(57)【要約】  本発明は、自己免疫疾患並びに他のＴ細胞媒介炎症性疾患及び病態を予防又は治療するための医薬組成物及び方法を提供し、この組成物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来のペプチド又はそのフラグメント、類似体、相同体及び誘導体の有効量を活性成分として含む。本発明はさらに、Ｔ細胞媒介病態の治療に有用なＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の新規のペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不適切又は有害なＴ細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項２】
ＨＩＶがＨＩＶ−１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合ペプチドが、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＲＳＭＴＬＴＶＱＡＲＱＬ（配列番号１）を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＡＥＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＲＳＭＴＬＴＶＱＡＲＱＬ（配列番号２）を有する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＲＳＭＴＬＴＶＱＡＲＱＬを有し、位置３、６、９及び１１の下線を付したアミノ酸残基が「Ｄ」異性体立体配置（配列番号６）である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＡＶＧＩＧＡＬＦ（配列番号４０６）を有する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧ（配列番号４０７）を有する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
融合ペプチドが、アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧを有し、位置２の下線を付したアミノ酸残基が、「Ｄ」異性体立体配置（配列番号４０８）である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
融合ペプチドが、ＧＡＶＦＬＧＦＬＧ（配列番号４０９）、ＧＡＭＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１０）、ＧＡＶＬＬＧＦＬＧ（配列番号４１１）、ＧＡＦＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１２）、ＧＡＭＩＦＧＦＬＧ（配列番号４１３）及びＧＡＬＬＦＧＦＬＧ（配列番号４１４）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
融合ペプチドが、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞病態が、自己免疫性疾患である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
自己免疫性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（結腸クローン病若しくは潰瘍性大腸炎）及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞病態が、炎症性疾患である請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞病態が、移植片拒絶反応及び移植片対宿主疾患から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
不適切又は有害なＴ細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法であって、式（Ｉ）：
Ｘ１−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２（Ｉ）
を有する、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法であって、
［式中、
Ｘ１は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡ９は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８のアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である］。
【請求項１７】
融合ペプチドが、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドが、１つを超えるセリン残基は含まない請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔ細胞病態が、自己免疫性疾患である請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
自己免疫性疾患が、多発性硬化症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、Ｉ型糖尿病、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（結腸クローン病若しくは潰瘍性大腸炎）及び自己免疫性肝炎からなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞病態が、炎症性疾患である請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞病態が、移植片拒絶反応及び移植片対宿主疾患から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞活性化を阻害する方法であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項２４】
ＨＩＶがＨＩＶ−１である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
融合ペプチドが、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
融合ペプチドが、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞活性化を阻害する方法であって、式（Ｉ）：
ＸＩ−ＡＡ１−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２（Ｉ）
を有する、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む方法
［式中、
Ｘｉは、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡｉ、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡ９は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡｓ、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８のアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である］。
【請求項２８】
融合ペプチドが、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ペプチドが、１つを超えるセリン残基は含まない請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
式（Ｉ）：
Ｘｉ−ＡＡ，−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２（Ｉ）
を有する、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド
［式中、
Ｘ１は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡｉ、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡ９は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８のアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である］。
【請求項３１】
１つを超えるセリン残基は含まない請求項３０のペプチド。
【請求項３２】
アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧ（配列番号４０７）を有する請求項３０のペプチド。
【請求項３３】
ＧＡＶＦＬＧＦＬＧ（配列番号４０９）、ＧＡＭＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１０）、ＧＡＶＬＬＧＦＬＧ（配列番号４１１）、ＧＡＦＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１２）、ＧＡＭＩＦＧＦＬＧ（配列番号４１３）及びＧＡＬＬＦＧＦＬＧ（配列番号４１４）からなる群から選択される請求項３０のペプチド。
【請求項３４】
「Ｌ」及び「Ｄ」アミノ酸の両方を含む請求項３０のペプチド。
【請求項３５】
位置２の下線を付したアミノ酸残基が、「Ｄ」異性体立体配置（配列番号４０８）である、アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＦＬＧを有する請求項３４のペプチド。
【請求項３６】
請求項３０のペプチド及び薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド又はそのフラグメント、相同体及び誘導体の有効量を対象に投与することを含む、自己免疫及び他のＴ細胞媒介病態を予防又は治療する方法における、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来のペプチドの新規用途を提供する。したがって、本発明の方法において有用な、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチドの特定の新規なフラグメントを特許請求する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染は、免疫応答を混乱させる。未治療のＨＩＶ感染は通常、全身的免疫抑制状態、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、及び他の場合には特に害はない日和見感染しやすい状態に導くことになる。しかし感染を達成し複製を確立するために、ウイルスは免疫による制御を回避する必要があり、ＨＩＶが多種多様な仕組みを用いて達成する作業が最近概説された（ＪｏｈｎｓｏｎとＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、２００２）。ＨＩＶそれ自体に向けられたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性阻害は、特に興味深く（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９７；ＮｏｒｒｉｓとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、２００１）、抗ＨＩＶ  ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ウイルスの制御が可能なＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を確立するために必要である（ＡｌｔｆｅｌｄとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、２０００）。
【０００３】
