(57)【要約】  本発明は、多型蛋白質の対立遺伝子バリアントと特異に反応する抗体、同一のものを同定する方法、その中に含まれる抗原結合断片、同一のものをコードする核酸、同一のものを含む、蛋白質、細胞、ウイルス粒子、組成物、及びキットを提供する。本発明は、被験者のハプトグロビンタイプを決定する方法、糖尿病合併症に対する罹病性に関して被験者を試験する方法も提供する。
2008505654.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｐ２−１よりもＨｐ２−２に対して高い親和性をもって結合し、且つＨｐ１−１よりもＨｐ２−１に対して高い親和性をもって結合する、抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体。
【請求項２】
配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体。
【請求項３】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン抗体を含む組成物。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である、請求項４記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体。
【請求項６】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン抗体を含む細胞、パッケージ細胞系、又は組換えウイルス粒子。
【請求項７】
請求項６記載の細胞又はパッケージ細胞系を含む組成物。
【請求項８】
第２のハプトグロビンアイソフォームよりも第１のハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性をもって結合する抗−ハプトグロビン抗体の抗原結合断片。
【請求項９】
請求項８記載の抗原結合断片を含む組成物。
【請求項１０】
請求項８記載の抗原結合断片を含む抗体又は組換え蛋白質。
【請求項１１】
請求項１０記載の抗体又は組換え蛋白質を含む組成物。
【請求項１２】
抗体がヒト化されているか又はキメラである、請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１記載の抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
請求項８記載の抗原結合断片を含む細胞、パッケージ細胞系、又は組換えウイルス粒子。
【請求項１６】
請求項１５記載の細胞又はパッケージ細胞系を含む組成物。
【請求項１７】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１８】
請求項８記載の抗原結合断片をコードする単離された核酸。
【請求項１９】
被験者のハプトグロビンタイプを決定する方法であって、
ａ．被験者の生物学サンプルを抗−ハプトグロビン抗体に接触させ、そして
ｂ．定量測定から得られる値が生物学サンプル中のＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の存在に特有な条件下でハプトグロビン蛋白質と上記抗体の間の結合又は相互作用を定量測定すること
を含む方法。
【請求項２０】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
サブストレート上で工程（ａ）にて形成された請求項１記載のハプトグロビンと抗体の複合体を固定化することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
固定化されていない請求項１記載の抗体のフラクションを除去するために上記の固定化に続いて複合体を処理することをさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を請求項１記載の抗体の追加量と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と追加量の請求項１記載の抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を第２の抗−ハプトグロビン抗体と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗−ハプトグロビン抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
値が、リットルあたり約０．１５グラムからリットルあたり約２．５グラムの間のハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ２−２の存在に特徴的である、請求項１９記載の方法。
【請求項３０】
大多数のヒトにより呈されるハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ２−２の存在に特徴的である、請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
糖尿病合併症の罹病性に関して被験者を試験する方法であって、
ａ．被験者の生物学サンプルを抗−ハプトグロビン抗体に接触させ；そして
ｂ．定量測定から得られる値が生物学サンプル中のＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の存在に特有な条件下でハプトグロビン蛋白質と請求項１記載の抗体の間の結合又は相互作用を定量測定すること
を含み、それにより被験者のハプトグロビンタイプの決定をもたらす方法。
【請求項３２】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
サブストレート上で工程（ａ）にて形成された請求項１記載のハプトグロビンと抗体の複合体を固定化することをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
固定化されていない請求項１記載の抗体のフラクションを除去するために上記の固定化に続いて複合体を処理することをさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を請求項１記載の抗体の追加量と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と追加量の請求項１記載の抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を第２の抗−ハプトグロビン抗体と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗−ハプトグロビン抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
値が、リットルあたり約０．１５グラムからリットルあたり約２．５グラムの間のハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ２−２の存在に特徴的である、請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
大多数のヒトにより呈されるハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ２−２の存在に特徴的である、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
糖尿病合併症が、血管疾患、ネフロパシー、網膜症又は心臓血管疾患である、請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験する方法であって、
ａ．第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子と接触させ；
ｂ．第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−１分子と接触させ；
ｃ．第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子と接触させ；そして
ｄ．抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定するが、
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の各々の存在に特有な定量測定から得られる値が、抗体がＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２を識別することを示し、
それにより、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験すること
を含む方法。
【請求項４５】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
工程（ａ），（ｂ），又は（ｃ）において形成されたＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２と抗体又は組換え蛋白質の複合体をサブストレート上に固定化することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
固定化に続き、固定化されていない抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するように複合体を処理することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を抗体又は組換え蛋白質の追加量と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と追加量の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を第２の抗−ハプトグロビン抗体と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗−ハプトグロビン抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
異なるハプトグロビン濃度の範囲にわたり値を評価することをさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項５３】
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して試験抗体又は組換え蛋白質を試験する方法であって、
ａ．抗−ハプトグロビン抗体をサブストレート上に固定化することにより抗サブストレート複合体を形成し；
ｂ．第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子と接触させ；
ｃ．第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−１分子と接触させ；
ｄ．第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子と接触させ；そして
ｅ．工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）の生成物を試験抗体又は組換え蛋白質に接触させ；そして
ｆ．試験抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定し、
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の各々の存在に特有な定量測定から得られる値が、抗体がＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２を識別することを示し、
それにより、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して試験抗体又は組換え蛋白質を試験すること
を含む方法。
【請求項５４】
固定化されていない試験抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するように工程（ｂ），（ｃ），及び（ｄ）の生成物を処理することをさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１記載の抗体である、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
抗−ハプトグロビン抗体が請求項１０記載の抗体である、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
異なるハプトグロビン濃度の範囲にわたり値を評価することをさらに含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５８】
異なるハプトグロビンタイプと別々に相互作用する能力に関して複数の試験抗体をスクリーニングする方法であって、
ａ．複数の媒体を生成するが、各々が上記の複数の抗体からの抗体と抗体をコードする核酸を含み；
ｂ．複数の媒体を非固定化Ｈｐ１−１又はＨｐ２−１及びサブストレートの上に固定化されたＨｐ２−２と接触させ；
ｃ．上記の複数の媒体の一つからの核酸分子を、当該核酸分子によりコードされる抗体を発現する媒体へサブクローニングし；
ｄ．工程（ｂ）と（ｃ）を１回又は複数回繰り返し；そして
ｅ．サブストレート上に残った媒体中に存在する抗体又は核酸分子を同定し、
