(57)【要約】  発明は、生体外においてクローン病を診断する方法又は、クローン病を発症する人の傾向を決定する方法に関連し、それは、前記疾患を患う被験者又はその危険のある被験者においてCD66ｃの過剰発現を検出することによる。発明は同様にクローン病の予防又は治療措置にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クローン病を診断する又はクローン病を発症する人の傾向を決定する生体外における方法であって、被験者の生体サンプル中のCD66ｃ受容体の発現レベルがコントロールサンプルにおける発現レベルより高いか否かを決定し、コントロールサンプルがクローン病の指標、又は被験者のクローン病を発症する傾向の指標である方法。
【請求項２】
生体サンプルが回腸生検又は回腸生検から単離されたエンテロサイトの標品である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
生体サンプルが血液又は排泄サンプルである請求項1に記載の方法。
【請求項４】
CD66ｃ受容体の発現レベルがCD66c受容体糖タンパク質の量を測定することによって決定される請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
CD66ｃ受容体タンパク質の量が、任意に標識されたCD66ｃを特異的に認識する抗CD66ｃ抗体に生体サンプルを接触させる段階と、形成された抗体−CD66ｃ受容体複合体を検出する段階とを含む免疫学的試験によって測定される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗CD66ｃ抗体がモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
生体サンプルが回腸生検であり、免疫学的試験が免疫組織化学試験である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルが血液又は排泄サンプルであり、免疫学的試験がELISA試験である請求項６に記載の方法。
【請求項９】
CD66ｃ受容体の発現レベルが、エンテロサイトの刷子縁部位に存在するマンノースユニットの定量解析によって間接的に決定される請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
マンノースユニットの定量解析が、生体サンプルを検出可能に標識されたコンカナバリンＡに接触させることと、マンノースユニットに結合したコンカナバリンＡによって形成された複合体を検出することとによって行われる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
CD66ｃ受容体の発現レベルが、生体サンプル中のCD66ｃのｍRNA量を測定することによって決定される請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生体サンプルが回腸生検であり、CD66ｃのｍRNA量がリアルタイムRT-PCRによって測定される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
CD66ｃ受容体の発現レベルが抗CD66ｃ抗体の産生レベルを測定することによって決定される請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
試験される血液又は排泄サンプルを、任意に固定されたCD66ｃ抗体又はそのエピトープ断片に接触させることと、形成される抗体−CD66ｃ受容体複合体を検出することとを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
特異的にCD66ｃ受容体を認識する抗CD66ｃ抗体の使用であって、クローン病の予防又は治療のための薬剤を製造するための使用。
【請求項１６】
CD66c受容体タンパク質又はCD66ｃ様糖タンパク質の使用であって、クローン病の予防又は治療のために、CD66c受容体と大腸菌AIEC株との間の相互作用を特異的に阻害するための薬剤を製造するための使用。
【請求項１７】
マンノシド又は一つ以上のマンノースユニットを支持する粒子の使用であって、クローン病の予防又は治療のために、CD66ｃ受容体と大腸菌AIEC株との間の相互作用を特異的に阻害するための薬剤を製造のための使用。
【請求項１８】
クローン病を予防又は治療するための候補物質を生体外において探索するための方法であって、
(i)試験する物質の存在下又は非存在下において、可溶型又は細胞表面で発現しているCD66ｃ受容体を少なくとも一つの大腸菌AIEC株に接触させる段階と、
(ii)CD66ｃ受容体と前記株との間の相互作用を特異的に阻害する物質の能力を決定し、前記物質を選択及び／又は同定する段階と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体外におけるクローン病の診断の分野に関する。それは、疾患の存在を診断することと、その人の病気になる傾向を決定することの両方ができる。発明は、本疾患の予防的又は治癒的処置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
１９３２年にクローンらによって記述されたクローン病は、腸の免疫システムの過剰反応状態によって特徴付けられ、様々な長さの沈静期間によって中断される再燃を通じて進行する。フランスにおいて、１０５人あたりの年間の新規患者として発表される発症率は、１００／１０５人と概算される。２００４年には、フランスで１００，０００症例以上が記録された。
【０００３】
クローン病（ＣＤ）は、腹痛、下痢、発熱及び栄養不良によって臨床的に症状を現す。消化管以外（関節、皮膚又は眼球）の炎症の症状は、しばしば関係している。診断は、臨床状態、内視鏡、回結腸の生検及び小腸の放射線検査に基づいて行われる。臨床の、内視鏡及び解剖病理学的な（anatomo-pathological）画像は特徴を有さず、診断法の確立には、同様の画像を生じる全ての他の治癒できる状態を除外することが必要である（コロンベル及びメナード、１９９３年（Colombel  and  Menard, 1993））。生体検査（biological test）がクローン病の診断及び観察のために用いられており、それは、以下のマーカー、ＡＮＣＡ（核周囲の抗好中球抗体（perinuclear  anti-neutrophilic  antibody））、ＡＳＣＡ（抗出芽酵母（Saccharomyces  cerevisiae）抗体）、及び抗OmpC（大腸菌由来の外膜ポリンＣ（outer  membrane  porin  C  from  E.  coli））を含む。これらのマーカーはクローン病に特異的ではなく、陰性試験（negative  test）はクローン病の可能性を排除できない（ナカムラら、２００３年（Nakamura  et  al.,  2003））。
【０００４】
クローン病は、主要な肝胃腸病学上の問題の一つを構成しており、それは、特定の治療法が無いからである。クローン病は著しく身体の自由を奪う病気であり、コルチコイド、免疫抑制剤、栄養補助及び手術によって程度の差はあっても抑制される。クローン病は患者にとって完全に治癒することがないため、治療は主に症状のデータに基づいて施され、あやふやなだけである。この治療の主な効果は、再燃を抑制し、そして再発を防ぐことである。簡潔に述べると、用いられる薬剤は、サリチル酸塩誘導体又はコルチコイドを例とする抗炎症薬及び免疫抑制剤の二つの区分に分けることができる。しかしながら、これらの治療はしばしば効果が無く、９０％の症例において手術による切除を回避することができない。最近、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（infliximab）が、深刻な臨床像を呈し、従来式の治療に反応しない何人かの患者の治療に効果的であることが発見された（ルトギールツら、１９９９年（Rutgeerts  et  al.,  1999）、プレゼントら、１９９９年（Presentet al., 1999））。しかしながらこの治療法は限界を有する。実際に、インフリキシマブで治療した患者は、しばしば抗インフリキシマブ抗体を産生し、結果的に治療に応答する期間を減じてしまう（バートら、２００３年（Baert et al., 2003））。更に、この治療を施された患者の何人かは、結核、アスペルギルス症及びカンジダ症タイプの深刻な感染症を発症した（ウォーリスら、２００４年（Wallis et al., 2004））。
【０００５】
クローン病の原因は、未だ明確に解明されていない。クローン病の残存、維持又は悪化に影響を与える様々な因子が想定されている。それらは特に、環境、免疫、遺伝及び感染性の因子である（ポドルスキー、２００２年（Podolsky 2002）シャナハン、２００２年（Shanahan2002））。
【０００６】
クローン病は腸の部位における免疫システムの過剰反応状態によって特徴付けられ、それはリンパ球及びマクロファージの集合及び活性化を引き起こす。クローン病を患う患者の腸粘膜に大量に放出されたインターロイキン−１（Il-1）、Il-6、Il-8及びＴＮＦαを例とする炎症誘導性サイトカインが、腸の炎症を誘導する原因であることが現在では良く知られている（デスレウモーら、１９９７年（Desreumaux et al., 1997））。
【０００７】
多くの臨床、実験及び疫学の議論が、クローン病の病巣（lesion）の発生及び／又は維持への病源菌の関与を示唆する（サーターら、１９９６年（Sartor et al., 1996））。病気の通常の進行、時々非常に活性化する病巣へのその分布、及び親族でない結婚したカップル及びその子供を含む家族性クローン病の発症例は、伝播可能な病源菌の役割を示す（ベネットら、１９９１年（Bennett et al., 1991））。
【０００８】
クローン病を患う患者の回腸生検から単離した大腸菌株の解析は、クローン病の急性及び慢性の回腸の病巣が、（全植物相の１００％に至るまでもが）大腸菌株によって異常にコロニーを形成されていたことを示した。これらの株は、腸の感染症の原因である様々な病原型大腸菌において従来から見つけられている毒性の遺伝子を欠損している。これらの株の大部分（８０％）は、腸上皮細胞であるCaco-2への生体外における接着に強い力を有し、接着力と、腸粘膜のコロニー形成のレベルとの間の関係が確立された（ダーフェウル−ミショーら、１９９８年（Darfeuille-Michaud et al., 1998））。
【０００９】
クローン病を患う患者の慢性の回腸病巣から単離した大腸菌株LF82は、感染細菌性病原体の全ての特徴を有している。(i)細菌は、培養液中で赤痢菌の取り込みレベルと同じレベルで上皮細胞によって取り込まれる。(ii)その能動的な侵入過程は微小管とアクチンの重合化との両方に依存する。(iii)エンドソーム系の小胞の溶解後に、宿主細胞の細胞質で生存及び増殖することが可能である。
【００１０】
LF82株の接着−侵入の表現型の特徴付け及び、大腸菌、赤痢菌及びサルモネラ菌で既に説明されている侵入の遺伝的決定基の欠損は、クローン病に関するであろう定義をされた病原性大腸菌の新規グループの存在を導き出した。それは、「接着−侵入性大腸菌（adherent-invasive E. coli）」であるためＡＩＥＣと命名された（ボードーら、１９９９年（Boudeau et al.,1999））。これらＡＩＥＣ株は、エンテロサイト（enterocyte）の刷子縁に接着することによって、患者の腸粘膜にコロニーを形成すると考えられる（ダーフェウル−ミショーら、２００２年（Darfeuille-Michaud et  al., 2002））。それらの有病率は、クローン病を患う患者の急性回腸病巣の部位において３６．４％である（ダーフェウル−ミショーら、２００4年（Darfeuille-Michaud  et  al., 2004））。
【００１１】
クローン病の組織学的特徴の一つは、症例の５０から８７％における肉芽腫の存在である。肉芽腫の炎症は、マクロファージの殺菌力に抵抗する能力も有する侵入性細菌として振舞うサルモネラ症、エルシニア症（yersiniosis）、又はパラツベルクリン症を例とするいくつかの細菌性感染症で見つかっている。最近、肉芽腫中の大腸菌DNAの存在がクローン病を患う患者の８０％において示され、大腸菌を含む感染経路が確認された（リャンら、２００４年（Ryan et al., 2004））。生体外におけるマウス又はヒトのマクロファージによるファゴサイトーシス後に、宿主細胞の完全性を保ったまま、AIEC株LF82は大きな液胞中で生存し、増殖する。感染の後に、マクロファージは大量のTNFαを分泌する。こうして、AIEC株は上皮細胞に侵入できるだけではなく、それらをマクロファージの殺菌作用に抵抗できるようにする遺伝的決定基も有する（グラッセルら、２００１年（Glasser et al., 2001））。
【００１２】
リボタイピング解析（ribotyping  studies）では単一株の存在を示せなかったが、一方で、慢性的な病巣又は再発する場所から単離したAIEC株は、同一のリボタイピングの結果を示すか、共通のグループに属する。これらの遺伝的に相関のある株は、細菌のクロモソーム中で遺伝子の水平移動又は病原性島の挿入による病原性因子の獲得によって、同じ祖先から進化したと考えられる（マセレットら、２００１年（Masseret et al., 2001））。
【００１３】
更に、生体外における腸の上皮細胞のモデルにおいて、I型繊毛がAIEC細菌の細胞への接着に関与しており、感染細胞による膜伸長の形成を誘導することによって細菌の能動的な内在化にも関与することが示された（ボードーら、２００１年（Boudeau et al., 2001））。
【００１４】
真核細胞への細菌の接着プロセスは、アドヘシン（Adhesin）と呼ばれる細菌表面のリガンドと、細胞の受容体との間の特異的な相互作用による結果である（ビーチーら、１９８１年（Beachey et al., 1981））。ここまで上述されたI型繊毛による大腸菌株の接着に関与する受容体は、GPIアンカー型（glycosylphosphatidylinositol（GPI）anchored）糖タンパク質である（ギュグノら、２０００年（Guignot et al., 2000）；ロイシュら、１９９０年（Leusch et al., 1990）；マラビヤら、１９９９年（Malaviya et al., 1999）；ノウィキら、１９９３年（Nowicki et al., 1993））。I型繊毛のアドヘシンFimHはGPIアンカー型受容体であるCD48及びCEACAM6（CD66c）を認識する（シンら、１９９９年（Shin et al., 1999）；シンら、２０００年（Shinet al., 2000）；ソーターら、１９９１年（Sauter etal., 1991）；ソーターら、１９９３年（Sauter etal., 1993））。糖タンパク質CD66ｃ（CEACAM6又は“Non-specific Cross-reacting Antigen”としてNCAとも呼ばれる）は、イムノグロブリンファミリーに属し、それは、タンパク質のN末端部位の可変領域及び、ループの形成を導くジスルフィド結合（disulfide bridge）を含む定常領域の特徴を有する（ハマーストロム及びバラノブ、２００１（Hammarstrom and Baranov, 2001））。CD66ｃは、顆粒球、マクロファージ及び多核性好中球の表面に通常発現しているが、結腸、肺及び脾臓の表皮細胞においても発現している（オーデットら、１９８７年（Audette et al., 1987）；コルビンガーら、１９８９年（Kolbinger et al., 1989）；フォン，クライストら、１９７２年（von Kleist et al., 1972）；ジャントスチェフら、２００３年（Jantscheff et al., 2003））。