標的細胞のＨＩＶ感染は、細胞膜とウイルス膜の融合を必要とし、この過程は、ｅｎｖ遺伝子産物、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１６０により触媒される。成熟ｇｐ１６０は、２つの非共有結合したサブユニット、ｇｐ１２０及びｇｐ４１で構成される（ＷｙａｔｔとＳｏｄｒｏｓｋｉ、１９９８）。ｇｐｌ２０と標的細胞上の膜レセプターとの相互作用の後、ｇｐ４１サブユニットは標的細胞へのウイルス侵入において重要な役割を果たす。いくつかの機能的領域が、ｇｐ４１ですでに同定されている（図１）。Ｎ末端の疎水性融合領域である融合ペプチド（ＦＰ）が、膜融合において中心的な役割を果たすと考えられる（図１）。実際に１つのアミノ酸（ａａ）置換を伴うＦＰ変異体であるＶ２Ｅは、野生型ＦＰより低い融合性活性を示す（Ｋｌｉｇｅｒら、１９９７）。ＦＰの最初の１６個のａａを標的細胞膜に挿入し、Ｃ２０領域をウイルス膜に挿入する（ＰｅｉｓａｊｏｖｉｃｈとＳｈａｉ、２００３；Ｓｕａｒｅｚら、２０００）。Ｎ３６及びＣ３４ペプチドは、ウイルス膜と標的膜とを近接させる６−ヘリックスバンドルリンカー（ｓｉｘ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）（Ｃｈａｎら、１９９７）を形成する７残基反復を含む。Ｃ末端７残基反復に対応する１つのペプチドであるＤＰ  １７８（ＨＩＶ−１ＬＡＩ  ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸６３８〜６７３）により、融合は阻害でき、このペプチドはＨＩＶ感染の強力な阻害剤であり、ヒトに使用するために最近承認された（Ｌａｗｌｅｓｓら、１９９６）。ウイルス感染を阻害するのに有用なＨＩＶ  ｇｐ４１由来ペプチドが、たとえば米国特許第５，４６４，９３３号、同第６，１３３，４１８号、同第６，０９３，７９４号（ＨＩＶＬＡＩ  ｇｐ４１のアミノ酸５５８〜５９５に対応するペプチド及びその類似体であるＤＰ１７８及びＤＰ１０７に関する）、並びに第５，８４０，８４３号（アミノ酸残基６００〜８６２、又はＨＩＶ−１ＩＩＩＢのエンベロープ糖タンパク質のアミノ酸残基６３７〜６６６に対応する配列を含むこれらの一部に相当するものに関する）に開示されている。
【０００４】
ＦＰとＴ細胞膜との相互作用に関して、ＦＰの１６個のＮ末端ａａをコードする合成ペプチドが、ジャーカットＴ細胞系の細胞膜上で不均一な分布を示すことをＣｌａｄｅｒａらは報告した（Ｃｌａｄｅｒａら、２００１）。応答するＴ細胞の細胞膜領域中で顕著なものは、免疫シナプスである。免疫シナプスは、抗原特異的Ｔ細胞と抗原提示細胞間の特異的相互作用を達成する膜貫通分子のクラスターである。免疫シナプスは、ＴＣＲ及びＣＤ４分子並びにＴ細胞活性化に関与する他の主要な分子を含む（ＤａｖｉｓとＤｕｓｔｉｎ、２００４；Ｈｕｐｐａら、２００３）。完全なＴ細胞の活性化には、免疫シナプス機能が必要である（Ｈｕｐｐａら、２００３）。ただし、背景技術のいずれも、ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１のＦＰ領域が免疫シナプスに局在化し、Ｔ細胞の活性化を調節することを開示も示唆もしていない。
【０００５】
正常な免疫系は厳密に調節されるが、免疫応答の異常はまれでない。場合によっては免疫系が不適切に機能し、あたかも宿主の構成成分が実際に外来性であるかのようにその構成成分に反応する。このような応答は、宿主の免疫系が宿主自体の組織を攻撃する自己免疫性疾患を生じる。免疫系の主要な制御因子として、Ｔ細胞は直接的に又は間接的にこのような自己免疫病態に影響を及ぼす。
【０００６】
Ｔ細胞媒介炎症性疾患とは、不適切なＴ細胞応答が疾患の構成要素である全ての症状を指す。この疾患は、Ｔ細胞により直接的に媒介される疾患及び不適切なＴ細胞応答が異常な抗体産生の原因となる疾患の両方を含む。
【０００７】
多数の疾患が、自己免疫機序に起因していると考えられている。これらの中でも関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡が顕著である。世界中で何百万人もの人々が自己免疫疾患を患っており、実際の治療経費及び失われた生産性からみたこれらの疾患の経費は、毎年数十億ドルと評価されている。
【０００８】
さらにＴ細胞は、骨髄（造血幹細胞）移植による、臓器移植又は移植片対宿主疾患に対する拒絶反応において主要な役割を果たす。したがって、このような免疫応答の制御が、治療上望まれる。
【０００９】
また患者で免疫応答を制御する試みに用いられた従来の試薬と方法は望ましくない副作用を生じ、有効性が限られている。たとえば、自己免疫疾患を有する患者の治療に用いられる免疫抑制試薬（たとえば、シクロスポリンＡ、アザチオプリン及びプレドニゾン）は、患者の免疫応答全体も抑制して、それにより感染リスクを増加させ、非リンパ系組織に有毒な副作用を引き起こすことがある。免疫制御の医学的な重要性及び既存の免疫薬理学的な試薬の不完全性のため、免疫系の特異的な要素を制御する試薬と方法が、長年研究の対象であった。
【００１０】
いくつかの自己免疫性疾患では、関連する自己抗原が知られており、したがって特異的療法のために用いることができる。たとえば、特異的な自己抗原に免疫寛容及び／又は防御免疫を誘導する方法が、とりわけ、たとえばＷＯ０１／１２２２２、ＷＯ９７／０２０１６及びＷＯ０１／３０３７８により開示されている。
【００１１】
とりわけ、たとえばＷＯ０１／５７０５６、米国特許第６，３１６，４２０号、ＷＯ０４／００２５００及びＷＯ００／６３２５１により開示されているように、免疫応答の他の構成要素、たとえばサイトカイン及び接着分子も、免疫調節剤の開発の標的であった。
【００１２】
おそらく分子集合を妨げてＴＣＲ機能を乱すことに関する、ＴＣＲ由来配列に基づくペプチドも開示されている（ＷＯ９６／２２３０６、ＷＯ９７／４７６４４）。しかし、これらのペプチドは、本発明のペプチドより約１００倍高い濃度で有効であることが示され、したがって毒性と副作用のかなり高い可能性を有していた。
【００１３】
同種の非免疫血清と比べて、同種免疫−免疫原−吸収（ＡＩＡ）血清と免疫反応性のより高い抗原の低免疫原性用量を投与することにより、自己免疫疾患の症状を治療又は抑制する方法が、米国特許第５，２３０，８８７号で開示された。ＭＨＣクラスＩＩ抗原との、その主張されている血清学的な交差反応性に基づく１つの推定上の抗原は、ＨＩＶの完全なｇｐ４１であることが示唆された。推定された交差反応性は、Ｃ末端のペプチドに存在する（Ｇｏｌｄｉｎｇら、１９８９）。
【００１４】
ＷＯ８９／０９７８５は、ＨＩＶ誘導細胞融合又は細胞壊死性の融合細胞形成を阻害できるＨＩＶ−Ｉのｇｐ４１のアミノ末端及びＨＩＶ−２のｇｐ４０のアミノ末端に位置する疎水性領域に対応するペプチド配列に関する。本開示は、Ｄ−アミノ酸を含むいかなるペプチドの特定の実施形態も開示されないが、これらのペプチドは、ペプチドのアミノ末端及び／又はペプチドの最初の２つのアミノ酸の位置にＬ−異性体ではなくＤ−異性体を有し得ることを明記している。全てがＢＨｌＯ株のｇｐ４１の少なくとも最初の３つのアミノ酸を含む関連ペプチド、すなわちアミノ酸残基１〜３に対応する特異的なペプチド、アミノ酸残基１〜６に対応するペプチド、及び変更された順序でアミノ酸残基１〜６を含むペプチドのファミリーを用いる、ＨＩＶに誘導された融合と融合細胞形成の阻害を‘７８５公開公報は開示している。
【００１５】
本発明の優先日以後に発表された、本発明の一部の発明者によるＷＯ２００５／０６０３５０は、膜貫通タンパク質のフラグメントに対応するアミノ酸配列を含む細胞膜結合ジアステレオ異性のペプチドであって、ジアステレオ異性のペプチドの少なくとも２つのアミノ酸残基が、特にウイルスの複製と伝染を含む融合膜タンパク質事象の阻害に有用な、Ｄ−異性体立体配置であるペプチドを開示する。とりわけ‘３５０公開公報は、膜融合過程を阻害するためのＨＩＶ−Ｉ  ＬＡＶ１  ｇｐ４１のアミノ酸５１２〜５４４に対応するジアステレオ異性のペプチドの使用を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
Ｔ細胞媒介炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療又は改善する、さらに有効な方法の必要性が長い間望まれている。したがって、最小限の副作用でＴリンパ球の活性化を選択的に抑制できる、新たな免疫抑制因子の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、炎症性疾患、自己免疫及び移植片拒絶反応を含むがこれに限定されるものではないＴ細胞媒介病態の予防又は治療に有効な、ＨＩＶのｇｐ４１融合ペプチド領域（ＦＰ）由来のペプチド又はそのフラグメント、相同体及び誘導体の新規の用途を初めて開示する。したがって、これらの方法において特に有用なＨＩＶのｇｐ４１融合ペプチド領域（ＦＰ）の特定の新規な活性フラグメントを特許請求する。
【００１８】
本発明は、ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１分子の単離した融合ペプチド（ＦＰ）が、Ｔ細胞媒介炎症性自己免疫疾患に対して治療特性を有するという、一部には予想外の発見に基づいている。ＦＰが他のｇｐ４１領域と共に作用してウイルス粒子の宿主細胞との融合を媒介することは当該技術分野では公知である。ＦＰはＴ細胞膜中のＴＣＲ及びＣＤ４分子と共存することが今初めて開示され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞活性化を阻害することが、今示される。意外にも、分裂促進的抗体などの非特異的な活性化因子によるＴ細胞活性化は影響を受けないが、ＦＰ（配列番号１）が、抗原特異的Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を特に阻害することが認められた。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏのこれらの疾患の動物モデルで、ＦＰは関節炎誘発性Ｔ細胞の活性化及びアジュバント関節炎を阻害した。さらに細胞−細胞融合を阻害するＦＰの能力と相関しない配列と構造に依存する様式で、ＦＰはｉｎ  ｖｉｖｏで非免疫原性であることが認められた。これらの予期しない発見は、Ｔ細胞媒介病態治療のための新規用途を有するｇｐ４１融合ペプチド領域の新規の機能を開示する。
【００１９】
意外にも、配列番号１のアミノ酸残基５〜１３（配列番号４０７）に対応するＦＰフラグメントが、アミノ酸残基１〜８（配列番号４０６）に対応するＦＰフラグメントよりも、抗原特異的Ｔ細胞増殖をはるかに強く阻害するＦＰの能力を保持することが本明細書で認められた。本発明は、ペプチドの二次構造の破壊にもかかわらず、ＦＰに対応するジアステレオ異性のペプチド又はこれらの部分的配列が炎症を阻害するというさらに予期しない発見に基づく。
【００２０】
したがって、本発明は、Ｔ細胞免疫の調節における、ＨＩＶのｇｐ４１由来の単離した融合ペプチド並びにそのフラグメント、類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩の新規の用途を提供する。したがって、本発明は、たとえば完全長ＦＰ（配列番号１）、そのジアステレオ異性誘導体ＩＦＦＡ（配列番号６）、及びＦＰ変異体Ｖ２Ｅ（配列番号２）などの既知のペプチド、並びに当該技術分野で以前に述べられていないペプチドの両方の使用に関する。本発明は、以下に詳述するようなＦＰの新規なフラグメント、類似体及び変異体をさらに提供する。
【００２１】
一態様において、本発明は、炎症性疾患、自己免疫疾患及び移植片拒絶反応を含むがこれに限定されるものではないＴ細胞媒介病態の治療のための、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩の使用に関する。
【００２２】
ある特定の実施形態によれば、疾患はＴ細胞媒介自己免疫疾患、たとえば多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（結腸クローン病及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性肝炎又は関節リウマチを含むがこれに限定されるものではない。
【００２３】
本発明は、アジュバント関節炎（ＡＡ）の動物病モデルである、関節リウマチの実験モデルとして用いられているＴ細胞媒介炎症性自己免疫疾患により、以下に特に例示される。このモデルは、本発明の原理の例示の目的に用いる非制限的な例として意図したものである。
【００２４】
別の特定の実施形態では、Ｔ細胞媒介病態は同種異系移植片拒絶反応及び対宿主性移植片病からなる群から選択される。
【００２５】