それにより異なるハプトグロビンタイプと別々に相互作用する能力に関して複数の試験抗体をスクリーニングすること
を含む方法。
【請求項５９】
複数の試験抗体がＨｐ２−２対立遺伝子を欠く動物中で生成される、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
媒体がファージ又はウイルスである、請求項５８記載の方法。
【請求項６１】
モノクローナル抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
工程（ｃ）のサブクローニングが異なるハプトグロビンタイプに特異的の相互作用する能力を有する抗体をコードする核酸分子の増幅をもたらす、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
生物学的サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別する方法であって、但し、当該２つの対立遺伝子バリアントはエピトープの多数のコピーにおいて異なり、
ａ．生物学サンプルを抗体又は組換え蛋白質に接触させるが、その際、抗体又は組換え蛋白質が多型蛋白質を結合し；そして
ｂ．２つの対立遺伝子バリアントの各々の存在が対立遺伝子バリアントの特性である定量的評価から得られた値をもたらす条件下で、多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を定量的に評価し、
それにより生物学的サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別すること
を含む方法。
【請求項６４】
抗体又は組換え蛋白質が対立遺伝子バリアントに特異に結合する、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
工程（ａ）において形成された多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の複合体をサブストレート上に固定化することをさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
固定化に続き、固定化されていない抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するように複合体を処理することをさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６８】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を抗体又は組換え蛋白質の追加量と接触させ；そして
ｂ．多型蛋白質と追加量の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を多型蛋白質を結合する第２の抗体又は組換え蛋白質と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項６７記載の方法。
【請求項７０】
第２の抗体又は組換え蛋白質が請求項６１記載の対立遺伝子バリアントを特異に結合する、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体を含むキット。
【請求項７２】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、請求項７１記載のキット。
【請求項７３】
請求項８記載の抗原結合断片を含むキット。
【請求項７４】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、請求項７３記載のキット。
【請求項７５】
請求項１９記載の方法を利用するキット。
【請求項７６】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、請求項７５記載のキット。
【請求項７７】
請求項３１記載の方法を利用するキット。
【請求項７８】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、請求項７７記載のキット。
【請求項７９】
請求項６３記載の方法を利用するキット。
【請求項８０】
エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、請求項７９記載のキット。
【請求項８１】
第２ハプトグロビンアイソフォームよりも第１ハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性をもって結合する抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体の相補決定領域。
【請求項８２】
請求項８１記載の相補決定領域を含む組成物。
【請求項８３】
請求項８１記載の相補決定領域を含む抗体又は組換え蛋白質。
【請求項８４】
請求項８３記載の抗体又は組換え蛋白質を含む組成物。
【請求項８５】
抗体がヒト化されているか又はキメラである、請求項８３記載の抗体。
【請求項８６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項８３記載の抗体。
【請求項８７】
モノクローナル抗体が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項８６記載の抗体。
【請求項８８】
請求項８１記載の相補決定領域を含む、細胞、パッケージ細胞系、又は組換えウイルス粒子。
【請求項８９】
請求項８８記載の細胞又はパッケージ細胞系を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［００１］本発明は、多型蛋白質の対立遺伝子バリアントと別々に反応する抗体、同を同定する方法、その中に含まれる断片を結合する抗原、同をコードする核酸、同を含む、蛋白質、細胞、ウイルス粒子、組成物、及びキットを提供する。発明は、被験者のハプトグロビンタイプを決定する方法及び糖尿病の合併症に対する罹病性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）に関して被験者を試験する方法も提供する。
発明の背景
［００２］１６ｑ２２のハプトグロビン遺伝子座は多型であり、１及び２として記された対立遺伝子の２つの公知のクラスを伴う［Ｌａｎｇｌｏｉｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１５８９−１６００，１９９６］。多型は確かによくあることであり、２つの対立遺伝子の全世界の頻度はほぼ等しい。ハプトグロビンは複数の長期的で代表的な集団研究において糖尿病の血管の合併症の発症のための主要な影響を受けやすい遺伝子である［Ｌｅｖｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：９６９−７０，２０００；Ｒｏｇｕｉｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄ  ８７：３３０−２，２００１］。ハプトグロビン２（Ｈｐ２）対立遺伝子の糖尿病の個々の同型接合体、ハプトグロビン１対立遺伝子（Ｈｐ１）の糖尿病の個々の同型接合体に比較して、心臓血管病を発症するリスクが５倍高く、中間のリスクが異型接合体に存在する［Ｌｅｖｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄ  ４０：１９８４−９０，２００２］。Ｈｐ１とＨｐ２の対立遺伝子の精製された蛋白質産物を用いた機械的研究は、抗酸化活性及び免疫変調活性において意味のある違いを同定した［Ｆｒａｎｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ；９８：３６９３−８，２００１；Ａｓｌｅｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９２：１１９３−２００，２００３］。
［００３］機能上の違い並びに構造上の違いが様々なハプトグロビン対立遺伝子の蛋白質産物の間に存在する［Ｌａｎｇｌｏｉｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４２：１５８９−１６００，１９９６］。Ｈｐ２対立遺伝子はＨｐ１対立遺伝子のエクソン３と４のコピーを２つ有し、エクソン３のマルチマー化ドメインの複製をもたらす。結果的に、Ｈｐ１対立遺伝子蛋白質産物はダイマーのみを形成するが、Ｈｐ２対立遺伝子蛋白質産物は組合わさって３つのモノマー以上のサイズの範囲の環状ポリマーを形成する。異型接合体においては、直鎖状ポリマーが両方の対立遺伝子蛋白質産物を含んで存在する。
［００４］ハプトグロビンを分類するための抗体に基づくＥＬＩＳＡ試験の開発は、何れかの対立遺伝子蛋白質産物に独特の抗原決定基の明白な欠如により妨害されてきた。エクソン３の複製の部位の単一のジャンクションとは別に、ハプトグロビン対立遺伝子間に一次アミノ酸配列上の違いはない。最適な治療を確定するためにそれらハプトグロビンタイプに関しての糖尿病個々の（西側の世界（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｗｏｒｌｄ）の１０％）大きな集団をスクリーニングすることの要求並びに特定の集団を迅速にスクリーニングすることの要求を仮定すると、単純で迅速で安価なハプトグロビン分類試験に関する多大な要求が存在する。
【０００２】
発明の概要
［００５］一つの態様において、本発明は、Ｈｐ２−１に対してよりもＨｐ２−２に対して高い親和性を伴い、且つＨｐ１−１に対してよりもＨｐ２−１に対して高い親和性を伴って結合する抗ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体を提供する。一つの態様において、上記の抗体は、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有してよい。
［００６］別の態様において、本発明は、第２のハプトグロビンアイソフォームよりも第１のハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性を伴って結合する抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体の抗原結合断片を提供する。別の態様において、本発明は、抗原結合断片を含む抗体又は組換え蛋白質を提供する。一つの態様において、抗体はモノクローナルであってよい。別の態様において、抗体は、ポリクローナルであってよい。別の態様において、抗体はヒト化されるか又はキメラであってよい。別の態様において、抗体はｓｃＦｖ抗体であってよい。
［００７］別の態様において、本発明は、本発明のあらゆる抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のあらゆる抗原−結合断片をコードする単離された核酸を提供する。
［００８］別の態様において、本発明は、被験者のハプトグロビンタイプを決定する方法を提供し、（ａ）被験者の生物学サンプルを抗−ハプトグロビン抗体に接触させ、そして（ｂ）定量測定から得られる値が生物学サンプル中のＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の存在に特有な条件下でハプトグロビン蛋白質と上記抗体の間の結合又は相互作用を定量測定することを含む。
［００９］別の態様において、本発明のあらゆる方法は、糖尿病の合併症に対する罹病性に関して被験者を試験するのに利用してよい。
［０１０］別の態様において、本発明は、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験する方法を提供し、（ａ）第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子と接触させ；（ｂ）第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−１分子と接触させ；（ｃ）第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子と接触させ；そして（ｄ）抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定し、それによりＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の各々の存在に特有な定量測定から得られる値が、抗体がＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２を識別することを示すことを含む。
［０１１］別の態様において、本発明は、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験する方法を提供し、（ａ）抗−ハプトグロビン抗体をサブストレート上に固定化して抗体サブストレート複合体を形成し；（ｂ）第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子と接触させ；（ｃ）第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−１分子と接触させ；（ｄ）第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子と接触させ；（ｅ）工程（ｂ），（ｃ）、及び（ｄ）の生成物を、試験抗体又は組換え蛋白質と接触させ；そして（ｅ）試験抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定し；それによりＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の各々の存在に特有なことを定量測定することから得られる値が、試験抗体がＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２を識別することを示すことを含む。
