(57)【要約】  本発明は、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることによって、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトする方法に関する。ここで該トランスフェクション複合体は、輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡとを含む。前記輸送性ポリマーは、例えば、Ｈ３Ｋ８ｂおよび／または構造上類似した化合物を含み得る。また、本発明は、そのようなトランスフェクション複合体と、そのようなトランスフェクション複合体を含む組成物に関する。さらに本発明は、本発明のトランスフェクション複合体を用いて患者を治療する方法に関する。
2008520209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトする方法であって、
トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることを包含し、
ここで、前記トランスフェクション複合体は、輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡとを含み、
前記輸送性ポリマーはヒスチジンおよびリジンを含む、方法。
【請求項２】
前記輸送性ポリマーは、６個から１０個のターミナルブランチを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記輸送性ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−の配列またはそのサブセグメントを有する少なくとも１つのターミナルブランチを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記輸送性ポリマーは、少なくとも１つの安定剤を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記安定剤はＰＥＧを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記輸送性ポリマーは標的リガンドを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーは、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂおよび（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）からなる群から選ばれる１つまたは複数のポリマーを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーはＨ３Ｋ８ｂを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーは（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーは（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の細胞は、トランスフォームされたもの、遺伝子組み換えされたもの、悪性のものおよびプライマリー細胞株からなる群から選ばれる１つまたは複数の細胞を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の細胞は、ＳＶＲ−ｂａｇ４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃ６およびＨＵＶＥＣの各細胞株からなる群から選ばれる１つまたは複数の細胞を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡはＲａｆ−１配列を標的にしている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトする方法であって、
ｓｉＲＮＡを、ヒスチジンとリジンを含む輸送性ポリマーと混合して、トランスフェクション複合体を形成することと、
前記トランスフェクション複合体を約１５分から約１時間半の間ほぼ室温に置いておくことと、
前記トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることと、
を包含する、方法。
【請求項１６】
トランスフェクション複合体を作製する方法であって、
ｓｉＲＮＡを、ヒスチジンとリジンを含む輸送性ポリマーと混合することを包含し、
ここで、前記輸送性ポリマーは、６個から１０個のターミナルブランチを含む、方法。
【請求項１７】
前記輸送性ポリマーの前記ｓｉＲＮＡに対する比は、約０．５：１（ｗｔ／ｗｔ）から約２４：１（ｗｔ／ｗｔ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−の配列またはそのサブセグメントを有する少なくとも１つのターミナルブランチを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーは、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂおよび（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）からなる群から選ばれる１つまたは複数のポリマーを包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｉＲＮＡと、ヒスチジンおよびリジンを含む輸送性ポリマーとを含むトランスフェクション複合体であって、
前記輸送性ポリマーは、約６個から約１０個のターミナルブランチを含む、トランスフェクション複合体。
【請求項２１】
前記ポリマーは、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂおよび（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）からなる群から選ばれる１つまたは複数のポリマーを包含する、請求項２０に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項２２】
前記ｓｉＲＮＡはＲａｆ−１配列を標的にしている、請求項２０に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項２３】
前記輸送性ポリマーの前記ｓｉＲＮＡに対する比は、約０．５：１（ｗｔ／ｗｔ）から約２４：１（ｗｔ／ｗｔ）である、請求項２０に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項２４】
請求項２０のトランスフェクション複合体を含む組成物。
【請求項２５】
１つまたは複数の疾患を有する患者を治療する方法であって、
治療有効量のトランスフェクション複合体を患者に投与することを包含し、
ここで、前記トランスフェクション複合体は、ｓｉＲＮＡと輸送性ポリマーとを含み、
前記輸送性ポリマーはヒスチジンとリジンを含み、約６個から約１０個のターミナルブランチを有する、方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の疾患は、１つまたは複数の遺伝的疾患または非腫瘍性疾患を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の疾患は、ＡＤＡ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損型の慢性肉芽腫症、ＨｂＳ症（鎌状赤血球症）、β−サラセミア（地中海性貧血）、ファンコニ貧血、家族性高コレステロール血症、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、アポリポプロテインＥ欠損症、Ａ型およびＢ型血友病、筋ジストロフィ症、嚢胞性線維症、パーキンソン病、網膜色素変性、リソソーム蓄積症、糖尿病性網膜症、ヒト免疫不全ウイルス病ウイルス感染、後天性貧血、心疾患および末梢血管疾患、関節炎からなる群から選ばれる１つまたは複数の疾患を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つまたは複数の疾患は癌を包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
１つまたは複数の疾患を有する患者を治療する方法であって、
請求項１に記載の方法によってｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を患者に投与することを包含する、方法。
【請求項３０】
１つまたは複数の疾患を有する患者を治療する方法であって、
患者から細胞を取り出すことと、
前記細胞をトランスフェクション複合体と接触させることによって前記細胞にｓｉＲＮＡを送達することと、
前記ｓｉＲＮＡを含む前記細胞を前記被験者に投与することと、
を包含し、
ここで、前記トランスフェクション複合体は、ｓｉＲＮＡと輸送性ポリマーとを含み、
前記輸送性ポリマーは、ヒスチジンとリジンを含み、約６個から約１０個のターミナルブランチを有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【特許に係る政府の権利の陳述】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所から研究資金を受けて、米国政府とともに開発された（付与番号第ＣＡ０９６９８４号）。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【関連出願の相互参照】
【０００２】
本発明は、 ２００４年１１月１７日付出願の米国特許仮出願第６０／６２８，３４１号の利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることによって、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトする方法に関する。本発明はまた、トランスフェクション複合体およびその組成物に関する。本発明はさらに、本発明のトランスフェクション複合体および組成物を用いて、患者を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
短鎖干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）の使用は、遺伝子、それゆえに遺伝子産物を抑制するための強力な新技術である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、アンチセンスＲＮＡ単独よりも１０倍効率よく遺伝子を抑制すると報告されてきた（Rocheleau CEらによる"Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos"、Cell、１９９７年、９０：７０７〜７１６）。ｓｉＲＮＡは、シグナル伝達経路におけるタンパク質の役割を研究するために用いられ、これらの分子はまた、原因タンパク質が過剰発現する様々な疾患を治療するのに有用であることが示されてきた（Arenz C, Schepers U.による"RNA interference: from an ancient mechanism to a state of the art therapeutic application?"、Naturwissenschaften、２００３年、９０：３４５〜３５９、Coburn GA, Cullen BRによる"siRNAs: a new wave of RNA-based therapeutics"、J Antimicrob Chemother、２００３年、５１：７５３〜７５６）。より長い二本鎖ＲＮＡによって誘発される非特異的な遺伝子抑制を避けるために、短鎖干渉ＲＮＡ、すなわち２１〜２３のヌクレオチドの二本鎖が、標的ｍＲＮＡを分解するための伝達物質として用いられてきた（Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CCによる"Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans"、Nature、１９９８年、３９１：８０６〜８１１）。細胞内に入ると、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、すなわち、ＲＮＡ二本鎖の巻き戻しおよび鎖分離を招く、タンパク質とＲＮＡの複合体に取り込まれる。その後、アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡをアニールし、切断するために、活性化ＲＩＳＣをガイドする（Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJによる"An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells"、 Nature、２０００年、４０４：２９３〜２９６、Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova Aによる"Rational siRNA design for RNA interference"、Nat Biotechnol、２００４年、２２：３２６〜３３０、Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, Hannon GJによる"Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi" 」、Science、２００１年、２９３：１１４６〜１１５０、Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJによる"Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference"、Nature、２００１年、４０９：３６３〜３６６）。
【０００５】
ウイルスキャリアおよび非ウイルスキャリアの両方が、ｓｉＲＮＡをそれらの細胞質のｍＲＮＡ標的へと運ぶために用いられてきた（Simeoni F, Morris MC, Heitz F, Divita Gによる"Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells"」、Nucleic Acids Res、２００３年、３１：２７１７〜２７２４）。しかし、今日まで、真核細胞に効率よくｓｉＲＮＡを送達（すなわちトランスフェクション）するのに効果的であると証明されてきたペプチドキャリアはほとんど開発されてきていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡの治療有効量を標的細胞に送達するのに十分なトランスフェクション効率を有する薬剤送達システムが必要である。特に、当該技術分野では、ｓｉＲＮＡを細胞の内側に送達することが可能な、改善された送達システムが必要である。当該技術分野では、送達システムが生体外および生体内の両方で効果的となるよう血清内で安定したキャリアもまた必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトする方法に関する。詳細には、該方法は、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることを含み、ここで該トランスフェクション複合体は、輸送性ポリマー（transport polymer）とｓｉＲＮＡとを含んでいる。輸送性ポリマーは、ヒスチジンとリジンを含んでいる。輸送性ポリマーとして、これらに限定されないが、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、および、８個のターミナルブランチ（terminal branch）とヒスチジンに富む（ヒスチジン−リッチ）ドメインを有する構造上似たアナログ、特に、Ｈ３Ｋ８ｂとほぼ同じ大きさか幾分小さいポリマーが挙げられる。ある実施形態によると、上記細胞は、トランスフォームされたもの、遺伝子組み換えされたもの（リコンビナント）、悪性のもの（癌化したもの）またはプライマリー細胞株（セルライン）から選択されてもよい。
【０００８】
本発明の方法はまた、トランスフェクション複合体を形成することを包含してもよい。さらに、本方法は、トランスフェクション複合体を細胞と接触させる前に、約１５分から約１時間半の間、ほぼ室温にトランスフェクション複合体を置いておくことをさらに含み得る。
【０００９】
さらに、本発明は、ｓｉＲＮＡと、Ｈ３Ｋ８ｂまたはその構造上のアナログを含む輸送性ポリマーとを含むトランスフェクション複合体に関する。さらに、本発明は、このようなトランスフェクション複合体を含む組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明は、添付の図面で示された本発明の実施形態を参照して、より容易に理解されるであろう。 
【００１１】