【００１５】
状態の深刻性及びその診断の現時点での困難性から、クローン病になりやすい性質又はクローン病の症例の早期及び信頼性の高い診断が、明らかに非常に高く望まれている。それは非常に長い待ち時間を解消するのに貢献するであろう。現時点で患者の管理と、類似した臨床画像を生じる他の全ての状態を除外した後における診断の確定との間である待ち時間は、常に患者に不利となる。
【００１６】
最後に、クローン病を予防する及び／又はこの疾患を治療することを可能にする方法も求められており、それは、現在用いられている方法より、より良い標的とされる。
【００１７】
従って、本発明の筆者は、クローン病の診断及び治療のための代替法の開発に着目した。発明の中心は、発明者によってなされた実証であり、クローン病を患う患者の回腸の部位におけるCD66ｃ受容体の異常な過剰発現及び、この受容体と大腸菌AIEC株との間の注目すべきアフィニティーの実証である。発明者によって得られたデータは、一方で、受容体がエンテロサイトの刷子縁の部位で過剰発現していることを示し、他方では、AIEC型大腸菌株がこれらの受容体に対して非常に高いアフィニティーを有することを示し、この事は、AIEC細菌による回腸粘膜のコロニー化の説明となるであろう。AIEC株のCD66ｃ受容体への接着はI型繊毛によって起こる。このAIECグループの参照株、すなわちLF82株は、大サブユニット（major  subunit）FimAと、小サブユニット（minor subunit）FimI及びFimFと、アドヘシンFimHとにいくつかのアミノ酸変異を有するI型繊毛の変異体を発現する（ジェイ，ボードーら、２００１年（J. Boudeau etal., 2001））。本発明の筆者は、クローン病を患う患者から単離した大腸菌株の５１％が、LF82参照株のFimHに観察されたのと同様に、FimHにアミノ酸変異を有するI型繊毛の変異体を有することを見出した。それ故に、これらI型繊毛変異体は、CD66c受容体に対するこれらの株の高アフィニティーの原因であると考えられる。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ01/013937号明細書
【非特許文献１】Colombel,   J.   F.   and  Mesnard,   B.   (1993)   Maladie  de  Crohn.   In:   Editions  Techniques,   Encycl.   Med.   Chir.   (Paris,   France).   Gastroenterologie,.   9-057-G10,:   1-15
【非特許文献２】Nakamura  RM.,  Matsutani  M.,  Barry  M  2003.  Advances  in  clinical  laboratory  tests  for  inflammatory  bowel  disease.  Clinic  Chimica  Acta  335:9-20
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【非特許文献４】Present,  D.H.,  Rutgeerts,  P.,  Targan,  S.,  Hanauer,  S.B.,  Mayer,  L.,  van  Hogezand,  R.A.,  et  al  (1999)  Infliximab  for  the  treatment  of  fistulas  in  patients  with  Crohn’s  disease  N  Engl  J  Med.  340: 1398-1405
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【非特許文献８】Shanahan  F.  Crohn’s  disease.  Lancet  2002;359:62-9
【非特許文献９】Desreumaux,  P.,  Brandt,  E.,  Gambiez,  L.,  Emilie,  D.,  Geboes,  K.,  Klein,  O.,  et  al.  (1997)  Distinct  cytokine  patterns  in  early  and  chronic  ileal  lesions  of  Crohn’s  disease.  Gastroenterology,  113:  118-126
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【非特許文献１２】Darfeuille-Michaud,  A.,  Neut,  C.,  Barnich,  N.,  Lederman,  E.,  Di  Martino,  P.,  Desreumaux,  P.,  et  al  (1998)  Presence  of  adherent  Escherichia  coli  strains  in  ileal  mucosa  of  patients  with  Crohn’s  disease.  Gastroenterology.  115:  1405-1413
【非特許文献１３】Boudeau,  J.,  A.  L.  Glasser,  E.  Masseret,  B.  Joly,  and  A.  Darfeuille-Michaud  1999.  Invasive  ability  of  an  Escherichia  coli  strain  isolated  from  the  ileal  mucosa  of  a  patient  with  Crohn’s  disease  Infect  Immun.  67:4499-509
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【非特許文献１８】Masseret,  E.,  Boudeau,  J.,  Colombel,  J.F.,  Neut,  C.,  Desreumaux,  P.,  Joly,  B.,  et  al  (2001)  Genetically  related  Escherichia  coli  strains  associated  with  Crohn’s  disease.  Gut.  48:  320-325
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【非特許文献３２】von  Kleist,  S.,  G.  Chavanel,  and  P.  Burtin  1972.  Identification  of  an  antigen  from  normal  human  tissue  that  crossreacts  with  the  carcinoembryonic  antigen.  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  69:2492-4
【非特許文献３３】Jantscheff  P,  Terracciano  L,  Lowy  A,  Glatz-Krieger  K,  Grunert  F,  Micheel  B,  Brummer  J,  Laffer  U,  Metzger  U,  Herrmann  R,  Rochlitz  C,  2003.  Expression  of  CEACAM6  in  respectable  colorectal  cancer:  a  factor  of  independent  prognostic  significance.  J  Clin  Oncol.  21:3638-46
