(57)【要約】  本発明は、薬剤、並びに炎症及び炎症性疼痛の身体状態の治療に関連した、カリオフィレンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、それが動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態及び炎症性疼痛の治療のための薬剤の製造におけるものであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項２】
カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、それが動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態及び炎症性疼痛の治療におけるものであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項３】
カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、それがサイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２を含む群の一つ以上の体内での生産、又は酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現の阻害のためであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項４】
カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、それがサイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２からなる群の一つ以上の体内での生産、又は酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現の阻害のための薬剤の製造におけるものであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項５】
請求項１から４の一項に記載の、カリオフィレンの使用であって、それがリウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス（ｅｒｉｔｅｍａｔｏｓｕｓ）、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症の群を含む慢性変性疾患の治療、又は抑うつ、並びに蜂巣炎の群を含む非変形性疾患、及びアレルギーの、治療におけるものであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項６】
請求項１から４の一項に記載の、カリオフィレンの使用であって、それがリウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症の群に含まれる慢性変性疾患の治療のための、又は抑うつ、及び蜂巣炎の群を含む非変形性疾患、又はアレルギーの、治療においての薬剤の製造におけるものであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項７】
請求項１から４の一項に記載の、カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、それが経口、局所、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、浸潤、吸入、経皮、経粘膜、筋肉内、肺内、経膣、経直腸、眼内及び舌下を含む、経腸又は非経口経路を通して投与されるという事実を特徴とする、使用。
【請求項８】
前記投与が、局所又は全身性であって、特に浸潤、経口、吸入又は経皮の中から選択される事を特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１から４の一項に記載の、カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用であって、前記カリオフィレンが一つ以上のアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンであるという事実を特徴とする、使用。
【請求項１０】
動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態及び炎症性疼痛の治療の方法であって、それが患者へのカリオフィレンの治療有効量の投与を含むという事実を特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記炎症状態及び炎症性疼痛が、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症の群に含まれる慢性変性疾患、又は抑うつ、及び蜂巣炎の群に含まれる非変形性疾患、又はアレルギーに、存在する事を特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２の１又はそれ以上の体内での生産、又は酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現を阻害する方法であって、それがカリオフィレンの治療有効量の患者への投与を含むという事実を特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記カリオフィレンが一つ以上のアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンであるという事実を特徴とする、請求項１０から１２の一項に記載の方法。
【請求項１４】
