(57)【要約】  ヒトを含む動物の多能性間葉系幹細胞の増殖を「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」及び「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で非常に刺激する能力を有する、オリゴヌクレオチドが開示される。これらのオリゴヌクレオチドは、（１）本発明のＯＤＮの接種による、急性損傷、異常な遺伝子発現、又は後天性疾患によって損なわれた間葉系組織の再生と、（２）骨髄の小さなアリコートの除去により、損なわれた間葉系組織を有する宿主の治療、それらの間葉系幹細胞の単離、及び損なわれた身体部位（複数可）にＭＳＣを送達するのに適切な生体適合性のある担体と組み合わせた、本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養したＭＳＣによる損なわれた組織の治療と、（３）例えば、損なわれた身体部位（複数可）に「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で産生された組織を送達するのに適切な生体適合性のある担体と組み合わせた、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で得られた間葉系組織により組織損傷又は欠陥を置き換えて修復するための、本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養されたＭＳＣの方向付けられた分化による様々な間葉系組織の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での生産と、（４）本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養され、遺伝的欠陥を置き換えることができるタンパク質を発現するように遺伝子工学的手法によって形質転換されたＭＳＣによる異常な遺伝子発現をともなう宿主の治療、のような広範囲の臨床的手順で用いることができる。【選択図】図１ａ
2008542339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系組織機能障害の治療のための、及び／又は間葉系組織再生を誘導するための医薬品の製造のための、約１４〜４０のヌクレオチドを有しており、かつ、式ＰｙＮＴＴＴＴＮＴ（式中、ＰｙがＣ又はＴであり、Ｎが任意のデオキシリボヌクレオチドである）の少なくとも１つのサブシークエンスを有する、オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２】
前記間葉系組織が、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、腱組織、靭帯組織、真皮組織、表皮組織、神経組織、心臓組織、腎臓組織、腺組織及び肝組織から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
心臓発作による組織損傷の治療、骨格の欠損又は変性の治療、軟骨の欠損又は変性による組織損傷の治療、神経系の欠損又は変性による組織損傷の治療、脂肪組織の欠損又は変性による組織損傷の治療、肝臓の欠損又は変性による組織損傷の治療、筋肉の欠損又は変性による組織損傷の治療、皮膚の欠損又は変性による組織損傷の治療、熱傷事故による組織損傷の治療、膵臓の欠損又は変性による組織損傷の治療、粘膜の欠損又は変性による組織損傷の治療、血管の欠損又は変性による組織損傷の治療、血液の欠損又は変性による組織損傷の治療のための医薬品を製造するための、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、１４〜２６のヌクレオチドから成ることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、天然（ホスホジエステル）ホスフェート骨格の任意の種類の改変を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、５’インターヌクレオチド結合にホスフェート骨格改変を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、３’インターヌクレオチド結合にホスフェート骨格改変を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合として、インターヌクレオチド結合の少なくとも１つを有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、
【化１】
2008542339.tif 000009
【化２】
2008542339.tif 000010
【化３】
2008542339.tif 000011
