(57)【要約】  本発明はヒトβｉｇ−ｈ３に対する単クローン抗体及びその用途に関する。具体的に、本発明はエピトープがヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのＨ１領域であるヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識する単クローン抗体に関する。本発明の単クローン抗体は組織内でヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識し得るので、βｉｇ−ｈ３蛋白質の増加又は減少に関連した疾患の診断に有用である。加えて、この単クローン抗体はβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性を抑制する効果を有する。
2008520654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単クローン抗体のエピトープがヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのＨ１領域である、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識する単クローン抗体。
【請求項２】
前記ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのＨ１領域が、配列番号３で示されているアミノ酸配列を有する請求項１に記載の単クローン抗体。
【請求項３】
ラットまたはマウスのβｉｇ−ｈ３蛋白質と交叉反応性を有しない、請求項１に記載の単クローン抗体。
【請求項４】
ハイブリドーマ７Ａ６−ａ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０７０５ＢＰ）により生産される、請求項１に記載の単クローン抗体。
【請求項５】
ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性を抑制する、請求項１に記載の単クローン抗体。
【請求項６】
請求項１に記載の単クローン抗体を生産するハイブリドーマ  ７Ａ６−ａ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０７０５ＢＰ）。
【請求項７】
請求項６に記載のハイブリドーマをマウスの腹腔内に注射する段階、
腹腔より腹水を採取する段階、および
得られた腹水より単クローン抗体を分離する段階
を含む、ヒトβｉｇ−ｈ３に対する単クローン抗体を調製する方法。
【請求項８】
請求項１項から５のいずれか一項に記載の単クローン抗体を含む、βｉｇ−ｈ３の増加または減少に関連する疾患の診断のためのキット。
【請求項９】
前記疾患が、腎臓疾患、肝臓疾患およびリウマチ疾患からなる群より選ばれる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
（ａ）試験サンプルと請求項１に記載の単クローン抗体とを接触させる段階、
（ｂ）前記試験サンプルと前記単クローン抗体との免疫反応の産物を検出して、βｉｇ−ｈ３の発現レベルを測定する段階、および
（ｃ）段階（ｂ）において測定されたβｉｇ−ｈ３の発現レベルと対照サンプルにおけるβｉｇ−ｈ３の発現レベルとを比較する段階
を含む、個体におけるβｉｇ−ｈ３の発現レベルの増加または減少に関連する疾患の診断のための方法。
【請求項１１】
前記診断のための方法が、免疫細胞化学および免疫組織化学、放射線免疫分析法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫ブロット法、ファル（Ｆａｒｒ）分析法、沈降素反応法、比濁計法、免疫拡散法、カウンター電流電気泳動法、単一ラジカル免疫拡散法、蛋白質チップ法、ラピットアッセイ法、マイクロアレイ法、免疫蛍光法および免疫吸着法からなる群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患が、腎臓疾患、肝臓疾患およびリウマチ疾患からなる群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の単クローン抗体の有効量を、投与を必要とする個体に投与することを含む、βｉｇ−ｈ３の細胞付着活性を抑制する方法。
【請求項１４】
請求項１に単クローン抗体の有効量を投与を必要とする個体に投与することを含む、癌転移を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００４年１１月１９日付で出願された大韓民国特許出願第２００４−００９５２９２号の優先権を主張している。
【０００２】
本発明はヒトβｉｇ−ｈ３に対する単クローン抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
βｉｇ−ｈ３は、種々の細胞においてＴＧＦ−βにより発現が誘導される細胞外基質蛋白質である（Ｓｋｏｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１，５１１−５２２，１９９２）。βｉｇ−ｈ３蛋白質は、ＴＧＦ−１により処理されたヒト肺腺癌細胞Ａ５４９から構成されたｃＤＮＡライブラリーからの分別スクリーニングにより、スコニア（Ｓｋｏｎｉｅｒ）ら（Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：５１１−５２２，１９９２）により最初に分離された。βｉｇ−ｈ３蛋白質は、６８３個のアミノ酸から構成され、アミノ末端に分泌配列およびカルポキシル末端に種々のインテグリン受容体のリガンド認識部位を提供できるＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）モチーフを有する（Ｓｋｏｎｉｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：５１１，１９９２）。また、βｉｇ−ｈ３蛋白質は、ショウジョウバエのファシクリン（ｆａｓｃｉｃｌｉｎ）−Ｉに存在する類似のモチーフと同質性を有する、‘ｆａｓ−１ドメイン’と称される４個の同質性内部繰返しドメインを含む。ｆａｓ−１ドメインは、哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母および細菌を含む多くの生物の分泌または膜蛋白質において見出される高度に保存された配列を有する（Ｋａｗａｍｏｔｏ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，２８８−２９２，１９９８）。ｆａｓ−１ドメインは、約１１０から１４０個のアミノ酸を有し、特に、それぞれ約１０個のアミノ酸から構成された２個の高度に保存された領域（Ｈ１およびＨ２）を有している。
【０００４】
βｉｇ−ｈ３蛋白質は、繊維状構造を有し、フィブロネクチンおよびコラーゲンなどの幾つかの細胞外マトリックス蛋白質と相互作用するものとして知られている（Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，４３：６５６−６６１，２００２）。また、βｉｇ−ｈ３蛋白質は細胞の成長および分化、創傷治癒および形態形成に関与していると報告されている（Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３：５７１−５８４，１９９４；Ｄｉｅｕｄｏｎｎｅ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７６：２３１−２４３，１９９９；Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７７：１６９−１７８，２０００；Ｒａｗｅ  Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３８：８９３−９００，１９９７；ＬｅＢａｒｏｎ  Ｒ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４：８４４−８４９，１９９５）。加えて、βｉｇ−ｈ３は角膜上皮細胞、軟骨細胞および繊維芽細胞などの細胞の付着を媒介することが知られている（ＬｅＢａｒｏｎ  Ｒ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４：８４４−８４９，１９９５；  Ｏｈｎｏ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４５１：１９６−２０５，１９９９；Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３０９０７−３０９１５，２０００）。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者等は、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する単クローン抗体を開発し、この単クローン抗体は交叉反応することなくヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質だけを特異的に認識することを見出した。
【０００６】
従って、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のみを特異的に認識する単クローン抗体およびその用途を提供することが、この発明の目的である。
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、抗体のエピトープがヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのＨ１領域である、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識する単クローン抗体を提供する。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記単クローン抗体を生産するハイブリドーマを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記単クローン抗体を調製する方法を提供することである。
【００１０】
さらに、本発明の他の目的は、βｉｇ−ｈ３の発現の増加または減少に関連する疾患の診断のためのキットを提供することである。このキットは前記単クローン抗体を含む
【００１１】
さらに、本発明のさらに他の目的は、前記単クローン抗体を使用するβｉｇ−ｈ３の発現の増加または減少に関連する疾患の診断方法を提供することである。
【００１２】
さらに、本発明のさらに他の目的は、βｉｇ−ｈ３の細胞付着活性を抑制する方法を提供することである。この方法は、本発明の単クローン抗体の有効量を、投与を必要とする個体に投与することを含む。
【００１３】
さらに、本発明のさらに他の目的は、癌の転移を抑制する方法を提供することである。この方法は、本発明の単クローン抗体の有効量を、投与を必要とする個体に投与することを含む。
【００１４】
定義
