(57)【要約】  本発明は、１または数種の分析物、特に病原体、ウイルス、プリオン、細菌、寄生体、薬剤、抗生物質、細胞増殖抑制剤、向精神薬、麻酔剤、鎮痛剤、心臓薬、代謝物質、凝固抑制因子、ホルモン、インターロイキンおよびサイトカイン、ドーピング剤、薬物、毒素、毒物、農薬、殺虫剤、木材保護剤、除草剤、殺菌剤、爆薬、ビタミンおよび香料を検出するための方法に関し、該ユーロピウムクリプテート蛍光色素および／または該テルビウムクリプテート蛍光色素との該分析物の結合体が、該分析物に特異的な抗体およびユーロピウムクリプテート蛍光色素および／またはテルビウムクリプテート蛍光色素に特異的な抗体と共に準備され、そして分析物を添加して蛍光消失が分光学的方法で測定される。本発明はまた、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素および／またはテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体、および分析物を検出するためのキットにも関する。
2008541022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の分析物の検出方法であって、該方法が以下の工程：
ａ）以下の３成分：
該分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素またはテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体、
該分析物に対して特異的な抗体、および
該ユーロピウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体または該テルビウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体
を準備する工程であって、
分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との該結合体、または分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、工程；
ｂ）該分析物を添加する工程；および
ｃ）該ユーロピウムクリプテート蛍光色素の蛍光を分光学的に測定する工程、または該テルビウムクリプテート蛍光色素の蛍光を分光学的に測定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
さらに、過酸化水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、少なくとも１つの追加の発光団を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との結合体中に、分析物分子とユーロピウムクリプテート蛍光色素の分子との間の共有結合が存在する、あるいは前記分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体中に、分析物分子とテルビウムクリプテート蛍光色素の分子との共有結合が存在する、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記分析物が、病原体、ウイルス、プリオン、細菌、寄生体、薬剤、抗生物質、細胞増殖抑制剤、精神活性物質、麻酔剤、鎮痛剤、心臓病薬、代謝物質、凝固抑制因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカイン、運動能力向上薬、薬物、毒素、有害物質、農薬、殺虫剤、木材防腐剤、除草剤、殺菌剤、爆薬、ビタミンおよび香料を含む群から選択される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記分析物に対して特異的な抗体と、前記ユーロピウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体との割合が決定されているか、または前記分析物に対して特異的な抗体と、前記テルビウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体との割合が決定されている、前記請求項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記ユーロピウムクリプテート蛍光色素または前記テルビウムクリプテート蛍光色素が、トリスビピリジンクリプテートを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
ａ）分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との結合体であって、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、結合体；
ｂ）該分析物に対して特異的な抗体；および
ｃ）該ユーロピウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体
を含む、組成物。
【請求項９】
ａ）分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体であって、分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、結合体；
ｂ）該分析物に対して特異的な抗体；および
ｃ）該テルビウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体
を含む、組成物。
【請求項１０】
さらに、過酸化水素を含む、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、少なくとも１つの追加の発光団を含む、請求項８、９、または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ）分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との結合体であって、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、結合体；
ｂ）該分析物に対して特異的な抗体；および
ｃ）該ユーロピウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体
を含む、少なくとも１つの分析物の検出のためのキット。
【請求項１３】
ａ）分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体であって、分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、結合体；
ｂ）該分析物に対して特異的な抗体；および
ｃ）該テルビウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体
を含む、少なくとも１つの分析物の検出のためのキット。
【請求項１４】
さらに、過酸化水素を含む、請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
さらに、少なくとも１つの追加の発光団を含む、請求項１２、１３、または１４に記載のキット。
【請求項１６】
分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との結合体、あるいは分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体であって、
該分析物が、病原体、ウイルス、プリオン、細菌、寄生体、薬剤、抗生物質、細胞増殖抑制剤、精神活性物質、麻酔剤、鎮痛剤、心臓病薬、代謝物質、凝固抑制因子、ホルモン、インターロイキンおよびサイトカイン、運動能力向上薬、薬物、毒素、有害物質、農薬、殺虫剤、木材防腐剤、除草剤、殺菌剤、爆薬、ビタミン、香料を含む群から選択され、そして、該ユーロピウムクリプテート蛍光色素または該テルビウムクリプテート蛍光色素が、トリスビピリジンクリプテートを含む、結合体。
【請求項１７】
前記分析物が、前記ユーロピウムクリプテート蛍光色素または前記テルビウムクリプテート蛍光色素に共有結合されている、請求項１６に記載の結合体。
【請求項１８】
病原体、ウイルス、プリオン、細菌、寄生体、薬剤、抗生物質、細胞増殖抑制剤、精神活性物質、麻酔剤、鎮痛剤、心臓病薬、代謝物質、凝固抑制因子、ホルモン、インターロイキンおよびサイトカイン、運動能力向上薬、薬物、毒素、有害物質、農薬、殺虫剤、木材防腐剤、除草剤、殺菌剤、爆薬、ビタミン、および香料を含む群から選択される、分析物の検出のための、請求項１６または１７に記載の結合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物とユーロピウム（またはテルビウム）クリプテート蛍光色素との結合体を、分析物に対して特異的な所定量の抗体およびユーロピウム（テルビウム）クリプテート蛍光色素に対して特異的な所定量の抗体と共に準備すること；ならびに該分析物が添加される場合に生じる蛍光消光を分光学的に測定することによって、１以上の分析物の検出のための方法に関する。さらに、本発明は、分析物とユーロピウム（テルビウム）クリプテート蛍光色素との結合体、および１以上の分析物の検出のために必要な成分を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の分析物の検出のために、特異的な抗体を用いる種々の方法が知られている。例えば、EP 0343346 Bには、蛍光免疫測定法が開示されている。US 4,261,968には、抗体および蛍光消光剤を用いる分析物の検出方法が開示され、この方法では、蛍光消光度が、測定される分析物の量と直接に相関関係にあることが開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、任意の物質の検出に一般に適用され得る簡便な方法を提供すること、および該方法に適した化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的は、本発明の独立クレームの技術的な教示によって達成される。さらに、本発明の有利な実施態様は、従属クレーム、本明細書の記載および実施例から与えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、１以上の分析物の検出方法に関し、該方法は以下の工程：
