(57)【要約】  本発明は、酵母株の遺伝子調節たんぱく質に対する結合部位を含む合成遺伝子調節配列、および前記合成遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモータ（前記プロモータは前記酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識可能であり、前記合成遺伝子調節配列は前記酵母株において前記糸状真菌プロモータによって開始される転写を制御することができる）を含む合成遺伝子制御領域を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母株の遺伝子調節たんぱく質に対する結合部位を含む合成遺伝子調節配列、および前記合成遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモータ（前記プロモータは前記酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識可能であり、前記合成遺伝子調節配列は前記酵母株において前記糸状真菌プロモータによって開始される転写を制御することができる）を含む合成遺伝子制御領域。
【請求項２】
結合部位が合成結合部位である、請求項１記載の制御領域。
【請求項３】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１記載の制御領域。
【請求項４】
酵母株が、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項１記載の制御領域。
【請求項５】
酵母株が、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項１記載の制御領域。
【請求項６】
酵母株が、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１記載の制御領域。
【請求項７】
糸状真菌株が、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびペニシリウム・パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）よりなる群から選ばれる、請求項１記載の制御領域。
【請求項８】
プロモーターが、ペニシリウム・パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）のＸｙｎＡ遺伝子、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のＤＰＭ１遺伝子およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡｒｇＢ遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる、請求項７記載の制御領域。
【請求項９】
遺伝子調節タンパク質に対する結合部位が、酵母株の遺伝子アクチベーターに対する結合部位である、請求項１記載の制御領域。
【請求項１０】
結合部位がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ４タンパク質に対する結合部位である、請求項９記載の制御領域。
【請求項１１】
結合部位が、配列番号１０、１１、１２および１５よりなる群から選ばれるＤＮＡ配列を含む、請求項１０記載の制御領域。
【請求項１２】
遺伝子調節タンパク質に対する結合部位が酵母株の遺伝子リプレッサーに対する結合部位である、請求項１記載の制御領域。
【請求項１３】
遺伝子調節配列が遺伝子リプレッサーに対する結合部位を更に含む、請求項９記載の制御領域。
【請求項１４】
遺伝子調節配列がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位を更に含む、請求項１０記載の制御領域。
【請求項１５】
ＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位が、配列番号１８、１９および２０よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項１４記載の制御領域。
【請求項１６】
合成遺伝子制御領域が、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項１記載の制御領域。
【請求項１７】
酵母株の遺伝子調節たんぱく質に対する結合部位を含む合成遺伝子調節配列、および前記合成遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモータを含む合成遺伝子制御領域（前記プロモータは前記酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識可能であり、前記合成遺伝子調節配列は前記酵母株において前記糸状菌類プロモータにより開始される転写を制御することができる）、前記制御領域の制御下にたんぱく質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするコード配列、および酵母選択マーカーを含む、ＤＮＡ発現ベクター。
【請求項１８】
コード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナル配列を更に含む、請求項１７記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項１９】
コード配列の下流に位置する転写ターミネーターを更に含む、請求項１７記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２０】
酵母選択マーカーがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）選択マーカーである、請求項１７記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２１】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）選択マーカーが、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３よりなる群から選ばれる、請求項２０記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２２】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）複製起点を更に含む、請求項２０記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２３】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）複製起点がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ミクロンＤＮＡ配列に基づくものである、請求項２２記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２４】
