(57)【要約】  一般式：  【化１】2008508350.tif 000023の化合物、並びにその塩、そのエナンチオマー、及び該化合物を含む薬学的組成物が製造される。それらは治療、特に痛み、鬱病及び不安症の管理に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2008508350.tif 000016
の化合物、その薬学的許容塩、その溶媒和物、そのプロドラッグ、そのジアステレオマー、そのエナンチオマーの１つ又はそれ以上、およびそれらの混合物。
【請求項２】
化合物が：
【化２】
2008508350.tif 000017
その薬学的許容塩、そのエナンチオマーの１つ又はそれ以上及びその混合物から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
化合物が：
【化３】
2008508350.tif 000018
及びその薬学的許容塩から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
化合物が：
【化４】
2008508350.tif 000019
及びその薬学的許容塩から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項５】
化合物が：
【化５】
2008508350.tif 000020
及びその薬学的許容塩から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
化合物が：
【化６】
2008508350.tif 000021
及びその薬学的許容塩から選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
医薬として使用するための請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
痛み、不安症又は鬱病の治療用の医薬を製造するための請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１０】
温血動物における痛みの治療方法であって、かかる治療を必要とする該動物に請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の治療的有効量を投与する処置を含む治療方法。
【請求項１１】
温血動物における不安症の治療方法であって、かかる治療を必要とする該動物に請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の治療的有効量を投与する処置を含む治療方法。
【請求項１２】
温血動物における鬱病の治療方法であって、かかる治療を必要とする該動物に請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の治療的有効量を投与する処置を含む治療方法。
【請求項１３】
温血動物におけるパーキンソン病の治療方法であって、かかる治療を必要とする該動物に請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物の治療的有効量を投与する処置を含む治療方法。
【請求項１４】
式Ｉ：
【化７】
2008508350.tif 000022
の化合物の製造法であって、N,N−ジエチル−4−[(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミドをR−CH2X又はR−CHO〔式中、Ｒは２−フルオロフェニル、３−フルオロフェニル及び４−フルオロフェニルから選ばれ；そしてＸはCl、Ｉ、Br、−OTs (トシル)及び−OMs (メシラート)から選ばれる〕と反応させて中間体化合物を形成し、該中間体を適当な還元剤で還元することを含む製造法。
【請求項１５】
還元剤が水素、亜鉛及び鉄から選ばれ得る、請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
エナンチオマー的に純粋な4−｛(S)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド；エナンチオマー的に純粋な4−｛(R)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド；エナンチオマー的に純粋な4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(2−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチル−ベンズアミド；エナンチオマー的に純粋な4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(3−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル] メチル]−N,N−ジエチル−ベンズアミド、及びそれらの薬学的許容塩から選ばれる化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は米国仮出願60／602,363、2004年8月18日出願の利益を請求するものであり、その全体を参照により本願に組み入れる。そして本願はスエーデン出願第0401968-3号、2004年8月2日出願、に基づき、35 U.S.C. § 119(a)−(d)に基づく優先権を請求するものである。
【０００２】
本発明は新規な化合物、その製造法、その使用、及び該新規化合物を含む薬学的組成物に関する。該新規化合物は治療、特に痛み、不安症、及び機能的胃腸障害の治療に有用である。
【背景技術】
【０００３】
デルタ(“δ”)受容体は、循環系及び疼痛系のような多くの身体機能において役割を果たすことが確認されている。従って、該δ受容体のリガンドは鎮痛剤及び／又は降圧剤としての潜在的用途が見出しえる。該δ受容体のリガンドはまた、免疫調節活性を有することが示された。
【０００４】
少なくとも３種の異なるオピオイド受容体(μ、δ及びκ)の群(populations)の同定が現在充分に確立され、３種全てが人を含む多くの種族の中枢及神経系及び末梢神経系の両方によく表れている。種々の動物モデルにおいて、これらの受容体の１つ又はそれ以上が活性化されると、痛覚消失が観察された。
【０００５】
僅かな例外はあるが、現在入手可能な選択的オピオイドδリガンドは本来ペプチド性であり、全身経路による投与に適さない。非ペプチド性δアゴニストの一例はSNC80(非特許文献１)である。
【０００６】
従来確認された多くのδアゴニスト化合物は、薬物動態学的に十分ではなく、全身経路で投与した場合に鎮痛性でないという多くの欠点がある。また、これらのδアゴニスト化合物の多くは、全身投与した場合、著しいけいれん作用を示すことも実証された。
【０００７】
特許文献１はいくつかのδ−アゴニストを記載している。
【非特許文献１】Bilsky E.J. et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 273(1), 359-366頁(1995年)
【特許文献１】PCT公報WO02／094794
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、改良されたδ−アゴニストへの要求が未だにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
驚くべきことに、本発明者等は、ある種の化合物が１つ又はそれ以上の改良された性質、即ち、改良されたδアゴニスト効力、インビボ（生体内）効力、薬物動態学、生物学的利用能、インビトロ（試験管内）安定性、インビボ安定性、脳透過性、及び／又は低毒性、を示すことを見出した。
【００１０】
この明細書で他に特定されない限り、この明細書で使用される命名はNomenclature of Organic Chemistry，SectionA, B, C, D, E, F, 及びH, Pergamon Press, Oxford, 1979（例示的化学構造名及び化学構造の命名に関する規則について、参照により本願に組み入れる）に一般に従う。場合によっては化合物の名前は、化学命名プログラム：ACD／ChemSketch, Version 5.09／September 2001, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canadaを使用して生じることもある。
【００１１】
“エナンチオマー的に純粋”とは、化合物中に含まれる二つの可能なエナンチオマーの合計量中に指名したエナンチオマーを少なくとも75％含む化合物を云う。特定の態様では、“エナンチオマー的に純粋”とは、化合物中に含まれる二つの可能なエナンチオマーの合計量中に指名したエナンチオマーを少なくとも90％含む化合物を云う。更に特定の態様では、“エナンチオマー的に純粋”とは、化合物中に含まれる二つの可能なエナンチオマーの合計量中に指名したエナンチオマーを少なくとも95％含む化合物を云う。
【００１２】
“温血動物”は人を含む。
【００１３】
一側面で、本発明は式Ｉの化合物、その薬学的許容塩、その溶媒和物、そのプロドラッグ、そのジアステレオマー、そのエナンチオマーの１つ又はそれ以上、及びそれらの混合物を提供する：
【化１】
2008508350.tif 000002
【００１４】
１つの態様では、本発明の化合物は下記の化合物、その薬学的許容塩、その単離されたエナンチオマーの１つ又はそれ以上、及びその混合物から選び得る：
【化２】
2008508350.tif 000003
