(57)【要約】  本発明は、ヒトマンノース結合型レクチンのコード領域の配列を含むベクターによって形質転換された組換えヒトマンノース結合型レクチン（ｒｈＭＢＬ）生産用ＣＨＯ細胞株で高分子形の組換えヒトＭＢＬを大量生産する方法、及びバクテリアまたはカビのような微生物による感染及び／または免疫欠乏の予防及び治療のために前記方法によって製造された組換えヒトＭＢＬの治療学的用途に関するものである。特に、本発明の組換えヒトＭＢＬは、ウイルス、バクテリアまたはカビによって感染した個体を治療するのに有用なので、補体系を活性化するための開始剤として使用されるだけでなく、ヒトＭＢＬを検出する診断用キットの製造にもまた有用に使用できる。
2008517619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトマンノース結合型レクチン（ｈｕｍａｎ  ｍａｎｎｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ）コード領域の配列を含む、図１の遺伝子地図に図示された発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬ。
【請求項２】
請求項１の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３】
ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
ＫＣＴＣ（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）１０４７２ＢＰとして寄託されたＣＨＯ細胞株ＭＢＬ／Ｄ１−３である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項５】
（１）ヒトマンノース結合型レクチンコード領域の配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する工程；
（２）前記ヒトマンノース結合型レクチンのコード領域配列を培養システムで発現させて組換えヒトマンノース結合型レクチンを生産する工程；及び
（３）工程（２）の組換えヒトマンノース結合型レクチンを精製する工程を含む、高分子形の組換えマンノース結合型レクチンの大量生産方法。
【請求項６】
形質転換された宿主細胞が、ＫＣＴＣ１０４７２ＢＰとして寄託されたＣＨＯ細胞株ＭＢＬ／Ｄ１−３である、請求項５に記載の大量生産方法。
【請求項７】
前記工程（２）が、
無血清／無タンパク培地で細胞を浮遊培養する工程；及び
無血清／無タンパク培地で適応した細胞を順次にスケールアップしながら継代培養して多重合体形態の組換えヒトマンノース結合型レクチンタンパク質を大量生産する工程である、請求項５に記載の大量生産方法。
【請求項８】
前記精製工程（３）が、
（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー法を使用して多重合体からなる高分子形の組換えマンノース結合型レクチンタンパク質試料を分画化する工程；
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルスプレＳが付着した基質を充填してカラムを製造する工程；
（ｃ）前記カラムを平衡化させた後に組換えマンノース結合型レクチンタンパク質試料をカルシウムイオンの存在下でカラムに投入して高分子形の組換えマンノース結合型レクチンタンパク質を前記Ｂ型肝炎ウイルスプレＳに特異的に結合させる工程；及び
（ｄ）前記組換えマンノース結合型レクチンタンパク質が結合されたカラムにＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ緩衝液を流し入れて高分子形の組換えマンノース結合型レクチンタンパク質のみを溶出させる工程である、請求項５に記載の大量生産方法。
【請求項９】
前記マンノース結合型レクチン結合型糖化タンパク質が、プレＳ糖化ウイルス性外皮タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、糖化バクテリア性タンパク質、糖化カビ性タンパク質及び人工合成糖化タンパク質からなる群から選択される、請求項５に記載の大量生産方法。
【請求項１０】
ｉ）抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体またはプレＳタンパク質がテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）に固定された支持体；
ｉｉ）前記支持体の下端部に連結されて染料接合体が吸着された染料パッド（ここで、コントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）に抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体を固定した場合には、前記染料接合体は抗マウスＩｇＧ抗体−ゴールドパーティクルで、コントロールラインにプレＳタンパク質を固定した場合には、前記染料接合体はプレＳタンパク質に対する抗体−ゴールドパーティクルである）；及び
ｉｉｉ）前記染料パッドの下端部に連結されたサンプルパッドを含む組換えヒトマンノース結合型レクチン検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子形の組換えヒトマンノース結合型レクチン（ｒｈＭＢＬ）の大量生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マンノース結合型レクチン（ｍａｎｎｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ：以下「ＭＢＬ」と略称する）は、先天性免疫を担当している血清タンパク質で、その分子量は  ３２ｋＤａで、カルボキシ−末端部位の炭水化物認識ドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＣＲＤ）、コラーゲンドメイン及びアミノ−末端部位のシステイン豊富地域（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）からなっている。前記コラーゲンドメインは、３個の分子が三重ラセン構造を形成して、３個のＭＢＬ分子からなる一つの複合体を形成した後、再びアミノ−末端部位のシステインによる内部分子間のニ硫化結合（−ｓ−ｓ−）を通じて６個の複合体が結合することにより、総１８個からなる巨大なＭＢＬ分子を形成する。
【０００３】
また、ＭＢＬは、ＭＢＬ連関セリンプロテアーゼ（ＭＢＬａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ；ＭＡＳＰ−１、ＭＡＳＰ−２またはＭＡＳＰ−３）またはＭＢＬ関連タンパク質（ＭＢＬａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍａｐ１９）のような他のタンパク質と結合する。ＭＢＬは、全体分子構造及び機能面で補体系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）中の古典的な経路（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）の第１成分であるＣ１ｑと類似であるが、Ｃ１ｑとは異なりレクチン経路（ｌｅｃｔｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ）を通じてＣ４とＣ２を分割することにより補体系を活性化させる。ＭＢＬによる補体系の活性化は、抗体が形成される前に微生物感染に対する１次的な防御の役割をする。すなわち、補体系の活性化によってＭＢＬの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）が、微生物表面に存在する表面タンパク質の独特の糖化形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ）を認識して微生物と複合体を形成する。ここで前記複合体は、セリンプロテアーゼの前駆体であるＭＡＳＰ−１またはＭＡＳＰ−２のプロテアーゼ活性を誘導して補体系のＣ４とＣ２をＣ４ｂ２ａに活性化させて、窮極的にはＣ３ｂを形成して補体系を活性化させる。また、補体系を成すタンパク質の中で一部は、オプソニン（ｏｐｓｏｎｉｎ）として作用して微生物表面に直接結合することにより大食作用または中性白血球による食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導するが、ＭＢＬもまた、自体がオプソニンとして作用して微生物に直接結合することにより食細胞による食菌作用を誘導する。また、ある程度活性化されたタンパク質は、膜攻撃性複合体（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｔｔａｃｋｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＡＣ）を形成して侵入した微生物を直接分解したりし、それ以外にも活性化過程で生成された補体タンパク質切片は、強い炎症反応を起こすサイトカインの分泌を促進することによって外来物質が存在する部位に白血球を集めるようにする。
