(57)【要約】イオン交換クロマトグラフィーによる免疫グロブリンの精製法を記載する。クロマトグラフィー法は、免疫グロブリンの精製のために弱イオン交換樹脂および1段階溶出工程を用いる。さらに、免疫グロブリンのイオン交換樹脂からの1段階溶出のための塩濃度の決定法を記載する。2008542218.tif 000005
2008542218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
b）免疫グロブリンが弱イオン交換材料に結合する条件下で溶液と弱イオン交換材料を接触させる段階；
c）緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で免疫グロブリンを弱イオン交換材料から回収する段階
を含む、免疫グロブリンの精製方法。
【請求項２】
弱イオン交換材料が弱陽イオン交換材料であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
緩衝物質が、クエン酸もしくはその塩またはリン酸もしくはその塩であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
クロマトグラフィー法またはバッチ法であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
段階c）における塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸塩、リン酸塩、およびこれらの成分の混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
免疫グロブリンが免疫グロブリンクラスGまたはEのメンバーであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
回収段階c）における溶液がpH3.0〜pH7.0のpH値を有することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
以下の2段階を含む、1段階の精製工程においてポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するための塩濃度を決定する方法：
a）以下の下位段階を含む段階1
a1）ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
a2）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
a3）緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、ポリペプチドをイオン交換材料から回収する段階；
a4）ポリペプチドの第1画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階；
b）以下の下位段階を含む段階2
b1）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
b2）ポリペプチドを3段階溶出法を用いることによってイオン交換材料から回収する段階であって、
i）第1の溶出段階の塩濃度が、
段階a4）で決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和として計算され；
ii）第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25から1.35までの因子との積であり；
iii）第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50から1.70までの因子との積であり；
ここで、段階ii）およびiii）の因子が、10mMから40mMまでの開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mMから70mMまでの開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、ならびに70mMを超える開始濃度においてそれぞれ1.25および1.50であるように決定される段階；
b3）段階b2）の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、それによって、1段階精製工程においてポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するための塩濃度を決定する段階。
【請求項９】
イオン交換クロマトグラフィー材料が弱イオン交換クロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドが免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項8〜9のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリペプチド精製の分野に関するものである。イオン交換樹脂を用いた免疫グロブリン精製の新規の方法を、本明細書に記載する。同時に、精製条件の迅速な決定法を示す。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質および特に免疫グロブリンは、今日の医学のポートフォリオ（portfolio）において重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、すべての薬学的物質は、明確な基準を満たさなければならない。生物学的製剤（biopharmaceutical agent）のヒトに対しての安全性を確かなものにするために、重度の害を引き起こす可能性がある、核酸、ウイルス、および宿主細胞タンパク質は、特に除去しなければならない。規定の水準を満たすために、1つまたは複数の精製段階は、製造工程の後に続かなければならい。とりわけ、純度、スループット、および収率は、適切な精製工程の決定に重要な役割を果たす。
【０００３】
微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインAまたはプロテインG アフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合様式交換、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル-Sepharose、アザ-アレノフィリック（arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ni(II)-およびCu(II)-アフィニティー材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー泳動など）（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998)93-102（非特許文献1））のような、タンパク質精製に用いられる様々な方法は、十分確立され、普及している。
【０００４】
Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698（非特許文献2）は、高い電荷密度を示すイオン交換手段による細胞培養液上清からの直接的なヒトモノクローナル抗体の捕捉を報告した。WO 89/05157（特許文献1）において、細胞培養用培地を直接陽イオン交換処理に供することによる、生成物免疫グロブリンの精製の方法を報告する。マウス腹水由来のモノクローナルIgG抗体の1段階精製は、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988),79-88（非特許文献3）により記載されている。
【０００５】
方法、すなわち、カプリル酸沈殿とイオン交換クロマトグラフィーの組み合わせは、ペプシン消化ウマ解毒剤F(ab')2抗体を分画するための手段として、Raweerith, R. et al. (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72）（非特許文献4）により用いられた。WO 2003/102132（特許文献2）において、タンパク質の精製のための非アフィニティー精製段階と高性能タンジェンシャルフローろ過の組み合わせが報告されている。2つのアフィニティークロマトグラフィー段階の組み合わせは、WO 92/19973（特許文献3）において報告されている。
【０００６】
Follman, D.K.およびFahrner, R.L.は、プロテインAなしの3つのクロマトグラフィー段階を用いた抗体精製工程の要因（factorial）スクリーニングを報告した（J. Chrom. A 1024 (2004）79-85）（非特許文献5）。Mhatre, R. et al.（J. Chrom. A 707 (1995）225-231）（非特許文献6）は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびpH勾配溶出による抗体Fab断片の精製を探求した。
【０００７】
WO 94/00561（特許文献4）は、ヒトモノクローナル抗アカゲザル抗体および同じ物を産生する細胞株を報告している。イオン交換クロマトグラフィーによるポリペプチド精製法は、勾配洗浄を用いて1つまたは複数の夾雑物から対象となるポリペプチドを分析するWO 2004/024866（特許文献5）において報告される。Schwarz, A. et al. (Laborapraxis 21 (1997)62-66）（非特許文献7）は、CM-HyperD-カラムを用いたモノクローナル抗体の精製を報告している。
【０００８】
WO 2004/076485（特許文献6）は、プロテインAおよびイオン交換クロマトグラフィーによる抗体精製の工程を報告している。EP 0 530 447（特許文献7）において、3つのクロマトグラフィー段階の組み合わせによるIgGモノクローナル抗体を精製する工程が報告されている。抗体調製物からのプロテインAの除去は、US 4,983,722（特許文献8）において報告されている。
【０００９】
WO 95/16037（特許文献9）は、プロテインA陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われるハイブリッドハイブリドーマからの抗EGF-R/抗CD3二重特異性モノクローナル抗体の精製を報告している。イオン交換クロマトグラフィーの使用による抗体単量体のその多量体からの分離は、EP 1 084 136（特許文献10）において報告されている。US 5,429,746（特許文献11）は、抗体分子タンパク質の精製への疎水性相互作用クロマトグラフィー組み合わせクロマトグラフィーの適用に関するものである。
