(57)【要約】  本発明は、多発性硬化症の治療において使用される、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成するための改良された方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成すること；
ｃ）トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドを有機ベース溶液と接触させることにより、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドからトリフルオロアセチル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、ポリペプチドの混合物を形成すること；
ｄ）遊離のトリフルオロアセチル基および低分子量の不純物を限外濾過により除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を得ること；および
ｅ）各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を酢酸水溶液と接触させて、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を形成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記第一のピーク分子量が、2,000ダルトン〜40,000ダルトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のピーク分子量が、4,700ダルトン〜11,000ダルトンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のピーク分子量が、12,500ダルトンである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記所望のピーク分子量が、2,000ダルトン〜40,000ダルトンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記所望のピーク分子量が、4,700ダルトン〜11,000ダルトンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記所望のピーク分子量が、12,500ダルトンである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記水素化分解触媒が、パラジウム/炭素、レーニーニッケル、Pt、Pt/C、PtO2、Pd(OH)2、Rh/C、またはRhCl(PPh3)3である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記水素化分解触媒が、パラジウム/炭素である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
パラジウム/炭素触媒に対する保護されたポリペプチドの重量比が、１０：１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドを水素化分解触媒と接触させる工程が、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールから成る群より選択される溶媒中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶媒がメタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イニシエーターが、第一級アミン、ジアルキルアミン、またはナトリウムメトキシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イニシエーターがジエチルアミンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記イニシエーターの量が１〜１０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記イニシエーターの量が２〜５重量％である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記イニシエーターの量が２重量％である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記イニシエーターの量が５重量％である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｃ）における前記有機ベースが、水性有機ベースである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記水性有機ベースが、第一級、第二級もしくは第三級アミン、またはメタノールアンモニア（methanolic ammonia）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記水性有機ベースがピペリジンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１−２１の何れか１項に記載の方法により作成されるポリペプチドの酢酸塩の混合物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の混合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の混合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することを含む、薬学的組成物の調製方法。