【０００４】
以前報告されたように、ＣＨＯ細胞、またはＨＬＦ肝臓癌細胞、骨髄腫細胞またはＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を含む多様な細胞でＭＢＬ遺伝子が発現されることが明らかにされた。特に、ＣＨＯ細胞では、ＭＢＬ遺伝子が高収率で発現されたが、回収されたＭＢＬは主に活性がない単量体またはニ量体の分子で、ＭＢＬの活性を示す高分子形重合体の生産量は非常に低いという問題があり（Ｋａｔｓｕｋｉ  Ｏｈｔａｎｉ等．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９年，第２２２巻，１３５−１４４頁）、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞では、多重合体形態に発現したが、発現量が１μｇ／ｍｌ未満で非常に低く、ＭＢＬ生産細胞株としては適当ではなかった（Ｔ．Ｖｏｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ等．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１年，第１巻，６７７−６８７頁）。
【０００５】
中性白血球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）等のような食菌作用をする細胞は、外部から侵入した微生物または異物を食菌作用及び直接的な溶菌によって効果的に除去する重要な役割をするだけでなく、ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）として作用する大食細胞は、Ｔ−細胞を活性化させてインターフェロンガンマ、ＴＮＦまたはＩＬ−１２の分泌を誘導することにより後天性免疫反応もまた効果的に誘導する。すなわち、補体系を活性化することができる高分子形態のＭＢＬは、先天性免疫反応に関与して人体での１次防御に重要な役割を果たすだけでなく、後天性免疫反応を誘導するのにおいても重要な役割をする。
【０００６】
ヒト血清内ＭＢＬの量は、ＭＢＬ遺伝子の遺伝的変異によって５０ｎｇ／ｍｌ以下から３μｇ／ｍｌ以上の範囲で個人によって多くの差が見られ。例えば、ＭＢＬ遺伝子中エクソン（ｅｘｏｎ）１の５２番、５４番または５７番に点突然変異が発生すると、ＭＢＬ分子間の複合体を形成することができなくてその活性が阻害される。また、ＭＢＬ遺伝子のプローモーター部位に突然変異が発生する場合にも、ＭＢＬの発現量に影響を及ぼし得る。一般的に血中ＭＢＬの量が少ない人、特に新生児または免疫力が弱化した成人は、微生物感染に対する感受性が増加することが知られている（Ｓｕｍｉｙａ、Ｍ．等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９１年，第３３７巻，１５６９−１５７０頁；Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａ．等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９５年，第３４５巻，８８６頁；Ｇａｒｒｅｄ、Ｐ．等，Ｌａｎｃｅｔ，１９９５年，第３４６巻，９４１頁；Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ、Ｊ．等，Ｂｒ．Ｍｅｄ  Ｊ．，１９９７年，第３１４巻，１２２９頁；Ｍｕｌｌｉｇｈａｎ、Ｃ．  Ｇ．等，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第５１巻，１１１−１２２頁；Ｎｅｔｈ、Ｏ．等，Ｌａｎｃｅｔ，２００１年，第３５８巻，６１４−６１８頁；Ｐｅｔｅｒｓｌｕｎｄ、Ｎ．Ａ．等，Ｌａｎｃｅｔ，２００１年，第３５８巻，６３７−６３８頁；Ｍｕｌｌｉｇｈａｎ  Ｃ．Ｇ．等，Ｂｌｏｏｄ，２００２年，第９９巻，３５２４−３５２９頁）。
【０００７】
また、Ｂ型肝炎ウイルス感染患者を対象にした研究（Ｈａｋｏｚａｋｉ  Ｙ．等、Ｌｉｖｅｒ，２００２年，第２２巻，２９−３４頁）では、Ｂ型肝炎ウイルスの感染によって劇症肝炎（Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ）に進展した患者たちの血漿内ＭＢＬの量が３μｇ／ｍｌ以上なら死亡率が０％で、１．５μｇ／ｍｌなら死亡率が５４％であり、０．５μｇ／ｍｌ以下なら死亡率がほぼ８０％以上に達し、このような感染は、血漿内ＭＢＬの量に依存することが示された。したがって、ＭＢＬ量が低い人にＭＢＬを補充してやればこのような感染可能性を下げることができる。
【０００８】
前記のような治療目的に組換えＭＢＬを使用するために組換えＭＢＬは、活性を示す多重合体の形態で大量発現されなければならないが、いまだに活性形態の組換えＭＢＬを大量生産する方法が明らかにされていないのが実情である。
【０００９】
したがって、本発明者等は、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下にＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する組換えＭＢＬを解明するために鋭意研究努力した結果、ヒトＭＢＬのコード領域の配列を含む発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞株から治療目的に使用できる活性形態の組換えヒトＭＢＬを多重合体形態で大量生産することができることを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、組換えヒトマンノース結合型レクチン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｍａｎｎｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ、ｒｈＭＢＬ）、ヒトＭＢＬのコード領域の配列を含むベクター、前記ベクターによって形質転換された組換えヒトＭＢＬ生産用ＣＨＯ細胞株、前記ＣＨＯ細胞株での組換えヒトＭＢＬの大量生産方法、及び微生物による感染及び／または免疫欠乏の予防及び治療のための組換えヒトＭＢＬの用途に関するものである。
【００１１】
また、本発明は、ｉ）抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体またはプレＳタンパク質がテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）に固定された支持体；ｉｉ）前記支持体の下端部に連結されて染料接合体が吸着した染料パッド（ここで、コントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）に抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体を固定した場合には、前記染料接合体は抗マウスＩｇＧ抗体−ゴールドパーティクルで、コントロールラインにプレＳタンパク質を固定した場合には前記染料接合体はプレＳタンパク質に対する抗体−ゴールドパーティクルである）；及びｉｉｉ）前記染料パッドの下端部に連結されたサンプルパッドを含む組換えヒトＭＢＬ検出用キット、前記ＭＢＬ検出用キットの製造方法、及び前記ＭＢＬ検出用キットを使用してＭＢＬを検出する方法に関するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を果たすために、本発明は、ヒトＭＢＬコード領域の配列を含む、図１の遺伝子地図に開示された発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬを提供する。
【００１３】
