(57)【要約】本発明は日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルスに対するワクチンなどの、弱毒化フラビウイルス(Flavivirus)ワクチン、ならびにこれらのワクチンを作出するおよび使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質突然変異を含む組換えフラビウイルス(Flavivirus)。
【請求項２】
突然変異がフラビウイルスを弱毒化する、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項３】
突然変異がフラビウイルスの内臓向性/ウイルス血症を減少させる、請求項2記載のフラビウイルス。
【請求項４】
突然変異が、突然変異のない対応するフラビウイルスに比べて、フラビウイルスの安定性の増大をもたらす、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項５】
突然変異が、突然変異のない対応するフラビウイルスに比べて、細胞中でのウイルス複製の増大をもたらす、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項６】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項７】
キメラフラビウイルスが第一のフラビウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質ならびに第二のフラビウイルスの膜および/または外被タンパク質を含む、請求項6記載のフラビウイルス。
【請求項８】
第一のフラビウイルスが黄熱病ウイルスである、請求項7記載のフラビウイルス。
【請求項９】
黄熱病ウイルスがYF-17Dである、請求項8記載のフラビウイルス。
【請求項１０】
第二のフラビウイルスが日本脳炎ウイルスである、請求項7記載のフラビウイルス。
【請求項１１】
第二のフラビウイルスが西ナイルウイルスである、請求項7記載のフラビウイルス。
【請求項１２】
第二のフラビウイルスがデングウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスからなる群より選択される、請求項7記載のフラビウイルス。
【請求項１３】
デングウイルスがデング-1、デング-2、デング-3、またはデング-4ウイルスである、請求項12記載のフラビウイルス。
【請求項１４】
突然変異が膜タンパク質の膜貫通ドメイン内にある、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項１５】
突然変異が日本脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルスの膜タンパク質内の膜ヘリックスのアミノ酸番号40〜75の領域に対応する一つまたは複数のアミノ酸の置換である、請求項14記載のフラビウイルス。
【請求項１６】
突然変異が日本脳炎ウイルスの膜タンパク質のアミノ酸番号60に対応するアミノ酸の置換である、請求項15記載のフラビウイルス。
【請求項１７】
突然変異が膜タンパク質のアミノ酸60位でシステインとのアルギニンの置換をもたらす、請求項16記載のフラビウイルス。
【請求項１８】
突然変異が西ナイルウイルスの膜タンパク質のアミノ酸66位に対応するアミノ酸の置換である、請求項15記載のフラビウイルス。
【請求項１９】
突然変異が膜タンパク質のアミノ酸66位でプロリンとのロイシンの置換をもたらす、請求項18記載のフラビウイルス。
【請求項２０】
突然変異が日本脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルスの膜タンパク質の60、61、62、63、64、65、または66位のものに対応する一つまたは複数のアミノ酸にある、請求項15記載のフラビウイルス。
【請求項２１】
突然変異が膜タンパク質の細胞外ドメインにある、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項２２】
突然変異が細胞外ドメインのアミノ酸番号1〜5からなる群より選択されるアミノ酸にある、請求項21記載のフラビウイルス。
【請求項２３】
突然変異が細胞外ドメインのアミノ酸番号5での置換である、請求項22記載のフラビウイルス。
【請求項２４】
突然変異がプロリンとのグルタミンの置換である、請求項23記載のフラビウイルス。
【請求項２５】
アミノ酸番号107、138、176、177、224、264、280、316、および440からなる群より選択される西ナイルウイルス外被タンパク質アミノ酸に対応する残基での一つまたは複数の外被タンパク質突然変異を含む、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項２６】
西ナイルウイルス外被タンパク質アミノ酸番号107、316、および440に対応する残基での外被タンパク質突然変異を含む、請求項25記載のフラビウイルス。
【請求項２７】
西ナイルウイルスの膜タンパク質の66位ならびに外被タンパク質の107、316、および440位に対応する残基での突然変異を含む、請求項25記載のフラビウイルス。
【請求項２８】
フラビウイルスの外被タンパク質の蝶番領域の疎水性ポケット内の突然変異をさらに含む、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項２９】
突然変異がデング1ウイルス外被タンパク質のアミノ酸番号204に対応するアミノ酸に存在する、請求項28記載のフラビウイルス。
【請求項３０】
突然変異が黄熱病ウイルス外被タンパク質アミノ酸番号48〜61、127〜131、および196〜283に対応する一つまたは複数の蝶番領域のアミノ酸にある、請求項28記載のフラビウイルス。
【請求項３１】
フラビウイルスの3'非翻訳領域中の弱毒化突然変異をさらに含む、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項３２】
フラビウイルスのカプシドタンパク質中の弱毒化突然変異をさらに含む、請求項1記載のフラビウイルス。
【請求項３３】
請求項1記載のフラビウイルスおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含むワクチン組成物。
【請求項３４】
請求項33記載のワクチン組成物を患者に投与する段階を含む、患者においてフラビウイルスに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項３５】
患者がフラビウイルスによる感染を有していないが、その感染を来たす危険性がある、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
患者がフラビウイルスに感染している、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
突然変異をフラビウイルスの膜タンパク質に導入する段階を含む、組換えフラビウイルスを含むワクチンを産生する方法。
【請求項３８】
突然変異が、突然変異のない対応するフラビウイルスに比べて、フラビウイルスを弱毒化する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
突然変異が、突然変異のない対応するフラビウイルスに比べて、フラビウイルスの安定性の増大をもたらす、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
突然変異が、突然変異のない対応するフラビウイルスに比べて、フラビウイルスの複製の増大をもたらす、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
フラビウイルスがキメラフラビウイルスである、請求項37記載の方法。
【請求項４２】
請求項1記載のフラビウイルスのゲノムに対応する核酸分子またはその相補体。
【請求項４３】
請求項1記載のフラビウイルスを製造する方法であって、フラビウイルスのゲノムに対応する核酸分子を細胞に導入する段階および細胞中で産生されたフラビウイルスを細胞またはその上清から単離する段階を含む方法。
【請求項４４】
細胞がVero細胞である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
細胞が無血清培地中で培養される、請求項43記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルスに対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
フラビウイルス(Flaviviridae)科のフラビウイルス(Flavivirus)属の中には、およそ70種のウイルス、大部分はアルボウイルスがあり、黄熱病(YF)ウイルス、デング(DEN)ウイルス、日本脳炎(JE)ウイルス、およびダニ媒介性脳炎(TBE)ウイルスなどの、その多くが主要なヒト病原体である(rev. in Burke and Monath, Fields Virology, 第4版: 1043-1126, 2001)。例えば、日本脳炎はアジアにおけるウイルス脳炎の主な原因であり、そこでは毎年30,000〜50,000件の新たな症例が報告されている。別の例として、西ナイルウイルスは、最初の症例が1999年にニューヨーク地域で診断されて以来、北米中に急速に広がり続けている。このウイルスが南米に移動するばかりでなく、発展途上国での蔓延の危険性も極めて高い。これらのウイルスによる感染を阻止するのに効果的な方法が必要とされており、その結果、ワクチン接種が最も費用効果的な手段になっている。
【０００３】
フラビウイルス粒子は、ウイルスRNAとカプシドタンパク質Cからなるヌクレオカプシドを含む。ヌクレオカプシドは、外被糖タンパク質E (50〜60 kDa)と小さな膜タンパク質M (7〜8 kDa)とを含む外被により囲まれている。ゲノムRNAの翻訳の結果、細胞のおよびウイルスのプロテアーゼによって、順にC、prM/M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、2K、NS4B、およびNS5、ここでCからEはウイルス粒子の構造成分であり、NS1からNS5は複製に必要な非構造タンパク質である、ウイルスタンパク質へ切断されるポリタンパク質前駆体を生ずる(Lindenbach and Rice, Fields Virology, 第4版:991-1041, 2001)。prMタンパク質(約25 kDa)はMの細胞内前駆体である。prMを含有する未成熟なウイルス粒子は小胞体(ER)の内腔中への出芽によって産生され、開口分泌経路を通じて細胞表面に輸送される。prMの切断は後期ゴルジ小胞での粒子放出の直前に起こる。成熟な細胞外ウイルスは主にMタンパク質を含むが、わずかな非切断prMが存在することもある。
【０００４】
Eタンパク質はウイルス粒子の主要な機能上のおよび抗原性の表面成分である。中性pHにて成熟なウイルス粒子の表面上でホモ二量体を形成する、Eの細胞外ドメインの分子構造は、低温電子顕微鏡観察によって解像されており(Rey et al., Nature 375:291-298, 1995)、ウイルス粒子の電子密度図に適合されている(Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002)。感染の間に、Eタンパク質はクラスII融合タンパク質として機能する(Modis et al., Nature 427:313-319, 2004)。細胞受容体とのウイルスの結合と内部移行の後に、生じたエンドソーム内の酸性pHが二量体の解離を引き起こし、その前には隠れていた、各単量体の疎水性融合ループが外側に曝露されるようになる。同時に、ループが細胞(エンドソーム)膜に挿入され、単量体が、伸長した三量体に再構成される。さらに三量体の再折畳みが細胞とウイルスの膜を近接近させ、強行にそれらを融合させて、ウイルス粒子の内容物を細胞質の中に放出する。以前の研究によって、マウス脳でのならびに培養サル腎臓および蚊細胞での連続継代の間に選択されている、DENおよびJEのEタンパク質中のいくつかの置換がタンパク質の3D構造の特定領域内に局在していたことが示されており、ウイルスの融合機能の変化と関連していることが報告されている。この研究によって、ある種の弱毒化ワクチンに対する融合pH閾が、対応する親ウイルス分離株と比べて0.6〜1 pH単位だけ低下したことが示された。DEN3のタンパク質E中の6残基(残基番号54、191、202、266、268、および277)でのいくつかの変化はドメインII内の領域に位置する。この領域は、保存された疎水性cd融合ループの表面曝露に必要な、低pH媒介性の立体構造変化の中心と提唱されている(Lee et al., Virology 232:281-290, 1997)。
【０００５】
小さな(成熟)Mタンパク質がエンドソームからウイルス内部移行に至る事象に関与するかまたはその他任意の重要な機能を有するという証拠はないが、その細胞内前駆体prMは子孫ウイルス粒子の形態形成や輸送にとって重要であることが公知である。prMタンパク質は同様に、Eの適切な折畳みを促進し(Lorenz et al., J. Virol. 76:5480-5491, 2002)、新たな粒子が酸性の分泌性区画を通じて細胞表面方向へ通過中に未成熟な立体構造再構成からEタンパク質二量体を保護するように機能する(Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991; Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992)。
【０００６】
ChimeriVax(商標)技術は、医学的に重要なフラビウイルスに対する弱毒化された生ワクチン候補を作出するために使われている。この技術ではYF 17Dワクチンウイルスを、prM-E遺伝子がJEウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、またはセントルイス脳炎ウイルスなどの、異種フラビウイルス由来のprM-E遺伝子と交換されるベクターとして利用する(Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999; Monath et al., Curr. Drug Targets - Inf. Disorders 1:37-50, 2001; Monath et al., Vaccine 20: 1004-1018, 2002; Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304, 2001; Guirakhoo et al., Virology 298:146-159, 2002; Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003; Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004)。以前に、SA14-14-2ウイルス由来のprM-E遺伝子を含有するChimeriVax(商標)-JEワクチンウイルス(中国で使われた弱毒化生JEワクチン)は、ウシ胎仔血清(FBS)を補った培地中で培養されたVero細胞において高力価にまで増殖された(Monath et al., Biologicals 33:131-144, 2005)。これは前臨床試験ならびに第I相および第II相治験において成功裏に試験されている(Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002; Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003)。同様に、成功した第I相治験が、Eタンパク質に組み入れられた3つの特異的アミノ酸変化によって弱毒化を増大させて(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)、西ナイルウイルス(NY99株)由来のprM-E配列を含むChimeriVax(商標)-WNワクチン候補で行われている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、フラビウイルスを弱毒化させる突然変異(例えば、フラビウイルスの内臓向性/ウイルス血症を減少させる突然変異)、細胞培養での増殖(例えば、無血清培養での製造)の間のフラビウイルスの遺伝的安定性を増大させる突然変異、および/またはワクチンウイルスの収量を増大させる突然変異などの、一つまたは複数の膜(M)タンパク質突然変異(例えば、置換、欠失、または挿入)を含む組換えフラビウイルスを提供する。本発明のフラビウイルスは、第一のフラビウイルス(例えば、YF 17Dなどの、黄熱病ウイルス)のカプシドおよび非構造タンパク質ならびに第二のフラビウイルス(例えば、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、デングウイルス(デング-1、デング-2、デング-3、またはデング-4ウイルス)、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ならびにYF、JE、DEN、およびTBE血清型群由来のヒト/動物病原体であるその他任意のフラビウイルス)の膜および/または外被タンパク質を含むフラビウイルスなどの、キメラフラビウイルスでありうる。
【０００８】
本発明のフラビウイルスでは、突然変異(例えば、置換)は膜タンパク質Mの膜貫通または細胞外ドメイン内にありうる。例えば、突然変異はフラビウイルスの膜タンパク質Mのうちの予測される膜ヘリックスのアミノ酸番号40〜75の領域内にありうる。一例として、突然変異は日本脳炎ウイルスなどのフラビウイルスの膜タンパク質アミノ酸番号60の置換(例えば、日本脳炎ウイルスMタンパク質ではアルギニンからシステイン)、または別のフラビウイルスの対応するアミノ酸での置換でありうる。所与のフラビウイルス内のどのアミノ酸が別のフラビウイルスのそのアミノ酸に「対応する」のかという判定は、当業者には周知であるように、標準的なアミノ酸配列アライメントによって実行することができる。別の例として、突然変異は西ナイルウイルスなどのフラビウイルスの膜タンパク質アミノ酸番号66の置換(例えば、西ナイルウイルスのMタンパク質でのロイシンのプロリンとの置換)、または別のフラビウイルスの対応するアミノ酸での置換でありうる。その他の例では、突然変異は別の膜アンカーアミノ酸、例えば、日本脳炎ウイルスもしくは西ナイルウイルスの60、61、62、63、64、65、および66位を含め、M66残基に隣接する群より選択される一つもしくは複数のアミノ酸(またはその他のフラビウイルスでの対応するアミノ酸)あるいは膜貫通ドメインの他のアミノ酸残基の位置にある。
【０００９】
本発明者らは初めて、Mタンパク質の細胞外ドメインが重要な機能的意義をもつという証拠も提供する。これはM5残基でのグルタミンからプロリンの変化が感染のpH閾を増大させたからである。それゆえ、今回、フラビウイルス弱毒化はそのC末端の疎水性アンカーだけでなく、アミノ末端の細胞外ドメイン、またはMタンパク質の表面部分でのアミノ酸変化または様々な欠失もしくは挿入の導入を通じて達成できると期待することができる。このように、その他の例では、本発明のウイルスは、本明細書において記述されるようにMタンパク質細胞外ドメイン(残基番号1〜40)内に一つまたは複数の突然変異を含む。この結果は、フラビウイルスの成熟Mタンパク質には何らの公知の機能もないことを考えると、かなり予想外である。