【００１０】
【特許文献１】WO 89/05157
【特許文献２】WO 2003/102132
【特許文献３】WO 92/19973
【特許文献４】WO 94/00561
【特許文献５】WO 2004/024866
【特許文献６】WO 2004/076485
【特許文献７】EP 0 530 447
【特許文献８】US 4,983,722
【特許文献９】WO 95/16037
【特許文献１０】EP 1 084 136
【特許文献１１】US 5,429,746
【非特許文献１】Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998)93-102
【非特許文献２】Necina, R. et al., Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698
【非特許文献３】Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988),79-88
【非特許文献４】Raweerith, R. et al. (J. Immun. Meth. 282 (2003) 63-72）
【非特許文献５】Follman, D.K.およびFahrner, R.L.（J. Chrom. A 1024 (2004）79-85）
【非特許文献６】Mhatre, R. et al.（J. Chrom. A 707 (1995）225-231）
【非特許文献７】Schwarz, A. et al. (Laborapraxis 21 (1997)62-66）
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
このように、本発明の目的は、組換え生成された免疫グロブリンの精製のための、ならびに単量体および多量体免疫グロブリン種の分離のためのもう1つの方法を提供することである。
【００１２】
本発明は、以下の段階を含む、免疫グロブリンの精製法を提供する：
a）免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
b）免疫グロブリンが弱イオン交換材料に結合する条件下で、溶液と弱イオン交換材料を接触させる段階；
c）緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で弱イオン交換材料から免疫グロブリンを回収する段階。
【００１３】
本発明はさらに、以下の2段階を含む、1段階精製工程においてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するための塩濃度を決定する方法を提供する：
a）以下の下位段階を含む段階1
a1）ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
a2）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1のアリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
a3）緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、イオン交換材料からポリペプチドを回収する段階；
a4）ポリペプチドの第1の画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階；
b）以下の下位段階を含む段階2
b1）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2のアリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
b2）3段階溶出法を用いることによってイオン交換材料からポリペプチドを回収する段階であって、
i）第1の溶出段階の塩濃度が、
段階a4）において決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積と
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積
との合計として計算され；
ii）第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積であり；
iii）第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積であり；
ここで、段階ii)およびiii)の因子は、10mM〜40mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、ならびに70mMを超える開始濃度において因子がそれぞれ1.25および1.50であるように計算される段階：
b3) 段階b2)の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、これにより1段階精製工程においてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出するための塩濃度を決定する段階。
【００１４】
発明の詳細な説明
これらの用語は、以下の定義に従って本願で用いられる。
【００１５】
本願で用いられる場合の「イオン交換樹脂」または「イオン交換材料」という用語は、共有結合した荷電置換基を保有する固定高分子量マトリックスを意味する。全体の電荷の中立性のために、非共有結合の対イオンがそれに結合している。「イオン交換材料」は、その非共有結合の対イオンを周囲の溶液の同様に荷電したイオンと交換する能力がある。その交換可能な対イオンの電荷によって、「イオン交換樹脂」は、陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂と呼ばれる。荷電基（置換基）の性質によって、「イオン交換樹脂」は、例えば陽イオン交換樹脂の場合、スルホン酸樹脂（S）、またはカルボキシメチル樹脂（CM）と呼ばれる。荷電基/置換基の化学的性質によって、ならびに共有結合した荷電置換基の強度によって「イオン交換樹脂」は、強イオン交換樹脂または弱イオン交換樹脂としてさらに分類されうる。例えば、強陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてスルホン酸基を有し、弱陽イオン交換樹脂は、荷電置換基としてカルボキシル基、好ましくはカルボキシメチル基を有し、ならびに弱陰イオン交換樹脂は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。
【００１６】
陽イオン交換樹脂は、例えば、Bio-Rex、Macro-Prep CM（Biorad Laboratories, Hercules, CA, USAより入手可能）、弱陽イオン交換体 WCX 2（Ciphergen, Fremont, CA, USAより入手可能）、Dowex（登録商標）MAC-3（Dow chemical company-liquid separations, Midland, MI, USAより入手可能）、Mustang C（Pall Corporation, East Hills, NY, USAより入手可能）、セルロース CM-23、CM-32、CM-52、ハイパー-D、およびpartisphere（Whatman plc, Brentford, UKより入手可能）、Amberlite（登録商標）IRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73（Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germanyより入手可能）、CM 1500、CM 3000（BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USAより入手可能）、およびCM-Sepharose（商標）Fast Flow（GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germanyより入手可能）などの多くの会社で異なる名称のもとで入手可能である。
【００１７】
好ましくは、弱イオン交換材料の荷電置換基は、少なくとも90％カルボン酸基、90％を超えるカルボン酸基、または95％を超えるカルボン酸基である。
【００１８】
本願で同義で用いられる、「1段階溶出」および「1段階勾配溶出」という用語は、例えば溶出、すなわち材料からの結合化合物の分離を引き起こす物質の濃度が、即座に、すなわち直ちに開始値/レベルから最終値/レベルに、すなわち、1段階で上昇または低下する方法を意味する。
【００１９】
「ポリペプチド」は、天然で生成されようと合成により生成されようと、ペプチド結合によってつなげられるアミノ酸残基のポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれる。
【００２０】
「タンパク質」は、100アミノ酸残基を超える1つまたは複数のポリペプチド鎖またはポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭化水素基のような非ペプチド成分を含んでもよい。炭化水素および他の非ペプチド基は、タンパク質を生成する細胞によってタンパク質に加えられてもよく、細胞の種類により異なると考えられる。タンパク質は、それらのアミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；炭化水素基のような置換基は、一般的には指定されないが、それにもかかわらず存在してもよい。
【００２１】
