(57)【要約】  本発明は、医学、免疫学、ウイルス学及び分子生物学の分野に関連する。本発明は、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、ＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量が、ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量の最大２０％であり、ＶＬＰと少なくとも一の抗原が互いに結合している組成物を提供する。また、本発明は、本発明の組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、疾患、障害及び症状の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、望ましくないＴ細胞応答を低減するか排除しながら、示した範囲内の抗原に対して強い抗体応答を効率よく誘発するために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有してなるウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、該ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰに含有される二次構造を有する該宿主ＲＮＡの量が、該ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量の最大２０％である、ウイルス様粒子；
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して該ＶＬＰ(a)に結合している、組成物。
【請求項２】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有してなるウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、該ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を本質的に含有しない、ウイルス様粒子；
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して該ＶＬＰ(a)に結合している、組成物。
【請求項３】
さらに、前記ＶＬＰに結合された少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含んでなり、好ましくは該ポリ陰イオン性高分子が該ＶＬＰ内にパッケージ化されている、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリ陰イオン性高分子の分子量が１００００から１０００００ダルトンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリ陰イオン性高分子が、
(a) ポリ陰イオン性ポリペプチド；
(b) ポリ陰イオン性糖類；
(c) ポリ陰イオン性有機ポリマー；及び
(d) ｔｏｌｌ様レセプターリガンドでない核酸、
からなる群から選択されるものである、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸がｔＲＮＡである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリ陰イオン性ポリペプチドが、
(a) ポリグルタミン酸；
(b) ポリアスパラギン酸；
(c) ポリ(ＧｌｕＡｓｐ)；及び
(d) (a)−(c)の任意の化学的修飾、
からなる群から選択されるものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリ陰イオン性高分子がポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸であり、好ましくは該ポリ陰イオン性高分子がポリグルタミン酸である、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリ陰イオン性糖類が、
(a) 陰イオン性デキストラン；
(b) ホスホセルロース；
(c) ポリグルクロン酸；
(d) ポリガラクツロン酸；
(e) ポリシアル酸；
(f) ヒアルロン酸；及び
(g) グリコサミノグリカン
からなる群から選択されるものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記の陰イオン性デキストランが、
(a) 硫酸デキストラン；
(b) カルボキシルメチルデキストラン；
(c) スルホプロピルデキストラン；
(d) メチルスルホン酸デキストラン；及び
(e) リン酸デキストラン
からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グリコサミノグリカンが、
(a) ヘパリン；
(b) ヘパラン硫酸；
(c) デルマタン硫酸；
(d) コンドロイチン硫酸；及び
(e) ケラタン硫酸
からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリ陰イオン性有機ポリマーが、
(a) ポリビニル硫酸；及び
(b) ポリアクリラート
からなる群から選択されるものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＲＮＡファージが、
(a) バクテリオファージＱβ；
(b) バクテリオファージＲ１７；
(c) バクテリオファージｆｒ；
(d) バクテリオファージＧＡ；
(e) バクテリオファージＳＰ；
(f) バクテリオファージＭＳ２；
(g) バクテリオファージＭ１１；
(h) バクテリオファージＭＸ１；
(i) バクテリオファージＮＬ９５；
(j) バクテリオファージｆ２；
(k) バクテリオファージＰＰ７；および、
(l) バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択されるものである、請求項１ないし１２の何れか一に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＶＬＰがＲＮＡファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡのコートタンパク質、及び／又はそのムテイン、及び／又はその断片を含んでなる、請求項１ないし１３の何れか一に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第一付着部位が、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド共有結合を介して前記第二付着部位に結合する、請求項１ないし１４の何れか一に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第一付着部位がアミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含有する、請求項１ないし１５の何れか一に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第二付着部位がスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含有する、請求項１ないし１６の何れか一に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第一付着部位がリジンのアミノ基を含有し、前記第二付着部位がシステインのスルフヒドリル基を含有する、請求項１ないし１７の何れか一に記載の組成物。
【請求項１９】
さらに、リンカーを含んでなる、請求項１ないし１８の何れか一に記載の組成物。
【請求項２０】
前記の少なくとも一の抗原が、
(a) ポリペプチド；
(b) 炭水化物；
(c) ステロイドホルモン；
(d) 有機分子；及び
(e) ハプテン
からなる群から選択されるものである、請求項１ないし１９の何れか一に記載の組成物。
【請求項２１】
前記の少なくとも一の抗原が自己抗原又はその断片ないしはその変異体である、請求項１ないし２０の何れか一に記載の組成物。
【請求項２２】
前記自己抗原が、
(a) リンホトキシン(好ましくはリンホトキシンα(ＬＴα)、リンホトキシンβ(ＬＴβ))；
(b) リンホトキシンレセプター；
(c) 核因子ｋＢリガンド(ＲＡＮＫＬ)のレセプター活性化因子；
(d) 血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)；
(e) 血管内皮成長因子レセプター(ＶＥＧＦ-Ｒ)；
(f) インターロイキン-５；
(g) インターロイキン-１７；
(h) インターロイキン-１３；
(i) ＩＬ-２３ｐ１９；
(j) グレリン；
(k) ＣＣＬ２１；
(l) ＣＸＣＬ１２；
(m) ＳＤＦ-１；
(n) Ｍ-ＣＳＦ；
(o) ＭＣＰ-１；
(p) エンドグリン；
(q) ＧｎＲＨ；
(r) ＴＲＨ；
(s) エオタキシン；
(t) ブラジキニン；
(u) ＢＬＣ；
(v) 腫瘍壊死因子α；
(w) アミロイドβペプチド(Ａβ１−４２)；
(x) Ａβ１−６；
(y) アンギオテンシン；
(z) ガストリン及び／又はプロガストリン；
(aa) ＣＥＴＰ；
(bb) ＣＣＲ５；
(cc) Ｃ５ａ；
(dd) ＣＸＣＲ４；
(ee) Ｄｅｓ-Ａｒｇブラジキニン；
(ff) ＧｎＲＨペプチド；
(gg) アンギオテンシンペプチド；
(hh) ＴＮＦ-ペプチド；
(ii) 前述の抗原(a)−(hh)の断片；及び、
(jj) 前述の抗原(a)−(hh)の変異体
からなる群から選択されるものである、請求項１ないし２１の何れか一に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１ないし２２の何れか一に記載の組成物を含んでなるワクチン組成物。
【請求項２４】
前記ワクチンがアジュバントを欠いている、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
さらに、少なくとも一のアジュバントを含んでなる、請求項２３に記載のワクチン組成物。
【請求項２６】
ＲＮＡバクテリオファージ-抗原コンジュゲートのＶＬＰと本発明の組成物をそれぞれ調整する方法であって、
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を宿主によって組み換えて産生させる工程、このときの該ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有するものである；
(b) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片にウイルス様粒子を分解させる工程；
(c) 該コートタンパク質、そのムテインないしはその断片を精製する工程；
(d) 精製した該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片をウイルス様粒子に再構築させる工程、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである；そして
(e) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を工程(d)より得た該ＶＬＰに結合させる工程、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記の精製されたコートタンパク質は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下で再構築される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡバクテリオファージ-抗原コンジュゲートのＶＬＰを調整する方法であって、
(a) ウイルス様粒子(ＶＬＰ)を宿主によって組み換えて産生させる工程、このときの該ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片と、少なくとも一の抗原を含有する融合タンパク質を含んでなるものである；
(b) 該ＶＬＰを該融合タンパク質に分解させる工程；
(c) 該融合タンパク質を精製する工程；
(d) 該精製された融合タンパク質をＶＬＰに再構築させる工程、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである
を含む、方法。
【請求項２９】
前記の精製されたコートタンパク質は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下で再構築される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＶＬＰがＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２３ないし２５の何れか一に記載のワクチン組成物が動物又はヒトに投与されることを含む、免疫化方法。
【請求項３２】
疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１ないし２２の何れか一に記載の組成物又は請求項２３ないし２５の何れか一に記載のワクチン組成物の使用であって、好ましくは該疾患が炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患である、使用。
【請求項３３】
請求項１ないし２２の何れか一に記載の組成物又は請求項２３ないし２５の何れか一に記載のワクチン組成物が動物又はヒトに投与されることを含む疾患の治療方法であって、好ましくは該疾患が炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患である、治療方法。
【請求項３４】
(a) 請求項１ないし２２の何れか一に記載の組成物；及び
(b) 受容可能な製薬的担体
を含有してなる薬剤組成物。
【請求項３５】
請求項２６ないし３０の何れか一に記載の方法によって入手可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野に関する。本発明は、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含んでなる組成物であって、該ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量が、該ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量の最大２０％であって、該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原が互いに結合するものである組成物を提供する。
また、本発明は、本発明の組成物を産生する方法を提供する。本発明の組成物は、疾患、障害及び症状の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、望ましくないＴ細胞応答を低減するか排除しながら、示した範囲内の抗原に対して強い抗体応答を効率よく誘発するために特に有用である。
【０００２】
関連技術
抗原に結合するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子(ＶＬＰ)は有用なワクチン組成物であることが記載されている。したがって、国際公開公報02/056905には、癌を予防する又は治癒するため、並びに効率よく自己特異的な免疫応答を誘導するための、感染疾患の治療のためのワクチンとしてＶＬＰ-抗原コンジュゲートが記載される。さらに、自己特異的な免疫応答の誘導においては、例えばアレルギー(国際公開公報03/040164)又は骨疾患(国際公開公報03/039225)の治療のため、又はレニン活性化アンギオテンシン系に関連する疾患(国際公開公報03/031466)の治療及び予防のための特異的なＶＬＰ-抗原コンジュゲートが開示されている。
抗原及び関連する疾患の特徴に応じて、通常、ワクチンによって生じるある種類の免疫応答が他のものよりも好ましい。例えば、通常、腫瘍細胞又はウイルス感染に対して強い細胞障害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)応答を誘導することが望ましいが、特に自己抗原を含むワクチンの場合のそのような応答は自己特異的なＴ細胞の誘導などの重大な副作用となりうる(Orgogozo, J.M. 等, Neurology 61, 46-54 (2003)；Hock, C. 等, Natural Med. 8, 1270-75 (2002)；Hock C. 等, Neuron 38, 547-554, (2003))。
【０００３】
抗原特異的なＴ細胞の活性化は、Ｔ細胞と、ＭＨＣ分子との関係でＴ細胞抗原を提示する樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージなどの抗原提示細胞(ＡＰＣ)との掛け合い応答(cross-talk)に大きく依存する。ＡＰＣの活性化を引き起こす一つの方法は、Ｔｈ細胞上のＣＤ４０Ｌと樹状細胞上のＣＤ４０との相互作用である(Foy, T.M., 等, Annu. Rev. Immunol. 14:591 (1996))。興味深いことに、この樹状細胞のＣＤ４０Ｌ媒介性成熟によりＣＴＬ応答への補助的効果が生じるようである。実際、近年、ＴｈによるＣＤ４０誘発により樹状細胞がＣＴＬ応答を開始することが示されている(Ridge, J. P., 等, Nature 393:474 (1998)；Bennett, S. R. M., 等, Nature 393:478 (1998)；Schoenenberger, S. P., 等, Nature 393:480 (1998))。
ＡＰＣの活性化を引き起こす他の方法は、ＡＰＣに発現するｔｏｌｌ様レセプターの活性化を介するものである。これまでに１０のヒトｔｏｌｌ様レセプターが同定されており、そのリガンドは病原と思われる限られた数の不変のパターンを表す(Medzhitov, R. and Janeway, C.A., Jr., Cell 91:295-298 (1997))。このようなパターンの例には、それぞれバクテリア及びウイルス感染に特異的な、二本鎖ＲＮＡ、非メチル化ＣＧリッチＤＮＡ(ＣｐＧ)又はリポポリサッカリド(ＬＰＳ)などがある。
【０００４】
先天性の免疫を刺激する因子によるＡＰＣの全身性の活性化は、自己特異的なリンパ球及び自己免疫を引き起こす原因となることが多い。活性化により、ＩＬ-１２やＩＦＮαなどのサイトカインや共刺激分子の発現が亢進されうる。この所見は、ＬＰＳと共に甲状腺抽出物を投与すると耐容性が破られて自己免疫性甲状腺炎が引き起こされるという所見と一致する(Weigle, W. O., Adv. Immunol. 30:159 (1980))。さらに、トランスジェニックマウスモデルでは、自己ペプチド単独を投与すると、ＡＰＣが別の経路によって活性化されない限り、自己免疫を起こさないことが近年示された(Garza, K. M., 等, J. Exp. Med. 191:2021 (2000))。先天性の免疫と自己免疫性疾患との関連は、ＬＰＳ、ウイルス感染又はＡＰＣの全身性の活性化が末梢の耐容性の確立を遅らせる又は妨げるという所見によりさらに理解される(Vella, A. T., 等, Immunity 2:261 (1995)；Ehl, S., 等, J. Exp. Med. 187:763 (1998)；Maxwell, J. R., 等, J. Immunol. 162:2024 (1999))。この場合、先天性の免疫は、自己特異的なリンパ球の活性化を亢進するだけでなく、その後の除去を阻害する。
【０００５】
従来技術において開示され、予防接種の抗原担体として用いられるＱβやＡＰ２０５などのＲＮＡファージのウイルス様粒子は、大腸菌から組み換えて発現させることによって調整されている。しかしながら、大腸菌溶解物から続いて精製して得たＶＬＰはまだ、封入された大腸菌構成成分、主に大腸菌ＲＮＡ並びにいくらかの大腸菌タンパク質を含有している。多くの細菌構成成分、特に細菌核酸、さらに特に細菌ＤＮＡ及び細菌ＲＮＡは、ｔｏｌｌ様レセプターの活性化を介するＴ細胞応答を刺激する。示されているように、Ｔ細胞応答の活性化により重篤な副作用が生じうる。さらに、ワクチン内の薬剤活性成分として証明されているもの以外の同定されていない細菌構成成分などの物質の存在は、このような同定されていない細菌構成成分による副作用やリスクを生じる可能性があるので望ましくない。
したがって、当分野では、あらゆる疾患を治療するために新規の強力なワクチンの開発が必要とされている。特に、当分野では、最大限の治療効果を維持しながら、望ましくないＴ細胞応答の活性化や刺激などの望ましくない副作用を可能な限り抑えるか除去する新規のワクチンの開発が望まれている。
【０００６】
（発明の概要）
我々は、驚くべきことに、本発明の組成物が、望ましくないＴ細胞応答や熱などの他の望ましくない副作用を最小限にするかないしは避けながら、ワクチンに含有される抗原に対する免疫応答、特に抗体応答を強力に誘導することができることを発見した。
先天性の免疫を刺激するとＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ型の抗体が誘導される。この誘導はＩｇＧ１より強力に組織を破壊する(マウス)。我々は、驚くべきことに、本発明の組成物がＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ１から抗体アイソタイプ性質を変える(ヒト)ことを発見した。
さらに、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物が、限定するものではないが、自己免疫性疾患、炎症性疾患、肥満及び薬物中毒などの多様な疾患を治療する際の標的として用いられうる、多様な抗原、特に自己抗原に対する強力な免疫応答を誘導する強力なワクチンであることを発見した。
【０００７】
したがって、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有してなるウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、該ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰに含有される二次構造を有する該宿主ＲＮＡの量が、該ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡの量の最大２０％、好ましくは最大１０％である、ウイルス様粒子；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して該ＶＬＰ(a)に結合している、組成物を提供する。好ましくは、本発明の組成物は規則的で反復性の抗原配列を形成している。前記の少なくとも一の抗原は、ポリペプチド、炭水化物、ステロイドホルモン、有機分子又はハプテンからなる群から選択されうる。前記の少なくとも一の抗原は自己抗原又はハプテンである。典型的に好ましくは、本明細書中では、本発明によってＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する方法が提供される。
【０００８】
本発明の組成物及びワクチン中の宿主のＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量をかなり減らすと、ＶＬＰ又はＶＬＰ-抗原コンジュゲートが生じ、その結果、Ｔｏｌｌ様レセプターリガンドの量がかなり減る、ないしは本質的には欠失する。Ｔｏｌｌ様レセプターは先天性の免疫応答と適応する免疫応答を連結する軸となると考えられている。Ｔｏｌｌ様レセプターの活性化により、先天性の免疫系の全身性の活性化並びにＡＰＣの活性化が起こり、さらに抗原特異的な免疫応答が引き起こされる。さらに、ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主のＲＮＡの最大２０％、好ましくは最大１０％量を含有するＶＬＰ、より好ましくは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を本質的に含まないＶＬＰ、さらにより好ましくはＴｏｌｌ様レセプターを本質的に含まないＶＬＰを含んでなる本発明の組成物及びワクチンが、Ｔｏｌｌ様レセプターの活性化を典型的には回避しながら、抗原特異的免疫応答、特に抗原応答を誘導することは驚くべきことである。さらに、本発明の組成物及びワクチンは、ＣＴＬ応答の刺激を最小限にするかないしは刺激しないで、該組成物中の特定の抗原に対する強い免疫応答を誘導する。さらに、本発明の組成物及びワクチンは、ＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂの産生を低減して、より組織破壊性のあるＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂから抗体アイソタイプを変化させる。
【０００９】
更なる態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有してなるウイルス様粒子(ＶＬＰ)であって、該ＶＬＰが宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を本質的に含有しない、ウイルス様粒子；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して該ＶＬＰ(a)に結合している、組成物を提供する。
さらに、我々は、本発明の組成物及びワクチンが、ＩｇＧ２ａ力価の減少、特に低いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比となることから示されるように、Ｔｈ１細胞のサブセットである、注目すべき又は典型的に好ましくは顕著な炎症性Ｔ細胞を活性化することなく、ＶＬＰに結合した特定の抗原に対して強い免疫応答を誘導することを発見した。異なるサブセットのＴ細胞を活性化することにより、異なる抗体サブタイプの発現が起こる。例えば、Ｔｈ１細胞はＩＦＮ-γを顕著に産生し、それによってイムノグロブリンＩｇＧ２ａオプソニンと補体固定(complement-fixing)抗体の産生を促し、マクロファージ活性化及び抗体依存性細胞性細胞障害を媒介する。Ｔｈ２細胞はＩＬ-４及びＩＬ-１０産生に特徴があり、Ｂ細胞成熟及びＩｇＧ１抗体産生に役立つ。したがって、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は、Ｔｈ２細胞に対してＴｈ１細胞の活性の程度を測定するための優れた容認されたパラメータである。さらに、例えば自己抗原に対する抗体の誘導のために開発されたワクチンの場合など、抗体サブクラスの補体固定性質及びオプソニンが望ましくない場合、ＩｇＧ２ａ及び／又はＩｇＧ２ｂの減少は非常に有用である。
【００１０】
本発明の他の好適な実施態様では、本発明は、さらにＶＬＰに結合した少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含有する。本発明のさらにより好適な実施態様では、前記少なくとも一のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰに封入ないしはパッケージ化される。典型的には、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在により、低いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比と低いＣＴＬ応答を維持しながら、抗原に対する抗体力価、特にＩｇＧ１力価がさらに高くなる。さらに、ＶＬＰに結合する、又は好ましくはＶＬＰに封入されるかパッケージ化される少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在は、典型的には、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片のＶＬＰ内への再構築(再集合化)並びにその安定性のために有用であり、有益である。好適な実施態様では、前記のポリ陰イオン性高分子はポリ陰イオン性ポリペプチドであり、より好ましくはポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物及びＲＮＡバクテリオファージ-抗原コンジュゲートのＶＬＰのそれぞれを調整する方法を提供する。好適な態様では、本発明は、本発明の組成物及びＲＮＡバクテリオファージ-抗原コンジュゲートのＶＬＰのそれぞれを調整する方法であって、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を宿主によって組み換えて産生させる工程、このときの該ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片を含有するものである；(b) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片にウイルス様粒子を分解させる工程；(c) 該コートタンパク質、そのムテインないしはその断片を精製する工程；(d) 精製した該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、そのムテインないしはその断片をウイルス様粒子に再構築させる工程、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである；そして(e) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を工程(d)より得た該ＶＬＰに結合させる工程、を含む、方法を提供する。好適な実施態様では、前記の精製されたコートタンパク質を再構成する工程は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下で行われる。
【００１２】
他の態様では、本発明は、本発明の組成物を含んでなる、好ましくはさらにバッファを含んでなるワクチン組成物を提供する。前記ワクチンは、少なくとも一のアジュバントと共にないしは含まないで患者に投与される。更なる態様では、本発明は、動物又はヒトに前記ワクチンが投与されることを含む免疫化の方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、動物又はヒトに前記組成物が投与されることを含む、疾患の治療方法を提供する。好適な実施態様では、本発明は、例えば限定するものではないが、炎症性疾患、慢性自己免疫性疾患、肥満又は薬物中毒などの疾患の治療方法を提供する。
更なる他の態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な薬剤的担体を含んでなる薬剤組成物を提供する。
より更なる態様では、本発明のワクチン組成物は、本質的に細菌のＲＮＡ並びに他の細菌構成成分を含まない。これによって、それぞれより明確な組成物及びワクチンとなる。これにより、より安全なワクチンが生じるだけでなく、適正製造規範(ＧＭＰ)標準に合うものとなる。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
定義：
抗体アイソタイプ：特に明記しない限り、本出願に使用した抗体アイソタイプの命名法はマウス命名法とした。当業者は対応するヒト命名法を理解する。例えば、マウスの抗体アイソタイプＩｇＧ２ａはヒトの抗体アイソタイプＩｇＧ１である。
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ又は抗原性部位（ＢおよびＴエピトープ）を有しうる。本明細書中で用いる特異的な結合とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【００１４】
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、リジンなどのアミノ酸のアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＶＬＰと会合(結合)する。更なる好適な実施態様では、第一付着部位はＶＬＰに天然に生じている。あるいは、好適な実施態様では、第一付着部位は人工的にＶＬＰに付加されている。
【００１５】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、本発明の抗原に天然に生じる又は本発明の抗原に人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。本発明の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原」なる用語は、本発明の抗原と少なくとも一の第二付着部位を含むコンストラクトを指す。しかしながら、特に、抗原内に天然に生じない第二付着部位の場合、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介して本亜発明の抗原と会合(結合)する。更なる実施態様では、第二付着部位は、本発明の抗原内に天然に生じる。さらに他の好適な実施態様では、第二付着部位は、好ましくはタンパク質融合によりシステインを含むリンカーを介して本発明の抗原に人工的に付加される。
【００１６】
結合(bound)：本明細書中で用いられる「結合(bound)」なる用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などによるものである結合を指す。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−イオウ結合、炭素−リン結合などであってよい。また、この用語には物質の封入または部分的な封入も含まれる。「結合(bound)」なる用語はより広義であり、「カップル(coupled)」、「融合(fused)」、「封入(enclosed)」、「パッケージ化(packaged)」及び「付着(attached)」などの用語も含む。例えば、ポリグルタミン酸などのポリ陰イオン性高分子は、典型的かつ好ましくは、実際には共有結合しないで、典型的かつ好ましくは、ＶＬＰに封入されるかパッケージ化される。
【００１７】
コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質を指す。典型的かつ好ましくは、「コートタンパク質」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのゲノム、又はＲＮＡバクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を指す。より好ましくは、例として、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号２９又は、第一メチオニンが配列番号２９から切断されているアミノ酸配列を指す。より好ましくは、例として、「Ｑβのコートタンパク質」はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらず、配列番号１０(「Ｑβ ＶＬＰ」)と配列番号１１(Ａ１)を指す(配列番号６７)。バクテリオファージＱβのキャプシドは主にＱβ ＶＬＰと少量のＡ１タンパク質からなる。
