(57)【要約】  本発明は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。本発明はより詳細には、ｐ７５Ｒに比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。
2008521783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制することを特徴とする抗ＴＮＦα抗体。
【請求項２】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を実質的に抑制する、請求項１に記載の抗ＴＮＦα抗体。
【請求項３】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を４５％よりも大きく減少させる、請求項２に記載の抗ＴＮＦα抗体。
【請求項４】
ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を４０％以下減少させる、請求項３に記載の抗ＴＮＦα抗体。
【請求項５】
抗体或いはその機能的に活性なフラグメント又は誘導体である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体又はそのフラグメントがＣＤＲ移植抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又はそのエピトープ結合フラグメントである、請求項５又は請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体又はそのフラグメントが、１つ又は複数のエフェクター分子（複数可）にコンジュゲートされている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療用の医薬品を製造するための、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１０】
対象の自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療及び／又は予防するための方法であって、前記対象に、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗ＴＮＦα抗体及び薬学的に許容し得る担体を含む医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦαに対する抗体に関する。特に本発明は、例えばＴＮＦαがｐ５５レセプターに結合することを選択的に抑制することにより、ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介したＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、免疫系の細胞により放出され、免疫系の細胞と相互作用する炎症誘発性サイトカインである。ＴＮＦαは、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎及び多発性硬化症などの慢性疾患を含む多数のヒトの疾病で上方制御されることが示されている。
【０００３】
ヒトＴＮＦ−αは１７ｋＤａのタンパク質で、活性型はホモ３量体として存在する（Ｐｅｎｎｉｃａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、７２４〜７２９；Ｄａｖｉｓら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６、１３２２〜１３２６；Ｊｏｎｅｓら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３８、２２５〜２２８）。２つの構造的には関連するが機能的には異なる細胞表面レセプターであり、大部分の細胞型で同時発現するｐ５５Ｒ及びｐ７５Ｒとの相互作用を介して、ＮＦαはその生物学的効果を及ぼす（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら、１９９０、Ｃｅｌｌ、６１、３５１；Ｓｍｉｔｈら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１０１９）。ｐ５５Ｒは、ｐ５５ＴＮＦＲ、ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲ  Ｉ、ＴＮＦＲ  １及びＴＮＦＲＳＦ１ａとしても知られている。ｐ７５Ｒは、ｐ７５ＴＮＦＲ、ＣＤ１２０ｂ、ＴＮＦＲ  ＩＩ、ＴＮＦＲ  ２及びＴＮＦＲＳＦ１ｂとしても知られている。両レセプターはタンパク質加水分解で、ＴＮＦαを結合できる可溶性分子としても放出される。２つのレセプターの細胞外ドメインは、保存された位置に４〜６個のシステイン含む４つの反復するシステインに富むモチーフから成る配列相似性を示す。対照的に、これらの細胞質のシグナル伝達領域の配列には関連がなく、異なるシグナル伝達及び機能の様式を示唆している。
【０００４】
２つのレセプターの異なった役割が、２つのレセプターの１方又は両方を、遺伝的に欠損させたマウスの生成によって示された（Ｐｅｓｃｈｏｎら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０、９４３〜９５２）。本研究は、ｐ５５Ｒは多くのＴＮＦαを介した炎症反応の原因となり、ｐ７５Ｒはある環境下では、ＴＮＦα媒介炎症反応を抑制する働きをし、２つのレセプターは、ＴＮＦα機能に対する平衡システムとして働くことができることを明らかにした。
【０００５】
疾病の治療、特に関節リウマチを治療する方法としてのＴＮＦα活性の抑制が、抗体及び可溶性のレセプターなどの抑制剤を用いる、多くの異なる方法によって達成されている。例として、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからエンブレル（商標）として市販されているエタナーセプトが挙げられる。エタナーセプトはヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に連結した２つのｐ７５可溶性ＴＮＦ−レセプタードメインを含む組換え型の融合タンパク質である。Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  からレミケード（商標）として市販されているインフリキシマブは、マウス抗ＴＮＦα可変領域及びヒトＩｇＧ  １の定常領域を有するキメラ抗体である。Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＨｕｍｉｒａ（商標）として市販されているアダリムマブは、組換え型の完全なヒト抗ＴＮＦα抗体である（ＴｕｓｓｉｒｏｔとＷｅｎｄｌｉｎｇ、２００４、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５、５８１〜５９４）。その他の抑制剤には、天然のＴＮＦαを使って３量体を形成し、受容体結合を妨げる操作したＴＮＦα分子が挙げられる（Ｓｔｅｅｄら、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０１、１８９５〜１８９８；ＷＯ０３０３３７２０；ＷＯ０１６４８８９）。
【０００６】
