(57)【要約】  本発明は、ＩＶタンパク質またはその断片、変異体、あるいは誘導体をコード化する1個あるいはそれ以上の核酸領域から成る少なくとも１個のポリヌクレオチドを、ヒトの一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のあるヒトの免疫反応を高めることに関する。本発明はさらにまた、少なくとも１個のＩＶタンパク質またはその断片、変異体、あるいは誘導体を、ヒトの一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のあるヒトの免疫反応を高めることに関する。当該ＩＶタンパク質は、例えば、精製形態であってもよく、または不活性化ＩＶワクチンに存在するような不活性化ＩＶであってもよい。当該ポリヌクレオチドを、ヒトの細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込み、免疫学的に効果的な量の免疫原性を有するＩＶのエピトープまたはその断片、変異体、あるいは誘導体を、ｉｎ  ｖｉｖｏで生産する。当該ＩＶタンパク質（精製形態あるいは不活性化ＩＶワクチン形態）をまた、免疫学的に効果的な量で、投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である前記単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がTTTであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がTTCであり；
前記コード領域の３３個のロイシンコドンのうち約２個がTTAであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がTTGであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がCTTであり、前記ロイシンコドンのうち約６個がCTCであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がCTAであり、さらに前記ロイシンコドンのうち約１３個がCTGであり；
前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がATTであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がATCであり、さらに前記イソロイシンコドンのうち約４個がATAであり；
前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり；
前記コード領域の２３個のバリンコドンのうち約４個がGTTであり、前記バリンコドンのうち約５個がGTGであり、前記バリンコドンのうち約３個がGTAであり、さらに前記バリンコドンのうち約１１個がGTGであり；
前記コード領域の４０個のセリンコドンのうち約７個がTCTであり、前記セリンコドンのうち約９個がTCCであり、前記セリンコドンのうち約６個がTCAであり、前記セリンコドンのうち約２個がTCGであり、前記セリンコドンのうち約６個がAGTであり、さらに前記セリンコドンのうち約１０個がAGCであり；
前記コード領域の１７個のプロリンコドンのうち約５個がCCTであり、前記プロリンコドンのうち約６個がCCCであり、前記プロリンコドンのうち約５個がCCAであり、さらに前記プロリンコドンのうち約２個がCCGであり；
前記コード領域の２８個のスレオニンコドンのうち約７個がACTであり、前記スレオニンコドンのうち約１０個がACCであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がACAであり、さらに前記スレオニンコドンのうち約３個がACGであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がGCTであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がGCCであり、前記アラニンコドンのうち約９個がGCAであり、さらに前記アラニンコドンのうち約４個がGCGであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がTATであり前記チロシンコドンのうち約８個がTACであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がCATであり前記ヒスチジンコドンのうち約４個がCACであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がCAAであり前記グルタミンコドンのうち約１６個がCAGであり；
前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がAATであり前記アスパラギンコドンのうち約１４個がAACであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がAAAであり前記リジンコドンのうち約１２個がAAGであり；
前記コード領域の２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がGATであり前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がGACであり；
前記コード領域の２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がGAAであり前記グルタミン酸コドンのうち約１５個がGAGであり；
前記コード領域の６個のシステインコドンのうち約３個がTGTであり前記システインコドンのうち約３個がTGCであり；６個のトリプトファンコドンがTGGであり；
前記コード領域の４９個のアルギニンコドンのうち約４個がCGTであり、前記アルギニンコドンのうち約９個がCGCであり、前記アルギニンコドンのうち約５個がCGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がCGGであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGGであり；
前記コード領域の４１つのグリシンコドンのうち約７個がGGTであり、前記グリシンコドンのうち約１４個がGGCであり、前記グリシンコドンのうち約１０個がGGAであり、さらに前記グリシンコドンのうち約１０個がGGGであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:23を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンがTTCであり、前記コード領域の３３個のロイシンコドンがCTGであり、前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンがATCであり、前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり、前記コード領域の２３個のバリンコドンがGTGであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンがAGCであり、前記コード領域の１７個のプロリンコドンがCCCであり、前記コード領域の２８個のスレオニンコドンがACCであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンがGCCであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンがTACであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンがCACであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンがCAGであり、前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンがAACであり、前記コード領域の２１つのリジンコドンがAAGであり、前記コード領域の２２個のアルパラギン酸コドンがGACであり、前記コード領域の３６個のグルタミン酸コドンがGAGであり、前記コード領域の６個のトリプトファンコドンがTGGであり、前記コード領域の４９個のアルギニンコドンがCGG、AGA、及びAGGから成る群から選択されており、さらに前記コード領域の４１つのグリシンコドンがGGCであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:24を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１つのグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１つのリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド４６から１５４２から成り；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:25を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がTTTであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がTTCであり；
前記コード領域の３３個のロイシンコドンのうち約２個がTTAであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がTTGであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がCTTであり、前記ロイシンコドンのうち約６個がCTCであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がCTAであり、さらに前記ロイシンコドンのうち約１３個がCTGであり；
前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がATTであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がATCであり、さらに前記イソロイシンコドンのうち約４個がATAであり；
前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり；
前記コード領域の２３個のバリンコドンのうち約４個がGTTであり、前記バリンコドンのうち約５個がGTGであり、前記バリンコドンのうち約３個がGTAであり、さらに前記バリンコドンのうち約１１個がGTGであり；
前記コード領域の４０個のセリンコドンのうち約７個がTCTであり、前記セリンコドンのうち約９個がTCCであり、前記セリンコドンのうち約６個がTCAであり、前記セリンコドンのうち約２個がTCGであり、前記セリンコドンのうち約６個がAGTであり、さらに前記セリンコドンのうち約１０個がAGCであり；
前記コード領域の１７個のプロリンコドンのうち約５個がCCTであり、前記プロリンコドンのうち約６個がCCCであり、前記プロリンコドンのうち約５個がCCAであり、さらに前記プロリンコドンのうち約２個がCCGであり；
前記コード領域の２８個のスレオニンコドンのうち約７個がACTであり、前記スレオニンコドンのうち約１０個がACCであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がACAであり、さらに前記スレオニンコドンのうち約３個がACGであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がGCTであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がGCCであり、前記アラニンコドンのうち約９個がGCAであり、さらに前記アラニンコドンのうち約４個がGCGであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がTATであり前記チロシンコドンのうち約８個がTACであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がCATであり前記ヒスチジンコドンのうち約４個がCACであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がCAAであり前記グルタミンコドンのうち約１６個がCAGであり；
前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がAATであり前記アスパラギンコドンのうち約１４個がAACであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がAAAであり前記リジンコドンのうち約１２個がAAGであり；
前記コード領域の２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がGATであり前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がGACであり；
前記コード領域の２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がGAAであり前記グルタミン酸コドンのうち約１５個がGAGであり；
前記コード領域の６個のシステインコドンのうち約３個がTGTであり前記システインコドンのうち約３個がTGCであり；６個のトリプトファンコドンがTGGであり；
前記コード領域の４９個のアルギニンコドンのうち約４個がCGTであり、前記アルギニンコドンのうち約９個がCGCであり、前記アルギニンコドンのうち約５個がCGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がCGGであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGAであり、さらに前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGGであり；
前記コード領域の４１つのグリシンコドンのうち約７個がGGTであり、前記グリシンコドンのうち約１４個がGGCであり、前記グリシンコドンのうち約１０個がGGAであり、さらに前記グリシンコドンのうち約１０個がGGGであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンがTTCであり、前記コード領域の３３個のロイシンコドンがCTGであり、前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンがATCであり、前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり、前記コード領域の２３個のバリンコドンがGTGであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンがAGCであり、前記コード領域の１７個のプロリンコドンがCCCであり、前記コード領域の２８個のスレオニンコドンがACCであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンがGCCであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンがTACであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンがCACであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンがCAGであり、前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンがAACであり、前記コード領域の２１つのリジンコドンがAAGであり、前記コード領域の２２個のアルパラギン酸コドンがGACであり、前記コード領域の３６個のグルタミン酸コドンがGAGであり、前記コード領域の６個のトリプトファンコドンがTGGであり、前記コード領域の４９個のアルギニンコドンがCGG、AGA、及びAGGから成る群から選択されており、前記コード領域の４１つのグリシンコドンがGGCであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１つのグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１つのリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド４６から１５４２から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１から１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42から成る群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインがSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に可能にプロモータが附随している、請求項１から２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ＲＮＡである、請求項１から２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
プラスミドである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１から２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項３２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物から成る群から選択される構成成分を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(c)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(d)  CRL1005/BAK
から成る群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記アジュバントが、((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
から成る群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
から成る群から選択される濃度で存在する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３７あるいは請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１から２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項４１】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約4個がＴＴＣであり；
前記コード領域の２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧであり；
前記コード領域の１１つのイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡであり；
前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の１６個のバリンコドンのうち約３個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり；
前記コード領域の１８個のセリンコドンのうち約３個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＡＧＣであり；
前記コード領域の８個のプロリンコドンのうち約２個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧであり；
前記コード領域の１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧであり；
前記コード領域の２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧであり；
前記コード領域の５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣであり；
前記コード領域の５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣであり；
前記コード領域の１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の１１つのアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣであり；
前記コード領域の１３個のリジンコドンのうち約５個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約８個がＡＡＧであり；
前記コード領域の６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣであり；
前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧであり；および
前記コード領域の１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:26を含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の１１つのイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の１１つのアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、前記コード領域の１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ，ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択され、前記コード領域の１６個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:27を含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２６個のロイシンコドンがCTGであり、８個のプロリンコドンがCCCであり、２５個のアラニンコドンがGCCであり、１５個のグルタミンコドンがCAGであり、１１つのアルパラギンコドンがAACであり、１３個のリジンコドンがAAGであり、１７個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から７８４から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:28を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項４１から４６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項４１から４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項４１から４８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約4個がＴＴＣであり；
前記コード領域の２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧであり；
前記コード領域の１１つのイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡであり；
前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の１６個のバリンコドンのうち約３個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり；
前記コード領域の１８個のセリンコドンのうち約３個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＡＧＣであり；
前記コード領域の８個のプロリンコドンのうち約２個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧであり；
前記コード領域の１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧであり；
前記コード領域の２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧであり；
前記コード領域の５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣであり；
前記コード領域の５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣであり；
前記コード領域の１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の１１つのアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣであり；
前記コード領域の１３個のリジンコドンのうち約５個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約８個がＡＡＧであり；
前記コード領域の６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣであり；
前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧであり；および
前記コード領域の１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の１１つのイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の１１つのアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、前記コード領域の１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ，ＡＧＡ，ＡＧＧであり、前記コード領域の１６個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:4に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２６個のロイシンコドンがCTGであり、８個のプロリンコドンがCCCであり、２５個のアラニンコドンがGCCであり、１５個のグルタミンコドンがCAGであり、１１つのアルパラギンコドンがAACであり、１３個のリジンコドンがAAGであり、１７個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から７８４から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:4に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項４１から５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:41を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項４１から６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
ＲＮＡである、請求項４１から６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項６８】
プラスミドである、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項７０】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成要素から成る、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジコリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７５】
前記アジュバントあるいは形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）から成る、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７６】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項７５あるいは請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項７９】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣであり；
前記コード領域の１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＧであり；
前記コード領域の７個のセリンコドンのうち約１個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＡＧＣであり；
前記コード領域の４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧであり；
前記コード領域の４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧであり；
前記コード領域の５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧであり；
前記コード領域の３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣであり；
前記コード領域の２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣであり；
前記コード領域の５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３個がＡＡＧであり；
前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧであり；
前記コード領域の８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:29を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の７個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり、さらに前記コード領域の８個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:30を含む、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
１０個のロイシンコドンがCTGであり、４個のプロリンコドンがCCCであり、５個のアラニンコドンがGCCであり、２個のグルタミンコドンがCAGであり、３個のアルパラギンコドンがAACであり、５個のリジンコドンがAAGであり、さらに９個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域が、NO:3のヌクレオチド７４０から１００７にフレーム内で融合されているSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から５１から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:31を含む、請求項８３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４をコードする、請求項７９から８３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項７９から８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項７９から８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項７９から８７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣであり；
前記コード領域の１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＧであり；
前記コード領域の７個のセリンコドンのうち約１個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＡＧＣであり；
前記コード領域の４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧであり；
前記コード領域の４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧであり；
前記コード領域の５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧであり；
前記コード領域の３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣであり；
前記コード領域の２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣであり；
前記コード領域の５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３個がＡＡＧであり；
前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧであり；
前記コード領域の８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:5に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項８９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の７個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択され、前記コード領域の８個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:5に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
１０個のロイシンコドンがCTGであり、４個のプロリンコドンがCCCであり、５個のアラニンコドンがGCCであり、２個のグルタミンコドンがCAGであり、３個のアルパラギンコドンがAACであり、５個のリジンコドンがAAGであり、９個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域が、NO:3のヌクレオチド７４０から１００７にフレーム内で融合されているSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から５１から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項９５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項７９から９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項９８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項９９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記異種のポリペプチドがＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質である、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質がSEQ ID NO:2から成る、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項７９から１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
ＲＮＡである、請求項７９から１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１０５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１０８】
プラスミドである、請求項１０７に記載のベクター。
【請求項１０９】
請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項１１０】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよび [mono-phosphoryl lipid A] およびトレハロースジコリノミコレートＡＦ[trehalosedicorynomycolate AF] (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項１１５あるいは請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法で、請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:7の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＧＴ＊９であり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１つのアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:32を含む、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:7の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり、前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:33を含む、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項１１９から１２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１１９から１２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:7に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約４個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＧＴであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１つのアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:7に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7をコードする、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
SEQ ID NO:5＊４２に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり、さらに前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:7に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7をコードする、請求項１２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１１９から１３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１１９から１３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
ＲＮＡである、請求項１１９から１３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１３９】
プラスミドである、請求項１３８に記載のベクター。
【請求項１４０】
請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項１４１】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド) ((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradeceneyloxy)-1-propanaminium bromide)]（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジコリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミドを含む、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記CRL1005およびBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１４６に記載の組成物。
【請求項１４８】
曇点より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項１４６あるいは請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１４９】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１５０】
SEQ ID NO:9の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＧＴ＊９であり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１つのアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:34を含む、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
SEQ ID NO:9の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり、前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:35を含む、請求項１５２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項１５０から１５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１５０から１５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
SEQ ID NO:9に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約４個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＧＴ＊９であり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１つのアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:9に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9をコードする、請求項１５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
SEQ ID NO:9に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドで、前記核酸断片がSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧであり、さらに前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:9に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9をコードする、請求項１６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１５０から１６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６３】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６４】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項１６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６５】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１５０から１６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
ＲＮＡである、請求項１５０から１６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６９】
請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１７０】
プラスミドである、請求項１６９に記載のベクター。
【請求項１７１】
請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと担体とを含む組成物。
【請求項１７２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１７１に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記アジュバントが、((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１７３に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項１７６あるいは請求項１７８に記載の組成物。
【請求項１８０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１８１】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２１つのフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣであり；
３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧであり；
３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡであり；
２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧであり；
４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、ｖセリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧであり；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
４１つのアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣであり；
１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧであり；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣであり；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧであり；
３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣであり；
３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧであり；
５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約３個がＴＧＣであり；
単一のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
３０個のアルギニンコドンのうち約２個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧであり；
４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:36を含む、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８３】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の２１つのフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の４１つのアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧ（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）からなる群から選択され、さらに前記コード領域の４４個のグリシンコドンはＧＧＣであり； 
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:37を含む、請求項１８３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８５】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３９個のロイシンコドンがCTGであり、２６個のプロリンコドンがCCCであり、４１つのアラニンコドンがGCCであり、１９個のグルタミンコドンがCAGであり、２５個のアルパラギンコドンがAACであり、５２個のリジンコドンがAAGであり、３０個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド１から１６８０から成り； 
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:38を含む、請求項１８５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１８１から１８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１８１から１８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１８８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９０】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2＊４４のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２１つのフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣであり；
３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧであり；
３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡであり；  ２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧであり；
４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧであり；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
４１つのアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣであり；
１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧであり；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣであり；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧであり；
３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣであり；
３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧであり；
５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約３個がＴＧＣであり；
単一のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
３０個のアルギニンコドンのうち約２個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧであり；
４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１９１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９３】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の２１つのフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の４１つのアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）であり、さらに前記コード領域の４４個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１９４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９６】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片から成る単離ポリヌクレオチドで、前記核酸断片がSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である前記単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１つのグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１つのリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド１から１６８０から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１９７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１８１から１９８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２００】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１９９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２０１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０３】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０４】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０５】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインがSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４を含む、請求項２０４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１８１から２０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０７】
ＲＮＡである、請求項１８１から２０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２０７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０９】
請求項１８１から２０８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１０】
プラスミドである、請求項２０９に記載のベクター。
【請求項２１１】
請求項１８１から２０８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２１２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２１１に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項２１４に記載の組成物。
【請求項２１６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記アジュバントあるいは形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項２１７に記載の組成物。
【請求項２１９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項２１７又は２１８に記載の組成物。
【請求項２２０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法で、請求項１８１から２０９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項２２１】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、およびインフルエンザウィルスタンパク質／またはその断片／変異体あるいは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成要素から成る、請求項３１から３９、６９から７７、１０９から１１７、１４０から１４８、１７１から１７９、又は２１１から２１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記単離ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、インフルエンザＭ２タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインに融合されたＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質を含むポリペプチド、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質に融合されたＡ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質を含むポリペプチド、並びにＢ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体からなる群から選択される任意の単離インフルエンザウィルスポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体である、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記単離ポリペプチドが、脊椎動物に免疫応答を誘導することができる免疫原性を有するエピトープを少なくとも１つ含む、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２４】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドが同一の製剤に含まれている、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２５】
前記組成物が組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物である、請求項２２４に記載の組成物。
【請求項２２６】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが異なった製剤に含まれており、前記異なった製剤が連続して又は同時に投与される、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２７】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に比べて、同等の又はそれより高い免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２８】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせがより広範囲の免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２９】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量で治療効果を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２３０】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少ない単離ポリペプチド投与量で治療効果を提供する、請求項２２９に記載の組成物。
【請求項２３１】
前記コドン最適化核酸組成物及び前記単離ポリペプチドの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量でより広範囲の免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２３２】
請求項３２から３９、７０から７８、１１１から１１９、１４３から１５１、１７５から１８３のいずれか１項に記載されている前記組成物、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを投与することにより得られる免疫応答に比べて、前記免疫応答が同等であるかあるいはより高い、請求項２２１に記載の組成物を投与することにより免疫応答を誘導する方法。
【請求項２３３】
前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、前記節約された投与量が従来投与濃度より低い濃度である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドの節約された投与量が、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３７】
前記免疫応答が、高められた細胞性免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３８】
前記免疫応答が、高められた体液性免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３９】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要としている脊椎動物に、請求項１から２８、４１から６６、７９から１０６、１５０から１６８のいずれか１項に記載されているポリヌクレオチドあるいは請求項３１から３９、６９から７７、１０９から１１７、１７１から１７９、２２１から２３１のいずれか１項に記載されている組成物を、請求項１８１から２０８に記載されている任意のポリヌクレオチド又は請求項２１１から２１９に記載されている任意の成分との組み合わせ又は置換による形態で、投与することを含む方法。
【請求項２４０】
SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む単離ポリペプチドであって、前記の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリペプチド。
【請求項２４１】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４２】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４３】
SEQ ID NO:76に少なくとも９０％は同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリペプチド。
【請求項２４４】
前記アミノ酸がSEQ ID NO:76に少なくとも９５％は同一である、請求項２４３に記載のポリペプチド。
【請求項２４５】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４６】
さらに、前記ポリペプチドに連結された異種のポリペプチドを含む、請求項２４０から２４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４７】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２４６に記載のポリペプチド。
【請求項２４８】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２４７に記載のポリペプチド。
【請求項２４９】
前記異種のポリペプチドが少なくとも、インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項２４６に記載のポリペプチド。
【請求項２５０】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４およびSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択される、請求項２４９に記載のポリペプチド。
【請求項２５１】
請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載のポリペプチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２５２】
さらに、アジュバントを含む、請求項２５１に記載の組成物。
【請求項２５３】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載のポリペプチドを、そのような治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項２５４】
SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５５】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76の少なくとも２００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項２５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76の少なくとも２５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項２５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５７】
SEQ ID NO:76に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５８】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項２５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列をコードする、請求項２５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項２５４から２５９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:75を含む、請求項２６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６２】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項２５４から２６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６３】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合された異種のポリペプチドをコードする、請求項２６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６４】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６５】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40 及び SEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６６】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６７】
前記異種のポリペプチドが少なくともインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外領域を含む、請求項２６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６８】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４及びSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択される、請求項２６７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６９】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項２５４から２６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７０】
ＲＮＡである、請求項２５４から２６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２７０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７２】
請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項２７２に記載のベクター。
【請求項２７４】
請求項２５４から２９２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２７５】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２７４に記載の組成物。
【請求項２７６】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２７７】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２８０】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および 
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項２８０又は請求項２８２に記載の組成物。
【請求項２８３】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項２８４】
脊椎動物に投与されると前記アミノ酸配列を発現しSEQ ID NO:77に対する検知可能な免疫応答を誘導する、SEQ ID NO:77のコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８５】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:77のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項２８４に記載のベクター。
【請求項２８６】
前記核酸断片がSEQ ID NO:79を含む、請求項２８５に記載のベクター。
【請求項２８７】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項２８４から２８６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８８】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項２８７に記載のベクター。
【請求項２８９】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２８８に記載のベクター。
【請求項２９０】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２８９に記載のベクター。
【請求項２９１】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２８７に記載のベクター。
【請求項２９２】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４及びSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択されている、請求項２９１に記載のベクター。
【請求項２９３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項２８４から２９２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２８４から２９２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９５】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２９４に記載のベクター。
【請求項２９６】
プラスミドである、請求項２８４から２９３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９７】
請求項２８４から２９６のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項２９８】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２９７に記載の組成物。
【請求項２９９】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３００】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２９９に記載の組成物。
【請求項３０１】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３００に記載の組成物。
【請求項３０２】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３０３】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３０４】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３０３に記載の組成物。
【請求項３０５】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３０３又は請求項３０４に記載の組成物。
【請求項３０６】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２８４から２９６のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３０７】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、SEQ ID NO:77のコンセンサスアミノ酸配列を含むポリペプチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することかを含む方法。
【請求項３０８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:77のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域を含む核酸断片によりコードされる、請求項３０７に記載の方法。
【請求項３０９】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:79を含む核酸断片によりコードされる、請求項３０８に記載の方法。
【請求項３１０】
脊椎動物に投与されると前記アミノ酸配列を発現しSEQ ID NO:78に対する検知可能な免疫応答を誘導する、SEQ ID NO:78のコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項３１１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:78のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項３１０に記載のベクター。
【請求項３１２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:80を含む、請求項３１１に記載のベクター。
【請求項３１３】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項３１０から３１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１４】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項３１３に記載のベクター。
【請求項３１５】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項３１４に記載のベクター。
【請求項３１６】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項３１５に記載のベクター。
【請求項３１７】
前記異種のポリペプチドが、インフルエンザウィルスＭ１タンパク質又はその断片である、請求項３１３に記載のベクター。
【請求項３１８】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１９】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２０】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３１９に記載のベクター。
【請求項３２１】
プラスミドである、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２２】
請求項３１０から３２１のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項３２３】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３２２に記載の組成物。
【請求項３２４】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２５】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３２４に記載の組成物。
【請求項３２６】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３２５に記載の組成物。
【請求項３２７】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２８】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２９】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３２８に記載の組成物。
【請求項３３０】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３２８又は３２９に記載の組成物。
【請求項３３１】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３１０から３２１のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３３２】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、SEQ ID NO:78のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項３３３】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:78のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域を含む核酸断片によりコードされる、請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３４】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:80を含む核酸断片によりコードされる、請求項３３３に記載の方法。
【請求項３３５】
SEQ ID NO:60の核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドを含有するベクターであって、前記核酸断片が脊椎動物に投与された場合にSEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリペプチドの断片を発現し、前記ポリペプチドの断片がSEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78及びそれらの混合物からなる群から選択される前記ポリペプチドに対する検知可能な免疫応答を誘導する、前記ベクター。
【請求項３３６】
前記核酸断片がコドン最適化されている、請求項３３５に記載のベクター。
【請求項３３７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:79を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３３８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:80を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３３９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:61を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３４０】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項３３５から３３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４１】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項３４０に記載のベクター。
【請求項３４２】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項３４１に記載のベクター。
【請求項３４３】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42を含む群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項３４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項３３５から３４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３３５から３４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４６】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３４５に記載のベクター。
【請求項３４７】
プラスミドである、請求項３３５から３４４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４８】
請求項３３５から３４７のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項３４９】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３４８に記載の組成物。
【請求項３５０】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジミクリノコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５１】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３５０に記載の組成物。
【請求項３５２】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３５１に記載の組成物。
【請求項３５３】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５４】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５５】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３５４に記載の組成物。
【請求項３５６】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３５４又は請求項３５５に記載の組成物。
【請求項３５７】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３３５から３４７のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３５８】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、及びインフルエンザウィルスタンパク質／又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成成分を含む、請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、又は３４８から３５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５９】
前記単離ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、インフルエンザＭ２タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインに融合されたＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質を含むポリペプチド、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質に融合されたＡ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質を含むポリペプチド、及びＢ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体からなる群から選択される任意の単離インフルエンザウィルスポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体である、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６０】
前記単離ポリペプチドが、脊椎動物に免疫応答を誘導することができる免疫原性を有するエピトープを少なくとも１つ含む、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６１】
前記コンセンサスアミノ酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが同一の製剤に含まれている、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６２】
前記組成物が組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物である、請求項３６１に記載の組成物。
【請求項３６３】
前記コンセンサスアミノ酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが異なった製剤に含まれており、前記異なった製剤が連続して又は同時に投与される、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６４】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に比べて、同等の又はそれより高い免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６５】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせがより広範囲の免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６６】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量で治療効果を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６７】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない単離ポリペプチド投与量で治療効果を提供する、請求項３６６に記載の組成物。
【請求項３６８】
前記コンセンサスアミノ酸組成および前記単離ポリペプチドの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量でより広範囲の免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６９】
請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、３４８から３５６のいずれか１項に記載されている前記組成物、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを投与することにより得られる免疫応答に比べて、前記免疫応答が同等であるかあるいはより高い、請求項３５８に記載の組成物を投与することにより免疫応答を誘導する方法。
【請求項３７０】
前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７１】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記節約された投与量が従来投与濃度より低い濃度である、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７２】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項３７１に記載の方法。
【請求項３７３】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドの節約された投与量が、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない、請求項３７１に記載の方法。
【請求項３７４】
前記免疫応答が、高められた細胞性免疫応答である、請求項３７０に記載の方法。
【請求項３７５】
前記免疫応答が、高められた体液性免疫応答である、請求項３７０に記載の方法。
【請求項３７６】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防するを必要としている脊椎動物に、請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載されているポリヌクレオチド又は請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載されているポリペプチドを、請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、又は３４８から３５６に記載されている任意の組成物との組み合わせ又は置換による形態で、投与することを含む当該方法。
【請求項３７７】
プラスミドバックボーンがVR10551バックボーン、VR10682バックボーン及びVR10686バックボーンから成る群から選択される、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３７８】
前記プラスミドバックボーンが、ヒトサイトメガロウィルスプロモータ、ニワトリ肉腫ウィルスプロモータ、プラスミドVCL1005由来の修飾ニワトリ肉腫ウィルスプロモータ、及びヒトＴ−細胞白血病ウィルス-I RU5因子に融合したニワトリ肉腫ウィルスプロモータからなる群から選択されるプロモータを含む、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３７９】
さらに、付加的なプロモータを含む、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３８０】
さらに、請求項１から２６、４１から６４、７９から１０４、１１９から１３５、１５０から１６６、１８１から２０６および２５４から２６９のいずれか１項に記載の付加的なポリヌクレオチドを含む、請求項３７９に記載のプラスミド。
【請求項３８１】
さらに、SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:77；SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:79；及びSEQ ID NO:80から成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項３７９に記載のプラスミド。
【請求項３８２】
請求項３７７から３８１のいずれか１項に記載のプラスミドを含む組成物。
【請求項３８３】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３８２に記載の組成物。
【請求項３８４】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８５】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３８４に記載の組成物。
【請求項３８６】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３８５に記載の組成物。
【請求項３８７】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８８】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８９】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３８８に記載の組成物。
【請求項３９０】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３８８あるいは請求項３８９に記載の組成物。
【請求項３９１】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、及びインフルエンザウィルスタンパク質／またはその断片／変異体若しくは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成成分を含む、請求項３８２から３９０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９２】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３７７から３８０のいずれか１項に記載のベクター又は請求項３８２から３９１のいずれか１項に記載の組成物を、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、インフルエンザウィルスワクチン組成物、並びに哺乳動物におけるインフルエンザ感染及び疾病を治療又は予防する方法に関する。インフルエンザは、気道の感染により引き起こされる急性熱性の疾患である。インフルエンザウィルスにはＡ型、Ｂ型及びＣ型の３つの型があり、それぞれ「IAV」、「IBV」、又は「IAC」とし、総括的に、「IV」とする。A型（数種の亜型を含む）は、１９１８年、１９５７年、及び１９６８年に起こった流行のような、広範な流行及び世界的なパンデミック（大規模流行）を引き起こす。B型は、地域的な流行を引き起こす。C型は、散発性の症例、及び小規模且つ局所的な集団発生を引き起こす。これらのウィルス型は、大部分は、二つの構造タンパク質（すなわち、ウィルスの中心に見出される核タンパク質と、ウィルスのシェルを形成している膜タンパク質）における差異に基づいて区別される。
【０００２】
当該疾患は、重大な全身症状、入院を必要とする重症の疾患（例えば、ウィルス性肺炎）、及び二次性の細菌性肺炎等の合併症を引き起こし得る。１９１８年から１９１９年のパンデミック流感大規模流行期に２千万人を超える人々が死んだ。これは、２０世紀最大のパンデミックであった。アメリカ合衆国における近年の流行により、１年当たり１万件を超える（最高で４万件まで）過剰死亡が引き起こされ、また流行のなかった年でも、１年当たり５千件から１万件の死亡が引き起こされたと考えられる。
【０００３】
インフルエンザに関連する罹患率及び死亡率を抑えるための最良のストラテジーは、予防接種である。予防接種は、老人ホームや高齢者住宅の住人などのハイリスク集団に属する人々、および糖尿病、慢性腎不全又は慢性呼吸器系疾患の患者に特に薦められている。
【０００４】
従来のインフルエンザワクチンの製造方法は、単離株をふ化鶏卵において増殖させることを伴うものである。まず、患者咽頭を拭った綿棒又はそれに類似した採取源よりウィルスを採取し、鶏卵において単離する。鶏卵における初期の単離は難しいが、ウィルスはその鶏卵宿主に適応し、その後比較的容易に繁殖が起こる。しかし、ワクチン製造目的で鶏卵由来のIV を調製することには不利な点がいくつかあるということが、広く認識されている。ひとつの不利な点は、そのような製造過程は鶏卵の（微）生物学的品質の差異によりかなり影響を受けやすいということである。もうひとつの不利な点は、需要が急に高まった場合（すなわち、重大な流行又はパンデミックの場合）に、適切な鶏卵を大量に入手できないことによる補給の問題があるので、当該過程は完全に柔軟性を欠いているということである。また、上記のように調製されたワクチンは、鶏肉及び／又は鶏卵タンパク質に対し過敏症があることが既知である個人には、禁忌とされる。
【０００５】
現在使用されているインフルエンザワクチンは、完全ウイルス（WV）ワクチン又はサブビリオン（SV）（「スプリット」又は「表面抗体」とも呼ばれている）ワクチンである。WVワクチンが、完全な、不活化されたウィルスを含むのに対し、SVワクチンは、脂肪を含むウィルスのエンベロープを溶かす洗剤(detergents)を用いて壊し、その後残余のウィルスを化学的不活性化で不活性化した精製ウィルスを含む。インフルエンザに対する弱毒化ウィルスワクチンもまた開発中である。従来のワクチンを調製する方法に関する記述は、例えば、Wright, P.F. & Webster, R.G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D.M. et al. Ed.), 1464-65 (2001)に見出される。
【０００６】
ウィルス構造
ＩＶは、ほぼ球形をしているが、細長い形又は不規則な形を取ることもある。ウィルスの内部では、一本鎖RNAの8つのセグメントがあり、当該ウィルスを作る遺伝的指示を含んでいる。このウィルスの最も際立った特徴は、その表面を覆う外側に向かって突き出しているスパイクの層である。これらのスパイクには二種類ある：一方はヘマグルチニン分子（ＨＡ）から成り、他方はノイラミニダーゼ（ＮＡ）から成る。ＨＡ分子は、ウィルスが細胞に「吸着」し、感染を開始することを可能とする。ＮＡ分子は、新しく形成されたウィルスが、細胞の表面又はウィルス同士で相互に吸着することなく、その宿主細胞から出ることを可能とする。ウィルスキャプシッドは、ウィルスリボ核酸及び数種のいわゆる「内部」タンパク質｛ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ）、膜タンパク質（Ｍ１）、及び核タンパク質（ＮＰ）｝から成る。ＨＡ及びＮＡに対する抗体は、感染と戦う上で最も効果的であると従来より立証されているので、それらの分子の構造、機能及び遺伝的変異に焦点を当てて多くの研究が行われてきた。研究者達はまた、二つの非構造的タンパク質、Ｍ２及びＮＳ１に興味を持っている。これらの分子は双方とも、ウィルス感染において重要な役割を担っている。
【０００７】
Ａ型の亜型は、当該亜型が発見された地理的場所、研究所認識番号、発見された年、さらに当該亜型が持つＨＡ及びＮＡの型を括弧内に含む名称システムにより示され、その名称は、例えば、A/Hong Kong/156/97 (H5N1)となる。ウィルスがヒト以外の動物に感染する場合は、A/Chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2)のように、宿主の種が地理的場所の前に含められる。
【０００８】
ビリオンには、直線状のマイナス一本鎖RNAの７セグメント（Ｃ型ウィルス）から８セグメント（Ａ型及びＢ型ウィルス）が含まれている。ウィルスゲノムの殆どのセグメントは、単一タンパク質をコードする。多くのインフルエンザウィルスについて、ゲノム全体が今や既知となっている。ウィルスの遺伝的再集合(genetic reassortment)は、ある細胞が所与の型に属する二つの異なったウィルスにより同時に感染を受けた場合に、親遺伝子セグメントがそれらのウィルスの子孫で混交することに起因する。この現象は、インフルエンザウィルスのゲノムのセグメントの特性により促進される。遺伝的再集合は、ウィルスの表面抗原の突然変異(sudden change)として現れる。
【０００９】
ＨＡ及びＮＡにおける抗原の変異は、インフルエンザウィルスが多大な変異性(variability)を有することを可能にする。「抗原ドリフト」は、元の親ウィルスに由来するインフルエンザウィルスのＨＡ及びＮＡにおける小さな抗原変異を表すために使用される用語である。これに対し、新しいビリオンを大きく異なったものにするような大きな変異は、「抗原シフト」と呼ばれている。この２つの現象の違いは、程度の差である。
【００１０】
抗原ドリフト（小さな抗原変異）は、遺伝子における点突然変異の蓄積により起こり、これはそのタンパク質におけるアミノ酸の変異を生じさせる。極度で大規模な（変異の程度が非常に大規模であるため突然変異によるだけでは説明がつかない）変異は、ウィルスの抗原シフトを生じさせる。インフルエンザウィルスのセグメント化されたゲノムは、二重に感染した細胞に容易に再集合する。ヒトインフルエンザウィルスとヒト以外の動物に感染するインフルエンザウィルスの間に起こる遺伝的再集合は、抗原シフトの機序として示唆されている。インフルエンザは、人畜共通の疾患であり、野生及び家畜化されたブタ、ウマ、及びトリを含む多くの動物種において重要な病原である。インフルエンザウィルスは、ヒトからその他の種に感染する。
【００１１】
抗原シフト及び抗原ドリフトのため、ある特定のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するＩＶに対する免疫は、変異体、すなわち異なったＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するＩＶ菌株に対し、必ずしも防御免疫を与えない。ＨＡ及びＮＡに対する抗体は、ＩＶ感染と戦う上で最も効果的であると従来より立証されているので、それらの分子の構造、機能、及び遺伝的変異に焦点を当てて多くの研究が行われてきた。
【００１２】
近年のＩＶワクチン候補
過去数年間、ワクチン又は改良されたワクチンが求められている多くの感染症疾患に対し、ＤＮＡワクチンをテストすることについて強い関心が示されている。ＤＮＡワクチンのよく知られた幾かの利点には、製造を迅速、容易に且つ安価にできること、多価ワクチンを開発しテストすることができるという多用性(versatility)、ＤＮＡワクチンがヒトを含む多様な動物モデルにおいて頑健性(robust)の高い細胞性応答を引き起こすことができるという知見、並びにプラスミドＤＮＡを送達ベクターとして使用することの安全性が立証されていることが挙げられる（Donnelly, J.J., et al., Annu. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)； Manickan, E., et al., Crit. Rev. Immunol. 17(2):139-154 (1997)；アメリカ合衆国特許番号 6,214,804）。ＤＮＡワクチンは、次世代のワクチン開発を代表するものであり（Nossal, G., Nat. Med. 4(5 Supple):475-476 (1998)) 、多くのＤＮＡワクチンが治験中である。上記の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。
【００１３】
ＤＮＡワクチンを動物に用いた研究が既に行われている。Ulmer, J.B. et al., Science 259:1745-9 (1993)は、ＩＶ核タンパク質ＤＮＡワクチンのみを用いることにより、同種(homologous)又は異種(heteologous)のＩＶウィルスの攻撃に起因する重症疾患及び死亡から、ネズミを保護できたことを明らかにした。さらなる研究によりこのモデルは実証され、また生インフルエンザワクチンとＤＮＡインフルエンザワクチンとの比較研究によりネズミのモデルにおいて免疫誘導及び保護について両者が同等であることを示された。
【００１４】
国際公開特許９４／２１７９７（本明細書にその全体を参考により組み入れる）は、ＮＰ、ＨＡ、Ｍ１、ＰＢ１及びＮＳ１をコードするＤＮＡ構築物を含むＩＶワクチン組成物を開示している。国際公開特許９４／２１７９７はまた、このＤＮＡワクチン組成物の予防有効量を用いて予防接種することを含む、ＩＶ感染からの保護方法を開示している。
【００１５】
ＩＶ核タンパク質は、比較的保存され（Shu, L.L. et al., J. Virol. 67:2723-9 (1993)を参照せよ）、ＲＮＡセグメント７の別個のリーディングフレームによりコードされるＭ１膜タンパク質（主要なＴ−細胞標的である）及びＭ２膜タンパク質は保存される（Neirynck, S. et al., Nat. Med. 5:1157-63 (1999); Lamb, R.A. & Lai, C.J., Virology 112:746-51 (1981)；Ito, T. et al., J. Virol. 65:5491-8 (1991)を参照せよ）。ＤＮＡワクチンの動物実験が、これらの遺伝子を単独で若しくは組み合わせてコードするＤＮＡ構築物を用いて行われており、通常好ましい結果が出ている（Okuda, K., et al., Vaccine 19:3681-91 (2001); Watabe, S. et al., Vaccine 19:4434-44 (2001)を参照せよ）。面白いことに、Ｍ２タンパク質は、イオンチャンネルの一部として関与しており、抗ウィルス剤であるアマンタジン及びリマンタジンに対する耐性において必須であり、さらに約２４個のアミノ酸が細胞外に存在する（ｅＭ２）（Fischer, W.B., Biochim Biophys Acta 1561:27-45 (2002); Zhong, Q., FEBS Lett 434:265-71 (1998) を参照せよ）。この細胞外に存在する高度に保存されたタンパク質（ｅＭ２）に対する抗体（感染細胞において高度に発現している；Lamb, R.A., et al., Cell 40:627-33 (1985) を参照せよ）は、動物モデルに関連を持っていると報告されている（Treanor, J.J., J. Virol. 64:1375-7 (1990); Slepushkin, V.A. et al., Vaccine 13:1399-402 (1995) を参照せよ）。コンジュゲートＢ型肝炎コアｅＭ２タンパク質を用いたアプローチが、動物モデルにおいて評価され、パンデミックインフルエンザワクチンとして提案された（Neirynck, S. et al., Nat. Med. 5:1157-63 (1999) を参照せよ）。しかし、１件の研究においては、ｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質を発現するＤＮＡ構築物でのブタの予防接種が、Ａ型インフルエンザウィルスの攻撃後の疾患を悪化させた（Heinen, P.P., J. Gen. Virol. 83:1851-59 (2002) を参照せよ）。上記の参考文献はすべて、本明細書にその全体を参照により組み入れられる。
【００１６】
異種(heterologous)の「プライム−ブースト」ストラテジーが、多くの病原に対し免疫応答を高め、それらの病原からの保護を高めるために有効であった（Schneider et al., Immunol. Rev.170:29-38 (1999);  Robinson, H.L., Nat. Rev. Immunol. 2:239-50 (2002); Gonzalo, R.M. et al., Vaccine 20:1226-31 (2002); Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041-7 (2001) を参照せよ）。プライム及びブースト注射により異なった形態の抗原を提供することにより、当該抗原に対する免疫応答が最大限になるように思われる。ＤＮＡワクチンのプライミング、その後のアジュバント中のタンパク質のブースティング又は抗原をコードするＤＮＡのウィルスベクター投与は、抗原に特異的な抗体及びＣＤ４＋Ｔ−細胞性応答又はＣＤ８＋Ｔ−細胞性応答をそれぞれ改善する上で最も効果的な方法と思われる（Shiver J.W. et al., Nature 415: 331-5 (2002); Gilbert, S.C. et al., Vaccine 20:1039-45 (2002); Billaut-Mulot, O. et al., Vaccine 19:95-102 (2000); Sin, J.I. et al., DNA Cell Biol. 18:771-9 (1999) を参照せよ）。サルの予防接種研究から得られた最近のデータによると、ＣＲＬ１００５ポロキサマー （１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を、ＨＩＶ  Ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えると、サルにＨＩＶ  Ｇａｇ  ＤＮＡプライムを用いて予防接種を施し、続いてＨＩＶ  Ｇａｇ（Ａｄ５−ｇａｇ）を発現するアデノウイルスベクターをブーストした場合に、Ｔ−細胞性応答が高められることが示唆されている。ＤＮＡ／ポロキサマーによるプライム及びそれに続くＡｄ５−ｇａｇのブーストを行った場合の細胞の免疫応答は、ＤＮＡ（ポロキサマーなし）によるプライム及びそれに続くＡｄ５−ｇａｇのブーストを行った場合、又はＡｄ５−ｇａｇのみの場合に誘導される反応に比べ、強かった（Shiver, J.W. et al. Nature 415:331-5 (2002) を参照せよ）。アメリカ合衆国特許出願公開番号ＵＳ  ２００２／０１６５１７２  Ａ１は、免疫応答を発生させるような、ある抗原の免疫原性がある部分をコードするベクター構築物と、ある抗原の免疫原性がある部分から成るタンパク質との同時投与について説明している。この文献は、Ｂ型肝炎抗原及びＨＩＶ抗原に限定されている。さらに、アメリカ合衆国特許番号６，５００，４３２は、対象のポリヌクレオチド及びポリペプチドの同時投与により核酸ワクチンの免疫応答を高める方法に関する。この特許によると、同時投与とは、同一の免疫応答中にポリヌクレオチドとポリペプチドを投与することであり、望ましくは二者の投与間隔は０日−１０日又は３日−７日以内である。この特許で検討されている抗原には、肝炎の抗原（全部の形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例：プラスモジウム属の寄生虫）、及び病原細菌（M. tuberculosis, M. leprae, Chlamydia, Shigella, B. burgdorferi, enterotoxigenic E. coli, S. typhosa, H. pylori, V. cholerae, B. pertussisなどを含むがそれらに限定されるものではない）が含まれる。上記の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要約
本発明は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを脊椎動物の一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めることに関する。ここで、前記ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸断片を含み、この１つ以上の核酸断片は、任意に、１つ以上のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。本発明はさらに、上記の１つのポリヌクレオチドに加えて、少なくとも１つの単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を脊椎動物の一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めることに関する。前記単離ＩＶポリペプチドは、例えば、精製サブユニット、組み換えタンパク質、又は単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクターであってよく、或いは従来のＩＶワクチンに存在するような不活性化若しくは弱毒化したＩＶであってもよい。どの方法によっても、当該ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、免疫学的に有効な量でコードされたＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体からなる免疫原性エピトープをｉｎ  ｖｉｖｏで生産する。使用される場合には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体もまた、免疫学的に有効な量で投与される。
【００１８】
本発明によると、ポリヌクレオチドは、当該単離ＩＶポリペプチドを投与する前、それと同じ時(同時)、又はその後に投与してよい。当該ポリヌクレオチドによりコードされた単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、脊椎動物においてインフルエンザウィルスに対する免疫応答を誘導することができる、少なくとも１つの免疫原性を有するエピトープを含む。加えて、使用する場合には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、脊椎動物において免疫応答を誘導することができる少なくとも１つの免疫原性を有するエピトープを含む。当該ポリヌクレオチドによりコードされた当該ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、当該方法により投与してよい当該単離ＩＶポリペプチドと同じタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体であってもよいが、その必要はない。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、核酸断片を含み、この核酸断片は、任意のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質又はそれらの断片（例えば、ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体を含むが、それらに限定されるものではない）を、作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。本発明のポリヌクレオチドはまた、誘導融合タンパク質をコードすることができ、ここでは２つ以上の核酸断片（これらの核酸断片のうち少なくとも１つは、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくはそれらの誘導体をコードする）が、ｅＭ２に融合したＮＰのように、単一ポリペプチドをコードするフレームで合体している。さらに、本発明のポリヌクレオチドはまた、異種の核酸又は核酸断片を含んでもよい。そのような異種の核酸又は核酸断片は、融合される異種のポリペプチド(例：Ｂ型肝炎コアタンパク質又は分泌シグナルペプチド)を、ＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共にフレーム中にコードしてもよい。好ましくは、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫原性があるＩＶエピトープを含むＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードし、このエピトープは、Ｂ−細胞（抗体）応答、Ｔ−細胞（例：ＣＴＬ）応答、又はその双方を誘導する。
【００２０】
同様に、投与する単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態の何れか）は、任意の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体であってよく、その例としてはＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２タンパク質、又はそれらの断片（例：ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体が挙げられるがそれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、誘導体タンパク質は、ＮＰ−ｅＭ２などの融合タンパク質であってよい。その他の実施形態では、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、異種のタンパク質（例：分泌性シグナルペプチド又はＢ型肝炎ウィルスコアタンパク質）に融合されていてもよい。好ましくは、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、少なくとも１つの免疫原性があるＩＶエピトープを含み、この抗原はＢ−細胞抗体応答、Ｔ−細胞抗体応答、又はその双方を誘導する。
【００２１】
本発明の核酸及びその断片は、次に示す方法の１つ以上の方法により、それらの天然状態から改変することができる。まず、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする核酸又はその断片は、コドン最適化コード領域（ワクチンを投与する動物におけるコドン用法に従って最適化した領域）の一部又は全部であってもよい。さらに、ＩＶポリペプチドをコードする核酸及びその断片は、全長ポリペプチドの一部のみコードする断片であってよく、且つ／又は、例えば、コードされたポリペプチドに存在する望ましくないタンパク質モチーフ及び当該コードされたポリペプチドに関連した病原性因子をコードポリペプチドから切り離すように、突然変異を起こさせてもよい。例えば、核酸配列は、ｅＭ２などに見られるような細胞からのポリペプチド放出を防げる膜アンカー領域をコードしないように、突然変異を起こさせてもよい。送達されると、本発明のポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで脊椎動物の細胞に取り込まれ、予防学的又は治療的に有効な量で、ＩＶの免疫原性エピトープがｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。
【００２２】
同様に、本発明のタンパク質は、全長ＩＶポリペプチドの断片であってもよく、且つ／又は、例えば、ポリペプチドに存在する望ましくないタンパク質モチーフ及び当該ポリペプチドに関連した病原性因子をポリペプチドから切り離すように、改変してもよい。例えば、ポリペプチドは、細胞からのポリペプチド放出を防げる膜アンカー領域をコードしないように、改変してもよい。
【００２３】
本発明はさらに、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、このポリヌクレオチドが、１以上の核酸断片を含み、この核酸断片は、それぞれ、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である組成物；並びに上記のポリヌクレオチドと、少なくとも１つの単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物を提供する。そのような組成物はさらに、本明細書に記載されているように、例えば、担体、賦形剤、形質移入促進剤、及び／又はアジュバントを含んでよい。
【００２４】
上記の、ポリヌクレオチドと、１つの単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物は、(例えば、組成物のポリヌクレオチド部分を、組成物の単離ＩＶポリペプチド部分を投与する前に（又は投与した後で）、投与す場合などでは)当該ポリヌクレオチドと当該タンパク質製剤とを別々に投与するように、提供することができる。あるいはまた、当該ポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物は、（例えば、ポリヌクレオチド及びタンパク質を同時に投与する場合などでは）当該ポリヌクレオチド及びタンパク質の双方を含む単一の製剤として提供することができる。さらにまた、組成物のポリヌクレオチド部分と組成物の単離ＩＶポリペプチド部分を、同時に、別々の製剤において提供することができる。