エピトープ：ここで用いる「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトの、抗原性又は免疫活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的一部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子の関係でそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。
【００１８】
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的に好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味し、該宿主は好ましくは細菌、さらにより好ましくは大腸菌である。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的で好適な方法は、従来のＱβ ＶＬＰ及び本発明のＱβ ＶＬＰについて実施例１７に記載される。典型的に好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。典型的に好ましくは、測定される量の数値は、示された数値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する値として理解されうる。
【００１９】
免疫賦活性核酸：本明細書で使用するように、「免疫賦活性核酸」なる用語は、免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる核酸を指す。
免疫賦活物質：本明細書で使用するように、「免疫賦活物質」なる用語は、免疫応答、典型的かつ好ましくは、本発明の組成物に含有される抗原に特異的な免疫応答を誘導する、及び／又は高めることができる物質を指す。
結合(linked)：ここで用いられる場合、「結合（連結）」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位の直接結合を包含するだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接的な結合を包含する。
【００２０】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位と本発明の抗原を結合させるか、第二付着部位を既に含むか、基本的に第二付着部位からなるか第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも一のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーは本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含む分子である。さらに、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。本発明の抗原とリンカーの間の会合(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。第二付着部位が本発明の抗原に天然にない場合、リンカーは、好ましくは少なくとも一の共有結合により、より好ましくは少なくとも一のペプチド結合により、少なくとも一の第二付着部位、例えばシステインに結合する。
【００２１】
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、ウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある抗原の反復パターンを指す。本発明の一つの実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージのＶＬＰは、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ。
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。好適な実施態様では、「パッケージ化」なる用語はＶＬＰによるポリ陰イオン性高分子の封入、又は部分的封入を意味する。したがって、ポリ陰イオン性高分子を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。
【００２２】
ポリ陰イオン性高分子：本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性電荷の反復性基を含んでなる相対的に高い質量の分子を指すものであり、その構造は、実際のところ又は概念的には、相対的に低い質量の分子から得られるユニットの複数の繰り返しを基本的に含んでなる。ポリ陰イオン性高分子は、少なくとも２０００のダルトン、好ましくは少なくとも３０００のダルトン、そしてさらにより好ましくは少なくとも５０００のダルトンの分子量を有するものである。本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくは、ｔｏｌｌ様レセプターを活性化することができない分子を指す。ゆえに、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、典型的かつ好ましくはＴｏｌｌ様レセプターリガンドを除く、さらにより好ましくはさらに、免疫賦活性物質、例えばＴｏｌｌ様レセプターリガンド、免疫賦活性核酸およびリポポリサッカリド(ＬＰＳ)を除くものである。より好ましくは、本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。さらにより好ましくは、「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は免疫賦活性物質を除くものである。
【００２３】
ポリアスパラギン酸：本明細書中で用いる「ポリアスパラギン酸」なる用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％がアスパラギン酸であるポリペプチドを指す。その結果、アスパラギン酸分子はそのすべてのＬないしはすべてのＤ又はそれらの混合物である。
ポリグルタミン酸：本明細書中で用いる「ポリグルタミン酸」なる用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％がグルタミン酸であるポリペプチドを指す。その結果、グルタミン酸分子はそのすべてのＬないしはすべてのＤ又はそれらの混合物である。
ポリ(ＧｌｕＡｓｐ)：本明細書中で用いる「ポリ(ＧｌｕＡｓｐ)」なる用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸の総数のうちの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％がグルタミン酸とアスパラギン酸の合計であるポリペプチドを指す。その結果、グルタミン酸分子およびアスパラギン酸分子はそのすべてのＬないしはすべてのＤ又はそれらの混合物である。
【００２４】
ポリペプチド：本願明細書において、用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
本明細書中で用いる「組換えＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含む方法によって、得られるＶＬＰを指す。本明細書中で用いる「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含む方法によって、得られるＶＬＰを指す。ゆえに、「組換えＶＬＰ」および「組み換えて生産されるＶＬＰ」なる用語は本願明細書において、交換可能に用いられ、同一の意味を有する。
【００２５】
二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸：本明細書中で用いる「二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸」なる用語は、エチジウムブロマイドを間に介入するＲＮＡ、好ましくは核酸を指すものであり、紫外線の下でエチジウムブロマイドの蛍光によって、視覚化されうるものを指す。本発明の二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸にエチジウムブロマイドをさし込む代表的で好適な方法は、Ｑβ ＶＬＰを用いた本発明の実施例２および３に記載する。典型的かつ好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸にエチジウムブロマイドを差し込むために同一の、同種の又は類似した条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸：本明細書中で用いる「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸」なる用語は、宿主が本来合成するＲＮＡ又は好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、典型的かつ好ましくは、本発明の方法による、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を少なくするかないしは除去する方法の間に、化学的及び／又は物理的な変化が起こりうる。例えばＲＮＡ、好ましくは核酸の大きさが短くなったり、その二次構造が変化しうる。しかしながら、この結果として生じるＲＮＡ又は核酸でも、宿主ＲＮＡ又は宿主核酸とみなす。
【００２６】
二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量：本明細書中で用いる「二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量」なる用語は、エチジウムブロマイドを間に介入するＲＮＡ、好ましくは核酸を指すものであり、紫外線の下でエチジウムブロマイドの蛍光によって、視覚化されうるものを指す。本発明のエチジウムブロマイドを間に挟むことができる宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量、及びＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する代表的で好適な方法は、Ｑβ ＶＬＰを用いた本発明の実施例２および３に記載するように、ＲＮＡ、好ましくは核酸内にさし込まれたエチジウムブロマイドの量を測定することである。典型的かつ好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量を測定するために同一の、同種の又は類似した条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。
【００２７】
ＶＬＰに当初より含有(内包)される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量：本明細書中で用いられる「ＶＬＰに当初より含有(内包)される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量」なる用語は、典型的かつ好ましくは、本発明の方法によって、なされた、典型的かつ好ましくは同じＶＬＰの二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を減らす又は除去する前で、宿主によって、組み換えて産生された後のＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を指す。この文脈で用いる「同じＶＬＰ」は、典型的かつ好ましくは、同じ発現バッチで生じるＶＬＰを指す。本明細書中で用いられる「ＶＬＰに当初より含有(内包)される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量」なる用語は、典型的かつ好ましくは、本発明の方法によって、なされた、典型的かつ好ましくは同じＶＬＰの二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を減らす又は除去する前で、宿主によって、組み換えて産生された後に結果として生じたＶＬＰを精製した後のＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を指す。示されるように、この文脈で用いる「同じＶＬＰ」とは、典型的かつ好ましくは、同じバッチの発現、好ましくは同じバッチの精製により生じるＶＬＰを指す。組み換えて生産されたＶＬＰは、典型的かつ好ましくは、宿主細胞溶解物から精製される。宿主細胞溶解物からのＶＬＰの精製の方法は、当分野で開示されており、例えば、国際公開公報02/056905、国際公開公報04/007538、好ましくは、Ｑβ ＶＬＰについての本出願の実施例１に開示されている。典型的かつ好ましくは、本発明の二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の減少は、まずＶＬＰ内に当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量と、次に本発明のＶＬＰ(すなわち、典型的かつ好ましくは本発明の方法を適応して得たＶＬＰ)内に含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量とを続けて、好ましくは同時に測定して、精製した後の組み換えて発現させたＶＬＰの適当な量を差し引くことにより測定される。上記のように、二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する代表的で好適な方法は、Ｑβ ＶＬＰによる本発明の実施例２および３に記載する。典型的かつ好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸の量を測定するために同一の、同種の又は類似した条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。
【００２８】
自己抗原：本明細書中で用いる「自己抗原」なる用語は、(i) 宿主のＤＮＡによって、コードされるポリペプチドないしはタンパク質又は宿主ＤＮＡによって、コードされるＲＮＡないしはポリペプチド由来の産物、(ii) (i)に対して高い相同性を有するポリペプチド又はタンパク質であって、その相同性が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、およびさらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％であり、典型的かつ好ましくは、(i)のタンパク質又はポリペプチドに特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導するポリペプチド又はタンパク質、並びに(iii) (i)に定義した自己抗原のオルソログ、を意味する。典型的かつ好ましくは、前記オルソログは、(i)のポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導する。「オルソログ」なる用語は、異なる種からのポリペプチドの機能的な相対物である、ある種から得たポリペプチド又はタンパク質を意味する。オルソログ間の配列の相違は種分化の結果である。本明細書中で用いられる「自己抗原」なる用語は、上記に定義したように自己抗原のグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含むがこれに限らない化学修飾をさらに含む。さらに、本明細書中で用いる「自己抗原」なる用語は、好ましくは、２又はいくつかの自己抗原の組合せから生じるポリペプチドを指す。
【００２９】
自己抗原の断片：本明細書中で用いる「自己抗原の断片」なる用語は、自己抗原の断片を含むか、あるいはそれからなるポリペプチドであって、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８又はさらに好ましくは少なくとも１２又は少なくとも１５のアミノ酸長であり、典型的かつ好ましくは、自己抗原の定義にある、(i)のポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導するポリペプチドを指す。本明細書中で用いる「自己抗原の断片」なる用語は、上記に定義したように「自己抗原の断片」のグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含むがこれに限らない化学修飾をさらに含む。
自己抗原の変異体：本明細書中で用いる「自己抗原の変異体」なる用語は、自己抗原定義にある、(i)のポリペプチド又はタンパク質に相同性があるポリペプチドであって、その相同性が少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８７％であり、典型的かつ好ましくは、自己抗原の定義にある、(i)のポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導するポリペプチドを指す。本明細書中で用いる「自己抗原の変異体」なる用語は、上記に定義したように「自己抗原の変異体」のグリコシル化、アセチル化、リン酸化を含むがこれに限らない化学修飾をさらに含む。
【００３０】
Ｔｏｌｌ様レセプター(ＴＬＲ)リガンド：Ｔｏｌｌ様レセプター(ＴＬＲｓ)は同様に骨髄単球性細胞及び内皮細胞及び上皮細胞並びに様々な臓器系で発現される。Ｔｏｌｌ様レセプターは膜貫通タンパク質であり、その全ては共通の細胞外ロイシンリッチドメインおよび保存された細胞質ドメインを有する。ＴＬＲの細胞質ドメインは、ＩＬ-１およびＩＬ-１８レセプターに相同であり、これらのレセプターに共通のＴｏｌｌ／ＩＬ-１レセプター(ＴＩＲ)相同性ドメインを含有する。Ｔｏｌｌ様レセプターは、ＴＩＲシグナル伝達ドメインを介して媒介する共通の活性化経路を共有しているため、核転座及び炎症誘発性転写因子ＮＦ-ｋＢが活性化される (Abreu M.T. 及び Arditi M. J. Pediatrics (2004), 421-9)。現在まで、１０の異なるＴＬＲ分子がヒトゲノムからクローニングされており(Zarember KA 等, J. Immunol. (2002), 168:554-61)、１１のＴＬＲがマウスでクローニングされている(Zhang 等, science, (2004), 303:1522-6)。
【００３１】
ここで用いる「Ｔｏｌｌ様レセプターリガンド」又は「ＴＬＲリガンド」なる用語は、少なくとも一のＴＬＲを活性化することができる任意のリガンドを指す(例としてBeutler, B. 2002, Curr. Opin. Hematol., 9, 2-10, Schwarzら., 2003, Eur.J.Immunol., 33, 1465-1470を参照)。本発明のＴＬＲリガンドは、限定しないが、少なくとも一のＴｏｌｌ様レセプター１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、又はＴＬＲ１１を活性化する。例えば、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）又はリポテイコ酸（ＬＴＡ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ２を活性化し(Aliprantisら., Science (1999), 285:736-9；Underhill, ら., Nature, (1999), 401:811-5)；ポリ（Ｉ：Ｃ）などの二本鎖ＲＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ３を活性化し(Alexopoulou ら., Nature (2001), 413:732-8)；リポ多糖類（ＬＰＳ）は典型的かつ好ましくはＴＬＲ４を活性化し(Poltorak, ら., Science (1998), 282:2085-8)；フラゲリンは典型的かつ好ましくはＴＬＲ５を活性化し(Hayashiら. Nature (2001), 410:1099-103)；バクテリアＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ及びイミダゾキノリン(imidazoquinoline)などのある種の合成物質は典型的かつ好ましくはＴＬＲ７及びＴＬＲ８を活性化し(Diebold S.ら. Science 303:1529；Heil, FH.ら. Science 303:1526)；バクテリアＤＮＡ、特にＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは典型的かつ好ましくはＴＬＲ９を活性化する(Schnareら. Curr. Biol. (2000), 10:1139-42；Hemmi H ら. Nature (2000), 408: 740-5)。ここに挙げた論文は出典明記によりここに組み込まれる。ＴＬＲリガンドの概要は、Abreuの論文の表に挙げられており、出典明記によりここに組み込まれ(Abreu M.T.及びArditi M. J., Pediatrics (2004), 421-9)、ＴＬＲ１１とそのリガンドについての参考文献はZhangら., Science, (2004), 303:1522-6に記載されている。当業者の一般的な知識とともにこれら組み込まれる論文を参照すると、ある分子が本発明に基づくＴＬＲリガンドであるかどうか、ＴＬＲリガンドが少なくとも一のＴＬＲを活性化するかどうかを試験することは常套法の範囲内である。
【００３２】
本発明のＴｏｌｌ様レセプターの活性化を測定するある一般的で、代表的で好適な方法は、少なくとも一のＴｏｌｌ様レセプターを発現できるコンストラクトを細胞株に形質移入させることであり、Ｔｏｌｌ様レセプターを発現させることではない。ＮＦ-ｋＢ活性化リポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ）を前記細胞株に形質移入させるか、前記細胞株のゲノムに含めることができる。細胞培養物に試験すべき分子を加えた後に、リポーター遺伝子の活性を定量化し、試験すべき分子を加えなかった細胞と比較できる。ＴＬＲ１およびＴＬＲ６活性試験のために、ＴＬＲ２の共発現が不可欠であると言われる。二次構造を有するＲＮＡなどの、不安定であるいくつかのＴＬＲ-リガンドを、試験するために安定化する必要があることは、当業者に明らかである。安定化のための１つの方法は、二次構造を有するＲＮＡを形質移入のために使用するリポソーム又は物質(例えばＤＯＴＡＰ)に封入することである。
ＴＬＲ配列の参照は、受託番号TLR1_human、TLR2_human、TLR3_human、TLR4_human、TLR5_human、TLR6_human、TLR7_human、TLR8_human、TLR9_humanとしてデータベースSwissprotで見つけることができる。TLR10_humanは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号AAQ88667又はAAK26744として見つけることができる。したがって、マウス配列の受託番号は、Swissprotデータベースにおいて、TLR1_mouse、TLR2_mouse、TLR3_mouse、TLR4_mouse、TLR5_mouse、TLR6_mouse、TLR7_mouse、TLR8_mouse、TLR9_mouse、TLR10_mouseである。マウスＴＬＲ１１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号AY531552である。当業者は、他の哺乳類種からＴＬＲレセプターに対応するアッセイを準備できる。
【００３３】
本発明に関してそのような試験の典型的かつ好ましい例は以下の通りである：３×１０６個のＨＥＫ２９３細胞に１μｇのＴＬＲ発現プラスミドと２０ｎｇのＮＦ-ｋＢルシフェラーゼレポータープラスミドを２００ボルトで９６０μＦにて電気穿孔法を行う。適当な空の発現ベクターを添加することによって一度の電気穿孔につき全量のプラスミドＤＮＡを１５μｇに保つ。１ウェルあたり１０５個の細胞をまき、一晩培養した後、試験すべきリガンドにてさらに７〜１０時間刺激する。公知のＴＬＲリガンドの濃度範囲は、典型的な例として２５μｇ／ｍｌ  ＲＮＡ４０-４２とＤＯＴＡＰの複合体（ＲＮＡの細胞内への内部移行を促進する）、１μＭ  ＣｐＧ-ＯＤＮ２００６、１０μＭ  Ｒ-８４８、５０μｇ／ｍｌ  ポリ（Ｉ：Ｃ）、又は１μｇ／ｍｌ  Ｐａｍ３Ｃｙｓである(Heil, FH.ら. Science 303:1526)。刺激した細胞をレポーター溶解バッファ(Promega, Mannheim, Germany)を用いて溶解し、製造者の指示書にしたがってルミノメーター、典型的かつ好ましくはBertholdルミノメーター(Wildbad, Germany)を用いて溶解物のルシフェラーゼ活性を評価する。これは当業者の知識の範囲内であり、したがって任意のリガンドの試験のための前述の実験を適用する。
次いで、誘導されたルシフェラーゼ活性がネガティブコントロールの活性で測定された閾値(試験されるリガンド添加のない同一の実験および同一の実験条件)よりも統計学的に有意に高い場合、リガンドは本発明のＴＬＲを活性化するとみなされる。この場合の閾値は、６つの独立した実験におけるネガティブコントロールのルシフェラーゼ活性の平均と３回の６つの実験からのルシフェラーゼ活性の標準偏差によって、定められる。次いで、典型的かつ好ましくは、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように測定される閾値より高い場合に、リガンドは「統計学的に有意に」ＴＬＲを活性化するとみなされる。好ましくは、リガンドのルシフェラーゼ活性が上記のように測定される閾値の少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍高い場合に、リガンドは「統計学的に有意に」ＴＬＲを活性化するとみなされる。
【００３４】
ＲＮＡファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、そのムテインないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡファージの構造に類似するＲＮＡファージのウイルス様粒子は非複製性又は非感染性、そして典型的かつ好ましくは、非複製性かつ非感染性である。典型的かつ好ましくは、「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」は、ＲＮＡファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくはすべての遺伝子、及び典型的かつさらに好ましくは、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくはすべての遺伝子を欠損するＲＮＡファージのウイルス様粒子をさらに指す。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が包含される。さらに、「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、ゲノムが化学的又は遺伝的方法によって、不活性化されているため、ウイルス粒子が感染及び／又は複製ができないＲＮＡファージのウイルス粒子も広義の定義に包含される。ＲＮＡファージから得られる好適なＶＬＰは、対称の正二十面体であり、１８０のサブユニットから成る。本開示の範囲内で、「サブユニット」及び「単量体」なる用語は、この文脈において、相互に交換可能に、同等に用いられる。本出願では、「ＲＮＡファージ」なる用語及び「ＲＮＡ-バクテリオファージ」なる用語は、相互に交換可能に使われる。
【００３５】
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性であるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００３６】
この発明は、(ａ)少なくとも一の第一の付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体(ムテイン)又は断片を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)で、該ＶＬＰが宿主により組み換えて産生され、ＶＬＰに含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量が、ＶＬＰに当初より含有される二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量の、せいぜい２０％、好ましくは１０％、さらに好ましくは５％、より好ましくは３％、よりさらに好ましくは１％であるもの；(ｂ)少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を含み；前記少なくとも一の抗原(ｂ)が、前記少なくとも一の第一の付着部位と前記少なくとも一の第二の付着部位を介して前記ＶＬＰ(ａ)に結合している組成物を提供する。好ましい実施態様では、本発明のＶＬＰは、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有しない。
一側面では、本発明は、(ａ)少なくとも一の第一の付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)で、該ＶＬＰが宿主により組み換えて産生され、該ＶＬＰが宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有していないもの；(ｂ)少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を含み；前記少なくとも一の抗原(ｂ)が、前記少なくとも一の第一の付着部位と前記少なくとも一の第二の付着部位を介して前記ＶＬＰ(ａ)に結合している組成物を提供する。
【００３７】
一側面では、この発明は、(ａ)少なくとも一の第一の付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むウイルス様粒子(ＶＬＰ)で、該ＶＬＰが宿主により組み換えて産生され、該ＶＬＰが、６０μｇ以下、好ましくは５０μｇ以下、さらに好ましくは４０μｇ以下、また好ましくは２７μｇ以下、よりさらに好ましくは２０μｇ以下、特に９μｇ以下、最も好ましくは５μｇ以下の、二次構造を有する宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を含むもの；(ｂ)少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を含み；前記少なくとも一の抗原(ｂ)が、前記少なくとも一の第一の付着部位と前記少なくとも一の第二の付着部位を介して前記ＶＬＰ(ａ)に結合している組成物を提供する。好ましい一実施態様では、本発明のＶＬＰは、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有しない。
本発明のウイルス様粒子は組換えＶＬＰである。典型的にかつ好ましくは、組換えＶＬＰは、ＶＬＰを形成する能力を保持している、ウイルスコートタンパク質又はその変異体又は断片をコードする遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、適合性宿主、例えば細菌、典型的にかつ好ましくは大腸菌、酵母、昆虫又は哺乳動物の発現系中で、得られたコンストラクトを発現させることにより、産生される。
【００３８】
好ましい例は、国際公開第０２／０５６９０５号に開示されており、出典明示によりここに援用される。ＱβからＶＬＰ粒子を調製するための詳細な記述は、特に国際公開第０２／０５６９０５号の実施例１８に開示されている。国際公開第０２／０５６９０５号等の従来技術に記載されているＶＬＰ-抗原抱合体(コンジュゲート)は、上述した形での発現を介して得られ、生じたるため、ＶＬＰ中に所定量の宿主ＲＮＡを含んでいることを記しておく。他方、ＶＬＰ又は本発明のＶＬＰ-抗原抱合体は、本発明の方法により調製され、又はさらに処理されて、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸が排除、低減又は除去される。
好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、及び／又は変異体、及び／又はその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。またさらに好ましい実施態様では、組成物は、少なくとも一の第一の付着部位を有するＲＮＡ-バクテリオファージのウイルス様粒子を含む。さらに好ましい一実施態様では、ＲＮＡ-バクテリオファージは、ａ）バクテリオファージＱβ；ｂ）バクテリオファージＲ１７；ｃ）バクテリオファージｆｒ；ｄ）バクテリオファージＧＡ；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；ｊ）バクテリオファージｆ２；ｋ）バクテリオファージＰＰ７、及びｌ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、ＲＮＡファージのコートタンパク質は、配列番号：１０；配列番号：１０と配列番号：１１の混合物；配列番号：１２；配列番号：１３；配列番号：１４；配列番号：１５；配列番号：１５と配列番号：１６の混合物；配列番号：１７；配列番号：１８；配列番号：１９；配列番号：２０；配列番号：２１；配列番号：２２及び配列番号：２９を含むか、又はそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３９】
ここで使用される「コートタンパク質の断片」なる用語は、集合して好ましくはＲＮＡファージのウイルス様構造を形成可能であって、野生型コートタンパク質の長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％であるポリペプチドと定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一の内部欠失、又はＮ及び／又はＣ末端での少なくとも一の切断、又はそれらの少なくとも一の組合せから得られる。コートタンパク質の断片は、集合してＲＮＡファージのウイルス様粒子を形成可能で、上で定義したコートタンパク質の断片と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをさらに含む。
