(57)【要約】  本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の発現を阻害する物質を含む、癌の転移を予防するための薬剤に関する。そのような物質には、ＭＩＦのｓｉＲＮＡが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の発現を阻害する物質を含む、癌の転移を予防するための薬剤。
【請求項２】
前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記癌が前立腺腺癌または結腸癌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
ＭＩＦの発現を阻害する物質を使用することを特徴とする、癌の転移を予防する方法。
【請求項６】
前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記癌が前立腺腺癌または結腸癌である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
癌の転移を予防するための薬剤の製造を目的とする、ＭＩＦの発現を阻害する物質の使用。
【請求項１０】
前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が前立腺腺癌または結腸癌である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の発現を阻害する物質を含む、癌の転移を予防するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、もともとは、Ｔ細胞由来のリンホカインとして同定された（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1966; 56: 72-7;Science 1966;153:80-2）。最近の研究により、ＭＩＦはさまざまなタイプの細胞で遍在的に発現されることが明らかになり、広域スペクトラム免疫系に関与する多能性サイトカインとして再評価されている（FASEB. J.1996;7:19-24;J. Interferon. Cytokine Res 2000;20:751-62）。簡単に述べると、ＭＩＦは、一連の刺激に応答して放出される下垂体ホルモンであり（Nature １９９３；３６５：７５６-９）、主としてマクロファージによって放出される炎症誘発性サイトカインであり（J Exp Med 1994;179:1895-902）、そして免疫応答に不可欠なＴ細胞活性化因子である（Proc Natl Acad Sci U. S. A.1996;93:7849-54）と認識されている。ＭＩＦは、グルココルチコイドによって誘導され、それらの抗炎症機能および免疫抑制機能を妨害するという、ユニークなタンパク質である（Nature 1995;377:68-71）。他方、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒらは、前立腺腺癌およびその転移性腫瘍におけるＭＩＦ  ｍＲＮＡレベルが、正常前立腺組織におけるレベルよりも高いと報告した（Urology 1996;48:448-52）。さらにまた、ＭＩＦは血管新生、腫瘍成長および転移に関与することも知られている（Int J Mol Med 2003;12:633-41）。これらの観察結果から、本発明者らは、腫瘍浸潤および転移へのＭＩＦの関与を調べることにした。
【０００３】
肝臓はいくつかの腫瘍タイプ（特に結腸癌）にとって一般的な転移部位である。結腸直腸癌肝転移は予後が極めて不良とされており、ほとんどの患者は、数多くの治療法があるにもかかわらず、診断から２年以内に死亡する。治療戦略の選択を改善するには、癌細胞の浸潤および転移の機序を明確にすることが非常に重要である。細胞の移動および浸潤は、Ｒｈｏ活性によるアクトミオシンの収縮、ストレスファイバーの形成、および接着斑のターンオーバーを含む、異なる過程の組み合わせによって制御される（Science 1999;286:1102-3;J Cell Biol 1996;133:1403-15）。リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は結腸癌の発生または進行に重要な役割を果たし（Cancer Res 2003;63:1706-11）、有糸分裂誘発、タンパク質分解酵素の分泌を含む数多くの細胞効果を誘発しうる（FASEB J 1998;12:1589-98）。腫瘍浸潤および転移の過程で、移動活性は、Ｒｈｏ／Ｒｈｏ関連キナーゼ経路によるストレスファイバー形成および接着斑アセンブリーを伴う（Gynecol Oncol 2002;87:252-9）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような状況の下で、癌を治療しまたは癌の転移を予防するための有効な薬剤の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記を考慮して、本発明者らは、腫瘍浸潤および転移におけるＭＩＦの腫瘍浸潤および転移に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの細胞効果を解析し、本発明を完成するに至った。本発明は、
（１）ＭＩＦの発現を阻害する物質を含む、癌の転移を予防するための薬剤；
（２）前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、上記（１）に記載の薬剤；
（３）前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、上記（１）に記載の薬剤；
（４）前記癌が前立腺腺癌（prostatic adenocarcinoma）または結腸癌（colon cancer）である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の薬剤；
（５）ＭＩＦの発現を阻害する物質を使用することを特徴とする、癌の転移を予防する方法；
（６）前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、上記（５）に記載の方法；
（７）前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、上記（５）に記載の方法；
（８）前記癌が前立腺腺癌または結腸癌である、上記（５）〜（７）のいずれか一項に記載の方法；
（９）前記癌の転移を予防するための薬剤の製造を目的とする、ＭＩＦの発現を阻害する物質の使用；
（１０）前記物質が、ＭＩＦのｓｉＲＮＡ、ＭＩＦのアンチセンス、ＭＩＦのリボザイム、およびＭＩＦの発現を阻害する化合物から選択される、上記（９）に記載の使用；
（１１）前記物質がＭＩＦのｓｉＲＮＡである、上記（９）に記載の方法；