から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬品が、ヒトに投与されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが、薬学的に許容される担体に含まれていることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが、徐放性送達ビヒクル中に封入されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが、組織又は器官の欠損若しくは変性の治療を支援すること目的とした装置と組み合わせて被験体に投与されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが、１用量当たり１μｇ〜１００ｍｇの量で存在することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬品が、液体、ゲル及び凍結乾燥された製剤から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品が、皮内注射、筋肉内注射、又は静脈注射によって投与されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬品が、経口、鼻腔内、肛門、膣、又は経皮的な経路によって投与されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記間葉系幹細胞が、骨髄から得られることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記間葉系幹細胞が、骨膜から得られることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記間葉系幹細胞が、２つ以上の組織細胞型の細胞に分化することを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、２５以下のヌクレオチドから成ることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスでないことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＳＣの「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」及び「ｉｎ  ｖｉｖｏ」の増殖を誘導する医薬組成物の製造のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。より詳細には、ヒトを含む動物中のＭＣＳの増殖を非常に刺激する能力を有する約１４〜１００のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを指す。
【０００２】
ヒトを含む動物の多能性間葉系幹細胞の増殖を「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」及び「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で非常に刺激する能力を有する、これらのオリゴヌクレオチドが開示される。それらは、（１）本発明のＯＤＮの接種による、急性損傷、異常な遺伝子発現、又は後天性疾患によって損なわれた間葉系組織の再生と、（２）骨髄の小さなアリコートの除去により、損なわれた間葉系組織を有する宿主の治療、それらの間葉系幹細胞の単離、及び損なわれた身体部位（複数可）にＭＳＣを送達するのに適切な生体適合性のある担体と組み合わせた、本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養したＭＳＣによる損なわれた組織の治療と、（３）例えば、損なわれた身体部位（複数可）に「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で産生された組織を送達するのに適切な生体適合性のある担体と組み合わせた、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で得られた間葉系組織により組織損傷又は欠陥を置き換えて修復するための、本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養されたＭＳＣの方向付けられた分化による様々な間葉系組織の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での生産と、（４）本発明のＯＤＮの１つ又は複数とのインキュベーションによって継代培養され、遺伝的欠陥を置き換えることができるタンパク質を発現するように遺伝子工学的手法によって形質転換されたＭＳＣによる異常な遺伝子発現をともなう宿主の治療、のような広範囲の臨床的手順で用いることができる。
【０００３】
動物の領域で、例えば組織に欠損のある場合の、間葉系組織を産生する方法が提供される。該方法は、薬学的に許容される担体中のオリゴヌクレオチドの１つ又は複数から成る組成物の、動物への局所的又は全身投与である。該組成物は、損なわれた部位での修復を誘導するのに有効な量で投与される。
【０００４】
動物のＭＳＣの「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での大規模な増殖のための方法も提供される。該方法は、動物から抽出された骨髄の小さなアリコートをインキュベートすることであって、医学的治療の成功に必要な細胞量を得るのに十分な時間、本発明のＯＤＮの１つ又は複数の有効濃度を含む培養培地中で、例えば、骨髄のアリコートに存在する細胞の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」でのインキュベートすることである。
【背景技術】
【０００５】