【００１５】
別の態様では、本発明の化合物は下記の化合物、及びその薬学的許容塩から選び得る：
【化３】
2008508350.tif 000004
【００１６】
更なる態様では、本発明の化合物は下記の化合物、及びその薬学的許容塩から選び得る：
【化４】
2008508350.tif 000005
【００１７】
更なる態様では、本発明の化合物は下記の化合物、及びその薬学的許容塩から選び得る：
【化５】
2008508350.tif 000006
【００１８】
更なる態様では、本発明の化合物は下記の化合物、及びその薬学的許容塩から選び得る：
【化６】
2008508350.tif 000007
【００１９】
更なる態様では、本発明の化合物は4−｛(S)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロ
ベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド; 4−｛(R)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド; 4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(2−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチルベンズアミド; 4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(3−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル] メチル]−N,N−ジエチル−ベンズアミド、及びその薬学的許容塩から選び得る。
【００２０】
更なる態様では、本発明の化合物はエナンチオマー的に純粋な4−｛(S)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド; エナンチオマー的に純粋な4−｛(R)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド; エナンチオマー的に純粋な4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(2−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチルベンズアミド; エナンチオマー的に純粋な4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(3−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル] メチル]−N,N−ジエチルベンズアミド、及びその薬学的許容塩から選び得る。
【００２１】
本発明の化合物が１つ又はそれ以上のキラル（不斉）中心を含む場合は、本発明の化合物はエナンチオマー形若しくはジアステレオマー形、又はラセミ混合物として存在しそして単離され得ることが理解されるであろう。本発明は、式Ｉの化合物のあらゆる可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体又はそれらの混合物を含む。本発明の化合物の光学活性形は、例えば、ラセミ体のキラルクロマトグラフィー分離、光学活性な出発材料からの合成、又は以下に記載する手順に基づく非対称合成法により製造し得る。
【００２２】
本発明のある種の化合物は溶媒和物形態、例えば水和物形態、並びに非溶媒和物形態で存在し得ることも理解されるであろう。本発明はかかる溶媒和形態の式Ｉの化合物の全てを包含することが更に理解されるであろう。
【００２３】
式Ｉの化合物の塩もまた本発明の範囲内である。一般に、本発明の化合物の薬学的許容塩は、例えば、充分に塩基性の化合物、例えばアルキルアミン、を適当な酸、例えばHCl又は酢酸、と反応させて生理的に許容されるアニオンを得ることにより、当業界で良く知られた標準的手順を用いて得ることができる。適当な酸性プロトンを有する本発明の化合物、例えばカルボン酸又はフェノール、を水性媒体中で等量のアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属の水酸化物若しくはアルコキシド(例えばエトキシド又はメトキシド)、或いは適当に塩基性の有機アミン(例えばコリン又はメグルミン)で処理し、次いで慣用の精製技術により、対応するアルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム、又はリチウム）塩又はアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩を製造することも可能であろう。
【００２４】
一態様では、上記式Ｉの化合物を薬学的許容塩又はその溶媒和物、特に酸付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩又はｐ−トルエンスルホン酸塩、に変換し得る。
【００２５】
本発明の新規化合物は治療、特に種々の疼痛症状、例えば慢性疼痛、神経疼痛、急性疼痛、癌疼痛、リウマチ性関節炎によって生じる疼痛、片頭痛、内臓疼痛等、の治療に有用である。しかしながら、この掲示は包括的であると解釈すべきではない。
【００２６】
本発明の化合物は下痢、鬱病、不安症及び／又はストレス関連障害、例えば外傷後ストレス障害、パニック障害、全般的不安障害、社会恐怖症、及び強迫神経症障害、尿失禁、早漏、種々の精神的病気、咳、肺浮腫、種々の胃腸障害、例えば便秘、機能的胃腸障害、例えば過敏性腸症候群、及び機能的消化不良、パーキンソン病、及び他の運動障害、外傷性脳損傷、発作、心筋梗塞後の心臓保護(cardioprotection)、脊髄のけが及び薬物依存症の治療、アルコール、ニコチン、オピオイド及び他の薬物乱用の治療、及び交感神経系の障害、例えば高血圧、の治療を含めた治療に有用である。
【００２７】
本発明の化合物は免疫調節剤として、特に関節炎のような自己免疫疾患、植皮、臓器移植及び同様の外科的要求、膠原病、種々のアレルギー用の免疫調節剤として、抗腫瘍剤として及び抗ウイルス剤として使用するのに有用である。
【００２８】
本発明の化合物は、オピオイド受容体の変性又は機能不全がパラダイム中に存在するか又は関連する病状に有用である。これは、本発明の化合物の同位体的標識変形物を診断技術及び陽電子射出断層撮影法(PET)のような画像応用に使用することを含む。
【００２９】
本発明の化合物は、一般的麻酔及び監視した麻酔介護中に使用するための鎮痛剤として有用である。異なる性質を有する薬剤の組み合わせが、麻酔状態（例えば記憶喪失、痛覚消失、筋肉弛緩及び鎮静）を維持するのに必要な効果のバランスを達成するためにしばしば使用される。この組み合わせに含まれるのは、吸入麻酔薬、睡眠薬、抗不安薬、神経筋遮断薬、及びオピオイドである。
【００３０】
前に定義した式Ｉのあらゆる化合物を医薬の製造に使用することは本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明のあらゆる化合物を、急性疼痛、慢性疼痛、神経痛、背痛、癌疼痛、及び内臓痛を含むがこれらに限定されない痛みの治療用医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【００３２】
本発明のあらゆる化合物を、社会恐怖症、全般的不安障害、急性不安症を含むがこれらに限定されない不安症の治療用医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【００３３】
本発明のあらゆる化合物を、鬱病の治療用医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【００３４】
本発明のあらゆる化合物を、パーキンソン病の治療用医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【００３５】
本発明のあらゆる化合物を、前に論じたあらゆる症状の治療用医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【００３６】
本発明の更なる側面は、前に論じたあらゆる症状を患う対象の治療方法であり、ここで本発明の化合物の有効量をかかる治療が必要な患者に投与する。
【００３７】
従って、本発明は、治療に使用するための、前に定義した式Ｉの化合物又はその薬学的許容塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００３８】
本願明細書の文脈で、用語 “治療(therapy)”は、他の特定の指示がない限り、“予防”も含む。用語“治療的”及び“治療的に”はそれに合わせて解釈すべきである。本願明細書の文脈で用語“治療”は更に、本発明の化合物の有効量を投与すること、前に存在する急性若しくは慢性の病状、又は繰り返す症状を和らげることを包含する。この定義はまた、繰り返す症状を予防するための予防的治療及び慢性障害の継続的治療を包含する。
【００３９】
人のような温血動物における治療のための使用において、本発明の化合物は、慣用の薬学的組成物の形態で、経口、筋肉内、皮下、局部的、鼻腔内、腹腔内、胸部内、静脈内、硬膜外、さや内、脳室内を含むあらゆる経路により、及び関節への注入により投与し得る。
【００４０】
本発明の一態様では、投与経路は経口、静脈内又は筋肉内であることができる。
【００４１】
投与量は、投与経路、病気の重症度、患者の年齢及び体重、及び担当医が個々の処方計画及び投与量を特定の患者に最も適当であるように決定する場合に通常考える他の要因に依存するであろう。