他に定義されない限り、ここに使用されているすべての技術的および科学的用語は、本発明が関与する当業者等により通常理解されるものと同一の意味を有する。下記の参考文献は、本発明において使用された多くの用語等の一般的な定義を有する技術の一つを提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  （２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ。
【００１５】
さらに、次の定義が、本発明の実施において読者の助けのために提供される。
【００１６】
本発明において、抗体は、一般に、抗原を生物体内に注入して体液性免疫反応を誘導し、前記抗原に対する抗体生成を誘導して血液を採取することにより収得される。この方法で得られた抗体を多クローン抗体と称す。この多クローン抗体は、異なる抗体遺伝子を有するプラズマ細胞より分泌された種々の抗体の集合である。一方、一つの抗原決定基にのみと反応し、同じ分子構造を有する、単一のプラズマ細胞プラズマ細胞において調製された抗体の単一のタイプを、単クローン抗体と称す。多クローン抗体は複数種類の抗体の混合物であり、他の抗原と望ましくない交叉反応性を示すことがあり得る。しかしながら、抗体の単一タイプは単一の特定のエピトープのみを認識し、従って、極めて特異的なおよび精密な結果が得られる。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明の単クローン抗体は、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのＨ１領域に対応するエピトープを有し、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識することを特徴とする。好ましくは、本発明の単クローン抗体のエピトープは配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質は、６８３個のアミノ酸から構成され、リガンド認識部位を提供するＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）と４個の内部繰返しドメインからなるｆａｓ−１ドメインを含んでいる。ヒトβｉｇ−ｈ３の全アミノ酸配列が配列番号１に示してある。このｆａｓ−１ドメインは１１０個乃至１４０個のアミノ酸からなる。より具体的に、βｉｇ−ｈ３蛋白質の４個のｆａｓ−１ドメインは、βｉｇ−ｈ３蛋白質のアミノ酸１３３番から２３６番までに対応する１番目のｆａｓ−１ドメインＤ−Ｉ、この蛋白質のアミノ酸２４２番から３７２番までに対応する２番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＩ、この蛋白質のアミノ酸３７３番から５０１番までに対応する３番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＩＩおよびアミノ酸５０２番から６３２番までに対応する４番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＶ（配列番号２）からなる（図５参照）。ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＶ）は、２つの、高度に保存されたそれぞれ約１０個のアミノ酸からなる領域（Ｈ１およびＨ２）を有する。本発明の単クローン抗体の抗原決定基であるβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ領域のＨ１領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明の一つの態様において、本発明の単クローン抗体のエピトープを決定するために、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶのＨ１またはＨ２領域において欠失を有する一連の欠失変異体を調製し、本発明の単クローン抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った。その結果、Ｈ１が欠失された変異体の場合にのみ、抗原−抗体反応が起らなかった（図８参照）。これらの結果は、本発明の単クローン抗体のエピトープがβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶのＨ１領域であることを示唆している。
【００２１】
一方、本発明の単クローン抗体は、ヒトβｉｇ−ｈ３のみを特異的に認識することを特徴とする。
【００２２】
本発明の一つの態様において、本発明の単クローン抗体が、それぞれ１個のｆａｓ−１ドメインを有する、ミコバクテリウム・ツバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）により生産されたＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３蛋白質と抗原−抗体反応を示すかを調査した。その結果、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを認識した本発明の単クローン抗体は、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３蛋白質を認識しなかった（図４参照）。
【００２３】
さらに、本発明の単クローン抗体は、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインのみを特異的に認識し、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の他のｆａｓ−１ドメインは認識しない。
【００２４】
本発明の一つの態様において、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の１番目のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−Ｉ）、２番目のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＩ）および３番目のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＩＩ）を本発明の単クローン抗体が認識するかをウェスタンブロット分析で調査した。その結果、本発明の単クローン抗体はヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメイン（Ｄ−ＩＶ）のみを特異的に認識することが観察された（図６参照）。
【００２５】
さらに、本発明の単クローン抗体はヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のみを特異的に認識し、マウスまたはラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質とは交叉反応性を示さないことにおいて特徴的である。
【００２６】
本発明の一つの態様において、マウスのβｉｇ−ｈ３蛋白質が誘導されたマウス軟骨細胞培養液、ラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質が誘導されたラットの腎臓細胞培養液およびヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質が誘導されたヒト肺臓腺癌腫細胞培養液が本発明の単クローン抗体を用いてウェスタンブロット法で分析された。その結果、本発明の単クローン抗体はヒト肺臓腺癌腫細胞により発現されたβｉｇ−ｈ３蛋白質のみを認識できることが示された（図１１参照）。
【００２７】
また、本発明において、組織および細胞中に発現されたヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質が実際に本発明の抗体により認識されるか否かをヒト腎臓組織および肺組織を用いて免疫組織染色により試験した（図１２参照）。その結果、本発明の単クローン抗体は組織および細胞より発現されたヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を極めて特異的に認識することが見出された。
【００２８】
本発明の単クローン抗体は、
（ａ）βｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインを免疫源として使用して動物を免疫する段階；
（ｂ）免疫された動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する段階；
（ｃ）ヒトβｉｇ−ｈ３を特異的に認識する単クローン抗体を生産する陽性クローンを選別する段階；および
（ｄ）選別されたハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養液から抗体を分離する段階
を含む方法により製造できる。
【００２９】
また、本発明の単クローン抗体は、前記ハイブリドーマを動物の腹腔に注入すること、注入後の一定期間経過後腹水を回収することおよび得られた腹水から抗体を分離すること、により調製できる。
【００３０】
本発明において免疫源として使用されるヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１  ドメインは、遺伝子組換え方法により製造されたものが使用できる。例えば、前記ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインは、知られている塩基配列を使用して当分野で知られている通常の方法によりｃＤＮＡを作製し、このｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このｃＤＮＡを宿主細胞において発現させ、このｃＤＮＡを精製することにより獲得できる。
【００３１】
上述のように発現された蛋白質は、当分野において知られている通常の方法、例えば、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等を使用する順相または逆相液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を利用して、発酵培養培地または細胞培養培地から分離および精製できる。当業者は本発明の範囲を逸脱しない範囲内で最も適合した分離および精製技術を容易に選定できる。しかしながら、親和性クロマトグラフィーが好ましく使用できる。
【００３２】
好ましくは、本発明における免疫源として、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインの４回重複物からなる組換え蛋白質が使用できる。したがって、この組換え蛋白質は、元のβｉｇ−ｈ３蛋白質に似た大きさを有する。
【００３３】
