(57)【要約】  本発明は、新しく同定されたペンタミン系界面活性剤化合物、かかる化合物の使用およびそれらの製造に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にするためのペンタミン系化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008520610.tif 000043
［式中、
ｍは、１〜６であり；
ｑは、１〜６であり；
ｎは、１〜１０であり；
ｐは、１〜１０であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同一であっても異なっていてもよく、各々、水素、Ｒw、または(Ａａ)xから選択され；
ここで、Ｒwは、アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸であり、ここで、分子中に少なくとも２個のＲw基が存在し；
(Ａａ)xは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、直鎖または分枝状に結合した一連のｘ個の天然または非天然アミノ酸であり；
ｘは、０〜６である］
で示される一般構造を有する化合物、またはその塩、好ましくは、医薬上許容される塩。
【請求項２】
ｍが２または３である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｑが２または３である、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
ｎが３〜６である、請求項１〜３いずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
ｐが３〜６である、請求項１〜４いずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
(Ａａ)が塩基性アミノ酸である、請求項１〜５いずれか１項記載の化合物。
【請求項７】
(Ａａ)が[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]Ｎ(ＣＨ2)ＣＯ2Ｈ、(Ｈ2ＮＣＨ2)2ＣＨＣＯ2Ｈ、またはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＤａｂまたはＤａｐのＬまたはＤエナンチオマーから選択される、請求項１〜５いずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
ｘが１である、請求項１〜６いずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1およびＲ5が共にＲwであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が(Ａａ)xである：
【化２】
2008520610.tif 000044
［Ｒ1およびＲ5は、独立して、Ｒwであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、(Ａａ)xである］、請求項１〜８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ2およびＲ4がＲwであり、Ｒ3が水素であり、Ｒ1およびＲ5が(Ａａ)xである：
【化３】
2008520610.tif 000045
［Ｒ2およびＲ4は、独立して、Ｒwであり、Ｒ1およびＲ5は、独立して、(Ａａ)xである］、請求項１〜８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ2およびＲ4がＲwであり、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5が全て水素または全て(Ａａ)xである：
【化４】
2008520610.tif 000046
または
【化５】
2008520610.tif 000047
［Ｒ2およびＲ4は、独立して、Ｒwであり、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5は、全てＨまたは全て独立して(Ａａ)xである］、請求項１〜８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＲwであり；Ｒ1およびＲ5が共に水素または共に(Ａａ)xである：
【化６】
2008520610.tif 000048
または
【化７】
2008520610.tif 000049
［Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｒwであり、Ｒ1およびＲ5は、共に水素または共に独立して(Ａａ)xである］、請求項１〜８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１３】
アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸Ｒwが炭素原子１２個またはそれ以上を有する、請求項１〜８いずれか１項記載の化合物。
【請求項１４】
アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸Ｒwが
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)10ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)12ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)14ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)16ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)18ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)20ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3天然混合物、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3シス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3トランス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7(ＣＨ＝ＣＨＣＨ2)3ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)3ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ)3(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)[ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)]3ＣＨ3、または
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)22ＣＨ3
から選択される、請求項１〜１１いずれか１項記載の化合物。
【請求項１５】
式：
【化８】
2008520610.tif 000050
で示される化合物。
【請求項１６】
式：
【化９】
2008520610.tif 000051
で示される化合物。
【請求項１７】
インビボまたはインビトロでのＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのアナログの真核細胞または原核細胞へのトランスフェクションを可能にすることにおける請求項１〜１６いずれか１項で定義した化合物の使用。
【請求項１８】
請求項１７記載のペンタミン界面活性剤化合物の使用であって、該化合物が、
（ｉ）中性担体；または
（ｉｉ）錯化剤
からなる群から選択される１つまたはそれ以上の補充物と合わせて用いられる、使用。
【請求項１９】
中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
錯化剤がＰＬＵＳ剤である、請求項１８記載の使用。
【請求項２１】
錯化剤が主に塩基性アミノ酸を含むペプチドである、請求項１８記載の使用。
【請求項２２】
ペプチドが塩基性アミノ酸からなる、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項２１記載の使用。
【請求項２５】
遺伝子治療のためにインビボでポリヌクレオチドを細胞へトランスフェクトする方法であって、請求項１〜１６いずれか１項記載の化合物を遺伝子治療ベクターと一緒にまたは遺伝子治療ベクターとは別に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
抗感染症治療のためのポリヌクレオチドまたは抗感染症化合物の原核生物または真核生物への移入を容易にするための請求項１〜１６いずれか１項記載の使用。
【請求項２７】
培養細胞のお互いの接着または固体もしくは半固体表面への接着を容易にするための請求項１〜１６いずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２８】
１個またはそれ以上の活性化アミノ酸および／または１個またはそれ以上の活性化Ｒw基と保護されていてもよいペンタミン分子とのカップリングを含んでおり、必要に応じて該カップリングの後に脱保護工程を含んでいてもよい、請求項１〜１６いずれか１項記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しく同定されたペンタミン系界面活性剤化合物、かかる化合物の使用、およびそれらの製造法に関する。本発明はまた、ポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にするための、および薬物送達のための治療的に活性な化合物の細胞への移入を容易にするための、該ペンタミン系化合物の使用に関する。本発明の化合物の特性に関連する特性を有する化合物は、しばしば、ジェミニ界面活性剤と称される。
【背景技術】
【０００２】
界面活性剤は、低濃度であっても、液体の表面特性に著しい影響を及ぼす物質である。例えば、界面活性剤は、水または水性溶液に溶解した場合には表面張力を有意に減少させるであろうし、２つの液体間、または液体と固体との間の界面張力を減少させるであろう。界面活性剤分子のこの特性は、工業的に、特に、洗剤および石油工業において、幅広く活用されてきた。１９７０年代には、疎水性橋によって結合される極性頭部を有する２本の疎水性鎖を特徴とする新しい種類の界面活性剤分子が報告された（Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974（非特許文献１））。「ジェミニ」と称されているこれらの分子（Menger, FM and Littau, CA, J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991（非特許文献２））は、それらの単量体等価物よりも非常に望ましい特性を有する。例えば、それらは、油性液体と水性液体との間の界面張力を低下させるのに非常に効果的であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する（Menger, FM and Keiper, JS, Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906（非特許文献３））。