細菌複製起点を更に含む、請求項１７記載のＤＮＡ発現ベクター。
【請求項２５】
酵母株の遺伝子調節たんぱく質に対する結合部位を含む合成遺伝子調節配列、および前記合成遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモータを含む合成遺伝子制御領域（前記プロモータは前記酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識可能であり、前記合成遺伝子調節配列は前記酵母株において前記糸状菌類プロモータにより開始される転写を制御することができる）、前記制御領域の制御下にたんぱく質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするコード配列、および酵母選択マーカーを含むＤＮＡ発現ベクターを含む酵母株。
【請求項２６】
酵母株が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）よりなる群から選ばれる、請求項２５記載の酵母株。
【請求項２７】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２５記載の酵母株。
【請求項２８】
請求項２５記載の酵母株のコード配列を発現させることを含む、組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、パン酵母は、種々の異種ポリペプチドの発現のための宿主として広く使用されている。種々の種からの多種多様なタンパク質がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現されており、いくつかは全細胞タンパク質の１０％を超える。典型的には、発現は、異種ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における遺伝子発現を制御する遺伝子制御領域ならびにサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の両方におけるプラスミドの選択および増幅に必要な他の配列を含有するプラスミドによりもたらされている。あるいは、コード配列および遺伝子制御領域をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体内に組込み、高レベルの発現を達成することも可能である。
【０００２】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種ポリペプチドの発現において利用される遺伝子制御領域は、典型的には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において天然に存在するもの、例えば、多岐にわたるＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子の発現のための遺伝子制御領域である。これに対して、異種遺伝子制御領域は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞において使用されると、一般には、不活性であり又は異常な転写開始を引き起こすことが見出されている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子制御領域の使用はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞における効率的な発現に必須であることが提示されている（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＹＥＡＳＴ  ８：４２３−４８８（１９９２））。
【０００３】
本明細書中に引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、酵母株の遺伝子調節タンパク質に対する結合部位を含む遺伝子調節配列と遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモーターとを含む合成遺伝子制御領域に関する。糸状真菌プロモーターは酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる。合成遺伝子調節配列は、酵母株において糸状真菌プロモーターにより開始される転写を調節しうる。遺伝子アクチベーターに対する結合部位は、好ましくは、合成結合部位である。
【０００５】
本発明の１つの実施形態においては、酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）よりなる群から選ばれる。本発明の好ましい実施形態においては、酵母株はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。本発明のもう１つの実施形態においては、酵母株はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【０００６】
糸状真菌株は、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびペニシリウム・パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）よりなる群から選ばれうる。糸状真菌プロモーターは、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）のＤＰＭ１遺伝子、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡｒｇＢ遺伝子およびペニシリウム・パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）のＸｙｎＡ遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれうる。
【０００７】