ＴＮＦα活性を抑制するこれら現在の方法は、ｐ５５及びｐ７５レセプターの両方にＴＮＦαの結合を妨げる（例えば、Ｍｅａｓｅ、２００５、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ、５、１１、１４９１〜１５０４を参照のこと）。興味深いことに、レネルセプト及びインフリキシマブはいずれも、多発性硬化症を悪化させることが明らかになり、ＭＳに関してＴＮＦαの有益な役割があることも示唆している（ＷｉｅｎｄｌとＨｏｈｌｆｅｌｄ、２００２、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、１６、１８３〜２００）。現在では、ＭＳの急性期におけるＴＮＦαの有害な効果には、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達が必要であるが、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達が、炎症性浸潤の除去などの有益な効果に導くと考えられている。このＴＮＦαの免疫抑制の役割が、他の自己免疫性疾患でも提案されている（Ｃｏｐｅ、１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０、６６９〜６７６）。実際に、ｐ７５Ｒアゴニストは、アレルギー性気管支喘息のようなアレルギー性疾患の治療に用いることができることが示唆されている（ＷＯ９９／５９６３２）。
【０００７】
２つのレセプターがＴＮＦαに結合する正確なメカニズムは分かっていないが、１つの報告では、類似した相互作用部位を用いて、両方のＴＮＦαレセプターがＴＮＦαと結合することを示唆している（Ｂａｎｎｅｒら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７３（４３１〜４４５））。ＴＮＦαポリペプチドでの点突然変異を用いた多くの研究で、サブユニットの底部寄りに位置する表面ループの小さな領域が、機能的に最も関連していることが示されている。３量体では、これらの領域は２つのサブユニットの間の表面の溝の反対側に互いに向き合っている。このことは、１つのレセプターは、２つの隣接したサブユニットの部位と相互作用し、ＴＮＦα３量体は、３つの空間的には異なるが、等価なレセプター結合部位を有することを示唆している。両方のレセプターが、同時に同じ３量体に結合できることが可能であるとは考えられない（Ｂａｒｂａｒａら、１９９４、ＥＭＢＯ、１３、８４３〜８５０）。
【０００８】
しかし、ｐ７５又はｐ５５レセプターに選択的に結合するＴＮＦα変異体を作製することは可能であった。ｐ５５Ｒに結合しないが、ｐ７５Ｒには結合するＴＮＦα変異体は、抗腫瘍活性を保持するが、炎症誘発性活性の減少を示すことが明らかにされた（Ｂａｒｂａｒａら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３、８４３〜８５０）。このことが、天然のＴＮＦαに対して見られる全身毒性を避けるため、抗癌治療用に研究されているｐ７５Ｒに選択的なＴＮＦαの変異体の作製につながった（Ｂｕｒｒｅｓｓ  Ｗｅｌｂｏｒｎ  ＩＩＩら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１８４、１６５〜１７１；ＵＳ５，６０６，０２３；ＥＰ０４８６９０８；ＥＰ０６１９３７２；ＥＰ０５６３７１４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＭＳのような特定の自己免疫性疾患及び特定の炎症性疾患の治療のためには、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達には殆ど影響を与えずに、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を、選択的に抑制できることが望ましい。
【００１０】
ｐ５５Ｒを介するシグナル伝達の選択的抑制は、ｐ５５レセプター特異的抗体を用いて達成できるであろう。現在まで、マウスのｐ５５及びｐ７５レセプターに選択的な抗体のみが分離されている（Ｓｈｅｅｈａｎら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１、６０７〜６１７）。しかし、これらの抗体がレセプターの可溶型にも結合でき、可溶性レセプターの保護効果を失うばかりでなく、抗体の有効性を減少させるので、抗レセプター抗体の使用は潜在的欠点を伴う。さらに、抗体は一旦レセプターと結合すると、それ自体シグナル伝達を引き起こし得る、すなわちアゴニストになり得るリスクも存在する。また、低レベルではあるが体の大部分の細胞型でｐ５５Ｒが見られるので、大量の抗体が、十分なｐ５５Ｒシグナル伝達遮断の達成には必要とされるだろう。したがって、その代わりにより少量のリガンドであるＴＮＦαのシグナル伝達を、ｐ５５Ｒを介して、例えばｐ５５Ｒに対する結合の遮断によって選択的に遮断することがより優れているだろう。ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達は保持しているが、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体についての報告は今までになかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
意外にも、ｐ５５及びｐ７５レセプターがＴＮＦα３量体上の同じ結合部位を明らかに共有しているにもかかわらず、例えばＴＮＦαのｐ５５Ｒへの結合を選択的に抑制して、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を分離できることを、本発明者らは実証することができた。それゆえ、本発明は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。特に、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する。したがって本発明の抗体は、本抗体がｐ５５Ｒで仲介されるＴＮＦαの効果を選択的に抑制でき、一方でｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達の有益な効果保持できるという有利な特性を有する。したがって、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防用の医薬品の製造のための、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体の使用も、本発明は提供する。さらに、対象の自己免疫又は炎症性疾患の治療及び／又は予防のために、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗体の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
抗体の可変領域の残基には、Ｋａｂａｔらによって考案された方式に従って慣例通りに番号をつける。この方式は、Ｋａｂａｔら、１９８７、ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以下「Ｋａｂａｔら（上述の）」という）に記載されている。特に示された場合を除いて、このナンバリング方式が本明細書で用いられる。
【００１３】