図１．ＨＫポリマーの概略的な構造。図１は、Ｈ３Ｋ８ｂなど、本発明に係る幾つかのＨＫポリマーを包含する、本明細書で論ずるＨＫポリマーの概略的な構造を描いている。図中、実線でつながれた３つの黒塗り丸は、各ポリマーの３−リジンコアを表している。点線は、ポリマー内を重要なドメインまたはグループ（基）に分けている。高度に枝分かれしたポリマーであるＨ３Ｋ８ｂでは、上記リジンコアから外側に向かって、（１）４つのヒスチジンに富む（ヒスチジンリッチ）ドメイン（Ｈ８：ＨＨＨＨＮＨＨＨＨ）、（２）（Ｋで表される）４つのリジン、および（３）Ｒで示される８つのターミナル（末端）ＨＫブランチの順序である。ブランチが少ないポリマー（Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨＫ４ｂ）では、上記３−リジンコアから出るターミナルＨＫブランチは４つである。本願を通して、「Ｈ３Ｋ８ｂ」という用語は、インテグリンリガンド、すなわちＲＧＤのない、図１で描かれた構造を意味している。同様に、「Ｈ３Ｋ８ｂ（−ＲＧＤ）」という用語は、ＲＧＤのない構造を意味している。
【００１２】
図２．Ｈ３Ｋ８ｂはｓｉＲＮＡの有効なキャリアである。図２は、β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡのいくつかの可能なキャリア（リポフェクタミン、ＤＯＴＡＰ、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨＫ４ｂ）の効率を、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内でβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の発現を抑制する能力について描いた棒グラフである。Ｈ３Ｋ８ｂは、発現を８０％減らすのに最も有効なキャリアであった。４つのターミナルブランチしか有していないポリマー（すなわち、ＨＫ４ｂ、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ４ｂ）のうち、ポリマーＨ３Ｋ４ｂがｓｉＲＮＡの最も有効なキャリアであった。データは、３つの実験の平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を表している。Ｐ＜０．００１、コントロール対Ｈ３Ｋ８ｂまたはＨ３Ｋ４ｂ；**、Ｐ＜０．０５、コントロール対リポフェクタミン、Ｈ２Ｋ４ｂまたはＨＫ４ｂ（コントロールグループに対しての多重比較コントロール（ボンフェローニｔ検定））。
【００１３】
図３．β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡを有した複合体におけるＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、β−ガラクトシダーゼの発現を著しく抑制する。ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞が、β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（４：１、μｇ：μｇ比）で４８時間トランスフェクトされ、その後、β−ガラクトシダーゼ活性が、β−ガラクトシダーゼ着色キットを用いて測定された。β−ガラクトシダーゼ着色によって、β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）がＳＶＲ−ｂａｇ４細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を著しく抑制することが確認された。図３Ａは、トランスフェクション複合体の一部としてＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を用いてトランスフェクトされたＳＶＲ−ｂａｇ４細胞を描いている。図３Ｂは、未処理のコントロール細胞を描いている。
【００１４】
図４．最適なＨ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ比。図４は、ポリマー：ｓｉＲＮＡ（ｗｔ／ｗｔ）の種々の比率を用いた、β−ガラクトシダーゼ抑制を描いた棒グラフである。Ｈ３Ｋ８ｂに対する最適なポリマー：ｓｉＲＮＡ（μｇ：μｇ）比を決定するために、種々の比のポリマーとβ−ガラクトシダーゼを標的とするｓｉＲＮＡとでＳＶＲ−ｂａｇ４細胞をトランスフェクトした。４８時間後、β−ガラクトシダーゼ活性が、実施例の欄で記載しているように、定量化された。ポリマー：ｓｉＲＮＡの比が約３：１と約６：１の間にある場合、他の比の場合よりもβ−ガラクトシダーゼの発現を抑制した。データは、３つの実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表している。
【００１５】
図５．ルシフェラーゼ標的ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、ルシフェラーゼ活性を著しく抑制する。図５は、種々のキャリアが用いられる場合のルシフェラーゼの抑制を描いた棒グラフである。他のｓｉＲＮＡのキャリアとしてのＨ３Ｋ８ｂの能力を検査するために、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔと複合したルシフェラーゼ発現プラスミド（２：１のキャリア／核酸比）で、ルシフェラーゼ標的ｓｉＲＮＡとともに、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（４：１）、Ｈ３Ｋ４ｂ（４：１）、またはＤＯＴＡＰ（４：１）によって、２４時間、悪性のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株を同時トランスフェクト（コ−トランスフェクト）した。ルシフェラーゼ活性が、Ｔｕｒｎｅｒ  ２０／２０のルミノメータを用いて測定された。β−ガラクトシダーゼ ｓｉＲＮＡが、コントロールｓｉＲＮＡとして用いられ、Ｈ３Ｋ８ｂによって、４：１の比でトランスフェクトした。データは、３つの実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表している。*、Ｐ＜０．００１、コントロール対Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、Ｈ３Ｋ４ｂまたはＤＯＴＡＰ；**、Ｐ＜０．０１、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）対Ｈ３Ｋ４ｂまたはＤＯＴＡＰ（ボンフェローニｔ検定の多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００１６】
図６．Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）とＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの取り込み効率が増した他のキャリアとの比較。図６は、ＳＶＲ−ｂａｇ４（ＳＶウイルスによってトランスフォームされ、β−ガラクトシダーゼを発現するマウスの内皮細胞株）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（悪性の胸部（乳）癌細胞株）およびＣ６細胞株におけるトランスフェクション効率を描いている。ＤＯＴＡＰ（４：１）、リポフェクタミン（４：１）またはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（４：１）と複合したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡで上記細胞がトランスフェクトされた。４時間後、１００ｘの蛍光顕微鏡を用いて画像が得られた。図６は、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡのキャリアとしてＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を用いてトランスフェクトされた細胞で、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡの取り込みが増大することを示している。
【００１７】
図７．Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体によって誘導されたアポトーシスおよびネクロシス。以下の実施例で詳述するように、β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂでＳＶＲ−ｂａｇ４細胞をトランスフェクトした。処理グループは、未処理（Ａ）とＨ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体（４：１比、ｗｔ／ｗｔ）（Ｂ）である。その後、細胞は、ＹＯ−ＰＲＯ−１とＰＩ蛍光色素で処理され、４８８ｎｍ励起を用いたフローサイトメトリーによって分析された。Ｖは生存細胞、Ａはアポトーシスを起こした細胞、Ｎはネクロシスを起こした（壊死）細胞である。
【００１８】
図８．種々のキャリア：ｓｉＲＮＡ複合体によって誘発された毒性。実施例で詳述する、β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡと複合した種々のキャリアでＳＶＲ−ｂａｇ４細胞をトランスフェクトした。その後、細胞はＹＯ−ＰＲＯ−１およびＰＩ蛍光色素で処理され、４８８ｎｍ励起を用いたフローサイトメトリーによって分析された。毒性（即ち死細胞）が、生存細胞群から除去された細胞の百分率で求められた。データは３つの実験の平均値およびＳ．Ｄ．を表している。*、Ｐ＜０．０５、Ｈ３Ｋｂ（＋ＲＧＤ）対ＤＯＴＡＰ、**、Ｐ＜０．００１、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）対リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００またはオリゴフェクタミン（ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。トランスフェクションキャリア：ｓｉＲＮＡ複合体の比は４：１（ｗｔ：ｗｔ）であった。ただし、リポフェクタミン２０００およびオリゴフェクタミンに関する複合体では、その比は２：１であった。
【００１９】
図９．Ｈ３Ｋ８ｂの重要なドメイン。Ｈ３Ｋ８ｂの重要なドメインを決定するために、３つのドメインのうちの１つまたはそれ以上のドメインが改変されたいくつかのポリマーが合成された。すなわち、（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂは、各ターミナルブランチに単一のリジンを加える。（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂは、各ターミナルブランチから４つのアミノ酸を取り除く。Ｈ３Ｋ（Ｇ）８ｂは、ヒスチジンリッチドメインをグリシンと置換する。Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）はインテグリンリガンド、すなわちＲＧＤを有している。図９は、これらのポリマーの構造を描いている。
【００２０】
図１０．図１０は、ターミナルブランチに単一のリジンを加えること（（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ））、またはヒスチジンに富むドメイン（Ｈ８）をグリシンと置換すること（Ｈ３Ｋ（Ｇ）８ｂ（＋ＲＧＤ））によって、ｓｉＲＮＡのキャリアとしてのこれらポリマーの能力が著しく低減することを示した棒グラフである。データは、３つの実験の平均値±Ｓ．Ｄ．を表している。*、Ｐ＜０．００１、未処理対オリゴフェクタミン、Ｈ３Ｋ８ｂ、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）および（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）；**、Ｐ＜０．０１、オリゴフェクタミン対Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）または（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（ボンフェローニの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。ＨＫポリマーとｓｉＲＮＡと複合したオリゴフェクタミンとの比は、それぞれ、４：１および２：１（ｗ／ｗ）であった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の態様、利点および他の特徴は、本発明の様々な非限定の実施形態を開示している以下の詳細な記述の観点から明らかとなろう。本発明の実施形態を記載するに際して、明確にすべく、特定の用語が用いられている。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定するよう意図されていない。特定の構成要素はそれぞれ、同様の目的を達成するために同様の方法で作用する全ての技術的な均等物を含んでいると理解されるべきである。さらに、本明細書中における引用は全て、その全内容を、参照により援用する。
【００２２】
本発明は、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトすることに関する。特に、本明細書で開示されているのは、予想されないほどの有利な輸送性ポリマーを含んだ、新規なｓｉＲＮＡ輸送性複合体である。本発明の方法は、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞に接触させることを包含し、ここで該トランスフェクション複合体は、輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡとを含んでいる。この輸送性ポリマーは、ヒスチジンとリジンを含むキャリア（ＨＫキャリア）である。
【００２３】
本明細書で用いられているように、"ａ"または"ａｎ"は１つまたはそれ以上を意味し得る。本明細書で用いられているように、"ａｎｏｔｈｅｒ"は、少なくとも２つ目またはそれ以上を意味し得る。
【００２４】
「アミノ酸」という用語は、２０種類の一般アミノ酸とともにノンスタンダードなアミノ酸を包括している。例えば、Ｄ−アミノ酸や、「一般」アミノ酸から化学的に（または生物学的に）作製された誘導体（例えばβ−アミノ酸が包含される）である。
【００２５】
２つの化合物間が電子対の共有（covalent）または非共有（non-covalent）で相互作用した結果、該２つの化合物が複合体を形成した場合、１つの化合物は第２の化合物と「関連する（associated with）」ことになる。
【００２６】
「コポリマー」という用語は、鎖に沿ったユニットの配置（ランダム、交互(alternating)、ブロック、グラフト）に関係なく、またその分子構造（直線状またはブランチ状）に関係なく、２種類以上のユニットを含んだポリマーを意味している。「ヒスチジンコポリマー」という用語は、コポリマーがそのユニットの種類のうちの１つとしてヒスチジンを含んでいることを意味している。「輸送性ポリマー」という用語は、本発明のヒスチジンコポリマーを含むポリマーを意味している。
【００２７】
「ブランチ」という用語は、少なくとも一端でブランチ（分岐）モノマーの側基に共有結合で結合された任意のモノマーおよびそれから成る線状ポリマー（コポリマーを含む）を包括している。それ自体が１つまたは複数のブランチモノマーを含んでいるブランチは、「非（ノン）ターミナルブランチ」と呼ばれる。ブランチモノマーを含まないブランチは「ターミナルブランチ」と呼ばれる。「ターミナルブランチ」は、例えば、該ブランチのＮ末端アミノ酸へと分岐するヒスチジンまたはリジンから成る分岐に係る最終的な部分を包含し得る。ターミナルブランチは、ヒスチジンでもリジンでもないアミノ酸（例えばシステインまたは他の連結作用因子）を含み得る。それらは、安定剤（ＰＥＧまたはＨＰＭＡのようなもの）および／または標的リガンドをコンジュゲートするのに役立つ。
【００２８】
「ブランチ（分岐）ポリマー」という用語は、少なくとも１つの主鎖と少なくとも１つのターミナルブランチとを含む任意のポリマーを包括している。ブランチポリマーは、１つまたは複数の非（ノン）ターミナルブランチをさらに含んでもよい。
【００２９】
「ＨＫペプチド」、「ＨＫポリマー」および「ＨＫキャリア」という用語は、ヒスチジンおよびリジンを含んだ輸送性ポリマーを意味するよう意図され、本発明のポリマーを包含する。
【００３０】
「生体内（インビボ）」という用語には、静脈内であろうと局所的であろうと、注入をベースとした療法（例えば、腫瘍内、筋肉内、皮下、気管内、静脈内または眼球内における器官または気道への直接的な注射、器官の血管への注射、または気道へのエアロゾル化）が包含される。「生体内（インビボ）」という用語はまた、腫瘍、組織または器官の電気穿孔法（エレクトロポレーション）に基づいた療法を包含する。