本願で同義で用いることができる「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、少なくとも2つの軽ポリペプチド鎖および2つの重ポリペプチド鎖を含む。重および軽ポリペプチド鎖のそれぞれは、抗原との相互作用のための結合ドメインを含む可変領域（一般的にはポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重および軽ポリペプチド鎖のそれぞれはまた、免疫系のさまざまな細胞、いくつかの食細胞および古典的な相補システムの第1の能力（C1q）を含む宿主の組織または因子への抗体の結合を媒介することができる定常領域（一般的にはカルボキシ末端部分）を含む。典型的には、軽および重ポリペプチド鎖は、完全な鎖であり、それぞれ本質的に、可変領域、すなわちVLまたはVHから、および完全な定常領域、すなわち軽ポリペプチド鎖の場合はCLから、または重ポリペプチド鎖の場合は、CH1、CH2、CH3、および任意でCH4からなる。本発明による抗体の可変領域は、他のアイソタイプの定常領域に接ぎ合わせることができる。例えば、1-アイソタイプの重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、もう1つの重鎖クラス（またはサブクラス）の定常領域をコードするポリヌクレオチドに接ぎ合わせることができる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、抗体遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識される抗体の遺伝子は、さまざまな定常領域遺伝子ならびに無数の抗体可変領域遺伝子を含む。抗体は、例えばFv、Fab、およびF(ab)2ならびに単鎖（例えばHuston, J.S., et al., PNAS USA 85（1988）5879-5883；Bird et al., Science 242 (1988) 423-426；ならびに一般的にはHood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 第2版（1984）ならびにHunkapillerおよびHood, Nature 323（1986）15-16）を含む多様な形態で存在してもよい。1つの態様において、本発明による抗体は、モノクローナル抗体およびその断片、例えば単離された重鎖もしくは軽鎖、または定常領域のみからなる重鎖もしくは軽鎖ならびにその断片を含む。
【００２３】
一般的なクロマトグラフィー法およびそれらの使用は、当業者に公知である。例えば、Chromatography, 第5版, パートA：Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.（編）, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)；Advanced Chromatogrphic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (編), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)；Chromatography Today, Poole, C. F.およびPoole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；Sambrook, J., et al.(編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；またはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al.(編), John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照のこと。
【００２４】
本発明は、以下の段階を含む、免疫グロブリンを精製する方法を提供する：
a) 免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
b) 免疫グロブリンが弱イオン交換材料に結合する条件下で、溶液と弱イオン交換材料を接触させる段階；
c) 緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で免疫グロブリンを弱イオン交換材料から回収する段階。
【００２５】
一般の免疫グロブリンの精製工程は、多段階クロマトグラフィー部を含む。第1段階において、非免疫グロブリンポリペプチドおよびタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えばプロテインAを用いて、免疫グロブリン画分から分離される。その後、個々の免疫グロブリンクラスを分離するために、および第1のカラムから同時溶出された微量のプロテインAを除去するために、イオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。最終的に、第3のクロマトグラフィー段階は、免疫グロブリン単量体を同クラスの多量体および断片から分離する必要がある。時折、凝集体の量は高く（5％またはそれ以上）、かつさらなる精製段階を必要とする第3の精製段階において、それらを効率的に分離することができない。
【００２６】
特定の免疫グロブリンの組換え生成により、さまざまな免疫グロブリンクラスの分離のための精製段階は必要でない。従って、組換え生成された免疫グロブリンの全精製工程は、2つのクロマトグラフィー段階にまで減らしてもよい。
【００２７】
調整された（conditioned）プロテインA溶出液は、一般的に陽イオン交換材料においてそれぞれの免疫グロブリンタンパク質の等電点より低いpH値でクロマトグラフィーにより処理される。
【００２８】
抗IL-1R抗体（WO 2005/023872）およびHerceptin（登録商標）、抗HER2抗体（WO 99/57134）は、本発明時に本発明者らの実験室において十分量入手できたので、本発明は、これら2つの免疫グロブリンを用いて例示される。同様に、本発明は、一般に免疫グロブリンを用いて実施されうる。この例示の説明は、一例としてのみでなされており、本発明を限定するつもりでなされてはいない。これらの例は、本発明、本発明の添付の特許請求の範囲に示される真の範囲の理解を助けるために提供される。
【００２９】
本発明は、免疫グロブリン単量体を凝集体および断片から分離するならびに他のポリペプチド不純物を減少させるための精製法を記載する。実験からわかるように、この精製は、弱イオン交換樹脂の使用によって、好ましくは弱陽イオン交換樹脂の使用によって達成される。強イオン交換材料と弱イオン交換材料の比較によって例示されるように、弱イオン交換材料は、免疫グロブリンの単量体のおよび凝集体の形態の分離を提供する（実施例1および2ならびに実施例9および12を参照のこと）。
【００３０】
本発明の1つの態様において、緩衝材料（物質）のpH値は、pH3.0〜pH10.0、好ましくはpH3.0〜pH7.0、より好ましくはpH4.0〜pH6.0、および最も好ましくはpH4.5〜pH5.5である。
【００３１】
1つの態様において、pH値は、1段階において一定に保たれる、すなわちそれは1段階において同じ値で維持される。
【００３２】
本発明のもう1つの好ましい項目は、本発明の方法が6.0またはそれ以上（pI≧6.0）の等電点（pI）を有し、そのためpH6.0からpH14までのpH範囲において正味の正電荷を有する免疫グロブリンに適用できることである。
【００３３】
本発明の好ましい態様は、IgGまたはIgEクラスの免疫グロブリンの精製である。
【００３４】
弱陽イオン交換材料は、本発明の好ましい態様において用いられる。
【００３５】
緩衝物質は、好ましくは例示のように5mM〜100mMの濃度範囲で用いられる。
【００３６】
弱イオン交換材料から結合免疫グロブリンを回収するために、緩衝液/溶液の伝導度を増加させる。これは、緩衝塩の濃度増加によってまたは緩衝溶液への溶出塩と呼ばれる他の塩の添加によってのどちらかで達成することができる。好ましい溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウムに加え、クエン酸およびリン酸の他の塩、ならびにこれらの成分の任意の混合物である。特に好ましいのは、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびその混合物である。
【００３７】
溶出を引き起こす塩濃度は、好ましくは5mM〜500mM、より好ましくは5mM〜400mM、および特に好ましくは5mM〜250mMの範囲である。
【００３８】
本発明のもう1つの好ましい態様は、緩衝物質と同時に、特にクエン酸およびその塩またはリン酸およびその塩と共に、溶出を引き起こす塩の使用である。
【００３９】
本発明の方法は、好ましくはクロマトグラフィー法またはバッチ法であり、特にバッチ溶出を含む方法が好ましい。
【００４０】
本発明のもう1つの好ましい態様は、精製が1段階精製工程であることである。
【００４１】
「一段階」とは、1つまたは複数の条件、例えばpH、イオン強度、塩濃度、および/またはクロマトグラフィーのフローが、開始値から最終値まで突然変化する、すなわち、条件が、直線的変化とは異なり、漸増的に、すなわち段階的に変化する工程を意味する。
【００４２】
本発明のさらに好ましい態様は、方法が、方法の段階a)の前にプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリンの精製の追加の段階を含むことである。
【００４３】
本発明は、以下の2段階を含む、1段階精製工程におけるイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを溶出する塩濃度を決定する方法をさらに提供する：
a) 以下の下位段階を含む段階1
a1) ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
a2) ポリペプチドがイオン交換材料へ結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
a3)緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、ポリペプチドをイオン交換材料から回収する段階；
a4) ポリペプチドの第1画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階；
b) 以下の下位段階を含む段階2
b1) ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
b2) イオン交換材料からポリペプチドを、3段階溶出法を用いて回収する段階であって、
i) 第1溶出段階の塩濃度が、
段階a4)において決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積と
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる1価の陽イオンの総数との積
