(57)【要約】  本発明は、ＳＤＦ−１活性および／または濃度が発症および／または経過に関与する疾患を治療するための医薬の製造における、カテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子の使用に関する。
2008520554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＦ−１活性および／または濃度が発症および／または経過に関与する疾患を治療するための医薬の製造における、カテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子の使用。
【請求項２】
前記疾患がＳＤＦ−１活性によって引き起こされる／悪化される請求項１記載のＣＴＫの使用。
【請求項３】
前記疾患が癌、炎症および感染症から選択される請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記疾患がアレルギー性気道疾患である請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記疾患が慢性関節リウマチである請求項３記載の使用。
【請求項６】
前記疾患が動脈硬化症である請求項３記載の使用。
【請求項７】
前記疾患が癌である請求項３記載の使用。
【請求項８】
前記疾患が前立腺癌である請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記疾患が腎臓癌である請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患が神経芽腫である請求項７記載の使用。
【請求項１１】
前記疾患が神経膠腫である請求項７記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患が膵臓癌である請求項７記載の使用。
【請求項１３】
前記疾患が結腸癌である請求項７記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患が乳癌である請求項７記載の使用。
【請求項１５】
転移を予防するための請求項７記載の使用。
【請求項１６】
前記癌細胞がＣＸＣＲ４を発現する請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記疾患が白血病である請求項７記載の使用。
【請求項１８】
前記疾患が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記疾患が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
前記疾患がＳＤＦ−１活性によって予防／緩和される請求項１記載のＣＴＫＩの使用。
【請求項２１】
前記疾患がＨＩＶである請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
必要とする対象において幹細胞の動員を誘導するための医薬の製造における、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子の使用。
【請求項２３】
前記必要とする対象が重篤な好中球減少症に苦しむ請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記好中球減少症が骨髄移植の際に生じる請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記好中球減少症が癌化学療法の際に生じる請求項２３記載の使用。
【請求項２６】
必要とする対象において骨髄中の幹細胞の滞留を増大させるための医薬の製造におけるＣＴＫＩの使用。
【請求項２７】
必要とする対象において器官の再生を増強するための請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
前記器官が骨髄である請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
有効量のＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、ＳＤＦ−１活性および／または濃度によってその発症および経過が影響される疾患を治療する方法。
【請求項３０】
有効量のＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、哺乳動物における癌を治療する方法。
【請求項３１】
前記癌細胞がＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を発現する請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
転移を予防するための請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
必要とする対象へ有効量のＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、組織への多能性幹細胞の標的化を調節する方法。
【請求項３４】
前記標的組織への前記細胞の標的化を増大させるために、ＣＴＫＩを標的組織へ投与する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が正常な造血細胞である請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記造血細胞が造血幹細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞がインビボで患者にあり、かつ治療的に有効量のＣＸＣＲ４アゴニストをこのような治療を必要とする該患者へ投与する請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＸＣＲ４アゴニストがＳＤＦ−１、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子である請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
前記患者が癌を有する請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記患者が自家もしくは同種異系骨髄または末梢血幹細胞移植を必要とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記患者を細胞毒性薬で治療することをさらに含む請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
有効量のＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が、標的組織への前記細胞の標的化を減少させるために、該標的組織へ投与される請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が新生細胞である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
造血細胞へ有効量のＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、造血細胞増殖の速度を減少させる方法。
【請求項４５】
前記造血細胞が造血幹細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がインビボで患者にあり、かつ治療的に有効量のＣＸＣＲ４アゴニストをこのような治療を必要とする該患者へ投与する請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記患者が自家または同種異系骨髄あるいは末梢血幹細胞移植を必要とする請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記患者が癌を有する請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記患者を細胞毒性薬で治療することをさらに含む請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
ＣＴＫをＳＤＦ−１と接触させること、ＳＤＦ−１の活性を測定すること、およびＣＴＫによるＳＤＦ−１活性の阻害を防止または逆転し得る化合物を単離することを含む、ＣＴＫアンタゴニストを同定する方法。
【請求項５１】
ＣＴＫをＳＤＦ−１と接触させること、ＳＤＦ−１の完全性を測定すること、およびＣＴＫによるＳＤＦ−１活性の分解を防止し得る化合物を単離することを含む、ＣＴＫアンタゴニストを同定する方法。
【請求項５２】
請求項４３または４４記載の方法によって得られるアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発症および／または経過へのＳＤＦ−１の関与によって特徴付けられる疾患を治療するための医薬の製造におけるカテプシンＫ（ＣＴＫ）またはカテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中を循環する形態学的に認識可能でありかつ機能的に有能である細胞としては、赤血球、好中球性、好酸性、および好塩基性顆粒、Ｂ−、Ｔ−、非Ｂ−、非Ｔ−リンパ球、および血小板が挙げられる。これらの成熟造血細胞は、赤血球系についての赤芽球、顆粒球系についての骨髄芽球、前骨髄球および骨髄球、ならびに血小板についての巨核球のような、それぞれの系統についての形態学的に認識可能な分裂する前駆細胞によって、必要に応じて、置換されるかまたはこれらに由来する。前記前駆細胞は、２つの主要なサブグループへ簡略化して分類され得るより始原的な細胞から生じる：幹細胞および前駆細胞［レビューについては、（１）を参照のこと］。
【０００３】
ＣＸＣＬ１２またはストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）は、リンパ球、単球、およびＣＤ３４−陽性造血前駆細胞を休止させるための強力な化学誘引物質である（２）。ＳＤＦ−１は、既知のリガンドとしてこのケモカインのみを有する、１つの受容体、ＣＸＣＲ４へのみ結合する。
【０００４】
ＳＤＦ−１は、低濃度で、白血球インテグリンの活性化、キャピラリー内皮細胞上への白血球の捕捉（arrest）、およびこれらの細胞の溢出へと導く（３）。ＳＤＦ−１は、Ｂ細胞リンパ球産生および骨髄細胞骨髄造血を制御し（４）、そして骨髄移植のために重要である（１３）。それは、ＣＤ４＋Ｔ細胞生存を促進し、そしてサイトカインおよびＴ細胞受容体媒介刺激のためにこれらの細胞をプライムする（５）。ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４複合体の機能的活性は、白血球エラスターゼによって媒介されるタンパク質分解によりインビトロで阻害され得ることが示され、そしてこれは、造血細胞前駆体のホーミングが調節される機構であり得る（６）。実際に、インビボでの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）によって誘発される末梢血への骨髄および他の器官からのＣＤ３４＋造血細胞前駆体の放出（動員）は、好中球エステラーゼによるＳＤＦ−１のタンパク質分解による不活性化に依存する（４１）。
【０００５】
LevesqueおよびPetitによって実証されたように、カテプシンＧおよびエラスターゼはＧ−ＣＳＦ誘発動員（G-CSF induced mobilization）においてＳＤＦ−１を切断することが公知である。
【０００６】
２つの増殖因子（サイトカイン）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、（たとえば、骨髄移植および集中的癌化学療法後）重篤な好中球減少症を有する患者における熱および感染を予防するために広く使用される。しかし、サイトカイン療法は高価であり；発熱性好中球減少症の危険性が＞＝３０％である場合に、Ｇ−ＣＳＦの費用は正当化される。一般的に、Ｇ−ＣＳＦが化学療法の完了の約２４時間後に投与される場合に、最大の臨床的利益が生じる。５μｇ／ｋｇ／日（皮下）の投与量がしばしば有効である。Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、自家骨髄移植または集中的化学療法を受ける患者において、＞５００／μｌへの好中球カウントの戻りを促進する。
【０００７】
先天性、周期性、および特発性好中球減少症における好中球産生は、Ｇ−ＣＳＦ  ３〜１０μｇ／ｋｇ／日（皮下）の投与によって改善され得る。この治療は、口内炎および他のタイプの口腔咽頭の炎症、熱、および蜂巣炎ならびに他の文書化された細菌感染を有さない患者において示される。利益は滞留され、そして患者は、その効果を失うことなく、数ヶ月または数年間、毎日または隔日Ｇ−ＣＳＦに維持され得る。長期間のＧ−ＣＳＦはまた、脊髄形成異常症、ＨＩＶおよびＡＩＤＳならびに自己免疫疾患を含む、他の状況において、好中球産生および好中球動員を誘発して好中球減少症を予防するために使用されている。一般的に、特に重篤な好中球減少症を有さない患者について、この療法の臨床的利益はあまり明確でないが、好中球カウントは増加する。特異体質の薬物反応によって引き起こされる好中球減少症を有する患者もまた、特に遅延した回復が予想される場合、Ｇ−ＣＳＦから利益を得るかもしれない。しかし、これまでのところ、制御されない試行のみが、後者の状況において報告されている。
【０００８】
ＳＤＦ−１およびその受容体ＣＸＣＲ４の相互作用は、マウス胚発生のあいだのＢＭの幹細胞播種において重要な役割を果たす（１０、１１）。以前、本発明者らは、レシピエントとして免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用して、マウス骨髄の高レベル多系統再生（multilineage repopulation）および短期間インビボ移動（short term in vivo migration）（ホーミング）の両方がＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用に依存することを示すことが出来た（１２〜１５）。これらのデータのサポートにおいて、ヒトＣＤ３４＋細胞における高レベルのＣＸＣＲ４発現またはインビトロでの高ＳＤＦ−１誘発指向性運動性（directional motility）のいずれかが、ＣＤ３４＋細胞の正の選択を伴う、同種異系および自家臨床移植の両方においてより早い回復と関連することが示されている（１６、１７）。
【０００９】
他の初期に作用するサイトカイン（early acting cytokines）との相乗効果で低濃度のＳＤＦ−１は、ヒトＣＤ３４＋細胞とマウス幹細胞および前駆細胞との両方の増殖を増強し、これは前駆細胞生存におけるこのケモカインの役割を示唆し（２５〜２９）、一方、高濃度のＳＤＦ−１は、移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの連続再生（serial repopulation）を可能にする原始ヒト胎児肝臓ＣＤ３４＋細胞およびヒト長期培養始原細胞（ＬＴＣＩＣ）の増殖との停止を誘発する（３０、３１）ことが十分に実証されている。
【００１０】
ＣＸＣＲ４発現は、サイトカイン、ケモカイン、間質細胞、接着分子、およびタンパク質分解酵素のような環境因子によって調節される、動的プロセスである（１８）。ヒト起源の造血幹細胞および前駆細胞において、ＣＸＣＲ４は、短期間（約４０時間）インビトロサイトカイン培養（１３、１９）またはタンパク質分解酵素（たとえば、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９２０）での臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋の刺激よって、細胞内プールからアップレギュレートされ得る。これは、引き続いて、ＳＤＦ−１勾配へのそれらのインビトロ移動ならびに移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤおよび連続的に移植されたｂ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤにおけるそれらのインビボホーミングおよび再生能を増強し、幹細胞自己再生および発生を運動性とリンクする。最近の報告は、サイトカインカクテルとのより長い培養期間が、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋に富む細胞における細胞表面ＣＸＣＣＲ４発現の減少（２２）を生じさせることを実証し、そして減少された再生が、より長い期間インビトロで培養されたヒト前駆体で実証された。最近、本発明者らは、ＣＢ  ＣＤ３４＋／ＣＸＣＲ４−ソート細胞は低レベルの細胞内ＣＸＣＲ４を有することを示し、これは、短期間のインビトロサイトカイン刺激に続いて、迅速に細胞表面上に機能的に発現され、移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＳＤＦ−１依存性ホーミングおよび再生を媒介し得る（１５）。
【００１１】
ＳＤＦ−１の不活性化と関連するタンパク質分解切断は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９、カテプシンＧおよびエラスターゼを含むいくつかの分解酵素によって実証される（Petitら Natl Immunol. 3:687 2002, Valenzuela-Femandezら JBC 277:15677, 2002, Levesqueら JCI 111 :187, 2003 および McQuibbanら JBC 276: 43503, 2001）。
【００１２】
ヒトおよびマウス幹細胞２４の指向性移動を媒介することにおけるそれらの中心的役割に加えて、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用はまた、他の幹細胞機能に関与する。重要なことに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用はまた、ＢＭにおける幹細胞および前駆細胞の滞留に関与する（１０、３２、３３）。この仮説はまた、マウスＢＭ腔へ直接注入されたヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の固定におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用の関与を実証する他の研究によって確認されている（３４、３５）。これらの相互作用の干渉は、ＢＭから循環へのヒトおよびマウスの両方の前駆体の放出／動員を誘発する（３６〜４１）。
【００１３】
骨は、骨を生成する骨芽細胞および骨を再吸収する破骨細胞の活性により平衡化される恒常的な再構築を受けている。骨粗しょう症、パジェット病、特定の形態の関節炎、および骨転移のような、種々の骨疾患は、過剰な破骨細胞媒介骨再吸収によって特徴付けられる。ＲＡＮＫＬ（ＮＫκＢリガンドの受容体アクチベータ）およびその対応のＲＡＮＫ受容体は、破骨細胞分化および活性化において重要な役割を果たし、そしてオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬの生理学的阻害剤である。
【００１４】