【００３１】
「脂質」という用語は、当該技術分野で用いられているように用いられ、疎水性および親水性部分を有する任意の化学種を含んでいる。親水性の特性は、典型的には、ホスファト基、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルフィドリル基、ニトロ基および他の同様の基の存在に由来している。疎水性は、コレステロールおよびその誘導体、並びに、これらに限定されないが、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基およびそのような基で１つまたは複数の芳香族基、脂環式基または複素環式基と置換された基を含むことによって与えられ得る。
【００３２】
「非カチオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで非荷電型、中性の双性イオン型またはアニオン型のいずれかで存在する多数の脂質種のうちのいずれかを意味する。このような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、ＤＯＰＥおよびコレステロールが包含される。
【００３３】
「カチオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨで正味正電荷を運ぶ多数の脂質種のうちのいずれかを意味する。このような脂質には、これらに限定されないが、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＳＰＥＲ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥが包含される。さらに、本発明で用いられ得る多数のカチオン性脂質の市販調製物が入手可能である。これらには、例えば、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）」（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されているＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを含んだカチオン性リポソーム）、「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）」（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されているＤＯＳＰＡとＤＯＰＥとを含んだカチオン性リポソーム）および「ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）」（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から市販されているＤＯＧＳを含むカチオン性リポソーム）が含まれる。
【００３４】
「ペプチド」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、直線状および枝分かれ状（分岐）アミノ酸鎖のほかに環状アミノ酸鎖を包括している。「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では交換可能に用いられている。
【００３５】
「薬剤（pharmaceutical agent）」には、疾患の発症の重症度を防ぎ、遅らせ、もしくは低減するのに、または進行中の疾患の重症度を低減するのに、または正常な生理機能を高めるのに有用な任意の治療薬や、マーカー遺伝子（ＧＦＰ、ルシフェラーゼ）といった診断薬が包含される。「薬剤」は、１つまたは複数の治療薬、１つまたは複数の診断薬または１つまたは複数の治療薬と１つまたは複数の診断薬との組み合わせから成ってもよい。
【００３６】
本明細書で用いられているように、本発明にかかる薬剤送達組成物（pharmaceutical agent delivery composition）の「製薬上受容可能な」成分（例えば、塩、キャリア、賦形剤または希釈剤）は、（１）薬剤を送達する組成物の能力をなくさずに送達組成物に含有可能であるという点で、送達組成物の他の成分と比較可能であり、（２）送達組成物が治療用途を意図している場合には、過度の有害な副作用（毒性、刺激およびアレルギー反応など）なく、動物（例えばヒト）での使用に適した成分である。副作用のリスクが薬剤によって与えられる利益より勝る場合、副作用は「過度」である。
【００３７】
本明細書で用いられているように、「生理的ｐＨ」という用語は、約７．２と約７．５の間のｐＨと規定されている。
【００３８】
本明細書で用いられているように、「リコンビナント（組み換え）」という用語は、遺伝子組み換えＤＮＡを有する細胞を意味している。該遺伝子組み換えＤＮＡは、生体外で調製され、宿主生物からの、または、宿主生物と比較するとより頻繁には種々の異なる種、属、族、目、クラスからのＤＮＡを含んでいる。
【００３９】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、当該技術分野で用いられているように用いられ、ｍＲＮＡを標的にするＲＮＡの二本鎖（各ストランドにおいて３０塩基以下）を含んでいる。ｓｉＲＮＡは、化学的または酵素学的に合成されてもよい。本発明に基づいたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）に取り込まれ、その後活性化されてもよい。
【００４０】
「治療有効量」とは、疾患の発症の重症度を防ぎ、遅らせ、もしくは低減するのに、または進行中の疾患の重症度を阻むまたは低減するのに必要な量であり、また、正常な生理機能を高めるのに必要な量を包含する。
【００４１】
「トランスフェクトする」という単語は、本明細書では広義に用いられ、ポリヌクレオチド配列など外来性の化合物を原核細胞または真核細胞に導入することを意味している。この用語は、限定はしないが、外来性の核酸を細胞に導入することを含み、それによって、不死化または非不死化細胞株（セルライン）で、永久的または一時的に遺伝子型を改変することになり得る。
【００４２】
本発明者は、プラスミドのトランスフェクションに有用なヒスチジンおよびリジンを含む新規なブランチ（枝分かれした）キャリアを開発した（Chen QR, Zhang L, Stass SA, Mixson AJによる"Branched co-polymers of histidine and lysine are efficient carriers of plasmids"、Nucleic Acids Res、２００１年、２９：１３３４〜１３４０参照のこと）。これらのブランチコポリマーでは、リジンおよびヒスチジン成分は、複合体を形成し、プラスミドＤＮＡの負電荷を部分的に中和させる。さらに、ｐＫａが約６．０の上記ヒスチジン成分はバッファーの役割を果たし、エンドソーム小胞からプラスミドＤＮＡを遊離するのを助ける。一般的に、ＨＫペプチドは、ｓｉＲＮＡの送達には効果的ではない。本発明では、発明者はこれらのキャリアをさらに発展させ、今やｓｉＲＮＡの予想外に効率的なキャリアである、新規で高度に枝分かれしたＨＫポリマーを開発した。本発明のＨＫポリマーは、例えば、毒性が弱く、他のポリマーよりも有効にｓｉＲＮＡを送達するという点で有利である。
【００４３】
本発明のＨＫポリマーは、例えば、ｓｉＲＮＡを細胞の内側へ生体外（インビトロ）で送達するのに有用であり得る。しかしながら、これらのポリマーは生体内（インビボ）でも適用され得る。これらの方法は全て、ｓｉＲＮＡを送達するために、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることを含んでいる。かかるトランスフェクション複合体は少なくとも１つの輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡとを含んでいる。輸送性ポリマーはヒスチジンとリジンを含んでいる。
【００４４】
概して、トランスフェクトされる細胞には、これらに限定されないが、本発明のトランスフェクション複合体を生体外または生体内のいずれかで用いて、ｓｉＲＮＡを細胞内で送達しやすい任意の動物、植物または細菌の細胞が包含される。例えば、適切な細胞標的には、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単核細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞が含まれている。ある態様では、細胞は、肺細胞、肝細胞、内皮細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、造血幹細胞および腫瘍細胞からなる群から選択される。
【００４５】
ある実施形態によると、細胞には、トランスフォームされたもの、遺伝子組み換えされたもの（リコンビナント）、悪性のもの、およびプライマリー細胞株からなる群から選ばれる１つまたは複数の細胞を含んでいる。非限定的な例として、本発明にかかる細胞には、ＳＶＲ−ｂａｇ４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ｃ６およびＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の各細胞株から選ばれる１つまたは複数の細胞が包含され得る。
【００４６】
プラスミドに基づいた治療の場合、転写を生じさせるためには、核内へのインポートが重要であり、これは、いくつかの細胞株においては律速段階となるように思われる。（Pollard H, Remy JS, Loussouarn G, Demolombe S, Behr JP, Escande Dによる"Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells"、J Biol Chem、１９９８年、２７３：７５０７〜７５１１、Zabner J, Fasbender AJ, Moninger T, Poellinger KA, Welsh MJ.による、"Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid"、J Biol Chem、１９９５年、２７０：１８９９７〜１９００７。）核内へのインポートは、ｓｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡを分解するのには必要ではないため、本発明のポリマーは、ほとんどの細胞株でｓｉＲＮＡのキャリアとして有効であると考えられる。
【００４７】
また、本発明に係る細胞をトランスフェクトする方法は、トランスフェクション複合体を形成することと、そのトランスフェクション複合体を細胞と接触させる前に、約１５分〜約１時間半、または約１５分〜約４５分、ほぼ室温で置いておくこととを包含し得る。
【００４８】
本発明に係るヒスチジンおよびリジンを含む輸送性ポリマーは、１つまたは複数のＨＫキャリアを含んでいる。ＨＫキャリアは、ｓｉＲＮＡを輸送するのに効果的で、例えば、６個から１０個のターミナルブランチを有するポリマーを含んでいる。ある実施形態によると、本発明の輸送性ポリマーは、８個のターミナルブランチとヒスチジンリッチドメインとを含んでいる。ある実施形態によると、輸送性ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−の配列またはそのサブセグメントを有するターミナルブランチを含んでいる。本発明に係る輸送性ポリマーの非限定的な例として、Ｈ３Ｋ８ｂおよびその構造上のアナログ（例えば、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、１つまたは複数の他のリガンドを含んだＨ３Ｋ８ｂ、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）など）から選ばれる１つまたは複数のポリマーが含まれる。
【００４９】
本発明の輸送性ポリマーは、任意で、１つまたは複数の安定剤を含んでもよい。適切な安定剤は、本開示に照らして、当業者には明らかであろう。本発明に係る安定剤の非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシプロピルメチルアクリルイミド（ＨＰＭＡ）が包含される。
【００５０】
本発明の輸送性ポリマーは、任意で、１つまたは複数の標的リガンドを含んでもよい。適切な標的リガンドは、本開示に照らして、当業者には明らかであろう。
【００５１】
ｓｉＲＮＡ輸送に効果的であろうＨＫポリマーの多数のパターンが分離され、作り出され、考察された。４つのブランチを有するポリマーのうち、ターミナルブランチのＨＨＨＫの繰り返しパターン（例えばＨ３Ｋ４ｂ）は、ＨＨＫの繰り返しパターン（例えばＨ２Ｋ４ｂ）またはＨＫの繰り返しパターン（例えばＨＫ４ｂ）よりも効果的にｓｉＲＮＡの取り込み量を増加させるように思われる（このようなポリマーの構造とその有効性を描いた図１および図２を参照のこと）。その結果、本発明者は、高度に枝分かれしたＨ３Ｋ８ｂおよびＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を構成する際に同様のパターンを採用し、このことがｓｉＲＮＡのキャリアを調製するのに極めて効果的であることを突き止めた。
【００５２】
Ｈ３Ｋ８ｂは８つのターミナルブランチを有し、高い割合でヒスチジン、低い割合でリジンを有している。ＨＨＫと比較すると、ＨＨＨＫパターンは、ヒスチジンの割合が高いため緩衝能力が高まり、リジンの割合が低いために結合が弱まる。酸性エンドソームコンパートメントを中和するターミナルブランチ中のヒスチジンの数が増えると、エンドソーム溶解（endosomal lysis）が可能となり、エンドソームからのＤＮＡの放出ができよう。同様に、Ｈ３Ｋ８ｂ内のヒスチジンリッチドメインは、ポリマーの緩衝（中和）能力を高めることによって、サイトゾル送達（cytosol delivery）を増大させることが期待されよう。それにもかかわらず、ヒスチジンリッチドメインを、グリシンまたは先端が欠損したヒスチジンリッチドメイン（−ＨＨＫＨＨ）と置換することによって、ＨＫポリマーがｓｉＲＮＡに無効なキャリアとなった。先端欠損のヒスチジンリッチドメインを有するＨＫポリマーが、前記グリシンを有するポリマーと同様に有効でないことは、ヒスチジンリッチドメインの緩衝（中和）能力がこのドメインの主要なメカニズムではないようであることを示唆している。さらに、これらの結果によると、高度に枝分かれしたＨＫペプチドの全てのドメイン（ターミナルブランチおよびヒスチジンリッチドメイン）が、有効なｓｉＲＮＡキャリアの開発に重要であることを示している。
【００５３】
Ｈ３Ｋ４ｂおよびＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）にはＨＨＫの繰り返しパターンが存在しているが、高度に枝分かれしたポリマーすなわちＨ３Ｋ８ｂではＮ末端リジンが除去された。Ｈ３Ｋ８ｂのターミナルブランチ内のリジンの数を減らすことによって、ｓｉＲＮＡの結合を弱まらせ得る。また、核内のｓｉＲＮＡ量に比べて細胞質内のｓｉＲＮＡ量を増大させ得る。１つのリジンをＨ３Ｋ８ｂの各ターミナルブランチに加えることによって（ポリマーにつき、全部で８つのリジン）、それにより得られた新たなポリマー（（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ））の標的ｍＲＮＡを減少させることに関する効果は、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）の同効果と比べて著しく減じられた。ｓｉＲＮＡ輸送を達成するポリマー配列（すなわち、各ターミナルブランチに上記追加のリジンを有していないポリマー配列）が小さければ小さいほど、ポリマーをより容易に合成するという点で有利である。結合によってｓｉＲＮＡの放出が調節されるという考えは、ｓｉＲＮＡとの結合が強められたキャリアペプチドはｓｉＲＮＡのキャリアとして有効でなくなるという発見と一致する（Simeoni F, Morris MC, Heitz F, Divita G.による、"Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells"、Nucleic Acids Res、２００３年、３１：２７１７〜２７２４）。それにもかかわらず、核酸結合能力を異ならせた大量のＨＫキャリアは、ｓｉＲＮＡに非有効なキャリアであった。
【００５４】
ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（−ＲＧＤ）は、Ｈ２Ｋ４Ｂ／ｓｉＲＮＡ複合体よりも大きさが小さいだけである。本発明者は、Ｈ３Ｋ８ｂ（ＲＧＤ）／ｓｉＲＮＡ比を変動させると、ゼータ電位（粒子の表面電荷の測定値）は正の電荷から負の電荷へ変化するが、トランスフェクション活性がほとんど達成されないことを見出した。対照的に、複合体の取り込みは、ポリプレックスのトランスフェクションレベルとより密接に相互に関連していた。Ｈ２Ｋ４ｂは、プラスミドの取り込みと、トランスフェクトされたプラスミドからのタンパク質の発現を、Ｈ３Ｋ８ｂ（またはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ））よりも著しく増大させた。対照的に、Ｈ３Ｋ８ｂは、テストされた他のＨＫポリマーまたは非ウイルス性キャリアよりも効果的にｓｉＲＮＡの取り込みを増大させた（図６参照）。ほとんどの場合のＨＫキャリアによる核酸の取り込みは、上記核酸の所望の効果と相互に関係するが、核酸の取り込みと上記効果との間の不一致は、ｓｉＲＮＡ送達システムを用いるよりもプラスミドに基づいたシステムを用いる方が頻繁に起こり得る。
【００５５】
本発明に係るＨＫポリマーの非限定的な例として、これらに限定されないが、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂおよび（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）からなる群から選ばれる１つまたは複数のポリマーが包含される。当業者によって、本発明の範囲内で他に改変されてもよい。例えば、他の受容体を標的とするリガンドなど、ＲＧＤ以外のリガンドが、本発明の範囲内でポリマーに加えられてもよい。さらに、１６ｍｅｒＨ３Ｋ８ｂポリマーと１２ｍｅｒ（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂポリマーとの間（両方を含む）の大きさのポリマーは、本発明の範囲内である。さらに、Ｈ３Ｋ８ｂから５番目または６番目のアミノ酸が除去されてもよく、依然として本発明の範囲内にある。
【００５６】
以下は、本発明の範囲内のある化合物の命名の例である。この命名は、有機化合物に対する国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の命名法に基づいている。
Ｈ３Ｋ８ｂ：
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］
Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］− 
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］（ＲＧＤ）
（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ
［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］
【００５７】
Ｈ３Ｋ８ｂとＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のターミナルブランチは、配列（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）を含んでいる。（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂのターミナルブランチは、配列（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）を含んでいる。高度に枝分かれしたポリマーのターミナルブランチおよび／またはそのコアに、安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシプロピルメチルアクリルイミド（ＨＰＭＡ））および／または標的リガンドが、任意で加えられてもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、当該技術分野において周知の技術によって、化学的に合成および精製され得る。例えば、枝分かれポリペプチドは、当該技術分野において知られている方法であって、アミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基（それらにより当該アミノ酸はポリペプチド鎖と共有結合により結合されることになる）と反応可能な側鎖基を有するポリペプチド鎖内の任意の天然または合成アミノ酸と、任意の天然または合成アミノ酸とを共有結合で結合させるための任意の方法によって調製され得る。特に、遊離の側鎖アミノ基を有するアミノ酸（例えば、これらに限定されないが、ジアミノ酪酸、リジン、アルギニン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、シトルリンなど）が、ポリペプチドに組み込まれることができ、それによってアミノ酸は該ポリペプチドのブランチを形成し得る。例えば、遊離側鎖アミノ基とのポリペプチド結合を、その残基から形成することによって、ポリペプチドのブランチ（分岐）を形成することができる。あるいは、遊離の側鎖カルボキシル基を有するアミノ酸（例えば、これらに限定されないが、グルタミン酸、アスパラギン酸、ホモシトルリンなど）が、ポリペプチドに組み込まれることができ、それによってアミノ酸は該ポリペプチドのブランチを形成し得る。例えば、遊離側鎖カルボキシル基とのポリペプチド結合を、その残基から形成することによって、ポリペプチドのブランチ（分岐）を形成することができる。ブランチを形成するアミノ酸は、これらに限定されないが、ポリペプチド結合、エステル結合およびジスルフィド結合を包含する任意のタイプの共有結合によって、ポリペプチド鎖内のアミノ酸の側鎖基と結合し得る。
【００５９】
例えば、これに限定するものではないが、枝分かれしたポリペプチド（ブランチポリペプチド）は以下のように調製することができる。（１）主ポリペプチド鎖から分岐するアミノ酸を、Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護アミノ酸ペンタフルオロフェニル（Ｏｐｆｐ）エステルとして調製することができ、この分岐したアミノ酸が結合する主鎖内の残基は、Ｎ−Ｆｍｏｃ−α−γ−ジアミノ酪酸であり得る。（２）Ｂｏｃ保護アミノ酸のジアミノ酪酸へのカップリングは、各前駆体５グラムを、１５０ｍｌのＤＭＦを含んだフラスコに、２．２５ｍｌのピリジンと５０ｍｇのジメチルアミノピリジンとともに加え、その溶液を２４時間混ぜることによって実現し得る。（３）その後、このカップリング反応物１５０ｍｌを４００ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）および２００ｍｌの０．１２Ｎ−ＨＣｌと１リットルの分液漏斗内で混合し、相を分離可能にし、一番下の水性層を採取し且つ最上層を２００ｍｌの０．１２Ｎ−ＨＣｌでさらに２回再抽出することによって、上記１５０ｍｌのカップリング反応物からポリペプチドを抽出することができる。（４）ポリペプチドを含んだ溶液は、２〜５グラムの硫酸マグネシウムを添加し、その硫酸マグネシウムをフィルターをかけて除去し、残った溶液を容積が約２〜５ｍｌになるまでエバポレートすることによって、脱水することができる。（５）次に、酢酸エチル、次いで２倍容量のヘキサンを加えることによって、（ジ）ポリペプチドを沈澱させ得る。次いで、該沈澱物を濾過して回収し、冷ヘキサンで２回洗浄する。（６）結果として得られた濾過物を凍結乾燥し、軽量の粉末形態の所望の（ジ）ポリペプチドを得ることができる。この方法で調製されたブランチ（分岐）ポリペプチドは、分岐されるアミノ酸位置でジアミノ酪酸の置換を有するであろう。ジアミノ酪酸以外のアミノ酸またはアミノ酸アナログの置換を含むブランチポリペプチドは、当該アミノ酸またはアミノ酸アナログのＮ−Ｆｍｏｃ結合形態を用いて、上述の手順と同じように調製可能である。
【００６０】
輸送性ポリマーのポリペプチドは、ウイルスＤＮＡによってコード化し得、ウイルス表面で発現させ得る。あるいは、ヒスチジンが、水溶性のジカルボイミドとのアミド結合を介してタンパク質と共有結合し得る。
【００６１】
ＨＫ輸送性ポリマーは、ポリペプチド−「合成モノマー」コポリマーを包含し得る。これらの実施形態においては、輸送性ポリマーの主鎖（バックボーン）は、共有結合したポリペプチドセグメントと合成モノマーまたは合成ポリマーのセグメントとを含んでいてもよい。合成モノマーまたはポリマーは、生体適合性および／または生分解性であり得る。合成モノマーの例として、ポリペプチドと結合するための少なくとも１つの反応活性部位を含むエチレン性またはアセチレン性不飽和モノマーが包含される。適切なモノマーおよびポリペプチド−「合成モノマー」コポリマー調製方法が、Nowinskiらによる"Polymerizable compounds and methods for preparing synthetic polymers that integrally contain polypeptides"に関する米国特許第４，５１１，４７８号に開示されており、これを本明細書に参照により援用する。輸送性ポリマーが枝分かれ（ブランチ）ポリマーを含んでいる場合、合成モノマーまたはポリマーが主鎖および／またはブランチに組み込まれてもよい。さらに、主鎖またはブランチが、合成モノマーまたはポリマーを含んでもよい。最後に、本実施形態では、枝分かれした（分岐）モノマーは、分岐アミノ酸または枝分かれした（分岐）合成モノマーであり得る。分岐合成モノマーとしては、例えば、少なくとも１つの反応性置換側基（substituent reactive side-group）を含むエチレン性またはアセチレン性不飽和モノマーが包含され得る。
【００６２】
本発明に係るｓｉＲＮＡの非限定的な例は、Ｒａｆ−１配列である５'−ＡＡＵＧＵＣＣＡＣＡＵＧＧＵＣＡＧＣＡＣＣ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ１）を標的にするｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの他の形態も本発明によって包括される。
【００６３】
本発明のｅｘ  ｖｉｖｏ送達方法は、例えば、（ｉ）被験者から細胞を取り出すことと、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡとＨＫ ポリマーとを含む送達（デリバリー）組成物（トランスフェクション複合体またはそのようなトランスフェクション複合体を含む組成物）と細胞を接触させることによって、ｓｉＲＮＡを該細胞に導入することと、（ｉｉｉ）該細胞を被験者に再導入することと、を包含し得る。
【００６４】
局所注入に基づいた生体内（インビボ）治療（例えば、腫瘍内、筋肉内、腹膜腔内、心臓内およびエアロゾル処置）に関しては、ヒスチジンおよびヒスチジンでないアミノ酸の全含有量が、枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマーの全体を水溶性にし得る。枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマーがアミノ酸からなる場合、枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマーは、ヒスチジンおよびヒスチジンでない親水性アミノ酸（すなわち、荷電または非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸）の含有量が当該枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマーに水溶性を与えるように設計し得る。これらの実施形態では、ヒスチジンおよびヒスチジンでない親水性アミノ酸は、枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマー内のアミノ酸の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％であり得る。あるいは、別の方法として、水に不溶の枝分かれ（ブランチ）輸送性ポリマーは、親水性成分（すなわち、可溶性リガンド、可溶性薬剤など）を当該輸送性ポリマーに共有結合させることによって、水溶性を付与し得る。ここで上記薬剤が核酸（通常は負電荷）で、輸送性ポリマーとの共有結合でない関連が望まれる場合、中性の親水性である側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、アスパラギンおよびグルタミン）および、生理的ｐＨで正の電荷を運ぶ側鎖基を有するアミノ酸（例えば、リジン、オミシン（omithin）およびアルギニン）からなる群から、ヒスチジンでないアミノ酸が選択されてもよく、リジンであってもよい。水溶性の枝分かれ（分岐）輸送性ポリマーと水溶性の薬剤（例えば、ＤＮＡ）との共有結合ではない関連（つながり）が意図されている場合、ＨＫ輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡとは、注入前に結合していなくてもよい。薬剤送達複合体（pharmaceutical delivery complex）が注入前に形成されていることが好ましいが、輸送性ポリマーおよびｓｉＲＮＡは、注入部位で薬剤送達組成物を形成するよう、（どちらの順でも）順次または同時に（局所注入によって）投与され得る。
【００６５】
本発明はまた、例えば、ｓｉＲＮＡをＨＫ輸送性ポリマーと混合することによってトランスフェクション複合体を形成する方法に関する。該トランスフェクション複合体では、輸送性ポリマーのｓｉＲＮＡに対する比は、約０．５：１（ｗｔ／ｗｔ）から約２４：１（ｗｔ／ｗｔ）、または約０．５：１（ｗｔ／ｗｔ）から約２４：１（ｗｔ／ｗｔ）、または約０．５：１（ｗｔ／ｗｔ）から約６：１（ｗｔ／ｗｔ）、または約３：１（ｗｔ／ｗｔ）から約６：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
【００６６】
本発明はさらに、ｓｉＲＮＡとＨＫ輸送性ポリマーとを含むトランスフェクション複合体に関する。本発明に係るトランスフェクション複合体は、本発明の任意のＨＫポリマーを含み得る。本発明に係るトランスフェクション複合体の非限定的な例には、Ｈ３Ｋ８ｂ、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂおよび（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）からなる群から選ばれる１つまたは複数のポリマーが包含される。
【００６７】
本発明に係る輸送ＨＫポリマーは、当業者に既知の方法で合成され得る。非限定的な例として、本明細書で論じたあるＨＫポリマーが、次のように合成され得る。例えば、（１）Ｈ２Ｋ４ｂ（８３ｍｅｒ、分子量１１１３７Ｄａ）、（２）Ｈ３Ｋ４ｂ（７１ｍｅｒ、ＭＷ９５９６Ｄａ）、（３）ＨＫ４ｂ（７９ｍｅｒ、ＭＷ１０８９６Ｄａ）、（４）Ｈ３Ｋ８ｂ（１６３ｍｅｒ、ＭＷ２３２１８Ｄａ）、（５）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（１６６ｍｅｒ、ＭＷ２３５６４Ｄａ）、（６）（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（１３１ｍｅｒ、ＭＷ１８９０１Ｄａ）、（７）（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（１３４ｍｅｒ、ＭＷ１９２４３Ｄａ）、（８）（（Ｋ＋）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（１７４ｍｅｒ、ＭＷ２４５９４Ｄａ）のＨＫポリマーを、Ｒａｎｉｎ  Ｖｏｙａｇｅｒ固相合成装置（Ranin Voyager  solid-phase synthesizer）（米国アリゾナ州トゥーソンのＰＴＩ）で合成するために、メリーランド大学にある生体高分子コア施設（The Biopolymer Core Facility）が用いられ得る。いくつかの枝分かれ（ブランチ）ポリマーの構造が図１および図９に示されている。４つのブランチを有するポリマー（例えば、Ｈ３Ｋ４ｂ、ＨＫ４ｂ）が、当業界で既知の方法によって合成され得る。８つのターミナルブランチを有する高度に枝分かれしたポリマーに対する合成の順序は、以下の通りであり得る。即ち、（１）ＲＧＤまたは（もしあれば）他のリガンド、（２）上記３−リジンコア、（３）ヒスチジン−リッチドメイン、（４）１つのリジンの付加、および、（５）ターミナルブランチ。上記ＲＧＤ配列は、まず上記装置によって、次いで、（ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ−（Ｄｄｅ）（上記リジンコア）との３度のマニュアルのカップリング（結合）操作によって合成され得る。上記（Ｄｄｅ）保護基は、自動脱保護サイクルの間に除去され得る。その後、上記リジンコアに、上記ヒスチジンリッチドメインを含む活性化アミノ酸群が上記装置によって順次付加され得る。次いで、１つの（ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ−（ｆｍｏｃ）アミノ酸が上記ヒスチジンリッチドメインに付加され、そして当該ｆｍｏｃ保護基が除去される。その後、このリジンのαおよびεアミン基に、上記ターミナルブランチの活性化アミノ酸が付加され得る。ペプチドは、樹脂から切断され、当該技術分野で既知の方法により沈澱回収される。
【００６８】