この発明で交換可能に使用される「変異コートタンパク質」又は「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一である、野生型コートタンパク質から誘導されたアミノ酸配列を有し、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持しているポリペプチドを言う。変異の典型的でかつ好ましい例には、野生型コートタンパク質に対して、一又は複数のアミノ酸の切断、内部欠失、付加又は置換が含まれ、よって、野生型コートタンパク質に対して、好ましくは最大１０、より好ましくは最大６、さらに好ましくは最大４、３、２及び１のアミノ酸変異が含まれる。また「変異コートタンパク質」は、好ましくは集合してＶＬＰを形成可能な野生型コートタンパク質の断片を含む。さらにここで使用される「変異コートタンパク質」なる用語は、好ましくは、対応する野生型コートタンパク質に対し、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は好ましくは集合してＶＬＰを形成可能なその断片を含む。
【００４０】
コートタンパク質、その変異体又は断片の集合によるＶＬＰの形成は、当業者には理解されるように、大腸菌中でコートタンパク質、又はその変異体又は断片を発現させ、場合によっては細胞可溶化物をゲル濾過することによりキャプシドを精製し、免疫拡散アッセイ(オークタロニーテスト)又は電子顕微鏡法(ＥＭ)(Kozlovska, T. M.ら, Gene 137：133-37(1993))によりキャプシド形成を分析することにより、試験することができる。免疫拡散アッセイ及びＥＭは、細胞可溶化物で直接実施してもよい。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのコートタンパク質、及び／又はその変異体、及び／又は断片の一以上の配列、好ましくは２つの配列を含むか、又はそれらからなるモザイクＶＬＰである。好ましくは、モザイクＶＬＰはＲＮＡファージの異なる２つのコートタンパク質を含むか、又はそれらからなり、該２つのコートタンパク質は、配列番号：１０及び配列番号：１１、又は配列番号：１５及び配列番号：１６のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施態様では、モザイクＶＬＰは、ＲＮＡファージの異なる２つのコートタンパク質を含むか、又はそれらからなり、該２つのコートタンパク質は、配列番号：１０及び配列番号：１１のＣ-末端切断、又は配列番号：１５及び配列番号：１６のＣ-末端切断のアミノ酸配列を有する。ここで使用される「配列番号：１１のＣ-末端切断」なる用語は、配列番号：１１のＣ-末端から、１、２、３、・・・５０、・・・１００、・・・１５０、・・・１９５又は１９６のアミノ酸が切断された結果の配列を意味する。
【００４１】
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子及び本発明の組成物は、ａ）バクテリオファージＡＰ２０５；ｂ）バクテリオファージｆｒ；ｃ）バクテリオファージＲ１７；ｄ）バクテリオファージｆ２；ｅ）バクテリオファージＳＰ；ｆ）バクテリオファージＭＳ２；ｇ）バクテリオファージＭ１１；ｈ）バクテリオファージＭＸ１；ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；及びｊ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択されるＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、及び／又はその断片、及び／又はその変異体を含む、又はそれらから本質的になる、又はそれらからなる。
本発明のさらに好ましい実施態様では、ウイルス様粒子及び本発明の組成物は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、又はＲＮＡ-バクテリオファージｆｒ、又はＲＮＡ-バクテリオファージＡＰ２０５、又はＲＮＡ-バクテリオファージＧＡのコートタンパク質、及び／又はその断片を含む、又はそれらから本質的になる、又はそれらからなる。本発明のさらに好ましい実施態様では、前記ＲＮＡ-バクテリオファージはＭＳ２ではない。
【００４２】
ＲＮＡ-ファージＱβのキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性五量体及び六量体に連鎖し(Golmohammadi, Rら, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβキャプシドに至らしめる、コートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。しかしながら、典型的には約８０％以上のサブユニットは、ＶＬＰ内において、互いにジスルフィド架橋を介して結合している。また、Ｑβキャプシドタンパク質は、有機溶媒及び変性剤に対し、普通ではない耐性を示す。
国際公開第２００４／００７５３８号、特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するか、又はそれらからなるＶＬＰを得る方法、よって特にその発現及び精製のための方法が記載されている。国際公開第２００４／００７５３８号、よって特にその実施例１及び実施例２は出典明示によりここに援用される。しかしながら、国際公開第２００４／００７５３８号に記載されたＶＬＰ-抗原抱合体は、発現を介して得られ、生成される所定量の宿主ＲＮＡをＶＬＰ内に含んでいることを記しておく。一方で、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片を含んでなる本発明のＶＬＰ-抗原抱合体、又はＶＬＰは、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を排除、低減又は除去するために本発明の方法により調製され、又はさらに処理される。
【００４３】
さらに、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主での発現の際に自己集合化することがまた示されている(Kastelein, RAら, Gene 23：245-254(1983)、Kozlovskaya, TMら, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287：452-455(1986)、Adhin, MRら, Virology 170：238-242(1989)、Priano, Cら, J. Mol. Biol. 249：283-297(1995))。特にＧＡ(Ni, CZら, Protein Sci. 5：2485-2493(1996)、Tars, Kら, J. Mol. Biol. 271：759-773(1997))及びｆｒ(Pushko Pら, Prot. Eng. 6：883-891(1993)、Liljas, Lら, J. Mol. Biol. 244：279-290(1994))の生物学的及び生化学的特性が開示されている。
好ましい一実施態様では、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質は、置換又は欠失により、少なくとも一つ、又は少なくとも二つのリジン残基が除去されることにより修飾される。他の実施態様では、ＲＮＡファージの変異コートタンパク質は、置換又は挿入により、少なくとも一つ、又は少なくとも二つのリジン残基が付加されることにより修飾される。非常に好ましい一実施態様では、変異コートタンパク質は、少なくとも一つ、又は少なくとも二つのリジン残基が、置換又は欠失により除去された、ＲＮＡファージＱβのものである。別の非常に好ましい実施態様では、変異コートタンパク質は、少なくとも一つ、又は少なくとも二つのリジン残基が、置換又は挿入により付加された、ＲＮＡファージＱβのものである。さらに好ましい一実施態様では、ＲＮＡファージＱβの変異コートタンパク質は、配列番号：２３−２７の任意の一つから選択されるアミノ酸配列を有する。少なくとも一のリジン残基の欠失、置換又は付加により、カップリング度合い、すなわちＲＮＡ-ファージのＶＬＰのサブユニット当たりの本発明の抗原の量を、特にワクチンの要求に適合させ調整するために、変えることができる。上述したＱβコートタンパク質、変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びキャプシドの構成、発現及び精製は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号に記載されている。特に上述した出願の実施例１８が参照される。国際公開第０２／０５６９０５号等の従来技術に記載されているＶＬＰ-抗原抱合体は、発現を介して得られ、生じるため、ＶＬＰ中に所定量の宿主ＲＮＡを含んでいることを記しておく。他方、ＶＬＰ又は本発明のＱβ変異コートタンパク質を含有するＶＬＰ-抗原抱合体は、本発明の方法により調製され、またさらには処理され、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸が排除、低減又は除去されている。
【００４４】
さらに好ましい実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．０５〜４．０の抗原密度を有する。ここで使用される場合「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、ここで好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合する抗原の平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰのモノマー又はサブユニット全体の平均として算出される。抗原が８ＫＤａ以上の分子量を有しているさらに好ましい本発明の実施態様では、抗原密度は好ましくは０．１〜１．５である。抗原が、好ましくは５−３０のアミノ酸からなるさらに好ましい実施態様では、抗原密度は好ましくは０．５〜４である。
好ましい一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡ-ファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの変異コートタンパク質、及び／又はその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００４５】
本発明の好ましい一実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなり、ここでコートタンパク質は、前述の変異体及び対応するＡ１タンパク質のいずれか一方の混合物を含むか、又は本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
アミノ酸５でプロリンがスレオニンに、又はアミノ酸１４でアスパラギンがアスパラギン酸に置換された、ＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ＶＬＰの集合化適格性変異型も本発明の実施に使用することができ、本発明の他の好ましい実施態様になる。
【００４６】
数種のＲＮＡバクテリオファージの結晶構造は決定されている(Golmohammadi, Rら, Structure 4：543-554(1996))。このような情報を使用し、表面露出残基を同定することができ、よってＲＮＡ-ファージコートタンパク質を、一又は複数の反応性アミノ酸残基が挿入又は置換により挿入できるように修飾することができる。その結果、バクテリオファージコートタンパク質の修飾形態を本発明に対して使用することもできる。ＲＮＡファージから誘導されるＶＬＰの他の利点は、手頃なコストでの多量の物質の生産を可能にする、細菌、特に大腸菌中におけるその高い発現収率である。
本発明の他の好ましい実施態様では、組成物は、ＶＬＰに結合する少なくとも一のポリアニオン系高分子をさらに含有する。好ましくは、前記ポリアニオン系高分子は、ＶＬＰ内部に収容されている。さらにまた好ましい実施態様では、その少なくとも一のポリアニオン系高分子は、(ａ)ポリアニオン系ポリペプチド類；(ｂ)ポリアニオン系糖類で、好ましくはＬＰＳでないもの；(ｃ)ポリアニオン系有機ポリマー、及び(ｄ)核酸で、好ましくはＴｏｌｌ様レセプターリガンドではなく、好ましくは免疫賦活性核酸ではないものからなる群から選択される。
【００４７】
さらに好ましい実施態様では、少なくとも一のポリアニオン系高分子は核酸であり、ここで、該核酸はＴｏｌｌ様レセプターリガンドではない。さらに好ましい実施態様では、核酸は２０を越えるヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。さらに好ましい一実施態様では、核酸はｔＲＮＡである。ｔＲＮＡは化学会社から購入することもできるし、生物から抽出することもできる。この発明にとって好ましいｔＲＮＡは、例えば小麦胚芽ｔＲＮＡ又は酵母ｔＲＮＡである。他の好ましい実施態様では、核酸はＤＮＡであり、ここでＤＮＡはＣｐＧモチーフを含まず、ＴＬＲ９を刺激しない。
好ましい実施態様では、ポリアニオン系ポリペプチドは、(ａ)ポリグルタミン酸；(ｂ)ポリアスパラギン酸；(ｃ)ポリ(ＧｌｕＡｓｐ)、及び(ｄ)(ａ)から(ｃ)の任意の化学修飾されたものからなる群から選択される。化学修飾の例には、限定するものではないが、グルコシル化、アセチル化、及びホスホリル化が含まれる。
【００４８】
本発明の他の好ましい実施態様では、ポリアニオン系糖類は、(ａ)アニオン性デキストラン類；(ｂ)ホスホセルロース；(ｃ)ポリグルクロン酸(polyglucoronic acid)；(ｄ)ポリガラクトウロン酸；(ｅ)ポリシアル酸；(ｆ)ヒアルロン酸、及び(ｇ)グリコサミノグリカン類からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、アニオン性デキストランは、(ａ)硫酸デキストラン；(ｂ)カルボキシルメチルデキストラン；(ｃ)スルホプロピルデキストラン；(ｄ)メチルスルホナートデキストラン、及び(ｅ)リン酸デキストランからなる群から選択される。他のさらに好ましい実施態様では、グリコサミノグリカンは、(ａ)ヘパリン；(ｂ)ヘパリン硫酸；(ｃ)デルマタン硫酸；(ｄ)コンドロイチン硫酸；及び(ｅ)ケラタン硫酸からなる群から選択される。
本発明の他の好ましい実施態様では、ポリアニオン系有機ポリマーは、(ａ)ポリビニルスルファート、及び(ｂ)ポリアクリラート類からなる群から選択される。
【００４９】
本発明のある好ましい実施態様では、少なくとも一のポリアニオン系高分子の分子量は約２０００〜約２０００００ダルトンであり、最も低い分子量は、好ましくは少なくとも約３０００ダルトン、より好ましくは少なくとも約５０００ダルトン、さらに好ましくは少なくとも約７０００ダルトンであり、最も高い分子量は、好ましくは最大で約２０００００ダルトン、より好ましくは最大で約１８００００ダルトン、さらに好ましくは最大で約１６００００ダルトン、またさらに好ましくは最大で約１５００００ダルトンである。
ポリアニオン系高分子の種類に応じて、好ましい分子量の範囲は変化する。例えば、ポリアニオン系ポリペプチド、特にポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸において、好ましい分子量は５０００ダルトン〜１５００００ダルトンである。これにより、最も低い分子量は、好ましくは少なくとも約５０００ダルトン、より好ましくは少なくとも約１００００ダルトン、さらに好ましくは少なくとも約３００００ダルトンである。また最も高い分子量は、好ましくは最大で約１５００００ダルトン、より好ましくは最大で約１２００００ダルトン、さらに好ましくは最大で約１０００００ダルトンである。
【００５０】
非常に好ましい実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一のポリアニオン系高分子を含有し、ここで該ポリアニオン系高分子は、少なくとも一のポリアニオン系ポリペプチドであることが好ましく、また、さらに好ましくは、ポリアニオン系高分子は、少なくとも一のポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。
ポリアニオン系高分子は、便宜的に、化学会社から購入することができる。例えば、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸は、広範囲の分子量(ポリグルタミン酸：７５０−１５００、１５００−３０００、３０００−１５０００、１５０００−５００００、５００００−１０００００；ポリアスパラギン酸：５０００−１５０００、１５０００−５００００)をカバーしている、シグマ社(Sigma, New Jersey, USA)から購入することができる。分子量は、粘度(Idelson, M. & Blout, E.R.(1958)J. Am. Chem. Soc. 80, p.4631)及びＬＡＬＬＳ法、すなわち低角レーザー光散乱法に基づき決定される。
【００５１】
ポリガラクトウロン酸(ＭＷ、２５０００−５００００)はフルカ社(Fluka, Buchs, Swizerland)から、デキストラン硫酸(ＭＷ、５０００、８０００及び１００００)はシグマ社から、デキストラン硫酸(ＭＷ、１０００００)はフルカ社から購入することができる。分子量は、ＬＡＬＬＳ、粘度、又はゲル濾過法により決定される。有機ポリマー、例えばポリビニルスルファート(ＭＷ、〜１７００００)はアルドリッチ社(Aldrich)から購入される。
さらなる態様では、本発明は、それぞれ以下の工程：(ａ)宿主により、少なくとも一の第一の付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を組み換えて産生し、ここで該ＶＬＰはＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含み；(ｂ)宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を加水分解可能な金属イオンを含有する溶液と共に、該ＶＬＰをインキュベートし；(ｃ)(ａ)又は(ｂ)から得られた該ＶＬＰ、好ましくは工程(ｂ)から得られたＶＬＰに、少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を結合させることを含む、本発明の組成物、及びＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ-抗原抱合体の調製方法を提供する。好ましい実施態様では、金属イオンは亜鉛(Ｚｎ)イオン、銅(Ｃｕ)イオン及び鉄(Ｆｅ)イオンから選択される。さらに好ましくは、ＶＬＰのインキュベートの後、消化された核酸を取り除くために、好ましくは透析による少なくとも一のＶＬＰの精製工程が続く。
【００５２】
他の態様において、本発明は、それぞれ以下の工程：(ａ)宿主により、少なくとも一の第一の付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を組み換えて産生し、ここで該ＶＬＰはＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含み；(ｂ)ＲＮａｓｅと共に、該ＶＬＰをインキュベートし；(ｃ)工程(ａ)又は(ｂ)から得られた該ＶＬＰ、好ましくは工程(ｂ)から得られたＶＬＰに、少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を結合させることを含む、本発明の組成物、及びＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ-抗原抱合体の調製方法を提供する。好ましい実施態様では、ＲＮａｓｅはＲＮａｓｅＡである。他の好ましい実施態様では、前記ＶＬＰと前記ＲＮａｓｅ、好ましくはＲＮａｓｅＡとのインキュベートは、低イオン強度バッファー中で実施され、ここで、低イオン強度バッファーは、好ましくは５０ｍＭ未満、より好ましくは４０ｍＭ未満、さらに好ましくは３０ｍＭ以下の濃度を有し、さらに好ましい低イオン強度バッファーは、３０ｍＭの濃度を有する。さらに好ましくは、前記ＶＬＰ工程のインキュベートの後、消化された核酸を取り除くために、好ましくは透析による少なくとも一のＶＬＰの精製工程が続く。
さらなる態様において、本発明は、それぞれ以下の工程：(ａ)宿主により、少なくとも一の第一の付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)を組み換えて産生し、ここで該ＶＬＰはＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含み；(ｂ)該ウイルス様粒子を、該ＲＮＡ-バクテリオファージの該コートタンパク質、その変異体又は断片に分解し；(ｃ)該コートタンパク質、その変異体又は断片を精製し；(ｄ)該ＲＮＡ-バクテリオファージの、該精製されたコートタンパク質、その変異体又は断片を、ウイルス様粒子に再構築させ；ここで該ウイルス様粒子は、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有せず；及び(ｅ)工程(ｄ)から得られた該ＶＬＰに、少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を結合させることを含む、本発明の組成物、及びＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ-抗原抱合体の調製方法を提供する。さらに好ましい実施態様では、精製されたコートタンパク質の再構築は、少なくとも一のポリアニオン系高分子の存在及び／又は付加により達成される。この発明の方法は、特に分解工程によって、本質的に全ての宿主核酸の放出が可能となるため、特に有利である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では、前記ウイルス様粒子の分解は、好ましくは変性条件下で達成される。好ましい変性条件は、高濃度の塩、例えば０．５Ｍ〜１Ｍの塩化マグネシウム、又は５Ｍ以上の尿素である。さらに好ましくは、前記コートタンパク質、その変異体又は断片の精製工程は、特に、宿主核酸と、コートタンパク質、その変異体又は断片とを分離させるために、カチオン交換クロマトグラフィー及び／又はサイズ排除クロマトグラフィーにより達成される。
さらに好ましい態様において、本発明は、それぞれ以下の工程：(ａ)宿主により、ＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を組み換えて産生し；(ｂ)該コートタンパク質、その変異体又は断片を精製し；(ｃ)少なくとも一の第一の付着部位を有するウイルス様粒子を形成し、ここで該ウイルス様粒子は、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有せず；及び(ｄ)工程(ｃ)から得られた該ＶＬＰに、少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原を結合させることを含む、本発明の組成物、及びＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ-抗原抱合体の調製方法を提供する。さらに好ましい実施態様では、精製されたコートタンパク質の再構築は、少なくとも一のポリアニオン系高分子の存在及び／又は付加により達成される。
【００５４】
再度、さらなる態様において、本発明は、本発明の組成物、及びＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ-抗原抱合体の生産方法を提供するものであり、ＶＬＰと抗原は、少なくとも一のペプチド結合を介して結合している。本方法は、次の工程：(ａ)宿主により、抗原、及びＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含有する融合タンパク質を組み換えて産生し；(ｂ)該融合タンパク質を精製し；(ｃ)ウイルス様粒子を形成し、ここで該ウイルス様粒子は、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有しないことを含む。さらに好ましい実施態様では、精製された融合タンパク質の再構築は、少なくとも一のポリアニオン系高分子の存在及び／又は付加により達成される。
代替方法は、(ａ)宿主により、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)を組み換えて産生し、ここで該ＶＬＰは、少なくとも一の抗原、及びＲＮＡ-バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含有する融合タンパク質を含み；該ＶＬＰを該融合タンパク質に分解し；該融合タンパク質を精製し；該精製された融合タンパク質をＶＬＰに再構築し、ここで、該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含有しない、工程を含む。さらに好ましい実施態様では、精製された融合タンパク質の再構築は、少なくとも一のポリアニオン系高分子の存在及び／又は付加により達成される。好ましい実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡ-バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。
【００５５】
本発明の非常に好ましい実施態様では、本発明の組成物は、ＲＮＡファージＱβ、ＡＰ２０５、ｆｒ又はＧＡ、より好ましくはＲＮＡファージＱβ又はＧＡ、最も好ましくはＲＮＡファージＱβの、宿主の核酸を本質的に含有しないＶＬＰを含み、また組成物は、少なくとも一のポリアニオン系分子、好ましくはポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸をさらに含む。本発明の他の好ましい実施態様では、組成物は、少なくとも一のポリアニオン系高分子をさらに含まず、宿主の核酸を本質的に含有しないＲＮＡファージＡＰ２０５又はｆｒのＶＬＰを含む。
本発明のさらに好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、ステロイドホルモン、有機分子及びハプテンからなる群から選択される。
【００５６】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はハプテンである。好ましいハプテン類は、ホルモン類、薬剤及び毒性化合物である。さらに好ましくは、薬剤、特にそれぞれ依存性薬物及び乱用される薬物、さらには気晴らしのための麻薬である。このような抗原の代表例には、オピオイド及びモルヒネ誘導体、例えばコデイン、フェンタニル、ヘロイン、モルフィウム、アヘン；弛緩剤、例えばジアゼパム；刺激剤、例えばアンフェタミン、コカイン、ＭＤＭＡ(メチレンジオキシメタンフェタミン)、メタンフェタミン、メチルフェニデート、及びニコチン；幻覚剤、例えばＰＣＰ、ＬＳＤ、メスカリン、及びシロシビン；カンナビノイド類、例えばハシッシュ及びマリファナ；並びにデシプラミン／イミプラミンクラスの薬剤、及びノルトリプチリン／アミトリプチリンクラスの薬剤が含まれる。またニコチン中毒の治療でも、ノルニコチン及びコチニンを含む代謝産物、Ｏ-スクシニル-３'-ヒドロキシメチル-ニコチン等のニコチン誘導体を標的としてよい。
ニコチン又はニコチン誘導体、又は乱用される他の薬剤、例えばコカインをＶＬＰに結合される詳細な教示は、国際公開第２００４／００９１１６号、特に６１頁の２８行から６６頁の１３行に開示されている。よって、国際公開第２００４／００９１１６号の一般的及び特定の開示は、出典明示によりここに援用される。
【００５７】
しかして、好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、依存性薬物から選択される有機分子であり、ここで好ましくは、該依存性薬物はニコチン又はコカイン、特にニコチンである。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は自己抗原又はその断片又は変異体である。好ましくは、自己抗原は、該自己抗原に対して免疫応答を誘導するのに適したそのタンパク質又は断片である。よって、本発明は、「自己」遺伝子産物(例えば腫瘍壊死因子)により引き起こされるか又は悪化する疾患又は病状を防止及び／又は弱化させるための方法への使用に適したワクチン組成物を提供する。しかして、本発明のワクチン組成物は、「自己」遺伝子産物により引き起こされるか又は悪化する疾患又は病状を防止及び／又は弱化させる抗体の生産に至らしめる組成物を含む。このような疾患又は病状の例には、移植片対宿主病、ＩｇＥ-媒介性アレルギー反応、アナフィラキシー、成人呼吸促迫症候群、クローン病、アレルギー性喘息、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、グレーブス病、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、炎症性自己免疫疾患、重症筋無力症、免疫増殖性疾患リンパ節腫(ＩＰＬ)、血管免疫増殖性リンパ節腫(ＡＩＬ)、免疫芽球性リンパ節症(ＩＢＬ)、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、心筋炎、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び骨粗鬆症が含まれる。
【００５８】
本発明の非常に好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原は、リンホトキシン類(例えばリンホトキシンα(ＬＴα)、リンホトキシンβ(ＬＴβ))、リンホトキシンレセプター、核因子ｋＢリガンドのレセプター活性化因子(ＲＡＮＫＬ)、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、血管内皮増殖因子レセプター(ＶＥＧＦ-Ｒ)、インターロイキン-５、インターロイキン-１７、インターロイキン-１３、ＩＬ-２３ｐ１９、グレリン、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＳＤＦ-１、Ｍ-ＣＳＦ、ＭＣＰ-１、エンドグリン、ＧｎＲＨ、ＴＲＨ、エオタキシン、ブラジキニン、ＢＬＣ、腫瘍壊死因子α、アミロイドベータペプチド(Ａβ１−４２)、Ａβ１−６、アンギオテンシン、ガストリン、プロガストリン、ＣＥＴＰ、ＣＣＲ５、Ｃ５ａ、ＣＸＣＲ４、Ｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン、又は上述した抗原の断片又は変異体からなる群から選択される。上述の抗原に対して使用される場合、その抗原の「断片」なる用語は、(ｉ)対応する抗原、又は場合によっては自己抗原の配列、GeneBankに寄託されている野生型抗原のヒト配列又は任意の他の動物からの対応するオルソログ、好ましくはGeneBankに寄託されている野生型抗原のヒト配列の、少なくとも４、５、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５又は３０の近接アミノ酸を含む、又はもしくは好ましくはそれらからなる任意のポリペプチド；並びに(ｉｉ)(ｉ)のポリペプチドの任意の一つと同一であるアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを称すべきであり、ここで該アミノ酸配列同一性は、６５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、またより好ましくは９５％以上ある。さらに、上に列挙された抗原の「断片」なる用語は、少なくとも一の抗原部位を含むべきである。好ましくは、ここで使用される場合、上に列挙された抗原の「断片」なる用語は、１００以下のアミノ酸、好ましくは８０以下のアミノ酸、好ましくは６０以下のアミノ酸、より好ましくは４０以下のアミノ酸、再度さらに好ましくは３０以下のアミノ酸、またさらに好ましくは２０以下のアミノ酸長さを有するポリペプチドを意味するべきである。さらに好ましくは、ここで使用される場合、また自己抗原を指す場合、上に列挙された抗原の「断片」なる用語は、本発明で提供される場合はポリペプチドを称すべきであり、上に列挙された対応抗原に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導可能なものであるべきである。さらにここで使用される場合、上に列挙された抗原の「断片」なる用語は、対応抗原の少なくとも一つ、好ましくは二つ、より好ましくは一方の切断又は内部欠失により得られるポリペプチドを、好ましくは意味するべきである。タンパク質の抗原部位(類)を決定するための方法は、当業者に知られている。米国仮出願第６０／５６９３２２号の２６頁の第一段落から２７頁の第４段落までに、これらの方法のいくつかが詳述されており、これらの特定の開示は、出典明示によりここに援用される。これらの方法は、一般的に他のポリペプチドの抗原にも応用され、よって米国仮出願第６０／５６９３２２号に開示されているようなＩＬ-２３ｐ１９に限定されないことを記しておく。
上述の抗原について使用される場合、その抗原の「変異体」なる用語は、上に列挙した抗原、又は自己抗原の場合は、GeneBankに寄託されている野生型抗原のヒト配列又は任意の他の動物からの対応するオルソログの配列、好ましくはGeneBankに寄託されている野生型抗原のヒト配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、またより好ましくは９５％、最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する、任意の天然の又は遺伝子操作されたポリペプチド又はタンパク質を含むか、又はもしくは好ましくはそれらからなる任意のポリペプチドを指すべきである。タンパク質の変異体を産生させるための好ましい方法は、遺伝子操作、好ましくは挿入、置換、欠失又はそれらの組合せによる。本発明で提供される場合、タンパク質の変異体は、上に列挙された対応の抗原に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導可能なものであるべきである。
【００５９】