【００２５】
１つ以上の核酸断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチド含有する組成物であって、当該核酸断片は、それぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であり、加えて１つ以上の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態で）を含む組成物を、本明細書において「組み合わせポリヌクレオチド(例：ＤＮＡ)ワクチン組成物」又は「単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物」と呼ぶ。
【００２６】
本発明の組成物は、一価、二価、三価、または多価であってよい。一価の組成物は、１つの核酸断片を含む１つのポリヌクレオチドのみを含有し、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であり、任意に、単離形態の同一ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含む。単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物において、一価の組成物には、１つの核酸断片を含む１つのポリヌクレオチドを含有し、この核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該ポリヌクレオチドと同じ抗原領域を有する単離ポリペプチドを含む。二価の組成物は、ポリヌクレオチドの形態であってもタンパク質の形態であっても、免疫応答を誘導する能力を有する、２つの異なったＩＶポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体を含む。本組成物のポリヌクレオチドは、２つのＩＶポリペプチドをコードしてもよいし、或いはまたポリヌクレオチドは、１つのＩＶポリペプチドだけをコードして、二番目のＩＶポリペプチドは、例えば、単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物に存在するような本発明の単離ＩＶポリペプチドを用いて提供するようにしてもよい。二価組成物のＩＶポリペプチドを両方ともポリヌクレオチド形態で投与する場合は、それらのＩＶポリペプチドを作動可能にコードする核酸断片は、同一のポリヌクレオチドに存在する必要はなく、２つの異なったポリヌクレオチドに存在するもであってもよい。三価又はそれ以上の多価の組成物は、単離形態であっても、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる形態であっても、３つのＩＶポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体を含む。
【００２７】
本発明はさらに、例えばヒトのような脊椎動物に本発明の核酸断片を送達するためのプラスミド及びその他のポリヌクレオチド構築物を提供し、これらのプラスミド及びその他のポリヌクレオチド構築物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の発現を提供する。本発明はさらに、投与された遺伝子及びその遺伝子産物の形質移入、発現、又は効能を高めるために、担体、賦形剤、形質移入促進剤、アジュバントなどの免疫原性亢進剤、又はその他の添加剤を、提供する。
【００２８】
一の実施形態では、多価の組成物は、作動可能にＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする１つ以上の核酸領域を含有する単一のポリヌクレオチド(例：プラスミド)を含む。本発明の組成物におけるポリヌクレオチド(例：プラスミド)の数を減じると、製品の製造及び販売に大きな効果をもたらし、それにより当該組成物を製造することに関わるコストを低減することができる。単一のプラスミド上に１つ以上の発現される抗原のコード配列を含めるための数多くのアプローチがある。これらのアプローチには、例えば、リボソーム内部進入部位[Internal Ribosome Entry Site (IRES)]配列、デュアルプロモータ／発現カセット、及び融合タンパク質の使用が挙げられる。
【００２９】
本発明はまた、ＩＶ感染に対する脊椎動物の免疫応答を高める方法を提供する。この方法は、脊椎動物の組織へ、１つ以上の核酸断片を含む１つ以上のポリヌクレオチドであって、この核酸断片が、それぞれ任意に、１つのＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であるポリヌクレオチドを投与し、さらに任意に、脊椎動物の組織へ１つ以上の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を投与することによる。単離ＩＶポリペプチドは、ＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与する前に、同じ時(同時)に、又は投与した後に、投与してよい。
【００３０】
さらに、本発明は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体についてのコンセンサスアミノ酸配列を提供し、その例には、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質、又はその断片（例：ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体が含まれるがそれらに限定されるものではない。コンセンサスポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明で具現化されている。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、後述するように、アミノ酸配列の逆翻訳や当該ポリヌクレオチドのPCR合成のような、既知の方法により得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、１つ以上の核酸断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを、脊椎動物の組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法であって、前記１つ以上の核酸断片がそれぞれ、任意に、保護の必要性のある脊椎動物の細胞において１つのＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である組成物及び方法に関する。本発明はまた、上記の１つのポリヌクレオチドと、少なくとも１つの単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを脊椎動物の組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することに関する。当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、当該タンパク質を発現する異種の生、不活性化又は弱毒化ウィルスベクターにより発現され担持されるタンパク質であってよく、或いは市販されている従来の不活性化ＩＶワクチンに存在するような不活性化ＩＶであってもよい。どの方法によっても、当該ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、免疫学的に有効な量の、当該ポリヌクレオチドによりコードされるインフルエンザタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体がｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。当該単離タンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体もまた、免疫学的に有効な量で投与される。当該ポリヌクレオチドは、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を投与する前、それと同じ時(同時)、又はその後に投与することができる。
【００３２】
本発明の範囲内のＩＶポリペプチドの非限定的な例には、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１及びＭ２ポリペプチド、又はそれらの断片（例：ｅＭ２）、誘導体(例：ＮＰ−ｅＭ２の融合)及び変異体が含まれるが、それらに限定されるものではない。多種多様なＩＶ型及び亜型に由来するＩＶポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列が、当業界において知られている。下記のヌクレオチド配列は、野生型配列である。例えば、Influenza A/PR/8/34 (H1N1)のＮＰタンパク質のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号Ｍ３８２７９．１として入手可能であり、以下に示す配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:1として参照する。
【化１】
2008505660.tif 000002
【００３３】
SEQ ID NO:1のヌクレオチド46-1494によりコードされる、Influenza A/PR/8/34 (H1N1)のＮＰタンパク質のアミノ酸配列は以下に示す通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:2として参照する。
【化２】
2008505660.tif 000003
【００３４】
ＩＡＶゲノムのセグメント７は、Ｍ１及びＭ２の双方をコードする。Ａ型インフルエンザウィルスのセグメント７(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1))は、GenBank受託番号AF389121.1として入手可能であり、本明細書では、下記配列をSEQ ID NO:3として参照する。
【化３】
2008505660.tif 000004
【００３５】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド26から784によりコードされる、Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)のＭ１タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:4として参照する。
【化４】
2008505660.tif 000005
【００３６】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド26から51及び740 から1007により（スプライス形態で）コードされる、Influenza A /Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)のＭ２タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、下記配列をSEQ ID NO:5として参照する。
【化５】
2008505660.tif 000006
【００３７】
Ｍ２タンパク質（ｅＭ２）の細胞外領域は、当該タンパク質のN末端の最初の２４個のアミノ酸に対応し、上記に下線で示されている（Fischer, W.B. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1561:27-45 (2002); Zhong, Q. et al., FEBS Lett. 434:265-71 (1998)を参照せよ）。
【００３８】
本明細書で説明しているＮＰ及びｅＭ２の誘導体は、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸及びＮＰの全部若しくは一部をコードする構築物によりコードされる。融合構築物は、ｅＭ２配列及びそれに続くＮＰ配列により構築してもよく、或いはＮＰ配列及びそれに続くｅＭ２配列により構築してもよい。Influenza A/PR/8/34 (H1N1)に由来するＮＰ及びｅＭ２配列を用いた融合構築物の例を、以下に示す。元のインフルエンザウィルスのヌクレオチド配列を使用し、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸をコードし、その３’末端で、ＮＰをその全体においてコードする配列に融合している配列であるｅＭ２−ＮＰは、本明細書では、下記のSEQ ID NO:6として参照する。
【化６】
2008505660.tif 000007
【００３９】
SEQ ID NO:6のヌクレオチド1から1566によりコードされる、Influenza A/PR/8/34/ (H1N1)のｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:7として参照する（ｅＭ２アミノ酸配列は下線で示した）。
【化７】
2008505660.tif 000008
【００４０】
元のインフルエンザウィルスのヌクレオチド配列を使用し、NPをその全体においてコードし、このＮＰは、その３’末端で、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸に融合し、さらにこのＭ２は、ＮＰを全体としてコードする配列に融合している配列が、本明細書では、下記SEQ ID NO:8として参照される。
【化８】
2008505660.tif 000009
【００４１】
SEQ ID NO:8のヌクレオチド1 から1566によりコードされる、Influenza A/PR/8/34/ (H1N1)のＮＰ−ｅＭ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:9と呼ぶ（ｅＭ２  アミノ酸配列は下線で示した）。
【化９】
2008505660.tif 000010
【００４２】
機能性融合タンパク質の構築は、最大限の柔軟性を与えるために拡大したコンフォメーションを採用する目的で、二つの融合断片間にリンカー配列を必要とすることがよくある。我々は、LINKER というプログラムを使用した｛Chiquita J. Crasto C.J. and  Feng, J. Protein Engineering 13:309-312  (2000), このプログラムは以下のサイトに公開されている：http://chutney.med.yale.edu/linker/linker.html（２００３年４月１６日に閲覧した）｝。このプログラムは、自動的にリンカー配列のセットを作り出すものであり、このリンカー配列のセットは、Ｘ線による結晶構造解析及びNMR による測定により、拡大したコンフォメーションを採用するのに知られている。多様なeM2-NP およびNP-eM2融合タンパク質において使用できる適切なリンカーの例を、以下に挙げる。
【化１０】
2008505660.tif 000011
【００４３】
Influenza B/LEE/40のNPタンパク質のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号K01395として入手可能であり、この配列は、以下の配列を有し、本明細書ではSEQ ID NO:15として参照する。
【化１１】
2008505660.tif 000012
【００４４】
SEQ ID NO:1のヌクレオチド1から1680によりコードされる、IBV B/LEE/40のＮＰタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:16として参照する。
【化１２】
2008505660.tif 000013
【００４５】
IAV のヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列の非限定的例を下記に示す。ＨＡ配列はＩＶ亜型間で大きく異なるということを特筆しておかなければならない。実質的には、ＩＶＨＡをコードするヌクレオチド配列であればどのような配列であっても、本発明に適合する。実際、本発明のワクチン及び治療用製剤に含まれるＨＡ配列は（下記に、より詳細に説明されている）、ＩＶの流行株により年毎に変わる可能性がある。
【００４６】
IAV A/New_York/1/18(H1N1)のHAタンパク質の部分ヌクレオチド配列は、GenBank受託番号AF116576として入手可能であり、この配列は、以下の配列を有し、本明細書ではSEQ ID NO:17として参照する。
【化１３】
2008505660.tif 000014
【００４７】
SEQ ID NO:17のヌクレオチド1から1218によりコードされる、IAV A/New_York/1/18(H1N1)の部分HAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:18として参照する。
【化１４】
2008505660.tif 000015
【００４８】
IAV A/Hong Kong/482/97ヘマグルチニン（Ｈ５）のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号AF046098として入手可能であり、以下の配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:19として参照する。
【化１５】
2008505660.tif 000016
【００４９】
SEQ ID NO:19のヌクレオチド9 から1715によりコードされる、IAV A/Hong Kong/482/97 (H5)のHAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:20として参照する。
【化１６】
2008505660.tif 000017
【００５０】
IAV A/Hong Kong/1073/99(H9N2)のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号INA404626として入手可能であり、以下の配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:21として参照する。
【化１７】
2008505660.tif 000018
【００５１】
SEQ ID NO:21のヌクレオチド32から1711によりコードされる、IAV A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)のHAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:22として参照する。
【化１８】
2008505660.tif 000019
【００５２】
本発明はまた、コドン最適化及び／又はその他の処理により達成される最適な発現性及び安全性を持って、ＩＶコード配列を脊椎動物に送達するためのワクチン組成物及び方法を提供する。これらのワクチン組成物は、コードされた遺伝子産物が対象の脊椎動物において最適に発現するように調製され、投与される。その結果、これらの組成物及び方法は、ＩＶ感染に対する免疫応答を刺激することにおいて有用である。本発明には、発現システム、送達システム、及びコドン最適化ＩＶコード領域もまた含まれる。
【００５３】
ある特殊な実施の形態において、本発明は、組合せポリヌクレオチド(例：ＤＮＡ)ワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物は、ポリヌクレオチドワクチンとポリペプチド（組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態のもの）ワクチンとを単一の製剤に組合せたものである。当該単一製剤は、本明細書で記述のＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるワクチンと、任意に、望ましい単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との有効量を含む。当該ポリペプチドは、いかなる形態で存在してもよく、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態のものでもよい。当該ポリヌクレオチドワクチンによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と同一であってもよい。あるいはまた、ポリヌクレオチドによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と異なっていてもよい。
【００５４】
「１つの（ａ又はａｎ）：（翻訳上、oneは、１つと訳したが、ａ又はａｎは特に訳していない：翻訳者記」」物という語は、１つ以上の物を表すことを特筆しておく。例えば、「１つのポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は１つ以上のポリヌクレオチドを表していると理解される。そのように、「１つの（ａ（又はａｎ））」、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という語は、本明細書においては、相互に交換して使ってよい。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」という語は、単数の核酸又は核酸断片、並びに複数の核酸又は核酸断片を網羅する意味で使われており、さらに単離分子又は構築物を意味する。単離分子又は構築物の例には、ウィルスゲノム（例えば、非感染性ウィルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、又はポリヌクレオチドを含むｐＤＮＡの誘導体｛例えば、Darquet, A-M et al., Gene Therapy 4:1341-1349 (1997)に説明されているミニサークル｝がある。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合や一般的でない結合｛例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合｝を含んでもよい。
【００５６】
「核酸」又は「核酸断片」という語は、ポリヌクレオチド又は構築物に存在する１つ以上の核酸セグメント（例：ＤＮＡ又はＲＮＡ断片）を意味する。核酸又はその断片は、直線状(例えばｍＲＮＡ)又は環状(例えば、プラスミド)で提供されてよく、二本鎖状又は一本鎖状で提供されてもよい。「単離」核酸又はポリヌクレオチドという語は、その天然環境から取り出された核酸分子(ＤＮＡ又はＲＮＡ)を意味する。例えば、ベクターに含まれている組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的に基づき、単離されているとみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞で保持されている組み換えポリヌクレオチド及び溶液中の精製（不完全精製又は完全精製）ポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチド又は核酸にはさらに、合成により生産されたそのような分子も含まれる。
【００５７】
本明細書で用いる際、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなしてよい。しかし、フランキング配列（例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写終結など）はコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上の核酸又は核酸断片は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のプラスミド）に存在してもよく、又は別のポリヌクレオチド構築物｛例えば、別の（異なった）プラスミド｝に存在してもよい。さらに、いかなる核酸又は核酸断片も、単一のＩＶポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードしてよいし、あるいはまた、例えば、１つ以上のポリペプチドをコードしてよく、例えば、１つの核酸は２つ以上のポリペプチドをコードしてよい。さらに、核酸は、制御因子（例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写終結など）を含んでいてもよいし、ＩＶコード領域に融合した異種のコード領域（例えば、分泌性シグナルペプチドや異種の機能ドメインなどの特殊化された因子やモチーフ）をコードしてもよい。
【００５８】
本発明のＩＶポリペプチドに言及する場合、「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」という語は、それらの対応する天然のポリペプチドの免疫原性又は抗原性を少なくともある程度保持するすべてのポリペプチドを含む。本発明のＩＶポリペプチドの断片は、タンパク分解断片、欠失断片、及び、特に、動物に送達された場合に、細胞からの分泌を高め、免疫原性を向上させ、又は病原性を減じるＩＶポリペプチドの断片を含む。ポリペプチドの断片にはさらに、天然のポリペプチドの抗原性又は免疫原性を有するエピトープ（直線状及び立体状のエピトープを含む）を含むポリペプチドの部分が含まれる。本発明のＩＶポリペプチドの変異体は、上に説明されているような断片に加えて、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入により起こったアミノ酸配列の改変を有するポリペプチドを含む。変異体は、対立遺伝子変異体のように、自然に起こる場合がある。「対立遺伝子変異体」は、有機体又はウィルスのある染色体又はゲノム上の所与の座を占める遺伝子の代替形態を意味する（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)を参照せよ；この参考文献は本明細書に参照により組み入れる）。この例としては、本明細書に記載されているように、所与の遺伝子産物における変異がある。ＩＶのＮＡ又はＨＡタンパク質について言及する場合は、そのようなタンパク質は、天然のＩＶ株がウィルスによりコードされたＮＡ又はＨＡタンパク質の型に基づいて区別されるという点において、それぞれ「変異体」である。しかし、単一のＨＡ又はＮＡ変異体型内において、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換のような自然に又は人工的に起こる変異は起こり得る。人工的に生じる変異体は、突然変異生成技術を用いて作製することができる。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含んでいてよい。本発明のＩＶポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドに無い付加的な特徴を提示するように改変されたポリペプチドである。その例には、融合タンパク質がある。類似体は、本発明のＩＶポリペプチドの別の形態である。その一例は、その開裂により活性化し活性成熟ポリペプチドを生産することができるプロタンパク質である。
【００５９】
「感染性ポリヌクレオチド」又は「感染性核酸」という語は、許容細胞への取込みで、完全な感染性ウィルス粒子の合成を単独で充分に仲介する単離ウィルスポリヌクレオチド及び／又は核酸を網羅する意味で使われている。このように、「感染性核酸」は、許容宿主細胞における自己の複製サイクルを開始するために、自己がコードするいかなるポリペプチドのプレ合成コピー（例えば、ウィルスレプリカーゼ）を必要としない。
【００６０】
本明細書で定義している「非感染性ポリヌクレオチド」又は「非感染性核酸」という語は、ポリペプチドのような付加材料を加えなければ、許容細胞への取込みで完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介することができないポリヌクレオチド又は核酸である。感染性ポリヌクレオチド又は核酸は、単にそれが非許容細胞へ取込まれたという理由で、「非感染性」ポリヌクレオチドにならない。例えば、限定された宿主範囲を有するウィルスに由来する感染性ウィルスポリヌクレオチドは、それが許容宿主(例えば、当該ウィルス自体を許容する宿主)に由来する細胞により取り込まれた時に完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介する能力がある場合に、感染性である。非許容宿主に由来する細胞により取り込まれることが完全な感染性ウィルス粒子の合成を生じないという事実により、当該核酸が「非感染性」になるわけではない。言い換えれば、この語は、宿主細胞の性質、組織の種類、或いは当該ポリヌクレオチド又は核酸断片を取り込む動物種により、制限されるのではない。
【００６１】
一部のケースでは、単離感染性ポリヌクレオチド又は核酸が、ウィルス粒子のためのレセプターを欠いた（すなわち、ウィルス侵入に対し非許容的である）宿主細胞集団において、完全に感染性のウィルス粒子を生産することがある。従って、生産されたウィルスは、周りの細胞に感染を起こさない。しかし、ウィルス粒子を含む上澄液を当該ウィルスに対し許容性のある細胞に移すと、感染が起こる。
【００６２】
「複製するポリヌクレオチド」又は「複製する核酸」は、許容宿主細胞に取り込まれると同一のポリヌクレオチド又は核酸のコピーを複数（例えば、１つ以上）生産する能力があるポリヌクレオチド及び／又は核酸を網羅する意味で使われている。感染性ポリヌクレオチド及び核酸は、「複製するポリヌクレオチド」又は核酸のサブセットであり、これらの語は同義語ではない。例えば、ウィルスコートタンパク質の遺伝子を欠いた欠損ウィルスゲノムは、複製はする（自己のコピーを複数生産する）が、感染性ではない。なぜなら、欠損ウィルスゲノムは、コートタンパク質又はこのコートタンパク質をコードする別の核酸が外因的に提供されない限り、完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介する能力がないからである。
【００６３】
ある実施の形態において、ポリヌクレオチド、核酸又は核酸断片は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドはまた、通常、プロモータ及び／又はポリペプチドコード核酸断片に作動可能に附随するその他の転写又は翻訳制御因子を含む。作動可能に附随するということは、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)をコードする核酸断片に、当該遺伝子産物の発現を制御配列の影響下若しくは制御の下で行うように、１つ以上の制御配列が付随している場合である。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード核酸断片及び当該核酸断片の５’末端に附随したプロモータ）は、以下の条件が満たされた場合に「作動可能に附随している」：プロモータ機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じ、当該２個のＤＮＡ断片間の連結の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生じず、（２）当該遺伝子産物の発現を制御する発現制御配列の能力を干渉せず、さらに（３）転写されるＤＮＡテンプレートの能力を干渉しない場合。このように、プロモータ領域は、当該プロモータが核酸断片の転写に影響を与える能力がある場合に、ポリペプチドをコードする当該核酸断片に作動可能に附随している。当該プロモータは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的なプロモータであってもよい。プロモータ以外のその他の転写制御因子（例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終止シグナル）は、ポリヌクレオチドに作動可能に附随して、細胞特異的な転写を指示することができる。適切なプロモータ及びその他の転写制御領域は本明細書に開示されている。
【００６４】
多様な転写制御領域が、当業者に公知である。これらの転写制御領域には、限定なく、脊椎動物の細胞において機能する転写制御領域が含まれ、その例には、サイトメガロウィルスに由来するプロモータ及びエンハンサーのセグメント（イントロンＡと協働する、最初期プロモータ(immediate early promoter））、シミアンウィルス４０（初期プロモータ）、及びレトロウィルス （例えば、ニワトリ肉腫ウィルス）が含まれるがそれらに限定されるものではない。その他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子に由来するもの（アクチン、抗熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及び ウサギb-グロビン）、並びに真核細胞で遺伝子発現を制御する能力のあるその他の配列が含まれる。さらに適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモータ及びエンハンサー、並びにリンフォカイン誘導可能プロモータ（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモータ）が含まれる。
【００６５】
同様に、多様な転写制御因子が、当業者に公知である。これらの転写制御因子には、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終止コドン、ピコルナウィルスに由来する因子｛特に、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）又はＣＩＴＥ[Cap-Independent Translation Enhancer]配列とも呼ばれている因子｝が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、環状又は直線化されたプラスミド又はベクター、或いは非感染性で組み込み能力がない（すなわち、当該ＤＮＡが脊椎動物の細胞のゲノムに組み込まれないということ）その他の直線状ＤＮＡであってよい。直線化されたプラスミドは、以前に環状だったが例えば制限エンドヌクレアーゼ消化により直線化されたプラスミドである。Cherng, J.Y., et al., J. Control. Release 60:343-53 (1999)、及びChen, Z.Y., et al. Mol. Ther. 3:403-10 (2001)（これらの参考文献は本明細書に参照により組み入れる）で検討されているように、直線状ＤＮＡは、ある状況においては、有利であるかもしれない。本明細書で用いる際、プラスミド及びベクターという語は、相互に交換可能に使用できる。
【００６７】
あるいはまた、ＤＮＡウィルスゲノムを用いてＤＮＡポリヌクレオチドを脊椎動物の細胞に投与してもよい。ある実施の形態においては、本発明のＤＮＡウィルスゲノムは、非複製、非感染性、及び／又は組み込み能力がない。適切なＤＮＡウィルスゲノムには、限定なく、ヘルペスウィルスゲノム、アデノウィルスゲノム、アデノ関連ウィルスゲノム、及びポックスウィルスゲノムがある。非感染性のウィルスゲノムを脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ導入する方法を引用している参考文献は、当業者には周知であり、上記に引用されている。
【００６８】
その他の実施の形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。ＲＮＡ配列を脊椎動物の細胞に導入する方法は、アメリカ合衆国特許番号５，５８０，８５９に説明されており、その開示はその全体において参照により本明細書に組み入れる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド、核酸及び核酸断片は、分泌性ペプチド又はシグナルペプチドをコードする付加的な核酸を伴ってもよく、このような付加的な核酸は、本発明の核酸断片又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する。シグナル仮説によると、成長しているタンパク質鎖の粗面小胞体を横断する輸送が一旦開始されると、哺乳動物の細胞によって分泌されたタンパク質は、成熟したタンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物の細胞から分泌されたポリペプチドが一般的に当該ポリペプチドのN末端に融合したシグナルペプチドを有しており、当該シグナルペプチドが完全又は「全長」ポリペプチドから切断されて当該ポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するということを認識している。ある実施の形態においては、天然のリーダー配列が使用されるか、あるいはその配列に作動可能に附随する当該ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種の哺乳動物のリーダー配列又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型のリーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はネズミβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換してもよい。
【００７０】
本発明のひとつの態様に従って、ポリヌクレオチドの構築物が提供される。その例には、核酸断片を含有するプラスミドであって、当該核酸断片が、ＩＶ由来のポリペプチドを作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該コード領域は、治療又は予防接種を施す脊椎動物に送達されるように、望ましい脊椎動物種（例えばヒト）の脊椎動物細胞における発現について最適化されているプラスミドがある。適切なＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、ＩＶ  ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、又はＭ２のタンパク質に由来するものであってよいが、それらに限定されるものではない。さらなるＩＶ由来のコード配列（例えば、ＩＶ  ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２又はｅＭ２をコードする）が、当該プラスミドに又は別個のプラスミドに含まれてよく、天然のＩＶコドン、又は治療若しくは予防接種を施す脊椎動物での発現について最適化されたコドンを用いて発現させてもよい。１つ以上の最適化インフルエンザ配列をコードするそのようなプラスミドを治療又は予防接種を施す脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ投与すると、１つ以上のコードされた遺伝子産物が発現される（すなわち、転写され翻訳される）。遺伝子産物の発現レベルは、附随するプロモータの強度及び附随するエンハンサー因子の存在と活性化、並びに当該コード領域の最適化の程度に、多いに依存する。
【００７１】
本明細書で用いる際「プラスミド」という語は、遺伝物質（すなわち、核酸）から作製された構築物を意味する。一般的に、プラスミドには複製起点(origin of replication)が含まれており、この複製起点は、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）内で機能し、当該プラスミドを有する細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーである。本発明のプラスミドは、本明細書で記述するような、挿入されたコード配列が真核細胞内で転写・翻訳されるように配置された遺伝因子を含んでいてよい。また、当該プラスミドは、ウィルス核酸に由来する配列を含んでいてよい。しかし、そのようなウィルス配列は通常、ウィルス粒子に当該プラスミドを組み入れることを指示又は可能にするのに充分ではなく、従って当該プラスミドは非ウィルスベクターである。本明細書で記述するある実施の形態では、プラスミドは閉鎖環状DNA 分子である。
【００７２】
「発現」という語は、コード配列によりコードされる産物の生物学的生産を意味する。ほとんどの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列が、転写されメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。その後メッセンジャーＲＮＡが、翻訳されて、関連のある生物活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現の過程には、転写のＲＮＡ産物に対するさらなる処理過程（例えば、イントロンを除去するスプライシング、及び／又はポリペプチド産物の翻訳後処理）が含まれる。
【００７３】
本明細書で用いる際「ポリペプチド」という語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を網羅し、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を含むことを意味する。このように、本明細書で用いる際、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸の鎖」を含むがそれらに限定されない語群、或いは２つ以上のアミノ酸からなる鎖を意味するその他のいかなる語も、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という語をこれらのいかなる語の代わりに、又は相互に取り替えて使ってもよい。この「ポリペプチド」という語にはさらに、翻訳後の修飾を経たポリペプチドが含まれ、翻訳後の修飾の例としては、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基を用いた誘導体化、タンパク質分解性の開裂、又は人工的に発生するアミノ酸を用いた修飾がある。
【００７４】
本発明のポリペプチドに含まれるものにはさらに、前記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、並びにそれらの組み合わせがある。本発明のポリペプチドの断片、誘導体、類似体又は変異体は、ＩＶポリペプチドに関連する抗原性及び免疫原性のポリペプチドであり得、そのようなポリペプチドは、ＩＶにより引き起こされた感染症疾患を、予防し、治療し（直し）、改善し、その重篤度を和らげ、その伝染を防ぎ又は減少させるために使用される。
【００７５】
本明細書で用いる際「抗原性を有するポリペプチド」又は「免疫原性を有するポリペプチド」は、脊椎動物に導入した場合に、脊椎動物の免疫システム分子と反応し（すなわち、抗原性を有する）、及び／又は当該の脊椎動物に免疫応答を誘導する（すなわち、免疫原性を有する）ポリペプチドである。免疫原性を有するポリペプチドは抗原性をも有するが、抗原性を有するポリペプチドはその大きさ又はコンフォメーションのため必ずしも免疫原性を有するとは限らないということはかなり生じ得る。本発明の抗原性又は免疫原性を有するポリペプチドの例には、ＨＡ又はその断片若しくは変異体、ＮＰ又はその断片、ＰＢ１又はその断片若しくは変異体、ＮＳ１又はその断片若しくは変異体、Ｍ１又はその断片若しくは変異体、及びＭ２又はその断片若しくは変異体｛Ｍ２の細胞外断片（ｅＭ２）を含む｝、或いは例えばＢ型肝炎コア抗原などの異種ポリペプチドに融合した前記のポリペプチド又はその断片が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の抗原性又は免疫原性の単離ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるものに加えて、組み換えタンパク質、精製サブユニット、又は当該タンパク質を発現するウィルスベクターとして提供してもよく、或いは不活性化ＩＶワクチン（すなわち、生弱毒化ウィルスワクチン）、熱殺菌（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ）ウィルスワクチンなどの形態で提供してよい。
【００７６】
「単離」ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体という語は、その天然形態でないＩＶポリペプチド又はタンパク質を意味している。精製のレベルは特に指定がない。例えば、単離ＩＶポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組み換え体で生産したＩＶポリペプチド又はタンパク質であっても、適切な技術で単離、分画、部分的な若しくは実質上完全な精製の諸処理（当該ＩＶポリペプチド又はタンパク質を増殖させた鶏卵又は培養細胞からのＩＶビリオンの単離を含む）を施した天然又は組み換えＩＶポリペプチドであっても、本発明の目的のため単離されたものと考えられる。さらに、単離ＩＶポリペプチド又はタンパク質は、単離ＩＶポリペプチドを発現する生若しくは不活性ウィルスベクターとして提供してよく、不活性ＩＶワクチン組成物に見られるようなものを含んでよい。このように、単離ＩＶポリペプチド又はタンパク質は、例えば、組み換えタンパク質、ＩＶの精製サブユニット、又は単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクターとして、或いは不活性化又は弱毒化ＩＶワクチンの形態で提供してよい。
【００７７】
「エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、例えばヒトのような脊椎動物における抗原性又は免疫原性を有するポリペプチドの部分を意味する。「免疫原性エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、動物に免疫応答を誘導するタンパク質の一部として定義され、それは当業界で既知の方法により決められている。「抗原性エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、抗体又はＴ−細胞受容体が免疫特異的に結合することができるタンパク質の一部として定義され、それは当業界で既知の方法により決められている。免疫特異的結合には、非特異的な結合は含まれないが、その他の抗原との交差反応性は除外されない。免疫原性のエピトープは抗原性を有するが、抗原性のエピトープは免疫原性を有する必要はない。
【００７８】
「免疫原性担体」という語は、本明細書で用いる際、第一のポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体であって、第二のポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の免疫原性を高めるものを意味する。一般的に、「免疫原性担体」は、所望のポリペプチド又はその断片に融合又はコンジュゲートされる。「免疫原性担体」の一例は、対象の免疫原性エピトープを表面エピトープとして発現する組み換えＢ型肝炎コア抗原である（例えば、ヨーロッパ特許番号 EP 0385610 B1を参照せよ；この参考文献は、その全体を本明細書に参照により組み入れる）。
【００７９】
本発明では、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は約８個から約３０個のアミノ酸からなる配列を含み、これらのアミノ酸は本発明のＩＶポリペプチド（例えば、ＮＰポリペプチド、Ｍ１ポリペプチド、又はＭ２ポリペプチド）のアミノ酸配列に含まれている。免疫原性又は抗原性のエピトープを含むある種のポリペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５及び１００個の長さを持つアミノ酸残基である。抗原性及び免疫原性を有するエピトープは、直線状、すなわち、ポリペプチドが連続したアミノ酸で構成されているものであってよく、３次元状、すなわち、エピトープが、当該ポリペプチドの二次若しくは三次構造によって結合している非連続的なアミノ酸で構成され、それによって、エピトープを形成しているものであってもよい。
【００８０】
抗原性エピトープを持つペプチド又はポリペプチド（例えば、抗体又はＴ細胞受容体が結合することができる、タンパク質分子の領域を含むもの）の選択については、タンパク質の配列の一部を模擬する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に模擬されたタンパク質と反応する抗血清を誘導する能力を持つということが当業界では公知である（例えば、Sutcliffe, J. G., et al., Science 219:660-666 (1983) を参照せよ；この参考文献は、本明細書に参照により組み入れる）。
【００８１】
免疫原性応答を誘導する能力のあるペプチドは、タンパク質の主要な配列に表れていることが多く、単純な化学的な法則により特徴付けることができ、完全なタンパク質の主要抗原決定領域にもアミノ末端若しくはカルボキシル末端にも限定されない。疎水性が非常に高いペプチド及び残基の数が６個以下のペプチドは、一般的に、模擬されたタンパク質に結合する抗体を誘導するのに効果的ではないが、より長いペプチド、特にプロリン残基を含む長いペプチドは、通常、効果的である（上記に引用されているSutcliffe et al.の６６１ページを参照せよ）。例えば、これらのガイドラインに沿って作製された20個のペプチドのうち18個のペプチドで、ＩＶヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％を覆う８個から３９個の残基を含むものが、ＨＡ１タンパク質又はインタクトなウィルスと反応する抗体を誘導した。さらに、ＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２個のペプチドのうち１２個のペプチドが、また狂犬病の糖タンパク質由来の１８個のペプチドのうち１８個のペプチドが、それぞれのタンパク質を沈殿する抗体を誘導した。
【００８２】
コドン最適化
「コドン最適化」は、対象の脊椎動物（例えば、ヒト）の細胞において発現を高める目的で、天然配列に存在する少なくとも１つ、又は１つより多くの、又はかなりの数のコドンを、当該脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使われているコドンと置き換えることにより、核酸配列を修飾することとして定義される。多様な動物種が、特定のアミノ酸の一定のコドンに特定の偏りを有する。
【００８３】
一の態様では、本発明は、コドン最適化コード領域からなる核酸断片を含むポリヌクレオチドであって、当該核酸断片が、所与の脊椎動物(例えば、ヒト)の細胞内で発現が最適化するように適応させたコドンの使用頻度で、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、対象の脊椎動物の遺伝子に使用するために好ましいコドンをＤＮＡ配列に組み入れることにより調製する。本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域からなる核酸断片を含む、ポリヌクレオチド発現構築物、ベクター及び宿主細胞、並びにポリヌクレオチド発現構築物、ベクター及び宿主細胞を用いて、脊椎動物におけるインフルエンザ疾患を治療又は予防する多様な方法も提供する。
【００８４】
本明細書で用いる際「コドン最適化コード領域」という語は、少なくとも１つ、又は１つより多くの、又はかなりの数のコドンを、当該脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に使われている１つ以上のコドンと置き換えることにより、所与の脊椎動物(例えば、ヒト)の細胞における発現に適応させた核酸コード領域を意味する。
【００８５】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏りは、当該遺伝子をコードする配列における変異を可能とする。それぞれのコドンは3個のヌクレオチドから構成されており、ＤＮＡから成るこれらのヌクレオチドは4個の特定な塩基に制限されるので、６４通りのヌクレオチドの組み合わせが可能であり、それらの組み合わせのうち６１がアミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を終止させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」が本明細書に表１として再現されている。その結果、多くのアミノ酸が1個以上のコドンにより指定されている。例えば、アミノ酸のアラニン及びプロリンは、4個のトリプレットによりコードされ、セリン及びアルギニンは、６個のトリプレットによりコードされる。これに対し、トリプトファン及びメチオニンは、１つのトリプレットによりコードされる。この縮重が、当該ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、広範囲に亘るＤＮＡ塩基組成を可能とする。
【表１】
2008505660.tif 000020
【００８６】
多くの生物が、成長ペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンについて偏りを有する。コドン選好性、すなわちコドン偏位（生物間のコドンの使用頻度における差異）は、遺伝コードの縮重の結果として産まれ、多くの生物について記述されている。コドン偏位は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関関係がある場合が多く、それに従って、特に、翻訳されているコドンの性質及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内において選択されるｔＲＮＡの優位性は、通常、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。このように、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現を求めて、特別の目的に合わせることが可能である。
【００８７】
多種多様な動物、植物及び微生物の種について利用できる多数の遺伝子配列を考慮に入れると、コドンの使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドンの使用頻度表が入手可能であり、その入手経路には例えば、「コドンの使用頻度データベース["Codon Usage Database"] であり、そのURLはhttp://www.kazusa.or.jp/codon/（２００２年７月9日に閲覧した）である。さらに、これらの表は多様な目的に適合させることができる（Nakamura, Y., et al. 「国際ＤＮＡ配列データベースに基づき表にまとめたコドンの使用頻度：2000年の状況」["Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000"] Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照せよ；この参考文献は、本明細書に参考により組み入れる）。例として、GenBank データ公開１２８．０（２００２年２月１５日）に基づいて計算されたヒト、ネズミ、飼いネコ及びウシについてのコドンの使用頻度が下記に表２−５として再現されている。これらの表では、ｍＲＮＡの名称が使われており、それに合わせてＤＮＡに存在するチミン（Ｔ）の代わりに、当該の表では、ＲＮＡに存在するウラシル（Ｕ）が使われている。当該の表は、６４個のコドンすべてについてではなく、それぞれのアミノ酸について、頻度が計算されるように適合されている。
【表２−１】
2008505660.tif 000021
【表２−２】
2008505660.tif 000022
【表２−３】
2008505660.tif 000023
【表３−１】
2008505660.tif 000024
【表３−２】
2008505660.tif 000025
【表３−３】
2008505660.tif 000026
【表４−１】
2008505660.tif 000027
【表４−２】
2008505660.tif 000028
【表４−３】
2008505660.tif 000029
【表５−１】
2008505660.tif 000030
【表５−２】
2008505660.tif 000031
【表５−３】
2008505660.tif 000032
【００８８】
これらの表又は類似した表を用いることにより、当業者は当該頻度をいかなるポリペプチド配列にも応用することができ、ポリペプチドをコードし所与の動物種に最適化されたコドンを使う、コドン最適化コード領域からなる核酸断片を生産することができる。コドン最適化コード領域は、多様な方法で作製することができる。
【００８９】
「均一最適化」と名づけられた１つの方法では、コドンの使用頻度表を用いて、所与のアミノ酸に対し最も高頻繁に使われる単一のコドンを見い出し、このコドンを当該アミノ酸がポリペプチド配列に現れる度に使用する。例えば、上記の表２を見ると、ロイシンについてヒトにおいて最も高頻繁に使われているコドンはＣＵＧであり、その使用頻度は４１％である。そこで、所与のアミノ酸配列内のロイシン残基をすべて、コドンＣＵＧに割り当てる。「均一最適化」方法により最適化されたIAV NP (SEQ ID NO:2) に対するコード領域が、本明細書に下記のSEQ ID NO:24として提示される。
【化１９】
2008505660.tif 000033
【００９０】
「完全最適化」と名づけられた別の方法では、実際のコドン頻度を無作為にコード領域全体に分布させる。従って、この最適化方法を用いて、仮説ポリペプチド配列が１００個のロイシン残基を有していると仮定し、ヒトにおける使用頻度を上記表２を参照して調べると、約７個すなわち７％のロイシンコドンがＵＵＡであり、約１３個すなわち１３％のロイシンコドンがＵＵＧであり、約１３個すなわち１３％のロイシンコドンがＣＵＵであり、約２０個すなわち２０％のロイシンコドンがＣＵＣであり、約７個すなわち７％のロイシンコドンがＣＵＡであり、約４１個すなわち４１％のロイシンコドンがＣＵＧである。これらの頻度を、仮説ポリペプチドをコードするコード領域のロイシンコドンに無作為に分布させる。当業者には理解できるように、この方法を用いて、配列内のコドンの分布を大きく変えることができるが、当該配列は常に同一のポリペプチドをコードする。
【００９１】
一例として、ヒトのコドン使用頻度に合わせて完全に最適化されたNP (SEQ ID NO:2)のヌクレオチド配列を、SEQ ID NO:23として示す。コドン最適化コード領域（SEQ ID NO:23）とSEQ ID NO:1 （天然のＮＰコード領域）のヌクレオチド46から1542とのアライメントを、図１に示す。
【００９２】
「完全最適化」方法を用いると、ポリペプチド配列全体を、上記にようにコドン最適化することができる。完全なポリペプチドの多様な望ましい断片、変異体又は誘導体について、断片、変異体又は誘導体をまず作製し、その後個別にコドン最適化を行う。あるいはまた、全長ポリペプチド配列を所与の動物種についてコドン最適化して、当該ポリペプチド全体をコードするコドン最適化コード領域を生じさせ、その後、当該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片を、コドン最適化コード領域から作製する。当業者にはよく理解できるように、所与の動物種におけるコドン使用頻度に基づいてコドンを無作為に全長コード領域に割り当てたとすると、断片、変異体及び誘導体をコードする核酸断片は、当該の動物種について必ずしも完全にコドン最適化されないことになる。しかし、そのような配列は依然として、天然のコドン使用頻度に比べて、対象動物種のコドン使用頻度にはるかに近い。このアプローチの不利な点(advantage)は、所与のポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化核酸断片を合成するには、ルーチン作業であっても、時間がかかり、支出が大変多くなるということである。
【００９３】
「完全最適化」方法を使用する場合に、「約」という語が、所与のアミノ酸のコドン使用頻度の分画百分率を正確に説明するために使われている。本明細書に用いられる際「約」という語は、与えられた値に比べ、１つ多い又は１つ少ないアミノ酸の数として定義される。アミノ酸の整数値は、分画使用頻度が０．５０以上の場合は切り上げ、分画使用頻度が０．４９以下の場合は切り下げる。６２個のロイシン(leucine)残基を有する仮説ポリペプチドについてヒト遺伝子のロイシンの使用頻度の例を再び用いれば、コドン使用の分画頻度は、多様なコドンの使用頻度に６２を乗じることにより計算される。従って、６２の７．２８％は、４．５１ＵＵＡコドンとなり、言い換えれば「約5個」すなわち４、５又は6個のＵＵＡコドンとなる。６２の１２．６６％は７．８５ＵＵＧ コドンとなり、言い換えれば「約８個」すなわち７、８又は９個のＵＵＧコドンとなる。６２の１２．８７％は７．９８ＣＵＵ コドンとなり、言い換えれば「約８個」すなわち７、８又は９個のＣＵＵコドンとなる。６２の１９．５６％は１２．１３ＣＵＣコドンとなり、言い換えれば「約１２個」すなわち１１、１２又は１３個のＣＵＣコドンとなる。６２の７．００％は４．３４ＣＵＡコドンとなり、言い換えれば「約４個」すなわち３、４又は５個のＣＵＡコドンとなる。６２の４０．６２％は２５．１９ＣＵＧコドンとなり、言い換えれば「約２５個」すなわち２４、２５又は２６個のＣＵＡコドンとなる。
【００９４】
「最小最適化」と名づけられた第三の方法では、コード領域は部分的にしか最適化されない。例えば、本発明は、コドン位置の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％が、所与の動物種に合わせてコドン最適化されている、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を含む。すなわち、これらのコドン位置は、天然の核酸配列で通常使われているコドンの代わりに、対象動物種（例えば、脊椎動物のヒト）の遺伝子で好ましく使われるコドンを含んでいる。対象の脊椎動物の遺伝子でめったに見られないコドンは、対象の脊椎動物のコード領域においてより一般的に使われるコドンに変えられる。
【００９５】
従って、対象の脊椎動物の遺伝子に比べ、対象のＩＶ遺伝子において、より頻繁に使われているコドンは、より頻繁に使われているコドンに置換される。ＩＶコドンを置換する頻度における差異は、下記で記述する複数の因子に基づいて変化させることができる。例えば、対象の脊椎動物の遺伝子に比べ、ＩＶ遺伝子において使用頻度が千個当たり少なくとも２倍であるコドンは、対象の脊椎動物におけるそのアミノ酸に対応する最も頻繁に使われるコドンと置換される。この率は、下記で記述する多様な因子に応じて、より高く又はより低く調整してよい。従って、ＩＶ天然コード領域のコドンは、以下の条件の時に、対象の脊椎動物のコード領域にあるそのアミノ酸についてより頻繁に使われるコドンと置換される：対象の脊椎動物のコード領域に比べて、ＩＶコード領域における当該コドンの使用頻度が、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、又はそれ以上の場合。
【００９６】
変異性が高いコドンについての最小限のヒトコドン最適化には、利点がいくつかあり、それらの利点には下記の例が含まれるがそれらの限定されるものではない。対象の遺伝子のヌクレオチド配列に加える変化が少ないため、必要とされる操作過程数も少なくなる。その結果、不要な突然変異を導入するリスクが下がりコストを削減できるとともに、市販の部位特異的突然変異誘発キットを使用することができるようになり、高価なオリゴヌクレオチド合成の必要性を低減する。さらに、ヌクレオチド配列における変化の数を減少させることは、当該配列の二次構造を改変する可能性も減少し、その結果、ある宿主細胞における遺伝子発現に大きな効果をもたらす可能性がある。望ましくない制限部位の導入も減少し、対象の遺伝子のプラスミド発現ベクターへのサブクローニングが促進される。 
【００９７】
本発明はまた、ＩＶポリペプチド（Ｐ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１及びＮＳ２）又はその断片、変異体若しくは誘導体のコード領域を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドもまた、コドン最適化することができる。
【００９８】
本明細書で記述するある実施の形態では、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化している。あるいはまた、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、植物、動物、微生物の種におけるコドン使用頻度に従って最適化してもよい。ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、以下のように作製する。SEQ ID NO:2のアミノ酸組成を、表６に示す。
【表６】
2008505660.tif 000034
【００９９】
表６に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:2をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計してもよい。「均一」最適化を行う場合は、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:2をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３３個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２６個 のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２５個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２３個のバリンコドンはＧＴＧであり、４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、１７個のプロリンコドンはＣＣＣであり、２８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、２６個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、２２個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３６個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、６個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、４９個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ であり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４１つのグリシンコドンはＧＧＣである。
【０１００】
あるいはまた、SEQ ID NO:2をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、上記表６に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:2をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３３個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約６個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１３個がＣＴＧである；２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである； ２５個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２３個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約５個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１７個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；２８個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１０個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約３個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個が ＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである； ６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１４個がＡＡＣである；２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１５個がＧＡＧである；６個のシステインコドンのうち約３個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約３個がＴＧＣである；６個のトリプトファンコドンは ＴＧＧである；４９個のアルギニンコドンのうち約��個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約９個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約５個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４１つのグリシンコドンのうち約７個が ＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１４個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１０個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１０個がＧＧＧである。
【０１０１】
上記で説明しているように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、1つ多くても、１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１つ「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１つ「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１０２】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:2をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:23として提示される。
【０１０３】
さらに、SEQ ID NO:2をコードする、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【表７−１】
2008505660.tif 000035
【表７−２】
2008505660.tif 000036
【０１０４】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１０５】
SEQ ID NO:2をコードし、さらにこの後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:25として提示される：
【化２０】
2008505660.tif 000037
【０１０６】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:4をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:4をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物、又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:4をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:4のアミノ酸組成を、表８に示す。
【表８】
2008505660.tif 000038
【０１０７】
表8に示したアミノ酸組成を用い、SEQ ID NO:4をコードするヒトコドン最適化コード領域は、本明細書で説明しているいかなる方法によっても設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、ヒトゲノムにおいて当該アミノ酸について最も使用頻度が高いコドンに、それぞれのアミノ酸を割り当てる。この方法によると、コドンは、SEQ ID NO:4をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、１１つのイソロイシンコドンはＡＴＣであり、１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、１１つのアスパラギンコドンはＡＡＣであり、１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり(ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、１６個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化コード領域は、下記のSEQ ID NO:27として本明細書に提示される：
【化２１】
2008505660.tif 000039
【０１０８】
あるいはまた、SEQ ID NO:4をコードするヒトコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により、設計することができる。この方法では、アミノ酸はそれぞれ、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、コドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度を、上記表8に示した。この後者の方法を用い、コドンは、SEQ ID NO:4をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約４個がＴＴＣである；２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧである；１１つのイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡである；１４個のメチオニンコドンはＡＴＧである；１６個のバリンコドンのうち約３個が ＧＴＴであり、バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約８個がＧＴＧである；１８個のセリンコドンのうち約３個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約４個がＡＧＣである；８個のプロリンコドンのうち約２個が ＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧである；１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧである；２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧである；５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣである；５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣである；１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧである；１１つのアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣである；１３個のリジンコドンのうち約５個が ＡＡＡであり、リジンコドンのうち約８個がＡＡＧである；６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣである；１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧである；３個のシステインコドンのうち約１個が ＴＧＴであり、システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；１つのトリプトファンコドンは ＴＧＧである；１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、アルギニンコ���ンのうち約３個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧである；１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧである。
【０１０９】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１つ多くても１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１つ「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１つ「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１１０】
SEQ ID NO:4をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、代表的な「完全最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:26として提示される：
【化２２】
2008505660.tif 000040
【０１１１】
さらに、SEQ ID NO:4をコードし、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１１２】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１１３】
SEQ ID NO:4をコードし、さらにこの後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:28として提示される：
【化２３】
2008505660.tif 000041
【０１１４】
本明細書で記述するある実施の形態では、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化している。あるいはまた、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、植物、動物、微生物の種におけるコドン使用頻度に従って最適化してもよい。ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、以下のように作製する。SEQ ID NO:5のアミノ酸組成を、表9に示す。
【表９】
2008505660.tif 000042
【０１１５】
表９に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:5をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:5をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、４個のバリンコドンはＧＴＧであり、７個のセリンコドンはＡＧＣであり、４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、５個のリシンコドンはＡＡＧであり、５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ であり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、８個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:30として提示した：
【化２４】
2008505660.tif 000043
【０１１６】
あるいはまた、SEQ ID NO:5をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらの使用頻度は、上記表9に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:5をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣである；１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧである；８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡである；２個のメチオニンコドンはＡＴＧである；４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約２個がＧＴＧである；７個のセリンコドンのうち約１個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約２個がＡＧＣである；４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧである；４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧである；５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧである；３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣである；２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣである；２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧである；３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣである；５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約３個がＡＡＧである；５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣである；９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧである；３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；２個のトリプトファンコドンはＴＧＧである；７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧである；８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧである。
【０１１７】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１つ多くても１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが1個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが1個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１１８】
SEQ ID NO:5をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、代表的な「完全最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:29として提示される：
【化２５】
2008505660.tif 000044
【０１１９】
さらに、SEQ ID NO:5をコードする、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１２０】
最小最適化の別の形態では、問題の特異ＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１２１】
SEQ ID NO:5をコードし、この後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:31として提示される：
【化２６】
2008505660.tif 000045
【０１２２】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:7をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:7をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:7をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:7のアミノ酸組成を、表１０に示す。
【表１０】
2008505660.tif 000046
【０１２３】
表１０に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:7をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:7をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２７個 のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、さらに４３個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書にSEQ ID NO:33として提示した：
【化２７】
2008505660.tif 000047
【０１２４】
あるいはまた、SEQ ID NO:7をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により作製することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらの使用頻度は、上記表１０に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:7をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧである；２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである；２６個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個が ＧＧＴ＊９であり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣである；２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧである；８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約４個がＴＧＣである；７個のトリプトファンコドンは ＴＧＧである；５１つのアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１２５】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１つ多くても１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１つ「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１つ「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１２６】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:7をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:32として提示される:
【化２８】
2008505660.tif 000048
【０１２７】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:9をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:9をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:9をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:9のアミノ酸組成を、表１１に示す。
【表１１】
2008505660.tif 000049
【０１２８】
表１１に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:9をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されている方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:9をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１つのグルタミンコドンはＣＡＧであり、２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１つのリシンコドンはＡＡＧであり、２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、５１つのアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４３個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:35として提示する：
【化２９】
2008505660.tif 000050
【０１２９】
あるいはまた、SEQ ID NO:9をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、上記表１１に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:9をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧである；２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである；２６個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１つのグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣである；２１つのリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧである；８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約４個がＴＧＣである；７個のトリプトファンコドンはＴＧＧである；５１つのアルギニンコドンのうち約��個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１３０】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１つ多くても１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１つ「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１つ「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１３１】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:9をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:34として提示される：
【化３０】
2008505660.tif 000051
【０１３２】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:16をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:16をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:16をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:16のアミノ酸組成を、表１２に示す。
【表１２】
2008505660.tif 000052
【０１３３】
表１２に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:16をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されている方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:16をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：２１つのフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、４１つのアラニンコドンはＧＣＣであり、１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、１つのトリプトファンコドンはＴＧＧであり、３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４４個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:37として提示する：
【化３１】
2008505660.tif 000053
【０１３４】
あるいはまた、SEQ ID NO:16をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、上記表１２に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:16をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：２１つのフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣである；３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧである；３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡである；２７個のメチオニンコドンはＡＴＧである；３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧである；４０個のセリンコドンのうち約７個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧである；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；４１つのアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣである；１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧである；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣである；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧである；３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣである；３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧである；５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約３個がＴＧＣである；単一のトリプトファンコドンはＴＧＧである；３０個のアルギニンコ��ンのうち約２個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧである；４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１３５】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１つ多くても１つ少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１つ「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１つ「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１３６】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:16をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:36として提示されている：
【化３２】
2008505660.tif 000054
【０１３７】
さらに、SEQ ID NO:16をコードし、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１３８】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１３９】
SEQ ID NO:16をコードし、この後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:38として提示されている：
【化３３】
2008505660.tif 000055
【０１４０】
「完全最適化」又は「最小最適化」方法を用いて、所与のポリペプチド配列をコードするコドンを、最適化した頻度で無作為に割り当てることは、それぞれのアミノ酸についてコドン頻度を計算し、次いで当該コドンを当該ポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手作業で行うことができる。さらに、多様なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが当業者には入手可能であり、その例としては、ウィソコンシン州マディソン市にあるDNAstar, Inc.社製のLasergene Package プログラムに含まれている「EditSeq」機能、メリーランド州のベセスダにあるInforMax, Inc.製のVectorNTI Suiteプログラムに含まれている逆翻訳機能、およびカリフォルニア州サンディエゴ市にあるAccelrys, Inc.製のGCG--Wisconsin Package プログラムに含まれている逆翻訳機能などがある。さらに、コドン最適化コード領域配列について、多様な資源が公的に利用可能であり、その例としては、http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html（２００２年７月９日に閲覧した）のサイトにある「逆翻訳」機能、およびhttp://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html（２００２年１０月１５日に閲覧した） のサイトにある「backtranseq」機能などがある。所与の頻度に基づきコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムは、基本的な数学的関数を用いて、当業者が簡単に作製することができる。
【０１４１】
当業者に周知の標準若しくはルーチンの分子生物学的操作法を用いることで、多くの選択肢が、上記に説明した方法の何れかの方法により設計したコドン最適化コード領域を合成するために利用可能である。１つのアプローチにおいて、それぞれ８０から９０ヌクレオチドの長さを持ち、当該望ましい配列の長さを持つ一連の相補的なオリゴヌクレオチドペアを、標準的な方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアは、アニーリング時に、８０から９０の塩基ペアの二本鎖の断片を形成し、付着末端を含むように合成する。これは、例えば、ペアを構成しているそれぞれのオリゴヌクレオチドを、当該ペアのもうひとつのオリゴヌクレオチドに対し相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多くの数の塩基を延長させて、合成するということである。それぞれのオリゴヌクレオチドペアの一本鎖の末端は、別のオリゴヌクレオチドペアの一本鎖の末端にアニールするように設計されている。オリゴヌクレオチドペアがアニールされ、次いでこれらの二本鎖断片の約5個若しくは6個が相互に一本鎖の付着末端を介してアニールされることを可能とし、その後それらは相互に連結して、標準細菌用クローニングベクター（例えば、カリフォルニア州カールスバッド市にあるInvitrogen Corporation製のTOPO（登録商標））にクローニングされる。その後、当該構築物を、標準方法により配列決定する。連結された８０個から９０個の塩基ペア断片の5個から6個の断片群から成る構築物（すなわち、約５００個の塩基ペアの断片群）を、対象配列全体を一連のプラスミド構築物において再提示できるように作製する。その後、これらのプラスミド挿入片を、適切な制限酵素を用いて切除し、連結して、最終構築物を形成する。その後、最終構築物を、標準細菌用クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。上記以外の方法が、当業者には明白であろう。さらに、市販の遺伝子合成技術が利用できる。
【０１４２】
コドン最適化コード領域は、ＩＶのいかなる菌株、誘導体又は変異体に由来するいかなる遺伝子産物をコードするものであってもよく、当該遺伝子産物の断片、変異体、又は誘導体であってもよい。その例としては、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２ポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域からなる核酸断片が挙げられる。その他のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１又はＮＳ２）をコードするコドン最適化コード領域は、本発明に含まれる。さらに、ＩＶポリペプチド又はその他のポリペプチドをコードするさらなる非コドン最適化ポリペプチドもまた含まれる。
【０１４３】
コンセンサス配列
本発明はさらに、インフルエンザウィルスタンパク質、並びにその断片、誘導体及び変異体の特定のコンセンサス配列に関する。「コンセンサス配列」は、例えば、相互比較された２つ以上の配列の各々の位置で存在頻度が最も高いアミノ酸を表す理想化配列(idealized sequence)である。コンセンサス配列は、理論上の代表的アミノ酸配列であり、この配列では、それぞれのアミノ酸は、自然に発生する異なった配列内の当該部位で、最も発生頻度の高いアミノ酸である。この語はまた、理論上のコンセンサスに近似した実際の配列をも意味する。コンセンサス配列は、例えば、共通の機能的若しくは構造的目的を持った配列に由来するものであってよい。コンセンサス配列という語は、同種を最大限にするため、できるだけ多くの特定の構造的若しくは機能的ドメインの例をアライメントすることにより、定義することができる。それぞれの特定のアミノ酸がその位置において合理的に優勢であり、比較の基礎を形成するほとんどの配列が少数の置換（０個から１００個の置換）によりコンセンサスと関連性を持つ場合に、配列は一般的にコンセンサスとして受け入れられる。一般的に、野生型比較配列は、少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の割合で、コンセンサス配列と一致する。従って、本発明のポリペプチドは、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の割合で、コンセンサス配列と一致する。コンセンサスアミノ酸配列は、いかなるインフルエンザ抗原についても作製することができる。１９９０年以来配列が解明されたＡ型インフルエンザ菌株を分析することにより、コンセンサスアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザＮＰ(SEQ ID NO: 76)、Ｍ１(SEQ ID NO:77)およびＭ２(SEQ ID NO:78)タンパク質（実施例３）より、見出された。
【０１４４】
［コンセンサスアミノ酸］は、コンセンサスタンパク質における所与の位置を占めるように選択されたアミノ酸である。コンセンサスアミノ酸を選択する目的で組織化されたシステムは、コンピュータプログラム、又は１つ以上のコンピュータプログラムと手作業の分析計算とを組み合わせたものであってよい。アライメントされたアミノ酸配列のそれぞれの位置に対し、コンセンサスアミノ酸が得られたら、これらのコンセンサスアミノ酸を「整列し」、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を得る。
【０１４５】
本発明の別の実施の形態は、コンセンサスタンパク質を作製する方法であって、いわゆるコンセンサスタンパク質のほとんどすべての位置についてアミノ酸残基を算出する工程と、原核若しくは真核発現システムで発現させることができる完全な遺伝子をこの配列から合成する工程とを含む方法に関する。
【０１４６】
コンセンサスインフルエンザポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部である。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、アミノ酸配列の逆翻訳及び対応するポリヌクレオチドのＰＣＲ合成のような既知の方法により得ることができる。
【０１４７】
組成物および方法
ある実施の形態においては、本発明は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする少なくとも１つのコドン最適化コード領域を含む１つ以上のポリペプチドを、脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染から保護する必要のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、本明細書に記述するような１つ以上のポリペプチドと、少なくとも１つの単離ポリペプチド、又はそれの断片、変異体若しくは誘導体とを含む組成物を、脊椎動物に投与することにより、ＩＶ感染から保護する必要のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法に関する。当該ポリペプチドは、単離ポリペプチドを投与する前に、同じ時(同時)に、又は投与した後に、投与してよい。
【０１４８】
ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする当該コドン最適化コード領域は、特定の脊椎動物に合わせてコドン最適化してよい。コドン最適化は、本明細書で記述の各種の方法により行う。例えば、ある実施の形態においては、ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を、当該特定の脊椎動物のコドン使用頻度に従って最適化する。本発明のポリヌクレオチドを、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込み、免疫学的に有効な量のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をｉｎ  ｖｉｖｏで生産する。ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする当該コード領域は、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル[cebus]、アカゲザル[rhesus]、アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]、及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン及びチンパンジー、イヌ、オオカミ、ネコ、ライオン及びトラ、ウマ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、キリン、クマ、ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラなどの哺乳動物；カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、ホシムクドリ及びセキセイインコなどの鳥禽類、或いはその他の脊椎動物に合わせてコドン最適化してよい。
【０１４９】
１つの実施の形態において、本発明は、ヒトのコドン使用頻度に従って最適化した、ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片に関する。例えば、ＩＶポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするヒトコドン最適化コード領域は、ＩＶポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするＤＮＡ配列において天然に起こるコドンを、ヒト遺伝子においてより好ましく使用される１つ以上のコドンに置換することにより、作製される。本発明ではさらに以下のものが提供される：ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物；ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物を含む医薬組成物；並びにそのようなポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物を使用する様々な方法。ＩＶポリペプチドをコードするコード領域は、本明細書で記述のように、均一に最適化し、完全に最適化し、最小限に最適化し、領域毎にコドン最適化し、及び／又はコドン最適化しないことができる。
【０１５０】
本発明はさらに、任意にその他の抗原と共同させる、ＩＶポリペプチド抗原（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２）をコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドの断片、変異体又は誘導体（例えば、ｅＭ２ポリペプチド、又はＮＰとｅＭ２との融合ポリペプチド）をコードするコドン最適化核酸断片を含むポリヌクレオチドに関する。
【０１５１】
ある実施の形態において、本発明は、核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、当該核酸断片が、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の割合で、ＩＶポリペプチド（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１又はＭ２）と一致するポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該核酸断片が、ＩＶポリペプチド（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１又はＭ２）をコードするコドン最適化コード領域の変異体である、単離ポリヌクレオチドを提供する。ヒトコドン最適化コード領域は、いかなる脊椎動物に対しても、本明細書で説明しているいかなる方法によって、最適化することができる。
【０１５２】
単離ＩＶポリペプチド
本発明はさらに、１つ以上の単離ＩＶ構成成分又は単離ポリペプチドに加えて、１つ以上の核酸断片を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する組成物であって、当該の核酸断片が、それぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である、組成物に関する。ＩＶ構成成分は、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はそれ断片、変異体若しくは誘導体であってよい。
【０１５３】
コドン最適化核酸組成物と組み合わせた、ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を、組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物と呼ぶ。
【０１５４】
本発明の単離ＩＶポリペプチドは、いかなる形態であってもよく、本発明の技術分野において周知の技術を用いて生産される。その例には、組み換え技術により生産された単離ＩＶタンパク質、天然環境から直接精製された単離ＩＶタンパク質、単離ＩＶタンパク質を発現する組み換え（非ＩＶ）ベクター、又は従来のワクチンのような不活性化ＩＶワクチンの形態で投与されるタンパク質が含まれる。
【０１５５】
使用時には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を、免疫学的に有効な量で投与する。従来のＩＶワクチンは、ウィルス抗原であるＨＡ及びＮＡのマイクログラムに標準化されている（Subbarao, K., Advances in Viral Research 54:349-373 (1999)を参照せよ；この文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる）。これらのワクチンの推奨投与量は、０．５ｍｌ．Ｉｄ．あたり各ＨＡ15 μｇ である。当業者は、従来のＩＶワクチンの有効な量を、いくつかの要因（発現されている抗原、被験体の年齢と体重、治療を必要としている正確な病状とその重篤度、及び投与経路を含む）に基づき、決定することができる。
【０１５６】
本発明において、従来の抗原ワクチン組成物とコドン最適化核酸組成物を組み合わせたものは、投与量節約濃度で治療上有益な効果を提供する。例えば、コドン最適化核酸を適量用いて補ったり高めたりした場合には、当該の承認市販製品の使用量を減じても、上記の従来の製品のような承認市販製品について予定される治療上有益な効果を患者に及ぼすのに充分な免疫応答を達成することができる。従って、本発明のコドン最適化核酸と組み合わせて従来のＩＶワクチンを投与することにより、投与量の節約が企図される。
【０１５７】
特に、本発明のコドン最適化核酸と組み合わせて投与する場合に、従来のワクチンの投与量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％低減することができる。
【０１５８】
同様に、ＤＮＡを用いた薬剤のみにより提供される所望レベルの免疫応答を、一部に従来のワクチンを含めることにより、より少ない量のＤＮＡで達成できる。さらに、従来の薬剤とＤＮＡを用いた薬剤とを組み合わせて用いることにより、所望レベルの免疫応答を提供しながら、いずれかの材料を単独で投与した場合に比較して、より少ない量で使用できる（例えば、これらの材料を組み合わせて使用した場合、いずれかの免疫産物の使用量が少なくて済む）。これは、毎回投与する材料の量が少なくて済むということだけでなく、ワクチン療法において投与回数を減らすことができるということ（例えば、3回又は4回の注射を２回に減らす）、及び／又は、免疫応答の反応時間が減じられるということ（例えば、望ましい反応レベルが、予防接種後6週間ではなく、予防接種後3週間で達成される）にも現れる。
【０１５９】
特に、従来のＩＶワクチンと組み合わせて投与する場合に、ＤＮＡを用いた薬剤の投与量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％低減することができる。
【０１６０】
ＤＮＡを用いた薬剤および従来の抗原の正確な量を決定することは、上記の多くの因子に基づいており、当業者は容易に決定することができる。
【０１６１】
投与量の節約に加えて、請求される組み合わせ組成物は、免疫応答を広げること及び／又は免疫応答を高めることを提供する。そのような免疫応答の広がり及び向上は、以下により達成される：従来のワクチンにＤＮＡを加え、細胞性応答を高める；従来のワクチンをＤＮＡ薬剤に加え、体液性応答を向上させる；より多くのエピトープ（体液性応答及び／又は細胞性応答の双方）が認識され及び／又はより望ましい応答がなされるような組み合わせを用いること（エピトープの拡大）；特殊な望ましいスペクトルの免疫学的応答を求めて設計されたＤＮＡを用いた薬剤及び従来のワクチンの組み合わせを用いる；どちらか任意の構成成分をより多い量で用いることにより、望ましいスペクトルを得る。当業者は、拡大された免疫応答を、当該望ましい反応スペクトルに特異的な標準免疫アッセイにより、測定することができる。
【０１６２】
免疫応答の広がり及び投与量の節約は、双方とも同時に得ることができる。
【０１６３】
投与する単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態で）は、いかなる単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体でもよく、その例としては、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体が含まれるが、それらに限定されるものではない。断片の例には、ｅＭ２タンパク質が含まれるが、それに限定されるものではない。ある実施の形態において、誘導体タンパク質は、融合タンパク質（例えば、ＮＰ−ｅＭ２）であってよい。本明細書で記述するいかなる単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体も、核酸断片を含むいかなるポリヌクレオチドを含有する組成物において組み合わせることができ、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であるということは留意すべきである。タンパク質は、異なっていても同一であってもよく、１つ以上の単離ＩＶたんぱく質と１つ以上のポリヌクレオチドとを任意の組合せにおいて組み合わせることができる。
【０１６４】
ある実施の形態においては、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、第二の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体に融合又はコンジュゲートしていてもよく、あるいは、その他の異種のタンパク質に融合していてもよい。当該異種のタンパク質の例には、Ｂ型肝炎たんぱく質（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ））又はジフテリア若しくは破傷風に由来するものがあるが、それらに限定されるものではない。第二の単離ＩＶポリペプチド又はその他の異種のタンパク質は、自己が付着しているＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の免疫原性を増す「担体」として機能することができる。本発明の範囲内で担体として有用であるＢ型肝炎ウィルスタンパク質、又はその断片及び変異体が、アメリカ合衆国特許番号６，２３１，８６４及び５，１４３，７２６に開示されており、これらの参考文献はその全体を参照により本明細書に組み入れる。前記の融合又はコンジュゲートタンパク質をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６５】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及び異種のタンパク質配列を含む組み換え粒子を、免疫原性を強化する部分として使用することが、よく説明されている。例えば、異種の配列を、組み換えＨＢｃＡｇのアミノ末端に加えることにより、特殊な構造が自然に構築され、当該構造は、その表面に異種のエピトープを発現し、実験動物に接種した場合に高い免疫原性を有する｛Clarke et al., Nature 330:381-384 (1987)を参照せよ｝。異種のエピトープはまた、タンパク質のカルボキシ末端の約40個のアミノ酸を異種の配列に置換することにより、ＨＢｃＡｇ粒子内に挿入することができる。この組み換えＨＢｃＡｇタンパク質はまた、自然に免疫原性を有する粒子を形成する｛Stahl and Murray, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6283-6287 (1989)を参照せよ｝。さらに、異種エピトープが挿入されるか、或いはＨＢｃＡｇタンパク質のより中心的領域で（すなわち免疫優勢ループ[immunodominant loop]で）異種のエピトープがアミノ酸残基の配列の総て若しくは一部を置換している場合に、キメラＨＢｃＡｇ粒子が構築され、それにより、生成される粒子の表面に異種のエピトープが提示されることがある（ヨーロッパ特許番号 ０４２１６３５  Ｂ１を参照せよ）。下記に、Galibert, F., et al., Nature 281:646-650 (1979)に記載され、アメリカ合衆国特許番号４，８１８，５２７、４，８８２，１４５ 及び５，１４３，７２６にも記載されているヒトＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列、さらに亜型ａｙｗ（SEQ ID NO 39及びSEQ ID NO 40）を示した。上記の参考文献の総てが、その全体を本明細書に参照により組み入れられる。ヌクレオチド及びアミノ酸が、本明細書に下記のSEQ ID NO 39：
【化３４】
2008505660.tif 000056
及び下記のSEQ ID NO:40：
【化３５】
2008505660.tif 000057
として提示されている。
【０１６６】
完全合成ＨＢｃＡｇも合成された（Nassal, M. Gene 66:279-294 (1988)を参照せよ）。ヌクレオチド及びアミノ酸が、本明細書に下記のSEQ ID NO 41：
【化３６】
2008505660.tif 000058
及び下記のSEQ ID NO:42：
【化３７】
2008505660.tif 000059
として、提示されている。
【０１６７】