ａ）以下の３成分：
該分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との結合体、
該分析物に対して特異的な抗体、および
該ユーロピウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体を準備する工程であって、
分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、工程；
ｂ）該分析物を添加する工程；および
ｃ）該ユーロピウムクリプテート蛍光色素の蛍光を分光学的に測定する工程
を包含する。
【０００６】
また、テルビウムも、ユーロピウムの代わりに用いられ得、そのため、本明細書で与えられる記載は、ユーロピウムおよびテルビウムの両方に有効である。したがって、本発明は、１以上の分析物の検出方法に関し、該方法は以下の工程：
ａ）以下の３成分：
該分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との結合体、
該分析物に対して特異的な抗体、および
該テルビウムクリプテート蛍光色素に対して特異的な抗体を準備する工程であって、
分析物とテルビウムクリプテート蛍光色素との該結合体が、１つの単一の抗体のみが結合されることを可能とする、工程；
ｂ）該分析物を添加する工程；および
ｃ）該テルビウムクリプテート蛍光色素の蛍光を分光学的に測定する工程
を包含する。
【０００７】
本発明による方法には、３成分が必要である：第一に、検出される物質、すなわち分析物と蛍光色素との結合体、第二に、検出される物質に対して特異的な抗体、そして第三に、蛍光色素に対して特異的な第２の抗体。過酸化水素は、第四の好ましい成分である。この成分の機能は以下でより詳細に記載される。その存在または濃度が測定される分析物は、追加の成分と見なされ得る。しかし、本発明による分析は、ある分析物の非存在を検出するために用いられる場合もあるため、この成分は必須ではない。
【０００８】
本明細書に用いられる用語「蛍光」または「蛍光消光」は、すべての発光効果を記載することを意図する；したがって、それはリン光を含み、そのため用語「蛍光」または「蛍光消光」はまた、「リン光」または「リン光消光」を含む。
【０００９】
一般に、すべての現存の種類の抗体が用いられ得る。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、組み換え抗体、二重特異性抗体、および抗体断片など。中でも、モノクローナル抗体が好ましい。
【００１０】
抗体断片、アプタマー、ミモトープ、ｆａｂ断片、ｆｃ断片、ペプチド、レクチン、ヌクレオチド、ペプチド模倣薬、ギャップマー、リボザイム、ＣｐＧオリゴマー、ＤＮＡザイム、リボスイッチ、または脂質が、抗体の代わりに用いられ得る。
【００１１】
この化合物、特に抗体およびモノクローナル抗体の製造方法は、当業者に知られている。
【００１２】
好ましくは、分析物に対して特異的な抗体（分析物特異的抗体）および分析物と蛍光色素との結合体に対して特異的な抗体（蛍光色素特異的抗体）は、所定かつ既知の割合で用いられる。用語「分析物特異的抗体」とは、分析物に特異的に結合する抗体をいい、この結合に関して、分析物が抗体によって完全にまたは一部のみ結合されるかどうか、あるいはリンカーおよび／または蛍光色素の一部も抗体によって結合されるかどうか、あるいはリンカーおよび／または蛍光色素までもが結合に完全に関与しているかどうかは無関係である。唯一の重要な局面は、その結合が、第２の分析物特異的抗体および蛍光色素特異的抗体のいずれも結合できないようにして行わなければならないということにある。同様に、蛍光色素特異的抗体に関して、この抗体が蛍光色素を完全にまたは一部のみ結合するかどうか、およびリンカーおよび／または分析物が結合に完全にまたは部分的に関与しているかどうかは関係がない。蛍光色素特異的抗体もまた、分析物特異的抗体およびさらなる蛍光色素特異的抗体のいずれもが結合できないようにして結合されなければならない。したがって、抗体結合の種類は、同時に結合され得る他の抗体がない限り、本発明に本質的ではない。
【００１３】
分析物／蛍光色素結合体は、一度には１つの単一の抗体のみが結合体に結合できるように設計される。したがって、２つの分析物特異的抗体、または２つの蛍光色素特異的抗体、または１つの分析物特異的抗体と１つの蛍光色素特異的抗体とが同時に結合することはできない。
【００１４】
さらに、本発明は、分析物／蛍光色素結合体の蛍光は、分析物特異的抗体の結合によっては大して影響を受けることはないが、蛍光色素特異的抗体の結合によっては、蛍光が消光する、あるいは少なくとも蛍光が測定可能な程度に減少するという原理に基づく。
【００１５】
上記３成分（すなわち結合体、分析物特異的抗体、および蛍光色素特異的抗体）の溶液を準備する場合、溶液中の結合体は、これらの２つの抗体のうちの一方によって結合される；したがって、結合体は、例えば、約５０％が分析物特異的抗体に結合され、そして約５０％が蛍光色素特異的抗体に結合される。少量が非結合の形態で存在する。
【００１６】
上記溶液に、検出される物質（すなわち分析物）を含む試料溶液を添加する場合、分析物と分析物を含む結合体とが、分析物特異的抗体で結合部位について競合する。その結果、結合体に結合されている分析物特異的抗体の一部は、結合体を放出し、そして検出される物質（すなわち分析物）に結合する。この手順によって、遊離結合体の濃度が増加するが、しかし、この遊離結合体は、溶液中に過剰に存在する蛍光色素特異的抗体によってすぐに結合される。蛍光色素特異的抗体の結合により蛍光は消光され、このことは、分光学的に測定され得る。
【００１７】
溶液の蛍光の減少は、検出される物質である分析物の存在を示し、その蛍光消光度は、試料溶液中の分析物の量を明らかにする。
【００１８】
したがって、本発明の方法は、蛍光の減少と、ある分析物の存在および濃度との間の関係を確立する一般的な原理に基づく。
【００１９】
もちろん、蛍光消光抗体の代わりに、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に結合された場合、あるいは分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との結合体に結合された場合に蛍光色素の蛍光を増強する、または測定可能な程度に増加させるような抗体が用いられ得ることは、当業者に明らかである。表現「測定可能な程度に増加」とは、分光法により明確に決定され得、そしてバックグラウンド蛍光と区別され得る増加をいう。本発明の方法において、蛍光増加度と測定される分析物の濃度との間には、相関がある。
【００２０】
したがって、本発明は特に、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）および／または分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との結合体に結合可能であり、かつその結合によって蛍光色素の蛍光を消光または測定可能な程度に減少可能な抗体に関する。
【００２１】
他方、本発明はまた、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）、および／または分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との結合体に結合可能であり、かつその結合によって蛍光色素の蛍光を増強または測定可能な程度に増加可能な抗体に関する。
【００２２】
好適に用いられるユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）は、本明細書に記載される。
【００２３】
本発明の抗体は、標準法にしたがって（例えば、ハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein、Nature、1975年、256、495-497頁）によって、エプスタインバーウイルス、ゼノマウスを用いることによって、または細胞培養中で永久に生存可能であり、抗体を産生する細胞（PasqualiniおよびArap、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004年、6、257-259頁）によって）製造される。さらに、抗体は、例えば、ファージ提示法、リボソーム提示法、または同様の手法によって製造される組み換え抗体ライブラリー由来であり得る。
【００２４】
キレート結合またはクリプテート結合ランタニド（特にユーロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋））の蛍光を減少する抗体、あるいはキレート結合またはクリプテート結合ランタニド（特にユーロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋））の蛍光を増強する抗体が、種々の測定系を確立するために用いられ得る。特に、これは、所望の特異性の抗体産生細胞のスクリーニング法および公知の抗体の結合親和性に関して抗体親和性の測定法においてそれらを用いることに関係する。同様に、このような抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく免疫測定法の開発に用いられ得る。本明細書に記載される適用は、溶液中の均一系測定法における上記抗体の使用である。リアルタイムＰＣＲシステムを行う際に本発明の抗体が用いられ得るのと同様に、固相アッセイ（特にマイクロアレイの形態での）においてももちろん、このような抗体は用いられ得る。
【００２５】
以下の試料は、試料溶液として特に使用され得る：唾液試料、血液試料、尿試料、粘液試料、消化された組織試料、水試料、廃水試料、化学品製造工程由来の試料、抽出された土壌試料、食品試料、生物学的および生化学的製造工程由来の試料、発酵溶液など。血清試料および上述された種類の希釈試料、または、例えば、土壌試料、粘液試料、発酵溶液などの希釈抽出物が特に好ましい。分光分析法のための適切な希釈溶液の調製は、当業者に明らかである。
【００２６】
