(57)【要約】  本発明は、候補イメージングプローブを同定するための方法であって：ａ）第１の候補化合物ライブラリを標的生体高分子と接触させること、ｂ）第１の候補化合物ライブラリから、第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを同定すること、ｃ）第１の候補化合物ライブラリから同定された、第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを、標的生体高分子と接触させること、ｄ）第２の候補化合物ライブラリを第１のメンバー及び標的生体高分子と接触させること、ｅ）生体高分子により誘起されるクリックケミストリー反応により、相補的な第１の官能基を第２の官能基と反応させて、候補イメージングプローブを形成すること；ｆ）候補イメージングプローブを単離及び同定すること、ｇ）化学合成により候補イメージングプローブを調製すること；及び、ｈ）イメージング適用のため、候補イメージングプローブをイメージングプローブへ転換すること、を含んでなる方法を提供する。
2008541014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補イメージングプローブを同定するための方法であって：
ａ）第１の候補化合物ライブラリを標的生体高分子と接触させること、ここで、前記第１の化合物ライブラリの各化合物は、クリックケミストリー反応に関与することが可能な第１の官能基を含んでなり、各化合物は、第１の結合部位及び第２の結合部位を含んでなる標的生体高分子の前記第１の結合部位に親和性を示してもよく；
ｂ）前記第１の候補化合物ライブラリから、前記第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを同定すること；
ｃ）前記第１の候補化合物ライブラリから同定された、前記第１の結合部位に親和性を示す前記第１のメンバーを、前記標的生体高分子と接触させること；
ｄ）第２の候補化合物ライブラリを前記第１のメンバー及び前記標的生体高分子と接触させること、ここで、前記第２の候補化合物ライブラリは、前記第２の結合部位に親和性を示してもよく、前記第２の候補化合物ライブラリの各化合物は、前記第１の官能基とのクリックケミストリー反応に関与することが可能な、相補的な第２の官能基を含んでなり、
前記第１のライブラリの各化合物か前記第２のライブラリの各化合物のいずれか、又は、前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、独立して、ｉ）化学元素の非放射性同位元素、ここで、前記化学元素が少なくとも１つの放射性同位元素を含んでなり及び／又はｉｉ）脱離基及び／又はｉｉｉ）金属キレート基及び／又はｉｖ）蛍光性の基、を含んでなり、各々はリンカーを介して結合されていてもよく；
ｅ）生体高分子により誘起されるクリックケミストリー反応により、前記相補的な第１の官能基を前記第２の官能基と反応させて、前記候補イメージングプローブを形成すること；
ｆ）前記候補イメージングプローブを単離及び同定すること；
ｇ）化学合成により候補イメージングプローブを調製すること；及び
ｈ）イメージング適用のため、前記元素の非放射性同位元素を放射性同位元素に転換し、又は前記脱離基を放射性試薬で置換え、又は放射性金属と複合体を形成することにより、前記候補イメージングプローブをイメージングプローブへ転換すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
生体高分子が、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオンチャンネル及び抗体からなる群より選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３】
標的生体高分子が、アルツハイマー病患者の脳組織におけるベータ−アミロイドを含め、疾病状態において過剰発現されるタンパク質である、請求項１の方法。
【請求項４】
第２の結合部位が、前記第１の結合部位の一部を構成する、請求項１の方法。
【請求項５】
第１のライブラリの各化合物又は第２のライブラリの各化合物又は第１及び第２の双方の化合物ライブラリの各化合物が、金属キレート基及び／又は蛍光体を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項６】
クリックケミストリー反応がペリ環状反応である、請求項１の方法。
【請求項７】
ペリ環状反応が付加環化反応である、請求項６の方法。
【請求項８】
付加環化反応が、ディールス・アルダー反応及び１，３−双極子付加環化反応からなる群より選ばれる、請求項７の方法。
【請求項９】
付加環化反応が１，３−双極子付加環化反応である、請求項８の方法。
【請求項１０】
相補的なクリック官能基がアジド及びアルキンを含んでなり、クリック反応が１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する、請求項１の方法。
【請求項１１】
第１の官能基がアジドであり、第２の官能基がアルキンであるか、又は、第１の官能基がアルキンであり、第２の官能基がアジドである、請求項１の方法。
【請求項１２】
アルキンが末端アルキンである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ａ）〜ｆ）の段階が、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること、並びに、最適化された結合、生体内分布、代謝及び薬物動態特性をもつ候補イメージングプローブが同定されるまで再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される、請求項１の方法。
【請求項１４】
脱離基が、交換反応、求核置換反応又は求電子置換反応により転換されて、標識された誘導体を形成してもよい、請求項１の方法。
【請求項１５】
同定された候補イメージングプローブが、放射性同位元素で標識され、結果として得られた放射性イメージングプローブが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法に使用される、請求項１３の方法。
【請求項１６】
候補イメージングプローブを同定するための方法であって；
ａ）第１の候補化合物ライブラリを標的酵素と接触させること、ここで、前記第１の化合物ライブラリの各化合物は、クリックケミストリー反応に関与することが可能な第１の官能基を含んでなり、各化合物は、第１の結合部位及び第２の結合部位を含んでなる標的酵素の、前記第１の結合部位に親和性を示してもよく；
ｂ）前記第１の候補化合物ライブラリから、前記第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを同定すること；
ｃ）前記第１の候補化合物ライブラリから同定された、前記第１の結合部位に親和性を示す前記第１のメンバーを、前記標的酵素と接触させること；
ｄ）第２の候補化合物ライブラリを前記第１のメンバー及び前記標的酵素と接触させること、ここで、前記第２の候補化合物ライブラリは、前記第２の結合部位に親和性を示してもよく、前記第２の候補化合物ライブラリの各化合物は、前記第１の官能基とのクリックケミストリー反応に関与することが可能な、相補的な第２の官能基を含んでなり、
前記第１のライブラリの各化合物か前記第２のライブラリの各化合物のいずれか、又は、前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、独立して、ｉ）化学元素の非放射性同位元素、ここで、前記化学元素が少なくとも１つの放射性同位元素を含んでなり及び／又はｉｉ）脱離基及び／又はｉｉｉ）金属キレート基及び／又はｉｖ）蛍光性の基、を含んでなり、各々はリンカーを介して結合されていてもよく；
ｅ）クリックケミストリー反応により、前記相補的な第１の官能基を前記第２の官能基と反応させて、前記候補イメージングプローブを形成すること；
ｆ）前記候補イメージングプローブを単離及び同定すること；
ｇ）化学合成により前記候補イメージングプローブを調製すること；及び
ｈ）イメージング適用のため、前記化学元素の非放射性同位元素を放射性同位元素に転換し、又は前記脱離基を放射性試薬で置き換えることにより、前記候補イメージングプローブをイメージングプローブへ転換すること、
を含んでなる方法。
【請求項１７】
標的酵素が、ＣＯＸ−２、ＡＫＴ、Ｐ１３Ｋ、又はＣＡ−９／ＣＡ−１２といった、疾病状態において過剰発現されるか又は過剰に活性化されるものからなる群より選ばれる、請求項１６の方法。
【請求項１８】
標的生体高分子が、アルツハイマー病患者の脳組織におけるベータ−アミロイドを含め、疾病状態において過剰発現されるタンパク質である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
第２の結合部位が、第１の結合部位の一部を構成する、請求項１６の方法。
【請求項２０】
第１のライブラリの各化合物又は第２のライブラリの各化合物又は第１及び第２の双方の化合物ライブラリの各化合物が、金属キレート基及び／又は蛍光体を含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項２１】
クリックケミストリー反応がペリ環状反応である、請求項１６の方法。
【請求項２２】
ペリ環状反応が付加環化反応である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
付加環化反応が、ディールス・アルダー反応及び１，３−双極子付加環化反応からなる群より選ばれる、請求項２１の方法。
【請求項２４】
付加環化反応が１，３−双極子付加環化反応である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
相補的なクリック官能基がアジド及びアルキンを含んでなり、クリック反応が１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する、請求項１６の方法。
【請求項２６】
第１の官能基がアジドであり、第２の官能基が末端アルキンであるか、或いは、第１の官能基が末端アルキンであり、第２の官能基がアジドである、請求項１６の方法。
【請求項２７】
ａ）〜ｆ）の段階が、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること及び、最適化された結合親和性をもつ候補イメージングプローブが同定されるまで再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される、請求項１６の方法。
【請求項２８】
脱離基が、交換反応、求核置換反応、又は求電子置換反応により、標識された誘導体を形成するのに適している、請求項１６の方法。
【請求項２９】
同定された候補イメージングプローブが、放射性同位元素で標識され、結果として得られた放射性イメージングプローブが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法に使用される、請求項２７の方法。
【請求項３０】
相補的なクリック官能基がアジド及びアルキンを含んでなり、クリック反応が１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する、請求項１６の方法。
【請求項３１】
第１の官能基がアジドであり第２の官能基がアルキンであるか、又は、第１の官能基がアルキンであり第２の官能基がアジドである、請求項１６の方法。
【請求項３２】
ａ）〜ｆ）の段階が、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること、並びに、最適化された結合、生体内分布、代謝及び薬物動態特性をもつ候補イメージングプローブが同定されるまで再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される、請求項１６の方法。
【請求項３３】
脱離基が、交換反応、求核置換反応若しくは求電子置換反応によるか、又は放射性金属と複合体を形成することにより、転換されて、標識された誘導体を形成してもよい、請求項１６の方法。
【請求項３４】
脱離基が、ハロ、ヒドロキシ、アシルオキシ、ニトロ、ジアゾニウム塩及びスルホニルオキシ基からなる群より選ばれる、請求項３３の方法。
【請求項３５】
同定されたリガンド化合物が、放射性同位元素により標識され、結果として生じたリガンド化合物が、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法のために使用される、請求項３３の方法。
【請求項３６】
放射性同位元素が、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５、Ｉ−１２７、Ｉ−１３１、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｃｕ−６４、Ｔｃ−９９ｍ、Ｙ−９０、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｃｒ−５１、Ｉｎ−１１１、Ｉｒ−１９２、１７７−Ｌｕ、Ｍｏ−９９、Ｓｍ−１５３及びＴＩ−２０１からなる群より選ばれる、請求項３５の方法。
【請求項３７】
酵素結合部位内の前記候補化合物の結合が、何ら外的な触媒の添加なしに、クリックケミストリー反応を促進する、請求項１６の方法。
【請求項３８】
第２の候補化合物ライブラリが、１又はそれ以上の化合物を含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項３９】
第１の候補化合物ライブラリ及び／又は第２の候補化合物ライブラリが、更に、化合物と第１の官能基との間のリンカー及び／又は、化合物と第２の官能基との間のリンカーを含んでなる、請求項１６の方法。
【請求項４０】
リンカーが、前記化合物と前記官能基との間のリンカー鎖中に、１〜１０個の間の原子を含んでなる、請求項３９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＥＴプローブのような、高親和性の分子イメージングプローブをスクリーニングするための、インサイチュのクリックケミストリー法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）は、疾病の検出にますます使用頻度が増えてきている分子イメージング技術である。ＰＥＴイメージングシステムは、患者の組織内における陽電子放射同位元素の分布に基づき、イメージを作成する。同位元素は、典型的には、体内で容易に代謝されるか又は局在化される（例えば、グルコース）か、又は体内の受容体部位へ化学的に結合する分子に対して共有結合により結合された、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｎ−１３又はＯ−１５といった陽電子放射同位元素を含んでなるプローブ分子の注入により、患者へ投与される。いくつかの場合には、同位元素はイオン溶液として、又は吸入により、患者へ投与される。最も広く使用される陽電子放射体標識されたＰＥＴ分子イメージングプローブの１つは、２−デオキシ−２−［18Ｆ］フルオロ−Ｄ−グルコース（［18Ｆ］ＦＤＧ）である。
【０００３】
主としてグルコーストランスポータを標的とするグルコース類似体［18Ｆ］ＦＤＧを用いたＰＥＴスキャニングは、癌の早期検出、ステージング及びリステージングのための正確な臨床ツールである。ＰＥＴ−ＦＤＧイメージングは、グルコース利用における初期の変化が結果予測と関係づけられることが示されているため、癌の、化学−及び化学放射線療法をモニターするべく、ますます使用頻度が増えている。腫瘍細胞の特徴的な性質は、迅速に増殖する腫瘍組織の高い代謝要求からの結果として生じる、その加速された解糖速度である。グルコース同様、ＦＤＧはグルコーストランスポータを介して癌細胞により取込まれ、ヘキソキナーゼによりＦＤＧ−６リン酸へリン酸化される。後者は、解糖の連鎖においてはそれ以上進むことができず、或いはその電荷の故に細胞を離れることができないため、細胞が高い解糖速度で検出できるようにする。
【０００４】
多くの状況において有用であるとはいえ、ＦＤＧ−ＰＥＴイメージングには癌のモニタリングに関して限界も又存在する。炎症組織における蓄積は、ＦＤＧ−ＰＥＴの特異性を制限する。逆に、非特異的なＦＤＧの取込みは、また、腫瘍応答の予測のためのＰＥＴの感度を制限するかもしれない。放射線療法及び化学療法薬によって処置された腫瘍細胞系では、治療誘発性の細胞ストレス反応が、ＦＤＧ取込みに一過性の増加を引き起こすことが示されている。更に、身体のいくつかの領域においては生理的な高い正常バックグラウンド活性（即ち、脳内の）は、癌関連性のＦＤＧ取込みの定量化を不能にする可能性がある。
