(57)【要約】  本発明は、種々の治療目的（例えば、洞不全症候群、てんかん、神経因性疼痛、糖尿病等の）を達成するために、関連する生理的な応答（例えば、心拍数、ニューロン発火、インスリン分泌等）を増加又は低減する新規なタンパク質及び遺伝子組み換えの手法によるペースメーカーチャネルをコードしたＨＣＮの活性の微調整によって、（例えば、心臓、ニューロン及び膵臓細胞での）生体電気リズムを誘導する及び／又は調節する、新規な組成物及び方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を投与することにより、細胞がカスタマイズされた自発性の反復性電気信号を生成すること、を含んでなる細胞の電気活性機能を調節する方法。
【請求項２】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を含有する電気的に活性な細胞を投与することにより、組織がカスタマイズされた自発性の反復性電気信号を生成すること、
を含んでなる組織の電気活性機能を調節する方法。
【請求項３】
電気的に活性な細胞が心筋細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
電気的に活性な細胞が神経細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
電気的に活性な細胞が膵島細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
電気的に活性な細胞又は組織が、その生理的機能が生体電気リズムに依存する何れかの細胞型又は組織型である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物が、２２９位〜２３７位の（又は、より延長された間の）何れかのアミノ酸残基の欠失によりＳ３−Ｓ４リンカーが短縮されたＨＣＮ１であるか、又は野生型のＨＣＮチャネルとは異なる表現型を示すように改変された何れかのＨＣＮ構築物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸残基の２３２位のメチニオンが欠失していない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＨＣＮの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物が、２３５位〜２３７位のアミノ酸残基の欠失によりＳ３−Ｓ４リンカーが短縮されたＨＣＮ１−ＥＶＹ２３５−７ΔΔΔである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物の発現が、細胞の電気信号の出力頻度を少なくとも約１０％変化させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子改変心筋細胞が、カスタマイズされた自発性の律動的な電気活性を生成する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子改変神経細胞が、カスタマイズされた自発性の律動的な電気活性を生成する、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子改変膵島細胞が、カスタマイズされた自発性の律動的な電気活性を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子が改変された電気的に活性な細胞又は組織（の何れかの型）が、カスタマイズされた自発性の律動的な電気活性を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物の発現が、誘導プロモーターにより推進される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記誘導プロモーターが、外的制御が可能な刺激により調整される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を不適切な頻度で電気信号を生成している細胞に投与することにより、細胞が、投与前の細胞の電気信号の頻度と較べて増加又は減少した望ましい頻度の電気信号を生成することを含んでなる、電気的に活性な細胞の機能を調節する方法。
【請求項１８】
電気的に活性な細胞が心筋細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電気的に活性な細胞が神経細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
電気的に活性な細胞が膵島細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
電気的に活性な細胞又は組織が、その生理的機能が生体電気リズムに依存する何れかの細胞型又は組織型である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を含む電気的に活性な細胞を、不適切な頻度で電気信号を生成している細胞に投与することにより、細胞が、投与前の細胞の電気信号の頻度と較べて増加又は減少した望ましい頻度の電気信号を生成することを含んでなる、電気的に活性な組織の機能を調節する方法。
【請求項２３】
電気的に活性な細胞が心筋細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
電気的に活性な細胞が神経細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
電気的に活性な細胞が膵島細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
電気的に活性な細胞が、その生理的機能が生体電気リズムに依存する何れかの細胞型である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を含む組成物の有効量を哺乳動物に投与することにより、望ましくない電気活性を有する哺乳動物の細胞が調節されること
を含んでなる、望ましくない電気活性を有する細胞が関与する疾病又は疾患に罹っている又は罹患する恐れのある哺乳動物を治療する方法。
【請求項２８】
疾病又は疾患が、心不整脈である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
疾病又は疾患が、神経因性疼痛である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
疾病又は疾患が、糖尿病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
疾病又は疾患が、肥満症である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
疾病又は疾患が、易興奮性疾病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ＨＣＮチャネルの遺伝子改変ポリヌクレオチド構築物を含む、電気的に活性な細胞の有効量を哺乳動物に投与することにより、望ましくない電気活性を有する哺乳動物の細胞が調節されることを含んでなる、望ましくない電気活性を有する細胞が関与する疾病又は疾患に罹っている又は罹患する恐れのある哺乳動物を治療する方法。。
【請求項３４】
疾病又は疾患が、心不整脈である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
疾病又は疾患が、神経因性疼痛である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
疾病又は疾患が、糖尿病である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
疾病又は疾患が、肥満症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
疾病又は疾患が、易興奮性疾病である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年８月２日出願の米国特許仮出願第６０／５９８，１７０号の優先権を主張するものであり、その開示の全てを参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
（連邦政府の助成による研究）