本発明の一つの態様において、単クローン抗体の調製のための抗原としてβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅により収得し、このｃＤＮＡをベクターに挿入して組換えベクターを調製した。この組換え蛋白質の精製のために、この蛋白質のＣ−末端域にヒスチジン残基を連結させ、ヒスチジン−タグを作った。この組換えベクターを用いてＤ−ＩＶ蛋白質の発現を誘導し、発現した蛋白質をＮｉ−ＮＴＡを用いて精製し、次いで純粋なβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを多クローン抗体を用いた親和性クロマトグラフィーにより精製した。この精製したβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを本発明の単クローン抗体を調製するための免疫源として使用した（実施例１参照）。
【００３４】
本発明の単クローン抗体を調製するために、前記にて調製した免疫源を抗原として用いて動物を免疫する。より好ましくは、マウスおよびラットを使用する。前記抗原は通常の免疫方法により腹腔内、筋肉内、眼内または皮下注射して投与する。必要ならば、種々の技術が、前記蛋白質によりもたらされる免疫反応を増加させて、増加した抗体反応性を展開させるために、使用し得る。例えば、発明の抗原蛋白質にフロイント完全または不完全アジュバントが前記蛋白質の免疫性を増加させるために使用できる。免疫性付与期間は、特に制限はしないものの、抗原は２回乃至１０回、好ましくは２回乃至５回投与されて、好ましくは数日間のまたは数週間の間隔、より好ましくは１から３週間の間隔が好ましい。最終の免疫後、１から１０日、好ましくは２から５日、動物から抗体産生細胞が獲得できる。抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ細胞、胸腺細胞および末梢血細胞を含む。好ましくは脾臓細胞が使用される。マウスが使用される場合、マウス１匹当り１から１００μｇ、好ましくは２５から５０μｇの抗原を投与する。
【００３５】
前記のように獲得した抗体生産細胞と骨随腫細胞とを、知られている方法により、例えばケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）とミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の方法により、融合させる。使用し得る骨随腫細胞の例としては、ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８、ｐ３−Ｕ１、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ−２／０、Ｆ０、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．Ｖ６５３およびＳ１９４などのマウス由来のものである。加えて、ラット由来の細胞系、例えばＲ−２１０株が利用できる。
【００３６】
上記のように調製したハイブリドーマから、ヒトβｉｇ−ｈ３の４番目のｆａｓ−１ドメインを選択的に認識する陽性クローンを選択する。ヒトβｉｇ−ｈ３の４番目のｆａｓ−１ドメインを選択的に認識する単一クローンの選別は、当分野において知られている免疫化学的方法のいずれかを用いて行い得る。免疫化学的方法の例は、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、ウェスタンブロット法およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）が用いられる。
【００３７】
本発明の一つの態様において、本発明のヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ組換え蛋白質を抗原としてマウスを免疫し（実施例２参照）、免疫されたマウスの脾臓細胞を摘出し、および摘出された脾臓細胞を骨随腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを調製した（実施例３参照）。このハイブリドーマから、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを選択的に認識する４個の陽性クローンをＥＬＩＳＡにより選別することができた（実施例４参照）。
【００３８】
本発明者は、前記選別された４個の陽性クローンから、ヒスチジン−タグに対して抗原−抗体反応性を示さず、細胞の生命力が優れ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶに対する抗原−抗体反応性が最も優れた７Ａ６ａを選択した。
【００３９】
本発明の一つの態様により調製したヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する単クローン抗体を生産するハイブリドーマ７Ａ６ａは、ブタペスト条約下の国際寄託機関であるＫｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）、Ｋｏｒｅａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（大韓民国大田市儒城区魚殷洞５２番地）に２００４年１０月１１日付で、寄託番号ＫＣＴＣ−１０７０５ＢＰとして寄託した。前記寄託物は、特許の全期間を通じて、ＫＣＴＣに生きている状態で保持され、寄託を管理する法律の規定に基づいて、非商業的用途のためならば、制限なくいかなる個人または法人も入手可能である。前記ハイブリドーマは通常の培養方法により植え次ぎ培養が可能であり、必要に応じて凍結保存できる。前記ハイブリドーマは通常の方法により培養でき、培養培地を得ることができまたは培養培地を哺乳動物の腹腔内に移植して腹水を得ることができる。この培養培地中または腹水中の抗体は、塩析、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィー、親和性コラムクロマトグラフィー等の通常使用される方法により精製できる。
【００４０】
本発明の他の態様において、前記にて収得されたハイブリドーマは、マウスの腹腔に注射されて腹水が調製され（実施例９参照）、マウス腹水の抗体を認識する能力が試験された（実施例１０参照）。その結果、本発明によるマウス腹水は５ｎｇまでの濃度のヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを認識できることが分かった（図１０参照）。
【００４１】
さら別の観点において、本発明は、本発明の単クローン抗体を用いる、個体におけるβｉｇ−ｈ３の発現における増加または減少に関連する疾患の診断方法を提供する。この方法は、
（ａ）試験サンプルを本発明の単クローン抗体と接触させる段階、
（ｂ）前記試験サンプルと前記単クローン抗体との免疫反応産物を検出してβｉｇ−ｈ３の発現レベルを測定する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で測定されたβｉｇ−ｈ３の発現レベルを対照群サンプルにおけるβｉｇ−ｈ３の発現レベルと比較する段階
を含み得る。
【００４２】
ここに使用される用語「試験サンプル」は、前記疾患を有していることが疑われる個体から得られた生物学的サンプルを指す。この用語は、例えば、細胞、組織、血液および生物学的起源のその他の液状サンプル、生検標本、組織培養のような固形組織サンプルまたはこれより由来した細胞およびその子孫が含まれるが、これらに限定されない。また、サンプルは、試薬により処理されたサンプルおよび可溶化されたサンプルまたは培養細胞、細胞上澄液および細胞溶解物等を指す。用語「対照サンプル」は、正常な個体から得られた生物学的サンプルをいう。
【００４３】
段階（ａ）において、本発明の抗体は好ましくは固体基質上に固定される。この抗体は文献（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ；Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８８）に記載されているような多様な方法を用いて固定できる。適切な固体基質には、棒、合成ガラス、寒天ビーズ、コップ、平板パック、他の固体支持体により支持されている物、他の支持体に付いている膜または他の支持体を被覆している物が含まれる。他の固体基材には細胞培養プレート、ＥＬＩＳＡプレート、チューブおよびポリマー膜等が挙げられる。固体基質上に固定された本発明の抗体は試験サンプルにより処理されて、相互に接触させられ得る。
【００４４】
段階（ｂ）における「免疫反応産物」とは、試験サンプル中のβｉｇ−ｈ３蛋白質と本発明の抗体との抗原−抗体反応により生成されたものを指す。前記免疫反応産物の検出は、当分野に知られている免疫学的分析を使用して行うことができる。免疫学的分析の例として、本発明の抗体への抗原の結合を測定する全てのアッセイ方法が含まれ得る。これらのアッセイ方法は、この分野において知られていて、例えば、免疫細胞化学および免疫組織化学、放射線免疫分析法、酵素結合免疫法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈澱法、免疫ブロッティング、ファル（Ｆａｒｒ）分析法、沈降素反応法、比濁計法、免疫拡散法、カウンター電流電気泳動法、単一ラジカル免疫拡散法、蛋白質チップ、ラピットアッセイ、マイクロアレイ法、免疫蛍光法および免疫吸着法等がある。
【００４５】
免疫学的分析方法は、抗原−抗体結合を原理に基づく、知られている全ての定量分析に用いられる適切な担体、検出可能な信号を生成することができる標識、溶解剤、洗浄剤を用いて行うことができる。適切な担体として、可溶性担体、例えば当分野に知られている生理学的に許容される緩衝液のいずれか（例えば、ＰＢＳ）または不溶性担体、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋テキストラン、ポリサッカライド、ガラス、金属、寒天およびこれらの組合せを含むが、これらに限定はされない。
【００４６】
試験サンプルにおけるβｉｇ−ｈ３の発現レベルは、検出可能な信号を生成することができる標識を用いて測定できる。検出可能な信号を生成することができる標識は、酵素、蛍光物質、発光性物質および放射性物質等がある。前記酵素は、過酸化酵素、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−カラクトシターゼ、グルコースオキシターゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、インベルターゼ等を含む。蛍光物質は、フルオレシンイソチオキシアナート、フィコビリン蛋白質、ロダミン、フィコエリスリン、フイコシアニンおよびオルトフタル酸アルデヒド等を含む。発光物質は、イソルミノ（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏ）、ルシゲーニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）等を含む。放射性物質には１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等を含む。しかしながら、上に例示された物質に加えて、免疫学的分析法に使用できるものであれば、いずれの物でも使用することができる。前記標識は本発明の抗体または本発明の抗体と結合し得る２次抗体に連結することができる。前記２次抗体は当分野に知られているものであればいずれの物でも制限なく使用することができる。