【０００５】
このような制限のため、癌組織における他の酵素介在性の形質変換を標的とするべく、他のＰＥＴイメージングトレーサーが開発中であり、例えば、ドーパミン合成には６−［Ｆ−１８］フルオロ−Ｌ−ＤＯＰＡ、ＤＮＡ複製には３'−［Ｆ−１８］フルオロ−３'−デオキシチミジン（ＦＬＴ）、又コリンキナーゼには［Ｃ−１１］（メチル）コリン、並びに、超高特異活性受容体−リガンド結合（例えば、１６α［Ｆ−１８］フルオロエストラジアル（ｆｌｕｏｒｏｅｓｔｒａｄｉａｌ））及び、潜在的な遺伝子発現（例えば、［Ｆ−１８］フルオロ−ガンシクロビル）がある。分子を標的とした薬剤は、癌における非侵襲性のＰＥＴイメージングに向けて、大いなる潜在的価値を証明した。
【０００６】
こうした研究は、癌の特異的代謝標的に向けた非侵襲性ＰＥＴイメージングの、大いなる価値を証明してきた。ＰＥＴイメージングを患者の管理に取入れることの明確な臨床的価値にもかかわらず、限界も存在する。いくつかの例では、現行のイメージングプローブは特異性を欠くか、又はバックグラウンド特性に対し不適切なシグナルをもつ。加えて、治療介入に向けて試験されている新規な生体標的は、治療の可能性を評価するための新規なイメージングプローブを必要とするであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
癌の薬物開発を支援するため、又健康管理プロバイダーに、疾病を正確に診断しかつ治療をモニターするための手段を提供するため、腫瘍標的に対し非常に高い親和性及び特異性を示すさらなるバイオマーカーが必要である。かかるイメージングプローブは、ＰＥＴスキャナの見かけの空間分解能を劇的に改良することも可能であって、より小さい腫瘍が検出されるようになり、ナノモル量が患者に注射可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、癌及び他の疾病に関連する生体高分子を標的とする、高親和性のＰＥＴプローブを同定するための、インサイチュクリックケミストリー法（モウカーラ(Ｍｏｃｈａｒｌａ，Ｖ．Ｐ．)；コラッソン（Ｃｏｌａｓｓｏｎ，Ｂ．）；リー（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．）；ルーパー（Ｒｏｅｐｅｒ，Ｓ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）、ウォング（Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．）；コルブ（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）」、２００５年、第４４巻、ｐ．１１６−１２０）に基づくテクノロジープラットフォームを提供する。生体標的用の高親和性リガンドは、インサイチュクリックケミストリーにより作成され、これによれば、生体標的はその結合ポケットの範囲内で、２つの反応性フラグメントの集合の鋳型となる。標的により生成されたリガンドの放射性標識は、腫瘍局在についての診断及び同定を可能にし、候補ＰＥＴイメージングプローブを提供する。また、腫瘍タイプについて治療のための機械的情報を提供するであろう。スクリーニングプロセスにおいて使用される対になったフラグメントの少なくとも１つは、放射性核種（例えば、Ｆ−１８）の後程の導入を促進する目的で、そのデザインの一部として、分子イメージングプローブにおける使用に適した、その核種内に放射性同位元素を含む元素（又は化学元素）の非放射性同位元素（例えば、Ｆ−１９）をもつ。
【０００９】
１つの態様においては、本発明は、炭酸脱水酵素−ＩＩ（ＣＡ−ＩＩ）のための新規なクラスの分子イメージングプローブを同定する。生理的には、ＣＡ−ＩＩは炭酸脱水酵素ファミリーの１４の既知のイソ酵素の１つであり、身体のほとんどあらゆる臓器及び組織において発現される。このことは明らかに、二酸化炭素の重炭酸イオンへの可逆的水和を触媒する能力の重要性の反映である。この非常に重要な生物学的機能が、ＣＡ−ＩＩを、組織間のＨＣＯ3-／ＣＯ2の輸送、ｐＨ制御、骨吸収及び種々の上皮における電解質分泌に関与するプロセスにおけるキープレイヤーたらしめている。ＣＡファミリーには他のメンバーがあり、特にイソ酵素ＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩは、癌細胞において過剰発現されることが報告されている。新規なＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩイメージング剤の同定に向けてこのスクリーニング技術を更に適用することにより、ＣＡ−ＩＸ及びＣＡ−ＸＩＩを発現している腫瘍を首尾よくイメージでき、かつ、最終的には、新規な治療法及び治療養生法の確認に至ることができるであろう。
【００１０】
もう１つの態様においては、スクリーニングプラットフォームは、また、新規なトリアゾール含有シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）放射性リガンドの同定に向けて適用されたが、それは、生体内でＣＯＸ−２発現をイメージングするために使用されてもよい。アラキドン酸からのプロストグランジン（ｐｒｏｓｔｏｇｌａｎｄｉｎ）産生を触媒するＣＯＸファミリーの、誘導性のメンバーであるＣＯＸ−２は、炎症組織において高度に発現される。ＣＯＸ−２の発見によって、新規なクラスのＣＯＸ−２特異な、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が、ＣＯＸ−２介在性の炎症関連疾患、最も一般的にはリウマチ性関節炎、の治療法を提供した。こうしたＣＯＸ−２特異阻害剤は、ＣＯＸ−１ではなくＣＯＸ−２を選択的に標的とすることから、胃出血のような、従来のＮＳＡＩＤＳ関連療法に付随する共通した副作用は存在しない。新規のＣＯＸ−２療法はＣＯＸ−１阻害性の副作用に関連しないとはいえ、ＣＯＸ−２ベースの療法は、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標））の治療的使用に伴うといわれる心血管問題の結果として、多いに注目されてきた。生体内イメージングの観点から、ＣＯＸ−２阻害剤のような、まだ説明されていない副作用をもつ化合物の薬力学をモニターすることは、より安全な治療法の開発に向けた洞察及び指針を提供するであろう。
【００１１】
もう１つの態様においては、スクリーニング法は、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び抗体といった、多様な生体高分子に由来する分子イメージングプローブを同定するために用いられる。これらの生体高分子が生体内において過剰に発現されるか、又は過剰に活性化される場合、それらは分子イメージングプローブへの結合を介して検出される。例えば、高レベルの炭酸脱水酵素−ＩＩ（ＣＡ−ＩＩ）を発現する組織（例えば、赤血球）の生体内イメージングは、このスクリーニングプロセスによって同定された高親和性のＣＡ−ＩＩ放射性リガンドを投与することにより達成されてよい。もう１つの態様においては、スクリーニング技術は、また、徴候を示す生体高分子を高度に発現する腫瘍を同定するためにも適用可能である。例えば、腫瘍学イメージングの領域では、キナーゼファミリーの発癌性タンパク質を特異的に標的とする放射性リガンドは、特異な腫瘍表現型の検出をもたらすことが可能である。特に好ましい標的キナーゼは、ＰＩ−３−キナーゼ／ＡＫＴシグナリング経路（ＰＩ−３−キナーゼ：ホスホイノシトール３−キナーゼ；Ａｋｔ；プロテインキナーゼＢ）に属しており、これは癌における細胞の生存に関係する。例えば、キナーゼＡｋｔは細胞の発癌性トランスフォーメーションにおける重要な中心点であって、細胞に浸透して高い特異性及び親和性をもつ活性化されたＡｋｔを見つけ出すイメージングプローブを開発するための重要な標的となっている。
【００１２】
１つの態様においては、スクリーニング法は、酵素の結合部位に対し親和性を示してもよい多数の分子を同定することと及び、その核種内に少なくとも１つの放射性同位元素（例えば、Ｆ−１８）を包含する元素の非放射性同位元素（例えば、Ｆ−１９）を、該分子へ共有結合により結合させることとを包含する。アジド又はアルキル基といった、クリックケミストリー反応に関係し得る官能基は、場合により、１つのリンカー又は複数のリンカーを介して、該分子へ結合される。結果として生じる多数の分子の個々のメンバーは、次に、標的分子及び、酵素の基質結合部位に対し親和性を示してよい多数の化合物又は化合物のライブラリの個々のメンバーと混合される。基質結合性ライブラリのメンバーは、相補的なクリックフラグメント分子のライブラリの官能基と適合するクリックケミストリー官能基を含むように、化学的に修飾されている。１つの特別な態様においては、各ライブラリに由来する化合物からなる、標的キナーゼの二つの標的化された結合部位に対し親和性を示す化合物の任意のペアは、クリックケミストリー官能基により、インサイチュにおいて共有結合により結合する。これらのリガンドは、選択イオンモニタリング質量分析法（ＳＩＭ／ＭＳ）のような、既知の方法により同定される。これらの化合物は、その化学的合成に続き、通常のバイオアッセイ技術を用いて検定され、それらの結合定数が測定される。充分に高い結合親和性を有するリガンド（典型的には１００ｎＭ未満かつ１ｆＭを超えるＩＣ50値をもつ）は、ヒット化合物とみなされ、分子イメージングプローブとなる候補である。しかしながら、最初のスクリーニングで充分な結合親和性をもつ化合物が示されない場合には、新たなスクリーニングが開始され、最適な候補イメージングプローブが同定されるまで反復過程が繰返される。ヒット化合物は次に、標準的な放射化学技術により、分子イメージングプローブへ転換される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明をこのように一般的な用語で記述してきたため、ここで添付の図面が参照されるが、これらは必ずしも一律の縮尺に従って描かれていない。
本発明は、次に以下において更に十分に記述される。本発明は、しかしながら、多くの異なる形態において具現化されてよく、本明細書に示された態様に制限されるものとして解釈されるべきではない；むしろこれらの態様は、この開示が徹底的かつ完全であって、本発明の範囲を当業者に充分に伝えるように提供されている。
【００１４】
Ｉ．定義
本明細書において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の規定をしない限り、複数の指示物を包含する。
【００１５】
「アルキル」は、典型的には、約１から２０原子までの範囲の長さの炭化水素鎖を指す。かかる炭化水素鎖は、分枝鎖又は直鎖でよいが、典型的には直鎖が好ましい。代表的なアルキル基は、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル及び３−メチルペンチル等を含む。本明細書において使用されるように、「アルキル」は、３個又はそれ以上の炭素原子が言及される場合には、シクロアルキルを含む。
【００１６】
本明細書において使用される「アンカー部位」は、第１の結合部位と同義である。
【００１７】
「アリール」は、各５又は６個のコア炭素原子からなる１又はそれ以上の芳香環を意味する。アリールは、ナフチルにおけるように融合た、又はビフェニルにおけるように非融合の多数のアリール環を包含する。アリール環は、また、１又はそれ以上の環状炭化水素、ヘテロアリール、又はヘテロ環と融合されるか、又は未融合でもよい。本明細書に用いられるように、「アリール」はヘテロアリールを含む。
【００１８】
「生体標的」は、癌（例えば、白血病、リンパ腫、脳腫瘍、乳癌、肺癌、前立腺癌、胃癌、並びに皮膚癌、膀胱癌、骨癌、子宮頚癌、結腸癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、肝臓癌、腎臓癌、咽頭癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、腺腫、直腸癌、小腸癌、肉腫、精巣癌、尿道癌、子宮癌及び膣癌）、糖尿病、神経変性性疾患、心血管疾患、呼吸器疾患、消化器疾患、感染症、炎症性疾患及び自己免疫疾患等を始めとする、任意の種々の疾患及び症状のいずれかに関連した生物学的経路に関与している任意の生体分子であることが可能である。代表的な生物学的経路は、例えば、細胞周期調節（例えば、細胞増殖及びアポトーシス）、血管形成、シグナリング経路、腫瘍抑制経路、炎症（ＣＯＸ−２）、癌遺伝子及び成長因子受容体を含む。生体標的は、また、「標的生体高分子」又は「生体高分子」と呼ばれてもよい。生体標的は、酵素受容体、リガンド依存性イオンチャンネル、Ｇ−タンパク質共役受容体及び転写因子のような受容体であることが可能である。生体標的は、好ましくは、酵素、膜輸送タンパク質、ホルモン及び抗体のような、タンパク質又はタンパク質複合体である。１つの特に好ましい態様においては、タンパク質生体標的は、炭酸脱水酵素−ＩＩのような酵素及び、炭酸脱水酵素ＩＸ及びＸＩＩといったその関連イソ酵素である。
【００１９】
本明細書において使用される「相補的官能基」は、高い特異性をもって互いに反応して新規な共有結合を形成する化学的反応基を意味する（即ち、これらの基は互いに選択的であり、その反応により充分に定義された生成物が予測可能な様式で得られる）。
【００２０】
「シクロアルキル」は、架橋、融合、又はスピロ環状化合物を含む、好ましくは３〜約１２個、更に好ましくは３〜約８個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和の環状炭化水素鎖を指す。
「ヘテロアリール」は、１から４個までのヘテロ原子、好ましくはＮ、Ｏ若しくはＳか又はこれらの組合せを含有するアリール基である。ヘテロアリール環は、また、１又はそれ以上の環状炭化水素、ヘテロ環、アリール又はヘテロアリール環と融合されていてもよい。
【００２１】
「ヘテロ環」又は「ヘテロ環系」は、不飽和結合ないし芳香族性を有し又は有しない、少なくとも１つの炭素ではない環原子を有している、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子からなる１又はそれ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子は、硫黄、酸素及び窒素を含む。
【００２２】
本明細書に用いられ、又当該技術分野において周知として定義される「キナーゼ」は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からのリン酸塩を基質分子上へ転移する酵素である。キナーゼは、リン酸化における共因子であるＡＴＰへの結合部位と、典型的には別のタンパク質である基質分子に対する少なくとも１つの結合部位とを含む。
【００２３】
本明細書に用いられる「脱離基」は、例えば、アミン、チオール又はアルコール求核試薬といった求核試薬か又はその塩により、容易に置換される基を指す。かかる脱離基は周知であり、例えば、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン化物、トリフレート、トシレート、−ＯＲ、−ＳＲ等を包含する。
【００２４】
「リガンド」は、タンパク質等の生体標的分子上の第１の結合部位に対し親和性を示す第１の基と、同じ生体標的分子上の第２の結合部位に対し親和性を示す第２の基とを含んでなる分子であり、好ましくは約８００Ｄａ未満、更に好ましくは約６００Ｄａ未満の分子量を有する。これらの２つの結合部位は、標的分子上の同じ結合ポケット内の別々の領域であることが可能である。リガンドは、好ましくは、生体標的分子に対しナノモルの結合親和性を示す。本明細書に開示された、いくつかの観点においては、リガンドは「基質」と同義的に用いられている。リガンドは、本明細書に定義された「分子構造」を含んでなるものであってもよい。
【００２５】