また、本発明は前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞株を提供する。
【００１４】
また、本発明は、
（１）ヒトＭＢＬコード領域の配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する工程；
（２）前記ヒトＭＢＬコード領域配列を培養システムで発現させて組換えヒトＭＢＬを生産する工程；及び
（３）工程（２）の組換えヒトＭＢＬを精製する工程を含む高分子形の組換えＭＢＬの大量生産方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、
ｉ）抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体またはプレＳタンパク質がテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）に固定された支持体；
ｉｉ）前記支持体の下端部に連結されて染料接合体が吸着した染料パッド（ここで、コントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）に抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体を固定した場合には、前記染料接合体は抗マウスＩｇＧ抗体−ゴールドパーティクルで、コントロールラインにプレＳタンパク質を固定した場合には、前記染料接合体はプレＳタンパク質に対する抗体−ゴールドパーティクルである）；及び
ｉｉｉ）前記染料パッドの下端部に連結されたサンプルパッドを含む、組換えヒトＭＢＬ検出用キットを提供する。
【００１６】
また、本発明は、
（１）プレＳまたは抗ヒトＭＢＬ抗体をゴールドパーティクルに結合させて染料接合体（ｄｙｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を製造する工程；
（２）前記染料接合体を染料パッドに吸着させる工程；
（３）工程１においてプレＳがゴールドパーティクルに結合する場合に支持体にテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）として抗ヒトＭＢＬ抗体及びコントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）として抗プレＳ抗体を結合させたり、抗ヒトＭＢＬ抗体がゴールドパーティクルに結合する場合には支持体にテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）として抗ヒトＭＢＬ抗体及びコントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）として抗マウスＩｇＧ抗体を結合させたりする工程；及び
（４）前記支持体の下端部に前記染料パッド及びサンプルパッドを順次に付着させる工程を含むＭＢＬ検出用キットの製造方法を提供する。
【００１７】
同時に、本発明は、
（１）支持体の下端部に結合された染料パッドにＭＢＬが含まれた試料を処理する工程；及び
（２）支持体上のテストライン及びコントロールラインに抗体が結合することを確認する工程を含む、ＭＢＬ検出用キットを使用してＭＢＬを検出する方法を提供する。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下にＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する組換えヒトＭＢＬを形質転換された宿主細胞で発現させるのに十分であり、ヒトＭＢＬコード領域の配列を含む、図１の遺伝子地図に開示された発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬを提供する。
【００１９】
本発明の一実施態様は、ベータグロビン遺伝子のＭＡＲ因子（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）逆方向体、ＳＶ４０ウイルスのｐｏｌｙ−Ａ及びガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）遺伝子の転写終結因子の組合わせ体を含むｐＭＳＧ（寄託番号  ＫＣＣＭ（Ｋｏｒｅａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）１０２０２）ベクターにヒトＭＢＬｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ＮＭ＿０００２４２）を挿入してｐＭＳＧ−ＭＢＬベクターを製造することができる。
【００２０】
また、本発明は、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下にＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する組換えヒトＭＢＬを、形質転換された宿主細胞で発現させるのに十分であり、前記発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬで形質転換された宿主細胞を提供する。
【００２１】
本発明での宿主細胞は、通常的な動物細胞であり、好ましくはＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、ＨＥＫ（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞などからなる群から選択することができる。
【００２２】
本発明の一実施態様では、ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下でＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する組換えヒトＭＢＬを形質転換された宿主細胞で発現させるのに十分であり、前記発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬをＣＨＯ細胞株に導入して形質転換体を製造して、前記形質転換体をＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の存在下で適応させて組換えヒトＭＢＬを多重合体形態で大量発現する形質転換体を選別した。選別された形質転換体は、ＣＨＯＭＢＬ／Ｄ１−３と名付けて、２００３年５月１６日付けで大韓民国大田所在の遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託して、寄託番号ＫＣＴＣ  １０４７２ＢＰが付与された。
【００２３】
本発明のＭＢＬ形質転換体で生産された組換えヒトＭＢＬは、先天性免疫体系を活性化することができない単量体またはニ量体のようなオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）形態ではない、ヒト来由の天然型ＭＢＬと類似の多重合体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）形態のタンパク質であり、本発明の組換えヒトＭＢＬは形質転換されたＣＨＯ宿主細胞で多重合体形態で非常に高い発現率を示す。したがって、前記形質転換体は、組換えヒトＭＢＬを大量生産することができる細胞株として使用することができる。
【００２４】
また、本発明は、
（１）ＭＢＬ結合型糖化タンパク質及びセリンプロテアーゼの存在下でＭＢＬ結合型糖化タンパク質に特異的に結合して補体を活性化する組換えヒトＭＢＬを形質転換した宿主細胞で発現させるのに十分であり、ヒトＭＢＬコード領域の配列を含む前記発現ベクターｐＭＳＧ−ＭＢＬで形質転換された宿主細胞を提供する工程；
（２）前記ヒトＭＢＬコード領域の配列を培養システムで発現して組換えヒトＭＢＬを生産する工程；及び  
（３）工程（２）の組換えヒトＭＢＬを精製する工程を含む、組換えヒトＭＢＬの生産方法を提供する。
【００２５】
