(57)【要約】  本発明は、以下の反応により、アロエレシンＡをアロエシンに加水分解で変換する方法に関する。その結果、アロエ植物の液汁からの抽出物として入手可能なアロエシンの量は増大され、そしてアロエシンの抽出及び精製はより有用でありかつ費用も安い。アロエシンはアロエレシンＡより商業的に価値が高いので、当該方法は、アロエ植物からの液汁又はアロエビターの商業的価値も増大する。本発明は、場合により、ｐ−クマリン酸からアロエシンを分離するステップも含む。当該方法において使用される典型的な加水分解ステップは、酸加水分解、塩基加水分解、及び酵素加水分解である。酸加水分解の場合、当該酸は、塩酸、硫酸、硝酸、若しくはリン酸の如きいずれかの好適な有機酸又は無機酸である。酵素加水分解の場合、当該加水分解酵素は、典型的には、エステラーゼ、リパーゼ又はプロテアーゼである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロエレシンＡの少なくとも一部をアロエシン、及びｐ−クマリン酸に加水分解するステップを含む、アロエレシンＡをアロエシンに転換するための方法。
【請求項２】
ｐ−クマリン酸からアロエシンを分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アロエレシンＡをアロエシンに加水分解するステップが、酸加水分解を使用して実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アロエレシンＡをアロエシンに加水分解するステップが、酵素加水分解を使用して実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
有機酸が、前記酸加水分解のために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
無機酸が、前記酸加水分解のために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記酸が、塩酸、硫酸、硝酸、及びリン酸からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素加水分解を実施するために使用される酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼ、ＥＳＬ００１−０２（登録商標）、ＮＯＶＯ３８８（登録商標）、及びＭｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼからなる群より選択される、請求項４又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼ酵素が、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）又はＢｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アロエレシンＡが、副産物を形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アロエレシンＡが、ポリマーを形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記アロエレシンＡが、いずれかの種のアロエ植物から得られる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アロエレシンＡが、Ａ．ｆｅｒｏｘ種から得られる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アロエレシンＡが、Ａ．ｆｅｒｏｘ種から得られる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アロエレシンＡが、アロエ植物の葉から作られた液汁から入手される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アロエレシンＡが、部分的に精製されたか、又は精製された型である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
約０．５Ｎ〜約１０Ｎの酸濃度において実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
約２Ｎ〜約５Ｎの酸濃度において実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記加水分解ステップが、約２０℃〜約１２１℃の温度で実施される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記加水分解ステップが、約９０℃の温度で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記加水分解ステップが、約３０℃〜約９０℃の温度で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記加水分解ステップが、約３７℃の温度で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前記加水分解ステップが、約７０℃の温度で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
