(57)【要約】  本発明は、哺乳動物において、小筋細胞増殖、再狭窄及び内膜過形成を軽減するための、ビタミンＤ受容体を活性化する化合物、好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α−２５−ジヒドロキシビタミンＤ２の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管障害に罹患している哺乳動物において平滑筋細胞増殖を低下させる方法であり、前記血管障害は血管の狭窄又は閉塞を引き起こし、前記方法はビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化させる化合物の治療上有効量を前記動物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２】
前記化合物が経口又は静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ステント上のコーティングとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、グラフト又はインプラント上のコーティングとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物がビタミンＤ化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ビタミンＤ化合物が、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で静脈内投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ代謝産物又は類似体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ビタミンＤ代謝産物又は類似体が１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
慢性腎疾患に罹患している哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法であり、前記方法はビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化させる化合物の治療上有効量を前記動物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記化合物が経口又は静脈内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、ステント上のコーティングとして投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が血管アクセスグラフト上のコーティングとして投与される請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物がビタミンＤ化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビタミンＤ化合物が、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で静脈内投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ代謝産物又は類似体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビタミンＤ代謝産物又は類似体が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血管形成が行われた哺乳動物において再狭窄を軽減する方法であり、前記方法はビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化させる化合物の治療上有効量を前記動物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記化合物が経口又は静脈内投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ステント上のコーティングとして投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記化合物が、グラフト又はインプラント上のコーティングとして投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物がビタミンＤ化合物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ビタミンＤ化合物が、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で静脈内投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ代謝産物又は類似体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ビタミンＤ代謝産物又は類似体が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
冠動脈バイパス術が行われた哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法であり、前記方法はビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化させる化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与する段階を含む、前記方法。
【請求項２６】
前記化合物が経口又は静脈内投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、ステント上のコーティングとして投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、グラフト又はインプラント上のコーティングとして投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がビタミンＤ化合物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ビタミンＤ化合物が、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で静脈内投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ代謝産物又は類似体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ビタミンＤ代謝産物又は類似体が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化させる化合物の治療上有効量を下記哺乳動物に投与する段階を含む、慢性腎疾患に罹患しており、血管アクセス装置の実装を必要とする血液透析が必要な哺乳動物における内膜過形成を減少させる方法。
【請求項３４】
前記化合物が経口又は静脈内投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が、血管アクセス装置上のコーティングとして投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物がビタミンＤ化合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ビタミンＤ化合物が、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で静脈内投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ビタミンＤ化合物がビタミンＤ代謝産物又は類似体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ビタミンＤ代謝産物又は類似体が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ受容体（本明細書中で以後、「ＶＤＲ」と呼ぶ。）を活性化させる少なくとも１つの化合物の投与により、哺乳動物、特にヒトにおいて、平滑筋細胞増殖又は内膜過形成を低下させる方法に関する。ＶＤＲを活性化させ、本明細書中に記載の方法において使用できる化合物には、以下に限定されないが、ビタミンＤ化合物が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