との和として計算され；
ii) 第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積であり；
iii) 第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積であり；
ここで、段階ii)およびiii)の因子が、10mM〜40mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、および70mMを超える開始濃度において因子がそれぞれ1.25および1.50であるように決定される段階、
b3)段階b2)の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、それによってポリペプチドをイオン交換材料から、1段階精製工程において溶出する塩濃度を決定する段階。
【００４４】
段階b2)の因子は、実験により決定された範囲を定める。これらの値は、絶対的な値ではなく、単に目標値である。10％の偏差は、維持可能である。
【００４５】
本発明は、他のタンパク質材料からポリペプチドを精製する1段階精製工程において、ポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出する塩濃度を決定する方法を記載する。
【００４６】
イオン交換樹脂からポリペプチドの、好ましくは免疫グロブリンの溶出が開始する濃度は、第2の最適化段階b)、3段階溶出法の基礎となる。段階溶出のためのおおよその緩衝液/塩濃度は、以下のように計算される。
-第1溶出段階の塩濃度は、
第1の加数として、直線的に増加する塩勾配を用いて決定されるイオン交換カラムからの溶出が開始する塩濃度と、溶出を引き起こす塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
第2の加数として、緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和と等しい。
-第2の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積と等しい。
-第3の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積と等しい。
【００４７】
濃度段階の計算において含まれる因子は、濃度レベル間の隔たりの原因となり、かつ開始濃度に依存して調整される。低い開始濃度において、すなわち10mM〜40mMの間では因子はそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の中間の開始濃度において因子はそれぞれ1.30および1.60であり、かつ70mMを超える高い開始濃度において因子はそれぞれ1.25および1.50である。これらの因子は、実験により決定された範囲を定める。これらの値は、絶対的な値ではなく、単に目標値である。10％の偏差は維持可能である。
【００４８】
実施例3に概説されるように、イオン交換樹脂からのタンパク質の溶出がクロマトグラフィーの間、緩衝塩の濃度の変化によって実施されうる可能性があるため、緩衝塩は、計算において計上されなければならない。緩衝塩の濃度が、クロマトグラフィーの間一定に保たれる、または溶出を引き起こす開始の塩濃度と比較して低い場合には、計算時に複雑さを減らすためにそれを無視してもよい。
【００４９】
1つの態様において、溶出を引き起こす塩は、緩衝塩ではなく、段階b2i)の塩濃度は、段階a4)において直線的に増加する塩勾配を用いて決定される、イオン交換カラムからの溶出が開始する塩濃度と、溶出を引き起こす塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積である。
【００５０】
抗IL-1R抗体を用いる実施例4に基づく計算が例示される。実施例3において決定されるように、10mMの緩衝液濃度および直線勾配からの5mM分からなる15mMクエン酸ナトリウムの開始濃度を用いて、3段階は以下のように計算される。
- 段階1のための目標となる濃度は、30mM（5mM * 2+10mM * 2）クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には：2倍にされる5mM（開始濃度）（クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり；このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する) ＋ 2倍にされる10mM（緩衝塩の濃度）（クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり；このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する）
- 段階2のための目標となる濃度は、40.5mM（30mM * 1.35）クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には：30mMクエン酸ナトリウムは、1.35倍にされる段階1の濃度である（開始濃度は15mMであり、このため因子として1.35が選択される）。
- 段階3のための目標となる濃度は、51mM（30mM * 1.70）クエン酸ナトリウムであるように計算される
詳細には：30mMクエン酸ナトリウムは、1.70倍にされる段階1の濃度である（開始濃度は15mMであり、このため因子として1.70が選択される）。
【００５１】
実験よりわかるように、この精製は、好ましい態様において弱イオン交換材料の使用によって、特に好ましいのは弱陽イオン交換材料の使用によって達成される。
【００５２】
本発明の好ましい態様は、ポリペプチドが免疫グロブリン、特に好ましいのはIgGまたはIgEクラスの免疫グロブリンであることである。
【００５３】
本発明の1つの態様において、緩衝材料/物質のpH値は、pH3.0〜10.0、好ましくはpH3.0〜pH7.0、より好ましくはpH4.0〜pH6.0、最も好ましくはpH4.5〜pH5.5である。
【００５４】
本発明のもう1つの好ましい項目は、本発明の方法が6.0またはそれ以上（pI≧6.0）の等電点を有し、このためpH6.0から始まりpH14までのpH範囲において正味の正電荷を有する免疫グロブリンに適用可能であることである。
【００５５】
緩衝材料/物質は、好ましくは例示のように5mM〜100mMの間の濃度範囲で用いられる。
【００５６】
イオン交換材料から結合免疫グロブリンの回収のために、緩衝液/溶液の伝導度が増加される。これは、緩衝塩の濃度の増加によってまたは緩衝溶液への溶出塩とよばれる他の塩の添加によってのどちらかで達成することができる。好ましい溶出塩は、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウムに加え、クエン酸およびリン酸の他の塩、ならびにこれらの成分の任意の混合物である。特に好ましいのは、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよびその任意の混合物である。
【００５７】
溶出を引き起こす塩の濃度は、好ましくは5mM〜500mM、より好ましいのは5mM〜400mM、特に好ましいのは5mM〜250mMの間の範囲である。
【００５８】
本発明のもう1つの好ましい態様は、溶出を引き起こす塩を、緩衝物質と同時に、特にクエン酸およびその塩またはリン酸およびその塩とともに使用することである。
【００５９】
本発明の方法は、好ましくはクロマトグラフィー法またはバッチ法であり、特に好ましいのは、バッチ溶出を含む方法である。
【００６０】
本発明のもう1つの好ましい態様は、精製が1段階精製工程であることである。
【００６１】
本発明のさらに好ましい態様は、方法が、方法の段階a)の前のプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる免疫グロブリンの精製の追加の段階を含むことである。
【００６２】
以下の実施例および図面は、本発明、本発明の添付の特許請求の範囲において示される真の範囲の理解を助けるために提供される。改変は、本発明の精神から逸脱することなく示される手順でなされうることが理解される。
【００６３】
実験部
材料
IgG4免疫グロブリン抗IL-1R抗体（以下、免疫グロブリンと呼ぶ、WO 2005/023872）をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる第1段階において精製した。プロテインAカラムからの溶出は、酸性条件下で行われた（10mM クエン酸ナトリウム緩衝液、pH値3.0±0.5）。ろ過段階前に、免疫グロブリンを含む画分のpH値は、濃縮した、例えば1MのpH9.0の緩衝溶液（例えば、トリス-ヒドロシキメチル-アミノ-メタン（TRIS）またはリン酸緩衝液）によりpH5.0に調整した。プロテインA溶出液は、タンパク質濃度が5mg/ml〜15mg/mlの間である溶液であり、クエン酸ナトリウムで緩衝化される。この材料は、以下において調整されたプロテインA溶出液と呼ばれ、陽イオン交換樹脂へのローディング（loading）のために調製される。
【００６４】
実施例1
この比較実施例において、強陽イオン交換樹脂および1段階溶出を用いたイオン交換クロマトグラフィーが記載される。
【００６５】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        SP-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄段階：    pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        pH5.0に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた25mMクエン酸ナトリウム緩衝液
【００６６】
調整したプロテインA溶出液を、強陽イオン交換樹脂（SP-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムへ適用した。流速160cm/hにおけるローディング段階後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、1段階溶出法で溶出し、ここでpH値は一定に保たれ、伝導度は塩化ナトリウムの添加によって変化（増加）した。
【００６７】