【００４７】
段階（ｃ）において、段階（ｂ）において測定されたβｉｇ−ｈ３の発現レベルは対照群サンプルにおけるβｉｇ−ｈ３の発現レベルと比較され、βｉｇ−ｈ３の発現レベルが変化したか否かが調べられ、かくして、βｉｇ−ｈ３の発現レベルの増加または減少に関連する疾患が診断される。
【００４８】
ここに使用される語句「βｉｇ−ｈ３の発現レベルの増加または減少に関連する疾患」は、βｉｇ−ｈ３の発現レベルが正常のレベルに比べて増加または減少する特徴を示す疾患をいう。βｉｇ−ｈ３の発現レベルが正常レベル（対照サンプルにおける発現レベル）に比べて増加する特徴を示す疾患の例は、腎臓疾患、肝臓疾患およびリウマチ疾患を含むが、これらに限定されない。βｉｇ−ｈ３蛋白質は、その発現が腎臓疾患の病理メカニズムにおいて重要な役割をするＴＧＦ−βにより強力に誘導される特徴がある。より具体的に、糖尿病性腎臓疾患を有する患者、腎臓移植手術前の患者および腎不全症患者の尿中のβｉｇ−ｈ３の濃度は、正常人に比べて高く表われる。また、肝炎を有する患者の組織においておよび退行性関節炎およびリウマチ性関節炎を有する患者の滑膜液において、βｉｇ−ｈ３の濃度が、正常人に比べて高いことが示されている（大韓民国特許公開公報第２００２−８２４２１号）。従って、本発明の単クローン抗体は、βｉｇ−ｈ３の濃度を測定することにより、前述の疾患の診断において極めて有用である。
【００４９】
本発明の一つの態様において、本発明の単クローン抗体を用いる酵素免疫分析法（ＥＩＡ）が例示される。すなわち、βｉｇ−ｈ３蛋白質を標準蛋白質としておよび本発明の単クローン抗体を用いて直接サンドイッチ分析を行った。その結果、本発明の単クローン抗体は標準蛋白質の濃度に比例して相関係数０．８９以上を示し、極めて正確にβｉｇ−ｈ３を検出できることが示された（図１３参照）。従って、本発明の単クローン抗体は、前述の疾患の診断のために、例えばＥＩＡにおいて、使用することができる。
【００５０】
加えて、本発明の単クローン抗体は細胞付着の抑制において使用することができる。
【００５１】
本発明の一つの態様において、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質とこの蛋白質の４個のｆａｓ−１ドメインをＥＬＩＳＡプレートに付着させ、本発明の単クローン抗体とマウス繊維芽細胞を用いて処理し、本発明の単クローン抗体がヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質等と前記マウス繊維芽細胞との間の細胞付着を抑制するか否かを調べた。その結果、本発明の単クローン抗体は、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質およびこの蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインの細胞付着活性を抑制することが示された（図１４参照）。
【００５２】
本発明の他の態様において、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性の抑制を、本発明の単クローン抗体の種々の処理濃度において調べた。その結果、腹水から生成された単クローン抗体の１μｌの濃度でヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を処理した場合でさえも、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性が大きく抑制されることが示された（図１５参照）。
【００５３】
従って、本発明は、本発明の単クローン抗体の有効量を投与を必要とする個体に投与することを含む、βｉｇ−ｈ３の細胞付着活性を抑制する方法を提供する。
【００５４】
ここに使用される用語「細胞」は、その付着がβｉｇ−ｈ３により媒介されることが知られている全ての細胞を含み得る。前記細胞の例として、角膜上皮細胞、軟骨細胞および繊維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
用語「個体」は、動物、好ましくは哺乳動物であり得、哺乳動物はヒトを含む。この用語は、動物に由来する、細胞、組織、器官等も含み得る。
【００５６】
ここに使用される用語「有効量」は、個体に投与されたとき、予防効果または治療効果を示す単クローン抗体の量をいう。本発明の単クローン抗体の投与量は、投与経路、投与個体、年齢、性別、体重、個人差および疾病状態に基づいて適宜選択できる。
【００５７】
また、本発明の単クローン抗体は、単独で投与され得または薬学的に許容される担体と共に投与され得る。
【００５８】
ここに使用される用語「薬学的に許容される」は、ヒトに投与された際、通常的に胃腸障害、眩暈症等のようなアレルギー性反応またはこれと類似した反応を起さない生理学的に許容される組成物をいう。薬学的に許容される担体の例は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレートおよびステアリン酸等の経口投与用担体ならびに水、適切なオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコール等の非経口投与用担体等がある。本発明において。安定化剤および保存剤を追加して使用し得る。適切な安定化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤には、ベンゾアルコニウムクロライド、メチル−パラベンまたはプロピル−およびクロロブタノールがある。他の薬学的に許容される担体は、下記の文献に見出すことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【００５９】
本発明の単クローン抗体は、当分野において知られている方法により、上述の薬学的に許容される担体と共に、適切な形態に調合することができる。すなわち、本発明の薬学的組成物は、通常の方法により、多様な非経口投与形態または経口投与形態に調合できる。非経口投与用調合剤は、一般に、等張水溶液または懸濁液などの注射用調合剤が好ましい。注射用調合剤は、当分野において知られている方法により、適切な分散剤、湿潤剤または懸濁剤を用いて調製できる。例えば、注射用調合剤は、必要な成分を食塩水または緩衝液に溶解することにより調製できる。また、経口投与用調合剤は、粉末、顆粒、錠剤、丸剤およびカプセル等があるが、これらに限定されない。
【００６０】
前記のように調合された単クローン抗体は、有効量で経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む多くの経路を通じて投与できる。
【００６１】
さらに、本発明の単クローン抗体は細胞の付着を抑制する機能があるので、実験動物における原発癌の転移過程で表われる癌細胞の浸透、吸着、移動等に影響を及ぼす。したがって、本発明の単クローン抗体は、細胞の転移能の探索、癌組織の転移抑制または癌組織形成をもたらす新生血管形成内皮細胞の付着の抑制等に使用できる。
【００６２】
従って、本発明は、本発明の単クローン抗体の有効量を、投与を必要とする個体に投与することを含む、癌の転移を抑制する方法を提供する。
【００６３】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトβｉｇ−ｈ３および組換え蛋白質ＦＮ１１５の構造を表す概要図である。
図２は、本発明の単クローン抗体がヒスチジン−タグを認識するか否かのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図３は、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３のそれぞれのｆａｓ−１ドメイン構造を示す概要図である。黒色部分：ｆａｓ−１ドメイン内の高度に保存された部分、灰色部分：ｆａｓ−１ドメイン内の保存された部分。
図４は、本発明の単クローン抗体がＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３を認識するか否かのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図５は、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のｆａｓ−１ドメインを示す概要図である。
図６は、本発明の単クローン抗体がヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のＤ−Ｉ、Ｄ−ＩＩ、Ｄ−ＩＩＩおよびＤ−ＩＶを認識するか否かのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図７は、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体を示す概要図である。
図８は、本発明の単クローン抗体がヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体を認識するか否かのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図９は、本発明のハイブリドーマを用いてマウスにおいて腹水を形成させることにより本発明の単クローン抗体を誘導する段階を示す。
図１０は、本発明のマウス腹水中に生成された抗体の認識感度についてのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図１１は、腹水中に生成された本発明の単クローン抗体の、マウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質との交叉反応性についてのウェスタンブロット分析の結果を示す。
図１２は、本発明の単クローン抗体を用いたヒト腎臓組織および肺組織における免疫組織染色の結果を示す写真である。矢印はβｉｇ−ｈ３が検出された領域である。
図１３は、本発明の単クローン抗体を用いた酵素免疫分析（ＥＩＡ）の結果を示す。
図１４は、本発明の単クローン抗体の、βｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性抑制効果を、多クローン抗体それと比較して示す。
図１５は、本発明の単クローン抗体の種々の処理濃度における、βｉｇ−ｈ３蛋白質およびドメインＤ−ＩＶのそれぞれの細胞付着活性の抑制を示す。
【００６４】
発明の実施のための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示するためだけのものであり、本発明の範囲を限定していると解釈されるべきものでないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００６５】
ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ組換え蛋白質の調製