単離ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むキメラＨＢｃＡｇ粒子は、当業者には周知の組み換え技術を用いて作製できる。プロモータが作動可能に付随しているＨＢｃＡｇに対するコード領域を持つポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を構築する。便利な制限部位を、異種の配列が挿入されるように、ＨＢｃＡｇのN末端、中央部、及び／又はC末端部分をコードするコード領域に組み込む。ＨＢｃＡｇのコード領域内にある所望の制限部位に、フレーム内で、ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより、ＨＢｃＡｇ／ＩＶ融合タンパク質を発現する構築物を作製する。得られた構築物を、例えば大腸菌などの適切な宿主細胞に、キメラＨＢｃＡｇが発現されるであろう条件下で挿入する。キメラＨＢｃＡｇは、発現すると、粒子内に自己集合し、その後超遠心単離などにより単離される。形成された粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスから単離される天然の２７ｎｍＨＢｃＡｇ粒子に似ているが、単離ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体が粒子内に含まれており、好ましくは外側の粒子表面に露出されていることが天然粒子と異なる。
【０１６８】
キメラＨＢｃＡｇ粒子に発現しているＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、適切なキメラＨＢｃＡｇ粒子が自己集合できる大きさであればいかなる大きさでもよい。先に述べたように、小さい抗原性エピトープであっても、免疫原性を持つ担体（例えば、ＨＢｃＡｇ）との関連において発現した場合は、免疫原性を有する。従って、本発明のＨＢｃＡｇ粒子は、それに挿入されるＩＶタンパク質断片の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、あるいは１５個から３０個のアミノ酸を含む。本発明のＨＢｃＡｇ粒子はさらに、それに挿入されるＩＶタンパク質断片の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個のアミノ酸残基から成る、免疫原性又は抗原性のエピトープを含む。
【０１６９】
ＨＢｃＡｇの免疫優勢ループ領域(immunodminant loop region)を、アミノ酸番号７５から８３のあたり、アミノ酸番号７５から８５のあたり、またはアミノ酸番号１３０から１４０のあたりに位置させた（Colucci et al., J. Immunol. 141:4376-4380 (1988)、およびSalfeld et al. J. Virol. 63:798 (1989)を参照せよ；これらの文献は参照により組み入れられる）。キメラＨＢｃＡｇは、免疫優勢ループに外来性エピトープをクローンする場合に、多くの場合依然としてコア粒子を形成する能力を有する。従って、例えばＩＶタンパク質断片のアミノ酸は、ＨＢｃＡｇアミノ酸の配列の様々な位置に挿入してよく、その挿入位置の例としては、Ｎ末端、アミノ酸番号約７５から約８５、アミノ酸番号約７５から約８３、アミノ酸番号約１３０から約１４０、又はC末端が挙げられる。ＩＶタンパク質断片のアミノ酸が、天然コアタンパク質配列を全部若しくは一部置換している場合には、挿入されたＩＶ配列は、それが置換するＨＢｃＡｇ配列に比べ、一般的に短くなく、むしろ長いことがある。
【０１７０】
あるいはまた、粒子形成を望まない場合は、完全長のＩＶコード配列をＨＢｃＡｇのコード領域に融合することができる。ＨＢｃＡｇ配列は、本明細書で記述するインフルエンザ抗原（ｅＭ２−ＮＰ構築物を含む）の何れかのN末端若しくはC末端の何れにも融合させることができる。融合には、上記ＮＰ−ｅＭ２で説明したフレキシブルタンパク質リンカーを含むことができる。SEQ ID NO:41のＨＢｃＡｇコード領域に融合されるＩＶコード配列の例には、以下があげられる：ＩＡＶ  ＮＰ−ＨＢｃＡｇ融合 (SEQ ID NO:43)：
【化３８−１】
2008505660.tif 000060
【表３８−２】
2008505660.tif 000061
ＢＶＮＰ−ＨＢｃＡｇ融合(SEQ ID NO:44)：
【化３９】
2008505660.tif 000062
及びＩＡＶ  Ｍ１−ＨＢｃＡｇ融合(SEQ ID NO:45)：
【化４０】
2008505660.tif 000063
が挙げられる。
【０１７１】
これらの融合構築物は、本書で説明している方法により、コドン最適化することができる。
【０１７２】
本発明において、キメラＨＢｃＡｇは、核酸断片を含むポリヌクレオチドと共同して、脊椎動物用のインフルエンザワクチンとして用いることができ、当該核酸はそれぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。
【０１７３】
投与方法
本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をヒトに送達するための方法であって、本明細書で記述する１つ以上の組成物を、そのような組成物などの組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、ＩＶに対する免疫応答を引き起こすのに充分な量でヒトの細胞内で発現されるようにヒトに投与するか、或いはＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体自体をヒトに免疫応答を引き起こすのに充分な量で投与することを含む、方法をも提供する。
【０１７４】
本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をヒトに送達するための方法であって、本明細書で記述する組成物などの組成物を投与した場合に、免疫応答が当該の脊椎動物に引き起こされるように、本明細書で記述する１つ以上の組成物を脊椎動物に投与することを含む、方法をも提供する。
【０１７５】
「脊椎動物」という語は、単数の「脊椎動物」および複数の「脊椎動物群」を包含する意味で使われており、哺乳類、鳥禽類、魚類、爬虫類及び両生類を含む。
【０１７６】
「哺乳類」という語は、単数の「哺乳動物」及び複数の「哺乳動物群」を包含する意味で使われており、その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：ヒト；類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル[cebus]、アカゲザル[rhesus],アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン[gibbons]、並びにチンパンジー等の霊長目；イヌ、オオカミ等のイヌ科；ネコ、ライオン及びトラ等のネコ科；ウマ、ロバ、シマウマ等のウマ科、ウシ、ブタ、ヒツジ等の食用動物；シカ、キリン等の有蹄類；クマ等のクマ科；ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラ等のその他の動物。特に、哺乳類は、ヒト被験者、食用動物、又はペット動物であってよい。
【０１７７】
「鳥禽類」という語は、単数の「鳥」および複数の「鳥群」を包含する意味で使われており、その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ等の野生の水鳥；シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、アヒルなどの家畜化された鳥類。「鳥禽類」という語はまた、ホシムクドリ、およびセキセイインコ等のスズメ科の鳥類も包含する。
【０１７８】
本発明はさらに、ＩＶに対する免疫応答を引き起こし、高め、又は調整する方法であって、本明細書で記述する１つ以上の組成物を脊椎動物に投与することを含む、方法を提供する。この方法では、本発明の組成物は、少なくとも１つの核酸断片を含む１つ以上の単離ポリヌクレオチドを含有し、当該の核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である。別の実施の形態では、本発明の組成物は、上記ポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含んでいてよく、当該タンパク質は組み換えタンパク質として（特に、融合タンパク質、精製サブユニット、当該タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態で）提供される。従って、後者の組成物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との双方を含む。当該組成物のポリヌクレオチドによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、当該組成物のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と同じである必要はない。この方法に従って使用する組成物は、一価、二価、三価、及び多価であってよい。
【０１７９】
当該組成物のポリヌクレオチドは、ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするヒトの（又はその他の脊椎動物の）コドン最適化コード領域の断片を含むことができる。当該ポリヌクレオチドは、当該脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の抗原性を有する量がｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。この方法により当該組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、免疫応答を引き起こすのに充分な量で、当該脊椎動物の体内で発現される。そのような免疫応答は、例えば、診断アッセイ用又は研究用試液として、或いは本明細書で記述するような治療又は予防を目的としたワクチンとして、ＩＶに対する抗体を作るために使用することができる。
【０１８０】
本発明はさらに、予防及び／又は治療を目的とするＩＶに対する免疫応答を脊椎動物に引き起こし、高め又は調整する方法であって、本明細書で記述する１つ以上の組成物を、治療及び／又は予防のための免疫を必要とする脊椎動物に投与することを含む、方法を提供する。この方法では、本発明の組成物は、少なくとも１つの核酸断片を含む１つ以上の単離ポリヌクレオチドを含み、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である。さらなる実施の形態では、この方法で使用される組成物は、少なくとも１つの核酸断片を含む単離ポリヌクレオチド（当該の核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である）と；少なくとも１つの単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との双方を含んでいる。従って、後者の組成物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニット、当該タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチン）との双方を含む。この方法により当該組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、治療又は予防上有効な量でヒトに発現される。
【０１８１】
本明細書で用いる際「免疫応答」という語は、背脊椎動物に投与された組成物に対し免疫反応を誘発させる当該脊椎動物の能力を意味する。免疫応答の例には、抗体応答、又は細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）応答が含まれる。本発明の１つ以上の組成物を用いて脊椎動物に起こるインフルエンザ感染を予防することができる。すなわち、予防ワクチンとして、インフルエンザに晒される前に又はインフルエンザ疾患に罹患する前に、健康な個体にＩＶに対する免疫を確立させ又は高めるために用い、疾患を予防し又は疾患症状の重篤度を減じることができる。
【０１８２】
上記のように、本発明の組成物は、ＩＶ感染を予防する目的、又はＩＶ感染を治療する目的の双方に用いることができる。既にインフルエンザに晒されたか又は既にインフルエンザ疾患に苦しんでいる個体に対しては、本発明を用いて、さらに当該脊椎動物の免疫系を刺激することができ、それにより、当該疾患又は障害に関する症状を軽減又は除去することができる。本明細書で定義しているように、「治療」という語は、本発明の１つ以上の組成物を用いて、脊椎動物に起こったインフルエンザ疾患症状を予防、治療、遅延又はその重篤度を軽減すること、及び／又は既にＩＶに晒され治療を必要としている脊椎動物において特定の期間に渡りインフルエンザ疾患が悪化しないようにすることを意味する。「予防」という語は、本発明の１つ以上の組成物を用いて、特定のＩＶ菌株にまだ晒されていない脊椎動物に免疫を形成し、それによって当該脊椎動物が後に当該の特定のＩＶ菌株に晒された場合に疾患症状を予防し又は軽減することを意味する。従って、本発明の方法は、治療用ワクチン又は予防用(preventative or prophylactive)ワクチンと言ってよい。本発明のいかなる組成物も、インフルエンザに対する完全な免疫を提供したり、総てのインフルエンザ疾患症状を完全に治療し除去するということは求められていない。本明細書で用いる際「治療及び／又は予防のための免疫を必要としている脊椎動物」とは、インフルエンザ疾患症状を予防、治療、遅延又はその重篤度を軽減することが望ましい個体、及び／又は既にＩＶに晒され治療を必要としている脊椎動物において特定の期間に渡りインフルエンザ疾患が悪化しないようにすることが望ましい個体を意味する。治療及び／又は予防接種を施す脊椎動物には、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル [cebus]、アカゲザル[rhesus]、アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]、及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン及びチンパンジー、イヌ、オオカミ、ネコ、ライオン及びトラ、ウマ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、キリン、クマ、ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラ、カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、ホシムクドリ、及びセキセイインコがある。
【０１８３】
本発明の１つ以上の組成物を、「プライム−ブースト」投与計画で利用する。「プライム−ブースト」投与計画の一例が、Yang, Z. et al. J. Virol. 77:799-803 (2002)に記載されており、この文献はその全体を本明細書に参照により組み入れる。これらの実施の形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドワクチン組成物を脊椎動物に投与し、それにより当該脊椎動物のＩＶに対する免疫応答をプライミングさせ、その後二番目の免疫原性組成物をブーストワクチンとして使用する。本発明の１つ以上のポリヌクレオチドワクチン組成物を用いて免疫をプライミングさせ、その後二番目の免疫原性組成物（例えば、組み換えウィルスワクチン、異なったポリヌクレオチドワクチン、或いは１つ以上の精製サブユニット単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体）を用いて抗ＩＶ免疫応答をブーストする。
【０１８４】
１つの実施の形態では、プライミング組成物とブースティング組成物が、単一の組成物又は単一の製剤に組み合わされている。例えば、単一の組成物は、プライミング成分としての単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と、ブースティング成分としてのインフルエンザタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むことができる。この実施の形態では、組成物は、プライミング組成物とブースティング組成物が一緒に混ざり合って、単一のバイアルに含まれていてよい。一般的に、ポリヌクレオチドに由来する発現のピークレベルは投与後しばらく時間を経なければ起こらないので（例えば、７日から１０日）、ポリヌクレオチド成分が単離タンパク質成分にブーストを提供する。プライミング成分とブースティング成分の双方を含む組成物を、本明細書で、「組み合わせワクチン組成物」又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物」と呼ぶ。さらに、ブースティング組成物が作用するのにより長い時間がかかると予測される場合には、プライミング組成物をブースティング組成物の前のみならず、ブースティング組成物の後に投与してもよい。
【０１８５】
また別の実施の形態では、プライミング組成物とブースティング組成物が分かれている別々の製剤で投与する場合であっても、プライミング組成物をブースティング組成物と同時に投与してよい。
【０１８６】
本明細書で用いる際「プライミング」若しくは「プライマリー」又は「ブースト」若しくは「ブースティング」という語は免疫学で通常これらの語が持つ定義に準じて、それぞれ初回の又はそれに続く予防接種を意味してよい。しかし、ある実施の形態においては（例えば、プライミング成分とブースティング成分が単一の製剤に含まれている場合）、「プライム」成分と「ブースト」成分は同時に投与されるのであるから、初回の又はそれに続く予防接種は必要でないかもしれない。
【０１８７】
ある実施の形態では、本発明の１つ以上の組成物を、本明細書で記述する方法により脊椎動物に投与し、それにより、効果的な治療、及び／又は効果的な予防のための免疫応答を達成する。より具体的には、本発明の組成物は、脊椎動物のいかなる組織にも投与してよく、組織の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝組織、脾組織、骨髄組織、胸腺組織、心組織（例えば、心筋、心内膜及び心膜）、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵組織、腎組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、舌組織、および結合組織（例えば、軟骨）。
【０１８８】
さらに、本発明の組成物は、脊椎動物のいかなる体内腔に投与してもよく、体内腔の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、心房のすべて、静脈、動脈、毛細血管、リンパ腔、子宮腔、膣腔、直腸腔、関節腔、脳室、脊髄の脊髄管、眼腔、唾液腺管あるいは肝臓管の管腔。本発明の組成物を唾液腺管又は肝臓管の管腔に投与する場合では、対象ポリペプチドは唾液腺若しくは肝臓で発現し、ポリペプチドが唾液腺から又は肝臓から血流に送達される。唾液腺若しくは肝臓を使って対象のポリペプチドを血流に放出する胃腸系の分泌器官に投与する方法が、アメリカ合衆国特許番号 ５，８３７，６９３および６,００４，９４４に開示されており、これらの文献はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１８９】
ある実施の形態では、Kodihalli S. et al., Vaccine  18:2592-9 (2000)（本明細書にその全体を参照により組み入れる）に記載されているように、当該組成物を孵化鶏卵に、又は筋肉内注射で毛をむしったニワトリの胸部に投与する。
【０１９０】
ある実施の形態では、当該組成物を筋肉（骨格筋又は心筋のどちらか）或いは肺組織に投与する。具体的だが限定的ではない投与方法が、Wheeler, C.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996)に開示されており、この文献は本明細書にその全体を参照により組み入れられる。
【０１９１】
開示された方法によると、本発明の組成物は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は肺内の経路で投与することができる。その他の適切な投与経路には、気管内、経皮[transdermal]、眼内、鼻腔内、吸入、体腔内、静脈内（ｉ．ｖ．）、分泌管内（すなわち、膵臓への投与）及び組織内（組織への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。経皮[transdermal]投与には、皮内（すなわち、真皮又は表皮への投与）、経皮[transdermal]（すなわち、経皮[percutaneous]）及び粘膜（すなわち、皮膚あるいは粘膜への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。体内腔投与には、口腔、膣腔、直腸腔、腹腔又は腸腔への投与、さらに、骨腔内（すなわち、骨髄管への投与）、脳室内若しくは心室内（すなわち、脳室あるいは心室への投与）、動脈内（すなわち、心臓の心房への投与）、及びくも膜下腔（すなわち、脳のくも膜下腔への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１９２】
対象組織に、ＩＶに対する免疫応答を引き起こすのに充分な量で、及び／又は予防若しくは治療上有効な免疫応答をそのような応答を必要としているヒトに引き起こすのに充分な量で、対象のペプチド又はタンパク質が発現されさえすれば、いかなる投与方法を使用してもよい。本発明の投与手段には、注射針を用いた注射、カテーテルを用いた点滴、バイオリスティック注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」あるいは空気圧「無針」注射器）、Med-E-Jet (Vahlsing, H., et al., J. Immunol. Methods 171:11-22 (1994))、Pigjet (Schrijver, R., et al.,  Vaccine 15: 1908-1916 (1997))、Biojector (Davis, H., et al., Vaccine 12: 1503-1509 (1994); Gramzinski, R., et al., Mol. Med. 4: 109-118 (1998))、AdvantaJet (Linmayer, I., et al., Diabetes Care 9:294-297 (1986)), Medi-jector (Martins, J., and Roedl, E. J. Occup. Med. 21:821-824 (1979))、ゲルフォームスポンジデポー、その他市販されているデポー材（例えば、ハイドロゲル）、浸透パイプ（例えば、Alza minipumps）、経口若しくは座薬の固形（錠剤若しくは丸薬）薬剤、局所皮膚用クリーム状製品、およびデカンティング、ポリヌクレオチドで被覆した縫合糸（Qin, Y., et al., Life Sciences 65: 2193-2203 (1999)）或いは手術中の局所適用。ある投与モードは、針を使用した筋肉内注射およびカテーテル点滴による肺への適用である。エネルギー補助プラスミド投与[Energy-assisted plasmid delivery (EAPD)]方法を用いて、本発明の組成物を投与してもよい。そのような方法のひとつは、電気パルスを短時間注入組織に印加することに関し、これは一般にエレクトロポレーション法として知られている手順である（Mir, L.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4262-7 (1999); Hartikka, J. et al., Mol. Ther. 4:407-15 (2001); Mathiesen, I., Gene Ther. 6:508-14(1999); Rizzuto G. et al., Hum. Gen. Ther. 11:1891-900 (2000)を参照せよ）。これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる。
【０１９３】
本発明の１つ以上の組成物の有効な量の決定は、多くの因子に依存しており、それらの因子の例には、発現している又は直接投与された抗原｛ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２、又はそれらの断片（例えば、ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体｝、被験体の年齢及び体重、治療を必要としている正確な病状及びその重篤度、さらに投与経路が挙げられる。上記の因子に基づけば、正確な量、投与回数、投与時期を決定することは、当該技術分野の通常の知識の範囲内であり、医師若しくは獣医は容易に決定することができるであろう。
【０１９４】
アメリカ合衆国特許出願公開番号２００２／００１９３５８（２００２年２月１４日に公開された；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）に開示されているように、本発明の組成物は、様々な塩、賦形剤、投与基剤、およびまたは補助剤を含んでいてよい。
【０１９５】
さらに、本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞内部又は細胞内の目的の位置への送達を促進する１つ以上の形質移入促進化合物を含んでいてよい。本明細書で用いる際「形質移入促進化合物」、「形質移入促進剤」及び「形質移入促進物質」という語は、同義語であり、相互に取り替えて使用してよい。下記に説明しているように、ある形質移入促進化合物はまた「アジュバント」であってもよい。すなわち、このような化合物は、細胞の内部にポリヌクレオチドの送達を促進することに加えて、当該ポリヌクレオチドによりコードされる抗原に対する免疫応答を変え若しくは増強させるように作用し得るということは留意すべきである。形質移入促進化合物の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：リン酸カルシウム、ミョウバン（硫酸アルミニウム）及び金粒子（例えば、粉末型投与基剤）などである無機物質；例えば、カチオンペプチド、細胞間ターゲティング（ある種の細胞型への選択的投与を行うため）、細胞内ターゲティング（核局在化又はエンドソームエスケープを行うため）、両親媒性（ヘリックス形成又はポア形成）などであるペプチド；例えば、ヒストンなどの塩基性（例えば、正の帯電を付与したもの）、ターゲティング（例えば、アシアロタンパク質）、ウィルス性（センダイウィルス被覆タンパク質）及びポア形成性などであるタンパク質；カチオン（例えば、DMRIE, DOSPA, DC-Chol）、塩基性（例えば、ステリルアミン[steryl amine]）、中性（例えば、コレステロール）、アニオン（例えば、ホスファチジルセリン）及び両性イオン型[zwitterionic]（例えば、DOPE, DOPC）などである脂質；デンドリマー、スターポリマー、「同種の」ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン）、「異種の」ポリアミノ酸（例えば、リジンとグリシンの混合物）、コポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポロキサマー（例えば、ＣＲＬ１００５）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などであるポリマー。形質移入促進物質は、単独で用いても、或いは１つ以上のその他の形質移入促進物質を組み合わせて用いてもよい。２つ以上の形質移入促進物質を化学的結合（例えば、脂質化したポリリジン、ポリエチレングリコール化したポリリジンに見られるような共有結合及びイオン結合）（Toncheva, et al., Biochim. Biophys. Acta 1380(3):354-368 (1988)を参照せよ)、機械的混合（例えば、「ポリリジン＋カチオン脂質」のような、液体又は固体相において自在に動く物質）（Gao and Huang, Biochemistry 35:1027-1036 (1996); Trubetskoy, et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:311-313 (1992)を参照せよ)、及び凝集（例えば、カチオン脂質＋ポリ乳酸、及びポリリジン＋ゼラチンに見られるような、共沈殿、ゲル形成)により、組み合わせることができる。この段落に引用した文献は、本明細書に参照によりその全体を組み入れられる。
【０１９６】
形質移入促進物質のひとつの種類は、カチオン脂質である。カチオン脂質の例は、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）及びジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン-カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳである。カチオンコレステロール誘導体もまた有用であり、{3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノ)エタン]-カルボモイル}-コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジメチルジアクタデシル-アンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-テトラデシルオキシエチル))-N-メチル-アンモニウム ブロミド（ＰＡ−ＤＥＭＯ）、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-ドデシルオキシエチル))-N-メチル-アンモニウム ブロミド （ＰＡ＿ＤＥＬＯ）、N,N,N-トリス-(2-ドデシルオキシ)エチル-N-(3-アミノ)プロピル-アンモニウム ブロミド（ＰＡ−ＴＥＬＯ） (PA-TELO)、及びN1-(3-アミノプロピル)((2-ドデシルオキシ)エチル-N2-(2-ドデシルオキシ)エチル-1-ピペラジンアミニウムブロミド（ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）を本発明に用いることができる。
【０１９７】
DL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-b-ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩジエーテル）、 1-O-オレイル-2-オレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-b-ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩエステル／エーテル）、及びそれらの塩類のような非ジエーテルカチオン脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子投与を促進する。いくつかの実施の形態においては、カチオン脂質は、頭基における第四アンモニウム部位に結合したヘテロ原子を介して結合する基を含む。グリシルスペーサーを用いて、リンカーをヒドロキシ基に結合することができる。
【０１９８】
本発明のある実施の形態で利用することができるカチオン脂質の具体的だが非限定的な例には、DMRIE ((±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、GAP-DMORIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、及びGAP-DLRIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-ドデシルアオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)が挙げられる。
【０１９９】
本発明のある実施の形態で利用することができるカチオン脂質のその他の具体的だが非限定的な例には、Bn-DHRIE、DhxRIE、DhxRIE-OAc、DhxRIE-OBz及びPr-DOctRIE-OAc が挙げられる。これらの脂質は、同時係属中のアメリカ合衆国特許出願番号１０／７２５，０１５に開示されている。本発明の別の態様では、カチオン界面活性剤は、Pr-DOctRIE-OAc である。
【０２００】
その他のカチオン脂質には、(±)-N,N-ジメチル-N-[2-(スペルミンカルボキサミド) エチル]-2,3-ビス (ジオレイルオキシ)-1-プロパンイミニウムペンタヒドロキシクロライド（ＤＯＳＰＡ）、(±)-N-(2-アミノエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンイミニウムブロミド (b-アミノエチル-DMRIE又はbAE-DMRIE) (Wheeler, et al., Biochim. Biophys. Acta 1280:1-11 (1996))、及び(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-l-プロパンイミニウム ブロミド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）(Wheeler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996))]（これは、ＤＭＲＩＥに基づき開発された）がある。これらの文献は双方とも、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
本発明で有用であるＤＭＲＩＥ系のカチオン脂質のその他の例には、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-デシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＤＲＩＥ）、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ）、(±)-N-((N''-メチル)-N'-ウレイル)プロピル-N,N-ジメチル-2,3-ビス(トラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＭＧＵ−ＤＭＲＩＥ）、(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、及び (±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス-([Z]-9-オクタデセニールオキシ)プロピル-1- プロパンアミニウムブロミド（ＨＰ−ＤＯＲＩＥ）が挙げられる。
【０２０２】
免疫原性組成物がカチオン脂質を含む実施の形態においては、カチオン脂質を１つ以上のコ・リピド[co-lipid]と混合してよい。定義としては、「コ・リピド[co-lipid]」という語は、カチオン脂質を組み合わせてよい総ての疎水性物質を意味し、その例には、リン脂質のような両親媒性脂質、及びコレステロールのような中性脂質が挙げられる。カチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]は、多数の方法により混合又は組み合わせて、多様な非共有結合による巨視的構造を創り出すことができ、当該非共有結合の巨視的構造の例には、例えば、リポソーム、多層小胞、単層小胞、ミセル及び単純膜がある。コ・リピド[co-lipid]の１つの非限定的なクラスは、両性イオン型[zwitterionic]の両親媒性脂質であり、このクラスには、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンが含まれる。ホスファチジルエタノールアミンの例には、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ及びＤＰｙＰＥがある。ある実施の形態においては、コ・リピド[co-lipid]は、ジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格に組み込まれれた２個のフィタノイル置換基を有するＤＰｙＰＥである。その他の実施の形態では、コ・リピド[co-lipid]は、ＤＯＰＥ  ＣＡＳ、すなわち、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン[1,2-diolyeoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine] である。
【０２０３】
本発明の組成物は、カチオン脂質及びコ・リピド[co-lipid]を含むとき、カチオン脂質対コ・リピド[co-lipid]のモル比を、約９：１から約１：９、約４：１から約１：４、約２：１から約１：２、又は約１：１とすることができる。
【０２０４】
均一性を最大限にするため、カチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]をクロロホルムのような溶媒に溶かし、次にカチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]の溶液を真空下にて蒸発させ、ガラス容器（ロータリーエバポレーター丸底フラスコ）の内表面上の膜になるまで乾燥させる。水溶性の溶媒に懸濁すると、両親媒性脂質成分分子が均一性の脂質小胞に自己集合する。次に、例えば、当業者に既知の方法を用いて、本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドで複合化する前に、これらの脂質小胞を、均一な大きさの選択された平均直径を有するように処理してもよい。例えば、脂質溶液の音波破砕が、Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:,7413-7417 (1987)及びアメリカ合衆国特許番号５，２６４，６１８に記述されており、その開示は本明細書に参照により組み込まれる。
【０２０５】
組成物にカチオン脂質を含む実施の形態においては、例えば、水溶液中のプラスミドと本明細書において調製されるカチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]との溶液を混合するなどして、本発明のポリヌクレオチドを脂質と混合により複合化する。それぞれの構成成分の溶液の濃度を、混合前に、所望の最終のプラスミド／脂質及びコ・リピド[co-lipid]の比率、並びに所望の最終プラスミド濃度がこれら２つの溶液を混合した時点で得られるように調整することができる。適切な量の水溶性溶媒中の混合脂質物質の薄膜を、周囲温度でボルテックスミキサーを用い１分間混練することにより水和させて、脂質とコ・リピド[co-lipid]との混合物を適切に調製する。当該薄膜は、個々の構成成分のクロロホルム溶液を混合し、所望の分子溶質比率(molarsolute ratio)を得た後、当該溶液の望ましい量を適切な容器に等分することにより調製する。溶媒は、蒸発により（まず、例えばアルゴンのような乾燥した不活性ガスを用い、次に高度真空処理を施す）除去する。
【０２０６】
例えば、ステロール、脂肪酸、ガングリオシド[gangliosides]、糖脂質、リポペプチド、リポサッカリド、ネオビー[neobees]、ニオサム[niosomes]、プロスタグランジン[prostaglandins]、およびスフィンゴリピッド[sphingolipids]その他の疎水性及び両親媒性添加剤が、本発明の組成物に含まれていてよい。そのような組成物内において、これらの添加剤は、約０．１ｍｏｌ％から約９９．９ｍｏｌ％（総脂質に対して）、約１ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％、又は約２ｍｏｌ％から約２５ｍｏｌ％の量で含まれていてよい。
【０２０７】
本発明のさらなる実施の形態は、ポリヌクレオチドを投与する前、投与した後、又はポリヌクレオチドの投与と同時に投与する補助剤を含む組成物に関する。本明細書で用いる際「補助剤」という語は、補助剤を含めたこと以外はまったく同じである組成物に比べて、ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏの脊椎動物の細胞への侵入及び／又はそのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を高める能力があるので組成物に含められた物質である。ある種の補助剤は、ポリペプチドの細胞への侵入を高めることに加えて、ポリヌクレオチドによりコードされる免疫原に対する免疫応答をも高めることができる。本発明の補助剤には、非イオン系、アニオン系、カチオン系、又は両性イオン型の界面活性剤又は洗剤（非イオン系界面活性剤又は洗剤が好ましい）、キレート剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、ポロキサマー、核酸を凝集凝縮させる製剤、乳化剤若しくは溶解補助剤、湿潤剤、ゲル形成剤、及び緩衝剤が含まれる。
【０２０８】
本発明の組成物で使用する補助剤の例には、以下の非イオン性洗剤及び界面活性剤が含まれるが、それらに限定されるものではない：IGEPAL CA 630（登録商標）、NONIDET NP-40、Nonidet（登録商標）P40、Tween-20TM、Tween-80TM、Pluronic（登録商標）F68(平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic F77（登録商標）(平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%), Pluronic P65（登録商標）(平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800;親水物質の概算重量百分率50%), Triton X-100TM、およびTriton X-114TM；アニオン系洗剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；糖スタキオース；凝縮剤ＤＭＳＯ；キレート剤／ＤＮａｓｅ阻害剤 ＥＤＴＡ、CRL 1005 (12 kDa、5% POE)、およびBAK（塩化ベンザルコニウム５０％溶液、Ruger Chemical Co. Inc.より入手可能）。ある特定の実施例では、補助剤はＤＭＳＯ、Nonidet P40、Pluronic F68（登録商標）(平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic F77（登録商標）(平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic P65（登録商標）(平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic L64（登録商標）(平均分子量：2900；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率40%)、およびPluronic F108（登録商標）(平均分子量：14600；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率80%)（例えば、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号２００２／００１９３５８を参照せよ；この文献は、参照により本明細書にその全体を組み込まれる）。
【０２０９】
本発明のある組成物はさらに、ポリヌクレオチドの前、後、又は同時に、１つ以上のアジュバントを含んでいてよい。「アジュバント」という語は、（１）ある特定の抗原に対する免疫応答を変え又は増強する能力、或いは（２）薬理学的な物質の効果を高め又は補助する能力を有する物質総てを意味する。ポリヌクレオチドワクチンに関しては、「アジュバント」は形質移入促進物質であり得るということは留意すべきである。同様に、上記の「形質移入促進物質」はまた、「アジュバント」であり得る。アジュバントは、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物と共に使用してよい。本明細書で記述するように、プライム−ブースト投与計画においては、アジュバントは、プライミング予防接種、ブースター予防接種、又はこれら双方と共に使用してよい。適切なアジュバントには、サイトカイン及び成長因子；細菌の構成成分（例えば、エンドトキシン、特に超抗原(super antigen)、エキソトキシン及び細胞壁構成成分）；アルミニウム系の塩類；カルシウム系の塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウィルスおよびウィルス由来物質、毒、毒液、イミダゾキニリン化合物、ポロキサマー、並びにカチオン脂質が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０２１０】
多種多様な物質が、多様な機序を介するアジュバント作用を有することが示されている。ポリペプチドの発現、抗原性若しくは免疫原性を高める可能性のある化合物は総て、潜在的なアジュバントである。本発明は、免疫応答を改善させる能力があるか否かにつき潜在的なアジュバントを選別するアッセイを提供する。本発明に従って免疫応答を高める能力があるか否かにつき選別される潜在的なアジュバントには、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：ミョウバン、ベントナイト、ラテックス及びアクリル粒子などの不活性担体；TiterMax（登録商標）｛ブロックコポリマーＣＲＬ−８９４、スクアレン（代謝可能オイル）及び微粒子シリカ安定剤｝などのプルロニックブロックポリマー；フロイントアジュバントなどのデポー形成剤、サポニン、リソレシチン、レチナール、クイルＡ、リポソーム及びプルロニックポリマー製剤などの表面活性物質；細菌性リポポリサッカリドなどのマクロファージ刺激因子；インシュリン、ザイモサン、エンドトキシン及びレバミゾールなどの第二経路補体活性化因子；並びにポロキサマー、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)トリ−ブロックコポリマーなどの非イオン系界面活性剤。上記に説明している形質移入促進物質もまたアジュバントとして含められる。
【０２１１】
本発明に従って免疫応答を高める能力があるか否かにつき選別されるポロキサマーの例には、以下の市販のポロキサマーが含まれるが、それらに限定されるものではない：酸化プロピレンと酸化エチレンとのブロックコポリマーであって、酸化プロピレンブロックが酸化エチレンブロック間に挟まれているブロックコポリマーである、Pluronic（登録商標）界面活性剤。Pluronic（登録商標）界面活性剤の例には、以下を含む： Pluronic（登録商標） L121 （平均分子量：4400；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率10%）、Pluronic（登録商標）L101 (平均分子量：3800；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L81 （平均分子量：2750；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L61 (平均分子量：2000；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L31 (平均分子量：1100；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率10%), Pluronic（登録商標） L122 (平均分子量：5000；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L92 (平均分子量：3650；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L72 (平均分子量：2750；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L62 (平均分子量：2500；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L42 (平均分子量：1630；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L63 (平均分子量：2650；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）L43 (平均分子量： 1850；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）L64 (平均分子量：2900；疎水物質の概算分子量, 1800; 親水物質の概算重量百分率, 40%), Pluronic（登録商標） L44 (平均分子量：: 2200; 疎水物質の概算分子量, 1200; 親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標） L35 (平均分子量：1900；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P123 (平均分子量：5750；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）P103 (平均分子量：4950；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）P104 (平均分子量：5900；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）P84 (平均分子量：4200；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）P105 (平均分子量：6500；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P85 (平均分子量：4600；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P75 (平均分子量：4150；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P65 (平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）F127 (平均分子量：12600；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F98 (平均分子量：13000；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F87 (平均分子量：7700；疎水物質の概算分子量2400；親水物��の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F77 (平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F108 (平均分子量：14600；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F98 (平均分子量：13000；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F88 (平均分子量：11400；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F68 (平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F38 (平均分子量：4700；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率80%)。
【０２１２】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別される逆ポロキサマーの例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない： Pluronic（登録商標） R 31R1 (平均分子量：3250；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 25R1 (平均分子量：2700；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 17R1 (平均分子量：1900；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 31R2 (平均分子量：3300；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 25R2 (平均分子量：3100；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 17R2 (平均分子量：2150；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 12R3 (平均分子量： 1800；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）R 31R4 (平均分子量：4150；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 25R4 (平均分子量： 3600；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 22R4 (平均分子量： 3350；疎水物質の概算分子量2200；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 17R4 (平均分子量：3650；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 25R5 (平均分子量： 4320；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）R 10R5 (平均分子量：1950；疎水物質の概算分子量1000；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）R 25R8 (平均分子量： 8550；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）R 17R8 (平均分子量： 7000；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率80%)、およびPluronic（登録商標） R 10R8 (平均分子量： 4550；疎水物質の概算分子量1000；親水物質の概算重量百分率80%)。
【０２１３】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他の市販ポロキサマーには、ポリエチレンとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマーである以下の化合物が含まれるが、それらに限定されるものではない： Synperonic（登録商標） L121 (平均分子量：4400)、Synperonic（登録商標） L122 (平均分子量：5000)、Synperonic（登録商標） P104 (平均分子量：5850)、Synperonic（登録商標） P105 (平均分子量：6500)、Synperonic（登録商標） P123 (平均分子量：5750)、Synperonic（登録商標） P85 (平均分子量： 4600)及び Synperonic（登録商標） P94 (平均分子量： 4600)（上記の化合物において、Ｌは当該界面活性剤が液体であることを表し、Ｐは当該界面活性剤がペースト状であることを表し、一桁目は当該界面活性剤のポリプロピレン部分の分子量の測定値を表し、数字の最後の桁は１０を乗じて当該界面活性剤の酸化エチレン含量百分率を表す）；並びに、Synperonic（登録商標） NP10 (ノニルフェノルエトキシ化 界面活性剤 - 10% 溶液)、Synperonic（登録商標） NP30 (１モルのノニルフェノルと３０モルの酸化エチレンとの濃縮物) 及びSynperonic（登録商標） NP5 (１モルのノニルフェノルと５．５モルの酸化ナフタリンとの濃縮物)などのノニルフェニルポリエチレングリコールである化合物。
【０２１４】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他のポロキサマーの例には、以下が含まれる：（ａ）Ａ型セグメントとＢ型セグメントとを含むポリエーテルブロックコポリマーであって、当該Ａ型セグメントは、比較的親水性の性質を持つ直線状の高分子セグメントを含み、当該高分子セグメントの繰り返し単位により平均Hansch-Leo 断片の定数が約−０．４以下になり、当該繰り返し単位の分子量寄与が約３０から約５００の間であり、当該Ｂ型セグメントは、比較的疎水性の性質を持つ直線状の高分子セグメントを含み、当該高分子セグメントの繰り返し単位により平均Hansch-Leo 断片の定数が約−０．４以上になり、当該繰り返し単位の分子量寄与が約３０から約５００の間であり、該高分子セグメントの繰り返し単位を繋いでいる少なくとも約８０％の連結がエーテル結合から成る、ポリエーテルブロックコポリマー；（ｂ）ポリエーテルセグメントとポリカチオンセグメントを有するブロックコポリマーであって、当該ポリエーテルセグメントは少なくとも１つのＡ型ブロックを含み、当該ポリカチオンセグメントは複数のカチオン繰り返し単位を含む、ブロックコポリマー；並びに（ｃ）ポリマー、ポリエーテルセグメント及びポリカチオンセグメント（化学式−NH−R0の複数のカチオン繰り返し単位を含む）を含むポリエーテル−ポリカチオンコポリマーであって、式中R0 は、置換可能な２個から６個の炭素原子を有する直鎖の脂肪基であり、前記ポリエーテルセグメントは少なくともＡ型セグメントとＢ型セグメントのひとつを含むコポリマー（Kabonov, et al.によるアメリカ合衆国特許番号5,656,611を参照せよ；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。その他の対象のポロキサマーには、CRL1005 (12 kDa、5% POE)、CRL8300 (11 kDa、5% POE)、CRL2690 (12 kDa、10% POE)、CRL4505 (15 kDa、5% POE)及びCRL1415 (9 kDa、10% POE)がある。
【０２１５】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他の補助剤には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：アカシア（アラビアゴム）；ポロクシエチレンエーテルR-O-(C2H4O)x-H (BRIJ（登録商標）)（例えば、ポリエチレングリコールドデシルエーテル(BRIJ（登録商標） 35、x=23)、ポリエチレングリコールドデシルエーテル (BRIJ（登録商標） 30、x=4)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル (BRIJ（登録商標） 52、x=2)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 56、x=10)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 58P、x=20)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 72、x=2)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 76、x=10)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 78P、x=20)、ポリエチレングリコールオレイルエーテル (BRIJ（登録商標） 92V、x=2)及びポリオキシル１０オレイルエーテル (BRIJ（登録商標） 97、x=10)）；ポリ-D-グルコサミン（チトサン）；クロルブタノール；コレステロール；ジエタノールアミン；ジギトニン；ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、エチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ）；グリセリンモノステアレート; ラノリンアルコール類；モノ−およびジ−グリセリド；モノエタノールアミン；ノニルフェノールポリオキシエチレン エーテル(NP-40（登録商標）)；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(アムレスコ社製NONIDET NP-40)；エチルフェノールポリ (エチレングリコールエーテル)n、n=11 (ロッシェ社製Nonidet（登録商標） P40)；約９個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(nonidet P40)；IGEPAL CA 630（登録商標） ((オクチルフェノキシ) ポリエトキシエタノール；構造的にはNONIDET NP-40と同じ)；オレイン酸；オレイルアルコール類；ポリエチレングリコール8000；ポリオキシル２０セトステアリルアルコールエーテル；ポリオキシル ３５キャスターオイル；ポリオキシル ４０水素添加キャスターオイル；ポリオキシル 40 ステアリン酸塩；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (ポリソルベート２０、あるいは TWEEN-20（登録商標）；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート８０、あるいは TWEEN-80（登録商標）);プロピレングリコールジアセタート；プロピレングリコールモノステアレート；硫酸プロタミン；タンパク質分解酵素；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；モノラウリン酸ナトリウム；ステアリン酸ナトリウム；ソルビタン誘導体(SPAN（登録商標）)、その例には、ソルビタンモノパルミテート(SPAN（登録商標） 40)、ソルビタンモノステアレート(SPAN（登録商標） 60)、ソルビタントリステアレート(SPAN（登録商標） 65)、ソルビタンモノオレエート(SPAN（登録商標） 80)、およびソルビタントリオレエート(SPAN（登録商標） 85)がある；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサ-ヘキセン(スクアレン)；スタキオース；ステアリン酸；スクロース；サーファクチン(枯草菌に由来するリポペプチド抗生物質)；ドデシルポリ (エチレングリコールエーテル)9 (Thesit（登録商標）) 分子量 582.9；約９個から１０個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(Triton X-100TM)；約７個から８個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（Triton X-114TM）；トリス(2-ヒドロキシエチル)アミン (トロラミン)；並びに乳化ワックス。
【０２１６】
あるアジュバント組成物では、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は、１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物；或いは１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない；顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、コロニー刺激因子(CSF)、エリスロポイエチン(EPO)、インターロイキン２(IL-2)、インターロイキン３ (IL-3)、インターロイキン４ (IL-4)、インターロイキン５ (IL-5)、インターロイキン６ (IL-6)、インターロイキン７ (IL-7)、インターロイキン８ (IL-8)、インターロイキン１０ (IL-10)、インターロイキン１２ (IL-12)、インターロイキン １５ (IL-15)、インターロイキン１８ (IL-18)、インターフェロンアルファ(IFNa)、インターフェロンベータ (IFNb)、インターフェロンガンマ (IFNγ)、インターフェロンオメガ (IFNw)、インターフェロンタウ (IFNτ)、因子Iを誘導するインターフェロンガンマ(IGIF)、形質転換成長因子ベータ(TGF-b)、RANTES (活性に対する制御、正常Ｔ−細胞の発現、おそらく分泌)、マクロファージ炎症タンパク質(例：MIP-1 アルファ およびMIP-1ベータ)、Leishmania伸長開始因子[Leishmania elongation initiating factor (LEIF)]、並びにFlt-3 リガンド。
【０２１７】
本発明のある組成物においては、ポリヌクレオチド構築物を、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）を含むアジュバント組成物により複合化してよい。この組成物はまた、１つ以上のコ・リピド[co-lipid]を含んでもよく、そのようなコ・リピド[co-lipid]の例には、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、及び／又は 1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン （ＤＭＰＥ）がある。１：１のモル比でＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ及びＤＰｙＰＥを含むアジュバント組成物を、本明細書ではVaxfectinTMと呼ぶ（例えば、特許協力条約公開番号ＷＯ００／５７９１７を参照せよ；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。
【０２１８】
その他の実施の形態では、本発明のポリヌクレオチドの全部若しくは一部が細菌のＤＮＡに由来する場合は、ポリヌクレオチド自体がアジュバントとして機能することもある。メチル化されていないＣｐＧ−ジヌクレオチド（ＣｐＧ−ＤＮＡ）モチーフを含む細菌のＤＮＡは、パターン認識受容体（ＴＬＲ９のようなＴｏｌｌ様受容体を含む）を通じて、脊椎動物の体内の生得の免疫細胞を誘発するため、マクロファージ、樹状細胞及びＢ−リンパ球に対する潜在免疫刺激効果を有する（例えば、Wagner, H., Curr. Opin. Microbiol. 5:62-69 (2002)；Jung, J. et al., J. Immunol. 169: 2368-73 (2002)を参照せよ；また、Klinman, D.M. et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 93:2879-83 (1996)を参照せよ）。メチル化されていないＣｐＧ−ジヌクレオチドをアジュバントとして使用する方法は、例えば、アメリカ合衆国特許番号6,207,646、6,406,705及び6,429,199に説明されており、これらの開示は本明細書に参照により組み入れられる。
【０２１９】
抗原に対する免疫応答を高めるアジュバントの能力は、一般的に、免疫媒介保護の著しい増強によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増強は、一般的に、抗原に対し抗体力価が高まったことにより明らかになり、Ｔ−細胞活性の増強は、一般的に、細胞増殖の増強、細胞障害反応、又はサイトカイン分泌により明らかになる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性、すなわちＴｈ２の反応を、主として細胞性、すなわちＴｈ１の応答に変えることにより、免疫応答を変えることができる。
【０２２０】
本発明の核酸分子及び／又はポリヌクレオチド（プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、直線状ＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチド）は、様々な緩衝液によって溶解することができる。適切な緩衝液には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、通常生理食塩水、トリス緩衝液、およびリン酸ナトリウム(例：１５０ｍＭリン酸ナトリウム)  が挙げられる。非水溶性のポリヌクレオチドは、弱酸若しくは弱塩基で溶解し、その後緩衝液を用いて望ましい量に希釈する。緩衝液のｐＨは、適切に調節してよい。さらに、薬学上許容可能な添加剤を、適切なモル浸透圧濃度を得るために添加することができる。そのような添加剤は、当業者の技能範囲内である。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する水性の組成物については、滅菌済みの発熱物質の無い水を用いてよい。そのような製剤は、ヒトに投与するのに適した薬学的に許容可能な組成物を調整することを目的として、有効な量のポリヌクレオチドを、適切な量の水溶液と共に含む。
【０２２１】
本発明の組成物は、既知の方法により調製することができる。適切な調製方法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, A. Osol, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)に説明されており、これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる。本発明の組成物は、水溶液として投与してもよいが、乳剤、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥剤又は当該技術分野で既知のその他の形態として調製してもよい。さらに本発明の組成物は、薬学的に許容可能な添加剤を含んでいてよく、そのような添加剤の例としては、希釈剤、結合剤、安定剤及び防腐剤が挙げられる。
【０２２２】
以下の実施例は例示の目的のみに含められているのであって、本明細書の終わりに付け加えた請求項により定義した本発明を限定するものではない。実施例に引用した参考文献は総て参照によりその全体を本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２２３】
材料および方法
以下の材料および方法は、一般的に、本明細書に開示されているすべての実施例に適用される。具体的な材料及び方法は、必要に応じて、それぞれの実施例に開示されている。
【０２２４】
本発明を実施するにあたり、別途記載のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学（ＰＣＲを含む）、ワクチン学、微生物学、遺伝子組み換えＤＮＡ、および免疫学における従来の技術を用い、それらの技術は当業者の技能の範囲内である。そのような技術は、参考文献に完全に説明されている（例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al. アメリカ合衆国特許番号 4,683,195；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論争集 Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；並びにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照せよ）。この段落で引用した文献は、参照により本明細書にその全体を組み入れられる。
【０２２５】
遺伝子の構築
本発明の構築物は、本明細書で又は当該技術分野で提供している配列情報に基づいて、以下を含むがそれらに限定されない標準分子生物学の技術を用いて、構築される。まず、それぞれの長さが８０個から９０個のヌクレオチドで当該構築物の長さを持つ一連の相補的なオリゴヌクレオチドペアを標準方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアを、アニーリングの際にそれらが８０個から９０個の塩基ペアを有する二本鎖の断片を形成し、付着末端を含むように合成する。それぞれのペアにおけるオリゴヌクレオチドの一本鎖末端を、隣接するオリゴヌクレオチド二重鎖の一本鎖末端とアニールするように設計する。このように作製されたいくつかの隣接オリゴヌクレオチドペアをアニールさせ、次いで、約５個から６個の隣接するオリゴヌクレオチド二重鎖断片を一本鎖付着末端を介してアニールさせる。次いで、この一連のアニール処理を施したオリゴヌクレオチド二重鎖断片を連結して、適切なプラスミド（カリフォルニア州カールスバッド市のInvitrogen Corporationから入手できるTOPO（登録商標） ベクター）にクローンする。目的の構築物を標準方法により配列決定する。このように作製された構築物（相互に連結された８０個から９０個の塩基ペアを有する二本鎖の断片を約５個から６個含む；すなわち、約５００個の塩基ペアから成る断片群）を、構築物の全体の目的配列が一連のプラスミド構築物に表されるように作製する。次いで、これらのプラスミドの挿入片を、適切な制限酵素で切り、連結して、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を、標準クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。本明細書で言及されているオリゴヌクレオチド及びプライマーは、本明細書又は当該技術分野でで提供している配列情報に基づいて、当業者により容易に設計することができ、当該オリゴヌクレオチド及びプライマーは、多くの商業目的のヌクレオチド提供業者（例えば、カリフォルニア州サンディエゴ市のRetrogenおよびドイツ国レーゲンスブルグ市のGENEART）が合成している。
【０２２６】
プラスミドベクター
本発明の構築物を、例えば、真核細胞発現ベクターVR1012又はVR10551に、挿入することができる。これらのベクターは、修飾pUC18バックグラウンドに基づいて構築されており（Yanisch-Perron, C., et al. Gene 33:103-119 (1985)を参照せよ)、カナマイシン耐性遺伝子、ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーター[cytomegalovirus immediate early promoter]／エンハンサー及びイントロンＡ、ウシ成長ホルモン転写終結シグナル、並びに外部の遺伝子を挿入するためのポリリンカーを含んでいる（Hartikka, J., et al., Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996)を参照せよ）。しかし、その他の市販されている標準の真核細胞発現ベクターを本発明で使用してもよく、その例には以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：プラスミド群 pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、および pZeoSV2 （カリフォルニア州カールスバッド市のInvitrogenから入手可能）、並びにプラスミド pCI （ウィスコンシン州マディソン市のPromegaから入手可能）。
【０２２７】
VR10551という名の最適化バックボーンプラスミドは、上記のVR1012バックボーンに、多少の変更を加えてできている。当該VR10551ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの最初期(hCMV-IE)遺伝子[human cytomegalovirus immediate early (hCMV-IE) gene]エンハンサー／プロモータおよび5’非翻訳領域（hCMV-IE イントロン Aを含む）を使用する点において、VR1012に由来し、またVR1012に類似している。VR1012 からVR10551への変更には、複数のクローニング部位になされたいくつかの修飾が含まれ、修飾ウサギベータグロビン3'非翻訳領域／ポリアデニレーションシグナル配列／転写ターミネーターが、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する同じ機能ドメインに置換されている。
【０２２８】
さらに、本発明の構築物を、その他の真核細胞発現ベクターバックボーン（例えば、VR10682又はVR10686）に挿入してもよい。VR10682発現ベクターバックボーン(SEQ ID NO:94)は、発現プラスミドVCL1005に由来する修飾ニワトリ肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータ、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニレーション部位および外部遺伝子を挿入するためのポリリンカー、およびカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。VCL1005および VR10682内のＲＳＶプロモータは、配列TAC TCT AGA CG (SEQ ID NO:82)の転写開始部位の近くにXbaIエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでいる。修飾ＲＳＶプロモータが、VR10682に含まれている。発現プラスミドVCL1005がアメリカ合衆国特許番号5,561,064 に説明されており、この文献は本明細書に参照により組み入れられる。
【０２２９】
VR10686発現ベクターバックボーン(SEQ ID NO:112) は、VR6430 (SEQ ID NO:89)内のウェストナイルウィルス（ＷＮＶ）抗原挿入片を、VR1012ベクターに由来する複数のクローニング部位と置換することにより、作製された。VR10686 およびVR6430発現ベクターバックボーンは、ＲＳＶプロモータ｛VCL1005に由来し、野生型ＲＳＶ配列(TAC AAT AAA CG (SEQ ID NO:83))に戻すように修飾されている｝を含んでいる。野生型ＲＳＶプロモータは、Ｒ領域およびヒトＴ−細胞白血病ウィルスＩ(HTLV-I)に由来するＵ５領域の最初の３９個のヌクレオチドに融合されている（以後、ＲＵ５エレメントと呼ぶ）。Ｒ領域およびＵ５領域は、HTLV-Iの長端末反復領域(LTR)の一部であり、この部分は、HTLV-I転写の発現を制御し、レトロウイルス統合メカニズム[retroviral integration mechanism]の結果として統合ウィルスゲノムのどちらかの末端で複製される。HTLV-IのＬＴＲおよびほとんどのレトロウイルスは、三つの領域、Ｕ３、Ｒ及びＵ５に分けられる。統合ウィルスゲノムに由来する転写は５'ＬＴＲのＵ３−Ｒ間の境界線で開始し、転写物は３'ＬＴＲのＲ−Ｕ５間の境界線でポリアデニレーション化される（Goff, S. P. Retroviridae, Field's Virology4th ed. 2:1871-1939 (2001)を参照せよ）。このＲＵ５  ＨＴＬＶ−Ｉエレメントは、ＳＶ４０初期遺伝子プロモータに融合された場合に、強力な翻訳刺激因子であることが示されている（Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)を参照せよ）。ＨＴＬＶ−ＩＲＵ５エレメントによる翻訳刺激が部分的には翻訳向上リボソーム内部侵入部位[translational enhancing internal ribosome entry site (IRES)]としてのその機能によるということが提案されている(Attal et al. FEBS Letters 392:220-224 (1996)を参照せよ)。さらに、ＨＴＬＶ−ＩＲＵ５エレメントは、5'−スプライスドナー部位を提供する。ＲＵ５エレメントのすぐ下流には、スプライス受容保存配列[splice acceptor sequence]を含むＨＣＭＶイントロンＡの３'末端がある。VR10686およびVR6430 発現ベクターは、ＨＣＭＶイントロンＡの３'末端に融合された５'−ＨＴＬＶ−Ｉイントロン配列から成るハイブリッドイントロン、ウシ成長ホルモンポリアデニレーション部位、外部の遺伝子を挿入するためのポリリンカー、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。VR6430ベクターは、prM およびE ウェストナイルウィルス抗原 （Genebank 受託番号AF202541）を発現する。
【０２３０】
上記のベクターバックボーンを用いて、複数のインフルエンザタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を発現する発現ベクターを作製することができる。本明細書で説明している発現ベクターは、付加的なプロモータを含んでいてよい。例えば、VR4774構築物（実施例１３に説明されている）は、ＣＭＶプロモータ及びＲＳＶプロモータを含んでいる。従って、本明細書で説明しているベクターバックボーンは、プロモータ及びインフルエンザコード配列（特に本明細書で説明しているポリヌクレオチドを含む）を含む複数の発現カセットを含んでいてよい。発現カセットは、同一の又は異なったインフルエンザポリペプチド群をコードしてよい。さらに、発現カセットは、相互に同一の又は異なった配向であってよい。従って、それぞれのカセットに由来する転写も、同一の又は異なった方向であってよい（すなわち、双方の発現カセットにおいて５' から３' の方向であってもよく、ひとつの発現カセットにおいて５' から ３'の方向でありもうひとつの発現カセットにおいて３' to ５' の方向であってよい）。
【０２３１】
プラスミドＤＮＡ精製
プラスミドＤＮＡは、適切な大腸菌株（DH5α菌株を含むがそれに限定されない）のコンピテント細胞に転換してよく、また高度に精製した共有結合で閉じた環状プラスミドＤＮＡを修飾細胞溶解法[modified lysis procedure] （Horn, N.A., et al., Hum. Gene Ther. 6:565-573 (1995)）、続いて標準二本鎖ＣｓＣｌ−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法[standard double CsCl-ethidium bromide gradient ultracentrifugation] （Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989))）を用い、単離した。あるいはまた、プラスミドＤＮＡを、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア市）製のGigaカラムを用いそのキットの使用方法に基づき、精製する。すべてのプラスミド調製は、ゲル分析及びビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ[bicinchoninic protein assay]により検知できる染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質不純物がない状態であった。エンドトキシンレベルは、アメリカ産カブトガニ血球抽出液エンドトキシン検出方法（リムルス試験）[Limulus Amebocyte Lysate assay] （マサチューセッツ州ファルマウスケープコッド市のLAL、Associates）を用いて測定され、その結果はプラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり０．６エンドトキシン単位未満であった。ＤＮＡ溶液のスペクトル吸光度A260/A280比の典型的数値は、１．８を超えていた。プラスミドを、エタノール沈殿し、適切な溶液（例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム）を用いて再懸濁する（その他の適切な賦形剤および補助剤については、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号2002/0019358を参照せよ）。ＤＮＡを使用するまで、−２０°Ｃで保存した。ＤＮＡを、３００ｍＭ塩溶液と混合するかあるいは適切な量のＵＳＰ水を加えて希釈し、望ましい分子濃度の望ましい塩におけるプラスミドＤＮＡ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度を得た。
【０２３２】
哺乳類細胞ラインにおけるプラスミド発現
発現プラスミドを、プラスミドを充分に特徴付けたネズミの黒腫（メラノマ）細胞ライン（VM-92またはUM-449として公知である）に形質移入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した（例えば、Wheeler, C.J., Sukhu, L., Yang, G., Tsai, Y., Bustamente, C., Felgner, P. Norman, J & Manthorpe, M. "Converting an Alcohol to an Amine in a Cationic Lipid Dramatically Alters the Co-lipid Requirement, Cellular Transfection Activity and the Ultrastructure of DNA-Cytofectin Complexes," Biochim. Biophys. Acta. 1280:1-11 (1996)を参照せよ）。その他の充分に特徴付けたヒトの細胞ラインを用いてもよく、その例としては、ATCC アクセッション番号CCL-171のMRC-5 細胞、あるいは、ヒト胎児横紋筋肉腫ＲＤ（ATCC CCL-136）が挙げられる。形質移入を、当業者に公知であるカチオン脂質に基づく形質移入方法を用いて行った。その他の形質移入方法が当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーションおよび塩化カルシウム媒介形質移入法 （Graham F.L.and A.J. van der Eb Virology 52:456-67 (1973)）を用いてもよい。形質移入後、形質移入細胞の細胞溶解産物および培養上澄みを評価し、ＩＶ抗原タンパク質の相対的発現レベルを比較した。検体を、市販のポリクロナールモノクロナール抗体（例えば、ニュージャージー州フランダース市のResearch Diagnostics Inc.より入手可能）を用いて、ウェスタンブロット法および 酵素免疫測定法（ELISA）により検査し、発現抗原の質と量を比較した。
【０２３３】
プラスミドＤＮＡの注入
拘束した有意識下のネズミ（インディアナ州インディアナポリス市Harlan Sprague Dawley社から入手した週齢６週間から１２週間のメスのBALB/cネズミ）の大腿四頭筋に、50 μl 溶液に溶解させた１μg から５０ μg のＤＮＡ（ネズミ一匹あたりに投与した１００ μlの溶液総量中に１００ μgのＤＮＡ）を、使い捨てプラスチック製のインシュリンシリンジおよびマイクロピペットの先端を切って作ったプラスチック製のカラーに装着した28G 1/2針（ニュージャージー州フランクリンレークス市にあるBecton-Dickinsonより入手した；カタログ番号329430）を用いて、先に説明したように（Hartikka, J., et al., Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996)）、二側注射した。
【０２３４】
研究中の動物のケアは、「実験動物の使用法およびケアについてのガイドライン」["Guide for the Use and Care of Laboratory Animals"]、動物実験に関連する団体[Institute of Laboratory Animal Resources]、生命科学研究所[Commission on Life Sciences]、国立研究機構[National Research Council]、National Academy Press, Washington, D.C., 1996 およびVICAL社の研究機関の動物ケアおよび使用方法に関する委員会[Vical’s Institutional Animal Care and Use Committee]に準拠して行った。
【０２３５】
（実施例１）
発現ベクターの構築
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、ＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体をコードする天然のコード領域から成るプラスミドを以下のように構築する。ＩＶ(A/PR/8/34)に由来するＮＰ、Ｍ１、およびＭ２遺伝子をウィルスＤＮＡから単離するか、あるいは野生型配列が既知である場合は直接合成により作製するか、あるいは標準方法により作製し、VR10551ベクターに標準制限部位を用いて標準方法で挿入する。
【０２３６】
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合をコードするヒトコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物；またはその他のＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体を単独でまたはＨＢｃＡｇなどのような担体タンパク質との融合タンパク質としてコードするその他のコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物を、以下のように作製する。当該コドン最適化コード領域群は、本明細書で説明している完全、最小限、または均一コドン最適化方法群を用いて、作製する。当該コドン最適化コード領域群は、本明細書で説明している標準ＰＣＲ法を用いて構築するか、あるいは市販のものを注文する。Ｍ２の最初の２３から２４のａａ細胞外領域を表すオリゴヌクレオチドを構築し、それらを上記のＮＰコード領域とのオーバーラップPCR反応に用い、ｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするヒトコドン最適化コード領域（例えば、SEQ ID NOs 6 および7に示しているようなもの）を作製する。該コドン最適化コード領域群を、VR10551ベクターに、標準制限部位を用いて標準方法により、挿入する。
【０２３７】
上記のように構築したプラスミドを、大腸菌を用いて増殖させ、アルカリ溶解方法[alkaline lysis method]により精製する（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2 (1989)）。塩化セシウム水溶液により層化したDNA [CsCl-banded DNA]を、エタノール沈殿し、０．９％の生理食塩水 あるいはＰＢＳで再度懸濁し、注入用の２ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。あるいはまた、プラスミドを、多様な市販のキットを用いるか、あるいは差別化沈殿法およびまたはクロマトグラフ精製に関連した公知の方法に従って、精製する。
【０２３８】
それぞれのプラスミドをDMRIE/DOPEおよび形質移入VM92細胞に組み入れることにより、発現をテストした。上澄みを採取し、タンパク質の生産をウェスタンブロット法あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりテストした。相対的な発現レベルを、野生型とコドン最適化構築物について、比較する。
【０２３９】
上記の方法に従って作製した構築物の例を、表１３に一覧表示する。一覧表示した構築物を作製した実験手続きを、本明細書で説明した使用した特殊なパラメータおよび材料と共に、上記に記載した。
【表１３】
2008505660.tif 000064
【０２４０】
インフルエンザＮＰをコードするｐＤＮＡ発現ベクターVR4700 が、当該技術分野で説明されている（例えば、Sankar, V., Baccaglilni, L., Sawddey, M., Wheeler, C. J., Pillemer, S. R., Baum, B. J. and Atkinson, J. C., "Salivary Gland Delivery of pDNA-Cationic Lipolplexes Elicits Systemic Immune Responses," Oral Diseases 8:275-281 (2002)を参照せよ）。下記は、ＴＰＡ−ＮＰ（VR4700由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:46として言及されている：
【化４１】
2008505660.tif 000065
【０２４１】
精製VR4700 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。ウェスタンブロット分析により、ネズミポリクロナール抗ＮＰ抗体につき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける非常に低いレベルのVR4700の発現が示された。Ｉｎ  ｖｉｖｏの抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより、平均力価 が62,578であることがわかった。
【０２４２】
プラスミドVR4707は、分泌形態のＭ２（すなわち、ＴＰＡ−Ｍ２）を発現する。オリゴが相互にアニールされている合成オリゴヌクレオチドを使って、配列をアセンブルし、その後、ライゲーションし、ゲル精製した。次に、精製製品をVR10551のEco RI/Sal Iにライゲーション(クローニング)した。Ｍ２配列は、膜貫通ドメインを欠いている；クローニングした配列は、アミノ酸を含んでいる[TPA(1-23)]ARGSG[M2(1-25)]GGG[M2(44-97)]。ＴＰＡ とＭ２との間の、またＭ２ドメイン群間のアミノ酸残基を、フレキシブルリンカーとして加えた。以下の突然変異を、適切なＴ−細胞エピトープを誘導するために導入した：74S->G and 78S->N 。以下はTPA-M2ΔTM （VR4707由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:47として言及されている：
【化４２】
2008505660.tif 000066
【０２４３】
精製VR4707 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２タンパク質の発現を決定した。Ｍ２タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。Ｉｎ  ｖｉｖｏのVR4707に対するＭ２抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより測定したところ、平均力価 が１１０であることがわかった。これは、セグメント７由来の全長Ｍ２をコードするVR4756の平均力価９，２４０より、低い。Ｍ２に特異なＴ−細胞をIFNγ ELISPOTアッセイで測定したところ、平均細胞数61 SFU/106に対し、セグメント７構築物については平均細胞数121 SFU/106という結果であった。
【０２４４】
VR4710を、ＴＰＡリーダーおよびVR4707由来のM2の最初の24個のアミノ酸をVR4700由来の全長NP遺伝子に融合することにより作製した。プライマー5'-GCCGAATCCATGGATGCAATGAAG-3'  (SEQ ID NO:48) およびプライマー5'-GGTGCCTTGGGACGCCATATCACTTGAATCGTTGCA-3' (SEQ ID NO:49) を使って、VR4707由来のTPA-M2断片を増幅した。プライマー 5'-TGCAACGATTCAAGTGATATGGCGTCCCAAGGCACC-3' (SEQ ID NO:50) およびプライマー5'-GCCGTCGACTTAATTGTCGTACTC-3' (SEQ ID NO:51) を使って、VR4700由来のＮＰ遺伝子を増幅した。その後、Ｎ末端およびＣ末端を使って、融合をアセンブルし、ｅＭ２ＮＰ融合をEcoRI-SalI 断片としてVR10551 にクローニングした。以下はTPA-M2-NP （VR4710由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:52として言及されている：
【化４３】
2008505660.tif 000067
【０２４５】
精製VR4710 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ネズミにｐＤＮＡを二度注入した後に行ったＥＬＩＳＡアッセイにより、抗Ｍ２抗体応答はほとんどなかったが抗ＮＰ抗体の平均力価は６６，５６０であるということがわかった。
【０２４６】
VR4750は、以下の手順で作製した。まず、ネズミ適応A/Hong Kong/1/68 ウィルスストックに由来するＲＮＡを、無作為のヘキサマーを用いて、逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、プライマー5' GGGCTAGCGCCGCCACCATGAAGACCATCATTGCT  3' (SEQ ID NO:53) およびプライマー5' CCGTCGACTCAAATGCAAATGTTGCA 3' (SEQ ID NO:54) を使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＨＡ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、Invitrogen 社製TOPO-TA ベクターにまず挿入し、その後、制限酵素のNheI およびSalI を用いて、VR10551にサブクローニングした。以下は、ネズミ適応A/Hong Kong/68（VR4750由来）由来のHA (H3N2)のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:55として言及されている：
【化４４】
2008505660.tif 000068
【０２４７】
VR4750発現は、ウェスタンブロットアッセイによると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは明確に検知されなかったが、１００μg のVR4750を二度接種した場合に、ネズミ適応A/Hong Kong/68ウィルスによる鼻腔内の攻撃からネズミを保護することがわかった。
【０２４８】
VR4752は、以下の手順で作製した。まず、ネズミ適応A/Puerto Rico/8/34ウィルスストックに由来するＲＮＡを、無作為のヘキサマーを用いて、逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、プライマー5' GGGCTAGCGCCGCCACCATGAAGGCAAACCTACTG 3' (SEQ ID NO:56) およびプライマー5' CCGTCGACTCAGATGCATATTCTGCA 3' (SEQ ID NO:57) を使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＨＡ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、TOPO-TA ベクターにまず挿入し、その後、制限酵素のNheI およびSalI を用いて、VR10551にサブクローニングした。以下は、ネズミ適応A/Puerto Rico/34（VR4752由来）由来のHA (H1N1)のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:58として言及されている：
【化４５】
2008505660.tif 000069
【０２４９】
精製VR4752 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、HAタンパク質の発現を決定した。HAタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ａ型インフルエンザ(H1N1)抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２５０】
Ｍ２遺伝子のＭ１遺伝子への直接融合を、「万能」最適化戦略を用いて、実施例４で説明している方法に由来するコドン最適化配列に基づき、合成した。合成した遺伝子をpUC119ベクターに組み込み、その後、EcoRI-SalI 断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ２Ｍ１融合タンパク質（VR4755由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:59として言及されている：
【化４６】
2008505660.tif 000070
【０２５１】
精製VR4755 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２Ｍ１融合タンパク質の発現を決定した。Ｍ２Ｍ１融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ１および抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、Ｍ２Ｍ１融合の発現を可視化した。
【０２５２】
Ａ型インフルエンザのセグメント７ＲＮＡは、Ｍ１遺伝子およびＭ２遺伝子の双方をコードする。Ｍ１遺伝子およびＭ２遺伝子のに対するコンセンサスアミノ酸配列を、本明細書で説明している方法により、引き出した。しかしながら、これら双方のタンパク質に対するコンセンサス配列は、ＩＶ 菌株 A/Niigata/137/96に由来するＭ１アミノ酸配列およびＭ２アミノ酸配列と同一であり、それらのコンセンサス配列は、本明細書ではそれぞれSEQ ID NO:77 および SEQ ID NO:78として言及されている。それに応じて、A/Niigata/137/96のセグメント７に対する天然配列を合成し、pUC119における挿入片として組み入れた。以下は、セグメント７（VR4756由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:60として言及されている：
【化４７】
2008505660.tif 000071
【０２５３】
SEQ ID NO:77 （「コンセンサス」 (A/Niigata/137/96) M1）：
【化４８】
2008505660.tif 000072
【０２５４】
SEQ ID NO:78 （「コンセンサス」 (A/Niigata/137/96) M2）:
【化４９】
2008505660.tif 000073
【０２５５】
精製VR4756 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、セグメント７によりコードされるタンパク質の発現を決定した。Ｍ２およびＭ１の発現は、市販の抗Ｍ１および抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、ウェスタンブロットアッセイで確認した。ネズミにｐＤＮＡを二度注入した後に行ったＥＬＩＳＡアッセイにより、抗Ｍ２抗体の平均力価が９，２４０に対し、VR4707の平均力価が１１０であるということがわかった。Ｍ２に特異なＴ−細胞をIFNγ ELISPOTアッセイで測定したところ、VR4756を注入したネズミについては平均細胞数121 SFU/106であったのに対し、VR4707構築物については平均細胞数61 SFU/106という結果であった。
【０２５６】
セグメント７配列をもうひとつ作製した。それは、VR4763であり、この配列はセグメント７の選択的にコドン最適化した領域を含んでいる。セグメント７におけるコード領域の最適化は選択的である。その理由は、セグメント７は2個の重複するコード領域（すなわち、Ｍ１とＭ２）を含んでおり、これらのコード領域は部分的に異なったリーディングフレーム内にあるからである。セグメント７のヌクレオチド１から３によりコードされるＡＵＧから、Ｍ１がセグメント７のＲＮＡの ｂｐ１ から７５９によりコードされているのに対し、Ｍ２はスプライスされたメッセンジャーＲＮＡによりコードされており、このスプライスされたメッセンジャーＲＮＡはセグメント７のヌクレオチド１から２６を含み、これらのヌクレオチドはセグメント７のヌクレオチド７１５から９８２にスプライスされている。７１５から７５９の領域の最適化を避ける。その理由は、Ｍ１およびＭ２のコード配列（異なったリーディングフレームにある）がその領域では重複しているからである。セグメント７配列のｂｐ７１５でｂｐ２６を代替フレームに加えるために行うスプライシングのため、これらのスプライシング領域における最適化を避ける。また、おそらく間違いなくスプライシングに関与すると思われる隣接領域も同様に避ける。最適化は、新しいスプライシング部位を不注意に導入することのないように行う。これらの最適化する領域は、「万能」戦略（すなわち、最も使用頻度の高いコドンをそれぞれのアミノ酸に挿入すること）を用いて行う。以下は、コドン最適化セグメント７（VR4763由来）のヌクレオチド配列であり、本明細書ではSEQ ID NO:61として言及されている：
【化５０】
2008505660.tif 000074
【０２５７】
Ｍ１のコドン最適化コード領域は、SEQ ID NO:61のヌクレオチド１からヌクレオチド７５９まで伸びており、終止コドンを含み、本明細書ではSEQ ID NO:79として表されている。Ｍ２のコドン最適化コード領域は、SEQ ID NO:61のヌクレオチド１からヌクレオチド２６まで伸びており（この領域はSEQ ID NO:61のヌクレオチド７１５からヌクレオチド９５９までの領域にスプライスされている）、終止コドンを含み、本明細書ではSEQ ID NO:80として表されている。
【０２５８】
最適化されたＭ１コード領域 (SEQ ID NO:79)：
【化５１】
2008505660.tif 000075
【０２５９】
最適化されたＭ２コード領域(SEQ ID NO:80)：
【化５２】
2008505660.tif 000076
【０２６０】
eM2-NP 融合タンパク質をコドン最適化し、pUC119 に挿入し、さらにEcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、eM2-NP（契約によりコドン最適化されたもの）（VR4757由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:62として言及されている：
【化５３】
2008505660.tif 000077
【０２６１】
精製VR4757 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ＥＬＩＳＡにより検査したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗ＮＰ抗体応答の平均力価は５１，２００であるということがわかった。
【０２６２】
VR4758 におけるeM2-NP融合遺伝子を、コドン最適化し、合成した。当該遺伝子を、pUC119に挿入し、EcoRI-SalI 断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、eM2-NP（出願人によりコドン最適化されたもの）（VR4758由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO: 63として言及されている：
【化５４】
2008505660.tif 000078
【０２６３】
精製VR4758 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ＥＬＩＳＡにより検査したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗ＮＰ抗体応答の平均力価は４８，６４０であるということがわかった。
【０２６４】
Ｍ２遺伝子を、VR4755から、プライマー5'- GCCGAATTCGCCACCATGAGCCTGCTGACC-3' (SEQ ID NO:64) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCACTCCAGCTCGATGCTCAC-3' (SEQ ID NO:65)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ２（VR4759由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:66として言及されている：
【化５５】
2008505660.tif 000079
【０２６５】
精製VR4759 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２タンパク質の発現を決定した。Ｍ２タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２６６】
Ｍ１遺伝子を、VR4755から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGTCCCTGCTGACAGAAGTG-3' (SEQ ID NO:67) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCACTTGAATCTCTGCATC-3' (SEQ ID NO:68)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ１（VR4760由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:69として言及されている：
【化５６】
2008505660.tif 000080
【０２６７】
精製VR4760 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ１タンパク質の発現を決定した。Ｍ１タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ１モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２６８】
ＮＰ遺伝子を、VR4757から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGGCCTCCCAGGGAACCAAAAG-3' (SEQ ID NO:70) および プライマー5'-GCCGTCGACTGATCAATTGTCGTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:71)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、ＮＰ（契約によりコドン最適化されたもの）（VR4761由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:72として言及されている：
【化５７】
2008505660.tif 000081
【０２６９】
精製VR4761 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。VR4761のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、VR4700に比べ著しく高く、VR4762に匹敵するものであった。
【０２７０】
ＮＰ遺伝子を、VR4758から、プライマー 5'-GCCGAATTCGCCACCATGGCCAGCCAGGGCACCAAG-3' (SEQ ID NO:73) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCAGTTGTCGTACTCC-3' (SEQ ID NO:74)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、ＮＰ（出願人によりコドン最適化されたもの）（VR4762由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:75として言及されている：
【化５８】
2008505660.tif 000082
【０２７１】
精製VR4762 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。VR4762のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、VR4700に比べ著しく高く、VR4761に匹敵するものであった。
【０２７２】
単一のＩＶタンパク質をコードするプラスミドに加えて、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域を含む単一プラスミド群を、標準方法に従って構築する。例えば、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域が単一転写として真核細胞に転写されている多シストロン性構築物を、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）配列を用いて多様なコード領域を単離することにより、構築することができる。あるいはまた、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域を、それぞれがそれ自身のプロモータ配列を有する単一プラスミドに挿入してもよい。
【０２７３】
（実施例２）
組み換えＮＰＤＮＡおよびタンパク質の調製 
組み換えＮＰＤＮＡおよびタンパク質を、以下の手順を用いて調製する。真核細胞を使って、形質移入した発現プラスミドからＮＰタンパク質を発現させる。あるいはまた、Sf9、Sf21、あるいはD.Mel-2 細胞を含むがそれらに限定されない昆虫細胞を、ＮＰタンパク質を発現する能力のある組み換えバキュロウイルスに感染させるバキュロウイルスシステムを使ってもよい。すでにバキュロウイルスに感染した組み換えＮＰをコードする細胞、あるいは発現プラスミドを含む組み換えＮＰをコードする細胞を、それらが増殖しているフラスコの底を叩くかまたはこそげることにより採取する。感染後24時間から４８時間の細胞は、フラスコからはがれにくく溶解する可能性もあるので、そのような細胞の除去には注意が必要である。次に、細胞が入っていたフラスコをＰＢＳで洗浄し、細胞を２５０ｍＬのコニカル試験管に移す。試験管をＪ−６遠心機（３００  ｘｇ）により１０００ｒｐｍで約5分から10分回転させる。細胞ペレットを、ＰＢＳで2度洗浄し、約１０ｍＬから２０ｍＬのＰＢＳで再度懸濁させ、数を数える。細胞を、ＲＳＢ(10mM Tris pH=7.5、1.5mM MgCl2、10mM KCl)中で、2x107 細胞個/mlの濃度で、最後にもう一度懸濁させる。
【０２７４】
約106個の細胞を、標準SDS-PAGEミニタンパク質ゲル法のレーン毎に使う。これは、ゲル分析用の全細胞分画と同等である。１０％ＮＰ４０を細胞に加え、最終濃度を０．５％にする。細胞とＮＰ４０との混合物を、ボルテックスミキサーにかけ、時折ボルテックスミキサーにかけながら氷上に１０分間置く。氷上培養後、細胞をＪ−６遠心機（６００  ｘｇ）により１５００ｒｐｍで１０分回転させる。上澄み（細胞質分画）を取る＊２３。残存ペレット（核を含んでいる）を、緩衝液Ｃ(20 mM HEPES pH = 7.9、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mM PMSF、0.5 mM DTT)を用いて二度洗浄し、細胞質タンパク質を取り除く。緩衝液Ｃを用いて、核が１ｍｌあたり5x107 個含まれている濃度に、核を懸濁する。核をボルテックスミキサーで粒子がばらばらになるように激しく混練し、分割量をミニタンパク質ゲル用に取り除く（核分画）。
【０２７５】
残存核に、5M NaCl の４分の１の量を加え、得られた混合物を超音波処理する（浴槽型超音波処理器使用、最大出力、超音波処理時間５分間、温度４°C、バースト時間1分から2分、バースト間休止時間３０秒）。超音波処理を施した混合物を、４°Cで攪拌し、１２０００ｘｇで約１０分間回転させる。核の数で約106個に相当するタンパク質ミニゲル用の検体を取り出す。ゲル検体を遠心単離し、上澄みは核抽出物であり、ペレットはゲル分析用核ペレットである。
【０２７６】
ゲル分析を行うには、少量の（約106個の核に相当する量）核ペレットをゲル検体緩衝液に直接懸濁し、同量の全細胞、細胞質、核、核抽出物および核ペレットを用いて分析を行う。上記の方法により、比較的粗質のＮＰが得られる。純度の高いＮＰを採取するには、5M NaCl の代わりに2.1M NaCl を、核ペレットに加える。これにより、塩含有量が0.42M NaCl になる。そうすると、上澄み液に含まれている総ＮＰと核タンパク質の率が、６０％から７０％になる。得られたペレットを、次に、1M NaCl を用いて抽出し、上記のように遠心単離する。得られた上澄み液は、総ＮＰを９５％の純度で含んでいる。
【０２７７】
（実施例３）
ＮＰ、Ｍ１およびＭ２のコンセンサスアミノ酸配列
１９９０年以降シーケンスされたインフルエンザ菌株に由来するアミノ酸配列を分析することにより、インフルエンザＮＰ、Ｍ１およびＭ２抗原に対するコンセンサスアミノ酸配列を得た。
【０２７８】
ＮＰコンセンサスアミノ酸配列
インフルエンザＮＰ（Ａ菌株）に対するアミノ酸配列を選択する方法を以下に記す。各セグメントにつきインフルエンザ配列情報を記載しているデータベース（ＵＲＬ：http://www.flu.lanl.gov）で、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、ＮＰ、アミノ酸を検索した。検索結果には、約４００個の配列があり、その大部分は単なる部分列であった。得られた配列を、約８５個の全長配列に絞った。同一菌株の異なったパッセージが見つかった場合は、最も初期のパッセージを選択した。得られた配列をさらに、１９９０年から２０００年に単離された２８個の全長ＮＰ配列に絞った（２００１年から２００３年の期間には全長配列は単離されなかった）。同年に単離された他の配列と同じである5個の配列をさらに除外した。これは、単離年が同じでアミノ酸配列が同じである配列は、同じウィルス菌株である可能性が高いという仮定に基づいて行った（二重に加重価値を与えことを避けるため）。同じ年に由来していてもアミノ酸配列が異なっていれば、双方の配列を含めた。
【０２７９】
配列を、A/PR/8/34菌株にアラインし、新しいものから古いものの順に並べ、コンセンサス配列を多数派のアミノ酸を用いて決定した(図１２)。A/PR/8/34 とコンセンサス配列との間に、３２のアミノ酸変化があり、これらのアミノ酸変化がすべて2個の２０００年に単離されたＮＰ配列にも存在している。もうひとつのアミノ酸についていえば、(aa 275)15/23がE (A/PR/34において) からG/D あるいはV （7G、7D、1V）へ変化していた。これらの2個の２０００年に単離されたＮＰ配列は双方とも、この部位にＧを有しているので、Ｇを選択した。変化は、全部で３３アミノ酸であり、これはA/PR/8/34 菌株と比較して約７％異なっていることになる。
【０２８０】
優勢Balb/c エピトープTYQRTRALV は、依然として新しいコンセンサスに維持されている。その他の理論的ヒトエピトープに起こった変化が、また決定されていないのである。
【０２８１】
過去８年間インフルエンザワクチンとして（米国で）使用されたＡ菌株は、以下の通りである（これらの菌株のＮＰ遺伝子についての全長配列は入手不能である）：
a.  2002-2003 A/Moscow/10/99, A/New Caledonia/20/99
b.  2001-2002 A/Moscow/10/99, A/New Caledonia/20/99
c.  2000-2001 A/Panama/2007/99, A/New Caledonia/20/99
d.  1999-2000 A/Sydney/05/97, A/Beijing/262/95
e.  1998-1999 A/Sydney/05/97, A/Beijing/262/95
f.  1997-1998 A/Nanchang/933/95, A/Johannesburg/82/96
g.  1996-1997 A/Nanchang/933/95, A/Texas/36/91
h.  1995-1996 A/Johannesburg/33/94, A/Texas/36/91
【０２８２】
この方法を用いて得た最終ＮＰコンセンサスアミノ酸配列を、本明細書ではSEQ ID NO:76と呼ぶ：：
【化５９】
2008505660.tif 000083
【０２８３】
Ｍ１およびＭ２コンセンサスアミノ酸配列
Ｍ１およびＭ２のコンセンサス配列を、以下に示した類似した方法で決定した。http://www.flu.lanl.gov/のウェブサイトで使用した検索パラメータは、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、セグメント７、ヌクレオチド（Ｍ１およびＭ２の双方がセグメント７に由来する）であった。１９９０年から１９９９年の期間から、全長配列を選択した（２０００年以降の配列は入手不能であった）。同じ年および同じ都市から出た配列群については、最も時期の早いもののみを使用した。同じ年から出た記載事項については、同年に単離された他の配列と同じである配列を除外した(異なった都市から出たものであっても)。２１つの配列（１９９３年から１９９９年の期間から出たＭ１およびＭ２のの全長配列）を比較した。各部位において、多い方のアミノ酸を使用した。
【０２８４】
Ｍ１アミノ酸コンセンサス配列を、本明細書ではSEQ ID NO:77と呼ぶ：
【化６０】
2008505660.tif 000084
【０２８５】
Ｍ２アミノ酸コンセンサス配列を、本明細書ではSEQ ID NO:78と呼ぶ：
【化６１】
2008505660.tif 000085
【０２８６】
（実施例４）
コドン最適化アルゴリズム
以下に、インフルエンザ抗原のヒトコドン最適化配列を得るためのアルゴリズムの概要を示す。
【０２８７】
逆翻訳
アミノ酸配列からスタートし、（ａ）http://www.kazusa.or.jp/codon/のウェブサイトにあるヒトコドン使用頻度表を用いて手動で逆翻訳する。
【０２８８】
ホモサピエンス [gbpri]： 55194 CDS's (24298072 コドン) 
【０２８９】
フィールド： [トリプレット] [使用頻度: １０００当たり] ([数]) 
【化６２】
2008505660.tif 000086
【０２９０】
あるいは (b) www.syntheticgenes.comのウェブサイトのログオンし、以下に示した逆翻訳ツールを使用する：
【０２９１】
(1) 「Protein (タンパク質)」のタブの下に、アミノ酸配列を貼り付けする；
【０２９２】
(2) 「Download codon usage（コドン使用頻度をダウンロードする）」のタブの下に、「homo sapiens（ホモサピエンス）」をハイライトし、「CUT」を ダウンロードする。
【化６３】
2008505660.tif 000087
【０２９３】
(3) 「Apply （適用）」ボタンをクリックする。
【０２９４】
(4) 「Optimize （最適化する）」のタブの下で、「General （一般）」のタブを開ける。
【０２９５】
(5) 「use only most frequent codon （最も使用頻度の高いコドンのみを使用する）」のボックスにチェックマークを付ける。
【０２９６】
(6) 「Apply （適用）」ボタンをクリックする。