カリオフィレンを含む組成物であって、前記カリオフィレンの用量が約１から約１０００mgであるという事実を特徴とする、組成物。
【請求項１５】
前記用量が約１０から約２００mgであるという事実を特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記用量が約３０から約１００mgであるという事実を特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載の組成物であって、前記カリオフィレンが、前記組成物の約０．１から約９９重量％を構成するという事実を特徴とする、組成物。
【請求項１８】
請求項１４に記載の組成物であって、前記カリオフィレンが、前記組成物の約１から約７０重量％を構成するという事実を特徴とする、組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の組成物であって、前記カリオフィレンが、前記組成物の約１０から約４０重量％を構成するという事実を特徴とする、組成物。
【請求項２０】
前記カリオフィレンが一つ以上のアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンであるという事実を特徴とする、請求項１５から１９の一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤、並びに炎症及び炎症性疼痛の身体状態の治療に関するカリオフィレンの使用に関するものである。特に、ヒトの身体を含む動物の身体の炎症状態の治療のための薬剤の製造における、カリオフィレンの使用に関する。本発明はまた、炎症性の疼痛を含む身体の炎症状態の治療のための、カリオフィレンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カリオフィレンは、種々の応用において有用である既知の化学化合物である。例えば、特許文献ＵＳ３，９８７，００８は、セスキテルペン誘導体が嗅覚及び味覚改変剤である事を明らかにし；Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  １９９２  Ｊｕｌ；５５（７）：９９９−１００３において、ベータ−カリオフィレン及びアルファ−フムレンは、可能性のある抗癌剤として引用され；ＷＯ９２１８００１においては、アルファ及びベータ−フムレン並びに（−）−ベータ−カリオフィレンは、コナジラミ類の防除において引用され；特許ＵＳ５，３１４，６９３は、アルファ−フムレンがマツノザイセンチュウの防除剤として引用され；ＷＯ０２０７８７１９においてはアルファ及びベータ−カリオフィレンは、抗癌組成物に含まれている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ある一つの特定の態様において、カリオフィレンの新規のおよび有用な使用に関するものであり、さらに詳細には、広い意味での抗炎症剤及び鎮痛剤としてのアルファ−フムレン又はベータ−カリオフィレンに関する。より特定の意味で、前記の化合物は、炎症過程に関与していることが知られている実体の有用な阻害剤であることが見い出された：
−炎症促進性サイトカインＩＬ−１β（インターロイキン１β）及びＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）；
−ＰＧＥ２（プロスタグランジン−Ｅ２）、
−ＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ（ｃｙｃｌｏｘｉｇｅｎａｓｅ）−２）及びｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）酵素の発現。
【０００４】
本発明のカリオフィレンの一つの特定の例は、ＣＡＳ（ケミカルアブストラクトサービス）登録番号６７５３−９８−６で識別されるセスキテルペンであるアルファ−フムレンであって、次の構造式で表されるアルファ−カリオフィレンとしても知られている：
【０００５】
【化１】
2008514649.tif 000002
【０００６】
本発明のカリオフィレンのもう一つの特定の例は、同じくＣＡＳ（ケミカルアブストラクトサービス）登録番号８７−４４−５で識別されるセスキテルペンであるトランス−カリオフィレン（またはベータ−カリオフィレン）であって、次の代替構造式Ａ及びＢで表される：
【０００７】
【化２】
2008514649.tif 000003
【０００８】
本明細書で用いられる意味では、本発明の対象であるカリオフィレンに言及する場合は、その分子自体、それらの塩、異性体、代謝物、プロドラッグ、溶媒和（水和物を含む）及び付加物を含む。
【０００９】
セスキテルペンを含むテルペン類は、植物から抽出された複合的混合物の構成要素としてしばしば言及され、当業者には知られているように、どの単一の化合物又は複数の化合物が効果的であるのか、それらがどの程度効果的であるのか、及びそれらがそれ自身で効果的であるのか、組成物が含む媒体／溶媒（水、アルコール、他の溶媒、これらの混合物等）を介して効力があるのか、又は混合物中の他の成分との相互作用を介して効力があるのか、については決定されていない。天然の又は合成産物（例えばＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ９９，  ３８６４  （１９７７））の個々のテルペンは、有効な薬剤としては殆ど言及されていない。アルファ−フムレンは、抗炎症または化学療法効果に関しては事実上不活性であると言われてさえいる（参考文献：  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  （２００２），  ２３（５），  ７９５−８０２）。
【００１０】
