(57)【要約】  種々のサイズで任意の所望の配列を有する二本鎖ＤＮＡ分子を直接合成する方法を開示する。合成すべきＤＮＡ分子を、より小さな重複ＤＮＡセグメントに論理的に破壊する。マスクレスマイクロアレイ合成機を使用して、アレイの各エレメントまたはフィーチャーが重複ＤＮＡセグメントの１つのＤＮＡによって占められるＤＮＡマイクロアレイを基材上に作製する。マイクロアレイ中に各セグメントの相補物も作製される。ＤＮＡセグメントを基材から放出させ、ＤＮＡのハイブリッド形成を好む条件下におき、この条件下でセグメントがハイブリッド形成して二重鎖を形成する。次いで、二重鎖を、不適切に形成されたＤＮＡらせんに結合するＤＮＡ結合剤を使用して分離し、ＤＮＡ分子のセットからエラーを除去する。次いで、セグメントを互いにハイブリッド形成させて、より大きな標的ＤＮＡ配列にアセンブリする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不正確な配列のＤＮＡ分子から正確な配列のＤＮＡ分子を分離する方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ分子を合成する工程と、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡ分子をより小さなフラグメントに消化する工程と、
（ｃ）前記のより小さなＤＮＡフラグメントを、二重鎖間に配列ミスマッチを有する二重鎖ＤＮＡ分子と選択的に結合するＤＮＡ結合剤に曝露する工程と、
（ｄ）前記ＤＮＡ結合剤が結合しなかったＤＮＡ分子から、前記ＤＮＡ結合剤が結合したＤＮＡ分子を分離する工程と、
（ｅ）前記ＤＮＡ結合剤が結合しなかったＤＮＡ分子のみを増幅する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記分離を固定した位置での前記ＤＮＡ結合剤の親和性結合によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離を電気泳動によって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合剤がＭｕｔＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）および（ｅ）を、正確な配列の純度が所望のレベルに達成されるまで繰り返し行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）を、多数の一本鎖ＤＮＡ分子を並行して作製し、その後、前記ＤＮＡ分子を互いにハイブリッド形成して出発二本鎖ＤＮＡ分子を作製することによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記多数の一本鎖ＤＮＡ分子を作製する工程を、マスクレスアレイ合成装置を使用して基材上に多数の一本鎖ＤＮＡ分子を有するＤＮＡマイクロアレイを作製し、その後、前記ＤＮＡ分子を前記基材から放出させることによって行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
不正確な配列のＤＮＡ分子から正確な配列のＤＮＡ分子を分離する方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ分子を合成する工程と、
（ｂ）前記二本鎖ＤＮＡ分子をより小さなフラグメントに消化する工程と、
（ｃ）前記のより小さなＤＮＡフラグメントを、二重鎖間に配列ミスマッチを有する二重鎖ＤＮＡ分子と選択的に結合するＤＮＡ結合剤に曝露する工程と、
（ｄ）前記ＤＮＡ結合剤が結合しなかったＤＮＡ分子から、前記ＤＮＡ結合剤が結合した二重鎖ＤＮＡ分子を分離する工程と、
（ｅ）前記ＤＮＡ結合剤が結合しなかった二重鎖ＤＮＡ分子のみを増幅する工程と、
（ｆ）前記の増幅された二重鎖ＤＮＡ分子を、二重鎖間に配列ミスマッチを有する二重鎖ＤＮＡ分子と選択的に結合するＤＮＡ結合剤に再度曝露する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）で結合しなかった前記二重鎖ＤＮＡ分子を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項９】
