(57)【要約】  本発明は、ポリオールおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在下で、少なくとも１つのｄＮＴＰ、少なくとも１つの増幅に必要とされる酵素、少なくとも１つの−オリゴヌクレオチドプライマー、および少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、核酸を増幅するための濃縮および緩衝化された液体組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリオールおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在下で、少なくとも１つのｄＮＴＰ、少なくとも１つの増幅に必要とされる酵素、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、および少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、核酸を増幅するための濃縮および緩衝化された液体組成物。
【請求項２】
ポリオールおよびＰＶＰを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
マグネシウム塩またはマンガン塩も含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ポリオールがグリセロール、ソルビトール、イノシトールおよびペンタエリトリトールから選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ポリオールおよび／またはＰＶＰの存在下で、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰの内１つ、少なくとも１つのＰＣＲに必要とされる酵素、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、ＰＣＲによって核酸を増幅するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
ポリオールおよび／またはＰＶＰの存在下で、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰの内１つ、少なくとも１つのＲＴ−ＰＣＲに必要とされる酵素、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、ＲＴ−ＰＣＲによって核酸を増幅するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも５Ｍのグリセロールを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１Ｍのソルビトールを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも５００ｍＭのイノシトールを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも２５０ｍＭのペンタエリトリトールを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項１１】
ＰＶＰがＰＶＰ−１０である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも３０ｍＭのＰＶＰ−１０を含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
以下の工程を包含する、核酸を増幅するための完全反応混合物を調製する方法：
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１項記載の濃縮された組成物を、核酸の増幅に適切な緩衝化生理食塩水中で希釈する工程；
（ｉｉ）増幅されるべき核酸のサンプルを、工程（ｉ）において希釈された組成物の所望の容量と接触させる工程。
【請求項１４】
以下の工程を包含する、核酸を増幅するための完全反応混合物を調製する方法：
（ｉ）  増幅されるべき核酸のサンプルを、核酸の増幅に適切な緩衝化生理食塩水中に混合する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた混合物を、請求項１〜１２のいずれか１項記載の濃縮された組成物の所望の容量に添加する工程。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の工程（ｉ）および（ｉｉ）、ならびに（ｉｉｉ）サンプル中に存在する核酸を増幅するための反応を開始する工程であって、ここで増幅はプローブによって保有される蛍光標識によって検出可能である、工程、を包含する核酸の増幅方法。
【請求項１６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項１５記載の増幅方法。
【請求項１７】
リアルタイムＰＣＲである、請求項１５記載の増幅方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の濃縮された組成物を含む少なくとも１つの容器を含む、核酸を増幅および／または検出するためのキット。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の濃縮された組成物を含む第１の容器、および核酸の増幅に適切な緩衝化生理食塩水を含む第２の容器を含む、核酸を増幅および／または検出するためのキット。
【請求項２０】
緩衝化生理食塩水が、少なくとも８ｍＭの濃度のＴＲＩＳ、少なくとも８ｍＭの濃度のカリウム塩またはナトリウム塩、少なくとも５ｍＭの濃度のアンモニウム塩、および少なくとも０．８ｍＭの濃度のマグネシウム塩またはマンガン塩から選択される少なくとも１つの成分を含み、ここで成分は単独でまたは混合物として使用される、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
液体組成物中の酵素および蛍光ヌクレオチドプローブの両方を安定化するための、ポリオールおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の使用。
【請求項２２】
ポリオールおよび／またはＰＶＰがｄＮＴＰも安定化する、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
液体組成物が、少なくとも１つのｄＮＴＰ、少なくとも１つの増幅に必要とされる酵素、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー、および少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む核酸を増幅するための濃縮および緩衝化された組成物である、請求項２１または２２記載の使用。