それに対する抗体が製造され得、かつユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に結合され得る任意の分析物が、検出される物質として用いられ得る。ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との（おそらく分析物のリンカーを介する）共有結合が好ましい。リンカーは、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との間に置かれ、そして分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との間の距離を増加する任意の化学成分または断片からなり得る。この距離は、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との間の距離のために、分析物特異的抗体および蛍光色素特異的抗体の同時結合が可能となるような大きさであってはならない。
【００２７】
可能な分析物としては、以下が挙げられる：
ヒト診断由来の分析物：
病原体：ウイルス：例えば、麻疹、インフルエンザ、ＳＡＲＳ、ＨＩＶ、肝炎、疱疹｛ほうしん｝、ダニ媒介性髄膜脳炎など
プリオン
細菌：例えば、結核、ライム病、コレラ、百日咳など
寄生体：例えば、マラリア、リーシュマニア属など
腫瘍マーカー。
【００２８】
腫瘍マーカーとしては、β２−マイクログロブリン、フェリチン、ｐ５３、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ、ｈＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、絨毛性｛じゅうもうせい｝ゴナドトロピン（ｈＣＧおよびＣＧ）、カルシトニン（ＣＴ）、チログロブリン（ｔｇ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ抗原１２５、７２−４、１５−３、および１９−９、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ガラクトシルトランスフェラーゼＩＩが挙げられる。
【００２９】
病原体としては、ブルセラＩｇＧおよびＩｇＭ；肺炎クラミジアＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ；クラミジア・トラコマチスＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ；ＣＭＶ  ＩｇＧおよびＩｇＭ；デング熱ウイルスＩｇＧおよびＩｇＭ；ＥＢＶ−ＶＣＡ  ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ；ヘリコバクター・ピロリＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ；ＨＳＶ１＋２  ＩｇＧおよびＩｇＭ；麻疹ＩｇＧおよびＩｇＭ；ムンプスＩｇＧおよびＩｇＭ；マイコプラズマＩｇＧおよびＩｇＭ；風疹ＩｇＧおよびＩｇＭ；サルモネラ菌ＩｇＧおよびＩｇＭ；トキソプラズマＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ；トレポネーマ・パリダム（treponima pallidum）ＩｇＧおよびＩｇＭ；ＶＺＶ  ＩｇＧおよびＩｇＭ；肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ；ＨＩＶ１、２などが挙げられる。
【００３０】
薬剤：例えば、
抗生物質（アンピシリン、アモキシシリン、ペニシリンなど）
細胞増殖抑制剤（ドキソルビシン、シスプラチンなど）
精神活性物質
麻酔剤
鎮痛剤
心臓病薬
凝固抑制因子。
【００３１】
代謝物質：
例えば、ホルモン（ステロイドホルモン、ゴナドトロピンなど）
インターロイキンおよびサイトカインなど
トリヨードチロニン
血漿タンパク質
酵素（セクレターゼ、リパーゼ、ホスファターゼなど）
脂質（コレステロールなど）
疾病因子（自己免疫診断薬など）。
【００３２】
スポーツ医学における目的物：
運動能力向上薬（アンフェタミン、成長ホルモン、エリスロポエチンなど）。
【００３３】
薬物、例えば、ヘロイン、コカイン、ＬＳＤなど。
【００３４】
毒素、マイコトキシン、細菌毒素：コレラ毒素、百日咳毒素など。
【００３５】
抗生物質、抗真菌薬、および抗ウイルス薬としては、アシクロビル、アンピシリン、アモキシシリン、アミノグリコシド、アムホテリシンＢ、アジスロマイシン、セファゾリン、セフェピム、セフォタキシム、セフォテタン、セフポドキシム、セフタジジム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、クロラムフェニコール、クロトリマゾール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ダプソン、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ラクトビオネート、フルコナゾール、フォスカーネット、ガンシクロビル、ガチフロキサシン、イミペネム／シラスタチン、イソニアジド、イトラコナゾール、ケトコナゾール、メトロニダゾール、ナフシリン、ニトロフラントイン、ナイスタチン、ペンタミジン、ペニシリン、ピペラシリン／タゾバクタム、リファムピン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、チカルシリン／クラブラネート（clavulanate）、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、バラシクロビル、バンコマイシンが挙げられる。
【００３６】
ホルモンとしては、ＡＣＴＨ、Ｃ−ペプチド、コルチゾール、ＤＨＥＡ−Ｓ、エストラジオール、エストリオール、テストステロン、インスリン、プロインスリン、プロゲストロン、ＰＴＨが挙げられる。
【００３７】
インターロイキン、サイトカインおよび成長因子としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターロイキン１〜１８、腫瘍壊死因子α、β（ＴＮＦ−α、β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、顆粒球、マクロファージ、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板増殖因子（ＰＧＦ）、窒素酸化物、ロイコトリエンが挙げられる。
【００３８】
血漿タンパク質およびその他の血漿分子としては、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、アルブミン、凝固因子、補体因子、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、ホスホリパーゼ、バソプレシン、ホモシステイン、ミオグロビン、トロポニンＩ、カスパーゼ、インスリン、血液型決定因子、リーサス因子、αアミラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンキナーゼ、γ−ＧＴ、ＧＯＴ／ＡＳＡＴ、ＧＰＴ／ＡＬＡＴ、ＬＤＨ、膵リパーゼ、ホスファターゼ、ビリルビン、グルコース、クレアチニン、リポプロテインが挙げられる。
【００３９】
自己免疫診断薬としては、ＡＣＡ  ＩｇＧ、ＡＮＡスクリーニングＩｇＧ（ANA Screen IgG）、カルジオリピンＩｇＡ、カルジオリピンＩｇＧ、カルジオリピンＩｇＭ、カルジオリピン総ａｂ、ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ、ミトコンドリア（ＭＡ）ａｂ、ＲＮＰ／Ｓｍ  ＩｇＧ、Ｓｃｌ−７０、Ｓｍ  ＩｇＧ、ＳＳＡ  ＩｇＧ、ＳＳＢ  ＩｇＧ、チログロブリン（ｔｇ）ａｂ、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）ＩｇＧが挙げられる。
【００４０】
スポーツ医学における目的物：
運動能力向上薬（アンフェタミン、成長ホルモン、エリスロポエチンなど）。
【００４１】
薬物（例えば、ヘロイン、コカイン、ＬＳＤなど）およびその分解産物。
【００４２】
毒素、マイコトキシン、細菌毒素：コレラ毒素、百日咳毒素など。
【００４３】
運動能力向上薬としては、同化剤（例えば、ボラステロン、ボルデノン、デヒドロクロロメチルテストステロン、ジヒドロテストステロン、クロステボル、フルオキシメステロン、メステロロン、メタンジエノン、メテノロン、メチルテストステロン、ナンドロロン、ノルエタンドロロン、オキサンドロロン、オキシメステロン、オキシメトロン）；スタノゾロール、テストステロン、および化学的または薬理学的に関連される化合物；β２アゴニスト（例えば、クレンブテロール）；アンフェタミン（例えば、アミネプチン、アンフェタミン、アンフェタミニル、ベンズフェタミン、ジメチルアンフェタミン、エチルアンフェタミン、フェネチリン、フェンプロポレクス、フルフェノレクス、メソカルブ、メトキシフェナミン、メチルアンフェタミン、メチルフェニデート、モラゾン、ペモリン、フェンジメトラジン、ピップラドル、ピロバレロン、および化学的または薬理学的に関連される化合物）；経口、筋内または静脈内投与用コルチコステロイド；ペプチドホルモンおよびその類似物（例えば、絨毛性ゴナドトロピンＨＣＧ（ヒト性ホルモン）、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン（ＨＧＨ，ソマトトロピン）、エリスロポエチン（ＥＰＯ））が挙げられる。上記物質から放出される全ての対応する因子も同様に禁止されている。
【００４４】
覚醒剤：例えば、アミフェナゾール、コフェイン、カシン（Cathin）、クロルフェンテルミン、クロベンゾレクス、クロルプレナリン、クロプロパミド、クロテタミド、エフェドリン、エタフェドリン、エタミバン、フェンカムファミン、メフェノレクス、メチルエフェドリン、ニケタミド、ペンテトラゾール、フェニルプロパノールアミン、プロリンタン、プロピルヘキセドリン、ストリキニン、および化学的または薬理学的に関連される化合物。
【００４５】
麻酔剤／鎮痛剤：例えば、アルファプロジン、アニレリジン、ブプレノルフィン、デキストロモラミド、デキストロプロポキシフェン、ジアモルフィン、ジピパノン、エトヘプタジン、エチルモルフィン、レボルファノール、メタドン、モルヒネ、ナルブフィン、ペンタゾシン、ペチジン、トリメペリジン、および化学的または薬理学的に関連される化合物。
【００４６】
薬物としては、アンフェタミン、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカイン代謝物、コチニン、フェンタニル、フルニトラゼパム、ＬＳＤ、メタンフェタミン、モルヒネ、オピエート、ＰＣＰ、三環系抗うつ薬が挙げられる。
