(57)【要約】  アントシアニジン類及びアントシアニン類によるインスリン分泌を刺激するための方法が記載される。その分泌はヒトを包含する哺乳動物の生体内において、又は生体外においてであることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓ベータ細胞に、アントシアニン類又はアントシアニジン類又はそれらの混合物を与えて、該アントシアニンの存在なしでのインスリン分泌に優ってインスリン分泌を増大させることを含む、インスリンを分泌する膵臓細胞によるインスリン分泌を増大させるための方法。
【請求項２】
アントシアニンが果物類、野菜類及び花類から単離される、請求項１の方法。
【請求項３】
アントシアニンが、シアニジン−３−グリコシド、デルフィニジン−３−グリコシド、ペラルゴニジン−３−グリコシド及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項４】
膵臓細胞が生体内にある、請求項１、２又は３のいずれか１項の方法。
【請求項５】
膵臓細胞が生体外にある、請求項１、２又は３のいずれか１項の方法。
【請求項６】
生体内膵臓細胞からのインスリン産生を増大させることにおいて使用するための、投薬量単位としてのアントシアニン又はアントシアニジン又はそれらの混合物。
【請求項７】
アントシアニンが、果物類、野菜類及び花類から単離される、請求項６の組成物。
【請求項８】
アントシアニンが、シアニジン−３−グリコシド、デルフィニジン−３−グリコシド、ペラルゴニジン−３−グリコシド及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項６の組成物。
【請求項９】
アントシアニジン又はアントシアニン又はそれらの混合物が単離されそして精製される、請求項１の方法。
【請求項１０】
アントシアニジン又はアントシアニン又はそれらの混合物が単離されそして精製される、請求項６の組成物。
【請求項１１】
アントシアニン又はアントシアニジン又はそれらの混合物が果物類又は野菜類のジュースにある、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
この出願は、優先権について、２００４年７月２９日に出願された仮の特許出願シリアル第６０／５９１，８０６号に依存する。
【０００２】
米国政府の権利
この発明はＵＳＤＡ（米国農務省）認可第２００３−３５５０４−１３６１８号に基づいて資金を受けた。米国政府はこの発明に対して或る権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、細胞によるインスリン産生を増大させるためにアントシアニン類、アントシアニジン類又はそれらの混合物を使用する方法に関する。本発明はまた、インスリンの産生においての増大を生成するための方法に使用されるべき組成物に関する。それらの方法及び組成物は生体内（インビボ）又は生体外（インビトロ）であることができる。
【背景技術】
【０００４】
インスリンの機能は、肝臓からのグルコース出量の抑制によるか、あるいはグルコース吸収及びその代謝の刺激によるかのいずれかによる正常な血液グルコース水準を維持することである（Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ａ．，等の、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０４，第１２５５頁〜第１２８２頁（２００４）における糖尿病の化学及び生化学）。インスリンの不十分な放出又は目標組織でのインスリン作用の損失は、異常なグルコース及び脂質代謝を生ずる。このことは糖尿病の特徴である血液中の上昇したグルコース水準を生ずる（Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，Ｌ．，等、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．２９，第３３頁〜第４２頁（１９９９）における、ＩＩ型糖尿病：新しい世紀のトピックス）。Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）及びＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）、の２つのタイプの糖尿病が存在する。Ｉ型糖尿病は、インスリンを分泌する細胞である、膵臓β−細胞の自己免疫破壊から生じ、これはインスリン不足に導く。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病はより広く認められており、そして遺伝的及び環境的要因によりうち立てられたインスリン抵抗を克服するために十分な量のインスリンを分泌することに対するβ−細胞の不能力により起こされる（Ｈｅｎｑｕｉｎ，Ｊ．Ｃ．によるＤｉａｂｅｔｅｓ  ４９，第１７５１頁〜第１７６０頁（２０００））。インスリン抵抗は、インスリンが骨格筋及び脂肪においてのグルコース輸送を不適切に刺激し、そして肝臓グルコース産生を不適切に抑制する疾患である。周辺のインスリン抵抗を克服するためにβ細胞が十分な量のインスリンを分泌することを妨げることを包含するそのメカニズムは、確立されたままの状態にある。しかしながら、β−細胞からのインスリン放出を直接に刺激する経口低血糖剤（例えばスルホニル尿素をベースとする医薬）は、ＩＩ型糖尿病患者の複数の島（ｉｓｌｅｔｓ）からのインスリン分泌を、周辺インスリン抵抗を克服し且つ血液グルコース水準を正常化させるのに十分に上昇させることができることを示した。
【０００６】