この出願において、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性(Ｋａ)で、本発明の抗原、抗原タンパク質、抗原の断片、又は抗原の変異体と、結合するならば特異的に結合するものと定義される。抗体の親和性は、典型的にかつ好ましくはスキャッチャード分析により、当業者によって容易に測定され得る。
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＧｎＲＨ-ペプチド(黄体形成ホルモン放出ホルモン、すなわちＬＨＲＨとしても知られている生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン)である。ワクチンの製造に有用なＶＬＰ-ＧｎＲＨ抱合体は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５３８５８号に開示されている。
【００６０】
ここで使用される場合、「ＧｎＲＨ-ペプチド」なる用語は、少なくとも一つの、好ましくは一つの哺乳動物ＧｎＲＨ、よって特に、配列番号：１又は配列番号：２８、好ましくは配列番号：１の少なくとも一のアミノ酸配列、好ましくは一のアミノ酸配列、又はその断片もしくは変異体を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなるペプチドである。いくつかの実施態様では、ＧｎＲＨペプチドは、Ｎ-末端プログルタミン酸(puroglutamic acid)(ｐＧｌｕ又はｐＥ)を含む。他の実施態様では、ＧｎＲＨペプチドは、Ｃ-末端グリシンアミド(Ｇ-ＮＨ２)を含む。本発明の他の実施態様では、ＧｎＲＨペプチドは、一つを越えるＧｎＲＨペプチド又はその断片を、例えば配列番号：３０−３２の場合のように２つ、３つ以上のＧｎＲＨペプチド又はその断片を、タンデムに含む。本発明のテンデム-ＧｎＲＨペプチドは、ＧｎＲＨ配列がスペーサーを介して相互に連結しているペプチドをさらに含む。スペーサー基の性質は、一又は複数のアミノ酸から、より短い又はより長い炭化水素鎖及び他の化合物の基又は分子まで、大きく変わり得る。
好ましい実施態様では、ＧｎＲＨペプチドは、システインを含むか又はそれからなるアミノ酸リンカーに結合している。さらに好ましい一実施態様では、アミノ酸リンカーは、ＧｎＲＨペプチドのＮ-又はＣ-末端のいずれかに融合したシステインである。さらに好ましい実施態様では、システインは、配列番号：１のＮ-又はＣ-末端のいずれか(配列番号：４又は５になる)、好ましくは配列番号：１のＮ-末端(配列番号：４)に融合している。他の好ましい実施態様では、リンカーＣＧＧは、ＧｎＲＨペプチドのＮ-末端、好ましくは配列番号：１又は配列番号：２８のＮ-末端、より好ましくは配列番号：１のＮ-末端に融合し、配列番号：２になる。さらなる他の好ましい実施態様では、リンカーＧＧＣは、ＧｎＲＨペプチドのＣ-末端、好ましくは配列番号：１又は配列番号：２８のＣ-末端、より好ましくは配列番号：１のＣ-末端に融合し、配列番号：３になる。
【００６１】
少なくとも一の抗原としてＧｎＲＨを含有する本発明のこの組成物は、肉への雄ブタ汚染を防止するために、ブタ等の哺乳動物に投与することができる。ＧｎＲＨを含有する組成物は、動物、例えばイヌ、ネコ、ヒツジ、ウシに、それらの生殖行動をコントロール及び／又はそれらの生殖性を低減させるために投与することができる。ＧｎＲＨを含有するこの修飾ＶＬＰは、性腺ステロイドホルモン依存性癌を患っているヒトに投与することができる。
好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原は、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ(配列番号：８６)、又はその断片を有するアミロイドベータペプチド(Ａβ１−４２)、例えばアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨ(配列番号：８７)を有するＡβ１−６である。アミロイドベータペプチドの蓄積は、アルツハイマー病を引き起こすか、又は悪化させるおそれがあり、よって本発明の組成物は、病状を治療又は緩和する方法を提供する。Ｑβ又はｆｒ等の、種々のＶＬＰへの種々のＡβ断片のカップリング、及びマウスへのそれらの予防接種については、出典明示によりここに援用される国際公開第０２／０５６９０５号の実施例１３、１５、１７及び５４に開示されている。ウイルス性コートタンパク質とＡβ１−６断片の融合は、国際公開第０４／０１６２８２号の実施例７、８、９、１０、１１に開示されており；さらにＶＬＰへのＡβ１−６のカップリングは、実施例１３、１８、２０に開示されており；ＶＬＰ-Ａβ１−６を用いた動物の免疫化、及び結果として生じるワクチン効果は、国際公開第０４／０１６２８２号の実施例１２、１４、１６、１７、１９及び２０に開示されている。
【００６２】
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原はグレリン又はその断片又は変異体である。グレリンは摂食行動の主要制御因子である。グレリンの末梢投与により食物取り込みが増加し、体重増加に至る(Tschopら, Nature 407：908-12)。よって、本発明のグレリンに対する免疫化により、肥満の治療方法が提供される。好ましいグレリン又はグレリンペプチドは、国際公開第０４／００９１２４号の６８−７４頁に開示されている。グレリンはヒト以外の他の哺乳動物種、例えばイヌ及びネコから選択されてよい。国際公開第０４／００９１２４号の実施例８、９、１３、１５には、ＶＬＰへのグレリンのカップリング方法のいくつかが開示されており、出典明示によりここに援用される。さらに好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、配列番号：７７、配列番号：７８、配列番号：７９又は配列番号：８２又は配列番号：８５のアミノ酸配列を含む又はそれらからなるグレリン断片である。他のさらに好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、配列番号：８３を含むか又はそれからなるグレリン断片であり、ここで前記本発明の組成物は、好ましくはイヌに投与され；配列番号：８４の場合は、該本発明の組成物は、好ましくはネコに投与される。
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、その全体が出典明示によりここに援用されるＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０号に記載されているような、ＩＬ-２３ｐ１９タンパク質又はＩＬ-２３ｐ１９断片である。好ましい一実施態様では、ＩＬ-２３タンパク質は、配列番号：６又は配列番号：７を含む又はそれらから本質的になる、又はそれらからなる。好ましい一実施態様では、ＩＬ-２３断片は、(ａ)配列番号：８-９、及び(ｂ)配列番号：３３−４４；(ｃ)(ａ)及び(ｂ)の配列の任意の一つの断片又は変異体からなる群から選択される任意の配列を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００６３】
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、アンジオテンシンペプチド又はその断片である。ここで使用される場合、「アンジオテンシンペプチド」なる用語は、アンジオテンシノゲン、アンジオテンシンＩ又はアンジオテンシンＩＩの配列を含む任意のペプチド又はその断片を含む。配列は以下の通りである：アンジオテンシノゲン：ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＶＩＨＮ(配列番号：１０８)；アンジオテンシンＩ：ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ(配列番号：１０９)；アンジオテンシンＩＩ：ＤＲＶＹＩＨＰＦ(配列番号：１１０)。典型的には、一又は複数の付加的なアミノ酸が、アンジオテンシンペプチド配列のＣ-又はＮ-末端のいずれかに付加される。それらの付加的なアミノ酸は、特に、ＶＬＰに対する配向し規則性のある結合のために有益である。さらに好ましい実施態様は、国際公開第０３／０３１４６６号に開示されており、出典明示によりここに導入される。第二の付着部位を有する特に好ましいアンジオテンシン断片配列は、ａ）ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦ(配列番号：１１１)；ｂ）ＣＧＧＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ(配列番号：１１２)；ｃ）ＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬＧＧＣ(配列番号：１１３)；ｄ）ＣＤＲＶＹＩＨＰＦＨＬ(配列番号：１１４)；ｅ）ＣＨＰＦＨＬ(配列番号：１１５)；ｆ）ＣＧＰＦＨＬ(配列番号：１１６)；ｇ）ＣＹＩＨＰＦ(配列番号：１１７)；ｈ）ＣＧＩＨＰＦ(配列番号：１１８)；ｉ）ＣＧＧＨＰＦ(配列番号：１１９)；ｊ）ＤＲＶＹＩＧＧＣ(配列番号：１２０)；ｋ）ＤＲＶＹＧＧＣ(配列番号：１２１)；及びｌ）ＤＲＶＧＧＣ(配列番号：１２２)からなる群から選択される。よって本発明の組成物は、高血圧の病状を治療又は緩和する方法を提供する。組成物の調製及びその使用についての詳細な記載は、国際公開第０３／０３１４６６号に開示されており、出願全体が出典明示によりここに援用される。
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原はＲＡＮＫＬ(破骨細胞分化因子)、又はその断片又は変異体である。ＲＡＮＫＬは、ＴＮＦ-スーパーファミリーに属する２４５アミノ酸の膜貫通タンパク質である。細胞外領域の一部(１７８ａａ)は、ＴＡＣＥ様プロテアーゼにより分断可能である(Lumら, J Biol Chem. 274：13613(1999))。ヒトＲＡＮＫＬの細胞外部分のアミノ酸配列は、配列番号：２２１(ＴｒＥＭＢＬ：Ｏ１４７８８)に示されており、ヒトアイソフォームのアミノ酸配列は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２２２である。ネズミ科動物ＲＡＮＫＬの細胞外部分の配列及びアイソフォームは、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２２３(ＴｒＥＭＢＬ：Ｏ３５２３５)及び配列番号：２２４(ＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＪＪＫ８、及びＴｒＥＭＢＬ：Ｑ９ＪＪＫ９)に示されている。
【００６４】
ＲＡＮＫＬは破骨細胞形成の必須因子であることが示されている。ＲＡＮＫＬとそのレセプターＲＡＮＫとの相互作用の阻害により、破骨細胞形成の抑制に至り、よって、骨粗鬆症及び他の病状に見られるような、過度の骨吸収を停止させる手段が提供される。
ＲＡＮＫＬの細胞外部分に融合したシステイン残基を含有するＮ-末端アミノ酸リンカーを有するヒト-ＲＡＮＫＬコンストラクトは、本発明の非常に好ましい実施態様である。ＲＡＮＫＬの生理学的機能、それを発現させるための方法についてのさらなる情報は、国際公開第０２／０５６９０５号の６２〜６４頁に開示されており、ヒト-ＲＡＮＫＬコンストラクトは、国際公開第０２／０５６９０５号の実施例６に開示されており、ここで出典明示により援用される。ＲＡＮＫＬタンパク質、断片又はＲＡＮＫＬペプチド変異体のさらに好ましい実施態様は、国際公開第０３／０３９２２５号の２２３〜２３５段落に開示されており、出典明示によりここに援用される。
【００６５】
本発明の他の実施態様では、少なくとも一の抗原はインターロイキン-１７(ＩＬ-１７)又はその断片又は変異体である。ヒトＩＬ-１７は、可変グリコシル化を伴う、３２-ｋＤａのジスルフィド結合したホモ二量体タンパク質である(Yao, Z.ら, J. Immunol. 155：5483-5486(1995))。ヒト及びマウスＩＬ-１７のアミノ酸配列は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２２８(受入＃：ＡＡＣ５０３４１)及び配列番号：２２９(受入＃：ＡＡＡ３７４９０)に与えられている。
臨床試験では、ＩＬ-１７が多くの炎症性疾患に関与していることが示されている。高レベルのＩＬ-１７が、関節リウマチを患っている患者で報告されている(Ziolkowska M.ら, J Immunol. 164：2832-8(2000))。インターロイキン１７は、マウスの膝関節のプロテオグリカン分解に効果を有し(Dudler J.ら, Ann Rheum Dis. 59：529-32(2000))、滑膜マトリックス破壊の一因である(Chabaud M.ら, Cytokine. 12：1092-9(2000))ことが示されている。多発性硬化症を患っている患者からの単核細胞においては、ＩＬ-１７ｍＲＮＡのレベル上昇が見出されている(Matusevicius, D.ら, Mult. Scler. 5：101-104(1999))。苦痛を伴う全身性エリテマトーデスを患っている患者においては、ＩＬ-１７の血清濃度の上昇が観察される(Wong C.K.ら, Lupus 9：589-93(2000))。さらに、ＩＬ-１７ｍＲＮＡのレベルは、損傷性の乾癬のある皮膚から単離されたＴ細胞において増加している(Teunissen,M.B.ら，及びJ. Invest. Dermatol. 111：645-649(1998))。また腎臓移植片の拒絶におけるＩＬ-１７の関与も示されている(Fossiez F.ら, Int. Rev. Immunol. 16：541-51(1998))。上の発見により、ＩＬ-１７が炎症反応の開始及び維持における中枢的役割を担っていることが示唆される(Jovanovic, D.V.ら, J. Immunol. 160：3513-3521(1998))。ヒト及びマウスのＩＬ-１７配列は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２２８(ＡＡＣ５０３４１)及び配列番号：２２９(ＡＡＡ３７４９０)に与えた。ＩＬ-１７を発現させるための方法は、国際公開第０２／０５６９０５号の６９頁に記載されており、出典明示によりここに援用される。
【００６６】
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原はインターロイキン-１３(ＩＬ-１３)又はその断片又は変異体である。ヒトＩＬ-１３前駆体のアミノ酸配列は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２３０、プロセシングされたヒトＩＬ-１３のアミノ酸配列は配列番号：２３１に示されている。前駆体タンパク質の最初の２０のアミノ酸はシグナルペプチドに相当し、プロセシングされたタンパク質にはない。  
ＩＬ-１３は、近年、アレルギー性気道応答(喘息)に関連しているヘルパーＴ細胞-誘導性サイトカイン(ＩＬ-４、ＩＬ-５等)である。ＩＬ-１３及びＩＬ-１３レセプターのアップレギュレーションは、多くの腫瘍型(ホジキンリンパ腫)に見出されている。インターロイキン１３は、ホジキン及びリード・シュテルンベルグ細胞より分泌させ、その成長を促進させる(Kapp Uら, J Exp Med. 189：1939-46(1999))。よって、ＩＬ-１３に対する免疫化により、上述した他の病状、例えば喘息又はホジキンリンパ腫の治療方法が提供される。ＩＬ-１３を発現させるための方法は、国際公開第０２／０５６９０５号の７０頁に記載されており、ＩＬ-１３構築物は国際公開第０２／０５６９０５号の実施例９に開示されており、出典明示によりここに援用される。
【００６７】
本発明のさらなる他の実施態様では、少なくとも一の抗原はインターロイキン-５(ＩＬ-５)又はその断片又は変異体である。ＩＬ-５は、エオシノフィロポイエシス(eosinophilopoiesis)に対する系統特異性サイトカインであり、喘息等、好酸球の数の増加に伴う疾患において、重要な役割を担っている。前駆体及びプロセシングされたヒトＩＬ-５の配列は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２３３及び配列番号：２３４に提供されており、プロセシングされたマウスのアミノ酸配列は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２３５に示されている。
ＩＬ-５の生物学的機能は、いくつかの研究に示されており(Coffman R.L.ら, Science 245：308-10(1989)；Kopfら, Immunity 4：15-24(1996))、好酸球を介して媒介される疾患において、ＩＬ-５の機能を阻害するという有益な効果を提示している。よって、ＩＬ-５の作用を阻害することにより、喘息及び好酸球に関連した他の疾患の治療方法が提供される。
【００６８】
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＣＬ-２１又はその断片又は変異体である。関連する好ましい実施態様では、抗原性は、ＳＤＦ-１とも称されるＣＸＣＬ１２である。ケモカインレセプターＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４は、乳癌細胞においてアップレギュレーションされ、ＣＣＬ２１及びＣＸＣＬ１２、それぞれのリガンドは、乳癌転移の最初の目的地を表す器官に、高度に発現することが示されている(Mullerら(Nature 410：50-6(2001)))。よって、ＣＣＬ２１及びＣＣＬ１２それぞれに対する免疫化により、癌、特に乳癌における転移伝播の治療方法が提供される。さらに、ＣＣＬ１２／ＣＸＣＲ４ケモカイン-レセプター対は、骨髄への、原発性造血前駆細胞のホーミングの有効性を増加させることが示されている。さらに、ＣＸＣＲ４及びＳＤＦ-１は、慢性リンパ性白血病細胞の分布に影響を与えると思われる。よって、ＣＸＣＬ１２に対する免疫化により、慢性リンパ性白血病の治療方法が提供される。さらにＣＣＬ１２-ＣＸＣＲ４相互作用は、関節リウマチ滑膜における、ＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積の中枢的役割を担っている(Nankiら, 2000)。よって、ＳＤＦ-１に対する免疫化により、関節リウマチの治療方法が提供される。
ＣＣＬ２１のヒト及びマウス配列は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２３６(Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ＳＹ２１＿ヒト)及び配列番号：２３７(Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ＳＹ２１＿マウス)に見出されている。ＣＣＬ１２のヒト及びマウス配列は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２３８(Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ＳＤＦ１＿ヒト)及び配列番号：２３９(Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ＳＤＦ１＿マウス)に見出されている。
【００６９】
本発明のさらなる他の実施態様では、少なくとも一の抗原はＢ-リンパ球化学誘引物質(ＢＬＣ、ＣＸＣＬ１３)又はその断片又は変異体である。ヒト及びマウスＢＬＣの配列は、それぞれ国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２４０(受託番号：ＮＰ＿００６４１０)及び配列番号：２４１(受託番号：ＮＰ＿０６１３５４)に示されている。シグナルペプチドは、ヒト及びマウスのそれぞれについて最初の２２又は２１アミノ酸である。ＢＬＣを含有する本発明の組成物は、好ましくは成熟形態のタンパク質を含む。
ＢＬＣのさらなる生理学的機能、及び組成物の調製方法は、国際公開第０２／０５６９０５号の７４〜７５頁に開示されており、出典明示によりここに援用される。ＢＬＣに対する免疫化により、リンパ系新生が関与している自己免疫疾患、例えばリウマチ性滑膜炎及び関節リウマチ又はＩ型糖尿病の治療方法が提供される。
【００７０】
他の特定の実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原はエオタキシン又はその断片又は変異体である。ＩＬ-５は、骨髄から血液への好酸球の移動の原因であると思われているが、エオタキシンは、組織内における局所的移動のためのものである(Humblesら, J. Exp. Med. 186：601-12(1997))。出典明示によりここに援用される国際公開第０２／０５６９０５号において、ヒトエオタキシン-１の配列は、配列番号：２４２(アミノ酸１−２３はシグナルペプチドに相当)に示されており、ヒトエオタキシン-２の配列は、配列番号：２４３(アミノ酸１−２６はシグナルペプチドに相当)に示されており、ヒトエオタキシン-３の配列は、配列番号：２４４(アミノ酸１−２３はシグナルペプチドに相当)に示されており、マウスエオタキシン-１の配列は、配列番号：２４５(アミノ酸１−２３はシグナルペプチドに相当)に示されており、及びマウスエオタキシン-２の配列は、配列番号：２４６(アミノ酸１−２３はシグナルペプチドに相当)に示されている。さらに、エオタキシンの生理学的、生化学的情報及びその発現及び本発明における構築は、国際公開第０２／０５６９０５号の７５〜７６頁に開示されており、出典明示によりここに援用される。
本発明のさらなる他の特定の実施態様では、少なくとも一の抗原はマクロファージコロニー刺激因子(Ｍ-ＣＳＦ又はＣＳＦ-１)又はその断片又は変異体である。Ｍ-ＣＳＦ及びそのレセプターの発現度合いの上昇は、ある種の上皮癌、例えば乳癌、子宮癌及び卵巣癌における予後の乏しさに関連している。可溶化形態のＭ-ＣＳＦの構造データが利用できる(結晶構造：Panditら, Science 258：1358-62(1992))。ヒト配列は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２４７(受託番号：ＮＰ＿０００７４８)に示されている。本発明のさらに好ましい抗原は、可溶化形態のレセプターに相当する、配列番号：２４７の残基３３-１８１又は３３-１８５からなるＮ-末端断片を含む。マウス配列(受託番号：ＮＰ＿０３１８０４)は、国際公開第０２／０５６９０５号の配列番号：２４８に示されている。Ｍ-ＣＳＦのさらなる生物学的情報及びその発現及び本発明の組成物の構築は、国際公開第０２／０５６９０５号の７７〜７８頁に開示されており、出典明示によりここに援用される。
【００７１】
本発明の他の好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原はＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー又はその断片又は変異体である。ここで使用される場合、「ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー」なる用語は、ＴＮＦ様ドメインを含有するタンパク質を称する。ここで使用される場合、「ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー」は、ヒト、ネコ、イヌ、マウス、ラット、一般的な真獣類、一般に哺乳動物、並びに他の動物において知られている全ての形態のＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーを含む。ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーは、約１５０残基の球状のＴＮＦ様細胞外ドメインを含み、該ドメインは、保存ドメインデータベースＣＤＤ(Marchler-Bauer A,ら, (2003)、「CDD：a curated Entrez database of conserved domain alignments」、Nucleic Acids Res. 31：383-387)において、ｃｄ００１８４、ｐｆａｍ００２２９又はｓｍａｒｔ００２０７として分類されている。ここで使用される場合、ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーは：ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴα／β、ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３０Ｌ、４-１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ及びＢＡＦＦ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＴＬ１Ａ、ＥＤＡ、及びＴＮＦ様ドメインが同定可能な他の任意のポリペプチドを含む。
さらに好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原はＴＮＦ-ペプチドである。ここで使用される場合、「ＴＮＦ-ペプチド」なる用語は、保存ドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：４５)に対するコンセンサス配列のアミノ酸残基３ないし８に相当するものに相同するアミノ酸配列、好ましくは保存ドメインｐｆａｍ００２２９(配列番号：４５)に対するコンセンサス配列のアミノ酸残基１ないし８に相同するペプチド配列、さらに好ましくは該コンセンサス配列のアミノ酸残基１ないし１３に相同するペプチド配列を含有するペプチドを意味する。ＴＮＦ-ペプチドがヒト又はマウスＴＮＦαからのペプチドである場合、該ＴＮＦ-ペプチドは、６〜１８のアミノ酸残基長さ、好ましくは６〜１６のアミノ酸残基長さ、より好ましくは６〜１４のアミノ酸残基長さを有するペプチドからなる。相同ペプチドは、ヒトを含む動物のＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー、特に例えばマウス又はヒトＲＡＮＫＬ、もしくはマウス又はヒトＴＮＦα等の、哺乳動物ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーから誘導されるペプチドであり、配列番号：４５に相当するアミノ酸残基を表す。これらの相同ペプチドは、他の動物のＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーと、ＴＮＦ-スーパーファミリーのコンセンサス配列(配列番号：４５)を整列させる方法で、当業者により同定することができる。上述にて説明したように、ＴＮＦ-ペプチドは、コンセンサス配列の上述したアミノ酸配列に相当するペプチド配列を含む。(例えばコンセンサス配列のアミノ酸残基３ないし８等の)コンセンサス配列を有する特定の相同領域の他のＴＮＦ-ペプチドは、ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーであるポリペプチドとは異なる。しかしながら、好ましくは、コンセンサス配列を有する上で特定した相同領域の他のＴＮＦ-ペプチドの一部は、ＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー、好ましくは哺乳動物のＴＮＦ-スーパーファミリーメンバー、より好ましくはヒトＴＮＦ-スーパーファミリーメンバーであるポリペプチドと、少なくとも一の７０％同一、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一である。
【００７２】
さらに好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原は、配列ＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥ(配列番号：８８)を有するヒトＴＮＦαペプチド(４-２３)である。本発明の他のさらに好ましい実施態様では、抗原は、配列ＳＳＱＮＳＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＨＱＶＥ(配列番号：８９)を有するマウスＴＮＦαペプチド(４-２３)である。他の好ましい実施態様では、抗原は成熟マウスのＴＮＦαのアミノ酸残基２２−３２：ＶＥＥＱＬＥＷＬＳＱＲ(配列番号：９０)である。さらなる他の好ましい実施態様では、抗原はヒトＴＮＦ-αのアミノ酸残基２２−３２：ＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲ(配列番号：９１)である。
好ましい実施態様では、マウスＴＮＦαペプチド(４−２３)を含有する本発明の組成物は、自己免疫疾患又は骨関連疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、多発性硬化症、糖尿病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性肝炎、乾癬、及び乾癬性関節炎を処置する医薬の製造に使用され、ここで前記骨関連疾患は、骨粗鬆症、歯周炎(periondontis)、プロテーゼ周囲骨溶解、骨転移(metasis)、骨癌痛、パジェット病、多発性骨髄腫、シェーグレン(Sjorgen's)症候群、及び原発性胆汁性肝硬変からなる群から選択される。
【００７３】
本発明の好ましい一実施態様では、自己抗原は、国際公開第０２／０５６９０５号の５５〜５６頁に開示されているＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ、又はその断片又は変異体；国際公開第０２／０５６９０５号の７９〜８０頁に開示されているリンホトキシンβ；国際公開第０２／０５６９０５号の９３頁のリンホトキシンβ及びリンホトキシンα及びリンホトキシンβレセプターであってよい。その情報は、出典明示によりここに援用される。
好ましい一実施態様では、前記少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４又はその断片又は変異体である。ＬＥＳＴＲ又はフーシンとしても知られているケモカインレセプターＣＸＣＲ４は、７回膜貫通型ドメインＧ-タンパク質結合レセプターのファミリーに属する(Federsppielら. (1993), Genomics 16：707)。ＣＸＣＲ４の唯一の既知のリガンドはＳＤＦ-１である(Pelchen-Mattewsら, (1999) Immunol. Rev. 168：33)。ＣＸＣＲ４及びＳＤＦ-１は、造血、Ｔ-細胞の活性化及び炎症部位への移動、及びＴ-細胞ホーミング、血管新生、脳の発育、及び胚形成等、ヒトの生理における多くの領域に関与していると考えられている(Murdoch, (2000) Immunol. Rev. 177：175)。
【００７４】
最近、ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶのコレセプターとして同定されている(Fengら(1996)Science 272：872)。従って、挿入にＣＸＣＲ４を必要とするＨＩＶ菌株は、Ｘ４菌株と分類される。ＳＤＦ-１はＨＩＶ-１挿入をブロックすることが示されている(Oberlinら(1996), Nature 382：833；Bleulら, (1996) Nature 382：829)。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＣＸＣＲ４細胞外ドメインの断片を含む又はそれからなる。ＣＸＣＲ４細胞外ドメインの断片は、少なくとも６、７、好ましくは８、９、１０のアミノ酸を有し、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は、３０、好ましくは２０、より好ましくは１５、さらに好ましくは１２未満のアミノ酸を有する。
【００７５】
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４のＮ-末端細胞外ドメインを含むか又はそれからなる。さらに好ましい一実施態様では、ＣＸＣＲ４のＮ-末端細胞外ドメインは、配列番号：６６を含むか又はそれからなる。好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２の断片を含むか又はそれからなる。好ましくは、前記断片は、少なくとも６、好ましくは７のアミノ酸を有する。さらに好ましい実施態様では、少なくとも一の抗原は、配列番号：６５のアミノ酸配列を有するＣＸＣＲ４細胞外ドメインＥＣＬ２の断片を含むか又はそれからなる。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＣＣＲ５又はその断片又は変異体である。ＨＩＶ Ｒ５菌株は、結合、及びマクロファージ及びＣＤ４＋Ｔ細胞への挿入に、細胞表面分子ＣＤ４及びＣＣＲ５を使用する。ＣＣＲ５は、４つの細胞外ドメイン：ＥＣＬ-１、ＥＣＬ-２、ＥＣＬ-３、及びＰＮｔと称される、細胞外間隙に暴露される３のループ及びＮ-末端配列を有する７回膜貫通型レセプターである。天然ＣＣＲ５リガンド、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１β及びそられの類似体は、ウイルス-コレセプターの相互作用をブロックし、さらにＣＣＲ５の内部移行を引き起こすことができる(Ledermanら, 2004, Science 306, p485)。ＣＣＲ５特異性自己抗体は、ＨＩＶに繰り返し暴露されているが、非感染のままである女性の１２．５％に見出されている(Lopalcoら, 2000, J. Immunology 164, 3426)。これらの抗体は、ＣＣＲ５の第一の細胞外ループ(ＥＣＬ-１)に結合し、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)のＲ５-向性ＨＩＶ感染を阻害可能であることが示されている。女性における同種異系免疫化により、インビトロでのＲ５-ＨＩＶ感染を阻害可能なＣＣＲ５特異的抗体が生じる(Wangら, 2002, Clin. Exp. Immunol. 129, 493)。
【００７６】
