(57)【要約】  本発明は、金属イオンを液体から除去したり、酵素若しくは免疫原を発現するバイオレメディエーションにおける様々な目的に役立つフラゲリンベースの融合タンパク質（ＦＢＦＰ）、ＦＢＦＰをコードする核酸、核酸を含むベクター及びベクターを含む宿主細胞を提供する。更に、本発明はグラム陽性細菌細胞で、特にバチルス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）で異種ポリペプチドの過剰発現及び表面提示を得るための方法を提供する。また、本発明は、組換えＦＢＦＰをその表面で発現することに役立つ遺伝子破壊細菌を特徴とする。ＦＢＦＰの作製に役立つ遺伝子構築物及びＦＢＦＰの使用方法もまた、本発明に含まれる。
2008521431.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌フラゲリンタンパク質の全部又は一部であって、該フラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域を含むその一部と、
該フラゲリンタンパク質の可変部の中の又はそれを置換する異種ポリペプチド配列とを含む、融合タンパク質であって、
グラム陽性細菌細胞によって産生される場合、グラム陽性細菌細胞の表面で過剰発現される能力を有する、上記融合タンパク質。
【請求項２】
前記異種ポリペプチドは金属イオンに結合する能力を有するポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記金属イオンはニッケル、銅、カドミウム、プラチナ、パラジウム、チタン、銀及び金からなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記異種ポリペプチドはポリヒスチジン配列である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリヒスチジン配列は６ヒスチジン残基を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記異種ポリペプチドは酵素又は酵素の機能性断片である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記酵素はリパーゼ酵素である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リパーゼ酵素はＧ．サーモレオボランス（Ｇ．ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）リパーゼＡである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記酵素は加水分解酵素である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記酵素はアミラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ及びセルラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記異種ポリペプチドは免疫原である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記異種ポリペプチドのＮ末端基の１から１５のリンカー残基Ｎ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドのＣ末端基の１から１５のリンカー残基Ｃ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドのＮ末端基の切断可能な部位Ｎ末端及び異種ポリペプチドのＣ末端基の切断可能な部位Ｃ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
前記核酸配列は転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合される、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１９】
原核細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
細菌細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
グラム陽性細菌細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
Ｂ．ハロジュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）種のものである、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
２００５年１１月２３日にＮＣＩＭＢにアクセション番号＿＿で寄託した菌株ＢｈＦＣ０４のものである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１８に記載の細胞を培養すること、及び培養物から融合タンパク質を得ることを含む、融合タンパク質の作製方法。
【請求項２６】
細菌フラゲリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部であって、該フラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域をコードするヌクレオチドを含むそのコード配列の一部と、
該フラゲリンポリペプチドの可変部をコードする配列へ挿入されるかそれを置換する、少なくとも１つの制限酵素部位を含むヌクレオチド配列とを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記細菌フラゲリンはバチルスのフラゲリンである、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２８】
前記バチルスフラゲリンはＢ．ハロジュランスフラゲリン（配列番号１）である、請求項２６に記載の構築物。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド１６２及びヌクレオチド６０６の間のいずれかのヌクレオチドの直後に挿入される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３０】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４４１及びヌクレオチド５７０の間のいずれかのヌクレオチドの直後に挿入される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４５９及びヌクレオチド５４０の間のいずれかのヌクレオチドの直後に挿入される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３２】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４５９の直後に挿入される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド５４０の直後に挿入される、請求項２６から２８までのいずれか一項に記載の構築物。
【請求項３４】
グラム陽性細菌細胞の実質的に純粋な培養物であって、かなりの数の該グラム陽性細菌細胞は破壊されたフラゲリン遺伝子を含み、該破壊は機能性フラゲリンの発現を阻止する、上記培養物。
【請求項３５】
前記破壊はポリペプチドをコードしないか又は非機能性フラゲリンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列による、かなりの数の細菌細胞内の内因性遺伝子の置換によるものである、請求項３４に記載の培養物。
【請求項３６】
前記細菌細胞はグラム陽性細菌細胞である、請求項３４又は請求項３５に記載の培養物。
【請求項３７】
前記グラム陽性細菌細胞はバチルス細胞である、請求項３６に記載の培養物。
【請求項３８】
前記バチルス細胞はＢ．ハロジュランス細胞である、請求項３７に記載の培養物。
【請求項３９】
前記Ｂ．ハロジュランス細胞は２００５年１１月２３日にアクセション番号＿＿でＮＣＩＭＢに寄託されたＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ｗｐｒＡ）細胞及びＢｈＦＣ０１（ｈａｇ）細胞から選択される、請求項３８に記載の培養物。
【請求項４０】
前記非機能性フラゲリンポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１４〜２２６が欠けている、請求項３５から３９までのいずれか一項に記載の培養物。
【請求項４１】
破壊されたフラゲリン遺伝子を含むことに加えて、かなりの数の前記細菌細胞の少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子が破壊される、請求項３４から４０までのいずれか一項に記載の培養物。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子の破壊はポリペプチドをコードしないか又は非機能性細胞壁プロテアーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列による、かなりの数の細菌細胞内の内因性遺伝子の置換によるものである、請求項４１に記載の培養物。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子である、請求項４１に記載の培養物。
【請求項４４】
前記破壊は細胞壁プロテアーゼ遺伝子の全てのコード配列の欠失を含む、請求項４１又は請求項４３に記載の培養物。
【請求項４５】
破壊されたフラゲリン遺伝子を含む単離されたグラム陽性細菌細胞であって、該破壊は機能性フラゲリンの発現を阻止する、上記グラム陽性細菌細胞。
【請求項４６】
バチルス属の細菌を遺伝子操作する方法であって、該細菌の染色体内のｈａｇ遺伝子を破壊することを含み、該破壊はその遺伝子による機能性フラゲリンの発現を阻止する、上記方法。
【請求項４７】
細菌はバチルス・ハロジュランス細菌菌株ＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ｗｐｒＡ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
１つ又は複数のプロテアーゼをコードする１つ又は複数の遺伝子を破壊することを更に含み、該破壊はその１つ又は複数の遺伝子による１つ又は複数の機能性プロテアーゼの発現を阻止する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
液体から１つ又は複数の金属イオンを除去する方法であって、
１つ又は複数の金属イオンを含む液体を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることを含み、前記異種ポリペプチドは該１つより多い金属イオンと結合するポリペプチドである、上記方法。
【請求項５１】
前記液体は融合タンパク質をその表面で発現する細菌細胞と接触させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記融合タンパク質は細胞表面ポリペプチドである、請求項５０又は請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
１つ又は複数の金属イオンを該１つ又は複数の金属イオンを含む液体から単離する方法であって、
１つ又は複数の金属イオンを含む液体を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることであって、前記異種ポリペプチドは該１つ又は複数の金属イオンと結合するポリペプチドであり、該接触は該１つより多い金属イオンの融合タンパク質への結合をもたらすこと、及び
該１つ又は複数の金属イオンを融合タンパク質から分離することを含む、上記方法。
【請求項５４】
基質を生成物に変換する方法であって、
酵素基質を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることを含み、前記異種ポリペプチドは該酵素又は該酵素の機能性断片である、上記方法。
【請求項５５】
前記異種ポリペプチドは免疫原である、哺乳類の対象で免疫応答を起こすための調製物の製造における請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項５６】
請求項１に記載の融合タンパク質を含み、哺乳類の対象で免疫応答を起こす方法における使用のための物質又は組成物であって、前記異種ポリペプチドは免疫原であり、該方法は該物質又は組成物の有効量を該哺乳類の対象に投与することを含む、物質又は組成物。
【請求項５７】
請求項１に記載の融合タンパク質を哺乳類の対象に投与することを含み、前記異種ポリペプチドは免疫原である、免疫応答を起こす方法。
【請求項５８】
前記哺乳類の対象はヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項２６に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクターを含むキット。
【請求項６０】
少なくとも１つの制限酵素を更に含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記発現ベクターが複製することができる細胞である宿主細胞を更に含む、請求項５９又は請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
異種ポリペプチドをコードする核酸配列を前記ＤＮＡ構築物へ挿入するための説明書を更に含む、請求項５９から６１までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
グラム陽性菌の細胞表面に結合したポリペプチドの産生方法であって、請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸を有する宿主細胞を増殖させ、それによって該ポリペプチドの産生を実現させることを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えタンパク質に関し、特に、グラム陽性細菌によって産生される組換えタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌による組換えタンパク質の産生は、最も一般的にはグラム陰性菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で実施される。グラム陽性菌中で組換えタンパク質及びペプチドを産生する方法を開発する必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明者らは、それらの表面でフラゲリン及びフラゲリンアミノ酸配列内の様々な異種ポリペプチドのいずれかから構成される融合タンパク質を産生及び発現するように形質転換された、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３４８で寄託されているグラム陽性バチルス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）ＡＬＫ３６細菌の菌株を開発した。これらの組換え細菌は、組換え細菌細胞の表面で、高レベルの安定した可溶性組換えタンパク質を産生する。それらは、フラゲリンをコードするヌクレオチド配列、及び、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を挿入することができる、フラゲリンをコードするヌクレオチド配列内の部位を含む遺伝子構築物も開発した。本発明は、本発明のフラゲリンに基づく融合タンパク質（ＦＢＦＰ）を産生するために適当な修飾された細菌系統、その融合タンパク質の作製に役立つ構築物、ＦＢＦＰ、ＦＢＦＰをコードする核酸、核酸を含むベクター、ベクターを含む細胞、ＦＢＦＰを発現する形質転換された細菌系統、並びにＦＢＦＰを作製及び使用する方法を特徴とする。
【０００４】
より詳しくは、本発明は細菌細胞の実質的に純粋な培養物を特徴とし、そのかなりの数は破壊されたフラゲリン遺伝子を含み、破壊は機能性フラゲリンの発現を阻止する。本発明は、破壊されたフラゲリン遺伝子を含む単離された細菌細胞も含み、破壊は機能性フラゲリンの発現を阻止する。両方の場合とも、破壊は、ポリペプチドをコードしないか又は非機能性フラゲリンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列による、かなりの数の細菌細胞内の内因性遺伝子の置換によるものであってよい。細菌細胞は、グラム陽性細菌細胞、例えばＢ．ハロジュランス細胞などのバチルス細胞でよい。細胞は、菌株ＢｈＦＣ０１（ｈａｇ）のものでよい。非機能性フラゲリンポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１４〜２２６を欠くことができる。
【０００５】
破壊されたフラゲリン遺伝子を含むことに加えて、かなりの数の細菌細胞又は単離された細菌細胞の少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子を破壊することができ、破壊は、ポリペプチドをコードしないか又は非機能性細胞壁プロテアーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列による、かなりの数の細菌細胞内の内因性遺伝子の置換によるものでよい。細菌細胞は、上で列記されたものでよい。少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子でよく、破壊としては細胞壁プロテアーゼ遺伝子の全コード配列の欠失を挙げることができる。細胞は、２００５年１１月２３日にＮＣＩＭＢにアクセション番号＿＿で寄託した、ＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ｗｐｒＡ）細胞でよい。
【０００６】
本発明の他の態様は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌を遺伝子操作する方法である。この方法は細菌の染色体内のｈａｇ遺伝子を破壊することを含み、破壊はその遺伝子による機能性フラゲリンの発現を阻止する。バチルス細菌は、バチルス・ハロジュランス細菌でよい。
【０００７】
この方法は１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼをコードする１つ又は複数の遺伝子を破壊することを更に含むことができ、破壊はその１つ又は複数の遺伝子による１つ又は複数の機能性細胞壁プロテアーゼの発現を阻止する。１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼ遺伝子としては、ｗｒｐＡ遺伝子を挙げることができる。
【０００８】
また、本発明は、細菌フラゲリンタンパク質の全部又はフラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域を含むその一部と、フラゲリンタンパク質の可変部の中の又はそれを置換する異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を包含する。細菌細胞によって産生される場合、融合タンパク質は細菌細胞の表面で発現される能力を有する。異種ポリペプチドは、金属イオンに結合する能力を有するポリペプチドでよい。金属イオンはニッケル、銅、カドミウム、プラチナ、パラジウム、チタン、銀又は金でよく、異種ポリペプチドはポリヒスチジン配列でよい。ポリヒスチジン配列は、６ヒスチジン残基を含むことができる。
【０００９】
更に、異種ポリペプチドは酵素又は酵素の機能性断片であることができる。酵素は、リパーゼ酵素、例えばＧ．サーモレオボランス（Ｇ．ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）リパーゼＡであることができる。酵素は、加水分解酵素、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ又はセルラーゼであることができる。更に、異種ポリペプチドは抗原でよい。
【００１０】
融合タンパク質は、異種ポリペプチドのＮ末端基のＮ末端の１から１５のリンカー残基を、及び／又は異種ポリペプチドのＣ末端基のＣ末端の１から１５のリンカー残基を更に含むことができる。融合タンパク質は、異種ポリペプチドのＮ末端基のＮ末端及び異種ポリペプチドのＣ末端基のＣ末端に、切断可能な部位を含むこともできる。
【００１１】
本発明は、上記の融合タンパク質をコードする核酸、核酸配列を含むベクター、例えば核酸配列が転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合したベクター、及びベクターを含む単離細胞も提供する。細胞は、細菌細胞などの原核細胞でよい。細菌細胞は、バチルス属の細胞、例えばＢ．ハロジュランス種の細胞などのグラム陽性細菌細胞でよい。細胞は、２００５年１１月２３日にＮＣＩＭＢにアクセション番号＿＿で寄託した、ＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ｗｐｒＡ）菌株のものでよい。
【００１２】
他の態様では、本発明は融合タンパク質を作製する方法を包含する。この方法は、上記の融合タンパク質をコードし、ＴＲＥに作動可能に結合した核酸を含むベクターを含む細胞を培養すること、及び培養物から融合タンパク質を得ることを含むことができる。
【００１３】
また、本発明は、細菌フラゲリンポリペプチドのコード配列の全部又はフラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域をコードするヌクレオチドを含むコード配列の一部と、フラゲリンポリペプチドの可変部をコードする配列へ挿入されるか置換する、少なくとも１つの制限酵素部位を含むヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ構築物を特徴とする。細菌のフラゲリンポリペプチドは、バチルス・フラゲリンポリペプチド、例えばＢ．ハロジュランスフラゲリン（配列番号１）であることができる。構築物では、ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド１６２及びヌクレオチド６０６の間の任意のヌクレオチドの直後に、配列番号１のヌクレオチド４４１及びヌクレオチド５７０の間の任意のヌクレオチドの直後に、又は配列番号１のヌクレオチド４５９及びヌクレオチド５４０の間の任意のヌクレオチドの直後に挿入することができる。
【００１４】
また、本発明は液体から１つ又は複数の金属イオンを除去する方法を提供する。この方法は、１つ又は複数の金属イオンを含む液体を本発明の融合タンパク質と接触させることを含むことができ、融合タンパク質中の異種ポリペプチドは、１つ又は複数の前記金属イオンに結合するポリペプチドである。液体は、融合タンパク質を発現する細菌細胞と接触させることができる。或いは、融合タンパク質は無細胞ポリペプチドであることができる。
【００１５】
本発明の他の方法は、１つ又は複数の金属イオンを含む液体から１つ又は複数の金属イオンを単離するためのものである。その方法は、１つ又は複数の金属イオンを含む液体を本発明の融合タンパク質と接触させることであって、融合タンパク質中の異種ポリペプチドは、１つ又は複数の金属イオンに結合するポリペプチドであり、接触はもう１つの金属イオンの融合タンパク質への結合をもたらすこと、及び、１つ又は複数の金属イオンを融合タンパク質から分離することを含むことができる。
【００１６】
本発明の他の態様は、基質を生成物に変換する方法であって、酵素基質を本発明の融合タンパク質と接触させることを含み、融合タンパク質中の異種ポリペプチドは酵素基質のための酵素又はその酵素の機能性断片であり、それにより前記基質を前記生成物に変換する方法である。
【００１７】
本発明は、哺乳類の対象で免疫応答を起こすための調製物の製造における、本発明の融合タンパク質の使用も包含する。
【００１８】
本発明は、哺乳類の対象で免疫応答を起こす方法における使用のための物質又は組成物に更に関し、前記物質又は組成物は本発明の融合タンパク質を含み、前記方法は前記物質又は組成物の有効量を前記哺乳類の対象に投与することを含む。
【００１９】
また、本発明は免疫応答を起こす方法も包含する。この方法は、本発明の融合タンパク質を哺乳類の対象に投与することを含むことができ、融合タンパク質中の異種ポリペプチドは免疫原である。哺乳類の対象は、例えば、ヒトであることができる。
【００２０】
本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含む発現ベクターを含むキットも提供する。このキットは、更に、少なくとも１つの制限酵素、その中でベクターが複製することができる細胞である宿主細胞、及び／又は、異種ポリペプチドをコードする核酸配列をＤＮＡ構築物へ挿入するための説明書を含むことができる。
【００２１】
長さ又は翻訳後修飾に関係なく、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は互換的に用いられ、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【００２２】