出願人は、今回カリオフィレン、特にアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンが、炎症性疼痛を含めて、著明な抗炎症効果があることを見出し、その効果が、炎症促進サイトカインＩＬ−１βおよびサイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２の生産、又は酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現に与える阻害効果にあることを見出した。
【００１１】
出願人はまたカリオフィレン、特にアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンが、抗アレルギー効果、特に抗ヒスタミン効果がある事も見出した。
【００１２】
本発明のカリオフィレンは、炎症に関与している生理病理学的プロセスを阻害し、直接的または間接的な炎症作用を有する薬剤を求める、現在進行中の探索の一部である。そのような薬剤は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス（ｅｒｉｔｅｍａｔｏｓｕｓ）、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症のような慢性変性疾患、並びに抑うつ及び蜂巣炎のような非変形性疾患、及びアレルギーの制御に用いられる。
【００１３】
したがって、本発明の目的の一つは、動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態の治療用の薬剤の製造における、カリオフィレン、特にアルファ−フムレン及び／又はトランス−カリオフィレンの使用、又はカリオフィレンを含む組成物の使用である。
【００１４】
本発明の他の目的は、動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態の治療におけるカリオフィレン、特にアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンの使用、又はカリオフィレンを含む組成物の使用である。
【００１５】
本発明の他の目的は、カリオフィレン、特にアルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンの治療有効量を患者に投与することを含む、動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態の治療方法である。
【００１６】
本発明の他の目的は、サイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２の体内での１つまたはそれ以上の生産、酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現の阻害のための、カリオフィレン、特にアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレン、又はカリオフィレンを含む組成物の使用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のカリオフィレン並びに本発明のカリオフィレンを含む組成物を、治療を必要とする対象へ、経口、局所、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、浸潤、吸入、経皮、経粘膜、筋肉内、肺内、経膣、経直腸、眼内及び舌下を含む、経腸または非経口のいずれかの適した経路を通して投与することが出来る。本発明の特に適した投与方法は、全身的（浸潤、経口、噴霧吸入、経皮）及び局所的投与法である。本発明のカリオフィレンを、緩慢なまたは制御された放出組成物に構成することが出来る。既知の補助剤及び賦形剤を、該組成物に用いることが出来る。本発明に関連した組成物にとって有用である薬剤剤形に関する参照は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことが出来る。
【００１８】
カリオフィレンを含む組成物を、固体、液体又は半液体、錠剤、カプセル、丸薬、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、分散剤及び他の全ての有用な既知の剤形で、患者に投与できる。
【００１９】
本組成物は、所望の効果に応じて、例えば抗生物質のような他の活性剤を更に含んでも良い。
【００２０】
錠剤又はカプセル（軟及び硬カプセル両方）として経口投与する場合は、カリオフィレンを、乳糖、デンプン、ショ糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、リン酸カルシウム、マニトール、ソルビトール等のような、薬学的に許容できる不活性賦形剤と併用することが出来る；液体の剤形で経口投与する場合は、カリオフィレンを、エタノール、グリセロール、水等と併用することが出来る。所望する又は必要である場合は、凝集剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤及び芳香剤を混合物に加えることが出来る。一般的な凝集剤は、グルコース、β−乳糖、コーン甘味剤、天然又は合成ゴム（アラビアゴム、トラガカントゴム又はアルギン酸ナトリウムなど）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等である。滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられる。
【００２１】
本発明に関する組成物は、リポソームとして、又は媒体として可溶性高分子と結合させても投与することが出来る。
【００２２】
