(57)【要約】  本発明は多重の機能および／あるいは結合特異性を有する、規定された安定なテザー構造体の方法および組成物に関する。特定の実施態様は、第一の前駆体に付着した、二量化およびドッキングドメインを含む第一の前駆体のホモニ量体および第二の前駆体に付着したアンカードメインを含む、第二の単量体（単量体）を含む安定テザー構造体に関する。第一および第二の前駆体は、抗体、抗体断片、抗体アナログまたは模倣体、アプタマー、結合ペプチド、結合タンパク質の断片、タンパク質または他の分子に対する既知のリガンド、酵素、検出可能な標識またはタグ、治療剤、毒素、薬剤、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、放射性同位体、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、オリゴ糖、天然または合成ポリマー物質、ナノ粒子、量子ドット、有機または無機化合物等のような、事実上いかなる分子、構造体であり得る。開示された方法および組成物は、いかなる単量体に結合している二成分化合物、またはいかなる三成分化合物であっても、これらを得るための簡単で容易な精製を提供する。
2008542194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定なテザー構造体を含む組成物であって、該構造体は
ａ）ホモ二量体のそれぞれの第一単量体が、二量化および第一前駆体に結合するドッキングドメイン（ＤＤＤ）を含む該ホモ二量体；
ｂ）第二前駆体に結合するアンカードメイン（ＡＤ）を含み、該ＡＤが共有結合であるいは非共有結合で該ＤＤＤに結合する第二単量体
を含む組成物。
【請求項２】
該ＡＤがジスルフィド結合でＤＤＤに結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該ＤＤＤが該第一前駆体に共有結合しており、該ＡＤが該第二前駆体に共有結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該第一単量体が、該第一前駆体とＤＤＤを含む融合タンパク質であり、および該第二単量体が該第二前駆体とＡＤを含む融合タンパク質である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
該第一前駆体がＤＤＤに化学的に架橋しており、該第二前駆体がＡＤに化学的に架橋している、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
該第一および第二前駆体が、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、オリゴ糖、天然または合成重合物質、ナノ粒子、量子ドット、有機あるいは無機化合物からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該タンパク質が、バクテリア毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンーＡ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ｔＰＡ、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、界面活性タンパク質Ｄ、ＩＬ−４、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、ＶＥＧＦ１２１、ＴＰＯ、ＥＰＯ、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク質、ｓＴＮＦα−Ｒ、アビマー、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびナノボディからなる群から選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
該第一および第二前駆体が、抗体、ＩｇＧ抗体、抗体フラグメント、モノクローン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、抗体の抗原結合領域、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、単鎖抗体およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
該抗体フラグメントが、ｈＭＮ−１４、Ｌ１９、ｈＡ２０、ｈＬＬ２、Ｌ２４３、ｈＣＣ４９、７Ｅ３、ｈＬＬ１、ｈＰＡＭ４、ｈＲＳ７、ｒＨ１、Ｌ４９、抗−ＣＤ１４、抗−ＣＤ１１１、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）およびｈＭＮ−１５の該抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
該ＤＤＤの配列が、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節サブユニットに由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
該ＡＤの配列が、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）の配列に由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
該第一前駆体および第二前駆体が抗原に対して結合親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
該第一および第二前駆体が同じ抗原に対して親和性を有する、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
該第一および第二前駆体が二つの別の抗原に対して親和性を有する、請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
該抗原が、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、アルファフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に対する特異的抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＤｌ、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原タンパク質−Ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−Ｉ、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＦＩｔ−Ｉ、Ｆｌｔ−３、葉酸レセプター、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ−４抗体に対する特異的抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テナスシン、ＴＲＡＩＬレセプター、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、１７−ｌＡ−抗原、血管新生マーカー、発癌遺伝子マーカーまたは発癌遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１２記載の組成物。
【請求項１６】
該第一前駆体が、免疫グロブリンＣＨ１配列に結合している免疫グロブリンＶＨ配列を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
該第一前駆体が免疫グロブリンの軽鎖に結合している、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
該軽鎖が、ＣＫまたはＣＬ配列に結合しているＶＬ配列を含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
該第一前駆体が、該軽鎖にジスルフィド結合により結合している、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
該第一前駆体が、腫瘍関連抗原に対する結合部位を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
該腫瘍関連抗原が、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、アルファフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に対する特異的抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＤｌ、ＣＤＩａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原タンパク質−Ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＦＩｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸レセプター、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ−４抗体に対する特異的抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テナスシン、ＴＲＡＩＬレセプター、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、１７−ｌＡ−抗原、血管新生マーカー、発癌遺伝子マーカーまたは発癌遺伝子産物からなる群から選択される、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
該第二前駆体が、ハプテンに対する結合部位を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
該ハプテンが治療剤と結合している、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
該治療剤が、アブリン、アマンタジン、アモキシリン、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、アズトレオナム、アジスロマイシン、バシトラシン、バクトリム、バトラフェン（登録商標）、ビフォナゾール、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチンー１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルベニシリン、カスポファンジン、カルムスチン、セファクロール、セファゾリン、セファロスポリン、 セフェピム、 セフトリアキソン、セフォタキシム、セレブレックス、 クロラムブシル、クロラムフェニコール、シプロ（登録商標）、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、SN-38、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、グルクロニド、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベステロール、ジフテリア毒素、ＤＮアーゼＩ、ドクソルビシン、２−ピロリノドクソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、ドキシサイクリン、シアノモルホリノドクソルビシン、ドクソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エストロゲンレセプター結合剤、エトポシド、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エリスロサイクリン、エリスロマイシン、フラギル、ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害剤、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、ゲロニン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲステロール、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトタン、ミノサイクリン、ナフチフィン、ナリジキシン酸、ネオマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、ナイスタチン、オンコナーゼ、オキサシリン、パロモマイシン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリンータゾバクタム、フェニル酪酸、プレドニソン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ＰＳＩ−３４１、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、ラロキシフェン、ｒａｐＬＲ１、リボヌクレアーゼ、リシン、セムスチン、リファブチン、リファンピン、リマンタジン、ストレプトマイシン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、テトラサイクリン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、トランスプラチナ、トリメトプリムスルファメトキサゾール、ウラシルマスタード、バラシクロビル、バンコマイシン、ベルケイド、ビンブラス���ン、ビノレルビン、ビンクリスチン、ザナミル、ジスロマイシン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
該ハプテンが造影剤に結合している、請求項２２記載の組成物。
【請求項２６】
該造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジミウム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）およびビスマス（III）からなる群から選択される、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
該ハプテンが造影または治療用の放射性同位体に結合している、請求項２２記載の組成物。
【請求項２８】
該放射性同位体が、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、４５Ｔｉ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１５２Ｅｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１９５ｍＨｇ、１６６Ｈｏ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１９１Ｏｓ、２１２Ｐｂ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４２Ｐｒ、１９５ｍＰｔ、２２３Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１１１Ａｇ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒからなる群から選択される、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
該ハプテンが、抗血管新生剤に結合している、請求項２２記載の組成物。
【請求項３０】
該抗血管新生剤が、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗−ＶＥＧＦ抗体またはペプチド、抗−胎盤増殖因子抗体またはペプチド、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗−Ｆｌｔ−１抗体またはペプチド、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエステラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリ硫酸、アンギオポイエチン２、インターフェロンーアルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第四因子およびミノサイクリン、からなる群から選択される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
該ハプテンが光検出標識と結合している、請求項２２記載の組成物。
【請求項３２】
該第一前駆体が、バクテリア毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、抗−ｇｐ１２０、抗−ＰＩＧＦ、抗−ベータアミロイド、ｈＭＮ−１４、Ｌ１９、ｈＡ２０、ｈＬＬ２、Ｌ２４３、ｈＣＣ４９、７Ｅ３、ｈＬＬｌ、ｈＰＡＭ４、ｈＲＳ７、ｒＨ１、Ｌ４９、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ｔＰＡ、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、界面活性タンパク質Ｄ、ＩＬ−４、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、抗−ＶＥＧＦ１２１、抗−ＣＤ１４、抗−ＣＤ１１１、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、ｈＭＮ−１５、ＴＰＯ、ＥＰＯ、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク質およびｓＴＮＦα−Ｒ、からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３３】
該第二前駆体が、バクテリア毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、血栓溶解タンパク質、ウロキナーゼ、ヒルジン、ｈ６７９、ｈ７３４、ｈＡ２０、Ｓ１１、Ｐ４Ｂ６、Ｒａｐ、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ストレプトアビジン、アビジン、ＨＲＰ、ＡＰ、ＧＦＰ、ｔＰＡ、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、カルボキシペプチダーゼＧ２、ペニシリナミダーゼ、β−ラクタマーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン、ヒトカルボキシエステラーゼ２、抗−ｇｐｌ２０、抗−ＰｌＧＦ、抗−ＶＥＧＦ１２１、ｈＬＬｌ、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲＳ７、ｈＲｌ、７Ｅ３、α−ＣＤ８９、ＩＬ−４、ｓＩＬ−１３Ｒ、ｓＩＬ−４Ｒ、シガ様毒素、ジフテリア毒素、抗−ＣＤ１４、抗−ＣＤ１１１、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、ＸＯＬＡＩＲ（登録商標）、ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、ｈＭＮ−１５、ＴＰＯ、ＥＰＯ、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク質およびｓＴＮＦα−Ｒ、からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３４】
該第一前駆体が、細胞表面レセプター、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、ウロキナーゼ、ＣＡｌ９−９、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＥＤ−Ｂ  フィブロネクチン、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ／１７−ｌＡ、ＧＤ２、Ｇ２５０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＲ、ＨＬＡクラスＩＩ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＮ／ＮＤＶ、ＩＧＦｌＲ、ＩＬ−２Ｒ／Ｔａｃ、ＩＬ−１７、ＭＵＣｌ、ＰＳＭＡ、Ｍ１３コートタンパク質、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ７４、ＥＧＰ−Ｉ、ＩＧＦｌＲ、ＣＤ２５／Ｔａｃ、Ｌｅγ、メソテリン、Ｅｒｂ−Ｂ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰ２４０、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ｐ９７、ＣＤ３、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ１４、ＣＤ１１１／ネクチン−１、葉酸レセプターα、Ｇｐｌ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＣＤ１５４、ＩｇＥ、ＬＦＡ−Ｉ、β−トリプターゼ、ＣＤ１０５／エンドグリン、ＴＮＦα、ＲＳＶ  Ｆ−タンパク質、ＣＥＡのＡｌＢｌ、ＣＥＡのＮドメイン、ＰｆＭＳＰ−１、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＶＥＦＧＲｌ／Ｆｌｔｌ、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲまたはＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ−４、に対する結合親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３５】
該第二前駆体がＩＬ−１７、ヒスタミン−サクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、インジウム−ＤＴＰＡ、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲ１／Ｆｌｔ１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ−４、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ２、アデノウイルスファイバーノブ、Ｍ１３コートタンパク質、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジンまたはウロキナーゼ、に対する結合親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３６】
該第一前駆体が、ＣＥＡ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲｌ／Ｆｌｔ１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ−４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＰｆＭＳＰ−１、ＨＮ／ＮＤＶ、ＥｐＣＡＭ／１７−ｌＡ、ｈＴＲ、ＩＬ−２Ｒ／Ｔａｃ、ＣＡ１９−９、ＭＵＣ１、ＨＬＡクラスＩＩ、ＧＤ２、Ｇ２５０、ＴＡＧ−７２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＨＭＷＭＡＡ、ＣＤ４０、Ｍｌ３コートタンパク質、およびＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａからなる群から選択される細胞表面抗原に対して親和性を有し、該第二前駆体が、ヒスタミン−サクシニル−グリシン（ＨＳＧ）およびインジウム−ＤＴＰＡからなる群から選択されるハプテン、またはＣＤ２２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＦＧＲ１／Ｆｌｔ１、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ、ＶＥＧＲＦ３／Ｆｌｔ−４、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８９、ＣＤ２およびアデノウイルスファイバーノブからなる群から選択される細胞表面抗原のいずれかと親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３７】
該第一前駆体が、Ｍ１３コートタンパク質およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａからなる群から選択される細胞表面抗原に対して、または、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジンまたはウロキナーゼからなる群から選択される生体分子に対して親和性を有し、該第二前駆体が、Ｍ１３コートタンパク質およびＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａからなる群から選択される細胞表面抗原に対して、または、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ｔｐＡ、ストレプトキナーゼ、ヒルジンまたはウロキナーゼからなる群から選択される生体分子に対して親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３８】
該第一前駆体が、ＣＤ３、ＣＤ７４、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＭＵＣ１、ＥＧＰ−１、ＩＧＦｌＲ  ＣＤ３０、ＣＤ２５／Ｔａｃ、ＬｅＹ、ベーターアミロイド、メソテリン、Ｅｒｂ−Ｂ２、ＥｐＣＡＭ、ＧＰ２４０、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはｐ９７に対して親和性を有し、該第二前駆体が、リボヌクレアーゼ、ランピルナーゼ、遺伝子改変ランピルナーゼ、バクテリア毒素、植物毒素、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ホスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ゲロニン、血栓溶解タンパク質、ｔＰＡ、ウロキナーゼまたはヒルジンである、請求項１記載の組成物。
【請求項３９】
該第一前駆体が、疾患または病状と関連する細胞表面抗原に対して親和性を有し、該第二前駆体が、サイトカイン、増殖因子、カルボキシペプチダーゼＧ２、ペニシリアミダーゼ、β−ラクタミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４０】
該第一前駆体が、リボヌクレアーゼ、バクテリア毒素、植物毒素、サイトカイン、増殖因子および界面活性タンパク質Ｄ（Ｓｐ−Ｄ）からなる群から選択され、該第二前駆体が、疾患または病状と関連する細胞表面抗原に対して親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項４１】
該第一前駆体が、細胞表面レセプター、ＩＬ−４、ＶＥＧＦ１２１、可溶性レセプター成分、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、毒素、ＰＥ３８、シガ様毒素、およびジフテリア毒素、に対するリガンドからなる群から選択され、該第二前駆体が、細胞表面レセプター、ＩＬ−４、ＶＥＧＦ１２１、可溶性レセプター成分、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、毒素、ＰＥ３８、シガ様毒素、およびジフテリア毒素、に対するリガンドからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４２】
該第一と該第二前駆体が同一であって、ＣＤ１４、ＣＤ１１／ネクチン−１、葉酸レセプターα、ｇｐｌ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＣＤ１５４、ＩｇＥ、ＬＦＡ−１、β−トリプターゼ、ＣＤ１０５／エンドグリン、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＴＮＦα、ＲＳＶ  Ｆ−タンパク質、ＣＥＡのＡｌＢ１およびＣＥＡのＮ−ドメインに対する結合分子からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４３】
該第一と該第二前駆体が同一であって、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、ｔＰＡ、ＴＰＯ、ＥＰＯおよびｓＴＮＦα−Ｒ、からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項４４】
共有結合または非共有結合によって、安定なテザー構造体にコンジュゲートした一つ以上のエフェクターまたは担体を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４５】
該エフェクターが、診断剤、治療剤、化学療法、放射性同位体、造影剤、抗血管新生剤剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、薬剤、プロドラッグ、酵素、結合分子、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節物質、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出標識、色素、ペプチド、毒素、コントラスト剤、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子またはそれらの組み合わせである、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
該エフェクターまたは担体が、安定なテザー構造体に化学的に架橋された、請求項４４記載の組成物。
【請求項４７】
該安定なテザー構造体が、二つ以上のエフェクターまたは二つ以上の担体に結合している請求項４４記載の組成物。
【請求項４８】
該二つ以上の担体または二つ以上のエフェクターが、同一であるかまたは異なっている、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
該一つ以上の担体が少なくとも一つの診断または治療剤を含む、請求項４４記載の組成物。
【請求項５０】
ａ）請求項１記載の安定なテザー構造体を得ること；および
ｂ）状態を有する被験体に該安定なテザー構造体を投与すること
からなる方法であって、該安定なテザー構造体は、該状態に対して治療効果を有する、方法。
【請求項５１】
該状態が、癌、過形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リューマチ性関節炎、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、若年性糖尿病、乾癬、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、敗血症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、プラーク新血管形成、再狭窄、血管外傷後新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症関連線維症、肺線維症、深静脈血栓症または創傷肉芽形成である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該状態が癌であって、該第一前駆体が、腫瘍関連抗原に対して結合親和性を有する請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
該安定なテザー構造体と組み合わせて、一つ以上の抗癌治療を行う事を更に含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該治療が、化学治療剤、サイトカイン、ペプチド、免疫調節物質、放射線治療、免疫療法、放射免疫療法、局所温熱療法、レーザー放射、抗血管新生剤または外科的摘出である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
該第二前駆体に結合するハプテンを被験体に投与する事を更に含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
該安定なテザー構造体が該状態に関連した組織に局在化した後、該ハプテンが投与される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
該ハプテンが、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、放射性同位体、免疫調節物質、ホルモン、結合分子、脂質、ポリマー、ミセル、リポソーム、ナノ粒子またはこれらの組み合わせ、からなる群から選択される薬剤と結合している、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
該状態が、真菌に起因する、請求項５０記載の方法。
【請求項５９】
該状態が、ウイルスに起因する、請求項５０記載の方法。
【請求項６０】
該状態が、細菌に起因する、請求項５０記載の方法。
【請求項６１】
該状態が、自己免疫疾患に起因する、請求項５０記載の方法。
【請求項６２】
該状態が、神経変性疾患に起因する、請求項５０記載の方法。
【請求項６３】
該状態が、アルツハイマー病に起因する、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
安定なテザー構造体が、ベーターアミロイドに対し少なくとも一つの結合部位を有する、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
該状態が、心筋梗塞、虚血性心疾患、粥状硬化プラーク、血管炎、移殖拒絶、アトピー性の組織または、活性化した顆粒球、単球、リンパ球、ＮＫ細胞またはマクロファージの付着に起因する炎症である、請求項５０記載の方法。
【請求項６６】
該安定したテザー構造体の投与が標的細胞群にアポトーシスを誘導する、請求項５０記載の方法。
【請求項６７】
該安定したテザー構造体が、抗−ＣＤ７４Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ７４Ｘ  抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２２Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ  抗−ＨＬＡ−ＤＲ、抗−ＣＤ１９Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ  抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ２Ｘ  抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ８Ｘ  抗−ＣＤ２５、および抗−ＣＤ２Ｘ  抗−ＣＤ１４７、からなる群から選択される抗体または抗体フラグメントの組合わせを含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該第一および／または該第二前駆体が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＣＡ−１２５、ＴＡＧ−７２、ＥＦＧＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲｌ、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、テネイシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸおよびＩＬ−６からなる群から選択される抗原に対して結合親和性を有する、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
状態を診断する方法であって、
ａ）ホモ二量体を含む安定したテザー構造体であって、二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）を含む該ホモ二量体のそれぞれの第一単量体が第一前駆体に結合しており、アンカードメイン（ＡＤ）を含む該第二単量体をさらに含む該二成分複合体が第二前駆体に結合しており、該ＡＤがＤＤＤに共有結合しており、該第一前駆体が該状態と関連した抗原と結合し、また該第二前駆体が診断ハプテンと結合する、安定したテザー構造体を
得ること；
ｂ）状態を有すると疑われる被験体に複合体を投与すること； 
ｃ）同じ被験体に二成分複合体と結合する診断ハプテンを投与すること；および
ｄ）該二成分複合体と結合する該ハプテンの存在を検出すること；
を含み、該状態と関連する組織にハプテンが局在化することが該被験体における該状態の存在の診断である、方法。
【請求項７０】
該ハプテンが、放射性核種にコンジュゲートしている、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
該放射性核種が、同位元素検出装置を用いて検出される、または単光子放射型コンピュータ断層撮影法もしくは陽電子放射断層撮影法を用いて造影される、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
該状態が癌であり、該第一前駆体が腫瘍関連抗原と結合する、請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
該ハプテンが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）造影剤とコンジュゲートし、二成分複合体と結合した該ハプテンをＭＲＩによって検出する、請求項６９記載の方法。
【請求項７４】
該ハプテンが、超音波画像造影剤とコンジュゲートし、二成分複合体と結合した該ハプテンを超音波画像によって検出する、請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
該該超音波画像造影剤がリポソームである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
該第一前駆体または該第二前駆体のいずれかが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＩＬ−１７に対して結合親和性を有する、請求項６９記載の方法。
【請求項７７】
該結合したハプテンを、生体内内視鏡検査、手術中検出または手術中検出および治療を用いて検出すことを更に含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７８】
インビトロ診断法であって：
ａ）ホモ二量体を含む二成分複合体であって、二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）を含む該ホモ二量体のそれぞれの第一単量体が第一前駆体に結合しており、アンカードメイン（ＡＤ）を含む第二単量体を更に含む該二成分複合体が第二前駆体に結合しており、該ＡＤが該ＤＤＤに共有結合しており、該第一前駆体が該状態と関連した抗原と結合し、また該第二前駆体が診断ハプテンと結合する、二成分複合体を得ること；
ｂ）状態を有すると疑われる対象からのサンプルに該複合体を投与すること；
ｃ）該二成分複合体に結合する診断ハプテンを投与すること；および
ｄ）該二成分複合体に結合した該ハプテンの存在を検出すること；
を含み、該ハプテンの該サンプルへの結合が、被験体における該状態の存在を診断することである、診断法。
【請求項７０】
状態の診断法であって：
ａ）ホモ二量体を含む二成分複合体であって、二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）を含む該ホモ二量体のそれぞれの第一単量体が第一前駆体に結合しており、アンカードメイン（ＡＤ）を含む第二単量体を更に含む該二成分複合体が第二前駆体に結合しており、該ＡＤが該ＤＤＤに共有結合しており、該第一前駆体が該状態と関連した抗原と結合し、また該第二前駆体が検出可能な部分を含む、二成分複合体を得ること；
ｂ）状態を有すると疑われる被験体に該複合体を投与すること；および
ｃ）該診断成分の存在を検出すること；
を含み、該状態と関連した組織に該診断部分が局在化することが該被験体における該状態の存在の診断である、診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
多機能または結合特異性を有する抗体に基づく薬剤の製造に関する既存の技術には、多くの限界がある。組み換え技術によって産生された薬剤については、そのような限界として、高い製造コスト、低い発現収率、血清中での不安定性、溶液中での不安定性による凝集体または解離サブユニットの形成、多様な産物形態の存在に由来するバッチ組成の不明確さ、汚染副産物、立体構造因子または構造変化による機能活性または結合親和性／結合力の低下等が挙げられる。化学的架橋の種々の手法で産生された薬剤については、高い製造コストおよび精製産物の不均一性が二つの主要な限界である。
【０００２】
近年、一つ以上の抗原決定基（エピトープとも呼ばれる）と結合可能な抗体または他の結合部分に対する興味が増加している。一般的に天然に存在する抗体およびモノクローン抗体は、同じエピトープを認識する二つの抗原結合部を有している。その一方、二機能性または二重特異性抗体(以後二重特異性抗体と呼ぶ)は、二つの別のエピトープに結合可能な、合成または遺伝子操作された構造である。従って二つの異なった抗原決定基との結合能は、同一の分子構築物に存在する。
【０００３】
二重特異性抗体は多くの生物医学的な応用では有用である。例えば腫瘍細胞表面抗原およびＴ細胞表面レセプターに対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特定の腫瘍細胞の溶解を導くことができる。グリオーマおよびＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体を用いて、ヒトの患者の脳腫瘍の治療に成功している(Nittaら. Lancet. 1990; 355:368-371)。
【０００４】
二重特異性抗体を製造する多くの方法が知られている。二重および多特異性抗体の構築および使用方法は、例えば、U.S. Patent Application Publication No. 20050002945, 2/11/2004出願、に開示されており、全文は本明細書に参照として取り込まれる。二重特異性抗体は、異なった抗原部位を認識するモノクローン抗体をそれぞれ産生する二つの別のハイブリドーマの融合が関与する、クアドローマ法によって製造することができる(Milstein and Cuello. Nature. 1983; 305:537-540)。融合したハイブリドーマは、異なった二つの重鎖と二つの異なった軽鎖を合成することが可能であり、それらは無作為に会合して１０の異なった抗体構造を有する不均一な群を生成し、そのうちの一つのみ、全抗体分子の１／８量が二重特異性抗体である。それ故、他の抗体から更に精製しなければならず、例えそれが可能であっても、費用効果が無い。更に加えて、融合ハイブリドーマは、親ハイブリドーマに比較して細胞発生的に安定性が低く、細胞株の産生をより困難にしている。
【０００５】
二重特異性抗体を製造する別の方法は、ヘテロ二重機能性架橋リンカーを用いて、２つの異なるモノクローン抗体を化学的につないで（tether）、得られたハイブリドコンジュゲート（conjugate）が２つの異なる標的に結合するようにした物である(Staerzら. Nature. 1985; 314:628-631; Perez,ら. Nature. 1985; 316:354-356)。この方法によって産生した二重特異性抗体は、本質的に二つのＩｇＧ分子のヘテロコンジュゲートであり、それらは組織に徐々に拡散し循環系から急速に除かれる。二重特異性抗体はまた、二つの親モノクローン抗体のそれぞれを、半分子に還元し、それらを混合し再酸化してハイブリッド構造を得ることによっても製造することができる(Staerz and Bevan. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83:1453-1457)。代替法としては、二つまたは三つの別々に精製したＦａｂ’フラグメントを適切なリンカーを用いて、化学的に架橋する事を含む方法が挙げられる。例えば、欧州特許出願0453082号は、二または三重特異性抗体様構造の製造に、トリ−マレイミド化合物を応用する事を開示している。米国特許6,511,663号では、結合構造を介して、３または４つのＦａｂフラグメントを互いに共有結合によって結合させて、３および４価の単特異性抗原結合タンパク質を調製する方法が提供されている。これら全ての化学的方法は、高い製造コスト、込み入った製造工程、高度の精製ステップ、低収率（＜２０％）および不均一な産物のため、商業的開発には望ましく無い。
【０００６】
他の方法としては、各親ハイブリドーマにレトロウイルス由来のシャトルベクターを介して区別できる選択マーカーを遺伝子導入にすることよって、ハイブリッドハイブリドーマの産生の効率を改善し、次いで親ハイブリドーマを融合する方法 (DeMonte, ら. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990, 87:2941-2945);または別の抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子を含む発現プラスミドを用いて、ハイブリドーマ細胞株をトランスフェクトする方法が挙げられる。これらの方法もまた上に考察した、避けて通れない精製の問題に直面する。
【０００７】
抗体重鎖の定常部の領域に挿入された、相補的干渉ドメインによって会合する、同一または異なった抗体由来のＦａｂフラグメントより成る組み換え二重特異性抗体を製造する方法が、米国特許5,582,996号では開示されている。相補的干渉ドメインは、相反性ロイシンジッパー、または一つが正電荷を有するアミノ酸残基の一連を含み、他方が負電荷を有するアミノ酸残基の一連を含む、ペプチドセグメントの一対、から選択される。そのような方法の一つの限界は、融合した相補的干渉ドメインを含む個々のＦａｂサブユニットは、両方のサブユニットが結合していない場合は、標的抗原に対する親和性が非常に低くなっているように思われる事である。
【０００８】
組み換えＤＮＡ技術によって作成された抗体の別々のＶＨおよびＶＬは、互いに一対になって、結合能を有する二量体(組み換えＦＶフラグメント)を形成するかも知れない(米国特許4,642,334号)。しかしながら、そのような非共有結合によって会合した分子は、実用にするには、生理的条件下で充分な安定性を有しない。同族のＶＨおよびＶＬドメインは、適切な組成と長さのペプチドリンカー（通常１２を越えるアミノ酸残基より成る）によって結合し、結合能を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成させる事ができる。ｓｃＦｖの製造法は、米国特許第4,946,778号と米国特許第5,132,405号に開示されている。該ペプチドリンカーのアミノ酸残基を１２未満に減少させると、同一鎖上のＶＨおよびＶＬドメインが対になる阻止し、他の鎖上の相補的ドメインとの対形成を強制し、その結果機能的な多量体を形成することになる。３から１２の間のアミノ酸残基のリンカーで結合したＶＨおよびＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主として二量体（ダイアボディー（diabody）と呼ばれる）を形成する。０から２の間のアミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディー（triabody）と呼ばれる）および四量体（テトラボディー（tetrabody）と呼ばれる）が主となるが、しかし多量体化の正確な型は、リンカーの長さに加えて、Ｖドメイン（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）組成および方向に依存するように思われる。
【０００９】