具体的には、本発明の工程（１）で前記ＭＢＬ結合型糖化タンパク質の例としては、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ（ｐｒｅ  Ｓ）を含む糖化ウイルス性外皮タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、糖化バクテリア性タンパク質、糖化カビ性タンパク質及び人工合成糖化タンパク質を挙げることができる。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様で、工程（１）で前記工程（２）の組換えヒトＭＢＬを生産する工程は、無血清／無タンパク培地で細胞を浮遊培養する工程；無血清／無タンパク培地で適応された細胞を継代培養することで順次にスケールアップして多重合体形態の組換えヒトＭＢＬを大量生産する工程であることを特徴とする。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様で、前記工程（３）は陰イオン交換クロマトグラフィー法及びＢ型肝炎ウイルスプレＳの結合性を使用して、ＭＢＬ形質転換体の培養液から精製することができる。ＭＢＬ精製方法は、（ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー法を使用して多重合体を構成する高分子形組換えヒトＭＢＬ試料を分画化する工程；（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルスプレＳが付着した基質を充填してカラムを製造する工程、（ｃ）前記カラムを平衡化させた後、組換えヒトＭＢＬ試料をカルシウムイオンの存在下にカラムに投入して組換えヒトＭＢＬを前記Ｂ型肝炎ウイルスプレＳに特異的に結合させる工程；及び（ｄ）前記組換えヒトＭＢＬが結合されたカラムにＥＤＴＡまたはＥＧＴＡが含まれた緩衝液を流し入れて組換えヒトＭＢＬを溶出させる工程であることを特徴とする。
【００２８】
前記（ａ）工程で、前記基質は通常的な陰イオン交換クロマトグラフィー法に使用されるもので、その例としては、Ｑ−セファロースがある。ここで、単量体またはニ量体形態のＭＢＬ試料は、ＮａＣｌが１５０乃至２００ｍＭ含まれた条件で分画され、多重合体形態の高分子形の組換えヒトＭＢＬ試料は、ＮａＣｌが３５０乃至４００ｍＭ含まれた条件で分画される。
【００２９】
前記（ｂ）工程で、前記基質は通常的な親和性クロマトグラフィーに使用されるもので、その例にはセファロースがある。
【００３０】
前記（ｃ）工程で、カラムの平衡化は組換えヒトＭＢＬをＢ型肝炎ウイルスプレＳと結合させる時に使用される同一な溶液または緩衝液をカラムに流し入れることにより実施することができる。組換えヒトＭＢＬをＢ型肝炎ウイルスプレＳと結合させる場合には、カルシウムイオンの存在下で実施するのが好ましく、ここでカルシウムの濃度は２乃至２０ｍＭであることが好ましい。組換えヒトＭＢＬ試料は、ＭＢＬ形質転換体の培養培地またはＭＢＬ形質転換体の溶出物から修得された上澄み液であることができる。
【００３１】
前記（ｄ）工程で、組換えヒトＭＢＬの溶出は、カルシウムイオンが含まれないＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ緩衝液を使用して実施する。前記緩衝液は、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡが２乃至１０ｍＭの濃度で含まれた緩衝液、例えば蒸留水またはＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液であることができる。
【００３２】
前記（ｄ）工程以後に溶出物は、凍結乾燥したり、透析後凍結乾燥して精製された組換えヒトＭＢＬを修得することができる。
【００３３】
本発明の前記組換えヒトＭＢＬ精製方法は、形質転換体から生産された組換えヒトＭＢＬ以外にも天然の生体試料からＭＢＬを精製するのに使用することができる。前記生体試料としては、血液、プラズマまたは血清（ｓｅｒｕｍ）が使用できる。
【００３４】
また、本発明は、
ｉ）抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体またはプレＳタンパク質がテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）に固定された支持体；
ｉｉ）前記支持体の下端部に連結されて染料接合体が吸着した染料パッド（ここで、コントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）に抗ヒトマンノース結合型レクチン抗体を固定した場合には、前記染料接合体は抗マウスＩｇＧ抗体ゴールドパーティクルで、コントロールラインにプレＳタンパク質を固定した場合には、前記染料接合体はプレＳタンパク質に対する抗体ゴールドパーティクルである）；及びｉｉｉ）前記染料パッドの下端部に連結されたサンプルパッドを含む組換えヒトＭＢＬ検出用キットを提供する。
【００３５】
本発明に使用され得る支持体としては、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）及びナイロン膜（ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を挙げることができる。また、本発明で使用できる染料パッドとしては、ポリエステル、グラスファイバー（ｇｌａｓｓ  ｆｉｂｅｒ）などを挙げることができるが、それに限定されない。
【００３６】
また、本発明は、
（１）プレＳまたは抗ヒトＭＢＬ抗体をゴールドパーティクルに結合させて染料接合体を製造する工程；
（２）前記染料接合体を染料パッドに吸着させる工程；
（３）工程（１）においてプレＳがゴールドパーティクルに結合する場合に支持体にテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）として抗ヒトＭＢＬ抗体及びコントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）として抗プレＳ抗体を結合させたり、抗ヒトＭＢＬ抗体がゴールドパーティクルに結合する場合には支持体にテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）として抗ヒトＭＢＬ抗体及びコントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）として抗マウスＩｇＧ抗体を結合させたりする工程；及び
（４）前記支持体の下端部に前記染料パッド及びサンプルパッドを順次に付着させる工程を含む、ＭＢＬ検出用キットの製造方法を提供する。本発明で使用できる染料接合体には、プレＳタンパク質または抗ヒトＭＢＬ抗体を挙げることができるが、それに限定されない。
【００３７】
同時に、本発明は、
（１）支持体の下端部に結合された染料パッドにＭＢＬが含まれた試料を処理する工程；及び
（２）支持体上のテストライン及びコントロールラインに抗体が結合することを確認する工程を含む、ＭＢＬ検出用キットを使用してＭＢＬを検出する方法を提供する。
【００３８】
特に、本発明の組換えヒトＭＢＬは、ウイルス、バクテリアまたはカビによって感染した個体を治療するのに有用なので、補体系を活性化するための開始剤として使用されるだけではなく、組換えヒトＭＢＬを検出する診断用キットの製造にもまた、有用に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１：ＭＢＬ形質転換体製作及び組換えヒトＭＢＬの発現
１−１．発現ベクター製作
ヒトの肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ法によって修得されたＭＢＬｃＤＮＡをｐＥＺベクターにクローニングしてｐＥＺ−ＭＢＬ２−５を製造して、報告されたＭＢＬ塩基配列とＭＢＬｃＤＮＡ塩基配列を比べた（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ＮＭ＿０００２４２）。鋳型としての前記ｐＥＺ−ＭＢＬ２−５、及び順方向プライマー１及び逆方向プライマー２のセットを使用して、ＰＣＲを実施することにより約７５０ｂｐのＭＢＬｃＤＮＡを増幅した。プライマー各々は、制限酵素認識配列及びコザック配列（Ｋｏｚａｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでいて、暗号化部位全体を増幅することができる。続いて、ＭＢＬｃＤＮＡを  ｐＭＳＧベクター（寄託番号ＫＣＣＭ１０２０２）にクローニングしてｐＭＳＧ−ＭＢＬを製造し、遺伝子配列分析法によって挿入されたＭＢＬ塩基配列を確認した（図１）。
【００４１】
順方向プライマー１（配列番号１）
ｃｔａｇｃｔａｇｃｃ  ａｃｃａｔｇｔｃｃｃ  ｔｇｔｔｔｃｃａｔｃ  ａｃｔｃ（３４ｍｅｒ）  
逆方向プライマー２（配列番号２）
ｇａａｇａｔｃｔｃａ  ｇａｔａｇｇｇａａｃ  ｔｃａｃａｇａｃｇ（２９ｍｅｒ）
【００４２】