【００４２】
更に、本発明の化合物、その溶媒和物、又はその薬学的許容塩を薬学的に許容される担体と共に含む薬学的組成物が提供される。
【００４３】
特に、本発明の化合物、その溶媒和物、又はその薬学的許容塩を薬学的に許容される担体と共に含む治療用、更に特に痛み及び不安症の治療用の薬学的組成物が提供される。
【００４４】
更に、本発明の化合物、その溶媒和物、又はその薬学的許容塩を薬学的に許容される担体と共に含む、前に論じたいずれかの症状に使用する薬学的組成物が提供される。
【００４５】
本発明の化合物から薬学的組成物を調製するためには、不活性の薬学的に許容される担体は固体及び液体のいずれかであることもできる。固体形態の製剤には粉剤、錠剤、分散性顆粒剤、カプセル剤、カシェ剤、及び坐薬が含まれる。
【００４６】
固体担体は１つ又はそれ以上の物質であることができ、それは希釈剤、風味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁剤、結合剤、又は錠剤崩壊剤としても作用し得；また封入材料であることができる。
【００４７】
粉剤においては、担体は微粉砕固体であり、それは微粉砕した本発明の化合物、又は活性成分との混合物である。錠剤においては、活性成分は、必要な結合性を有する担体と適当な割合で混合され、そして所望の形状及び大きさに成形される。
【００４８】
坐薬組成物を調製するには、脂肪酸グリセリドとココアバターとの混合物のような低融点ワックスをまず融解し、そして活性成分を例えば攪拌によりその中に分散させる。次に融解した均質混合物を便利な大きさの型に注ぎ、冷却しそして固化させる。
【００４９】
適当な担体は炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、砂糖、ペクチン、デキストリン、澱粉、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、ココアバター等である。
【００５０】
用語“組成物”はまた、活性成分と担体としての封入材料との配合物であって、活性成分(他の担体を有する又は有しない)が担体により囲まれ、従って担体が活性成分と共同してカプセル剤を与える配合物を含むことが企図されている。同様に、カシェ剤が含まれる。
【００５１】
錠剤、粉剤、カシェ剤及びカプセル剤は、経口投与に適した固体投与形として使用することができる。
【００５２】
液体形組成物には、溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。例えば、活性化合物の殺菌水又は水プロピレングリコール溶液は、非経口投与に適した液体製剤であり得る。液体組成物は、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液にも処方することができる。
【００５３】
経口投与用の水溶液は、活性成分を水に溶解し、そして所望により適当な着色剤、風味剤、安定剤、及び増粘剤を加えることにより調製することができる。経口用の水性懸濁液は、微粉砕活性成分を、天然ゴム、合成ゴム、樹脂、メチルセルロ−ス、ナトリウムカルボキシメチルセルロースのような粘性材料、及び薬学的処方技術に知られた他の懸濁剤と共に水に分散させることにより製造できる。
【００５４】
投与態様に依存して、薬学的組成物は好ましくは本発明の化合物を0.05％〜99％ｗ(質量％)、更に好ましくは0.10〜50％ｗ含む。全ての質量％は全組成物に基づく。
【００５５】
本発明の実施のための治療的有効量は、年齢、体重及び個々の患者の反応を含む公知の基準を用いて決定し得、そして治療しようとする又は予防しようとする病気の状況内で、当業者に解釈される。
【００５６】
更なる観点では、本発明は、本発明の化合物の製造法を提供する。
【００５７】
一態様では、本発明は下記を含む式Ｉの化合物の製造法を提供する：
【化７】
2008508350.tif 000008
N,N−ジエチル−4−[(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミドをR−CH2X又はR−CHOと反応させてニトロ中間体化合物を形成し；
該中間体化合物を適当な還元剤で還元する
（式中、Ｒは2−フルオロフェニル、3−フルオロフェニル及び4−フルオロフェニルから選ばれ；そしてＸはCl、Ｉ、Br,−OTs (トシル)及び−OMs (メシラート)から選ばれる）。
【００５８】
一態様では、該還元剤は水素、亜鉛及び鉄から選ばれ得る。
【００５９】
別の態様では、該N,N−ジエチル−4−[(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミドは、N,N−ジエチル−4−[(S)−(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミド及びN,N−ジエチル−4−[(R)−(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミドから選ばれ得る。
【００６０】
更なる態様では、Ｒは2−フルオロフェニル；そして式Ｉの化合物は4−[(3−アミノフェニル)[4−[(2−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチルベンズアミドであり得る。
【００６１】
更なる態様では、Ｒは3−フルオロフェニル；そして式Ｉの化合物は4−[(3−アミノフェニル)[4−[(3−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチルベンズアミドであり得る。
【００６２】
更なる態様では、Ｒは4−フルオロフェニル；そして式Ｉの化合物は4−[(3−アミノフェニル)[4−[(4−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル]メチル]−N,N−ジエチルベンズアミドであり得る。
【００６３】
更に詳しくは、本発明の化合物及びその製造に使用される中間体は、スキーム１及び２に例示されるような合成経路に従って製造できる。
【００６４】
【化８】
2008508350.tif 000009
【００６５】
【化９】
2008508350.tif 000010
【００６６】
生物学的評価及び性質
本発明の化合物は温血動物、例えば人、におけるδ受容体に対して活性であることが見出される。特に本発明の化合物は有効なδ受容体リガンドであることが見出される。インビトロ検定は、以下にラット脳機能検定及び／又はヒトδ受容体機能検定(低)に例証されるように、これらの驚くべき活性、特にアゴニスト効力及び効能に関する活性を例証する。この特徴はインビボ活性に関係するかもしれず、そして結合親和性に線形的に関連しないであろう。これらのインビトロ検定で、化合物をδ受容体に対する活性についてテストし、そしてIC50を得て、特定化合物のδ受容体に対する選択的活性を決定する。現在の文脈で、IC50は一般に、標準放射性δ受容体リガンドの５０％置換が観測されたときの化合物の濃度を云う。
【００６７】
κ及びμ受容体に対する化合物の活性もまた同様の検定で測定される。
【００６８】
インビトロモデル
細胞培養
クローン化ヒトκ、δ及びμ受容体、並びにネオマイシン抵抗を発現するヒト293S細胞を、カルシウム無しのDMEM10％ FBS、５％ BCS、0.1％ Pluronic F−68、及びゲネチシン（geneticin）600μg／mlを含むシェーカーフラスコ内で、懸濁液中で37℃及び５％ CO2で生育させる。
ラット脳を秤量し、氷冷PBS (2.5mM EDTAを含む、pH 7.4)中ですすぐ。該脳を、ポリトロン（polytron）を用いて30秒間(ラット)氷冷溶解バッファ(50mM トリス, pH 7.0, 2.5mM EDTA, 使用直前にDMSO：エタノール中の0.5Ｍ原液からの0.5MmMに加えたフェニルメチルスルホニルフロリド)中で均質化する。
【００６９】
膜調製
細胞をペレット化しそして溶解バッファ(50mM トリス, pH 7.0, 2.5mM EDTA, 使用直前にエタノール中の0.1Ｍ原液からの0.1mMに加えたPMSF)中に再懸濁し、氷上で15分インキ
ュベートし、次にポリトロンで30秒間均質化する。懸濁液を1000ｇ(最高)で10分間４℃で回転する。上澄みを氷上に保ち、そしてペレットを再懸濁しそして前のように回転させる。両回転物からの上澄みを合わせ、そして46,000ｇ(最高)で30分間回転させる。ペレットを冷トリスバッファ(50mMトリス／Cl, pH 7.0)に再懸濁し、そして再度回転させる。最終のペレットを膜バッファ(50mMトリス, 0.32Mスクロース, pH 7.0)に再懸濁させる。ポリプロピレン管中のアリコート(１ml)をドライアイス／エタノール中で凍結させ、使用まで−70℃で保存する。タンパク質濃度を、ナトリウムドデシル硫酸ナトリウムを用いて変更ローリー(modified Lowry)検定により決定する。
【００７０】
結合検定
