(57)【要約】本発明はアルターナリア・アルターナタの代謝物質であるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類による生物除草の方法である。微生物を農業植物保護へ応用するものである。5-800μg/gの濃度で、耕地にある広葉雑草、禾草とハマスゲの茎と葉をスプレーしたあと、その雑草は迅速に傷害を受け、枯れて、死んでしまうことになる。除草対象が広く、迅速的、効率的な除草活性を具する。補助剤を添加すれば、除草活性を増やすことがある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及びその塩類による雑草防除の方法とは、固体或いは液体にアルターナリア・アルターナタを培養して、得られた代謝物質をコルム・クロマトグラフとチン・ライヤー・クロマトグラフにより、精錬して得られたテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類を5-800μg/gの濃度で、雑草の茎と葉にスプレーして、５日以内に毒害症状が出て雑草を殺すことができ、補助剤を添加すれば、除草活性を増やすことができる。
【請求項２】
請求項１に述べたテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及び塩類とは、カルシウム・テヌアゾン酸、カルシウム・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾン酸、マグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾン酸、コッパー・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾン酸、アイロン・イソ-テヌアゾン酸、ソディウム・テヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸、カリウム・テヌアゾン酸、カリウム・イソ-テヌアゾン酸、及び新しい化合物であるカルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸などである。
【請求項３】
請求項１に述べたアルターナリア・アルターナタの代謝物質であるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類による生物除草の方法は、その殺せる雑草の種類は広葉雑草、禾草、ハマスゲであることから、テヌアゾン酸、イソーテヌアゾン酸、及び塩類はブロードスペクトルを有することを表明される。
【請求項４】
請求項１に述べたアルターナリア・アルターナタの代謝物質であるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類による生物除草の方法は、適正な助剤を添加して、その雑草を殺す活性を増やすことができるが、その助剤の特徴はソディアム・ドッドシルスルフォナト、農昇GL-110、ナイトロゼンケトン、小4204である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は紫茎ヒヨドリ花のアルターナリア・アルターナタ（Alternaria alternata）の代謝物質を生物除草に用いる方法である。微生物による農業植物の保護、農作物雑草の防止と除去への応用技術であり、耕地、芝生、果樹園、道畔などの雑草への除去に使用するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え除草剤を幅広く使用されているため、選択性が広く、除草対象が狭く、効果が遅く、残留期間が長いという従来の化学除草剤は逐次に淘汰されることになるが、除草が速く、除草対象が広く、毒低く、残留が低く、薬剤耐性が生じにくい化学除草剤を開発し、遺伝子組み換え農作物の栽培を通して、幅広く普及されることは生物除草剤開発の主な方向である。
【０００３】
微生物の代謝物質或いは微生物の中から分離し得た植物毒素を除草剤として、雑草を治めることは生物除草剤の開発研究のホットポイントの一つであるが、主に土壌の中にある放線菌と植物病原性真菌に集中している。例えば連鎖黴菌により生じたバイアラフォス（Bialaphos）、ハービンマイシンA（Herbimycin A）、ヘルビシディン（Herbicidin）とアニソマイシン（Amismycin）など、及びアルターナリア・アルターナタにより生じたAAL毒素、テントシン（Tentoxin）、アルターナリク酸（Alternaric acid）とACRLなど、凹へそ蠕動胞子菌により生じた水稲アマ病菌毒素（Ophiobolins）、トリプトフォル（Tryptophol）とResorcylidesなどである。バイアラフォスの構造によりシミュレーションし、合成できたブロードスペクトル型の除草剤であるグルフォシナトはすでに遺伝子組み換え抗グルフォシナトの油菜など農作物に広く応用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アルターナリア・アルターナタから得た代謝物質の除草活性に関しては、報道されたことがある。発明者はこの前、当該菌の粗代謝物質を雑草の制御に用いることができることをすでに発見され、且つ中国発明特許（特許No ZL00112560.5）を取得されていた。本発明は更にその粗代謝を純化し、分離してきた純物質である。但し、粗代謝物質を純化して分離してきた単体毒素を雑草の制御にすることについては、AAL-toxin毒素の除草方法のみの特許（特許No US Patent, 5,256,628, Abbas et al., 1993）を申請されていた。この特許には当該毒素を有する粗代謝物質の除草活性について言及された。主な特徴としては、イヌホウズキ、マンダラゲ、バージニアアカザ、大果田菁などのある広葉雑草を対象とするが、イネ科の雑草に対して殆ど効果がない。粗代謝物質は玉蜀黍粉或いは米などを固体培養基として培養したあと、水洗ろ過を経て得られたろ過液であり、濃度が1000ppm以上であれば、活性を有する。従って、それは除草対象の広い本発明と比べて、明らかに違うところである。