多価の単特異性の二、三および四量体を、５未満のアミノ酸残基より成るペプチドリンカーを用いて得た。一つの抗体からのＶＨドメインが短いペプチドリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに結合して成る２つのｓｃＦｖｓのヘテロダイマーである二重特異性二量体もまた、一つのシストロンにＶＨ１−リンカー−ＶＬ２を含む組換え遺伝子構造体および他のシストロンにＶＨ２−リンカー−ＶＬ１を含む第２の組換え遺伝子構造体を含む二シストロン発現ベクターを用いて、作成された(Holliger,ら. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90: 6444-6448; Atwell,ら. MoI Immunol. 1996; 33:1301-1302; Holliger,ら. Nature Biotechnol. 1997; 15: 632-631; Helfrich,ら. Int. J Cancer.1998; 76: 232-239; Kipriyanov,ら. Int J Cancer. 1998; 77: 763-772; Holliger,ら. Cancer Res.1999; 59: 2909-2916)。
【００１０】
さらに最近、二重特異性を有する四価の直列型二量体（tandabと呼ぶ）も報告された(Cochlovius,ら. Cancer Res. 2000; 60: 4336-4341)。二重特異性のｔａｎｄａｂは、自己会合時、二つの異なった特異性のそれぞれに対する二つの潜在的な結合部位の形成を容易にするための方向に連結している、二つの異なった抗体の四つの可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）をそれぞれ含む、二つの同一のポリペプチドのダイマーである。
【００１１】
現在までの所、二重特異性または三重特異性三量体を発現するベクターの構築は、達成されていない。しかしながら、コレクチンの首（collectin neck）領域を含むポリペプチドが三量体を形成していると報告されている(Hoppe,ら. FEBS Letters. 1994; 344: 191-195)。コレクチンの首領域を含む融合タンパク質由来のホモまたはヘテロ三量体の生産は米国特許6,190,886号に開示されている。
【００１２】
リンカーの長さを変えることによる、多価および多重特異性を有するｓｃＦＶに基づく薬剤の製造方法は、米国特許第5,844,094号、米国特許第5,837,242号、WO98/44001号に開示されている。一つのポリペプチドは少なくとも二つの抗体由来のＶＨドメインを含み、他のペプチドはＶＬドメインに対応している、二つのポリペプチドを構築することによる、多価および多重特異性を有するｓｃＦＶに基づく薬剤の製造方法は米国特許第5,989,830号と米国特許第6,239,259号に開示されている。先行技術による多価および多重特異性を有するｓｃＦＶに基づく薬剤の製造方法にしばしば関連してきた共通の問題としては、低発現、生産物の不均一性、凝集体を生ずる溶液中における不安定性、血清中での不安定性および親和性の損傷が挙げられる。
【００１３】
ＦａｂのＣＨ１およびＣＬのｃ−末端がそれぞれが、同一または異なったモノクローン抗体に由来したｓｃＦｖと融合している、組み換え技術によって製造された、二重特異性または三重特異性抗体が、米国特許第6,809,185号に開示された。この“トリボディー（Tribody）”技術の主要な欠陥としては、付加したｓｃＦｖの結合親和性の損傷、生産物の不均一性、凝集体を生ずる溶液中における不安定性があげられる。
【００１４】
従って、一般的には多特異性または多機能の多価構造体、特定すれば二重特異性抗体を作成する方法であって、規定された組成、均質な純度、不変な親和性を有する抗体を、高収率で、高度な精製ステップを必要とせずに生産できる方法が、当該技術分野では必要とされる。更にそのような構造体はまた、インビボでの応用が可能であるように、血清中で充分に安定でなければならない。構築が容易でありおよび／または比較的精製された形で得ることができる、多特異性または多機能性の安定な多価構造体に対する必要性が存在する。
【００１５】
発明の概要
本発明は、多機能または多結合特異性を有する安定なテザー構造体（tethered structures）を定量的に産生するプラットホーム技術を提供する。好ましい実施態様では、そのような安定したテザー構造体は、二つの区別できるペプチド配列であって、一つは二量体形成およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれ他の一つはアンカードメイン（ＡＤ）と呼ばれるペプチド配列の間の特異的な相互作用を介して、本明細書ではＡおよびＢと呼ばれる任意の二成分による、独占的な二成分複合体として製造される。より好ましい実施態様では、該ＤＤＤ配列(図１ではＤＤＤ１およびＤＤＤ２として示される)は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の制御（Ｒ）サブユニットに由来し、該ＡＤ配列(図２ではＡＤ１およびＡＤ２として示される)は、ＰＫＡのＲサブユニットとの会合を仲介する種々のＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰｓ）では見出される特異的な領域に由来する。しかしながら、当業者なら、他の二量体形成およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）およびアンカードメイン（ＡＤ）が知られており、本請求項の主題の範囲内で、そのような既知のドメインを用いることができることを理解するであろう。他の例として、４−ヘリクス束型ＤＤＤドメインを、ｐ５３、ＤｃｏＨ（プテリン４アルファカルビノールアミンデヒドラターゼ／肝細胞核因子-1α（ＴＣＦ１）およびＨＮＦ−１（幹細胞核因子１）の二量体化コファクター）から得てもよい。Ｓ−１００タンパク質もまた４−ヘリクス束型ＤＤＤ配列を示すが、これらのタンパク質は、腫瘍形成のような生物活性を有するため、そのような使用には不適格である。潜在的に使用可能な他のＡＤ配列は、特許出願番号US20003/0232420A1に見出されるが、その全文は本明細書に参照により援用される。
【００１６】
最も好ましい実施態様では、二成分複合体の一つの成分Ａは、組み換え工学または化学的コンジュゲーション（conjugation）によってＤＤＤ配列をＡの前駆体（Ａと呼ぶ）に連結することにより作成され、その結果Ａ／ＤＤＤ(本明細書ではａと呼ぶ)の構造体が得られる。ａにおけるＤＤＤ配列が二量体の自然形成をもたらすので、Ａは従ってａ２より構成される。該二成分複合体の他の成分Ｂは、ＡＤ配列をＢの前駆体（Ｂと呼ぶ）に組み換え工学または化学的コンジュゲーションによってスペーサー基を介して連結することにより作成され、その結果Ｂ／ＡＤ（本明細書ではｂと呼ぶ）の構造体が得られる。ａ２に含まれる二量体構造が、ｂに含まれるＡＤ配列と結合するドッキング部位を作る事実が、ａ２とｂの容易な会合をもたらし、ａ２ｂより構成される二成分複合体が形成される。種々の実施態様では、この結合事象は、この集合体の二成分を共有結合的に確保する次に起こる反応によって安定化する。これは例えばジスルフィド架橋を介してであり、最初の結合相互作用が反応性チオール基を部位特異的に連結するように方向づけることから、非常に効率良く起こる。
【００１７】
ＤＤＤおよびＡＤ配列の両者ではシステイン残基を戦略的な場所に置くことにより（ＤＤＤ２およびＡＤ２として示す）、ａ２およびｂ間の結合相互作用は、ジスルフィド架橋を介して共有結合とすることができ、それにより、生体内での応用をより実行可能にする安定したテザー構造体を形成する。該安定したテザー構造体はまた二つの前駆体ＡおよびＢの全機能の特質を保持している。本発明者らは、このような独特の特性の組み合わせを有した先行技術による二重特異性組成物に関しては承知していない。上に開示されたデザインは、選択された二つの前駆体のそれぞれはＤＤＤまたはＡＤのいずれかに連結することができ、後に組み合わせることができるので、本質的にモジュラーである。二つの前駆体は同一（Ａ＝Ｂ）であっても異なって（Ａ≠Ｂ）いてもよい。Ａ＝Ｂである場合は、得られるａ２ｂ複合体は、安定してつながれた三つのサブユニットの集合体からなり、本明細書ではａ３と呼ぶ。前駆体として受け入れることができる材料は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、オリゴ糖類、天然または合成重合物質、ナノ粒子、量子ドットおよび有機または無機化合物が挙げられる。潜在的に使用可能な前駆体の、限定されない例を以下の表６から１０に示す。
【００１８】
構成サブユニットの分離を阻止するためのジスルフィド結合の使用に加えて、ａ２ｂ構造の総合的安定性を増加する、他の方法を用いてもよい。例えば、市販のまたは研究に用いられている種々の架橋剤または方法を、その目的のために選択してもよい。潜在的に有用な薬剤の一つは、グルタルアルデヒドであって、構成サブユニットを架橋して安定コンジュゲートを形成して、非共有結合で会合している多量体タンパク質の構造を探査する目的で広範に用いられている(Silva,ら. Food Technol Biotechnol. 2004; 42:51-56)。更に興味深いのは、タンパク質サブユニットの酸化架橋が関与した２つの化学的方法である。一つはヘキサヒスチジン・タグを付けたタンパク質(Fancy,ら. Chem Biol. 1996; 3:551-559)、またはＮ−末端グリシン−グリシン−ヒスチジン・タグを付けたタンパク質(Brown,ら. Biochemistry. 1998; 37:4397-4406)を用いる近接標識技術である。これらのタグは、過酸を用いて酸化した場合、Ｎｉ（ＩＩ）と強固に結合し、タンパク質−タンパク質の架橋を含む種々の酸化反応を仲介することが可能なＮｉ（ＩＩＩ）種を生成する。他の技術はＰＩＣＵＰ（未修飾タンパク質の光誘導架橋）と呼ばれ、タンパク質−タンパク質架橋を誘導するために、[Ru(II)(bipy)3]2+、過硫酸アンモニウムおよび可視光を用いる(Fancy and Kodadek. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96:6020-6024)。しかしながら、以下に考察するように、当技術分野において、数多くの、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の高分子類を化学的に架橋する方法が知られており、いずれかのそのような方法を用いてａ２ｂ構造を共有結合で安定化してもよい。
【００１９】
請求された方法および組成を用いて、多くの産物を開発することができる。例えば、遺伝子操作された構造の安定なテザー集合体より構成されるタンパク質またはペプチドに基づく産物の少なくとも六つのタイプを想像することができる：
タイプ１：同一のモノクローン抗体（ｍＡｂ）由来の二つのＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントおよび異なるｍＡｂ由来の一つのＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントから成る二重特異性三価ａ２ｂ複合体（例えば表６参照）。
タイプ２Ａ：同一のｍＡｂ由来の二つのＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントおよびひとつの非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドから成る多機能ａ２ｂ複合体（例えば表７Ａ参照）。
タイプ２Ｂ：二つの同一の非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドおよびｍＡｂ由来の一つのＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントから成る多機能ａ２ｂ複合体（例えば表７Ｂ参
照）。
タイプ３：三つの内二つが同一である、三つの非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドから成る多機能ａ２ｂ複合体（例えば表８参照）。
タイプ４：同一のｍＡｂ由来の三つのＦａｂまたはｓｃＦｂフラグメントから成る三価ａ３複合体(例えば表９参照)。
タイプ５：三つの同一の非免疫グロブリンタンパク質またはペプチドから成る三価ａ３複合体(例えば表１０参照)
【００２０】
当業者は上記の考察において言及されたＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメントは、以下により詳しく考察されるように、他のタイプの抗体および／または抗体フラグメントで置換できることに気付くであろう。一般的に、タイプ１の部類の産物は、二重特異性抗体が望まれる場合の種々の応用において有用である。例えば、活性化された血小板と組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の両方と反応する二重特異性抗体は、血小板の凝集を阻害することにより更なる凝血を阻害するだけでなく、内在するｔＰＡを血小板表面に動員することによって凝血塊を溶解することができる(Neblockら., Bioconjugate Chem. 1991, 3:126-31)。
【００２１】
一般的に、タイプ２Ａおよびタイプ２Ｂの部類の産物は、非免疫グロブリンタンパク質の標的特異的送達または結合が望まれる場合の種々の応用では有用である。例えば、毒素（リボヌクレアーゼのような）に連結した内在化する腫瘍関連抗原（ＣＤ７４のような）に対する二価の抗体結合構造よりなる、安定につながれたａ２ｂ複合体は、標的腫瘍細胞を破壊するために、毒素を選択的に送達するのに有効であろう。
【００２２】
一般的に、タイプ３の部類の産物は、非免疫グロブリンタンパク質のそれぞれ単独よりも、二つの異なる非免疫グロブリンタンパク質の組み合わせのほうが、より望ましい場合の種々の応用では有用であろう。例えば、ＩＬ−４Ｒに対するレセプター（ｓＩＬ−４Ｒ）の可溶成分およびＩＬ−１３に対するレセプター（ｓＩＬ−１３Ｒ）に可溶成分より成る安定につながれたａ２ｂ複合体は、ぜんそくまたはアレルギーを治療するための潜在的な治療剤であるかも知れない。
【００２３】
一般的に、タイプ４およびタイプ５の部類の産物は、三価の複合体が一価のアナログよりもより望ましい場合の種々の応用では有用である。例えば、三つの抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  Ｆａｂフラグメントよりなる、安定につながれたａ３複合体結合構造体は、そのより高い結合能のために、一価(ReoPro, Centocor)または二価のアナログよりも血栓の再形成の阻止により有効であるはずである。ＴＮＦα−Ｒの可溶性成分の三つのコピーから成る、安定につながれたａ３複合体は、リューマチ性関節炎およびある種の他の自己免疫疾患（ＡＩＤ）の治療では、エンブレル（Amgen）よりもＴＮＦを阻止するのにより有効であるはずである。
【００２４】
請求される方法および組成物はまた、ａ２ｂまたはａ３のいずれかの形の安定なテザー構造体に連結した１以上のエフェクターまたは担体から構成されるコンジュゲートを含む。エフェクターまたは担体は、ａ２ｂまたはａ３複合体に非共有結合でまたは例えば化学架橋のような共有結合のいずれかで連結できる。意図する応用に従って、エフェクターは、診断剤、治療剤、化学治療剤、放射性同位体、放射核種、造影剤、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、薬剤、プロドラッグ、酵素、結合分子、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節物質、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出標識、色素、ペプチド、毒素、コントラスト剤（contrast agent）、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子またはこれらの組み合わせ、から選択しても良い。更に、コンジュゲート（conjugate）は、同一であっても異なっていてもよい、一を越えるエフェクターを含んでも良く、または同一であっても異なっていてもよい、一を越える担体を含んでもよい。エフェクターおよび担体はまた同一のコンジュゲートに存在してもよい。エフェクターがキレート剤である場合、得られるコンジュゲートは、通常更に放射性のまたは非放射性の金属と複合化する。担体を含むコンジュゲートはまた更に、意図する応用のために診断または治療機能を有する薬剤を更に組み込んでいる。
【００２５】
ある特定の実施態様では、エフェクターまたは担体を、例えば以下に考察する先標的戦略においては、ａ２ｂ複合体の後に被験体に投与できる。ａ２ｂ複合体を最初に被験体に投与できるし、例えば疾患を有する組織、例えば腫瘍に局在化させてもよい。エフェクター又は担体を次に加えて、局在化したａ２ｂ複合体に結合させてもよい。エフェクターまたは担体が毒性部分、例えば放射性核種とコンジュゲートしている場合、この先標的方法は、被験体の毒物に対する全身被曝を減少させ、標的組織へ毒剤を比例的により多く送達することができる。そのような実施態様では、Ａサブユニットは、例えば腫瘍関連抗原に対する結合部位を含むことができ、一方Ｂサブユニットは、エフェクターまたは担体、あるいはエフェクターまたは担体にコンジュゲートするハプテンに対する結合部位を含むことができる。
【００２６】
開示された方法および組成物により、ＤＤＤ／ＡＤカップリング系を用いた二つの構造体の部位特異的な共有または非共有結合による会合が可能になる。ＤＤＤの構造的な特徴である、Ｘ型四ヘリクス束二量化モチーフ(Newlon, ら. EMBO J. 2001; 20: 1651-1662; Newlon, ら. Nature Struct Biol. 1999; 3: 222-227)は、Ｓ１００タンパク質（例えば、Ｓ１００Ｂおよびカルサイクリン）および転写因子（例えばＨＮＦ−１αおよびＨＮＦ−１β）の肝細胞核因子（ＨＮＦ）のようなタンパク質の他のクラスに見い出される。シグナル伝達または転写活性化に関与している３００以上のタンパク質もまた、ステライル（sterile）のαモチーフ（ＳＡＭ）ドメインと呼ばれる６５−７０アミノ酸のモジュールを含んでおり、それはその二量化界面に存在するＸ型の四ヘリクス束の変異体である。Ｓ１００Ｂに関しては、このＸ型四ヘリクス束によって、ｃ−末端制御ドメイン（残基３６７−３８８）に由来した二つのｐ５３ペプチドへの各ダイマーの結合が、マイクロモルの親和性で、可能になる(Rustandi, ら. Biochemistry. 1998; 37: 1951- 1960)。同様にＨＮＦ−Ｉα（ＨＮＦ−ｐｌ）のＮ−末端二量化ドメインは、HNF-plのダイマーを介してDCoH (HNF-Iの二量化コファクター)のダイマーと会合することが示された（Rose,ら. Nature Struct Biol. 2000; 7: 744-748）。他の実施態様では、これらの天然の系もまた、請求された方法と組成物の範囲内で、多機能または多結合特異性を有する安定した多量体構造を提供するために利用してもよい。他の結合事象、例えばクチナーゼおよびホスホン酸のような、酵素とその基質／阻害剤(Hodneland, ら. Proc Natl Acd Sci U S A. 2002; 99: 5048-5052)もまた、二つの会合する成分（“ドッキング”ステップ）を作成するために用いても良く、それらは次に共有結合により安定化される（“固定（lock）”ステップ）。
【００２７】
種々の実施態様では、治療および／あるいは診断の目的で、ある状態の被験体に本主題の組成物を投与できる。当業者は、多機能、二価、三価、多特異性、二重特異性複合体を用いて診断および／治療してもよい、いかなる状態でも、本対象組成物で治療可能であることに気付くであろう。代表的な状態としては、必ずしも限定されるものではないが、癌、過形成、神経変性疾患、アルツハイマー病、血管炎、ウイルス感染、真菌感染、細菌感染、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リューマチ性関節炎、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、若年性糖尿病、乾癬、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、敗血症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、プラーク新血管形成、再狭窄、血管外傷後新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症関連線維症、肺線維症、深静脈血栓症または創傷肉芽形成があげられる。
【００２８】
特定の実施態様では、開示された方法と組成物は、急性突発性血小板減少性紫斑病、慢性突発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、Henoch-Schonlein紫斑病、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、Goodpasture症候群、血栓性血管炎（thromboangitisubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、Wegener肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化肺胞炎、のような自己免疫疾患を治療するために用いることができる。
【００２９】
特定の実施態様では、本安定なテザー構造物は、癌の治療に有用であり得る。いかなるタイプの腫瘍も、いかなるタイプの腫瘍抗原も標的である可能性が期待される。標的となるかも知れない腫瘍の代表的なタイプとしては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道、胃、頭部、首の癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、腎癌、卵巣癌、すい臓癌、神経膠腫、黒色肉腫、肝癌、前立腺癌および膀胱癌、が挙げられる。
【００３０】
標的にしてもよい腫瘍関連抗原は、限定されないが、カルボン酸アンヒドラーゼＩＸ、Ａ３、Ａ３３抗体に対する特異的な抗原、ＢｒＥ３−抗原、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＨＣＧおよびそのサブユニット、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＣＥＡＣＡＭ−６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−Ｉ、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｂａ７３３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＡＭ−４−抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、ＴＡＧ−７２、ｐ５３、テナスシン、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、Ｔｎ抗体、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、１７−１Ａ−抗原、血管新生マーカー、（例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン)、癌遺伝子マーカー、癌遺伝子産物、および他の腫瘍関連抗原が挙られる。腫瘍関連抗原に関する最近の報告としては、Mizukami ら., (2005, Nature Med. 11 :992-97); Hatfield ら., (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48); Vallbohmer ら. (2005, J. Clin. Oncol. 23:3536-44); and Ren ら. (2005, Ann. Surg. 242:55-63)、が挙られ、それぞれは本明細書に参照により援用される。
【００３１】
他の実施態様は、該第二前駆体の結合部位がリンパ球抗原に結合し、該第一前駆体の結合部位が、同一または異なったリンパ球抗原に結合する場合、安定なテザー構造物の一以上の用量を被験体に投与することにより、被験体におけるリンパ腫、白血病または自己免疫疾患を治療する方法に関するものであり得る。結合部位は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ５、テナスシン、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＮＣＡ  ６６ａ−ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択される抗原の区別できるエピトープに結合することができる。本組成物は非経口的に、例えば、２０から１５００ミリグラム、２０から５００ミリグラム、２０から１００ミリグラムまたは２０から１５００ミリグラムタンパク質／投与量の一用量で投与できる。
【００３２】
更に他の実施態様では、安定なテザー構造物は、細菌、ウイルスまたは真菌のような病原体に感染した被験体を治療するために、有用であり得る。治療可能である真菌の代表的なものとしては、小胞菌（Microsporum）、白癬菌（Trichophyton）、表皮菌（Epidermophyton）、スポルトリクス（Sporothrix schenckii）、 Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis または Candida albicanが挙られる。代表的なウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エップスタインーバーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスまたはブルータングウイルスが挙られる。代表的な細菌としては、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ストレプトコッカス・アガラクチア、レジオネラ肺炎菌（Legionella pneumophilia）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎双球菌（Pneumococcus spp.）、インフルエンザ菌Ｂ（Hemophilis influenzae B）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）またはマイコプラズマが挙られる。そのような安定なテザー構造体は、例えば、病原体上の一以上の抗原決定基に対する結合部位を含むことができ、また例えば、抗ウイルス剤、抗生物質または抗真菌剤のような病原体に対する治療剤とコンジュゲートまたは付着できる。あるいは、安定なテザーコンジュゲートは、病原体抗原に対する該第一結合部位および一つ以上の治療剤に結合しているハプテンまたは担体に対する該第二結合部位を有することができる。
【００３３】
感染性病原体に対して使用される、本主題の安定なテザー構造体にコンジュゲートされ、組み込まれ、または結合するために標的とできる治療剤としては、これらに限定されないが、アシクロビル、アルベンダゾール、アマンタジン、アミカシン、アモキシリン、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、アズトレオナム、アジトロマイシン、バシトラシン、バクトリム、バトラフェン（Batrafen（登録商標））、ビフォナゾール、カルベニシリン、カスポファンジン、セファクロール、セファゾリン、セファロスポリン、セフェピム、セフトリアキソン、セフォタキシム、クロラムフェニコール、シドフォビル、シプロ（登録商標）、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クロトリマゾール、クロキサシリン、ドキシサイクリン、エコナゾール、エリスロサイクリン、エリスロマイシン、フラジル、フルコナゾール、フルシトシン、フォスカルネット、フラゾリドン、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、イミペネム、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、リンコマイシン、リネゾリド、メロペネム、ミコナゾール、ミノサイクリン、ナフチフィン、ナリジキシン酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ナイスタチン、オセルタミビル、オキサシリン、パラモマイシン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリンータゾバクタム、リファブチン、リファンピン、リマンタジン、ストレプトマイシン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、テトラサイクリン、チオコナゾール、トブラマイシン、トルシクレート、トルナフテート、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、バラシクロビル、バンコマイシン、ザナミールおよびジスロマイシンが挙られる。
【００３４】
限定される訳ではないが、種々の実施態様では、安定なテザー構造体に取り込まれた前駆体は、バクテリア毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンーＡ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（gelonin）、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ｔＰＡ、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、界面活性タンパク質Ｄ、ＩＬ−４、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、ＶＥＧＦ１２１、ＴＰＯ、ＥＰＯ、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク質、ｓＴＮＦα−Ｒ、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびナノボディのようなタンパク質を一つ以上含むことができる。
【００３５】
他の実施態様では、抗血管新生剤は前駆体の一部または全部を形成することができ、または安定なテザー構造体に結合できる。代表的な有用な抗血管新生剤としては、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体またはペプチド、抗胎盤増殖因子またはペプチド、抗Ｆｌｋ−１抗体またはペプチド、抗Ｆｉｔ−抗体またはペプチド、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリファリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポイエチン２、インターフェロンーアルファ、ハービマイシンＡ、PNU145156E、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニスタイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（accutin）、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第四因子およびミノサイクリンが挙げられる。
【００３６】
更に他の実施態様では、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチンー１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、 クロラムブシル、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、グルクロニド、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベステロール、ドクソルビシン、２−ピロリノドクソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノドクソルビシン、ドクソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エチニルエストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲステロール、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトタン、フェニル酪酸、プレドニソン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ベルケイド、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、オンコナーゼ、ｒａｐＬＲ１、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを安定なテザー構造体にコンジュゲートされまたは取り込まれうる。
【００３７】
別の実施態様では、該第一前駆体は疾患組織と関連した抗原または他の標的に結合でき、一方該第二前駆体は一つ以上のエフェクターの送達のための、標的となり得る構造体と結合するようにデザインし得る。安定なテザー構造体の投与および疾患関連細胞または組織への局在化の後、標的となる構造体を、局在化した、安定したテザー構造体に結合するように加えることができる。場合によっては、標的となる構造体の投与以前に、局在化していない安定なテザー構造体を循環から除去するために、除去剤を投与できる。これらの技術は当分野ではは既知であり、米国特許4,624,846号、WO92/19273号および Sharkey ら., Int. J. Cancer 51 : 266 (1992)に詳細が記載されている。代表的な標的となる構造体としては、X-Phe- Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2の構造を有し、ここでＸまたはＹには強い酸カチオンキレーター、残りのＸまたはＹには弱い酸カチオンキレーターを含み、化合物は更に、診断または治療用のカチオンを少なくとも一つ、および／もしくはキレートまたは化学結合した治療剤、診断剤または酵素を更に含む。診断剤としては、例えば、Ｇｄ（III）、Ｅｕ（III）、Ｄｙ（III）、Ｐｒ（III）、Ｐａ（IV）、Ｍｎ（II）、Ｃｒ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｔｉ（III）、Ｖ（IV）イオンまたはラジカルであり得る。第二の代表的な構造体は、式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2で表され、ここでＸまたはＹに強い酸カチオンキレーターまたは弱い酸カチオンキレーターを含み、残りのＸまたはＹには何も含まず、化合物は更に、診断または治療用のカチオンを少なくとも一つ、および／あるいはキレートまたは化学結合した治療剤、診断剤または酵素を更に含む。
【００３８】
種々の実施態様は、病んだ細胞のアポトーシス誘導に有用である、安定したテザー構造体とその使用方法に関するものであり得る。より詳細については米国特許出願20050079184号に見出すことができるが、全文書は本明細書に参照により援用される。そのような構造体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＣＡ−１２５、ＴＡＧ−７２、ＥＦＧＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、テナスシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸおよびＩＬ−６からなる群から選択される抗原に結合親和性を有する第一および／あるいは第二前駆体を含むことができる。より特定の実施態様では、アポトーシスを誘導するのに有用な安定なテザー構造体はモノクローン抗体、Ｆａｂフラグメント、キメラ、ヒト型またはヒト抗体またはフラグメント、を含むことができる。好ましい実施態様では、安定なテザー構造体は、抗−ＣＤ７４Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ７４Ｘ、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２２Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ、抗−ＨＬＡ−ＤＲ、抗−ＣＤ１９Ｘ、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ  抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ２Ｘ  抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ８Ｘ  抗−ＣＤ２５、および抗−ＣＤ２Ｘ、抗−ＣＤ１４７の組み合わせを含むことができ、更に好ましい実施態様では、キメラ、ヒト化またはヒト抗体もしくは抗体フラグメントは、ＬＬ２（抗−ＣＤ２２）、ＬＬ１（抗−ＣＤ７４）またはＡ２０（抗−ＣＤ２０）の変異ドメインに由来しうる。
【００３９】
種々の実施態様は、炎症、免疫制御不全疾患、感染症、病理的血管新生または癌の治療法に関するものであり得る。この応用では、安定なテザー構造体は、（Ａ）内在免疫系の炎症誘発性エフェクター、（Ｂ）凝固因子、（Ｃ）補体因子および補体制御タンパク質および（Ｄ）炎症または免疫制御不全障害もしくは病理的血管新生または癌に特異的に関連した標的、からなる群から選択される二つの異なる標的に結合するが、後者の標的は（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）ではない。標的の少なくとも一つは（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）である。適切な標的の組み合わせは、２００４年１２月８日に出願された、“免疫治療のための方法及び組成物ならびに炎症および免疫制御不全疾患、感染症、病理的血管新生および癌の検出”と題する、米国仮出願60/634,076号に記載されており、そのすべては本明細書に参照により援用される。
【００４０】
結合分子が結合することができる、生得の免疫系の炎症誘発性エフェクターは、炎症誘発性エフェクターサイトカイン、炎症誘発性エフェクターケモカインまたは炎症誘発性エフェクターレセプターであり得る。適切な炎症誘発性エフェクターサイトカインとしては、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−Ｉ（高移動度群ボックスタンパク質１）、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８が挙げられる。代表的な炎症誘発性エフェクターケモカインとしては、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−Ｉ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＥＮＡ−７８、ＭＣＰ−Ｉ、ＩＰ−１０、ＧＲＯＢおよびエオタキシンが挙げられる。炎症誘発性レセプターとしては、ＩＬ−４Ｒ（インターロイキン−４レセプター）、ＩＬ−６Ｒ（インターロイキン−６レセプター）、ＩＬ−１３Ｒ（インターロイキン−１３レセプター）、ＩＬ−１５Ｒ（インターロイキン−１５レセプター）およびＩＬ−１８Ｒ（インターロイキン−１８レセプター）が挙げられる。
【００４１】
結合分子はまた、少なくとも一つの凝固因子、特に組織因子（ＴＦ）またはトロンビンと特異的に反応できる。他の実施態様では、結合分子は、少なくとも一つの補体因子または補体制御タンパク質と、特異的に反応できる。好ましい実施態様では、補体因子はＣ３、Ｃ５、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂおよびＣ５ａからなる群から選択される。結合タンパク質が補体制御タンパク質と特異的に反応する場合、補体制御タンパク質は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびｍＣＲＰからなる群から選択されるのが好ましい。
【００４２】
発明の詳細な説明
ある特定の実施態様では、ａ２ｂ型の新規安定なテザー二成分複合体およびこれらの複合体の作成法が提供される。一般的に二成分複合体は、Ａまたはａ２と呼ばれる、非共有結合で連結したホモ二量体構造とＢまたはｂと呼ばれる第二構造との部位特異的な会合によりなる。得られたａ２ｂ構造体は、ＡおよびＢの非共有または好ましくは共有相互作用（例えばジスルフィド結合）によって安定化され得る。Ａは二つの同一のサブユニットから形成され、各サブユニットは、好ましい実施態様ではｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）に由来した二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれるペプチド配列と連結した前駆体よりなる。サブユニットに含まれるＤＤＤ領域は、自然に会合して安定したホモ二量体を形成し、この会合は次いで、例えば種々のＡ−キナーゼアンカータンパク質に見出され（ＡＫＡＰｓ）、Ｂに含まれている、アンカードメイン（ＡＤ）と呼ばれるペプチド配列に対して高い親和性を有する結合部位を作成する。従って、ＢはＡＤに連結した前駆体より成る。
【００４３】
二成分複合体の集合は、ＡＤペプチドと（ＤＤＤ）２結合部位との相互作用を介して容易に起こる。ＤＤＤペプチドは、その誘導体化がその二量化能およびＡＤペプチドとの結合能に干渉しない限り、本質的にいかなるポリペプチド配列に挿入され、またはいかなる前駆体につながれ得る。同様にＡＤペプチドも、その誘導体化がホモ二量体ＤＤＤ結合部位との結合に干渉しない限り、本質的にいかなるポリペプチド配列に挿入され、いかなる前駆体とつながれ得る。このモジュラー法は高度な多用性を有し、Ａの前駆体に由来する二つのサブユニット（ａ２）およびＢの前駆体に由来する一つのサブユニット（ｂ）を含む二成分集合体を形成するために、本質的にどのようなＡとどのようなＢも組み合わせて使用することができる。両前駆体ＡおよびＢが、抗原結合部位を作るために第二抗体ドメインと会合できる抗体ドメインを含む場合（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）、結果として得られるａ２ｂ複合体は二重特異性を有しまた三価である。いくつかの実施態様では、二成分複合体は、例えば化学コンジュゲーションを介して、リガンドまたは薬剤のようなエフェクター、デキストランまたはナノ粒子のような担体またはエフェクターおよび担体の両方に連結でき、そのような修飾によって更なる応用が可能になる。
【００４４】
二成分複合体の安定性は主として、Ｂに含まれるＡＤに対するＡに含まれるＤＤＤの結合親和性に依存するのであるが、平衡サイズ排除ＨＬＰＣ分析による推定によれば、Ｃ末端融合ＡＤ１構造体（実施例３に記載されているｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１）とＣ−またはＮ−末端融合ＤＤＤ１構造体（実施例４に両方記載されている、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４またはＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４）の間で形成される二つの原型ａ２ｂ複合体（実施例５に記載されている）については８ｎＭよりも強く無いとされており、ａ２ｂ複合体におけるＡおよびＢを共有結合で連結することは、個々のサブユニットの望ましくない分離を防ぎ、それによって生体内における応用を容易にするであろう。二成分複合体を安定化するために、システイン残基を、ＤＤＤとＡＤの間にジスルフィド結合を形成を可能にする戦略的な位置に、ＤＤＤおよびＡＤ配列の両方上に導入してもよい。ａ２とｂとの架橋を介して安定複合体を形成させるために、他の方法または戦略を用いることができる。例えば、構成サブユニットを、グルタルアルデヒドまたはＰＩＣＵＰを用いて、比較的特異性の低い、低効率な方法で互いに共有結合で結合できる。他の既知の共有結合架橋方法もまた使用できる。
【００４５】
定義
以下の説明では、多くの用語が使用されるが、本明細書の開示の理解を容易にするために、以下の定義を提供する。明確に定義されない用語は、平易な通常の意味に従って使用される。
【００４６】
本明細書では、“ａ”または“ａｎ”は一つ以上の物を意味し得る。
【００４７】
本明細書では、用語“および”および“または”は接続詞または離接的接続詞の意味で用いることができる。すなわち、そうでないと言明された場合以外は、両語は“および／または”と同義であると理解されたい。
【００４８】
二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）はＤＤＤ配列を含む二つのホモ単量体の自然二量体形成を可能にするペプチド配列を言う。結果として得られるホモ二量体は、アンカードメインに関するＤＤＤ配列中のドッキング部位を含む。代表的なＤＤＤ配列は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼから得られるが、他の既知のＤＤＤ配列を用いることができる。
【００４９】
アンカードメイン（ＡＤ）は、二量化ＤＤＤ配列に結合親和性を有するペプチド配列である。代表的なＡＤ配列は、いかなるＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰｓ）に由来し得るが、他の既知のＡＤ配列を利用できる。
【００５０】
前駆体と言う用語は、もっと安定した、確定的なまたは最終の産物が形成される物質、と言う平易な通常の意味に従って用いられる。
【００５１】
本明細書では、結合分子、結合部分または標的分子は、標的分子、細胞、複合体および／または組織に特異的に結合することが可能ないかなる分子でもあり得る。結合分子としては、これらに限られないが、抗体またはそのフラグメント、それらのアナログまたは模倣体、アビマー（avimer）、アプタマーまたは標的ペプチドが挙げられる。
【００５２】
本明細書では、抗体とは、全長（すなわち、天然のまたは正常免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組み換えプロセスによって形成された）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）または、例えば抗体フラグメントのような、免疫活性を有する（すなわち特異的に結合する）免疫グロブリン分子の一部またはアナログを言う。
【００５３】
抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等のような抗体の一部である。構造の如何に関わらず、抗体フラグメントは無傷な抗体によって認識されると同じ抗原に結合する。“抗体フラグメント”と言う用語はまた、特定の抗原と結合して複合体を形成することによって、抗体のように挙動する合成または遺伝子改変タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、重鎖および軽鎖の可変領域よりなるＦｖフラグメントのような、可変領域よりなる単離フラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続している組み換え単鎖ポリペプチド分子（ｓｃＦｖタンパク質）および高頻度可変領域を模倣するアミノ酸残基よりなる最小認識ユニットが挙げられる。
【００５４】
エフェクターとは、選択された結果をもたらす原子、分子または化合物である。
エフェクターは、治療剤及び／又は診断剤を含む。
【００５５】
治療剤とは、疾患の治療に有用な原子、分子または化合物である。治療剤の例としては、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、薬剤、毒素、酵素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、キレーター、ホウ素化合物、光活動性剤、色素、および放射性同位体が挙げられる。他の代表的な有用な治療剤および治療法は米国特許第20050002945号、第20040018557号、第20030148409号および第 20050014207号に開示されており、各々は本明細書に参照により援用される。
【００５６】
診断剤とは、疾患の診断において有用な、原子、分子または化合物である。有用な診断薬剤としては、それらに限定されないが、放射性同位体、色素（ビオチンーストレプトアビジン複合体と伴ったような）、造影剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴画像法のための増感剤（例えば常磁性イオン）が挙げられる。