経口投与のための液体剤形は、患者の受容性を増加するために、着色剤及び甘味料を含んで良い。水溶性剤形に許容される賦形剤は、水、適切なオイル、食塩水、水性デキストロース、他の糖溶液及びグリコール（プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、リン酸緩衝液である。
【００２３】
本発明に関する組成物は、通常約１mgから約１０００mgの１つ又はそれ以上のカリオフィレン、特に約１０から２００mg、より特別に約３０から１００mgを含む。そのような組成物においては、カリオフィレンは約０．１から９９重量％を占め、特に約１から７０％、より特別には約１０から４０％を占める。場合により、少なくとも、１つの薬学的に許容できる賦形剤を含んでも良い。
【００２４】
（実施例）
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を表すが、本発明の範囲を限定するものではなく、それは本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ制限される。
【実施例１】
【００２５】
カラギーナン（ＣＡＲＲＥＧＥＮＩＮ）によって誘導される炎症性侵害受容
この試験で用いられた評価法は、Ｖａｚ等によって、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２７８：３０４−３１２，  １９９６に記載されている。
【００２６】
雄のマウス（２５から３５ｇ）を実験開始１時間前に投与したアルファ−フムレン５０mg／kgで全身的に（経口的に）処置した。０．９％食塩水（０．１ml／１０ｇ）で処置した動物を対照として用いた。動物のもう一つの群を、パラセタモール（６００mg／kg、処置１時間前に経口投与）で処置して、陽性対照として用いた。炎症性疼痛を誘導するために、動物に、カラギーナンを０．０５ml（足当たり３００μg）を右後足底表面に注射した。この用量は、注射された足の浮腫、痛覚感受性及びかなりの腫れを引き起こす。
【００２７】
痛覚感受性は、３，４及び６時間後Ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ線維（０．４ｇ）を用いて評価した。反応の基底値を得るために、動物を前日に０．４ｇ  ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ線維を用いて、予備試験を行なった。約２０％の反応を示した動物のみを選択した。以下の基準に従って、線維を右後足に当てた：（１）線維が曲がるまでの十分な圧力を足底表面に垂直に当て、全圧を得た；（２）４つの足がスクリーンに触れている場合に、動物の評価を行った；（３）動物が足を支持スクリーンから完全に離した場合が、足引っ込め反応であると考えた；（４）各動物は連続１０回刺激を受け、それぞれの刺激は１秒間続いた；（５）各足引っ込め事象を反応の１０％と考え、１０回の足引っ込め事象は１００％反応に相当する。
【００２８】
下のグラフ１は、アルファ−フムレンによって得られた疼痛阻害を、パラセタモールの投与と比較したものである。各点は、５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００２９】
【化３】
2008514649.tif 000004
【００３０】
本発明に従って、アルファ−フムレンのようなカリオフィレンが、炎症を減少させた結果、既知の鎮痛剤であるパラセタモールと同程度に炎症性の減少の結果としての痛覚感受性を減少させたことを、グラフは明瞭に示している。
【実施例２】
【００３１】
マウスの足におけるカラギーナン浮腫
以下に用いた試験は、Ｃｕｎｈａ等によって、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ７０：１５９−１６９，２００１に記載されている。
【００３２】
雄の２５ｇから３５ｇのマウスをエーテルで軽く鎮静させ、右足にカラギーナン（３００μl／足）を含む５０μlの食塩水を注射した。左足には同量の食塩水を注射し、陰性対照とした。腫れを、催炎剤の注射後種々の時間に、血管内血量計（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ製造）を用いて測定した。右足および左足の体積の差（mlで）を数値化し、浮腫の指標とした。試験１時間前に、動物をアルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレン５０mg／kg（経口）で全身的に処置した。
【００３３】
下のグラフ２は、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのいずれかの投与による浮腫の容量の阻害と、陽性対照として用いられたデキサメタゾン（０．５mg／kg，試験４時間前に皮下注射）投与によって得られた阻害とを比較している。浮腫の体積測定時間間隔は、３０、６０、１２０及び２４０分、２４時間及び４８時間であった。各点は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００３４】
【化４】
2008514649.tif 000005
【００３５】
本発明によって、アルファ−フムレンのようなカリオフィレンが、デキサメタゾンのように炎症の体積を減少させたことをグラフは明瞭に示している。
【実施例３】
【００３６】
マウスの足におけるブラジキニン浮腫
以下に用いた試験は、Ｃｕｎｈａ等によって、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７０：１５９−１６９，２００１に記載されている。
【００３７】