【請求項２４】
ポリオールがグリセロール、ソルビトール、イノシトールおよびペンタエリトリトールから選択される、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【請求項２５】
ＰＶＰがＰＶＰ−１０である、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を増幅するための試薬の安定な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の増幅は一般に、診断分野、または特に医学分野において、少量の特異的な遺伝子を検出するために使用されている。
【０００３】
いくつかの増幅技術が存在する：ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写およびそれに続くＰＣＲ）、ＳＤＡ（鎖置換増幅（strand displacement amplification））、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅（nucleic acid sequence-based amplification））など。これらの各々はいくつかの試薬の混合物の使用を必要とする：１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド３リン酸）、１つ以上の酵素（ポリメラーゼ、逆転写酵素など）、生理食塩水緩衝液、および有利には１つ以上の蛍光プローブ。
【０００４】
必要とされる感度および特異性性能レベルを達成し、そして増幅結果の再現性を確実にするために、これら試薬の混合はその各々の細心のピペッティングを含む。さらに、増幅されるべき核酸の増幅試薬のストック溶液への混入を防止するために、増幅試薬の混合物の調製は、増幅されるべき核酸の添加から物理的に分離されなければならない。
【０００５】
長期間継続する貯蔵を確実にするように、これら試薬は一般に−２０℃で保存され、プローブおよびプライマーは最も一般的には凍結乾燥される。
【０００６】
次いで、凍結乾燥の間オリゴヌクレオチドの完全性を維持するように、低温保護剤（例えば、糖またはポリオール）が使用され得る（ＥＰ  ８３３  ６６７）。同様に、酵素を保護するためにグリセロールが使用されている（ＥＰ  ４５５  ７４４）。
【０００７】
さらに、ＥＰ  ４５５  ７４４は、核酸を配列決定するための反応濃縮物を提供し、これは耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、還元剤、グリセロールおよび所望によりプライマーを含み、従って使用時にこれらの試薬を混合することを回避する。
【０００８】
さらに、増幅に必要とされる全ての試薬を含む増幅キットが会社ＡＲＴＵＳによって販売されている。しかし、これらのキットは不可避的に−２０℃で保存されなければならない。さらに、供給者は４℃での保存は５時間を超えることができないことを示している。
【０００９】
４℃で数ヶ月間安定である、核酸を増幅するための、増幅反応に必要とされる全ての試薬（特に１つ以上の蛍光ヌクレオチドプローブ）を含む組成物（一般に「混合物」と呼ばれる）は存在しない。
【００１０】
蛍光ヌクレオチドプローブの使用は、増幅反応（例えば、特にリアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）を検出およびモニターするのに特に有利である。これは、蛍光プローブを使用した増幅試験が、検出のためのいずれもの手動の増幅後工程を排除し、これが迅速な結果を得、そしてエアロゾルの混入（「キャリーオーバー」）の危険を防止することを可能にするからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ここで、生じる問題は、増幅に使用される酵素およびｄＮＴＰの不安定性に加え、迅速に分解する、使用される蛍光プローブの安定性の問題である。
【００１２】
本発明の著者らは、これらの問題を解決するために努力する一方、同時に試薬の即席混合の欠点を回避することを望んだ。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
次いで、本発明の著者らは、ポリオールおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在が、液体組成物中の酵素および蛍光プローブの両方、またはｄＮＴＰさえも安定化することを可能にすることを実証した。
【００１４】
それゆえ、本発明の主題は、ポリオールおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の存在下で、少なくとも１つのｄＮＴＰ、少なくとも１つの増幅に必要とされる酵素、少なくとも１つのヌクレオチドプライマー、および少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、核酸を増幅するための濃縮および緩衝化された液体組成物である。特に、核酸を増幅するための緩衝化された液体組成物がポリオールを含み、ＰＶＰを含まない場合、ポリオールはグリセロールと異なり、そして好ましくはソルビトール、ペンタエリトリトール、イノシトール、ズルシトール、マンニトール、プロピレングリコールまたはエチレングリコールからなる群より選択される；さらに、核酸を増幅するための緩衝化された液体組成物がポリオールおよびＰＶＰの両方を含む場合、ポリオールは好ましくは、グリセロール、ソルビトール、ペンタエリトリトール、イノシトール、ズルシトール、マンニトール、プロピレングリコールまたはエチレングリコールからなる群より選択される。
【００１５】
そのような組成物（一般に「混合物」ともいわれる）は、貯蔵条件に依存せず経時的に安定であるという利点を与える。周囲温度で数ヶ月間の保存の後でさえ、酵素、蛍光プローブまたはｄＮＴＰでさえ安定なままである。核酸の増幅および検出に必要とされる感度および特異性のレベルは確実にされる。
【００１６】
組成物は、希釈剤の添加以外に、いずれのさらなる取り扱いの使用も必要とせず、この理由のために使用準備済みの（ready-to-use）反応混合物と考えられ得る。
【００１７】
この組成物は、意図される核酸増幅の型に関わらず有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