本発明の１つの実施形態においては、結合部位は酵母株の遺伝子アクチベーターに対するものである。本発明の好ましい実施形態においては、結合部位はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ４タンパク質に対する結合部位である。本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、結合部位は、配列番号１０、１１、１２および１５、合成ＧＡＬ４結合部位よりなる群から選ばれる配列を含む。
【０００８】
遺伝子調節配列は更に、酵母株の遺伝子リプレッサーに対する結合部位を含みうる。本発明の実施形態においては、遺伝子リプレッサーに対する結合部位はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位である。本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位は、配列番号１８、１９および２０よりなる群から選ばれる配列を含む。
【０００９】
好ましい実施形態においては、合成遺伝子制御領域は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６よりなる群から選ばれる配列を含みうる。
【００１０】
本発明は、合成遺伝子制御領域、制御領域の制御下にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするコード配列および酵母選択マーカーを含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。コード配列は真核生物、原核生物またはウイルスアミノ酸配列をコードしうる。酵母株がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である場合、選択マーカーは、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３よりなる群から選ばれうる。
【００１１】
ＤＮＡ発現ベクターは更に、コード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナル配列を含みうる。ＤＮＡ発現ベクターは更に、コード配列の下流に位置する転写ターミネーターを含みうる。ＤＮＡ発現ベクターは更に、酵母複製起点、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ミクロンＤＮＡ配列を含みうる。ＤＮＡ発現ベクターは更に、細菌複製起点を含みうる。
【００１２】
本発明は更に、ＤＮＡ発現ベクターを含有する酵母株を提供する。酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）およびヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）よりなる群から選ばれうる。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書の更なる説明から明らかである。記載されている実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００１４】
図の簡単な説明
図1。糸状真菌由来のプロモーター。潜在的ＴＡＴＡボックス、転写開始部位が下線（波線）で示されている。推定ＭＩＧ１結合部位が下線（破線）で示されている。
図１Ａ：トランケート化ＸｙｎＡプロモーター配列（配列番号１）。
図１Ｂ：ＤＰＭ１プロモーター配列（配列番号２）。
図１Ｃ：ＡｒｇＢプロモーター配列（配列番号３）。
図２。トランケート化ＸｙｎＡプロモーターと遺伝子調節領域とを含む合成遺伝子制御領域。推定ＧＡＬ４タンパク質結合部位が下線で示されている。推定ＭＩＧ１タンパク質結合部位が下線（破線）で示されている。図２Ａ〜２Ｆは合成遺伝子調節領域のＤＮＡ配列である。
図２Ａ〜２Ｆは合成遺伝子調節領域のＤＮＡ配列である。
図２Ａ：ＥＥ２−ＸｙｎＡ（配列番号２１）。
図２Ｂ：ＥＥ２１−ＸｙｎＡ（配列番号２２）。
図２Ｃ：ＥＥ２２−ＸｙｎＡ（配列番号２３）。
図２Ｄ：ＥＥ２４−ＸｙｎＡ（配列番号２４）。
図２Ｅ：ＥＥ２５−ＸｙｎＡ（配列番号２５）。
図２Ｆ：ＥＥ２６−ＸｙｎＡ（配列番号２６）。
図３。それぞれ種々の合成遺伝子制御領域および天然に存在する酵母ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子制御領域により駆動されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種ポリペプチドの発現。レーン２〜５は、ガラクトースで誘導した酵母細胞からのサンプルである。レーン６〜９は、ガラクトースでは誘導せずグルコースの存在下で増殖させた酵母細胞からのサンプルである。
【００１５】
発明の詳細な説明
前記のとおり、酵母における異種タンパク質の発現において広く使用される遺伝子制御領域は、典型的には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において天然に存在し（例えば、分岐ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子の発現のための遺伝子制御領域）対応サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子の発現を正常に制御するものである。これに対して、本発明は、天然に存在することが公知ではない合成遺伝子制御領域を提供する。本明細書中で用いる「遺伝子制御領域」は、遺伝子の転写（すなわち、転写開始の速度）を制御するＤＮＡ配列である（Ａｌｂｅｒｔｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；１９９４）。本発明の合成遺伝子制御領域は酵母株における異種遺伝子発現の調節において使用されうる。
【００１６】
１．酵母株