骨髄間質細胞又は間葉系前駆細胞としても知られている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、様々な生理活性因子からの影響に依存して、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、筋細胞、肝細胞、腎細胞、心臓細胞、及び神経細胞へと分化することができる、特に、骨髄、血液、真皮及び骨膜中の身体部位で見られる芽球細胞である（Alhadlaq, A and Mao, JJ. Stem Cells Dev. 13:436, 2004）。さらに、培養されたＭＳＣは、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で所与の損傷組織部位に置かれた場合に、異なる細胞特異的系列へと分化する能力を有する。したがって、ＭＳＣは、全身性疾患のための全身的な移植、局所的組織欠損のための局所的な移植、遺伝子治療手順又は細胞工学手順における移植可能な組織及び器官の産出のような、医療用途の有益な材料である。ＭＳＣを単離するためには、骨髄又は他のＭＳＣ源中の他の細胞からＭＳＣを分離することが必要である。骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊柱、肋骨又は他の骨髄腔から得られてもよい。ＭＳＣの他の源は、胚の卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児及び青年期の皮膚、血液、及び他の間葉系幹細胞組織を含む。多くのプロセスが、培養におけるＭＳＣの単離、精製、及び複製のために開発されている（Alhadlaq, A and Mao, JJ. Stem Cells Dev. 13:436, 2004）。しかしながら、ＭＳＣが骨髄又は他の源において非常に少数であることに加えて、限られた増殖能であることから、今までのところ、それらの臨床応用は限定されている。ウイルス形質転換タンパク質を用いるＭＳＣの不死化が記述されている。しかしながら、潜在的な腫瘍誘導の可能性のため、形質転換細胞は、おそらく標準の治療には受け入れられない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ここで、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」及び「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で、ヒトを含む動物の多能性間葉系幹細胞の増殖を刺激する強力な活性を有する化合物である、約１４〜１００、好ましくは１４〜４０、さらにより好ましくは１４〜２６のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを開示する。好ましい実施の形態によれば、本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、２５以下のヌクレオチドから成り、アンチセンスではない。本発明の１つの実施の形態によれば、好ましいオリゴヌクレオチドは、ＰｙＮＴＴＴＴＮＴ（式中、ＰｙはＣ又はＴであり、Ｎは任意のデオキシリボヌクレオチドである）である組成物を有する少なくとも１つのサブシークエンスを有する。
【０００７】
適切なオリゴヌクレオチドは、
【０００８】
【化１】
2008542339.tif 000003
【０００９】
【化２】
2008542339.tif 000004
【００１０】
【化３】
2008542339.tif 000005
【００１１】
から成る群から選択されてもよい。
【００１２】
本発明は、正常な新しい正常組織の生産のために、必要な場合に、欠損のある組織を有する動物に本発明のオリゴヌクレオチドの１つ又は複数を提供することを目的とする。本発明の別の目的は、医学的治療の成功のために、これらの細胞の十分な数を得ることができるように、多能性間葉系幹細胞の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での複製を促進する方法を提供することである。
【００１３】
これらの目的は当業者に明らかになるだろう。
【００１４】
上記の目的の第１のものは、組織に欠損のある動物の部位において組織を再生するための方法を提供することによって達成され、これは、各場合に必要に応じてその部位において局所的又は全身的に、本発明のオリゴヌクレオチドの１つ又は複数から構成される組成物の有効な量を薬学的に許容される担体中で動物へ投与することであり、該組成物は、該部位における組織再生を誘導するのに有効な量で投与される。
【００１５】
本発明のこの局面は、必要に応じて全身又は局所的に正常組織の産出を可能にする。下記に記載する本発明の骨形成ＯＤＮのいくつかを実施例として使用する前臨床結果は、ラットの組織の欠損において組織の形成を示す。
【００１６】
上記の目的の第２のものは、多能性の間葉系幹細胞の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」での複製を促進する方法の提供によって達成され、該方法は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊柱、肋骨又は他の骨髄腔のような適切な源から骨髄細胞を採取し、本発明のオリゴヌクレオチドの１つ又は複数を追加した当該技術の培養培地を用いて、これらの細胞を「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で、医学的治療の成功に必要な細胞の量を得るのに十分な期間培養することである。