スルホニル尿素をベースとする医薬の欠点の１つは、それが正常な血液グルコース水準を制御しないことである（ロンドンのＭａｌｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．発行、Ｂ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，等（監修）のＩＩ型糖尿病のテストブック第７７頁〜第８５頁（２００３）におけるＰｆｅｉｆｆｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｈ．による、経口低血糖剤：スルホニル尿素類及びメグリチニド類（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ））。これらの医薬はまた、インスリンを分泌しそして体重増加を生ずるβ−細胞の能力に不利に影響する（ロンドンのＭａｌｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．発行、Ｂ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，等（監修）のＩＩ型糖尿病のテストブック第７７頁〜第８５頁（２００３）におけるＰｆｅｉｆｆｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｈ．による、経口低血糖剤：スルホニル尿素類及びメグリチニド類（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ））。したがって、血液グルコース水準を調整するか又は膵臓β−細胞によるインスリン産生を誘導することができる役割が、規定食（ダイエット）構成成分に存在する。
【０００７】
脂肪が低く、そして酸化防止剤に富んでいる規定食（ダイエット）の消費は、肥満及びインスリン抵抗の危険性を減少させる（Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｓ．，等の、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３３第２８３８頁〜第２８４４頁（２００３））。アントシアニン類は酸化防止剤のポリフェノール類に属し、そして種々の食品類及び飲料類に存在する。アントシアニン類の消費は、アテローム性動脈硬化症、心臓血管疾患、癌及び糖尿病のような、幾つかの退行変性疾患の減少した危険性を伴う（Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．，等の、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６０，第３１０９頁〜第３１２１頁（２００４）におけるＷｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａからの効力ある脂質過酸化抑制因子）。これらの化合物は、周知の遊離基スカベンジャーでありそして潜在性化学的予防剤として報告されている（Ｄｕｔｈｉｅ，Ｇ．Ｇ．，等のＮｕｔｒ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３，第７９頁〜第１０６頁（２０００））。
【０００８】
例えば、血清酸化防止剤能力は、イチゴ類、チェリー類、及び赤ワインの消費により増大された（Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｙ．，等のＣａｎｃ．Ｌｅｔｔ．１９４第１３頁〜第１９頁（２００３）；Ｖａｎ  Ｖｅｌｄｅｎ，Ｄ．Ｐ．，等のＡｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５７，第３３７頁〜第３４０頁（２００２）；およびＷａｎｇ，Ｈ．，等のＪ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６２第２９４頁〜第２９６頁（１９９９））。最近の研究は、アントシアニンであるシアニジン３−グルコシドがハッカネズミにおいて高脂肪食誘導肥満を減少させたことを示した（Ｔｓｕｄａ，Ｔ．等によるＪ．Ｎｕｔ．１３３第２１２５頁〜第２１３０頁（２００３））。それ故、食品中に存在する天然の着色剤は、それらの安全な栄養的及び治療的価値に起因して消費者達を引きつけた（Ｅｓｐｉｎ，Ｊ．Ｃ．等のＪ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４８第１５８８頁〜第１５９２頁（２０００））。アントシアニン類は広く消費されているので、これらの化合物の追加の生物学的活性は非常に関心のあるものであろう。
【０００９】
ミズキ属種（Ｃｏｒｎｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の果物は、アントシアニン類の豊富な源である。ヨーロッパ及びアジアのセイヨウサンシュユ（Ｃｏｒｎｅｌｉａｎ  ｃｈｅｒｒｙ）としてまた知られているＣｏｒｎｕｓ  ｍａｓ  Ｌ．の果物は、ヨーロッパにおける飲料の製造において用いられている（ニューヨーク、のＤｏｖｅｒ  Ｐｕｂｉｃａｔｉｏｎｓ発行Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｍｉｌｌｓｐａｕｇｈ，Ｃ．Ｆ．２８２頁（１９７４年））。伝統的な医薬において、Ｃｏｒｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ果物は、それらの鎮痛活性及び利尿活性のために知られている（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｋ．，等の、Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１第７８７頁〜第７８９頁（１９９８））。ミズキ属の果物類はまたアジアの国々においての幾種かの抗糖尿病薬草製剤の主要な成分の１つである（Ｙａｍａｈａｒａ，Ｊ．，等の薬学雑誌１０１第８６頁〜第９０頁（１９８１））。Ｃ．ｍａｓ及びＣ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの果物の、本発明者等の早期の調査研究は、両方が高水準のアントシアニン類を含有していることを明らかにした（Ｓｅｅｒａｍ，Ｎ．Ｐ．等の、Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５０第２５１９頁〜第２５２３頁（２００２））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それ故、生体外（インビトロ）又は生体内（インビボ）でのインスリン産生を増大させるための方法及び組成物を提供することが本発明の目的である。追加の目的は以下の記載及び図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、アントシアニン無しでのインスリン分泌よりも優れたインスリン分泌を増大させるために、膵臓ベータ細胞に、アントシアニン類又はアントシアニジン類又はそれらの混合物を与えることを含む、インスリン分泌する膵臓細胞によるインスリン分泌を増大させるための方法に関する。