１−２．宿主細胞へのｐＭＳＧ−ＭＢＬの形質導入
１−２−１．ｐＭＳＧ−ＭＢＬ発現プラスミドＤＮＡの準備
ｐＭＳＧ−ＭＢＬを大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換させた後、得られた形質転換体をアムピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ；Ｓｉｇｍａ、米国）１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地１００ｍｌで培養して、プラスミドミディキット（ＱＵＩＡＰＲＥＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ；Ｑｕｉａｇｅｎ、米国）を使用してｐＭＳＧ−ＭＢＬＤＮＡを分離した。分離したＤＮＡをＳｃａ  Ｉ制限酵素で切断して線形化して、ＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｑｕｉａｇｅｎ、米国）で分離して使用した。
【００４３】
１−２−２．宿主細胞の準備
ＣＨＯ  ＤＧ４４（ｄｈｆｒ−／ｄｈｆｒ−）宿主細胞を、１０％ｃＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地で培養した後、血球計数器（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞の数を測定した。１０％ｃＦＢＳを添加したα−ＭＥＭ培地に２×１０５細胞／ウェルで分注して、ＣＯ２培養器で２４時間培養した。
【００４４】
１−２−３．形質転換
ｐＭＳＧ−ＭＢＬベクター２μｇをＤｏｓｐｅｒＴＭ５．３μｌ、ｐＤＣＨ１Ｐベクター（ＤＨＦＲ遺伝子を含むプラスミド；Ｖｅｎｏｌｉａ，Ｌ．等．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８７年，第１３巻，４９１−５０１頁）ＤＮＡ１６ｎｇと混合して常温で４５分間反応させて、それを宿主細胞に添加した。３７℃で６時間培養した後、培地を除去して、新鮮な１０％ｃＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培地を３ｍｌ／ウェルで添加して再び培養した。２乃至３日後、形質転換された細胞が充分に成長した時にトリプシンを処理し、続いて細胞（４×１０５細胞／ウェル）に１０％ｄＦＢＳを含むα−ＭＥＭ（ｗ／ｏ）培地２ｍｌを添加した後、それを培養した。２乃至３日間隔で培地を交換しながら顕微鏡で細胞の状態及び単一コロニーの生成有無を観察し、１０日後に初期適応した細胞を得た。
【００４５】
１−３．ＭＢＬ発現細胞株の選別及び発現量の増幅
初期適応した細胞を得た後、培地に添加したＭＴＸ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）濃度を段階的に増加させることにより、導入遺伝子の増幅を誘導した。初期適応した細胞を４×１０５細胞／ウェルで分注して、１０ｎＭ  ＭＴＸを添加した培地（α−ＭＥＭ＋１０％ｄＦＢＳ）で培養した。２乃至３日間隔で培地を交換しながらコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に至るまで培養した。前記細胞を４×１０５細胞／ウェルで再び分注した後に前記と同一な方法で１００ｎＭ  ＭＴＸを添加した培地で適応させて、引き続き１ｕＭ  ＭＴＸの条件下で適応させた。上述したように導入した遺伝子の増幅過程を遂行する間、各工程で試料を採取してＭＢＬ発現量の変化をウエスタンブロットによって観察した。ＭＢＬは、培地に含有されたＭＴＸ濃度が高くなるにつれて発現量が増加することが示された。
【００４６】
１−４．単一細胞株分離
ＭＢＬ発現効率が高い単一細胞株を選別するために、１ｕＭ  ＭＴＸ培養条件で適応した細胞を０．５細胞／ウェルで９６ウェル平板に分注して、１ｕＭ  ＭＴＸを含んだ培地（α−ＭＥＭ＋１０％ｄＦＢＳ）で培養した。約２週間後に単一コロニーが形成されると２４ウェル平板に移して、それを継続的に培養して十分な数の細胞に増殖させた後、一部を凍結保管して、一部をウエスタンブロットによって細胞の発現量を比べた。多重合体を成す高分子形ＭＢＬを多量発現することが確認された単一細胞Ｄ１−３形質転換体を細胞株に選別し、それをＣＨＯＭＢＬ／Ｄ１−３と命名して、２００３年５月１６日付けで大韓民国大田所在の遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託して、寄託番号ＫＣＴＣ１０４７２ＢＰが付与された。形質転換体で発現した組換えＭＢＬを非変性条件で電気泳動した結果、ヒト由来天然型ＭＢＬと類似の多重合体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）様相を示すことが明らかになった。
【００４７】
１−５．形質転換体での組換えヒトＭＢＬ発現量の測定
ヒト血清から精製／定量された天然ＭＢＬと比べて形質転換体ＣＨＯＭＢＬ／Ｄ１−３での組換えヒトＭＢＬ発現量を分析した。Ｔ２５フラスコに５×１０５個の細胞を分注して１０％ｄＦＢＳを含むα−ＭＥＭ（ｗ／ｏ）培地で培養した。細胞が約９０％のコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に至った時、培地（α−ＭＥＭ（ｗ／ｏ）＋５％ｄＦＢＳ）３ｍｌを添加した後、４日間培養した。得られた培養液を１０倍希釈してウエスタンブロットを遂行して天然型ＭＢＬとの発現量を比べた。その結果、平板培養時に組換えヒトＭＢＬの発現量は、約５０μｇ／１０６細胞／日であると示された。
【００４８】
実施例２：組換えヒトＭＢＬの大量生産方法
２−１．無血清浮遊培養適応細胞株の確保
付着細胞であるＭＢＬ発現細胞株を１０％ｄＦＢＳ及び１ｕＭ  ＭＴＸを添加したα−ＭＥＭ（ｗ／ｏ）培地で培養した後、細胞を回収して、０．１５％重炭酸ナトリウムを添加した無タンパク培地ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）１００ｍｌを含む２５０ｍｌスピンナーフラスコに５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種した。スピンナーフラスコでの培養は、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターで４０ｒｐｍで撹拌しながら遂行した。細胞数が１．０乃至２．０×１０６細胞／ｍｌに到達すると再び０．１５％重炭酸ナトリウム１００ｍｌを添加したＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種して、前記のように培養を繰り返した。細胞の生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、トリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）で決定し、適応過程後半期には細胞が９０％以上の生存度を維持した。
【００４９】
無血清浮遊培養培地に適応した細胞株を２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで培養した後、細胞を回収して凍結培地に再懸濁して、２．８×１０７細胞／ｍｌの濃度で凍結用バイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に分注して液体窒素タンクに保存した。
【００５０】
２−２．無血清浮遊培養適応細胞株を使用した生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）工程の開発
０．１５％重炭酸ナトリウムを添加した無血清／無タンパク培地であるＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地１００ｍｌを含む２５０ｍｌスピンナーフラスコに浮遊培養細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種した。細胞数が１．０乃至２．０×１０６細胞／ｍｌに到達すると、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地２００ｍｌを含む５００ｍｌスピンナーフラスコに５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種して培養して、再び細胞数が２×１０６細胞／ｍｌに到達すると、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地４００ｍｌを含む１，０００ｍｌスピンナーフラスコに５×１０５細胞／ｍｌの濃度で接種して培養した。前記のように順次的な方式でスケールアップ（ｓｃａｌｅ  ｕｐ）して、２．５×１０６細胞／ｍｌ濃度の接種用細胞１ｌを準備した。