【００５７】
免疫コンジュゲートとは、結合分子（例えば抗体成分）と原子、分子、または高次構造体（例えば、担体、治療剤または診断剤）とのコンジュゲートである。
【００５８】
裸の抗体とは、他の薬剤とコンジュゲートしていない抗体である。
【００５９】
担体とは、治療剤または診断剤と会合して、そのような薬剤の標的細胞への送達を促進することのできる、原子、分子または高次構造体である。担体としては、脂質（例えば、高次構造体を形成し得る、両親媒性の脂質）、多糖類(デキストランのような)、ペプチド、タンパク質またはミセル、リポソーム、またはナノ粒子のような高次構造体を挙げてもよい。
【００６０】
本明細書では、抗体融合タンパク質と言う用語は、同一または異なったｓｃＦｖまたは同一または異なった特異性を有する抗体フラグメントの二つ以上が連結している、遺伝子組み換えによって作成された抗原結合分子である。融合タンパク質の価は、一つの抗原またはエピトープに対して、融合タンパク質がいくつの結合手または部位を有するかを示す；すなわち、一価、二価、三価または多価である。抗体融合タンパク質が多価であると言う事は、抗原との結合では、相互作用が多数である事を利用できることを意味し、従って抗原に結合する結合力の増加を意味する。特異性とは、一つの抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープと結合できるかを示す；すなわち一重特異的、二重特異的、三重特異的または多重特異的である。これらの定義を用いると、例えばＩｇＧのような天然抗体は、二つの結合腕を有していることから、二価であるが、一つのエピトープと結合することから一重特異的である。一重特異的、多価融合タンパク質は、一つのエピトープに対して一つ以上の結合部位を有しているが、そのようなエピトープの一つに結合するだけである；例えば同一の抗原と反応性を有する二つの結合部位を有する、ダイアボディー（diabody）である。融合タンパク質は、一つの抗体成分、別の抗体成分の多価または多重特異性の組み合わせ、または同一の抗体成分の多重コピーを含むことができる。融合タンパク質は更に、抗体または抗体フラグメントおよび治療剤を含むことができる。そのような融合タンパク質に適切な治療剤としては、免疫調節剤（“抗体ー免疫調節剤融合タンパク質”）および毒素（“抗体−毒素融合タンパク質”）が挙げられる。一つの好ましい毒素は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含み、好ましくは組み換えＲＮａｓｅである。
【００６１】
多重特異性抗体とは、異なった構造の少なくとも二つの標的に同時に結合できる抗体であり、二つの標的とは、例えば、二つの抗原、同じ抗原上の二つの異なったエピトープ、またはハプテンおよび／または抗原またはエピトープである。
【００６２】
多価抗体とは、同一または異なった構造である少なくとも二つの標的に、同時に結合可能な抗体である。
【００６３】
多重特異的、多価抗体とは、異なった特異性の二つ以上の結合部位を有する構造体である。
【００６４】
二重特異性抗体は、異なった構造の二つの標的に、同時に結合可能な抗体である。特に興味深い二重特異性抗体および二重特異性抗体フラグメントは、少なくとも一つの腕が、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄、血漿およびマスト細胞抗原またはエピトープに特異的に結合し、また少なくとも一つの他の腕は治療剤または診断剤を有する標的となりうるコンジュゲートに特異的に結合する。
【００６５】
本明細書では、機能的なタンパク質とは、生物活性を有するタンパク質である。
【００６６】
抗体または免疫コンジュゲート調製品、もしくは本明細書に記載される組成物は、投与量に生理学的に意義がある場合、“治療上有効量”投与された、と言う。投与を受けた哺乳動物の生理学において、薬剤の存在が検出可能な変化を引き起こす場合、薬剤は生理学的に意義がある。特に、抗体調製物は、その存在が抗腫瘍反応を引き起こす、または自己免疫疾患の徴候および症状を緩和するならば、生理学的に意義がある。生理学的に意義がある効果は、投与を受けた哺乳動物では液性および／または細胞性免疫反応の誘起が標的細胞の増殖阻害または死をまねくことでもある。
【００６７】
組成物は、その投与が投与を受ける患者によって許容されることができるなら、“製薬的に許容される担体”であると言われる。無菌リン酸緩衝食塩水は、製薬的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は、当業者には良く知られている。例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGoodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980 and 2001 editions)を参照のこと。
【００６８】
モジュラーサブユニットの安定なテザー集合体の作成する方法
開示された方法および組成物は、モジュラーサブユニットの安定したテザー集合体を作成する基盤技術を提供する。一つの実施態様は、好ましくは別々に生産される二つの規定された成分、ＡおよびＢから形成される安定なつながれた二成分複合体に関する。しかしながら、他の実施態様では、ＡおよびＢの両者を一緒に生産でき、例えば一つの細胞株を、ＡとＢの両方をコード化するベクターを用いて、またはＡとＢを別々にコード化する二つの異なったベクターを用いてトランスフェクトすることにより生産できる。ＡおよびＢが両方ともＦａｂフラグメントである場合、別々の生産が好ましい。その理由は別々に生産しないで、一緒に生産すると、軽鎖のスクランブルにより製造物の不均一化が起こるからである。
【００６９】
ある実施態様では、二つの同一なサブユニット（ａ２）より成るＡは、一つのサブユニット（ｂ）より成るＢと組み合わさって、ａ２ｂ配置の集合体を形成する。ＡとＢとの会合は、ＡとＢそれぞれに組み込まれたＤＤＤおよびＡＤ配列間の強い結合相互作用によって、部位特異的であり、自然発生的である。ＡおよびＢの両者は、いかなる実体であリ得るし、ＤＤＤが連結しているＡの前駆体は、ＡＤが連結したＢの前駆体と異なってまたは同一であり得る。後者の場合、結果として得られるａ２ｂ複合体は、ａ３と呼ばれ、それぞれが同じ前駆体を含むことができるが、ＤＤＤとＡＤの両方に連結している三つのサブユニットから構成されている。
【００７０】
請求されている方法および組成物のモジュラーの性質により、いかなるＡといかなるＢとの組み合わせも可能である。ＤＤＤの二量化またはＤＤＤのＡＤへの結合に干渉しない限りは、ＡおよびＢに結合しまたは組み込まれることができる前駆体のタイプに関しては、本質的に制限が無い。組み換え技術によって構築された時、ＡおよびＢは独立して、異なった宿主において製造し、精製し、貯蔵することができる（または、その代わりに、上記の如く同じ宿主細胞中で製造することもできる）。しかしながら、ＡおよびＢを集合する前に精製する必要性が、絶対的に要求されているわけではない。ＡおよびＢを含む細胞抽出液または培養液を、二成分複合体の形成をもたらす適切な条件下で直接混合することもでき、その後二成分複合体は、酸化によってジスルフィド結合で安定化しそれから精製することができる。ある特定の応用では、Ｂを、精製後、Ａと組み合わせる前に、エフェクターまたは担体とコンジュゲートさせることが望ましいこともあり得る。代わりに、Ａを、精製後、Ｂと組み合わせる前に、エフェクターまたは担体とコンジュゲートさせることが望ましいこともあり得る。また、ＡおよびＢを、組み合わせる前に、エフェクターまたは担体で修飾することが望ましいこともあり得る。更に加えて、ａ２ｂ複合体をエフェクターまたは担体とコンジュゲートさせることは、ある種の応用では望ましいこともあり得る。同じ宿主細胞ではＡおよびＢが製造される場合は、それらは自然にａ２ｂ複合体に集合することができる。
【００７１】
好ましい実施態様は、自然に起こる、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）調節サブユニットとＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）アンカードメインの間の特異的なタンパク質／タンパク質相互作用を利用する。ＰＫＡは１９６８年に最初に報告された(Walsh et al, J. Biol. Chem. 243:3763-65 (1968)参照)。制御（Ｒ）サブユニット二量体によって不活性型に止められている二つの触媒作用を有するサブユニットから成るホロ酵素の構造は、１９７０年代の中頃解明された(Corbin et al, J. Biol. Chem. 248:1813- 21 (1973)参照)。Ｒサブユニットの二つの型（ＲＩおよびＲＩＩ）が発見され、それぞれがαおよびβのイソ型を有していた。Ｒサブユニットは安定二量体として分離され、二量化ドメインはアミノ末端の最初の４４残基から成ることが示された(Hausken et al, J. Biol. Chem. 271 :29016-22 (1996)参照)。広範囲セリン／スレオニンキナーゼであるPKAのシグナル特異性は、A-キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰｓ）と呼ばれるドッキングタンパク質を介するホロ酵素の区画化を通じて達成される(Scott et al., J. Biol. Chem. 265:21561-66 (1990))。
【００７２】
最初のAKAPである、微小管関連タンパク質２、は１９８４年に性質が明らかにされた(Lohmann et al, Proc. Natl. Acad. Sd USA. 81 :6723-27 (1984))。今日まで５０を越える種々の構造のＡＫＡＰｓが、酵母からヒトにいたる範囲の種で同定された(Wong et al, Nat Rev Mol Cell Biol. 12:959-70 (2004)参照)。AKAPsのPKAアンカードメインは１４−１８残基の両親媒性のヘリクスである(Carr et al. J. Biol. Chem. 266:14188- 92 (1991)参照)。ＰＫＡアンカードメインのアミノ酸配列はＡＫＡＰｓの中では極めて多様であり、ＲＩＩ二量体の結合親和性は２−９０ｎＭの範囲にあり、一方ＲＩ二量体の結合親和性はその１００分の一程度と弱い(Alto et al. Proc. Natl. Acad. Sd USA. 100:4445-50 (2003)参照))。アンカードメインはRIIのアミノ末端の最初の２３残基によって形成されるRII二量体の疎水性表面に結合する(Colledge et al, Trends Cell Biol. 6:216-21 (1999))。従って、ＲＩＩ二量化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインの両方は同じ４４のアミノ酸配列内に位置している。更に、ＡＫＡＰｓはＲＩＩの二量体にのみ結合し、単量体には結合しない。この相互作用の構造モデルを、図３に示す。
【００７３】
ＤＤＤとＡＤ配列の相互作用を介して形成されたａ２ｂまたはａ３複合体を、生体内応用を可能にするために共有結合で安定化できる。これは、ａ２およびｂの間のジスルフィド結合の形成を促進するために、ＤＤＤおよびＡＤ配列の両方にシステイン残基を戦略的な位置に導入することにより達成できる。代わりに共有結合架橋の他の既知のタイプを用いることができる。
【００７４】
二成分複合体の二成分（ＡおよびＢ）を組み換え技術で製造する場合、同じ宿主細胞中で合成できるが、より好ましくは別の宿主細胞系中で合成した方がよい。Ａの合成を導く発現ベクターは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα、ＲＩＩβ、またはいずれかの天然または合成機能的アナログの最初の３０以上のアミノ酸から成ってもよい、ＤＤＤ１またはＤＤＤ２のようなＰＫＡのＲサブユニットのＤＤＤをコード化する配列と融合した対象のポリペプチド（Ａ）のＤＮＡ配列を含むであろう。ＤＤＤは、直接にまたは好ましくは適切な長さのまたはアミノ酸残基の組成を含むスペーサーによって、Ａのアミノ末端またはカルボキシ末端と結合することができる。代わりに、ＤＤＤの結合活性およびポリペプチド融合パートナーの欲する活性を損なわない限り、ＤＤＤを融合タンパク質の内部に置くこともできる。合成時、Ａ／ＤＤＤ融合タンパク質はＤＤＤ１と安定ホモ二量体（ａ２）のみを、ＤＤＤ２と主として安定ホモ四量体（ａ４）を形成する。
【００７５】
Ａの合成を導くベクターと同じベクターであることも可能であるが、好ましくは独立したベクターである、Ｂの合成を導く第二の発現カセットは、いずれかのＡＫＡＰタンパク質もしくはＵＳ  ２００３／０２３２４２０Ａ１（本明細書に参照により援用される）に開示された天然または合成アナログに由来することが可能な、ＡＤ１またはＡＤ２のようなアンカードメイン（ＡＤ）をコード化する配列と融合した対象（Ｂ）のポリペプチドのＤＮＡ配列を含む。ＡＤは直接にまたは好ましくは適切な長さのまたはアミノ酸残基の組成を含むスペーサーによって、Ｂのアミノ末端またはカルボキシ末端と結合することができる。Ｂ／ＡＤ２融合タンパク質（ｂ）とＡ／ＤＤＤ２融合タンパク質（主としてａ４）をジスルフィド還元剤の存在下で混合すると、ａ２ｂからなる二成分複合体が得られ、次にジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を加えることによって、ジスルフィド結合の形成を促進し安定化される。
【００７６】
サブユニットのモジュラーの性質により、いかなるＤＤＤ２ポリペプチド二量体といかなるＡＤ２ポリペプチドとの組み合わせも可能である。種々のａ４／ａ２およびｂモジュラーサブユニットのストックを、精製した産物または精製しない細胞培養上清として個々に維持することができ、その後組み合わせて、必要な時に種々のａ２ｂ構造体を得ることができる。
【００７７】
更なる実施態様では、薬剤またはキレーターのようなエフェクターもしくはデキストランまたはナノ粒子のような担体を、精製後のＡまたはＢに適切なコンジュゲーション化学を用いて結合できる。代わりに、そのような修飾を、ａ２ｂの形成と精製後に行う事ができ、または混合前のＡとＢの両方に行うこともできる。
【００７８】
組み換え抗体結合ドメインに由来したモジュラーサブユニットの安定なテザー集合体
開示された方法および組成物は、組み換え抗体に基づく、単特異性または二重特異性多価結合構造体を提供するために有用である。例えばＤＤＤ２配列を、ａ４／ａ２の型で単特異性結合構造を得るために、単鎖Ｆｖに融合させることができる。より一般的には、ＤＤＤ配列を、相補的抗体可変ドメインと会合して抗原結合部位を形成することができる、抗体の可変部と融合させることができる。例えば、ＤＤＤ１またはＤＤＤ２配列を、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む抗体配列と融合させることができ（Ｆｄ／ＤＤＤ）、またはその代わりにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗体配列と融合させることもできる（Ｌ／ＤＤＤ）。そこでＦｄ／ＤＤＤまたはＬ／ＤＤＤは、それぞれ相補的なＬまたはＦｄと会合し、Ｆａｂ／ＤＤＤおよび更にＦａｂ／ＤＤＤ１の二量体またはＦａｂ／ＤＤＤ２の四量体／二量体を形成することができる。
【００７９】
同様に、ＡＤ２のようなＡＤ配列は、単鎖Ｆｖ、またはより一般的には、同族のＬ鎖と対にした場合Ｆａｂ／ＡＤ２を形成するＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含む抗体配列（Ｆｄ／ＡＤ２）と融合させることができる。その代わりに、ＡＤ２のようなＡＤ配列は、同族のＦｄ鎖と対にした場合、Ｆａｂ／ＡＤ２を形成する、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む抗体配列と融合できる。Ｆａｂ／ＤＤＤ２の四量体／二量体とＦａｂ／ＡＤ２を混合し、次いで還元および酸化を行うことにより、単特異性（ａ３）または二重特異性（ａ２ｂ）である事ができる三価結合構造体の安定なテザー集合体が結果として得られる。
【００８０】
結合構造体のＶＨおよびＶＬ領域は、“ヒト化”モノクローン抗体またはヒト抗体に由来し得る。その代わりに、ＶＨおよび／またはＶＬ領域は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから分離されたヒト抗体フラグメントに由来する配列を含むことができる。例えば、Barbas et al., METHODS: A companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991)、および Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)を参照されたい。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを作成するために有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えばSTRATAGENEクローニングシステム(La Jolla, Calif.)から得ることができる。
【００８１】
ヒト抗体ＶＨまたはＶＬ配列は、マウスでは作成されたヒトモノクローン抗体に由来しうる。そのような抗体を、抗原チャレンジに反応して、特異的なヒト抗体を製造するように改変された、遺伝子導入マウスから得る。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の要素が、内在の重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞由来のマウスの系統に導入される。該遺伝子導入マウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該マウスはヒト抗体を分泌するハイブリドーマを製造するために、用いることができる。遺伝子導入マウスからヒト抗体を得る方法は、Green 等によって、（Nature Genet. 7: 13 (1994)）、Lonberg 等、（Nature 368: 856 (1994)）、および Taylor 等、（Int. Immun. 6: 579 (1994)によって記述されている。
【００８２】
抗体フラグメントを含む組み換え融合タンパク質の一般的な製造法
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントをコード化する核酸配列は、当該技術分野ではよく知られた技術によって得ることができる。ＰＣＲまたは従来のｃＤＮＡクローニング技術のような既知の技術よって調製できる、抗体をコード化するＤＮＡを得るために、例えば、欲する特異性の抗体を分泌するハイブリドーマを、使用することができる。その代わりに、Ｆａｂ’発現ライブラリーまたは抗体ファージディスプレイライブラリーを、欲する特異性を有する抗体フラグメントをスクリーニングするために構築することができる。
【００８３】
抗体フラグメントをコード化する核酸を、直接またはペプチドスペーサーをコード化した配列を介して、ＤＤＤまたはＡＤをコード化する核酸へ結合することができる。これらの型の融合タンパク質をコード化する核酸配列を製造する方法は当該技術分野では良く知られており、以下の実施例では更に考察されるであろう。
【００８４】
他の実施態様では、追加のアミノ酸残基を、Ａ／ＤＤＤまたはＢ／ＡＤから構成されるモジュラーサブユニットのＮまたはＣ末端に加えることができるが、正確な融合部位は、ＤＤＤまたはＡＤがＮまたはＣ末端（または内部の位置に）に結合するかどうかに依存する。追加アミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（例えばプロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、毒素、ペプチド薬剤、膜相互作用ペプチドまたは他の機能タンパク質を含むことができる。
【００８５】
欲する宿主細胞では組み換えタンパク質を製造する方法は、当該技術分野では良く知られている。精製を促進するために、安定なテザー構造体は、関連のあるアフィニティーカラムによる精製を容易にするために、ＦＬＡＧ配列またはポリ−ＨＩＳ配列のような関連した適切なペプチドタグを含むことができる。
【００８６】
安定なテザー構造体の成分サブユニットを発現するための代表的な発現システムは、ｐｄＨＬ２ベクターであって、メトトレキセート処理によるマウス選択と増幅を可能にする、増幅可能なマウスのｄｈｆｒ遺伝子を有している。Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989)を参照のこと。ｐｄＨＬ２ベクターは、二つのメタロチオニンプロモータおよびＩｇＨエンハンサーによって独立に制御される二つの遺伝子の独立した発現を提供する。
【００８７】
安定なテザー構造体の構成サブユニットの発現のために適当な宿主細胞または細胞株は、当業者には知られている。ヒト宿主細胞を使用すれば、いかなる発現分子であっても、ヒトの糖鎖付加パターンで修飾されることができるであろう。しかしながら、開示された方法については、ヒト宿主細胞が必須であるかまたは好ましいことは示されていない。
【００８８】
一例として、Ｓｐ２／０のようなマウス骨髄腫株は、安定なテザー構造体の構成成分サブユニットをコード化する線形にしたｐｄＨＬ２ベクターを電気穿孔法によりトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後４８時間に、０．０５−０．１μＭメトトレキセートを含む培地中で細胞を培養することにより選択を開始できる。それから５μＭまでメトトレキセートの濃度を段階的に増加させることにより、選択されたクローンを増幅させることができる。
【００８９】
安定なテザー構造体のコンジュゲート
追加の成分を上記の安定なテザー構造体にコンジュゲートさせることができる。例えば、薬剤、毒素、放射性化合物、酵素、ホルモン、細胞毒性タンパク質、キレート剤、サイトカインおよび他の機能剤を、安定なテザー構造体のひとつ以上のモジュラーサブユニットにコンジュゲートしてもよい。コンジュゲーションは、たとえば、サブユニットの側鎖のアミン、カルボキシ、チオールまたはヒドロキシ基を含むアミノ酸残基への共有結合を介して行うことができる。種々の従来のリンカーを、この目的のために用いても良く、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド等が挙げられる。安定なテザー構造体へ薬剤のコンジュゲーションは、未修飾の構造体の各サブユニットの活性に、有意には影響しないことが好ましい。ａ２またはｂは、安定なテザー構造体の形成前に化学的コンジュゲーションに供することができる。ａ２およびｂの両者は混合前にコンジュゲーションさせてもよい。コンジュゲーションはまた、安定なテザー構造体ａ２ｂの形成後に行うことができる。さらに細胞毒剤は、ポリマー担体に最初に結合させても良く、その後安定なテザー構造体にコンジュゲートさせる。この方法に関しては、Ryser et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3867-3870, 1978、U.S. 4,699,784および U.S. 4,046,722を参照されたい。これらは本明細書に参照により援用される。
【００９０】
本明細書記載のコンジュゲートは、抗体を脂質、炭水化物、タンパク質、放射核種または他の原子または分子と連結させることが知られている方法によって調製することができる。例えば、本明細書に記載される安定なテザー構造体は、本明細書に記載された担体（例えば、脂質、ポリマー、リポソーム、ミセルまたはナノ粒子）一つ以上と連結してコンジュゲートを形成させることができ、それから治療剤または診断剤を共有結合、非共有結合または他の結合で組み込むことができる。代わりに、本明細書に記載された安定なテザー構造体のいずれも、本明細書に記載された一つ以上の治療または診断剤と直接コンジュゲートさせることができる。
【００９１】
例えば、安定なテザー構造体は１３１Ｉで放射線標識しおよび得られたコンジュゲートがリポソームを形成できるように脂質とコンジュゲートできる。リポソームはひとつ以上の治療剤（例えば、ＦｕｄＲ−ｄＯのような薬剤）または診断剤を取り込むことができる。代わりに、担体に加えて、安定なテザー構造体は、１３１Ｉ（例えば、チロシン残基に）および薬剤（例えばリジン残基のイプシロンアミノ基）とコンジュゲートでき、また担体は追加の治療または診断剤を取り込むことができる。治療および診断剤は安定なテザー構造体のひとつ以上のサブユニットを共有結合で会合できる。
【００９２】
リポソームおよびミセルの形成法は当該技術分野では知られている。例えばWrobel and Collins, Biochimica et Biophysica Acta (1995)1235: 296-304; Lundberg et al., J. Pharm. Pharmacol. (1999), 51:1099-1105; Lundberg et al., Int. J. Pharm. (2000), 205:101-108; Lundberg, J. Pharm. Sci. (1994), 83:72-75; Xu et al., Molec. Cancer Ther. (2002), 1:337-346; Torchilin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A. (2003), 100:6039-6044; U.S. 5,565,215; U.S. 6,379,698; および U.S. 2003/0082154を参照されたい。
【００９３】
ポリマー、シリカまたは金属で形成された、薬剤送達または造影に有用である、ナノ粒子またはナノカプセルについても記述されている。West et al., Applications of Nanotechnology to Biotechnology (2000), 11:215-217; U.S. 5,620,708; U.S. 5,702,727; および U.S. 6,530,944を参照されたい。治療剤または診断剤のための標的担体を形成するために、リポソームに抗体または結合分子をコンジュゲートさせることについては、記述されている。Bendas, Biodrugs (2001), 15:215-224; Xu et al., Mol. Cancer Ther (2002), 1:337- 346; Torchilin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S. A (2003), 100:6039-6044; Bally, et al., J. Liposome Res.(1998), 8:299-335; Lundberg, Int. J. Pharm. (1994), 109:73-81; Lundberg, J. Pharm. Pharmacol. (1997), 49:16-21; Lundberg, Anti-cancer Drug Design (1998), 13: 453- 461を参照されたい。またU.S. 6,306,393; U.S. Serial No. 10/350,096; U.S. Serial No. 09/590,284, and U.S. Serial No. 60/138,284, filed June 9, 1999も参照されたい。これらは参照により本明細書に援用される。
【００９４】
広範囲の診断および治療剤が、安定なテザー構造体のコンジュゲートを形成するために使用すると有利であり、また安定なテザー構造体上の認識部位に結合するハプテンに連結してもよい。診断剤としては、放射性同位体、ＭＲＩに用いる増感剤、超音波画像解析用のコントラスト剤および蛍光化合物が挙げられる。多くの適切な造影剤が当該技術分野では知られており同様にそれらをタンパク質またはペプチドに付着させる方法（例えば、米国特許第5,021,236号および第4,472,509号、両者は参照により本明細書に援用される）も知られている。ある付着方法は、例えばタンパク質またはペプチドに付着したＤＴＰＡのような有機キレート剤の使用する金属キレート複合体の使用が関与している（米国特許第4,472,509号）。
【００９５】
安定なテザー構造体に、放射性金属または常磁性イオンを負荷させるために、放射性金属または常磁性イオンに結合するためのキレート基の多数が付着している担体とそれらを最初に反応させることが必要であろう。そのような担体としては、この目的に有用であることが知られているエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム等のキレート基と結合可能であるペンダント（pendant）鎖を有する、ポリリジン、多糖または派生したまたは派生可能なポリマー物質であり得る。キレート剤を含む担体は、凝集と免疫反応性の低下を最小化するような標準的な化学反応を用いて、安定なテザー構造体に結合している。
【００９６】
そのようなコンジュゲートを調製するために適用する、他のより通常の方法および試薬は、U.S. 4,824,659に開示されており、そのすべては参照により本明細書に援用される。特に有用な金属−キレート剤の組み合わせは、２−ベンジルーＤＴＰＡとそのモノメチルおよびシクロヘキシルアナログであって、一般エネルギー範囲が６０から４，０００ＫｅＶにおいて、診断用同位体とともに用いられる。有用な診断核種の幾つかとしては、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、または１１１Ｉｎが挙げられる。マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属との同じキレート剤による複合体は、安定なテザー構造体および本明細書に記載された担体と共に用いられた時は、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ，ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレート剤は、種々の金属、放射性金属、特にガリウム、イットリウムおよび銅の核種と共にそれぞれ使用される。そのような金属キレート剤複合体は、対象となる金属に環のサイズを合わせることにより、非常に安定にすることができる。２２３Ｒａとの複合体を形成するために、他の環状キレート剤、例えば大環ポリエステルを使用できる。
【００９７】
治療剤としては、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィルトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗血管新生剤およびアポトーシス促進剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソル、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、のような化学療法剤、およびその他のこのまたは他のクラスの抗癌剤等が挙げられる。他の癌化学療法薬としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルフォネート、ニトロソウレア、トリアゼン類、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、プラチナ配位錯体、ホルモン等が挙げられる。適切な化学療法剤は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995), and in GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、およびこれらの公表書の改訂版に記載されている。実験的な薬剤のような、他の適切な化学療法剤は、当業者には知られており、当該技術分野で知られた方法を用いて、本明細書に記載された安定なテザー構造体とコンジュゲートすることができる。
【００９８】
他のクラスの治療剤は、α−粒子を放射する核種（２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ）、β−粒子を放射する核種（３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ５、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ）またはオージェ電子を放射する核種（１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇ））より成る。安定なテザー構造体を、上記の核種のひとつ以上を用いて、診断剤について記載した方法を用いて標識してもよい。
【００９９】
検出可能な標識（例えば蛍光分子）または細胞毒剤（例えば放射性ヨウ素）を含む適切なペプチドは、共有結合、非共有結合または他の結合で安定なテザー構造体と会合することができる。例えば、治療的に有用なコンジュゲートは、安定なテザー構造体に光活性剤または色素を取り込ませることによって得ることができる。可視光線に感受性を有する、蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、ポルフィリンのような色素は、適切な光を病変部に導くことにより、病変部を検出しおよび治療するために用いられてきた。治療においては、これは光放射、光療法または光線力学的療法と呼ばれてきた。Jori et al. (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain (1986), 22:430を参照のこと。さらにものクローン抗体を、光療法を達成するために、光活性化色素と結合させた。Mew et al., J. Immunol. (1983),130:1473; idem., Cancer Res. (1985), 45:4380; Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 83:8744; idem., Photochem. Photobiol. (1987), 46:83; Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. (1989), 288:471; Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. (1989), 9:422; Pelegrin et al., Cancer (1991), 67:2529を参照。内視鏡または腹腔鏡への応用も考慮された。検出および治療へ内視鏡を用いる方法は、U.S. 4,932,412; U.S. 5,525,338; U.S. 5,716,595; U.S. 5,736,119; U.S. 5,922,302; U.S. 6,096,289; and U.S. 6,387,350に記載されており、そのすべては参照により本明細書に援用される。
【０１００】
治療剤
薬剤組成物
ある実施態様では、安定なテザー構造体および／あるいはひとつ以上の治療剤を、癌を有する被験体のような被験体に投与してもよい。そのような薬剤は薬剤組成物の形で投与してもよい。一般的にこれは、ヒトまたは動物に有害であるかも知れない不純物が本質的に存在しない組成物を調製することを伴う。当業者ならば、薬剤組成物を例えば経口的または静脈内投与のような非経口的経路を含む種々の経路により被験体に投与することができることを知っているであろう。
【０１０１】
ある特定の実施態様では、治療剤の有効量を被験体に投与しなければならない。“有効量”とは、欲する効果を生じさせる薬剤の量を言う。有効量は、例えば、薬剤の有効性および意図する効果に依存するであろう。例えば、固形癌を減少あるいは除去し、その転移を阻止または減少させるために癌治療に必要とする量に比較して、黄斑変性症や子宮内膜症のような過形成状態の治療に必要とする抗血管新生剤の量はより少なくてもよい。ある特定の薬剤の特定の目的のための有効量は、当業者には良く知られた方法を用いて決定することができる。
【０１０２】
化学療法剤
ある特定の実施態様では、化学療法剤を投与できる。有用な抗癌化学療法剤としては、これらに限られるわけではないが、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドクソルビシン、エストロゲンレセプター結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、メトトレキセート、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性型）、トランスプラチナ、ビンブラスチン、およびメトトレキセート、ビンクリスチンまたはこれらのアナログまたは派生変異物が挙げられる。感染性微生物に対して有用な化学療法剤としては、これらに限定されるわけではないが、アシクロビル、アルベンダゾール、アマンタジン、アミカシン、アモキシリン、アンフォテリシンＢ、アンピシリン、アズトレオナム、アジトロマイシン、バシトラシン、バクトリム、バトラフェン（Batrafen（登録商標））、ビフォナゾール、カルベニシリン、カスポファンジン、セファクロール、セファゾリン、セファロスポリン、セフェピム、セフトリアキソン、セフォタキシム、クロラムフェニコール、シドフォビル、シプロ（登録商標）、クラリスロマイシン、クラブラン酸、クロトリマゾール、クロキサシリン、ドキシサイクリン、エコナゾール、エリスロサイクリン、エリスロマイシン、フラジル、フルコナゾール、フルシトシン、フォスカルネット、フラゾリドン、ガンシクロビル、ゲンタマイシン、イミペネム、イソニアジド、イトラコナゾール、カナマイシン、ケトコナゾール、リンコマイシン、リネゾリド、メロペネム、ミコナゾール、ミノサイクリン、ナフチフィン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ナイスタチン、オセルタミビル、オキサシリン、パラモマイシン、ペニシリン、ペンタミジン、ピペラシリン−タゾバクタム、リファブチン、リファンピン、リマンタジン、ストレプトマイシン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、テトラサイクリン、チオコナゾール、トブラマイシン、トルシクレート、トルナフテート、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、バラシクロビル、バンコマイシン、ザナミールおよびジスロマイシンが挙られる。
【０１０３】
化学療法剤および投与方法、用量その他は当業者には良く知られている（"Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics" および in "Remington's Pharmaceutical Sciences"を参照。本明細書には関連した部分は参照により本明細書に援用される）。治療を受ける対象の状態に依存して用量における変動が必然的に起こるであろう。いずれにせよ、投与責任者が個々の被験体に対する適切な用量を決定する。
【０１０４】
ホルモン
コルチコステロイドホルモンは、他の化学療法剤の有効性を増加させることができ、組み合わせ療法にしばしば用いられる。プレドニソンとデキサメタゾンはコルチコステロイドホルモンの例である。カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲステロールのようなプロゲスチンは、子宮内膜および乳癌に用いられてきた。ジエチルスチルベステロールおよびエチニルエストラジオールのようなエストロゲンは、前立腺癌のような癌に用いられてきた。タモキシフェンのような抗エストロゲンは乳癌のような癌に用いられてきた。プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンのようなアンドロゲンは、乳癌の治療において使用されてきた。
【０１０５】
血管新生阻害剤
ある特定の実施態様では、アンギオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＩＧＦペプチドおよび抗体、抗血管増殖因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポエチン−２、インターフェロンアルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニスタイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第四因子およびミノサイクリン、を用いることができる。
【０１０６】
免疫調節物質
本明細書では、“免疫調節物質”という用語は、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロン（例えばインターフェロンーα、−β、−γ）および“Ｓ１因子”と呼ばれる幹細胞増殖因子のようなサイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、および造血因子を含む。適切な免疫調節物質成分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンーガンマ、ＴＮＦ−アルファ等が挙げられる。
【０１０７】
“サイトカイン”という用語は、細胞間媒介物として他の細胞に作用するひとつの細胞群によって放出されるタンパク質およびペプチドの一般名である。本明細書で広く用いられるものとして、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、増殖因子および従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、および牛成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵細胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモンのような糖タンパク質ホルモン；肝細胞増殖因子；プロスタグランジン、繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよびβ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのような形質転換増殖因子；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒細胞−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒細胞−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、のようなインターロイキン、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴが挙げられる。本明細書では、サイトカインという用語は、天然源、または組み換え細胞培養から得られたタンパク質および天然配列の生物活性同等物を含む。
【０１０８】
ケモカインは一般的に、ケモカイン発現の場所へ免疫エフェクター細胞を動員する化学誘引物質として作用する。ケモカインとしては、これに限定されないが、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰｌ−α、ＭＩＰｌ−βおよびＩＰ−１０が挙げられる。当業者には、ある特定のサイトカインが、化学誘引作用を有することが知られており、ケモカインの用語の下に分類可能であることを認識するであろう。同様に、免疫調節物質およびサイトカインはそれぞれのメンバーが重なっている。
【０１０９】
放射性同位体療法および放射性免疫療法
ある実施態様では、ペオチドおよび／またはタンパク質は放射性核種療法または放射性免疫療法では有用であるかも知れない。（例えば、以下を参照：Govindan et al., 2005, Technology in Cancer Research & Treatment, 4:375-91; Sharkey and Goldenberg, 2005, J. Nucl. Med. 46:115S-127S; Goldenberg et al. ( J Clin Oncol 2006; 24:823-834), "Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy," それぞれは参照により本明細書に援用される）。具体的な実施態様では、安定なテザー構造体を、有用な放射性同位体と直接結び付けて、被験体に投与できる。別の実施態様では、放射性同位体を上記のような、プレターゲット法で投与することができる。すなわち放射線標識化されたハプテンペプチドまたはリガンドを用いて、疾患組織において発現が上昇している部位に局在化する二重特異的な安定なテザー構造体を投与した後に、投与する方法である。
【０１１０】
疾患組織を治療するために有用である放射性同位体としては、これらに限定されないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。治療用の放射線核種は、好ましくは、崩壊エネルギーが２０から６０００ｋｅＶの範囲にあり、オージェ放射体に関しては、６０から２００ｋｅＶ、ベータ放射体に関しては、１００〜２，５００ｋｅＶおよびアルファ放射体に関しては、４，０００から６，０００ｋｅＶの範囲であるのか好ましい。有用なベータ粒子放射核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは、２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは、１００〜４，０００ｋｅＶおよび最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。実質的にオージェ放射粒子で崩壊する核種もまた好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−Ｉｌｌ、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。実質的にアルファ粒子を生成して崩壊する放射核種もまた好ましい。そのような核種としては、これらに限られないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なアルファ粒子放射核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００−７，０００ｋｅＶである。
【０１１１】
例えば、６７Ｃｕは、その６１．５時間の半減期およびベータ粒子とガンマ線を豊富に供給することから、放射性免疫療法のためのより有望な核種の一つと考えられており、キレート剤ｐ−ブロモアセタミド−ベンジルテトラエチルアミン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いてタンパク質やペプチドとコンジュゲートさせることができる。代わりに、強力なベータ粒子ｗｐ放射する９０Ｙは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、ペプチド、抗体、融合タンパク質またはその断片と結合させることができる。
【０１１２】
更なる潜在的に有用な放射性核種としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂ等が挙げられる。
【０１１３】
他の実施態様では、放射線増感剤を用いることができる。放射線増感剤を加えると、有効性の増加が得られる。放射線増感剤は、D. M. Goldenberg (ed.), CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995)に記載されており、そのすべては参照により本明細書に援用される。
【０１１４】
熱中性子捕捉療法のための、ホウ素追加担体を有する安定したテザー構造体は、通常同様にして効率を良くする。しかしながら、中性子照射の前に標的ではない免疫コンジュゲートが浄化するまで待ったほうが、有利であろう。浄化は、リガンドに結合する抗体を用いて加速することができる。この一般的な原理の説明については、米国特許第4,624,846号を参照。カルボランのようなホウ素追加体を抗体に結合できる。カルボランは、当該技術分野では良く知られているように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。カルボランの、アミノデキストランのような担体への結合は、カルボランのカルボキシル基を活性化および担体上のアミンと縮合させることによって達成できる。コンジュゲートの中間体は、その後抗体にコンジュゲートされる。コンジュゲートの投与後、追加ホウ素は熱中性子放射によって活性化され、放射性原子に変換し、それらがアルファ放射によって崩壊し、非常に毒性の強い、狭い範囲での効果を生み出す。
キット
【０１１５】