マトリクス分解は、主に、システインプロテアーゼ、ＣＴＫの活性に起因する（７、８）。ＣＴＫは、破骨細胞において高度に発現されそして骨再吸収（破骨細胞が骨を分解するプロセス）に関連する、リソソームシステインプロテアーゼである。Ｉ型コラーゲンは、有機骨量（organic bone mass）の９０〜９５％を構成し（Krane, S. M., and Simon, L.(1994) in Scientific American Medicine (Rubenstein, E. および Federman, D. D., eds), Vol. 3 , pp. 1-26, Scientific American, Inc., New York）、そしてＣＴＫについての主要な生物学的基質を示す（９）。全ての哺乳動物コラゲナーゼの中で、ＣＴＫは、それらの三重らせん構造内の複数の部位で間質コラーゲンを切断し得る唯一のプロテアーゼである（Garnero, P., Borel, O., Byrjalsen, I., Ferreras, M., Drake, F. H., McQueney, M. S., Foged, N. T., Delmas, P. D., および Delaisse, J. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 32347-32352, 6Kafienah, W., Bromme, D., Buttle, D. J., Croucher, L. J., および Hollander, A. P. (1998) Biochem. J. 331, 727-732）。ＣＴＫ活性の欠乏は、常染色体劣性骨格形成異常濃化異骨症（autosomal recessive skelら dysplasia pycnodysostosis）を有する患者において観察されるように（GeIb, B. D., Shi, G. P., Chapman, H. A., and Desnick, R. J. (1996) Science 273, 1236-1238）、破骨細胞内のリソソーム中の未消化の膠原原線維の蓄積へ導く（Everts, V., Aronson, D. C, および Beertsen, W. (1985) Calcif. Tissue Int. 37, 25-31）。ＣＴＫ突然変異体の分析によって、コラーゲン分解異常は、ＣＴＫのタンパク質分解活性の損失と必ずしも連結されないことが判明した。前記プロテアーゼの活性部位から離れている、１つの疾患を引き起こす変異、Ｙ２１２Ｃは、ＣＴＫの全体的なタンパク質分解活性に少しだけ影響を与えたが、そのコラゲナーゼ活性を完全に排除した（Hou, W.-S., Bromme, D., Zhao, Y., Mehler, E., Dushey, C, Weinstein, H., Miranda, C. S., Fraga, C, Greig, F., Carey, J., Rimoin, D. L., Desnick, R. J., および GeIb, B. D. (1999) J. Clin. Invest. 103, 731-738）。この観察は、ＣＴＫの触媒活性に加えて、他の特徴が、ＣＴＫによるコラーゲンの加水分解のために必要とされることを示した。骨−および軟骨耐性グリコサミノグルカンは、特に、カテプシンＬまたはマトリックスメタロプロテアーゼＩでは観察されない効果である、ＣＴＫによるＩ型およびＩＩ型の間質コラーゲンの分解を増強する（Li, Z., Hou, W. S., and Bromine, D. (2000) Biochemistry 39, 529-536）。この知見は、ＣＴＫのコラゲナーゼ活性が、ＣＴＫタンパク質およびグリコサミノグルカンの特異的な相互作用を必要とすることを示唆した。しかし、ＣＴＫがコラーゲンを分解する機構は、理解しにくいままである。Li Zら（J Biol Chem. 2002 Aug 9;277(32):28669-76. Epub 2002 May 30）は、ＣＴＫの膠原溶解性活性はＣＴＫタンパク質とコンドロイチン硫酸との新規のオリゴマー複合体の形成に依存することを実証した。したがって、現在、ＣＴＫ阻害剤は、骨再吸収を阻害するために使用されている。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、ＳＤＦ−１活性および／または濃度が発症および／または経過に関与する疾患を治療するための医薬の製造における、カテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体（circularly permutated derivative）、塩または誘導因子の使用に関する。
【００１６】
本発明の１局面において、ＣＴＫは、癌、炎症および感染症のような、ＳＤＦ−１活性によって引き起こされる／悪化される疾患において使用される。
【００１７】
本発明の一実施形態において、前記疾患はアレルギー性気道疾患である。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態において、前記疾患は慢性関節リウマチである。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態において、前記疾患は動脈硬化症である。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、前記疾患は、癌、たとえば、前立腺癌、腎臓癌、神経芽腫、神経膠腫、膵臓癌、結腸癌、乳癌、白血病、たとえば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、ＣＴＫは、好ましくはＣＸＣＲ４を発現する癌細胞においいて、癌転移を予防するために使用される。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、ＣＴＫＩは、ＨＩＶのような、ＳＤＦ−１活性によって予防／緩和される疾患において使用される。
【００２３】
さらに、本発明は、必要とする対象において幹細胞の動員を誘発するための医薬の製造における、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子の使用を提供する。
【００２４】
一実施形態において、必要とする前記対象は、たとえば骨髄移植または癌化学療法に続いて生じる、重篤な好中球減少症に苦しむ。
【００２５】
また、本発明は、たとえば必要とする対象において骨髄、肝臓および腎臓のような器官の再生を増強するための、必要とする対象において骨髄中の幹細胞の滞留を増大させるための医薬の製造におけるＣＴＫＩの使用を提供する。
【００２６】
本発明はまた、有効量のＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、ＳＤＦ−１活性および／または濃度によってその発症および経過が影響される疾患を治療する方法を提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、有効量のＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物における癌を治療する方法を提供する。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、前記癌細胞は、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を発現する。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、転移を予防するために使用される。
【００３０】
さらに、本発明は、必要とする対象へ有効量のＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、組織への多能性幹細胞の標的化を調節する方法を提供する。
【００３１】
本発明の一実施形態において、ＣＴＫＩが、標的組織への前記細胞（たとえば、正常な造血細胞）の標的化を増大させるために、該標的組織へ投与される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、前記細胞がインビボで患者にあり、かつ治療的に有効量のＣＸＣＲ４アゴニスト、たとえば、ＳＤＦ−１、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が、癌患者のような、必要とする該患者へ投与される。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、前記患者は自家または同種異系骨髄あるいは末梢血幹細胞移植を必要とし、および／または前記患者は細胞毒性薬で治療される。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が、標的組織への前記細胞（たとえば、新生細胞）の標的化を減少させるために、該標的組織へ投与される方法を提供する。
【００３５】
別の局面において、本発明は、造血細胞へ有効量のＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を投与することを含む、造血細胞増殖の速度を減少させる方法を提供する。
【００３６】
本発明の一実施形態において、前記造血細胞は、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態において、前記細胞はインビボで患者にあり、かつ治療的に有効量のＣＸＣＲ４アゴニスト、たとえば、ＳＤＦ−１、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が必要とする該患者へ投与される。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態において、前記患者は、自家または同種異系骨髄あるいは末梢血幹細胞移植を必要とする。
【００３９】
本発明のさらなる実施形態において、前記患者は、癌を有し、そして細胞毒性薬で治療される。
【００４０】
別の局面において、本発明は、ＣＴＫをＳＤＦ−１と接触させること、ＳＤＦ−１の活性を測定すること、およびＣＴＫによるＳＤＦ−１活性の阻害を防止または逆転し得る化合物を単離することを含む、ＣＴＫアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【００４１】
本発明はまた、ＣＴＫをＳＤＦ−１と接触させること、ＳＤＦ−１の完全性を測定すること、およびＣＴＫによるＳＤＦ−１活性の分解を防止し得る化合物を単離することを含む、ＣＴＫアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、本発明の方法によって得られるアンタゴニストに関する。
【００４３】
本発明は、例示のためのみに、添付の図面を参照して本明細書に記載される。ここで詳細な図面を特に参照しているが、示される詳細は、例示のためにそして本発明の好ましい実施形態の例示的議論のためにのみ示され、そして本発明の原理および概念的局面の最も有用でありかつ容易に理解される説明であると思われるものを提供するために提示されることが強調される。この点において、本発明の基本的理解のために必要とするよりもより詳細に本発明の構造的詳細を示す試みは成されず、図面を考慮しての説明により、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、ケモカインストロマ細胞由来因子（ＳＤＦ−１）が発症および／または経過に関与する疾患を治療するための医薬の製造における、ＣＴＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子の使用に関する。
【００４５】
本発明は、ＣＴＫがＳＤＦ−１活性を特異的に阻害し得るという知見に基づく。本発明者らは、ストレスシグナルが以下の事象を誘発することを本明細書中において示す：ＢＭ  ＳＤＦ−１の一時的増加、破骨細胞活性化、ＣＴＫ活性化の増加、ＣＴＫ分解によって媒介されるＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少、および細胞動員。
【００４６】
本発明の原理および作用は、図面および付随の説明を参照してよりよく理解され得る。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、以下の説明に記載されるかまたは実施例によって例示される詳細へ本発明がその適用で限定されないことが理解される。本発明は、他の実施形態あるいは種々の方法で実施または実行され得る。また、本明細書中で使用される表現および用語は、説明のためであり、そして限定としてみなされるべきでないことが理解される。
【００４８】
下記に示される知見は、炎症および損傷のようなストレスシグナルが、破骨細胞活性化および骨髄から末梢血（ＰＢ）への前駆体動員を誘発することを実証する。本発明者らは、ストレスシグナルが以下の事象を誘発することを示す：ＢＭ  ＳＤＦ−１の一時的増加、破骨細胞活性化、ＣＴＫ活性化の増加、ＣＴＫ分解によって媒介されるＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少、および細胞動員。
【００４９】
また、得られた結果は、外から投与されたＳＤＦ−１、あるいはＧ−ＣＳＦおよび／またはＨＧＦの機能により産生されたＳＤＦ−１、あるいはストレスシグナル（たとえば、炎症または損傷）が、破骨細胞活性化、ＢＭ  ＣＴＫの増加、ＳＤＦ−１の減少、および前駆体動員を直接誘発することを示す。
【００５０】
本発明者らは、インビボでのＲＡＮＫＬ（破骨細胞活性化の誘導因子）投与が機能性ＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１）を必要とする動員を誘発することを実証した。
【００５１】
本願において得られた結果は驚くべきことであり、何故ならば、Takamatsuら(Blood. 1998 Nov l;92(9):3465-73. 1998)の結果とは対照的に、結果は、破骨細胞活性化が骨髄から循環への幹／前駆体細胞動員を媒介すること示すためである。ＣＴＫ、すなわち主要な破骨細胞プロテイナーゼは、そのアミノ末端の特異的かつ迅速な切断によりＳＤＦ−１活性化を阻害することが実証された。
【００５２】
したがって、本知見は、ＳＤＦ−１活性を調節するために、カテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を使用するという可能性を提供する。
【００５３】
多くの疾患の発症または経過は、ＳＤＦ−１濃度および／または活性のアップまたはダウンレギュレーションに伴って生じる。したがって、ＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子は、発症および／または経過へのＳＤＦ−１の関与によって特徴付けられる疾患を治療するための医薬の製造において使用され得る。
【００５４】
ＳＤＦ−１およびその受容体ＣＸＣＲ４は、ヒト免疫不全ウイルス１型病態生理学、白血球輸送、炎症、造血、胚形成、新脈管形成、および癌転移において重要な役割を果たす。本発明者らの知見に基づいて、本発明者らは、ＣＴＫ媒介タンパク質分解が、ＳＤＦ−ｌ／ＣＸＣＲ４依存細胞シグナル伝達を不活性化しかつ停止させることを示唆する。
【００５５】
本発明の一局面において、カテプシンＫ阻害剤（ＣＴＫＩ）またはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が、腫瘍、感染症および炎症性疾患のような、ＳＤＦ−１活性によって引き起こされる／悪化される疾患において使用される。
【００５６】
増加する証拠は、アレルギー性気道疾患（Gonzalo ら, [J immunol 165:499-508, 2000], Lukacs ら, [Am. J Pathol. 160:1353-1360, 2002]）、慢性関節リウマチ  Buckley ら, [J immunol 165:3423-3429, 2000]、および動脈硬化症（Abi-Younes ら, [Circ Res 86:131-138, 2000]のようないくつかの疾患における、腫瘍、感染性および炎症性プロセスの病因に、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４シグナル伝達系を関係させ、ここでＳＤＦ−１はアップレギュレートされる。
【００５７】
ＣＸＣＲまたはＳＤＦ−１の異常発現は、前立腺癌（Taichman ら. Cancer Res 2002, 62:1832-7）、腎臓癌（Br J Cancer 2002, 86:1250-6）、神経芽腫（J Immunol. 2001, 167:4747-57）、神経膠腫（Zhou ら. J Biol. Chem. 2002, 277:49481, Salmaggi ら J Neurooncol. 2004 May;67(3):305-17.）、膵臓癌（Clin. Cancer Res 2000,6:3530）、結腸癌（Zeelenberg ら. Cancer Res 2003, 63:3833-9）および乳癌（Muller ら. Nature 2001, 410:50-6）のような固形癌において観察されている。
【００５８】
大抵の白血病細胞は、接着、生存および増殖の増加を伴ってＳＤＦ−１に応答する（Juarez ら Histol Histopathol. 2004, 19 (1): 299-309）。
【００５９】
ＳＤＦ−１はまた、プレＢＡＬＬ細胞（pre-BALL cells）の増殖および生存に関与する（Nishii ら. Br J Haematol. 1999 Jun;105(3):701-10）。Tavorら（Cancer Research 64, 2817-2824, 2004）は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞がＳＤＦ−１を発現すること、および内因性ＳＤＦ−１を遮断することによりＡＭＬ細胞生存が減少することを示した。
【００６０】
悪性神経膠腫におけるＳＤＦ−１は、新脈管形成および内皮細胞と腫瘍細胞とのあいだのクロストークにおける役割を有しているようである（Salmaggi ら J Neurooncol. 2004 May;67(3):305-17）。したがって、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を用いてＳＤＦ−１活性を阻害することは、臨床的に有益である。
【００６１】
ＳＤＦ−１およびＣＸＣＲ４は、腫瘍細胞の転移先を決定する。ＣＸＣＲ４はヒト乳癌細胞によって発現され、そしてＳＤＦ−１は、マウスモデルにおける転移の最初の目的地である器官において高く、このケモカインシグナル伝達が浸潤反応を誘発することを示している（Muller ら., [Nature 410:50-56, 2001]）。したがって、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子を用いてＳＤＦ−１活性を遮断することは、ＣＸＣケモカイン受容体４を発現する腫瘍細胞における転移阻害のために有益である。
【００６２】
得られた結果は、必要に応じて、破骨細胞活性化および／またはＣＴＫ活性を誘発することにより、動員を誘発することができることを実証する。あるいは、動員は、破骨細胞活性化および／またはＣＴＫ活性を阻害することによって防止され得る。
【００６３】
本発明の一実施形態において、ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、円順列誘導体、塩または誘導因子が、重篤な好中球減少症において前駆体の動員を誘発するために使用される。たとえば、骨髄移植後および／または集中的な癌化学療法後に生じる重篤な好中球減少症において。
【００６４】
本発明の別の実施形態において、破骨細胞活性化が、重篤な好中球減少症において前駆体の動員を誘発するために使用される。
【００６５】
本発明の別の局面において、ＣＴＫＩは、ＳＤＦ−１活性によって予防／緩和される疾患において使用される。
【００６６】
ＳＤＦ−１は、リンパ器官、肝臓、肺、および内皮細胞を囲む間葉細胞を含む種々の組織において産生されることが公知である（Tachibana ら. 1998. Nature 393:591.）。
【００６７】
ＣＴＫは、比較的に組織特異的であり、そして破骨細胞に加えて、マクロファージ、大動脈平滑筋細胞、甲状腺上皮細胞および肺上皮細胞に存在する。これらの細胞で占められる器官において、ＣＴＫＩは、ＳＤＦ−１アゴニストとして機能すると予想される。たとえば、骨髄におけるＣＴＫの活性の阻害は、この酵素によるＳＤＦ−１分解および引き続いての動員を防止する。