【０００５】
アルターナリア・アルターナタの固体と液体の培養物から得た除草活性を具するアミド系物質である、化学式１に示すテヌアゾン酸(Tenuazonic acid)、化学式２に示すイソ-テヌアゾン酸（構造式）(Iso-tenuazonic acid)は互いに異性体としている。テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸の物理化学性質パラメーターとして分子式がC10H15NO3であり、無色で、ねばねばする油のようなものである。テヌアゾン酸、カルシウム・イソ-テヌアゾン酸とテヌアゾン酸、化学式３に示すマグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、化学式４に示すカルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸などは不定形粉末で、メタノール、酢酸エチル、ジメチルスルホキシドなどの有機溶剤に特に溶けやすい。クロロホルム、ベンゼン、氷酢酸、アセトンの中に溶けにくい。リグロインなどの極性の低い溶剤の中に溶解性は特に悪い。
【０００６】
【化１】
2008528523.tif 000002
【０００７】
【化２】
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【０００８】
【化３】
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【０００９】
【化４】
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【００１０】
テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）の発見はアルターナリア・アルターナタの中からだけでなく、りんご、胡椒、トマト、小麦、高粱、向日葵の種、油菜の種、オリーブ、かんきつ、煙草と水稲など及び水稲病原真菌Aspergillus flavus、Pyricularia oryzae、ジャワアスペルギルス（Eleusine coracana Gaertn）などの微生物、または干したカッサバ、トマト製品などの食品の中にもテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）の存在を発見した。テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸は水稲の株と煙草を感染して茶色の病斑を形成し、またトマトの葉の緑を失い、死ぬまでさせることができるが、トマト、水稲、小麦、黒麦、レタスの苗などの生長を抑制することができる。そして、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸人参の種の発芽と早苗の生長を抑制することができる。活性については報道したことがあるが、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸は濃度10-4M以下の場合には、寄生雑草のStriga hermonthicaの種の発芽を50％くらい抑制することができるなどを報道されたことがある。
【００１１】
しかし、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸による雑草を除去する方法は種の発芽への抑制ばかりでなく、茎葉の処理により、直接生長中の雑草を殺すことができる。また、殺せる雑草の種類も報道された寄生雑草のStriga hermonthicaと違って、耕地に生じる殆どすべての主要な雑草（添付リストを参考）を除去することができるが、これは特許の中に、及び報道したものの中に見つからなかったものである。特に、カルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸などは新しい化学構造のものである。これらの特性は本特許発明が従来のものと違うところである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特許請求の範囲に記載通りである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は植物毒素活性を具するアルターナリア・アルターナタの代謝物質としてのテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及びその塩類を生物化学除草剤とし、生物除草に使うものである。