本明細書で使用するように、ポリペプチドに適用される用語「単離した」は、天然の対応物を有さないか、それに天然に附属する成分、例えば細菌細胞成分などの微生物細胞成分から分離若しくは精製された、ポリペプチドを指す。一般的に、ポリペプチドは、それが自然界で結合するタンパク質及び他の天然の有機分子の乾燥重量で少なくとも７０％が取り除かれている場合、「単離された」とみなされる。好ましくは、本発明のポリペプチド（又はそのペプチド断片）の調製物は、それぞれ乾燥重量で本発明のポリペプチド（又はそのペプチド断片）の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％である。したがって、例えば、ポリペプチドＸの調製物は、乾燥重量でポリペプチドＸの少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％である。化学合成されるポリペプチドは本来自然界でそれに附属する成分から分離されるので、その合成ポリペプチドは「単離される」。更に、本発明のＦＢＦＰなどの融合タンパク質は自然界に存在しないので、それらは常に「単離される」。
【００２３】
本発明の単離されたポリペプチドは、例えばポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、又は化学合成によって得ることができる。それの自然界での発生源と異なる細胞系で産生されるポリペプチドは、自然界でそれに附属する成分を必然的に含まないので、「単離される」。単離又は純度の程度は任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析で測定することができる。
【００２４】
単離されたＤＮＡなどの「単離された核酸」は、（１）任意の天然の配列のそれと同一でない配列を含む核酸、又は（２）天然の配列（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を有する核酸との関連で、関心の核酸を含む遺伝子が自然界で見られる生物のゲノム内で関心の核酸を含む遺伝子に連結する遺伝子の少なくとも１つを含まない核酸である。この用語は、したがって、ベクターに、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルスに、又は、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換え核酸を含む。また、この用語は別個の分子、例えば、対応するゲノムＤＮＡがイントロンを含むことができ、したがって異なる配列を有することができるｃＤＮＡと、フランキング遺伝子の少なくとも１つが欠けたゲノム断片と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生されてフランキング遺伝子の少なくとも１つが欠けたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの断片と、フランキング遺伝子の少なくとも１つが欠けた制限断片と、非天然のタンパク質、例えば与えられたタンパク質の融合タンパク質、突然変異タンパク質又は断片をコードする核酸と、ｃＤＮＡ又は天然の核酸の変性変異体である核酸とを含む。更に、それは雑種遺伝子、すなわち非天然の融合タンパク質をコードする遺伝子の部分である、組換えヌクレオチド配列を含む。単離されたＤＮＡは、例えば制限酵素消化反応混合物又は電気泳動ゲルスライス中の、例えばｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡ制限酵素消化物中の、数百から数百万の他のＤＮＡ分子に存在するＤＮＡを意味しないことは、前述したことから明らかである。
【００２５】
本明細書で使用するように、「作動可能に結合した」は、発現制御配列（転写又は翻訳の調節エレメント）が効果的に関心のコード配列の発現を制御するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
【００２６】
核酸又は遺伝子及び特定の細胞に関して本明細書で使用する用語「内因性」は、自然界で見られるような特定の細胞で見られる（及びそれから得られる）任意の核酸又は遺伝子を指す。
【００２７】
別に定義されていなければ、本明細書で使われる技術用語及び科学用語の全ては、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。紛争事件では、定義を含めた本明細書が優先するだろう。本発明の実施又は試験においては本明細書で記載されているものと類似又は同等の方法及び物質を使用できるが、以下においては好ましい方法及び物質が記載される。本明細書で言及した全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体において参照により組み込まれる。本明細書で開示される物質、方法及び実施例は、例示のためだけであり、限定することを目的とはしない。
【００２８】
バイオレメディエーション又はバイオマイニング（ｂｉｏｍｉｎｉｎｇ）に役立ち、免疫原としても役立つＦＢＦＰなどの本発明の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の様々な態様を以下に記す。
フラゲリンに基づく融合タンパク質（ＦＢＦＰ）
本発明は広範囲の目的に役立つＦＢＦＰを特徴とする。ＦＢＦＰは、細菌のフラゲリンタンパク質の全部又は一部と、そのフラゲリンタンパク質の可変部を置換するか又はその内部にある異種ポリペプチド配列とを含む。ＦＢＦＰはそれを作る細菌細胞の表面へ輸送され、その上で発現される能力を有する。本明細書で使用するように、「細菌細胞の表面で発現される」タンパク質は、その細菌の細胞壁に直接、又は間接的に結合する（例えば細菌の鞭毛の成分であるタンパク質）か、細胞壁に取り込まれるタンパク質である。いずれにせよ、タンパク質の全部又は一部は細菌細胞の外側に露出して、細菌細胞の外部の適当な物質、例えば金属イオン、酵素基質、又は、免疫系の細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球（ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、若しくは抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ、単球、かみ合う樹状細胞（本明細書では樹状細胞と称する）及びＢリンパ球の上の受容体と相互作用することができる。
【００３０】
ＦＢＦＰのフラゲリン部分は任意の細菌フラゲリンでよいが、好ましくはグラム陽性細菌のフラゲリンである。関心のグラム陽性細菌の属としては、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）があるが、これらに限定されるものではない。バチルス属の細菌は、特に興味がある。有用種としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ若しくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、又は、ストレプトマイセス菌株、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、又はラクトコッカス菌株、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓがある。
【００３１】
特に役立つ種はＢ．ハロジュランスであり、そのフラゲリンは図７で示すアミノ酸配列（配列番号２）及び図３で示すコード配列（配列番号１）を有するものでよい。ＦＢＦＰのフラゲリン部分は、フラゲリン分子全体又はフラゲリン分子の一部を含むことができる。実施例２で記載されるように、異なる細菌からのフラゲリン分子は、Ｎ末端及びＣ末端保存領域並びに内部可変部を含む、比較的高い相同性の領域を有する。関心の任意の細菌フラゲリンのアミノ酸配列を実施例２で言及するものの１つ若しくは複数と、又は配列番号２と整列させることにより、当業者は関心のフラゲリン内のどこにこれらの３領域が位置するかを決定することができる。
【００３２】
ＦＢＦＰは、例えば、タンパク質の可変部の全部又は一部を欠くことができる。２７２アミノ酸のポリペプチドであるＢ．ハロジュランスのフラゲリン（配列番号２）では、可変部はアミノ酸５４からアミノ酸２０２に位置し、それはそのコード配列（配列番号１）のヌクレオチド１６２から６０６に対応し、また、Ｎ末端及びＣ末端の保存領域はその可変部のいずれかの側にある（すなわち、それぞれ配列番号２のアミノ酸１〜５３及びアミノ酸２０３〜２７２であり、配列番号１のヌクレオチド１〜１６１及び６０７〜８１６に対応する）。フラゲリン配列にこれらの修正を加える際に必要である全ては、ＦＢＦＰが細菌細胞で作製される場合は細菌細胞の表面へ運ばれてそこで発現される能力を有するということである。
【００３３】
本発明のＦＢＦＰに役立つ異種ポリペプチドは、（ａ）ＦＢＦＰのフラゲリン由来部分がそれから得られた特定のフラゲリン、及び（ｂ）その特定のフラゲリンの部分以外の任意のポリペプチドでよい。それは関心のフラゲリンタンパク質の可変部の全て又は一部を置換することができるか、又は、それは無傷の可変部に挿入することができる。可変部の一部を置換する場合は、可変部アミノ酸の最高で１４８（例えば最高で１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３又は２）を削除することができる。異種ポリペプチドは任意の長さでよいが、好ましくは５〜４５０（例えば５〜４５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１０〜４５０、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、２０〜４５０、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜１００、２０〜５０、２０〜４０又は２０〜３０）アミノ酸の長さである。
【００３４】
更に、異種ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、又は両端には、異種ポリペプチドをフラゲリン由来の配列から分離する「リンカー」アミノ酸が存在してもよい。これらのアミノ酸は、異種ポリペプチドが適当な三次元構造をとることを可能にする部分として切断可能な部位（下記参照）として挿入することができ、及び／又は、それらはＦＢＦＰを組換えで作製するために用いる遺伝子構築物中の適当な制限部位の含有を反映する（下記参照）。そのようなリンカーは、長さが１〜２０（例えば、１〜１５、１〜１２、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３又は１〜２）アミノ酸でよい。
【００３５】
ＦＢＦＰ内の異種ポリペプチドのいずれかの末端上の切断可能な部位は、任意選択にリンカーからの残基を含む異種ポリペプチドをＦＢＦＰから切除して、その切除された形態で用いることを可能にする。ＦＢＦＰを化学的に作製する場合、多くの切断可能な架橋剤（例えば二官能基の切断可能な架橋剤）が当技術分野で公知であり、それらを含めることができた。或いは、ＦＢＦＰを組換えで作製する場合、他の切断可能な部位をＦＢＦＰに「組み入れる」ことができる。化学的切断法の例では、異種ポリペプチドのいずれかの末端での（Ｎ末端及びＣ末端のすぐ近くで、又は末端から１つ又は複数のリンカー残基によって分離して）単一のメチオニン残基の挿入を利用する。異種ポリペプチドは、次に、臭化シアンを使って容易に切断することができる。第２の例は、異種ポリペプチドのいずれかの末端（メチオニン残基に関して記載した位置）での単一のシステイン残基の使用、及び以降のＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）を用いた切断の使用である。酵素切断は、特定のアミノ酸配列を認識することができる酵素活性のあるエンドプロテアーゼを利用する。一例は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘを認識するＥｎｄｏ  Ａｒｇ  Ｃシステインプロテアーゼであり、Ｘは任意のアミノ酸でよい。この方法は、したがって異種ポリペプチドの片側への２つのアミノ酸の付加を必要とする。他の例は、配列Ｌｙｓ−Ｘを認識するＥｎｄｏ  Ｌｙｓ  Ｃセリンプロテアーゼであり、Ｘは任意のアミノ酸でよい。ここでも、２つのアミノ酸を異種ポリペプチドの片側の末端に加える必要がある。異なる酵素的及び化学的切断の方法の様々な組み合わせを用いて、全ての不要なアミノ酸を確実に除去することができる。
【００３６】
異種ポリペプチドは、又は１つ又は２つのリンカーが使用される場合は、異種ポリペプチド及びリンカーは、配列番号２のアミノ酸５４〜２０２の間の任意のアミノ酸の直後に、配列番号２のアミノ酸１４７〜１９０の間の任意のアミノ酸の直後に、配列番号２のアミノ酸１５０〜１８４の間の任意のアミノ酸の直後に、又は配列番号２のアミノ酸１５３〜１８０の間の任意のアミノ酸の直後に挿入することができる。例えば、異種ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１５３又は１８０の直後に挿入することができる。関心のフラゲリンが配列番号２（Ｂ．ハロジュランスのアミノ酸配列）と異なるアミノ酸配列を有する場合、当業者は関連するアミノ酸配列を配列番号２と整列させることによって、配列番号２に関して上記したそれらに対応するそのフラゲリン中のアミノ酸を予測することができ、したがって、異種ポリペプチドを挿入する適当な位置を、又は１つ又は２つのリンカーを使用する場合は関心の異種ポリペプチド及びリンカーを挿入する適当な位置を予測することができる。更に、フラゲリンコード配列の全体未満が構築物に含まれる場合、配列番号２に関して上記したそれらに対応する位置を、当業者は容易に確認することができる。
【００３７】
本発明は、ＦＢＦＰのフラゲリン部分又は異種ポリペプチド部分で保存的置換を有するＦＢＦＰも特徴とする。保存的置換は、一般に下記群内の置換を含む：グリシン及びアラニン、バリン、イソロイシン及びロイシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン、リシン、ヒスチジン及びアルギニン、並びに、フェニルアラニン及びチロシン。各部分は、多くても３０（例えば、多くて２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１）の保存的置換しか含まない。
【００３８】
上で示したように、配列に上の修正のいずれかを加える際に必要である全ては、ＦＢＦＰが細菌細胞で作製される場合は細菌細胞の表面へ運ばれてそこで発現される能力を有することである。
【００３９】
関心の異種ポリペプチドとしては、それらには限定されないが、バイオレメディエーション、バイオマイニング、酵素媒介基質転換において、様々な哺乳動物のいずれかで免疫応答を活性化するための免疫原として役立つもの、治療又は予防の方法及び治療用途で用いる物質若しくは組成物として免疫原調製物を調製するのに有用なものがある。
【００４０】
バイオレメディエーションは、液体（例えば飲用水）を固形基質の上に流して有害物質（例えば重金属のイオン又は原子）をそれに結合させることによって有害物質を液体から除去し、その液体を動物（例えばヒト）が摂取しても安全であるようにする過程である。バイオマイニングは、液体中の有用な及び／又は貴重な金属のイオン又は原子の固形基質への結合、及び以降の固形基質からの金属原子又はイオンの回収を含む。目的がいずれであれ、ある金属結合ポリペプチドを用いることができる。これらの方法は下で更に説明される。本発明のＦＢＦＰへ異種ポリペプチドとして組み込むことができる関連するポリペプチドとしては、様々な重金属、有用金属、貴金属及び／又は有害金属のイオンに結合することが知られているものがある。関連する金属としては、ニッケル（Ｎｉ）、カドミウム（Ｃｄ）、金（Ａｕ）、プラチナ（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、チタン（Ｔｉ）、銅（Ｃｕ）及び銀（Ａｇ）などがあるが、これらには限定されない。したがって、例えば、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ、例えばヘキサヒスチジン）ポリペプチドは、Ｃｄ、Ｎｉ及びＣｕと結合することが示された。更に、Ａｇはアミノ酸配列ＮＰＳＳＬＦＴＹＬＰＳＤ（配列番号２０）を有するポリペプチドに結合することが示された。Ｐｄは、アミノ配列ＣＳＶＴＱＮＫＹＣ（配列番号２１）、ＣＳＰＨＰＧＰＹＣ（配列番号２２）及びＣＨＡＰＴＰＭＬＣ（配列番号２３）を有するポリペプチドと結合することが示された。Ｐｔは、アミノ酸配列ＣＤＲＴＳＴＷＲＣ（配列番号２４）、ＣＱＳＶＴＳＴＫＣ（配列番号２５）及びＣＳＳＳＨＬＮＫＣ（配列番号２６）を有するポリペプチドと結合することが示された。Ｔｉはアミノ酸配列ＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ（配列番号２７）を有するポリペプチドに結合することが示された（Ｋｒｉｐｌａｎｉ及びＫａｙ（２００５），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：４７０−４７５）。したがって、これらの全てのポリペプチドは、本発明のＦＢＦＰ中の異種ポリペプチドとして用いることができる。
【００４１】
所望の生成物へのある基質の（例えば発酵槽内での）大量変換に役立つ様々な酵素（又はそのような酵素の機能性断片）を、異種ポリペプチドとして本発明のＦＢＦＰへ挿入することもできる。関連する酵素としては、アミラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ及びセルラーゼなどの加水分解酵素があるが、これらに限定されるものではない。特に興味があるのは、実施例８で記載されているようなリパーゼ酵素である。酵素の「機能性断片」は、成熟した完全長酵素より短く、その基質をその関連する生成物に変換する完全長の野生型酵素の能力の少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％又はそれ以上）の能力を有する酵素断片である。
【００４２】
哺乳動物（下記参照）で免疫応答を誘導することに役立つ免疫原性ポリペプチドも、異種ポリペプチドとして用いることができる。そのようなポリペプチドは、成熟した完全長ポリペプチド又はそのようなポリペプチドのペプチド断片でよい。免疫原性ポリペプチドは、例えば多種多様な感染性の（例えば、細菌、真菌（酵母を含む）、ウイルス若しくは寄生虫（例えば寄生原虫））微生物又は癌細胞のいずれかに由来するものでよい。関連する微生物の例としては、それらには限定されないが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、マイコプラズマ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、ヒト免疫不全ウイルス１及び２、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、肝炎ウイルスＡ、Ｂ及びＣ、ロタウイルス、乳頭腫ウイルス、ＲＳウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス及びサル免疫不全ウイルスがある。関連する微生物タンパク質の例としては、それらには限定されないが、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら（２０００）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２７（４）：３２１−３３２）、熱ショックタンパク質、例えばＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ熱ショックタンパク質６０（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙら（２０００）前掲；Ｍｅｒｔｚら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（３）：１５２９−１５３７）及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ熱ショックタンパク質ｈｓｐ６０及びｈｓｐ７０、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ外膜タンパク（Ｏｒｔｉｚら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（３）：１７１９−１７２３）、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ外表面タンパク質（Ｃｈｅｎら（１９９９）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４２（９）：１８１３−１８２３）、Ｌ．ｍａｊｏｒＧＰ６３（Ｗｈｉｔｅら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７（１７）：２１５０−２１６１（Ｖａｃｃｉｎｅ  １７（２０−２１）；２７５５）で誤って出版された））、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ髄膜炎菌性血清型１５ＰｏｒＢタンパク質（Ｄｅｌｖｉｇら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８５（２）；１３４−１４２）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ３８１の線毛タンパク質（Ｏｇａｗａ，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（５）：３４９−３５８）、大腸菌外膜タンパクＦ（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２５３５−２５４５）、インフルエンザウイルス血球凝集素及びノイラミニダーゼ、レトロウイルス（例えばＨＩＶ）表面糖タンパク質（例えばＨＩＶ  ｇｐ１６０／１２０／４１）又はレトロウイルスｔａｔ若しくはｇａｇタンパク質などがある。
【００４３】
更に、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はＴＡＡのペプチド断片は、異種ポリペプチドとして用いることができる。本明細書で使用するように、「ＴＡＡ」は腫瘍細胞によって発現される分子（例えばタンパク質分子）であり、（ａ）正常細胞で発現されるその対応物と質的に異なるか、又は（ｂ）腫瘍細胞で正常細胞よりも高いレベルで発現される。したがって、腫瘍抗原は正常細胞で発現されるその対応物と異なる（例えば、その分子がタンパク質である場合は１つ又は複数のアミノ酸残基が異なる）ことも、同一であることもある。それは、好ましくは正常細胞によって発現されない。或いは、それは腫瘍細胞においてその腫瘍細胞の正常な対応物よりも少なくとも２倍高い（例えば２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍又は１５，０００倍高い）レベルで発現される。関連する癌の例としては、白血病及びリンパ腫などの血液癌、神経膠星状細胞腫又は神経グリア芽細胞腫などの神経腫瘍、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌又は結腸癌などの胃腸腫瘍、肝癌、膵臓癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌又は陰茎癌などの性尿器腫瘍、骨腫瘍並びに血管腫瘍があるが、これらに限定されるものではない。関連するＴＡＡとしては、それらには限定されないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＭＡＧＥ（メラノーマ抗原）１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、など）、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ  ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（黒色腫ユビキタス変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２〜１０、Ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタインバーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺抵抗性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃ１〜２並びにＫｉ−６７がある。
【００４４】
本発明のＦＢＦＰへ異種ポリペプチドとして組み込むことができる治療用ポリペプチドとしては、それらに限定されないが、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、抗レトロウイルス剤（例えば、ＦＵＺＥＯＮ、ＮＥＵＰＯＧＥＮ）、抗菌性ペプチド（例えば、インドリシン、ブフォリン、ナイシン及びトリゴジン）、心臓血管疾患の治療に役立つポリペプチド（例えば、ネシリチド）、並びに糖尿病の治療に役立つポリペプチド（例えば、リラグルチド及びインシュリノトロピン）がある。必ずではないが一般的に、これらの異種ポリペプチドはＦＢＦＰから切り出され、状況によっては適当な哺乳動物対象（例えばヒト対象又は患者）への投与の前に調製物に製剤化される。
【００４５】