【００１０】
上記の膜タンパク質突然変異に加えて、西ナイルウイルスの膜および外被タンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合、本発明のウイルスはアミノ酸番号107、138、176、177、224、264、280、316、および440からなる群より選択されるアミノ酸において一つまたは複数の外被タンパク質突然変異を含むことができる。その他のフラビウイルスでは、突然変異はこれらのアミノ酸に対応するアミノ酸において存在することができる。具体例として、フラビウイルスは、西ナイルMタンパク質アミノ酸番号66における突然変異に対応する突然変異ならびに西ナイルウイルス・アミノ酸番号107、316、および440に対応するアミノ酸でのEタンパク質突然変異を含むことができる。上記の突然変異に加えて、本発明のフラビウイルスは同様に、本明細書中の他の箇所に記述されているように、外被タンパク質の蝶番領域の疎水性ポケット内に一つまたは複数の突然変異を含むことができる。本発明のウイルスに含まれることができるさらなる突然変異は、以下にさらに記述されるように、3'UTR、カプシドタンパク質、またはその他の外被タンパク質領域中の突然変異である。
【００１１】
本発明は同様に、上記におよび本明細書中の他の箇所に記述されるフラビウイルスおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含むワクチン組成物、ならびにこのようなワクチン組成物の投与により患者においてフラビウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。そのような方法によって処置される患者は、フラビウイルスによる感染を有していないが、その感染を来たす危険性がある者、およびフラビウイルスに感染している患者を含む。さらに、本発明は、本明細書において記述される予防的および治療的方法における、ならびにこれらの目的に向けた医薬の製造における本明細書において記述されるフラビウイルスの使用を含む。
【００１２】
本発明はさらに、本明細書において記述されるフラビウイルスを含むワクチンを産生する方法であって、内臓向性/ウイルス血症の減少、および/または遺伝的安定性/収量の増大をもたらす突然変異をフラビウイルスの膜タンパク質に導入する段階を含む方法を提供する。さらに、本発明は、本明細書において記述されるフラビウイルスのゲノムに対応する核酸分子(RNAもしくはDNA) (またはその相補体)、および本発明のウイルスを作出するためにこのような核酸分子を使用する方法を提供する。
【００１３】
本発明のフラビウイルスは好都合である。というのは、病原性の減少(例えば、内臓向性/ウイルス血症の減少により示される)を有するという点で、それらが、患者に投与される場合に、その非突然変異対応物に比べて、さらなるレベルの安全性を提供するからである。さらなる利点は、ChimeriVax (商標)-JEにおけるM-60突然変異などの、いくつかの突然変異がワクチン製造の間に別の方法で安全性を損ないうる望ましくない突然変異の蓄積を排除することや、製造時の収量を増大させることである。これらのウイルスのさらなる利点は、それらが、(i) 安全性が60年間を超えて立証されており、その間に3億5000万回分超がヒトに投与されており、(ii) 単回投与後に長期間の免疫を誘導し、および(iii) 接種から数日以内に、素早く免疫を誘導する、黄熱病ウイルス株YF17Dの配列(例えば、カプシドおよび非構造タンパク質をコードする配列)を含むことができるという事実によって示される。さらに、本発明のワクチンウイルスは処置患者において活動性感染を引き起こす。予防接種を受けた個体のサイトカイン環境および先天性免疫応答は自然感染でのものに類似するので、その抗原性集団は宿主内で広がり、適切に折り畳まれた立体構造エピトープが効果的にプロセッシングされ、適応免疫応答が強くなり、記憶が確立される。
【００１４】
ワクチンの安全性および細胞培養での製造に関するMタンパク質中の突然変異の有利な局面は、フラビウイルスの成熟Mタンパク質には何らの公知の機能もないことを考えると、新規かつ予想外である。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１６】
詳細な説明
本発明はフラビウイルス(例えば、日本脳炎(JE)または西ナイル(WN)ウイルス)感染の予防および処置で用いるためのワクチンおよび方法を提供する。本発明の方法は全体として、一つまたは複数の構造タンパク質(例えば、膜および/または外被タンパク質)が第二のフラビウイルス(例えば、日本脳炎(JE)および/または西ナイル(WN)ウイルス; 同様に以下参照)のものと交換された第一のフラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス)からなる弱毒化生キメラフラビウイルスを用いた被験者のワクチン接種に関係する。本発明のキメラの膜タンパク質は、以下にさらに記述されるように、一つまたは複数の突然変異を含む。同様に以下に記述されるとおり、その他のフラビウイルスの膜および/または外被タンパク質などの構造タンパク質を、本発明のキメラウイルスにおける日本脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルスのものに代えて使用することができる。さらに、本発明の膜タンパク質突然変異を同様に、構造タンパク質の任意の交換を含んでいない、および本明細書において記述されるものなどの、一つまたは複数のさらなる突然変異を任意で有する、無傷の非キメラフラビウイルス(例えば、本明細書において掲載されるもののいずれか)で使用することができる。
【００１７】
本発明のワクチンの中に含めることができるキメラウイルスの具体例は、膜および外被タンパク質を日本脳炎ウイルスの膜および外被タンパク質(本明細書において記述されるように、M60での置換などの、Mタンパク質突然変異を含む)と交換させたヒト黄熱病ウイルス株YF 17D (例えば、YF17D-204 (YF-VAX (登録商標)、Sanofi-Pasteur, Swiftwater, PA, USA; Stamaril (登録商標)、Sanofi-Pasteur, Marcy-L'Etoile, France; ARILVAX(商標)、Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAVIMUN (登録商標)、Berna Biotech, Bern, Switzerland); YF17D-204 France (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice et al., Science 229:726-733, 1985))である。別の例では、YF 17Dの膜および外被タンパク質を西ナイルウイルスのもの(本明細書において記述されるように、M66での置換などの、Mタンパク質突然変異を含む)と交換する。
【００１８】
その他の例では、デングウイルス(血清型1型、2型、3型、もしくは4型)、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、YF 17D株を含む黄熱病ウイルスなどの別のフラビウイルス、またはその他任意のフラビウイルスは、そのようなキメラウイルス中の膜および/または外被タンパク質を供与することができる。本発明によって弱毒化できるさらなるフラビウイルスは、無傷の非キメラウイルスとしてであれ、キメラ中の膜および/または外被タンパク質の供給源としてであれ、クンジン(Kunjin)ウイルス、ロシオ(Rocio)脳炎ウイルス、およびイルヘウス(Ilheus)ウイルスなどの、その他の蚊媒介性フラビウイルス; 中央ヨーロッパ脳炎ウイルス、シベリア脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサン(Powassan)ウイルス、ネギシ(Negishi)ウイルス、アブセッタロブ(Absettarov)ウイルス、ハンサロバ(Hansalova)ウイルス、アポイ(Apoi)ウイルス、およびHyprウイルスなどの、ダニ媒介性フラビウイルス; ならびにヘパシウイルス(Hepacivirus)属由来ウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス)を含む。その他の黄熱病ウイルス株、例えば、YF17DD (GenBankアクセッション番号U 17066)、YF17D-213 (GenBankアクセッション番号U17067; dos Santos et al., Virus Res. 35:35-41, 1995)、およびGaller et al., Vaccines 16(9/10): 1024-1028, 1998により記述されている黄熱病ウイルス17DD株を同様に、異種の構造タンパク質を本発明によって挿入できる骨格ウイルスとして使用することができる。
【００１９】
上記に掲載されるウイルスはそれぞれ内臓に感染する性向を持っている。これらのウイルスの内臓向性は、非常に稀ではあるが、YFワクチンに関連した有害な疾患事象で観察されるような、生命維持に不可欠な内臓の機能不全を引き起こすことがある。これらの臓器でのウイルスの複製は同様に、ウイルス血症を引き起こし、したがって中枢神経系への浸潤の一因になる場合がある。かくして、本発明による突然変異誘発によってこれらのウイルスの内臓向性を減少させることにより、有害な内臓向性疾患を引き起こすおよび/または脳に侵入し脳炎を引き起こすウイルスの能力を低減させることができる。
【００２０】
本発明の突然変異はウイルスに有益な効果をもたらし、この中には、例えば、弱毒化、安定性、および/または複製の増大を含むことができる。突然変異は膜タンパク質の中に、例えば、膜タンパク質の膜貫通領域の中にもしくは細胞外ドメインの中に存在する。例えば、突然変異は膜タンパク質アミノ酸番号60もしくは66および/または予測される膜貫通ドメイン内のその他のアミノ酸(例えば、アミノ酸番号40〜75のいずれかの一つまたは複数)、あるいはMタンパク質(例えば、M-5)のN末端細胞外ドメインにありうる。具体例として、膜タンパク質アミノ酸番号60 (野生型日本脳炎ウイルスではアルギニン)をシステインなどの、別のアミノ酸と交換することができる。ChimeriVax (商標)-JEウイルスにおけるM-60位でのアルギニンからシステインの置換により、M-60突然変異の有るおよび無いワクチン変異体が試験された治験において、ヒトに対するウイルスのウイルス血症(内臓向性)が著しく低下した(表11Aおよび11B)。システインに加えて、セリン、スレオニン、グリシン、メチオニンなどのような、その他のアミノ酸を膜タンパク質の60位の野生型アミノ酸の代わりに用いることができる。別の例では、膜タンパク質アミノ酸番号66 (野生型西ナイルウイルスではロイシン)をプロリンなどの、別のアミノ酸と交換することができる。プロリンに加えて、イソロイシン、メチオニン、もしくはバリンなどの、その他の疎水性アミノ酸、またはアラニンもしくはグリシンなどの、小さなアミノ酸を膜タンパク質の66位の野生型アミノ酸の代わりに用いることができる。これらの突然変異は同様に、本明細書において記述されるように、その他のフラビウイルスの対応するアミノ酸においても存在することができる。
【００２１】
膜タンパク質配列の中に作出できる置換の他の例としては、61位、62位、63位、および/または64位のアミノ酸を単独で、またはお互い、60位の突然変異と、66位の突然変異と、および/もしくは別の突然変異と組み合わせて置換することができる。西ナイルウイルスの膜タンパク質配列中のこれらの位置での置換の例としては、61位でのバリンからアラニン、62位でのバリンからグルタミン酸またはメチオニン、63位でのフェニルアラニンからセリン、および64位でのバリンからイソロイシンが挙げられる。これらの突然変異は同様に、本明細書において記述されるように、その他のフラビウイルスの対応するアミノ酸において存在することができる。
【００２２】
JEウイルスの膜タンパク質配列中のこれらのまたは周囲の位置での置換の例としては、内臓向性および/または製造の間の細胞培養でのワクチンウイルスの複製/安定性に及ぼす所望の効果が達成されるという期待のある残りの20アミノ酸のいずれかが挙げられる。キメラまたは非キメラフラビウイルスにおけるその他の例としては、タンパク質の残基番号1〜約40からなるMタンパク質のN末端細胞外ドメイン内の、単独でのまたは組合せでの、任意のアミノ酸置換、ならびにMタンパク質の細胞外ドメインおよび/または膜貫通ドメイン内に導入される様々なサイズ(例えば、1、2、3、4、5などのアミノ酸長)の欠失が挙げられる。
【００２３】
上記の膜タンパク質突然変異の一つまたは複数に加えて、本発明のウイルスは同様に、一つまたは複数のさらなる突然変異を含むことができる。例えば、西ナイルウイルスの場合、そのようなさらなる突然変異は、西ナイルウイルス外被タンパク質の107位(例えば、LからF)、316位(例えば、AからV)、もしくは440位(例えば、KからR) (またはその組合せ)の領域中とすることができる。したがって、突然変異は、例えば、西ナイル外被タンパク質のアミノ酸番号102〜112、番号138 (例えば、EからK)、番号176 (例えば、YからV)、番号177 (例えば、TからA)、番号244 (例えば、EからG)、番号264 (例えば、QからH)、番号280 (例えば、KからM)、番号311〜321、および/または番号435〜445の一つまたは複数にありうる。具体例として、西ナイルウイルス株NY99-フラミンゴ382〜99 (GenBankアクセッション番号AF196835)の配列を参照として利用し、107位のリジンをフェニルアラニンと交換することができ、316位のアラニンをバリンと交換することができ、および/または440位のリジンをアルギニンと交換することができる。突然変異させることができるアミノ酸のさらなる組合せの例としては、以下が挙げられる: 176位、177位、および280位; 176位、177位、244位、264位、および280位; ならびに138位、176位、177位、および280位。さらに、これらの突然変異は同様に、本明細書において記述されるように、その他のフラビウイルスの対応するアミノ酸において存在することができる。
【００２４】
ChimeriVax (商標)-JEワクチンは、これがSA14-14-2特異的なJE外被を含むので、上記のSA14-14-2特異的な突然変異の全てを既に含んでいる。Eタンパク質のさらなるアミノ酸変化は同様に、さらなる弱毒化に向けてEタンパク質の構造/機能に関する知識に基づき選択し導入することができる(例えば、以下に記述されるように)。これらの突然変異は同様に、本明細書において記述されるように、その他のフラビウイルスの対応するアミノ酸においても存在することができる。
【００２５】
上記のアミノ酸に加えて、置換は上記のもの由来の保存的変化をもたらしうるアミノ酸などの、その他のアミノ酸を用いて作出することができる。同類置換は、典型的には、以下のグループ内での置換を含む: グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン; セリンおよびスレオニン; リジンおよびアルギニン; ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００２６】
本発明のウイルス(例えば、日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルス、ならびにこれらのまたはその他のフラビウイルス由来の膜および外被タンパク質を含むキメラフラビウイルス)は同様に、上記の突然変異(たとえば、膜タンパク質突然変異)に加えて、外被タンパク質の蝶番領域または疎水性ポケット内に一つまたは複数の突然変異をも含むことができる。そのような突然変異は内臓向性の減少をもたらすことが明らかにされているからである(Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002; WO 03/103571 A2; WO 05/082020; Guirakhoo et al., J. Virol. 78(18):9998-10008, 2004)。外被タンパク質のポリペプチド鎖は、三つの別個のドメイン、つまり中央ドメイン(ドメインI)、二量化ドメイン(ドメインII)、および免疫グロブリン様モジュールドメイン(ドメインIII)に折り畳まれる。蝶番領域はドメインIとIIとの間に存在しており、酸性pHに曝されると、立体構造変化を起こし(ゆえに「蝶番」という呼称)、この結果、受容体を介した飲食作用によるウイルス取込み後の、ウイルス膜とエンドソーム膜の融合に関与する外被タンパク質三量体の形成をもたらす。立体構造変化の前、このタンパク質は二量体の形で存在している。
【００２７】
例えば、黄熱病ウイルスのアミノ酸番号48〜61、127〜131、および196〜283を含めて、数多くの外被アミノ酸が蝶番領域の中に存在している(Rey et al., Nature 375:291-298, 1995)。これらのアミノ酸、または近接する周囲のアミノ酸(およびその他のフラビウイルス外被タンパク質中の対応するアミノ酸)のいずれかを本発明によって突然変異させ、弱毒化について試験することができる。特に関心の対象となるのは、蝶番領域の疎水性ポケット内のアミノ酸である。具体例として、黄熱病ウイルスベクターに挿入されたデング1外被タンパク質の配列を含むキメラフラビウイルスにおいて、蝶番領域の疎水性ポケットの中に存在する、外被タンパク質のアミノ酸番号204を置換(KからRに)することで、弱毒化がもたらされることが明らかにされている(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004)。この置換は、野生型タンパク質での一つの外被単量体と別のものとの間の分子間水素結合が破壊され、単量体内部での新たな分子内相互作用と置き換えられるような、外被タンパク質の構造の変化を引き起こす。この観測結果によって、この置換から生じた弱毒化が、最も可能性が高いのは宿主細胞とのウイルス膜の融合に必要なpH閾を変えることにより、融合前の立体構造においてタンパク質の構造を変化させる、これらの新たな相互作用によるものであり、さらなる置換を用いて、弱毒化を引き起こす、疎水性ポケット内での分子内相互作用を高めてあるさらに弱毒化された突然変異体のデザインの基礎を提供するという提案につながった。疎水性ポケット内に作出され、本発明のウイルスに含まれうるそのような突然変異/置換の例としては、E202K、E204K、E252V、E253L、E257E、E258G、およびE261Hでの置換(ならびにその他のフラビウイルスでの対応する置換)が挙げられる。JEおよびWNウイルスのEタンパク質の対応領域での任意のアミノ酸変化を同種のタンパク質構造に関する知識に基づいてデザインし、組み入れることができる。
【００２８】
E遺伝子は、Hurrelbrink and McMinn (Adv. Virus Dis. 60:1-42, 2003)により記述されているように、アミノ酸の変化が感染に影響を及ぼし、それによって病原性を減らしうる機能ドメインを含む。本出願において記述される膜欠失/突然変異とともに、突然変異を挿入できるEタンパク質の機能領域であって、適切に弱毒化されたワクチンをもたらしうるその領域は、a) ドメインIIIの外部表面の推定上の受容体結合領域、b) エンドソーム中でのEタンパク質の酸依存的な立体構造変化を決定づけ、ウイルス内部移行の効率を低下させる、ドメインIとIIとの間の分子蝶番領域; c) prMおよびEタンパク質の接触面、つまりエンドソーム中での低pHへの曝露後の二量体から三量体への再構成の後にprMと相互作用するEタンパク質の領域; d) 内部移行事象の間のエンドソーム膜との融合に関与する、ドメインIIの融合ドメインの先端; ならびにe) 同様に酸誘導性の融合事象の間のEタンパク質の立体構造変化に機能的に関与する、ステムアンカー領域を含む。