特定の実施形態によれば、ペプチドは、ＨＩＶ−Ｉのｇｐ４１タンパク質の融合ペプチド領域由来のフラグメントである。好ましい一実施形態では、ペプチドは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する（表１を参照）。代替実施形態によれば、ペプチドはＶ２Ｅ変異体である（配列番号２、表１を参照）。特定の好ましい実施形態によれば、ペプチドは、配列番号７〜１９８のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する、表２に記載のＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチド変異体である。別の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号１９９〜４０５のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する表２に記載のＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、本ペプチドは本明細書でＦＰｉ−８（配列番号４０６、表１を参照）と名付けた配列番号１のアミノ酸１〜８に対応するＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書でＦＰ５−Ｉ３（配列番号４０７、表１を参照）と名付けた配列番号１のアミノ酸５〜１３に対応するＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチドフラグメントである。別の特定の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号４０９〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有するＦＰ５−Ｉ３の変異体である（表２を参照）。ペプチド由来の配列番号１、２、７〜４０７及び４０９〜４１４と表す短い活性フラグメントとこれらの配列を含む長いペプチドは両方とも、本発明の範囲内に入ることに留意されたい。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。別の特定の実施形態では、ペプチドは配列番号６に示されたアミノ酸配列を有する、本明細書でＩＦＦＡ（表１を参照）と名付けた完全長のＦＰに対応するジアステレオ異性のペプチドである。別の特定の実施形態では、ペプチドは配列番号４０８に示されたアミノ酸配列を有する本明細書でＦＰｓ−Ｊ３  Ａ６（表１を参照）と名付けた、ＦＰ５−１３に対応するジアステレオ異性のペプチドである。
【００２７】
ある実施形態では、ペプチドは、本明細書において式（Ｉ）：
Ｘｉ−ＡＡｒＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２  （Ｉ）
に記載のＴ細胞活性化を阻害できるＦＰ５−Ｉ３の類似体、変異体、誘導体及びコンジュゲートを含み、
式中、
Ｘ１は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡ９は、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡｇのアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である。
【００２８】
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチドは１つを超えるセリン残基は含まない。
【００２９】
他の態様では、本発明は、不適切な又は有害なＴ細胞応答に関連する疾患又は障害の症状を治療又は予防する方法を提供し、この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００３０】
一実施形態では、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００３１】
別の実施形態では、ペプチドは、上記に詳述したように、式（Ｉ）に記載のＴ細胞活性化を阻害できるペプチドである。
【００３２】
本発明の他の態様は、Ｔ細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の単離したペプチド又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を活性成分として含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【００３３】
一実施形態では、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、ペプチドは配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はこれらのフラグメント、類似体、変異体、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００３４】
別の実施形態では、ペプチドは、上記に詳述したように、式（Ｉ）に記載のＴ細胞活性化を阻害できるペプチドである。
【００３５】
本発明の他の態様は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド領域由来の新規のペプチド及びこのペプチドを含む医薬組成物に関する。
【００３６】
したがって、他の態様では、式（Ｉ）：
ＸＩ−ＡＡＩ−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２  （１）
を有する、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチドが提供され、
式中、
Ｘ１は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡｉ、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡｇは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８のアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸はＬ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態では、ペプチドは１つを超えるセリン残基は含まない。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号４０７に示されたアミノ酸配列を有するＦＰ５−Ｉ３である。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号４０９〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する。
【００３８】
別の実施形態では、ペプチドはＬ及びＤアミノ酸の両方を含む。特定の一実施形態では、ペプチドは配列番号４０８に示されたアミノ酸配列を有するＦＰ５−１３Ａ６である。
【００３９】
一態様によれば、本発明は式（Ｉ）のペプチド及びその塩並びに薬剤学的に許容し得る担体又は希釈剤を活性成分として含む医薬組成物を提供する。
【００４０】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図、説明及び特許請求の範囲と共に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、Ｔ細胞の活性を制御する新規な方法に関する。ＨＩＶ  ｇｐ４１融合ペプチド（ＦＰ）を含む組成物は、Ｔ細胞媒介疾患の治療に有効な治療試薬であることが今初めて示される。
【００４２】
具体的には、本発明は、Ｔ細胞活性化を阻害するための、単離したヒトウイルスの融合ペプチドの使用に関する。ウイルスはヒト免疫不全ウイルスであるのが好ましい。ウイルスはＨＩＶ−Ｉであるのがより好ましい。自己免疫性疾患、炎症性疾患、移植片拒絶反応及びアレルギーなどのＴ細胞媒介病態を予防又は改善するために、単離した融合ペプチドを使用する。
【００４３】
本発明は本明細書でさらに詳細に記載されるように、ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチド領域（ＦＰ）が、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を抑制できるという、一部には予想外の発見に基づいている。
【００４４】
特定の作用機序に束縛されることを望むものではないが、本発明のペプチドは免疫シナプスに局在し、それによりＴ細胞活性化を阻害するという前提に立っている。
【００４５】
図７は、ＦＰがＨＩＶ感染で２つの機能を果たす、ＦＰの仮定した機能の概略図を示し、免疫療法のための新たな手段を提供する。ＨＩＶ感染が、ＨＩＶ感染症に及ぼすＦＰの２つの効果を図式的に示す。Ｔ細胞免疫シナプスへのＦＰの挿入は、融合及び感染を促進し、一方、挿入はＨＩＶエピトープに対する特異的なＴ細胞免疫を下方制御する。Ｔ細胞媒介免疫応答、たとえば自己抗原に対する応答又は移植片拒絶反応が有害である状況下で、免疫療法はＦＰによる下方制御を、Ｔ細胞媒介免疫応答にまで拡大する。したがって、ＦＰそれ自体又はその活性フラグメントを、新たな免疫療法薬剤として使用することができる。
【００４６】
（Ｔ細胞活性化）
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答に関与する多様な別個の細胞型の１つである。Ｔ細胞の活性は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に関連してＴ細胞に提示される抗原により制御される。次いでＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ−抗原複合体と結合する。一旦、抗原がＭＨＣと複合体を形成すると、ＭＨＣ−抗原複合体はＴ細胞上の特異的ＴＣＲに結合し、それによりそのＴ細胞の活性を変更する。
【００４７】
抗原提示細胞によるＴリンパ球の適切な活性化には、ＴＣＲだけでなく、そのコレセプターの組合せ、協調した関与の刺激を必要とする。大部分のＴＣＲコレセプターは、細胞表面リガンドに結合し、細胞間接触の領域で濃縮され、免疫シナプスと呼ばれるものを形成する。シナプス形成は、抗原特異的Ｔ細胞増殖の誘導、サイトカイン産生及び溶解性顆粒放出を伴い、完全なＴ細胞活性化に必要なその機能が決定された（ＤａｖｉｓとＤｕｓｔｉｎ、２００４；Ｈｕｐｐａら、２００３）。
【００４８】
（Ｔ細胞媒介病態）
一態様において、本発明はＴ細胞媒介病態を治療するための方法を提供する。用語「Ｔ細胞媒介病態」とは、不適切又は有害なＴ細胞応答が、疾患又は障害の病因又は病態の構成要素である任意の症状を意味する。本用語は、Ｔ細胞により直接的に媒介される疾患、及びまた不適切又は有害なＴ細胞応答が、異常な抗体の産生並びに移植片拒絶反応の原因となる疾患の両方を含むものである。
【００４９】
本発明の一実施形態において、組成物はＴ細胞媒介自己免疫性疾患、たとえば多発性硬化症、自己免疫性神経炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）、シェーグレン病、甲状腺疾患、重症筋無力症、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患（結腸クローン病及び潰瘍性大腸炎）又は自己免疫性肝炎、関節リウマチを含むがこれに限定されるものではない疾患を治療するのに有用である。
【００５０】
他の実施態様においては、組成物はＴ細胞媒介炎症性疾患、たとえば喘息、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（たとえば、特発性肺線維症又は関節リウマチ、若しくは他の炎症性疾患に伴うＩＬＤ）などの炎症性又はアレルギー性疾患；硬皮症；乾癬（Ｔ細胞媒介乾癬を含む）；皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、皮膚エリテマトーデス、硬皮症、腟炎、直腸炎、薬疹、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、グレーヴス眼症及び原発性胆汁性肝硬変を含むがこれに限定されるものではない疾患を治療するのに有用である。
【００５１】
他の実施形態においては、組成物は、同種移植片拒絶又は移植片対宿主病を含む移植片拒絶反応を治療するのに有用である。
【００５２】
（ペプチド及びペプチドに基づく医薬組成物）
本発明は、ＨＩＶ融合ペプチド（ＦＰ）並びにそのフラグメント及び誘導体がＴ細胞活性化を阻害するという、一部には予想外の発見に基づいている。意外にも、ＦＰのアミノ酸残基５〜１３に対応する単離したＦＰフラグメント及びそのジアステレオ異性誘導体、並びにある程度ではあるが、ＦＰのアミノ酸残基１〜８に対応する単離したフラグメントが、Ｔ細胞抗原依存性増殖を阻害するＦＰの能力を保持していることがさらに分かった。
【００５３】
したがって、本発明はその第１の態様において、式（Ｉ）：
Ｘ，−ＡＡ，−ＡＡ２−ＡＡ３−ＡＡ４−ＡＡ５−ＡＡ６−ＡＡ７−ＡＡ８−ＡＡ９−Ｘ２
のＴ細胞活性化を阻害できるペプチドを提供し、
式中、