本発明のＦＢＦＰは、当業者に公知の標準的化学的手段で合成することができる。更に、ＦＢＦＰは、適当なＦＢＦＰをコードするヌクレオチド配列を用いて、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術及びｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入（例えば下記実施例で記載される手法）によって産生することができる。当業者に公知の方法を用いて、関連するコード配列及び適切な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９］及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９］で記載されている手法を参照。
【００４６】
本発明のＦＢＦＰは上で記載されるものを含むこともできるが、関連するＦＢＦＰの生存を促進するためにアミノ及び／又はＣ末端への遮断剤の付加によって修飾される。このことは、ペプチド末端が（例えば哺乳類の対象において）プロテアーゼによって分解する傾向がある状況で役立つことがある。そのような遮断剤としては、投与されるペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端残基と結合することができる更なる関連した若しくは関連しないペプチド配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。これは、ペプチドの合成の間に化学的に、又は、当業者が熟知した方法を用いて組換えＤＮＡ技術によって実施することができる。
【００４７】
或いは、ピログルタミン酸などの遮断剤又は当技術分野で公知の他の分子をアミノ及び／若しくはカルボキシル末端残基に結合することができ、又は、アミノ末端のアミノ基若しくはカルボキシル末端のカルボキシル基を異なる部分で置換することができる。同様に、ペプチドは投与の前に薬剤として許容される「担体」タンパク質と、共有結合又は非共有結合で結合することができる。
【００４８】
ＦＢＦＰのアミノ酸配列に基づいて設計されるペプチド様化合物も関心の的である。ペプチド様化合物は、選択されたポリペプチドの三次元高次構造と実質的に同じ三次元高次構造を有する合成化合物である（すなわち「ペプチドモチーフ」）。ポリペプチドモチーフは、必要に応じて機能する能力を有するペプチド様化合物を提供する。ペプチド様化合物は、増加した細胞透過性及び生物学的半減期の延長などの、それらの治療的有用性を強化する更なる特性を有することができる。
【００４９】
ペプチド様物質は、一般的に、部分的又は完全に非ペプチドであるが、そのペプチド様物質がベースにしたペプチドで見られるアミノ酸残基の側鎖基と同一である側鎖基を有する骨格を有する。数種類の化学結合、例えばエステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレン及びケトメチレン結合が、一般的にプロテアーゼ抵抗性のペプチド様物質の構築においてペプチド結合の有用な代替物であることが当技術分野で知られている。
【００５０】
核酸分子
本発明は、本発明の上記ＦＢＦＰをコードする核内分子も特徴とする。これらの核酸分子において、ＦＢＦＰのフラゲリン由来部分をコードする配列、異種ポリペプチド部分をコードする配列及び任意選択のリンカーをコードする配列は、全ての部分が適当な読み枠内にあり、したがって核酸分子によってコードされるＦＢＦＰにおいて、各部分がそれが由来するタンパク質の部分に対応するアミノ酸配列又はそのような配列を有するが任意の修飾を意図的に含むように組み立てられる。当業者は、適当な「インフレーム」核酸分子を構築する方法を知るであろう。
【００５１】
本発明の核酸分子は、関心の任意の異種ポリペプチドを有するＦＢＦＰを作製するために役立つ遺伝子（ＤＮＡ）構築物も含む。遺伝子構築物は、上述のフラゲリンのいずれかのコード配列の全部又は一部、及びフラゲリン可変部（本明細書ではフラゲリンコード配列の可変部とも称する）をコードするコード配列の領域に挿入されたリンカー核酸配列を含む。リンカー核酸リンカー配列として特に役立つものは、少なくとも１つの（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１７、２０更には３０の）連続する及び／又は重なる制限酵素認識／切断部位を含む、多回クローニング部位（ＭＣＳ）である。制限酵素及びそれらの認識／切断配列は当技術分野で公知であり、下記実施例で記載されるものがある。そのようなＭＣＳは、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入のために用いる。その「下流」のヌクレオチド配列が適当なフレームで読まれるように、又は読まれないようにＭＣＳを挿入することができると、理解される。必要なことの全ては、異種ポリペプチドをコードする配列の挿入の後、ＦＢＦＰコード配列全体が正しい読み枠内にあることである。
【００５２】
フラゲリン（又はフラゲリンの一部）がＢ．ハロジュランスのフラゲリンである場合、リンカー核酸配列（ＭＣＳを含む）は配列番号１のヌクレオチド１６２及びヌクレオチド６０６の間の任意のヌクレオチドの直後に、例えば、配列番号１のヌクレオチド４４１及びヌクレオチド５７０の間の任意のヌクレオチドの直後に、配列番号１のヌクレオチド４５０及びヌクレオチド５５２の間の任意のヌクレオチドの直後に、又は、配列番号１のヌクレオチド４５９及びヌクレオチド５４０の間の任意のヌクレオチドの直後に挿入することができる。リンカー核酸配列（ＭＣＳを含む）は、例えば、配列番号１のヌクレオチド４５９又はヌクレオチド５４０の直後に挿入することができる。関心のフラゲリンが配列番号２（Ｂ．ハロジュランスのアミノ酸配列）と異なるアミノ酸配列を有する場合、当業者は関連するアミノ酸配列を配列番号２と整列させることによって、配列番号１に関して上記したそれらに対応するそのフラゲリンのコード配列中のヌクレオチドを予測することができ、したがって、関心のリンカー核酸配列を挿入する適当な位置を予測することができる。更に、フラゲリンコード配列の全体未満が構築物に含まれる場合、配列番号１に関して上記したそれらに対応する位置を、当業者は容易に確認することができる。
【００５３】
本発明は、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）構築物の１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含むキットも提供する。構築物は、通常、発現ベクターに組み込まれる成分として供給される。キットは、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築物に挿入するために、構築物の消化に役立つ１つ又は複数の制限酵素を更に含むことができる。キットは、緩衝液、塩溶液及び／又は関連する制限酵素消化反応のための他の任意の試薬などの、補助的試薬を含むこともできる。更に、キットは構築物に異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を連結するために、リガーゼ酵素（及び、上記補助剤）を含むことができる。更に、キットは遺伝子構築物の発現に役立つ宿主（本明細書で挙げるもののいずれか）を含むことができる。キットは、構築物を１、２の適当な制限酵素で消化する方法、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を構築物に連結する方法、及び／又はそのような連結の後に遺伝子構築物で宿主細胞を形質転換する方法についての説明文書を（例えば、包装材又は添付文書上で）含むこともできる。
【００５４】
本発明のＦＢＦＰをコードする核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はＲＮＡでよく、また、二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス又はアンチセンス鎖）でもよい。これらの分子の部分も本発明の範囲内とみなされ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生すること、又は１つ又は複数の制限酵素による処理によって生成することができる。リボ核酸（ＲＮＡ）分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生することができる。好ましくは、核酸分子は、長さに関係なく通常の生理的条件下で可溶性であるポリペプチドをコードする。
【００５５】
本発明の核酸分子は、天然の配列、又は自然界で見られるものとは異なるが遺伝子コードの変性のために同じポリペプチドをコードする配列を含むことができる。更に、これらの核酸分子はコード配列に限定されず、例えば、それらはコード配列の上流又は下流にある非コード配列の一部又は全てを含むことができる。
【００５６】
本発明の核酸分子は、（例えば、ホスホラミダイトをベースにした合成によって）合成することができ、又は、原核生物（例えばバチルス細菌若しくは大腸菌などの細菌）の細胞などの生物細胞から得ることができる。この種の核酸内のヌクレオチドの組み合わせ又は修飾体も包含される。
【００５７】
本発明の単離された核酸分子は、自然状態ではそのようではない部分を包含する。したがって、本発明はベクター（例えば、プラスミド又はウイルスのベクター）に、又は異種細胞のゲノム（又は、同種細胞の染色体内の自然界で見られる場所以外の位置のゲノム）に組み込まれる組換え核酸分子を包含する。組換え核酸分子及びその使用は、更に下で議論される。
【００５８】
本発明は、（ａ）前述の配列（コード配列部分を含む）及び／又はそれらの相補体（つまり「アンチセンス」配列）のいずれかを含むベクター（下記参照）、（ｂ）コード配列の発現を指示するのに必要な１つ又は複数の転写及び／又は翻訳調節エレメント（ＴＲＥ：その例は下で示す）に作動可能に結合した前述の配列（コード配列部分を含む）のいずれかを含む発現ベクター、（ｃ）ＦＢＦＰに加えて、ＦＢＦＰとは無関係な配列、例えばＦＢＦＰと融合したレポーター、マーカー又はシグナルペプチドをコードする発現ベクター、並びに（ｄ）前述の発現ベクターのいずれかを含むので本発明の核酸分子を発現する遺伝子操作された宿主細胞（下記参照）も包含する。
【００５９】
上で言及し更に以下に記すＴＲＥとしては、それらには限定されないが、誘導可能な及び誘導可能ではないプロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び当業者に公知であり原核生物で遺伝子発現を誘起又はさもなければ調節する他のエレメントがある。そのような調節エレメントとしては、それらには限定されないが、バチルス温度ファージＳＰＯ２からクローン化されたプロモーター断片（Ｓｃｈｏｎｅｒら，（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２２：４７−５７）、ショ糖誘導可能なｓａｃＢプロモーター（Ｌｅｅら，（２０００），Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：４７６−４８０）、枯草菌からのｖｅｇｌプロモーター（Ｌａｍら，（１９９８），Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６３：１６７−１７７）、ａｐｒＥプロモーター（Ｏｌｍｏｓ  Ｓｏｔｏ及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ−Ｆｌｏｒｅｓ，（２００３）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６２：３６９−３７３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのＡｍｙＱプロモーター（Ｗｉｄｎｅｒら，（２０００），Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：２０４−２１２）、及び温度感受性Ｃ１調節プロモーター系（Ｓｃｏｆｉｅｌｄら，（２００３），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３３８５−３３９２）がある。特に興味があるのは、Ｂ．ハロジュランスフラゲリン（ｈａｇ）遺伝子の天然のプロモーターであるＤプロモーターである（Ｓａｋａｍｏｔｏら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：２１５９−２１６６）。
【００６０】
宿主細菌細胞は、宿主細胞によって発現される又は発現されるべきＦＢＦＰのフラゲリン由来の配列が得られた又は得られない種又は属と、同じ種又は属のものでよい。宿主細胞及びフラゲリン由来の配列は、好ましくは同じ属であり、より好ましくは同じ種である。
【００６１】
更に、本発明は微生物の実質的に純粋な培養物（例えば細菌細胞などの微生物細胞）を提供する。本明細書で使用するように、微生物の「実質的に純粋な培養物」は、その培養物中の微生物の総生細胞（例えば細菌細胞）数の約４０％未満（すなわち約３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％未満、又は更にそれ以下）がその微生物以外の微生物生細胞である、その微生物の培養物である。これに関連する用語「約」は、関連する百分率が特定された百分率の上下１５％であってもよいことを意味する。したがって、例えば約２０％は、１７％から２３％であることができる。そのような微生物の培養物は、微生物及び増殖培地、保存培地又は輸送培地を含む。培地は液体、半固体（例えばゼリー状の培地）又は凍結されていてもよい。培養物は、液体培地中で若しくは半固体培地中／上で増殖する細胞、又は、凍結保存培地若しくは輸送培地を含む、保存培地若しくは輸送培地で保存又は輸送される細胞を含む。培養物は、培養容器又は保存容器又は基質中にある（例えば、培養用の皿、フラスコ若しくは管、又は保存用のバイアル若しくは管）。
【００６２】
本発明の微生物細胞は、例えば凍結乾燥細胞として、グリセリン又はショ糖などの凍結保護物質を含む緩衝液中で、凍結細胞懸濁液として保存することができる。或いは、それらは例えば、流動床乾燥又は噴霧乾燥、又は他の任意の適当な乾燥方法により得られる乾燥細胞調製物として、保存することができる。同様に、活性を保持するために、酵素製剤は凍結、凍結乾燥又は固定して、適当な条件で保存することができる。
【００６３】
本発明は、本発明のＦＢＦＰの作製方法も提供する。そのような方法では、その細胞が形質転換される発現ベクターを発現し、コードするヌクレオチド配列が１つ又は複数の転写及び／又は翻訳調節エレメントに作動可能に結合される細胞（本明細書で記載されるもののいずれか）が培養される。ＦＢＦＰが次に得られる（例えば、培養物から回収される）。培養物からの取得又は回収は、細胞又は培地からのＦＢＦＰの単離を含むことができる。本発明のＦＢＦＰは、それらを組換えで発現する細胞からフラゲリンチャンネルを通して活発に分泌され、最大で２００００モノマーの鎖の状態で細胞表面に付着したままであるが、そこでは、例えば機械的分断によって、それらは細胞表面から培地中に活発に分離されることができる。
【００６４】
遺伝子破壊細胞
本発明の細胞のある種の実質的に純粋な培養物の相当数において、また、ある種の単離細胞において、内因性フラゲリン遺伝子はそれがフラゲリンタンパク質をコードしないように、又はそれが非機能性フラゲリンをコードするように破壊されている。本明細書で使用するように、「培養物中の相当数の細胞」は、培養物中の細胞の少なくとも６０％（例えば、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、更には１００％）である。本明細書で使用するように、「非機能性フラゲリン」は、それを産生する細胞の表面へ輸送することができないフラゲリン、及び／又はそれを産生する細胞の表面上で発現することができないフラゲリンである。非機能性フラゲリンポリペプチドの例は、アミノ酸１４〜２２６が欠けているＢ．ハロジュランスフラゲリンである（実施例４を参照）。そのような細胞は、ＦＢＦＰをコードする発現ベクターで形質転換の後に、それらの表面で本発明のＦＢＦＰを産生及び発現するための宿主細胞として役立つ。内因性の遺伝子を破壊する方法は当技術分野で公知であり、一般に相同組換えを含む。特に役立つ方法は、実施例４で記載される強制的統合方法又はその変異体である。
【００６５】
機能性フラゲリン遺伝子を欠いていることに加えて、上記培養物の細胞の相当数（上記参照）及び単離細胞は、上記方法によって破壊された細胞壁プロテアーゼをコードする１つ又は複数の遺伝子を有することができる。細胞壁プロテアーゼ遺伝子の破壊の結果、関連する細胞壁プロテアーゼが産生されなくなるか、又は非機能性細胞壁プロテアーゼが産生される。本明細書で使用するように、「非機能性細胞壁プロテアーゼ」は、関連する野生型細胞壁プロテアーゼのタンパク分解活性の２０％未満（例えば、１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０１％未満、又は０％）の活性を有するものである。１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼ遺伝子を破壊することによって、細胞の形質転換で用いた発現ベクターによってコードされるＦＢＦＰの、関連した破壊細胞の表面での発現レベルを増加させることができる。そのような遺伝子の一つは、ｗｒｐＡ遺伝子である（実施例７を参照）。他のプロテアーゼ遺伝子としては、中でもａｐｒ、ａｌｐ、ｖｐｒ、ａｐｒ  Ｘが挙げられる。細胞は、本明細書で再引用する属、種及び菌株のいずれかの細菌細胞でよい。機能性フラゲリン遺伝子を欠き、細胞壁プロテアーゼ遺伝子のコード配列を欠く細菌細胞の例は、Ｂ．ハロジュランスの菌株ＢｈＦＣ０４である（実施例７を参照）。
【００６６】
ＦＢＦＰを使う方法
上で指摘したように、ＦＢＦＰは、それらには限定されないが、バイオレメディエーション、バイオマイニング、酵素媒介基質転換において、様々な哺乳動物のいずれかで免疫応答を活性化するための免疫原として役立つことができる。したがって本発明は、バイオレメディエーション、バイオマイニング、酵素媒介基質転換を実施する方法、治療法又は予防法において用いる物質又は組成物としての免疫原性調製物の調製での使用、及び哺乳類の対象における免疫応答の活性化における使用を特徴とする。
【００６７】
バイオレメディエーション及びバイオマイニング
上で示したように、バイオレメディエーション及びバイオマイニングは、水又は産業有毒廃水又は金及びプラチナ鉱山などの鉱山からの流出水などの流体を、流体中の適当な金属のイオン又は原子に結合するように適応した固形基質へ曝露させることを含む。バイオレメディエーションの場合、それに結合した金属原子又はイオンを有する固形基質は廃棄されるか、又は金属原子又はイオンを溶出及び廃棄することによって再使用のために処理される。バイオマイニングの場合、金属原子又はイオンは固形基質から分離され、適宜、更に処理される。
【００６８】
本発明のバイオレメディエーション及びバイオマイニング法では、流体は、それらの表面で金属結合異種ポリペプチドを含むＦＢＦＰを発現する細菌（本明細書で列挙したもののいずれか）に曝露させることができる。細菌は生細菌又は死細菌（例えば、加熱殺菌される）でよく、例えば適当な濾過装置に含まれてもよい。或いは、ＦＢＦＰは適当な組換え細菌から単離して、固形基質（例えば金属、プラスチック、セルロース、アガロース又はナイロンなどの合成ポリマー）に結合する（例えば共有結合で）ことができる。固形基質は、例えば、シート、ビーズ、粒子、繊維又はスレッドの形態であり得る。他の代替手段として、異種ポリペプチドをＦＢＦＰから切断、単離して、上に列挙した固形基質の１つに結合することができる。流速を金属原子又はイオンのＦＢＦＰへの最適な結合が起こるように調節して、流体を、細菌のカラム若しくはベッド又はそれに結合したＦＢＦＰ（又は、異種ポリペプチド）を有する基質の上又はその中を通過させる。流体は、金属原子又はイオンのＦＢＦＰへの最適な結合のために、ＦＢＦＰ（又は異種ポリペプチド）と一度、又は必要に応じて複数回、接触させることができる。
【００６９】
バイオレメディエーションでは、流体はその後、その意図するいかなる目的のために、例えば飲料水として、又は関心の工業プロセスのために用いられる。ＦＢＦＰ源は通常廃棄されるか、又は、金属原子又はイオンの除去によって再生されて、再利用することができる。
【００７０】
バイオマイニングの場合、金属原子又はイオンはＦＢＦＰ源から回収される。このことは、ＦＢＦＰを発現する細菌又は単離されたＦＢＦＰを、酸性若しくはアルカリの条件などの加水分解条件に、又はＥＤＴＡなど高濃度の正に荷電したイオンに曝露し、その結果、金属をペプチドから解離し、再単離することによって達成することができる。
【００７１】
酵素媒介基質変換
本発明のこれらの方法において、関心の基質は、エステル又は構成カルボン酸及びアルコールでよい。構成分子は脂肪族、それと組み合わせた芳香族でよく、他の官能基を含むことができる。構成分子はより大きいか小さくてもよく、食品（例えば脂肪酸、メントール）で、又は医薬用の化合物若しくは中間体（例えばナプロキセン、イブプロフェン）で見られるものでよい。リパーゼ及びエステラーゼは、食品及び飲料の加工、バイオレメディエーション又は精密化学物質及び医薬品の合成において用いることができる。後者では、酵素を化学選択性、位置選択性又は立体選択性のために用いることができる。詳細には、リパーゼ及びエステラーゼはしばしばエステルの立体選択的合成又は加水分解に適用され、それによってラセミ混合物からの所望のキラル化合物の分解を可能にする。
【００７２】
この場合、十分な量の生成物が生成された後、反応を停止させて、生成物を反応混合物から抽出又は単離することができる。
【００７３】
この場合、反応の後、例えば酵素を不活性化すること、及び／又は混合物若しくは組成物をＦＢＦＰ源から分離することを含め、組成物又は混合物を所望に従い処理する。
【００７４】
反応は、例えば大容積発酵槽で実行することができる。ＦＢＦＰ（又は、異種ポリペプチド酵素（若しくは、ＦＢＦＰから切断される）は、バイオレメディエーション及びバイオマイニングのためにしたのと同じ形態で用いることができる。したがって、適当なＦＢＦＰ、単離されたＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された異種ポリペプチド酵素をそれらの表面で発現する生細菌又は死細菌は、酵素基質を含む反応混合物に直接加えることができる。或いは、単離されたＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された異種ポリペプチド酵素は、上記固形基質（例えばアガロースビーズ）の１つに結合することができる。任意選択に、また、好ましくは、反応混合物は撹拌されるか、かき混ぜられる。これは例えば、それらの表面にＦＢＦＰを発現する組換え細菌又は固形基質と結合した剤をＦＢＦＰ源として用いる場合に、その細菌又は固形基質を懸濁させておくために実施される。生成物の生成及び／又は基質除去に役立つと予め決められた時間に、生成物及び／又は基質を除去した組成物若しくは混合物はＦＢＦＰ源から分離されて、所望により処理される。或いは、反応を監視し、所望のレベルの生成物及び／又は基質除去が一旦観察されたならば、生成物及び／又は基質を除去した組成物若しくは混合物はＦＢＦＰ源から分離されて、所望により処理される。生成物及び／又は組成物若しくは混合物のＦＢＤＰ源からの分離の前に、任意選択に酵素反応を停止することができる（例えば、熱によって）。
【００７５】
免疫応答活性化法
本発明は、異種ポリペプチドが免疫原性ポリペプチド（上記参照）である本発明の１つ又は複数のＦＢＦＰに、又は、ＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドに免疫系の細胞が曝露させられる、哺乳類の免疫応答を活性化する方法を特徴とする。ＦＢＦＰの場合、免疫系の細胞は単離されたＦＢＦＰ、又はそれらの表面でＦＢＦＰを発現する組換え細菌と接触させることができる。そのような細菌は、生菌、死菌又は弱毒菌でよい。これらの剤によって活性化することができる免疫応答は、例えば、抗体産生（Ｂリンパ球）応答でよい。ＦＢＦＰ（単離されたものか、又は細菌の表面の）は、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩ又はクラスＩＩ制御Ｔ細胞応答を起こすためにペプチドエピトープを抗原提示細胞（ＡＰＣ）に導入することにも役立つ。そのような応答は、一般に、適当なＡＰＣ内で合成されるポリペプチドの処理によって産生されるペプチドエピトープの認識によってのみ起こる。更に、本発明のＦＢＦＰは、ＦＢＦＰが含むペプチドエピトープ（異種ポリペプチドとして）に対する特異性を有する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による溶解のために、標的細胞を感作することにも役立つ。
【００７６】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、又はｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。ＦＢＦＰ又は切断された免疫原性異種ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの適用は、例えば、免疫機構の科学的基礎研究に、又は、Ｔ細胞の機能若しくは例えば受動免疫療法の研究のために用いる活性化Ｔ細胞の産生のために役立つ。