【００２９】
本発明のウイルスにおいて一つまたは複数の膜タンパク質突然変異とともに含まれうるさらなる弱毒化突然変異は、黄熱病ウイルス骨格の3'非翻訳領域中の突然変異を含む。全てのChimeriVax (商標)ウイルスが共有する、黄熱病ウイルスワクチン株YF 17Dの3'UTRの構成を図1Aに示す。これは3'末端から順番に(i) マイナス鎖RNA合成のプロモーターとして機能すると仮定され、全てのフラビウイルスで保存されている3'末端ステムループ構造、(ii) 全ての蚊媒介性フラビウイルスと高度のヌクレオチド配列相同性を共有する、二つの保存配列要素CS1およびCS2、ならびに(iii) YF17Dワクチンウイルスを含め、西アフリカ黄熱病ウイルス株に特有な、3'UTRの上流部分に位置する3コピーの反復配列要素(RS) (Chambers et al., Annu. Rev. Microbiol. 44:649-688, 1990)を含む。3'UTRは同様に、図1Bに描かれるように、RS要素から下流の非保存領域中のものなどの、数多くのステムループ構造を含む。
【００３０】
本発明のウイルスにおいて含まれうるさらなる3'UTR突然変異は全体として、例えば、30未満のヌクレオチド(例えば、1、2、3などの、および29までの(例えば、長さが2〜25、3〜20、4〜15、5〜10、または6〜8ヌクレオチド); 米国特許出願第60/674,546号および同第60/674,415号)の短い、弱毒化性の欠失である。いくつかの例では、短い3'UTRの欠失をデザインして、3'UTR中のステム構造の一つまたは複数の二次構造を不安定化させる。欠失に加えて、そのような構造中の突然変異は、ステム構造の不安定化を同様にもたらす置換を含むこともできる。ある種の例では、突然変異を受けやすいステムループ構造は、3'UTRの非保存領域中にまたはそのような突然変異を許容できる保存領域中に(例えば、CS2中に)存在する。例えば、ステムを不安定化させる突然変異は、4例のそのような欠失(dA、dB、dC、およびdD)を示した、図1Bに示される予測上のステム構造のいずれかの一つまたは複数の中に存在することができる。このように、これらの具体例に加えて、黄熱病ウイルスにおける3'UTR突然変異のその他の例としては、例えば、5'から3'方向に読んだときの、図1Bに示される、以下のステム配列の1〜2、3〜8、4〜7、または5〜6ヌクレオチドを含む突然変異が挙げられる:
2008520187.tif 000002
。これらの突然変異は同様に、本明細書において記述されるように、その他のフラビウイルスの対応するアミノ酸において存在することができる。
【００３１】
ステムを不安定化させる突然変異に加えて、3'UTR中のその他の短い欠失を同様に、本発明のウイルスにおける一つまたは複数の膜(および恐らくその他の)突然変異とともに含めることができる。例えば、既報のΔ30突然変異(Men et al., J. Virol. 70:3930-3937, 1996; 米国特許第6,184,024 B1号)またはこの配列に含まれる突然変異を使用することができる。したがって、例えば、本発明は、この領域内の長さが1、2、3などの、および29までの(例えば、1〜25、2〜20、3〜15、4〜14、5〜13、6〜12、7〜11、8〜10、または9)ヌクレオチドである任意の実行可能な欠失を含む。具体例として、本発明のウイルスは、YF17Dにおけるこの領域由来の以下のヌクレオチドが欠失された、欠失d7を含むことができる: ヌクレオチド番号345〜351 (AAGACGG; ウイルスORFのUGA終止コドン後の、3'UTRの1番目のヌクレオチドからの付番; 図1A)。この配列の3'または5'末端からの、例えば、1、2、3、4、または5個のさらなるヌクレオチドの欠失を含む突然変異も本発明に含まれる。その他の例では、保存配列CS1およびCS2中の短い欠失が本発明に含まれる。これらの突然変異は、これらの配列の、例えば、1〜29、2〜25、3〜20、4〜15、5〜10、または6〜8ヌクレオチドの欠失を含むことができる。二つの具体例として、ヌクレオチド番号360〜364 (GGTTA; CS2d5; 図1A)および/またはヌクレオチド番号360〜375 (GGTTAGAGGAGACCCT; CS2d16; 図1A)がYF17D特異的な3'UTRのCS2から欠失される。この配列の3'または5'末端からの、例えば、1、2、3、4、または5個のさらなるヌクレオチドの欠失を含む突然変異も使用することができる。その他のフラビウイルス3'UTRの場合、3'UTRの二次構造に基づいて、類似の突然変異を作出することができる。その他のフラビウイルスの3'UTRの二次構造の予測は、例えば、デング、クンジン、およびTBE (例えば、Proutski et al., Virus Res. 64:107-123, 1999を参照のこと)ならびにHCV (例えば、Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996を参照のこと)の場合、公表されている。さらに、四つの主要な血清型群(YF、JE、デング、およびTBE)の全てに相当するフラビウイルスの多くの株に対する数多くの3'UTRヌクレオチド配列がGenBankから入手可能である。さらなる株の配列はウイルスの配列決定により判定することができる。これらの配列の二次構造は、突然変異誘発を受けやすい潜在的なステムループ構造を解明するための標準的なソフトウェア(例えば、mfoldまたはRNAfoldプログラム)を用いて容易に予測することができる。
【００３２】
YF 17Dウイルスを含めて、フラビウイルスの3'UTRの真の二次構造は、完全なウイルスという状況でその存在を実験的に証明するのに利用できる方法がないので未知であり、したがって、公表されている予測、例えば、Proutskiおよび共同研究者らによってYF 17Dに対して予測されている構造(図1B)は正確でない可能性があることに留意されたい。多くの代替構造が比較的長いRNA分子では生ずると予測することができ(Zuker et al., N.A.R. 19:2707-2714, 2001)、ウイルス生活環の異なる段階で異なる構造(プラスまたはマイナス鎖での)が生じ機能する可能性がある。真の構造は、様々な偽結び目(pseudoknot)の形成(Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001)および遠距離RNA相互作用(例えば、RNA環化およびその他の相互作用(Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005))、ならびに宿主およびウイルスタンパク質との考えられるRNA相互作用に影響されることがある。理論的コンピュータ予測の公表結果の解釈をさらに複雑化するため、最初に予測された構造のもっと長いRNA配列の構造への後の強制的進行を伴う部分的配列の最初の折畳み、最初の折畳み段階の間のN'sの人為的使用、および好ましい構造要素の主観的選択などの、手動操作が使われることが多い(例えば、Mutebi et al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004)。この目的のため、本発明者らは、よく使われるZukerの予測アルゴリズムを用いてYF 17Dの3' UTR RNA配列を折り畳んだ。予測された最適構造を図1Cに示す。この構造は図1Bに示されるProutskyの予測とは異なる。図1Aおよび1B中の小さい欠失dA、dB、dC、dD、d7、およびd14が通常、予測された天然YF 17Dの最適な(図1C)および準最適な構造を不安定化させたことは重要である。そのような改変された最適構造(dC突然変異体に対する)の一つの例を図1Dに示す。対照的に、CS2d5およびCS2d16欠失(図1Aおよび1B)は、最適な天然構造を顕著に変化させなかったことから、これらの欠失が3'UTR構造ではなくCS2それ自体の配列を改変させることによって、またはある種の準最適な構造を改変させることによりウイルスを弱毒化できることが示唆された(弱毒化はChimeriVax (商標)-WNのハムスターモデルで実証された)。このように、欠失の一部がProutskiの構造予測に基づいてデザインされたが(図1B)、その真の効果は、図1Bの予測ステムループとは異なる構造要素の不安定化による可能性がある。
【００３３】
本発明のウイルスにおける膜タンパク質(および恐らくその他の)突然変異とともに含めることができるさらなる突然変異は、カプシドタンパク質内の短い欠失(例えば、1、2、3、または4アミノ酸の欠失)突然変異である。YF 17Dウイルスカプシドタンパク質に関連して示される、そのような突然変異の例としては、タンパク質のヘリックスIに影響を及ぼす実行可能な欠失が挙げられる(図2Aを参照のこと)。そのような突然変異の具体例は突然変異C2であり、これはヘリックスI由来のアミノ酸PSRの欠失を含む(図2A)。この領域におけるその他の短い突然変異(およびその他のフラビウイルス配列中の対応する突然変異)を生存性および弱毒化について試験することができ、本発明で使用することもできる。その他のフラビウイルスのカプシドタンパク質配列は、例えば、TBEウイルス、WNウイルス、クンジンウイルス、JEウイルス、およびデングウイルスの場合、公表されている(例えば、Pletnev et al., Virology 174:250-263, 1990)。
【００３４】
以下は、本発明のウイルスを作出するのに使用できる、キメラフラビウイルスの具体例であり、これらはブダペスト条約の条項に従ってManassas, Virginia, U.S.A.のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、1998年1月6日付の寄託日を付与された: キメラ黄熱病17D/デング2型ウイルス(YF/DEN-2; ATCCアクセッション番号ATCC VR-2593)およびキメラ黄熱病17D/日本脳炎SA14-14-2ウイルス(YF/JE A1.3; ATCCアクセッション番号ATCC VR-2594)。本発明で使用できるキメラウイルスを作出する詳細は、例えば、米国特許第6,696,281 B1号; 国際出願PCT/US98/03894 (WO 98/37911)およびPCT/US00/32821 (WO 01/39802); ならびにChambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999に示されており、同様に以下に示される。これらの方法は、本明細書において記述される一つまたは複数の突然変異を挿入配列(例えば、日本脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルスの膜タンパク質またはその他の配列)に導入する段階を含めることにより、本発明で用いるために修正することができる。本発明におけるウイルスを産生するのに使用できる方法は同様に、PCT/US03/01319 (WO 03/060088 A2; 同様に以下参照)に記述されている。
【００３５】
部位特異的突然変異誘発法などの標準的な方法を用いて、突然変異を本発明のウイルスに作出することができる。本発明のウイルスに存在する突然変異のタイプの一例は置換であるが、欠失および挿入などの、その他のタイプの突然変異も使用することができる。さらに、上で述べたとおり、突然変異は、膜タンパク質それ自体の中であれ、例えば、3'UTR、カプシド、または外被配列の任意の組合せにおいてであれ、単独でまたは一つもしくは複数のさらなる突然変異との関連で存在してもよい。
【００３６】
本発明のウイルス(キメラを含む)は、当技術分野における標準的な方法を用いて作出することができる。例えば、ウイルスのゲノムに対応するRNA分子を初代細胞、ニワトリ胚、または2倍体細胞系に導入することができ、次いで、それ(またはその上清)から子孫ウイルスを精製することができる。ウイルスを産生するために使用できる別の方法では、Vero細胞などの、異数体細胞を利用する(Yasumura et al., Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963)。この方法では、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子(例えば、RNA分子)を異数体細胞に導入し、この細胞が培養された培地からウイルスを回収し、回収されたウイルスをヌクレアーゼ(例えば、Benzonase (商標)などの、DNAとRNAの両方を分解するエンドヌクレアーゼ; 米国特許第5,173,418号)で処理する。Benzonase (商標)の場合、15単位/mLを使用することができ、馴化培地を2〜8℃に約16時間またはそれ以上の時間冷蔵して、核酸の消化を可能にすることができる。次に、ヌクレアーゼ処理されたウイルスを濃縮し(例えば、500 kDaの分子量カットオフを有するフィルター(例えば、Pellicon-2 Miniウルトラフィルターカセット)を用いた限外ろ過の利用により)、フェノールレッドまたはFBS不含のMEMEに対してダイアフィルトレーションし、ラクトースの添加によって調剤し、無菌容器の中にろ過する。この方法の詳細はWO 03/060088 A2に示されている。さらに、本発明のウイルスの増殖に使われる細胞は、以下に記述されるように、無血清培地中で増殖させることができる。
【００３７】
本発明のウイルスは感染の危険性がある者での一時的予防薬として投与することができ、または感染した患者を処置するための二次的薬剤として使用することができる。ウイルスは弱毒化されるので、それらは高齢者、小児、またはHIV感染者などの「危険性がある個体」への投与にとりわけよく適している。ワクチンは同様に、獣医学的状況で、例えば、西ナイルウイルス感染に対するウマのワクチンで、または家庭用ペット(例えば、ネコ、イヌ、および鳥)、家畜(例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、鳥、およびヤギ)、ならびに珍しい鳥などの価値のある動物のワクチンで使用することができる。さらに、本発明のワクチンは特定の突然変異(例えば、M5、M60、および/またはM66突然変異)を含むキメラウイルスなどのウイルスを、このような突然変異のないウイルスとの混合物中に含むことができる。
【００３８】
本発明のウイルスの調剤は、当技術分野において標準的である方法を用いて行うことができる。ワクチン調製物で用いるのに薬学的に許容される数多くの溶液は、周知であり、当業者によって本発明で用いるのに容易に適合されることができる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照のこと)。二つの具体例として、ウイルスは、7.5%ラクトースおよび2.5%ヒト血清アルブミンを含有する最小必須培地アール塩(MEME)または10%ソルビトールを含有するMEMEの中で調剤される。しかしながら、ウイルスは無菌食塩水または無菌緩衝食塩水などの、生理学的に許容される溶液中に単純に希釈されてもよい。別の例では、ウイルスは、例えば、黄熱病17Dワクチンと同じように、例えば、感染ニワトリ胚組織の清澄化懸濁液、またはキメラ黄熱病ウイルスが感染した細胞培養物から回収された液体として投与され調剤されてもよい。
【００３９】
本発明のワクチンは当技術分野において周知である方法を用いて投与することができ、投与されるワクチンの適切な量は当業者によって容易に判定されることができる。投与するのに適切なウイルス量であると判定されるものは、例えば、ウイルスが投与される被験者のサイズや全般的健康などの、要因の考慮によって判定することができる。例えば、本発明のウイルスは、例えば、筋肉内経路、皮下経路、または皮内経路により投与される、0.1〜1.0 mlの用量体積中に102〜108、例えば、103〜107または104〜106の感染単位(例えば、プラーク形成単位または組織培養感染用量)を含有する無菌水溶液として調剤することができる。また、フラビウイルスは経口経路などの、粘膜経路を介してヒト宿主に感染可能でありうるため(Gresikova et al.,「Tick-borne Encephalitis」, In The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (編), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, 第IV巻, 177-203)、ウイルスは同じく粘膜(例えば、経口)経路によって投与することができる。さらに、本発明のワクチンは単回用量で投与することができ、または任意で、投与は初回用量に続けて、当業者により適切であると判定される、例えば、2〜6ヶ月後に投与される一回もしくは複数回の追加用量の使用を含んでもよい。
【００４０】
任意で、当業者に知られているアジュバントが本発明のウイルスの投与で使用されてもよい。ウイルスの免疫原性を高めるのに使用できるアジュバントは、例えば、リポソーム製剤、合成アジュバント、例えば、(例えばQS21)、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、またはポリホスファジンを含む。これらのアジュバントは、典型的には、不活性化ワクチンに対する免疫応答を高めるために使用されるが、これらは生ワクチンとともに使用することもできる。例えば、経口のような粘膜経路により送達されるウイルスの場合、大腸菌(E. coli)の易熱性毒素(LT)またはLTの突然変異誘導体などの粘膜アジュバントをアジュバントとして使用することができる。さらに、アジュバント活性を持つサイトカインをコードする遺伝子をウイルスに挿入することができる。したがって、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、またはIL-5などのサイトカインをコードする遺伝子を外来抗原遺伝子とともに挿入して、免疫応答の増強をもたらすワクチンを産生することができ、または細胞性、体液性、もしくは粘膜性の応答に対する免疫をより特異的に調節することができる。任意で本発明において使用されてもよいさらなるアジュバントは、トール様受容体(TLR)調節因子を含む。
【００４１】
デングウイルスならびに/またはデングウイルスの膜および外被タンパク質を含むキメラフラビウイルスの場合、これに対する最適なワクチン接種は、デング血清型の四つ全てに対する免疫の誘導を含むことができ、本発明のウイルスを四価ワクチンの製剤で使用することができる。そのような四価製剤で用いられるウイルスの一部または全部は、本明細書において記述されるように、内臓向性を減少させる一つまたは複数の突然変異を含むことができる。ウイルスは調剤の間のどの時点で四価調製物を生ずるよう混合されてもよく、または順次投与されてもよい。四価ワクチンの場合、各ウイルスの等量を使用することができる。または、投与されるワクチンに存在する異なるウイルスのそれぞれの量を変えてもよい(WO 03/101397 A2)。
【００４２】