【請求項２５】
各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の水性混合物を含有する薬学的組成物の調製方法であって、改良点が、請求項１−２１の何れか１項に記載の方法によりポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成することを含む方法。
【請求項２６】
各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；および
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を得ること
を含む方法。
【請求項２７】
前記水素化分解触媒が、パラジウム/炭素、レーニーニッケル、Pt、Pt/C、PtO2、Pd(OH)2、Rh/C、またはRhCl(PPh3)3である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記水素化分解触媒が、パラジウム/炭素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
パラジウム/炭素触媒に対する保護されたポリペプチドの重量比が、１０：１である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドを水素化分解触媒と接触させる工程が、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールから成る群より選択される溶媒中で行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶媒がメタノールである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記イニシエーターが、第一級アミン、ジアルキルアミン、またはナトリウムメトキシドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記イニシエーターがジエチルアミンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記イニシエーターの量が１〜１０重量％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記イニシエーターの量が２〜５重量％である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記イニシエーターの量が２重量％である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記イニシエーターの量が５重量％である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一のピーク分子量が、2,000ダルトン〜40,000ダルトンである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第一のピーク分子量が、4,700ダルトン〜11,000ダルトンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第一のピーク分子量が、12,500ダルトンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２６−４０の何れか１項に記載の方法により作成される、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成る、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物。
【請求項４２】
各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、
ａ）請求項４１に記載の混合物を有機ベース溶液で処理すること、
ｂ）遊離のトリフルオロアセチル基および低分子量の不純物を限外濾過により除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を得ること、および
ｃ）前記ポリペプチドの混合物を酢酸水溶液と接触させて、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を形成すること
を含む方法。
【請求項４３】
前記有機ベースが水性有機ベースである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記水性有機ベースが、第一級、第二級もしくは第三級アミン、またはメタノールアンモニア（methanolic ammonia）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記水性有機ベースがピペリジンである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【序文】
【０００１】
本出願を通して、種々の刊行物が、完全な引用により参照される。これら刊行物の全体の開示は、本発明が属する技術の水準をより完全に説明するために、本出願に参照により組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
グラチラマーアセテート(GA)は、多発性硬化症の治療のために承認されたポリペプチドの混合物である。COPAXONE（登録商標）は、グラチラマーアセテート(GA)を有効成分として含有する薬学的組成物の商標名であり、４つの天然存在アミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、およびＬ−リジンを、それぞれ0.141、0.427、0.095、および0.338の平均モル分率で含有する合成ポリペプチドの酢酸塩を含有する。グラチラマーアセテートの平均分子量は、4,700〜11,000ダルトンである。化学的にグラチラマーアセテートは、Ｌ−グルタミン酸とＬ−アラニン、Ｌ−リジンおよびＬ−チロシンとの重合体、アセテート(塩)を意味する。その構造式は、以下のとおりである：