緩衝液が使用される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝液が、リン酸ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液又は水である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記緩衝液が、約４〜約８のｐＨ範囲におけるｐＫａを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記緩衝液濃度が、約０．０１Ｍ〜約１Ｍの範囲内である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記緩衝液濃度が、約０．１Ｍである、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
有機溶媒が、前記加水分解ステップに添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項３１】
前記有機溶媒が、エタノール又はアセトンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記有機溶媒の濃度が、約１０〜約５０％（ｖ／ｖ）である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記有機溶媒の濃度が、約３０％（ｖ／ｖ）である、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
アロエ植物の液汁からアロエシンを抽出する方法であって、以下のステップ：
アロエ植物における少なくとも一部のアロエレシンＡを、アロエシン及びｐ−クマリン酸に加水分解し；そして
液汁の自然発生的なアロエシン、及び前記アロエレシンＡから転換されたアロエシンから抽出する
を含む、上記方法。
【請求項３５】
前記アロエ植物が、Ａ．ｆｅｒｏｘ種のものである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アロエレシンＡが、酸加水分解によりアロエシンに加水分解される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アロエレシンＡが、酵素水分解によりアロエシンに加水分解される、請求項３４又は３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、アロエレシンＡをアロエシンに転換するための方法に関する。
【０００２】
アロエは、その３００種超が存在するとして知られる多肉植物であり、その大半はアフリカ原産である。アロエ由来の製品は、何世紀にも渡って伝統薬において使用され、特に、やけど、傷、及び他の外傷の治療のための皮膚病の適用において使用されている。近代的治療観察結果は、抗炎症活性、抗腫瘍活性、抗酸活性、抗糖尿病活性、チロシナーゼ抑制活性、及び抗酸化活性を含む。アロエ製品は、特に、昨今の天然物の人気増大につれて、美容品、及び健康食品業界においても広範囲に使用される。
【０００３】
そこから医薬、治療、又は皮膚、美容適用が得られるアフリカのアロエの主な種は、南アフリカの限定種であるＡｌｏｅ  ｆｅｒｏｘである。アロエの他種も似たような目的のために使用される。Ａｌｏｅ  ｖｅｒａは、スキンケア製品、シャンプー、及び健康飲料において米国内で広範囲に使用される。しかしながら、Ａ．ｆｅｒｏｘは、Ａ．ｖｅｒａより優れたいくつかの特性を有することがわかっている。例えば、Ａ．ｆｅｒｏｘは、Ａ．ｖｅｒａより高いカルシウム、及びアミノ酸含量を有する。栽培されたＡ．ｆｅｒｏｘ植物の切断された葉は、側で育っているＡ．ｖｅｒａ植物よりも２０倍超の重量／重量の苦味のある液汁を産生する。Ａ．ｆｅｒｏｘの葉は非常に厚くかつ広いので、１枚の葉あたりの苦味のある液汁の総産生量がより多い。Ａ．ｆｅｒｏｘから回収されるゲルの量も、Ａ．ｖｅｒａからのものよりも、常に量が多い。
【０００４】
当該アロエの特定成分を分離するために多くの方法が存在する（例えば、米国特許第４，７３５，９３５号、及び同第４，６５６，０２９号を参照のこと）。アロエの商業用製品は、アロエの葉により製造された液汁から入手され、そして当該液汁はその苦味に起因してアロエビターと呼ばれる。当該液汁を収集し、そして当業者に知られる慣習的方法により乾燥させ、アロエビター又はケープアロエ（Ｃａｐｅ  Ａｌｏｅ）として知られる暗褐色の固形物質を製造する。
【０００５】
商業的アロエビターは、４つの主成分、すなわち、アロインＡ、アロインＢ、アロエシン、及びアロエレシンＡを含む。