用語「増幅」は、精製された核酸からのまたは核酸配列の混合物からの特異的な核酸配列の濃度の増加を意味することが意図される。この増幅工程は、酵素的にＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する任意の従来の方法（例えば、特にＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）によってならびに特許ＥＰ  ２００  ３６２および２０１  １８４において記載されるＰＣＲ、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）によって提案されるＴＡＳ（転写ベースの増幅システム（transcription-based amplification system））技術、Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）によって記載される３ＳＲ（自己維持配列複製（self-sustained sequence replication））技術、ＥＰ  ３２９  ８２２において記載されるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅（nucleic acid sequence-based amplification））技術、ＵＳ  ５，３９９，４９１において記載される転写媒介増幅（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）技術、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）によって記載されるＳＤＡ（鎖置換増幅（strand displacement amplification））技術、特許ＥＰ  ０  ３２０  ３０８において記載されるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ｇａｐ−ＬＣＲ）技術、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  （１９９８）  Ｊｕｌ；  １９（３）：２２５−２３２において記載されるローリングサークル増幅（rolling circle amplification）（ＲＣＡ）技術、またはそうでなければＵＳ  ６，０２７，９２３において記載されるＬＬＡ（連結型線形増幅（linked linear amplification））技術）によって実施され得る。
【００１９】
好ましくは、増幅はリアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである。
【００２０】
好ましい組成物は、ポリオールおよび／またはＰＶＰの存在下で、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰからの１つ、少なくとも１つのＰＣＲに必要とされる酵素、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、ＰＣＲによって核酸を増幅するための上記のような組成物である。
【００２１】
別の好ましい組成物は、ポリオールおよび／またはＰＶＰの存在下で、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰまたはｄＵＴＰからの１つ、少なくとも１つのＲＴ−ＰＣＲに必要とされる酵素、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに少なくとも１つの蛍光ヌクレオチドプローブを含む、ＲＴ−ＰＣＲによって核酸を増幅するための上記のような組成物である。
【００２２】
緩衝液：
用語「緩衝化された組成物」は、組成物のｐＨが緩衝液の存在によって制御されることを意味することが意図される。緩衝化された組成物は、標準的な緩衝化生理食塩水（例えば、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））塩、好ましくは塩酸塩または酢酸塩）を水中に、５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは７ｍＭ〜４００ｍＭのＴＲＩＳ（登録商標）の濃度を達成するように含む）であり得る。
【００２３】
マグネシウムおよび／またはマンガン塩（好ましくは塩化物または硫酸塩）が、１ｍＭ〜８ｍＭ、好ましくは１．５ｍＭ〜５ｍＭの作業濃度を提供するようにこの緩衝液に添加され得る。カリウム塩（好ましくは塩化カリウム）もまた、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは７ｍＭ〜８００ｍＭの作業濃度で溶液に添加され得る。ナトリウム塩（好ましくは塩化ナトリウム）もまた、５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは７ｍＭ〜４００ｍＭの濃度で添加され得る。アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）もまた、２ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは３．５ｍＭ〜８０ｍＭの作業濃度で混合物に添加され得る。硫酸アンモニウムのおよび塩化カリウムのまたはその他の塩の組み合わせもまた、既に記載したものと等価の濃度で使用することができる。他の化合物もまた添加され得る（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはｔｒｉｔｏｎＸ−１００）。ｐＨは、７．４〜９．２の間、好ましくは７．８〜８．８の間のｐＨ値を得るように調整される。
【００２４】
酵素：
組成物は、少なくとも１つの増幅に必要とされる酵素を含む。それはＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（登録商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｕ、ＰｗｏまたはＴｔｈ）であり得る。それはまた、「ホットスタート」Ｔａｑ  ポリメラーゼであり得る。その酵素部位は低温において免疫反応（ＥＰ  ５９２  ０３５）、化学反応（ＵＳ  ５，６７７，１５２；ＵＳ  ５，７７３，２５８）またはイオン性相互作用によってブロックされ得る。これら酵素の全ては市販されている。適切な場合、逆転写酵素（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有する逆転写酵素）が使用され得る。他の酵素が（例えば、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ））が添加され得る。特に易熱性ＵＤＧ酵素が使用され得る。
【００２５】