本発明は同様に、本明細書において記述される本発明のウイルスのゲノムに対応する核酸分子(例えば、RNAもしくはDNA (例えば、cDNA)分子)、またはその相補体を含む。これらの核酸分子は、例えば、本発明のウイルスを製造する方法で使用することができる。そのような方法では、ウイルスのゲノムに対応する核酸分子を、ウイルスが産生されうるおよび複製できる細胞(例えば、初代細胞、ニワトリ胚、2倍体細胞系、または異数体細胞系(例えば、Vero細胞))に導入し、次いで、それ(またはその上清)から子孫ウイルスを精製することができる。これらの方法はさらに、当技術分野において公知であるように、ウイルス精製段階を含むことができる。
【００４３】
上で述べたとおり、本発明で使用できるキメラウイルスを作出する詳細は、例えば、米国特許第6,696,281 B1号; 国際出願PCT/US98/03894 (WO 98/37911)およびPCT/US00/32821 (WO 01/39802); ならびにChambers et al, J. Virol. 73:3095-3101, 1999に示されている。日本脳炎ウイルス(または西ナイルウイルス)の前膜および外被タンパク質、ならびに黄熱病ウイルスのカプシドおよび非構造タンパク質を含むキメラフラビウイルスの構築の詳細を以下のように示す。当業者はこれらの方法を、本明細書において記述される突然変異を含むキメラ、ならびにその他の前膜および外被配列を含むキメラの構築で用いるのに容易に適合させることができる。
【００４４】
手短に言えば、YF/JEキメラの誘導は以下を含むことができる。YFゲノム配列を二つのプラスミド(YF5'3'IVおよびYFM5.2)の中で増殖させる。これらのプラスミドはヌクレオチド番号1〜2,276および8,279〜10,861由来のYF配列(YF5'3'IV)ならびに1,373〜8,704由来のYF配列(YFM5.2)をコードする(Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989)。これらのプラスミドに由来する適切な制限断片のライゲーションにより、完全長の鋳型cDNAを作出する。次いで、YF5'3'IVおよびYFM5.2プラスミド内のYF配列をprMタンパク質の出発点(ヌクレオチド番号478、アミノ酸番号128)からE/NS1切断部位(ヌクレオチド番号2,452、アミノ酸番号817)までの対応するJE配列と交換する。
【００４５】
確実なJE構造タンパク質遺伝子のクローンは、JE SA14-14-2株(JE生弱毒化ワクチン株; JE SA14-14-2ウイルスはCenter for Disease Control, Fort Collins, ColoradoおよびYale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticutより入手可能である。これらは世界保健機関指定の米国内アルボウイルスリファレンスセンターである)から作出された。継代レベルPDK-5のJE SA14-14-2ウイルスを得、LLC-MK2細胞で継代させて、cDNAクローニングに十分な量のウイルスを得た。使われた戦略には、インビトロライゲーションに用いることができる、NheI部位(JEヌクレオチド番号1,125)で重複する二つの小片に構造領域をクローニングすることが含まれた。
【００４６】
RNAを感染LLC-MK2細胞の単層から抽出し、初めにpBluescript II KS(+)に、その後YFM5.2(NarI)にクローニングするための、それぞれ、入れ子になったXbaIおよびNarI制限部位を含むマイナスセンスプライマー(JEヌクレオチド配列番号2,456〜71)とともに逆転写酵素を利用し、マイナスセンスcDNAの第一鎖合成を行った。第一鎖cDNA合成に続いて、同じマイナスセンスプライマーと、pBluescriptおよびYFM5.2(NarI)にクローニングするための、それぞれ、入れ子になったXbaIおよびNsiI制限部位を含むプラスセンスプライマー(JEヌクレオチド配列番号1,108〜1,130)とを用いて、ヌクレオチド番号1,108〜2,471由来のJE配列のPCR増幅を行った。制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定によってJE配列を検証した。ヌクレオチド番号1〜1,130由来のJEヌクレオチド配列は、ともにEcoRI制限部位を含む、JEヌクレオチド番号1,116〜1,130に対応するマイナスセンスプライマーとJEヌクレオチド番号1〜18に対応するプラスセンスプライマーとを利用し、マイナス鎖JE cDNAのPCR増幅により得られた。PCR断片をpBluescriptにクローニングし、ヌクレオチド配列決定によってJE配列を検証した。併せて、これはヌクレオチド番号1〜2,471(アミノ酸番号1〜792)由来のJE配列のクローニングを示している。
【００４７】
YF E/NS1切断部位にJE外被タンパク質のC末端を挿入するため、E/NS1切断部位(YFヌクレオチド番号2,447〜2,452、アミノ酸番号816〜817)にシグナラーゼ配列のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発により、YFM5.2プラスミドに唯一のNarI制限部位を導入してYFM5.2(NarI)を作出した。この変化を組み込んだ鋳型に由来する転写産物を感染性について検査し、親の鋳型に類似の特異的感染性を得た(およそ100プラーク形成単位/転写産物250ナノグラム)。ヌクレオチド番号1,108〜2,471由来のJE配列は、唯一のNsiIおよびNarI制限部位を利用し、pBluescript/JEのいくつかの独立したPCR由来クローンからYFM5.2(NarI)にサブクローニングされた。JE prM-E領域に隣接するYF 5'非翻訳領域(ヌクレオチド番号1〜118)を含むYF5'3'IV/JEクローンはPCR増幅によって得られた。
【００４８】
YFカプシドとJE prMとの接合部を含む配列を得るため、この領域に及ぶマイナスセンスキメラプライマーをYF5'3'IVヌクレオチド番号6,625〜6,639に対応するプラスセンスプライマーとともに用いてPCR断片を作出し、この断片を、EcoRI部位上流のpBluescriptベクター配列に相補的なプラスセンスプライマーとともにマイナスセンスPCRプライマーとして用いて、ヌクレオチド番号477 (prMタンパク質のN末端)からヌクレオチド番号1,125のNheI部位までのJE配列(pBluescriptベクター中で逆方向にコードされた)を増幅した。得られたPCR断片をNotIおよびEcoRI制限部位を用いてYF5'3'IVプラスミドに挿入した。この構築体は、配列YF (C) JE (prM-E)が後ろに続くYF5'非翻訳領域に先行してSP6プロモーターを含んでおり、インビトロライゲーションに必要なNheI部位(JEヌクレオチド番号1,125)を含んでいる。
【００４９】
JE外被配列内のNheI部位を5'インビトロライゲーション部位として使用するため、YFM5.2プラスミド中の余分なNheI部位(ヌクレオチド番号5,459)を除去した。これはヌクレオチド番号5,461 (T C; アラニン、アミノ酸番号1820)でのYF配列のサイレント変異によって達成された。この部位を適当な制限断片のライゲーションによってYFM5.2に組み込み、キメラYF/JE配列をコードするNsiI/NarI断片の交換によってYFM5.2(NarI)/JEに導入した。
【００５０】
インビトロライゲーション用の唯一の3'制限部位を作出するため、YF5'3'IVおよびYFM5.2から完全長の鋳型を産生するのに通常使われるAatII部位の下流のBspEI部位を操作した(複数のAatII部位がJE構造配列の中に存在しており、この部位をインビトロライゲーションに用いることを不可能にしている)。BspEI部位をYFヌクレオチド番号8,581 (A C; セリン、アミノ酸番号2,860)のサイレント変異によって作出し、適切な制限断片の交換によってYFM5.2に導入した。この唯一の部位をXbaI/SphI断片の交換によってYFM5.2/JEに組み込み、これらの親プラスミド由来のおよびヌクレオチド番号1と番号6,912のEcoRI部位間のYF配列を欠いたYFM5.2 (BspEI)の誘導体由来の適切な制限断片の三片ライゲーションによってYF5'3'IV/JE (prM-E)プラスミドに組み込んだ。
【００５１】
発現実験でおよび防御免疫を誘発するその能力について十分に特徴づけられているJE Nakayama株のクローン由来のcDNA (例えば、McIda et al., Virology 158:348-360, 1987を参照のこと; JE Nakayama株はCenter for Disease Control, Fort Collins, ColoradoおよびYale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticutより入手可能である)を同様に、キメラフラビウイルスの構築に用いた。Nakayama cDNAはYF/JEキメラプラスミドの中に、インビトロライゲーション用のNheI部位を利用するため無傷で残された、49位の、単一のアミノ酸、セリンを除いて二つのプラスミド系のprM-E領域全体に取って代わるよう、利用可能な制限部位(HindIIIからPvuIIおよびBpmIからMunI)を用いて挿入された。
【００５２】
完全長の鋳型cDNAを作出する手順は、本質的にはRiceら(The New Biologist 1:285-96, 1989)に記述されているとおりである。キメラ鋳型の場合、プラスミドYF5'3'IV/JE (prM-E)およびYFM5.2/JEをNheI/BspEIで消化し、T4 DNAリガーゼの存在下、精製断片300ナノグラムを用いてインビトロライゲーションを行う。ライゲーション産物をXhoIで直線化して、ランオフ(run-off)転写を可能にする。SP6転写産物を、精製済みの鋳型50ナノグラムを用いて合成し、3H-UTPの取込みによって定量化し、RNAの完全性を非変性アガロースゲル電気泳動によって検証する。収量はこの手順を用いて1反応当たりRNA 5〜10 マイクログラムに及び、その大部分が完全長の転写産物として存在する。陽イオン性リポソームの存在下でのRNA転写産物のトランスフェクションをYF 17Dに対しRiceら(上記)により記述されているように行って、キメラウイルスを作出する。
【００５３】
西ナイルウイルスおよび黄熱病ウイルスの配列を含むキメラフラビウイルスの場合、上記の二つのプラスミド系を使用することもできる。一つの例では、使われる西ナイル(WN)ウイルスprMおよびE遺伝子をWNVフラミンゴ分離株383-99、配列GenBankアクセッション番号AF196835からクローニングした。ウイルスprME cDNAをRT-PCR (XL-PCR Kit, Perkin Elmer)により得た。WN prM遺伝子の5'末端を、Pwoポリメラーゼ(Roche)を用いた重複伸長PCRによってYF 17Dカプシド遺伝子の3'末端に正確にクローニングした。E遺伝子の3'末端を同様に、重複伸長PCRによってYF NS1コード配列の5'末端に正確にクローニングした。サイレント変異をprMおよびEの配列に導入して、唯一の制限部位Bsp EIおよびEag Iを作出した。これらの酵素を用いた二つのプラスミドの消化によってDNA断片を得、これをゲル精製し、インビトロでライゲーションして完全長のキメラcDNAを産生した。このcDNAをXho Iで直線化して、SP6ポリメラーゼ(Epicentre)によるインビトロ転写を進めやすいようにした。RNA産物を、ウイルスRNA翻訳およびウイルスの複製を許容する真核細胞系に導入した。上記のYF/JEキメラと同様に、本発明の突然変異は、標準的な方法を用いて、本明細書に記述されるYF/WNキメラに導入することができる。
【００５４】
その他のフラビウイルスキメラは、天然のまたは操作された制限部位および、例えば、表14に示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用い、類似の戦略により遺伝子工学で作出することができる。
【００５５】
本発明は、部分的に、以下の実施例に記述される実験結果に基づいている。
【００５６】
実施例
実施例1: ChimeriVax(商標)-WN
実験結果
背景と概要
キメラ黄熱病-西ナイル(YF-WN)ウイルスChimeriVax(商標)-WNは、WNウイルス(NY99)の前膜(prM)および外被(E)遺伝子のYF17D骨格への挿入によって産生された。このウイルスは無血清条件下のVero細胞(継代数5回、P5の時点)で産生され、前臨床モデルで安全性、免疫原性、および有効性について評価され、ヒトでの第I相試験において試験されている。ワクチンウイルス(P5)のさらなる弱毒化はEタンパク質中の三つのSA14-14-2特異的な突然変異(残基番号107、316、および440)によって判定される。ワクチンウイルスは、IC経路によりワクチン接種されたマウスおよびサルで試験された場合、YF-VAX (登録商標)よりも神経毒性が低く、単回のワクチン接種によってマウス、ハムスター、およびサルを防御した(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; Tesh et al., Emer. Infect. Dis. 8:1392-1397, 2002)。ワクチンウイルスには、Mタンパク質中66位のアミノ酸残基(M66)が一つ異なるウイルスの混合群(小型Sおよび大型Lのプラーク表現型を示す)が含まれた。この突然変異は8日齢の授乳マウスに対するウイルスの神経毒性に影響を与えなかった(Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004)。本発明において、本発明者らはM66突然変異が宿主内でのウイルス血症を低減し、したがって現行のワクチン(ChimeriVax(商標)-WN02、P5、親および突然変異体ウイルスの混合群)または大型のプラーク変異体(非突然変異体)ウイルスの安全性を向上させるために使用できるという発見について記述する。
【００５７】
TおよびCのヌクレオチド不均質性(CTA/CCA) (約50%)が無血清条件下のVero細胞で産生されたP5時点のChimeriVax(商標)-西ナイルワクチンウイルスのコンセンサス配列で確認された。この突然変異は膜(M)タンパク質中の残基番号66 (本明細書においてM66突然変異と指定される)にアミノ酸のプロリン(突然変異体)またはロイシン(親野生型)のいずれかを含むウイルスの存在をもたらすはずである。ChimeriVax(商標) WN02およびChimeriVax(商標) WN02 M66変異体の配列は、別配列表に示されており、この表にはこれらのタンパク質のアミノ酸配列のアライメントも含まれる。
【００５８】
西ナイルウイルスのMタンパク質は75アミノ酸を含む。タンパク質の構造が予測され、http://www.predictprotein.orgウェブサイトへのタンパク質配列の投稿によってJE SA14 (AAA67174)、Kunjin (AAP78942)、MVE (CAA27184)、SLE MSI (AAP44973)、およびSLE CORAN (AAP44972)のMタンパク質の構造と比較された。予測された構造の全てで、Mタンパク質の最初の40アミノ酸
2008520187.tif 000003
は膜領域以外にあると予測され、その一方で残りの35アミノ酸(40〜75)
2008520187.tif 000004
はウイルス膜領域内にあると予測される。さらに、最初の40アミノ酸残基内には9〜10個の荷電アミノ酸(3〜4個の酸性アミノ酸EまたはD)および6個の塩基性アミノ酸(RまたはK)が存在するのに対し、本明細書で記述される5種全てのフラビウイルス(WNV、SLE、MVE、JE、およびKunjin)の残基番号60には荷電アミノ酸(塩基性)が一つしか存在しない。したがって、M60残基がその隣接するアミノ酸内での相互作用によりウイルスの生物学において決定的な役割を果たすということなのかもしれない。
【００５９】
P5時点のワクチンウイルスのプラーク形態から、LおよびSプラークサイズ表現型の混合群であることが明らかになった。P2、P3、P4、およびP5ウイルスの配列決定から、突然変異は最初にP4で現れ(全群の10%)、P5では約50%に達したことが明らかになった。ワクチンウイルスのSおよびLプラーク分離株の配列決定により、突然変異がLからSへのプラークサイズの変化に関与していることが示された。SおよびLの両ウイルス変異体(研究用ウイルスとして調製された)は、8日齢の授乳マウスに対するその神経毒性が有意には違わなかった(p=<0.0001)。
【００６０】
LおよびSの両ウイルスのプレマスターシード(Pre-Master Seed)(PMS, P10)ストックは、3ラウンドの直接的なプラーク間精製および2ラウンドのウイルス増幅により「無菌の実験室条件」下のChimeriVax(商標)-WN02 (p5)由来Vero細胞で産生された。P10 SおよびLウイルスの配列決定によって、M66残基の単一アミノ酸の相違が明らかになった(SウイルスはM66残基にプロリンを含んでいたのに対し、Lウイルスはこの部位にロイシンを含んでいた)。M66突然変異は大規模な製造条件下で安定であるように思われた。Sプラークウイルス(P10, PMS)は皮下接種によってハムスターに接種された場合、これはワクチンウイルス(P5)またはLプラークウイルス変異体(P10, PMS)に比べて非常に低いレベルのウイルス血症を引き起こした。ChimeriVax(商標)-WN P5ウイルス(約50:50のSおよびLプラーク変異体を含んでいた)を接種されたサルおよびヒトの血清では、ウイルスの大部分はLプラークサイズ表現型のものであった。さらに、Sプラークはヒト肝細胞系においてLプラークよりも低い力価になることが示された。これらのデータから、Sプラークウイルス(M66突然変異を有するChimeriVax(商標)-WN02)は、ChimeriVax(商標)-WN02 (M66突然変異がない)よりもヒトにおいてウイルス血症のレベルが低く起こる可能性があり、したがって高齢者、小児、またはHIV感染者などの「危険性がある個体」に適した(安全な) WNワクチンの候補となりうることが示唆された。M領域中のさらなる突然変異がP10からP12のPMS Sプラークの大規模製造による継代(例えば、M62、M63、およびM64)またはChimeriVax(商標)-WN02ワクチンを接種されたサル(例えば、M60、M61、およびM63)から単離された個々のプラークの配列決定によって見出された。これらの突然変異を本発明のウイルスの構築で使用することもできる。
【００６１】
Vero細胞でのSおよびLプラークウイルスのPMSの産生
ChimeriVax(商標)-WN02ワクチン材料(P5)を無血清Vero細胞中で増殖させた:「小型」(S)と同定された10プラークおよび「大型」(L)と同定された10プラークをピックした。次いで、各分離株を無血清Vero細胞にて継代し、1プラークを各分離株からピックした。この手順を計3ラウンドのプラーク精製の間に、もう一度繰り返した。プラーク精製された分離株(P8)を、無血清Vero細胞を含有するT25 cm2フラスコの中で増幅させ(および無血清(SF)培地中で増殖させ)、次いで回収し、-80℃で保存した。分離株を配列決定して、誤った突然変異を含んでいないPMS候補を見出した。2つの分離株は発現された(サイレントではない)突然変異を含んでいないと同定された: 1つの分離株は小型のプラーク(M66プロリン)であると確認された(表1)、およびその他はwt配列(M66ロイシン)を含んでいた(表2)。次いで、これらの2つの分離株を大きいフラスコの中で増殖させ、等分し、LPおよびSP PMS (P10)ウイルスとしてQCインベントリに付した。