【０００６】
Ａ．ｆｅｒｏｘの葉浸出液における主な化合物の全体組成は、特にこの種の形態多様性、及び広範な自然分布領域を考慮しても、かなり不変のものである。Ａ．ｆｅｒｏｘにおいて、アロエレシンＡ、アロエシン、及びアロイン（Ａ、及びＢの両方のエピマー）は、各々約４：３：２の比率において、総乾燥重量の７０％〜９７％に寄与する。
【０００７】
アロインＡ及びＢ（又はバルバロイン）は、通常選択的抽出によりアロエビターから単離され、そして下剤として主に使用される。アロエシンはアロエビターからも単離され、皮膚美白、及び日焼け防止剤として使用される（米国特許第４，６５６，０２９号）。アロエレシンＡは、通常処分される。それ故、アロエレシンＡはアロエ液汁に最も多量に存在するけれども、商業的はほぼ又は全く無い。それ故、当該アロエレシンＡをより高い商業的価値を有する化合物へ転換することは有意義なことであろう。
【０００８】
以下の記載において、アロエ液汁へのいかなる言及も、アロエビター又はアロエビター抽出物を言及することを目的とする。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の概要
本発明の第１態様において、アロエレシンＡの少なくとも一部をアロエシン、及びｐ−クマリン酸に加水分解するステップを含む、アロエレシンＡをアロエシンに転換するための方法を提供する。
【００１０】
当該方法は、ｐ−クマリン酸からアロエシンを分離するステップをさらに含み得る。
【００１１】
当該アロエレシンＡをアロエシンに加水分解するステップは、酸加水分解を使用して実施され得る。
【００１２】
あるいは、当該アロエレシンＡをアロエシンに加水分解するステップは、加水分解酵素を使用して実施され得る。
【００１３】
酸加水分解の場合、当該酸は、いずれかの有機酸又は無機酸となり得る。特に、当該酸は、塩酸、硫酸、硝酸、及びリン酸からなる群より選択される１又は複数の酸となり得る。
【００１４】
酵素加水分解の場合、当該加水分解酵素は、エステラーゼ、リパーゼ又はプロテアーゼとなり得る。
【００１５】
特に、当該加水分解酵素は、アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼ、ＤｉｖｅｒｓａのＥＳＬ００１−０２（登録商標）、ＮｏｒｄｉｓｋのＮＯＶＯ３８８（登録商標）、及びＡｌｔｕｓ  Ｃｈｉｒｏｓｃｒｅｅｎキット（登録商標）のＭｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼからなる群より選択される。より特には、当該酵素は、Ｑｕｅｓｔ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＡｍａｎｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）又はＢｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）のいずれかとなり得、両方はアスペルギルス・オリザエ由来のプロテアーゼである。
【００１６】
あるいは、当該酵素は、上述の酵素のいずれか１つのＤＮＡ又はアミノ酸配列、あるいはその部分配列に少なくとも実質的に一致するＤＮＡ又はアミノ酸配列によりコードされる酵素となり得る。
【００１７】
当該酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列は、上記酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列と少なくとも７０％相同性を有し得る。
【００１８】
当該酵素は、固形か液体状態のどちらかとなり得る。
【００１９】
好ましくは、アロエレシンＡは、副産物を形成せずに、特にポリマーを形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される。
【００２０】
アロエレシンＡは、アロエ植物のいずれかの種、特にＡ．ｆｅｒｏｘ種又はＡ．ｖｅｒａ種、及びさらに特にはＡ．ｆｅｒｏｘ種から入手され得る。
【００２１】
アロエレシンＡは、アロエ植物の葉より製造される液汁から入手され得る。当該液汁は、液体状態又は固形となり得る。
【００２２】
アロエレシンＡは、特に精製形態となり得る。
【００２３】
酸を使用する際の加水分解ステップは、約０．５Ｎ〜約１０Ｎの酸濃度範囲において実施され得、好ましくは２Ｎ〜５Ｎの酸濃度で実施される。
【００２４】
当該加水分解ステップは、約２０〜約１２１℃で実施され得、酸を使用する際、通常、約９０℃で実施される。加水分解酵素を使用するとき、当該加水分解ステップは、通常、約３７℃で実施される、例外として、ＥＳＬ００１−０２（登録商標）を使用するとき、当該加水分解ステップは約５０〜約９０℃、より好ましくは約７０℃で実施され得る。
【００２５】