酵素（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびＵＤＧ）は、好ましくは反応当たり０．５Ｕ〜８Ｕの間のＴａｑポリメラーゼの濃度（これは１０Ｕ／ｍｌ〜８×１０３Ｕ／ｍｌに対応する）で使用される。酵素の濃度の表現は当業者に周知であり、１ユニットは、７２℃で３０分の期間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸中で不溶性の物質中に取り込む酵素の量である。逆転写酵素は好ましくは、反応当たり１Ｕ〜１０３Ｕの間（これは２０Ｕ／ｍｌ〜１０６Ｕ／ｍｌに対応する）で使用される。逆転写酵素ユニットは、ポリＡ  ＲＮＡテンプレートおよびオリゴ−ｄＴ１２−１８プライマーとともに、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを酸中で不溶性の産物中に取り込む酵素の量である。ＵＤＧが組成物に添加される場合、ＵＤＧは好ましくは０．１〜２Ｕの間（２Ｕ／ｍｌ〜２×１０３Ｕ／ｍｌに対応する）で使用される。１ユニットのＵＤＧは、３７℃で１時間に１ｎｍｏｌの遊離ウラシルのポリ（ｄＵ）からの遊離を触媒する。
【００２６】
ｄＮＴＰ：
デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）が、好ましくは作業濃度より少なくとも５倍高い濃度で提供される。これは各ｄＮＴＰが、好ましくは０．３ｍＭ〜７５ｍＭの間で使用されることを意味する。ｄＮＴＰはデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）を含む。好ましくは、これら４つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）は、本発明の組成物において使用される。他のｄＮＴＰ（例えば、デオキシウリジン３リン酸（ｄＵＴＰ）およびｄＮＴＰアナログならびにｄＮＴＰコンジュゲート）もまた使用され得、そして本明細書において使用される用語「ｄＮＴＰ」に含まれる。
【００２７】
プライマー：
代表的には、オリゴヌクレオチドプライマーは一般に、１２〜２５ヌクレオチドの間の長さである。しかし、１２ヌクレオチド未満または２５ヌクレオチド超の長さのプライマーも使用され得る。プライマーの長さは、本発明の実行にとって重要ではない。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーは化学的に合成される。オリゴヌクレオチドプライマーは、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣもしくはＵ、または塩基アナログ（例えば、イノシンもしくはＰＮＡ（ペプチド核酸））から構成され得る。
【００２８】
使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅反応の間にテンプレートの相補鎖と慣習的にハイブリダイズする。
【００２９】
各プライマーは、好ましくは作業濃度の少なくとも５倍の濃度で使用され、これは約０．１μＭ〜２００μＭ、好ましくは１μＭ〜５０μＭの間の濃度を意味する。
【００３０】
プローブ：
ヌクレオチドプローブは、８〜４０ヌクレオチドの長さを含み得る。プローブの長さは本発明の使用にとって重要ではない。代表的には、プローブは、プローブがハイブリダイズする標的配列を捕獲または検出するために使用される。
【００３１】
プローブの標識化は、増幅された核酸の検出、特にリアルタイム増幅および検出反応（すなわち、増幅反応が起こる間に、標的配列が検出および／または定量される）を容易にするために特に有利である。
【００３２】
プローブは、それが蛍光標識を有するという点で「蛍光」といわれる。
【００３３】
これらの蛍光標識は、特にフルオレセイン、Ｔａｍｒａ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；ＦＡＭ、５−カルボキシフルオレセイン；ＪＯＥ、２’，７’−ジメチル−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、ＲＯＸ、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン；ＣＹ３；ＣＹ５；ＴＥＴ、テトラクロロフルオレセインまたはＨＥＸ、ヘキサクロロフルオレセインを含む。
【００３４】
増幅された核酸の検出は、特に「分子ビーコン（molecular beacon）」技術を使用して実施することができる（Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，  １９９６；  Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。この技術により、フルオロフォアおよび「クエンチャー」がプローブの配列の各末端に付着される。標的核酸の非存在下では、アームの配列はフルオロフォアをクエンチャーと接触させる「ヘアピン」構造を形成するように、互いにハイブリダイズする。標的核酸の存在下では、プローブおよび標的配列はハイブリダイズする。ヘアピン構造は、このハイブリダイゼーションによって形成される強固な２重らせんと共存し得ず、そしてそれから生じる立体構造の変化がアームの配列の分離を導き、フルオロフォアおよびクエンチャーを引き離す。フルオロフォアおよびクエンチャーが分離されると、フルオロフォアシグナルは検出可能である。上記の全ての蛍光標識が使用され得る。クエンチャーは、好ましくはＤａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｄａｒｋ  ＱｕｅｎｃｈｅｒおよびＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒから選択され得る。これらの分子は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｏｌｉｇｏから容易に入手可能である。
【００３５】
各蛍光プローブは、好ましくは作業濃度の少なくとも５倍より高い濃度で使用され、これは０．１μＭ〜２００μＭの間、好ましくは０．５μＭ〜３０μＭの間を意味する。
【００３６】
ポリオール：
本発明において使用され得るポリオールは、直鎖状、分枝状または環状構造を有する。最も適切なポリオールは、グリセロール、ソルビトールまたはペンタエリトリトールを含む。他のポリオール（例えば、イノシトール、ズルシトール、マンニトール、プロピレングリコールまたはエチレングリコール）およびその誘導体もまた使用され得る。ポリオールの組み合わせもまた使用され得る。
【００３７】
ポリオールは好ましくは緩衝液または水中で溶解され、そして１ｍＭより高い濃度、好ましくは２５０ｍＭより高い濃度、好ましくは５００ｍＭより高い濃度、さらに好ましくは１Ｍより高い濃度で組成物中で好適に使用される。
【００３８】
好ましくは、グリセロールは５Ｍより高い濃度で使用され、ソルビトールは１Ｍより高い濃度で使用され、イノシトールは５００ｍＭより高い濃度で使用され、そしてペンタエリトリトールは２５０ｍＭより高い濃度で使用される。
【００３９】
ＰＶＰ：
ポリビニルピロリドンは、下記式で表されるポリマーである：