Ｋａｂａｔの残基命名は、アミノ酸残基の直線的な番号付けと必ずしも直接的には対応していない。実際の直線的なアミノ酸配列が、厳密なＫａｂａｔのナンバリングより少いか又は多くのアミノ酸を含む場合があり、ナンバリングは、基本的な可変領域構造のフレームワークであれ相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、構造成分の短縮又は構造成分への挿入に対応している。任意の抗体に対して、抗体配列の相同な残基を「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列と並べることにより、正しい残基のＫａｂａｔナンバリングを決定することができる。
【００１４】
Ｈ鎖可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈｌ）残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．とＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６、９０１〜９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループが、残基２６から残基３２まで延びている。したがって、本明細書で使用した「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔのナンバリング方式とＣｈｏｔｈｉａの位相的なループ定義の組合せにより記載されるように、残基２６〜３５を含む。
【００１５】
Ｌ鎖可変領域のＣＤＲは、Ｋａｂａｔのナンバリング方式に従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００１６】
本発明の抗ＴＮＦα抗体は、選択的にＴＮＦαに結合する。選択的に結合するということは、抗体が他ポリペプチドに対するよりもＴＮＦαポリペプチドに対してより大きな親和性を有することを意味する。ＴＮＦαポリペプチドは、ヒトＴＮＦαであることが好ましい。
【００１７】
ＴＮＦαポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞を、特異的に前記ポリペプチドを認識する抗ＴＮＦα抗体産生に用いることができる。ＴＮＦαポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド、又は生物学的に活性なフラグメント、又はレセプター結合部位を含むこれらの誘導体であってもよい。ＴＮＦαポリペプチドは、成熟ポリペプチドであるのが好ましい。ＴＮＦαポリペプチドは、当分野で既知の方法により、発現系を含む遺伝子改変の宿主細胞から調製できるか又は、天然の供給源から回収されてもよい。本明細書中では、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらの用語は、特に断わらない限り互換的に用いられる。ＴＮＦαポリペプチドは、場合によっては、例えば親和性タグに融和した融合タンパク質などの、さらに大きなタンパク質の部分あってもよい。動物に免疫処置が必要な場合、動物に、好ましく人間以外の動物に、周知の通常の手法を用いてポリペプチドを投与して、これらのポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる（例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、Ｖｏｌ  ４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６を参照のこと）。多くの温血動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ又はブタを免疫してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが通常は選ばれる。
【００１８】
本発明で使用する抗ＴＮＦα抗体は、完全な抗体及び機能的に活性フラグメント又はそれらの誘導体を含み、これらに限定されるものではないが、モノクローナル、多価、多重特異的、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖の抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記のもののいずれかのエピトープ−結合フラグメントであってもよい。特定の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０とＷＯ２００５００３１７１（２００５年１月１３日に全て公開）に記載された抗体フラグメントも含む。抗体フラグメント及び抗体フラグメントを産生する方法は、当分野でよく知られている（例えばＶｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１．を参照）。
【００１９】
本発明で使用する抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分、すなわち特異的に抗原と結合する抗原結合部位を有する分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えばＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，ＩｇＤ及びＩｇＡ）又は免疫グロブリン分子のサブクラスであってもよい。
【００２０】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインがもし存在する場合は、定常領域ドメインを抗体分子の提唱された機能及び必要とされることがある特にエフェクター機能を考慮して選択できる。例えば、定常領域ドメインが、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧの定常領域ドメインを用いることができ、抗体分子が治療的使用を目的とし、抗体のエフェクター機能が必要とされるときは、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプの定常領域ドメインを用いることができる。或いは、抗体分子が治療用途を目的とし、抗体のエフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２とＩｇＧ４アイソタイプを用いることができる。これらの定常領域ドメインの変異体も用いることができる。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８に記載されているように、２４１位のセリンがプロリンに変異したＩｇＧ分子を用いることができる。ＩｇＧ４定常ドメインにこの変異を含んでいるのが特に好ましい。
【００２１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）のような任意の当分野で知られている方法によって作製できる。
【００２２】
特異的抗体生産のために選択された単一のリンパ球から作製された可変領域ｃＤＮＡのクローニング及び発現により、単一リンパ球抗体法を用いて、本発明に使用する抗体を生成することもでき、例えばＢａｂｃｏｏｋ、Ｊら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３〜７８４８１；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７により記載された方法による。
【００２３】