緩衝液が、反応媒体において使用され得る。当該緩衝液は、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム緩衝液又は水、あるいは約４〜約８のｐＨ範囲にｐＫａを有するいずれかの他の緩衝液となり得る。当該緩衝液濃度は、０．０１Ｍ〜１Ｍの範囲となり得、好ましくは０．１Ｍである。
【００２６】
エタノール又はアセトンの如き有機溶媒が、約１０〜５０％の濃度、好ましくは約３０％の濃度で添加され得る。
【００２７】
本発明の第２態様において、アロエ植物の液汁からアロエシンを抽出するための方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む：当該アロエ植物におけるアロエレシンの少なくとも一部をアロエシン、及びｐ−クマリン酸に加水分解し；そして液汁自然発生的なアロエシン及びアロエレシンＡから転換されたアロエシンから抽出する。
【００２８】
当該アロエ植物は、Ａ．ｆｅｒｏｘ種のものとなり得る。当該液汁は、液体又は固形となり得る。
【００２９】
当該アロエレシンＡは、上記詳述した方法によって加水分解され得る。
【００３０】
本発明の第３態様として、上記詳述したように、アロエレシンＡをアロエシン、及びｐ−クマリン酸に加水分解することにより形成されるアロエシンを提供する。
【００３１】
当該アロエレシンＡは、当該アロエ植物の液汁由来、好ましくはＡ．ｆｅｒｏｘ種の液汁由来となり得る。
【００３２】
当該アロエシンは、上記詳述したように、自然発生的なアロエシン、及びアロエレシンＡから転換されたアロエシンの組合せとなり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の詳細説明
本明細書中に、アロエレシンＡをアロエシンに加水分解で転換するための方法を記載する。
【００３４】
アロエレシンＡは、ｐ−クマリン酸のアロエシニル（ａｌｏｅｓｉｎｙｌ）・エステルであり、出願人はアロエレシンＡをアロエシン（Ｃ−グリコシド−５−メチルクロモン）に効果的かつ経済的に加水分解し、その結果アロエ植物の液汁からの抽出としてのアロエシン有用量を増大することが可能であることを見出した。アロエシンはアロエレシンＡより商業的により価値が高いので、当該方法は、当該アロエ植物由来の液汁又はアロエビターの商業的価値をも増大させる。アロエレシンＡのアロエシンへの転換反応を以下に示す。
【００３５】
【化１】
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【００３６】
当該アロエレシンＡのアロエシンへの転換は、アロエシン、並びにアロエビター由来の副産物アロインＡ、及びアロインＢの選択的除去も促進する。アロエレシンＡの非存在下でのアロエシンの抽出、及び精製は、アロエレシンＡの存在下よりも、困難性、及び費用が非常に少ない、その理由として主な２つは、以下の通りである：（ａ）転換後、抽出され得るより多くのアロエシンが存在すること、及び（ｂ）転換後、たった２つの主成分（アロエシン、及びアロイン）をアロエビターから分離することが必要であり、そしてこれらは非常に異なる物理的特性を有しているので、アロエシンの選択的抽出がより容易になる。
【００３７】
当該方法は、ｐ−クマリン酸からアロエシンを分離するステップも含み得る。好適な分離ステップは、当業者にとって明らかであり、本明細書中において議論されるものではないだろうが、典型的な分離方法は、溶媒抽出、クロマトグラフィー、及び結晶化を含む。
【００３８】
当該方法において使用され得る加水分解ステップの例は、酸加水分解、塩基加水分解、及び酵素加水分解である。
【００３９】
酸加水分解の場合、当該酸は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などのいずれかの有機酸又は無機酸となり得る。
【００４０】
酵素加水分解の場合、当該加水分解酵素は、エステラーゼ、リパーゼ又はプロテアーゼとなり得、例えば、アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼ、ＤｉｖｅｒｓａのＥＳＬ００１−０２（登録商標）、ＮｏｒｄｉｓｋのＮＯＶＯ３８８（登録商標）（特に、製品中のプロテアーゼ混入物質）又はＡｌｔｕｓ  Ｃｈｉｒｏｓｃｒｅｅｎキット（登録商標）のＭｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼである。より好ましくは、当該酵素は、ＡｍａｎｏのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）かＱｕｅｓｔ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＢｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）のいずれかであり、両方ともアスペルギルス・オリザエ由来のプロテアーゼである。
【００４１】