本明細書に用いられる「リンカー」は、１〜１０個の原子を含んでなる鎖を指し、Ｃ、−ＮＲ−、Ｏ、Ｓ、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）2−、ＣＯ、−Ｃ（ＮＲ）−等といった原子又は基を含んでいてもよく、Ｒは、Ｈ又は、各々置換又は非置換の、（Ｃ1-10）アルキル、（Ｃ3-8）シクロアルキル、アリール（Ｃ1-5）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ1-5）アルキル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ1-10）アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシからなる群より選ばれる。リンカー鎖は、また、多環及びヘテロ芳香環を含め、飽和、不飽和又は芳香族性の環の一部を含んでなるものであってもよい。
【００２６】
本明細書において使用される「金属キレート基」は、当該技術分野において定義されるとおりであり、例えば、選択的に金属イオンに付着又は結合して錯体を形成する、分子、フラグメント又は官能基を包含してよい。いくつかの有機化合物は、該有機化合物の２個又はそれ以上の原子を介し、金属と配位結合を形成してもよい。かかる分子の実例は、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ及びポルフィンを含む。
【００２７】
「分子構造」は、クリック官能基へ結合されているか、脱離基及び／又は放射性同位元素に対し結合されていてもよい、分子、分子の一部又はフラグメントを指し、或いはいくつかの変形においては、分子は、クリック官能基へ結合されているリンカーに対し結合されていてもよい。かかる分子構造の実例は、これらに限るものではないが、例えば、置換又は非置換のメチレン、各々がＯ、Ｎ及びＳからなる群より選ばれるヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又は分枝鎖のアルキル基（Ｃ１−Ｃ１０）、それぞれ置換又は非置換のアリール又はヘテロアリール基、生体高分子、ヌクレオシド及びその類似体又は誘導体、ペプチド又はペプチド模擬体、炭水化物及びこれらの組合せを包含する。
【００２８】
「ポリデンテート金属キレート基」は、金属に同時に配位する（即ち、キレートする）ことが可能な２個又はそれ以上の供与体原子をもつ化学基を意味する。従ってポリデンテート基は、２個又はそれ以上の供与体原子を有し、かつ配位圏内に２つ又はそれ以上の部位を占める。
【００２９】
用語「患者」及び「被験者」は、特に全ての哺乳類を含めて、任意のヒト又は動物被験者を指す。
【００３０】
用語「ペリ環状反応」は、結合が協奏的な環状遷移状態において形成又は破壊される反応を指す。協奏反応は、反応の過程を通じて何ら中間体が関与しないものである。典型的には、反応物自体が偶然帯電されていること、即ちカルボニウム又はカルバニオンであることがない限り、反応速度に対する溶媒効果は比較的小さい。
【００３１】
本明細書において使用されるように、「放射化学」は、共有結合により結合された放射性同位元素を含んでなる任意の有機、無機又は有機金属化合物、任意の無機放射性イオン溶液（例えば、Ｎａ［18Ｆ］Ｆイオン溶液）又は任意の放射性ガス（例えば、［11Ｃ］ＣＯ2）を包含することが意図され、特に、組織イメージングを目的とする、患者への投与（例えば、吸入、摂取又は静脈内注射による）を意図した放射性分子イメージングプローブを包含し、これらは、また、当該技術分野では、放射性医薬品、放射性トレーサー、放射性リガンドとも呼ばれる。本発明は主に、ＰＥＴイメージングシステムにおいて使用される陽電子放射分子イメージングプローブの合成に向けられているが、本発明は、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のような他のイメージングシステムにおいて有用な放射性化学薬品を始めとする、放射性核種を含んでなる任意の放射性化合物の合成に向けて容易に適応され得る。
【００３２】
本明細書において使用されるように、用語「放射性同位元素」は、放射性崩壊（即ち、陽電子放射）を示す同位元素、及び、放射性同位元素（例えば、［11Ｃ］メタン、［11Ｃ］一酸化炭素、［11Ｃ］二酸化炭素、［11Ｃ］ホスゲン、［11Ｃ］尿素、［11Ｃ］臭化シアン、並びに、炭素−１１を含有する種々の酸塩化物、カルボン酸、アルコール、アルデヒド及びケトン）を含んでなる放射性標識薬剤を指す。かかる同位元素は、また、当該技術分野においては、放射性同位元素又は放射性核種とも呼ばれる。放射性同位元素は、本明細書においては、元素の名前又は記号及びその質量数の、一般に使用される種々の組合せを用いて命名される（例えば、18Ｆ、Ｆ−１８又はフッ素−１８）。代表的な放射性同位元素は、Ｉ−１２４、Ｆ−１８フッ化物、Ｃ−１１、Ｎ−１３及びＯ−１５を含み、これらは、それぞれ、４．２日、１１０分、２０分、１０分及び２分間の半減期を有する。放射性同位元素は、好ましくは極性非プロトン性溶媒等の有機溶媒中に溶解される。好ましくは、本発明において使用される放射性同位元素は、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２７、Ｉ−１３１、Ｂｒ−７６、Ｃｕ−６４、Ｔｃ−９９ｍ、Ｙ−９０、Ｇａ−６７、Ｃｒ−５１、Ｉｒ−１９２、Ｍｏ−９９、Ｓｍ−１５３及びＴＩ−２０１を含む。使用されてよい他の放射性同位元素は：Ａｓ−７２、Ａｓ−７４、Ｂｒ−７５、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６１、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６８、Ｇｅ−６８、Ｉ−１２５、Ｉ−１３２、Ｉｎ−１１１、Ｍｎ−５２、Ｐｂ−２０３及びＲｕ−９７を包含する。
【００３３】
光学イメージング薬剤は、４００ｎｍより大きく１２００ｎｍより小さい波長の放射を有する分子を指す。光学イメージング薬剤の実例は、アレックス・フルオール（Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ）、ＢＯＤＩＰＹ、ナイル・ブルー（Ｎｉｌｅ  Ｂｌｕｅ）、ＣＯＢ、ローダミン、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）、フルオレセイン及びアクリジンである。
【００３４】
用語「反応性前駆体」は、低分子、天然産物又は生体分子（例えば、ペプチド又はタンパク質）といった、アジド又はアルキニル基の付加により化学的に修飾可能である任意の多様な分子に向けられている。２つの前駆体分子からのリガンド形成のためには、前駆体分子のうちの１つは、その核種内に放射性同位元素を有する元素の非放射性同位元素を含んでなる。本明細書において使用されるいくつかの観点においては、用語「リガンド」は、生体高分子へ結合する前駆体、化合物及びイメージングプローブを指してよい。リガンドの２つの前駆体は、好ましくは、酵素のような生体標的分子上の別々の結合部位（又は、同一の結合部位又はポケットの別々の部分）に対し親和性を示す。生体高分子上の活性部位に対して結合親和性を有する反応性前駆体は、本明細書において「アンカー分子」と呼ばれることがある。キナーゼの基質結合部位に対し結合親和性を有する反応性前駆体は、本明細書において「基質模擬体」と呼ばれることがある。用語「反応性前駆体」は、また、候補化合物のライブラリを含んでなる候補化合物を調製するべく使用される、前駆体又は化合物を指してもよい。
【００３５】
リガンド放射化学の態様による方法の特別の観点においては、１つの前駆体分子は、放射性同位元素を共有結合により該前駆体へ結合させる目的で、求核置換により容易に置き換えられることが可能な脱離基を含んでいてもよい。代表的な反応性前駆体は、既存のＰＥＴプローブ分子、ＥＧＦ、癌マーカー（例えば、乳癌用のｐ１８５ＨＥＲ２、卵巣、肺、乳、膵臓、及び消化管癌用のＣＥＡ及び前立腺癌用のＰＳＣＡ）、成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ）、自己免疫疾患に関係する糖タンパク質（例えば、ＨＣ  ｇｐ−３９）、腫瘍又は炎症特異性の糖タンパク質受容体（例えば、セレクチン）、インテグリン特異性抗体、ウイルス関連抗原（例えば、ＨＳＶ糖タンパク質Ｄ、ＥＶｇｐ）及び臓器特異性遺伝子産物に対し、構造上の類似性をもつ低分子を包含する。
【００３６】
本明細書において使用される「置換された」又は「置換基」は、その１又はそれ以上の水素原子が、−Ｃ1-5アルキル、Ｃ2-5アルケニル、ハロゲン（塩素、フッ素、臭素、ヨウ素原子）、−ＣＦ3、ニトロ、アミノ、オキソ、−ＯＨ、カルボキシル、−ＣＯＯＣ1-5アルキル、−ＯＣ1-5アルキル、−ＣＯＮＨＣ1-5アルキル、−ＮＨＣＯＣ1-5アルキル、−ＯＳＯＣ1-5アルキル、−ＳＯＯＣ1-5アルキル、−ＳＯＯＮＨＣ1-5アルキル、−ＮＨＳＯ2Ｃ1-5アルキル、アリール及びヘテロアリール等といった基（置換基）によって置換されている（これらの基が更に置換されてもよい）化合物又は官能基を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「基質模擬体」は、その三次元構造、電荷分布及び水素結合供与体又は受容体の向きにおいて酵素基質に類似しており、それにより酵素の活性部位により認識可能である化合物を意味する。
【００３８】
ＩＩ．インサイチュクリックケミストリー法
分子イメージングプローブの調製のための従来法は、堅く結合している分子の同定から始まる。この分子は、大規模スクリーニング又はＳＡＲ開発から、あらかじめ同定されていてもよい。化合物は次に、放射性標識のし易さ、並びに、分子自体の上の優先的な標識化部位について評価される。ひとたび放射性標識用の位置が決まれば、化合物は、ＰＥＴイメージングに使用される場合には、１８Ｆ−フッ化物を用いた標識化によりイメージング薬剤へ転換され、マウス等の適当な生きた生物体へ注入され、ＰＥＴスキャナを用いて画像化されて、トレーサーの生体分布、薬物動態及び薬力学的プロフィール、代謝及び排出経路を決定する。分子内へ導入された放射性元素が元の分子中にその非放射性同位元素として存在しなかった例では、標識された化合物が親化合物とは非常に異なる挙動をすることが可能性として存在する。例えば、水素原子の代わりに１８Ｆ−フッ化物を導入すると、イメージングプローブの標的に対する結合親和性の脆弱化を引き起こす可能性がある。この脆弱化は、トレーサーの生体内の局在化を妨げることがあり、従って適切なＰＥＴイメージの形成を妨げ得る。
【００３９】
分子イメージングプローブの同定に向けた代替えのアプローチは、リガンドを含有する非放射性同位元素のライブラリを調製し、各々の個別のリガンドを、生体外での潜在的活性についてスクリーニングすることであろう。ひとたびヒットが見出されれば、この分子はその放射性類似体へ転換され、生体内で画像化される。この親化合物の放射性類似体は、放射性同位体の立体化学及び電子工学における類似性の故に、親化合物と同様の物理化学的特性を保有することが期待される。この方法の欠点は、潜在的に多数の化合物が調製され、同定され、精製され、活性に関し個別にスクリーニングされねばならないことである。このプロセスは、多くの時間、投資及び努力を必要とする。クリックケミストリーの使用により、生体標的をその好ましい潜在的分子イメージングプローブを組立てるための反応器として使用する第３の方法は、先の２つの方法よりも明確な利点を示すであろう。
【００４０】
クリックケミストリーは、生体標的に対し極端に高い親和性を示す低分子ＰＥＴイメージングトレーサーをデザインする機会を与え、優れたシグナル対バックグラウンド比をもつ「高性能」分子イメージングのためのステージを設定する。クリックケミストリーは、最も実用的かつ信頼できる化学的転換のみを利用する、化学合成への組立て式のアプローチである。この技術は、標的の結合ポケット内に、ビルディングブロック試薬を不可逆的に組立てることにより、高親和性の阻害剤を産生する。インサイチュクリックケミストリーの一般的なアプローチは、図１に呈示されている。クリックケミストリー技術は、例えば、以下の参考文献に記述されている。これあの参考文献の全てが参考として本明細書に組み込まれる：
・コルブ（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．）；フィン（Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー、国際版（Ａｎｇｅｗａｎｄｅｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」、２００１年、第４０巻、ｐ．２００４−２０２１。
・コルブ（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）著、「ドラッグ・ディスカバリ・トゥデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ）」、２００３年、第８巻、ｐ．１１２８−１１３７。
・ロストーフツェフ（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．）；グリーン（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｇ．）；フォキン（Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー、国際版（Ａｎｇｅｗａｎｄｅｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」、２００２年、第４１巻、ｐ．２５９６−２５９９。
・トルネー（Ｔｏｒｎφｅ，Ｃ．Ｗ．）；クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．）；メルダル（Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．）著、「ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第６７巻、ｐ．３０５７−３０６４。
・ワン（Ｗａｎｇ，Ｑ．）；チャン（Ｃｈａｎ，Ｔ．Ｒ．）；ヒルグラフ（Ｈｉｌｇｒａｆ，Ｒ．）；フォキン（Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）；フィン（Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．）著、「ジャーナル・オブ・ディ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、２００３年、第１２５巻、ｐ．３１９２−３１９３。
・リー（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．）；ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｌ．）；フワング（Ｈｕａｎｇ，Ｓ．−Ｊ．）；フォキン（Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）；ウォング（Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．）著、「ジャーナル・オブ・ディ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ」、２００３年、第１２５巻、ｐ．９５８８−９５８９。
・ルイス（Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．）；グリーン（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｇ．）；グリンスパン（Ｇｒｙｎｓｚｐａｎ，Ｆ．）；ラディック（Ｒａｄｉｃ，Ｚ．）；カーリア（Ｃａｒｌｉｅｒ，Ｐ．Ｒ．）；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．）；フィン（Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．）；バリー（Ｂａｒｒｙ，Ｋ．）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー、国際版」、２００２年、第４１巻、ｐ．１０５３−１０５７。
・マネッシュ（Ｍａｎｅｔｓｃｈ，Ｒ．）；クラシンスキ（Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ａ．）；ラディック（Ｒａｄｉｃ，Ｚ．）；ラウシェル（Ｒａｕｓｈｅｌ，Ｊ．）；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）；コルブ（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．）著、「ジャーナル・オブ・ディ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ」、２００４年、第１２６巻、ｐ．１２８０９−１２８１８。