【００７７】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法において、哺乳類の対象から得られたＴ細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋）は、ＦＢＦＰ（単離されたもの、又は細菌、好ましくは死細菌の表面で発現されるもの）及び、必ずしもその必要はないが好ましくは、Ｔ細胞と同じ個体から得られたＡＰＣと一緒に培養される。ＡＰＣが異なる個体から得られた場合は、Ｔ細胞の供与体及びＡＰＣの供与体は、好ましくは、少なくとも１つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子（例えばＭＨＣクラスＩ分子）を共通して発現する。ＡＰＣは、基本的に任意のＭＨＣ分子発現細胞でよい。ＭＨＣクラスＩ制御免疫応答を導き出したい場合は、ＡＰＣはＭＨＣクラスＩ分子（及び、任意選択にＭＨＣクラスＩＩ分子）を発現し、ＭＨＣクラスＩＩ制御免疫応答を導き出したい場合は、ＡＰＣはＭＨＣクラスＩＩ分子（及び、任意選択にＭＨＣクラスＩ分子）を発現する。ＡＰＣは、最適には１つ又は複数の副刺激分子、例えばＢ７ファミリーの分子も発現する。したがって、ＡＰＣは、例えば、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、単球、Ｂ細胞又はこれらの細胞のいずれかに由来する細胞系（クローン若しくは非クローン性）でよい。それらは、適当なＭＨＣ分子をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクション又は形質導入され、それを発現する任意の細胞型（例えば線維芽細胞）でもよい。そのような培養物は、１つ又は複数のサイトカイン又は成長因子、例えば、それらには限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−、腫瘍壊死因子−（ＴＮＦ−）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を補うこともできる。培養物は、ＦＢＦＰ又は切断された免疫原性異種ポリペプチドで必要なだけ「再刺激する」ことができる。培養物は、所望レベルの免疫応答性（例えばＣＴＬ活性）が達成されたかどうかを確かめるために、様々な時間に監視することもできる。
【００７８】
ＦＢＦＰ（及び、ＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチド）は、通常、予防ワクチン又は免疫応答刺激治療法として、治療又は予防の方法における使用のための物質又は組成物として免疫応答を起こすことに、及び、治療又は予防の方法における使用のための免疫原性調製物を調製するために役立つ。したがって、それらは、例えば本明細書で列挙した病原体のいずれかによる感染症に対する免疫原性調製物、ワクチン又は治療剤として用いることができる。免疫原性ペプチドをフラゲリンタンパク質との融合物として投与することも可能である。フラゲリンはアジュバント（処方薬又は溶液におけるような、主成分の作用を促進又は修飾する成分）と同じ効果を示すので、これにより標的生物の免疫原性応答が強化される。アジュバントは、先天性免疫を刺激して、次に適応免疫応答を活性化する能力を有する。フラゲリンはＡＰＣ（上記参照）の活性化を通して炎症性反応を誘導することは、すでに証明されている。一例は、フラゲリンによって強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）融合タンパク質の生成及び提示の成功例である。フラゲリン−ＥＧＦＰ融合物は、ＡＰＣの、更にはＡＰＣ特異的抗ＥＧＦＰＴ細胞応答を刺激することができた。ＥＧＦＰだけでは、ＡＰＣの及びＡＰＣ特異的Ｔ細胞応答を刺激することができなかった（Ｃｕａｄｒｏｓら，２００４，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ  ７２，２８１０−２８１６、ＭｃＳｏｒｌｅｙら，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ  １６９，３９１４−３９１９）。免疫応答を誘導するフラゲリンに挿入された他のペプチドとしては、コレラ毒素サブユニットＢ、Ｂ型肝炎エピトープ、化膿連鎖球菌Ｍタンパク質エピトープ、ＨＩＶエピトープ（ｇｐ４１及びｇｐ１２０）、インフルエンザＡ赤血球凝集素エピトープ、及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ．、ロタウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）及びＭｉｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ外膜タンパク質からの様々な細胞表面抗原がある（Ｓｔｏｃｋｅｒ及びＮｅｗｔｏｎ，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ２，１６７−１７８）。
【００７９】
更に、ＦＢＦＰ（及び、ＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチド）は、癌（例えば、上で引用したもののいずれか）のための有用な治療法となることができ、対象が比較的高い癌のリスクを有する場合（例えばタバコ喫煙者の肺癌又は複数の母斑を有する対象の黒色腫）、適当な融合剤をワクチンとして用いることができる。
【００８０】
本明細書で使用するように、「予防」は疾患の症状の完全な予防、疾患の症状の開始の遅延、又は、後に発達する病徴の重症度の低減を意味する。本明細書で使用するように、「治療」は疾患の症状の完全な消失又は疾患の症状の重症度の減少を意味する。
【００８１】
ＦＢＦＰ（及びＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチド）によって生成される免疫応答は予防的及び／又は治療的であるのが好ましいが、そうである必要はないと理解されている。例えば、ＦＢＦＰ（及び、ＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチド）は、例えば本明細書で引用されているものなどの微生物の抗原又はＴＡＡなどの様々な抗原のいずれかを検出又は精製するために役立つ抗体を生成するための、予防的でも治療的でもない免疫応答に関する科学的基礎研究において用いることができる。
【００８２】
本発明の方法は、広範囲にわたる種、例えばヒト、ヒト以外の霊長類（例えばサル）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラット及びマウスに適用することができる。
【００８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ手法
ｉｎ  ｖｉｖｏの１手法において、ＦＢＦＰ自体、それらの表面でＦＢＦＰを発現する細菌（例えば共生細菌）、又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドが対象に投与される。通常、本発明の融合剤は、薬剤として許容される担体（例えば生理的食塩水）で懸濁されて、経口的若しくは経皮的に投与されるか、又は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、直腸、膣、鼻腔、胃、気管若しくは肺の内部に注射（又は、注入）される。それらは適当なリンパ系組織（例えば脾臓、リンパ節又は粘膜関連リンパ系組織（ＭＡＬＴ））に直接送達することができる。必要な投薬量は、投与経路、製剤の性質、患者の病気の性質、対象の大きさ、体重、表面積、年齢及び性別、他の投与剤並びに主治医の判断によって決まる。単離されたＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドの適当な投薬量は、０．００１〜１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。利用できるＦＢＦＰ（及び、ＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチド）の多様性及び様々な投与経路の異なる効率を考慮すると、広範囲にまたがる必要投薬量が予想される。例えば、経口投与は静脈内注射による投与よりも高い投薬量を必要とすると予想される。当技術分野で理解されるように、これらの投薬量の変更は、最適化のための標準の経験的なルーチンを使用して調節することができる。投与は単回でも多回（例えば２回又は３回、４回、６回、８回、１０回、２０回、５０回、１００回、１５０回、又はそれ以上）でも構わない。適当な送達媒体（例えばポリマー微小粒子又は植込型装置）へのポリペプチドのカプセル化は、送達の効率、特に経口送達の効率を増加させることができる。
【００８４】
或いは、関心のＦＢＦＰをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、動物の適当な細胞に送達することができる。コード配列の発現は、好ましくは、例えばリンパ系組織へのポリヌクレオチドの送達によって、対象のリンパ系組織に向けられる。このことは、例えば、マクロファージなどの食細胞による食作用を最適化するための大きさに調製された、ポリマーの生物分解性微小粒子又はマイクロカプセル送達媒体の使用によって達成することができる。例えば、約１〜１０ｍの直径のＰＬＧＡ（ポリ−ラクト共グリコリド）微小粒子を用いることができる。ポリヌクレオチドはこれらの微小粒子に封入され、それらはマクロファージによって取り込まれて細胞内で徐々に生物分解され、それによりポリヌクレオチドが放出される。一旦放出されると、ＤＮＡが細胞内で発現される。微小粒子の第２の型は、細胞によって直接取り込まれるのではなく、むしろ生分解を通して微小粒子から放出されて初めて細胞に取り込まれる、徐放性核酸貯蔵所の役目を主に果たすためのものである。これらのポリマー粒子は、したがって、食作用を排除するのに十分な大きさでなければならない（すなわち、５ｍより大きく、好ましくは２０ｍより大きい）。
【００８５】
核酸の取り込みを達成する他の方法は、標準の方法によって調製されたリポソームを使う方法である。ベクターは単独でこれらの送達媒体に組み込むことができ、又は、組織特異抗体と一緒に組み込むことができる。或いは、静電気又は共有結合の力によってポリ−Ｌ−リジンに結合したプラスミド又は他のベクターから構成される、分子コンジュゲート体を調製することができる。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドと結合する（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３，４７９）。或いは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球又は樹状細胞特異ＴＲＥなどのリンパ球系組織特異転写調節エレメント（ＴＲＥ）を用いて、リンパ系組織特異的ターゲッティングを達成することができる。リンパ系組織特異ＴＲＥは公知である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，１０４３−１０５３、Ｔｏｄｄら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１６６３−１６７４、Ｐｅｎｉｘら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，１４８３−１４９６）。筋肉内、皮内又は皮下の部位への「裸のＤＮＡ」（すなわち、送達媒体のないＤＮＡ）の送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現を達成する他の手段である。
【００８６】
関連したポリヌクレオチド（例えば発現ベクター）では、イニシエータメチオニン及び任意選択にターゲッティング配列を有する関心のＦＢＦＰをコードする核酸配列は、プロモーター又はエンハンサー−プロモーターの組み合わせに動作可能に結合される。
【００８７】
ポリヌクレオチドは、薬剤として許容される担体で投与することができる。薬剤として許容される担体は、生理的食塩水などの、ヒト又は他の哺乳類の対象への投与に適当な生体適合性媒体である。治療的有効量は、治療した動物で医学的に望ましい結果（例えばＴ細胞応答）を生むことができる、ポリヌクレオチドの量である。医学分野において周知のように、任意の１患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、健康状態、及び並行投与され他剤を含む、多くの因子によって決まる。投薬量は変動するが、ポリヌクレオチドの投与のための好ましい投薬量は約１０６から１０１２のポリヌクレオチド分子である。必要に応じて、この用量を繰り返して投与することができる。投与経路は、上で列挙したもののいずれかで構わない。
【００８８】
ｅｘ  ｖｉｖｏ手法
ｅｘ  ｖｉｖｏの１手法において、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を含むリンパ系細胞を対象から単離して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＢＦＰに曝露させる（上記参照）。リンパ系細胞は一度、又は複数回（例えば、２、３、４、６、８又は１０回）曝露させることができる。リンパ系細胞における免疫活性（例えばＣＴＬ活性）のレベルは、１回又は複数回の曝露の後に試験することができる。所望の活性及びその活性のレベルが一旦達成されたならば、本明細書で列挙した経路のいずれかにより、それらの細胞を対象に再導入する。このｅｘ  ｖｉｖｏ手法の治療的又は予防的効力は、ｅｘ  ｖｉｖｏで活性化されたリンパ球の、例えば感染性微生物、微生物に感染した宿主細胞又は腫瘍細胞に対する中和性又は細胞傷害性影響を直接に、又は間接的に及ぼす能力によって決まる。
【００８９】
代わりのｅｘ  ｖｉｖｏ戦略は、ＦＢＦＰをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで、対象から得られた細胞をトランスフェクション又は形質導入することを含むことができる。トランスフェクション又は形質導入された細胞は、次に対象に戻される。そのような細胞は好ましくはリンパ系細胞であるが、それらには限定されないが、それらが対象内で生存する間は融合タンパク質の供給源の働きをする線維芽細胞、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト又は筋細胞を含めた様々な種類の任意の細胞であってよい。癌の対象では、細胞は癌細胞でよく、例えばそれら自身の癌細胞、又は同じ癌型の細胞であるが他の個体、好ましくは１つ又は複数（例えば１、２、３、４、５若しくは６）のＭＨＣ分子を対象と共有する個体からの細胞でよい。リンパ系細胞の使用は、そのような細胞はリンパ系組織（例えばリンパ節又は脾臓）に戻り、したがってＦＢＦＰが、それらがそれらの影響、すなわち免疫応答の活性化を及ぼす部位で高濃度で生じると予想される点で、特に有利である。この手法を用いて、融合剤をコードするポリヌクレオチドを用いる上記のｉｎ  ｖｉｖｏ手法の場合のように、ＦＢＦＰによる活性ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化が達成される。ｉｎ  ｖｉｖｏ手法のために記載されるのと同じ遺伝子構築物及びシグナル配列を、このｅｘ  ｖｉｖｏ戦略でも用いることができる。
【００９０】
ｅｘ  ｖｉｖｏの方法は、対象から細胞を収集し、細胞を培養し、発現ベクターでそれらを形質導入して、細胞をＦＢＦＰの発現に適当な条件に保つ工程を含む。このような方法は、分子生物学の技術分野において公知である。形質導入工程は、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染及び微粒子銃遺伝子導入を含め、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療のために用いる任意の標準的な手段によって達成される。或いは、リポソーム又はポリマー微小粒子を用いることができる。形質導入に成功した細胞は、次に、例えば、ＦＢＦＰ又は薬剤耐性遺伝子の発現について選択される。所望により、細胞は細胞増殖を抑制する剤（例えば、Ｘ線又は照射又はマイトマイシンＣ）で処理することができ、一般に細胞が癌細胞である場合、（特に対象又は対象とＭＨＣが同一の個体からの癌細胞である）そのように処理される。細胞は、次に患者に注入されるか植え込まれる。
【００９１】
本発明のこれらの方法は、本明細書で列挙される疾患及び種のいずれかに適用することができる。ＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドが、特定の疾患に治療的であるか又は予防的であるかを試験する方法が、当技術分野で公知である。治療効果を試験する場合、疾患の症状を示す試験集団（例えば癌患者）は、上記戦略のいずれかを用いて、試験ＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドで処理される。同じく疾患の症状を示す対照群は、同じ方法を用いてプラセボで処理される。被験者の病徴の消失又は減少は、ＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドが有効な治療剤であることを示す。
【００９２】
病徴の開始の前に同じ戦略を対象に適用することによって、ＦＢＦＰ又はＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドは、予防剤、すなわちワクチンとしての効力を試験することができる。この状況で、病徴の開始の予防が試験される。類似の戦略は、上で列挙した微生物のいずれかが関係するものなど、多種多様な感染症の予防におけるＦＢＦＰ及びＦＢＦＰから切断された免疫原性異種ポリペプチドの効力を試験するのに用いることができる。
【００９３】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、限定するものではない。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンの単離及び配列決定
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１３４８のもとでＮＣＩＭＢ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＩＭＢ社、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１  ９ＹＡ）に寄託されているＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６細菌の一定量を、４２℃のＬｕｒｉａ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）ｐＨ８．５で、最高７２時間までの様々な時間で増殖させた。全ての試料の細胞表面タンパク分画は、細胞（３０ｍｌ）をＳＳ３４管に入れ、７，０００ｒｐｍ（毎分回転数）で１０分間の遠心分離によりペレット化することによって調製した。上清（細胞外分画）の６ｍｌを１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、６ｍｌ）と混合して、１時間撹拌した。タンパク質はガラスＣｏｒｅｘ管に入れて７，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってペレット化し、１００μｌ試料緩衝液（１×）中で再懸濁し、２分間沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルへ加えた。
【００９５】
細胞ペレットは蒸留水（３ｍｌ）及び０．２ＮのＮａＯＨ（３ｍｌ）で再懸濁して、室温で３０分間撹拌した。細胞は７，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化し、上清（６ｍｌ）を１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ、６ｍｌ）と混合して、１時間撹拌した。沈殿した細胞表面タンパク質はガラスＣｏｒｅｘ管に入れて７，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってペレット化し、１００μｌ試料緩衝液（１×）中で再懸濁し、２分間沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルへ加え（１ウェルにつき５０ｇのタンパク質）て、標準の方法を用いて分解した。
【００９６】
高度に発現されたタンパク質は、約３４ｋＤａに対応するバンドに分解した。このタンパク質は、少なくとも７２時間安定して存在していた（図１）。分解したタンパク質分画は次にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上へブロッティングし、クーマシーブルー（５０％（ｖ／ｖ）メタノール中に０．１％のＲ２５０）で２分間染色し、脱色溶液（５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｖ／ｖ）酢酸）中で５分間脱色した。図１レーン４からの約３４ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、ブロッティングされたタンパク質のアミノ酸配列は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）４９１シーケンサをメーカーの説明書に従って用いて、Ｎ末端シークエンシングで決定した。初めの２２のアミノ酸の配列が得られた（図２）。
【００９７】
（実施例２）
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンの生物情報科学的分析
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンのＮ末端から得られた２２のアミノ酸ペプチド配列を用いて、相同タンパク質についてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースをスクリーニングした。このペプチド配列は、現在、Ｂ．ハロジュランスＣ−１２５（Ｔａｋａｍｉら（１９９９），Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５：９４３−９４５）と改名されている好アルカリ性バチルスｓｐ．Ｃ−１２５（Ｓａｋａｍｏｔｏら（１９９２），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：２１５９−２１６６）からのｈａｇ生成物フラゲリンタンパク質のＮ末端とかなりの相同性を示した（図３）。Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンのＮ末端の最初の１２アミノ酸は、Ｂ．ハロジュランスＣ−１２５フラゲリンのＮ末端と９２％の同一性を示した（Ｓａｋａｍｏｔｏら、前掲）。大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８からのフラゲリンタンパク質のアミノ酸配列の更なる比較（ＬａＶａｌｌｉｅら（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３０８５−３０９４）は、この一群のフラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端の領域は配列のかなりの保存を示したので、約３４ｋＤａのＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６タンパク質はフラゲリンタンパク質であり、したがってｈａｇ遺伝子の生成物であると結論された。
【００９８】
（実施例３）
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６遺伝子のＰＣＲ増幅及びクローニング
ｈａｇ遺伝子読取り枠（ＯＲＦ）のクローニング
ｈａｇ遺伝子のＯＲＦは、Ｂ．ハロジュランスＣ−１２５のｈａｇ遺伝子のＮ末端及びＣ末端の領域の保存配列に基づいて、順方向プライマー（Ｆ−ｆｌａｇ、５’ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ３’Ｔｍ＝５８．１℃）及び逆方向プライマー（Ｒ−ｆｌａｇ、５’ＧＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＧＣＴ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＴＣ  ３’Ｔｍ＝６１℃）を用いて、染色体ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（Ｓａｋａｍｏｔｏら，１９９２）。ＰＣＲ反応は、１００μｌの最終容積となるように、ＭｇＣｌ２（２．０ｍＭ）を含む１×ＰＣＲ緩衝液中の、テンプレート染色体ＤＮＡ（１００μｇ／μｌ）、Ｆ−ｆｌａｇ（０．５μｍ／１０μｌ）、Ｒ−ｆｌａｇ（０．５μｌ／１０μｌ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、０．８μｌ／１０μｌ）及び１μｌのＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（５μ／μｌ、Ｒｏｃｈｅ）の最終濃度を含んでいた。ＰＣＲ反応は、適当な最適化を行った標準手順に従ってインキュベートした。ＰＣＲ生成物は低融点アガロースを使って標準のアガロース（１．０％）電気泳動によって分解し、８００ｂｐ（塩基対）に対応するバンドに分解する断片を得た。８００ｂｐバンドを長波ＵＶの下で切除し、ＤＮＡはＢＩＯ  １０１（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（商標）システムを用いてゲルから抽出し、メーカーの説明書に従ってｐＭＯＳＢｌｕｅのＥｃｏＲＶ部位（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、Ｕ．Ｓ．Ａ．からの平滑末端クローニングキット）にクローン化してｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ｆｌｇ）を作製した。