（１２）前記癌が前立腺腺癌または結腸癌である、上記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載の使用
を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、免疫系だけでなく腫瘍形成にも重要な役割を果たす。本発明者らは、腫瘍浸潤および転移に関してＭＩＦの潜在的役割を調べた。
【０００７】
ＭＩＦの機能を評価するために、本発明者らは、低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA; ｓｉＲＮＡ）を使って、ＭＩＦ ｍＲＮＡをノックダウンした。マウスＭＩＦのｍＲＮＡ配列に特異的な２１塩基ｓｉＲＮＡを、マウス結腸癌細胞株ｃｏｌｏｎ２６に導入した。上側メンブレンをマトリゲルでコートし、下側メンブレンをフィブロネクチン（ＦＮ）でコートしたトランスウェル法（孔径８μＭ）を使って、腫瘍細胞浸潤を評価した。さらにまた、本発明者らは、Ｒｈｏ依存的経路に関連するＬＰＡのシグナル伝達を調べ、さらに、このシグナル伝達系に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を検討した。インビボでは、腫瘍細胞をＭＩＦ ｓｉＲＮＡで前処理してから門脈に注射し、肝臓への転移に対する効果を評価した。
【０００８】
本発明者らは、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡが、上側および下側メンブレンからの細胞の浸潤を著しく減少させることを見出した。本発明者らは、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）によって活性化されるＲｈｏ依存的経路がＭＩＦ ｓｉＲＮＡによって抑制されることを明らかにした。次に本発明者らは、接着斑キナーゼ（focal adhesion kinase）のチロシンリン酸化、およびインテグリンβ１のＬＰＡ誘発性発現が、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡによって有意に抑制されることを見出した。インビボでは、肝臓への転移が、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡで細胞を前処理することにより、有意に阻害された。
【０００９】
総合すると、これらの結果は、Ｒｈｏ依存的経路による腫瘍浸潤および転移をＭＩＦが促進することを示している。本発明はこれらの発見に基づいている。
【００１０】
本発明は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の発現を阻害する物質を含む、癌の転移を予防するための薬剤を提供する。以下にこれを詳述する。
【００１１】
「癌の転移」という用語は、癌が進行するにつれて、癌が他の器官に、そして最終的には全身に伝播することを意味する。癌の転移については、二つの形態、すなわち播種性転移および血行性転移が、当業者に知られている。播種性転移とは、癌細胞が周囲組織に浸潤し、体液を通して腹腔内に拡がることを示し、血行性転移とは、癌細胞が周囲の静脈およびリンパ管に浸透し、血液およびリンパ液を通して遠隔器官に拡がることを意味する。ＭＩＦは、癌細胞の浸潤および転移に関与するサイトカインの一つである。
【００１２】
本明細書の全体を通して、「ＭＩＦ遺伝子」という用語は、ＮＣＢＩ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅにアクセッション番号Ｓ７３４２４として登録されている、３４８ヌクレオチドからなる遺伝子を意味する。ただし、例えば、その遺伝子のヌクレオチド配列上で１またはそれ以上のヌクレオチドが置換、欠失、付加または挿入されている変種も包含される。
【００１３】
本明細書において「遺伝子発現（または単に「発現」）の阻害」という用語は、その遺伝子によってコードされるタンパク質の産生が、転写および翻訳を含む遺伝子からタンパク質に至る事象の任意の過程を阻害することによって阻害されることを意味する。
【００１４】
一般に、遺伝子発現を阻害するには、（ｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）リボザイム、（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡ、（ｉｖ）発現を阻害する他の物質などを使用することができる。好ましくは、本発明では、ｓｉＲＮＡを使用することができる。
【００１５】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに相補的な短い一本鎖分子であり、典型的には１０〜５０マーの長さ、好ましくは１５〜３０マーの長さ、より好ましくは１８〜２０マーの長さを持つ。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、開始コドン、標的遺伝子の転写開始部位またはイントロン-エクソン接合部を標的とするように設計される。
【００１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下に挙げるさまざまな機序によって遺伝子発現を阻害すると考えられる：（１）標的ＲＮＡ１μｇ／ｍｌＤＮＡオリゴヌクレオチド間に形成される複合体の、ＲＮアーゼＨによる分解。ＲＮアーゼＨはＤＮＡ合成に要求される遍在性核内酵素であり、二重鎖中のＲＮＡを認識し切断するエンドヌクレアーゼとして機能する。全てではないが、ほとんどのタイプのオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる切断を導くｍＲＮＡとの複合体を形成する；（２）リボソーム複合体による翻訳の阻害；（３）オリゴヌクレオチドがイントロン-エクソン接合部に対して設計されている場合は、ｍＲＮＡスプライシングをめぐる競合。
【００１７】
（リボザイム）
リボザイムは触媒活性を持つ一本鎖ＲＮＡ分子である。それらの構造は、天然の部位特異的自己切断ＲＮＡ分子に基づいている。５種類のリボザイムがそのユニークな特徴に基づいて記述されている。すなわち、テトラヒメナのグループＩイントロン、ＲＮアーゼＰ、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイムおよびデルタ型肝炎ウイルスリボザイムである。
【００１８】
約４０ヌクレオチドのハンマーヘッド型リボザイムは、ハンマーヘッドに似た形状を持っている。それらは、天然のリボザイムのなかで最も一般的であり、最も小さい。それらの正常な機能は、マルチマー型ウイルスＲＮＡをモノマーにプロセシングすることである。ハンマーヘッドモチーフは、ＲＮＡのランダムプールから単離することができる最も効率のよい自己切断配列として示された。ハンマーヘッド型リボザイム様のオリゴヌクレオチドは、その有効性およびその短い配列ゆえに、現在使用されている。