わが国には目下まだ生物化学除草剤は産業化していないから、この発明は生物化学除草技術を発展し、産業化させることにより、わが国の目下除草剤製品の構成と農薬化学工業の産業の構成を変え、全面的に科学技術含有量を向上させることができる。この化合物は通常処理したあと24時間ぐらいで、顕著な症状が出て、3〜5日で雑草を殺してしまうという除草効果が早い。また、除草対象は広い。テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸はメヒシバ、稗草、ゴースグラス、エノコログサ、デンテスフォクストール、ジャパンニーズデンテスフォクストール、シキミ、野生燕麦、早熟ブルーグラス、硬草、ポリポゴン、長芒ポリポゴンなどのイネ科の雑草、及び、紫茎ヒヨドリ花、鉄ヒユ、田烏菜、レッドルートアマランス、クリーブズ、野生ソラマメ、モノチョリア、節節菜、水ヒユ、スベリヒユ、クジラクサ、ナズナ、つゆ草、グンバイナズナ、小花エトシミュム、カーダンミニー、ヴェロニカ、ミミナグサなどの広葉雑草と牛毛草、異型ハマスゲ、カヤツリグサ、ファイブリステリスなどのハマスゲを含む耕地に生じる主な雑草を殺すことができる。
【００１４】
本発明に関連する化合物は活性が高く、5-70μg/gの低い濃度の中に著しい活性を具するから、効果の高い生物化学除草剤である。
【００１５】
また、環境への汚染も少なく、残留も少ないから、土壌に入ったあと、殆ど活性がなく、速やかに鈍化していまうから、環境への安全性が相当高い。
【００１６】
本発明はアルターナリア・アルターナタの代謝物質とするテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及びその塩類を生物除草の方法とする詳細及び実施方案は下記のとおりである。
【００１７】
テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及びその塩類を雑草制御にする方法として、固体或いは液体でアルターナリア・アルターナタを培養し得た粗代謝物質をシリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフとチン・ライヤー・クロマトグラフにより、精錬して得られたテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）は5-500μg/gの濃度（或いは少量の助剤を加える）で、五日間内で雑草とある作物に対する植物毒性は明らかに表れ、広葉雑草、禾草とハマスゲなどを含む主な雑草を殺すことができる。
【００１８】
請求項１に述べたテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸及び塩類というのは、テヌアゾン酸、カルシウム・イソ-テヌアゾン酸、テヌアゾン酸、マグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、テヌアゾン酸、コッパー・イソ-テヌアゾン酸、テヌアゾン酸、アイロン・イソ-テヌアゾン酸、テヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸、テヌアゾン酸、カリウム・イソ-テヌアゾン酸、カルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸などである。
【００１９】
請求項１に述べたアルターナリア・アルターナタのメタボライトとするテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類の生物除草の方法として、その殺せる雑草の種類はメヒシバ,、稗草、ゴースグラス、エノコログサ、デンテスフォクストール、ジャパンニーズデンテスフォクストール、シキミ、野生燕麦、早熟ブルーグラス、硬草、ポリポゴン、長芒ポリポゴンなどのイネ科の雑草、及び、紫茎ヒヨドリ花、鉄ヒユ、田烏菜、レッドルートアマランス、クリーブズ、野生ソラマメ、モノチョリア、節節菜、水ヒユ、スベリヒユ、クジラクサ、ナズナ、つゆ草、グンバイナズナ、小花エトシミュム、カーダンミニー、ヴェロニカ、ミミナグサなどの広葉雑草と牛毛草、異型ハマスゲ、カヤツリグサ、ファイブリステリスなどのハマスゲを含む耕地に生じる主な雑草を殺すことができる。従って、当該物質は除草対象が広いことがわかる。
【００２０】
請求項1に述べたアルターナリア・アルターナタの代謝物質とするテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類の生物除草の方法として、その雑草と作物への毒性は下記のとおりである。雑草の早苗の茎と葉に対して。処理を施した12時間後、雑草は顕著な傷害症状が出てくる。その薬液を接触した茎と葉は緑を失い、萎びて、かれて、死ぬまでにする。成長している株に対して、その茎、葉には茶色の病斑が起こり、死んでしまうことになる。雑草の三葉期前は最適な処理期間である。
【００２１】
請求項1に述べたアルターナリア・アルターナタの代謝物質とするテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類の生物除草の方法として、その助剤の特徴は表面活性剤、植物源助剤、効果増加剤及び浸透剤であり、主な種類はJFC、SDL、テゥイーン-80、ソディアム・ドッドシルスルフォナト、農昇GL-110、CGN-3、ナイトロゼンケトン、小4204、SDPなどがある。
【００２２】