あるいは、当該酵素は、上記酵素又はそれらの部分配列の内のいずれか１つのＤＮＡ又はアミノ酸配列と少なくとも実質的に一致するＤＮＡ又はアミノ酸配列によりコードされる酵素となり得る。当該酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列は、上記酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有する。当該酵素は固形又は液体状態のいずれかである。
【００４２】
アロエレシンＡは、通常、ポリマーの如き複産物を形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される。
【００４３】
当該アロエ植物のいずれの種も、アロエシンＡの源として好適であり、当該アロエ植物の葉により産生される液汁から入手される。当該液汁は液体又は固形となり得、当該アロエレシンＡは、精製型、部分精製型となり得、あるいはアロエ植物の液汁又は他の部分における非精製型となり得る。
【００４４】
当該加水分解ステップは、酸を使用するとき、通常、約０．５Ｎ〜約１０Ｎの酸濃度範囲において実施され、好ましくは、約２〜約５Ｎ酸濃度で実施される。約１０〜５０％、好ましくは約３０％の濃度におけるエタノール又はアセトンの如き有機溶媒は、場合により、当該反応過程に添加される。
【００４５】
当該加水分解ステップは、通常、約２０〜約１２１℃で実施され、そして酸を使用するとき、通常、約９０℃で実施される。加水分解酵素を使用するとき、当該加水分解ステップは、通常、約３７℃で実施され、例外として、酵素ＥＳＬ００１−０２を使用するとき、当該加水分解ステップは、約５０〜約９０℃、より好ましくは約７０℃で実施される。
【００４６】
緩衝液は、反応媒体において使用され得る。当該緩衝液は、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム緩衝液又は水、あるいは約４〜約８のｐＨ範囲にｐＫａを有するいずれかの他の緩衝液となり得る。当該緩衝液濃度は、約０．０１Ｍ〜１Ｍの範囲、好ましくは０．１Ｍである。
【００４７】
上記加水分解方法により得られたアロエシンは、局所的皮膚用組成物において使用され得る。当該アロインは、ヒト、及び獣医市場のための様々な組成物に使用され得る。
【実施例】
【００４８】
実施例において、塩酸、及び硫酸を使用しアロエレシンＡをアロエシンに加水分解する酸の能力を示し、そしてアスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼを使用しアロエシンへのアロエレシンＡの酵素加水分解を示した。
【００４９】
定量的ＨＰＬＣ方法を、本明細書に記載される加水分解過程の最適化の間、アロエレシンＡ、アロエシン、及びｐ−クマリン酸の量を測定するための分析ツールとして開発した。試験、及び結果の詳細を、以下の実施例において示す。
【００５０】
実施例１：ＨＣｌ、及びアセトンを使用する酸加水分解
アロエレシンＡを含むアロエ液汁（１５％）を、長時間かけて、アセトンの存在下又は非存在下、１．３又は５ＮのＨＣｌと共に９０℃で加水分解した。当該アロエ液汁中の基質の溶解度を増大するためにアセトンを使用した。当該反応液の一定分量（２０μｌ）を、一定の時間間隔で取り出し、３０％のアセトンを含むｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸緩衝液に添加した。サンプルの分析を、確立された方法を使用して、ＨＰＬＣにより実施した。
【００５１】
結果は、加水分解の比率は酸強度に依存していたこと、及び５ＮのＨＣｌを使用したとき４０％〜８０％の転換が達成されたことを示した。１０％のアセトンの存在は、加水分解をわずかに改良した。アロエレシンＡの消失比率は、酸強度が高ければ高いほど大きかった。当該結果は、９０〜９５％のアロエレシンＡが、３〜５ＮのＨＣｌで２時間以内に消失することも示した。
【００５２】
実施例２：ＨＣｌ又はＨ２ＳＯ４、及びエタノールを使用する酸加水分解
エタノールをアセトンの代わりとして使用した。アロエレシンＡを含むアロエ抽出物を、長時間にわたり、５０％（ｖ／ｖ）エタノールの存在下、１ＮのＨＣｌ又はＨ２ＳＯ４と共に９０℃で加水分解した。アロエ抽出物の量を、１０〜５０％（ｖ／ｖ）に変化させた。各反応物の一定分量（１ｍｌ）を表示された時間間隔で取り出し、そして０．５ｍｌの冷アセトンに添加した。サンプルの分析を、確立された方法を使用して、ＨＰＬＣにより実施した。
【００５３】
アロエレシンＡとアロエシンとの終止モルバランスは、加水分解する酸としてのＨ２ＳＯ４、及び３０％のアロエ液汁濃度を使用して、４時間反応後、８０％の範囲内であった（及びこの期間内でできるかぎり高かった）。終止モルバランスは、酸としてＨ２ＳＯ４を使用したとき、約１０％超だったが、モルバランスにおける損失は、ＨＣｌと比較してより素早く観察された。
【００５４】
実施例３：アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼを使用する酵素加水分解