【０００３】
カチオン性界面活性剤は、とりわけ、ポリヌクレオチドの培養細胞へのトランスフェクションのために使用されており、遺伝子技術に関与する科学者が商業的に入手可能なこのような作用物質の例がある（例えば、アメリカ合衆国ウィスコンシン州のPromega Corp.から入手可能な真核細胞のトランスフェクションのための試薬ＴｆｘTM−５０）。
【０００４】
遺伝子治療またはアンチセンス治療のいずれかのためのインビボでのＤＮＡの細胞への効果的な送達は、数年間、主要な目標であった。送達ビヒクルとしてのウイルスの使用、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）の矯正的遺伝子治療を目的とした気道における上皮細胞のためのアデノウイルスの使用に多くの注目が集まった。しかしながら、ＣＦ患者におけるいくつかの成功した遺伝子移入の証拠があるにもかかわらず、アデノウイルス経路は、炎症性副作用および移入された遺伝子の限られた一過性発現のため問題をかかえたままである。カチオン性界面活性剤を使用する研究を含むインビボ遺伝子送達のためのいくつかの代替法が研究された。Gao, X  et al. Gene Ther. 2, 710-722,1995（非特許文献４）は、アミン担持カチオン性脂質を用いて、ＣＦマウスの呼吸上皮へのＣＦ膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の正常なヒト遺伝子を用いるこの方法の実行可能性を立証した。このグループは、引き続いてリポソームＣＦ遺伝子治療試験を行い、一部が成功しただけであったが、ヒトにおけるこの方法の可能性を立証した（Caplen, NJ. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995（非特許文献５））。最近では、別のグループが遺伝子送達のための別のカチオン性脂質、例えば、コレステロール誘導体（Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997（非特許文献７））の可能性を研究した（Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998（非特許文献６））。この限られた研究によって、インビトロおよびインビボの両方で遺伝子の上皮細胞への移入を容易にするこれらコレステロール系化合物の能力が立証され、それにより、この一般的方法の有効性が支持された。
【０００５】
最近、遺伝子トランスフェクションのための非ウイルス（カチオン性脂質）ベクターの使用が論評された。D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer, Curr. Med. Chem., 2003, 10, 1233（非特許文献８）を参照。
【０００６】
これらの研究および他の研究は、この新しい研究分野において、細胞ベースの実験におけるトランスフェクションのためにインビトロで、および遺伝子治療およびアンチセンス治療のためにインビボで、ポリヌクレオチドの細胞への有効な移入を容易にするための新規低毒性界面活性剤分子の開発が依然として必要とされていることを示している。以前、システイン（ＷＯ ９９／２９７１２（特許文献１））またはスペルミン（ＷＯ ００／７７０３２（特許文献２））またはジアミン（ＷＯ ００／７６９５４（特許文献３））をベースとするジェミニ界面活性剤が調製された。ＷＯ ００／２７７９５（特許文献４）、ＷＯ ０２／３０９５７（特許文献５）、ＷＯ ０２／５０１００（特許文献６）およびＷＯ ０３／８２８０９（特許文献７）には別のジェミニ界面活性剤の例が記載されている。最近、ポリヌクレオチドベクターとしてのジェミニ界面活性剤の使用が論評された（A. J. Kirby, P. Camilleri, J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garcia Rodriguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448（非特許文献９）、R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004（非特許文献１０）もまた参照）。
【０００７】
最近開発された技術は、遺伝子機能を一時的に抑制するための合成低分子干渉（ｓｉ）二本鎖ＲＮＡ分子の使用を含む。もともとC.elegans（A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358（非特許文献１１））の研究からつくられたこのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技術は、後に開発されて、その用途を哺乳動物細胞に適用することができるようになった（S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494（非特許文献１２））。これらのｓｉＲＮＡエフェクター分子を細胞集団の大部分の正しい位置に送達する能力がこの技術の有効な利用において重要な工程である。いったん正しく配置されると、ＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖が標的メッセンジャー（ｍ）ＲＮＡ（目的の標的をコードする）の相補的な領域と結合し、ｍＲＮＡの加水分解およびそれに続く分解を引き起こす。このｍＲＮＡの一過性の減少は、標的遺伝子発現の一過性の減少を引き起こす。標的遺伝子発現を、該標的の機能を解明することができるようなレベルに減少させるために、非常に効果的な送達および正しい局在化が必要とされる。
【特許文献１】ＷＯ ９９／２９７１２
【特許文献２】ＷＯ ００／７７０３２
【特許文献３】ＷＯ ００／７６９５４
【特許文献４】ＷＯ ００／２７７９５
【特許文献５】ＷＯ ０２／３０９５７
【特許文献６】ＷＯ ０２／５０１００
【特許文献７】ＷＯ ０３／８２８０９
【非特許文献１】Deinega, Y et al., Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974
【非特許文献２】Menger, FM and Littau, CA, J.Am.Chem.Soc. 113, 1451, 1991
【非特許文献３】Menger, FM and Keiper, JS, Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906
【非特許文献４】Gao, X  et al. Gene Ther. 2, 710-722,1995
【非特許文献５】Caplen, NJ. et al., Nature Medicine, 1, 39-46, 1995
【非特許文献６】Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998
【非特許文献７】Oudrhiri, N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997
【非特許文献８】D. Niculescu-Duvaz, J. Heyes and C. J. Springer, Curr. Med. Chem., 2003, 10, 1233
【非特許文献９】A. J. Kirby, P. Camilleri, J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soederman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garcia Rodriguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448
【非特許文献１０】R. Zana and J. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004
【非特許文献１１】C.elegans (A. Fire, Trends Genet., 1999, 15(9), 358）
【非特許文献１２】S. M. Elbashir, J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, T. Tuschl, Nature, 2001, 411, 494
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、既存の化合物によって示される問題を克服することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2008520610.tif 000002
［式中、
ｍは、１〜６であり；
ｑは、１〜６であり；
ｎは、１〜１０であり；
ｐは、１〜１０であり；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、同一であっても異なっていてもよく、各々、水素、Ｒw、または(Ａａ)xから選択され；
ここで、Ｒwは、アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸であり、ここで、分子中に少なくとも２個のＲw基が存在し；
(Ａａ)xは、各場合において同一であっても異なっていてもよく、直鎖または分枝状に結合した一連のｘ個の天然または非天然アミノ酸であり；
ｘは、０〜６である］
で示される一般構造を有する化合物、またはその塩、好ましくは、医薬上許容される塩に関する。
【００１０】
好ましくは、ｍは、２または３であり、最も好ましくは３である。
【００１１】
好ましくは、ｑは、２または３であり、最も好ましくは３である。
【００１２】
好ましくは、ｎは、３〜６であり、最も好ましくは４である。
【００１３】
好ましくは、ｐは、３〜６であり、最も好ましくは３である。
【００１４】
(Ａａ)は、好ましくは、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸の例としては、[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]2Ｎ(ＣＨ2)ＣＯ2Ｈ、(Ｈ2ＮＣＨ2)2ＣＨＣＯ2Ｈ、またはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ（ジアミノ酪酸）またはＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）のＬまたはＤエナンチオマーが挙げられる。例えば、アミノ酸（Ａａ）は、側鎖にアミノ基（またはＯＨ基であってもよい）を含んでおり、合計１２個以下の炭素原子、例えば、合計１０個以下の炭素原子を含んでいるアミノ酸であり得る。
【００１５】
ｘは、好ましくは、１〜４である。最も好ましくは、ｘは１である。
【００１６】
一の実施態様ａ）では、Ｒ1およびＲ5は、共にＲwであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は全て(Ａａ)xである：
【化２】
2008520610.tif 000003