【００１２】
そのアントシアニンは、果物類、野菜類及び花類から単離されるのが好ましい。好ましくは、本方法において、アントシアニンはシアニジン−３−グリコシド、デルフィニジン−３−グリコシド、ペラルゴニジン−３−グリコシド及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。膵臓細胞は、生体内（インビボ）であることができる。膵臓細胞は、生体外（インビトロ）であることができる。好ましくは、本方法において、アントシアニジン又はアントアシアニン又はそれらの混合物は単離され、そして精製される。
【００１３】
本発明はまた、生体内（インビボ）における膵臓細胞からのインスリン産生を増大させることにおいて使用するための、投薬量単位としてアントシアニン又はアントシアニジン又はそれらの混合物に関する。
【００１４】
好ましくは、本組成物においてアントシアニンは、果物類、野菜類及び花類から単離される。好ましくは、本組成物においてアントシアニンはシアニジン−３−グリコシド、デルフィニジン−３−グリコシド、ペラルゴニジン−３−グリコシド及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。好ましくは、本組成物においてアントシアニジン又はアントシアニン又はそれらの混合物は単離され、そして精製される。“グリコシド”類は、炭水化物分子（糖）を含有する任意の化合物であって、特に加水分解開裂により糖と非糖部分（アグリコン）とに転換可能な、植物における任意のそのような天然生成物であり、そしてグルコシド（グルコース）、ペントシド（ｐｅｎｔｏｓｉｄｅ）（ペントース）、フルクトシド（フルクトース）、等としてその含有される糖について特に名ずけられた任意の化合物である。
【００１５】
アントシアニン類は、果物類、野菜類及び花類において、赤色、青色及び紫色を包含する種々の明るい色に応答性であり、そしてダイエットポリフェノール類として消費される。アントシアニン含有果物は、心臓冠状動脈疾患を減少させることにおいて関係があり、そして抗糖尿病製剤において用いられる。本発明は、生体外（インビトロ）での齧歯類動物の膵臓ベータ細胞（ＩＮＳ−１  ８１３／３２）によるインスリン分泌を刺激するための、アントシアニン類の、シアニジン−３−グルコシド（１）、デルフィニジン−３−グルコシド（２）、シアニジン−３−ガラクトシド（３）及びペラルゴニジン−３−ガラクトシド（４）；そしてアントシアニジン類のシアニジン（５）、デルフィニジン（６）、ペラルゴニジン（７）、マルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）（８）、及びペトウニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）（９）の能力を示す。４及び１０ｍＭのグルコース濃度の存在下にそれらの化合物を試験した。シアニジン−３−グルコシド（１）及びデルフィニジン−３−グルコシド（２）は、４及び１０ｍＭグルコース濃度で試験されたアントシアニン類及びアントシアニジン類の中で最も有効なインスリン分泌促進物質であった。ペラルゴニジン−３−ガラクトシドは主要なアントシアニン類の１種であり、そしてそのアグリコンであるペラルゴニジンは、４ｍＭグルコース濃度でインスリン分泌において１．４倍の増加を生じた。試験された残りのアントシアニン類及びアントシアニジン類は、４及び１０ｍＭグルコース濃度でインスリンに対してほんのぎりぎりの影響しか有しなかった。
【実施例】
【００１６】
好ましい態様の記載
材料及び方法
化学剤
胎児ウシ血清（ＦＢＳ）及びＲＰＭＩ−１６４０培地をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（ニューヨーク州のグランドアイランド（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ））から得た。使用した全ての有機溶媒はＡＣＳ（アメリカ化学会）試薬級であった。ＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＢＳＡ（ウシ，アルブミン；ＲＩＡ級）、フォリン−シオラチュース（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｌａｔｕｅｓ）試薬及び緩衝液の調製のために使用された化学剤を、シグマ−アルドリッヒケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス）から購入した。アッセイにおいて使用されたアントシアニジン類のシアニジン、デルフィニジン、ペラルゴニジン、マルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）及びペトウニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）を、クロマデクス（Ｃｈｒｏｍａｄｅｘ）社（カリフォルニア州ラグナヒルス（Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ））から購入した。アントシアニン類のデルフィニジン−３−グルコシド（２）をＣ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ果物から精製した。シアニジン−３−ガラクトシド（３）及びペラルゴニジン−３−ガラクトシド（４）をＣ．ｍａｓ果物から単離した。この研究において用いられた純粋なシアニジン−３−グルコシド（１）は、−２０℃での本出願人の貯蔵からのものであった。