前記分離を固定した位置での前記ＤＮＡ結合剤の親和性結合によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離を電気泳動によって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ結合剤がＭｕｔＳである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）および（ｅ）を、正確な配列の純度が所望のレベルに達成されるまで繰り返し行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）を、多数の一本鎖ＤＮＡ分子を並行して作製し、その後、前記ＤＮＡ分子を互いにハイブリッド形成して出発二本鎖ＤＮＡ分子を作製することによって行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記多数の一本鎖ＤＮＡ分子を作製する工程を、マスクレスアレイ合成装置を使用して基材上に多数の一本鎖ＤＮＡ分子を有するＤＮＡマイクロアレイを作製し、その後、前記ＤＮＡ分子を前記基材から放出させることによって行う、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年８月２７日出願の米国仮出願番号６０／６０４，８６７号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明を、以下の政府機関によって授与された米国政府支援を使用して行った：ＤＯＤ  ＡＲＰＡ  ＤＡＡＤ１９−０２−２−００２６。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（背景技術）
本発明は、一般に、生物学、特に、定義された配列または所望の配列のＤＮＡ分子の製造のための技術および装置に関する。所望ならば、ＤＮＡ分子の製造により、任意の所望のペプチド、タンパク質、またはタンパク質および核酸のアセンブリの合成も可能である。
【０００４】
組換えＤＮＡ化学技術を使用して、現在、天然物からＤＮＡ配列を複製および増幅し、次いで、これらの配列を構成要素に分解し、新規のＤＮＡ配列に組換えるか再アセンブリすることが一般的である。現在、オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いＤＮＡ配列を各ヌクレオシドから直接合成することが可能且つ一般的である一方で、約４００塩基対を超えるＤＮＡ配列の巨大なセグメントまたはアセンブリを直接構築することは一般に実用的ではないと考えられている。結果として、より大きなＤＮＡセグメントを、一般に、個別に購入、クローン化、または合成することができる構成要素およびセグメントから構築し、所望のＤＮＡ分子にアセンブリする。
【０００５】
例えば、選択された宿主中で発現ベクターが新規のタンパク質を発現することが望ましい場合、科学者は、しばしば、分子生物学製品の供給会社から遺伝子発現ベクターを購入し、次いで、発現すると考えられる遺伝子のタンパク質コード領域をクローン化または合成することができる。宿主中でベクターが所望のタンパク質を発現するのに効果的な様式ならびに正確な位置および配向で、コード領域をベクターにライゲーションしなければならない。ベクターの購入者はまた、ベクターの他のＤＮＡ成分が、購入者が実施を望む試験に悪影響を及ぼし得る他の性質を確実に持たないかどうかベクター配列を試験しなければならない。したがって、任意の新規の所望のより大きなＤＮＡ構築物を構築することの困難さは、どのような類似の構築物または構築物の成分を公的な供給元から購入または入手することができるのか、および、これらの成分の配列についての情報をどれくらい利用可能であるのかによって決まる。
【０００６】
長さが明確でない新規に設計されたＤＮＡ配列を構築およびアセンブリするための新規の方法は、ＤＮＡマイクロアレイで構築されたＤＮＡの使用に基づいて開発されている。ＤＮＡマイクロアレイは、基材（substrate）上に配置された複数の一本鎖ＤＮＡプローブのセットから作り上げられる。プローブのセットは、ヌクレオチド配列が同一であるが、他のプローブのセットと配列が異なる。カスタマイズされたアレイの製造に適合したＤＮＡマイクロアレイのｉｎ  ｓｉｔｕ合成技術が記載されている。ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９９／４２８１３号および米国特許第６，３７５，９０３号は、コンピュータによるソフトウェア制御下での高密度マイクロミラーアレイによってアレイが合成されるように光が選択的に誘導するようなアレイの作製方法を記載している。