正常な状態下では、ヒトの身体は、食事を介して、又は太陽光に当たることにより、ビタミンＤ３を獲得する。通常、ビタミンＤ３は活性ではなく、肝臓において２５−ヒドロキシラーゼにより修飾されることにより、及び、腎臓において２５−ヒドロキシビタミンＤ１α−ヒドロキシラーゼにより修飾されて、活性のある代謝産物、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が形成され、次いでこれが、２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−ヒドロキシラーゼ（本明細書中で以後「２４−ＯＨａｓｅ」と呼ぶ。）により代謝される（Ｂｒｏｗｎ  ＡＪ，Ｄｕｓｓｏ  ＡＳ  ＆  Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  Ｅ，「Ｖｉｔａｍｉｎｅ  Ｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７：１０−１９（２００２）；Ｗｕ−Ｗｏｎｇ  ＪＲ，Ｔｉａｎ  Ｊ  ＆  Ｇｏｌｔｚｍａｎ  Ｄ，「Ｖｉｔａｍｉｎｅ  Ｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｐｄａｔｅ，「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ，５：３２０−３２６（２００４））。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２もしくはＤ３又はこれらの類似体がＶＤＲ、核受容体へ結合することにより、ＶＤＲが活性化され、レチノイドＸ受容体（本明細書中で以後「ＲＸＲ」と呼ぶ。）と相互作用し、ＶＤＲ／ＲＸＲ／共同因子複合体が形成され、これが、標的遺伝子のプロモーター領域においてビタミンＤ応答エレメントと結合し、遺伝子転写を制御する（Ｃａｒｌｂｅｒｇ  Ｃ，Ｑｕａｃｋ  Ｍ，Ｈｅｒｄｉｃｋ  Ｍ，Ｂｕｒｙ  Ｙ，Ｐｏｌｌｙ  Ｐ  ＆  Ｔｏｅｌｌ  Ａ，「Ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＶＤＲ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎｅ  Ｄ（３）  ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，６６：２１３−２２１（２００１））。腸、骨、腎臓、副甲状腺、膵臓β細胞、単球、ケラチノサイト及び多くの癌細胞を含む３０を超える組織においてＶＤＲが見出されており、このことから、ビタミンＤ内分泌系がまた、免疫系、細胞増殖、分化及びアポトーシスを制御することに関与し得ることが示唆される。
【０００３】
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３又はカルシトリオール、内在性ＶＤＲ活性化因子としても知られている。）は、カルシウム及びリンのホメオスタシスを制御することがよく示されている。１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３はまた、骨へのカルシウムおよびリンの蓄積の制御に関与している。腎臓は、２５−ヒドロキシビタミンＤ−１α−ヒドロキシラーゼが存在し、ビタミンＤを活性化する主要な部位である。ビタミンＤ欠乏は、腸でのカルシウム及びリンの吸収不全をもたらす。
【０００４】
初期の段階でさえも、腎疾患の結果、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の合成が低下することが多い。腎疾患が進行するにつれて、最適範囲内にイオン化カルシウムレベルを維持するために腎リン酸クリアランスが不適切となり、カルシウム吸収が不十分となって、副甲状腺及びＰＴＨ合成の慢性的な過度の刺激を招く。さらに、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＰＴＨの合成及び分泌の制御において直接的な役割を果たす（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｊ，Ｋｉｌａｖ  Ｒ，Ｎａｖｅｈ−Ｍａｎｙ  Ｔ，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８３：Ｆ３６７−７６（２００２））。低カルシウム血症及び高リン血症は、ＰＴＨのｍＲＮＡの安定性に転写後に影響を与えることによりＰＴＨ遺伝子発現を上方制御するが、一方で、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＰＴＨ遺伝子発現を転写レベルで下方制御する（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｊ，Ｋｉｌａｖ  Ｒ，Ｎａｖｅｈ−Ｍａｎｙ  Ｔ，「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８３：Ｆ３６７−７６（２００２））。故に、二次的な副甲状腺機能亢進症（本明細書中で以後「ＳＨＰＴ」と呼ぶ。）は、副甲状腺過形成及びＰＴＨの合成及び分泌促進を特徴とする、慢性腎疾患においてよくある合併症である（Ｓｌａｔｏｐｏｌｓｋｙ  Ｅ，Ｂｒｏｗｎ  Ａ，Ｄｕｓｓｏ  Ａ，「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ」、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，７３：Ｓ１４−１９（１９９９））。さらに、慢性腎疾患患者は、高、低又は混合型代謝回転骨疾患を特徴とする腎性骨ジストロフィーを経験することが多い。ＰＴＨは、複数の器官に影響を与える尿毒症毒素とみなされ、ＰＴＨレベルの調節は、慢性腎疾患の管理において非常に重要な段階である。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（カルシウム血症性の副作用が少ない１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の類似体）などのＶＤＲ活性化因子が現在、日常的にＳＨＰＴを管理するために使用されている。ＶＤＲ活性化因子は、直接及び間接的影響の両方により副甲状腺機能を調節する。ＶＤＲ活性化因子は、ＰＴＨ転写及び合成を直接下方制御し、また、副甲状腺細胞増殖を直接阻害する。これらの物質は、ＰＴＨのカルシウム血症作用に対する骨の抵抗性を向上させ、カルシウムホメオスタシスを改善し、次いで、ＰＴＨ機能を間接的に調節する。正常な腎機能には、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３レベルの維持が必要であることを強調することは重要である。ＣＫＤ患者はＳＨＰＴを治療するためにＶＤＲ活性化因子を必要とする。どんなに高レベルであろうと、ビタミンＤ補給はＣＫＤ患者には効果がない。さらに、ＣＫＤ患者を１α（ＯＨ）Ｄ２またがＤ３などのプロドラッグにより治療する場合、１α、２５（ＯＨ）Ｄ２またはＤ３が肝臓において活性化型になるには２５−ヒドロキシラーゼを必要としている、正常な肝機能を考慮することが重要である。
【０００５】
慢性腎疾患（「ＣＫＤ」と略す。）に罹患している患者は、長い期間にわたり、ゆっくりと腎機能を失う。ＣＫＤは、現在、腎生検より確認されるか、又は、腎障害のマーカーもしくは又は３ヶ月間の糸球体濾過率（「ＧＦＲ」と略す。）＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２であることを特徴とする腎障害として定義されている。腎障害は、血液もしくは尿検査又は画像検査における異常を含む、病理学的異常又は障害のメーカーとして定義される。腎障害のマーカーとしては、尿タンパク、尿検査もしくは沈殿物検査における異常又は腎臓の画像検査における異常が挙げられる。血清クレアチニン及びその他の可変要素（年齢、性別、人種及び身体の大きさを含む。）に基づく予測方程式からＧＦＲを推定することができる。
【０００６】
ＣＫＤに罹患している個体の中で、疾患のステージ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（Ｋ／ＤＯＱＩ）、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４２（４）、Ｓｕｐｐ．３、Ｓ１−Ｓ２０１（２００３年１０月））からの下記表１参照）は、腎疾患の原因に関わりなく、ＧＦＲのレベルに基づく。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
ＣＫＤ患者は、代謝的に活性のあるビタミンＤを作ることができなくなり、リン酸の排泄が非効率的となる。結果として、代謝的に活性のあるビタミンＤのレベルが低下し、循環血カルシウムレベルが低下し、循環血リン酸レベルが上昇する。循環血カルシウム及びリン酸レベルの変化を補おうとする場合、副甲状腺がＰＴＨを分泌し、カルシウム及びリン酸レベルを正常化する。最終的には、ＰＴＨの分泌が過剰となる。このＰＴＨの過剰分泌は、二次性副甲状腺機能亢進症（「ＳＨＰＴ」と略す。）と呼ばれる。さらに、ＰＴＨレベルが推奨範囲のレベルよりも高い患者ほど、骨疾患のリスクが大きい。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（Ｋ／ＤＯＱＩ）ガイドライン（「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４２（４）Ｓｕｐｐ．３、Ｓ１−Ｓ２０１（２００３年１０月））は、骨疾患を予防又は改善するために、ＰＴＨレベルが７０ｎｇ／ｍＬを超える場合に治療を推奨している。
【０００９】
これらの患者が、疾患の末期（「末期腎不全」又は「ＥＳＲＤ」として知られている。）となるまでに、これらの患者の腎臓はベースラインの１０％未満しか機能せず、日常生活に必要なレベルで機能することはもはや不可能である。この時点で、これらの患者は、透析治療を受けるか、腎移植を受ける必要がある。
【００１０】
ＣＫＤに罹患している患者において血液透析を開始する前に、血管アクセス部位を用意しなければならない。血管アクセス部位は、透析中に血液を取り出し、戻す部位である。ＣＫＤ患者においては、３種類の血管アクセスが一般に用いられる。これらは、動静脈（ＡＶ）瘻、ＡＶグラフト及び静脈カテーテルである。これらの血管アクセスのそれぞれにより、さらなる治療又は手術が必要となる合併症が起こり得る。最もよくある合併症は、アクセス感染及び障害である。アクセス障害は、主に、内膜過形成（主に平滑筋細胞増殖を含む。）、炎症及び血栓症の結果である狭窄による。アクセス障害は、狭くなった血管の小さい部分を広げる血管形成手術により解決され得る。あるいは、別の選択肢は、手術を行い、血管の狭窄部分を取り替えることである。
【００１１】