［Ｒ1およびＲ5は、独立して、上記定義のＲwであり、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、独立して、上記定義の(Ａａ)xである］。かかる実施態様では、Ｒ1およびＲ5は、例えば、同一のＲwであってよく、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、例えば、同一の(Ａａ)xであってよい。
【００１７】
別の実施態様ｂ）では、Ｒ2およびＲ4はＲwであり、Ｒ3は水素であり、Ｒ1およびＲ5は(Ａａ)xである：
【化３】
2008520610.tif 000004
［Ｒ2およびＲ4は、独立して、上記定義のＲwであり、Ｒ1およびＲ5は、独立して、上記定義の(Ａａ)xである］。かかる実施態様では、Ｒ2およびＲ4は、例えば、同一のＲwであってよく、Ｒ1およびＲ5は、例えば、同一の(Ａａ)xであってよい。
【００１８】
別の実施態様ｃ）では、Ｒ2およびＲ4はＲwであり、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5はすべて水素またはすべて(Ａａ)xである：
【化４】
2008520610.tif 000005
または
【化５】
2008520610.tif 000006
［Ｒ2およびＲ4は、独立して、上記定義のＲwであり、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5は、すべてＨまたはすべて独立して上記定義の(Ａａ)xである］。かかる実施態様では、Ｒ2およびＲ4は、例えば、同一のＲwであってよい。Ｒ1、Ｒ3およびＲ5は、例えば、同一の(Ａａ)であってよい。
【００１９】
別の実施態様ｄ）では、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はＲwであり；Ｒ1およびＲ5は共に水素または共に(Ａａ)xである：
【化６】
2008520610.tif 000007
または
【化７】
2008520610.tif 000008
［Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はＲwであり、Ｒ1およびＲ5は共に水素または共に上記定義の(Ａａ)xである］。かかる実施態様では、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、例えば、同一のＲwであってよく、Ｒ1およびＲ5は、例えば、同一の(Ａａ)xであってよい。
【００２０】
さらに好ましい実施態様では、アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸Ｒwは、炭素原子１０個またはそれ以上、例えば、炭素原子１２個またはそれ以上、例えば、１４個またはそれ以上、例えば、１６個またはそれ以上有する。さらに好ましい実施態様では、アミド誘導体として結合した、炭素原子２４個までの飽和または不飽和の分枝状または非分枝状脂肪族カルボン酸Ｒwは
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)10ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)12ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)14ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)16ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)18ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)20ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3天然混合物、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3シス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)5ＣＨ3トランス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランス、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7(ＣＨ＝ＣＨＣＨ2)3ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)3ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ)3(ＣＨ2)4ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)7ＣＨＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3、
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)[ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)]3ＣＨ3、または
−Ｃ(Ｏ)(ＣＨ2)22ＣＨ3
から選択される。
【００２１】
最も好ましくは、該基は、−ＣＯ(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3天然混合物、−ＣＯ(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3シスおよび−ＣＯ(ＣＨ2)7ＣＨ＝ＣＨ(ＣＨ2)7ＣＨ3トランスから選択される。
【００２２】
一の実施態様では、本発明の化合物は、いわゆる「ジェミニ」界面活性剤化合物である。言い換えると、該化合物は、少なくとも２本の脂肪族鎖について対称的である。
【００２３】
本発明の化合物は、当業者に周知の合成化学を使用して容易に入手可能な出発物質から調製され得る。図１に示されるスキームは、本発明の化合物の合成のための中間体５の一般的な合成スキームを示している。
【００２４】
図２の一般的なスキームに示されるように、中間体５を保護し、還元して、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の位置が保護されており、Ｒ1およびＲ5の位置が遊離ＮＨ2基である進行したペンタミン中間体７を得ることができる。Ｒ1およびＲ5の位置のアミノ基の、Ｒw基を付加するさらなる反応、ならびにＲ2、Ｒ3およびＲ4の位置の脱保護、次いで、適当な条件下での(Ａａ)x基の付加により、本発明の実施態様ａ）による置換パターンを有する分子を調製することができる。
【００２５】
図４の一般的なスキームに示されるように、中間体５を還元して、Ｒ3の位置だけが保護されており、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5の位置が遊離アミノ基である他の進行したペンタミン中間体１２を得ることができる。次の、Ｒ1およびＲ5の位置の第一級アミノ基の保護、Ｒ2およびＲ4の位置でのＲw基の付加、次いで、Ｒ1およびＲ5での脱保護および適当な条件下での(Ａａ)x基の付加、ならびに最後の、Ｒ3の位置での脱保護により、本発明の実施態様ｂ）による置換パターンを有する分子を調製することができる。Ｒ1およびＲ5の位置の(Ａａ)x基の付加を省略するならば、類似の方法で本発明の実施態様ｃ）による置換パターンを有する分子を調製することができる。Ｒ5の位置での脱保護を(Ａａ)x基の付加の前に生じさせるならば、類似の方法で本発明の実施態様ｃ）の２番目の選択肢による置換パターンを有する分子を調製することができる。
【００２６】
図５の一般的なスキームに示されるように、中間体１２から調製され得る、Ｒ1、Ｒ3およびＲ5の位置で保護されている進んだ中間体１３をＲ3の位置で脱保護し、その後、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の各位置へのＲw基の付加により官能化することができる。次の、Ｒ1およびＲ5の位置のアミノ基の脱保護および適当な条件下での(Ａａ)x基の付加、ならびに最後の脱保護により、本発明の実施態様ｄ）による置換パターンを有する分子を調製することができる。Ｒ1およびＲ5の位置での(Ａａ)x基の付加を省略するならば、類似の方法でＲ1およびＲ5の位置に第一級アミノ基を有する本発明の実施態様ｄ）の選択肢による置換パターンを有する分子を調製することができる。
【００２７】
様々な代替の保護および脱保護ストラテジーが当業者には周知であり、特定の望ましい最終置換パターンのために適当なストラテジーを考えることができる。非対称的な置換パターンについては、生成物または中間体の物理的分離が必要となる場合がある。適当な分離方法、例えば、クロマトグラフィー法が当業者に周知である。
【００２８】
本発明の分子の塩は、例えば図６および７におけるスキームに示されるように、標準的な技術により調製することができる。図６に示されるスキームでは、塩形成工程は脱保護工程でもある。
【００２９】
本発明の別の態様は、ペンタミン系化合物を使用するための方法に関する。かかる使用は、全生物におけるアンチセンス、遺伝子治療および遺伝子免疫化（抗体の発生に関する）のためのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの細胞への移入を容易にすることを含む。他の使用は、例えば特に遺伝子発現研究およびアンチセンス制御実験において、かかる移入が必要とされる場合にポリヌクレオチドの培養細胞へのトランスフェクションを容易にするために本発明の化合物を用いることを含む。かかるポリヌクレオチドおよびアンチセンス分子の調製のためのプロトコールは当該技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、Cohen, JS ed. Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1989)）。ポリヌクレオチドを該化合物と混合し、細胞に加え、インキュベートしてポリヌクレオチド取り込みを可能にすることができる。さらなるインキュベーションの後、トランスフェクトＤＮＡにより与えられる表現型形質について該細胞をアッセイすることができるか、または、ノーザンブロッティングにより、またはＰＣＲに基づく定量化方法（例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法（アメリカ合衆国コネティカット州のPerkin Elmer））を使用することにより、該ＤＮＡから発現されるｍＲＮＡのレベルを測定することができる。本発明の化合物は、従来技術における化合物と比べて、培養細胞におけるＤＮＡの細胞取り込み効率において有意な（典型的には３〜６倍の）向上をもたらす。トランスフェクションプロトコールでは、該ペンタミン界面活性剤化合物は、トランスフェクションの効率を向上させるために１種類またはそれ以上の補充物と合わせて使用することができる。かかる補充物は、例えば、
（ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood, H., et al (1985) Biochim. Biophys. Acta, 1235-1289）；
（ｉｉ）錯化剤、例えば、商業的に入手可能なＰＬＵＳ剤（アメリカ合衆国メリーランド州のLife Technologies Inc.）、またはポリリジンもしくはポリオルニチンペプチドのようなペプチド、または排他的ではないが主にリジン、オルニチンおよび／またはアルギニンのような塩基性アミノ酸を含むペプチド（例えば、Henner, WD et al (1973) J. Virol. 12(4) pp741-747）