【００１７】
特に、本発明によるオリゴヌクレオチドは、心臓発作による組織損傷の治療、骨格の欠損又は変性の治療、軟骨の欠損又は変性による組織損傷の治療、神経系の欠損又は変性による組織損傷の治療、脂肪組織の欠損又は変性による組織損傷の治療、肝臓の欠損又は変性による組織損傷の治療、筋肉の欠損又は変性による組織損傷の治療、皮膚の欠損又は変性による組織損傷の治療、熱傷事故による組織損傷の治療、膵臓の欠損又は変性による組織損傷の治療、粘膜の欠損又は変性による組織損傷の治療、血管の欠損又は変性による組織損傷の治療、血液の欠損又は変性による組織損傷の治療、及び／又は骨髄移植の改良のための医薬品の製造に用いることができる。
【００１８】
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、天然（ホスホジエステル）ホスフェート骨格のいかなる種類の改変も有していてもよく、例としては、５’インターヌクレオチド結合のホスフェート骨格改変若しくは３’ヌクレオチド結合のホスフェート骨格改変、又はホスホロチオエート結合のようなインターヌクレオチド結合の少なくとも１つを有していてもよい。
【００１９】
上記で記載されたオリゴヌクレオチドの少なくとも１つを含んでいる医薬品は、好ましくはヒトに投与され、オリゴヌクレオチドは、好ましくは１用量当たり１μｇ〜１００ｍｇの量である。医薬品は、皮内注射、筋肉内注射又は静脈注射、又は経口、鼻腔内、肛門、膣、経皮的な経路によって投与されてもよく；医薬品は、液体、ゲル及び凍結乾燥された製剤から成る群から選択されてもよい。オリゴヌクレオチドは薬学的に許容される担体に含まれてもよく、及び／又は徐放性送達ビヒクルに封入されてもよい。
【００２０】
オリゴヌクレオチドは、組織又は器官の欠損若しくは変性の治療を支援することを目的とした装置と組み合わせて、被験体にさらに投与されてもよい。
【００２１】
一実施形態によれば、間葉系幹細胞は骨髄又は骨膜から得られる。さらなる実施の形態によれば、間葉系幹細胞は２つ以上の組織の細胞型の細胞（前記組織は好ましくは、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、腱組織、靭帯組織、真皮組織、表皮組織、神経組織、心臓組織、腎臓組織、腺組織及び肝組織から選択される）に分化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
組織の修復は、置き換えられる必要のある組織欠損がある部位でのみ、形態学的に正常で成熟した組織の形成が促進されることを意味する。
【００２３】
「動物」とは、脊椎構造がある任意の動物、好ましくは哺乳類、及び最も好ましくはヒトを意味する。
【００２４】
「被験体」は、ヒトを含む霊長目の動物を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」は、複数のヌクレオチド（すなわち、ホスフェート基に、及び置換ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）若しくはウラシル（Ｕ））、又は置換プリン（例えばアデニン（Ａ）若しくはグアニン（Ｇ））のいずれかである置換可能な有機塩基に結合した糖（例えばリボース又はデオキシリボース）から成る分子）を意味するものとする。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）及びオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の両方を指す。用語「オリゴヌクレオチド」はさらにオリゴヌクレオシド（すなわちリン酸を除いたオリゴヌクレオチド）及び他の有機塩基を含有するポリマーも含むものとする。オリゴヌクレオチドは既存の核酸源（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）から、しかし好ましくは合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生産された）から得ることができる。
【００２６】
「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって結合された複数のヌクレオチドを指す。
【００２７】
「免疫賦活オリゴヌクレオチド」は、統計的に有意な方法で、免疫系の細胞（すなわちリンパ球又はマクロファージ）を刺激する（すなわち、それらの細胞に対する細胞分裂促進性の効果を有するか、それらの細胞によって発現されるサイトカインを誘導、増加、又は減少させる）オリゴヌクレオチドを指す。
【００２８】
「ＣｐＧ」はシトシン−グアニンジヌクレオチドを指す。
【００２９】
「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、免疫系の細胞を刺激し、その免疫賦活活性が、シークエンス中の少なくとも１つのＣｐＧの存在に決定的に依存するオリゴヌクレオチドを指す。
【００３０】
「非ＣｐＧオリゴヌクレオチド」は、免疫系の細胞を刺激し、その免疫賦活活性が、シークエンス中のＣｐＧの存在に決定的に依存しないオリゴヌクレオチドを指す。
【実施例】
【００３１】