【０２９７】
(7) 「Optimize （最適化する）」のタブの下で、「Motif （モチーフ）」のタブを開ける。
【０２９８】
(8) 望ましいクローニング制限部位を悪いモチーフにロードする；望ましくない配列｛例えば、プリブノーボックス配列(TATAA)、カイ 配列 (GCTGGCGG)、または制限部位｝を悪いモチーフにロードする。
【０２９９】
(9) 「Output （出力）」タブ下で、「Start （開始）」ボックスをクリックする。出力には、配列、モチーフ検索結果（「Report（レポート）」タブ下）、およびコドン使用頻度レポートが含まれている。
【０３００】
当該プログラムは、システインプロリンまたはアルギニンのようなアミノ酸については、最も使用頻度の高いコドンを常に使用するとは限らなかった。これを変えるためには、「Edit CUT（CUTを編集する）」 のタブへ戻り、対象コドンに関する虹色のバーを手動で１００％になるまでドラッグする。その後、「Output （出力）」タブ下で、「Start （開始）」をやり直す。
【０３０１】
アルギニンについてCGG を使用すると、GCの含有量が非常に高くなるので、アルギニンについてはAGA を代替として使うことができる。コドン使用頻度における差異は、CGG が１０００あたり１１．６であるのに対し、AGA は１０００あたり１１．５である。
【０３０２】
スプライスドナー およびアクセプター部位の検索
(1) Berkeley Drosophila Genome Project ウェブサイトにログオンする（ＵＲＬ：http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html\）＊。
【０３０３】
(2) 「Human or other （ヒトあるいはその他の生物）」および「both splice sites （双方のスプライス部位」のボックスにチェックマークを付ける。
【０３０４】
(3) ５’ および ３’ スプライス部位に対する最小限のスコア（０から１まで）を選択する。
０．４のディフォルト設定を使用した場合：
ディフォルト最小限スコアが０．４である場合：
%認識された        %偽陽性
スプライス部位
ヒト 5’ スプライス部位        93.2%          5.2%
ヒト 3’ スプライス部位        83.8%          3.1%
【０３０５】
(4) 配列を貼り付ける。
【０３０６】
(5) 「Submit（提出する）」をクリックする。
【０３０７】
(6) 予測ドナーあるいはアクセプターに基づき、当該部位がそれ以上予測されなくなるまで個々のコドンを変える。
【０３０８】
5' および 3' 配列を加える
遺伝子配列の5'末端上に、制限酵素部位およびコザック配列(gccacc)をATG の前に加えた。配列の3'末端上の終止コドン（反対の鎖上のtga）の後に続く制限酵素部位の後に、tca を加えた。GC の含有量およびオープンリーディングフレームを、SEC Central を用いて調べた。
【０３０９】
（実施例５）
ワクチン製剤の調製
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、ポロキサマーCRL 1005 およびBAK （５０％塩化ベンザルコニウム液、Ruger Chemical Co. Inc.より入手可能）を用いて、以下の方法により、調製する。製剤のそれぞれの構成要素の特定な最終濃度を以下に示す方法群に説明するが、これらの方法群について、構成要素の濃度は、当業者に公知の基本的な化学量論的計算に基づき、望ましい濃度を得る目的で、異なっていてもよい。
【０３１０】
例えば、CRL 1005の濃度は、例えば、形質移入効率、発現効率、あるいは免疫原性などの要因により、約1 mg/ml から約 75 mg/mlの範囲に調整する。CRL 1005の濃度の例には、以下がある：約 1 mg/ml、約 2 mg/ml, 約 3 mg/ml、約 4 mg/ml、約 5 mg/ml、約6.5 mg/ml、約 7 mg/ml、約 7.5 mg/ml、約 8 mg/ml、約 9 mg/ml、約 10 mg/ml、約 15 mg/ml、約 20 mg/ml、約 25 mg/ml、約 30 mg/ml、約 35 mg/ml、約 40 mg/ml、約 45 mg/ml、約 50 mg/ml、約 55 mg/ml、約 60 mg/ml、約 65 mg/ml、約 70 mg/ml、or 約 75 mg/ml。
【０３１１】
同様に、ＤＮＡの濃度を、多くの要因により、調整する。その要因には、投与する製剤の量、被験体の年齢と体重、投与方法および投与経路、および投与する抗原の免疫原性が含まれる。一般的に、本発明の製剤は、最終プラスミド（あるいはその他のポリヌクレオチド）濃度が約 1 ng/ml から 約30 mg/mlの範囲になるように調整する。例えば、本発明の製剤は、以下の最終プラスミド濃度を有してよい：約 1 ng/ml、約 5 ng/ml、約10 ng/ml、約 50 ng/ml、約 100 ng/ml、約 500 ng/ml、約 1 μg/ml、約 5 μg/ml、約 10 μg/ml、約 50 μg/ml、約 200 μg/ml、約 400 μg/ml、約 600 μg/ml、約 800 μg/ml、約 1 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2.5、約 3 mg/ml、約 3.5、約 4 mg/ml、約 4.5、約 5 mg/ml、約 5.5 mg/ml、約 6 mg/ml、約 7 mg/ml、約 8 mg/ml、約 9 mg/ml、約10 mg/ml、約 20 mg/ml、あるいは約 30 mg mg/ml。
【０３１２】
本発明のある製剤には、本発明のプラスミドのカクテル（上記実施例２を参照せよ）が含まれ、そのようなプラスミド例には、ＩＶタンパク質ＮＰ，Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコード領域から成るプラスミド、および任意に免疫を高めるタンパク質（サイトカイン）をコードするプラスミドがある。カクテルにおいて望ましい多様なプラスミドは、その他の材料に当該プラスミドを加える前に、ＰＢＳあるいはその他の希釈剤と混合する。さらに、プラスミドは、カクテルにおいて均等な割合で存在してよく、あるいは比率は抗原の相対的発現レベルあるいはコードされた抗原の相対的免疫原性に基づいて調整してよい。従って、カクテルにおける多様なプラスミドは、均等な割合で存在してよいし、あるいはまた、カクテル内のその他のプラスミドと比較して、1種類のプラスミドが最高で２倍から３倍の割合で含まれていてもよい。
【０３１３】
さらに、ＢＡＫの濃度を、例えば、望ましい粒子サイズを得るため、また安定性を向上させるために、調整してよい。実際に、ある実施の形態では、本発明の製剤は、CRL 1005 およびDNA を含んでいるが、ＢＡＫを含んでいない。一般的に、本発明のＢＡＫ含有製剤は、ＢＡＫの最終濃度が約０．０５ｍＭから約０．５ｍＭの範囲になるように調整してある。例えば、本発明のＢＡＫ含有製剤は、ＢＡＫの最終濃度が、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭあるいは約０．５ｍＭであってよい。
【０３１４】
下記に示す方法群により生産する製剤の総量は、比例サイズの装置を選択することにより、減じても増やしてもよい。最後に、下記に示す方法群を実施する場合に、製剤の３つの構成要素、すなわち、BAK、CRL 1005、および プラスミド DNAは、いかなる順序で加えてもよい。下記に示す方法群のそれぞれにおいて、「クラウドポイント」という語は、温度シフトあるいはその他の滴定におけるポイントを意味しており、このポイントにおいては、澄明な溶液が濁る、すなわち、溶液に溶解している構成要素が沈殿し始める。
【０３１５】
予備混合製剤のサーマルサイクル 
この例は、０．３ｍＭの BAK、７．５ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が３．６ｍLである製剤の調製について説明している。これらの材料を、図２にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後製剤に室温で（クラウドポイント以上の温度）サーマルサイクル処理を数回施す。
【０３１６】
ＢＡＫの１．２８ｍＭ溶液をＰＢＳを用いて調製し、得られた溶液８４６μｌを磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れ、さらに氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１０分間攪拌する。この後、１００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使って、CRL 1005 （２７μｌ）を加え、氷上にて当該溶液をさらに60分間攪拌する。本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が６．４ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、５ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、攪拌中の溶液に加える。この時点（氷上にある）の溶液は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて１５分間攪拌する。その後、氷水槽を取り除き、周囲温度にて１５分間攪拌し、ポロキサマーのクラウドポイントを超え、混濁溶液にする。
【０３１７】
当該フラスコを氷水槽に戻し、さらに１５分間攪拌し、混合物をポロキサマーのクラウドポイント以下に冷却し、澄明溶液にする。氷水槽を再度取り除き、当該溶液をさらに周囲温度にて１５分間攪拌する。クラウドポイント以上およびクラウドポイント以下の温度で１５分間づつ（合計３０分間）攪拌することを、１回のサーマルサイクルと定義する。当該混合物をさらに６回のサーマルサイクルで処理する。得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに入れ、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３１８】
濃い濃度のCRL 1005を用いた予備混合製剤のサーマルサイクル、希釈、およびろ過
この例は、０．３ｍＭの BAK、３４ｍｇ／ｍｌあるいは５０ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が４．０ｍLである製剤の調製について説明している。これらの材料を、図３にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後製剤に室温で（クラウドポイント以上の温度）サーマルサイクル処理を数回施し、希釈し、ろ過する。
【０３１９】
本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が６．４ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れる。CRL 1005を50 mg/mlの濃度で含んだ製剤については、ＮＰコードプラスミドを約3.2 mg/ml の濃度で含みさらにＭ２コードプラスミドを約3.2 mg/ml の濃度で（総ＤＮＡ濃度6.4 mg/ml）を含んだ溶液３．１３ｍｌを、磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れる。これらの溶液（プラスミドカクテルとCRL 1005製剤）を、氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１０分間攪拌する。次に、２００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使ってCRL 1005（最終濃度を３４ｍｇ／ｍｌにするには、１３６μｌ；最終濃度を５０ｍｇ／ｍｌにするには、２００μｌ）を加え、得られた溶液をさらに氷上にて３０分間攪拌する。１．６ｍＭおよび１．８ｍＭのＢＡＫをＰＢＳを用いてそれぞれ調製し、次に、１．６ｍＭ溶液を７３４μｌ、１．８ｍＭを６７０μｌ、１ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、それぞれ攪拌中のポロキサマー溶液群（混合物濃度は３４ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌ）に加える。この時点の溶液群は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて３０分間攪拌する。その後、氷水槽を取り除き、周囲温度にて１５分間攪拌し、ポロキサマーのクラウドポイントを超え、混濁溶液にする。
【０３２０】
当該フラスコ群を氷水槽に戻し、さらに１５分間攪拌し、混合物をポロキサマーのクラウドポイント以下に冷却し、澄明溶液にする。氷水槽を再度取り除き、当該溶液群をさらに１５分間攪拌する。クラウドポイント以上およびクラウドポイント以下の温度で１５分間ずつ（合計３０分間）攪拌することを、１回のサーマルサイクルと定義する。当該混合物をさらに２回のサーマルサイクルで処理する。
【０３２１】
この間に、2個の５０ｍｌ使い捨て真空ろ過器Steriflip（登録商標）を、それぞれ０．２２μｍMillipore Express（登録商標） 濾膜（Millipore社より入手可能；cat # SCGP00525）を装着した状態で、真空ラインを接続した状態の氷水槽に入れ、ろ過器の温度が氷の温度と同じになるまで1時間放置する。次に、当該ポロキサマー製剤群を、ＰＢＳでＤＮＡ濃度が2.5 mg/ml になるまで希釈し、真空下でろ過する。
【０３２２】
得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに移し、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３２３】
サーマルサイクルを含まない簡易方法
この例は、０．３ｍＭの BAK、７．５ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が２．０ｍLである製剤の簡易調製について説明している。これらの材料を、図４にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後ろ過処理のみを施し、その後使用するかあるいは保存する。
【０３２４】
ＢＡＫの０．７７ｍＭ溶液をＰＢＳを用いて調製し、得られた溶液７８０μｌを磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れ、さらに氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１５分間攪拌する。この後、１００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使って、CRL 1005 （１５μｌ）を加え、当該溶液をさらに60分間攪拌する。本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が８．３ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、５ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、攪拌中の溶液に加える。この時点（氷上にある）の溶液は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて１５分間攪拌する。
【０３２５】
この間に、１つの５０ｍｌ使い捨て真空ろ過器Steriflip（登録商標）を、それぞれ０．２２μｍMillipore Express（登録商標） 濾膜（Millipore社より入手可能；cat # SCGP00525）を装着した状態で、真空ラインを接続した状態の氷水槽に入れ、ろ過器の温度が氷の温度と同じになるまで1時間放置する＊２５。次に、当該ポロキサマー製剤を、クラウドポイント以下の温度で真空下でろ過し、その後クラウドポイント以上の温度に暖める。得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに移し、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３２６】
（実施例６）
動物への予防接種
本明細書で説明しているコドン最適化ポリヌクレオチドによりコードされる多様なＩＶ発現製品の免疫原性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答をはめ込むそれぞれのプラスミドの能力に基づいて、まず評価する＊２６。プラスミドを、単一構築物としてあるいはマルチ構築物として、個別にあるいは組み合わせでテストする。予防接種を、まず、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ヒト以外の霊長目、あるいはその他の適切な動物などの動物で、筋肉内注射（ＩＭ）により行う。標準プロトコルに従って、予防接種を施した動物から血清を採取し、タンパク質−予防接種を施した被験体の抗体−抗種抗体型のアッセイの精製固定化抗原タンパク質を用いて、抗原に特異的な抗体応答をＥＬＩＳＡアッセイにより定量する。免疫原性のテストには、さらに抗体力価の測定、抗体力価の中性化、Ｔ−細胞の増殖、Ｔ−細胞のサイトカイン分泌、細胞溶解性のＴ−細胞性応答、および抗原特異性のCD4+ および CD8+Ｔ−細胞を直接列挙することが含まれる。ヒトにおける免疫応答と保護レベルとの相関関係を、当業者に公知の方法により明らかにした（上記を参照せよ）＊２７。
【０３２７】
A.  ＤＮＡ製剤
プラスミドＤＮＡを、実施例３で説明した方法群のうち任意の方法によるポロキサマーを用いて調製する。あるいはまた、プラスミドＤＮＡを、上記で説明したように調製し、ＰＢＳを用いて約０．１ｍｇ／ｍｌから 約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度に（好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ）、溶解し、この場合形質移入促進剤のカチオン脂質（例えば、DMRIE/DOPE）は加えても加えなくてもよい（加える場合の質量比はＤＮＡ対脂質４：１である）。代替のＤＮＡ製剤は、以下を含む：ＰＢＳの代わりに１５０ｍMのリン酸ナトリウム、アジュバント（例えば、VaxfectinTMで、ＤＮＡ対VaxfectinTMの質量比は４：１である）、２％オイル（スクワレン）−Tween 80−水 ｛ＭＰＬ＋ＴＤＭ、ミズーリ州セントルイス市のSigma/Aldrich 社より入手可能、(カタログ番号  M6536)｝に溶解してS. minnesotaモノリン酸リピドA（MPL）[mono-phosphoryl lipid A]（解毒したエンドトキシン）およびトレハロースジミコレート[trehalosedicorynomycolate]ＡＦ（ＴＤＭ）、溶解モノリン酸リピドA（MPL）[mono-phosphoryl lipid A]製剤（ＡＦ、Corixa より入手可能）、あるいは(±)-N-(3-アセトキシプロピル)-N、N-ジメチル-2、3-ビス(オクチルオキシ)-1-プロパンアミニウムクロライド[(±)-N-(3-Acetoxypropyl)-N、N-dimethyl-2、3-bis(octyloxy)-1-propanaminium chloride] (化合物番号 VC1240)（Shriver、J.W. et al.、Nature 415:331-335 (2002)、およびP.C.T. Publication No. WO 02/00844 A2を参照せよ；これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。
【０３２８】
B.  動物への予防接種
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、BALB/c ネズミに、単一プラスミドとしてまたは２個あるいはそれ以上のプラスミドのカクテルとして、ＰＢＳに溶解したＤＮＡあるいはポロキサマーを使った投与システムで製剤化して（すなわち、２ｍｇ／ｍｌのDNA、３ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および０．１ｍＭの BAK）注射する。一群が１０匹から成るネズミの群に、予防接種を３回、隔週で行い、血清を採取しそれぞれの抗原に対する抗体の力価を調べる。ネズミに三価の製剤（当該の３つのプラスミド構築物をそれぞれ等しい質量でふくむもの）を予防接種する群も、含める。
【０３２９】
接種日程は以下である：
−３日        接種前採血
０日          プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
２１日        プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
４９日        プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
５９日  血清採取
【０３３０】
形質移入VM-92細胞の生、不活性化、あるいは溶解したウィルスに由来する組み換えタンパク質、ペプチドあるいは形質移入上澄みおよび溶解産物の血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより決定する。
【０３３１】
C.  VaxfectinTMアジュバントを使ったワクチン製剤のネズミへの接種
VaxfectinTM（カチオン脂質VC1052と中性コ・リピド[co-lipid] DPyPEとのモル比は１：１である）は、合成カチオン脂質製剤であり、ＤＮＡと共にネズミに筋肉内投与した場合に、[ＩＶタンパク質]＊４９に対する抗体力価を高める能力を有しているのではないかと期待されている。
【０３３２】
ネズミにおいて、VaxfectinTMをＮＰＤＮＡと混ぜて製剤化したものを筋肉内注射したところ、抗体力価が２０倍にまで、すなわちＤＮＡ単独では達成できないレベルにまで増強した。ウサギにおいては、ＤＮＡをVaxfectinTMで複雑化した場合、抗体力価が５０倍に増強した。従って、VaxfectinTMは、ＤＮＡワクチンにおける投与システムとして、また、アジュバントとして、有望である。
【０３３３】
VaxfectinTM混合物を、VC1052カチオン脂質のクロロホルム溶液を、DPyPE中性コ・リピド[co-lipid]のクロロホルム溶液と混合することにより、調製する＊２８。乾燥膜を、滅菌済みの２ｍｌガラス製バイアル内に入れ、窒素ストリーム下においてクロロホルムを蒸発させ、当該バイアルを真空下に一晩置き、微小量の溶媒を除去することにより、調製する。それぞれのバイアルは、VC1052 and DPyPEを、それぞれ１．５μモル含んでいる。リポソームを、滅菌済みの水を加え、続いてボルテックスミキサーで混練することにより、調製する。得られたリポソームを、リン酸モル対カチオン脂質モルの比率４：１で、ＤＮＡと混合する。
【０３３４】
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌを得る。得られたプラスミドカクテルと対照を、VaxfectinTMを用いて製剤化する。一群あたり５匹のメスのBALB/c ネズミの群に対し、５０μｌのＤＮＡ溶液（ネズミ1匹あたり、１００μｌ）を、大腿直筋に、1日目、２１日目、および４９日目に、それぞれ一製剤ずつ二側注射した。０日（接種前採血）、２０日（採血１）、４１日（採血２）、６２日（採血３）、および注射後４０週まで、ネズミを出血させ血清を採取する。プラスミドＤＮＡ群によりコードされる多様なＩＶタンパク質に対する抗体力価を、本明細書の他の箇所で説明しているようにＥＬＩＳＡにより測定する。
【０３３５】
細胞溶解性のＴ−細胞性応答を、Hartikka et al."Vaxfectin Enhances the Humoral Response to Plasmid DNA-encoded Antigens," Vaccine 19:1911-1923 (2001)（この文献は、参考として本明細書にそのまま組み入れられている）に説明されているように、測定する＊２９。実施例６のパートＡに説明しているように、標準ELISPOT 技術を使って、CD4+ および CD8+ Ｔ−細胞アッセイを行う。
【０３３６】
D.  動物におけるＮＰ、Ｍ１あるいはＭ２抗血清の生産
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、上記の予防接種スキームに従って調製し、適切な動物に注射し、ポリクロナール抗体を作る。血清を採取し、力価を上記のように測定する。
【０３３７】
ハイブリドーマ技術を用いて、モノクロナール抗体も生産する(Kohler、et al.、Nature 256:495 (1975)；Kohler、et al.、Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler、et al.、Eur. J. Immunol. 6:292 (1976)；Hammerling、et al.、in Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、Elsevier、N.Y.、(1981)、pp. 563-681、これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる)。一般的に、そのような手順は、上記のように動物（好ましくは、ネズミ）に対し予防接種を行うことに関連する。そのようなネズミの脾細胞を抽出し、適切な骨髄腫細胞ラインに融合する。いかなる適切な骨髄腫細胞ラインも本発明に従って使用してよいが、親髄腫細胞ライン(SP2O)（メリーランド州ロックビル市のAmerican Type Culture Collectionから入手可能）を使用するのが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞を選択的にＨＡＴ培地で維持し、次にWands et al.、Gastroenterology 80:225-232 (1981)（この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）に説明されているようにクローニングする。そのような選択を経て得られたハイブリドーマ細胞に対し、次に、アッセイを行い、多様なＩＶタンパク質を結合する能力のある抗体を分泌するクローンを特定する。
【０３３８】
あるいはまた、本発明で説明しているＩＶタンパク質に結合する能力のある付加的な抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階の手続きで、生産してもよい。そのような方法は、抗体自体が抗原であるという事実、さらに、それゆえ、第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用している。この方法に従って、多様なＩＶ特異性抗体を用いて、動物（好ましくは、ネズミ）に予防接種をする。次に、そのような動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、さらに得られたハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＩＶタンパク質特異性抗体に結合するその抗体の能力が同族ＩＶタンパク質によりブロックすることができるような抗体を生産するクローンを特定する。そのような抗体は、ＩＶタンパク質特異性抗体に対する抗イディオタイプ抗体から成り、さらなるＩＶタンパク質特異性抗体の形成を誘導することを目的として、動物に対し予防接種を施すのに使用することができる。
【０３３９】
本発明の抗体群のFab および F(ab')2 さらにその他の断片を、本明細書で開示している方法群に従って使用してよいということが深く理解されるであろう。そのような断片は、一般的に、タンパク質分解性の開裂により、（Fab断片生産するためには）パパインおよび（F(ab')2断片を生産するためにはペプシン）などの酵素を用いて、生産される。あるいはまた、NP、M1、M2、HA および eM2結合断片は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、あるいは合成化学を用いて、生産することができる。
【０３４０】
「ヒト化した」キメラモロクロナール抗体を使うことが好ましいかもしれない。そのような抗体は、上記のモロクロナール抗体を生産するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子の構築物を用いて生産することができる。キメラ抗体を生産する方法群は、当該技術分野において公知である（そのような方法群を閲覧するには、Morrison、Science 229:1202 (1985)；Oi、et al.、BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly、et al.、U.S. Patent No. 4、816、567；Taniguchi、et al.、EP 171496; Morrison、et al.、EP 173494; Neuberger、et al.、WO 8601533；Robinson、et al.、WO 8702671；Boulianne、et al.、Nature 312:643 (1984)；Neuberger、et al.、Nature 314:268 (1985)を参照せよ）。
【０３４１】
これらの抗体を、例えば、診断のためのアッセイで、研究用試薬として、あるいはまたＩＶタンパク質特異性の抗イディオタイプの抗体を作る目的で、使用する。非限定的な抗ＩＶ抗体に使用例には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合、サンドイッチ、および直接吸着）、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、放射性免疫検定法、免疫沈澱法、凝集法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、およびエピトープマッピング法が含まれる（Weir、D. Ed. Handbook of Experimental Immunology、4th ed. Vols. I and II、Blackwell Scientific Publications (1986))。
【０３４２】
（実施例７）
粘膜接種および電気的補助プラスミド投与
A.  ＤＮＡの粘膜接種
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を（総ＤＮＡ濃度１００μｇ／５０ μｌ）、BALB/c ネズミに、０週、2週、および4週に、筋肉内（i.m.）、  鼻腔内(i.n.)、静脈内 (i.v.)、膣内(i.vag.)、直腸内(i.r.)、あるいは経口の投与経路で投与する。ＤＮＡは、カチオン脂質類DMRIE/DOPE (DD) または GAP-DLRIE/DOPE (GD)と混合してあるはまた混合しないで、投与する。エンドポイントとして、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、脾性のＴ−細胞性応答をIFN-ガンマ およびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイで測定する。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。テトラマー検査を使って、抗原特異性を持つＴ−細胞を検知し定量する。この場合、定量の確認および表現型の特徴は、細胞内サイトカイン染色で行う。さらに、多様なＩＶ抗原に対するIgG および IgA 反応を、膣洗浄液のＥＬＩＳＡで分析する。
【０３４３】
B.  電気的補助プラスミド投与 
ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子投与を、電気的パルスを注入組織に短時間印加することにより高めてもよく、この手続きを本明細書で電気的補助プラスミド投与と呼ぶ（例えば、Aihara、H. & Miyazaki、J. Nat. Biotechnol. 16:867-70 (1998)；Mir、L.M. et al.、Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:4262-67 (1999)；Hartikka、J. et al.、Mol. Ther. 4:407-15 (2001)；および Mir、L.M. et al.; Rizzuto、G. et al.、Hum Gene Ther 11:1891-900 (2000)；Widera、G. et al、J. of Immuno. 164: 4635-4640 (2000)を参照せよ）。細胞電気易透化法[cell electropermeabilization]を行うために電気パルスを使用することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外部のＤＮＡを原核細胞および真核細胞に導入することを目的として行われてきた。細胞の易透化は、細胞の生存と矛盾しない電極および最適電気パラメータを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで局所的に行うことができる。
【０３４４】
多様な電気泳動装置を用いて、電気泳動法を行うことができる。これらの装置には、外付けプレート型電極および侵入性の針型あるいは棒型電極があり、１つのアレーに２個あるいは多数の電極を有していてよい。プレートと針型電極の間の距離は、電極の数、対象域のサイズ、治療を施す被験体により異なっていてよい。
【０３４５】
本明細書で説明している実施例で使用しているTriGridニードルアレーは、ほぼ幾何学的三角形の形をした部分にある３個の延長電極から成る３電極アレーである。ニードルアレーは、多様なアレー形成において、１本、２本、３本、４本、５本、6本、あるいはそれ以上の針を含む。電極は、導電ケーブルを通して、電源に接続した高圧スイッチング装置に接続している。
【０３４６】
電極アレーを、核酸注射部位の周辺の筋肉組織内に、約３ｍｍから３ｃｍの深さに、設置する。挿入の深度は、対象組織および電気泳動を施す被験体のサイズによって、異なる。プラスミドＤＮＡのような外部の核酸を注射した後、当該核酸が分布するのに充分な時間を置き、方形波の電気的パルスを当該組織に印加する。パルスの振幅は、約１００ボルトから約１５００ボルトの範囲で、電極間の距離に基づいて、例えば、約 １００ ボルト、約 ２００ ボルト、約 ３００ ボルト、約 ４００ ボルト、約 ５００ ボルト、約 ６００ ボルト、約 ７００ ボルト、約 ８００ ボルト、約 ９００ ボルト、約 １０００ ボルト、約 １１００ ボルト、約 １２００ ボルト、約 １３００ ボルト、約 １４００ ボルト、あるいは約 １５００ ボルト あるいは約 １ｋＶ／ｃｍから１．５ｋＶ／ｃｍである。それぞれのパルスの長さは、約 １μｓ から約１０００μｓの範囲であり、例えば、約 １μｓ、約 １０μｓ、約 ５０μｓ、約 １００μｓ、約 ２００μｓ、約 ３００μｓ、約 ４００μｓ、約 ５００μｓ、約 ６００μｓ、約 ７００μs、約 ８００μs、約 ９００μs、あるいは約 １０００μs、さらに約 １Ｈｚから１０Ｈｚのパルス周波数である。パルスの極性を、電気泳動処理中に、コネクタをパルス発生器に切り替えることにより、逆転してよい。パルスは多数回数繰り返される。電気泳動パラメータ（例えば、電圧振幅、パルスの長さ、パルスの数、電極挿入深度、および周波数）は、対象組織の種類、使用電極数、および電極間の距離に基づきことなるが、このことは当業者には理解されているであろう。
【０３４７】
パルスを用いた治療計画終了直後に、電気泳動を施した被験体を、任意に、細胞膜の易透化を延長させることを目的として、細胞膜安定剤で治療してもよい。細胞膜安定剤の例には、ステロイド（例えば、デキサメタソン、メチルプレドニゾン、およびプロゲステロン）、アンジオテンシンII およびビタミンＥが含まれるが、それらに限定されるものではない。デキサメタソンを、体重１キログラム当たり０．１ｍｇの投与量で単回投与すれば、望む効果を得るに充分であろう。
【０３４８】
電気泳動法などのＥＡＰＤテクニックを、リポソーム製剤に含まれているプラスミドにも使用することができる。リポソーム−プラスミド懸濁液を動物あるいは患者に投与し、注射部位を安全だが効果のある電界を例えばTriGridニードルアレーなどで発生させ治療する。電気泳動法により、リポソーム二重層を不安定化し、それによりリポソームと対象細胞構造との間の細胞膜融合を起こすことにより、細胞へのプラスミド投与を補助することができる。電気泳動法はまた、プラスミドの放出を、高濃度で、対象細胞の表面に存在するリポソームから誘導し、電気泳動法の結果として、プラスミドが濃度勾配のため細胞膜に作られた穴を経て細胞膜を超えて運ばれることにより、細胞へのプラスミド投与を補助することができる。
【０３４９】
週齢８週間から１０週間のメスのBALB/c ネズミを吸入イソフルランで麻酔し、電気泳動プロシージャ中麻酔下に維持した。ネズミの脚を、処置を施す前に剃った。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、BALB/c ネズミ（ｎ＝１０）の大腿四頭筋に、一側注射により、ネズミ1匹当たりプラスミドＤＮＡ25 μgの総量で、０．３ｃｃインシュリンシリンジおよび注射深度を制御するためのプラスチックカラーに装着した２６ゲージ、針長１／２の針を用いて、投与する。注射後約1分経った時点で、電極を適用する。修正キャリパー電極を用い、電気的パルスを印加する（Hartikka J. et al. Mol Ther 188:407-415 (2001)を参照せよ）。当該キャリパー電極プレートは、導電ゲルで被覆してあり、パルスを印加するために必要である３ｍｍの隙間を狭くする前に注射した筋肉の両側にあてがう。方形波のパルス型を、１Ｈｚから１０Ｈｚの周波数で、また電界強度については、１００Ｖ／ｃｍから５００Ｖ／ｃｍの振幅、１パルスから１０パルスの回数、１０ｍｓから１００ｍｓの時間的長さで、ＥＡＰＤを適用する。
【０３５０】
０週、2週、および4週時に（± EAPD）、ネズミに予防接種をする。多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、脾性のＴ−細胞性応答をIFN-ガンマ およびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイで測定する。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。
【０３５１】
ウサギ（ｎ＝３）の大腿四頭筋に、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、二側注射した。埋め込み部分の毛を剃り、当該筋肉の対象領域にTriGrid 電極アレーを埋め込む。３．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、電極アレーの注射ポートから投与量毎に投与する。注射器の口金を使って、注射の深度を制御する。プラスミドＤＮＡの注入が完了してから約1分後に、電気泳動を開始する。電気泳動は、TriGridニードルアレーを用い、電極間の距離を等しく７ｍｍに保ち、Ichor TGP-2パルス発生器を使用して、行う。当該アレーを対象の筋肉に、約１ｃｍから２ｃｍの深さで、挿入する。４パルスから8パルスを印加する。それぞれのパルスの時間的長さは約５０μｓから１００μｓ、振幅は約１ｋＶ／ｃｍから２ｋＶ／ｃｍ、さらにパルス周波数は１Ｈｚである。注入および電気泳動は、繰り返してもよい。
【０３５２】
抗血清を、あらゆる時点でワクチン接種したウサギから採取する。エンドポイントとして、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡおよびＰＢＭＣ  Ｔ−細胞増殖反応で測定する＊３１。
【０３５３】
ヒト以外の霊長目における治療目的のタンパク質発現に及ぼす電気泳動の効果を調べるために、雌雄のアカゲザルに、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物（動物一頭あたり０．１ｍｇから１０ｍｇの総ＤＮＡ量）を、２回あるいは６回の筋肉内経路で投与した。対象筋肉群には、二側の大腿直筋、頭蓋骨筋、二頭筋、腓腹筋または三角筋が含まれるが、それらに限定されるものではない＊３０。対象部分の毛を剃り、０．５ｃｍから１．５ｃｍの間隔をおいて設置した４個から１０個の電極から成るニードルアレーを対象筋肉に埋め込む。注入が完了したら、Ichor TGP-2パルス発生器を使用して、対象筋肉に埋め込んだ電極に、一連の電気的パルスを短時間印加する。印加パルスの振幅は、約１２０Ｖから２００Ｖである。パルスシーケンスは、一秒以内に完了する。この間、対象筋肉は、多少収縮あるいは攣縮するかもしれない。注入および電気泳動は、繰り返してもよい。
【０３５４】
抗血清を、あらゆる時点でワクチン接種したサルから採取する。エンドポイントとして、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、さらにＰＢＭＣ  Ｔ−細胞増殖反応をIFN-ガンマ およびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイあるいはテトラマー検査で測定し、抗原特異性を持つＴ−細胞を検知し定量する。この場合、定量の確認および表現型の特徴は、細胞内サイトカイン染色で行う。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。
【０３５５】
（実施例８）
異種プライム−ブーストワクチン接種を用いた組み合わせＤＮＡワクチン
この例は、組み合わせ製剤を用いたワクチン接種について説明している。当該組み合わせ製剤は、ＩＶタンパク質またはその断片、変異体、あるいは誘導体をコードする１つのコドン最適化コード領域から成るひとつまたはそれ以上のポリヌクレオチド（アジュバント及び／又は形質移入促進剤を混合して調製してある）および単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体から成る。従って、抗原は二つの形態で提供される。この外因性の単離タンパク質は、抗原特異性を持つ抗体およびCD4+ Ｔ−細胞性応答を刺激し、一方でポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質（コード領域の細胞への取り込みおよび発現の結果として生産される）は、CD8+ Ｔ−細胞性応答を刺激する。従来の「プライム−ブースト」ワクチン接種戦略とは異なり、このアプローチは抗原の異なった形態を同一の製剤において提供するものである。ＤＮＡワクチンに由来する抗原発現のピークは注射後7日から１０日経なければ現れないので、ＤＮＡワクチンはタンパク質構成要素にブーストを提供する。さらに、当該製剤は、細菌性プラスミドＤＮＡの免疫刺激特性を利用している。
【０３５６】
A.  非コドン最適化ＮＰ遺伝子
この例は、ＮＰをコードする非コドン最適化ポリヌクレオチドを用いて、このプロシージャの効用を実証しているが、本明細書で説明している方法群はいかなるＩＶポリヌクレオチドワクチン製剤にも応用可能である。この方法では少量のタンパク質しか必要でないので、当該アプローチを従来のワクチンの投与量を減じる目的で使用することができると考えられ、従って、品不足で高価なワクチンの入手可能性を高める。この特徴は、パンデミックインフルエンザあるいは生物兵器については特に重要である。
【０３５７】
主としてUlmer、J.B.、et al.、Science 259:1745-49 (1993) およびUlmer、J.B. et al.、J Virol. 72:5648-53 (1998)に説明されているように調製したネズミ1匹あたり１０μｇのインフルエンザA/PR/8/34核タンパク質（ＮＰ）ＤＮＡ注射用投与量が、用量-反応関係についての研究において、用量-反応関係の直線範囲において、Ｔ−細胞および抗体応答を誘導するということが予備判断され、注射したネズミの９５％以上に反応率が見られたという結果が得られた。それぞれの製剤（ＮＰ  ＤＮＡ単独、あるいはRibi I またはカチオン脂質 DMRIE：DOPE あるいはVaxfectinTMを混合して製剤化した＊３２ＮＰ  ＤＮＡ +/-ＮＰタンパク質）を、当該ワクチンモダリティーに推奨されている緩衝液で調製した。ＮＰ  ＤＮＡをカチオン脂質と混合した注射剤については、ＤＮＡを2XPBSで希釈し０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に、また+/-精製組み合わせＮＰタンパク質（実施例２に説明したようにバキュロウイルスにおいて生産される）は０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度にした。それぞれのカチオン脂質は、注射剤用滅菌水（ＳＷＦＩ）を１ｍｌそれぞれのバイアルに加え、ボルテックスミキサーを用いて2分間連続して混練し、さらにＳＷＦＩを用いて最終濃度の0.15 mMまで希釈することにより、乾燥膜から再作製した。同量のＮＰ  ＤＮＡ（+/-ＮＰタンパク質）とカチオン脂質を混合し、ＤＮＡ対カチオン脂質の分子比率を４：１にした。Ribi I アジュバント（Sigma社）を含むＤＮＡ注射剤については、Ribi I を、生理食塩水を用いて、最終濃度の二倍に再作製した。Ribi I (2X)を、同量の、生理食塩水に溶解した0.2 mg/ml の濃度のNP DNA 、0.08 mg/mlの濃度の+/- NP タンパク質 と混合した。カチオン脂質またはRibi を含まない接種については、NP DNA を、150 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で調製する。それぞれの実験において、一群に9匹のメスのBALB/c ネズミ（7週から9週の週齢）に、NP DNA +/- NP タンパク質、カチオン脂質またはRibiを５０μL注射した。 注射剤を、０日および２１日に大腿直筋に二側投与した。２０日および３３日に、ネズミをOSPにより出血させ、個々のネズミの血清力価を測定した。
【０３５８】
ＮＰ特異性血清抗体力価を、間接結合ＥＬＩＳＡ法により、定量した。当該ＥＬＩＳＡ法は、BBS緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解した１ウェルあたり0.5 μgの精製組み換えＮＰタンパク質で４oCの温度で一晩被覆した、ウェルが９６個あるＥＬＩＳＡプレートを用いて、行った。ＮＰで被覆したウェルを、室温にて１時間、ＢＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。ブロッキング緩衝液に溶解した抗血清の２倍連続希釈液を、室温で２時間培養し、アルカリフォスファタ−ゼによりコンジュゲートした（ＡＰ）ヤギ抗ネズミIgG-Fc（ペンシルバニア州ウェストグローブ市のJackson Immunoresearch社製）と共に１：５０００の比率で室温で２時間培養することにより検査した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および1 mM MgCl2に溶解した１ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスフェイト （カリフォルニア州ラ・ホヤ市のCalbiochem社）により発色させ、その吸光度は４０５ｎｍであった。力価は、ワクチン接種前血液検査検体の吸光度の2倍の吸光度を呈した最終希釈液の相関値である。
【０３５９】
標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査 に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。スクリーニング検査では、それぞれの群から3匹のネズミを３４日、３５日、および３６日に、堵殺した。採取時には、それぞれの群から採取した脾臓を集め、加圧型細胞破砕装置を用い、細胞培養培地で単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を溶解し、細胞を洗浄し、数を数えた。CD4+ およびCD8+の検査を行うために、ウェル当たり106個の細胞から始めて、細胞を３倍に連続希釈し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの９６個のウェル（抗ネズミIFN-γモノクロナール抗体で事前に被覆してある）に移る。CD8+ アッセイのためには、１μｇ／ｍｌの濃度のH-2Kd 結合ペプチド、すなわちTYQRTRALV (SEQ ID NO:81)をおよび１Ｕ／ｍｌの濃度の組み替えネズミIL-2 用いて脾臓細胞を刺激し、CD4+ アッセイのためには、２０μｇ／ｍｌの濃度の精製組み換えＮＰタンパク質を用いて、脾臓細胞を刺激した。37oC 、5% CO2の条件下で２０時間から２４時間、細胞を刺激し、その後当該細胞を洗浄し、室温で２時間の培養を経てビオチン標識抗IFN-γモノクロナール抗体を加えた。プレートを洗浄し、ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識アビジンを加えた。室温で１時間培養した後、ＡＥＣ基質を加え、「スポット」を15分間形成させた。免疫スポット用スポット自動カウンター（オハイオ州クリーブランド市のC.T.L. Inc.製）を用いて、形成されたスポットの数を数えた。このように、CD4+ およびCD8+反応は、連続した３日のそれぞれの日に採取した脾臓を用いて、３つの別々のアッセイで測定する。
【０３６０】
一回の注射の後3週間経った時点で、精製タンパク質を含むワクチン製剤を投与したネズミにおける抗体応答は、ＮＰＤＮＡを単独で投与したネズミの抗体応答より、６倍から８倍高かった（図５、表１５）。カチオン脂質を混合して製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価は、Ribi アジュバントに混合したタンパク質あるいはRibi アジュバントに混合したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価に類似していた。これらのデータにより、アジュバントと混合してタンパク質を注射した場合に観察される抗体レベルを、カチオン脂質を混合して（従来のアジュバントを加えずに）製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を含むＤＮＡワクチンで得られるということがわかる。
【０３６１】
二回目の注射の後12日経った時点で、精製タンパク質を含むワクチン製剤を投与したネズミの抗体応答は、ＮＰ  ＤＮＡだけを投与したネズミの抗体応答に比べて９倍から１２９倍高かった（図６、表１５）。３３日における抗ＮＰ抗体力価７５０、９３３の平均を取ると、VaxfectinTMに混合して製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価は、ＤＮＡを単独で投与したネズミの力価（平均力価＝３０、５７８）に比べて２５倍高く、さらにRibi アジュバントに混合したタンパク質を投与したネズミの力価（平均力価＝１、７４８、１３３）と同程度に高かった。
【表１４】
2008505660.tif 000088
【０３６２】
予測どおり、ＮＰ特異性CD8+ Ｔ−細胞IFN-γ 反応は、Ribiに混合したＮＰタンパク質を投与したネズミの脾臓には検知されなかった（図７）。その他の全群では、ＮＰ特異性CD8+ Ｔ−細胞性応答が検知された。ＮＰタンパク質を含むワクチン製剤を投与した全群のCD8+ Ｔ−細胞性応答は、相互に統計学的に相違がなかった。
【０３６３】
全群のネズミに、ＮＰ特異性CD4+ Ｔ−細胞性応答が検知された（図８）。ＮＰ  ＤＮＡおよびＮＰタンパク質をカチオン脂質と混合して製剤化したワクチン製剤を投与した群から採取した脾細胞のCD4+ Ｔ−細胞性応答は、ＤＮＡ単独投与群に比べて、２倍から６倍高かった。
【０３６４】
B.  コドン最適化ＩＶ構築物
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするヒトコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物；及び／又はその他のＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体を単独でまたはＨＢｃＡｇなどのような担体タンパク質との融合タンパク質としてコードするその他のコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物を、本明細書で説明しているプライム−ブースト組成物で使用する。プライム−ブーストモダリティーとしては、同一タンパク質（例えば、ＮＰタンパク質を伴った、ＮＰをコードするＤＮＡ）をブーストに用いてもよいし、また異種のブースト（例えば、Ｍ１タンパク質ブーストを伴った、ＮＰをコードするＤＮＡ）を用いてもよい。それぞれの製剤化については、ＩＶタンパク質のみをコードするコード領域から成るプラスミド、あるいはＩＶタンパク質に加えて単離タンパク質をコードするコード領域から成るプラスミドを、それぞれRibi I またはカチオン脂質 DMRIE：DOPE あるいはVaxfectinTMを混合して製剤化する。当該ワクチンモダリティーに推奨されている緩衝液を用いて、当該製剤を調製する。例示的製剤は、ＮＰをその一例として、本明細書に説明してある。その他のプラスミド／タンパク質製剤（多価製剤を含む）は、この例に従って、当業者により容易に調製可能である。カチオン脂質を混合して製剤化したＤＮＡの注射剤については、ＤＮＡを2X PBS を用いて、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に、+/- 精製組み換えＮＰタンパク質を０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。それぞれのカチオン脂質は、注射剤用滅菌水（ＳＷＦＩ）を１ｍｌそれぞれのバイアルに加え、ボルテックスミキサーを用いて2分間連続して混練し、さらにＳＷＦＩを用いて最終濃度の0.15 mMまで希釈することにより、乾燥膜から再作製した。同量のＮＰ  ＤＮＡ（+/-ＮＰタンパク質）とカチオン脂質を混合し、ＤＮＡ対カチオン脂質の分子比率を４：１にした。Ribi I アジュバント（Sigma社）を含むＤＮＡ注射剤については、Ribi I を、生理食塩水を用いて、最終濃度の二倍に再作製した。Ribi I (2X)を、同量の、生理食塩水に溶解した0.2 mg/ml の濃度のNP DNA 、0.08 mg/mlの濃度の+/- NP タンパク質 と混合した。カチオン脂質またはRibi を含まない接種については、NP DNA を、150 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で調製する。それぞれの実験において、一群に9匹のメスのBALB/c ネズミ（7週から9週の週齢）に、NP DNA +/- NP タンパク質、カチオン脂質またはRibiを５０μL注射した。 注射剤を、０日および２１日にBALB/c ネズミ（ｎ＝１０）の大腿直筋に二側投与した。
【０３６５】
２０日および３３日に、ネズミを出血させ、個々のネズミの多様なＩＶ抗原に対する血清力価を測定した。多様なＩＶ抗原に特異的な血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡ法により、定量した。標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、それぞれのワクチン接種群から3匹ずつ取ったネズミ（接種後３４日、３５日、および３６日に堵殺したもの）を用いて、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査 に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。
【０３６６】
（実施例９）
インフルエンザのネズミ攻撃モデル
一般的な実験手続き 
Ａ型インフルエンザを用いたネズミ攻撃モデルを使用して、当該免疫療法の効用をテストする。このモデルは、Ulmer、J.B.、et al.、Science 259:1745-49 (1993) およびUlmer、J.B. et al.、J Virol. 72:5648-53 (1998)に説明されているモデルに基づき、これらの文献は本明細書に参照によりその全体を組み入れられる。このモデルはＡ型インフルエンザ/HK/8/68のネズミ適応菌株を使用しており、この菌株はネズミの肺で複製しMadin Darby Canine Kidney 細胞における組織培養で力価を測定する。このネズミ適応インフルエンザウィルスのLD90を、週齢１３週から１５週のメスのBALB/cねずみで定量する。このモデルにおいては、２種類の攻撃研究を行うことができる：致死攻撃（ケタミン麻酔による深い鎮静状態にあるネズミに、ウィルスを鼻腔内投与する）；および亜致死攻撃（ウィルス性接種物を接種する時点でネズミは麻酔されていない；投与経路はやはり鼻腔内である）。致死攻撃のエンドポイントは、生存であるが、身体質量の減および体温もモニターしてもよい。亜致死攻撃のデータには、肺ウィルス力価、身体質量の減および体温が含まれる。
【０３６７】
本明細書で説明している研究においては、ネズミを致死攻撃に晒す。ＩＶ抗原をコードするＤＮＡを用いて先にワクチン接種したネズミに麻酔をかけ、０．２％ｗｔ／ｖｏｌBSAを含むPBSを用いて１から１０，０００（５００PFU）に希釈したネズミ適応Ａ型インフルエンザ/HK/8/68（ネズミパッセージ＃６）の鼻腔内投与により攻撃する。
【０３６８】
これらの攻撃研究では、一群当たり１０匹のネズミから成る群を使用している。投与経路は大腿直筋（大腿四頭筋）への筋肉内投与で、プラスミドＤＮＡ総量は０．１μｇから１ｍｇであった。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、単独で、または多価カクテルの形態で、攻撃に対するその保護能力につき、テストする。当該プラスミドを、アジュバント及び／又は 形質移入促進剤（例えばVaxfectinTM）を用いて、本明細書の他の箇所で説明している方法により、製剤化する。０日および２１日に、実施例６で説明している量のプラスミドを用いて、ネズミにワクチン接種をする。後続の注射剤を投与してよい。ネズミの鼻腔内攻撃を最終接種後3週間後に起こし、動物を身体質量、低体温、一般外貌、さらに死亡につき毎日観察する。
【０３６９】
研究対象のネズミの各群につき、2回目の注射の後及び／又はいかなる後続の注射の後2週間目に採血し、さらに最終の注射の後2週間目に最終採血をする。先に説明したように、抗体力価をＭ２、Ｍ１、およびＮＰ につき、ＥＬＩＳＡ法により定量する。
【０３７０】
プラスミド
上記のように、本発明の構築物を、発現ベクターVR10551に挿入した。VR10551は、いかなる導入遺伝子の挿入もされていない発現ベクターである。
【０３７１】
VR4750 は、ネズミ適応A/Hong Kong/68に由来するヘマグルチニン (HA) (H3N2)のコード配列を含む。ＤＮＡをQiagen製のプラスミド精製キットを用いて調製した。
【０３７２】
実験手続き
以下に示す例の実験手続きは、上に説明してあり、使用する特殊なパラメータおよび材料も本明細書に説明してある。ネズミインフルエンザ攻撃モデルにおける保護につきｐＤＮＡ対照を提供するために、インフルエンザA/HK/8/68 攻撃ウィルスストックからヘマグルチニン(HA) 遺伝子をクローニングし、それをネズミで６回パッセージングした。
【０３７３】
３週間の間隔をおいて2回、１００μｇのネズミ適応インフルエンザA/HK/8/68 菌株から直接クローニングしたHA遺伝子をコードするpDNA VR4750、あるいは１００μｇのブランクベクターpDNA (VR10551)を用いて、ネズミにワクチン接種した。もうひとつ別の対照群に、生A/HK/8/68ウィルス(500 PFU)を用いて、鼻腔内投与でワクチン接種した。最終注射後３週間を経た時点で、ネズミ適応インフルエンザA/HK/8/68の３種類の投与量のうち（５０、５００、５，０００  ＰＦＵ）１種類の投与量を用いて、鼻腔内投与でネズミを攻撃した。ウィルス攻撃後、ネズミを疾患症状、身体質量、さらに死亡につき毎日観察した。
【０３７４】
図９は、同種のHA-pDNAでワクチン接種したネズミが、攻撃後３週間の期間に、多様な投与量のウィルス攻撃から完全に保護されており（図９Ａ）、また体重減少を蒙らなかったということを示している。
【０３７５】
これらの結果に基づき、将来のネズミインフルエンザ研究には、VR4750 (HA) pDNA を保護の陽性対照として含め、攻撃投与量として500 PFU（これは、このネズミ適応ウィルスのLD90である）を用いてよい。
【０３７６】
（実施例１０）
ヒト以外の霊長目における攻撃
これらの研究の目的は、ヒト以外の霊長目における免疫原性につき、３つあるいはそれ以上の最適プラスミドＤＮＡワクチン製剤を評価することである。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、アカゲザルまたはカニクイザル＊３３（一群あたり６匹）に、筋肉内経路で、０．１ｍｇ から２ｍｇのDNAをカチオン脂質、及び／又はポロキサマー及び／又はリン酸アルミニウム系のまたはその他のアジュバントと組み合わせて、０ヶ月目、１ヶ月目、および4ヶ月目に、ワクチン接種する。
【０３７７】
ベースラインの採血を二回行い、その後接種時毎にまた毎回の接種後２週間目に、さらに最終接種後4ヶ月目に、採血する。接種後２週間目に、本明細書で説明している標準方法群により、体液性応答を調べるためプラズマを分析し、細胞性応答を調べるためにPBMCsを観察する。最終接種後4ヶ月目に動物をモニターし、免疫応答の持続性を判断する。
【０３７８】
最終接種後２週間から４週間以内に、動物を攻撃する。予備の攻撃研究に基づき、攻撃は、適切な投与量を用いて気管内経路で行う。鼻をぬぐった綿棒、咽頭をぬぐった綿棒、および肺の洗浄液を、攻撃後０日、２日、４日、６日、８日、および１１日に採取し、サル腎臓細胞につき細胞を含まないウィルス力価を調べる。攻撃後、臨床症状（直腸温度、体重、白血球数、ヘマトクリット、および呼吸速度）につき、動物を観察する。口咽頭をぬぐった綿棒の検体を採取し、ウィルス排出の期間を決定する。Berendt & Hall (Infect Immun 16:476-479 (1977))により考案されたシステムを使って疾病に点数を付け、分散分析および最小有意差を使って分析する。
【０３７９】
（実施例１１）
トリにおける攻撃
この例では、本発明の多様なワクチン製剤を、ニワトリインフルエンザモデルでテストする。これらの研究では、トリに感染するとして知られているIV H5N1 ウィルスを使用する。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、カチオン脂質、及び／又はポロキサマー及び／又はリン酸アルミニウム系のまたはその他のアジュバントと組み合わせて製剤化する。ワクチン製剤を、約１μｇから１０μｇの投与量で、筋肉内経路で羽をむしった胸部に、０ヶ月目および１ヶ月目に、投与する。二回目の接種後３週間目に抗体結果を調べるため、トリから採血する。多様なＩＶ抗原に対する抗体力価を、文献に説明されているテクニックを用いて定量する（例えば、Kodihalli S. et al.、Vaccine 18:2592-9 (2000)を参照せよ）。２回目の接種後３週間目に、１００ LD50を含む０．１ｍL を用いて鼻腔内経路で、トリを攻撃する。疾患症状（食欲減退、下痢、顔面の脹れ、チアノーゼ、麻痺、および死亡を含む）につき、１０日間にわたり、トリを観察する。ウィルス滴定のため、気管および排出腔をぬぐった綿棒を攻撃後4日目に採取する。
【０３８０】
（実施例１２）
製剤選択研究
多様なワクチン製剤群の力価を、インフルエンザA/PR/8/34のＮＰタンパク質を用いた多様な実験で評価した。
【０３８１】
ワクチン接種投与計画
一群あたり９匹から成る６週から８週の週齢のBALB/cネズミ（Harlan-Sprague-Dawley社）の群に、プラスミドＤＮＡを二側（一本の脚当たり５０μL）筋肉内注射した。対照のネズミには、ＰＢＳに溶解したＤＮＡを単独で投与した。ネズミへの注射は、０日目、２０日目、および４９日目に行った。ネズミをＯＳＰにより６２日目に出血させ、ＮＰ特異性抗体をＥＬＩＳＡ法により分析した。脾細胞を一日当たり一群当たり３匹のネズミから６３日目に開始して３日間連続shして採取し、ＮＰ特異性Ｔ−細胞をIFNγ ELISPOT 法により重複ペプチド刺激を用いて分析した。
【０３８２】
細胞培養培地
脾細胞培養を、25 mM HEPES 緩衝液およびＬ−グルタミンを含むRPMI-1640 培地を用いて行い、さらに10% (v/v) FBS、55 ｍＭ ベータ-メルカプトエタノール、100 U/mLの ペニシリンGナトリウム塩、および100 μg/mL の硫酸ストレプトマイシンにより補足した。
【０３８３】
標準インフルエンザＮＰ間接結合アッセイ
ＮＰ特異性血清抗体力価を、間接結合ＥＬＩＳＡ法により、定量した。当該ＥＬＩＳＡ法は、BBS緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解した１ウェルあたり0.5 μgの精製組み換えＮＰタンパク質で４oCの温度で一晩被覆した、ウェルが９６個あるＥＬＩＳＡプレートを用いて、行った。ＮＰで被覆したウェルを、室温にて１時間、ＢＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。ブロッキング緩衝液に溶解した抗血清の２倍連続希釈液を、室温で２時間培養し、アルカリフォスファタ−ゼによりコンジュゲートした（ＡＰ）ヤギ抗ネズミIgG-Fc（ペンシルバニア州ウェストグローブ市のJackson Immunoresearch社製）と共に１：５０００の比率で室温で２時間培養することにより検査した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および1 mM MgCl2に溶解した１ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスフェイト （カリフォルニア州ラ・ホヤ市のCalbiochem社）により発色させ、その吸光度は４０５ｎｍであった。力価は、ワクチン接種前血液検査検体の吸光度の2倍の吸光度を呈した最終希釈液の相関値である。
【０３８４】
標準ＮＰCD8+ およびCD4+ Ｔ−細胞 ELISPOT アッセイ
標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査 に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。それぞれの群から3匹のネズミを、連続した３日間のそれぞれの日に、堵殺した。採取時には、それぞれの群から採取した脾臓を集め、加圧型細胞破砕装置を用い、細胞培養培地で単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を溶解し、細胞を洗浄し、数を数えた。CD4+ およびCD8+の検査を行うために、ウェル当たり106個の細胞から始めて、細胞を３倍に連続希釈し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの９６個のウェル（抗ネズミIFN-γモノクロナール抗体で事前に被覆してある）に移る。CD8+ アッセイのためには、１μｇ／ｍｌの濃度のH-2Kd 結合ペプチド、すなわちTYQRTRALV (SEQ ID NO:81)をおよび１Ｕ／ｍｌの濃度の組み替えネズミIL-2 用いて脾臓細胞を刺激し、CD4+ アッセイのためには、２０μｇ／ｍｌの濃度の精製組み換えＮＰタンパク質を用いて、脾臓細胞を刺激した。37oC 、5% CO2の条件下で２０時間から２４時間、細胞を刺激し、その後当該細胞を洗浄し、室温で２時間の培養を経てビオチン標識抗IFN-γモノクロナール抗体を加えた。プレートを洗浄し、ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識アビジンを加えた。室温で１時間培養した後、ＡＥＣ基質を加え、「スポット」を15分間形成させた。免疫スポット用スポット自動カウンター（オハイオ州クリーブランド市のC.T.L. Inc.製）を用いて、形成されたスポットの数を数えた。
【０３８５】
実験１
この実験の目的は、裸のpDNA (VR4700)に対する投与量反応およびVF-P1205-02Aを加えて製剤化したpDNAについての投与量反応を判断することであった。VR4700は、VR10551バックボーンにおいてインフルエンザA/PR/8/34核タンパク質(NP)をコードするプラスミドである。VR10551は、いかなる導入遺伝子の挿入もされていない発現ベクターである。VF-P1205-02A は、ＰＯＰ分子量が１２ＫＤａでありＰＯＥが５％ (CRL1005)であるポロキサマーを含む製剤であり、そのＤＮＡ対ポロキサマー対ＢＡＫの比率が５ｍｇ／ｍｌ：７．５ｍｇ／ｍｌ：０．３ｍＭである。この実験の結果を下記の表に示す： 
【表１５】
2008505660.tif 000089
【０３８６】
この実験の結果により、ＤＮＡの投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。ＤＮＡをポロキサマーおよびＢＡＫを混合して製剤化した場合、投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まる。
【０３８７】
実験２
この実験の目的は、pDNA (VR4700)投与量を固定してＢＡＫを加えなかった場合のCRL1005に対する投与量反応を判断することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１６】
2008505660.tif 000090
【０３８８】
この実験の結果により、CRL1005の投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３８９】
実験３
この実験の目的は、DMRIE：DOPE （１：１、モル：モル）を含むカチオン脂質製剤とVaxfectinTMを含むカチオン脂質製剤との免疫応答を、異なったpDNA/カチオン脂質分子比につき、比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１７】
2008505660.tif 000091
【０３９０】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPE または VaxfectinTMと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３９１】
実験４
この実験の目的は、第一に、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１であるDMRIE：DOPE （１：１、モル：モル）の免疫応答を、ＭＬＶ（多層小胞製剤−マルチバイアル）あるいはＳＵＶ（単層小胞−シングルバイアル）製剤として、比較することであった。第二には、スクロース系製剤（凍結乾燥形態）とＰＢＳ系製剤を比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１８】
2008505660.tif 000092
【０３９２】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPEと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激するということがわかる。
【０３９３】
実験５
この実験の目的は、第一に、DMRIE 対DOPEの比率を変えることが、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１である場合の免疫応答に対し、ＭＬＶ（多層小胞製剤−マルチバイアル）あるいはＳＵＶ（単層小胞−シングルバイアル）製剤として、どのような効果を及ぼすかを判断することであった。第二には、共脂質をDOPEからコレステロールに変えることの効果を比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１９】
2008505660.tif 000093
【０３９４】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPEと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激するということがわかる。共脂質をDOPEからコレステロールに変えることもまた、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激する。
【０３９５】
実験６
この実験の目的は、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１になるようにDMRIE：DOPE (１：１、モル：モル)を混合して製剤化したpDNAに対する投与量反応を得ることであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表２０】
2008505660.tif 000094
【０３９６】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPE または VaxfectinTMと混合して製剤化した場合に、投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３９７】
（実施例１３）
インフルエンザ抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
プラスミドベクター
本発明のポリヌクレオチドを、真核発現ベクターバックボーンVR10551、VR10682 および VR6430に挿入した（これらのベクターバックボーンはすべて先に説明した）。VR10551ベクターは、修飾pUC18のバックグラウンドに構築されており（ Yanisch-Perron、C.、 et al. Gene 33:103-119 (1985)を参照せよ）、カナマイシン耐性遺伝子、ヒトサイトメガロウィルス直近の初期１プロモータ／エンハンサー、およびイントロンA、ウシ成長ホルモン転写終結シグナル、および外部遺伝子挿入用ポリリンカーを含む（Hartikka、J.、et al.、Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996を参照せよ)。しかし、その他の標準市販真核発現ベクターを本発明で用いてもよく、その例には、pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2 （カリフォルニア州サンディエゴ市Invitrogenより入手可能）、およびpCI （ウィスコンシン州マディソン市のPromegaより入手可能）などのプラスミドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０３９８】
多様なプラスミドを、以下のＡ型インフルエンザ抗原のヌクレオチド配列をクローニングすることにより作製した：セグメント７（ディファレンシャルスプライシング[differential splicing]によりＭ１およびＭ２の双方のタンパク質をコードする）、下記に説明しまた図１３に図示したような、発現構築にライゲーションするＭ２およびＮＰ。
【０３９９】
プラスミドPlasmids VR4756 (SEQ ID NO:91)、VR4759 (SEQ ID NO:92) およびVR4762 (SEQ ID NO:93) を、以下のＡ型インフルエンザ抗原のそれぞれについてのコンセンサス配列をコードするヌクレオチド配列をクローニングすることにより、作製した：セグメント７（ディファレンシャルスプライシング[differential splicing]によりＭ１およびＭ２の双方のタンパク質をコードする）、VR10551バックボーンにライゲーションするＭ２およびＮＰ。VR4756、VR4759 and VR4762プラスミドについては、表１３でも説明している。
【０４００】
VR4756 およびVR4762にそれぞれ由来するセグメント７およびＮＰコード領域をVR10682ベクターにライゲーション することにより、VR4764 (SEQ ID NO:95) プラスミドおよび VR4765 (SEQ ID NO:96)プラスミドを構築した。具体的には、EcoRV および SalI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4756ベクターを消化し、平滑末端化した断片を、EcoRV制限エンドヌクレアーゼを用いて既に消化したVR10682バックボーンにライゲーションした。EcoRV および NotI を用いてVR4762 ベクターを消化し、ＮＰコード領域を、同一の制限エンドヌクレアーゼを用いて既に消化したVR10682のバックボーンにライゲーションすることにより、VR4765ベクターを構築した。
【０４０１】
VR4766 (SEQ ID NO:97) および VR4767 (SEQ ID NO:98)は、CMV プロモータ／イントロン A-NP 発現カセットおよび RSV プロモータ (VCL1005由来)-セグメント 7発現カセットを、同じ配向で(VR4766)、あるいは反対の配向で(VR4767)、含んでいる。DraIII制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4762を消化し、EcoRV およびBamHI制限エンドヌクレアーゼを用いてRSV-セグメント 7-mRBG カセットをVR4764から切り離すことにより、これらのプラスミドを作製した。ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片 [Klenow fragment]を用いてエキソヌクレアーゼ消化を行った後、Eco RV/BamHI 断片を、DraIII を用いて消化したVR4762にクローニングした。双方の挿入配向 を、このブラントエンドクローニング方法により、得た。
【０４０２】
CMV プロモータ／イントロンA-セグメント7 発現カセットおよびRSV プロモータ-NP発現カセットを含んでいるVR4768 (SEQ ID NO:99) および VR4769 (SEQ ID NO:100)を、類似した方法により得た。DraIII 制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4756を消化し、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用いた処理により平滑末端化した。RSV プロモータ、NPコード領域およびmRBGターミネーターを含むカセットを、KpnI およびNdeI制限エンドヌクレアーゼを用い消化することによって、VR4765から除去した。断片もまた、ポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化し、DraIIIにより消化したVR4756ベクターに両方の遺伝子配向でライゲーションした。
【０４０３】
VR4756、VR4762 およびVR4759にそれぞれ由来するコード領域を、VR6430ベクターバックボーンにクローニングすることにより、VR4770 (SEQ ID NO:101)、VR4771 (SEQ ID NO:102) およびVR4772 (SEQ ID NO:103)を構築した。具体的には、VR4756に由来するセグメント７遺伝子を、SalI およびEcoRV制限エンドヌクレアーゼを用いて除去し、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化した。EcoRV および BamHI を用いてVR6430プラスミドを消化し、ベクターバックボーン断片をＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化した。セグメント７遺伝子を、次に、VR6430ベクターバックボーンにライゲーションした。EcoRV および BglII制限エンドヌクレアーゼによる消化に続いて、ＮＰ挿入片をVR4762から除去し、断片を、同一の制限エンドヌクレアーゼにより既に消化したVR6430ベクターバックボーンにライゲーションすることにより、VR4771を得た。VR4759に由来するＭ２コード領域を、平滑末端化したSalI-EcoRV断片としてサブクローニングし、平滑末端化したEcoRV-BamHI消化に由来するVR6430ベクターバックボーンにライゲーションすることにより、VR4772を得た。
【０４０４】
VR4773 (SEQ ID NO:104) およびVR4774 (SEQ ID NO:105) は、CMVプロモータ／イントロンA-セグメント 7 発現カセットおよび RSV/R-NP発現カセットを、同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。DraIII制限エンドヌクレアーゼによりVR4756を消化し、平滑末端化し、さらに、NdeI and SfiIにより消化および平滑末端化したVR4771に由来するRSV/R-NP-BGH断片にライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０５】
VR4775 (SEQ ID NO:106) およびVR4776 (SEQ ID NO:107) は、CMV プロモータ／イントロンA-NP発現カセットおよびRSV/R-セグメント 7発現カセットを同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。DraIII制限酵素を用いてVR4762を消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて平滑末端化することにより、これらのプラスミドを作製した。NdeI およびSfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4770を消化し、DraIII制限エンドヌクレアーゼにより消化したVR4762を用いて平滑末端化した断片をライゲーションすることにより、RSV/R-セグメント 7-BGH 断片を作製した。
【０４０６】
VR4777 (SEQ ID NO:108) およびVR4778 (SEQ ID NO:109)は、CMVプロモータ／イントロン A-NP発現カセットおよび RSV/R-M2発現カセットを同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。MscI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4762を消化し、NdeI および SfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4772を消化し、RSV/R-M2-BGHをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理し、これらの2個のゲル精製断片をライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０７】
VR4779 およびVR4780は、CMV プロモータ／イントロン A-M2発現カセットおよび RSV/R-NP発現カセットを、同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。MscI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4759を消化し、NdeI および SfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4771を消化し、RSV/R-NP-BGH セグメントをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理し、これらの2個のゲル精製断片をライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０８】
プラスミドＤＮＡ精製
プラスミドＤＮＡを、大腸菌DH5アルファ コンピテント 細胞に形質転換し、高度精製した共有結合で閉じた環状プラスミドＤＮＡを修飾細胞溶解法[modified lysis procedure]により単離し（Horn、N.A.、et al.、Hum. Gene Ther. 6:565-573 (1995)を参照せよ)、次に標準ＣｓＣｌ二本鎖臭化エチジウム平衡密度勾配遠心[standard double CsCl-ethidium bromide gradient ultracentrifugation]を行った（Sambrook、J.、et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York (1989)を参照せよ）。すべてのプラスミド調製は、ゲル分析およびビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ[bicinchoninic protein assay]により検知できる染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質不純物がない状態であった。エンドトキシンレベルは、アメリカ産カブトガニ血球抽出液エンドトキシン検出方法（リムルス試験）[Limulus Amebocyte Lysate assay] （マサチューセッツ州ファルマウス市のLAL、Associates of Cape Cod）を用いて測定され、その結果はプラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり０．６エンドトキシンユニット未満であった。ＤＮＡ溶液のスペクトル光度A260/A280率の典型的数値は、１．８を超えていた。プラスミドを、エタノール沈殿し、適切な溶液（例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム）を用いて再度懸濁する（その他の適切な賦形剤および補助剤については、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号2002/0019358を参照せよ）。ＤＮＡを使用するまで、−２０°Ｃで保存した。ＤＮＡを、３００ｍＭ塩溶液と混合するかあるいは適切な量のＵＳＰ水を加えて希釈し、望ましい分子濃度の望ましい塩におけるプラスミドＤＮＡ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度を得た。
【０４０９】
哺乳類細胞ラインにおけるプラスミド発現
発現プラスミドを、プラスミドを充分に特徴付けたネズミの黒腫（メラノマ）細胞ライン（VM-92またはUM-449として公知である）およびヒト横紋筋肉腫細胞ラインＲＤ（ATCC CCL-136）（双方ともヴァージニア州マナサス市のAmerican Type Culture Collectionより入手可能）に形質移入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。その他の充分に特徴付けたヒトの細胞ラインを用いてもよく、その例としては、ATCC アクセッション番号CCL-171のMRC-5 細胞が挙げられる。形質移入を、当業者に公知であるカチオン脂質に基づく形質移入方法を用いて行った。その他の形質移入方法が当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーションおよび塩化カルシウム媒介形質移入法 （Graham F.L.and A.J. van der Eb Virology 52:456-67 (1973)）を用いてもよい。形質移入後、形質移入細胞の細胞溶解産物および培養上澄みを評価し、ＩＶ抗原タンパク質の相対的発現レベルを比較した。検体を、市販のポリクロナールモノクロナール抗体（例えば、ニュージャージー州フランダース市のResearch Diagnostics Inc.より入手可能）を用いて、ウェスタンブロット法および 酵素免疫測定法（ELISA）により検査し、発現抗原の質と量を比較した。
【０４１０】
ＮＰ、Ｍ１、およびＭ２抗原について得たコンセンサスアミノ酸配列（上記）をコードする遺伝子を、いくつかのコンフィギュレーションにおいていくつかのプラスミドベクターバックボーンにクローニングした。pDNA群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現につきテストした。さらに、当該pDNA群を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫原性、インフルエンザ攻撃からネズミを保護する能力につき、現在評価中である。
【０４１１】
実験１
Ｍ１およびＭ２につきアミノ酸コンセンサス配列を得た後、天然のセグメント７単離片がこのコンセンサスをコードすることがわかったので、このヌクレオチド配列を上記の方法群に従って合成した。Ｍ２−Ｍ１融合遺伝子も作製し、実施例４の上記コドン最適化アルゴリズムを用いて当該ヌクレオチド配列をヒトコドン最適化した。個々の全長Ｍ２遺伝子およびＭ１遺伝子を、ＰＣＲ法によりこの融合からクローニングした。
【０４１２】
細胞溶解産物におけるインフルエンザ抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を、ネズミの黒腫（メラノマ）細胞ラインに形質移入後48時間目に評価した。VR4756 (セグメント7)、VR4755 (M2-M1 融合) および VR4759 （全長Ｍ２）の形質移入後、抗Ｍ２モノクロナール抗体（１４Ｃ２）を用いてAffinity BioReagents試薬から、Ｍ２発現を検知した。VR4756 およびVR4755についてのデータを、図１０に示す。形質移入したVR4756、VR4755 およびVR4760 （全長Ｍ１）pDNAからＭ１の発現を検知した。当該Ｍ１発現は、VR4756 および VR4755について図１０に示したように、抗Ｍ１モノクロナール抗体（Serotec社）を用いて、あるいは抗Ｍ１ヤギポリクロナール（Virostat社、データは示していない）を用いて検知した。VR10551は空のクローニングベクターである。
【０４１３】
実験２
代替のヒトコドン最適化方法群を比較するため、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸を、全長ＮＰ（「ｅＭ２−ＮＰ」）に融合したものを２通り構築した。一方のヌクレオチド配列を上記のコドン最適化アルゴリズムにより得、他方のヌクレオチド配列を外部の契約業者により作製させた。２種類のｅＭ２−ＮＰ  ｐＤＮＡ群を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定したが、ｉｎ  ｖｉｖｏの免疫原性の比較は現在進行中である。さらに、これら２通りのコドン最適化に関する全長ＮＰ遺伝子群をｅＭ２−ＮＰ  ｐＤＮＡ群からサブクローニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現につき分析した。
【０４１４】
上記のコドン最適化アルゴリズムおよびの外部の契約業者のアルゴリズムに由来するｅＭ２−ＮＰ  ｐＤＮＡとＮＰ  ｐＤＮＡを比較するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現をテストした。そのデータを、図１１に示す。発現レベルは、VR4757 （ｅＭ２−ＮＰ契約業者最適化）対VR4758 （ｅＭ２−ＮＰ出願人最適化）との間で、ほぼ同じであり、抗Ｍ２モノクロナール抗体（図１１Ａ）あるいは抗ＮＰネズミポリクロナール（データは示していない）により検知した。同様に、ＮＰ発現は、VR4761 （契約業者最適化） 対VR4762 （出願人最適化）との間で、ほぼ等しく、出願人が作製した抗ＮＰネズミポリクロナール（図１１B）により検知した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＰコンセンサスタンパク質発現も、全H1N1 あるいは H3N2 ウィルスに対して作製したヤギポリクロナール抗体（Fitzgerald社）（データは示していない）を用いて、検知した。これらのＮＰ構築物の発現レベルは、双方ともA/PR/34 NP (VR4700)を含むpDNA に比べて、はるかに高かった。
【０４１５】
実験３
インフルエンザ抗原をコードするプラスミドを、上記の方法群を用いて、VM92 細胞に形質移入した。形質移入後48時間を経た時点で、細胞溶解産物および培地を採取した。細胞を２００μｌのLaemmliで溶解し、細胞屑をマイクロ遠心単離で除去し、２０μｌを過熱し4-12% ビス-トリスゲルにロードした。 分泌ＮＰタンパク質をコードするそれらのベクターの発現を定量するために、15 μlの培地を5 μlローディング緩衝液と混合し、過熱しゲルにロードした。ウェスタンブロットを上記のように処理した。主たる抗体は、以下であった：M2タンパク質を検知するためのモノクロナール抗体MA1-082 (ABR社)、M1タンパク質を検知するためのモノクロナール抗体MCA401 （Serotec社）、およびVR4762を接種したウサギに対するポリクロナール抗体で出願者の社内で作製されたもの。主な抗体は、１：５００希釈率で使った。
【０４１６】
図１４は、ウェスタンブロットの結果を示しており、その結果によると、セグメント７−コードプラスミドに由来するＭ２タンパク質の発現は、VR4764 (RSVプロモータ)に比べて、CMV プロモータ/イントロン A-セグメント 7 (VR4756) および RSV/R-セグメント７ (VR4770)について、高かった。ＮＰ発現については、RSV/R-NP plasmid (VR4771)に由来する発現が最も高く、次にCMV/intron A-NP (VR4762) に由来する発、さらにRSV- NP (VR4765) に由来する発現の順であるように思われた。ヒトＲＤ形質移入細胞のウェスタンブロットに類似した結果が見られた。
【０４１７】
RSV-セグメント 7 およびCMV/イントロン A-NP （VR4766 およびVR4767）を含むデュアルプロモータプラスミドについては、セグメント７に由来するＭ２発現は非常に低く、配向について独立している。これらのデュアルプロモータプラスミドにおけるCMV/イントロン A-NP 発現は、VR4762と比べてあまり違いがない。デュアルプロモータプラスミド（VR4768 および VR4769）におけるRSV-NP 発現（セグメント７がCMV/intron A から発現する）については、ＮＰ発現はいくらか下がるが、デュアルプロモータVR4766 および VR4767におけるＭ２発現ほど劇的には下がらない＊４８。
【０４１８】
図１５は、CMVプロモータ／イントロン A、RSV プロモータ、およびRSV/R-含有プラスミド由来のセグメント７またはＮＰ由来のM1およびM2の発現を表している。これらのウェスタンブロットについて言えば、デュアルプロモータプラスミドは、ＮＰあるいはセグメント７のどちらかを作動させるCMV プロモータ／イントロン A およびRSV/R を含んでいる。ヒトＲＤ形質移入細胞由来のウェスタンブロットに類似した結果が見られた。
【０４１９】
ウェスタンブロットの結果により、CMV プロモータ／イントロン A-セグメント７ （VR4756） およびRSV/R-セグメント７ （VR4770）に由来するＭ１およびＭ２タンパク質発現はRSV-セグメント 7 (VR4764)より優れているということが確認される。デュアルプロモータプラスミド（VR4773、VR4774、VR4775、およびVR4776）において、RSV/R-セグメント７ あるいは CMV/イントロン A-セグメント７をCMVイントロン A-NP あるいは RSV/R-NPと組み合わせると、Ｍ１およびＭ２発現は若干下がる。結果は、ヒトＲＤ形質移入細胞由来のウェスタンブロットに類似していた。プラスミド、RSV/R-M2 （VR4772）およびCMV/イントロン A-M2 （VR4759）をコードするM2抗原を形質移入したヒトＲＤ細胞は、類似したレベルのM2発現を示し、この発現レベルはデュアルプロモータプラスミド（VR4777、VR4778、VR4779、およびVR4780）では下がった。プラスミド、VR4762、VR4771、VR4777、VR4778、VR4779、およびVR4780をコードするＮＰ抗原により形質移入したヒトＲＤ細胞は、すべて類似したＮＰ発現レベルを示した。
【０４２０】
（実施例１４）
ネズミＡ型インフルエンザ攻撃モデル
Ａ型インフルエンザ攻撃モデルを、ネズミ適応A/HK/8/68菌株を用いて確立した＊３６。ネズミ適応 A/Hong Kong/68 (H3N2) および A/Puerto Rico/34 (H1N1) ウィルスにそれぞれ直接由来するＨＡ遺伝子のＰＣＲにより、陽性および陰性対照のヘマグルチニン＊３７(ＨＡ)含有プラスミドを作製した。
【０４２１】
すべての実験につき、プラスミドＤＮＡ予防接種を０週から３週の期間に二側の大腿直筋注射で行い、次に５週目に眼窩血脈洞穿刺[Orbital Sinus Puncture; OSP]出血を行い、さらに６週目にウィルス500 pfu (1 LD90)を用いて鼻腔内ウィルス攻撃を行う。ウィルス攻撃後、約３週間にわたり、罹患率および体重減少につき、ネズミを観察する。ＮＰおよびＭ２に関するエンドポイント抗体力価を、ＥＬＩＳＡ法により定量する。研究GSJ08については、一試験群当たり５匹のネズミを加えて接種を行い、５週目にインターフェロン−γELISPOT アッセイを行った。
【０４２２】
研究CL88：
ネズミインフルエンザ攻撃研究を、Ｍ１、Ｍ２、セグメント７、および ＮＰをコードするプラスミドを単独で、あるいは組み合わせで検査する目的で開始した。HA pDNA群に加えて、亜致死感染およびまだ実験に使用されたことのないネズミをそれぞれ、付加的な陽性および陰性対照として使う。それぞれのプラスミドをポロキサマーCRL1005  02A 剤で製剤化して１００μｇの投与量でネズミに投与する。試験群および２１日目攻撃後生存を、表２１に示す：
【表２１】
2008505660.tif 000095
【０４２３】
研究CL88の結果：
この研究の性能判断基準は、陽性対照については生存が９０％を超えること、陰性対照については１０％以下であること、さらに実験群については７５％を超えることであった。表２１は、対照群および実験群のすべてが性能判断基準を満たしていたということを示している。M2 + NP およびS7 + NP プラスミドＤＮＡ組み合わせは、それぞれ１００％および７５％の生存という結果を呈した。当該の２個のリードプラスミド組み合わせ間には統計学的に有意な差異（p < 0.05）はなかったが、S7、S7 + NP、およびM2 + NP 群 対 陰性対照との間には、統計学的に有意な差異があった。
【０４２４】
体重減少データにより、実験群のすべてに体重減少が観察されるのに対し、陽性対照群にはウィルス攻撃後に全く体重減少が観察されなかったということがわかる。ウィルス攻撃に耐えたネズミは、研究の終わりまでに開始時の体重に回復した。表２２および表２３は、Ｍ２、セグメント７、および ＮＰ 抗原群 を含む試験群についてエンドポイント抗体を示している。色のついたボックスは、ウィルス攻撃後に死んだネズミを表している。
【表２２】
2008505660.tif 000096
【表２３】
2008505660.tif 000097
【０４２５】
研究GSJ05：
２種類の抗原組み合わせ、すなわち、S7 + NP とM2 + NIとの間の差異を明らかにする目的で、投与量を変える攻撃実験をこれらの二つのプラスミド組み合わせを用いて行った。ひとつのプラスミド当たり１００μｇ、３０μｇ、あるいは１０μｇを02Aポロキサマー剤に混合して、０週目および３週目に投与し、5週目に血液検査を行い、６週目にウィルス攻撃を行った。ＡからＨの試験群については一群当たり１６匹のネズミに接種を行い、一方対照群については一群当たり１２匹のネズミに接種を行った。ポロキサマー02Aで製剤化したＨＡプラスミド、VR4750 (HA H3) および VR4752 (HA H1)をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として含めた。試験群および２１日目攻撃後生存を、表２４に示す：
【表２４】
2008505660.tif 000098
【０４２６】
結果 
ＨＡ陽性対照については生存が９０％を超えること、ＨＡ陰性対照については１０％以下であることという性能判断基準は、再度満たされた。実験群についての性能判断基準（プラスミド当たりの投与量３０μｇで７５％を超えること）は、M2 + NP および S7 + NP の双方で満たされた（表２４）。事実、プラスミド当たりの投与量１０μｇで、S7 + NP および M2 + NPではそれぞれ、６９％、７５％の生存という結果を得た。M2 + NP の3種類の投与量の間にも、またS7 + NPの3種類の投与量の間にも、統計学的有意性（p < 0.05）はなく、また２００μｇ、６０μｇ、あるいは２０μｇの投与量でM2 + NP をS7 + NP に比較した場合にも、統計学的有意性（p < 0.05）はなかった。しかし、ＨＡ陽性対照対S7 + NPの間の、２００μｇおよび２０μｇの投与量において、統計学的有意性があった。身体質量データにより、体重減少およびそれからの回復がすべての生存実験プラスミドＤＮＡ接種群に観察されたが、ＨＡ陽性対照ネズミでは体重減少は観察されなかったということがわかる。Ｍ２およびＮＰに関する抗体データを表２５および表２６に示す。
【表２５】
2008505660.tif 000099
【表２６】
2008505660.tif 000100
【０４２７】
研究GSJ06
VR4759 (M2) および VR4762 (NP)のプラスミドの組み合わせをさらなるネズミインフルエンザ攻撃研究において使用して、付加的な製剤を調べた。
【０４２８】
上記の実験プロトコルを用いて、一群あたり１２匹のネズミに、以下の製剤形態で、同じ重さのVR4759 (M2) およびVR4762 (NP)の接種を行った：
・先の2つの攻撃実験で使用したポロキサマー02A 
・DNA ：DMRIE の分子比が４：１であるDMRIE + コレステロール (DM:Chol) 、DM：Chol の分子比は３：１である。
・DNA: VC1052の分子比が４：１であるVaxfectinTM(VC1052 + DPyPE)、VC1052: DpyPEの分子比は１：１である。
GSJ06の研究デザインおよび攻撃後２１日目生存 を、表２７に示す。
【表２７】
2008505660.tif 000101
【０４２９】
結果
ポリキサマー02A およびVaxfectinTMを混合して製剤化したプラスミドＤＮＡにつき、それぞれ、２０μｇpDNA 投与量で９２％および１００％の生存率が得られ、２μｇ の投与量で５８％および７５％の投与量が得られた（表２７）。
【０４３０】
攻撃開始日からネズミの各群につき、平均体重を追跡した。表２８に示すように、この実験では、E群の体重回復が４日目以降に開始し、一方その他の回復開始は７日目以降であったと言うことが注意を引いた。抗体力価を、表２９および３０に示すように、Ｍ２およびＮＰにつき定量し、灰色のボックスはウィルス攻撃後に死んだネズミを表す。
【表２８】
2008505660.tif 000102
【表２９】
2008505660.tif 000103
【表３０】
2008505660.tif 000104
【０４３１】
研究GSJ08
さらなる製剤比較をVR4759 (M2) およびVR4762 (NP)を用いて、行った。同じ体重の一試験群あたり１７匹のネズミ（Ａ群からＧ群まで）に、以下の製剤を用いて、VR4759 (M2) および VR4762 (NP) ベクターを接種した：
・ポロキサマー02A 
・VaxfectinTM （製剤ＡとＢは、異なった精製を表す）
・DNA 対DMRIE の分子比が４：１であるDMRIE ：DOPE 
・DNA 対DMRIE の分子比が２．５：１であるDMRIE：DOPE 
・PBS （製剤化されていないpDNA）
一試験群当たり１２匹のネズミを、６週目にインフルエンザウィルスで攻撃した。一試験群当たり５匹のネズミを、３６日目から３８日目に堵殺し、Ｔ−細胞検査を行った（IFN-γ ELISPOT）。試験群および攻撃後２１日目生存を、表３１に示す。Ａ群からＤ群およびＦ群からＧ群には、一注射あたり２０μｇの総プラスミドＤＮＡを用いて接種を行い、VaxfectinTMを加えて製剤化したｐＤＮＡでGSJ06研究において観察された体重減少および回復現象を調べた。
【表３１】
2008505660.tif 000105
【０４３２】
結果
DMRIE:DOPE およびVaxfectinTMで製剤化した群では、２０μｇのｐＤＮＡ 投与量で、９２％から１００％の生存率が得られた。Ａ群（ポロキサマー02A）とＧ群（ＰＢＳ）の生存率の結果は、陰性対照と比べて統計学的に差異がなかった（フィッシャーの直接確率検定のｐ値により測定した）が、DMRIE:DOPE およびVaxfectinTM の群（Ｂ群からＦ群）では、陰性対照と比べて統計学的に優れていた（(p<0.05）。従って、脂質を混合して製剤化したプラスミドＤＮＡは、ネズミのインフルエンザモデル攻撃において、より優れた保護を提供すると思われる。
【０４３３】
Ｂ群、Ｃ群、およびＤ群の体重減少と回復についての体重データを反復測定による分散分析混合モデル分析で分析したところによると、Ｂ群およびＤ群は統計学的に差異がなかったが、Ｃ群とＤ群は統計学的に差異があった。
【０４３４】
Ｔ−細胞性応答をIFN-γ ELISPOT アッセイにより、一群あたり５匹のネズミを使って、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸を包含するＭ２ペプチド（表３３）、バキュロウィルスで発現するＮＰタンパク質（表３４）、およびNP CD8+ Balb/c 免疫優勢ペプチド（表３５）を用いて、分析した。
【０４３５】
表３６および表３７に示す抗体力値を、Ｍ２およびＮＰタンパク質につき定量した。各群のリストの最初の１２匹のネズミを、４２日目に攻撃し、各群の最後の５匹のネズミを堵殺し、IFN-γ ELISPOT検査を行った。灰色のボックスは、ウィルス攻撃後に死んだネズミを表す。
【表３２】
2008505660.tif 000106
【表３３】
2008505660.tif 000107
【表３４】
2008505660.tif 000108
【表３５】
2008505660.tif 000109
【表３６】
2008505660.tif 000110
【表３７】
2008505660.tif 000111
【０４３６】
本発明は、本発明の個々の局面をわかりやすく説明することのみを意図している特定の実施例の範囲内に限定されるものではなく、機能的に同等であるいかなる組成物群も方法群も本発明の範囲内にある。実際、本明細書で示しまた説明している変更に加えて、前記の説明あるいは付随する図面により多様な変更が当業者には明白になるであろう。そのような変更は付加された請求項の範囲内に含まれるように意図した。
【０４３７】
本明細書に記載されている出版および特許出願はすべて、個々の出版および特許出願が特別にまた個別に参考として組み入れられていると示していることと同じ程度に、本明細書に参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０４３８】
【図１】図１は、SEQ ID NO:1（天然ＮＰコード領域）のヌクレオチド46-1542のアライメントを、ヒトに使用するためにコード領域を完全にコドン最適化した状態で(SEQ ID NO:23)、示している。
【図２】図２は、３．６ｍLの最終量において、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、７．５ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤をサーマルサイクルを使用して調整するためのプロトコルを示している。
【図３】図３は、４．０ｍLの最終量において、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、３４ｍｇ／ｍＬあるいは５０ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および２．５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤をサーマルサイクルを使用して調整するためのプロトコルを示している。
【図４】図４は、０．３ｍＭ  ＢＡＫ、７．５ｍｇ／ｍＬ  ＣＲＬ  １００５および５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから成る製剤の簡易調製法（サーマルサイクルなし）を示している。
【図５】図５は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を単回投与した後３週間目の抗ＮＰ抗体応答を示している。
【図６】図６は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を二回目に投与した後１２日目の抗ＮＰ抗体応答を示している。
【図７】図７は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を投与した場合のＣＤ８＋Ｔ−細胞性応答を示している。
【図８】図８は、インフルエンザウィルスＮＰタンパク質に対し、組み合わせプライム−ブーストワクチン製剤を投与した場合のＣＤ４＋Ｔ−細胞性応答を示している。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＬＡＶ  ＨＡ（Ｈ３）をコードするプラスミドを用いた２投与量ネズミ予防接種投与計画研究の結果を示している。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、セグメント７由来のＭ１およびＭ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現、およびＭ１Ｍ２融合を示している。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ｅＭ２−ＮＰおよびコドン最適化インフルエンザウィルスNPタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を示している。
【図１２】図１２は、２２全長ＮＰ配列とアライメントしたＡ型インフルエンザＮＰタンパク質コンセンサスアミノ酸配列を示している。
【図１３】図１３は、本明細書で説明しているインフルエンザタンパク質をコードする多様なベクターの概略図である。
【図１４】図１４は、実施例１３の実験３で説明しているウェスタンブロット実験の結果である。ブロットは、異なる発現ベクター由来のインフルエンザタンパク質の発現を比較するために、Ｍ２あるいはＮＰ を発現するプラスミドを用いて形質移入したＶＭ９２細胞の溶解産物を示している。
【図１５】図１５は、実施例１３の実験３で説明しているウェスタンブロット実験の結果である。異なる発現ベクター由来のインフルエンザタンパク質の発現を比較するために、Ｍ１，Ｍ２，あるいはＮＰを発現するプラスミドを用いて形質移入したVM92細胞の溶解産物を示している。
【図１Ａ】
2008505660.tif 000112
【図１Ｂ】
2008505660.tif 000113
【図１Ｃ】
2008505660.tif 000114
【図１Ｄ】
2008505660.tif 000115
【図１Ｅ】
2008505660.tif 000116
【図１Ｆ】
2008505660.tif 000117
【図１Ｇ】
2008505660.tif 000118
【図１Ｇ−１】
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【図２】
2008505660.tif 000120
【図３】
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【図４】
2008505660.tif 000122
【図５】
2008505660.tif 000123
【図６】
2008505660.tif 000124
【図７】
2008505660.tif 000125
【図８】
2008505660.tif 000126
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2008505660.tif 000129
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２−１】
2008505660.tif 000133
【図１２−２】
2008505660.tif 000134
【図１２−３】
2008505660.tif 000135
【図１２−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である前記単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がTTTであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がTTCであり；
前記コード領域の３３個のロイシンコドンのうち約２個がTTAであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がTTGであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がCTTであり、前記ロイシンコドンのうち約６個がCTCであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がCTAであり、さらに前記ロイシンコドンのうち約１３個がCTGであり；
前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がATTであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がATCであり、さらに前記イソロイシンコドンのうち約４個がATAであり；
前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり；
前記コード領域の２３個のバリンコドンのうち約４個がGTTであり、前記バリンコドンのうち約５個がGTGであり、前記バリンコドンのうち約３個がGTAであり、さらに前記バリンコドンのうち約１１個がGTGであり；
前記コード領域の４０個のセリンコドンのうち約７個がTCTであり、前記セリンコドンのうち約９個がTCCであり、前記セリンコドンのうち約６個がTCAであり、前記セリンコドンのうち約２個がTCGであり、前記セリンコドンのうち約６個がAGTであり、さらに前記セリンコドンのうち約１０個がAGCであり；
前記コード領域の１７個のプロリンコドンのうち約５個がCCTであり、前記プロリンコドンのうち約６個がCCCであり、前記プロリンコドンのうち約５個がCCAであり、さらに前記プロリンコドンのうち約２個がCCGであり；
前記コード領域の２８個のスレオニンコドンのうち約７個がACTであり、前記スレオニンコドンのうち約１０個がACCであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がACAであり、さらに前記スレオニンコドンのうち約３個がACGであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がGCTであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がGCCであり、前記アラニンコドンのうち約９個がGCAであり、さらに前記アラニンコドンのうち約４個がGCGであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がTATであり前記チロシンコドンのうち約８個がTACであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がCATであり前記ヒスチジンコドンのうち約４個がCACであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がCAAであり前記グルタミンコドンのうち約１６個がCAGであり；
前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がAATであり前記アスパラギンコドンのうち約１４個がAACであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がAAAであり前記リジンコドンのうち約１２個がAAGであり；
前記コード領域の２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がGATであり前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がGACであり；
前記コード領域の２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がGAAであり前記グルタミン酸コドンのうち約１５個がGAGであり；
前記コード領域の６個のシステインコドンのうち約３個がTGTであり前記システインコドンのうち約３個がTGCであり；６個のトリプトファンコドンがTGGであり；
前記コード領域の４９個のアルギニンコドンのうち約４個がCGTであり、前記アルギニンコドンのうち約９個がCGCであり、前記アルギニンコドンのうち約５個がCGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がCGGであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGGであり；
前記コード領域の４１個のグリシンコドンのうち約７個がGGTであり、前記グリシンコドンのうち約１４個がGGCであり、前記グリシンコドンのうち約１０個がGGAであり、さらに前記グリシンコドンのうち約１０個がGGGであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:23を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンがTTCであり、前記コード領域の３３個のロイシンコドンがCTGであり、前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンがATCであり、前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり、前記コード領域の２３個のバリンコドンがGTGであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンがAGCであり、前記コード領域の１７個のプロリンコドンがCCCであり、前記コード領域の２８個のスレオニンコドンがACCであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンがGCCであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンがTACであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンがCACであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンがCAGであり、前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンがAACであり、前記コード領域の２１個のリジンコドンがAAGであり、前記コード領域の２２個のアルパラギン酸コドンがGACであり、前記コード領域の３６個のグルタミン酸コドンがGAGであり、前記コード領域の６個のトリプトファンコドンがTGGであり、前記コード領域の４９個のアルギニンコドンがCGG、AGA、及びAGGから成る群から選択されており、さらに前記コード領域の４１個のグリシンコドンがGGCであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:24を含む、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:2の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１個のグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１個のリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド４６から１５４２から成り；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:25を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がTTTであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がTTCであり；
前記コード領域の３３個のロイシンコドンのうち約２個がTTAであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がTTGであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がCTTであり、前記ロイシンコドンのうち約６個がCTCであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がCTAであり、さらに前記ロイシンコドンのうち約１３個がCTGであり；
前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がATTであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がATCであり、さらに前記イソロイシンコドンのうち約４個がATAであり；
前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり；
前記コード領域の２３個のバリンコドンのうち約４個がGTTであり、前記バリンコドンのうち約５個がGTGであり、前記バリンコドンのうち約３個がGTAであり、さらに前記バリンコドンのうち約１１個がGTGであり；
前記コード領域の４０個のセリンコドンのうち約７個がTCTであり、前記セリンコドンのうち約９個がTCCであり、前記セリンコドンのうち約６個がTCAであり、前記セリンコドンのうち約２個がTCGであり、前記セリンコドンのうち約６個がAGTであり、さらに前記セリンコドンのうち約１０個がAGCであり；
前記コード領域の１７個のプロリンコドンのうち約５個がCCTであり、前記プロリンコドンのうち約６個がCCCであり、前記プロリンコドンのうち約５個がCCAであり、さらに前記プロリンコドンのうち約２個がCCGであり；
前記コード領域の２８個のスレオニンコドンのうち約７個がACTであり、前記スレオニンコドンのうち約１０個がACCであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がACAであり、さらに前記スレオニンコドンのうち約３個がACGであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がGCTであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がGCCであり、前記アラニンコドンのうち約９個がGCAであり、さらに前記アラニンコドンのうち約４個がGCGであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がTATであり前記チロシンコドンのうち約８個がTACであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がCATであり前記ヒスチジンコドンのうち約４個がCACであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がCAAであり前記グルタミンコドンのうち約１６個がCAGであり；