【００９９】
ｐＭＯＳＢｌｕｅ（Ｆｌｇ）を、メーカーの説明書に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）（１．８ｋｖ、２５Ｆ、２００オーム）を用いて大腸菌ＪＭ８３細胞にエレクトロポレーションして、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａ寒天プレート上で平板培養した。青／白の選択のために、３５ｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−−Ｄ−ガラクトピラノシド）（５０ｍｇ／ｍＬ）及び２０ｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（１００ｍＭ）をプレート上に広げた。３７℃で一晩、プレートをインキュベートした。テトラサイクリンは、ＬａｃＺ  Ｍ１５を含む選択可能な表現型が維持され、したがって、表現型を失った非組換え白色コロニーのバックグラウンドが排除されることを確認する。形質転換コロニーを選択してアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬ培地に入れ、３７℃で一晩、振盪させながらインキュベートした。プラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）プラスミド精製キットを使用して抽出し、標準のＴ７及びＵ−１９塩基長プライマーを使ってケープタウン大学（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ、Ｃａｐｅ  Ｔｏｗｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）ＤＮＡ配列決定サービスによって両方向で配列決定された。比較すると、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇ  ＯＲＦは、Ｂ．ハロジュランスＣ−１２５のｈａｇ  ＯＲＦとヌクレオチド配列で１００％の同一性を示した（図４）。
【０１００】
逆ＰＣＲを用いるｈａｇ遺伝子断片のフランキング領域のクローニング
その上流側及び下流側の調節領域を含めて、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇのクローニングを完成させるため、ＯＲＦフランキング領域を逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）で増幅した。ｉＰＣＲのために用いた方法は、Ｏｃｈｍａｎら（（１９９０）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ．Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  Ｍ．Ａ．ら編），ｐ．２１９−２２７．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．）による方法を応用した。コア領域を一度だけ「制限」して容易に増幅することが可能な既知の８００ｂｐ断片に連結する約１ｋｂの断片を生成する制限酵素を特定するために、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６の染色体ＤＮＡを様々な制限酵素で消化した。消化した染色体ＤＮＡは、１％アガロースゲル上で分離し、Ｒｅｅｄら（（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７２０７−７２２１）が記載しているようにＩｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上へブロッティングし、メーカーの仕様書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってＤＩＧ標識８００ｂｐ断片で探索した。ＤＩＧ標識バンドは、化学発光反応（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使って検出した。ブロット（図５）から、最も有望な消化物はＨｉｎｄＩＩＩ（下流領域については）及びＡｃｃＩ（上流領域については）消化物であると結論された。
【０１０１】
逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）のためのプロトコル
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６の染色体消化物（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｃｃＩ）を、１％低融点アガロースゲル上で分離した。電気泳動の後、適当な大きさの断片を含むゲルの領域を、かみそりの刃で切り取った。ゲルスライスは６８℃で２０分間加熱して、アガロースを融解した。ＤＮＡ断片は、１０ｌの融解アガロース、５ｌの１０×ライゲーション緩衝液、３４ｌの蒸留水及び１Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む５０ｌの総反応量中で、単量体環の形成を有利にする条件で再連結した。反応物を１５℃で一晩インキュベートし、６８℃で１５分間加熱することによって終了させた。以下のプライマーを用いて１００ｌのＰＣＲ反応体中で１０ｌのライゲーション混合物を用いた：
【化１】
2008521431.tif 000003
【０１０２】
ＰＣＲ反応は先に述べたように設定し、９４℃で２分間インキュベートし、次に、９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間の３工程サイクルを、合計３５サイクル反復した。７２℃で５分の最終伸長工程が含まれた。
【０１０３】
ｉＰＣＲの完了後、反応生成物を１％アガロースゲル上で分解して、臭化エチジウム染色により可視化した。ゲル（図６）から、約１．１５ｋｂ及び０．９２５ｋｂのＰＣＲ生成物がそれぞれＡｃｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化物で増幅されたことがわかる。ＰＣＲ生成物の大きさは、サザンブロット法から得られた結果とよく相関した。
【０１０４】
ＰＣＲ反応物は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して精製した。得られたＤＮＡは、ＰＣＲ反応のためのプライマーと同じ２つのプライマーによる配列決定のために用いた。ＤＮＡ塩基配列決定は、両方のＰＣＲ断片が正しい上流及び下流領域を含むことを確認した。２つの断片はｐＭＯＳＢｌｕｅベクターにクローン化して、Ｔ７及びＵ１９量体プライマーを使って再び配列決定をした。これにより、ｉＰＣＲ配列決定をされた試料の初期配列が確認された。２つのクローンは、８００ｂｐのコア領域及び下流７９６ｂｐの上流の、９７７ｂｐの新しい配列データを生成した（図７）。これらの配列は、上流側及び下流側両方の調節領域を含むのに十分である。これらの調節領域配列をＢ．ハロジュランスＣ−１２５のそれらと比較して、それらが４つの異なる塩基対だけとかなりの同一性（９９．９％を超える）を示すことがわかった。調節領域を含む完全なｈａｇ遺伝子を図８に示す。
【０１０５】
（実施例４）
内因性Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体フラゲリン遺伝子の不活性化
プラスミドｐＥ１９４（ＤＳＭＺ  ４５５４）を、ドイツ菌株保存機関ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  Ｇｍｂｈ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。プラスミドｐＥ１９４は、黄色ブドウ球菌細菌から単離され、枯草菌細菌に形質転換され、３４℃までの温度で安定して維持されることがわかった。しかし、３７℃より高温では、コピー数は分離によるプラスミド消失で減少する（Ｗｅｉｓｂｌｕｍら（１９７９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３７：６３５−６４３）。４２℃より上ではプラスミドは複製することができず、細胞がクロラムフェニコール上で生存することができる唯一の方法は、プラスミドを染色体に組み込むことによるものである。ｐＥ１９４からの複製起点、ｐＣ１９４からのクロラムフェニコール遺伝子、及び大腸菌複製起点、並びにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）からのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ｐＳＫベクターからの（−ラクタマーゼ）遺伝子だけを用いて、シャトルベクター（ｐＳＥＣ１９４）を作製した。ｐＥ１９４は３７℃より上の温度で不安定で、４３℃を超えると複製することができないので、この特徴を利用してＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６への組込みを推進した。
【０１０６】
全てのＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６菌株は、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ（（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５）によるプロトプラスト形質転換方法を使って形質転換した。
【０１０７】
シャトルベクターｐＳＥＣ１９４の構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ／大腸菌シャトルベクター（ｐＳＥＣ１９４）は、ｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換して、ｐＳＫ  ｏｒｉをｐＥ１９４  ｏｒｉの上へ連結することによって構築した。プラスミドｐＥ１９４は、ＴａｑＩで消化した。ｏｒｉを含む１．３５ｋｂバンドはＣｌａＩ（２．９５９ｋｂ）で消化したｐＳＫに連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂへ形質転換してｐＳＥ１９４を作製した（図９Ａ）。プラスミドｐＪＭ１０３は、元のｐＣ１９４からクロラムフェニコール遺伝子（１．２ｋｂ）を得るために、ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩで消化した（Ｉｏｒｄａｎｅｓｃｕら（１９８０）Ｐｌａｓｍｉｄ  ４：２５６−２６０）。この遺伝子を含む断片は、ＢａｍＨＩ／ＳｍａＩで消化したｐＳＥ１９４へ連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂへ形質転換してｐＳＥＣ１９４を作製した（図９Ｂ）。クロラムフェニコールによるスクリーニングは構築物内の欠失をもたらすので、アンピシリンを含むプレート上で大腸菌の形質転換体をスクリーニングすることが重要であった。しかし、ｐＳＥＣ１９４をＢ．ハロジュランスに形質転換し、クロラムフェニコールをマーカーとして用いたとき、得られたクローンは３０℃〜３４℃で安定して維持された。このベクターは、大腸菌／Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６及び枯草菌の間のシャトルベクターとして、また、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体への関心の遺伝子の組込みのために用いた。
【０１０８】
組込み型ベクターｐＳＥＣ１９４Ｆｌｇ−の構築
不完全な（内因性の遺伝子が破壊される）ｈａｇ遺伝子を、Ｎ末端及びＣ末端のＯＲＦ領域、並びに上流側及び下流側の調節領域の一部だけを用いて構築し、ｐＳＥＣ１９４に連結し、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６に形質転換した。ｐＳＥＣＦｌｇ−の構築において、ｈａｇ遺伝子の大部分の内部領域（図１０Ａ）は削除されている。Ｆｌｇ−断片の構築のために必要とされる２つのＰＣＲ生成物を得るために、以下のプライマーを用いた：
【化２】
2008521431.tif 000004
【０１０９】
ＰＣＲ生成物は適当に最適化した標準手順を用いて得、一緒に連結してｐＢＣＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とし、スリーウェイライゲーションによりＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩで消化してＦｌｇ−断片を得た。次にｐＢＣＦｌｇ−をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化したｐＳＥＣ１９４へクローニングしてｐＳＥＣＦｌｇ−を得た（図１０Ｂ）。
【０１１０】
組込みのために用いたプロトコルは、Ｂｉｓｗａｓら（（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３６２８−３６３５）及びＰｏｎｃｅｔら（（１９９７）Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４４１３−４４２０）によって記載されている２つの異なる方法の組み合わせであった。第１のクロスオーバー（単一のクロスオーバー（ｓｃｏ））事象は、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）を含む２５ｍｌのＬＢ（ｐＨ８．５）内に選択したｐＳＥＣ１９４Ｆｌｇ−を含むＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６形質転換体を、５２℃で１６〜２４時間インキュベートすることによって促進した。得られた細胞懸濁液の連続希釈液を作製して、ＬＡ  Ｌｕｒｉａ寒天（ｐＨ８．５、１０μｌ／ｍｌクロラムフェニコール）及びＬＡ（ｐＨ８．５）プレート上に塗布し、５２℃で一晩インキュベートした。ＬＡ（ｐＨ８．５、１０μｌ／ｍｌクロラムフェニコール）及びＬＡ（ｐＨ８．５）プレート上の増殖を比較して、組込み効率を判定した。ｓｃｏ事象はコロニーＰＣＲで判断した（図１１）。２つのクロラムフェニコール抵抗性クローン４９及び５０を特定し、次にクローン４９を用いて第２のクロスオーバー（二重クロスオーバー（ｄｃｏ））事象を形成した。これは、その後、クロラムフェニコールの非存在下で、２５ｍｌのＬＢ  Ｌｕｒｉａ培地（ｐＨ８．５）に入れたクローン４９を３０℃で２〜２．５時間（対数期）インキュベートすることによって達成された。培養物を希釈してＬＡ（ｐＨ８．５）プレート上へ塗布し、３０℃で一晩インキュベートした。コロニーを２連で拾い、ＬＡ（ｐＨ８．５、１０μｌ／ｍｌクロラムフェニコール）及びＬＡ（ｐＨ８．５）プレート上へ移植した。遺伝子置換が起こったコロニー（ｄｃｏ）はクロラムフェニコール感受性であり、非運動性であった。クロラムフェニコール感受性のコロニーは、非運動性突然変異体についてスクリーニングを行うために、運動性評価プレート（Ｌｕｒｉａプレート、ｐＨ８．５、０．４％寒天＋０．８％ゼラチン）の上へ移植した。非運動性のｄｃｏ突然変異体は、コロニーＰＣＲによりｄｃｏ事象のスクリーニングを行った（図１０）。この変異した非運動性の培養物は、菌株ＢｈＦＣ０１と改名した。二重クロスオーバーはクロラムフェニコール遺伝子の消失を確実にするために必須であって、このことはプラスミド配列の消失も示し、それによって不完全なｈａｇ遺伝子を有し非運動性の表現型（運動性プレート、図１５Ａ）を示すＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６突然変異株ＢｈＦＣ０１（ｈａｇ）が産生される。
【０１１１】
ｄｃｏ事象を示すために、異なるプライマーセットを用いた：
【０１１２】
ＳｉｇＤＦ／ＩｎｖＲプライマーの組み合わせは、無傷のｈａｇ遺伝子が染色体上に存在するならば、３４２ｂｐのＰＣＲ生成物を与えると予測された。
【０１１３】
ＳｉｇＤＦ／ＦｌｉＣＲプライマーセットは、染色体上に存在する不完全（４００ｂｐ）及び無傷のｈａｇ（１．１５０）ｋｂ遺伝子を増幅すると予測された。ＳｉｇＤ／ＩｎｖＲプライマーセットを用いると無傷のコピーが存在することが示された（図１１、プライマーセットＢ、レーン１）が、２つのｓｃｏ事象において不完全なバンドだけが存在することがわかった（図１１、プライマーセットＢ、レーン１及び２）。プライマーは不完全なコピーを優先して増幅するようであった。類似した結果がＡｑｕｉｎｏ  ｄｅ  Ｍｕｒｏら（（２０００）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５１：５４７−５５５）によって報告され、その研究では非常に顕著なバンドが１コピーで観察され、他のコピーでは非常にかすかなバンドが観察された。
【０１１４】
ＳｉｇＤＦ／Ｍ１３Ｒプライマーセットは、ｓｃｏ事象から得られたプラスミドＤＮＡが染色体上に存在するならば、ｈａｇ遺伝子だけを増幅すると予測された。ｄｃｏの後、全てのプラスミドＤＮＡは環から排除され、いかなるＰＣＲ生成物も得られてはならない。これは、観察されたことである（図１１、プライマーセットＣ、レーン３及び４）。ＰＣＲ生成物（ｓｃｏ）の大きさは、Ｎ末端又はＣ末端のクロスオーバーがあったかどうかによって、２．５０７ｋｂ（不完全なｈａｇ）又は３．１７８（無傷のｈａｇ）であると予想された。適当な大きさのバンドが観察された。
【０１１５】
ＵｐＦｏｒ／ＤｏｗｎＲｅｖプライマーセットは、クロスオーバーの位置によって不完全又は完全なｈａｇ遺伝子を増幅すると予想された。予測されたように、Ｎ末端クロスオーバー（不完全なｈａｇ）は１．７３５ｋｂのＰＣＲ生成物を与え（図１１、プライマーセットＤ、レーン１〜３）、Ｃ末端クロスオーバー（無傷のｈａｇ）は２．４０６ｋｂの生成物を与えた（図１１、プライマーセットＤ、レーン４）。ｄｃｏの後、より小さなバンドだけが増幅された。
【０１１６】
ＰＣＲプロファイルから得られた成績は、ｄｃｏ事象が得られる結果フラゲリン突然変異体ＢｈＦＣ０１が得られることを示した。次の工程は、ｐＳＥＣ１９４上のｈａｇ遺伝子の無傷のコピーによる変異の補完により、変異がｈａｇ遺伝子内のものであることを確認することであった。
【０１１７】
（実施例５）
補完研究は、菌株ＢｈＦＣ０１におけるフラゲリン発現の回復を示した
これらの実験で用いたプライマーは、以下のものである：
【化３】
2008521431.tif 000005
【０１１８】
Ｄプロモーター並びにコード配列を含む完全なｈａｇ遺伝子をｐＳＥＣ１９４にクローニングして、菌株ＢｈＦＣ０１へ形質転換した。ゲノムのｈａｇ欠失を遺伝子の複数コピーで補完する能力を評価するために、プラスミドｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣ（無傷のフラゲリンプロモーター及び構造遺伝子を含む）をプロトプラスト形質転換によってＢｈＦＣ０１に導入した。形質転換体を運動性評価プレート上へ楊枝で移すと、それらはｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣを含む菌株ＢｈＦＣ０１の明白な運動を示した（図１５）。実施例１の場合のように菌株ＢｈＦＣ０１から細胞表面タンパク質抽出物を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。約３４ｋＤａに対応するバンドに分解したタンパク質は、菌株ＢｈＦＣ０１形質転換体においてフラゲリンタンパク質発現の回復を示した（図１４Ａ、レーン６）。
【０１１９】
（実施例６）
Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンの可変部のタンパク質モデリング及び融合タンパク質発現ベクターの構築
３Ｄ−ＰＳＳＭ（三次元の、位置特異スコアリングマトリックス）は、一次元及び三次元の配列プロファイルを二次構造及び溶媒和能力情報と組み合わせて用いる、タンパク質折りたたみを認識するための迅速な、ウェブベースの方法である。プロトコルの概要は、雑誌Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２９９：５０１−５２２（Ｋｅｌｌｅｙら、２０００）で見られ、その開示は本明細書でその全体が参照により組み込まれている。Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンの推定上の可変部は、３Ｄ−ＰＳＳＭソフトウェアを使用してモデル化した。タンパク質モデルから、可変部の中でペプチド挿入が可能な５部位を選択した。これらの全部位は、Ｂ．ハロジュランスＦｌｉＣタンパク質の可変部の外部に露出した伸長した鎖及びコイルに位置するか、又はその操作を含む（図１２）。ベクターｐＳＥＣ１９４  ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩを骨格として用いて、５構築物を作製した。
【０１２０】
ＮＣ１構築物はフラゲリン可変部の欠失及び９アミノ酸ペプチドの挿入を含んでいたが、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ５及びＮＣ６構築物は様々な大きさのペプチドの挿入を含んでいた。
【０１２１】
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ１の構築
トランケーションをしたｈａｇ遺伝子（ｐＳＥＣ１９４ＮＣ１）の構築のために、適当な最適化を行った標準手順によるＰＣＲ増幅によりＮ末端及びＣ末端の領域を得るために、ｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣをテンプレートとして用いた。ｐＳＥＣＦｌｉＣをＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、Ｎ末端断片（５６６ｂｐ）を得た。ＦｌｉＣＲ及びＣｔｅｒＦプライマーを用いたＰＣＲ増幅を用いて、Ｃ末端断片（２３２ｂｐ）を得た。
【化４】
2008521431.tif 000006
【０１２２】
Ｃ末端のＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩ／ＤｒａＩで消化して、Ｎ末端断片（ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ）と、スリーウェイライゲーションによりＫｐｎＩ／ＤｒａＩで消化したｐＳＥＣ１９４へ連結した。得られたトランケーションされたフラゲリン（ＦｌｉＣ）タンパク質は、アミノ酸１１４〜２０２で８９アミノ酸の欠失を有する。この欠失は、ＦｌｉＣタンパク質の可変部の大きな領域にわたる。
【０１２３】
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ２の構築
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ２（ＮＣ２）は、読取り枠のヌクレオチド（ｎｔ）６０６の後ろに、１５ｂｐ（５アミノ酸に対応する）多回クローニング部位（ＭＣＳ）インサートを挿入することによって得られた（図１３Ａ）。適当な最適化を行った標準手順を用いて、Ｎ末端領域はプライマーＳｉｇＤＫｐｎ及びＦｌｉＮ−ｔｅｒＲｅｖ（下記参照）を使ってＰＣＲ増幅し、Ｃ末端領域はプライマーＣｔｅｒＦ２及びＤｏｗｎＲｅｖ（下記参照）を使ってＰＣＲ増幅した。全てのＰＣＲ反応のために、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた。
【化５】
2008521431.tif 000007
【０１２４】
Ｎ末端断片は、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで、Ｃ末端断片はＸｈｏＩ／ＳｓｐＩで消化した。ｐＳＥＣ１９４はＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩで消化し、スリーウェイライゲーションの結果ｐＳＥＣ１９４ＮＣ２が得られた。
【０１２５】
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ３の構築
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ３は、インサートの位置（ｎｔ６０６ではなくｎｔ４５９の後）及びインサートの大きさ（９アミノ酸に対応する２７ｂｐ）においてｐＳＥＣ１９４ＮＣ２と異なった（図１３Ｂ）。適当な最適化を行った標準手順に従って、Ｎ末端領域はプライマーＳｉｇＤＫｐｎ及びＶＮＲ２（下記参照）を使ってＰＣＲ増幅し、Ｃ末端領域はプライマーＶＣＦ及びＤｏｗｎＲｅｖ（下記参照）を使って増幅した。両反応のためのテンプレートは、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６ゲノムＤＮＡであった。
【化６】
2008521431.tif 000008
【０１２６】
Ｃ末端のＰＣＲ断片はＳａｌＩ及びＰｓｔＩで消化し、同じ２つの制限酵素で消化したｐＳＫベクターに連結してｐＳＫＣｔｅｒを作製した。Ｎ末端断片はＫｐｎＩだけで消化し（反対側は平滑のまま）、ＨｉｎｃＩＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＳＫＣｔｅｒへ連結してｐＳＫＮＣ３を作製した。この構築物はＫｐｎＩ及びＳｓｐＩで消化してＮＣ３断片を遊離し、これを次にＫｐｎＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化したｐＳＥＣ１９４と連結してｐＳＥＣ１９４ＮＣ３を得た。