実施例１
材料及び方法
以下の材料及び方法は、実施例の全体にわたって概して用いられた。
１）オリゴヌクレオチド
ホスホロチオエートのインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを購入し、Operon Technologies（Alameda, California）又はAnnovis (Aston, Pennsylvania）又はOligos Etc (Bethel, Maine）からの高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ＯＤＮは、脱パイロジェン化した（depyrogenated）水の中で懸濁し、リムルス試験を用いてＬＰＳ混入を分析し、使用するまで−２０℃で保存した。純度は、ＨＰＬＣ分析及びＰＡＧＥ分析によって評価した。ＬＰＳレベルが検出できなかった場合、ＯＤＮ調製品を使用した。
２）動物実験
２ａ―骨髄（ＢＭ）抽出：ラットのＢＭに由来するＭＳＣは、８〜１２週齢（約３５０ｇ）のオスのスプレーグドーリーラットから採取した。動物は、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラシン（xilacine）（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔をかけた。骨端を切除し、髄腔への接近を可能にした後に、全体のＢＭプラグを、１ｍｌの注射器を使用して、１００ＩＵ／ｍｌゲンタマイシン及び２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンを加えたα−ＭＥＭ培地で、大腿部骨から洗い流した。
【００３２】
２ｂ―オリゴヌクレオチド治療による「ｉｎ  ｖｉｖｏ」におけるＭＳＣの複製刺激：重さ約３５０ｇの若い（８〜１２週齢）成体のオスのスプレーグドーリーラットに、５日間１日に１度、オリゴヌクレオチドＩＭＴ５０４（配列番号２）２５０μｇを含むＰＢＳを３００μｌ（投与された（treated）動物）、又はＰＢＳを３００μｌ（対照動物）皮下注射した。この２日後に、動物を犠牲にし、上述されるように、ＢＭに由来するＭＳＣを抽出した。
【００３３】
２ｃ―オリゴヌクレオチド治療による「ｉｎ  ｖｉｖｏ」の骨形成刺激：重さ約３５０ｇの若い（８〜１２週齢）成体のオスのスプレーグドーリーラットを使用した。動物は、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラシン（５ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって麻酔をかけた。後脚を覆う皮膚を剃毛及び滅菌した後、１．５ｃｍの縦方向の切開を脛骨最前部区域で行なった。骨における欠損を生じさせるために、生理食塩水による洗浄下で円形ダイヤモンドソーに接続された低速歯科用ドリルを使用して、骨切断術を行った。骨切断術のために、筋肉挿入のない部位を、足首下より１５ｍｍを選択した。創傷は骨髄に到達する程、十分に深かった。１％メチルセルロース３μｌ中のＯＤＮの一回の用量（各々の実験において述べられるように）を、右の脛骨に作られた欠損へ導入した。対照として、同量（３μｌ）のビヒクルを、左の脛骨に作られた欠損へ導入した。骨折仮骨の形成を、０日目、２１日目及び２８日目にＸ線写真で評価した。２８日目において、動物はエーテル大気の下で安楽死させ、脛骨の摘出及び撮影を行なった。この後、脛骨を１０％ホルモール溶液中で固定し、１０％ＥＤＴＡ溶液中で脱灰し、パラフィンに包埋した。各々の脛骨の縦断面で切片を作成し、石灰化された区域を可視化するためにマッソンのトリクロム酸技法で染色し、光学顕微鏡の下で検査した。
３）組織培養
３ａ―ＭＳＣのコロニー形成単位の測定（Castro-Malaspina H., Gay R. E., Resnick G., Kapoor N., Meyers P., Chiarieri D., McKenzie S., Broxmeyer H.E., Moore M.A.著「ヒト骨髄線維芽細胞コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）及びそれらの子孫細胞の特性評価（Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells（CFU-F）and their progeny）」（Blood. 1980; 56(2): 289-301））：上述されるような大腿部の骨から抽出した２×１０６の細胞を、１００ＩＵ／ｍｌゲンタマイシン、２５μｇ／ｍｌアンフォテリシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び２０％ウシ胎仔血清が加えられた１０ｍｌのα−ＭＥＭ培地を含む２５ｃｍ２の培養皿で培養した。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２で行なった。７日後に接着していない細胞を洗い流し、新しい培地を加えた。培養の最初の７日間に、ＯＤＮを投与した培養は、示されたＯＤＮを１μＭ含んでいた。インキュベーションを１４日目まで継続した。この後に、接着細胞をＰＢＳで２度洗浄し、メタノールで固定し、メイ−グルングバルド−ギムザ技法を使用して染色した。光学顕微鏡を使用して、コロニーの観察及びカウントを行なった。
【００３４】