【００１９】
ハンマーヘッド型リボザイムは３つの短いステムからなる。すなわり、ステムＩおよびＩＩは特異的ＲＮＡ配列とアニールするように設計され、ステム-ループＩＩＩは触媒的切断部位を含有する。ひとたび結合すると、ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ＲＮＡのホスホジエステル主鎖を、エステル交換反応によって切断する。リボザイムの触媒部分は、ｍＲＮＡ標的の特異的５'-ＵＨ-３'部位を認識する（Ｕはウラシルであり、Ｈはアデニン、シトシンまたはウラシルである）。その切断機序はタンパク質因子を一切含まないが、二価金属カチオン（例えばＭｇ2+）の存在を必要とする。リボザイムは、ひとたびその標的を切断し終えると、そのｍＲＮＡ標的から解放されて、別のｍＲＮＡ分子を自由に切断することができるようになる。
【００２０】
無修飾および修飾（２'-Ｏ-メチルおよびホスホロチオエート）合成リボザイムは、インビトロで遺伝子発現を特異的に阻害するために使用できることが示されている。また、生きている生物への合成修飾リボザイムの投与によっても遺伝子発現の阻害を達成できることが示されている。
【００２１】
（ｓｉＲＮＡ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、クウェリング（quelling）または転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とは、ｄｓＲＮＡが標的遺伝子の発現を翻訳後レベルで特異的に抑制する現象を指す。もともとはシノラブディス・エレガンスで発見されたこの機序は、現在では、数多くの生物（真菌、寄生生物、プラナリア、ヒドラ、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、植物、および哺乳動物を含む）に見出されている。
【００２２】
通常、ＲＮＡｉは、数千塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。インビボでは、細胞内に導入されたｄｓＲＮＡが切断されて、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短いｄｓＲＮＡ分子の混合物になる。この切断を触媒する酵素ダイサーは、ＲＮアーゼＩＩＩドメインを含有するエンドＲＮアーゼである。ダイサーによって生成されるｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞では２１〜２３ｂｐ長である。
【００２３】
（本発明のｓｉＲＮＡ配列の取得）
標的遺伝子上でｓｉＲＮＡを効果的に選択するために、本発明者らは、北海道大学の多田光宏（Mitsuhiro Tada）博士によって開発された学習アルゴリズムを用いる回帰分析を利用することができる。
【００２４】
（癌の転移を予防するための薬剤）
ＭＩＦの発現を阻害する物質（ｓｉＲＮＡなどの活性成分）を、癌の転移を予防するための薬剤として使用する場合、医薬製剤の製造には従来の手段を応用することができる。例えば、上述の物質を、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、滅菌溶液剤、懸濁剤などに調剤することができる。
【００２５】
このようにして得た製剤は安全であり、毒性が低いので、ヒトまたは温血動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サルなど）に、経口投与または非経口投与することができる。
【００２６】
活性成分の用量は、活性、標的疾患、投与対象、投与方法などに依存して変動する。例えば、本発明の活性成分を経口投与する場合、用量は通常、成人（体重６０ｋｇ）の場合で１日あたり約０.１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１.０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１.０〜約２０ｍｇである。非経口投与では、単回用量は投与対象、標的疾患などに依存して変動し、成人（体重６０ｋｇ）の場合、約０.０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０.１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０.１〜約１０ｍｇの１日量で、静脈内に、本発明の活性成分を投与することが有利である。
【実施例】
【００２７】
（実験例１：材料）
以下の材料は全て供給業者から入手した。ニトロセルロースフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州ベッドフォード）から；ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から；セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体およびＭｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキットはＰｉｅｒｃｅ（イリノイ州ロックフォード）から；コニカＨＲＰ−１０００免疫染色キットはコニカ（日本国東京）から；Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ液は国際試薬株式会社（日本国神戸）から；大腸菌ＢＬ２１／ＤＥ３はＮｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソン）から；ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびＲＰＭＩ−１６４０はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（ニューヨーク州グランドアイランド）から；ＲｈｏプルダウンアッセイキットキットはＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ（コロラド州デンバー）から；プロテインＡセファロースはＰｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン国ウプサラ）から；Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬はＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）から；そして１−オレオイル−２−リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびＩ型コラーゲンはＳｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。使用した他の化学薬品は全て分析等級のものである。組換えマウスＭＩＦは、既述のように大腸菌ＢＬ２１１μｇ／ｍｌＤＥ３で発現させ、精製した（Biochim Biophys.Acta 1995;1247:159-62）。ポリクローナル抗マウスＭＩＦ抗体は、ニュージーランド白ウサギを組換えマウスＭＩＦで免疫することによって生成させた。プロテインＡセファロースを製造者のプロトコールに従って使用することにより、ＩｇＧ画分を調製した。
