(57)【要約】  本発明は、治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミド、より具体的には細胞増殖性疾患、免疫疾患、ニューロンの障害、後天性感染、および、炎症の治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミド、同様に、このようなプラスミドを、トランスフェクション試薬と共に含む製剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミド。
【請求項２】
細胞増殖性疾患、免疫疾患、ニューロンの障害、後天性感染および／または炎症の治療に使用するための、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
疾患は、癌、ＳＣＩＤ、パーキンソン病、Ｃ型肝炎感染、および／または、糖尿病から選択される、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
複製可能型ウイルスは、レトロウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５】
複製可能型レトロウイルスは、
レトロウイルスのＧＡＧコード配列；
レトロウイルスのＰＯＬコード配列；
レトロウイルスのＥＮＶコード配列；
レトロウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列；
を含み、場合により、以下の構成要素；
調節核酸配列に機能するように連結した異種コード配列；
レトロウイルスの細胞または組織特異的な標的化のための１またはそれ以上の標的配列；
の１種またはそれ以上を含む、請求項４に記載のプラスミド。
【請求項６】
プラスミドは、治療遺伝子および／またはコード配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項７】
治療遺伝子および／またはコード配列は、治療が標的とする細胞に特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーに機能するように連結している、請求項６に記載のプラスミド。
【請求項８】
複製可能型ウイルスは、溶解性ウイルスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項９】
溶解性ウイルスは、アデノウイルスである、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】
ウイルスの親和性は、強化されるか、または、改変されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１１】
プラスミドを治療が必要な患者に送達するのに用いられる方法は、高水圧トランスフェクションである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミドを、トランスフェクション試薬と共に含む製剤。
【請求項１３】
治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミドの製造方法であって：
（ａ）宿主細胞に、複製可能型ウイルスをコードする核酸を含むベクターを提供すること；
（ｂ）上記宿主細胞を培養すること；および、
（ｃ）上記プラスミドを回収すること、
を含む、上記方法。
【請求項１４】
インビボで、ヒトまたは動物である患者の細胞を複製可能型ウイルスをコードするプラスミドでトランスフェクションすることを含む、該患者の治療方法。
【請求項１５】
ウイルスのゲノムは、患者が罹っている症状の治療に適した治療遺伝子またはコード配列を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
症状は、細胞増殖性疾患、免疫疾患、ニューロンの障害、後天性感染、および、炎症からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００４年１１月２４日付で出願された米国特許第６０／６３０，９６３号の優先権を主張し、その開示は、参照により本発明の開示に含まれる。
【０００２】
本発明は、治療目的で複製可能型ウイルスをインビボで送達する分野に関し、具体的には、このようなウイルスを患者または宿主に導入することができる新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスは、ヒト以外の動物とヒトの両方における病気との闘いで現在広く用いられている治療剤である。特に、遺伝子治療のベクターとしてウイルスが利用されている。あるいは、癌または好ましくない増殖細胞を標的とし、それらを死滅させるために、細胞溶解性ウイルスが用いられており、このような治療は、「ウイルス療法」としても知られている。従って、薬物療法においてウイルスを直接使用することは、大いに成長する分野であり、処置や治療でウイルスを用いる新しい技術と用途が開発されつつある。
【０００４】
ウイルスとは、効率的にそれらの宿主細胞に侵入し、その細胞の細胞機構を利用してそれらの複製を容易にする、高度に進化した生物学的な実体である。このようなものとして、ウイルスは、外来／異種遺伝子またはコード配列をウイルスのゲノムに挿入することが可能であり、感染によって外来遺伝子を宿主細胞の細胞核に送達することができるため、理想的な遺伝子治療ベクターとして歓迎されている。遺伝子治療は最初に異常が遺伝子に単一遺伝子の欠陥にあるような遺伝病（例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ））を治療するために考慮された。しかしながら、現在、遺伝子治療の範囲はかなり広範囲になりつつあり、癌、心臓血管疾患、神経変性障害、炎症さらには感染症のような後天性疾患においても、遺伝子送達のためにウイルスが利用可能になることが想定される。
【０００５】
現在のところ、臨床的に適用できるウイルスベクターには、オンコレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来する５つの主要なクラスがある。各クラスのベクターはそれぞれ、ある種の用途には適しているが、その他の用途には不適切になるといった一連の異なる特性を有する。
【０００６】
この５つの主要なクラスのウイルスベクターは、それらのゲノムが宿主ＤＮＡに組み込まれるのか（オンコレトロウイルス、および、レンチウイルス）、または、細胞核中に、染色体外のエピソーム（ＡＡＶ、アデノウイルス、および、ヘルペスウイルス）として主に維持されるのかによって、２つの群に分類することができる。この区別は、各ベクターの特定の用途に対する適性の重要な決定要素である；非組み込み型ベクターは、所定の環境下で、非増殖細胞における持続的な導入遺伝子発現を媒介することができるが、組み込み型ベクターは、今のところ、分裂細胞で維持されるような安定な遺伝学的改変が必要かどうかを選択する手段にすぎない。
【０００７】
オンコレトロウイルスベクターは、開発すべきウイルスベクターの最初のクラスであり、これまで臨床試験で最も広く用いられている。これらは、従来、エクスビボでの幹細胞導入のための選択ベクターであった。しかしながら、ほとんどの研究が、自然に無傷の核膜に浸透し、非分裂細胞に形質導入することができるレンチウイルスベクターの開発に焦点を当ててきた。レンチウイルスベクターは恐らく、将来的に様々な病気の治療において重要なベクター系になると予想される。これらは、炎症を起こすことなく長期にわたり遺伝子発現を実現する、中枢神経系への遺伝子送達のための有効な手段であることが証明されている。
【０００８】
癌細胞のような増殖細胞を破壊するためにこのようなウイルスの細胞溶解能を利用する「ウイルス療法」技術に関して、このようなウイルスが、何らかの異種コード配列を含むことや、または、標的細胞に何らかの配列を送達することは必須ではない。このような方策において、増殖細胞だけが破壊されるように分裂細胞のみを標的化するウイルスを使用することが極めて望ましいといえる。このような場合において、薬物を系に添加することによってウイルスを破壊することができる核酸配列をウイルスベクターに挿入することも可能であり、それによりさらに高度な制御が可能になる。溶解性ウイルスとしては、アデノウイルスが挙げられる。
【０００９】
具体的な治療用途のためのベクターの選択に影響を与えるその他の因子としては、ベクターの親和性（すなわち宿主細胞の標的化）、標的細胞中での導入遺伝子発現の持続時間、および、ベクターの免疫原性が挙げられる。アデノウイルスベクターは、ほぼ間違いなくそれらの核酸配列を細胞核に送達することに関して最も効率的なベクター種であり、そしてアデノウイルスベクターを直接注射することによって、ほとんどの組織で効率的に形質導入を起こすことができる。
【００１０】
組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）は、非増殖組織における安全で長期にわたる遺伝子移入と発現のための最も将来性のあるベクター系の一つである。ＡＡＶは、その野生型ウイルスがヒトの病気をまったく引き起こさないことがわかっているという点で、遺伝子治療用途で開発されているウイルスのなかでも独特のものである。そのベクター粒子のサイズが小さく、単純であるために、急性の炎症性反応または毒性の副作用を惹起することなくベクターを高用量で全身投与することが可能である。
【００１１】
特異的な治療用途のためのベクターの選択に影響を与えるその他の基準は、ベクターのゲノムに異種ＤＮＡの取り込みを可能にする余地があることである。
【００１２】
モロニー白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のような単純なレトロウイルスをベースとする遺伝子治療のためのベクターは、標的細胞のゲノムに効率的に組み込まれることから、これらが選択されることが多い。組み込みは、形質導入された遺伝子を長期間にわたり発現させるための必要条件であると考えられる。
【００１３】
感染初期の過程で、レトロウイルスは、それらの核タンパク質のコアを標的細胞の細胞質に送達する。ここで、ウイルスのゲノムの逆転写が起こり、同時に、コアは組み込み前の複合体まで成熟する。この複合体は、細胞核に到達して、ウイルスのＤＮＡを宿主細胞の染色体に組み込まれなければならない。単純なレトロウイルス（オンコレトロウイルス）にとって、この過程は、細胞分裂中の核膜の溶解を必要とするが、これは、細胞核への能動輸送を促進するための明確な局在化シグナルがないために、このような嵩高なタンパク質／核酸複合体の核孔を介する受動拡散を妨害する可能性が極めて高いためである。
【００１４】
現在のところ、ヒトの遺伝子治療に用いられるほとんどのレトロウイルスベクターは複製欠損型であるため、組み込まれた野生型ウイルスのゲノム配列を含み、従ってウイルスを構築するのに必要な構造要素の全てを提供するパッケージング細胞中で生産しなければならないが、パッケージングシグナル配列（ｐｓｉ）が欠失しているため、それら自身の野生型ウイルスのゲノムを外殻で包むことはできない。
【００１５】
一般的に、このようなパッケージング細胞からは、わずか１０6-7コロニー形成単位（
ｃｆｕ）／ｍｌ程度のタイターでしか複製欠損型レトロウイルスベクターは生産されず、これでは、インビボでの形質導入にはまったく不十分である。
【００１６】
しかしながら、本発明は、一般に、複製可能型ウイルスに関し、インビトロで生産された治療用ウイルスの欠点に対処する方策を求めるものである。
【００１７】
ヒトなどの動物に導入するための十分に臨床上使用可能なグレードの治療用ウイルスを生産するためには、厳しい必要条件に従ってウイルスを生産しなければならない。一般的に、ウイルスを生産するためには、まず最初に、ウイルス配列（さらに、必要に応じて治療遺伝子）を含むプラスミドとして組換えウイルスを構築する。このプラスミドをインビトロで細胞にトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞によって生産されたウイルスを回収し、精製するが、このような治療用ウイルスは、自己複製能があるはずである。場合によっては、ウイルスを複製できなくすることが望ましく、すなわちこの場合、ウイルスはパッケージング細胞中で生産されなければならない。本発明は、自己複製できないウイルスには関係しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