【００６２】
大規模に産生されたSPウイルスの遺伝的安定性
Sプラーク表現型が大規模製造過程の間に安定であるかを判定するため、小型プラークのPMSウイルスをVero細胞に感染させ、無血清条件下で増殖させることにより生物反応器の中で2回継代して、P12ウイルスを産生させた。P12ウイルスを回収し、6ウェルプレート中でプラーク形成させた。プラークの大部分は小サイズのものであった。利用可能な最大のプラークのうち20個をピックし、O-Veroにて増幅させ(継代1回)、prME領域をTitan One-Tube RT-PCRキット(Roche)によって転写/増幅させた。M領域を含むcDNA断片を配列決定し、WN特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫染色によって分離株の形態を確認した。20プラークのうちの13個にはM66 (SP形態に関与する遺伝子マーカー)だけが含まれ、5個の分離株にはM66に加えてその他の突然変異が含まれていた。分離株#4にはM63 (LP表現型)がふくまれ、分離株#16にはwtとM66の混合群が含まれた。これらのデータから、一部のプラークは大きなサイズのものであるように思われたという事実にもかかわらず、それらがM66突然変異を含んでおり、増幅によってハッキリとSサイズのものであることが実証された。20個のうち1個のプラーク(#4)だけが、明らかにM63でのLからPの突然変異に起因して、Lサイズのものであるように思われた。プラーク#16はM66位でwtのLと突然変異体のPアミノ酸の両方を含む大型と小型のプラークサイズのウイルスの混合群を産生するように思われた(表3)。
【００６３】
肝細胞でのChimeriVax(商標)-WNウイルス変異体の増殖
ヒト肝細胞がん細胞系HepG2およびTHLE-3細胞に0.005のMOIでChimeriVax(商標)-WN01 (野生型prME)、ChimeriVax(商標)-WN02 P5 (E107、E313、E316、E440の突然変異、M66 L/P混合アミノ酸、SおよびL混合プラークを含む)、ChimeriVax(商標)-WN LP (E107、E313、E316、およびE440、WNL)、ならびにChimeriVax(商標)-WN SP (E107、E313、E316、E440、およびM66P、WNS)を感染させた。上清を毎日回収し、標準的なニュートラルレッド含有アガロース重層法を用いてO-Vero細胞で力価判定した。
【００６４】
HepG2細胞(図3)では、最大のウイルス増殖(7×106 PFU/ml)はWN01 (野生型prME)で5日目に確認され、その次が5日目のLPのもの(2.7×106 PFU/ml)であった。YF-VAX(登録商標)でのウイルスピークには3日目に到達し(1.17×106 PFU/ml)、その次が4日目のWN02混合ワクチンウイルス(6.4×105 PFU/ml)であった。最低の増殖はSPウイルスで見られた(4日目のピーク力価が6.1×105 PFU/mlであった)。このウイルスにはM66に単一のアミノ酸置換(LからP)が含まれていた。THLE-3細胞(図4)では、YF-VAX(登録商標)の力価がLPウイルスのものよりも若干高かったことを除き、HepG2細胞の場合と同じパターンが確認された。最大の力価はこの場合もやはりWN01 (1.3×105 PFU/ml、4日目)で認められ、その後がLP (5.7×104 PFU/ml、7日目)、YF-VAX(登録商標) (8.8×104 PFU/ml、4日目)、および混合P5ウイルス(1.8×104 PFU/ml、4日目)のものであった。最低の力価はこの場合もやはりSPウイルス(9.2×103 PFU/ml、4日目)で確認された。
【００６５】
細胞変性効果(CPE)の誘導を各ウイルスに対して毎日記録した(表4)。WN 01およびLPウイルスに対するCPEは最初に5日目に確認され、2日後に完結した(100%)のに対し、SPまたは混合プラーク群はCPEをさらに早い時点(3日目)に誘導し、WN01またはLPよりも1日早く(6日目)細胞単層を完全に破壊した。YF-VAX(登録商標)でのCPEの誘導は最初に3日目に確認され、単層は接種から6日後までに完全に破壊された。HepG2細胞でのCPEの誘導は、野生型デングウイルスで示されているように(Catteau et al., J. Gen. Virol. 84:2781-2793, 2003)、Mタンパク質のアポトーシス活性が原因であるかもしれない。これらのデータはSPウイルス変異体が混合ウイルスまたはLPウイルスのものよりも低い力価になることを示しており、M66突然変異がウイルスをヒトに対していっそう低い肝親和性とした可能性があることを示唆していた。
【００６６】
混合(SPおよびLPウイルス) P5ワクチンウイルスによるサルのワクチン接種後のChimeriVax(商標)-WN、SPウイルスの検出の欠如
WN、JE、およびYFウイルスなどの、フラビウイルスに対する検出可能な抗体を欠いた(プラーク減少中和試験(PRNT)によって判定した場合)実験未使用のカニクイザル計8頭にChimeriVax(商標)-WN02 (P5) (n=4)またはYF-VAX(登録商標) (n=4)のいずれかを皮下経路により接種した。本研究の目的は3日の観察期間の間のChimeriVax(商標)-WN02ワクチンのウイルス血症、生体内分布、および毒性の可能性を評価することであった。接種量はChimeriVax(商標)-WN02およびYF-VAX(登録商標)に対し、それぞれ約1.25×105 PFU/0.5 mLおよび5.5×104 PFU/mLであった。動物から毎日採血し、動物を接種から4日後に殺処理した。Vero細胞での標準的なプラークアッセイを用いてウイルス血症レベルを判定するのに血液を使用し、その一方、回収された組織はウイルス分析のために急速冷凍されたかまたは組織病理学的評価のために保存されたかのいずれかであった。
【００６７】
ウイルス血症は1日目(接種前)から4日目(安楽死の前)までに集められたサル血清で評価された。アッセイは記述のように(Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000)、アガロース重層とニュートラルレッド染色の利用によって(個々のプラークを単離し配列決定するため)またはメチルセルロース重層とクリスタルバイオレット染色によって(ウイルス血症のレベルを測定するため)行われた。ChimeriVax(商標)-WN02が接種されたサルでのウイルス血症の程度と期間は、YF-VAX(登録商標)のものよりも大きかった(表5)。ウイルス血症に関するYF-VAX(登録商標)の最大の力価は200 PFU/mL (動物MF21157、4日目)であった。ウイルス血症に関するChimeriVax(商標)-WN P5ウイルスの最大の力価は1000 PFU/mL (動物MF21191F、4日目)であった。ChimeriVax(商標)-WN02ウイルスを接種された全ての動物(4/4)が接種後の3日間にウイルス血症であったのに対し、YF-VAX(登録商標)を接種された2/4の動物しかウイルス血症にならなかった(2日間だけ) (表5)。
【００６８】
ChimeriVax(商標)-WN02ウイルスを接種された動物はSPおよびLPウイルスの混合物を受けていたので、高レベルのウイルス血症に関与するウイルス変異体(SまたはL)を同定するため、血清から各種のSPおよびLPウイルスを単離することが必要であった。接種後の2日目から4日目までに得られた4頭全てのサルの血清を1:2および1:10に希釈し、Vero細胞を播いた6ウェルプレートの二重ウェルに接種するのに用いた。ニュートラルレッドを含有する2回目のアガロース重層の付加後、個々のプラーク(4つのSおよび3つのLプラーク)をピックし、直接的に配列決定してM66突然変異体ウイルスの存在を同定した(表6)。単離されたプラークのどれもM66突然変異(LからPの置換)を含んでいなかったことから、M66突然変異体ウイルスが、これらの動物で検出された高レベルのウイルス血症に関与していないことが示唆された。興味深いことに、その他の3つの突然変異がM領域内で確認された(M60、M61、おおびM63)。これらのウイルス変異体がChimeriVax(商標)-WN02ワクチンウイルスの中に少量で存在していた(コンセンサス配列の決定により検出できなかった)可能性があり、またはそれらがLPウイルス変異体のゲノム中の突然変異によってインビボ(サル)で産生された可能性がある。
【００６９】
ChimeriVax(商標)-WN SP (PMS、P10)、LP (PMS、P10)、または混合(P5、SP、およびLP)ウイルスを接種されたハムスターでのウイルス血症および中和抗体応答
本研究で使われた動物は、BL2下のマイクロセパレータ内で管理され、研究の間中IACUCにより承認された動物プロトコルにしたがって扱われた。3種のChimeriVax(商標)-WN02ウイルス(SP、PMS、P10; LP、PMS、P10、ならびに混合SPおよびLPワクチンウイルス、P5)を用いて、Harlan Sprague-Dawley系由来の7週齢雌性ゴールデンシリアンハムスター(Mesocricetus auratus)に感染させた。各ウイルスをハムスター15匹の群へ皮下経路を介して鼠径部に注射した。感染量は105 pfuであり、接種量は100 μlであった。動物5匹のさらなる群にシャム対照としてウイルス希釈剤100 μlを同様に注射した。ウイルス感染日(0日目)および感染から5日後までの各後日に、血液サンプルをシャム対照群以外の全動物から後方眼窩採血によって採取した。動物は採血および接種の前にイソフルオランの吸入によって効くまで麻酔させた。試験サンプルのウイルス濃度は、12ウェルプレートの中で増殖されたVero細胞培養物の二重ウェルにおいて10倍希釈済み血清サンプル0.1 mLを直接的にプラーク形成させることにより測定された(図5)。
【００７０】
図5に示されるように、LPウイルス感染ハムスターから採取された血清サンプルではいっそう高いレベル(平均してpfu 3 log)のピーク時ウイルス血症が確認されたのに対し、SPウイルス接種ハムスターの血液サンプルでは非常に低いレベル(＜10 pfu)のウイルス血症が認められた。接種材料中でのSPウイルスの割合が増やされた場合(混合プラークウイルスに関しては50%にまで)、ピーク時のウイルス血症の力価は、LPウイルスにより誘発されたウイルス血症レベルのおよそ半分にまで低下した。さらに、ウイルス血症のピーク時間は、感染後の少なくとも1日から4日間遅れた。
【００７１】
これらのデータから、同一の親ウイルスから単離されたLPおよびSP変異体のChimeriVax(商標)-WN02は、異なる生物学的特性を有することが実証された。LPウイルスはハムスターにおいてSPウイルスに比べ、より速い速度でいっそう高いレベルにまで複製した。さらに、SPウイルスをLP (P5ウイルス)と混合することで、LPウイルスのある種の特性は明らかに相殺される。これはハムスター感染実験で示されており、この場合、血中ウイルスの存在がいっそう低いレベルにまで低減し、ウイルス複製反応速度が混合ウイルス感染ハムスターで低下した。つまり、SP変異体ウイルスに存在するM66での突然変異(LからP)は、ハムスターにおいてそのウイルス血症を著しく低下させた。
【００７２】
実施例2: ChimeriVax(商標)-JEおよびChimeriVax(商標)-DEN1〜4
背景と概要
以下に記述される研究において、本発明者らはウシ伝染性脳症のプリオン因子によるワクチン汚染の可能性に関する懸念を排除するため、無血清(SF)培地中で増殖されたVero細胞を用いて新たなChimeriVax(商標)-JEシードウイルスを調製し、特徴づけた。SF培養での増殖の間、クローニングされていないウイルスは、血清含有培養で以前には見られなかった突然変異を蓄積しており、これはウイルス複製の速度を増大させる、SF増殖条件への適応であるように思われた。これらの突然変異はEまたはMタンパク質中で起こっており(E-107でのFからLまたはM-60でのRからCの突然変異)、ウイルス複製の過程におけるMタンパク質の機能的重要性を示唆するものであった。それらはSF条件でのウイルス増殖の間に顕著になった(実施例1 (ChimeriVax(商標)-WN)に示されるMタンパク質の60位のアミノ酸Rを参照のこと)。ワクチンの生物学的特性に及ぼすMタンパク質内部(M60、ChimeriVax(商標)-JEではM5)またはEタンパク質内部(ChimeriVax(商標)-JEではE-107、ChimeriVax(商標)-DEN1および-DEN3ではE202/204ならびにChimeriVax(商標)-DEN2ではE251)の突然変異の影響が規定された。これらのキメラウイルスの全てが既に治験において試験されている。
【００７３】
材料と方法
細胞と培地
Vero細胞は、もとはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC; Manassas, VA; CCL 81; アフリカミドリザル腎細胞)から受け取った。これらの細胞をSF培地中で増殖するように適合させ、継代数133でBaxter (Orth, Austria)から得た後に、フラスコの中に播いて直接的に用いるかまたは細胞バンクから継代数136で始めて播いた。全ての実験において、Vero細胞の継代レベルは継代数149を超えなかった。細胞およびウイルスを7.5% CO2下、36℃で増殖させた。細胞をSF条件下で増殖させた。
【００７４】
ChimeriVax(商標)-JE変異体
前臨床試験および治験で試験された非SF ChimeriVax(商標)-JEワクチン候補の産生のため以前に使われ(Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002)、既報(Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999)のように調製された、同一のインビトロRNA転写産物(-80℃で保存された)を用いてのSF Vero細胞のエレクトロポレーションにより、ウイルスを始動させた(継代P1)。増幅的継代を通常、0.001 pfu/細胞のMOIで行い、ウイルス収集物を感染後3〜4日で(CPEが約10%であった場合に)回収し、低速の遠心分離によって清澄化し、10%ソルビトールを追加し、-80℃で保存した。クローニングされた変異体は、ガンマ線を照射したFBS (HyClone; SF培地を用いて調製された寒天下で細胞はプラークを形成できなかったので、FBSが使われた)の存在下、標準的な寒天ニュートラルレッド重層法を利用した3回連続のプラーク精製によりBaxter Vero細胞で産生させ、その後SF条件で増幅させた。指定のサンプルでウイルス力価を測定するためのプラークアッセイは、感染後5日でのクリスタルバイオレットによるプラークの可視化とともに単回のメチルセルロース重層法を利用して行った。
【００７５】
ChimeriVax(商標)-DENウイルス
ChimeriVax(商標)-DEN1〜4ワクチンウイルスは、ウイルスcDNAから調製されたRNA転写産物を用いてのVero細胞のエレクトロポレーションにより調製された。子孫ウイルスを3ラウンドのプラーク精製に供して、継代数7 (P7)の時点でプレマスターシード(PMS)ウイルスを産生させた。さらに3回の継代を米国の現行の医薬品、医薬部外品の製造管理および品質管理基準(Good Manufacturing Practice)(cGMP)により行って、ワクチンロット(P10ウイルス)を産生した。Vero細胞での複数回の継代後に、いくつかの突然変異がキメラのE遺伝子中に現れた(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004)。これらの突然変異のうちの一つ(ChimeriVax(商標)-DEN1中のE204)は、非ヒト霊長類においてウイルスの内臓向性を著しく低下させた(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004)。
【００７６】
コンセンサス配列の決定
指示されたウイルスサンプルのコンセンサス配列の決定は、既報(Pugachev et al., Vaccine 20:996-999, 2003)のように行われた。手短に言えば、TRIZOL LS試薬(Life Technologies-Gibco BRL)を用いて抽出されたウイルス粒子RNAをTitan One-Tube RT-PCRキット(Roche)により、長さが約2〜3 kbの重複する5つのcDNA単位複製配列で増幅させた。正と負の両方向のJE特異的なおよびYF特異的なオリゴヌクレオチドプライマーならびにCEQ Dye Terminator Cycle Sequencingキット(Beckman)を用いて単位複製配列を配列決定した。配列決定用の反応産物はCEQ2000XL自動配列決定装置(Beckman Coulter)で分解した。Sequencher 4.1.4 (GeneCodes)ソフトウェアを用いて、データをアライメントし解析した。ヌクレオチド不均質性は、プラス鎖とマイナス鎖の両方の配列決定反応に相当する全てのクロマトグラムで不均質なシグナルが確認された場合に記録された。一部のウイルスについては、構造遺伝子を含む、5個のcDNA単位複製配列のうちの1番目(断片I)だけが配列決定された。
【００７７】
授乳マウスでの神経毒性
マウスの管理と世話は、実験動物の人道的使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従った。妊娠非近交系ICR雌性マウスはTaconic Farms (Germantown, NY)から購入した。新生マウスを育成し、接種の6日前に新たな群に混ぜ合わせた。8日齢の授乳マウスの群に脳内(IC)経路によって指示されたウイルスサンプル0.02 mlを接種した。接種に使われたウイルスの1:10連続希釈はMEM-10% FBS中で行われた。未希釈の接種材料を逆力価判定し、各希釈液の正確な用量を計算した。死亡率を21日間にわたって記録した。YF 17D対照ウイルスは市販のワクチンバイアルから再構成されたYF-VAX(登録商標) (Aventis Pasteur, Swiftwater, PA)とした。
【００７８】
サルでの安全性と有効性試験
実験1
YF-VAX(登録商標)対照(YF 17Dワクチンウイルス)と比べたときの、新たなクローンC (M-60) ChimeriVax(商標)-JEのワクチンマスターウイルスバンク(Vaccine Master Viral Bank) (MVB; P11)とプロダクションウイルスバンク(Production Viral Bank) (PVB; P12)ストックの神経毒性と毒性プロファイルをカニクイザルにおいてGLP基準にしたがって研究した。実験未使用の、フラビウイルス血清反応陰性(HAI試験により判定された場合)カニクイザル33頭を表9に示される処置群に割り当てた。全てのサルに単回のIC注射を介して1日目に投薬し、30日間観察し、それから安楽死させて解剖した。サルを臨床的徴候(毎日2回)、ならびに飼料消費(毎日)、体重(毎週)、および臨床病理学的指数の変化について評価した。黄熱病ワクチンに関する世界保健機関(WHO)の必要条件(WHO, Technical Report Series, No. 872, 1998)に基づき、臨床スコアリングシステムにしたがって臨床スコアを割り当てた。血液サンプルを臨床病理学的解析(血液生化学的および血液学的パラメータ)のため、1日目の接種前にならびに3、5、7、15、および31日目に採取した。さらなる血液サンプルをウイルス血症の定量的測定のため1日目(投薬前)および2〜11日目に採取し、中和抗体力価分析のため1日目(投薬前)および31日目に採取した。完全な解剖は31日目に行い、組織を保存用に採取した。組織を肝臓、脾臓、心臓、腎臓、および副腎の病理組織診断用に調製した。Levenbookら(J. Biol. Stand. 15:305, 1987)により記述され、黄熱病ワクチンに関するWHOの必要条件(WHO, 1998)に組み入れられている方法にしたがって、脳および脊髄の病理組織診断を行った。