マイクロアレイが完全にソフトウェアの制御下で操作されるので、複雑且つ高価なフォトリソグラフマスクの作製が完全に回避される。このようなカスタマイズされたマイクロアレイを使用して、中程度の長さの二本鎖ＤＮＡ分子をアセンブリするのに必要且つ十分な一本鎖ＤＮＡセグメントを得ることができることが既に提案されていた。ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ０２／０９５０７３号（その開示が本明細書中で参考として援用される）では、この過程を記載している。簡単に述べれば、このアプローチを使用して、一本鎖ＤＮＡの短いセグメントをマイクロアレイ上に作製し、各プローブがアレイ上の別のセットで２つの他のオリゴヌクレオチドと相補的であるように設計する。理論的には、次いで、オリゴヌクレオチドがアレイの基材から放出される場合、各相補セグメントがその相補物とハイブリッド形成するので、ＤＮＡセグメントは、完全な所望のＤＮＡ分子に自己アセンブリする。
【０００７】
合成過程または生化学的過程が決して完全に有効および正確ではないＤＮＡ合成に対するこの一般的アプローチによって複雑になる。したがって、この過程によって作製されたＤＮＡセグメントの偶発的な欠失および置換によるエラーは不可避である。有利且つ質の良いより長いＤＮＡ分子の実際的な合成を促進するために、プローブの合成およびアセンブリ過程における種々のエラーおよび効率の悪さから生じる不自然な結果から目的のＤＮＡ配列を精製する方法を開発しなければならない。
【０００８】
１つのエラー修正過程（一致フィルタリングと呼ばれる過程）が以前に提案されている。この過程は、長いＤＮＡ配列中の稀な単一塩基対エラーが検出および除去されるように至適化されている。
【０００９】
（発明の要旨）
簡潔には、本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子の小さなフラグメントの溶液を局所的に不規則な二重鎖ＤＮＡ分子と選択的に結合するＤＮＡ結合剤に曝露する工程と、ＤＮＡ結合剤が結合しなかったＤＮＡ分子からＤＮＡ結合剤が結合したＤＮＡ分子を分離する工程とを含む、不正確な配列のＤＮＡ分子から正確な配列のＤＮＡ分子を分離する方法である。
【００１０】
本発明により、最小限のエラーでの実質的に任意のサイズの一連のＤＮＡ構築物が実用化される。これにより、ＤＮＡまたは遺伝子発現実験を行うことを望む実験者が、市販のベクターまたは遺伝因子を使用する制約された作業から解放される。それどころか、このマイクロアレイベースの技術を使用して、初めて短期間でコンピュータにてＤＮＡ配列を考案し、加工することができる。
【００１１】
本発明はまた、大部分の配列を有する配列プールから一部の配列を有するＤＮＡ二重鎖を分離する方法に関する。この方法は、二重鎖ＤＮＡ分子を変性させる工程と、ＤＮＡ分子をハイブリッド形成させて新規のＤＮＡ二重鎖分子を形成させる工程と、二重鎖ＤＮＡ分子を局所的に不規則なＤＮＡ二重鎖を有するＤＮＡ分子と選択的に結合するＤＮＡ結合剤に曝露する工程と、ＤＮＡ結合剤が結合したＤＮＡ分子からの分離によってＤＮＡ分子を分離する工程とを含む。
【００１２】
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と併せて考慮した場合、以下の詳細な説明から明らかである。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
１つの実施形態では、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドの合成時に生じるエラー量を減少させる方法に由来する。本発明者らは、この方法を本明細書中で「コンセンサスシャフリング」と称する。いくらかのエラー配列を有する二重鎖集団中のコンセンサス配列を示すＤＮＡ二重鎖を同定および単離するように設計されているので、本方法はこの名称を有する。本方法は、「一致フィルタリング」として公知の以前のエラー修正法と異なる。両過程は、核酸集団から核酸集団内にミスマッチまたは欠失を有する核酸を除去することを意図する。全過程はまた、正確で適合した配列を有するが、作製されたＤＮＡ分子集団中のＤＮＡ配列の大部分の配列と異なる任意の二本鎖ＤＮＡ分子を選択的にフィルタリングして除去する方法を含む。２つの過程は、その方法の詳細が異なる。コンセンサスシャフリングでは、アセンブリ下でのＤＮＡ配列はより短いフラグメントにアセンブリされるか、より短いフラグメントに消化され、その後にハイブリッド形成される。次いで、二本鎖の短縮フラグメントを、選択的ＤＮＡフィルタリング剤（ＭｕｔＳなど）に曝露し、配列集団からミスマッチ配列を除去する。次いで、残存フラグメントを、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用し、より大きな配列にアセンブリする。