本発明の一部は、米国国立衛生研究所のグラント第ＨＬ７２８５７号による米国連邦政府の助成によりなされたものである。従って、米国連邦政府は、本願の特許請求の範囲に係る発明に於いて／対して特定の権利を有している。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子を改変した膜チャネルを用いた（心臓、ニューロン及び膵臓細胞等からの）生体電気インパルスを工学的に生成するための新規な手法に関する。
【背景技術】
【０００４】
自発性の細胞の電気リズム（又は、ペーシング）は、心臓の自律的な鼓動、痛覚の伝達、呼吸リズム及びインスリンの分泌に由来する幾多の生体プロセスを支配している。例えば、損傷した後根神経節における自発的なニューロンの電気的放電が、神経障害性疼痛の根底にあるが、利用できる有用な治療法は限定されている。最近、本発明者らはまた、膵臓のβ細胞の電気リズムの根底にある主要なイオン成分がインスリンの分泌を調節することを見出した。心臓に於いては、ペーシングの異常により、従来の薬理学的介入並びに種々の副作用、固有のリスク及び出費を伴う、高価な電子デバイスの移植を必要とする、多様な形態の不整脈及び電気的疾患が誘導される。
【０００５】
自律的に刻まれる心臓の鼓動は、常用性であるため交感神経及び副交感神経によって調節され、このような平常のリズムは、律動的な活動電位（ＡＰ）（つまり、ペーシング）を自律的に生成する数千のペースメーカー細胞からなる特殊な心臓組織である、心臓の洞房（ＳＡ）結節に源を発している。ＳＡ結節細胞のペーシング活性を顕著に調節するとして知られているものの一つに、脱分極を誘発する、Ｎａ＋／Ｋ＋混合の内向き電流１である心臓の膜電流Ｉｆ（おかしな挙動する、ｆｕｎｎｙの意）である。Ｉｆは２０年以上も前からその存在が認識されていたにも関わらず、それをコードする、過分極誘発性サイクリックヌクレオチド制御型（ＨＣＮ）チャネル遺伝子ファミリーとして知られる遺伝子は、比較的最近になってようやくクローン化されるようになった２−４。今日までに４つのアイソフォーム、即ち、それぞれ独特の組織分布及び生物物理学的側面有するＨＣＮ１〜４が同定されている３−８。ＳＡ結節の２つの支配的なアイソフォームのうち、時間依存性のＨＣＮ１の電流は、ＨＣＮ４チャネルに較べて約４０倍も早くチャネルを開口させるものであり９−１３、患者のヒトＨＣＮ４遺伝子に検出された一塩基対欠失変異は、特発性の洞結節機能不全と関連している１４。
【０００６】
ＨＣＮ１〜４は容易に結合して、個々のアイソフォームからは予測できない、状況依存性のテトラ４量複合体を形成するので１５−１８、未変性の（native）Ｉｆの分子同一性は、発現している特定のアイソフォームに左右される複雑なものとなっている。更に、ＨＣＮチャネルは、哺乳動物の発現系よりも未変性の心筋細胞において、よりプラス電位に活性化しており、Ｉｆのゲート特性は状況（例えば、内在性のサブユニットの存在）に高度に依存することが示唆されている（Quら, 2002, Pflugers）。従って、未変性のＩｆを、ＨＣＮのアイソフォームの一つを単純に発現させることにより再生成するのは難しい。事実、心室の成熟心筋細胞において野生型のＨＣＮ２を過剰発現させる従来の試みは、自動能１９に誘導することに失敗しているが、恐らくは、心臓のペーシングの電位範囲に対してその負の活性化（negative activation）によるものであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一連の治療成果を得るように、ＨＣＮチャネルの活性化がきめ細かにカスタマイズできるような、柔軟で効果的な手法の開発が強く望まれている。例えば、野生型ＨＣＮチャネルより更に容易に開口し（そして、それにより心臓細胞で状況依存性の負の活性化を補う）、心臓の自動能を効果的に誘導する又は調節するような、より優れた未変性の偽Ｉｆを得るようにＨＣＮチャネル構築物を設計することである。同様の方針を、電気的なリズムに依存するその他の細胞型へ応用することも想定される。
【０００８】
上記のように、ＨＣＮにコードされるＩｆ（又はＩｈ）は、インスリン分泌の細胞と同様に、ニューロン、心臓での自発性の律動活性に重要な役割を果たしている（３２−３８）。古典的な脱分極を活性化する電位ゲートＫ＋（Ｋｖ）及びＨＣＮチャネルは、構造的には互いに相同であるが、後者はそれらの特殊な「逆行（backward)」ゲーティング（つまり、脱分極よりもむしろ過分極化の活性）によりＫｖに対応するものとは際だって異なっている。ＨＣＮゲーティングの原理は、殆ど知られていない。
【０００９】
ＨＣＮ及びＫｖチャネルの電位感知のメカニズムは、それらのゲーティング動作が正反対であるにも関わらず、保持されている（つまり、ＨＣＮのＳ４も、脱分極及び過分極の際、それぞれ内向き、外向きの動作をする）ことが、近年証明されている（３９、４０）。この発見により、Ｓ４の電位センサー（voltage-sensor）に直接繋がれているＳ３−Ｓ４リンカー（図１にて、ＨＣＮ１の残基２２９ＥＫＧＭＤＳＥＶＹとして定義される）が、Ｋｖチャネルと同様にＨＣＮチャネルの活性化表現型にも影響する可能性が導かれる（４１〜４３）。事実、本発明者らは、Ｓ３−Ｓ４リンカーが幾つかの重要な機能を有するアミノ酸残基を含有していることを見出した（４４、４５）。例えば、Ｇ３１２、Ｍ２３２及びＥ２３５のアラニンの一塩基置換が、脱分極を誘発する。ＨＣＮ活性化の部位依存性の摂動のパターン（計算上のモデルと同調しているが）から更に、リンカー部分がらせん状の二次構造を、片方に集束した決定因子Ｇ２３１、Ｍ２３２及びＥ２３５に合致させることが示唆される。ＨＣＮのＳ３−Ｓ４リンカーの構造的及び機能的役割を理解することが望まれる。このような理解は、心臓、ニューロン、膵臓細胞等における自動能を増加させる（又は、減少させる）ように、より開口し易くすく（開口しにくく）する、人工的なＨＣＮチャネルを開発する助けとなるであろう。
【００１０】
この出願を通じて、種々の刊行物を多数参考にした。これら刊行物の引用の全てを、本明細書の最後（要約の直後）に記載する。本明細書に記載され、クレームされている本発明がなされた当時の当該技術分野に於ける状況の十分な理解のために、本明細書で引用した刊行物による開示を参照してその全てを本明細書に取り込む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要約）
本発明者らは、タンパク質工学及び遺伝子工学を組合せた新規な手法を用いて、特定のイオンチャネルを標的とする、心臓、ニューロン及び膵臓細胞のような特殊な細胞での生体電気リズムを調節する又は「特注にて変更する（custom-tailor)」新規な方法を見出した。タンパク質工学と組み合わせることにより、正常な及び／又は人工的なイオンチャネルタンパク質を未変性の組織又は幹細胞由来の誘導物（細胞移植による）に、それぞれ、インビボ又はエキソビボで遺伝子導入することにより当該方法は達成され、インビボで望ましい生理学上の結果を得ることを可能にするものである。例えば、活性化の閾値を標準チャネルの値の上方又は下方のどちらかへ一定のレベルでシフトさせるようなＨＣＮチャネルを先ず設計する。このような人工的な遺伝子組み換え構築物は、細胞に導入されると、生体電気の律動活性を変化させ、次いで細胞の生理的な応答（例えば、心臓の鼓動、痛みの感覚、食欲、インスリン分泌等）を増大又は減衰させることができる。要するに、本発明者らの手法は、不整脈（洞不全症候群）、てんかん、神経障害性の疼痛、肥満症、糖尿病等のような臨床上の問題に対し、新規で効果的な治療法をもたらすものである。この様な取り組みの有効性は、以下に記載のように、心臓の不整脈（洞不全症候群）を是正するための、本発明者らによるインビボでの遺伝子導入実験で検証されている。
【００１２】
本発明者らは、遺伝子改変のＨＣＮ構築物を用いて、ペースメーカーとしての機能を発揮する、及び／又は、内在性の若しくは誘導された心臓のペースメーカー機能の活性を調節する「生体バッテリー」を産生することができる、遺伝子導入及び細胞投与の方法を提供するものである。
【００１３】
遺伝子が改変されたＨＣＮ構築物を用いた本発明の方法は、内在性のペースメーカー（哺乳動物の心臓の洞結節、中枢神経系のニューロン、膵臓のβ細胞等のような）及び／又は誘導されたペースメーカー（例えば、幹細胞又は転換された電気的に静止の細胞から生成される生物学的ペースメーカー）の律動活性を生成する及び／又は調節するのに用いられる。
【００１４】
更に具体的には、本発明の好ましい様態では、静止の心筋細胞は、インビボでウィルス遺伝子の導入又は遺伝子改変細胞の導入（例えば、分化した幹細胞）によって、ペースメーカー細胞に転換される。
【００１５】