狭窄は、血液透析を行っているＣＫＤ患者に影響があるだけではなく、血管を閉塞させるか又は狭窄させる血管障害に罹患しているあらゆる患者に影響がある。例えば、コレステロール、内膜過形成、炎症及び血栓症による、冠動脈などの血管に対する損傷の結果、やがて血管の狭窄が起こり得る。バルーン血管形成を使用して、閉塞した又は狭窄した血管を広げるか又は開くことができる。
【００１２】
冠動脈バイパス移植後などのバイパス移植術後にも狭窄が起こり得る。このタイプの手術は、詰まった血管、特に動脈、周辺の血液を別の経路に切り替えるか、又は「バイパス」するために行われる。この状況において、移植した血管セグメントで狭窄が起こり得る。他の狭窄血管のように、血管を広げるか又は再開させるために、血管形成又はアテローム切除術が必要となり得る。
【００１３】
通常の血管形成手順は、次の段階を含む。最初に、執刀医が、光ファイバーカメラが入った細いカテーテル（チューブ）を直接、ブロックされている血管に装着する。次に、執刀医が、バルーン血管形成を用いてブロックされている血管を開き、ここで、執刀医は、カテーテルを介して血管へと小さなしぼんだバルーンを通す。次に、バルーンを膨らませ、血管壁に対してプラークを圧迫してそれを平らにし、血液が再び血管を自由に流れられるようにする。その後動脈の開通を保つために、執刀医は、通常、「ステント」と呼ばれる装置を使用するが、これは、閉塞部位において血管形成中に移植される拡張可能な金属又はポリマーメッシュチューブである。準備ができたら、ステントを血管壁に向かって押し、それを開き続ける。
【００１４】
研究により、複数の血管との使用を含め、ステントの使用により高い生存率が報告されている。しかし、多くの場合、ステント血管は、最終的に、再狭窄（再び狭くなる。）により閉塞状態となる。再狭窄は、ステント処置又はバルーン血管形成後の損傷に対する血管の自然な反応である。血管形成を受けた患者のおよそ３分の１で、術後約６ヶ月以内に拡張部位の再狭窄が起こる。再狭窄動脈は、さらなる血管形成を行う必要があり得る。再狭窄を低減させるために、ステントがときおり薬剤により被覆されまたは薬剤が埋め込まれる。
【００１５】
ＣＫＤ患者は、心血管障害のリスクが非常に高くなる。Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙからのデータから、若年（２５−３４歳）透析患者群における心血管系死亡のリスクが、年齢適合集団におけるリスクよりも５００倍高いことが示されている。４５−５５歳の年齢層でも、正常の年間死亡率よりもまだ６０倍高い。実際に、ＣＫＤ患者の心血管障害による死亡の絶対的リスクは、陳旧性心筋梗塞であった患者よりも高い。臨床的に著明な冠動脈疾患の患者の間での、ＣＫＤ、死亡率及び治療ストラテジーに関連する研究から、ＧＦＲが各１０ｍＬ／ｍｉ減少すると、ステージ２のＣＫＤでの死亡率が＞１０％上昇することが示された。ステージ３及び４において、正常な個体と比較した場合、５年後生存可能性は、＜５０％に低下する。ＣＫＤにおける血管障害の高率発生は十分に分かっている。末期腎不全の患者における冠動脈の形態を評価する試験において、及び、適合する非尿毒性対照患者の冠動脈と比較して、末期腎不全患者の冠動脈は、プラークの石灰化が顕著に進んでいることが分かった。尿毒性患者において、冠動脈の内側の厚さが顕著により高かった。尿毒性患者において、内腔領域は顕著に小さかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
その結果、哺乳動物、特に冠動脈疾患などの血管障害に罹患している哺乳動物において、平滑筋細胞増殖を低下させるための方法が当技術分野で必要とされている。さらに、慢性腎疾患に罹患している哺乳動物及び／又は冠動脈バイパス術を受けた哺乳動物において内膜過形成を軽減することが当技術分野でさらに必要とされている。最後に、血管形成術を受けた哺乳動物において動脈再狭窄を軽減すことも当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、血管障害に罹患している哺乳動物において平滑筋細胞増殖を低下させる方法に関し、ここで、この血管障害は、血管の狭窄又は閉塞を引き起こす。この方法は、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化する化合物の治療上有効量を哺乳動物に投与する段階を含む。これらの化合物は、経口もしくは静脈内投与するか、又はステント上のコーティングの一部として、又はグラフト又はインプラント上のコーティングの一部として投与することができる。ビタミンＤ受容体を活性化する化合物としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ代謝産物又は類似体（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２など）などのビタミンＤ化合物が挙げられる。ビタミンＤ化合物が投与されるべき場合、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で、静脈内投与することができる。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、慢性腎疾患に罹患している哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法に関する。この方法は、ＶＤＲを活性化する化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与する段階を含む。これらの化合物は、経口もしくは静脈内投与で、又は、ステント上のコーティングの一部として、又はグラフトもしくはインプラント上のコーティングの一部として、投与することができる。ビタミンＤ受容体を活性化する化合物としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ代謝産物又は類似体（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２など）などのビタミンＤ化合物が挙げられる。ビタミンＤ化合物が投与されるべき場合、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で、静脈内投与することができる。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、血管形成が行われた哺乳動物において再狭窄を軽減する方法に関する。この方法は、ＶＤＲを活性化する化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与する段階を含む。これらの化合物は、経口もしくは静脈内投与で、又は、ステント上のコーティングの一部として、又はグラフトもしくはインプラント上のコーティングの一部として、投与することができる。ビタミンＤ受容体を活性化する化合物としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ代謝産物又は類似体（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２など）などのビタミンＤ化合物が挙げられる。ビタミンＤ化合物が投与されるべき場合、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で、静脈内投与することができる。
【００２０】
またさらに別の実施形態において、本発明は、冠動脈バイパス術を行った哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法に関する。この方法は、ＶＤＲを活性化する化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与する段階を含む。これらの化合物は、経口もしくは静脈内投与で、又は、ステント上のコーティングの一部として、又はグラフトもしくはインプラント上のコーティングの一部として、投与することができる。ビタミンＤ受容体を活性化する化合物としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ代謝産物又は類似体（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２など）などのビタミンＤ化合物が挙げられる。ビタミンＤ化合物が投与されるべき場合、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で、静脈内投与することができる。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、血管アクセス装置の実装を要する血液透析が必要な慢性腎疾患に罹患している哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法に関する。この方法は、ＶＤＲを活性化する化合物の治療上有効量を前記哺乳動物に投与する段階を含む。これらの化合物は、経口もしくは静脈内投与で、又は、ステント上のコーティングの一部として、又はグラフトもしくはインプラント上のコーティングの一部として、投与することができる。ビタミンＤ受容体を活性化する化合物としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ代謝産物又は類似体（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２など）などのビタミンＤ化合物が挙げられる。ビタミンＤ化合物が投与されるべき場合、週に３回、約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの量で、静脈内投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