【００１４】
一致フィルター法は、ＤＮＡ配列中に１つのエラーを有するより大きなＤＮＡ配列に対して使用するとよい。しかし、この技術を実施した場合、ほとんどのＤＮＡ合成過程のエラー率が低いが不可避であるという事実はより顕著になる。人為的に合成した長いＤＮＡ配列は、集団の実質的に全てのメンバーが複数のエラーを有するＤＮＡ鎖集団になる。コンセンサスシャフリングは、名前が示すように、集団中のコンセンサス配列に対する配列の再シャフリングによってエラーを除去し、それにより、無作為な誤ったヌクレオチド付加の結果であるエラーを排除するように働く。この方法は、コンセンサス配列が正確な配列であるという理論に基づく。
【００１５】
コンセンサスシャフリングによるエラー修正を図１に概説する。ＤＮＡ合成に起因する二本鎖ＤＮＡ分子集団は、無作為なエラーを含む。ＤＮＡ分子集団は、最初に再ハイブリッド形成して新規の二本鎖分子を作製し、これらは必然的にミスマッチを含む。二重鎖分子を酵素によって小さな重複フラグメントに切断する。次いで、ミスマッチを含むフラグメントを、ＭｕｔＳまたは局所的異常を有するＤＮＡに選択的に結合する他の結合分子への吸収によって選択的に除去する。したがって、集団中の残存フラグメントが正確な配列中に増加する。これらのフラグメントをアセンブリＰＣＲ用のテンプレートとして使用して、全長産物を産生する。この過程を、不可避に起こるように、コンセンサス配列が集団中の主要な種になるまで必要に応じて何度でも繰り返すことができる。このアプローチは、ＤＮＡシャフリングといくつかの態様を共有するが（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，３８９−３９１（１９９４））、さらなるミスマッチの曝露および除去工程を含む。図１は、全長遺伝子アセンブリ産物に対するＭｕｔＳフィルターの適用（本発明者が、一致フィルタリングと称する過程）も概説する。一致フィルタリングでは、エラー含有ヘテロ二重鎖を、遺伝子アセンブリ産物から直接除去する。しかし、ＤＮＡ集団の実質的に全てのメンバー中に無作為なエラーが存在する場合、一致フィルタリングは無効であり、有効なエラー除去にはコンセンサスシャフリングが必要である。そのようなものとして、コンセンサス配列に到達するまでのコンセンサスシャフリングの実施およびその後の集団から任意の残存エラーを除去するための一致フィルタリングの使用によって２つの過程を互いに有効に機能させることができる。
【００１６】
本発明の方法は、米国特許第６，３７５，９０３号（その開示も本明細書中で参考として援用される）に記載のマスクレス（ｍａｓｋｌｅｓｓ）ＤＮＡ合成装置型の大量並行ＤＮＡ作製能力（massively parallel DNA fabrication capability）を使用した汎用ＤＮＡ合成過程を行うための試みから得られる。マスクレスアレイ合成機により、コンピュータ制御下で多数の一本鎖ＤＮＡプローブが短期間に並行して（in parallel）作製される。この技術により、数時間で、アレイ中の一本鎖ＤＮＡプローブが任意のＤＮＡ配列に由来し得るカスタムＤＮＡマイクロアレイが製造される。マイクロアレイを、所与のフィーチャー中の全プローブが同一のＤＮＡ配列に由来するフィーチャー中に配列させ、このＤＮＡ配列は任意の他のフィーチャー中のプローブ配列とは異なり得る。この技術により、１つのマイクロアレイにおいて何万から何十万もの異なるフィーチャー（各フィーチャーが２０〜１５０ヌクレオチド長のＤＮＡプローブから構成される）をおよそ数時間で合成可能である。ここで、一本鎖ＤＮＡセグメントの大量並行生成機としてマイクロアレイ合成装置を使用し、本明細書中に記載の過程は、これらのセグメントの長いＤＮＡ片へのアセンブリと並行した合成過程におけるエラーの排除に関する。
【００１７】