［００１２］別の態様において、本発明は、異なるハプトグロビンタイプと別々に相互作用する能力に関して複数の試験抗体をスクリーニングする方法を提供し、（ａ）複数の媒体を生成するが、各々が上記の複数の抗体からの抗体と抗体をコードする核酸を含み；（ｂ）複数の媒体を非固定化Ｈｐ１−１又はＨｐ２−１及びサブストレートの上に固定化されたＨｐ２−２と接触させ；（ｃ）上記の複数の媒体の一つからの核酸分子を、当該核酸分子によりコードされる抗体を発現する媒体へサブクローニングし；（ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）を１回又は複数回繰り返し；そして（ｅ）サブストレート上に残った媒体中に存在する抗体又は核酸分子を同定することを含む。
［００１３］別の態様において、本発明は、生物学サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントの間を識別する方法を提供し、但し、２つの対立遺伝子バリアントはエピトープのコピー数に違いがあり、（ａ）生物学サンプルを抗体又は組換え蛋白質と接触させるが、その際、抗体又は組換え蛋白質は上記多型蛋白質に結合し；そして（ｂ）多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を定量的に評価するが、２つの対立遺伝子バリアントの各々の存在が対立遺伝子バリアントに特有な定量評価から得られた値をもたらすような条件下で評価することを含む。
【０００３】
発明の詳細な説明
［００２０］一つの態様において、本発明は、Ｈｐ２−１に対してよりもＨｐ２−２に対して高い親和性を伴い、且つＨｐ１−１に対してよりもＨｐ２−１に対して高い親和性を伴って結合する抗ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体を提供する。Ｈｐ２−２は、一つの態様において、Ｈｐ２を含むがＨｐ１を含まないハプトグロビンのポリマーを意味する。Ｈｐ２−１は、一つの態様において、Ｈｐ１とＨｐ２の両方を含むハプトグロビンのポリマーを意味する。Ｈｐ１−１は、一つの態様において、Ｈｐ１を含むがＨｐ２を含まないハプトグロビンのポリマーを意味する。一つの態様において、上記の抗体は、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有してよい。
［００２１］一つの態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様において、本発明の抗体はポリクローナル抗体である。用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、一つの態様において、実質上均一な抗体の集団から得られた抗体を意味し、集団を含む個々の抗体は、マイナーな量で存在してよい潜在的に自然界に存在する変異体を除いて、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原性部位に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体はそれらがハイブリドーマ培養により合成できて他のイムノグロブリンにより汚染され得ない点で有利である。変異（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）「モノクローナル」は、抗体の実質上均一な集団から得られるものとして抗体の特性を示し、そして如何なる特定の方法によっても抗体の生産を必要とするものとして解釈されないべきである。例えば、本発明に従い用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してよいか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作成してよい。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｈｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離された抗原認識及び結合の部位を含む抗体断片（Ｆｖクローン）のクローンも含む。抗体の各種類は本発明の別々の態様を表す。
［００２２］本明細書に記載されたモノクローナル抗体は、抗体の可変（高可変を含む）ドメインを定常ドメインによりスプライスするか（例えば、「ヒト化された」抗体）又は軽鎖を重鎖でスプライスするか、又は一つの種由来の鎖を別の種由来の鎖でスプライスするか、又は外来蛋白質と融合させることにより生成したハイブリッド及び組換え抗体を、オリジンの種又はイムノグロブリンクラス又はサブクラスの名称並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，及びＦｖ）に拘わらず、それらが所望の生物活性を呈する限りにおいて、含む（例えば、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｌａｍｏｙｉ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。抗体の可変領域と定常領域は以下に記載される。各種類の抗体は本発明の別の態様を表す。
［００２３］本発明のモノクローナル抗体は、一つの態様において、「キメラ」抗体（イムノグロブリン）を含むが、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一か又は相同であり、一方、鎖の残りは、それらが所望の生物活性を呈する限り、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内並びにそのような抗体の断片内の対応する配列と同一か又は相同である（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８４）。各種類の抗体は本発明の別の態様を表す。
［００２４］非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」抗体は、特定のキメライムノグロブリン、イムノグロブリン鎖又はその断片（例えば、Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２，又は抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、非ヒトイムノグロブリン由来の最小の配列を含む。ほとんどの部分において、ヒト化抗体はヒトイムノグロブリンであり（レシピエントの抗体）、レシピエントの相補決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲ由来の残基により置換される。いくつかの例において、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも引き入れられたＣＤＲにも又はフレームワーク配列にも見いだされない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精錬して最大化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部又は実質上全てが非ヒトイムノグロブリンのそれらに相当し、そしてＦＲの全部又は実質上全てがヒトイムノグロブリンコンセンサス配列に相当する、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質上全てを含むことになる。ヒト化抗体は、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ），典型的にはヒトイムノグロブリンのそれを少なくとも一部含むことになる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，１９８６：Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３，１９９２）。
［００２５］天然の抗体は、約１５０，０００ドルトンのヘテロダイマー糖蛋白質であって、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖からなり、鎖内と鎖間のジスルフィドブリッジを共に含む。各重鎖は、一方のエンドに可変ドメイン（ＶＨ）、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方のエンドに可変ドメインを、そして他方のエンドに定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１定常ドメインと一直線に並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線に並ぶ。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の境界を形成すると信じられている（Ｃｌｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；Ｎｏｖｏｔｎｙ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
［００２６］用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が配列において抗体間で広範囲に異なる事実を意味し、そしてその特定の抗原に関して各特定の抗体の結合と特異性において用いられる。しかしながら、生存性は抗体の可変ドメインを通して等しく分配されていない。それは、軽鎖及び重鎖の両方において相補決定領域（ＣＤＲ）又は高可変領域と呼ばれる３つのセグメントに終結される（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの各々は、４つのＦＲ領域を含み、ベータシートの配置を大きく採用し、３つのＣＤＲｓにより接続されており、２０がループ接続を形成し、そしていくつかの場合にはベータシート構造の一部を形成する。各鎖の中のＣＤＲｓはＦＲ領域により密に近接して一緒になって結合し、そして他の鎖からのＣＤＲｓと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、ナショナルインスティチュートオブヘルス、ベセスダ、Ｍｄ，１９９１）。定常ドメインは抗体の抗原に対する結合に直接関与していないが、様々なエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害性における抗体の沈殿を呈する。
［００２８］抗体のパパイン消化は「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生じさせ、各々は単一の抗原結合部位、及びその名称がその結晶化を容易にする能力を反映する残基「Ｆｃ」断片を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、そしてなお抗原を架橋結合することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。各種類の抗体断片は本発明の別の態様を代表する。
［００２８］一つの態様において、発明の抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である。「Ｆｖ」は一つの態様において完全な抗原認識部位と結合部位を含む最小の抗体断片であり、「抗原結合断片」とも呼ばれる。２つの鎖Ｆｖ種においては、この領域が、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインのタイトな非共有結合したダイマーからなる。単鎖Ｆｖ種（ｓｃＦｖ）において、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖ドメインは、軽鎖と重鎖が２つの鎖のＦｖ種のそれに類似した「ダイマー」構造にて結合し得るように、柔軟性ペプチドリンカーにより共有結合し得る。この配置においては、各可変ドメインの３つのＣＤＲｓがＶＨ−ＶＬダイマーの表面上で抗原結合部位を規定するように相互作用する。まとめると、６つのＣＤＲｓが抗体に対する抗原結合特異性を授ける。しかしながら、単鎖可変ドメイン（又は抗原に関して特異的な３つのＣＤＲｓのみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識して結合する能力を有するが、完全な結合部位に比較すると親和性は低い。ｓｃＦｖに関する総説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編纂、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
［００２９］Ｆａｂ断片も軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’第１は、抗体のヒンジ領域から一つ又はそれより多くのシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基の追加がある点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’も本発明の態様を代表する。