【００６８】
したがって、別の実施形態において、ＣＴＫＩは、再生（repopulation）を増強するためおよび欠点のある造血（defective hematopoiesis）を回復させるために、前駆体の動員を阻害するためおよびしたがって骨髄における前駆体の滞留を増大させるために使用される。
【００６９】
本発明のこの局面にしたがう幹細胞／前駆体は、好ましくは、治療される対象から得られる。しかし、幹細胞／前駆体はまた、同系（syngeneic）、同種異系（allogeneic）から、そしてより好ましくはないが、異種（xenogeneic）ドナーから得られ得る。
【００７０】
同種異系または異種幹細胞が使用される場合、レシピエント対象および／または細胞は、好ましくは、移植片対宿主および宿主対移植片拒絶反応を防止するように処理されることが理解される。免疫抑制プロトコルは、当該分野において周知であり、そして米国特許第６，４４７，７６５号に開示されている。
【００７１】
ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞指向性（tropic）ヒト免疫不全ウイルス１についてのコレセプター（coreceptor）として役立ち得る（Oberlin ら, [Nature 382:833-835, 1996]）。ＳＤＦ−１は、この受容体のダウンレギュレーションの支配および促進を両方することによって、ＣＸＣＲ４へ結合することについてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と拮抗することが示されており；したがって、それは、このウイルスに対する宿主防衛において役割を果たし得る（Amara ら, [J Exp Med 186:1390-146, 1997]）。
【００７２】
したがって、本発明の一実施形態において、ＣＴＫＩは、ＨＩＶのようなＳＤＦ−１活性によって予防／緩和される疾患において使用される。
【００７３】
一局面において、本発明は、有効量のＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、循環的に置換された誘導体、塩または誘導因子を含む、ＳＤＦ−１濃度および／または活性のアップまたはダウンレギュレーションによって影響される疾患を治療する方法を提供する。
【００７４】
一実施形態において、本発明は、哺乳動物における腫瘍細胞の転移を阻害する方法を提供し、ここで該腫瘍細胞はＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を発現し、該方法は、該腫瘍の転移を阻害するに十分な量のＣＴＫを該哺乳動物へ投与することを含む。
【００７５】
一局面において、本発明は、対象内の組織への多能性幹細胞（たとえば、正常な前駆体）の標的化を調節するために医薬の製造のための、ＣＴＫＩまたはＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、循環的に置換された誘導体、塩または誘導因子の使用を提供する。
【００７６】
１実施形態において、本発明は、標的組織におけるＣＴＫ活性を阻害することを含む、骨髄のような標的細胞への正常な前駆細胞の標的化を増大させることに関する。
【００７７】
別の実施形態において、本発明は、標的組織におけるＣＴＫ活性を増大させることを含む、標的組織（たとえば、骨髄）への新生細胞の標的化の減少に関する。
【００７８】
ＣＴＫ、そのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、活性画分、循環的に置換された誘導体、塩または誘導因子は、ＳＤＦ−１阻害剤として機能し、したがって、それは、白血球輸送、炎症、造血、造血細胞の増殖、胚形成、新脈管形成、および癌転移においてＳＤＦ−１活性を阻害する。
【００７９】
ＣＴＫ阻害剤はＳＤＦ−１アゴニストとして機能し、したがって、それは、ＢＭ  ＳＤＦ−１を増加させる（たとえば、照射）またはＳＤＦ−１が骨髄において増加される条件を有する治療または薬剤が投与された患者において、骨髄における造血細胞の増殖を増強する。
【００８０】
したがって、一実施形態において、本発明は、造血細胞へ有効量のＣＴＫ阻害剤を投与することを含む、正常な造血細胞増殖の速度を増加させる方法に関する。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、前記造血細胞は、造血幹細胞および造血前駆細胞からなる群から選択される。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、前記細胞は患者中に存在し、そしてＳＤＦ−１は、このような治療の必要がある患者において投与されるかまたは誘導される。
【００８３】
さらに好ましい実施形態において、このような必要がある前記患者は癌を有する。
【００８４】
さらなる好ましい実施形態において、前記患者は、自家または同種異系骨髄または末梢血幹細胞移植の必要性を有する。
【００８５】
別の好ましい実施形態において、前記患者は細胞毒性薬で治療され、ここで、ＣＴＫ阻害剤の前記有効量は、該細胞毒性薬に対する正常細胞の感受性を減少させるに十分である。
【００８６】
本発明の一局面において、ＣＴＫ阻害剤はＳＤＦ−１アゴニストとして機能し、したがって、それは、ＢＭ  ＳＤＦ−１を増加させる（たとえば、照射）またはＳＤＦ−１が骨髄において増加される条件を有する治療または薬剤が投与された患者において、骨髄への造血細胞の移植を増強する。
【００８７】
本発明の一局面において、ＣＴＫはＳＤＦ−１アンタゴニストとして機能し、したがって、それは、骨髄から末梢血への前駆体動員へ導くＳＤＦ−１分解を媒介する。
【００８８】
本発明の一局面によれば、ＣＴＫをＳＤＦ−１と接触させること、ＳＤＦ−１の活性または完全性を測定すること、およびＳＤＦ−１活性の阻害または分解を防止または逆転し得る化合物を単離することを含む、ＣＴＫアンタゴニストを同定する方法が提供される。
【００８９】
一実施形態において、測定されるＳＤＦ−１の活性は移動である。本発明は、本方法によって得られ得るＣＴＫアンタゴニストをも意図する。
【００９０】
別の局面において、本発明は、ＣＸＣＲ４が該癌細胞において発現されるおよび／またはＳＤＦ−１が該癌細胞によって分泌される癌患者の治療方法に関し、該方法は、該患者への治療的に有効な量のＣＴＫの投与を含む。
【００９１】
本発明の一実施形態において、癌のタイプは、ＳＤＦ−１を発現する細胞を含む器官へ典型的に転移するものである。
【００９２】
さらなる実施形態において、前記癌は、典型的に、皮膚、肝臓、脳、および肺に転移する。
【００９３】
さらなる実施形態において、前記腫瘍細胞は、リンパ腫細胞、神経芽腫細胞、肺癌細胞、血管肉腫細胞、白血病細胞、神経膠腫細胞、または黒色腫細胞、乳癌細胞または前立腺癌細胞から選択される。
【００９４】
本明細書中で使用される場合、句「幹細胞」は、特定の特別な機能を有する他の細胞タイプ（即ち、「完全に分化した」細胞）へ分化し得る細胞をいう。
【００９５】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック細胞」は、導入された遺伝子または断片を有する細胞である。
【００９６】
用語「動員」は、たとえばサイトカインＧ−ＣＳＦによって誘発される、定常状態ホメオタシスの不均衡に起因して、細胞が骨髄から循環へ放出されるプロセスをいう。
【００９７】
用語「前駆細胞」は、コロニー形成し得る、未熟な未分化の造血細胞の不均一な集団をいう。前駆体は幹細胞について富化されるが、それらはまた、真の幹細胞を特徴付ける長期間の骨髄再生をすることが出来ないより成熟した細胞も含む。用語「ＴＲＡＰ＋ＭＮＣ細胞」は、酵素ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）を発現する多核細胞である、活性化された破骨細胞をいう。
【００９８】
用語「ストレスシグナル」は、サイトカイニン、ケモカイン、タンパク質分解酵素および接着分子のアップまたはダウンレギュレーションによって達成される、定常状態条件の重篤な不均衡によって誘発される危険状況をいう。例としては、炎症、照射、毒性薬物、サイトカイン刺激または欠乏が挙げられる。
【００９９】
用語「ＣＴＫの阻害剤」は、本発明の文脈内において、ＣＴＫ産生および／または機能が弱められ、減少され、あるいは部分的に、実質的にまたは完全に防止または遮断される様式で、ＣＴＫ産生、発現および／または機能をダウンレギュレートするいずれの分子をもいう。用語「ＣＴＫ阻害剤」は、ＣＴＫ産生の阻害剤およびＣＴＫ機能の阻害剤を含むように意図される。
【０１００】
産生の阻害剤は、合成、またはＣＴＫのプロセッシングに悪影響を与えるいかなる分子でもあり得る。本発明にしたがって考慮される阻害剤は、たとえば、ＣＴＫの遺伝子発現の抑制因子、ＣＴＫ  ｍＲＮＡの転写を減少もしくは防止するかまたは該ｍＲＮＡの分解へ導くアンチセンスｍＲＮＡ、正しい折り畳みを妨げるかまたは部分的にもしくは実質的にＣＴＫの分泌を防止するタンパク質、あるいはＣＴＫを分解するプロテアーゼなどであり得る。
【０１０１】
ＣＴＫ機能の阻害剤は、たとえば、ＣＴＫアゴニストであり得る。アゴニストは、その基質へのＣＴＫ結合を担うＣＴＫまたはＣＴＫ結合部位を部分的にまたは実質的に中和するに十分な親和性および特異性で、ＣＴＫ分子自体へ結合し得るかまたはこれを隔離し得る。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、句「発現または活性を阻害する」は、ＣＴＫの発現（転写および／または翻訳）あるいは活性（たとえば、酵素的またはリガンド結合）を部分的にまたは完全に阻害することをいう。いくつかの異なるアプローチが、ＣＴＫの活性をダウンレギュレートするために使用され得る。
【０１０３】
たとえば、ＣＴＫ活性を阻害することは、ＣＴＫに特異的に結合し得る抗体または抗体フラグメントのような薬剤によって達成され得る。好ましくは、該抗体は、ＣＴＫの少なくとも１つのエピトープへ特異的に結合する。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上のいかなる抗原決定基をもいう。
【０１０４】
エピトープ決定基は、通常、アミノ酸あるいは炭水化物側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピング（groupings）からなり、そして通常、特定の３次元構造的特徴および特定の電荷特性を有する。ＣＴＫの好ましいエピトープは、ＳＤＦ−１とのＣＴＫの会合の触媒部位または領域を含むものである。
【０１０５】
用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、インタクトな分子、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖのような機能性フラグメントを含む。これらの機能性抗体フラグメントは、以下のように規定される：（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含み、酵素パパインで完全抗体（whole antibody）を消化してインタクトな軽鎖および１つの重鎖の部分を得ることによって作製され得る、フラグメント；（２）Ｆａｂ’、ペプシンで完全抗体を処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖および重鎖の部分を得ることによって得られ得る抗体分子のフラグメント；２つのＦａｂ’フラグメントが、１抗体分子当たり得られる；（３）Ｆ（ａｂ’）２、引き続いての還元無しに酵素ペプシンで完全抗体を処理することによって得られ得る抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に滞留された２つのＦａｂ’フラグメントの２量体である；（４）Ｆｖ、２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして規定される；ならびに（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、遺伝子的に融合された一本鎖分子のような、好適なポリペプチドリンカーによって結合された、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子。
【０１０６】
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらのフラグメントを作製する方法は、当分野において周知である（たとえば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照のこと。これは、参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＴＫへ結合する市販のポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、本発明における使用に好適である。
【０１０７】
本発明にしたがう抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解あるいは該フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌または哺乳動物細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）における発現によって作製され得る。抗体フラグメントは、従来法による完全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得られ得る。たとえば、抗体フラグメントは、ペプシンでの抗体の酵素的切断によって作製され得、Ｆ（ａｂ’）２という５Ｓフラグメントを提供する。このフラグメントは、さらに、チオール還元剤および必要に応じてジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基についてのブロック基を使用して切断され得、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントが作製される。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断によって、直接、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントが作製される。これらの方法は、たとえば、Goldenberg、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号、ならびにそれらに含まれる参照文献によって記載されており、これらはそれらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。また、Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]を参照のこと。抗体を切断する他の方法、たとえば、一価軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技術もまた、インタクトな抗体によって認識される抗原へフラグメントが結合する限りにおいて、使用され得る。
【０１０８】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら[Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659- 62 (1972)]において記載されるように、非共有結合的であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結されるか、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によって架橋され得る。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって作製される。該構造遺伝子は、発現ベクターへ挿入され、引き続いてこれは大腸菌のような宿主へ導入される。
【０１０９】
抗体フラグメントの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、問題の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得られ得る。このような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって、作製される。たとえば、LarrickおよびFry [Methods, 2: 106-10 (1991)]を参照のこと。
【０１１０】
非ヒト（たとえば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含む、免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖またはフラグメント（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２または抗体の他の抗原結合サブ配列）のキメラ分子である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられ、ここで、該レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、所望の特異性、親和性および能力（capacity）を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ由来の残基（ドナー抗体）によって置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応の非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においてもまたは取り込まれた（imported）ＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリン共通配列のそれらである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれ）の少なくとも部分を含む［Jones ら, Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann ら, Nature, 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０１１１】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれへ導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。それらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基（import residues）と呼ばれ、これらは典型的にインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応の配列の代わりに使用することによって、Winterおよび共同研究者［Jones ら, Nature, 321 :522-525 (1986)；Riechmann ら, Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen ら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法にしたがって本質的に行われ得る。したがって、このようなヒト化抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここで、実質的に１つ未満のインタクトなヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応の配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１１２】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリ［Hoogenboom および Winter, J. MoI. Biol., 227:381 (1991)；Marks ら, J. MoI. Biol., 222:581 (1991)］を含む、当該分野において公知の種々の技術を使用して作製され得る。ColeらおよびBoernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の作製のために利用可能である（Cole ら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)およびBoerner ら, J. Immunol., 147(l):86-95 (1991)）。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているトランスジェニック動物（たとえば、マウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によって作製され得る。挑戦に際して、ヒト抗体作製が観察され、これは、遺伝子再配列、集合（assembly）、および抗体レパートリーを含む、全ての点でヒトにおいて見られるものに非常に似ている。このアプローチは、たとえば、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および以下の科学刊行物において記載されている：Marks ら, Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg ら, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368 812-13 (1994)；Fishwild ら, Nature Biotechnology 14, 845- 51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995)。
【０１１３】
ＣＴＫ活性の阻害はまた、ＣＴＫの公知のペプチド阻害剤を使用することによって、またはＣＴＫの触媒部位と相互作用し得るポリペプチド配列から誘導される任意のペプチド阻害剤（たとえば、基質アナログ）によって、行われ得る。さらなる阻害剤を同定するために使用され得る好適な生化学／分子アプローチの記載は、本明細書以下に提供される。
【０１１４】
ＣＴＫのさらなる阻害剤は、Blanchardら（Structure 7:1125-1133, 1999）およびWattら（Structure 7:1135-1143, 1999）によって記載されるＣＴＫの３次元分子構造についてならびにChouら（FEBS 419:49-54, 1997）によって作製されたその基質結合モデルについて、分子設計アプローチを使用して同定され得る。
【０１１５】
ＣＴＫを細胞内小器官／位置へ再配置し、そしてそれをその生物学的効果を示すことが出来ないようにするタンパク質によって、ＣＴＫ活性はまた阻害され得る。ＣＴＫ細胞の発現のダウンレギュレーションは、いくつかの分子アプローチのいずれか１つを使用して行われ得る。
【０１１６】
たとえば、ＣＴＫ転写は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子を使用することによって、ＲＮＡ干渉を介して阻害され得る。ＲＮＡ干渉は、２工程プロセスであり；開始工程と呼ばれる第１工程は、恐らくＤｉｃｅｒ（ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバー）［これは、ＡＴＰ依存性様式で（直接またはトランスジーンまたはウイルスを介して導入される）ｄｓＲＮＡを処理する（切断する）］の作用によって、インプットされたｄｓＲＮＡが２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へ消化される。連続する切断事象は、各々が２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する、１９〜２１ｂｐ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）へ前記ＲＮＡを分解する［Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002)；およびBernstein Nature 409:363- 366 (2001)］。
【０１１７】
前記エフェクター工程において、前記ｓｉＲＮＡデュプレックスは、ヌクレアーゼ複合体へ結合し、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡデュプレックスのＡＴＰ依存性の巻戻しが、ＲＩＳＣの活性化のために必要とされる。活性ＲＩＳＣは、次いで、塩基対相互作用によって相同転写物（homologous transcript）を標的化し、そして前記ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端から１２のヌクレオチドフラグメントへ切断する［Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002)；Hammond ら. (2001) Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001)；およびSharp Genes. Dev. 15:485-90 (2001)］。切断機構は依然として解明されていないが、研究は、各ＲＩＳＣが単一ｓｉＲＮＡおよびＲＮアーゼを含むことを示す（Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232, 2002）。
【０１１８】
ＲＮＡｉの顕著な効力のために、ＲＮＡｉ経路内の増幅工程が示唆されている。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを生じるインプットｄｓＲＮＡのコピーによって、あるいは形成されるｓｉＲＮＡの複製によって生じ得る。あるいはまたはさらに、増幅は、ＲＩＳＣの複数の代謝回転事象によって行われ得る［Hammond ら. Nat. Rev. Gen. 2:110-119 (2001), Sharp Genes. Dev. 15:485-90 (2001)；Hutvagner and Zamore Curr. Opin. Genetics and Development 12:225-232 (2002)］。ＲＮＡｉについてのより多くの情報については、以下のレビューを参照のこと：Tuschl ChemBiochem. 2:239-245 (2001); Cullen Nat. Immunol. 3:597-599 (2002)；およびBrantl Biochem. Biophys. Act. 1575:15-25 (2002)。
【０１１９】
本発明での使用に好適なＲＮＡｉ分子の合成は、以下のように行われ得る。先ず、ＣＴＫ  ｍＲＮＡ配列を、ＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンの下流でスキャンする。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの出現を、可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位は、非翻訳領域（ＬＩＴＲ）は調節タンパク質結合部位により富んでいるので、オープンリーディングフレームから選択される。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉し得る［Tuschl ChemBiochem. 2:239-245］。しかし、非翻訳領域に指向されるｓｉＲＮＡはまた有効であり得ることが理解され、何故ならば、ＧＡＰＤＨについて実証されているからであり、ここで、５’ＵＴＲで向けられるｓｉＲＮＡは、細胞性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％減少を媒介し、そして完全にタンパク質レベルを廃した（abolished）（www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html）。
【０１２０】
次に、ＮＣＢＩサーバ（www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/）から利用可能なＢＬＡＳＴソフトウエアのような任意の配列アラインメントソフトウエアを使用して、可能性のある標的部位を好適なゲノムデータベース（たとえば、ヒト、マウス、ラットなど）と比較する。他のコード配列に対して有意な相同性を示す推定標的部位を除去する。
【０１２１】
資格（qualifying）標的配列は、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択される。好ましい配列は低Ｇ／Ｃ含有量を含むものであり、何故ならば、これらは、５５％を越えるＧ／Ｃ含有量を有するものと比較した場合に、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより有効であると判明したためである。いくつかの標的部位は、好ましくは、評価のために該標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されるｓｉＲＮＡのよりよい評価のために、ネガティブコントロールが、結合（conjunction）において好ましくは使用される。ｓｉＲＮＡのネガティブコントロールは、好ましくは、該ｓｉＲＮＡと同一のヌクレオチド組成を含むが、該ゲノムに対して有意な相同性を欠いている。したがって、前記ｓｉＲＮＡのスクランブルされたヌクレオチド配列が、それが他の遺伝子に対していずれの有意な相同性を示さない限りにおいて、好ましくは使用される。
【０１２２】
ＣＴＫをダウンレギュレートし得る別の薬剤は、ＣＴＫのＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ転写物を特異的に切断し得るＤＮＡ酵素（DNAzyme）分子である。ＤＮＡ酵素は、一本鎖標的配列および二本鎖標的配列の両方を切断し得る一本鎖ポリヌクレオチドである（Breaker, R.R. および Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262）。ＤＮＡ酵素の一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡ酵素は、各々７〜９のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインが両側に並ぶ、１５のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このタイプのＤＮＡ酵素は、プリン：ピリミジン接合部でその基質ＲＮＡを効率的に切断し得る（Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199；ＤＮＡ酵素のレビューについては、Khachigian, LM [Curr Opin MoI Ther 4: 119-21 (2002)]を参照のこと）。
【０１２３】
一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する合成の人工ＤＮＡ酵素の構築および増幅の例は、Joyceらの米国特許第６，３２６，１７４号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向された類似の設計のＤＮＡ酵素は、ウロキナーゼ受容体発現を阻害しそしてインビボで首尾良く結腸癌細胞転移を阻害することが最近観察された（Itohら, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org）。別の適用において、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子に相補的なＤＮＡ酵素は、白血病細胞における該癌遺伝子発現を阻害し、そしてＣＭＬおよびＡＬＬのケースにおける自家骨髄移植における再発率を減少させることに成功した。
【０１２４】
ＣＴＫ発現の阻害はまた、ＣＴＫをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズしそれによってＣＴＫ転写物の翻訳を特異的に阻害し得るアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって行われ得る。
【０１２５】
ＣＴＫ発現を効率的に阻害するために使用され得るアンチセンス分子の設計は、アンチセンスアプローチにとって重要な２つの局面を考慮しながら、行われなければならない。第１局面は、好適な細胞の細胞質への前記オリゴヌクレオチドの送達であり、一方、第２局面は、その翻訳を阻害する様式で細胞内の該設計されたｍＲＮＡへ特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
【０１２６】
先行技術は、広範囲の細胞タイプにオリゴヌクレオチドを効率的に送達するために使用され得る、多数の送達戦略を教示する。［たとえば、Luft, J MoI Med 76: 75-6, 1998；Kronenwett ら, Blood 91 : 852-62, 1998；Rajur ら, Bioconjug Chem 8: 935-40, 1997；Lavigne ら, Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71, 1997；およびAoki ら, Biochem Biophys Res Commun 231 : 540-5), 1997を参照のこと］。
【０１２７】
さらに、前記標的ｍＲＮＡおよび前記オリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー論の原因となる熱力学サイクルに基づく、最も高い予想される結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムもまた、利用可能である［たとえば、Walton ら. Biotechnol Bioeng 65: 1-9, 1999を参照のこと］。
【０１２８】
このようなアルゴリズムは、細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために首尾良く使用されてきた。たとえば、Waltonらによって開発されたアルゴリズムは、科学者が、ウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦアルファ）転写物について首尾良くアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することを可能にした。同一の研究グループは、より最近、動的ＰＣＲ技術によって評価した場合、細胞培養物において３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対して合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性は、ほとんど全てのケース（ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学で２つの細胞タイプにおける３つの異なる標的に対する試験を含む）において有効であることが判明したことを報告した。
【０１２９】
さらに、インビトロ系を使用して特異的オリゴヌクレオチドの有効性を設計および予想するためのいくつかのアプローチもまた公表された（Matveeva ら, Nature Biotechnology 16, 1374-1375, 1998）。
【０１３０】
いくつかの臨床試験は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性および活性を実証した。たとえば、癌の治療に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドが首尾良く使用され（Holmund ら, Curr Opin MoI Ther 1 :372-85, 1999）、一方、ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる血液悪性腫瘍の治療は、臨床試験に入っており、そして患者によって許容されることが示された（Gerwitz Curr Opin MoI Ther 1 :297-306, 1999）。
【０１３１】
より最近、ヒトヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介抑制が、マウスモデルにおけるヒト癌細胞の胸膜転移を抑制すると報告された（Uno ら., Cancer Res 61 :7855-60, 2001）。
【０１３２】
したがって、現在の総意は、上述されるように、非常に正確なアンチセンス設計アルゴリズムおよび多種多様のオリゴヌクレオチド送達系の作製へ導いたアンチセンス技術の分野における最近の進展は、当業者が、過度な試行錯誤実験に頼る必要無しに、公知の配列の発現をダウンレギュレートするに好適なアンチセンスアプローチを設計および実行することを可能にしたということである。
【０１３３】
アンチセンス配列は、ＣＴＫをコードする転写物を切断し得るリボザイム配列を含み得、それによって、機能性ＣＴＫへのそれらの転写物の翻訳を防止する。このようなリボザイムは、固相オリゴヌクレオチド合成を使用して容易に合成可能である。
【０１３４】
リボザイムは、問題のタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的阻害のためにますます使用されている［Welch ら., "Expression of ribozymes in gene transfer systems to modulate target RNA levels." Curr Opin Biotechnol. 1998 Oct;9(5):486-96］。何らかの特定の標的ＲＮＡを切断するようにリボザイムを設計する可能性のために、基礎研究および治療適用の両方においてそれらを価値あるツールにした。治療学分野において、リボザイムは、感染症におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子、および遺伝性疾患における特定の体細胞突然変異を標的化するために開発された［Welch ら, "Ribozyme gene therapy for hepatitis C virus infection." Clin Diagn Virol. 1998 JuI 15;10(2- 3): 163-71.］。最も顕著には、ＨＩＶ患者についてのいくつかのリボザイム遺伝子療法プロトコルが、既に臨床第１相試験にある。より最近では、リボザイムは、トランスジェニック動物、遺伝子標的確認、および経路解明のために使用されている。いくつかのリボザイムが臨床試験の種々の段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは、ヒト臨床試験において研究される最初の化学合成されたリボザイムであった。ANGIOZYMEは、新脈管形成経路における重要な成分である、ＶＥＧＦ−ｒ（血管内皮成長因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.、ならびに他の企業は、動物も出るにおける抗新脈管形成療法の重要性を実証した。ＨＥＰＴＡＺＹＭＥ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するように設計されたリボザイムは、細胞培養アッセイにおいてＣ型肝炎ウイルスＲＮＡを減少させることにおいて有効であると判った（Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated−ウェブホームページ）。