種々の実施態様は、患者の疾患組織を治療または診断するのに適した成分を含むキットに関する。代表的なキットは、少なくとも一つの安定なテザー構造体を含むことができる。もし成分を含む投与のための組成物が、経口による送達のような、消化管を介しての送達用に製剤されていない場合、そのキットの成分を他の経路を介して送達することを可能にするような用具を含むことができる。非経口的な送達のような適用のための用具の一つのタイプは、組成物を対象の体内へ注入するために用いる注射器である。吸入用の器具もまた使用できる。
【０１１６】
キットの成分は、一緒に包装されても、または二つ以上の別の容器に分離してもよい。ある実施態様では、容器は再構成するのに適した組成物の無菌の凍結乾燥された製剤を含むバイアルであってもよい。キットはまた、他の試薬の再構成および／または希釈に適した1つ以上のバッファーを含んでもよい。使用してもよい容器としては、これに限定されないが、小袋、トレイ、箱、管等が挙げられる。キットの成分は容器の中で無菌的に包装され、保持されてもよい。含まれてもよい他の成分としては、そのキットを使用する人に対してその使用に関する指示書であってもよい。
製剤および投与
【０１１７】
安定したテザー構造体を、そのコンジュゲートを含めて、一つ以上の薬剤として適切な賦形剤、一つ以上の成分またはこれらのある組み合わせを含む組成物を得るために更に製剤化できる。これは、医薬的に有用な製剤を調製するための既知の方法によって達成することができ、その方法によって、活性成分（すなわち安定なテザー構造体またはコンジュゲート）は、一つ以上の医薬的に適切な賦形剤との混合状態で組み合わされる。無菌リン酸緩衝食塩水が、医薬的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者には良く知られている。例えばAnsel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)およびGennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990)、およびそれの改訂版を参照されたい。
【０１１８】
本明細書記載の組成物の好ましい投与経路は非経口的注入である。非経口的投与では、医薬的に受容できる賦形剤を伴って、溶液剤、懸濁剤あるいは乳剤のような注入可能な単位用量に組成物を製剤化する。そのような賦形剤は、本質的に無毒でありまた治療剤ではない。そのような賦形剤の例としては、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液およびハンクス液である。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性賦形剤もまた使用できる。好ましい賦形剤は食塩水中の５％ブドウ糖である。賦形剤は、バッファーや保存剤を含む、等張性および化学的安定性を増加させる物質のような、添加物を少量含むことができる。経口投与を含む投与の他の方法も、考慮に入れる。
【０１１９】
安定なテザー構造体を含む、製剤された組成物を、例えばボーラス（bolus）注射または連続的点滴を介して静脈内投与に用いることができる。注射用の組成物を、例えば添加された保存剤を伴ってアンプルまたは多用量容器に、単位用量剤形で提供できる。組成物はまた、油性のまたは水性の媒体中の懸濁液、溶液または乳液の形で提供でき、懸濁剤、安定剤および／あるいは分散剤のような製剤のための物質を含むこともできる。その代わりに、無菌の発熱物質を含まない水のような適切な媒体で使用前に調製するための粉末の形態であることもできる。
【０１２０】
組成物は溶液として投与してもよい。溶液のｐＨはｐＨ５から９．５の範囲であるべきで、好ましくはｐＨ６．５から７．５である。その製剤は、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンー塩酸またはクエン酸等のような、医薬的に受容できるバッファーを有する溶液中に存在するべきである。バッファー濃度は、１から１００ｍＭの範囲にあるべきである。製剤の溶液はまた、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩を、５０から１５０ｍＭの濃度で含むことができる。グリセロール、アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩のような安定剤の有効量をまた含むことができる。製剤組成物の全身投与は、安定なテザー構造体に関する鋳型としてヒト化抗体を用いた場合、典型的には２から３日毎に、もしくは週に１回行われる。代わりに、毎日投与も有用である。通常、投与は筋肉内注射または静脈内点滴による。
【０１２１】
組成物は、哺乳動物に、皮下または他の経口経路によって投与できる。更に、投与は、連続的な点滴または単回の又は複数回のボーラス投与によってもよい。抗体または免疫コンジュゲートにとって有用な方法は、本明細書に記載された組成物に適用できる。一般的に、投与された免疫コンジュゲート、融合タンパク質またはヒトに関する裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的な医学的状態および過去の病歴のような因子に依存して変異する。典型的には、受容者に、単回静脈内点滴として、約１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの範囲で、活性成分の用量を提供するのが望ましいが、状況によっては更に低いまたは高い容量をも投与できる。この用量を、例えば、週に1回４−１０週間、好ましくは週に１回８週間および更に好ましくは週に１回４週間、必要に応じて繰り返すことができる。２週間毎に数ヶ月のように、より少ない頻度で投与できる。製剤を、投与用量と投与計画の適切な調節を伴って、種々の非経口経路を通して、与えることができる。
【０１２２】
免疫コンジュゲートまたは抗体の作用の期間を制御するために用いられる医薬的方法を、本明細書に記載された製剤化された組成物に対して、応用できる。徐放性調製物は、免疫コンジュゲートまたは裸の抗体と複合体を形成するまたは吸着する、生体適合性ポリマーの使用を通じて達成できる。そのポリマーの例としては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ無水コポリマーのマトリックスが挙げられる。Sherwood et al., Bio/Technology (1992), 10: 1446を参照のこと。そのようなマトリックスからの免疫コンジュゲートまたは抗体の放出の速度は、免疫コンジュゲートまたは抗体の分子量、マトリックス内の免疫コンジュゲートまたは抗体の量および分散する粒子のサイズに依存する。Saltzman ら, Biophys. J (1989), 55: 163; Sherwood ら, 同上を参照。他の固形剤形については、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), および Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), およびそれらの改定版に記載されている。
【０１２３】
治療の目的で、本組成物は哺乳動物に治療有効量投与される。本明細書に開示される、治療および診断に適した被験体は、通常ヒトであるが、ヒト以外の動物被験体もまた考慮される。
【０１２４】
本明細書に開示された安定なテザー構造体は、自己免疫障害の治療の方法において特に有用であって、“Ｂ細胞を標的とする抗体を用いた自己免疫障害の免疫療法”と題する２０００年6月９日に出願された、未決定のU.S. Serial No. 09/590,284に開示され、そのすべては参照により援用される。そのような結合構造を含む組成物は、静脈内または筋肉内に、２０−５０００ｍｇの用量を投与するのが好ましい。投与は、鼻腔内または他の非経皮的経路で行われても良い。組成物を、微粒子、リポソームまたは血液を含む特定の組織に置かれた他の微細粒子送達システムを介しても投与できる。
【０１２５】
組成物を、肺への局所的送達を達成するために、アエロゾルによって投与できる。水性アエロゾルまたは非水性（例えばフッ化炭素噴霧剤）懸濁液を用いることができる。分解と失活を引き起こす、組成物中の安定なテザー構造体を剪断力にさらすことを最小にするために、アエロゾルの調製において超音波噴霧器は好ましくは使用される。
【０１２６】
一般的に投与用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、総合的な医学的状態および過去の病歴のような因子に依存して変異するであろう。安定なテザー構造体の飽和用量が患者に投与されることが好ましい。
【０１２７】
典型的には、受容者に安定テザー構造体を、約５０から５００ミリグラムの範囲の用量で提供することが望ましいが、状況によっては、より低いまたは高い用量を投与してもよい。用量の例としては、投与量あたり２０から１５００ミリグラムタンパク質、２０から５００ミリグラムタンパク質、２０から１００ミリグラムタンパク質、２０から１０００ミリグラムタンパク質、１００から１５００ミリグラムタンパク質が挙げられる。組成物が放射性核種を含む場合の実施態様では、用量はミリキュリーで測ってもよい。９０Ｙの場合、用量は、１５および４０ｍＣｉ、１０および３０ｍＣｉ、２０および３０ｍＣｉまたは１０および２０mＣｉの間であり得る。
【０１２８】
放射性核種に連結した安定なテザー構造体は、微生物治療法に関して特に有効である。安定なテザー構造体が、被験体の一つ以上の感染部位に局在化していることが判明した後、標識化合物の高用量、１３１Ｉについては２０ｍＣｉから１５０ｍＣｉ、９０Ｙについては５ｍＣｉから３０ｍＣｉ、１８６Ｒｅに関しては５ｍＣｉから２０ｍＣｉの用量を、一般的に７０ｋｇの体重の患者に注射する。注射は、静脈内、動脈内、リンパ内、くも膜下腔内、腹腔内注射であり、また繰り返すことができる。幾つかの治療法については、多回、分割した用量を用いる利点があり、このようにしてより微生物に対する高い毒性を、通常の正常組織への比例的に増加する放射線の影響無しで与える。
【０１２９】
化学療法剤、抗微生物剤、サイトカイン、顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒細胞マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン等、安定なテザー構造体に化学的に結合していないものは、組成物の投与前、中または後、投与できる。その代わりに、そのような薬剤を安定なテザー構造体に付着してもよい。
【０１３０】
ａ２ｂ構造の安定なテザー構造体は、プレターゲット剤として特に適している。代表的な構造体は、標的組織または細胞に二価で結合するａ２として、二つのｓｃＦｖまたはＦａｂサブユニット、およびハプテンと結合するｂとして一つのｓｃＦｖまたはＦａｂから構成される。そのような二重特異的、三価の構造体は最初に被験体に投与され、場合によっては次いで浄化剤、次いで診断のためには検出可能な標識または治療法のための治療剤のような機能剤と、ハプテンが結合している薬剤が投与される。当業者は、二重特異性抗体を用いる他の既知の方法もまた安定なテザー構造体を用いて実施できることに気づくであろう。抗体に基づく薬剤が診断および治療のために用られてきた本質的にいかなる環境下でも、診断および治療のこれら方法を利用できる。
【０１３１】
治療および診断のための使用：プレターゲット法が関与しない応用
安定なテザー構造体は、それらのコンジュゲートを含め、抗体または免疫コンジュゲートを使用するが、プレターゲット法を必要としない広範囲の種々な診断および治療応用において、使用するのに適している。例えば、三価の構造体は、「裸（naked）」の構築物として、すなわちそのような構造体が更なる機能剤とコンジュゲートしていない実施態様では、裸の抗体を用いる治療法と同じ様式で、治療に用いることができる。その代わりに、安定なテザー構造体は、診断および治療応用を可能にするために、一つ以上の機能剤とともに誘導体を形成することができる。追加の剤は上記のように、安定なテザー構造体に共有結合できる。
【０１３２】
更に、安定なテザー構造体に連結した放射性および非放射性診断剤の使用も考慮される。適切な非放射性診断剤としては、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影、または超音波に使用されるものである。ＭＲＩ剤としては、例えば、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属が挙げられ、それらは、２−ベンジル−ＤＴＰＡおよびそのモノメチルおよびシクロヘキシルアナログのような適切なキレート剤と複合体を形成する。2001年10月10日出願のU.S. Serial No. 09/921,290 filed on October 10, 2001を参照。そのすべては参照により援用される。
【０１３３】
安定テザー構造体は、診断画像法に有用な放射性同位体を用いて標識しても良い。適切な放射性同位体としてはエネルギー範囲が６０から４，０００ＫｅＶの範囲にあるものが挙げられ、より特定すれば、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、４５Ｔｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ等またはこれらの組み合わせである。「ガリウム-68を用いる標的標識剤」と題する発明者 G.L.Griffiths and WJ. McBrideの米国特許出願及び米国仮出願No. 60/342,104, は画像法のための１８Ｆ、６８Ｇａ、９４ｍＴｃ等のようなポジトロン放射物を開示している。これらすべては参照により援用される。検出は、例えば、単一光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）によって行うことができる。潜在している新生腫瘍を同定するための術中診断にも応用できる。
【０１３４】
他の実施態様では、安定テザー構造体は、腫瘍性のまたは他の急速分裂細胞を殺すために有用である一つ以上の放射性同位体で標識しても良く、それらはβ−放射物（例えば３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６６Ｄｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ）、オージェ電子放射物（例えば１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、６７Ｇａ、１９１Ｏｓ、１９３ｍＰｔ、１９５ｍＰｔ、１９５ｍＨｇ）、α−放射物（例えば２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ）またはこれらの組み合わせである。
【０１３５】
安定したテザー構造体は、一つ以上の増感剤と結合してＭＲＩのために用いても良く、増感剤としてはクロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジミウム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）からなる群から選択される金属の錯体が挙げられる。同様に、安定なテザー構造体は、現在市販されている一つ以上の増感剤と連結することにより、超音波画像法に用いることができる。米国特許6,331,175号はＭＲＩ技術およびＭＲＩ増感剤とコンジュゲートした抗体の調製について記載しており、そのすべては参照により援用される。
【０１３６】
毒素のような機能タンパク質は、安定なテザー構造体に幾つかの方法で存在することができる。例えば、機能タンパク質は、ＤＤＤ２またはＡＤ２と融合することにより、二成分複合体のどちらかの成分の前駆体として作用することができ、それはその後、例えばＦａｂ／ＡＤ２またはＦａｂ／ＤＤＤ２から構成される標的実体とそれぞれ組み合わされる。その代わりに、機能タンパク質は、Ａの前駆体として作用するために標的構造体と融合することができ、得られたＡは場合によっては適切なＢと対になる。この点で使用しても良い毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（gelonin）、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素が挙げられる。（Pastan. ら, Cell (1986), 47:641, and Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians (1994), 44:43を参照）。本明細書において使用するのに適切な更なる毒素は、当業者には知られており、米国特許第6,077,499号に開示されており、そのすべては参照により援用される。興味の対象となる他の機能タンパク質としては、種々のサイトカイン、血栓溶解剤、酵素および蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１３７】
更に提供される物は、上記の「裸」の安定なテザー結合構造体を対象へ投与することによって、対象の腫瘍による障害を治療する方法であって、抗原結合部位の少なくとも一つが、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、アルファフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に対する特異的抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原Ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸レセプター、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン様増殖因子、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１、ＫＳ１−４、Ｌｅ（Ｙ）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、壊死抗原、ｐ５３により結合された抗原、ＰＡＭ−４抗体、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｗ抗原、腫瘍壊死抗原、テナスシン、ＴＲＡＩＬレセプター、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＶＥＧＦ、１７−１Ａ−抗原、血管新生マーカー、発癌遺伝子マーカーまたは発癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原と結合する、方法である。ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２のようなＴＲＡＩＬレセプターに対する抗体は、当該技術分野では良く知られている。（例えばGeorgakis et al., Br. J. Haematol. 2005, 130:501-510; Mori et al., FEBS Lett. 2005, 579:5379-84を参照）。そのような抗体または断片は、単独でまたは抗ＴＡＡ抗体と組み合わせて、癌の治療に用いることができる。
【０１３８】
腫瘍障害は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病および黒色肉腫からなる群から選択できる。標的としてもよい腫瘍の代表的なものとしては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、胆道癌、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道、胃、頭部、首の癌、ホジキンリンパ腫、肺癌、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、すい臓癌、神経膠腫、黒色肉腫、肝癌、前立腺癌および膀胱癌、が挙げられる。
【０１３９】
更に提供されるのは、被験体におけるＢ細胞癌またはＢ細胞免疫または自己免疫障害の治療法であって、上記の安定なテザー結合構造体を含む治療用の組成物の一以上の用量と医薬的に許容できる担体を対象に投与することを含み、各抗原結合部位はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＩＬ−１７の異なるエピトープに結合する方法である。該治療用組成物を、一用量あたり２０から１５００ミリグラムタンパク質、２０から５００ミリグラムタンパク質または２０から１００ミリグラムタンパク質を非経口的に投与できる。被験体はまた、一用量あたり、２０から１００ミリグラムタンパク質または２０から１５００ミリグラムタンパク質の繰り返し非経口投与を受けてもよい。これらの方法では、結合構造体のサブフラクションを、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはこれらの組み合わせで標識化できる。
【０１４０】
更に提供されるのは、被験体におけるＢ細胞癌またはＢ細胞免疫または自己免疫障害の検出または診断法であって、各抗原結合部位がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＩＬ−１７の異なるエピトープに結合する安定なテザー結合構造体、医薬的に許容される担体、および１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、４５Ｔｉおよび１８８Ｒｅまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される核種を含む診断用組成物を対象に投与することにより行われる方法である。検出は上記のようにＳＰＥＣＴまたはＰＥＴに行う。潜在している新生腫瘍を同定するための術中診断にも応用できる。
【０１４１】
更に提供されるのは、被験体のＢ細胞癌またはＢ細胞免疫または自己免疫障害の検出または診断法であって、各抗原結合部位がＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＩＬ−１７の異なるエピトープに結合する安定したテザー結合構造体、医薬的に許容される担体および一以上の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用するための増感剤を含む診断用組成物を対象に投与することにより行われる方法である。増感剤を上記の物から選択できる。
【０１４２】
更に提供されるのは、非腫瘍性疾患または障害を診断および／または治療する方法であって、疾患または障害を有する被験体に、検出可能な標識または治療剤が付着しており、また一以上の抗原結合部位が疾患または障害のマーカー物質に特異的である安定なテザー結合構造体を投与することにより行われる、方法である。該疾患または障害は、小胞菌（Microsporum）、白癬菌（Trichophyton）、表皮菌（Epidermophyton）、スポルトリクス（Sporothrix schenckii）、Cryptococcus neoformans、Coccidioides immitis、Histoplasma capsulatum、Blastomyces dermatitidis または Candida albicanのような真菌類、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体ウイルス、マウス乳腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、ルベラウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エップスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスまたはブルータングウイルスのようなウイルスによって引き起こされ得る。
【０１４３】
該疾患または障害は、炭疽菌（Anthrax bacillus）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、レジオネラ肺炎菌（Legionella pneumophilia）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎双球菌（Pneumococcus）、インフルエンザ菌Ｂ（Hemophilis influenzae B）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ（Lyme disease spirochetes）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）またはマイコプラズマのようなバクテリアによって引き起こされ得る。
【０１４４】
該疾患または障害は、急性突発性血小板減少性紫斑病、慢性突発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、若年性糖尿病、Henoch-Schonlein紫斑病、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、Goodpasture症候群、血栓性血管炎（thromboangitisubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、Wegener肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬または線維化肺胞炎、のような自己免疫疾患であり得る。
【０１４５】
該疾患または障害は、心筋梗塞、虚血性心疾患、粥状硬化プラク、移殖拒絶またはアルツハイマー病またはアトピー性の組織によって起こされたものであり得る。該疾患または障害は、感染病原体によって引き起こされた炎症部位における活性化された顆粒細胞、単球、リンパ細胞またはマクロファージに癒着によって起こされた炎症でであり得る。
【０１４６】
更に特定のレセプターを発現または過剰発現する細胞は、安定なテザー構造体のＡまたはＢ成分が該レセプターに対するリガンドを含んでおり、そのリガンドがレセプターを有する細胞へ安定なテザー構造体を結合させる場合、安定なテザー構造体の標的となり得る。治療または診断剤を該構造体のサブユニットに融合またはコンジュゲートさせて、診断および治療方法に用いることができる。
【０１４７】
治療および診断のための使用：プレターゲット法を含む応用
プレターゲット法は、直接に標的を定める抗体の緩慢な血中クリアランスを解決するために本来開発された多段階の工程であり、正常組織、特に骨髄への望ましくない毒性に対して効果がある。プレターゲット法により、放射性核種あるいは他の治療剤は、血液から数分以内に除去される低分子化合物に結合する。標的抗原ならびに低分子放射性標識化合物を認識し得るプレターゲット剤が最初に投与され、プレターゲット剤が血液から十分に除去された時に該放射性標識化合物を遅らせて投与する。
【０１４８】
プレターゲット法が開発され、検出または治療剤の標的：バックグラウンド比は増加している。プレターゲット法およびビオチン／アビジン比のアプローチの例として、例えばGoodwinら、米国特許4,863,713号；Goodwinら、J．Nucl．Med．29：226、1988年；Hnatowichら、J．Nucl．Med．28：1294、1987年；Oehrら、J．Nucl．Mｅd．、29：728、1988年；Klibanovら、J．Nucl．Med．、29：1951、1988年；Sinitsynら、J．Nucl．Med．、30：66、1989年；Kalofonosら、J．Nucl．Med．、31：1791、1990年；Schechterら、Int．J．Cancer、48：167、1991年、Paganelliら、Cancer Res．、51：5960、1991年；Paganelliら、Nucl．Med．Commun．12：211、1991年；米国特許5,256，39５号；Stickneyら、Cancer Res．51：6650、1991年、；Yuanら、Cancer Res. 51:3119, 1991年；米国特許6,077,499号；米国特許出願09/597,580号；米国特許出願10/361,026号；米国特許出願09/337,756号；米国特許出願09/823,746号；米国特許出願10/116,116号；米国特許出願09/382,186号；米国特許出願10/150,654号；米国特許6,090,381号；米国特許6,472,511号；米国特許出願10/114,315号；米国仮出願60/386，41１号；米国仮出願60/345,641号；米国仮出願60/3328,835号；米国仮出願60/426,379号；米国特許出願09/823,746号；米国特許出願09/337,756号；米国仮出願60/342，103号；および米国特許6,962,702号に記載されており、これらすべては参照により本明細書に援用される。
【０１４９】
具体的で、限定的でない一例では、安定なテザー構造体に基づくプレターゲット剤は、ＣＥＡに特異的である２つの同一の腫瘍抗原結合部位を含み、第三結合部位はハプテンであるヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）に特異的である。他の実施態様では、異なる腫瘍関連抗原が同一のあるいは異なるハプテンによって標的にされることもある。
【０１５０】
プレターゲットの応用のために、標的に成り得る薬剤は、リポソーム脂質膜の外表面に共有結合している二価のＨＳＧペプチドを有するリポソームであってもよい。該リポソームはガスで充填されていてもよい。
【０１５１】
被験体における疾患または障害を治療または診断するプレターゲット法を以下によって用意する。：（１）上記の二重特異性三価結合構造体を被験体に投与すること。この場合、２つの二量体抗原結合部位はマーカー物質、あるいは疾患に特異的なマーカー物質に向けられており、他の抗原結合部位は二価のハプテンを含む標的に成り得る構築物に向けられている；（２）場合により除去成分を被験体に投与し、該成分が結合構造体を循環から除去すること；および（３）二価のハプテンを含む標的に成り得る構築物を被験体に投与すること。この場合、標的に成り得る構築物はさらに、一種以上のキレートされたあるいは化学結合した治療または診断薬を含んでいる。疾患または障害は上記のものであってよい。
【０１５２】
抗体依存性酵素プロドラッグ療法（antibody dependent enzyme prodrug therapy：ＡＤＥＰＴ）の方法もまた、以下によって用意する。：（１）上記の結合構造体を、腫瘍性疾患の患者に投与する。この場合、該構造体は、プロドラッグを活性化させ得る共有結合した酵素を含む；（２）場合により除去成分を被験体に投与し、該成分が結合構造体を循環から除去すること；および（３）プロドラッグを患者に投与すること。
【０１５３】
付加的使用
一般的に、安定なテザー構造体は、癌または非癌疾患に効力のある抗体ベースの薬剤と代替してもよい。放射性同位体、薬物および毒素は、癌細胞によりあるいは結合して産生されるマーカーに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントとコンジュゲートし得ること、ならびにこのような抗体コンジュゲートを使用して、腫瘍部位を放射性同位体、薬物、あるいは毒素の標的にすることができ、治療効果を高め、副作用を最小限にすることは周知である。これらの薬剤および方法の例は、Wawrzynczak and Thorpe（Cellular and Molecular Biology of Cancer、L．M．Franks及びN．M．Teich編、第18章、pp．378-410、オックスフォード大学出版、オックスフォード、1986年）、Immunoconjugates．Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer（C．W．Vogel編、3-300、オックスフォード大学出版、N．Y．、1987年）およびDillman、R.O.（CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1：357、ＣＲＣ出版社、1984年）において再考されている。また、Pastanら、Cell（1986年）、47：641；Vitettaら、Science（1987年）、238：1098-1104；及びBradyら、Int．J．Rad．Oncol．Biol．Phys．（1987年）、13：1535-1544を参照されたい。
【０１５４】
特定の実施態様では、安定なテザー多価の構造体を、正常または病変組織および器官を治療および／または造影する場合に使用でき、例えば米国特許6,126,916号；6，077,499号；6,010,680号；5,776,095号；5,776,094号；5,776,093号；5,772,981号；5,753,206号；5,746，996号；5,697,902号；5,328,679号；5,128，119号；5,101,827号；および4,735,210号記載の方法を使用しており、各々は参照により本明細書に援用される。その他の方法は、米国出願09/337,756号1999年6月22日出願および米国出願09/823,746号2001年4月3日出願に記載されている。このような造影は、安定なテザー構造体の直接的な標識化によって、あるいはGoldenbergら「Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radiotherapy」（印刷中、J．Clin．Oncol．）記載のプレターゲット造影法によって行うことが可能であり、米国特許20050002945号、20040018557号、20030148409号および20050014207号も参照されたい。各々は参照により本明細書に援用される。
【０１５５】
癌に対する免疫コンジュゲートおよび他の治療形態の使用のその他の例が、とりわけ以下の米国特許：4,331,647号、4,348,376号、4,361,544号、4,468,457号、4,444，744号、4,460,459号、4,460,561号、4,624,846号、4,818,709号、4，046，722号、4,671,958号、4,046,784号、5,332,567号、5,443,953号、5,541,297号、5,601,825号、5,635,603号、5,637,288号、5,677,427号、5,686,578号、5,698,178号、5,789,554号、5,922,302号、6,187,287号および6,319,500号に開示されている。これらの方法は、改変抗体および既往の方法の抗体を本安定なテザー構造体で置換することによって、本明細書に開示された方法にも適用できる。
【０１５６】
いくつかの実施態様では、本明細書において開示および請求した、安定なテザー構造体は放射性核種療法または放射免疫治療法に使用できる（例えばGovindanら、2005年、Technology in Cancer Research＆Treatment、4：375-91；Sharkｅｙ及びGoldenberg、2005年、J．Nucl．Med．46：115Ｓ-127S；Goｌdenbergら（印刷中、J．Clin．Oncol．）、「Antibody Pretargeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy」を参照されたい。各々は参照により本明細書に援用される）。
【０１５７】
別の実施態様では、放射線増感剤は、裸のまたはコンジュゲートさせた安定なテザー構造体、抗体あるいは抗体フラグメントと組み合わせて使用できる。例えば、該放射線増感剤は、放射性標識化した安定なテザー構造体と組み合わせて使用できる。放射線増感剤を添加すると結果として、放射性標識化した安定なテザー構造体のみで治療した時と比較して効力は高められ得る。放射線増感剤は、D．M．Goldenberg（編）、CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES、CRC Press（1995年）に記載されており、全体が参照により本明細書に援用される。
【０１５８】
請求された方法のいずれかで使用されるための安定なテザー構造体は抗菌薬に結合あるいは抗菌薬と共に投与してもよい。
【０１５９】
請求された方法のいずれかで使用されるための安定なテザー構造体を、サイトカインおよび免疫調節物質に結合あるいはそれらと共に投与できる。これらのサイトカインおよび免疫調節物質は、少なくともインターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマ、ならびにコロニー刺激因子を含む。
【０１６０】
開示された方法はまた、安定なテザー構造体を使用して、患者の免疫応答を刺激するために使用できる。１つの実施態様では、安定なテザー構造体は、抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位（antigen binding site：ＡＢＳ）を含むことができる。このような安定なテザー構造体は、腫瘍関連抗原のエピトープを模倣し、身体の免疫応答を高めることができる。
【０１６１】
安定なテザー構造体を、現在抗体を利用している多くの免疫学的手法に使用できる。これらの手法には、抗イディオタイプ抗体およびエピトープコンジュゲート抗体を使用した免疫系の促進も含まれる。米国特許5,798,100号；6,090,381号および6,132,718号を参照されたい。抗イディオタイプ抗体はまた、癌および感染症に対するワクチンとしても使用される。米国特許6,440,416号および6,472,511号を参照されたい。さらに、多特異性三量体結合構造体は多剤輸送体タンパク質に結合し、細胞および病原体中の多剤耐性表現型に打ち勝つ可能性がある。これらの方法の抗体を、本明細書で開示された安定なテザー構造体によって置換できる。
【０１６２】
様々な実施態様は自己免疫疾患の症状を治療する方法に関する。該方法では、安定なテザー構造体は自己免疫疾患の患者に投与され、この場合投与の前に医薬的に許容され得る担体と混合できる。この方法の安定なテザー構造体は、Ｂ細胞またはＴ細胞抗原エピトープに結合特異性がある少なくとも一種のＡＢＳを含むことが好ましい。Ｂ細胞抗原はＣＤ２２でもよく、エピトープはＣＤ２２のエピトープＡ、エピトープＢ、エピトープＣ、エピトープＤおよびエピトープＥ等でもよい。Ｂ細胞関連抗原はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ７４などの別の細胞抗原でもよい。Ｔ細胞抗原は、ＣＤ２５を含んでもよい。特定の実施態様では、自己免疫疾患を治療するために使用する安定なテザー構造体を選択し、ＩＬ−１７に結合できる。
【０１６３】
ＡＢＳは類人猿、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいはヒト由来の配列を含むことができる。例えば、ＡＢＳは、ヒト化ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ヒト化ＬＬ１（抗ＣＤ７４）あるいはＡ２０（抗ＣＤ２０）モノクローナル抗体由来のものが可能である。
【０１６４】
投与は、一回につき２０〜２０００ｍｇの用量で非経口的でもよい。症状がある程度軽減するまで投与を繰り返すことができる。
【０１６５】
請求した方法で治療され得る患者は、ヒトも含むあらゆる動物を包含している。好ましくは、該動物は、ヒト、霊長類、ウマ科、イヌ科、ネコ科などの哺乳類である。
【０１６６】
安定なテザー構造体を、全身化学療法に対して耐性あるいは不応答性である疾患の治療に使用できる。これらには様々なウイルス性、真菌性、細菌性および原生動物性感染、ならびに特定の寄生性感染が含まれる。ウイルス性感染にはインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス（ラブドウイルス科）、パピローマウイルスおよびパポバウイルスによるものが含まれ、それらすべては全身性抗生剤／細胞毒性薬で治療することは困難である。多価の結合構造体を使用すると標的ウイルスに対する結合活性が高まり治療指数が有意に高くなる。放射性同位体（および熱中性子で活性可能となるホウ素添加物を含む）で標識化した、安定なテザー構造体のコンジュゲートを使用した標的化放射免疫治療により、抗ウイルス治療への新規な方法が与えられる。
【０１６７】
本発明記載の方法によって処理され得る原生動物には、例えばプラスモディウム（Plasmodia）（特に熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、マラリア原虫）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）（トキソプラズマ症の感染体）、リーシュマニア（リーシュマニア症の感染体）、およびエシェリキアヒストリティカが含まれる。マラリアのその様々な段階における検出および治療は、安定なテザー構造体を使用して非常に促進される。種虫（sporozoite）抗原に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は公知である。しかしながら、種虫抗原は血液期寄生体と共通ではないので、種虫抗原に対するこのようなｍＡｂをターゲティングに使用することは比較的短期間に限られてしまい、そこでは種虫は、注入の直後および宿主の肝細胞における増殖の直前には、血液循環中で遊離している。したがって、原生動物（熱帯熱マラリア原虫など）の１つを超える寄生段階を標的にできるｍＡｂの混合物を使用することが好ましく、それは多重特異性を有する１つ以上の安定なテザー構造体で達成できる。コンジュゲートを使用すると、例えば、９９ｍＴｃによって造影が、あるいは例えば２１１Ａｔ、あるいは抗マラリア薬、例えばピリメタミンによって治療がさらに有利になり得る。
【０１６８】
トキソプラズマ症は全身化学療法にも耐性である。トキソプラズマ原虫に特異的に結合するｍＡｂｓあるいは天然の宿主抗体はトキソプラズマ症の免疫応答に関連している可能性があるが、マラリア原虫の場合、適切に標的にした安定なテザー構造体が治療薬の輸送に効果的なビヒクルである可能性があるかは明らかでない。
【０１６９】
広くまん延している蠕虫感染である住血吸虫症は、数種のたにしが有する自由遊泳性のケルカリアによって発症する。マラリアの場合のように、感染過程に関与するケルカリアの異なる段階がある。ケルカリアの複数の段階に結合し、場合により１つ以上の段階においては複数のエピトープに結合し、好ましくは多重特異性混合体の形で結合する安定なテザー構造体は、効果的ターゲティングや治療効果を高めるために造影剤あるいは治療剤とコンジュゲートすることができる。
【０１７０】
クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）の１つ以上の形態、シャーガス病の原因物質に結合する安定なテザー構造体を、この微生物感染の検出および治療のためにつくり、使用できる。トリパノソーマの分化段階において細胞表面糖タンパク質あるいは他の表面抗原と反応する安定なテザー構造体は、造影剤および治療剤を身体の寄生体侵入部位に向けることに適している。
【０１７１】
入手できる薬物では非常に治療困難なその他の感染生物はハンセン菌（Mycobacterium leprae）である。ハンセン菌表面上の複数のエピトープに特異的に結合する安定なテザー構造体をつくることができ、単独であるいは併用で使用して、造影剤および／あるいは病原菌に対する抗生剤／細胞毒性物質の標的にすることができる。
【０１７２】
化学療法薬に対して自身では比較的難治性の、糞線虫症や旋毛虫症のような蠕虫寄生性感染は、安定なテザー構造体に好適な標的である。それらの診断や治療は、寄生体上の１つあるいは好ましくは複数のエピトープに特異的に結合する適切に安定なテザー構造体またはコンジュゲートによって可能となる。
【０１７３】
抗体は入手でき、あるいはヒトの感染症の大部分に関与するほとんどの微生物および寄生体に特異的に結合することが容易に想起できる。これらの多くはこれまでインビトロでの診断目的に利用でき、抗体コンジュゲートの成分として安定なテザー構造体に組み込んで感染部位を診断薬および治療薬の標的にすることができる。ヒトおよび哺乳類の微生物病原体および無脊椎動物寄生体は、自体の様々な段階で発現する多様な抗原を有する複雑なライフサイクルを持つ生物である。ゆえに、異なる形態の抗原決定因子を認識する安定なテザー構造体を生成し、混合物あるいは多重特異的コンジュゲートのいずれかとして、適切な治療様式と併用して使用するとき、標的治療は最も有効になる。例えば放射性核種および／あるいはＭＲＩ促進剤のような造影剤を付与することによって、同様の原則が、感染部位を検出する安定なテザー構造体を含む試薬の使用に当てはまる。
【０１７４】
他の実施態様は、有効量の安定なテザー構造体および標的に成り得る構築物を投与することで病変組織を手術中に同定する方法に関するもので、ここでは、安定なテザー構造体は、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、および標的に成り得る構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他の抗原結合部位から成り、そして少なくとも１つの前記抗原結合部位は、標的細胞、組織または病原体上の、あるいはそれらによって産生された分子またはそれらと結合した分子上の相補的結合部分に結合できる。
【０１７５】
さらに他の実施態様は、有効量の安定なテザー構造体および標的に成り得る構築物を投与することで被験体の病変組織を内視鏡で同定する方法に関連する。安定なテザー構造体は、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、および標的に成り得る構築物に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位から成り、そして少なくとも１つの前記抗原結合部位は、標的細胞、組織または病原体上の、あるいはそれらによって産生された分子またはそれらと結合した分子上の相補的結合部分に特異的に結合する。
【０１７６】
使用における検出の代替的方法は、例えばGiven Imaging（Norcross GA）から市販されているタイプの、摂取されたカプセルカメラ／検出器を使用する無線カプセル内視鏡である。特定の実施態様は、有効量の安定なテザー構造体および標的に成り得る構築物を投与することで被験体の病変組織を内視鏡で同定する方法に関する。この実施態様では、安定なテザー構造体は、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、および標的に成り得る構築物に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位から成り、そして少なくとも１つの前記抗原結合部位は、標的細胞、組織または病原体上の、あるいはそれらによって産生された分子またはそれらと結合した分子上の相補的結合部分に特異的に結合する。
【０１７７】
他の実施態様は、有効量の安定なテザー構造体および標的に成り得る構築物を投与することで被験体の病変組織を血管内で同定する方法に関する。安定なテザー構造体は、標的細胞、組織または病原体上の、あるいは該細胞、組織または病原体によって産生された分子またはそれらと結合した分子上の相補的結合部分に特異的に結合する少なくとも１つのＡＢＳから、および標的に成り得る構築物に特異的に結合する少なくとも１つのＡＢＳから成る。標的組織は甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、胸腺、副甲状腺、子宮内膜、骨髄、リンパ節または脾臓などの正常組織でよい。
【０１７８】
いくつかの実施態様は、請求された方法を実行するためのキットに関する。該キットには標的に成り得る構築物を含むことができる。標的に成り得る構築物を、上記の標的に成り得る構築物に好適であると記述された薬剤のいずれかで標識化できる。さらに、標的に成り得る構築物を非標識化できるが、キットは標的に成り得る構築物を標識する標識試薬を含むことができる。標識試薬には、含有するとしたら標識および架橋剤を含むことができる。キットには、標的に成り得る構築物に特異的な少なくとも１つのＡＢＳおよび標的に成り得る組織に特異的な少なくとも１つのＡＢＳを含む安定なテザー構造体も含むことができる。キットには場合により、安定なテザー構造体を血液循環から除去する除去組成を含むことができる。
【０１７９】
安定なテザー構造体に対する標的
安定なテザー構造体の標的に関連する別の開示は、米国仮出願60/634,076号「Method and Compositions for Immunotherapy and Detection of Inflammatory and Immune−dysregulator Disease, Infectious Disease, Pathologic Angiogenesis and Cancer」Goldenbergら、2004年12月9日出願、に開示され、全本文は参照により本明細書に援用される。
【０１８０】