更なる態様において、既存の内在性の又は誘導された心臓のペースメーカー機能の頻度を変更する（つまり、調律する）ために、組成物を対象に投与する。特定の表現型を示す、遺伝子を改変したＨＣＮ構築物を含むポリヌクレオチド又は改変細胞は、投与するのに好ましい薬剤である。本発明の方法は、実質的に心臓の細胞以外（例えば、ある特定のニューロン及び膵臓の細胞）の生体電気リズムを持つ全ての細胞型に適用でき、引き続いてそれらの生理的機能を修正する／改善することができる。例えば、神経障害性疼痛の症状において電気的に活性な神経細胞の活性を、痛みの知覚を減らす又は除去する（つまり、疾病又は精神的外傷による特定の不具合を修正する）ために、異なったＨＣＮ構築物（例えば、容易に開口しない又はドミナントネガティブ構築物に等しいもの）を用いて減衰させることができる。
【００１６】
本願は特に、ＨＣＮ１のＳ３−Ｓ４リンカーの長さが、ゲーティングの決定要因であることを開示するものである。リンカーの長さを（アミノ酸の）欠失又は挿入により系統的に変更し、次いでそれによる機能への影響を詳細に特徴付けることにより、リンカーの長さとそのアミノ酸構成が、系統的なパターンでゲーティング特性を顕著に調節することを明らかにした。しかしながら、原則的には、その他の機能的なＨＣＮ領域（例えば、ゲーティング特性に影響するＳ４及び細孔部位、ｃＡＭＰ結合領域等）についても同様に改変することにより、特定の結果を得るようすることが主たる目的である。
本発明のその他の様態を以下に考察する。
【００１７】
（本発明の詳細な説明）  
本願は、未変性の結節Ｉｆをプラスに活性化させる特性を模倣する単一の人工的なＨＣＮ構築物の過剰発現が、通常は静止状態である心室の心筋細胞を律動的なペースメーカー様の細胞（ＩＫ１阻害効果がなくても、またその阻害効果よりも優れている）に変換することができることを開示するものである。このことから、Ｉｆは事実上、膜電位の重要な発振器であることを示唆している。この発見により、（心臓、ニューロン及び膵臓の）ペーシングにおいて、Ｉｆの機能的な役割に新しい識見が提供された。今日まで、心臓における異所性のペースメーカー活性を誘導するのに、少なくとも３つの取り組みがされてきた。これらには、心房のβ２−アドレナリン作用の受容体を過剰発現させること３０、及び心室のＩＫ１を遺伝子的に抑制すること２１、２２、が包含される。具体的には、ドミナントネガティブ構築物であるＫｉｒ２．１−ＡＡＡの体細胞遺伝子を成熟モルモットの心室筋細胞へ導入したところＩＫ１の発現を（約８０％）抑制したことにより、当該研究に記載のＡｄ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ形質導入細胞と同様な方法により、静止状態の心室筋細胞を自発的に活性化する「ペースメーカー様」の細胞に変換させることが導かれた。しかしながら、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡに誘導される心室の自動能は、Ｂａ２＋によるＩＫ１ブロックと同様に、通常の心拍数よりもかなり遅い。つまり、Ｋｉｒ２．１−ＡＡＡによるＩＫ１抑制は、別な静止状態にある心室細胞に於けるペースメーカーとしての潜在的な活性を発揮させる単純なオン・オフスイッチとして働く。しかし、それは誘導された電気的な発火活性を調節する直接の手段を提供ものではない。本発明の成果は、インヒビターであるＩＫ１を抑制するよりも本来のペースメーカー電流であるＩｆを調節することにより、異所性の心臓のペーシングが上守備で達成されることに関与するものである、。
【００１８】
心室の筋細胞の結節Ｉｆを野生型ＨＣＮ２の単独の過剰発現によって再成する試みが従来からなされてきたが、自動能を導入することに失敗している２８。それに反して、左心房又は左脚に於ける同様のチャネルの過剰発現が、ペースメーカーとしての機能を誘導できるが、これは迷走神経の刺激誘導の洞停止後のみに引き起こされるものであり、有用な治療への応用の可能性が制限されている１９。ＩＫ１とＩｆは、膜電位を安定させる又は発振させるものであり、互いに対立するものとして考えられており、これらの実験で観察される相違は、心房より心室においてＩＫ１の発現レベルがより高いことの結果と考えられる３１。これらのＨＣＮ２の実験（本発明のケースでは−１４０ｍＶでの、−９６ｍＶ及び約０．８ｐＡ／ｐＦ対５３．８ｍＶ及び８．２±１．４ｐＡ／ｐＦ）におけるＶ１／２及び／又はＩｆ発現の規模が、ＩＫ１の存在下で活性なペーシングを誘導するのに要求される閾値より下であると考えられており、これは本発明の成果（以下を参照されたい）に支持されるものである。
【００１９】
興味深いことに、Ｉｆの過剰発現が、Ｂａ２＋によるＩＫ１ブロックなしでより早いペーシング速度を誘導する。恐らく、ＩＫ１がＭＤＰを過分極し、その結果として、フェイズ４早期の脱分極時に過分極活性誘導型のＩｆチャネルを開口する可能性が高い。従って、ペーシングを誘導するＩｆ過剰発現及びＩＫ１抑制の手法は、相乗作用を必要とするものではない。むしろ、ペーシングにおけるＩｆの機能的な効果は、独自の特性（伝導性、ゲーティング特性等）はもとより、幾つかの細胞パラメーター（ＭＤＰ及びＩＫ１のような）の機能である。当該出願に示されるデータは、特異的な生体物理的特性を示す人工的なＨＣＮ構築物を使用する実践の機会を提供するものである。特異的な生体物理的特性とは、カスタマイズされた基本的発振頻度範囲を有する、遺伝子又は細胞ベース（例えば、エキソビボの成熟又は胚性の幹細胞由来の）の人工的な生体バッテリー（又はペースメーカー）のライブラリーを構築するものである。
【００２０】
Ｋ＋チャネルに関する従来の研究により、チャネルのＳ３−Ｓ４リンカーの長さがゲーティングキネティックス（kinetics）の決定要因であることが示された（４１〜４３）。ＫＶチャネルのＳ３−Ｓ４リンカーが完全に消失しても、依然として堅調なＫ＋電流が生成される（４２）が、このことは、チャネル活性化時の立体構造に於ける多大な変化には、リンカーは関与していないことを示唆している（４２、４３）。このことは、言い換えれば、Ｋｖチャネルが活性化するときに、Ｓ４電位センサーがほんの少ししか動作しないか又はＳ３−Ｓ４リンカーがＳ４に同調して動作することができるかのどちらかを暗示する（下記、参考文献４８のパドルモデルを参照されたい）。これらのＫＶチャネルに関する研究にもかかわらず、Ｓ３−Ｓ４リンカーの長さのＨＣＮチャネル機能に於ける役割は、充分解明されていない。本発明者らのデータは、Δ２３５−２３７欠失変異体の短縮されたリンカーが脱分極化をもたらし、２３５位のみの電荷を除くことでは説明できないキネティックスを遅延させたことを示すものである（４４、４５）。ＨＣＮ及びＫＶチャネルが構造的に似ていることが、ＨＣＮ機能におけるＳ３−Ｓ４リンカーの長さの役割を詳細に検討する動機となった。事実、本発明者らは、Ｓ３−Ｓ４リンカーの長さ及び組成の両方が、ＨＣＮゲーティングに顕著に影響していることを見出し、この部位をＨＣＮチャネルの活性を調節する（次なる細胞組織の設計に際して）最有力候補とした。
【００２１】
Ｓ４電位センサーに直接繋がれたＳ３−Ｓ４リンカーは、ゲーティング過程で立体構造が一連に変化することによって、チャネルの開口に必要とされるチャネルのトランジションを分離させるエネルギーバリアーに影響を与える。本発明者らのデータは、Ｓ３−Ｓ４リンカーの短縮及び延長が、一般に定常状態の活性化をプラス及びネガティブな方にシフトすることを示し、それは、短縮されたリンカーは一般に、ＨＣＮチャネルの活性化を促進し（臨界の長さに達した場合で、しかも短縮されたリンカーが臨界の決定要因であるＭ２３２を含んでいる場合のみ）、一方、延長されたリンカーはチャネルの活性化を制限することを示唆する。欠失又は挿入による構築物の幾つかは、ゲーティングキネティックスに於いては実質的な変化を示したが、定常状態の活性化特性に於ける変化は比較的小さなものであった。恐らくは、リンカーの長さが変われば、活性化の過程に生じるチャネルの様々な立体構造の変遷にも変化が生じるのであろう。事実、リンカーは、Ｓ４電位センサーの膜電位の変化に応答する速度に影響を及ぼすか、又は膜電位の変化にＳ４が応答した後に起こる立体構造の変化に影響を及ぼすかのどちらかである。順序を度外視するならば、これらの結果は、Ｌ型のＣａ２＋チャネル（４９）に対して従来提案されてきたように、ＨＣＮチャネルの活性化の時間経過の設定において、Ｓ３−Ｓ４リンカーが果たす役割を暗示するものである。
【００２２】