膜を37℃で解凍し、氷上で冷却し(又は直ぐに使用しない場合は氷上に保持し)、３回25−ゲージ針に通し、そして結合バッファ(50mMトリス, ３mM MgCl2, １mg／ml BSA (Sigma A-7888), pH 7.4)に希釈し、それを0.22mフィルターを通して濾過後、４℃で保存し、そして膜が組織(ラット、マウス、猿、DTTなし)から誘導された場合はそれにアプロチン５μg／ml、ベスタチン10μM、ジプロチンA10μMを新たに加える。アリコート100μlを、適当な放射性リガンド100μl及びいろいろな濃度のテスト化合物100μlを含む氷冷12×75mmポリプロピレン管に加える。全(TB)及び非特異性(NS)結合を、それぞれナロキソン10μMの不存在下及び存在下で決定する。該管を渦混合し、そして25℃で60−75分間インキュベートし、その時間後、内容物を急速に減圧濾過し、そして約12ml／管の氷冷洗浄バッファ(50mMトリス, pH 7.0, ３mM MgCl2)を用いて、少なくとも２時間0.1％ポリエチレンイミンに予備浸漬したGF／Bフィルター(Whatman)を通して洗う。フィルターに保持された放射能(dpm)を、該フィルターを少なくとも12時間、シンチレーション流体６−７mlを含む小瓶に浸漬後、ベータカウンターで測定する。検定が96−箇所深穴プレートで設定された場合は、濾過は96−箇所PEI−浸漬したユニフィルター上で行い、該ユニフィルターを洗浄バッファ３×１mlで洗浄し、そしてオーブンで55℃にて２時間乾燥する。フィルタープレートをTopCount(Packard)で、MS−20シンチレーション流体50μl／穴を添加した後、計数する。検定を96深穴プレートで行った場合、化合物のIC50はデルタの場合10−点置換曲線、そしてミュー及びカッパの場合５−点置換曲線から評価する。検定は、適当量の膜タンパク質(デルタの場合２μg、ミューの場合35μg、そしてカッパの場合１μg)及び適当なトレーサー(それぞれデルタ、ミュー及びカッパに対して125I−Deltorphin II、125I−FK33824、及び125I−DPDYN) 50000−80000dpm／穴を用いて300μl中で行う。全結合及び非特異性結合をナロキソン10μMの不存在下及び存在下で測定する。
【００７１】
機能性検定
化合物のアゴニスト活性を、化合物受容体複合体がGTPの受容体が結合したＧ−タンパク質への結合を活性化する程度を決定することにより測定する。GTP結合検定において、GTP[γ]35Sを、テスト化合物及びクローン化ヒトオピオイド受容体を発現するHEK−293S細胞からの膜又は均質化ラット若しくはマウス脳からの膜と組み合わせる。アゴニストはこれらの膜中のGTP[γ]35S結合を刺激する。化合物のEC50値及びEmax値は用量−反応曲線から決定する。デルタアンタゴニストナルトリンドール（naltrindole）による投与量反応曲線の右へのシフトは、アゴニスト活性がデルタ受容体を介して媒介されることを立証するために行う。ヒトδ受容体機能検定には、EC50(低)は、検出に使用したヒトδ受容体がEC50(高)を決定するために使用したものと比べて低いレベルで発現した場合に、測定する。Emax値は標準δアゴニストSNC80に対して決定した。即ち、100％超はSNC80よりも効能がよい化合物である。
【００７２】
ラット脳GTPに対する手順
ラット脳膜を37℃で解凍し、25−ゲージ平滑末端針を３回通し、そしてGTPγS結合液(50mMヘペス, 20mM NaOH, 100 mM NaCl, １mM EDTA, ５mM MgCl2, pH 7.4, 新しいうちに添加する：１mM DTT, 0.1％ BSA )中に希釈する。120μM GDP最終を膜希釈液に加える。化合物のEC50及びEmaxを、適当量の膜タンパク質(20μg／穴)及び100000−130000dpmのGTPγ35S／穴(0.11−0.14nM)を用いて300μl中で行った10点用量−反応曲線から評価する。基本的及び最高の刺激結合は３μMのSNC80の非存在下及び存在下で決定する。クローン化デルタ受容体を安定して発現するHEK293S細胞に対して行う検定は、僅かに異なるバッファ(50mMヘペス, 20mM NaOH, 200mM NaCl, １mM EDTA, ５mM MgCl2, pH 7.4, 新たに添加: 0.5％ BSA, DTTなし)中でGDP ３μM最終濃度で行う。
【００７３】
データ分析
特異性結合(SB)をTB−NSとして計算し、種々のテスト化合物の存在下でのSBを対照SBパーセントとして表した。特異的に結合された放射性リガンドを変位する際のリガンドのIC50値及びヒル係数(nH)は、ロジットプロット又はカーブフィッティングプログラム、例えばLigand、GraphPad Prism、SigmaPlot、又はReceptorFit、から計算した。Ki値はCheng-Prussoff式から計算した。IC50、Ki及びnHの平均±S.E.M.値は、少なくとも３つの置換曲線で試験したリガンドについて報告した。
【００７４】
表１は上記の検定を用いて測定した本発明のある化合物の生物学的データのいくつかを示す。
【表１】
2008508350.tif 000011
【００７５】
受容体飽和実験
放射性リガンドKδ値を、推定Kδの0.2〜５倍の範囲（必要な放射性リガンドの量が実施可能であれば１０倍まで）の濃度の適当な放射性リガンドを用いて、細胞膜に対して結合検定を行うことによって決定する。特異的放射性リガンド結合をpmole／mg（膜たんぱく質）として表す。個々の実験からのKδ及びBmaxの値は、ワンサイトモデルに従って、個体（individual）からの特異性結合(Ｂ)対nMフリー(free)(Ｆ)放射性リガンドの非線形フィット(fits)から得られる。
【００７６】
フォン フライ試験（Von Frey Testing）を用いたメカノ−アロジニア(Mechano−Allodynia)の測定
試験を08：00から16：00時の間、Chaplan外(1994)に記載された方法を用いて行う。ラットを、プレキシグラスかご内の、足に近づくことを可能にする金網底の上に置き、10−15分間慣らす。試験した領域は左後ろ足の中央足底であり、感度がより低い足肉趾を避ける。足を、縦方向に硬度が増加する一連の８本のフォンフライ毛(0.41、0.69、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、及び15.14グラム; Stoelting, Ill, USA)に触れさせる。フォンフライ毛は金網床の下から足底表面に垂直に、足に対して僅かな屈折を起こすに十分な力で当て、そしてほぼ６−８秒間保持する。足を急に引込めた時に正の反応を書き留める。該毛を除くと直ちに尻込みするのも正の反応と考える。動き回りは曖昧な反応と考え、かかる場合は刺激を繰り返す。
【００７７】
試験プロトコル
動物をFCA−処理グループに対して手術後１日に試験する。50％引込め閾値を、ディクソン(Dixon)(1980)のアップダウン法(up−down method)を用いて決定する。試験は一連の系の真ん中の2.04ｇの毛を用いて始める。刺激は、上昇であろうと下降であろうと、常に連続的な方法で与える。最初に選んだ毛に対して足引込め反応がないと、より強い刺激を与える。足引込めがある場合、次に弱い刺激を選ぶ。この方法による最適閾値計算は、50％閾値の直近くに６つの反応を必要とし、そしてこれらの６つの反応の計数は、反応における最初の変化が生じた時、例えば閾値が初めて乗り越えられた時、始める。閾値が刺激の範囲外に落ちた場合、それぞれ15.14 (正常な感度)又は0.41 (最高の異痛(allodynic))の値を割当てる。得られる正反応及び負反応のパターンを、変換、Ｘ＝引込めなし；Ｏ＝引込め、を用いて集計し、50％引込め閾値を、式：
50％ ｇ 閾値 ＝ 10(Xf+kδ)／10,000
〔ここで、Xf＝使用した最後のフォンフライ毛の値(log単位); ｋ＝正／負反応パターンについての集計値(Chaplan外(1994)から); そしてδ＝刺激(log単位)間の平均差〕を用いて内挿する。ここで、δ＝0.224である。
【００７８】
フォンフライ閾値をChaplan外、1994に従って、最大可能効果パーセント(％ MPE)に変換する。下記の等式が％ MPEを算出するのに使用される:
％ MPE ＝［薬物処理閾値(ｇ)−異痛閾値(ｇ)×100]／[対照閾値(ｇ)−異痛閾値(ｇ)]
【００７９】
テスト物質の投与
ラットに、フォンフライ試験前にテスト物質を注入(皮下、腹腔内、静脈内又は経口的に)する。テスト化合物の投与とフォンフライ試験の間の時間はテスト化合物の性質に依存して変化する。
【００８０】
苦悶試験
酢酸は、マウスに腹腔内投与した場合、腹部けい縮をもたらすであろう。マウスは次に身体を典型的なパターンで伸ばすであろう。鎮痛薬を投与すると、この記述した動きが観察される頻度がより少なくなり、そして薬物は潜在的に良好な候補として選ばれる。
完全且つ典型的な苦悶反射作用は、下記の要素が存在する場合のみ考えられる。動物が動いていない；背下部が僅かに凹んでいる；両足の足底面が観察できる。この検定で、本発明の化合物は１−100μmol／kg経口投与後に苦悶反応を著しく阻止することを示す。
【００８１】
(ｉ) 溶液の調製
酢酸(AcOH): 酢酸120μLを蒸留水19.88mlに加えて、最終容量20ml及び最終濃度0.6％AcOHを得る。次に溶液を混合し(渦巻き)そして注射できる状態になる。
化合物(薬物): 各化合物を標準的手順に従って調製しそして最も適したベヒクルに溶解する。
(ii) 溶液投与
化合物(薬物)を経口的、腹腔内(i.p.)、皮下(s.c.)又は静脈内(i.v.)に10ml／kg(平均マウス体重を考慮)で、試験の20、30又は40分前(化合物の種類及びその特性に従う)に投与する。化合物が中枢に送達される場合：脳室内(i.c.v.)又は鞘内に容量５μLが投与される。
AcOHは腹腔内(i.p.)に２つの部位に10ml／kg (平均マウス体重を考慮)で試験直前に投与する。
(iii) 試験