非限定的な例として、本発明のポリマーは以下のように分析され得る。ポリマーはまず、ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、米国カリフォルニア州フラートンのＢｅｃｋｍａｎ）によって分析され得る。ＨＰＬＣでポリマー純度が９５％以上であると示される場合には、ポリマーはそれ以上精製しなくてもよい。ポリマーはＨＰＬＣカラム上で精製され得る。例えば、二成分溶液システムを備えたＤｙｎａｍａｘ２１−４×２５０ｍｍＣ−１８逆相分取カラムを用いて、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄのオペレーティングソフトウェアによる。検出は２１４ｎｍで行い得る。上記ポリマーの更なる解析は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（米国カリフォルニア州フォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびアミノ酸分析（米国オレゴン州ボーリングのＡＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）を用いて実行し得る。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（カリフォルニア州バレンシアのＱｉａｇｅｎ）、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクタミン２０００（Lipofectamine2000）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびリポフェクタミン（Lipofectamine）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのトランスフェクション試薬が、製造者の指示に基づいて用いられ得る。ＤＯＴＡＰリポソームは、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。
【００６９】
本発明はさらに組成物に関し、該組成物は本発明のトランスフェクション複合体を含む。このような組成物は、例えば、上記ＨＫポリマーおよび／または上記ｓｉＲＮＡと関連した１つまたは複数の細胞内送達成分（intracellular delivery components）を含んでもよい。細胞内送達成分は、例えば、脂質（例えばカチオン性脂質）、遷移金属、または当業者に明らかであろう他の成分を包含し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容可能なキャリアなどの適切なキャリアを含む。これらの実施形態では、ウイルス性のまたはリポソーム成分があってもなくてもよい。これらの実施形態では、上記輸送性ポリマーおよびｓｉＲＮＡによって形成された複合体は、約 ５．０〜７．４の間のｐＨで安定し得る。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、トランスフェクション複合体組成物は、（細胞内送達成分として機能し得る）輸送性ポリマーと、ｓｉＲＮＡとを含んでいる。これらの実施形態では、かかる輸送性ポリマーは、付加的な送達成分を必要とせずに細胞内送達成分として機能することができ、または他の送達成分と連動して機能し得る。
【００７２】
その他の実施形態として、上記トランスフェクション複合体組成物は、（ｉ）輸送性ポリマー、（ｉｉ）該輸送性ポリマーと関連した（合わさった）少なくとも１つの細胞内送達成分、および、（ｉｉｉ）該細胞内送達成分および／または該輸送性ポリマーと関連した（合わさった）ｓｉＲＮＡ、を含み得る。かかる組成物を製造する方法には、安定した複合体へと結合させるために、輸送性ポリマーとｓｉＲＮＡに対して十分な時間（ｉ）と（ｉｉ）とを混合することを包含し得る。成分（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、薬学的に許容可能なキャリアなどの適切なキャリア内に含有され得る。上記輸送性ポリマー以外の細胞内送達成分を含む実施形態では、該輸送性ポリマーは、リポソームなどの細胞内送達成分と、非共有的または共有的相互作用によって相互作用し得る。
【００７３】
輸送性ポリマーは、非共有的または共有的相互作用によって、ｓｉＲＮＡと相互作用し得る。あるいは、輸送性ポリマーはｓｉＲＮＡと直接相互作用しなくてもよく、むしろ、該輸送性ポリマーは細胞内送達成分（複数可）と相互作用してもよい。この場合、複合体全体との関連において、該細胞内送達成分が代わりにｓｉＲＮＡと相互作用する。
【００７４】
本発明の細胞内送達成分は、輸送性ポリマーそれ自体であり得る。当該細胞内送達成分以外に細胞内送達成分が用いられる場合、そのような送達成分としては、ウイルス性または非ウイルス性成分であり得る。適切なウイルス性細胞内送達成分には、これらに限定されないが、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、鳥(avian)、レンチウイルス）、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ライノウイルス、センダイウイルスおよびポックスウイルスが包含される。適切な非ウイルス性細胞内送達成分には、これらに限定されないが、脂質およびリポソームやミセルなどの脂質ベースの種々の物質、並びに当該技術分野で既知の種々のポリマーが包含される。
【００７５】
適切な脂質には、これらに限定されないが、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、グリコスフィンゴ脂質、両親媒性脂質が含まれる。脂質は、単層または多層リポソームの形態であり得る。
【００７６】
細胞内送達成分には、これらに限定されないが、カチオン性脂質が包含され得る。このようなカチオン性脂質の多くが当該技術分野で知られている。ジアシルグリセロールまたはコレステロール疎水性部分が代謝的に分解可能なエステル結合によってカチオン性先端基と結合している様々なカチオン性脂質が、製造されてきた。例えば、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（４−'−トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）およびコレステリル（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノエート（ＣｈｏＴＢ）である。他の適切な脂質には、これらに限定されないが、カチオン性、非ｐＨ感受性脂質が含まれる。例えば、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）である。他の非ｐＨ感受性、カチオン性脂質には、これらに限定されないが、Ｏ，Ｏ'−ジドデシル−Ｎ−［ｐ−（２−トリメチルアンモニオエチルオキシ）ベンゾイル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、リポスペルミン（Lipospermine）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ''−ジメチルアミノエタン）カルボニル］コレステロール）、リポポリ（Ｌ−リジン）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）を含有するカチオン性多層リポソーム、ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ（商標）（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドであるＤＤＡＢとＤＯＰＥの比が１：２．５（ｗ：ｗ））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２０（［２，５−ビス［３−アミノ−プロピル）アミノ］−１−オキシペンタル］アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートであるＤＯＳＰＡとＤＯＰＥの比が３：１（ｗ：ｗ））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。その他の適切な脂質は、Wolffらによる"Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds"に関する米国特許第５，９６５，４３４号に記載されている。
【００７７】
本発明に基づいて使用され得るカチオン性脂質には、これらに限定されないが、生理的に適応され得る環境でリポソームを形成するカチオン性脂質が含まれる。適切なカチオン性脂質には、これらに限定されないが、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウムブロミド、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、１，２−ジオレオイル−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、１，２ジミリスチル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン、［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６カルボキシ−スペルミル）プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ，ジメチル−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、および１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）からなる群から選ばれるカチオン性脂質が包含される。
【００７８】
カチオン性脂質は、トランスフェクションを高めるために、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはコレステロールなどの１つまたは複数のヘルパー脂質と共に用いられ得る。カチオン性リポソーム中のこれらヘルパー脂質のモルパーセンテージは、約５〜５０％である。さらに、カチオン性リポソームのインビボでの半減期を延長することができるペグ化脂質（pegylated lipids）が、約０．０５〜０．５％のモルパーセンテージで存在可能である。
【００７９】
本発明に係る組成物は或いは、トランスフェクションを高めるために、試薬を保存するために、または上記送達複合体（delivery complex）の安定性を高めるための１つまたは複数の成分を含み得る。例えば、ポリエチレングリコールなどの安定化のための化合物は、脂質または輸送性ポリマーのいずれかと共有結合することができる。
【００８０】
本発明に係る組成物は、ｐＨが約４〜７．４の適切な緩衝液を含み得る。好ましくは、酸性溶液をｐＨが約５．０〜７．４となるまで中和して２時間以内に上記組成物を投与する。かかる組成物の種々の成分は凍結乾燥され、ｐＨが約５．０〜７．４のバッファーで再構成し得る。上記ポリマーの安定性および溶解度は、特にＤＮＡなどの大きな負電荷の巨大分子と複合する場合、わずかに酸性である溶液で維持され得る。
【００８１】
本発明の組成物はデンドリマーを含み得る。細胞内送達成分とｓｉＲＮＡはともに、デンドリマー−ｓｉＲＮＡ複合体を包含し得る。
【００８２】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の種々の送達増強成分（delivery enhancing components）を適切に含むこともできる。例えば、該組成物は、受容体介在エンドサイトーシスなどを受ける核またはリガンドに入ることが知られている１つまたは複数の化合物を含んでもよい。例えば、リガンドは、エンドソームを崩壊させる膜融合ウイルスペプチド（fusogenic viral peptide）を含み、それによって核酸のリソソーム分解を回避し得る。送達増強成分の他の例としては、これらに限定されないが、核タンパク質、アデノウイルス粒子、トランスフェリン、界面活性剤−Ｂ、アンチ（抗）−トロンボモジュリン、挿入剤（intercalating agent）、血球凝集素、アシアログリコプロテイン、クロロキン、コルヒチン、インテグリンリガンド、ＬＤＬ受容体リガンドおよび発現を維持するためのウイルス性タンパク質（例えば、インテグラーゼ、ＬＴＲエレメント、ｒｅｐタンパク質、ｏｒｉＰ、ＥＢＮＡ−１タンパク質）、または細胞表面タンパク質と相互作用するウイルス成分（例えば、ＩＣＡＭ、ＨＡ−１、ＭＬＶのｇｐ７０−リン酸輸送体およびＨＩＶのｇｐ１２０−ＣＤ４）が含まれる。送達増強成分は、上記輸送性ポリマー、細胞内送達成分または薬剤と共有的または非共有的に結合することができる。例えば、−ＲＧＤ−または−ＮＧＲ−モチーフを共有結合させることによって、腫瘍血管系への送達を標的にすることができる。これは、ペプチド合成機を用いて、または輸送性ポリマー上のアミノ基またはカルボキシル基に、水溶性のジカルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）をカップリング（結合）することによって実現し得る。これらの両方の方法は、当業者には既知である。
【００８３】
本発明の組成物は、亜鉛イオンなどの遷移金属イオンを適切に含み得る。本発明の複合体に遷移金属が存在することによって、トランスフェクション効率が向上し得る。
【００８４】
本発明はさらに、細胞内へトランスフェクションするためのｓｉＲＮＡの有効なキャリアを決定するためのアッセイを包含する。これらのアッセイ（検査法、評価法）は、ｓｉＲＮＡを輸送性ポリマーと混ぜ合わせてトランスフェクション複合体を形成することと、トランスフェクション複合体を１つまたは複数の細胞と接触させることと、細胞内のｓｉＲＮＡ活性の有無を検出することとを含んでいる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡはβ−ガラクトシダーゼを対象とする。
【００８５】
本発明はまた、本発明の複合体または組成物を用いることを包含する、疾患を治療する方法も提供する。特に、本発明の治療有効量の複合体または組成物を患者に投与することによって、疾患を有する患者を治療する方法が提供される。また、本明細書で開示した方法でトランスフェクトされた細胞を患者に投与することによって、疾患を有する患者を治療する方法も包括される。上記複合体、組成物および方法を用いて治療できる可能性がある遺伝的疾患および／または非腫瘍性疾患の例には、これらに限定されないが、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、ｐ４７ｐｈｏｘ欠損型の慢性肉芽腫症、ＨｂＳ症（鎌状赤血球症）、β−サラセミア（地中海性貧血）、ファンコニ貧血（Faconi's anemia）、家族性高コレステロール血症、フェニルケトン尿症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、アポリポプロテインＥ欠損症、Ａ型およびＢ型血友病、筋ジストロフィ症、嚢胞性線維症、パーキンソン病、網膜色素変性、リソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖Ｉ型、Ｈｕｎｔｅｒ、Ｈｕｒｌｅｒ、Ｇａｕｃｈｅｒ）、糖尿病性網膜症、ヒト免疫不全ウイルス病ウイルス感染、後天性貧血、心疾患および末梢血管疾患、関節炎が包含される。これらの疾患の例のうちのいくつかでは、治療遺伝子は、遺伝的または後天性疾患に係る代替の酵素またはタンパク質、アンチセンスまたはリボザイム分子、デコイ分子または自殺遺伝子産物をコードし得る。
【００８６】
また、ｓｉＲＮＡを用いたｅｘ  ｖｉｖｏおよびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での遺伝子治療は癌で用いられ得る。癌に向けられたこれらのｓｉＲＮＡの適用には、これらに限定されないが、１）増殖因子類の発現を減らすこと、細胞周期を増やすタンパク質類（例えばＲａｆ−１、ＰＩ−３キナーゼ）、増殖因子受容体類（例えば、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２）、または腫瘍中の細胞をサポートするのに欠かせないタンパク質類（例えば、腫瘍内皮細胞についてのＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１−２）を減らすこと、２）抗アポトーシス（例えばＢＣＬ−２）である因子類の発現を標的にする又は減らすこと、および３）腫瘍に対する免疫活性を減じるタンパク質類または酵素類を標的にすること、が包含される。
【００８７】
本発明はまた、（ｉ）被験者から細胞を取り出すこと、（ｉｉ）該細胞を本発明のトランスフェクション複合体或いはかかるトランスフェクション複合体を含んだ組成物に接触させることによって、該細胞の内部に核酸（例えばｓｉＲＮＡ）を送達すること、および、（ｉｉｉ）該核酸（例えばｓｉＲＮＡ）を含む細胞を該被験者に投与することを包含するｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療の方法を提供する。