【０１３５】
上記の発現可能な阻害剤（たとえば、抗体フラグメント、アンチセンスなど）は組換え技術を使用して合成され得そしてたとえば注入によって直接提供され得るが、このような分子はまた、哺乳動物細胞において構成的組織特異的または誘発性転写を指向するために好適なプロモータ配列の転写制御下に配置された、該阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを使用することによって細胞において直接発現され得る。
【０１３６】
本発明での使用に好適な構成的プロモータは、大抵の環境条件および大抵のタイプの細胞（たとえば、サイトメガロウイルス（CMV）およびラウス肉腫ウイルス（RSV））下で機能性である（即ち、転写を指向し得る）配列を含む。本発明の使用に好適な組織特異的プロモータは、造血細胞において機能性である配列を含み、例としては、たとえば、ClarkおよびGordon（Leukoc Biol. 63:153-68, 1998）；Steinら（Cancer 15::2899-902, 2000）；ならびにHormasら（Curr Top. Microbiol. Immunol. 211 :159-64, 1996）によって記載されるプロモータが挙げられる。本発明での使用に好適な誘導性プロモータとしては、たとえば、テトラサイクリン誘導性プロモータ（Srour ら, hromb. Haemost. 90: 398-405, 2003）が挙げられる。
【０１３７】
本発明の発現ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくは両方（たとえば、シャトルベクターにおける複製および組込みにこのベクターを好適にするさらなる配列を含む。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列（たとえば、プロモータ、エンハンサー）ならびに転写および翻訳ターミネータ（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
【０１３８】
真核生物プロモータは、典型的に、２タイプの認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモータエレメントを含む。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に配置される、ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼに指令することに関与すると考えられる。他の上流プロモータエレメントは、転写開始速度を決定する。
【０１３９】
エンハンサーエレメントは、同種または異種プロモータから１，０００倍まで転写を刺激し得る。エンハンサーは、転写開始部位から下流または上流に配置される場合、活性である。ウイルスから誘導される多くのエンハンサーエレメントは、広い宿主範囲を有し、そして種々の組織において活性である。たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞タイプについて好適である。本発明に好適である他のエンハンサー／プロモータ組み合わせとしては、以下から誘導されるものが挙げられる：ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルス、マウスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶのようなレトロウイルス由来の長い末端反復配列（long term repeat）が挙げられる。たとえば、Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1983を参照のこと。これは、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１４０】
ポリアデニル化配列はまた、Ｓｃｆｖのようなポリペプチド阻害剤の翻訳効率を増加させるために発現ベクターへ添加され得る。２つの異なる配列エレメントが、正確かつ効率的なポリアデニル化のために必要とされる：ポリアデニル化部位から下流に配置されるＧＵまたはＵに富む配列、および１１〜３０ヌクレオチド上流に配置される、６ヌクレオチドの高度に保存された配列、ＡＡＵＡＡＡ。本発明に好適である終止およびポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０から誘導されるものが挙げられる。
【０１４１】
既に述べたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、典型的に、クローン化核酸の発現レベルを増大させるかまたは組換えＤＮＡを有する細胞の同定を促進するように意図された他の特殊エレメントを含む。たとえば、多数の動物ウイルスは、許容性細胞タイプにおけるウイルスゲノムの余分な（extra）染色体複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、プラスミド上に保有される遺伝子によってまたは宿主細胞のゲノムで好適な因子が提供される限り、エピソーム複製される。
【０１４２】
前記ベクターは、真核細胞のレプリコンを含んでも含まなくてもよい。真核細胞レプリコンが存在する場合、前記ベクターは、好適な選択可能なマーカーを使用して、真核細胞中において増幅可能である。前記ベクターは真核細胞レプリコンを含まない場合、エピソーム性の増幅は可能でない。その代わりに、組換えＤＮＡは、遺伝子操作された細胞のゲノムへ組み込まれ、ここで、前記プロモータは所望の核酸の発現を指令する。
【０１４３】
本発明の発現ベクターは、さらに、以下を可能にする追加のポリヌクレオチドを含み得る：たとえば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびプロモータキメラポリペプチドのゲノム組込みのための配列のような、単一のｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳。
【０１４４】
哺乳動物発現ベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ρＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴｌ、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴＳｌ（これらは、Invitrogenから入手可能）、ｐＣＩ（これは、Promegaから入手可能）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらは、Strategeneから入手可能）、ｐＴＲＥＳ（これは、Clontechから入手可能）、ならびにそれらの誘導体。
【０１４５】
レトロウイルスのような真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターもまた、本発明によって使用され得る。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。ウシ乳頭腫ウイルスから誘導されるベクターとしてはｐＢＶ−ＩＭＴＨＡが挙げられ、そしてエプスタイン・バー・ウイルスから誘導されるベクターとしてはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＳＶ−４０初期プロモータ、ＳＶ−４０後期プロモータ、メタロチオネインプロモータ、マウス乳腺癌ウイルスプロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、ポリヘドリンプロモータ、または真核生物細胞における発現に有効と示される他のプロモータの指令下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１４６】
ウイルスは、多くの場合において宿主防衛機構を回避するように進化した、非常に特殊な感染体である。典型的に、ウイルスは、特定の細胞タイプにおいて感染および繁殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、その天然の特異性を使用し、所定の細胞タイプを特異的に標的化しそして感染された細胞へ組換え遺伝子を導入する。したがって、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換される細胞タイプに依存する。形質転換される細胞タイプにしたがって好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力内にあり、したがって選択考慮の一般的な説明は本明細書中において提供されない。たとえば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化され得る。
【０１４７】
組換えウイルスベクターは、ＣＴＫ阻害剤のインビボ発現のために有用であり、何故ならば、それらは、側方感染（lateral infection）および標的特異性のような利点を提供するからである。側方感染は、たとえばレトロウイルスのライフサイクルにおいて固有であり、そして単一の感染された細胞が多くの子孫ビリオン（これらは、出芽しそして隣接する細胞に感染する）を産生するプロセスである。結果は、その大部分が元々のウイルス粒子によって最初感染されなかった、広い領域が迅速に感染されるということである。これは、感染因子が娘子孫（daughter progeny）によってのみ広がる垂直感染とは対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターもまた、産生され得る。この特徴は、所望の目的が限定数の標的化細胞へのみ特定の遺伝子を導入することである場合に、有用であり得る。
【０１４８】
造血細胞特異的発現に好適である構築物のさらなる記載は、Malikら（Blood 15: 86:2993-3005, 1995）に提供される。
【０１４９】
十分でない量の阻害剤を発現するか、または阻害剤の発現について通常サイレントな細胞における、ＣＴＫの内因性阻害剤の内因性産生を誘発および／または増強するためのベクターの使用もまた、本発明にしたがって考慮される。前記ベクターは、前記阻害剤を発現することが望まれる細胞中で機能性である調節配列を含むかもしれない。このような調節配列は、プロモータまたはエンハンサーを含む。次いで、調節配列は、相同組換えによってゲノムの正しい遺伝子座へ導入され、このようにして、該調節配列と該遺伝子（この発現が、誘発または増強されるように要求される）とを作動可能に連結する。前記技術は、通常、「内因性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、そしてそれは、たとえばＷＯ９１／０９９５５に記載されている。
【０１５０】
同一の技術を使用して、即ち、ＣＴＫの遺伝子座へ、ＣＴＫ発現のダウンレギュレーションもしくは防止を生じさせる負の調節エレメント（たとえば、サイレンシングエレメント）を導入することによって、ＣＴＫ発現を停止させることが可能であることが、当業者よって理解される。ＣＴＫ発現のこのようなダウンレギュレーションまたはサイレンシングは、疾患を予防および／または治療するためのＣＴＫＩの使用と同一の効果を有することを、当業者は理解する。種々の方法が、本発明の発現ベクターを造血細胞へ導入するために使用され得る。このような方法は、一般的に、以下において記載されており：Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)；Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)；Changら, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)；Vega ら, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)；Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)；およびGilboaら[Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]、そしてたとえば、組換えウイルスベクターを用いての安定的または一時的トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染を含む。さらに、陽性−陰性の選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および第５，４８７，９９２号を参照のこと。
【０１５１】
ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクションおよびエレクトロポレーションのような他の方法に対していくつかの利点を提供し、何故ならば、より高いトランスフェクション効率がウイルスの感染性に起因して得られ得るためである。
【０１５２】
前記阻害剤を発現するために使用される発現構築物は、好ましくは、これらの細胞中での独占的かつ制御可能な発現を可能にする様式で、構築されそして造血細胞へ導入されることが理解される。たとえば、もっぱら造血細胞を形質転換し得るウイルス発現ベクターを使用することによってあるいはこのような細胞をエクスビボで形質転換することによって、そして該発現構築物（上記の例を参照のこと）において誘発性プロモータ配列を使用することによって、これらの細胞中での独占的かつ制御可能な発現が達成され得る。
【０１５３】
このような発現戦略は、白血病治療の文脈において使用される場合に特に有利であり、何故ならば、それは、造血（hematopoesis）に対する正確な制御およびしたがって造血細胞数の調節を可能にするためである。
【０１５４】
本明細書に記載されるように、ＣＴＫ発現または活性化のダウンレギュレーションは、ダウンレギュレーション剤へ培養造血細胞を暴露することによってインビトロで、あるいは対象へこのような薬剤を投与することによってインビボで行われてもよい。これらのインビボおよびインビトロアプローチは、ＣＴＫ阻害剤の以下の非限定的な例を処理するために使用され得る：ペプチド阻害剤、たとえば、Ｍｕ−Ｌｅｕ−ｈｐｈ−ｕｓ−ｐｈ（Palmer J Med. Chem 1995, 38:3193-3196）、非ペプチド阻害剤、たとえば、ＳＢ−４６２７９５、ＳＢ−３５７１１４、４６２７９５（Glaxo Swithkline's）、Ｅ６４、ＡＡＲ４９４、アンチセンス（Inui らJ Biol Chem. 1997 Mar 28;272(13):8109-12.）、ＮＨ連結されたアリール／ヘテロアリールＣＴＫＩ（Robichaud ら Bioorg Med Chem Lett. 2004 Aug 16;14(16):4291-5)、ＡＡＥ５８１（Novartis）。
ＣＴＫ阻害剤はまた、以下に開示されている：ＷＯ００／５５１２６およびＷＯ０１／４９２８８、Taveresら（J Med Chem 47:5049, 2004, Jmed Chem 29:47(3):588-99, 2004）、Catalaiioら（Bioorg Med Chem Lett.2004 9;14(3):719-22, and 14(1) 275-8）、Robichaudら（J Med Chem 14;46(17):3709-27, 2003）、Settiら（Bioorg Med Chem Lett 13(12):2051-3, 2003）、Altmannら（Bioorg Med Chem Lett 13(12): 1997-2001, 2003）、Chenら（J Org Chem, 68(7):2633-8, 2003）。
【０１５５】
本明細書中の用語「ポリペプチドおよびタンパク質」は、互換可能である。本発明はまた、本発明のＣＴＫタンパク質のムテインに関し、このムテインは、ＣＴＫの天然に生じる配列のみを本質的に有するＣＴＫタンパク質と同一の生物学的活性を本質的に滞留する。このような「ムテイン」は、この種の修飾が該タンパク質自体に対して該タンパク質ムテインの生物学的活性を実質的に変化させないように、約２０および１０アミノ酸残基までが、それぞれ、ＣＴＫタンパク質において、欠失されているか、付加されているか、または他のものによって置換されていてもよいものであり得る。
【０１５６】
これらのムテインは、公知の合成および／または部位特異的突然変異誘発技術によって、あるいはその好適な任意の他の公知の技術によって作製される。
【０１５７】
このようなムテインはいずれも、好ましくは、基本であるＣＴＫのそれの実質的に複製的であるアミノ酸配列を有し、その結果、それと実質的に類似の活性を有する。したがって、下記実施例に記載の生物学的活性試験へこのようなムテインを供することを含む、慣用実験によって、どの所定のムテインが本発明の基本タンパク質と実質的に同一の活性を有するかが決定され得る。
【０１５８】
本発明にしたがって使用され得るＣＴＫタンパク質のムテイン、またはその核酸コードは、置換ペプチドまたはポリヌクレオチドのような実質的にＣＴＫ対応配列の有限セットを含み、これらは、本明細書中で示される技術およびガイダンスに基づいて、過度な実験無しに、当業者によって慣用的に得られ得る。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Schulz, G.E. ら, Principles of Protein Structure, Springer- Verlag, New York, 1978；およびCreighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983を参照のこと。これらは参照により本明細書中に組み込まれる。コドン選択のような、ヌクレオチド配列置換の表示については、以下を参照のこと：Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995；Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989。
【０１５９】
本発明にしたがうムテインについての好ましい変化は、「保存的」置換と知られているものである。天然に生じるＣＴＫ配列を本質的に有するタンパク質におけるそれらの保存的アミノ酸置換は、あるグループ内の同義のアミノ酸を含み得、このグループは、該グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存するという十分に類似の物理化学的特性を有する。Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)を参照のこと。特に、前記挿入または欠失が数個のアミノ酸（たとえば、５０以下、そして好ましくは２０ＣＴＫ以下）のみを含みかつ機能性構造（functional conformation）に重要であるアミノ酸（たとえば、システイン残基）を除去または置換しない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく、上記で定義される配列において成され得ることが明らかである［Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 223- 230 (1973)］。このような欠失および／または挿入によって作製されるムテインは、本発明の範囲内に入る。好ましくは、前記同義のアミノ酸基は、表Ａに規定されるものである。より好ましくは、前記同義のアミノ酸は、表Ｂに規定されるものであり；そして最も好ましくは、前記同義のアミノ酸は、表Ｃに規定されるものである。
【０１６０】
【表１】
2008520554.tif 000003
【０１６１】
【表２】