動物(マウス)を20分間観察し、出来事(苦悶反射)の回数を記録しそして実験の終わりに編集する。マウスを個々の“靴箱”型のかごに寝具類と接触して飼育する。通常合計４匹のマウスが同時に観察される；１匹は対照そして３匹は薬物投与である。
不安症及び不安症様の徴候については、ラットにおけるgeller−seifter葛藤試験で効能を確立した。
機能的胃腸障害徴候については、ラットにおけるCoutinho SV 等によるAmerican Journal of Physiology − Gastrointestinal & Liver Physiology. 282(2):G307−16, 2002 Feb,に記載された検定で効能を確立することができる。
【００８２】
追加のインビボ試験プロトコル
対象及びハウジング
実験未使用の雄Sprague Dawleyラット(175−200ｇ)を５匹ずつのグループに温度制御室(22℃, 湿度40−70％, 12時間の明／暗)に収容する。実験はサイクルの明相中に行う。動物は自由に食物と水を与えられ、データが得られた直後、と殺される。
【００８３】
サンプル
化合物(薬物)試験は、いかなる治療も受けないラットのグループと、大腸菌（E. Coli）リポ多糖類(LPS)で処理した他のグループを含む。LPS−処理実験のために、４グループにLPSを注入し、４グループの１グループを次にベヒクル処理し、他の３グループに薬物とそのベヒクルを注入する。第２組の実験は５グループのラットをふくめて行われ、それらのすべてはLPS処理を受けない。実験未使用のグループは化合物(薬物)又はベヒクルを投与されず；他の４グループは薬物と共にまたは薬物なしでベヒクルで処理する。これらは、USVの低減に寄与することができる薬物の抗不安効果又は鎮静効果を決定するために行う。
【００８４】
LPSの投与
ラットを処理前に実験室で15−20分間慣らす。LPS (グラム陰性大腸菌血清型0111:B4の内毒素、Sigma)の投与により炎症を誘発する。LPS (2.4μg)を、10μlの容量で、イソフルレン麻酔下で標準的定位外科技術を用いて脳室内(i.c.v.)に注射する。耳の間の皮膚をくちばし状に押し、そして約１cmの縦方向切開をして頭蓋骨表面を露出させる。刺し傷部位を座標により決定する：ブレグマの0.8mm後部、ラムダ（矢状縫合）に対して1.5mm横（左）、そして側脳室内の頭蓋骨の表面（垂直）から５mm下。LPSを、ポリエチレン管(PE20; 10−15cm)により100μl Hamilton注射器に取り付けた５mm長の殺菌ステンレス鋼針(26−G 3／8)により注入する。切断針(20−G)から作った４mmのストッパーを置きそしてシリコーン接着剤により26−G針に固定して所望の深さ５mmを生じさせる。
LPSの注入後、針を更に１０秒間そのままに置いて化合物を拡散させ、次に取り除く。切開創を閉じ、そしてラットを元のかごに戻し、試験前最低3.5時間休ませる。
【００８５】
エアーパフ(air−puff) 刺激のための実験準備
ラットをLPS注入及び化合物(薬物)投与後、実験室に留め置く。試験の時、全てのラットを取り出しそして実験室の外に置く。一時に１匹のラットを試験室に持っていき、透明な箱(９×９×18cm)に入れ、それを次に音減衰換気小部屋62(ｗ)×35(ｄ)×46(ｈ)cm (BRS／LVE, Div. Tech−Serv社)に置く。0.32cmの空気排出ノズルを通してのエアーパフの送達は、エアーパフを固定時間（0.2秒）そして固定強度で１パフ／10秒の頻度で送ることができるシステム（AirStim、San Diego Intruments）により制御する。最大10パフを与えるか、又は最初に起こる発声(vocalisation)が開始するまでパフを与える。最初のエアーパフは記録の開始の印となる。
【００８６】
超音波記録のための実験準備
発声を、各小部屋内に置かれそしてLMS (LMS CADA−X 3.5B、Data Acquisition Monitor、Troy、Michigan)ソフトウェアで制御されたマイクロホン(G.R.A.S. 音及び振動、Vedbaek、デンマーク)を用いて１０分間記録する。０と32000Hzの間の振動数を記録し、保存しそして同じソフトウェア〔LMS CADA−X 3.5B, Time Data Processing Monitor及びUPA(User Programming and Analysis)〕で分析する。
【００８７】
化合物(薬物)
全化合物(薬物)を6.5と7.5の間にｐＨ調節し、そして４ml／kgの容量で投与する。化合物(薬物)投与後、動物を試験時までもとのかごに戻す。
【００８８】
分析
記録は一連の統計及びフーリェ解析を通して行って、フィルターを通し(20−24kHzの間)そして対象とするパラメータを計算する。データは平均( SEMとして表す。統計的有意性を、未処理のラットとLPS−処理ラットとの比較のためのＴ−テスト、及びワンウェイANOVA、次いで薬物有効性についてのDunnettの多重比較検定(post−hoc)を用いて評価する。グループ間の差異を、最小ｐ値≦0.05で有意と考える。実験を最低２回繰り返す。
【００８９】
Hargreaves足底試験を用いた温熱性痛覚過敏の測定
FCA又はカラギーナンの投与
フロイント完全アジュバント(FCA)：熱殺菌、乾燥したSIGMA カタログNo. F 5881, ヒト型結核菌(Mycabacterium tuberculosis) (H37Ra, ATCC 25177)１mg／ml、パラフィン0.85ml，モノオレイン酸マンニド(mannide monooleate) 0.15ml。或いはカラギーナンLambda型IV(Cg)：SIGMA カタログNo.C−3889, (ゼラチン、野菜；トチャカ)、NaCl中(1.0％溶液)。
注射を、26G5／8"サイズの殺菌針を有するHamilton注射器で行う。ラットをイソフランでの麻酔のために扱いそして室に入れる。所望の効果が達成されると、ラットを取り出しそして腹臥位(胸骨位置)に置く。左後ろ足をつかみ、そして針を皮下の腹側に第２指と第３指の間の足肉趾に導入して、足の真ん中(中足骨領域)に達するようにする。最後に、容量100μlのFCA、又は100μlのカラギーナン溶液をゆっくり足に注入し、そして針を除去した後、少しの圧力を３−４秒かける。
手順中動物が眼を覚ますと、動物を所望の効果が達成されるまで吸入室に戻す。足底注入後、動物をかごの中で観察下に目覚めさせる。
FCA処理のために、ラットを、炎症過程を進展させるために48時間放置する。カラギーナン処理にために、ラットを、炎症過程を進展させるために３時間放置する。試験の朝、ラットを実験室（かごの中）に置く。ラットを少なくとも30分間部屋に慣らす。
【００９０】
試験部位
熱刺激を肉趾の間の足底表面の中央に適用する。試験部位は、ガラスから皮膚への正しい熱移動を維持するために、間に尿又は糞便がないようにガラスと接触していなければならない。
足底装置は、ガラスの頂部／プラットホームを有する箱から成り、ガラス表面は内部フィードバック機構により30℃に維持される。このガラスプラットホームの下は可動性アームに設けられた電球があり、鏡が下に置かれて、光がラットの足の下に位置するようにする。光が作動すると、光は直径約２mmの孔を通過して輝く。実験者は光を作動し、そして自動センサーは足が取り除かれた時、光を消す。20.48秒の遮断により、万一ラットがその足を取り除かなくても確実に組織の損傷が起こらないようにする。実験者はまたいつの時点でも光を消すことができる。タイマーは光が作動している時間を記録するであろう。
フラックスメータは、光が作動しているときフラックス／cm2を測定する。これは約97−98に維持しなければならない。フラックスは足底器具を調節することにより変更することができるが、実験の途中では決して変えてはならない。
【００９１】
時間的経過
実験は、炎症誘発後、時間の長さを変えた後に行うことができる。痛覚過敏はFCA注入48時間後、又はカラギーナン注入３時間後測定する。
【００９２】
試験の手順
未投薬ラット：用量反応曲線を確立する手順のために、7匹のラットのグループを対照グループとして使用した。それらは残りの28匹のラットと共に麻酔したが、どのような注射もしなかった。未投薬グループの試験は実験の開始前又は実験直後のいずれかで、ありえる最小のストレスで行い得る。ラットを個々のプレキシグラス（商標）箱(14×21×９cm)中の足底器具の上部に置く。それらを30分の時間慣らす。動物のテストの準備ができた時、明かりをテスト部位の直下に置きそして点灯し、引込めまでの待ち時間を記録する。皮膚の温度を正常温度に戻すための５−８分の時間後、２回目の読み込みを取り出し、そして次にラットを取り出し、それらのかごに戻す。
ベースライン値：FCA（又はカラギーナン）を注射した残りの28匹のラット(４グループに分ける)を機械上の個々の箱に置き、30分間慣らす。実験者は足の炎症度を確認しそして変色を検査しなければならない。熱刺激を試験部位の下に置き、そして引込めまでの待ち時間を記録し、上記のように２つの読み込みを取り出す。痛覚過敏が在るか否かを確立するのは、これらのベースライン値と未投薬動物のベースライン値との比較である。
薬物試験後：一旦痛覚過敏が確立されると、ラットに対象とする化合物を注射する。各化合物を調製し、標準的な手順に従って最も適したベヒクルに溶解させる。投与経路、投与量、容量、及び注射後の試験の時間はその化合物(又は化合物の種類)に特有である。i.v.又はs.c.注射のような注射から20−30分後に化合物を試験する場合、ラットを足底装置の上に置きそして慣らし、その間、薬物はその効果を生じる。化合物を注射後60分又はそれ以上後に試験する場合、ラットを元のかごにかご仲間と共に戻す。ラットは常に元のかごに元のかご仲間と共に戻して、ラットのグループ内で社会構造を再確立するストレスを最小にする。30分後、ラットを足底機械の上に置き、足底機械に30分間慣らす。試験は上記のようにして行う。２回の読み込みを取り出す。