【非特許文献３４】Grunert,  F.,  S.  Daniel,  G.  Nagel,  S.  von  Kleist,  and  P.  Jantscheff  1995.  CD66b,  CD66c  and  carcinoembryonic  antigen  (CEA)  are  independently  regulated  markers  in  sera  of  tumor  patients.  Int  J  Cancer.  63:349-55
【非特許文献３５】Kohler  et  Milstein,  (1975),  Nature  (London),  256:495-497
【非特許文献３６】Harlow  et  al.,  ed.,  1988  “Antibodies:  a  laboratory  manual”
【非特許文献３７】Scott,  J.K.  and  Smith,  G.P.,  1990  Searching  for  Peptide  Ligands  with  an  Epitope  Library.  Science,  249 :386-390
【非特許文献３８】Marks  JD,  Hoogenboom  HR,  Bonnert  TP,  McCafferty  J,  Griffiths  AD,  Winter  G.1991.  By-passing  immunization.  Human  antibodies  from  V-gene  libraries  displayed  on  phage.  J.  Mol.  Biol.  222,581-597
【非特許文献３９】Institut  Pasteur  Production,  Marnes-la-Coquette,  France
【非特許文献４０】Darfeuille-Michaud,  A.,  D.  Aubel,  G.  Chauviere,  C.  Rich,  M.  Bourges,  A.  Servin,  and  B.  Joly  1990.  Adhesion  of  enterotoxigenic  Escherichia  coli  to  the  human  colon  carcinoma  cell  line  Caco-2  in  culture  Infect  Immun.  58:893-902
【非特許文献４１】Knutton,  S.,  D.  R.  Lloyd,  D.  C.  Candy,  and  A.  S.  McNeish  1985.  Adhesion  of  enterotoxigenic  Escherichia  coli  to  human  small  intestinal  enterocytes  Infect  Immun.  48:824-31
【非特許文献４２】Lafeuille,  B.,  A.  Darfeuille,  S.  Petit,  B.  Joly,  and  R.  Cluzel  1981.  [“In  vitro”  study  of  attachment  to  human  enterocytes  in  “Escherichia  coli”  strains  isolated  from  infants  with  diarrheal  disease  (author’s  transl)]  Ann  Microbiol  (Paris).  132B:57-6
【発明の開示】
【００１８】
診断の適用（diagnostic  applications）
従って本発明の対象は、生体外でクローン病の診断又は、人のクローン病を発症する傾向の決定法であり、試験される被験者からの生体サンプル中におけるCD66ｃ受容体の発現レベルが、クローン病の指標となるコントロールのサンプル又は、試験対象者のクローン病を発症する素因の発現レベルより高いか否かが決定される。
【００１９】
発明の文中においては、「生体サンプル」は回腸生検（ileal  biopsy）又は、回腸生検から単離されたエンテロサイトの標品であろう。「回腸生検」という表現は、例えば、手術切離（回腸から除去される手術事項の表現であって、この場合に用いられる）又は、内視鏡の間に得られる回腸又は回腸粘膜の一部のサンプルを意味することが理解される。生体サンプルは同様に、血液又は血清を例とする生体の流体のサンプルであるか、その代わりの排泄サンプルであろう。
【００２０】
発明の方法は、回腸生検又は単離されたエンテロサイトの標品以外の生検サンプル、すなわち、特に生検サンプルが血液又は排泄サンプルである場合、について実施され、CD66ｃの検出を、CEA（「癌胎児性抗原（carcinoembryonic  antigen）」）を例とする腫瘍マーカーの（定量的又は半定量的）検出と組合せることが有利である（グラナートら、１９９５年（Grunert et al., 1995））。こうして、結腸直腸癌を患う患者とクローン病を患う患者とを直接区別することが可能である。
【００２１】
発明の方法は、CD66ｃの絶対発現レベルの定量的な決定をして、その後に平行して決定された又はそうでなければ既知であるコントロール対象中の受容体の発現レベルと比較することか、試験される生体サンプル中のコントロールサンプルと比較されるCD66ｃ受容体の相対的な発現レベルを直接決定することの（発現の半定量的検出がこの場合用いられるであろう）いずれかを含む。「コントロール」サンプルは、「健康な」被験者若しくはクローン病を患っていない被験者、又はいかなる炎症性腸疾患（IBD）若しくは結腸直腸癌も罹っていない被験者からのサンプルである。これは、場合によって、外傷性又は感染性起源の小腸の炎症性病巣を有する被験者であろう。クローン病の進行を決定するために、被験者のCD66ｃの発現レベルを決定すること及び、例えば数週間後に被験者に二回目の試験を行うことによって薬剤の効果又は疾患の進行を制御することが有効であろう。この場合、二回目の試験の結果は、一回目の試験の結果及び、通常は「健康な」被験者から得られた結果とも比較される。このように「コントロール」サンプルは、同一試験の被験者又は「健康な」被験者のいずれかを指す。
【００２２】
「被験者」又は「患者」は哺乳類、好ましくはヒトであり、性別、年齢及び全身の状態は関係ない。子供も含まれる。試験の被験者は無症状であるか、クローン病を発症する危険性があると考えられる者であろう。
【００２３】
「診断」の用語は、その発症の段階に関わらずクローン病の感染の決定及び確認を指す。これは特に早期診断又は再発の診断であろう。
【００２４】
CD66ｃ受容体の発現レベルは、様々な方法で決定されるであろう。それは特に、CD66ｃ受容体を解析すること又はその転写レベルを決定することによって決定されるであろう。転写レベルは、受容体をコードするｍRNAの量とも言える。それもまた、CD66ｃが豊富にあるマンノースユニットの検出及び／又は定量によって決定されるであろう。CD66ｃ受容体の発現を検出及び／又は定量するための様々な方法が、以下に説明される。
【００２５】
第一の実施形態においては、CD66ｃ受容体の発現レベルがCD66ｃ受容体タンパク質の量を測定することによって決定され、それは一般に、サンプル中に存在するCD66ｃ受容体と選択的に相互作用できる結合パートナーに生体サンプルを接触させることによる。一般に結合パートナーは抗体であり、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであろう。これは、特許出願ＷＯ01/013937に記載されるペプチド、及び以下の表１に記載されるペプチドの一つを例とするCD66ｃ受容体のペプチド断片でもあろう。
表１：
2008517261.tif 000002
【００２６】
抗体