・モカルラ（Ｍｏｃｈａｒｌａ，Ｖ．Ｐ．）；コラソン（Ｃｏｌａｓｓｏｎ，Ｂ．）；リー（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．）；ルーパー（Ｒｏｅｐｅｒ，Ｓ．）；シャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．）；ウォング（Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．）；コルブ（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー、国際版」、２００５年、第４４巻、ｐ．１１６−１２０。
・ホワイティング（Ｍ．Ｗｈｉｔｉｎｇ）；マルドーン（Ｊ．Ｍｕｌｄｏｏｎ）；リン（Ｙ．−Ｃ．Ｌｉｎ）；シルバーマン（Ｓ．Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ）；リンドストロム（Ｗ．Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ）；オルソン（Ａ．Ｊ．Ｏｌｓｏｎ）；コルブ（Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ）；フィン（Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ）；シャープレス（Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）；エルダー（Ｊ．Ｈ．Ｅｌｄｅｒ）；フォキン（Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー（Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．）」、２００６年、第１１８巻、ｐ．１４６３−１４６７；「アンゲヴァンテ・ヘミー、英語国際版（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．）」、２００６年、第４５巻、ｐ．１４３５−１４３９。
【００４１】
上記の参考文献に記述されたもののような、他のクリックケミストリー官能基が使用可能であるが、付加環化反応、特にアジドのアルキニル基との反応の使用が好ましい。末端アルキンのようなアルキン及びアジドは、１，３−双極子付加環化を受け、１，４−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する。別法として、１，５−二置換１，２，３−トリアゾールが、アジド及びアルキニル試薬を用いて形成され得る（クラシンスキ（Ｋｒａｓｉｎｓｋｉ，Ａ．）、フォキン（Ｆｏｋｉｎ，Ｖ．Ｖ．）及びバリー（Ｂａｒｒｙ，Ｋ．）著、「オーガニック・レターズ（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００４年、ｐ．１２３７−１２４０）。ヘテロ・ディールス・アルダー反応又は１，３−双極子付加環化反応も、また、使用可能である（ホイスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）著、「１，３−ダイポーラー・シクロアディション・ケミストリー（１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１巻」，パドワ（Ｐａｄｗａ，Ａ．）編、ウイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ｐ．１−１７６；ジョーゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）著、「アンゲヴァンテ・ヘミー、英語国際版」、２０００年、第３９巻、ｐ．３５５８−３５８８；ティーツ（Ｔｉｅｔｚｅ，Ｌ．Ｆ．）及びケッチャウ（Ｋｅｔｔｓｃｈａｕ，Ｇ．）著、「トピックス・イン・カレント・ケミストリー（Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９７年、第１８９巻、ｐ．１−１２０）。これらの反応は、生体標的分子により、インサイチュにその結合ポケット内で触媒される。生体標的触媒反応とは異なり、どちらかの部位に対する結合基をもつ、アジドと、アセチレン又はアルキニル反応前駆体との間の、熱的１，３−双極子付加環化反応は、室温では極めて遅く、反応物はバイオ−オルトゴナルであり（即ち、それらは生体分子と反応せず、生理的条件下ではほとんど不活性である）、従って阻害化合物がインサイチュで生成されるという主張を支持する。この、非触媒反応の極小化は、スクリーニング法において偽陽性をもたらすこととなる、望ましくない非鋳型標的リガンドの形成及び同定を防止する。
【００４２】
１つの特別の態様においては、本明細書に議論されたインサイチュクリックケミストリー法は、デザインの一部としてＰＥＴ標識をもつ、ナノモル以下の力価をもつ新規なリガンドを生成する。リガンド発見段階の間は、非放射性又は「コールド」の同位元素（例えば、Ｆ−１９）が、ＰＥＴ放射性核種のためのプレースホルダーとして使用される。ひとたび高親和性のリガンドが見出されれば、Ｆ−１９はＦ−１８で置き換えられる。この標的ガイド戦略は、選択的に酵素に結合し次いでその結合ポケットの領域内で互いに不可逆的に結合する「一価の」ビルディングブロック試薬から、強力なリガンド阻害剤を生成するための鋳型として酵素自体を利用する。このアプローチは、何千というライブラリ化合物の合成、精製及びスクリーニングを必要とするのではなく、生体標的を用いて、比較的少ない試薬（何千もの異なる方法で組合されてよい）からそれ自体の阻害剤を組立てることから、従来のコンビナトリアルケミストリーよりも更に効率的であることを約束する。酵素に発生されたヒットの追跡試験は、次に、標的に対するそれらの結合親和性及び特異性を立証する。１つの特別の態様において、タンパク質のような生体高分子との多重の相互作用をもつ二価の分子では、結果として生じるヒットは非常に強力である。結果として得られる二価の分子は、共因子結合部位へ結合し、基質ポケット内へ到達する。主としてエントロピー的な理由（３度の、回転及び並進自由度の損失の回避）のため、リガンド阻害剤は、それらの生体標的に対し、個々の成分よりもはるかに高い親和性を示す。従って、個々の結合ポケットに対し、あまり大きくないマイクロモルの親和性しかもたないフラグメントであっても、生体標的との最適の結合相互作用を可能にするべく一緒に結合された場合、ナノモルの阻害剤を生成することが可能である。従って、ビルディングブロック試薬又は前駆体の、酵素に対する結合親和性は、ナノモルの範囲である必要がない。マイクロモルの親和性は、クリックケミストリー反応が起こるのに充分である。
【００４３】
インサイチュクリックケミストリーは、従来の手段によって苦心して調製された最終化合物のスクリーニングに依存せず、むしろ酵素に、その結合部位内へフィットするビルディングブロックを選択及び組合させて、その固有の阻害剤分子を組立てることができることから、しばしば、分子プローブ発見に向けて魅力的な新規なアプローチを提供する。例えば、わずか２００個のビルディングブロック（１００個のモノアジド及び１００個のモノアセチレン）を用いて、２０，０００個の可能な組合せ（１００×１００×２；係数「２」は、シン−及びアンチ−トリアゾール形成が可能であることを説明する）を、実際にこれらの化合物を作成する必要なしに、迅速にスキャンすることが可能である。この数は、もし１つがジ−若しくはトリ−アジド又はジ−若しくはトリ−アセチレンを含むなら、同じ数のビルディングブロックを用いて、更に大きくなり、これによって、適当なビルディングブロック及び官能基を同時に選択するための、より大きい柔軟性をもつ酵素を提供する。スクリーニング法は、所与の試験混合物中に生成物が形成されているか否かを、ＬＣ／ＭＳにより測定するという単純なものである。酵素により形成される化合物は、相互作用の多価性のため、良好かつ選択的な結合剤になりそうである。
【００４４】
リガンド開発か又はイメージングプローブ同定のための方法は、二段階で起きてよい。いくつかの態様では、発見段階の間は、それぞれの化合物は「コールド」Ｆ−１９原子をもち、化合物の酵素に対する結合親和性をかなりの程度で変化させることなく、後で「ホット」Ｆ−１８を導入するために備えておく。前駆体は、低いマイクロモル又はそれを上回る親和性をもって標的の結合ポケットへ付着し、かつバイオ−オルトゴナルな官能基（アジド又はアセチレン）をもつ化合物である。本方法の１つの態様においては、各分子は１つのフッ素原子をもち、それは後に、Ｆ−１８放射性核種によって置き換えられる。いくつかの態様においては、基質模擬体又はリンカーモジュールよりもむしろ、アンカー分子内にフッ素原子を導入することが好ましく、その理由は、このことが合成のための努力を最小限にするからであり−潜在的なアンカー分子の総数は、基質／リンカー成分の数よりもずっと小さいことから、より少ないフッ素含有化合物を作成すればよいからである。
【００４５】
１つの態様においては、スクリーニング法は、標的酵素の結合部位に親和性を示す多数の分子を同定すること及び、その核種に少なくとも１つの放射性同位元素を含む元素の非放射性同位元素（例えば、Ｆ−１９又はＩ−１２７）を、該分子へ結合することを伴う。アジド又はアルキニル基といった、クリックケミストリー反応に関与することが可能な官能基は、必要ならばリンカーを介して、該分子へ結合される。結果として生じる多数の分子の個々のメンバーは、次に標的分子及び、酵素の基質結合部位に親和性を示すであろう多数の化合物又は化合物のライブラリと混合される。基質結合性ライブラリのメンバーは、化学的に修飾されて共因子結合性分子のライブラリの官能基と適合するクリックケミストリー官能基を含んでいる。従って、酵素の結合部位に親和性を示す各々のライブラリから由来する、化合物の任意のペアは、クリックケミストリー官能基を介しインサイチュで共有結合する。スクリーニングプロセスにおいては、マルチウェルマイクロタイタープレートのような、当該技術分野において公知の通常のスクリーニング装置を利用することが可能である。
【００４６】
質量分析計は、スクリーニングプロセスの一連の自動化されたデータ分析のために使用されてよい。使用可能な質量分析計装置の実例は、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＭＳＤ１１００ＳＬシステム、リニアイオントラップシステム（サーモ・フィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＴＱ）、４極子イオントラップ（ＬＣＱ）又は４極子飛行時間（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）又はアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＱＴＯＦ）を包含する。これらの分析器のそれぞれは、ＬＣ−ＭＳ実験用の非常に有効なＨＰＬＣインターフェースを有する。
【００４７】
１つの態様においては、出発前駆体フラグメントは、アンカー分子であってもよく、発見は既知の薬物及び／又は基質に基づき、小さい、標的化された化合物のライブラリ（例えば、１００個未満の化合物）をデザインすることにより実行可能である。これらのライブラリは、通常の結合アッセイを用いてスクリーニングされてよい。アンカー分子は、酵素標的及び、相補的なクリックケミストリー試薬又は前駆体（例えば、アンカー分子がアジドである場合にはアセチレン）の小さいライブラリと一緒にインキュベートされてよい。各々の反応混合物は、ＬＣ／ＭＳにより分析されて、酵素により形成された生成物を同定する。ヒット確認は、化合物が実際に酵素によって形成されることを証明するための競合実験によって実行され、結合アッセイが酵素によって発生されたヒットの結合親和性を立証し得る。
【００４８】
１つの態様においては、アンカー分子は、後で酵素の内部でリガンド化合物へへ転換するため、バイオ−オルトゴナルな官能基（例えば、−Ｎ3、−Ｃ≡ＣＲ（式中、Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリール等））をもつ。好ましくは、Ｒは水素である。更に、各候補アンカー分子は１つのフッ素原子をもっており、それは求核置換化学により容易に導入され、対応する放射性核種で「コールド」の［Ｆ−１９］を置換することにより、後で［Ｆ−１８］標識することを可能にする。この変化は、結合親和性に対し最小限の影響しか及ぼさないことが期待され、それによりＰＥＴプローブの開発を更に予測可能なものとなる。
【００４９】
２つの反応基又は前駆体の間のリンカーの性質及び長さは、化合物に最適の結合親和性を与えるべく選択されてよい。それ故、種々のタイプのリンカーが、上述の基質模擬体に結合可能である。このことは、直接的（トリアゾール形成）又は間接的（アジド還元及びそれに続く、結果として生じるアミンのアシル化又はスルホニル化）にアジド基を関与させる、炭素−ヘテロ原子結合形成反応により容易に達成されることが可能である。基質模擬体のライブラリは、好ましくは、ジ−アジド及びジ−アセチレンを包含し、これにより可能な組合せ反応の数が増える。
【００５０】
発明の側面：
１つの態様においては、候補イメージングプローブを同定するための方法であって：
ａ）第１の候補化合物ライブラリを標的生体高分子と接触させること、ここで、前記第１の化合物ライブラリの各化合物は、クリックケミストリー反応に関与することが可能な第１の官能基を含んでなり、各化合物は、第１の結合部位及び第２の結合部位を含んでなる標的生体高分子の前記第１の結合部位に親和性を示してもよく；
ｂ）前記第１の候補化合物ライブラリから、前記第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを同定すること；
ｃ）前記第１の候補化合物ライブラリから同定された、前記第１の結合部位に親和性を示す前記第１のメンバーを、前記標的生体高分子と接触させること；
ｄ）第２の候補化合物ライブラリを前記第１のメンバー及び前記標的生体高分子と接触させること、ここで、前記第２の候補化合物ライブラリは、前記第２の結合部位に親和性を示してもよく、前記第２の候補化合物ライブラリの各化合物は、前記第１の官能基とのクリックケミストリー反応に関与することが可能な、相補的な第２の官能基を含んでなり、
前記第１のライブラリの各化合物か前記第２のライブラリの各化合物のいずれか、又は、前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、独立して、ｉ）化学元素の非放射性同位元素、ここで、前記化学元素が少なくとも１つの放射性同位元素を含んでなり及び／又はｉｉ）脱離基及び／又はｉｉｉ）金属キレート基及び／又はｉｖ）蛍光性の基、を含んでなり、各々はリンカーを介して結合されていてもよく；
ｅ）生体高分子により誘起されるクリックケミストリー反応により、前記相補的な第１の官能基を前記第２の官能基と反応させて、前記候補イメージングプローブを形成すること；
ｆ）前記候補イメージングプローブを単離及び同定すること；
ｇ）化学合成により候補イメージングプローブを調製すること；及び
ｈ）イメージング適用のため、前記元素の非放射性同位元素を放射性同位元素に転換し、又は前記脱離基を放射性試薬で置換え、又は放射性金属と複合体を形成することにより、前記候補イメージングプローブをイメージングプローブへ転換すること、
を含んでなる方法が提供される。前記方法の１つの変形においては、前記生体高分子は、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、イオンチャンネル及び抗体からなる群より選ばれる。もう１つの変形においては、前記標的生体高分子は、アルツハイマー病患者の脳組織におけるベータ−アミロイドのような、疾病状態において過剰発現されるタンパク質である。
【００５１】