【００８８】
本発明の複合体を用いて組換細胞（リコンビナントセル）が産生され得る。結果として得られる組換細胞は、当該技術分野で既知の種々の方法によって被験者に送達可能である。幾つかの実施形態においては、かかる組換細胞は、例えば、皮下に注入される。別の実施形態においては、組換（リコンビナント）皮膚細胞が、皮膚移植片として患者に適用され得る。組換血液細胞（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）が、好ましくは、静脈内に投与される。上記細胞はまた、適切な媒体内に封入され、次いで被験者に埋め込まれ得る（例えば、Ｄｉｏｎｎｅらによる、１９９２年１１月１２日付ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９１９５号参照のこと）。投与される細胞の量は、例えば、所望の効果、被験者の状態、キメラポリペプチドの発現率など、当該技術分野で既知の種々の要因に依存し、当業者によって容易に決定され得る。
【００８９】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示している。本明細書で記載する実施例は、例示的であることが意図され、クレームされた発明の範囲を制限するように用いられるべきではない。当分野の技術者に明らかであろうように、種々の変更および改変が可能であって、記載される本発明の意図する範囲内にあり、本発明の精神から逸脱することなく当業者によってなされ得る。
【実施例】
【００９０】
実施例１
方法
いくつかの枝分かれ（分岐）ポリマーを、当業者に既知の方法で、Ｒａｎｉｎ  Ｖｏｙａｇｅｒ合成機（アリゾナ州トゥーソンのＰＴＩ）で合成した。その後、これらのポリマーを、ｓｉＲＮＡを、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞およびＣ６細胞に導入する能力について検査した。１つのポリマーＨ３Ｋ８ｂをｓｉＲＮＡの有効なキャリアとして同定し、毒性についてフローサイトメトリーで調べた後、追加のポリマーを合成して、ｓｉＲＮＡ送達に重要なドメインを決定した。次に、ＨＫ：ｓｉＲＮＡ複合体の大きさ／ゼータ電位を、Ｎ４サブミクロン粒径分析器とＤｅｌｓａ４４０ＳＸゼータ電位分析器とを用いてそれぞれ算出した。
【００９１】
細胞株（セルライン）：
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（悪性乳癌細胞株）、Ｃ６（ラットグリオーマ細胞株）、Ｃ６／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼを発現するＣ６細胞株）、およびＳＶＲ−ｂａｇ４（ＳＶウイルスによりトランスフォームされた、β−ガラクトシダーゼを発現するマウスの内皮細胞株）を、約１０％のウシ胎児血清と約２０ｍＭのグルタミンとを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９２】
トランスフェクション試薬：ＨＫポリマーおよび他のキャリア：
メリーランド大学のバイオポリマーコア施設において、ＨＫポリマーをＲａｎｉｎ  Ｖｏｙａｇｅｒ固相合成装置（米国アリゾナ州トゥーソンのＰＴＩ）で合成した。枝分かれ（分岐）ポリマーの構造は図１および図９に示されている。その後、ＨＰＬＣを用いてポリマーを精製した。トランスフェクション試薬、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に基づいて用いた。本明細書で記載されているとおり、ＤＯＴＡＰを調製した。
【００９３】
ｓｉＲＮＡ：該ｓｉＲＮＡ二重鎖はカッコ内の標的と併せて以下の通りである。１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ、センス ５'−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ２）およびアンチセンス５'−Ｕ  ＣＧＡ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＣＡＧ  ＣＣＵ  ＡＡＧ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ３）（標的５'−ＣＴＴ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＣＧ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ４））並びに、２）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）ｓｉＲＮＡ、センス５'−ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＵＧ  ＡＡＵ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ５）およびアンチセンス５'−ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＵＧ  ＡＡＴ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ６）（標的５'−ＡＡＣ  ＡＧＵ  ＵＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＵＧＡ  ＡＵＧ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ７））。ｓｉＲＮＡのインポートの調査には、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ（センス５'−ＣＧＵ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ−ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ８）およびアンチセンス５'−Ｔ  ＣＧＡ  ＡＧＵ  ＡＵＵ  ＣＣＧ  ＣＧＵ  ＡＣＧ−ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ：ＩＤ９））がＤａｒｍａｃｏｎから購入された。
【００９４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：最初に、３×１０４個のＳＶＲ−ｂａｇ４細胞を、１０％血清を添加したＤＭＥＭをウェル当たり約５００μｌ含有する２４穴ウェルプレートにプレーティングした。およそ２４時間後、細胞が約４０％集密したとき、トランスフェクション複合体を培養液に加えた。キャリア：ｓｉＲＮＡ（特に指示がない限り、４：１の比率）の複合体を調製するために、ＯｐｔｉＭＥＭ中のｓｉＲＮＡ（２μｇ）をキャリア（約８μｇ）と少しの間よく混ぜ、室温で約３０分間置いた。ＯｐｔｉＭＥＭ中のポリマー／ＤＮＡ複合体の全容積は約５０μｌであり、この複合体を、約０．５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％血清中の細胞に滴下した。
【００９５】
リポフェクタミン２０００に対しては、トランスフェクション方法は同様であった。ただし、キャリア：ｓｉＲＮＡの比は２：１で、さらに、オリゴフェクタミン：ｓｉＲＮＡの比は２：１であり、複合体を０．５ｍｌのＤＭＥＭ中の細胞に４時間かけて、培養液をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに変える前に加えた。（４時間かけて加え、その後培養液をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳに変えた。）
【００９６】
β−ガラクトシダーゼ染色および活性アッセイ：
ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞のβ−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションから約４８時間後、β−ガラクトシダーゼの細胞内レベルを、製造者によって記載されているとおり、β−ガラクトシダーゼ染色アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。培養液をトランスフェクトされた細胞から除去し、次に細胞をＰＢＳで洗浄した。染色に関しては、細胞を約１０分間室温で固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。Ｘ−ｇａｌ染色液を細胞に加え、約３７℃で約６時間培養した。β−ガラクトシダーゼ活性を決定するために、溶解バッファー（約５０ｍｌ）を各ウェルに加え、細胞を３サイクル凍結融解した。次に、β−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧを約３７℃で３０分間、細胞とともに培養した。反応を１Ｍの炭酸ナトリウム溶液を加えて停止し、４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。β−ガラクトシダーゼの特異性を、n moles(加水分解されたＯＮＰＧのモル数)／分 (min)／抽出タンパク（タンパク質ライセート）のｍｇとして報告した。
【００９７】
ルシフェラーゼ発現プラスミドおよびルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡでの同時トランスフェクション：約１×１０５個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、約７０％の集密度に到達するように、２４穴ウェルプレートにプレーティングしてから約２４時間後、これらの細胞をプラスミドとｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトした。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔと複合したルシフェラーゼ発現プラスミド（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）（２：１）と、いくつかのキャリアのうちの１つと複合したｓｉＲＮＡ（ルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とする）を、同時に別々に調製した。その後、これら２つの複合体をともに細胞に加え、約２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、約１００μｌの１×passive lysis buffer (PLB溶解剤）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）で溶解した。タンパク質の濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性を直流Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０のルミノメータ（カリフォルニア州サニーベールのＴｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）で測定した。相対的光ユニットを、リコンビナントルシフェラーゼ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を基準として用いて、ピコグラム（ｐｇ）のルシフェラーゼに換算した。各濃度で重複して測定し、３つの別々の実験を行った。
結果
【００９８】
β−ガラクトシダーゼを安定して発現する内皮細胞株（ＳＶＲ−ｂａｇ４）では、Ｈ３Ｋ８ｂポリマーと複合したｓｉＲＮＡがβ−ガラクトシダーゼの発現を８０％より多く抑制した。同様に、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内のルシフェラーゼ発現を抑制した。対照的に、プラスミドの有効なキャリアであるポリマーＨ２Ｋ４ｂは、ｓｉＲＮＡの有効なキャリアではなかった。その標的を抑制するのに最適な濃度で、Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体の毒性は最小限であった。ヒスチジンリッチドメインとＨ３Ｋ８ｂのターミナルアームの長さとが、ｓｉＲＮＡの送達に影響を及ぼすようであった。しかし、大きさおよび表面電荷はｓｉＲＮＡの送達に影響を及ぼさないようであった。
結論
【００９９】
したがって、複雑性の度合いと配列の特異性の両方が、ｓｉＲＮＡのＨＫキャリアを開発するのに考慮されるべき要素である。特に、本発明者は、８つのターミナルブランチと１つのヒスチジンリッチドメインとを備えた、ある（特定の）枝分かれ（分岐）ＨＫポリマー（Ｈ３Ｋ８ｂおよび構造上のアナログ（類似体））が、ｓｉＲＮＡの有効なキャリアであることを見出した。
【０１００】
実施例２
取り込み実験
【０１０１】
上述したように、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡと複合したキャリア（ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン、またはＨ２Ｋ４ｂ、またはＨ３Ｋ８ｂ）で細胞をトランスフェクトした。約４時間後、Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ蛍光顕微鏡１００Ｘ（日本国東京の株式会社ニコン）を用いて画像を採取した。
【０１０２】
フローサイトメトリー。
Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体でトランスフェクトした後の細胞毒性を決定するために、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ａｓｓａｙ＃４（分子プローブ）についての製造者の指示に従った。トランスフェクションの２４時間前に、２×１０５個のＳＶＲ−ｂａｇ４細胞を、１２穴ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。キャリア（Ｈ３Ｋ８ｂ、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン（８μｇ）、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン２０００（４μｇ））と複合したβ−ガラクトシダーゼ発現ｓｉＲＮＡ（約２μｇ）で細胞をトランスフェクトした。次に、約２４時間後、細胞を採取し、冷却した１×ＰＢＳ中で洗浄し、細胞を約１ｍｌのＰＢＳで懸濁した。この懸濁液に、約１μｌの緑色蛍光色素溶液（ＹＯ−ＰＲＯ−１）と、約１μｌの赤色蛍光色素溶液（ヨウ化プロピジウム）を加えた。氷上で約３０分間培養した後、生存細胞、死細胞、および／またはアポトーシス細胞の数を、ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンノゼのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で４８８ｎｍの励起を用いて分析した。その後、未処理の群の死細胞を差し引いた後、死細胞のパーセント割合を各キャリア：ｓｉＲＮＡ複合体から算出した（図７および図８参照のこと）。
【０１０３】
図８にあるデータは、３つの実験、すなわち、**Ｐ＜０．００１、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）対リポフェクタミン、対リポフェクタミン２０００または対オリゴフェクタミン（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）の平均値とＳ．Ｄ．（標準偏差）を表している。トランスフェクションキャリア：ｓｉＲＮＡ複合体の比は４：１（ｗ／ｗ）であった。ただし、リポフェクタミン２０００とオリゴフェクタミン複合体においては、比は２：１であった。
【０１０４】
ＤＮＡ−ＨＫポリマー複合体の大きさおよびゼータ電位の測定。
プラスミドＤＮＡ（約１２μｇ）と複合したＨＫポリマー、Ｈ３Ｋ８ｂ（−ＲＧＤ）およびＨ２Ｋ４ｂ（２４または４８μｇ）を、先に記載したトランスフェクション複合体と同様に調製した。ポリマー複合体（ポリプレックス）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（約３００μｌ）中で約３０分間置いた後、約９５０μｌのＨｅｐｅｓ バッファー（約２０ｍＭ、ｐＨ約７．５）をウェルに加えた。種々の複合体の粒径を、Ｎ４サブミクロン粒径分析器（フロリダ州ハイアリーアのＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、約９０度の角度における光散乱を測定することによって決定した。該粒径は、製造業者が提供するソフトウェアを用いて行われた単峰分析（unimodal analysis）から得られた平均サイズとして報告されている。ゼータ電位、すなわち粒子の表面電荷の測定値（尺度、指標）を、Ｄｅｌｓａ４４０ＳＸ器具（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定した。電界における粒子の移動度に対してゼータ電位の値を決定した。各データの点は、３つの測定値の平均値±Ｓ．Ｄ．（標準偏差）を表している。