本明細書中で用いる「酵母」なる語は、クロロフィルおよび管組織を欠き出芽または分裂により生殖する単細胞真核生物のいずれか、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属を意味する。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属は、セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、ジアスタチクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、オビフォルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）、ロウキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）、モンタヌス（ｍｏｎｔａｎｕｓ）、クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）およびエロンギスポルス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）を含む種々の種から構成される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態においては、酵母株はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。前記のとおり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は種々の異種ポリペプチドの組換え発現のための宿主として一般に使用されている。組換え発現に使用されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞は、組換え遺伝子発現を促進するよう選択され又は操作されうる。株の遺伝的背景は異種タンパク質発現のための株の特性に大きな影響を及ぼしうるため、以下のいくつかの所望の遺伝マーカーをも含有する種々の遺伝的背景を有する酵母株を構築することが望まれた：分泌タンパク質の過グリコシル化を避けるためのｍｎｎ９突然変異、ならびにタンパク質分解の問題を軽減するためのｐｒｂ１および／またはｐｅｐ４プロテアーゼ突然変異（Ｊｏｙｃｅら，米国特許第５，８２０，８７０号）。ＧＡＬ４結合部位を含有する合成遺伝子制御領域の場合、制御領域からの発現を増強するために、宿主サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株においてＧＡＬ４転写因子の過剰発現を行うことが可能である（Ｈｏｐｐｅｒら，米国特許第５，０６８，１８５号）。
【００１８】
さらに、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）のようないくつかの酵母属は、成長のための唯一の炭素源としてのメタノールの利用のための類似した代謝経路を含有することが示されている。さらに、他の酵母属の種は、ガラクトースなどを含む種々の炭素源を成長のために利用することが可能である。酵母株は、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロミコプシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）属の種を含む（これらに限定されるものではない）サッカロミセス科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）およびクリプトコックス科（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）のものでありうる。
【００１９】
特に、酵母株は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）およびシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）よりなる群からも選ばれうる。これらの酵母株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と同様、異種遺伝子発現のための宿主生物としても使用された（例えば、ＢｕｃｋｈｏｌｚおよびＧｌｅｅｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１０６７−１０７２（１９９１）；ＧｅｌｌｉｓｅｎおよびＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅ  １９０：８７−９７（１９９７）；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら，Ｉｎｔ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．１：１３１−１４２（１９９８）を参照されたい）。
【００２０】
本発明の１つの実施形態においては、酵母株はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である（例えば、Ｗｅｒｔｅｎら，Ｙｅａｓｔ  １５：１０８７−１０９６（１９９９）；Ｃｒｅｇｇら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２３−５２（２０００）を参照されたい）。
【００２１】
本発明のもう１つの実施形態においては、酵母株はハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である。
【００２２】
本発明の１つの実施形態においては、酵母株はヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｙｅａｓｔ  １４：１２６７−１２８３（１９９８）；Ｍａｄｚａｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０９：６３−８１（２００４））。
【００２３】
２．合成制御領域
本発明は、酵母株における遺伝子調節タンパク質に対する結合部位を含む合成遺伝子調節配列と遺伝子調節配列の下流に位置する糸状真菌株由来のプロモーターとを含む合成遺伝子制御領域を提供する。合成遺伝子制御領域は特異的ＤＮＡ配列である。結合部位の配列は、好ましくは、酵母株の天然に存在する遺伝子調節領域における配列ではない。
【００２４】
本明細書中で用いる「糸状真菌」なる語は、特殊化した子実体をしばしば産生する分枝糸状菌糸の体塊を形成する、クロロフィルおよび管組織を欠く多細胞真核生物のいずれかを意味する。糸状真菌の具体例には、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびペニシリウム・パープロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）が含まれる。
【００２５】
２．１．プロモーター