【００１７】
アントシアニン類の単離及び精製
ミズキ属果物を、水（ｐＨ＝３）とブレンドし、そして濾過した。濾液をカラム中のＸＡＤ−１６アンバーライト樹脂中に通過させ、そして吸着したアントシアニン類を有する樹脂を水で繰り返して洗浄した（１７）。次にＸＡＤ−１６樹脂を酸性ＭｅＯＨ（ｐＨ＝３）で溶離し、そして得られた溶液を減圧下に濃縮して粗製アントシアニン画分を生成した。この画分を勾配条件下にＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（ｐＨ＝３）を用いてＭＰＬＣカラム（Ｃ１８シリカ）により精製した。アントシアニン類を、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（６５：３５、容量／容量）溶媒システムを用いて溶離した。勾配条件下にカプセル（Ｃａｐｃｅｌｌ）Ｃ１８分析カラムを用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．製）により、化合物の純度を調べた。使用した溶媒は、Ａ；ＴＦＡ：Ｈ２Ｏ（９９．９：０．１、容量／容量）及びＢ；Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ：ＣＨ３ＣＯＯＨ：ＴＦＡ（５０．４：４８．５：１．０：０．１、容量／容量／容量／容量）であった。勾配は０．８ｍｌ／分の流速で２６分で２０％Ｂ〜６０％Ｂ、及び３０分で〜２０％Ｂであった。ＰＤＡを用いて５２０ｎｍでピークを検出した。
【００１８】
インスリン分泌研究
（ノースカロライナ州デューク（Ｄｕｋｅ）大学のクリストファー  ニューガード（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｎｅｗｇａｒｄ）博士から好意をもって提供された）ＩＮＳ−１  ８３２／１３細胞（１８）は、１１．１ｍＭのグルコースを含有し、そして１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び５０μＭの２−メルカプトエタノールが補給された、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃で５％ＣＯ２／空気中でごく普通に培養された。トリプシン−ＥＤＴＡ分離の後、細胞を週に一度通過させた。定常的分泌研究のために、ウエル当たり０．６４ｘ１０６細胞の密度で２４ウエル平板上で細胞を平板培養し、そして２４時間増殖させた。次に、４ｍＭグルコース及び上記補給物を含有するＲＰＭＩ−１６４０において追加の２４時間、細胞を培養した。
【００１９】
次に、４ｍＭのグルコース及び０．１％ＢＳＡを含有するクレブスリンゲル重炭酸塩緩衝液（Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＫＲＢＢ）において細胞を３０分間２回インキュベートした。ＫＲＢＢを用いて細胞を迅速に洗浄し、そして示されたアントシアニン類又はアントシアニジン類と共に、又はそれの存在なしに、４又は１０ｍＭのグルコースを含有するＫＲＢＢ中で６０分間インキュベートした。次にインスリン放出を調べるために培地を除去した。次にＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、そして１ＭのＮａＯＨに溶解した。次に細胞たんぱく質濃度をロウリー（Ｌｏｗｒｙ）アッセイにより測定した。アントシアニン類及びアントシアニジン類をＤＭＳＯに溶解して所望の濃度を得た。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。細胞により培地中に分泌されたインスリンを放射性同位元素標識免疫測定法（ラジオイムノアッセイ）により測定し、そして総細胞たんぱく質に正規化した。
【００２０】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
ＲＩＡのためのキットをＬＩＮＣＯリサーチ  インコーポレーテッド（ＬＩ  ＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）（ミズーリ州セントチャールズ）から購入し、そして前記アッセイを製造者の使用説明書に従って行った。しばらくして、インスリン標準（ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（１００μｌ）の０．１〜１０ｎｇを１２ｘ７５ｍｍ試験管に加えた。同様に、インスリン分泌研究からのサンプル（２５μｌ）をまた、該試験管に加えた。これに、アッセイ緩衝液の分取量（アリコ−ト）（７５μｌ）を加えた。次に１２５Ｉ標識化インスリン（１００μｌ）を各々の試験管に加えた。１００μｌの抗ネズミインスリン抗体の分取量（アリコート）を試験管に加え、混合し、そして２４時間４℃でインキュベートし、そして４℃で２０分間、沈殿用剤の１ｍｌの分取量（アリコート）と共にさらにインキュベートして、該抗体に結合されたインスリンを沈殿させた。次に、試験管を遠心分離し、そしてガンマ計数器を用いて放射能を測定した。
【００２１】
ロウリー（Ｌｏｗｒｙ）たんぱく質アッセイ
アッセイウエル中のたんぱく質の量をロウリー（Ｌｏｗｒｙ）法により測定した（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．Ａ．，等のＨｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８７第３１７頁〜第３２６頁（２００４））。ロウリー（Ｌｏｗｒｙ）溶液、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ（１％）及び酒石酸ナトリウム（１％）を一緒にすることによりロウリーアッセイ溶液を調製した。しばらくの間、たんぱく質サンプル（１００μｌ）及びロウリー混合物（１ｍＬ）を試験間（１２ｘ７５）中で混合した。フォリン−シオラチュース（Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｌａｔｕｅｓ）試薬（１００μｌ）をこれらの試験管に加え、混合しそして室温で３０分間インキュベートした。得られた溶液の光学濃度を、ＵＶ分光光度計を用いて、７００ｎｍで読み取った。