アロエ抽出物又は精製アロエレシンＡにおける、アロエシンへのアロエレシンＡの酵素加水分解を予備的に最適化するために、条件変数を試験した。アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼを、加水分解酵素の例として選択し、そして２つのアスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼを試験した、一方はＡｍａｎｏのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）であり、他方はＱｕｅｓｔ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＢｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）であった。
【００５５】
Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）仕様書：
起源：Ａｓｐ．ｏｒｙｚａｅ（Ｎｏｎ−ＧＭＯ）
希釈剤：Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｉｎ  （Ｎｏｎ−ＧＭＯ）
希釈剤の濃度：約１５％
【００５６】
Ｂｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）仕様書：
最小４００，０００ＨＵＴプロテアーゼ  ｕ／ｇｍ
・総生存濃度＜５０，０００／ｇｍ
・酵母＆かび＜２００／ｇｍ
・Ｅ．ｃｏｌｉ：２５ｇｍｓ中なし
・サルモネラ菌：２５ｇｍｓ中なし
・ＦＣＣ＆ＪＥＣＦＡにより示されたような全ての他の国際規格
（重金属、鉛、ヒ素など）に適合
【００５７】
以下のパラメーターをスモールスケールに関して調べた。
酵素濃度：１〜５０ｍｇｌの酵素
アロエ抽出物：３ｍｌあたり１５μｌ〜２００μｌ
緩衝液型：リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム又は炭酸ナトリウム
緩衝液濃度：０．００１Ｍ〜１Ｍ
ｐＨ：４〜７
Ｔｗｅｅｎ濃度：０、１、及び１０％ｖ／ｖ
アセトン濃度：０〜５０％
【００５８】
通常、基質としてアロエ液汁を使用したとき、アロエシン濃度の少なくとも５０％増大を得た。
【００５９】
実施例４：アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼを使用する酵素加水分解
酵素としてＡｍａｎｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）又はＱｕｅｓｔ  Ｂｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）を使用して、１ｍｌ反応液あたり３ｍｇの純（９１％）アロエレシンＡに関して反応を実施した。当該調べたパラメーターは以下の通りであった。
酵素濃度：２、及び２０ｍｇ
緩衝液濃度：０．０１Ｍのリン酸ナトリウム
ｐＨ：５．５
【００６０】
反応を、２０時間超、振動しているアジテーター上で撹拌しながら、３７℃で実施した。アロエシンへのアロエレシンＡの完全な転換を達成した。
【００６１】
全ての反応について、３ｍｌの全反応液を分析のために提示した。当該サンプルを、水：メタノール：ＴＨＦ（２０：４０：４０）で２５ｍｌとし、ＨＰＬＣで分析した。
【００６２】
アスペルギルス・オリザエ・プロテアーゼは３７℃で最適に機能することを見つけ出した。アロエシン、及びｐ−クマリン酸へのアロエレシンＡの転換を、上記パラメーターを使用して最適化し、そして、アロエレシンＡがアロエシン、及びｐ−クマリン酸に完全に転換される条件を見つけ出した。４時間後、アロエシン含有量において１００％増大し、アロエレシンＡにおいて１００％低減した。それ故、当該転換は、基質として純アロエレシンＡを使用したとき、１００％の終止モルバランスで完了する。
【００６３】
実施例５：アロエシンのラージスクール製造
当該反応を、被覆撹拌槽、ガラス裏打ち反応器内で実施した。アロエ液汁を、窒素下、２モル濃度のＨＣｌ溶液の等価質量を使用して加水分解した。当該反応器を９０℃まで加熱し、そして温度を、約５．５時間、維持した。得られたアロエレシンの転換は、およそ３０％のアロエシンへの平均選択度を伴う、およそ９４％だった。
【００６４】
反応の終わりで、当該反応内容物を、被覆を通して冷水を透過させることにより７０℃に冷却した。この系を、４５％の苛性溶液（当該酸に対しておよそ０．７５当量）を使用して、およそｐＨ４．５に中和した。
【００６５】
当該反応器を２８℃までさらに冷却し、そして撹拌を止めた。当該反応混合物を２相への分離に供した。水層（加水分解物といわれる）が底に固定され、そして固形物を含む上層（上層といわれる）が上に固定された。当該加水分解物を保持槽に排水した。
【００６６】
当該上層を、撹拌しながら、窒素と共に酸素を供給し、その後、水を添加した。次いで、当該反応器内容物を水の等価質量で洗浄した。当該反応器を、２５℃で、３０分間撹拌し、次いで、さらに３０分間、放置した。