【００２８】
（実験例２：マウス）
４週齢雌ＢＡＬＢ１μｇ／ｍｌｃマウスをクレア（日本国東京）から購入し、少なくとも１週間は馴化させた。それらを６〜８週齢で使用した。マウスを、１２時間明／暗周期下（６：００ＡＭから６：００ＰＭまで点灯）、２０〜２２℃の温度で飼育した。飼料および水は自由に摂取させた。動物試験は北海道大学大学院医学研究科附属動物実験施設の動物実験規則に準拠した。
【００２９】
（実験例３：細胞培養）
ＢＡＬＢ／ｃマウスから樹立されたｃｏｌｏｎ２６細胞株は、Ｔ．Ｋａｔａｏｋａ博士（癌化学療法センター、日本国東京）から分譲していただいた。ｃｏｌｏｎ２６は、１０％熱不活化ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ-１６４０培地中、５％ＣＯ2下に３７℃で培養し、３日ごとに継代した。全ての実験に、対数増殖期の細胞を使用した。
【００３０】
（実験例４：ｓｉＲＮＡのトランスフェクション）
ＲＮＡｉ技術は、相同な二本鎖ＲＮＡを導入することによって、生細胞中の特定遺伝子の発現をダウンギュレートするために使用され、２１塩基ｓｉＲＮＡは哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉ効果の強力な媒介物質である（１６）。マウスｍＲＮＡ用のｄｓＲＮＡおよび相補的ｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列は、それぞれ５'-ＣＣＧＣＡＡＣＵＡＣＡＧＵＡＡＧＣＵＧｄＴｄＴ-３'（配列番号１）および５'-ＣＡＧＣＵＵＡＣＵＧＵＡＧＵＵＧＣＧＧｄＴｄＴ-３'（配列番号２）だった。対照ＲＮＡ二重鎖（スクランブルＲＮＡ）として、５'-ＧＣＧＣＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＵＵＣＧｄＴｄＴ-３'（配列番号３）および５'-ＣＧＡＡＵＣＣＵＡＣＡＡＡＧＣＧＣＧＣｄＴｄＴ-3'（配列番号４）を使用した。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅを製造者のプロトコールに従って使用することにより、ＦＣＳ（１０％）を含むＲＰＭＩ-１６４０が入っている培養皿（直径６０ｍｍ）中のｃｏｌｏｎ２６細胞（２×１０5細胞）に、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡまたは対照ＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトした。４８時間後に、培養培地を除去し、刺激に先だって、細胞を無血清条件下で１８時間培養した。
【００３１】
（実験例５：ＲＮＡ抽出および半定量ＲＴ-ＰＣＲ）
ＲＮＡ抽出のために、ラットを、手術の４、７、１４、２１、および２８日後に、ナトリウムペントバルビタールで麻酔してから屠殺し、正常な大腿骨および骨折した大腿骨を収集した。組織を直ちに液体窒素中で凍結し、ＲＮＡ単離に使用するまで、-８０℃で貯蔵した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル）を製造者のプロトコールに従って使用することにより、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ（３.０μｇ／ｍｌ）を６５℃で１０分間インキュベートすることにより、変性させた。変性したＲＮＡ（３.０μｇ／ｍｌ）、５×ＲＴバッファー（１×ＲＴバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、８.０ｍＭ ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ ジチオスレイトール）、２.５ｍＭ デオキシオリゴヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１００ｐＭ オリゴ-ｄＴ、および０.５μｌのサル（Monkey）マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、および０.４μｌ ＲＮアーゼ阻害剤を、室温で１０分間インキュベートした。この工程の後、その混合物１０μｌを４２℃で１時間インキュベートした。次に、３μｌの二本鎖産物を１０×Ｔａｑ／ＲＴバッファー（１×Ｔａｑ／ＲＴバッファー：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.０１％ゼラチン、および２.０ｍＭ ジチオスレイトール）、５００μＭ ｄＮＴＰミックス、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５００μＭの各センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに０.２５μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）と混合した。ラットＭＩＦ、ＭＭＰ-１３、およびグリセロアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を増幅するためのＰＣＲプライマーを以下のように設計した：ＭＩＦ（３６０ｂｐ）、センスプライマー５'-ＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＴＧＴＴＣＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡ-３'（配列番号５）およびアンチセンスプライマー５'-ＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＣＧＴＴ-３'（配列番号６）；ＭＭＰ-１３（４２４ｂｐ）、センスプライマー５'-ＧＣＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＣ-３'（配列番号７）およびアンチセンスプライマー５'-ＴＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＧ-３'（配列番号８）；ＧＡＰＤＨ（９８３ｂｐ）、センスプライマー５'-ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ-３'（配列番号９）およびアンチセンスプライマー５'-ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ-３'（配列番号１０）。