いくつかの実施態様では、本明細書で請求された安定なテザー構造体は２種の異なる標的と特異的に反応する。異なる該標的には、先天的免疫系、凝固因子、補体因子、相補的調節タンパク質の炎症性エフェクターを含むことができるが、これらに限定されるものではなく、標的は炎症性または免疫調節不全症に、感染性病原体に、あるいは病的血管新生または癌に特異的に関連している。この後者のクラスの標的は、免疫系または凝固因子の炎症性エフェクターではない。したがって、特定の実施態様では、安定なテザー構造体には病変細胞、病的血管新生または癌、あるいは感染症に関する少なくとも１つの結合特異性を、ならびにＢ細胞、Ｔ細胞、好中球、単球およびマクロファージの受容体あるいは抗原および樹状細胞などの免疫系の成分、トロンビンまたは組織因子などの凝固モジュレーター、あるいはＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＨＭＧＢ−１およびＭＩＦなどの炎症性サイトカインへの少なくとも１つの特異性を含む。
【０１８１】
安定なテザー構造体が別個の抗体の組み合わせを含む場合で、成分のひとつがＢ細胞抗原を標的にし、他の成分がＴ細胞、血漿細胞、マクロファージまたは炎症性サイトカインを標的にする場合、このような組み合わせは、免疫系機能障害を促進するので除かれる。
【０１８２】
安定なテザー構造体は裸でもよいが、診断的造影剤（例えば同位体、放射線造影剤）とコンジュゲートすることも可能であり、あるいは放射性核種、ホウ素化合物、免疫調節物質、ペプチドホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞毒性薬剤、血管新生阻害剤およびそれらの組み合わせを含む治療薬とコンジュゲートすることも可能である。安定なテザー構造体の標的への結合は、免疫細胞機能を下方制御し、あるいはその他ではそれに影響を及ぼすが、安定なテザー構造体は、免疫細胞機能に直接影響を及ぼさない他の標的にも結合できる。例えば、ＣＤ６６またはＣＥＡＣＡＭ６（例えばＮＣＡ９０あるいはＮＣＡ９５）などに対する抗顆粒球抗体を、感染組織において顆粒球を標的にするために使用でき、またＣＥＡＣＡＭ６を発現する癌を標的にするために使用することもできる。
【０１８３】
１つの実施態様では、治療薬はオリゴヌクレオチドである。例えば、該オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいは二重鎖干渉ＲＮＡ（interfering RNA：RNAi）分子であり得る。オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２またはｐ５３などの癌遺伝子に対することが可能である。ｂｃｌ−２発現を阻害するアンチセンス分子は、米国特許5,734,033号に記載されている。それは、安定なテザー構造体の治療薬部分とコンジュゲートすることができるか、あるいは安定なテザー構造体の治療薬部分を形成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを安定なテザー構造体と同時にまたは連続的に投与できる。
【０１８４】
他の実施態様では、治療薬はホウ素添加物であり、治療は、治療薬の局在化後に熱中性子または熱外中性子を照射しなければならない。治療薬は、光活性治療薬、特に色原体または色素であり得る。
【０１８５】
好ましい実施態様では、治療薬は薬物や毒素等の細胞毒性薬である。さらに好ましくは、該薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、プラチナ配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、ＳＮ−３８、カンプトテシン、ドキソルビシンおよびそのアナログ、代謝拮抗薬、アルキル化剤、有糸分裂阻害薬、血管新生抑制薬、アポトーシス剤、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１およびこれらの組み合わせから成る群から選択される。
【０１８６】
別の好ましい実施態様では、治療薬は、動物、植物および微生物源から成る群から選択される起源由来の毒素である。好ましい毒素は、リシン、アブリン、アルファ溶血毒、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素を含む。
【０１８７】
治療薬には、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞成長因子、エリスロポイエチン、トロンボポイエチンおよびこれらの組み合わせなどの免疫モジュレーターが可能であり、前記リンホトキシンは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。造血因子には、インターロイキン（ＩＬ）が可能であり、コロニー刺激因子には、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）あるいは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が可能であり、インターフェロンには、インターフェロンα、βまたはγが可能であり、幹細胞成長因子にはＳ１因子が可能である。あるいは、免疫モジュレーターは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロンγ、ＴＮＦ−αあるいはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１８８】
好ましい治療放射性核種は、ベータ、アルファおよびオージェ放射体を含み、ｋｅＶは８０〜５００ｋｅＶの範囲である。治療放射性核種の好適な例として、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８６Ｙ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１１１Ａｇ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃおよびこれらの組み合わせがある。光活性治療薬の好適な例は、色原体および色素から成る群から選択される。
【０１８９】
さらに好ましくは、治療薬は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼから成る群から選択される酵素である。
【０１９０】
治療薬ペプチドの様々な例は当該技術分野で公知であり、このような公知の薬剤はすべて使用できる。治療ペプチドの好適な例として、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、結合ペプチド、遮断ペプチド、毒素、血管新生因子、抗血管新生因子、抗生剤、抗癌ペプチド、抗ウイルスペプチド、ペプチド性医薬品、酵素、アゴニスト、アンタゴニスト、エリスロポイエチンなどの増血剤および他の多くの臨床的に有用な化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９１】
安定なテザー構造体は、少なくとも一種の炎症誘発性エフェクターサイトカイン、炎症誘発性エフェクターケモカインまたは炎症誘発性エフェクター受容体に特異的に結合できる。安定なテザー構造体が結合できる炎症性エフェクターサイトカインとしては、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−１、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−1、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−1２、ＩＬ−1５、ＩＬ−1７およびＩＬ−1８が挙げられるがこれらに限定されるものではない。炎症誘発性エフェクターケモカインとしては、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１（単球走化因子１）、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１Ａ（マクロファージ炎症性タンパク質１Ａ）、ＭＩＰ−１Ｂ（マクロファージ炎症性タンパク質１Ｂ）、ＥＮＡ−７８（上皮好中球活性化ペプチド７８）、ＩＰ−１０、ＧＲＯＢ（ＧＲＯベータ）およびエオタキシンが挙げられるがこれらに限定されるものではない。炎症誘発性エフェクター受容体としては、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７ＲおよびＩＬ−１８Ｒが挙げられるがこれらに限定されるものではない。安定なテザー構造体は、組織因子またはトロンビンなどの少なくとも一種の凝固因子とも特異的に反応できる。リンフォカイン／サイトカインは免疫細胞上のそれらの受容体と反応して活性化を有効にし、抗体はリンフォカイン／サイトカインを中和することで活性化を遮断できる。あるいは、抗体はリンフォカイン／サイトカイン受容体と反応し、活性化を遮断できる。
【０１９２】
安定なテザー構造体が特異的に結合する異なる標的は、同一のあるいは異なるクラスのエフェクターおよび凝固因子からのものであり得る。例えば、安定なテザー構造体が特異的に結合する二種以上の異なる標的は、二種以上の異なる炎症誘発性エフェクターサイトカイン、二種以上の異なる炎症誘発性エフェクターケモカイン、二種以上の異なる炎症誘発性エフェクター受容体、あるいは二種以上の凝固因子などの同じクラスのエフェクターあるいは凝固因子から選択できる。あるいは、二種以上の異なる標的は、異なるクラスのエフェクターおよび凝固因子から選択できる。例えば、１つの標的は、先天的免疫システムの炎症誘発性エフェクターであることもでき、また１つの標的は、凝固因子であることもできる。あるいは、安定なテザー構造体は、少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターサイトカインと少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターケモカイン、少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターサイトカインと少なくとも一つの炎症誘発性エフェクター受容体、あるいは少なくとも一つの炎症誘発性エフェクターケモカインと少なくとも一つの炎症誘発性エフェクター受容体のように二つの異なるクラスの炎症誘発性エフェクターと特異的に反応できる。また、安定なテザー構造体と特異的に反応する異なる二つの標的が、先天的免疫系の同一の炎症誘発性エフェクターの一つを超えるエピトープあるいは同一の凝固因子の一つを超えるエピトープである場合もある。
【０１９３】
したがって、「二つの異なる標的」は、二つの異なる抗原、あるいは同一の抗原の二つの異なるエピトープを意味し得る。多重抗体を、同一の抗原に対して使用することができ、このようにすると価数は増加する。例えば、特に敗血症、数種の癌およびアテローム斑のＭＩＦまたはＨＭＧＢ−１を標的にする場合、該標的の２つの同一のエピトープに結合する二つの抗体を、ＣＤ７４などのＨＬＡクラスＩＩ不変鎖抗原のような異なる抗原に結合する１つ以上の腕を有するもう１つの抗体を持つ安定なテザー構造体に組み込むことができる。抗体は、例えばＭＩＦおよびＣＤ７４の抗体ならびにＨＭＧＢ−１およびＣＤ７４の抗体のように二つの異なる抗原を結合させるために選択できる。
【０１９４】
炎症誘発性エフェクター受容体が標的になる場合、好ましい実施態様では、実際の標的は炎症誘発性エフェクター受容体の細胞外ドメインが可能である。他の実施態様では、安定なテザー構造体は、炎症誘発性エフェクター受容体と反応性の少なくともひとつの分子を含むことができる。この分子には前記炎症誘発性エフェクター受容体の天然のアンタゴニスト、あるいは特に受容体と相互に作用するこのアンタゴニストのフラグメントまたは変異体が可能である。好ましい実施態様では、天然のアンタゴニストは天然ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、あるいはこのアンタゴニストのフラグメントまたは変異体である。
【０１９５】
１つの実施態様では、標的は適応的免疫系の抗原または受容体である。他の実施態様では、安定なテザー構造体の標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびＮＫ細胞などの先天的免疫系の細胞に発生することがある。他の標的には、血小板および内皮細胞がある。しかし、Ｃ５ａ、ＬＰＳ、ＩＦＮγおよびＢ７から成る別の標的群もある。好ましい標的のさらなる群には、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ１４７およびＣＤ１５４が含まれる。それらＣＤは、免疫細胞上の標的であり、免疫細胞応答の妨害を遮断することができる。ＣＤ８３は、活性化された樹状細胞のマーカーとして特に有用である（Caoら、Biochem J.、2004年8月2３日（印刷先行電子出版）；Zinserら、J．Exp Med．200（3）：345-51（2004年））。
【０１９６】
特定の標的は、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ−１、ＴＮＦ−α、補体因子および補体調節タンパク質、ならびに凝固因子のように特に関心を引くものである。ＭＩＦは先天的免疫系の極めて重要なサイトカインであり、炎症反応の制御における重要な役割を担っている。マクロファージのランダムな遊走を阻害するＴリンパ球由来因子として当初記載されていたマクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）として知られるタンパク質は、ほぼ３０年間にわたって不可解なサイトカインであった。近年、脳下垂体前葉の産物としてのＭＩＦの発見及びクローニングおよび生物活性的組換えＭＩＦタンパク質の発現は、インビボにおけるその重大な生物学的役割を定義づけることとなった。ＭＩＦは、グルココルチコイドで刺激されるマクロファージおよびＴリンパ球から放出されるという独特の性質を持つ。いったん放出されるとＭＩＦは、インビトロで単球がＬＰＳに刺激を受けることによるＴＮＦ−α、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＩＬ−８産生に対するグルココルチコイドの阻害作用を打ち負かし、インビボにおける致命的な内毒血症に対するテロイドの防御作用を抑制する。またＭＩＦは、ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ産生を修復することによって、インビトロにおけるＴ細胞増殖のグルココルチコイド阻害に拮抗する。ＭＩＦは、グルココルチコイドの阻害作用に拮抗的に調節し得ると同定される第一媒介物であり、したがって炎症および免疫の宿主制御において重大な役割を果たす。ＭＩＦは特に癌、病的血管新生および敗血症または敗血性ショックの治療に有用である。
【０１９７】
ＨＭＧＢ−１、ＤＮＡ結合核タンパク質および細胞質タンパク質は、ＩＬ−１β、ＴＮＦまたはＬＰＳに活性化される単球およびマクロファージによって放出される炎症誘発性のサイトカインである。そのＢボックスドメインを介して、それはＤＣの表現型変異体を含む。それはまた、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＲＡＮＴＥＳの分泌を増加させる。壊死細胞によって放出されたＨＭＧＢ−１は、ＤＣに察知されると、免疫反応を誘発および／あるいは促進するという、組織または細胞の障害の信号である可能性がある。Palumboらは、ＨＭＢＧ１が中胚葉性血管芽細胞の移行および増殖を誘発することを報告している（J Cell Biol、164：441-449（2004年））。
【０１９８】
ＨＭＧＢ−１は、ＴＮＦおよびＩＬ−１ベータに関連する反応速度が非常に遅い内毒素誘発死の遅発性媒介物である。ＴＮＦおよびＩＬ−１ベータなどの特異的な早期炎症媒介物のみを標的にする実験治療は臨床的に有効を与えなかったが、安定なテザー構造体は、早期および遅発性炎症媒介物の両方を標的にすることで応答を改善できる。
【０１９９】
ＨＭＧＢ−１を標的にする安定なテザー構造体は特に関節炎、特にコラーゲン誘発性関節炎の治療に特に有用である。ＨＭＧＢ−１から成る安定なテザー構造体はまた、敗血症および／または敗血性ショックの治療に有用である。Yangら、PNAS USA 101：296-301（2004年）；Kokkolaら、Arthritis Rheum、48：2052-8（2003年）；Czuraら、J Infect Dis、187 Supple 2：S391-6（2003年）；Treutigerら、J Intern Med、254：375-85（2003年）。
【０２００】
ＴＮＦ−αは、全身性炎症および急性期応答に関与する重要なサイトカインである。ＴＮＦ−αは、単球、線維芽細胞および内皮細胞が刺激を受けることによって放出される。マクロファージ、Ｔ細胞およびＢリンパ球、顆粒球、平滑筋細胞、好酸球、軟骨細胞、骨芽細胞、肥満細胞、グリア細胞およびケラチノサイトもまた、刺激を受けてＴＮＦ−αを産生する。その放出は、例えば感染による損傷を経て、インターロイキン−１および細菌性内毒素などの数種の他の媒介物によって刺激される。それは、概してインターロイキン−１および６と共に様々な器官系におよぼす多くの作用を持っている。ＴＮＦ−αの作用の１つに食欲抑制がある。したがって、悪液質を治療するための安定なテザー構造体は、ＴＮＦ−αを標的にすることが好ましい。それは、肝臓の急性期応答も刺激し、Ｃ反応性タンパク質および多くの他の媒介物を増加させる。それはまた、敗血症または敗血性ショックを治療する場合、有用な標的となる。
【０２０１】
補体系は、細胞受容体によって頻繁に活性化される血清糖タンパク質のタンパク質分解的切断を含む複合カスケードである。「補体カスケード」は恒常的および非特異的であるが、機能するために活性化しなければならない。補体の活性化は、酵素的および生化学的な反応の一方向連続に帰結する。このカスケードでは、特異性補体タンパク質Ｃ５は、白血球細胞を連携して活性化する、高度に活性的な２つの炎症性の副産物Ｃ５ａおよびＣ５ｂを形成する。これは、有害なサイトカイン、炎症性酵素および細胞接着分子を含む多くの他の炎症性副産物を順に引き起こす。同時に、これらの副産物は多くの炎症性疾患に見られる組織の破壊を誘導できる。このカスケードは最終的に、炎症反応、食細胞の走化性およびオプソニン化の誘導ならびに細胞溶解に帰結する。
【０２０２】
補体系は、２つの明確な経路、古典的な経路および代替的経路を介して活性化できる。ほとんどの相補的成分を番号付けする（例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３等）が、「ファクター」と見なされるものもある。成分には、酵素的に切断し、その機能を活性化しなければならないものもあるし、単純に結合し活性的な複合体を形成するものもある。古典的な経路の活性的な成分としては、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａおよびＣ４ｂがある。代替的経路の活性成分としては、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ファクターＢ、ファクターＢａ、ファクターＢｂ、ファクターＤおよびプロパージンがある。各経路の最終段階は同様であり、成分を集合させ膜攻撃複合体を形成することもある。膜攻撃複合体の活性成分としては、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９ｎがある。
【０２０３】
補体系のこれらの成分のいずれかが、安定なテザー構造体によって標的になり得る場合、特定の補体成分が好ましい。Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａは、肥満細胞に食細胞、抗体および補体等を誘発するヒスタミンおよびセロトニンなどの走化性因子の放出を引き起こす。これらは好ましい標的の１つの群を形成する。好ましい標的のその他の群は外来細胞の食作用を増加させるＣ３ｂ、Ｃ４ｂおよびＣ５ｂを含む。標的のその他の好ましい群は、これら２つの群すなわちＣ３、Ｃ４およびＣ５の前駆成分である。Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９は、外来細胞（膜攻撃複合体）の溶解を誘導し、さらに標的の別の好ましい群を形成する。
【０２０４】
Ｃ３ａと同様に補体Ｃ５ａは、アナフィラトキシンである。それは炎症を媒介し、抗菌プロテアーゼおよび酸素ラジカルの好中球放出を誘導するための走化性誘引物質である。したがって、Ｃ５ａおよびその前駆体Ｃ５は特に好ましい標的である。Ｃ５を標的にすることによって、Ｃ５ａのみならずＣ５ｂも作用され、膜攻撃複合体の集合を開始する。よって、Ｃ５は別の好ましい標的である。古典的および代替的補体経路の両方がＣ３ｂに依存しているので、Ｃ３ｂおよびその前駆体Ｃ３もまた好ましい標的である。三種のタンパク質、Ｃ１阻害物質、タンパク質ＨおよびファクターＩがこの因子のレベルに影響を及ぼしており、これらもまた、本発明記載の好ましい標的である。ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９などの補体調節タンパク質は、安定なテザー構造体が結合する標的であり得る。
【０２０５】
凝固因子もまた、好ましい標的であり、特に組織因子（ＴＦ）およびトロンビンが好ましい。ＴＦもまた、組織トロンボプラスチン、ＣＤ１４２、凝固因子ＩＩＩあるいはファクターＩＩＩとして公知である。ＴＦは不可欠な膜受容体糖タンパク質であり、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＴＦのリガンド結合細胞外ドメインは、タイプ２サイトカイン受容体のメンバーとしてＴＦの分類と一致する特徴を持つ２つの構造モジュールから成る。ＴＦは血液凝固プロテアーゼカスケードに関与し、また、ＴＦの細胞外ドメインと循環血液凝固因子であるセリンプロテアーゼファクターＶＩＩまたはファクターＶＩＩａの間に高い親和性の複合体を形成することによって外因性および内因性血液凝固カスケードの両方を開始する。これらの酵素的に活性的な複合体はその後、ファクターＩＸおよびファクターＸを活性化し、トロンビンを産生し、血栓を形成する。
【０２０６】
ＴＦは、単球、マクロファージおよび血管内皮細胞を含む様々な細胞型によって発現され、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αまたは細菌性リポ多糖に誘導される。タンパク質キナーゼＣは内皮細胞ＴＦ発現のサイトカイン活性化に関与している。内毒素およびサイトカインによるＴＦの誘導は、グラム陰性敗血症の患者に見られる播種性血管内凝固の開始における重要なメカニズムである。ＴＦはまた、炎症、癌、脳機能、免疫応答および腫瘍関連血管新生などの様々な非止血機能に関与していることが明らかになっている。したがって、ＴＦを標的にする安定なテザー構造体は凝固障害の治療のみならず、敗血症、癌、病的血管新生および本発明記載の他の免疫性および炎症性調節障害疾患の治療に有用である。凝固経路およびサイトカインネットワーク間の複雑な相互作用は、様々な細胞におけるＴＦ発現に影響を与える数種のサイトカインの能力によって、ならびに受容体に結合するリガンドの作用によって示唆される。リガンド結合（ファクターＶＩＩａ）は、細胞内カルシウムシグナルを付与することが報告されており、よってＴＦが真の受容体であることが示唆される。
【０２０７】
トロンビンは凝固ファクターＩＩ（プロトロンビン）の活性化形であり；それはフィブリノーゲンをフィブリンに変換する。トロンビンはマクロファージに対する強力なケモタキシンであり、マクロファージがサイトカインおよびアラキドン酸代謝産物を産生することを修正し得る。それは敗血症を伴う凝固障害において特に重要である。敗血症の患者における、あるいは動物モデルにＬＰＳを投与した後の、凝固系の活性化を多くの研究が明らかにしてきた。研究が３０年以上なされてきたにもかかわらず、ＬＰＳ誘導肝臓毒性のメカニズムは未だに詳しく解明されていない。現在それらが、細胞と体液介在物質の間の相互作用の複雑で連続的な系列を含むことは明らかになっている。同時期に、グラム陰性全身性敗血症およびその続発症が主要な衛生上の懸念となり、ＬＰＳまたは様々な炎症介在物質に向けられたモノクローナル抗体を使用する試みは臨床的には全く成功していない。トロンビンおよび少なくとも１つの他の標的を標的にする安定なテザー構造体は、敗血症の治療における臨床的失敗に取り組んでいる。
【０２０８】
他の実施態様では、安定なテザー構造体は、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０またはＣＤ８６などのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩあるいはアクセサリー分子に結合する。安定なテザー構造体はまた、Ｔ細胞活性化サイトカインに、あるいはＮＦ−κＢなどのサイトカイン介在物質に結合できる。
【０２０９】
特定の実施態様では、２つの異なる標的のうち１つは癌細胞受容体または癌関連抗原、特にＢ細胞系統抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３等）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）、テネイシン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、ＮＣＡ６６、ＣＥＡＣＡＭ６（癌胎児性抗原関連細胞接着分子６）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１６、ＩＬ−６、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａ３、ＣＡ１２５、大腸特異性抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、葉酸受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、Ｉａ、ＥＬ−２、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）およびＩＬＧＦ受容体、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、壊死抗原、ＰＡＭ−４、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、Ｐｒ１、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ７２、ＴＲＡＩＬ受容体および炭酸脱水酵素ＩＸから成る群から選択されるものであり得る。
【０２１０】
敗血症ならびに免疫調節不全および他の免疫障害に関連する標的としては、ＭＩＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＤ７４、ＣＤ８３およびＣ５ａＲがある。Ｃ５ａＲに対する抗体および阻害物質は、敗血症（Huber-Langら、FASEB J 2002年；16：1567-1574；Riedemannら、J Clin Invest 2002年；110：101-108）および敗血性ショックの齧歯類、ならびに成体呼吸窮迫症候群のサル(Hangenら、J Surg Res 1989年；46：195-199；Stevensら、J Clin Invest 1986年；77：1812-1816)における生存率を改善することが見出されている。したがって、敗血症に対して、２つの異なる標的のうち１つがＬＰＳ／Ｃ５ａなどの感染に関連する標的であることが好ましい。他の好ましい標的としては、ＨＭＧＢ−１、ＴＦ、ＣＤ１４、ＶＥＧＦおよびＩＬ−６があり、その各々は敗血症あるいは敗血性ショックに関連している。好ましい安定なテザー構造体は、ＭＩＦ／ＴＦ、およびＨＭＧＢ−１／ＴＦのようにＨＭＧＢ−１、ＴＦおよびＭＩＦの中からの２つ以上の標的を狙うものである。
【０２１１】
さらに他の実施態様では、２つの異なる標的のうち１つは、ＭＩＦなどの移植片対宿主病あるいは移植拒絶反応に関連する標的であり得る（Loら、Bone Marrow Transplant、30（6）：375-80（2002年））。また２つの異なる標的のうち１つは、ＩＬ−８などの急性呼吸窮迫症候群（Bourosら、PMC Pulm Med、4（1）：6（2004年））、ＭＩＦなどのアテローム性動脈硬化あるいは再狭窄（Chenら、Arterioscler Thromb Vasc Biol、24（4）：709-14（2004年））、ＩＬ−１８などのぜんそく（Hataら、Int Immunol、2004年10月11日印刷先行電子出版）、ＴＮＦ−αなどの肉芽腫性疾患（7-8（2004年）、カルバミル化ＥＰＯ（エリスロポイエチン）などの神経障害（Leistら、Science 305（5681）：164-5（2004年）、あるいはＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの悪液質に関連するものでであり得る。
【０２１２】
他の標的としては、Ｃ５ａ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−ガンマ、Ｂ７；ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８３、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４がある。ＬＰＳを含む特定の細菌性抗原による単核細胞の活性化は、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂあるいはＣＤ１１ｃの抗体によってある程度阻害することが可能であり、したがってβ２−インテグリンが関わっている（Cuzzolaら、J Immunol、2000年；164：5871-5876；Medvedevら、J Immunol、1998年；160：4535-4542）。ＣＤ８３は、中動脈、大動脈、主に大動脈弓および大動脈自体の頭蓋外枝に影響を及ぼす全身性脈管炎である巨細胞動脈炎（ＧＣＡ）に関与していることが分かっており、それは血管狭窄症およびそれに続く組織虚血、ならびに失明、脳卒中および大動脈弓症候群の重篤な合併症につながる（Weyand及びGoronzy、N Engl J Med、2003年；349：160-169；Hunder及びValente：Inflammatory Diseases of Blood Vesselsにおいて、G．S．Hoffman及びC．M．Weyand編、Marcel Dekker、ニューヨーク、2002年；255-265）。ＣＤ８３の抗体は、ヒトＧＣＡのＳＣＩＤマウスモデルにおける脈管炎を抑止することが分かり（Ma-Krupaら、J Exp Med 2004年；199：173-183）、よって当研究者らは、活性化されるとＣＤ８３を発現する樹状細胞はＧＣＡの重大な抗原処理細胞であるということを理解した。これらの研究では、研究者らはマウス抗ＣＤ８３Ｍａｂ（Research-Diagnostics社から入手したＩｇＧ１クローンＨＢ１５ｅ）を使用した。ＴＮＦファミリーのメンバーであるＣＤ１５４はＣＤ４陽性Ｔリンパ球の表面上で発現し、ＣＤ１５４に対するヒト化モノクローナル抗体が、活性的全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の患者に有意な臨床的利益をもたらすことが報告されている（Grammarら、J Clin Invest、2003年；112：1506-1520）。この抗体は他の自己免疫疾患にも有用である可能性が示唆されている（Kelsoe、J Clin Invest、2003年；112：1480-1482）。確かにこの抗体は不応性免疫性血小板減少性紫斑病の患者に効果的であることも報告されている（Kuwanaら、Blood、2004年；103：1229-1236）。
【０２１３】
関節リウマチにおいて、組み換えインターロイキン１受容体アンタゴニストであるＩＬ−１Ｒａあるいはアナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））は活性を示す（Cohenら、Ann Rheum Dis 2004年；63：1062-8；Cohen、Rheum Dis Clin North Am、2004年；30：365-80）。これらの患者において、これまでメトトレキサートでの併用治療を必要とした治療を改善することは、１つ以上の抗炎症誘発性エフェクターサイトカインあるいは抗炎症誘発性エフェクターケモカイン（上記に列挙）とアナキンラを併用することである。確かに、関節リウマチの抗体療法の検討では、ＴＮＦに加えて、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８などのサイトカインに対する他の抗体も有用であることがＴａｙｌｏｒ（Curr Opin Pharmacol、2003年；3：323-328）によって示唆されている。
【０２１４】
さらに好ましい標的の組み合わせには以下のものを含むものもある。これは好ましい組み合わせの例のリストであるが、包括しようというものではない。
【０２１５】
【表１】
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【０２１６】
安定なテザー構造体は、異なる標的に結合する少なくとも二種の別個の抗体および／または受容体あるいはそれらのリガンドを含む混合物であり得る。１つの好ましい実施態様では、標的は、先天的免疫システム、凝固因子、補体因子および補体調節タンパク質の炎症誘発性エフェクター、ならびに炎症性または免疫不全疾患、病的血管新生または癌あるいは感染性疾患に特に関連する標的から成る群から選択される。
【０２１７】
安定なテザー構造体は、ＬＰＳ、ＩＬ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ、ＩＦＮ、組織因子、トロンビン、ＣＤ１４、ＣＤ２７およびＣＤ１３４などに対する受容体またはその標的分子に結合することができる。これらの多くは受容体として、および血液中の可溶形態として存在する。安定なテザー構造体によって結合すると血液から迅速に除去され、その後安定なテザー構造体の第二成分により、移送および細胞、特にリソソームによる分解のためにマクロファージなどの他の細胞が標的となる。このことは、第二のターゲティング成分が、マクロファージや樹状細胞によって発現されたＣＤ７４などの内在化抗原に対する場合、特に有効である。このことはＨａｎｓｅｎの米国特許6,458,933号の開示と一致しているが、これは炎症性サイトカインおよび免疫調節不全症に対する他の免疫修飾分子と受容体、ならびにこれらの癌の免疫療法の癌抗原に焦点を当てたものである。
【０２１８】
癌治療のための好ましい安定なテザー構造体としては、ＣＤ５５および上記癌抗原のいずれかに対する抗体、ＣＤ４６および上記癌抗原のいずれかに対する抗体、ＣＤ５９および上記癌抗原のいずれかに対する抗体、ＭＩＦおよび上記癌抗原のいずれかに対する抗体、ＮＦ−κＢおよび上記癌抗原のいずれかに対する抗体、およびＩＬ−６およびＩＬ−６以外の上記癌抗原のいずれかに対する抗体がある。
【０２１９】
安定なテザー構造体は、１つ以上の二次的な治療法と併用することができる。この二次的な治療法は、先天的免疫系の成分に影響を及ぼすものであり得る。あるいは、適応可能免疫系の成分に影響を及ぼすものであり得る。該二次的治療法は、凝固、癌あるいは自己免疫疾患に影響を及ぼす細胞毒性薬などの成分でもあり得る。
【０２２０】
安定なテザー構造体は、診断薬または治療薬とともに、ヒトあるいは哺乳動物の治療および診断用途のキットとして、医薬的に許容できる注射ビヒクル、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、生理学的ｐＨおよび濃度で提供されてよい。製剤は、特にヒトに使用する場合には無菌であることが好ましい。場合によってこのようなキットは、安定剤、緩衝剤、標識試薬、放射性同位体、常磁性化合物、除去を促進するための二次抗体および標準的なシリンジ、カラム、バイアル等を含む。
【０２２１】
ファージ提示
いくつかの代替的実施態様では、ＤＤＤおよび／またはＡＤドメインを構築するための結合ペプチドは、当技術分野で公知のファージ提示法によって決定できる。例えば、ＤＤＤドメインに結合し、およびそのため天然に存在するＡＤ配列と置換し得るペプチドは、ＤＤＤ二量体に対してパニングし結合親和性が高いファージを選択するファージ提示法によって同定できる。特定の標的分子に選択的であり特異的である他タイプの結合ペプチドは、選択された標的に対してパニングするファージ提示によって検出できる。
【０２２２】
ファージ提示の様々な方法およびペプチドの多様な集合体を産生する技術は当技術分野で公知である。例えば米国特許5,223,409号、5,622,699号および6,068,829号の各々は参照により本明細書に組み入れられ、ファージライブラリーを調製する方法を開示している。ファージ提示技術は、遺伝的にバクテリオファージを操作しその表面に低分子ペプチドが発現できるようにすることを含んでいる（SmithおよびScott、1985年、Science 228：1315-1317；Smith及びScott、1993年、Meth．Enzymol．21：228-257）。
【０２２３】
ファージ提示ペプチドライブラリーの構築およびライブラリーを使用しペプチドリガンドを単離するスクリーニング法の開発はこの１０年間で目覚ましく進歩した。例えば、ペプチドライブラリーを使用し、炎症反応に関与する抗体や細胞接着を媒介するインテグリンなどの多くのタンパク質の中で、相互作用部位および受容体リガンド結合モチーフを特徴付けることが可能となった。この方法はまた、ペプチド模倣薬あるいは造影剤の開発を導くことに貢献し得る新規のペプチドリガンドを同定することに使用されてきた（Arapら、1998a年、Science 279：377-380）。ペプチドの他、単鎖抗体などの巨大タンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面に提示され得る（Arapら、1998a年）。
【０２２４】
所与の標的分子に選択的なターゲティングアミノ酸配列はパニングにより単離できる（Pasqualini及びRuoslahti、1996年、Nature 380：364-366；Pasqualini、1999年、The Quart．J．Nucl．Med．43：159-162）。すなわち、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリーは標的分子に投入し、結合したファージを含む試料を回収する。例えば標的分子は、９６ウェルプレートのマイクロタイターウェルの底にセットできる。標的に結合するファージを溶出し、その後宿主細菌で増殖させて増幅できる。
【０２２５】
特定の実施態様では、ファージはパニングのサイクルの間に宿主細菌内で繁殖できる。細菌はファージで溶菌されずに、かわりに特定の挿入部を提示するファージの多数のコピーを分泌することがある。必要ならば、増幅したファージは再度標的分子に接触させ、パニングのさらなるサイクルに供するため回収してもよい。パニングは、選択的または特異的結合剤の集合体が得られるまで複数サイクル行ってもよい。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージのゲノム中のターゲティングペプチド挿入部に対応するＤＮＡの配列を決定することによって決定できる。その後同定されたターゲティングペプチドを、標準的タンパク質化学技術によって合成ペプチドとして産生できる（Arapら、1998a、Smithら、1985年）。
【０２２６】
アプタマー
特定の実施態様では、構築物形成のための前駆体はアプタマーを含むことができる。アプタマーの結合特性を構築および決定する方法は当該技術分野で公知である。例えば、このような技術は米国特許5,582,981号、5,595,877号および5,637,459号に記載されており、各々は参照により本明細書に援用される。
【０２２７】
アプタマーは、合成法、組み換え法および精製法等の任意の公知の方法で調製してもよく、単独で、あるいは同じ標的に特異的な他のリガンドと併用して使用してもよい。一般的に、最低約３個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５個のヌクレオチドが、特異的結合を有効にするために必要である。１０、２０、３０あるいは４０ヌクレオチドのアプタマーが好ましいが、１０塩基よりも短い配列のアプタマーも実行可能である。
【０２２８】
アプタマーは結合特異性を付与する配列を含む必要があるが、隣接領域を付けて拡張できるし、その他誘導体化できる。好ましい実施態様では、アプタマーの結合配列では、その側面にプライマー結合配列が存在し、これによりＰＣＲまたは他の増幅技術でアプタマーの増幅が容易になる。別の実施態様では、該隣接配列は、アプタマーの基質への固定化を促進する部分を選択的に認識あるいは結合する特異的な配列を含むことができる。
【０２２９】
アプタマーは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として単離、配列決定および／または増幅あるいは合成できる。あるいは、目的のアプタマーは修飾オリゴマーを含むことができる。通常アプタマーに存在するあらゆるヒドロキシル基は、ホスホン酸基やリン酸基で置換しても、標準的な保護基で保護しても、または他のヌクレオチドとの更なるリンケージを調製するために活性化してもよく、あるいは固体の支持体とコンジュゲートしてもよい。１つ以上のホスホジエステルリンケージは、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＮＲ２（式中、ＲはＨまたはアルキル（１〜２０Ｃ）であり、Ｒ’はアルキル（１〜２０Ｃ）である）で置換したＰ（Ｏ）Ｏなどの代替的結合基で置換してもよく、さらに、この基はＯまたはＳを介して隣接ヌクレオチドに結合してもよい。オリゴマーのすべてのリンケージは同一である必要はない。
【０２３０】
目的の特定の標的に結合するアプタマーを調製およびスクリーニングする方法は公知であり、例えば、米国特許5,475,096号および米国特許5,270,163号は各々参照により本明細書に援用される。概して該技術は、混合物からの候補アプタマーの選択、ならびに結合アプタマーの非結合アプタマーからの分離および増幅の段階的反復を含む。最大親和性を持つアプタマーに対応する配列は混合物に少数（アプタマー分子は１つしかない可能性がある）しか存在しないので、混合物中の相当量のアプタマー（約５〜５０％）が分離中に維持されるように分離基準を設定することが一般的に望ましい。各サイクルによって、標的に対して高い親和性を持つアプタマーが豊富になる。３〜６回の選択および増幅サイクルを反復し、標的に対する高い親和性および特異性で結合を行うアプタマーを生成し得る。
【０２３１】
アビマー
特定の実施態様では、本明細書記載の前駆体、成分および／または複合体は１つ以上のアビマー配列を含むことができる。アビマーは、様々な標的分子に対する親和性および特異性が抗体と多少類似している結合タンパク質のクラスである。それは、インビトロでのエキソン混合（shuffling）およびファージ提示（display）によってヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Silvermanら、2005年、Nat．Biotechnol．23：1493-94；Silvermanら、2006年、Nat．Biotechnol．24：220）。得られた多ドメインタンパク質は、単エピトープ結合タンパク質と比較して、改善された親和性(いくつかのケースではナノモル以下である)および特異性を示し得る多独立型結合ドメインを含んでもよい（同書）。様々な実施態様にでは、アビマーは例えば、請求された方法および組成への使用目的でＡＤおよび／またはＤＤＤ配列に結合してもよい。アビマーの構築および使用の方法に関係するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開20040175756号、20050048512号、20050053973号、20050089932号および20050221384号に開示されており、これらの各実施例の部分は参照により本明細書に援用される。
【０２３２】
タンパク質およびペプチド
様々なポリペプチドまたはタンパク質は請求された方法および組成の範囲内で使用できる。特定の実施態様では、タンパク質は抗原結合部位を含む抗体または抗体フラグメントを含んでいてもよい。他の実施態様では、タンパク質またはペプチドは、酵素、ホルモン、サイトカイン、結合タンパク質または毒素などのエフェクター分子であり得る。
【０２３３】
本明細書で使用されているような、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、約２００アミノ酸よりも大きく、遺伝子から翻訳した最長配列までのタンパク質；約１００アミノ酸よりも大きいポリペプチド；および／または約３〜約１００アミノ酸のペプチドを意味するがこれらに限定されるものではない。便宜上、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は本明細書では同じ意味で用いられる。したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然に存在するタンパク質に見られる共通の２０アミノ酸の少なくとも１つ、あるいは修飾されたまたは通常と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含する。
【０２３４】
本明細書で使用されているような、「アミノ酸残基」は、当技術分野で公知の天然に存在する任意のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の実施態様では、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、アミノ酸残基の配列を中断する非アミノ酸は含まない。他の実施態様では、配列は１つ以上の非アミノ酸部分を含んでよい。特定の実施態様では、タンパク質またはペプチドの残基の配列は１つ以上の非アミノ酸部分によって中断される可能性がある。
【０２３５】
したがって、用語「タンパク質またはペプチド」は、天然に存在するタンパク質に見られる共通の２０アミノ酸の少なくとも１つ、あるいは修飾されたまたは通常と異なる少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列を包含し、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノ−プロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルアスパラギン酸、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリンノルロイシンおよびオルニチンを含むがこれらに限定されるものではない。あるいは、タンパク質またはペプチドは、天然に存在するＬ−アミノ酸に加えて、またはそれの代わりに１つ以上のＤ−アミノ酸を含んでもよい。Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチドを産生する方法は、例えば米国特許出願公開20050025709号、McBrideら、２００４年６月１４日出願に開示されている。
【０２３６】
タンパク質またはペプチドは、当業者に公知の任意の技術で作成することができ、その技術には、標準的分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、天然源からのタンパク質またはペプチドの単離、あるいはタンパク質またはペプチドの化学合成がある。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列はこれまで開示されており、当業者に公知のコンピュータ化されたデータベースで見られることもある。このようなデータベースの１つは全米バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。既知の遺伝子をコード化する領域は、本明細書に開示されている技術または当業者に公知の技術を使用して、増幅および／または発現してもよい。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの様々な市販調製物は当業者に公知である。
【０２３７】
ペプチド模倣薬