Ｘｉは、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＮ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が、配列アラニン−バリン−グリシンを有するペプチドを含まず、
ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ６及びＡＡｐは、それぞれ独立してアラニン又はグリシンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ３は、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニンアミノ酸残基を示し、
ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８は、それぞれ独立してフェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン又はセリンアミノ酸残基を示し、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８の任意の３つがロイシンアミノ酸残基であってもよいことを除いて、ＡＡ４、ＡＡ５、ＡＡ７及びＡＡ８のアミノ酸残基の２つ以下が同一であり、
Ｘ２は、アミノ酸配列の長さが約２０アミノ酸残基以下であるＣ末端ブロック基を示すか、又は存在しなくてもよく、ここで、アミノ酸残基の少なくとも５０％が疎水性であり、前記配列が配列バリン−グルタミン−アラニンを有するペプチドを含まず、
ただし、各アミノ酸は、Ｌ型又はＤ型のいずれかであってもよく、ペプチドは長さが３０アミノ酸残基以下である。
【００５４】
疎水性は、非極性溶媒と水の間でのアミノ酸の分配に関して一般に定義される。疎水性アミノ酸は、非極性溶媒に対する優先性を示すアミノ酸である。アミノ酸の相対的な疎水性は、グリシンが値０．５を有する疎水性スケールで表すことができる。このようなスケールで、水に対する優先性を有するアミノ酸は０．５より下の値を有し、非極性溶媒に対する優先性を有するアミノ酸は、０．５を上回る値を有する。本明細書で用いられる用語「疎水性アミノ酸」は、疎水性スケールで０．５より大きいか又は等しい値を有するアミノ酸を意味し、言い換えれば、少なくともグリシンの値に等しい非極性溶媒に分配される傾向を有するアミノ酸を意味する。天然の疎水性アミノ酸の例は、脂肪族アミノ酸アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン及びバリン、並びに芳香族アミノ酸トリプトファン、フェニルアラニン及びチロシンである。これらのアミノ酸は、タンパク質中の残基として見いだされる場合、脂肪族の長さと芳香族の側鎖のサイズの関数として疎水性を与える。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは１つを超えるセリン残基は含まない。一実施形態で、ペプチドは、配列番号４０７（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧ）に示されたアミノ酸配列を有するＦＰ５−Ｉ３である。式（Ｉ）の一般的な構造の他の典型的な実施形態は、ＧＡＶＦＬＧＦＬＧ（配列番号４０９）、ＧＡＭＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１０）、ＧＡＶＬＬＧＦＬＧ（配列番号４１１）、ＧＡＦＦＬＧＦＬＧ（配列番号４１２）、ＧＡＭＩＦＧＦＬＧ（配列番号４１３）及びＧＡＬＬＦＧＦＬＧ（配列番号４１４）からなる群から選択される単離したペプチドである。
【００５６】
別の実施形態では、ペプチドはジアステレオ異性ペプチド、すなわちＬ及びＤアミノ酸の両方を含むペプチドである。ジアステレオ異性ペプチドの、より高い水溶性及びタンパク質分解に対するより低い感受性のため、ジアステレオ異性ペプチドは、同じアミノ酸配列を有する全てがＬ又は全てがＤアミノ酸ペプチドに比べ有利でありうる。このような特性は、ジアステレオ異性ペプチドに、同じアミノ酸配列を含む全てがＬ又は全てがＤアミノ酸ペプチドよりもさらに高い有効性とさらに高い生物学的利用能を与える。特定の一実施形態で、ペプチドは配列番号４０８（
【化１】
2008528480.tif 000002
、Ｄアミノ酸は太字で下線を施した）に示されたアミノ酸配列を有するＦＰ５−Ｉ３  Ａ６である。
【００５７】
式（Ｉ）のペプチドは、長さが３０アミノ酸未満であることが好ましい。より長い、たとえば長さが５０アミノ酸以下のペプチドも、本発明のＴ細胞媒介病態の治療のために用いることができることを理解すべきである。しかし一実施形態では、産生するのがより容易なために、より短いペプチドが好ましい。本発明の別の好ましい実施形態では、ペプチドは長さが２０アミノ酸以下である。本発明の別の好ましい実施形態では、ペプチドは、長さが１０アミノ酸以下である。したがって、ある実施形態では、任意のＮ及びＣ末端、すなわちＸｉ及びＸ２は、長さが２０アミノ酸以下の、好ましくは１０アミノ酸以下の、より好ましくは５アミノ酸、又は他の実施形態では、３アミノ酸以下であるか、若しくは存在しなくてもよい。
【００５８】
ペプチドが、当該分野においてすでに記載されているペプチドでない限り、ＸｉとＸ２のアミノ酸配列は、ＦＰのフランキング領域に対応する配列を含むことができる。式（Ｉ）によって提供されるペプチドは、既知のペプチド、たとえば、完全長のＦＰ（配列番号１）及びＩＦＦＡ（配列番号６）などの完全長配列に対応するジアステレオ異性誘導体、並びにＷＯ２００５／０６０３５０で開示された完全長配列に対応する他のジアステレオ異性誘導体、Ｋｌｉｇｅｒら（１９９７）よりに開示された既知のＶ２Ｅ突然変異体（配列番号２）、Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）により開示された配列番号２２５に示されたアミノ酸配列を有する配列番号１のアミノ酸１〜１６に対応するペプチド、及びＷＯ８９／０９７８５により開示された配列番号１のアミノ酸１〜３を含むペプチドを含まないことを意図していることに留意されたい。
【００５９】
代替実施形態では、配列が疎水性の要求されるレベルを保持する限り、Ｘ１及びＸ２は、ＦＰに由来しない配列を含むことができる。
【００６０】
別の態様によれば、本発明は、ＨＩＶのｇｐ４１由来の単離した融合ペプチド並びにその類似体、突然変異体、変異体、コンジュゲート及び誘導体を含む組成物に関する。
【００６１】
特定の実施形態によれば、融合ペプチドはＨＩＶ−Ｉのｇｐ４１タンパク質に由来する。代替実施態様によれば、融合ペプチドはＶ２Ｅ変異体である。ある好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは配列番号７〜１９８のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する、表２に記載のＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチド変異体である。さまざまなＨＩＶ株と変異体のデータベースが、利用可能である（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘを参照）。他の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号１９９〜４０５のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する、表２に記載のＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチドフラグメントである。他の好ましい実施形態によれば、融合ペプチドは、配列番号４０６〜４０７及び４０９〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する、表２に記載のＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１融合ペプチドフラグメントである。他の好ましい実施形態では、融合ペプチドは、Ｌ及びＤアミノ酸残基の両方を含む。別の好ましい実施形態では、融合ペプチドは、配列番号６及び４０８のいずれか１つに示されたアミノ酸配列を有する。
【００６２】
配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメントとこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。本発明による融合ペプチドフラグメントは、長さが５〜５０アミノ酸であるのが好ましく、長さが１０〜３６アミノ酸であるのがより好ましい。
【００６３】
他の好ましい実施形態では、上記に詳述したように、組成物は式（Ｉ）のペプチドを含む。
【００６４】
本発明のペプチドは、実施例で詳述する手順を用いて合成できる。しかし、固相（たとえばＢｏｃ又はｆ−Ｍｏｃ化学反応）並びに液相合成法を含むがこれに限定されるものではない、当技術分野で既知の他の方法を、本発明のペプチド合成に用いることができる。
【００６５】
本明細書に記載されているアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体形態であるのが好ましい。しかし、ペプチドが望ましい機能的特性を保持する限り、「Ｄ」異性体形態の残基を任意のＬ−アミノ酸残基で置換できる。
【００６６】
融合ペプチドが必要とされる配列を含み、本明細書に記載されるような本発明のペプチドとして機能できる限り、融合ペプチドは本発明のペプチドのアミノ酸配列と同一である必要はないことを理解されたい。
【００６７】
本発明は、ペプチドがＴ細胞活性化を阻害できる限り、本発明のＦＰを含む任意の類似体、誘導体及びコンジュゲートを含む。したがって、本発明は非自然アミノ酸誘導体又は非タンパク質側鎖を含むペプチドを含む。
【００６８】
用語「類似体」は、１つ又は複数の残基が機能的に同等の残基で保存的に置換され、本明細書に記載されるような能力を示す、特にここに示された配列の１つに実質的に同一であるアミノ酸配列を有する任意のペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性の）残基の他の残基への置換、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間などの１つの極性（親水性の）残基の他の残基への置換、リジン、アルギニン若しくはヒスチジンなどの１つの塩基性残基の他の残基への置換、又はたとえばアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の他の残基への置換を含む。
【００６９】
「保存的置換」という語句は、このようなペプチドが、本明細書で特定されているＴ細胞に対して要求される阻害的機能を発揮するならば、非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用も含む。
【００７０】
誘導体という用語は、側鎖又は官能基の反応により化学的に誘導体化した、１つ若しくは複数の残基を有する本発明のペプチドの任意の化学的誘導体を含む。このような誘導体化分子として、たとえば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成した分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチルエステル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル若しくはヒドラジドを形成するように誘導体化され得る。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されてＯ−アシル誘導体又はＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。また化学的誘導体としては、２０種類の標準的なアミノ酸残基の１つ若しくは複数の天然アミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンでプロリンを置換してもよく、５−ヒドロキシリシンでリジンを置換してもよく、３−メチルヒスチジンでヒスチジンを置換してもよく、ホモセリンでセリンを置換してもよく、オルニチンでリジンを置換してもよい。
【００７１】
さらに、末端−ＮＨ２アシル化、アセチル化又はチオグリコール酸アミド化を含むが、これに限定されるものではない化学的改変により、たとえばアンモニア、メチルアミンなどによる末端カルボキシルアミド化により、ペプチド誘導体は本発明のペプチドの天然配列と異なっていてもよい。ペプチドは直鎖状、環状又は分枝状その他であってもよく、当該技術分野で周知の方法を用いて配座を達成できる。
【００７２】