モノクローナルα-ＣＣＲ５抗体は、ＨＩＶ感染を防止することができる(Olsonら, 1999, J. Virol. 73, 4145；Wu及びLaRosaら, 1997, J. Exp. Med. 186, 1373)。小細胞外ループＥＣＬ-２(Ａｒｇ１６８-Ｔｈｒ１７７)に対応する環状ペプチドに結合する抗体は、ＨＩＶ-１ Ｒ５による感染を抑制する(Misumiら, 2001, J. Virol. 75, 11614)。直鎖状ＣＣＲ５ペプチド(Ｎ-末端、ＥＣＬ-１又はＥＣＬ-２配列)を用いて、サルを免疫化することにより生じる抗体は、インビトロでウイルス阻害効果を有する(Lehnerら, 2001, J. Immunology 166, 7446)。ＣＣＲ５のＮ-末端ドメインは、パピローマウイルス様粒子及び免疫化サルにおいて提示された。ウイルス量は少なく、急速に低下し、最終的には検査した５匹全てのサルにおいて検出不可能となった(Chackerianら, 2004, J. Virol. 78, 4037)が、６匹のコントロールマカクの半分においては、さらに血漿随伴ウイルスが検出不可能なレベルまで低下していた。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片を含むか又はそれからなる。ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は、少なくとも６又は７、好ましくは少なくとも８、９又は１０のアミノ酸を有し、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片は、３５未満、好ましくは３０未満、好ましくは２０未満、より好ましくは１５未満、さらに好ましくは１２未満のアミノ酸を有する。
【００７７】
好ましい一実施態様では、ＣＣＲ５細胞外ドメインの断片はＥＣＬ２Ａを含むか又はそれからなる。当該分野で一般的に理解されているように、ＥＣＬ２Ａは、好ましくはＥＣＬ２の第一のアミノ酸から出発し、好ましくはＥＣＬ２のシステイン直前にあるスレオニンで停止する。さらに好ましい一実施態様では、ＥＣＬ２Ａは配列番号：６２を含むか又はそれからなる。好ましい一実施態様では、ＥＣＬ２Ａは環化している。さらに好ましい実施態様では、環化ＥＣＬ２Ａは、配列番号：６２を含むか又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、ＥＣＬ-２Ａは、配列番号：６１のように環状ペプチドであり、ここでペプチドは、両端のＣ及びＧ残基により環化している。
好ましい一実施態様では、本発明の抗原は、ＣＣＲ５細胞外ドメインＰＮｔを含むか又はそれからなる。さらに好ましい一実施態様では、ＰＮｔドメインは、配列番号：６３を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【００７８】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ガストリン及び／又はプロガストリンである。ガストリン(Ｇ１７)は、結腸及び膵臓にかなり少ない量で含有される古典的な腸ペプチドホルモンの群である(Koh, Regulatory Peptides. 93, 37-44(2000))。ガストリンは前駆プロガストリン(Ｇ３４)からプロセシングされる。ガストリン及びプロゲスチンの双方は、Ｃ-末端グリシン-伸長形態、及びＣ-末端フェニルアラニンアミド化形態で存在する。
ガスチンは、胃酸分泌を刺激する能力についてよく知られている(Pharmacol Ther. 98, 109-127(2003))。ガストリンとして、Ｃ-末端テトラペプチドアミドを有する関連ホルモンコレシストキニン(ＣＣＫ)は十二指腸で合成され、膵酵素分泌の原因となるものである。アミド化Ｇ１７はＣＣＫ-２レセプターに結合するが、ＣＣＫはＣＣＫ-１レセプター及びＣＣＫ-２レセプターの双方に結合する(Steel. IDrugs. 5, 689-695(2002))。ガイシン(gaycine)-伸長ガストリンに対するレセプターは、不明瞭なままである。最近のデータは、ガストリンが、胃腸管の管の発育を促進する可能性があることを示唆している(Watson. Aliment Pharmacol Ther. 14, 1231-1247(2000))。これに対して、非アミド化ガストリンは、結腸粘膜成長を刺激し、結腸直腸癌形成における初期の段階を促進させ、結腸直腸癌を患っている患者の循環及び腫瘍において上昇する(Watson. Aliment Pharmacol Ther. 14, 1231-1247(2000))。
【００７９】
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｇ１７(配列番号：５０)を含むか、又は好ましくはそれからなる。さらなる好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｃ-末端に付加的なグリシンを有するＧ１７(配列番号：５１)を含むか又はそれからなる。またさらに好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、最後のアミノ酸Ｆがアミド化しているＧ１７を含むか、又は好ましくはそれからなる。好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はプロガストリンＧ３４(配列番号：５２)を含むか又はそれからなる。さらに好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、Ｃ-末端に付加的なグリシンを有するプロガストリンＧ３４(配列番号：５３)を含むか又はそれからなる。またさらに好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、最後のアミノ酸Ｆがアミド化しているプロガストリンＧ３４を含むか、又は好ましくはそれからなる。
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、好ましくはＣ-末端に融合したリンカー配列、さらに好ましくはＣ-末端に融合したリンカー配列ＳＳＰＰＰＰＣを有するＧ１７ １−９断片(配列番号：４９)を含むか又はそれからなる。
【００８０】
非常に好ましい一実施態様では、リンカーと融合した少なくとも一の抗原は、配列番号：５４のようなアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
ガストリン配列の一部として、配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥの１位にあるＥは、Ｅ、ｐｙｒｏＥ又はＱとすることができることを記しておく。付加的なアミノ酸がＥＧＰＷＬＥＥＥＥのＮ-末端に融合している場合、配列ＥＧＰＷＬＥＥＥＥの１位にあるＥは、Ｅ又は好ましくはＱとすることができる。
【００８１】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ５ａ又はその断片又は変異体である。７４-アミノ酸、４-ヘリックス束糖タンパク質であるＣ５ａ(Fernandez及びHugli, J. Biol. Chem. 253, 6955-6964, 1978)は、細胞系、特に好中球、内皮細胞、及びマクロファージに、局所的炎症を誘発させ、微生物感染に抗するための多種多様な効果を生じせしめる一因である(Ward P., Nat. Rev. Immunol. 4：133, 2004)。しかしながら、同様に、敗血症において過剰のＣ５ａが生じると、好中球では重篤な機能欠損に至る(Czermakら, Nat. Med. 5：788, 1999；Huber-Langら, J. Immunol. 166：1193, 2001)。また、活性が上昇したＣ５ａは、多数の原発性及び／又は慢性の炎症性疾患、例えば関節リウマチ(Jose P. Ann Rheum. Dis. 49：747, 1990)、乾癬(Takematsu H., Arch. Dermatol. 129：74, 1993)、成人呼吸促迫症候群(Langlois P., Heart Lung 18：71, 1989)、再灌流障害(Homeister, J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34：17, 1994)、ループス腎炎、及び類天疱瘡にも関連している。
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ５ａを含むか又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、Ｃ５ａタンパク質は、配列番号：５７のアミノ酸配列を有する。好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原はＣ５ａ断片を含むか又はそれからなる。さらに好ましい一実施態様では、Ｃ５ａ断片は、配列番号：５９のようなアミノ酸配列を有する。
【００８２】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＣＥＴＰ又はその断片又は変異体である。コレステリル-エステル転送タンパク質(ＣＥＴＰ)は、高密度リポタンパク質(ＨＤＬ)粒子とアポリポタンパクＢリッチ粒子、例えば超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)粒子又は低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)粒子の間での、コレステロールエステル(ＣＥ)とトリグリセリド(ＴＧ)の交換を媒介する血漿糖タンパク質である。ＣＥＴＰは、さらにリン脂質(ＰＬ)を転送する。ヒトＣＥＴＰ ｃＤＮＡは、４７６のアミノ酸でＭｒ５３０００のタンパク質をコードし、これが、グリコシル化によってＭｒ７４０００の糖タンパク質を生じる。
ＨＤＬは、ＨＤＬ-コレステロールレベルと冠動脈心疾患(ＣＨＤ)との間に、逆相関が観察される場合、抗-アテローム生成性であるとみなされる(Barter P.J. 及び Rye K.-A.(1996) Atherosclerosis 121：1-12)。これに対し、ＬＤＬとＶＬＤＬはアテローム生成誘発性リポタンパク質である。ヒトにおけるＣＥＴＰ欠損は、ＨＤＬ-ｃの増加、及びＬＤＬ-ｃの減少に関連しており、典型的には抗-アテローム生成性となる。メタボリックシンドロームを発症している患者は、低ＨＤＬ-ｃで、低密度ＬＤＬ粒子の濃縮フラクション、軽度から中程度の高トリグリセリド血症、軽度の高血圧、体幹肥満、及びインシュリン耐性を有し、特にＣＨＤの危険性がある。また、インシュリン非依存性糖尿病又は家族性複合型高脂血症を患っている患者も低ＨＤＬ-ｃを有しており、ＣＨＤの危険性がある(Barter P.J.及びRye K.-A.(1996) Atherosclerosis 121：1-12)。
【００８３】
好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、配列番号：６９のアミノ酸配列を有するＣＥＴＰ断片を含むか又はそれからなる。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ブラジキニン又はその断片又は変異体を含むか又はそれからなる。ブラジキニン(BK, KRPPGFSPFR, 配列番号：８０)は主要な血管拡張ペプチドであり、血圧、血流及び血管透過性の局所的調節において重要な役割を担っている(Margolius H.Sら, Hypertension, 1995)。さらに、平滑筋の収縮及び弛緩、痛覚及び痛覚過敏の誘発、及び炎症反応の媒介を含む、ブラジキニンのいくつかの他の生物学的活性が記載されている。ブラジキニンは、Ｂ２-レセプターを介して、その効果を奏する。
【００８４】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニン、その断片又は変異体を含むか又はそれからなる。ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ(ＫＲＰＰＧＦＳＰＦ、配列番号：８１)は、ブラジキニンと重複及び異なった機能の双方を有する。証拠は、ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫが組織傷害後に素早く生じ、血管拡張、血管透過性の増加、血漿滲出、細胞遊走、痛み及び痛覚過敏を含む、炎症プロセス中に観察されるほとんどの事象を調節することを示唆している(Calixto J.B.ら, Pain 2000)。Ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫは、Ｂ１-レセプターを介してその効果を奏する。
ＢＫ及びＤｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫは、いくつかの炎症性疾患においてある役割を担っていることが報告されている。例えば、滑膜線維芽細胞及び血清キニン生成増加において、Ｂ２及びＢ１-レセプターのアップレギュレーションが、抗原誘導性の慢性又は関節リウマチ(ＲＡ)において観察された(Cruwys S.C.ら, Br J Pharmacol, 1994；Cassim B.ら, Immunopharmacology 1997)。実験的証拠は、ＢＫ、ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫの双方が、喘息の発生中においてある役割を担っていることを示唆している(Christiansen S.C.ら, Am. Rev. Dis. 1992)。ＢＫ及びＤｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫは、原発性及び慢性の炎症性疾患、特に関節炎、及びアレルゲン又は粒子状アレルゲン、例えばウイルスにより誘発される気道炎症においてある役割を担っている。
【００８５】
さらに本発明は、ここに記載した抗原のミモトープを含む組成物を含む。本発明のワクチン組成物にミモトープを使用することについてのさらなる情報は、国際公開第０２／０５６９０５号の８３−８５頁に開示されており、出典明示によりここに援用する。
少なくとも一の抗原は、天然源から精製することにより、又はより好ましくは細菌発現系中で、最も好ましくは大腸菌系中で、好ましくは組換え発現させることにより、調製することができる。精製目的のために、本発明の抗原は、通常、タグ、例えばヒスチジンタグ、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ又は抗体の定常領域(Ｆｃ領域)を有する融合タンパク質として発現される。典型的には、必要ではないが、エンテロキナーゼ切断部位が、タグを切断可能なように、タグと抗原との間にある。他の好ましい実施態様では、５０以下のアミノ酸を有する少なくとも一の抗原は、化学的に合成される。
【００８６】
従来技術、例えば国際公開第０２／０５６９０５号、国際公開第０３／０３１４４６号、国際公開第０３／０３９２２５号、国際公開第０３／０４０１６４号、国際公開第０４／００９１１６号、国際公開第０４／００９１２４号、国際公開第０４／０１６２８２号、米国特許第６０／５６９３２２号、国際公開第０３／０３１４６６号、国際公開第２００４／００７５３８号、及び本発明による他の援用された参考文献に記載されているＶＬＰ-抗原抱合体は、発現から得られ、生じるため、ＶＬＰ中に所定量の宿主ＲＮＡを今だ含有していることを記しておく。他方、本発明において、本発明のＶＬＰ-抗原抱合体は、低減した、又は本質的には除去された量の宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を有する。
本発明の一実施態様では、本発明のＶＬＰ及び本発明の少なくとも一の抗原は、少なくとも一の第一及び少なくとも一の第二の付着部位を介して、すなわち少なくとも一のペプチド結合を介して融合している。このような融合は、例えばウイルス性コートタンパク質を有する本発明の少なくとも一の抗原、ウイルス様粒子の建築ブロックの融合によって、ここでは典型的には遺伝子操作により生じさせることができる。
【００８７】
本発明の抗原、好ましくは１００未満のアミノ酸、好ましくは８０未満のアミノ酸、より好ましくは６０未満のアミノ酸、さらに好ましくは４０未満、最も好ましくは２０未満のアミノ酸である抗原をコードする遺伝子は、ＶＬＰのコートタンパク質をコードしている遺伝子に、内部で、又は好ましくはＮ-もしくはＣ-末端で、読み枠を一致させて連結されている。また、融合は、ＶＬＰサブユニットの変異体に、抗原の配列を挿入することによっても生じ、ここで、該サブユニット配列の一部は欠失しており、それはさらに切断変異体とも呼ばれる。切断変異体は、ＶＬＰコートタンパク質の配列の一部のＮ-又はＣ-末端での、もしくは内部での欠失を有していてもよい。好ましくは、融合タンパク質は、電子顕微鏡により検査可能な、ＶＬＰの形成能力を保持している。
フランキングアミノ酸残基が付加されて、コートタンパク質と外来エピトープとの間の距離が増加させられる。グリシン及びセリン残基が、フランキング配列に使用される特に好ましいアミノ酸である。このようなフランキング配列により付加的な可撓性が付与され、ＶＬＰコートタンパク質の配列における外来配列の融合を不安定にさせる可能性のある影響を低減させ、外来エピトープの存在による集合化の妨害を低減させうる。
【００８８】
好ましい一実施態様では、修飾ＶＬＰはモザイクＶＬＰであり、ここで好ましくは該モザイクＶＬＰは、少なくとも一の融合タンパク質と少なくとも一のウイルスコートタンパク質を含むか、又はそれらからなる。
好ましい実施態様では、本発明の少なくとも一の抗原、好ましくは５０未満のアミノ酸からなる抗原は、多くのウイルスコートタンパク質、例えばＱβのＡ１タンパク質のＣ-末端切断形態に融合させるか(Kozlovska, T.Mら, Intervirology 39：9-15(1996))、又はＣＰ伸展の７２及び７３位の間に挿入することができる。例えば、Kozlovskaら(Intervirology, 39：9-15(1996))は、エピトープが１９位で切断されたＱβＣＰ伸長のＣ末端で融合しているＱβＡ１タンパク質融合体を記載している。他の例として、抗原はｆｒ ＣＰのアミノ酸２及び３の間に挿入可能であり、抗原-ｆｒ ＣＰ融合タンパク質に至る(Pushko Pら, Prot. Eng. 6：883-891(1993))。さらに、抗原は、ＲＮＡファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ-末端隆起β-ヘアピンに融合可能である(国際公開第９２／１３０８１号)。
【００８９】
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、ＡＰ２０５バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片のＮ-又はＣ-末端に融合している。さらに好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、スペーサーを介し、ＡＰ２０５のコートタンパク質、変異体又は断片のＮ-又はＣ-末端に融合している。一般的に、フレキシブルなスペーサーが好ましい。第一のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間のスペーサーの設計は、組換えＤＮＡ技術により達成される。本発明の特定の一実施態様では、スペーサーのアミノ酸配列は：(ａ)ＧＳＧＧ(配列番号：９２)；(ｂ)ＧＳＧ(配列番号：９３)；(ｃ)ＧＴＡＧＧＧＳＧ(配列番号：９４)；及び(ｄ)ＧＳＧＴＡＧＧＧＳＧＳ(配列番号：９５)からなる群から選択される。
本発明の好ましい一実施態様では、組成物は、少なくとも一の共有結合を介して、少なくとも一の第二の付着部位を有する少なくとも一の抗原に結合した、少なくとも一の第一の付着部位を有するウイルス様粒子を含むか、又はそれらから本質的になり、該共有結合は、好ましくは非ペプチド結合である。ＲＮＡファージのＶＬＰの典型的には固有の高度に反復し、組織化された構造は、有利には、好ましくは高度に規則化された反復アレイに本発明の抗原を提示する能力に寄与しており、これは本発明に開示されているように、配向され、定められた結合により、さらに確実となる。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様では、第一の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、又は好ましくは該基である。本発明の他の好ましい実施態様では、第二の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、又は好ましくは該基である。本発明の他の好ましい実施態様では、第二の付着部位は、少なくとも一の抗原に結合し、好ましくは共有結合しているマレイミド基を含むか、又は好ましくは該基である。
米国特許第５６９８４２４号には、キャプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。ついで、挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原タンパク質等として提示される。
【００９１】
しかしながら、キャプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、キャプシドのオリゴマー化に至りうることを我々は記す。さらに、ジスルフィド結合によるキャプシドと抗原タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、ジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一の第２の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらに、また本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、硫黄-硫黄結合を含まない。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、システインのスルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、スルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
【００９２】
本発明の非常に好ましい実施態様では、第一の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含むか、又は好ましくは該基であり、第二の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、又は好ましくは該基である。
本発明の好ましい一実施態様では、少なくとも一の抗原は、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましい第一の付着部位、すなわち、好ましくはＶＬＰのリジン残基(類)のアミノ基と反応可能な官能基と、本発明の抗原に生来的であるか又は人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくは第二の付着部位、すなわち、好ましくはシステイン(類)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(ピアス社(Pierce))、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばピアス・ケミカル社(Pierce Chemical Company)から入手可能な他の架橋剤が含まれる。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合を、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合を形成する。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時に抗原とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(ピアス社)が含まれる。
【００９３】
本発明の好ましい一実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。よって、いくつかの実施態様では、抗原における第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、第二の付着部位として適切なアミノ酸を含む、又はそれらからなるリンカーとの会合により達成される。よって、本発明の好ましい実施態様では、リンカーは少なくとも一の共有結合、好ましくは典型的には少なくとも一のペプチド結合により、抗原に会合している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含む又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
リンカーの選択は、抗原の性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。本発明のまた好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーは１０未満のアミノ酸を含む。リンカーの好ましい実施態様は：(ａ)ＣＧＧ(配列番号：９６)；(ｂ)Ｎ-末端ガンマ１-リンカー(例えばＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ、配列番号：９７)；(ｃ)Ｎ-末端ガンマ３-リンカー(例えばＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ、配列番号：４８)；(ｄ)Ｉｇヒンジ領域；(ｅ)Ｎ-末端グリシンリンカー(例えばＧＣＧＧＧＧ、配列番号：９８)；(ｆ)ｎ＝０-１２、ｋ＝０-５である(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｎ；(ｇ)Ｎ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するｎ＝１−３の(ＧＧＧＧＳ)ｎ(例えば配列番号：９９、ｎ＝１の実施態様に相当))；(ｈ)ｎ＝０-３、ｋ＝０-５、ｍ＝０-１０、ｌ＝０-２である(Ｇ)ｋＣ(Ｇ)ｍ(Ｓ)ｌ(ＧＧＧＧＳ)ｎ(例えば配列番号：１００、ｎ＝１、ｋ＝１、ｌ＝１及びｍ＝１の実施態様に相当)；(ｉ)ＧＧＣ；(ｋ)ＧＧＣ-ＮＨ２；(ｌ)Ｃ-末端ガンマ１-リンカー(例えばＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ、配列番号：１０１)；(ｍ)Ｃ-末端ガンマ３-リンカー(例えばＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ、配列番号：１０２)；(ｎ)Ｃ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ、配列番号：１０３)；(ｏ)ｎ＝０-１２及びｋ＝０-５である(Ｇ)ｎＣ(Ｇ)ｋ；(ｐ)Ｃ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するｎ＝１-３の(ＳＧＧＧＧ)ｎ(例えば配列番号：１０４、ｎ＝１の実施態様に相当))；(ｑ)ｎ＝０-３、ｋ＝０-５、ｍ＝０-１０、ｌ＝０-２及びｏ＝０-８である(Ｇ)ｍ(Ｓ)ｌ(ＧＧＧＧＳ)ｎ(Ｇ)ｏＣ(Ｇ)ｋ(例えば配列番号：１０５、ｎ＝１、ｋ＝１、ｌ＝１、ｏ＝１及びｍ＝１の実施態様に相当)からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、リンカーは抗原のＮ-末端に融合している。本発明の他の好ましい実施態様では、リンカーは抗原のＣ-末端に融合している。
【００９４】
この発明に係る好ましいリンカーは、第２付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号：１０６)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号：１０７)、ペプチドのＣ-末端にはＧＧＣＣ、ＧＧＣ又はＧＧＣ-ＮＨ２(「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端にはＣＧＧのリンカーにある。一般的に、グリシン残基は、第２付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。
本発明の他の実施態様では、リンカーは化学的相互作用、好ましくはペプチド結合ではない少なくとも一の共有結合により、本発明の抗原と結合する。
【００９５】
ＶＬＰに抗原を連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、ＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。本発明の抗原は、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(ピアス社)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、抗原をＶＬＰに結合させる。
好ましい一実施態様では、第一の付着部位は、スルフヒドリル基、さらに好ましくは、ＶＬＰを構成するか又はそれにより本質的になるコートタンパク質に天然に又は人工的に付加されるスルフヒドリル基を含むか又は好ましくは該基である。第二の付着部位は、抗原に化学的に会合し、好ましくは抗原に共有的に結合し、より好ましくは抗原のアミノ基に共有的に結合し、さらに好ましくは抗原のＮ-末端アミノ酸のアミノ基と、リンカーのＮＨＳ-エステル基により共有的に結合する、ＳＭＰＨ(スクシンイミジル-６-[β-マレイミドプロピオンアミド]ヘキサノアート)又はＭＢＳ(ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル)等の、リンカーのマレイミド基である。好ましい一実施態様では、抗原、好ましくは７０以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは３０以下のアミノ酸の抗原は、好ましくは化学的に合成され、マレイミド基は、好ましくはＮ-末端アミノ酸のアミノ基に結合している。第一の付着部位及び第二の付着部位は、チオ-エーテル結合を介して結合している。
【００９６】
組成物の好ましい一実施態様では、第一の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、又は好ましくは該基であり、第二の付着部位は、マレイミド基を含むか、又は好ましくは該基である。第一の結合部位であるリジンのアミノ基は、天然に生じたものであってもよいし、コートタンパク質に人工的に付加されたものであってもよい。好ましくは、第二の付着部位は、上の段落で詳述されたようなリンカーの基である。ＶＬＰのアミノ基は、ヘテロ二官能性架橋剤、例えばＮ-スクシンイミジル-Ｓ-アセチルチオアセタート(ＳＡＴＡ)又は２-イミノチオランにより、スルフヒドリル基に誘導体化され、これがついでリンカーのマレイミド基と反応する。
少なくとも一のマレイミド基を有する好ましいリンカーは、例えばＳＭＰＨ、スルホ-ＭＢＳである。さらに好ましいリンカーは、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばピアス・ケミカル社から入手可能な他の架橋剤で、スルフヒドリル基と反応性のある一の官能基と、アミノ基と反応性のある一の官能基を有するものである。
【００９７】
本発明の他の実施態様では、ＶＬＰと本発明の少なくとも一の抗原は、化学的相互作用によって結合しており、ここで、これらの化学的相互作用の少なくとも一は共有結合ではない。抗原へのＶＬＰの結合は、ＶＬＰのビオチン化、及びストレプタビジン-融合タンパク質としての抗原の発現により、達成することができる。また、抗原とＶＬＰの双方は、例えば国際公開第００／２３９５５号に記載されているようにしてビオチン化される。他の結合対、例えばリガンド-レセプター、抗原-抗体も、ビオチン-アビジンと同様の形で、カップリング試薬として使用することができる。
一側面では、本発明は、本発明の組成物を含むワクチン組成物を提供する。好ましくはワクチン組成物は、適切なバッファーをさらに含む。ワクチン組成物中のＶＬＰに結合する抗原は、動物、好ましくは哺乳動物又はヒト由来のものであってよい。好ましい実施態様では、抗原は、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ、又はウマ由来のものであってよい。
【００９８】
好ましい一実施態様では、ワクチン組成物は、少なくとも一のアジュバントをさらに含有する。ここで、少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与前、投与と同時、又は投与後になされうる。少なくとも一のアジュバントの具体例は、アルミニウム塩、モノホスホリル脂質Ａ(ＭＰＬ)、不完全フロイントアジュバント(ＩＦＡ)である。アジュバントは、局所的抗原デポーの形成を誘導する。
他の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを欠く。本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。さらにアジュバントを含んでいないので、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する所望されない炎症性Ｔ細胞反応の発生が最小となる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。
【００９９】
本発明は、本発明のワクチンを動物又はヒトに投与することを含んでなる免疫化方法を開示する。動物は、好ましくは哺乳動物、例えばネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、特にヒトである。ワクチンは、当該分野で知られている様々な方法により、動物又はヒトに投与することができるが、一般には、注射、注入、吸入、経口投与、又は他の適切な物理的方法により投与される。また、抱合体は、筋肉内、静脈内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、又は皮下投与することができる。投与のための抱合体の成分は、滅菌水(例えば生理的食塩水)又は非水溶液及び懸濁液を含む。非水性溶媒の具体例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えばオリブ油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。担体又は閉鎖包帯を、皮膚透過性を増加させ、抗原吸収を高めるために使用することができる。
本発明のワクチンは、それらの投与がレシピエント個体にとって許容可能ならば、「製薬的に許容可能である」と言える。さらに、本発明のワクチンは「治療的有効量」(すなわち、所望する生理学的効果を生じる量)で投与されるであろう。免疫応答の性質及びタイプは、この開示の制限要因ではない。以下の機序の説明により本発明を制限することを意図するものではないが、本発明のワクチンは本発明の抗原に結合し、よってその濃度を低下させ、及び／又はその生理学的又は病理学的機能に干渉する抗体を誘導する。