９４℃で5分間の加熱ステップ後に、ＭＩＦ、ＭＭＰ-１３、およびＧＡＰＤＨについて、ＰＣＲを行った。増幅は以下の条件で行った：ＭＩＦ、９４℃で1分、５５℃で1分、および７２℃で３０秒を３０サイクル；ＭＭＰ-１３、９４℃で１分、５８℃で２分、および７２℃で２分を２２サイクル；ＧＡＰＤＨ、９４℃で１分、５８℃で１分、および７２℃で１分を１８サイクル。これらのステップ後に、これら三つの試料について７２℃で７分間の最終伸長を、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、コネティカット州ノーウォーク）を使って行った。ゲル電気泳動（２％アガロース）による分離後に産物の解析を行い、スキャニングデンシトメトリーで解析すること���より、定量可能な反応産物の直線範囲を決定する標準曲線を作成した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現をローディング対照として使用した。
【００３２】
（実験例６：組織構造および免疫組織化学的解析）
肝組織を１０％ＰＢＳ緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡検査法で検査することにより、組織学的変化を評価した。免疫組織化学的解析は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキットを製造者のプロトコールに従って使用することにより行った。簡単に述べると、マウスから得た肝組織を、接種後１４日目に、外科的に切除した。肝臓を１０％ＰＢＳ緩衝ホルマリンに浸漬した。内在性ペルオキシダーゼを失活させるために、０.３％過酸化水素を含有するメタノールで、切片を３０分間処理した。ＰＢＳで洗浄した後、切片をブロッキング溶液と共に３０分間インキュベートした。ＣＤ３１に対する抗マウスモノクローナル抗体をマクロファージのマーカーとして使用した。切片を抗ＣＤ３１抗体（１：１００希釈）と共に４℃で終夜インキュベートし、０.０１％過酸化水素を含有する３,３'-ジアミノベンジジンテトラクロリドを使って反応を可視化した。ヘマトキシリンによる対比染色後に、切片を検鏡し、陽性染色細胞の数を計数した。１００倍対物レンズを使って各切片あたり１０視野を計数した（ｎ＝３）。
【００３３】
（実験例７：免疫ブロット解析）
細胞（１×１０6細胞）をポリトロンホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、スイス国ルチェルン）で破壊した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットを使って細胞ホモジネートのタンパク質濃度を定量した。等量のホモジネートを、２-メルカプトエタノール（１％）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（２％）、グリセロール（２０％）、およびブロモフェノールブルー（０.０４％）を含有する２０μｌのＴｒｉｓ-ＨＣｌ，５０ｍＭ（ｐＨ６.８）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。試料をＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に付し、ニトロセルロースメンブレンに電気泳動的に転写した（Proc Natl Acad Sci U. S. A. 1979;76:4350-4;およびAnal Biochem 1987;166:368-79）。そのメンブレンをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％脱脂粉乳および０.１％Ｔｗｅｅｎでブロックし、抗ＦＡＫ（ｐＹ３９７）リン酸化タンパク質特異的（phosphospecific）抗体でプローブし、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングした抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた。インテグリンβ１のアッセイを行うために、メンブレンを抗マウスＣＤ２９（インテグリンβ１鎖）でプローブし、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングしたラット抗ラットＩｇＧ抗体と反応させた。ＭＭＰ-１３によるアッセイについては、抗マウスＭＭＰ-１３抗体を一次抗体として使用し、抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。その結果生じた複合体を、エンハンストケミルミネセンスによって検出するために、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システムを使用して、製造者のプロトコールに従って処理した。ＭＩＦによるアッセイについては、本発明者らは、抗ラットＭＩＦポリクローナル抗体、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングした抗ウサギＩｇＧ抗体を、それぞれ一次抗体および二次抗体として使用することにより、同様の方法で免疫ブロット解析を行った。反応後に、コニカＨＲＰ-１０００免疫染色キットを製造者のプロトコールで推奨されているとおりに使用して、タンパク質を可視化した。
【００３４】
（実験例８：浸潤の解析）
マトリゲルコートトランスウェルインサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイク）を通した細胞の浸潤によって、ｃｏｌｏｎ２６の浸潤を測定した。簡単に述べると、孔径８μＭのトランスウェルインサートを、受動的吸着により、上面はマトリゲル（４０μｇ１μｇ／ｍｌウェル）で、下面はフィブロネクチン（１０μｇ１μｇ／ｍｌウェル）でコートした。細胞を、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで処理した後、無血清条件下で２４時間培養した。これに続いて、細胞（２×１０5／１００μｌ／ウェル）をＬＰＡの存在下で上室に播種し、２４時間浸潤させた。非浸潤細胞を上室から綿棒で取り除き、フィルターの下面に付着している移動細胞を固定し、Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ液で染色し、接眼マイクロメーターを使って数えた。少なくとも１０個／フィルターのランダムな視野を計数した。実験は全て独立して三重に行った。
【００３５】
（実験例９：インビボ転移アッセイ）