真核生物細胞における転写は、ＲＮＡポリメラーゼおよび一般転写因子がプロモーターにおいて集合することを要する。本明細書中で用いる「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび一般転写因子が集合する場となるＤＮＡ配列である。プロモーターはＴＡＴＡボックスおよび転写の開始点を含みうる。ＴＡＴＡボックスは、一般転写因子であるＴＦＩＩＤにより認識されるＴ−ＡおよびＡ−Ｔ塩基対の短い配列である。転写の開始点は、典型的には、哺乳類細胞においてはＴＡＴＡボックスの２５塩基対下流に位置する（同誌）。酵母においては、ＴＡＴＡボックスから転写の開始点までの距離は、典型的には、約１００塩基対である。
【００２６】
合成遺伝子制御領域のプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母株の一般転写因子およびＲＮＡポリメラーゼにより認識されうる、糸状真菌株由来のプロモーターである（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＹＥＡＳＴ  ８：４２３−４８８，（１９９２））。
【００２７】
糸状真菌プロモーターの具体例には、ＸｙｎＡ遺伝子、ＤＰＭ１遺伝子およびＡｒｇＢ遺伝子のプロモーター（図１）が含まれる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｙｅａｓｔ  １２：７６５−７７１（１９９６），Ｕｐｓｈａｌｌら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３４９−３５４（１９８６），Ｃｈａｖｅｚら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３４：２１７−２２６（２００１））。
【００２８】
２．２．遺伝子調節配列
遺伝子調節配列は、ＤＮＡ上に存在することにより転写開始の速度に影響を及ぼす遺伝子調節タンパク質に対する少なくとも１つの結合部位を含有する。遺伝子調節タンパク質には、遺伝子発現を刺激する遺伝子アクチベーター、および遺伝子発現を抑制する遺伝子リプレッサーが含まれる。転写開始の速度は、対応遺伝子調節配列における遺伝子調節タンパク質の結合により上昇または低下しうる。本明細書中で用いる「結合部位」は、遺伝子調節タンパク質が特異的に結合する、遺伝子調節領域内のＤＮＡ配列を意味する。
【００２９】
遺伝子調節タンパク質に対する結合部位は、元々は、天然に存在する遺伝子調節領域から特定された。ある与えられた遺伝子調節タンパク質に対する特定された結合部位から、推定コンセンサス結合部位配列が推定されうる。本発明の好ましい実施形態においては、結合部位は合成結合部位である。本明細書中で用いる「合成結合部位」は、天然に存在する遺伝子調節領域からは特定されない、遺伝子調節タンパク質の推定コンセンサス配列を考慮して構築される結合部位を意味する。
【００３０】
真核生物遺伝子調節配列は、プロモーターに隣接して、またはその遥か上流に、または更にはプロモーターの下流に位置しうる（Ａｌｂｅｒｔｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；１９９４）。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子調節配列は通常、プロモーターの数百塩基対上流に位置する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子調節配列は、転写因子に結合することにより、その制御下に、遺伝子の発現を刺激および／または抑制しうる。遺伝子調節配列の具体例には、ＧＡＰ（ＴＤＨ）、ＰＧＫ、ＴＰＩ、ＰＨ０５、ＡＤＨ２およびＣＵＰ１遺伝子に由来するものが含まれる（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＹＥＡＳＴ  ５：４２３−４８８，（１９９２））。
【００３１】
遺伝子調節配列は、遺伝子制御領域が構成的であるかどうか、すなわち、遺伝子の連続的な発現を駆動するかどうか、あるいは誘導性であるかどうか、すなわち、シグナルに応答して遺伝子発現を駆動するかどうかをも決定する。例えば、ＧＡＰ（ＴＤＨ）、ＰＧＫおよびＴＰＩ遺伝子に対する遺伝子制御領域は構成的遺伝子制御領域である（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＹＥＡＳＴ  ５：４２３−４８８（１９９２））。
【００３２】
遺伝子調節配列は、好ましくは、１以上のシグナルに応答して転写を調節する誘導性のものである。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような種々の組換え酵母発現系においては、多数の異なる異種ポリペプチドの発現は宿主細胞にとって有害であることがしばしば示される。その結果、そのような異種ポリペプチドの発現に対する選択圧が生じることがあり、それにより、そのような組換え培養の大規模化において蓄積する唯一の細胞は、異種ポリペプチドを発現しないものとなるか、または異種ポリペプチドをほんの僅かしか発現しないものとなって、培養は、そのポリペプチドの不経済的な入手源となる。そのような組換え培養の大規模化のための最適な方法は、培養を大容量および高細胞密度へと成長させる過程において異種遺伝子の発現を最小またはゼロに維持し、ついで、産物の単離の前の培養成長の最終段階においてのみ、異種遺伝子の最高の発現を誘導することであろう。したがって、組換え遺伝子発現のための合成遺伝子制御領域は、好ましくは、誘導性遺伝子制御領域である。
【００３３】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子の遺伝子調節配列は誘導性遺伝子調節配列である。ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子調節配列はガラクトースおよびグルコースの両方に対して応答性である。それは、炭素源としてのガラクトースの利用をもたらす酵素（例えば、ＧＡＬ１（ガラクトキナーゼ）およびＧＡＬ１０（ウリジンジホスホガラクトース−４−エピメラーゼ））の制御された発現により、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のガラクトース代謝の調節に関与する（Ｌｏｈｒら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：７７７−７８７（１９９５））。ガラクトースの非存在下では、これらの酵素の非常に僅かな発現が検出される。グルコースを含有する培地内で初めに細胞を増殖させ、そして培養にガラクトースを加えたた場合には、これらの酵素は、培地からのグルコースの枯渇に際して、少なくとも１０００倍、協同的に誘導される。この誘導はメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルで生じることが示されている。