本発明の単クローン抗体を産生する抗原のために、組換えヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメイン（βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ）を４個繰返して含む発現ベクターを、知られている方法（Ｋｉｍ  Ｊ．−Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：３０９０７−３０９１５，２０００；大韓民国登録特許第１０−０３８２０４２号）により調製した。
【００６６】
＜１−１＞組換えベクターの調製
ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質の４番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＶ（アミノ酸５０２―６３２（配列番号２））に対応するｃＤＮＡを次のように調製した。βｉｇ−Ｈ３  ｃＤＮＡのアミノ末端領域における部分欠失を有するＡｓｐ７１８−Ｂｇ１ＩＩ断片を発現ベクターｐＥＴ−２９βのＥｃｏＲＶ部位およびＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ｐＨｉｓ−β−ｂを調製した。この調製したｐＨｉｓ−β−ｂを鋳型として用いて、Ｄ−ＩＶドメイン領域をＰＣＲにより増幅させた。この増幅産物をベクターｐＥＴ−２９ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）のＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ位置にクローニングしてｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ発現ベクターを調製した。Ｄ−ＩＶドメインのフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩを使用してｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ発現ベクターに追加して挿入し、ドメインＤ−ＩＶ領域が４回重複して存在するｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ４Ｘを調製した。ここにおいて、ドメインＤ−ＩＶの４回重複からなる組換え蛋白質を調製したのは、元々のβｉｇ−ｈ３蛋白質に類似の性質を示すように、元々のβｉｇ−ｈ３蛋白質に似た大きさにしたためである。一方、前記組換え蛋白質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて精製するために、前記ｃＤＮＡ断片のＣ−末端に６個のヒスチジン残基を連結し、ヒスチジン−タグを作った。
【００６７】
＜１−２＞組換え蛋白質の発現および分離
大腸菌ＢＳ２１（ＤＥ３）を前記組換えベクターβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ４Ｘにより形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地（トリップトン１０ｇ／Ｌ，酵母抽出物５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）に接種した。次いで、この培地を、３７℃の培養器に６００ｎｍにおける吸光度が０．５から０．６になるまで置いた。次いで、前記培養液に１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−（−）−チオガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で４時間培養してヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ組換え蛋白質が発現されるように誘導した。得られた培養培地を遠心分離して細菌細胞を回収した。得られた細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０），１００ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％トリップトンＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ，０．５ｍＭＤＴＴ）に懸濁し、超音波破砕機で菌体を破砕した。この過程を５回繰返した後、破砕された細胞を遠心分離して上澄液を収得した。
【００６８】
前記上澄液の中の、封入体形態で発現された蛋白質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（樹脂，Ｑｉａｇｅｎ）に加えられ、２時間混合されて結合させた。この混合液をコラムに入れ、このカラムに樹脂の５倍の量の結合緩衝液（２０ｍＭトリス−Ｃ１、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾル）を加え、このカラムを同量の洗滌緩衝液（２０ｍＭトリス−Ｃ１、５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾル）で洗滌した。コラムに結合している組換え蛋白質を３００ｍＭイミダゾルを含む溶出緩衝液で溶出させた。
【００６９】
＜１−３＞組換え蛋白質の確認および定量
実施例＜１−２＞において収得した精製蛋白質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）分析法（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によりその濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質の大きさを調べた。すなわち、実施例＜１−２＞において得られた溶出液を蛋白質定量システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて反応させ、自動ＥＬＩＳＡ読み取り器を用いて吸光度５９５ｎｍにおける蛋白質の濃度を測定した。また、この溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル１２％に負荷し、８０ＶでのＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。蛋白質の分子量を比較するための標準として、低分子量衡正キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。電気泳動後、クーマシブリリアントブルーＲ−２５０で染色して組換え蛋白質の分子量を確認した。
【００７０】
その結果、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ４Ｘは約６８ｋＤａ分子量を有していた。
【実施例２】
【００７１】
組換え蛋白質によるマウスの免疫誘導
実施例１において調製された組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ３０μｇを同量のフロイント完全アジュバント（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）と混合した。この懸濁液を０．２ｍｌをＢａ１ｂ／Ｃマウス（６週令、雌性）の腹腔内に注射した。１次接種の４週後、２次接種を行い、次いで、２週間隔で総計４回の抗原接種を行った。この時点で、前記蛋白質を
同量のフロイント不完全アジュバント（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）と混合して懸濁液を製造し、この懸濁液を腹腔内にそれぞれの時間、０．２ｍｌずつ注射した。第３次の腹腔内注射の後、マウスの尾の静脈から血液を採取して血清を採取し、抗体力価を測定した。抗体力価は、抗原として使用した組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを使用する酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。この目的のために、抗原としての前記組換え蛋白質０．５μｇ／ｍｌを９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに１００μｌずつ添加し、これらウェルを常温で２時間被覆した。このプレートをＰＢＳで１回洗滌し、このプレートに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌを添加して濃度１ｍｇ／ｍｌとし、このプレートを常温で２時間遮蔽した。このプレートをＰＢＳで１回洗滌し、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。マウスから採取した前記血清をＰＢＳにより１０００倍に希釈し、常温で１時間培養し、次いでＰＢＳで３回洗滌した。次に、アルカリホスファターゼで標識された、２次抗体である抗−マウスＩｇＧ羊抗体（Ｓｉｇｍａ）を１：５０００に希釈し、この希釈液の１００μｌずつを前記プレートの各々のウェルに添加した。このプレートを常温で１時間培養してリン酸緩衝生理食塩水で３回洗滌した。アルカリホスファターゼの基質であるＰＮＰＰをこのプレートの各ウェルに１００μｌずつ添加して呈色反応を誘導した。呈色反応が表われたとき、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。ここにおいて、正常的なマウス血清の吸光度より２倍（０．２以上）高い吸光度を示す血清サンプルの希釈率の逆数が３０，０００以上の時、免疫化が十分であると判断した。抗体力価が不十分な場合には再び組換え蛋白質をマウスの尾の静脈に注射した。
【実施例３】
【００７２】
ハイブリドーマの調製
実施例２で免疫されたマウスの脾臓細胞を摘出し、この脾臓細胞を骨随腫細胞Ｓｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）と融合させ、ハイブリドーマを調製した。
【００７３】
免疫されたマウスの脾臓を無菌的に摘出した後、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）が補充された培地中に細胞成分のみを分離した。分離された純粋な脾臓細胞をＳｐ２１０−Ａｇ１４細胞と１０：１の比率で混合し、一方でＰＥＧ（ポリエチレングリコール）溶液を添加して融合を促進させた。融合された細胞をＨＡＴ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に添加して混合した。融合細胞１００μｌを、マウス支持細胞を前もって敷いてある９６ウェルプレートに添加した。次に、このプレートを３７℃で７日間保温器に置いた。培養が完了した後、ＨＡＴ培地に生存していてハイブリドーマを形成したコロニーを有するウェルを選択した。
【実施例４】
【００７４】
陽性クローンの選択
実施例３にて調製されたハイブリドーマを培養し、ＥＬＩＳＡを用いて培養されたハイブリドーマから陽性クローンを選択した。実施例３のハイブリドーマを、培養皿のウェルに１０細胞、５細胞、０．５細胞が入れるように、９６ウェル培養皿に接種した。この時点で、接種された細胞をＨＡＴ培地中に培養した。この間、培地を、３日毎に新たな培地に交換した。顕微鏡により観察して単一コロニーの形成を有するウェルの培養上澄液を採取し、実施例２と同じ方法によりＥＬＩＳＡを実施して、陽性クローンを選択した。