【化１】
2008520232.tif 000002
【００４０】
ＰＶＰは、主に錠剤または顆粒剤の生産のための、医薬製品の調製における賦形剤である。平均分子量２５００〜７５００００を有するＰＶＰは、以下の名称のもとに販売されている：Ｋｏｌｌｉｄｏｎ，、Ｌｕｖｉｓｋｏｌ、Ａｌｂｉｇｅｎ  ＡおよびＤｉｖｅｒｇａｎ（ＢＡＳＦ）；ＰＶＰおよびＰｌａｓｄｏｎｅ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｎｉｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏｒｐ．）；ＣｏｌｌａｃｒａｌおよびＬｕｖｉｓｋｏｌ  ＶＡ（ビニルエステルとのコポリマー、ＢＡＳＦ）；ＰＶＰ／ＶＡ（酢酸ビニルとのコポリマー、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｎｉｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏｒｐ．）。
【００４１】
ＰＶＰは、好ましくは緩衝液または水中で溶解される。それは０．１ｍＭより高い濃度で、特に０．１ｍＭ〜５Ｍの濃度で、さらに特に１ｍＭ〜１Ｍの濃度で、さらに特に１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で使用される。
【００４２】
本発明の関連において、好ましくは分子量２５００ｇ／ｍｏｌ〜７５００００ｇ／ｍｏｌを有するＰＶＰが使用され、さらに好ましくは分子量７５００ｇ／ｍｏｌ〜５５０００ｇ／ｍｏｌを有するＰＶＰが使用され、なおさらに好ましくはＰＶＰ−１０が使用され、その分子量は１００００ｇ／ｍｏｌである。ＰＶＰ−１０は、３０ｍＭより高い濃度で、好ましくは３０ｍＭ〜１Ｍの濃度で、さらに好ましくは約３００ｍＭで好適に使用される。
【００４３】
使用：
組成物は、濃縮された形態で、核酸増幅に必要とされる試薬を含む。増幅を開始するのに必要とされる唯一のさらなる工程は、それを増幅されるべき核酸サンプルと接触させる前または後のこの組成物の希釈である。
【００４４】
希釈剤は、好ましくは緩衝化生理食塩水であり、所望により塩類の中でもとりわけマグネシウム塩またはマンガン塩を含む。緩衝液および塩の濃度は、増幅反応に適切な最終的な緩衝液および塩の濃度を得るように調整される。それは、少なくとも８ｍＭの濃度のＴＲＩＳ、少なくとも８ｍＭの濃度のカリウム塩またはナトリウム塩、少なくとも５ｍＭの濃度のアンモニウム塩、および少なくとも０．８ｍＭの濃度のマグネシウム塩またはマンガン塩から選択される少なくとも１つの成分を含む緩衝化生理食塩水であり得、成分は単独でまたは混合物として使用される。
【００４５】
例えばそれは、標準的な緩衝化生理食塩水であり得、８ｍＭ〜２．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１２５ｍＭのＴＲＩＳ濃度を達成するように、水中にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）塩（好ましくは塩酸塩または酢酸塩）を含む。マグネシウム塩および／またはマンガン塩（好ましくは塩化物または硫酸塩）は、０．８５ｍＭ〜４００ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度でこの緩衝液に添加され得る。カリウム塩（好ましくは塩化カリウム）もまた、８ｍＭ〜４．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭの作業濃度で溶液に添加され得る。ナトリウム塩（好ましくは塩化物）もまた、８ｍＭ〜２．５Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１２５ｍＭの濃度で添加され得る。アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）もまた、５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭの作業濃度で混合物に添加され得る。硫酸アンモニウムの、塩化カリウムのまたはその他の塩の組み合わせもまた、上記したものと等価の濃度で使用され得る。他の化合物もまた使用し得る（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）。ｐＨは、７．４〜９．２の間、好ましくは７．８〜８．８の間のｐＨ値を得るように調整される。
【００４６】
希釈剤の一例は、１ｍＭ〜２０ｍＭの間のＭｇＣｌ２濃度のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液である。
【００４７】
いくつかの実施態様が、核酸増幅用の完全反応混合物の調製のために可能である。
【００４８】
本発明の好ましい態様は、以下の工程を包含する、核酸を増幅するための完全反応混合物を調製する方法に関する：
（ｉ）上記で規定する濃縮された組成物を、核酸の増幅に適切な緩衝化生理食塩水中で希釈する工程；
（ｉｉ）増幅されるべき核酸のサンプルを、工程（ｉ）において希釈された組成物の所望の容量と接触させる工程。
【００４９】
好ましくは、調製方法は以下の工程を包含する：
（ｉ１）濃縮された組成物を容器中に分注し、そしてこの形態で貯蔵する工程；
（ｉ２）使用時に緩衝化生理食塩水を添加する工程；
（ｉｉ）増幅されるべき核酸のサンプルを、工程（ｉ２）において希釈された組成物と接触させる工程。
【００５０】
実施において、例えば上記で規定する濃縮された組成物（混合物）５μｌをとり、そして希釈剤（緩衝液）３５μｌ、および次いで核酸サンプル１０μｌを添加するか、またはそうでなければ濃縮された組成物（混合物）５μｌをとり、そしてサンプル２５μｌ中の希釈剤（緩衝液）２０μｌに添加することが可能である。
【００５１】
接触させる工程は、増幅に適切な任意の容器（例えば、チューブ、マイクロプレートのウェル、キャピラリー）において実施し得る。
【００５２】
あるいは、核酸を増幅するための完全反応混合物を調製する別の方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）増幅されるべき核酸のサンプルを、核酸の増幅に適切な緩衝化生理食塩水中に混合する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）において得られた混合物を、上記で規定する濃縮された組成物の所望の容量に添加する工程。
【００５３】
好ましくは、この方法は、実施において上記で規定する濃縮された組成物をチューブ、マイクロプレートのウェルまたは増幅に適切な任意の他の容器中に分注する工程、および次いで（事前に緩衝化生理食塩水と混合された）核酸サンプルを、濃縮された組成物中に分配する工程を包含する。