臨床上使用可能なグレードのウイルスを生産するためには、費用がかかり技術的に要求の多い大規模の哺乳動物細胞培養物を増殖させなければならない。これは、一般的に、大きい表面領域を有するバイオリアクターを用い、滅菌状態を一定に維持することが必要であり（ほとんどの哺乳動物細胞は表面に付着させる必要があり、さもなくばアポトーシスを受ける）、さらに、長期間にわたる一定の潅流と培地の補充を維持することが必要である（ほとんどの哺乳動物細胞は平均して２４時間毎に１回しか分裂しないため、スケールアップさせたプロセスは、長時間かかる可能性がある）。回収の際に、特にレトロウイルスのような脂質のエンベロープを有するウイルスの場合、ウイルスを穏和に、しかし非効率的な方法で精製しなければならず、これらは非常にもろく、そして体積を減少させてウイルス調製物を濃縮するための低速の遠心分離、または、サイズ排除フィルターを介したタンジェンシャルフローろ過を必要とする場合が多い。レトロウイルスをペレット化する超遠心分離法による手法も考えられるが、一般的に、ウイルス粒子の多くがペレット化の際に破壊されるため、それよりいくらか濃縮された調製物が少量得られる代わりに全体の収率が相当量損失する。従って、治療で使用するための臨床グレードのウイルスの生産は、時間と費用がかかる挙げ句に、低い収量しか得られないと思われる。
【００１９】
従って、従来のウイルス治療法で行われている長期の培養および精製工程が原因で生じる問題を克服する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、この工程を完全に除くことによって、インビトロでの臨床グレードのウイルスの生産に関する問題を克服しようとするものである。従って、本発明者等は、インビボで組換え複製可能型ウイルスを生産するために、インビボでの細胞のトランスフェクションで、プラスミドを直接利用することを提案する。これまでに、当業者は、このような素晴らしい解決法を考案していない。
【００２１】
本発明は、このような従来の実施方法からの重要な移行に基づく。特に、インビボでの細胞の直接のトランスフェクションは、対象の細胞型、臓器または組織内での直接のウイルス生産を可能にし、さらに、標的細胞の局在的なトランスフェクション、それに続く低頻度のトランスフェクション事象を可能にする。また、インビボで生産されたビリオンが標的細胞型に対して親和性を受け入れる場合、まず最初に、非標的細胞型をプラスミドでトランスフェクションし、それらをプロデューサー細胞として作用させることも可能である。これは明らかに、治療方法に多大な柔軟性を提供する。
【００２２】
従って、本発明は、インビボでの細胞のトランスフェクションにおいて、組換え複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを利用することを目的とする。細胞がプラスミドでうまくトランスフェクションされると、複製能のある組換えウイルスの発現が起こると予想され、続いて、それにより細胞からウイルスが放出され、標的細胞をトランスフェクションすることが可能になると予想される。従って、最初の１回のプラスミドのトランスフェクション事象で、複数の標的細胞をトランスフェクションさせることが可能である。本発明において初めて、このような方法でプラスミドの利用が可能であることが確認された。上述したように、従来の遺伝子治療およびウイルス治療法は、ウイルスそのものの送達に焦点を当ててきたが、そのウイルスをコードするプラスミドの使用は極めて簡単であり、上記で述べられたいくつもの問題を克服する。
【００２３】
従って、一形態において、本発明は、治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを提供する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「プラスミド」は、細胞中で染色体外に存在することができる核酸構造物を意味する。従って、プラスミドは自律的な存続が可能であり、別個のレプリコンを構成する。プラスミドは、ＤＮＡ構造でもよいし、または、ＲＮＡ構造でもよく、好ましくはＤＮＡ構造であり、一本鎖または二本鎖の形態のいずれでもよい。一般的に、プラスミド分子は、環状の核酸分子であり、コード配列（遺伝子）と、調節配列（以下でさらに説明する）とを含む。しかしながら、ニックが入った環状の核酸分子や直鎖状の核酸分子も考慮される。特に好ましくは、プラスミドが、環状の二本鎖ＤＮＡであること、または、それらのニックが入った型（この場合、鎖の一方は、連続した環状ではない）であることである。上記ＤＮＡは、ウイルスのｃＤＮＡを含んでいてもよい。さらに、修飾された、または、非天然型の核酸残基がプラスミドに利用されていてもよい（例えば、イノシンが組み込まれていること）。
【００２５】
「ウイルス」とは、適切な宿主細胞中で増殖することができる非細胞性の感染性物質である。構造的に、感染性粒子（ビリオン）は、タンパク質様のキャプシドで被覆された核酸のコア（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および、場合によっては外側のエンベロープからなる。
【００２６】
細胞のトランスフェクションで用いられるプラスミドは、複製可能型ウイルスをコードする。本明細書で用いられる成句「組換え複製可能型ウイルスをコードするプラスミド」は、ウイルス（以下でさらに考察されているようなＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのいずれか）に関するコード配列を含むプラスミドを意味し、このようなプラスミドは、インビボにおけるトランスフェクションされた細胞内でのウイルスの生産に必要な全ての配列（例えば、コード配列遺伝子、および、プロモーター／エンハンサー）を含み、このような配列によって生きたウイルスが生産され、それらを生産した細胞から放出されると、さらにインビボで細胞をトランスフェクトできる。従って、本プラスミドは、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞を必要とすることなく、インビボで細胞をトランスフェクションすることができるウイルスの生産を可能にするのに必要な配列全てを含む。複製可能型ウイルスは、標的細胞に感染することができるため、それらによるインビボでの効率的なトランスフェクションが可能である。
【００２７】
本発明で使用するためのプラスミドは、（ｉ）ビリオン粒子の生産、集合および放出、（ii）前記粒子内にあるウイルスの配列（本明細書では、「ウイルスのゲノム」という）のパッケージング、（iii）前記粒子の細胞への侵入と感染の確立、および、（iv）感染した細胞中でのウイルスのゲノム配列の複製、に必要なウイルスの核酸配列を含む。
【００２８】
これらの配列としては、これらに限定されないが、末端反復配列、および、パッケージ
ングシグナル配列が挙げられ、加えて、野生型または異種ウイルスの転写因子、ポリメラーゼおよび構造的なキャプシド、および／または、エンベロープタンパク質をコードする配列も挙げられ、これらは野生型または異種プロモーターまたはエンハンサーのような機能するように連結した調節配列を共に含む。本発明で用いられるプラスミドの構造を以下でさらに詳細に述べる。
【００２９】
本発明において、適切なウイルスであればどのようなものでも使用可能である。このようなウイルスは、上述したように複製能があるため、限局された場で増殖が可能である。適切なウイルスとしては、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルス、および、ＤＮＡウイルスが挙げられる。適切なＤＮＡウイルスの例としては、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスが挙げられ、ヘルペスウイルスのようなより大きいＤＮＡウイルスを使用することは、それらのゲノム長さが１５０ｋｂにもなるためあまり好ましくはない。
【００３０】
好ましくは、本プラスミドにクローニングされたウイルス配列は、５０ｋｂ未満と予想され、典型的には、４ｋｂ（例えば、パロビン（ｐａｒｏｖｉｎｓ））〜約３６ｋｂ（例えば、アデノウイルス）の範囲のものである。本発明の用途に適したＲＮＡウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルスが挙げられ、例えばスプマウイルス、または、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、および、オンコウイルスのようなレトロウイルス科である。レンチウイルスとしては、「免疫不全ウィルス」が挙げられ、例えばヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ならびに、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）である。オンコウイルスは、腫瘍形成性でなくてもよく、例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、および、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型およびＩＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）が挙げられる。さらなる適切なＲＮＡウイルスとしては、ピコルナウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、肝炎ウイルス、および、インフルエンザウイルスが挙げられる。
【００３１】
当然ながら、本発明はさらに、改変されたウイルスにも及ぶことが理解されると思われ、例えば、特定の望ましい特徴を有するウイルスを生産するために、様々なウイルス由来の成分を利用したハイブリッドウイルスである。このようなハイブリッドウイルスとしては、アデノウイルス−レトロウイルスハイブリッド、および、アデノウイルス−レトロトランスポゾンハイブリッドが挙げられるが、適切なハイブリッドであればどのようなものでも使用可能である。
【００３２】
さらに、多数のウイルス由来の様々なコード配列および調節配列の組換えによって「デザイナー」ウイルスを生産することも可能である。
【００３３】
本ウイルスは、典型的には組換え体であり、そのゲノムが組換え核酸技術による操作の産物であり、野生型ゲノムとは同じではない。従って、そのゲノムは、一般的に、異種核酸の領域、すなわち通常野生型ウイルスに存在しない領域（例えば、それらの機能が変化するように改変されている天然型の領域）を包含すると予想される。好ましくは、異種領域は、治療のための分子、例えば、自殺遺伝子（例えばＰＮＰ）、または、治療用タンパク質（例えば、免疫刺激または抗炎症性サイトカイン）、または、ドミナント・ネガティブ分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子などをコードすると予想される。
【００３４】
従って、本発明のプラスミドは、複製可能型ウイルスをコードする配列を含む。本プラスミドに含まれる構成要素は、それによってコードされるウイルスの性質に応じて様々であると予想される。上述したように、本プラスミドは、以下の構成要素を含む：
（ｉ）ビリオン粒子の生産、集合および放出に必要なウイルスの核酸配列、例えば、ア
デノウイルスのＥ１Ｂ−１９ＫＤ遺伝子アイソフォーム（これは、感染の後の段階で宿主細胞のタンパク質合成を止めて、アポトーシスを促進することによって、ウイルスの放出を促進する）；ならびに、構造遺伝子、例えばレトロウイルスのｅｎｖ（エンベロープタンパク質）遺伝子、および、アデノウイルスＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４の「後期」遺伝子（これらは、ヘキソン、ペントンおよび繊維単位のようなウイルスのキャプシドの構造部材をコードする）；
（ii）前記粒子中での前記ウイルス配列（本明細書では、「ウイルスのゲノム」という）のパッケージングに必要なウイルスの核酸配列、例えばＰｓｉレトロウイルスパッケージング配列；