【００３４】
実験は、ガラクトース誘導に必要かつ十分であり従ってサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種遺伝子の発現の駆動に有用な遺伝子制御領域を特定している。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子は分岐転写される。ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子制御領域は、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターとガラクトースおよびグルコースに応答性である誘導性遺伝子調節配列とを含有する、それらの２つの遺伝子の間に位置する約６０６ｂｐの配列である。６０６ｂｐ配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において下流クローン化異種遺伝子発現を駆動する約１２．０ｋｂｐの酵母発現プラスミドであるｐＧＡＬ１１０（Ｈｏｆｍａｎｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９：５０６−５１８（１９９５））において使用される。
【００３５】
ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子調節配列は、ガラクトースに応答性である、酵母遺伝子アクチベーターであるＧＡＬ４タンパク質に対する結合部位を含有する。ＧＡＬ４タンパク質に対する結合部位の具体例は表１に記載されている。
【００３６】
【表１】
2008543308.tif 000002
【００３７】
表１〜２に挙げた配列番号４〜９の配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然に存在する遺伝子調節領域において特定されたＧＡＬ４結合部位である。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
表１〜２に挙げた配列番号１０〜１２および配列番号１５の配列は合成ＧＡＬ４結合部位であり、これらはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然に存在する遺伝子調節領域においては特定されていない。配列番号１３および１４の配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然に存在する遺伝子調節領域において特定されたＧＡＬ４結合部位である。
【００４０】
ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子調節配列は、グルコースに応答性である、酵母遺伝子リプレッサーであるＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位をも含有する。ＭＩＧ１タンパク質に対する結合部位の具体例を表２に示す。
【００４１】
【表３】
2008543308.tif 000004
【００４２】
配列番号１６〜１７の配列は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然に存在する遺伝子調節領域において特定されたＭＩＧ１結合部位である。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
配列番号１８〜２０の配列は合成ＭＩＧ１結合部位であり、これらはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然に存在する遺伝子調節領域においては特定されていない。
【００４５】
糸状真菌プロモーターと酵母転写因子（例えば、ＧＡＬ４およびＭＩＧ１）に対する結合部位とを含むよう合成遺伝子調節領域を構築した。好ましい実施形態においては、合成遺伝子調節領域はグルコースの存在下で抑制され、ガラクトースの存在下かつグルコースの非存在下で活性化される。
【００４６】
ＥＥ２−ＸｙｎＡ（図２Ａ、配列番号２１）、ＥＥ２１−ＸｙｎＡ（図２Ｂ、配列番号２２）、ＥＥ２２−ＸｙｎＡ（図２Ｃ、配列番号２３）、ＥＥ２４−ＸｙｎＡ（図２Ｄ、配列番号２４）、ＥＥ２５−ＸｙｎＡ（図２Ｅ、配列番号２５）およびＥＥ２６−ＸｙｎＡ（図２Ｆ、配列番号２６）を含む合成遺伝子調節領域の具体例のいくつかを図２に示す。
【００４７】
３．発現ベクター
本発明は、合成遺伝子制御領域、制御領域の制御下でポリペプチドをコードするＤＮＡ配列およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）選択マーカーを含むＤＮＡ発現ベクターを提供する。
【００４８】
３．１  ベクターの成分
ベクターは、酵母染色体内に組込まれうる組込みベクターまたはエピソームベクターでありうる。エピソームベクターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞内に維持されるためには、複製されるための複製起点を含有する必要がある。複製起点の具体例には、酵母自律複製配列（ＡＲＳ）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の天然２μサークル（ｃｉｒｃｌｅ）由来の配列が含まれる。ＡＲＳベクターは酵母動原体配列（ＣＥＮ）により安定化されうる。典型的には、ＡＲＳ／ＣＥＮベクターのコピー数は細胞当たり約１または２であり、一方、２μに基づくベクターのコピー数は細胞当たり約１０または４０である（Ｒｏｍａｎｏｓら，ＹＥＡＳＴ  ８：４２３−４８８（１９９２））。
【００４９】
発現ベクターは、酵母選択マーカー、すなわち、酵母における表現型選択のためのポリペプチドをコードする遺伝子を含みうる。選択マーカーは、それぞれロイシン、トリプトファン、ウラシルおよびヒスチジンに関して栄養要求性である対応突然変異株において使用される、ＬＥＵ２、ＴＲＰｌ、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３を含む栄養要求性選択マーカーでありうる。選択マーカーは、酵母に銅耐性を付与するＣＵＰ１のような優性選択マーカーでありうる（同誌）。
【００５０】
発現ベクターは、分子クローニングのために細菌細胞内で複製される必要があるかもしれない。したがって、発現ベクターは細菌複製起点を含有しうる。発現ベクターは、細菌選択マーカー、すなわち、細菌における表現型選択のためのポリペプチドをコードする遺伝子をも含みうる。細菌選択マーカーは抗生物質耐性マーカーでありうる。細菌選択マーカーの具体例には、それぞれアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。