［００３０］それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、イムノグロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。イムノグロブリンにはＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ１，及びＩｇＡ２に分類され得る。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、エプシロン、ｄｗｎａｒｗ，及びミューである。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニットの構造及び三次元の配置は、よく知られている。あらゆる脊椎種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種のうちの一つに割り当てることができる。抗体の各種類は本発明の別の態様を表す。
［００３１］本明細書にて使用される「抗体断片」及びその全ての文法上のバリアントは、完全な抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む完全な抗体の一部として規定され、但し、当該部分は完全な抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメインを含まない（即ち、ＣＨ２，ＣＨ３，及びＣＨ４，抗体アイソタイプに依存して）。抗体断片の例は、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，及びＦｖ断片；二重特異性抗体（小さな二価又は二重特異性の抗体断片のクラス；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０：６４４４−８，１９９３）；連続するアミノ酸の一つの中断しない配列からなる一次構造を有するポリペプチドのあらゆる抗体断片であって（本明細書においては「単鎖抗体断片」又は「単鎖ポリペプチド」と呼ぶ）、限定ではないが（１）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）連結する重鎖モイエティ無しの軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲｓを含むたった一つの軽鎖可変ドメイン又はその断片を含む単鎖ポリペプチド及び（３）連結する軽鎖モイエティの無しの重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲｓを含むたった一つの重鎖可変ドメイン又はその断片を含む単鎖ポリペプチドを含む；及び、抗体断片から形成される多重特異性又は多価の構造を含む。抗体のＣＤＲｓの決定方法は、当業界でよく知られており且つ例えば米国特許６，７５０，３２５及び６，６３２，９２６に記載されている。一つ又はそれより多くの重鎖を含む抗体断片において、重鎖は完全な抗体の非Ｆｃ領域に見いだされるあらゆる定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプ中のＣＨ１）を含むことができるか、及び／又は、完全な抗体に見いだされるあらゆるヒンジ領域配列を含むことができるか、及び／又は、重鎖のヒンジ領域配列又は定常ドメイン配列に融合されたか又は中に位置するロイシンジッパー配列を含むことができる。適当なロイシンジッパー配列は、Ｋｏｓｔｅｌｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９：１５４７−１５５３（１９９２）に教示されたｊｕｎ及びロイシンジッパーを含む。
［００３２］本明細書において使用される用語「抗体」は、一つの態様において、本発明の抗体又は抗体断片のあらゆる種、及び当業界公知の抗体又は抗体断片のあらゆる種を意味する。
［００３３］別の態様において、本発明は、第２ハプトグロビンアイソフォームよりも第１ハプトグロビンアイソフォームに対して大きな親和性をもって結合する抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体の抗原結合断片を提供する。別の態様において、本発明は、発明の抗−Ｈｐ抗体の抗原結合断片を含む抗体又は組換え蛋白質を提供する。別の態様において、本発明は、発明の抗−Ｈｐ抗体のＣＤＲを含む抗体又は組換え蛋白質を提供する。一つの態様において、当該抗体はモノクローナルであってよい。別の態様において、当該抗体はポリクローナルであってよい。別の態様において、当該抗体はヒト化されているかまたはキメラであってよい。別の態様において、当該抗体はｓｃＦｖ抗体であってよい。
［００３４］本発明は、本明細書において記載された抗体の抗体バリアントを包含する。抗体バリアントは、一つの態様において、親の抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗体を意味する。好ましくは、抗体バリアントは、天然には見いだされないアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含む。そのようなバリアントは必然的に親の抗体と１００％より低い配列同一性又は類似性を有する。一つの態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約７５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約７７％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約８０％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約８３％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約８５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約８７％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約９０％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約９２％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。別の態様において、抗体バリアントは、親抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメイン何れかのアミノ酸配列に約９７％のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有することになる。この配列に関する同一性又は類似性は、本明細書においては、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を並べて（ａｌｉｇｎｅｄ）必要ならギャップを導入した後に親抗体残基と同一の（即ち、同じ残基）候補配列中の後に残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中のＮ末端、Ｃ末端、又は内部伸長、欠失又は挿入の何れも配列同一性又は類似性に影響するものと解釈されるべきではない。抗体バリアントは、一般に、親抗体の対応する高可変性領域よりも長い高可変領域（一つ又はそれより多いアミノ酸残基だけ、例えば、約１から約３０アミノ酸残基、そして好ましくは約２から約１０アミノ酸残基だけ）を有するものである。
［００３５］「アミノ酸の変更（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」は、予め決定されたアミノ酸配列のアミノ酸配列内の変化を意味する。例示の変化は、挿入、置換及び欠失を含む。
［００３６］「アミノ酸挿入」は、予め決定されたアミノ酸配列への一つ又はそれより多いアミノ酸残基の導入を意味する。アミノ酸挿入は、ペプチド結合により連結した２つ又はそれより多いアミノ酸残基を含むペプチドが予め決定されたアミノ酸配列に導入される「ペプチド挿入」を含んでよい。アミノ酸挿入がペプチドの挿入の場合、挿入されたペプチドは、それが天然には存在しないアミノ酸配列を有するようにランダムな変異導入により生じてよい。
［００３７］挿入されたペプチド又は残基は、「天然に生じるアミノ酸残基」（即ち、遺伝コードによりコードされる）であってよく、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。
［００３８］一つ又はそれより多い非天然アミノ酸残基の挿入も本明細書においてはアミノ酸挿入の定義に包含される。「非天然アミノ酸残基」は、上に掲載された天然に生じるアミノ酸残基以外の残基を意味し、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基を共有結合することができる。非天然アミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されたものを含む。そのような非天然アミノ酸残基を生成するためには、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前出の手法を用いることができる。簡単に言えば、これらの手法は、非天然アミノ酸残基によりサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化することを含み、ＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳に続く。
［００３９］「高可変領域」内のアミノ酸挿入は、高可変領域アミノ酸配列内の一つ又はそれより多いアミノ酸残基の導入を意味する。
［００４０］「高可変領域に隣接する」アミノ酸挿入は、挿入されたアミノ酸残基の少なくとも一つが問題の高可変領域のＮ末端又はＣ末端アミノ酸残基とペプチド結合を形成するような、高可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端エンドにおける一つ又はそれより多いアミノ酸残基の導入を意味する。
［００４１］「アミノ酸置換」は、予め決定されたアミノ酸配列内の存在するアミノ酸残基の別のアミノ酸残基による置き換えを意味する。本明細書において記載されたあらゆる種類の抗体バリアントが本発明の別の態様を表す。
［００４２］本発明のあらゆるペプチドは、一つの態様において、単離され、合成により生成され、あらゆる変異導入技術に供される配列の翻訳により得て、並びに当業界公知のあらゆる蛋白質進化技術により得てよい。
［００４３］別の態様において、組換え蛋白質生産は、発明のペプチドが生産される手段である。組換え蛋白質は、次に、いくつかの態様において、生物に導入されてよい。当業界公知の蛋白質又はペプチドの生成方法は、本発明の別の態様を表す。
［００４４］抗体「結合親和性」は、平衡化方法（例えば、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））又はキネティクスにより測定してよい。抗体結合親和性を評価するための方法は当業界においてよく知られており、例えば、Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６９：２５７−７２，１９９４；Ｓｃｈｏｔｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０９：２２５，１９８８；及びＳｔｅｗａｒｄ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７２：９９−１０３，１９９１；及びＧａｒｃｉａ−Ｏｊｅｄａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２：３４５１−６０，２００４に記載されている。各技術は本発明の別の態様を表す。
［００４５］別の態様において、本発明は、本発明のあらゆる抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のあらゆる抗原結合断片をコードする単離された核酸を提供する。