前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がAATであり前記アスパラギンコドンのうち約１４個がAACであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がAAAであり前記リジンコドンのうち約１２個がAAGであり；
前記コード領域の２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がGATであり前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がGACであり；
前記コード領域の２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がGAAであり前記グルタミン酸コドンのうち約１５個がGAGであり；
前記コード領域の６個のシステインコドンのうち約３個がTGTであり前記システインコドンのうち約３個がTGCであり；６個のトリプトファンコドンがTGGであり；
前記コード領域の４９個のアルギニンコドンのうち約４個がCGTであり、前記アルギニンコドンのうち約９個がCGCであり、前記アルギニンコドンのうち約５個がCGAであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がCGGであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGAであり、さらに前記アルギニンコドンのうち約１０個がAGGであり；
前記コード領域の４１個のグリシンコドンのうち約７個がGGTであり、前記グリシンコドンのうち約１４個がGGCであり、前記グリシンコドンのうち約１０個がGGAであり、さらに前記グリシンコドンのうち約１０個がGGGであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンがTTCであり、前記コード領域の３３個のロイシンコドンがCTGであり、前記コード領域の２６個のイソロイシンコドンがATCであり、前記コード領域の２５個のメチオニンコドンがATGであり、前記コード領域の２３個のバリンコドンがGTGであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンがAGCであり、前記コード領域の１７個のプロリンコドンがCCCであり、前記コード領域の２８個のスレオニンコドンがACCであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンがGCCであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンがTACであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンがCACであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンがCAGであり、前記コード領域の２６個のアスパラギンコドンがAACであり、前記コード領域の２１個のリジンコドンがAAGであり、前記コード領域の２２個のアルパラギン酸コドンがGACであり、前記コード領域の３６個のグルタミン酸コドンがGAGであり、前記コード領域の６個のトリプトファンコドンがTGGであり、前記コード領域の４９個のアルギニンコドンがCGG、AGA、及びAGGから成る群から選択されており、前記コード領域の４１個のグリシンコドンがGGCであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
SEQ ID NO:2に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１個のグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１個のリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド４６から１５４２から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:2に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:2をコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１から１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42から成る群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインがSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に可能にプロモータが附随している、請求項１から２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ＲＮＡである、請求項１から２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０】
プラスミドである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項１から２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項３２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物から成る群から選択される構成成分を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(c)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(d)  CRL1005/BAK
から成る群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記アジュバントが、((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
から成る群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
から成る群から選択される濃度で存在する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３７あるいは請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１から２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項４１】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約4個がＴＴＣであり；
前記コード領域の２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧであり；
前記コード領域の１１個のイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡであり；
前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の１６個のバリンコドンのうち約３個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり；
前記コード領域の１８個のセリンコドンのうち約３個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＡＧＣであり；
前記コード領域の８個のプロリンコドンのうち約２個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧであり；
前記コード領域の１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧであり；
前記コード領域の２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧであり；
前記コード領域の５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣであり；
前記コード領域の５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣであり；
前記コード領域の１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の１１個のアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣであり；
前記コード領域の１３個のリジンコドンのうち約５個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約８個がＡＡＧであり；
前記コード領域の６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣであり；
前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧであり；および
前記コード領域の１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:26を含む、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の１１個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の１１個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、前記コード領域の１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ，ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択され、前記コード領域の１６個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:27を含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
SEQ ID NO:4の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２６個のロイシンコドンがCTGであり、８個のプロリンコドンがCCCであり、２５個のアラニンコドンがGCCであり、１５個のグルタミンコドンがCAGであり、１１個のアルパラギンコドンがAACであり、１３個のリジンコドンがAAGであり、１７個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から７８４から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:28を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項４１から４６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項４１から４７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項４１から４８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約4個がＴＴＣであり；
前記コード領域の２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧであり；
前記コード領域の１１個のイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡであり；
前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の１６個のバリンコドンのうち約３個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり；
前記コード領域の１８個のセリンコドンのうち約３個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約４個がＡＧＣであり；
前記コード領域の８個のプロリンコドンのうち約２個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧであり；
前記コード領域の１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧであり；
前記コード領域の２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧであり；
前記コード領域の５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣであり；
前記コード領域の５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣであり；
前記コード領域の１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の１１個のアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣであり；
前記コード領域の１３個のリジンコドンのうち約５個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約８個がＡＡＧであり；
前記コード領域の６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣであり；
前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧであり；および
前記コード領域の１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:４に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の１１個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の１１個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、前記コード領域の１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ，ＡＧＡ，ＡＧＧであり、前記コード領域の１６個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:4に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
SEQ ID NO:4に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:4のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２６個のロイシンコドンがCTGであり、８個のプロリンコドンがCCCであり、２５個のアラニンコドンがGCCであり、１５個のグルタミンコドンがCAGであり、１１個のアルパラギンコドンがAACであり、１３個のリジンコドンがAAGであり、１７個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から７８４から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:4に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:4に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:4をコードする、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項４１から５８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:41を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項４１から６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
ＲＮＡである、請求項４１から６３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項６８】
プラスミドである、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項７０】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成要素から成る、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジコリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７２】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７５】
前記アジュバントあるいは形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）から成る、請求項７０に記載の組成物。
【請求項７６】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項７５あるいは請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項４１から６６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項７９】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣであり；
前記コード領域の１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＧであり；
前記コード領域の７個のセリンコドンのうち約１個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＡＧＣであり；
前記コード領域の４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧであり；
前記コード領域の４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧであり；
前記コード領域の５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧであり；
前記コード領域の３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣであり；
前記コード領域の２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣであり；
前記コード領域の５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３個がＡＡＧであり；
前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧであり；
前記コード領域の８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:29を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の７個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり、さらに前記コード領域の８個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:30を含む、請求項８１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:5の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
１０個のロイシンコドンがCTGであり、４個のプロリンコドンがCCCであり、５個のアラニンコドンがGCCであり、２個のグルタミンコドンがCAGであり、３個のアルパラギンコドンがAACであり、５個のリジンコドンがAAGであり、さらに９個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域が、NO:3のヌクレオチド７４０から１００７にフレーム内で融合されているSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から５１から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:31を含む、請求項８３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４をコードする、請求項７９から８３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項７９から８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項７９から８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項７９から８７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣであり；
前記コード領域の１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約２個がＧＴＧであり；
前記コード領域の７個のセリンコドンのうち約１個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約２個がＡＧＣであり；
前記コード領域の４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧであり；
前記コード領域の４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧであり；
前記コード領域の５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧであり；
前記コード領域の３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣであり；
前記コード領域の２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧであり；
前記コード領域の３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣであり；
前記コード領域の５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３個がＡＡＧであり；
前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣであり；
前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧであり；
前記コード領域の３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧであり；
前記コード領域の８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:5に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項８９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の７個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧからなる群から選択され、前記コード領域の８個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:5に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:5に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:5のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
１０個のロイシンコドンがCTGであり、４個のプロリンコドンがCCCであり、５個のアラニンコドンがGCCであり、２個のグルタミンコドンがCAGであり、３個のアルパラギンコドンがAACであり、５個のリジンコドンがAAGであり、９個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域が、NO:3のヌクレオチド７４０から１００７にフレーム内で融合されているSEQ ID NO:3のヌクレオチド２６から５１から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:5に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:５に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項９５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:5をコードする、請求項９６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項７９から９７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項９８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項９９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記異種のポリペプチドがＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質である、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質がSEQ ID NO:2から成る、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項７９から１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
ＲＮＡである、請求項７９から１０３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１０５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１０８】
プラスミドである、請求項１０７に記載のベクター。
【請求項１０９】
請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項１１０】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよび [mono-phosphoryl lipid A] およびトレハロースジコリノミコレートＡＦ[trehalosedicorynomycolate AF] (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項１１５あるいは請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法で、請求項７９から１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:7の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＣＵであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１個のアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:32を含む、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:7の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり、前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:33を含む、請求項１２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項１１９から１２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１１９から１２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:7に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約４個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＧＴであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１個のアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:7に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7をコードする、請求項１２６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
SEQ ID NO:5＊４２に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:7のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり、さらに前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:7に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:7に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
前記核酸断片がSEQ ID NO:7をコードする、請求項１２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１１９から１３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１３３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１１９から１３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
ＲＮＡである、請求項１１９から１３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１３９】
プラスミドである、請求項１３８に記載のベクター。
【請求項１４０】
請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項１４１】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項１４２】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド) ((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(syn-9-tetradeceneyloxy)-1-propanaminium bromide)]（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジコリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１４３に記載の組成物。
【請求項１４５】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミドを含む、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１４１に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記CRL1005およびBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１４６に記載の組成物。
【請求項１４８】
曇点より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせることにより製剤化した、請求項１４６あるいは請求項１４７に記載の組成物。
【請求項１４９】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１１９から１３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１５０】
SEQ ID NO:9の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＣＵであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１個のアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５１】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:34を含む、請求項１５０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５２】
SEQ ID NO:9の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり、前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５３】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:35を含む、請求項１５２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５４】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9の少なくとも５０個のアミノ酸をコードする、請求項１５０から１５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１５０から１５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５６】
SEQ ID NO:9に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣであり；
前記コード領域の３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧであり；
前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡであり；
前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
前記コード領域の２４個のバリンコドンのうち約４個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧであり；
前記コード領域の４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、前記セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
前記コード領域の１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧであり；
前記コード領域の３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
前記コード領域の３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＣＵであり、前記アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
前記コード領域の１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；
前記コード領域の６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣであり；
前記コード領域の２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧであり；
前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣであり；
前記コード領域の２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧであり；
前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣであり；
前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧであり；
前記コード領域の８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約４個がＴＧＣであり；
前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
前記コード領域の５１個のアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧであり；
前記コード領域の４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:9に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9をコードする、請求項１５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
SEQ ID NO:9に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドで、前記核酸断片がSEQ ID NO:9のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧであり、さらに前記コード領域の４３個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:9に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:9に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１５９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:9をコードする、請求項１６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１５０から１６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６３】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６４】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項１６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６５】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項１６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１５０から１６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
ＲＮＡである、請求項１５０から１６５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１６７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６９】
請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項１７０】
プラスミドである、請求項１６９に記載のベクター。
【請求項１７１】
請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと担体とを含む組成物。
【請求項１７２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される構成成分を含む、請求項１７１に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記アジュバントが、((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項１７３に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項１７４に記載の組成物。
【請求項１７６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項１７２に記載の組成物。
【請求項１７９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項１７６あるいは請求項１７８に記載の組成物。
【請求項１８０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項１５０から１６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項１８１】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２１個のフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣであり；
３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧであり；
３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡであり；
２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧであり；
４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、ｖセリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧであり；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
４１個のアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣであり；
１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧであり；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣであり；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧであり；
３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣであり；
３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧであり；
５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約３個がＴＧＣであり；
単一のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
３０個のアルギニンコドンのうち約２個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧであり；
４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８２】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:36を含む、請求項１８１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８３】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の２１個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の４１個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧ（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）からなる群から選択され、さらに前記コード領域の４４個のグリシンコドンはＧＧＣであり； 
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８４】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:37を含む、請求項１８３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８５】
SEQ ID NO:16の少なくとも２０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片はSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の核酸断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
３９個のロイシンコドンがCTGであり、２６個のプロリンコドンがCCCであり、４１個のアラニンコドンがGCCであり、１９個のグルタミンコドンがCAGであり、２５個のアルパラギンコドンがAACであり、５２個のリジンコドンがAAGであり、３０個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド１から１６８０から成り； 
前記の少なくとも２０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８６】
前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:38を含む、請求項１８５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16の少なくとも５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１８１から１８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16の少なくとも１００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項１８１から１８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１８８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９０】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:2のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
２１個のフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、前記フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣであり；
３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、前記ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、前記ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、前記ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、前記ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧであり；
３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、前記イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、前記イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡであり；  ２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり；
３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、前記バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、前記バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、前記バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧであり；
４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、前記セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、前記セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、前記セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、前記セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣであり；
２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、前記プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、前記プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、前記プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧであり；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、前記スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、前記スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、前記スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧであり；
４１個のアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、前記アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、前記アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、前記アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧであり；
１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、前記チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣであり；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、前記ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣであり；
１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、前記グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧであり；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、前記アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣであり；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、前記リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧであり；
３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、前記アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣであり；
３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、前記グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧであり；
５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、前記システインコドンのうち約３個がＴＧＣであり；
単一のトリプトファンコドンはＴＧＧであり；
３０個のアルギニンコドンのうち約２個がＣＧＴであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、前記アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、前記アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧであり；
４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、前記グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、前記グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:2に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９１】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１９１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９３】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸断片がSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である単離ポリヌクレオチドにおいて；
前記コード領域の２１個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、前記コード領域の３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、前記コード領域の３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、前記コード領域の２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、前記コード領域の３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、前記コード領域の４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、前記コード領域の２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、前記コード領域の３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、前記コード領域の４１個のアラニンコドンはＧＣＣであり、前記コード領域の１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、前記コード領域の４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、前記コード領域の１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、前記コード領域の２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、前記コード領域の５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、前記コード領域の３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、前記コード領域の３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、前記コード領域の１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、前記コード領域の３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）であり、さらに前記コード領域の４４個のグリシンコドンはＧＧＣであり；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９４】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９５】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１９４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９６】
SEQ ID NO:16に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片から成る単離ポリヌクレオチドで、前記核酸断片がSEQ ID NO:16のポリペプチドのコドン最適化コード領域の変異体断片である前記単離ポリヌクレオチドにおいて；
３３個のロイシンコドンがCTGであり、１７個のプロリンコドンがCCCであり、３９個のアラニンコドンがGCCであり、２１個のグルタミンコドンがCAGであり、２６個のアルパラギンコドンがAACであり、２１個のリジンコドンがAAGであり、３６個のグルタミン酸コドンがGAGであることを除いて、前記コドン最適化コード領域がSEQ ID NO:1のヌクレオチド１から１６８０から成り；
前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:16に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９７】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:16に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項１９６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:16をコードする、請求項１９７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９９】
前記核酸断片を異種の核酸に連結した、請求項１８１から１９８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２００】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項１９９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０１】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０２】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２０１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０３】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０４】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０５】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインがSEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４を含む、請求項２０４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０６】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項１８１から２０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０７】
ＲＮＡである、請求項１８１から２０５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０８】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２０７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０９】
請求項１８１から２０８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１０】
プラスミドである、請求項２０９に記載のベクター。
【請求項２１１】
請求項１８１から２０８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２１２】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２１１に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２１３に記載の組成物。
【請求項２１５】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項２１４に記載の組成物。
【請求項２１６】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記アジュバントあるいは形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項２１７に記載の組成物。
【請求項２１９】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項２１７又は２１８に記載の組成物。
【請求項２２０】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法で、請求項１８１から２０９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをそのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項２２１】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、およびインフルエンザウィルスタンパク質／またはその断片／変異体あるいは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成要素から成る、請求項３１から３９、６９から７７、１０９から１１７、１４０から１４８、１７１から１７９、又は２１１から２１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２２】
前記単離ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、インフルエンザＭ２タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインに融合されたＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質を含むポリペプチド、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質に融合されたＡ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質を含むポリペプチド、並びにＢ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体からなる群から選択される任意の単離インフルエンザウィルスポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体である、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２３】
前記単離ポリペプチドが、脊椎動物に免疫応答を誘導することができる免疫原性を有するエピトープを少なくとも１個含む、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２４】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドが同一の製剤に含まれている、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２５】
前記組成物が組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物である、請求項２２４に記載の組成物。
【請求項２２６】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが異なった製剤に含まれており、前記異なった製剤が連続して又は同時に投与される、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２７】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に比べて、同等の又はそれより高い免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２８】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせがより広範囲の免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２２９】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量で治療効果を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２３０】
前記コドン最適化核酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少ない単離ポリペプチド投与量で治療効果を提供する、請求項２２９に記載の組成物。
【請求項２３１】
前記コドン最適化核酸組成物及び前記単離ポリペプチドの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量でより広範囲の免疫応答を提供する、請求項２２１に記載の組成物。
【請求項２３２】
請求項３２から３９、７０から７８、１１１から１１９、１４３から１５１、１７５から１８３のいずれか１項に記載されている前記組成物、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを投与することにより得られる免疫応答に比べて、前記免疫応答が同等であるかあるいはより高い、請求項２２１に記載の組成物を投与することにより免疫応答を誘導する方法。
【請求項２３３】
前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３４】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、前記節約された投与量が従来投与濃度より低い濃度である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３５】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３６】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドの節約された投与量が、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない、請求項２３４に記載の方法。
【請求項２３７】
前記免疫応答が、高められた細胞性免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３８】
前記免疫応答が、高められた体液性免疫応答である、請求項２３２に記載の方法。
【請求項２３９】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要としている脊椎動物に、請求項１から２８、４１から６６、７９から１０６、１５０から１６８のいずれか１項に記載されているポリヌクレオチドあるいは請求項３１から３９、６９から７７、１０９から１１７、１７１から１７９、２２１から２３１のいずれか１項に記載されている組成物を、請求項１８１から２０８に記載されている任意のポリヌクレオチド又は請求項２１１から２１９に記載されている任意の成分との組み合わせ又は置換による形態で、投与することを含む方法。
【請求項２４０】
SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む単離ポリペプチドであって、前記の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリペプチド。
【請求項２４１】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４２】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも２５０個の連続したアミノ酸を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４３】
SEQ ID NO:76に少なくとも９０％は同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリペプチド。
【請求項２４４】
前記アミノ酸がSEQ ID NO:76に少なくとも９５％は同一である、請求項２４３に記載のポリペプチド。
【請求項２４５】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項２４０に記載のポリペプチド。
【請求項２４６】
さらに、前記ポリペプチドに連結された異種のポリペプチドを含む、請求項２４０から２４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４７】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２４６に記載のポリペプチド。
【請求項２４８】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２４７に記載のポリペプチド。
【請求項２４９】
前記異種のポリペプチドが少なくとも、インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項２４６に記載のポリペプチド。
【請求項２５０】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４およびSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択される、請求項２４９に記載のポリペプチド。
【請求項２５１】
請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載のポリペプチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２５２】
さらに、アジュバントを含む、請求項２５１に記載の組成物。
【請求項２５３】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載のポリペプチドを、そのような治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項２５４】
SEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記の少なくとも１５０個の連続したアミノ酸が、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５５】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76の少なくとも２００個の連続したアミノ酸をコードする、請求項２５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５６】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76の少なくとも２５０個の連続したアミノ酸をコードする、請求項２５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５７】
SEQ ID NO:76に少なくとも９０％は同一であるポリペプチドをコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが、脊椎動物に投与された場合に、SEQ ID NO:76に対する検知可能な免疫応答を誘導することを特徴とする前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５８】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76に少なくとも９５％は同一であるポリペプチドをコードする、請求項２５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:76のコンセンサスアミノ酸配列をコードする、請求項２５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６０】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:76のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項２５４から２５９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:75を含む、請求項２６０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６２】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項２５４から２６１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６３】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合された異種のポリペプチドをコードする、請求項２６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６４】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６５】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40 及び SEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２６４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６６】
SEQ ID NO:43を含む、請求項２６５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６７】
前記異種のポリペプチドが少なくともインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外領域を含む、請求項２６３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６８】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４及びSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択される、請求項２６７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６９】
ＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項２５４から２６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７０】
ＲＮＡである、請求項２５４から２６８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７１】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２７０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７２】
請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７３】
前記ベクターがプラスミドである、請求項２７２に記載のベクター。
【請求項２７４】
請求項２５４から２９２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、担体とを含む組成物。
【請求項２７５】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２７４に記載の組成物。
【請求項２７６】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２７７】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２８０】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２７５に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および 
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項２８０又は請求項２８２に記載の組成物。
【請求項２８３】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項２８４】
脊椎動物に投与されると前記アミノ酸配列を発現しSEQ ID NO:77に対する検知可能な免疫応答を誘導する、SEQ ID NO:77のコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８５】
前記核酸断片が、SEQ ID NO:77のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項２８４に記載のベクター。
【請求項２８６】
前記核酸断片がSEQ ID NO:79を含む、請求項２８５に記載のベクター。
【請求項２８７】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項２８４から２８６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８８】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項２８７に記載のベクター。
【請求項２８９】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項２８８に記載のベクター。
【請求項２９０】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項２８９に記載のベクター。
【請求項２９１】
前記異種のポリペプチドがインフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２８７に記載のベクター。
【請求項２９２】
前記インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインが、SEQ ID NO:5のアミノ酸１から２４及びSEQ ID NO:78のアミノ酸１から２４から成る群から選択されている、請求項２９１に記載のベクター。
【請求項２９３】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項２８４から２９２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２８４から２９２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９５】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項２９４に記載のベクター。
【請求項２９６】
プラスミドである、請求項２８４から２９３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２９７】
請求項２８４から２９６のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項２９８】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項２９７に記載の組成物。
【請求項２９９】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３００】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項２９９に記載の組成物。
【請求項３０１】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３００に記載の組成物。
【請求項３０２】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３０３】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005および塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項２９８に記載の組成物。
【請求項３０４】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３０３に記載の組成物。
【請求項３０５】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３０３又は請求項３０４に記載の組成物。
【請求項３０６】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項２８４から２９６のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３０７】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、SEQ ID NO:77のコンセンサスアミノ酸配列を含むポリペプチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することかを含む方法。
【請求項３０８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:77のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域を含む核酸断片によりコードされる、請求項３０７に記載の方法。
【請求項３０９】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:79を含む核酸断片によりコードされる、請求項３０８に記載の方法。
【請求項３１０】
脊椎動物に投与されると前記アミノ酸配列を発現しSEQ ID NO:78に対する検知可能な免疫応答を誘導する、SEQ ID NO:78のコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドから成るベクター。
【請求項３１１】
前記核酸断片がSEQ ID NO:78のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域の断片である、請求項３１０に記載のベクター。
【請求項３１２】
前記核酸断片がSEQ ID NO:80を含む、請求項３１１に記載のベクター。
【請求項３１３】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項３１０から３１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１４】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項３１３に記載のベクター。
【請求項３１５】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項３１４に記載のベクター。
【請求項３１６】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項３１５に記載のベクター。
【請求項３１７】
前記異種のポリペプチドが、インフルエンザウィルスＭ１タンパク質又はその断片である、請求項３１３に記載のベクター。
【請求項３１８】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１９】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２０】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３１９に記載のベクター。
【請求項３２１】
プラスミドである、請求項３１０から３１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２２】
請求項３１０から３２１のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項３２３】
さらに、アジュバントおよび形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３２２に記載の組成物。
【請求項３２４】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２５】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３２４に記載の組成物。
【請求項３２６】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３２５に記載の組成物。
【請求項３２７】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２８】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３２３に記載の組成物。
【請求項３２９】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３２８に記載の組成物。
【請求項３３０】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３２８又は３２９に記載の組成物。
【請求項３３１】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３１０から３２１のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３３２】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、SEQ ID NO:78のコンセンサスアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む前記方法。
【請求項３３３】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:78のポリペプチドに対するコドン最適化コード領域を含む核酸断片によりコードされる、請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３４】
前記ポリペプチドがSEQ ID NO:80を含む核酸断片によりコードされる、請求項３３３に記載の方法。
【請求項３３５】
SEQ ID NO:60の核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドを含有するベクターであって、前記核酸断片が脊椎動物に投与された場合にSEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリペプチドの断片を発現し、前記ポリペプチドの断片がSEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78及びそれらの混合物からなる群から選択される前記ポリペプチドに対する検知可能な免疫応答を誘導する、前記ベクター。
【請求項３３６】
前記核酸断片がコドン最適化されている、請求項３３５に記載のベクター。
【請求項３３７】
前記核酸断片がSEQ ID NO:79を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３３８】
前記核酸断片がSEQ ID NO:80を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３３９】
前記核酸断片がSEQ ID NO:61を含む、請求項３３６に記載のベクター。
【請求項３４０】
さらに、前記核酸断片に連結された異種の核酸を含む、請求項３３５から３３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４１】
前記異種の核酸が、前記核酸断片によりコードされるポリペプチドに融合されている異種のポリペプチドをコードする、請求項３４０に記載のベクター。
【請求項３４２】
前記異種のポリペプチドがＢ型肝炎コア抗原である、請求項３４１に記載のベクター。
【請求項３４３】
前記Ｂ型肝炎コア抗原が、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:42を含む群から選択されるポリペプチドの少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項３４２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、前記核酸断片に作動可能にプロモータが附随している、請求項３３５から３４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４５】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３３５から３４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４６】
前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項３４５に記載のベクター。
【請求項３４７】
プラスミドである、請求項３３５から３４４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４８】
請求項３３５から３４７のいずれか１項に記載のベクターと、担体とを含む組成物。
【請求項３４９】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３４８に記載の組成物。
【請求項３５０】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジミクリノコレートＡＦ(MPL + TDM)；
(d)  溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)  CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５１】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３５０に記載の組成物。
【請求項３５２】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３５１に記載の組成物。
【請求項３５３】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５４】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物がCRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３４９に記載の組成物。
【請求項３５５】
前記CRL1005及びBAKが
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３５４に記載の組成物。
【請求項３５６】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK、およびポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３５４又は請求項３５５に記載の組成物。
【請求項３５７】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３３５から３４７のいずれか１項に記載のベクターを、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【請求項３５８】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、及びインフルエンザウィルスタンパク質／又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成成分を含む、請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、又は３４８から３５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５９】
前記単離ポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、インフルエンザＭ２タンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質の細胞外ドメインに融合されたＡ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質を含むポリペプチド、Ａ型インフルエンザウィルスＭ２タンパク質に融合されたＡ型インフルエンザウィルスＭ１タンパク質を含むポリペプチド、及びＢ型インフルエンザウィルスＮＰタンパク質断片又はその変異体若しくは誘導体からなる群から選択される任意の単離インフルエンザウィルスポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体である、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６０】
前記単離ポリペプチドが、脊椎動物に免疫応答を誘導することができる免疫原性を有するエピトープを少なくとも１個含む、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６１】
前記コンセンサスアミノ酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが同一の製剤に含まれている、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６２】
前記組成物が組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物である、請求項３６１に記載の組成物。
【請求項３６３】
前記コンセンサスアミノ酸組成物と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとが異なった製剤に含まれており、前記異なった製剤が連続して又は同時に投与される、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６４】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に比べて、同等の又はそれより高い免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６５】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせがより広範囲の免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６６】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、個々の構成成分を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量で治療効果を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６７】
前記コンセンサスアミノ酸組成と、インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体／誘導体に由来する前記単離ポリペプチドとの組み合わせが、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない単離ポリペプチド投与量で治療効果を提供する、請求項３６６に記載の組成物。
【請求項３６８】
前記コンセンサスアミノ酸組成および前記単離ポリペプチドの組み合わせが、個々の構成要素を単独で投与した場合に得られる治療効果に比べて、より少ない投与量でより広範囲の免疫応答を提供する、請求項３５８に記載の組成物。
【請求項３６９】
請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、３４８から３５６のいずれか１項に記載されている前記組成物、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを投与することにより得られる免疫応答に比べて、前記免疫応答が同等であるかあるいはより高い、請求項３５８に記載の組成物を投与することにより免疫応答を誘導する方法。
【請求項３７０】
前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７１】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記節約された投与量が従来投与濃度より低い濃度である、請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７２】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドを、節約された投与量で投与することにより、前記免疫応答が達成され、さらに前記免疫応答がより広範囲の免疫応答である、請求項３７１に記載の方法。
【請求項３７３】
インフルエンザウィルスタンパク質、又はその断片／変異体若しくは誘導体に由来する前記単離ポリペプチドの節約された投与量が、ポリペプチドを単独で投与した場合に比べて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％少ない、請求項３７１に記載の方法。
【請求項３７４】
前記免疫応答が、高められた細胞性免疫応答である、請求項３７０に記載の方法。
【請求項３７５】
前記免疫応答が、高められた体液性免疫応答である、請求項３７０に記載の方法。
【請求項３７６】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、そのような治療又は予防するを必要としている脊椎動物に、請求項２５４から２７１のいずれか１項に記載されているポリヌクレオチド又は請求項２４０から２５０のいずれか１項に記載されているポリペプチドを、請求項２５１、２５２、２７４から２８２、２９７から３０５、３２２から３３０、又は３４８から３５６に記載されている任意の組成物との組み合わせ又は置換による形態で、投与することを含む当該方法。
【請求項３７７】
プラスミドバックボーンがVR10551バックボーン、VR10682バックボーン及びVR10686バックボーンから成る群から選択される、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３７８】
前記プラスミドバックボーンが、ヒトサイトメガロウィルスプロモータ、ニワトリ肉腫ウィルスプロモータ、プラスミドVCL1005由来の修飾ニワトリ肉腫ウィルスプロモータ、及びヒトＴ−細胞白血病ウィルス-I RU5因子に融合したニワトリ肉腫ウィルスプロモータからなる群から選択されるプロモータを含む、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３７９】
さらに、付加的なプロモータを含む、請求項３０、６８、１０８、１３９、１７０、２１０、２７３、３２１および３４７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項３８０】
さらに、請求項１から２６、４１から６４、７９から１０４、１１９から１３５、１５０から１６６、１８１から２０６および２５４から２６９のいずれか１項に記載の付加的なポリヌクレオチドを含む、請求項３７９に記載のプラスミド。
【請求項３８１】
さらに、SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:77；SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:79；及びSEQ ID NO:80から成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項３７９に記載のプラスミド。
【請求項３８２】
請求項３７７から３８１のいずれか１項に記載のプラスミドを含む組成物。
【請求項３８３】
さらに、アジュバント及び形質移入促進化合物からなる群から選択される成分を含む、請求項３８２に記載の組成物。
【請求項３８４】
前記アジュバントが、
(a)  ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）及び中性脂質；
(b)  サイトカイン；
(c)  モノリン酸リピドAおよびトレハロースジクリノミコレートＡＦ (MPL + TDM)；
(d)溶解モノリン酸リピドA [mono-phosphoryl lipid A]製剤；および
(e)CRL1005/BAK
からなる群から選択される、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８５】
前記アジュバントが((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)（GAP-DMORIE）を含み、
前記中性脂質が、
(a)  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
(b)  1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）；および
(c)  1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＭＰＥ）
からなる群から選択される、請求項３８４に記載の組成物。
【請求項３８６】
前記中性脂質がＤＰｙＰＥである、請求項３８５に記載の組成物。
【請求項３８７】
形質移入促進化合物(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（DMRIE）を含む、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８８】
前記アジュバント又は形質移入促進化合物が、CRL1005及び塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）を含む、請求項３８３に記載の組成物。
【請求項３８９】
前記CRL1005及びBAKが、
(a)  0.3mM BAK及び7.5mg/ml CRL 1005；
(b)  0.3mM BAK及び34mg/ml CRL 1005；および
(c)  0.3mM BAK及び50mg/ml CRL 1005
からなる群から選択される濃度で存在する、請求項３８８に記載の組成物。
【請求項３９０】
曇点（ｃｌｏｕｄ  ｐｏｉｎｔ）より高い温度でのサーマルサイクルを行わずに、CRL1005、BAK及びポリヌクレオチドを曇点より低い温度で組み合わせる（ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ）ことにより製剤化した、請求項３８８あるいは請求項３８９に記載の組成物。
【請求項３９１】
さらに、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、及びインフルエンザウィルスタンパク質／またはその断片／変異体若しくは誘導体に由来する単離ポリペプチドからなる群から選択される従来のワクチン構成成分を含む、請求項３８２から３９０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９２】
脊椎動物におけるインフルエンザ感染を治療又は予防する方法であって、請求項３７７から３８０のいずれか１項に記載のベクター又は請求項３８２から３９１のいずれか１項に記載の組成物を、そのようなインフルエンザ感染に対する治療又は予防を必要としている脊椎動物に投与することを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、インフルエンザウィルスワクチン組成物、並びに哺乳動物におけるインフルエンザ感染及び疾病を治療又は予防する方法に関する。インフルエンザは、気道の感染により引き起こされる急性熱性の疾患である。インフルエンザウィルスにはＡ型、Ｂ型及びＣ型の３個の型があり、それぞれ「IAV」、「IBV」、又は「IAC」とし、総括的に、「IV」とする。A型（数種の亜型を含む）は、１９１８年、１９５７年、及び１９６８年に起こった流行のような、広範な流行及び世界的なパンデミック（大規模流行）を引き起こす。B型は、地域的な流行を引き起こす。C型は、散発性の症例、及び小規模且つ局所的な集団発生を引き起こす。これらのウィルス型は、大部分は、二つの構造タンパク質（すなわち、ウィルスの中心に見出される核タンパク質と、ウィルスのシェルを形成している膜タンパク質）における差異に基づいて区別される。
【０００２】
当該疾患は、重大な全身症状、入院を必要とする重症の疾患（例えば、ウィルス性肺炎）、及び二次性の細菌性肺炎等の合併症を引き起こし得る。１９１８年から１９１９年のパンデミック流感大規模流行期に２千万人を超える人々が死んだ。これは、２０世紀最大のパンデミックであった。アメリカ合衆国における近年の流行により、１年当たり１万件を超える（最高で４万件まで）過剰死亡が引き起こされ、また流行のなかった年でも、１年当たり５千件から１万件の死亡が引き起こされたと考えられる。
【０００３】
インフルエンザに関連する罹患率及び死亡率を抑えるための最良のストラテジーは、予防接種である。予防接種は、老人ホームや高齢者住宅の住人などのハイリスク集団に属する人々、および糖尿病、慢性腎不全又は慢性呼吸器系疾患の患者に特に薦められている。
【０００４】
従来のインフルエンザワクチンの製造方法は、単離株をふ化鶏卵において増殖させることを伴うものである。まず、患者咽頭を拭った綿棒又はそれに類似した採取源よりウィルスを採取し、鶏卵において単離する。鶏卵における初期の単離は難しいが、ウィルスはその鶏卵宿主に適応し、その後比較的容易に繁殖が起こる。しかし、ワクチン製造目的で鶏卵由来のIV を調製することには不利な点がいくつかあるということが、広く認識されている。ひとつの不利な点は、そのような製造過程は鶏卵の（微）生物学的品質の差異によりかなり影響を受けやすいということである。もうひとつの不利な点は、需要が急に高まった場合（すなわち、重大な流行又はパンデミックの場合）に、適切な鶏卵を大量に入手できないことによる補給の問題があるので、当該過程は完全に柔軟性を欠いているということである。また、上記のように調製されたワクチンは、鶏肉及び／又は鶏卵タンパク質に対し過敏症があることが既知である個人には、禁忌とされる。
【０００５】
現在使用されているインフルエンザワクチンは、完全ウイルス（WV）ワクチン又はサブビリオン（SV）（「スプリット」又は「表面抗体」とも呼ばれている）ワクチンである。WVワクチンが、完全な、不活化されたウィルスを含むのに対し、SVワクチンは、脂肪を含むウィルスのエンベロープを溶かす洗剤(detergents)を用いて壊し、その後残余のウィルスを化学的不活性化で不活性化した精製ウィルスを含む。インフルエンザに対する弱毒化ウィルスワクチンもまた開発中である。従来のワクチンを調製する方法に関する記述は、例えば、Wright, P.F. & Webster, R.G., FIELDS VIROLOGY, 4d Ed. (Knipe, D.M. et al. Ed.), 1464-65 (2001)に見出される。
【０００６】
ウィルス構造
ＩＶは、ほぼ球形をしているが、細長い形又は不規則な形を取ることもある。ウィルスの内部では、一本鎖RNAの8個のセグメントがあり、当該ウィルスを作る遺伝的指示を含んでいる。このウィルスの最も際立った特徴は、その表面を覆う外側に向かって突き出しているスパイクの層である。これらのスパイクには二種類ある：一方はヘマグルチニン分子（ＨＡ）から成り、他方はノイラミニダーゼ（ＮＡ）から成る。ＨＡ分子は、ウィルスが細胞に「吸着」し、感染を開始することを可能とする。ＮＡ分子は、新しく形成されたウィルスが、細胞の表面又はウィルス同士で相互に吸着することなく、その宿主細胞から出ることを可能とする。ウィルスキャプシッドは、ウィルスリボ核酸及び数種のいわゆる「内部」タンパク質｛ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２又はＰＡ）、膜タンパク質（Ｍ１）、及び核タンパク質（ＮＰ）｝から成る。ＨＡ及びＮＡに対する抗体は、感染と戦う上で最も効果的であると従来より立証されているので、それらの分子の構造、機能及び遺伝的変異に焦点を当てて多くの研究が行われてきた。研究者達はまた、二つの非構造的タンパク質、Ｍ２及びＮＳ１に興味を持っている。これらの分子は双方とも、ウィルス感染において重要な役割を担っている。
【０００７】
Ａ型の亜型は、当該亜型が発見された地理的場所、研究所認識番号、発見された年、さらに当該亜型が持つＨＡ及びＮＡの型を括弧内に含む名称システムにより示され、その名称は、例えば、A/Hong Kong/156/97 (H5N1)となる。ウィルスがヒト以外の動物に感染する場合は、A/Chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2)のように、宿主の種が地理的場所の前に含められる。
【０００８】
ビリオンには、直線状のマイナス一本鎖RNAの７セグメント（Ｃ型ウィルス）から８セグメント（Ａ型及びＢ型ウィルス）が含まれている。ウィルスゲノムの殆どのセグメントは、単一タンパク質をコードする。多くのインフルエンザウィルスについて、ゲノム全体が今や既知となっている。ウィルスの遺伝的再集合(genetic reassortment)は、ある細胞が所与の型に属する二つの異なったウィルスにより同時に感染を受けた場合に、親遺伝子セグメントがそれらのウィルスの子孫で混交することに起因する。この現象は、インフルエンザウィルスのゲノムのセグメントの特性により促進される。遺伝的再集合は、ウィルスの表面抗原の突然変異(sudden change)として現れる。
【０００９】
ＨＡ及びＮＡにおける抗原の変異は、インフルエンザウィルスが多大な変異性(variability)を有することを可能にする。「抗原ドリフト」は、元の親ウィルスに由来するインフルエンザウィルスのＨＡ及びＮＡにおける小さな抗原変異を表すために使用される用語である。これに対し、新しいビリオンを大きく異なったものにするような大きな変異は、「抗原シフト」と呼ばれている。この２つの現象の違いは、程度の差である。
【００１０】
抗原ドリフト（小さな抗原変異）は、遺伝子における点突然変異の蓄積により起こり、これはそのタンパク質におけるアミノ酸の変異を生じさせる。極度で大規模な（変異の程度が非常に大規模であるため突然変異によるだけでは説明がつかない）変異は、ウィルスの抗原シフトを生じさせる。インフルエンザウィルスのセグメント化されたゲノムは、二重に感染した細胞に容易に再集合する。ヒトインフルエンザウィルスとヒト以外の動物に感染するインフルエンザウィルスの間に起こる遺伝的再集合は、抗原シフトの機序として示唆されている。インフルエンザは、人畜共通の疾患であり、野生及び家畜化されたブタ、ウマ、及びトリを含む多くの動物種において重要な病原である。インフルエンザウィルスは、ヒトからその他の種に感染する。
【００１１】
抗原シフト及び抗原ドリフトのため、ある特定のＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するＩＶに対する免疫は、変異体、すなわち異なったＨＡ及び／又はＮＡタンパク質を有するＩＶ菌株に対し、必ずしも防御免疫を与えない。ＨＡ及びＮＡに対する抗体は、ＩＶ感染と戦う上で最も効果的であると従来より立証されているので、それらの分子の構造、機能、及び遺伝的変異に焦点を当てて多くの研究が行われてきた。
【００１２】
近年のＩＶワクチン候補
過去数年間、ワクチン又は改良されたワクチンが求められている多くの感染症疾患に対し、ＤＮＡワクチンをテストすることについて強い関心が示されている。ＤＮＡワクチンのよく知られた幾かの利点には、製造を迅速、容易に且つ安価にできること、多価ワクチンを開発しテストすることができるという多用性(versatility)、ＤＮＡワクチンがヒトを含む多様な動物モデルにおいて頑健性(robust)の高い細胞性応答を引き起こすことができるという知見、並びにプラスミドＤＮＡを送達ベクターとして使用することの安全性が立証されていることが挙げられる（Donnelly, J.J., et al., Annu. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)； Manickan, E., et al., Crit. Rev. Immunol. 17(2):139-154 (1997)；アメリカ合衆国特許番号 6,214,804）。ＤＮＡワクチンは、次世代のワクチン開発を代表するものであり（Nossal, G., Nat. Med. 4(5 Supple):475-476 (1998)) 、多くのＤＮＡワクチンが治験中である。上記の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。
【００１３】
ＤＮＡワクチンを動物に用いた研究が既に行われている。Ulmer, J.B. et al., Science 259:1745-9 (1993)は、ＩＶ核タンパク質ＤＮＡワクチンのみを用いることにより、同種(homologous)又は異種(heteologous)のＩＶウィルスの攻撃に起因する重症疾患及び死亡から、ネズミを保護できたことを明らかにした。さらなる研究によりこのモデルは実証され、また生インフルエンザワクチンとＤＮＡインフルエンザワクチンとの比較研究によりネズミのモデルにおいて免疫誘導及び保護について両者が同等であることを示された。
【００１４】
国際公開特許９４／２１７９７（本明細書にその全体を参考により組み入れる）は、ＮＰ、ＨＡ、Ｍ１、ＰＢ１及びＮＳ１をコードするＤＮＡ構築物を含むＩＶワクチン組成物を開示している。国際公開特許９４／２１７９７はまた、このＤＮＡワクチン組成物の予防有効量を用いて予防接種することを含む、ＩＶ感染からの保護方法を開示している。
【００１５】
ＩＶ核タンパク質は、比較的保存され（Shu, L.L. et al., J. Virol. 67:2723-9 (1993)を参照せよ）、ＲＮＡセグメント７の別個のリーディングフレームによりコードされるＭ１膜タンパク質（主要なＴ−細胞標的である）及びＭ２膜タンパク質は保存される（Neirynck, S. et al., Nat. Med. 5:1157-63 (1999); Lamb, R.A. & Lai, C.J., Virology 112:746-51 (1981)；Ito, T. et al., J. Virol. 65:5491-8 (1991)を参照せよ）。ＤＮＡワクチンの動物実験が、これらの遺伝子を単独で若しくは組み合わせてコードするＤＮＡ構築物を用いて行われており、通常好ましい結果が出ている（Okuda, K., et al., Vaccine 19:3681-91 (2001); Watabe, S. et al., Vaccine 19:4434-44 (2001)を参照せよ）。面白いことに、Ｍ２タンパク質は、イオンチャンネルの一部として関与しており、抗ウィルス剤であるアマンタジン及びリマンタジンに対する耐性において必須であり、さらに約２４個のアミノ酸が細胞外に存在する（ｅＭ２）（Fischer, W.B., Biochim Biophys Acta 1561:27-45 (2002); Zhong, Q., FEBS Lett 434:265-71 (1998) を参照せよ）。この細胞外に存在する高度に保存されたタンパク質（ｅＭ２）に対する抗体（感染細胞において高度に発現している；Lamb, R.A., et al., Cell 40:627-33 (1985) を参照せよ）は、動物モデルに関連を持っていると報告されている（Treanor, J.J., J. Virol. 64:1375-7 (1990); Slepushkin, V.A. et al., Vaccine 13:1399-402 (1995) を参照せよ）。コンジュゲートＢ型肝炎コアｅＭ２タンパク質を用いたアプローチが、動物モデルにおいて評価され、パンデミックインフルエンザワクチンとして提案された（Neirynck, S. et al., Nat. Med. 5:1157-63 (1999) を参照せよ）。しかし、１件の研究においては、ｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質を発現するＤＮＡ構築物でのブタの予防接種が、Ａ型インフルエンザウィルスの攻撃後の疾患を悪化させた（Heinen, P.P., J. Gen. Virol. 83:1851-59 (2002) を参照せよ）。上記の参考文献はすべて、本明細書にその全体を参照により組み入れられる。
【００１６】
異種(heterologous)の「プライム−ブースト」ストラテジーが、多くの病原に対し免疫応答を高め、それらの病原からの保護を高めるために有効であった（Schneider et al., Immunol. Rev. 170:29-38 (1999);  Robinson, H.L., Nat. Rev. Immunol. 2:239-50 (2002); Gonzalo, R.M. et al., Vaccine 20:1226-31 (2002); Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041-7 (2001) を参照せよ）。プライム及びブースト注射により異なった形態の抗原を提供することにより、当該抗原に対する免疫応答が最大限になるように思われる。ＤＮＡワクチンのプライミング、その後のアジュバント中のタンパク質のブースティング又は抗原をコードするＤＮＡのウィルスベクター投与は、抗原に特異的な抗体及びＣＤ４＋Ｔ−細胞性応答又はＣＤ８＋Ｔ−細胞性応答をそれぞれ改善する上で最も効果的な方法と思われる（Shiver J.W. et al., Nature 415: 331-5 (2002); Gilbert, S.C. et al., Vaccine 20:1039-45 (2002); Billaut-Mulot, O. et al., Vaccine 19:95-102 (2000); Sin, J.I. et al., DNA Cell Biol. 18:771-9 (1999) を参照せよ）。サルの予防接種研究から得られた最近のデータによると、ＣＲＬ１００５ポロキサマー （１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を、ＨＩＶ  Ｇａｇ抗原をコードするＤＮＡに加えると、サルにＨＩＶ  Ｇａｇ  ＤＮＡプライムを用いて予防接種を施し、続いてＨＩＶ  Ｇａｇ（Ａｄ５−ｇａｇ）を発現するアデノウイルスベクターをブーストした場合に、Ｔ−細胞性応答が高められることが示唆されている。ＤＮＡ／ポロキサマーによるプライム及びそれに続くＡｄ５−ｇａｇのブーストを行った場合の細胞の免疫応答は、ＤＮＡ（ポロキサマーなし）によるプライム及びそれに続くＡｄ５−ｇａｇのブーストを行った場合、又はＡｄ５−ｇａｇのみの場合に誘導される反応に比べ、強かった（Shiver, J.W. et al. Nature 415:331-5 (2002) を参照せよ）。アメリカ合衆国特許出願公開番号ＵＳ  ２００２／０１６５１７２  Ａ１は、免疫応答を発生させるような、ある抗原の免疫原性がある部分をコードするベクター構築物と、ある抗原の免疫原性がある部分から成るタンパク質との同時投与について説明している。この文献は、Ｂ型肝炎抗原及びＨＩＶ抗原に限定されている。さらに、アメリカ合衆国特許番号６，５００，４３２は、対象のポリヌクレオチド及びポリペプチドの同時投与により核酸ワクチンの免疫応答を高める方法に関する。この特許によると、同時投与とは、同一の免疫応答中にポリヌクレオチドとポリペプチドを投与することであり、望ましくは二者の投与間隔は０日−１０日又は３日−７日以内である。この特許で検討されている抗原には、肝炎の抗原（全部の形態）、ＨＳＶ、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ、ＶＺＶ、ＨＰＶ、ポリオ、インフルエンザ、寄生虫（例：プラスモジウム属の寄生虫）、及び病原細菌（M. tuberculosis, M. leprae, Chlamydia, Shigella, B. burgdorferi, enterotoxigenic E. coli, S. typhosa, H. pylori, V. cholerae, B. pertussisなどを含むがそれらに限定されるものではない）が含まれる。上記の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の要約