（iii）前記粒子の細胞の侵入と感染の確立に必要なウイルスの核酸配列、例えば、アデノウイルスのＥ１Ｂ−５５ＫＤアイソフォーム（これは、別の方法でＤＮＡ複製を阻害してウイルス感染を停止させると考えられている細胞の防御タンパク質ｐ５３を阻害するタンパク質をコードする）；および、
（iv）感染した細胞中でのウイルスのゲノム配列の複製に必要なウイルスの核酸配列、例えば、ウイルス複製のための優れた転写活性化因子であるアデノウイルスの「初期」遺伝子Ｅ１Ａ、または、逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼタンパク質をコードするレトロウイルスのｐｏｌ遺伝子。
【００３５】
従って、本プラスミドは、トランスフェクションされた細胞内で完全に複製能のある組換えウイルスを生産するのに必要な少なくとも最小限の配列を含むと理解されるだろう。本プラスミドに存在する配列のうちのいくつかは、１種より多くの機能を発揮するものでもよく、すなわち（ｉ）〜（iv）で確認されたような役割の１種より多くを果たすものでもよい。当然ながら、このような上述の役割を果たす配列は必ずしもペプチドをコードする「遺伝子またはコード」配列である必要はないが、核酸配列内ではプロモーターまたはエンハンサー領域である可能性があると理解されるだろう。本プラスミドに含まれる配列としては、これらに限定されないが、末端反復配列、および、パッケージングシグナル配列が挙げられ、加えて、野生型または異種ウイルスの転写因子、ポリメラーゼ、および、構造的なキャプシド、および／または、エンベロープタンパク質をコードする配列も挙げられ、これらは、野生型または異種プロモーター、または、エンハンサーのような機能するように連結した調節配列を共に含む。
【００３６】
レトロウイルスのゲノムはかなり単純なため、このようなゲノムまたはそれらの変異体は、本発明において有用なプラスミドへ取り込むのに特に好ましい。このようなゲノムは、３種の遺伝子座；ｇａｇ（キャプシドとマトリックスタンパク質をコードする）、ｐｏｌ（逆転写酵素をコードする）、および、ｅｎｖ（ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする）のみを含む。これらの構造遺伝子は、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化の実行に役立つ２個のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列を両端に持ち、さらに、パッケージングシグナル配列などのウイルスの繁殖に必要なその他全てのシス作用性配列を含む。
【００３７】
プラスミドを用いたトランスフェクションにより細胞に導入された組換えウイルスによって、治療遺伝子を標的細胞に送達することが要求される場合、このような治療遺伝子（またはコード配列）は、ウイルスのゲノムの一部として本プラスミドに含まれる。しかしながら、いくつかの実施態様において、標的細胞にいかなる治療遺伝子も送達されないことが望ましい場合も予想される。その代わりに、溶解性ウイルスが本プラスミドによってコードされてもよく、さらに細胞中でこのウイルスが生産されると、子孫ウイルスを放出するためにアポトーシスを促進することによってそれらが細胞を破壊する（例えばアデノウイルスは、溶解性ウイルスである）。この方策は、例えば癌細胞の治療に使用可能である。このようなプラスミドが癌細胞にトランスフェクションされ、溶解性ウイルスが発現されると、子孫ウイルスが放出されるために癌細胞は死滅する。このようなウイルスは、「細胞溶解性」ウイルスとして知られており、本発明の範囲内である。このようなウイルスは、以下でさらに考察されているように、癌細胞を標的とすることもできる。
【００３８】
あるいは、本プラスミドは、標的細胞に導入することが望ましい治療遺伝子またはコード配列を含んでいてもよい。これは、あらゆる望ましい治療剤をコードする遺伝子が可能であり、例えば、正常な宿主タンパク質の突然変異していない型、例えばインスリン、成長ホルモン、血液凝固因子、サイトカイン（例えばインターロイキン）、またあるいは、自殺遺伝子、例えばプロドラッグを変換することができる酵素、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（遺伝子サイレンシングのための阻害的低分子ＲＮＡ）、および、遺伝子発現の調節因子／エンハンサー／サプレッサーをコードする遺伝子である。当業者であれば、プラスミドに含ませるのに適した遺伝子を認識しているものとする。治療遺伝子／コード配列は、一般的に、一旦細胞の内部にあれば、遺伝子の転写を可能にするプロモーターに機能するように連結していると予想される。場合により、治療遺伝子はエンハンサーにも連結している。プロモーターとエンハンサーはいずれも、ウイルス中に天然に存在するものでもよいし、通常、その天然の形態で遺伝子またはコード配列に結合しているものでもよく、または、あらゆる適切な源由来の外因性の構成要素も可能である。本発明の好ましい実施態様において、治療遺伝子の発現を制御するプロモーターおよび／またはエンハンサー配列は、治療が標的とする細胞（標的細胞）に特異的であり、従って、標的細胞集団中でのみ治療遺伝子またはコード配列を発現させることができる。このような標的化は、以下でさらに考察する。
【００３９】
本明細書で説明されている使用において、本プラスミドは、標的細胞に送達するための治療遺伝子を、０個、１個またはそれ以上（例えば、１、２、３、４、または、５個）含んでいてもよい。
【００４０】
本発明で利用されるプラスミドは、治療のためのコード配列が存在する場合はそれと共に、ウイルス遺伝子／コード配列の転写と翻訳を起こすのに必要な配列を含む。下記で、このような配列は、「調節核酸配列」として説明されており、例えば、細胞中でコード配列の複製、転写および翻訳を総合的に実施するプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製開始点、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサーなどが挙げられる。天然のウイルス配列を用いてもよい。これらの構成要素全てが、必ずしもコード配列を複製、翻訳および転写するために存在する必要はない。しかしながら、標的細胞の特異性を高めるために、異種ではない配列を使用して、プラスミドからコード配列を直接発現させることが可能である。例えば、組織特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサー、または、プラスミドに含まれる遺伝子の発現レベルを改変するその他のあらゆる配列を使用することが可能である。従って、例を挙げれば、腫瘍関連のプロモーターおよびエンハンサー、例えばＭＵＣ−１、ＰＳＡおよびチロシナーゼ、ならびに、組織特異的なプロモーターおよび／またはエンハンサーが挙げられ、例えば、グルカゴン遺伝子プロモーター由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーであり、これは、遺伝子発現を消化管内分泌細胞に制限する。
【００４１】
プラスミドによる細胞のトランスフェクションによって生じた後代のウイルスは、標的細胞に感染するために、それらの天然の細胞結合能（親和性）を利用すると考えられる。より好ましくは、ウイルスの親和性は、標的細胞との結合および侵入に関連するタンパク質の遺伝子／コード配列を改変することによって強化または改変してもよい。このような再標的化ウイルスは当業界周知である。例えば、レトロウイルスのエンベロープタンパク質は、親和性を変化させるために改変することができる。従って、いずれかのウイルスの細胞の標的化に関与するコートまたはエンベロープタンパク質に関するコード配列は、改変されていてもよく、これは好ましくは標的化核酸配列の添加による。標的化核酸配列は、標的化リガンド、例えば抗体およびそれらの誘導体（例えば単鎖抗体）、抗原、レクチン、糖ペプチド、ペプチドホルモン、例えばヘレグリン、受容体または受容体のためのリガンド（例えば、ビオチンおよびアビジンの結合対）をコードする。しかしながら、どのような標的化のための成分でも使用可能である。
【００４２】
最初のプラスミドのトランスフェクション工程は、どのような細胞で行ってもよく、以下でさらに考察されているように、ウイルス治療の標的細胞である必要はない。「最初の細胞」とは、投与したプラスミドによってトランスフェクションされた細胞である。従って、最初のトランスフェクションされた細胞はどのような細胞でもよいが、好ましくは、ウイルス治療がその必要がある領域に向けられるように、標的細胞であるか、または、標的細胞と同じ臓器または組織中である。従って、最初の細胞は、例えば、プラスミドのトランスフェクションにおいて容易に接触できる場所に存在していてもよく、すなわち肝臓（標的細胞が接触しにくい、すなわち標的細胞が肝臓の内部にある）のような臓器の表面上に存在していてもよい。しかしながら、好ましくは、トランスフェクションしようとする最初の細胞は、標的細胞であるか、または、それに極めて近接している。
【００４３】
本プラスミドは、好ましくは、本プラスミドを特定のタイプの組織または細胞に方向付けることによって、その特異的な組織または細胞型のトランスフェクションを促進するような標的化成分またはリガンドに結合（例えば接合）していてもよい。例えば、標的化成分を用いて、腫瘍細胞を特異的に標的とすることもできる。
【００４４】
「標的細胞」は、ウイルス治療が対象とする細胞である。細胞は、単に細胞型に基づいた標的細胞（例えば肝細胞）でもよいし、および／または、位置に基づいた標的細胞（例えば脚の平滑筋細胞）でもよい。標的細胞は、癌細胞でもよい。あるいは、標的細胞は、Ｃ型肝炎のような感染を受けている細胞、炎症の過程に関与する細胞、または、外部から提供された遺伝子の供給を必要とする細胞であってもよく、例えば、糖尿病患者の膵臓細胞に、機能するインスリンをコードする配列が供給できる。従って、標的細胞は、その細胞に関連する症状を直接的または間接的に軽減、改善または治療すると予想されるコード配列をその細胞に移入させることによって、所定の特性を破壊することが望ましい細胞、または、所定の特性を変化させることが望ましい細胞であり得る。
【００４５】
複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを用いて、あらゆる病気、状態、障害、感染または炎症を治療することが可能である。特に、本発明を用いて、あらゆる細胞増殖性疾患、例えば癌、免疫疾患、例えばＳＣＩＤ、ニューロンの障害、例えばパーキンソン、後天性感染、例えばＣ型肝炎感染、および、炎症を治療することができる。当業者であれば、遺伝子、特にウイルスベースの治療を用いて治療が可能な状態および病気の範囲を認識できるだろう。
【００４６】
さらに、本発明は、免疫化の目的で用いることができ、例えば、本プラスミドは、対応する抗体が生じることが望ましい複製可能型ウイルスをコードする。
【００４７】
複製可能型ウイルス配列に加えて、本発明のプラスミドは、プラスミド主鎖を含んでいてもよい。適切なプラスミド主鎖は当業者既知であると予想され、これは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））のような一般的な教本で説明されている。プラスミド主鎖は、好ましくは、細胞培養物中でプラスミドを複製させるための複製起点を有する。このような状況において、「細胞培養物」は、プラスミドが増殖し、維持することができるインビトロでの細胞培養物を意味するが、治療目的で本発明のプラスミドが投与される患者の細胞のことではない。典型的には、細胞培養物は、細菌細胞培養物と予想され、例えば適切なＥ．ｃｏｌｉ株であるが、酵母などのその他の細胞培養物を用いてもよい。本プラスミドの複製起点は、細胞培養物の細胞に適合していなければならず、当業者であれば、適切な組み合わせをどのようにして選ぶかを認識できるだろう。
【００４８】