から選択され得る。上記リストは網羅していることを意図するものではなく、トランスフェクションの効率を向上させる他の補充物は本発明の範囲内となる。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の化合物を使用する遺伝子治療における遺伝物質の移入に関する。例えば、当業者は、当該技術分野で周知のプロトコールを使用して、本発明のペンタミン界面活性剤化合物の使用を含む遺伝子治療用の遺伝子送達方法を開発することができる。例えば、遺伝子移入ベクターの肺への送達のための界面活性剤の使用は、Weiss, DJ (2002) Molecular Therapy 6(2) pp148 to 152において論評されている。
【００３１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の化合物を使用してインビトロおよびインビボで非ヌクレオチド系薬剤化合物の細胞への送達をもたらす方法に関する。
【００３２】
以下の定義は、本明細書にてしばしば使用される用語の理解を容易にするためのものである。
【００３３】
「アミノ酸」とは、+Ｈ3ＮＣＨ(Ｒ)ＣＯ2-の形の双極子イオン（双性イオン）をいう。それらは、基Ｒの性質によって区別され、Ｒが水素と違う場合にはＤ系列およびＬ系列を形成する不斉性であり得る。Ｒ基が例えば非極性である場合（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）または極性である場合（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）の２０種類の天然アミノ酸がある。非天然アミノ酸の場合、Ｒは、自然界に見られるアミノ酸では見られない他の基であり得る。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」とは、一般に、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであっても修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」としては、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るかまたは一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。加えて、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドなる用語としてはまた、１個またはそれ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡのものまたはＲＮＡのもの、および安定性のためまたは別の理由のために修飾された骨格をもつＤＮＡのものまたはＲＮＡのものが挙げられる。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような珍しい塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して様々な修飾が行われてきた；かくして、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性をもつ化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【００３５】
「トランスフェクション」とは、化学的手段または物理的手段のいずれかによる細胞膜の修飾を含む方法を使用するポリヌクレオチドの培養細胞への導入をいう。かかる方法は、例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。該ポリヌクレオチドは、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖であってよく、ポリヌクレオチドの複製、またはポリヌクレオチドの一部を含んでいてもよい相同的もしくは非相同的遺伝子の発現を制御するエレメントを含むことができる。
【００３６】
医薬上許容される酸付加塩は、所望により有機溶媒のような適当な溶媒中にて、式（Ｉ）で示される化合物を適当な無機酸または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、コハク酸、マレイン酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸（例えば、２−ナフタレンスルホン酸）、またはヘキサン酸）と反応させて、例えば結晶化および濾過により通常単離される塩を得ることにより形成することができる。式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される酸付加塩は、例えば、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩（例えば、２−ナフタレンスルホン酸塩）またはヘキサン酸塩を含み得るかまたはこの塩である。
【００３７】
本発明は、水和物および溶媒和物を含む式（Ｉ）で示される化合物の塩の可能な全ての化学量論的形態および非化学量論的形態をその範囲内に包含する。
【００３８】
式（Ｉ）で示される化合物には、立体異性体形態で存在することができるものがある。本発明は、これらの化合物の全ての幾何異性体および光学異性体、ならびにラセミ化合物を包含するその混合物を包含することが理解されるであろう。互変異性体もまた本発明の態様をなす。
【００３９】
ここで、以下の実施例によって本発明を説明する。該実施例は、如何なる場合も本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例】
【００４０】
記載１：  Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩（２；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化８】
2008520610.tif 000009
スペルミジン１（ｍ＝３、ｎ＝４；８.０ｇ、５５.０ｍｍｏｌ）のＣＨ3ＣＮ（１５０ｍＬ）および水（２.０ｍＬ）中溶液にトリフルオロ酢酸エチル（３３.０ｍＬ、２７５ｍｍｏｌ）を添加し、該混合物を還流させながら３時間加熱した。室温に冷却した後、溶媒を真空蒸発させた。残留固体をＣＨ2Ｃｌ2（２×１５０ｍＬ）と一緒にトリチュレートして、白色固体としてトリフルオロ酢酸塩２を得た（２１.０ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１.１０分（ｍ／ｚ＝３３８.１ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００４１】
記載２：  Ｎ4−(tert−ブトキシカルボニル)−Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン（３；ｍ＝３、ｎ＝４)。
【化９】
2008520610.tif 000010
窒素雰囲気下、ジ炭酸ジ−tert−ブチル（１１.３ｇ、５１.３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７５.０ｍＬ、５４.０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２５ｍＬ）中溶液をＮ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)スペルミジン・トリフルオロ酢酸塩２（２１.０ｇ、４６.７ｍｍｏｌ）に添加した。室温で１８時間後、溶媒を真空蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）を添加した。該溶液を５％ＮａＨＣＯ3水溶液（２×１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、白色固体としてＢｏｃカルバメート３を得た（２０.０ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝４.０９分（ｍ／ｚ＝４３８.３ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００４２】
記載３：  Ｎ4−(tert−ブトキシカルボニル)−スペルミジン（４；ｍ＝３、ｎ＝４)。
【化１０】
2008520610.tif 000011
１０℃で水酸化ナトリウム水溶液（１００ｍＬ×０.５Ｎ）をＮ4−(tert−ブトキシカルボニル)−Ｎ1,Ｎ8−ビス(トリフルオロアセチル)−スペルミジン３（２０.０ｇ、４５.７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５００ｍＬ）中撹拌溶液に添加した。冷却浴を外し、該混合物を１８時間撹拌した後、ＭｅＯＨを真空蒸発させた。得られた水性懸濁液をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ［９：１］（５×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、無色油状物としてＢｏｃカルバメート４（１０.０ｇ）を得た。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝２.１５分（ｍ／ｚ＝２４６.２ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００４３】
記載４：  [４−(２−シアノ−エチルアミノ)−ブチル]−[３−(２−シアノ−エチルアミノ)−プロピル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（５；ｍ＝３、ｎ＝４)。
【化１１】
2008520610.tif 000012
０℃に維持したＢｏｃカルバメート４（４.０ｇ、１６.３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中撹拌溶液にアクリロニトリル（２.１５ｍＬ、３２.６ｍｍｏｌ）を２時間にわたってゆっくりと添加した。得られた混合物をさらに１８時間室温に維持し、次いで、真空濃縮した。得られた残留物をＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ［１０：９０］で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、無色の粘稠性油状物としてビス−ニトリル５を得た（５.００ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝２.１５分（ｍ／ｚ＝３５２.１ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００４４】
記載５：  ｛４−[tert−ブトキシカルボニル−(２−シアノ−エチル)−アミノ]−ブチル｝−｛３−[tert−ブトキシカルボニル−(２−シアノ−エチル)−アミノ]−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（６；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化１２】
2008520610.tif 000013