【００９３】
試験の基準：
動物は沈静化し落ち着いており、しかも機敏でなければならず、そして正しい位置に、足の皮膚と機械のガラス表面との間に尿又は糞便が無い状態でなければならない。動物は、下記の場合は試験してはならない：
- 動物がクンクン鼻をかぐ、身づくろい及び探査行動を含めて、動き回っている。
- 動物が眠っている。
- 動物が明白なストレスのサインを示している〔緊張性不動、発声、耳が平ら(ears flat)〕。但し、これらが化合物の副作用により起こり得る結果ではなく、避けられないのではない場合。
- 動物が、足をガラスに直接接しないように置かれている(足が尾の上部に置かれている)；
- 動物の足が、下手な注射の結果、青く着色している。この場合、動物は実験から完全に（初めから）排除される。
【００９４】
尿又は糞便があると、動物を動かし、ガラス表面をきれいに拭き、次に動物を置く。動物が眠っている場合、又は緊張性不動を示している場合、実験者は静かに箱を動かすか、又は箱の前で手を動かして、短期間の注意挙動を誘い出す。動物の挙動の周到な観察を試験全体にわたって行わなければならない。
【００９５】
再試験；:
実験中のいかなる時にも、実験者は足引込め反応が熱刺激に対する反応でないことが確かでない場合は、動物を５−８分後に再試験してもよい。これは刺激が適用されている間に動物が突然動くか、又は排尿若しくは排便することによるかもしれない。
【００９６】
許容される反応：
下記のいずれかは熱刺激への反応と考えられる：
- 足をガラスから引込める動き（しばしば足をなめた後）
- 身体の横方向の動き（刺激された足の反対側）
- つま先をガラスからどかせる
- 炎症を起こした足の中央平面（足の真ん中）面をガラスから動かす。
【００９７】
分析
データは平均±SEMとして表される。統計的有意性は、実験未使用のラットと炎症を起こしたラットとの比較のためのＴ−試験、及び一方向ANOVA、次いで薬物有効性についてのDunnettの多重比較検定(Dunnett's multiple comparison test)(post−hoc) を用いて評価する。グループ間の差異は最小ｐ値≦0.05で有意差ありと考えられる。
【００９８】
薬物代謝及び薬物動態的性質
驚くべきことに、化合物の１つ又はそれ以上の薬物代謝的性質及び薬物動態的性質は、式Ｉのベンジル−ピペラジニル基の基部ベンジル上のフルオロ置換により改良されることが見出された。一態様では、ある種の反応性代謝産物が本発明の化合物については減少又は除去されることが見出された。別の態様では、ある種の本発明の化合物は改良された生物学的利用能を与え、それは該化合物の2D6及び3A4シトクロムP450との弱い親和性から生じ得る。下記の検定は、これらの化合物のこれらの驚くべき性質の１つ又はそれ以上を例証する。
【００９９】
ミクロソームインキュベーション
本発明の化合物(10μM表示初期濃度)を個々に、0.1M KH2PO4バッファ(pH 7.4)中のラット肝臓ミクロソーム(0.5mg／mlタンパク質)で、５mM MgCl2及び５mM捕捉試薬〔グルタチオン(GSH), Ｎ−アセチルシスチン(NAC), 又はCH3ONH2〕と共に60分間37℃でインキュベートした。反応はNADPH(1mM)の添加により開始し、そして等容量の酸性化アセトニトリル(アセトニトリル中0.1％蟻酸)をインキュベーション混合物に添加することにより停止した。
【０１００】
肝細胞インキュベーション
本発明の化合物(表示初期濃度10μM)を個々に新たに単離したラット(Sprague Dawley)及び低温保存した犬(Beagle)肝細胞(１×106 細胞／mL)でpH7.4にて37℃で１時間インキュベートした。肝細胞インキュベーション混合物は、25mM HEPES, １％ ITS−G溶液(Life Technologies, カタログNo.41400−045)、10mM HEPES(pH 7.4)、及び２mMのL−グルタミンを補充したWilliams E Mediumを含んでいた。インキュベーションを、等容量の酸性化(0.1％蟻酸)アセトニトリルをインキュベーション混合物に添加することにより停止した。
【０１０１】
LS−MS分析
タンパク質沈殿後、サンプル上澄みを完全走査LC−MSにより代謝産物について分析した。分子量情報を検出した各代謝産物について得た。追加のLC−MS／MS実験からのフラグメンテーションパターンを分析して、主な代謝産物の構造を割り当てる助けとした。
【０１０２】
機器
HPLC    HP 1100 HPLCシステム(Hewlett Packard, D-76337, ヴァルドブロン，ドイツ)
MS      LCQ(Finnigan Corporation, 355 リバーオークス, サン  ホセ, カルフォルニア)
【０１０３】
MS条件(LCQ)
源電圧               4.5Kv
キャピラリ温度       180℃
シースガス流         80
オウク(Aux)ガス流    ５
源の型               EPI
イオン化モード       正
【０１０４】
HPLC 条件
カラム    Phenomenex Synergi MAX-RP, 4μ, 2.0×150mm(Phenomenex, トランス, カルフォルニア)
可動相    Ａ＝水中の0.1％蟻酸, Ｂ＝CAN
流速      0.2mL／min
温度      45℃
検出      LCQ質量分光計
【０１０５】
勾配法
時間             Ａ               Ｂ  
０              90               10
30              40               60
30.1            10               90
33              10               90
33.1            90               10
40              90               10  
【０１０６】
試験結果
化合物に観察された主な生体内変換経路はＮ−脱エチル化、Ｎ−脱アルキル化及びヒドロキシル化であった。フルオロ置換ベンジル−ピペラジニル基を有する本発明の化合物については、ベンゼン上のグルタチオン付加物はラット肝細胞インキュベート物に検出されなかった。これと対照的に、フルオロ置換ベンジル環を有しない類似の化合物については、環上のいくらかのグルタチオン付加物がラット肝細胞インキュベート物に検出された。
【０１０７】
生体内マイクロ透析法
手順
ラットを無作為に８つの処理グループに割り当てる：ベヒクル−鎮静化(quiet)、ベヒクル−ストレス、薬物−鎮静、薬物−ストレス。マイクロ透析プローブ(CMA／12, mPFCについて４mm膜長)を実験２時間前に脳に埋め込み、人工CSF (aCSF, CMA Microdialysis AB)を流速1.1mL／minで２時間かん流させて、ベースラインを安定化する。３個の20分サンプルを集めてベースラインを規定し、動物にベヒクル又は化合物を腹腔内注入し、そしてサンプル収集を次の５時間実施する。ストレスパラダイムプログラムを化合物の投与から20分後に開始する。サンプルを直ちに(オンライン)HPLC系に注入して、モノアミン濃度を分析する。化合物／ベヒクルの投与前に集めた３個のサンプル中の神経伝達物質の濃度を平均し、そしてベースライン(100％)として定義する。引き続くマイクロ透析物中の神経伝達物質の濃度を次にベースラインレベルの百分率として表す。
【０１０８】
ストレスの手順
ストレスの手順のために、照明、音調(tone)及び衝撃手段(shockers)を備えた標準的受動的回避箱を使用する(Med Associates，Inc.)。箱を音減衰室に入れる。ストレスパラダイムが１日にわたって起こる。動物を該室に２時間順応させ、次に一連の点滅光に６分のコースにわたってさらし、次いで電気フットショックに当てる(0.5秒間、強度1.5mA、合計10回のショック)。“沈静化”グループを照明のある室に露出させ、ショックは受けさせない。40分後、動物に光シーケンスを繰り返すが、ショックは与えない。
【０１０９】
薬物投与
全化合物を殺菌蒸留水(ベヒクル)に溶解し、ストレス手順をする日の２０分前、腹腔内(IP)投与する。
【０１１０】
HPLC及び電気化学的検出
HPLC系は5041ポンプ、モデル5200A Coulochem II検出器、MD−150 ３×150mmカラム、モデル5041 Amperometric cell(全てESA社製)及びオンライン注入器(BAS社製)から成る。可動相は：75mM Na2HPO4, 25mM EDTA, 1.7mM １−オクタンスルホン酸, トリエチルアミン100μl／L, 10％アセトニトリル, pH3.0である。電位は＋0.65Vに設定し、流速は0.3ml／minに維持する。データを、更なる分析のために集計表／グラフソフトウェアーに一体化しそして移したPCを基礎とした取得／分析系(501 Computer及びA／D Software, ESA社)を用いて収集する。
中央前葉前部皮質（ここでは神経化学シグナルが最も強い）に大脳内マイクロ透析プローブを入れて調製した６−８匹のラットのグループを上記の状態調節パラダイムに付した時、ノレピンフェリンルエピネフリン(NE)及びドーパミンの増加がベヒクル処理動物に観察される。ある種の本発明化合物はＮＥ及びドーパミンの持続的増加を遮断する。