「抗体」の用語は、あらゆる全長の抗体又は（遺伝子操作によって又はそうではなく得られた）抗体の機能性断片を指し、それらは、前記抗体を抗原性複合物の少なくとも一つの抗原性決定基に結合させることができる少なくとも一つの抗原性組合せ領域（antigenic  combination  site）を有する又はから成る。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)２断片、及び一本鎖可変断片（scFv鎖）が挙げられるであろう。
【００２７】
「捕捉抗体（capture  antibody）」の用語は、好ましく固相に固定された抗体又は抗体の一部を意味するものと理解される。それは、アフィニティー結合によって生体サンプル中に存在するCD66ｃ抗原を保持することができる。
【００２８】
生体サンプル中の抗原の存在は、「検出手段」によって明らかにされる。抗原の検出に関して、発明は特に、少なくとも一つの「検出抗体」を用いた検出を提供する。そのような標識された検出抗体は、捕捉抗体によって認識される領域とは異なるエピトープ領域を認識することによるアフィニティー結合によって、捕捉された抗原に結合することができる。
【００２９】
「標識された」の用語は、（酵素、放射線、蛍光色素及び発光化合物などによる）直接の標識と、（例えばそれらが直接標識された抗体による、又は、限定するのではないが、標識されたアビジン−ビオチンのペアなどを例とする標識された「アフィニティーペア」の試薬を用いた）間接的な標識の両方を指す。
【００３０】
「抗原断片」の表現は、免疫された動物において、CD66ｃにのみほぼ特異的な抗体の合成を誘導できるCD66ｃのあらゆる部分を意味するものと理解される。
【００３１】
「特異的に」の用語は、それが抗原に対する抗体の認識又は特定の結合を指す時には、抗体が他の抗原とほぼ相互作用することなくその抗原と相互作用することを意味する。
【００３２】
本発明で用いられる抗CD66ｃ抗体は、その抗原に特異的な抗体である。それらは、好ましくはモノクローナル抗体又は単一特異的（monospecific）ポリクローナル抗体であり、それらは一つのエピトープのみを特異的に認識するとも言える。
【００３３】
発明との関係において有益な、モノクローナル抗体若しくは単一特異的ポリクローナル血清、又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる抗体の生成は、従来式の技術である。
【００３４】
抗CD66ｃポリクローナル抗体は、とりわけウサギ、マウスなどを例とする動物に可溶性CD66ｃ受容体、又はその抗原断片を用いて免疫し、回収して、その後に例えば受容体を含む免疫吸着によって得られる抗血清を除去する（depleting）ことによって、得られるであろう。それは、当業者にとって周知の方法である。
【００３５】
いくつかのモノクローナル抗体が、開発されて市販されている。従って、抗CD66ｃモノクローナル抗体のクローン９A６（スイスのジェノバ（Genovac））又は、イノジェネックス、メナリニ  ダイアグノスティクス（InnoGenex,Menarini Diagnostics）（フランスのアンソニー（Anthony））の抗CD66ｃモノクローナル抗体を用いることができる。
【００３６】
一般に、他のモノクローナル抗体は、コーラーとミルステイン（Kohler and Milstein）（１９７５年）によって示されたリンパ球の融合及びハイブリドーマの培養の従来式の方法によって得られるであろう。モノクローナル抗体を調製する他の方法も知られている（ハーロウら、編、１９８８年「抗体：研究室マニュアル」（Harlow et al., ed., 1988 “Antibodies: a laboratory manual”））。モノクローナル抗体は、（マウス、ラット、ウサギ又はヒトでさえも、及び同類のものを例とする）哺乳類に免疫し、ハイブリドーマをもたらすリンパ球融合技術を用いて調製されるであろう（コーラーとミルステイン、１９７５年（Kohler and Milstein, 1975））。
【００３７】
この慣習的な技法の代わりとなる技法も存在する。例えば、ハイブリドーマによってクローン化された核酸を発現させることによって、モノクローナル抗体を生成することが可能である。抗体用ｃDNAをベクターに導入することによるファージディスプレイ法によっても、抗体の生成は可能である。それは一般に、（大腸菌用のFUSE5を例とする、スコット、１９９０年（Scott, 1990））ファージの表面に遺伝子ライブラリVを提示する線状ファージである。これらの抗体ライブラリを構築するプロトコルは、マークスら（Marks et al.,）（１９９１年）の文献に記載されている。
【００３８】
本発明の方法において、生体サンプル中のCD66ｃの検出に有用なキット及び試薬が、多数の生体サンプルに適用できる発明の簡単な実際の実施のために提供されるであろう。
【００３９】
生体サンプル中のCD66ｃの検出用キットは、上述したような抗体を少なくとも一つ含むであろう。
【００４０】
免疫学的試験
こうして、CD66ｃ受容体糖タンパク質の量は、生体サンプルを任意に標識された抗CD66ｃ抗体と接触させることと、形成される抗体−CD66ｃ受容体の複合体を検出することとを含む免疫学的試験によって測定される。前記抗CD66ｃ抗体は、特異的にCD66ｃを認識する。
【００４１】
例えば、CD66ｃの存在は、例えば競合、直接反応又はサンドイッチ式によるイムノアッセイを含む標準的な電気泳動及び免疫診断法を用いて検出されるであろう。前記アッセイは、特にウエスタンブロット、凝集試験（agglutination  test）、エライザ（enzyme-linked immunosorbent assay  (ELISA)）、アビジン／ビオチン型アッセイ、放射免疫アッセイ、免疫電気泳動、及び免疫沈降などを含む。一般に反応は、蛍光色素、化学発光色素、又は放射性分子若しくは酵素マーカー、又は代わりの染色液を例とするマーカーの可視化を含む。
【００４２】
発明による診断法は、固相又は均一相；一段階又は二段階；サンドイッチ法又は競合法を非限定的な例とする当業者に周知の様々な態様で実施されるであろう。
【００４３】
好適な実施形態によると、捕捉抗体は固相に固定される。固相の非限定的な例として、デンマークのヌンク（Nunc, Denmark）社から市販されているものを例とするマイクロプレート、特にポリスチレンのマイクロプレートを用いることができる。ディナル又はメルク−ユーロラボ（フランス）（Dynal or Merch-Eurolab (France)）から（エスタポール（商標）（EstaporTM）のブランド名で）販売されている物を例とする固形の粒子又は、ビーズ若しくは常磁性ビーズ又は、代わりのポリスチレン若しくはポリプロピレンのテストチューブなどを用いることも可能である。
【００４４】
二つの（捕捉及び検出）抗体間におけるサンドイッチ式イムノアッセイ様式は、生体サンプルが例えば血液又は排泄サンプルを例とする生体の流体である場合に、生体サンプル中に存在する抗原を検出するのに特に有利である。
【００４５】
競合による抗原検出のためのイムノアッセイ様式も可能である。他のイムノアッセイ法も想定されていると共に、当業者にとって周知であろう。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法、放射免疫アッセイ、又は他の検出法が用いられることによって、形成される抗原−抗体の複合体の存在が検出されるであろう。
【００４７】
好適な実施形態によると、生体外でクローン病を診断する方法は、血液又は排泄サンプルについての例えばＥＬＩＳＡ試験型の免疫学的試験を含む。従って、固定された捕捉抗体CD66abceと血液又は排泄物の様々な希釈物を伴う免疫プレートアッセイ（immunological plate assay）を用いることが可能である。CD66ｃ抗原は、特異的な検出抗体、すなわち、例えば酵素又は蛍光色素に結合されている標識された抗CD66ｃ抗体によって検出される。抗CD66ｃ抗体は、例えばダコー（DAKO）（Kat4Cクローン、デンマークのダコー）のマウス抗ヒトCD66abceモノクローナル抗体であろう。固定された抗体の代わりにコンカナバリンＡ（concanavalin A）を用いることで、そのマンノースユニットによって抗CD66ｃ受容体を捕捉する事もできる。