本発明は、少なくとも１個のポリヌクレオチドを脊椎動物の一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めることに関する。ここで、前記ポリヌクレオチドは、１個以上の核酸断片を含み、この１個以上の核酸断片は、任意に、１個以上のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。本発明はさらに、上記の１個のポリヌクレオチドに加えて、少なくとも１個の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を脊椎動物の一組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めることに関する。前記単離ＩＶポリペプチドは、例えば、精製サブユニット、組み換えタンパク質、又は単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクターであってよく、或いは従来のＩＶワクチンに存在するような不活性化若しくは弱毒化したＩＶであってもよい。どの方法によっても、当該ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、免疫学的に有効な量でコードされたＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体からなる免疫原性エピトープをｉｎ  ｖｉｖｏで生産する。使用される場合には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体もまた、免疫学的に有効な量で投与される。
【００１８】
本発明によると、ポリヌクレオチドは、当該単離ＩＶポリペプチドを投与する前、それと同じ時(同時)、又はその後に投与してよい。当該ポリヌクレオチドによりコードされた単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、脊椎動物においてインフルエンザウィルスに対する免疫応答を誘導することができる、少なくとも１個の免疫原性を有するエピトープを含む。加えて、使用する場合には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、脊椎動物において免疫応答を誘導することができる少なくとも１個の免疫原性を有するエピトープを含む。当該ポリヌクレオチドによりコードされた当該ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、当該方法により投与してよい当該単離ＩＶポリペプチドと同じタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体であってもよいが、その必要はない。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、核酸断片を含み、この核酸断片は、任意のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質又はそれらの断片（例えば、ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体を含むが、それらに限定されるものではない）を、作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。本発明のポリヌクレオチドはまた、誘導融合タンパク質をコードすることができ、ここでは２個以上の核酸断片（これらの核酸断片のうち少なくとも１個は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくはそれらの誘導体をコードする）が、ｅＭ２に融合したＮＰのように、単一ポリペプチドをコードするフレームで合体している。さらに、本発明のポリヌクレオチドはまた、異種の核酸又は核酸断片を含んでもよい。そのような異種の核酸又は核酸断片は、融合される異種のポリペプチド(例：Ｂ型肝炎コアタンパク質又は分泌シグナルペプチド)を、ＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと共にフレーム中にコードしてもよい。好ましくは、当該ポリヌクレオチドは、少なくとも１個の免疫原性があるＩＶエピトープを含むＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードし、このエピトープは、Ｂ−細胞（抗体）応答、Ｔ−細胞（例：ＣＴＬ）応答、又はその双方を誘導する。
【００２０】
同様に、投与する単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態の何れか）は、任意の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体であってよく、その例としてはＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２タンパク質、又はそれらの断片（例：ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体が挙げられるがそれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態においては、誘導体タンパク質は、ＮＰ−ｅＭ２などの融合タンパク質であってよい。その他の実施形態では、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、異種のタンパク質（例：分泌性シグナルペプチド又はＢ型肝炎ウィルスコアタンパク質）に融合されていてもよい。好ましくは、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、少なくとも１個の免疫原性があるＩＶエピトープを含み、この抗原はＢ−細胞抗体応答、Ｔ−細胞抗体応答、又はその双方を誘導する。
【００２１】
本発明の核酸及びその断片は、次に示す方法の１個以上の方法により、それらの天然状態から改変することができる。まず、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする核酸又はその断片は、コドン最適化コード領域（ワクチンを投与する動物におけるコドン用法に従って最適化した領域）の一部又は全部であってもよい。さらに、ＩＶポリペプチドをコードする核酸及びその断片は、全長ポリペプチドの一部のみコードする断片であってよく、且つ／又は、例えば、コードされたポリペプチドに存在する望ましくないタンパク質モチーフ及び当該コードされたポリペプチドに関連した病原性因子をコードポリペプチドから切り離すように、突然変異を起こさせてもよい。例えば、核酸配列は、ｅＭ２などに見られるような細胞からのポリペプチド放出を防げる膜アンカー領域をコードしないように、突然変異を起こさせてもよい。送達されると、本発明のポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで脊椎動物の細胞に取り込まれ、予防学的又は治療的に有効な量で、ＩＶの免疫原性エピトープがｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。
【００２２】
同様に、本発明のタンパク質は、全長ＩＶポリペプチドの断片であってもよく、且つ／又は、例えば、ポリペプチドに存在する望ましくないタンパク質モチーフ及び当該ポリペプチドに関連した病原性因子をポリペプチドから切り離すように、改変してもよい。例えば、ポリペプチドは、細胞からのポリペプチド放出を防げる膜アンカー領域をコードしないように、改変してもよい。
【００２３】
本発明はさらに、少なくとも１個のポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物であって、このポリヌクレオチドが、１以上の核酸断片を含み、この核酸断片は、それぞれ、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である組成物；並びに上記のポリヌクレオチドと、少なくとも１個の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物を提供する。そのような組成物はさらに、本明細書に記載されているように、例えば、担体、賦形剤、形質移入促進剤、及び／又はアジュバントを含んでよい。
【００２４】
上記の、ポリヌクレオチドと、１個の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物は、(例えば、組成物のポリヌクレオチド部分を、組成物の単離ＩＶポリペプチド部分を投与する前に（又は投与した後で）、投与す場合などでは)当該ポリヌクレオチドと当該タンパク質製剤とを別々に投与するように、提供することができる。あるいはまた、当該ポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含む免疫原性組成物は、（例えば、ポリヌクレオチド及びタンパク質を同時に投与する場合などでは）当該ポリヌクレオチド及びタンパク質の双方を含む単一の製剤として提供することができる。さらにまた、組成物のポリヌクレオチド部分と組成物の単離ＩＶポリペプチド部分を、同時に、別々の製剤において提供することができる。
【００２５】
１個以上の核酸断片を含む少なくとも１個のポリヌクレオチド含有する組成物であって、当該核酸断片は、それぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であり、加えて１個以上の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態で）を含む組成物を、本明細書において「組み合わせポリヌクレオチド(例：ＤＮＡ)ワクチン組成物」又は「単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物」と呼ぶ。
【００２６】
本発明の組成物は、一価、二価、三価、または多価であってよい。一価の組成物は、１個の核酸断片を含む１個のポリヌクレオチドのみを含有し、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であり、任意に、単離形態の同一ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含む。単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物において、一価の組成物には、１個の核酸断片を含む１個のポリヌクレオチドを含有し、この核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該ポリヌクレオチドと同じ抗原領域を有する単離ポリペプチドを含む。二価の組成物は、ポリヌクレオチドの形態であってもタンパク質の形態であっても、免疫応答を誘導する能力を有する、２個の異なったＩＶポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体を含む。本組成物のポリヌクレオチドは、２個のＩＶポリペプチドをコードしてもよいし、或いはまたポリヌクレオチドは、１個のＩＶポリペプチドだけをコードして、二番目のＩＶポリペプチドは、例えば、単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物に存在するような本発明の単離ＩＶポリペプチドを用いて提供するようにしてもよい。二価組成物のＩＶポリペプチドを両方ともポリヌクレオチド形態で投与する場合は、それらのＩＶポリペプチドを作動可能にコードする核酸断片は、同一のポリヌクレオチドに存在する必要はなく、２個の異なったポリヌクレオチドに存在するもであってもよい。三価又はそれ以上の多価の組成物は、単離形態であっても、本発明の１個以上のポリヌクレオチドによりコードされる形態であっても、３個のＩＶポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体を含む。
【００２７】
本発明はさらに、例えばヒトのような脊椎動物に本発明の核酸断片を送達するためのプラスミド及びその他のポリヌクレオチド構築物を提供し、これらのプラスミド及びその他のポリヌクレオチド構築物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の発現を提供する。本発明はさらに、投与された遺伝子及びその遺伝子産物の形質移入、発現、又は効能を高めるために、担体、賦形剤、形質移入促進剤、アジュバントなどの免疫原性亢進剤、又はその他の添加剤を、提供する。
【００２８】
一の実施形態では、多価の組成物は、作動可能にＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする１個以上の核酸領域を含有する単一のポリヌクレオチド(例：プラスミド)を含む。本発明の組成物におけるポリヌクレオチド(例：プラスミド)の数を減じると、製品の製造及び販売に大きな効果をもたらし、それにより当該組成物を製造することに関わるコストを低減することができる。単一のプラスミド上に１個以上の発現される抗原のコード配列を含めるための数多くのアプローチがある。これらのアプローチには、例えば、リボソーム内部進入部位[Internal Ribosome Entry Site (IRES)]配列、デュアルプロモータ／発現カセット、及び融合タンパク質の使用が挙げられる。
【００２９】
本発明はまた、ＩＶ感染に対する脊椎動物の免疫応答を高める方法を提供する。この方法は、脊椎動物の組織へ、１個以上の核酸断片を含む１個以上のポリヌクレオチドであって、この核酸断片が、それぞれ任意に、１個のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片であるポリヌクレオチドを投与し、さらに任意に、脊椎動物の組織へ１個以上の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を投与することによる。単離ＩＶポリペプチドは、ＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与する前に、同じ時(同時)に、又は投与した後に、投与してよい。
【００３０】
さらに、本発明は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体についてのコンセンサスアミノ酸配列を提供し、その例には、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質、又はその断片（例：ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体が含まれるがそれらに限定されるものではない。コンセンサスポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明で具現化されている。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、後述するように、アミノ酸配列の逆翻訳や当該ポリヌクレオチドのPCR合成のような、既知の方法により得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、１個以上の核酸断片を含む少なくとも１個のポリヌクレオチドを、脊椎動物の組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染に対する保護の必要性のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法であって、前記１個以上の核酸断片がそれぞれ、任意に、保護の必要性のある脊椎動物の細胞において１個のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である組成物及び方法に関する。本発明はまた、上記の１個のポリヌクレオチドと、少なくとも１個の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを脊椎動物の組織へｉｎ  ｖｉｖｏ投与することに関する。当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、当該タンパク質を発現する異種の生、不活性化又は弱毒化ウィルスベクターにより発現され担持されるタンパク質であってよく、或いは市販されている従来の不活性化ＩＶワクチンに存在するような不活性化ＩＶであってもよい。どの方法によっても、当該ポリヌクレオチドは、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、免疫学的に有効な量の、当該ポリヌクレオチドによりコードされるインフルエンザタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体がｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。当該単離タンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体もまた、免疫学的に有効な量で投与される。当該ポリヌクレオチドは、当該単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を投与する前、それと同じ時(同時)、又はその後に投与することができる。
【００３２】
本発明の範囲内のＩＶポリペプチドの非限定的な例には、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１及びＭ２ポリペプチド、又はそれらの断片（例：ｅＭ２）、誘導体(例：ＮＰ−ｅＭ２の融合)及び変異体が含まれるが、それらに限定されるものではない。多種多様なＩＶ型及び亜型に由来するＩＶポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸配列が、当業界において知られている。下記のヌクレオチド配列は、野生型配列である。例えば、Influenza A/PR/8/34 (H1N1)のＮＰタンパク質のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号Ｍ３８２７９．１として入手可能であり、以下に示す配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:1として参照する。
【化１】
2008505660.tif 000306
【００３３】
SEQ ID NO:1のヌクレオチド46-1494によりコードされる、Influenza A/PR/8/34 (H1N1)のＮＰタンパク質のアミノ酸配列は以下に示す通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:2として参照する。
【化２】
2008505660.tif 000307
【００３４】
ＩＡＶゲノムのセグメント７は、Ｍ１及びＭ２の双方をコードする。Ａ型インフルエンザウィルスのセグメント７(A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1))は、GenBank受託番号AF389121.1として入手可能であり、本明細書では、下記配列をSEQ ID NO:3として参照する。
【化３】
2008505660.tif 000308
【００３５】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド26から784によりコードされる、Influenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)のＭ１タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:4として参照する。
【化４】
2008505660.tif 000309
【００３６】
SEQ ID NO:3のヌクレオチド26から51及び740 から1007により（スプライス形態で）コードされる、Influenza A /Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (H1N1)のＭ２タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、下記配列をSEQ ID NO:5として参照する。
【化５】
2008505660.tif 000310
【００３７】
Ｍ２タンパク質（ｅＭ２）の細胞外領域は、当該タンパク質のN末端の最初の２４個のアミノ酸に対応し、上記に下線で示されている（Fischer, W.B. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1561:27-45 (2002); Zhong, Q. et al., FEBS Lett. 434:265-71 (1998)を参照せよ）。
【００３８】
本明細書で説明しているＮＰ及びｅＭ２の誘導体は、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸及びＮＰの全部若しくは一部をコードする構築物によりコードされる。融合構築物は、ｅＭ２配列及びそれに続くＮＰ配列により構築してもよく、或いはＮＰ配列及びそれに続くｅＭ２配列により構築してもよい。Influenza A/PR/8/34 (H1N1)に由来するＮＰ及びｅＭ２配列を用いた融合構築物の例を、以下に示す。元のインフルエンザウィルスのヌクレオチド配列を使用し、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸をコードし、その３’末端で、ＮＰをその全体においてコードする配列に融合している配列であるｅＭ２−ＮＰは、本明細書では、下記のSEQ ID NO:6として参照する。
【化６】
2008505660.tif 000311
【００３９】
SEQ ID NO:6のヌクレオチド1から1566によりコードされる、Influenza A/PR/8/34/ (H1N1)のｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:7として参照する（ｅＭ２アミノ酸配列は下線で示した）。
【化７】
2008505660.tif 000312
【００４０】
元のインフルエンザウィルスのヌクレオチド配列を使用し、NPをその全体においてコードし、このＮＰは、その３’末端で、Ｍ２の最初の２４個のアミノ酸に融合し、さらにこのＭ２は、ＮＰを全体としてコードする配列に融合している配列が、本明細書では、下記SEQ ID NO:8として参照される。
【化８】
2008505660.tif 000313
【００４１】
SEQ ID NO:8のヌクレオチド1 から1566によりコードされる、Influenza A/PR/8/34/ (H1N1)のＮＰ−ｅＭ２融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:9と呼ぶ（ｅＭ２  アミノ酸配列は下線で示した）。
【化９】
2008505660.tif 000314
【００４２】
機能性融合タンパク質の構築は、最大限の柔軟性を与えるために拡大したコンフォメーションを採用する目的で、二つの融合断片間にリンカー配列を必要とすることがよくある。我々は、LINKER というプログラムを使用した｛Chiquita J. Crasto C.J. and  Feng, J. Protein Engineering 13:309-312  (2000), このプログラムは以下のサイトに公開されている：http://chutney.med.yale.edu/linker/linker.html（２００３年４月１６日に閲覧した）｝。このプログラムは、自動的にリンカー配列のセットを作り出すものであり、このリンカー配列のセットは、Ｘ線による結晶構造解析及びNMR による測定により、拡大したコンフォメーションを採用するのに知られている。多様なeM2-NP およびNP-eM2融合タンパク質において使用できる適切なリンカーの例を、以下に挙げる。
【化１０】
2008505660.tif 000315
【００４３】
Influenza B/LEE/40のNPタンパク質のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号K01395として入手可能であり、この配列は、以下の配列を有し、本明細書ではSEQ ID NO:15として参照する。
【化１１】
2008505660.tif 000316
【００４４】
SEQ ID NO:1のヌクレオチド1から1680によりコードされる、IBV B/LEE/40のＮＰタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:16として参照する。
【化１２】
2008505660.tif 000317
【００４５】
IAV のヘマグルチニン（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列の非限定的例を下記に示す。ＨＡ配列はＩＶ亜型間で大きく異なるということを特筆しておかなければならない。実質的には、ＩＶＨＡをコードするヌクレオチド配列であればどのような配列であっても、本発明に適合する。実際、本発明のワクチン及び治療用製剤に含まれるＨＡ配列は（下記に、より詳細に説明されている）、ＩＶの流行株により年毎に変わる可能性がある。
【００４６】
IAV A/New_York/1/18(H1N1)のHAタンパク質の部分ヌクレオチド配列は、GenBank受託番号AF116576として入手可能であり、この配列は、以下の配列を有し、本明細書ではSEQ ID NO:17として参照する。
【化１３】
2008505660.tif 000318
【００４７】
SEQ ID NO:17のヌクレオチド1から1218によりコードされる、IAV A/New_York/1/18(H1N1)の部分HAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:18として参照する。
【化１４】
2008505660.tif 000319
【００４８】
IAV A/Hong Kong/482/97ヘマグルチニン（Ｈ５）のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号AF046098として入手可能であり、以下の配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:19として参照する。
【化１５】
2008505660.tif 000320
【００４９】
SEQ ID NO:19のヌクレオチド9 から1715によりコードされる、IAV A/Hong Kong/482/97 (H5)のHAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:20として参照する。
【化１６】
2008505660.tif 000321
【００５０】
IAV A/Hong Kong/1073/99(H9N2)のヌクレオチド配列は、GenBank受託番号INA404626として入手可能であり、以下の配列を有する。本明細書では、この配列をSEQ ID NO:21として参照する。
【化１７】
2008505660.tif 000322
【００５１】
SEQ ID NO:21のヌクレオチド32から1711によりコードされる、IAV A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)のHAタンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りであり、本明細書では、この配列をSEQ ID NO:22として参照する。
【化１８】
2008505660.tif 000323
【００５２】
本発明はまた、コドン最適化及び／又はその他の処理により達成される最適な発現性及び安全性を持って、ＩＶコード配列を脊椎動物に送達するためのワクチン組成物及び方法を提供する。これらのワクチン組成物は、コードされた遺伝子産物が対象の脊椎動物において最適に発現するように調製され、投与される。その結果、これらの組成物及び方法は、ＩＶ感染に対する免疫応答を刺激することにおいて有用である。本発明には、発現システム、送達システム、及びコドン最適化ＩＶコード領域もまた含まれる。
【００５３】
ある特殊な実施の形態において、本発明は、組合せポリヌクレオチド(例：ＤＮＡ)ワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物は、ポリヌクレオチドワクチンとポリペプチド（組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態のもの）ワクチンとを単一の製剤に組合せたものである。当該単一製剤は、本明細書で記述のＩＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなるワクチンと、任意に、望ましい単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との有効量を含む。当該ポリペプチドは、いかなる形態で存在してもよく、例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニットタンパク質、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化若しくは弱毒化ＩＶワクチンの形態のものでもよい。当該ポリヌクレオチドワクチンによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と同一であってもよい。あるいはまた、ポリヌクレオチドによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と異なっていてもよい。
【００５４】
「１個の（ａ又はａｎ）：（翻訳上、oneは、１個と訳したが、ａ又はａｎは特に訳していない：翻訳者記」」物という語は、１個以上の物を表すことを特筆しておく。例えば、「１個のポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は１個以上のポリヌクレオチドを表していると理解される。そのように、「１個の（ａ（又はａｎ））」、「１個以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１個の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という語は、本明細書においては、相互に交換して使ってよい。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」という語は、単数の核酸又は核酸断片、並びに複数の核酸又は核酸断片を網羅する意味で使われており、さらに単離分子又は構築物を意味する。単離分子又は構築物の例には、ウィルスゲノム（例えば、非感染性ウィルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、又はポリヌクレオチドを含むｐＤＮＡの誘導体｛例えば、Darquet, A-M et al., Gene Therapy 4:1341-1349 (1997)に説明されているミニサークル｝がある。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合や一般的でない結合｛例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合｝を含んでもよい。
【００５６】
「核酸」又は「核酸断片」という語は、ポリヌクレオチド又は構築物に存在する１個以上の核酸セグメント（例：ＤＮＡ又はＲＮＡ断片）を意味する。核酸又はその断片は、直線状(例えばｍＲＮＡ)又は環状(例えば、プラスミド)で提供されてよく、二本鎖状又は一本鎖状で提供されてもよい。「単離」核酸又はポリヌクレオチドという語は、その天然環境から取り出された核酸分子(ＤＮＡ又はＲＮＡ)を意味する。例えば、ベクターに含まれている組み換えポリヌクレオチドは、本発明の目的に基づき、単離されているとみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞で保持されている組み換えポリヌクレオチド及び溶液中の精製（不完全精製又は完全精製）ポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチド又は核酸にはさらに、合成により生産されたそのような分子も含まれる。
【００５７】
本明細書で用いる際、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなしてよい。しかし、フランキング配列（例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写終結など）はコード領域の一部ではない。本発明の２個以上の核酸又は核酸断片は、単一のポリヌクレオチド構築物（例えば、単一のプラスミド）に存在してもよく、又は別のポリヌクレオチド構築物｛例えば、別の（異なった）プラスミド｝に存在してもよい。さらに、いかなる核酸又は核酸断片も、単一のＩＶポリペプチド、又はその断片、誘導体若しくは変異体をコードしてよいし、あるいはまた、例えば、１個以上のポリペプチドをコードしてよく、例えば、１個の核酸は２個以上のポリペプチドをコードしてよい。さらに、核酸は、制御因子（例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写終結など）を含んでいてもよいし、ＩＶコード領域に融合した異種のコード領域（例えば、分泌性シグナルペプチドや異種の機能ドメインなどの特殊化された因子やモチーフ）をコードしてもよい。
【００５８】
本発明のＩＶポリペプチドに言及する場合、「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」という語は、それらの対応する天然のポリペプチドの免疫原性又は抗原性を少なくともある程度保持するすべてのポリペプチドを含む。本発明のＩＶポリペプチドの断片は、タンパク分解断片、欠失断片、及び、特に、動物に送達された場合に、細胞からの分泌を高め、免疫原性を向上させ、又は病原性を減じるＩＶポリペプチドの断片を含む。ポリペプチドの断片にはさらに、天然のポリペプチドの抗原性又は免疫原性を有するエピトープ（直線状及び立体状のエピトープを含む）を含むポリペプチドの部分が含まれる。本発明のＩＶポリペプチドの変異体は、上に説明されているような断片に加えて、アミノ酸の置換、欠失、又は挿入により起こったアミノ酸配列の改変を有するポリペプチドを含む。変異体は、対立遺伝子変異体のように、自然に起こる場合がある。「対立遺伝子変異体」は、有機体又はウィルスのある染色体又はゲノム上の所与の座を占める遺伝子の代替形態を意味する（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)を参照せよ；この参考文献は本明細書に参照により組み入れる）。例えば、本明細書で用いる際、所与の遺伝子産物における変異が、変異体である。ＩＶのＮＡ又はＨＡタンパク質について言及する場合は、そのようなタンパク質は、天然のＩＶ株がウィルスによりコードされたＮＡ又はＨＡタンパク質の型に基づいて区別されるという点において、それぞれ「変異体」である。しかし、単一のＨＡ又はＮＡ変異体型内において、アミノ酸の欠失、挿入、又は置換のような自然に又は人工的に起こる変異は起こり得る。人工的に生じる変異体は、突然変異生成技術を用いて作製することができる。変異体ポリペプチドは、保存的又は非保存的なアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含んでいてよい。本発明のＩＶポリペプチドの誘導体は、天然のポリペプチドに無い付加的な特徴を提示するように改変されたポリペプチドである。その例には、融合タンパク質がある。類似体は、本発明のＩＶポリペプチドの別の形態である。その一例は、その開裂により活性化し活性成熟ポリペプチドを生産することができるプロタンパク質である。
【００５９】
「感染性ポリヌクレオチド」又は「感染性核酸」という語は、許容細胞への取込みで、完全な感染性ウィルス粒子の合成を単独で充分に仲介する単離ウィルスポリヌクレオチド及び／又は核酸を網羅する意味で使われている。このように、「感染性核酸」は、許容宿主細胞における自己の複製サイクルを開始するために、自己がコードするいかなるポリペプチドのプレ合成コピー（例えば、ウィルスレプリカーゼ）を必要としない。
【００６０】
本明細書で定義している「非感染性ポリヌクレオチド」又は「非感染性核酸」という語は、ポリペプチドのような付加材料を加えなければ、許容細胞への取込みで完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介することができないポリヌクレオチド又は核酸である。感染性ポリヌクレオチド又は核酸は、単にそれが非許容細胞へ取込まれたという理由で、「非感染性」ポリヌクレオチドにならない。例えば、限定された宿主範囲を有するウィルスに由来する感染性ウィルスポリヌクレオチドは、それが許容宿主(例えば、当該ウィルス自体を許容する宿主)に由来する細胞により取り込まれた時に完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介する能力がある場合に、感染性である。非許容宿主に由来する細胞により取り込まれることが完全な感染性ウィルス粒子の合成を生じないという事実により、当該核酸が「非感染性」になるわけではない。言い換えれば、この語は、宿主細胞の性質、組織の種類、或いは当該ポリヌクレオチド又は核酸断片を取り込む動物種により、制限されるのではない。
【００６１】
一部のケースでは、単離感染性ポリヌクレオチド又は核酸が、ウィルス粒子のためのレセプターを欠いた（すなわち、ウィルス侵入に対し非許容的である）宿主細胞集団において、完全に感染性のウィルス粒子を生産することがある。従って、生産されたウィルスは、周りの細胞に感染を起こさない。しかし、ウィルス粒子を含む上澄液を当該ウィルスに対し許容性のある細胞に移すと、感染が起こる。
【００６２】
「複製するポリヌクレオチド」又は「複製する核酸」は、許容宿主細胞に取り込まれると同一のポリヌクレオチド又は核酸のコピーを複数（例えば、１個以上）生産する能力があるポリヌクレオチド及び／又は核酸を網羅する意味で使われている。感染性ポリヌクレオチド及び核酸は、「複製するポリヌクレオチド」又は核酸のサブセットであり、これらの語は同義語ではない。例えば、ウィルスコートタンパク質の遺伝子を欠いた欠損ウィルスゲノムは、複製はする（自己のコピーを複数生産する）が、感染性ではない。なぜなら、欠損ウィルスゲノムは、コートタンパク質又はこのコートタンパク質をコードする別の核酸が外因的に提供されない限り、完全な感染性ウィルス粒子の合成を仲介する能力がないからである。
【００６３】
ある実施の形態において、ポリヌクレオチド、核酸又は核酸断片は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドはまた、通常、プロモータ及び／又はポリペプチドコード核酸断片に作動可能に附随するその他の転写又は翻訳制御因子を含む。作動可能に附随するということは、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド)をコードする核酸断片に、当該遺伝子産物の発現を制御配列の影響下若しくは制御の下で行うように、１個以上の制御配列が付随している場合である。２個のＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード核酸断片及び当該核酸断片の５’末端に附随したプロモータ）は、以下の条件が満たされた場合に「作動可能に附随している」：プロモータ機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じ、当該２個のＤＮＡ断片間の連結の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生じず、（２）当該遺伝子産物の発現を制御する発現制御配列の能力を干渉せず、さらに（３）転写されるＤＮＡテンプレートの能力を干渉しない場合。このように、プロモータ領域は、当該プロモータが核酸断片の転写に影響を与える能力がある場合に、ポリペプチドをコードする当該核酸断片に作動可能に附随している。当該プロモータは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的なプロモータであってもよい。プロモータ以外のその他の転写制御因子（例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終止シグナル）は、ポリヌクレオチドに作動可能に附随して、細胞特異的な転写を指示することができる。適切なプロモータ及びその他の転写制御領域は本明細書に開示されている。
【００６４】
多様な転写制御領域が、当業者に公知である。これらの転写制御領域には、限定なく、脊椎動物の細胞において機能する転写制御領域が含まれ、その例には、サイトメガロウィルスに由来するプロモータ及びエンハンサーのセグメント（イントロンＡと協働する、最初期プロモータ(immediate early promoter））、シミアンウィルス４０（初期プロモータ）、及びレトロウィルス （例えば、ニワトリ肉腫ウィルス）が含まれるがそれらに限定されるものではない。その他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子に由来するもの（アクチン、抗熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及び ウサギb-グロビン）、並びに真核細胞で遺伝子発現を制御する能力のあるその他の配列が含まれる。さらに適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモータ及びエンハンサー、並びにリンフォカイン誘導可能プロモータ（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモータ）が含まれる。
【００６５】
同様に、多様な転写制御因子が、当業者に公知である。これらの転写制御因子には、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終止コドン、ピコルナウィルスに由来する因子｛特に、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）又はＣＩＴＥ[Cap-Independent Translation Enhancer]配列とも呼ばれている因子｝が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００６６】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、環状又は直線化されたプラスミド又はベクター、或いは非感染性で組み込み能力がない（すなわち、当該ＤＮＡが脊椎動物の細胞のゲノムに組み込まれないということ）その他の直線状ＤＮＡであってよい。直線化されたプラスミドは、以前に環状だったが例えば制限エンドヌクレアーゼ消化により直線化されたプラスミドである。Cherng, J.Y., et al., J. Control. Release 60:343-53 (1999)、及びChen, Z.Y., et al. Mol. Ther. 3:403-10 (2001)（これらの参考文献は本明細書に参照により組み入れる）で検討されているように、直線状ＤＮＡは、ある状況においては、有利であるかもしれない。本明細書で用いる際、プラスミド及びベクターという語は、相互に交換可能に使用できる。
【００６７】
あるいはまた、ＤＮＡウィルスゲノムを用いてＤＮＡポリヌクレオチドを脊椎動物の細胞に投与してもよい。ある実施の形態においては、本発明のＤＮＡウィルスゲノムは、非複製、非感染性、及び／又は組み込み能力がない。適切なＤＮＡウィルスゲノムには、限定なく、ヘルペスウィルスゲノム、アデノウィルスゲノム、アデノ関連ウィルスゲノム、及びポックスウィルスゲノムがある。非感染性のウィルスゲノムを脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ導入する方法を引用している参考文献は、当業者には周知であり、上記に引用されている。
【００６８】
その他の実施の形態において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。ＲＮＡ配列を脊椎動物の細胞に導入する方法は、アメリカ合衆国特許番号５，５８０，８５９に説明されており、その開示はその全体において参照により本明細書に組み入れる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド、核酸及び核酸断片は、分泌性ペプチド又はシグナルペプチドをコードする付加的な核酸を伴ってもよく、このような付加的な核酸は、本発明の核酸断片又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する。シグナル仮説によると、成長しているタンパク質鎖の粗面小胞体を横断する輸送が一旦開始されると、哺乳動物の細胞によって分泌されたタンパク質は、成熟したタンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物の細胞から分泌されたポリペプチドが一般的に当該ポリペプチドのN末端に融合したシグナルペプチドを有しており、当該シグナルペプチドが完全又は「全長」ポリペプチドから切断されて当該ポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するということを認識している。ある実施の形態においては、天然のリーダー配列が使用されるか、あるいはその配列に作動可能に附随する当該ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいはまた、異種の哺乳動物のリーダー配列又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型のリーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はネズミβ-グルクロニダーゼのリーダー配列と置換してもよい。
【００７０】
本発明のひとつの態様に従って、ポリヌクレオチドの構築物が提供される。その例には、核酸断片を含有するプラスミドであって、当該核酸断片が、ＩＶ由来のポリペプチドを作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該コード領域は、治療又は予防接種を施す脊椎動物に送達されるように、望ましい脊椎動物種（例えばヒト）の脊椎動物細胞における発現について最適化されているプラスミドがある。適切なＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、ＩＶ  ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、又はＭ２のタンパク質に由来するものであってよいが、それらに限定されるものではない。さらなるＩＶ由来のコード配列（例えば、ＩＶ  ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２又はｅＭ２をコードする）が、当該プラスミドに又は別個のプラスミドに含まれてよく、天然のＩＶコドン、又は治療若しくは予防接種を施す脊椎動物での発現について最適化されたコドンを用いて発現させてもよい。１個以上の最適化インフルエンザ配列をコードするそのようなプラスミドを治療又は予防接種を施す脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ投与すると、１個以上のコードされた遺伝子産物が発現される（すなわち、転写され翻訳される）。遺伝子産物の発現レベルは、附随するプロモータの強度及び附随するエンハンサー因子の存在と活性化、並びに当該コード領域の最適化の程度に、多いに依存する。
【００７１】
本明細書で用いる際「プラスミド」という語は、遺伝物質（すなわち、核酸）から作製された構築物を意味する。一般的に、プラスミドには複製起点(origin of replication)が含まれており、この複製起点は、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）内で機能し、当該プラスミドを有する細菌宿主細胞を検出するための選択マーカーである。本発明のプラスミドは、本明細書で記述するような、挿入されたコード配列が真核細胞内で転写・翻訳されるように配置された遺伝因子を含んでいてよい。また、当該プラスミドは、ウィルス核酸に由来する配列を含んでいてよい。しかし、そのようなウィルス配列は通常、ウィルス粒子に当該プラスミドを組み入れることを指示又は可能にするのに充分ではなく、従って当該プラスミドは非ウィルスベクターである。本明細書で記述するある実施の形態では、プラスミドは閉鎖環状DNA 分子である。
【００７２】
「発現」という語は、コード配列によりコードされる産物の生物学的生産を意味する。ほとんどの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列が、転写されメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。その後メッセンジャーＲＮＡが、翻訳されて、関連のある生物活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現の過程には、転写のＲＮＡ産物に対するさらなる処理過程（例えば、イントロンを除去するスプライシング、及び／又はポリペプチド産物の翻訳後処理）が含まれる。
【００７３】
本明細書で用いる際「ポリペプチド」という語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を網羅し、２個以上のアミノ酸の任意の鎖を含むことを意味する。このように、本明細書で用いる際、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸の鎖」を含むがそれらに限定されない語群、或いは２個以上のアミノ酸からなる鎖を意味するその他のいかなる語も、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という語をこれらのいかなる語の代わりに、又は相互に取り替えて使ってもよい。この「ポリペプチド」という語にはさらに、翻訳後の修飾を経たポリペプチドが含まれ、翻訳後の修飾の例としては、糖鎖形成、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基を用いた誘導体化、タンパク質分解性の開裂、又は人工的に発生するアミノ酸を用いた修飾がある。
【００７４】
本発明のポリペプチドに含まれるものにはさらに、前記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、並びにそれらの組み合わせがある。本発明のポリペプチドの断片、誘導体、類似体又は変異体は、ＩＶポリペプチドに関連する抗原性及び免疫原性のポリペプチドであり得、そのようなポリペプチドは、ＩＶにより引き起こされた感染症疾患を、予防し、治療し（直し）、改善し、その重篤度を和らげ、その伝染を防ぎ又は減少させるために使用される。
【００７５】
本明細書で用いる際「抗原性を有するポリペプチド」又は「免疫原性を有するポリペプチド」は、脊椎動物に導入した場合に、脊椎動物の免疫システム分子と反応し（すなわち、抗原性を有する）、及び／又は当該の脊椎動物に免疫応答を誘導する（すなわち、免疫原性を有する）ポリペプチドである。免疫原性を有するポリペプチドは抗原性をも有するが、抗原性を有するポリペプチドはその大きさ又はコンフォメーションのため必ずしも免疫原性を有するとは限らないということはかなり生じ得る。本発明の抗原性又は免疫原性を有するポリペプチドの例には、ＨＡ又はその断片若しくは変異体、ＮＰ又はその断片、ＰＢ１又はその断片若しくは変異体、ＮＳ１又はその断片若しくは変異体、Ｍ１又はその断片若しくは変異体、及びＭ２又はその断片若しくは変異体｛Ｍ２の細胞外断片（ｅＭ２）を含む｝、或いは例えばＢ型肝炎コア抗原などの異種ポリペプチドに融合した前記のポリペプチド又はその断片が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の抗原性又は免疫原性の単離ポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるものに加えて、組み換えタンパク質、精製サブユニット、又は当該タンパク質を発現するウィルスベクターとして提供してもよく、或いは不活性化ＩＶワクチン（すなわち、生弱毒化ウィルスワクチン）、熱殺菌（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ）ウィルスワクチンなどの形態で提供してよい。
【００７６】
「単離」ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体という語は、その天然形態でないＩＶポリペプチド又はタンパク質を意味している。精製のレベルは特に指定がない。例えば、単離ＩＶポリペプチドは、その天然又は自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組み換え体で生産したＩＶポリペプチド又はタンパク質であっても、適切な技術で単離、分画、部分的な若しくは実質上完全な精製の諸処理（当該ＩＶポリペプチド又はタンパク質を増殖させた鶏卵又は培養細胞からのＩＶビリオンの単離を含む）を施した天然又は組み換えＩＶポリペプチドであっても、本発明の目的のため単離されたものと考えられる。さらに、単離ＩＶポリペプチド又はタンパク質は、単離ＩＶポリペプチドを発現する生若しくは不活性ウィルスベクターとして提供してよく、不活性ＩＶワクチン組成物に見られるようなものを含んでよい。このように、単離ＩＶポリペプチド又はタンパク質は、例えば、組み換えタンパク質、ＩＶの精製サブユニット、又は単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクターとして、或いは不活性化又は弱毒化ＩＶワクチンの形態で提供してよい。
【００７７】
「エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、例えばヒトのような脊椎動物における抗原性又は免疫原性を有するポリペプチドの部分を意味する。「免疫原性エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、動物に免疫応答を誘導するタンパク質の一部として定義され、それは当業界で既知の方法により決められている。「抗原性エピトープ」という語は、本明細書で用いる際、抗体又はＴ−細胞受容体が免疫特異的に結合することができるタンパク質の一部として定義され、それは当業界で既知の方法により決められている。免疫特異的結合には、非特異的な結合は含まれないが、その他の抗原との交差反応性は除外されない。免疫原性のエピトープは抗原性を有するが、抗原性のエピトープは免疫原性を有する必要はない。
【００７８】
「免疫原性担体」という語は、本明細書で用いる際、第一のポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体であって、第二のポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の免疫原性を高めるものを意味する。一般的に、「免疫原性担体」は、所望のポリペプチド又はその断片に融合又はコンジュゲートされる。「免疫原性担体」の一例は、対象の免疫原性エピトープを表面エピトープとして発現する組み換えＢ型肝炎コア抗原である（例えば、ヨーロッパ特許番号 EP 0385610 B1を参照せよ；この参考文献は、その全体を本明細書に参照により組み入れる）。
【００７９】
本発明では、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は約８個から約３０個のアミノ酸からなる配列を含み、これらのアミノ酸は本発明のＩＶポリペプチド（例えば、ＮＰポリペプチド、Ｍ１ポリペプチド、又はＭ２ポリペプチド）のアミノ酸配列に含まれている。免疫原性又は抗原性のエピトープを含むある種のポリペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５及び１００個の長さを持つアミノ酸残基である。抗原性及び免疫原性を有するエピトープは、直線状、すなわち、ポリペプチドが連続したアミノ酸で構成されているものであってよく、３次元状、すなわち、エピトープが、当該ポリペプチドの二次若しくは三次構造によって結合している非連続的なアミノ酸で構成され、それによって、エピトープを形成しているものであってもよい。
【００８０】
抗原性エピトープを持つペプチド又はポリペプチド（例えば、抗体又はＴ細胞受容体が結合することができる、タンパク質分子の領域を含むもの）の選択については、タンパク質の配列の一部を模擬する比較的短い合成ペプチドが、通常、部分的に模擬されたタンパク質と反応する抗血清を誘導する能力を持つということが当業界では公知である（例えば、Sutcliffe, J. G., et al., Science 219:660-666 (1983) を参照せよ；この参考文献は、本明細書に参照により組み入れる）。
【００８１】
免疫原性応答を誘導する能力のあるペプチドは、タンパク質の主要な配列に表れていることが多く、単純な化学的な法則により特徴付けることができ、完全なタンパク質の主要抗原決定領域にもアミノ末端若しくはカルボキシル末端にも限定されない。疎水性が非常に高いペプチド及び残基の数が６個以下のペプチドは、一般的に、模擬されたタンパク質に結合する抗体を誘導するのに効果的ではないが、より長いペプチド、特にプロリン残基を含む長いペプチドは、通常、効果的である（上記に引用されているSutcliffe et al.の６６１ページを参照せよ）。例えば、これらのガイドラインに沿って作製された20個のペプチドのうち18個のペプチドで、ＩＶヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチド鎖の配列の７５％を覆う８個から３９個の残基を含むものが、ＨＡ１タンパク質又はインタクトなウィルスと反応する抗体を誘導した。さらに、ＭｕＬＶポリメラーゼ由来の１２個のペプチドのうち１２個のペプチドが、また狂犬病の糖タンパク質由来の１８個のペプチドのうち１８個のペプチドが、それぞれのタンパク質を沈殿する抗体を誘導した。
【００８２】
コドン最適化
「コドン最適化」は、対象の脊椎動物（例えば、ヒト）の細胞において発現を高める目的で、天然配列に存在する少なくとも１個、又は１個より多くの、又はかなりの数のコドンを、当該脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使われているコドンと置き換えることにより、核酸配列を修飾することとして定義される。多様な動物種が、特定のアミノ酸の一定のコドンに特定の偏りを有する。
【００８３】
一の態様では、本発明は、コドン最適化コード領域からなる核酸断片を含むポリヌクレオチドであって、当該核酸断片が、所与の脊椎動物(例えば、ヒト)の細胞内で発現が最適化するように適応させたコドンの使用頻度で、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、対象の脊椎動物の遺伝子に使用するために好ましいコドンをＤＮＡ配列に組み入れることにより調製する。本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域からなる核酸断片を含む、ポリヌクレオチド発現構築物、ベクター及び宿主細胞、並びにポリヌクレオチド発現構築物、ベクター及び宿主細胞を用いて、脊椎動物におけるインフルエンザ疾患を治療又は予防する多様な方法も提供する。
【００８４】
本明細書で用いる際「コドン最適化コード領域」という語は、少なくとも１個、又は１個より多くの、又はかなりの数のコドンを、当該脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に使われている１個以上のコドンと置き換えることにより、所与の脊椎動物(例えば、ヒト)の細胞における発現に適応させた核酸コード領域を意味する。
【００８５】
任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏りは、当該遺伝子をコードする配列における変異を可能とする。それぞれのコドンは3個のヌクレオチドから構成されており、ＤＮＡから成るこれらのヌクレオチドは4個の特定な塩基に制限されるので、６４通りのヌクレオチドの組み合わせが可能であり、それらの組み合わせのうち６１がアミノ酸をコードする（残りの３個のコドンは、翻訳を終止させるシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」が本明細書に表１として再現されている。その結果、多くのアミノ酸が1個以上のコドンにより指定されている。例えば、アミノ酸のアラニン及びプロリンは、4個のトリプレットによりコードされ、セリン及びアルギニンは、６個のトリプレットによりコードされる。これに対し、トリプトファン及びメチオニンは、１個のトリプレットによりコードされる。この縮重が、当該ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、広範囲に亘るＤＮＡ塩基組成を可能とする。
【表１】
2008505660.tif 000324
【００８６】
多くの生物が、成長ペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンについて偏りを有する。コドン選好性、すなわちコドン偏位（生物間のコドンの使用頻度における差異）は、遺伝コードの縮重の結果として産まれ、多くの生物について記述されている。コドン偏位は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関関係がある場合が多く、それに従って、特に、翻訳されているコドンの性質及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内において選択されるｔＲＮＡの優位性は、通常、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映している。このように、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現を求めて、特別の目的に合わせることが可能である。
【００８７】
多種多様な動物、植物及び微生物の種について利用できる多数の遺伝子配列を考慮に入れると、コドンの使用の相対的頻度を計算することが可能である。コドンの使用頻度表が入手可能であり、その入手経路には例えば、「コドンの使用頻度データベース["Codon Usage Database"] であり、そのURLはhttp://www.kazusa.or.jp/codon/（２００２年７月9日に閲覧した）である。さらに、これらの表は多様な目的に適合させることができる（Nakamura, Y., et al. 「国際ＤＮＡ配列データベースに基づき表にまとめたコドンの使用頻度：2000年の状況」["Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000"] Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照せよ；この参考文献は、本明細書に参考により組み入れる）。例として、GenBank データ公開１２８．０（２００２年２月１５日）に基づいて計算されたヒト、ネズミ、飼いネコ及びウシについてのコドンの使用頻度が下記に表２−５として再現されている。これらの表では、ｍＲＮＡの名称が使われており、それに合わせてＤＮＡに存在するチミン（Ｔ）の代わりに、当該の表では、ＲＮＡに存在するウラシル（Ｕ）が使われている。当該の表は、６４個のコドンすべてについてではなく、それぞれのアミノ酸について、頻度が計算されるように適合されている。
【表２−１】
2008505660.tif 000325
【表２−２】
2008505660.tif 000326
【表２−３】
2008505660.tif 000327
【表３−１】
2008505660.tif 000328
【表３−２】
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【表３−３】
2008505660.tif 000330
【表４−１】
2008505660.tif 000331
【表４−２】
2008505660.tif 000332
【表４−３】
2008505660.tif 000333
【表５−１】
2008505660.tif 000334
【表５−２】
2008505660.tif 000335
【表５−３】
2008505660.tif 000336
【００８８】
これらの表又は類似した表を用いることにより、当業者は当該頻度をいかなるポリペプチド配列にも応用することができ、ポリペプチドをコードし所与の動物種に最適化されたコドンを使う、コドン最適化コード領域からなる核酸断片を生産することができる。コドン最適化コード領域は、多様な方法で作製することができる。
【００８９】
「均一最適化」と名づけられた１個の方法では、コドンの使用頻度表を用いて、所与のアミノ酸に対し最も高頻繁に使われる単一のコドンを見い出し、このコドンを当該アミノ酸がポリペプチド配列に現れる度に使用する。例えば、上記の表２を見ると、ロイシンについてヒトにおいて最も高頻繁に使われているコドンはＣＵＧであり、その使用頻度は４１％である。そこで、所与のアミノ酸配列内のロイシン残基をすべて、コドンＣＵＧに割り当てる。「均一最適化」方法により最適化されたIAV NP (SEQ ID NO:2) に対するコード領域が、本明細書に下記のSEQ ID NO:24として提示される。
【化１９】
2008505660.tif 000337
【００９０】
「完全最適化」と名づけられた別の方法では、実際のコドン頻度を無作為にコード領域全体に分布させる。従って、この最適化方法を用いて、仮説ポリペプチド配列が１００個のロイシン残基を有していると仮定し、ヒトにおける使用頻度を上記表２を参照して調べると、約７個すなわち７％のロイシンコドンがＵＵＡであり、約１３個すなわち１３％のロイシンコドンがＵＵＧであり、約１３個すなわち１３％のロイシンコドンがＣＵＵであり、約２０個すなわち２０％のロイシンコドンがＣＵＣであり、約７個すなわち７％のロイシンコドンがＣＵＡであり、約４１個すなわち４１％のロイシンコドンがＣＵＧである。これらの頻度を、仮説ポリペプチドをコードするコード領域のロイシンコドンに無作為に分布させる。当業者には理解できるように、この方法を用いて、配列内のコドンの分布を大きく変えることができるが、当該配列は常に同一のポリペプチドをコードする。
【００９１】
一例として、ヒトのコドン使用頻度に合わせて完全に最適化されたNP (SEQ ID NO:2)のヌクレオチド配列を、SEQ ID NO:23として示す。コドン最適化コード領域（SEQ ID NO:23）とSEQ ID NO:1 （天然のＮＰコード領域）のヌクレオチド46から1542とのアライメントを、図１に示す。
【００９２】
「完全最適化」方法を用いると、ポリペプチド配列全体を、上記のようにコドン最適化することができる。完全なポリペプチドの多様な望ましい断片、変異体又は誘導体について、断片、変異体又は誘導体をまず作製し、その後個別にコドン最適化を行う。あるいはまた、全長ポリペプチド配列を所与の動物種についてコドン最適化して、当該ポリペプチド全体をコードするコドン最適化コード領域を生じさせ、その後、当該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片を、コドン最適化コード領域から作製する。当業者にはよく理解できるように、所与の動物種におけるコドン使用頻度に基づいてコドンを無作為に全長コード領域に割り当てたとすると、断片、変異体及び誘導体をコードする核酸断片は、当該の動物種について必ずしも完全にコドン最適化されないことになる。しかし、そのような配列は依然として、天然のコドン使用頻度に比べて、対象動物種のコドン使用頻度にはるかに近い。このアプローチの不利な点は、所与のポリペプチドの断片、変異体及び誘導体をコードするコドン最適化核酸断片を合成するには、ルーチン作業であっても、時間がかかり、支出が大変多くなるということである。
【００９３】
「完全最適化」方法を使用する場合に、「約」という語が、所与のアミノ酸のコドン使用頻度の分画百分率を正確に説明するために使われている。本明細書に用いられる際「約」という語は、与えられた値に比べ、１個多い又は１個少ないアミノ酸の数として定義される。アミノ酸の整数値は、分画使用頻度が０．５０以上の場合は切り上げ、分画使用頻度が０．４９以下の場合は切り下げる。６２個のロイシン(leucine)残基を有する仮説ポリペプチドについてヒト遺伝子のロイシンの使用頻度の例を再び用いれば、コドン使用の分画頻度は、多様なコドンの使用頻度に６２を乗じることにより計算される。従って、６２の７．２８％は、４．５１ＵＵＡコドンとなり、言い換えれば「約5個」すなわち４、５又は6個のＵＵＡコドンとなる。６２の１２．６６％は７．８５ＵＵＧ コドンとなり、言い換えれば「約８個」すなわち７、８又は９個のＵＵＧコドンとなる。６２の１２．８７％は７．９８ＣＵＵ コドンとなり、言い換えれば「約８個」すなわち７、８又は９個のＣＵＵコドンとなる。６２の１９．５６％は１２．１３ＣＵＣコドンとなり、言い換えれば「約１２個」すなわち１１、１２又は１３個のＣＵＣコドンとなる。６２の７．００％は４．３４ＣＵＡコドンとなり、言い換えれば「約４個」すなわち３、４又は５個のＣＵＡコドンとなる。６２の４０．６２％は２５．１９ＣＵＧコドンとなり、言い換えれば「約２５個」すなわち２４、２５又は２６個のＣＵＡコドンとなる。
【００９４】
「最小最適化」と名づけられた第三の方法では、コード領域は部分的にしか最適化されない。例えば、本発明は、コドン位置の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％が、所与の動物種に合わせてコドン最適化されている、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を含む。すなわち、これらのコドン位置は、天然の核酸配列で通常使われているコドンの代わりに、対象動物種（例えば、脊椎動物のヒト）の遺伝子で好ましく使われるコドンを含んでいる。対象の脊椎動物の遺伝子でめったに見られないコドンは、対象の脊椎動物のコード領域においてより一般的に使われるコドンに変えられる。
【００９５】
従って、対象の脊椎動物の遺伝子に比べ、対象のＩＶ遺伝子において、より頻繁に使われているコドンは、より頻繁に使われているコドンに置換される。ＩＶコドンを置換する頻度における差異は、下記で記述する複数の因子に基づいて変化させることができる。例えば、対象の脊椎動物の遺伝子に比べ、ＩＶ遺伝子において使用頻度が千個当たり少なくとも２倍であるコドンは、対象の脊椎動物におけるそのアミノ酸に対応する最も頻繁に使われるコドンと置換される。この率は、下記で記述する多様な因子に応じて、より高く又はより低く調整してよい。従って、ＩＶ天然コード領域のコドンは、以下の条件の時に、対象の脊椎動物のコード領域にあるそのアミノ酸についてより頻繁に使われるコドンと置換される：対象の脊椎動物のコード領域に比べて、ＩＶコード領域における当該コドンの使用頻度が、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．８倍、３．９倍、４．０倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、又はそれ以上の場合。
【００９６】
変異性が高いコドンについての最小限のヒトコドン最適化には、利点がいくつかあり、それらの利点には下記の例が含まれるがそれらの限定されるものではない。対象の遺伝子のヌクレオチド配列に加える変化が少ないため、必要とされる操作過程数も少なくなる。その結果、不要な突然変異を導入するリスクが下がりコストを削減できるとともに、市販の部位特異的突然変異誘発キットを使用することができるようになり、高価なオリゴヌクレオチド合成の必要性を低減する。さらに、ヌクレオチド配列における変化の数を減少させることは、当該配列の二次構造を改変する可能性も減少し、その結果、ある宿主細胞における遺伝子発現に大きな効果をもたらす可能性がある。望ましくない制限部位の導入も減少し、対象の遺伝子のプラスミド発現ベクターへのサブクローニングが促進される。 
【００９７】
本発明はまた、ＩＶポリペプチド（Ｐ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１及びＮＳ２）又はその断片、変異体若しくは誘導体のコード領域を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。単離ポリヌクレオチドもまた、コドン最適化することができる。
【００９８】
本明細書で記述するある実施の形態では、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化している。あるいはまた、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、植物、動物、微生物の種におけるコドン使用頻度に従って最適化してもよい。ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化コード領域を、以下のように作製する。SEQ ID NO:2のアミノ酸組成を、表６に示す。
【表６】
2008505660.tif 000338
【００９９】
表６に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:2をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計してもよい。「均一」最適化を行う場合は、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:2をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３３個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２６個 のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２５個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２３個のバリンコドンはＧＴＧであり、４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、１７個のプロリンコドンはＣＣＣであり、２８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、２６個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、２２個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３６個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、６個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、４９個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ であり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４１個のグリシンコドンはＧＧＣである。
【０１００】
あるいはまた、SEQ ID NO:2をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、下記表７に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:2をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約８個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３３個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約６個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１３個がＣＴＧである；２６個のイソロイシンコドンのうち約９個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである； ２５個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２３個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約５個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４０個のセリンコドンのうち約７個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１７個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；２８個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１０個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約３個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個が ＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである； ６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２６個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１４個がＡＡＣである；２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２２個のアスパラギン酸コドンのうち約１０個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；２６個のグルタミン酸コドンのうち約１１個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１５個がＧＡＧである；６個のシステインコドンのうち約３個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約３個がＴＧＣである；６個のトリプトファンコドンは ＴＧＧである；４９個のアルギニンコドンのうち約��個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約９個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約５個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４１個のグリシンコドンのうち約７個が ＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１４個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１０個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１０個がＧＧＧである。
【０１０１】
上記で説明しているように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、1個多くても、１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１０２】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:2をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:23として提示される。
【０１０３】
さらに、SEQ ID NO:2をコードする、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【表７−１】
2008505660.tif 000339
【表７−２】
2008505660.tif 000340
【０１０４】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１０５】
SEQ ID NO:2をコードし、さらにこの後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:25として提示される：
【化２０】
2008505660.tif 000341
【０１０６】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:4をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:4をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物、又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:4をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:4のアミノ酸組成を、表８に示す。
【表８】
2008505660.tif 000342
【０１０７】
表8に示したアミノ酸組成を用い、SEQ ID NO:4をコードするヒトコドン最適化コード領域は、本明細書で説明しているいかなる方法によっても設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、ヒトゲノムにおいて当該アミノ酸について最も使用頻度が高いコドンに、それぞれのアミノ酸を割り当てる。この方法によると、コドンは、SEQ ID NO:4をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：７個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、２６個のロイシンコドンはＣＴＧであり、１１個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、１４個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、１６個のバリンコドンはＧＴＧであり、１８個のセリンコドンはＡＧＣであり、８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、１８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、２５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、５個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、１５個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、１１個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、１３個のリジンコドンはＡＡＧであり、６個のアスパラギン酸はＧＡＣであり、１７個のグルタミン酸はＧＡＧであり、１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、１７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり(ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、１６個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化コード領域は、下記のSEQ ID NO:27として本明細書に提示される：
【化２１】
2008505660.tif 000343
【０１０８】
あるいはまた、SEQ ID NO:4をコードするヒトコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により、設計することができる。この方法では、アミノ酸はそれぞれ、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、コドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度を、上記表8に示した。この後者の方法を用い、コドンは、SEQ ID NO:4をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：７個のフェニルアラニンコドンのうち約３個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約４個がＴＴＣである；２６個のロイシンコドンのうち約２個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約３個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１１個がＣＴＧである；１１個のイソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約５個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約２個がＡＴＡである；１４個のメチオニンコドンはＡＴＧである；１６個のバリンコドンのうち約３個が ＧＴＴであり、バリンコドンのうち約４個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約２個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約８個がＧＴＧである；１８個のセリンコドンのうち約３個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約４個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約３個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約１個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約３個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約４個がＡＧＣである；８個のプロリンコドンのうち約２個が ＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約３個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約１個がＣＣＧである；１８個のスレオニンコドンのうち約４個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約７個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約５個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約２個がＡＣＧである；２５個のアラニンコドンのうち約７個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１０個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約６個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約３個がＧＣＧである；５個のチロシンコドンのうち約２個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約３個がＴＡＣである；５個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約３個がＣＡＣである；１５個のグルタミンコドンのうち約４個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１１個がＣＡＧである；１１個のアスパラギンコドンのうち約５個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約６個がＡＡＣである；１３個のリジンコドンのうち約５個が ＡＡＡであり、リジンコドンのうち約８個がＡＡＧである；６個のアスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣである；１７個のグルタミン酸コドンのうち約７個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１０個がＧＡＧである；３個のシステインコドンのうち約１個が ＴＧＴであり、システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；１個のトリプトファンコドンは ＴＧＧである；１７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、アルギニンコ���ンのうち約３個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約２個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約４個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約３個がＡＧＧである；１６個のグリシンコドンのうち約３個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約６個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約４個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約４個がＧＧＧである。
【０１０９】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１個多くても１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１１０】
SEQ ID NO:4をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、代表的な「完全最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:26として提示される：
【化２２】
2008505660.tif 000344
【０１１１】
さらに、SEQ ID NO:4をコードし、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１１２】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１１３】
SEQ ID NO:4をコードし、さらにこの後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:28として提示される：
【化２３】
2008505660.tif 000345
【０１１４】
本明細書で記述するある実施の形態では、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化している。あるいはまた、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、植物、動物、微生物の種におけるコドン使用頻度に従って最適化してもよい。ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:5をコードするコドン最適化コード領域を、以下のように作製する。SEQ ID NO:5のアミノ酸組成を、表9に示す。
【表９】
2008505660.tif 000346
【０１１５】
表９に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:5をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:5をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：４個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、１０個のロイシンコドンはＣＴＧであり、８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、４個のバリンコドンはＧＴＧであり、７個のセリンコドンはＡＧＣであり、４個のプロリンコドンはＣＣＣであり、４個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、５個のアラニンコドンはＧＣＣであり、３個のチロシンコドンはＴＡＣであり、２個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、３個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、５個のリシンコドンはＡＡＧであり、５個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、２個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、７個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧ であり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、８個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:30として提示した：
【化２４】
2008505660.tif 000347
【０１１６】
あるいはまた、SEQ ID NO:5をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらの使用頻度は、上記表9に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:5をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：４個のフェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約２個がＴＴＣである；１０個のロイシンコドンのうち約１個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約１個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＣＴＧである；８個のイソロイシンコドンのうち約３個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約４個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約１個がＡＴＡである；２個のメチオニンコドンはＡＴＧである；４個のバリンコドンのうち約１個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約１個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約０個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約２個がＧＴＧである；７個のセリンコドンのうち約１個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約１個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約０個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約１個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約２個がＡＧＣである；４個のプロリンコドンのうち約１個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約１個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約０個がＣＣＧである；４個のスレオニンコドンのうち約１個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約１個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約０個がＡＣＧである；５個のアラニンコドンのうち約１個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約２個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約１個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約１個がＧＣＧである；３個のチロシンコドンのうち約１個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約２個がＴＡＣである；２個のヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約１個がＣＡＣである；２個のグルタミンコドンのうち約１個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１個がＣＡＧである；３個のアスパラギンコドンのうち約１個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約２個がＡＡＣである；５個のリジンコドンのうち約２個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約３個がＡＡＧである；５個のアスパラギン酸コドンのうち約２個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約３個がＧＡＣである；９個のグルタミン酸コドンのうち約４個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約５個がＧＡＧである；３個のシステインコドンのうち約１個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約２個がＴＧＣである；２個のトリプトファンコドンはＴＧＧである；７個のアルギニンコドンのうち約１個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１個がＡＧＧである；８個のグリシンコドンのうち約１個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約３個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約２個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約２個がＧＧＧである。
【０１１７】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１個多くても１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが1個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが1個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１１８】
SEQ ID NO:5をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、代表的な「完全最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:29として提示される：
【化２５】
2008505660.tif 000348
【０１１９】
さらに、SEQ ID NO:5をコードする、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１２０】
最小最適化の別の形態では、問題の特異ＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１２１】
SEQ ID NO:5をコードし、この後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:31として提示される：
【化２６】
2008505660.tif 000349
【０１２２】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:7をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:7をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:7をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:7のアミノ酸組成を、表１０に示す。
【表１０】
2008505660.tif 000350
【０１２３】
表１０に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:7をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されているいかなる方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:7をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２７個 のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ，あるいはＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、さらに４３個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書にSEQ ID NO:33として提示した：
【化２７】
2008505660.tif 000351
【０１２４】
あるいはまた、SEQ ID NO:7をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により作製することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらの使用頻度は、上記表１０に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:7をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧである；２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである；２６個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個が ＧＣＵであり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣである；２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧである；８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約４個がＴＧＣである；７個のトリプトファンコドンは ＴＧＧである；５１個のアルギニンコドンのうち約４個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１２５】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１個多くても１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１２６】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:7をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:32として提示される:
【化２８】
2008505660.tif 000352
【０１２７】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:9をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:9をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:9をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:9のアミノ酸組成を、表１１に示す。
【表１１】
2008505660.tif 000353
【０１２８】
表１１に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:9をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されている方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:9をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３５個のロイシンコドンはＣＴＧであり、２７個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２６個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、２４個のバリンコドンはＧＴＧであり、４３個のセリンコドンはＡＧＣであり、１８個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３０個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、３９個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１５個のチロシンコドンはＴＡＣであり、６個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、２１個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、２８個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、２１個のリシンコドンはＡＡＧであり、２３個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３９個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、７個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、５１個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４３個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:35として提示する：
【化２９】
2008505660.tif 000354
【０１２９】
あるいはまた、SEQ ID NO:9をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、上記表１１に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:9をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：１８個のフェニルアラニンコドンのうち約8個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＣである；３５個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約４個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約７個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約２個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１４個がＣＴＧである；２７個のイソロイシンコドンのうち約１０個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１３個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約4個がＡＴＡである；２６個のメチオニンコドンはＡＴＧである；２４個のバリンコドンのうち約4個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約６個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約３個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１１個がＧＴＧである；４３個のセリンコドンのうち約８個がＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；１８個のプロリンコドンのうち約５個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約６個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約５個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約２個がＣＣＧである；３０個のスレオニンコドンのうち約７個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約８個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；３９個のアラニンコドンのうち約１０個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１６個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１５個のチロシンコドンのうち約７個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；６個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約４個がＣＡＣである；２１個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１６個がＣＡＧである；２８個のアスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１５個がＡＡＣである；２１個のリジンコドンのうち約９個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約１２個がＡＡＧである；２３個のアスパラギン酸コドンのうち約１１個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１２個がＧＡＣである；３９個のグルタミン酸コドンのうち約１６個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約２３個がＧＡＧである；８個のシステインコドンのうち約４個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約４個がＴＧＣである；７個のトリプトファンコドンはＴＧＧである；５１個のアルギニンコドンのうち約��個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１１個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約１０個がＡＧＧである；４３個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１３０】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１個多くても１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１３１】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:9をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:34として提示される：
【化３０】
2008505660.tif 000355
【０１３２】
本明細書で記述するある実施の形態において、SEQ ID NO:16をコードするコドン最適化コード領域は、ヒト（ホモサピエンス）におけるコドン使用頻度に従って最適化されている。あるいはまた、SEQ ID NO:16をコードするコドン最適化コード領域は、植物、動物又は微生物におけるコドン使用頻度に従って最適化されてもよい。SEQ ID NO:16をコードし、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、コドン最適化コード領域は、以下のように作製する。SEQ ID NO:16のアミノ酸組成を、表１２に示す。
【表１２】
2008505660.tif 000356
【０１３３】
表１２に示したアミノ酸組成を用いて、SEQ ID NO:16をコードするヒトコドン最適化コード領域を、本明細書に記載されている方法によって設計することができる。「均一」最適化を行う場合には、それぞれのアミノ酸は、当該アミノ酸についてヒトゲノムで最も使用頻度の高いコドンに割り当てられる。この方法によれば、コドンはSEQ ID NO:16をコードするコード領域に、以下のように割り当てられる：２１個のフェニルアラニンコドンはＴＴＣであり、３９個のロイシンコドンはＣＴＧであり、３８個のイソロイシンコドンはＡＴＣであり、２７個のメチオニンコドンはＡＴＧであり、３２個のバリンコドンはＧＴＧであり、４０個のセリンコドンはＡＧＣであり、２６個のプロリンコドンはＣＣＣであり、３８個のスレオニンコドンはＡＣＣであり、４１個のアラニンコドンはＧＣＣであり、１４個のチロシンコドンはＴＡＣであり、４個のヒスチジンコドンはＣＡＣであり、１９個のグルタミンコドンはＣＡＧであり、２５個のアスパラギンコドンはＡＡＣであり、５２個のリシンコドンはＡＡＧであり、３４個のアスパラギン酸コドンはＧＡＣであり、３０個のグルタミン酸コドンはＧＡＧであり、１個のトリプトファンコドンはＴＧＧであり、３０個のアルギニンコドンはＣＧＧ、ＡＧＡ又はＡＧＧであり（ヒトゲノムにおけるこれら3個のコドンの使用頻度にはあまり差異がない）、４４個のグリシンコドンはＧＧＣである。この方法により設計したコドン最適化ＰＡコード領域を、本明細書に下記のSEQ ID NO:37として提示する：
【化３１】
2008505660.tif 000357
【０１３４】
あるいはまた、SEQ ID NO:16をコードするヒトのコドン最適化コード領域は、「完全最適化」方法により設計することができる。この方法では、ヒトゲノムにおける使用頻度に基づいて、それぞれのアミノ酸がコドンに割り当てられる。これらアミノ酸の使用頻度は、上記表１２に示してある。この後者の方法を用いて、コドンは、SEQ ID NO:16をコードするコード領域に以下の様に割り当てられる：２１個のフェニルアラニンコドンのうち約１０個がＴＴＴであり、フェニルアラニンコドンのうち約１２個がＴＴＣである；３９個のロイシンコドンのうち約３個がＴＴＡであり、ロイシンコドンのうち約５個がＴＴＧであり、ロイシンコドンのうち約５個がＣＴＴであり、ロイシンコドンのうち約８個がＣＴＣであり、ロイシンコドンのうち約３個がＣＴＡであり、ロイシンコドンのうち約１６個がＣＴＧである；３８個のイソロイシンコドンのうち約１４個がＡＴＴであり、イソロイシンコドンのうち約１８個がＡＴＣであり、イソロイシンコドンのうち約６個がＡＴＡである；２７個のメチオニンコドンはＡＴＧである；３２個のバリンコドンのうち約６個がＧＴＴであり、バリンコドンのうち約８個がＧＴＧであり、バリンコドンのうち約４個がＧＴＡであり、バリンコドンのうち約１５個がＧＴＧである；４０個のセリンコドンのうち約７個が ＴＣＴであり、セリンコドンのうち約９個がＴＣＣであり、セリンコドンのうち約６個がＴＣＡであり、セリンコドンのうち約２個がＴＣＧであり、セリンコドンのうち約６個がＡＧＴであり、セリンコドンのうち約１０個がＡＧＣである；２６個のプロリンコドンのうち約７個がＣＣＴであり、プロリンコドンのうち約９個がＣＣＣであり、プロリンコドンのうち約７個がＣＣＡであり、プロリンコドンのうち約３個がＣＣＧである；３８個のスレオニンコドンのうち約９個がＡＣＴであり、スレオニンコドンのうち約１４個がＡＣＣであり、スレオニンコドンのうち約１１個がＡＣＡであり、スレオニンコドンのうち約４個がＡＣＧである；４１個のアラニンコドンのうち約１１個がＧＣＴであり、アラニンコドンのうち約１７個がＧＣＣであり、アラニンコドンのうち約９個がＧＣＡであり、アラニンコドンのうち約４個がＧＣＧである；１４個のチロシンコドンのうち約６個がＴＡＴであり、チロシンコドンのうち約８個がＴＡＣである；４個のヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＴであり、ヒスチジンコドンのうち約２個がＣＡＣである；１９個のグルタミンコドンのうち約５個がＣＡＡであり、グルタミンコドンのうち約１４個がＣＡＧである；２５個のアスパラギンコドンのうち約１２個がＡＡＴであり、アスパラギンコドンのうち約１３個がＡＡＣである；５２個のリジンコドンのうち約２２個がＡＡＡであり、リジンコドンのうち約３０個がＡＡＧである；３４個のアスパラギン酸コドンのうち約１６個がＧＡＴであり、アスパラギン酸コドンのうち約１８個がＧＡＣである；３０個のグルタミン酸コドンのうち約１２個がＧＡＡであり、グルタミン酸コドンのうち約１８個がＧＡＧである；５個のシステインコドンのうち約２個がＴＧＴであり、システインコドンのうち約３個がＴＧＣである；単一のトリプトファンコドンはＴＧＧである；３０個のアルギニンコ��ンのうち約２個がＣＧＴであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＣであり、アルギニンコドンのうち約３個がＣＧＡであり、アルギニンコドンのうち約６個がＣＧＧであり、アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＡであり、アルギニンコドンのうち約６個がＡＧＧである；４４個のグリシンコドンのうち約７個がＧＧＴであり、グリシンコドンのうち約１５個がＧＧＣであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＡであり、グリシンコドンのうち約１１個がＧＧＧである。
【０１３５】
上記で説明したように、「約」という語は、あるコドンによりコードされるアミノ酸の数が与えられた数より、１個多くても１個少なくてもよいことを意味している。ポリペプチド配列内のアミノ酸の総数は一定でなければならないので、所与のアミノ酸をコードするコドンが１個「多く」あるのなら、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが１個「少なく」あるはずだということは、当業者には理解できることである。
【０１３６】
ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化された、SEQ ID NO:16をコードする、代表的な「完全最適化」コドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:36として提示されている：
【化３２】
2008505660.tif 000358
【０１３７】
さらに、SEQ ID NO:16をコードし、最小限にコドン最適化されたヌクレオチド配列は、表７に示すように、ヒト遺伝子に比べてＩＶ遺伝子に、より頻繁に見出されるある種のコドンだけを変えることにより、作製することができる。例えば、ヒトで使用頻度が高いコドンを、ＩＶ遺伝子で少なくとも2倍の使用頻度で起こるコドン（表７にアストリスク＊で示した）と置換したい場合は、Ａｒｇ  ＡＧＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．３倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＧＧに変える；Ａｓｎ  ＡＡＴ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＡＣに変える；Ｉｌｅ  ＡＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に３．６倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＡＴＣに変える；さらに、Ｌｅｕ  ＣＴＡ（ヒト遺伝子に比べて、ＩＶ遺伝子に２．０倍より頻繁に起こる）を、例えば、ＣＴＧに変える。
【０１３８】
最小最適化の別の形態では、問題の特定のＩＶ配列に関するコドン使用頻度表（ＣＵＴ）を作成し、ヒトゲノムＤＮＡに関するＣＵＴ（上記表７を参照せよ）と比較した。ヒトとＩＶＤＮＡ間でコドン使用頻度に少なくとも１０％の違いのある（多いか少ないか）アミノ酸を確認した。その後、野生型ＩＶコドンを修飾し、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合させた。さらに、そのようなアミノ酸に対応する優勢なヒトコドンに適合するように、そのアミノ酸に対応する残りのコドンもまた修飾した。
【０１３９】
SEQ ID NO:16をコードし、この後者の方法によりヒトにおけるコドン使用頻度に従って最小限に最適化された、代表的な「最小限に最適化」されたコドン最適化コード領域は、本明細書に下記のSEQ ID NO:38として提示されている：
【化３３】
2008505660.tif 000359
【０１４０】