３ｂ―長期的骨髄（ＬＴＢＭ）培養：この培養技術を、培養されたＭＳＣの分化能を評価するために使用した（Gartner S., Kaplan H. S.著「ヒト骨髄細胞の長期培養（Long-term culture of human bone marrow cells）」（Proc Natl Acad Sci U S A. 1980; 77(8): 4756-4759））。上述されるような大腿部の骨から抽出した１０×１０６の細胞を、１００ＩＵ／ｍｌゲンタマイシン、２５μｇ／ｍｌアンフォテリシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１２．５％ウシ胎仔血清、１２．５％ウマ血清、及び１０−８Ｍハイドロコルチゾンが加えられた１０ｍｌのα−ＭＥＭ培地を含む２５ｃｍ２の培養皿で培養した。インキュベーションは２８日間３７℃、５％ＣＯ２で行なった。接着していない細胞を、７日ごとに細胞上清を遠心分離することによって除去した。この後、上清の半分を新しい培地と取り替え、培養皿に返した。培養の最初の７日間に、ＯＤＮを投与した培養は、示されたＯＤＮを１μＭ含んでいた。この後に、この刺激物質は、培地交換で次第に希釈された。インキュベーション後に、接着細胞をＰＢＳで２度洗浄し、メタノールで固定し、メイ−グルングバルド−ギムザ技法を使用して染色した。細胞は光学顕微鏡を使用して観察した。
【００３５】
３ｃ―「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」におけるＭＳＣの骨形成分化（Bruder S. P, Jaiswal N., Haynesworth S.E.著「大規模な継代培養中及び凍結保存後の、精製されたヒト間葉系幹細胞の成長速度、自己複製、及び骨形成能（Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation）」（J Cell Biochem. 1997; vol. 64, p. 278））：上述されるような大腿部の骨から抽出した２×１０６の細胞を、１００ＩＵ／ｍｌゲンタマイシン、２．５μｇ／ｍｌアンフォテリシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清が加えられた１０ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を含む２５ｃｍ２の培養皿で培養した。培養は、ｌμＭの示されたＯＤＮも含んでいた。３日間の培養後に、接着していない細胞を洗い流し、新しい培地及びＯＤＮを加えた。さらに７日培養後に、細胞をトリプシン処理し、３０００細胞／ｃｍ２で分化培地を含む新しい培養皿へ播種した。この培地は、１０−８のデキサメタゾン、０．２ｍＭアスコルビン酸及び１０ｍＭβ−グリセロリン酸を加えたＤ−ＭＥＭであった。細胞上清を３日ごとに新しい培地で取り替えた。２１日後に、接着細胞をＰＢＳで２度洗浄し、メタノールで固定し、カルシウム沈着を可視化するためにアリザリンレッド技法を使用して染色した。
実施例２
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」におけるＭＳＣ複製のＯＤＮによる刺激
これらの実験において使用するオリゴヌクレオチドは、ＩＭＴ５０４（配列番号２）であった。このオリゴヌクレオチドは２４ヌクレオチドの長さであり；そのヌクレオチド配列は５’−ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＣＡＴＴ−３’であり、すべてのＤＮＡの（天然の）フォスフォジエステル結合を、酵素の分解から保護するためにホスホロチオエート結合で置換した。図１ａは、ラットの大腿部の骨髄から抽出されたＭＳＣの複製がＯＤＮ５０４の存在下で非常に刺激されることを示す。図１ｂは、対照及び処置した培養における細胞の典型的なＭＳＣ形態を示す。他の多くのオリゴヌクレオチド（例えば：配列番号３、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０）を分析し、同様の結果であった。
実施例３
ＯＤＮの刺激の下で「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で複製したＭＳＣは多能性分化能を保持する
図２ａは、ＯＤＮ刺激の下で「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で複製したＭＳＣは、正常なＭＳＣで期待されるように、ＬＴＢＭ培養において、脂肪細胞、線維芽細胞及びマクロファージへ分化することができたことを示す（Gartner S., Kaplan H.S.著「ヒト骨髄細胞の長期培養（Long -term culture of human bone marrow cells）」（Proc Natl Acad Sci U S A. 1980; 77(8): 4756-4759））。他方では、図２ｂは、骨形成培地中（Bruder S. P, Jaiswal N., Haynesworth S.E.著「大規模な継代培養中及び凍結保存後の、精製されたヒト間葉系幹細胞の成長速度、自己複製、及び骨形成能（Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation）」（J Cell Biochem. 1997; vol. 64, p. 278））で、ＯＤＮ刺激の下で「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で複製したＭＳＣが、カルシウム沈着を形成する骨芽細胞に分化することができたことを示す。