雄の２５ｇから３５ｇのマウスをエーテルで軽く鎮静させ、右足足底内にブラジキニン（ＢＫ、３nmol／足）を含む５０μlの食塩水を注射した。左足には同量の食塩水を注射し、陰性対照とした。腫れを、催炎剤の注射後種々の時間間隔で、血管内血量計（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ製造）を用いて測定した。右足及び左足の体積の差（mlで）を数値化し、浮腫の指標とした。試験１時間前に、動物をアルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレン５０mg／kg（経口）で全身的に処置した。
【００３８】
キニンの分解を避けるために、動物を試験１時間前にカプトプリル５mg／kg皮下注射前処理を行った。
【００３９】
下のグラフ３Ａ及び３Ｂは、アルファ−フムレン（３Ａ）又はトランス−カリオフィレン（３Ｂ）の投与による浮腫体積の阻害を比較している。浮腫の体積測定時間間隔は、１０、２０、３０、６０及び１２０分、２４時間及び４８時間であった。各点は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００４０】
【化５】
2008514649.tif 000006
【００４１】
本発明に従って、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンが、ブラジキニン誘導の足の浮腫を著明に減少させたことをグラフは明瞭に示している。
【実施例４】
【００４２】
マウスの足におけるヒスタミン誘導浮腫
以下に用いた試験は、Ｃｕｎｈａ等によって、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ７０：１５９−１６９，２００１に記載されている。
【００４３】
雄の２５ｇから３５ｇのマウスをエーテルで軽く鎮静させ、右足足底内にヒスタミン（１００nmol／足）を含む５０μlの食塩水を注射した。左足には同量の食塩水を注射し、陰性対照とした。腫れを、催炎剤の注射後種々の時間間隔で、血管内血量計（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ製造）を用いて測定した。右足と左足の体積の差（mlで）を数値化し、浮腫の指標とした。試験１時間前に、動物をアルファ−フムレン５０mg／kg（経口）で全身的に処置した。
【００４４】
下のグラフ４は、アルファ−フムレンの投与による浮腫体積の阻害を比較している。浮腫の体積測定時間間隔は、１０、２０、３０、６０及び１２０分、２４時間及び４８時間であった。各点は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００４５】
【化６】
2008514649.tif 000007
【００４６】
本発明によって、アルファ−フムレンのようなカリオフィレンが、ヒスタミン誘導の浮腫の形成を有意に減少させたことをグラフは明瞭に示している。アレルギーに対する効果も間接的に示している。
【実施例５】
【００４７】
マウスの足の血小板凝集因子（ＰＡＦ）誘導浮腫
以下に用いた試験は、Ｃｕｎｈａ等によって、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７０：１５９−１６９，２００１に記載されている。
【００４８】
雄の２５ｇから３５ｇのマウスをエーテルで軽く鎮静させ、右足足底内に血小板凝集因子（ＰＡＦ、３nmol／足）を含む５０μlの食塩水を注射した。左足には同量の食塩水を注射し、陰性対照とした。腫れを、催炎剤の注射後種々の時間間隔で、血管内血量計（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｉｔａｌｙ製造）を用いて測定した。右足と左足の体積の差（mlで）を数値化し、浮腫の指標とした。試験１時間前に、動物をアルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレン５０mg／kg（経口）で全身的に処置した。
【００４９】
下のグラフ５は、アルファ−フムレン（５Ａ）およびトランス−カリオフィレン（５Ｂ）の投与による浮腫体積の阻害を比較している。浮腫の体積測定時間間隔は、３０、４５、６０及び１２０分であった。各点は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００５０】
【化７】
2008514649.tif 000008
【００５１】
本発明によって、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンが、ＰＡＦ誘導の浮腫の形成を著明に減少させたことをグラフは明瞭に示している。ＰＡＦはまた、アレルギープロセスに関与していることが知られているので、そのようなデータは、アレルギー状態の管理におけるカリオフィレンの使用の支持を更に強めることとなる。
【実施例６】
【００５２】
マウスの耳におけるアラキドン酸誘導浮腫
下の試験における耳の浮腫は、Ｃａｌｉｘｔｏらによって報告されたＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，  ５：５１５−５２６，  １９９１の記載に従って測定されたが、多少の修正を加えた。
【００５３】
第一の群の雄の２５ｇから３５ｇのマウスには、耳の内側の表面にアルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンを０．０２５から０．２％までの範囲で含む軟膏を局所塗布した。陽性対照群には、耳あたりフェニドン０．０５mgを動物に局所塗布した。６０分後に、動物の右の耳の内側の表面に、アセトンに溶解したアラキドン酸（２mg／耳）２０μlを塗布した。浮腫を、デジタルマイクロメーターを使用して測定し、反応をアラキドン酸塗布の前後の耳の厚さの差をμmで表した。カリオフィレンで処置した動物の反応を、軟膏基剤で処置した対照群の動物において観察される反応と比較した。
【００５４】