(Glu，Ala，Lys，Tyr)X・ＸＣＨ3ＣＯＯＨ
(Ｃ5Ｈ9ＮＯ4・Ｃ3Ｈ7ＮＯ2・Ｃ6Ｈ14Ｎ2Ｏ2・Ｃ9Ｈ11ＮＯ3)X・ＸＣ2Ｈ4Ｏ2
CAS - 147245-92-9
(“Copaxone”, Physician’s Desk Reference, (2000), Medical Economics Co., Inc., (Montvale, NJ), 3115)。
【０００３】
グラチラマーアセテートを含むこのタイプのポリペプチドの製造方法は、Teitelbaum, et al.の1974年11月19日に発行された米国特許第3,849,550号、Konfino, et al.の1998年9月1日に発行された米国特許第5,800,808号、および2000年2月3日に公開されたPCT国際公開公報WO 00/05250 (Aharoni, et al.) に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。たとえば、このタイプのポリペプチドは、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメートおよびε−Ｎ−トリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物から調製された。重合は、室温において、無水ジオキサン中で、イニシエーターとしてジエチルアミンを用いて行われた。グルタミン酸のγ−カルボキシル基の脱ブロッキング（deblocking）は、氷酢酸中で、臭化水素(HBr)による作用により行い、その後、1 Mピペリジンにより、リジン残基からトリフルオロアセチル基を除去した（Teitelbaum, et al.の1974年11月19日に発行された米国特許第3,849,550号）。
【０００４】
グルタミン酸のγ−カルボキシル基の脱保護には、大量のHBr/酢酸の使用が必要である。その結果、大量の酸性廃棄物がつくられる。この酸性廃棄物の処分は、困難でコストがかかる。酸性廃棄物の問題を解決するために、既存の方法に代わるかかるポリペプチドの作成方法が望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成すること；
ｃ）トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドを有機ベース溶液と接触させることにより、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドからトリフルオロアセチル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、ポリペプチドの混合物を形成すること；
ｄ）遊離のトリフルオロアセチル基および低分子量の不純物を限外濾過により除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を得ること；および
ｅ）各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を酢酸水溶液と接触させて、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を形成すること
を含む方法を提供する。
【０００６】
また本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；および
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を得ること
を含む方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成すること；
ｃ）トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドを有機ベース溶液と接触させることにより、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドからトリフルオロアセチル保護基を除去して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、ポリペプチドの混合物を形成すること；
ｄ）遊離のトリフルオロアセチル基および低分子量の不純物を限外濾過により除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を得ること；および
ｅ）各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を酢酸水溶液と接触させて、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を形成すること
を含む方法を提供する。
【０００８】
一つの態様において、第一のピーク分子量は、2,000ダルトン〜40,000ダルトン、または2,000ダルトン〜20,000ダルトン、または4,000ダルトン〜8,600ダルトン、または4,000ダルトン〜8,000ダルトン、または6,250ダルトン〜8,400ダルトン、または2,000ダルトン〜13,000ダルトン、または4,700ダルトン〜13,000ダルトン、または10,000ダルトン〜25,000ダルトン、または15,000ダルトン〜25,000ダルトン、または18,000ダルトン〜25,000ダルトン、または20,000ダルトン〜25,000ダルトン、または4,700ダルトン〜11,000ダルトン、または7,000ダルトン、または13,000ダルトン〜18,000ダルトン、または15,000ダルトン、または12,500ダルトンであり得る。