ヒト化の抗体は、１つ若しくは複数の非ヒト種由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び１つのヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えばＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。
【００２４】
キメラ抗体は、Ｌ鎖及びＨ鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子断片から構成されるように遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子によってコードされたキメラ抗体である。これらのキメラ抗体は、抗原性が低い傾向がある。２価抗体は、当該分野で公知の方法により作製できる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５〜３６５９）。多価抗体は、多重特異性を含んでもよく、又は単一特異性であってもよい（例えばＷＯ９２／２２８５３を参照）。
【００２５】
本発明使用する抗体は、当該分野で公知の多様なファージディスプレイ方法を用いて作製することもでき、以下に開示されているものが含まれる。Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら、（Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７  ９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら、（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１〜２８０）並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８。単鎖抗体を生成する技法、例えばＵＳ４，９４６，７７８で記載された技術は、ＴＮＦαポリペプチドに対する単鎖抗体の生成にも適用できる。また、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物を含む他の生物を、ヒト化抗体の発現に用いてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
一実施形態では、本発明は、Ｈ鎖の可変領域が、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号９に示した配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１０又は配列番号２１に示した配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１１に示した配列を有するＣＤＲの、少なくとも１つを含む１つのＨ鎖を含む、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。
【００２７】
一例では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のうちの少なくとも２つが、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号９に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１０又は配列番号２１に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１１に示した配列から選択されるＨ鎖を含む。例えば、抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号９に示した配列を有し、及びＣＤＲ−Ｈ２が配列番号１０に示した配列を有する１つのＨ鎖を含んでもよい。代わりに、抗体が、ＣＤＲ−Ｈ１が配列番号９に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３が配列番号１１に示した配列を有する１つのＨ鎖を含んでもよく、或いは抗体が、ＣＤＲ−Ｈ２が配列番号２１に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３が配列番号１１に示した配列を有するＨ鎖を含んでもよい。疑義を回避するため、全ての置換を含むことは理解されよう。
【００２８】
一実施形態では、本発明に記載の抗体は、可変領域が、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号９に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１０に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１１に示した配列を含む１つのＨ鎖を含む。
【００２９】
一実施形態では、本発明に記載の抗体は、可変領域が、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号９に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号２１に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１１に示した配列を含む１つのＨ鎖を含む。
【００３０】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域が配列番号６に示した配列を含む、１つのＨ鎖を含む。
【００３１】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域が配列番号２０に示した配列を含む、１つのＨ鎖を含む。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、配列番号６に示した配列又は配列番号２０に示した配列に、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＨ鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、配列番号６に示した配列又は配列番号２０に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＨ鎖を含む。
【００３３】
本明細書で用いる「同一性」とは、整列配列において任意の特定の位置における、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で用いる「類似性」とは、整列配列において任意の特定の位置における、アミノ酸残基が配列間で類似した種類であることを示す。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンと置換されうる。互いにしばしば置換され得る他アミノ酸としては、限定するものではないが、
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
−リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基側鎖を有するアミノ酸）、
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
−システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。
