(57)【要約】  本発明は、キトサンが約３．０〜約７．５の範囲のｐＨで沈殿するキトサンの群から選択される、約４．０未満のｐＨを有する溶媒に溶解したキトサンおよび上記キトサン溶液に可溶な少なくとも１つの薬物を含む、徐放薬のための組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）約３．０〜約７．５の範囲のｐＨで沈殿するキトサンの群から選択される、約４．０未満のｐＨを有する溶媒に溶解したキトサン、および
ｂ）前記キトサン溶液に可溶な少なくとも１つの薬剤化合物、
を包含する、徐放薬用の組成物。
【請求項２】
前記キトサンが約５．０〜約７．５の範囲のｐＨで沈殿するキトサンの群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記溶媒が、０．１ＭのＨＣｌおよび／または水であることを特徴とする請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記薬物が、ジクロフェナクナトリウム、イブプロフェンナトリウム、バルプロ酸ナトリウムおよび／または同様のものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
前記キトサンの分子量が約５００〜約４００，０００であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前期薬物が、約０．１〜１０重量対容量％濃度の量で組成物中に存在することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記キトサンが、約１〜１５重量対容量％濃度の量で組成物中に存在することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物を薬物徐放に使用する方法。
【請求項９】
前記組成物が経口投薬であることを特徴とする請求項８記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物徐放のためのキトサン含有組成物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンは、事実上非常に入手し易い天然物質である。キトサンは、他の重合体と比較して、安価で、非毒性、生物分解性であり、また、生体適合性である。キトサンの製薬学的用途は非常に多い。科学文献および医学文献には、数百の工業用、医療用および食用のキトサンの用途が記載されている。非特許文献１および２参照。キトサナーゼがある種の細菌には存在するが、ヒトにはないことから、キトサンは、経口経路では消化しにくいと考えられている。
【０００３】
ドラッグ・デリバリーの賦形剤として、キトサンは２１世紀の薬物担体と考えられている。ドラッグ・デリバリー制御システムにおける可能性のため、製薬産業による広範囲にわたった調査が行われている。ドラッグ・デリバリー制御システムにおけるキトサンの利用は、その放出が、薬の理化学的性質よりも製剤によって決定されるようにするため、薬の放出を速度論的に制御する微粒子または高分子系を含む固形の剤型の調製を目的としている。例を挙げれば、次の通りである：キトサンの直接圧縮錠、胃壁に付着するキトサンのミクロスフィア、溶出溶媒に晒してスポンジ構造を形成する、無水酢酸およびグルタルアルデヒドと架橋するキトサン、および、徐放薬物担体として調製されるキトサンビーズ。
【０００４】
固体の薬剤組成物の投与は、ある種の患者にとっては不便な場合がある。液体と比較して、固体の投薬形態は飲み込みにくいため、固体の投薬形態は、子ども、乳児および新生児には与えることができない。さらには、錠剤を飲めない大人もおり、それに加えて、一回分の投薬量は、特に高力価の薬剤では、固体の投薬形態と比較して、液体の投薬形態の方がより多くの量を与えることが可能である。
【非特許文献１】J. Karlsen and O. Skaugrud, Exicipient Properties of Chitosan, Manufacturing Chemist, 62, p. 18, 1991
【非特許文献２】I. Orienti, K. Aieda, C. Ponti, E. Gianasi, V. Zecchi, Progesterone Loaded Chitosan Microspheres, Effect of triethylene glycol glutarate linked to the chitosan molecule on drug release, S.T.P. Pharm. Sci., 6, p. 424-429, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、先行技術の不利な点の克服、および、患者に容易にかつ確実に投与されるであろう、薬物徐放のための組成物の提供が、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、ａ）約３．０〜約７．５の間の範囲のｐＨで沈殿するキトサンの群より選択される、約４．０未満のｐＨを有する溶媒に溶解したキトサン、および、ｂ）キトサン溶液に溶解可能な少なくとも１つの薬剤化合物、を包含する徐放薬用の組成物によって達成される。