【０１００】
一実施態様では、本発明は、薬学的組成物及び許容可能な製薬用担体を提供する。本発明のワクチンが個人に投与される場合、それは、塩、バッファー、アジュバント、又は抱合体の効能を改善するのに望ましい他の物質を含む形態であってもよい。薬学的組成物の調製での使用に適した物質の具体例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol, A編, Mack Publishing Co.(1990))を含む多くの出典において提供される。
本発明は、疾患又は病状を治療及び／又は緩和させるための本発明の組成物の使用方法を提供するものであり、本発明の少なくとも一の抗原は、動物又はヒトにおいて重要な病理学的機能をなす。
他の側面では、本発明は、動物又はヒトにおける疾患の治療のための医薬の製造における、本発明の組成物の使用を提供するものであり、本発明の少なくとも一の抗原は、重要な病理学的機能をなす。
【実施例】
【０１０１】
便宜上、「従来のＶＬＰ」及び「本発明のＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「従来のＱβ ＶＬＰ」、「本発明のＱβ ＶＬＰ」、「従来のＡＰ２０５ＶＬＰ」及び「本発明のＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、特に実施例の項目及び図の短い説明文において用いられる。実施例の項目で用いられる「従来のＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「従来のＱβ ＶＬＰ」、「従来のＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、国際公開公報02/056905、国際公開公報04/007538、又は特に本出願の実施例１に記載のように、大腸菌から組み換えて発現させ、その後精製して得たＶＬＰを指す。実施例の項目で用いられる「本発明のＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「本発明のＱβ ＶＬＰ」、「本発明のＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、本発明によるＶＬＰ、特に本発明の方法によって得られるＶＬＰを指す。さらに、便宜上、「再構築(再構築された)ＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「再構築(再構築された)Ｑβ ＶＬＰ」、「再構築(再構築された)ＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、典型的かつ好ましくは、請求項３５、３７、３９又は４１に記載の本発明の方法によって得られるＶＬＰを指すためにこの実施例の項目で用いる。さらに、「ＲＮアーゼ処理ＶＬＰ」並びにより具体的な用語である「ＲＮアーゼ処理Ｑβ ＶＬＰ」、「ＲＮアーゼ処理ＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、典型的かつ好ましくは、請求項４３に記載の本発明の方法によって得られるＶＬＰを指すためにこの実施例の項目で用いる。よりさらには、「金属イオン処理ＶＬＰ」なる用語並びにより具体的な用語である「金属イオン処理Ｑβ ＶＬＰ」、「金属イオン処理ＡＰ２０５ＶＬＰ」などは、典型的かつ好ましくは、請求項４４に記載の本発明の方法によって得られるＶＬＰを指すためにこの実施例の項目で用いる。
【０１０２】
実施例１  Ｑβコートタンパク質の発現と結果として生じた従来のＱβ ＶＬＰの精製
大腸菌ＪＭ１０９をＱβコートタンパク質を発現するプラスミドにて形質転換させた。２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ液体培地にＱβコートタンパク質を発現するプラスミドで形質転換させたクローンを播種した。播種した培養物を振とうしないで37℃で16−24時間培養した。その後、この培養物を２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１００−３００ｍｌの新鮮ＬＢ培地にて１：１００に希釈し、振とうしないで３７℃で終夜培養した。結果として生じた二次種菌を、１％カザミノ酸と０．２％グルコースを含有するＭ９培地にてフラスコ内で１：５０に希釈し、振とうしながら３７℃で終夜インキュベートした。細胞を遠心してペレット状にし、凍結して貯蔵した。
【０１０３】
精製
精製手順のための精製溶液とバッファ：
１. 溶解緩衝液ＬＢ
リゾチーム及びＤＮアーゼを含まない５μｇ／ｍｌの濃度の５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ トリトンＸ１００及び新たに調製されたＰＭＳＦを含む５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ ｐＨ８．０。
２. 水で飽和した硫酸アンモニウム(ＳＡＳ)
３. バッファＮＥＴ
５ｍＭ ＥＤＴＡ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス-ＨＣｌ ｐＨ７．８。
４. ＰＥＧ
ＮＥＴ中、４０％(ｗ／ｖ) ポリエチレングリコール６０００
破壊と溶解
凍結細胞を２ｍｌ／ｇ細胞の濃度でＬＢに懸濁した。混合液を２２ｋＨの超音波にて１５秒間、５回処理した。各処理の間は氷上に１分間置いて溶液を冷やした。次いで、溶解物を、Janecki K60ローターを用いて１４０００ｒｐｍにて１時間遠心した。特に言及しなければ、以下に記載の遠心工程を同じローターを用いてすべて行った。上清を４℃に保存し、細胞細片を２回ＬＢで洗浄した。遠心後、溶解物の上清と洗浄分画をプールした。
【０１０４】
分画
飽和した硫酸アンモニウム溶液を、上記のプールされた溶解物に撹拌しながら液滴した。ＳＡＳの容量は総容積の１／５に調整し、２０％飽和させた。溶液を終夜放置し、翌日に１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心した。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムにて洗浄し、再び遠心した。得られた上清をプールし、ＳＡＳを液滴して４０％飽和させた。溶液を終夜放置し、翌日に１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心した。得られたペレットは、ＮＥＴバッファにて溶解した。
クロマトグラフィ
ＮＥＴバッファに溶解させたＶＬＰタンパク質又はキャプシドをセファロースＣＬ-４Ｂカラムに流した。クロマトグラフィにて３つのピークが得られた。第一のピークには、主に膜及び膜断片が含まれており、回収しなかった。第二のピークにはＶＬＰが含まれており、第三のピークには他の大腸菌タンパク質が含まれている。
ピークの分画をプールし、ＮａＣｌ濃度を０．６５Ｍの終濃度に調整した。プールされたピークの分画の半分に相当する量のＰＥＧ溶液を撹拌しながら液滴した。溶液は撹拌しないで終夜放置した。キャプシドタンパク質は、１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心することによって沈殿させた。次いで、最少量のＮＥＴに溶解し、セファロースＣＬ-４Ｂカラムに流した。ピークの分画をプールし、６０％飽和(ｗ／ｖ)の硫酸アンモニウムにて沈殿させた。遠心してＮＥＴバッファに溶解させた後、キャプシドタンパク質を再クロマトグラフィのためにセファロースＣＬ-６Ｂカラムに流した。
透析及び乾燥
上記で得られたピークの分画をプールし、滅菌水にて大規模に透析し、凍結乾燥させて保存した。
【０１０５】
実施例２  従来のＱβ ＶＬＰに被包させたＲＮＡのＲＮアーゼＡによる加水分解
０．２×ＨＢＳ(４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４)に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む従来のＱβ ＶＬＰを、終濃度３００μｇ／ｍｌで添加したＲＮアーゼＡ(Qiagen AG, Switzerland)にて消化した。試料を６５０ｒｐｍのサーモミキサー中で３７℃で３時間インキュベートした。次いで、試料を３０００００分子量カットオフメンブランに０．２ＨＢＳバッファを用いて１回バッファ交換をして終夜透析した。同じ処理単位(バッチ)による適切な割合の従来のＱβ ＶＬＰをＲＮアーゼＡで処理しないで、後の手順でＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するために取っておいた。
【０１０６】
ＶＬＰ内に残る二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するために、ＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰとＲＮアーゼＡで処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰの等量(重量)を、ＲＮＡ、好ましくは核酸の二次構造に入り込むエチジウムブロマイド(典型的に好ましくは、０．５μｇ／ｍｌの濃度)を含有する１％アガロースゲルに流した。等量の流したＶＬＰを、典型的に好ましくはAlbumin(PIERCE)を標準物質として用いた製品(BIO-RAD)による標準的なプロトコールに従ったBradfordアッセイによって、ＲＮアーゼＡで処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰとＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰのタンパク質濃度を、同じ実験で測定することによって明らかにした。本明細書中で用いる「等量」は、ゲルに流したＲＮアーゼ処理ＶＬＰ、好ましくはＲＮアーゼＡ処理ＶＬＰ、さらにより好ましくはＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰの量が、ゲルに流した従来のＶＬＰ、好ましくは従来のＱβ ＶＬＰと５％より大きく、好ましくは３％より大きく、さらにより好ましくは１％より大きく変わらないことを意味する。典型的に好ましくは１時間、典型的に好ましくは８０Ｖで電気泳動した後、Sambrook, J. 等, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及び特にその６．１５章及び６．１９章に記載のように、典型的に好ましくはゲルをＵＶ光に曝した。ＲＮＡの量はＲＮＡ内に入り込んだエチジウムブロマイドの蛍光強度によって示された。ＲＮアーゼＡで処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰは、強い蛍光強度を示したのに対して、ＲＮアーゼＡ処理ＶＬＰの強度は非常に小さかった。濃度測定器(Kodak 1D Scientific Imaging System)による蛍光強度の量により、ＲＮアーゼＡ処理ＶＬＰに含有される二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸は、ＲＮアーゼＡで処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰにより含有される二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸の量の１０％より少ない(様々な実験により３−９％の値となった)ことが示された(図１)。
従来のＱβ ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡの量は、実施例１７に記載される方法によって測定されるように、３００μｇ／ＶＬＰｍｇであると、ＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰ内に残る二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸の量は３０μｇ／ＶＬＰｍｇより少ない(又は様々な実験では９−２７μｇ／ＶＬＰｍｇに相当)となった。
【０１０７】
実施例３  ＶＬＰのＲＮＡ含量の非酵素的加水分解
ＶＬＰの核酸含量のＺｎＳＯ４依存性分解：
従来のＱβ ＶＬＰ(０．２×ＨＢＳバッファ中に１．０ｍｇ／ｍｌ)を２．５ｍＭ ＺｎＳＯ４の存在下にて６０℃で２４時間インキュベートした。結果として生じた試料を３０００００分子量カットオフメンブランに０．２ＨＢＳバッファを用いて１回バッファ交換をして終夜透析した。同じ処理単位(バッチ)による適切な割合の従来のＱβ ＶＬＰをＺｎＳＯ４で処理しないで、後の手順でＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するために取っておいた。
【０１０８】
ＶＬＰ内に残る二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定するために、ＺｎＳＯ４処理Ｑβ ＶＬＰとＺｎＳＯ４で処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰの等量(重量)を、ＲＮＡ、好ましくは核酸の二次構造に入り込むエチジウムブロマイド(典型的に好ましくは、０．５μｇ／ｍｌの濃度)を含有する１％アガロースゲルに流した。等量の流したＶＬＰを、典型的に好ましくはAlbumin (PIERCE)を標準物質として用いた製品(BIO-RAD)による標準的なプロトコールに従ったBradfordアッセイによって、ＺｎＳＯ４で処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰとＺｎＳＯ４処理Ｑβ ＶＬＰのタンパク質濃度を、同じ実験で測定することによって明らかにした。本明細書中で用いる「等量」は、ゲルに流したＺｎＳＯ４処理ＶＬＰ、好ましくはＺｎＳＯ４処理Ｑβ ＶＬＰの量が、ゲルに流した従来のＶＬＰ、好ましくは従来のＱβ ＶＬＰと５％より大きく、好ましくは３％より大きく、さらにより好ましくは１％より大きく変わらないことを意味する。典型的に好ましくは１時間、典型的に好ましくは８０Ｖで電気泳動した後、Sambrook, J. 等, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及び特にその６．１５章及び６．１９章に記載のように、典型的に好ましくはゲルをＵＶ光に曝した。ＲＮＡの量はＲＮＡ内に入り込んだエチジウムブロマイドの蛍光強度によって示された。ＺｎＳＯ４で処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰは強い蛍光強度を示したのに対して、ＺｎＳＯ４処理ＶＬＰの強度は非常に小さかった。濃度測定器(Kodak 1D Scientific Imaging System)による蛍光強度の量により、ＺｎＳＯ４処理ＶＬＰに結合した二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸は、ＺｎＳＯ４で処理しなかった従来のＱβ ＶＬＰに結合した二次構造を有するＲＮＡ、好ましくは核酸の量の９％であったことが示された。
従来のＱβ ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡの量は、実施例１７に記載される方法によって測定されるように、３００μｇ／ＶＬＰｍｇであると、ＺｎＳＯ４処理Ｑβ ＶＬＰ内に残る二次構造を有するＲＮＡの量は２７μｇ／ＶＬＰｍｇとなった。
【０１０９】
実施例４  結果として再構築Ｑβ ＶＬＰが生じる、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下における分解／再構築による本発明のＱβ ＶＬＰの調整
(A) 従来のＱβ ＶＬＰの分解
大腸菌溶解物から精製される４５ｍｇの従来のＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、Bradford分析によって測定)を含むＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を１０ｍＭ ＤＴＴにて還元して、撹拌しながら室温に１５分間置いた。次いで、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度まで添加し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートを続け、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡの沈殿を得た。溶液から沈殿されたＲＮＡを取り除くために、溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した(Eppendorf 5810 R、以下のすべての工程で固定角ローターA-4-62を用いた)。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含有する上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
【０１１０】
(B) 陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質および残渣の宿主細胞ＲＮＡを含有する分解反応の上清を水で１：１５に希釈し、１０ｍｓ／ｃｍ以下の伝導率を調整し、ＳＰ-セファロースＦＦカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に流した。カラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７にて予め平衡化した。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムの勾配法により溶出させ、タンパク質は約２５ｍｌの分画容量に回収した。室温で５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をモニターした。
第二工程では、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)をセファクリルＳ-１００ＨＲカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に流し(２列)、２０ｍｍ リン酸ナトリウム／２５０ｍｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．５にて平衡化した。室温で２．５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
【０１１１】
(C1) 透析によるＱβ ＶＬＰの再構築
精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に２．２ｍｇ／ｍｌ)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)及びＤＴＴ(Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、それぞれ終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ)を、３．５ｋＤａのカットオフのメンブランを用いて２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りであったポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、硫酸デキストラン(MW 5000及び10000, Sigma)、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸(MW 11000及び33400, Sigma)、ポリ-Ｌ-グルタミン酸(MW 3000、13600及び84600, Sigma)、及びパン酵母と小麦麦芽由来のｔＲＮＡ。
(C2) 透析濾過(ダイアフィルトレーション)によるＱβ ＶＬＰの再構築
３３ｍｌの精製されたＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１．５ｍｇ／ｍｌ)を、Ｈ２Ｏ及び尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)、ＮａＣｌ(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)及びポリ-Ｌ-グルタミン酸(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 84600)と混合した。混合物の容量は５０ｍｌであり、成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．０Ｍ 尿素及び０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ-Ｌ-グルタミン酸であった。次いで、混合物を室温で、５００ｍｌの２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析濾過した。この透析濾過は、１０ｍｌ／分の交差流速と２．５ｍｌ／分の透過流速で、Pellicon XL薄膜カートリッジ(Biomax 5K, Millipore)を用いた正接流量濾過装置(tangential flow filtration apparatus)にて行った。
【０１１２】
再構築Ｑβ-ＶＬＰの分析
(D1) Ｑβ-ＶＬＰにおけるジスルフィド結合の形成
実施例４(C1)及び(C2)に記載のように、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下にて再構築Ｑβ-ＶＬＰを、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、従来のＱβ ＶＬＰと比較した。再構築Ｑβ-ＶＬＰは、コートタンパク質のジスルフィド結合された五量体型及び六量体型のバンドを示すことから、従来のＱβ ＶＬＰと同様に、再構築Ｑβ ＶＬＰにおいて、コートタンパク質単位が適切に構造的に配位していることが示唆された(図２)。
(D2) 分析的サイズ排除クロマトグラフィによる異なるポリ陰イオン性高分子の存在下において、再構築されるＱβ ＶＬＰの水力学的なサイズ
実施例４(C1)及び(C2)に記載のように、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下にて再構築Ｑβ-ＶＬＰ試料を、分析的サイズ排除クロマトグラフィにて分析し、従来のＱβ ＶＬＰと比較した。再構築Ｑβ ＶＬＰは従来のＱβ ＶＬＰを示すピークと同じ滞留時間で移動するピークを示したことから、再構築ＶＬＰの全体のサイズと構造は従来のＶＬＰと同じであることが示唆された。
【０１１３】
実施例５  ＡＰ２０５ ＶＬＰのインビトロ構築(アセンブリ)
(A) ＡＰ２０５コートタンパク質の精製
分解：２０ｍｌのＡＰ２０５ ＶＬＰ溶液(ＰＢＳ中に１．６ｍｇ／ｍｌ、大腸菌抽出物から精製)を、０．２ｍｌの０．５Ｍ ＤＴＴと混合し、室温で３０分間インキュベートした。５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加して、次いで混合物を６０℃で１５分間インキュベートし、ＤＴＴ還元コートタンパク質の沈殿を得た。混濁した混合物を遠心分離し(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)、上清を廃棄し、ペレットを、２０ｍｌの１Ｍ 尿素／２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ３．２に播種した。室温で３０分間撹拌した後、１．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を加えることによって、ｐＨ６．５にばらつきを調整し、その後二量体コートタンパク質を含む上清を得るために遠心分離した(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)。
陽イオン交換クロマトグラフィ：上清(上記参照)を２０ｍｌの水で希釈して、約５ｍＳ／ｃｍの伝導率を調整した。結果として生じた溶液を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５バッファにて予め平衡化した６ｍｌのＳＰセファロースＦＦ (Amersham Bioscience)のカラムに流した。流した後、カラムを４８ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５のバッファにて洗浄し、その後、２０倍のカラム容量の１Ｍ ＮａＣｌへの比例勾配により結合したコートタンパク質を溶出した。メインピークの分画をプールし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびＵＶ分光法にて分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによると、単離されたコートタンパク質は基本的に他のタンパク質混入がなく純粋であった。ＵＶ分光法によると、タンパク質濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ(総量１２ｍｇ)であり、１Ａ２８０単位はＡＰ２０５コートタンパク質の１．０１ｍｇ／ｍｌを表す。さらに、Ａ２６０(０．２９１)の値に対してＡ２８０(０．５９９９)の値は２であることから、調製物は本質的に核酸を欠いていることが示唆される。
【０１１４】
(B) ＡＰ２０５ ＶＬＰの構築
任意のポリ陰イオン性高分子のない条件下における構築：上記で溶出されたタンパク質分画を透析濾過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５にて１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にまでＴＦＦによって、濃縮した。その溶液の５００ｍｌを、５０ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、室温で４８時間インキュベートした。混合物中での再構築ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥに及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された(図５Ａ)。２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて平衡化したTSKgel G5000 PWXLカラム(Tosoh Bioscience)をＨＰＬＣ分析に用いた。
ポリグルタミン酸存在下における構築：３７５ｍｌの精製されたＡＰ２０５コートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に１ｍｇ／ｍｌ)を、５０ｍｌのＮａＣｌ貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)、５０ｍｌのポリグルタミン酸貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 86400, Sigma)及び２５ｍｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を室温にて４８時間インキュベートした。混合物中における再構築ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された(図５Ｂ)。混合物中のコートタンパク質がＶＬＰ内にほぼ完全に組み込まれたことから、任意のポリ陰イオン性高分子がない条件下で構築されたＡＰ２０５コートタンパク質より効率よく、多く構築されたことが示された(図５Ａ)。
【０１１５】
実施例６  ポリ陰イオン性高分子の存在下における再構築ｆｒＶＬＰ又は再構築ＧＡの調整
実施例１及び４に開示したのと同じ実験条件で、大腸菌において、従来のｆｒ又はＧＡ ＶＬＰを組み換えて産生し、これらＶＬＰを精製して分解し、得られた対応するＲＮＡファージのコートタンパク質を精製した。次いで、同じ実験条件で、再構築ｆｒＶＬＰ又は再構築ＧＡ ＶＬＰ内にコートタンパク質を再構築した。
【０１１６】
実施例７  従来のＱβ ＶＬＰおよび本発明のＱβ ＶＬＰへのニコチン誘導体のカップリング
ＶＬＰへの結合に適切なニコチン誘導体は、Langone 等 (1982, 上掲)に従って合成した。トランス-4'-カルボキシコチニンは市販されている。トランス-4'-カルボキシコチニンのメチルエステルは、メタノール硫酸を有するトランス-4'-カルボキシコチニンを反応させることによって、産生した。溶液は重炭酸ナトリウムで中和し、クロロホルムにて抽出し、回転乾燥機にて濃縮し、エーテル-アセトンから再結晶した。次いで、エーテルの水素化アルミニウムリチウムにてメチルエステルを還元してトランス-3'-ヒドロキシメチルニコチンを生産した。次いで、ベンゼンに無水コハク酸を添加してＯ'-サクシニル-ヒドロキシメチルニコチンを産生した。溶液を回転乾燥機にて濃縮した。Ｏ'-サクシニル-ヒドロキシメチルニコチン(以下「Ｓｕｃ-Ｎｉｃ」と略す)のＮ-ヒドロキシサクシンイミドエステルが生じるＥＤＣ(１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド)及びＮ-ヒドロキシサクシンイミド(ＮＨＳ)の添加によって、カルボキシル基が活性化される。
従来のＱβ ＶＬＰ及び図３に示すように異なるポリ陰イオン性高分子の存在下で再構築Ｑβ ＶＬＰである本発明のＱβ ＶＬＰ(ＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰを含む)は、Ｈｅｐｅｓ-緩衝食塩水ＨＢＳ(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０)にて透析した。ニコチン誘導体Ｓｕｃ-Ｎｉｃを、１２１ｍＭの濃度でＨＢＳに溶解した。１×、５×、５０×、１００×および５００×モル過剰の異なるＱβ ＶＬＰ溶液(０．１４ｍＭ)に加え、振とう器上で室温で２時間インキュベートした。次いで、反応溶液をＨＢＳ、ｐＨ８．０(１００００ダルトンのカットオフ)にて透析して、液体窒素にて急速に凍結して、−８０℃で保存した。ニコチン誘導体ｓｕｃ-ｎｉｃを、アミド結合の形成下にてＱβの表面上のリジンと反応させた。結果として生じた共有複合体は、本明細書中で「従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃ」および「本発明Ｑβ ＶＬＰ-Ｎｉｃ」とそれぞれ称する。
【０１１７】
実施例８  特異的抗体応答を誘導する本発明のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃ
(A) マウスの免疫化
７−８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをそれぞれ６０μｇの従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃと本発明のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃワクチンにて２回予防接種した。このときのニコチン誘導体はＳｕｃ-Ｎｉｃとした。このワクチンは２００μｌの滅菌ＰＢＳにて希釈して、左右の鼠径部に皮下投与した。初めの免疫化から１４日後にマウスを追加免疫した。第１４日目(追加免疫前)と第２１日目(追加免疫から７日後)の血清を採取した。血清中のニコチン特異的抗体をＥＬＩＳＡによって、測定した。
【０１１８】
(B) ＥＬＩＳＡ
５μｇ／ｍｌのＢＳＡに結合したニコチン(BSA-NicB01)を含有するＰＢＳ(ｐＨ７．３−７．７)にてマイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を終夜コートした。洗浄して(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ)、２％ＢＳＡを含むＰＢＳにてブロックした後、２％ＢＳＡ／１％ＦＣＳ／ＰＢＳにて様々に希釈した血清を添加した。ＩｇＥの検出のために、プロテインＧビーズ(Pharmacia)とともにインキュベートすることによって、ＩｇＧから血清を枯渇させた。室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄して、マウスＩｇＧ(ヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)、Jackson ImmunoResearch)、ＩｇＧ１(ウサギ抗マウスＩｇＧ１、Zymed)、ＩｇＧ２ａ(ラット抗マウスＩｇＧ２ａ、Pharmingen)及びＩｇＥ(ヤギ抗マウスＩｇＥ)に特異的なＨＲＰ-標識抗体を加えた。１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、製造業者の指示に従って、色彩基質ＯＰＤ(Fluka)を含有するクエン酸バッファを加えた。５分後に、５％Ｈ２ＳＯ４にて色彩反応を止めた。４５０ｎｍの光学濃度を、ＥＬＩＳＡ読み取り機 (Benchmark, Biorad)にて読み取った。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡにおいて、最大半量の光学濃度シグナル(ＯＤ５０％)を示す血清の相互希釈物として求められた。
すべての本発明のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃワクチンは、従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃワクチンにより誘導される抗体価と同等のレベルに、ニコチン-特異的抗体を誘導した。(図３)。１グループ当たり３匹のマウスの血清プールのＥＬＩＳＡ力価を、第１４日目及び第２１日目で総ＩｇＧ応答について測定した。図３に示すように、第２１日目の本発明のワクチンのＱβ ＶＬＰ-ＮｉｃのＩｇＧ力価は、従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃワクチンの力価と同じであった。
【０１１９】