「完全最適化」又は「最小最適化」方法を用いて、所与のポリペプチド配列をコードするコドンを、最適化した頻度で無作為に割り当てることは、それぞれのアミノ酸についてコドン頻度を計算し、次いで当該コドンを当該ポリペプチド配列に無作為に割り当てることにより、手作業で行うことができる。さらに、多様なアルゴリズム及びコンピュータソフトウェアプログラムが当業者には入手可能であり、その例としては、ウィソコンシン州マディソン市にあるDNAstar, Inc.社製のLasergene Package プログラムに含まれている「EditSeq」機能、メリーランド州のベセスダにあるInforMax, Inc.製のVectorNTI Suiteプログラムに含まれている逆翻訳機能、およびカリフォルニア州サンディエゴ市にあるAccelrys, Inc.製のGCG--Wisconsin Package プログラムに含まれている逆翻訳機能などがある。さらに、コドン最適化コード領域配列について、多様な資源が公的に利用可能であり、その例としては、http://www.entelechon.com/eng/backtranslation.html（２００２年７月９日に閲覧した）のサイトにある「逆翻訳」機能、およびhttp://bioinfo.pbi.nrc.ca:8090/EMBOSS/index.html（２００２年１０月１５日に閲覧した） のサイトにある「backtranseq」機能などがある。所与の頻度に基づきコドンを割り当てる基本的なアルゴリズムは、基本的な数学的関数を用いて、当業者が簡単に作製することができる。
【０１４１】
当業者に周知の標準若しくはルーチンの分子生物学的操作法を用いることで、多くの選択肢が、上記に説明した方法の何れかの方法により設計したコドン最適化コード領域を合成するために利用可能である。１個のアプローチにおいて、それぞれ８０から９０ヌクレオチドの長さを持ち、当該望ましい配列の長さを持つ一連の相補的なオリゴヌクレオチドペアを、標準的な方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアは、アニーリング時に、８０から９０の塩基ペアの二本鎖の断片を形成し、付着末端を含むように合成する。これは、例えば、ペアを構成しているそれぞれのオリゴヌクレオチドを、当該ペアのもうひとつのオリゴヌクレオチドに対し相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれより多くの数の塩基を延長させて、合成するということである。それぞれのオリゴヌクレオチドペアの一本鎖の末端は、別のオリゴヌクレオチドペアの一本鎖の末端にアニールするように設計されている。オリゴヌクレオチドペアがアニールされ、次いでこれらの二本鎖断片の約5個若しくは6個が相互に一本鎖の付着末端を介してアニールされることを可能とし、その後それらは相互に連結して、標準細菌用クローニングベクター（例えば、カリフォルニア州カールスバッド市にあるInvitrogen Corporation製のTOPO（登録商標））にクローニングされる。その後、当該構築物を、標準方法により配列決定する。連結された８０個から９０個の塩基ペア断片の5個から6個の断片群から成る構築物（すなわち、約５００個の塩基ペアの断片群）を、対象配列全体を一連のプラスミド構築物において再提示できるように作製する。その後、これらのプラスミド挿入片を、適切な制限酵素を用いて切除し、連結して、最終構築物を形成する。その後、最終構築物を、標準細菌用クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。上記以外の方法が、当業者には明白であろう。さらに、市販の遺伝子合成技術が利用できる。
【０１４２】
コドン最適化コード領域は、ＩＶのいかなる菌株、誘導体又は変異体に由来するいかなる遺伝子産物をコードするものであってもよく、当該遺伝子産物の断片、変異体、又は誘導体であってもよい。その例としては、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２ポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域からなる核酸断片が挙げられる。その他のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳ１又はＮＳ２）をコードするコドン最適化コード領域は、本発明に含まれる。さらに、ＩＶポリペプチド又はその他のポリペプチドをコードするさらなる非コドン最適化ポリペプチドもまた含まれる。
【０１４３】
コンセンサス配列
本発明はさらに、インフルエンザウィルスタンパク質、並びにその断片、誘導体及び変異体の特定のコンセンサス配列に関する。「コンセンサス配列」は、例えば、相互比較された２つ以上の配列の各々の位置で存在頻度が最も高いアミノ酸を表す理想化配列(idealized sequence)である。コンセンサス配列は、理論上の代表的アミノ酸配列であり、この配列では、それぞれのアミノ酸は、自然に発生する異なった配列内の当該部位で、最も発生頻度の高いアミノ酸である。この語はまた、理論上のコンセンサスに近似した実際の配列をも意味する。コンセンサス配列は、例えば、共通の機能的若しくは構造的目的を持った配列に由来するものであってよい。コンセンサス配列という語は、同種を最大限にするため、できるだけ多くの特定の構造的若しくは機能的ドメインの例をアライメントすることにより、定義することができる。それぞれの特定のアミノ酸がその位置において合理的に優勢であり、比較の基礎を形成するほとんどの配列が少数の置換（０個から１００個の置換）によりコンセンサスと関連性を持つ場合に、配列は一般的にコンセンサスとして受け入れられる。一般的に、野生型比較配列は、少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の割合で、コンセンサス配列と一致する。従って、本発明のポリペプチドは、約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の割合で、コンセンサス配列と一致する。コンセンサスアミノ酸配列は、いかなるインフルエンザ抗原についても作製することができる。１９９０年以来配列が解明されたＡ型インフルエンザ菌株を分析することにより、コンセンサスアミノ酸配列が、Ａ型インフルエンザＮＰ(SEQ ID NO: 76)、Ｍ１(SEQ ID NO:77)およびＭ２(SEQ ID NO:78)タンパク質（実施例３）より、見出された。
【０１４４】
［コンセンサスアミノ酸］は、コンセンサスタンパク質における所与の位置を占めるように選択されたアミノ酸である。コンセンサスアミノ酸を選択する目的で組織化されたシステムは、コンピュータプログラム、又は１個以上のコンピュータプログラムと手作業の分析計算とを組み合わせたものであってよい。アライメントされたアミノ酸配列のそれぞれの位置に対し、コンセンサスアミノ酸が得られたら、これらのコンセンサスアミノ酸を「整列し」、コンセンサスタンパク質のアミノ酸配列を得る。
【０１４５】
本発明の別の実施の形態は、コンセンサスタンパク質を作製する方法であって、いわゆるコンセンサスタンパク質のほとんどすべての位置についてアミノ酸残基を算出する工程と、原核若しくは真核発現システムで発現させることができる完全な遺伝子をこの配列から合成する工程とを含む方法に関する。
【０１４６】
コンセンサスインフルエンザポリペプチド、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の一部である。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、アミノ酸配列の逆翻訳及び対応するポリヌクレオチドのＰＣＲ合成のような既知の方法により得ることができる。
【０１４７】
組成物および方法
ある実施の形態においては、本発明は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする少なくとも１個のコドン最適化コード領域を含む１つ以上のポリペプチドを、脊椎動物の組織にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することにより、ＩＶ感染から保護する必要のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法に関する。さらに、本発明は、本明細書に記述するような１個以上のポリペプチドと、少なくとも１個の単離ポリペプチド、又はそれの断片、変異体若しくは誘導体とを含む組成物を、脊椎動物に投与することにより、ＩＶ感染から保護する必要のある脊椎動物の免疫応答を高めるための組成物及び方法に関する。当該ポリペプチドは、単離ポリペプチドを投与する前に、同じ時(同時)に、又は投与した後に、投与してよい。
【０１４８】
ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする当該コドン最適化コード領域は、特定の脊椎動物に合わせてコドン最適化してよい。コドン最適化は、本明細書で記述の各種の方法により行う。例えば、ある実施の形態においては、ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を、当該特定の脊椎動物のコドン使用頻度に従って最適化する。本発明のポリヌクレオチドを、脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込み、免疫学的に有効な量のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をｉｎ  ｖｉｖｏで生産する。ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードする当該コード領域は、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル[cebus]、アカゲザル[rhesus]、アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]、及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン及びチンパンジー、イヌ、オオカミ、ネコ、ライオン及びトラ、ウマ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、キリン、クマ、ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラなどの哺乳動物；カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、ホシムクドリ及びセキセイインコなどの鳥禽類、或いはその他の脊椎動物に合わせてコドン最適化してよい。
【０１４９】
１個の実施の形態において、本発明は、ヒトのコドン使用頻度に従って最適化した、ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片に関する。例えば、ＩＶポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするヒトコドン最適化コード領域は、ＩＶポリペプチドの断片、変異体又は誘導体をコードするＤＮＡ配列において天然に起こるコドンを、ヒト遺伝子においてより好ましく使用される１個以上のコドンに置換することにより、作製される。本発明ではさらに以下のものが提供される：ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物；ＩＶポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域、又はＩＶポリペプチドの断片、変異体若しくは誘導体をコードするそのようなコード領域の核酸断片を含むポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物を含む医薬組成物；並びにそのようなポリヌクレオチド、ベクター、及びその他の発現構築物を使用する様々な方法。ＩＶポリペプチドをコードするコード領域は、本明細書で記述のように、均一に最適化し、完全に最適化し、最小限に最適化し、領域毎にコドン最適化し、及び／又はコドン最適化しないことができる。
【０１５０】
本発明はさらに、任意にその他の抗原と共同させる、ＩＶポリペプチド抗原（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１及びＭ２）をコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリペプチドの断片、変異体又は誘導体（例えば、ｅＭ２ポリペプチド、又はＮＰとｅＭ２との融合ポリペプチド）をコードするコドン最適化核酸断片を含むポリヌクレオチドに関する。
【０１５１】
ある実施の形態において、本発明は、核酸断片を含む単離ポリヌクレオチドであって、当該核酸断片が、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の割合で、ＩＶポリペプチド（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１又はＭ２）と一致するポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の断片であり、当該核酸断片が、ＩＶポリペプチド（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１又はＭ２）をコードするコドン最適化コード領域の変異体である、単離ポリヌクレオチドを提供する。ヒトコドン最適化コード領域は、いかなる脊椎動物に対しても、本明細書で説明しているいかなる方法によって、最適化することができる。
【０１５２】
単離ＩＶポリペプチド
本発明はさらに、１個以上の単離ＩＶ構成成分又は単離ポリペプチドに加えて、１個以上の核酸断片を含む少なくとも１個のポリヌクレオチドを含有する組成物であって、当該の核酸断片が、それぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である、組成物に関する。ＩＶ構成成分は、不活性化ウィルス、弱毒化ウィルス、単離インフルエンザウィルスポリペプチドを発現するウィルスベクター、或いはインフルエンザウィルスタンパク質、又はそれ断片、変異体若しくは誘導体であってよい。
【０１５３】
コドン最適化核酸組成物と組み合わせた、ポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を、組み合わせポリヌクレオチドワクチン組成物又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物と呼ぶ。
【０１５４】
本発明の単離ＩＶポリペプチドは、いかなる形態であってもよく、本発明の技術分野において周知の技術を用いて生産される。その例には、組み換え技術により生産された単離ＩＶタンパク質、天然環境から直接精製された単離ＩＶタンパク質、単離ＩＶタンパク質を発現する組み換え（非ＩＶ）ベクター、又は従来のワクチンのような不活性化ＩＶワクチンの形態で投与されるタンパク質が含まれる。
【０１５５】
使用時には、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を、免疫学的に有効な量で投与する。従来のＩＶワクチンは、ウィルス抗原であるＨＡ及びＮＡのマイクログラムに標準化されている（Subbarao, K., Advances in Viral Research 54:349-373 (1999)を参照せよ；この文献は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる）。これらのワクチンの推奨投与量は、０．５ｍｌ．Ｉｄ．あたり各ＨＡ15 μｇ である。当業者は、従来のＩＶワクチンの有効な量を、いくつかの要因（発現されている抗原、被験体の年齢と体重、治療を必要としている正確な病状とその重篤度、及び投与経路を含む）に基づき、決定することができる。
【０１５６】
本発明において、従来の抗原ワクチン組成物とコドン最適化核酸組成物を組み合わせたものは、投与量節約濃度で治療上有益な効果を提供する。例えば、コドン最適化核酸を適量用いて補ったり高めたりした場合には、当該の承認市販製品の使用量を減じても、上記の従来の製品のような承認市販製品について予定される治療上有益な効果を患者に及ぼすのに充分な免疫応答を達成することができる。従って、本発明のコドン最適化核酸と組み合わせて従来のＩＶワクチンを投与することにより、投与量の節約が企図される。
【０１５７】
特に、本発明のコドン最適化核酸と組み合わせて投与する場合に、従来のワクチンの投与量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％低減することができる。
【０１５８】
同様に、ＤＮＡを用いた薬剤のみにより提供される所望レベルの免疫応答を、一部に従来のワクチンを含めることにより、より少ない量のＤＮＡで達成できる。さらに、従来の薬剤とＤＮＡを用いた薬剤とを組み合わせて用いることにより、所望レベルの免疫応答を提供しながら、いずれかの材料を単独で投与した場合に比較して、より少ない量で使用できる（例えば、これらの材料を組み合わせて使用した場合、いずれかの免疫産物の使用量が少なくて済む）。これは、毎回投与する材料の量が少なくて済むということだけでなく、ワクチン療法において投与回数を減らすことができるということ（例えば、3回又は4回の注射を２回に減らす）、及び／又は、免疫応答の反応時間が減じられるということ（例えば、望ましい反応レベルが、予防接種後6週間ではなく、予防接種後3週間で達成される）にも現れる。
【０１５９】
特に、従来のＩＶワクチンと組み合わせて投与する場合に、ＤＮＡを用いた薬剤の投与量は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％低減することができる。
【０１６０】
ＤＮＡを用いた薬剤および従来の抗原の正確な量を決定することは、上記の多くの因子に基づいており、当業者は容易に決定することができる。
【０１６１】
投与量の節約に加えて、請求される組み合わせ組成物は、免疫応答を広げること及び／又は免疫応答を高めることを提供する。そのような免疫応答の広がり及び向上は、以下により達成される：従来のワクチンにＤＮＡを加え、細胞性応答を高める；従来のワクチンをＤＮＡ薬剤に加え、体液性応答を向上させる；より多くのエピトープ（体液性応答及び／又は細胞性応答の双方）が認識され及び／又はより望ましい応答がなされるような組み合わせを用いること（エピトープの拡大）；特殊な望ましいスペクトルの免疫学的応答を求めて設計されたＤＮＡを用いた薬剤及び従来のワクチンの組み合わせを用いる；どちらか任意の構成成分をより多い量で用いることにより、望ましいスペクトルを得る。当業者は、拡大された免疫応答を、当該望ましい反応スペクトルに特異的な標準免疫アッセイにより、測定することができる。
【０１６２】
免疫応答の広がり及び投与量の節約は、双方とも同時に得ることができる。
【０１６３】
投与する単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（組み換えタンパク質、精製サブユニット、単離ＩＶポリペプチドを発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態で）は、いかなる単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体でもよく、その例としては、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２タンパク質、又はそれらの断片、変異体若しくは誘導体が含まれるが、それらに限定されるものではない。断片の例には、ｅＭ２タンパク質が含まれるが、それに限定されるものではない。ある実施の形態において、誘導体タンパク質は、融合タンパク質（例えば、ＮＰ−ｅＭ２）であってよい。本明細書で記述するいかなる単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体も、核酸断片を含むいかなるポリヌクレオチドを含有する組成物において組み合わせることができ、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片であるということは留意すべきである。タンパク質は、異なっていても同一であってもよく、１個以上の単離ＩＶたんぱく質と１個以上のポリヌクレオチドとを任意の組合せにおいて組み合わせることができる。
【０１６４】
ある実施の形態においては、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、第二の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体に融合又はコンジュゲートしていてもよく、あるいは、その他の異種のタンパク質に融合していてもよい。当該異種のタンパク質の例には、Ｂ型肝炎たんぱく質（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ））又はジフテリア若しくは破傷風に由来するものがあるが、それらに限定されるものではない。第二の単離ＩＶポリペプチド又はその他の異種のタンパク質は、自己が付着しているＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の免疫原性を増す「担体」として機能することができる。本発明の範囲内で担体として有用であるＢ型肝炎ウィルスタンパク質、又はその断片及び変異体が、アメリカ合衆国特許番号６，２３１，８６４及び５，１４３，７２６に開示されており、これらの参考文献はその全体を参照により本明細書に組み入れる。前記の融合又はコンジュゲートタンパク質をコードするコード領域を含むポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６５】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）及び異種のタンパク質配列を含む組み換え粒子を、免疫原性を強化する部分として使用することが、よく説明されている。例えば、異種の配列を、組み換えＨＢｃＡｇのアミノ末端に加えることにより、特殊な構造が自然に構築され、当該構造は、その表面に異種のエピトープを発現し、実験動物に接種した場合に高い免疫原性を有する｛Clarke et al., Nature 330:381-384 (1987)を参照せよ｝。異種のエピトープはまた、タンパク質のカルボキシ末端の約40個のアミノ酸を異種の配列に置換することにより、ＨＢｃＡｇ粒子内に挿入することができる。この組み換えＨＢｃＡｇタンパク質はまた、自然に免疫原性を有する粒子を形成する｛Stahl and Murray, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6283-6287 (1989)を参照せよ｝。さらに、異種エピトープが挿入されるか、或いはＨＢｃＡｇタンパク質のより中心的領域で（すなわち免疫優勢ループ[immunodominant loop]で）異種のエピトープがアミノ酸残基の配列の総て若しくは一部を置換している場合に、キメラＨＢｃＡｇ粒子が構築され、それにより、生成される粒子の表面に異種のエピトープが提示されることがある（ヨーロッパ特許番号 ０４２１６３５  Ｂ１を参照せよ）。下記に、Galibert, F., et al., Nature 281:646-650 (1979)に記載され、アメリカ合衆国特許番号４，８１８，５２７、４，８８２，１４５ 及び５，１４３，７２６にも記載されているヒトＢ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃ）のＤＮＡ及びアミノ酸配列、さらに亜型ａｙｗ（SEQ ID NO 39及びSEQ ID NO 40）を示した。上記の参考文献の総てが、その全体を本明細書に参照により組み入れられる。ヌクレオチド及びアミノ酸が、本明細書に下記のSEQ ID NO 39：
【化３４】
2008505660.tif 000360
及び下記のSEQ ID NO:40：
【化３５】
2008505660.tif 000361
として提示されている。
【０１６６】
完全合成ＨＢｃＡｇも合成された（Nassal, M. Gene 66:279-294 (1988)を参照せよ）。ヌクレオチド及びアミノ酸が、本明細書に下記のSEQ ID NO 41：
【化３６】
2008505660.tif 000362
及び下記のSEQ ID NO:42：
【化３７】
2008505660.tif 000363
として、提示されている。
【０１６７】
単離ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を含むキメラＨＢｃＡｇ粒子は、当業者には周知の組み換え技術を用いて作製できる。プロモータが作動可能に付随しているＨＢｃＡｇに対するコード領域を持つポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）を構築する。便利な制限部位を、異種の配列が挿入されるように、ＨＢｃＡｇのN末端、中央部、及び／又はC末端部分をコードするコード領域に組み込む。ＨＢｃＡｇのコード領域内にある所望の制限部位に、フレーム内で、ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより、ＨＢｃＡｇ／ＩＶ融合タンパク質を発現する構築物を作製する。得られた構築物を、例えば大腸菌などの適切な宿主細胞に、キメラＨＢｃＡｇが発現されるであろう条件下で挿入する。キメラＨＢｃＡｇは、発現すると、粒子内に自己集合し、その後超遠心単離などにより単離される。形成された粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスから単離される天然の２７ｎｍＨＢｃＡｇ粒子に似ているが、単離ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体が粒子内に含まれており、好ましくは外側の粒子表面に露出されていることが天然粒子と異なる。
【０１６８】
キメラＨＢｃＡｇ粒子に発現しているＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、適切なキメラＨＢｃＡｇ粒子が自己集合できる大きさであればいかなる大きさでもよい。先に述べたように、小さい抗原性エピトープであっても、免疫原性を持つ担体（例えば、ＨＢｃＡｇ）との関連において発現した場合は、免疫原性を有する。従って、本発明のＨＢｃＡｇ粒子は、それに挿入されるＩＶタンパク質断片の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、あるいは１５個から３０個のアミノ酸を含む。本発明のＨＢｃＡｇ粒子はさらに、それに挿入されるＩＶタンパク質断片の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００個のアミノ酸残基から成る、免疫原性又は抗原性のエピトープを含む。
【０１６９】
ＨＢｃＡｇの免疫優勢ループ領域(immunodminant loop region)を、アミノ酸番号７５から８３のあたり、アミノ酸番号７５から８５のあたり、またはアミノ酸番号１３０から１４０のあたりに位置させた（Colucci et al., J. Immunol. 141:4376-4380 (1988)、およびSalfeld et al. J. Virol. 63:798 (1989)を参照せよ；これらの文献は参照により組み入れられる）。キメラＨＢｃＡｇは、免疫優勢ループに外来性エピトープをクローンする場合に、多くの場合依然としてコア粒子を形成する能力を有する。従って、例えばＩＶタンパク質断片のアミノ酸は、ＨＢｃＡｇアミノ酸の配列の様々な位置に挿入してよく、その挿入位置の例としては、Ｎ末端、アミノ酸番号約７５から約８５、アミノ酸番号約７５から約８３、アミノ酸番号約１３０から約１４０、又はC末端が挙げられる。ＩＶタンパク質断片のアミノ酸が、天然コアタンパク質配列を全部若しくは一部置換している場合には、挿入されたＩＶ配列は、それが置換するＨＢｃＡｇ配列に比べ、一般的に短くなく、むしろ長いことがある。
【０１７０】
あるいはまた、粒子形成を望まない場合は、完全長のＩＶコード配列をＨＢｃＡｇのコード領域に融合することができる。ＨＢｃＡｇ配列は、本明細書で記述するインフルエンザ抗原（ｅＭ２−ＮＰ構築物を含む）の何れかのN末端若しくはC末端の何れにも融合させることができる。融合には、上記ＮＰ−ｅＭ２で説明したフレキシブルタンパク質リンカーを含むことができる。SEQ ID NO:41のＨＢｃＡｇコード領域に融合されるＩＶコード配列の例には、以下があげられる：ＩＡＶ  ＮＰ−ＨＢｃＡｇ融合 (SEQ ID NO:43)：
【化３８−１】
2008505660.tif 000364
【化３８−２】
2008505660.tif 000365
ＢＶＮＰ−ＨＢｃＡｇ融合(SEQ ID NO:44)：
【化３９】
2008505660.tif 000366
及びＩＡＶ  Ｍ１−ＨＢｃＡｇ融合(SEQ ID NO:45)：
【化４０】
2008505660.tif 000367
が挙げられる。
【０１７１】
これらの融合構築物は、本書で説明している方法により、コドン最適化することができる。
【０１７２】
本発明において、キメラＨＢｃＡｇは、核酸断片を含むポリヌクレオチドと共同して、脊椎動物用のインフルエンザワクチンとして用いることができ、当該核酸はそれぞれ任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体を作動可能にコードするコドン最適化コード領域の断片である。
【０１７３】
投与方法
本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をヒトに送達するための方法であって、本明細書で記述する１個以上の組成物を、そのような組成物などの組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、ＩＶに対する免疫応答を引き起こすのに充分な量でヒトの細胞内で発現されるようにヒトに投与するか、或いはＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体自体をヒトに免疫応答を引き起こすのに充分な量で投与することを含む、方法をも提供する。
【０１７４】
本発明はまた、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をヒトに送達するための方法であって、本明細書で記述する組成物などの組成物を投与した場合に、免疫応答が当該の脊椎動物に引き起こされるように、本明細書で記述する１個以上の組成物を脊椎動物に投与することを含む、方法をも提供する。
【０１７５】
「脊椎動物」という語は、単数の「脊椎動物」および複数の「脊椎動物群」を包含する意味で使われており、哺乳類、鳥禽類、魚類、爬虫類及び両生類を含む。
【０１７６】
「哺乳類」という語は、単数の「哺乳動物」及び複数の「哺乳動物群」を包含する意味で使われており、その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：ヒト；類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル[cebus]、アカゲザル[rhesus],アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン[gibbons]、並びにチンパンジー等の霊長目；イヌ、オオカミ等のイヌ科；ネコ、ライオン及びトラ等のネコ科；ウマ、ロバ、シマウマ等のウマ科、ウシ、ブタ、ヒツジ等の食用動物；シカ、キリン等の有蹄類；クマ等のクマ科；ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラ等のその他の動物。特に、哺乳類は、ヒト被験者、食用動物、又はペット動物であってよい。
【０１７７】
「鳥禽類」という語は、単数の「鳥」および複数の「鳥群」を包含する意味で使われており、その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ等の野生の水鳥；シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、アヒルなどの家畜化された鳥類。「鳥禽類」という語はまた、ホシムクドリ、およびセキセイインコ等のスズメ科の鳥類も包含する。
【０１７８】
本発明はさらに、ＩＶに対する免疫応答を引き起こし、高め、又は調整する方法であって、本明細書で記述する１個以上の組成物を脊椎動物に投与することを含む、方法を提供する。この方法では、本発明の組成物は、少なくとも１個の核酸断片を含む１個以上の単離ポリヌクレオチドを含有し、当該の核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である。別の実施の形態では、本発明の組成物は、上記ポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体とを含んでいてよく、当該タンパク質は組み換えタンパク質として（特に、融合タンパク質、精製サブユニット、当該タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチンの形態で）提供される。従って、後者の組成物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との双方を含む。当該組成物のポリヌクレオチドによりコードされるＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、当該組成物のＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と同じである必要はない。この方法に従って使用する組成物は、一価、二価、三価、及び多価であってよい。
【０１７９】
当該組成物のポリヌクレオチドは、ＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするヒトの（又はその他の脊椎動物の）コドン最適化コード領域の断片を含むことができる。当該ポリヌクレオチドは、当該脊椎動物の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで組み込まれ、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体の抗原性を有する量がｉｎ  ｖｉｖｏで生産される。この方法により当該組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体が、免疫応答を引き起こすのに充分な量で、当該脊椎動物の体内で発現される。そのような免疫応答は、例えば、診断アッセイ用又は研究用試液として、或いは本明細書で記述するような治療又は予防を目的としたワクチンとして、ＩＶに対する抗体を作るために使用することができる。
【０１８０】
本発明はさらに、予防及び／又は治療を目的とするＩＶに対する免疫応答を脊椎動物に引き起こし、高め又は調整する方法であって、本明細書で記述する１個以上の組成物を、治療及び／又は予防のための免疫を必要とする脊椎動物に投与することを含む、方法を提供する。この方法では、本発明の組成物は、少なくとも１個の核酸断片を含む１個以上の単離ポリヌクレオチドを含み、当該核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である。さらなる実施の形態では、この方法で使用される組成物は、少なくとも１個の核酸断片を含む単離ポリヌクレオチド（当該の核酸断片は任意に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするコドン最適化コード領域の断片である）と；少なくとも１個の単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体との双方を含んでいる。従って、後者の組成物は、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドと、単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体（例えば、組み換えタンパク質、精製サブユニット、当該タンパク質を発現するウィルスベクター、又は不活性化ＩＶワクチン）との双方を含む。この方法により当該組成物を投与した場合に、ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体は、治療又は予防上有効な量でヒトに発現される。
【０１８１】
本明細書で用いる際「免疫応答」という語は、背脊椎動物に投与された組成物に対し免疫反応を誘発させる当該脊椎動物の能力を意味する。免疫応答の例には、抗体応答、又は細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）応答が含まれる。本発明の１個以上の組成物を用いて脊椎動物に起こるインフルエンザ感染を予防することができる。すなわち、予防ワクチンとして、インフルエンザに晒される前に又はインフルエンザ疾患に罹患する前に、健康な個体にＩＶに対する免疫を確立させ又は高めるために用い、疾患を予防し又は疾患症状の重篤度を減じることができる。
【０１８２】
上記のように、本発明の組成物は、ＩＶ感染を予防する目的、又はＩＶ感染を治療する目的の双方に用いることができる。既にインフルエンザに晒されたか又は既にインフルエンザ疾患に苦しんでいる個体に対しては、本発明を用いて、さらに当該脊椎動物の免疫系を刺激することができ、それにより、当該疾患又は障害に関する症状を軽減又は除去することができる。本明細書で定義しているように、「治療」という語は、本発明の１個以上の組成物を用いて、脊椎動物に起こったインフルエンザ疾患症状を予防、治療、遅延又はその重篤度を軽減すること、及び／又は既にＩＶに晒され治療を必要としている脊椎動物において特定の期間に渡りインフルエンザ疾患が悪化しないようにすることを意味する。「予防」という語は、本発明の１個以上の組成物を用いて、特定のＩＶ菌株にまだ晒されていない脊椎動物に免疫を形成し、それによって当該脊椎動物が後に当該の特定のＩＶ菌株に晒された場合に疾患症状を予防し又は軽減することを意味する。従って、本発明の方法は、治療用ワクチン又は予防用(preventative or prophylactive)ワクチンと言ってよい。本発明のいかなる組成物も、インフルエンザに対する完全な免疫を提供したり、総てのインフルエンザ疾患症状を完全に治療し除去するということは求められていない。本明細書で用いる際「治療及び／又は予防のための免疫を必要としている脊椎動物」とは、インフルエンザ疾患症状を予防、治療、遅延又はその重篤度を軽減することが望ましい個体、及び／又は既にＩＶに晒され治療を必要としている脊椎動物において特定の期間に渡りインフルエンザ疾患が悪化しないようにすることが望ましい個体を意味する。治療及び／又は予防接種を施す脊椎動物には、ヒト、類人猿、サル（例えば、ヨザル、リスザル、オマキザル [cebus]、アカゲザル[rhesus]、アフリカングリーンサル[African green]、パタスモンキー[patas]、カニクイザル[cynomolgus]、及びオナガザル[cercopithecus]）、オランウータン、ヒヒ、ギボン及びチンパンジー、イヌ、オオカミ、ネコ、ライオン及びトラ、ウマ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、キリン、クマ、ウサギ、ネズミ、フェレット、アザラシ、クジラ、カモ、ガチョウ、アジサシ、ミズナギドリ、カモメ、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、キジ、ガチョウ、ホシムクドリ、及びセキセイインコがある。
【０１８３】
本発明の１個以上の組成物を、「プライム−ブースト」投与計画で利用する。「プライム−ブースト」投与計画の一例が、Yang, Z. et al. J. Virol. 77:799-803 (2002)に記載されており、この文献はその全体を本明細書に参照により組み入れる。これらの実施の形態では、本発明の１個以上のポリヌクレオチドワクチン組成物を脊椎動物に投与し、それにより当該脊椎動物のＩＶに対する免疫応答をプライミングさせ、その後二番目の免疫原性組成物をブーストワクチンとして使用する。本発明の１個以上のポリヌクレオチドワクチン組成物を用いて免疫をプライミングさせ、その後二番目の免疫原性組成物（例えば、組み換えウィルスワクチン、異なったポリヌクレオチドワクチン、或いは１個以上の精製サブユニット単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体）を用いて抗ＩＶ免疫応答をブーストする。
【０１８４】
１個の実施の形態では、プライミング組成物とブースティング組成物が、単一の組成物又は単一の製剤に組み合わされている。例えば、単一の組成物は、プライミング成分としての単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体と、ブースティング成分としてのインフルエンザタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むことができる。この実施の形態では、組成物は、プライミング組成物とブースティング組成物が一緒に混ざり合って、単一のバイアルに含まれていてよい。一般的に、ポリヌクレオチドに由来する発現のピークレベルは投与後しばらく時間を経なければ起こらないので（例えば、７日から１０日）、ポリヌクレオチド成分が単離タンパク質成分にブーストを提供する。プライミング成分とブースティング成分の双方を含む組成物を、本明細書で、「組み合わせワクチン組成物」又は単一製剤異種プライム−ブーストワクチン組成物」と呼ぶ。さらに、ブースティング組成物が作用するのにより長い時間がかかると予測される場合には、プライミング組成物をブースティング組成物の前のみならず、ブースティング組成物の後に投与してもよい。
【０１８５】
また別の実施の形態では、プライミング組成物とブースティング組成物が分かれている別々の製剤で投与する場合であっても、プライミング組成物をブースティング組成物と同時に投与してよい。
【０１８６】
本明細書で用いる際「プライミング」若しくは「プライマリー」又は「ブースト」若しくは「ブースティング」という語は免疫学で通常これらの語が持つ定義に準じて、それぞれ初回の又はそれに続く予防接種を意味してよい。しかし、ある実施の形態においては（例えば、プライミング成分とブースティング成分が単一の製剤に含まれている場合）、「プライム」成分と「ブースト」成分は同時に投与されるのであるから、初回の又はそれに続く予防接種は必要でないかもしれない。
【０１８７】
ある実施の形態では、本発明の１個以上の組成物を、本明細書で記述する方法により脊椎動物に投与し、それにより、効果的な治療、及び／又は効果的な予防のための免疫応答を達成する。より具体的には、本発明の組成物は、脊椎動物のいかなる組織にも投与してよく、組織の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：筋肉、皮膚、脳組織、肺組織、肝組織、脾組織、骨髄組織、胸腺組織、心組織（例えば、心筋、心内膜及び心膜）、リンパ組織、血液組織、骨組織、膵組織、腎組織、胆嚢組織、胃組織、腸組織、精巣組織、卵巣組織、子宮組織、膣組織、直腸組織、神経系組織、眼組織、腺組織、舌組織、および結合組織（例えば、軟骨）。
【０１８８】
さらに、本発明の組成物は、脊椎動物のいかなる体内腔に投与してもよく、体内腔の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：肺、口、鼻腔、胃、腹腔、腸、心房のすべて、静脈、動脈、毛細血管、リンパ腔、子宮腔、膣腔、直腸腔、関節腔、脳室、脊髄の脊髄管、眼腔、唾液腺管あるいは肝臓管の管腔。本発明の組成物を唾液腺管又は肝臓管の管腔に投与する場合では、対象ポリペプチドは唾液腺若しくは肝臓で発現し、ポリペプチドが唾液腺から又は肝臓から血流に送達される。唾液腺若しくは肝臓を使って対象のポリペプチドを血流に放出する胃腸系の分泌器官に投与する方法が、アメリカ合衆国特許番号 ５，８３７，６９３および６,００４，９４４に開示されており、これらの文献はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１８９】
ある実施の形態では、Kodihalli S. et al., Vaccine  18:2592-9 (2000)（本明細書にその全体を参照により組み入れる）に記載されているように、当該組成物を孵化鶏卵に、又は筋肉内注射で毛をむしったニワトリの胸部に投与する。
【０１９０】
ある実施の形態では、当該組成物を筋肉（骨格筋又は心筋のどちらか）或いは肺組織に投与する。具体的だが限定的ではない投与方法が、Wheeler, C.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996)に開示されており、この文献は本明細書にその全体を参照により組み入れられる。
【０１９１】
開示された方法によると、本発明の組成物は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は肺内の経路で投与することができる。その他の適切な投与経路には、気管内、経皮[transdermal]、眼内、鼻腔内、吸入、体腔内、静脈内（ｉ．ｖ．）、分泌管内（すなわち、膵臓への投与）及び組織内（組織への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。経皮[transdermal]投与には、皮内（すなわち、真皮又は表皮への投与）、経皮[transdermal]（すなわち、経皮[percutaneous]）及び粘膜（すなわち、皮膚あるいは粘膜への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。体内腔投与には、口腔、膣腔、直腸腔、腹腔又は腸腔への投与、さらに、骨腔内（すなわち、骨髄管への投与）、脳室内若しくは心室内（すなわち、脳室あるいは心室への投与）、動脈内（すなわち、心臓の心房への投与）、及びくも膜下腔（すなわち、脳のくも膜下腔への投与）投与が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１９２】
対象組織に、ＩＶに対する免疫応答を引き起こすのに充分な量で、及び／又は予防若しくは治療上有効な免疫応答をそのような応答を必要としているヒトに引き起こすのに充分な量で、対象のペプチド又はタンパク質が発現されさえすれば、いかなる投与方法を使用してもよい。本発明の投与手段には、注射針を用いた注射、カテーテルを用いた点滴、バイオリスティック注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」あるいは空気圧「無針」注射器）、Med-E-Jet (Vahlsing, H., et al., J. Immunol. Methods 171:11-22 (1994))、Pigjet (Schrijver, R., et al.,  Vaccine 15: 1908-1916 (1997))、Biojector (Davis, H., et al., Vaccine 12: 1503-1509 (1994); Gramzinski, R., et al., Mol. Med. 4: 109-118 (1998))、AdvantaJet (Linmayer, I., et al., Diabetes Care 9:294-297 (1986)), Medi-jector (Martins, J., and Roedl, E. J. Occup. Med. 21:821-824 (1979))、ゲルフォームスポンジデポー、その他市販されているデポー材（例えば、ハイドロゲル）、浸透パイプ（例えば、Alza minipumps）、経口若しくは座薬の固形（錠剤若しくは丸薬）薬剤、局所皮膚用クリーム状製品、およびデカンティング、ポリヌクレオチドで被覆した縫合糸（Qin, Y., et al., Life Sciences 65: 2193-2203 (1999)）或いは手術中の局所適用。ある投与モードは、針を使用した筋肉内注射およびカテーテル点滴による肺への適用である。エネルギー補助プラスミド投与[Energy-assisted plasmid delivery (EAPD)]方法を用いて、本発明の組成物を投与してもよい。そのような方法のひとつは、電気パルスを短時間注入組織に印加することに関し、これは一般にエレクトロポレーション法として知られている手順である（Mir, L.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4262-7 (1999); Hartikka, J. et al., Mol. Ther. 4:407-15 (2001); Mathiesen, I., Gene Ther. 6:508-14(1999); Rizzuto G. et al., Hum. Gen. Ther. 11:1891-900 (2000)を参照せよ）。これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる。
【０１９３】
本発明の１個以上の組成物の有効な量の決定は、多くの因子に依存しており、それらの因子の例には、発現している又は直接投与された抗原｛ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１若しくはＭ２、又はそれらの断片（例えば、ｅＭ２）、変異体若しくは誘導体｝、被験体の年齢及び体重、治療を必要としている正確な病状及びその重篤度、さらに投与経路が挙げられる。上記の因子に基づけば、正確な量、投与回数、投与時期を決定することは、当該技術分野の通常の知識の範囲内であり、医師若しくは獣医は容易に決定することができるであろう。
【０１９４】
アメリカ合衆国特許出願公開番号２００２／００１９３５８（２００２年２月１４日に公開された；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）に開示されているように、本発明の組成物は、様々な塩、賦形剤、投与基剤、およびまたは補助剤を含んでいてよい。
【０１９５】
さらに、本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞内部又は細胞内の目的の位置への送達を促進する１個以上の形質移入促進化合物を含んでいてよい。本明細書で用いる際「形質移入促進化合物」、「形質移入促進剤」及び「形質移入促進物質」という語は、同義語であり、相互に取り替えて使用してよい。下記に説明しているように、ある形質移入促進化合物はまた「アジュバント」であってもよい。すなわち、このような化合物は、細胞の内部にポリヌクレオチドの送達を促進することに加えて、当該ポリヌクレオチドによりコードされる抗原に対する免疫応答を変え若しくは増強させるように作用し得るということは留意すべきである。形質移入促進化合物の例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：リン酸カルシウム、ミョウバン（硫酸アルミニウム）及び金粒子（例えば、粉末型投与基剤）などである無機物質；例えば、カチオンペプチド、細胞間ターゲティング（ある種の細胞型への選択的投与を行うため）、細胞内ターゲティング（核局在化又はエンドソームエスケープを行うため）、両親媒性（ヘリックス形成又はポア形成）などであるペプチド；例えば、ヒストンなどの塩基性（例えば、正の帯電を付与したもの）、ターゲティング（例えば、アシアロタンパク質）、ウィルス性（センダイウィルス被覆タンパク質）及びポア形成性などであるタンパク質；カチオン（例えば、DMRIE, DOSPA, DC-Chol）、塩基性（例えば、ステリルアミン[steryl amine]）、中性（例えば、コレステロール）、アニオン（例えば、ホスファチジルセリン）及び両性イオン型[zwitterionic]（例えば、DOPE, DOPC）などである脂質；デンドリマー、スターポリマー、「同種の」ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン）、「異種の」ポリアミノ酸（例えば、リジンとグリシンの混合物）、コポリマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポロキサマー（例えば、ＣＲＬ１００５）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などであるポリマー。形質移入促進物質は、単独で用いても、或いは１個以上のその他の形質移入促進物質を組み合わせて用いてもよい。２つ以上の形質移入促進物質を化学的結合（例えば、脂質化したポリリジン、ポリエチレングリコール化したポリリジンに見られるような共有結合及びイオン結合）（Toncheva, et al., Biochim. Biophys. Acta 1380(3):354-368 (1988)を参照せよ)、機械的混合（例えば、「ポリリジン＋カチオン脂質」のような、液体又は固体相において自在に動く物質）（Gao and Huang, Biochemistry 35:1027-1036 (1996); Trubetskoy, et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:311-313 (1992)を参照せよ)、及び凝集（例えば、カチオン脂質＋ポリ乳酸、及びポリリジン＋ゼラチンに見られるような、共沈殿、ゲル形成)により、組み合わせることができる。この段落に引用した文献は、本明細書に参照によりその全体を組み入れられる。
【０１９６】
形質移入促進物質のひとつの種類は、カチオン脂質である。カチオン脂質の例は、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）及びジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン-カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳである。カチオンコレステロール誘導体もまた有用であり、{3β-[N-N’,N’-ジメチルアミノ)エタン]-カルボモイル}-コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジメチルジアクタデシル-アンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-テトラデシルオキシエチル))-N-メチル-アンモニウム ブロミド（ＰＡ−ＤＥＭＯ）、N-(3-アミノプロピル)-N,N-(ビス-(2-ドデシルオキシエチル))-N-メチル-アンモニウム ブロミド （ＰＡ＿ＤＥＬＯ）、N,N,N-トリス-(2-ドデシルオキシ)エチル-N-(3-アミノ)プロピル-アンモニウム ブロミド（ＰＡ−ＴＥＬＯ） (PA-TELO)、及びN1-(3-アミノプロピル)((2-ドデシルオキシ)エチル-N2-(2-ドデシルオキシ)エチル-1-ピペラジンアミニウムブロミド（ＧＡ−ＬＯＥ−ＢＰ）を本発明に用いることができる。
【０１９７】
DL-1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-b-ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩジエーテル）、 1-O-オレイル-2-オレオイル-3-ジメチルアミノプロピル-b-ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩエステル／エーテル）、及びそれらの塩類のような非ジエーテルカチオン脂質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子投与を促進する。いくつかの実施の形態においては、カチオン脂質は、頭基における第四アンモニウム部位に結合したヘテロ原子を介して結合する基を含む。グリシルスペーサーを用いて、リンカーをヒドロキシ基に結合することができる。
【０１９８】
本発明のある実施の形態で利用することができるカチオン脂質の具体的だが非限定的な例には、DMRIE ((±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、GAP-DMORIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)、及びGAP-DLRIE ((±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-ドデシルアオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド)が挙げられる。
【０１９９】
本発明のある実施の形態で利用することができるカチオン脂質のその他の具体的だが非限定的な例には、Bn-DHRIE、DhxRIE、DhxRIE-OAc、DhxRIE-OBz及びPr-DOctRIE-OAc が挙げられる。これらの脂質は、同時係属中のアメリカ合衆国特許出願番号１０／７２５，０１５に開示されている。本発明の別の態様では、カチオン界面活性剤は、Pr-DOctRIE-OAc である。
【０２００】
その他のカチオン脂質には、(±)-N,N-ジメチル-N-[2-(スペルミンカルボキサミド) エチル]-2,3-ビス (ジオレイルオキシ)-1-プロパンイミニウムペンタヒドロキシクロライド（ＤＯＳＰＡ）、(±)-N-(2-アミノエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンイミニウムブロミド (b-アミノエチル-DMRIE又はbAE-DMRIE) (Wheeler, et al., Biochim. Biophys. Acta 1280:1-11 (1996))、及び (±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-l-プロパンイミニウム ブロミド（ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）(Wheeler, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11454-11459 (1996))]（これは、ＤＭＲＩＥに基づき開発された）がある。これらの文献は双方とも、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０１】
本発明で有用であるＤＭＲＩＥ系のカチオン脂質のその他の例には、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-デシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＤＲＩＥ）、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-(ビス-テトラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＲＩＥ）、(±)-N-((N''-メチル)-N'-ウレイル)プロピル-N,N-ジメチル-2,3-ビス(トラデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＭＧＵ−ＤＭＲＩＥ）、(±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(ドデシルオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、及び (±)-N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス-([Z]-9-オクタデセニールオキシ)プロピル-1- プロパンアミニウムブロミド（ＨＰ−ＤＯＲＩＥ）が挙げられる。
【０２０２】
免疫原性組成物がカチオン脂質を含む実施の形態においては、カチオン脂質を１個以上のコ・リピド[co-lipid]と混合してよい。定義としては、「コ・リピド[co-lipid]」という語は、カチオン脂質を組み合わせてよい総ての疎水性物質を意味し、その例には、リン脂質のような両親媒性脂質、及びコレステロールのような中性脂質が挙げられる。カチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]は、多数の方法により混合又は組み合わせて、多様な非共有結合による巨視的構造を創り出すことができ、当該非共有結合の巨視的構造の例には、例えば、リポソーム、多層小胞、単層小胞、ミセル及び単純膜がある。コ・リピド[co-lipid]の１個の非限定的なクラスは、両性イオン型[zwitterionic]の両親媒性脂質であり、このクラスには、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンが含まれる。ホスファチジルエタノールアミンの例には、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ及びＤＰｙＰＥがある。ある実施の形態においては、コ・リピド[co-lipid]は、ジアシルホスファチジルエタノールアミン骨格に組み込まれれた２個のフィタノイル置換基を有するＤＰｙＰＥである。その他の実施の形態では、コ・リピド[co-lipid]は、ＤＯＰＥ、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン[1,2-diolyeoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine] である。
【０２０３】
本発明の組成物は、カチオン脂質及びコ・リピド[co-lipid]を含むとき、カチオン脂質対コ・リピド[co-lipid]のモル比を、約９：１から約１：９、約４：１から約１：４、約２：１から約１：２、又は約１：１とすることができる。
【０２０４】
均一性を最大限にするため、カチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]をクロロホルムのような溶媒に溶かし、次にカチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]の溶液を真空下にて蒸発させ、ガラス容器（ロータリーエバポレーター丸底フラスコ）の内表面上の膜になるまで乾燥させる。水溶性の溶媒に懸濁すると、両親媒性脂質成分分子が均一性の脂質小胞に自己集合する。次に、例えば、当業者に既知の方法を用いて、本発明のコドン最適化ポリヌクレオチドで複合化する前に、これらの脂質小胞を、均一な大きさの選択された平均直径を有するように処理してもよい。例えば、脂質溶液の音波破砕が、Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:,7413-7417 (1987)及びアメリカ合衆国特許番号５，２６４，６１８に記述されており、その開示は本明細書に参照により組み込まれる。
【０２０５】
組成物にカチオン脂質を含む実施の形態においては、例えば、水溶液中のプラスミドと本明細書において調製されるカチオン脂質とコ・リピド[co-lipid]との溶液を混合するなどして、本発明のポリヌクレオチドを脂質と混合により複合化する。それぞれの構成成分の溶液の濃度を、混合前に、所望の最終のプラスミド／脂質及びコ・リピド[co-lipid]の比率、並びに所望の最終プラスミド濃度がこれら２つの溶液を混合した時点で得られるように調整することができる。適切な量の水溶性溶媒中の混合脂質物質の薄膜を、周囲温度でボルテックスミキサーを用い１分間混練することにより水和させて、脂質とコ・リピド[co-lipid]との混合物を適切に調製する。当該薄膜は、個々の構成成分のクロロホルム溶液を混合し、所望の分子溶質比率(molarsolute ratio)を得た後、当該溶液の望ましい量を適切な容器に等分することにより調製する。溶媒は、蒸発により（まず、例えばアルゴンのような乾燥した不活性ガスを用い、次に高度真空処理を施す）除去する。
【０２０６】
例えば、ステロール、脂肪酸、ガングリオシド[gangliosides]、糖脂質、リポペプチド、リポサッカリド、ネオビー[neobees]、ニオサム[niosomes]、プロスタグランジン[prostaglandins]、およびスフィンゴリピッド[sphingolipids]その他の疎水性及び両親媒性添加剤が、本発明の組成物に含まれていてよい。そのような組成物内において、これらの添加剤は、約０．１ｍｏｌ％から約９９．９ｍｏｌ％（総脂質に対して）、約１ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％、又は約２ｍｏｌ％から約２５ｍｏｌ％の量で含まれていてよい。
【０２０７】
本発明のさらなる実施の形態は、ポリヌクレオチドを投与する前、投与した後、又はポリヌクレオチドの投与と同時に投与する補助剤を含む組成物に関する。本明細書で用いる際「補助剤」という語は、補助剤を含めたこと以外はまったく同じである組成物に比べて、ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏの脊椎動物の細胞への侵入及び／又はそのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を高める能力があるので組成物に含められた物質である。ある種の補助剤は、ポリペプチドの細胞への侵入を高めることに加えて、ポリヌクレオチドによりコードされる免疫原に対する免疫応答をも高めることができる。本発明の補助剤には、非イオン系、アニオン系、カチオン系、又は両性イオン型の界面活性剤又は洗剤（非イオン系界面活性剤又は洗剤が好ましい）、キレート剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、ポロキサマー、核酸を凝集凝縮させる製剤、乳化剤若しくは溶解補助剤、湿潤剤、ゲル形成剤、及び緩衝剤が含まれる。
【０２０８】
本発明の組成物で使用する補助剤の例には、以下の非イオン性洗剤及び界面活性剤が含まれるが、それらに限定されるものではない：IGEPAL CA 630（登録商標）、NONIDET NP-40、Nonidet（登録商標）P40、Tween-20TM、Tween-80TM、Pluronic（登録商標）F68(平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic F77（登録商標）(平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%), Pluronic P65（登録商標）(平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800;親水物質の概算重量百分率50%), Triton X-100TM、およびTriton X-114TM；アニオン系洗剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；糖スタキオース；凝縮剤ＤＭＳＯ；キレート剤／ＤＮａｓｅ阻害剤 ＥＤＴＡ、CRL 1005 (12 kDa、5% POE)、およびBAK（塩化ベンザルコニウム５０％溶液、Ruger Chemical Co. Inc.より入手可能）。ある特定の実施例では、補助剤はＤＭＳＯ、Nonidet P40、Pluronic F68（登録商標）(平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic F77（登録商標）(平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic P65（登録商標）(平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic L64（登録商標）(平均分子量：2900；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率40%)、およびPluronic F108（登録商標）(平均分子量：14600；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率80%)（例えば、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号２００２／００１９３５８を参照せよ；この文献は、参照により本明細書にその全体を組み込まれる）。
【０２０９】
本発明のある組成物はさらに、ポリヌクレオチドの前、後、又は同時に、１個以上のアジュバントを含んでいてよい。「アジュバント」という語は、（１）ある特定の抗原に対する免疫応答を変え又は増強する能力、或いは（２）薬理学的な物質の効果を高め又は補助する能力を有する物質総てを意味する。ポリヌクレオチドワクチンに関しては、「アジュバント」は形質移入促進物質であり得るということは留意すべきである。同様に、上記の「形質移入促進物質」はまた、「アジュバント」であり得る。アジュバントは、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物と共に使用してよい。本明細書で記述するように、プライム−ブースト投与計画においては、アジュバントは、プライミング予防接種、ブースター予防接種、又はこれら双方と共に使用してよい。適切なアジュバントには、サイトカイン及び成長因子；細菌の構成成分（例えば、エンドトキシン、特に超抗原(super antigen)、エキソトキシン及び細胞壁構成成分）；アルミニウム系の塩類；カルシウム系の塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウィルスおよびウィルス由来物質、毒、毒液、イミダゾキニリン化合物、ポロキサマー、並びにカチオン脂質が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０２１０】
多種多様な物質が、多様な機序を介するアジュバント作用を有することが示されている。ポリペプチドの発現、抗原性若しくは免疫原性を高める可能性のある化合物は総て、潜在的なアジュバントである。本発明は、免疫応答を改善させる能力があるか否かにつき潜在的なアジュバントを選別するアッセイを提供する。本発明に従って免疫応答を高める能力があるか否かにつき選別される潜在的なアジュバントには、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：ミョウバン、ベントナイト、ラテックス及びアクリル粒子などの不活性担体；TiterMax（登録商標）｛ブロックコポリマーＣＲＬ−８９４、スクアレン（代謝可能オイル）及び微粒子シリカ安定剤｝などのプルロニックブロックポリマー；フロイントアジュバントなどのデポー形成剤、サポニン、リソレシチン、レチナール、クイルＡ、リポソーム及びプルロニックポリマー製剤などの表面活性物質；細菌性リポポリサッカリドなどのマクロファージ刺激因子；インシュリン、ザイモサン、エンドトキシン及びレバミゾールなどの第二経路補体活性化因子；並びにポロキサマー、ポリ(オキシエチレン)−ポリ(オキシプロピレン)トリ−ブロックコポリマーなどの非イオン系界面活性剤。上記に説明している形質移入促進物質もまたアジュバントとして含められる。
【０２１１】
本発明に従って免疫応答を高める能力があるか否かにつき選別されるポロキサマーの例には、以下の市販のポロキサマーが含まれるが、それらに限定されるものではない：酸化プロピレンと酸化エチレンとのブロックコポリマーであって、酸化プロピレンブロックが酸化エチレンブロック間に挟まれているブロックコポリマーである、Pluronic（登録商標）界面活性剤。Pluronic（登録商標）界面活性剤の例には、以下を含む： Pluronic（登録商標） L121 （平均分子量：4400；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率10%）、Pluronic（登録商標）L101 (平均分子量：3800；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L81 （平均分子量：2750；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L61 (平均分子量：2000；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）L31 (平均分子量：1100；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率10%), Pluronic（登録商標） L122 (平均分子量：5000；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L92 (平均分子量：3650；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L72 (平均分子量：2750；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L62 (平均分子量：2500；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L42 (平均分子量：1630；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）L63 (平均分子量：2650；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）L43 (平均分子量： 1850；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）L64 (平均分子量：2900；疎水物質の概算分子量, 1800; 親水物質の概算重量百分率, 40%), Pluronic（登録商標） L44 (平均分子量：: 2200; 疎水物質の概算分子量, 1200; 親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標） L35 (平均分子量：1900；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P123 (平均分子量：5750；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）P103 (平均分子量：4950；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）P104 (平均分子量：5900；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）P84 (平均分子量：4200；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）P105 (平均分子量：6500；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P85 (平均分子量：4600；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P75 (平均分子量：4150；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）P65 (平均分子量：3400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）F127 (平均分子量：12600；疎水物質の概算分子量3600；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F98 (平均分子量：13000；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F87 (平均分子量：7700；疎水物質の概算分子量2400；親水物��の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F77 (平均分子量：6600；疎水物質の概算分子量2100；親水物質の概算重量百分率70%)、Pluronic（登録商標）F108 (平均分子量：14600；疎水物質の概算分子量3000；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F98 (平均分子量：13000；疎水物質の概算分子量2700；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F88 (平均分子量：11400；疎水物質の概算分子量2400；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F68 (平均分子量：8400；疎水物質の概算分子量1800；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）F38 (平均分子量：4700；疎水物質の概算分子量900；親水物質の概算重量百分率80%)。
【０２１２】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別される逆ポロキサマーの例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない： Pluronic（登録商標） R 31R1 (平均分子量：3250；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 25R1 (平均分子量：2700；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 17R1 (平均分子量：1900；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率10%)、Pluronic（登録商標）R 31R2 (平均分子量：3300；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 25R2 (平均分子量：3100；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 17R2 (平均分子量：2150；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率20%)、Pluronic（登録商標）R 12R3 (平均分子量： 1800；疎水物質の概算分子量1200；親水物質の概算重量百分率30%)、Pluronic（登録商標）R 31R4 (平均分子量：4150；疎水物質の概算分子量3100；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 25R4 (平均分子量： 3600；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 22R4 (平均分子量： 3350；疎水物質の概算分子量2200；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 17R4 (平均分子量：3650；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率40%)、Pluronic（登録商標）R 25R5 (平均分子量： 4320；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）R 10R5 (平均分子量：1950；疎水物質の概算分子量1000；親水物質の概算重量百分率50%)、Pluronic（登録商標）R 25R8 (平均分子量： 8550；疎水物質の概算分子量2500；親水物質の概算重量百分率80%)、Pluronic（登録商標）R 17R8 (平均分子量： 7000；疎水物質の概算分子量1700；親水物質の概算重量百分率80%)、およびPluronic（登録商標） R 10R8 (平均分子量： 4550；疎水物質の概算分子量1000；親水物質の概算重量百分率80%)。
【０２１３】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他の市販ポロキサマーには、ポリエチレンとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマーである以下の化合物が含まれるが、それらに限定されるものではない： Synperonic（登録商標） L121 (平均分子量：4400)、Synperonic（登録商標） L122 (平均分子量：5000)、Synperonic（登録商標） P104 (平均分子量：5850)、Synperonic（登録商標） P105 (平均分子量：6500)、Synperonic（登録商標） P123 (平均分子量：5750)、Synperonic（登録商標） P85 (平均分子量： 4600)及び Synperonic（登録商標） P94 (平均分子量： 4600)（上記の化合物において、Ｌは当該界面活性剤が液体であることを表し、Ｐは当該界面活性剤がペースト状であることを表し、一桁目は当該界面活性剤のポリプロピレン部分の分子量の測定値を表し、数字の最後の桁は１０を乗じて当該界面活性剤の酸化エチレン含量百分率を表す）；並びに、Synperonic（登録商標） NP10 (ノニルフェノルエトキシ化 界面活性剤 - 10% 溶液)、Synperonic（登録商標） NP30 (１モルのノニルフェノルと３０モルの酸化エチレンとの濃縮物) 及びSynperonic（登録商標） NP5 (１モルのノニルフェノルと５．５モルの酸化ナフタリンとの濃縮物)などのノニルフェニルポリエチレングリコールである化合物。
【０２１４】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他のポロキサマーの例には、以下が含まれる：（ａ）Ａ型セグメントとＢ型セグメントとを含むポリエーテルブロックコポリマーであって、当該Ａ型セグメントは、比較的親水性の性質を持つ直線状の高分子セグメントを含み、当該高分子セグメントの繰り返し単位により平均Hansch-Leo 断片の定数が約−０．４以下になり、当該繰り返し単位の分子量寄与が約３０から約５００の間であり、当該Ｂ型セグメントは、比較的疎水性の性質を持つ直線状の高分子セグメントを含み、当該高分子セグメントの繰り返し単位により平均Hansch-Leo 断片の定数が約−０．４以上になり、当該繰り返し単位の分子量寄与が約３０から約５００の間であり、該高分子セグメントの繰り返し単位を繋いでいる少なくとも約８０％の連結がエーテル結合から成る、ポリエーテルブロックコポリマー；（ｂ）ポリエーテルセグメントとポリカチオンセグメントを有するブロックコポリマーであって、当該ポリエーテルセグメントは少なくとも１個のＡ型ブロックを含み、当該ポリカチオンセグメントは複数のカチオン繰り返し単位を含む、ブロックコポリマー；並びに（ｃ）ポリマー、ポリエーテルセグメント及びポリカチオンセグメント（化学式−NH−R0の複数のカチオン繰り返し単位を含む）を含むポリエーテル−ポリカチオンコポリマーであって、式中R0 は、置換可能な２個から６個の炭素原子を有する直鎖の脂肪基であり、前記ポリエーテルセグメントは少なくともＡ型セグメントとＢ型セグメントのひとつを含むコポリマー（Kabonov, et al.によるアメリカ合衆国特許番号5,656,611を参照せよ；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。その他の対象のポロキサマーには、CRL1005 (12 kDa、5% POE)、CRL8300 (11 kDa、5% POE)、CRL2690 (12 kDa、10% POE)、CRL4505 (15 kDa、5% POE)及びCRL1415 (9 kDa、10% POE)がある。
【０２１５】
本発明に従って免疫応答を高める能力につき選別されるその他の補助剤には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない：アカシア（アラビアゴム）；ポロクシエチレンエーテルR-O-(C2H4O)x-H (BRIJ（登録商標）)（例えば、ポリエチレングリコールドデシルエーテル(BRIJ（登録商標） 35、x=23)、ポリエチレングリコールドデシルエーテル (BRIJ（登録商標） 30、x=4)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル (BRIJ（登録商標） 52、x=2)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 56、x=10)、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 58P、x=20)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 72、x=2)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 76、x=10)、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル  (BRIJ（登録商標） 78P、x=20)、ポリエチレングリコールオレイルエーテル (BRIJ（登録商標） 92V、x=2)及びポリオキシル１０オレイルエーテル (BRIJ（登録商標） 97、x=10)）；ポリ-D-グルコサミン（チトサン）；クロルブタノール；コレステロール；ジエタノールアミン；ジギトニン；ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、エチレンジアミン四酢酸 （ＥＤＴＡ）；グリセリンモノステアレート; ラノリンアルコール類；モノ−およびジ−グリセリド；モノエタノールアミン；ノニルフェノールポリオキシエチレン エーテル(NP-40（登録商標）)；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(アムレスコ社製NONIDET NP-40)；エチルフェノールポリ(エチレングリコールエーテル)n、n=11 (ロッシェ社製Nonidet（登録商標） P40)；約９個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(nonidet P40)；IGEPAL CA 630（登録商標） ((オクチルフェノキシ) ポリエトキシエタノール；構造的にはNONIDET NP-40と同じ)；オレイン酸；オレイルアルコール類；ポリエチレングリコール8000；ポリオキシル２０セトステアリルアルコールエーテル；ポリオキシル ３５キャスターオイル；ポリオキシル ４０水素添加キャスターオイル；ポリオキシル 40 ステアリン酸塩；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート (ポリソルベート２０、あるいはTWEEN-20（登録商標）；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート８０、あるいは TWEEN-80（登録商標）);プロピレングリコールジアセタート；プロピレングリコールモノステアレート；硫酸プロタミン；タンパク質分解酵素；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；モノラウリン酸ナトリウム；ステアリン酸ナトリウム；ソルビタン誘導体(SPAN（登録商標）)、その例には、ソルビタンモノパルミテート(SPAN（登録商標） 40)、ソルビタンモノステアレート(SPAN（登録商標） 60)、ソルビタントリステアレート(SPAN（登録商標） 65)、ソルビタンモノオレエート(SPAN（登録商標） 80)、およびソルビタントリオレエート(SPAN（登録商標） 85)がある；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサ-ヘキセン(スクアレン)；スタキオース；ステアリン酸；スクロース；サーファクチン(枯草菌に由来するリポペプチド抗生物質)；ドデシルポリ (エチレングリコールエーテル)9 (Thesit（登録商標）) 分子量 582.9；約９個から１０個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物(Triton X-100TM)；約７個から８個のエチレンオキシドユニットを有するオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物（Triton X-114TM）；トリス(2-ヒドロキシエチル)アミン (トロラミン)；並びに乳化ワックス。
【０２１６】
あるアジュバント組成物では、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は、１個以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物；或いは１個以上のサイトカイン、ケモカイン、又はサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。その例には、以下が含まれるが、それらに限定されるものではない；顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、コロニー刺激因子(CSF)、エリスロポイエチン(EPO)、インターロイキン２(IL-2)、インターロイキン３ (IL-3)、インターロイキン４ (IL-4)、インターロイキン５ (IL-5)、インターロイキン６ (IL-6)、インターロイキン７ (IL-7)、インターロイキン８ (IL-8)、インターロイキン１０ (IL-10)、インターロイキン１２ (IL-12)、インターロイキン １５ (IL-15)、インターロイキン１８ (IL-18)、インターフェロンアルファ(IFNa)、インターフェロンベータ(IFNb)、インターフェロンガンマ (IFNγ)、インターフェロンオメガ(IFNw)、インターフェロンタウ(IFNτ)、因子Iを誘導するインターフェロンガンマ(IGIF)、形質転換成長因子ベータ(TGF-b)、RANTES (活性に対する制御、正常Ｔ−細胞の発現、おそらく分泌)、マクロファージ炎症タンパク質(例：MIP-1 アルファ およびMIP-1ベータ)、Leishmania伸長開始因子[Leishmania elongation initiating factor (LEIF)]、並びにFlt-3 リガンド。
【０２１７】
本発明のある組成物においては、ポリヌクレオチド構築物を、(±)-N-(3-アミノプロピル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(シン-9-テトラデセニールオキシ)-1-プロパンアミニウムブロミド（ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ）を含むアジュバント組成物により複合化してよい。この組成物はまた、１個以上のコ・リピド[co-lipid]を含んでもよく、そのようなコ・リピド[co-lipid]の例には、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、及び／又は 1,2-ジミリストイル-グリセロ-3-ホスフォエタノールアミン （ＤＭＰＥ）がある。１：１のモル比でＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ及びＤＰｙＰＥを含むアジュバント組成物を、本明細書ではVaxfectinTMと呼ぶ（例えば、特許協力条約公開番号ＷＯ００／５７９１７を参照せよ；この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。
【０２１８】
その他の実施の形態では、本発明のポリヌクレオチドの全部若しくは一部が細菌のＤＮＡに由来する場合は、ポリヌクレオチド自体がアジュバントとして機能することもある。メチル化されていないＣｐＧ−ジヌクレオチド（ＣｐＧ−ＤＮＡ）モチーフを含む細菌のＤＮＡは、パターン認識受容体（ＴＬＲ９のようなＴｏｌｌ様受容体を含む）を通じて、脊椎動物の体内の生得の免疫細胞を誘発するため、マクロファージ、樹状細胞及びＢ−リンパ球に対する潜在免疫刺激効果を有する（例えば、Wagner, H., Curr. Opin. Microbiol. 5:62-69 (2002)；Jung, J. et al., J. Immunol. 169: 2368-73 (2002)を参照せよ；また、Klinman, D.M. et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 93:2879-83 (1996)を参照せよ）。メチル化されていないＣｐＧ−ジヌクレオチドをアジュバントとして使用する方法は、例えば、アメリカ合衆国特許番号6,207,646、6,406,705及び6,429,199に説明されており、これらの開示は本明細書に参照により組み入れられる。
【０２１９】
抗原に対する免疫応答を高めるアジュバントの能力は、一般的に、免疫媒介保護の著しい増強によって明らかになる。例えば、体液性免疫の増強は、一般的に、抗原に対し抗体力価が高まったことにより明らかになり、Ｔ−細胞活性の増強は、一般的に、細胞増殖の増強、細胞障害反応、又はサイトカイン分泌により明らかになる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性、すなわちＴｈ２の反応を、主として細胞性、すなわちＴｈ１の応答に変えることにより、免疫応答を変えることができる。
【０２２０】
本発明の核酸分子及び／又はポリヌクレオチド（プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、直線状ＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチド）は、様々な緩衝液によって溶解することができる。適切な緩衝液には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、通常生理食塩水、トリス緩衝液、およびリン酸ナトリウム(例：１５０ｍＭリン酸ナトリウム)  が挙げられる。非水溶性のポリヌクレオチドは、弱酸若しくは弱塩基で溶解し、その後緩衝液を用いて望ましい量に希釈する。緩衝液のｐＨは、適切に調節してよい。さらに、薬学上許容可能な添加剤を、適切なモル浸透圧濃度を得るために添加することができる。そのような添加剤は、当業者の技能範囲内である。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する水性の組成物については、滅菌済みの発熱物質の無い水を用いてよい。そのような製剤は、ヒトに投与するのに適した薬学的に許容可能な組成物を調整することを目的として、有効な量のポリヌクレオチドを、適切な量の水溶液と共に含む。
【０２２１】
本発明の組成物は、既知の方法により調製することができる。適切な調製方法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, A. Osol, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995)に説明されており、これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる。本発明の組成物は、水溶液として投与してもよいが、乳剤、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥剤又は当該技術分野で既知のその他の形態として調製してもよい。さらに本発明の組成物は、薬学的に許容可能な添加剤を含んでいてよく、そのような添加剤の例としては、希釈剤、結合剤、安定剤及び防腐剤が挙げられる。
【０２２２】
以下の実施例は例示の目的のみに含められているのであって、本明細書の終わりに付け加えた請求項により定義した本発明を限定するものではない。実施例に引用した参考文献は総て参照によりその全体を本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０２２３】
材料および方法
以下の材料および方法は、一般的に、本明細書に開示されているすべての実施例に適用される。具体的な材料及び方法は、必要に応じて、それぞれの実施例に開示されている。
【０２２４】
本発明を実施するにあたり、別途記載のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学（ＰＣＲを含む）、ワクチン学、微生物学、遺伝子組み換えＤＮＡ、および免疫学における従来の技術を用い、それらの技術は当業者の技能の範囲内である。そのような技術は、参考文献に完全に説明されている（例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al. アメリカ合衆国特許番号 4,683,195；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論争集 Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；並びにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照せよ）。この段落で引用した文献は、参照により本明細書にその全体を組み入れられる。
【０２２５】
遺伝子の構築
本発明の構築物は、本明細書で又は当該技術分野で提供している配列情報に基づいて、以下を含むがそれらに限定されない標準分子生物学の技術を用いて、構築される。まず、それぞれの長さが８０個から９０個のヌクレオチドで当該構築物の長さを持つ一連の相補的なオリゴヌクレオチドペアを標準方法により合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアを、アニーリングの際にそれらが８０個から９０個の塩基ペアを有する二本鎖の断片を形成し、付着末端を含むように合成する。それぞれのペアにおけるオリゴヌクレオチドの一本鎖末端を、隣接するオリゴヌクレオチド二重鎖の一本鎖末端とアニールするように設計する。このように作製されたいくつかの隣接オリゴヌクレオチドペアをアニールさせ、次いで、約５個から６個の隣接するオリゴヌクレオチド二重鎖断片を一本鎖付着末端を介してアニールさせる。次いで、この一連のアニール処理を施したオリゴヌクレオチド二重鎖断片を連結して、適切なプラスミド（カリフォルニア州カールスバッド市のInvitrogen Corporationから入手できるTOPO（登録商標） ベクター）にクローンする。目的の構築物を標準方法により配列決定する。このように作製された構築物（相互に連結された８０個から９０個の塩基ペアを有する二本鎖の断片を約５個から６個含む；すなわち、約５００個の塩基ペアから成る断片群）を、構築物の全体の目的配列が一連のプラスミド構築物に表されるように作製する。次いで、これらのプラスミドの挿入片を、適切な制限酵素で切り、連結して、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を、標準クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。本明細書で言及されているオリゴヌクレオチド及びプライマーは、本明細書又は当該技術分野でで提供している配列情報に基づいて、当業者により容易に設計することができ、当該オリゴヌクレオチド及びプライマーは、多くの商業目的のヌクレオチド提供業者（例えば、カリフォルニア州サンディエゴ市のRetrogenおよびドイツ国レーゲンスブルグ市のGENEART）が合成している。
【０２２６】
プラスミドベクター
本発明の構築物を、例えば、真核細胞発現ベクターVR1012又はVR10551に、挿入することができる。これらのベクターは、修飾pUC18バックグラウンドに基づいて構築されており（Yanisch-Perron, C., et al. Gene 33:103-119 (1985)を参照せよ)、カナマイシン耐性遺伝子、ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーター[cytomegalovirus immediate early promoter]／エンハンサー及びイントロンＡ、ウシ成長ホルモン転写終結シグナル、並びに外部の遺伝子を挿入するためのポリリンカーを含んでいる（Hartikka, J., et al., Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996)を参照せよ）。しかし、その他の市販されている標準の真核細胞発現ベクターを本発明で使用してもよく、その例には以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：プラスミド群pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、および pZeoSV2 （カリフォルニア州カールスバッド市のInvitrogenから入手可能）、並びにプラスミド pCI （ウィスコンシン州マディソン市のPromegaから入手可能）。
【０２２７】
VR10551という名の最適化バックボーンプラスミドは、上記のVR1012バックボーンに、多少の変更を加えてできている。当該VR10551ベクターは、ヒトサイトメガロウイルスの最初期(hCMV-IE)遺伝子[human cytomegalovirus immediate early (hCMV-IE) gene]エンハンサー／プロモータおよび5’非翻訳領域（hCMV-IE イントロン Aを含む）を使用する点において、VR1012に由来し、またVR1012に類似している。VR1012 からVR10551への変更には、複数のクローニング部位になされたいくつかの修飾が含まれ、修飾ウサギベータグロビン3'非翻訳領域／ポリアデニレーションシグナル配列／転写ターミネーターが、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来する同じ機能ドメインに置換されている。
【０２２８】
さらに、本発明の構築物を、その他の真核細胞発現ベクターバックボーン（例えば、VR10682又はVR10686）に挿入してもよい。VR10682発現ベクターバックボーン(SEQ ID NO:94)は、発現プラスミドVCL1005に由来する修飾ニワトリ肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモータ、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニレーション部位および外部遺伝子を挿入するためのポリリンカー、およびカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。VCL1005および VR10682内のＲＳＶプロモータは、配列TAC TCT AGA CG (SEQ ID NO:82)の転写開始部位の近くにXbaIエンドヌクレアーゼ制限部位を含んでいる。修飾ＲＳＶプラスミドが、VR10682に含まれている。発現プラスミドVCL1005がアメリカ合衆国特許番号5,561,064 に説明されており、この文献は本明細書に参照により組み入れられる。
【０２２９】
VR10686発現ベクターバックボーン(SEQ ID NO:112) は、VR6430 (SEQ ID NO:89)内のウェストナイルウィルス（ＷＮＶ）抗原挿入片を、VR1012ベクターに由来する複数のクローニング部位と置換することにより、作製された。VR10686 およびVR6430発現ベクターバックボーンは、ＲＳＶプロモータ｛VCL1005に由来し、野生型ＲＳＶ配列(TAC AAT AAA CG (SEQ ID NO:83))に戻すように修飾されている｝を含んでいる。野生型ＲＳＶプロモータは、Ｒ領域およびヒトＴ−細胞白血病ウィルスＩ(HTLV-I)に由来するＵ５領域の最初の３９個のヌクレオチドに融合されている（以後、ＲＵ５エレメントと呼ぶ）。Ｒ領域およびＵ５領域は、HTLV-Iの長端末反復領域(LTR)の一部であり、この部分は、HTLV-I転写の発現を制御し、レトロウイルス統合メカニズム[retroviral integration mechanism]の結果として統合ウィルスゲノムのどちらかの末端で複製される。HTLV-IのＬＴＲおよびほとんどのレトロウイルスは、三つの領域、Ｕ３、Ｒ及びＵ５に分けられる。統合ウィルスゲノムに由来する転写は５'ＬＴＲのＵ３−Ｒ間の境界線で開始し、転写物は３'ＬＴＲのＲ−Ｕ５間の境界線でポリアデニレーション化される（Goff, S. P. Retroviridae, Field's Virology 4th ed. 2:1871-1939 (2001)を参照せよ）。このＲＵ５  ＨＴＬＶ−Ｉエレメントは、ＳＶ４０初期遺伝子プロモータに融合された場合に、強力な翻訳刺激因子であることが示されている（Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)を参照せよ）。ＨＴＬＶ−ＩＲＵ５エレメントによる翻訳刺激が部分的には翻訳向上リボソーム内部侵入部位[translational enhancing internal ribosome entry site (IRES)]としてのその機能によるということが提案されている(Attal et al. FEBS Letters 392:220-224 (1996)を参照せよ)。さらに、ＨＴＬＶ−ＩＲＵ５エレメントは、5'−スプライスドナー部位を提供する。ＲＵ５エレメントのすぐ下流には、スプライス受容保存配列[splice acceptor sequence]を含むＨＣＭＶイントロンＡの３'末端がある。VR10686およびVR6430 発現ベクターは、ＨＣＭＶイントロンＡの３'末端に融合された５'−ＨＴＬＶ−Ｉイントロン配列から成るハイブリッドイントロン、ウシ成長ホルモンポリアデニレーション部位、外部の遺伝子を挿入するためのポリリンカー、およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。VR6430ベクターは、prM およびE ウェストナイルウィルス抗原 （Genebank 受託番号AF202541）を発現する。
【０２３０】
上記のベクターバックボーンを用いて、複数のインフルエンザタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を発現する発現ベクターを作製することができる。本明細書で説明している発現ベクターは、付加的なプロモータを含んでいてよい。例えば、VR4774構築物（実施例１３に説明されている）は、ＣＭＶプロモータ及びＲＳＶプロモータを含んでいる。従って、本明細書で説明しているベクターバックボーンは、プロモータ及びインフルエンザコード配列（特に本明細書で説明しているポリヌクレオチドを含む）を含む複数の発現カセットを含んでいてよい。発現カセットは、同一の又は異なったインフルエンザポリペプチド群をコードしてよい。さらに、発現カセットは、相互に同一の又は異なった配向であってよい。従って、それぞれのカセットに由来する転写も、同一の又は異なった方向であってよい（すなわち、双方の発現カセットにおいて５' から３' の方向であってもよく、ひとつの発現カセットにおいて５' から ３'の方向でありもうひとつの発現カセットにおいて３' to ５' の方向であってよい）。
【０２３１】
プラスミドＤＮＡ精製
プラスミドＤＮＡは、適切な大腸菌株（DH5α菌株を含むがそれに限定されない）のコンピテント細胞に転換してよく、また高度に精製した共有結合で閉じた環状プラスミドＤＮＡを修飾細胞溶解法[modified lysis procedure] （Horn, N.A., et al., Hum. Gene Ther. 6:565-573 (1995)）、続いて標準二本鎖ＣｓＣｌ−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法[standard double CsCl-ethidium bromide gradient ultracentrifugation] （Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989))）を用い、単離した。あるいはまた、プラスミドＤＮＡを、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア市）製のGigaカラムを用いそのキットの使用方法に基づき、精製する。すべてのプラスミド調製は、ゲル分析及びビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ[bicinchoninic protein assay]により検知できる染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質不純物がない状態であった。エンドトキシンレベルは、アメリカ産カブトガニ血球抽出液エンドトキシン検出方法（リムルス試験）[Limulus Amebocyte Lysate assay] （マサチューセッツ州ファルマウスケープコッド市のLAL、Associates）を用いて測定され、その結果はプラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり０．６エンドトキシン単位未満であった。ＤＮＡ溶液のスペクトル吸光度A260/A280比の典型的数値は、１．８を超えていた。プラスミドを、エタノール沈殿し、適切な溶液（例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム）を用いて再懸濁する（その他の適切な賦形剤および補助剤については、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号2002/0019358を参照せよ）。ＤＮＡを使用するまで、−２０°Ｃで保存した。ＤＮＡを、３００ｍＭ塩溶液と混合するかあるいは適切な量のＵＳＰ水を加えて希釈し、望ましい分子濃度の望ましい塩におけるプラスミドＤＮＡ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度を得た。
【０２３２】
哺乳類細胞ラインにおけるプラスミド発現
発現プラスミドを、プラスミドを充分に特徴付けたネズミの黒腫（メラノマ）細胞ライン（VM-92またはUM-449として公知である）に形質移入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した（例えば、Wheeler, C.J., Sukhu, L., Yang, G., Tsai, Y., Bustamente, C., Felgner, P. Norman, J & Manthorpe, M. "Converting an Alcohol to an Amine in a Cationic Lipid Dramatically Alters the Co-lipid Requirement, Cellular Transfection Activity and the Ultrastructure of DNA-Cytofectin Complexes," Biochim. Biophys. Acta. 1280:1-11 (1996)を参照せよ）。その他の充分に特徴付けたヒトの細胞ラインを用いてもよく、その例としては、ATCC アクセッション番号CCL-171のMRC-5 細胞、あるいは、ヒト胎児横紋筋肉腫ＲＤ（ATCC CCL-136）が挙げられる。形質移入を、当業者に公知であるカチオン脂質に基づく形質移入方法を用いて行った。その他の形質移入方法が当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーションおよび塩化カルシウム媒介形質移入法 （Graham F.L.and A.J. van der Eb Virology 52:456-67 (1973)）を用いてもよい。形質移入後、形質移入細胞の細胞溶解産物および培養上澄みを評価し、ＩＶ抗原タンパク質の相対的発現レベルを比較した。検体を、市販のポリクロナールモノクロナール抗体（例えば、ニュージャージー州フランダース市のResearch Diagnostics Inc.より入手可能）を用いて、ウェスタンブロット法および酵素免疫測定法（ELISA）により検査し、発現抗原の質と量を比較した。
【０２３３】
プラスミドＤＮＡの注入
拘束した有意識下のネズミ（インディアナ州インディアナポリス市Harlan Sprague Dawley社から入手した週齢６週間から１２週間のメスのBALB/cネズミ）の大腿四頭筋に、50 μl 溶液に溶解させた１μg から５０ μg のＤＮＡ（ネズミ一匹あたりに投与した１００ μlの溶液総量中に１００ μgのＤＮＡ）を、使い捨てプラスチック製のインシュリンシリンジおよびマイクロピペットの先端を切って作ったプラスチック製のカラーに装着した28G 1/2針（ニュージャージー州フランクリンレークス市にあるBecton-Dickinsonより入手した；カタログ番号329430）を用いて、先に説明したように（Hartikka, J., et al., Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996)）、二側注射した。
【０２３４】
研究中の動物のケアは、「実験動物の使用法およびケアについてのガイドライン」["Guide for the Use and Care of Laboratory Animals"]、動物実験に関連する団体[Institute of Laboratory Animal Resources]、生命科学研究所[Commission on Life Sciences]、国立研究機構[National Research Council]、National Academy Press, Washington, D.C., 1996 およびVICAL社の研究機関の動物ケアおよび使用方法に関する委員会[Vical’s Institutional Animal Care and Use Committee]に準拠して行った。
【０２３５】
（実施例１）
発現ベクターの構築
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、ＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体をコードする天然のコード領域から成るプラスミドを以下のように構築する。ＩＶ(A/PR/8/34)に由来するＮＰ、Ｍ１、およびＭ２遺伝子をウィルスＤＮＡから単離するか、あるいは野生型配列が既知である場合は直接合成により作製するか、あるいは標準方法により作製し、VR10551ベクターに標準制限部位を用いて標準方法で挿入する。
【０２３６】
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合をコードするヒトコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物；またはその他のＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体を単独でまたはＨＢｃＡｇなどのような担体タンパク質との融合タンパク質としてコードするその他のコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物を、以下のように作製する。当該コドン最適化コード領域群は、本明細書で説明している完全、最小限、または均一コドン最適化方法群を用いて、作製する。当該コドン最適化コード領域群は、本明細書で説明している標準ＰＣＲ法を用いて構築するか、あるいは市販のものを注文する。Ｍ２の最初の２３から２４のａａ細胞外領域を表すオリゴヌクレオチドを構築し、それらを上記のＮＰコード領域とのオーバーラップPCR反応に用い、ｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするヒトコドン最適化コード領域（例えば、SEQ ID NOs 6 および7に示しているようなもの）を作製する。該コドン最適化コード領域群を、VR10551ベクターに、標準制限部位を用いて標準方法により、挿入する。
【０２３７】
上記のように構築したプラスミドを、大腸菌を用いて増殖させ、アルカリ溶解方法[alkaline lysis method]により精製する（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2 (1989)）。塩化セシウム水溶液により層化したDNA [CsCl-banded DNA]を、エタノール沈殿し、０．９％の生理食塩水あるいはＰＢＳで再度懸濁し、注入用の２ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。あるいはまた、プラスミドを、多様な市販のキットを用いるか、あるいは差別化沈殿法およびまたはクロマトグラフ精製に関連した公知の方法に従って、精製する。
【０２３８】
それぞれのプラスミドをDMRIE/DOPEおよび形質移入VM92細胞に組み入れることにより、発現をテストした。上澄みを採取し、タンパク質の生産をウェスタンブロット法あるいは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によりテストした。相対的な発現レベルを、野生型とコドン最適化構築物について、比較する。
【０２３９】
上記の方法に従って作製した構築物の例を、表１３に一覧表示する。一覧表示した構築物を作製した実験手続きを、本明細書で説明した使用した特殊なパラメータおよび材料と共に、上記に記載した。
【表１３】
2008505660.tif 000368
【０２４０】
インフルエンザＮＰをコードするｐＤＮＡ発現ベクターVR4700 が、当該技術分野で説明されている（例えば、Sankar, V., Baccaglilni, L., Sawddey, M., Wheeler, C. J., Pillemer, S. R., Baum, B. J. and Atkinson, J. C., "Salivary Gland Delivery of pDNA-Cationic Lipolplexes Elicits Systemic Immune Responses," Oral Diseases 8:275-281 (2002)を参照せよ）。下記は、ＴＰＡ−ＮＰ（VR4700由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:46として言及されている：
【化４１】
2008505660.tif 000369
【０２４１】
精製VR4700 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。ウェスタンブロット分析により、ネズミポリクロナール抗ＮＰ抗体につき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける非常に低いレベルのVR4700の発現が示された。Ｉｎ  ｖｉｖｏの抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより、平均力価 が62,578であることがわかった。
【０２４２】
プラスミドVR4707は、分泌形態のＭ２（すなわち、ＴＰＡ−Ｍ２）を発現する。オリゴが相互にアニールされている合成オリゴヌクレオチドを使って、配列をアセンブルし、その後、ライゲーションし、ゲル精製した。次に、精製製品をVR10551のEco RI/Sal Iにライゲーション(クローニング)した。Ｍ２配列は、膜貫通ドメインを欠いている；クローニングした配列は、アミノ酸を含んでいる[TPA(1-23)]ARGSG[M2(1-25)]GGG[M2(44-97)]。ＴＰＡ とＭ２との間の、またＭ２ドメイン群間のアミノ酸残基を、フレキシブルリンカーとして加えた。以下の突然変異を、適切なＴ−細胞エピトープを誘導するために導入した：74S->G and 78S->N 。以下はTPA-M2ΔTM （VR4707由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:47として言及されている：
【化４２】
2008505660.tif 000370
【０２４３】
精製VR4707 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２タンパク質の発現を決定した。Ｍ２タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。Ｉｎ  ｖｉｖｏのVR4707に対するＭ２抗体応答は、ＥＬＩＳＡにより測定したところ、平均力価 が１１０であることがわかった。これは、セグメント７由来の全長Ｍ２をコードするVR4756の平均力価９，２４０より、低い。Ｍ２に特異なＴ−細胞をIFNγ ELISPOTアッセイで測定したところ、平均細胞数61 SFU/106に対し、セグメント７構築物については平均細胞数121 SFU/106という結果であった。
【０２４４】
VR4710を、ＴＰＡリーダーおよびVR4707由来のM2の最初の24個のアミノ酸をVR4700由来の全長NP遺伝子に融合することにより作製した。プライマー5'-GCCGAATCCATGGATGCAATGAAG-3'  (SEQ ID NO:48) およびプライマー 5'-GGTGCCTTGGGACGCCATATCACTTGAATCGTTGCA-3' (SEQ ID NO:49) を使って、VR4707由来のTPA-M2断片を増幅した。プライマー 5'-TGCAACGATTCAAGTGATATGGCGTCCCAAGGCACC-3' (SEQ ID NO:50) およびプライマー5'-GCCGTCGACTTAATTGTCGTACTC-3' (SEQ ID NO:51) を使って、VR4700由来のＮＰ遺伝子を増幅した。その後、Ｎ末端およびＣ末端を使って、融合をアセンブルし、ｅＭ２ＮＰ融合をEcoRI-SalI 断片としてVR10551 にクローニングした。以下はTPA-M2-NP （VR4710由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:52として言及されている：
【化４３】
2008505660.tif 000371
【０２４５】
精製VR4710 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ネズミにｐＤＮＡを二度注入した後に行ったＥＬＩＳＡアッセイにより、抗Ｍ２抗体応答はほとんどなかったが抗ＮＰ抗体の平均力価は６６，５６０であるということがわかった。
【０２４６】
VR4750は、以下の手順で作製した。まず、ネズミ適応A/Hong Kong/1/68 ウィルスストックに由来するＲＮＡを、無作為のヘキサマーを用いて、逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、プライマー5' GGGCTAGCGCCGCCACCATGAAGACCATCATTGCT  3' (SEQ ID NO:53) およびプライマー5' CCGTCGACTCAAATGCAAATGTTGCA 3' (SEQ ID NO:54) を使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＨＡ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、Invitrogen 社製TOPO-TA ベクターにまず挿入し、その後、制限酵素のNheI およびSalI を用いて、VR10551にサブクローニングした。以下は、ネズミ適応A/Hong Kong/68（VR4750由来）由来のHA (H3N2)のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:55として言及されている：
【化４４】
2008505660.tif 000372
【０２４７】
VR4750発現は、ウェスタンブロットアッセイによると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは明確に検知されなかったが、１００μg のVR4750を二度接種した場合に、ネズミ適応A/Hong Kong/68ウィルスによる鼻腔内の攻撃からネズミを保護することがわかった。
【０２４８】