前に記載のＰＣＴ公開出願ＷＯ０２／０９５０７３号に記載の技術は、非常に長い目的のＤＮＡ配列を作製するために使用されるマスクレスアレイ合成機の大量並行ＤＮＡ配列合成能力の使用を既に想定している。本発明は、特に、以下の問題を解決するための過程に関する。マイクロアレイ中のＤＮＡプローブへのヌクレオチドの付加における各工程の効率および正確さが９９％であると考えられる。効率レベルは、付加した１００ヌクレオチド毎について、間違った場所に１つのヌクレオチドも付加されないか１つが付加されることを意味するであろう。このエラー率は、ＤＮＡセグメントが２５量体であるか、２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドから構成される場合、４プローブあたり平均して１プローブがエラーを有することを意味するであろう。実際には、実際の効率を９９％を超えさせることができるが、エラー率を決してゼロにできない。いくつかのプローブはエラーを有する。エラーは、以下のいずれかであり得る：ヌクレオチド付加の失敗（すなわち、欠失）、不正確な位置へのヌクレオチドの付加（すなわち、付加）、あるヌクレオチドの別のヌクレオチドへの完全な置き違え（すなわち、置換）、またはヌクレオチドの化学修飾。したがって、エラー型と無関係にハイブリッド形成過程中に作製された集団の配列から、エラーを含むできる限り多くのプローブが除去されるように精製過程を配列すべきである。本明細書中に記載の方法はこれを行う。この過程がＤＮＡ合成のためにマイクロアレイ技術が使用される状況において特定のＤＮＡの精製および分離における問題が解決されるように設計および意図される一方で、この過程は最終的に目的の単一のＤＮＡ分子のコピーが得られるように設計された任意の他のＤＮＡ合成手順で有用であると理解すべきである。
【００１８】
この過程で使用されるＤＮＡ結合剤の主な要件は、ＤＮＡ結合剤がその２つの鎖で配列ミスマッチを有する二本鎖ＤＮＡに優先的に結合することである。好ましい薬剤は、ＭｕｔＳ（細菌タンパク質）である。テルムス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＭｕｔＳを、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（カタログ番号ＳＰ７２１００およびＳＰ７２２５０）から購入することができる。タンパク質の遺伝子配列も公知であり、Ｂｉｓｗａｓ  ａｎｄ  Ｈｓｉｅｈ，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５０４０−５０４８（１９９６）に公開されており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３３１１７で利用可能である。したがって、当業者は、培地中で従来の遺伝子発現ベクターを使用して細菌で形質転換してこのタンパク質を産生することも容易に可能である。この過程でＤＮＡ結合剤として使用することができる別の分子は、挿入、欠失、および塩基置換のミスマッチに高い特異性を有し、互いに離れた５つのヌクレオチドである２つの多型を検出することができるセロリ由来のＣＥＬ１エンドヌクレアーゼである。二量体ナフチリジン１（ｎａｐｔｈｙｒｉｄｉｎｅ  １）（Ｇ−Ｇミスマッチに結合する合成リガンド）などの特定のヌクレオチドミスマッチに結合する有機小分子を設計および合成することも可能である。組み合わせて全ての可能なミスマッチを認識するこのようなリガンドのカクテルは、ＭｕｔＳに置換することができる。適合二重鎖とミスマッチ二重鎖とを識別することができる他のタンパク質剤も使用することができる。例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは、ミスマッチでＤＮＡ鎖を特異的に切断し、この酵素をミスマッチ配列の触媒破壊物としてこの酵素を使用することが可能であるか、ミスマッチ結合剤としてこの過程で使用するためにこの酵素の切断機能を不活化することが可能である。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩは、二重鎖ミスマッチでＤＮＡに特異的に結合して切断し、ヌクレアーゼ活性を欠くが、変異二重鎖ＤＮＡ分子に結合する能力が保持されているこの酵素の変異バージョンは既に操作されている。ＧｏＩｚ  ａｎｄ  Ｋｅｍｐｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：ｅ７（１９９９）。ＳＰヌクレアーゼは、グアニン残基を含むミスマッチを除く全てのミスマッチを切り出すホウレンソウ由来の高活性ヌクレアーゼであり、この酵素を、切断活性を除去するように操作して直接使用することもできる。２つまたはそれを超えるこれらの結合剤を組み合わせて、濾過に対するさらなるストリンジェンシーを得るか、ある薬剤が全ての可能なミスマッチに結合しない場合、全ての配列エラー型を対象とすることができる。