ＭＩＦ ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡによる４８時間の処理後に、ｃｏｌｏｎ２６細胞を、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴＡを使って収集し、無血清ＲＰＭＩ-１６４０で３回洗浄し、最終濃度が１×１０4細胞／１００μｌになるようにＰＢＳに再懸濁した。エーテルで麻酔して開腹しておいたＢＡＬＢ／ｃマウスの門脈に、細胞を注射した。本発明者らは、マウスを次の３群に分割した：（ｉ）ｃｏｌｏｎ２６細胞を門脈に注射した陰性対照群；（ｉｉ）対照ｓｉＲＮＡで処理したｃｏｌｏｎ２６細胞を門脈に注射した陽性対照群；および（ｉｉｉ）ＭＩＦ ｓｉＲＮＡで処理したｃｏｌｏｎ２６細胞を門脈に注射した試験試料群。腫瘍細胞を接種した１４日後に、マウスを屠殺し、各肝臓中の転移コロニーの数を検鏡によって計数した。それと同時に、腫瘍転移を評価するために肝重量を記録した。
【００３６】
（実験例１０：Ｒｈｏプルダウンアッセイ）
Ｒｈｏプルダウンアッセイは、製造者のプロトコールに従って行った。簡単に述べると、細胞（５×１０5／ウェル）をプレートに播種し、１２時間付着させ、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡで４８時間処理し、無血清条件下で２４時間培養した。インキュベーション後に、細胞を３０分間および６０分間にわたって２０μＭ ＬＰＡで刺激し、ＰＢＳで２回洗浄し、免疫沈降アッセイバッファー中で溶解した。細胞溶解液を遠心分離によって清澄化し、等体積の溶解液をＲｈｏｔｅｋｉｎ  ＲＢＤ-アガロースビーズ（３０μｇ）と共に４℃で４５分間インキュベートした。ビーズを洗浄バッファーで３回洗浄した。結合したＲｈｏタンパク質を、Ｒｈｏに対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析によって検出した。異なる試料中のＲｈｏ活性（ＧＴＰ結合型Ｒｈｏ）を比較するために、細胞溶解液中の総Ｒｈｏ量のウェスタンブロット解析を行った。
【００３７】
（実験例１１：統計解析）
統計解析は全てスチューデントのｔ検定を使って行った。ｐ＜０.０５の値は統計的有意性を示すとみなした。
（実施例１）
【００３８】
本発明者らは、ＭＩＦタンパク質発現に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を評価するために、ｃｏｌｏｎ２６細胞を使用し、ウェスタンブロット解析によって、用量依存的試験を行った。ＬＰＡ（２０μＭ）を含有するＦＣＳ不含ＲＰＭＩ-１６４０中のこれらの細胞（１×１０6細胞／５ｍｌ）を、０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲にあるさまざまな用量のＭＩＦ ｓｉＲＮＡで処理した。４８時間後に細胞を洗浄し、ＭＩＦタンパク質のレベルを測定するためのウェスタンブロット解析に付した。具体的に述べると、ウェスタンブロット解析を行って、ＭＩＦタンパク質発現に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を評価した。０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲にあるさまざまな用量のＭＩＦ ｓｉＲＮＡを、ＬＰＡ（２０μＭ）を含有するＦＣＳ不含ＲＰＭＩ-１６４０中のｃｏｌｏｎ２６細胞（１×１０6細胞／５ｍｌ）に加えた。４８時間後に、細胞を洗浄し、ＭＩＦタンパク質を検出するためのウェスタンブロット解析に付した。また、ＬＰＡに応答して起こるＭＩＦ  ｍＲＮＡの発現を調べるために、ノーザンブロット解析も行った。０.２〜２０μＭの範囲にあるさまざまな用量のＬＰＡを、ＦＣＳ不含ＲＰＭＩ-１６４０中のｃｏｌｏｎ２６細胞（１×１０7細胞／１０ｍｌ）に加えた。２４時間後に、全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析に付した。エチジウムブロミドで染色した２８ＳリボゾームＲＮＡのバンドが、各レーンの最下部に示される。本発明者らは、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡがＭＩＦ発現を有意に抑制することを見出した（図１Ａ）。第２に、ＬＰＡに応答して起こるＭＩＦ  ｍＲＮＡの発現を評価するために、ノーザンブロット解析を行った。０.２〜２０μＭの範囲にあるＬＰＡを、ＦＣＳ不含ＲＰＭＩ-１６４０中のｃｏｌｏｎ２６細胞（１×１０7細胞／１０ｍｌ）に加えた。２４時間の培養後に、ＭＩＦ  ｍＲＮＡが用量依存的に増加していることがわかった（図１Ｂ）。
（実施例２）
【００３９】
ｃｏｌｏｎ２６細胞のＭＩＦ  ｍＲＮＡおよびＭＩＦタンパク質の発現レベルを、それぞれＲＴ-ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析によって調べた。具体的に述べると、本発明者らは、ｃｏｌｏｎ２６細胞におけるＭＩＦ  ｍＲＮＡ発現およびＭＩＦタンパク質に対するＬＰＡ（２０μＭ）の効果を評価し、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）の効果を評価した。スクランブルｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を対照（ｃｏｎ  ｓｉＲＮＡ）として使用した。ＭＩＦ  ｍＲＮＡ発現（Ａ）については、全ＲＮＡを単離し、ＲＴ-ＰＣＲ解析を、実験例５で述べたように行った。対照としてＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現を示す。ＭＩＦタンパク質（Ｂ）については、等量の細胞溶解液（タンパク質４０μｇ）を各レーンに適用し、抗ＭＩＦ抗体を使って免疫ブロット解析を行った。β-アクチンによって標準化したＭＩＦの量を各レーンの下に示す。*値は統計的に有意である（Ｐ＜０.０５）。ＭＩＦ  ｍＲＮＡ発現およびＭＩＦタンパク質レベルの両方に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を、ＬＰＡの不在下で、それぞれＲＴ-ＰＣＲおよびウェスタンブロット解析によって評価した（Ｃ）。ＭＩＦ  ｍＲＮＡはＬＰＡ（２０μＭ）によってアップレギュレートされ、それは４８時間のｓｉＲＮＡ処理（１μｇ／ｍｌ）によって抑制されたが、対照ｓｉＲＮＡでは有意な影響を受けなかった（図２Ａ）。対照として、ＧＡＰＤＨの発現を測定した。本発明者らは、次に、ＭＩＦタンパク質産生に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を検討した。免疫ブロット解析によって評価したところ、ＬＰＡ（２０μＭ）によって増加したＭＩＦ含量は、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡにより、約５０％有意に減少した（図２Ｂ）。対照としてβ-アクチンの量を測定した。ＬＰＡの不在下では、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡはＭＩＦ  ｍＲＮＡ発現に対して明白な効果を持たなかった（図２Ｃ）。この結果と一致して、本発明者らは、培養培地中のＭＩＦ含量がＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理によって減少することを見出した（未掲載データ）。