【００４７】
獣医学由来の分析物：病原体、薬剤、代謝物質、運動能力向上薬、毒素など。
【００４８】
環境診断由来の分析物（空気、水および土壌分析物）：
有害物質：農薬（ＰＣＢ、アトラジンなど）
殺虫剤（ピレスロイド、バチルス−スリンギエンシス毒素など）
木材防腐剤（リンデンなど）
除草剤（ジウロン、モヌロンなど）
殺菌剤
毒素および爆薬（例えば、ジオキシン、ＴＮＴなど）
着色剤およびニス
環境汚染物質、毒性物質。
【００４９】
着色剤およびニスとしては、フタレート、アゾ染料、グリコールエーテル、グリコールエステル、ジオキシンが挙げられる。
【００５０】
殺虫剤としては、ジメトエート、デルタメトリン、ジフルベンズロン、α−シペルメトリン、ζ−シペルメトリン、フェノキシカルブ、テブフェンピラド、ピリミカルブ、アザジラクチン、ピペロニルブトキサイド、ピレスリン、フロクマフェン、クロルピリホス、ペルメトリン、チャルコグラン（Chalcogran）、デカジエンカルボン酸メチルエステル、イプスジエノール、（Ｓ）−シス−ベルベノール、メチルブテノールが挙げられる。
【００５１】
農薬としては、３，４，５−トリメタカルブ、３−ヒドロキシカルボフラン、５−ヒドロキシクレトジムスルホン、５−ヒドロキシイミダクロプリド、５−ヒドロキシチアベンダゾール、６−クロロ−３−フェニル−ピリダジン−４−（ピリデート代謝物）、アセフェート、アセタミプリド、アシベンゾラル−Ｓ−メチル、アクロニフェン、アクリナトリン、アラクロール、アルジカルブ、アルジカルブスルホキシド、アルドキシカルブ、アメトリン、アミドスルフロン、アミノカルブ、アニラジン、アトラジン、アベルメクチンＢ１ａ、アベルメクチンＢ１ｂ、アザメチホス、アジンホスエチル、アジンホスメチル、アゾキシストロビン、ベナラキシル、ベンダイオカルブ、ベンフラカルブ、ベンスルフロンメチル、ベンゾキシメート、ビフェノックス、ビテルタノール、ボスカリド、ブロマシル、ブロムコナゾール、ブピリメート、ブプロフェジン、ブトカルボキシム、ブトカルボキシムスルホキシド、ブトキシカルボキシム、ブツロン、カルバリル、カルベンダジム、カルベタミド、カルボフラン、カルボスルファン、カルボキシン、カルフェントラゾンエチル、クロルブロムロン、クロルフェンビンホス、クロルフルアズロン、クロリダゾン、クロロトルロン、クロロクスロン、クロルピリホス、クロロスルフロン、クロルチオホス、シノスルフロン、クレトジム、クレトジムイミンスルホン（Clethodim-imin-sulfone）、クレトジムイミンスルホキシド（Clethodim-imin-sulfoxid）、クレトジムスルホン、クレトジムスルホキシド、クロジナホッププロパルギル、クロフェンテジン、クロマゾン、クロピラリド、クロキントセットメキシル、クマホス、シアナジン、シアノフェンホス、シアゾファミド、シクロエート、シモキサニル、シプロジニル、シロマジン、ダミノジド、デルタメトリン、デメトン−ｓ−メチル、デメトン−ｓ−メチルスルホン、デスメディファム、デスメチルホルムアミド−ピリミカルブ（Desmethylformamido-pirimicarb）、デスメチル−ピリミカルブ（Desmethyl-pirimicarb）、ジアリホール、ジアレート、ジアジノン、ジクロフルアニド、ジクロルボス、ジクロブトラゾール、ジエトフェンカルブ、ジフェノコナゾール、ジフェノクスウロン、ジフルフェニカン、ジメフロン、ジメタクロル、ジメテナミド、ジメトエート、ジメトモルフ、ジニコナゾール、ジフェニルアミン、ジスルホトン、ジウロン、ドデモルフ、ＥＰＮ、エポキシコナゾール、エチオフェンカルブ、エチオフェンカルブスルホン、エチオフェンカルブスルホキシド、エチオン、エチリモール、エトフメセート、エトプロホス、エトフェンプロックス、エトリムホス、ファモキサドン、フェナミホス、フェナリモル、フェナザキン、フェンブコナゾール、フェンフラム、フェンヘキサミド、フェノキサプロップエチル、フェノキシカルブ、フェンピクロニル、フェンプロパトリン、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フェンプロキシメート、フェンチオン、フェヌロン、フラムプロップイソプロピル、フラムプロップメチル、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップブチル、フルフェナセット、フルフェノクスロン、フルオメツロン、フルオログリコフェンエチル、フルキンコナゾール、フルリドン、フルロキシピルメプチル（Fluroxypyr-meptyl）、フルルタモン、フルシラゾール、フルトリアホール、フォルペット、ホノホス、ホスチアゼート、フベリダゾール、フラチオカルブ、ハロキシホップエトチル（Haloxyfop-etotyl）、ハロキシホップメチル、ヘプテノホス、ヘキサコナゾール、ヘキサジノン、ヘキシチアゾックス、イマザリル、イミダクロプリド、インドキサカルブ、イオドスルフロンメチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イサゾホス、イソフェンホス、イソプロツロン、イソキサチオン、クレソキシムメチル、リニュロン、マラオキソン、マラチオン、ＭＣＰＡ−ブトチル（MCPA-Butotyl）、メカルバム、メパニピリム、メタラキシル、メタミトロン、メタザクロール、メトコナゾール、メタベンズチアズロン、メタミドホス、メトフロキサム、メチダチオン、メチオカルブ、メトミル、メトキシフェノジド、メトブロムロン、メトラクロール、メトスラム、メトクスロン、メトリブジン、メトスルフロンメチル、モリネート、モノクロトホス、モノリニュロン、モニュロン、ミクロブタニル、ナレド、ナプロパミド、ネブロン、ニコスルフロン、ニコチン、ヌアリモル、オフレース、オメトエート、オキサジキシル、オキサミル、オキサミルオキシム、オキシカルボキシン、オキシデメトンメチル、パクロブトラゾール、パラオキソンメチル（Paraoxon-methyl）、パラチオン、パラチオンメチル、ペンコナゾール、ペンシクロン、ペンディメタリン、フェンメディファム、フェントエート、ホレート、ホレートスルホキシド、ホサロン、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピコリナフェン、ピコキシストロビン、ピリミカルブ、ピリミホスエチル、ピリミホスメチル、プリミスルフロンメチル、プロクロラズ、プロシミドン、プロフェノホス、プロメカルブ、プロメトリン、プロパクロル、プロパモカルブ、プロパルギット、プロペタンホス、プロファム、プロピコナゾール、プロポクスル、プロピザミド、プロスルホカルブ、プロスルフロン、プロチオホス、ピメトロジン、ピラクロストロビン、ピラゾホス、ピリダベン、ピリダフェンチオン、ピリデート、ピリメタニル、ピリプロキシフェン、キナルホス、キンメラック、キノクラミン、キノキシフェン、キザロホップエチル、リムスルフロン、ロテノン、シマジン、シメトリン、スピロキサミン、スルホスルフロン、スルホテップ、スルプロホス、テブコナゾール、テブフェノジド、テブフェンピラド、テブタム、テブチウロン、ターバシル、テルブホス、ターブメトン、テルブチラジン、テルブトリン、テトラクロルビンホス、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チアクロプリド、チアメトキサム、チフェンスルフロンメチル、チオジカルブ、チオファノックス、チオファノックススルホン、チオファノックススルホキシド、チオファーネート（エチル）、チオファーネートメチル、トルクロホスメチル、トリルフルアニド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリアスルフロン、トリアゾホス、トリベヌロンメチル、トリクロルホン、トリシクラゾール、トリエタジン、トリフロキシストロビン、トリフルミゾール、トリフルスルフロンメチル、トリチコナゾール、バミドチオンが挙げられる。
【００５２】
有害物質および毒性物質としては、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエタン、１，１−ジクロロエテン、１，２，３，４，６，７，８，９−オクタクロロジベンゾフラン、１，２，３，４，６，７，８−ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、１，２，３−トリクロロベンゼン、１，２，３−トリクロロプロパン、１，２，４−トリクロロベンゼン、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン、１，２−ジブロモエタン、１，２−ジクロロベンゼン、１，２−ジクロロエタン、トランス−１，２−ジクロロエテン、１，２−ジクロロエチレン、１，２−ジフェニルヒドラジン、１，３，５−トリニトロベンゼン、１，３−ブタジエン、１，３−ジクロロベンゼン、シス−およびトランス−３−ジクロロプロペン、１，４−ジクロロベンゼン、２，３，４，７，８−ペンタクロロジベンゾフラン、２，３，５，６−テトラクロロフェノール、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４，６−トリクロロフェノール、２，４，６−トリニトロトルエン、２，４、−ジクロロフェノール、２，４−ジメチルフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，４−ジニトロトルエン、２，６−ジニトロトルエン、２−ブタノン、２−クロロアニリン、２−クロロフェノール、２−ヘキサノン、２−メチルナフタレン、３，３’−ジクロロベンジジン、４，４’−メチレンビス（２−クロロアニリン）、４，６−ジニトロ−ｏ−クレゾール、４−アミノビフェニル、４−ニトロフェノール、アセナフテン、アセトン、アクロレイン、アルドリン、α−クロルデン、アモサイトアスベスト、アロクロール１０１６、１２２１、１２３２、１２４０、１２４２、１２４８、１２５４、１２６０、１２６２、砒酸、アスベスト、ベンゼン、ベンジジン、ベンゾ［ａ］アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ベンゾ［ｂまたはｋ］フルオランテン、ベンゾフルオランテン、ベンゾピレン、ビス（２−クロロエチル）エーテル、アジピン酸ビス（２−エチルヘキシル）、フタル酸ビス（２−メトキシエチル）、ブロモジクロロエタン、ブロモホルム、フタル酸ブチルベンジル、ブチレート、砒酸カルシウム、カルバゾール、四塩化炭素、カルボフェノチオン、クロルデン、クロルデコン、クロロベンゼン、クロロジブロモメタン、クロロエタン、クロロメタン、クロルピリホス、クリセン、クリソタイルアスベスト、シス−クロルデン、コールタールクレオソート、パラ−クレゾール、クレゾール、シアニド、シクロトリメチレントリニトラミン（ＲＤＸ）、ｏ，ｐ’−またはｐ，ｐ’−ｄｄｄ、ｐ，ｐ’−ｄｄｅ、ｏ，ｐ’−またはｐ，ｐ’−ｄｄｔ、フタル酸ジ（２−エチルヘキシル）、ジアジノン、ジベンゾ［ａまたはｈ］アントラセン、（塩化）ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェン、ジブロモクロロプロパン、ジクロロベンゼン、ジクロロエタン、ジクロロプロップ、ジクロルボス、ジコホル、ジエルドリン、ジメトエート、ジメチルホルムアミド、ジメチルアルシン酸、ジ−ｎ−ブチルフタレート、ジニトロトルエン、ジスルホトン、（α−��β−）エンドスルファン（スルフェート）、エンドリン（アルデヒド；ケトン）、エトプロップ、エチルエーテル、エチルベンゼン、フルオランテン、ホルムアルデヒド、γ−クロルデン、グチオン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、ヘプタクロロビフェニル、ヘプタクロロジベンゾフラン、ヘプタクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、ヘキサクロロベンゼン、ヘキサクロロブタジエン、α−ヘキサクロロシクロヘキサン、β−ヘキサクロロシクロヘキサン、δ−ヘキサクロロシクロヘキサン、γ−ヘキサクロロシクロヘキサン、ヘキサクロロシクロペンタジエン、ヘキサクロロジベンゾフラン、ヘキサクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、ヘキサクロロエタン、ヒドラジン、シアン化水素、インデノ（１，２，３−ｃｄ）ピレン、メトキシクロール、メチルイソブチルケトン、メチルパラチオン、塩化メチレン、メチル水銀、ナレド、ナフタレン、ｎ−ニトロソジメチルアミン、ｎ−ニトロソジ−ｎ−プロピルアミン、ｎ−ニトロソジフェニルアミン、オルト−クレゾール、オキシクロルデン、パラチオン、ペンタクロロベンゼン、ペンタクロロビフェニル、ペンタクロロブタジエン、ペンタクロロジベンゾフラン、ペンタクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、ペンタクロロフェノール、フェナントレン、フェノール、ホレート、ホロニウム−２１０、ポリ臭化ビフェニル、ポリ塩化ビフェニル、多環芳香族炭化水素、ｐ−キシレン、ピレン、除虫菊、トリチオリン酸ｓ，ｓ，ｓ−トリブチルエステル（S,S,S-TRIBUTYL PHOSPHOROTRITHIOATE）、ストロバン、スチレン、テトラクロロビフェニル、テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン、テトラクロロエタン、テトラクロロエチレン、テトラクロロフェノール、チオシアネート、トルエン、トキサフェン、トランス−クロルデン、トリブチルスズ、トリクロロベンゼン、トリクロロエタン、トリクロロエチレン、トリクロロフルオロエタン、トリフルラリン、塩化ビニルが挙げられる。
【００５３】
農学および林学由来の分析物：
植物および動物の病原体、マイコトキシン、環境汚染物質など。
【００５４】
プロセス工学／食品技術／生物工学／化粧品における分析物：
化学的および生物工学的な合成製品（主製品、中間産物、副産物、および分解産物を含む、例えば、ビタミン、香料、薬剤、毒素、脂質、アミノ酸、グリセリド、炭水化物、繊維、甘味料、着色剤、保存剤、多糖、マイコトキシンなど）。
【００５５】
食品添加物としては、アセスルファムＫ、アセチル化酸化デンプン、アセチル化デンプン、アセチル化アジピン酸架橋デンプン、アセチル化リン酸架橋デンプン、アルラレッドＡＣ、α−トコフェロール、アルミニウムラッカー、硫酸アルミニウムナトリウム、アマランス、アンモニア・カラメル色素、亜硫酸アンモニア・カラメル色素、アナトー、アントシアン、リンゴ酸、アスコルビン酸、アスパルテーム、アゾルビン、赤ビート色素、ベントナイト、安息香酸、ベンジルアルコール、コハク酸、β−アポ−８’−カロテナール、β−アポ−８’−カロチン酸エチルエステル、β−シクロデキストリン、蜜蝋（白および黄色）、ビフェニル、ビキシン、ホウ酸、ブラウンＦＫ、ブラウンＨＡＴ、ブリリアントブルーＦＣＦ、ブリリアントブラックＢＮ、ブタジエン−スチレン共重合体、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、５’−リボヌクレオチドカルシウム、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、カルバミド、カルボキシメチルセルロース、カルナウバワックス、カロテン（混合カロテン、βカロテン）、カラギーナン、セルロース（微結晶性セルロース、セルロース粉末）、キノリンイエロー、クロロフィル、クロロフィリン、コチニールレッドＡ、酵素加水分解カルボキシメチルセルロース、エリトロシン、γ−トコフェロール、サンセットイエローＳ、ジェラン（gellan）、グリーンＳ、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル化リン酸架橋デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、インジゴチンＩ、インベルターゼ、クロロフィルの銅含有錯体、クロロフィリンの銅含有錯体、クルクミン、リン酸化デンプン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ネオヘスペリジンＤＣ、ナイシン、ノルビキシン、酸化デンプン、パテントブルーＶ、ペクチン（ペクチン、アミド化ペクチン）、リン酸モノエステル化リン酸架橋デンプン、リン酸、ポリデキストロース、ポリエチレングリコール６０００、酸化ポリエチレンワックス、炭素数が２〜１８の非分岐鎖脂肪酸のポリビニルエステル、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルピロリドン、リボフラビン、リボフラビン５’−リン酸エステル、レッド２Ｇ、サッカリンおよびそのナトリウム塩、カリウム塩、およびカルシウム塩（サッカリン、サッカリンナトリウム、サッカリンカルシウム、サッカリンカリウム）、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、ソルビタンモノラウレート、シルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム、タンニン、タートラジン、ソーマチン、トラガカント、加工ユーケマ藻類、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンが挙げられる。
【００５６】
化粧品由来の例としては、ＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体、ホルムアルデヒド樹脂、ムスク化合物、テンシド、パラフィン、芳香族アミン、メチルパラベン、ブチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、イソブチルパラベン、ポロキサマー１８４、加水分解エラスチン、アラントイン、乳酸酵素、キサンタンが挙げられる。
【００５７】
文献において、種々のカチオンを有する種々のキレートが蛍光色素として知られている。一定量の芳香族基を有するタンパク質または抗体さえも、蛍光色素として使用し得る。本発明に関しては、特にユーロピウムクリプテート蛍光色素およびテルビウムクリプテート蛍光色素が、非常に有利であることが示された。なぜならこれらの蛍光色素は、特徴的な発光スペクトルを有しており、このスペクトルは測定試料中に存在する他の成分（例えば、タンパク質）の生じ得る蛍光から非常によく区別され得るためである。ユーロピウムクリプテート蛍光色素およびテルビウムクリプテート蛍光色素は、クリプテートの有機部分によって、およびユーロピウムイオンへの直接的なエネルギー移動によって生じる光吸収で特徴付けられる。ユーロピウムイオンは、酸化状態３＋で存在する。テルビウムイオンもまた、酸化状態３＋で存在する。ユーロピウムクリプテート蛍光色素は、好ましくは、窒素レーザーを用いて、３３７ｎｍの波長で励起される。発光は、６２０ｎｍ（およびテルビウムの場合５４５ｎｍ）で測定される。ユーロピウムクリプテート蛍光色素およびテルビウムクリプテート蛍光色素の蛍光は、他の蛍光色素または測定試料の他の蛍光物質の蛍光に比べて明らかに長い。そのため、ユーロピウムクリプテート蛍光色素またはテルビウムクリプテート蛍光色素の蛍光は、他の成分または他の蛍光色素によって生じるバックグラウンド蛍光があり得るにも関わらず、非常によく正確に測定され得る。
【００５８】
いわゆる「小分子」は、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に、直接的またはリンカーを介して結合され得る薬理成分または毒素などの小さな化学分子のことである。このような「小分子」に加えて、巨大分子をユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に結合することも可能である。蛍光色素特異的抗体もまた、巨大分子とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）とからなる結合体に結合し、そのため、本明細書に記載の方法はまた、巨大分子の検出にも用いられ得る。
【００５９】