【００７５】
その結果、４個の陽性クローンを収得し、これらをそれぞれ７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａ、９Ｇ１２−ｂおよび１０Ｂ２−ｂと命名した。
【実施例５】
【００７６】
本発明の単クローン抗体がヒスチジン−タグを認識するか否かの試験
実施例４により得られた４個の陽性クローンがヒスチジン−タグと反応するか否かを否かを試験した。実施例１におけるヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質の調製の間に、組換え蛋白質の精製を容易にするために、ヒスチジン−タグを付けた。従って、前記４個の陽性クローンがヒスジン−タグと反応するか否かを組換え蛋白質ＦＮ１１５を用いるウェスタンブロット分析法によりで分析した。組換え蛋白質ＦＮ１１５（３３ｋＤ）を、フィブロネクチンタイプＩＩＩの９番目および１０番目のドメインを含むｃＤＮＡフラグメントをｐＥＴ２９ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）に挿入し、このベクターにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、蛋白質の発現を誘導して精製することにより調製した。ヒスチジン−タグが付いており、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶと類似性のない組換え蛋白質である（図１）（Ｍａｒｄｏｎ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｇｒａｎｔ，Ｋ．Ｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４０，１９７−２０１，１９９４）。従って、前記４個の陽性クローンがＦＮ１１５蛋白質を認識すれば、これらは、ヒスチジン−タグと反応するものと判定できる。
【００７７】
先ず、実施例４において得られた陽性クローンをそれぞれＤＭＥＭ−低グルコース（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリンＧおよび１％ストレプトマイシンが補充された培地に接種し、３７℃にて、５％ＣＯ２保温器中に培養した。
【００７８】
４種の陽性クローン培養液について、次のようにウェスタンブロット分析を行った。先ず、ブラッドフォード分析法で測定した蛋白質濃度としての、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質およびＦＮ１１５蛋白質のそれぞれ５０ｎｇずつを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動に付し、ゲルをＮＣ膜に移した。この膜をＴＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｃｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中の５％スキムミルクと共に１時間保温して、非特異的な結合を遮断した。次いで、このＮＣ膜を、前記４個の陽性クローン培養液のそれぞれに９０分間浸漬し、次に、抗マウス抗体が結合された西洋わさび過酸化酵素を１：１００００の濃度で含む５％スキムミルクに６０分間入れて免疫染色した。免疫染色程度は強化化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ）を用いて観察した。
【００７９】
この試験結果は、４個の陽性クローン７Ａ６−ａ，９Ｂ２−ａ、９Ｇ１２−ｂおよび１０Ｂ２−ｂ全てが６８ｋＤａのヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を認識することを示した。しかしながら、前記陽性クローンの内７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａおよび９Ｇ１２−ｂは、ＦＮ１１５を認識せず、陽性クローン１０Ｂ２−ｂのみ３３ｋＤａＦＮ１１５蛋白質を認識することを示した（図２）。
【００８０】
従って、陽性クローン１０Ｂ２−ｂはヒスチジン−タグと抗原−抗体反応性があることが分かり、残りの陽性クローン７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａおよび９Ｇ１２−ｂはヒスチジン−タグに対する抗原−抗体反応性が無く、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のみを特異的に認識することが分かった。
【実施例６】
【００８１】
本発明の単クローン抗体がＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３を認識するか否かの試験
ミコバクテリウム・ツバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中に生成されたＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３はｆａｓ−１（ファクシリン１相同性ドメイン）の巨大集合蛋白質群に属し、それぞれ１個のｆａｓ−１ドメインを有している（図３）。実施例４において収得した陽性クローンはβｉｇ−ｈ３蛋白質のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＶに対する抗原−抗体反応性を有している。これらの特性に基づいて、これらの陽性クローンがＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３のｆａｓ−１ドメインも認識できるか否かに付いて、実施例５と同じようにしてウェスタンブロット分析法により試験した。
【００８２】
Ｍｐｔ７０（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３７９６８）のｆａｓ−１ドメイン（配列番号４）およびＭｐｔ８３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９４５９７）のｆａｓ−１ドメイン（配列番号５）に該当するそれぞれのＤＮＡをＰＣＲ増幅してｃＤＮＡ断片を得た。これらＤＮＡ断片のそれぞれをｐＥＴ２９ａベクターのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に挿入して発現ベクターを調製した。大腸菌をそれぞれの発現ベクターで形質転換した後、これら大腸菌における蛋白質の発現を誘導した。実施例１において調製されたヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質および上において調製されたＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に分離させ、分析のためにＮＣ上に付着させた。
【００８３】
分析結果は、陽性クローン７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａおよび９Ｇ１２−ｂはヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質は認識するが、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３は認識しないことを示した。一方、陽性クローン１０Ｂ２−ｂはヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３の全てを認識することを示した（図４）。これは、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３蛋白質はヒスチジン−タグを有しているので、１０Ｂ２−ｂとＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３との抗原−抗体反応性はヒスチジン−タグによるものと思われる。
【実施例７】
【００８４】
本発明の単クローン抗体がヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のＤ−Ｉ、Ｄ−ＩＩおよびＤ−ＩＩＩを認識するか否かの試験
実施例４において得られた陽性クローンがヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＶのみならずＤ−Ｉ、Ｄ−ＩＩおよびＤ−ＩＩＩをも認識するか否かを試験した。
【００８５】
この目的のために、ヒトβｉｇ−ｈ３のＤ−Ｉ、Ｄ−ＩＩおよびＤ−ＩＩＩを実施例１と同じ様にして調製した。これらドメインを調製するために、ヒトβｉｇ−ｈ３（配列番号１）の１番目のｆａｓ−１ドメインＤ−Ｉ（アミノ酸配列１３３番から２３６番まで）、２番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＩ（アミノ酸配列２４２番から３７２番まで）および３番目のｆａｓ−１ドメインＤ−ＩＩＩ（アミノ酸配列３７３番から５０１番まで）に該当するそれぞれのヒトβｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメイン（図５）のｃＤＮＡ切片をＰＣＲで増幅させた。それぞれの増幅産物をベクターｐＥＴ−２９ｂ（＋）のＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ位置にクローニングして発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを調製した。また、組換え蛋白質の精製を容易にするために、前記ｆａｓ−１ドメインのそれぞれのＣ−末端にヒスチジン残基６個を連結させてヒスチジン−タグを作った。
【００８６】
実施例＜１−２＞と同じ方法により前記発現ベクターを用いて組換え蛋白質の発現を誘導し、発現蛋白質を精製し、かくしてヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩおよびヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩＩ蛋白質をそれぞれ得た。得られた蛋白質は、実施例１において調製されたヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質と共に、実施例５と同じ方法によりウェスタンブロットによる分析を行った。
【００８７】
分析結果において、陽性クローン７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａおよび９Ｇ１２−ｂは、Ｄ−ＩＶを除いて、ｆａｓ−１ドメインと抗原−抗体反応性を示さなかった。一方、１０Ｂ２−ｂは、ｆａｓ−１ドメインの全てと抗原−抗体反応性を示した（図６）。これは、１０Ｂ２−ｂがヒスチジン−タグに対して抗原−抗体反応性を有しているためであると考えられる。
【００８８】
上記の試験結果から、陽性クローン７Ａ６−ａ、９Ｂ２−ａおよび９Ｇ１２−ｂはヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶドメインに特異的であることが分かった。