実施例４
ＣｐＧ  ＯＤＮは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」におけるＭＳＣの複製の不十分な刺激因子である
１．  図３は、ＣｐＧ  ＯＤＮプロトタイプＯＤＮ２００６及びＯＤＮ２２１６（Krieg, A.M.著「細菌ＤＮＡ中のＧｐＧモチーフ及びそれらの免疫効果（GpG motifs in bacterial DNA and their immune effects）」（2002. Annu. Rev. Immunol. 20, 709-760)）が、ＯＤＮ５０４と比較して、ＭＳＣの複製の不十分な刺激因子であることを示す。他の多くのＣｐＧ  ＯＤＮを分析し、同一の結果が得られた。
実施例５
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」におけるＭＳＣの複製のＯＤＮによる刺激
図４は、ＯＤＮ５０４を接種されたラットの骨髄が、プラセボを接種されたラットと比較して、ＭＳＣコロニー形成細胞の非常に高いレベルを有していることを示す。この結果は、ＯＤＮによるＭＳＣ複製の刺激が「ｉｎ  ｖｉｖｏ」においても生じることを示す。
実施例６
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」における骨形成のＯＤＮによる刺激
ＭＳＣの複製の刺激がＯＤＮによって誘導されることが可能であり、動物に注入された場合、ＭＳＣが骨形成するので（Bruder SP, Fink DJ, Caplan AI.著「骨発生、骨修復及び骨の再生治療における間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy）」（J Cell Biochem. 1994 Nov;56(3):283-94. Review））、ＯＤＮ注入によって「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で過剰複製したＭＳＣの骨形成能を分析した。図５ａ及び図５ｂは、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４を投与した動物において、プラセボを注入したラットと比較してラットの脛骨で誘発された実験による欠損が急速に修復されることを示す。
【００３６】
【表１】
2008542339.tif 000006
【００３７】
【表２】
2008542339.tif 000007
【００３８】
【表３】
2008542339.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ａ】図１ａは、ＯＤＮ５０４（配列２）で刺激された、又はＯＤＮ５０４の非存在下での、ラットの大腿部の骨髄から抽出されたＭＳＣの複製を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、対照の培養及びＯＤＮ  ＩＭＴ５０４処理された培養におけるＭＳＣ細胞の形態を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４を加えたＬＴＢＭ培養における、脂肪細胞、線維芽細胞及びマクロファージを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４を加えた骨形成培地中の、ラット骨髄細胞から得られた骨芽細胞におけるカルシウム沈着を示す。
【図３】図３は、ＯＤＮ５０４を加えた培養におけるＭＳＣ複製能と比較した、ＣｐＧ  ＯＤＮプロトタイプＯＤＮ２００６及びＯＤＮ２２１６を加えた培養におけるＭＳＣ複製能を示す。
【図４】図４は、ＯＤＮ５０４を接種したラットの骨髄細胞又は接種していない細胞をインキュベーションすることにより得られたＭＳＣのコロニー形成単位を示す。
【図５ａ】図５ａは、４週間の処置後にプラセボを注入されたラットと比較した、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４を注入されたラットの脛骨における、実験的に誘発された欠損のＸ線写真の変遷を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、４週間の処置後にプラセボを注入されたラットと比較した、ＯＤＮ  ＩＭＴ５０４を注入されたラットの脛骨における、実験的に誘発された欠損の組織学的分析を示す。
【図１ａ】
2008542339.tif 000012
【図１ｂ】
2008542339.tif 000013
【図２ａ】
2008542339.tif 000014
【図２ｂ】
2008542339.tif 000015
【図３】
2008542339.tif 000016
【図４】
2008542339.tif 000017
【図５ａ】
2008542339.tif 000018
【図５ｂ】
2008542339.tif 000019
【配列表】
2008542339000001.app
【国際調査報告】
2008542339.tif 000020
2008542339.tif 000021
2008542339.tif 000022
2008542339.tif 000023