したがって、たとえば式（Ｉ）でＸ１及びＸ２により示される「保護基」は、エキソペプチダーゼによる消化に対して生化学的な安定性と耐性を与えるために、ペプチド化学の技術分野において通常用いられる化学基である。適当なＮ末端ブロック基には、たとえば、アセチルなどのＣｉ−５アルカノイル基が含まれ、他の例示的な保護基としては、限定されないが、ｔ−ブチルオキシカルボニル、メチル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）、アジピルアゼライル（ａｄｉｐｙｌ  ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアセライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｓｅｌａｙｌ）、メトキシアジピル、メトキシスベリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）、及び２，３−ジニトロフェニル基が挙げられる。またアミノ機能を欠くアミノ酸類似体も、Ｎ末端ブロック基として適している。適切なＣ末端ブロック基には、Ｃ末端カルボキシルの炭素原子においてケトン若しくはアミドを形成する基、又は該カルボキシルの酸素原子においてエステルを形成する基が含まれる。ケトン及びエステルを形成する基は、アルキル基、特に分枝状又は非分枝状のＣｉ−５アルキル基、たとえばメチル、エチル及びプロピル基が含まれ、アミド形成基には、アミノ官能基、たとえば第一級アミン、又はアルキルアミノ官能基、たとえばモノＣｉ−５アルキルアミノ及びジＣｉ−５アルキルアミノ基、たとえばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどが含まれる。他の例示的な保護基としては、限定されないが、Ｃ３−８シクロアルキル基、たとえばシクロペンチル、シクロヘキシル、Ｃ６〜Ｉ２アリール基、たとえばフェニル及びα−ナフチル、フェニル−Ｃｉ−２アルキル基、たとえばベンジル、フェネチル又はＣ７−ｉ４アラルキル基、Ｃｉ−２アルキル基、たとえばαナフチルメチル基、並びにさらに経口用の生物利用可能なエステルとして一般に用いられるピバロイルオキシメチル基が挙げられる。また、たとえばアグマチンなどの脱カルボキシル化アミノ酸類似体も、本化合物のＣ末端を保護するのに適している。
【００７３】
本発明のペプチドは、要求される阻害活性が維持される限り、本発明の融合ペプチドの配列に比べて、残基の１つ若しくは複数の付加及び／又は欠失を有する任意のペプチドも含む。
【００７４】
本発明のペプチドが、担体に都合良く結合することができる「リンカー」を提供するために、アミノ酸残基の付加を本発明のペプチドのどちらの末端に実施してもよい。このようなリンカーは、通常は少なくとも１つのアミノ酸残基であり、４０又はそれ以上の残基、より一般的には１〜１０残基であってもよい。結合に用いる代表的なアミノ酸残基は、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸等である。
【００７５】
本発明のペプチドを、別のタンパク質又はポリペプチドに結合させるか又はコンジュゲートさせてコンジュゲートを産生できる。このようなコンジュゲートは、単独で用いられたペプチドに比べ利点を有する。たとえば本発明のペプチドを、Ｔ細胞媒介病態に関与する抗原に結合できる。理論又は作用機序に束縛されることを望むものではないが、このようなコンジュゲートによるワクチン接種で、結合抗原に対するＴ細胞の活性化が低下することもあり、それにより前記疾患の標的抗原に対し免疫寛容を生じる免疫応答を誘導する。ペプチドは、二重リガンドペプチドとして合成されたアミド結合を介して直接的に結合することができるか、又は本発明が関係する本技術分野でよく知られているように、リンカー部分を用いて結合することができる。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の単離した融合ペプチドの治療有効量及び薬剤学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
【００７７】
本発明の実施において有用な医薬組成物は、典型的には薬剤学的に許容し得る中和した塩の形態で、医薬組成物に処方された本発明のペプチドを含んでいる。薬剤学的に許容し得る塩は、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）を含み、たとえば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸で形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸などのような有機酸で形成される。
【００７８】
本発明のペプチドと塩を形成できる適切な塩基としては、無機塩基、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど、並びに有機塩基、たとえばモノ、ジ及びトリアルキル及びアリールアミン（たとえばトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）、並びに任意に置換されたエタノールアミン（たとえばエタノールアミン、ジエタノールアミンなど）を含むが、これに限定されるものではない。
【００７９】
活性成分としてペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物の調製は、当技術分野で周知である。典型的にはこのような組成物は、注射し得るように溶液又は懸濁液として調製されるが、注射前に懸濁又は可溶化できる固体形態としても調製できる。調製物はまた、乳化することができる。活性な治療的成分を、薬剤学的に許容し得る活性成分と適合性の無機及び／又は有機担体と混合する。担体は適切な粘稠性を与えるか又は組成物に形成するために、医薬組成物に添加される場合に、多少の不活性物質を含む薬剤学的に許容し得る賦形剤（ビヒクル）である。適切な担体としては、たとえば水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せである。さらに必要に応じて、組成物は少量の補助物質、たとえば活性成分の有効性を増強する湿潤剤又は乳化剤及びｐＨ緩衝剤などを含むことができる。
【００８０】
（治療的な使用）
一態様において、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の予防又は治療に有効な、ｇｐ４１融合ペプチド領域（ＦＰ）を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００８１】
本発明の一態様は、自己免疫性疾患を治療する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチド又はその活性フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドは、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８２】
本発明の他の態様は、自己免疫性疾患を治療する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載の、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態では、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００８３】
本発明の他の態様では、自己免疫性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８４】
本発明の他の態様は、自己免疫性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載の、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態では、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００８５】
本発明の一態様は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患を治療する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態では、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８６】
本発明の他の態様は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患を治療する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載の、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００８７】
本発明の他の態様は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−１である。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００８８】
本発明の他の態様は、Ｔ細胞媒介炎症性疾患の症状を予防する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載の、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００８９】
本発明の一態様は、移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患の症状を治療又は予防する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドは、Ｄ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００９０】
本発明の他の態様は、移植片拒絶反応又は移植片対宿主疾患の症状を治療又は予防する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載のＴ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００９１】
本発明の一態様は、Ｔ細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、本発明の単離した融合ペプチドを含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００９２】
本発明の他の態様では、Ｔ細胞活性化を阻害する方法であり、この方法は、式（Ｉ）に記載の、Ｔ細胞活性化を阻害できるペプチド又はその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、前記治療を必要とする個体に投与することを含む。別の実施形態において、ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。
【００９３】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療又は予防用の医薬組成物の調製のための本発明の融合ペプチドの使用に関する。一実施形態において、ＨＩＶはＨＩＶ−Ｉである。別の実施形態では、融合ペプチドは、配列番号１、２及び６〜４１４のいずれか１つに示されたアミノ酸配列又はそれらのフラグメント、類似体、変異体、コンジュゲート、誘導体及び塩を有する。別の実施形態において、融合ペプチドはＤ及びＬアミノ酸の両方を含む。配列番号１、２及び６〜４１４として表されているペプチド由来のより短い活性フラグメント並びにこれらの配列を含むより長いペプチドの両方が、本発明の範囲内であることに留意されたい。
【００９４】
他の態様では、本発明は、Ｔ細胞媒介病態の治療又は予防用の医薬組成物の調製のための、式（Ｉ）に記載のＴ細胞活性化を阻害できるペプチドの使用に関する。
【００９５】
他の態様では、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、注入液、経口、鼻腔内、腹腔内、皮下、直腸、局所、又は滑液などの他部位を含む種々の方法により送達できる。しかし、経皮パッチを介する拡散によるような組成物の経皮的な送達も考慮される。経口摂取用に、当技術分野で知られているように、改善された経口生物学的利用能及び分解に対する増強した耐性を有するペプチド類似体又は特異的なペプチド製剤を調製することは可能である。
【００９６】
組成物は、投薬処方物に適合する様式で且つ治療有効量で投与される。投与する量は、治療する対象、活性成分を利用する対象の血液止血系の能力、及びＴ細胞活性化の阻害又は所望のＴ細胞媒介病態の程度に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は、専門家の判断によって決まり、個体毎に特有である。