【００８９】
従って、ヒスチジン−タグに対する反応性があることが示された１０Ｂ２−ｂを除く上記４個の陽性クローンから、実施例５、６、７に示された結果を比較に基づいて、細胞の生命力が良好であり、Ｄ−ＩＶドメインとの抗原−抗体反応性が最も優れた７Ａ６−ａを選択した。選択されたクローン７Ａ６−ａは、ブタペスト条約の国際寄託機関であるＫｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅに２００４年１０月１１日付にて寄託番号ＫＣＴＣ  １０７０５ＢＰにて寄託された。
【実施例８】
【００９０】
本発明の単クローン抗体のエピトープの特定
本発明のハイブリドーマ７Ａ６−ａにより生産された単クローン抗体のエピトープを特定するために、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体を調製し、ウェスタンブロット法により分析を行った。ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体として、Ｈ１が欠失している△Ｈ１、Ｈ２が欠失している△Ｈ２、進化的に保存されてきたＨ２配列の中でもより高度に保存されている、細胞付着、拡散および脱着活性を示すペプチドが欠失されている△Ｈ２（６）およびＨ１とＨ２が全て欠失されている△Ｈ１Ｈ２を、それぞれ調製した。ヒトβｉｇ−ｈ３（配列番号１）のアミノ酸５４８番から６３２番までに該当するＤＮＡ（△Ｈ１）、βｉｇ−ｈ３のアミノ酸５０２番から６２０番までに該当するＤＮＡ（△Ｈ２）、βｉｇ−ｈ３のアミノ酸５０２番から６１４番までに該当するＤＮＡ（△Ｈ２（６））およびβｉｇ−ｈ３のアミノ酸５４８番から６２０番までに該当するＤＮＡ（△Ｈ１Ｈ２）を、実施例１−１において調製されたヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ  ｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ増幅により調製した（図７）。
【００９１】
上記のＰＣＲ増幅により得られた、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体のＤＮＡ断片を実施例＜１−１＞におけると同じ方法によりベクターにクローニングして実施例＜１−２＞におけると同じ方法により発現させ、精製した。
【００９２】
前記にて得られた△Ｈ１変異体、△Ｈ２変異体、△Ｈ２（６）変異体および△Ｈ１Ｈ２変異体のそれぞれの培養液を、陽性クローン７Ａ６−ａを用いて、実施例５におけると同じようにしてウェスタンブロット法により分析を行った。対照群として、実施例１で製造したヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを使用した。
【００９３】
分析結果において、Ｈ１が欠失された変異体の場合にのみ、本発明の単クローン抗体との抗原−抗体反応性を示さなかった（図８）。このことは、本発明の７Ａ６−ａのエピトープがＨ１領域（配列番号３）であることを示している。
【実施例９】
【００９４】
マウス腹水の形成誘導
実施例８において調製されたハイブリドーマ７Ａ６−ａをマウスの腹腔に注射し、マウス腹水中に高濃度の単クローン抗体を生成させた。この目的のために、ＢＡＬ／Ｃマウス（雌）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（プリスタン、ｓｉｇｍａ  Ｔ７６４０）０．５ｍｌを腹腔に注射して腹水が形成できる環境を作った。７日後に５×１０５個のハイブリドーマ細胞を、１×リン酸緩衝生理食塩水と混合し、マウスの腹腔に注射した。注射後の１０日目に、マウスを麻酔させ、この状態で、注射器で腹腔から腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を採取した（図９）。採取した上清に０．０２％ナトリウムアジドを添加して−２０℃で保管した。
【実施例１０】
【００９５】
マウス腹水の抗体を認識する能力についての試験
前記実施例９において調製されたマウス腹水がヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを認識するか否かを、前記実施例５おけると同じようにウェスタンブロット分析により試験した。この際、ヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇおよび１ｎｇの濃度で使用した。
【００９６】
この試験結果は、腹水から生成された単クローン抗体はヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶを５ｎｇ濃度まで認識することを示した（図１０）。
【実施例１１】
【００９７】
本発明の単クローン抗体のマウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質との交叉反応性の試験
マウスβｉｇ−ｈ３蛋白質を誘導するマウス軟骨細胞（ＡＴＤＣ５）と、ラットβｉｇ−ｈ３蛋白質を誘導する正常ラット腎臓細胞（ＮＲＫ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−６５０９）をβｉｇ−ｈ３蛋白質が誘導できる条件で培養した。すなわち、前記マウス軟骨細胞とラット腎臓細胞を、Ｌ−グルタミン４ｍＭ、炭酸水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／ＬおよびＦＢＳ１０％を含むＤＭＥＭ培地において増殖させ、次いで、血清が含まれていない培地に移し、２４時間、この血清が含まれていない培地中に培養した。次いで培養液を採取した。また、ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を誘導するヒト肺臓腺癌腫細胞（Ｈ４６０，  ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７７）をβｉｇ−ｈ３蛋白質が誘導できる条件で培養した。すなわち、このヒト肺臓腺癌腫細胞をＬ−グルタミン２ｍＭ、炭酸水素ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭおよびＦＢＳ１０％を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中に増殖させ、これを血清が含まれていない培地に移し、２４時間、この血清が含まれていない培地中に培養し、培養液を回収した。培養液を凍結乾燥した後、実施例１−３におけると同じブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）分析による牛の血清アルブミンを基準にして、蛋白質濃度を分析した。次いで、本発明の単クローン抗体が前記マウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質を認識するか否かを実施例５におけると同じようにしてウェスタンブロット分析法により試験した。この分析において、前記培養液等のそれぞれは２５μｌを使用し、対照群としてマウスβｉｇ−ｈ３に対する多クローン抗体を使用した。
【００９８】
この試験結果は、本発明のヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する単クローン抗体は、ヒト肺臓腺癌腫中に発現されたβｉｇ−ｈ３を認識することができたが、マウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３は認識しないことを示した。一方、マウスβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する多クローン抗体はマウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質の全て認識できることが示された（図１１）。
【００９９】
従って、本発明のヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する単クローン抗体はマウスとラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する交叉反応性がないことが分かった。
【実施例１２】
【０１００】
本発明の単クローン抗体を用いるヒト腎臓組織中および肺臓組織中のβｉｇ−ｈ３蛋白質の検出
本発明の単クローン抗体が組織中および細胞中に発現されたβｉｇ−ｈ３蛋白質を実際に認識するかを試験するために、ヒト腎臓組織および肺臓組織を本発明の単クローン抗体を用いる免疫組織化学に処した。
【０１０１】
この目的のために、提供者から得た腎組織および肺組織を４５％パラホルムアルデヒド中にて２４時間固定した。固定された組織をＴｉｓｓｕｅ−ＴＥＫ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｊａｐａｎ  ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いて脱水し、パラフィン中に埋め込んだ。これら組織を回転ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３μｍに切断してスライドに載せた。この組織切片のパラフィンをキシレンにより除去し、組織を生体状態に水和させるために、水分含量を漸次増やすエタノール溶液（９９％，９６％，７０％）中で連続的に水和させた。間接的なＤＡＢ免疫染色のために、前記水和させた組織を１００％メタノールで希釈した３％Ｈ２Ｏ２に３０分間入れて置き、組織中の過酸化酵素を遮断した。組織中の抗原−抗体反応を活性化させるために、腎組織切片を電子レンジ中で１０分間加熱した。この組織切片を、室温で長時間冷却させた後、抗体の非特異的な結合を防止するために５０ｍＭＮＨ４Ｃｌ中に３０分間置き、スライドを非特異的な結合を防止するための溶液（１％ＢＳＡ，０．０５％サポニン，０．２％ゼラチン）により処理した。次に、本発明のヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質に対する単クローン抗体を抗体希釈溶液（ＰＢＳ中、０．１％ＢＳＡ，０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）により１：５００に希釈し、前記切片を前記希釈した抗体溶液により処理し、４℃で一晩反応させた。反応完了後、反応液を洗滌溶液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ，０．０５％サポニン，０．２％ゼラチン）で３回それぞれ１０分間洗滌した。次いで、抗体希釈溶液を用いて西洋ワサビ過酸化酵素が連結された羊抗−マウス免疫グロブリン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：２００に希釈し、組織切片を前記希釈された抗体溶液により処理した。得られた切片を上述の方法と同じ方法により洗滌した後、ＤＡＢを組織切片上に振り撒き、約５分後褐色を呈する反応を観察した。反応の完了後、組織切片をＰＢＳで速やかに洗滌し、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で染色した。最後に、組織切片をエタノールの濃度を漸次高めるタノール溶液（７０％，  ９６％，９９％）中で連続的に脱水させた。脱水させた組織をＰｅｒｍｏｕｎｔＳＰ１５−５００（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて剥離させた。組織切片上に染色されたβｉｇ−ｈ３の組織学的様相を光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