【０００９】
一つの態様において、所望のピーク分子量は、2,000ダルトン〜40,000ダルトン、または2,000ダルトン〜20,000ダルトン、または4,000ダルトン〜8,600ダルトン、または4,000ダルトン〜8,000ダルトン、または6,250ダルトン〜8,400ダルトン、または2,000ダルトン〜13,000ダルトン、または4,700ダルトン〜13,000ダルトン、または10,000ダルトン〜25,000ダルトン、または15,000ダルトン〜25,000ダルトン、または18,000ダルトン〜25,000ダルトン、または20,000ダルトン〜25,000ダルトン、または4,700ダルトン〜11,000ダルトン、または7,000ダルトン、または13,000ダルトン〜18,000ダルトン、または15,000ダルトン、または12,500ダルトンであり得る。
【００１０】
一つの態様において、水素化分解触媒は、パラジウム/炭素、レーニーニッケル、Pt、Pt/C、PtO2、Pd(OH)2、Rh/C、またはRhCl(PPh3)3であり得る。
【００１１】
別の態様において、水素化分解触媒は、パラジウム/炭素であり得る。
【００１２】
更に別の態様において、パラジウム/炭素触媒に対する保護されたポリペプチドの重量比は、１０：１であり得る。
【００１３】
一つの態様において、ポリペプチドを水素化分解触媒と接触させる工程は、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールから成る群より選択される溶媒中で行われ得る。
【００１４】
別の態様において、溶媒はメタノールであり得る。
【００１５】
一つの態様において、イニシエーターは、第一級アミン、ジアルキルアミン、またはナトリウムメトキシドであり得る。
【００１６】
別の態様において、イニシエーターはジエチルアミンであり得る。
【００１７】
更に別の態様において、イニシエーターの量は、０．０５〜１９重量％、または０．１〜１７重量％、または０．５〜１５重量％、または１〜１０重量％、または２〜５重量％、または２重量％、または５重量％であり得る。
【００１８】
一つの態様において、工程ｃ）における有機ベースは、水性有機ベースであり得る。
【００１９】
別の態様において、水性有機ベースは、第一級、第二級もしくは第三級アミン、またはメタノールアンモニア（methanolic ammonia）であり得る。
【００２０】
更に別の態様において、水性有機ベースはピペリジンであり得る。
【００２１】
また本発明は、前述の方法により作成されるポリペプチドの酢酸塩の混合物を提供する。
【００２２】
更に本発明は、前述の混合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００２３】
更に本発明は、前述の混合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することを含む、薬学的組成物の調製方法を提供する。
【００２４】
更に本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の水性混合物を含有する薬学的組成物の調製方法であって、改良点が、前述の方法の何れかによりポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を作成する方法であって、
ａ）チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタメート、およびトリフルオロアセチルリジンのＮ−カルボキシ無水物を、0.01〜20重量％の量のイニシエーターを用いて、適切な時間、適切な温度で重合して、保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、保護されたポリペプチドの混合物を形成すること；および
ｂ）保護されたポリペプチドを水素化分解触媒および水素と接触させることにより、保護されたポリペプチドの混合物からベンジル保護基を除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成り、かつ保護されていない形態のポリペプチドの混合物が第一のピーク分子量を有する、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を得ること
を含む方法を提供する。
【００２６】
一つの態様において、水素化分解触媒は、パラジウム/炭素、レーニーニッケル、Pt、Pt/C、PtO2、Pd(OH)2、Rh/C、またはRhCl(PPh3)3であり得る。
【００２７】
別の態様において、水素化分解触媒は、パラジウム/炭素であり得る。
【００２８】
更に別の態様において、パラジウム/炭素触媒に対する保護されたポリペプチドの重量比は、１０：１であり得る。
【００２９】
一つの態様において、ポリペプチドを水素化分解触媒と接触させる工程は、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールから成る群より選択される溶媒中で行われ得る。
【００３０】
別の態様において、溶媒はメタノールであり得る。
【００３１】
更に別の態様において、イニシエーターは、第一級アミン、ジアルキルアミン、またはナトリウムメトキシドであり得る。
【００３２】
一つの態様において、イニシエーターはジエチルアミンであり得る。
【００３３】