窒素雰囲気下、ビス−ニトリル５（２.５ｇ、７.１１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１５ｍＬ）の混合液中溶液にジ炭酸ジ−tert−ブチル（３.４０ｇ、１５.６４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）中溶液を添加した。室温で１８時間後、溶媒を真空蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加した。有機溶液を５％ＮａＨＣＯ3水溶液（２×５０ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、薄黄色の液体としてトリス−Ｂｏｃカルバメート６を得た（３.９ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH １.４５（ｍ，３１Ｈ）、１.７５（ｍ，２Ｈ）、２.６０（ｍ，４Ｈ）、３.１６（ｍ，４Ｈ）、３.２６（ｍ，４Ｈ）、３.４５（ｍ，４Ｈ）。
【００４５】
記載６：  ｛４−[(３−アミノ−プロピル)−tert−ブトキシカルボニル−アミノ]−ブチル｝−｛３−[(３−アミノ−プロピル)−tert−ブトキシカルボニル−アミノ]−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（７；ｍ＝３、ｎ＝４）。 
【化１３】
2008520610.tif 000014
トリス−Ｂｏｃニトリル６（３.９０ｇ、７.０６ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（０.４５ｇ、１１.２ｍｍｏｌ）およびラネーニッケル（２.１ｇ）の９５％エチルアルコール（３０ｍＬ）中混合物を水素雰囲気下（１気圧）にて室温で１８時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を１０ｍＬに真空濃縮し、４０％ＮａＯＨ水溶液（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で処理した。分取した油状物をＣＨＣｌ3（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して、薄黄色の油状物としてジアミン７を得た（３.９０ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δH １.４５（ｂｒｓ，３１Ｈ）、１.６３（ｍ，４Ｈ）、１.７３（ｍ，２Ｈ）、２.６７（ｍ，４Ｈ）、３.２０（ｍ，１２Ｈ）。
【００４６】
記載７：  オクタデカ−９−エン酸(３−アミノ−プロピル)−(４−｛３−[(３−アミノ−プロピル)−オクタデカ−９−エノイル−アミノ]−プロピルアミノ｝−ブチル)−アミド・三トリフルオロ酢酸塩（９；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）。
【化１４】
2008520610.tif 000015
オレイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２.７８ｇ、７.３２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）中溶液および炭酸カリウム（１.０８ｇ、７.８６ｍｍｏｌ）の水（１０ｍＬ）中溶液を７（６３２ｍｇ、２.５８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物を酢酸エチル（３００ｍＬ）に溶解し、水（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、次いで、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して、無色の粘稠性油状物としてトリス−Ｂｏｃカルバメート８を得た。油状物をＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）で処理した。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、真空濃縮し、残留物をジエチルエーテル（２００ｍＬ）と一緒に共蒸発させて、白色固体として三トリフルオロ酢酸塩９を得た（３.７２ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.９４分（ｍ／ｚ＝７８８.７ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００４７】
記載８：  Ｎ1,Ｎ8−ジオレイル−Ｎ4−トリス−(Ａａ)x−ペンタミン・塩酸塩（１１；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４)の一般的な製造方法
【化１５】
2008520610.tif 000016
トリス−アミン９（３００ｍｇ、０.２７ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中溶液に、Ｎ末端保護アミノ酸（(ＰＧ)y(Ａａ)x：３.５モル当量）、ＴＢＴＵ（２９８ｍｇ、０.９３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１２５ｍｇ、０.９３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０.２０ｇ、１.５９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後、該反応混合物を真空濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解した。有機溶液を水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して油状物を得、これを、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2［５：９５］で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、油状物として中間体Ｂｏｃカルバメート１０を得た。カルバメート１０をジエチルエーテル（２ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌのジオキサン中溶液（４Ｍ、４ｍＬ）で処理した。室温で１８時間撹拌した後、得られた白色沈殿物を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末としてペンタミン・塩酸塩１１を得た（１１〜７７％）。
【００４８】
実施例１：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｌｙｓ
【化１６】
2008520610.tif 000017
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.９７分（ｍ／ｚ＝１１７３.１ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ67Ｈ134Ｎ11Ｏ5）１１７３.０５６９、測定値１１７３.０５４２ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００４９】
実施例２：  (Ａａ)x＝Ｄ−Ｌｙｓ
【化１７】
2008520610.tif 000018
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.９３分（ｍ／ｚ＝１１７３.１ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ67Ｈ134Ｎ11Ｏ5）１１７３.０５６９、測定値１１７３.０５４０ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００５０】
実施例３：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｏｒｎ
【化１８】
2008520610.tif 000019
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.１２分（ｍ／ｚ＝１１３１.０ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ64Ｈ128Ｎ11Ｏ5）１１３１.０１００、測定値１１３１.００８７ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００５１】
実施例４：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｓｅｒ
【化１９】
2008520610.tif 000020
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.９４分（ｍ／ｚ＝１０４９.９ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ58Ｈ113Ｎ8Ｏ8）１０４９.８６８１、測定値１０４９.８６６２ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００５２】
記載９：  [４−(３−アミノ−プロピルアミノ)−ブチル]−[３−(３−アミノ−プロピルアミノ)−プロピル]−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１２；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化２０】
2008520610.tif 000021
ビス−ニトリル５（３.１０ｇ、８.８１ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（０.３ｇ、７.５ｍｍｏｌ）およびラネーニッケル（１.５ｇ）の９５％エチルアルコール（３０ｍＬ）中混合物を水素雰囲気下（１気圧）で室温にて１８時間撹拌した。触媒を濾去し、濾液を１０ｍＬに真空濃縮し、４０％ＮａＯＨ水溶液（２０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で処理した。油状物を分取し、これをＣＨＣｌ3（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して、薄黄色の油状物としてアミン１２を得た（２.９０ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）：δH １.４２−１.６１（ｍ，１３Ｈ）、１.６２−１.８０（ｍ，６Ｈ）、２.５２−２.７５（ｍ，１２Ｈ）、３.１８−３.３３（ｍ，４Ｈ）。
【００５３】
記載１０：  ｛４−[３−(２,２,２−トリフルオロ−アセチルアミノ)−プロピルアミノ]−ブチル｝−｛３−[３−(２,２,２−トリフルオロ−アセチルアミノ)−プロピルアミノ]−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１３；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化２１】
2008520610.tif 000022