請求項1に述べたアルターナリア・アルターナタの代謝物質とするテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸、及び塩類の生物除草の方法として、その雑草に対する作用メカニズムはテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）を使って葉の光合成の効率と表観量子速度を顕著に低くさせる。その作用位置はチラコイド膜にあり、光化学系IIの電子伝達活性を抑制することである。
【００２３】
発明者は紫茎ヒヨドリ花の生物に関する研究をしたとき、野外紫茎ヒヨドリ花の自然発病の現象を発見したから、その寄生真菌に対する分離鑑定の研究を始めた。そのいくつかの菌株の病原性と毒性の篩い分けと研究を加えて、アルターナリア・アルターナタ（Alternaria alternata (Fr.) Keissler）の菌株501を得られた。さらにその生物学特性、培養方法、大量生産プロセス、病原性及び病原メカニズムを深く研究した結果として、その発病を起こす作用メカニズムは発病植物毒素の発生にあることが発見された。。アルターナリア・アルターナタを液体で培養したあとの培養残液を検定し、粗毒素を取って、濃度1-1000μg/ml以内で雑草に顕著な毒害症状を起こさせることができることがわから。毒害症状を起こす時間は速ければ5時間くらいで、二日以内で雑草を完全に殺すことができる。そして、固体或いは液体でアルターナリア・アルターナタを培養し得た粗代謝物質をシリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフとチン・ライヤー・クロマトグラフにより、精錬してテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）を得られた。この物質の生物活性を検定して、濃度5-800μg/gの間で、雑草とある作物に対して顕著な植物毒性があることがわかっていた。検定により、この物質は紫茎ヒヨドリ花、メヒシバ、イヌビエと田烏菜（後ろ三種への処理には少量の助剤を加える）の茎と葉を処理すれば、除去する効果がよいことがわかる。この物質はメヒシバ、イヌビエなどの雑草の種、根及び胚芽の発生を抑制し、その発芽率に影響を与えることができる。大豆、水稲、小麦と玉蜀黍などいくつ種類の作物の種、根と胚芽の発生に、ある程度の影響を与えている。
【００２４】
PDAで培養した菌種培養物を下記の液体培養基の一つに接種する。
PSK培養基：煮込んだポテトのろ過液（ガーゼ4層でろ過）200g、砂糖30g、1gK2HPO4、1Lまで水を加える。
SCSC培養基：玉蜀黍粉15g＋大豆粉15g、砂糖30g、3gCaCO3、1Lまで水を加える。
或いは上述の培養基で培養した菌種を固体培養基RHWHに接種する。
RHWH培養基：米ぬか50g＋ふすま50g＋水33.3ml
【００２５】
液体培養は接種後の三角瓶を23−26℃で、暗い或いは12時間光照射と12時間暗いと交替で、1分間110回転数で動揺して5〜8日培養する。それから、ろ過ペーパーで培養液をろ過し、そのろ過液を大穴樹脂で吸着してから、アルコールで脱着し、減圧と濃縮をして、エチルアセテートで粗毒素を抽出することである。固体培養液は接種後のステンレスかごを23〜26℃温度で、暗い或いは12時間光照射と12時間暗いと交替で、8〜10日培養したあと、60度で乾燥してから、培養干物の中に培養干物：水：エチルアセテートそれぞれ2：1：10（m/v/v、単位：ml或いはg）の比例で水とエチルアセテートを加え、減圧（0.1Mpa）蒸留する。それから常圧蒸留と濃縮して粗毒素を得る。上述で抽出できた粗毒素をシリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフで何回で分離してから、何回でTLCで純化し、酸性条件の下でオレンジ色の液体状態のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸を得られる。中性或いはアルカリ性条件の下で、それぞれ不定形の固体粉末状態のカルシウム・テヌアゾン酸、カルシウム・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾン酸、マグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、ソディウム・テヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸、カリウム・テヌアゾン酸、カリウム・イソ-テヌアゾン酸、カルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸を得られる。液体状態のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸の中にそれぞれコッパーアセテートとアイロンアセテートを加えると、それぞれコッパー・テヌアゾン酸、コッパー・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾン酸、アイロン・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸を得られる。
【００２６】