下のグラフ６Ａおよび６Ｂは、アルファ−フムレン（６Ａ）及びトランス−カリオフィレン（６Ｂ）の局所投与による浮腫体積の阻害を比較している。カリオフィレンを０．０２５％、０．０５％、０．１％及び０．２％含む軟膏の塗布後、浮腫体積の測定を行い、フェニドン及びアラキドン酸（Ｃ）塗布によって誘起される浮腫体積と比較した。各点は、５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す。
【００５５】
【化８】
2008514649.tif 000009
【００５６】
本発明によって、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンの局所塗布が、用量依存的に浮腫の形成を著明に減少させたことをグラフは明瞭に示している。
【実施例７】
【００５７】
炎症促進性サイトカインＩＬ−１βのレベル
以下に用いられた試験は、ＣａｍｐｏｓらによりＢｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３５：１１０７−１１１４，  ２００２に記載されたものに拠ったが、多少の修正を加えた。
【００５８】
１６０から１８０ｇの雄ラットにアルファ−フムレン５０mg／kgを経口的に与えた。０．９％（０．１ml／１０ｇ）食塩水で処置した動物を対照として使用した。動物の別の群に、試験４時間前にデキサメタゾン０．５mg／kgを皮下注射して、陽性対照として使用した。６０分後、動物に、カラギーナン１００μlを足底に注射し（３００μg／足）、１８０分後に屠殺した。対照動物には、食塩水を注射した。注射した足の皮下組織を取り出し、０．５％ツイーン２０、０．１mM  塩化ベンズアメトニウム（ｂｅｎｚａｍｅｔｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１０mM  ＥＤＴＡ、２μg／m  アプロチニン、０．１mM  ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）及び０．５％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むリン酸緩衝液に入れた。組織をホモゲナイズし、−４℃で１０分間３０００ｇで遠心分離した。上清を試験に用いた。ＩＬ−１βのレベルを、製造者指示に従いＥｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），  ＵＳＡ）を用いて測定した。試験は二組で行ない、３回繰り返した。測定値を、pg／組織１mgで表した。
【００５９】
下のグラフ７（それぞれの結果は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す）は、ラットの足内でカラギーナンによって誘導された、炎症性サイトカインＩＬ−１βの生産の阻害を比較している。
【００６０】
【化９】
2008514649.tif 000010
【００６１】
本発明によって、アルファ−フムレンのようなカリオフィレンの投与が、ラットの足内でカラギーナンによって誘導された炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの生産を著明に阻害することを、グラフは明瞭に示している。
【実施例８】
【００６２】
炎症促進性サイトカインＴＮＦαのレベル
以下に用いられた試験は、Ｃａｍｐｏｓ等によりＢｒ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３５：１１０７−１１１４，  ２００２に記載されたものに拠ったが、多少の修正を加えた。
【００６３】
１６０から１８０ｇの雄ラットに、トランス−カリオフィレン５０mg／kgを経口的に与えた。０．９％（０．１ml／１０ｇ）食塩水で処置した動物を対照として使用した。動物の別の群に、試験４時間前にデキサメタゾン０．５mg／kgを皮下注射して、陽性対照として使用した。６０分後、動物に、カラギーナン１００μlを足底に注射し（３００μg／足）、１８０分後に屠殺した。対照動物には、食塩水を注射した。注射した足の皮下組織を取り出し、０．５％ツイーン２０、０．１mM  塩化ベンズアメトニウム（ｂｅｎｚａｍｅｔｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１０mM  ＥＤＴＡ、２μg／ml  アプロチニン、０．１mM  ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）及び０．５％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むリン酸緩衝液に入れた。組織をホモゲナイズし、−４℃で１０分間３０００ｇで遠心分離した。上清を試験に用いた。ＴＮＦαのレベルを、製造者の指示に従いＥｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），ＵＳＡ）を用いて測定した。試験は二組で行ない、３回繰り返した。測定値はpg／組織１mgで表した。
【００６４】
下のグラフ８（それぞれの結果は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す）はラットの足内でカラギーナンによって誘導された、炎症性サイトカインＴＮＦαの生産の阻害を比較している。
【００６５】
【化１０】
2008514649.tif 000011
【００６６】
本発明によって、トランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンの投与が、ラットの足内でカラギーナンによって誘導された炎症促進性サイトカインＴＮＦαの生産を著明に阻害することを、グラフは明瞭に示している。
【実施例９】
【００６７】
ＰＧＥ２のレベル