アミン１２（２.９８ｇ、８.２３ｍｍｏｌ）のＣＨ3ＣＮ（１００ｍＬ）中溶液にトリフルオロ酢酸エチル（５.８８ｍＬ、４９.３９ｍｍｏｌ）および水（２.０ｍＬ）を添加した。該反応混合物を還流させながら３時間加熱し、次いで、室温に冷却させ、溶媒を真空蒸発させた。残留固体をまずＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）と一緒にトリチュレートし、次いで、無水ジエチルエーテル（１００ｍＬ）と一緒にトリチュレートして、薄黄色固体として二トリフルオロ酢酸塩１３を得た（６.０ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δH １.３５（ｓ，９Ｈ）、１.４５（ｍ，４Ｈ）、１.７８（ｍ，６Ｈ）、２.８８（ｍ，８Ｈ）、３.０７−３.１９（ｍ，４Ｈ）、３.２５（ｍ，４Ｈ）、８.４８（ｂｒｓ，４Ｈ）、９.５０（ｍ，２Ｈ）。
【００５４】
記載１１：  ｛４−[(３−アミノ−プロピル)−オクタデカ−９−エノイル−アミノ]−ブチル｝−｛３−[(３−アミノ−プロピル)−オクタデカ−９−エノイル−アミノ]−プロピル｝−カルバミン酸tert−ブチルエステル（１５；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化２２】
2008520610.tif 000023
オレイン酸（１.６０ｇ、５.６６ｍｍｏｌ）およびジアミン１３（２.００ｇ、２.５７ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）およびＤＭＦ（１０ｍＬ）の混合液中溶液にＴＢＴＵ（１.８１ｇ、５.６６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０.７６ｇ、５.６６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１.９９ｇ、１５.４２ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後、該反応混合物を真空濃縮した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に再溶解し、５％ＫＨＳＯ4水溶液（２５ｍＬ）、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×２５ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄した。有機溶液を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮させてガム状物を得、これを、ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ3［３：９７］の混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、無色のガム状物として中間体トリフルオロ酢酸塩１４を得た。該ガム状物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に溶解し、水（２ｍＬ）およびＫ2ＣＯ3（１.１３ｇ、８.１２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解し、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×２５ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、無色のガム状物としてジアミン１５を得た（１.３０ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝４.５１分（ｍ／ｚ＝８８８.８ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００５５】
記載１２：  保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアミノ酸(ＰＧ)y(Ａａ)xＯＳｕｃの一般的な製造方法
【化２３】
2008520610.tif 000024
室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１.１当量）およびＮ末端保護アミノ酸（１当量）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中混合物にジシクロヘキシルカルボジイミド（１.０５当量）のＴＨＦ（１５ｍＬ）中溶液を撹拌しながら添加した。該混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、濾過して、沈殿した固体を除去した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）に再溶解し、さらに２回濾過した。最後に、溶媒を真空蒸発させて、白色粉末としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。
(Ａａ)x(ＰＧ)y＝Ｄ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)2。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.８８分（ｍ／ｚ＝３４５.１ [Ｍ−ＯＳｕｃ]+）。
(Ａａ)x(ＰＧ)y＝Ｌ−Ｏｒｎ(Ｂｏｃ)2。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.７９分（ｍ／ｚ＝３３１.１ [Ｍ−ＯＳｕｃ]+）。
(Ａａ)x(ＰＧ)y＝Ｌ−Ｓｅｒ(ＯtＢｕ)(Ｂｏｃ)。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.０２分（ｍ／ｚ＝２０４.１ [Ｍ−ＯＳｕｃ]+）。
(Ａａ)x(ＰＧ)y＝Ｌ−Ｓｅｒ(ＯtＢｕ)−Ｌ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)2。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.６１分（ｍ／ｚ＝４３３.１ [Ｍ−ＯＳｕｃ]+)。
(Ａａ)x(ＰＧ)y＝[ＢｏｃＨＮ(ＣＨ2)3]2ＮＣＨ2ＣＯ2Ｈ。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝３.１２分（ｍ／ｚ＝３８８.１ [Ｍ−ＯＳｕｃ]+）。
【００５６】
記載１３：  ビス−オレイルペンタミン・塩酸塩（１７；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）の一般的な製造方法
【化２４】
2008520610.tif 000025
室温にて、保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアミノ酸エステル(ＰＧ)y(Ａａ)xＯＳｕｃ（２.２当量）およびジアミン１５（１.０当量）のＴＨＦ（３０ｍＭ）中溶液をＫ2ＣＯ3の水中溶液（２.２当量、０.２Ｍ）で処理した。該混合物を１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＭ）で希釈し、半分の量の水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、溶媒を真空蒸発させてガム状物を得、これを、ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ3［１０：９０］の混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、ガム状物として中間体Ｂｏｃカルバメート１６を得た。該ガム状物を、窒素下にて室温で１８時間、ＨＣｌのジエチルエーテル中溶液（２Ｍ、５０ｍＭ）で処理した後、沈殿した固体を濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末としてビス−オレイルペンタミン・塩酸塩１７を得た（収率６６〜８８％）。
【００５７】
実施例５：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｌｙｓ
【化２５】
2008520610.tif 000026
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.１７分（ｍ／ｚ＝１０４４.９６ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ61Ｈ122Ｎ9Ｏ4）１０４４.９６０６、測定値１０４４.９６２６ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００５８】
実施例６：  (Ａａ)x＝Ｄ−Ｌｙｓ
【化２６】
2008520610.tif 000027
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.２４分（ｍ／ｚ＝１０４４.９６ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ61Ｈ122Ｎ9Ｏ4）１０４４.９６２０、測定値１０４４.９６３０ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００５９】
実施例７：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｏｒｎ
【化２７】
2008520610.tif 000028
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.２５分（ｍ／ｚ＝１０１６.９３ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ59Ｈ118Ｎ9Ｏ4）１０１６.９３０７、測定値１０１６.９３１３ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６０】
実施例８：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｓｅｒ
【化２８】
2008520610.tif 000029
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１１.７１分（ｍ／ｚ＝９６２.８３６４ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ55Ｈ108Ｎ7Ｏ6）９６２.８３６１、測定値９６２.８３６４ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６１】
実施例９：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｌｙｓ
【化２９】
2008520610.tif 000030
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１０.３９分（ｍ／ｚ＝１２１９.０３ [Ｍ＋Ｈ]+）、ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ67Ｈ132Ｎ11Ｏ8）１２１９.０２６０、測定値１２１９.０２５８ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６２】
実施例１０：  (Ａａ)x＝[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]2ＮＣＨ2ＣＯ2Ｈ