【００９７】
本発明のペプチドの治療有効量は、患者に投与されたとき、Ｔ細胞活性化を阻害できる量である。本発明のペプチドの活性を検出する分析法としては、Ｔ細胞抗原特異的な増殖阻害、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−ＩＯなどのサイトカインのＴ細胞抗原特異的分泌の阻害、並びに実施例で記載される限定はされないがアジュバント関節炎及びＤＴＨを含むｉｎ  ｖｉｖｏでの疾病モデルの阻害が挙げられる。しかし抗原特異的Ｔ細胞活性化の阻害を検出する他の方法は、当該分野で周知であり、本発明のペプチドの活性を評価するために用いることができる。好ましくは、本発明のペプチドの治療有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの分析又はｉｎ  ｖｉｖｏの分析で測定時にＴ細胞活性化を少なくとも１０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント減少させる（阻害する）量である。本明細書にさらに記載するように、医薬組成物は患者でＴ細胞媒介病態を阻害するのに有用であるのが好ましい。この実施形態で治療有効量とは、患者に投与したとき、Ｔ細胞媒介病態を阻害するのに十分な、好ましくは根絶するのに十分な量である。融合ペプチドの好ましい単回用量は、約５μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、好ましくは約５０μｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、より好ましくは約０．１２５ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ（体重）である。典型的には、医師が個々の患者に対して最も好適な実際の投与量を決定し、投与量は年齢、体重及び個々の患者の応答によって異なる。当然のことながら、個々の場合に、用量範囲が当然より高く又はより低くなるが、これらも本発明の範囲内である。本発明の融合ペプチドを、たとえば、上記のように１日又は１週の単回投与として投与することができる。
【００９８】
本発明による疾患の治療法は、単一の活性物質として又は治療の他の方法と組み合わせて本発明の医薬組成物の投与を含むことができる。本発明の治療法は、治療の他の方法に平行して、先行して又は続いてもよい。
【００９９】
本発明のいくつかの実施形態をより十分に例示するために、以下の実施例を示す。しかし、これらは発明の幅広い範囲を限定するものとして決して解釈すべきでない。
【実施例】
【０１００】
ペプチド合成。本研究で用いたペプチド（下記の表１に示す）は、前述したように、固相法を用いて合成した（Ｋｌｉｇｅｒら、１９９７、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９８２）。６０分間、０．０５％ＴＦＡ中で、２０〜６０％アセトニトリルの直線勾配を用いてＣ４カラムの逆相ＨＰＬＣで、合成ペプチドを精製した（＞９８％均質性）。ペプチドの組成を確かめるために、ペプチドをアミノ酸分析及び質量分析に供した。特に記載しない限り、濃縮したペプチドのストック溶液は、ＤＭＳＯ中に保持して使用前のペプチドの凝集を避けた。各試験でのＤＭＳＯの最終濃度（５％ｖ／ｖ）は、研究中のシステムに影響しなかった。
【０１０１】
【表１】
2008528480.tif 000003
【０１０２】
ペプチドの蛍光標識。樹脂に結合したペプチドを、４−クロロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールフルオライド（ＮＢＤ−Ｆ）又は５−カルボキシテトラメチルローダミン、スクシンイミジルエステル（５−ＴＡＭＲＡ）、ＳＥ（ローダミン−ＳＥ）でそれぞれ処理した。ＮＢＤ−Ｆとローダミン−ＳＥ蛍光プローブは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した（Ｃｉｔｙ、Ｓｔａｔｅ、Ｃｏｕｎｔｒｙ）。すでに記載しているように、ＮＢＤ−Ｆとの反応はＤＭＦ中で実施し、ローダミンとの反応は２％ジイソプロピルエチルアミンを含むＤＭＦ中で実施した（ＧｅｒｂｅｒとＳｈａｉ、２０００）。蛍光プローブを、過剰の２つの当量中で用いて、樹脂に結合したＮ末端ＮＢＤ又はローダミンペプチドの生成に導いた。１時間後、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄し、次いで塩化メチレンで十分に洗浄した。樹脂を窒素気流下で乾燥後、ＴＦＡ  ９５％、Ｈ２Ｏ  ２．５％及びトリエチルシラン  ２．５％で３時間開裂した。蛍光標識ペプチドを、Ｃ４  Ｂｉｏ−Ｒａｄセミプレパラティブカラム（２５０×１０ｍｍ、孔部サイズ３ＯθＡ、粒径５μｍ）で、６０分間、アセトニトリル／水（双方とも０．０５％ＴＦＡを含む）の２０％〜６０％の勾配を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高性能液体クロマトグラフィー）により精製した。精製したペプチドは、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣにより、均質（＞９８％）であることが示された。
【０１０３】
（細胞系、抗原及びアジュバント）。ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンＡ２ｂ  ２１は、Ｍ．チュバキュローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔ）の６５ＩｃＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）のエピトープ１８０〜１８８と反応し、このエピトープは本明細書で用いられるペプチドＭｔＩ  ７６〜９０に含まれる（ｖａｎ  Ｅｄｅｎら、１９８８）。
【０１０４】
Ｍｔ株Ｈ３７Ｒａ及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、Ｄｉｆｃｏから購入した（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）。ツベルクリン精製タンパク誘導体（ＰＰＤ）は、Ｓｔａｔｅｎｓ血清研究所（Ｓｔａｔｅｎｓ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）より提供された。精製した組換え型７１ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ７１）は、Ｒｕｕｒｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ教授（感染症と免疫学研究所、獣医学部（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＩｎｆｅｃｔｉｏＵＳＤｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のご好意により提供された。ＰＭＡ、イオノマイシン、オバルブミン（ＯＶＡ）及びコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。
【０１０５】
（細胞膜分子とペプチドの共存）。Ａ２ｂ細胞を４％パラホルムアルデヒドで、氷上で１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を室温で、２％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で処理して非特異的な結合を阻止した。３０分後に、細胞を５０，０００細胞／１００μｌを含むアリコートに分け、αＴＣＲ−ＦＩＴＣか又はαＣＤ４−ＦＩＴＣを（１：１００で）、２時間の間添加した。ローダミン標識ＦＰ又はＶ２Ｅペプチドを最終濃度０．５〜１μＭで、インキュベーションの最後の５分間に添加した。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ガラススライド上に置いた。標識化した細胞試料を、蛍光共焦点顕微鏡下で観察した。ＦＩＴＣ励起は、フルオロフォアの褪色を最小限に抑えるために、２０％パワーのレーザー設定で、４８８ｎｍに設定した。蛍光は５０５〜５２５ｎｍから記録した。ローダミン励起は、５％パワーのレーザー設定で５４３ｎｍに設定した。蛍光データは５６０ｎｍ及びこれ以上から収集した。
【０１０６】
ＦＩＴＣ（ドナー標識）とローダミン（アクセプター標識）間の蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ローダミンプローブが褪色した箇所でのＦＩＴＣ蛍光の増加により検出した。５４３ｎｍで、６秒間、１００％までのレーザー設定で、褪色はポイント励起によって達成した。ＦＩＴＣ蛍光の増加が自己蛍光によるものではないことを確認するために、褪色は最初に４８８ｎｍレーザーを用い、その後に５４３ｎｍでのみ行った。５０５〜５２５ｎｍか又は５６０ｎｍ以上では、シグナルは認められず、自己蛍光の可能性はなくなった。
【０１０７】
（Ｔ細胞増殖）。Ｔ細胞増殖の分析は、ＭｔＩ  ７６〜９０ペプチドと反応するリンパ節細胞（ＬＮＣ）か又はＡ２ｂ  Ｔ細胞系を用いて実施した。ＰＰＤ及びＭＵ７６〜９０に対する強いＴ細胞応答が検出可能である、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中でＭｔを注射後の２６日目に、膝窩部及び鼠蹊部ＬＮＣを摘出した（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。２×１０５細胞／ウェルの濃度でＬＮＣを培養し、前述したように調製した照射した５×１０５胸腺抗原提示細胞（ＡＰＣ）／ウェルの存在下で、５×１０４  Ａ２ｂ  Ｔ細胞を刺激した（ｖａｎ  Ｅｄｅｎら、１９８５）。抗原と共に、又は抗原なしで、さまざまな濃度の研究中のペプチドの存在下で、２００μｌの丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＳＡ）に、細胞を４組反復して播種した。いくつかの実験のために、記述のように固定化した抗ＣＤ３抗体又はＰＭＡ／イオノマイシンで、細胞を活性化した（Ｗａｎｇら、２００２）。培養を７．５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞応答は、インキュベーションの最後の１８時間に添加した［メチル−３Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ；１μＣｉ／ウェル）の取り込みにより検出した。Ｔ細胞増殖実験の結果は、ＨＩＶ又は対照ペプチドの不在下で、抗原により誘発されるＴ細胞増殖阻害の％として示される。
【０１０８】
（サイトカインの分析）。記述のように、刺激から７２時間後、上清を採取し、ラットＩＬ−１０及びＩＦＮγは、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＯＰＴＥＩＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量化した（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。必要な場合、サイトカイン濃度は、ペプチドが存在しない場合のサイトカイン濃度に対するサイトカイン阻害の百分率として表す。その他の場合は、サイトカインはｐｇ／ｍｌで示す。本特許に記載した実験の検出の下限は、ＩＬ−１０及びＩＦＮγに関して１５ｐｇ／ｍｌであった。サイトカイン量は、標準物質として組換え型のサイトカインを用いて作成した検量線に基づいて算定した。
【０１０９】
（動物）。ワイツマン科学研究所（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の動物飼育センターで無菌状態下で飼育し維持した、生後３カ月の雌ルイスラットを我々の実験に用いた。実験は、動物の権利保護委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の監督と指針に従って実施した。
【０１１０】