【００１９】
本発明は、例示として本明細書中に記載の特定の実施形態に制限されず、実施形態の全ての修正形態が以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれると理解される。
【００２０】
実施例
エラーフィルターを作製するために、本発明者らは、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ（ＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６）を有するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とテルムス・アクアチカス由来のミスマッチ結合タンパク質（ＭｕｔＳ）との融合タンパク質を構築した。ＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６は、Ｅ．ｃｏｌｉより過剰発現され、また９５％以上の純度となるように精製された。アミロース樹脂上に固定したＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６は、ｗｔホモ二重鎖に欠失変異を含む４０量体のヘテロ二重鎖を選択的に保持することが示された。
【００２１】
エラー修正を証明するために、精製されていない４０量体のオリゴヌクレオチドをＰＣＲによってアセンブリして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰｕｖ）をコードする７６０ｂｐの遺伝子を産生した。典型的な遺伝子合成エラーを含むＧＦＰｕｖの２つの独立した調製物（表１）を再ハイブリッド形成させ、一致フィルタリングまたはコンセンサスシャフリングを２回繰り返した。コンセンサスシャフリングのために、各集団を３つのプールに分割し、異なる制限エンドヌクレアーゼで切断して、平均サイズが１５０ｂｐでサイズ範囲が４〜３９６ｂｐのフラグメントを産生した。フラグメントをプールし、ＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６を添加しているか添加していないエラーフィルタリングに供した。非結合フラグメントを全長産物に再アセンブリし、ＰＣＲ増幅した。一致フィルタリングのために、エラーフィルターでの処理後に非結合ＧＦＰｕｖをＰＣＲ増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉでのクローニング後、手持ち式ＵＶランプ下での蛍光によるコロニーのスコアリングによってエラー率を評価した。入力およびコンセンサスシャフリングした集団の実際のエラー率を、無作為に選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡの配列決定によって決定した（図２）。結果は、２ラウンドのコンセンサスシャフリングによって蛍光コロニー率が約６０％から９０％超に増加し、集団のエラー率が、約１．１７エラー／ｋｂから約０．３１エラー／ｋｂへと３〜４倍に減少したことを示す。ＭｕｔＳは、各エラーフィルタリングラウンドで蛍光コロニー画分を増加させるのに必要であった。コンセンサスシャフリングを行った手段は、欠失およびＧ−Ａ変異の有意な減少を示し、これは、Ｔ．ａｑ．ＭｕｔＳの以前に報告された選択性と一致する（表１）。
【００２２】
【表１】
2008517586.tif 000002
【００２３】