【００２２】
結果及び検討
ミズキ属果物を、“ハチミ−ガン（Ｈａｃｈｉｍｉ−Ｇａｎ）”のような抗糖尿病の伝統的な漢方薬（中国式処方薬）において使用する（Ｙａｍａｈａｒａ，Ｊ．，等の薬学雑誌１０１第８６頁〜第９０頁（１９８１））。Ｃｏｒｎｕｓ  ｓｐｐ．果物においてのアントシアニン類の定量化が最近報告された（Ｓｅｅｒａｍ，Ｎ．Ｐ．，等のＪ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５０第２５１９頁〜第２５２３頁（２００２））。ミズキ属果物の調査研究は、これらにおいての主要な生物活性成分がシアニジン、デルフィニジン及びペラルゴニジン、のグルコシド類であることを示した。それ故、本発明者等は、抗糖尿病製剤においてのミズキ属果物の個々の事例に基づく使用を具体化させるために膵臓ベータ細胞を使用するこれらのアントシアニン類及びそれらのアグリコン類のインスリン分泌能力に、本発明者等の注意を集中させた。ペトウニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）、マルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）及びペオニジン、のアグリコン類は、それらが他の果物に豊富に存在するので、それらをまた、効力検定（アッセイ）に包含させた。
【００２３】
アントシアニン類は水溶性の化合物である。Ｃ．ｍａｓ果物の水性抽出液は、糖類、バイオフラボノイド類及びアントシアニン類を含有し、したがってＸＡＤ−１６樹脂により分別化された。樹脂から溶離して得られたアントシアニン画分をＭＰＬＣにより精製して純粋なアントシアニン類を得た。ＩＮＳ−１  ８３２／１３細胞によるグルコース誘導インスリン産生を、４、１０及び１６ｍＭグルコース濃度で測定し、そして１０ｍＭグルコース濃度でインスリン分泌が遅滞期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）に到達したことを見い出した（データ提供せず）。４ｍＭ水準でのグルコース濃度は、ヒトにおける正常なグルコース水準の典型である（Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．等のＭｅｄ．Ｂｏｉｌ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐ．３１第２８４頁〜第２９０頁（１９９３））。１０ｍＭグルコースでの細胞による、たんぱく質ｍｇ当たりのインスリン分泌は、４ｍＭグルコース濃度でのインスリン分泌と比較した場合に３倍高かった。
【００２４】
アントシアニン類及びアントシアニジン類をまた、細胞増殖培地において４及び１０ｍＭグルコース負荷で試験した。アントシアニン類及びアントシアニジン類を５０μｇ／ｍＬ濃度で最初に効力検定（アッセイ）した。アントシアニン類の、シアニジン３−グルコシド（１）は、４ｍＭグルコースで、インスリン分泌において９ｎｇ／ｍｇたんぱく質（１．３倍）の増加を示し、それに対してそれは、１０ｍＭグルコース濃度で１．４３倍（１１９ｎｇ／ｍｇたんぱく質）インスリン分泌を高めた（図２Ａ）。デルフィニジン−３−グルコシド（２）は、試験された最も活性のあるアントシアニンであって、４ｍＭグルコース濃度でインスリン分泌において、１．８倍の増加（４９ｎｇ／ｍｇたんぱく質）を示した。しかしながら、１０ｍＭのグルコース濃度でそれはインスリン産生において１．４倍（１１３ｎｇ）のみの増加を示した（図２Ａ）。この効力検定（アッセイ）において、４及び１０ｍＭグルコース濃度で細胞により分泌されたインスリンは、たんぱく質のｍｇ当たり、それぞれ２７及び８３ｎｇのインスリンであった。アントシアニン類であるシアニジン−３−ガラクトシド（３）及びペラルゴニジン−３−ガラクトシド（４）は、４ｍｇグルコース濃度でインスリン分泌を増加しなかった。しかしながら、シアニジン−３−ガラクトシドは、１０ｍＭグルコース濃度で１７ｎｇ／ｍｇたんぱく質のインスリン（１．２倍）の増加を示した（図３）。ペラルゴニジン−３−ガラクトシド（４）は、サンプルの制限によって、１回のみしか試験されなかった。
【００２５】
アントシアニンであるシアニジン−３−グルコシド（１）を５、１０、５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬ濃度で投薬量依存性インスリン分泌について評価した。このアッセイにおいて用いられたグルコース濃度は、ヒトにおける正常なグルコース水準の典型である４ｍＭ水準であった（Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．等のＭｅｄ．Ｂｏｉｌ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐ．３１第２８４頁〜第２９０頁（１９９３））。この濃度で、非処理細胞はインスリンの３３ｎｇ／ｍｇたんぱく質を分泌した。シアニジン−３−グルコシド（１）により処理された細胞により分泌されたインスリンは、５μｇ／ｍＬで、たんぱく質のｍｇ当たり４６ｎｇのインスリンであった。しかしながら化合物１の１０、５０、１００及び２５０μｇ／ｍＬ濃度でインスリン分泌における有意差はなかった。本発明者等は、投薬依存性アッセイを行うためにデルフィニジン−３−グルコシドの適当な補給を有しなかった。
【００２６】