興味深いことには、Δ２３４−２３７は、野生型のものとは判別し難いＶ１／２の活性化及び脱活性化キネティックスであるＨＣＮ１のゲーティング特性をほぼ正常なものに修復する。本発明者らが従来から提案してきたモデル（つまり、残基２３１−２３７が、ヘリカル配列をＧｌｕ−２２９及びＬｙｓ−２３０と一致させて、Ｓ３−Ｓ４リンカーをＳ３に結合させるコイル構造を形成する）（１４）に基づいて、Δ２３４−２３７は１つのヘリカル回転を有していると予測される。同時に３個のアミノ酸のみ（つまり、１つのヘリカル回転）から成るＳ３−Ｓ４リンカーもまた、ＳｈａｋｅｒＫ＋チャネルの野生型の活性化表現型を回復するのに充分である（１２）。Δ２３４−２３７のＶ１／２は、野生型のものとは統計的に区別できない（ｐ＞０．０５）が、活性化は脱分極方向に穏やかにシフトされており、これは表面電荷として働くことにより活性化ゲーティングに影響すると知られているＥ２３５欠失の結果と推定される。
【００２３】
ＨＣＮ１のＳ３−Ｓ４リンカーのもう一つの特性は、その他のリンカー残基ではなくＭ２３２が、チャネルの機能の必須の条件であることを意味する。本発明者らは、２３２番の残基であるアラニンの置換がゲーティングを著しく変化させることを、以前に実証した（４５）。アラニンで置換される（つまり、Ｍ２３２Ａ）と、活性化は脱分極方向にシフトし、ゲーティング速度は減速する。本発明の発見は、Ｍ２３２の存在がＳ４の電位センサーの構造的な完全性を保持するために重要であることを、更に示唆する。後者の可能性と一致するように、Δ２２９−２３４、Δ２２９−２３７、Δ２３２−２３４及びΔ２３２−２３７のような非機能性の構築物は、原型のヘリカルの立体構造から、モデリングアルゴリズムＳＳｐｒｏ２による予測をベースにしたコイル状の構造に変化する、Ｎ末端のＳ４セグメント（残基２３９−２４０）を有している（データは示していない）。それに反して、大きな電流を発現する構築物（例えば、Δ２２９−２３１、Δ２３４−２３７及びＱＱＱ２３３ＱＱＱ）は、野生型のものと相違がない原型のヘリカルを保持している。また、Ｍ２３２を有さないＳ４は、電位変化への応答に、もはや適切に動作することができないか、又はその動作は次なるチャネルの開口を誘導することができない。Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７及びΔ２２９−２３１／Δ２３５−２３７を観察により、非常に短いＳ３−Ｓ４リンカーでさえ、ＨＣＮチャネル開口に必要なＳ４電位センサーを変化（displacement）させるのに充分なものであることが示唆された。
【００２４】
ＨＣＮチャネル
ある特定のイオンチャネル、つまりＨＣＮチャネルファミリーは、発振頻度を決定して、心臓、膵臓及びＣＮＳにおける律動的な電気活性を顕著に調節する。「ＨＣＮチャネル」は、膜の過分極で活性化されて、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰにより調節される、ナトリウム／カリウムの浸透性カチオンチャネルである。ＨＣＮチャネルの活性化は、一般に膜電位の脱分極を導くナトリウム／カリウムによって運ばれる、内向きの電流を生み出すように導く。
【００２５】
本発明者らは、ＨＣＮチャネルの活性化を精巧にカスタマイズできる、柔軟で効果的な手法を設計した。例えば、本発明者らは、それらの活性化閾値が通常のチャネルの値の上方又は下方のどちらかにシフトさせるような、ＨＣＮチャネルを設計した。このような遺伝子組み換えの構築物は、細胞に導入されると、関連する生体電気律動活性を変更し、引き続いてそれらの生理的応答を増加又は減衰させることができる。この手法の有効性は、本発明者らのインビボでの遺伝子導入実験によって実証されている。心室の心筋細胞に於いてＨＣＮ２チャネルを過剰発現させる従来の試みは失敗したが、本発明者らは、活性な膜電位生物発振器（つまり、自己再生可能な生体バッテリー）を、組み換え型のＨＣＮ構築物（つまり、具体的な提案例として、ＨＣＮ１−ＥＶＹ２３５−７ΔΔΔ）の体細胞遺伝子の導入を経由して心筋細胞に移植することに成功した。この構築物の活性化の閾値は、野生型チャネルより約２０ｍＶ低く、チャネルの開口に好ましい。この結果、静止状態の心筋細胞が、自発的な活性を有する「ペースメーカー」細胞に顕著に転換された。Ｋｉｒ２がコードするＩＫ１チャネルの遺伝子的な抑制は、単にオン・オフスイッチであり、誘導されたペーシング速度を調節する直接の手段を提供するものではないが、それとは異なってＨＣＮ遺伝子は、ペーシングを調節及びカスタマイズするのと同様に、ペーシングを誘導（つまり、オン及びオフの調光スイッチと同じような）するのに用いられる純粋なペースメーカー遺伝子である。この戦略は、生理的作用を調節するニューロン及び膵臓細胞のような電子的に活性な細胞に同様に適用できる。即ち、本発明の成果により、生体電気リズム（例えば、新規な疼痛処理、インスリン分泌促進等のための、電気的な発火頻度（firing rate）がカスタマイズされている遺伝子又は細胞ベースの生物学的なペースメーカー）を人工的に設計する新規な手法が導かれる。
【００２６】
上記のように、遺伝子改変のＨＣＮ構築物を含む改変細胞は、またペースメーカーを導入又は調節するように細胞又は対象に投与することができる。例えば、投与される改変細胞は、ペースメーカー機能を提供でき、そして多機能性の胚性幹細胞（又はその他の多機能性の幹細胞）のような幹細胞から分化した心筋細胞が適している。後者は、幹細胞由来のペースメーカー細胞（自発的な及び／又は分化された）、及び／又はペースメーカーの機能を提供するように変換された幹細胞由来の筋細胞（ミオサイと、例えば、心室の細胞）でありえる。本明細書に記載のように、投与される細胞は、投与の前に本明細書に示すような発現系で形質転換された幹細胞由来の心筋細胞又は心筋細胞のように、修飾されているものが好ましい。
【００２７】
遺伝子改変ＨＣＮ構築物の遺伝子発現は、好適なポリヌクレオチド化合物を哺乳動物に投与することにより促進することができる。特に本発明者らは、ＨＣＮ活性がそれらの活性化の閾値を望ましいレベルにシフトできるような上方及び下方の両方に調節することができることを見出した。従って、心臓のペーシング及びそれに続く心拍数、又はニューロン及び膵臓のペーシングが、このようなＨＣＮ遺伝子発現の制御により、効率的に調節（増加又は減衰の両方）することができる。例えば、ペーシングは、内在性のＨＣＮチャネルの活性を阻害することにより、及び／又は活性化の閾値を内生レベルより上方にシフトすることにより、減速することができる（もしくは、加速は、過剰発現により動作するチャネルの数を増やす及び／又は活性化の閾値を内生レベルより下にシフトすることにより達成することができる）。同様に、第二のメッセンジャーｃＡＭＰに対する未変性のペースメーカーの応答もまた、例えば、所与の感度の人工的なチャネルを用いて、調節することができる。
【００２８】
遺伝子改変ＨＣＮ構築物ポリヌクレオチドの投与は、少なくとも一つの電気特性を誘導する又は調節（増加又は減衰）するのに適している。心臓において、例えば、本発明の使用は電気伝導を調節するのに好ましく、そして心臓の活動電位（ＡＰ）の全て又は一部を再設定するのに好ましい。その使用は、望ましい治療効果を達成する助けとなり、通常の電気的作用の深刻な分断は、一般に、本発明の方法により減じられ、しばしば回避される。
【００２９】
本発明によるポリヌクレオチド又は改変細胞の投与は、好ましくは、治療される心臓、ニューロン、膵臓の細胞等の電気的シグナルの出力の頻度（発火頻度）に於いて、顕著な差異（増加又は減衰）を提供する。より具体的には、治療される細胞の発火頻度において、約２、３、４又は５パーセントの増減を提供する投与が好ましく、少なくとも約１０、１５、２０、３５、３０、４０、５０又は１００パーセントの増減がより好ましい。治療される細胞の発火頻度は、通常の方法で、具体的には以下に定義されるアッセイのような標準の電気物理学的アッセイにより測定することができる。
【００３０】
好ましい投与経路の例として、ポリヌクレオチドは以下に述べるように提供される。一般に、本発明を用いて導かれるポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つの標準の電気物理学的アッセイより得られる記録での変化（シフト）（ベースラインに対して相対的な）から明らかなものとなっている。本発明によるポリヌクレオチドの投与は、好ましくは、ベースラインの作用に較べて少なくとも約１０％の増加又は減衰した電気的特性を提供する。より好ましくは、少なくとも約２０％の増加又は減衰、より好ましくは、少なくとも約３０％〜約５０％又はそれを超えての増加又は減衰を提供する。ベースラインの作用は、例えば、本発明の方法実施の前に、具体的な哺乳動物で電気物理学的アッセイを実施して、容易に確定することができる。もしくは、相対的なベースラインの作用は、目的のポリヌクレオチドの代わりに対照のポリヌクレオチドを投与する平行実験を実施することにより測定することができる。一度信頼できるベースラインの作用が確立されれば（又は、公の機関から得られれば）、実験実施者によるベースライン作用の測定は常に必要とされるものではないことは明らかであろう。適切な電気的特性の例として公知であるが、発火頻度、不応性、伝導速度、焦点自動能及び空間的励起パターンの少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されるものではない。心拍数若しくは収縮頻度（発火頻度）又は脈拍数を評価することが好ましい。