［００４６］本発明の別の態様において、「核酸」は、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの糸（ｓｔｒｉｎｇ）を意味する。当該用語は、一つの態様において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。「ヌクレオチド」は、一つの態様において、核酸ポリマーのモノマーユニットを意味する。ＲＮＡはｔＲＮＡ（運搬ＲＮＡ）、ＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、小阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はリボザイムの形態であってよい。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの用途は記載されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６（２００２），Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６５：８５−１００（２００４），Ｐａｄｉｓｓｏｎ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９９：１４４３−８（２００２）及びそれらに引用された文献）。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡ又はこれらの群の誘導体の形態であってよい。さらに、これらの形態のＤＮＡ及びＲＮＡは、単鎖、二重鎖、三重鎖又は四重鎖であってよい。当該用語は、一つの態様において、他の種類のバックボーンを含むが同じ塩基を含んでよい人工の核酸も含む。人工の核酸の例は、ＰＮＡｓ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、及び天然核酸のリン酸バックボーンの他のバリアントである。ＰＮＡはペプチドバリアントとヌクレオチド塩基を含んでよく、そしてＤＮＡ及びＲＮＡ分子の療法に結合できてよい。ホスホロチオエート核酸及びＰＮＡの使用は当業界で知られており、そして例えばＮｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７（１９９９），Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ．，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：２３３−４８（２００４），Ｒｅｂｕｆｆａｔ  ＡＧ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６：１４２６−８（２００２），Ｉｎｕｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８１０９−１２（１９９７），Ｃｈａｓｔｙ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．２０：３９１−５（１９９６）及びそれらに引用されている文献；及びＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載されている。別の態様において、当該用語は、当業界で公知のあらゆる種類のＲＮＡ又はＤＮＡのあらゆる誘導体を含む。核酸の生産と用途は当業者に知られており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，編纂、（２００１）、及びＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００２１）Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，編纂に記載されている。各核酸誘導体は本発明の別の態様を表す。
［００４７］核酸は当業界で公知のあらゆる合成又は組換えプロセスにより生産され得る。核酸は、さらに、当業界で公知の技術により生物物理的又は生物学的な特性を変更するように修飾することができる。例えば、核酸は、ヌクレアーゼに対して安定性を増加させる（例えば、「エンドキャッピング」）か、又はその脂肪親和性、溶解性、又は相補配列に対する結合親和性を修飾するように修飾することができる。
［００４８］発明によるＤＮＡは。当業界で公知のあらゆる方法により化学的に合成することもできる。例えば、ＤＮＡは当業界で公知の方法により全部又は一部を４つのヌクレオチドから化学合成することができる。そのような方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：２８１−５（１９８５）に記載されたものを含む。ＤＮＡはオーバーラップする二重鎖オリゴヌクレオチドを用意し、ギャップをフィルインし、そしてエンドを共に連結することにより合成することもできる（一般には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｉｎｉｎｇ（同書）及びＧｌｏｖｅｒ  ＲＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ９：８９７−９０１，１９９５を参照）。当該蛋白質の機能的相同体を発現するＤＮＡは、野生型ＤＮＡから部位特異的変異導入（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ：Ａ．Ｍ．編纂、（１９９５）；及びＫｉｍ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．６６：１１９−２６（２００１）を参照）により調製することができる。得られたＤＮＡは当業界公知の方法により増幅することができる。一つの適切な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（同書）に記載されたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法である。これらの方法の各々は本発明の別の態様を表す。
［００４９］特定の目的を達成するための核酸を修飾する方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（同書）に開示されている。さらに、発明の核酸配列は目的の蛋白質に関して非コードのヌクレオチド配列の一つ又はそれより多くの部分を含み得る。点変異によるか又は誘導された修飾（挿入、欠失、及び置換を含む）により引き起こされてそれによりコードされるポリペプチドの活性、半減期又は生産を増強する当該ＤＮＡ配列のバリエーションも、発明に包含される。これらの方法及びバリエーションの各々は本発明の別の態様を表す。
［００５０］別の態様において、本発明は、この発明のあらゆる核酸を含むベクターを提供する。別の態様において、本発明は、この発明のあらゆる抗体、ペプチド、又は核酸を含む細胞又はパッケージング細胞系を提供する。一つの態様において、「ベクター」は、細胞内で挿入された核酸分子の発現を促進させる媒体を意味する。別の態様において、ベクターは、網状赤血球抽出物のような発現系において発現を促進させるかもしれない。ベクターは、一つの態様において、挿入された核酸以外の非コード核酸配列又はコーディング配列を含む核酸を含んでよい。
［００５１］当業界公知の多数のベクターがこの態様において用いられてよい。ベクターは、いくつかの態様において、適切な選択可能なマーカーを含んでよい。他の態様において、ベクターは、さらに複製オリジンを含んでよく、あるいは、シャトルベクターであってよく、細菌、例えばエシェリヒアコリの両方で増殖可能であり（ベクターは適切な選択可能なマーカー及び複製オリジンを含む）、あるいは脊椎細胞中での増殖又はえり抜きの生物のゲノム中での組み込みに適合可能である。本発明のこの側面によるベクターは、例えば、プラスミド、バクミッド（ｂａｃｍｉｄ）、ファジミッド、コスミッド、ファージ、修飾されたか又は未修飾のウイルス、人工の染色体、又は当業界公知のあらゆる他のベクターであってよい。そのようなベクターが多数市販されており、それらの用途は当業者によく知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，編纂を参照）。各ベクターは本発明の別の態様を表す。
［００５２］別の態様において、上記ベクター中に存在するヌクレオチド分子は、プラスミド、コスミッド、等、又はベクター又は核酸の鎖であってよい。別の態様において、ヌクレオチド分子は、生きている生物、ウイルス、ファージの遺伝物質、又は生きている生物、ウイルス、又はファージに由来する物質であってよい。上記ヌクレオチド分子は、一つの態様において、直鎖状、環状、又はコンカテマイズされていてよく、そしてあらゆる長さであってよい。各種類のヌクレオチド分子は、本発明の別の態様を表す。
［００５３］別の態様によると、単離された核酸配列を含む核酸ベクターは、単離された核酸の発現を制御するプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、転写のために必要なシス作用性配列要素であることが知られており、それらはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合して、その下流に位置する配列を転写する。本明細書に開示された各ベクターは、本発明の別の態様を表す。
［００５４］一つの態様において、単離された核酸は、ベクターにサブクローニングしてよい。本明細書に開示された全ての刊行物の中の「サブクローニング」は、一つの態様において、オリゴヌクレオチドをヌクレオチド分子に挿入することを意味する。例えば、一つの態様において、ＲＮＡ転写物をコードする単離されたＤＮＡは、当該ＤＮＡが転写されてＲＮＡを生産するように宿主細胞に適した適当な発現ベクターに挿入することができる。
［００５５］ベクターへの挿入は、一つの態様において、ＤＮＡ断片を相補性結合性末端を有するベクターに連結することにより達成できる。しかしながら、ＤＮＡを断片化するのに使用される相補性の制限部位がクローニングベクター中に存在しないなら、当該ＤＮＡ分子のエンドを、別の態様においては酵素で修飾してよい。或いは、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することにより望まれるあらゆる部位を生産してよく；これらの連結されたリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチドを含んでよい。サブクローニングの方法は当業者に知られており、そして、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，編纂、に記載されている。これらの方法の各々は、本発明の別の態様を表す。
［００５６］「パッケージ細胞系」は、一つの態様において、ウイルスゲノムの全て又は一部を含み且つウイルス粒子を生産できる細胞を意味する。一つの態様において、パッケージ細胞系は、ウイルス粒子を生産するために、追加のウイルス配列が外部から供給されることを必要とする（例えば、ベクター、プラスミド等）。別の態様において、パッケージ細胞系はウイルス粒子を生産するために追加のウイルス配列を必要としない。パッケージ細胞の構築と用途は当業界でよく知られており、例えば、米国特許６，５８９．７６３及びＫａｌｐａｎａ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １９：２７−３７（１９９９）に記載されている。当業界で知られているパッケージ細胞系は、本発明の別の態様を表す。
［００５７］別の態様において、本発明は、被験者のハプトグロビンタイプを決定する方法を提供し、（ａ）被験者の生物学サンプルを抗−ハプトグロビン抗体に接触させ；そして（ｂ）ハプトグロビン蛋白質と上記抗体の間の結合又は相互作用を定量測定することを含むが、当該定量測定が生物学サンプル中のＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の存在の特徴であるような条件下で行う。例えば、Ｈｐ１−１．Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２は本発明のＥ３抗体を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて特徴的な値を生じる（実施例２）。
［００５８］一つの態様において、上記の方法に利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、Ｈｐ２−１よりもＨｐ２−２に大きな親和性をもって結合してよい。別の態様において、上記の方法に利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、Ｈｐ２−１よりもＨｐ２−２に大きな親和性をもって結合しなくてよい。一つの態様において、上記の方法に利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、Ｈｐ１−１よりもＨｐ２−１に大きな親和性をもって結合してよい。別の態様において、上記の方法に利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、Ｈｐ１−１よりもＨｐ２−１に大きな親和性をもって結合しなくてよい。一つの態様において、利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有してよい。別の態様において、利用される抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体は、ハプトグロビンに結合するあらゆる抗体であってよい。