【化３０】
2008520610.tif 000031
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝９.９６分（ｍ／ｚ＝１１３１.０５ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ65Ｈ132Ｎ11Ｏ4）１１３１.０４６４、測定値１１３１.０４７０ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６３】
記載１４：  ２,２,２−トリフルオロ−Ｎ−[３−(４−｛３−[３−(２,２,２−トリフルオロ−アセチルアミノ)−プロピルアミノ]−プロピルアミノ｝−ブチルアミノ)−プロピル]−アセトアミド・三トリフルオロ酢酸塩（１８；ｍ＝３、ｎ＝４）
【化３１】
2008520610.tif 000032
室温で、Ｂｏｃカルバメート１３（４.００ｇ、５.１４ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中撹拌溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。１８時間後、該混合物を真空濃縮し、残留物を無水ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で処理した。得られた沈殿物を濾過により回収し、無水ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄して、白色粉末として三トリフルオロ酢酸塩１８を得た（４.００ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ）：δＨ １.７５（ｍ，４Ｈ）、１.９５（ｍ，４Ｈ）、２.１０（ｍ，２Ｈ）、３.０５（ｍ，８Ｈ）、３.１５（ｍ，４Ｈ）、３.３８（ｍ，４Ｈ）。
【００６４】
記載１５：  オクタデカ−９−エン酸｛４−[(３−アミノ−プロピル)−オクタデカ−９−エノイル−アミノ]−ブチル｝−｛３−[(３−アミノ−プロピル)−オクタデカ−９−エノイル−アミノ]−プロピル｝−アミド（２０；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）
【化３２】
2008520610.tif 000033
オレイン酸（３.００ｇ、１０.６ｍｍｏｌ）、１８（２.５０ｇ、３.２１ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中溶液にＴＢＴＵ（４.１２ｇ、１２.８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１.７３ｇ、１２.８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（４.１５ｇ、３２.１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１８時間撹拌した後、該混合物を真空濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に再溶解し、５％ＫＨＳＯ4水溶液（２５ｍＬ）、５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×２５ｍＬ）、およびブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機溶液を乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空濃縮して油状物を得、これを、ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ3［３：９７］の混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、無色のガム状物としてトリフルオロアセトアミド１９を得た。
【００６５】
該ガム状物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合物に溶解し、Ｋ2ＣＯ3（１.１３ｇ、８.１２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を窒素下にて室温で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）で希釈し、有機溶液を５％Ｋ2ＣＯ3水溶液（２×２５ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、真空蒸発させて、無色のガム状物としてビス−アミン２０を得た（１.５０ｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝８.９８分（ｍ／ｚ＝１０５３.４ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００６６】
記載１６：  トリス−オレイル,ビス−(Ａａ)x−ペンタミン・塩酸塩（２２；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）の一般的な製造方法
【化３３】
2008520610.tif 000034
室温で、保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアミノ酸エステル(ＰＧ)y(Ａａ)xＯＳｕｃ（２.２当量）およびジアミン２０（１.０当量）のＴＨＦ（２０ｍＭ）中溶液をＫ2ＣＯ3の水中溶液（２.２当量、０.２Ｍ）で処理した。該混合物を窒素下で１８時間撹拌し、次いで、真空濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＭ）で希釈し、半分の量の水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、溶媒を真空蒸発させてガム状物を得、これを、ＭｅＯＨおよびＣＨＣｌ3［１０：９０］の混合物で溶離するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）により精製して、ガム状物として中間体Ｂｏｃカルバメート２１を得た。該ガム状物を、窒素下にて室温で１８時間、ＨＣｌのジエチルエーテル中溶液（２Ｍ、５０ｍＭ）で処理し、沈殿した固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末としてトリス−オレイルペンタミン・塩酸塩２２を得た（収率４１〜５６％）。
【００６７】
実施例１１：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｌｙｓ
【化３４】
2008520610.tif 000035
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.９４分（ｍ／ｚ＝１３０９.２０ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ79Ｈ154Ｎ9Ｏ5）１３０９.２０７３、測定値１３０９.２０７０ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６８】
実施例１２：  (Ａａ)x＝Ｄ−Ｌｙｓ
【化３５】
2008520610.tif 000036
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.９４分（ｍ／ｚ＝１３０９.２０ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ79Ｈ154Ｎ9Ｏ5）１３０９.２０７３、測定値１３０９.２０７５ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００６９】
実施例１３：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｏｒｎ
【化３６】
2008520610.tif 000037
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.９７分（ｍ／ｚ＝１２８１.１７ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ59Ｈ118Ｎ9Ｏ5）１２８１.１７６０、測定値１２８１.１７５９ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００７０】
実施例１４：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｓｅｒ
【化３７】
2008520610.tif 000038
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１７.２８分（ｍ／ｚ＝１２２７.０８ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ73Ｈ140Ｎ7Ｏ7）１２２７.０８１４、測定値１２２７.０８１４ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００７１】
実施例１５：  (Ａａ)x＝Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｌｙｓ
【化３８】
2008520610.tif 000039
ＬＣ−ＭＳ（ＬＣ−ＴＯＦ)：ｔR＝３.１７分（１４８４.６０ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００７２】
実施例１６：  (Ａａ)x＝[Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)3]2ＮＣＨ2ＣＯ2Ｈ
【化３９】
2008520610.tif 000040
ＬＣ−ＭＳ（ＬＣ−ＴＯＦ)：ｔR＝３.８３分（ｍ／ｚ＝１３９６.７５ [Ｍ＋Ｈ]+）。
【００７３】
実施例１７：  ビス−オレイルペンタミン・塩酸塩（２３；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）の製造方法
【化４０】
2008520610.tif 000041
モノ−Ｂｏｃジアミン１４（９０.０ｍｇ、０.１０ｍｍｏｌ）をＨＣｌのジエチルエーテル中溶液（２Ｍ、５ｍＬ）で処理し、窒素下にて室温で３時間撹拌した。窒素流下で溶媒を蒸発させ、残留固体を無水ジエチルエーテル（２ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末として三塩酸塩２３を得た（８５.０ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１２.２８分（ｍ／ｚ＝７８８.７７ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ49Ｈ98Ｎ5Ｏ2）７８８.７７２１、測定値７８８.７７１０ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００７４】
実施例１８：  トリス−オレイルペンタミン・塩酸塩（２４；Ｒ＝オレイル、ｍ＝３、ｎ＝４）の製造方法
【化４１】
2008520610.tif 000042