図1において、強陽イオン交換樹脂SP-Sepharoseにおける抗IL-1R抗体の陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出クロマトグラムが示される。溶出は、クロマトグラフィーシステムのpH値を変更することなく塩化ナトリウムを用いた1段階置換溶出である。単量体のおよび凝集した免疫グロブリン分子は、分離されず、従ってこの方法を用いて、ローディングされた材料と比較して溶出液中の凝集体含量が低減することによって精製が達成できるものはない。
【００６８】
実施例2
本実施例において、弱陽イオン交換樹脂および1段階溶出を用いるイオン交換クロマトグラフィーを記載する。
【００６９】
免疫グロブリンの単量体のおよび凝集した形態の分離を達成するために、弱陽イオン交換樹脂を用いた。この種類の樹脂を用いることによって、1つの段階溶出による伝導度の増加には、この樹脂における特定のpHシフトが付随する（溶出緩衝液のpHが一定のままである場合でさえ）。この影響により、例えば単量体免疫グロブリンと凝集形態との区別を容易にする。さらに、微量の宿主細胞タンパク質またはプロテインAなどの他の不純物は、収率において有意な損失なく単量体の中間の（mean）の画分から効率よく分離することができる。
【００７０】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Toyopearl
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        pH5.0に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた25mMクエン酸ナトリウム緩衝液
【００７１】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Toyopearl）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、1段階溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値は一定に保たれ、伝導度は塩化ナトリウムの添加によって変化した。
【００７２】
図2において、弱陽イオン交換樹脂であるCM-Toyopearlを用いるこの場合以外は、実施例1における条件と同じクロマトグラフィー条件による溶出プロファイルを示す。本明細書において、主ピークの肩（shoulder)として第2のピークが現れている。この分離挙動は、SP-Sepharoseのような強陽イオン交換樹脂を用いたものとは異なる。主ピークにおよび第2の肩のあるピークに対応する画分の分析により、凝集体の有意な量が肩のあるピーク画分に存在していることが示された。凝集体は、主ピーク画分には検出できるものはなかった（図9a〜cも参照のこと）。
【００７３】
実施例3
クロマトグラフィー法の最適化−第1段階：直線的濃度勾配
弱陽イオン交換材料における陽イオン交換クロマトグラフィーを最適化するために、3段階からなる最適化手段を実施した。
【００７４】
第1段階は、緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの直線的濃度勾配を用いたクロマトグラフィーである。全く同様に、緩衝塩の濃度を一定に保ち、直線的に増加する濃度の免疫グロブリンの溶出を引き起こす塩を混ぜることが可能である。どちらの場合にも、移動相のpH値の変化なしで溶液の伝導度が増加する。溶出液に適した塩は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、クエン酸およびその塩ならびにこれらの成分の混合物である。適用される10mM〜500mMの濃度は、伝導度を約1ミリS/cmから約50ミリS/cmまでの範囲におくよう、それに応じて調整する。
【００７５】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Toyopearl
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        直線勾配；pH5.0に調整した10mM クエン酸ナトリウム緩衝液からpH5.0に調整した100mM クエン酸ナトリウム緩衝液まで
【００７６】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Toyopearl）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、直線勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値は一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度を、40カラム容量より多い容量で10mMから100mMまで直線的に上昇させた。クエン酸ナトリウムの最終濃度に到達した後、溶出を追加の40カラム容量について継続した。
【００７７】
図3において、抗IL-1R抗体の直線的緩衝液勾配溶出のクロマトグラムを示す。免疫グロブリンの単量体のおよび凝集した形態は、15mM クエン酸ナトリウム濃度で開始し、55mM クエン酸ナトリウム濃度において終了する半分離ピークにおいて溶出する。
【００７８】
陽イオン交換樹脂からの結合免疫グロブリンの回収は、適用した溶液の伝導度に依存する。このため、回収段階時の溶出溶液中に存在する緩衝塩の陽イオンは、陽イオン交換樹脂からの免疫グロブリンの溶出をもたらすと考えなければならない。伝導度ならびに移動相のイオン強度は、溶液中のイオン総数によってもたらされる。したがって、用いた緩衝塩、および溶出を引き起こす、用いた塩の1つの分子式中の水素とは異なる一価の陽イオンの数をここで考慮しなければならない。
【００７９】
実施例4
クロマトグラフィー法の最適化−第2段階：3段階濃度勾配溶出
実施例3で決定されるような、イオン交換樹脂から免疫グロブリンの溶出が開始する濃度は、第2の最適化段階、3段階溶出法の基礎を提供する。段階溶出のためのおおよその緩衝液/塩の濃度は以下のように計算される。
- 第1溶出段階の塩濃度は、
第1の加数として、直線的に増加する塩勾配を用いて決定されるようなイオン交換カラムからの溶出が開始する塩濃度と、溶出を引き起こす塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
第2の加数として、緩衝塩の濃度と、緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和と等しい。
- 第2の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.25〜1.35の間の因子との積と等しい。
- 第3の溶出段階の塩濃度は、第1の溶出段階の塩濃度と1.50〜1.70の間の因子との積と等しい。
【００８０】
濃度段階の計算に含められる因子は、濃度レベル間の隔たりの原因になり、開始濃度に依存して調整される。低い開始濃度において、すなわち10mM〜40mMと間において因子はそれぞれ1.35および1.70であり、40mM〜70mMの間の中間の開始濃度において因子はそれぞれ1.30と1.60であり、かつ70mMを超える高い開始濃度はそれぞれ1.25および1.50である。
【００８１】
因子は、実験により決定された範囲を定める。これらの値は、絶対的な値ではなく、単に目標値である。10％の偏差は、維持可能である。
【００８２】
実施例3に概説されるように、クロマトグラフィーの間、イオン交換樹脂からのタンパク質の溶出が緩衝塩の濃度の変化によってもたらされうる可能性があるため、緩衝塩は、計算において計上されなければならない。緩衝塩の濃度が、クロマトグラフィーの間一定に保たれる場合には、または開始濃度と比較して低い（≦塩濃度の15％）場合には、計算時に複雑さを減らすためにそれを無視してもよい。
【００８３】
実施例3において決定されたように、10mMの緩衝液濃度および直線勾配からの5mM分からなる15mMクエン酸ナトリウムの開始濃度を用いて、3段階を以下のように計算することができる。
- 段階1のための目標となる濃度は、30mM（5mM * 2+10mM * 2）クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には：2倍にされる5mM（開始濃度）（クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり；このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する) ＋ 2倍にされる10mM（緩衝塩の濃度）（クエン酸は、二ナトリウム塩として用いられる三価の酸であり；このため水素とは異なる2つの一価の陽イオンが分子式中に存在する）
- 段階2のための目標となる濃度は、40.5mM（30mM * 1.35）クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には：30mMクエン酸ナトリウムは、1.35倍にされる段階1の濃度である（開始濃度は15mMであり、このため因子として1.35が選択される）。
- 段階3のための目標となる濃度は、51mM（30mM * 1.70）クエン酸ナトリウムであるように計算される。
詳細には：30mMクエン酸ナトリウムは、1.70倍にされる段階1の濃度である（開始濃度は15mMであり、このため因子として1.70が選択される）。
【００８４】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Toyopearl
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.0に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        段階1：pH5.0に調整した、34mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階2：pH5.0に調整した、44mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階3：pH5.0に調整した、54mM クエン酸ナトリウム緩衝液