［００５９］一つの態様において、本発明の方法は、リットルあたり約０．１５グラムからリットルあたり約２．５グラムの間のハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ−２−２の存在に特徴的な値を生じてよい。別の態様において、本発明の方法は、ハプトグロビン濃度の生理学的範囲にわたり、Ｈｐ１−１，２−１，及び２−２の間を識別する。別の態様において、本発明の方法は、より狭い範囲のハプトグロビン濃度にわたってのみ、Ｈｐ１−１，２−１，及び２−２の間を識別する。本発明の方法のＨｐ１−１，２−１，及び２−２の間を識別する能力は、溶血により影響されない。別の態様において、各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６０］一つの態様において、本発明の方法は、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含んでよい。ＥＬＩＳＡの方法は当業界で良く知られており、例えば、米国特許５，６５４，４０７に記載されている。この方法の一つの態様において、抗原の濃度は、抗原の異なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体を用いて測定される。この態様の第１ステージにおいて、抗原含有サンプルを抗体（捕捉抗体）が吸収されている測定プレート上に注ぐ；サンプル中の抗原は一次抗体に結合する。第２ステージにおいて、抗原以外のサンプル中の物質は洗浄剤により洗い流される。次に、第３のステージにおいて、リポーター分子、例えば、酵素又は放射性同位元素により標識された二次抗体の溶液をプレート上に注ぐ；標識された抗体は一次抗体に結合していた抗原に結合する。一つの態様において、二次抗体は捕捉抗体と同じ特異性を有してよい。別の態様において、二次抗体は捕捉抗体と異なる特異性を有してよい。各種の方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６１］過剰に標識された抗体は、一つの態様において、洗浄剤により完全に洗い流されて、次に、測定プレート中に残ったリポーター分子の量を酵素活性リーダー又は液体シンチレーションカウンターにより測定し；そして観察された値をサンプル中の抗原の量の評価に用いる。
［００６２］別の態様において、本発明の方法は、捕捉抗体の使用無しにリポーター分子を含んでよい。各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６３］別の態様において、本発明のあらゆる方法を利用して、糖尿病合併症に対する罹病性に関して被験者を試験してよい。一つの態様において、糖尿病合併症とは、血管の合併症を意味する。別の態様において、糖尿病合併症はＰＴＣＡ又は冠動脈ステント移植の後の再狭搾を意味する。別の態様において、糖尿病合併症は、糖尿病ネフロパシーを意味する。別の態様において、糖尿病合併症は急性心筋不全の後の規定された期間の脂肪率を意味する。別の態様において、糖尿病合併症は、糖尿病心臓血管疾患を意味する。別の態様において、糖尿病合併症は、糖尿病網膜症を意味する。別の態様において、糖尿病合併症は、ハプトグロビンタイプが役割を担うかもしれない糖尿病の合併症のあらゆる他の種類を意味する。各糖尿病合併症は、本発明の別の態様を表す。
［００６４］別の態様において、本発明は、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験する方法を提供し、（ａ）第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子に接触させ；（ｂ）第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子に接触させ；（ｃ）第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子に接触させ；そして（ｄ）抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定することを含み、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の各々の存在の特性である定量測定から得られた値が、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を上記抗体が識別することの指標である。この方法の一つの態様において、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として用いられた場合に、抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別することにおける有用性に関して試験してよい。本明細書において記載されたあらゆる方法を用いて、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験してよく、各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６５］一つの態様において、上記抗体は、異なるハプトグロビン濃度の範囲にわたりＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する能力に関して試験してよい。別の態様において、上記抗体は、単一のハプトグロビン濃度のみにおいて、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する能力に関して試験してよい。各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６６］別の態様において、本発明は、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験してよく、（ａ）抗−ハプトグロビン抗体をサブストレート上に固定化することにより抗体−サブストレート複合体を形成させ；（ｂ）第１の量の抗体−サブストレート複合体をＨｐ１−１分子に接触させ；（ｃ）第２の量の抗体−サブストレート複合体をＨｐ２−１分子に接触させ；（ｄ）第３の量の抗体−サブストレート複合体をＨｐ２−２分子に接触させ；（ｅ）工程（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）の生成物を試験抗体又は組換え蛋白質に接触させ；そして（ｆ）試験抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定することを含み；Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の各々の存在の特性である定量測定から得られた値が、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を上記試験抗体が識別することの指標である。
［００６７］一つの態様において、上記抗体は、さらに、異なるハプトグロビン濃度の範囲にわたりＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する能力に関して試験してよい。別の態様において、上記抗体は、単一のハプトグロビン濃度のみにおいて、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する能力に関して試験してよい。各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００６８］別の態様において、本発明は、異なるハプトグロビンタイプに特異に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）相互作用する能力に関して多数の試験抗体をスクリーニングする方法を提供し、（ａ）多数の試験抗体からの抗体及び当該抗体をコードする核酸分子を各々が含む多数の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を生成し；（ｂ）多数の媒体を非固定化Ｈｐ１−１又はＨｐ２−１及びサブストレート上に固定化されたＨｐ２−１に接触させ；（ｃ）多数の媒体の一つからの核酸分子を当該核酸分子によりコードされる抗体を発現する媒体にサブクローニングし；（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）を１回又はそれより多く繰り返し；そして（ｅ）サブストレート上に残った媒体上に存在する抗体又は核酸分子を同定することを含む。一つの態様において、上記の方法において利用される抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体であってよい。本発明は、この方法によりＥ３  ｓｃＦｖ抗体を同定するための抗体のスクリーニングを示す（実施例１）。
［００６９］一つの態様において、スクリーニングされた多数の試験抗体は、Ｈｐ２−２対立遺伝子を欠く動物において生成される。マウス、Ｈｐ２−２対立遺伝子を欠く動物の使用（実施例１）は、一つの態様において、Ｈｐ２−１を超えてＨｐ２−２に優先的に結合する抗体の生成に好都合である。
［００７０］一つの態様において、媒体は、ファージ又はウイルスであってよい。別の態様において、媒体は、抗体及び抗体をコードする核酸分子を運ぶことができるあらゆる媒体であってよい。各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００７１］上記の方法の工程（ｃ）のサブクローニングは、異なるハプトグロビンタイプと特異に相互作用する能力を有する抗体をコードする核酸分子の増幅をもたらす。
［００７２］別の態様において、本発明は、生物学的サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別する方法を提供し、但し、当該２つの対立遺伝子バリアントはエピトープの多数のコピーにおいて異なり、（ａ）生物学サンプルを抗体又は組換え蛋白質に接触させるが、その際、抗体又は組換え蛋白質が多型蛋白質に結合し；そして（ｂ）２つの対立遺伝子バリアントの各々の存在が対立遺伝子バリアントの特性である定量的評価から得られた値をもたらす条件下で、多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を定量的に評価することを含む。本発明は、エピトープの多数のコピーが単に異なる多型蛋白質の対立遺伝子バリアントが抗体反応性に基づいてそれでもなお識別されるかもしれないという第１の証明を提供する（実施例２）。
［００７３］一つの態様において、上記方法において使用される抗体又は組換え蛋白質は、対立遺伝子バリアントに特異に結合してよい。別の態様において、組換え蛋白質は、対立遺伝子バリアントに関して同じ内在性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）親和性を有してよい。本明細書において開示されたあらゆる方法は、本明細書において記載されたハプトグロビンに関する応用に類似した様式にて、あらゆる多型蛋白質の対立遺伝子バリアントを識別するのに使用してよい。各方法は、本発明の別の態様を表す。
［００７４］理論に拘束されることを意図しないが、Ｈｐ１−１とＨｐ２−２のサンドイッチＥＬＩＳＡにおける反応性の観察された違いは、Ｈｐ１−１ダイマーがＥ３により認識される抗原部位をたった２つしか有さないのに対して、Ｈｐ２−２ポリマーは３つ又はそれより多くの抗原部位を有するという事実に帰するかもしれない。固定化されたＥ３抗体に対するダイマーの両部位の結合は、即ち、第２（検出用）Ｅ３抗体の結合を阻止するかもしれない。この態様によれば、第１捕捉抗体により、そのようなブロッキング事象は、Ｈｐ蛋白質の中のポリマーユニットの数が増加するにつれて生じるのではないらしいので、Ｈｐ２−１を用いると、より大きなシグナルを生じ、Ｈｐ２−２を用いたときは、いっそう大きなシグナルを生じる。即ち、本発明に基づくと、サンドイッチＥＬＩＳＡ方法は、本明細書において記載されたハプトグロビンに関しての応用に類似した様式にてあらゆる多型蛋白質の対立遺伝子バリアントを識別するのに有用になる。
［００７５］別の態様において、本発明は、被験者のハプトグロビンタイプを決定するあらゆる方法、糖尿病合併症に対する罹病性に関して被験者を試験するあらゆる方法、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，及びＨｐ２−２の間を識別する有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験するあらゆる方法、又は本発明において記載された生物学サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別するあらゆる方法を含むキットを提供する。キットは、便利なフォーマットにおいて材料又はその必要な試薬を提供することにより、診断又は他の手法を促進させるパッケージである。
［００７６］一つの態様において、上記キットは、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含んでよい。別の態様において、上記キットは、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置を含まなくてよい。各キットは、本発明の別の態様を表す。
［００７７］別の態様において、本発明は、この発明の、単離された核酸、ポリペプチド、ベクター、細胞、又はパッケージ細胞系を含む組成物を提供する。一つの態様において、上記組成物は、単離された核酸を細胞に導入するか又は核酸を患者に導入するためのリボソーム又は他の媒体を含んでよい。
［００７８］別の態様において、発明の、核酸、ベクター、ペプチド、化合物及び組成物の投与の経路は、限定ではないが、経口、局所投与を含み、例えば、エアロゾル、筋肉内又は経皮、そして非経口適用を含む。組成物は、投与の方法に依存して様々なユニット投薬形態にて投与することができる。適切なユニット投与形態は、限定ではないが、粉末、タブレット、ピル、カプセル、トローチ、座剤等を含む。経皮投与は、化合物が皮膚に浸透するのを可能にすることができるクリーム、リンス、ゲル等により達成してよい。非経口投与経路は、限定ではないが、電気的、直接注射、例えば、中枢神経系への直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、又は皮下注射を含む。