上記の方法のもう１つの側面においては、前記第２の結合部位は、前記第１の結合部位の一部を構成する。この方法の１つの変形においては、前記第１のライブラリの各化合物又は前記第２のライブラリの各化合物か、又は前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、金属キレート基及び／又は蛍光体を含んでなる。１つの特別の変形においては、前記クリックケミストリー反応はペリ環状反応である。上記のもう１つの変形においては、前記ペリ環状反応は付加環化反応である。なお、もう１つの変形においては、前記付加環化反応は、ディールス・アルダー反応及び１，３−双極子付加環化反応からなる群より選ばれる。好ましくは、本発明において使用されるいくつかの方法においては、前記付加環化反応は１，３−双極子付加環化反応である。
【００５２】
上記の方法の更にもう１つの側面においては、相補的なクリック官能基は、アジド及びアルキンを含んでなり、前記クリック反応は１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する。１つの変形においては、前記第１の官能基はアジドであり、前記第２の官能基はアルキンであるか、又は、前記第１の官能基がアルキンであり、前記第２の官能基はアジドである。もう１つの変形においては、前記アルキンは末端アルキンである。上記の方法の１つの特別の変形においては、ａ）〜ｆ）の段階は、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること、並びに、最適化された結合、生体内分布、代謝及び薬物動態特性をもつ候補イメージングプローブが同定されるまで再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される。
【００５３】
１つの特別の側面においては、同定された前記イメージングプローブは、標的化された生体高分子に対し、高い結合親和性及び特異性を示す。好ましくは、結合親和性はナノモル又はそれを上回るものであり、同定されたイメージングプローブは、最適の生体内分布、代謝、薬物動態及びクリアランス特性を示す。
【００５４】
上記の方法の１つの変形においては、前記脱離基は、転換されて、交換反応、求核置換反応又は求電子置換反応により、標識された誘導体を形成してもよい。上記の方法のもう１つの変形においては、同定された候補イメージングプローブは、放射性同位元素で標識され、結果として得られた放射性イメージングプローブは、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法に使用される。
【００５５】
もう１つの態様においては、候補イメージングプローブを同定するための方法であって；
ａ）第１の候補化合物ライブラリを標的酵素と接触させること、ここで、前記第１の化合物ライブラリの各化合物は、クリックケミストリー反応に関与することが可能な第１の官能基を含んでなり、各化合物は、第１の結合部位及び第２の結合部位を含んでなる標的酵素の、前記第１の結合部位に親和性を示してもよく；
ｂ）前記第１の候補化合物ライブラリから、前記第１の結合部位に親和性を示す第１のメンバーを同定すること；
ｃ）前記第１の候補化合物ライブラリから同定された、前記第１の結合部位に親和性を示す前記第１のメンバーを、前記標的酵素と接触させること；
ｄ）第２の候補化合物ライブラリを前記第１のメンバー及び前記標的酵素と接触させること、ここで、前記第２の候補化合物ライブラリは、前記第２の結合部位に親和性を示してもよく、前記第２の候補化合物ライブラリの各化合物は、前記第１の官能基とのクリックケミストリー反応に関与することが可能な、相補的な第２の官能基を含んでなり、
前記第１のライブラリの各化合物か前記第２のライブラリの各化合物のいずれか、又は、前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、独立して、ｉ）化学元素の非放射性同位元素、ここで、前記化学元素が少なくとも１つの放射性同位元素を含んでなり及び／又はｉｉ）脱離基及び／又はｉｉｉ）金属キレート基及び／又はｉｖ）蛍光性の基、を含んでなり、各々はリンカーを介して結合されていてもよく；
ｅ）クリックケミストリー反応により、前記相補的な第１の官能基を前記第２の官能基と反応させて、前記候補イメージングプローブを形成すること；
ｆ）前記候補イメージングプローブを単離及び同定すること；
ｇ）化学合成により前記候補イメージングプローブを調製すること；及び
ｈ）イメージング適用のため、前記化学元素の非放射性同位元素を放射性同位元素に転換し、又は前記脱離基を放射性試薬で置き換えることにより、前記候補イメージングプローブをイメージングプローブへ転換すること、
を含んでなる方法が提供される。
【００５６】
本方法の１つの側面においては、いくつかの生体高分子については、前記第１の結合部位は共因子結合部位であり、前記第２の結合部位は基質結合部位である。
【００５７】
上記の方法の１つの変形においては、前記標的酵素は、ＣＯＸ−２、ＡＫＴ、Ｐ１３Ｋ又はＣＡ−９／ＣＡ−１２といった、疾病状態において過剰発現されるか又は過剰に活性化されるものからなる群より選ばれる。もう１つの変形においては、前記標的生体高分子は、アルツハイマー病患者の脳組織におけるベータ−アミロイドを含め、疾病状態において過剰発現されるタンパク質である。なおもう一つの変形においては、前記第２の結合部位は、前記第１の結合部位の一部を構成する。上記の方法の１つの特別の側面においては、前記第２の結合部位は、前記第１の結合部位の一部又は一区域を構成しており、第２の候補化合物の結合は、前記第１の結合部位をキャッピングすることにより、前記結合部位へ結合する。上記の方法のなおもう１つの変形においては、前記第１のライブラリの各化合物又は前記第２のライブラリの各化合物か又は前記第１及び前記第２の双方の化合物ライブラリの各化合物は、金属キレート基及び／又は蛍光体を含んでなる。もう１つの変形においては、クリックケミストリー反応はペリ環状反応である。好ましくは、いくつかの変形においては、ペリ環状反応は付加環化反応である。更にもう１つの変形においては、前記付加環化反応は、ディールス・アルダー反応及び１，３−双極子付加環化反応からなる群より選ばれる。好ましくは、上記のいくつかの変形においては、前記付加環化反応は１，３−双極子付加環化反応である。更にもう１つの変形においては、前記相補的なクリック官能基は、アジド及びアルキンを含んでなり、前記クリック反応は、１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する。
【００５８】
上記の方法の１つの特別な変形においては、前記第１の官能基はアジドであり、前記第２の官能基は末端アルキンであるか、又は、前記第１の官能基は末端アルキンであり、前記第２の官能基はアジドである。本方法のもう１つの変形においては、ａ）〜ｆ）の段階は、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること及び、最適化された結合親和性を有する候補イメージングプローブが同定されるまで、再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される。なおもう１つの変形においては、前記脱離基は、交換反応、求核置換反応又は求電子置換反応により、標識された誘導体を形成するのに適している。上記の方法のもう１つの側面においては、同定された候補イメージングプローブは、放射性同位元素で標識され、結果として得られた放射性イメージングプローブは、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法に使用される。上記の１つの変形においては、前記相補的なクリック官能基は、アジド及びアルキンを含んでなり、前記クリック反応は１，２，３トリアゾールを含んでなる生成物を形成する。なおもう１つの変形においては、前記第１の官能基はアジドであり、前記第２の官能基はアルキンであるか、或いは、前記第１の官能基がアルキンである場合、前記第２の官能基はアジドである。上記の１つの特別な側面においては、前記クリック反応において用いられるアルキンは、末端アルキンである。
【００５９】
上記の方法の１つの特別の変形においては、ａ）〜ｆ）の段階は、新規な第１の化合物ライブラリ及び／又は第２の化合物ライブラリを調製すること及び、最適化された結合、生体内分布、代謝及び薬物動態特性をもつ候補イメージングプローブが同定されるまで再度スクリーニングすることからなる、反復過程で実行される。
【００６０】
本方法の１つの特別な側面においては、本方法は少なくとも１回の反復を用いて実行される。１つの変形においては、本方法は、最適化された結合、生体内分布、薬物動態、代謝及びクリアランス特性を有する候補イメージングプローブが同定されるまで、少なくとも５回の反復、少なくとも１０回の反復又は少なくとも２０回の反復を用いて実行される。本明細書に開示された方法においては、最適化された結合親和性は、ナノモル又はそれを上回る範囲にあるものと定義される。最適化された生体内分布及び薬物動態は、化合物が、生体内において標的化された組織まで到達すること及び、例えば１８−Ｆ  ＰＥＴの場合には数分間から２時間までといった充分な期間、血流中に留まり、化合物又はイメージングプローブが、標的化された生体高分子に対し生体内で結合されるようにすることを意味する。最適化された代謝は、化合物又はプローブが、不活性な生成物、又は、更に悪いことには他の望ましくない組織を標的とする放射性化合物又はイオンの形成によって、代謝されないことを意味する。例えば、もし化合物がその放射性１８Ｆを失えば、強力な望ましくないＰＥＴシグナルを骨において与えるであろう。最適化されたクリアランス特性は、その標的組織に到達していなかった未結合の化合物又はプローブが、迅速に生体から消失され（１８Ｆの場合、遅くとも２〜３時間以内）、大きいシグナル対バックグラウンド比を与えることを意味する（「シグナル」は、信号、例えば、結合化合物から発する放射能を意味する）。
【００６１】
本方法のもう１つの側面においては、第１の結合部位が基質結合部位であり第２の結合部位が共因子結合部位であるか、又は、第１の結合部位が共因子結合部位であり第２の結合部位が基質結合部位である。
【００６２】
上記の方法の１つの特別の変形においては、脱離基は、交換反応、求核置換反応若しくは求電子置換反応によるか、又は放射性金属と複合体を形成することにより転換されて、標識された誘導体を形成してもよい。本方法の１つの特別な変形においては、脱離基は、ハロ、ヒドロキシ、アシルオキシ、ニトロ及びスルホニルオキシ基からなる群より選ばれる。脱離基の特別の実例は、アルカノイルオキシ（例えば、アセトキシ、プロピオニルオキシその他）及びスルホニルオキシ（例えば、メシルオキシ、トシルオキシその他・・）等を含む。
【００６３】
本方法の１つの特別な変形においては、同定されたリガンド化合物は、放射性同位元素により標識され、結果として生じたリガンド化合物は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及び光学イメージングからなる群より選ばれるイメージング法のために使用される。上記の方法の特別の適用のためには、放射性同位元素は、Ｆ−１８、Ｃ−１１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２７、Ｉ−１３１、Ｂｒ−８６、Ｃｕ−６４、Ｔｃ−９９ｍ、Ｙ−９０、Ｇａ−６７、Ｃｒ−５１、Ｉｒ−１９２、Ｍｏ−９９、Ｓｍ−１５３及びＴＩ−２０１からなる群より選ばれる。本方法の１つの変形においては、酵素結合部位内の候補化合物の結合は、何ら外的な触媒の添加なしに、クリックケミストリー反応を促進する。本方法のなおもう１つの変形においては、第２の候補化合物ライブラリは、１又はそれ以上の化合物を含んでなる。本方法の１つの特別の変形においては、第１の候補化合物ライブラリ及び第２の候補化合物ライブラリは、互いに独立して、少なくとも１つの化合物、少なくとも５つの化合物、少なくとも１０若しくはそれ以上の化合物、又は少なくとも２５若しくはそれ以上の化合物を含んでなる。
【００６４】
上記の方法のもう１つの側面においては、第１の候補化合物ライブラリ及び／又は第２の候補化合物ライブラリは、更に、化合物と第１の官能基との間のリンカー及び／又は、化合物と第２の官能基との間のリンカーを含んでなる。１つの変形においては、リンカーは、化合物と官能基との間のリンカー鎖において、１〜１０個の間の原子を含んでなる。
【００６５】
もう１つの態様においては、上記による方法であって、
第１の候補化合物ライブラリが式Ｉの化合物を含んでなり、第２の候補化合物ライブラリが式ＩＩ  の化合物を含んでなる方法が提供される。
【００６６】
【化１】
2008541014.tif 000003
【００６７】
［式中、Ａ及びＡ'は、互いに独立して、置換又は非置換の、アリール又はヘテロアリール基、非ペプチド基質模擬体、ペプチド模擬体及びアルギニン基模擬体からなる群より選ばれる基質模擬体であり；Ｌ及びＬ'は、互いに独立して、結合又は該連結基鎖内に１〜１０個の原子を含んでなり０〜３個の置換基により置換されてもよい連結基であり；Ｘ及びＸ'は、互いに独立して、相補的なクリックケミストリー官能基であり；Ｚ及びＺ'は、互いに独立して−ＮＨ2、ヒドラジニル、置換ヒドラジニル若しくは置換されてもよい尿素か又は存在しなくてもよい；ｕ及びｕ'は、互いに独立して、０、１、２又は３であり；Ｖ及びＶ'は、互いに独立して、１、２又は３であり；且つ、Ｗ及びＷ'は、互いに独立して、１、２又は３である］、
【００６８】
本明細書において列挙された開示の上記の側面のそれぞれにおいて、全ての側面、態様及び変形及び代表的な実例は、適用可能な場合には相互に交換可能であり、種々の側面、態様及び変形は、互換性に、かつ様々な順序で組合されてよい。例えば、リンカー無しの第１の官能基を含んでなる特定の第１の分子構造は、リンカー無しの相補的な官能基をもつ第２の分子構造との、１，３−双極子付加環化反応を受けてよく、或いは別法として、リンカーのある官能基を含んでなる同様の第１の分子構造が、分子構造と相補的官能基との間にリンカーを含んでなる、相補的な官能基を含んでなる第２の分子構造により、１，３−双極子付加環化反応を受けてもよい。これらの及び他の順序及び変形は、本発明の側面に含まれることが意図されている。
【００６９】
試薬濃度は、酵素に誘起される反応（即ち、所望のインサイチュ反応）、並びに酵素無しのバックグラウンド反応の、双方の速度に影響を及ぼすことから、１つの重要なパラメータである。実際的な理由からは、バックグラウンド反応の程度を最小化して、酵素に基づく生成物の形成をより容易に同定できるようにする目的で、試薬濃度を低く保つことが望ましい。同時に、アンカー分子の濃度は、利用可能な酵素の最適利用に向けて、結合部位の有意な飽和を達成するために、充分に高くあるべきである。９５％以上の活性部位の飽和を達成するべく充分に高い、アンカー分子及び酵素の濃度を使用することが好ましい。最終反応成分である基質模擬体は、酵素／アンカー分子複合体と基質模擬体との間の２分子反応が、適度の速度で起こるように、充分に高い濃度で利用できるようにするべきである。典型的には、基質模擬体濃度は、少なくとも４００μＭであろう。濃度は、もしバックグラウンド反応が速すぎる方へ変化するか、又はインサイチュで検出されるヒットが非常に少なければ、下方又は上方に調整可能である。
【００７０】
それぞれの試薬／酵素の組合せは、潜在的なインサイチュのヒットであるトリアゾール生成物を同定するべく、ＬＣ−質量分析法により分析されることが可能である。このような潜在的なインサイチュのヒットを評価するため、それらが酵素によって形成されたかどうかを測定することにより、いくつかの試験が実行されることが可能である：（ａ）酵素無しのＢＳＡの対照実験は、偽陽性を同定することが可能であり；（ｂ）既知の酵素阻害剤（例えば、ＣＡ−ＩＩの場合にはエトキシゾラミド）の存在下での、インサイチュの生成物形成の競合阻害は、所与のヒットが、酵素の活性部位の中又は付近で形成されるかどうかを示すことが可能である。評価されたインサイチュのヒットは、化学的に合成され生物学的試験において特徴付けられることによって、それらの結合親和性を測定することが可能である。酵素は１，４−二置換又は１，５−二置換異性体のいずれをも形成し得ることから、トリアゾールの置換パターンもまた決定可能である。このことは、１，４−二置換トリアゾールを与える、ＣｕIに触媒されるアジド／アセチレン反応か、１，５−二置換トリアゾールを与える、ＲｕIIに触媒されるアジド／アセチレン反応、又は１，４−及び１，５−二置換トリアゾールの混合物を生成する熱的付加環化反応を用いて、参照化合物を作成することにより達成可能である。
【００７１】