図４は、ＥＬＩＳＡで測定される第２１日目でのサブクラスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗ニコチン力価を示す。従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃは、高いＩｇＧ２ａ力価で免疫応答のＴｈ１タイプを誘導した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価の比率はおよそ０．５であった。ＲＮアーゼ処理されたＱβ ＶＬＰ-ＮｉｃはＩｇＧ１力価に作用しなかったが、ＩｇＧ２ａ力価を大幅に減らし、その結果０．００６の比となった。また全体の抗体力価は従来のＶＬＰと比較して減少していた。従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃと比較して、再構築Ｑβ ＶＬＰ-Ｎｉｃワクチンにより、ＩｇＧ１は高いがＩｇＧ２ａは低い力価が誘導された。これはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価の比が０．０３５未満であることにより示され、このことからＴｈ２型応答が従来より大きいことが示唆される。しかしながら、より多くのＴｈ２応答にもかかわらず、ＩｇＥは、再構築Ｑβ ＶＬＰ-Ｎｉｃで予防接種された血清において検出されなかった。同様に、ＩｇＥは、従来のＱβ ＶＬＰ-Ｎｉｃにてワクチン接種を受けた血清において検出されなかった。
このデータから、再構築Ｑβ ＶＬＰ-Ｎｉｃは高い免疫原性を保持しているが、免疫応答がＩｇＥ産生を誘導することなくより多くのＴｈ２タイプ応答変化に移行していることが示された。
【０１２０】
実施例９  再構築Ｑβ ＶＬＰへのＧｎＲＨペプチドのカップリング
カップリングのための付着部位としてのシステインにより又は２つのグリシン残基と付着部位としてのシステイン残基により伸展された、ＧｎＲＨ(配列番号：１)のアミノ酸１−１０を含んでなる以下のペプチド類似体を化学的に合成した：
CGG-GnRH  CGGEHWSYGLRPG-NH2  (配列番号：２)
GnRH-GGC  pEHWSYGLRPGGGC  (配列番号：３)
C-GnRH    CEHWSYGLRPG-NH2  (配列番号：４)
GnRH-C    pEHWSYGLRPGC  (配列番号：５)
ペプチドは、後述のように再構築Ｑβ ＶＬＰにカップリングした。
組み換えて産生した再構築Ｑβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌ)を２５℃の２０倍モル過剰のＳＭＰＨ(ＤＭＳＯ中に１００ｍＭ, Pierce)を含む５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２中に３０分間置いて誘導体化することによって、CGG-GnRH(配列番号：２)を高い効率でカップリングした(＞９０％の単量体が少なくとも１ペプチドを有する)。
その後、反応しなかったＳＭＰＨを除去するために10.000 MWCO透析管を用いて４℃の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２に対して２時間、２回透析した。７倍モル過剰のＧｎＲＨペプチド(ＤＭＳＯ中に５ｍＭ)を加えて、サーモミキサー中で２５℃で２時間反応させた。カップリングしなかったペプチドを取り除くために、反応物を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて終夜透析した。
【０１２１】
再構築Ｑβ ＶＬＰ(１ｍｇ／ｍｌ)を２５℃の１８倍モル過剰なＳＭＰＨを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２中に３０分間置いて誘導体化することによって、ペプチドCGG-GnRH (配列番号: 2)及びGnRH-GGC (配列番号: 3)を中程度の効率でカップリングした(８２％の単量体が少なくとも１ペプチドを有する)。次いで、反応物を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて透析して、サーモシェーカーにて２５℃で２時間インキュベートすることによって、１０倍モル過剰のＧｎＲＨペプチド(ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ)とカップリングさせた。再構築Ｑβ ＶＬＰ(２．８ｍｇ／ｍｌ)を２５℃の２０倍モル過剰なＳＭＰＨ (ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ)を含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２中に３０分間置いて誘導体化した後に２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて終夜透析することによって、ペプチドC-GnRH(配列番号：４)及びGnRH-C(配列番号：５)のカップリングを行った。その後、７倍及び２．５倍モル過剰のペプチド(ＤＭＳＯ中に５ｍＭ)をそれぞれ２５℃で２時間サーモシェーカーにてインキュベートすることによって、高い(＞９０％)及び低い(６０−７１％)効率でカップリングした。カップリングしなかったペプチドを取り除くために、反応物を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて終夜透析した。Ｑβ-ＧｎＲＨカップリング産物を遠心して、上清を還元条件下のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルにて分析した。Ｑβ-ＧｎＲＨカップリング産物は、カップリングに用いたそれぞれのペプチド(配列番号：２、３、４および５)に従ってＱβ-CGG-ＧｎＲＨ、ＧｎＲＨ-GGC-Ｑβ、Ｑβ-C-ＧｎＲＨ及びＧｎＲＨ-C-Ｑβと称した。
【０１２２】
実施例１０  本発明のＶＬＰへのヒトＩＬ-２３ ｐ１９のカップリング
再構築Ｑβウイルス様粒子(２ｇ／ｌ)、ＡＰ２０５(２ｇ／ｌ)、ｆr (２ｇ／ｌ)及びＧＡ(２ｇ／ｌ)、ＲＮアーゼＡ処理Ｑβウイルス様粒子(２ｇ／ｌ)、ＡＰ２０５ (２ｇ／ｌ)、ｆr (２ｇ／ｌ)及びＧＡ(２ｇ／ｌ), ＺｎＳＯ４処理Ｑβウイルス様粒子(２ｇ／ｌ)、ＡＰ２０５(２ｇ／ｌ)、ｆr (２ｇ／ｌ)及びＧＡ(２ｇ／ｌ)を、０．７１４ｍＭ ＳＭＰＨ (Pierce, Perbio Science)と２５℃で３０分間置いて誘導体化し、次いで２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析した。ヒトＩＬ-２３ ｐ１９タンパク質(配列番号：７、０．２８ｇ／ｌ)と誘導体化されたＱβ粒子(０．５ｇ／ｌ)を、１ｍＭ ＥＤＴＡと１０μＭ、３０μＭないしは９０μＭのＴＣＥＰ(Pierce, Perbio Science)存在下にて２５℃で２時間インキュベートした。カップリング産物をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析した。ワクチンの抗原濃度を濃度測定分析にて測定した。
【０１２３】
実施例１１  ＣＰ伸展の位置１９で切断されたＱβＡ１タンパク質のＣ末端へのＡβ１-６ペプチドの融合
ＱβＡ１遺伝子の５'末端にアニールするプライマーとＡ１遺伝子の３'末端にアニールするプライマーと、配列DAEFRH又はDAEFGHのＡβ１-６ペプチドをコードする配列を付加的に含むものを、ｐＱβ１０を鋳型としたＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ産物をｐＱβ１０内にクローン化し (Kozlovska T.M. 等, Gene 137: 133-37 (1993))、実施例１にて説明したように、融合タンパク質を含んでなるＶＬＰを発現させ、同じ条件で精製した。
精製されたＱβ ＶＬＰ-Ａβ１-６は、実施例４にて説明したように分解される。精製されたＱβ-Ａβ１-６融合タンパク質(２．２ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)およびＤＴＴ (Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、終濃度１．４ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのそれぞれのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ)を３．５ｋＤａカットオフのメンブランを用いて、２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りである：ポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、ポリ-Ｌ-グルタミン酸(MW 3000、13600及び84600, Sigma)又はパン酵母ないしは小麦麦芽由来のｔＲＮＡ。
【０１２４】
実施例１２  ｆｒコートタンパク質の位置２と位置３の間へのＡβ１-６ペプチドの挿入
配列DAEFRH又はDAEFGHのＡβ１-６ペプチドの配列をコードする相補的なプライマーで、Ｂｓｐ１１９Ｉ適合性末端とインフレーム挿入を可能にする付加的なヌクレオチドを含有するものを、標準的な分子生物学技術によって、ｐＦｒｄ８ベクターのＢｓｐ１１９Ｉ部位に挿入した(Pushko, P. 等, Prot. Eng. 6: 883-91 (1993))。あるいは、Ｂｓｐ１１９Ｉで消化した後、ｐＦｒｄ８ベクターのオーバーハングをクレノーにて挿入し、クレノー処理の後にＡβ１-６ペプチドの配列をコードするオリゴヌクレオチドとインフレームをコードする付加的なヌクレオチドをライゲーションした。右配位に挿入物を有するクローンを配列決定によって分析した。セファロースＣＬ-４Ｂ又はセファクリルＳ-４００(Pharmacia)カラムを使用してクロマトグラフィ工程を行うことを除いて、Pushko, P. 等, Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)に記載のように、大腸菌ＪＭ１０９又は大腸菌Ｋ８０２において、キメラ融合タンパク質の発現および精製を行った。実施例１のＱβについて記載した手順と同様に、細胞溶解物を硫酸アンモニウムで沈殿して、２つの連続したゲル濾過精製工程によって、精製した。
精製されたキメラｆｒ  ＶＬＰ-Ａβ１-６は、実施例４にて説明したように、分解されることになっている。精製されたｆｒＡβ１-６融合タンパク質(２．２ｍｇ／ｍｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)およびＤＴＴ (Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、終濃度１．４ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのそれぞれのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ各々)を３．５ｋＤａカットオフのメンブランを用いて、２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りである：ポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、硫酸デキストラン(MW 5000及び10000, Sigma)、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸(MW 11000及び33400, Sigma)。
【０１２５】
実施例１３  再構築ＡＰ２０５ ＶＬＰ及びＧＡＶＬＰへのアンギオテンシンＩ及びアンギオテンシンＩＩ由来のペプチドのカップリング及び結果として生じるコンジュゲートによるマウスの免疫化
Ａ．コンジュゲートの産生
以下のアンギオテンシンペプチド成分を化学的に合成した：
CGGDRVYIHPF (「Angio 1」)、CGGDRVYIHPFHL (「Angio 2」)、DRVYIHPFHLGGC (「Angio 3」)、CDRVYIHPFHL (「Angio 4」)、CHPFHL (「Angio 5」)、CGPFHL (「Angio 6」)、CYIHPF (「Angio 7」)、CGIHPF (「Angio 8」)、CGGHPF (「Angio 9」)、DRVYIGGC (「Angio 13」)、DRVYGGC (「Angio 14」)及びDRVGGC (「Angio 15」)。これらを、以下に記載の再構築ＡＰ２０５又はＧＡＶＬＰへの化学的なカップリングに用いた。
ペプチドAngio 1からAngio 4：再構築２ｍｇ／ｍｌのＡＰ２０５又はＧＡ  ＶＬＰを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４の５ｍｌ溶液を、１３ｍｇ／ｍｌのＳｕｌｆｏ-ＭＢＳ(Pierce)を含む５０７μｌの水溶液と、振とうシェーカー上で２５℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４にて４℃で２時間、２回透析した。次いで、６６５μｌの透析された反応混合物を、２．８μｌの各々の対応する１００ｍＭ ペプチド貯蔵溶液(ＤＭＳＯ中)と、振とうシェーカー上で２５℃で２時間反応させた。その後、反応混合物を２ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４にて４℃で２時間、２回透析した。
ペプチドAngio 5-9およびAngio 13-15：再構築２ｍｇ／ｍｌのＡＰ２０５又はＧＡ  ＶＬＰを含む２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２の３ｍｌ溶液を、１００ｍＭ ＳＭＰＨ (スクシニミジル-６-(β-マレイミドプロピオノアミドヘキサノエート, Pierce)を含む８６μｌのＤＭＳＯ溶液と、振とうシェーカー上で２５℃で５０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。次いで、５１４μｌの透析された反応混合物を、３．６μｌの各々の対応する１００ｍＭ ペプチド貯蔵溶液(ＤＭＳＯ中)と、振とうシェーカー上で２５℃で４時間反応させた。その後、反応混合物を２ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。
【０１２６】
Ｂ．免疫化
アジュバントを添加していない再構築ＡＰ２０５又はＧＡ  ＶＬＰにカップリングされた９つのアンギオテンシンペプチド誘導体のうちの１にて、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスにワクチン接種した。各々の試料の総タンパクの５０μｇ(Angio 1-4ワクチン)又は２０μｇ(Angio 5-9ワクチン)をＰＢＳにて２００μｌに希釈し、第０日目と第１４日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。第２１日目にマウスの後眼窩から採血し、アンギオテンシン特異的ＥＬＩＳＡを用いて血清を分析した。
アンギオテンシンペプチドのヒト及びマウスの配列が互いに等しく対応する必要がある。したがって、本発明の抗原決定基としてアンギオテンシンペプチド分子を含有するワクチン又はコンジュゲートのそれぞれによるヒト又はマウスの免疫化は、自己抗原に対する予防接種である。
【０１２７】
実施例１４  ポリグルタミン酸存在下において、再構築Ｑβ ＶＬＰのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の排除
ＬＣＭＶ-ペプチドｇｐ３３(KAVYNFATM) (Ｑβｘ３３)に化学的に類似するＱβ ＶＬＰ １５０μｇを皮下投与することによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。一グループのマウスには完全なＱβ ＶＬＰｘ３３粒子を投与し、他のグループは異なる量のポリ-Ｌ-グルタミン酸(０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌおよび０．４ｍｇ／ｍｌのポリ-Ｌ-グルタミン酸とのＱβ／ポリＬ-Ｇｌｕ／ｘ３３)存在下にて再構築させたＱβ ＶＬＰｘ３３で処理した。免疫化して８日後の動物の血液を、ｇｐ３３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡張について分析した。血液をＦＡＣＳバッファ(ＰＢＳ、２％ ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．２)に回収し、ｇｐ３３-ペプチドを有するＰＥ標識Ｈ２-Ｄｂ-四量体(Proimmune, Oxford, UK)にて３７℃で１０分間染色し、その後ＡＰＣ標識ラット抗マウスＣＤ８ａ-抗体(BD PharMingen, San Jose, USA)にて４℃で３０分間染色した。洗浄後、赤血球を、ＢＤ-Ｌｙｚｉｎｇ溶液(BD Biosciences, San Jose, USA)にて室温で１０分間置いて溶解した。最後に、細胞をCellQuestソフトウェアを用いたFACS Caliburにて分析した。まず第一に、細胞を前方散乱(フォワードスキャッチャー)および側方散乱(サイドスキャッチャー)に取り込み、リンパ球をゲートした。このリンパ球集団から、ｇｐ３３-ＰＥ標識細胞及びＣＤ８-ＡＰＣ標識細胞をそれぞれＦＬ２及びＦＬ４検出器にて測定した。ｇｐ３３特異的Ｔ細胞の量を、総ＣＤ８陽性リンパ球に対するパーセントＣＤ８陽性細胞、ｇｐ３３陽性細胞として算出した。
フローサイトメトリ分析法により、従来のＱβ ＶＬＰｘ３３が投与された動物と比較して、ｇｐ３３特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の拡張を誘導したＱβ／ポリＬ-Ｇｌｕ／ｘ３３試料はなかった。(表１を参照)。
【０１２８】
ｇｐ３３特異的Ｔ細胞応答を測定した後、ｇｐ３３-ペプチドを発現する組換えワクチンウイルスの１．５×１０６ｐｆｕにてマウスを負荷試験した。５日後に、マウスの卵巣におけるウイルス力価を測定した。卵巣の単一細胞懸濁液を、ＢＳＣ４０細胞の階段希釈液中でインキュベートした。５％ＣＯ２、３７℃で終夜インキュベートした後、ウイルス誘導細胞溶解物由来の細胞層において、プラークを可視化するために、クリスタルバイオレット(５００ｍｌ ９６％ エタノール、５ｇ クリスタルバイオレット(Sigma C-3886)、８ｇ ＮａＣｌ、４５０ｍｌ Ｈ２Ｏ、５０ｍｌ ホルムアルデヒド)にて細胞を染色した。卵巣に残存するウイルスの数をプラーク形成単位(ｐｆｕ)として算出した。プラーク形成単位は、従来のＱβ ＶＬＰｘ３３が投与されたマウスのグループと比較して、Ｑβ ＶＬＰｘ３３ワクチンが投与されたマウスにおいて有意に高かった(表１を参照)。
表１
2008515851.tif 000002
【０１２９】
実施例１５  マウスＴＮＦにカップリングされたＲＮアーゼＡ消化Ｑβ ＶＬＰと誘導される免疫応答
Ａ．従来のＱβ ＶＬＰへのマウスＴＮＦタンパク質のカップリング
システイン含有リンカー、ヘキサヒスチジンタグおよび成熟したマウスＴＮＦタンパク質からなる融合タンパク質(配列番号：６７)(未成熟タンパク質のアミノ酸７８−２３３に対応する)を、大腸菌内で組み換えて発現させ、親和性クロマトグラフィによって、均一になるまで精製した。２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に１．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含有する溶液を、等量のＴＣＥＰとともに室温で６０分間インキュベートした。
次いで、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に３．０６ｍｇ／ｍｌの従来のＱβ ＶＬＰを含有する５００μｌの溶液を、４．２μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯ中に６５ｍＭ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を３Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２にて２回交換して、４℃でそれぞれ２時間と１４時間透析した。６０μｌの誘導体化して、透析したＱβ溶液を、３０μｌのＨ２Ｏと１８０μｌの精製して予め稀釈したマウスＴＮＦタンパク質と混合して、化学的に架橋するために１５℃で４時間インキュベートした。カップリングしなかったタンパク質を、３０００００Ｄａの分子量を有するセルロースエステルメンブランを用いて、ＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析した。
【０１３０】
Ｂ．Ｑβ-ｍＴＮＦのＲＮアーゼ消化
Ａ１由来のマウスＴＮＦα (Ｑβ-ｍＴＮＦ、０．７ｍｇ／ｍｌ)にカップリングされた従来のＱβ ３００μｌを、３μｌのＲＮアーゼＡ(１００ｍｇ／ｍｌ)とともにゆっくりと撹拌しながら３７℃で３時間インキュベートした。従来のＱβ内に含有されるＲＮＡの消化の程度は、一定量の反応物のアガロースゲル電気泳動とその後のエチジウムブロマイド染色によって、確認した。この処理の後に、およそ９５％の大腸菌宿主ＲＮＡを消化した。ＲＮアーゼ処理Ｑβ-ｍＴＮＦを、過剰量の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ  ７．２にて終夜透析した。
【０１３１】
Ｃ．マウスの免疫化
３匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、従来のＱβ-ｍＴＮＦによって、免疫化し、５匹の雌ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＲＮアーゼ処理Ｑβ-ｍＴＮＦによって、免疫化した。２５μｇの総タンパクをＰＢＳにて２００μｌまでに希釈し、第０日目と第１４日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。第０日目及び第２１日目にマウスの後眼窩から採血し、ＥＬＩＳＡによって、血清中のマウス抗ＴＮＦ特異的抗体力価を測定した。
【０１３２】
Ｄ．ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、１μｇ／ｍｌの組換えマウスＴＮＦαにて終夜をかけてコートした。実施例８に記載のものと実質的に同じＥＬＩＳＡによって、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ、及び血清中のＴＮＦαに特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価及び総ＩｇＧ力価を測定した。
従来のＱβ-ｍＴＮＦ及びＲＮアーゼ処理Ｑβ-ｍＴＮＦがマウスＴＮＦαに特異的な抗体を誘導したことが表２より示された。従来のＱβ-ｍＴＮＦは、高いＩｇＧ２ａ力価でＴｈ１型の免疫応答を誘導した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価の平均比率はおよそ０．７５であった。Ｑβ-ｍＴＮＦのＲＮアーゼ処理はＩｇＧ１力価に影響しなかったが、ＩｇＧ２ａ力価を大幅に低減し、０．１３５の比とした。これらのデータより、従来のＱβ-ｍＴＮＦにより誘導される免疫応答と比較して、ＲＮアーゼ処理Ｑβ-ｍＴＮＦにより誘導される免疫応答はより多くのＴｈ１免疫応答からより多くのＴｈ２応答へ変化していたことが示された。
表２
2008515851.tif 000003
【０１３３】
実施例１６  従来のＱβ ＶＬＰ及び再構築ＱβとＡＰ２０５ ＶＬＰへのマウスＴＮＦα(４-２３)ペプチドのカップリング
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に３．０６ｍｇ／ｍｌの完全なＱβ ＶＬＰを含有する３ｍｌの溶液を、９９．２μｌのＳＭＰＨ溶液(６５ｍＭを含むＤＭＳＯ)と室温で６０分間反応させた。反応溶液を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて２回交換して、４℃でそれぞれ４時間と１４時間透析した。６９μｌの誘導体化して、透析したＱβ溶液を、２６５．５μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２と７．５μｌのＮ末端に融合した第二付着部位CGGを有するｍＴＮＦα(4-23)ペプチド(ＤＭＳＯ中に２３．６ｍｇ／ｍｌ)と混合して、化学的に架橋するために１５℃で２時間インキュベートした。カップリングしなかったペプチドは、ＰＢＳにて４℃で２時間、２回透析して除去した。カップリングした産物を、還元条件下の１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲルにて分析した。
同じ条件を、再構築ＱβおよびＡＰ２０５ ＶＬＰそれぞれへのマウスＴＮＦα(４-２３)のカップリングに適用した。
【０１３４】
実施例１７  ＶＬＰに含有されるＲＮＡの量の測定
ＶＬＰ試料(表２を参照、１ｍｇ／ｍｌ)を１０ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ  ９．７中で、６０℃でおよそ１６時間インキュベートした。これは、被包されたＲＮＡ、好ましくは核酸をヌクレオチドに加水分解して、タンパク質を沈殿させるためである。試料を、ローターF45-30-11 (Eppendorf)を用いて１４０００ｒｐｍで５分間遠心して、可溶性のヌクレオチドから沈殿したタンパク質を分離した。
上清のｐＨを、０．５Ｍ リン酸ナトリウムバッファｐＨ７を加えて、ｐＨ７に調整した。さらに、各々の試料中のヌクレオチド濃度を段階的に希釈して調整し、２ＡＵ(ＡＵは「吸光単位」を指す)以下で変動する吸光でＵＶデータを記録した。ＶＬＰがないこと以外は同じバッファを対照として用いた。
元のＲＮＡ、好ましくは核酸の量に対応するヌクレオチド濃度は、１ＡＵが３３μｇのＲＮＡ／ｍｌに相当するとする２６０ｎｍの吸光度から算出した。試料のＲＮＡ濃度を表３にまとめる。
【０１３５】
表３
2008515851.tif 000004
【０１３６】
実施例１８  従来のＱβ ＶＬＰ及び再構築Ｑβ ＶＬＰへのマレイミド-ＧｎＲＨのカップリング
(A) マレイミド-ＧｎＲＨの調製
ペプチドＧｎＲＨを標準的な方法を用いて化学的に合成した。ＭＢＳ(ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル)又はＳＭＰＨ(スクシンイミジル-６[β-マレイミドプロピオンアミド]ヘキサノエート)を、ペプチドのＮ末端のアミノ基に共有結合して付着した。
(B) スルフヒドリル基へのＱβ ＶＬＰのアミノ基の形質転換従来のＱβ ＶＬＰおよび再構築Ｑβ ＶＬＰ(ＰＢＳの貯蔵溶液)を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７および２-イミノチオラン(２００ｍＭの貯蔵溶液を含むＤＭＳＯ)と混合して、終濃度２ｍｇ／ｍｌ Ｑβ ＶＬＰ、５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７および１５ｍＭ ２-イミノチオランとした。混合物を室温で２時間インキュベートし、その後、過剰量の反応しなかった２-イミノチオランをゲル濾過(セファデックスＧ２５、ＰＢＳ)によって、除去し、その結果、およそ１．４ｍｇ／ｍｌの濃度の精製された、ＳＨ変性Ｑβ ＶＬＰ溶液を得た。
(C) マレイミド-ＧｎＲＨのカップリング
ＳＨ変性の従来のＱβ ＶＬＰと工程(B)で得られたＳＨ変性の再構築Ｑβ ＶＬＰ(１．４ｍｇ／ｍｌ)を、２０分の１量のマレイミド-ＧｎＲＨ貯蔵溶液(１０ｍＭを含むＤＭＳＯ)と混合して、室温で１時間インキュベートした。カップリングしなかったマレイミド-ＧｎＲＨを、３００ｋＤａのメンブランを用いた透析濾過によって、除去した。カップリングの結果はＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルによって、確認した。
【０１３７】
実施例１９  パイロジェン試験
この試験は、European Pharmacopoeia 4th edition, Chapter 2.6.8., page 131-132に記載されるように、標準的なパイロジェン試験手順に従って行った。この文献は出典明記によって、本明細書中に組み込まれる。
試験試料は、ポリグルタミン酸存在下で再構築されたＱβ ＶＬＰ、ＲＮアーゼで処理したＱβ ＶＬＰ、ＺｎＳＯ４で処理したＱβ ＶＬＰ、および大腸菌のＲＮＡを含んでなる従来のＱβとした。Ｑβ ＶＬＰの濃度は０．３ｍｇ／ｍｌであった。注射する前に、試料を３８．５℃まで予め暖めた。
この試験に用いた動物は、およそ３ｋｇ体重の健康な成体ウサギである。３匹のウサギを別々のグループで試験した。
簡単に言うと、０．３ｍｌ／ｋｇ体重の量の試料を、４分以内で各々のウサギの耳の周縁静脈内にゆっくり注入した。各々のウサギの開始時の温度は、試料を注射する４０分前に３０分の間を空けて記録したそのウサギの２つの温度の平均である。各々のウサギの最大温度は、注射の３時間後に記録したウサギの最高温度である。各々のウサギの温度の記録は、せいぜい３０分の間隔であり、試料を注射する少なくとも９０分前に開始し、注射後３時間続ける。各々のウサギの最大温度と開始時の温度との相違は応答によるものであるとみなす。ウサギに熱を誘導する試験されたＶＬＰの能力を調べて、従来のＶＬＰと比較した。
【０１３８】
実施例２０  再構築Ｑβ ＶＬＰへのＩＬ-５のカップリングと誘導された免疫応答の測定
【０１３９】
実施例２１  従来のＱβ ＶＬＰ及びポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下にて再構築されたＱβ ＶＬＰへのＩＬ-５のカップリングと誘導された免疫応答の測定
Ｎ末端のγ３アミノ酸リンカー(配列番号：４８)に融合したマウスＩＬ-５(配列番号：４６)又はヒトＩＬ-５(配列番号：４７)を大腸菌内で組み換えて産生して精製した。従来のＱβ ＶＬＰ及び、ポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下にて再構築されたＱβ ＶＬＰを、１０倍モル過剰のＳＭＰＨにて２５℃で３０分間誘導体化した。誘導体化反応物を、10`000のMWCOを有するSlide-A-Lyzer透析カセット中で、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４からなる１０００倍量の透析バッファにて２時間、２回透析した。精製されたマウスＩＬ-５を、２倍モル過剰のｐＨ中和ＴＣＥＰにて６０分間予め還元した。還元したマウスＩＬ-５(４２μＭ)を、実施例１のように調製した４０μＭのＳＭＰＨ誘導体化された従来のＱβ ＶＬＰと４２μＭのマウスＩＬ-５とそれぞれ２０℃で３時間インキュベートして、実施例４のように調整した４０μＭのポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下にて再構築されたＳＭＰＨ誘導体化Ｑβ ＶＬＰと２０℃で３時間インキュベートした。カップリング反応物を、３００ｋＤａのカットオフ透析メンブランを用いて、ＰＢＳ ｐＨ８．０にて１２時間、その後６時間透析した。
１グループ当たり５匹の雌ＢａｌｂＣマウスに、「従来のＱβ-マウスＩＬ-５」又は「再構築Ｑβ-マウスＩＬ-５」何れかのワクチンを５０μｇ、２５μｇおよび再度５０μｇを有する２００μｌのＰＢＳを、それぞれ第０日目、第１４日目および第２８日目に皮下注射した(腹部２箇所に１００μｌずつ)。コントロールとして、５匹のマウスを、従来のＱβ ＶＬＰ又はポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下にて再構築されたＱβ ＶＬＰ何れかのみにて、第０日目、第１４日目および第２８日目に免疫化した。ワクチンはアジュバントなしで投与した。免疫化プロトコールの第０、１４、２１及び２８日目にマウスから採血した。
【０１４０】
マイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、２μｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ-５又は２μｇ／ｍｌの従来のＱβ又は２μｇ／ｍｌのポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下で再構築されたＱβにて終夜をかけてコートした。実施例８に記載のものと実質的に同じＥＬＩＳＡによって、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ、及び血清中のＩＬ-５に特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価及び総ＩｇＧ力価を測定した。
表４
2008515851.tif 000005
【０１４１】
表４より、従来のＱβ-マウスＩＬ-５及び再構築Ｑβ-マウスＩＬ-５がマウスＩＬ-５に特異的な抗体を誘導したことが示された。従来のＱβ-ＩＬ-５は高いＩｇＧ２ａ力価でＴｈ１型の免疫応答を誘導した。ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１力価の平均比率はおよそ２．５であった。しかし、ポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下で再構築されたＱβ ＶＬＰから作成したＱβ-マウスＩＬ-５ワクチンにてマウスを免疫化すると、ＩｇＧ２ａ力価が劇的に減少し、その結果、平均力価が０．００７７となった。これらのデータより、従来のＱβ-ｍＩＬ-５により誘導される免疫応答と比較して、ポリ-Ｌ-グルタミン酸を含む再構築Ｑβ-ｍＩＬ-５により誘導される免疫応答はＴｈ１免疫応答からより多くのＴｈ２応答へ変化していたことが示された。５匹のマウスの血清(各グループにつき５匹)をＥＬＩＳＡ分析のためにプールした。
同様に、抗Ｑβ力価はＶＬＰに対して同じ免疫応答を示した。従来のＱβ ＶＬＰを用いると、高いＩｇＧ２ａ力価でＱβに対してＴｈ１型の免疫応答が誘導された。対照的に、ポリ-Ｌ-グルタミン酸存在下で再構築されたＱβ ＶＬＰを用いることにより、Ｑβに対するより多くのＴｈ２型の免疫応答が誘導された(データは示さない)。
【０１４２】
好酸球増加症モデル
アレルギー性気道炎症の実験的喘息モデルを、好酸球増加症に対する予防接種の効果を評価するために用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス(１グループにつき５匹)を、上記のマウスＩＬ-５にカップリングされた再構築Ｑβ ＶＬＰによって、予防接種をされる。予防接種プログラムの３５日目に５０μｇの卵白アルブミン(ＯＶＡ)を含むミョウバン(Ａｌｕ-Ｇｅｌ-Ｓ)をマウスに腹膜内投与した。免疫化をしなかった４匹の３つめのグループにも投与した。１０日後(すなわち第３３日目)に、１００μｇのＯＶＡを含むＰＢＳを投与したマウスに４日間毎日鼻腔内投与した。最後の抗原投与の２４時間後に、マウスを屠殺し、肺をＰＢＳにて洗浄した。気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)に含有する細胞をMaigrunwald-ギムザで染色して、好酸球性細胞の数を数えた(Trifilieff A, 等 Clin Exp Allergy. 2001 Jun、31(6): 934-42)。