【０１２７】
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ５の構築
２１のヌクレオチド（図１３Ｃのｎｔ３８７の後の７アミノ酸に対応する）を挿入して、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ５を作製した。適当な最適化を行った標準手順を用いて、Ｎ末端領域はプライマーＮＣ５Ｒ及びＳｉｇＤＫｐｎ（下記参照）を使ってＰＣＲ増幅し、Ｃ末端はプライマーＮＣ５Ｆ及びＤｏｗｎＲｅｖ（下記参照）を使って増幅した。全てのＰＣＲ反応のために、Ｂ．ハロジュランスのゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いた。
【化７】
2008521431.tif 000009
【０１２８】
Ｎ末端ＰＣＲ断片は、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化した。Ｃ末端はｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使って作製し、この結果、平滑末端のＰＣＲ生成物が得られた。Ｃ末端のＰＣＲ断片は、次にＸｈｏＩで制限消化してスリーウェイライゲーションで用い、その結果ｐＳＥＣ１９４ＮＣ５が得られた。
【０１２９】
ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６の構築
２７ｂｐ（図１３Ｄのｎｔ５４０の後の９アミノ酸に対応する）を挿入して、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６を作製した。Ｎ末端（７６７ｂｐ）領域はプライマーＳｉｇＤＫｐｎ及びＶＮＲ６を使ってＰＣＲ増幅し、Ｃ末端（３４９ｂｐ）はプライマーＶＣＦ６及びＤｏｗｎＲｅｖを使って増幅した。Ｃ末端の生成物はＳａｌＩ／ＰｓｔＩで制限消化し、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩで制限したｐＳＫへ連結してｐＳＫＣｔｅｒ２を得た。プラスミドｐＳＫＣｔｅｒ２並びにＮ末端ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩ／ＳａｌＩで制限し、連結してプラスミドｐＳＫＮＣ６を作製した。ｐＳＫＮＣ６からのＮＣ６断片は、プライマーＳｉｇＤＫｐｎ及びＦｌｉＣＲを使ってＰＷＯ  ｔａｑでＰＣＲ増幅して平滑末端のＰＣＲ生成物を得、これを次にＫｐｎＩで制限し、ｐＳＥＣ１９４（ＫｐｎＩ／ＨｉｎｃＩＩ）に連結してｐＳＥＣ１９４ＮＣ６を得た。
【化８】
2008521431.tif 000010
【０１３０】
全ての場合、インサートは異種ペプチド及びタンパク質をコードする配列の追加のために、多回クローニング部位（ＭＣＳ）を持つように設計されていた。全てのＮＣ構築物は、ＦｌｉＣタンパク質中の機能性挿入部位を識別し、発現レベルを決定し、形質転換後の表現型（Ｂ．ハロジュランスＢｈＦＣ０１における運動性の回復）特性を観察するように作製された。細胞表面タンパク質（ＣＳ）抽出物は、それぞれＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ５及びＮＣ６で形質転換したＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６の培養物から生成し、タンパク質抽出物は前の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。ＮＣ３及びＮＣ６構築物を含むＢｈＦＣ０１は、ＦｌｉＣタンパク質のそれに対応するバンドに分解するタンパク質を過剰発現することがわかった（図１４Ａ、レーン１〜５及び図１４Ｂ、レーン２〜３）。電気泳動ゲルから、ＢｈＦＣ０４（ＮＣ６）菌株によって産生される修飾されたＦｌｉＣタンパク質のレベルは、ＷＴ（野生型）細菌のそれと対等であったことが明らかである。ＮＣ６は、Ｂ．ハロジュランスの非運動性変異体に運動性を回復させた唯一の構築物であった（図１５）。
【０１３１】
細胞表面（ＣＳ）分画中の約３４ｋＤａのタンパク質バンドは、ＦｌｉＣ特異抗体によるウェスタンブロット分析によって、フラゲリン又は修飾フラゲリンであることが確認された（図１４Ｃ）。
【０１３２】
（実施例７）
ｐＳＥＣ１９４組込み型ベクターを用いるＢ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０１の染色体上の細胞壁プロテアーゼをコードするｗｐｒＡ遺伝子の誘導不活化
ｗｐｒＡ遺伝子は、関連する組換え細菌の表面で発現される融合タンパク質のレベルを低下させることができた細胞壁プロテアーゼをコードする。ＢｈＦＣ０１細菌でｗｐｒＡ遺伝子を削除するために、ある戦略が考案された。
【０１３３】
プラスミドｐＳＥＣｗｐｒＡ−は、ｗｐｒＡ遺伝子の１０５６ｂｐの内部領域を削除することによって構築した（図１６Ａ）。この領域は、全てのｗｐｒＡコード配列を含んでいた。図１６Ｂは、ｗｐｒＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。ｗｐｒＡ−断片の構築のために必要とされるＮ末端及びＣ末端のＰＣＲ生成物を得るために、以下のプライマーを用いた。
【化９】
2008521431.tif 000011
【０１３４】
ＰＣＲ生成物を消化し、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで制限したｐＳＥＣ１９４に連結してｐＳＥＣ１９４ｗｐｒＡ−を得た（図１６Ｂ）。プラスミドｐＳＥＣ１９４ｗｐｒＡ−を、前の通り菌株ＢｈＦＣ０１へ形質転換した。実施例４で記載されているように、ｓｃｏを含む形質転換体を用いてｄｃｏ事象を促進した。得られた菌株は、ＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）と命名した。Ｂ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０１及びＢｈＦＣ０４の細胞外及び細胞表面のタンパク質を抽出し、タンパク質及びプロテアーゼのプロファイルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゼラチン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で得た（図１７）。
【０１３５】
両菌株のレポーター遺伝子から得られた結果は、タンパク質産生の改善及びＢｈＦＣ０４の異なる分画における安定性を示した（結果は示さない）。プラスミドｐＳＥＣ１９４ＮＣ３及びｐＳＥＣ１９４ＮＣ６は、次に、表面の修飾されたＦｌｉＣタンパク質の産生及び安定性を改善するために、菌株ＢｈＦＣ０４へ形質転換した。
【０１３６】
出願人は、２００６年１１月２３日にブダペスト条約の下、ＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）Ｂ．ハロジュランス菌株をアクセッション番号ＮＣＩＭＢの下、ＮＣＩＭＢ菌株保存機構（ＮＣＩＭＢ社、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１  ９ＹＡ）に寄託した。ＢｈＦＣ０４菌株は、ＮＣＩＭＢアクセション番号＿＿を割り当てられた。ＮＣＩＭＢ菌株保存機構に寄託した菌株は、本出願の優先権主張日の前からＣｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＳＩＲ）によって維持されていた寄託菌から取られた。菌株の寄託菌は、３０年間、又は最も最近の要請から５年間、又は特許の有効期間のうちより長い期間、ＮＣＩＭＢ保管所で規制なしに維持され、その期間の間に寄託菌が生育不能になる場合は交換される。
【０１３７】
（実施例８）
融合タンパク質の表面提示
バイオレメディエーション及びバイオマイニング：ポリＨｉｓタグペプチドの表面提示
ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６の構築
ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６は、ＮＣ６挿入部位を用いた、菌株ＢｈＦＣ０４の表面での金属結合ペプチド（ポリＨｉｓタグ）の提示の例として構築した。ポリＨｉｓタグ（６ヒスチジン残基を含む）は、以前、カドミウム、ニッケル及び銅と結合することが示された（Ｓｏｕｓａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１０１７−１０２０）。タグは、したがって、鉱業における貴金属のバイオレメディエーション又はバイオマイニングのためのフラゲリン提示システムの使用を示すために適当であった。
【０１３８】
ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６は、３ｇ  ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで制限することによって構築した。ポリＨｉｓタグは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって記載される方法を用いて、２つの相補性オリゴヌクレオチド（ＨｉｓＦ３及びＨｉｓＲ３、下記参照）をアニールすることによって生成した。
【化１０】
2008521431.tif 000012
【０１３９】
要約すると、２つのオリゴヌクレオチド（オリゴ）を、５０Ｍの最終濃度になるようにＳＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で別々に希釈した。各オリゴ溶液の等量を混合して、５Ｍの最終濃度に希釈した。オリゴ混合物は沸騰水浴中で１００℃に加熱し、次に、水浴のスイッチを切ることによって室温まで徐々に放冷させた。アニールしたオリゴは、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（商標）ＩＩＩキット（ＢＩＯ  １０１）を用いて精製した。アニールしたオリゴは、５’及３’末端にそれぞれＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を含んでいた。
【化１１】
2008521431.tif 000013
【０１４０】
制限したｐＳＥＣ１９４ＮＣ６へのアニールしたポリＨｉｓタグの連結をＦａｓｔ−Ｌｉｎｋ（商標）ＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって行い、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６を得た。２０ｎｇのｐＳＥＣ１９４ＮＣ６及び３０ｎｇのアニールしたＨｉｓオリゴを、ライゲーション反応で用いた。反応は、７０℃で１５分間の熱不活性化によって止めた。ライゲーション混合物の２ｌをエレクトロポレーション（２５Ｆ、２００オーム、１．６ＫＶ）によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。クローンは、プライマーＨｉｓＦ３及びＦｌｉＣＲ（５’ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ３’）を用いたコロニーＰＣＲ分析（２５ｌ）によってスクリーニングした。クローンを拾って５０ｌ滅菌水に移し、５分間沸騰させた。沸騰させたコロニーは、細胞片をペレット化するために、３０秒の間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。５ｌの沸騰させた溶解物を、各ＰＣＲ反応で用いた。反応混合物は、以下の通りであった。２．５ｌの１０×緩衝液、２．５ｌの８ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．７５ｌの５０ｍＭＭｇＣｌ、５Ｍの各プライマーを１．２５ｌ、０．２ｌのＴａｑポリメラーゼ（１単位）及び滅菌ＰＣＲ水を２５ｌの総容積まで。ＰＣＲパラメータは以下のようであった：９４℃で４分間を１サイクル、９４℃で１分間、５６℃で１分間及び７２℃で１．５分間のサイクルを３５サイクル、７２℃で４分間の１サイクルの最終伸長。単一の陽性クローンを増殖させて、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。ポリＨｉｓペプチドのアミノ酸配列（及びそのコードヌクレオチド配列）並びに挿入された異種ポリペプチドを形成するＭＣＳの一部によってコードされるアミノ酸を、図１８に示す。完全な挿入ペプチドの長さは、１３アミノ酸であった。
【０１４１】
菌株ＢｈＦＣ０４は、その構築物の金属結合能力を測定するために、先に述べたようにｐＳＥＣ１９４ＮｈｉｓＣ６で形質転換した。形質転換体は、コロニーＰＣＲによってｐＳＥＣ１９４ＮｈｉｓＣ６を持つと確認された。ｐＳＥＣ１９４ＮｈｉｓＣ６構築物を持つＢｈＦＣ０４クローンは、ペプチドの良好な提示、並びにＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ粒子に結合するその能力を判定するために、２５ｍｌのＬＢ培地ｐＨ８．５で増殖させた。
【０１４２】
ＮＨｉｓＣ６タンパク質の産生及び機能性
細菌細胞内で提示されたペプチドの位置は、細胞外（Ｅｘ）、細胞表面（ＣＳ）、細胞壁（ＣＷ）及び細胞内（ＩＣ）のタンパク分画を単離して、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質試料を分離することで決定した。分画は、以下の通りに単離した。
【０１４３】
細胞は、安定期（１６時間）まで、２５ｍｌのＬ培地（ＬＢ）ｐＨ８．５により３０℃で増殖させた。細胞をペレット化して２．５ｍｌの滅菌リン酸緩衝液ｐＨ７．５中で再懸濁し、この細胞ペレットはＣＳ分画のために用いた（次の段落を参照）。上清は等量の５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えることによって沈殿させ、室温で３０分間インキュベートした。沈殿したタンパク質は１７，０００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化し、３７℃で３０分間乾燥させた。タンパク質ペレットは、ＥＸタンパク分画を生成するために、３００μｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．５の中で再懸濁した。
【０１４４】
等量の０．２Ｍ  ＮａＯＨを再懸濁した細胞ペレットに加え、氷上で３０分間スターラー棒で激しく撹拌した。細胞物質を除去して上清を得るために、８，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。等量の５％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を上清に加え、生じた混合物を振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。細胞表面（ＣＳ）タンパク質は１７，０００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。ペレットは滅菌水で洗浄して、３７℃で３０分間乾燥した。ＣＳタンパク質は、次に３００μｌリン酸緩衝液ｐＨ７．５の中で再懸濁した。ＮａＯＨによる「ストリッピング」の後に得られた細胞ペレットは、５ｍｌリン酸緩衝液の中で再懸濁し、Ｓｏｎｏｐｕｌｓ超音波ホモジナイザ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて最大強度で３０分間超音波処理した。溶解した細胞は、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離してＣＷ分画を沈殿させた。上清（ＩＣ）を取り出して、２ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。ＣＷペレットは３７℃で３０分間乾燥し、５００ｌのリン酸緩衝液ｐＨ７．５の中で再懸濁した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２４８〜２５９）で測定した。ＣＳ分画は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上で分離して、クーマシー染色液で染色した（図１９）。
【０１４５】
提示されたポリＨｉｓタグの金属結合能を測定するために、ＭａｇｎｅＨｉｓ（商標）タンパク質精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いた。このキットは、磁石を使ってその後単離することができるニッケル粒子に結合する、Ｈｉｓタグの能力を利用する。タンパク質は、次にイミダゾールを使ってニッケル粒子から切断することができる。未精製の細胞抽出物は、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６及びｐＳＥＣ１９４ＮＣ６の形質転換細菌（−ｖｅ対照）の一晩培養物の６ｍｌをペレット化して、ペレットを５ｍｌのリン酸緩衝液の中で再懸濁することによって得た。上記のＩＣ抽出のために記載されているように、各試料を超音波処理した。タンパク質は等量の５％ＴＣＡで沈殿させて、６００ｌの溶解緩衝液（ＭａｇｎｅＨｉｓキット）の中で再懸濁した。以降の全工程は、メーカーの説明書に従って非変性条件下で実施した。タンパク質は、１００ｌの最終量で溶出させた。
【０１４６】
ＭａｇｎｅＨｉｓビーズ（ニッケル）へのＨｉｓタグの結合が成功したものは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで試料を分離してクーマシーブルーで染色することによって視覚化した（図２０）。未結合のタンパク質（レーン６及び７）、溶出しなかったビーズ結合タンパク質（レーン４及び５）並びにビーズ結合して溶出したタンパク質（レーン２及び３）を含む３分画が含まれた。フラゲリンとのポリＨｉｓタグの融合は、機能形態のこのペプチドの提示の成功をもたらした。また、調製が非変性条件下で実行されたことは、配列アラインメント研究が予測するように、ペプチドがフラゲリンの露出ドメイン上で提示されることを証明する。
【０１４７】
抗原の表面発現：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）ペプチド
ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｖＣ６の構築
Ｂ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０４の表面で外来の抗原エピトープを提示するために、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｖＣ６を構築した。これらのような組換え生物は、多種多様な起源からの抗原に対して様々な型の免疫応答を起こすための免疫原として用いることができる。ＨＩＶ単離株ＨＩＶ−１のＶ３ループ部分を、例として選択した。ｇｐ１２０（Ｖ３ループ）の抗原性モチーフは保存される（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）ことがわかり、それは中和抗体の産生を誘導する。このエピトープは、Ｔ−ヘルパー及び細胞傷害性Ｔリンパ球の応答を活性化することも示された（Ｇｏｕｄｓｍｉｔら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：４４７８−４４８２；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６７８８−６７７２）。
【０１４８】
ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｖＣ６は、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６をＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで切断することによって構築した。ＨＩＶｇｐ１２０抗原エピトープは、先に述べたように２つの相補性オリゴヌクレオチド（下記の配列）をアニールすることによって生成した。
【化１２】
2008521431.tif 000014
【０１４９】
アニールしたオリゴは、先に述べたようにＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで切断して精製した。
【化１３】
2008521431.tif 000015
【０１５０】
切断したｐＳＥＣ１９４ＮＣ６へのＨＩＶペプチドの連結をＦａｓｔ−Ｌｉｎｋ  ＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって行い、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｖＣ６を得た。２０ｎｇのｐＳＥＣ１９４ＮＣ６及び３０ｎｇのアニールしたＨＩＶオリゴを、連結反応で用いた。連結反応は、７０℃で１５分間の加熱により不活性化した。
【０１５１】
連結混合物の２ｌをエレクトロポレーション（２５Ｆ、２００オーム、１．６ＫＶ）によって大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。クローンは、プライマーＮＣ５Ｆ及びＦｌｉＮ−ｔｅｒＲｅｖを用いてコロニーＰＣＲ分析法（２５ｌ）でスクリーニングした。ＰＣＲは、アニール時間を１．５分から１分に短縮して、先に述べたように実施した。全ての試料は、１．５％ＴＡＥアガロースゲル上で分析した。単一の陽性クローンが成長し、得られた培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。ＨＩＶ  Ｖ３ループペプチドのアミノ酸配列（及びそのコードヌクレオチド配列）並びに挿入された異種ポリペプチドを形成するＭＣＳの一部によってコードされるアミノ酸を、図２１に示す。配列は正しいことが確認され、その後Ｂ．ハロジュランスＢｈＦＣ０４（ｈａｇ、ｗｐｒＡ）に形質転換した。
【化１４】
2008521431.tif 000016
【０１５２】
菌株ＢｈＦＣ０４は、先に述べたように形質転換した。陽性の形質転換体は、プライマーＦｌｉＮ−ｔｅｒＲｅｖ及びＮＣ５Ｆを用いてコロニーＰＣＲで確認した。先に述べたようにタンパク分画を単離するために、単一の陽性クローンを選択した。１０ｇのＣＳ、２０ｇのＥＸ、４０ｇのＣＷ及び４０ｇのＩＣ分画を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に加え、クーマシーブルー染色剤で染色した。
【０１５３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上では、ＣＳ分画だけが鞭毛−Ｈｉｖペプチド融合の正しい大きさに近いバンドを与えた（図２２）。ペプチドの含有は、ＦｌｉＣタンパク質内の２１ａａペプチドの挿入、及びゲル上で明瞭に見ることができる約２．３ＫＤａの鞭毛キメラの大きさの増加をもたらした。
【０１５４】
ＦｌｉＣ特異抗体を使うウェスタンブロット分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で得られたバンドはＦｌｉＣ又は機能性ＦｌｉＣの融合タンパク質であることを示した（図２３）。
【０１５５】
生体内変換
ｐＳＥＣ１９４ＮＭＬｉｐＣの構築
生体内変換のためのＦｌｉＣ提示システムの使用を実証するために、ｐＳＥＣ１９４ＮＭＬｉｐＣ３を構築した。上述の実施例は、バイオレメディエーション又はワクチン開発における抗原決定基のために用いることができる小さなペプチドに注目した。Ｅｚａｋｉら（（１９９８）Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：５００−５０３）及びＴａｎｓｋａｎｅｎ（（２０００）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．６６：４１５２−４１５６）は、長さが４７１及び３０２のアミノ酸の大きなポリペプチドも大腸菌フラゲリンを使って良好に提示することができることを示した。リパーゼはよく特徴づけられており、いくつかの組成物及び方法で、例えば、それらに限定されないが、デタージェント、油脂のグリセロール分解、直接的エステル化、キラル分解及びアシレート合成で役割を果たす（Ｌｉｔｔｈａｕｅｒら（２００２）Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏ．Ｔｅｃｈ．３０：２０９−２１５）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓの細胞表面で固定されたリパーゼの使用が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓリパーゼに融合したフィブロネクチン結合タンパク質Ｂを使って実証された（Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：４９１−５００）。
【０１５６】
ｐＳＥＣ１９４ＮＬｉｐＣは、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩでｐＳＥＣ１９４ＮＣ３を切断することによって構築した。成熟リパーゼは、シグナル配列が存在しないようにＧ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ染色体ＤＮＡ（ＬｉｐＡ）からＰＣＲ増幅した（図２４）。用いたプライマーは、ＬｉｐＦＳＤ及びＬｉｐＲであった（下記参照）。ＰＣＲ生成物を精製して、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断した。