【００７９】
実験2
この実験はカニクイザルにおいて単回皮下(SC)投与後30日間にわたりChimeriVax(商標)-JEワクチン[Eタンパク質の疎水性尾部内のE491でのLからFの変化を除いて突然変異を含有していない、FBS存在下のLS5 Vero細胞で以前に産生された、オリジナルの非クローン化ワクチンP5 (BB-IND #9167, Serial #000)]および新たなクローンC (M-60突然変異体) ChimeriVax(商標)-JE精製ワクチン大量調製物(P13)のウイルス血症、免疫応答、および安全性をGLP基準にしたがって比較するために行われた。実験未使用の、フラビウイルス血清反応陰性(HAI試験による)カニクイザル18頭を表10に示される処置群に割り当てた。全てのサルにSC注射を介して片腕の単一個所に1日目に一度投薬した。サルを毒性の臨床的徴候(毎日2回)、体重の変化(毎週)、ならびに血液生化学的、血液学的、および凝固パラメータについて評価した。血液サンプルを血液生化学的、血液学的、および凝固パラメータ分析のため、1日目(接種前)にならびに4、7、15、および31日目に採取した。さらなる血液サンプルをウイルス血症の定量的測定のため1日目(接種前)および2〜11日目に採取し、日本脳炎ウイルス特異的な血清抗体の力価分析のため1日目(接種前)および31日目に採取した。
【００８０】
ウイルス不活性化のpH閾(間接的融合アッセイ)
低pHへのフラビウイルスの曝露(細胞膜の非存在下で)の結果の一つが、Eタンパク質の不可逆的な立体構造変化の誘導とウイルス不活性化(効力の喪失)である。細胞膜の存在下では、これらの立体構造変化は、細胞膜のものとのウイルス膜の融合に必要であり、宿主細胞へのウイルスゲノムの放出を結果的に引き起こす。蚊細胞系C6/36を用いて、WN、DEN、YF、およびJEなどの蚊媒介性ウイルスに対する融合のpH閾を内部からの融合(FFWI)により測定することができる(Guirakhoo et al, Virology 169(1):90-99, 1989)。しかしながら、本発明者らは、恐らく蚊および蚊細胞系でのウイルスの十分な増殖の欠如によって、本発明者らのChimeriVax(商標)ウイルスの全てでFFWIを実証することができなかった(Johnson et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 70(1):89-97, 2004)。したがって、本発明者らは「間接的融合アッセイ」と本明細書で呼ばれるアッセイにおいて、異なるpHレベルへの曝露後のウイルス効力の喪失を測定することを試みた。このアッセイでは、細胞膜のものとのウイルス膜の融合が起こるpH閾を間接的に測定する。
【００８１】
融合は2 mM L-グルタミン、2.7%重炭酸ナトリウム、10% HI FBS、およびMES (Sigma)で適切なpHに調整された1%抗生物質/抗真菌溶液[100 U/mlのペニシリン、0.1 mg/mlのストレプトマイシン、0.25 μg/mlのアンホテリシン(Sigma)]を補った1×MEMを利用し、pH 7.0、6.8、6.6、6.4、6.2、6.0、5.8、5.6、5.4、および5.0で行われた。1×104プラーク形成単位(PFU)/mlの各ウイルス液の一定分量を各pHの培地に希釈(10倍希釈)した。各pH値での10分の曝露後、50%熱不活化(HI) FBSを各バイアルに加え、各溶液のpHを重炭酸ナトリウムで中性にした。各pH値の各ウイルス液100 μl容量を用いてVero細胞の単層(6ウェルプレート中に9×105細胞/ウェルの密度で播かれた)に感染させ、その力価を測定した。50 PFU/ウェルをもたらすように、感染は二重で行われた; プレート1枚につき非感染の細胞2ウェルを残しておき、陰性対照として役立てた。pH 7.0および6.8のサンプルを参照基準とした。力価を標準的なプラークアッセイにより分析した。このアッセイでは、Vero細胞にウイルスの連続希釈液(10-1〜10-6)を二つ組のウェルで感染させた。感染後、Vero単層に2 mM L-グルタミン、2.7%重炭酸ナトリウム、5% HI FBS、1%抗生物質/抗真菌溶液[100 U/mlのペニシリン、0.1 mg/mlのストレプトマイシン、0.25 μg/mlのアンホテリシン(Sigma)]、および44%の0.6%アガロース(Sigma)を補った1×MEM (Sigma)を重層した。細胞を37℃、5%CO2で4日間インキュベートし、次いで2 mM L-グルタミン、2.6%重炭酸ナトリウム、2% HI FBS、1%抗生物質/抗真菌溶液、44%の0.6%アガロース、および3%のニュートラルレッド溶液(Sigma)を補った1×MEMを含有する二度目の重層液で重層した。二度目の重層液の添加から24時間後にプラークを計測して、1ミリリットル当たりのプラーク形成単位(PFU)で定義されるウイルスの力価を測定した。
【００８２】
Vlaychevaら(J. Virol. 76:6172-6184, 2002)によるウイルス侵入アッセイ
M-60突然変異(およびE-107突然変異)がSF Vero細胞での侵入を促進することを実証するため、SF Vero細胞に5、10、20、または60分間、SF培地に適切に希釈されたクローンA、C、およびIウイルスを感染させ、その後0.1 Mグリシン、0.1 M NaCl、pH 3.0で3分間処理して、細胞外のウイルスを不活性化させた。ウェルをPBSで2回洗浄し、次いで単層にメチルセルロースを重層した後、クリスタルバイオレットを用いて5日目にプラークを染色した。グリシンの代わりにPBSで処理された対照感染ウェルと比べたときの、グリシン処理後に確認されたプラーク数の割合として侵入率を計算した。
【００８３】
ChimeriVax(商標)-JEの治験
臨床試験(プロトコルH-040-003)が行われた。健常な成人男性および女性被験者に投与されたワクチンは、M60に天然配列(アルギニン)を持っていた。健常な成人被験者/群はChimeriVax(商標)-JEワクチンの段階的用量の皮下投与を受け、各種の対照群が含まれた。1用量群につき被験者11〜33人が試験された。Vero細胞単層でのプラークアッセイによって、ウイルス血症が毎日測定された。同一のアッセイおよび検査室により、両試験でのウイルス血症レベルが測定された。
【００８４】
安全性評価には有害事象、体温、身体検査、および検査室検査(ウイルス血症レベルの測定を含む)の記録が含まれた。ウイルス血症はChimeriVax(商標)-JEを受けている被験者の大部分に見られた。
【００８５】
第二の試験(プロトコルH-040-007)は健常な成人男性および女性被験者で行われ、この場合、1群当たり被験者31または32人がM60システイン突然変異を含有するChimeriVax(商標)-JEの段階的な皮下投与量(3、4、または5 log10 PFU)を受けた。投与量範囲は、2.8、3.8、および4.8 log10 PFUを受けた被験者における前回の試験でのものと同様であった。
【００８６】
結果
非クローン化SF ChimeriVax(商標)-JEウイルスの適応突然変異、およびクローン化変異体の調製
本研究で産生されたウイルスサンプルの線図を図6に示す。クローニングされていない継代数2回(P2)の初期サンプル(プレマスターシード候補; PMS)は、以前の研究(Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002)のためFBS含有培地中でワクチンを産生するために用いられたインビトロRNA転写産物を細胞にトランスフェクトし、続けてさらに増幅的継代を行うことによりSF培養で得られた。このウイルスの全ゲノムを配列決定し、検出可能な任意の突然変異を含まないことが示された(表7) (コンセンサス配列決定法では微量な亜集団を検出していない; 突然変異の検出限界は約10%であることに留意されたい)。このP2ウイルスから始めてP10レベルまでの小規模継代をT25フラスコ中で行って、SF培養での持続的増殖の間にその遺伝的安定性(g.s.)を分析した(図6; g.s.継代)。g.s. P5およびg.s. P10継代物の全ゲノム配列には、残基M-60でのRからCのアミノ酸置換を引き起こす、ヌクレオチド番号935でのCからTの1ヌクレオチド変化があった(表7)。この突然変異はg.s. P3ではなく、g.s. P4継代物で不均質性として最初に検出可能であった。
【００８７】
小規模な遺伝的安定性分析の結果にもかかわらず、3回の大規模製造によるSF継代を非クローン化P2 PMSからローラーボトル中で行って候補用の非クローン化マスターシード(Master Seed) (P3)およびプロダクションシード(Production Seed) (P4)を産生させ、その後100 Lの生物反応器中でワクチンバルク(P5)を産生させた場合、異なる突然変異、つまり50:50%の不均質性として確認された、ヌクレオチド番号1301でのTからCの変化による残基E-107でのFからLのアミノ酸変化が蓄積した(表7)。これは許容できない突然変異であった。何故なら、それは重大な意味を持つ弱毒化残基(Arroyo et al., J. Virol. 75:934-942, 2001)でのSA14-14-2配列から野生型JE配列への復帰突然変異であり、したがってワクチンの安全性を損なう可能性がありうるからである。
【００８８】
下記の検討事項に基づき、今度はクローン化PMS候補をプラーク精製により作出して、SFワクチンを安定化し、E-107などの、望ましくない突然変異の蓄積を阻止した。プラーク精製により、YF 17D-特異的なRNAポリメラーゼによるウイルスRNA合成に比べて、RNA合成の低忠実度によって特徴づけられるインビトロ転写により導入された、非クローン化ウイルスでのランダム突然変異を取り除く(Pugachev et al., J. Virol. 78:1032-1038, 2004)。非クローン化P2 PMSウイルスから始めて、任意のアミノ酸置換のなかったP7の生物学的クローン、つまりクローンAウイルスは3回の連続的プラーク精製に続けてSF培地での2回の増幅的継代により得られ、非突然変異体P7クローンA PMSと名付けられた。そのゲノムには、ヌクレオチド番号6952および7147に、2つのサイレントなヌクレオチド変化が含まれていた(表7)。これらの変化は許容可能であった。何故なら、それらはウイルスタンパク質のアミノ酸配列を変化させず、効率的なウイルス複製に必要不可欠なシス作用性RNA要素の外側に位置していたからである。M-60突然変異を含有するクローンC P10ウイルス(M-60 P10 クローンC PMS変異体と名付けられた)は、P5 g.s.ウイルスから始めて同様に産生された(図6)。これには、所望のM-60突然変異に加えて、ヌクレオチド番号3616でのサイレントなヌクレオチド変化が含まれていただけであった(表7)。さらに、その後、研究グレードのクローンIおよびクローンEウイルスは同様に、Vero細胞での単一のプラーク精製(大型プラークの選択)と1回の増幅的継代によって非クローン化P5ワクチンバルクウイルスから単離された。クローンIにはE-107残基での単一のアミノ酸変化が含まれ、この変化はアミノ酸Lへのアミノ酸Fからの、野生型への復帰突然変異であった。このように、クローンIはE-107復帰突然変異体の純粋な集団に相当する。クローンEにはMタンパク質のN末端に単一のアミノ酸突然変異、つまりM-5残基でのQからPのアミノ酸変化が含まれていた。
【００８９】
クローン化PMS変異体の遺伝的安定性を確かめるため、製造事象を模倣した比較的大規模なg.s.継代をSF培養で行った(図6) (Sと名付けた連続継代はT-225フラスコの中で行い、Fと名付けた継代は、Vero細胞がCytodex Iマイクロキャリヤビーズ上で増殖された5または15 Lの生物反応器の中で行った)。prM-E領域(cDNA断片I)のみの配列決定を両候補のSSSおよびSSFサンプル(それぞれ、3回の静置継代、または2回の静置継代に加えて1回の発酵槽での継代によって得られた)、ならびにM-60変異体のFFFサンプルについて行った。これらのg.s.サンプルのどれもクローンCのM-60突然変異以外にはウイルスのprMまたはEタンパク質に検出可能な突然変異を持っていなかった。E-107突然変異の痕跡は全く残っていなかった(表7)。このことは、許容されるレベルの遺伝的安定性がプラーク精製により達成されたことを示唆するものであった。M-60変異体の高い遺伝的安定性がその後、細胞工場で産生された新しいマスター(P11)およびプロダクションウイルス(P12)シードならびに50 Lの生物反応器中で産生された最終のワクチンバルク(P13)の製造の間に確認され、コンセンサス配列の決定により、それらは全てM-60突然変異を保持していたが、その全ゲノム中に検出可能なその他の変化を持っていなかった。
【００９０】
SF Vero細胞でのウイルス増殖に及ぼすM-60およびE-107突然変異の影響
SF培養での非突然変異体、M-60突然変異体、およびE-107突然変異体ウイルスの増殖速度を比較するため、細胞に0.001 pfu/mlのMOI (逆力価判定により確認された)で非クローン化P2 PMS、非クローン化P5 g.s.サンプル(M-60突然変異体)、または非クローン化P5ワクチンバルク変異体(E-107突然変異を含有する)、ならびにある割合のE-107突然変異を同様に含有する非クローン化P3マスターシードおよびP4プロダクションシードウイルスを感染させた。ウイルスを含有する培地の日単位の一定分量を回収し、プラークアッセイによって力価判定した。図7に示されるように、M-60ウイルスは非突然変異体P2ウイルスよりも速く増殖し、感染後の3日目および4日目に著しく(10倍を超える)高い力価をもたらした。E-107突然変異もM-60突然変異と同様にウイルス複製を強めた。このように、M-60およびE-107突然変異はどちらもSF培養での増殖優位性を明らかに付与した。この結論の裏付けとして、非突然変異体クローンAおよびM-60突然変異体クローンCの両ウイルスのS、SSS、およびSSF g.s.継代(図6参照)由来の日単位サンプルを回収し力価判定して、増殖速度を分析し、その結果、M-60突然変異体は非突然変異体に比べて最大10倍までの高いピーク時力価(ほぼ8 log10 pfu/ml)を常にもたらした。さらに、この結論は小規模なSF培養でのクローンA、C、およびIウイルスの増殖曲線を比較することで確認された。クローンC (M-60)およびI (E-107)がクローンA (非突然変異体)よりも高い力価にまで常に増殖していたからである。
【００９１】
授乳マウスでのChimeriVax(商標)-JEの神経毒性に及ぼすM-60およびE-107突然変異の影響
マウス神経毒性試験を利用して、ChimeriVax(商標)ワクチン候補の神経毒性がYF 17Dベクターのものを超えないことを裏付けた。YF 17DワクチンはIC接種後の全齢のマウスに致死的である。対照的に、ChimeriVax(商標)ワクチンはかなり弱毒化されている。成体マウスは一般に、神経毒性の微妙な相違、例えば、単一のアミノ酸変化によるものを検出するには感度がよくないので、生存率解析を用いたさらに感度のよい授乳マウスモデルをその目的に使うことができる(Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., Virology 298:146-159, 2002; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002)。
【００９２】
8日齢の授乳マウスにクローンA P7ウイルス、クローンC P10ウイルス(M-60突然変異)、非クローン化P5ワクチンバルク(E-107突然変異)、および以前に産生された対照FBS含有ChimeriVax(商標)-JEウイルス(P5品質管理標準品ウイルス; 突然変異なし)、YF 17D陽性対照(YF-VAX(登録商標))の連続希釈液をIC接種し、または希釈剤をモック接種した。21日間にわたっての死亡率、メジアンIC 50%致死用量値(LD50)、および死亡したマウスの平均生存時間(AST)を表8に示す。予想どおり、YF-VAX(登録商標)は極めて神経毒性であった。このウイルスの2.4 log10 PFUの接種は100%の死亡率をもたらし、その結果8.8日の短いASTとなった。P7非突然変異体クローンもP10 M-60突然変異体クローンもともにオリジナルのFBS含有キメラ型と同じくらい高度に弱毒化され、その結果、LD50値は5 log10 PFUを超え、より長いASTとなった。このように、M-60突然変異は、この動物モデルにおいて高度に弱毒化されたワクチン表現型を変えることはない。非クローン化P5ワクチンバルクウイルスはそのクローンに比べて顕著に毒性が高く、3.1 log10 PFUのIC LD50となったが、YF-VAX(登録商標)に比べて毒性は低かった。その後、クローン化M-60ワクチンの製造的継代(マスターシード、プロダクションシード、およびワクチンバルク)をGLP条件下、この試験で調べたところ、類似の結果になった。このことから、プラーク精製およびM-60突然変異の利用によって達成された高い遺伝的/表現型安定性が確認された。
【００９３】
非ヒト霊長類での安全性と有効性の分析
実験1
この実験では、クローンC (M-60突然変異体) ChimeriVax(商標)-JEワクチンマスターウイルスバンク(MVB)およびプロダクションウイルスバンク(PVB)の神経毒性を、対照としてYF-VAX(登録商標)ウイルスを利用し、カニクイザルへのIC投与後に比較した(表9)。
【００９４】
ワクチンに関連した臨床的徴候または飼料消費、体重、もしくは血液生化学的および血液学的パラメータの変化は確認されなかった。脾臓中のリンパ結節のサイズと数の増加からなるリンパ過形成は、群1〜3由来の、それぞれ、11頭のうち9頭、11頭のうち4頭、および11頭のうち8頭のサルで顕著であった。この所見はカニクイザルでの共通の背景所見であるが、群発生率はこれらのサルにおいて通常よりも大きく、ワクチンによって誘発された予想の免疫応答に対する二次的なものと考えられた。類似の変化がChimeriVax(商標)-JE処置群とYF-VAX(登録商標)参照対照群の両方で起きたことは注目に値する。[全3群のサルの中には短期間の、接種後ウイルス血症を低レベルで発現したものもいたが、これは許容される限界の範囲内であり、動物の全てが、接種に使われたウイルスに対して抗体陽転された。31日目、YF-VAX(登録商標)で処置されたサルに対する黄熱病ウイルス特異的な中和抗体の力価はLNIアッセイにおいて2.07から6.13を超える範囲となり、YF-VAX(登録商標)で処置されたサルはPRNT50アッセイにおいてJEウイルスに対する交差反応性抗体を有していなかった。ChimeriVax(商標)-JE MVBワクチンで処置されたサルは全て、320以上(320から20480を超える範囲)のJE中和抗体の力価を有しており、LNIアッセイにおいてYFウイルスに対する交差反応性抗体を有していなかった。ChimeriVax(商標)-JE PVBワクチンで処置されたサルは全て、160以上(160から20480を超える範囲)のJE中和抗体の力価を有しており、YFウイルスに対する交差反応性抗体を有していなかった。検出可能なウイルス血症の大きさまたは期間とJE中和抗体の力価誘導の大きさとの間には識別できる関係がなかった]。