ポリペプチド調製物の他の実施態様はペプチド模倣薬を使用することである。模倣薬は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Johnsonら、BIOTECHNOLOGY AND PHARMACYの「Peptide Turn Mimetics」、Pezzutoら編、ChapmanおよびHall、ニューヨーク（1993年）を参照されたい。これは参照により本明細書に援用される。ペプチド模倣薬の使用の背後にある論拠は、タンパク質のペプチド骨格は主にアミノ酸側鎖を配向するために存在し、それによって抗体抗原相互作用のような分子間相互作用を促すことにある。ペプチド模倣薬は、天然分子に類似の分子間相互作用を可能にすると期待されている。本明細書に開示されている結合ペプチドの自然特性を多く持つが、胃や腸による吸収の増加および／またはインビボでの安定性や活性の改善といった改変または改善された性質も持つ第二世代分子を設計するために、これらの原則は利用される。
【０２３８】
融合タンパク質
様々な実施態様は融合タンパク質に関連している可能性がある。これらの分子は概して、ＮまたはＣ末端で第二ポリペプチドまたはタンパク質のすべてあるいは一部に連結したペプチドのすべてあるいは実質部分を有する。例えば、融合は他の種由来のリーダー配列を使用し、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を可能にする。他の有用な融合には、抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの添加がある。さらに、融合の他の形態には、ＦＬＡＧエピトープなどの、精製に使用する部分の結合もある（Prickettら、1989年、Biotechniques 7：580-589；Castrucciら、1992年、J Virol 66：4647-4653）。融合タンパク質の他の用途は、本明細書で請求したつながれた複合体の成分の構築に関連しており、例えば第一単量体に結合したＤＤＤ配列および第二単量体に結合したＡＤ配列を提供するものである。
【０２３９】
融合タンパク質を生成する方法は当業者に公知である。後述の実施例で例示するように、このようなタンパク質は、例えば二官能性架橋剤を使用した化学結合によって、完全融合タンパク質のデノボ合成によって、あるいは第一タンパク質またはペプチドをコード化するＤＮＡ配列を、第二ペプチドまたはタンパク質をコード化するＤＮＡ配列に結合し、その後無傷の融合タンパク質を発現することによって産生できる。
合成ペプチド
【０２４０】
タンパク質またはペプチドは従来技術に従って、全体的にまたは部分的に、液体中でまたは固体の支持体上で合成してもよい。様々な自動合成機が市販されており、既知のプロトコールにしたがって使用が可能である。例えば、StewartおよびYoung（1984年、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、Pierce Chemical社）；Tamら（1983年、J．Am．Chem．Soc．105：6442）；Merrifield（1986年、Science、232：341-347）；ならびにBaranyおよびMerrifield（1979年、The Peptides、GrossおよびMeienhofer編、Academic Press、ニューヨーク、pp.1-284）を参照されたい。通常約６から約３５〜５０までのアミノ酸である短ペプチド配列は、このような方法によって容易に合成できる。あるいは、組み換えＤＮＡ技術が利用されてもよく、ここでは目的のペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、また発現に適した条件下で培養する。
【０２４１】
ペプチド投与
請求された方法および／または組成の様々な実施態様は、ペプチドをベースにした、被験体に投与する一つ以上の安定なテザー構造体に関連している可能性がある。投与は、当技術分野に公知のどのようなルートからでも可能であり、経口、経鼻、口腔、吸入、直腸、膣、局所、同所、内皮、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄腔内あるいは静脈注射の投与を含むがこれらに限定されるものではない。
【０２４２】
被験体に経口投与された非修飾ペプチドは消化管で分解することが可能であり、配列および構造によっては腸粘膜での吸収が低いことがある。しかしながら、内因性プロテアーゼによる分解に対する感受性を抑えたり、消化管での吸収を高めるためにペプチドを化学的に修飾する方法は公知である（例えば、Blondelleら、1995年、Biophys. J. 69:604〜11；Ecker及びCrooke、1995年、Biotechnology 13：351-69；GoodmanおよびRo、1995年、BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY and DRUG DISCOVERY、VOL. I、Wollf, John Wiley & Sons編；Goodman及びShao、1996年、Pure & Appl. Chem. 68：1303-08）。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド、ペプチド構造を模倣する有機分子からなるペプチド模倣薬、あるいはビニル性ペプトイドなどのペプトイドのようなペプチドアナログのライブラリーを調製する方法も記載されており、被験体への経口投与に適した、ペプチドをベースにした安定なテザー構造体を構築するために使用できる。
【０２４３】
特定の実施態様では、標準的なペプチド結合リンケージは、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨＯＨ−ＣＨ２等の１つ以上の代替的結合基と置換してもよい。ペプチド模倣薬を調製する方法は公知である（例えば、Hruby、1982年、Life Sci 31：189-99；Holladayら、1983年、Tetrahedron Lett．24：4401-04；Jennings-Whiteら、1982年、Tetrahedron Lett．23：2533；Almquiestら、1980年、J．Med．Chem．23：1392-98；Hudsonら、1979年、Int．J．Pept．Res．14：177-185；Spatolaら、1986年、Life Sci 38：1243-49；米国特許5,169,862号;5,539,085号;5,576,423号、5,051,448号、5,559,103号、各々は参照により本明細書に援用される）。ペプチド模倣薬は、ペプチドアナログと比較して、インビボでは安定性および／または吸収性が高められている。
【０２４４】
あるいは、エキソペプチダーゼ活性を防止するためにＮ末端および／またはＣ末端キャッピングを利用した経口デリバリーで、ペプチドを投与できる。例えば、Ｃ末端はアミドペプチドを使用してキャップでき、Ｎ末端はペプチドのアセチル化でキャップできる。ペプチドは、エキソペプチダーゼを遮断するために、例えば環状アミド、ジスルフィド、エーテル、スルフィド等を形成して環化することもできる。
【０２４５】
ペプチドの安定化は、特にエンドペプチダーゼが活動的になることが知られている場所でＤ−アミノ酸で天然に存在するＬ−アミノ酸が置換されることで起こることがある。エンドペプチダーゼ結合および開裂配列は当該技術分野で公知であり、Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチドを作成および使用する方法は、記載されてきた（例えば、米国特許出願公開20050025709号、McBrideら、２００４年６月１４日出願、参照により本明細書に援用される）。特定の実施態様では、ペプチドおよび／またはタンパク質は、プロテイナーゼ阻害剤および／またはペプチダーゼ阻害剤との併用処方で経口投与できる。
【０２４６】
治療ペプチドの経口デリバリーの他の方法はＭｅｈｔａ（「Oral delivery and recombinant production of peptide hormones」2004年6月、BioPharm International）に開示されている。腸のタンパク質分解活性を調節し、腸壁でのペプチド輸送を促進する賦形剤と共に、腸溶性固形剤形で、該ペプチドは投与される。本技術を使用した無傷のペプチドの相対的生物学的利用率は、投与された量の１％〜１０％の範囲であった。コール酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤を含む腸溶性マイクロカプセルを使用して、インスリンをイヌに投与することに成功している（Zivら、1994年、J．Bone Miner．Res．18（Suppl．2）：792-94）。ペプチドの経口投与は、透過促進剤および腸溶コーティングとしてのアシルカルニチンを使用して行われてきた（Eudragit L30D-55、Rohm Pharma Polymers、Mehta、2004年参照）。経口投与ペプチドのために使用する賦形剤は、ペプチドの可溶性または吸収性を促す洗剤または他の薬剤とともに、腸管プロテイナーゼ／ペプチダーゼの一種以上の阻害剤を概して含んで、腸溶性のカプセルまたはタブレット中に封入してもよい（Mehta、2004年）。有機酸がカプセルに含まれて、一旦カプセルが腸で溶解すれば腸を酸性化し腸プロテアーゼ活性を阻害できる（Mehta、2004年）。ペプチド経口デリバリーにおける他の代替法には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースにした両親媒性オリゴマーとのコンジュゲートであり、吸収性と酵素分解への耐性を高めるものである（Soltero及びEkwuribe、2001年、Pharm．Technol．6：110）。
【０２４７】
さらに他の実施態様では、ペプチドは、経口または吸入投与するために、ＩｇＧ１のＦｃ領域のような特定のタンパク質とのコンジュゲーションによって修飾してもよい（実施例３〜７を参照）。ペプチド−Ｆｃコンジュゲートを調製および使用する方法は、例えば、Ｌｏｗら（2005年、Hum．Reprod．20：1805-13）および（Dumontら（2005年、J．Aerosol．Med．18：294-303）に開示されており、各々は参照により本明細書に援用される。Lowら（2005年）は、ＣＨＯ細胞中の組み換え発現を利用し、単鎖あるいはヘテロ二量体の形態で、ＦＳＨのアルファおよびベータサブユニットをＩｇＧ１のＦｃ領域とコンジュゲートさせることを開示している。Ｆｃコンジュゲートペプチドは、新生児のＦｃ受容体媒介輸送システムによって、肺または腸の上皮細胞で吸収された。Ｆｃコンジュゲートペプチドでは、天然ペプチドと比較して、インビボでの安定性および吸収性が改善された。ヘテロ二量体コンジュゲートは単鎖形態よりも活性的であることも観察された。
【０２４８】
架橋剤
いくつかの実施態様では、タンパク質、ペプチドまたは他の高分子は、ホモ二官能性、ヘテロ二官能性および／または光活性化可能な架橋剤などの当該技術分野で公知の様々な架橋剤を使用して共有的に架橋できる。このような試薬の非限定的な例として、ビスイミデート；１，５−ジフロロ−２，４−（ジニトロベンゼン）；スベリン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル；酒石酸ジサクシンイミジル；ジメチル−３，３’−ジチオ−ビス−プロピオンイミデート；Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート；４−（ブロモアミノエチル）−２−ニトロフェニルアジド；および４−アジドグリオキサルがある。好適な実施形態では、ＤＣＣＤまたはＥＤＣなどのカルボジイミド架橋剤は酸性残基とアミノ基または他の基を架橋するために使用できる。このような試薬を修飾し、蛍光標識などの多種の標識と結合できる。
【０２４９】
二官能性架橋剤は様々な目的で広範囲に使用されてきた。２つの同一官能基を担持するホモ二官能性試薬は、同一または異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋の誘導、あるいはポリペプチドリガンドとその特異的結合部位の連結において有効性が高いことが分かった。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含んでいる。２つの異なる官能基の異なる反応性を活かして、架橋が選択的に、ならびに連続的に制御可能となる。二官能性架橋試薬は、その官能基、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異性基の特異性にしたがって分類できる。これらのうち、遊離アミノ基に向けられた試薬は、その市販入手可能性、合成の簡便性、適用できる穏和な反応条件のために特に人気が高くなっている。大半のヘテロ二官能性架橋試薬は一級アミン反応基およびチオール反応基を含んでいる。
【０２５０】
他の例では、ヘテロ二官能性架橋試薬および架橋試薬を使用した方法が記載されている（米国特許5,889,155号）。架橋試薬は、求核ヒドラジド残基を求電子性マレイミド残基に結合させ、ある例では、アルデヒドと遊離チオールとのカップリングを可能にする。架橋試薬を修飾し、様々な官能基を架橋できる。
【０２５１】
抗体
様々な実施態様が標的に対する抗体リガンドに関係している可能性がある。本明細書で使用の用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を意味し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）等の抗体フラグメントを含む。様々な抗体をベースにした構築物およびフラグメントを調製および使用する技術は、当技術分野で公知である。抗体を調製および特徴化する手段もまた当技術分野で公知である（例えば、Harlowe及びLane、1988年、Antibodies：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー研究所を参照）。使用の抗体は既知の広範な販売元からも市販されている。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア）。
【０２５２】
抗体フラグメントの産生
請求された方法および／または組成のいくつかの実施態様は、抗体フラグメントに関係している可能性がある。このような抗体フラグメントは、従来の方法によって、抗体全体をペプシンまたはパパイン消化で得ることができる。例えば、抗体フラグメントはペプシンで抗体を酵素切断して産生し、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓフラグメントを産生できる。このフラグメントはさらに、チオール還元剤および、場合によりジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基に対する保護基を使用して切断し、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価フラグメントを産生できる。あるいは、ペプシンを使用して酵素切断すると、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生できる。抗体フラグメントを産生する方法の好適な例が、米国特許4,036,945号;米国特許4,331,647号；Nisonoff ら、1960年、Arch. Biochem. Biophys., 89；230；Porter，1959年、Biochem．J．、73：119；Edelmanら、1967年、METHODS IN ENZYMOLOGY、422ページ（Academic Press）、およびColiganら（編）、1991年、CURRENT PROＴOCOLS IN IMMUNOLOGY（John Wiley & Sons）に開示されている。
【０２５３】
フラグメントが無傷の抗体で認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法、例えば一価の軽／重鎖フラグメントを形成する重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは他の酵素的、化学的または遺伝子的技術も使用できる。例えば、ＦｖフラグメントはＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Inbarら、1972年、Proc．Nat’l．Acad．Sci．USA、69：2659に記載されているように、非共有的であり得る。あるいは、該可変鎖は、分子内ジスルフィド結合で連結あるいはグルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋してもよい。Sandhu、1992年、Crit．Rev．Biotech．、12：437を参照されたい。
【０２５４】
好ましくは、Ｆｖフラグメントはペプチドリンカーで結合されたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列で結合されたＶＨおよびＶＬドメインをコード化するＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製する。構造遺伝子は、大腸菌などの宿主細胞に連続的に誘導する発現ベクターに挿入する。組み換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドで単ポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖの産生法は当該技術分野で公知である。Whitlowら、1991年、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97；Birdら、1988年、Science、242：423；米国特許4,946,778号；Packら、1993年、Bio/Technology、11：1271、及びSandhu、1992年、Crit．Rev．Biotech．、12：437を参照されたい。
【０２５５】
抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコード化するペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコード化する遺伝子を構築することで得られる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成して調製する。Larrickら、1991年、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106；Ritterら（編）、1995年、MONOCLOＮAL ANTIBODIES：PRODUCTION、ENGINEERING and CLINICAL APPLICATION、166-179ページ（ケンブリッジ大学印刷）；Ｂirchら（編）、1995年、MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES and APPLICATIONS、137〜185ページ（Wiley-Liss社）を参照されたい。
【０２５６】
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は組み替えタンパク質であり、ここではヒト抗体の可変領域が、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域に置換されている。被験体に投与したときにキメラ抗体は、免疫原性の減少および安定性の増加を示す。キメラ抗体の構築法は当該技術分野で公知である（例えばLeungら、1994年、Hybridoma 13：469）。
【０２５７】
キメラモノクローナル抗体は、マウスＣＤＲをマウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からその対応するヒト抗体の可変ドメインに移転することによってヒト化できる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列で置換する。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を保つために、１つ以上のヒトＦＲ残基をマウスの対応する残基で置換できる。ヒト化モノクローナル抗体は、被験体の治療に使用してもよい。ヒト化抗体の標的に対する親和性は、ＣＤＲ配列の修飾を選択することによって高められる可能性がある（WO0029584A1）。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は当技術分野で公知である（例えばJohnesら、1986年、Nature、321：522；Riechmannら、Nature、1988年、332:323; Verhoeyenら、1998、Science, 239:1534；Carterら、1992年、Proc．Nat'l Acad．Sci．USA、89：4285；Sandhu、Crit．Rev．Biotech．、1992年、12：437；Tempestら、1991年、Biotechnologｙ 9：266；Singerら、J．Immun．、1993年、150：2844）。
【０２５８】
他の実施態様は非ヒト霊長類抗体に関連している可能性がある。治療に有用なヒヒ抗体をもたらす一般的な方法が、例えばGoldenbergら、WO91/11465（1991年）、およびLosmanら、Int．J．Cancer 46：310（1990年）で見出される可能性がある。
【０２５９】
他の実施態様では、抗体はヒトモノクローナル抗体となり得る。このような抗体は、抗原投与に応えて特異性ヒト抗体を産生するために設計されたトランスジェニックマウスから得る。この技術では、ヒト重／軽鎖の遺伝子座の要素を、内因性重鎖の遺伝子座と軽鎖の遺伝子座の標的化された破壊を有する胚幹細胞系由来のマウス株に導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することが可能であり、該マウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することに使用することが可能である。ヒト抗体をトランスジェニックマウスから得る方法は、Greenら、Nature Genet．7：13（1994年）、Lonbergら、Nature 368：856（１994年）及びTaylorら、Int．Immun．6：579（1994年）によって記述されている。
【０２６０】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチあるいはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを利用して完全ヒト抗体を産生する方法は当技術分野で公知である（例えば、Manciniら、2004年、New Microbiol．27：315-28；ConradおよびScheller、2005年、Comb．Chem．High Throughput Screen．8：117-26；BrekkeおよびLoset、2003年、Curr．Opin．Phamacol．3：544-50：各々は参照により本明細書に組み入れられる）。このような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりもさらに副作用が少ないこと、および本質的に内因性ヒト抗体としてインビボで機能することが期待される。特定の実施態様にでは、請求された方法および手法はこのような技術によって産生されたヒト抗体を利用してよい。
【０２６１】
ある代替法では、上述したようにファージ提示技術はヒト抗体を生成するために使用してよい（例えば、Dantas-Barbosaら、2005年、Genet．Mol．Res．4：126-40、参照により本明細書に援用される）。ヒト抗体は、正常なヒト、あるいは癌などの特定の病状のヒトから生成してもよい（Dantas-Barbosaら、2005年）。罹患した個体からヒト抗体を構築するのに有利な点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性があることである。
【０２６２】
この方法論の非限定的な例の１つとして、Dantas-Barbosaら（2005年）は骨肉種患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージ提示ライブラリーを構築した。一般的に、全ＲＮＡは、循環血液リンパ球から得ていた（同書）。組み換えＦａｂは、μ、γおよびκ鎖抗体レパートリーからクローン化され、ファージ提示ライブラリーに挿入された（同書）。ＲＮＡはｃＤＮＡに変換され、重及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使用してＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリーを作成するために使用された（Marksら、1991年、Ｊ．Ｍol．Biol．222：581-97、参照により本明細書に援用される）。ライブラリー構築はＡｎｄris-Widhopfら（2000年、In：Phage Display Laboratory Manual、Barbasら（編）、初版、コールド・スプリング・ハーバー研究所印刷、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、ｐｐ．９．１〜９．２２、参照により本明細書に援用される）にしたがって行われた。最終Ｆａｂフラグメントは制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージゲノムに挿入しファージ提示ライブラリーを作成した。このようなライブラリーは、上述したように標準的ファージ提示法でスクリーニングしてもよい。当業者はこの技術が、ヒト抗体を作成しスクリーニングする好適な唯一の公知の方法であること、あるいはファージ提示により抗体フラグメントが利用可能であることを理解しよう。
【０２６３】
他の代替例では、ヒト抗体を産生するために遺伝子組み換えされたトランスジェニック動物は、上述した標準免疫化プロトコールを用いて、本質的にあらゆる免疫原性標的に対する抗体を生成するため使用できる。このような系の非限定的例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（フレモント、カリフォルニア州）から購入できるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えばGreenら、1999年、J．Immunol．Methods 231：11-23、参照により本明細書に援用される）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似の動物においては、マウス免疫系の残りは無傷のまま、マウス抗体遺伝子は不活性化され、機能的ヒト抗体遺伝子と置換されている。
【０２６４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、生殖細胞系で構成されたＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されたもので、ＹＡＣはヒトＩｇＨおよびＩｇカッパ遺伝子座を部分的に有し、アクセサリー遺伝子および調節配列に沿って、可変領域配列の大部分を含んでいる。ヒト可変領域レパートリーは、抗体産生Ｂ細胞を生成するために使用され、既知の技術でハイブリドーマへと加工してもよい。標的抗原で免疫化したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は正常免疫応答でヒト抗体を産生するものであり、上述した標準技術で回収および／あるいは産生してもよい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の様々な株は入手可能で、各々は抗体の様々なクラスを産生し得る。このようなヒト抗体は化学架橋あるいは他の既知の方法で他の分子とカップリングし得る。遺伝子導入で産生したヒト抗体は、正常ヒト抗体の薬物動態学的特性を維持しながら治療における可能性を示してきた（Greenら、1999年）。請求された組成および方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されず、遺伝子組み換えされてヒト抗体を産生する任意のトランスジェニック動物を利用し得ることは、当業者に理解されよう。
【０２６５】
クローニング、遺伝子導入および発現のためのベクター
特定の実施態様では、発現ベクターは、ペプチドまたは融合タンパク質などのタンパク質を発現するために選択され、その後精製され使用される。発現には、適切なシグナルがベクターに付与され、それが宿主細胞の目的遺伝子の発現を操作するウイルスまたは哺乳動物源由来のエンハンサー／プロモーターなどの様々な調節要素を含むことが必要である。宿主細胞においてはメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適化するように設計された要素も公知である。
【０２６６】
調節要素
用語「発現構築物」あるいは「発現ベクター」は、核酸コーディング配列の一部またはすべてが転写可能である遺伝子産物をコード化する核酸を含むあらゆるタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。好ましい実施態様では、遺伝子産物をコード化する核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は細胞の合成機構あるいは導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を意味し、遺伝子の特異的転写を開始するのに必要とされる。「転写制御下」のフレーズは、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関してプロモーターが正しい位置と配向にあることを意味する。
【０２６７】
プロモーターが標的細胞中の核酸の発現を方向付けることが出来さえすれば、目的の核酸配列の発現を制御するために選択した特定のプロモーターは重要ではないと考えられる。したがって、ヒト細胞が標的になる場合、ヒト細胞で発現し得るプロモーターに隣接しその制御下に核酸コーディング領域を置くことが好ましい。概して、このようなプロモーターはヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含んでいる可能性がある。
【０２６８】
様々な実施態様では、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長鎖末端反復配列、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが使用され、対象のコーディング配列を高度に発現する。当技術分野に公知で、対象のコーディング配列の発現を実現する、他のウイルスまたは哺乳動物細胞あるいは細菌性ファージのプロモーターも、発現レベルが所与の目的に十分であるなら、同様に検討される。
【０２６９】
ｃＤＮＡ挿入物が使用される場合、それは典型的にポリアデニル化シグナルを含み、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化を有効にする。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を首尾よく実行するのに決定的なものではないと考えられ、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなどのこのような配列はすべて使用できる可能性がある。また、発現構築物の要素として考えられるものはターミネーターである。これらの要素はメッセージレベルを高め、該構築物から他の配列への読み込みを最小限にするために貢献している。
【０２７０】
選択可能マーカー
特定の実施態様では、核酸構築物を含む細胞は、発現構築物中のマーカーを含むことでインビトロまたはインビボで同定できる。このようなマーカーは、発現構築物を含む細胞を簡単に同定できるようにする細胞に同定可能な変化を付与するものである。通常、薬物選択マーカーを含有すると形質転換体のクローニングおよび選択が助けられる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに耐性を付与する遺伝子は有用な選択可能マーカーである。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの酵素を使用してもよい。免疫学的マーカーもまた使用し得る。使用された選択可能マーカーは、それが遺伝子産物をコード化する核酸と同時に発現することさえできるのであれば重要ではないと考えられる。選択可能マーカーの別の例は当業者に公知である。
【０２７１】
特許および特許出願を含む引用された参照のすべては、全体として本明細書に援用される。
【０２７２】
実施例
以下の実施例は説明のために提供されたものであるが、請求された発明を限定するものではない。
３つのＦａｂ−サブユニットから成る非共有ａ２ｂ複合体を生成する方法
【０２７３】
実施例１．モジュラーＦａｂサブユニットを産生する一般的方策
Ｆａｂモジュールは、ＤＤＤまたはＡＤ配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生される。独立したトランスジェニック細胞系は各Ｆａｂ融合タンパク質に対して作成する。いったん産生すると、モジュールは必要であれば精製、あるいは細胞培養上清液中で維持することが可能である。産生に続いて、任意の（Ｆａｂ−ＤＤＤ）２モジュールはＦａｂ−ＡＤモジュールと結合し、二重特異性三価Ｆａｂ（ｂｓＴＦ）が生成できる。
【０２７４】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、多くの抗体および抗体がベースとなる構築物を産生するのに使用されてきた。Gilliesら、J Immunol Methods（1989年）、125:191〜202；Losmanら、Cancer（Phila）（1997年）、80：2660〜6を参照されたい。ジシストロン性の哺乳動物発現ベクターはＩｇＧの重／軽鎖の合成に向けられている。ベクター配列は、多数の異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築物に対してほとんど同一であり、可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列にのみ相違が存在する。当業者に公知である分子生物学的手段を利用し、これらのＩｇＧ発現ベクターはＦａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクター生成するため、ヒンジ部、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコード化する配列は、ヒンジ部の最初の４残基、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの１４残基およびヒトＲＩＩαの最初の４４残基をコード化する配列と置換する（ＤＤＤ１と称される、図１）。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成するため、ヒンジ部、ＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインの配列は、ヒンジ部の最初の４残基、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーの１５残基およびＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる合成ＡＤ（ＡＤ１と称される、図２）の１７残基をコード化する配列と置換する。それはバイオインフォマティクスおよびペプチドアレイ技術を利用して生成し、親和性が非常に高いＲＩＩαダイマー（０．４ｎＭ）に結合することが分かった。Ａｌｔｏら、Proc．Natl．Acad．Sci．、Ｕ．Ｓ．Ａ．（2003年）、100：4445-50を参照されたい。
【０２７５】
後述のように、ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターをＦａｂ−ＤＤＤ１またはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれかに変換することを容易にするために、二つのシャトルベクターを設計した。
【０２７６】
ＣＨ１の調製
ＣＨ１ドメインは、ｐｄＨＬ２プラスミドベクターをテンプレートにしたＰＣＲで増幅した。左のＰＣＲプライマーは、ＣＨ１をコード化する配列の５’であるＣＨ１ドメインの上流（５’）およびＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位から成る。右のプライマーは、Ｂａｍ  ＨＩ制限部位を含む最後の２つのコドン（ＧＳ）を有するＧＧＧＧＳの前にあるヒンジ部（ＰＫＳＣ）の最初の４残基をコード化する配列から成る。
【０２７７】
【表２】
2008542194.tif 000004
【０２７８】
４１０ｂｐのＰＣＲアンプライマーをｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローン化し、クローンをＴ７（５’）の配向の挿入に対してスクリーニングした。
【０２７９】
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１の構築
二本鎖オリゴヌクレオチド、指定（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１は、ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２つのコドンを有するリンカーペプチドの１１残基に先立つＤＤＤ１のアミノ酸配列をコード化するようにＳｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ、ＵＫ）で合成された。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位は３’末端に付加される。コード化したポリペプチド配列は以下に示す。
【０２８０】
【表３】
2008542194.tif 000005
【０２８１】
３’末端における３０塩基対によって重なっている二つのオリゴヌクレオチド、指定ＲＩＩＡ１−４４先端部およびＲＩＩＡ１−４４下端部を合成し（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列の中心にある１５４塩基対を含むように結合した。オリゴヌクレオチドはアニールし、Ｔａｑポリメラーゼを使用したプライマー伸長反応に供した。
【０２８２】
【表４】
2008542194.tif 000006
【０２８３】
プライマー伸長に続いて、以下のプライマーを使用したＰＣＲで二本鎖を増幅した。
【０２８４】
【表５】
2008542194.tif 000007
【０２８５】
このアンプライマーは、ｐＧｅｍＴにクローン化し、Ｔ７（５’）の配向の挿入に対してスクリーニングした。
【０２８６】
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１の構築
二本鎖オリゴヌクレオチド、指定（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１は、ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２つのコドンを有するリンカーペプチドの１１残基に先立つＡＤ１のアミノ酸配列をコード化するように合成された（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位は３’末端に付加される。コード化したポリペプチド配列は以下に示す。
【０２８７】
【表６】
2008542194.tif 000008
【０２８８】
二つの相補的に重なるオリゴヌクレオチド、指定ＡＫＡＰ−ＩＳ先端部およびＡＫＡＰ−ＩＳ下端部が合成された。
【０２８９】
【表７】
2008542194.tif 000009
【０２９０】
以下のプライマーを使用したＰＣＲで二本鎖を増幅した。
【０２９１】
【表８】
2008542194.tif 000010
【０２９２】
このアンプライマーをｐＧｅｍＴベクターにクローン化し、Ｔ７（５’）の配向の挿入に対してスクリーニングした。
【０２９３】
ＣＨ１とＤＤＤ１をライゲーションする
ＤＤＤ１配列をコード化する１９０ｂｐのフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切り離し、その後ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ中の同じ部位にライゲーションしシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０２９４】
ＣＨ１とＡＤ１をライゲーションする
ＡＤ１配列を含む１１０ｂｐのフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩでｐＧｅｍＴから切り離し、その後ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ中の同じ部位にライゲーションしシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
【０２９５】
ｐｄＨＬ２をベースにしたベクターへＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１をクローン化する
このモジュラー設計を利用して、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のいずれかを、ｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧ構築物に組み込むことが可能である。ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限フラグメント（ＣＨ１−ＣＨ３）をｐｄＨＬ２から除去し、それをＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩフラグメントで置換することによって、全重鎖定常ドメインを上記構築物の１つと置換し、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り離す。
【０２９６】
Ｎ−末端ＤＤＤドメイン
ＤＤＤまたはＡＤの位置はＣＨ１のカルボキシル末端に限定されるものではない。設計された構築物の中で、ＤＤＤ１配列はＶＨドメインのアミノ末端に結合された。
【０２９７】
実施例２：発現ベクター
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基から成る柔軟なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にカップリングされたＡＤ１を有するｈ６７９Ｆａｂを産生するための発現ベクターである。ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩフラグメントをＣＨ１−ＡＤ１フラグメントで置換することによって、ｈ６７９の可変ドメインを含むｐｄＨＬ２をベースにしたベクターを、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２に変換し、これをＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り離した。
【０２９８】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２つのコピーを含む安定した二量体を産生するための発現ベクターであり、ここではＤＤＤ１は、ＣＨ１のカルボキシル末端で柔軟なペプチドスペーサーを介してｈＭＮ−１４Ｆａｂに連結している。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを除去し、またＣＨ１−ＤＤＤ１フラグメントを挿入することによって、ｈＭＮ−１４ＩｇＧの産生に使用されるプラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２を、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に変換した。これをＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り離した。
【０２９９】
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、融合プロテインＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２つのコピーを含む安定した二量体を産生するための発現ベクターであり、ここではＤＤＤ１は、ＶＨのアミノ末端で柔軟なペプチドスペーサーを介してｈＭＮ−１４Ｆａｂに連結している。
【０３００】
発現ベクターは下記のように設計した。ＤＤＤ１ドメインは下記のような２つのプライマーを使用したＰＣＲで増幅した。
【０３０１】
【表９】
2008542194.tif 000011
【０３０２】
ＰＣＲの結果、ＮｃｏＩ制限部位、およびＢａｍＨＩ制限部位を含むリンカー（Ｇ４Ｓ）２の一部をコード化する配列を、それぞれ５’および３’末端に付加した。１７０ｂｐのＰＣＲアンプライマー（amplimer）をｐＧｅｍＴベクターにクローン化し、クローンをＴ７（５’）の配向の挿入に対してスクリーニングした。１９４ｂｐの挿入部位を、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩ制限酵素でｐＧｅｍＴベクターから切り離し、その同じ酵素で消化して調製したＳＶ３シャトルベクターにクローン化し、媒介的ベクターＤＤＤ１−ＳＶ３を生成した。
【０３０３】
ｈＭＮ−１４Ｆｄ配列を、以下に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲで増幅した。
【０３０４】
【表１０】
2008542194.tif 000012
【０３０５】
ＰＣＲの結果、ＢａｍＨＩ制限部位、およびリンカー（Ｇ４Ｓ）の一部をコード化する配列を、アンプライマーの５’末端に付加した。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位を３’末端に付加した。１０４３ｂｐのアンプライマーをｐＧｅｍＴにクローン化した。ｈＭＮ−１４−Ｆｄ挿入部をＢａｍＨＩおよびＥａｇＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切り離し、その後その同じ酵素で消化して調製したＤＤＤ１−ＳＶ３ベクターでライゲーションし、構築物Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４Ｆｄ−ＳＶ３を生成した。
【０３０６】
Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４Ｆｄ配列をＸｈｏＩおよびＥａｇＩ制限酵素で切り離し、その同じ酵素でＣ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２を消化して調製したベクターフラグメントと１．２８ｋｂの挿入フラグメントをライゲーションした。最終発現ベクターはＮ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐＤＨＬ２である。
【０３０７】
実施例３．ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の産生および精製
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２ベクターはＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することで直線化し、Ｓｐ／ＥＥＥミエローマ細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトした。ジシストロン発現ベクターは、結合してｈ６７９Ｆａｂ−ＡＤ１を形成するＨ６７９カッパ軽鎖およびｈ６７９Ｆｄ−ＡＤ１の両方の合成および分泌を目的にするものである。エレクトロポレーションに続いて、細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入体クローンは０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＢＳＡ−ＩＭＰ−２６０（ＨＳＧ）コンジュゲートで被覆したマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡ、およびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂでの検出によって、クローンはタンパク質発現に関してスクリーニングした。ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析を利用し、希釈培養液試料の注入から得られた初期傾斜を測定することによって生産性を判定した。最も生産性の高いクローンでは、初期生産率は約３０ｍｇ／Ｌであった。総量２３０ｍｇのｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１は、一段階のＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーにより４．５リットルのローラーボトル培養液から精製した。培地は、限外ろ過で約１０倍に濃縮し、その後ＩＭＰ−２９１−アフィゲルカラムに添加した。ＰＢＳでカラムを基準線まで洗浄し、１Ｍのイミダゾール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．５でｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を溶出した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、１つのシャープなピークが得られ、保持時間（９．６３分）は、５０ｋＤａのタンパク質と一致している。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりｈ６７９−ＡＤ１のポリペプチド成分を示す２つのバンドのみが明らかになる。