少量のメタノールでテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）を溶解して、蒸留水を加えて、それぞれ5-40μg/g濃度の溶液を配合したあと、紫茎ヒヨドリ花の葉に針刺法で致病性検査を行う。濃度の上昇につれて、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸が紫茎ヒヨドリ花の葉に対する致病性が増えることがわかる。40μg/g濃度の場合、48時間後紫茎ヒヨドリ花の葉の病斑が4.9625mmに形成できる。
【００２７】
35μg/gのテヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸混合液の中に0.1%濃度の補助液を加える。その補助液はJFC、SDL、テゥイーン-80、ソディアム・ドッドシルスルフォナト、農昇GL-110、CGN-3、ナイトロゼンケトン、小4204、SDPなどがある。ペトリ皿で葉より離れて点滴して、助剤が当該物質の薬効に対する作用を篩い分けた結果は、使用した8種類の助剤は程度異なるが、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸がメヒシバの葉に対する致病作用を向上させることができるが、その中のソディアム・ドッドシルスルフォナトの効果が一番よく、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸をメヒシバの葉に十分広げさせ、浸透能力を向上させ、薬剤の体内への伝達を促進させ、効果を高めることができることがわかる。そのほか、ナイトロゼンケトン、小4204の効果も割合よい。
【００２８】
下記通りの２種の配合例を作る。I、ソディアム・ドッドシルスルフォナト＋ナイトロゼンケトン＋小4204+35μg/gのテヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸（塩）溶液；II、ソディアム・ドッドシルスルフォナト＋ナイトロゼンケトン＋TFC+35μg/gのテヌアゾン酸、ソディウム・イソ-テヌアゾン酸（塩）溶液という調合例である。それをペトリ皿で点滴法でそれぞれメヒシバの成熟葉に点滴する。この2種類の配合例は薬効をそれぞれ5倍と6倍高めた。
【００２９】
配合例IIで温室盆栽の三葉期の耕地雑草であるメヒシバ、ゴースグラス、稗草、タカサブロウ、鉄ヒユ、小アカザ、つゆ草、水花生、レッドルートアマランス、打碗花、ノゲシ などの茎と葉を処理する。ある雑草に対しては、処理後12時間経ってから、雑草の葉が顕著な傷害現象が出て、葉が2〜3日が経つと、緑も失い、枯れて死んでしまうことになる。
【００３０】
5-70μg/gのテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）溶液でメヒシバ、イヌヒエ、硬草、タカサブロウ、野生ソラマメ、小麦、玉蜀黍、大豆、水稲の種を処理すれば、メヒシバ、イヌヒエ、水稲と小麦の種発芽率に対し、メヒシバ、イヌヒエ、水稲と玉蜀黍の胚根の生長、水稲と小麦の胚芽の生長に対して、顕著な抑制作用がある。
【００３１】
テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）が雑草に対する作用メカニズムは植物の光合成作用を影響するからである。それは葉の光合成速度と表観量子の速度を顕著に低くさせる。その作用位置はチラコイド膜にあり、2光系統の電子伝達活性を抑制するが、チラコイドの中の膜蛋白の合成と分解、特に光合成系統IIの中角蛋白に対しては影響がない。
【００３２】
本発明のメリットと積極的な効果は下記の如きである。
1)アルターナリア・アルターナタの代謝物質を生物除草にすることはすでに特許を取得していた。ただし、今までの特許の中に、有効成分の具体的な物質構造にかかわる内容がないから、応用するときの活性成分の含量と製品品質を有効的にコントロールすることに難しい。本発明は前の特許を基礎にして更に開発を進め、活性物質を分離、純化、検定できたが、濃縮、純化により、製品の有効性と除草効果を高めることができ、用量を著しく降下させた。
【００３３】
2）テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸の物質構造が簡単なので、人工的な合成のシミュレーションがしやすい。本発明は耕地の雑草に対して、除草対象が広い除草活性を明確にしたから、構造が類似する化学除草剤を合成することに、テンプレートを提供した。カルシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、マグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、コッパー・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸、アイロン・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸は初めて報道した新しい化合物で、その生物活性は化合物の生理活性メカニズムの研究に対して、除草剤の化学合成に対して、積極的な参考価値がある。
【００３４】
すでに報道された除草活性を有するアルターナリア・アルターナタ例えばテントシン（Tentoxin）、アルターナリク酸（Alternaric acid）とACRLの構造が複雑で、人工的なシミュレーション合成が困難で、且つコストも高い。
【００３５】
3) テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸は水稲、トマト、小麦、黒麦、レタス、煙草などの作物に対しては、それらの作物の葉を茶色の病斑を起こし、早苗の生長を抑制させ、そして、寄生雑草のStriga hermonthicaの種の発芽への抑制作用などがすでに報道されたが、耕地の主な雑草への除草作用の報道を見ていなかった。本発明はテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸特にその塩類が広い範囲での耕地雑草への除草活性を発見した。最低5μg/gの低い濃度の場合、紫茎ヒヨドリ花、メヒシバなどの雑草に対し、毒害作用を起こすことができる。その作用が迅速で、用量が少なく、環境への汚染も小さいから、効果の高い生物化学除草剤と言える。これはこういう物質の生物除草への利用価値と応用前景を広げていくことができる。当該物質は作用が迅速なので、現在の大量に応用している滅生性除草剤であるパラコードとグリフォセートの代替品とすることができる。パラコードは環境への毒性が高いし、グリフォセートは作用が遅く、速くても10日以上ならないと、除草効果が出てこない。
【００３６】
既存技術では、アルターナリア・アルターナタの代謝物質のAAL-Toxinを除草に使っているが、主にイヌホウズキ、マンダラゲ、バージニアアカザ、大果田菁などのある広葉雑草を除草対象するが、イネ科の雑草に対して殆ど効果がない。本発明は耕地に生じる主な雑草例えばメヒシバ、稗草、gゴースグラス、エノコログサ、デンテスフォクストール、ジャパンニーズデンテスフォクストール、シキミ、野生燕麦、早熟ブルーグラス、硬草、ポリポゴン、長芒ポリポゴンなどを含むイネ科の雑草、及び紫茎ヒヨドリ花、鉄ヒユ、田烏菜、レッドルートアマランス、クリーブズ、野生ソラマメ、モノチョリア、節節菜、水ヒユ、スベリヒユ、クジラクサ、ナズナ、つゆ草、グンバイナズナ、小花エトシミュム、カーダンミニー、ヴェロニカ、ミミナグサなどを含む広葉雑草と牛毛草、異型ハマスゲ、カヤツリグサ、ファイブリステクスなどを含むハマスゲをコントロールすることができる。
【００３７】
4)テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）を使って、茎と葉を処理すると、耕地に生じる大半の主な雑草を除草でき、使用も便利であるほかに環境への汚染も少なく、残留も少ない。土壌に入った後、速やかに鈍化する。この物質の生物源から見て、相当な環境安全性を有すると考えられる。
【００３８】
実施例1:紫茎ヒヨドリ花（Eupatorium adenophorum Spreng.）の自然致病菌――アルターナリア・アルターナタ[Alternaria alternata (Fr.) Keissler]21株をPDA培養基上に自然変異し、温度25℃の暗いところで、3日培養してから、15ワットの紫外線灯の下30cmのところで、12時間照射12時間暗いと交替して、7日培養する。また、無菌水でその胞子溶液を水洗し、105胞子を80mlPSK培養基に接種し、25℃，100r/minで6日間培養する。あと、培養液濾紙でろ過後、121℃温度で、20分滅菌して、無菌ろ過液を得た。紫茎ヒヨドリ花の第三枚の葉を取って、まず水道水で洗って、それから0.1%HgCl235minで処理する。あとは無菌水で三回洗い、滅菌のろ紙で葉の表面水分を吸収して乾かせたあと、葉の裏の端より1-2cmのところに針で軽く刺して、それぞれ無菌ろ過液20μlを針刺しのところにたらして、25±1℃の温度で、12h光照射したあと、解剖鏡の下で病斑の直径を測定する。最後に、統計分析を加え、菌株の毒産出能力を確定する。結果は表1で示す。
【００３９】
表１には菌株NEW、新402、新501と安501の四つの菌株の致病力はほかの菌株より、はるかに高いことを表明されている。その中のNEWという菌株の致病力が最強なので、中の致病毒素は一番高いはずで、毒を作る菌株として毒素の生産に使うことができる。
【００４０】
表１は21個菌株のPSK培養ろ過液の致病力比較を示す。
【表１】
2008528523.tif 000006
【００４１】
実施例2：501菌株をSCSC液体培養基に接種し、25±1℃の温度で、光照射12h/d、110rpm/min動揺する条件の下で、5〜7日培養する。それから、培養液をろ紙でろ過して、ろ過液を高速遠心して、そして、上澄み液を取って0.45μmの微小孔膜でろ過して、無菌液を得る。それから、100-200目のクロマトグラフィ用のシリコン・ゴム・クロマトグラフでクロマトグラフィし、弱から強への順番で、異なる溶媒系統で不連続的に勾配溶出する。
【００４２】
溶出溶媒系統を加える順番として、石油エーテル→石油エーテル：酢酸エチル＝5：1→石油エーテル：：酢酸エチル＝3：1→石油エーテル：酢酸エチル＝１：１→石油エーテル：酢酸エチル＝1：3→石油エーテル：酢酸エチル＝1：5→酢酸エチル：メタノール＝5：1→酢酸エチル：メタノール＝3：1→酢酸エチル：メタノール＝1：1→酢酸エチル：メタノール＝1：3→酢酸エチル：メタノール＝1：5→メタノール
（2）2回目シリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフ（方法は同上）