【化１５】
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【０１５７】
切断したｐＳＥＣ１９４ＮＣ３へのリパーゼポリペプチドの連結をＦａｓｔ−Ｌｉｎｋ（商標）ＤＮＡライゲーションキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって行い、ｐＳＥＣ１９４ＮＬｉｐＣ３を得た。２０ｎｇのベクターＤＮＡ及び６０ｎｇのリパーゼを、連結反応のために用いた。連結反応は、７０℃で１５分間の加熱により不活性化した。連結混合物の２ｌを上述したように大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換した。更なる分析のために単一の陽性クローンを選択した。
【０１５８】
ｐＳＥＣＮＬｉｐＣによるＢ．ハロジュランスＢｈＦＣ０４の形質転換及びリパーゼ活性の測定
Ｂ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０４の形質転換は、先に述べたように実施した。クローンは、プライマーＭ１３Ｆ（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ−３’）及びＬｉｐＲを用いてコロニーＰＣＲによりスクリーニングした。クロラムフェニコール（１０ｇ／ｍｌ）を含む５０ｍｌのＬＢに、一晩培養した培養物を接種して、ＯＤ５４０が１．２〜１．６になるまで増殖させた。細胞表面からＣＳタンパク質を剥がすためにＮａＯＨではなく５ｍｌのＬｉＣｌ（５Ｍ）を用いたことを除き、タンパク分画を上記のように単離した。ＮａＯＨはリパーゼ酵素を不活性化したので、このことは最大のリパーゼ活性を可能にした。この方法はリパーゼ活性を低下させたものの、ＥＸ及びＣＳ分画はＴＣＡで沈殿させた。ザイモグラム（活性ゲル）の上で画像化するのに十分な活性が残されていた（図２５）。しかし、この方法は、当然、ＥＸ及びＣＳ分画中の活性を正確に定量するのに用いることはできなかった。それにもかかわらず、活性ゲルは融合タンパク質の実際の大きさ及び安定性を測定するのに役立つ手段であり、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（（１９９８）Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：１６４−１６８）によって記載されているように実施される。試料は、非変性ローディング色素を加えて３７℃で３０分間のインキュベーションによって調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、色素先端がゲル末端に到達するまで、３０ｍＡの定電流で流した。ゲルはＳＤＳを除去するために２５ｍＭトリスｐＨ７．５及び２．５％トリトンＸ−１００の中で一晩インキュベートし、３０分間平衡化緩衝液（２５ｍＭトリスｐＨ７．５）へ移し、次に、０．１％ナフチルアセタート及び０．２％Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲ  Ｓａｌｔを含む平衡化緩衝液を用いてリパーゼ活性のために染色した。一旦バンドが明らかに見られたならば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄して反応を停止させた。
【０１５９】
リパーゼ活性は、ＣＳ、ＣＷ及び細胞内分画で観察されたが、細胞外分画では観察されなかった。これらの知見は、ＦｌｉＣ−リパーゼ融合はＣＷ及びＣＳ分画に固く結合したまま細胞表面に露出することを示した。ＣＳ分画における活性低下は、リパーゼを不活性化するＴＣＡによるものかもしれない。これらの結果も、融合タンパク質が非常に安定していることを示す。
【０１６０】
次の工程は、液体培養物中に生成したリパーゼ活性を定量化することであった（図２６）。ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６（対照）又はｐＳＥＣ１９４ＮＬｉｐＣ構築物で形質転換したＢｈＦＣ０４の一晩培養した培養物を、３０℃のＬ培地ｐＨ８．５、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌ中で増殖させた。クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬ培地ｐＨ８．５（６０ｍｌ）を含む２つのフラスコにＯＮ培養物を接種して、０．１の出発ＯＤ５４０を得た。フラスコを３０℃でインキュベートして、８、２４及び４８時間後に試料を採取した。全細胞及び細胞外の試料は、リパーゼアッセイのために用いた。脂肪分解活性は、基本的にＶｏｒｄｅｒｗｕｌｂｅｃｋｅら（（１９９２）Ｅｎｚｙｍ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６３１−６３９）に従ってｐ−ニトロフェニル−パルミタートを基質として用いて、分光光度アッセイによって測定した。アッセイ溶液１は、９０ｍｇのｐ−ニトロフェニル−パルミタートを３０ｍｌのプロパン−２−オルに溶かすことによって調製した。アッセイ溶液２は、４５０ｍｌのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８に溶解したＮａ−デオキシコール酸（２ｇ）及びアラビアゴム（０．５ｇ）を含んでいた。アッセイ溶液１の１ｍｌをアッセイ溶液２の９ｍｌに加えることによって、乳濁溶液を調製した。６００μｌの乳濁溶液及び２５μｌの酵素製剤をインキュベートすることによって、アッセイを標準条件下で実施した。
【０１６１】
反応は６５℃で実施し、吸光度は４１０ｎｍで測定した。リパーゼ活性は、Ｕ／ｍｌ（μｍｏｌ脂肪酸／分／ｍｌ酵素）として計算した。４１０ｎｍにおけるｐ−ニトロフェノールの吸光係数（ｐＨ８）は１５である（１×ｎｍｏｌ−１×ｃｍ−１＝ｍｌ×ｃｍ−１）。酵素試料のタンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミン希釈溶液を使ってＢｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法で測定した。図２６で示すように、最終的な活性はＵ／ｍｇ総タンパクとして表した。このデータは、ＦｌｉＣサンドイッチへ酵素を挿入して、活性を保持することが可能であることを示す。ＦｌｉＣ／リパーゼ融合タンパク質は、Ｂ．ハロジュランス細胞壁の中で非常に安定した複合体を形成し、リパーゼ活性は細胞表面で利用できる。酵素活性は比較的強く、長期間持続することが示された。上清では酵素活性はほとんど検出されず、いずれも生体内変換のためには好ましい特性である。
【０１６２】
（実施例９）
フラゲリンタンパク質との融合物としての免疫原性ペプチド
アジュバントは先天性免疫を刺激して、次に適応免疫応答を活性化する能力を有する。フラゲリンはＡＰＣ（上記参照）の活性化を通して炎症性反応を誘導することは、すでに証明されている。一例は、フラゲリンによって強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）融合タンパク質の生成及び提示の成功例である。フラゲリン−ＥＧＦＰ融合物は、ＡＰＣの、更には特異的抗ＥＧＦＰ  Ｔ細胞応答を刺激することができた。ＥＧＦＰだけでは、ＡＰＣの及び特異的Ｔ細胞応答を刺激することができなかった（Ｃｕａｄｒｏｓら，２００４，Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．Ｖｏｌ  ７２，２８１０−２８１６、ＭｃＳｏｒｌｅｙら，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ  １６９，３９１４−３９１９）。フラゲリンに挿入された免疫応答を誘導する他のペプチドとしては、コレラ毒素サブユニットＢ、Ｂ型肝炎エピトープ、化膿連鎖球菌Ｍタンパク質エピトープ、ＨＩＶエピトープ（ｇｐ４１及びｇｐ１２０）、インフルエンザＡ赤血球凝集素エピトープ、並びにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ．、ロタウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）及びＭｉｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ外膜タンパクからの様々な細胞表面抗原がある（Ｓｔｏｃｋｅｒ及びＮｅｗｔｏｎ，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ  ２，１６７−１７８）。Ｎｅｗｔｏｎら，（１９９５）Ｒｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４６：２０３−２１６。
【０１６３】
本発明のいくつかの実施形態を説明した。しかしながら、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を加えることができるのは言うまでもない。したがって、他の実施形態も以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、異なる増殖段階の間に採取された、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６によって産生された細胞外（ＥＸ）及び細胞結合性（ＣＢ）のタンパク質のタンパク質プロファイルを示す、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動）ゲルの写真である。レーン１、ＣＢ（６時間）、レーン２、ＣＢ（２４時間）、レーン３、ＣＢ（４８時間）、レーン４、（７２時間）、レーン５、分子量マーカー、レーン６、ＥＸ（２４時間）、レーン７、ＥＸ（７２時間）。様々な分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は、写真の右側に示す。写真の左側の矢印は、過剰発現された３４ｋＤａタンパク質の位置を示す。
【図２】図２は、好アルカリ性バチルス種Ｃ−１２５（配列番号４）からのフラゲリンタンパク質の対応する最初の２２のアミノ酸と整列させた、約３４ｋＤａのＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６タンパク質（配列番号３）の最初の２２のＮ−末端アミノ酸を示す図である。同一の位置は、＋記号並びに関連するアミノ酸に対応する文字で示す。
【図３】図３は、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６（配列番号１）からクローン化した推定上のｈａｇコード領域とバチルス種Ｃ−１２５（配列番号１）からのｈａｇ遺伝子の対応するコード領域とのヌクレオチド配列整列を示す図である。
【図４】図４は、様々な制限酵素で消化したＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体ＤＮＡのＤＩＧ標識サザンブロットの写真である。ブロットは、ＤＩＧで標識した８００ｂｐのＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇコーディング断片で探索した。レーン１、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化した８００ｂｐのＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇ遺伝子断片、レーン２〜７、異なる制限酵素で消化したＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体ＤＮＡ：レーン２、ＡｃｃＩ、レーン３、ＥｃｏＲＩ、レーン４、ＨｉｎｄＩＩＩ、レーン５、ＰｓｔＩ、レーン６、ＣｌａＩ、レーン７、ＰｖｕＩ。レーン８、分子量マーカー。サイズマーカーの位置（Ｋｂ）は写真の右側に示し、１．７０Ｋｂ及び１．４７Ｋｂの断片のブロット上の位置は写真の左側の矢印で示す。
【図５】図５は、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体消化物から得た逆ＰＣＲ生成物を示す、臭化エチジウム染色アガロース（１％）電気泳動ゲルの写真である。レーン１、サイズマーカー、レーン２、ＡｃｃＩ消化物（１０  Ｉ）、レーン３、ＨｉｎｄＩＩＩ消化物（１０  Ｉ）、レーン４、陽性対照（ＳｃａＩで消化したフラゲリンＤＮＡ断片を含むプラスミド）。サイズマーカー（Ｋｂ）の位置は写真の左側に示し、１．１５７Ｋｂ及び０．９２５Ｋｂの断片のブロット上の位置は写真の右側の矢印で示す。
【図６】図６は、コード配列（配列番号５）に連結する領域を含むＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇ遺伝子の、完全ヌクレオチド配列を示す図である。ボックス内のヌクレオチドは、推定上のプロモーター領域及び潜在的リボソーム結合部位を表す。白色のヌクレオチドは、バチルス・ハロジュランスＣ１２５からのｈａｇ遺伝子のそれらとは異なる。影付きのヌクレオチドは、ｉＰＣＲから得られた全ての新しい配列を示す。遺伝子（配列番号１）のコード領域は、太字体で示す。
【図７−１】図７は、上流及び下流の領域（配列番号５）を含むＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。ボックス内のヌクレオチドは、推定上のプロモーター領域を表す。下線付きヌクレオチドは、潜在的リボソーム結合（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）部位を表す。また、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６フラゲリンの完全アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図７−２】図７−１から続く。
【図８】図８Ａは、ｐＳＥ１９４（４．３１３ｋｂ）プラスミドマップを示す図である。図８Ｂは、ｐＳＥＣ１９４（５．４９６ｋｂ）プラスミドマップを示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、欠陥ｈａｇ遺伝子がどのように構築されたかを示す、その上流及び下流の領域（配列番号６）を有するＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ｈａｇ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。黒い配列はｈａｇ読取り枠の欠失領域を示し、灰色の影付き配列は、ＰＣＲ反応から得られて、ｐＳＥＣＦＩｇ−の構築で用いた欠陥ｈａｇ遺伝子を作製するために連結した２つの断片、Ｎ末端及びＣ末端（コード領域の一部並びに上流及び下流配列を含む）を示す。ＰＣＲプライマーに対応する配列は、白色である。  配列はｈａｇ読取り枠の欠失領域を示し、ｐＳＥＣＦＩｇ−の構築において読取り枠の残りを配列決定する。用いるプライマーは下線付きである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｐＳＥＣ１９４Ｆ１ｇ−プラスミドマップを示す図である。
【図１０】図１０は、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体におけるｐＳＥＣ１９４Ｆ１ｇ−の組込み事象のＰＣＲ測定結果を示す、臭化エチジウム染色アガロース（０．８％）電気泳動ゲルの写真である。異なるプライマーセット（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を用いて、異なる組込み事象を試験した。レーン１、ｓｃｏ、突然変異体４９、レーン２、ｓｃｏ、突然変異体５０、レーン３、ｄｃｏ、非運動性突然変異体−ＢｈＦＣ０１（４９に由来する）、及び、レーン４、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６染色体ＤＮＡ。プライマーセットＢ及びＣの間のレーンは、サイズマーカーを含む。サイズマーカー（Ｋｂ）の位置は、写真の右側に示す。
【図１１】図１１は、ＰＳＩ−Ｐｒｅｄソフトウェアによって予測される、ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ５及びＮＣ６によってコードされるタンパク質の二次構造の比較を示す図である。このプログラムは、各タンパク質のために３状態の予測を作成するのに用いた。二次構造のα−ヘリックス（Ｈ）、伸長したβ−鎖（Ｅ）及びコイル（Ｃ）を示す。アミノ酸挿入は、太字体及び灰色のブロックで示す。
【図１２】図１２Ａは、ＮＣ２ペプチドのアミノ酸配列（配列番号７）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。図１２Ｂは、ＮＣ３ペプチドのアミノ酸配列（配列番号９）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す図である。図１２Ｃは、ＮＣ５ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１１）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す図である。図１２Ｄは、ＮＣ６ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、細胞表面タンパク分画を含むクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１〜７、様々な遺伝子構築物で形質転換されたＢ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０１。レーン１、ＮＣ１、レーン２、ＮＣ２、レーン３、ＮＣ３、レーン４、ＮＣ３ｓｃｏ、レーン５、ＮＣ５、レーン６、ＦｌｉＣ、レーン７、ＢｈＦＣ０１、レーン８、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３  ＷＴ（野生型）、レーン９、分子量マーカー。様々な分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の右側に示す。写真の右側の矢印は、過剰発現された３４ｋＤａタンパク質の位置を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、レーン１、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６、レーン２、菌株ＢｈＦＣ０１  ｐＳＥＣ１９４ＮＣ３、レーン３、菌株ＢｈＦＣ０１  ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６、及びレーン４、分子量マーカーから抽出したＣＳタンパク質を含む、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。様々な分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の右側に示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、図１３Ａに記載されているタンパク分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットの写真である。ウェスタンブロットは、ポリクローナルフラゲリン特異抗体で染色した。様々な分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の左側に示す。写真の左側の矢印は、過剰発現された３４ｋＤａタンパク質の位置を示す。
【図１４】図１４は、様々なＢ．ハロジュランスＡｌｋ３６菌株の運動性プレートの写真である。Ａ：コロニー（１）、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ＷＴ、コロニー（２）ＢｈＦＣ０１（ｈａｇ）、コロニー（３）、ＢｈＦＣ０１（ｈａｇ）＋ｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣ。Ｂ：コロニー（１）、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ＷＴ、コロニー２〜６、（２）ｐＳＥＣＮＣ１、（３）ｐＳＥＣＮＣ２、（４）ｐＳＥＣＮＣ３、（５）ｐＳＥＣＮＣ５、（６）ｐＳＥＣＮＣ６で形質転換したＢｈＦＣ０１。
【図１５】図１５Ａは、完全なｗｐｒＡ−コード領域の概略図である。Ａの白色の領域は、Ｂで示すｐＳＥＣｗｐｒＡ−の構築において削除されたコード領域の領域を示す。この構築物は、次に、Ｂ．ハロジュランスＢｈＦＣ０１の染色体上のｗｐｒＡ遺伝子のノックアウトのために用いた。図１５Ｂは、ｐＳＥＣ１９４ｗｐｒＡ−プラスミドマップを示す図である。
【図１６】図１６は、菌株ＢｈＦＣ０１及びＢｈＦＣ０４の細胞外（ＥＸ）及び細胞表面（ＣＳ）分画中のプロテアーゼを分析する、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。タンパク質バンド（レーン２〜５）を可視化するために、又は復元処理後のプロテアーゼ活性（レーン７〜１０）のために、ＥＸ及びＣＳ分画の一定量をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動によって分離してクーマシーブルーで染色した。レーン１及び６、分子量マーカー、レーン２及び７、ＢｈＦＣ０４細胞外分画、レーン３及び８、ＢｈＦＣ０１細胞外分画、レーン４及び９、ＢｈＦＣ０４細胞表面分画、レーン５及び１０、ＢｈＦＣ０１細胞表面分画。様々な分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の左側に示す。矢印は、ＢｈＦＣ０４細胞壁分画レーン４中の欠失したＷｐｒＡタンパク質バンドを示す。同じ分画中のプロテアーゼ活性の除去に成功した例を、レーン９で示す。
【図１７】図１７は、ポリＨｉｓペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を示す図である。ヌクレオチド配列は、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６構築物中に残存するＭＣＳの部分を含み、フルサイズの組込みペプチドを与える。挿入されたペプチド全体の大きさは、１３アミノ酸であった。
【図１８】図１８は、以下の菌株のＣＳ分画のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６  ＷＴ、レーン２、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６を含むＢｈＦＣ０４、レーン３、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６を含むＢｈＦＣ０４、及び、レーン４、分子量マーカー。様々な分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は、写真の右側に示す。
【図１９】図１９は、ｐＳＥＣ１９４ＮｈｉｓＣ６を含む菌株ＢｈＦＣ０４のＣＳ分画上で提示されたポリＨｉｓタグの金属結合を示す、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。レーン１、分子量マーカー、レーン２、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６（溶出した）、レーン３、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６（溶出した）、レーン４、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６（ビーズ）、レーン５、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６（ビーズ）、レーン６、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６（フロースルー）、レーン７、ｐＳＥＣ１９４ＮＣ６（フロースルー）。分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は、写真の左側に示す。矢印は、フラゲリン融合タンパク質の位置を示す。ポリＨｉｓタグの存在のためにｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｓＣ６融合タンパク質（レーン２）の結合が成功したことに注意する。
【図２０】図２０は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１５）及びそれをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す図である。ヌクレオチド配列は、ｐＳＥＣ１９４ＮＨｉｖＣ６構築物中に残存するＭＣＳの部分を含む。
【図２１】図２１は、様々な菌株のＣＳ分画のクーマシーブルー染色１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真であり、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原ペプチドを運ぶフラゲリン融合タンパク質を示す写真である。レーン１、ｐＳＥＣ１９４ＨｉｖＮＣ６を含むＢｈＦＣ０４、レーン２、ＷＴ（野生型）Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６、及び、レーン３、分子量マーカー。様々な分子量マーカー（ｋＤａ）の位置は、写真の右側に示す。