【００５１】
発現ベクターは、ｍＲＮＡ３’末端の効率的な形成のために、異種遺伝子の下流に位置する転写ターミネーターを含有しうる。ターミネーターはＴＲＰｌ、ＡＤＨ１、ＧＡＰ、ＭＦαＩおよびＣＹＣ１由来のものでありうる（同誌）。
【００５２】
３．２．サッカロミセス・セレビシエにおいて発現される異種コード配列
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするコード配列は、ＤＮＡ発現ベクター内の制御領域の制御下に配置されうる。コード配列は真核生物、原核生物またはウイルスアミノ酸配列をコードしうる。
【００５３】
遺伝暗号の縮重のため、特定のアミノ酸配列をコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００５４】
所望により、個々の宿主における異種ポリペプチドの発現をコドンの最適化により増強することが可能である。コドンの最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。種々の宿主におけるコドンの最適化のための技術は当技術分野でよく知られている。
【００５５】
個々の宿主のためのコドンの最適化は、低い又は中等度の使用レベルを有するコドンを、高い使用レベルを有するコドンで置換することにより行われる。コード配列内に存在する最適なコドンの割合は様々でありうる。種々の実施形態において、（最初から存在するコドンおよび導入されたコドンを含む）最適なコドンの数はコドンの総数に対して少なくとも約５０％、少なくとも７５％、少なくとも９５％または１００％である。
【００５６】
コドンの最適化は以下のとおりに行われうる。
【００５７】
１．特定のコドンに関して、野生型コドン出現頻度を、酵母遺伝子により用いられる全体的なコドン出現頻度と比較する。
【００５８】
２．コドンが、酵母により一般的に用いられるコドンの１つでない場合には、それを、酵母細胞における高発現のための最適なコドンで置換する。
【００５９】
３．所望のレベルのコドン最適化が達成されるまで、異なるコドンに関して工程（１）および（２）を繰返す。
【００６０】
４．望ましくない制限酵素部位、スプライス部位、プロモーター、望ましくない回文配列または反復配列、転写ターミネーター配列および高頻度のＧＣ塩基のような、生じる望ましくない配列に関して、新たなコード配列を精査する。代替的なコドンを使用して、望ましくない配列を除去する。
【００６１】
代替的なコドンの使用はＬａｔｈｅ  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ，１８３：１−１２，１９８５により定義されている。種々の酵母宿主におけるコドン使用は当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｙｅａｓｔ  ７：６５７−６７８，１９９１はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における同義コドン使用を記載している。
【００６２】
酵母発現は、最適化配列、および酵母発現に関して最適化されていない配列の両方を用いて達成されうる。
【００６３】
組換え遺伝子の製造、細胞内への導入および組換え遺伝子発現のための技術は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２，  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｆ  ａｈ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９のような参考文献に記載されている。
【００６４】
実施例
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。実施例は、本発明を実施するための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６５】
ベクターの構築
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における遺伝子発現を合成制御領域が駆動する能力を分析するために、ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子制御領域をＢａｍＨＩおよびＸｍａＩ消化によりｐＧＡＬ１１０から除去して、１１．３ｋｂｐプラスミドｐＦＵＮＧＩを得た。合成遺伝子制御領域および異種遺伝子をｐＦＵＮＧＩ内に挿入した。例えば、ＥＥ２２−ＸｙｎＡ（図２Ｃ、配列番号２５）およびＥＥ２５−ＸｙｎＡ（図２Ｅ、配列番号２７）を、異種タンパク質（ＨＰ）をコードする最適遺伝子の存在下または非存在下でｐＦＵＮＧＩ内に挿入して、それぞれｐＦ２５ＭＣＳ、ｐＦ２５ＭＣＳ−ＨＰおよびｐＦ２２ＭＣＳ−ＨＰを得た。また、異種遺伝子をｐＧＡＬ１１０内に挿入して、対照としてのｐＧＡＬ１１０−ＨＰを得る。
【実施例２】
【００６６】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現
スフェロプラスト形質転換法（Ｈｉｎｎｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９−３３，１９７８）を用いることにより、ベクターを使用して、ロイシン原栄養性（Ｌｅｕ＋）へのｌｅｕ２突然変異を含有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を形質転換した。
【００６７】
ロイシンを欠き１．０Ｍ  ソルビトールを含有する合成寒天培地上で形質転換体を選択した。ロイシンを欠く及び１．０Ｍソルビトールを含有する最上層および最下層の合成寒天培地はＲＥＭＥＬ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ（それぞれｃａｔ＃０９４５９および９２１５５）から入手した。ロイシン非含有ＳＤプレート（ＫＤ  ＭＥＤＩＣＡＬ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ＭＤ）上の連続的培養によりクローン性Ｌｅｕ＋単離物を得た。
【００６８】