以下で用いられた試験はＰｉｎｈｅｉｒｏ等によって、Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  ５１：  ６０３−６１０，  ２００２  に記載されたものに拠ったが、多少の修正を加えた。
【００６８】
１６０から１８０ｇの雄ラットにトランス−カリオフィレン５０mg／kgを経口的に与えた。０．９％（０．１ml／１０ｇ）食塩水で処置した動物を対照として使用した。動物の別の群に、試験４時間前にデキサメタゾン０．５mg／kgを皮下注射して、陽性対照として使用した。６０分後、動物に、カラギーナン１００μlを足底に注射し（３００μg／足）、１８０分後に屠殺した。
【００６９】
足の浸出物を、２本のポリエチレン製のカニューレを用いた透析により採取し、製造者指示に従いＥｌｉｓａキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），  ＵＳＡ）を用いた、ＰＧＥ２の定量に用いた。試験を二組で行ない、３回繰り返した。測定値はpg／組織１mgで表した。
【００７０】
下のグラフ９（それぞれの結果は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す）は、アルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンの投与による、ラットの足内でカラギーナンによって誘導されたＰＧＥ２レベルの増加の阻害と、デキサメタゾン（ｄｅｘｏｍｅｔｈａｓｏｎｅ）処置によって得た効果とを比較したものである。
【００７１】
【化１１】
2008514649.tif 000012
【００７２】
本発明によって、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンの投与が、ラットの足内でカラギーナンによって誘導されたＰＧＥ２レベルの増加を著明に阻害することを、グラフは明瞭に示している。
【実施例１０】
【００７３】
酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現の阻害
酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現は、Ｍｅｄｅｉｒｏｓ等によって、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  ２８：１３７５−１３８２，  ２００４に記載された方法に従って、ウエスタンブロットによって決定した。
【００７４】
１６０から１８０ｇの雄ラットにトランス−カリオフィレン５０mg／kgを経口的に与えた。０．９％（０．１ml／１０ｇ）食塩水で処置した動物を対照として使用した。動物の別の群に、試験４時間前にデキサメタゾン０．５mg／kgを皮下注射して、陽性対照として使用した。６０分後、動物に、カラギーナン１００μlを足底に注射し（３００μg／足）、１８０分後に屠殺し、カラギーナン注射２４０分後に足の皮下組織を取り出した。
【００７５】
採取した組織をただちに液体窒素中で冷凍し、低張の溶解緩衝液（１０mM  ＨＥＰＥＳ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、１．５mM  ＭｇＣｌ２、１０mM  ＫＣｌ、０．５mM  ＰＭＳＦ  フッ化フェニルメチルスルホニル、１．５μg／ml  トリプシンインヒビター、７μg／ml  ペプスタチンＡ、５μg／ml  ロイペプチン、０．１mM  ベンズアミジン０．１mM及び０．５mM  ジチオスレイトール）に再懸濁し、ホモゲナイズした。ホモジネートを三つの２mlアリコートに分け、氷中で１５分冷却し、２０μl  １０％の非イオン界面活性剤Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＵＳＡ）の存在下で、激しく撹拌し、再び氷中で冷却した。核分画を遠心分離（１，５００ｇ、５分）により沈殿させ、細胞質抽出物を含む上清を、−７０℃で貯蔵し、ウエスタンブロッティング試験に供した。タンパク濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．  キット、Ｍｉｌａｎ，  Ｉｔａｌｙ）によって決定した。抽出液を等容のＬａｅｍｍｌｙ緩衝液（１２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２mM  ＥＤＴＡ、４％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール及び０．１％  クマシ−ブリリアントブルー、pH６．８）と共に煮沸した。タンパクをニトロセルロース膜（１００μg／ウェル）に移し、電気泳動によって分離した。その後、膜をスキム粉ミルク（１０％  ＰＢＳ）で一夜４℃で定温放置して、ブロックし、次いで室温で１時間、抗−ｉＮＯＳ又は抗−ＣＯＸ−２抗体とインキュベートした。膜を抗体−ペルオキシダーゼ結合体（抗ウサギ）を含む１０％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳで３回洗浄した。こうして得られたバンドを、化学発光キット及び放射線フィルムの濃度解析（相対ユニット）によって定量した。
【００７６】
下のグラフ１０（それぞれの結果は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す）は、カラギーナンを注射した皮下組織又は足を測定した場合、アルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンの投与によって得られたＣＯＸ２酵素の発現の阻害と、デキサメタゾン処置によって得た、カラギーナンによって誘導されたＣＯＸ２の発現とを、比較したものである。
【００７７】
【化１２】