上記巨大分子としては、特に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ミモトープ、ｆａｂ断片、ｆｃ断片、ペプチド、レクチン、ペプチド模倣薬、ギャップマー、リボザイム、ＣｐＧオリゴマー、ＤＮＡザイム、リボスイッチ、ポリマー、ホルモン、ビタミン、炭水化物、グリセリドまたは脂質が挙げられる。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様は、分析物分子とユーロピウムクリプテート蛍光色素の分子または錯体との間の結合体を用いる。本発明によれば、同じ分析物由来の２つの分子を１つのユーロピウムクリプテート蛍光色素の分子に結合すること、あるいは２つの異なる分析物由来のそれぞれの１つの分子を１つのユーロピウムクリプテート蛍光色素に結合することも可能である。他方、同一のまたは異なる場合でさえも２つのユーロピウムクリプテート蛍光色素の分子が、１つの分析物分子に結合されることも可能である。これは、ある分析物の検出精度を増加させるために、あるいはいくつかの分析物の同時検出を可能にするために有利であり得る。さらに、２を超える分析物分子および／またはユーロピウムクリプテート蛍光色素の分子の結合体（例えば、３つの同一のまたは異なる分析物分子と１または２以上のユーロピウムクリプテート蛍光色素分子との結合体など）も利用可能であることは、当業者に明らかである。これはまた、テルビウムについても当てはまる。
【００６１】
使用される好ましいクリプテートは、環式化合物、特に二環式化合物である。クリプテートが、橋頭位窒素原子を有することがさらに好ましい。さらに、クリプテートは、好ましくは１以上のピリジン残基またはピリジン成分を含み、そして、ビピリジン残基またはビピリジン成分あるいはビピリジン断片が特に好ましい。したがって、２つの橋頭位窒素原子を有する二環式クリプテートが特に好ましい。
【００６２】
さらに、好ましくは、ピリジン成分が環系中、特に二環系の中に存在する。好ましいクリプテートは、以下の一般式を有する。
【００６３】
【化１】
2008541022.tif 000003
【００６４】
ここで、Ｘ、Ｘ＊、Ｘ＊＊は、互いに独立して、アルキル残基、アルケン残基、アリール残基、ヘテロアリール残基、アルキルアリール残基、ヘテロアリールアルキル残基、環状残基（Cyclylrest）、複素環残基（Heterocyclylrest）を表し、そして特にメチレン基、エチレン基、エチレンオキシ基、エテニレン基、アルキレンアミノ基、アルキレンオキシ基、フェニル基、ビフェニル基、ピリジル基、ビピリジル基、ベンゾピリジル基、ベンゾビピリジル基、イミダゾール基、ピロリニル基および／またはピロリジニル基を含む。
【００６５】
１６〜２０の原子、好ましくは１７〜１９の原子の大きさの環を有する環状物が特に好ましい。この場合、環の大きさとは、ユーロピウムまたはテルビウムに最も近接することが明らかな環を形成する原子のみが考慮されることを意味する。上記の大きさの環を有する環系状、特に二環系は、ユーロピウム３＋（またはＴｂ３＋）が組み込まれるのに特によく適する。トリスビピリジルクリプテート（Trisbipyridylkryptate）、ピリジルジビピリジルクリプテート（Pyridyldibypyridylkryptate）、およびジピリジルビピリジルクリプテート（Dipyridylbipyridylkryptate）（すなわち６、５、または４個のピリジル環を有するクリプテート）が特に好ましい。
【００６６】
以下に、Ｅｕ３＋またはＴｂ３＋を有するまたは有しない考えられ得るクリプテートの例を示す。ここでＴｂ３＋は、Ｅｕ３＋の代わりに用いられ得る。
【００６７】
【化２】
2008541022.tif 000004
【００６８】
【化３】
2008541022.tif 000005
【００６９】
【化４】
2008541022.tif 000006
【００７０】
【化５】
2008541022.tif 000007
【００７１】
【化６】
2008541022.tif 000008
【００７２】
分析物は、イオン、共有結合性、または脂肪親和性の相互作用によって、挿入（Interkalation）または組み込みによって、および水素結合を介して、クリプテートに結合され得る。中でも共有結合が好ましい。
【００７３】
したがって、クリプテートが少なくとも１つの環に官能基を含むことも好ましく、この基に分析物が直接的またはリンカーを介して間接的に結合され得る。
【００７４】
以下は、特に適する官能基である：ハロゲン、水酸基、カルボキシレート基、カルボニル基、チオール基、アミノ基、シアネート基、イソシアネート基。分析物への結合は、好ましくはイミン結合、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、アルドール付加、ケタール結合、アセタール結合、求核置換、カーボネート結合、ウレタン結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、または尿素結合によって行われる。
【００７５】
以下の構造は、好ましい例を示す。
【００７６】
【化７】
2008541022.tif 000009
【００７７】
ここで、カルボキシル基または残基Ｒは、分析物の分子の結合可能部位を示す。
【００７８】
好ましくは、検出される物質の１つの単一の分子のみが、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）の分子に結合される。さらに、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）と分析物とからなる結合体の分子ごとに、１つの単一の抗体のみが結合されることが、本発明に必須である。したがって、使用可能なリンカーは、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）と分析物との間の距離が、分析物特異的抗体に加えて蛍光色素特異的抗体もが結合するのに十分であるような長さであってはならない。このように、１つの結合体に対して２つの抗体が結合されることは、立体構造上の効果によって除外される。分析物として、上記物質がユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に結合され得る。
【００７９】
本明細書に記載のクリプテートと共に用いられる場合、Ｅｕ３＋およびＴｂ３＋は、蛍光の時間分解測定（ＴＲＦ：時間分解蛍光）を可能にし、そしてしたがって、測定シグナルとバックグラウンドシグナルとの間の明らかな区別を可能にする。
【００８０】
本発明の別の実施態様は、ある分析物自身を検出するのではなく、生物によって形成された、その分析物に対する抗体を検出することに関する。この実施態様においては、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との結合体を蛍光色素特異的抗体と組み合わせて用い、試料溶液を添加した場合の蛍光の増加を測定する。分析物特異的抗体および蛍光色素特異的抗体が同時に結合することはできないため、少なくとも部分的に、検出されるべき分析物特異的抗体が、結合体との結合において蛍光色素特異的抗体に取って代わる。
【００８１】
本明細書に記載の方法は、分析物の定性的な測定および特に定量的な測定を可能にする。さらに本発明による方法は、すべての従来の免疫測定法（特にＥＬＩＳＡなどのすべての不均一系免疫測定法）に対して本発明による方法を適用できる点で有利である。したがって、作業工程は非常に容易になる。これは、本発明による方法が均一系測定法に相当する、すなわちユーザーは、ユーザーの試料を測定試料と共に混合し、その後、その蛍光を測定するだけでよいからである。さらに、その工程は容易に自動化でき（例えば、ルーチン診断で）、それによって、時間と費用との両方が有利に節約され得る。
【００８２】
また、ある量の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）と分析物との結合体と、分析物特異的抗体および蛍光色素特異的抗体とを含む試料溶液に添加されることが特に好ましい。過酸化水素は、蛍光にプラスの影響、すなわち発光の効果を有することが示されている。特に、過酸化水素は、発光を増加または増強させるようであり、その結果、測定感度の明らかな増加が生じ、または非常に少量の分析物を測定することを可能にする。しかし、過酸化水素の作用機構は明らかではない。
【００８３】
好ましくは、結合体に対して、少なくとも等モル量の過酸化水素が添加される。より大量の過酸化水素、例えば、結合体に対して、２倍モル過剰（２モル当量）、３倍モル過剰（３モル当量）、５倍モル過剰（５モル当量）、または１０倍モル過剰（１０モル当量）も同様に可能である。したがって、過酸化水素は、結合体に対して、０．１：１〜５０：１、好ましくは０．５：１〜１０：１、さらに好ましくは０．８：１〜４：１、そして特に好ましくは１：１〜２（Ｈ２Ｏ２）：１（結合体）のモル比で用いられ得る。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施態様は、さらなる発光団が分析物特異的抗体および蛍光色素特異的抗体と、ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）と分析物との結合体とを含む試料溶液に添加されることを含む。この追加の発光団は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）によって蛍光（発光）シグナルを移動または受容する働きをし、そのため、１つの測定試料中の種々の分析物が分析され得る。１または複数の追加の発光団は、好ましくは、いわゆる、異なる波長の量子ドットである。結合体、２つの抗体、および量子ドットからなるこのような組成物は、１つの測定試料中のいくつかの異なる分析物の多重スクリーニングを可能にする。
【００８５】
さらに、本発明は、
ａ）分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との結合体であって、分析物とユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との該結合体が、単一の抗体のみが結合されることを可能とする、結合体；
ｂ）該分析物に対して特異的な抗体；および
ｃ）該ユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）に対して特異的な抗体
を含む、組成物である。
【００８６】
この組成物は、追加の成分として、過酸化水素および／または追加の発光団をさらに含んでもよい。
【００８７】
このような組成物は、種々の分析物の検出用キットの必須成分である。このようなキットは、１以上の分析物の検出のための少なくとも１つの上記組成物、および反応を行うための１以上の試料容器、ならびに反応をどのように行うかに関する説明書を含む。
【００８８】
さらに組成物はまた、種々の分析物の存在を同時に検出するために、種々の分析物と同一または異なるユーロピウムクリプテート蛍光色素（またはテルビウムクリプテート蛍光色素）との種々の結合体；および種々の分析物特異的抗体を含み得る。