【００５４】
増幅は、自発的にまたは熱（９５℃）インキュベーションの後（例えば、「ホットスタート」ポリメラーゼが使用される場合）に開始させ得る。
【００５５】
核酸サンプルは、任意の型であり得る。それは好ましくは、生物学的サンプル（例えば、血液、尿、唾液または組織生検）由来であり、有利にはそれらは事前に処理され、当業者に公知である任意の方法によってそこから核酸を抽出する。
【００５６】
それゆえ、本発明はまた、上記で規定する工程（ｉ）および／または（ｉｉ）、ならびに（ｉｉｉ）サンプル中に存在する核酸を増幅するための反応を開始する工程であって、ここで増幅はプローブによって保有される蛍光標識によって検出可能である、工程、を包含する核酸の増幅方法に関する。
【００５７】
それは、上記のような、任意の型の増幅であり得る（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）。
【００５８】
キット：
本発明はまた、上記で規定する濃縮された組成物を含む少なくとも１つの容器、および所望によりキットの使用のための説明書を含む、核酸を増幅および／または検出するためのキットを提供する。他のキットは、上記で規定する濃縮された組成物を含む第１の容器、および上記で規定する緩衝化生理食塩水を含む第２の容器を含み得る。
【実施例】
【００５９】
実施例：
実施例１：
この実施例は、リアルタイムＰＣＲ用の混合物に対するグリセロール、ソルビトール、ペンタエリトリトールおよびイノシトールの安定化効果を示す。
【００６０】
試薬安定性の研究を、３７℃で実施する。アレニウスの法則に基づき、３７℃で１週間安定な酵素は４℃で６ヶ月間その活性を保持することが受け入れられている。
【００６１】
リアルタイムＰＣＲ用の５つの組成物を調製する。各組成物（混合物）は、１×緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５μＭの各プライマー（Ｅｕｒｏｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｅｕｒｏｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）、Ｆａｍ−Ｄａｂｃｙｌで標識した１μＭの分子ビーコンプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）および以下を含む：
ポリオールなし：混合物１、
６．８Ｍのグリセロール（Ｐｒｏｌａｂｏ）：混合物２、
７５０ｍＭのイノシトール（Ｆｌｕｋａ）：混合物３、
５３０ｍＭのペンタエリトリトール（Ｍｅｒｃｋ）：混合物４、
１．５Ｍのソルビトール（Ｓｉｇｍａ）：混合物５。
【００６２】
各組成物（混合物）から４５μｌのアリコート画分をとり、そして分析日まで３７℃で保存する。
【００６３】
希釈剤溶液を調製する。それは１．２９×緩衝液および６．９３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。３１５μｌのアリコート画分をとり、分析日まで３７℃で保存する。
【００６４】
分析日に、希釈剤のアリコート画分をＰＣＲ混合物のアリコート画分に添加する。混合した後、溶液の４０μｌをＰＣＲチューブ中に分注する。１コピー／μｌを含むマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）ＤＮＡ  １０μｌを３つの異なるＰＣＲチューブに添加し、１００コピー／μｌを含むマイコバクテリウム・ツベルクロシスＤＮＡ  １０μｌを３つの異なるＰＣＲチューブに添加し、そして１０μｌの水を２つの異なるチューブに添加する。
【００６５】
ＰＣＲ反応を０日目、３±１日目、６または７日目、１３日目および２１日目に実施する。
【００６６】
ＰＣＲ反応をｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で実施する。「ホットスタート」ポリメラーゼを活性化させるための９５℃での１５分間の最初の工程の後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間および７２℃で３０秒間から構成される５０サイクルを実施する。
【００６７】
分析をｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒソフトウェアによって実施する。サイクル４と２５との間のベースラインの手動配置および５０相対蛍光単位（ＲＦＵ）の定数値における閾値の手動配置の後に、各ＰＣＲ反応についてのサイクル閾値（Ｃｔ）の値を決定する。Ｃｔはそこから測定される蛍光がバックグラウンドノイズのそれより高いＰＣＲのサイクルである。
【００６８】
３７℃でインキュベートした混合物（混合物１〜５）を用いた１０コピー／ＰＣＲおよび１０００コピー／ＰＣＲの増幅の後に得られた三連についてのＣｔ値の平均を図１に示す。
【００６９】
この実施例において示す全てのポリオールは、リアルタイムＰＣＲ用の全ての反応混合物を安定化することを可能にする。ペンタエリトリトールおよびソルビトールは、これらがそれぞれ少なくとも３．５および６．５と等価な係数で混合物の安定性を増加させるので、安定化剤として最も有効である。
【００７０】
混合物３、４、５および５’を、３つの温度（３７℃、４℃、−２０℃）においてその安定性についてさらに試験した。混合物５’は、ＭｇＣｌ２濃度（３ｍＭ）およびプローブ濃度（２μＭ）以外、混合物５と同一である。混合物３、４、５および５’について得られた結果を、それぞれ下記の表１Ａ、１Ｂ、表２Ａ、２Ｂ、表３Ａ、３Ｂおよび４Ａ、４Ｂに示す。
【００７１】
表１Ａおよび１Ｂ：７５０ｍＭのイノシトールを含むＰＣＲ混合物３の３７℃、４℃および−２０℃での種々のインキュベーション時間の後に、１０００コピーのＤＮＡ（Ａ）および１０コピーのＤＮＡ（Ｂ）の増幅について得られたＣｔ値の比較：
【００７２】
【表１Ａ】
2008520232.tif 000003
【００７３】
【表１Ｂ】
2008520232.tif 000004
【００７４】
表２Ａおよび２Ｂ：５３０ｍＭのペンタエリトリトールを含むＰＣＲ混合物４の３７℃および４℃での種々のインキュベーション時間の後に、１０００コピーのＤＮＡ（Ａ）および１０コピーのＤＮＡ（Ｂ）の増幅について得られたＣｔ値の比較：
【００７５】
【表２Ａ】
2008520232.tif 000005
【００７６】
【表２Ｂ】
2008520232.tif 000006
【００７７】
表３Ａおよび３Ｂ：１．５Ｍのソルビトールおよび１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ混合物５の３７℃、４℃および−２０℃での種々のインキュベーション時間の後に、１０００コピーのＤＮＡ（Ａ）および１０コピーのＤＮＡ（Ｂ）の増幅について得られたＣｔ値の比較：