【００９５】
ChimeriVax(商標)-JE MVBおよびPVB調製物は、この試験においてわずかな神経毒性を示した。フラビウイルスワクチンに対するサル神経毒性試験での神経毒性の最も包括的な指標は、合併群での平均病変スコアであり、これは標的領域平均スコアと識別領域平均スコアの平均値に相当する。カニクイザルでの標的領域は黒質ならびに脊髄の頸膨大および腰膨大であり、全てのフラビウイルスによって損傷をうける中枢神経系(CNS)の領域に相当する。識別領域は淡蒼球、被殻、視床前核群および視床内側核群、ならびに視床外側核であり、異なる毒性特性を有するYF 17D (および恐らくその他のフラビウイルス)の株によって選択的に損傷をうけ、かつ参照株と神経毒性の増加した株とを分け隔てるCNSの領域に相当する。ChimeriVax(商標)-JE MVBおよびPVB調製物で処置されたサルについての平均病変スコアは併せて、YF-VAX(登録商標)参照対照群の場合よりも有意に低かった(p<0.05)。ChimeriVax(商標)-JE MVBおよびPVBで処置されたサル二群に対する平均識別中央スコアは同様に、YF-VAX(登録商標)参照対照群の場合よりも有意に低かった(p<0.05) (表9)。ChimeriVax(商標)-JEワクチン調製物を受けたサル二群に対する平均スコアと、サルでの神経毒性試験において同様に低い神経毒性を実証された両調製物との間に統計的に有意な相違はなかった。
【００９６】
このように、サル神経毒性試験の結果から、新しい(M60、クローンC)プラーク精製済みのMVBおよびPVBは満足な安全性プロファイルを有することが明らかである。被験物質は臨床毒性を示さず、参照対照(YF-VAX(登録商標))よりも神経病理学的検査に対する有意に低い識別および合併損傷スコアを有していた。被験物質は定量的なウイルス血症によって測定された場合、内臓向性が参照対照(YF-VAX(登録商標))とは異ならなかった。
【００９７】
実験2
この実験はカニクイザルでの単回の皮下(SC)投与後のオリジナルの非クローン化P5 ChimeriVax(商標)-JEワクチン[FBS存在下のVero細胞で以前に産生されており、生物学的表現型の点から見ると良性の突然変異であるように思われる、Eタンパク質の疎水性尾部に位置するE491でのLからFの変化を除いては突然変異がなく、治験で既に試験されている(Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Monath et al., Vaccine 20:1004-1018, 2002)]と新しいクローンC (M-60突然変異体)のChimeriVax(商標)-JE精製済みワクチンバルク(P13)のウイルス血症、免疫応答、および安全性を比較するために行われた。ChimeriVax(商標)-JEワクチンは、オリジナルの非クローン化P5 ChimeriVax(商標)-JEワクチンを接種された血清反応陰性のサル5頭のうち5頭(100%)の血清中で検出された。ウイルス血症の期間は2〜5日で、力価が20〜790 PFU/mLの範囲であった。平均のピーク時ウイルス血症(±SD)は244 (±310) PFU/mLであり、平均のウイルス血症日数は3.4 (±1.34)であった(表10)。
【００９８】
ChimeriVax(商標)-JEウイルスは、新しいP13のJEワクチン精製済みバルクを接種された血清反応陰性のサル4頭のうち4頭(100%)の血清中で検出された。ウイルス血症の期間は2〜5日で、力価が50〜290 PFU/mLの範囲であった。平均のピーク時ウイルス血症(±SD)は160 (±123) PFU/mLであり、平均のウイルス血症日数は3.75 (±1.26)であった(表10)。平均のピーク時ウイルス血症もウイルス血症日数も二つの処置群の間で有意差がなかった(p値、それぞれ、0.6290および0.7016; ANOVA)。
【００９９】
血清反応陰性のサルは全て、オリジナルの非クローン化P5 ChimeriVax(商標)-JEワクチンまたはP13のJEワクチン精製済みバルクによる処置後に抗体陽転した(表10)。31日目、非クローン化P5ワクチンを接種されたサル5頭のうち5頭(100%)の血清には、640〜5120 の範囲(幾何平均力価 = 1689)のJEウイルス中和抗体の力価があった。P13のChimeriVax(商標)-JEワクチン精製済みバルクを接種されたサル4頭のうち4頭(100%)の血清には、320〜2560の範囲 (幾何平均力価 = 761)のJEウイルス中和抗体の力価があった。抗体の力価は処置群の間で有意差がなかった(p = 0.2986、ANOVA)。
【０１００】
このように、新しいM-60ワクチンを安全性(ウイルス血症)および免疫原性についてオリジナルの非クローン化ChimeriVax(商標)-JEワクチン(E491を除いて突然変異なし)と比較した。新しいワクチンは若干低い内臓向性(所望の特徴)を示したが、依然として高い免疫原性を示した。ウイルス血症および免疫原性の大きさの相違は、統計的に有意でなかった。
【０１０１】
ウイルス感染性のpH閾に及ぼすM-5、M-60、およびE-107突然変異の影響
ChimeriVax(商標)-JEワクチンは、YF 17Dウイルスの骨格へのJEウイルスのSA14-14-2株由来のprMおよびE遺伝子の挿入によって産生された。SA14-14-2ウイルス(ChimeriVax(商標)-JEの中に存在する)の外被は、その親ウイルスSA14とは10アミノ酸異なっていた: E107でLからF、E138でEからK、E176でIからV、E177でTからA、E227でPからS、E244でEからG、E264でQからH、E279でKからM、E315でAからV、およびE439でKからR (Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999)。部位特異的突然変異誘発法により、これらの残基の一部がChimeriVax(商標)-JEウイルスの弱毒化に関与することが明らかになった。ChimeriVax(商標)-JEの突然変異体または復帰突然変異体を選択して、突然変異がこれらのウイルスのpH閾を変化させたかどうかを確認した。M-60、E-107、またはM-5の突然変異がpH依存的にウイルス感染性に影響を及ぼすかどうかを判定するため、感染性のpH閾に対する標準的なアッセイを材料と方法で記述したように行った。以下のウイルスを試験した: (1) ChimeriVax(商標)-JE非突然変異体(Eタンパク質中の10種全てのSA14-14-2突然変異を含有するクローンA、P7); (2) ChimeriVax(商標)-JEのE107でのFからLの復帰突然変異体(9種のEタンパク質突然変異を含有するクローンI P6); (3) ChimeriVax(商標)-JEのM60でのRからCの突然変異体(10種全てのEタンパク質突然変異を含有するクローンC、P10)、および(4) M-5でのQからPの突然変異体(10種全てのEタンパク質突然変異を含有するクローンE、P6) (表12)。
【０１０２】
非突然変異体クローンA P7ウイルス、M-60突然変異体クローンC P10ウイルス、M-5突然変異体クローンE、およびE-107突然変異を含有する非クローン化P5ウイルスを一連の漸減的pHを用いて処理した後に、残存するウイルス感染性の力価判定を行った。これらのウイルス(クローンA対照ウイルス、クローンC M-60突然変異体、およびクローンI E-107突然変異体)の感染性は、M5突然変異体クローンEウイルスを除いて、pH 6.0後に一様に落ち始め、pH 5.8で失われた(pH閾5.9)。M-5突然変異体は、その他全てのウイルス(pH 5.9)に比べて顕著に高いpH閾(pH 6.3)を有していた(図8A)。これはMタンパク質の細胞外ドメインがフラビウイルスによる細胞の感染の過程において必須の役割を果たすという最初の直接的な証拠である。したがって、Mタンパク質のN末端は、もっぱら外被Eタンパク質によって先に起こされる機能であるウイルス吸着と内部移行に続いて、エンドソーム内の低pHにより惹起される融合の過程で機能する可能性がある。
【０１０３】
ChimeriVax(商標)-JEウイルスの融合に対するpH閾5.9は、その他の野生型(wt)フラビウイルスについて報告されている(Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991)ものよりも低く、ウイルスの弱毒化に関与する可能性がある。
【０１０４】
これらのデータから、ChimeriVax(商標)-JEのE領域中のE-107突然変異は融合のpH閾を変化させないことが実証された。一般に、低いpH閾は、二量体から三量体への移行に不可欠な、Eタンパク質の立体構造変化が起きるのに、特定のアミノ酸のより多くのプロトン化が必要になることを意味する。一つまたは複数のSA14-14-2特異的な突然変異(保存された融合ペプチド内に位置するE107突然変異以外)は、融合に対する低いpH閾(pH 5.9)の保持に関与しており、したがって宿主に対するウイルスの弱毒化表現型である可能性が高い。明らかに、M-5突然変異はこの閾値を5.9から、wtフラビウイルスのものに近い6.3にまで増大させることができる(Guirakhoo et al., Virology: 169(1):90-99, 1989; Guirakhoo et al, J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991)。融合に対するpH閾の増大は、理論的にはウイルスの弱毒化表現型を低下させるはずである。何故なら、ウイルスは、融合活性状態への移行に必要なプロトン化が少なくて済むいっそう高いpHで融合できるからである。脳内経路により3〜4日齢の授乳マウスへ1.4 log10 PFUで接種されたM5ウイルスは、1.7 log10 PFUで接種された対照ウイルス(M5突然変異のないChimeriVax(商標)-JEワクチンウイルス)よりも有意(p=0056)に高い毒性を示したので(図8B)、これは正しいように思われる。それでもなお、M5突然変異体ウイルス(1.4 log10 PFUの投与量で)は、3〜4日齢の授乳マウスにおいてYF-VAX(登録商標) (0.9 log10 PFUの投与量で)よりも有意に低い神経毒性のままであったこと(図8C)から、ワクチンウイルスの外被タンパク質内のSA14-14-2の突然変異が依然としてこのウイルスの十分な弱毒化レベルを供与していることが示唆された。
【０１０５】
融合のpH閾に影響を及ぼすその他のキメラでの突然変異
各ChimeriVax(商標)-DENワクチンウイルスの二つの群、つまりEタンパク質突然変異を含有しないChimeriVax(商標)-DEN1〜4 P7およびChimeriVax(商標)-DEN4 P10を除いて、Eタンパク質中に単一の突然変異を含んだChimeriVax(商標)-DEN1〜4 P10を利用し、間接的融合アッセイを行った。ウイルスを室温で10分間、異なるpHの培地を用いてインキュベートした。pHを中性pHに戻した後に、標準的なプラークアッセイを利用して、力価を測定した。表13に示されるように、ウイルス不活性化(融合)の閾値は、ChimeriVax(商標)-DEN2およびDEN4ウイルスのP7とP10との間で類似していた(pH 6.4)。その一方、ChimeriVax(商標)-DEN1 P10のpH閾は、ChimeriVax(商標)-DEN1 P7ウイルスのものよりも0.4単位低かった(pH 6.0 対 pH 6.4)。pH閾の相違はChimeriVax(商標)-DEN3 P10ウイルスの場合にはあまり劇的ではなかった(pH 6.4 対 pH 6.2)。
【０１０６】
最大のウイルス不活性化は、若干低めであった(pH 6.0) ChimeriVax(商標)-DEN4のものを除いて、ChimeriVax(商標)-DENウイルスのP7全てに対しpH 6.2で起こった。ChimeriVax(商標)-DEN1 P10は完全な不活性化には著しく低いpH (pH 5.6)を必要とするように思われた。ChimeriVax(商標)-DEN1ウイルスもChimeriVax(商標)-DEN3ウイルスもともにE-204でKからRのアミノ酸置換を含んでいる(DEN3のEタンパク質はその他3種の血清型よりも2アミノ酸短かく、したがって、このウイルスでのE-202残基はDEN1でのE-204に相同である)。DEN3キメラに対する融合閾のあまり劇的ではない相違は、コンセンサス配列の決定によって示されたように、P10ウイルスストックでのWTの(K)と突然変異体のRアミノ酸(E204K/R)の存在(K:R=50:50)によるものであったかもしれない(Pugachev et al., J. Virol. 78:1032-1038, 2004)。ウイルス不活性化に対する閾値の変化は、E251での突然変異にもかかわらず、DEN2 P10キメラでは確認されなかったので、この残基での突然変異はウイルス融合過程には関与していないということが結論づけられる(図8D)。
【０１０７】
ChimeriVax(商標)-DEN3のP10でのK/R不均質性の存在が融合に対するpH閾のその劇的ではない変化に関与していたかどうかを判定するため、P7 (突然変異なし、E202K)、P10 (50%突然変異、E202K/R)、およびP15 (完全な突然変異、E202R)ウイルスを利用し、間接的融合アッセイを行った。図8Eに示されるように、ChimeriVax(商標)-DEN3 P10の不活性化(融合)のpH閾はpH 6.2となり、これはChimeriVax(商標)-DEN3 P7 (pH 6.4)ウイルスのものとChimeriVax(商標)-DEN3 P15 (pH 6.0)ウイルスのものとの間であった。E202でのKからRの突然変異は、これらのキメラのEタンパク質で検出された唯一のアミノ酸置換であったので、この突然変異がP15ウイルスの融合に対するpH閾の0.4 pHのシフトに関与している可能性が最も高い。
【０１０８】
前述のように、ワクチンの細胞培養製造の間に起きた、E204でのKからRの突然変異は、融合のpH閾をpH 0.4単位だけ低下させた。E204でのKからRの突然変異は、E二量体の解離に大きな影響を及ぼす可能性のある新たな分子内H結合と新たな塩橋を作り出すように思われる。界面活性剤n-オクチル-β-D-グルコシドの存在下で測定されたDEN2 Eタンパク質の細胞外ドメイン(S1株)の394残基の原子座標に基づいて、ChimeriVax(商標)-DEN1 (PMS、P7)のEタンパク質の構造をモデル化した(Modis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6986-6991, 2003)。204位のK残基をRに変えて突然変異体ウイルスを模倣し、モデル化を繰り返して、ChimeriVax(商標)-DEN1 (VL、P10)ウイルスのEタンパク質構造を描いた(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004)。204位のK残基(204K)は、神経毒性または融合のpH閾に影響を与えることが明らかにされている、残基により裏打ちされた疎水性ポケット中の、短いループ内に位置している(Lee et al., Virology 232:281-290, 1997; Lindenbach et al., 2001 Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields Virology, eds. Knipe D.M., and Howley P.M. [Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia], 1, 991-1004; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002)。図8Fでは、ワクチンウイルス(204R)のEホモ二量体構造の相同性モデルがPMS (204K)ウイルスのものと比較されている。
E単量体のうちの一つの204Kおよび261Hの側鎖が、対向する単量体の、それぞれ、252Vおよび253Lの骨格原子とH結合を作り出すように思われた。204位で、ワクチンウイルス(VL P10)のEタンパク質中のRは、これらの水素(H)結合が失われるようにそれ自身を再配向すると予測される。その代わりに、突然変異体Rの側鎖が261Hおよび257Eと近接する結果、204Rと261Hとの間の新しい分子内H結合の生成と、恐らく204Rと257Eとの間の新しい塩橋の生成を引き起こす。ヒスチジンのpkはおよそ6.0になる可能性があり、これは融合閾値(pH約6.4)をわずかに下回っているので、Guirakhooら(J. Virol. 78:9998-10008, 2004)による初期の仮説は、204Rと261Hとの間の予測される新しいH結合および204Rと257Eとの間の塩橋が融合のpH閾に影響を及ぼす可能性があるというものであった。本明細書に記述される実験は、ChimeriVax(商標)-DEN1の融合の閾値が6.0前後であり、これはそのP7ウイルス(pH 6.4)よりも0.4 pH単位低いことを明らかにしたので、この理論は正しいと判明した。残基番号204のRにより導入される新しい分子間結合は、低pHへの移行がしかるべき残基(例えば、H261)のいっそうのプロトン化を必要とするようにE二量体の会合を強固にするのは明らかである。低い融合閾値はサルにおけるウイルスの内臓向性に影響を及ぼし、i.c.経路により接種された授乳マウスの神経毒性を低減する(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004)。
【０１０９】
ChimeriVax(商標)-DEN3 P10ワクチンのEタンパク質中のE202でのKからRの置換は、ChimeriVax(商標)-DEN1 P10ワクチンにおけるE204突然変異に相同である。ChimeriVax(商標)-DEN1 P10と同様に、ChimeriVax(商標)-DEN3 P10 (残基番号202でKとR残基の両方を含み不均質)はP7と比べた場合、低い融合pH閾(およそ0.2 pH単位)を示した。融合のpH閾は、突然変異がChimeriVax(商標)-DEN3のP15で固定された場合、さらに低下した(ChimeriVax(商標)-DEN1 P10と同様に、0.4 pH単位)。これらのデータから、残基番号202/204は全てのデングウイルスにおいて弱毒化の普遍的な決定因子でありうることが示された。これまでのところ、ChimeriVax(商標)-DEN3および-DEN4 P10ワクチンウイルスは、この突然変異を含んでおらず、両ウイルスとも四価ワクチン製剤を接種されたサルにおいていっそう高いウイルス血症レベルを誘発している(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004)。ChimeriVax(商標)-DEN3またはChimeriVax(商標)-DEN4でのKからRの突然変異がその宿主においてその内臓向性を低下させるかどうかはまだ分からない。
【０１１０】