【００３１】
心臓の収縮頻度を調節することにより、本発明は、広い範囲の心臓関連の疾病及び疾患の治療又は予防（予防的処置）に用いることができる。例えば、本発明の方法は、心臓関連の失神症、具体的には、ストークス・アダムス失神症を患っている又は患う恐れのある対象の治療に有用とされる。本発明の方法はまた、持続性洞性徐脈、ＳＡウェンケバッハ症として現れる洞房（ＳＡ）ブロック、完全なＳＡブロック又は洞停止（心房を活性化できない洞刺激）及び高度の房室ブロックを包含する、種々の洞結節機能の異常症を患っている又は患う恐れのある対象の治療に有用とされる。本発明の方法はまた、徐脈頻脈症候群及びその他の原因での徐脈を、患っている又は患う恐れのある対象の治療に有用とされる。生体電気リズムに関連する、神経因性疼痛、てんかん、筋緊張症（ミオトニア）、糖尿病、肥満症のような心臓以外の興奮性疾患も治療することができる。
【００３２】
本発明の治療方法は、一般に本発明の方法に従って、遺伝子改変ＨＣＮ１構築物を含むポリヌクレオチド又は改変細胞の、発火頻度を調節するのに有効な量を哺乳動物に投与することを含む。投与に於いては、例えば、毒性を避けるために、哺乳動物の目的組織の標的部位に局所投与することが望ましい。このような投与は、注射、カテーテル注入、及び例えば、本明細書に記載の他の方法で、実施するのが好ましい。治療用に哺乳動物を先ず同定し、選択しておいてから、治療組成物を投与するのが好ましい。例えば本明細書に記載のようにして、心臓関連の失神症（具体的には、ストークス・アダムス失神症）、洞結節機能の異常症（持続性洞性徐脈のような）、ＳＡウェンケバッハ症として現れる洞房（ＳＡ）ブロック、完全なＳＡブロック又は洞停止及び高度の房室ブロック、又は徐脈頻脈症候群若しくはその他の徐脈関連の疾患、のような疾病又は疾患を患っている又は患う恐れのある哺乳動物を同定することができる。
【００３３】
別な様態では、本発明は、本発明の方法の１つ又は組合せて、実施するためのキットを提供する。前記キットは、好ましくは、少なくとも１つの好適な心筋の核酸伝達システム、並びに好ましくは、遺伝子改変のＨＣＮ１の構築物を包含する、少なくとも１つの望ましいポリヌクレオチド及び／又は改変細胞を含む。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは操作可能な程度にシステムに結合していることである。つまり、前記ポリヌクレオチドを心臓に良好に投与するのに十分に機能しており、そして／又はポリヌクレオチドが物理的に結合した状態であるシステムである。更に、好ましいキットには、遺伝子改変のＨＣＮ１の構築物を包含するポリヌクレオチド又は改変の細胞を、哺乳動物に投与するための手段、例えば、シリンジ、カテーテル等が含まれる。
【００３４】
本明細書で引用された全ての刊行物及び特許出願は、各々の刊行物及び特許出願を参照して本明細書に取り込むよう、それぞれ特に指示されているように、参照して本明細書に取り込む。
【００３５】
（例示）
実施例１〜３のための材料及び方法
分子生物学、アデノウイルス形質導入及び筋細胞単離
本発明者らの従前の刊行物２３、２４に記載のようにＰＣＲ法を利用してオーバーラッピングオリゴヌクレオチドにより、ｒｂＨＣＮ１（京都大学（日本）の大森博士の好意により提供された）に突然変異を誘発した。ＨＣＮ１−ΔΔΔを、ｐＡｄＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔを生成するために、バイシストロニックなアデノウイルスベクターｐＡｄＣＭＶ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ又はｐＡｄ−ＣＧＩ２５にサブクローンした。アデノウイルスは、以前に記載２６のように精製したΨ５ウイルスのＤＮＡ及びシャトル・ベクターのＤＮＡのクレロックス（Cre-lox）組み換えにより生成した。組み換え生成物はプラーク精製して、１０１０オーダー濃度のプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）ｍｌ−１を生成し、次いで、クロスクランプで一時的に大血管を止血した麻酔されたモルモットの左心室洞に注射した。左心室の心筋細胞は、電気生理学的な記録のため、インビボで形質導入した後、７２〜９４時間の酵素処理により単離した。ＧＦＰ落射蛍光により測定された、形質導入の効率は通常約２０％であった。
【００３６】
電気生理学
電気的な記録は、一体型の増幅器を用いた全細胞パッチクランプ手法２７を用いて実施した。ピペットは、内液（internal solution）を満たした状態で、１〜３ＭΩの先端電気抵抗を保持している。この内液は、１４０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＡＴＰ（マグネシウム塩）、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含む。外部の槽溶液は、１４０ｍＭのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、５．４ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのグルコース、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍＭのＣｄＣｌ２、５ｍＭの４−アミノピリジン及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を含む。全ての記録は、室温（約２３℃）にて実施した。データは、統計的に有意であることを示すＰ＜０．０５で、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として報告した。
【００３７】
ブタの洞不全症候群及び遺伝子導入
ミニブタ（miniswine）（４５〜５５ｋｇ）は、（気管内）挿管及び人工呼吸器を備えて、プロポフォール及びイソフルレン（１％）の静脈注射で知覚麻痺とした。大腿の静脈切開により血管へのアクセスを確保した後、７Ｆの電気生理的なカテーテル（Biosense-Webster, CA, USA）をＲＡに導入して、上大静脈と上右心房の間にあるＳＡ結節部へと操縦し、温度制御モード並びに５０℃及び３５ワットの最大出力セットをそれぞれ備えたＳｔｏｃｋｅｒｔ７０ＲＦ発電機（Biosense-Webster, CA）を用いて発生させた高周波のエネルギーを、洞律動の間の心臓内の最初期の活性化部位に通電して洞の機能不全を導いた。アブレーション後に、本研究者らは、心拍数が６０ｂｐｍより下に低下した場合にペーシングをサポートできるように、ＲＡの上前外側壁部位に片方の電極を、右心室の先端にもう片方の電極を備えたデュアルチャンバー・ペースメーカー（Medtronic Inc. or Guidant Corp）を移植した。左の開胸術後に、ｐＡｄＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ（２ｘ１０１０ＰＦＵ）又は生理食塩水（２〜３ｍｌ）をＬＡ付属部に注入した。注射部位をマークするために金属クリップを使用した。
【００３８】
電気的解剖図
注入処置の１０〜１４日後に、本発明者らは、ＳＳＳ動物の心臓内の活性化パターンを心房の電気的解剖図で評価した。磁気技術での参考の電子グラフと関連した局部の心臓内の活性化時間の立体的分布を収集するために、特殊なマッピング・カテーテル（NAVI-STAR; Biosense Webstar）を用いた非蛍光透視の磁気電気解剖学的なシステム（non-fluoroscopic magnetic electroanatomic system: CARTO; Biosense Webster）を、Ｂｅｎ−Ｈａｉｍ，１９９６  ＃３８８に記載されているのように採用した。このマッピング・カテーテルを自発性の又は心房の歩調取り律動の間にＲＡ及びＬＡの異なった場所に移動して、カラーで色付けした３次元の心臓内活性化の地図を構築した（赤色：最初期の活性化部位、紫色：最終の活性化部位）。アブレーションを施していないの動物の平常の洞律動も対照として地図化した。
【００３９】
実施４〜８のための材料及び方法
分子生物学及び非相同的な発現