【０００７】
キトサンは、ｐＨが５．０〜７．５の範囲で沈殿するキトサンの群から選択されることが望ましく、６．０〜７．５が好ましく、６．５〜７．５がさらに好ましく、７．０〜７．５が最も好ましい。
【０００８】
さらには、溶媒は、０．１ＭＨＣｌおよび／または水であることが好ましい。
【０００９】
１つの好ましい実施の態様では、薬は、ジクロフェナク、イブプロフェンナトリウム、バルプロ酸ナトリウムおよび／または同種のものである。
【００１０】
キトサンが、約５００〜約４００，０００、好ましくは約５００〜約１００，０００の分子量を有する組成物が提供されるであろう。
【００１１】
薬は、約０．１〜１０重量対容量％濃度の量で液体組成物中に存在することが好ましく、０．１〜２重量対容量％濃度がさらに好ましい。
【００１２】
また、キトサンは、約１〜１５重量対容量％濃度の量で液体組成物中に存在することが好ましく、１〜５重量対容量％濃度がさらに好ましい。
【００１３】
本発明にかかる組成物は、薬物徐放に利用して差し支えない。
【００１４】
液体組成物は、経口投与されることが好ましい。
【００１５】
意外にも、本発明に従った液体組成物の利用により、ｐＨがやや高めの薬の放出が腸管に対して持続的に行われることから、ジクロフェナクナトリウムまたはイブプロフェンナトリウムなどの酸性薬物による深刻な副作用から胃が保護される可能性があることが判明した。これまで、ジクロフェナクナトリウムまたはイブプロフェンナトリウムは、酸性の媒体には不溶性であると考えられていた。しかしながら、本発明に従った液体組成物に利用される際に、それぞれのキトサンポリマー溶液と組み合わせた場合には、酸性の媒体（ｐＨ５．０未満）に対して溶解性に変わる。
【００１６】
ｐＨの上昇と共に、ｐＨ値によるキトサンの沈殿に起因して、薬はゆっくりと放出された。ヒトの腸管のｐＨは、１．０〜７．８の間で変化し、ここで、胃は酸性であり（ｐＨ約１．０〜３．０）および小腸のｐＨは約５．５０〜７．８である。
【００１７】
本発明の液体組成物を利用する場合、薬の放出は、消化管の特異的領域、例えば、十二指腸および結腸を目的として差し支えない。徐放は、特に、薬とともに利用するキトサンの分子量によって決定されると考えられている。
【００１８】
さらには、胃中の薬の滞在時間は、本発明にかかる組成物に、粘膜付着性ポリマーおよび／または粘度上昇ポリマーを加えることによって、胃の外部の溶液除去率を変化させることにより、提供可能であることが観察された。
【００１９】
本発明の更なる利点および特性は、添付の図面を参照しつつ、後に続く好ましい実施の形態についての詳細な説明を研究することにより、明らかになるであろう。
【実施例】
【００２０】
キトサンオリゴ糖の分離方法
本発明に従った薬物徐放のための液体組成物を調製する目的で、市販されているキトサン混合物からキトサンの１画分（または数画分）を調製することが必要である。
【００２１】
Ａ）２５ｇのキトサンオリゴ糖混合物を、５００ｍｌの蒸留水または０．１Ｍ ＨＣｌに溶解し、６．０Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ１．０に調節した。キトサンオリゴ糖混合物は、例えば、分子量が２，０００以下、分子量が３，０００以下、分子量が４，０００以下、分子量が１０，０００以下、分子量が５０，０００以下、分子量が１０，０００〜１００，０００の間、分子量が１００，０００または２５０，０００〜４００，０００以下のキトサンを含む混合物であって差し支えない。各キトサン溶液を、次に、０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターを用いて濾過した。
【００２２】
Ｂ）上述のように調製した各キトサン溶液（それぞれ異なる分子量を有する）について、沈殿物を、次のとおりに、異なるｐＨ値で回収した。
【００２３】
１．濾液のｐＨを、１．０Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いてｐＨ３．０に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２４】
２．処理１で得られた濾液のｐＨを、１．０Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いてｐＨ４．０に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２５】
３．処理２で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ５．０に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２６】
４．処理３で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２７】
５．処理４で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２８】