５０μｇ／ｍＬ濃度でアントシアニジン類を効力検定（アッセイ）した。シアニジン−３−グルコシドのアグリコンであるシアニジン（５）は、４ｍＭグルコースで１．５倍（２９ｎｇ／ｍｇたんぱく質）インスリン分泌を高め、それに対して１０ｍＭグルコースでそれは８８ｎｇ／ｍｇたんぱく質のインスリンを分泌した（図２Ｂ）。このセットのアッセイで、４及び１０ｍＭグルコースでの非処理細胞は、それぞれ１９及び８３ｎｇのインスリン／ｍｇたんぱく質を分泌した。アグリコンであるデルフィニジン（６）は４ｍＭグルコース濃度で６ｎｇ／ｍｇたんぱく質だけインスリン分泌において増加を示し、そして有意ではなかった。デルフィニジンは１０ｍＭグルコースでグルコース誘導インスリン分泌を示さなかった（図２Ｂ）。ペラルゴニジンは、最も活性のあるアントシアニジンであった、そしてそれは４及び１０ｍＭグルコースで、それぞれ４９ｎｇ（１．４倍）及び９１ｎｇ（１．２倍）のインスリン／ｍｇたんぱく質を分泌した（図３）。アグリコンであるペトウニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ）（９）は、４ｍＭグルコース濃度でインスリンの４ｎｇ／ｍｇたんぱく質だけインスリン分泌を増加させた。しかしながらマルビジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ）（８）は、非処理細胞に関しては、インスリン分泌において増加を示さなかった。
【００２７】
複数の報告は、特にポリフェノール類に富んでいる果物類及び野菜類の消費がＩＩ型糖尿病の発生数を減少させたことを示している（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．等のＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５０第７１８２頁〜第７１８６頁（２００２）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．等のＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５２第６５頁〜第７０頁（２００４）；及びＬａｎｄｒａｕｌｔ，Ｎ．等のＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５１第３１１頁〜第３１８頁（２００３））。また、ダイエット酸化防止剤は、グルコース誘導酸化性ストレスから、膵臓β−細胞を保護することが知られている。アントシアニン類は、果物類、野菜類、そしてワイン、サイダー及び茶のような加工された食物製品に豊富に存在している；しかしながら、糖尿病を減少させるか、又は予防すのためのその能力についてはほとんど知られていない。本発明者等の結果は、アントシアニン類及びアントシアニジン類の両方がインスリン分泌促進物質であることを示唆した。これらの中で最も効力があるのはデルフィニジン−３−グルコシドであって、そしてそれは、非処理細胞に比較して、４及び１０ｍＭグルコース濃度でインスリン分泌を有意に誘導した。シアニジン−３−グルコシドは、より低いグルコース濃度でデルフィニジン−３−グルコシドよりも低い活性であったが、それはより高いグルコース濃度でより高い活性であった。ガラクトシド類の中で、ペラルゴニジン−３−ガラクトシドは、研究された４及び１０ｍＭグルコース濃度でインスリン分泌を誘導しなかったが、それに対してシアニジン−３−ガラクトシドはインスリン分泌において有意な増加を示した。
【００２８】
インスリンを分泌することが研究されたアントシアニン類の能力は、デルフィニジン−３−グルコシド＞シアニジン−３−グルコシド＞ペラルゴニジン−３−グルコシドの増加していく順にあった。このことは、アントシアニン類の環−Ｂにおいてのヒドロキシル基の数がインスリンを分泌するそれらの能力において重要な役割を演じていることを示している。試験されたアントシアニジン類の中で、４ｍＭグルコースで、ペラルゴニジンが最も活性であった。他のアグリコン類は、研究された４又は１０ｍＭグルコース濃度で有意なインスリン分泌の効能を助長しなかった。
【００２９】
これは膵臓ベータ細胞に曝した場合の、アントシアニン類及びアントシアニジン類によるインスリン分泌の最初の報告である。本発明者等の結果は、これらのアントシアニン類を含有するミズキ属果物、チェリー類及びベリー類がＩＩ型糖尿病の予防のために有用であることを示唆している。また、果物類及び野菜類からの単離され且つ精製されたアントシアニン類及びアントシアニジン類は、ＩＩ型糖尿病を治療するために有用であろう。
【００３０】
引用された文献
（１）Ｒｏｓｓ，Ｓ．Ａ．、Ｇｕｌｖｅ，Ｅ．Ａ．、Ｗａｎｇ，Ｍ．；糖尿病の化学及び生化学；Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００４，１０４，第１２５５頁〜第１２８２頁。
（２）Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ，Ｌ．、Ｇｏｎｄｏｓ，Ｂ．；ＩＩ型糖尿病：新しい世紀のトピックス；Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．１９９９，２９第３３頁〜第４２頁。
（３）Ｈｅｎｑｕｉｎ，Ｊ．Ｃ．；グルコースによるインスリン分泌の調節の誘因及び拡大経路；Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０００，４９，第１７５１頁〜第１７６０頁。
（４）Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ａ．Ｆ．Ｈ．２００３年ロンドンＭａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．発行Ｂ．Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｄ．、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｗｉｅｌａｎｄ（監修）、ＩＩ型糖尿病のテキストブック第７７頁〜第８５頁において；経口低血糖薬：スルホニル尿素類及びメグリチニド類（ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ）。
（５）Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｓ．、Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ａ．、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．、Ｇｒｕｎｄｅｌ，Ｅ．、Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｋ．Ｒ．、Ｋｈａｃｈｉｋ，Ｆ．；ルテインは、α−トコフェロールとよりも、いっそう頻繁にアスコルビン酸と相互作用して、雌Ｚｕｃｋｅｒ肥満ネズミにおいての酸化性ストレスの生体標識を変化させる；Ｊ．Ｎｕｔｒ．２００３，１３３，第２８３８頁〜第２８４４頁。