別の態様において、イニシエーターの量は、０．０５〜１９重量％、または０．１〜１７重量％、または０．５〜１５重量％、または１〜１０重量％、または２〜５重量％、または２重量％、または５重量％であり得る。
【００３４】
一つの態様において、第一のピーク分子量は、2,000ダルトン〜40,000ダルトン、または2,000ダルトン〜20,000ダルトン、または4,000ダルトン〜8,600ダルトン、4,000ダルトン〜8,000ダルトン、または6,250ダルトン〜8,400ダルトン、または2,000ダルトン〜13,000ダルトン、または4700〜13,000ダルトン、または10,000ダルトン〜25,000ダルトン、または15,000ダルトン〜25,000ダルトン、または18,000ダルトン〜25,000ダルトン、または20,000ダルトン〜25,000ダルトン、または4,700ダルトン〜11,000ダルトン、または7,000ダルトン、または13,000ダルトン〜18,000ダルトン、または15,000ダルトン、または12,500ダルトンであり得る。
【００３５】
また本発明は、直前に記載の方法の何れかにより作成される、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびトリフルオロアセチルリジンから成る、トリフルオロアセチルで保護されたポリペプチドの混合物を提供する。
【００３６】
また本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、
ａ）前述の混合物を有機ベース溶液で処理すること、
ｂ）遊離のトリフルオロアセチル基および低分子量の不純物を限外濾過により除去して、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの混合物を得ること、および
ｃ）前記ポリペプチドの混合物を酢酸水溶液と接触させて、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成り、かつ所望のピーク分子量を有するポリペプチドの酢酸塩の混合物を形成すること
を含む方法を提供する。
【００３７】
前述の方法の一つの態様において、有機ベースは水性有機ベースであり得る。
【００３８】
前述の方法の別の態様において、水性有機ベースは、第一級、第二級もしくは第三級アミン、またはメタノールアンモニア（methanolic ammonia）であり得る。
【００３９】
前述の方法の更に別の態様において、水性有機ベースはピペリジンであり得る。
【実験の詳細】
【００４０】
例１
ポリ[5-ベンジル-l-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Ala, L-Tyr]の合成
7.43 gのL-チロシンN-カルボキシ無水物を、260 mlのジオキサンに添加し、その混合液を60℃で20分間加熱し、その後濾過した。34.61 gのN6-トリフルオロアセチル-L-リジンN-カルボキシ無水物を、630 mlのジオキサンに添加し、その溶液を20−25℃で15分間攪拌し、その後濾過した。21.25 gのL-アラニンN-カルボキシ無水物を、395 mlのジオキサンに添加し、その溶液を20−25℃で15分間攪拌し、その後濾過した。14.83 gの5-ベンジルL-グルタメートN-カルボキシ無水物を、260 mlのジオキサンに添加し、その溶液を20−25℃で10分間攪拌し、その後濾過した。
【００４１】
これら溶液を、機械式スターラーを備えた2Lエルレンマイアーフラスコ中で混合した。これら溶液を一緒に5分間撹拌した。その後、反応混合液に3.9 gのジエチルアミンを添加した。その混合液を23−27℃で24時間撹拌した。
【００４２】
その後、反応混合液を5Lの脱イオン水に添加した。固形反応生成物を濾過し、洗浄し、真空下60℃において乾燥させた。65.6 gの固形のホワイト−オフホワイト粉末を得た。
【００４３】
例２
ポリ[5-ベンジル-L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Ala, L-Tyr]の脱保護（水素化分解）によるポリ[L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Ala, L-Tyr]の形成
例１に記載されるとおり合成された18 gの固形生成物を、540 mlのメタノール中に懸濁した。1.8 gのウェットパラジウム炭 (10% Pd on charcoal type 87L Powder, Johnson Matthey - Precious Metals Division) を添加した。その混合液にＨ2を2 Atm.で7時間バブリングすることにより水素化分解を行った。混合液を濾過した。反応混合液を270 mlに濃縮し、600 mlの水に添加した。その混合液を1時間撹拌し、濾過し、乾燥させて、14 gのホワイト−オフホワイト粉末を得た。
【００４４】
例３
トリフルオロアセチル基の除去によるポリ[L-Glu, L-Lys, L-Ala, L-Tyr]の形成
例２で合成された生成物9 gを540 mlの水に添加した。その混合液に60 mlのピペリジンを添加し、混合液を室温で24時間撹拌した。混合液を濾過し、黄色がかった透明な濾液を得た。5キロダルトンメンブレンを用いて限外濾過を行い、低分子量の不純物をすべて除去した。6サイクルの限界濾過を行った後、その溶液をpHが4.0になるまで酢酸で酸性化した。水を添加し、pHが5.5になるまで溶液に限外濾過を行った。その溶液を濃縮し、60時間凍結乾燥させた。4.7 gのポリ[L-Glu, L-Lys, L-Ala, L-Tyr]の白色凍結乾燥ケークを得た。
【００４５】
例４
分子量分析
例３の生成物の分子量を、UV検出器を備えたSuperose 12 HR Gel Permeation HPLCカラムを用いて決定した。リン酸緩衝液、pH 1.5を移動相として使用した。