６．処理５で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ６．５に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００２９】
７．処理６で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００３０】
８．処理７で得られた濾液のｐＨを、１．０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調節し、濾過し、沈殿物を回収する。
【００３１】
Ｃ）上記沈殿物をそれぞれ０．１ＭのＨＣｌに溶解させることにより、精製した。次に、１ＭのＮａＯＨを加え、ｐＨを、各調製液を沈殿させるためのｐＨまで上昇させた。沈殿物を濾過して回収した。この処理を２回繰り返した。
【００３２】
Ｄ）上記のように調製した沈殿物を風乾し、粉砕し、粉末として回収した。
【００３３】
異なる分子量を有するキトサンで、ｐＨが５．０〜８．０の範囲にある上記により得られたキトサン沈殿物のいくつかを、更なる評価に用い、また、キトサン画分および複数の種類の薬を用いて、徐放薬のための溶液を調製した。
【００３４】
１．モデル薬物としてジクロフェナクナトリウムを用いた生体内における薬の放出試験
実施例１
ｐＨ５．０におけるキトサン混合物（分子量１００，０００以下）から、処理Ｂ３で回収した沈殿物を風乾し、粉砕し、粉末として回収した。この粉末２．０ｇを０．１ＭのＨＣｌ ２０ｍｌに溶解させた。溶液のｐＨを、６．０ＭのＨＣｌを用いて２．０に調節した。キトサンの結果として得られた濃度は、１０重量対容量％である。
【００３５】
さらには、更なる評価に用いるため、次の溶液を調製した。
【００３６】
溶液（１）：１５ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクナトリウムのプロピレン・グリコール溶液１．６６７ｍｌを、上記のように調製したキトサンオリゴ糖溶液２０ｍｌに加えた。
【００３７】
溶液（２）：１５ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクナトリウムのプロピレン・グリコール溶液１．６６７ｍｌを、蒸留水２０ｍｌに加えた。
【００３８】
溶液（３）：蒸留水１．６６７ｍｌを、上記のように調製したキトサンオリゴ糖溶液２０ｍｌに加えた。
【００３９】
溶液（４）：０．１ＭのＨＣｌ溶液を用い、ｐＨを他の溶液と同じになるように調節した。１５ｍｇ／ｍｌのジクロフェナクナトリウムのプロピレン・グリコール溶液１．６６７ｍｌを上記のように調製したキトサンオリゴ糖溶液２０ｍｌに加えた。
【００４０】
調製した４種類の溶液に、０．１ＭのＨＣｌを６００ｍｌずつ加え、温度３７℃、５０ｍｉｎ−１（５０ｒｐｍ）の速度のＵＳＰパドル装置を用いて攪拌した。０．２Ｍのリン酸三ナトリウムを段階的に加え、ｐＨを次のようにゆっくりと上昇させた。
【００４１】
１．０．１ＭのＨＣｌ（ｐＨ１．２０）を６００ｍｌ。
【００４２】
２．上記溶液に、０．２Ｍのリン酸三ナトリウム１０５．０ｍｌを加え、ｐＨ２．９２にする。
【００４３】
３．０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．０ｍｌ加え、ｐＨ４．２５にする。
【００４４】
４．０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに３．０ｍｌ加え、ｐＨ５．２０にする。
【００４５】
５．０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．７５ｍｌ加え、ｐＨ６．０６にする。
【００４６】
処理Ｂ３（分子量１００，０００以下）に従って調製したキトサン画分からの薬物放出のパーセンテージを、以下にまとめる。薬物放出は、当業者に知られている標準的な溶解方法により測定する。例えば、M. Sheu, H. Chou, C. Kao, C. Liu, T. Sokotoskiによる Dissolution of Diclofenac Sodium from Matrix Tablets, Int. J. Pharm., 85, pp. 57 - 63, 1992を参照のこと。
【表１】
2008530148.tif 000002
【００４７】
図１は、表１で得られた結果を表している。
【００４８】
実施例２
ｐＨ６．０におけるキトサンオリゴ糖混合物（分子量１０，０００〜１００，０００）から、処理Ｂ５で回収した沈殿物を風乾し、粉砕し、粉末として回収した。キトサン溶液を、前述の実施例１のように調製し、さらに、実施例１にあるように４種類の溶液を調製した。さらには、次のスキームに従って、リン酸三ナトリウムを加えることにより、ｐＨを上昇させた。
【００４９】
１）０．１ＭのＨＣｌ（ｐＨ１．２０）を６００ｍｌ。
【００５０】
２）上記溶液に、０．２Ｍのリン酸三ナトリウム１０５．０ｍｌを加え、ｐＨ２．９２にする。
【００５１】
３）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．０ｍｌ加え、ｐＨ４．２５にする。