（実施例３）
【００４０】
浸潤は転移カスケード中の決定的ステップである。ＬＰＡに応答して起こる腫瘍細胞浸潤におけるＭＩＦ ｓｉＲＮＡの役割を明確にするために、本発明者らは、インビトロ浸潤アッセイを行った。具体的に述べると、ｃｏｌｏｎ２６細胞の浸潤に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）の効果を、実験例８に記載のマトリゲルコートトランスウェルアッセイを用いるインビトロアッセイを使って評価した。図３Ａでは、メンブレンの細孔を通して移動した細胞をＤｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋ液で染色した。図示した画像は、３回の独立した実験を代表する画像である。
ａ，刺激無しの対照；ｂ，ＬＰＡ（２０μＭ）による刺激；ｃ，対照ｓｉＲＮＡ処理後にＬＰＡ（２０μＭ）による刺激；ｄ，ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理後にＬＰＡによる刺激。図３Ｂには、ＬＰＡ誘発性細胞浸潤およびＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果の定量的解析（ｎ＝３）。*値は統計的に有意である（Ｐ＜０.０５）。細胞をＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）または対照ｓｉＲＮＡで２４時間処理し、ＬＰＡ刺激に先だって、血清の不在下でさらに２４時間培養した。これに続いて、本発明者らは細胞をＬＰＡ（２０μＭ）で刺激した。本発明者らは、ＬＰＡ誘発性の移動および浸潤が、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡによって抑制されるのに対して、対照ｓｉＲＮＡは腫瘍細胞の移動度に影響を及ぼさないことを見出した（図３）。これらの発見は、ＭＩＦがｃｏｌｏｎ２６細胞の移動および浸潤に重要な役割を果たしうることを示している。
（実施例４）
【００４１】
結腸直腸癌転移の治療に関するｓｉＲＮＡの有用性を検討するために、本発明者は肝転移モデルを使用した。４８時間のＭＩＦ ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡ処理（１μｇ／ｍｌ）を施したｃｏｌｏｎ２６細胞の転移能力を、門脈を通した接種の１４日後に存在する転移結節の数によって決定した。結果を図４に示す：Ａ，肝臓中の転移結節の肉眼像，（ａ）正常（腫瘍細胞注射なし）；（ｂ）陽性対照；（ｃ）対照ｓｉＲＮＡ；および（ｄ）ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ；Ｂ，肝転移結節の数の定量的解析であり、*値は統計的に有意である（Ｐ＜０.０５）；Ｃ，肝重量の定量的解析であり、*統計的に有意（Ｐ＜０.０５）および**統計的に有意（Ｐ＜０.０１）；Ｄ，転移性腫瘍を持つ肝臓または転移性腫瘍を持たない肝臓におけるＭＩＦタンパク質レベルを調べるための、全肝を使ったウェスタンブロット解析。肉眼的には、転移巣の数およびサイズは、対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理によって減少した（図４Ａ）。ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理細胞を注射したマウスの肝臓における転移結節の数は、対照ｓｉＲＮＡを使った処理によるものよりも、はるかに少なかった（図４Ｂ）。ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理細胞によって生じた転移結節を含有する肝臓の重量は、対照ｓｉＲＮＡを使った処理によるものよりも少なかった（図４Ｃ）。ＭＩＦ ｓｉＲＮＡは、転移結節の数および肝重量に、用量依存的な影響を及ぼした（未掲載データ）。本発明者らは、転移性腫瘍を持つ肝臓または転移性腫瘍を持たない肝臓におけるＭＩＦタンパク質レベルを調べるために、全肝を使ったウェスタンブロット解析を行った。ｓｉＲＮＡで処理したまたはｓｉＲＮＡで処理していないｃｏｌｏｎ２６細胞を注射した各全肝をホモジナイズし、ウェスタンブロット解析に付した。本発明者らは、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡが転移性腫瘍を持つ肝臓のＭＩＦタンパク質レベルを低下させることを見出した（図４Ｄ）。これらのデータは、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡが腫瘍成長および転移を抑制する潜在能力を持つことを示している。
（実施例５）
【００４２】
ＭＩＦ ｓｉＲＮＡの有効性を評価するために、転移巣を取り囲む肝臓における組織学的変化を調べた。具体的に述べると、方法は実験例６に従った。前処理を何も行っていないｃｏｌｏｎ２６細胞を門脈を通して注射した場合（陽性対照）は、Ｈ-Ｅ染色において、いくつかの単核細胞および脈管形成が正常組織と腫瘍の間の境界に観察された（図５ａ，ｂ）。同様に、対照ｓｉＲＮＡで前処理したｃｏｌｏｎ２６細胞を注射した場合（対照）にも、かなりの脈管形成が確認された（図５ｃ，ｄ）。一方、正常組織とＭＩＦ ｓｉＲＮＡで処理した腫瘍細胞との間では、脈管形成が著しく減少した（図５ｅ，ｆ）。
（実施例６）
【００４３】
新脈管形成を確認するために、本発明者らは、血管内皮増殖を反映する抗ＣＤ３１抗体を使って、免疫組織化学的解析を行った。図５の結果と一致して、本発明者らは、無処理の細胞（図６ａ）または対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞（図６ｂ）の転移巣を取り囲む陽性染色が増加していることを見出した。対照的に、ＣＤ３１陽性染色細胞の数が著しく減少した（図６ｃ）。
（実施例７）
【００４４】
ＬＰＡ誘発性の移動および浸潤に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの阻害効果を確認するために、本発明者らは、ＧＴＰが結合した活性型Ｒｈｏの細胞内レベルを、プルダウンアッセイ系を使って測定した。活性型ＲｈｏのレベルはＬＰＡの添加後３０分では上昇し、６０分では徐々に減少していた（図７）。本発明者らが、ＬＰＡ刺激（２０μＭ）に先だって細胞をＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）で４８時間処理したところ、ＬＰＡによって誘発される上昇は著しく抑制された。これらの結果は、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡが、ＬＰＡによって誘発されるｃｏｌｏｎ２６細胞の移動および浸潤を、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏのプレニル化を抑制することによって阻害したことを示している。