マウスＨＣＮ１（ＳｉｅｇｅｌｂａｕｍとＳａｎｔｏｒｏの両博士の好意により提供された）を、ｐＧＨＥ発現ベクター（１６）にサブクローンした。ＰＣＲ法により変異誘発性のオーバーラッピングプライマーを用いて突然変異体を生成した。ＤＮＡの配列決定により望ましい突然変異体を確認した。ｃＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Promega, Madison, WI）を用いてＮｈｅＩで直線化されたＤＮＡ（NheI-linearized DNA）から転写した。ＨＣＮ１チャネル構築物をアフリカツメガエルの卵母細胞に非相同に発現させて解析した。ＩＶ〜ＶＩステージの卵母細胞を、０．３％の３−アミノ安息香酸エチルエステルに浸漬して知覚麻痺した雌のカエルから外科的に取り出し、次にＯＲ−２溶液（８８ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）を含む）中の１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーザ（ＩＡ型）で、３０〜４０分間消化処理した。ＮＤ−９６溶液（９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）を含む）中、１０％のウシ胎仔血清と共に、１５〜３０分間細胞を培養することにより濾胞除去処理した。単離した卵母細胞は、ｃＲＮＡ（５０ｎｇ／細胞）を注入して、９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）中で、室温にて１〜２日間、電気的記録の前のタンパク質発現のために保存した。
【００４０】
ＴｓＡ−２０１細胞におけるＨＣＮ１−ＧＦＰ融合構築物及び非相同的な発現
ＨＣＮ１−ＧＦＰ及びＨＣＮ１Δ２３２−２３４−ＧＦＰは、哺乳動物の発現ベクターｐＣＩにサブクローンし、次に製造業者の手順に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  Ｐｌｕｓ２０００（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｔｓＡ−２０１細胞に形質導入する。形質導入した細胞は、トリプシン処理して、ガラス底の培養皿（MatTek Corporation, Ashland, MA）に４時間置き、そして４８８ｎｍの励起波長で共焦点の顕微鏡検査（UltraView Confocal Imaging System, PerkinElmer life Sciences）を実施した。
【００４１】
電気生理学
ＷａｎｅｒＯＣ−７２５Ｂ増幅器を用いて、室温で、２電極の電圧固定法により記録を実施した。アガロースで栓をした電極（TW120-6, World Precision Instruments, Inc., sarasota, FL）を、３ＭのＫＣｌで満たした場合２〜４メガオームの最終の先端抵抗値を有する、ＮａｒｉｓｈｉｇｅＰＰ−８３垂直引き抜き器具を用いて引き抜いた。記録時の槽の溶液は、９６ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２ｍＭのＭｇＣｌ２（ｐＨ７．６）を含むものであった。
【００４２】
実験手順及びデータ分析
定常状態の電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係は、テスト電位に対して−３０ｍＶの保持電位から、−１４０〜０ｍＶの３−ａパルス範囲の終点に測定されるＨＣＮ１の電流をプロットして決定した。電流は、野生型のチャネルに記録されている最大平均電流に正規化した。
【００４３】
ＨＣＮチャネル活性化に依存する電圧は、記録された最大テール電流に正規化された先行の３−ａテストパルスの関数として、−１４０ｍＶにパルスした直後に測定されたテール電流をプロットして評価した。データは、非線形最小二乗法のマルクウルト−レーベンベルグ演算手法（Marquardt-Levenberg algorithm）を用いて、ボルツマン関数に適合させた。
Ｍ∞＝１／（１＋ｅｘｐ（（Ｖｔ−Ｖ１／２）／ｋ）
上記式において、Ｖｔは、テスト電位であり；Ｖ１／２は、相関関係の中間点であり；ｋ＝ＲＴ／ｚＦは、勾配要素であり、そしてＲ、Ｔ、ｚ及びＦは、それらの通常の意味で用いられている。
【００４４】
活性化（τａｃｔ）及び非活性化（τｄｅａｃｔ）の時間定数は、簡単にするために、初期減衰のＳ字模様が幾つかの電圧でＨＣＮ１電流の開始前に観察されるが、マクロスコーピック及びテール電流を単指数関数に適合させて、推定した。ＨＣＮ１チャネルのこのような複雑なキネティックス挙動に内在するメカニズムは、未だ理解されておらず、複指数関数的な要素を用いた更なる解析は、本発明の範囲を逸脱している。
データは、平均値±Ｓ．Ｅ．として示した。統計的な有意性は、分散の一方向分析及び５％レベルでのチューキーＨＳＤホストホック（post-hoc）テストを用いて、個々のデータポイント及び適合パラメーターに対して評価した。
（実施例）
【実施例１】
【００４５】
心室心筋細胞での人工的なＩｆの発現
本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び人工的なＨＣＮ１構築物ＥＶＹ２３５−７ΔΔΔチャネルをそれぞれ過剰発現させるアデノウイルスＡｄ−ＣＧＩ及びＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔを先ず生成した。そのＳ３−Ｓ４リンカーが２３５−２３７残基の欠失により短くなっている、ＨＣＮ１−ＥＶＹ２３５−７ΔΔΔチャネルが選択されたが、それは、それらが非相同の発現系２３，２４で発現した場合、野生型のＨＣＮ１〜４のアイソフォームのどれよりも容易に開口（活性化Ｖ１／２値を約２０ｍＶ脱分極化している）するのからである。それで、本発明者らは、多様なＨＣＮアイソフォームを同時発現させる又は操作する必要もなく、心筋細胞で過剰発現するＥＶＹ２３５−７ΔΔΔチャネルだけでヘテロ多量体の未変性の結節Ｉｆを充分再現すると推測した。
【００４６】
図９は、１ｍＭのＢａ２＋（Ｂ及びＦ）で完全にブロックされるＩＫ１（Ａ及びＥ）が、対照（非又はＡｄ−ＣＧＩ形質導入された）の成熟モルモットの左心室（ＬＶ）の心筋細胞（ｎ＝３６）で大きく発現することを示す。インビボでの心臓内への注射でＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔを遺伝子導入し、７２〜９６時間後に動物より単離したＬＶ細胞に対しても、対照の細胞のそれとは違わない特性の類似のＢａ２＋感受性のＩＫ１が、同様に発現した（図９Ｃ＆Ｅ；ｐ＞０．０５）。それに反して、結節Ｉｆを連想させる時間依存性の電流成分が、１ｍＭのＢａ２＋の減算後に記録された（ｎ＝６；図９Ｄ）。このＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ誘導のＩｆ様の成分は、既知のＨＣＮブロッカーＣｓ＋又はＺＤ７２８８に感受性があり（データは示していない）、（発現の）規模が増大し、進行性の過分極でより速くなる（図９Ｆ〜Ｇ）。定常状態の活性化曲線から由来する中間点（Ｖ１／２）及び傾斜要素（ｋ）は、それぞれ−６１．９±１．６ｍＶ及び９．７±１．０である（図９Ｈ）。即ち、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ誘導したＩｆは、よりゆっくりと（約１０倍で）そしてネガティブに（Ｖ１／２、約−８２ｍＶ）活性化する心室でのＨＣＮ２の過剰発現のみにより仲介されるものとは異なって、真のペースメーカー細胞に内在するヘテロ多量体のＩｆ機能とよく似た特性を有していた。
【実施例２】
【００４７】
ＨＣＮがコードするＩｆの過剰発現により誘導される自動能
図１０（左側）に示すのは、自発的な活性が全くない平常の電気的に静止している、典型的な対照の心室細胞（図９Ａ〜Ｂのものと同じ）である。安静時の膜電位、ＲＭＰは、−７６±５ｍＶ（ｎ＝７）であった。刺激電流（約０．８ｎＡで５ｍｓ間）を注入後、平常の興奮性を示す、単一の活動電位を生成した。ＩＫ１をブロックする１ｍＭのＢａ２＋の添加が、平常のＲＭＰを不安定化し、続いて６８９±１３２ｍｓの平均サイクル長で、自発的な発火となった（図１０Ａ、右側）。このサイクル長さは、モルモットの結節細胞のそれよりも約３倍ゆっくりで、ＩＫ１遺伝子の抑制により誘導されるものと似ている（ＨＢ  Ｎｕｓｓ博士との個人的な交信）。即ち、これらの観察では、ＩＫ１性の抑制は心室の心筋細胞の潜在的なペ−スメーカー活性を開放するが、内在の結節ペーシングの平常の振動数を再生産するには不十分であることが示される。
【００４８】