前述の記述に呈示された教示の恩恵を受けることにより、本発明が属する技術分野の熟練者は、本発明の多くの修飾及び他の態様を思いつくであろう。それゆえ、本発明が、開示された特定の態様に制限されないこと及び、修飾及び他の態様が本発明の範囲内に包まれることが意図されることが理解されるべきである。本明細書には特別の用語が用いられているが、それらは一般的かつ記述的な意味でのみ使用されており、制限を目的としたものではない。
【実施例】
【００７２】
ＣＡ−ＩＩのインサイチュスクリーニング
【００７３】
【化２】
2008541014.tif 000004
【００７４】
概略。ウシ赤血球からの炭酸脱水酵素ＩＩ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ番号Ｃ２５２２；ロット番号０８３Ｋ９２９５、４，０１４ウィルバー・アンダーソン（Ｗｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ）単位／ｍｇ，ビウレットによるタンパク質含有量９０％）は、インサイチュのクリックケミストリー実験用に及び結合定数の測定用に使用された。本発明者らは、ＳＤＳゲル電気泳動によりタンパク質を検査し、それが２９〜３０，０００分子量単位に相当する単一バンドを示すことを見出した。ヒト赤血球からの炭酸脱水酵素ＩＩ（シグマ・アルドリッチ、カタログ番号Ｃ−６１６５、４，２６０ウィルバー・アンダーソン単位／ｍｇ）は、ヒト酵素に対する結合親和性の測定用に使用された。全ての蛍光測定は、スペクトラ・マックス・ジェミニ（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ）蛍光プレートリーダーにおいて、３７℃で行われた。ＬＣ／ＭＳ分析は、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ（ＳＬ）において、フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）Ｃ１８プレカラムを具備した３０×２．１ｍｍのゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８カラムを用いて行なわれた。化合物検出は、エレクトロスプレー質量分光により、ポジティブ選択イオンモード（ＬＣ／ＭＳ−ＳＩＭ）において達成された。溶出溶媒は、アセトニトリル及び水であり、０．０５％ＴＦＡを含有していた。
【００７５】
インサイチュクリックケミストリー実験用の一般的な方法：
アジド１９Ｆ−１（２０ｍＭ）、エトキサゾラミド（ｅｔｈｏｘａｚｏｌａｍｉｄｅ）（２０ｍＭ）及びエチニルベンゼンスルホンアミド（２ｍＭ）の原液は、ＤＭＳＯ中に調製した。アルキン（３μＬ）は、酵素（９４μｌの１ｍｇ／ｍＬ溶液、市販の純度９０％のタンパク質から、ｐＨ７．４の２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中への溶解により調製）を含有する９６穴マイクロタイタープレートのウェルへ添加され、続いてアジド試薬（２μＬ）及びＤＭＳＯ（１μＬ）が添加された。反応プレートは、３７℃で４０時間貯蔵された。
【００７６】
最終的な試薬濃度は以下のとおりであった：
酵素（２９μＭ）、アルキン（６０μＭ）、アジド（４００μＭ）及びＤＭＳＯ（６体積％）。平行して、いくつかの対照反応が準備され、類似の実験条件を受けた：（１）エトキサゾラミド（１μＬ、終濃度２００μＭ）による競合阻害の対照；（２）ｂＣＡ−ＩＩの代わりにウシ血清アルブミン（終濃度１ｍｇ／ｍＬ）を用いた非特異的タンパク質結合の対照。いくつかの場合、本発明者らはまた、ｂＣＡ−ＩＩの代わりにｐＨ７．４の緩衝液を用いて「タンパク質なし」の対照実験も行なった。ＬＣ／ＭＳ−ＳＩＭ分析：全ての試料は、逆相ＨＰＬＣにより、エレクトロスプレー質量分光検出を用いて、ポジティブ選択イオンモードにおいて分析された。注入体積は３０μＬであり、流速は０．３ｍＬ／分であった。以下の溶出勾配が使用された：０−１００％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ及び水／０．０５％ＴＦＡで１６分間、１００％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡで２分間、続いて１００−０％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ及び水／０．０５％ＴＦＡで３分間。ポストランタイムは２分であった。
【００７７】
ウシ／ヒト炭酸脱水酵素ＩＩの生体外結合分析：
概略。ホワイトサイド（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）ら、（「ジャーナル・オブ・ディ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」，１９９４年、第１１６巻、ｐ．５０５７）及び、カーノハン（Ｊ．Ｃ．Ｋｅｒｎｏｈａｎ）（「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」，１９６７年、第２４２巻、ｐ．５８１３）により、試験化合物によって置き換えられるレポーティングリガンドとしてＤＮＳＡを用いて開発された蛍光競合アッセイが、結合親和性の測定に使用された。アッセイは、２９０ｎｍにおける励起に対し、ＤＮＳＡの極小吸収である４６０ｎｍにおいて検出される蛍光シグナルのみが、ＤＮＳＡ・ＣＡ複合体のものである、という観察に基づいている。試料濃度が増加するにつれ、試験化合物との競合の結果として、ＤＮＳＡ・ＣＡによる蛍光強度は減少し、スキャッチャードプロットからの解離定数の測定を可能にする。後者は、０．３９μＭのＤＮＳＡの解離定数Ｋｄ（滴定実験により決定）及び全酵素濃度（０．１８μＭ）に基づき、各試験化合物について、ＤＮＳＡに結合したＣＡの濃度［ＣＡ・ＤＮＳＡ］、非蛍光試料に結合したＣＡの濃度［ＣＡ・Ｉｎｈ］及び溶液中の遊離ＣＡの濃度［ＣＡ］を計算するための物質収支を用いて明らかにされた。アッセイ条件：量の増加していく試験化合物（１０ｎＭから１００００ｎＭまで、ＤＭＳＯ中に作成された原液）は、９６穴マイクロタイタープレート中の、５０ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸カリウム緩衝液中の、ＤＮＳＡ（２０μＭ）及びウシ又はヒトのＣＡ−ＩＩ（１８０ｎＭ）の溶液へ添加された。溶液は混合され、蛍光プレートリーダー（２９０ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長）で蛍光強度の変化が測定されるのに先立ち、室温で１時間インキュベートされた。Ｋｄ値は、ホワイトサイドらにより記述された、以下の等式を用いたスキャッチャードプロットから測定された。
［ＣＡ・Ｉｎｈ］／［ＣＡ］ｔｏｔ・［Ｉｎｈ］＝Ｋ１１ｉｎｈ−Ｋ１１ｉｎｈ｛［ＣＡ・Ｉｎｈ］＋［ＣＡ・ＤＮＳＡ］｝／（［ＣＡ］ｔｏｔ）
【００７８】
用語［ＣＡ・ＤＮＳＡ］、［ＣＡ・Ｉｎｈ］及び遊離のＣＡは、ＣＡ・ＤＮＳＡの解離定数及び各反応におけるＣＡの全濃度についての既知の値に基づく物質収支を用いて計算された。ＣＡ・ＤＮＳＡの解離定数（Ｋｄ）は、各々の酵素（２００ｎＭのｐＨ７．４のリン酸緩衝液）をＤＮＳＡ（２００から１０００ｎＭ、ＤＭＳＯ中に作成された原液）を用いて滴定すること及び、蛍光の変化を記録することにより、ヒトの炭酸脱水酵素ＩＩに対し０．４２５μＭ、ウシの炭酸脱水酵素ＩＩに対し０．３９３μＭと決定された。これらの結果は、報告された値と厳密に適合する。
【００７９】
【化３】
2008541014.tif 000005
【００８０】
図Ａ、Ｂ及びＣは、典型的なスクリーニングから取られたアリコートのＳＩＭ／ＭＳクロマトグラムである。この例では、生成物はインサイチュのヒットとして同定された。結合アッセイは、化合物のＫｄが０．５ｎＭであることを示した。図Ａは、炭酸脱水酵素ＩＩ（１）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）のインキュベーション混合物のアリコートである。点線は、新たに形成されたリガンドの保持時間を表す。図Ｂは、炭酸脱水酵素ＩＩ（１）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）及び炭酸脱水酵素ＩＩ阻害剤（４）のインキュベーション混合物のアリコートである。図Ｃは、ウシ血清アルブミン（５）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）のインキュベーション混合物のアリコートである。図Ａは、リガンドが酵素を鋳型とすることによって形成されることを示す。図Ｂは、既知の阻害剤の存在下では、所望のリガンドが形成されず、従って、リガンド形成が酵素を鋳型とするという主張を支持している。更に、図Ｃは、ＣＡ−ＩＩの不在下には、何らリガンドが形成されないことを示す。この分子イメージング候補は、ピリジン骨格における、１８Ｆ−フッ化物によるパラ−ニトロ基の置換の容易性のため、放射性標識用に選ばれた。
【００８１】
概略：
【００８２】
【化４】
2008541014.tif 000006
【００８３】
４−ニトロ−２−シアノピリジンの合成は、公知の文献の方法（「ジャーナル・オブ・オーガノメタリック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．）」、１９９７年、第５４４巻、ｐ．１６３−１７４）に従って行なわれた。４−フルオロ−２−シアノピリジンの調製は、既知の文献の方法（「オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）」、２００５年、第７巻、ｐ．５７７−５７９）に従って行なわれた。
【００８４】
４−フルオロ−２−アミノメチルピリジンの合成
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の４−フルオロ−２−シアノピリジン（２７８ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ＢＨ3−ＴＨＦ（１Ｍ、６ｍＬ、６ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は、１５分間還流された。反応液は次に室温に冷却され、ＨＣｌ（３０ｍＬ）が通風下に添加された。水性層はＥｔ2Ｏ（３ｘ）で洗浄された。水性層は、ＮａＯＨ（１５％水溶液）で塩基性化され、最少量のＣＨ2Ｃｌ2で抽出された。合一された有機物は食塩水で洗浄され、乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、冷水浴中で濃縮乾燥されて、１５０ｍｇの澄明な無色の油を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．０（２Ｈ，ｓ），６．８５−６．９５（１Ｈ，ｍ），７．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．０Ｈｚ），８．４６−８．５８（１Ｈ，ｍ）  ＮＨ2検出されず
19Ｆ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ6Ｆ6）δ：６４．１７８
【００８５】
４−フルオロ−２−アミノメチルピリジンの、Ｌ−バリンアジド酸とのカップリング
ＴＨＦ（１ｍＬ）中に溶解された、ガラスバイアル中のＬ−バリンアジド酸（０．０３８ｇ，０．２６８ｍＭ，１当量）に、室温で攪拌しながら、４−フルオロ−２−メチルアミノピリジン（０．０４ｇ、０．３１７ｍＭ、１．２当量）が添加され、続いてトリエチルアミン（０．２４３ｍＬ、１．７４８ｍＭ、５当量）、ＥＤＣ（０．０８５ｇ，０．５５９ｍＭ，１．６当量）及びＨＯＢｔ（０．０７６ｇ，０．５５９ｍＭ，１．６当量）が添加され、６時間にわたり反応液させた。反応液は、終了後に水でクエンチされ、酢酸エチルで抽出された。有機層は、水、炭酸水素ナトリウム、食塩水で洗浄され、次いでＭｇＳＯ4上で乾燥された。有機層は濾過され、濃縮乾燥された後、反応混合物はカラムクロマトグラフィーにより、酢酸エチル／ヘキサンを溶出溶媒として用いて精製された（８０／２０のＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ中で充填され、１００ｍｌで溶出され、次いで５０／５０のＨｅｘ／ＥｔＯＡｃに増加された）。生成物は、無色の油として単離された（０．０２１ｇ、３２％）。
【００８６】
【化５】
2008541014.tif 000007
【００８７】
４−ニトロ−２−アセトキシメチルピリジンの合成
９０℃において、無水酢酸（８０ｍＬ）を含有している丸底フラスコに、４−ニトロ−２−メチルピリジンＮ−オキシド（１０ｇ）が添加された。反応は１２０℃で一晩続けられた。反応液は、次に濃縮乾燥された。反応混合物はシリカゲル上で、ヘキサン（過剰の無水酢酸を除去するため）、続いて３０％Ｅｔ2Ｏ：Ｈｅｘ（４−アセトキシ−２−アセトキシメチルピリジンを除去するため），続いて５０％Ｅｔ2Ｏ：Ｈｅｘを用いて精製され、３．５ｇ（２７．５％）の黄色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：２．２４（３Ｈ，ｓ），５．３７（２Ｈ，ｓ），７．９７−８．００（１Ｈ，ｍ），８．０９（１Ｈ，ｓ），８．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：１９７（Ｍ＋Ｈ），１５５（Ｍ−ＯＡｃ）
【００８８】
４−ニトロ−２−ヒドロキシメチルピリジンの合成
４−ニトロ−２−アセトキシメチルピリジン（８５６ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ＨＣｌ（１Ｎ，２０ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は５０℃で一晩加熱された。反応液は次に、Ｅｔ2Ｏへ注がれた。水性層はＥｔ2Ｏで洗浄された。水性層は次に、飽和Ｎａ2ＣＯ3で処理され、ＣＨ2Ｃｌ2（３×）で抽出された。合一された有機層は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥されて、５６１ｍｇ（８３．４％）の澄明な黄色の油を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：２．０５−２．５５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．９５（２Ｈ，ｓ），７．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．０Ｈｚ），８．１０（１Ｈ，ｓ），８．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：１５５（Ｍ＋Ｈ）
【００８９】
４−ニトロ−２−クロロメチルピリジンの合成
アルコール（５６２ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）及びＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）を含有する丸底フラスコに、０℃において、ＳＯＣｌ2（３．６５ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は０℃で２時間攪拌された。反応液は、次に飽和ＮａＨＣＯ3へ注がれＣＨ2Ｃｌ2中へ抽出された。合一された有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。反応混合物はシリカゲル上で、１：１のＥｔ2Ｏ：Ｈｅｘを溶出液として用いて精製され、３５０ｍｇ（５５．８％）の黄色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．８３（１Ｈ，ｓ），８．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．０Ｈｚ），８．２７（１Ｈ，ｍ），８．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
【００９０】
４−ニトロ−２−メチルアミノピリジンの合成