【００８５】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Toyopearl）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、段階勾配溶出法で溶出し（＝溶出塩の濃度が開始値/レベルから最終値/レベルまで段階的に変化する方法）、ここで移動相のpH値は一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度を、第1段階において開始条件として10mMから34mMまで、第2段階において44mMまで、ならびに最終段階において54mMまで上昇させた。塩濃度のそれぞれの増加の後に、10カラム容量の溶出緩衝液を次の段階の前にカラムに通した。クエン酸ナトリウムの最終濃度に到達した後、溶出を追加の10カラム容量について継続した。
【００８６】
図4において、抗IL-1R抗体の3段階勾配溶出の溶出プロファイルを示す。単量体免疫グロブリンは、第1段階画分において溶出し、凝集体は第2段階画分において溶出する。
【００８７】
実施例5
クロマトグラフィー法の最適化−第3段階：塩化ナトリウムによる1段階溶出
最適化手段の最終段階は、1段階溶出法への適用である（＝溶出塩の濃度が開始値から最終値まで即座に変化する方法）。このため、クロマトグラフィーのpHは5.0から5.5まで上昇する。プロテインAが5.5より低い等電点を有するため、このpHシフトはプロテインAからの分離を向上させる。さらに、溶出塩を、緩衝液塩としてもさらに用いられるクエン酸ナトリウムを塩化ナトリウムへ変更する。このクロマトグラフィー実行の後に、この画分を用いて追加の分析が行われた（DNA、宿主細胞タンパク質、プロテインAの含量、およびLC-MSによるグリコシル化パターン）。
【００８８】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
溶出：        pH5.5に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム
【００８９】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、1段階勾配溶出法（＝溶出塩の濃度が開始値から最終値まで即座に変化する方法）で溶出し、ここで移動相のpH値は一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度は、一定に保たれ、150mM 塩化ナトリウムを混合した。塩濃度の増加の後に、15カラム容量の溶出緩衝液をカラムに通し、結合免疫グロブリンを溶出した。
【００９０】
図5において、塩化ナトリウムを用いた1段階溶出の溶出のクロマトグラムを示す。1段階勾配クロマトグラフィーは、主な単量体画分および凝集体/プロテインA画分の分離をもたらす。単量体免疫グロブリンの収率は80％を超える。95％を超える収率でさえ可能である。
【００９１】
実施例6
強陽イオン交換樹脂（SP-Sepharose fast flow）を用いた分離と弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose fast flow）との比較
強SP-Sepharose ff 交換体とCM-Sepharose ffとの比較がなされた。実験は実施例5に従って2回行い（各カラムから1つのみを図6aおよびbに示す）、追加の分析を行った（DNA、宿主細胞タンパク質、プロテインAの含量、およびLC-MSによるグリコシル化パターン）。
【００９２】
分析方法：
サイズ排除クロマトグラフィー：樹脂：    TSK 3000（Tosohaas）
カラム：  300x7.8 mm
流速：    0.5 ml/min
緩衝液：  pH7.0に調整した、250mM 塩化カリウムを含む200mM リン酸カリウム
DNA閾値システム：             例えば、Merrick, H.およびHawlistschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照のこと
プロテインA ELISA：            マイクロタイタープレートのウェルを、ヒヨコ由来のポリクローナルプロテインA-IgGでコーティングする。結合後、非反応の抗体はサンプルバッファで洗浄することによって除去する。プロテインAの結合のために、規定のサンプル容量をウェルに添加する。サンプル中に存在するプロテインAは、ヒヨコ抗体によって結合され、プレートのウェルに保持される。インキュベート後、サンプル溶液を除去し、ウェルを洗浄する。その後、検出のために、ヒヨコ由来のポリクローナル抗プロテインA-IgG-ビオチン結合体とストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合体を添加する。さらなる洗浄段階の後に、基質溶液を添加し、結果として有色の反応生成物の形成が生じる。色の彩度は、サンプルのプロテインA含量に比例する。規定時間後、反応を止め、吸光度を測定する。
宿主細胞タンパク質（HCP）ELISA：マイクロタイタープレートのウェルの壁を血清アルブミンとストレプトアビジンとの混合物でコーティングする。ヤギ由来のHCPに対するポリクローナル抗体は、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄段階後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを異なる濃度のHCP較正配列およびサンプル溶液とともにインキュベートする。インキュベート後、未結合のサンプル材料を緩衝溶液で洗浄することによって除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ結合体とともにインキュベートし、結合宿主細胞タンパク質を検出する。固定ペルオキシダーゼの活性を、ABTSとのインキュベーションおよび405nmにおける検出によって検出する。
【００９３】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Sepharose；SP-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        pH5.5に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
【００９４】
図6aおよび6bにおいて、弱および強陽イオン交換樹脂の溶出クロマトグラムの比較を示す。弱陽イオン交換樹脂を用いて（図6a）、他の不純物からの単量体抗IL-1R抗体の分離を達成する。強陽イオン交換樹脂により（図6b）、同条件下では分離可能なものはない。ピークに対応する画分は、回収および分析された。表1に列挙される分析結果は、弱陽イオン交換樹脂を用いて凝集体および他の不純物を免疫グロブリン調製物から効果的にほとんど無しの状態にしてしまうことができることを示す。
【００９５】
表1に示されるデータは、弱陽イオン交換樹脂を用いて、単量体抗IL-1Rを抗体の凝集形態から分離することができることを示す。さらに、DAN不純物およびプロテインA不純物はほとんどないの状態にしてしまうことができる。
【００９６】
（表１）溶出液の分析：SP-SepharoseとCM-Sepharoseとの比較、2つの異なる分離結果を示す
2008542218.tif 000003
【００９７】
実施例7
比較例−異なる伝導度における溶出
クロマトグラフィー条件：  
樹脂：        CM-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        pH5.5に調整した、100mM、150mMまたは200mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
【００９８】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、1段階勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値は一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度は、一定に保たれ、3つの異なる実行において、100mM、150mM、および200mM塩化ナトリウムをそれぞれ混合した。塩濃度の増加の後に、15カラム容量の溶出緩衝液をカラムに通し、結合免疫グロブリンを溶出した。溶出クロマトグラムを図7a〜7cに示す。
【００９９】
溶出塩濃度として150mM 塩化ナトリウムと200mM 塩化ナトリウムを用いて、良好な分離が達成された。
【０１００】
実施例8
比較例−異なるpH値における溶出
クロマトグラフィー条件：  
樹脂：        CM-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        pH4.0または6.0に調整した、150mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
【０１０１】
調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液で洗浄した（10カラム容量）。結合免疫グロブリンを、1段階勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値はそれぞれpH4.0または6.0において一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度は、一定に保たれ、150mM 塩化ナトリウムを混合した。塩濃度の増加の後に、15カラム容量の溶出緩衝液をカラムに通し、結合免疫グロブリンを溶出した。溶出クロマトグラムを図8a〜bに示す。
【０１０２】
pH4.0において、この免疫グロブリンの凝集体を形成する傾向が増加する。しかし、CM-Sepharoseは、2つのピークにおいてこのより多量の凝集体を分離することができる。
【０１０３】
実施例9
強陽イオン交換樹脂（SP-Sepharose）を用いたモノクローナル抗HER-2抗体（WO 99/57134）のクロマトグラフィー分離
本発明は、Herceptin（登録商標）、モノクローナル抗HER-2抗体を用い、以下にさらに例示する。
【０１０４】
強陽イオン交換樹脂であるSP-Sepharoseにおける陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたHerceptin（登録商標）の精製を行った。本発明の標準的な条件、すなわち例えば塩化ナトリウムによる段階溶出の下で、抗体の単量体のおよび凝集した形態の分離はもたらされない（図10）。