適切なプラスミド主鎖の例としては、ＣｏｌＥ１複製起点を含むＣｏｌＥ１型のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２（例えばトポジェン社（ＴｏｐｏＧＥＮ，Ｉｎｃ.，１０８エイセズ・アレイ・ポートオレンジ，フロリダ州，米国３２１２８）より入手可能）、ｐＵＣ１８（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｌ０９１３６）、ｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｌ０９１３７）、ｏｒｉＲを含むＲ１プラスミド（Ｎｏｒｄｓｔｒoｍ  Ｋ，Ｍｏｌｉｎ  Ｓ，Ｌｉｇｈｔ  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｉｄｓ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｒ１  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｌａｓｍｉｄ．１９８４年９月；１２（２）：７１〜９０）、ならびに、ｐＭＢ１および／またはｐ１５Ａ複製起点を含むプラスミドが挙げられる。
【００４９】
適切なプラスミド主鎖のその他の例は、例えばＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ブラウンシュバイク，ドイツ）から入手可能なＲ６Ｋである。Ｒ６Ｋは、３個の複製起点、アルファ、ベータおよびガンマ、ならびに、Ｒ６Ｋ複製に必要なｐｉタンパク質をコードするｐｉｒ遺伝子を含む。
【００５０】
本発明に係るプラスミドは、適切な複製可能型ウイルス由来の配列と、適切なプラスミド由来の配列とを組み合わせて構築されてもよい。あるいは、望ましいプラスミドおよび／またはウイルス配列をデノボ合成してもよい。
【００５１】
好ましくは、複製起点は、宿主細胞あたり大量のコピー数のプラスミドを生産して、宿主細胞あたり大量のプラスミドが回収できるようなものであるが（例えばＣｏｌＥ１）、場合によっては、少ないコピー数の複製起点が好ましい場合がある。
【００５２】
好ましくは、プラスミド主鎖はまた、本プラスミドで形質転換された細胞を同定／選択できる１種またはそれ以上の選択マーカーも含む。適切な選択マーカーは、当業者既知である。好ましくは、このようなマーカーは、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ブレオマイシンなどに対する耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子である。適切な選択マーカーのその他の例としては、重金属耐性遺伝子、および、アミノ酸生合成マーカーが挙げられる。
【００５３】
本プラスミドは、慣例的な組換え核酸技術を用いて構築してもよく、例えば、制限エンドヌクレアーゼで望ましい核酸フラグメントを切断し、核酸フラグメントを例えばＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションすることが挙げられる。元のウイルス配列がＲＮＡであり、ＤＮＡプラスミドを使用することが望まれる場合、そのＲＮＡ配列に対応するベクターで使用するためのＤＮＡ配列を生成するために、逆転写酵素を使用することが可能である。いくつかのＲＮＡウイルスにおいては、プラスミド構築にｃＤＮＡ配列を使用してもよい。プラスミドの構築方法は当業界周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，コールドスプリングハーバーラボラトリープレスで説明されている。
【００５４】
本発明において、本プラスミドは、インビボで直接用いられる。従って、組換え複製可能型ウイルスをコードするプラスミドそのものが、標的の生物に導入される。上記のプラスミドが「治療に使用するため」であるという記述は、これを念頭において解釈しなければならない。本明細書で説明されているようなプラスミドが治療に関する環境下で製造されるもの、例えばそのプラスミドによってコードされたウイルスが投与されるために、プラスミドそのものが患者には投与されることがないような方法または使用はいずれも、本発明の範囲内ではない。これまでに、本発明のようなウイルスをコードするプラスミドの送達は考慮されておらず、これは、最初のトランスフェクション事象のために十分なウイルスタイターを得ている点において従来技術の操作が難しい方法を克服している。
【００５５】
それゆえに、その他の観点において、本発明は、インビボでの複製ウイルス生産に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを提供する。
【００５６】
さらに、本発明は、治療遺伝子を標的細胞／組織／臓器に送達するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを提供する。
【００５７】
上述したように、本発明は、操作が難しいウイルス粒子の精製を必要とせず；その代わりに、プラスミドを用いて、治療が必要な被検体の細胞を形質転換させることができる。一実施態様において、本プラスミドは、適切な細胞（典型的には細菌細胞）を本プラスミドで形質転換すること、この細胞を、本プラスミドの維持および／または複製を容易にする条件下で培養すること、および、標準的な方法を用いて、この細胞培養物から本プラスミドを精製することによって生産してもよい。続いて、本プラスミドを直接用いて、治療が必要な被検体の細胞を形質転換してもよい。ＲＮＡウイルスの場合、この実施態様が好ましい。
【００５８】
本発明の、ＤＮＡウイルスに好ましいその他の実施態様において、本ウイルス配列は、まず、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）または酵母人工染色体（ＹＡＣ）のような適切なベクターに挿入される。続いて、望ましい量の上記ベクター＋ウイルス配列構築体が、適切な宿主細胞（典型的には細菌細胞だが、ＹＡＣの場合は酵母）を形質転換することによって生産され、この宿主細胞を培養してもよい。続いて、ベクター＋ウイルス配列構築体を細胞から精製してもよく、さらに、例えば制限酵素消化によって、または、リコンビナーゼを用いることによって、一部または全部のベクターからそのウイルス配列を分離してもよい。続いて、上記ウイルス配列を含む望ましい核酸分子を、標準的な方法、例えばゲル電気泳動またはクロマトグラフィーによって精製してもよい。続いて、この方法で得られた上記ウイルス配列を含む核酸分子を、本発明のプラスミドとして使用することができる。このプラスミドは、直鎖状でもよいし、または、環状でもよい。場合によっては、例えばウイルスが自然状態で直鎖状の核酸分子として存在する場合（例えばアデノウイルス）、直鎖状のプラスミドが好ましい場合がある。好ましくは、直鎖状の核酸分子の末端は、例えば、患者へのトランスフェクションの前に、ウイルスの末端結合タンパク質ＴＢＰの組換え型とそれらを結合させることによって保護してもよい。
【００５９】
その他の例において、環状のプラスミドが好ましい場合があり、この場合、いずれかの直鎖状の核酸分子を処理して、それらを環状にしてもよい。この実施態様において、好ましくは、最初の構築体は、挿入されたウイルスの直鎖状の配列の末端部分に、特異的な、かつ特徴的な制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ認識配列（例えば、珍しい切断制限酵素、例えばＰｍｅＩ、またはＣＲＥリコンビナーゼに対応するｌｏｘＰ部位）を含む。
【００６０】
従って、さらなる形態において、本発明は、治療に使用するための複製可能型ウイルスをコードするプラスミドの製造方法を提供し、前記方法は：
（ａ）宿主細胞に、複製可能型ウイルスをコードする核酸を含むベクターを提供すること；
（ｂ）前記宿主細胞を培養すること；および、
（ｃ）前記プラスミドを回収すること、
を含む。
【００６１】
一実施態様において、本方法は、
（ｄ）前記複製可能型ウイルスをコードする核酸フラグメントを切り出すこと；
（ｅ）前記フラグメントを精製すること、
をさらに含む。
【００６２】
好ましくは、上記の方法で用いられる宿主細胞は、パッケージング細胞（組み込まれた野生型ウイルスのゲノム配列を含むため、ウイルスの集合に必要な全ての構造的な構成要素を提供するが、パッケージングシグナル配列ｐｓｉの欠失により、それら自身の野生型ウイルスのゲノムを外殻で包むことができない細胞）ではない。
【００６３】
標的の生物は、ヒト以外の動物でもよく、例えば哺乳動物、鳥類、爬虫類または魚類である。好ましくは、本プラスミドは、哺乳動物、例えば愛玩動物（イヌおよびネコ）、家畜動物（例えばウシ、ウマ、ヒツジおよびヤギ）、または、ヒト以外の霊長類、例えばサルおよびゴリラに対してインビボで直接用いられる。しかしながら、最も好ましくは、標的の生物はヒトである。
【００６４】
本プラスミドは、あらゆる適切な方法論を用いて、インビボで細胞（上記で考察されたように、それ自身が標的細胞であってもよいし、そうでなくてもよい）にトランスフェクションされる。従って、本プラスミドは、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、または、弾丸遺伝子導入法によって最初の細胞にトランスフェクションされてもよい。さらに、トランスフェクションを誘導する化学物質も、インビボで本プラスミドと共に導入されてもよい。典型的には、トランスフェクション試薬は、本プラスミドを含む混合調製物に含ませてもよいし、または、同時または連続的に投与してもよい。
【００６５】
従って、さらなる形態において、本発明は、複製可能型ウイルスをコードするプラスミドを、トランスフェクション試薬と共に含む配合物を提供する。以下に、より詳細に考察されているように、化学物質と同様にトランスフェクション試薬は、弾丸遺伝子導入が用いられる場合、ペレット（例えば、タングステン製のマイクロペレット）の形態であってもよい。トランスフェクション試薬としては、トランスフェクションに使用するのに適したキャリアーが挙げられる。適切なトランスフェクション試薬の例としては、哺乳動物細胞によるそれらの取り込みを容易にするために、ＤＮＡと混合することができる脂質化合物、例えばリポフェクチン、リポフェクトアミン、フージーン（Ｆｕｇｅｎｅ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌの製剤が挙げられる。これらは当業者既知であり、多くは市販されている。「ポリプレックス」を形成するために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなポリマー、または、ＤＮＡとの静電気的な結合のためのポリカチオン性の配列を含むペプチドリガンドも使用可能である。
【００６６】
エレクトロポレーション法によるトランスフェクションの場合（この方法において、組織または臓器を電解質／プラスミド溶液に浸し、約２０００ボルトの電気を印加することによって、細胞と核膜に大きい穴があき、そこを本プラスミドが通過することができる）、当然ながら、最初のトランスフェクション事象に関与した細胞が、容易に接触できることがより望ましいと予想される。
【００６７】
また、粒子衝撃法（または「弾丸遺伝子導入」としても知られている）を用いて、最初の細胞を本プラスミドでトランスフェクションしてもよく、この場合、プラスミドを結合させたタングステン製のマイクロペレットを細胞や組織に高速で撃ち込むために、いわゆる「ジーンガン」が用いられる。このような技術は、インビボで容易に用いることができる。
【００６８】
あるいは、本プラスミドは、生理学的に許容できる化学的なトランスフェクション試薬（例えばリポフェクション試薬）と共に、インビボで導入することができ、このような試薬は、カチオンまたはアミンベースのものが可能である。リポフェクションには、細胞へのエンドサイトーシスを受けたプラスミドとリポソーム複合体が含まれる。細胞に入る複合体の多くがリソソームで分解されると予想されるため、一般的に、そのうちいくつかがリソソームによる分解を回避して、まったく能動輸送メカニズムが存在しなくても全体的な流れによって細胞核への侵入が可能になるように、複数（すなわち数千、数万、数十万）のプラスミドのコピーをトランスフェクションすることが必要である。使用可能なその他の化学物質としては、リン酸カルシウムが挙げられる。
【００６９】