1回目のシリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフィの石油エーテル：酢酸エチル＝5：1と石油エーテル：酢酸エチル＝3：1で溶出した生物活性のある部位をそれぞれ再び100-200目のシリコン・ゴム・コルム・クロマトグラフで、溶媒系統を更に細分化して、石油エーテル：酢酸エチル＝3：1→石油エーテル：酢酸エチル＝2：1→石油エーテル：酢酸エチル＝3：2→石油エーテル：酢酸エチル＝1：1→酢酸エチル→アルコールの順番で、常圧濃縮した後、水で一定の倍数で薄めてから、生物活性を検定する。活性部位を検定シリコン・ゴム・ボードでの展開状況により合併して、TLCで分離する。
【００４３】
コルム・クロマトグラフで得た活性のある物質を適量な酢酸エチルで溶解し、スポットサンプル用毛細管をTLCボードの基部にして、展開剤で展開した後、それぞれ酢酸エチル或いはアルコールで物質流出がなくなるまで流し、クロマトグラフィ条件を変え、活性物質を追跡し、酸性条件の下で常圧濃縮すると、オレンジ色の液体を得られ、中性或いはアルカリ性の条件の下で常圧濃縮すると、無定形なオレンジ固体粉末を得る。
【００４４】
実施例3：少量のメタノールでテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸混合物を溶解したあと、蒸留水でそれぞれ5μg/g、10μg/g、15μg/g、20μg/g、25μg/g、30μg/g、35μg/g、40μg/g濃度の溶液を配合する。同時に、相当濃度のメタノール溶剤対照と清水対照を設ける。それから、紫茎ヒヨドリ花の葉を針で刺して、致病性を検定する。一度の処理では6回以上繰り返す。温度25℃で、自然光照射の下で、48時間保湿放置後、顕微観測尺で病斑の直径を計る。
【００４５】
表２ではテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸混合物が紫茎ヒヨドリ花に対して高い致病性があることを示す。5μg/g濃度の条件の下で顕著な植物毒性が見え、無菌液の毒性と同様であるが、対照と比べて相違が明らかである。（P<0.01）。
【００４６】
表２は濃度異なるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸が紫茎ヒヨドリ花荷対する致病性検定の分析結果を示す。
【表２】
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【００４７】
実施例３：少量のメタノールでマグネシウム・テヌアゾン酸、マグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、とマグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸を溶解したあと、蒸留水を加えて、それぞれ50μg/g濃度の溶液を配合する。同時に相当濃度のメタノール対照と清水対照を設ける。それから、紫茎ヒヨドリ花の葉を針で刺して、致病性を検定する。一度の処理では6回以上繰り返す。温度25℃、自然光照射の下で、48時間保湿放置後、顕微観測尺で病斑の直径を計る。
【００４８】
表3ではマグネシウム・テヌアゾン酸、マグネシウム・イソ-テヌアゾン酸、とマグネシウム・テヌアゾナト・イソ-テヌアゾン酸が紫茎ヒヨドリ花に対してともに高い致病性があることを示す。50μg/g濃度の条件の下で顕著な植物毒性が見え、無菌液の毒性より、明らかに高く、その対照相違が著しい（P<0.01）。
【００４９】
表３は濃度の異なるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸が紫茎ヒヨドリ花に対する致病性検定の分析結果を示す。
【表３】
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【００５０】
実施例4：それぞれ0.1%濃度のTFC、SDL、テゥイーン-80、ソディアム・ドッドシルスルフォナト、農昇GL-110、CGN-3、ナイトロゼンケトン、小4204、と35μg/g濃度のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）の混合物溶液を混合し、トリ皿で、葉より離れて点滴して、助剤を篩い分ける方法で8種の助剤の効果作用の相違を比較する。同時に、清水対照CK0、と0.1%濃度の助剤CK1対照及び35μg/g濃度のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）CK2を設ける。毎回処理は6回繰り返す。結果に対して分析する。分析結果は表4で示す。表4の結果は8種の助剤が程度異なるが、何れも粗毒素のメヒシバへの致病作用を高めることができることを表している。その中にソディアム・ドッドシルスルフォナトの効果が一番良い。ソディアム・ドッドシルスルフォナトが粗毒素のメヒシバの葉の上に充分延ばし、浸透能力も高め、薬剤の体内での伝達を促進することができるので、効果を増す作用が著しい。助剤G（ナイトロゼンケトン）とH（小4204）の効果増加も割りとよい。
【００５１】
表４は異なる補助剤の効果増加作用相違を示す。
【表４】
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【００５２】
実施例5：ペトリ皿で葉への点滴方で調合できた2種の配合をそれぞれ成熟のメヒシバにたらして、清水対照CK0、助剤対照CK1と35μg/g濃度のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）混合物溶液対照CK2を設ける。毎回の処理は16回繰り返す。配合の中の助剤の濃度は何れも0.1%である。結果は表5で示す。