チューブ内での製造のために、種培養の０．３ｍｌアリコートを、５〜１６．０／ｍｌの最終ＯＤ６００となるまで、２８〜３０℃で７２時間にわたり、５．０ｍｌの５×ロイシン非含有培地（１．６％  グルコース、４％  ガラクトースを含有する）またはＹＥＨＤＧ培地に移した。ＹＥＨＤＧ培地は１リットル当たりに以下のものを含有する：Ｌ−Ｈｙ−Ｓｏｙペプトン−Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，１０ｇ；酵母エキス，２０ｇ；Ｌ−デキストロース，１６ｇ；Ｄ（＋）ガラクトース，４０ｇ。フラスコ内での製造のためには、種培養の１．５ｍｌアリコートを２５ｍｌの培地に移し、２２０ｒｐｍで振とうしながら前記のとおりに培養した。
【００６９】
サンプル当たり１０  ＯＤ６００単位の細胞を回収した後、細胞ペレットを、０．３ｍｌの細胞溶解バッファー（０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ）中、ガラスビーズで破砕した。ライセートを遠心分離により回収した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ａｓｓａｙにより、製造業者の説明に従いタンパク質濃度を測定した。還元および非還元条件下の１×Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳバッファー中のＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上の電気泳動の後の免疫ブロット分析により、異種遺伝子の発現に関して細胞ライセートを分析した。サンプルは全細胞タンパク質を含有していた。ゲルを０．４５ミクロンのニトロセルロースメンブレンフィルター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にウエスタントランスファーした。タンパク質のサイズを評価するために、ライセートと並べて、予め染色された標準を泳動させた。
【実施例３】
【００７０】
合成遺伝子制御領域により駆動される異種遺伝子発現
異種タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現させ、発現産物を比較した。
【００７１】
グルコースの枯渇の後のガラクトースによる誘導により、試験する全ての形質転換サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において異種タンパク質を発現させた。異種タンパク質に対するモノクローナル抗体（１：５，０００）を使用するウエスタンブロット分析により、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）により産生された主要タンパク質が検出され（５００ｎｇ／レーン）、図３（レーン２、３および４）に示すとおり、これは１０５未満〜１１０ｋＤａの分子量を有していた。１０５未満〜１１０ｋＤａのタンパク質は、精製組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生Ｈｉｓタグ付き異種タンパク質のサンプル（レーン１）において検出された最大タンパク質バンドより若干小さかった。なぜなら、対照の分子量にはＨｉｓタグが加えられているからである。ベクターｐＦ２５ＭＣＳのみを含有する対照形質転換体の抽出物では、検出可能なシグナルは観察されなかった（レーン４）。
【００７２】
ｐＧＡＬ１１０−ＨＯで形質転換された株における異種遺伝子発現レベルは、ｐＦ２５ＭＣＳ−ＨＰから得られる発現のレベルと比較しうるものであるが、ｐＦ２２ＭＣＳ−ＨＰで得られるものより大きい。したがって、合成遺伝子調節領域ＥＥ２５−ＸｙｎＡは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種遺伝子の発現の駆動において、天然に存在するＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子調節領域と同等に強力である。
【００７３】
グルコース中で増殖させた細胞に関しては、ウエスタンブロット上でタンパク質バンドは観察されなかった。このことは、形質転換されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において異種遺伝子が発現されなかった又は非常に低いレベルで発現されたことを示している（図３、レーン７、８および９）。このように、発現は合成遺伝子領域ＥＥ２２−ＸｙｎＡおよびＥＥ２５−ＸｙｎＡにより制御され、グルコースの存在下で抑制される。これは、ＧＡＬ−ＧＡＬ１０遺伝子の天然に存在する調節領域で見られる抑制に類似している。
【００７４】
他の実施形態は添付の特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態を示し記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を施すことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】トランケート化ＸｙｎＡプロモーター配列（配列番号１）。
【図１Ｂ】ＤＰＭ１プロモーター配列（配列番号２）。
【図１Ｃ】ＡｒｇＢプロモーター配列（配列番号３）。
【図２Ａ】図２Ａ：ＥＥ２−ＸｙｎＡ（配列番号２１）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ＥＥ２１−ＸｙｎＡ（配列番号２２）。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ＥＥ２２−ＸｙｎＡ（配列番号２３）。
【図２Ｄ】図２Ｄ：ＥＥ２４−ＸｙｎＡ（配列番号２４）。
【図２Ｅ】図２Ｅ：ＥＥ２５−ＸｙｎＡ（配列番号２５）。
【図２Ｆ】図２Ｆ：ＥＥ２６−ＸｙｎＡ（配列番号２６）。
【図３】それぞれ種々の合成遺伝子制御領域および天然に存在する酵母ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０遺伝子制御領域により駆動されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における異種ポリペプチドの発現。
【図１Ａ】
2008543308.tif 000006
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2008543308.tif 000012
【図２Ｅ】
2008543308.tif 000013
【図２Ｆ】
2008543308.tif 000014
【図３】
2008543308.tif 000015
【配列表】
2008543308000001.app
【国際調査報告】
2008543308.tif 000016