結果
【０１０５】
Ｈ３Ｋ８ｂはｓｉＲＮＡの有効なキャリアである。いくつかの枝分かれ（分岐）ＨＫペプチドを合成し、細胞内へのｓｉＲＮＡのキャリアとして検査した。ｓｉＲＮＡキャリアとして検査したこれらのＨＫペプチドの代表が図１に示されている。図２では、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内で発現されるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）を標的とするｓｉＲＮＡの送達におけるこれらＨＫキャリアの効率を比較した。４つのターミナルブランチを備えたキャリアは、Ｈ３Ｋ４ｂがやや例外と言える程度で、特にｓｉＲＮＡの有効なキャリアではなかった。とりわけ、プラスミドの有効なキャリアであるＨ２Ｋ４ｂなどのペプチドは、ｓｉＲＮＡのキャリアとしての効果はなかった。８つのターミナルブランチを有するＨ３Ｋ８ｂポリマーは、細胞内標的を約８０％減少させるという点でｓｉＲＮＡの最も有効なキャリアであった。他のＨＫポリマーと比較すると、Ｈ３Ｋ８ｂポリマーは、より高度に枝分かれし、最も高い割合のヒスチジンと最も低い割合のリジンとを有している。Ｈ３Ｋ８ｂは、Ｈ２Ｋ４ｂと比較して、プラスミドのトランスフェクションの効率が約１／５であった。β−ガラクトシダーゼ染色によって、β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂが、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内のβ−ガラクトシダーゼ活性を顕著に抑制することが確認された（図３）。
【０１０６】
β−ガラクトシダーゼの発現を減らすＨ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ比もまた決定された。比は、約０．５：１から約６：１（ｗｔ：ｗｔ）、または約３：１から約６：１の間で異ならせた（図４）。３：１のｗｔ：ｗｔ比は、約１．７Ｎ（＋）：Ｐ（−）比に対応する。次に、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞のβ−ｇａｌ染色が、β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）によって著しく抑制されることがわかった（図３）。さらに、β−ガラクトシダーゼを安定して発現するＣ６細胞株では、β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂが、β−ガラクトシダーゼの発現を約６０％抑制した。
【０１０７】
実施例３
【０１０８】
Ｈ３Ｋ８ｂ媒介ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの送達によるルシフェラーゼ活性の著しい抑制。
本発明者は、次に、悪性の細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ４３５細胞中のトランスフェクトされたルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを輸送する際のＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）の効率を決定した（図５）。これらの細胞を、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、Ｈ３Ｋ４ｂ、またはＤＯＴＡＰのキャリアのうちの１つと複合したルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡと、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔと複合したルシフェラーゼ発現プラスミドとで同時にトランスフェクトした。この結果によると、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ複合体が最も有効で、Ｈ３Ｋ８ｂ：β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡのコントロールと比較すると、約９０％のルシフェラーゼ活性を抑制した。したがって、β−ガラクトシダーゼを発現するＳＶＲ−ｂａｇ４細胞において、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の同時トランスフェクション実験において、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）が、ｓｉＲＮＡの最も有効なキャリアであった。
【０１０９】
実施例４
【０１１０】
いくつかの細胞株では、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）媒介ｓｉＲＮＡ送達が極めて効果的である。
ｓｉＲＮＡの有効なキャリアとしてのＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のメカニズムを決定するために、３つの細胞株（ＳＶＲ−ｂａｇ４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＣ６細胞）におけるＨ３Ｋ４ｂ（＋ＲＧＤ）：ｓｉＲＮＡ複合体の取り込みを検査した。その後、これらの細胞を、ＤＯＴＡＰ（キャリア（ｍｇ）／ｓｉＲＮＡ（ｍｇ）比で４：１の比）、リポフェクタミン（４：１）またはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（４：１）と複合したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。図６に示されるように、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）キャリアを有するｓｉＲＮＡの蛍光は、ＤＯＴＡＰおよびリポフェクタミンのグループよりもはるかに強かった。さらに、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）によって細胞内に送達されたｓｉＲＮＡの蛍光は、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨＫ４ｂを含む他のＨＫキャリアよりも大きかった（データは示さず）。３つの細胞株において、Ｈ３Ｋ８ｂによって送達されたＣｙ３標識ｓｉＲＮＡは、個別的蛍光集中(discrete foci of fluorescence)および核周囲分布(perinuclear distribution)を示した。ＨＫキャリアによるｓｉＲＮＡの取り込みは所望の効果に相関している。
【０１１１】
Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：ｓｉＲＮＡ複合体に見られる最小毒性。
トランスフェクトされたＳＶＲ−ｂａｇ４細胞集団をＹＯ−ＰＲＯ−１およびＰＩ色素で染色した後、アポトーシス細胞は緑色の蛍光を示し、死細胞は赤色および緑色の蛍光を示し、生存細胞はほとんどまたは全く蛍光を示さなかった。β−ｇａｌ ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：ｓｉＲＮＡが４：１ｗｔ／ｗｔの比）は、アポトーシスおよび／または細胞死が最小限の未処理の細胞（図７）と比較して、最小の毒性を示した。オリゴフェクタミンおよびリポフェクタミン２０００を含むｓｉＲＮＡの他のキャリアは、細胞に対して著しく有毒であった（図７）。トランスフェクションの重複実験では、細胞集団を生存細胞グループ（Ｖ）、アポトーシス細胞グループ（Ａ）および死細胞グループ（Ｎ）に分類した。未処理細胞については、生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞の割合はそれぞれ、９５．７９、１．６５および１．７５であった。Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体については、生存細胞、アポトーシス細胞および死細胞の割合はそれぞれ、９１．９９、２．２２および１．３９であった。したがって、ＨＫ：ｓｉＲＮＡ複合体からの（による）アポトーシスおよび／または細胞死は、約５％未満であった。データは、３回の実験の平均値を表している。
【０１１２】
実施例５
【０１１３】
Ｈ３Ｋ８ｂのドメイン。
ある実施形態において、発明者は、ｓｉＲＮＡの送達を補助する、Ｈ３Ｋ８ｂ内のいくつかのドメインを明らかにした。すなわち、１）ｓｉＲＮＡと結合しうるターミナルブランチ（例えば、ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）、２）ヒスチジンに富むコア（Ｈ８）および３）インテグリン結合ドメインである。インテグリン結合リガンド（＋ＲＧＤ）をＨ３Ｋ８ｂに付与すると、ｓｉＲＮＡの送達および有効性が向上する。これら、ｓｉＲＮＡインポートに潜在的に重要な領域を調べるために、本発明者は、Ｈ３Ｋ８ｂのドメインを改変したいくつかのＨＫポリマーを合成した（例えば図９を参照のこと）。−ＲＧＤをＨ３Ｋ８ｂに付与すると（例えば、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ））、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内におけるｓｉＲＮＡの有効性がわずかに向上し（図１０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内においては、ｓｉＲＮＡキャリアとしてＨ３Ｋ８ｂと比べて、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）には、ｓｉＲＮＡの有効性において２０％の向上が見られた。いくつかのアミノ酸をＨ３Ｋ８ｂまたはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のターミナルブランチから削除すると、ｓｉＲＮＡの輸送性ポリマーの有効性は最小限の低下（およそ２５％）を示した。したがって、ｓｉＲＮＡを運ぶＨ３Ｋ８ｂのターミナルブランチの長さを短くすることにおいては許容性がある。
【０１１４】
１つのリジンを各ターミナルブランチ（ポリマーにつき８つの追加リジン）に追加すると、ｓｉＲＮＡキャリアとしての枝分かれ（分岐）ＨＫポリマーの有効性が著しく低下する。
【０１１５】
別の実施形態では、Ｈ８ドメインをグリシンと置換した。その結果、ｓｉＲＮＡの効率が約１／３に下がることが示された。
【０１１６】
Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体の最適な比（ｗｔ：ｗｔ）は、約２：１と約４：１の間であった。特に、Ｈ３Ｋ８ｂは、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内へのｓｉＲＮＡのキャリアとして、オリゴフェクタミンよりも優れていた。
【０１１７】
実施例６
【０１１８】
ＨＫ：ｓｉＲＮＡ複合体の大きさおよびゼータ電位。
本発明者は、次に、β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂおよびＨ２Ｋ４ｂの大きさおよびゼータ電位を比較した。Ｈ３Ｋ８ｂがｓｉＲＮＡの有効なキャリアであったのに対し、Ｈ２Ｋ４ｂはｓｉＲＮＡの有効なキャリアではなかった。特筆すると、Ｈ３Ｋ８ｂポリマーもＨ２Ｋ４ｂポリマーも両方ともインテグリンリガンドであるＲＧＤを欠いていた。表１に見られるように、Ｈ３Ｋ８ｂ複合体の大きさは、Ｈ２Ｋ４ｂ複合体よりもやや小さかった。
【表１】
2008520209.tif 000003
【０１１９】
プラスミドＤＮＡ（１２μｇ）と複合したＨＫポリマー（４８μｇまたは９６μｇ）を、トランスフェクション複合体と同様にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（３００μｌ）中で調製した。ポリプレックスを３０分間置いた後、約９５０μｌのＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ７．５、２０ｍＭ）を加えた。大きさと表面電荷をＮ４プラスサブミクロン粒径分析器とＤｅｌｓａ４４０ＳＸゼータ電位分析器とを用いて、それぞれ測定した。各データ点は、３つの測定値の平均値を表している。
【０１２０】
生理ｐＨでヒスチジンが電荷をほとんど有していない、ヒスチジン：リジン比において、よりヒスチジンが多い比において、生理ｐＨ下ヒスチジンが電荷をほとんど有していない場合、Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体のゼータ電位は、Ｈ２Ｋ４ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体と比べて低かった。２：１の比で調製されたＨ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体と、４：１の比で調製されたＨ２Ｋ４ｂ：ｓｉＲＮＡ複合体のゼータ電位値は同程度であるが、ｓｉＲＮＡを送達する能力は著しく異なっていた。さらに、Ｈ３Ｋ８ｂ：ｓｉＲＮＡの比を変えることによってゼータ電位は正から負へと変わる一方、種々の電荷のこれら複合体によるｌａｃＺ  ｍＲＮＡの抑制は同程度であった。Ｈ３Ｋ８ｂポリマー：β−ｇａｌ  ｓｉＲＮＡ複合体には、２：１から６：１（ｗ／ｗ）の比が最良であり、細胞内のβ−ｇａｌレベルを同様に抑制した。
【０１２１】
実施例７
【０１２２】
Ｈ３Ｋ８ｂの１つまたは複数のドメインを変更したいくつかのポリマーが合成された。Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）はインテグリンリガンドＲＧＤを加える。（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、各ターミナルブランチに単一のリジンを加える。Ｈ３Ｋ（Ｇ）８ｂ（＋ＲＧＤ）は、ヒスチジンリッチドメインを（Ｇで表されている）単一のグリシンと置換している。（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂまたは（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、各ターミナルブランチからアミノ酸を取り去っている。これらのＨ３Ｋ８ｂの改変が図９に概略的に描かれている。実線でつながれた３つの黒塗り丸は、３つのリジンコアを表している。Ｋは、２つのターミナルブランチを結合するリジンを表している。
【０１２３】
インテグリンリガンドを含有するＨ３Ｋ８ｂの有効なアナログ（類似体）であるＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、細胞内のβ−ｇａｌ発現を著しく抑制することができた。さらに、ルシフェラーゼ標的ｓｉＲＮＡと複合したＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内のルシフェラーゼ発現を抑制することが明らかになった。その標的を抑制するのに最適な濃度で、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：ｓｉＲＮＡ複合体の毒性は最小である。これに対し、オリゴフェクタミンやリポフェクタミン２０００といったｓｉＲＮＡのキャリアは、より著しく有害であった。
【０１２４】
（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のターミナルブランチへの単一リジン付与ることや、Ｈ３Ｋ（Ｇ）８ｂ（＋ＲＧＤ）中におけるヒスチジンリッチドメイン（Ｈ８）をグリシンと置換することは、ｓｉＲＮＡのキャリアとしてのこれらのポリマーの能力を著しく低下させた。
【０１２５】
図１０に示されたデータは、３つの実験、すなわち、**Ｐ＜０．０１において、未処理対オリゴフェクタミン、対Ｈ３Ｋ８ｂ、対（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ、対Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）および対（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、**Ｐ＜０．０１において、オリゴフェクタミン対Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）または（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）（ボンフェローニ検定の多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）における平均値±Ｓ．Ｄ．を表している。ＨＫポリマー対ｓｉＲＮＡおよびオリゴフェクタミン対ｓｉＲＮＡの比は、それぞれ、４：１および２：１（ｗ／ｗ）であった。