トリス−オレアート２０（８５.０ｍｇ、８１.０μｍｏｌ）をＨＣｌのジエチルエーテル中溶液（１.５Ｍ、５ｍＬ）で処理し、窒素下にて室温で３時間撹拌した。窒素流下にて溶媒を蒸発させ、残留白色固体を無水ジエチルエーテル（２ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させて、白色粉末として二塩酸塩２４を得た（７０.０ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｔR＝１７.６３分（ｍ／ｚ＝１０５３.０１ [Ｍ＋Ｈ]+）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：計算値（Ｃ67Ｈ130Ｎ5Ｏ3）１０５３.０１７４、測定値１０５３.０１８１ [Ｍ＋Ｈ]+。
【００７５】
実施例１９  ペンタミン系化合物を使用する、ＧＦＰを発現する組換えプラスミドの細胞へのトランスフェクション
付着細胞系ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＶ１およびＡ５４９細胞を使用してトランスフェクション試験を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補充した、Ｆ１２培地（ＣＨＯ−Ｋ１について）およびＤＭＥＭ培地（ＣＶ１、Ａ５４９について）からなっていた。全ての培地および補充物は、Life Technologiesから入手した。
【００７６】
インビトロ遺伝子トランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に細胞を組織培養処理済み９６ウェルプレート（Costar）中に約２×１０4細胞／ウェルの密度で播種した。Ｏｐｔｉｍｅｍ中にて０.０２５μｇ／μｌのプラスミド溶液を調製した。使用したプラスミドは、Clontechから入手したｐＣＭＶ−ｅＧＦＰであった。最終反応混合物中の最終濃度が２０、１０、５および２.５μｇ／ｍｌとなるように該ペンタミン脂質を１０倍濃縮物としてＯｐｔｉｍｅｍに溶解した。ウェルごとにペンタミン脂質１０μｌをプラスミド１０μｌと混合した。該複合体を室温で１０分間インキュベートした。プレート中の細胞から培地を除去し、それらをＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。該複合体（２０μｌ）を各ウェルに加え、次に、Ｏｐｔｉｍｅｍ（無血清）または増殖培地（血清）８０μｌを加えて、最終容量を１００μｌにした。無血清プロトコールでは、次いで、該プレートを３７℃で６時間インキュベートし、次いで、培地を除去し、各ウェルに新鮮な完全培地を加え、さらに１８時間インキュベーションを続けた。血清プロトコールでは、該プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
【００７７】
製造者（Roche Diagnostics）のガイドラインに従ってレポーター遺伝子アッセイを行った。該プレートから培地を除去し、細胞をＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。次いで、各ウェルにレポーター溶解バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％トリトン×１００、２ｍＭ ＤＴＴ）１００μｌを加えた。次いで、該プレートを−８０℃で１５分間放置し、その後、室温で解凍した。次いで、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍを用いて標準的なプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ、Tecan）を使用して蛍光を測定した。
【００７８】
図８は、実施例４の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
図９は、実施例１２、１３、１５、１７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるｐＣＭＶ−ｅＧＦＰの発現を示す。
図１０は、実施例５、６、７、８および１１の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＶ−１細胞におけるｐＣＭＶ−ｅＧＦＰの発現を示す。
図１１は、実施例１２、１３、１５、１７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＶ−１細胞におけるｐＣＭＶ−ｅＧＦＰの発現を示す。
【００７９】
実施例２０  ペンタミン系界面活性剤化合物を使用するｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクション
付着細胞系Ａ５４９、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＭＣＦ７およびＣａｃｏ２を使用してノックダウン試験を行った。完全培地は、１０％ｖ／ｖのウシ胎仔血清および１×Ｌ−グルタミンを補充した、ＤＭＥＭ培地（Ａ５４９、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＭＣＦ７について）およびＥＭＥＭ培地（Ｃａｃｏ２について）からなっていた。全ての培地および補充物は、Life Technologiesから入手した。
【００８０】
インビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションの１６〜１８時間前に細胞を組織培養処理済み９６ウェルプレート（Costar）中に約２×１０4細胞／ウェルの密度で播種した。Ｏｐｔｉｍｅｍ中にてDharmaconから購入したｓｉＲＮＡ（ターゲティングＪＮＫ１または非ターゲティング対照）の１ｕＭ溶液を調製した。最終反応混合物中の最終濃度が５μｇ／ｍｌとなるようにジェミニ脂質を１０倍濃縮物としてＯｐｔｉｍｅｍに溶解した。市販の試薬リポフェクタミン２０００を最終濃度２.５μｇ／ｍｌで使用した。ウェルごとにジェミニ脂質の１０ｕｌ試料をｓｉＲＮＡ １０ｕｌと混合した。該複合体を室温で１０分間インキュベートした。プレート中の細胞から培地を除去し、それらをＰＢＳ １００μｌで１回洗浄した。該複合体（２０μｌ）を各ウェルに添加し、次いで、増殖培地（血清）８０μｌを添加して最終容量を１００μｌにし、該プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。この時点で、ＰＢＳ １００μｌを使用して細胞を１回洗浄し、次いで、ＲＮＡ溶解バッファー（Promega）１００μｌに溶解させた。標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ（taqman）を行って、Ｊｎｋ１ ｓｉＲＮＡ標識細胞および非標的細胞の両方においてハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比べたＪｎｋ１の相対的な存在量を測定した。ノックダウンの程度は、Ｊｎｋ１の処理（Ｊｎｋ１）コピー対Ｊｎｋ１の対照（非標的）コピーの比率として表した。
【００８１】
図１２は、実施例１２、１３および４の化合物を用いてトランスフェクトされたＣａｃｏ２細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。
図１３は、実施例１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。
図１４は、実施例１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。
図１５は、実施例１２および１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。
【００８２】
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に記載されているのと同様に参照することにより本明細書の一部を構成することを具体的かつ個別に明示されているのと同様に参照することにより本明細書の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の分子の合成において有用な進んだ中間体５の合成のための一般的なスキームを示す。
【図２】図２は、本発明の一の一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。
【図３】図３は、本発明の分子の合成において有用な活性化アミノ酸(Ａａ)x基の調製のための反応スキームを示す。
【図４】図４は、本発明のさらなる一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。
【図５】図５は、本発明のさらなる一般的な実施態様による分子の合成のための一般的なスキームを示す。
【図６】図６は、本発明の一の実施態様による分子の塩の生成のための進んだ中間体の脱保護のための一般的な反応スキームを示す。
【図７】図７は、本発明の一の実施態様による塩の生成のための反応スキームを示す。
【図８】図８は、実施例４の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＧＦＰの発現を示す。実施例４の濃度は、ｕｇ／ｍｌで示される。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図９】図９は、実施例１２、１３、１５、１７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるｐＣＭＶ−ＧＦＰの発現を示す。Ｌ２Ｋ＃は、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１０】図１０は、実施例５、６、７、８および１１の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＶ−１細胞におけるｐＣＭＶ−ＧＦＰの発現を示す。Ｌ２Ｋ＃は、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１１】図１１は、実施例１２、１３、１５、１７および１８の化合物を用いてトランスフェクトされたＣＶ−１細胞におけるｐＣＭＶ−ＧＦＰの発現を示す。Ｌ２Ｋ＃は、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１２】図１２は、実施例１２、１３および４の化合物を用いてトランスフェクトされたＣａｃｏ２細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１３】図１３は、実施例１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＩｓｈｉｋａｗａ細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１４】図１４は、実施例１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＭＣＦ７細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１５】図１５は、実施例１２および１３の化合物を用いてトランスフェクトされたＡ５４９細胞におけるＪｎｋ１のノックダウンを示す。Ｌ２Ｋは、リポフェクタミン２０００TMを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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