【０３０８】
実施例４．Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生および精製
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２およびＮ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ２／０由来ミエローマ細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトした。Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２はジシストロン発現ベクターであり、結合してＣ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４Ｆａｂを形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖およびｈＭＮ−１４Ｆｄ−ＤＤＤ１の両方の合成および分泌を目的にするものである。Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２はジシストロン発現ベクターであり、結合してＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖およびＮ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４の両方の合成および分泌を目的にするものである。各融合タンパク質は、ＤＤＤ１ドメインの相互作用を介して安定したホモ二量体を形成する。
【０３０９】
エレクトロポレーションに続いて、細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入体（transfectant）クローンは０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。Ｗ１２（ｈＭＮ−１４に対するラット抗ｉｄモノクローナル抗体）で被覆したマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡ、およびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦａｂでの検出によって、クローンはタンパク質発現に関してスクリーニングした。最も生産性の高いＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４ＦａｂおよびＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４Ｆａｂクローンでは、初期生産率はそれぞれ６０ｍｇ／Ｌおよび６ｍｇ／Ｌであった。
【０３１０】
ＡＤ１−アフィゲルによるＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４およびＣ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４の親和性精製
ＤＤＤ／ＡＤ相互作用を利用し、ＤＤＤ１含有構築物を親和性精製した。ＡＤ１−Ｃは、スルフヒドリル基をクロロ酢酸無水物と反応させた後、ペプチドをアフィゲルとカップリングさせるのに使用したＡＤ１配列およびカルボキシル末端システイン残基（実施例６を参照）からなる合成的に作られたペプチドである。ＤＤＤ含有ａ２構造体は、中性ｐＨでＡＤ１−Ｃ−アフィゲル樹脂に特異的に結合し、低ｐＨ（例えばｐＨ２．５）で溶出できる。
【０３１１】
総量８１ｍｇのＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４は、一段階のＡＤ１−Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより１．２リットルのローラーボトル培養液から精製した。培地は、限外ろ過して約１０倍に濃縮し、その後ＡＤ１−Ｃ−アフィゲルカラムに添加した。ＰＢＳでカラムを基準線まで洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）でＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を溶出した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、１つのタンパク質ピークが得られ、保持時間は８．７分であり、１０７ｋＤａのタンパク質と一致している。純度も還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２つのポリペプチド成分であると見込まれた分子サイズの２つのバンドのみが示された。
【０３１２】
総量１０ｍｇのＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４は、上述のように一段階のＡＤ１−Ｃアフィニティークロマトグラフィーにより１．２リットルのローラーボトル培養液から精製した。溶出液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、１つのタンパク質ピークが得られ、保持時間は８．７７分であり、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と類似しており、１０７ｋＤａのタンパク質と一致している。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のポリペプチド成分だと思われる２つのバンドのみが示された。
【０３１３】
被験物質を様々な量のＷＩ２と混合している試料をＳＥ−ＨＰＬＣ分析することで、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の結合活性を判定した。モル比０．７５：１でＷＩ２ＦａｂとＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を混合して調製した試料では、非結合型Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４（８．７１分）、１つのＷＩ２Ｆａｂに結合したＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（７．９５分）、および２つのＷＩ２Ｆａｂに結合したＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４（７．３７分）と思われる３つのピークが示された。モル比４でＷ１２ＦａｂおよびＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を含む試料を分析したとき、７．３６分でピークが１つのみ見られた。これらの結果によって、ｈＭＮ１４−Ｆａｂ−ＤＤＤ１が二量体であり、２つの活性的な結合部位を有することが明らかになった。この実験をＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４で再度行ったとき、非常に似通った結果が得られた。
【０３１４】
競合ＥＬＩＳＡによって、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の両方が、ｈＭＮ−１４ＩｇＧと類似し、一価のｈＭＮ−１４Ｆａｂよりも著しく強い結合性を持ってＣＥＡに結合することが明らかになった。ＥＬＩＳＡプレートは、ｈＭＮ−１４が特異性を示すＣＥＡのエピトープ（Ａ３Ｂ３）を含有する融合タンパク質で被覆した。
【０３１５】
実施例５．ａ２ｂ複合体の形成
ａ２ｂ複合体の形成は、等モル量で（ａ２として）Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４および（ｂとして）ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を含む混合物をＳＥ−ＨＰＬＣ分析して最初に証明された。このような試料を分析したとき、１つのピークが観察され、保持時間は８．４０分であり、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１（９．５５分）あるいはＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（８．７３分の）単独のいずれかよりも大きい新規なタンパク質の形成と一致していた。ｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１と混合、あるいはＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を６７９−Ｆａｂ−ＮＥＭと混合したとき、アップフィールドシフト（upfield shift）は観察されず、このことは相互作用がＤＤＤ１およびＡＤ１ドメインで特異的に媒介されていることを証明している。ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１およびＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を用いて非常に似通った結果が得られた。
【０３１６】
ＢＩＡｃｏｒｅを使用し、ＤＤ１およびＡＤ１融合タンパク質間の特異的相互作用をさらに証明ならびに特徴化した。初め実験は、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１または６７９−Ｆａｂ−ＮＥＭのいずれかが高密度ＨＳＧのカップリングした（ＩＭＰ２３９）センサーチップの表面に結合できるようにし、次いでＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４またはｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２を注入して行った。予想通り、後者を注入したとき、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１およびＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の混合物のみが反応単位でさらに増加した。Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１を用いて似通った結果が得られた。
【０３１７】
平衡ＳＥ−ＨＰＬＣ実験を行い、それぞれの融合タンパク質に存在するＡＤ１およびＤＤＤ１間の特異的相互作用の結合親和性を判定した。ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１のＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４、Ｎ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４および組み換えヒトＲＩＩαの市販サンプルとの結合に対する解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ１５ｎＭ、８ｎＭおよび３０ｎＭであることが分かった。
【０３１８】
他の関連手法
実施例６．ジ−ＡＤ１の産生
本実施例では、下記のアミノ酸配列を有する低分子ポリペプチド（ＡＤ１−Ｃ）が合成的に作成された。
【０３１９】
【表１１】
2008542194.tif 000013
【０３２０】
ＡＤ１−Ｃにおいて、Ｎ末端のリシン残基およびカルボキシル末端のＫＧＣトリペプチドは、ＡＤ１アミノ酸配列（下線部）の側面に存在する。２つのリシン（Ｋ）残基を導入して可溶性が高まり、グリシン（Ｇ）残基がＣ末端システインの前部に挿入され、柔軟性がさらに与えられた。ＤＭＳＯを用いた治療において、ＡＤ１−Ｃを二量体へと酸化して、指定ジ−ＡＤ１とし、これをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。ジ−ＡＤ１の構造図式を下記に示す（ジスルフィド架橋を示す）。
【０３２１】
【表１２】
2008542194.tif 000014
【０３２２】
さらなる修飾に利用され得るジ−ＡＤ１またはＡＤ１−Ｃに存在する官能基が多数ある。例えば、ジ−ＡＤ１およびＡＤ１−Ｃに含まれる８および４個の一級アミノ基はそれぞれ、薬物、毒素、タンパク質または他のエフェクターをカップリングすることに使用してよい。さらに、ジ−ＡＤ１およびＡＤ１−Ｃは２および１個のチロシン残基を持ち、それぞれ放射性ヨウ素化に使用してよい。最終的に、ＡＤ１−Ｃは、エフェクターをカップリングまたはエフェクターを含むジ−ＡＤ１アナログを形成するために使用することも可能な遊離のシステイン残基を含む。
【０３２３】
実施例７．新規なプレターゲット（pretargeting）法
本発明の方法は、それ自体で新規のプレターゲット手法に役立つ。以下のものは、親和性促進システムを使用するプレターゲットシステムの例を提供するものであり（Le Doussalら、J Nucl Med（1989年）、30：1358〜66）、ハプテン結合抗体を必要としない。実施例４の記載のとおりに産生したＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４またはＮ−Ｆａｂ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４の二量体は、腫瘍をプレターゲットするために使用してよい。最初に１０７ｋＤａのタンパク質を患者に静脈投与し、血液および正常組織から除去しながら、腫瘍上のＣＥＡに結合させる。その後、治療用放射性同位体（例えば９０Ｙ）または診断用放射性同位体（例えば１１１Ｉｎ）を担持するジ−ＡＤ１のＤＯＴＡコンジュゲートなどの二価ペプチドを静脈投与する。低分子ペプチド（〜５０００Ｄａ）は、血液および正常組織から除去するときに、腫瘍にすでに保持されているＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と特異的に相互作用すると見込まれている２つのＡＤ配列を含むので、腫瘍に局在化する。
【０３２４】
インビトロにおいてＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４がジ−ＡＤ１と架橋することはＳＥ−ＨＰＬＣによって証明した。Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をジ−ＡＤ１と混合した場合、タンパク質ピークは８．６７分から７．９５分へとシフトし、これは架橋構造体が形成されたことを示している。このようなシフトは、ｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２がジ−ＡＤ１と混合したときに見られ、ＤＤＤ１およびＡＤ１間の相互作用によって架橋が媒介されていることが明らかになった。ピークのシフトが実際にＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の特異的架橋に起因していることを確認するため、ＤＴＴでコンジュゲートを還元してジ−ＡＤ１のジスルフィド結合を切断し、そうすることによってピークが８．６７分に戻った。
【０３２５】
実施例８．ＤＤＤまたはＡＤ融合タンパク質のいずれかの親和性精製
一般的な親和性精製システムは、低親和性ドッキングを示すＤＤＤまたはＡＤタンパク質を産生して開発することが可能である。ＲＩα二量体で形成されるＤＤＤは、ＲＩＩαと比較して５００倍弱い（２２５ｎＭ）親和性でＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１）に結合する。したがって、最初の４４アミノ酸残基から形成されたＲＩα二量体を産生し樹脂とカップリングし、どんなＡＤ１含有融合タンパク質の精製にも対応する魅力的なアフィニティーマトリックスを作成することができる。
【０３２６】
ドメインを固定する低親和性（０．１μＭ）ＡＫＡＰは天然に多く存在する。必要ならば、高度に予想可能なアミノ酸置換を導入し、結合親和性をさらに低下させることができる。どんなＤＤＤ１融合タンパク質の親和性精製にも使用するために、低親和性ＡＤを合成的または生物学的に産生し樹脂とカップリングすることが可能である。
【０３２７】
安定なテザー構造体の産生に関する方法
実施例９．３つのＦａｂフラグメントから成るジスルフィド安定化構造を産生するベクター
Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｎ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２はＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターであり、Ｆｄのアミノ末端に付加されたＤＤＤ２の二量化およびドッキングドメイン配列を持っている（図４Ａ）。ＤＤＤ２は、１５アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＶＨドメインにカップリングする。ＤＤＤ２は、二量化配列およびドッキング配列の前にあるシステイン残基を有し、それはＤＤＤ１のものと同一である。分泌された融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有的相互作用によって一緒に保有されているｈＭＮ−１４Ｆａｂの２つの同一のコピーからなる（図４Ｂ）。
【０３２８】
発現ベクターを下記のように設計した。ＤＤＤ２の残基１〜１３を含む２つの重なっている相補性オリゴヌクレオチド（ＤＤＤ２先端部およびＤＤＤ２下端部）を合成的に作成した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）でリン酸化すると、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＰｓｔＩでそれぞれ消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’および３’末端にオーバーハングを生じる。
【０３２９】
【表１３】
2008542194.tif 000015
【０３３０】
二本鎖ＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化して調製したベクターフラグメントＤＤＤ１−ｈＭＮ１４Ｆｄ−ＳＶ３でライゲーションし、中間構築物ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４Ｆｄ−ＳＶ３を産生した。ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４Ｆｄをコード化する配列を含む１．２８ｋｂの挿入フラグメントを、ＸｈｏＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで中間構築物から切り離し、その同じ酵素で消化して調製したｈＭＮ１４−ｐｄＨＬ２ベクターＤＮＡとライゲーションした。最終発現ベクターはＮ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２である（図５）。
【０３３１】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２はＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターであり、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＦｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量化およびドッキングドメイン配列を持っている（図６Ａ）。分泌された融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有的相互作用によって一緒に保有されているｈＭＮ−１４Ｆａｂの２つの同一のコピーから成る（図６Ｂ）。
【０３３２】
発現ベクターを下記のように設計した。リンカーペプチドの一部をコード化する配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ）およびＤＤＤ２の残基１〜１３を含む２つの重なっている相補性オリゴヌクレオチドを合成的に作成した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化すると、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩでそれぞれ消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’および３’末端にオーバーハングを生じる。
【０３３３】
【表１４】
2008542194.tif 000016
【０３３４】
二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴでライゲーションし、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを産生した。５０７ｂｐのフラグメントを、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから切り離し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩで消化して調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２とライゲーションした。最終発現構築物はＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２である（図７）。
【０３３５】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を、ＢとしてＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４またはＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と対をなすように設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２はｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を産生するための発現ベクターであり、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたＡＤ２のアンカードメイン配列を持っている（図８）。ＡＤ２は、ＡＤ１のアンカードメイン配列の前にある１個のシステイン残基、およびＡＤ１のアンカードメイン配列の後方のもう１個のシステイン残基を有している。
【０３３６】
発現ベクターを下記のように設計した。ＡＤ２およびリンカー配列の一部をコード化する配列を含む２つの重なっている相補性オリゴヌクレオチド（ＡＤ２先端部およびＡＤ２下端部）を合成的に作成した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４  ＰＮＫでリン酸化すると、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩでそれぞれ消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’および３’末端にオーバーハングを生じる。
【０３３７】
【表１５】
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【０３３８】
二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴへとライゲーションし、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ｐＧｅｍＴを産生した。ＣＨ１およびＡＤ２をコード化する配列を含む４２９塩基対のフラグメントを、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限酵素でシャトルベクターから切り離し、その同じ酵素で消化して調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターへとライゲーションした。最終発現ベクターはｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である（図９）。
【０３３９】
実施例１０．ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２の産生
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトした。ジシストロン発現ベクターは、結合してｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を形成するｈ６７９カッパ軽鎖およびｈ６７９  Ｆｄ−ＡＤ２の両方の合成および分泌を目的にするものである。ＡＤのいずれかの末端にあるシステイン残基は、反応する可能性をもつ２つのスルフヒドリル基をもたらす。エレクトロポレーションに続いて、細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入体クローンは０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。ＢＳＡ−ＩＭＰ−２６０（ＨＳＧ）コンジュゲートで被覆したマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡ、およびヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰでの検出によって、クローンはタンパク質発現に関してスクリーニングした。ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）センサーチップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ分析を利用し、希釈培養液試料の注入から得られた初期傾斜を測定することによって生産性を判定した。最も生産性の高いクローンでは、初期生産率は約５０ｍｇ／Ｌであった。総量１６０ｍｇのｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２は、一段階のＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーにより２．９リットルのローラーボトル培養液から精製した。培地は、限外ろ過し約１０倍に濃縮し、その後ＩＭＰ−２９１−アフィゲルカラムに添加した。ＰＢＳでカラムを基準線まで洗浄し、１Ｍのイミダゾール、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）でｈ６７９−ＡＤ２を溶出した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、１つのシャープなピークが得られ、保持時間（〜１０分）は、５０ｋＤａのタンパク質と一致している（図１０）。この物質をｈＭＮ１４−Ｆａｂ−ＤＤＤ１と混合した場合、二成分複合体に起因すると思われる新しいピークのＳＥ−ＨＰＬＣ軌跡における観察によって明らかなように、１／３のみが反応性であった。しかしながら、ＴＣＥＰによりｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を還元すると１００％が活性的となった。このことは、（１）細胞内ジスルフィド結合が、ＡＤ２の２つのシステイン残基の間に生じ、ＤＤＤとの結合を防止し、しかもスルフヒドリル基を他の物質との反応から防御すること；および（２）分子内ジスルフィド架橋は還元により破壊され、２つの遊離スルフヒドリル基を有するＤＤＤ反応性アンカードメインが生じる、ことを示唆している（図１１Ｂ）。
【０３４０】
Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトした。ジシストロン発現ベクターは、結合してＮ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４Ｆａｂを形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖およびＮ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４Ｆｄの両方の合成および分泌を目的にするものである。Ａ２構造体はＤＤＤ２を介した二量化により生じ、各ＤＤＤ２のシステイン残基から得られる反応する可能性がある２つのスルフヒドリル基をもたらすと考えられている。エレクトロポレーションに続いて、細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入体クローンは０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。
【０３４１】
Ｗ１２（ｈＭＮ−１４抗Ｉｄ）で被覆したマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡ、およびヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰでの検出によって、クローンはタンパク質発現に関してスクリーニングした。最も生産性の高いクローンでは、初期生産率は約１０ｍｇ／Ｌであった。総量１６ｍｇのＮ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４は、タンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィーにより１．８リットルのローラーボトル培養液から精製した。培地は、限外ろ過して約１０倍に濃縮し、その後タンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィーカラムに添加した。ＰＢＳでカラムを基準線まで洗浄し、Ｎ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ１４を１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＡｃ（ｐＨ２．５）で溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌですみやかに中和した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析では、４つのタンパク質ピークが得られ（図１２）、次いでそのうちの２つはＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のａ４（７．９分）およびａ２（８．８分）形態と同定され、残りの２つはカッパ鎖の二量体および単量体であることが分かった。ＴＣＥＰなどのチオール還元剤を添加してほとんどのａ４形態をａ２形態に変換しないかぎり、この混合物はｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１との結合活性をわずかにしか示さない（図１３）。これらのデータは、（１）ａ４が、ＤＤＤ２に存在するシステインを介して２つのａ２構造体を連結することによって形成され、それによってＡＤとの会合を防止し、しかもスルフヒドリル基を他の物質との反応から防御すること(図１４Ａ)；および（２）分子内ジスルフィド架橋は還元により破壊され、２つの遊離スルフヒドリル基を含むＡＤ反応性ＤＤＤダイマーを有するａ２構造体が生じる、ことを示唆している（図１４Ｂ）。この副産物（ａ４）は４つの活性的Ｆａｂサブユニットから成ることを留意されたい。還元の後、高ＴＣＥＰ濃度および長い反応時間にもかかわらず全Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の約１５％がＡ４形態のままである（図１３）。このことは、ジスルフィド架橋に加えて、ドメイン交換などの他のメカニズムがａ４形態の形成に貢献している可能性があることを示唆している。
【０３４２】
実施例１２．Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ／ＥＥＥミエローマ細胞にエレクトロポレーションでトランスフェクトした。ジシストロン発現ベクターは、結合してＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ１４を形成するｈＭＮ−１４カッパ軽鎖およびＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４の両方の合成および分泌を目的にするものである。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のように、ａ２構造はＤＤＤ２を介した二量化により生じ、各ＤＤＤ２のシステイン残基から得られる反応する可能性がある２つのスルフヒドリル基をもたらすと考えられている。エレクトロポレーションに続いて、細胞は９６ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入体クローンは０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）で選択した。
【０３４３】
ＷＩ２（ｈＭＮ−１４抗Ｉｄ）で被覆したマイクロタイタープレートを使用したＥＬＩＳＡ、およびヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰでの検出によって、クローンはタンパク質発現に関してスクリーニングした。最も生産性の高いクローンでは、初期生産率は約１００ｍｇ／Ｌであり、これはＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と比べて１０倍高かった。総量２００ｍｇのＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４は、実施例３で述べたとおりタンパク質Ｌアフィニティークロマトグラフィーにより１．８リットルのローラーボトル培養液から精製した。タンパク質Ｌ精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のＳＥ−ＨＰＬＣ特性（図１５）は、Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のものと類似している。４つのタンパク質ピークのうちの２つはＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のａ４（８．４０分）およびａ２（９．２６分）形態と同定され、残りの２つはカッパ鎖の二量体および単量体を表している。ＴＣＥＰなどのチオール還元剤を添加してほとんどのａ４形態をａ２形態に変換し（図１６）、その後ｈ６７９−ＡＤ１に強く結合させないかぎり、この混合物はｈ６７９−ＡＤ１との結合活性をわずかにしか示さない。これらのデータはＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４がＮ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４と機能的に同等であることを示唆している。
【０３４４】
実施例１３．ＴＦ１の産生
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２は、Ｂ成分としてＮ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−Ｆａｂ−１４またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４などのａ２成分と対をなすように設計された。それは、混合したときに簡単に会合し、ジスルフィド結合を介して共有結合するためにさらに導入される可能性があるａ２ｂ構造(図１７Ａ)を形成するものである（図１７Ｂ）。Ｎ−ＤＤＤ２構造物およびＡＤ２構造物を特徴付けると、各還元が完全ＤＤＤ／ＡＤ相互作用を可能にするのに必要であることが明らかになったので、還元ステップを工程に組み入れた。最初に、還元剤の除去に要する時間を省略するために固定化ＴＣＥＰを還元剤として使用した。１時間室温で還元した後、ＴＣＥＰアガロースを遠心分離で除去し、ＤＭＳＯを反応液に添加し、最終濃度を１０％にした。以降ＴＦ１と称する共有結合したａ２ｂ複合体が存在することの最初の裏付けは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析で明らかになった（下記参照）。
【０３４５】
実行可能性を固定化ＴＣＥＰを使用した小規模反応で確立した後、ＴＦ１の大規模な調製を以下のように行った。（タンパク質Ｌで精製した）Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４および（ＩＭＰ−２９１で精製した）ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を最初に、おおよその化学量論濃度で１ｍＭのＥＤＴＡおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で混合した。ＴＣＥＰを添加する前には、ＳＥ−ＨＰＬＣでは全くａ２ｂ形成を裏付けられなかった（図１８Ａ）。代わりに、ａ４（７．９７分；２００ｋＤａ）、ａ２（８．９１分；１００ｋＤａ）およびＢ（１０．０１分；５０ｋＤａ）を表すピークがあった。５ｍＭのＴＣＥＰを添加するやいなや、１５０ｋＤａタンパク質に一致する８．４３分での新しいピークによって明らかになったようにａ２ｂ複合体が形成された（図１８Ｂ）。ａ２またはａ４のいずれかに対応する明らかなピークが観察されていないにもかかわらず、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（９．７２分）に起因すると思われるピークが依然として明確であるので、本実験では過剰Ｂが存在することは明らかであった。一時間におよぶ還元の後、ＰＢＳの何回かの交換による透析を一晩行い、ＴＣＥＰを除去した。得られた溶液を１０％ＤＭＳＯに移し、室温で一晩静置した。
【０３４６】
ＳＥ−ＨＰＬＣで分析した場合（図１８Ｃ）、８．３１分へ保持時間がわずか０．１分減少し、ａ２ｂを表すピークがシャープになったことが分かった。これは本発明者らによる以前からの発見に基づくもので、結合親和性の増加を示している。複合体はＩＭＰ−２９１アフィニティークラマトグラフィーでさらに精製し、カッパ鎖混入物質を除去した。予想どおり、過剰ｈ６７９−ＡＤ２を同時精製し、その後調製ＳＥ−ＨＰＬＣで除去した（図１８Ｄ）。
【０３４７】
図１９は、ＴＦ１が安定性の高い複合体であることを明らかにしている。ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９）センサーチップへの結合について、ＴＦ１を試験した場合、試料注入の最後に観察された応答の明らかな減少は見られなかった。対照的に、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の等モル混合物を含む溶液を類似の条件化で試験した場合、観察された反応単位の増加に続いて、試料注入の間および直後に低下が検出され、最初に形成されたａ２ｂ構造が安定していないことを示していた。さらに、ＷＩ２を続いて注入したところ、ＴＦ１に対する反応単位は顕著に増加した反面、Ｃ−ＤＤＤ１／ＡＤ１混合物に対して増加は顕著でなかった。
【０３４８】
センサーチップに固定されたＴＦ１へのＷＩ２の結合に起因する反応単位の付加的増加分は、各々がＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットによりもたらされる２つの完全機能的結合部位に相当している。このことは、図２０に示すとおりＷＩ２の２つのＦａｂフラグメントに結合するＴＦ１の能力によって確認された。ＴＦ１として正確に還元し酸化したｈ６７９−ＡＤ２およびＮ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ１４を含む混合物をＢＩＡｃｏｒｅで分析すると、Ｗ１２の結合がほとんど追加され（図２１）ないことが分かり、これはＴＦ１などのジスルフィドで安定化したａ２ｂ複合体が、ＤＤＤ２およびＡＤ２の相互作用を経てのみ生じ得ることを示していた。
【０３４９】
工程に対して２つの改善がなされ、工程時間を短縮し、効率を向上させた。初めに、ａ４／ａ２構造体の混合物として存在する、わずかに過剰モルのＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を使用しｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させ、そうすることによって、遊離のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２は残留せず、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２につながれていないあらゆるａ４／ａ２構造体ならびに軽鎖がＩＭＰ−アフィニティークロマトグラフィーによって除去された。第二に、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、透析またはダイアフィルトレーション（diafiltration）を、還元に続いてＴＣＥＰを除去する手段と置き換えた。この手段は工程時間を短縮するだけでなく、可能性があるウイルス除去ステップも付随している。Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４および６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を混合し、室温で一時間、５ｍＭのＴＣＥＰで還元した。該溶液を０．７５Ｍの硫酸アンモニウムに加え、その後Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ  ＨＩＣカラムに添加した。カラムを０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳで洗浄し、ＴＣＥＰを除去した。還元したタンパク質を、ＰＢＳでＨＩＣカラムから溶出し、１０％ＤＭＳＯに加えた。一晩室温でインキュベートした後、高度に精製されたＴＦ１をＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーにより単離した（図２２）。ゲルろ過などのその他の精製ステップは不要であった。
【０３５０】
実施例１４．ＴＦ２の産生
ＴＦ１を首尾よく作成した後、アナログに指定されたＴＦ２（図２３）もまた、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２とＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を反応させることによって得られた。ＴＦ１よりもＴＦ２は、可能性ある２つの利点を有している。第一に、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４はＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４よりも１０倍高いレベルで産出される。第二に、Ｃ末端ＤＤＤドメインを有する融合タンパク質は、Ｎ末端ＤＤＤドメインを有する融合タンパク質よりも顕著に強いＣＥＡ結合活性を示す。このことはおそらく、Ｎ−ＤＤＤ変異体の結合が立体的干渉によって損なわれることがあるドメインの配列に起因していると思われる。
【０３５１】
ＴＦ２のパイロットバッチを、以下のように９０％を越える収率で生成した。タンパク質Ｌで精製したＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｇ）を、１．４：１のモル比でｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と混合した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の総タンパク質濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった。続くステップはＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化およびＩＭＰ−２９１アフィニティークラマトグラフィーを含み、ＴＦ１で記載されたものと同様であった。ＴＣＥＰを添加する前は、ＳＥ−ＨＰＬＣではａ２ｂの形成を証明するものは何もなかった（図２４Ａ）。代わりにａ４（８．４０分；２１５ｋＤａ）、ａ２（９．３２分；１０７ｋＤａ）およびｂ（１０．３３分；５０ｋＤａ）に相当するピークがあった。５ｍＭのＴＣＥＰを添加するやいなや、二成分構造体と予測される１５７ｋＤａタンパク質に一致する８．７７分での新しいピーク（図２４Ｂ）によって明らかになったようにａ２ｂ複合体が形成された。図２５Ａの軌跡は、ＨＩＣおよびＤＭＳＯ処理からの溶出後に回収された画分の内容を示している。ＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーでＴＦ２を精製し、ほぼ均質にした（図２５Ｃ）。ＩＭＰ−２９１非結合画分をＳＥ−ＨＰＬＣ分析し、産物からａ４、ａ２および遊離カッパ鎖が除去されたことが分かった（図２５Ｂ）。
【０３５２】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、大部分のＴＦ２が、ＩｇＧに近い相対移動度を有する大きな共有構造体として存在していることが分かる(図２６Ａ)。付加的バンドは、本実験条件下ではジスルフィド形成が不完全であることを示唆している。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元ゲルで明らかな付加的バンドはどれも産物に関係していることを示した（図２６Ｂ）。これはＴＦ２の構成ポリペプチドを表すバンドのみが認められるためである。しかしながら、４つの各ポリペプチドの相対移動度があまりに近接しているので決定ができない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図２７）により、１つのピークが１５６，４３４Ｄａであることが明らかになり、これはＴＦ２の算出された質量（１５７，３１９Ｄａ）の９９．５％以内であった。
【０３５３】
ＴＦ２の機能性を、ＴＦ１で記述したようにＢＩＡＣＯＲＥで判定し、結果を図２８に示した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有ａ２ｂ複合体のコントロール試料として使用される）またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（非還元ａ２およびｂ成分のコントロール試料として使用される）を、１μｇ／ｍｌ（全タンパク質）に希釈し、ＨＳＧで固定したセンサーチップに供した。ＴＦ２に対する応答性は２つのコントロール試料の約２倍であり、コントロール試料におけるｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分のみがセンサーチップに結合して残ることが示唆された。次いでＷＩ２  ＩｇＧを注入し、付加的なシグナルの応答で示されるように、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤに強く会合するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４成分をＴＦ２のみが有していることが明らかになった。センサーチップに固定されたＴＦ２へのＷＩ２の結合に起因する反応単位の付加的増加分も、各々がＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットによりもたらされる２つの完全機能的結合部位に相当している。これは、図２９に示されるように、ＷＩ２の２つのＦａｂフラグメントと結合するＴＦ２の能力によって確定された。