【０１１１】
ゲラー−シーフター(Geller−Siefter)−不安症モデル法
葛藤試験において、空腹な動物を標準的操作室中で２つの条件下で食物供給に対してレバーを押す(lever−press)ように訓練する。非抑制コンポーネントと称される第１の条件で、食物を平均17回レバーを押した後に与える(VR17強化スケジュールとも呼ばれる)。抑制コンポーネントと云われそして操作室内の点滅光により信号で伝えられる第２の条件では、食物は平均17回レバーを押した後に与えるが、電気ショックを別のVR17スケジュールの下にかごの床に追加して伝える。１日のセッションは各コンポーネント(component)タイプ：抑制（持続時間３分）及び非抑制（持続時間３分）、を交互に５回の与えることから成る。抑制コンポーネント中で放出されるレバーを押す回数は非抑制コンポーネントと比べて明白に少ない。ジアゼパムのような抗不安剤は、ある投与量の範囲内で、抑制コンポーネント内で動物がするであろうレバー押し回数を、非抑制コンポーネント内で行われるレバー押し回数を変更することなく、増加させる。本発明のある種の化合物はこの手順で抗不安薬としての特徴を提示している。
【０１１２】
〔実施例〕
本発明を、本発明の化合物を製造、精製、分析及び生物学的試験する方法を記載する下記の実施例により更に詳しく記述する。該実施例は本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【０１１３】
中間体１：4−ヨード−N,N−ジエチルベンズアミド
CH2Cl2500mL中の４−ヨード−ベンゾイルクロリド(75ｇ)の混合物に、Et3N(50mL)とEt2NH (100mL)の混合物を０℃で加えた。添加後、得られた反応混合物を１時間で室温に温め、次に飽和塩化アンモニウムで洗った。有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮した。残留物を熱いヘキサンから再結晶化させて、中間体１ 80ｇを得た。
【０１１４】
中間体２：4−[ヒドロキシ(3−ニトロフェニル)メチル]−N,N−ジエチルベンズアミド
N,N−ジエチル−４−ヨードベンズアミド(5.0ｇ, 16mmol)をTHF(150mL)に溶かし、そして−78℃に窒素雰囲気下で冷却した。n−BuLi (15mL, ヘキサン中の1.07Ｍ溶液, 16mmol)
を10分間で−65ないし−78℃で滴下した。次に溶液をトルエン／THF (約1：1, 100mL) 中の３−ニトロベンズアルデヒド(2.4ｇ, 16mmol)に−78℃でカニューレ注入した。NH4Cl (水性)を30分後に加えた。減圧濃縮、EtOAc／水での抽出、乾燥(MgSO4)及び有機相の蒸発後、残留物をシリカ上のクロマトグラフィー(０−75％ EtOAc／ヘプタン)で精製して、中間体２ (2.6ｇ, 50％)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH  1.0−1.3 (m, 6H), 3.2
(m, 2H), 3.5 (m, 2H), 5.90 (s, 1H), 7.30−7.40 (m, 4H), 7.50 (m, 1H), 7.70 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.12 (m, 1H), 8.28 (m, 1H)。
【０１１５】
中間体３：N,N−ジエチル−4−[(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミド
アルコール中間体２ (10.01ｇ, 30.5mmol)のジクロロメタン(200mL)溶液に、臭化チオニル(2.58mL, 33.6mmol)を加えた。室温で１時間後、反応物を飽和水性重炭酸ナトリウム(100mL)で洗い、有機層を分離した。水性層をジクロロメタン(３×100mL)で洗い、合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮した。
粗製臭化ベンジルをアセトニトリル(350mL)に溶かし、そしてピペラジン(10.5ｇ, 122mmol)を加えた。反応物を１時間65℃に加熱した後、反応物を飽和塩化アンモニウム／酢酸エチルで洗い、そして有機層を分離した。水性層を酢酸エチルで抽出し(３×100mL)、合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮してラセミ中間体３を得た。
【０１１６】
中間体４ｂ：N,N−ジエチル−4−[(R)−(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミド
ラセミ中間体３をエタノール(150mL)に溶かし、そしてジ−p−トルオイル−D−酒石酸(11.79ｇ, １当量)を加えた。生成物が12時間にわたって沈殿した。固体をろ過により収集し、そして全固体が溶解するまで還流エタノール中に再溶解させた(エタノール約1200mL)。冷却して固体をろ過により集め、そして再結晶を２回繰り返した。固体をろ過により集め、水性水酸化ナトリウム(２Ｍ)で処理し、そして酢酸エチルで抽出した。次に有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過しそして濃縮して中間体４ｂ 1.986ｇを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δH 1.11 (br s, 3H), 1.25 (br s, 3H), 2.37 (br s, 4H), 2.91 (t, J = 5 Hz, 4H), 3.23 (br s, 2H), 3.52 (br s, 2H), 4.38 (s, 1H), 7.31−7.33 (m, 2H), 7.41−7.43 (m, 2H), 7.47 (t, J= 8 Hz, 1H), 7.75−7.79 (m, 1H), 8.06−8.09 (m, 1H), 8.30−8.32 (m, 1H)。
【０１１７】
キラル純度を下記の条件を使用してHPLCで決定した：
Chiralpack ADカラム(ダイセル化学工業)
低速１ml／分
操作時間30分、25℃
無勾配15％エタノール(0.1％ v／vのジエチルアミンを含む)、85％ヘキサン(0.1％v／vのジエチルアミンを含む)
分子の保持時間＝20分
【０１１８】
中間体４ａ：N,N−ジエチル−4−[(S)−(3−ニトロフェニル)(1−ピペラジニル)メチル]ベンズアミド
(Ｓ)エナンチオマー中間体４ａは、ジ−p−トルオイル−L−酒石酸を用いた上記の分割手順を行うことにより得ることができる。
【０１１９】
化合物１：4−｛(S)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド
【化１０】
2008508350.tif 000012
中間体４ａ(467mg)の1,2−ジクロロエタン(13ml)溶液に４−フルオロベンズアルデヒド(252μL；２当量)及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム(498mg; ２当量)を加えた。反応物を室温で窒素下で18時間攪拌し、そして濃縮した。飽和重炭酸ナトリウムを加え、そして水溶液をジクロロメタン３部分量で抽出し、そして合わせた有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。化合物をエタノール、テトラヒドロフラン、水及び飽和塩化アンモニウムの混合物(４ml；割合4：2：1：1 v／v)に溶解させた。鉄ナノ粒子(スパチュラで３チップ)を加え、そして溶液を150℃に10分間電子レンジで加熱した。得られた混合物を冷却し、セライトを通してろ過し、そして濃縮した。残留物をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより、ジクロロメタン中１％から５％MeOHの勾配で溶出して精製した。得られた生成物を、エーテル1.2mL中の１Ｍ HCl 1.2mLを添加したジクロロメタンに溶解した。溶媒を除去し、そして生成物を塩酸塩として単離して、化合物１ (164mg, 収率30％)を無色固体として得た。純度(HPLC): ＞99％; 光学純度(キラルHPLC)：＞99％; 1H NMR (400MHz, CD3OD), 1.08 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 1.21 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 3.20−3.26 (m, 4H), 3.51−3.54 (m, 6H), 4.43 (s, 2H), 7.19−7.23 (m, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.54−7.63 (m, 3H),
7.70−7.82 (m, 4H)。実測値: C, 54.63; H, 6.49; N, 8.68。C29H36N4OF×4.1 HCl×0.8 H2O×0.1 C4H10O はC, 57.67; H, 6.51;N, 8.67％を有する。
【０１２０】
化合物２：4−｛(R)−(3−アミノフェニル)[4−(4−フルオロベンジル)ピペラジン−1−イル]メチル｝−N,N−ジエチルベンズアミド
【化１１】
2008508350.tif 000013