【００４８】
あるいは、CD66ｃ受容体の発現レベルは、抗CD66ｃ抗体の産生レベルを測定することによって決定されるであろう。抗CD66ｃ抗体の発現レベルは、好ましくは血液又は排泄サンプルにおいて、サンプルを任意に固定されたCD66ｃ抗原又はそのエピトープ断片に接触させ、形成された抗体−CD66ｃ受容体の複合体を検出することによって決定されるであろう。従って、固定されたCD66ｃ抗原及び、血液又は排泄物の様々な希釈物を伴う免疫プレートアッセイを用いることが可能であり、抗CD66ｃ抗体は、例えば酵素又は蛍光色素に結合されている、標識された抗IgG若しくは抗IgA、或いは抗IgM抗体によって検出される。
【００４９】
他の実施形態によると、発明の方法は、回腸生検に対して行われる免疫組織化学試験（immunohistochemical test）を含む。
【００５０】
例えば、固定された回腸生検の切片は、抗CD66ｃ抗体を用いて標識され、その後に、蛍光色素又はペルオキシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼ型の酵素に結合された二次抗体を用いて検出されるであろう。CD66ｃ受容体の発現は、顕微鏡観察又は電子読取の後に解釈され、疾患の進行ステージを示す（発現が見られない）０から（細胞質及び刷子縁部位で非常に高発現の）４の間の解剖病理学的スコアに従って分類されるであろう。
【００５１】
或いは標識試験は、回腸生検から単離されたエンテロサイトの標品を、検出できるように例えばFITC又はアレクサフルオル（Alexa  Fluor）488若しくは647型の蛍光色素で直接標識された抗CD66ｃ抗体に接触させることによって行われるであろう。クローン病の場合、エンテロサイトの刷子縁の部位に過剰発現しているCD66ｃ受容体の特異的な標識が、こうして可視化される。
【００５２】
マンノースユニットの検出
発明の他の実施形態によると、CD66ｃ受容体の発現レベルは、エンテロサイトの刷子縁の部位に存在するマンノースユニットの定量的な検出によって間接的に決定される。この種の試験は、特に回腸生検又は単離されたエンテロサイトの標品に対して行うのが実用的である。
【００５３】
それは、エンテロサイトの刷子縁の部位で高度にマンノース化されたCD66ｃ受容体の過剰発現を容易に実証することができる。例えば、マンノースユニットの定量的又は半定量的な検出は、検出できるように標識されたコンカナバリンＡを例とするレクチンに生体サンプルを接触させ、マンノースユニットに結合したコンカナバリンＡによって形成された複合体を検出することによって行われるであろう。例えば、コンカナバリンＡはFITCを例とする蛍光色素に結合されるであろう。
【００５４】
RNA試験
発明の他の実施形態によると、CD66ｃの発現レベルが、生体サンプル中のCD66ｃのmRNA量を測定することによって決定される。
【００５５】
遺伝子の転写レベルを決定する方法は周知である。例えば、（エンテロサイト又は回腸生検の標品を例とする）サンプル中に含まれる核酸は、一般に、溶解酵素又は、核酸に結合する樹脂による化学試薬を用いることを例とする標準的な方法によって最初に抽出される。そして、抽出されたmRNAは、（例えばノーザンブロット解析による）ハイブリダイゼイション及び／又は、特異的なオリゴヌクレオチドプライマを用いた逆転写後の増幅（RT-PCR）によって検出される。用いることができる特異的なプライマの例が以下に示される：
CD66c F: 5’CCTGCAGATTGCATGTCCCC (SEQ ID No. 1)
CD66c R 5’CCAATACGATTCTGGGGCAGG (SEQ ID No. 2)。
【００５６】
特別な例としての実施形態においては、生体サンプルが回腸生検又は単離したエンテロサイトの標品であり、CD66ｃのmRNA量が、好ましくは全RNAの抽出後に、リアルタイムRT-PCRで測定される。
【００５７】
治療的応用
発明の別の面では、クローン病の予防又は治療のための療法を提供する。これらの方法は、CD66ｃ受容体が、クローン病を患う患者において過剰発現しており、且つエンテロサイトの刷子縁への大腸菌AIEC菌の結合に必須であることの実証に基づく。それ故に、CD66ｃ受容体と大腸菌AIEC株との間の相互作用を特異的に阻害するあらゆる薬剤が、クローン病の予防又は治療に有用である。
【００５８】
従って、発明はCD66ｃ受容体及び大腸菌AIEC株間の相互作用を特異的に阻害する薬剤の使用にも関係し、それは、クローン病を予防又は治療するための薬剤の製造のためである。
【００５９】
この薬剤は、CD66ｃ受容体を特異的に認識し、この受容体の大腸菌AIEC株との結合を防ぐ抗CD66ｃ阻害抗体であろう。
【００６０】
若しくは、前記薬剤は、CD66ｃ受容体糖タンパク質又はCD66ｃをミミックする合成糖タンパク質であろう。
【００６１】
それは、特許出願WO 01/013937に記載されるペプチド及び、上に示されるペプチドの一つを例とするCD66ｃ受容体のペプチド断片でもあろう。
【００６２】
薬剤は、D-マンノース、メチル-D-マンノースを例とするマンノシド（mannnoside）又は、一つ以上のマンノースユニットを支持する粒子でもあろう。従ってその名のとおり、マンノシドの用語は、D-マンノースと、加水分解によってD-マンノースを放出することができる化合物とを含み、その化合物は、例えば加水分解によってD-マンノースを放出する（ホモ又はヘテロサッカライドである）ポリサッカライド及びオリゴサッカライド、及びAIEC株のアドヘシンFimHと相互作用できるD-マンノースのあらゆる誘導体である。一つ以上のマンノースユニットを支持する粒子は、例えば不活性なビーズ若しくは粒子、又は生きている若しくは死んでいる細胞であろう。
【００６３】
より詳細には、用いられる薬剤は、CD66ｃ受容体とAIEC株のアドヘシンFimHとの間の相互作用を特異的に妨げる薬剤であろう。
【００６４】
更に、発明はクローン病の予防又は治療のための候補物質を生体外においてスクリーニングする方法を提供し、それは、
(i)細胞表面で発現したCD66ｃ受容体を、試験する物質の存在下又は非存在下において、少なくとも一つの大腸菌AIEC株と接触させること、
(ii)CD66ｃ受容体と前記株との間の相互作用を特異的に阻害する物質の能力を決定し、前記物質を選択及び／又は同定すること
を含む。
【００６５】
候補物質は、自然若しくは合成の化合物、又は化合物の混合物を含むあらゆる種類のものであろう。物質は、構造的に明らか、又は例えば生体抽出物の形態である未知の構造であろう。
【００６６】
大腸菌AIEC株とCD66ｃ受容体との間の結合を阻害する候補物質の能力を決定するために、標準的な競合試験が、CD66ｃ受容体を発現している培養細胞に対して行われるであろう。これは、例えば受容体を過剰発現させるために遺伝的に軽質転換した細胞、又はクローン病を患う患者の回腸生検から単離したエンテロサイトであろう。それらは、単層に培養された（HT29、Caco-2、T84、intestine-407細胞を例とする）腸上皮細胞であろう。候補物質が同定されている化合物である場合、それは、例えば放射線又は（蛍光色素を例とする）非放射線マーカーで標識されるであろう。
【００６７】
その後に、CD66c受容体に特異的に結合したマーカーは、例えば１０−１０から１０−５Mの様々な濃度の前記候補物質存在下において定量されるであろう。或いは、接着試験によって、CD66ｃ受容体に対する候補物質及び大腸菌AIEC菌間の競合を観測することも可能である。
【００６８】
CD66c受容体と大腸菌AIEC株との間の相互作用を特異的に阻害する薬剤は、好ましくは経口投与用の薬用組成物の形態で考案されるであろう。