【００７８】
【表３Ａ】
2008520232.tif 000007
【００７９】
【表３Ｂ】
2008520232.tif 000008
【００８０】
表４Ａおよび４Ｂ：１．５Ｍのソルビトールおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ混合物５’の３７℃、４℃および−２０℃での種々のインキュベーション時間の後に、１０００コピーのＤＮＡ（Ａ）および１０コピーのＤＮＡ（Ｂ）の増幅について得られたＣｔ値の比較：
【００８１】
【表４Ａ】
2008520232.tif 000009
【００８２】
【表４Ｂ】
2008520232.tif 000010
【００８３】
理解されるように、この実施例において示すポリオールは、全てのリアルタイムＰＣＲ用の反応混合物を１０ヶ月より長い間、４℃または−２０℃で安定化することを可能にする。
【００８４】
実施例２：
この実施例は、リアルタイムＰＣＲ用の混合物に対するグリセロールおよびＰＶＰ−１０の安定化効果を実証する。
【００８５】
４つのリアルタイムＰＣＲ用の濃縮された組成物を調製する。各組成物（「混合物」）は、１×緩衝液（Ｑｕｉａｇｅｎ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５μＭの各プライマー（Ｅｕｒｏｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）、２．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｅｕｒｏｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ）、Ｆａｍ−Ｄａｂｃｙｌで標識した２μＭの分子ビーコンプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、Ｔａｍｒａ−Ｄａｂｃｙｌで標識した４μＭの分子ビーコンプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、Ａｔｔｏ−５９０−Ｄａｂｃｙｌで標識した２μＭの分子ビーコンプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、２ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）ならびに以下を含む：
−ＰＶＰもｐｏｌｙｏｌもなし：混合物６、
−０．３ＭのＰＶＰ−１０（ｓｉｇｍａ）：混合物７、
−６．５Ｍのグリセロール（Ｐｒｏｌａｂｏ）：混合物８、
−６．５Ｍのグリセロールおよび０．３ＭのＰＶＰ−１０：混合物９
−５Ｍのグリセロールおよび０．３ＭのＰＶＰ−１０：混合物１０。
【００８６】
３つの配列を同時に増幅および検出する。配列１および２はマイコバクテリウム・ツベルクロシスのゲノムに属し、そして配列３は内部標準である。
配列１をＦａｍプローブによって検出し、配列２をＴａｍｒａプローブによって検出し、そして配列３をＡｔｔｏ−５９０プローブによって検出する。
【００８７】
４５μｌのアリコート画分を各組成物（混合物）からとり、分析日まで３７℃で保存する。
【００８８】
希釈剤溶液を調製する。それは１．１５×緩衝液および５．７５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。３１５μｌのアリコート画分をとり、分析日まで３７℃で保存する。
【００８９】
分析日に、希釈剤のアリコート画分をＰＣＲ混合物のアリコート画分に添加する。混合した後、溶液の４０μｌをＰＣＲチューブに分注する。
【００９０】
１コピー／μｌの配列２を含むマイコバクテリウム・ツベルクロシスＤＮＡ  １０μｌを２つの異なるＰＣＲチューブに添加し、１００コピー／μｌの配列２を含むマイコバクテリウム・ツベルクロシスＤＮＡ  １０μｌを２つの異なるチューブに添加し、そして１０μｌの水を２つの異なるチューブに添加する。
【００９１】
ＰＣＲ反応を０日目、３±１日目、６または７日目、１３日目および２１日目に実施した。
【００９２】
ＰＣＲ反応を、ｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で実施する。「ホットスタート」ポリメラーゼを活性化させるための９５℃での１５分間の最初の工程の後、９４℃で３０秒間、５９℃で３０秒間および７２℃で３０秒間から構成される５０サイクルを実施する。
【００９３】
分析は、ｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒソフトウェアによって実施する。
【００９４】
サイクル４と２３との間のベースラインの手動配置および３５ＲＦＵの定数値における閾値の手動配置の後に、配列１に対応する各ＰＣＲ反応（Ｆａｍ−Ｄａｂｃｙｌプローブ）についてのＣｔ値を決定する。
【００９５】
サイクル４と３０との間のベースラインの手動配置および２０ＲＦＵの定数値における閾値の手動配置の後に、配列２に対応する各ＰＣＲ反応（Ｔａｍｒａ−Ｄａｂｃｙｌプローブ）についてのＣｔ値を決定する。
【００９６】
サイクル４と３０との間のベースラインの手動配置および１０ＲＦＵの定数値における閾値の手動配置の後に、配列３に対応する各ＰＣＲ反応（Ａｔｔｏ−５９０−Ｄａｂｃｙｌプローブ）についてのＣｔ値を決定する。
【００９７】
３７℃でインキュベートした混合物（混合物６〜９）を用いた１０コピー／ＰＣＲおよび１０００コピー／ＰＣＲの増幅の後に得られた二連についてのＣｔ値の平均を図２に示す。
【００９８】
さらに、３７℃および４℃でインキュベートした混合物１０を用いて行った類似の実験を、配列１については下記表５に、配列２については表６に、そして配列３については表７に示す。
【００９９】
表５：５Ｍのグリセロール＋０．３ＭのＰＶＰ−１０を含むＰＣＲ混合物１０の３７℃および４℃での種々のインキュベーション時間の後に、ＤＮＡ配列１の増幅（Ｆａｍ−Ｄａｂｃｙｌプローブ）から得られたＣｔ値：
【０１００】
【表５】
2008520232.tif 000011
【０１０１】
表６：５Ｍのグリセロール＋０．３ＭのＰＶＰ−１０を含むＰＣＲ混合物１０の３７℃および４℃での種々のインキュベーション時間の後に、ＤＮＡ配列２の増幅（Ｔａｍｒａ−Ｄａｂｃｙｌプローブ）から得られたＣｔ値：
【０１０２】
【表６】
2008520232.tif 000012
【０１０３】
表７：５Ｍのグリセロール＋０．３ＭのＰＶＰ−１０を含むＰＣＲ混合物１０の３７℃および４℃での種々のインキュベーション時間の後に、ＤＮＡ配列３の増幅（Ａｔｔｏ−５９０−Ｄａｂｃｙｌプローブ）から得られたＣｔ値：
【０１０４】
【表７】
2008520232.tif 000013
【０１０５】
グリセロールまたはＰＶＰ−１０は、いくつかの蛍光プローブを含むリアルタイムＰＣＲ用の混合物を安定化することを可能にする。