【００８９】
本発明による方法は、均一系免疫測定法の実施に関する。均一系においては、測定試料（複数の他の成分（それらの種類、濃度、および測定系に対する作用は、大部分が知られていない）、および分析物を含む）と、測定系（測定シグナルを発生させるための成分を含む）とが組み合わされる。その直後に測定が行われる。すなわち、測定試料のすべての成分（測定系および従って測定シグナルに非特異的に作用し、その結果、不純化してしまう場合さえある）がその系の中に残る。この妨害は、決まったマトリクス（例えば、分析物の水溶液）で測定が行われる場合に限ってのみ制御され得る。しかし、このような系は、実用上の重要性を欠く。実用上重要な測定（例えば、患者の血清中物質、生成物残渣、または土壌試料の分解物）のために、測定シグナルとバックグラウンドシグナルとは区別されなければならない。この条件が満たされる場合にのみ、均一系は、測定プロセスの単純化および結果として生じる時間および作業の軽減に関して利点を示す。
【００９０】
本発明による方法は、均一系蛍光消光免疫測定法である。上記背景はまたこの系においてもあてはまる。「簡単な」蛍光色素（フルオレセインなど）を用いる系は、約２０年にわたって知られている。しかし、この系の明白な機能およびその自明な利点にもかかわらず、上記の理由のために実用上の重要性を得ていなかった。これまで解決されなかった問題は、上記のマトリクス影響にあった。
【００９１】
測定試料と測定系との混合物において、蛍光色素だけでなく、測定試料由来の複数の他の成分（例えば、血清タンパク質）も、それらが蛍光を発するように励起される。この場合、この発光団の光の放射は、測定試料の測定混合物中に残存する成分の放射と同じ時間帯で生じる。バックグラウンドシグナルの種類および強度は、測定試料の個々の組成に依存し、そして事前に測定することができない。その結果、実用上重要な測定試料（患者の血清など）の測定を行うことができない。
【００９２】
しかし、このような問題は、時間分解蛍光測定法（ＴＲＦ）で解決することができる。この目的のために、これまで使用してきた蛍光色素を、テルビウムおよびユーロピウム元素のキレートまたはクリプテートに換える。この錯体内の放射性自由エネルギー移動により、光の放射は遅延される。このシステムでさえも、上述のように、測定試料の成分が、蛍光色素と同時に蛍光を発するように励起される。しかし、バックグラウンド蛍光が消滅すると、測定シグナルが検出され得る。したがって、実用上重要な試料も分析され得る。これは、均一系試験の原理と蛍光の時間分解測定法との組み合わせによって可能となる。
【００９３】
したがって、本発明による方法は、測定試料の前精製を必要とすることなく、複数の他の成分を含む測定試料（血液試料または土壌試料など）に特に適している。
【実施例】
【００９４】
実施例１
１）ＴＢＰユーロピウムクリプテートに対する免疫血清の調製
５０μｇのストレプトアビジン−ＴＢＰユーロピウムクリプテート（第１回目の免疫化）および
２５μｇのストレプトアビジン−ＴＢＰユーロピウムクリプテート（第２回目の免疫化、１ヵ月後）を用いたｂａｌｂ／ｃマウスの免疫付与、採血、および血清抽出（当業者に公知）
【００９５】
２）血清によるＴＢＰユーロピウムクリプテートの結合の検証（図１）
試験結合体の調製：当業者に知られている方法にしたがって、グルタルアルデヒドで遊離アミノ基を架橋することによって、ＴＢＰユーロピウムクリプテートをＢＳＡにカップリング。
【００９６】
ＥＬＩＳＡでＢＳＡ結合体への抗体結合を検証。
【００９７】
３）ＴＢＰユーロピウムクリプテートへの抗体結合による蛍光消光の検証（図２）
測定試料（１５０μｌ）は以下からなる：
ＴＢＰユーロピウムクリプテート（１：２０００００（最終濃度））７５μｌ
ＴＢＰユーロピウムクリプテートに対する免疫血清（あるいはそれぞれ３種類の免疫前血清（丸）、３種類の他の抗原に対する３種類の免疫血清（四角））（希釈系）７５μｌ
【００９８】
蛍光測定：励起３３７ｎｍ、発光６２０ｎｍ：
【００９９】
４）分析物結合抗体による蛍光色素結合抗体の置換の検証（図３）
【０１００】
分析物（フルオレセイン）と蛍光色素（ユーロピウムクリプテート）との結合体の調製
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＴＢＰユーロピウムクリプテート（０．０３ｍＭ）を２：１のモル比で反応させた。ＰＢＳを媒体として用い、そして反応時間は室温にて４時間であった。
【０１０１】
測定試料（１５０μｌ）は、以下からなる：
結合体（１：２０００００（最終濃度））７５μｌ
ＴＢＰユーロピウムクリプテートに対する免疫血清（１：２００（最終濃度））３７．５μｌ
抗体ＤＥ１（抗フルオレセイン抗体）または抗体Ｄ３５（抗グルコースオキシダーゼ抗体）３７．５μｌ
【０１０２】
蛍光測定：励起３３７ｎｍ；発光６２０ｎｍ
【０１０３】
図３は、測定試料番号１〜４の測定値を示す。
【０１０４】
【表１】
2008541022.tif 000010
【０１０５】
実施例２：ユーロピウムキレートについての実験
目的：
血清試料中のユーロピウムキレートの蛍光を消光するポリクローナル抗体を検証する。
【０１０６】
モデル系：
試験動物（ｂａｌ／ｃマウス）を、ユーロピウムキレート／ＯＶＡ結合体で免疫化した（ＯＶＡ＝オボアルブミン）。調製した血清試料を、ユーロピウムキレート／ＢＳＡ結合体の蛍光を消光する特性について試験した。使用したユーロピウムキレートは、以下の構造を有する［ＥｕＬ］であった。Ｌｎはユーロピウムを表す:
【０１０７】
【化８】
2008541022.tif 000011
【０１０８】
ユーロピウムキレート／タンパク質結合体の調製
ユーロピウムキレート［ＥｕＬ］は、ＮＨＳエステルの形態で存在した。キャリアタンパク質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＯＶＡへのカップリングを、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で、室温にて一晩行った。
【０１０９】
カップリング後、結合体をＰＢＳで透析し、前精製またはキャラクタリゼーションなしで試験に用いた。
【０１１０】
［ＥｕＬ］−ＯＶＡを用いた試験動物の免疫化および血清抽出
２ｂａｌｂ／ｃマウス：
第１回目の免疫化を完全フロイントアジュバンド中の１００μｇの結合体を用いて行った。第２回目の免疫化を１ヵ月後に、アジュバンドなしの５０μｇの結合体を用いて行った。第２回目の免疫化の１週間後に血液を採取した。
【０１１１】
［ＥｕＬ］−ＢＳＡ結合体の蛍光の消光についての免疫血清の試験
測定試料は、７５μｌの希釈血清試料および７５μｌの［ＥｕＬ］／ＢＳＡ結合体（希釈率１：１００００、最終濃度）で構成される。測定試料のすべての成分をＰＢＳ−ＮＫＳ（ＰＢＳ中に５％のウシ血清）中に希釈した。
【０１１２】
１時間後、クリプター（Kryptor）（Cezanne社）で、蛍光を測定した。窒素レーザーを用いて３３７ｎｍで励起させた。蛍光の時間分解測定を６２０ｎｍで行った。
【０１１３】
結果：
ＴＷ９０６−１血清（免疫化９０６−１由来の血清）は、所望の蛍光消光効果を示していた。すなわち（クリプテートに類似して）ユーロピウムキレートの蛍光を消光する抗体が血清中に存在していた（図４参照）。
【０１１４】
実施例３：ハプテン−ユーロピウムクリプテートについての実験
目的：
ユーロピウムの蛍光を消光するモノクローナル抗体がハプテン（小分子）と蛍光色素（ユーロピウムクリプテート）との結合体への結合から、結合体中のハプテンに結合する第２の分子によって排除されることを検証し、そしてハプテンの濃度を測定するためにこの効果を使用する。
【０１１５】
モデル系：
ユーロピウムクリプテート（蛍光色素）とビオチン（ビタミンＨ）（ハプテン、分析物）との結合体を用いた。ユーロピウムクリプテートの蛍光を消光するモノクローナル抗体Ｇ２４−ＢＡ９が、ビオチン結合タンパク質であるストレプトアビジンによって、蛍光色素への結合から排除された。この効果は、遊離分析物（ビオチン）の外部投与によって、逆転し得た。このように生じる蛍光変化は、遊離分析物（ビオチン）の濃度の測定を可能にする。
【０１１６】
ユーロピウムクリプテート／ビオチン（ビタミンＨ）結合体Ｅｕ（ＮＨ２）−ビオチンの調製
材料：
クリプテートＮＨ２（cisbio社）（クリプテートＮＨ２＝ＴＢＰユーロピウムクリプテート、第１８頁参照）
ビオチンＮＨＳ（Fluka社）
【０１１７】
カップリング：
ビオチンＮＨＳおよびクリプテートＮＨ２をＤＭＳＯ中で予備溶解した。カップリング反応において、両成分を７（クリプテート）：１（ビオチン）のモル比で混合した。カップリングを、０．１Ｍの炭酸緩衝液、ｐＨ９．０中で、室温にて一晩行った。
【０１１８】
Ｅｕ（ＮＨ２）−ビオチン結合体を、さらに精製することなく用いた。
【０１１９】
蛍光消光免疫測定法におけるビオチン（ビタミンＨ）濃度の測定
以下の４成分を、示した最終濃度で１５０μｌの測定反応液中で混合した。
クリプテート    Ｅｕ−ＮＨ２−ビオチン  希釈率１：３０００００
消光剤          Ｇ２４−ＢＡ９          ２０μｇ／ｍｌ（クリプテート抗体）
置換抗体        ストレプトアビジン      ３μｇ／ｍｌ
分析物          ビオチン                希釈系０〜１００ｎｇ／ｍｌ
【０１２０】
測定試料のすべての成分をＰＢＳ−ＮＫＳ（ＰＢＳ中に５％のウシ血清）中に希釈した。
【０１２１】
１時間後、クリプター（Kryptor）（Cezanne社）で蛍光を測定した。窒素レーザーを用いて３３７ｎｍで励起させた。蛍光の時間分解測定を６２０ｎｍで行った。
【０１２２】
結果：
ストレプトアビジンは、Ｅｕ−ＮＨ２−ビオチンへの結合から遊離ビオチンによって排除された。したがって、Ｇ２４−ＢＡ９が、蛍光色素に結合し得、蛍光を消光させた。使用した材料（特に、使用した結合体の原始性）を鑑みると、この測定は、驚くほど感度がよい（図７参照）。
【０１２３】
実施例４：タンパク質−ユーロピウムクリプテートについての実験
目的：
ユーロピウムの蛍光を消光するモノクローナル抗体がタンパク質（巨大分子）と蛍光色素（ユーロピウムクリプテート）との結合体への結合から、結合体中のタンパク質に特異的に結合する抗体によって排除されることを検証する。
【０１２４】
モデル系