コンセンサスシャフリングのいくつかのパラメーターを評価するために、簡単な数学モデル（式１〜６）を構築した。Ｅエラー／塩基を含む長さＮのｄｓＤＮＡ分子の入力集団を再ハイブリッド形成させ、平均長さＳのより短いｄｓＤＮＡフラグメントに断片化し、エラーフィルタリングを行い、再アセンブリする。Ｐ（Ｆ）は、長さＳのフラグメントが正確な配列を有する確率である。本発明者らは、再ハイブリッド形成された二重鎖がエラーを０（Ｃ）、１つ（Ｈ）、または両方（Ｉ）の鎖に有する確率を決定する。式５は、ミスマッチ含有二重鎖の相対量を調整するためにＭｕｔＳ選択因子（Ｍ）を適用する一方で（Ｉ、Ｈ）、再ハイブリッド形成した二重鎖中の正確な鎖の全画分の計算によってフラグメントがＭｕｔＳフィルタリングサイクル後に正確である確率Ｐ（Ｆ’）を評価する。次いで、無エラーアセンブリ産物が得られる確率Ｐ（Ａ）を、式６によって得る。
【数１】
2008517586.tif 000003
【００２４】
コンセンサスシャフリングエラー率のデータから、本発明者らは、ＭｕｔＳ選択因子Ｍが約２．２であると評価する。図３は、典型的な長さ（２ｋｂ）、フラグメントサイズ（２００ｂｐ）、およびエラー率（１．８／ｋｂ）を想定したこのモデルから得られるいくつかの予測を示す。コンセンサスシャフリングはより小さなフラグメントサイズを使用して最も有効であると予想され（図３ａ）、ＭｕｔＳフィルタリングの複数回の繰り返しにより、わずかしか正確な配列を持たない集団に劇的な結果をもたらし得る（図３ｂ）。このモデルにより、結合条件の至適化および／またはより選択的なＭｕｔＳホモログの使用によるＭｕｔＳ選択因子の小さな改良でさえもコンセンサスシャフリングを劇的に改良することができることも予想される（図３ｃ）。一致フィルタリング（Ｎ＝Ｓ）は低エラー／クローンの集団で有効であることが予想されるが（図３ｄ）、再ハイブリッド形成した二重鎖の大部分がミスマッチを含む場合無効になる。
【００２５】
伝統的にＤＮＡシャフリングを使用して、集団中の変異の組み合わせシャフリングによって多様な集団が作製されているにもかかわらず、変異体小集団からの多様性を得るにはシャフリングされた産物の間の多様性を等価に減少させることも必要である。実際、コンセンサスシャフリングを使用して、集団中のそれぞれがエラーを含むＤＮＡ分子集団から出発し、主な配列がコンセンサス配列である新規の集団を作製することが可能なはずである。これを証明するために、それぞれ１〜２個の変異が分布する非経口ＧＦＰｕｖクローンをプールし、ＤＮＡシャフリングのみまたはコンセンサスシャフリングを２回繰り返し、Ｅ．ｃｏｌｉでクローン化する。ＤＮＡシャフリングのみ（ＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６なし）により、蛍光コロニー率は３０％に増加し（全部で３８７コロニー）、これは以前の報告と類似する。２ラウンドのコンセンサスシャフリングによって８２％蛍光（全部で５５１コロニー）である新規の集団が得られ、主な種がこの時点で入力集団のコンセンサス配列であったことを示す。
【００２６】
本発明者らは、合成遺伝子集団中のエラーを有意に減少させる実験方法としてコンセンサスシャフリングおよび一致フィルタリングを証明した。一致フィルタリングは、エラー率／クローンの低いＤＮＡ集団中のエラーを減少させるための簡潔且つ有効な手順である一方で、コンセンサスシャフリングは、一般に、典型的な長さおよびエラー率の合成ＤＮＡ集団のエラー修正に適用可能なはずである。コンセンサスシャフリング法は迅速であり（約６時間／反復）、手作業でのエラーの修正に必要な時間を大幅に減少させる。これらの方法は、速度および正確さが有意に増大するはずであり、本発明者らは、長いＤＮＡ配列を「書く」ことができる。
【００２７】
方法
遺伝子アセンブリ
ｐＧＦＰｕｖの配列２６１〜１０２０（Ｔ３５７Ｃ、Ｔ８１１Ａ、およびＣ８１２Ｇの塩基置換が行われたＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６２６３６）を、２０ｂｐが重複した精製されていない４０量体および２０量体オリゴヌクレオチド（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアセンブリした。アセンブリ反応は、以下の成分を含んでいた：６４ｎＭの各オリゴヌクレオチド、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１×緩衝液、および０．０２単位／μＬ  ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）。９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で２分間を２５サイクル行ってアセンブリした。