【００６９】
これらの組成物は、即座の又は制御されて放出されるタブレット、カプセル又は顆粒の形状を例として、例えば経口投与されるであろう。
【００７０】
経口投与用の固形組成物は、活性のある材料に、充填剤及び、適切な場合には結合剤、分解促進剤、潤滑剤、着色料又は味の矯正剤を添加すること、及び混合物をタブレット、コートされたタブレット、顆粒、粉末又はカプセルの形状にすることによって調製される。
【００７１】
充填剤の例には、ラクトース、コーンスターチ、スクロース、グルコース、ソルビトール、クリスタリンセルロース及び二酸化ケイ素が含まれ、結合剤の例には、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アカシア、トラガカントゴム、ゼラチン、セラック、水酸化プロピルセルロース、水酸化プロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン及びペクチンが含まれる。
【００７２】
潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ポリエチレングリコール、シリカ及び硬化した植物油が含まれる。着色料は、薬剤への使用が認可された物のいずれかであろう。
【００７３】
味の矯正剤の例には、ココアパウダ、ハーブ状のミント、アロマパウダ、オイル状のミント、ボルネオール、及びシナモンパウダが含まれる。タブレット又は顆粒は、糖又はゼラチンなどでコートするのに適しているであろう事が理解されるべきである。
【００７４】
クローン病の予防又は治療を目的とした治療薬の投与に効果的な用量及び投与量は、薬の性質、患者の大きさ、疾患のステージ、用いられている特定の治療用組成物及び担当医の観察及び結論を例とする多くの因子に基づく。
【００７５】
例えば経口投与の場合、タブレット又はカプセルを例とする適切で可能な投与量は、１日あたり体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは１日あたり体重の約０．５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１日あたり体重の約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの間、そして更に好ましくは１日あたり体重の約２ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇの間の活性物質である。
【００７６】
上述のように用いられるであろう経口による１日あたりの投与量の範囲を示すために、１０ｋｇから１００ｋｇの代表的な体重が考慮される場合、適切な投与量は、１日あたり約１−１０ｍｇから１０００−１００００ｍｇの間、好ましくは１日あたり約５−５０ｍｇから５００−５０００ｍｇの間、更に好ましくは１日あたり約１０．０−１００．０ｍｇから１００．０−１０００．０ｍｇの間、そしてより好ましくは、1日あたり約２０．０−２００．０ｍｇから約５０．０−５００．０ｍｇの間の活性材料であろう。
【００７７】
これらの投薬量の範囲は、投与される患者に対する１日あたりの活性材料の合計量を表す。１回分が投与される１日あたりの投与の回数は、特に薬物動態学的要因によって広く変化するであろう。
【００７８】
以下の図及び実施例は、その範囲を限定することなく発明を説明する。
【００７９】
実施例
実施例１：クローン病に関するAIEC菌に対する特異的な受容体としてのCD66ｃの同定：
A．細菌株及び培養
クローン病を患う患者由来の慢性の回腸病巣から単離された大腸菌LF８２株が、基準の株（接着性−侵入性大腸菌）として用いられている。この株は、ジェイ，ボードーら（J. Boudeau et al.）の文献（１９９９年）で説明されている。それは、培養中の腸上皮細胞に接着及び侵入して、エンドソーム系の小胞の溶解後に宿主細胞の細胞質で増殖する。それは、炎症誘導性サイトカインであるTNFαの大量分泌を誘導することによって、マウスのマクロファージJ774-A1中で生存及び増殖することができる。それは、マウスの腹膜のマクロファージ及びヒトの単球由来のマクロファージ中でも増殖する。
【００８０】
LF82株の変異体も用いられており、それらは、ジェイ，ボードーらの文献（２００１年）で説明されるように、I型繊毛をコードするfimオペロンのfimA遺伝子（変異体52D11）又はfimH遺伝子（変異体ZG2）へのトランスポゾンTn5phoAの挿入によってI型繊毛を発現しない。
【００８１】
細菌は、LB培地（Luria-Bertani (LB) broth）中、又はMH寒天プレート（Mueller-Hinton (MH) agar plate）上で培養される（Institut Pasteur Production, Marnes-la-Coquette, France）。
【００８２】
B. CDを患う患者及び健康なコントロール由来の回腸サンプル
エンテロサイトが手術による回腸部位から単離された。その部位は、１２人のクローン病を患う患者（CDの患者）及び、炎症性の腸疾患（IBD）を有さない7人の被験者から手術又は内視鏡生検によって得られた。サンプルは、回収直後に１０％グリセロール及び１０％DMSO（dimethyl  sulfoxide）（ミズーリ州セントルイスのシグマ，ケミカル，カンパニー（Sigma Chemical Company））を含むMEM（modified Eagle’smedium）（ドイツ、ベルリンのセロメド，バイオクロム（Seromed,  Biochrom））中において−８０℃で凍結された。
【００８３】
C. 生体外における単離したエンテロサイトへの接着
接着試験は、ダーフェウル−ミショーら（Darfeuille-Michaudet al.）（１９９０年）、エス，ヌットンら（S.Knutton et al.）（１９８５年）及びビー，ラフィーユら（B. lafeuille et al.）（１９８１年）の文献に説明されるように行われた。凍結された腸のサンプルは、PBSで３回洗浄され、そして回腸粘膜は、０．２５MのEDTAを含むPBSバッファー中でエンテロサイトを分離するために、カバーガラスによって剥された。約１０５個の単離されたエンテロサイトが、１０％牛胎児血清（FCS, セロメド（Seromed））を含むMEM培地中で１０８個の大腸菌細胞と混合された。穏やかに攪拌しながら３７℃で２時間培養した後に、エンテロサイトは（ｐH７．２の）PBSで３回洗浄された。細菌の接着は、１０００倍の倍率の位相差顕微鏡下で試験されることによって定量された。カウントは、３０から５０個のエンテロサイトの刷子縁に接着している大腸菌の数を決定するために、二重盲検デザイン（double blind design）に従って行われた。接着指数は、一つのエンテロサイトの刷子縁に接着している細菌の数として表される。
【００８４】
患者から得られるエンテロサイトの場合、観測される接着指数は、コントロールが０．０９６から０．５１１であるのに対し、０．５４２から１．９９９の範囲であった（表２）。
表２：エンテロサイトに対する細菌の接着指数
2008517261.tif 000003
a１個のエンテロサイトの刷子縁に接着している細菌の平均値。
【００８５】
１より大きい接着指数は、刷子縁に対する効果的な接着の指標として考えられる（エス，ヌットンら（１９８５年）；ビー，ラフィーユら（１９８１年））。実験において、１より大きい指数が、１３人中９人のCDの患者由来のエンテロサイトで観測され、それは６９％である。そして、コントロールでは、１より大きい指数は観測されなかった。エンテロサイトの刷子縁に接着するLF82株の能力は、コントロールよりCDの患者から単離されたエンテロサイトに対する方が著しく高い（P=0.006）。この事は、CDの患者が回腸のエンテロサイトの刷子縁に位置する受容体を発現しており、前記受容体がAIECであるLF82株の接着に関与するであろう考察を導き出した。
【００８６】