【００４６】
カラムの全保持時間を、1 mlの水で希釈した200μlのアセトンを用いて決定した。カラムは、2003年2月4日に発行された米国特許第6,514,938号 (Gad, et al.) (具体的には例２を参照)（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたミレニアム計算を利用して、TV分子量マーカーを用いてキャリブレーションを行った。
【００４７】
キャリブレーション後、例３の生成物の5 mg/ml溶液を調製した。ピーク最大保持時間を測定し、ピーク分子量を12,700ダルトンと決定した。
【００４８】
例５
加水分解およびアミノ酸含量の決定
例３で得たポリペプチド10 mgをアルギニン内部コントロール溶液に添加して、サンプル溶液を調製した。このサンプル溶液を、1％(w/v)フェノールを含有する濃HClを用いて、Ｎ2雰囲気下において110℃で24時間加水分解した。グルタメート、アラニン、チロシン、およびリジンHClの一つをそれぞれが含有するアミノ酸コントロール溶液を調製し、加水分解を行った。サンプル溶液およびコントロール溶液を、オルト−フタルジアルデヒドを用いて誘導体化した。
【００４９】
サンプルおよびコントロールを、UV検出器を備えたMerck LiChrosorb RP18 7μmカラムを用いて分析した。移動相は、リン酸緩衝液pH 2.5/アセトニトリル勾配とした。ポリペプチドサンプル中のアミノ酸のモル分率を、ピーク面積に基いて決定した。
【表１】
2008528589.tif 000002
【００５０】
例６
酢酸塩の形成
例１−３の何れか一の生成物を酢酸水溶液と接触させ、ポリペプチド酢酸塩を形成した。
【考察】
【００５１】
開示される発明の発明者らは、水素化分解が、保護されたポリペプチドのグルタメート残基からベンジル基を除去するのに有効であることを見出した。具体的には、本発明の発明者らは、パラジウム/炭素触媒を用いた水素化分解の利用が、グルタメート残基からベンジル基を除去し、リジン残基がトリフルオロアセチル基で保護されたトリフルオロアセチルポリペプチドを形成するのに有効であることを見出した。たとえばパラジウム/炭素などの触媒は、回収し再利用することにより、廃棄物を削減することができる。トリフルオロアセチル基は、その後、ピペリジンによりリジン残基から除去した。
【００５２】
また、グルタメート残基からベンジル基を除去するのに、他の水素化分解触媒を使用してもよい。かかる公知の水素化分解触媒は、レーニーニッケル、Pt、Pt/C、PtO2、Pd(OH)2、Rh/C、RhCl(PPh3)3、および他の遷移金属触媒である。水素化分解反応は、20℃〜100℃の温度および1 atm〜100 atmの圧力下で行うことができる。
【００５３】
しかし、HBr/酢酸の代わりに水素化分解を利用してベンジル基を除去することは、更なる問題を引き起こした。HBr/酢酸を使用する場合、これは、グルタメート残基からのベンジル基の除去と、所望の平均分子量の混合物を得るためのポリペプチドの切断の二つの機能を果たす。しかし、水素化分解は、ポリペプチドを切断しない。このため、開示される方法の発明者らは、更に製造方法を改変して、特定量の重合反応のイニシエーターを用いることにより所望のピーク分子量を達成した。
【００５４】
使用可能なイニシエーターは、ｎ−ヘキシルアミンおよび他の第一級アミン、ジエチルアミンおよび他のジアルキルアミン、またはナトリウムメトキシド、またはイニシエーターの任意の組合せである。1998年9月1日に発行された米国特許第5,800,808号 (Konfino, et al.) は、室温で24時間行われる方法においてイニシエーターとして0.1−0.2％ジエチルアミンを使用して、更にHBrも利用して、5000−9000ダルトンの範囲の分子量を有するポリペプチドを得ることを開示する。一方、出願人は、この実施例で、23℃〜27℃で24時間行われる方法において、7.43 gのL-チロシンN-カルボキシ無水物、34.61 gのN6-トリフルオロアセチル-L-リジンN-カルボキシ無水物、21.25 gのL-アラニンN-カルボキシ無水物、および14.83 gの5-ベンジルL-グルタメートN-カルボキシ無水物とともに、イニシエーターとして3.9 gのジエチルアミンを使用して、12,700ダルトンの平均分子量を有するポリペプチドの混合物を得た。また、ポリペプチドの混合物のピーク分子量は、処理温度および反応時間によっても影響を受ける。
【００５５】
本発明の任意の態様において、ポリペプチドの混合物のピーク分子量の決定は、ポリペプチドの重合反応後、ただしベンジル保護基またはトリフルオロアセチル保護基の何れかを除去する前に行うことができる。あるいは、本発明の任意の態様において、ポリペプチドの混合物のピーク分子量は、ベンジル保護基の除去後であるが、トリフルオロアセチル保護基の除去前に決定することができる。本発明の任意の態様において、更に別の選択肢として、両方の保護基をポリペプチドから除去した後、ポリペプチドの混合物のピーク分子量を決定する。ポリペプチドの混合物のピーク分子量の調整は、公知の技術により、たとえばクロマトグラフィー分画、濾過、限外濾過、透析、酵素的加水分解、または沈降により、当該方法の上記ステップで同様に行うことができる。
【００５６】
本発明は、各々がグルタミン酸、アラニン、チロシンおよびリジンから成るポリペプチドの酢酸塩の混合物を作成する方法であって、水性廃棄物の産生が低減され、かつポリペプチドの酢酸塩の混合物のピーク分子量のコントロールが改良された方法を提供する。
【国際調査報告】
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