【００５１】
準備した接種用細胞を７．５ｌ（５ｌ作業容積）生物培養器に接種した後、５０ｒｐｍで撹拌しながら３４℃で５日間ＤＯ５０で培養して目的とする培養液（ｐＨ７．２乃至７．４）を修得した。
【００５２】
実施例３：高分子形の組換えヒトＭＢＬの精製方法
ＭＢＬを大量発現するＣＨＯ細胞株をＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地で培養して、培養液を遠心分離した後に０．４５μｍ膜を通過させて細胞を除去した。続いて、通常的な陰イオン交換クロマトグラフィー法及び親和性クロマトグラフィー法によって組換えヒトＭＢＬを精製し、ＭＢＬエライザキットを使用してこれを定量化した。
【００５３】
３−１．Ｑセファロースカラムを使用した多重合体含有試料の分画化
上澄み液のｐＨと伝導率を滴定した後、Ｑセファロースが充填されたカラムを通過させて単量体またはニ量体のような分子量が少ない形態（ｓｍａｌｌｅｒ  ｆｏｒｍ）のタンパク質を除去して、多重合体を含む分子量が大きい形態（ｌａｒｇｅｒ  ｆｏｒｍ）のタンパク質を収集した。分子量が少ない形態のタンパク質試料を１５０乃至２００ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液で分画して、分子量が大きい形態のタンパク質試料を３５０乃至４００ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液で分画した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法によって組換えヒトＭＢＬ中で８０％以上が多重合体形態である高分子形に発現されることを確認した（図２Ａ）。
【００５４】
３−２．プレＳ−セファロースカラムの製造
使用されたプレＳ組換えタンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質であるプレＳタンパク質をサカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で発現して高糖化された形態に精製した（国際公開公報ＷＯ０２／０９４８６６号）。
【００５５】
ＣＮＢｒで活性化になったセファロース４Ｂパウダー１ｇを１ｍＭ  ＨＣｌに溶解させた後、数回洗浄した。プレＳ組換えタンパク質をリガンドに使用するためにプレＳ組換えタンパク質６．４ｍｇをカップリング緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ及びｐＨ８．３）に０．５乃至１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解させた。セファロース４Ｂ樹脂をプレＳ溶液と混合した後、常温で２時間反応させて、それをブロッキング緩衝液（０．１Ｍ  ＴｒｉｓＣｌ、ｐＨ８．０）に移して、再び常温で２時間反応させた。洗浄後、セファロースに結合されたプレＳをウエスタンブロットで確認した。その結果、大部分のプレＳ組換えタンパク質がセファロース樹脂に結合するということが確認された。プレＳ組換えタンパク質が結合されたプレＳ−セファロース４Ｂ樹脂をカラムに充填して、組換えヒトＭＢＬを精製するためのプレＳ−セファロースカラムを製造した。
【００５６】
３−３．組換えヒトＭＢＬ精製
プレＳ−セファロースが充填されたカラムを結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）で平衡化させた後、組換えヒトＭＢＬの培養培地をカラムに積載して組換えヒトＭＢＬを吸着させて、結合緩衝液でカラムを数回洗浄した。続いて、Ｃａ２＋イオンが添加されない溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）をカラムに通過させて、組換えヒトＭＢＬを溶出させた。得られた溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法によって確認した結果、純度が９９．９％である組換えヒトＭＢＬが精製されたことを確認した（図２Ａ及びＢ）。
【００５７】
実施例４：組換えヒトＭＢＬの多重合体形成及び微生物表面への結合
４−１．組換えヒトＭＢＬの多重合体形成確認
精製された組換えヒトＭＢＬが、花束形態の多重合体を形成するかどうかを確認するため、精製された組換えヒトＭＢＬを非結晶質炭素で処理した後、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、ＴＥＭ）であるテクナイ（Ｔｅｃｎａｉ）１２（ＦＥＩ、オランダ）を使用して、組換えヒトＭＢＬの形態を観察した。その結果、精製された組換えヒトＭＢＬは、花束形態の多重合体を成すことが確認された（図３）。
【００５８】
４−２．組換えヒトＭＢＬとプレＳが付着したゴールドパーティクルの結合
Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質であるプレＳを使用したモデルシステムによって、組換えヒトＭＢＬが微生物の表面に結合する方式を観察した。２０乃至４０ｎｍサイズに該当するゴールドパーティクル表面に、プレＳタンパク質を付着させて微生物の表面と類似の形態に製作して、カルシウムの存在下で組換えヒトＭＢＬを添加した後、透過型電子顕微鏡のテクナイ（Ｔｅｃｎａｉ）１２を使用して組換えヒトＭＢＬが結合された複合体形態を観察した。その結果、図４に図示されたように、組換えヒトＭＢＬはプレＳが付着したゴールドパーティクルを取り囲んでいる複合体形態の構造が観察された。実際に、組換えヒトＭＢＬは、前記の方式で微生物表面にも付着して補体系を活性化して、微生物に対する防御をすることが分かった。また、組換えヒトＭＢＬは、微生物がヒト細胞の表面に近付くことを遮断することによって、微生物の感染を抑制するということが分かった。
【００５９】
実施例５：組換えヒトＭＢＬの結合活性試験
カルシウムイオンの存在下で組換えヒトＭＢＬが、プレＳ及びマンナンに結合するかどうかを確認するために下記のように組換えヒトＭＢＬの生物活性実験を実施した。
【００６０】
５０ｍＭのカーボネート−バイカーボネート緩衝液に溶解されたマンナンまたはＢ型ウイルスプレＳタンパク質をウェル当り１μｇになるようにヌンクマキシソープイムノプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）に添加して、４℃でひと晩コーティングした。それを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）で４回洗浄した後、０．２％ＢＳＡで常温で１時間ブロッキングした。続いて、洗浄緩衝液で３回洗浄して、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）に溶解させた組換えヒトＭＢＬ１μｇを入れて、常温で２時間反応させた。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、マウス単一クローン性抗ヒトＭＢＬ８Ｆ６（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＭＢＬ８Ｆ６（ドゥビエル、大韓民国））を１：１００に希釈して常温で２時間反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを１：１５００に希釈して常温で１時間反応させた後、ＯＰＤ溶液１５０ｕｌを入れて、２０分間発色させた。３Ｍ  ＨＣＬ５０μｌを添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｅｘ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用してＯＤ値を測定した。図５Ａは、マンナン及びプレＳタンパク質に対するヒト血漿−来由天然型ＭＢＬの結合性を示したもので、図５Ｂはマンナン及びプレＳタンパク質に対する組換えヒトＭＢＬの結合性を示したもので、天然ＭＢＬ及び組換えヒトＭＢＬは糖化されたプレＳ及びマンナンに類似の活性で結合する一方、ＢＳＡには結合しなかった（図５Ａ及びＢ）。
【００６１】
実施例６：高分子形組換えヒトＭＢＬとオリゴマー型組換えヒトＭＢＬの生物活性比較