加えて、「高水圧トランスフェクション（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」として知られている手法もあり、この方法において、大量のプラスミド溶液の流動体が高圧で血管系に送達され、気圧障害と、本プラスミドと最初の細胞とのより長い接触時間（なぜなら、大量の流動体が排出されるのにより長い時間がかかるため）とを組み合わせることが可能なため、比較的優れたレベルのトランスフェクションが起こる。Ｚｈａｎｇ等（１９９７年）により、マウスにおける高水圧遺伝子送達の適切な方法が報告されている。これは、尾の静脈に留置された２７ゲージの注射針を介してプラスミド溶液を注入することを含む。より大型の動物やヒトでは、肝臓に高水圧プラスミド送達のための注射を行ってもよく、この場合、以下を介してなされる：（ａ）門脈内注射、この場合、注入処置中に、および、その直後に、肝静脈および下大静脈を閉塞させることによって流れを一時的にブロックする、または、（ｂ）肝静脈注射（下大静脈経由）、この場合、注入処置中に、および、その直後に、門脈、大静脈および肝臓動脈を閉塞させることによって流れを一時的にブロックする、または、（ｃ）肝臓動脈注射（大腿動脈および腹部大動脈経由）、この場合、注入処置中に、および、その直後に、肝静脈および門脈を閉塞させることによって流れを一時的にブロックする。高水圧トランスフェクションは、肝臓を例に取って上述した通りであるが、当業者であれば、その他の臓器または体の部分を、それに相当する方法を用いてトランスフェクションすることが可能であることが理解できるだろう。
【００７０】
製剤に含ませることができる適切な生理学的に許容できるキャリアーまたは希釈剤は、当業者既知である。
【００７１】
プラスミドを直接的に標的化に用いることによって、トランスフェクションと細胞核への侵入の速度を高めることが可能である。一般的に、プラスミド−タンパク質結合体を用いることが可能であり、例えばポリリジンがプラスミドの標的化方策で用いることができる。多数のグループが、核局在化配列を含むタンパク質をプラスミドＤＮＡに予め結合させると、プラスミドのトランスフェクションと発現の効率が強化されることを報告している（例えば、高移動度グループ（ＨＭＧ）非ヒストンタンパク質を用い、さらに転写因子を用いて、細胞核へのプラスミドの侵入を強化している）。
【００７２】
従って、本発明は、場合により治療遺伝子／コード配列が組み込まれた、組換え複製可能型ウイルスのコード配列を細胞に送達するための、インビボでのプラスミドの直接的な使用に関する。
【００７３】
従って、本発明は、インビボで、患者の細胞を複製可能型ウイルスをコードするプラスミドでトランスフェクションすることを含む、ヒトまたは動物である患者の治療方法に及ぶ。典型的には、本ウイルスのゲノムは、患者が罹っている状態を治療するための治療遺伝子を包含すると予想されるが、あるいは、本ウイルスそれ自身が、患者を「治療する」可能性があり、この場合、例えば本ウイルスがトランスフェクションされた細胞の溶解を引き起こすことによって、固型腫瘍が破壊される。好ましくは、患者はヒトである。「治療」は、患者の状態、または、そのうち１種またはそれ以上の症状が、部分的に、または、全体的に回復することを含む。
【００７４】
本プラスミドが細胞にトランスフェクションされ、プラスミドが細胞核に侵入すると、細胞による転写および翻訳機構により、本プラスミドに含まれるコード配列の転写および翻訳が始まると予想される。本プラスミドが細胞核に侵入したら、その細胞は、本プラスミドによコードされたウイルスによって効果的に感染し、宿主細胞の機構によってプラスミドのコード配列が翻訳、転写されてウイルスの生活環が始まる。
【００７５】
本プラスミドによってコードされたウイルスは複製能があるため、生活環のなかでも適切な時点で、最初にトランスフェクションされた細胞から組換え複製可能型ウイルスが放出されると予想される。子孫ウイルスが放出される間に、最初にトランスフェクションされた細胞が溶解するかどうかは、ウイルスの性質に依存する。そのウイルスに溶解能がある場合（例えばアデノウイルス）、子孫ウイルスの放出に細胞の溶解が伴うと予想される。しかしながら、いくつかのウイルスは、害を及ぼすことなく細胞表面から発達するため（例えばＭＬＶ）、最初にトランスフェクションされた細胞は生き残ると予想される。
【００７６】
従って、最初にトランスフェクションされた細胞は、実質的にインビボでのウイルス生産細胞として作用し、続いてそのウイルスが放出されてそれらの標的細胞に感染し、順にこれらの標的細胞がウイルスを生産するようになる。従って、プラスミドを用いた最初のトランスフェクション事象から、複数のトランスフェクション事象を達成することが可能である。
【００７７】
ウイルスベクターの放散を中断するために制御メカニズムを利用することが、望ましい場合がある。プラスミドが介在するウイルス治療に対する応答として受動または能動免疫法を用いてもよく、これは、治療を受ける患者に、抗体またはウイルス性ワクチンいずれかを供給することを含むと予想される。このような治療は、ウイルスの放散を止め、非標的細胞への何らかの危険を最小化するさらなる保護手段を提供すると予想される。抗ウイルス剤、例えば抗レトロウイルス剤ＡＺＴ（アジド−３’−デオキシチミジン）は、ウイルスの複製と放散を容易に止めることができる。さらなる「自殺」遺伝子（例えばすでに治療に関して述べたような遺伝子）が、本ウイルスのゲノムに挿入されていてもよく、これは望ましいと予想される。あるいは、主要な構造的なウイルス成分に関する調節核酸配列を、テトラサイクリンのような外因的に供給された物質に依存する、テトラサイクリン誘導性プロモーターの使用によって作製してもよい。その他のこのような誘導性プロモーターとしては、ラパマイシン／ＦＫ５０６結合タンパク質誘導性プロモーターが挙げられる。従って、外因的に供給された誘導物質が除去されると、ウイルスの放散が阻害される。
【００７８】
本発明の特に好ましい実施態様において、本プラスミドは、（組換え）複製可能型レトロウイルスをコードする。所定の細胞型を標的化するための核酸配列が取り込まれていることが好ましく、なぜなら、それにより、天然型の病原性が低減されるか、または除去され、同時に標的への特異性が改善されるためである。特に好ましいレトロウイルスの構築体は、ＵＳ６,４１０,３１３で考察されており、これは、この参照により開示に含まれる。
【００７９】
従って、好ましい一実施態様において、本発明は、レトロウイルスのＧＡＧコード配列；レトロウイルスのＰＯＬコード配列；レトロウイルスのＥＮＶコード配列；レトロウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列；および、場合により、以下の構成要素の１種またはそれ以上；調節核酸配列に機能するように連結した異種コード配列；レトロウイルスの細胞または組織特異的な標的化のための１またはそれ以上の標的配列を含む、複製可能型レトロウイルスをコードするプラスミドを提供する。
【００８０】
上述したような標的に特異的な核酸配列は、組織または細胞型に特異的なプロモーターまたはエンハンサー配列であってもよく、例えばヘレグリンプロモーター配列である。これは、一般的に、ウイルスのゲノムの５’および／または３’末端に置かれる。レトロウイルスを特異的な標的細胞または組織に標的化するために、レトロウイルスのＥＮＶコード配列は、上述したような標的特異的なリガンドまたは結合成分をさらに含むように改変してもよい。
【００８１】
本プラスミドにはキャプシド化に必要な配列が提供されているため、形成されたウイルスは複製能がある。
【００８２】
従って、本プラスミドは、少なくとも３種の遺伝子、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有し、これらは、ウイルスＲＮＡの効率的なキャプシド化に関与するｐｓｉのようなシス作用性配列を含む２個のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列を両端に持ち、さらに、ｔＲＮＡプライマー結合部位のようなゲノムの逆転写に必要な配列を有する。
【００８３】
ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、キャプシド、および、ヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし；ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼ、および、インテグラーゼをコードし；および、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’のＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写とポリアデニル化を促進する作用がある。また、ＬＴＲは、ウイルスの複製に必要なその他のシス作用性配列も含む。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、および、ｖｐｘ（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２および／またはＳＩＶ中）などの追加の遺伝子を有する。
【００８４】
組織または細胞特異的な調節要素（すなわちエンハンサー／プロモーター）が存在する場合、これらは、好ましくは、５’および／または３’ＬＴＲに連結しており、キメラＬＴＲを形成する。
【００８５】
本明細書で説明されているプラスミドにおいて、異種（典型的には治療用）コード配列は、好ましくは、本ウイルスのＬＴＲプロモーター−エンハンサーシグナルまたは内部プロモーターいずれかの制御下にある。従って、数々の部位に、および、異なる調節領域下に、望ましい配列を挿入することができる。例えば、挿入のための部位は、ウイルスのエンハンサー／プロモーター部位（すなわち５’のＬＴＲで稼働する遺伝子座）であってもよい。あるいは、望ましい配列を調節のための遠位部位に挿入してもよく、例えば、ｅｎｖ遺伝子の３’側にあるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列である。
【００８６】
従って、一実施態様において、本発明に従って用いられるレトロウイルスのプラスミドは、望ましい核酸配列（例えば異種配列）のための挿入部位ＩＲＥＳを含み、好ましくは、ＩＲＥＳは、レトロウイルスベクター中で、ｅｎｖ遺伝子の３’側にある。従って、例えば異種ポリペプチドをコードする異種核酸配列が、ＩＲＥＳに機能するように連結していてもよい。ＩＲＥＳに機能するように連結することが可能な核酸配列の例は、自殺遺伝子、例えばＰＮＰ、および、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ、アンチセンス分子をコードする配列、または、リボザイムをコードする配列である。
【００８７】
本ウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子またはコード配列は、適切であればどのようなレトロウイルス（例えば、ＭＬＶ、または、レンチウイルスから誘導されたもの、すなわちＨＩＶ、または、ＭｏＭＬＶ）から誘導してもよい。その代わりの実施態様において、本ウイルスのＥＮＶ遺伝子は、レトロウイルスから誘導されたものではない（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）。ｅｎｖ遺伝子は、あらゆるレトロウイルスから誘導することができる。ｅｎｖは、ヒトおよびその他の種の細胞の形質導入を可能にする両指向性エンベロープタンパク質であってもよいし、または、同種指向性エンベロープタンパク質であってもよく、これは、マウスおよびラット細胞にのみ形質導入が可能である。
【００８８】
好ましい実施態様において、本発明のプラスミドは、複製能のある両指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクター構築体の全配列を含む。より好ましくは、本発明のプラスミドは、複製能のある両指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクター構築体の全配列を含み、ここにおいて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）のＵ３領域を置換するのに用いられており、さらに、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）治療遺伝子発現カセットは、ｅｎｖ遺伝子と３’ＬＴＲとの間に挿入される。