【図２２】図２２は、フラゲリン特異ポリクローナル抗体で染色したウェスタンブロットの写真である。レーン１、ＢｈＦＣ０４＋ｐＳＥＣＮＨｉｖＣ６、レーン２、ＢｈＦＣ０４＋ｐＳＥＣＮＨｉｓＣ６、レーン３、ＢｈＦＣ０４＋ｐＳＥＣＮＣ６、レーン４、ＢｈＦＣ０４、レーン５、Ｂ．ハロジュランスＡｌｋ３６、レーン６、分子量マーカー。分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の右側に示す。写真の右側の矢印は、過剰発現されたフラゲリン（３４ｋＤａ）タンパク質の位置を示す。
【図２３】図２３は、ジオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）のｌｉｐＡ遺伝子の成熟リパーゼをコードする領域のヌクレオチド配列（配列番号１７）及び成熟リパーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す図である。
【図２４】図２４は、ｐＳＥＣ１９４ＮＬｉｐＣ３構築物を運ぶＢｈＦＣ０４から単離された様々なタンパク分画のリパーゼ活性のザイモグラムを示す写真である。ＥＸ（レーン１）、ＣＳ（レーン２と３）、ＣＷ（レーン４）及びＩＣ（レーン５）分画を示す。ＥＸ分画はリパーゼ活性を示さない点に注意する。レーン６、分子量マーカー。様々な分子量（ｋＤａ）マーカーの位置は、写真の右側に示す。写真の左側の矢印は、約７６ｋＤａの分子量を有するフラゲリン（ＦｌｉＣ）：リパーゼ（Ｌｉｐ）融合タンパク質の位置を示す。
【図２５】図２５は、８、２４及び４８時間の増殖後のｐＳＥＣ１９４ＮＣ６（リパーゼ陰性対照）又はｐＳＥＣ１９４ＮＬｉｐＣを含むＢｈＦＣ０４細胞の細胞外及び全細胞リパーゼ活性（１ｍｇタンパク質あたりの単位（Ｕ））を示す棒グラフである。
【図２６】図２６は、Ｂ．ハロジュランスｗｐｒＡ細胞壁プロテアーゼのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す図である。
【図１】
2008521431.tif 000018
【図２】
2008521431.tif 000019
【図３】
2008521431.tif 000020
【図４】
2008521431.tif 000021
【図５】
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【図６】
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2008521431.tif 000024
【図７】
2008521431.tif 000025
【図９Ａ】
2008521431.tif 000026
【図１０】
2008521431.tif 000027
【図１１】
2008521431.tif 000028
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2008521431.tif 000030
【図１２Ｃ】
2008521431.tif 000031
【図１２Ｄ】
2008521431.tif 000032
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2008521431.tif 000034
【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
2008521431.tif 000043
【図２６】
2008521431.tif 000044
【図８】
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【図９Ｂ】
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【図１５】
2008521431.tif 000047
【図２２】
2008521431.tif 000048
【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月26日(2007.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ハロジュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）フラゲリンタンパク質の全部又は一部であって、該フラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域を含むその一部と、
該フラゲリンタンパク質の可変部の中の又はそれを置換する異種ポリペプチド配列とを含む、融合タンパク質であって、
σＤプロモーターである転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合した核酸配列によってコードされる、上記融合タンパク質。
【請求項２】
前記異種ポリペプチドは金属イオンに結合する能力を有するポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記金属イオンはニッケル、銅、カドミウム、プラチナ、パラジウム、チタン、銀及び金からなる群から選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記異種ポリペプチドはポリヒスチジン配列である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリヒスチジン配列は６ヒスチジン残基を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記異種ポリペプチドは酵素又は酵素の機能性断片である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記酵素はリパーゼ酵素である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リパーゼ酵素はＧ．サーモレオボランス（Ｇ．ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）リパーゼＡである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記酵素は加水分解酵素である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記酵素はアミラーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ及びセルラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記異種ポリペプチドは免疫原である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記異種ポリペプチドのＮ末端基の１から１５のリンカー残基Ｎ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記異種ポリペプチドのＣ末端基の１から１５のリンカー残基Ｃ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記異種ポリペプチドのＮ末端基の切断可能な部位Ｎ末端及び異種ポリペプチドのＣ末端基の切断可能な部位Ｃ末端を更に含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
σＤプロモーターである転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合した、請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１６】
σＤプロモーターである転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合した、請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項１８】
原核細胞である、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
細菌細胞である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
グラム陽性細菌細胞である、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２１】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
Ｂハロジュランス（Ｂ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）種のものである、請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
２００５年１１月２８日にＮＣＩＭＢにアクセション番号４１３５７で寄託した菌株ＢｈＦＣ０４のものである、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
請求項１７に記載の細胞を培養すること、及び培養物から融合タンパク質を得ることを含む、融合タンパク質の作製方法。
【請求項２５】
配列番号１のＢ．ハロジュランスフラゲリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部であって、該フラゲリンタンパク質のＮ末端及びＣ末端保存領域をコードするヌクレオチドを含むそのコード配列の一部であり、該コード配列はσＤプロモーターである転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合したものと、
該フラゲリンポリペプチドの可変部をコードする配列へ挿入されるかそれを置換する、少なくとも１つの制限酵素部位を含むヌクレオチド配列とを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４４１及びヌクレオチド５７０の間のいずれかのヌクレオチドの直後に挿入される、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２７】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４５９及びヌクレオチド５４０の間のいずれかのヌクレオチドの直後に挿入される、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド４５９の直後に挿入される、請求項２５に記載の構築物。
【請求項２９】
前記ヌクレオチド配列は配列番号１のヌクレオチド５４０の直後に挿入される、請求項２５に記載の構築物。
【請求項３０】
Ｂ．ハロジュランス細菌細胞の実質的に純粋な培養物であって、かなりの数の該Ｂ．ハロジュランス細菌細胞は破壊されたフラゲリン遺伝子を含み、該破壊は機能性フラゲリンの発現を阻止し、破壊は細菌細胞内のフラゲリンポリペプチドのアミノ酸１４〜２２６をコードするｈａｇ遺伝子の内部断片の欠失によるものである、上記培養物。
【請求項３１】
前記非機能性フラゲリンポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１４〜２２６が欠けている、請求項３０に記載の培養物。
【請求項３２】
破壊されたフラゲリン遺伝子を含むことに加えて、かなりの数の前記細菌細胞の少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子が破壊される、請求項３０又は請求項３１に記載の培養物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子である、請求項３２に記載の培養物。
【請求項３４】
Ｂハロジュランス細胞は２００５年１１月２８日にアクセション番号４１３５７でＮＣＩＭＢに寄託されたＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）細胞から選択される、請求項３０から３３までのいずれか一項に記載の培養物。
【請求項３５】
Ｂハロジュランス細胞を遺伝子操作する方法であって、該細菌の染色体内のｈａｇ遺伝子を破壊することを含み、該破壊はその遺伝子による機能性フラゲリンの発現を阻止する、上記方法。
【請求項３６】
１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼをコードする１つ又は複数の遺伝子を破壊することを更に含み、該破壊はその１つ又は複数の遺伝子による１つ又は複数の機能性プロテアーゼの発現を阻止する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ又は複数の細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細菌はバチルス・ハロジュランス細菌菌株ＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）である、請求項３５から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
液体から１つ又は複数の金属イオンを除去する方法であって、
１つ又は複数の金属イオンを含む液体を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることを含み、前記異種ポリペプチドは該１つより多い金属イオンと結合するポリペプチドである、上記方法。
【請求項４０】
前記液体は融合タンパク質をその表面で発現する細菌細胞と接触させる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記融合タンパク質は細胞表面ポリペプチドである、請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つ又は複数の金属イオンを該１つ又は複数の金属イオンを含む液体から単離する方法であって、
１つ又は複数の金属イオンを含む液体を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることであって、前記異種ポリペプチドは該１つ又は複数の金属イオンと結合するポリペプチドであり、該接触は該１つより多い金属イオンの融合タンパク質への結合をもたらすこと、及び
該１つ又は複数の金属イオンを融合タンパク質から分離することを含む、上記方法。
【請求項４３】
基質を生成物に変換する方法であって、
酵素基質を請求項１に記載の融合タンパク質と接触させることを含み、前記異種ポリペプチドは該酵素又は該酵素の機能性断片である、上記方法。
【請求項４４】
前記異種ポリペプチドは免疫原である、哺乳類の対象で免疫応答を起こすための調製物の製造における請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項４５】
請求項１に記載の融合タンパク質を含み、哺乳類の対象で免疫応答を起こす方法における使用のための物質又は組成物であって、前記異種ポリペプチドは免疫原であり、該方法は該物質又は組成物の有効量を該哺乳類の対象に投与することを含む、物質又は組成物。
【請求項４６】
請求項１に記載の融合タンパク質を哺乳類の対象に投与することを含み、前記異種ポリペプチドは免疫原である、免疫応答を起こす方法。
【請求項４７】
前記哺乳類の対象はヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項４８】
請求項２６に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクターを含むキット。
【請求項４９】
少なくとも１つの制限酵素を更に含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項５０】
前記発現ベクターが複製することができる細胞である宿主細胞を更に含む、請求項５９又は請求項６０に記載のキット。
【請求項５１】
異種ポリペプチドをコードする核酸配列を前記ＤＮＡ構築物へ挿入するための説明書を更に含む、請求項５９から６１までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
Ｂ．ハロジュランスの細胞表面に結合したポリペプチドの産生方法であって、
σＤプロモーターである転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合した請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸を有するＢ．ハロジュランス宿主細胞を増殖させること、及び
該ポリペプチドの産生を実現させることを含む、上記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
破壊されたフラゲリン遺伝子を含むことに加えて、かなりの数の細菌細胞又は単離された細菌細胞の少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子を破壊することができ、破壊は、ポリペプチドをコードしないか又は非機能性細胞壁プロテアーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列による、かなりの数の細菌細胞内の内因性遺伝子の置換によるものでよい。細菌細胞は、上で列記されたものでよい。少なくとも１つの細胞壁プロテアーゼ遺伝子はｗｒｐＡ遺伝子でよく、破壊としては細胞壁プロテアーゼ遺伝子の全コード配列の欠失を挙げることができる。細胞は、２００５年１１月２８日にＮＣＩＭＢにアクセション番号４１３５７で寄託した、ＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）細胞でよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明は、上記の融合タンパク質をコードする核酸、核酸配列を含むベクター、例えば核酸配列が転写調節エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に結合したベクター、及びベクターを含む単離細胞も提供する。細胞は、細菌細胞などの原核細胞でよい。細菌細胞は、バチルス属の細胞、例えばＢ．ハロジュランス種の細胞などのグラム陽性細菌細胞でよい。細胞は、２００５年１１月２８日にＮＣＩＭＢにアクセション番号４１３５７で寄託した、ＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）菌株のものでよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
特に役立つ種はＢ．ハロジュランスであり、そのフラゲリンは図７で示すアミノ酸配列（配列番号２）及び図７で示すコード配列（配列番号１）を有するものでよい。ＦＢＦＰのフラゲリン部分は、フラゲリン分子全体又はフラゲリン分子の一部を含むことができる。実施例２で記載されるように、異なる細菌からのフラゲリン分子は、Ｎ末端及びＣ末端保存領域並びに内部可変部を含む、比較的高い相同性の領域を有する。関心の任意の細菌フラゲリンのアミノ酸配列を実施例２で言及するものの１つ若しくは複数と、又は配列番号２と整列させることにより、当業者は関心のフラゲリン内のどこにこれらの３領域が位置するかを決定することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
上で言及し更に以下に記すＴＲＥとしては、それらには限定されないが、誘導可能な及び誘導可能ではないプロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び当業者に公知であり原核生物で遺伝子発現を誘起又はさもなければ調節する他のエレメントがある。そのような調節エレメントとしては、それらには限定されないが、バチルス温度ファージＳＰＯ２からクローン化されたプロモーター断片（Ｓｃｈｏｎｅｒら，（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２２：４７−５７）、ショ糖誘導可能なｓａｃＢプロモーター（Ｌｅｅら，（２０００），Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：４７６−４８０）、枯草菌からのｖｅｇｌプロモーター（Ｌａｍら，（１９９８），Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６３：１６７−１７７）、ａｐｒＥプロモーター（Ｏｌｍｏｓ  Ｓｏｔｏ及びＣｏｎｔｒｅｒａｓ−Ｆｌｏｒｅｓ，（２００３）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６２：３６９−３７３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのＡｍｙＱプロモーター（Ｗｉｄｎｅｒら，（２０００），Ｊ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：２０４−２１２）、及び温度感受性Ｃ１調節プロモーター系（Ｓｃｏｆｉｅｌｄら，（２００３），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：３３８５−３３９２）がある。特に興味があるのは、Ｂ．ハロジュランスフラゲリン（ｈａｇ）遺伝子の天然のプロモーターであるσＤプロモーターである（Ｓａｋａｍｏｔｏら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：２１５９−２１６６）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
σＤプロモーター並びにコード配列を含む完全なｈａｇ遺伝子をｐＳＥＣ１９４にクローニングして、菌株ＢｈＦＣ０１へ形質転換した。ゲノムのｈａｇ欠失を遺伝子の複数コピーで補完する能力を評価するために、プラスミドｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣ（無傷のフラゲリンプロモーター及び構造遺伝子を含む）をプロトプラスト形質転換によってＢｈＦＣ０１に導入した。形質転換体を運動性評価プレート上へ楊枝で移すと、それらはｐＳＥＣ１９４ＦｌｉＣを含む菌株ＢｈＦＣ０１の明白な運動を示した（図１５）。実施例１の場合のように菌株ＢｈＦＣ０１から細胞表面タンパク質抽出物を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解した。約３４ｋＤａに対応するバンドに分解したタンパク質は、菌株ＢｈＦＣ０１形質転換体においてフラゲリンタンパク質発現の回復を示した（図１４Ａ、レーン６）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
ＰＣＲ生成物を消化し、ＳａｃＩ／ＸｂａＩで制限したｐＳＥＣ１９４に連結してｐＳＥＣ１９４ｗｐｒＡ−を得た（図１６Ｂ）。プラスミドｐＳＥＣ１９４ｗｐｒＡ−を、前の通り菌株ＢｈＦＣ０１へ形質転換した。実施例４で記載されているように、ｓｃｏを含む形質転換体を用いてｄｃｏ事象を促進した。得られた菌株は、ＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）と命名した。Ｂ．ハロジュランス菌株ＢｈＦＣ０１及びＢｈＦＣ０４の細胞外及び細胞表面のタンパク質を抽出し、タンパク質及びプロテアーゼのプロファイルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゼラチン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で得た（図１７）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
出願人は、２００６年１１月２８日にブダペスト条約の下、ＢｈＦＣ０４（Δｈａｇ、ΔｗｐｒＡ）Ｂ．ハロジュランス菌株をアクセッション番号ＮＣＩＭＢの下、ＮＣＩＭＢ菌株保存機構（ＮＣＩＭＢ社、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１  ９ＹＡ）に寄託した。ＢｈＦＣ０４菌株は、ＮＣＩＭＢアクセション番号４１３５７を割り当てられた。ＮＣＩＭＢ菌株保存機構に寄託した菌株は、本出願の優先権主張日の前からＣｏｕｎｃｉｌ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＳＩＲ）によって維持されていた寄託菌から取られた。菌株の寄託菌は、３０年間、又は最も最近の要請から５年間、又は特許の有効期間のうちより長い期間、ＮＣＩＭＢ保管所で規制なしに維持され、その期間の間に寄託菌が生育不能になる場合は交換される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−１】
2008521431.tif 000051
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−２】
2008521431.tif 000052
【国際調査報告】
2008521431.tif 000053
2008521431.tif 000054
2008521431.tif 000055
2008521431.tif 000056
2008521431.tif 000057
2008521431.tif 000058
2008521431.tif 000059
2008521431.tif 000060
2008521431.tif 000061
2008521431.tif 000062