【００６７】
当該混合物の分離を、上部に残る上層と共に、２５℃で実施した。水層を保持槽に排水した。水洗浄物を、先に排水された加水分解物と混合した。反応後のストリームから回収された総アロエシンは、およそ８４％だった。
【００６８】
残余固形物を、１０％の苛性溶液中への溶解により、当該反応器から除去した。次いで、当該洗浄溶液を排出し、廃棄物として処理した。
【００６９】
本発明は、本明細書中の記載のように、正確な詳細まで限定することを目的としない。例えば、出願人は、試験された酸又は酵素の化学的又は生化学的に同等の酸及び酵素の如き、他の加水分解剤も、当該加水分解反応に使用されることを企図する。
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月2日(2007.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロエ植物のアロエビターからアロエシンを抽出する方法であって、以下のステップ：
前記アロエビター中のアロエレシンＡを、アロエシン及びｐ−クマリン酸に加水分解し；そして
前記アロエビターの自然発生的なアロエシン、及び前記アロエレシンＡから転換されたアロエシンから選択的に抽出する
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記アロエ植物が、Ａ．ｆｅｒｏｘ種のものである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記アロエレシンＡが、酸加水分解によりアロエシンに加水分解される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アロエレシンＡが、酵素加水分解によりアロエシンに加水分解される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
有機酸が、前記酸加水分解のために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
無機酸が、前記酸加水分解のために使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記酸が、塩酸、硫酸、硝酸、及びリン酸からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素加水分解を実施するために使用される酵素が、エステラーゼ、リパーゼ、及びプロテアーゼからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、アスペリギリス・オリザエ・プロテアーゼ、ＥＳＬ００１−０２（登録商標）、ＮＯＶＯ３８８（登録商標）、及びＭｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼからなる群より選択される、請求項４又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アスペリギリス・オリザエ・プロテアーゼ酵素が、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｍ（登録商標）又はＢｉｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｐ  ｃｏｎｃ（登録商標）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アロエレシンＡが、副産物を形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アロエレシンＡが、ポリマーを形成せずに、アロエシン、及びｐ−クマリン酸に転換される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
約０．５Ｎ〜約１０Ｎの酸濃度において実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
約２Ｎ〜約５Ｎの酸濃度において実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
緩衝液が使用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
有機溶媒が、前記加水分解ステップに添加される、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機溶媒が、エタノール又はアセトンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アロエシンが、クロマトグラフィー法を使用してアロエビターから抽出されない、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2008533123.tif 000003