定義
本明細書中で使用する場合、「内膜過形成」という用語は、動脈の内側が厚くなり、内腔領域の狭窄が起こる血管損傷に対する平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖反応を指す。この損傷は、血管形成、動脈内膜切除、ＣＫＤ患者における血管アクセスの装着などの血管インターベンションによるものであり得る。この損傷はまた、高血圧、糖尿病又は異脂肪血症などの疾患によっても起こる。血管の内腔に徐々に侵入する過形成増殖は、狭窄（又は動脈再狭窄）の主要な原因である。インターベンション時にすぐに循環血液において生じ得るような、血栓とは区別されるように、動脈インターベンション後、数日から数週間にわたり、過形成が徐々に起こる。
【００２３】
より具体的には、血管損傷に対する反応における事象のカスケードにより内膜過形成が引き起こされる。血管手術から起こるものなど、血管損傷に対する炎症及び修復反応の一部として、炎症細胞（単球、マクロファージ及び活性化多形核球白血球及びリンパ球）は、血管壁において炎症性病変を形成することが多い。病変形成により、血管又は心臓の血管内膜及び内側細胞層において細胞が活性化される。細胞活性化には、内膜として知られる最深部の細胞層への細胞の移動が含まれ得る。内皮細胞が平滑筋細胞増殖因子（例えば、血小板由来増殖因子、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子、形質転換増殖因子−β及び塩基性繊維芽細胞増殖因子）を分泌し、これらがこのような新たに移動させられる平滑筋細胞を増殖させるため、このような移動は、血管グラフトの長期的な成功に対して問題を引き起こす。さらに、トロンビンが、増殖因子そのものとして作用することにより、及び、血小板及び内皮細胞により産生されるいくつかの他の増殖因子の放出を促進することにより、平滑筋細胞増殖を促進することが分かっている（Ｗｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：３１５−３１（１９９６））。平滑筋細胞増殖は、異常であり制御不能な、血管又は心臓の内腔への内膜増殖を引き起こし、これにより、血管の通路が妨げられ、しばしば閉じられる。内側の異常なカルシウム蓄積又は内膜での脂肪蓄積は、平滑筋細胞増殖を伴うことが多く、このような脂肪蓄積は一般に、マクロファージ、Ｔリンパ球及び平滑筋細胞内で蓄積されるコレステロール及びコレステリルエステルの形態で存在する。これらのカルシウム及び脂肪蓄積は、動脈及び血管を硬化させる動脈硬化を引き起こし、最後に血管不全を引き起こす。血管移植により引き起こされるこれらの動脈硬化性病変もまた、さらなる血管再建術により除去し得るが、再狭窄によるこの方法の失敗率は、３０から５０％の間であることが観察されている。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「ビタミンＤ受容体を活性化させる化合物」という句及び「ＶＤＲ活性化因子」という用語は、交換可能に使用される。本明細書中で使用する場合、「ビタミンＤ受容体を活性化させる化合物」という句及び「ＶＤＲ活性化因子」という用語は、ビタミンＤ受容体に結合し、ＶＤＲシグナル経路において機能的反応を引き出すことができるいずれの化合物をも指す。ＶＤＲ活性化因子の例としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ化合物ならびに、ビタミンＤ受容体へ結合し、ＶＤＲシグナル経路における機能的反応を引き出すことができるが、構造的にビタミンＤ化合物とは異なる、何らかのその他の化合物が挙げられる。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「ビタミンＤ化合物」という用語は、哺乳動物において１以上の様々なビタミンＤ−反応プロセス、即ち、腸カルシウム吸収、骨動員、骨石灰化及び細胞分化を調節する化合物を包含する。したがって、本発明に包含されるビタミンＤ化合物としては、コレカルシフェロール及びエルゴカルシフェロール及びこれらの代謝産物ならびに、カルシウム血症作用又は細胞分化活性を示す、合成コレカルシフェロール及びエルゴカルシフェロール類似体が挙げられる。本発明に包含されるビタミンＤ化合物に制限されることなく、これらの合成コレカルシフェロール及びエルゴカルシフェロール類似体は、５，６トランス−コレカルシフェロール及び５，６−トランス−エルゴカルシフェロール、フッ素化コレカルシフェロール、側鎖ホモロゲーテッド（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇａｔｅｄ）コレカルシフェロール及び側鎖ホモロゲーテッド２２コレカルシフェロール、側鎖短縮コレカルシフェロール、１９−ノルコレカルシフェロール及びエルゴカルシフェロール及び１０，１９−ジヒドロビタミンＤ化合物などの化合物のカテゴリーを含む。
【００２６】
このような化合物のある具体例としては、以下に限定されないが、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２、１−ヒドロキシビタミンＤ３、１−ヒドロビタミンＤ２、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２４，２４-ジフルオロ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４，２４−ジフルオロ−２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２−フルオロ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２−フルオロ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２６，２６，２６，２７，２７，２７−ヘキサフルオロ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２６，２６，２６，２７，２７，２７−ヘキサフルオロ−１，２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２４−２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１４，２５−トリヒドロキシビタミンＤ３、５，２６−ジヒドロキシビタミンＤ３、１５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ３、３，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２３，２５，２６−トリヒドロキシビタミンＤ３及び対応する１−ヒドロキシル化型、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、−２６，２３−ラクトン及びその１−ヒドロキシル化誘導体、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の、及び−ジヒドロキシビタミンＤ３の、側鎖、ノル、ジノル、トリノル及びテトラノル類似体、１−ヒドロキシプレグナカルシフェロール及びそのホモ及びジホモ誘導体、１，２５−ジヒドロキシ−２４−２０ｉビタミンＤ２、２４−ホモ−１，２５，ジヒドロキシビタミンＤ３、２４−ジホモ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３，２４−トリホモ−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３及び、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の、対応する２６−又は２６，２７−ホモ、ジホモ又はトリホモ類似体ならびに、上記で列記したものの対応する１９−ノル化合物などの、ビタミンＤ代謝産物又は類似体が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「血管の狭窄又は閉塞を引き起こす血管障害」という句は、血管を狭窄又は閉塞させる影響を有する何らかの血管障害を指す。この句には、血管狭窄、血管再狭窄、アテローム性動脈硬化症、ならびに内膜過形成により引き起こされる閉塞が含まれる。
【００２８】
本発明は、以下に限定されないが、１以上のビタミンＤ化合物などのビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を活性化する化合物を使用して、哺乳動物、好ましくは、（治療を必要としている）ヒト（即ちヒト患者）において平滑筋細胞増殖又は内膜過形成を軽減することができるという発見に関する。
【００２９】
より具体的には、ある実施形態において、本発明は、血管障害に罹患している哺乳動物において平滑筋細胞増殖を低下させる方法に関する。血管障害は、血管（即ち動脈）の狭窄又は閉塞（部分的閉塞又は完全閉塞）の原因となり得る何らかの血管障害（即ち、末梢動脈障害、腹部大動脈瘤、頸動脈疾患、静脈疾患など）であり得る。例えば、血管の狭窄又は閉塞は、病変、狭窄、再狭窄、内膜過形成などの結果であり得る。本方法は、このような血管障害に罹患している、及び治療を必要としている哺乳動物に、ＶＤＲを活性化する化合物の有効量を投与することを含む。
【００３０】