多重合体を成す分子量が大きい形態と単一体及びニ量体を含んだ分子量が小さな形態の組換えヒトＭＢＬの生物活性を比べるために、プレＳに対する結合実験とＣ４活性化実験を実施した。
【００６２】
６−１．糖化されたタンパク質プレＳに対する結合試験
実施例５と同一な条件下でプレＳタンパク質をヌンクマキシソープイムノプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）にコーティングした後、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）に溶解された組換えヒトＭＢＬを２００ｎｇから２倍数に希釈して添加して、３７℃で１時間反応させた。ここで使用された組換えヒトＭＢＬは、本発明で提供された多重合体形態の分子量が大きい高分子形の組換えヒトＭＢＬ（ｌａｒｇｅｒ  ｆｏｒｍ）と単量体及びニ量体を多量に含む分子量が小さな組換えヒトＭＢＬ（ｓｍａｌｌｅｒ  ｆｏｒｍ）を各々使用して活性を比べた。抗ヒトＭＢＬマウス単一クローン性抗体ＭＢ１Ｂ５（ドゥビエル、大韓民国）を１：１０，０００の割合に希釈して３７℃で１時間反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを１：１０，０００の割合に希釈して３７℃で１時間反応させた後、１００μｌ  ＴＭＢ溶液を入れて、３０分間発色させた。続いて、反応停止液（Ｈ２ＳＯ４）５０μｌを添加した後、４５０ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダーを使用してＯＤ値を測定した。
【００６３】
多重合体を成す分子量が大きい形態の高分子形組換えヒトＭＢＬは、単一体及びニ量体のようなオリゴマー型で主に成り立った分子量が小さな形態のタンパク質に比べてプレＳに対する結合活性が非常に高いことが示された（図６）。
【００６４】
６−２．補体係でのＣ４活性化試験
ヌンクマキシソープイムノプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）にウェル当り５００ｎｇのプレＳでコーティングして、そこに相違する濃度の組換えヒトＭＢＬを添加して常温で２時間結合させた。ＭＡＳＰタンパク質供給源でＭＢＬが欠乏した血清（ＭＢＬ−ｆｒｅｅ  ｓｅｒｕｍ）を１：１００に希釈して使用した。それを洗浄緩衝液で６回洗浄した後、Ｃ４  ５００ｎｇを入れて、常温で２時間反応させた。抗Ｃ４  抗体−ＨＲＰを１：１５００に希釈して常温で１時間反応させた後にＯＰＤ溶液１５０μｌを入れて、２０分間発色させて、Ｃ４ｂ沈殿物（ｄｅｐｏｓｉｔ）を測定した。３Ｍ  ＨＣｌ５０μｌを添加した後、４９２ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダーでＯＤ値を測定した（図７）。ここで、組換えヒトＭＢＬは、本発明で提供された多重合体形態の高分子形組換えヒトＭＢＬと単量体及びニ量体を多量に含む分子量が小さな組換えヒトＭＢＬを各々使用して活性を比べた。図７に図示されたように、高分子形組換えタンパク質は優秀なＣ４活性化を誘導する一方、分子量が小さな形態のＭＢＬは、Ｃ４活性化をほとんど誘導することができなかった。したがって、本発明で提供された多重合体形態の組換えヒトＭＢＬが、Ｃ４活性化を誘導することが確認された。
【００６５】
実施例７：多様な微生物に対する組換えヒトＭＢＬの結合試験
Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む１１種のグラム陽性菌（ｇｒａｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陰性菌（ｇｒａｍ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）及び真菌を選別して前記各々の菌株に適合した液体培地で培養した。ヌンクマキシソープイムノプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）にウェル当たり細胞数が１×１０７細胞／ｍｌの濃度になるように４℃でひと晩中コーティングした。０．２％ＢＳＡを使用して３７℃で１時間ブロッキングした後、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）に溶解された組換えヒトＭＢＬ５００ｎｇを入れて、３７℃で１時間反応させた。抗ヒトＭＢＬマウス単一クローン性抗体ＭＢ１Ｂ５（ドゥビエル、大韓民国）を１：１０，０００の濃度に希釈して、３７℃で１時間反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを１：１０，０００の濃度に希釈して、３７℃で１時間反応させた後、ＴＭＢ溶液１００μｌを入れて、３０分間発色させた。続いて、反応停止液（Ｈ２ＳＯ４）５０μｌを添加した後、４５０ｎｍでエライザプレートリーダーを使用してＯＤ値を測定した。
【００６６】
本発明で使用した微生物は、微生物表面に対する組換えヒトＭＢＬの結合力の差が多様な群から選択し、図８に図示したように、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＡＴＣＣ５１９０７）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＣＡＲＭ３１９７）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３）は、組換えヒトＭＢＬと高い結合力を示し、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ８６６８）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＣＡＲＭ３１１４）及び大便レンサ球菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９２１２）は中間程度の結合力を示したが、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ１００３１）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ１２２２８）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＣＣＡＲＭ３５０４８）、ヘシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＣＣＡＲＭ５０２８）は、組換えヒトＭＢＬとの結合力が非常に低かった。したがって、組換えヒトＭＢＬは、微生物表面の糖化された表面タンパク質パターンを認知して結合することが明らかになり、その結合程度は標的微生物によって相異することが分かった。
【００６７】
実施例８：組換えヒトＭＢＬによるＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の感染抑制試験
サルの腎臓細胞ＦＲｈｋ−４をＭＥＭ培地に接種して培養して、得られた培養液に組換えヒトＭＢＬを処理した後、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）を感染させた。組換えヒトＭＢＬは、２．５μｇ／ｍｌの濃度で４倍ずつ順次に希釈して使用し、ＳＡＲＳコロナウイルスはサス感染患者から直接分離して使用した（Ｋｓｉａｚｅｋ  Ｔ．Ｇ．等，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ，２００３年，第３４８巻，１９５３−１９６６頁；Ｐｅｉｒｉｓ等，Ｌａｎｃｅｔ，２００３年，第３６１巻，１３１９−１３２５頁）。
【００６８】
ＳＡＲＳコロナウイルスによる宿主細胞の感染有無を確認するため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに特異的なプライマーを使用して定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を実施した。対照群には培養液に組換えヒトＭＢＬを処理しないでＳＡＲＳ−ＣｏＶによって感染したＦＲｈｋ−４細胞を使用した。
【００６９】
図９に図示したように、組換えヒトＭＢＬを処理した場合には、濃度依存的にＳＡＲＳコロナウイルスの感染を抑制し、組換えヒトＭＢＬを２．５μｇ／ｍｌで処理した場合、対照群に比べてウイルスの増殖が約１５％以下に抑制されることが分かった。
【００７０】