【０３５４】
ＴＦ２の相対的ＣＥＡ結合活性を競合ＥＬＩＳＡで判定した（図３０）。ｈＭＮ−１４に認識されるＣＥＡのＡ３Ｂ３ドメインを含有する融合タンパク質でプレートを被覆した（０．５μ／ウェル）。ＴＦ１、ＴＦ２およびｈＭＮ−１４ＩｇＧの連続希釈を４重で行い、ＨＲＰコンジュゲートｈＭＮ−１４ＩｇＧを含む（１ｎＭ）ウェルでインキュベートした。データから、少なくともＩｇＧに等しく、またＴＦ１より２倍強い活性でＴＦ２はＣＥＡに結合することが分かる。これは驚くことではなく、何故なら類似のアッセイで以前にＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４はｈＭＮ−１４ＩｇＧよりも強いＣＥＡ結合活性を持ち、次にＮ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４よりも強く結合することが分かっているからである。元のＩｇＧを超えてＣ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の親和性がはっきりと改良されていることの考えられる説明としては、前者のＧｌｙ／ＳｅｒリンカーはＩｇＧよりも柔軟な分子をもたらすからである。Ｎ−ＤＤＤ変異体も柔軟なペプチドリンカーを有するが、ＣＥＡ結合部位は互いに近接してＤＤＤ二量体と隣り合って位置し、親和性は低下している。
【０３５５】
ＴＦ１およびＴＦ２を安定なテザー構造体となるように設計し、血液および組織において大規模な希釈が起こるインビボで使用することができた。ヒト血清中ＴＦ２の安定性をＢＩＡＣＯＲＥを使って評価し、結果を図３１に示す。ＴＦ２を、４人のドナーから集めた新鮮なヒト血清中で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７日間インキュベートした。毎日試料を１：２５で希釈し、その後ＩＭＰ−２３９ＨＳＧセンサーチップを使用したＢＩＡＣＯＲＥで分析した。ＷＩ２  ＩｇＧを注入し、無傷で完全に活性的なＴＦ２を計量した。血清試料を、ストックから直接希釈したコントロール試料と比較した。血清中でＴＦ２の安定性は高く、７日後もその二重結合活性を９８％維持している。類似の結果を、ヒトまたはマウス血清のいずれかのＴＦ１で得た。
【０３５６】
実施例１６．腫瘍担持マウスにおけるＴＦ２の体内分布
ヒト結腸直腸腺癌異種移植片を皮下に担持する雌の無胸腺ヌードマウス（ＬＳ  １７４Ｔ）において、ＴＦ２の体内分布試験を行った。細胞は組織培養で増殖し、その後十分量の細胞が成長し、５０匹のマウスの皮下に１ｘ１０７細胞個／匹の割合で注入した。１週間後、腫瘍を測定し、マウスを時点ごと５匹ずつのグループに割り当てた。この試験の開始時の平均腫瘍サイズは０．１４１±０．０４４ｃｍ３であった。すべてのマウスに４０μｇの１２５Ｉ−ＴＦ２（２５０ピコモル、２μＣｉ）を注入した。マウスはその後屠殺し、注入の０．５、２、４、１６、２４、４８および７２時間後に剖検した。３５匹の全マウスを試験に使用した。腫瘍ならびに様々な組織を除去し、γ線カウンターに設置し、各時点での組織１グラム当たりの注入量パーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を決定した。
【０３５７】
１２５Ｉ−ＴＦ２を放射性ヨウ素化し、１．４８ｍＣｉ／ｍｇの特異的活性を有する２．７％の非結合同位体を得た。その後標識標本をＳＥ−ＨＰＬＣ単独に供し、また２０倍過剰モルのＣＥＡと混合した後ＳＥ−ＨＰＬＣに供した。約８３％のＴＦ２が、１０．１分の保持時間で溶出した。標識ＴＦ２中に、９％の凝集物質（ＲＴ＝９．０３分）および８％の低分子量物質（ＲＴ＝１４．３７分）が含まれていた。ＣＥＡと混合したとき、標識ＴＦ２の９５％が高分子量種にシフトした（ＲＴ＝７．２５分）。これらの結果から、標識標本の腫瘍担持マウスへの投与が許容可能であることが示される。
【０３５８】
表１には、腫瘍および様々な組織での算出した％ＩＤ／ｇ値を示している。腫瘍による取り込みのピークは注入の４時間後であった（１０．３±２．１％ＩＤ／ｇ）。注入後１６〜２４時間の間では、腫瘍でのＴＦ２の量は大差が無く（５．３±１．１％ＩＤ／ｇおよび５．３７±０．７％ＩＤ／ｇ）、このことは、これら２つの時点間でいつでもペプチドが血液レベル次第で投与可能であり、腫瘍ターゲティングには影響を及ぼすこともないことを示している。ＴＦ２の取り込みおよび正常組織からの除去は、ＴＦ１で先行して観察されたときと非常に類似している。ＴＦ１およびＴＦ２はＲＥＳ系（脾臓および肝臓）から除去されることが好ましいと分かった。
【０３５９】
腫瘍担持マウスではＴＦ２に対する血液ＰＫも評価し、二相性のクリアランスを示すことが分かった。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖ．４．１）に提供された二区画解析（two-compartment analysis）を使用してこれらのデータを分析し、決定されたパラメータを表２に示す。
【０３６０】
実施例１７．腫瘍担持マウスにおけるＴＦ２でのプレターゲット法
ヒト結腸直腸腺癌異種移植片を皮下に担持する雌の無胸腺ヌードマウス（ＬＳ  １７４Ｔ）において、ＴＦ２でのプレターゲット試験を行った。細胞は組織培養で増殖し、その後十分量の細胞が成長し、５５匹のマウスの皮下に１ｘ１０７細胞個／匹の割合で注入した。１週間後、腫瘍を測定し、マウスを時点ごと５匹ずつのグループに割り当てた。この試験の開始時の平均腫瘍サイズは０．１０５±０．０６８ｃｍ３であった。２０匹のマウスに８０μｇの１２５Ｉ−ＴＦ２（５００ピコモル、２μＣｉ）を注入し、さらに１６時間後に９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（４０μＣｉ、９２ｎｇ、５０ピコモル）を投与した。マウスはその後屠殺し、ペプチド注入の０．５、１、４および２４時間後に剖検した。さらに、２４時間時点のグループの３匹のマウスを、注入の１、４および２４時間後にγカメラで造影した。コントロールとして、３匹の付加的マウスに９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（プレターゲット法なし）のみを投与し、注入の１、４および２４時間後に造影し、２４時間にわたる造影時間の後、剖検した。腫瘍ならびに様々な組織を除去し、γ線カウンターに設置し、各時点での組織中％ＩＤ／ｇを決定した。
【０３６１】
１２５Ｉ−ＴＦ２および１２５Ｉ−ＴＦ２でプレターゲットされた９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５を測定された％ＩＤ／ｇ値は、それぞれ表３および４にまとめてある。ＴＦ２レベルは、ペプチドの注入後から最初の４時間（またはＴＦ２の投与後２０時間）は、比較的変化のないままであり、その範囲は、ペプチド注入の０．５時間後（ＴＦ２投与の１６．５時間後）の６．７±１．６％ＩＤ／ｇから４時間時点（ＴＦ２注入の２０時間後）での６．５±１．５％ＩＤ／ｇの間である。ＴＦ２でプレターゲットされたＩＭＰ−２４５の腫瘍による取り込みの値は、ペプチド注入の０．５、１、４および２４時間後で、２２±３％、３０±１４％、２５±４％および１６±３％であった。
【０３６２】
正常組織に関して、これまで開発した他のプレターゲット剤から得られた結果と比較して、ＴＦ２でプレターゲットしたマウスで試験した各時点において、肝臓、肺および血液中のペプチドは有意に少なかった（Rossiら、Clin Cancer Res．2005年；11（別冊19）：7122s-7129s）。これらのデータから、後に投与されるペプチドに結合する可能性のある残余フラグメントを全く残すことなく、正常器官から効率よくＴＦ２が除去されることが示される。
【０３６３】
腫瘍による高い取り込みと正常組織による低いレベルが相まって、優れた腫瘍：非腫瘍比（Ｔ／ＮＴ）が生じ（表５）、したがってＴＦ２が、ジ−ＨＳＧをベースにしたエフェクターをＣＥＡ産生腫瘍に局在させる好適なプレターゲット剤として有効であることが立証された。
【０３６４】
実施例１８．グルタチオン酸化還元系を利用するＴＦ２の生成
上記実施例１３および１４に開示された方法への代替的態様として、ＴＦ１またはＴＦ２などの安定なテザー構造体はグルタチオン酸化還元系を利用して生成し、安定なテザー構造体を一緒に連結する特異的ジスルフィド結合を形成してもよい。
【０３６５】
ＴＦ２を生成する簡略化された効率的な方法は以下のように完成した。全工程を室温で行った。（タンパク質Ｌで精製した）Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４および（ＩＭＰ−２９１で精製した）ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を最初に、おおよその化学量論濃度で１ｍＭのＥＤＴＡおよびＰＢＳ、ｐＨ７．４に混入した。還元したグルタチオンを添加し、終濃度１ｍＭにした。３０分後、酸化グルタチオンを添加し、終濃度２ｍＭにした。ＢＩＡＣＯＲＥ分析により、ＴＦ２形成は、酸化グルタチオンの添加２分後に５０％完成され、４時間以内に１００％完成されることが明らかになった。上記実施例１４記載のとおり、ＴＦ２はＩＭＰ−２９１アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ほぼ均質にした。
【０３６６】
実施例１９．顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の部位特異的ペグ化
組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（１４ｋＤａ）を、様々な血液疾患を治療するため臨床的に使用する。現在のＧＭ−ＳＣＦ産物の限界は、血液循環中の半減期が短いことであり、したがって効果を最適にするために患者に毎日注射投与する必要がある。タンパク質治療の循環中半減期を延長するために用いられてきた１つのアプローチは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でタンパク質を修飾し有効なサイズを増加させることである。しかしながら、ＰＥＧをタンパク質とコンジュゲートさせることで公知の既存方法はすべてに最適というわけではなく、通常目的のタンパク質を改変して部位特異的カップリングを可能にすることを必要とする（Dohertyら、Bioconjugate Chem．2005年、16：1291-1298）。このような修飾を利用しても、コンジュゲートの収率は不規則であり、得られた産物は均質でないことがある。
【０３６７】
定量的な収率でのＧＭ−ＣＳＦの部位特異的ペグ化は、以下に概説するＤＮＬ技術で実現可能となる。ＤＤＤ２配列はスペーサーを介してＧＭ−ＣＳＦのＣ末端に融合してＧＭ−ＣＳＦの二量体を産生し、ＰＥＧとコンジュゲートするＡＤ２に対するドッキング部位を生成してＰＥＧ−ＡＤ２を得る。ペグ化ＧＭ−ＣＳＦの形成は、ＴＦ２で記載したものと類似した条件下でＧＭ−ＣＳＦ−ＤＤＤ２およびＰＥＧ−ＡＤ２を結合することによって生じる。血液循環中半減期の延長以外にも、ペグ化産物におけるＧＭ−ＣＳＦの二量体構造は、ＧＭ−ＣＳＦの現在の単量体型よりも効果があるはずであることを留意されたい。この方策は他のサイトカイン（組み換えヒトＩＬ−２など）、酵素（組み換えヒトアルギナーゼなど）、あるいは生物学的に活性なペプチド（トロンボポイエチン受容体のペプチドアゴニスト：Cwirtaら、Science 1997年、276：1696-1699を参照）または、治療効率を促進するために長い血液循環半減期を必要とするペプチド模倣薬に応用できる。
【０３６８】
実施例２０．免疫ＰＣＲ、ＬＡＭＰおよびＩＤＡＴに応用した生体分子の部位特異的共有結合性ライゲーション
共有結合性ＤＮＡ標識抗体は、ＰＣＲでのアッセイ応答の増幅に有用である（Nucl．Acid Res．1995年、23：522-529；Nicl．Acid Res．1999年、27：4553-4561）。このようなキメラは共役化学によって調製することが可能であり、未知のライゲーション部位による不確定な化学量論の産物が得られ、定量が好ましくない結果になることがよくある。最近、明確なＤＮＡ−タンパク質キメラ（オタマジャクシと称する）を産生する方法を開発し（Burbulisら、Nat．Methods 2005年、2：31-37）、分子が少数でも検出し計数することが可能であることが分かった。オタマジャクシ法は、二本鎖ＤＮＡフラグメントを目的のタンパク質に部位特異的に共有結合させるインテイン化学を含む複雑なスキームを使用している。本方法および組成もまた部位特異的方法でＤＮＡをタンパク質に共有結合させることに適用することが可能であり、明確な組成の均質な産物が得られ、しかもオタマジャクシ法よりもかなり簡単である。結合するＤＮＡを変えることによって、免疫ＰＣＲ、ＬＡＮＰ（ループ媒介等温増幅）：Nucl．Acid Res．2000年、28：e63を参照；またはＩＤＡＴ（T7 RNAにより増幅した免疫検出）：Proc．Natl．Acad．Sci．USA．2001年、98：5497-5502を参照；を利用して、本発明によって生成したＤＮＡ−タンパク質キメラは非常に少数（１００〜１０００）の分子を検出および定量することに用いることができる。
【０３６９】
試薬は以下のように生成する。
（ｉ）  ＤＤＤ２を目的の結合構造体（例えばｈＭＮ−１４Ｆａｂ、ｈＡ２０Ｆａｂ等）に融合させて成分Ａを調製する。
（ｉｉ）  スペーサー基を介してＡＤ２を選択の二本鎖ＤＮＡに化学的にコンジュゲートさせて成分Ｂを調製する。コンジュゲーションに即対応できるこのようなＤＮＡフラグメントの多くが市販されている。他のものは化学的に合成してもよい。
（ｉｉｉ）  チオール還元剤の存在下でＡとＢを結合し、その後酸化し最終産物を得る。この最終産物は、２つの同一サブユニットを含むＡの１つのコピーからなる。各サブユニットは標的分子の結合部位および適切なＰＣＲ技術で増幅されたＢの１つのコピーを有している。
【０３７０】
実施例２１．生物学的機能を持つナノ粒子
本開示は、特異的生物学的機能を持つ不活性の生体適合性材料をもたらす一般的および効率的な方法を提供する。相当の尽力がナノ粒子の理論的表面修飾および被覆に向けられ、薬物動態学的性質、毒性、免疫原性および標的能が調節されてきた。例えば、抗体またはペプチドとコンジュゲートすることで標的を定めるナノ粒子がインビトロにおける検知に成功したことが報告されている。しかしながら、インビボ応用では依然として多くの障害がある（Weissleder Rら、Nat．Biotechnol．2005年；23：1418-1423）。これら課題の１つとして、今まで入手できた化学物質が、特に部位特異的カップリング、急速表面修飾およびコスト削減に関して最適化されてない。このことは以下に概説するように実現可能である。
【０３７１】
表面に修飾された遊離アミノ酸を持つナノ粒子は、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド）およびスルホ−ＮＨＳ（スルホサクシンイミジルエステル）の存在下でＡＤ２の環状形態と反応することによって、Ｃ末端カルボキシル基を介してＡＤ２と結合する。精製後、ＡＤ２−ナノ粒子は、ＤＤＤ２と結合した目的の結合構造体を含むＡ成分と混合し、還元し、再酸化し最終産物を得る。この最終産物はＡから標的能を獲得し、ナノ粒子の特徴的な性質を保持している。有望な応用として、蛍光磁性粒子による標的細胞のインビボでの造影、および大きな多孔性粒子による標的細胞へのドラッグデリバリーがある（Tsapisら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．2002年、99：12001-12005）。
【０３７２】
実施例２２．ＤＮＬ技術で可能となる新規な免疫薬
目的の細胞毒性薬のコンジュゲーションを可能にすることが知られているＢ成分としての融合タンパク質は、Ａ成分として産生されたターゲティングタンパク質とカップリングするために産生および使用することが可能であり、以下で概説するような新しいタイプの免疫薬が得られる。初めに、良好に発現した免疫グロブリンヒト軽鎖は骨格または担体タンパク質として選択され、Ｃ末端のＡＤ２配列に融合する。軽鎖二量体の形成を防止するため、（Ｆｄ鎖とのジスルフィド結合を形成する）末端システインは、セリンと置換する。さらに、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位（トリペプチド配列Ｎ−Ｘ−Ｔ）を軽鎖へと設計して高収率で組み換え技術によって産生できるオリゴ糖の付加を可能にし、均質になるように精製し、適切な化学物質を介した薬物コンジュゲーションのための基質として使用した。これは例えばＳｈｉｈらがアミノデキストランとのアントラサイクリンのコンジュゲーションについて記述している（Cancer Res．1991年；51：4192-4198）。このような薬物を含むＢ成分は、ターゲティングおよび内在化機能を有する結合構造体に連結したＤＤＤ２を含む様々なＡ成分と結合が可能である。あるいは、ＡＤ２で誘導体化された薬物含有アミノデキストランを好適なＡ成分と結合し、標的特異的薬物療法を可能にする。他の良好に発現した組み換え分子もまた、薬物コンジュゲーションのための骨格または担体タンパク質として選択することができる。
【０３７３】
実施例２３．死滅させるため病原を好中球に向ける
インフルエンザＡウイルス、カンジダ菌（Candida albicans）および大腸菌（E. coli）を含む様々な病原から引き起こされる疾患の治療に有用である可能性がある広範な抗感染薬は近年、組み換えヒトサーファクタントタンパク質フラグメントＤ（ｒｆｈＳＰ−Ｄ）および抗ＣＤ８９抗体のＦａｂについて報告されている（Tackenら、J．Immunol．2004年、172：4934-4940）。ＤＮＬ技術は、死滅させるため病原を好中球に向けることもできる安定なテザーコンジュゲートを産生するのに使用が可能である。α−ヘリックスのコイルドコイルネックドメイン（α-helical coiled coil neck domain）およびＣ末端炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を含むｈＳＰ−Ｄの切断されたフラグメントは、Ｎ末端ＤＤＤ２に融合し、ＣＲＤを介して病原に多面的に結合するＡ構造体を生成する。好中球にあるＦｃＲｓに対して標的を定めるために、Ａ構造体を抗ＣＤ８９ＦａｂおよびＡＤ２の融合タンパク質から成るＢ成分に連結し、ｈＳＰ−Ｄの２つのＣＲＤおよび抗ＣＤ８９の１つのＦａｂから成る安定した複合体を得る。類似した抗感染薬類は、ヒトサーファクタントタンパク質Ａ（ｈＳＰ−Ａ）をｈＳＰ−ＤならびにＣＤ３およびＣＤ６４の抗体などの他の抗体と置換することで調製が可能である。
【０３７４】
実施例２４．ＤＮＬ技術で作成されたタンパク質マイクロアレイ
タンパク質マイクロアレイ技術における差し迫った問題は、その生物学的機能を維持しながらタンパク質をガラス表面に効率的に固定する着実な方法の開発を成功させることにある。タンパク質は好適な表面に適切にまた安定的に結合していない場合、活性を失う可能性があるので、マイクロアレイにおいてタンパク質の均一で安定した固定化を生む効果について多くの方策がなされてきた。例えば、Ｚｈｕらは酵母マイクロアレイのセミナーで、（Ｈｉｓ）６標識タンパク質の部位特異的結合のためにＮｉ−ＮＴＡで被覆したガラススライドを使用した（Science 2001年；293：2101-2105）。しかしながら、（Ｈｉｓ）６標識とＮｉ−ＮＴＡの間の非共有的相互作用は、このタイプのマイクロアレイと適合する可能性があるごく限られた数のダウンストリームスクリーニング技術を可能にする。
【０３７５】
タンパク質の安定した部位特異的固定化のためのいくつかの代替的方策が以後報告されている。Ｍｒｋｓｉｃｈらは、ホスホン酸塩リガンドを表す自己組織化単層へのセリンエステラーゼ、クチナーゼの結合に基づく方策およびそれに続く、リガンドを酵素活性部位に共有的につなげる置換反応によって、固定化クチナーゼ融合タンパク質をホスホン酸塩含有ガラス表面に固定化した（Proc．Natl．Acad．Sci．USA．2002年；99：5048-5052）。Ｋｉｎｄｅｒｍａｎｎらに報告された他のアプローチ（Am．Chem．Soc．2003年；125：7810-7811）は、ヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）の通常とは異なるメカニズムに基づいていた。このメカニズムはアルキル基を、その基質であるアルキル化またはベンジル化グアニンからｈＡＧＴの反応性システイン残基へと移動するものである。ベンジル基を表面に結合するために、ｈＡＧＴの融合タンパク質は、特異的および共有的態様で自身を固定化する。
【０３７６】
ペプチド担体タンパク質（ＰＣＰ）を含む融合タンパク質を固定化する他の酵素をベースにした方策はＹｉｎら（J．Am．Chem．Soc．2004年；126：7754-7755）から報告されており、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（Ｓｆｐ）および表面に固定化されたホスホパンテテイニルコンジュゲートを利用したものである。アジドとホスフィノチオエステルが反応し安定したアミドを形成する、シュタウジンガーライゲーション（Staudinger ligation）による部位特異的タンパク質固定はSoellnerら（J．Am．Chem．Soc．2003年；125：11790-11791）によって明らかにされ、リボヌクレアーゼＳの切断された形態を利用している。タンパク質マイクロアレイを作成するためにアビジン被覆表面に後に固定化されるタンパク質の部位特異的ビオチン化のための、インテイン媒介化学反応を利用した改変法が、Ｔａｎら（Bioorg．Med．Chem．Lett．2004年；14：6067-6070）によって報告された。
【０３７７】
本開示は、既存の技術と比較して簡易な化学反応、高効率および多用途性などのいくつかの利点を有するタンパク質の部位特異的共有的固定化の一般的方法を提供する。タンパク質マイクロアレイを以下に概説するように作成できる。ＥＤＣおよびスルホ−ＮＨＳの存在下で反応性アミノ基を含む好適な表面をＡＤ２の環状形態で処理し、そのＣ末端カルボキシル基を介してＡＤ２と共有結合させる。その後ＡＤ２誘導体化表面を、親和性認識ドメイン（Ｆａｂフラグメントなど）およびＤＤＤ２を含む融合タンパク質と共にインキュベートし、還元し、再酸化し融合タンパク質の共有的部位特異的固定化が可能となる。金で被覆したガラススライドもまたＡＤ２の誘導体化で可能性がある。
【０３７８】
実施例２５．ＰＫＡおよびＡＫＡＰ非由来のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインで生成した多価の多特異的構造体
２つの基本的方策が想定される。第一の方策は、ＤＤＤおよびＡＤの代役をするのに適している可能性がある他の天然に存在するタンパク質−タンパク質相互作用ドメインを調査および評価することに依存している。例えば、ＨＮＦ−１αのＮ末端二量化ドメインはＤＤＤに代わってもよく、ＨＦＮ−１に対する二量化補因子はＡＤに代わってもよい。２つ目の方策を以下に概説する。
【０３７９】
ヒトｐ５３は別個機能ドメインから成るモジュラータンパク質である。四量体化ドメインと称されるヒトｐ５３のＣ末端残基３２５〜３５５(ｐ５３ｔｅｔ)（スキームＩ）は、溶液中に四量体を自発的に形成し、実際、２つのダイマー間に弱い親和性（Ｋｄは〜２ｕＭ）を持つ二量体の二量体である。しかしながら、各二量体の２つの単量体は１０−１５Ｍよりも低いと報告されているＫｄで強く結合されている（Brokxら、J．Biol．Chem．2003年、278：2327-2332）。したがってｐ５３ｔｅｔを含む融合タンパク質は、ＰＫＡのヒトＲＩＩαのＤＤＤ配列を含む融合タンパク質のように、非常に強く結合した二量体を形成することが期待される。第二の構造体をｐ５３ｔｅｔの二量体にライゲーションするために、Ｋｄが１ｕＭ以下で１５〜５０残基を含むｐ５３ｔｅｔに対する結合ペプチドを、酵母２ハイブリッドシステムまたは好適なファージ提示ライブラリーを利用して選択する。最も親和性の高い（すなわちＫｄ値が最も低い）ペプチドを必要に応じてシステインで誘導体化し、ｐ５３ｔｅｔの二量体に安定的につなぐことのできる目的のタンパク質に融合する。
スキームＩ
ＧＥＹＦＴＬＱＩＲＧＲＥＲＦＥＭＦＲＥＬＮＥＡＬＥＬＫＤＡＱＡ（配列番号２８）
【０３８０】
【表１６】
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【０３８１】
【表１７】
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【０３８２】
【表１８】
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【０３８３】
【表１９】
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【０３８４】
【表２０】
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【０３８５】
【表２１】
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【０３８６】
【表２２】
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【０３８７】
【表２３】
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【０３８８】
【表２４】
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【０３８９】
【表２５】
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【０３９０】
【表２６】
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【図面の簡単な説明】
【０３９１】
【図１】二つの代表的なＤＤＤ配列を示す。ＤＤＤ１（配列番号１）の下線の配列は、ヒトＰＫＡのＲＩＩａに見出される最初の４４アミノ末端残基に相当する。ＤＤＤ２（配列番号２）はＤＤＤ１とＮ−末端では２アミノ酸残基異なっている。
【図２】二つの代表的なＡＤ配列を示す。ＡＤ１（配列番号３）の下線の配列は、０．４ｎＭのＫｄと共に報告された、最適化されたＲＩＩ−選択的ペプチドである、ＡＫＡＰ−ｉｓに相当する。ＡＤ２（配列番号４）も示す。
【図３】ＲＩＩのＤＤＤとＡＫＡＰのＡＤの間の相互作用の構造モデルを示す。
【図４】Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（Ａ）およびＤＤＤ２を介した二量化によって形成されたａ２推定構造を示す（Ｂ）の模式図を示す。
【図５】Ｎ−ＤＤＤ２−ＶＨ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２プラスミド発現ベクターのデザインを示す。
【図６】Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（Ａ）およびＤＤＤ２を介した二量化によって形成されたａ２推定構造を示す（Ｂ）の模式図を示す。
【図７】Ｃ−ＤＤＤ２−ＶＨ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２プラスミド発現ベクターのデザインを示す。
【図８】ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２の模式図（Ａ）およびその推定構造（Ｂ）を示す。
【図９】ｈ６７９−ＶＨ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２プラスミド発現ベクターのデザインを示す。
【図１０】ＩＭＰ−２９１−Ａｆｆｉｇｅｌによって精製したｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【図１１】ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２ｄｓ（Ａ）のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（Ｂ）への、還元による活性化を模式的に表す。
【図１２】ＣＢｉｎｄＬ（プロテインＬセルロース）を用いて精製Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４におけるａ４型の主たる存在を示す。ＳＥ−ＨＰＬＣの痕跡はまた、ａ２型および単量体および二量体の両者の遊離軽鎖の存在を明らかにする。
【図１３】５ｍＭＴＣＥＰを用いての還元時、精製されたＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４に存在するａ４型からａ２型への分離を示す。これは二量体の軽鎖を単量体の軽鎖へ変換する。
【図１４】還元時ａ４型（Ａ）におけるＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４のａ２型（Ｂ）への変換の模式図である。
【図１５】ＣＢｉｎｄＬ（プロテインＬセルロース）を用いて精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４におけるａ４型の主たる存在を示す。ＳＥ−ＨＰＬＣの痕跡はまた、ａ２型および単量体および二量体の両者の遊離軽鎖の存在を明らかにする。
【図１６】５ｍＭＴＣＥＰを用いての還元時、精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４に存在するａ４型からａ２型への分離を示す。
【図１７】還元条件下Ｎ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を混合した時に形成される非共有結合ａ２ｂ複合体の模式図（Ａ）およびジスルフィド架橋によって形成された共有結合ＴＦ１構造（Ｂ）を示す。
【図１８】ＴＦ１の作成に関与するステップのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。パネルＡはＴＣＥＰを加える前のＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を含む反応混合物を示す。パネルＢは５ｍＭＴＣＥＰを加えた後の非共有結合ａ２ｂ複合体の形成を示す。パネルＣは１０％ＤＭＳＯ処理後のジスルフィド結合産物を示す。パネルＤはＩＭＰ−２９１−アフィニティクロマトグラフィーおよび調製型ＳＥ−ＨＰＬＣ後のＴＦ１の純度を示す。
【図１９】共有結合ＴＦ１構造体のみが、ＢＩＡコア分析に用いられた条件下で、ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９としてセンサーチップ上に固定されている）およびＷＩ２（ｈＭＮ−１４に対して抗−ｉｄ）の両者と結合可能であることを示す。Ｎ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ１の間に形成された非共有結合ａ２ｂ複合体は、ＨＳＧ−の結合したセンサーチップに結合するが、ＷＩ２を捕らえることができなかった。
【図２０】ＷＩ２の二つのＦａｂ分子と結合できるので、ＴＦ１はｈＭＮ−１４の二つの機能的な結合部位を含むことを示す。
【図２１】ＢＩＡコア分析に用いられる条件下、ＨＳＧ（ＩＭＰ−２３９としてセンサーチップに固定されている）およびＷＩ２（ｈＭＮ−１４に対する抗−ｉｄ）の両者と結合できる安定構造体（Ｎ−ＤＤＤ２＋ＡＤ２）の形成をもたらす、成分ＡおよびＢのＤＤＤおよびＡＤ配列における、戦略的に配置されているシステイン残基の効果を示す。成分Ａが、ＤＤＤおよびＡＤの特異的な結合の後、成分Ｂとジスルフィド結合を形成できなかった場合、結果として得られるａ２ｂ複合体は、ＢＩＡコア分析に用いられる条件下では共に結合しているため、充分に安定では無い。ａ２のｂからの分離は複合体（Ｎ−ＤＤＤ１＋ＡＤ２）がＷＩ２を捕らえる事ができない事から明白である。
【図２２】ＩＭＰ−２９１によるアフィニティ精製の前（Ａ）および後（Ｂ）のＴＦ１のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。ＩＭＰ−２９１よるアフィニティ精製後、遊離ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２が安定なテザー複合体と共に精製されない事を保証するために、過剰のＮ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と混合させた。
【図２３】ＴＦ２の模式図である。
【図２４】ＴＦ２の作成に関与するステップのＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。パネルＡは、ＴＣＥＰを加える前のＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４およびｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を含む反応混合物を示す。パネルＢは、５ｍＭＴＣＥＰ添加後の非共有結合ａ２ｂ複合体の形成を示す。
【図２５】ＴＦ２のＩＭＰ−２９１よるアフィニティ精製のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。パネルＡはＩＭＰ−アフィジェルに加える前のＴＦ２を示す。パネルＢは非結合画分を示す。パネルＣはＴＦ２のみを含む、結合画分を示す。
【図２６】ＴＦ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの（Ａ）非還元および（Ｂ）還元分析を示す。
【図２７】ＴＦ２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を示す。
【図２８】ＢＩＡコア分析によるＨＳＧ（センサーチップに固定されている）およびＷＩ２の両者に対するＴＦ２の結合を示す。
【図２９】ＷＩ２の二つのＦａｂ分子と結合できるので、ＴＦ２はｈＭＮ−１４の二つの機能的な結合部位を含むことを示す。
【図３０】ＴＦ１、Ｆ２およびｈＭＮ−１４  ＩｇＧのＣＥＡに対する結合力を比較する競争ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３１】プールしたヒト血清中における７日間のＴＦ２の安定性の監視の結果を示す。濃度または二重特異的結合活性における検出可能な変化は、観察されなかった。
【図３２】ＴＦ２で前に標的化した９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５を用いて注射したヌードマウスの生体画像を示す。雌胸腺欠損ヌードマウスに、一匹当たり１ｘ１０７ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍細胞を皮下注射した。一週間後、平均腫瘍サイズは、０．１０５±０．０６８ｃｍ３であった。２０匹のマウスの一群に８０μｇの１２５Ｉ−ＴＦ２（５００ｐｍｏｌ，２μＣｉ）を注射し、ＴＦ２後１６時間に９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（４０μＣｉ、９２ｎｇ、５０ｐｍｏｌ）を投与した（画像の上列）。マウスの第二群には、ＴＦ２なしに、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５のみを投与した（画像の下列）。９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の注射後１、４および２４時間後に撮られた画像は、ＴＦ２が腫瘍に局在した強い腫瘍特異的なシグナルを示した（上列）。腫瘍の他には、膀胱のみが、１時間後に強いシグナルを示し、尿における排出を示唆した。ＴＦ２が存在しない場合は、非特異的な分布のみが観察された（下列）。データはＴＦ２がin vivoの応用では高度に安定であることを示し、優れた腫瘍画像を提供することを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月6日(2007.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定なテザー構造体を含む組成物であって、該構造体は
ａ）ホモ二量体のそれぞれの第一単量体が、二量化および第一前駆体に結合するドッキングドメイン（ＤＤＤ）を含む該ホモ二量体；
ｂ）第二前駆体に結合しているアンカードメイン（ＡＤ）を含み、該ＡＤが共有結合であるいは非共有結合で該ＤＤＤに結合している第二単量体
を含む組成物。
【請求項２】
該ＡＤがジスルフィド結合でＤＤＤに結合する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
該ＤＤＤが該第一前駆体に共有結合しており、該ＡＤが該第二前駆体に共有結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
該第一単量体が、該第一前駆体とＤＤＤを含む融合タンパクであり、および該第二単量体が該第二前駆体とＡＤを含む融合タンパクである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
該第一前駆体がＤＤＤに化学的に架橋しており、該第二前駆体がＡＤに化学的に架橋している、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
該第一および第二前駆体が、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、siＲＮＡ、オリゴ糖、天然または合成重合物質、ナノ粒子、量子ドット、有機あるいは無機化合物からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
該タンパクが、バクテリア毒素、植物毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンーＡ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス菌体外毒素、シュードモナス菌体内毒素、ランピルナーゼ（Ｒａｐ）、Ｒａｐ（Ｎ６９Ｑ）、ＰＥ３８、ｄｇＡ、ＤＴ３９０、ＰＬＣ、ｔＰＡ、サイトカイン、増殖因子、可溶性レセプター成分、界面活性タンパク質Ｄ、ＩＬ−４、ｓＩＬ−４Ｒ、ｓＩＬ−１３Ｒ、ＶＥＧＦ１２１、ＴＰＯ、ＥＰＯ、血栓溶解剤、酵素、蛍光タンパク、ｓＴＮＦα−Ｒ、アビマー、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびナノボディからなる群から選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
該第一および第二前駆体が、抗体、ＩｇＧ抗体、抗体フラグメント、モノクローン抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、抗体の抗原結合領域、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、単鎖抗体およびＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
該抗体フラグメントが、ｈＭＮ−１４、Ｌ１９、ｈＡ２０、ｈＬＬ２、Ｌ２４３、ヒト化ＣＣ４９、７Ｅ３、ｈＬＬ１、ｈＰＡＭ４、ｈＲＳ７、ｈＲ１、Ｌ４９、抗−ＣＤ１４、抗−ＣＤ１１１、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）、Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）およびｈＭＮ−１５の該抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
該ＤＤＤの配列が、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調整サブユニットに由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
該ＡＤの配列が、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）の配列に由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
該ＤＤＤ配列が、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調整サブユニットに由来し、およびＡＤ配列が、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）の配列に由来する、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
該第一および第二前躯体が、同じ抗原に対してまたは二つの異なった抗原に対して親和性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
該抗原が、カルボニックアンヒドラーゼＩＸ、アルファフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に対する特異的抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、結腸特異的抗原タンパク質−Ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−Ｉ、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＦＩｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸レセプター、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−１）、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−１−抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ−４抗体に対する特異的抗原、胎盤増殖因子、ｐ５３、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、ＳｌＯＯ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テナスシン、ＴＲＡＩＬレセプター、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、１７−ｌＡ−抗原、血管新生マーカー、発癌遺伝子マーカーまたは発癌遺伝子産物からなる群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
該第一前駆体が、腫瘍関連抗原に対する結合部位を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
該第二前駆体が、ハプテンに対する結合部位を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
該ハプテンが、治療剤に結合している、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
該共有結合または非共有結合によって、該安定なテザー構造体にコンジュゲートしている一つ以上のエフェクターまたは担体を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
該エフェクターが、診断剤、治療剤、化学療法剤、放射性同位体、造影剤、抗血管新生剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、薬剤、プロドラッグ、酵素、ＲＮアーゼ、結合分子、アプタマー、細胞表面レセプターに対するリガンド、キレート剤、免疫調節物質、オリゴヌクレオチド、ホルモン、光検出標識、色素、ペプチド、毒素、コントラスト剤、常磁性標識、超音波標識、アポトーシス促進剤、リポソーム、ナノ粒子、ワクチンまたはそれらの組み合わせである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
該安定なテザー構造体が、二つ以上のエフェクターまたは二つ以上の担体に結合している請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
病状を治療するための薬剤の製造のための、請求項１記載の安定なテザー構造体の使用。
【請求項２２】
該状態が、癌、炎症、感染、過形成、感染、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、リューマチ性関節炎、サルコイドーシス、喘息、浮腫、肺高血圧症、若年性糖尿病、乾癬、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、敗血症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、Osler-Webber症候群、心筋血管新生、プラーク新血管形成、再狭窄、血管外傷後新生内膜形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、慢性炎症関連線維症、肺線維症、深静脈血栓症または創傷肉芽形成である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
該状態が癌であり、該第一前駆体が腫瘍関連抗原に結合親和性を有する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
該第二前駆体がハプテンに親和性を有する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
該ハプテンが、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、放射性同位体、免疫調節物質、ホルモン、結合分子、脂質、ポリマー、ミセル、リポソーム、ナノ粒子またはこれらの組み合わせ、からなる群から選択される剤と結合している、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
該安定なテザー構造体が、抗−ＣＤ７４Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ７４Ｘ  抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ２２Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ  抗−ＨＬＡ−ＤＲ、抗−ＣＤ１９Ｘ  抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２０Ｘ  抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ２Ｘ  抗−ＣＤ２５、抗−ＣＤ８Ｘ  抗−ＣＤ２５、および抗−ＣＤ２Ｘ抗−ＣＤ１４７、からなる群から選択される抗体または抗体フラグメントの組み合わせを含む、請求項２１記載の使用。
【請求項２７】
該第一および／または第二前駆体が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＣＡ−１２５、ＴＡＧ−７２、ＥＦＧＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦ−ＩＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＤＧＦＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＮＧＦＲ、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、テネイシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、カルボニックアンヒドラーゼＩＸおよびＩＬ−６からなる群から選択される抗原に対して結合親和性を有する、請求項２１記載の使用。
【請求項２８】
安定なテザー構造体を製造する方法であって：
ａ）第一前駆体と結合した、ｃＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調整サブユニットに由来する、ＤＤＤ配列を有する第一単量体を提供すること；
ｂ）第二前駆体と結合した、Ａキナーゼアンカータンパク（ＡＫＡＰ）に由来する、ＡＤ配列を有する第二単量体を提供すること；
ｃ）安定なテザー構造体を形成させるために、二つのＤＤＤ配列がそれぞれＡＤ配列と結合するのを可能にする条件下で、該第一単量体を該第二単量体にさらすこと、
を含む方法。