次に本発明者らは、ＬＶ心筋細胞のＡＰ波形におけるＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔが介在するＩｆの過剰発現の機能的な因果関係を調査した。興味深いことに、自動能は、ＩＫ１阻害がない状態でさえＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ形質導入に限定的に観察される（ｎ＝６、図９ｃ〜ｄからと同じ代表的な細胞が図１０Ｂに示される）が、対照の心室細胞では全く観察されない。活動電位（ＡＰ）の発火頻度は、２３７±１２ｂｐｍ（２５６±１２ｍｓのサイクル長）であり、これは、モルモットの未変性の心拍数と同様であり、Ｂａ２＋又はＫｉｒ２．１−ＡＡＡ（ｐ＜０．０５）のどちらかにより導入されるよりずっと頻度が高い。注目すべきは、ＭＤＰ（−６２±２ｍＶ、ｎ＝６；ｐ＜０．０５）は、対照細胞のＲＭＰに較べて大きく脱分極し、段階的なフェイズ４の脱分極（傾斜＝０．１５±０．０２ｍＶ／ｍｓ、Ｎ−６）と関連している。このような特性は、真の結節Ｉｆに於いては典型的なものである。それでもなお、観察される急速なＡＰの上向き工程（Ｖ＝１２１±３４ｍＶ／ｍｓ、ｎ＝６）及びオーバーシュートは、心室由来の律動的な「ペースメーカー様」細胞に示されるものである。
【実施例３】
【００４９】
電子デバイスをインビボで機能的に置換させるＨＣＮによるアプローチ
本発明者らの遺伝子に基づくアプローチのインビボでの機能的な有効性及び治療的な可能性をより良くテストするために、次いで大型動物モデルに切り替えた。ヒトと生体構造及びベースラインの洞調律（７８±１４ｂｐｍ）が似ていることからブタ（swines）が選ばれた。本発明者らは、洞の機能不全を導くＳＡ結節のアブレーションによるＳＳＳのブタモデルを最初に開発した（図１１Ａ〜Ｂ）。アブレーション後の心停止又は徐脈を防ぐために、本発明者らは、ＲＡの上前外側壁の位置に電極及び右心房の先端に別な電極を備えた、デュアルチャンバー・ペースメーカーを移植した。アブレーション後の心電図（ＥＣＧ）の記録は、自発的なＨＲが３０ｂｐｍより下に低下した場合に、移植のデバイスのプログラムされた電気刺激の結果としての結合部回避リズム（図１１Ｃ）又は心室のペーシングリズム（図１１Ｄ）の存在を明らかにした。
【００５０】
ブタＳＳＳモデルを更に有効なものとするために、本発明者らは、アブレーションしたブタの心臓の律動を２週間厳密に観察した。事実、持続性のＳＡ結節の機能不全が７体で観察され；電気的なペースメーカーの記録のＨＲヒストグラムは、固有の頻度がのプログラムされた最低頻度６０ｂｐｍより圧倒的に遅く、デバイスがサポートする心房の電気刺激が、観察期間の８７±２５％で必要であったことが示された。
【００５１】
本発明者らは、次にＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ（ｎ＝３）又は生理食塩水（ｎ＝２）のどちらかをこれらのＳＳＳ動物のＬＡ付属物に注入した。遺伝子を導入して１０〜１４日後に、安定な自発的な心房のリズムの６４±９ｂｐｍ（表面ＥＣＧでのＰ波形態に注目されたい）を、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔを注入したＳＳＳ動物に於いて検知できた（図１２Ａ、左側）。増加した固有のＨＲで、デバイスによってサポートされる心房の電気的刺激の必要性は、２７±３０％まで減少した。興味深いことには、自発的な心房のリズムは、イソプロテレノール（１〜２μｇ／ｍｉｎ／ｋｇ）の投与により９２±１０ｂｐｍに増加した（図１２Ａ、右側）。一方、アトロピン（１．８ｍｇ；データは示されていない）では増加しないことから、以前の状態に復帰した平常のリズムが、迷走神経によりインプットされてでいるのではなく、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ注入部位のような、迷走神経が分布していない場所によって仲介されていることを示唆するものである。パッチクランプ実験で、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ形質が導入されたＬＡ心筋細胞に於いてＩｆの過剰発現が確認された（図１２Ｂ）。安定な自発的な心房のリズム及びＩｆのどちらも、対照のＳＳＳ動物では観察されなかった（非注入；ｎ＝２、又は生理食塩水の注入；ｎ＝２）。
【００５２】
正確なペーシング源を確認するために、本発明者らは、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ形質導入のＳＳＳ動物の心房の活性化パターンを、非蛍光透視のエレクトロ・アナトミカルマッピング手法を用いて調査した。対照として、アブレーションを施していないが、電気的ペースメーカーを設置したＳＳＳ動物（しかし、生理食塩水を注入している）に対して、心臓内の電気的な活性化が、未変性のＳＡ結節又は移植された電極（期待どおりに）のどちらか一方から開始される（データは示されていない）。それに対して、Ａｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔを注入したブタに於ける活性化は、ＲＡ活性化も存続（青紫色）しているが、ＬＡ付属物（赤色）の注入部位から開始される（図１２Ｃ）。平均の心房の心臓内活性化時間は、１０１±２１ｍｓである。興味深いことに、デバイスにより推進されるのＲＡペーシングが、後者の効果を無効するように、自発立性のＡｄ−ＣＧＩ−ＨＣＮ１−ΔΔΔ形質が導入されたＬＡリズムより１０〜１５ｂｐｍ速いままで、マッピングが実施された場合、この「逆の」活性化パターンが対照のパターンに戻った（図１２Ｄ）、つまり、最初期の電気的な活性化が上前外側ＲＡで一度再開され、次に１１０±３２ｍｓの活性化時間でＬＡに伝播されたのである。
【実施例４】
【００５３】
チャネル機能に絶対的に必要とされるＭｅｔ−２３２
ＨＣＮ１のＳ３−Ｓ４リンカーの長さの構造的及び機能的役割を分析するため、本発明者らは、先ず、リンカーから、異なった範囲のものを系統的に欠失させた（図２＆３）。ＫＶチャネルに対する完全に対比させ、Ｓ４−Ｓ４リンカーの完全な欠失（Δ２２９−２３７）では、−１４０ｍＶに過剰分極した後でさえ機能的な電流の発現は誘導されなかった。Δ２２９−２３７と同様に、Δ２２９−２３４、Δ２３２−２３４及びΔ２３２−２３７欠失も、平常の電流活性を完全に消失させた。このチャネル機能の喪失が、折り畳み、トラフィッキング（trafficking）又はゲーティング欠陥によるリンカー欠失によるものか調査するために、本発明者らは、野生型のＣ末端及びΔ２３２−２３４ＨＣＮ１チャネルのそれぞれに結合する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む融合構築物ＨＣＮ１−ＧＦＰ及びＨＣＮ１Δ２３２−２３４−ＧＦＰを生成した。図３Ａは、ＨＣＮ１−ＧＦＰ及びＨＣＮ１Δ２３２−２３４−ＧＦＰチャネルの両方のＧＦＰ蛍光シグナルが膜表面に局在しているこを示し、リンカーの欠失が折り畳み及びトラフィッキングよりもむしろゲーティングを妨害するらしいことを示唆した。興味深いことに、上記の欠失構築物と対比して、Δ２２９−２３１、Δ２３３−２３７、Δ２３４−２３７、Δ２３５−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７及びΔ２２９−２３１／Δ２３５−２３７の全ては、大きな過分極の活性化の内向き電流を生じた。それらのＳ３−Ｓ４配列を調べると、Ｍ２３２がこれらの構築物に共通にあることを示し（図１Ｂを参照されたい）、このリンカー残基がチャネル機能の必須条件であることを示唆している。この考えに完全に従えば、Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７は、機能的なチャネルを生成し、リンカーの欠失による機能喪失が、Ｍ２３２の単一アミノ酸だけを保持することによって回復されたことを示す。
【実施例５】
【００５４】
ＨＣＮ１活性化におけるＳ３−Ｓ４リンカー長の短縮効果