【０１０２】
この試験結果から、本発明の単クローン抗体は、ヒト腎臓組織中およびヒト肺臓組織中のβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識することが分かった（図１２）。
【実施例１３】
【０１０３】
本発明の単クローン抗体のＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）
本発明の単クローン抗体は疾病の診断に使用できるか否かを、直接サンドイッチ法を用いて調べた。
【０１０４】
濃度が分かっているβｉｇ−ｈ３蛋白質を標準蛋白質として使用して、試験を、本発明の単クローン抗体をＨＲＰと連結した場合と、連結せずに２次抗体と共にした場合について行った。また、組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質を兎に注射し、免疫を誘導して得られた多クローン抗体をこの試験に使用した。先ず、プレートを、連結していない本発明の単クローン抗体１００μｌ（０．５μｇ／ｍｌ）により被覆し、遮断緩衝液により処理して非特異的反応を遮断した。次いで、濃度が分かっている組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質をこのプレートに加えて抗原−抗体反応を再び誘導し、所定の時間経過後、反応液を除去した。洗滌後、兎由来の多クローン抗体を用いて抗原−抗体反応を再び誘導し、βｉｇ−ｈ３蛋白質と反応した兎抗体およびＨＲＰに連結された２次抗体を用いてβｉｇ−ｈ３蛋白質の量を測定した。前記と同じ方法により、プレートを兎の多クローン抗体により被覆して、ＨＲＰが連結された単クローン抗体を用いて、濃度が分っているβｉｇ−ｈ３蛋白質の量を測定した。測定した結果をグラフに表わした。
【０１０５】
この試験結果は、単クローン抗体により被覆した場合は、兎の多クローン抗体により被覆した場合に比べ、より広い測定範囲を有することを示し、非特異的な反応程度を表わすバックグラウンドも低くかった（図１３）。しかしながら、２つの場合の両方とも、標準蛋白質の濃度に比例する相関係数が０．９８以上を示し、本発明の単クローン抗体がＥＩＡに使用できることを示唆した。
【実施例１４】
【０１０６】
本発明の単クローン抗体がβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性を抑制するかの試験
本発明の単クローン抗体がβｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性を抑制するかを試験した。
【０１０７】
９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にｐＦＮ（精製されたヒトプラズマフィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｆ  ２００６）、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−Ｉ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＩＩ、βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶおよびβｉｇ−ｈ３蛋白質により処理して、４℃で一晩反応させ、前記蛋白質等をプレートに付着させた。対照群蛋白質としては牛の血清アルブミンを使用した。それぞれの蛋白質が付着したプレートを、リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗滌し、次いで２％牛血清アルブミンにより処理して１時間反応させて、非特異的反応を遮断した。前記プレートをＰＢＳで２回洗滌後、前記プレートに付着した前記蛋白質のそれぞれを、実施例９の腹水５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）により処理し、３０℃で３０分間反応させた。このとき、マウス腹水の代わりに、ＰＢＳ、マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）およびヒトβｉｇ−ｈ３に対する多クローン抗体を添加し、マウス腹水を添加した場合と比べた。反応完了後、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）２．５×１０４個を前記プレートに添加し、所定の時間繊維芽細胞の付着を誘導した。次に、このプレートを１×ＰＢＳを用いて２回洗滌し、このプレートに３．７５ｍＭｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グリコサミン（ヘキソサミニダーゼの基質）および２５％トリプトンＸ−１００を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）６０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。反応完了後、このプレートに５ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭグリシン９０μｌを添加して酵素活性を停止させた。酵素活性程度はマイクロプレートリーダＭｏｄｅｌ  ５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用して４５０ｎｍにおいてで測定した。
【０１０８】
上記の試験の結果において、本発明の単クローン抗体による細胞付着活性の抑制はヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質およびヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質を使用した場合にのみ示された（図１４）。従って、本発明の単クローン抗体は、βｉｇ−ｈ３蛋白質を、特にその４番目のｆａｓ−１ドメインであるβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質を特異的に認識して前記蛋白質への細胞の付着活性を阻害することが見出された。
【実施例１５】
【０１０９】
本発明の単クローン抗体の処理濃度による細胞付着活性の抑制
プレートに付着された蛋白質としてβｉｇ−ｈ３およびβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶのみを使用したことおよびマウス腹水の処理濃度をそれぞれ０、１、２、５、１０、２５および５０μｌとしたこと以外は実施例１３におけると同じ方法により、細胞付着活性の抑制程度を測定した。この試験結果から、βｉｇ−ｈ３蛋白質およびβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ蛋白質を本発明の単クローン抗体の１μｌの低濃度で処理した場合にも、これら蛋白質のマウス繊維芽細胞への付着活性が大きく減少することが見出された（図１５）。
【０１１０】
産業上の利用可能性
本発明の単クローン抗体は、組織においてヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質を特異的に認識でき、したがって、本発明の単クローン抗体はβｉｇ−ｈ３蛋白質の増加または減少に伴う疾患の診断に有用である。加えて、前記単クローン抗体は、βｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性を抑制する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ヒトβｉｇ−ｈ３および組換え蛋白質ＦＮ１１５の構造を示す概要図である。
【図２】本発明の単クローン抗体がヒスチジン−タグを認識するか否のをウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図３】βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶ、Ｍｐｔ７０およびＭｐｔ８３のそれぞれのｆａｓ−１ドメイン構造を示す概要図である（黒色部分：ｆａｓ−１ドメイン中の高度に保存的な部分、灰色部分：ｆａｓ−１ドメイン中の保存的な部分）。
【図４】本発明の単クローン抗体がＭｐｔ７０およびＭｐｔ８３を認識するか否のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図５】ヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のｆａｓ−１ドメインを示す概要図である。
【図６】本発明の抗体がヒトβｉｇ−ｈ３蛋白質のＤ−Ｉ、Ｄ−ＩＩ、Ｄ−ＩＩＩおよびＤ−ＩＶを認識するか否のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図７】βｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体を示す概要図である。
【図８】本発明の単クローン抗体がヒトβｉｇ−ｈ３  Ｄ−ＩＶの欠失変異体を認識するか否のウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図９】本発明のハイブリドーマを用いてマウスの腹水を形成することによる本発明の単クローン抗体を誘導する段階を示す。
【図１０】本発明のマウス腹水中に生成された抗体の認識感度についてのウェスタンブロット分析の結果を示す。
【図１１】腹水中に生成された本発明の単クローン抗体の、マウスおよびラットのβｉｇ−ｈ３蛋白質との交叉反応についてのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図１２】本発明の単クローン抗体を用いて行われた、ヒト腎臓組織および肺臓組織における免疫組織染色の結果を示す写真である。矢印はβｉｇ−ｈ３が検出された領域である。
【図１３】本発明の単クローン抗体を使用した酵素免疫分析（ＥＩＡ）の結果を示す。
【図１４】本発明の単クローン抗体の、βｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞付着活性の抑制効果を多クローン抗体のそれと比較した結果を示す。
【図１５】本発明の単クローン抗体の種々の処理濃度におけるβｉｇ−ｈ３蛋白質およびドメインＤ−ＩＶのそれぞれの細胞付着活性の抑制を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008520654.tif 000018
2008520654.tif 000019