【００５３】
配合I：補助剤D＋補助剤G＋補助剤H＋35μg/g濃度のテヌアゾン酸（塩）混合物溶液；配合II：補助剤D+補助剤G+補助剤A+35μg/g濃度のテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）混合物溶液；
【００５４】
結果に対する分析は表5で示す。表5の中の分析結果から見て、配合Iがテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）混合物溶液の薬効を5倍ぐらい高めたが、配合IIに劣っている、配合IIの効果増加の作用がもっと顕著で、薬効を6倍以上高めたことで、配合IIの効果増加作用（P<0.01）が配合Iより高いことがわかる。
【００５５】
表５は2種の配合が雌日芝の葉への毒性相違分析を示す。
【表５】
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【００５６】
実施例6：実施例4の配合IIを使って、温室盆栽の三葉期の雑草早苗の茎と葉に対して処理を行う。薬剤用量は雑草の茎と葉の表面が潤む程度でよい。毎回で3回繰り返す。同時に清水CK1と助剤CK2を設ける。2d後発病状況を統計する。発病状況の統計は表6で示す。統計結果は表7で示す。
【００５７】
表7から配合IIの場合、耕地にある主なイネ科の雑草、ハマスゲ、広葉雑草、メヒシバ、ゴースグラス、稗草、田鳥草、鉄ヒユ、小アカザ、つゆ草、水花生、レッドルートアマランス、打碗花、ノゲシなどを除去することができることがわかる。投薬期間は早苗三葉期である。
【００５８】
表６は配合が雑草茎と葉に病害を起こす程度に対する評価標準を示す。
【表６】
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【００５９】
表７は配合IIが雑草の茎と葉を処理した結果を示す。
【表７】
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【００６０】
実施例7：少量のメタノールでテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）を溶解した後、蒸留水で濃度それぞれ5μg/ml、50μg/ml和500μg/mlの溶液を配合して、温室盆栽の三葉期のメヒシバとタカサブロウの早苗の茎と葉をスプレー法で処理する。薬剤用量は雑草の茎と葉の表面が潤む程度でよい。毎回の処理は3回繰り返す。同時に清水CKを設ける。2d後、発病状況を統計する。病害状況の統計基準は表6で示す。統計結果は表8でします。
【００６１】
表８は異なるメタノールでテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）が雑草の茎と葉を処理した結果を示す。
【表８】
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表8からテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸（塩）は50μg/ml至500μg/mlの間の濃度の場合、雑草の代表であるイネ科のメヒシバと広葉雑草を有効的に除去できることがわかる。薬剤投与期間については早苗三葉期にすることをお薦めしたい。
【００６２】
実施例8：少量のメタノールでテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸混合物を溶解した後、蒸留水でそれぞれ5μg/ml、8.75μg/ml、17.5μg/ml、35μg/ml、70μg/ml濃度の溶液を配合して、メヒシバ、イヌヒエ、硬草、タカサブロウ、野生ソラマメ、小麦、玉蜀黍、大豆、水稲の種の発芽への抑制作用ついての試験を行う。まず水道水で種を洗って、0.1% HgCl2の濃度で3-5minで処理したあと、無菌水で洗ってから、滅菌ずみの濾紙で表面の水分を吸着する。毎回の処理は3回繰り返す。毎度の繰り返しのとき、小麦、玉蜀黍、大豆と水稲が30粒を使う以外に、ほかの植物が100粒を使う。同時に清水対照CKを設ける。試験は直径9cmの培養皿の中に行う。培養皿の中に薬液或いは対照物質の用量は5mlで、温度25℃で、光照射の培養箱の中にいれて、光照射12 h/dを維持する。小麦、玉蜀黍、大豆と水稲は5d後、ほかの植物は10d後、発芽率（種と芽の長さ同等で発芽とみなす）を計算するため、それぞれ芽と根の長さを測る。結果は表9で示す。
【００６３】
表９は濃度異なるテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸混合物が雑草と作物の発芽に対する影響を示す。
【表９】
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【００６４】
表9の結果から、特定の濃度の場合、テヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸混合物はメヒシバ、イヌヒエなどの雑草、水稲、小麦などの作物に対して、その発芽を抑制する作用があるが、大豆の発芽への影響が小さいことを示している。これはテヌアゾン酸、イソ-テヌアゾン酸を生物除草剤とする場合の実施範囲の根拠とすることができる。
【国際調査報告】
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