中間体４ｂ(5.790ｇ, 14.6mmol)の1,2−ジクロロエタン(60mL)溶液に４−フルオロベンズアルデヒド(2.04mL, 19.0mmol)及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム(4.02ｇ, 19.0mmol)を加えた。室温で20時間後、反応物を水性重炭酸ナトリウムでクエンチし、そして有機層を分離した。水性層をジクロロメタン(３×100mL)で抽出し、そして合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーにより、ヘキサン中の30％ないし50％アセトンで溶出して精製して、無色泡状物(5.285ｇ, 71％)を得たが、それはニトロ中間体である。ニトロ中間体(5.285ｇ, 10.4 mmol)をエタノール、テトラヒドロフラン、水及び水性飽和塩化アンモニウムの混合物(割合4：2：1：1 v／v) (100mL)に溶解し、鉄の顆粒(0.63mg, 11.5mmol)を加えた。反応物を還流加熱し、そして定期的にもっと顆粒を加えた。還流(90℃)下に24時間後、反応物を室温に冷却し、セライトを通してろ過し、そして濃縮した。残留物に水性重炭酸ナトリウム及びジクロロメタンを加えた。有機層を分離し、そして水性層をジクロロメタン(３×100mL)で抽出し、そして合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮した。生成物をシリカゲル上でジクロロメタン中の１％ないし５％メタノールで溶出して、化合物２(3.505ｇ)を淡黄色泡状物として得た。不純物質を上記のクロマトグラフィーから追加的に得、そしてこれを第２のフラッシュクロマトグラフィーにより、100％酢酸エチルないし酢酸エチル中の５％メタノールで溶出して再精製して、更なる化合物２を0.949ｇ得た。得られた合わせた物質：4.454ｇ (収率90％)。純度(HPLC)：＞99％; 光学純度(キラルHPLC)：＞99％; 1H NMR (400MHz, CD3OD), 1.08 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 1.21 (t, J = 6.5 Hz, 3H), 3.20−3.26 (m, 4H), 3.51−3.54 (m, 6H), 4.43 (s, 2H), 7.19−7.23 (m, 2H), 7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.54−7.63 (m, 3H), 7.70−7.82 (m, 4H)。実測値：C, 54.00; H, 6.34; N, 8.47。C29H35FN4O×4.7 HCl×0.2 C4H10O×0.1 H2OはC, 54.02; H, 6.37; N, 8.46％を有する。
【０１２１】
化合物３: 4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(2−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル] メチル]−N,N−ジエチル−ベンズアミド
【化１２】
2008508350.tif 000014
中間体４ｂ(298mg, 0.752mmol)の1,2−ジクロロエタン(8.5ml)溶液に２−フルオロベンズアルデヒド(160mg, 1.503mmol, ２当量)及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム(319mg, 1.503mmol, ２当量)を加えた。反応物を室温で窒素下にて18時間攪拌し、そして濃縮した。飽和重炭酸ナトリウムを加え、そして水溶液をジクロロメタン３部で抽出し、そして合わせた有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。化合物をエタノール、テトラヒドロフラン、水及び飽和塩化アンモニウムの混合物(３ml；割合4：2：1：1 v／v)に溶解した。鉄ナノ粒子(スパチュラで３チップ)を加え、そして溶液を150℃に10分間電子レンジ中で加熱した。得られた混合物を冷却し、セライトを通してろ過し、そして濃縮した。粗製物をCH2Cl2に溶解させ、そして水で洗った。有機層を分離し、そして水性層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、そして濃縮した。生成物を逆相HPLC(勾配：0.1％ TFAを含むH2O中で５−50 ％ CH3CN)で精製して、化合物３(0.28ｇ, 収率46％)をTFA塩として得た。この物質をCH3CN／H2Oで凍結乾燥して淡黄色粉末を生成した。1H NMR (400MHz, CD3OD) 1.08 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 6.6 Hz, 3H), 2.39 (br s, 2H), 3.02 (br s, 2H), 3.18−3.38 (m, 4H), 3.43 (br s, 2H), 3.52 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 4.43 (s, 2H), 4.53 (s, 1H), 7.09 (dt, J = 2.3, 6.8 Hz, 1H), 7.24−7.30 (m, 1H), 7.30−7.41 (m, 6H), 7.52−7.60 (m, 4H)。分析：C29H35FN4O×2.8 TFA×0.4 H2Oについての計算値：C, 51.88; H, 4.86; N, 6.99。実測値：C, 51.89; H, 4.89; N, 6.97％。M.S. (計算値): 475.3 (MH+), M.S. (実測値): 475.2 (MH+)。HPLC：k'：2.35; 純度：＞99％ (215nm), ＞99％ (254nm), ＞99％ (280nm)。HPLC条件：Zorbax C−18, 勾配10−95％ Ｂ, 流速１mL／min, 25℃, Ａ: H2O中0.1％ TFA, Ｂ: MeCN中0.1％ TFA。旋光度：[α]16D ＝−8.91(ｃ＝1.179, MeOH)。
【０１２２】
化合物4：4−[(R)−(3−アミノフェニル)[4−[(3−フルオロフェニル)メチル]−1−ピペラジニル] メチル]−N,N−ジエチル−ベンズアミド
【化１３】
2008508350.tif 000015
中間体４ｂ(281mg, 0.709mmol)の1,2−ジクロロエタン(８ml)溶液に３−フルオロベンズアルデヒド(180mg, 1.417mmol, ２当量)及びトリアセトキシホウ水素化ナトリウム(300mg, 1.417mmol, ２当量)を加えた。反応物を室温で窒素下にて18時間攪拌し、そして濃縮した。飽和重炭酸ナトリウムを加え、そして水溶液をジクロロメタン３部で抽出し、そして合わせた有機物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。生成物をエタノール、テトラヒドロフラン、水及び飽和塩化アンモニウムの混合物(３ml; 割合4：2：1：1 v／v)に溶解した。鉄ナノ粒子(スパチュラで３チップ)を加え、そして溶液を150℃に10分間電子レンジ中で加熱した。得られた混合物を冷却し、セライトを通してろ過し、そして濃縮した。得られた生成物をCH2Cl2に溶解させ、そして水で洗った。有機層を分離し、そして水性層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し(Na2SO4)、ろ過しそして濃縮した。生成物を逆相HPLC(勾配：0.1％ TFAを含むH2O中で５−50％ CH3CN)で精製して化合物４(0.375ｇ, 収率65％)をそのTFA塩として得た。この物質をCH3CN／H2Oで凍結乾燥して淡黄色粉末を生成した。1H NMR (400MHz, CD3OD) 1.08 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 1.21 (t, J = 6.8 Hz, 3H), 2.38 (br s, 2H), 3.00 (br s, 2H), 3.16−3.28 (m, 4H), 3.40 (br s, 2H), 3.51 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 4.37 (s, 2H), 4.56 (s, 1H), 7.18 (ddd, J = 1.2, 2.3, 7.8 Hz, 1H), 7.24 (ddd, J = 1.0, 2.7, 8.8 Hz, 1H), 7.28−7.38 (m, 4H), 7.55 (d, J = 8.2 Hz, 2H)。分析：C29H35FN4O×2.7 TFA×1.1 H2Oの計算値: C, 51.50; H, 5.01; N, 6.98。実測値：C, 51.52; H, 5.01; N, 6.87％。M.S. (計算値): 475.3 (MH+), M.S. (実測値): 475.2 (MH+)。HPLC: k': 2.43; 純度: ＞99％ (215nm), ＞99％ (254nm), ＞99％ (280nm)。HPLC条件: Zorbax C−18, 勾配10−95％ Ｂ, 流速：１mL／min, 25℃, Ａ: H2O中0.1％ TFA, Ｂ: MeCN中0.1％ TFA。旋光度: [α]16D ＝−8.94(ｃ＝1.04, MeOH)。
【国際調査報告】
2008508350.tif 000024
2008508350.tif 000025
2008508350.tif 000026