アセンブリ産物のＰＣＲ複製は、以下の成分を含んでいた：１０倍希釈したアセンブリ反応物、２５μＭの２０ｂｐ外側プライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１×緩衝液、０．０２単位／μＬ  ＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ。９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を３５サイクル、その後７２℃で１０分間の最終伸長を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ｄＨ2Ｏで溶離するＱｕｉａｇｅｎ  ｑｕｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、濃縮した。
【００２８】
ヘテロ二重鎖生成
アセンブリしたＧＦＰｕｖを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌで２５０ｎｇ／μＬに希釈し、９５℃で５分間加熱し、その後、０．１℃／秒で２５℃まで冷却した。
【００２９】
遺伝子の断片化
コンセンサスフィルタリングのためのヘテロ二重鎖を、３×プールに分割し、製造者のプロトコールに従って、ＮｌａＩＩＩ（ＮＥＢ）、Ｔａｑ１（ＮＥＢ）、またはＮｃｏｌ＋Ｘｈｏ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）で２時間完全に消化した。消化物を、ｄＨ2Ｏで溶離するＱｕｉａｇｅｎ  ｑｕｉａｑｕｉｃｋ（ＰＣＲ精製キット）を使用して精製した。サンプルをプールし、Ａ260の測定によって濃度を決定した。
【００３０】
ＭｕｔＳ結合
ＭｕｔＳ結合反応物は、１×結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．８）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール）中に約１１．５ｎｇ／μＬ  ＤＮＡおよび約９５０ｎＭ  ＭＢＰ−ＭｕｔＳ−Ｈ６二量体を含んでいた。反応物を、室温で１０分間インキュベートし、その後、１×結合緩衝液中で予め平衡化した同体積のアミロース樹脂（ＮＥＢ）と３０分間インキュベートした。タンパク質ＤＮＡ複合体を、低速遠心分離によって除去し、上清のアリコートをその後の処理のために除去した。
【００３１】
アセンブリおよび増幅
コンセンサスシャフリング実験由来の上清（５０μＬ）を、Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を使用して脱塩し、濃縮した。精製および濃縮したＤＮＡフラグメントを、種々のサイクルで除去したアリコートと上記のようにアセンブリした。アセンブリ反応物のアリコートを、２％アガロースゲルで分離してアセンブリ過程をモニタリングした。上記のように、大部分が再アセンブリした全長ＧＦＰｕｖを示すアリコートをＰＣＲ増幅した。上記のように、一致フィルタリング実験由来の上清のアリコートを１０倍希釈し、ＰＣＲ増幅した。
【００３２】
クローニング
ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、ｐＧＦＰｕｖの２５９５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１フラグメントにライゲーションした。ライゲーション物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５株に形質転換し、蛍光コロニーを手持ち式３６５ｎｍＵＶランプを使用してスコアリングした。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の全過程を示す簡略化した図である。
【図２】図２は、上記の実施例に適用した本発明によって達成されるエラー率の減少を示す図である。
【図３】図３は、上記の実施例由来のグラフによるデータを示す図である。
【図１】
2008517586.tif 000004
【図２】
2008517586.tif 000005
【図３】
2008517586.tif 000006
【国際調査報告】
2008517586.tif 000007
2008517586.tif 000008
2008517586.tif 000009