［００７９］別の態様において、本発明の組成物は、限定ではないが、皮膚に直接塗布されるか又は保護担体、例えば経皮デバイス（「経皮パッチ」）に取り込まれた懸濁液、オイル、クリーム、及び軟膏を含む。適当なクリーム、軟膏等の例は、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ，編纂に見いだすことができる。適切な経皮デバイスの例は、例えば、米国特許番号４，８１８，５４０に記載されている。
［００８０］別の態様において、非経口投与に適した本発明の組成物は、限定ではないが、滅菌等張水を含む。そのような溶液は、限定ではないが、中枢神経系への注射用、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、又は皮下注射用の塩水及びリン酸緩衝塩水を含む。
【０００４】
実施例
実施例１：
Ｈｐ１−１よりＨｐ２−２を選択的に結合するｓｃＦｖ抗体の単離と同定．
免疫
［００８１］Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１８２０，１９９６）に記載されるとおりに、ヒトＨｐ２−２蛋白質に共有結合されたツベルクリンの精製された蛋白質由来のペプチド（ＰＰＤ）を含むエマルジョンにより免疫した。マウスを、最初に真皮下、続いて皮下に、２週間隔で３−５カ月間、マウスあたり不完全フロイントアジュバント中の２０−３０マイクログラム（μｇ）の抗原性混合物を注射した。
ライブラリー構築
［００８２］脾臓組織からのｍＲＮＡを逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅することにより（Ｂｅｎｈａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４８：５９，２００２）、ｓｃＦｖレパートリーを調製した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片（図１Ａ）をｐＣＡＮＴＡＢ６ファージミッドベクターにサブクローニングして（Ｂｅｒｄｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２８：１５，１９９９）、Ｃ末端にｍｙｃを付加されたｓｃＦｖ抗体のクローンを各々がディスプレーするファージのライブラリーを生成した。当該ライブラリーは１．５ｘ１０６の別個のクローンを含んだ。Ｅ３のアミノ酸配列を図２に描写する。
抗体選択
［００８３］Ｈｐ２−２を被覆されたイムノチューブ（Ｎｕｎｃ）中のライブラリーからの１０１１のコロニー形成ユニット（ｃｆｕ）をインキュベートすることにより、Ｈｐ２−２を結合するクローンを選択した。大規模な洗浄の後に、結合したファージをトリエチルアミンで溶出した。エシェリヒアコリＴＧ１細胞に溶出したファージを感染させ、次に、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを重複感染させる（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔｅｄ）ことにより、溶出したファージのゲノムを増幅した（Ｂｅｒｄｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２８：１５１，１９９９）。Ｈｐ１−１よりも高い親和性でＨｐ２−２を結合した抗体を含むファージクローンに関して選択するために、このふるいわけ（ｐａｎｎｉｎｇ）プロセスを６回繰り返し、ラウンド４、５、及び６の間にＨｐ１−１がイムノチューブインキュベーションバッファー中に存在した。
［００８４］次に、固定化されたＨｐ２−２とＨｐ１−１を別々に結合する能力に関してＥＬＩＳＡアッセイにおいて個々のファージクローンをスクリーニングした。ｍｙｃを付加された単鎖Ｅ３抗体を次に精製して、そのプラスチックマイクロウエルに固定化されたＨｐ１−１又はＨｐ２−２に関する親和性に関して、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートされた抗−ｍｙｃを検出用抗体として用いて、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。Ｈｐ１−１に比較して４倍高いシグナルがＨｐ２−２に関して得られた。
【０００５】
実施例２：
Ｅ３抗体はＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイにおける
Ｈｐ１−１，２−２，及び２−２の間を識別できる．
材料と実験方法
［００８５］マイクロタイタープレート（マキシソーブ、Ｎｕｎｃ）に、１００マイクロリットル／ウエルのＥ３−Ｅｔａｇ抗体（被覆バッファー中１０？ｇ／ｍｌ）を一晩４℃において被覆した。ウエルを０．０５％のツイーンを含むＴｒｓｉ緩衝塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、次に、１５０？ｌ／ウエルのブロッキングバッファー（１％ＢＳＡと０．１％ツイーンを含むＴＢＳ）と１−２時間３７℃においてインキュベートした。ブロッキングバッファーにて１：１００希釈された血清サンプルをウエルに加え（１００？ｌ）、そして１時間室温において（ＲＴ）インキュベートした。洗浄後に、１００？ｌ／ウエルのＥ３−ｍｙｃ抗体を０．８マイクログラム（？ｇ）／ｍｌの濃度にて加え、そして１時間ＲＴにてプレートをインキュベートした。プレートをＴＭＢ基質（ＤＡＫＯ）で発色させ、そして１００？ｌ／ウエルの１標準硫酸にてクエンチした。定量は４５０ｎｍにおいて吸収を測定することにより実施した。
【０００６】
結果
［００８６］サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉用抗体と検出用抗体の両方としてＥ３  と用いることにより、当該アッセイを修飾した。Ｅ３のＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターにサブクローニングすることにより、ｍｙｃを欠くＥ３抗体を生成し（図１Ｂ）、そして検出用抗体として用い、一方、前のように捕捉用抗体としてｍｙｃ付加されたＥ３抗体を用いた。Ｅ蛋白質タグは必要でなく、むしろ、それがｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクター中に存在したから導入された。
［００８７］Ｈｐ１−１，２−２，又は２−２を有する個体からの血清（グループあたり３人）を分析した。吸収の読みは、それぞれ、０．１９６＋／−０．００７、０．５６０＋／−０．０３３及び０．９１６＋／−０．００９であった。これらの結果は、Ｅ３抗体がサンドイッチアッセイにおいて１−１，２−１及び２−２の間を識別可能であることを示す。
【０００７】
実施例３：
Ｅ３抗体を利用するサンドイッチアッセイは生理学的濃度を超える
ハプトグロビン濃度においてＨｐ１−１，２−１及び２−２を識別
可能であり且つ溶血に影響されない．
［００８８］血清中の正常な範囲のＨｐは、コーカサス人で０．３から２．０ｇ／Ｌであり、そしてジンバブエの黒人において０．１２から２．１５ｇ／Ｌである。この濃度範囲を超えてＥ３抗体を利用するサンドイッチアッセイを試験するため、血清をハプトグロビンアガロースカラムに通してハプトグロビンを消耗し、そして次にハプトグロビン１−１、２−１又は２−２を０．１５から２．５ｇ／Ｌの範囲の濃度に戻した。ＥＬＩＳＡ分析は、３つのＨｐタイプに関して４５０ｎｍの吸収がこの範囲を超えるＨｐ濃度において識別可能であったことを示したため、Ｅ３抗体を利用するサンドイッチアッセイは正常な生理学的ハプトグロビン濃度範囲を超えてハプトグロビン１−１，２−２及び２−２の間を識別可能であることを証明する。
［００８９］ヘモグロビンを１４ｍｇ／ｍｌの濃度において血清サンプルに加えたが、血清のハプトグロビンの１０倍過剰であり、全てのハプトグロビンのヘモグロビンによる結合をもたらし、よって、完全溶血の効果を模倣する。過剰なヘモグロビンによる４５０ｎｍの吸収に対する効果は観察されなかったことから、当該アッセイは溶血に感受性でないことが示された。
【０００８】
実施例４：
Ｅ３抗体を利用するサンドイッチアッセイはＨｐタイプを
評価するためのゲル電気泳動方法に相当する．
材料と実験方法
Ｈｐタイプの決定のゲル電気泳動
［００９０］Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １６１：４４１−４４６，２００２に記載されるとおりに、ポリアクリルアミドゲル電気泳動をＨｂ−追加血清上で実施し、そしてゲルを金属増強パーオキシダーゼ試薬（ピアスコープ）で染色することによりＨｐ−Ｈｂバンドの可視化を行った。
【０００９】
結果
［００９１］ハプトグロビン表現型判定に関するＥＬＩＳＡ方法の診断における正確性を試験するため、蛋白質ゲル電気泳動により以前にタイプ分けされた５０８人からの血清サンプル（７０人のＨｐ１−１，２２４人のＨｐ２−１，２人のＨｐ２−１Ｍ，そして２１４人のＨｐ２−２）をＥＬＩＳＡ法により分析した。各アッセイは、標準物として主要なハプトグロビン表現型の各々の３つのサンプルを含んだ。平均の吸収を各表現型に関して計算した。カットオフ値は異なる表現型の間の中間点に指定した。２つの表現型の間のボーダーラインに落ちるサンプルは、繰り返してハプトグロビンタイプを確認した。
［００９２］ＥＬＩＳＡ方法とゲル電気泳動の間には、９６％の相関があった。エラーの率はハプトグロビンタイプタイプとは独立していた。不正確な評価は２−１Ｍ表現型の血清サンプル（０．４％）及びそのハプトグロビン濃度が０．１５ｇ／Ｌ未満に入るサンプルにおいて記録され、ゲル電気泳動の弱いか又は部分的に分解したバンド形成パターンにより明らかであった。これらの発見は、この方法が異なるハプトグロビンタイプを識別可能であることを証明する。
【００１０】
実施例５：
Ｈｐ１対立遺伝子蛋白質産物と交差反応しないハプトグロビン
（Ｈｐ）２対立遺伝子の蛋白質産物に特異的な抗血清を得る
方法
［００９３］Ｈｐ２蛋白質のエクソン４と５の間のジャンクションからのペプチドによりウサギ及びマウスを免疫するが、このジャンクションはＨｐ１及びＨｐ２蛋白質の一次アミノ酸配列に基づいてＨｐ２にユニークな唯一のエピトープである。
［００９４］エクソン４／５ジャンクションペプチド（２０アミノ酸）をＰＣＲ断片として最初にベクターｐＴｅａｓｙ（プロメガバイオテック）にクローン化し、次に、Ｂａｍ／ＥｃｏＲＩ断片としてベクターｐＧＥＸ−２ＴＫ（ファルマシア／ダニエルバイオテック）にクローン化した。結果のプラスミドは酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と４／５ジャンクションペプシンの間に融合蛋白質をコードする。
［００９５］４／５ジャンクション断片をクローン化するために使用されたＰＣＲプライマーの配列：
【００１１】
【化１】
2008505654.tif 000003
【００１２】
［００９６］ｐＴｅａｓｙベクター中のクローン化されたＰＣＲ断片のヌクレオチド配列
【００１３】
【化２】
2008505654.tif 000004
【００１４】
［００９７］ｐＴｅａｓｙ組換え体からのＢａｍ／ＥｃｏＲＩ断片を次にｐＧＥＸ−２Ｔｋにサブクローニングして、エシェリヒアコリ株ＢＬ２１を形質転換した。約３５Ｋｄの融合蛋白質を、ＧＳＴに融合されたジャンクションペプチドを表すＩＰＴＧ誘導された細菌のペリプラズムフラクションから精製した。この融合蛋白質を次にマウス又はウサギの何れかにおいて抗血清（ポリクローナル）を調製するのに用いた。以下に示すこの抗血清を次にＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＨｐ１−１，Ｈｐ２−１及びＨｐ２−２蛋白質の間を識別するその能力を試験するために使用した。
結果
抗融合ペプチド抗血清を用いたＥＬＩＳＡの結果
［００９８］ＥＬＩＳＡプレートを１０ｕｇ／ｍｌのＨｐ（示されるとおり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２）で被覆した。抗ペプチド抗血清を１：１０００希釈にして用いた。二次抗体は適切なＡｂｓにコンジュゲートされたヤギ抗−マウス又はヤギ抗−ウサギＨＲＰであった。
マウス抗血清を用いた結果
［００９９］（ＯＤ４５０は二次抗体からのシグナルを意味する；番号３００，２７７，２８１は異なるマウスから採取された抗血清を意味する）、結果は図５に示し、マウス融合蛋白質抗血清がＨｐ１−１をＨｐ２−２から容易に識別可能であることを示す。
ウサギ抗融合ペプチド抗血清を用いた結果
［００１００］最初に粗抗血清をＧＳＴカラムに通して全ての抗血清をＧＳＴに関する特異性に関して抗血清から枯渇させることにより、未精製又は精製−精製された抗血清を作成した。フロースルーを、次に、再度ＧＳＴ−ペプチドカラムに通して、このＧＳＴ−ペプチドに結合する抗体を次に溶出して、これらの研究に用いた。
［００１０１］図６に示されるとおり、ウサギからの粗精製された及び親和性精製された４／５ジャンクションペプチド抗血清の両方がＥＬＩＳＡフォーマットにおいてＨｐ１−１，Ｈｐ２−１及びＨｐ２−２を識別できる。ＧＳＴ  ４／５は融合蛋白質である。ＧＳＴはジャンクションペプチドなしのＧＳＴである。ＧＳＴのみは、粗プール抗血清によってのみ認識され、親和性精製抗血清には認識されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】［００１４］図１Ａ−Ｂ。（Ａ）Ｈｉｓ及びＭｙｃタグによる注釈をつけられたｅ３抗体の配列。Ｓｆｉ  Ｉ−ＮｏｔＩ断片をｐＣＡＮＴＡＢ６にサブクローニングすることにより、Ｈｉｓ−及びＭｙｃ−タグを付加された抗体を生じさせた。上付き文字はＳｆｉとＮｏｔＩ部位、並びにｍｙｃとタグの境界を示し、並びに、単鎖抗体をなすＶＨとＶＫ鎖を連結するリンカー領域の配列を示す。ＶＨ鎖の配列はＳｆｉ部位からリンカーまでであり、そしてＶＫ鎖の配列はリンカーからＮｏｔＩ部位までである。