【００８９】
さらに、特定の細胞型の受容体を標的とするために、エンベロープタンパク質と、抗体または特定のリガンドとを連結させることによって、組換えウイルスを標的とすることが望ましい場合がある。上述したように、レトロウイルスベクターは、例えばグリコリピドまたはタンパク質を挿入することによって、標的を特異的にすることができる。標的化は、抗体を用いて、特定の細胞型（例えば、所定の組織で見出される細胞型または癌細胞型）の表面でレトロウイルスベクターを抗原に標的化することによって達成されることが多い。当業者であれば、レトロウイルスベクターの具体的な標的への送達を達成する具体的な方法がすでにわかっているか、または、余計な実験を行うことなく容易に解明することができる。一実施態様において、ｅｎｖ遺伝子は、非レトロウイルス（例えば、ＣＭＶまたはＶＳＶ）から誘導される。レトロウイルスから誘導されたｅｎｖ遺伝子の例としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、および、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。その他のｅｎｖ遺伝子、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（プロテインＧ）、サイトメガロウイルスエンベロープ（ＣＭＶ）、または、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）も用いることができる。従って、当業者であれば、本発明で使用するためのプラスミド構造中に、異なるウイルス由来の異なる遺伝子を利用したハイブリッドベクターを構築することができる。同様の標的化方法が様々なウイルスに適している。
【００９０】
細胞または組織特異的な調節核酸配列（例えばプロモーター）を利用して、具体的な標的細胞群における遺伝子配列の発現を標的とすることができる。本発明に適した哺乳動物およびウイルスのプロモーターは当業者既知である。従って、好ましい実施態様において、本発明は、本ウイルスのゲノムの５’および／または３’末端に組織特異的なプロモーター構成要素を有するプラスミドを提供する。好ましくは、組織特異的な調節因子／配列は、レトロウイルスのゲノムのＬＴＲのＵ３領域に存在し、このような調節因子／配列としては、例えば、癌細胞に対する細胞または組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー（例えば、腫瘍細胞特異的なエンハンサーおよびプロモーター）、および、誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン）が挙げられる。また、本発明の転写制御配列は、天然に存在する転写制御配列を含んでいてもよく、通常これは異種遺伝子と結合している。
【００９１】
本プラスミドが最初の細胞にトランスフェクションされ、子孫ウイルスが放出されると、組換え複製可能型レトロウイルスは、さらなる細胞、好ましくはそれらの標的細胞に感染することができる。細胞がこのようなウイルスに感染した後、ウイルスは自分の核酸を細胞に注入し、標的細胞のゲノムに遺伝物質を組み込ませることができる。続いて、宿主細胞中で移入された遺伝物質は転写され、タンパク質に翻訳される。本プラスミド中に挿入された異種（例えば治療用）コード配列は、標的細胞核に移入されると予想され、標的細胞のＤＮＡに組み込まれると考えられる。
【００９２】
いくつかの種類のレトロウイルスは、分裂細胞にしか感染できないが、これらはどのような時でも核膜を通過してそれらの遺伝物質を移入させるのに必要なシグナルを欠失しているため、有糸分裂の間に核膜が溶解する時期を待たなければならないからである。このようなウイルスの例としては、Ｃ型レトロウイルスのクラス、例えば脾臓壊死症ウイルス（ＳＮＶ）が挙げられる。従って、細胞増殖障害を有する標的細胞に遺伝子を送達するために、これらのウイルスを用いることが好ましい。このような障害としては、異常な数の細胞と活発な細胞分裂を特徴とするあらゆる状態が挙げられる。従って、このような状態としては全てのタイプの癌が挙げられるが、その細胞集団は、必ずしも形質転換されていたり、腫瘍形成性や悪性であったりする必要はなく、正常な細胞も含んでいてもよい。細胞増殖は、炎症および感染が起こっている最中、または、肝硬変のような状態が起こっている最中に起こる可能性がある。いくつかの細胞集団（例えば皮膚細胞）は連続的に再生しているため、分裂細胞しかトランスフェクションできないレトロウイルスを用いても標的化が可能である。
【００９３】
望ましくない増殖現象（例えば癌）の場合、本ウイルスは自殺遺伝子を送達することも可能であり、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子、および、Ｅ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）遺伝子である。あるいは、本ウイルスは、細胞周期のレギュレーター、抗炎症性サイトカイン、例えばインターロイキン、特定の悪性腫瘍関連のＲＮＡを認識し、それらを切断するためのリボザイム、または、抗血管新生因子を送達することも可能である。多くの適切な治療のためのコード配列が当業者既知である。当然のことながら、このような異種コード配列はまた、本明細書で述べられたどのウイルスで運搬されてもよい。
【００９４】
レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）は、ウイルスのＤＮＡ生産のためのテンプレートとして作用するＲＮＡゲノムを有する。これは、ＲＮＡゲノムと共にパッケージングされているＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって達成される。得られたウイルスのＤＮＡは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主由来のメカニズムによってウイルスのＲＮＡ合成のためのテンプレートを生産することができる。従って、レトロウイルスをコードするＤＮＡプラスミドを生産するために、逆転写酵素を使用して、本ウイルスのＲＮＡ配列のウイルスＤＮＡのコピーを生産することが可能である。このようなＤＮＡ配列は、必要に応じて改変されていてもよい。
【００９５】
特に好ましい実施態様において、本プラスミドは、組換え複製能のあるマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をコードし、これは、ＭＬＶのｇａｇコード配列；ＭＬＶのｅｎｖコード配列；ＭＬＶのｐｏｌコード配列；レトロウイルスのゲノムの５’および３’末端にＬＴＲ配列を含むＭＬＶの核酸配列；標的細胞における逆転写、パッケージングおよび組み込みに必要なシス作用性核酸配列を含み、場合により、調節核酸配列に機能するように連結した異種コード配列も含む。
【００９６】
当業界において、遺伝子治療のためのＭＬＶベースのベクターはすでに記載されている（Ｌｏｇｇ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２年１２月，１２７３８〜１２７９１；Ｌｏｇｇ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１年８月，６９８９〜６９９８、および、Ｔａｉ等，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４：７８９〜８０２，２００３年５月）。
【００９７】
ここで、以下の非限定的な実施例で、図を参照しながら本発明をさらに説明する：
図１は、複製可能型ＭｏＭＬＶレトロウイルスをコードする核酸分子の構造の概略図であり；
【００９８】
図２は、複製可能型レトロウイルスをコードするプラスミドである。この複製可能型レトロウイルスの標的細胞は、前立腺癌細胞であり；
【００９９】
図３は、Ａは、複製可能型レトロウイルスをコードする核酸の一般構造を示し、Ｂは、具体的なプラスミドベクターを示しており、さらに、導入遺伝子インサートと、この導入遺伝子インサートの両方の末端にある配列との同一性を示す。太字で示されるヌクレオチドは、ｅｎｖ停止コドンの位置を示す。
【０１００】
図４は、異なる用量で植え付けした後の、それぞれＷｉＤｒヒト結腸直腸癌細胞系、および、ＣＴ２６．ＷＴマウス結腸直腸癌細胞系におけるプラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたレトロウイルスベクターの増殖曲線を示す。上のパネルの曲線は、０.１および０.０１の感染の多重度（ＭＯＩ）（すなわち、それぞれ１０個の細胞または１００個の細胞に対して、１個の感染性のナノベクター）での最初の植え付けから３日毎にフローサイトメトリー分析によって測定されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。下のパネルは、植え付けから既定日数が経過した後の、蛍光顕微鏡検査法で撮影された、感染した細胞におけるＧＦＰ発現の代表的な画像を示す。
【０１０１】
図５は、高水圧プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰ注射の４８時間後に単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示す（実施例６）。コントロールは左に示し、ＧＦＰ発現は右に示す。
【０１０２】
図６は、実施例６で説明されている２１日目（中央のパネル）および２８日目（右のパネル）に単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示す。左のパネルは、ネガティブコントロールを示す。
【０１０３】
図７は、インビボでのｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたウイルスナノベクターの複製の最中の連続するタイムポイントで、切開した直後に回収された分散した腫瘍細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析の結果を示す。各マウスの最も大きい肝臓の腫瘍を切り出し、コラゲナーゼ／ディスパーゼで消化し、ＦＡＣＳで即座に解析した（各タイムポイントでｎ＝４）。このグラフは、各タイムポイント（Ｘ軸）の腫瘍サンプル中で検出されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（Ｙ軸）を示す。
【０１０４】
図８は、ＧＦＰ導入遺伝子のｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導された複製するウイルスの組み込みのＰＣＲ解析の結果を示す。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：レトロウイルスのウイルスをコードするプラスミドの構築：
感染性のモロニーＭＬＶプロウイルスのクローンをＮｈｅＩを用いて切り出し、これを各ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）内でプラスミドｐＺＡＰ（Ｓｏｎｅｏｋａ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，６２８〜６３３）（ウィスコンシン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＪｏｈｎ  Ａ．Ｙｏｕｎｇ氏より提供された）から切断して端にあるラットのゲノム配列を除去し、プラスミドｐＺＡＰ２が生産されるようにＭＬＶベクターｇ１ＺＩＮのプラスミド主鎖に再度クローニングした。特徴的なＮｓｉＩ部位から終止コドンまでのｅｎｖ遺伝子の領域をＰＣＲで増幅し、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳに融合し（Ｊａｎｇ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６２；２６３６〜２６４３，１９８８）、オーバーラップして伸長させるＰＣＲでプラスミドｐＥＭＣＦから増幅し（Ｈｏｒｔｏｎ等，Ｇｅｎｅ；７７，６０２８〜６０３６）、３’末端に制限部位ＢｓｔＢＩおよびＮｏｔＩを導入した。プラスミドｇ１ＺＩＮおよびｐＥＭＣＦは、Ｗ．Ｆｒｅｎｃｈ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，南カリフォルニア大学より入手可能である。