（アジュバント関節炎（ＡＡ）の誘導及び評価）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化に及ぼすＦＰの効果を試験するために、ＡＡをモデルシステムとして用いた。ＩＦＡ中に懸濁したＭｔ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の５０μｌを、尾の付け根に注射してＡＡを誘導した。ＡＡ誘導時に、さらに各ラットに１００μｇのＦＰ若しくは対照ペプチド、又は５０μｌのＩＦＡに溶解し、ＡＡを誘導するために用いたＭｔ／ＩＦＡと混合したＰＢＳを投与した。ＡＡ誘導日を０日として示した。重症度は、各動物で全４肢を直接観察して評価した。関節の炎症、赤み及び変形の程度に基づき、０と４の間の相対的なスコアを各肢に割り当て、したがって個々の動物に対する最大の可能なスコアは１６であった（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。平均ＡＡスコア（±ＳＥＭ）は、各実験群に対して示している。関節炎も、ノギスで後肢直径を測定して数量化した。測定は、ＡＡ誘導日及び２６日後（ＡＡのピーク時に）に行い、結果は各群の全ての動物の２つの値間の差の平均±ＳＥＭとして示す。疾患をスコアした人は、群の素性を知らされていなかった。
【０１１１】
（遅延型過敏（ＤＴＨ））。ＡＡ誘導後１６日目に、２０μｌのＰＰＤ（ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍｌ）を、右耳の耳介に皮内注射し、２０μｌ滅菌ＰＢＳを対照として左耳に注射した。耳の厚さを、ノギスを用いて４８時間後に測定し、右と左の耳間の差として示した。
【０１１２】
（実施例１：ＦＰはＩＳに、ＣＤ４及びＴＣＲと共存する）
活性化したＴ細胞膜上のＦＰの分布を、ローダミン（ＦＰ−Ｒｈｏ）と結合したＦＰ又はＮＢＤ（ＦＰ−ＮＢＤ）を用いて調べた。一様にＴ細胞膜を標識するのではなく、ＦＰ−Ｒｈｏ（図２Ａ）及びＦＰ−ＮＢＤの両方をそれ自体、特定の細胞膜領域に挿入した。濃縮された分布を、対照の細胞膜上で均一な分布を示す細胞膜活性な両親媒性ペプチド（ＡＭＰ−Ｒｈｏ）と比較した（図２Ａ）。
【０１１３】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞の細胞膜上で、ＩＳ領域は、種々の成分中、ＴＣＲ、ＣＤ３及びＣＤ４分子により標識される（ＨｕｐｐａとＤａｖｉｓ、２００３）。図２Ｂは、ＩＳ細胞膜領域でのＣＤ４及びＴＣＲ分子の局在化を示す。ＦＰコンジュゲートは、ＣＤ４及びＴＣＲ分子と共存したことに留意すべきである（図２Ｂ）。ＦＰ−Ｒｈｏ（図２Ｂ）及びＦＰ−ＮＢＤは同じ共存を示し、したがってＩＳに対する分布は、特定のフルオロフォアに限られていなかった。さらにローダミン標識したＦＰ突然変異体のＶ２Ｅ（Ｖ２Ｅ−Ｒｈｏ）は、ＣＤ４及びＴＣＲと同様な共存を示した（図２Ｃ）。
【０１１４】
ＦＰ及びそのＶ２Ｅ突然変異体の共存が、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、ＴＣＲ及びＣＤ４レセプターを用いて確かめられた（図２Ｄ）。５４３ｎｍレーザーを用いて、細胞膜の１箇所を褪色させ、それによりその特定の箇所でＦＰ−Ｒｈｏ又はＶ２Ｅ−Ｒｈｏコンジュゲートの蛍光を減少させた。標識した褪色したＦＰ（アクセプター）とＴＣＲ−特異的ＦＩＴＣ−結合抗体（ドナー）との間のＦＲＥＴに起因する、標識したＴＣＲの蛍光の有意な増加が観察された。平均Ｒ０は、ＦＩＴＣ／Ｒｈｏ対に対して５０Ａ未満であり（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒら、１９９５）、したがってＦＲＥＴ（図２Ｄ）の検出は、細胞膜中でドナーとアクセプター分子の距離は５０Ａ未満であることを示唆する。ＦＰは、Ｔ細胞膜に結合し、ＩＳでＣＤ４及びＴＣＲ分子と優先的に接近して共存することをこれらの結果は示唆する。
【０１１５】
（実施例２：ＦＰはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞活性化を妨げる）
ＦＰのＩＳへの挿入がＴ細胞活性化を妨げるかどうか決定するために、Ｍｔ抗原ＰＰＤ又はＭｔＩ  ７６〜９０ペプチドに対する、Ｍｔで免疫したラットＬＮＣのＴ細胞応答を調べた。これらの抗原は、ＡＡラットの排出ＬＮＣで強い増殖応答及びＴ細胞からのサイトカイン放出を誘導することが知られている（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００３；Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。
【０１１６】
図３Ａ及び３Ｂは、用量依存的な様式で、ＦＰ及びＶ２Ｅ突然変異体ペプチドが、ＰＰＤ及びＭｔＩ  ７６〜９０に対するＴ細胞増殖応答を阻害したことを示す。さらにＶ２Ｅの阻害効果は、ＦＰの阻害効果より低く、阻害は配列特異的であり、重要な分子的相互作用がＶ２ＥでＶからＥへの置換により乱されたことを示唆している（表ｖを参照）。ＦＰペプチド及びある程度ではあるがＶ２Ｅも、ＰＰＤ又はＭＵ７６〜９０ペプチドによる刺激により誘発されるＩＦＮｙ及びＩＬ−１０の分泌を用量依存的な様式で阻害した（図３Ｃ〜Ｆ）。ＦＰ、Ｖ２Ｅ又は対照ペプチドｐ２７７と共に培養した細胞が、培養で同じ生存を示したので、抗原に誘発される増殖及びサイトカイン放出に及ぼすＦＰ及びＶ２Ｅペプチドの阻害効果は、細胞死によるものではなかった。
【０１１７】
（実施例３：ＦＰは、ＡＰＣでなくＴ細胞に作用する）
ＭｔＩ  ７６〜９０ペプチドによる刺激に応じて増殖して、ＩＦＮγを分泌するラットＣＤ４＋  Ｔ細胞クローン、Ａ２ｂを用いて、Ｔ細胞活性化に及ぼすＦＰの阻害効果をさらに研究した（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００３；Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。ＦＰの存在下でＭｔＩ  ７６〜９０によるＡ２ｂの活性化は、細胞増殖の減少（図４）及びＩＦＮγの放出減少を招いた。
【０１１８】
Ｔ細胞活性化の阻害で、ＦＰの標的になる細胞を明確にするために、ＭｔＩ  ７６〜９０ペプチドと細胞を混合する前に、Ａ２ｂ  Ｔ細胞又はＡＰＣを、ＦＰと共に別々に前培養した。ＡＰＣの前培養は、Ａ２ｂ増殖には何の効果も示さなかった（図４）。しかし、対照ペプチドｐ２７７でなく、ＦＰとのＡ２ｂ  Ｔ細胞の前培養は、Ｔ細胞増殖の有意な阻害を招いた（図４）。したがって、ＦＰはＡＰＣよりは、むしろ直接的にＴ細胞に作用することによりＴ細胞活性化を阻害する。
【０１１９】
（実施例４：ＦＰは、ＰＭＡ／イオノマイシン又はＣＤ３に対する抗体により誘導されるＴ細胞活性化を阻害しない）
特異的抗原のＡＰＣ提示により誘導されるＴ細胞活性化以外のＴ細胞活性化も、ＦＰが阻害できるかどうかを知るために、ＰＭＡ／イオノマイシンにより誘導されるＴ細胞活性化に及ぼすＦＰの効果（白い棒グラフは、０．５ｍｇ／ｍｌのイオノマイシン投与を受けた細胞を示し、黒い棒グラフは、１ｍｇ／ｍｌのイオノマイシン投与を受けた細胞を示す）又はＣＤ３に対する分裂促進的モノクロナール抗体を試験した。ＰＭＡ／イオノマイシン（図５Ａ）によるか又は分裂促進的抗ＣＤ３（図５Ｂ）によるＡ２ｂ  Ｔ細胞の活性化を、ＦＰは阻害しなかった。これらの知見は、ＡＰＣで提示されたＭＨＣ−ペプチド複合体の認識により誘導されるＴ細胞活性化を、ＦＰが特異的に阻害することを示す。
【０１２０】
（実施例５；ＦＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞免疫を阻害する）
ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的Ｔ細胞の活性化に及ぼすＦＰの阻害効果の試験として、ＡＡに及ぼすＦＰの効果を調べた。自己抗原と交差反応性Ｍｔ−特異的Ｔ細胞によってもたらされる実験的自己免疫性疾患であるＡＡを、オイル中のＭｔによるルイスラットの免疫で誘発する（Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚら、１９８４；Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚら、１９８３）。ＭＵ７６−９０特異的Ｔ細胞は、ＡＡの誘導に応じて検出可能であり（Ａｎｄｅｒｔｏｎら、１９９４）、実際にＡ２ｂ  Ｔ細胞クローンは軟骨で交差反応してＡＡを媒介する（ｖａｎ  Ｅｄｅｎら、１９８５）。感作されたＬＮＣのＴ細胞応答並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＰＤ及びＭｔ１７６〜９０に対するクローンＡ２ｂのＴ細胞応答を、ＦＰが阻害したので（図３及び４）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＡを誘発するＴ細胞の活性化に及ぼすＦＰの効果を調べた。ＡＡ誘導の時点で抗原と共に投与したＦＰは、臨床スコア（図６Ａ）及びくるぶし腫脹（図６Ｂ）の両方に関して、ごく軽度な関節炎を招いた。対照ペプチドｐ２７７又はＶ２Ｅは、ＡＡを阻害しなかった。平均最大のスコアは、ＦＰ処理ラットの７．３±０．７に比べ、対照処理ラットで１３．７±０．３であった（対照群と比較した両試験群に関し、ｐ＜０．０５）。
【０１２１】
ＡＡを媒介するＴ細胞の活性は、ＰＰＤに対する遅延型過敏（ＤＴＨ）応答を調べることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでも検出できる（ｖａｎ  Ｅｄｅｎら、１９８５）。ペプチドＦＰ、Ｖ２Ｅ又はｐ２７７で処理したラットで、ＡＡ誘導後１６日目のＰＰＤに対するＤＴＨ応答を調べた。図６Ｃは、ＦＰの投与は、ＰＰＤに対するＤＴＨ応答の３５％減少を招くが、Ｖ２Ｅ又はｐ２７７ペプチド処理により生じる阻害は、それぞれ２５％及び１０％であったことを示す。
【０１２２】
ＡＡを誘発するＴ細胞は、ＴｈＩ表現型を表し、ＨＳＰ７１又はＭｔＩ  ７６〜９０などのＭｔ抗原による活性化に応じて比較的大量のＩＦＮγを分泌する（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００３；Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２）。対照的に種々の処理によるＡＡの制御は、通常減少したＴｈＩ応答を伴う（Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００３；Ｑｕｉｎｔａｎａら、２００２、Ｔａｎａｋａら、１９９９）。ＦＰで処理したラット由来のＬＮＣ（黒い棒グラフ）は、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）抗原ＨＳＰ７１又はＭｔＩ  ７６−９０（ＭｔＩ  ８０とも呼ばれる）による刺激に応じてＩＦＮγ分泌の減少を示したが、Ｖ２Ｅ（灰色の棒グラフ）又はｐ２７７（白い棒グラフ）による処理では、ＩＦＮγ分泌にわずかに影響を及ぼしただけであった（図６Ｄ）ことに留意すべきである。
【０１２３】
総合すればこれらの結果は、ＦＰはｉｎ  ｖｉｖｏで特異的抗原により誘導されるＴ細胞活性化を阻害できることを示す。この干渉は、より軽度のＡＡ（図６Ａ及び６Ｂ）、減少したＤＴＨ反応性（図６Ｃ）及びＭｔ抗原に応答するより減少したＩＦＮγ分泌（図６Ｄ）に導いた。
【０１２４】
（実施例６；ＦＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦＰに対するＴ細胞性免疫を阻害する。）
ラットにＭｔ及びＩＦＡの存在下で、ＦＰ、対照ペプチド（Ｖ２Ｅ若しくはＩＦＦＡ）又はＰＢＳを注射した。２６日後にＬＮＣを採取し、ＦＰ、Ｖ２Ｅ、ＩＦＦＡ又はＰＢＳのそれぞれとｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、ＬＮＣのＩＦＮ−γ分泌レベルを測定した。図８から理解できるように、ＬＮＣのＩＦＮ−γ分泌レベルが非活性化ＬＮＣ（ＰＢＳと共に培養した）の分泌のレベルと適合したので、ＦＰを注射したラット由来のＬＮＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＦＰにより活性化することができなかった。これらの結果は、ＦＰの低い免疫原性を示す。しかし、Ｖ２Ｅを注射したラット由来のＬＮＣは、Ｖ２Ｅで中程度のｅｘ  ｖｉｖｏでの活性化（ＦＰの活性化より約５倍高い）を示し、４個のＤ−アミノ酸残基が取り込まれたＦＰのジアステレオ異性誘導体（配列番号６）であるＩＦＦＡペプチドを注射したラット由来のＬＮＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏでＩＦＦＡに高い反応性（ＦＰより約１０倍）を有した。したがって、ＦＰの免疫抑制効果は、配列及び構造に特異的である。ＦＰ、Ｖ２Ｅ及びＩＦＦＡの１６個のＮ末端のアミノ酸に対応するペプチドを用いて実験を繰り返したとき、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１２５】
本明細書でＩＦＦＡペプチドの免疫原性を実質的に増加させることが示されたＩＦＦＡペプチド中へのＤアミノ酸の取り込みは、ｇｐ４１媒介膜融合を阻害するＩＦＦＡペプチドの能力に影響を及ぼさない（Ｇｅｒｂｅｒら、２００４）。したがって、初めて本明細書において開示されたＦＰの免疫抑制能力は、単なるＦＰの既知の融合性能力の反映ではなく、ペプチドに存在する新規に同定された機能である。