【０１０６】
ＰＶＰ−１０およびグリセロールの組み合わせは、この安定性を増加させることを可能にする。
【０１０７】
実施例３：
この実施例は、３つの異なる温度（３７℃、２０℃および４℃）において保存される同一の組成物の安定性を比較する。
【０１０８】
リアルタイムＰＣＲ用の組成物を調製する。それは２×緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、６μＭの各プライマー（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、２ｍＭのｄＡＴＰ、２ｍＭのｄＧＴＰ、２ｍＭのｄＣＴＰ、２ｍＭのｄＵＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ｆａｍ−Ｄａｂｃｙｌで標識した６μＭの分子ビーコンプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．２５ＵのＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、６．５Ｍのグリセロール（Ｐｒｏｌａｂｏ）および３００ｍＭのＰＶＰ−１０（Ｓｉｇｍａ）を含む。
【０１０９】
各組成物（混合物）から４５μｌのアリコート画分をとり、そして分析日まで３７℃、２０℃または４℃で保存する。
【０１１０】
希釈剤溶液を調製する。それは２×緩衝液および１４．２５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。１８０μｌのアリコート画分をとり、分析日まで３７℃、２０℃または４℃で保存する。
【０１１１】
分析日に、希釈剤のアリコート画分をＰＣＲ混合物のアリコート画分に添加する。混合した後、溶液の２５μｌをＰＣＲチューブ中に分注する。
【０１１２】
１コピー／μｌを含むＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ  ２５μｌを２つの異なるＰＣＲチューブに添加し、１０コピー／μｌを含むＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ  ２５μｌを２つの異なるチューブに添加し、１００コピー／μｌを含むＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ  ２５μｌを２つの異なるチューブに添加し、そして２５μｌの水を２つの異なるチューブに添加する。
【０１１３】
ＰＣＲ反応を０日目、２１日目、３５日目および次いで２〜６ヶ月の間は毎月、９ヶ月目および１２ヶ月目に実施する。
【０１１４】
ＰＣＲ反応をｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で実施する。ＵＤＧを活性化させるための３７℃での１０分間の、および「ホットスタート」ポリメラーゼを活性化させるための９５℃での１５分間の最初の工程の後、９５℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間から構成される５０サイクルを実施する。
【０１１５】
分析をｉＱ  ｉｃｙｃｌｅｒソフトウェアよって実施する。サイクル２と３２との間のベースラインの手動配置および５０ＲＦＵの定数値における閾値の手動配置の後に、各ＰＣＲ反応についてのＣｔ値を決定する。
【０１１６】
３７℃、２０℃および４℃で保存した組成物の、２５コピー／ＰＣＲ、２５０コピー／ＰＣＲおよび２５００コピー／ＰＣＲの増幅の後に得られた二連についてのＣｔ値の平均を下記の表８に示す：
【０１１７】
表８：３７℃、２０℃および４℃での組成物の種々の保存時間の後に、２５コピーのＤＮＡ、２５０コピーのＤＮＡおよび２５００コピーのＤＮＡの増幅について得られたＣｔ値の比較
【０１１８】
【表８】
2008520232.tif 000014
【０１１９】
３７℃で２１日間安定な組成物は、周囲温度で少なくとも６ヶ月間、そして４℃で少なくとも１２ヶ月間安定である。
【０１２０】
結論として、示される全ての結果は、２０℃での６ヶ月より長くの、４℃での１年より長くの組成物の安定性を、そして−２０℃でのより長い安定性を示す。
【０１２１】
文献目録
Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  Ｍ，  Ｓｕｃｈａｒｚｕｋ  Ａ，  Ｍｏｏｒｅｓ  Ｊ，  Ｔｙａｇｉ  Ｓ，  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ  （１９９９）  Ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｎｅｗｓｌ．  １２：８５−８８。
−Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．  Ａｐｐｌ．，  １，  ２５−３３
−Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  ＰＮＡＳ，  ８６，  １１７３−１１７７
−Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：４８７
−Ｔｙａｇｉ  Ｓ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  ＦＲ  （１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６，  ３０３−３０８
−Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，  ８９，  ３９２−３９６
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】ポリオールなし（混合物１）、６．５Ｍグリセロール（混合物２）、７５０ｍＭイノシトール（混合物３）、５３０ｍＭペンタエリトリトール（混合物４）、１．５Ｍソルビトール（混合物５）を含むＰＣＲ混合物の３７℃での種々のインキュベーション時間の後に、１０００コピーのＤＮＡ（Ａ）および１０コピーのＤＮＡ（Ｂ）の増幅について得られたＣｔ値の比較。
【図２】ポリオールもＰＶＰもなし（混合物６）、または０．３Ｍ  ＰＶＰ１０（混合物７）、６．５Ｍグリセロール（混合物８）、０．３Ｍ  ＰＶＰ−１０＋６．５Ｍグリセロール（混合物９）を含むＰＣＲ混合物の３７℃での種々のインキュベーション時間の後に、３つのＤＮＡ配列の増幅から得られたＣｔ値の比較。
【図１】
2008520232.tif 000015
【図２】
2008520232.tif 000016
【国際調査報告】
2008520232.tif 000017
2008520232.tif 000018
2008520232.tif 000019