この化合物は、多岐にわたる様々な方法で投与することができる。例えば、この化合物を経口又は静脈内投与することができる。あるいは、この化合物は、外科用用具又は医療用具又はインプラント（例えば、ステント（即ち、薬物被覆ステント）、グラフト（即ち、血管アクセスグラフト（即ち、動静脈（ＡＶ）瘻、ＡＶグラフト又は静脈カテーテル）もしくはバイパスグラフト（冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ））、カテーテル、縫合糸、プロテーゼ）などから放出させることができる。この装置又はインプラントは、この化合物により被覆されるか、この化合物が埋め込まれるか又はこの化合物により被覆されることができる。この化合物はまたフィルムでもあり得る。この化合物により被覆された、この化合物が埋め込まれたまたはこの化合物がしみ込まされたステントおよびグラフトを含む、ステントまたはグラフトを作製する方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第６，６５２，５８１号、６，７９７，７２７号及び６，８０８，５３６号に記載されている。
【００３１】
本明細書中に記載の方法に準じて投与される化合物は、当技術分野で公知であり、選択された経路を介した投与に適切な方法に従い処方することができる。例えば、以下に限定されないが、錠剤、溶液、粉末、懸濁液、クリーム、エアロゾルなど、この化合物を含有する何らかの医薬的に許容される処方物を使用し得る。当技術分野で公知であるか又は見込まれる何らかの医薬的に許容される担体をこの処方物に添加し得る。
【００３２】
投与することができる化合物の例は、ビタミンＤ化合物である。好ましくは、このビタミンＤ化合物はパリカルシトール（１９−ノル−１α，３β,２５−トリヒドロキシ−９，１０−セコエルゴスタ−５（Ｚ）；７（Ｅ），２２（Ｅ）−トリエン，１α，２５ジヒドロキシ１９ノルエルゴカルシフェロール、１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及び１α，２５−ジヒドロキシル−１９ノル−ビタミンＤ２としても知られている。）又はカルシトリオール（１−α−２５−ジヒドロキシビタミンＤ３としても知られている。）である。このビタミンＤ化合物は、当技術分野で公知であり、選択された経路を介した投与に適した方法に従い、処方することができる。例えば、経口カプセルが米国特許第４，３４１，７７４号で開示されており、静脈内投与に適した処方物が米国特許第４，３０８，２６４号及びＷＯ９６／３６３４０で開示されている。好ましくは、投与するビタミンＤ化合物に依存して、ビタミンＤ化合物を約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの治療上有効量で、週に３回、静脈内投与する。
【００３３】
第二の実施形態において、本発明は、ＣＫＤに罹患している哺乳動物において内膜過形成を軽減する方法に関する。本方法は、ＣＫＤに罹患している、及び治療を必要としている哺乳動物に、ＶＤＲを活性化する化合物の有効量を投与することを含む。
【００３４】
この化合物は、多岐にわたる様々な方法で投与され得る。例えば、この化合物は、経口的に又は静脈内に投与されることができる。あるいは、この化合物は、外科用用具又はインプラント（例えば、ステント（即ち、薬物により被覆されたステント）、グラフト（即ち、血液透析を必要とする患者のための血管アクセスグラフト（即ち、動静脈（ＡＶ）瘻、ＡＶグラフト又は静脈カテーテル）もしくはバイパスグラフト（冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ））、カテーテル、縫合糸、プロテーゼなど）から放出させることができる。この装置又はインプラントは、この化合物により被覆されるか、この化合物が埋め込まれるか又は化合物が染み込まされることができる。この化合物はフィルムとして形成させることもできる。本明細書中で前に考察したように、この化合物で被覆されているか、この化合物が埋め込まれているか又は化合物が染み込まされているステント及びグラフトなどのステント及びグラフトを作製するための方法は、当技術分野で周知である。
【００３５】
本明細書中に記載の方法に準じて投与される化合物は、当技術分野で公知であり、選択された経路を介した投与に適切な方法に従い処方することができる。例えば、本明細書中で先述した方法に関連して考察したような、この化合物を含有する何らかの医薬的に許容される処方物を使用することができ、当技術分野で公知であるか又は見込まれる何らかの医薬的に許容される担体をこの処方物に添加し得る。
【００３６】
投与することができる化合物の例は、ビタミンＤ化合物である。好ましくは、ビタミンＤ化合物はパリカルシトール又はカルシトリオールである。このビタミンＤ化合物は、当技術分野で公知であり、本明細書中で先述した方法に関連して考察したような、選択された経路を介した投与に適した方法に従い処方することができる。好ましくは、投与するビタミンＤ化合物に依存して、ビタミンＤ化合物を約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの治療上有効量で、週に３回静脈内投与する。
【００３７】
第三の実施形態において、本発明は、血管形成が行われた哺乳動物において再狭窄を軽減する方法に関する。本方法は、血管形成が行われた哺乳動物にＶＤＲを活性化する化合物の有効量を投与することを含む。
【００３８】
この化合物は、多岐にわたる様々な方法で投与され得る。例えば、この化合物は、経口的に又は静脈内に投与されることができる。あるいは、この化合物は、外科用用具又はインプラント（例えば、ステント（即ち、薬物により被覆されたステント）、グラフト（ＣＡＢＧなどのバイパスグラフト）、カテーテル、縫合糸、プロテーゼなど）から放出させることができる。この装置又はインプラントは、この化合物により被覆されるか、この化合物が埋め込まれるか又は化合物が染み込まされることができる。この化合物はフィルムとして形成させることもできる。本明細書中で前に考察したように、この化合物で被覆されているか、この化合物が埋め込まれているか又は化合物が染み込まされているステント及びグラフトなどのステント及びグラフトを作製するための方法は、当技術分野で周知である。
【００３９】
本明細書中に記載の方法に準じて投与される化合物は、当技術分野で公知であり、選択された経路を介した投与に適切な方法に従い処方することができる。例えば、本明細書中で先述した方法に関連して考察したような、この化合物を含有する何らかの医薬的に許容される処方物を使用することができ、当技術分野で公知であるか又は見込まれる何らかの医薬的に許容される担体をこの処方物に添加することができる。
【００４０】
投与することができる化合物の例は、ビタミンＤ化合物である。好ましくは、ビタミンＤ化合物はパリカルシトール又はカルシトリオールである。このビタミンＤ化合物は、当技術分野で公知であり、本明細書中で先述した方法に関連して考察したような、選択された経路を介した投与に適した方法に従い処方することができる。好ましくは、投与するビタミンＤ化合物に依存して、ビタミンＤ化合物を約０．０４から約０．２４ｍｃｇ／ｋｇの治療上有効量で、週に３回、静脈内投与する。
【００４１】
次の非限定実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【実施例１】
【００４２】
ビタミンＤ活性化因子を用いた平滑筋細胞増殖の低下
材料及び方法
細胞培養：Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から初代培養ヒト冠動脈平滑筋細胞（本明細書中で以後「ＣＡＳＭＣ」と呼ぶ。）を購入し、５．５ｍＭグルコース、５％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬアンホテリシン−Ｂ、５μｇ／ｍＬインスリン、２ｎｇ／ｍＬヒト組み換え繊維芽細胞増殖因子（本明細書中で以後「ｈＦＧＦ」と呼ぶ。）及び０．５ｎｇ／ｍＬヒト組み換え上皮細胞増殖因子（本明細書中で以後「ｈＥＧＦ」と呼ぶ。）を含有するＳｍＧＭ−２（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で、湿気のある５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気下で３７℃にてコンフルエントになるまで増殖させた。細胞を＞８０％コンフルエントまで増殖させ、５回の継代内で使用した。
【００４３】
チミジン取り込み：９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ３５９５−Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）に、１ｘ１０６個細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルで細胞を播種した。播種から１日後、試験薬剤で２４時間、細胞を処理し、次いで、３Ｈ−チミジン０．３μＣｉ／ウェルでさらに４８時間標識した。ＰＢＳ  ０．３ｍＬ／ウェルで各ウェルを洗浄し、氷冷１０％トリクロロ酢酸（本明細書中で以後「ＴＣＡ」）０．２ｍＬ／ウェルとともに４℃にて３０分間インキュベートし、その後、さらにＴＣＡ０．２ｍＬ／ウェルで洗浄した。ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴＴＭ２０中で試料を溶解させた後、カウントを行った。示されるデータは、平均±標準偏差（ｎ＝４）である。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ：細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、関心のある遺伝子及びグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（本明細書中で以後「ＧＡＰＤＨ」と呼ぶ。）遺伝子に対するＲＮＡレベルについて分析した。簡単に述べると、オリゴｄＴをプライマーとして使用して（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、トータルＲＮＡを最初にｃＤＮＭに逆転写した。