【０１４３】
実施例２１  再構築Ｑβ ＶＬＰへのガストリン断片のカップリング
融合したリンカー配列を有する以下のガストリン断片を、標準的方法に従って化学的に合成した。
Ｇ１７(１-９)Ｃ２：pEGPWLEEEESSPPPPC  (配列番号：７２)
ｃ１Ｇ１７：       pEGPWLEEEEEAYGWMDFGGC  (配列番号：７３)
ｎＧ１７アミド：   CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2  (配列番号：７４)
ｎＧ１７-Ｇ：      CGGQGPWLEEEEEAYGWMDFG  (配列番号：５４)
ｎＧ３４アミド：   CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFCONH2  (配列番号：７５)
ｎＧ３４-Ｇ：      CGGQLGPQGPPHLVADPSKKQGPWLEEEEEAYGWMDFG  (配列番号：７６)
【０１４４】
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に２．０ｍｇ／ｍｌの再構築Ｑβ ＶＬＰを含有する２ｍｌの溶液を、１１４．４μｌのＳＭＰＨ溶液(ＤＭＳＯに溶解した５０ｍＭの貯蔵溶液)と２５℃で６０分間反応させた。その後、反応溶液を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。
その後、透析して誘導体化したＱβ ＶＬＰをｃ１Ｇ１７とカップリングするために用いた。簡潔に言えば、１ｍｌの誘導体化されたＱβ ＶＬＰ(２ｍｇ／ｍｌの濃度)を、１０ｍＭのペプチド溶液を含む１６７μｌのＤＭＳＯおよび１００μｌのアセトニトリルと１５℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１６１００ｒｃｆで５分間遠心し、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。カップリング産物をＱβ-ｃ１Ｇ１７と称した。実質的に同じ条件下で、ｎＧ１７アミド、ｎＧ１７-Ｇ、ｎＧ３４アミドおよびｎＧ３４-Ｇを再構築Ｑβ ＶＬＰにカップリングした。
【０１４５】
実施例２２  Ｑβ-ｃ１Ｇ１７、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド、Ｑβ-ｎＧ３４-Ｇ、Ｑβ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２およびＤＴ-Ｇ１７(１-９)Ｃ２によるマウスの免疫化およびＥＬＩＳＡによる抗体価の検出
成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｑβ-ｃ１Ｇ１７(１グループにつき５匹)、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミド又はＱβ-ｎＧ３４-Ｇ(１グループにつき３匹)の何れかにてワクチン接種した。５０μｇのＱβ-ｃ１Ｇ１７、又は２５μｇのＱβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミドおよびＱβ-ｎＧ３４-Ｇ(実施例２１で得たもの)をＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０日目と第１４日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンはアジュバントなしで投与した。対照として、１グループのマウスに、５０μｇの再構築Ｑβを投与した。Ｑβ-Ｃ１Ｇ１７にて免疫化したマウスは第０、１４、２１、２８、４２、６９および１０１日目に後眼窩から採血し、Ｑβ-ｎＧ１７アミド、Ｑβ-ｎＧ１７-Ｇ、Ｑβ-ｎＧ３４アミドおよびＱβ-ｎＧ３４-Ｇにて免疫化したマウスは第０、１４、２１、２８、４２、５６および７７日目に後眼窩から採血した。
５ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼと０．２ｍＭ ＳＰＤＰ(終濃度)を室温で１時間インキュベートした。ＲＮアーゼ-ＳＰＤＰ溶液を、ＰＤ１０カラム(Amersham)にて精製した。精製後、１０ｍＭ ＥＤＴＡと１ｍＭ ペプチドをＲＮアーゼ-ＳＰＤＰ溶液に加えた。
【０１４６】
ＥＬＩＳＡプレート(96ウェルMAXIsorp, NUNC)を、１０μｇ／ｍｌの濃度のＲＮアーゼ-カップリングｃ１Ｇ１７又はｎＧ１７アミド、ｎＧ１７-Ｇ、ｎＧ３４アミド、ｎＧ３４-Ｇを含むコーティングバッファ(０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６)にて４℃で終夜をかけてコートした。プレートを洗浄バッファ(ＰＢＳ-０．０５  ％ Ｔｗｅｅｎ)で洗浄した後に、プレートを、ブロッキングバッファ(２％ ＢＳＡ-ＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液)にて３７℃で２時間かけてブロックし、その後再度洗浄して、段階的に希釈したマウス血清とともにインキュベートした。対照として、同じマウスの免疫前の血清も試験した。プレートを室温で２時間インキュベートした。さらに洗浄した後に、結合した抗体を、ＨＲＰＯ標識、Ｆｃ特異的な、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Jackson Immunoresearch)にて検出して、室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後に、プレートを、ＯＰＤ溶液(１ＯＰＤ錠剤、２５ｕｌ ＯＰＤバッファおよび８μｌ Ｈ２Ｏ２)にて６分間反応させ、反応物を５％ Ｈ２ＳＯ４溶液で止めた。プレートは、ＥＬＩＳＡ読み取り機(Biorad Benchmark)にて４５０ｎｍの値を読み取った。ＥＬＩＳＡ力価は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、最大半量のＯＤを生じる血清希釈物として表される。
【０１４７】
実施例２３  従来のＱβ ＶＬＰ及び再構築Ｑβ ＶＬＰへのＣＸＣＲ4断片のカップリング
Ｎ末端に負荷されたＣとＣ末端に負荷されたＧが連結することによって、環状化されたＣＸＣＲ４断片１７６−１８５(配列番号:６５)と、ＣＸＣＲ４断片１−３９のＮ末端又はＣ末端に融合されたCGG又はGGCリンカー配列を有するＣＸＣＲ４断片１−３９(配列番号:６６)を、標準的方法(Peter Henklein, Charite, Berlin, Germany)に従って化学的に合成した。
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２に従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰを含む３ｍｌ(１．０ｍｇ／ｍｌ)の溶液を、８５μｌのＳＭＰＨ (ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ, Pierce)と２５℃で３０分間反応させた。次いで、反応溶液を３Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ, ｐＨ  ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。次いで、透析され、誘導体化された従来のＱβ又は再構築ＶＬＰを、ペプチドＣＸＣＲ４-CGG-１−３９、ＣＸＣＲ４-１−３９-GGC、又はＣＸＣＲ４-C-１７６−１８５-Gをカップリングするために用いた。簡潔にいうと、１ｍｇ／ｍｌの濃度の誘導体化された従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ １ｍｌを、７０μｌの５ｍＭ ペプチド溶液と２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２中で２５℃で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、１Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
【０１４８】
実施例２４  Ｑβ-ＣＸＣＲ４-CGG-1-39、Ｑβ-ＣＸＣＲ４-1-39-GGC、又はＱβ- ＣＸＣＲ４-C-176-185-Gによるマウスの免疫化と抗体サブタイプの検出
成体雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループにつき３匹)に、ＣＸＣＲ4断片(実施例２３で得たもの)にカップリングした従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰをワクチン接種した。対照として従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰのみを用いた。各々の試料から透析した１００μｇのワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０日目と第１４日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンは、アジュバント(Allhydrogel、１ｍｇ／注射)なしで又はありで投与した。マウスは第１４、２１、２８日目に後眼窩から採血し、実施例８に記載のものと実質的に同じＥＬＩＳＡによって、マウスのＣＸＣＲ4断片に特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価、ＩｇＥ力価、総ＩｇＧ力価を測定した。
【０１４９】
実施例２５  従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰへのＣＣＲ5断片のカップリングとマウスの免疫化
Ｃ末端の付加的なアミド化Ｃｙｓを有する環状ペプチドＥＣＬ２Ａ(配列番号：６１)又はＰＮｔ(配列番号：６３)を標準的な手順に従って化学的に合成した。
２ｇ／ｌの従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰを、１．４３ｍＭのＳＭＰＨ (Pierce, Perbio Science)にて２５℃で３０分間誘導体化して、その後２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析した。１ｇ／ｌの誘導体化されたＱβ ＶＬＰを、２０％ アセトニトリル、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ リン酸 ｐＨ７．５に溶解した。０．２８６ｍＭのＣＣＲ５断片ＥＣＬ２Ａ又はＰＮｔを添加して、２５℃で２時間インキュベートした。
６匹の雌黒色マウスを、第０日目にＣＣＲ５断片にカップリングした従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ ５０μｇにて(０．２ｍｌのＰＢＳ、皮下投与)初回刺激して、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰのみ ５０μｇにて初回刺激したＢａｌｂＣと比較した。第１４日目に同じワクチンで追加免役した後、第１４日及び第２１日目にα-Ｑβとα-ＣＣＲ５抗体力価をＥＬＩＳＡにて確認した。
【０１５０】
実施例２６  ＣＣＲ５特異的マウスポリクローナル抗体の精製とＨＩＶ-中和アッセイにおけるその効果
免疫化したマウスの血清(実施例２５で得たもの)を、１４０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を、３．３ｍｌのプレウォッシュプロテインＧセファロース(Amersham Biosciences)のカラムに流した。次いでカラムをＰＢＳにて洗浄し、１００ｍＭ グリシンｐＨ２．８にて溶出した。１ｍｌの分画を、予め１００μｌの１Ｍ トリスｐＨ８を入れたチューブに回収した。２８０ｎｍの吸光度がピークになる分画をプールした。
ＣＣＲ５コレセプター特異的な細胞株である、ＪＲ-ＦＬ及びＳＦ１６２は既に記載されている(O'Brien 等, Nature 1990, 348, page 69、及びShioda 等, Nature 1991, 349, page 167)。貯蔵溶液中のＨＩＶ-１種菌を、アッセイ培地におよそ１０００〜４０００のＴＣＩＤ５０／ｍｌ(ＴＣＩＤ５０：５０％の組織培養伝染力のある用量)含むように調整した。刺激した一次ＣＤ８によりＰＢＭＣを枯渇させた(ＨＩＶ中和反応アッセイのため)。
簡潔に言うと、３の健康なドナーから得たバフィーコートをRosette Sep反応混液(StemCell Technologies Inc., BIOCOBA AG, Switzerland)を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇し、Ficoll-Hypaque(Amersham-Pharmacia Biotech)にてＰＢＭＣを単離した。細胞を４×１０６／ｍｌ培養液(ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２、グルタミン及び抗生物質)に調整して、３つに分けて、５μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン(ＰＨＡ)、０．５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ又は抗ＣＤ３ ＭＡｂ ＯＫＴ３の何れかで刺激した。７２時間後、３つの刺激産物からの細胞を混合して、感染およびウイルス中和反応のための刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の供与源として用いた。
簡単に言うと、細胞を、精製されたポリクローナルマウスＩｇＧ又はコントロール抗体2Ｄ７の階段希釈液(２５μｇ／ｍｌ−２５ｎｇ／ｍｌ、Pharmingen)とともに９６ウェル培養プレート中で３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウイルス種菌(１００ＴＣＩＤ５０、５０％の組織培養伝染力のある用量、Trkola 等, J. Virol., 1999, page 8966)を加えて、プレートを４−１４日間培養した。総感染容量は２００μｌとした。既に記載されているように(Moore 等, 1990. Science 250, page 1139)、好ましくは感染６日後に、イムノアッセイを用いて上清培養物をＨＩＶ-１ｐ２４抗原産生についてアッセイした。
【０１５１】
実施例２７  従来のＱβ ＶＬＰ及び再構築Ｑβ ＶＬＰへのブラジキニン(ＢＫ)およびｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニン(デス-Ａｒｇ９-ＢＫ)のカップリング
配列のＮ末端にシステインが融合しているブラジキニン(ＢＫ)(配列番号：５５)およびｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニン(配列番号：５６)又はＣ末端にシステインが融合しているブラジキニン(ＢＫ)を、標準的方法に従って化学的に合成した。
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２に従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰを含む３ｍｌ(１．０ｍｇ／ｍｌ)の溶液を、８４μｌのＳＭＰＨ (５０ｍＭを含むＤＭＳＯ, Pierce)とともに２５℃で３０分間反応させた。次いで、反応物を、３Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。その後、透析して、誘導体化したＱβ ＶＬＰを、ブラジキニン又はｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニンをカップリングするために用いた。簡潔に言うと、1ｍｇ／ｍｌの濃度の誘導体化された従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ ３ｍｌを、４２μｌの５０ｍＭ ブラジキニン又はｄｅｓ-Ａｒｇ-ブラジキニンとともに２５℃の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２中で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収して、３Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２にて４℃で２時間で１回透析した後、終夜透析した。
【０１５２】
実施例２８  Ｑβ-ＢＫおよびＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫによるマウスの免疫化と抗体サブタイプの検出
成体雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループにつき１０匹)に、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ(実施例２７で得たもの)にカップリングしたＱβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫを、ワクチン接種した。各々の試料から透析した５０μｇのワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０日目、第１４日目及び第２８日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンは、アジュバントなしで投与した。対照として、１グループのマウスにＰＢＳを注射した。マウスは第０、１４、２１及び３３日目に後眼窩から採血した。
実施例８に記載のものと実質的に同じＥＬＩＳＡによって、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ、及び血清中のＴＮＦαに特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価及び総ＩｇＧ力価を測定した。ＥＬＩＳＡ血清力価(表５及び６)は、飽和状態で測定した光学濃度の５０％を得るために必要な希釈の逆数として表した。
【０１５３】
表５  第０及び１４及び２８日目に、従来のＱβ、再構築Ｑβ、Ｑβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫそれぞれにて免疫化したマウスにおける抗-従来のＱβ、抗-再構築Ｑβ、抗-ＢＫ及び抗-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ特異的ｔＩｇＧ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１の平均(希釈比として示す)。このデータにより、抗原にカップリングしているかにかかわらず従来のＱβ ＶＬＰにより誘導される免疫応答と比較して、抗原にカップリングしているかにかかわらず再構築Ｑβ ＶＬＰがより多くのＴｈ１免疫応答からより多くのＴｈ２応答へ変化していたことが示された。
2008515851.tif 000006
表６
2008515851.tif 000007
このデータにより、免疫応答をＴｈ１からＴｈ２に変化する従来のＱβ-ｍＴＮＦにより誘導される免疫応答と比較して、抗原にカップリングしているかにかかわらず再構築Ｑβ ＶＬＰがより多くのＴｈ１免疫応答からより多くのＴｈ２応答へ変化していたことが示された。
【０１５４】
実施例２９  ＡＰ２０５ ＶＬＰのＣ末端に融合したＣＥＴＰ断片のクローニング、発現および精製
ＣＥＴＰ断片をコードしていて、Ｋｐｎ２ＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉのそれぞれの制限酵素部位を含有している２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニールすることによって、ＣＥＴＰ断片(配列番号：６９)をコードするＤＮＡ断片を作製した。得られた断片を、Ｋｐｎ２ＩおよびＭｐｈ１１０３Ｉにて消化して、大腸菌トリプトファンオペロンプロモータの制御下で、ベクターｐＡＰ４０５-６１(米国特許仮出願60/611,308の実施例１に記載される)内の同じ制限酵素部位にクローニングした。結果として生じるプラスミドは以下の通りである：ＡＰ２０５コートタンパク質−GTAGGGSG−FGFPEHLLVDFLQSLS。
国際公開公報04/007538に記載されるものと実質的に同じように、ＡＰ２０５-ｌｌ-ＣＥＴＰ1タンパク質を発現させて精製した。さらに、ＡＰ２０５ ＶＬＰ内部にパッケージ化される大腸菌ＲＮＡを取り除く工程は上記の実施例５に記載のものと実質的に同じように行った。
【０１５５】
実施例３０  再構築Ｑβ ＶＬＰへのＣＥＴＰペプチドＣＥＴＰ1の化学的カップリング
Ｎ末端に融合された付加的なCGGリンカーを有するＣＥＴＰ断片(配列番号：６９)を、EMC microcollections GmbH(Germany)の固相化学法によって、合成した。ペプチドはＣ末端をアミド化した。
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４に再構築Ｑβ ＶＬＰ(実施例４で得たもの)を含む２ｍｌ(２．０ｍｇ／ｍｌ)の溶液を、５７μｌのＳＭＰＨ溶液(５０ｍＭ 貯蔵溶液を含むＤＭＳＯ, Pierce)とともに２５℃で３０分間反応させた。次いで、反応物を２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２にて４℃で２時間、２回透析した。その後、透析して、誘導体化した再構築Ｑβ ＶＬＰを、ＣＥＴＰ断片をカップリングするために用いた。簡潔に言うと、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌの濃度の誘導体化した再構築Ｑβ ＶＬＰを、１００μｌの５０ｍＭ ペプチド溶液と、１５℃の２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０  ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４中で２時間反応させた。次いで、カップリング反応物を１６０００ｇにて５分間遠心して、上清を回収して、２Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４にて４℃で２時間、２回透析した。
【０１５６】
実施例３１  コレステロール摂食アテローム性動脈硬化のモデルウサギにおけるＣＥＴＰワクチン試験
ニュージランドホワイト種ウサギ(１グループにつきｎ＝１２)に、実施例３０又は実施例２９で得たＶＬＰ-ＣＥＴＰ断片ワクチン又はＶＬＰ ２００μｇを皮下投与してワクチン接種し、第３、６、９、１２、１５、１９、２３および２７週目に追加免疫した。ウサギは、第１６週目に高コレステロール食餌(０．２５％)とし、そこから１６週間この食餌を続けた。抗体価、リポタンパク質、コレステロールおよびＣＥＴＰ活性測定のために、絶食させたウサギから血漿試料を一定の間隔で回収した。第３２週目に動物を屠殺して、アテローム性動脈硬化病変分析のために大動脈を取り出した。大動脈を「正面に向けて開いた」後にオイルレッドＯにて染色して、各動物ごとに病変部が占める動脈の割合を算出した。
【０１５７】
実施例３２  再構築Ｑβ ＶＬＰへのｍＣ５ａｃｙｓのカップリング
Ｎ末端CGSGGリンカーを含有するマウスＣ５ａアミノ酸配列(配列番号：５８、本明細書では以降ｍＣ５ａｃｙｓと称する)をDictagene SAによって、化学的に合成した。マウスＣ５ａ配列のＣ末端の１９アミノ酸は、Ｎ末端にＣＧＧリンカーを付加することによって、合成した(EMC Microcollections GmbH, Germany)(配列番号：７１、本明細書では以降ｍＣ５ａｃｙｓ５９-７７と称する)。
４-(２-ヒドロキシエチル)ピペラジン-１-エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)バッファ(２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２)に１４３μＭの再構築Ｑβ ＶＬＰを含む溶液を、２倍モル過剰(２８６μＭ)のＳＭＰＨ(Pierce)と２５℃で３０分間、振とうしながら反応させた。反応生成物を、１００００Ｄａ分子量カットオフ(Slide-A-Lyzer, Pierce)を用いた透析ユニットを用いてダルベッコＰＢＳ(Gibco)にて２回交換して透析した。
等モル量のｍＣ５ａｃｙｓを、ＳＭＰＨ-誘導体化Ｑβ ＶＬＰの３６μＭ溶液に加えた。反応容量は１００μｌとし、複数の反応を同時に行った。反応物を１５℃で２時間、振とうしながらインキュベートした。カップリングの後、一定量を１６０００ｇにて４℃で３分間遠心して、不溶性物質をペレット化して、ワクチンを可溶性分画に移した。
２倍モル過剰のｍＣ５ａｃｙｓ５９-７７を、５モル過剰のＳＭＰＨ-誘導体化Ｑβ ＶＬＰの１０７μＭ溶液に加えた。反応容量は１００μｌとし、複数の反応を同時に行った。反応物を１５℃で２時間、振とうしながらインキュベートした。カップリングの後、一定量を１６０００ｇにて４℃で３分間遠心して、不溶性物質をペレット化した。可溶性ワクチンを、１００００ＭＷのカットオフ透析カセットを用いてＰＢＳにて２時間、２回透析した。
【０１５８】
実施例３３  コラーゲン誘導性関節炎モデルにおけるＱβ-ｍＣ５ａｃｙｓ ＶＬＰによるマウスの免疫化
雄６週齢ＤＢＡ／１ＪＣｒｌマウス(Charles River, Deutschland)の脇腹に、ダルベッコＰＢＳにて希釈した、５０μｇの再構築Ｑβ-ｍＣ５ａｃｙｓ(ｎ＝８)又は、３０μｇの再構築Ｑβ ＶＬＰのみ(ｎ＝８)を皮下投与して免疫化した。初回の免疫化の後の第１５及び２４日目に、さらに２回皮下投与して追加免疫を行った。抗ｍＣ５ａｃｙｓ抗体力価をＥＬＩＳＡにて測定した。完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)にて１：１の比として、ガラスシリンジを用いて乳化したウシＩＩ型コラーゲン(MD Biosciences) １００μｇにて初回免疫化した後、第３５及び５７日目に２回、マウスの尾の付け根に皮下投与して免疫化した。次いで、前肢と後肢の関節膜厚を毎日測定することによるコラーゲン誘導関節炎の誘導と重症度について、及び、関節の臨床的スコアを毎日評価することによって、マウスを評価した。関節膜厚は、一定張力カリパス(constant-tension caliper)を用いて測定した。
【０１５９】
実施例３４  Ｑβ-ＣＣＲ５断片によるマウスの免疫化と抗体サブタイプの検出
成体雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(１グループにつき３匹)に、ＣＣＲ５断片(実施例２５で得たもの)にカップリングした従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰの何れかをワクチン接種した。対照として従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰのみを用いた。各々の試料から透析した１００μｇのワクチンをＰＢＳにて２００μｌ容量まで希釈し、第０日目と第１４日目に皮下注射した(腹部の２箇所に１００μｌずつ)。ワクチンは、アジュバント(Allhydrogel、１ｍｇ／注射)なしで又はありで投与した。マウスは第１４、２１、２８日目に後眼窩から採血し、ＥＬＩＳＡによって、マウスのＣＣＲ５断片に特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価、ＩｇＥ力価、総ＩｇＧ力価を測定した。
マイクロタイタープレート(Maxisorp, Nunc)を、ＲＮアーゼにカップリングした１０μｇ／ｍｌのＣＣＲ５断片にて終夜をかけてコートした。実施例８に記載のものと実質的に同じＥＬＩＳＡによって、従来のＱβ ＶＬＰ又は再構築Ｑβ ＶＬＰ、及び血清中のＴＮＦαに特異的な異なるサブクラス(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ)の力価及び総ＩｇＧ力価を測定した。
【０１６０】
実施例３５  コラーゲン誘導性関節炎の治療のためのＱβ-ＢＫ、Ｑβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫに対するワクチン接種の有効性
再構築Ｑβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫの有効性を、マウスコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)モデルにおいて、試験した。１グループにつき１０匹の雄ＤＢＡ／1マウスに、５０μｇのＱβ-ＢＫ、Ｑβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ又はＱβ単独を３回(第０、１４および２８日目)皮下投与して免疫化した。次いで、完全フロインドアジュバントと混合した２００μｇのウシＩＩ型コラーゲンをマウスに２回(第３４及び５５日目)皮下投与した。
２回目のコラーゲン／ＣＦＡ注射の後、定期的にマウスを調べて、観察される赤みと腫脹の程度によって、各肢について０から３まで変動する臨床スコアを付けた。２回目のコラーゲン／ＣＦＡ注射の３週間後、３つの実験グループにおいて、肢ごとに平均的な臨床スコアを測定した。
【０１６１】
実施例３６  アレルギー性気道炎症(ＡＡＩ)の治療のためのＱβ-ＢＫ及びＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫに対するワクチン接種の有効性
ブラジキニン(ＢＫ)及びｄｅｓ-Ａｒｇ９-ブラジキニン(ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫ)に対するワクチン接種のＴｈ２媒介性免疫応答への効果を評価するために、アレルギー性気道炎症実験的喘息モデルを用いた。このＴｈ２媒介性免疫応答は、肺への好酸球性流入、サイトカイン(ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１３)産生、ＩｇＥ抗体と粘膜の産生及び気管支過敏症(ＢＨＲ)に特徴がある。Ｂａｌｂ／ｃマウス(１グループにつき５匹)に、実施例１５に記載のＱβ-ＢＫ又はＱβ-ｄｅｓ-Ａｒｇ９-ＢＫを投与して免疫化するか、Ｑβ単独を投与した。初回免疫化の３５日後に、アジュバント(Allhydrogel、１ｍｇＡＩＯＨ／注射)を含む卵白アルブミン(ＯＶＡ)又は含まない卵白アルブミン(ＯＶＡ) ５０μｇをマウスに腹膜内投与した。１０日後(すなわち第４５日目)に、５０μｇのＯＶＡを含むＰＢＳを連続する４日間毎日、鼻腔内に投与してすべてのマウスを抗原刺激した。最後の抗原投与から２４時間後に、全身phlegtismographにてＢＨＲを測定した。次いで、特定の時点でマウスを屠殺して、肺炎症及びＴｈ２媒介性免疫応答を分析した。肺洗浄にはＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた。既に記載されているように(Trifilieff A, 等 Clin Exp Allergy. 2001 Jun、 31(6): 934-42)、気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)に含まれる細胞をCoulterカウンター(Instrumenten Gesellschaft AG)にて計数して、Maigrunwald-ギムザ染色にて識別した。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】エチジウムブロマイドで染色した１％アガロースゲルにおけるＲＮアーゼによるＱβ ＶＬＰからのＲＮＡ加水分解の分析を示す。ゲルに流したものは以下の通りである。試料１：ＭＢＩ発酵物質１ｋｂＤＮＡラダー；試料２：従来のＱβ ＶＬＰ；試料３：０．２×ＨＢＳバッファ ｐＨ７．２中でＲＮアーゼにて処理Ｑβ ＶＬＰ。
【図２】従来のＱβ ＶＬＰと本発明に従って再構築したＱβ ＶＬＰのＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：分子標準物質；レーン２：非還元条件下での従来のＱβ ＶＬＰ；レーン３：分子標準物質；レーン４：還元条件(２５ｍＭ ＤＴＴ)下での再構築Ｑβ ＶＬＰ泳動物質；レーン５：非還元条件下での再構築Ｑβ ＶＬＰ泳動物質。
【図３】異なるポリ陰イオン性高分子の存在下にて、従来のＱβ ＶＬＰ、ＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰ、及び再構築Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたニコチン誘導物質にてマウスを免疫化した後のニコチンに対する抗体力価を示す。
【図４】異なるポリ陰イオン性高分子の存在下にて、従来のＱβ ＶＬＰ、ＲＮアーゼＡ処理Ｑβ ＶＬＰ、及び再構築Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたニコチン誘導物質にてマウスを免疫化した後のニコチンに対するＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体力価を示す。
【図５】サイズ排除ＨＰＬＣによる構築(アセンブリ)混合物の溶出特徴を示す。(A) ポリ陰イオン性高分子なしで構築させたＡＰ２０５コートタンパク質；(B) ポリグルタミン酸の存在下にて構築させたＡＰ２０５コートタンパク質。ＡＰ２０５ＶＬＰの形成は、従来のＡＰ２０５ＶＬＰと同じ滞留時間である７．８３分にピークがあることによって示される。構築されていないＡＰ２０５コートタンパク質は１１．７７分の滞留時間で溶出された。
【図１】
2008515851.tif 000008
【図２】
2008515851.tif 000009
【図３】
2008515851.tif 000010
【図４】
2008515851.tif 000011
【図５】
2008515851.tif 000012
【配列表】
2008515851000001.xml
【国際調査報告】
2008515851.tif 000061
2008515851.tif 000062
2008515851.tif 000063
2008515851.tif 000064