【０１０５】
クロマトグラフィー条件：  
樹脂：        SP-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、50mM 塩化ナトリウム
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、50mM 塩化ナトリウム
溶出：        pH5.6に調整した、25mM 2-モルホリンエタンスルホン酸、95mM 塩化ナトリウム
【０１０６】
モノクローナル抗HER-2抗体（以下、Herceptin（登録商標）と呼ぶ）をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる第1段階において精製した。プロテインAカラムからの溶出は、酸性条件下で行われる（10mM クエン酸ナトリウム緩衝液、pH値3.0±0.5）。ろ過段階前に抗体を含む画分のpH値は、濃縮したトリス-ヒドロシキメチル-アミノ-メタン（TRIS）緩衝液によりpH5.6に調整する。プロテインA溶出液は、タンパク質濃度が5mg/ml〜15mg/mlである溶液であり、クエン酸ナトリウムで緩衝化される。
【０１０７】
調整したプロテインA溶出液は、強陽イオン交換樹脂（SP-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液（10カラム容量）で洗浄した。結合免疫グロブリンを、1段階溶出法で溶出し、ここでpH値は一定に保たれ、伝導度は、塩化ナトリウム濃度の（段階的な）増加により変化した。溶出クロマトグラムを図10に示す。
【０１０８】
抗体の単量体のおよび凝集した形態の分離が達成されるものはなかった。
【０１０９】
実施例10
クロマトグラフィー法の最適化−第1段階：直線的濃度勾配
2つの画分の分離を向上するために、分離条件を抗IL-1R抗体を用いて概説した手順に従って最適化した。
【０１１０】
抗IL-1R抗体最適化工程とは異なり、（溶出）塩の、すなわち塩化ナトリウムの直線勾配を緩衝物質の勾配の代わりに用いた。最適化手順の第1段階に対応する、直線的塩化ナトリウム勾配溶出のクロマトグラムは、図11に示される。分析により、主ピークのテーリングが抗体の凝集形態に富んでいることが確認された。
【０１１１】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        直線勾配；pH5.5に調整した10mM クエン酸ナトリウム緩衝液からpH5.5に調整した400mM 塩化ナトリウムを含む10mMクエン酸ナトリウム緩衝液
【０１１２】
実施例9に記載されるような調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液（10カラム容量）で洗浄した。結合免疫グロブリンを、直線勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値および緩衝塩の濃度は一定に保った。溶出塩、つまり塩化ナトリウムの濃度を、40カラム容量より多い容量で0mMから400mMまで直線的に上昇させた。溶出クロマトグラムを図11に示す。
【０１１３】
弱陽イオン交換樹脂による強陽イオン交換樹脂の交換は、第1の主ピークの肩として第2ピークの分離を生じた。この観察は、抗IL-1R抗体の場合における観察と同様である。免疫グロブリンは、80mMの塩化ナトリウム濃度においてカラムから溶出し始める。
【０１１４】
実施例11
クロマトグラフィー法の最適化−第2段階：3段階濃度勾配溶出
実施例10において決定され、図11に示されるクロマトグラムから得られるような、免疫グロブリンが溶出し始める開始濃度は、80mM 塩化ナトリウムである。第2の最適化段階のための3つの濃度段階の計算について、緩衝液濃度は、クロマトグラフィーの間は低く、かつ一定に保たれるため、それを無視することができる。
【０１１５】
塩化ナトリウムの開始濃度は、80mMであり、塩化ナトリウムは、水素とは異なる1つの陽イオンをその分子式において有する。従って、3段階溶出のための濃度は、それぞれ80mM、100mM（＝1.25倍される80mM）、および120mM（＝1.50倍される80mM）の塩化ナトリウムであるように計算される。
【０１１６】
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
溶出：        段階1：pH5.5に調整した、80mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階2：pH5.5に調整した、100mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
段階3：pH5.5に調整した、120mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム緩衝液
【０１１７】
実施例9において記載されるような調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液（10カラム容量）で洗浄した。結合免疫グロブリンを、段階勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値および緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度は、一定に保った。溶出塩、つまり塩化ナトリウムの濃度を、第1段階において開始条件として0mMから80mMまで、第2段階において100mMまで、ならびに最終段階において120mMまで上昇させた。塩濃度のそれぞれの増加の後に、指定の塩化ナトリウム濃度とともに10カラム容量の溶出緩衝液を、次の濃度段階の前にカラムに通した。クエン酸ナトリウムの最終濃度に到達した後、溶出を追加の10カラム容量について継続した。溶出クロマトグラムを図12に示す。
【０１１８】
3段階溶出法において、単量体抗体を、80mMの塩化ナトリウム濃度を用いる段階において溶出する。サイズ排除分析により、単量体抗体のみが溶出することが確認された。塩化ナトリウム濃度が第2段階において100mMまで増加した後、凝集形態が溶出した（図12）。
【０１１９】
実施例12
クロマトグラフィー法の最適化−第3段階：塩化ナトリウムによる1段階溶出
クロマトグラフィー条件：
樹脂：        CM-Sepharose；SP-Sepharose
流速：        160cm/h
平衡化：      pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
ローディング：最大20g タンパク質/L ゲルマトリックス
洗浄：        pH5.5に調整した、10mM クエン酸ナトリウム
溶出：        pH5.5に調整した、80mM 塩化ナトリウムを含めた10mM クエン酸ナトリウム
【０１２０】
実施例9に記載されるような調整したプロテインA溶出液は、弱陽イオン交換樹脂（CM-Sepharose）を含むクロマトグラフィーカラムに適用した。ローディング段階後に、160cm/hの流速においてカラムを平衡化緩衝液（10カラム容量）で洗浄した。結合免疫グロブリンを、1段階勾配溶出法で溶出し、ここで移動相のpH値および緩衝塩の濃度は一定に保った。緩衝塩、つまりクエン酸ナトリウムの濃度は、一定に保たれ、80mM 塩化ナトリウムを混合した。塩濃度の増加の後に、塩化ナトリウムとともに15カラム容量の溶出緩衝液をカラムに通し、単量体形態における結合抗HER-2抗体を溶出した。抗体の単量体のおよび凝集した形態の分離を断言するために、単量体抗体の調製に必要ではない第2段階を、120mMの塩化ナトリウム濃度まで実施した。この第2の増加の後、抗体の凝集形態はカラムから溶出した。溶出クロマトグラムを図13に示す。
【０１２１】
同じ方法が強陽イオン交換樹脂を用いて行われる場合には、抗体の単量体のおよび凝集した形態の分離が見られるが、単量体抗体の有意な損失が観察される（弱陽イオン交換カラムにおける95％またはそれ以上と比較して約60％のみの収率）（図14）。
【０１２２】
弱陽イオン交換材料における分離に適した条件を強陽イオン交換樹脂であるSP-Sepharoseに適用することは有益ではない。2つの画分を分離できるが、単量体抗体の収率は60％またはそれ未満までも低下する。
【０１２３】
（表２）溶出液の分析：SP-SepharoseとCM-Sepharoseとの比較、2つの異なる分離結果を示す
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【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】強陽イオン交換樹脂SP-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、分離され、かつ1つのピークとして溶出する。
【図２】弱陽イオン交換樹脂CM-Toyopearlから抗IL-1R抗体の1段階溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに免疫グロブリンおよびプロテインAの単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。
【図３】pH5.0におけるクエン酸ナトリウムを用いた弱陽イオン交換樹脂CM-Toyopearlから抗IL-1R抗体の直線勾配溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ15mMのクエン酸ナトリウムの開始濃度において、免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに免疫グロブリンおよびプロテインAの単量体形態、凝集した形態の混合物を含む第2のピークとして溶出する。2つの画分のSEC分析は、イオン交換クトマトグラムに挿入される。主ピークにおいて、凝集体は存在しない。それと対照的に、第2のピークにおいて、免疫グロブリンの凝集した形態が存在する。
【図４】pH5.0におけるクエン酸ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Toyopearlから抗IL-1R抗体の3段階勾配溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ34mMのクエン酸ナトリウム濃度において免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに44mMのクエン酸ナトリウム濃度において免疫グロブリンおよびプロテインAの単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。