次に、表２で下記に示す特異的なＰＣＲプライマーを用いて、９４℃にて３０秒／５５℃にて３０秒／７２℃にて１分を３０サイクル繰り返すＰＣＲによりｃＤＮＡ試料を増幅させた。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析：試験薬剤で前処理した又はしていない、細胞（１試料あたり１ｘ１０６細胞）をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５０μＬ中で溶解させ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ＢＣＡタンパク質アッセイにより各試料中のタンパク質含量を調べた。４−１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離し、ウェスタンブロッティングのために、タンパク質を電気泳動的にポリビニリデンフルオリド（本明細書中で以後「ＰＶＤＦ」）膜に転写した。２５℃にて１時間、ＰＢＳ−Ｔ中の５％脱脂粉乳を用いて膜をブロットし、次いで、ＰＢＳ−Ｔ中のマウス抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体（１０００倍希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とともに４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで膜を洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体とともに２５℃にて１時間インキュベートした。次に、膜を検出試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベートした。ペーパーをＫｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘフィルムに曝露することにより特異的なバンドを視覚化した。
【００４７】
ＶＤＲ／ＲＸＲに対する免疫染色及び共焦点顕微鏡：様々な時間にわたり、４つのチャンバーのあるスライドにおいて増殖させた細胞を０．１μＭの試験薬剤で処理した。ＰＢＳで３０秒間細胞を洗浄し、固定溶液（ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド）で１５分間固定し、再びＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間処理した。スライドをＰＢＳでリンスし、室温にて１時間、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡとともにインキュベートした。次に、ＰＢＳ中のマウス抗ＶＤＲモノクローナル抗体及びウサギ抗ＲＸＲポリクローナル抗体（５０倍希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、４℃にて、＞２０時間、スライドをインキュベートした。インキュベーション後、スライドをＰＢＳでリンスし、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１５分間ブロッキングし、次いで二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒｏヤギ抗マウス５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒｏ  ヤギ抗ウサギ４８８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに３７℃にて１時間インキュベートした後、ＰＢＳでさらに洗浄した。スライドを載せ、イメージアナライザーと連結している共焦点顕微鏡で撮影した。
【００４８】
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）結合アッセイ：細胞を回収し、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、次いで、高張緩衝液中（ＫＴＥＤＭ：３００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴおよび１０ｍＭモリブデン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）に再懸濁しその後、超音波細胞破砕装置（Ｂｒａｎｓｏｎ，Ｎｉａｎｔｉｃ，ＣＴ）を用いて均質化した。２０７，０００ｘｇで３０分間、混合物を遠心分離した。ＫＴＥＤＭ中の［３Ｈ］カルシトリオール（０．１２５ｎＭ−２０ｎＭ）（濃度が上昇していく。）とともに４０℃にて１９−２４時間、上清をインキュベートした。１０μＭ非標識カルシトリオール存在下で非特異的結合を調べた。水酸リン灰石（本明細書中で以後「ＨＡＰ」と呼ぶ。）を添加することにより、結合した、及び遊離の放射性標識リガンドを分離した。簡単に述べると、既に述べられているように（Ｗｅｃｋｓｌｅｒ  ＷＲ、Ｎｏｒｍａｎ  ＡＷ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７９，９２：３１４−３２３）洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入り）６０ｍＬ中でＢｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＡＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）１０ｇを懸濁し、洗浄し、再懸濁することにより、ＨＡＰの５０％スラリーを調製した。各アッセイチューブに対して、ＨＡＰの５０％スラリーの等量を添加した。混合物を１２，０００ｇで１分間遠心分離した。ペレットを洗浄緩衝液で３回洗浄した。最終ペレットを４００μＬエタノール中で再懸濁し、放射活性の測定のためにシンチレーションバイアルに移した。
【００４９】
結果
ＣＡＳＭＣの初代培養においてビタミンＤ受容体の特徴を調べ、これらの細胞においてパリカルシトール及びカルシトリオールの機能的影響を調べた。これらの細胞から調製した細胞抽出物を用いたＶＤＲ結合において、Ｂｍａｘは０．１６ｐｍｏｌ／ｍｇであり、Ｋｄは［３Ｈ］−カルシトリオールについて０．８ｎＭであった（図１）。ＶＤＲに対する抗体を用いた共焦点顕微鏡から、ＶＤＲは、細胞が増殖培地中にある場合、ＶＤＲを活性化する化合物の非存在下で、主に細胞質に存在することが示された。パリカルシトール及びカルシトリオールにより処理すると、核へとＶＤＲが移動したが、全ての細胞がこの処理に反応したわけではなかった（図２参照）。ＶＤＲを活性化する化合物を添加した結果、ＤＮＡ合成（［３Ｈ］−チミジン取り込みにより求めた場合）が阻害され、これは、血清不含培地の影響と同様であった。ＤＮＡ合成におけるパリカルシトール及びカルシトリオールの影響は用量依存的であった（図３及び４参照）。対して、タキソール（抗新生物薬）は０．０１ｎＭでもＤＮＡ合成に顕著に影響を与えた（図３）。ＲＴ−ＰＣＲにより評価した場合、カルシトリオールは、２４−ＯＨａｓｅ発現の刺激において、パリカルシトールよりも１００倍強力であった（図５参照）。興味深いことに、パリカルシトールは、これらの細胞でのＤＮＡ合成の阻害において、僅かに強力であった（ＥＣ５０＝０．０４４±０．００４対０．１１１±０．０２ｎＭ、図４）。また、パリカルシトールは、アテローム硬化性プラークにおいて増大されマクロファージと共局在する（図６参照）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤タイプ１（ＰＡＩ−Ｉ）（冠動脈疾患のリスクマーカーの１つ）のレベルを低下させることにおいてカルシトリオールと同程度効力があった。これらの結果から、パリカルシトール及びカルシトリオールがＣＡＳＭＣにおいて核へのＶＤＲ移動を誘導し、パリカルシトールが細胞増殖及びＰＡＩ−Ｉ発現の阻害においてカルシトリオールと同程度の効力を有することが示唆される。パリカルシトールは通常、臨床の場において、カルシトリオールよりも３−４倍高い用量で投与されるが、これにより、平滑筋細胞の機能の制御においてパリカルシトールがより著しい効果をもたらし得る。したがって、平滑筋細胞増殖の阻害は、哺乳動物において内膜過形成を軽減することと関連しているであろう（内膜過形成が平滑筋細胞の増殖の結果である場合。）。
【実施例２】
【００５０】
血管形成におけるビタミンＤ類似体の効果
材料及び方法
細胞培養：５．５ｍＭグルコース、５％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０ｎｇ／ｍＬアンホテリシン−Ｂ、５μｇ／ｍＬインスリン、２ｎｇ／ｍＬヒト組み換え繊維芽細胞増殖因子及び０．５ｎｇ／ｍＬヒト組み換え上皮細胞増殖因子を含有するＳＭＧＭ−２（Ｃａｍｂｒｅｘ）（増殖培地）中で、湿気のある５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気下で３７℃にてコンフルエントになるまで初代培養ヒト冠動脈平滑筋細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ）を増殖させた。細胞を＞８０％コンフルエントまで増殖させ、５回の継代内で使用した。
【００５１】