定常状態の電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係（図３）で示されるように、本発明のＳ３−Ｓ４欠失構築物の異なった活性化閾値は機能性を有していたが、それらの活性化特性が異なっていることを暗示している。リンカー短縮による機能性への影響を詳細に調べるために、本発明者らは続いて、定常状態の活性化特性を検査した（図４）。Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７（つまり、Ｍ２３２のみが保持されている）は、（リンカーの完全な欠失がチャネル機能の全く消失させたのに対して）過分極方向に定常状態の活性化を、大きく約３０ｍＶシフトさせた。興味深いことに、Ｍ２３２のリンカーのＣ末端の段階的な延長は、連続的に脱分極化にシフトされていった（つまり、Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７＜Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７＜Δ２２９−２３１／Δ２３５−２３７＜Δ２２９−２３１；ｐ＜０．０５）。Δ２２９−２３１バックグラウンドでの長さ依存性の連続的なシフトも、リンカー上に存在する残基の数に正の相関があるように思われた（図８の■印；ｒ＝０．９９）。同様に、２２９−２３１を含むのセグメントにＮ末端からＭ２３２まで（つまり、Δ２３３−２３７）を回復することは、脱分極化を生成させることにより、引き続き同じような傾向が起こった。Δ２３４−２３７とΔ２３５−２３７の定常状態の活性化曲線も、野生型（２３１−２３７残基を完全な列を含む）に対して相対的に正にシフトするが、脱分極効果は飽和するように表れ、そしてリンカーが更に延長されると、下降し始める（下記、図８も参照されたい）。本発明者らによる欠失構築物の定常状態のゲーティング・パラメーターは、表１に纏めた。総合すれば、これらの結果は、Ｓ３−Ｓ４リンカーの組成に加えてリンカーの長さの両方が、ＨＣＮ１ゲーティングに決定的な影響を及ぼすことを示唆する。
【００５５】
【表１】
2008508362.tif 000003
【実施例６】
【００５６】
逆の過分極活性化のシフトを生成するＳ３−Ｓ４リンカーの大規模な延長
上記リンカーを欠失させる実験を補足すべく、本発明者らは、ＨＣＮ１活性化のゲーティングにおけるＳ３−Ｓ４リンカーを延長した場合の効果も検討した。先ず、Ｄ２３３側にグルタミンを挿入して、挿入構築物ＩｎｓＱ２３３Ｑ、ＩｎｓＱＱ２３３ＱＱ及びＩｎｓＱＱＱ２３３ＱＱＱを生成した。重大な意味を持つＧＭＥ２３１−２３５クラスタの反対側に面していること、そしてその置換が機能に影響しない（４５）ことから、Ｄ２３３を選んだ。更に、例えば、ＩｎｓＱＱＱ２３３ＱＱＱは、全体のリンカー荷電を変化させずに、元のグルタミン酸塩を２３５位にてグルタミンで置き換えることが期待される。Ｉｎｓ２３７ＱＱＱの効果もまたテストした。図５は、リンカーの延長と共に、ＨＣＮ１活性化が、過分極方向に連続的にシフトした（ｐ＜０．０５）。
【００５７】
過分極がリンカーの延長によるのか又はグルタミンの単なる挿入によるのか更にテストするために、本発明者らは、Ｄｕｐ２２９−２３２及びＤｕｐ２２９−２３７をそれぞれ生成するための完全なリンカーと同様に、残基２２９−２３２を含むリンカーセグメントを複製した。図６に示すように、両複製構築物の定常状態の活性化曲線もまた、負の方向にシフトした。事実、シフトの程度は、リンカーの長さに良く相関している（脱分極効果の飽和後）（図８の○印；ｒ＝０．９８）。
【００５８】
理解を深めるために例示的な方法及び実例に基づいて本発明を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲及び精神を逸脱することなく、様々な改変及び変更を実施できることは本発明の教示により、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、推定の膜貫通型のＨＣＮ１を位相幾何学的に示す。図１Ａは、単量のＨＣＮ１サブユニットの６個の推定の膜貫通型のセグメント（Ｓ１〜Ｓ６）であり、Ｓ３−Ｓ４リンカーは太くなっている。図１Ｂは、野生型のＨＣＮ１及び本発明の研究に於いて検討されたその他のチャネル構築物のＳ３−Ｓ４リンカー配列を示す。構築物の機能部性及び非機能性の部分は、それぞれ緑色及び紫色で標識し、Ｍ２３２部は赤色で強調した。
【図２】図２は、ＨＣＮ１電流における短縮されたＳ３−Ｓ４リンカーの効果を示す。野生型及び欠失部分が異なるＨＣＮ１構築物を発現する細胞の代表的な全細胞電流をトレースして記録した。Δ２２９−２３１、Δ２３３−２３７、Δ２３４−２３７、Δ２３５−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７及びΔ２２９−２３１／Δ２３５−２３７は、大きく過分極に活性化された時間依存性の電流値を示す。一方、Δ２２９−２３４、Δ２２９−２３７、Δ２３２−２３４及びΔ２３２−２３７を注入された卵母細胞は、測定可能な電流値を生成しなかった。
【図３】図３は、Ｓ３−Ｓ４を欠失させたの構築物の定常状態のＩ−Ｖの相関関係を示す。定常状態の電流−電圧（Ｉ−Ｖ）の相関関係は、ＨＣＮ１電流を３秒のパルスの終点で測定してプロットした。差し込み図は、電流を顕在化させるために用いられた電気生理学的な手順である。データは、平均値±ＳＥＭで示す。
【図４】図４は、ＨＣＮ１の定常状態の活性化に於けるＳ３−Ｓ４リンカー欠失の効果を示す。図４Ａは、野生型、Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３５−２３７及びΔ２２９−２３１の代表的なテール電流（ａ：−１２０ｍＶ、ｂ：−１００ｍＶ；ｃ：−８０ｍＶ）を記録された最大電流値に正規化して示した。図４Ｂは、野生型、Δ２２９−２３１／Δ２３３−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３４−２３７、Δ２２９−２３１／Δ２３５−２３７及びΔ２２９−２３１の定常状態の活性化曲線を示す。これらの構築物から観察されるようにＳ３−Ｓ４リンカーの長さを増大させることにより、連続的な脱分極への活性化が導かれる（図８も参照されたい）。
【図５】図５は、ＨＣＮ１定常状態の活性化において、Ｓ３−Ｓ４リンカーをグルタミンで延長した効果を示す。図５Ａは、野生型、ＩｎｓＱ２３３Ｑ、ＩｎｓＱＱ２３３ＱＱ、ＩｎｓＱＱＱ２３３ＱＱＱ及び２３７ＩｎｓＱＱＱチャネルからの全細胞電流及びそれらに対応するテール電流（ａ：−１２０ｍＶ、ｂ：−１００ｍＶ；ｃ：−８０ｍＶ）の代表的なトレースの記録である。図５Ｂは、図５Ａに示したのと同じチャネルの定常状態の活性化曲線である。Ｓ３−Ｓ４リンカーの大規模な延長は、活性化を負の方向にシフトさせた（本文と図８を参照されたい）。
【図６】図６は、Ｓ３−Ｓ４リンカーを延長させること（つまり、Ｄｕｐ２２９−２３２＆Ｄｕｐ２２９−２３７）が、ＨＣＮ活性化に及ぼす効果を示す。図６Ａは、野生型、Ｄｕｐ２２９−２３２及びＤｕｐ２２９−２３７チャネルの、全細胞電流及びそれらに対応するテール電流（ａ：−１２０ｍＶ、ｂ：−１００ｍＶ；ｃ：−８０ｍＶ）を記録された最大電流に正規化して示した。図６Ｂは、定常状態の活性化曲線を示す。グルタミン挿入の構築物と同じように、重複構築物の定常状態の活性化曲線もまた、負の方向にシフトした。Ｄｕｐ２２９−２３７の活性化曲線は、Ｄｕｐ２２９−２３２と較べて、より過分極された。
【図７】図７は、活性化（τａｃｔ）（図７Ａ）及び非活性化（τｄｅａｃｔ）（図７Ｂ）キネティックスにおける、Ｓ３−Ｓ４リンカーの延長（上の図）及び短縮（下の図）の効果を示す。活性化及び非活性化を誘導するのに用いた電気生理学的手順を示す。
【図８】図８は、Ｓ３−Ｓ４リンカーの長さのＨＣＮ１の定常状態の活性化に於ける効果をグラフに示す。チャネルのＶ１／２とリンカーの長さには、強い相関関係が観られた。
【図９】図９Ａ〜Ｈは、心筋細胞におけるＨＣＮ２過剰発現の効果を示す。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、ＩＫ１抑制の効果を示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、改変ＨＣＮ１がインビボで電子デバイスとして機能的に代用できることを部分的に示すものである。
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、改変ＨＣＮ１がインビボで電子デバイスとして機能的に代用できること部分的に示すものである。
【００６０】
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【図１】
2008508362.tif 000004
【図２】
2008508362.tif 000005
【図３】
2008508362.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008508362.tif 000012
【図１０】
2008508362.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
2008508362.tif 000016
2008508362.tif 000017