【０１０６】
また、ｅｎｖ終止コドンから３’ＬＴＲの３’末端までの領域もＰＣＲで増幅し、増幅産物の５’と３’末端それぞれにＮｏｔＩとＡｆｌ III部位を導入した。３種のライゲーションを用いて、このＰＣＲ産物とオーバーラップして伸長したＰＣＲ産物を、そのＮｓｉＩ部位とプラスミド主鎖中のＡｆｌＩＩＩ部位でｐＺＡＰ２に挿入し、プラスミドｐＺＡＰｄを製造した。プラスミドｐＰＵＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））由来のピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐａｃ）、プラスミドｐＴＫ−ｈｙｇｒｏ（クロンテック）由来のハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、および、プラスミドｐＥＧＦＰ（クロンテック）の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡ（Ｃｏｒｍａｃｋ等，Ｇｅｎｅ  １７３，３３〜３８，１９９６）をそれぞれＰＣＲで増幅し、ｐＺＡＰｄのＢｓｔＢＩおよびＮｏｔＩ部位にＩＲＥＳの真正な開始コドンと共にフレーム内に挿入し、それぞれｐＺＡＰｄｐｕｒｏ、ｐＺＡＰｄ−ｈｙｇｒｏ、および、ｐＺＡＰｄ−ＧＦＰを製造した。ＰＣＲで生成した全ての領域を配列解析によって検証した。また、ＩＲＥＳ−ＧＦＰインサートの端にある１１ｂｐの反復配列が除去され、ＭｌｕＩ部位で置き換えられたｐＺＡＰｄ−ＧＦＰベースの構築体も部位特異的変異誘発によって製造し、ｐＺＡＰｍ−ＧＦＰと命名した。モロニーＭＬＶ同種指向性エンベロープを、オーバーラップして伸長させるＰＣＲで製造した４０７０Ａ由来の両指向性エンベロープで置き換えた追加の構築体を、ｐＡＺＥ−ＧＦＰと命名した。
【０１０７】
実施例２：適正製造基準（ＧＭＰ）に準じたプラスミド生産：
これは、一般的に、臨床用途のためのＤＮＡプラスミドに関する以下の工程を伴う：
−  関連する監督官庁（例えばＦＤＡ）によって審査され、承認してもらうための、ＧＭＰプラスミド生産のための生物製剤のマスターファイルの提出。
−  活性な薬剤成分に関する適正製造基準に関するＣＦＲ２１（連邦行政規則集）、および、ＩＣＨ（ハーモナイゼーション国際会議の三極ガイドラインに従った、全てのＧＭＰ操作に関する総合的な標準操作手順（ＳＯＰ）の整備。
【０１０８】
−  ＳＯＰの実施、ＳＯＰとしては、全ての重要な器具に関するマスタープランの検証と検証方法、厳格な記録収集と追跡方法、および、入手する全ての原材料（米国薬局方（ＵＳＰ）、または、それに等しいグレードの成分および試薬）の完全な品質管理、全ての供給元に関する監査スケジュールの整備、ＧＭＰ手法等に関与する全てのスタッフの総合的な訓練プログラムが挙げられる。
【０１０９】
−  ＳＯＰに準じた、マスターセルバンク、および、製造用ワーキングセルバンクの生産（これは、対象のプラスミドで形質転換されており、本プラスミドを複製し、それらを安定して維持することが確認されたクローンのＥ．ｃｏｌｉ細菌ストックの製造からなる；マスターセルバンクが最初のストックであり、その後これを凍結させて保存し、一方、ワーキングセルバンクは、実際の生産に用いられるマスターバンクからのアリコートからなる）。
【０１１０】
−  ＧＭＰ生産の前に、スケールアップと規制遵守のために特定して設計されたプロセスの最適化、および、慣用のの精製方法の整備。
−  ワーキングセルストック（これはすでに、本プラスミドを生産することが確認されている）を望ましい合成スケールに達するまで培養スケールを徐々に大きくして、増量させることを含むスケールアップした生産方法。
【０１１１】
−  プラスミド精製のために、続いて細菌を遠心分離でペレット化し、上清培地を除去し、化学的／界面活性剤による溶解を用いて細菌細胞壁を崩壊させ、プラスミド分画を単離し、一般的には溶媒分画化と分画遠心分離によって、または、より一般的には樹脂による吸着および溶出、または、カラムクロマトグラフィーによって精製する。
【０１１２】
−  最終生成物はＱＣ試験に付されて、少なくとも以下の基準を満たすべきであり、それについて各ロットの分析証明書と共に文書化する：
低いレベルの残留内毒素（＜１ＥＵ／ｍｇプラスミド）、
低いレベルの宿主細胞の染色体ＤＮＡ（＜１％）、
低いレベルのＲＮＡ、
低い残留タンパク質、
低い残留溶媒、
大部分が共有結合で閉環（スーパーコイル化）されたプラスミド（＞９５％）（この特定の実験において）。
【０１１３】
実施例３：エレクトロポレーションによるインビボでのプラスミドのトランスフェクション：
電極アレイを用いた腫瘍エレクトロポレーション：
マウス（雌、５〜６週齢）の脇腹にＢ１６細胞を皮下注射した。特に他の指定がない限り、１０6個の細胞を注射し、４日間後、平均体積７５ｍｍ3の腫瘍が成長した。プラスミドＤＮＡ（５．５ｐｍｏｌ）を、Ｋ−ＰＢＳ（３０ｍＭのＮａＣｌ、１２０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１.５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、５ｍＭのＭｇＣｌ2）の５０マイクロリットルで希釈し、２７ゲージの針を備えた注射器を用いることによって腫瘍に経皮注射した。腫瘍に、７本の針電極からなる直径０.５ｃｍのアレイを備えたエレクトロポレーション装置ＣＵＹ２１（トキワ・サイエンス，東京，日本）を用いてパルスを当てた。この針電極のアレイでは、一本の中心の針が、６本の針で取り囲まれている。中心の針から周囲の針に、または、それとは逆の方向で電流を流した。６回の方形波パルスを、１回／秒の頻度で、パルス長さ１００ｍｓ、および、電圧５０Ｖを用いて送達した。３回のパルスに続いて、追加の３回の逆の極性を有するパルスを送達した。
【０１１４】
トランスジェニックマウス製造における、遺伝子組換え精子の作成のための精巣のエレクトロポレーション：
ＩＣＲ系、および、［Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２］Ｆ１マウスを、ＳＬＣ（日本）から購入した。出生後１４日目のＩＣＲ系マウスをネンブタール溶液で麻酔し、精巣を解剖用顕微鏡下で露出させた。細精管へ注射するために、マイクロピペットを精巣網に挿入した。各精巣にＤＮＡ／ＨＢＳ溶液（１００〜１２０μｇ／ｍｌ）の約６〜１０μｌを注射した。電気パルス発生装置（エレクトロスクエアポレーターＴ８２０（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０），ＢＴＸ，米国）を用いて電気パルスを送った。ピンセット型の電極対の間に精巣を固定し、方形波電気パルスを４回印加し、逆方向で再度４回印加した。パルスはそれぞれ、３０〜５０Ｖ、持続時間５０ｍｓで用いられた。
【０１１５】
実施例４：弾丸遺伝子導入を用いたプラスミドのトランスフェクション
ＤＮＡワクチン接種のための皮膚での遺伝子移入：
ジーンガン粒子によるＤＮＡワクチン接種を、ヘリウムによって稼働するジーンガン（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ），カリフォルニア州）を製造元によって提供されたプロトコールに従って用いて行った。簡単に言えば、１.６μｍの金製マイクロキャリアー（バイオ・ラッド，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）の２５ｍｇ、および、０.０５Ｍ  スペルミジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ），セントルイス，ミズーリ州）の１００μｌとを混合することによって、ＤＮＡで被覆した金粒子を製造した。このマイクロキャリアーに、プラスミドＤＮＡ（５０μｇ）、および、１.０ＭのＣａＣｌ2（１００μｌ）をボルテックスで混合しながら連続的に添加した。この混合物を室温で１０分間沈殿させた。次に、マイクロキャリアー／ＤＮＡ懸濁液を遠心分離し（１０，０００ｒｐｍで５秒間）、新しい無水エタノールで３回洗浄し、その後、無水エタノール中のポリビニルピロリドン（０.１ｍｇ／ｍｌ；バイオ・ラッド，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）の３ｍｌ中で再懸濁した。次に、この溶液を試験管に入れ、４分間放置した。エタノールを穏和に除去し、試験管を回転させてマイクロキャリアー／ＤＮＡ懸濁液を試験管の内部表面に均一に付着させた。次に、０.４リットル／分で窒素ガスを流してこの試験管を乾燥させた。次に、マイクロキャリアー／ＤＮＡで被覆された乾燥した試験管を０.５インチのカートリッジに切断し、キャップした乾燥ボトル中で４℃で保存した。結果として、各カートリッジには、プラスミドＤＮＡの１μｇと、金の０.５ｍｇが含まれる。ＤＮＡで被覆した金粒子（弾丸１個あたりＤＮＡ１μｇ）を、ヘリウムによって稼働するジーンガン（バイオ・ラッド，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）を吐出し圧力４００ｐ．ｓ．ｉで用いてマウスの毛を剃った腹部領域に送達した。
【０１１６】
実施例５：高水圧遺伝子移入
マウス肝臓への高水圧トランスフェクション：
これまで報告されているような発現に最適な条件下で（Ｚｈａｎｇ等，１９９７）、門脈または肝静脈（下大静脈経由）のいずれかを通じて肝臓に直接的な注射を行った。この最適な条件には、１５％マンニトール（シグマ，セントルイス，ミズーリ州）、および、ヘパリン（２.５単位／ｍｌ；リンフォーメッド（Ｌｙｐｈｏ−Ｍｅｄ），シカゴ，イリノイ州）を含む生理食塩水（０.９％ＮａＣｌ）１ｍｌ中のｐＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）の注射が含まれる。門脈注射のために、肝静脈および下大静脈を閉塞させることによって流れをブロックした。肝静脈注射のために、門脈、大静脈および肝臓動脈を閉塞させることによって流れをブロックした。７〜１２０秒にわたり、リンガー液（１４７ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１.１３ｍＭのＣａＣｌ2）の１〜３ｍｌに溶解させたｐＤＮＡ（１０〜２５０マイクログラム）を、２７ゲージの注射針を通じて注入することによって、尾の静脈への注射を行った。
【０１１７】
実施例６．マウス肝臓への高水圧注射を用いたトランスフェクションで開始されるナノベクターの送達（ＴＮＴ）：
６．１：プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰ
プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰは、複製能のある両指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターコンストラクトの全配列を含み、ここにおいて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）Ｕ３領域を置き換えるために用いられており、そして脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットが、ｅｎｖ遺伝子と３’ＬＴＲとの間に挿入されている。このプラスミド主鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、および、アンピシリン耐性遺伝子を含む。以下に、ｐＡＣＥ−ＧＦＰの完全な配列を示すが、ここにおいて、以下の通りである：
Ｇ＝ウイルスのｍＲＮＡの転写開始部位（ＴＳＳ）である。これは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）配列の開始点を示す。
ＴＳＳをＭＬＶゲノム配列の１位置と設定し、したがって：
５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）Ｒ／Ｕ５領域＝１〜１４５
ｇａｇポリタンパク質配列＝６２１〜２２３７