ユーロピウムクリプテート（蛍光色素）とペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（分析物）との結合体を用いた。ユーロピウムクリプテートの蛍光を消光するモノクローナル抗体Ｇ２４−ＢＡ９が、蛍光色素への結合から、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）に結合する抗体によって排除された。この効果は、遊離分析物（ＰＯＤ）の外部投与によって、逆転し得た。
【０１２５】
ユーロピウムクリプテート／ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）結合体（Ｅｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤ）の調製
材料：
クリプテートＮＨ２（cisbio社）（クリプテートＮＨ２＝ＴＢＰユーロピウムクリプテート、第１７頁参照）
ペルオキシダーゼ（sigma社）
【０１２６】
カップリング：
反応性アルデヒド基を、ペルオキシダーゼの糖残基に生じさせ、そしてこのように活性化されたペルオキシダーゼをその後０．１ＭのＮａＨＣＯ３を用いて脱塩した。このように調製されたＰＯＤをクリプテートＮＨ２と等モル比で混合した。カップリングを室温にて一晩行った。カップリングしていないアルデヒド基を、エタノールアミン（ｐＨ８．０）を用いてブロックし、結合体をＰＢＳで透析した。
【０１２７】
Ｅｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤ結合体を、さらに精製することなく用いた。
【０１２８】
抗ＰＯＤ血清によるＧ２４−ＢＡ９のＥｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへのその結合からの置換
以下の４成分を、示した最終濃度で１５０μｌの測定反応液中で混合した。
クリプテート    Ｅｕ−ＮＨ２−ＰＯＤ    希釈率１：２０００
消光剤          Ｇ２４−ＢＡ９          ５μｇ／ｍｌ
置換抗体        抗ＰＯＤ血清            希釈率１：１０００
分析物          ＰＯＤ                  ２０μｇ／ｍｌ
【０１２９】
測定試料のすべての成分をＰＢＳ−ＮＫＳ（ＰＢＳ中に５％のウシ血清）中に希釈した。
【０１３０】
１時間後、クリプター（Kryptor）（Cezanne社）で蛍光を測定した。窒素レーザーを用いて３３７ｎｍで励起させた。蛍光の時間分解測定を６２０ｎｍで行った。
【０１３１】
結果：
計４種類の抗ＰＯＤ血清のうち、ＴＷ７３８が所望の効果を示した。血清中に含まれるポリクローナル抗体は、Ｇ２４−ＢＡ９を、Ｅｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへの結合から部分的に排除することが可能であった。この効果は、遊離分析物ＰＯＤの投与によって、逆転し得た（図５参照）。
【０１３２】
図５の記載：
実験において、ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）で免疫化された４種類の試験動物の血清を用いた（ａ．ＰＯＤ）。免疫前血清、およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に対する免疫血清をコントロールとして用いた。血清を１：１０００に希釈した。
【０１３３】
Ｅｕ（ＮＨ２）／ＰＯＤ結合体の発光を、蛍光を消光する抗体Ｇ２４−ＢＡ９の存在下で測定した。実験は、免疫血清（ａ．ＰＯＤ）に含まれるＰＯＤ結合抗体が、抗体Ｇ２４−ＢＡ９を、結合体との結合からどの程度排除することができるかを試験するために行った。この排除の結果として、期待どおり蛍光の増加が得られた。血清ＴＷ７３８ａ．ＰＯＤは、この効果を示す。他の免疫血清および免疫前血清は、陰性であった。
【０１３４】
血清ＴＷ７３８ａ．ＰＯＤで観察される効果は、過剰の遊離ＰＯＤの投与によって逆転し得た。この場合、結合体に結合したＰＯＤ結合抗体は、主に遊離ＰＯＤに結合し、結合体には結合しなかった。したがって、Ｇ２４−ＢＡ９による結合体への結合およびその結果として蛍光の消光が観察された。
【０１３５】
モノクローナル抗体結合ＰＯＤによるＧ２４−ＢＡ９のＥｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへのその結合からの置換
以下の４成分を、示した最終濃度で１５０μｌの測定反応液中で混合した。
クリプテート    Ｅｕ−ＮＨ２−ＰＯＤ    希釈率１：２０００
消光剤          Ｇ２４−ＢＡ９          ５μｇ／ｍｌ
置換抗体        抗ＰＯＤ抗体            ２０μｇ／ｍｌ
分析物          ＰＯＤ                  ２０μｇ／ｍｌ
【０１３６】
測定試料のすべての成分をＰＢＳ−ＮＫＳ（ＰＢＳ中に５％のウシ血清）中に希釈した。
【０１３７】
１時間後、クリプター（Kryptor）（Cezanne社）で蛍光を測定した。窒素レーザーを用いて３３７ｎｍで励起させた。蛍光の時間分解測定を６２０ｎｍで行った。
【０１３８】
結果：
所望の効果は、試験された計３３のＰＯＤ結合モノクローナル抗体のうちの２つで観察できた。モノクローナル抗体Ｂ９２−ＦＧ９およびＥ１７−ＤＡ３が、Ｇ２４−ＢＡ９をＥｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへの結合から一部排除し得た。この効果は、遊離分析物ＰＯＤの投与によって逆転し得た。１つの反応におけるこれらの２つの抗体の組み合わせは、大いに成功であることがわかった（図６参照）。
【０１３９】
図６の記載：
ＰＯＤに対する２つのモノクローナル抗体Ｂ９２−ＦＧ９およびＥ１７−ＤＡ３を実験に用いた。
【０１４０】
Ｅｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤ結合体の発光を、蛍光を消光する抗体Ｇ２４−ＢＡ９の存在下で測定した。実験は、ＰＯＤを結合する２つの抗体の混合物が、抗体Ｇ２４−ＢＡ９を、結合体への結合からどの程度排除することができるかを試験するために行った。この置換の結果として、期待どおりの発光の増加が得られた。
【０１４１】
第１の棒は、ＰＯＤ結合抗体なしの発光を示している。第２の棒は、ＰＯＤ結合抗体の存在下における割合を示している。発光の増加が観察されている。第３の棒は、遊離ＰＯＤの添加が、この効果を逆転し、そして発光を明らかに減少させることを示している。
【０１４２】
実施例５：過酸化水素による蛍光の増加
過酸化水素によるユーロピウムクリプテートの発光の増加
ＴＢＰユーロピウムクリプテート（Ｅｕ（ＴＢＰ）−ストレプトアビジン、１０〜８Ｍ）および過酸化水素（過酸化尿素、１０〜５％）を実験に用いた。測定容量は、４００μｌであった。発光をＩＣＣＤ（Andor社）グリッドスペクトロメーターで測定した。
【０１４３】
その結果、ＴＢＰユーロピウムクリプテートの発光は、過酸化水素の添加により３０％増加された（図８参照）。
【０１４４】
実施例６：テルビウムキレートについての実験
目的：
血清試料中のテルビウムキレートの蛍光を消光するポリクローナル抗体を検証する。
【０１４５】
モデル系：
実施例２に記載のように、試験動物（ｂａｌｃ／ｃマウス）を、テルビウムキレート／ＯＶＡ結合体で免疫化した。同様に、実施例２と同じクリプテートを用いた。ただし、この実施例では、Ｌｎがテルビウム［ＴｂＬ］を表す点が異なる。
【０１４６】
テルビウムキレート／タンパク質結合体の調製
テルビウムキレート［ＴｂＬ］はＮＨＳ−エステルの形態で存在した。キャリアタンパク質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）およびＯＶＡへのカップリングを、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で、室温にて一晩行った。
【０１４７】
カップリング後、結合体をＰＢＳで透析し、前精製またはキャラクタリゼーションなしで試験に用いた。
【０１４８】
［ＴｂＬ］−ＯＶＡを用いた試験動物の免疫化および血清抽出
２ｂａｌｂ／ｃマウスを実施例２に記載のように免疫化した。
【０１４９】
［ＥｕＬ］−ＢＳＡ結合体の蛍光消光特性についての免疫血清の試験
測定試料を、７５μｌの希釈血清試料および７５μｌの［ＴｂＬ］−ＢＳＡ結合体（希釈率１：１００００、最終濃度）で構成した。測定試料のすべての成分をＰＢＳ−ＮＫＳ（ＰＢＳ中に５％のウシ血清）中に希釈した。
【０１５０】
１時間後、クリプター（Kryptor）（Cezanne社）で蛍光を測定した。テルビウムキレートの蛍光を５４５ｎｍで測定した。
【０１５１】
結果：
両血清、ＴＷ９０７−１（免疫化９０７−１由来の血清）およびＴＷ９０７−２（免疫化９０７−２由来の血清）は、所望の蛍光消光効果を示していた。すなわち、（クリプテートに類似して）テルビウムキレートの蛍光を消光する抗体が血清中に存在していた（図９参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】血清抗体によるＴＢＰユーロピウムクリプテートの結合を示すグラフである。
【図２】抗ユーロピウムクリプテート抗血清によるユーロピウムクリプテート蛍光の消光を示すグラフである。
【図３】フルオレセイン結合抗体によるＴＢＰユーロピウムクリプテート／フルオレセイン結合体の蛍光消光の阻害について、測定試料番号１〜４の測定値を示すグラフである。
【図４】［ＥｕＬ］−ＢＳＡ結合体の蛍光消光効果についての免疫血清の試験結果を示すグラフである。
【図５】抗ＰＯＤ血清によるＧ２４−ＢＡ９のＥｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへのその結合からの置換を示すグラフである。
【図６】Ｂ９２−ＦＧ９およびＥ１７−ＤＡ３によるＧ２４−ＢＡ９のＥｕ（ＮＨ２）−ＰＯＤへの結合からの置換を示すグラフである。
【図７】Ｅｕ−ＮＨ２ビオチン系におけるビオチン希釈系の蛍光変化を示すグラフである。
【図８】過酸化水素によるＴＢＰユーロピウムクリプテートの蛍光の増加を示すグラフである。
【図９】［ＴｂＬ］−ＢＳＡ結合体の蛍光消光特性についての免疫血清の試験結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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