マイクロアレイ：完全培地中で増殖させ、１００ｎＭのパリカルシトール又はカルシトリオールで３０分間処理したヒト冠動脈平滑筋細胞の初代培養から全ＲＮＡを抽出した（各条件に対してｎ＝３）。全ＲＮＡの収率が低かったが（〜２．０μｇトータル／試料）、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００分析により判定したところ、これらＲＮＡは無傷であった。各試料からの全ＲＮＡ１μｇを使用して、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールを用いて、ビオチン標識ｃＲＮＡ標的を調製した。調製したｃＲＮＡ標的は、質量ともに良好であった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  チップＵ１３３Ａｖ２を使用し（２２，０００＋プローブセット）、１０μｇ  ｃＲＮＡ標的を各アレイに使用した。ハイブリダイゼーション及びチップスキャン後、品質管理データ報告から（即ち、倍率、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ５’／３’率、ノイズ、バックグラウンド）、全てのアレイが質的基準全てをパスしたことが分かった。スキャンした画像をＲｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ４．０データベースに取り込み、Ｒｅｓｏｌｖｅｒ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエラーモデルを用いて処理した。Ｒｅｓｏｌｖｅｒ内において、薬物により処理されたサンプルの繰り返し（ｎ＝３）を情報学的に組み合わせ、組み合わせた対照（薬物添加せず）試料に対する比率を算出した。Ｒｅｓｏｌｖｅｒ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエラーモデルを使用して、各比率を出し、ｐ−値を計算した。Ｒｅｓｏｌｖｅｒエラーモデルは、ロバストであり、統計的有意性の計算においてレポーターレベル、バックグラウンド及びエラー値を含む。階層的クラスタ分析、遺伝子オントロジー分析及びパスウェイマッピングの組み合わせを用いて、制御された遺伝子の機能を評価した。
【００５２】
リアルタイム逆転写ＰＣＲに対するプライマー及びプローブ：定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に対して、レポーター６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で５’が標識され、消光剤テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で３’が標識されたＴａｑＭａＴＭプローブを使用した。プライマー及びプローブセットをＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄコレクション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得た。
【００５３】
リアルタイム逆転写−ＰＣＲ：７９００ＨＴ配列検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲを行った。各試料の最終体積は２５μＬであり、その中には、ｃＤＮＡ  ５０ｎｇ、フォワード及びリバースＰＣＲプライマー各０．４ｍＭ及びＴａｑＭａｎＴＭプローブ０．１ｍＭが含有されていた。温度条件は、９５℃にて５分の後、６０℃で１分及び９５℃で１５秒を４０サイクル繰り返すことにより構成された。ＰＣＲ反応の各伸長フェーズ中にデータを回収し、ＳＤＳソフトウェアパッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。各遺伝子に対して閾値サイクルを決定した。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した相対的発現として、関心のある標的遺伝子の発現レベルを与えた。
【００５４】
チミジン取り込み：１ｘ１０６個細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に細胞を播種した。播種から１日後、試験薬剤で２４時間細胞を処理し、次いで３Ｈ−チミジン０．３μＣｉ／ウェルでさらに４８時間標識した。各ウェルをＰＢＳ  ０．３ｍＬ／ウェルで洗浄し、氷冷１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０．２ｍＬ／ウェルとともに４℃にて３０分間インキュベートし、次いで、ＴＣＡ  ０．２ｍＬ／ウェルでさらに洗浄した。ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ登録商標２０（Ｐａｃｋａｒｄ）中で試料を溶解させた後、カウントした。
【００５５】
１．パリカルシトール対カルシトリオールの影響：
パリカルシトール又はカルシトリオールで処理された群のいずれかにおいて平均の差異における２倍変化を有意に調節された発現についてのｐ＜０．０５を有するカットオフ値として用い、全部で１７６の標的遺伝子を同定した。パリカルシトール群において、１１５及び６１遺伝子がそれぞれ上方及び下方制御された。カルシトリオール群において、１１６及び６０の遺伝子がそれぞれ上方及び下方制御された。
【００５６】
２．変調遺伝子の機能的集積：ＥＡＳＥ／ＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐ：／／Ａａｐｐｓｌ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｖｉｄ／）を用いた遺伝子オントロジー分析
ＮＩＡＩＤのＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＥＡＳＥ）プログラム及びＧｅｎＭＡＰＰ／ＭＡＰＰＦｉｎｄｅｒ  Ｐａｔｙｗａｙ分析プログラムを用いてパリカルシトールデータセットを分析し、細胞内シグナリング及び代謝経路における薬物の一般的効果を評価した。多くの機能的に関連のあるクラスターが明らかとなった。ＥＡＳＥスコアが＜０．０５（ＥＡＳＥスコアは、ＦｉｓｈｅｒＥｘａｃｔスコアの上限である。）であるという結果から、細胞増殖及び分化が、この分析から同定されるキーとなるクラスターの１つであることが示される。
【００５７】
３．細胞分化／増殖遺伝子オントロジーカテゴリーに存在する遺伝子：
平滑筋細胞増殖における疾患は、再狭窄／アテローム性動脈硬化症プロセスにおいて重要な役割を果たす。したがって、細胞増殖及び分化の遺伝子オントロジーカテゴリーで示される遺伝子は特に興味深い。表３は、細胞増殖及び分化に関与する一群の遺伝子を示す。増殖に関与する複数の受容体の強力な調節が明らかであった。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
先行研究から、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）遺伝子がＶＤＲ発現の正の制御因子であり、同時に、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）受容体発現及び機能の負の制御因子であることが分かっている。さらに、ＩＧＦ１が転写レベルでＷＴ１の発現を負の方向に制御し得るという証拠がある。形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）が上方制御されることが指摘され、これは、増殖に対し負の制御作用を有すると予想される。さらに、ＫＬＦ４などの増殖の負の調節因子が中程度に上方制御された。これらの結果から、ビタミンＤ類似体が平滑筋細胞の増殖を調節するのに関与することが示唆される。
【００６０】
４．心血管機能に連結する選択遺伝子：
心血管機能に関与することが既に示されているパリカルシトール及びカルシトリオールにより制御される選択遺伝子を下記表４で示す。
【００６１】
【表４】
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【００６２】
両薬物によりトロンボモジュリン（ＴＭ）発現が上昇した。トロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１、細胞外マトリクスタンパク質）、ＭＭＰ１４（マトリクスメタロプロテイナーゼの１つ）及びトロンビン受容体様１のｍＲＮＡ発現が下方制御された。プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ１（ＣＯＸ１）及びＢ型エンドセリン受容体が上昇した。対して、ナトリウム利尿ペプチドＢ（ＢＮＰ）が下方制御された。ナトリウム利尿ペプチドは、心血管系、腎及び内分泌ホメオスタシスの制御に関与することが知られている。さらに、内皮再生に関与するとされるアンジオポエチン１、ＩＧＦ及びＴＧＦβなどのいくつかの遺伝子が、パリカルシトール及びカルシトリオールにより変化した。
【００６３】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子ミクロアレイの結果の確認
この結果の確認として、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、細胞増殖の調節に関与することが知られている３種類の遺伝子、ＩＧＦ１、ＷＴ１１、ＴＧＦβ３におけるパリカルシトールの影響を調べた。図７で示されるように、パリカルシトールは、時間及び用量依存的にこれらの３種類の遺伝子発現を上方制御した。ＩＧＦ１、ＷＴ１、ＴＧＦβ３におけるパリカルシトールのＥＣ５０値は、それぞれ、０．２、２９．７及び１０．６ｎＭであった。
【００６４】
６．細胞増殖におけるパリカルシトール及びカルシトリオールの影響：
ビタミンＤ類似体が平滑筋細胞増殖を制御すると思われるという上記の観察の意義をさらに理解するために、３Ｈ−チミジン取り込みにおけるパリカルシトール及びカルシトリオールの影響の実験を行った。図８は、パリカルシトール及びカルシトリオールの両方が用量依存的にチミジン取り込みを阻害したことを示す。パリカルシトール及びカルシトリオールに対してＥＣ５０を求めたところ、それぞれ０．２及び０．１１ｎＭとなった。１０ｎＭにおいて、パリカルシトール及びカルシトリオールの両方がチミジン取り込みを４６％阻害した（増殖培地中の細胞と比較した場合。）。