2008520554.tif 000004
【０１６２】
【表３】
2008520554.tif 000005
【０１６３】
本発明における使用のための前記タンパク質のムテインを得るために使用され得る、タンパク質におけるアミノ酸置換体の作製例としては、以下に記載のような任意の公知の方法工程が挙げられる：米国特許第ＲＥ  ３３，６５３号、第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号（Markら）；第５，１１６，９４３号（Kothsら）；第４，９６５，１９５号（Namenら）；第４，８７９，１１１号（Chongら）；および第５，０１７，６９１号（Leeら）；ならびに米国特許第４，９０４，５８４号（Strawら）に記載のリシン置換タンパク質。
【０１６４】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明における使用のためのＣＴＫタンパク質の任意のムテインは、本発明の上述のＣＴＫタンパク質のそれに本質的に対応するアミノ酸配列を有する。用語「に本質的に対応する」は、特にＣＴＫに対するその能力が関連する場合、その基本的特徴に影響を与えない基本タンパク質の配列に対して僅かな変化を有するムテインを含むように意図される。用語「に本質的に対応する」に入ると一般的に考えられるタイプの変化は、本発明のＣＴＫタンパク質をコードするＤＮＡの従来の突然変異誘発技術から生じるものであり、ほんの僅かな修飾を生じ、たとえば化学誘引物質に対する幹細胞の感度を増大する所望の活性についてスクリーニングする。
【０１６５】
本発明はまた、ＣＴＫ変異体を含む。好ましいＣＴＫ変異体は、少なくとも８０％アミノ酸同一性を有するものであり、より好ましいＣＴＫ変異体は、少なくとも９０％アミノ酸同一性を有するものであり、そして最も好ましい変異体は、ＣＴＫアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一性を有するものである。
【０１６６】
用語「配列同一性」は、本明細書中で使用される場合、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラム［これは、ClustalWマルチプル配列アラインメントプログラム（Thompsonら，1994）についてのウインドウズインターフェースである］を使用する低相同性領域のリファイン（refinement）を伴う、HanksおよびQuinn（1991）にしたがうアラインメントによって該アミノ酸配列が比較されることを意味する。Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ftp://ftp-igbmc.u- strasbg.fr/pub/clustalx/でインターネットから入手可能である。当然ながら、このリンクが休止となった場合、当業者であれば、過度な実験無しに、標準的なインターネット検索技術を使用して他のリンクにあるこのプログラムのバージョンを見つけ出し得ることが理解される。特に述べない限り、本願の有効出願日現在で、本明細書中において言及されるプログラムの最新バージョンが、本発明を実施するために使用されるものである。
【０１６７】
「配列同一性」を測定するための別の方法は、以下である。−１２のギャップオープンペナルティー（ギャップの最初のゼロ）および−４のギャップエクステンションペナルティー（該ギャップにおける追加の連続するゼロの各々当たり）を有するデフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリクス（値−４〜＋１１）を使用し、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＤＡＰ（グローバルなアラインメントプログラム）のバージョン９を使用して、配列を整列する。整列後、パーセンテージ同一性が、請求される配列におけるアミノ酸の数のパーセンテージとして一致の数を表現することによって計算される。
【０１６８】
本発明にしたがうムテインとしては、ストリンジェント条件下でＤＮＡまたはＲＮＡへハイブリダイズしそして本発明にしたがうＣＴＫタンパク質をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）［ＣＴＫをコードする天然に生じる配列の本質的に全てと、遺伝暗号の縮重の理由で該天然に誘導されるヌクレオチド配列とはそのヌクレオチド配列が異なり得る配列（即ち、多少異なる核酸配列は、その縮重に起因して、同一のアミノ酸配列を依然としてコードし得る）とを含む］によってコードされるものが挙げられる。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書中で使用される場合、核酸の鎖が、塩基対形成により相補鎖と結合するいずれのプロセスをも含む（Coombs J, 1994, Dictionary of Biotechnology, stokton Press, New York NY）。「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生と規定され、そして一般的に、当該分野において周知のポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して行われる（Dieffenbach および Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）。
【０１６９】
「ストリンジェンシー」は、典型的に、約Ｔｍ−５℃（プローブの融点より５℃下）からＴｍより約２０℃〜２５℃下までの範囲で生じる。
【０１７０】
用語「ストリンジェント条件」は、当業者が慣習的に「ストリンジェント」と呼ぶ、ハイブリダイゼーションおよび引き続いての洗浄条件をいう。Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995；Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験において使用される温度、一価カチオンのモル濃度およびハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージの関数である。所定のセットの条件と関連するストリンジェンシーの程度を決定するために、先ず、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融点Ｔｍとして表される１００％同一性のハイブリッドの安定性を決定するためにMeinkothら（1984）の等式が使用される：
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム（form））−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは塩基対のハイブリッドの長さである。１００％同一性ハイブリッドについて計算されるものからＴｍが低下される各１Ｃについて、許容されるミスマッチの量は、約１％増加される。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度で所定のハイブリダイゼーション実験のために使用されるＴｍが、Meinkothの等式にしたがう１００％ハイブリッドについて計算されるＴｍより１０Ｃ下である場合、ハイブリダイゼーションは、約１０％ミスマッチまで存在しても生じる。
【０１７２】
本明細書中で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」は、上記式によって計算されるかまたは実際に測定される、標的配列との完全な二本鎖について存在するＴｍよりも多くて１０Ｃ下であるＴｍを提供するものである。「中程度にストリンジェントな条件」は、上記式によって計算されるかまたは実際に測定される、標的配列との完全な二本鎖について存在するＴｍより多くて２０Ｃ下であるＴｍを提供するものである。限定されること無しに、高度にストリンジェントな（前記ハイブリッドの計算または測定Ｔｍより５〜１０Ｃ下）および中程度にストリンジェントな（前記ハイブリッドの計算または測定Ｔｍより１５〜２０Ｃ下）条件の例は、前記ハイブリッドの計算Ｔｍ未満の好適な温度で、２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）および０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の洗浄溶液を使用する。特に、使用されるハイブリダイゼーション条件が、安定なハイブリッドと共にあまり安定でないハイブリッドが形成することを可能にするものである場合、前記条件の最終的なストリンジェンシーは、主として洗浄条件に起因する。より高いストリンジェンシーでの洗浄条件は、次いで、前記あまり安定でないハイブリッドを除去する。上述の高度にストリンジェントな〜中程度にストリンジェントな洗浄条件で使用され得る、典型的なハイブリダイゼーション条件は、前記Ｔｍの約２０〜２５Ｃ下の温度での、６×ＳＳＣ（または６×ＳＳＰＥ（標準食塩水−リン酸塩−ＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％  ＳＤＳ、１００＆マイクロ（100 &micro）；ｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡの溶液中におけるハイブリダイゼーションである。混合プローブが使用される場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい（Ausubel, 1987, 1999）。成人幹細胞は、骨髄吸引のような外科手術を使用して得られ得るか、またはNexell Therapeutics Inc. Irvine, CA, USAから入手可能なもののような市販のシステムを使用して収穫され得る。本発明によって使用される幹細胞は、好ましくは、対象の循環へのＨＳＣの放出に対する化学療法またはサイトカイン刺激を使用する、幹細胞動員手順を使用して、回収される（即ち、採取される）。動員は骨髄手術よりもより多くのＨＳＣおよび前駆細胞を得ることが知られているので、幹細胞は、好ましくはこの手順を使用して回収される。
【０１７３】
ＣＴＫの「アイソフォーム」は、ＳＤＦ−１または選択的スプライシングによって産生され得るそのフラグメントを分解し得るタンパク質である。用語「円順列誘導体」は、本明細書中で使用される場合、線形分子をいい、ここで、末端が直接的にまたはリンカーを介して一緒に結合されて環状分子が作製され、次いで該環状分子が別の位置で開裂されて、元の分子の末端とは異なる末端を有する新たな線形分子が作製されている。円順列物（circular permutations）としては、その構造が、環状化され次いで開裂されている分子と等しい分子が挙げられる。したがって、円順列分子は、線形分子として新たに合成されてもよく、そして環状化および開裂工程を経由しなくてもよい。円順列誘導体の製造は、ＷＯ９５／２７７３２に記載されている。
【０１７４】
なおさらなる実施形態において、本発明にしたがう物質は、免疫グロブリン融合を含み、即ち、本発明にしたがう分子は、免疫グロブリンの全部または一部へ融合される。免疫グロブリン融合タンパク質を作製するための方法は、当該分野において周知である（たとえば、ＷＯ０１／０３７３７に記載されるもの）。当業者であれば、本発明の得られる融合タンパク質はＣＴＫの生物学的活性を滞留することを理解する。得られる融合タンパク質は、体液中の延長された滞留時間（半減期）、増加された特異的活性、増加された発現レベル、または該融合タンパク質の促進された精製のような、改善された特性を理想的には有する。
【０１７５】
好ましくは、本発明にしたがう前記物質は、Ｉｇ分子の定常領域へ融合される。それは、たとえば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような、重鎖領域へ融合され得る。Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明にしたがう融合タンパク質の作製に好適である：たとえば、アイソフォームＩｇＧ２またはＩｇＧ４、あるいはＩｇＭまたはＩｇＡのような他のＩｇクラス。融合タンパク質は、単量体または多量体、ヘテロ−もしくはホモ多量体であってもよい。
【０１７６】
本発明にしたがう物質の機能性誘導体は、前記タンパク質の特性（たとえば、安定性、半減期、バイオアベイラビリティ、人体による許容性、または免疫原性）を改善するためにポリマーへ複合体化され得る。したがって、本発明の好ましい実施形態は、アミノ酸残基上の１またはそれ以上の部分として生じる１以上の官能基へ結合された少なくとも１つの部分を含む本発明にしたがう物質の機能性誘導体に関する。
【０１７７】
非常に好ましい実施形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）へ結合された本発明の物質に関する。ＰＥＧ化は、たとえばＷＯ９２／１３０９５に記載されるもののような、公知の方法によって行われ得る。
【０１７８】
本発明にしたがう「活性画分」は、たとえば、ＣＴＫのフラグメントであり得る。用語フラグメントは、前記分子の任意のサブセット、即ち、所望の生物学的活性を滞留するより短いペプチドをいう。フラグメントは、ＣＴＫ分子のいずれかの末端からアミノ酸を除去し、そして得られたフラグメントを、ＳＤＦ−１を分解するその特性について試験することによって、容易に得られ得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼは公知であり、そしてしたがって、所望の生物学的活性を滞留するフラグメントを決定することは、慣用的実験のみを含む。
【０１７９】
ＣＴＫ、そのムテインおよび融合タンパク質の活性画分として、本発明は、前記タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメントもしくは前駆体のみ、またはそこへ結合された関連分子または残基（たとえば、糖またはリン酸残基）、あるいはそれら自体による前記タンパク質分子または前記糖残基の凝集体をさらに含み、但し、前記画分は、ＣＴＫと実質的に類似の活性を有し、たとえばＳＤＦ−１を分解する。
【０１８０】
用語「塩」は、本明細書中において、ＣＴＫ分子またはそのアナログのアミノ酸基の酸付加塩およびカルボキシル基の塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、当該分野において公知の手段によって形成されてもよく、そして無機塩、たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄（ferric）または亜鉛塩など、および有機塩基との塩、たとえば、トリエタノールアミン、アルギニンもしくはリシン、ピペリジン、プロカインのようなアミンと形成されるものを含む。酸付加塩としては、たとえば、鉱酸（たとえば、塩酸または硫酸）との塩、および有機酸（たとえば、酢酸またはシュウ酸）との塩が挙げられる。当然ながら、いずれのこのような塩も、ＣＴＫの生物学的活性、たとえばＳＤＦ−１を分解する能力を滞留しなければならない。
【０１８１】
幹細胞動員は、ＣＴＫまたは破骨細胞活性化のみであるいは多数の分子と組み合わせて誘発され得る。例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：サイトカイン、たとえば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびｆｌｔ−３リガンド；ケモカイン、たとえば、ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１α、Ｇｒｏβ，またはＳＤＦ−１；ならびに化学療法薬  シクロホスファミド（Ｃｙ）およびパクリタキセル。これらの分子は速度論および効果で相違することが理解されるが、現在公知の実施形態によれば、Ｇ−ＣＳＦが、幹細胞を動員するために、単独でまたはたとえばシクロホスファミドと組み合わせて好ましくは使用される。典型的に、Ｇ−ＣＳＦは、５〜１０日間、５〜１０μｇ／ｋｇの用量で毎日投与される。幹細胞を動員する方法は、米国特許第６，４４７，７６６号および第６，１６２，４２７号に開示されている。ヒト胚幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離され得る。ヒト胚盤胞は、典型的に、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞ヒト胚は、胚盤胞段階へ拡張され得る。ヒトＥＳ細胞の単離のために、透明帯が胚盤胞から除去され、そして内細胞塊（ＩＣＭ）が免疫手術によって単離され、ここで、栄養外胚葉細胞が溶解され、そして穏やかなピペッティングによりインタクトなＩＣＭから除去される。次いで、ＩＣＭを、その成長（outgrowth）を可能にする好適な培地を含む組織培養フラスコ中にプレートする。９〜１５日後、ＩＣＭ誘導化成長を、機械的分離または酵素的分解のいずれかによって集団（clumps）に分離し、次いで該細胞を、新鮮な組織培養培地上に再度プレートする。未分化形態を実証するコロニーを、マイクロピペットによって個々に選択し、集団へ機械的に分離し、そして再度プレートする。次いで、得られるＥＳ細胞を１〜２週間毎に定期的に分ける。ヒトＥＳ細胞の作製方法についてのさらなる詳細については、Thomsonら［米国特許第５，８４３，７８０号；Science 282: 1145, 1998；Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995］；Bongsoら［Hum Reprod 4: 706, 1989］；Gardnerら［Fertil. Steril. 69: 84, 1998］を参照のこと。
【０１８２】
市販の幹細胞もまた、本発明のこの局面にしたがって使用され得ることが理解される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚幹細胞登録（NIH human embryonic stem cells registry）（<http://escr.nih.gov>）から購入され得る。市販の胚幹細胞株の非限定的な例は、ＢＧＯｌ、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹｌＯ、ＴＥ０３、およびＴＥ３２である。
【０１８３】
ヒトＥＧ細胞は、当業者に公知の実験室技術を使用して、妊娠の約８〜１１週のヒト胎児から得られる始原生殖細胞から回収され得る。生殖堤を分離し、そして小さな塊に切断し、その後これを機械的分離により細胞へ分離する。次いで、ＥＳ細胞を、好適な培地を含む組織培養フラスコ中で成長させる。ＥＳ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、典型的に７〜３０日または１〜４継代後まで、培地を毎日交換して、前記細胞を培養する。ＥＳ細胞を作製する方法についてのさらなる詳細については、Shamblottら［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998］および米国特許第６，０９０，６２２号を参照のこと。
【０１８４】
多分化能を示す幹細胞集団の富化が好ましくは行われ得ることが理解される。したがって、たとえば、上記に概述されるように、ＣＤ３４＋幹細胞は、以下にさらに説明されるようなＦＡＣＳまたはアフィニティーカラムを使用して制御され得る。
【０１８５】
増殖条件下での幹細胞の培養がまた、幹細胞の数が処置における使用には少なすぎる場合、行われてもよい。幹細胞の培養は、米国特許第６，５１１，９５８号、第６，４３６，７０４号、第６，２８０，７１８号、第６，２５８，５９７号、第６，１８４，０３５号、第６，１３２７０８号および第５，８３７，５７３９号に記載されている。
【０１８６】