４−ニトロ−２−クロロメチルピリジン（３５０ｍｇ，２．０３ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ヘキサメチレンテトラアミン（２８５ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）及びＣＨＣｌ3（５ｍＬ）が添加された。反応混合物は一晩加熱還流された。結果として生じた沈殿物は濾別され、Ｅｔ2Ｏで洗浄されて、４００ｍｇの白色の固体を与えた。この固体は次に、ＥｔＯＨ（７ｍＬ）中に溶解され、ＨＣｌ（濃、０．５ｍＬ）で処理された。反応混合物は９０℃で２時間加熱された。反応液は次に、濃縮乾燥され、水へ注がれ、Ｅｔ2Ｏで洗浄された。水性層は次に、Ｎａ2ＣＯ3の添加により塩基性化された。生成物は、ＣＨ2Ｃｌ2中へ抽出された。合一された有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥されて、１７５ｍｇの澄明な無色の油を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．６−１．８（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．２（２Ｈ，ｓ），７．９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．０Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｍ），８．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：１５４（Ｍ＋Ｈ）
【００９１】
２−アジド−３−メチル−Ｎ−（４−ニトロ−ピリジン−２−イルメチル）−ブチルアミドの合成
４−ニトロ−２−メチルアミノピリジン（１７５ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ＴＨＦ（５ｍＬ）、Ｅｔ3Ｎ（１．６ｍＬ、１１．４ｍｍｏｌ）、２−アジド−３−メチル−ブチリルアジド（１６４ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２７８ｍｇ，１．８３ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２４７ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は室温で一晩攪拌された。反応液は次に、ＨＣｌ（１Ｎ、２０ｍＬ）へ注がれ、ＥｔＯＡｃ中へ抽出された。合一された有機物は飽和ＮａＨＣＯ3で洗浄され、乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥されて、１９７ｍｇ（６１．８％）の淡褐色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：０．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．３９−２．５０（１Ｈ，ｍ），３．４−３．７（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），７．９７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，３．０Ｈｚ），８．０２（１Ｈ，ｓ），８．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：２７９（Ｍ＋Ｈ），３０１（Ｍ＋Ｎａ）
【００９２】
（２−アジド−３−メチル−ブチリル）−（４−ニトロ−ピリジン−２−イルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
出発アジド（４００ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ＣＨ3ＣＮ（１０ｍＬ），Ｂｏｃ2Ｏ（４７０ｍｇ，２．１６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（９ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は室温で一晩攪拌された。反応液は次に、水へ注がれ、ＥｔＯＡｃ中へ抽出された。合一された有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。残渣はシリカゲル上で、溶出液として２：１のＨｅｘ：Ｅｔ2Ｏを用いて精製され、３０９ｍｇ（５７％）の白色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：１．０３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．４１（９Ｈ，ｓ），２．２３−２．３９（１Ｈ，ｍ），５．３０（２Ｈ，ｓ），７．８９−７．９６（２Ｈ，ｍ），８．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：３７９（Ｍ＋Ｈ），４０１（Ｍ＋Ｎａ）
【００９３】
｛３−メチル−２−［４−（４−スルファモイル−フェニル）−［１，２，３］トリアゾール−１−イル］−ブチリル｝−（４−ニトロ−ピリジン−２−イルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
アジド（３００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）、ｔＢｕＯＨ（３ｍＬ）、４−エチン−ベンゼンスルホンアミド（１４４ｍｇ）を含有する丸底フラスコに、ＣｕＳＯ4（０．０４Ｍ，１．５ｍＬ）及びアスコルビン酸ナトリウム（０．１Ｍ、１．２ｍＬ）が添加された。反応液は、アルゴン下に一晩攪拌された。反応液は次に、水へ注がれ、ＥｔＯＡｃ中に抽出された。合一された有機物は、５％ＮＨ4ＯＨで洗浄され、乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。残渣は、シリカゲル上で、まず３０％ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを用いて出発試薬を溶出し、続いて１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを用いて精製され、３５０ｍｇ、７８．８％の白色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．５５（９Ｈ，ｓ），２．５９−２．７１（１Ｈ，ｍ），３．４０−３．５０（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．７８（２Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．８８−７．９１（２Ｈ，ｍ），７．９８−８．０３（４Ｈ，ｍ），８．２８（１Ｈ，ｓ），８．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：５０６（Ｍ＋Ｈ）
【００９４】
｛２−［４−（４−｛［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メチル］−スルファモイル｝−フェニル）−［１，２，３］トリアゾール−１−イル］−３−メチル−ブチリル｝−（４−ニトロ−ピリジン−２−イルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成
トリアゾール（３５０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５ｍＬ）及びＴＥＡ（４３６μＬ）を含有する丸底フラスコに、ＤＭＴ−Ｃｌ（３１８ｍｇ，０．９４ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は室温で１時間攪拌された。ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ）は、出発物質の完全な消費を示した。反応液は次に水へ注がれ、ＥｔＯＡｃ中に抽出された。合一された有機物は、乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。残渣は、シリカゲル上で、より溶出速度の速い物質を溶出するために３０％ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを用いて、続いて４０％ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを用いて精製され、４１７ｍｇ（７７％）の黄色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：０．９０（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．５６（９Ｈ，ｓ），２．５７−２．７１（１Ｈ，ｍ），３．７１（６Ｈ，ｓ），５．７５（２Ｈ，ｓ），６．６１−６．７１（２Ｈ，ｍ），６．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．１８−７．２６（５Ｈ，ｍ），７．３３−７．３７（１Ｈ，ｍ），７．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．９８−８．０３（２Ｈ，ｍ），８．２０（１Ｈ，ｓ），８．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）
ＭＳ（エレクトロスプレー）：８６２（Ｍ＋Ｈ）
【００９５】
化合物の放射性標識
炭酸脱水酵素Ｆ１８実験
【００９６】
【化６】
2008541014.tif 000008
【００９７】
酸素−１８水は、１１ＭｅＶプロトン（ＲＤＳ−１１１エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）、シーメンス（Ｓｉｅｍｅｎｓ）・モレキュラー・イメージング）を用いて照射され、［18Ｆ］フッ化物を、通常の方法で生成した。ボンバードメントの最後に、［18Ｆ］フッ化物イオンを含有する［18Ｏ］水は、タンタル標的から自動化された求核フッ素化モジュールへ移された（エクスプロラ（ｅｘｐｌｏｒａ）ＲＮ、シーメンス・バイオマーカー・ソリューションズ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ））。［18Ｏ］水／［18Ｆ］フッ化物イオン溶液は、あらかじめ水（５ｍＬ）、炭酸水素カリウム水溶液（０．５Ｍ、５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）ですすがれた、小型の陰イオン交換樹脂カラム（クロマフィックス（Ｃｈｒｏｍａｆｉｘ）４５−ＰＳ−ＨＣＯ３，マッハライ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ））へ、コンピュータ制御下に移された。［18Ｏ］水（１．８ｍＬ）は、次に続く精製及び再利用のため回収された。トラップされた［18Ｆ］フッ化物イオンは、水（０．４ｍＬ）中の炭酸カリウム（３．０ｍｇ）の溶液を用いて反応器内へ溶出された。アセトニトリル（１．０ｍＬ）中のクリプトフィックス（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ）２２２（２０ｍｇ）の溶液が添加され、混合物は真空下及びアルゴン気流下に加熱され（７０〜９５℃）、アセトニトリル及び水を蒸発した。冷却後、「ドライ」の反応性［18Ｆ］フッ化物イオン、Ｋ２２２及び炭酸カリウムの残渣に対し、アセトニトリル（１．０ｍＬ）中の、４−ニトロピリジン−Ｎ−ＢＯＣ−バリン−Ｎ−ジメチトキシトリチル−ベンゼンスルホンアミド（１，１７ｍｇ，１９．７μｍｏｌ）の溶液が添加された。反応混合物は、密閉容器中で（Ｐmax＝２．３ｂａｒ）１１０℃で１０分間、（磁石により）攪拌しながら加熱された。混合物は５５℃に冷却され、ほとんどのアセトニトリルは、先と同様に、真空及びアルゴン気流下に蒸発された。
【００９８】
【化７】
2008541014.tif 000009
【００９９】
保護された粗［18Ｆ］フッ素化中間体（２）に対し、塩酸水溶液（１．０Ｍ、１．０ｍＬ）が添加され、混合物は１０５℃で３分間加熱された。３５℃に冷却された後、酢酸ナトリウム水溶液（２．０Ｍ、０．５ｍＬ）が、攪拌しながら添加された。反応混合物はサンプルループ（１．５ｍＬ）へ移され、セミプレップＨＰＬＣカラム（フェノメネックス・ジェミニ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ）５μＣ１８、２５０×１０ｍｍ、２５％アセトニトリル、７５％水、０．０５％トリフルオロ酢酸移動相、５．０ｍＬ／分）上へ注入された。生成物、４−［18Ｆ］フルオロピリジン−バリン−ベンゼンスルホンアミド（３，［18Ｆ］ＦＰＶＢＳ）は、フロースルー放射線検出及びＵＶ（２５４ｎｍ）によってモニターしたところ、１５〜１６分において溶出された。生成物を含有するＨＰＬＣ溶出物（７〜８ｍＬ）は、磁気攪拌子を具備した３０ｍＬバイアル中に収集され、水（２０ｍＬ）が添加された。水溶液は完全に混合され、次いで、水／移動相溶液を廃液ボトルへ入れながら、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋを通された。Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋは、別途のアリコートの水（２０ｍＬ）で洗浄された。生成物は次に、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋからエタノール（１．０ｍＬ）で溶出され、０．２２μｍの無菌フィルタを通して、無菌のバイアル内へ通された。次に水（９．０ｍＬ）が、無菌のフィルタを通して無菌の生成物バイアルヘ添加され、エタノール濃度を１０％とした。
【０１００】
典型的なプロダクションランは、約９００ｍＣｉの［18Ｆ］フッ化物イオンでスタートし、６４分間の合成、ＨＰＬＣ精製及びＣ１８固相抽出及び１０％エタノール中の再構成の後、９１ｍＣｉ（ＥＯＢでは１３６ｍＣｉ、収率１５％）の単離された生成物を与えた。
【０１０１】
集められた生成物は、ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ジェミニ、５μＣ１８、１５０×４．６ｍｍ、２５％アセトニトリル、７５％水、０．０５％トリフルオロ酢酸移動相、１．０ｍＬ／分）により分析された。放射能及びＵＶ（２５４ｎｍ）検出によってモニターしたところ、この生成物は１２分間の保持時間及び、９９．４％の放射化学純度を有していた。
【０１０２】
【化８】
2008541014.tif 000010
【０１０３】
１８Ｆ−標識されたＣＡ−ＩＩイメージング剤は、選択的に肺、腎臓及び血液に結合し、それらのＣＡ−ＩＩの高い発現レベルとよく相関する。
【０１０４】
ＣＯＸ−２のインサイチュスクリーニング
【０１０５】
【化９】
2008541014.tif 000011
【０１０６】
概略。Ｓｆ２１細胞におけるバキュロウィルス過剰発言系から単離された、ＣＯＸ−ＩＩヒト組換え酵素（ケイマン・ケミカル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社、カタログ番号６０１２２、２４，０１６単位／ｍｇ（反応中の終濃度７μＭに希釈）が、インサイチュクリックケミストリーに使用された。
【０１０７】
生体外の活性アッセイ用には、ケイマン・ケミカル社からのＣＯＸ−２比色分析用（ヒツジ）阻害剤スクリーニングアッセイキットが使用された（カタログ番号７６０１１１）。全ての吸収測定は、スペクトラ・マックス（ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ）Ｍ２プレートリーダーで、２８℃において行なわれた。ＬＣ／ＭＳ分析は、アジレント１１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ（ＳＬ）で、フェノメネックスＣ１８プレカラムを具備した、３０×２．１ｍｍゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８カラムを用いて行なわれた。化合物検出は、エレクトロスプレー質量分光検出により、ポジティブ選択イオンモードにおいて行なわれた（ＬＣ／ＭＳ−ＳＩＭ）。溶出溶媒、アセトニトリル及び水は、０．０５％ＴＦＡを含有していた。
【０１０８】
１，４−二置換（「アンチ」）トリアゾールの合成のための一般的方法：
ｔｅｒｔ−ブタノール（０．４００ｍＬ）中の、アルキン（ｌ当量）及びアジド（ｌ当量）混合物は、ＣｕＳＯ4（０．０４Ｍ溶液、ｐＨ７．４リン酸緩衝液中、７．５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．１Ｍ溶液、ｐＨ７．４リン酸緩衝液中、１５ｍｏｌ％）の存在下に、室温で一晩反応された。反応混合物は水（数ｍｌ）へ注がれ、酢酸エチルで抽出され、５％水酸化アンモニウム水溶液で洗浄され、ＭｇＳＯ4上で乾燥され、濃縮されて、純度９８〜９９％のチアゾールを白色の固体として生じた。最適化されていない収率は４０％であった。クロマトグラフィーは、いくつかの純粋でない化合物（純度９０％未満）について、酢酸エチル：ヘキサン混合物を精製のための溶出液として用いて行なわれた。