【００６５】
上記の結果から、ヒト冠動脈ＳＭＣにおいてトロンボモジュリン（ＴＭ）が上方制御されることが示される。既に、ビタミンＤの活性型がＴＭ遺伝子発現を上方制御し、単球細胞において組織因子遺伝子発現を下方制御することが示されている。最近、ＶＤＲ  ＫＯマウスにおいて、血漿カルシウムレベルに依存して、大動脈、肝臓及び腎臓のＴＭ遺伝子が下方制御され、一方で、肝臓及び腎臓における組織因子ｍＲＮＡ発現が上方制御されることが示された。上記の結果からまた、細胞外マトリクスタンパク質トロンボスポンジン１、ＭＭＰ１４及びトロンビン受容体様１が下方制御されることも示される。線溶作用が低下し、血栓形成が向上することにより、粥腫発生が促進されることが示されている。まとめると、現在の結果から、ビタミンＤ類似体が血栓形成を抑制し、繊維素溶解を促進し得ることが示され、これにより、これらの薬物が、再狭窄／アテローム性動脈硬化症のプロセス中に、血管内膜プラーク形成を制御するのに有用であることが示唆される。
【００６６】
さらに、内皮再生及び血管弛緩に関与するいくつかの遺伝子がビタミンＤ類似体により制御されることが分かった。ＮＯ放出および血管弛緩の増強において役割を果たしているＢ型エンドセリン受容体がパリカルシトールおよびカルシトリオールにより上方制御される。オキシトシンに対する受容体であり、収縮に関与するオキシトシン受容体が下方制御される。シクロオキシゲナーゼは、アラキドン酸がプロスタグランジン及びトロンボキサン（血管収縮／弛緩に別々に影響を与える。）に変換される最初の段階を触媒することが知られている。我々の結果から、プロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ）がパリカルシトール及びカルシトリオールの両方により上方制御されることが分かった。さらに、アンジオポエチン１、インスリン様増殖因子及び形質転換増殖因子などのいくつかの遺伝子が変化する。これらの結果から、ビタミンＤ類似体によるＶＤＲ活性化が血管弛緩及び内皮再生において潜在的な役割を果たすことが示唆される。
【００６７】
ＳＭＣの異常な増殖は、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄などの疾患において重要な役割を果たすことが知られている。この実験において、増殖及び分化に関連する遺伝子群がパリカルシトール及びカルシトリオールにより顕著に調節されるという知見から、ビタミンＤ類似体が平滑筋細胞の増殖を制御すると思われることが示唆される。実際に、上記の結果から、カルシトリオール及びパリカルシトールの両方が増殖培地中で培養したヒト冠動脈平滑筋細胞の増殖を用量依存的に阻害することが示される。
【００６８】
この実験からの結果から、ビタミンＤ類似体が、平滑筋細胞増殖／分化、血栓症、繊維素溶解、血管弛緩及び内皮再生の制御を介して血管系に有益な影響を与えることが示唆される（図９）。
【００６９】
当業者にとって当然のことながら、本発明は、目的を遂行し、結果及び言及した長所ならびにそこで特有であるものを得るためによく適合する。分子複合体及び方法、手順、治療、分子、本明細書中に記載の具体的な化合物は、好ましい実施形態の現在のところ代表的なものであり、模範的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者にとって当然のことながら、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書中で開示される本発明に対して、様々な置き換え及び変更をなし得る。
【００７０】
この明細書中にで言及された全ての特許及び刊行物は、本発明が関係している当業者のレベルであることを示している。全ての特許および刊行物は、個別の各刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれるべきことが示されているかのように、同程度まで参照により本明細書中に組み込まれる。
【００７１】
説明として本明細書中で適切に記載される本発明は、本明細書中で具体的に開示されていない要素（単数又は複数）、制限（単数又は複数）の不存在下において、実施し得る。したがって、例えば、本明細書中の各例において、「含む」、「から基本的に構成される」及び「から構成される」という用語は何れも、他の２つの語の何れかで置き換え得る。使用されている用語及び表現は、説明するものとして使用され、限定するものではなく、示され記載される特徴の何らかの同等物を排除するかかる用語及び表現又はそれらの一部の使用において、主張される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。したがって、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、本明細書中で開示される概念の任意の特徴、変更及び変化が当業者により使用され得、かかる変更及び変化が添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲内にあるものとみなされることを理解されたい。
【００７２】
さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループの観点において記載される場合、当業者にとって当然のことながら、本発明はまた、マーカッシュグループのあらゆる個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点で、それによっても述べられる。例えば、Ｘが臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択されるとして述べられる場合、Ｘが臭素であるということに対する主張及びＸが臭素及び塩素であるということに対する主張が十分に述べられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ヒト冠動脈平滑筋細胞から調製した細胞抽出物への３Ｈ−カルシトリオール結合による、ヒト冠動脈平滑筋細胞におけるＶＤＲの特徴を示す。
【図２】図２は、共焦点顕微鏡からの結果を示す。より具体的には、ＶＤＲ活性化因子（パリカルシトール及びカルシトリオールなど）結合の結果、ＶＤＲが細胞核へ移動したが、全ての細胞が反応したわけではなかった（ＶＤＲ（赤）／ＲＸＲ（緑））。
【図３】図３及び図４は、異なる性質を有するが、ビタミンＤ化合物、パリカルシトール及びカリシトロール（ｃａｌｉｃｉｔｒｏｌ）などのＶＤＲ活性化因子を用いて、哺乳動物において平滑筋細胞増殖を阻害、低下させることができることを示す。これらの所見から、これらの細胞でのＤＮＡ合成の阻害において、カルシトリオールよりもパリカルシトールが僅かに強力であることが示される。
【図４】図３及び図４は、異なる性質を有するが、ビタミンＤ化合物、パリカルシトール及びカリシトロール（ｃａｌｉｃｉｔｒｏｌ）などのＶＤＲ活性化因子を用いて、哺乳動物において平滑筋細胞増殖を阻害、低下させることができることを示す。これらの所見から、これらの細胞でのＤＮＡ合成の阻害において、カルシトリオールよりもパリカルシトールが僅かに強力であることが示される。
【図５】図５は、これらの細胞での２４−ＯＨａｓｅ  ｍＲＮＡの合成の誘導における、パリカルシトール及びカリシトリオール（ｃａｌｉｃｉｔｒｉｏｌ）などのＶＤＲ活性化因子の影響を示す。強さは、カルシトリオール＞パリカルシトールの順である。
【図６】上のパネルにウエスタンブロットを示す。プラスミンーゲン活性化因子阻害剤タイプ１（ＰＡＩ−Ｉ）は、冠状動脈性心臓病と関連するリスクマーカーの１つであり、アテローム斑において強くなり、マクロファージと共局在する。図４の下のパネルは、ＰＡＩ−Ｉ発現の阻害においてパリカルシトールがカルシトリオールと同程度の強さであることを示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＩＧＦ１、ＷＴ１及びＴＧＦβ３  ｍＲＮＡ発現におけるパリカルシトールの影響を説明する。平滑筋細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。正規化のためにＧＡＤＰＨを使用した。
【図８】図８は、細胞増殖におけるパリカルシトール及びカルシトリオールの影響を説明する。実施例２に記載のようにパリカルシトール又はカルシトリオールの濃度を上げていきながら、細胞を処理した。データは、対照の％として表す（薬物処理なしの増殖培地中の細胞、１００％）。示される各値は、平均±標準偏差である（個別の２つの試験を組み合わせて、ｎ＝４から８）。実験において比較として血清不含培地を使用した（対照の２１．４±５．３％）。対応のないｔ検定により、統計比較を行った。対照と比較して、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図９】図９は、血管におけるビタミンＤ類似体の影響を示す。ビタミンＤ類似体によるＶＤＲ活性化の結果、増殖の抑制及び分化の誘導を導く細胞周期に関与する遺伝子が制御される。ＢＮＰ（ナトリウム利尿ペプチドＢ）が下方制御される。ビタミンＤ類似体による、ＴＭ、トロンボスポンジン１及びＭＭＰなどの遺伝子の制御の結果、血栓形成が軽減され、繊維素溶解が増加する。Ｂ型エンドセリン受容体、オキシトシン受容体及びプロスタグランジン−エンドペルオキシドシンターゼ１の制御から、ビタミンＤ類似体がまた、血管の弛緩及び内皮再生にも関与し得ることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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