行った。ｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ｍＬで５−ＦＵ―ＢＳＡ共役（例８のように生成）を混合したもの３００μＬを加え、室温で３時間保温することによって、各ウェルを５−ＦＵ―ＢＳＡ共役でコーティングした。ウェルをｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後５％スクロース４００μＬ、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１１９】
（例１１ａ）
５−ＦＵ誘導体１２―ＢＳＡ共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
５−ＦＵ濃度を測定するＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合及びプレートにつき９６ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp Ｃ８又はＦ８ Immunomodules）で行った。各ウェルを、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ｍＬで５−ＦＵ―ＢＳＡ共役（例７ａのように生成）を混合したもの３００μＬを加え、室温で３時間保温することによって、５−ＦＵ―ＢＳＡ共役でコーティングした。ウェルをｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後５％スクロース４００μＬ、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１２０】
（例１１ｂ）
５−ＦＵ誘導体６―ＢＳＡ共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
５−ＦＵ濃度を測定するＥＬＩＳＡ法を、タンパク質結合及びプレートにつき９６ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp Ｃ８又はＦ８ Immunomodules）で行った。各ウェルを、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム中に１０μｇ／ｍＬで５−ＦＵ―ＢＳＡ共役（例７ｂのように生成）を混合したもの３００μＬを加え、室温で３時間保温することによって、５−ＦＵ―ＢＳＡ共役でコーティングした。ウェルをｐＨ９．６の０．０５Ｍ重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後５％スクロース３７５μＬ、０．２％カゼインナトリウム溶液で室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１２１】
（例１２ａ）
抗体選別手順−滴定量
５−ＦＵ抗体（例９で生成）を選別するためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａ、７ｂ及び８で記載されるような５−ＦＵ―ＢＳＡで感作されたマイクロタイタープレートで行なった。抗体選別検査を、５−ＦＵ抗体を含む抗血清を、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％チメロサールを含むリン酸緩衝生理食塩水で１：１００、１：１０００、１：１０，０００及び１：１００，０００に希釈することによって行った。感作された５−ＦＵ―ＢＳＡウェル（例１１ａ，１１ｂ及び１０で生成）のそれぞれのウェルに、希釈抗体１００μＬを加え、振動させながら室温で１０分間培養した。この培養中、抗体はウェル内で５−ＦＵ共役に結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを、３回、０．０２Ｍのトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、洗浄した。ウェル内で５−ＦＵ―ＢＳＡ共役に結合する５−ＦＵ抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳに１／２０００で希釈されたヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役がウェル内で５−ＦＵ抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役を除去するためにプレートを再び３回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後ＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＦx、ＨＲＰ用培養基）１００μＬを加え、室温で振動させながら１０分培養する間に適度な色をつけた。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを着色を停止するために各ウェルに加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍの吸光度を測定した（モレキュラーデバイスプレートリーダ）。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、１．５の吸光度となる希釈（滴定量）として表わされる。滴定量は、測定された抗体の抗体希釈（ｘ軸）対６５０ｎｍでの吸光度（ｙ軸）をログで図示し、１．５の吸光度での滴定量を推定することによって測定される。滴定量は、例１３、１４及び１５に記載された間接競合マイクロタイタープレート測定で使用された抗体の濃度（希釈）を決定した。
【０１２２】
（例１２ｂ）
抗体選別手順―モノクロナール選別
５−ＦＵモノクロナール抗体（例９で生成）を選別するＥＬＩＳＡ法を、例７ｂで記載した５−ＦＵ―ＢＳＡで感作されたマイクロタイタープレートで行った。５−ＦＵ―ＢＳＡ感作ウェル（例１１ｂで生成）の各ウェルに、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％チメロサールを含む５０μＬリン酸緩衝生理食塩水と、そして次にモノクロナール培養上澄み５０μＬを加え、１０分間室温で振動させながら培養した。この培養の間、抗体はウェル内で５−ＦＵ―共役に結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを３回、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、洗浄した。ウェル内で５−ＦＵ―ＢＳＡ共役に結合する５−ＦＵ抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に予め決められた比活性に希釈（約１／２０００）されたヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役がウェル内で５−ＦＵ抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役を除去するためにプレートを再び３回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後ＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＦｘ、ＨＲＰ用培養基）１００μＬを加え、室温で振動させながら１０分培養する間に着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを着色を停止するために、各ウェルに加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍの吸光度を測定した（モレキュラーデバイスプレートリーダ）。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例した。２倍のバックグラウンドよりも大きい吸光度を有する試料を陽性とした。
【０１２３】
（例１３）
５−ＦＵ誘導体４共役の抗体におけるＩＣ５０及び交差反応を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
５−ＦＵ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡ法を、例７ａに記載する５−ＦＵ―ＢＳＡで感作したマイクロタイタープレートで行った。５−ＦＵ、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールは、０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の間でＰＢＳ中に１０倍希釈された。測定は、例１２ａで測定された滴定量に希釈された５０μＬの抗体（例５の免疫原を用いて例９で生産）で測定するために、５０μＬの分析物を培養することによって行った。１０分間の培養（振動を伴うローテーター（Ｒ．Ｔ.））の間、ウェル内及び溶液中の分析物に５−ＦＵ共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、３回洗浄した。ウェル内の５−ＦＵ―ＢＳＡ共役に結合した５−ＦＵ抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に１／２０００に希釈されたヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役がウェル内の５−ＦＵ抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び３回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、ＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＦｘ、ＨＲＰ用培養基）を１００μＬ加え、室温で振動させながら１０分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを、着色を停止するために加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍでの吸光度を測定した（モレキュラーデバイスプレートリーダ）。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の５−ＦＵ量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。