【図１Ｂ】（Ｂ）Ｓｆｉ−ＮｏｔＩ断片を、ｈｉｓ−ｍｙｃタグをＥタグで置き換えたｐＣＡＮＴＡＢ５ｅにサブクローニングした。
【図２】［００１５］図２。Ｈｉｓ及びＭｙｃタグを伴うｅ３抗体のＥ３アミノ酸配列。当該配列はＶＨ領域から始まり、ＶＨとＶＫ鎖を連結するリンカー領域に続き、ＮｏｔＩ部位及びＨｉｓ及びＭｙｃタグに続く（上付き文字により各々を示す）。Ｅタグ付加された構築物のアミノ酸配列は同一であるが、ＨｉｓとＭｙｃのタグがＥタグに置き換わっていることを除く。
【図３】［００１６］図３。Ｅ３抗体がハプトグロビンタイプを識別する能力がハプトグロビンの濃度に依存しない。
【図４】［００１６］図４は、Ｈｐ遺伝子（１又は２対立遺伝子）のエクソン配列の模式図を示す。
【図５】［００１７］図５は、マウス融合蛋白質抗血清がＨｐ１−１とＨｐ２−２の間を容易に識別することを示す。
【図６】［００１８］図６は、ウサギの粗精製の及び親和性精製された４／５ジャンクションペプチド抗血清がＨｐ１−１、Ｈｐ２−１及びＨｐ２−２をＥＬＩＳＡフォーマットにおいて識別できることを示す。
【図１】
2008505654.tif 000005
【図２】
2008505654.tif 000006
【図３】
2008505654.tif 000007
【図４】
2008505654.tif 000008
【図５】
2008505654.tif 000009
【図６】
2008505654.tif 000010
【配列表】
2008505654000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月13日(2007.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｐ２−１よりもＨｐ２−２に対して高い親和性をもって結合し、且つＨｐ１−１よりもＨｐ２−１に対して高い親和性をもって結合する、抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体、モノクローナル抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、又はその組成物。
【請求項２】
配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体。
【請求項３】
第２のハプトグロビンアイソフォームよりも第１のハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性をもって結合する抗−ハプトグロビン抗体の抗原結合断片、又はその組成物。
【請求項４】
請求項３記載の抗原結合断片を含む、任意にヒト化されているか、キメラであるか、モノクローナルであるか又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である抗体、又は組換え蛋白質、又はその組成物。
【請求項５】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン抗体又は請求項３記載の抗原結合断片を含む細胞、パッケージ細胞系、又は組換えウイルス粒子、又はその組成物。
【請求項６】
請求項１記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体又は請求項５記載の抗原結合断片をコードする単離された核酸。
【請求項７】
被験者のハプトグロビンタイプ又は血管疾患、ネフロパシー、網膜症又は心臓血管疾患のような糖尿病合併症に対する被験者の罹病性を決定する方法であって、
ａ．被験者の生物学サンプルを請求項１又は４記載の抗−ハプトグロビン抗体又は組換え蛋白質に接触させ；そして
ｂ．定量測定から得られる値が生物学サンプル中のＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の存在の特徴である条件下で、サンプル中の何れかのハプトグロビン蛋白質と上記抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を定量測定し；
ｃ．上記方法が任意にエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットをさらに含むか、又は上記方法が任意にサブストレート上で工程（ａ）にて形成された請求項１記載のハプトグロビンと抗体の複合体を固定化することをさらに含むか、任意にさらに固定化されていない抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するために上記の固定化に続いて複合体を処理し、そして任意に固定化に続いて複合体を抗体又は組換え蛋白質の追加量と接触させ、そしてハプトグロビン蛋白質と追加量の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価し、
被験者のハプトグロビンタイプの決定をもたらす、
方法。
【請求項８】
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して請求項１又は４記載の抗体又は組換え蛋白質のような抗体又は組換え蛋白質を試験する方法であって、
ａ．任意に、サブストレート上に抗ハプトグロビン抗体又は組換え蛋白質を固定化することにより、抗体又は組換え蛋白質とサブストレートの複合体を形成させ；
ｂ．第１の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ１−１分子と接触させ；
ｃ．第２の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−１分子と接触させ；
ｄ．第３の量の抗体又は組換え蛋白質をＨｐ２−２分子と接触させ；
ｅ．任意に、あらゆる複合体をサブストレート上に固定化し、そして任意にさらに固定化後に複合体を処理することにより固定化されなかった抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去し；
ｆ．任意にエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットにおいて抗体又は組換え蛋白質とＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の間の結合又は相互作用を定量測定するが、上記方法は任意にさらに工程（ｂ），（ｃ），又は（ｄ）において形成されたＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２と抗体又は組換え蛋白質の複合体をサブストレート上に固定化することをさらに含み、任意にさらに固定化に続き、固定化されていない抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するように複合体を処理することを含み、そして任意に固定化に続いて複合体を抗体又は組換え蛋白質の追加量と接触させ；そしてハプトグロビン蛋白質と追加量の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
を含み、
Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２の各々の存在に特有な定量測定から得られる値が、抗体がＨｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２を識別することを示し、
それにより、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，又はＨｐ２−２間を識別することにおける有用性に関して抗体又は組換え蛋白質を試験すること
を含む方法。
【請求項９】
値が、任意にリットルあたり約０．１５グラムからリットルあたり約２．５グラムの間のハプトグロビン濃度の範囲にわたり、又は大多数のヒトにより呈されるハプトグロビン濃度の範囲にわたり、Ｈｐ１−１，Ｈｐ２−１，Ｈｐ２−２の存在に特徴的である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を請求項１又は４記載の抗体又は組換え蛋白質のような第２の抗−ハプトグロビン抗体又は組換え蛋白質と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗−ハプトグロビン抗体の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１１】
異なるハプトグロビンタイプと別々に相互作用する能力に関して複数の試験抗体をスクリーニングする方法であって、
ａ．複数の媒体を生成するが、各々が上記の複数の抗体からの抗体と抗体をコードする核酸を含み；
ｂ．複数の媒体を非固定化Ｈｐ１−１又はＨｐ２−１及びサブストレートの上に固定化されたＨｐ２−２と接触させ；
ｃ．上記の複数の媒体の一つからの核酸分子を、当該核酸分子によりコードされる抗体を発現する媒体へサブクローニングするが、サブクローニングが異なるハプトグロビンタイプに特異的の相互作用する能力を有する抗体をコードする核酸分子の増幅をもたらすようにし；
ｄ．工程（ｂ）と（ｃ）を１回又は複数回繰り返し；そして
ｅ．サブストレート上に残った媒体中に存在する抗体又は核酸分子を同定し、
それにより異なるハプトグロビンタイプと別々に相互作用する能力に関して複数の試験抗体をスクリーニングすること
を含む方法。
【請求項１２】
複数の試験抗体がＨｐ２−２対立遺伝子を欠く動物中で生成される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
媒体がファージ又はウイルスである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
生物学的サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別する方法であって、但し、当該２つの対立遺伝子バリアントはエピトープの多数のコピーにおいて異なり、
ａ．生物学サンプルを抗体又は組換え蛋白質に接触させるが、その際、抗体又は組換え蛋白質が多型蛋白質を結合し；そして
ｂ．任意にエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットにおいて多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を定量測定するが、上記方法は任意にさらに工程（ａ）において形成された多型蛋白質と抗体又は組換え蛋白質の複合体をサブストレート上に固定化することをさらに含み、任意にさらに固定化に続き、固定化されていない抗体又は組換え蛋白質のフラクションを除去するように複合体を処理することを含み；そして任意に固定化に続いて複合体を抗体又は組換え蛋白質の追加量と接触させ；そして多型蛋白質と追加量の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
を含むが、
２つの対立遺伝子バリアントの各々の存在が対立遺伝子バリアントの特性である定量的評価から得られた値をもたらす条件下であって、それにより生物学的サンプル中の多型蛋白質の２つの対立遺伝子バリアントを識別すること
を含む方法。
【請求項１５】
さらに、
ａ．固定化に続いて複合体を多型蛋白質を結合する第２の抗体又は組換え蛋白質と接触させ；そして
ｂ．ハプトグロビン蛋白質と第２の抗体又は組換え蛋白質の間の結合又は相互作用を評価すること
をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第２の抗体又は組換え蛋白質が対立遺伝子バリアントに特異に結合する、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１又は４記載の抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体又は組換え蛋白質、あるいは請求項３記載の抗原結合断片を含むキットであって、任意にエンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、キット。
【請求項１８】
請求項７、９又は１１記載の方法を利用するキットであって、任意に、エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施するための装置をさらに含む、キット。
【請求項１９】
第２ハプトグロビンアイソフォームよりも第１ハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性をもって結合する抗−ハプトグロビン（Ｈｐ）抗体の相補決定領域、当該相補決定領域を含む抗体又は組換え蛋白質又はその組成物であるか、又はその抗体のヒト化されたか、キメラカ、モノクローナルか、又は単鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）抗体、又は上記の何れかを含む組成物であって、当該相補決定領域は第２のハプトグロビンアイソフォームよりも第１のハプトグロビンアイソフォームに対して高い親和性をもって結合する、相補決定領域。
【請求項２０】
請求項１９記載の相補決定領域を含む、細胞、パッケージ細胞系、又は組換えウイルス粒子、又はその組成物。