【００５２】
４）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに３．０ｍｌ加え、ｐＨ５．２０にする。
【００５３】
５）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．７５ｍｌ加え、ｐＨ６．０６にする。
【００５４】
６）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに４５．０ｍｌ加え、ｐＨ６．８８にする。
【００５５】
処理Ｂ５（分子量１０，０００〜１００，０００）で得られたキトサン画分からの薬物放出のパーセンテージを、以下にまとめる。
【表２】
2008530148.tif 000003
【００５６】
表２で得られた結果は、図２にも示されている。
【００５７】
実施例３
ｐＨ７．０におけるキトサンオリゴ糖混合物（分子量１０，０００以下）から、処理Ｂ７で回収した沈殿物を風乾し、粉砕し、粉末として回収した。キトサン溶液および溶解反応を評価するための溶液を、実施例１に従って調製し、これらの溶液のｐＨを、次のスキームに従い、リン酸三ナトリウムを用いて修正した。
【００５８】
１）０．１ＭのＨＣｌ（ｐＨ１．２０）を６００ｍｌ。
【００５９】
２）上記溶液に、０．２Ｍのリン酸三ナトリウム１０５．０ｍｌを加え、ｐＨ２．９２にする。
【００６０】
３）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．０ｍｌ加え、ｐＨ４．２５にする。
【００６１】
４）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに３．０ｍｌ加え、ｐＨ５．２０にする。
【００６２】
５）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．７５ｍｌ加え、ｐＨ６．０６にする。
【００６３】
処理Ｂ７（分子量１０，０００以下）で得られたキトサン画分からの薬物放出のパーセンテージを、以下にまとめる。
【表３】
2008530148.tif 000004
【００６４】
表３で得られた結果は、図３にも示されている。
【００６５】
実施例４
ｐＨ７．５におけるキトサンオリゴ糖混合物（分子量５，０００以下）から、処理Ｂ８で回収した沈殿物を風乾し、粉砕し、粉末として回収した。キトサン溶液および溶解反応を評価するための溶液を、実施例１に従って調製した。これらの溶液のｐＨを、次のスキームに従い、リン酸三ナトリウムを用いて修正した。
【００６６】
１）０．１ＭのＨＣｌ（ｐＨ１．２０）を６００ｍｌ。
【００６７】
２）上記溶液に、０．２Ｍのリン酸三ナトリウム１０５．０ｍｌを加え、ｐＨ２．９２にする。
【００６８】
３）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．０ｍｌ加え、ｐＨ４．２５にする。
【００６９】
４）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに３．０ｍｌ加え、ｐＨ５．２０にする。
【００７０】
５）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに６．７５ｍｌ加え、ｐＨ６．０６にする。
【００７１】
６）０．２Ｍのリン酸三ナトリウムをさらに４５．０ｍｌ加え、ｐＨ６．８８にする。
【００７２】
処理Ｂ８（分子量５，０００以下）で得られたキトサン画分からの薬物放出のパーセンテージを、以下にまとめる。
【表４】
2008530148.tif 000005
【００７３】
表４で得られた結果は、図４にも示されている。
【００７４】
上記の結果は、キトサン溶液の異なる画分を用いてｐＨを変化させる場合に、ジクロフェナクナトリウムが徐放を示すことを例証している。これらの状況は、ヒトが溶液を経口で取り込む場合の消化管の状態と似ている。
【００７５】
キトサン溶液に含める薬の量は、２５ｍｇのジクロフェナクナトリウム／２２ｍｌであった。この投薬量は、市販のジクロフェナクナトリウム投薬量が１２．５ｍｇから始められ、１５０ｍｇまでであることから、現実的だと思われる。
【００７６】
２．イブプロフェンナトリウムキトサン複合体の生体内における研究
イブプロフェンナトリウムは、生体内における徐放の提案を証明する別のモデル薬物である。
【００７７】
異なる分子量（Ｍｗ３０００未満、５０００未満および１００００未満）のキトサンについて、イブプロフェンの放出の調節に関する評価を行った。各徐放性のキトサン複合体溶液には、イブプロフェンナトリウムとキトサンの複合体を含めた。溶液の最終的なｐＨは６．６であった。複合体の経口溶液の投薬量は、３０ｍｇのイブプロフェン／ｋｇウサギであった。参照する即効性の経口溶液は、投薬量１０ｍｇのイブプロフェン／ｋｇウサギで与えた。血液試料を所定の時間の間隔で採取し、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分析前に、−２０℃の冷凍庫に入れた。試料を、ＨＰＬＣ法を用いて分析した。ＨＰＬＣによるイブプロフェンの濃度を測定する簡易で迅速な方法を開発した。ナプロキセンを内部標準として用いた。移動相：水：アセトニトリル（４０：６０）を、次に、Ｈ３ＰＯ４でｐＨが２．４になるように調整する。カラム：ウォーターズ社製、シンメトリー（登録商標）、５μｍ、Ｃ１８、および１５０×４．６ｍｍ。内部標準原液：５ｍｇのナプロキセンを５０ｍｌのＭｅＯＨに溶解させる。注入ループ：５０μｌ。流速：１ｍｌ／分。波長：２２０ｎｍ。