VR4752は、以下の手順で作製した。まず、ネズミ適応A/Puerto Rico/8/34ウィルスストックに由来するＲＮＡを、無作為のヘキサマーを用いて、逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。その後、プライマー5' GGGCTAGCGCCGCCACCATGAAGGCAAACCTACTG 3' (SEQ ID NO:56) およびプライマー5' CCGTCGACTCAGATGCATATTCTGCA 3' (SEQ ID NO:57) を使って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＨＡ遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、TOPO-TA ベクターにまず挿入し、その後、制限酵素のNheI およびSalI を用いて、VR10551にサブクローニングした。以下は、ネズミ適応A/Puerto Rico/34（VR4752由来）由来のHA (H1N1)のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:58として言及されている：
【化４５】
2008505660.tif 000373
【０２４９】
精製VR4752 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、HAタンパク質の発現を決定した。HAタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ａ型インフルエンザ(H1N1)抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２５０】
Ｍ２遺伝子のＭ１遺伝子への直接融合を、「万能」最適化戦略を用いて、実施例４で説明している方法に由来するコドン最適化配列に基づき、合成した。合成した遺伝子をpUC119ベクターに組み込み、その後、EcoRI-SalI 断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ２Ｍ１融合タンパク質（VR4755由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:59として言及されている：
【化４６】
2008505660.tif 000374
【０２５１】
精製VR4755 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２Ｍ１融合タンパク質の発現を決定した。Ｍ２Ｍ１融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ１および抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、Ｍ２Ｍ１融合の発現を可視化した。
【０２５２】
Ａ型インフルエンザのセグメント７ＲＮＡは、Ｍ１遺伝子およびＭ２遺伝子の双方をコードする。Ｍ１遺伝子およびＭ２遺伝子のに対するコンセンサスアミノ酸配列を、本明細書で説明している方法により、引き出した。しかしながら、これら双方のタンパク質に対するコンセンサス配列は、ＩＶ 菌株 A/Niigata/137/96に由来するＭ１アミノ酸配列およびＭ２アミノ酸配列と同一であり、それらのコンセンサス配列は、本明細書ではそれぞれSEQ ID NO:77 および SEQ ID NO:78として言及されている。それに応じて、A/Niigata/137/96のセグメント７に対する天然配列を合成し、pUC119における挿入片として組み入れた。以下は、セグメント７（VR4756由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:60として言及されている：
【化４７】
2008505660.tif 000375
【０２５３】
SEQ ID NO:77 （「コンセンサス」 (A/Niigata/137/96) M1）：
【化４８】
2008505660.tif 000376
【０２５４】
SEQ ID NO:78 （「コンセンサス」 (A/Niigata/137/96) M2）:
【化４９】
2008505660.tif 000377
【０２５５】
精製VR4756 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、セグメント７によりコードされるタンパク質の発現を決定した。Ｍ２およびＭ１の発現は、市販の抗Ｍ１および抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、ウェスタンブロットアッセイで確認した。ネズミにｐＤＮＡを二度注入した後に行ったＥＬＩＳＡアッセイにより、抗Ｍ２抗体の平均力価が９，２４０に対し、VR4707の平均力価が１１０であるということがわかった。Ｍ２に特異なＴ−細胞をIFNγ ELISPOTアッセイで測定したところ、VR4756を注入したネズミについては平均細胞数121 SFU/106であったのに対し、VR4707構築物については平均細胞数61 SFU/106という結果であった。
【０２５６】
セグメント７配列をもうひとつ作製した。それは、VR4763であり、この配列はセグメント７の選択的にコドン最適化した領域を含んでいる。セグメント７におけるコード領域の最適化は選択的である。その理由は、セグメント７は2個の重複するコード領域（すなわち、Ｍ１とＭ２）を含んでおり、これらのコード領域は部分的に異なったリーディングフレーム内にあるからである。セグメント７のヌクレオチド１から３によりコードされるＡＵＧから、Ｍ１がセグメント７のＲＮＡの ｂｐ１ から７５９によりコードされているのに対し、Ｍ２はスプライスされたメッセンジャーＲＮＡによりコードされており、このスプライスされたメッセンジャーＲＮＡはセグメント７のヌクレオチド１から２６を含み、これらのヌクレオチドはセグメント７のヌクレオチド７１５から９８２にスプライスされている。７１５から７５９の領域の最適化を避ける。その理由は、Ｍ１およびＭ２のコード配列（異なったリーディングフレームにある）がその領域では重複しているからである。セグメント７配列のｂｐ７１５でｂｐ２６を代替フレームに加えるために行うスプライシングのため、これらのスプライシング領域における最適化を避ける。また、おそらく間違いなくスプライシングに関与すると思われる隣接領域も同様に避ける。最適化は、新しいスプライシング部位を不注意に導入することのないように行う。これらの最適化する領域は、「万能」戦略（すなわち、最も使用頻度の高いコドンをそれぞれのアミノ酸に挿入すること）を用いて行う。以下は、コドン最適化セグメント７（VR4763由来）のヌクレオチド配列であり、本明細書ではSEQ ID NO:61として言及されている：
【化５０】
2008505660.tif 000378
【０２５７】
Ｍ１のコドン最適化コード領域は、SEQ ID NO:61のヌクレオチド１からヌクレオチド７５９まで伸びており、終止コドンを含み、本明細書ではSEQ ID NO:79として表されている。Ｍ２のコドン最適化コード領域は、SEQ ID NO:61のヌクレオチド１からヌクレオチド２６まで伸びており（この領域はSEQ ID NO:61のヌクレオチド７１５からヌクレオチド９５９までの領域にスプライスされている）、終止コドンを含み、本明細書ではSEQ ID NO:80として表されている。
【０２５８】
最適化されたＭ１コード領域 (SEQ ID NO:79)：
【化５１】
2008505660.tif 000379
【０２５９】
最適化されたＭ２コード領域(SEQ ID NO:80)：
【化５２】
2008505660.tif 000380
【０２６０】
eM2-NP 融合タンパク質をコドン最適化し、pUC119 に挿入し、さらにEcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、eM2-NP（契約によりコドン最適化されたもの）（VR4757由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:62として言及されている：
【化５３】
2008505660.tif 000381
【０２６１】
精製VR4757 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ＥＬＩＳＡにより検査したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗ＮＰ抗体応答の平均力価は５１，２００であるということがわかった。
【０２６２】
VR4758 におけるeM2-NP融合遺伝子を、コドン最適化し、合成した。当該遺伝子を、pUC119に挿入し、EcoRI-SalI 断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、eM2-NP（出願人によりコドン最適化されたもの）（VR4758由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO: 63として言及されている：
【化５４】
2008505660.tif 000382
【０２６３】
精製VR4758 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、eM2-NP融合タンパク質の発現を決定した。eM2-NP融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体および抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。ＥＬＩＳＡにより検査したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗ＮＰ抗体応答の平均力価は４８，６４０であるということがわかった。
【０２６４】
Ｍ２遺伝子を、VR4755から、プライマー5'- GCCGAATTCGCCACCATGAGCCTGCTGACC-3' (SEQ ID NO:64) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCACTCCAGCTCGATGCTCAC-3' (SEQ ID NO:65)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ２（VR4759由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:66として言及されている：
【化５５】
2008505660.tif 000383
【０２６５】
精製VR4759 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ２タンパク質の発現を決定した。Ｍ２タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ２モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２６６】
Ｍ１遺伝子を、VR4755から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGTCCCTGCTGACAGAAGTG-3' (SEQ ID NO:67) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCACTTGAATCTCTGCATC-3' (SEQ ID NO:68)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、Ｍ１（VR4760由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:69として言及されている：
【化５６】
2008505660.tif 000384
【０２６７】
精製VR4760 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、Ｍ１タンパク質の発現を決定した。Ｍ１タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗Ｍ１モノクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。
【０２６８】
ＮＰ遺伝子を、VR4757から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGGCCTCCCAGGGAACCAAAAG-3' (SEQ ID NO:70) および プライマー5'-GCCGTCGACTGATCAATTGTCGTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:71)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、ＮＰ（契約によりコドン最適化されたもの）（VR4761由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:72として言及されている：
【化５７】
2008505660.tif 000385
【０２６９】
精製VR4761 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。VR4761のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、VR4700に比べ著しく高く、VR4762に匹敵するものであった。
【０２７０】
ＮＰ遺伝子を、VR4758から、プライマー5'-GCCGAATTCGCCACCATGGCCAGCCAGGGCACCAAG-3' (SEQ ID NO:73) およびプライマー 5'-GCCGTCGACTGATCAGTTGTCGTACTCC-3' (SEQ ID NO:74)を使って、ＰＣＲで増幅し、EcoRI-SalI断片としてVR10551にサブクローニングした。以下は、ＮＰ（出願人によりコドン最適化されたもの）（VR4762由来）のオープンリーディングフレームであり、本明細書ではSEQ ID NO:75として言及されている：
【化５８】
2008505660.tif 000386
【０２７１】
精製VR4762 ＤＮＡを使用して、ネズミ細胞ラインVM92に形質移入し、ＮＰタンパク質の発現を決定した。ＮＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロットアッセイで確認した。市販の抗ＮＰネズミポリクロナール抗体を用いて、発現を可視化した。VR4762のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現は、VR4700に比べ著しく高く、VR4761に匹敵するものであった。
【０２７２】
単一のＩＶタンパク質をコードするプラスミドに加えて、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域を含む単一プラスミド群を、標準方法に従って構築する。例えば、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域が単一転写として真核細胞に転写されている多シストロン性構築物を、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）配列を用いて多様なコード領域を単離することにより、構築することができる。あるいはまた、２個あるいはそれ以上のＩＶコード領域を、それぞれがそれ自身のプロモータ配列を有する単一プラスミドに挿入してもよい。
【０２７３】
（実施例２）
組み換えＮＰＤＮＡおよびタンパク質の調製 
組み換えＮＰＤＮＡおよびタンパク質を、以下の手順を用いて調製する。真核細胞を使って、形質移入した発現プラスミドからＮＰタンパク質を発現させる。あるいはまた、Sf9、Sf21、あるいはD.Mel-2 細胞を含むがそれらに限定されない昆虫細胞を、ＮＰタンパク質を発現する能力のある組み換えバキュロウイルスに感染させるバキュロウイルスシステムを使ってもよい。すでにバキュロウイルスに感染した組み換えＮＰをコードする細胞、あるいは発現プラスミドを含む組み換えＮＰをコードする細胞を、それらが増殖しているフラスコの底を叩くかまたはこそげることにより採取する。感染後24時間から４８時間の細胞は、フラスコからはがれにくく溶解する可能性もあるので、そのような細胞の除去には注意が必要である。次に、細胞が入っていたフラスコをＰＢＳで洗浄し、細胞を２５０ｍＬのコニカル試験管に移す。試験管をＪ−６遠心機（３００  ｘｇ）により１０００ｒｐｍで約5分から10分回転させる。細胞ペレットを、ＰＢＳで2度洗浄し、約１０ｍＬから２０ｍＬのＰＢＳで再度懸濁させ、数を数える。細胞を、ＲＳＢ(10mM Tris pH=7.5、1.5mM MgCl2、10mM KCl)中で、2x107 細胞個/mlの濃度で、最後にもう一度懸濁させる。
【０２７４】
約106個の細胞を、標準SDS-PAGEミニタンパク質ゲル法のレーン毎に使う。これは、ゲル分析用の全細胞分画と同等である。１０％ＮＰ４０を細胞に加え、最終濃度を０．５％にする。細胞とＮＰ４０との混合物を、ボルテックスミキサーにかけ、時折ボルテックスミキサーにかけながら氷上に１０分間置く。氷上培養後、細胞をＪ−６遠心機（６００  ｘ１）により１５００ｒｐｍで１０分回転させる。上澄み（細胞質分画）を取る。残存ペレット（核を含んでいる）を、緩衝液Ｃ(20 mM HEPES pH = 7.9、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mM PMSF、0.5 mM DTT)を用いて二度洗浄し、細胞質タンパク質を取り除く。緩衝液Ｃを用いて、核が１ｍｌあたり5x107 個含まれている濃度に、核を懸濁する。核をボルテックスミキサーで粒子がばらばらになるように激しく混練し、分割量をミニタンパク質ゲル用に取り除く（核分画）。
【０２７５】
残存核に、5M NaCl の４分の１の量を加え、得られた混合物を超音波処理する（浴槽型超音波処理器使用、最大出力、超音波処理時間５分間、温度４°C、バースト時間1分から2分、バースト間休止時間３０秒）。超音波処理を施した混合物を、４°Cで攪拌し、１２０００ｘｇで約１０分間回転させる。核の数で約106個に相当するタンパク質ミニゲル用の検体を取り出す。ゲル検体を遠心単離し、上澄みは核抽出物であり、ペレットはゲル分析用核ペレットである。
【０２７６】
ゲル分析を行うには、少量の（約106個の核に相当する量）核ペレットをゲル検体緩衝液に直接懸濁し、同量の全細胞、細胞質、核、核抽出物および核ペレットを用いて分析を行う。上記の方法により、比較的粗質のＮＰが得られる。純度の高いＮＰを採取するには、5M NaCl の代わりに2.1M NaCl を、核ペレットに加える。これにより、塩含有量が0.42M NaCl になる。そうすると、上澄み液に含まれている総ＮＰと核タンパク質の率が、６０％から７０％になる。得られたペレットを、次に、1M NaCl を用いて抽出し、上記のように遠心単離する。得られた上澄み液は、総ＮＰを９５％の純度で含んでいる。
【０２７７】
（実施例３）
ＮＰ、Ｍ１およびＭ２のコンセンサスアミノ酸配列
１９９０年以降シーケンスされたインフルエンザ菌株に由来するアミノ酸配列を分析することにより、インフルエンザＮＰ、Ｍ１およびＭ２抗原に対するコンセンサスアミノ酸配列を得た。
【０２７８】
ＮＰコンセンサスアミノ酸配列
インフルエンザＮＰ（Ａ菌株）に対するアミノ酸配列を選択する方法を以下に記す。各セグメントにつきインフルエンザ配列情報を記載しているデータベース（ＵＲＬ：http://www.flu.lanl.gov）で、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、ＮＰ、アミノ酸を検索した。検索結果には、約４００個の配列があり、その大部分は単なる部分列であった。得られた配列を、約８５個の全長配列に絞った。同一菌株の異なったパッセージが見つかった場合は、最も初期のパッセージを選択した。得られた配列をさらに、１９９０年から２０００年に単離された２８個の全長ＮＰ配列に絞った（２００１年から２００３年の期間には全長配列は単離されなかった）。同年に単離された他の配列と同じである5個の配列をさらに除外した。これは、単離年が同じでアミノ酸配列が同じである配列は、同じウィルス菌株である可能性が高いという仮定に基づいて行った（二重に加重価値を与えことを避けるため）。同じ年に由来していてもアミノ酸配列が異なっていれば、双方の配列を含めた。
【０２７９】
配列を、A/PR/8/34菌株にアラインし、新しいものから古いものの順に並べ、コンセンサス配列を多数派のアミノ酸を用いて決定した(図１２)。A/PR/8/34 とコンセンサス配列との間に、３２のアミノ酸変化があり、これらのアミノ酸変化がすべて2個の２０００年に単離されたＮＰ配列にも存在している。もうひとつのアミノ酸についていえば、(aa 275)15/23がE (A/PR/34において) からG/D あるいはV （7G、7D、1V）へ変化していた。これらの2個の２０００年に単離されたＮＰ配列は双方とも、この部位にＧを有しているので、Ｇを選択した。変化は、全部で３３アミノ酸であり、これはA/PR/8/34 菌株と比較して約７％異なっていることになる。
【０２８０】
優勢Balb/c エピトープTYQRTRALV は、依然として新しいコンセンサスに維持されている。その他の理論的ヒトエピトープに起こった変化が、また決定されていないのである。
【０２８１】
過去８年間インフルエンザワクチンとして（米国で）使用されたＡ菌株は、以下の通りである（これらの菌株のＮＰ遺伝子についての全長配列は入手不能である）：
a.  2002-2003 A/Moscow/10/99, A/New Caledonia/20/99
b.  2001-2002 A/Moscow/10/99, A/New Caledonia/20/99
c.  2000-2001 A/Panama/2007/99, A/New Caledonia/20/99
d.  1999-2000 A/Sydney/05/97, A/Beijing/262/95
e.  1998-1999 A/Sydney/05/97, A/Beijing/262/95
f.  1997-1998 A/Nanchang/933/95, A/Johannesburg/82/96
g.  1996-1997 A/Nanchang/933/95, A/Texas/36/91
h.  1995-1996 A/Johannesburg/33/94, A/Texas/36/91
【０２８２】
この方法を用いて得た最終ＮＰコンセンサスアミノ酸配列を、本明細書ではSEQ ID NO:76と呼ぶ：
【化５９】
2008505660.tif 000387
【０２８３】
Ｍ１およびＭ２コンセンサスアミノ酸配列
Ｍ１およびＭ２のコンセンサス配列を、以下に示した類似した方法で決定した。http://www.flu.lanl.gov/のウェブサイトで使用した検索パラメータは、Ａ型インフルエンザ菌株、ヒト、セグメント７、ヌクレオチド（Ｍ１およびＭ２の双方がセグメント７に由来する）であった。１９９０年から１９９９年の期間から、全長配列を選択した（２０００年以降の配列は入手不能であった）。同じ年および同じ都市から出た配列群については、最も時期の早いもののみを使用した。同じ年から出た記載事項については、同年に単離された他の配列と同じである配列を除外した(異なった都市から出たものであっても)。２１個の配列（１９９３年から１９９９年の期間から出たＭ１およびＭ２の全長配列）を比較した。各部位において、多い方のアミノ酸を使用した。
【０２８４】
Ｍ１アミノ酸コンセンサス配列を、本明細書ではSEQ ID NO:77と呼ぶ：
【化６０】
2008505660.tif 000388
【０２８５】
Ｍ２アミノ酸コンセンサス配列を、本明細書ではSEQ ID NO:78と呼ぶ：
【化６１】
2008505660.tif 000389
【０２８６】
（実施例４）
コドン最適化アルゴリズム
以下に、インフルエンザ抗原のヒトコドン最適化配列を得るためのアルゴリズムの概要を示す。
【０２８７】
逆翻訳
アミノ酸配列からスタートし、（ａ）http://www.kazusa.or.jp/codon/のウェブサイトにあるヒトコドン使用頻度表を用いて手動で逆翻訳する。
【０２８８】
ホモサピエンス [gbpri]： 55194 CDS's (24298072 コドン) 
【０２８９】
フィールド： [トリプレット] [使用頻度: １０００当たり] ([数]) 
【化６２】
2008505660.tif 000390
【０２９０】
あるいは (b) www.syntheticgenes.comのウェブサイトのログオンし、以下に示した逆翻訳ツールを使用する：
【０２９１】
(1) 「Protein (タンパク質)」のタブの下に、アミノ酸配列を貼り付けする；
【０２９２】
(2) 「Download codon usage（コドン使用頻度をダウンロードする）」のタブの下に、「homo sapiens（ホモサピエンス）」をハイライトし、「CUT」を ダウンロードする。
【化６３】
2008505660.tif 000391
【０２９３】
(3) 「Apply （適用）」ボタンをクリックする。
【０２９４】
(4) 「Optimize （最適化する）」のタブの下で、「General （一般）」のタブを開ける。
【０２９５】
(5) 「use only most frequent codon （最も使用頻度の高いコドンのみを使用する）」のボックスにチェックマークを付ける。
【０２９６】
(6) 「Apply （適用）」ボタンをクリックする。
【０２９７】
(7) 「Optimize （最適化する）」のタブの下で、「Motif （モチーフ）」のタブを開ける。
【０２９８】
(8) 望ましいクローニング制限部位を悪いモチーフにロードする；望ましくない配列｛例えば、プリブノーボックス配列(TATAA)、カイ 配列(GCTGGCGG)、または制限部位｝を悪いモチーフにロードする。
【０２９９】
(9) 「Output （出力）」タブ下で、「Start （開始）」ボックスをクリックする。出力には、配列、モチーフ検索結果（「Report（レポート）」タブ下）、およびコドン使用頻度レポートが含まれている。
【０３００】
当該プログラムは、システインプロリンまたはアルギニンのようなアミノ酸については、最も使用頻度の高いコドンを常に使用するとは限らなかった。これを変えるためには、「Edit CUT（CUTを編集する）」 のタブへ戻り、対象コドンに関する虹色のバーを手動で１００％になるまでドラッグする。その後、「Output （出力）」タブ下で、「Start （開始）」をやり直す。
【０３０１】
アルギニンについてCGG を使用すると、GCの含有量が非常に高くなるので、アルギニンについてはAGA を代替として使うことができる。コドン使用頻度における差異は、CGG が１０００あたり１１．６であるのに対し、AGA は１０００あたり１１．５である。
【０３０２】
スプライスドナー およびアクセプター部位の検索
(1) Berkeley Drosophila Genome Project ウェブサイトにログオンする（ＵＲＬ：http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html\）＊。
【０３０３】
(2) 「Human or other （ヒトあるいはその他の生物）」および「both splice sites （双方のスプライス部位」のボックスにチェックマークを付ける。
【０３０４】
(3) ５’ および ３’ スプライス部位に対する最小限のスコア（０から１まで）を選択する。
０．４のディフォルト設定を使用した場合：
ディフォルト最小限スコアが０．４である場合：
%認識された        %偽陽性
スプライス部位
ヒト 5’ スプライス部位        93.2%          5.2%
ヒト 3’ スプライス部位        83.8%          3.1%
【０３０５】
(4) 配列を貼り付ける。
【０３０６】
(5) 「Submit（提出する）」をクリックする。
【０３０７】
(6) 予測ドナーあるいはアクセプターに基づき、当該部位がそれ以上予測されなくなるまで個々のコドンを変える。
【０３０８】
5' および 3' 配列を加える
遺伝子配列の5'末端上に、制限酵素部位およびコザック配列(gccacc)をATG の前に加えた。配列の3'末端上の終止コドン（反対の鎖上のtga）の後に続く制限酵素部位の後に、tca を加えた。GC の含有量およびオープンリーディングフレームを、SEC Central を用いて調べた。
【０３０９】
（実施例５）
ワクチン製剤の調製
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、ポロキサマーCRL 1005 およびBAK （５０％塩化ベンザルコニウム液、Ruger Chemical Co. Inc.より入手可能）を用いて、以下の方法により、調製する。製剤のそれぞれの構成要素の特定な最終濃度を以下に示す方法群に説明するが、これらの方法群について、構成要素の濃度は、当業者に公知の基本的な化学量論的計算に基づき、望ましい濃度を得る目的で、異なっていてもよい。
【０３１０】
例えば、CRL 1005の濃度は、例えば、形質移入効率、発現効率、あるいは免疫原性などの要因により、約1 mg/ml から約 75 mg/mlの範囲に調整する。CRL 1005の濃度の例には、以下がある：約 1 mg/ml、約 2 mg/ml, 約 3 mg/ml、約 4 mg/ml、約 5 mg/ml、約6.5 mg/ml、約 7 mg/ml、約 7.5 mg/ml、約 8 mg/ml、約 9 mg/ml、約10 mg/ml、約 15 mg/ml、約 20 mg/ml、約 25 mg/ml、約 30 mg/ml、約 35 mg/ml、約 40 mg/ml、約 45 mg/ml、約 50 mg/ml、約 55 mg/ml、約 60 mg/ml、約 65 mg/ml、約 70 mg/ml、or 約 75 mg/ml。
【０３１１】
同様に、ＤＮＡの濃度を、多くの要因により、調整する。その要因には、投与する製剤の量、被験体の年齢と体重、投与方法および投与経路、および投与する抗原の免疫原性が含まれる。一般的に、本発明の製剤は、最終プラスミド（あるいはその他のポリヌクレオチド）濃度が約 1 ng/ml から 約30 mg/mlの範囲になるように調整する。例えば、本発明の製剤は、以下の最終プラスミド濃度を有してよい：約 1 ng/ml、約 5 ng/ml、約10 ng/ml、約 50 ng/ml、約 100 ng/ml、約 500 ng/ml、約 1 μg/ml、約 5 μg/ml、約 10 μg/ml、約 50 μg/ml、約 200 μg/ml、約 400 μg/ml、約 600 μg/ml、約 800 μg/ml、約 1 mg/ml、約 2 mg/ml、約 2.5、約 3 mg/ml、約 3.5、約 4 mg/ml、約 4.5、約 5 mg/ml、約 5.5 mg/ml、約 6 mg/ml、約 7 mg/ml、約 8 mg/ml、約 9 mg/ml、約10 mg/ml、約 20 mg/ml、あるいは約 30 mg mg/ml。
【０３１２】
本発明のある製剤には、本発明のプラスミドのカクテル（上記実施例２を参照せよ）が含まれ、そのようなプラスミド例には、ＩＶタンパク質ＮＰ，Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコード領域から成るプラスミド、および任意に免疫を高めるタンパク質（サイトカイン）をコードするプラスミドがある。カクテルにおいて望ましい多様なプラスミドは、その他の材料に当該プラスミドを加える前に、ＰＢＳあるいはその他の希釈剤と混合する。さらに、プラスミドは、カクテルにおいて均等な割合で存在してよく、あるいは比率は抗原の相対的発現レベルあるいはコードされた抗原の相対的免疫原性に基づいて調整してよい。従って、カクテルにおける多様なプラスミドは、均等な割合で存在してよいし、あるいはまた、カクテル内のその他のプラスミドと比較して、1種類のプラスミドが最高で２倍から３倍の割合で含まれていてもよい。
【０３１３】
さらに、ＢＡＫの濃度を、例えば、望ましい粒子サイズを得るため、また安定性を向上させるために、調整してよい。実際に、ある実施の形態では、本発明の製剤は、CRL 1005 およびDNA を含んでいるが、ＢＡＫを含んでいない。一般的に、本発明のＢＡＫ含有製剤は、ＢＡＫの最終濃度が約０．０５ｍＭから約０．５ｍＭの範囲になるように調整してある。例えば、本発明のＢＡＫ含有製剤は、ＢＡＫの最終濃度が、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭあるいは約０．５ｍＭであってよい。
【０３１４】
下記に示す方法群により生産する製剤の総量は、比例サイズの装置を選択することにより、減じても増やしてもよい。最後に、下記に示す方法群を実施する場合に、製剤の３個の構成要素、すなわち、BAK、CRL 1005、および プラスミド DNAは、いかなる順序で加えてもよい。下記に示す方法群のそれぞれにおいて、「クラウドポイント」という語は、温度シフトあるいはその他の滴定におけるポイントを意味しており、このポイントにおいては、澄明な溶液が濁る、すなわち、溶液に溶解している構成要素が沈殿し始める。
【０３１５】
予備混合製剤のサーマルサイクル 
この例は、０．３ｍＭの BAK、７．５ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が３．６ｍLである製剤の調製について説明している。これらの材料を、図２にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後製剤に室温で（クラウドポイント以上の温度）サーマルサイクル処理を数回施す。
【０３１６】
ＢＡＫの１．２８ｍＭ溶液をＰＢＳを用いて調製し、得られた溶液８４６μｌを磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れ、さらに氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１０分間攪拌する。この後、１００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使って、CRL 1005 （２７μｌ）を加え、氷上にて当該溶液をさらに60分間攪拌する。本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が６．４ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、５ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、攪拌中の溶液に加える。この時点（氷上にある）の溶液は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて１５分間攪拌する。その後、氷水槽を取り除き、周囲温度にて１５分間攪拌し、ポロキサマーのクラウドポイントを超え、混濁溶液にする。
【０３１７】
当該フラスコを氷水槽に戻し、さらに１５分間攪拌し、混合物をポロキサマーのクラウドポイント以下に冷却し、澄明溶液にする。氷水槽を再度取り除き、当該溶液をさらに周囲温度にて１５分間攪拌する。クラウドポイント以上およびクラウドポイント以下の温度で１５分間づつ（合計３０分間）攪拌することを、１回のサーマルサイクルと定義する。当該混合物をさらに６回のサーマルサイクルで処理する。得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに入れ、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３１８】
濃い濃度のCRL 1005を用いた予備混合製剤のサーマルサイクル、希釈、およびろ過
この例は、０．３ｍＭの BAK、３４ｍｇ／ｍｌあるいは５０ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５．０ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が４．０ｍLである製剤の調製について説明している。これらの材料を、図３にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後製剤に室温で（クラウドポイント以上の温度）サーマルサイクル処理を数回施し、希釈し、ろ過する。
【０３１９】
本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が６．４ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れる。CRL 1005を50 mg/mlの濃度で含んだ製剤については、ＮＰコードプラスミドを約3.2 mg/ml の濃度で含みさらにＭ２コードプラスミドを約3.2 mg/ml の濃度で（総ＤＮＡ濃度6.4 mg/ml）を含んだ溶液３．１３ｍｌを、磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れる。これらの溶液（プラスミドカクテルとCRL 1005製剤）を、氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１０分間攪拌する。次に、２００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使ってCRL 1005（最終濃度を３４ｍｇ／ｍｌにするには、１３６μｌ；最終濃度を５０ｍｇ／ｍｌにするには、２００μｌ）を加え、得られた溶液をさらに氷上にて３０分間攪拌する。１．６ｍＭおよび１．８ｍＭのＢＡＫをＰＢＳを用いてそれぞれ調製し、次に、１．６ｍＭ溶液を７３４μｌ、１．８ｍＭを６７０μｌ、１ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、それぞれ攪拌中のポロキサマー溶液群（混合物濃度は３４ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌ）に加える。この時点の溶液群は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて３０分間攪拌する。その後、氷水槽を取り除き、周囲温度にて１５分間攪拌し、ポロキサマーのクラウドポイントを超え、混濁溶液にする。
【０３２０】
当該フラスコ群を氷水槽に戻し、さらに１５分間攪拌し、混合物をポロキサマーのクラウドポイント以下に冷却し、澄明溶液にする。氷水槽を再度取り除き、当該溶液群をさらに１５分間攪拌する。クラウドポイント以上およびクラウドポイント以下の温度で１５分間ずつ（合計３０分間）攪拌することを、１回のサーマルサイクルと定義する。当該混合物をさらに２回のサーマルサイクルで処理する。
【０３２１】
この間に、2個の５０ｍｌ使い捨て真空ろ過器Steriflip（登録商標）を、それぞれ０．２２μｍMillipore Express（登録商標） 濾膜（Millipore社より入手可能；cat # SCGP00525）を装着した状態で、真空ラインを接続した状態の氷水槽に入れ、ろ過器の温度が氷の温度と同じになるまで1時間放置する。次に、当該ポロキサマー製剤群を、ＰＢＳでＤＮＡ濃度が2.5 mg/ml になるまで希釈し、真空下でろ過する。
【０３２２】
得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに移し、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３２３】
サーマルサイクルを含まない簡易方法
この例は、０．３ｍＭの BAK、７．５ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡから成り、総量が２．０ｍLである製剤の簡易調製について説明している。これらの材料を、図４にその概要を示しているプロトコルに従って、クラウドポイント以下の温度で混合し、その後ろ過処理のみを施し、その後使用するかあるいは保存する。
【０３２４】
ＢＡＫの０．７７ｍＭ溶液をＰＢＳを用いて調製し、得られた溶液７８０μｌを磁気攪拌バーを付けた１５ｍL丸底フラスコに入れ、さらに氷水槽内で攪拌器／ホットプレート（ホットプレートのスイッチを切った状態で）に載せ中程度の速度で約１５分間攪拌する。この後、１００μｌポジティブ ディスプレイスメント ピペットを使って、CRL 1005 （１５μｌ）を加え、当該溶液をさらに60分間攪拌する。本明細書で説明しているＮＰ、Ｍ１及び／又はＭ２をコードするコドン最適化コード領域から成るプラスミド、および任意に付加的ＩＶタンパク質あるいはその他のタンパク質（サイトカイン）をコードするコドン最適化コード領域あるいは非コドン最適化コード領域から成る付加的プラスミドを、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、総ＤＮＡの濃度が８．３ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミドカクテルを、５ｍｌピペットを使ってゆっくりと一滴一滴1分以上かけて、攪拌中の溶液に加える。この時点（氷上にある）の溶液は、ポロキサマーのクラウドポイント以下であるため澄明である。当該溶液をさらに氷上にて１５分間攪拌する。
【０３２５】
この間に、１個の５０ｍｌ使い捨て真空ろ過器Steriflip（登録商標）を、それぞれ０．２２μｍMillipore Express（登録商標） 濾膜（Millipore社より入手可能；cat # SCGP00525）を装着した状態で氷水槽に入れ、ろ過器の温度が氷の温度と同じになるまで1時間放置する。次に、当該ポロキサマー製剤を、クラウドポイント以下の温度で真空下でろ過し、その後クラウドポイント以上の温度に暖める。得られた製剤はすぐ使用してもよいが、後で使用するためには、ガラス製のバイアルに移し、クラウドポイント以下に冷却し、−８０°C で凍結しておく。
【０３２６】
（実施例６）
動物への予防接種
本明細書で説明しているコドン最適化ポリヌクレオチドによりコードされる多様なＩＶ発現製品の免疫原性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫応答を発揮するそれぞれのプラスミドの能力に基づいて、まず評価する。プラスミドを、単一構築物としてあるいはマルチ構築物として、個別にあるいは組み合わせでテストする。予防接種を、まず、ネズミ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ヒト以外の霊長目、あるいはその他の適切な動物などの動物で、筋肉内注射（ＩＭ）により行う。標準プロトコルに従って、予防接種を施した動物から血清を採取し、タンパク質−予防接種を施した被験体の抗体−抗種抗体型のアッセイの精製固定化抗原タンパク質を用いて、抗原に特異的な抗体応答をＥＬＩＳＡアッセイにより定量する。免疫原性のテストには、さらに抗体力価の測定、抗体力価の中性化、Ｔ−細胞の増殖、Ｔ−細胞のサイトカイン分泌、細胞溶解性のＴ−細胞性応答、および抗原特異性のCD4+ および CD8+Ｔ−細胞を直接列挙することが含まれる。ヒトにおける免疫応答と保護レベルとの相関関係を、当業者に公知の方法により明らかにした（上記を参照せよ）。
【０３２７】
A.  ＤＮＡ製剤
プラスミドＤＮＡを、実施例３で説明した方法群のうち任意の方法によるポロキサマーを用いて調製する。あるいはまた、プラスミドＤＮＡを、上記で説明したように調製し、ＰＢＳを用いて約０．１ｍｇ／ｍｌから 約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度に（好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ）、溶解し、この場合形質移入促進剤のカチオン脂質（例えば、DMRIE/DOPE）は加えても加えなくてもよい（加える場合の質量比はＤＮＡ対脂質４：１である）。代替のＤＮＡ製剤は、以下を含む：ＰＢＳの代わりに１５０ｍMのリン酸ナトリウム、アジュバント（例えば、VaxfectinTMで、ＤＮＡ対VaxfectinTMの質量比は４：１である）、２％オイル（スクワレン）−Tween 80−水 ｛ＭＰＬ＋ＴＤＭ、ミズーリ州セントルイス市のSigma/Aldrich 社より入手可能、(カタログ番号  M6536)｝に溶解してS. minnesotaモノリン酸リピドA（MPL）[mono-phosphoryl lipid A]（解毒したエンドトキシン）およびトレハロースジミコレート[trehalosedicorynomycolate]ＡＦ（ＴＤＭ）、溶解モノリン酸リピドA（MPL）[mono-phosphoryl lipid A]製剤（ＡＦ、Corixa より入手可能）、あるいは(±)-N-(3-アセトキシプロピル)-N、N-ジメチル-2、3-ビス(オクチルオキシ)-1-プロパンアミニウムクロライド [(±)-N-(3-Acetoxypropyl)-N、N-dimethyl-2、3-bis(octyloxy)-1-propanaminium chloride] (化合物番号VC1240)（Shriver、J.W. et al.、Nature 415:331-335 (2002)、およびP.C.T. Publication No. WO 02/00844 A2を参照せよ；これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）。
【０３２８】
B.  動物への予防接種
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、BALB/c ネズミに、単一プラスミドとしてまたは２個あるいはそれ以上のプラスミドのカクテルとして、ＰＢＳに溶解したＤＮＡあるいはポロキサマーを使った投与システムで製剤化して（すなわち、２ｍｇ／ｍｌのDNA、３ｍｇ／ｍｌのCRL 1005、および０．１ｍＭの BAK）注射する。一群が１０匹から成るネズミの群に、予防接種を３回、隔週で行い、血清を採取しそれぞれの抗原に対する抗体の力価を調べる。ネズミに三価の製剤（当該の３個のプラスミド構築物をそれぞれ等しい質量でふくむもの）を予防接種する群も、含める。
【０３２９】
接種日程は以下である：
−３日        接種前採血
０日          プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
２１日        プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
４９日        プラスミド注射、筋肉内、大腿直筋に二側注射、
一本の脚につき５μｇから５０μｇ
５９日  血清採取
【０３３０】
形質移入VM-92細胞の生、不活性化、あるいは溶解したウィルスに由来する組み換えタンパク質、ペプチドあるいは形質移入上澄みおよび溶解産物の血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより決定する。
【０３３１】
C.  VaxfectinTMアジュバントを使ったワクチン製剤のネズミへの接種
VaxfectinTM（カチオン脂質VC1052と中性コ・リピド[co-lipid] DPyPEとのモル比は１：１である）は、合成カチオン脂質製剤であり、ＤＮＡと共にネズミに筋肉内投与した場合に、[ＩＶタンパク質]に対する抗体力価を高める能力を有しているのではないかと期待されている。
【０３３２】
ネズミにおいて、VaxfectinTMをＮＰＤＮＡと混ぜて製剤化したものを筋肉内注射したところ、抗体力価が２０倍にまで、すなわちＤＮＡ単独では達成できないレベルにまで増強した。ウサギにおいては、ＤＮＡをVaxfectinTMで複雑化した場合、抗体力価が５０倍に増強した。従って、VaxfectinTMは、ＤＮＡワクチンにおける投与システムとして、また、アジュバントとして、有望である。
【０３３３】
VaxfectinTM混合物を、VC1052カチオン脂質のクロロホルム溶液を、DPyPE中性コ・リピド[co-lipid]のクロロホルム溶液と混合することにより、調製する。乾燥膜を、滅菌済みの２ｍｌガラス製バイアル内に入れ、窒素ストリーム下においてクロロホルムを蒸発させ、当該バイアルを真空下に一晩置き、微小量の溶媒を除去することにより、調製する。それぞれのバイアルは、VC1052 and DPyPEを、それぞれ１．５μモル含んでいる。リポソームを、滅菌済みの水を加え、続いてボルテックスミキサーで混練することにより、調製する。得られたリポソームを、リン酸モル対カチオン脂質モルの比率４：１で、ＤＮＡと混合する。
【０３３４】
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、ＰＢＳを用いて望ましい割合で混合し、最終濃度１．０ｍｇ／ｍｌを得る。得られたプラスミドカクテルと対照を、VaxfectinTMを用いて製剤化する。一群あたり５匹のメスのBALB/c ネズミの群に対し、５０μｌのＤＮＡ溶液（ネズミ1匹あたり、１００μｌ）を、大腿直筋に、1日目、２１日目、および４９日目に、それぞれ一製剤ずつ二側注射した。０日（接種前採血）、２０日（採血１）、４１日（採血２）、６２日（採血３）、および注射後４０週まで、ネズミを出血させ血清を採取する。プラスミドＤＮＡ群によりコードされる多様なＩＶタンパク質に対する抗体力価を、本明細書の他の箇所で説明しているようにＥＬＩＳＡにより測定する。
【０３３５】
細胞溶解性のＴ−細胞性応答を、Hartikka et al."Vaxfectin Enhances the Humoral Response to Plasmid DNA-encoded Antigens," Vaccine 19:1911-1923 (2001)（この文献は、参考として本明細書にそのまま組み入れられている）に説明されているように、測定する。実施例６のパートＡに説明しているように、標準ELISPOT 技術を使って、CD4+ および CD8+ Ｔ−細胞アッセイを行う。
【０３３６】
D.  動物におけるＮＰ、Ｍ１あるいはＭ２抗血清の生産
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、上記の予防接種スキームに従って調製し、適切な動物に注射し、ポリクロナール抗体を作る。血清を採取し、力価を上記のように測定する。
【０３３７】
ハイブリドーマ技術を用いて、モノクロナール抗体も生産する(Kohler、et al.、Nature 256:495 (1975)；Kohler、et al.、Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler、et al.、Eur. J. Immunol. 6:292 (1976)；Hammerling、et al.、in Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas、Elsevier、N.Y.、(1981)、pp. 563-681、これらの文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる)。一般的に、そのような手順は、上記のように動物（好ましくは、ネズミ）に対し予防接種を行うことに関連する。そのようなネズミの脾細胞を抽出し、適切な骨髄腫細胞ラインに融合する。いかなる適切な骨髄腫細胞ラインも本発明に従って使用してよいが、親髄腫細胞ライン(SP2O)（メリーランド州ロックビル市のAmerican Type Culture Collectionから入手可能）を使用するのが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞を選択的にＨＡＴ培地で維持し、次にWands et al.、Gastroenterology 80:225-232 (1981)（この文献は参照により本明細書にその全体を組み入れられる）に説明されているようにクローニングする。そのような選択を経て得られたハイブリドーマ細胞に対し、次に、アッセイを行い、多様なＩＶタンパク質を結合する能力のある抗体を分泌するクローンを特定する。
【０３３８】
あるいはまた、本発明で説明しているＩＶタンパク質に結合する能力のある付加的な抗体を、抗イディオタイプ抗体を使用して２段階の手続きで、生産してもよい。そのような方法は、抗体自体が抗原であるという事実、さらに、それゆえ、第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能であるという事実を利用している。この方法に従って、多様なＩＶ特異性抗体を用いて、動物（好ましくは、ネズミ）に予防接種をする。次に、そのような動物の脾細胞を用いて、ハイブリドーマ細胞を生産し、さらに得られたハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＩＶタンパク質特異性抗体に結合するその抗体の能力が同族ＩＶタンパク質によりブロックすることができるような抗体を生産するクローンを特定する。そのような抗体は、ＩＶタンパク質特異性抗体に対する抗イディオタイプ抗体から成り、さらなるＩＶタンパク質特異性抗体の形成を誘導することを目的として、動物に対し予防接種を施すのに使用することができる。
【０３３９】
本発明の抗体群のFab および F(ab')2 さらにその他の断片を、本明細書で開示している方法群に従って使用してよいということが深く理解されるであろう。そのような断片は、一般的に、タンパク質分解性の開裂により、（Fab断片生産するためには）パパインおよび（F(ab')2断片を生産するためにはペプシン）などの酵素を用いて、生産される。あるいはまた、NP、M1、M2、HA および eM2結合断片は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、あるいは合成化学を用いて、生産することができる。
【０３４０】
「ヒト化した」キメラモロクロナール抗体を使うことが好ましいかもしれない。そのような抗体は、上記のモロクロナール抗体を生産するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子の構築物を用いて生産することができる。キメラ抗体を生産する方法群は、当該技術分野において公知である（そのような方法群を閲覧するには、Morrison、Science 229:1202 (1985)；Oi、et al.、BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly、et al.、U.S. Patent No. 4、816、567；Taniguchi、et al.、EP 171496; Morrison、et al.、EP 173494; Neuberger、et al.、WO 8601533；Robinson、et al.、WO 8702671；Boulianne、et al.、Nature 312:643 (1984)；Neuberger、et al.、Nature 314:268 (1985)を参照せよ）。
【０３４１】
これらの抗体を、例えば、診断のためのアッセイで、研究用試薬として、あるいはまたＩＶタンパク質特異性の抗イディオタイプの抗体を作る目的で、使用する。非限定的な抗ＩＶ抗体に使用例には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（競合、サンドイッチ、および直接吸着）、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法、放射性免疫検定法、免疫沈澱法、凝集法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、およびエピトープマッピング法が含まれる（Weir、D. Ed. Handbook of Experimental Immunology、4th ed. Vols. I and II、Blackwell Scientific Publications (1986))。
【０３４２】
（実施例７）
粘膜接種および電気的補助プラスミド投与
A.  ＤＮＡの粘膜接種
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を（総ＤＮＡ濃度１００μｇ／５０ μｌ）、BALB/c ネズミに、０週、2週、および4週に、筋肉内（i.m.）、  鼻腔内(i.n.)、静脈内 (i.v.)、膣内(i.vag.)、直腸内(i.r.)、あるいは経口の投与経路で投与する。ＤＮＡは、カチオン脂質類DMRIE/DOPE (DD) または GAP-DLRIE/DOPE (GD)と混合してあるはまた混合しないで、投与する。エンドポイントとして、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、脾性のＴ−細胞性応答をIFN-ガンマ およびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイで測定する。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。テトラマー検査を使って、抗原特異性を持つＴ−細胞を検知し定量する。この場合、定量の確認および表現型の特徴は、細胞内サイトカイン染色で行う。さらに、多様なＩＶ抗原に対するIgG および IgA 反応を、膣洗浄液のＥＬＩＳＡで分析する。
【０３４３】
B.  電気的補助プラスミド投与 
ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子投与を、電気的パルスを注入組織に短時間印加することにより高めてもよく、この手続きを本明細書で電気的補助プラスミド投与と呼ぶ（例えば、Aihara、H. & Miyazaki、J. Nat. Biotechnol. 16:867-70 (1998)；Mir、L.M. et al.、Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:4262-67 (1999)；Hartikka、J. et al.、Mol. Ther. 4:407-15 (2001)；および Mir、L.M. et al.; Rizzuto、G. et al.、Hum Gene Ther 11:1891-900 (2000)；Widera、G. et al、J. of Immuno. 164: 4635-4640 (2000)を参照せよ）。細胞電気易透化法[cell electropermeabilization]を行うために電気パルスを使用することが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外部のＤＮＡを原核細胞および真核細胞に導入することを目的として行われてきた。細胞の易透化は、細胞の生存と矛盾しない電極および最適電気パラメータを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで局所的に行うことができる。
【０３４４】
多様な電気泳動装置を用いて、電気泳動法を行うことができる。これらの装置には、外付けプレート型電極および侵入性の針型あるいは棒型電極があり、１個のアレーに２個あるいは多数の電極を有していてよい。プレートと針型電極の間の距離は、電極の数、対象域のサイズ、治療を施す被験体により異なっていてよい。
【０３４５】
本明細書で説明している実施例で使用しているTriGridニードルアレーは、ほぼ幾何学的三角形の形をした部分にある３個の延長電極から成る３電極アレーである。ニードルアレーは、多様なアレー形成において、１本、２本、３本、４本、５本、6本、あるいはそれ以上の針を含む。電極は、導電ケーブルを通して、電源に接続した高圧スイッチング装置に接続している。
【０３４６】
電極アレーを、核酸注射部位の周辺の筋肉組織内に、約３ｍｍから３ｃｍの深さに、設置する。挿入の深度は、対象組織および電気泳動を施す被験体のサイズによって、異なる。プラスミドＤＮＡのような外部の核酸を注射した後、当該核酸が分布するのに充分な時間を置き、方形波の電気的パルスを当該組織に印加する。パルスの振幅は、約１００ボルトから約１５００ボルトの範囲で、電極間の距離に基づいて、例えば、約 １００ ボルト、約 ２００ ボルト、約 ３００ ボルト、約 ４００ ボルト、約 ５００ ボルト、約 ６００ ボルト、約 ７００ ボルト、約 ８００ ボルト、約 ９００ ボルト、約 １０００ ボルト、約 １１００ ボルト、約 １２００ ボルト、約 １３００ ボルト、約 １４００ ボルト、あるいは約 １５００ ボルト あるいは約 １ｋＶ／ｃｍから１．５ｋＶ／ｃｍである。それぞれのパルスの長さは、約 １μｓ から約１０００μｓの範囲であり、例えば、約 １μｓ、約 １０μｓ、約 ５０μｓ、約 １００μｓ、約 ２００μｓ、約 ３００μｓ、約 ４００μｓ、約 ５００μｓ、約 ６００μｓ、約 ７００μs、約 ８００μs、約 ９００μs、あるいは約 １０００μs、さらに約 １Ｈｚから１０Ｈｚのパルス周波数である。パルスの極性を、電気泳動処理中に、コネクタをパルス発生器に切り替えることにより、逆転してよい。パルスは多数回数繰り返される。電気泳動パラメータ（例えば、電圧振幅、パルスの長さ、パルスの数、電極挿入深度、および周波数）は、対象組織の種類、使用電極数、および電極間の距離に基づきことなるが、このことは当業者には理解されているであろう。
【０３４７】
パルスを用いた治療計画終了直後に、電気泳動を施した被験体を、任意に、細胞膜の易透化を延長させることを目的として、細胞膜安定剤で治療してもよい。細胞膜安定剤の例には、ステロイド（例えば、デキサメタソン、メチルプレドニゾン、およびプロゲステロン）、アンジオテンシンII およびビタミンＥが含まれるが、それらに限定されるものではない。デキサメタソンを、体重１キログラム当たり０．１ｍｇの投与量で単回投与すれば、望む効果を得るに充分であろう。
【０３４８】
電気泳動法などのＥＡＰＤテクニックを、リポソーム製剤に含まれているプラスミドにも使用することができる。リポソーム−プラスミド懸濁液を動物あるいは患者に投与し、注射部位を安全だが効果のある電界を例えばTriGridニードルアレーなどで発生させ治療する。電気泳動法により、リポソーム二重層を不安定化し、それによりリポソームと対象細胞構造との間の細胞膜融合を起こすことにより、細胞へのプラスミド投与を補助することができる。電気泳動法はまた、プラスミドの放出を、高濃度で、対象細胞の表面に存在するリポソームから誘導し、電気泳動法の結果として、プラスミドが濃度勾配のため細胞膜に作られた穴を経て細胞膜を超えて運ばれることにより、細胞へのプラスミド投与を補助することができる。
【０３４９】
週齢８週間から１０週間のメスのBALB/c ネズミを吸入イソフルランで麻酔し、電気泳動プロシージャ中麻酔下に維持した。ネズミの脚を、処置を施す前に剃った。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、BALB/c ネズミ（ｎ＝１０）の大腿四頭筋に、一側注射により、ネズミ1匹当たりプラスミドＤＮＡ25 μgの総量で、０．３ｃｃインシュリンシリンジおよび注射深度を制御するためのプラスチックカラーに装着した２６ゲージ、針長１／２の針を用いて、投与する。注射後約1分経った時点で、電極を適用する。修正キャリパー電極を用い、電気的パルスを印加する（Hartikka J. et al. Mol Ther 188:407-415 (2001)を参照せよ）。当該キャリパー電極プレートは、導電ゲルで被覆してあり、パルスを印加するために必要である３ｍｍの隙間を狭くする前に注射した筋肉の両側にあてがう。方形波のパルス型を、１Ｈｚから１０Ｈｚの周波数で、また電界強度については、１００Ｖ／ｃｍから５００Ｖ／ｃｍの振幅、１パルスから１０パルスの回数、１０ｍｓから１００ｍｓの時間的長さで、ＥＡＰＤを適用する。
【０３５０】
０週、2週、および4週時に（± EAPD）、ネズミに予防接種をする。多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、脾性のＴ−細胞性応答をIFN-ガンマ およびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイで測定する。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。
【０３５１】
ウサギ（ｎ＝３）の大腿四頭筋に、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、二側注射した。埋め込み部分の毛を剃り、当該筋肉の対象領域にTriGrid 電極アレーを埋め込む。３．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、電極アレーの注射ポートから投与量毎に投与する。注射器の口金を使って、注射の深度を制御する。プラスミドＤＮＡの注入が完了してから約1分後に、電気泳動を開始する。電気泳動は、TriGridニードルアレーを用い、電極間の距離を等しく７ｍｍに保ち、Ichor TGP-2パルス発生器を使用して、行う。当該アレーを対象の筋肉に、約１ｃｍから２ｃｍの深さで、挿入する。４パルスから8パルスを印加する。それぞれのパルスの時間的長さは約５０μｓから１００μｓ、振幅は約１ｋＶ／ｃｍから２ｋＶ／ｃｍ、さらにパルス周波数は１Ｈｚである。注入および電気泳動は、繰り返してもよい。
【０３５２】
抗血清を、あらゆる時点でワクチン接種したウサギから採取する。エンドポイントで、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡおよびＰＢＭＣ  Ｔ−細胞増殖反応で測定する。
【０３５３】
ヒト以外の霊長目における治療目的のタンパク質発現に及ぼす電気泳動の効果を調べるために、雌雄のアカゲザルに、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物（動物一頭あたり０．１ｍｇから１０ｍｇの総ＤＮＡ量）を、２回あるいは６回の筋肉内経路で投与した。対象筋肉群には、二側の大腿直筋、頭蓋骨筋、二頭筋、腓腹筋または三角筋が含まれるが、それらに限定されるものではない。対象部分の毛を剃り、０．５ｃｍから１．５ｃｍの間隔をおいて設置した４個から１０個の電極から成るニードルアレーを対象筋肉に埋め込む。注入が完了したら、Ichor TGP-2パルス発生器を使用して、対象筋肉に埋め込んだ電極に、一連の電気的パルスを短時間印加する。印加パルスの振幅は、約１２０Ｖから２００Ｖである。パルスシーケンスは、一秒以内に完了する。この間、対象筋肉は、多少収縮あるいは攣縮するかもしれない。注入および電気泳動は、繰り返してもよい。
【０３５４】
抗血清を、あらゆる時点でワクチン接種したサルから採取する。エンドポイントで、多様なＩＶ抗原に対する血清IgG 力価をＥＬＩＳＡで測定し、さらにＰＢＭＣ  Ｔ−細胞増殖反応をIFN-ガンマおよびIL-4の抗原特異性生産によりELISPOTアッセイあるいはテトラマー検査で測定し、抗原特異性を持つＴ−細胞を検知し定量する。この場合、定量の確認および表現型の特徴は、細胞内サイトカイン染色で行う。標準クロミウム放出法を使って、多様なＩＶ抗原に対する特異性を持つ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を測定する。
【０３５５】
（実施例８）
異種プライム−ブーストワクチン接種を用いた組み合わせＤＮＡワクチン
この例は、組み合わせ製剤を用いたワクチン接種について説明している。当該組み合わせ製剤は、ＩＶタンパク質またはその断片、変異体、あるいは誘導体をコードする１個のコドン最適化コード領域から成るひとつまたはそれ以上のポリヌクレオチド（アジュバント及び／又は形質移入促進剤を混合して調製してある）および単離ＩＶポリペプチド、又はその断片、変異体若しくは誘導体から成る。従って、抗原は二つの形態で提供される。この外因性の単離タンパク質は、抗原特異性を持つ抗体およびCD4+ Ｔ−細胞性応答を刺激し、一方でポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質（コード領域の細胞への取り込みおよび発現の結果として生産される）は、CD8+ Ｔ−細胞性応答を刺激する。従来の「プライム−ブースト」ワクチン接種戦略とは異なり、このアプローチは抗原の異なった形態を同一の製剤において提供するものである。ＤＮＡワクチンに由来する抗原発現のピークは注射後7日から１０日経なければ現れないので、ＤＮＡワクチンはタンパク質構成要素にブーストを提供する。さらに、当該製剤は、細菌性プラスミドＤＮＡの免疫刺激特性を利用している。
【０３５６】
A.  非コドン最適化ＮＰ遺伝子
この例は、ＮＰをコードする非コドン最適化ポリヌクレオチドを用いて、このプロシージャの効用を実証しているが、本明細書で説明している方法群はいかなるＩＶポリヌクレオチドワクチン製剤にも応用可能である。この方法では少量のタンパク質しか必要でないので、当該アプローチを従来のワクチンの投与量を減じる目的で使用することができると考えられ、従って、品不足で高価なワクチンの入手可能性を高める。この特徴は、パンデミックインフルエンザあるいは生物兵器については特に重要である。
【０３５７】
主としてUlmer、J.B.、et al.、Science 259:1745-49 (1993) およびUlmer、J.B. et al.、J Virol. 72:5648-53 (1998)に説明されているように調製したネズミ1匹あたり１０μｇのインフルエンザA/PR/8/34核タンパク質（ＮＰ）ＤＮＡ注射用投与量が、用量-反応関係についての研究において、用量-反応関係の直線範囲において、Ｔ−細胞および抗体応答を誘導するということが予備判断され、注射したネズミの９５％以上に反応率が見られたという結果が得られた。それぞれの製剤（ＮＰ  ＤＮＡ単独、あるいはRibi I またはカチオン脂質 DMRIE：DOPE あるいはVaxfectinTMを混合して製剤化したＮＰ  ＤＮＡ +/-ＮＰタンパク質）を、当該ワクチンモダリティーに推奨されている緩衝液で調製した。ＮＰ  ＤＮＡをカチオン脂質と混合した注射剤については、ＤＮＡを2XPBSで希釈し０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に、また+/-精製組み合わせＮＰタンパク質（実施例２に説明したようにバキュロウイルスにおいて生産される）は０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度にした。それぞれのカチオン脂質は、注射剤用滅菌水（ＳＷＦＩ）を１ｍｌそれぞれのバイアルに加え、ボルテックスミキサーを用いて2分間連続して混練し、さらにＳＷＦＩを用いて最終濃度の0.15 mMまで希釈することにより、乾燥膜から再作製した。同量のＮＰ  ＤＮＡ（+/-ＮＰタンパク質）とカチオン脂質を混合し、ＤＮＡ対カチオン脂質の分子比率を４：１にした。Ribi I アジュバント（Sigma社）を含むＤＮＡ注射剤については、Ribi I を、生理食塩水を用いて、最終濃度の二倍に再作製した。Ribi I (2X)を、同量の、生理食塩水に溶解した0.2 mg/ml の濃度のNP DNA 、0.08 mg/mlの濃度の+/- NP タンパク質 と混合した。カチオン脂質またはRibi を含まない接種については、NP DNA を、150 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で調製する。それぞれの実験において、一群に9匹のメスのBALB/c ネズミ（7週から9週の週齢）に、NP DNA +/- NP タンパク質、カチオン脂質またはRibiを５０μL注射した。 注射剤を、０日および２１日に大腿直筋に二側投与した。２０日および３３日に、ネズミをOSPにより出血させ、個々のネズミの血清力価を測定した。
【０３５８】
ＮＰ特異性血清抗体力価を、間接結合ＥＬＩＳＡ法により、定量した。当該ＥＬＩＳＡ法は、BBS緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解した１ウェルあたり0.5 μgの精製組み換えＮＰタンパク質で４oCの温度で一晩被覆した、ウェルが９６個あるＥＬＩＳＡプレートを用いて、行った。ＮＰで被覆したウェルを、室温にて１時間、ＢＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。ブロッキング緩衝液に溶解した抗血清の２倍連続希釈液を、室温で２時間培養し、アルカリフォスファタ−ゼによりコンジュゲートした（ＡＰ）ヤギ抗ネズミIgG-Fc（ペンシルバニア州ウェストグローブ市のJackson Immunoresearch社製）と共に１：５０００の比率で室温で２時間培養することにより検査した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および1 mM MgCl2に溶解した１ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスフェイト （カリフォルニア州ラ・ホヤ市のCalbiochem社）により発色させ、その吸光度は４０５ｎｍであった。力価は、ワクチン接種前血液検査検体の吸光度の2倍の吸光度を呈した最終希釈液の相関値である。
【０３５９】
標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査 に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。スクリーニング検査では、それぞれの群から3匹のネズミを３４日、３５日、および３６日に、堵殺した。採取時には、それぞれの群から採取した脾臓を集め、加圧型細胞破砕装置を用い、細胞培養培地で単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を溶解し、細胞を洗浄し、数を数えた。CD4+ およびCD8+の検査を行うために、ウェル当たり106個の細胞から始めて、細胞を３倍に連続希釈し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの９６個のウェル（抗ネズミIFN-γモノクロナール抗体で事前に被覆してある）に移る。CD8+ アッセイのためには、１μｇ／ｍｌの濃度のH-2Kd 結合ペプチド、すなわちTYQRTRALV (SEQ ID NO:81)をおよび１Ｕ／ｍｌの濃度の組み替えネズミIL-2 用いて脾臓細胞を刺激し、CD4+ アッセイのためには、２０μｇ／ｍｌの濃度の精製組み換えＮＰタンパク質を用いて、脾臓細胞を刺激した。37oC 、5% CO2の条件下で２０時間から２４時間、細胞を刺激し、その後当該細胞を洗浄し、室温で２時間の培養を経てビオチン標識抗IFN-γモノクロナール抗体を加えた。プレートを洗浄し、ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識アビジンを加えた。室温で１時間培養した後、ＡＥＣ基質を加え、「スポット」を15分間形成させた。免疫スポット用スポット自動カウンター（オハイオ州クリーブランド市のC.T.L. Inc.製）を用いて、形成されたスポットの数を数えた。このように、CD4+ およびCD8+反応は、連続した３日のそれぞれの日に採取した脾臓を用いて、３個の別々のアッセイで測定する。
【０３６０】
一回の注射の後3週間経った時点で、精製タンパク質を含むワクチン製剤を投与したネズミにおける抗体応答は、ＮＰＤＮＡを単独で投与したネズミの抗体応答より、６倍から８倍高かった（図５、表１５）。カチオン脂質を混合して製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価は、Ribi アジュバントに混合したタンパク質あるいはRibi アジュバントに混合したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価に類似していた。これらのデータにより、アジュバントと混合してタンパク質を注射した場合に観察される抗体レベルを、カチオン脂質を混合して（従来のアジュバントを加えずに）製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を含むＤＮＡワクチンで得られるということがわかる。
【０３６１】
二回目の注射の後12日経った時点で、精製タンパク質を含むワクチン製剤を投与したネズミの抗体応答は、ＮＰ  ＤＮＡだけを投与したネズミの抗体応答に比べて９倍から１２９倍高かった（図６、表１５）。３３日における抗ＮＰ抗体力価７５０、９３３の平均を取ると、VaxfectinTMに混合して製剤化したＤＮＡおよびタンパク質を投与したネズミの力価は、ＤＮＡを単独で投与したネズミの力価（平均力価＝３０、５７８）に比べて２５倍高く、さらにRibi アジュバントに混合したタンパク質を投与したネズミの力価（平均力価＝１、７４８、１３３）と同程度に高かった。
【表１４】
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【０３６２】
予測どおり、ＮＰ特異性CD8+ Ｔ−細胞IFN-γ反応は、Ribiに混合したＮＰタンパク質を投与したネズミの脾臓には検知されなかった（図７）。その他の全群では、ＮＰ特異性CD8+ Ｔ−細胞性応答が検知された。ＮＰタンパク質を含むワクチン製剤を投与した全群のCD8+ Ｔ−細胞性応答は、相互に統計学的に相違がなかった。
【０３６３】
全群のネズミに、ＮＰ特異性CD4+ Ｔ−細胞性応答が検知された（図８）。ＮＰ  ＤＮＡおよびＮＰタンパク質をカチオン脂質と混合して製剤化したワクチン製剤を投与した群から採取した脾細胞のCD4+ Ｔ−細胞性応答は、ＤＮＡ単独投与群に比べて、２倍から６倍高かった。
【０３６４】
B.  コドン最適化ＩＶ構築物
ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、およびｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするヒトコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物；及び／又はその他のＩＶタンパク質、またはそれらの断片、変異体、あるいは誘導体を単独でまたはＨＢｃＡｇなどのような担体タンパク質との融合タンパク質としてコードするその他のコドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物を、本明細書で説明しているプライム−ブースト組成物で使用する。プライム−ブーストモダリティーとしては、同一タンパク質（例えば、ＮＰタンパク質を伴った、ＮＰをコードするＤＮＡ）をブーストに用いてもよいし、また異種のブースト（例えば、Ｍ１タンパク質ブーストを伴った、ＮＰをコードするＤＮＡ）を用いてもよい。それぞれの製剤化については、ＩＶタンパク質のみをコードするコード領域から成るプラスミド、あるいはＩＶタンパク質に加えて単離タンパク質をコードするコード領域から成るプラスミドを、それぞれRibi I またはカチオン脂質 DMRIE：DOPE あるいはVaxfectinTMを混合して製剤化する。当該ワクチンモダリティーに推奨されている緩衝液を用いて、当該製剤を調製する。例示的製剤は、ＮＰをその一例として、本明細書に説明してある。その他のプラスミド／タンパク質製剤（多価製剤を含む）は、この例に従って、当業者により容易に調製可能である。カチオン脂質を混合して製剤化したＤＮＡの注射剤については、ＤＮＡを2X PBS を用いて、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度に、+/- 精製組み換えＮＰタンパク質を０．０８ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。それぞれのカチオン脂質は、注射剤用滅菌水（ＳＷＦＩ）を１ｍｌそれぞれのバイアルに加え、ボルテックスミキサーを用いて2分間連続して混練し、さらにＳＷＦＩを用いて最終濃度の0.15 mMまで希釈することにより、乾燥膜から再作製した。同量のＮＰ  ＤＮＡ（+/-ＮＰタンパク質）とカチオン脂質を混合し、ＤＮＡ対カチオン脂質の分子比率を４：１にした。Ribi I アジュバント（Sigma社）を含むＤＮＡ注射剤については、Ribi I を、生理食塩水を用いて、最終濃度の二倍に再作製した。Ribi I (2X)を、同量の、生理食塩水に溶解した0.2 mg/ml の濃度のNP DNA 、0.08 mg/mlの濃度の+/- NP タンパク質 と混合した。カチオン脂質またはRibi を含まない接種については、NP DNA を、150 mM リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で調製する。それぞれの実験において、一群に9匹のメスのBALB/c ネズミ（7週から9週の週齢）に、NP DNA +/- NP タンパク質、カチオン脂質またはRibiを５０μL注射した。 注射剤を、０日および２１日にBALB/c ネズミ（ｎ＝１０）の大腿直筋に二側投与した。
【０３６５】
２０日および３３日に、ネズミを出血させ、個々のネズミの多様なＩＶ抗原に対する血清力価を測定した。多様なＩＶ抗原に特異的な血清抗体力価を、ＥＬＩＳＡ法により、定量した。標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、それぞれのワクチン接種群から3匹ずつ取ったネズミ（接種後３４日、３５日、および３６日に堵殺したもの）を用いて、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査 に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。
【０３６６】
（実施例９）
インフルエンザのネズミ攻撃モデル
一般的な実験手続き 
Ａ型インフルエンザを用いたネズミ攻撃モデルを使用して、当該免疫療法の効用をテストする。このモデルは、Ulmer、J.B.、et al.、Science 259:1745-49 (1993) およびUlmer、J.B. et al.、J Virol. 72:5648-53 (1998)に説明されているモデルに基づき、これらの文献は本明細書に参照によりその全体を組み入れられる。このモデルはＡ型インフルエンザ/HK/8/68のネズミ適応菌株を使用しており、この菌株はネズミの肺で複製しMadin Darby Canine Kidney 細胞における組織培養で力価を測定する。このネズミ適応インフルエンザウィルスのLD90を、週齢１３週から１５週のメスのBALB/cねずみで定量する。このモデルにおいては、２種類の攻撃研究を行うことができる：致死攻撃（ケタミン麻酔による深い鎮静状態にあるネズミに、ウィルスを鼻腔内投与する）；および亜致死攻撃（ウィルス性接種物を接種する時点でネズミは麻酔されていない；投与経路はやはり鼻腔内である）。致死攻撃のエンドポイントは、生存であるが、身体質量の減および体温もモニターしてもよい。亜致死攻撃のデータには、肺ウィルス力価、身体質量の減および体温が含まれる。
【０３６７】
本明細書で説明している研究においては、ネズミを致死攻撃に晒す。ＩＶ抗原をコードするＤＮＡを用いて先にワクチン接種したネズミに麻酔をかけ、０．２％ｗｔ／ｖｏｌBSAを含むPBSを用いて１から１０，０００（５００PFU）に希釈したネズミ適応Ａ型インフルエンザ/HK/8/68（ネズミパッセージ＃６）の鼻腔内投与により攻撃する。
【０３６８】
これらの攻撃研究では、一群当たり１０匹のネズミから成る群を使用している。投与経路は大腿直筋（大腿四頭筋）への筋肉内投与で、プラスミドＤＮＡ総量は０．１μｇから１ｍｇであった。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、単独で、または多価カクテルの形態で、攻撃に対するその保護能力につき、テストする。当該プラスミドを、アジュバント及び／又は形質移入促進剤（例えばVaxfectinTM）を用いて、本明細書の他の箇所で説明している方法により、製剤化する。０日および２１日に、実施例６で説明している量のプラスミドを用いて、ネズミにワクチン接種をする。後続の注射剤を投与してよい。ネズミの鼻腔内攻撃を最終接種後3週間後に起こし、動物を身体質量、低体温、一般外貌、さらに死亡につき毎日観察する。
【０３６９】
研究対象のネズミの各群につき、2回目の注射の後及び／又はいかなる後続の注射の後2週間目に採血し、さらに最終の注射の後2週間目に最終採血をする。先に説明したように、抗体力価をＭ２、Ｍ１、およびＮＰにつき、ＥＬＩＳＡ法により定量する。
【０３７０】
プラスミド
上記のように、本発明の構築物を、発現ベクターVR10551に挿入した。VR10551は、いかなる導入遺伝子の挿入もされていない発現ベクターである。
【０３７１】
VR4750 は、ネズミ適応A/Hong Kong/68に由来するヘマグルチニン (HA) (H3N2)のコード配列を含む。ＤＮＡをQiagen製のプラスミド精製キットを用いて調製した。
【０３７２】
実験手続き
以下に示す例の実験手続きは、上に説明してあり、使用する特殊なパラメータおよび材料も本明細書に説明してある。ネズミインフルエンザ攻撃モデルにおける保護につきｐＤＮＡ対照を提供するために、インフルエンザA/HK/8/68 攻撃ウィルスストックからヘマグルチニン(HA) 遺伝子をクローニングし、それをネズミで６回パッセージングした。
【０３７３】
３週間の間隔をおいて2回、１００μｇのネズミ適応インフルエンザA/HK/8/68 菌株から直接クローニングしたHA遺伝子をコードするpDNA VR4750、あるいは１００μｇのブランクベクターpDNA (VR10551)を用いて、ネズミにワクチン接種した。もうひとつ別の対照群に、生A/HK/8/68ウィルス(500 PFU)を用いて、鼻腔内投与でワクチン接種した。最終注射後３週間を経た時点で、ネズミ適応インフルエンザA/HK/8/68の３種類の投与量のうち（５０、５００、５，０００  ＰＦＵ）１種類の投与量を用いて、鼻腔内投与でネズミを攻撃した。ウィルス攻撃後、ネズミを疾患症状、身体質量、さらに死亡につき毎日観察した。
【０３７４】
図９は、同種のHA-pDNAでワクチン接種したネズミが、攻撃後３週間の期間に、多様な投与量のウィルス攻撃から完全に保護されており（図９Ａ）、また体重減少を蒙らなかったということを示している。
【０３７５】
これらの結果に基づき、将来のネズミインフルエンザ研究には、VR4750 (HA) pDNA を保護の陽性対照として含め、攻撃投与量として500 PFU（これは、このネズミ適応ウィルスのLD90である）を用いてよい。
【０３７６】
（実施例１０）
ヒト以外の霊長目における攻撃
これらの研究の目的は、ヒト以外の霊長目における免疫原性につき、３個あるいはそれ以上の最適プラスミドＤＮＡワクチン製剤を評価することである。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、アカゲザルまたはカニクイザル（一群あたり６匹）に、筋肉内経路で、０．１ｍｇ から２ｍｇのDNAをカチオン脂質、及び／又はポロキサマー及び／又はリン酸アルミニウム系のまたはその他のアジュバントと組み合わせて、０ヶ月目、１ヶ月目、および4ヶ月目に、ワクチン接種する。
【０３７７】
ベースラインの採血を二回行い、その後接種時毎にまた毎回の接種後２週間目に、さらに最終接種後4ヶ月目に、採血する。接種後２週間目に、本明細書で説明している標準方法群により、体液性応答を調べるためプラズマを分析し、細胞性応答を調べるためにPBMCsを観察する。最終接種後4ヶ月目に動物をモニターし、免疫応答の持続性を判断する。
【０３７８】
最終接種後２週間から４週間以内に、動物を攻撃する。予備の攻撃研究に基づき、攻撃は、適切な投与量を用いて気管内経路で行う。鼻をぬぐった綿棒、咽頭をぬぐった綿棒、および肺の洗浄液を、攻撃後０日、２日、４日、６日、８日、および１１日に採取し、サル腎臓細胞につき細胞を含まないウィルス力価を調べる。攻撃後、臨床症状（直腸温度、体重、白血球数、ヘマトクリット、および呼吸速度）につき、動物を観察する。口咽頭をぬぐった綿棒の検体を採取し、ウィルス排出の期間を決定する。Berendt & Hall (Infect Immun 16:476-479 (1977))により考案されたシステムを使って疾病に点数を付け、分散分析および最小有意差を使って分析する。
【０３７９】
（実施例１１）
トリにおける攻撃
この例では、本発明の多様なワクチン製剤を、ニワトリインフルエンザモデルでテストする。これらの研究では、トリに感染するとして知られているIV H5N1 ウィルスを使用する。ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、ｅＭ２、及び／又はｅＭ２−ＮＰ融合タンパク質をコードするコドン最適化および非コドン最適化コード領域から成るプラスミド構築物、あるいはまた多様なＩＶタンパク質、又はその断片、変異体若しくは誘導体を単独で、あるいはそれらの担体タンパク質（ＨＢｃＡｇ）または多様な対照（空ベクター）との融合タンパク質をコードする（コドン最適化あるいは非コドン最適化）コード領域から成るプラスミド構築物を、カチオン脂質、及び／又はポロキサマー及び／又はリン酸アルミニウム系のまたはその他のアジュバントと組み合わせて製剤化する。ワクチン製剤を、約１μｇから１０μｇの投与量で、筋肉内経路で羽をむしった胸部に、０ヶ月目および１ヶ月目に、投与する。二回目の接種後３週間目に抗体結果を調べるため、トリから採血する。多様なＩＶ抗原に対する抗体力価を、文献に説明されているテクニックを用いて定量する（例えば、Kodihalli S. et al.、Vaccine 18:2592-9 (2000)を参照せよ）。２回目の接種後３週間目に、１００ LD50を含む０．１ｍL を用いて鼻腔内経路で、トリを攻撃する。疾患症状（食欲減退、下痢、顔面の脹れ、チアノーゼ、麻痺、および死亡を含む）につき、１０日間にわたり、トリを観察する。ウィルス滴定のため、気管および排出腔をぬぐった綿棒を攻撃後4日目に採取する。
【０３８０】
（実施例１２）
製剤選択研究
多様なワクチン製剤群の力価を、インフルエンザA/PR/8/34のＮＰタンパク質を用いた多様な実験で評価した。
【０３８１】
ワクチン接種投与計画
一群あたり９匹から成る６週から８週の週齢のBALB/cネズミ（Harlan-Sprague-Dawley社）の群に、プラスミドＤＮＡを二側（一本の脚当たり５０μL）筋肉内注射した。対照のネズミには、ＰＢＳに溶解したＤＮＡを単独で投与した。ネズミへの注射は、０日目、２０日目、および４９日目に行った。ネズミをＯＳＰにより６２日目に出血させ、ＮＰ特異性抗体をＥＬＩＳＡ法により分析した。脾細胞を一日当たり一群当たり３匹のネズミから６３日目に開始して３日間連続shして採取し、ＮＰ特異性Ｔ−細胞をIFNγ ELISPOT 法により重複ペプチド刺激を用いて分析した。
【０３８２】
細胞培養培地
脾細胞培養を、25 mM HEPES 緩衝液およびＬ−グルタミンを含むRPMI-1640 培地を用いて行い、さらに10% (v/v) FBS、55 ｍＭ ベータ-メルカプトエタノール、100 U/mLの ペニシリンGナトリウム塩、および100 μg/mL の硫酸ストレプトマイシンにより補足した。
【０３８３】
標準インフルエンザＮＰ間接結合アッセイ
ＮＰ特異性血清抗体力価を、間接結合ＥＬＩＳＡ法により、定量した。当該ＥＬＩＳＡ法は、BBS緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解した１ウェルあたり0.5 μgの精製組み換えＮＰタンパク質で４oCの温度で一晩被覆した、ウェルが９６個あるＥＬＩＳＡプレートを用いて、行った。ＮＰで被覆したウェルを、室温にて１時間、ＢＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングした。ブロッキング緩衝液に溶解した抗血清の２倍連続希釈液を、室温で２時間培養し、アルカリフォスファタ−ゼによりコンジュゲートした（ＡＰ）ヤギ抗ネズミIgG-Fc（ペンシルバニア州ウェストグローブ市のJackson Immunoresearch社製）と共に１：５０００の比率で室温で２時間培養することにより検査した。５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および1 mM MgCl2に溶解した１ｍｇ／ｍｌパラニトロフェニルホスフェイト （カリフォルニア州ラ・ホヤ市のCalbiochem社）により発色させ、その吸光度は４０５ｎｍであった。力価は、ワクチン接種前血液検査検体の吸光度の2倍の吸光度を呈した最終希釈液の相関値である。
【０３８４】
標準ＮＰCD8+ およびCD4+ Ｔ−細胞ELISPOT アッセイ
標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーを、CD4+ およびCD8+Ｔ−細胞検査に使用した。この標準ＥＬＩＳＰＯＴテクノロジーは、特異性を持つ抗原を用いて刺激した後にインターフェロンガンマ(IFN-γ)分泌細胞の数（脾細胞百万当たりのスポット形成細胞で、SFU/millionと表される）を特定するのに用いる。それぞれの群から3匹のネズミを、連続した３日間のそれぞれの日に、堵殺した。採取時には、それぞれの群から採取した脾臓を集め、加圧型細胞破砕装置を用い、細胞培養培地で単一細胞懸濁液を作製した。赤血球を溶解し、細胞を洗浄し、数を数えた。CD4+ およびCD8+の検査を行うために、ウェル当たり106個の細胞から始めて、細胞を３倍に連続希釈し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの９６個のウェル（抗ネズミIFN-γモノクロナール抗体で事前に被覆してある）に移る。CD8+ アッセイのためには、１μｇ／ｍｌの濃度のH-2Kd 結合ペプチド、すなわちTYQRTRALV (SEQ ID NO:81)をおよび１Ｕ／ｍｌの濃度の組み替えネズミIL-2 用いて脾臓細胞を刺激し、CD4+ アッセイのためには、２０μｇ／ｍｌの濃度の精製組み換えＮＰタンパク質を用いて、脾臓細胞を刺激した。37oC 、5% CO2の条件下で２０時間から２４時間、細胞を刺激し、その後当該細胞を洗浄し、室温で２時間の培養を経てビオチン標識抗IFN-γモノクロナール抗体を加えた。プレートを洗浄し、ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識アビジンを加えた。室温で１時間培養した後、ＡＥＣ基質を加え、「スポット」を15分間形成させた。免疫スポット用スポット自動カウンター（オハイオ州クリーブランド市のC.T.L. Inc.製）を用いて、形成されたスポットの数を数えた。
【０３８５】
実験１
この実験の目的は、裸のpDNA (VR4700)に対する投与量反応およびVF-P1205-02Aを加えて製剤化したpDNAについての投与量反応を判断することであった。VR4700は、VR10551バックボーンにおいてインフルエンザA/PR/8/34核タンパク質(NP)をコードするプラスミドである。VR10551は、いかなる導入遺伝子の挿入もされていない発現ベクターである。VF-P1205-02A は、ＰＯＰ分子量が１２ＫＤａでありＰＯＥが５％(CRL1005)であるポロキサマーを含む製剤であり、そのＤＮＡ対ポロキサマー対ＢＡＫの比率が５ｍｇ／ｍｌ：７．５ｍｇ／ｍｌ：０．３ｍＭである。この実験の結果を下記の表に示す： 
【表１５】
2008505660.tif 000393
【０３８６】
この実験の結果により、ＤＮＡの投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。ＤＮＡをポロキサマーおよびＢＡＫを混合して製剤化した場合、投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まる。
【０３８７】
実験２
この実験の目的は、pDNA (VR4700)投与量を固定してＢＡＫを加えなかった場合のCRL1005に対する投与量反応を判断することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１６】
2008505660.tif 000394
【０３８８】
この実験の結果により、CRL1005の投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３８９】
実験３
この実験の目的は、DMRIE：DOPE （１：１、モル：モル）を含むカチオン脂質製剤とVaxfectinTMを含むカチオン脂質製剤との免疫応答を、異なったpDNA/カチオン脂質分子比につき、比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１７】
2008505660.tif 000395
【０３９０】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPE またはVaxfectinTMと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３９１】
実験４
この実験の目的は、第一に、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１であるDMRIE：DOPE （１：１、モル：モル）の免疫応答を、ＭＬＶ（多層小胞製剤−マルチバイアル）あるいはＳＵＶ（単層小胞−シングルバイアル）製剤として、比較することであった。第二には、スクロース系製剤（凍結乾燥形態）とＰＢＳ系製剤を比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１８】
2008505660.tif 000396
【０３９２】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPEと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激するということがわかる。
【０３９３】
実験５
この実験の目的は、第一に、DMRIE 対DOPEの比率を変えることが、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１である場合の免疫応答に対し、ＭＬＶ（多層小胞製剤−マルチバイアル）あるいはＳＵＶ（単層小胞−シングルバイアル）製剤として、どのような効果を及ぼすかを判断することであった。第二には、共脂質をDOPEからコレステロールに変えることの効果を比較することであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表１９】
2008505660.tif 000397
【０３９４】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPEと混合して製剤化すると、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激するということがわかる。共脂質をDOPEからコレステロールに変えることもまた、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方を刺激する。
【０３９５】
実験６
この実験の目的は、pDNA/カチオン脂質分子比が４：１になるようにDMRIE：DOPE (１：１、モル：モル)を混合して製剤化したpDNAに対する投与量反応を得ることであった。この実験の結果を下記の表に示す：
【表２０】
2008505660.tif 000398
【０３９６】
この実験の結果により、プラスミドをDMRIE：DOPE またはVaxfectinTMと混合して製剤化した場合に、投与量を増やすと、体液性媒介の免疫応答および細胞媒介の免疫応答の双方が高まるということがわかる。
【０３９７】
（実施例１３）
インフルエンザ抗原のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現
プラスミドベクター
本発明のポリヌクレオチドを、真核発現ベクターバックボーンVR10551、VR10682 およびVR6430に挿入した（これらのベクターバックボーンはすべて先に説明した）。VR10551ベクターは、修飾pUC18のバックグラウンドに構築されており（ Yanisch-Perron、C.、 et al. Gene 33:103-119 (1985)を参照せよ）、カナマイシン耐性遺伝子、ヒトサイトメガロウィルス直近の初期１プロモータ／エンハンサー、およびイントロンA、ウシ成長ホルモン転写終結シグナル、および外部遺伝子挿入用ポリリンカーを含む（Hartikka、J.、et al.、Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996を参照せよ)。しかし、その他の標準市販真核発現ベクターを本発明で用いてもよく、その例には、pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2 （カリフォルニア州サンディエゴ市Invitrogenより入手可能）、およびpCI （ウィスコンシン州マディソン市のPromegaより入手可能）などのプラスミドが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０３９８】
多様なプラスミドを、以下のＡ型インフルエンザ抗原のヌクレオチド配列をクローニングすることにより作製した：セグメント７（ディファレンシャルスプライシング[differential splicing]によりＭ１およびＭ２の双方のタンパク質をコードする）、下記に説明しまた図１３に図示したような、発現構築にライゲーションするＭ２およびＮＰ。
【０３９９】
プラスミドPlasmids VR4756 (SEQ ID NO:91)、VR4759 (SEQ ID NO:92) およびVR4762 (SEQ ID NO:93) を、以下のＡ型インフルエンザ抗原のそれぞれについてのコンセンサス配列をコードするヌクレオチド配列をクローニングすることにより、作製した：セグメント７（ディファレンシャルスプライシング[differential splicing]によりＭ１およびＭ２の双方のタンパク質をコードする）、VR10551バックボーンにライゲーションするＭ２およびＮＰ。VR4756、VR4759 and VR4762プラスミドについては、表１３でも説明している。
【０４００】
VR4756 およびVR4762にそれぞれ由来するセグメント７およびＮＰコード領域をVR10682ベクターにライゲーションすることにより、VR4764 (SEQ ID NO:95) プラスミドおよび VR4765 (SEQ ID NO:96)プラスミドを構築した。具体的には、EcoRV および SalI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4756ベクターを消化し、平滑末端化した断片を、EcoRV制限エンドヌクレアーゼを用いて既に消化したVR10682バックボーンにライゲーションした。EcoRV および NotI を用いてVR4762 ベクターを消化し、ＮＰコード領域を、同一の制限エンドヌクレアーゼを用いて既に消化したVR10682のバックボーンにライゲーションすることにより、VR4765ベクターを構築した。
【０４０１】
VR4766 (SEQ ID NO:97) および VR4767 (SEQ ID NO:98)は、CMV プロモータ／イントロン A-NP 発現カセットおよび RSV プロモータ (VCL1005由来)-セグメント 7発現カセットを、同じ配向で(VR4766)、あるいは反対の配向で(VR4767)、含んでいる。DraIII制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4762を消化し、EcoRV およびBamHI制限エンドヌクレアーゼを用いてRSV-セグメント 7-mRBG カセットをVR4764から切り離すことにより、これらのプラスミドを作製した。ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片 [Klenow fragment]を用いてエキソヌクレアーゼ消化を行った後、Eco RV/BamHI 断片を、DraIII を用いて消化したVR4762にクローニングした。双方の挿入配向 を、このブラントエンドクローニング方法により、得た。
【０４０２】
CMV プロモータ／イントロンA-セグメント7 発現カセットおよびRSV プロモータ-NP発現カセットを含んでいるVR4768 (SEQ ID NO:99) および VR4769 (SEQ ID NO:100)を、類似した方法により得た。DraIII 制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4756を消化し、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用いた処理により平滑末端化した。RSV プロモータ、NPコード領域および mRBGターミネーターを含むカセットを、KpnI およびNdeI制限エンドヌクレアーゼを用い消化することによって、VR4765から除去した。断片もまた、ポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化し、DraIIIにより消化したVR4756ベクターに両方の遺伝子配向でライゲーションした。
【０４０３】
VR4756、VR4762 およびVR4759にそれぞれ由来するコード領域を、VR6430ベクターバックボーンにクローニングすることにより、VR4770 (SEQ ID NO:101)、VR4771 (SEQ ID NO:102) およびVR4772 (SEQ ID NO:103)を構築した。具体的には、VR4756に由来するセグメント７遺伝子を、SalI およびEcoRV制限エンドヌクレアーゼを用いて除去し、ＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化した。EcoRV および BamHI を用いてVR6430プラスミドを消化し、ベクターバックボーン断片をＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断片を用い平滑末端化した。セグメント７遺伝子を、次に、VR6430ベクターバックボーンにライゲーションした。EcoRV および BglII制限エンドヌクレアーゼによる消化に続いて、ＮＰ挿入片をVR4762から除去し、断片を、同一の制限エンドヌクレアーゼにより既に消化したVR6430ベクターバックボーンにライゲーションすることにより、VR4771を得た。VR4759に由来するＭ２コード領域を、平滑末端化したSalI-EcoRV断片としてサブクローニングし、平滑末端化したEcoRV-BamHI消化に由来するVR6430ベクターバックボーンにライゲーションすることにより、VR4772を得た。
【０４０４】
VR4773 (SEQ ID NO:104) およびVR4774 (SEQ ID NO:105) は、CMVプロモータ／イントロンA-セグメント 7 発現カセットおよびRSV/R-NP発現カセットを、同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。DraIII制限エンドヌクレアーゼによりVR4756を消化し、平滑末端化し、さらに、NdeI and SfiIにより消化および平滑末端化したVR4771に由来するRSV/R-NP-BGH断片にライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０５】
VR4775 (SEQ ID NO:106) およびVR4776 (SEQ ID NO:107) は、CMV プロモータ／イントロンA-NP発現カセットおよびRSV/R-セグメント 7発現カセットを同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。DraIII制限酵素を用いてVR4762を消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて平滑末端化することにより、これらのプラスミドを作製した。NdeI およびSfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4770を消化し、DraIII制限エンドヌクレアーゼにより消化したVR4762を用いて平滑末端化した断片をライゲーションすることにより、RSV/R-セグメント 7-BGH 断片を作製した。
【０４０６】
VR4777 (SEQ ID NO:108) およびVR4778 (SEQ ID NO:109)は、CMVプロモータ／イントロン A-NP発現カセットおよび RSV/R-M2発現カセットを同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。MscI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4762を消化し、NdeI およびSfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4772を消化し、RSV/R-M2-BGHをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理し、これらの2個のゲル精製断片をライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０７】
VR4779 およびVR4780は、CMV プロモータ／イントロン A-M2発現カセットおよびRSV/R-NP発現カセットを、同じ配向または反対の配向における遺伝子と共に含んでいる。MscI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4759を消化し、NdeI およびSfiI制限エンドヌクレアーゼを用いてVR4771を消化し、RSV/R-NP-BGH セグメントをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理し、これらの2個のゲル精製断片をライゲーションすることにより、これらのプラスミドを作製した。
【０４０８】
プラスミドＤＮＡ精製
プラスミドＤＮＡを、大腸菌DH5アルファコンピテント細胞に形質転換し、高度精製した共有結合で閉じた環状プラスミドＤＮＡを修飾細胞溶解法[modified lysis procedure]により単離し（Horn、N.A.、et al.、Hum. Gene Ther. 6:565-573 (1995)を参照せよ)、次に標準ＣｓＣｌ二本鎖臭化エチジウム平衡密度勾配遠心[standard double CsCl-ethidium bromide gradient ultracentrifugation]を行った（Sambrook、J.、et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York (1989)を参照せよ）。すべてのプラスミド調製は、ゲル分析およびビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ[bicinchoninic protein assay]により検知できる染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質不純物がない状態であった。エンドトキシンレベルは、アメリカ産カブトガニ血球抽出液エンドトキシン検出方法（リムルス試験）[Limulus Amebocyte Lysate assay] （マサチューセッツ州ファルマウス市のLAL、Associates of Cape Cod）を用いて測定され、その結果はプラスミドＤＮＡ１ｍｇあたり０．６エンドトキシンユニット未満であった。ＤＮＡ溶液のスペクトル光度A260/A280率の典型的数値は、１．８を超えていた。プラスミドを、エタノール沈殿し、適切な溶液（例えば、１５０ｍＭリン酸ナトリウム）を用いて再度懸濁する（その他の適切な賦形剤および補助剤については、２００２年２月１４日に公開されたアメリカ合衆国特許出願公開番号2002/0019358を参照せよ）。ＤＮＡを使用するまで、−２０°Ｃで保存した。ＤＮＡを、３００ｍＭ塩溶液と混合するかあるいは適切な量のＵＳＰ水を加えて希釈し、望ましい分子濃度の望ましい塩におけるプラスミドＤＮＡ１ｍｌあたり１ｍｇの濃度を得た。
【０４０９】
哺乳類細胞ラインにおけるプラスミド発現
発現プラスミドを、プラスミドを充分に特徴付けたネズミの黒腫（メラノマ）細胞ライン（VM-92またはUM-449として公知である）およびヒト横紋筋肉腫細胞ラインＲＤ（ATCC CCL-136）（双方ともヴァージニア州マナサス市のAmerican Type Culture Collectionより入手可能）に形質移入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。その他の充分に特徴付けたヒトの細胞ラインを用いてもよく、その例としては、ATCC アクセッション番号CCL-171のMRC-5 細胞が挙げられる。形質移入を、当業者に公知であるカチオン脂質に基づく形質移入方法を用いて行った。その他の形質移入方法が当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーションおよび塩化カルシウム媒介形質移入法 （Graham F.L.and A.J. van der Eb Virology 52:456-67 (1973)）を用いてもよい。形質移入後、形質移入細胞の細胞溶解産物および培養上澄みを評価し、ＩＶ抗原タンパク質の相対的発現レベルを比較した。検体を、市販のポリクロナールモノクロナール抗体（例えば、ニュージャージー州フランダース市のResearch Diagnostics Inc.より入手可能）を用いて、ウェスタンブロット法および 酵素免疫測定法（ELISA）により検査し、発現抗原の質と量を比較した。
【０４１０】
ＮＰ、Ｍ１、およびＭ２抗原について得たコンセンサスアミノ酸配列（上記）をコードする遺伝子を、いくつかのコンフィギュレーションにおいていくつかのプ菣릂菣覃菣꾂苣벃菣莃苣鲃菣뎃臣꾂菣벃菣뎃苣鞁臣芀䑰䅎뻧銂胣覽뷯₎隽뷯钽뷯辽駧뺏臣ꒁ臣蚃苣袃臣龁胣閁苣ꮁ胣鎽ꧨ炲乄꒾苣膀뷯躽†뷯覽뷯辽臣膀藥ꮖ軥Ꞁ胣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂铦莒臣覂菣몂菣銂뿤랭臣讂菨鮊臣ꒁ臣膀迧ꢜꧨꆾ룤ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ껥鎨볯㲑牢ਾ†볯醼臣袂臣궼볯ꮁ臣趁苣龃菣뢅苣뎃苣뎃苣릂藩鞈苣鞾臣貾胣ꦤ蓧꺁苣낂菣뎃菣鞼跥ꊛ觧貁臣꺁苣뎃苣뎃苣릂苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ臣辂臣ꎁ臣꺁臣膀臣꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣誸꣨꺁雦閳뻧ꮁ뻥ꎁ臣袐裦鞁臣芀볯銼裢궼볯趞郥몁볤邭苣鲽ꏨ鞁胣龮雦设볯꺁룤風苣覃菣肜臩隌苣ꮃ苣ꪃ苣ꂃ苣ꢔ臣ꚁ뷥늩菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣銃菣뎂菣뎃鳦ꦁ賥鞁臣芀胥薀臣ꢅ闩궼볯몁볤邭臣袂臣궼볯몁볤邭苣膀볯ꎼ볯閳臣袂苣鎁臣趞郥讁苣꾂菣벃菣뎃苣鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 내菨뚺꟨ꎔ觧ꮁ臣醁苣ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂諦龎臣覽뷯₎隽뷯钽뷯辽駧뺏苣膀菣몂菣꺁믩ꮅ볯ꆃ菣躃菣覼듧麃菣ꒂ菣ꮁ뷥ꪳ꟧ꖅ뻥㒌芙雩꺛臣閩뻤鞁臣芀剖㜴㘵⠠苣낂菣뎃菣㞈膀剖㜴㔵⠠㉍䴭‱黨袐 臣袂臣₳剖㜴㤵袼藥랕볯銼볯꺁뷥ꪳ꟧ꖅ뻥膀諦궼볯ꊃ菣꾂菣誃菣ꮃ諦鎽볯醼볯ꎼ볯覼苣ꢔ臣ꚁ晁楦楮祴䈠潩敒条湥獴ꧨ겖臣覂胣궼볯몙迧銂ꓦꖟ臣龁胣嚂㑒㔷‶臣袂臣嚳㑒㔷ꮁ臣蒁臣꺁菣벃苣銂胣뎛볯邼臣몤臣芀뷥ꪳ꟧ꖅ臣龁剖㜴㘵胣嚁㑒㔷‵臣袂臣嚳㑒㘷‰볯ꢅ闩궼볯覼瀠乄讁苣궼볯꺁駧뺏苣鲤鿧鞁臣芀뷥늩볯醼駧뺏臣膀剖㜴㘵誁苣뎁嘠㑒㔷ꮁ臣蒁臣뎛볯邼臣몤臣龁苣蚁臣膀諦궼볯ꊃ菣꾂菣誃菣ꮃ諦鎽볯厈牥瑯捥ꓧ覼苣ꢔ臣ꚁ胣芁苣蒁臣鞊볯醼菣꺂菣ꪃ苣궃菣벃菣袼楖潲瑳瑡ꓧ膀菣벃苣꾁ꓧ鞁臣蒁臣蒁볯銂铧蒁臣鲤鿧鞁臣芀剖〱㔵꾁ꧧ꺁苣궃菣讃菣낂菣꾂苣벃臣芁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖龮꣩銼戼㹲 ꎻ鯦꺁菣袃苣覃菣肜臩隌雦閳뻧銂꿦莼臣讂臣膂胣궼볯꺁鳦鶈臣銼볯讀臣ꊂ菣躃藩銂胣ꢅ闩꺼볯袼胣薽볯銼裢꺼볯趀볯ꮁ黨袐臣龁苣꺁苣銼胩誂꟦覯臣龁胣肸雦꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣誸꣨꺁苣覃菣肜臩隌苣ꮃ苣ꪃ苣ꂃ臣袂苣鞾胣隻雦꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈苣隤菩꺁ꗥ蒴ꗦ薀臣袂苣鲽ꏨ閁臣龁胣銼꣧麡臣薽볯銼裢꺼볯₰邽볯꺼볯꒾苣膀뷯躽†뷯覽뷯銽뷯ꞁ룦骮臣龁臣膀뷯躽†뷯覽뷯辽臣超雧龎胦꺁꿦莼臣뺏鳥늀ꇨ궸臣芁苣芀臣覂臣膀臣貂苣銼胩誂臣뎂菣뎃鳦ꦁ賥ꮁ雩馁苣ꢅ闩꺼볯몁볤邭뻧銂뷯궼볯銈볯낼†뷯꒼볯ꆼ뻧讁苣떂菣꾂菣벃菣뎃苣鞁胣覽뷯₎隽뷯钽뷯辽駧뺏臣ꒁ臣蚈黦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 誸꣨꺁苣覃菣肜臩隌苣ꮃ苣ꪃ苣ꂃ臣袂臣꺁ꓥꢃ臣醥듧궥胨꺁苣ꮃ苣ꪃ苣ꂃ臣놔鷦馁苣薽볯銼裢꺼볯₰邽볯꺼볯ꢁ볯낼†뷯꒼볯ꆼ苣钯볨馁苣龁苣ꮁ胣覽뷯₎隽뷯钽뷯辽駧뺏苣蚃苣袃臣龁胣鶁臣螃菣뾂苣膀鯥醼볯ꮁꓧ馁胣몙迧것菣ꮃ臣膀剖㜴㜵袼뷯궼볯銈볯낼ꗥ蒴ꗦ薀鳦ꦁ賥覼꿥嚾㑒㔷‸볯薽볯銼裢꺼볯몇ꇩ몺鳦ꦁ賥覼臣꺁雩ꞁ胣뮁臣貐臣ꞁ臣誂胣鞊볯銼菣躃苣궃菣벃菣鞊뷤袼鯥醼볯ꆼ볯芁苣蒁臣鞊볯낼菣몂菣鶃菣꾂菣誃菣ꮃ볯螃菣뾂臣몤臣ꚁ臣ꪁ臣覼臣袂苣鲤鿧鞁臣芀郥颧臣膀볯낼駧뺏臣膀剖㜴ㄶ袼ꗥ蒴ꗦ薀鳦ꦁ賥覼뺯剖㜴㈶袼蟥颡뫤肜臩隌볯ꢁ臣鎖臣膀臣벁귧鞁臣膀蟥颡뫤貁뷤붣臣龁諦꺼볯趃苣龃菣ꪃ苣궃菣벃菣袼鯥醼볯䊑볯ꮁ苣誂ꓦꖟ臣龁胣覽뷯₎隽뷯钽뷯辽臣꺁볯낼苣뎃苣뎃苣릂苣뎃菣꾂돨몙迧节胣ꢅㅈㅎ芁苣蒁臣₯㍈㉎Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ꿥鞁臣鲽ꏨ鞁臣ꒃ苣鶃菣꾂菣誃菣ꮃ諦鎽볯䚈瑩杺牥污뺤볯袼菣벃苣꾁ꓧ鞁臣蒁臣蒁볯銂铧蒁臣膀ꓦꖟ臣龁胣鎁苣覂臣꺼볯讧꿧ꦉ臣몙迧것菣ꮃ臣膀迥릖臣节⽁剐㌯‴偎⠠剖㜴〰銂郥肂䑰䅎ꮁ꿦릁臣膀臣讂臣ꮁꯩ讁臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ껥鎨볯㲓牢ਾ†苣뎃菣ꮃ苣뎃苣鞊軥銂苣벃菣馁苣鞃菣릂菣覃苣膀룤風臣릖돦꒾苣ꢔ臣ꚁ胣嚁㥍′듧麃臣ꊽ돨뮧藥鞁臣芀뷥ꪳ꟧ꖅ뻥㒌芙雩銂뗧龁駦릂臣膀듧麃뫦ꎧ铧ꦉ臣袂臣릟鳥銂軦随臣龁胣내菨銂볯邼볯캐貽臣䲮敡浭楬臣뚺꟨鞁胣내菨醱苣麃苣꾂菣ꂁ뿥颍鯩ꞁ駩뮎臣膀볯邼볎뷯銂臩놆臣㒗ㄭ┲鎃苣ⶹ菣ꪃ苣늂菣ꮁ菣벃菣鞁臣芀蚈돦꺼볯뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂臣貂苣꺁菣꾂苣벃臣몙迧銂껥辇臣讂臣膂臣膀㔱츠沼臣릟鳥銂‵볎궃菣螃苣뎃苣ꦷꇨ늶臣랷郥鞁胣躁蛧鞁苣ꮃ臣궃菣覃臣龁胣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃苣誸꣨꺁苣蚁臣ꚇ郧鞁臣芀룤龁苣鞊뷤꾁胣ꖻ룤ꞁ臣ꎁ臣骼㉍苣뎃菣꾂돨銂ꓦꖟ臣讂臣膂臣ꊃ菣꾂菣誃菣ꮃ諦鎽䅍ⴱ㠰′䄨剂ꓧ⦾胣䶁뾂菣醃苣ꪳ苣鲤鿧馁苣龁苣꺁菣躃苣궃菣벃菣鞊뷤䶓䅃〴‱볯厈牥瑯捥ꓧ覼胣誁苣뎁剖㜴㈶苣ꖎ꣧鞁臣Ꚃ苣꺂臣뺯臣讂菣ꪃ苣궃菣벃菣鞊뷤ꞁ蟥颡胨꺁ꓧ薆臣鲽ꏨ閁苣龁苣꺁胣뮸臣鞊뷤꾁胣醼볯閼볯邼룥袇軧ꞁ뷤ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯钼臣膀苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣꺁뗧鲞苣몤臣ꚁ臣誂胣鶁臣邵黦ꮁ苣讂臣膀苣낂菣뎃菣鞼裢뎂菣覃菣ꦃ苣龃菣ꮁ铧ꖝ臣讂볯銼苣뎃菣꾂돨꺁駧뺏臣膀剖㜴㐶⠠卒鞃菣ꊃ菣뾂ꮁ꿦릁臣膀䵃⁖菣궃菣벃苣⾿苣뎃菣궃菣₳ⵁ苣낂菣뎃菣₈‷嘨㑒㔷⤶誁苣뎁删噓刯뮂苣ꆃ菣袃볯ₗ嘨㑒㜷⤰臣ꒁ臣ꚁ胣颫臣ꎁ臣芀볯낼駧뺏臣ꒁ臣ꚁ臣膀卒⽖ⵒ偎瀠慬浳摩⠠剖㜴ㄷꮁ铧ꖝ臣讂駧뺏臣肜苣颫臣膀곦ꮁ䵃⽖湩牴湯䄠中⁐嘨㑒㘷⤲ꮁ铧ꖝ臣讂駧膀臣覂臣劫噓‭偎⠠剖㜴㔶 臣놔鷦馁苣몙迧꺁ꃩꞁ臣讂苣蚁臣鶀苣貂臣芀菣袃볯꒼뷥ꪳ꟧ꖅ듧麃臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣麡볤鞁臣邵黦貁ꛨ覂苣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†卒ⵖ苣낂菣뎃菣₈‷臣袂臣䎳噍ꒂ菣袃菣뎃䄠中⁐볯嚈㑒㘷‶臣袂臣嚳㑒㘷覼苣ꮐ苣螃菣ꊂ菣鞃菣ꊃ菣뾂菣ꦃ苣龃菣ꮁ臣蒁臣꾁胣뮂苣ꆃ菣袃볯ꮁ铧ꖝ臣讂볯銼駧뺏臣麝룥ꮁ뷤辁胣超郥ꮁ臣蒁臣겋ꯧ鞁臣蒁苣芀臣貂苣꺁菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣鞃菣릂菣覃臣誁臣讂䵃⽖苣뎃菣궃菣₳ⵁ偎몙迧꾁胣嚁㑒㘷ꢁ꿦릁臣芁臣誂臩蒁臣ꪁ臣芀菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣鞃菣릂菣覃볯嚈㑒㘷‸臣袂臣₳剖㜴㤶볯ꮁ臣醁苣劋噓中⁐駧뺏볯뮂苣ꆃ菣袃볯貁䵃⽖湩牴湯䄠讁苣몙迧馁苣覼臣ꒁ臣ꚁ臣膀볯낼駧뺏臣蒁臣覂臣许臣讂臣膀菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣嚿㑒㘷‶臣袂臣₳剖㜴㜶臣誁臣讂볯銼駧뺏臣ꦁ諥蒚臣꾁룤貁苣ꪁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯閼臣膀䵃鞃菣ꊃ菣뾂볯ꒂ菣袃菣뎃䄠胣劁噓鞃菣ꊃ菣뾂胣誁苣뎁卒⽖ⵒ郥覜菣ꦃ苣龃菣놔鷦꺁苣낂菣뎃菣鞼臣龁臣꺼볯놔鷦꺁ㅍ臣袂臣䶳꺁駧뺏苣ꢡ臣ꚁ臣讂胣鎁苣覂臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣ꒁ臣ꚁ꣨袁臣膀菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣鞃菣릂菣覃臣膀볯낼臣讂臣꾁苣낂菣뎃菣鞼臣ꦁ臣覂臣銂뷤開臣鮁苣䎋噍鞃菣ꊃ菣뾂볯ꒂ菣袃菣뎃䄠誁苣뎁卒⽖⁒苣ꮐ苣ꞁ臣讂胣銃菣늼볯ꊽ돨뮧藥내菨놔鷦꺁苣Ꞃ苣뾂菣隃菣莃菣ꮁꇩ벼臣龁뗧鲞臣讦苣貂臣芀㰊䥄㹖胣邼볯醼볯醀⼼䥄㹖 Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣邵黦ꮁ苣誂胣䎁噍鞃菣ꊃ菣뾂볯ꒂ菣袃菣뎃䄠뮂苣ꆃ菣袃볯ₗ볯嚈㑒㔷覼誁苣뎁卒⽖ⵒ苣낂菣뎃菣鞼袼剖㜴〷볯ꮁ铧ꖝ臣讂볯醼臣袂臣궼볯뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣劯噓뮂苣ꆃ菣袃㜠⠠剖㜴㐶袂苣ꪄ苣ꚁ臣讂臣蒁臣鎁臣貁ꋧ趪臣貂苣芀菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣鞃菣릂菣覃볯嚈㑒㜷膀剖㜴㐷胣嚁㑒㜷膀臣袂臣嚳㑒㜷覼臣誁臣ꚁ胣劁噓刯뮂苣ꆃ菣袃볯ₗ臣讂臣꾁䌠噍ꒂ菣袃菣뎃䄠뮂苣ꆃ菣袃볯銂䵃ꒂ菣袃菣뎃䄠中⁐臣讂臣꾁删噓刯中ꢁ뗧뾁郥辂臣讂臣膀볯醼臣袂臣궼볯몙迧꾁诨늹룤貁苣芀뗧鲞臣膀菣袃볯꒼뷥ꪳ꟧ꖅ듧麃铧ꖝ臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣麡볤鞁臣蒁臣芀菣ꦃ苣龃菣膀卒⽖ⵒ㉍袼剖㜴㈷볯誁苣뎁䵃⽖苣뎃菣궃菣₳ⵁ㉍袼剖㜴㤵볯銂苣벃菣馁苣䶋鞊軥銂뷥ꪳ꟧ꖅ臣龁菣袃볯꒼듧麃臣膀ꇩ벼臣龁菣馃菣꺁㉍駧뺏苣몤臣膀臣꺁駧뺏菣馃菣꾁菣ꖃ苣ꮃ菣궃菣벃苣鞃菣릂菣覃볯嚈㑒㜷膀剖㜴㠷胣嚁㑒㜷膀臣袂臣嚳㑒㠷覼臣꾁룤貁臣龁胣鞃菣릂菣覃胣嚁㑒㘷膀剖㜴ㄷ胣嚁㑒㜷膀剖㜴㠷胣嚁㑒㜷膀臣袂臣嚳㑒㠷銂苣벃菣馁苣꺼볯鞊軥ꮁ苣誂뷥ꪳ꟧ꖅ臣龁菣袃볯꒼듧麃臣膀臣릁臣麡볤鞁臣꺼볯몙迧것菣ꮃ苣몤臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ볯龮雦设볯钼볯㲉牢ਾ菣몂菣ꆼ黥ꒂ菣閃菣ꢂ菣뚂铦莒菣螃菣㲫牢ਾ†볯讞苣뎃菣ꮃ苣뎃苣뮔鋦ꊃ菣ꮃ苣膀菣몂菣ꦁ뿥䆜䠯⽋⼸㠶迨ꪠ苣ꢔ臣ꚁꋧ讫臣龁胣趃苣龃臩鲿䄠䠯湯⁧潋杮㘯‸䠨丳⤲誁苣뎁䄠倯敵瑲⁯楒潣㌯‴䠨丱⤱Ꚃ苣ꮃ苣ꮁ臣貂臣貂鯧ꖎ铧ꖝ臣讂볯ꆼ臩鶼귥꺁볯ꎼ볯ꮁ苣誂胣붙胦誁苣뎁駩Ꞁ꿥ꞅ臣颃菣낂菣膃菣뎃ꢼ볯⦡郥覜菣ꦃ苣龃菣銂뷤붣臣龁胣ં䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣릁臣꺁껥鎨臣ꒁ臣膀菣ꦃ苣龃菣꒼볯ꆼ뫤늘軦꺨苣邼胩讁苣鎼胩꺁鳦鎖臣貺臥꺁ꓥ뾅鯧训돦蒰臣財臣膀곦ꮁ볯놀鯧ꮁ鳧ꦪꇨ袄듦뾩裥宺牏楢慴⁬楓畮⁳畐据畴敲※协嵐蟥股苣財臣膀臣覂臣隼胩꺛臣Ꚃ苣ꮃ苣㖹〰瀠畦⠠‱䑌猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㤾㰰猯扵⤾苣ꢔ臣ꚁ볩钅蛥Ꚃ苣ꮃ苣뮔鋦銂ꇨ蚁胣Ꚃ苣ꮃ苣뮔鋦貾胣蒴볯놀雩ꮁ苣龁苣膀뷧ꎂ軧誁苣뎁뷤趇룦醰臣ꒁ臣膀菣몂菣銂ꛨ龯臣讂胣꺼볯誁苣뎁볯銼臣ꊖ臣讂苣뎃菣鶃苣뎃菣鞊뷤鮊뻤銂胣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ돦ꮁ苣誂껥辇臣讂胣钠ꧧ䞶䩓㠰臣ꒁ臣ꚁ臣膀룤ꚩ꣩꒾뷥龁苣閼賥꺁菣몂菣銂諥袁臣ꖎ꣧銂ꇨ蒁胣閼胩꺛臣ꒂ菣뾂菣閃苣궃菣銈돎䱅卉佐⁔苣莃苣ꒂ苣財臣龁胣ં䐼噉邀볯钼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