与えられた分析物に対するＩＣ５０値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の５０％を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、５−ＦＵに対するＩＣ５０とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するＩＣ５０との比率で、パーセント表示で計算した。例５の免疫原で例９のように生成した抗体で測定するとき、ウラシル、チミンおよびシトシンに対する５−ＦＵに関連するパーセント表示で表わした交差反応性は７％以下で、テガフールに対しては２００％であった。結果を表１に示す。
【０１２４】
（例１４）
５−ＦＵ誘導体１３共役抗体におけるＩＣ５０及び交差反応性を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
５−ＦＵ濃度測定のためのＥＬＩＳＡ法を、例８で記載される５−ＦＵ―ＢＳＡで感作したマイクロタイタープレートで行った。５−ＦＵ、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールを、０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の間でＰＢＳ中に１０倍希釈した。測定は、例１２ａで測定された滴定量に希釈された５０μＬの抗体（例９で生成）で測定するために、５０μＬの分析物を培養することによって行った。１０分間の培養（振動を伴うローテーター（Ｒ．Ｔ.））の間、ウェル内及び溶液中の分析物に５−ＦＵ共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、３回洗浄した。ウェル内の５−ＦＵ―ＢＳＡ共役に結合した５−ＦＵ抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に１／２０００で希釈されたヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役がウェル内の５−ＦＵ抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び３回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、ＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＦｘ、ＨＲＰ用培養基）を１００μＬ加え、室温で振動させながら１０分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを、着色を停止するために加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍでの吸光度を測定した（モレキュラーデバイスプレートリーダ）。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の５−ＦＵ量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。与えられた分析物に対するＩＣ５０値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の５０％を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、５−ＦＵに対するＩＣ５０とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するＩＣ５０との比率で、パーセント表示で計算した。例６ａの免疫原を用いて例９のように生成した抗体で測定するとき、ウラシルに対する５−ＦＵに関連するパーセントで表わした交差反応性は８％未満で、シトシンに対しては０．０３％未満、テガフールに対しては１％未満、チミンに対しては約１２％であった。結果を表１に示す。
【０１２５】
（例１５）
５−ＦＵ誘導体１３共役抗体におけるＩＣ５０及び交差反応性を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
５−ＦＵ濃度測定のためのＥＬＩＳＡ法を、例７ｂで記載される５−ＦＵ―ＢＳＡで感作したマイクロタイタープレートで行った。５−ＦＵ、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールを、試料によって０．１〜１，０００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の間でＰＢＳ中に１０倍希釈した。測定は、例１２ａで測定された滴定量に希釈された５０μＬの抗体（例９で生成）で測定するために、５０μＬの分析物を培養することによって行った。１０分間の培養（振動を伴うローテーター（Ｒ．Ｔ.））の間、ウェル内及び溶液中の分析物に５−ＦＵ共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、３回洗浄した。ウェル内の５−ＦＵ―ＢＳＡ共役に結合した５−ＦＵ抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に、予め決められた比活性（約１／２０００）に希釈されたヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役がウェル内の５−ＦＵ抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び３回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、ＴＭＢ（ＴＭＢ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏＦｘ、ＨＲＰ用培養基）を１００μＬ加え、室温で振動させながら１０分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）を５０μＬ、着色を停止するために加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍにおける吸光度を測定した（モレキュラーデバイスプレートリーダ）。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の５−ＦＵ量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。与えられた分析物に対するＩＣ５０値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の５０％を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、５−ＦＵに対するＩＣ５０とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するＩＣ５０との比率で、パーセント表示で計算した。例６ｂの免疫原を用いて例９のように生成したモノクロナール抗体で測定するとき、ウラシルに対する５−ＦＵに関連するパーセント表示の交差反応性は８％未満で、シトシンに対しては０．０１％未満、テガフールに対しては約１％、チミンに対しては４％未満であった。結果を表２に示す。
【０１２６】
【表１】
2008530528.tif 000026
【０１２７】
【表２】
2008530528.tif 000027
【０１２８】
これらの表中の結果は、一般式ＩＩ−Ａの化合物から免疫原を、及び一般式ＩＩ−ＡあるいはＩＩ−Ｂの化合物から試薬を、生成する重要性を実証している。これらの結果から、免疫原が一般式ＩＩ−Ｂではなく一般式ＩＩ−Ａの化合物から生成されるとき、テガフールに交差反応しない抗体が生成されることがわかる。一般式ＩＩ−Ａの化合物の免疫原から供給されｔａ抗体及びＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂから提供される試薬担体により、５−ＦＵで治療されているモニター患者に対して５−ＦＵの正確な免疫測定が行なわれる。
【国際調査報告】
2008530528.tif 000082
2008530528.tif 000083