ｐｏｌポリタンパク質配列＝２２３８〜５８３７、である。
下線部分＝両指向性ＭＬＶ４０７０Ａエンベロープコード配列
３’ＬＴＲ＝７８１６〜８３３２
Ａ＝ＭＬＶ配列の終わり
残りの配列：Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、および、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド主鎖。
【０１１８】
【化１】
2008521405.tif 000003
【０１１９】
【化２】
2008521405.tif 000004
【０１２０】
【化３】
2008521405.tif 000005
【０１２１】
【化４】
2008521405.tif 000006
【０１２２】
【化５】
2008521405.tif 000007
【０１２３】
プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰのトランスフェクションの後に生産されたレトロウイルスナノベクターは、ヒトおよびマウスの両方の結腸直腸癌細胞系で、高効率で複製されることがわかっている。
【０１２４】
６．２：インビトロでの試験
図４は、異なる用量で植え付けした後の、それぞれＷｉＤｒヒト結腸直腸癌細胞系、および、ＣＴ２６．ＷＴマウス結腸直腸癌細胞系におけるプラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたレトロウイルスベクターの増殖曲線を示す。上のパネルの曲線は、０.１および０.０１の感染の多重度（ＭＯＩ）（すなわち、それぞれ、１０個の細胞または１００個の細胞に対して、１個の感染性のナノベクター）での最初の植え付けから３日毎にフローサイトメトリー分析によって測定されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。下のパネルは、植え付けから指示日数が経過した後の、蛍光顕微鏡検査法で撮影された、感染した細胞におけるＧＦＰ発現の代表的な画像を示す。
【０１２５】
６．３：結腸直腸癌の肝臓への転移に関するマウスモデルの確立：
複製ウイルスの送達を開始させるために、インビボでプラスミドを腫瘍に送達する方法として高水圧トランスフェクションの使用を実証する目的で、腫瘍細胞を脾臓内に注射することによって結腸直腸癌の肝臓への転移のマウスモデルを形成した。まず、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，マナサス，バージニア州，米国）から入手可能なＢａｌｂ／ｃマウス由来のマウス結腸腺癌細胞系ＣＴ２６を、加湿した５％ＣＯ2雰囲気中で、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。腫瘍を形成するために、イソフルラン麻酔して左肋骨下の切開を行った後、ＰＢＳ２００μｌ中のＣＴ２６腫瘍細胞（５×１０４細胞）を、３０ゲージの注射針によって６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓に注射した。５分間血流遮断した後、脾臓切除術を行い、切開部分を創傷クリップで閉じた。
【０１２６】
当然ながら、このタイプの腫瘍モデルには、適切な宿主（同じ系や種から誘導された腫瘍に関して免疫適格な同一遺伝子型の宿主、または、同種異系または異種の種から誘導された腫瘍に関して無胸腺の免疫不全の宿主）中のその他の適切な細胞系を用いてもよい。
【０１２７】
６．４：インビボでのトランスフェクション
腫瘍細胞の植え付けから２週間後に、ｐＡＣＥ−ＧＦＰプラスミド（３０μｇ）を、マウス１匹に対して総体積０.１ｍｌ／グラム（体重）（例えば、体重２０ｇのマウスの場
合、マウス１匹に対して総体積２.０ｍｌ）のＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲ（Ｑｕｉｃｋ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）高水圧溶液（ミルス・バイオ社（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  Ｃｏｒｐ．，マディソン，ウィスコンシン州，米国）と混合した。このプラスミドＤＮＡ溶液の高水圧注射を、これまで報告されているような遺伝子発現に最適な条件下で（Ｚｈａｎｇ等，１９９７）行った（ここにおいて、尾の静脈中に留置された２７ゲージの注射針を通じて４〜７秒以内に全量を一定速度で注入することが必要であった）。
【０１２８】
トランスフェクションによって開始されたウイルス複製後のＧＦＰ発現の解析：
プラスミド投与後の様々なタイムポイントで、肝臓を滅菌条件下で切り出し、キセノジェン（Ｘｅｇｅｎ）−ＩＶＩＳ冷却ＣＣＤ光学イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ，アラメダ，カリフォルニア州，米国）を用いて腫瘍中のＧＦＰ蛍光を可視化した。リビング・イメージ・ソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，キセノジェン）と、ＩＧＯＲ−ＰＲＯ画像解析ソフトウェア（ウェーブ・メトリックス（Ｗａｖｅ  Ｍｅｔｒｉｃｓ），レイクオスウェゴ，オレゴン州，米国）を用いて、単離した臓器のグレースケールのバックグラウンドの写真画像と、放出された蛍光の色を重ねた画像とで構成された複合画像が得られた。
【０１２９】
図５は、上述の条件下で、高水圧プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰ注射の４８時間後に単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示す（右のパネル，ｐＡＣＥ−ＧＦＰ）。興味深いことに、高水圧注射により、正常な肝実質（より暗い色の正常な肝臓組織のバックグラウンドに埋め込まれた白色の部分として可視化されている）と比較して、選択的な多病巣性のＣＴ２６腫瘍のトランスフェクションが起こるようであり、これはおそらく、新たに形成された腫瘍の新生血管系に、より大きくより多い「漏れやすい」開口部が存在することによると思われる。また、媒体コントロールとして、プラスミドＤＮＡが添加されていないＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲ  溶液を用いた高水圧注射も平行して行った；このトランスフェクションは、検出可能なＧＦＰ蛍光シグナルを示さなかった（左のパネル，コントロール）。右側の色のスケールは、蛍光シグナルの流れの相対強度をフォトン／秒／ｃｍ2で示す。
【０１３０】
図６は、２１日目と２８日目における、単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示すが、この時点で、トランスフェクションされたプラスミドからの直接のＧＦＰ発現が完全に消失していた；従って、全てのＧＦＰ蛍光は、複製されたレトロウイルスナノベクターから誘導されたと予想される（中央および右のパネルはそれぞれ、ＡＣＥ−ＧＦＰ２１日目および２８日目である）。ＧＦＰ放散の増加は、複製されたウイルスベクターによるＧＦＰ導入遺伝子の送達のために、複数の腫瘤で長期にわたり観察することができた。
【０１３１】
蛍光シグナルの流れの相対強度をフォトン／秒／ｃｍ2で示した右側の色のスケールは、その前の図より１０倍高い；これは、ＧＦＰ導入遺伝子発現の領域だけでなく、総体的な強度も、最初のプラスミドのトランスフェクションと比較して長期にわたり増加していることを実証する。また、媒体コントロールとして、プラスミドＤＮＡが添加されていないＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲ  溶液単独での高水圧注射後に単離した肝臓の光学的なイメージングも上述した通りに行った；ここでも、検出可能なＧＦＰ蛍光シグナルは存在しなかった（左のパネル，コントロール）。
【０１３２】
図７は、インビボでのｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたウイルスナノベクターの複製の間、連続するタイムポイントで切開した直後に回収された分散した腫瘍細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析の結果を示す。各マウスの最も大きい肝臓の腫瘍を切り出し、コラゲナーゼ／ディスパーゼで消化し、ＦＡＣＳで即座に解析した（各タイムポイントでｎ＝４）。このグラフは、各タイムポイント（Ｘ軸）の腫瘍サンプル中で検出されたＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージ（Ｙ軸）を示す。ここでも、複製されたウイルスによって、長期にわたりＧＦＰ導入遺伝子が腫瘤全体に有効に送達されたという結果が実証された。
【０１３３】
図８は、ＧＦＰ導入遺伝子のｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導された複製するウイルスの組み込みのＰＣＲ解析の結果を示す。肝臓のマウスＣＴ２６腫瘍から、または、腫瘍を有するマウスの様々な正常な組織（標識した通り）から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、ＧＦＰ導入遺伝子に特異的なプライマー（その配列は、通常、マウスのゲノムに存在しない）を用いた。また、ネガティブコントロールとして形質導入されていない腫瘍も増幅した（「腫瘍（陰性）」と示されている）。上のパネルは、ゲノムＤＮＡを異なるコピー数で混合したｐＡＣＥ−ＧＦＰプラスミドから直接、ＧＦＰ配列をＰＣＲ増幅した標準曲線を示す（示した通り）。下のパネルは、インターナルコントロールとしてその他の特異的なプライマー群と共に、内因性マウスベータ−アクチン遺伝子配列の増幅（５００ｂｐのバンド）を示したが、これにより、ゲノムＤＮＡサンプルとＰＣＲ手法の一貫性が実証された。この結果によれば、ｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたウイルス複製が起こっている腫瘍からのゲノムＤＮＡにおいてのみ、ＧＦＰに特異的な強いシグナル（７００ｂｐのバンド）が増幅したことがが示される；それに対して、最初のプラスミドＤＮＡのトランスフェクションそのものは、単に一時的なものであり、このような高レベルのゲノムＤＮＡへの組み込みがまったく起こらないと予想される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】複製可能型ＭｏＭＬＶレトロウイルスをコードする核酸分子の構造の概略図である。
【図２】複製可能型レトロウイルスをコードするプラスミドである。
【図３】Ａは、複製可能型レトロウイルスをコードする核酸の一般構造を示し、Ｂは、具体的なプラスミドベクターを示す。
【図４】異なる用量で植え付けした後の、それぞれＷｉＤｒヒト結腸直腸癌細胞系、および、ＣＴ２６．ＷＴマウス結腸直腸癌細胞系におけるプラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたレトロウイルスベクターの増殖曲線を示す。
【図５】高水圧プラスミドｐＡＣＥ−ＧＦＰ注射の４８時間後に単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示す（実施例６）。
【図６】実施例６で説明されている２１日目（中央のパネル）および（右のパネル）２８日目に単離した肝臓からのＧＦＰ蛍光を光学的にイメージングした後の代表的な複合画像を示す。
【図７】インビボでのｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導されたウイルスナノベクターの複製の最中に、切開した直後に連続するタイムポイントで回収された分散した腫瘍細胞の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析の結果を示す。
【図８】ＧＦＰ導入遺伝子のｐＡＣＥ−ＧＦＰで誘導された複製するウイルスの組み込みのＰＣＲ解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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