たとえば腫瘍細胞中のＣＸＣＲ４受容体レベルの分析は、フローサイトメトリーによって検出され得る。このアプローチは、液体媒体中の励起源を過ぎて流れる個々の細胞をスキャンする機器を使用する。前記技術は、可視光および蛍光発光の測定に基づく、単一生存（または死）細胞についての迅速で定量的なマルチパラメータ分析を提供し得る。この基本プロトコルは以下に焦点を合わせる：蛍光標識抗体および特異的細胞結合分子（specific cell-associated molecules）に結合するリガンドによって作製される蛍光強度を測定する。蛍光活性化細胞選別装置を使用して細胞集団を単離するために、本発明の幹細胞を、R&D, 614 McKinley Place NE Minneapolis, MNから市販される抗ＣＸＣＲ４と接触させる。
【０１８７】
走化性受容体発現のレベルを定量的に評価するための他の細胞学的または生化学的方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：標識された（たとえば、放射標識された）ケモカインを使用する結合分析、ウェスタンブロット分析、細胞表面ビオチン化、および免疫蛍光染色。前記受容体発現レベルもまた前記ｍＲＮＡレベルで測定され得ることが理解される。たとえば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡは、特異的プローブへのハイブリダイゼーションによって細胞中において検出されてもよい。このようなプローブは、クローン化ＤＮＡまたはそのフラグメント、ＲＮＡ（典型的に、インビトロ転写により作製される）、またはオリゴヌクレオチドプローブ（通常、固相合成によって作製される）であり得る。特異的ハイブリダイゼーションに好適なプローブを使用および作製する方法は、周知であり、そして当該分野において使用されている。問題の走化性受容体のｍＲＮＡへ特異的にハイブリダイズするプライマーを使用する、増幅反応［たとえば、ＰＣＲ、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)］を使用して、ｍＲＮＡレベルの定量もまた行われ得る。
【０１８８】
ｍＲＮＡ検出アッセイにおける精度を改善するために、種々のコントロールが、通常使用され得る。たとえば、偽ハイブリダイゼーションを評価するために、サンプルは、無関係のプローブへハイブリダイズされそしてハイブリダイゼーション前にＲＮアーゼＡで処理され得る。
【０１８９】
走化性受容体発現を測定するために使用され得る。たとえば、走化性剤（たとえば、ＳＤＦ−１）の勾配を使用しそして膜を介しての該走化性剤への幹細胞移動が続く、機能アッセイもまた、増加した走化性を示す幹細胞を同定および単離するために使用され得る。前記細胞が十分なレベルの前記走化性受容体（たとえば、ＣＸＣＲ４）を発現しない場合、該細胞の大部分は膜上に存在するままである。しかし、本発明の化学誘引物質受容体の増加した発現時に、細胞は、膜を通って移動し、そして走化性プレートのウエルの底部に定着する（実施例セクションの実施例３を参照のこと）。機能ホーミングアッセイ（functional homing assay）もまた、本発明の方法によって使用され得ることが理解される。このようなアッセイは、Kollet (2001) Blood 97:3283-3291（参照文献１２）に記載されている。
【０１９０】
本発明にしたがう好ましい個々の対象は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシおよび好ましくはヒトのような哺乳動物である。
【０１９１】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、限定される意図は無い以下の実施例の検討の際に、当業者に明らかとなる。さらに、上記で示されそして下記特許請求の範囲セクションにおいて特許請求されるような本発明の種々の実施形態および局面の各々は、下記の実施例に実験的サポートが見られる。
【実施例】
【０１９２】
上記説明と共に本発明を非限定的に示す以下の実施例がここで参照される。
【０１９３】
一般的に、本明細書中で使用される命名および本発明において使用される実験室手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献において十分に説明されている。たとえば、以下を参照のこと："Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook ら, (1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel ら., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley および Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson ら, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren ら. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", VoIs. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号および第5,272,057号に記載される方法；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligaii J. E., ed. (1994)；Stites ら. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)；利用可能な免疫学的検定法は、特許文献および科学文献に広く記載されており、たとえば、米国特許第3,791,932号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,219号、第5,011,771号および第5,281,521号を参照のこと；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D., および Higgins S. J., Eds. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak ら, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；これらの全ては、本明細書中に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。他の一般的な参照文献は、本明細書にわたって提供される。その中の手順は、当該分野において周知であると考えられ、そして読み手の便宜のために提供される。その中に含まれる全ての情報は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１９４】
実施例１：
ＬＰＳ誘発炎症は破骨細胞活性化をもたらす。
骨破壊は、慢性関節リウマチおよび歯周炎を含むいくつかの慢性炎症性疾患の病理学的特徴である。この種の炎症誘発される骨量減少は、破骨細胞活性化および増加した数の骨再吸収性破骨細胞の誘発から生じる。
【０１９５】
本発明者らは、骨髄（ＢＭ）中の破骨細胞活性化に対する、内毒素  リポ多糖類（ＬＰＳ）投与によって誘発される炎症の効果を研究した。
【０１９６】
ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を、２５０μｇ／マウスの単回皮下注射でＢａｌｂ／ｃマウスへ投与し、そしてコントロール群においてＬＰＳの代わりに生理食塩水を注射した。ＬＰＳ投与の５日後、マウスを犠牲にし、骨を固定し、脱灰し、パラフィン包埋し、そして切片化し、ＢＭを収穫し、そしてＴＲＡＰ＋破骨細胞（活性化破骨細胞）のレベルをモニターした。
【０１９７】
本発明者らは、ＴＲＡＰ＋破骨細胞（Ｓｉｇｍａ製のＴＲＡＰ染色用のキットを使用して、赤色染色により検出される）の急激な増加を見た。このアッセイにおいて、ＬＰＳ処理したマウスのＢＭにおける組織ＴＲＡＰの固有活性を測定するために、基質は外から提供される（図１ＡおよびＢ）。
【０１９８】
次に、本発明者らは、ＳＤＦ−１、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および破骨細胞特異的プロテアーゼＣＴＫのような骨髄媒介物（mediators）の転写に対するＬＰＳ媒介炎症の効果を研究した。
【０１９９】
各マウスの１つの大腿を、ＲＮＡ抽出のためにＴｒｉｒｅａｇｅｎｔでフラッシュした（flush）。１μｇ  ＲＮＡをｃＤＮＡの作製のために使用した。半定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、マウスＳＤＦ−１、ＨＧＦおよびＣＴＫの転写を測定した。以下のプライマーを使用した：ＳＤＦ−１（Ponomaryov, 2000, J. Clin. Invest. 106:1331）：左プライマー（配列番号１）５’−ＧＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＧ−３’、右プライマー（配列番号２）５’−ＴＴＧＣＡＴＣＴＣＣＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＡＧ−３’。ＨＧＦ（Weinstein, 2001, Moll Cell boil, 21(15):5122）：左プライマー（配列番号３）５’−ＴＧＣＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＣＧＡＣ−３’、右プライマー（配列番号４）５’−ＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＧＴＣＡＧ−３’。ＣＴＫ：左プライマー（配列番号５）５’−ＧＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＡ−３’、右プライマー（配列番号６）５’−ＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＧＧＡＡＧ−３’。
【０２００】
本発明者らは、ＬＰＳ処置マウスのＢＭ中におけるＳＤＦ−１転写の減少ならびにＨＧＦおよびＣＴＫ転写の急激な増加を観察した（図１Ｃ）。
【０２０１】
したがって、得られた結果は、ＬＰＳ誘発炎症（５日処置による）は、骨髄中の以下の変化を媒介することを実証する：破骨細胞活性化の増加、ＣＴＫおよびＨＧＦ転写の増加、ならびにＳＤＦ−１転写の減少。
【０２０２】
実施例２：
ＬＰＳ誘発炎症はＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少および前駆体動員をもたらす。
前の実施例において、本発明者らは、炎症が骨髄中のＳＤＦ−１の減少を媒介することを示した。本発明者らは、さらに以下の実験を行い、ＬＰＳ媒介炎症に続いてＢＭ中のＳＤＦ−１濃度の減少が存在するかどうかを研究した。したがって、本発明者らは、ＬＰＳ処理マウス対未処理マウスにおいて、ＢＭ中のＳＤＦ−１濃度をモニターした（図２Ａ）。
【０２０３】
実施例１に記載されるようにマウスに５日間ＬＰＳを投与し、そして骨髄中のＳＤＦ−１濃度をモニターした（Petitら2002によって記載されるようなＥＬＩＳＡによる）。
【０２０４】
図２Ａに概述される結果は、ＬＰＳ媒介炎症（５日間処理による）が、未処理コントロール群における１．２からＬＰＳ処理群における０．４ｎｇ／ｍｇタンパク質まで、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少（約６６％）を誘発することを示す。
【０２０５】
周知の動員剤である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）による、ＢＭから循環への前駆体の動員は、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度についての減少によって先行されるので（Petit ら Nature immunology (3) NO 7 687, 2002）、本発明者らは、ＬＰＳ媒介炎症およびＢＭ中のＳＤＦ−１減少に動員が続くのかどうかを研究した（図２Ｂ）。マウスに５日間ＬＰＳを投与し（実施例１に記載される通り）、そして末梢血（ＰＢ）中の前駆体増加を測定した（実施例９に記載される通り）。
【０２０６】
本発明者らは、ＬＰＳ処理マウス（５日間）のＰＢにおいて、コントロール未処理マウスのＰＢにおける前駆体のレベルと比較して前駆体の増加したレベル（約９５％より高い）を見た（図２Ｂ）。たとえば、５×１０5播種細胞当たり約１００前駆体コロニーがＬＰＳおよびコントロール群において見られ、対して、未処理群において５×１０5播種細胞当たり５コロニー。
【０２０７】
ＬＰＳ処理マウスにおけるＰＢ中で検出された前駆体増加は、骨髄からの細胞の放出または動員から生じることを検証するために、ＬＰＳ処理後まもなく（ＬＰＳ処理の１６時間後）血球計を使用して、フィコール化（ficolled）ＷＢＣ（白血球）の数をカウントすることによって、単核細胞（ＭＮＣ）をＢＭおよびＰＢ中において、ならびに未処理マウスのＢＭおよびＰＢ中においてモニターした（図３）。
【０２０８】
本発明者らは、ＬＰＳ媒介炎症は、それぞれの未処理マウスと比較した場合、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少（約５５％）、ＢＭ中のＭＮＣ細胞の減少（約５３％）、ならびにＰＢ中のＭＮＣ細胞の増殖（約７８％）を誘発することが判った（図３）。
【０２０９】
したがって、ＬＰＳ投与の１６時間後、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少およびＢＭからＰＢへの細胞の放出が観察される。
【０２１０】
実施例３：
機能性ＣＸＣＲ４はＬＰＳ媒介動員のために必要とされる。
Ｇ−ＣＳＦは、ＢＭ  ＳＤＦ−１を減少させそしてＣＸＣＲ４をアップレギュレートすることによって、幹細胞動員を誘発することが知られている（Petitら2002）。本発明者らは、実験を行い、前駆体のＬＰＳ媒介動員がＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用を必要とするかどうかを測定した。
【０２１１】
本発明者らは、ＬＰＳ投与の１６時間後、ＬＰＳ処理マウスのＢＭおよびＰＢにおける、ならびにコントロール未処理マウスにおける、ＣＸＣＲ４発現をモニターした。本発明者らは、ＬＰＳ処理マウスのＢＭおよびＰＢの両方において、フローサイトメトリーによって検出されるような（Petit 2002）ＣＸＣＲ４発現のレベルに対する有意な増加を見（図４Ａ）、これは、前駆体動員の有意な増加と関連した（図４Ｂ）。
【０２１２】
結果は、ＬＰＳによる前駆細胞の動員は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用を含むことを示す。
【０２１３】
機能性ＣＸＣＲ４がＬＰＳ媒介動員のために必要とされることを確認するために、マウスをＬＰＳのみで処理し（１６時間）、ＬＰＳおよび抗ＣＸＣＲ４抗体［抗ラットＣＸＣＲ４、これはまた、マウスＣＸＣＲ４（Torrey Pines Biolabs, CA）に対して有効であり、５００ｍｃｌ  ＰＢＳ中１０ｍｃｇ］で共処理し、あるいは未処理のままにし、そしてＰＢ中またはＢＭ中の白血球（ＷＢＣ）を、処理の１６時間後に血球計を使用してモニターした（図５）。
【０２１４】
本発明者らは、ＬＰＳ媒介動員は、機能性ＣＸＣＲ４の非存在下で減少されることが判った（図５）。したがって、結果は、機能性ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用は、ＬＰＳ媒介動員のために必要とすることを確認する。
【０２１５】
したがって、Ｇ−ＣＳＦ（Petitら2002）によって誘発される動員におけるのと同様に、ＬＰＳ媒介動員は、骨髄中のＳＤＦ−１の減少およびＣＸＣＲ４の増加を含む。
【０２１６】
ＬＰＳ媒介動員が続く骨髄中のＳＤＦ−１の減少は、恐らく、ＳＤＦ−１分解に起因する。
【０２１７】
実施例１〜３に示される結果によれば、炎症は、ＢＭ破骨細胞活性化、ＣＴＫおよびＨＧＦ発現、ＳＤＦ−１減少ならびに前駆体動員を誘発する。Ｇ−ＣＳＦ媒介動員と同様に、炎症媒介動員は、ＢＭ  ＳＤＦ−１減少を含み、そして機能性ＣＸＣＲ４を必要とすることもまた示された。
【０２１８】
実施例４：
損傷は動員を引き起こす。
本発明者らは、実験を行い、制御された出血（体重の１％の単回の出血）によって誘発された損傷のモデルにおける細胞動員を研究した。
【０２１９】
以下のパラメータを、出血の誘発後にモニターした：Ａ−  前駆体の動員、Ｂ−  骨髄中のＳＤＦ−１レベル、およびＣ−  血中のＣＸＣＲ４発現（図６）。
【０２２０】
本発明者らは、出血開始の７〜１４日後、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の有意かつ安定な減少を観察した。ＣＸＣＲ４発現の一時的増加が、出血の３〜７日後に見られた（図６）。ＰＢ中の前駆体の一時的増加が、出血の３〜７日後に検出された（図６）。
【０２２１】
したがって、制御された出血によって引き起こされる損傷は、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の安定な減少、ならびにＰＢ  ＣＸＣＲ４および前駆体動員の一時的増加を誘発する。
【０２２２】
実施例５：
損傷は破骨細胞活性化に影響を与える。
本発明者らは、ＢＭ中の破骨細胞活性化に対する、制御された出血によって誘発される損傷の効果を調べた。
【０２２３】
実験設定は、制御された出血の誘発（実施例４における通り）、ならびに処理マウス対未処理マウスにおけるＢＭ中の破骨細胞の活性化マーカー、ＴＲＡ＋をモニターすること（実施例１における通り）を含んだ。
【０２２４】
本発明者らは、出血誘発の７日後、ＢＭ中の劇的な破骨細胞活性化を検出することができた（図７）。
【０２２５】
実施例１〜５における上記の知見は、炎症および損傷のようなストレスシグナルが、骨髄からＰＢへの前駆体動員を誘発することを実証する。ストレスシグナル動員の誘発に含まれるのは、Ｇ−ＣＳＦ媒介動員と同様に、ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度の減少、およびＢＭ中のＣＸＣＲ４発現の増加である。予想外なことに、本発明者らは、ストレスシグナル媒介動員は破骨細胞活性化を伴うことを見出した。
【０２２６】
実施例６：
破骨細胞活性化を媒介する因子。
本発明者らは、実験を行い、細胞動員および運動性（motility）の媒介物（mediators）、たとえば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＤＦ−１およびＨＧＦ（Lapidot 2002 Exp Hematol, SDF-1 , Aiuti 1997, J Exp Med、およびKollet ら JCI 112:160-169 (2003)）が破骨細胞活性化を誘発し得るかどうかをインビトロで研究した。
【０２２７】
破骨細胞前駆体は、骨芽細胞との細胞−細胞接触によって刺激され、活性化多核化ＴＲＡＰ＋骨吸収細胞となる。インビトロで活性化破骨細胞を得るために、破骨細胞活性化のために必要とされる、それらのＭ−ＣＳＦ産生およびＲＡＮＫＬ発現を増強するビタミンＤ３およびＰＧ２Ｅと共に、頭蓋冠（clvarian）骨芽細胞をインキュベートする。次いで、破骨細胞前駆体を含むＢＭ細胞を、５日間、前記骨芽細胞単層上に播種し、活性化多核化破骨細胞を得る。
【０２２８】
原発性マウス骨芽細胞およびＢＭ（上記に詳述されるようなｏｃｌ前駆体を含有する）の共培養物を、Ｇ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、またはＳＤＦ−１（１０および１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で播種した。５日後、前記培養物中のＴＲＡＰ＋多核化破骨細胞を染色し（実施例１に記載される通り）、そして５日後カウントした。