【００３１】
（６）Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ，Ｇ．Ａ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．；Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａからの有力な脂質過酸化抑制剤；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００４，６０第３１０９頁〜第３１２１頁。
（７）Ｄｕｔｈｉｅ，Ｇ．Ｇ．、Ｄｕｔｈｉｅ，Ｓ．Ｊ．、Ｋｙｌｅ，Ｊ．Ａ．Ｍ．；癌および心臓疾患における植物ポリフェノール類：栄養酸化防止剤としての密接な関係；Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２０００，１３第７９頁〜第１０６頁。
（８）Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｙ．、Ｓｅｅｒａｍ，Ｎ．Ｐ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．、Ｂｏｕｒｑｕｉｎ，Ｌ．Ｄ．；酸味のあるチェリーのアントシアニン類は、ＡｐｃＭｉｎハッカネズミにおいての腫瘍発生を抑制し、そしてヒト結腸癌細胞の増殖を減少させる；Ｃａｎｃ．Ｌｅｔｔ．２００３，１９４第１３頁〜第１９頁。
（９）Ｖａｎ  Ｖｅｌｄｅｎ，Ｄ．Ｐ．、Ｍａｎｓｖｅｌｔ，Ｅ．Ｐ．Ｇ．、Ｆｏｕｒｉｅ，Ｅ．、Ｒｏｓｓｏｕｗ，Ｍ．、Ｍａｒａｉｓ，Ａ．Ｄ．；ヒト血液化学についてのワインの心臓保護効果；Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２，９５７第３３７頁〜第３４０頁。
（１０）Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．、Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ，Ｇ．Ｍ．、Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．、Ｂｏｏｒｅｎ，Ａ．Ｍ．、Ｇｒａｙ，Ｉ．Ｊ．、ＤｅＷｉｔｔ，Ｄ．Ｌ．；酸味のあるチェリー類からのアントシアニン類及びそれらのアグリコンであるシアニジンの酸化防止及び抗炎症活性；Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９９，６２第２９４頁〜第２９６頁。
【００３２】
（１１）Ｔｓｕｄａ，Ｔ．、Ｈｏｒｉｏ，Ｆ．、Ｕｃｈｉｄａ，Ｋ．、Ａｏｋｉ，Ｈ．、Ｏｓａｗａ，Ｔ．；ダイエットシアニジン３−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドに富む紫トウモロコシの色はハッカネズミにおいての肥満を予防しそして高血糖を改良する；Ｊ．Ｎｕｔ．２００３，１３３第２１２５頁〜第２１３０頁。
（１２）Ｅｓｐｉｎ，Ｊ．Ｃ．、Ｓｏｌｅｒ−Ｒｉｖａｓ，Ｃ．、Ｗｉｃｈｅｒｓ，Ｈ．Ｊ．、Ｇａｒｃｉａ−Ｖｉｇｕｅｒａ，Ｃ．；アントシアニンをベースとする天然着色剤．食料品のための抗ラジカル活性の新しい源；Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０００，４８第１５８８頁〜第１５９２頁。
（１３）Ｍｉｌｌｓｐａｕｇｈ，Ｃ．Ｆ．、１９７４年ニューヨークＤｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ発行Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ第２８２頁において。
（１４）Ｋｉｍ，Ｄ．Ｋ．、Ｋｗａｋ，Ｊ．Ｈ．；Ｃｏｒｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからのフラン誘導体；Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，２１第７８７頁〜第７８９頁。
（１５）Ｙａｍａｈａｒａ，Ｊ．、Ｍｉｂｕ，Ｈ．、Ｓａｗａｄａ，Ｔ．、Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｈ．、Ｔａｋｉｎｏ，Ｓ．、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．、Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｉ．；生薬の生物学的に活性な原理。ストレプトゾトシンにより誘発された実験的糖尿病においてのｃｏｒｎｉ  ｆｒｕｃｔｕｓの抗糖尿病原理；薬学雑誌１９８１，１０１第８６頁〜第９０頁。
【００３３】
（１６）Ｓｅｅｒａｍ，Ｎ．Ｐ．、Ｓｃｈｕｔｚｋｉ，Ｒ．、Ｃｈａｎｄｒａ，Ａ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．；ミズキ属種におけるアントシアニン類の特徴づけ、定量化及び生物活性；Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００２，５０第２５１９頁〜第２５２３頁。
（１７）Ｂｅｃｋｗｉｔｈ，Ａ．Ｇ．、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．、Ｓｅｅｒａｍ，Ｎ．Ｐ．、Ｃａｍｅｒｏｎ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．；Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｅｔａｃｅｕｍ  Ｃｖｓ．ヤマユリ及び赤色Ｒｉｄｉｎｇ  Ｈｏｏｄにおいての光量とアントシアニン生成との関係；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４，５２第４５６頁〜第４６１頁。