【０１２６】
（実施例７：ＦＰ由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞活性化を阻害する。）
抗原特異的Ｔ細胞増殖に及ぼす、ＦＰ由来のペプチドＦＰ５−Ｉ３、ＦＰｉ−８、ＦＰ５−ｉ３Ａ６及びＩＦＦＡ（表１を参照）の効果を調べた。Ｔ細胞増殖分析は、上記のように不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中でＭｔを注射後、２６日目に摘出した膝窩部及び鼠蹊リンパ節細胞（ＬＮＣ）を用いて実施した。いくつかの実験では、マウスＬＮＣを、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、ＭＯＧ  ３５〜５５ペプチド抗原と共に、又は無しで培養した（０．５μｇ／ｍｌ（図８Ａ）、０．２５μｇ／ｍｌ（図８Ｂ〜Ｃ））。他の実験では、研究下の種々の濃度のペプチドの存在下で、ラットＬＮＣをＰＰＤ抗原と共に、又は無しで培養した（２５μｇ／ｍｌ、図８Ｄ）。Ｔ細胞増殖実験の結果は、ＨＩＶ又は対照ペプチドの不在下で抗原により誘発されたＴ細胞増殖阻害の％として示される。
【０１２７】
図８から理解できるように、検討した全てのペプチドは、用量に依存する様式でＴ細胞増殖を阻害し、アミノ酸５〜１３に対応するフラグメント及びそのジアステレオ異性ペプチドは、ＦＰのアミノ酸１〜８に対応するフラグメントよりもはるかに強くＴ細胞増殖を阻害した。
【０１２８】
（実施例８：ＦＰ由来のジアステレオ異性ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞免疫を阻害する。）
ペプチド由来のジアステレオ異性ＦＰがｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞活性化に及ぼす効果をさらに検討するために、ＡＡ及びＤＴＨモデルを使用した。
【０１２９】
上記のように、ＡＡをラットで誘導した。すなわちＡＡ誘導時に、各ラットに５０μｌのＩＦＡ中に溶解し、ＡＡを誘導するために用いたＭｔ／ＩＦＡと混合したＩＦＦＡ  １００μｇ又はＰＢＳも投与した。重症度は上記のように評価した。
【０１３０】
図１０から理解できるように、ＩＦＦＡの投与により、ＡＡ臨床スコアで決定される軽度の関節炎を生じた。
【０１３１】
他の実験では、ＦＰ及びＩＦＦＡの存在下でオキサゾロンに対するＤＴＨ応答を測定した。雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当たり５匹）を、剃った腹部の皮膚に対して、アセトン／オリーブ油（４：１  容量／容量）に溶解した２％オキサゾロンの１００マイクロリットルを局所的に塗布して感作し、５日後にアセトン／オリーブ油中の０．５％オキサゾロンの２０マイクロリットルに曝露し、１０マイクロリットルを耳の両側に投与した。刺激の１時間後、ＦＰ、ＩＦＦＡ（４０μｌ  ＤＭＳＯ中１００μｇ）又はＤＭＳＯを耳の両側に投与した。耳の一定の領域を、曝露の直前及び曝露後２４時間目に測定した。
【０１３２】
図１１から理解できるように、ＦＰ及びＩＦＦＡは両方とも、ＤＴＨ反応を阻害した。
【０１３３】
特定の実施形態の前述の説明は、全般的な本発明の特質を十分に明らかにするので、現在の知識を適用することにより、他のものは各種の応用のために、過度の実験を行わずに且つ一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態に関して容易に改変及び／又は適応することができる。したがって、そのような適応形態及び改変形態は、開示された実施形態と同等の意味及び範囲内に包括されると意図されるべきである。本発明をこれらの特定の実施形態と関連させて記載したが、多くの代替形態、改変形態及び変更形態は当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、このような代替形態、改変形態及び変更形態は、全て本特許請求の範囲内に包含されるものと理解しなければならない。
【０１３４】
引用文献
【化２−１】
2008528480.tif 000004
【化２−２】
2008528480.tif 000005
【０１３５】
【表２−１】
2008528480.tif 000006
【表２−２】
2008528480.tif 000007
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＨＩＶ−Ｉ  ｇｐ４１外部領域の機能的な領域を示す図である。ｇｐ１２０が表面レセプターに結合後に、ｇｐ４１は活性になる；ＦＰを標的細胞の細胞膜へ挿入する；Ｃ２０をウイルス粒子の細胞膜へ挿入する；Ｎ３６及びＣ３４は、細胞膜の付着を生じさせる６−ヘリックスバンドル「スプリング（ｓｐｒｉｎｇ）」を形成する；ＩＳＵは、免疫抑制性である。
【図２】Ｔ細胞免疫シナプスでのＣＤ４及びＴＣＲ分子とＦＰの共存を示す図である。ＦＰ、Ｖ２Ｅ又はＡＭＰペプチドを、ローダミン（Ｒｈｏ）に結合し、ＣＤ４又はＴＣＲに対するＦＩＴＣ標識抗体と共に、活性化されたＴ細胞の細胞膜へのペプチドの結合を調べるために用いた。（ａ）活性化されたＴ細胞での、Ｒｈｏ標識ＦＰ又はＡＭＰの分布、（ｂ）ＣＤ４及びＴＣＲ分子とＦＰ−Ｒｈｏの共存、（ｃ）ＴＣＲとＶ２Ｅ−Ｒｈｏの共存、（ｄ）ＦＰ−Ｒｈｏ又はＶ２Ｅ−ＲｈｏとＴＣＲに対するＦＩＴＣ標識抗体間のＦＲＥＴ。
【図３Ａ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、Ｍｔ１７６〜９０ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、増殖応答性を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図３Ｂ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、ＰＰＤを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、増殖応答性を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図３Ｃ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、Ｍｔ１７６〜９０ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、ＩＦＮγ分泌を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図３Ｄ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、ＰＰＤを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、ＩＦＮγ分泌を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図３Ｅ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、Ｍｔ１７６〜９０ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、ＩＬ−１０分泌を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図３Ｆ】ＦＰによるＭｔに対するＴ細胞応答の阻害を示す図である。Ｍｔで免疫したラット由来のＬＮＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）の存在下で、ＰＰＤを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、ＩＬ−１０分泌を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図４】免疫シナプスで、ＦＰはＡＰＣではなくＴ細胞に作用することを示すグラフである。Ａ２ｂ  Ｔ細胞又はＡＰＣを、ＦＰ（黒）、Ｖ２Ｅ（灰色）又はｐ２７７（白）で別々に２時間前培養し、洗浄した。処理したＴ細胞を未処理のＡＰＣと混合し、処理したＡＰＣを未処理のＡ２ｂと混合して、ＭｔＩ  ７６〜９０による刺激に応じるＡ２ｂ  Ｔ細胞の増殖を分析した。
【図５】ＰＭＡ／イオノマイシン又はＣＤ３に対する抗体により誘導されるＴ細胞の活性化を、ＦＰが阻害しないことを示す図である。Ａ２ｂ  Ｔ細胞を、ＦＰ（黒）又はｐ２７７（白）の存在下でＰＭＡ／イオノマイシン（ａ）又はＣＤ３（ｂ）に対する抗体で刺激して、Ｔ細胞の増殖を調べた。
【図６Ａ】ＦＰによるＡＡの阻害を例示する図である。ＦＰ（菱形）、Ｖ２Ｅ（三角形）、ｐ２７７（中空四角）又はＰＢＳ（黒四角）と混合したオイル中のＭｔに対して免疫することにより、ＡＡを誘導した。関節炎を１０日目に開始して２日又は３日毎に記録した。
【図６Ｂ】ＦＰによるＡＡの阻害を例示する図である。ＦＰ（菱形）、Ｖ２Ｅ（三角形）、ｐ２７７（中空四角）又はＰＢＳ（黒四角）と混合したオイル中のＭｔに対して免疫することにより、ＡＡを誘導した。脚の腫れを２６日目に測定した。
【図６Ｃ】ＦＰによるＡＡの阻害を例示する図である。ＦＰ（菱形）、Ｖ２Ｅ（三角形）、ｐ２７７（中空四角）又はＰＢＳ（黒四角）と混合したオイル中のＭｔに対して免疫することにより、ＡＡを誘導した。ＰＰＤに対するＤＴＨ応答を１６日目に測定した。
【図６Ｄ】ＦＰによるＡＡの阻害を例示する図である。ＦＰ（菱形）、Ｖ２Ｅ（三角形）、ｐ２７７（中空四角）又はＰＢＳ（黒四角）と混合したオイル中のＭｔに対して免疫することにより、ＡＡを誘導した。ＨＳＰ７１又はＭｔＩ  ７６〜９０によるＬＮＣの刺激に応じるＩＦＮγ分泌を２６日目に測定した。
【図７】ＨＩＶ感染及び免疫療法におけるＦＰに関する作業仮説の概略図である。
【図８】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＰに対するＴ細胞性免疫のＦＰによる阻害を示す図である。ＦＰ（三角形）、Ｖ２Ｅ（×印）、ＩＦＦＡ（四角）又はＰＢＳ（菱形）と混合したオイル中のＭｔに対して免疫したラット由来のＬＮＣを、それぞれＦＰ、Ｖ２Ｅ、ＩＦＦＡ又はＰＢＳ５と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートし、ＩＦＮγの分泌を分析した。同様の結果が、少なくとも３つの別の実験で得られた。
【図９Ａ】ＦＰ由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドが、抗原特異的なＴ細胞の増殖を阻害することを示す図である。ＦＰ５−Ｉ３の非存在又は存在下で、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＭｔで免疫したマウス由来のＬＮＣの増殖応答性。
【図９Ｂ】ＦＰ由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドが、抗原特異的なＴ細胞の増殖を阻害することを示す図である。ＦＰｉ−８の非存在又は存在下で、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＭｔで免疫したマウス由来のＬＮＣの増殖応答性。
【図９Ｃ】ＦＰ由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドが、抗原特異的なＴ細胞の増殖を阻害することを示す図である。ＦＰ５−ｉ３Ａ６の非存在又は存在下で、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＭｔで免疫したマウス由来のＬＮＣの増殖応答性。
【図９Ｄ】ＦＰ由来のフラグメント及びジアステレオ異性ペプチドが、抗原特異的なＴ細胞の増殖を阻害することを示す図である。ＩＦＦＡの非存在又は存在下で、ＰＰＤによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＭｔで免疫したラット由来のＬＮＣの増殖応答性。
【図１０】ラットのアジュバント関節炎の、ＩＦＦＡによるｉｎ  ｖｉｖｏでの阻害を示す図である。ＩＦＦＡペプチド（円）又はＰＢＳ（菱形）を混合したオイル中のＭｔに対する免疫により、ＡＡを誘導した。関節炎を、１０日目に開始して２日又は３日毎に記録し、標準誤差は１０％未満であった。
【図１１】ＦＰ及びＩＦＦＡを用いた経皮治療による、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＴＨの阻害を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008528480.tif 000038
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