【０１２６】
図１０に示されているように、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）は、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞へのｓｉＲＮＡのキャリアとしてオリゴフェクタミンおよびリポフェクタミン２０００と比較してより好ましかった。Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）およびリポフェクタミン２０００はｓｉＲＮＡのキャリアとして、それぞれβ−ｇａｌを８１．９±０．１％または７４．２±０．４％減少させた（Ｐ＝０．０５３、マンホイットニーの順位和検定）。
【０１２７】
本発明は、特定の実施形態およびその応用という形で記載されてきたが、本発明の精神と範囲から逸脱せずに数多くの改修および改変がなされ得る。添付の特許請求項の範囲は、記載した特定の実施形態に限定されない。
【図１】
2008520209.tif 000004
【図２】
2008520209.tif 000005
【図３】
2008520209.tif 000006
【図４】
2008520209.tif 000007
【図５】
2008520209.tif 000008
【図６】
2008520209.tif 000009
【図７】
2008520209.tif 000010
【図８】
2008520209.tif 000011
【図９】
2008520209.tif 000012
【図１０】
2008520209.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月6日(2007.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記輸送性ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の配列またはそのサブセグメントを有する少なくとも１つのターミナルブランチを含む、請求項２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
前記ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の配列またはそのサブセグメントを有する少なくとも１つのターミナルブランチを含む、請求項１６に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
図１．ＨＫポリマーの概略的な構造。図１は、Ｈ３Ｋ８ｂなど、本発明に係る幾つかのＨＫポリマーを包含する、本明細書で論ずるＨＫポリマーの概略的な構造を描いている。図中、実線でつながれた３つの黒塗り丸は、各ポリマーの３−リジンコアを表している。点線は、ポリマー内を重要なドメインまたはグループ（基）に分けている。高度に枝分かれしたポリマーであるＨ３Ｋ８ｂでは、上記リジンコアから外側に向かって、（１）４つのヒスチジンに富む（ヒスチジンリッチ）ドメイン（Ｈ８：ＨＨＨＨＮＨＨＨＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、（２）（Ｋで表される）４つのリジン、および（３）Ｒで示される８つのターミナル（末端）ＨＫブランチ（出現順にそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８および２０〜２２）の順序である。ブランチが少ないポリマー（Ｈ３Ｋ４ｂ、Ｈ２Ｋ４ｂおよびＨＫ４ｂ）では、上記３−リジンコアから出るターミナルＨＫブランチは４つである。本願を通して、「Ｈ３Ｋ８ｂ」という用語は、インテグリンリガンド、すなわちＲＧＤのない、図１で描かれた構造を意味している。同様に、「Ｈ３Ｋ８ｂ（−ＲＧＤ）」という用語は、ＲＧＤのない構造を意味している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
図９．Ｈ３Ｋ８ｂの重要なドメイン。Ｈ３Ｋ８ｂの重要なドメインを決定するために、３つのドメインのうちの１つまたはそれ以上のドメインが改変されたいくつかのポリマーが合成された。すなわち、（＋Ｋ）Ｈ３Ｋ８ｂは、各ターミナルブランチに単一のリジンを加える。（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂは、各ターミナルブランチから４つのアミノ酸を取り除く。Ｈ３Ｋ（Ｇ）８ｂは、ヒスチジンリッチドメインをグリシンと置換する。Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）はインテグリンリガンド、すなわちＲＧＤを有している。図９は、これらのポリマーの構造を描いている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２０、２３および２４が出現順にそれぞれ示されている）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明に係るヒスチジンおよびリジンを含む輸送性ポリマーは、１つまたは複数のＨＫキャリアを含んでいる。ＨＫキャリアは、ｓｉＲＮＡを輸送するのに効果的で、例えば、６個から１０個のターミナルブランチを有するポリマーを含んでいる。ある実施形態によると、本発明の輸送性ポリマーは、８個のターミナルブランチとヒスチジンリッチドメインとを含んでいる。ある実施形態によると、輸送性ポリマーは、−ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の配列またはそのサブセグメントを有するターミナルブランチを含んでいる。本発明に係る輸送性ポリマーの非限定的な例として、Ｈ３Ｋ８ｂおよびその構造上のアナログ（例えば、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）、１つまたは複数の他のリガンドを含んだＨ３Ｋ８ｂ、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ、（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）など）から選ばれる１つまたは複数のポリマーが含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ｓｉＲＮＡ輸送に効果的であろうＨＫポリマーの多数のパターンが分離され、作り出され、考察された。４つのブランチを有するポリマーのうち、ターミナルブランチのＨＨＨＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の繰り返しパターン（例えばＨ３Ｋ４ｂ）は、ＨＨＫの繰り返しパターン（例えばＨ２Ｋ４ｂ）またはＨＫの繰り返しパターン（例えばＨＫ４ｂ）よりも効果的にｓｉＲＮＡの取り込み量を増加させるように思われる（このようなポリマーの構造とその有効性を描いた図１および図２を参照のこと）。その結果、本発明者は、高度に枝分かれしたＨ３Ｋ８ｂおよびＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）を構成する際に同様のパターンを採用し、このことがｓｉＲＮＡのキャリアを調製するのに極めて効果的であることを突き止めた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
Ｈ３Ｋ８ｂは８つのターミナルブランチを有し、高い割合でヒスチジン、低い割合でリジンを有している。ＨＨＫと比較すると、ＨＨＨＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）パターンは、ヒスチジンの割合が高いため緩衝能力が高まり、リジンの割合が低いために結合が弱まる。酸性エンドソームコンパートメントを中和するターミナルブランチ中のヒスチジンの数が増えると、エンドソーム溶解（endosomal lysis）が可能となり、エンドソームからのＤＮＡの放出ができよう。同様に、Ｈ３Ｋ８ｂ内のヒスチジンリッチドメインは、ポリマーの緩衝（中和）能力を高めることによって、サイトゾル送達（cytosol delivery）を増大させることが期待されよう。それにもかかわらず、ヒスチジンリッチドメインを、グリシンまたは先端が欠損したヒスチジンリッチドメイン（−ＨＨＫＨＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）と置換することによって、ＨＫポリマーがｓｉＲＮＡに無効なキャリアとなった。先端欠損のヒスチジンリッチドメインを有するＨＫポリマーが、前記グリシンを有するポリマーと同様に有効でないことは、ヒスチジンリッチドメインの緩衝（中和）能力がこのドメインの主要なメカニズムではないようであることを示唆している。さらに、これらの結果によると、高度に枝分かれしたＨＫペプチドの全てのドメイン（ターミナルブランチおよびヒスチジンリッチドメイン）が、有効なｓｉＲＮＡキャリアの開発に重要であることを示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
以下は、本発明の範囲内のある化合物の命名の例である。この命名は、有機化合物に対する国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の命名法に基づいている。
Ｈ３Ｋ８ｂ：
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）：
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］− （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］（ＲＧＤ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）
（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂ
［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
Ｋ［（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）２（ＫＨＨＨＨＮＨＨＨＨＨ）］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
Ｈ３Ｋ８ｂとＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のターミナルブランチは、配列（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を含んでいる。（−ＨＨＨＫ）Ｈ３Ｋ８ｂのターミナルブランチは、配列（ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を含んでいる。高度に枝分かれしたポリマーのターミナルブランチおよび／またはそのコアに、安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはヒドロキシプロピルメチルアクリルイミド（ＨＰＭＡ））および／または標的リガンドが、任意で加えられてもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本発明に係るｓｉＲＮＡの非限定的な例は、Ｒａｆ−１配列である５'−ＡＡＵＧＵＣＣＡＣＡＵＧＧＵＣＡＧＣＡＣＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を標的にするｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの他の形態も本発明によって包括される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
ｓｉＲＮＡ：該ｓｉＲＮＡ二重鎖はカッコ内の標的と併せて以下の通りである。１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ、センス ５'−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびアンチセンス５'−Ｕ  ＣＧＡ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＣＡＧ  ＣＣＵ  ＡＡＧ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）（標的５'−ＣＴＴ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＴＣＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４））並びに、２）β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）ｓｉＲＮＡ、センス５'−ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＵＧ  ＡＡＵ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）およびアンチセンス５'−ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＵＧ  ＡＡＴ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）（標的５'−ＡＡＣ  ＡＧＵ  ＵＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＵＧＡ  ＡＵＧ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７））。ｓｉＲＮＡのインポートの調査には、Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ（センス５'−ＣＧＵ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＡＡＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ−ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびアンチセンス５'−Ｔ  ＣＧＡ  ＡＧＵ  ＡＵＵ  ＣＣＧ  ＣＧＵ  ＡＣＧ−ｄＴｄＴ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））がＤａｒｍａｃｏｎから購入された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
Ｈ３Ｋ８ｂのドメイン。
ある実施形態において、発明者は、ｓｉＲＮＡの送達を補助する、Ｈ３Ｋ８ｂ内のいくつかのドメインを明らかにした。すなわち、１）ｓｉＲＮＡと結合しうるターミナルブランチ（例えば、ＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨＫＨＨＨ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、２）ヒスチジンに富むコア（Ｈ８）および３）インテグリン結合ドメインである。インテグリン結合リガンド（＋ＲＧＤ）をＨ３Ｋ８ｂに付与すると、ｓｉＲＮＡの送達および有効性が向上する。これら、ｓｉＲＮＡインポートに潜在的に重要な領域を調べるために、本発明者は、Ｈ３Ｋ８ｂのドメインを改変したいくつかのＨＫポリマーを合成した（例えば図９を参照のこと）。−ＲＧＤをＨ３Ｋ８ｂに付与すると（例えば、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ））、ＳＶＲ−ｂａｇ４細胞内におけるｓｉＲＮＡの有効性がわずかに向上し（図１０）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内においては、ｓｉＲＮＡキャリアとしてＨ３Ｋ８ｂと比べて、Ｈ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）には、ｓｉＲＮＡの有効性において２０％の向上が見られた。いくつかのアミノ酸をＨ３Ｋ８ｂまたはＨ３Ｋ８ｂ（＋ＲＧＤ）のターミナルブランチから削除すると、ｓｉＲＮＡの輸送性ポリマーの有効性は最小限の低下（およそ２５％）を示した。したがって、ｓｉＲＮＡを運ぶＨ３Ｋ８ｂのターミナルブランチの長さを短くすることにおいては許容性がある。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008520209000001.app
【国際調査報告】
2008520209.tif 000014
2008520209.tif 000015
2008520209.tif 000016
2008520209.tif 000017