D. エンテロサイトの刷子縁における結合されていないマンノース残基の存在の解析
I型繊毛に位置するアドヘシンFimHは、レクチンとして機能し、宿主細胞の表面に発現する糖脂質又は糖タンパク質のマンノース化ユニットを認識する。これに基づいて、マンノース残基に特異的に結合するコンカナバリンＡ（ConA）が、CDの患者及びコントロールのエンテロサイトの刷子縁において、結合していないマンノース残基の存在を探索するために用いられた。単離されたエンテロサイトは、５０μｇ／ｍｌのConA-FITC（FITCで標識されたConA、シグマ）を含むPBS中で１時間培養された。４回の洗浄後、エンテロサイトは４００倍の倍率の蛍光顕微鏡下で観察された。
【００８７】
観察は、レクチンがCDの患者のエンテロサイトの刷子縁に結合していることを示した。一方、コントロールのエンテロサイトへのレクチンの結合は観察されず、それは、CDの患者のエンテロサイトの刷子縁における高度にマンノース化された分子の発現を示しており、それはコントロールでは観察されない。
【００８８】
E. 外科的切離によって得られた回腸サンプルにおけるCD66ｃの発現
炎症性の粘膜及び健康な粘膜のサンプルが、２０人のCDの患者及び２０人のコントロールそれぞれに対する外科的切離によって得られた。AFA（アルコール−ホルマリン−酢酸（alcohol-formalin-aceticacid））によって固定され、その後にパラフィンに包埋された断片と、４μｍ厚切片の標品とを用いることで、免疫標識は、抗CD66ｃ抗体での免疫標識用の自動装置（ベンタナ  メディカル  システム（Ventana Medical System））によって行われた。それには、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体に基づく方法を用いた。切片は、圧力釜において圧力下で３分間熱処理されることによって、エピトープを露出させることができた。
【００８９】
抗CD66ｃモノクローナル抗体のクローン９A６（ジェノバック（Genovac）、スイス）は、１：５０の希釈で抗体として用いられた。
【００９０】
切片はメイヤー（Mayer）のヘマトキシリンで染色された。
【００９１】
結果は、図１及び図２に示されている。健康な被験者の８５％が、このCD66ｃ抗原による標識を有さない。一方で、クローン病を患う患者は、上皮細胞の刷子縁の部位でCD66ｃ受容体の過剰発現を示した。この発現は、高度の炎症及び潰瘍を呈する粘膜の場合において非常に高い。
【００９２】
実施例２：細菌の接着に対する阻害試験
A. Ｄ−マンノースによる阻害アッセイ
Ｉ型繊毛によるエンテロサイトの刷子縁への大腸菌LF82株の接着に対するＤ−マンノースの阻害力が試験された。接着試験は、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ中において２％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンノース（シグマ）存在下で行われ、その処理は、３人のＣＤの患者（Ａ、Ｂ及びＣ）から得られたエンテロサイトに対して上述のように行われた。結果は表３に示されている。
表３：
2008517261.tif 000004
a１００％を表すと規定されたＤ−マンノース非存在下と比較した場合の、２％Ｄ−マンノース存在下における野生型ＬＦ８２株の接着力の割合。
【００９３】
Ｄ−マンノースの添加は、クローン病を患う患者のエンテロサイトの刷子縁へのLF82株の接着指数に顕著な減少をもたらす。
【００９４】
LF82株の変異体、すなわちＩ型繊毛を発現していない変異体52D11及びアドヘシンFimHを発現していない変異体ZG2も試験された。これらの変異体は、表４に示される結果が証明するように、刷子縁へ接着するためのそれらの能力を失っていた。
表４：
2008517261.tif 000005
aエンテロサイトの刷子縁に接着している細菌の平均値。
b１００％を表すと規定された野生型LF82株の接着力と比較した、変異型の接着力の割合。
【００９５】
これらの結果は、Ｉ型繊毛、及びより詳細にはLF82株のアドヘシンFimHが、クローン病を患う患者の回腸のエンテロサイトの刷子縁への接着に関与することを裏付ける。
【００９６】
B. 抗体による阻害試験
試験されたモノクローナル抗体は、抗CD66ｃモノクローナル抗体（フランス、アンソニー（Anthony）のイノジェネックス、メナリニ  ダイアグノスティクス（InnoGenex,  Menarini  Diagnostics））及び抗CD48モノクローナル抗体（フランス、ル  ペレ  エン  イブリーヌ（Le  Perray  en  Yvelines）のペリクラスター、テブ（PeliCluster,  Tebu））。これらの抗体は、１０％FCS含有MEM中に１／１００希釈で用いられる。
【００９７】
エンテロサイトは、３７℃で３０分間抗体で前処理される。その後にLF82菌が加えられ、接着試験が上述のように行われる。
【００９８】
結果は表５に示される。
表５：
2008517261.tif 000006
a１００％を表すと規定された抗体非存在下におけるエンテロサイトによって得られた値と比較した場合の、様々な抗体と前処理した後のエンテロサイトの刷子縁へのLF82株の接着率。
【００９９】
抗CD66c抗体を用いた前処理は、LF82株の接着に劇的な減少をもたらす。一方で、抗CD48抗体は接着に影響を与えず、この事はCD66ｃ抗体で観察された阻害の特異性を示す。これらの結果は、CDの患者の回腸粘膜に対するLF82株の接着が、腸上皮細胞の刷子縁の部位で過剰発現しているCD66ｃ受容体へのI型繊毛の結合に関与することを裏付ける。
【０１００】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、クローン病の炎症性腸疾患又は出血性直腸結腸炎型疾患を患っていない被験者（１A及び１B）、及びクローン病を患っている被験者（１C及び１D）の回腸粘膜の一部を表す。図１A及び１Cは、粘膜の炎症の無い部分であり、図１B及び１Dは、浸潤した多核性好中球の存在によって示されるように、粘膜の炎症を伴う部分である。図１Aは抗CD66ｃ抗体による標識を示さず、これは、この糖タンパク質が健康な組織には発現していないことを示す。クローン病を患っていない被験者由来の炎症の兆候を示す組織（図１B）でさえも、CD66ｃ抗体による標識は観察されないことが注目されるべきである。前記被験者の腸の炎症は、（小腸穿孔の術後の癒着である）外傷を原因とする。従って、回腸部位の糖タンパク質CD66ｃの存在は、粘膜の炎症状態とは結びつかない。図１Cは、クローン病を患う患者のエンテロサイトの刷子縁部位におけるCD66ｃの発現を示す。この発現は、潰瘍になっていない粘膜部位において、炎症の非存在下で観察される。図１Dは、クローン病を患う患者の炎症及び病巣となっている領域における、エンテロサイトの刷子縁部位でのCD66ｃの高発現と、このタンパク質の細胞質での発現を示す。免疫標識は、色原体（chromogen）に結合したアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体によって標識された抗CD66ｃ抗体を用いて行われる。
【図２】図２は、（図１のプロトコルに従って）抗CD66ｃ抗体による標識を示す患者又はコントロールの被験者の割合を示すグラフである。標識は、強度に応じて−から＋＋＋で評価されている。健康な被験者の１５％のみに対して、クローン病を患う患者の８５％が回腸部位でCD66c受容体を異常に発現している。
【図１】
2008517261.tif 000007
【図２】
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【配列表】
2008517261000001.xml
【国際調査報告】
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