（１８）Ｈｏｈｍｅｉｅｒ，Ｈ．Ｅ．、Ｍｕｌｄｅｒ，Ｈ．、Ｃｈｅｎ，Ｇ．、Ｈｅｎｋｅｌ−Ｒｉｅｇｅｒ，Ｒ．、Ｐｒｅｎｔｋｉ，Ｍ．、Ｎｅｗｇａｒｄ，Ｃ．Ｂ．；活性のあるＡＴＰ−感受性Ｋ＋チャネル  −依存性及び−非依存性グルコース刺激インスリン分泌を有するＩＮＳ−１由来細胞系の単離；Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０００，４９第４２４頁〜第４３０頁。
【００３４】
（１９）Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｊ．Ａ．、Ｊａｙａｐｒａｋａｓａｍ，Ｂ．、Ｏｌｓｏｎ，Ｌ．Ｋ．、Ｎａｉｒ，Ｍ．Ｇ．；シクロオキシゲナーゼ酵素を用いてのＭｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａからのインスリン分泌促進物質及び脂質過酸化抑制活性；Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ２００４，８７，第３１７頁〜第３２６頁。
（２０）Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｈ．Ａ．；ヒト全血液における生理学的グルコース濃度のレーザー光音響学的測定；Ｍｅｄ．Ｂｏｉｌ．Ｅｎｇ．Ｃｏｍｐ．１９９３，３１，第２８４頁〜第２９０頁。
（２１）Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｏｌａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｍ．；茶はインスリン活性を高める；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００２，５０第７１８２頁〜第７１８６頁。
（２２）Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．、Ｂｒｏａｄｈｕｒｓｔ，Ｃ．Ｌ．、Ｐｏｌａｎｓｋｙ，Ｍ．Ｍ．、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｆ．、Ｋａｈｎ，Ａ．、Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｖ．Ｐ．、Ｓｈｏｅｎｅ，Ｎ．Ｗ．、Ｇｒａｖｅｓ，Ｄ．Ｊ．；インスリン様生物学的活性を有するシナモンからのポリフェノールタイプＡポリマー類の単離及び特徴づけ；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．２００４，５２第６５頁〜第７０頁。
（２３）Ｌａｎｄｒａｕｌｔ，Ｎ．、Ｐｏｕｃｈｅｒｅｔ，Ｐ．、Ａｚａｙ，Ｊ．、Ｋｒｏｓｎｉａｋ，Ｍ．、Ｇａｓｃ，Ｆ．、Ｊｅｎｉｎ，Ｃ．、Ｃｒｏｓ，Ｇ．、Ｔｅｉｓｓｅｄｒｅ，Ｐ．；糖尿病ネズミにおいてのポリフェノール類に富むシャルドネ白ワインの効果；Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００３，５１第３１１頁〜第３１８頁。
【００３５】
アントシアニン類及びアントシアニジン類の分離のための方法及び生成のための方法は、米国特許第６，１９４，４６９号、同第６，４２３，３６５号、同第６，６２３，７４３号、同第６，６７６，９７８号及び同第６，６５６，９１４号、及び２００２年２月２７日に出願された米国特許出願シリアル第１０／０８４，５７５号（これらの記載をそれらの全体において参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。
【００３６】
上記記載は、本発明の例示のためにだけのものであり、そして本発明は特許請求の範囲によってのみ、限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】アントシアニン類１〜４、及びアントシアニジン類５〜９の構造を示す線図である。
【図２Ａ】４及び１０ｍＭグルコースの存在下に化合物１及び２により、たんぱく質のミリグラム当たり分泌されたインスリンの量を示すグラフである。アッセイウエル中の最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。表された結果は、３回又は５回の独立した実験の平均であり、そして各々のサンプルを２回繰返しで検査した。化合物１及び２によるインスリン分泌はｔ−試験を用いてＬＳＤにより測定したときに、＊（９５％又はｐ≦０．０５）又は＊＊（９９％又はｐ≦０．０１）で有意なものであった。
【図２Ｂ】４及び１０ｍＭグルコースの存在下に化合物５及び６により、たんぱく質のミリグラム当たり分泌されたインスリンの量を示すグラフである。アッセイウエル中の最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。表された結果は、３回又は５回の独立した実験の平均であり、そして各々のサンプルを２回繰返しで検査した。化合物５及び６によるインスリン分泌はｔ−試験を用いてＬＳＤにより測定したときに、＊（９５％又はｐ≦０．０５）又は＊＊（９９％又はｐ≦０．０１）で有意なものであった。
【図３】４及び１０ｍＭグルコース濃度で化合物３、７〜９により分泌されたインスリンの量を示すグラフである。分泌されたインスリンの量をミリグラムたんぱく質に正規化した。アッセイウエル中の最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。表された結果は３回独立した実験の平均であり、そして各々のサンプルを２回繰返しで検査した。化合物３、７〜９によるインスリン分泌はｔ−試験を用いてＬＳＤにより測定したときに、＊（９５％又はｐ≦０．０５）で有意なものであった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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