図１０は、位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）でＳＡＲＳコロナウイルスによって感染したＦＲｈｋ−４細胞を観察した写真で、図１０の（１）では組換えヒトＭＢＬを処理しない対照群で元気な細胞が観察されないが、図１０の（２）乃至（６）では組換えヒトＭＢＬが処理された実験群で元気な細胞が観察された。特に、使用された組換えヒトＭＢＬの濃度が高くなるにつれて元気な細胞の数が増加することが分かった。
【００７１】
実施例９：臨床試料に含まれたＭＢＬ量の測定
Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳタンパク質が、ＭＢＬに結合する能力を使用して血液、血清、唾液などを含む臨床試料中のＭＢＬの量を測定する診断方法を開発した。
【００７２】
９−１．ゴールドパーティクルとプレＳタンパク質の結合
粒子サイズが、２０乃至８０ｎｍのコロイド性ゴールドパーティクルを準備した後、ｐＨ６．０乃至８．０条件下でプレＳタンパク質を添加して、室温で撹拌しながら反応させた。反応後、１０％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を最終濃度が０．３％（重量／体積）になるように添加して、室温で１５分間撹拌しながら反応させて残り表面をブロッキングした。１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去した後、ペレットを２％ＢＳＡが含まれた緩衝液に懸濁させた。前記のように製作した染料接合体（ｄｙｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、コロイド性ゴールドパーティクル表面にプレＳタンパク質が均一に結合し、ここでコロイド性ゴールドパーティクルによって赤色または紫色を示す。
【００７３】
９−２．診断用ストリップ（ｓｔｒｉｐ）製作
ニトロセルロース膜（Ｓ＆Ｓ、米国）に通常的なインクジェットプリンターまたはスプレー型プリンターを使用してテストライン（ｔｅｓｔ  ｌｉｎｅ）及びコントロールライン（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｌｉｎｅ）を引いて、前記通常的な方法によってテストラインには抗ヒトＭＢＬマウス単一クローン性抗体ＭＢ１Ｂ５（ドゥビエル、大韓民国）を結合させて、コントロールラインにはプレＳに対する単一クローン性抗体を結合させて診断用ストリップを製作した。診断用ストリップの支持体の下端部に連結された染料パッドであるポリエステルまたはグラスファイバー（ｇｌａｓｓ  ｆｉｂｅｒ）には、染料接合体を吸着させて診断時に陽性または陰性を確認することができるマーカー（ｍａｒｋｅｒ）として使用した。
【００７４】
組換えヒトＭＢＬが含まれた一滴の臨床試料を診断用ストリップの下端部に落とすと、臨床試料が毛細管現象及び拡散によってニトロセルロース膜にしたがって進行して、試料がテストラインに到達した場合にはＭＢＬ−プレＳ−ゴールドパーティクル複合体が抗ヒトＭＢＬマウス単一クローン性抗体と結合してラインが赤色に変わり、コントロールラインに到達した場合にはＭＢＬ−プレＳ−ゴールドパーティクル複合体及びプレＳ−ゴールドパーティクルがプレＳに対する単一クローン性抗体と結合してラインが赤色に変わった。したがって、試料中にＭＢＬが存在する場合にはテストライン及びコントロールラインが陽性で示され、試料中にＭＢＬが存在しない場合にはコントロールラインだけが陽性で示された（図１１）。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
上述したように、本発明の高分子形組換えヒトマンノース結合型レクチン（ｒｈＭＢＬ）は、ウイルス、バクテリアまたはカビによる感染を抑制する効果があるので、ウイルス、バクテリアまたはカビのような微生物、特にＳＡＲＳコロナウイルスによる感染の予防及び／または治療に使用することができる治療剤の開発及び組換えヒトＭＢＬを検出する診断用キットの製造に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ｐＭＳＧ−ＭＢＬプラスミドベクターの遺伝子地図を示したものである。
【図２】Ａ及びＢは、形質転換体ＣＨＯＭＢＬ／Ｄ１−３で生産された組換えヒトＭＢＬを精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロットで確認したものである。
【図３】組換えヒトＭＢＬの電子顕微鏡写真である。
【図４】組換えヒトＭＢＬとプレＳ−ゴールドパーティクルナノパーティクル複合体の電子顕微鏡写真である。
【図５】Ａ及びＢは、組換えヒトＭＢＬが糖化されたタンパク質であるプレＳ（ｐｒｅ  Ｓ）またはマンナン（ｍａｎｎａｎ）に特異的に結合することを示すグラフである。
【図６】多重合体を成す分子量が大きい形態と単量体及びニ量体で主に成り立った分子量が小さな形態の組換えヒトＭＢＬが糖化タンパク質であるプレＳに結合する活性を比べたグラフである。
【図７】分子量が大きい形態と分子量が小さな形態の組換えヒトＭＢＬがプレＳに結合してＣ４を活性化する程度を比べたグラフである。
【図８】組換えヒトＭＢＬが多様な微生物表面に特異的に結合する程度を示すグラフである。
【図９】組換えヒトＭＢＬがＳＡＲＳコロナウイルスによる感染を抑制する効果を示したグラフである。
【図１０】ＳＡＲＳコロナウイルスを感染させたＦＲｈＫ−４細胞を位相差顕微鏡（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察した写真である。
【図１１】組換えヒトＭＢＬを使用した診断用ストリップの例を示した写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１  ＭＢＬ  ｃＤＮＡ増幅のためのフォワードプライマー１
配列番号２  ＭＢＬ  ｃＤＮＡ増幅のためのリバースプライマー２
【図１】
2008517619.tif 000003
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月18日(2007.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
５０ｍＭのカーボネート−バイカーボネート緩衝液に溶解されたマンナンまたは肝炎Ｂ型ウイルスプレＳタンパク質をウェル当り１μｇになるようにヌンクマキシソープイムノプレート（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）に添加して、４℃でひと晩コーティングした。それを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）で４回洗浄した後、０．２％ＢＳＡで常温で１時間ブロッキングした。続いて、洗浄緩衝液で３回洗浄して、結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６）に溶解させた組換えヒトＭＢＬ１μｇを入れて、常温で２時間反応させた。洗浄緩衝液で６回洗浄した後、マウス単一クローン性抗ヒトＭＢＬ８Ｆ６（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＭＢＬ８Ｆ６（ドゥビエル、大韓民国））を１：１００に希釈して常温で２時間反応させた。抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを１：１５００に希釈して常温で１時間反応させた後、ＯＰＤ溶液１５０ｕｌを入れて、２０分間発色させた。３Ｍ  ＨＣＬ５０μｌを添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍでエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｅｘ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用してＯＤ値を測定した。図５Ａは、マンナン及びプレＳタンパク質に対するヒト血漿−来由天然型ＭＢＬの結合性を示したもので、図５Ｂはマンナン及びプレＳタンパク質に対する組換えヒトＭＢＬの結合性を示したもので、天然ＭＢＬ及び組換えヒトＭＢＬは糖化されたプレＳ及びマンナンに類似の活性で結合する一方、ＢＳＡには結合しなかった（図５Ａ及びＢ）。
【国際調査報告】
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