【図５】pH5.5における150mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、分離され、かつ免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに免疫グロブリンおよびプロテインAの単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。
【図６Ａ】CM-Sepharose fast flowにおける溶出プロファイル；2つのピークを同定することができる：単量体抗IL-1R抗体に対応する1つの主ピーク、ならびに主に凝集体および他の不純物を含むより小さい第2ピーク。
【図６Ｂ】SP-Sepharose fast flowにおける抗IL-1R抗体の溶出プロファイル；単量体免疫グロブリン、このカラムで分離されなかった凝集体および他の不純物を含む1つのピークを同定することができる。
【図７Ａ】pH5.5における100mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出。
【図７Ｂ】pH5.5における150mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出。
【図７Ｃ】pH5.5における200mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出。
【図８Ａ】pH4.0における150mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出。
【図８Ｂ】pH6.0における150mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階勾配溶出。
【図９Ａ】弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階溶出；免疫グロブリンの単量体のおよび凝集した形態の両方を示す開始材料のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）。
【図９Ｂ】弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに免疫グロブリンおよび他のタンパク質の単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。この図面において、第1の（主）ピークのサイズ排除クロマトグラフィーが示される。単量体免疫グロブリンである1つのピークのみが、SECカラムから溶出される。
【図９Ｃ】弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗IL-1R抗体の1段階溶出；受容体抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに免疫グロブリンおよび他のタンパク質の単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。この図面において、第2のピークのサイズ排除クロマトグラフィーが示される。このクロマトグラムにおいて、免疫グロブリンおよび他のタンパク質の単量体のおよび凝集した形態に相当する少なくとも3つのピークが見られる。
【図１０】強陽イオン交換樹脂SP-Sepharoseから抗HER-2抗体の1段階溶出；抗体の単量体のおよび凝集した形態は、分離されず、かつ1つのピークとして溶出する。
【図１１】pH5.5におけるクエン酸ナトリウム緩衝液中の塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗HER-2抗体の直線勾配溶出；抗体の単量体のおよび凝集した形態は、部分的に分離され、かつ80mMの塩化ナトリウム開始濃度で、免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして溶出し；単量体のおよび凝集した形態は、プロテインAとともに主ピークのテーリングにおいて混合物として溶出する。
【図１２】pH5.5におけるクエン酸ナトリウム緩衝液中の塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗HER-2抗体の3段階勾配溶出；抗体の単量体のおよび凝集した形態は、分離され、かつ80mMの塩化ナトリウム濃度において、免疫グロブリンの単量体形態を含む1つの主ピークとして、ならびに100mMの塩化ナトリウム濃度において免疫グロブリンおよびプロテインAの単量体のおよび凝集した形態を含む第2のピークとして溶出する。
【図１３】pH5.5における80mM 塩化ナトリウムを用いる弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharoseから抗HER-2抗体の1段階勾配溶出；単量体形態は、凝集した形態を含まず溶出され；凝集した形態は、第2の規定のピークとしての120mMまでの第2の塩化ナトリウム段階後に溶出する。
【図１４】pH5.5における80mM 塩化ナトリウムを用いる強陽イオン交換樹脂SP-Sepharoseから抗HER-2抗体の1段階勾配溶出；2つのピークが得られ：ピーク1は、単量体Herceptin（登録商標）のみを含み、120mMまでの第2の塩化ナトリウム段階の後に溶出するピーク2は、多量の単量体Herceptin（登録商標）および凝集体を含み；その単量体形態におけるHerceptin（登録商標）の収率は、60％未満である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月21日(2007.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）免疫グロブリン、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
b）免疫グロブリンが弱陽イオン交換材料に結合する条件下で溶液と弱陽イオン交換材料を接触させる段階；
c）緩衝物質および塩を含む溶液を用いることによって、1段階で免疫グロブリンを弱陽イオン交換材料から回収する段階
を含む、免疫グロブリンの精製方法。
【請求項２】
緩衝物質が、クエン酸もしくはその塩またはリン酸もしくはその塩であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフィー法またはバッチ法であることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
段階c）における塩が、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸塩、リン酸塩、およびこれらの成分の混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
免疫グロブリンが免疫グロブリンクラスGまたはEのメンバーであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
回収段階c）における溶液がpH3.0〜pH7.0のpH値を有することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
以下の2段階を含む、1段階の精製工程においてポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するための塩濃度を決定する方法：
a）以下の下位段階を含む段階1
a1）ポリペプチド、緩衝物質、および任意で塩を含む溶液を提供する段階；
a2）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第1アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
a3）緩衝物質および塩濃度を直線的に増加させる塩を含む溶液を用いることによって、ポリペプチドをイオン交換材料から回収する段階；
a4）ポリペプチドの第1画分がイオン交換カラムから溶出し始める、開始の塩濃度を決定する段階；
b）以下の下位段階を含む段階2
b1）ポリペプチドがイオン交換材料に結合する条件下で、ポリペプチドを含む溶液の第2アリコートとイオン交換材料を接触させる段階；
b2）ポリペプチドを3段階溶出法を用いることによってイオン交換材料から回収する段階であって、
i）第1の溶出段階の塩濃度が、
段階a4）で決定される開始の塩濃度と、塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積と、
緩衝塩の濃度と緩衝塩の分子式中に示される水素とは異なる一価の陽イオンの総数との積
との和として計算され；
ii）第2の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.25から1.35までの因子との積であり；
iii）第3の溶出段階の塩濃度が、第1の溶出段階の塩濃度と1.50から1.70までの因子との積であり；
ここで、段階ii）およびiii）の因子が、10mMから40mMまでの開始濃度においてそれぞれ1.35および1.70であり、40mMから70mMまでの開始濃度においてそれぞれ1.30および1.60であり、ならびに70mMを超える開始濃度においてそれぞれ1.25および1.50であるように決定される段階；
b3）段階b2）の3段階溶出法のどの下位段階においてポリペプチドがイオン交換カラムから溶出されるかを決定し、それによって、1段階精製工程においてポリペプチドをイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出するための塩濃度を決定する段階。
【請求項８】
イオン交換クロマトグラフィー材料が弱イオン交換クロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドが免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項7〜8のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
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