【０１０９】
インサイチュクリックケミストリー実験用の一般的な方法：
アジド（２０ｍＭ）、バルデコキシブ（２０ｍＭ）及びアルキン（３ｍＭ）の原液は、ＤＭＳＯ中に調製された。アルキン（１μＬ）は、酵素（ケイマン・ケミカル社からの、４７．５μｌの市販のＣＯＸ−２ヒト組換え酵素）を含有するエッペンドルフチューブ（容積０．５ｍＬ）へ添加され、続いてアジド試薬（１μＬ）及びＤＭＳＯ（０．５μＬ）が添加された。反応プレートは、３７℃で１８〜２０時間貯蔵された。最終試薬濃度は、以下のとおりであった：酵素（７μＭ）、アルキン（６０μＭ）、アジド（４００μＭ）及びＤＭＳＯ（５体積％）。
【０１１０】
並行して、対照反応が設定され、類似の実験条件に供された：（１）バルデコキシブ（１μＬ、終濃度２００μＭ）による競合阻害の対照；（２）３００μＭＤＤＣを用いた１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを使用した、ウシ血清アルブミン対照実験。
【０１１１】
ＬＣ／ＭＳ−ＳＩＭ分析：全ての試料は、逆相ＨＰＬＣにより、エレクトロスプレー質量分光検出を用いてポジティブ選択イオンモードで分析された。注入体積は、０．３ｍＬ／分の流速で１５μＬであった。以下の溶出勾配が用いられた：１０−１００％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ及び水／０．０５％ＴＦＡで２０分間、１００％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡで２分間、続いて１００−１０％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ及び水／０．０５％ＴＦＡで３分間。ポストラン時間は３分間であった。
【０１１２】
【化１０】
2008541014.tif 000012
【０１１３】
図Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは、典型的なスクリーニングから取られたアリコートのＳＩＭ／ＭＳクロマトグラムである。この例では、生成物６がインサイチュのヒットとして同定された。結合アッセイは、化合物のＫｄがほぼ１０ｎＭであることを示した。図Ａは、ＣＯＸ−２（１）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）のインキュベーション混合物のアリコートである。点線は、新たに形成されたリガンドの保持時間を表す。図Ｂは、ＣＯＸ−２（１）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）及びＣＯＸ−２阻害剤、バルデコキシブ（４）のインキュベーション混合物のアリコートである。図Ｃは、ウシ血清アルブミン（５）、アンカー分子（２）及びアジドフラグメント（３）のインキュベーション混合物のアリコートである。図Ｄは、Ｃｕ（Ｉ）の存在下に、（２）及び（３）のカップリングにより組立てられた純粋な生成物の注入である。図Ｅは、（６）の存在を確証するための、図Ａにおける反応への（６）の同時注入である。図Ａは、リガンドが酵素の鋳型によって形成されることを示す。図Ｂは、既知の阻害剤の存在下では、所望のリガンドが形成されず、従って、リガンドが酵素を鋳型として形成されるという主張を支持していることを示す。更に、図Ｃは、ＣＯＸ−２の不在下には、何らリガンドが形成されないことを示す。この分子イメージング候補は、ピリジン骨格における、１８Ｆ−フッ化物によるパラ−ニトロ基の置換の容易性のため、放射性標識用に選ばれた。
【０１１４】
前駆体の合成スキーム（続き）：
【０１１５】
【化１１】
2008541014.tif 000013
【０１１６】
実験法：
クロロメチルスルホンアミドは、文献の方法に従って調製された（テリー（Ｔａｌｌｅｙ，Ｊ．Ｊ）ら著、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）」、２０００年、第４３巻、ｐ．７７５−７７７）。
【０１１７】
スルホンアミドアルデヒド：トリメチル−Ｎ−オキシド（１．７２ｇ、２２．９８ｍＭ、４当量）が、丸底フラスコ内で、ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）中のクロロスルホンアミド（２．００ｇ、５．７４ｍＭ）に対し、アルゴン下に攪拌しながら添加された。反応液は、水で１時間後にクエンチされ、この時点でＴＬＣ上では何ら出発物質は見られなかった。反応混合物は次に、酢酸エチルで抽出され、有機相は水で２回洗浄され、ＭｇＳＯ4上で乾燥され、濾過され、濃縮乾燥された。単離された粗生成物は、オフホワイトの粉末であり（〜１．００ｇ、収率５０％）、そのまま次の段階に使用された。
【０１１８】
ＤＭＴ保護されたアルデヒド：トリエチルアミン（０．５６ｍＬ、３．９９ｍＭ、４当量）が、塩化メチレン（１５ｍＬ）中の、スルホンアミドアルデヒド（０．３２８ｇ、０．９９８ｍＭ）に対し、アルゴン下に攪拌しながら添加され、続いてＤＭＴ−クロライド（０．４４ｇ、１．２９ｍＭ、１．３当量）が添加され、１８時間反応させられた。反応混合物は次に水でクエンチされ、塩化メチレンで抽出され、その後、有機層は食塩水で洗浄され、ＭｇＳＯ4上で乾燥された。有機層が濾過され、濃縮乾燥された後、生成物はシリカゲル上のクロマトグラフィーにより、溶出液として酢酸エチル／ヘキサン混合物を用いて精製された。単離された生成物は、淡黄色の粉末であった（０．４４ｇ、７０％）。
【０１１９】
ＤＭＴ保護されたアルキン：アルゴン下にアセトニトリル（２０ｍＬ）中に攪拌されている、トシルアジド（０．３０４ｇ、１．５４ｍＭ）及び炭酸カリウム（０．３２ｇ、２．３１ｍＭ）の混合物に対し、ホスホネート試薬（０．１２８ｇ、０．７７ｍＭ）が添加された。反応液は徐々に濁っていった。２時間後、メタノール：アセトニトリル（２０ｍＬ：２０ｍＬ）中に溶解された、アルデヒド（０．４０７ｇ、０．６５ｍＭ）がゆっくりと添加され、不均一の反応混合物は、時間の経過とともに黄色の均一な溶液となった。６時間後、反応混合物は水でクエンチされ、酢酸エチルで抽出され、水で洗浄され、ＭｇＳＯ4上で乾燥された。濾過及び濃縮乾燥の後、生成物はカラムクロマトグラフィーにより精製され、アルキンは白色の泡沫様の化合物として得られた（０．２ｇ、５０％）。
【０１２０】
トリアゾールは、アンチトリアゾールを作成するための一般的な方法に記述されている、１，４−二置換トリアゾールのための一般的な方法を用いて合成された。
【０１２１】
１８Ｆ−標識ＣＯＸ−２イメージング剤の調製
【０１２２】
【化１２】
2008541014.tif 000014
【０１２３】
Ｎ−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メチル］−４−｛５−［１−（３，５−ジメチル−４−ニトロ−ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−３−フェニル−イソオキサゾール−４−イル｝−ベンゼンスルホンアミドの合成
アルキン（１５７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、ｔＢｕＯＨ（１０ｍＬ）、ＣｕＳＯ4（０．０４Ｍ、６２４μＬ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．１Ｍ、５００μＬ）及びアジド（５２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が添加された。不均一な溶液は、室温で一晩攪拌された。反応液はＥｔＯＡｃへ注がれ、希ＮＨ4ＯＨ及び水で希釈された。有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。残渣は、シリカゲル（１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘを用いて充填された）上で、まずＣＨ2Ｃｌ2を用いて充填すること、次いで１：１のＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘで溶出することにより精製され、１１５ｍｇ（５５％）の白色の固体を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6）δ：２．２１（３Ｈ，ｓ），２．２７（３Ｈ，ｓ），３．６４（６Ｈ，ｓ），５．９５（２Ｈ，ｓ），６．６７−６．７０（４Ｈ，ｍ），７．０９−７．５２（１８Ｈ，ｍ），８．４２（１Ｈ，ｓ），８．５８（１Ｈ，ｓ），８．６５（１Ｈ，ｓ）．
ＬＣ／ＭＳ：Ｃ46Ｈ39Ｎ7Ｏ7Ｓの計算値：８３３．２６；検出値８３４．２（Ｍ＋Ｈ）
【０１２４】
２−アジドメチル−３，５−ジメチル−４−ニトロ−ピリジン
ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中に溶解された、４−ニトロ−１−ヒドロキシメチル−３，５−ジメチルピリジン（０．９１ｇ、５ｍｍｏｌ）を含有する丸底フラスコに、トリエチルアミン（５５８μＬ、８ｍｍｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸無水物（１．９６ｇ、６ｍｍｏｌ）が添加された。反応液は室温で２時間攪拌された。反応液は水へ注がれ、ＣＨ2Ｃｌ2中へ抽出された。有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。固体はＭｅＯＨ（２５ｍｌ）中に再溶解され、あらかじめ水（５ｍＬ）中の溶解された、ＮａＮ3（３９０ｍｇ，６ｍｍｏｌ）で処理された。反応液は室温で４時間攪拌された。反応液は次に水へ注がれ、ＣＨ2Ｃｌ2中へ抽出された。有機物は乾燥され（ＭｇＳＯ4）、濾過され、濃縮乾燥された。固体は、シリカゲル上で、溶出液として４０％Ｅｔ2Ｏ：Ｈｅｘを用いて精製され、６００ｍｇ（５８％）の澄明な無色の油を与えた。
1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：２．３１（３Ｈ，ｓ），２．３３（３Ｈ，ｓ），４．５１（２Ｈ，ｓ），８．５３（１Ｈ，ｓ）
ＬＣ／ＭＳ：Ｃ8Ｈ9Ｎ5Ｏ2の計算値：２０７．０８；検出値１８０．２（Ｍ＋Ｈ−Ｎ2），２０８．２（Ｍ＋Ｈ）
【０１２５】
ＣＯＸ−２クリックＦ−１８実験
【０１２６】
【化１３】
2008541014.tif 000015
【０１２７】
酸素−１８水は、１１ＭｅＶプロトン（ＲＤＳ−１１１エクリプス、シーメンス・モレキュラー・イメージング）を用いて照射され、［18Ｆ］フッ化物イオンを、通常の方法で生成した。ボンバードメントの最後に、［18Ｆ］フッ化物イオンを含有する［18Ｏ］水は、タンタル標的から自動化された求核フッ素化モジュールへ移された（エクスプロラＲＮ、シーメンス・バイオマーカー・ソリューションズ）。［18Ｏ］水／［18Ｆ］フッ化物イオン溶液は、あらかじめ水（５ｍＬ）、炭酸水素カリウム水溶液（０．５Ｍ、５ｍＬ）及び水（５ｍＬ）ですすがれた、小型の陰イオン交換樹脂カラム（クロマフィックス）４５−ＰＳ−ＨＣＯ３，マッハライ・ナーゲル）へ、コンピュータ制御下に移された。［18Ｏ］水（１．８ｍＬ）は、次に続く精製及び再利用のため回収された。トラップされた［18Ｆ］フッ化物イオンは、水（０．４ｍＬ）中の炭酸カリウム（３．０ｍｇ）の溶液を用いて反応器内へ溶出された。アセトニトリル（１．０ｍＬ）中のクリプトフィックス２２２（２０ｍｇ）の溶液が添加され、混合物は真空下及びアルゴン気流下に加熱され（７０〜９５℃）、アセトニトリル及び水を蒸発した。冷却後、「ドライ」の反応性［18Ｆ］フッ化物イオン、Ｋ２２２及び炭酸水素カリウムの残渣に対し、アセトニトリル（８００μＬ）中の、４−｛５−［１−（４−ニトロ−３，５−ジメチル−ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−３−フェニル−イソオキサゾール−４−イル｝−Ｎ−ジメチトキシトリチル−ベンゼンスルホンアミド（１，  ８．０ｍｇ，９．６μｍｏｌ）の溶液が添加された。反応混合物は、密閉容器中で（Ｐmax＝２．３ｂａｒ）１１０℃で１０分間、（磁石により）攪拌しながら加熱された。混合物は５５℃に冷却され、ほとんどのアセトニトリルは、先と同様に、真空及びアルゴン気流下に蒸発された。
【０１２８】
【化１４】
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【０１２９】
保護された粗［18Ｆ］フッ素化中間体（２）に、アセトニトリル（６００μＬ）中のトリクロロ酢酸の４０％溶液が添加され、混合物は９０℃で５分間加熱された。３５℃に冷却された後、酢酸ナトリウム水溶液（２．０Ｍ、５５０μＬ）が、攪拌しながら添加された。反応混合物はサンプルループ（１．５ｍＬ）へ移され、セミプレップＨＰＬＣカラム（フェノメネックス・ジェミニ、５μＣ１８、２５０×１０ｍｍ、５５％アセトニトリル、４５％水、０．０１％トリフルオロ酢酸移動相、５．０ｍＬ／分）上へ注入された。
生成物、４−｛５−［１−（４−［18Ｆ］フルオロ−３，５−ジメチルピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−３−フェニル−イソオキサゾール−４−イル｝−ベンゼンスルホンアミド（３，  ５−［１−（４−［18Ｆ］フルオロ−３，５−ジメチル−ピリジン−２−イルメチル）−１Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イル］−バルデコキシブ、［18Ｆ］ＦＰＶＣ）は、フロースルー放射線検出及びＵＶ（２５４ｎｍ）によってモニターしたところ、８．５〜９．５分において溶出された。精製物を含有するＨＰＬＣ溶出物（７〜８ｍＬ）は、磁気攪拌子を具備した３０ｍＬバイアル中に収集され、水（２０ｍＬ）が添加された。水溶液は完全に混合され、次いで、水／移動相溶液と共に、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋを通された。Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋは、別途のアリコートの水（２０ｍＬ）で洗浄された。生成物は次に、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋからエタノール（１．０ｍＬ）で溶出され、０．２２μｍの無菌フィルタを貫通して、無菌のバイアル内へ通され、廃液ボトルへ入れられた。次に、無菌のフィルタを通して水（９．０ｍＬ）が、無菌の生成物バイアルヘ添加され、エタノール濃度を１０％とした。
【０１３０】
典型的なプロダクションランは、約６６０ｍＣｉの［18Ｆ］フッ化物イオンでスタートし、５２分間の合成、ＨＰＬＣ精製及びＣ１８固相抽出及び１０％エタノール中の再構成の後、６９．３ｍＣｉ（ＥＯＢでは９６．２ｍＣｉ、収率１４．６％）の単離された生成物を与えた。
【０１３１】
集められた生成物は、ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ジェミニ、５μＣ１８、１５０×４．６ｍｍ、５５％アセトニトリル、４５％水、０．０１％トリフルオロ酢酸移動相、１．０ｍＬ／分）により分析された。放射能及びＵＶ（２５４ｎｍ）検出によってモニターしたところ、この生成物は６．１分間の保持時間及び９９．９％の放射化学純度を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】インサイチュクリックケミストリープロセスの概念図である。
【図２】キナーゼ鋳型を用いてリガンドをスクリーニングするための本発明のインサイチュクリックケミストリー法の１つの態様の概念図である。
【図３ａ】リガンドがＡｋｔの内側で形成される２つの経路を例示している。
【図３ｂ】ＡｋｔのＸ線結晶構造であり、リボース成分とアルギニン残基との間の近接した距離（経路Ａ）及び、ＡＴＰのリン酸基とセリン残基との間の近接した距離（経路Ｂ）を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【国際調査報告】
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