【００７８】
試料の調製：１００Ｌの血漿を試験管に移し、１０Ｌの内部標準原液を加え、０．２５ｍｌの１Ｍ ＨＣｌを加えて３０秒間振り、５ｍＬの（８５：１５）（ヘキサン：イソプロパノール）を加え、ボルテックスで１分間かき混ぜ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、４ｍｌの有機層を新しい試験管に移し、空気シャワーを用いて有機溶媒を蒸発させ、１ｍｌの移動層で戻す。本方法について、イブプロフェンのピークに対する干渉が存在しないことを示す、特異性の評価を行った。イブプロフェンの回収率は、８５〜９０％であった。較正曲線は、０．５〜１０ｇ／ｍｌの濃度では直線であった。
【００７９】
キトサン複合体の溶液には、１２ｍｇのイブプロフェン／ｍｌが含まれていた。各ウサギへの投薬量は３０ｍｇ／ｋｇであった。
【００８０】
即効性の水溶液には、４ｍｇのイブプロフェン／ｍｌの濃度のイブプロフェンナトリウムが含まれていた。参照として与えられる投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇであった。この投薬量（１０ｍｇ／ｋｇウサギ）は、体重６０ｋｇのヒトに与えられる６００ｍｇのイブプロフェンと等価である（大人に対する通常の即効性の投薬量は、１日３回、２００〜６００ｍｇである）。徐放薬の調製では、製剤には、１日当たりの総量が含まれるべきであり、一度に、すなわち、３０ｍｇ／ｋｇが与えられるべきである。
【００８１】
このことは、即効性の溶液に比べて３倍になる徐放性溶液の投薬量が、正当であることを保証している。徐放の利点の一つは、１日１回の投薬により、薬の投与回数を減らせることである。
【００８２】
図５〜７に示すように、即効性の溶液からの薬物放出は、非常に早く生じ、最大に達し、下降もまた、非常に早い。
【００８３】
図５〜７は、複合体試料からのイブプロフェンの放出の特徴が、ｐＨによって決定されることを示している。異なったｐＨを持つある特定部分を薬が通過するときに、薬の一部が放出される。最初の部分では、放出される薬は、イブプロフェンの即効性の溶液から放出されるものとほとんど等価か、もしくはそれより少ない。
【００８４】
例えば、キトサンの分子量３０００未満の徐放性の溶液では、最高血中濃度比に基づいた最初の測定時点では、即効性の血漿レベルの約７０％に達した。その上、キトサンの分子量５０００未満およびキトサンの分子量１００００未満の徐放性の溶液では、最初の測定時点において、即効性の血漿レベルのそれぞれ約４５％および約８６％に達した。このことから、３０ｍｇ／ｋｇの徐放性の投薬量が、急速に吸収されなかったことがはっきりと示されている。複合体が、消化管の内部で起こるｐＨ変化および薬のキトサン複合体の分子量に依存するＧＩＴのあらゆるところをも通過することにより、薬のわずかな部分が輸送された。
【００８５】
上記の結果は、イブプロフェンが、キトサン複合体として与えられる場合に、消化管を通過する際に、徐放性を示すことを例証するものである。
【００８６】
前述の説明、特許請求の範囲、および／または図面において開示した特徴は、両方を独立して、および、それらのいずれかの組み合わせにおいて、それらの多様な形態で本発明を実現するための材料であって構わない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ｐＨ５．００のキトサン画分を用いたキトサンジクロフェナクナトリウム溶液における遊離のジクロフェナクナトリウムのパーセンテージ。
【図２】ｐＨ６．００のキトサン画分を用いたキトサンジクロフェナクナトリウム溶液における遊離のジクロフェナクナトリウムのパーセンテージ。
【図３】ｐＨ７．００のキトサン画分を用いたキトサンジクロフェナクナトリウム溶液における遊離のジクロフェナクナトリウムのパーセンテージ。
【図４】ｐＨ７．５０の画分のキトサンを用いたキトサンジクロフェナクナトリウム溶液における遊離のジクロフェナクナトリウムのパーセンテージ。
【図５】即効性の溶液と比較した徐放性の溶液（キトサンの分子量３０００未満）のイブプロフェンナトリウムの血漿中濃度の時間プロフィール。
【図６】即効性の溶液と比較した徐放性の溶液（キトサンの分子量５０００未満）のイブプロフェンナトリウムの血漿中濃度の時間プロフィール。
【図７】即効性の溶液と比較した徐放性の溶液（キトサンの分子量１００００未満）のイブプロフェンナトリウムの血漿中濃度の時間プロフィール。
【図１】
2008530148.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2008530148.tif 000014
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