（実施例８）
【００４５】
本発明者らは、ＦＡＫのリン酸化に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を、ウェスタンブロット解析によって解析した。予備実験として、本発明者らは、ＬＰＡによって誘発されるＦＡＫのリン酸化の時間経過を評価した。４８時間にわたるＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）の前処理により、ＬＰＡ処理（２０μＭ）の３０分後に、ＦＡＫのチロシンリン酸化が有意に上昇することを、本発明者らは見出した（図８）。これに続いて、本発明者らは、ＬＰＡに応答して起こるＦＡＫのチロシンリン酸化が著しく抑制されることを見出した。同様の結果が１５分および６０分でも得られた（未掲載データ）。ＦＡＫタンパク質の総量を各レーンの下に示す。これらの結果は、アクトミオシンの収縮性および接着斑タンパク質のチロシンリン酸化の、Ｒｈｏによる活性化を、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡが、Ｒｈｏのプレニル化を抑制することによって阻害したことを証明している。
（実施例９）
【００４６】
本発明者らは、ＬＰＡ誘発性インテグリンβ１発現に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を、ウェスタンブロット解析によって解析した。ｃｏｌｏｎ２６細胞をＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）または対照ｓｉＲＮＡで４８時間処理した後、それらの細胞をＬＰＡの不在下または存在下で２４時間培養した。細胞を溶解し、その溶解液（２０μｇ）を、抗インテグリンβ１、次にペルオキシダーゼ結合二次抗体、そしてエンハンストケミルミネセンス検出（ＥＣＬ検出）を用いる免疫ブロット解析に付した。本発明者らは、ＬＰＡがインテグリンβ１の発現を誘発することを見出した（図９）。細胞をＭＩＦ ｓｉＲＮＡで処理すると、インテグリンβ１の発現は著しく抑制された。これらの結果は、ＬＰＡが誘発するｃｏｌｏｎ２６細胞の接着および浸潤という事象におけるインテグリンシグナリングに、ＭＩＦが重要な役割を果たすことを示している。
（実施例１０）
【００４７】
ＭＭＰは、腫瘍浸潤および転移の誘発に関与する重要な分子の一つであると考えられる。腫瘍浸潤および転移を促進する際のＭＭＰ-１３発現に対するＭＩＦの潜在的効果を検討するために、本発明者らは、ＬＰＡに応答して起こるＭＭＰ-１３産生に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの有効性を評価した。具体的に述べると、ＭＩＦ ｓｉＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）または対照ｓｉＲＮＡによる４８時間の処理後に、細胞をＬＰＡ（２０μＭ）で２４時間処理し、細胞溶解液を、抗ＭＭＰ-１３抗体を使った免疫ブロット解析に付して、ＥＣＬ検出を行った。図示した結果は少なくとも３回の独立した実験を代表する結果である。図１０に示すように、本発明者らは、ＬＰＡ刺激（２０μＭ）に先だってＭＩＦ ｓｉＲＮＡ処理（１μｇ／ｍｌ）を４８時間行うことにより、ＭＭＰ-１３産生が著しく抑制されることを見出した。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
腫瘍浸潤および転移の有効な治療は臨床腫瘍学における最大の難問である。本発明者らは、ユニークな生物活性リゾリン脂質であるＬＰＡによって誘発される腫瘍細胞運動が、新しい遺伝子サイレンシング技術であるＲＮＡｉを使ったＭＩＦのダウンレギュレーションによって、有意に阻害されることを、ここに実証した。さらにまたＭＩＦ ｓｉＲＮＡは、Ｒｈｏの活性化を弱め、その結果として遊出および接着斑アセンブリーを減少させることにより、マウス結腸癌細胞のＬＰＡ誘発性浸潤を著しく阻害した。総合すると、これらの結果は、腫瘍細胞成長ならびにＬＰＡ誘発性の腫瘍浸潤および転移の機序に、ＭＩＦが関与しているであろうことを強く示している。これは、結腸癌の転移を制御する新しい治療法の基礎になりうる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＭＩＦ発現に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡおよびＬＰＡの用量応答試験の結果を示す図：（Ａ）ウェスタンブロット解析；および（Ｂ）ノーザンブロット解析。
【図２】ＭＩＦ ｓｉＲＮＡがＭＩＦ産生に及ぼす効果の結果を示す図。
【図３】ＬＰＡ誘発性細胞浸潤に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図４】インビボ転移アッセイの結果を示す図：（Ａ）肝臓中の転移結節の肉眼像；（Ｂ）肝転移結節の数の定量的解析；（Ｃ）肝重量の定量的解析；および（Ｄ）転移性腫瘍を持つまたは転移性腫瘍を持たない肝臓におけるＭＩＦタンパク質レベルを調べるための、全肝を使ったウェスタンブロット解析。
【図５】ＭＩＦ ｓｉＲＮＡの有効性を評価するためにＨ-Ｅ染色によって調べた、転移巣を取り囲む肝臓における組織学的変化を示す図。
【図６】血管新生に関する免疫組織化学的解析の結果を示す図。
【図７】Ｒｈｏの活性化に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図８】ＦＡＫのＬＰＡ刺激チロシンリン酸化に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を示す図：（Ａ）免疫ブロット解析によるリン酸化ＦＡＫの量；および（Ｂ）ＬＰＡ不在下でのＦＡＫリン酸化に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果。
【図９】ＬＰＡによって誘発されるインテグリンβ１産生に対するｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図１０】ＬＰＡによって誘発されるＭＭＰ-１３の産生に対するＭＩＦ ｓｉＲＮＡの効果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
2008530084000001.app
【国際調査報告】
2008530084.tif 000012