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【００７８】
本発明によって、アルファ−フムレン又はトランス−カリオフィレンのようなカリオフィレンの投与が、ラットの足内でカラギーナンによって誘導された酵素ＣＯＸ−２の発現を著明に阻害することを、グラフは明瞭に示している。
【００７９】
下のグラフ１１（それぞれの結果は５匹の動物の平均値を表し、垂直のバーは、平均の標準誤差偏差を表す）は、カラギーナンを注射した皮下組織又は足を測定した場合、アルファ−フムレン投与によって得られたｉＮＯＳ酵素の発現の阻害と、デキサメタゾン処置によって得た、カラギーナンによって誘導されたｉＮＯＳの発現に及ぼす効果とを、比較したものである。
【００８０】
【化１３】
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【００８１】
本発明に従って、アルファ−フムレンのようなカリオフィレンの投与が、ラットの足内でカラギーナンによって誘導された酵素ｉＮＯＳの発現を著明に阻害することを、グラフは明瞭に示している。
【００８２】
本実施例及び本明細書に示した情報は、本発明の特定の実施形態に関し、本明細書に添付した請求項の範囲によってのみ制限される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月28日(2006.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態の予防及び治療のための薬剤の製造における、カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用。
【請求項２】
炎症状態の予防及び治療に関連している、サイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２の体内での生産、並びに酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現を減少させるための薬剤の製造における、カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用。
【請求項３】
リウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症の群に含まれる少なくとも一つの慢性変性疾患の予防及び治療のための薬剤の製造における、又は抑うつ、及び蜂巣炎の群に含まれる少なくとも一つ非変形性疾患、もしくはアレルギーの治療における、請求項１から２の一項に記載のカリオフィレンの使用。
【請求項４】
経口、局所、経皮、皮下、腹腔内、静脈内、浸潤、吸入、経皮、経粘膜、筋肉内、肺内、経膣、経直腸、眼内および舌下を含む、経腸または非経口で投与される、請求項１から３の一項に記載の、カリオフィレンまたはカリオフィレンを含む組成物の使用。
【請求項５】
前記投与が、局所又は全身性であって、特に浸潤、経口、吸入又は経皮の中から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記カリオフィレンが一つ以上のアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンである、請求項１から５の一項に記載の、カリオフィレン又はカリオフィレンを含む組成物の使用。
【請求項７】
患者へのカリオフィレンの治療有効量の投与を含む、動物の身体、特にヒトの身体の炎症状態及び炎症性疼痛の治療の方法。
【請求項８】
前記炎症状態及び炎症性疼痛が、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、乾癬、アトピー性湿疹、粥状動脈硬化症の群に含まれる慢性変性疾患の少なくとも一つ、又は抑うつおよび蜂巣炎の群を含む非変形性疾患少なくとも一つの、もしくはアレルギーに、存在する事実を特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
炎症状態及び炎症性疼痛と関連している、サイトカインＩＬ−１β、サイトカインＴＮＦα、プロスタグランジンＰＧＥ２の体内での生産、並びに酵素ＣＯＸ−２及びｉＮＯＳの発現を減少させる方法であって、一つ以上のカリオフィレンの治療有効量を患者に投与する事を含む、方法。
【請求項１０】
前記カリオフィレンが、一つ以上のアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンである、請求項７から９の一項に記載の方法。
【請求項１１】
単位剤形当たり１から１０００mgの用量の一つ以上のカリオフィンを含む、抗炎症組成物。
【請求項１２】
カリオフィレンの前記用量が、単位剤形当たり１０から２００mgである、請求項１１に記載の抗炎症組成物。
【請求項１３】
カリオフィレンの前記用量が、単位剤形当たり３０から１００mgである、請求項１１に記載の抗炎症組成物。
【請求項１４】
前記カリオフィレンが、前記組成物の０．１から９９重量％を構成する、請求項１１に記載の抗炎症組成物。
【請求項１５】
前記カリオフィレンが、前記組成物の１から７０重量％を構成する、請求項１１に記載の抗炎症組成物。
【請求項１６】
前記カリオフィレンが、前記組成物の１０から４０重量％を構成する、請求項１１に記載の抗炎症組成物。
【請求項１７】
前記カリオフィレンがアルファ−フムレン及びトランス−カリオフィレンの一つ以上である、請求項１１から１６の一項に記載の抗炎症組成物。
【国際調査報告】
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2008514649.tif 000016
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