【０２２９】
本発明者らは、媒介物Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦおよびＳＤＦ−１のいずれかでの処理が、活性化ＴＲＡＰ＋破骨細胞のレベルを有意に増加させたことを観察した（図８Ａそれぞれ、および８Ｂ要旨）。
【０２３０】
本発明者らは、さらに実験を行い、上記の媒介物のどれが破骨細胞を直接活性化するかを研究した。
【０２３１】
骨芽細胞を、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦと共にインキュベートしたかまたは未処理のままとし、そしてＳＤＦ−１転写および発現を、このような細胞において測定した（図９）。
【０２３２】
原発性頭蓋冠骨芽細胞を、ＳＤＦ−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，１００ｎｇ／ｎｌ）、ＨＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，５０ｎｇ／ｍｌ）およびＧ−ＣＳＦ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｎ，Ｒｏｃｈｅ，５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で３日間培養した。条件化培地を回収し、実施例２に記載されるように、ＥＬＩＳＡによりＳＤＦ−１濃度を測定した。ＳＤＦ−１転写および発現の測定は、実施例２における通り。
【０２３３】
本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦの両方が、骨芽細胞においてＳＤＦ−１転写およびＳＤＦ−１産生を誘発することを示し（それぞれ、図９Ａおよび９Ｂ）、したがって、ＳＤＦ−１は、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＨＧＦによって骨芽細胞において誘発される因子であるようであり、そしてこれは、破骨細胞活性化を直接誘発する。
【０２３４】
本発明者らは、原発性マウス破骨細胞の培養物を染色し、そして破骨細胞がＣＸＣＲ４を発現することを見出した（示さず）。
【０２３５】
得られた結果は、Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦが骨芽細胞においてＳＤＦ−１発現を誘発すること、ならびにＳＤＦ−１が破骨細胞表面上のＣＸＣＲ４に結合しそして破骨細胞活性化へ導くことを示す。本発明者らは、ＳＤＦ−１媒介破骨細胞活性化が前駆体動員を誘発すると仮説を立てる。
【０２３６】
本発明者らは、以下の実験を行い、ＳＤＦ−１が破骨細胞活性化および造血前駆細胞（ＨＰＣ）動員を誘発するという本発明者らの仮説をインビボで検証した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１０ｍｃｇ  ＳＤＦ−１または１．５ｍｃｇ  ＨＧＦあるいは両方を、５連日間、皮下注射し、そして破骨細胞活性化（実施例１におけるようにＴＲＡＰ＋染色によって測定した）および末梢血への動員（実施例１におけるように半固体培養物においてアッセイした）を測定した。
【０２３７】
本発明者らは、ＳＤＦ−１およびＨＧＦ投与が、インビボで、破骨細胞活性化（図１０Ａ）および前駆体の動員（図１０Ｂ）の両方を誘発することが判った。
【０２３８】
全てにおいて、得られた結果は、外から投与されたＳＤＦ−１、あるいはＧ−ＣＳＦおよび／またはＨＧＦの作用によって産生されたＳＤＦ−１、あるいはストレスシグナル（たとえば、炎症または損傷）が、破骨細胞活性化および前駆体動員を直接誘発することを示す。
【０２３９】
実施例７：
ＮＦカッパＢリガンドの受容体アクチベータ（ＲＡＮＫＬ）による直接破骨細胞活性化は、インビボ造血幹細胞動員を誘発する
ＲＡＮＫＬは、破骨細胞分化因子である（SUDAらEndocr Rev 20:345, 1999）。本発明者らは、ＲＡＮＫＬによる破骨細胞の活性化が以下を誘発するかどうかを試験した：
Ａ−  骨髄中におけるＣＴＫおよびＭＭＰ−９のような活性化破骨細胞により典型的に分泌されるプロテアーゼの発現（Delaisse, Clin Chim Acta Feb 15;291(2):223-34 2002）；ならびに
Ｂ−  前駆体動員。
【０２４０】
マウスに、以下の通りにＲＡＮＫＬを投与した：３日間、５ｍｃｇの２回毎日皮下注射、そしてＲＡＮＫＬの非存在下でのもう２日後。以下のパラメータを、処理マウスおよびコントロール未処理マウスの両方においてモニターした：ＴＲＡＰ＋活性化破骨細胞（図１１Ａ）、骨髄中における破骨細胞プロテアーゼＭＭＰ−９（図１１Ｂ）およびＣＴＫ（図１１Ｃ）の誘発、ならびに動員（図１２）。
【０２４１】
本発明者は、ＲＡＮＫＬ投与が、骨内膜（幹細胞および前駆細胞を含むことが公知の、骨を結合するＢＭ領域）に沿ったＴＲＡＰ＋活性破骨細胞の形成、骨髄中におけるＭＭＰ−９およびＣＴＫ発現の誘発（それぞれ、図１１Ａ、ＢおよびＣ）ならびに前駆体の動員（図１２Ａ）を誘発したことを観察した。ＭＭＰ阻害剤またはＣＸＣＲ４中和抗体と共のＲＡＮＫＬでの以下の処理に続いて、損なわれた動員が見られた（図１２Ｂ）。したがって、ＲＡＮＫＬによって誘発される、破骨細胞活性化による動員は、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用およびＭＭＰ２／９機能（function）を必要とする（図１２Ｂ）。
【０２４２】
上記は、ＲＡＮＫＬ投与は、インビボで、機能性CXCR4/SDF-1相互作用を必要とする破骨細胞活性化および動員を誘発したことを実証する。
【０２４３】
実施例８：
破骨細胞活性化による動員の機構。
本発明者らは、前の実施例において、ストレスシグナルによる動員は、ＢＭ骨芽細胞による一時的ＳＤＦ−１産生を含み、このような産生されたＳＤＦ−１は、表面破骨細胞ＣＸＣＲ４へ結合し、それらの活性化へ導くことを実証した。次に、破骨細胞活性化は、ＳＤＦ−１分解およびＢＭ  ＳＤＦ−１濃度減少を誘発する。
【０２４４】
実施例１において得られた結果を考慮して、本発明者らは、特異的ＳＤＦ−１分解が、主要な破骨細胞骨吸収酵素、ＣＴＫによって誘発されるとい仮説を立てた。したがって、本発明者らは、ＳＤＦ−１の活性に対するＣＴＫの効果を研究した。
【０２４５】
本発明者らは、ＳＤＦ−１についてのインビトロ機能アッセイを使用し（実施例１０）、ＳＤＦ−１活性に対するＣＴＫの効果を調べた。ＳＤＦ−１への白血病性Ｐｒｅ  Ｂ  ＡＬＬ  Ｇ２（比較的低濃度のＳＤＦ−１へ非常によく移動する細胞、Spiegel, Blood, 2004）の移動について成った。
【０２４６】
手短に述べると、ＳＤＦ−１（１２５ｎｇ）を、３７℃で約１６時間、ＰＢＳで調節された１００ｕｌ反応体積でＣＴＫ（ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。いくつかのサンプルにおいて、プロテアーゼ阻害剤（システイン阻害剤Ｅ−６４を含有する、ＰＩ、１ｕｌ、Ｓｉｇｍａ）を、３７℃で１．５時間ＣＴＫと共にプレインキュベートし、その後、ＳＤＦ−１を添加した。前記白血病性Ｐｒｅ  Ｂ  ＡＬＬ  Ｇ２細胞をトランスウエル（transwells）上に加え、そしてＣＴＫ処理および未処理ＳＤＦ−１への移動を測定した。
【０２４７】
本発明者らは、ＳＤＦ−１の走化性活性はＣＴＫによって廃止されるが、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）の存在下では廃止されないと判った（図１３）。
【０２４８】
得られた結果は、ＣＴＫがＳＤＦ−１活性を阻害することを実証する。
【０２４９】
本発明者らは、さらに、分のタイムスケールでのＣＴＫによるＳＤＦ−１切断の速度論を研究した（図１４）。ＳＤＦ−１のサンプル（２０ｎｇ）を、３７℃で０、１５、３０、６０、１２０および２４０分間、ＣＴＫ（１．７６  ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。回収後、サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥへ供し、そしてブロットし、そして抗ＳＤＦ−１ポリクローナルＡｂ（Ｒ＆Ｄ）またはモノクローナルＡｂ  Ｋｌ  ５Ｃ（これは、該ケモカインのアミノ酸末端部分へ特異的に結合する）で検出した。
【０２５０】
得られた結果は、ＣＴＫによる迅速かつ部位特異的なＳＤＦ−１切断を示す。
【０２５１】
したがって、ＣＴＫ、主要な破骨細胞プロテイナーゼは、そのアミノ酸末端の特異的かつ迅速な切断によってＳＤＦ−１活性を阻害することが実証された。
【０２５２】
実施例９：
ＣＦＵアッセイ
血液循環におけるマウス前駆体（mouse progenitors）のレベルを検出するために、半固体培養を、以前に記載されるように行った（Petit, Nat Immunol, 2002）。手短に述べると、マウスＢＭ細胞（３ｘ１０5細胞／ｍｌ）を、０．９％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）、３０％ＦＣＳ、５ｘ１０-5％  ２ＭＥ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）、および２ｕ／ｍｌエリスロポイエチン（Ｏｒｔｏ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈ，  Ｄｏｎ  Ｍｉｌｌｓ，  Ｃａｎａｄａ）においてプレートした。前記培養物を、５％ＣＯ2を含有する湿気のある環境において３７℃でインキュベートし、そして７日後、形態学的基準によって、倒立顕微鏡法によりスコア化した。
【０２５３】
実施例１０：
移動アッセイ（Migration assay）
１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１αを、３７℃で一晩ＣＴＫ（１ｍｃｇ／ｍｌ）とインキュベートするかまたは未処理に保った。ＣＴＫの酵素活性を阻害するために、１および２ｍｃｌのプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）を、１．５時間ＣＴＫと共にインキュベートし、その後ＳＤＦ−１へ添加した。１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ（６００μｌ）を、試験されたＳＤＦ−１と共に、Ｃｏｓｔａｒ２４ウエルトランスウエル（Costar 24-wells transwell）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（孔サイズ５μｍ），ＮＹ）の下部チャンバへ添加した。１００μｌ培地中の１×１０5ｐｒｅ  Ｂ  ＡＬＬ  Ｇ２細胞を、上部チャンバへ加え、そして３７℃で４時間移動させた。移動細胞を下部チャンバから回収し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して６０秒間カウントした。コントロール自然移動を、下部チャンバにおいてＳＤＦ−１α無しに行った。
【０２５４】
実施例１１：
動物。
８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをHarlan Rehovotから購入した。全ての実験は、ワイツマン・インスティテュートの動物ケア委員会（the animal care committee of the Weizmann Institute）によって承認された。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】ＬＰＳ誘発炎症が破骨細胞活性化をもたらすことを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＬＰＳの単回注射（２５０ｍｃｇ／マウス）をＩＰで注射した。５日後、骨を採取し、そして活性化された破骨細胞を、赤色での酵素ＴＲＡＰ染色により検出した（Ａ）。ＢＭを採取し、そして２０ｎｇ／ｍｌのマウスＭ−ＳＣＦおよび可溶性マウスＲＡＮＫＬ（これらは、破骨細胞分化および活性化を誘発する）の存在下で播種し、アッセイを破骨細胞ＢＭ前駆体のレベルを定量するために使用した（Ｂ）。ＳＤＦ−１、ＨＧＦおよびカテプシンＫ（ＣＴＫ）の発現を、ＲＴ−ＰＣＲで評価した（Ｃ）。
【図２】ＬＰＳ誘発炎症がＳＤＦ−１分解および前駆体動員をもたらすことを示す。ＢＭ液および末梢血細胞を、図１に記載のマウスから収集した。（Ａ）ＥＬＩＳＡによって測定したＢＭ液中のＳＤＦ−１濃度。（Ｂ）半固体培養物（semi solid culture）において測定されたＰＢ前駆体によって増加されたコロニーの数。
【図３】ＬＰＳ誘発炎症が、１６時間以内にＳＤＦ−１の減少およびＢＭからの細胞放出（egress）をもたらすことを示す。ＬＰＳの単回注射（２５０ｍｃｇ）で処理したマウスを１６時間後に殺した。ＢＭ  ＳＤＦ−１濃度をＥＬＩＳＡによって測定し（Ａ）、そしてＢＭおよび血液循環中の単核細胞の数を血球計によって測定した（Ｂ）。
【図４】ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用が、前駆体のＬＰＳ誘発動員に関与することを示す。ＬＰＳの単回注射（２５０ｍｃｇ）１６時間後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを犠牲死させ、そしてＢＭおよびＰＢを採取した。ＣＸＣＲ４発現を、フローサイトメトリーによって測定し（Ａ）、そして循環中の前駆体のレベルを半固体培養物において測定した（Ｂ）。
【図５】機能性ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ  ２／９がＬＰＳ媒介動員（LPS-mediated mobilization）のために必要とされることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスにＬＰＳの単回注射（２５０ｍｃｇ）を注射した。ＭＭＰ  ２／９阻害剤（１００ｍｃｇ）および抗ＣＸＣＲ４（１０ｕｇ）を２回注射した：ＬＰＳ注射の２時間前および２時間後。ＬＰＳ注射の１６時間後、ＢＭおよびＰＢを採取し、そして血中（Ａ）およびＢＭ中（Ｂ）の白血球の数を、血球計を使用して評価した。
【図６】制御された出血によって誘発されたストレスシグナルに応答しての、ＳＤＦ−１レベルの減少およびＣＸＣＲ４発現の増加を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、体重１％の単回出血（single bleeding）によって処理した。３、７、１０および１４日後、ＢＭおよびＰＢを採取した。ＢＭ中のＳＤＦ−１レベルをＥＬＩＳＡによって測定した（Ａ）。ＰＢ細胞によるＣＸＣＲ４発現をフローサイトメトリーにより定量し（Ｂ）、そして動員を示す循環前駆体のレベルを半固体培養物において測定した（Ｃ）。
【図７】制御された出血が破骨細胞活性化を誘発することを示す。図６に記載のマウスの大腿を固定し、脱灰し、パラフィン包埋し、そして切片化した。ＴＲＡＰ染色を使用して、赤色の活性化破骨細胞を検出した。
【図８】Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦおよびＳＤＦ−１でのインビトロ刺激がＯｃｌ活性化を誘発することを示す。マウス原発性頭蓋冠骨芽細胞を、ビタミンＤ３およびＰＧ２Ｅの存在下で成長させ、Ｍ−ＣＳＦの分泌およびＲＡＮＫＬの発現を増強した。ＢＭ細胞を、Ｇ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＤＦ−１（１０および１００ｎｇ／ｍｌ）有りまたは無しで、骨芽細胞単層上に播種した。成熟活性化破骨細胞を、ＴＲＡＰ染色により、５日後に検出した。（Ａ）代表的ＴＲＡＰ染色。（Ｂ）Ａの要旨。
【図９】Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦに応答しての、原発性マウス骨芽細胞によるＳＤＦ−１分泌の増加を示す。マウス原発性頭蓋冠骨芽細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦおよびＨＧＦの存在下で３日間培養した。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲにより測定した、ＳＤＦ−１  ｍＲＮＡの発現。（Ｂ）ＥＬＩＳＡにより測定された、処理した骨芽細胞によって分泌されたＳＤＦ−１のレベル。
【図１０】サイトカインＳＤＦ−１およびＨＧＦが、インビボで破骨細胞活性化およびＨＰＣ動員を誘発することを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＳＤＦ−１（１０ｍｃｇ）およびＨＧＦ（１．５ｍｃｇ）の５連日注射を注射した。処理マウスの骨を、赤色で成熟活性破骨細胞を示すＴＲＡＰについて染色した（Ａ）。末梢血液細胞を半固体培養物によって、動員を示す循環前駆体のレベルについて測定した（Ｂ）。
【図１１】Ｏｃｌ分化因子ＲＡＮＫＬが、骨内膜に沿うＴＲＡＰ＋活性化破骨細胞のインビボ形成を誘発することを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、可溶性マウスＲＡＮＫＬ（１日当たり２回注射、皮下（subcoutaneous）注射当たり５ｍｃｇ）を注射した。処理マウスの骨を、成熟活性化破骨細胞を示すＴＲＡＰ（赤色で）について染色した（Ａ）。ＢＭ液中のＭＭＰ−９のレベルをザイモグラフィーアッセイ（zymography assay）により測定した（Ｂ）。ＣＴＫ  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した（Ｃ）。処理マウスの骨を、成熟活性化破骨細胞を示すＴＲＡＰ（赤色で）について染色した。ＢＭ液中のＭＰ−９のレベルをザイモグラフィーアッセイにより測定した（Ｂ）。ＣＴＫ  ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより検出した（Ｃ）。
【図１２】ＲＡＮＫＬ処理が、ＣＸＣＲ４およびＭＭＰ２／９によって媒介される、前駆体動員を誘発することを示す。（Ａ）５日間注射したＳＤＦ−１（１０ｍｃｇ）、ＨＧＦ（１．５ｍｃｇ）および最初の３日間注射したｓＲＡＮＫＬ（２×５ｍｃｇ）によって誘発された、半固体培養物において測定した前駆体動員。（Ｂ）ＲＡＮＫＬ誘発動員は、最後の２日間注射した、抗ＣＸＣＲ４抗体（１０ｍｃｇ）およびＭＭＰ２／９（１００ｍｃｇ）の投与によって阻害される。（Ｃ）処理マウスのＢＭ中の破骨細胞前駆体を、Ｍ−ＣＳＦおよびｓＲＡＮＫＬと共に４日間ＢＭ細胞を培養することによって測定し、続いてＴＲＡＰ染色し、成熟活性破骨細胞を検出した。
【図１３】ＳＤＦ−１の走化性活性が、ＣＴＫ（主要な破骨細胞再吸収酵素）によって廃止されることを示す。ＳＤＦ−１（１２５ｎｇ）を、３７℃で１６時間、１ｍｃｇ／ｍｌ  ＣＴＫ（反応における最終濃度）と共にインキュベートした。プロテアーゼ阻害剤を、ＳＤＦ−１を添加する前に１．５時間、ＣＴＫと共にイキュベートした。処理したＳＤＦ−１へのＰｒｅ  Ｂ  ＡＬＬ  Ｇ２細胞の移動は、その走化性活性を示す。
【図１４】ＳＤＦ−１がＣＴＫによりＮ末端で切断されることを示す。ＳＤＦ−１（２０ｎｇ）を、３７℃で、０、１５、３０および６０分間、ＣＴＫ（１．７６ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥへ供し、ブロットし、そして抗ＳＤＦ−１ポリクローナルＡｂまたはモノクローナルＡｂ  Ｋ１５Ｃ（これは、前記ケモカインのアミノ末端部へ特異的に結合する）で検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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