WT-JEは6.4の融合のpH閾を有することが以前に報告されていた(Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991)。この研究では、ChimeriVax(商標)-JEの全ての変異体が5.9のpH閾を有していた。これらの実験で確認された低いpH閾は、ChimeriVax(商標)-JEの外被タンパク質中の10種の弱毒化突然変異のうちの一つまたは複数の存在による可能性が高い。この突然変異はEタンパク質二量体の会合を強固にし、その結果、低いpHが解離と三量体構造への移行、その後の融合に必要となる可能性がある。本明細書に示されるデータから、E107でのFからLの突然変異(Eタンパク質のドメインIIのcd-ループ中に位置する)もE279でのMからKの突然変異(ドメインIIの疎水性ポケット内に位置する)もpH閾の低下に関与していないことが明らかになった。JE Eタンパク質中のその他の突然変異が融合のpH閾に影響を及ぼしうる可能性がある。JE Eタンパク質に酷似しているTBEウイルスEタンパク質の結晶構造の解析は、変化されると、融合のpH閾を変化させうる残基を予測するのに役立つ可能性がある。このモデルに基づけば、残基E244のGおよび/またはE264のHでの突然変異は、ChimeriVax(商標)-JEウイルスの融合に対して、WT JEよりも、低いpH閾に関与している可能性が高い。
【０１１１】
ウイルス侵入の効率に及ぼすM-60およびE-107突然変異の影響
Chambers (Vlaycheva et al., J. Virol. 76:6172-6184, 2002)の方法を用いて、SF Vero細胞へのウイルス侵入に及ぼすM-60 (クローンCウイルス)およびE-107 (クローンIウイルス)突然変異の影響を調べた。この実験では、SF Vero細胞に5、10、20、または60分間、(各時点で約50プラーク/ウェルをもたらすよう)適切に希釈されたウイルスを感染させた。内部移行しなかったウイルスを酸性グリシン溶液の添加によって不活性化し、その一方で対照の並行ウェルをPBS (中性pH)によって処理する。細胞をPBSで洗浄し、これをメチルセルロースの重層で覆い、その後5日目にプラークの可視化と計測を行った。侵入率は、対照のPBS処理ウェルでのプラーク数に対するグリシン処理ウェルでの平均プラーク数の割合として示される。予備的な侵入試験の結果を図9Aに示す。侵入したクローンCとクローンIウイルスの割合が、5および10分の時点で非突然変異体クローンAウイルスよりも高かったことは重要であり、その時点で、侵入に及ぼす突然変異の影響が検出される可能性がいっそう高い。この結果は標準偏差の棒からも明らかなように統計的に有意ではなく、さらなる繰り返し試験で確認される必要がある。それでもなお、この実験によって、M-60とE-107での突然変異のどちらも、SF条件で増殖された細胞とのChimeriVax(商標)-JEウイルスの膜融合の効率を改善できることが示唆された。膜融合の過程に及ぼすM-60およびE-107残基の影響に関して考えられる機構を図9Bに図解する。M-60残基はウイルス膜中に位置しており、その一方E-107残基は細胞膜に挿入されるので、低pH依存的なEタンパク質の再構成に続いてこの二つの膜は強引に融合される(これは本発明者らのデータに基に、Mタンパク質の細胞外ドメインによって促進されうる)。これらの二つの残基のいずれかでのさらに適切なアミノ酸は、膜の融合を促進することができる。
【０１１２】
本発明者らのデータは初めて、Mタンパク質の細胞外ドメインとその膜貫通ドメインの両方が機能的に重要であることを立証するので、Mタンパク質全体をこれからは、新たな生弱毒化ワクチンを開発する目的でフラビウイルスを弱毒化させる突然変異誘発のための魅力的な標的と考えることができる。例えば、ランダムなまたは特異的な(タンパク質構造のさらなる解析を受けての)アミノ酸変化、または漸増的長さの、例えば、1、2、3、4、5などの、アミノ酸の欠失を、ウイルスの生物学的表現型が改変されることを期待してタンパク質全体に組み入れ、顕著な弱毒化をもたらすことができる。
【０１１３】
治験の結果
上述の治験から得られた、アルギニンおよびシステインM60残基を有するChimeriVax(商標)-JEのウイルス血症プロファイルを表11AおよびBで比較する。ChimeriVax(商標)-JE M60アルギニンを受けた被験者では、ChimeriVax(商標)-JE M60システインを受けた被験者の場合の29〜50%に比べて、被験者の67〜100%が一日またはそれ以上の日数でウイルス血症であった。ChimeriVax(商標)-JE M60アルギニンを受けた被験者での平均最大ウイルス血症レベルは、ChimeriVax(商標)-JE M60システインの場合の3.5〜6.3 PFU/mlの平均最大ウイルス血症レベルに比べて、13〜40 PFU/mlの範囲であった。ウイルス血症の期間もChimeriVax(商標)-JE M60アルギニンの場合には著しく長かった。
【０１１４】
これらのデータから、M60突然変異を含有するワクチンの場合には、ウイルス血症のレベルが著しく低いことが実証された。ウイルス血症はワクチンウイルスの内臓向性(毒性)の指標である。ウイルスが脳血液関門を通過し、中枢神経系に侵入しうる可能性と同様に、ウイルス複製を支持するおよびウイルス血症の一因となる細胞傷害および臓器不全が軽減されるので、ウイルス血症の減少を伴うワクチンはいっそう安全であると考えられる。その他の実験では、M60突然変異体が非突然変異体と同じくらいヒトにおいて免疫原性が高いことが示された。
【０１１５】
（表１）小型のプラーク(P10 PMS)のコンセンサス配列(P/N IT-0116; L/N I020504A)
(p5 実行(Run)1 ワクチンロットから精製されたプラーク)
2008520187.tif 000005
【０１１６】
（表２）大型のプラークPMS (P10 PMS)のコンセンサス配列(P/N IT-0117; L/N I030804A)
(p5 実行(Run)1 ワクチンロット由来)
2008520187.tif 000006
【０１１７】
（表３）無血清条件下のVero細胞におけるSプラークPMS (p10)のさらに2回の継代後に単離された大型のプラークの配列
2008520187.tif 000007
【０１１８】
（表４）HepG2で観察されたCPE
2008520187.tif 000008
【０１１９】
（表５）ChimeriVax(商標)-WN02ワクチンまたはYF-VAX(登録商標)を接種されたサルでのウイルス血症
2008520187.tif 000009
＊ pfu/mLとして表されたウイルス血症
＊＊ 1日目: 研究1日目、研究1日目にサルに接種
0 PFU/mLは検出限界未満を意味する、理論上のアッセイカットオフ = 10 PFU/mL
【０１２０】
（表６）WN02ワクチンウイルスを接種されたウイルス血症のサル由来プラーク分離株から直接的に得られたYF-WNキメラのM領域の配列
2008520187.tif 000010
【０１２１】
（表７）非クローン化およびクローン化SF ChimeriVax(商標)-JEサンプルのヌクレオチドおよびアミノ酸配列(図6参照)
2008520187.tif 000011
a: ゲノムの始めから
b: 示されたタンパク質のN末端から
【０１２２】
（表８）8日齢の授乳マウスでのクローンA P7ウイルス、クローンC P10ウイルス、非クローン化P5ウイルス、FBS含有標準ウイルス、およびYF-VAX(登録商標)ウイルスの神経毒性
2008520187.tif 000012
【０１２３】
（表９）カニクイザルに対するM-60 (クローンC)マスターおよびプロダクションシード 対 YF-VAX(登録商標)対照の神経毒性
2008520187.tif 000013
1 PFU = プラーク形成単位
2 群1、2、および3の、それぞれ、動物11頭のうち4頭、11頭のうち2頭、および11頭のうち1頭がスコア計算から除外された。何故なら、それらはプレスクリーニングに用いられたHAI試験よりも高感度な、後向きのPRNT50試験において1日目(接種前)にJEに血清反応陽性であることが分かったからである。
【０１２４】
（表１０）FBSを含有する培地中で産生されたオリジナルの非クローン化P5 ChimeriVax(商標)-JEワクチン(E491を除いて突然変異を含有しない)および新たなクローンC P13の精製ワクチンバルク(M-60突然変異体)をSC接種されたカニクイザルでのウイルス血症および免疫原性の大きさの比較
2008520187.tif 000014
1 群1、2、および3の、それぞれ、動物6頭のうち2頭、6頭のうち1頭、および6頭のうち2頭が値の計算から除外された。何故なら、それらはプレスクリーニングに用いられたHAI試験よりも高感度な、後向きのPRNT50試験において1日目(接種前)にJEに血清反応陽性であることが分かったからである。
【０１２５】
（表１１Ａ）M60アルギニンアミノ酸を有するChimeriVax(商標)-JEが投与された試験H-040-003に登録された被験者におけるウイルス血症プロファイル
太字の用量範囲は、突然変異体M-60システインワクチンが投与された別の試験(H-040-007)で得られたものに類似している。
2008520187.tif 000015
【０１２６】
（表１１Ｂ）M60システインアミノ酸を有するChimeriVax(商標)-JEが投与された試験H-040-007に登録された被験者におけるウイルス血症プロファイル
2008520187.tif 000016
【０１２７】
（表１２）各ChimeriVax(商標)-JEワクチンに対する融合アッセイで判明した融合のpH閾値
2008520187.tif 000017
【０１２８】
（表１３）ChimeriVax(商標)-DEN P7およびP10の各組に対する間接的融合アッセイで判明した融合のpH閾値
2008520187.tif 000018
【０１２９】
（表１４）
2008520187.tif 000019
1, 2: この列はC/prMまたはE/NS1接合部に対応するキメラYF/フラビウイルスプライマーを作出するために使われたオリゴヌクレオチドを明示している。(本文参照)。X = YFカプシドのカルボキシル末端のコード配列。下線部はNarI部位(アンチセンス - ccgcgg)のすぐ上流の標的異種配列に相当する。この部位は、完全長の鋳型cDNAを作出するのに必要なYfm5.2 (NarI)プラスミドへのPCR産物の挿入を可能にする。その他のヌクレオチドは異種ウイルスに特異的である。オリゴヌクレオチドプライマーは5'から3'方向に記載されている。
3, 4: 完全長の鋳型キメラcDNAを産生するためにインビトロで単離でき連結できる制限断片を作出するのに使われた唯一の制限部位が記載されている。配列の中には好都合な部位を含んでいないものもあるので、適切な部位の遺伝子工学的な作出が場合によっては必要になる(脚注5)。
5: 括弧内は、効率的なインビトロライゲーションを可能にするためYF骨格または異種ウイルスのいずれかで作出されなければならない制限酵素部位である。括弧内にない部位は除去されなければならない。そのような改変は全て各クローンに対するcDNAのサイレントな突然変異誘発により行われる。空欄はcDNAクローンの改変が必要ないことを示す。
【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ】黄熱病ウイルスの3'非翻訳領域であって、この領域内のドメイン(反復配列(RS)、保存配列CS2、CS1、および3'-末端ステムループ構造)を示す略図、ならびに本発明のウイルスの中に含めることができる突然変異の例(例えば、欠失dA、dB、dC、dD、d7、d14、CS2 d5、およびCS2 d16)である。
【図１Ｂ】3番目のRS要素の中央からUTRの末端までの、黄熱病17Dウイルスの3'非翻訳領域の配列および公表されている二次構造予測の略図である(Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999)。
【図１Ｃ】ZukerのRNA折畳みアルゴリズムを使って作出された最適なYF 17D 3'UTR二次構造予測の図示である。
【図１Ｄ】最適なYF 17D構造に及ぼす3'UTR欠失の影響(dC欠失で示される; Zuker法)の図示である(図1Cと比較されたい)。
【図２Ａ】ダニ媒介性脳炎ウイルスのカプシドタンパク質の配列の略図、およびKofler et al., J. Virol. 76:3534-3543, 2002により報告されているこのタンパク質中の欠失である。
【図２Ｂ】YF 17Dウイルスのカプシドタンパク質の配列の略図である。コンピュータ解析によりα-ヘリックス二次構造(α-ヘリックスI〜IV)を有すると予測された領域、ならびに疎水性領域(中実棒)およびある種のChimeriVax(商標)-WNウイルスにおいてこのタンパク質に導入された欠失(例えば、欠失C1およびC2; 囲み)が示されている。
【図３】HepG2細胞での指定のウイルス(WN01、WN02 P5、大型のプラーク、小型のプラーク、およびYF/17D)の増殖を示すグラフである。
【図４】THLE-3細胞での指定のウイルス(WN01、WN02 P5、大型のプラーク、小型のプラーク、およびYF/17D)の増殖を示すグラフである。
【図５】示されたウイルス((WN02 P5; 混合プラーク)、小型のプラーク(PMS、P10)、および大型のプラーク(PMS、P10))により誘発されたハムスターでのウイルス血症を示すグラフである。
【図６】SF ChimeriVax(商標)-JEウイルスサンプルの継代(g.s、つまり遺伝的安定性を研究するための実験的継代)の略図である。
【図７】感染後の指定時間での本発明のSF ChimeriVax(商標)-JEウイルス(非クローン化P2、P3 MS (E-107)、P4 PS (E-107)、P5 g.s. (M-60)、およびP5 VB (E-107))の増殖曲線を示すグラフであって、非突然変異体ウイルス(P2)に比べてM-60 [アルギニン(R)→システイン(C)およびE-107フェニルアラニン(F)→ロイシン(L)]変異体を含有するウイルスサンプルのSF培養での高い増殖速度を示すグラフである。
【図８Ａ】酸性pHの範囲による処理後のP5非クローン化ワクチンバルクならびにクローンI (E-107突然変異体)、非突然変異体(クローンA)、およびM-60突然変異体(クローンC)に比べたM-5 ChimeriVax(商標)-JE突然変異体(クローンE)の感染性を示すグラフである。重要なのは希釈サンプルでの初めの力価(例えば、pH 6.8での)ではなく、勾配の概観およびどのpHでウイルスが感染性を喪失したかである。
【図８Ｂ】脳内経路により接種された3〜4日齢授乳マウスでのChimeriVax(商標)-JE M5突然変異体(接種材料の逆力価判定によって測定された場合、1.4 log10 PFU/用量)と比べたChimeriVax(商標)-JEワクチン(接種材料の逆力価判定によって測定された場合、1.9 log10 PFU/用量)の生存プロットである。
【図８Ｃ】脳内経路により接種された3〜4日齢授乳マウスでのYF-VAX(登録商標) (接種材料の逆力価判定によって測定された場合、0.9 log10 PFU/用量)と比べたChimeriVax(商標)-JE M5突然変異体ウイルス(接種材料の逆力価判定によって測定された場合、1.4 log10 PFU/用量)の生存プロットである。
【図８Ｄ】ChimeriVax(商標)-DEN1〜4ウイルスのP7およびP10の比較を供与する、間接的融合アッセイの結果を示す。各実験のウイルス産生量は標準的なプラークアッセイにより測定された。A、ChimeriVax(商標)-DEN1 PMS P7 (三角形)およびP10 (菱形); B、ChimeriVax(商標)-DEN2 PMS P7 (三角形)およびP10 (菱形); C、ChimeriVax(商標)-DEN3 PMS P7 (三角形)およびP10 (菱形); D、ChimeriVax(商標)-DEN4 PMS P7 (三角形)およびP10 (菱形)。
【図８Ｅ】PMS (P7)ワクチンをワクチンロット(P10)およびP15ウイルスと比べた、ChimeriVax(商標)-DEN3での間接的融合アッセイの結果を示す。各実験のウイルス産生量は標準的なプラークアッセイにより測定された。ChimeriVax(商標)-DEN3 PMS P7 (三角形)、P10 (菱形)、およびP15 (四角形)。
【図８Ｆ】ChimeriVax(商標)-DEN1ウイルスのDEN1 Eタンパク質二量体(アミノ酸番号1〜394)の構造を示す(Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004)。(A) P7 (PMS、204K)ウイルスの残基番号204の正荷電リジン(K)の位置をCPK (球面をファンデルワールス半径の大きさに合わせて示す)表示により示す。三つの構造ドメインを黒色(ドメインI)、薄灰色(ドメインII)、および濃い灰色(ドメインIII)で示す。(B) パネルA内の印の付いた領域の拡大。(C) 突然変異体DEN1ウイルス(P10、黒色で示される204R)のEタンパク質モデル由来の、パネルBにあるのと同じ領域。パネルBおよびCの選択のアミノ酸を棒表示で示す。中灰色、炭素; 濃い灰色、窒素; 黒色、酸素; 薄灰色、硫黄。
【図９Ａ】示された時間でのChimeriVax(商標)-JEウイルスM60突然変異体(クローンC)、E107突然変異体(クローンI)、および非突然変異体(クローンA)の侵入率を示すグラフである。これらの結果は、M60突然変異が5分および10分の時点で見掛け上SF Vero細胞での侵入を促進することを示唆する。SF Vero細胞に5、10、20、または60分間、適切に希釈されたウイルス(無血清培地中のクローンA、C、およびI)を感染させ、その後0.1 Mグリシン、0.1 M NaCl、pH 3.0の溶液で3分間処理して、細胞外のウイルスを不活性化させた。ウェルをPBSで2回洗浄し、次いで単層にメチルセルロースを重層した後、クリスタルバイオレットを用いて5日目にプラークを染色した。グリシンの代わりにPBSで処理された対照感染ウェルと比べたときの、グリシン処理後に確認されたプラーク数の割合として侵入率を示す。
【図９Ｂ】外被タンパク質EおよびM中のE-107、M-5、およびM-60アミノ酸残基の位置の略図であり、融合に及ぼすM-5残基の仮想的影響を図解する。E-107残基を含有するEタンパク質のドメインIIの先端にある破線の範囲は、細胞膜に挿入される融合ペプチド(c-dループ)を表す(Rey et al., Nature 375: 291-298, 1995)。M-5残基はMタンパク質の細胞外ドメインのN末端部分にある。Eタンパク質単量体が三量体複合体に再構成され、この複合体が、細胞とウイルスの膜を強引に融合させるように折り畳まれる(Modis et al., Nature 427(6972) :313-319, 2004)。Mタンパク質は、例えば、Eタンパク質とのその相互作用を介して細胞膜とのウイルス膜の融合を促進する、複合体の機能成分とすることができる。M-60残基はMの二つのC末端膜貫通ストレッチの間にあり、融合の間の細胞とウイルスの膜の相互作用に関与することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月16日(2008.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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