同一性及び類似性の程度は、容易に評価さすることができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【００３４】
本発明はまた、Ｌ鎖の可変領域が、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１２に示した配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１３に示した配列を有するＣＤＲ及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１４に示した配列を有するＣＤＲの、少なくとも１つを含む１つのＬ鎖を含む、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。
【００３５】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｌ鎖の可変領域のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つが、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１２に示した配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１３に示した配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１４に示した配列から選択されるＬ鎖を含む。例えば、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が配列番号１２に示した配列及びＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１３に示した配列を有するＬ鎖を含んでもよい。代わりに、抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１が、配列番号１２に示した配列及びＣＤＲ−Ｌ３が、配列番号１４に示した配列を有するＬ鎖を含んでもよく、或いは抗体が、ＣＤＲ−Ｌ２が配列番号１３に示した配列、及びＣＤＲ−Ｌ３が配列番号１４に示した配列を有するＬ鎖を含んでもよい。疑義を回避するため、全ての置換を含むことは理解されよう。
【００３６】
一例では、本発明の抗体は、可変領域が、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１２に示した配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１３に示した配列及びＳＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１４に示した配列を含むＬ鎖を含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、Ｌ鎖の可変領域は、配列番号８に示した配列を含むＬ鎖を含む。
【００３８】
別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列に対して、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含むＬ鎖を含む。抗体は、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有す配列を含むＬ鎖を含むのが好ましい。
【００３９】
本発明の抗体分子は、それぞれ相補的Ｌ鎖又は相補的Ｈ鎖を含むのが好ましい。
【００４０】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号９に示した配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号１０又は配列番号２１に示した配列及びＣＤＲ−Ｈ３として配列番号１１に示した配列を含むＨ鎖、及びＬ鎖の可変領域が、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１２に示した配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１３に示した配列、及びＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１４に示した配列を含むＬ鎖を含む。
【００４１】
一実施形態において、抗体はＨ鎖の可変領域が配列番号６に示した配列を含むＨ鎖、及びＬ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列を含むＬ鎖を含む。
【００４２】
一実施形態において、抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、配列番号２０に示した配列を含むＨ鎖、及びＬ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列を含むＬ鎖を含む。
【００４３】
本発明のさらなる一実施形態では、抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、配列番号６に示した配列に対して、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列に対して、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含むＨ鎖及びＬ鎖を含む。抗体は、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号６に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＨ鎖、及び配列番号８に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＬ鎖を含むのが好ましい。
【００４４】
本発明のさらなる一実施形態では、抗体は、Ｈ鎖の可変領域が、配列番号２０に示した配列に対して、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列に対して、少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する配列を含むＨ鎖及びＬ鎖を含む。抗体は、Ｌ鎖の可変領域が、配列番号２０に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＨ鎖、及びＬ鎖の可変領域が、配列番号８に示した配列に対して、少なくとも９０％、９５％又は９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む１つのＬ鎖を含むのが好ましい。
【００４５】
本発明によって提供される１つの抗体を、本明細書では抗体「４６２」と呼ぶ。ラット抗体「４６２」のＨ鎖可変領域の完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号５及び６に示し、ラット抗体「４６２」のＬ鎖可変領域の完全なヌクレオチドとアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。ラットのリーダー配列を含むこの抗体のＨ鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号１及び２に示し、Ｌ鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号３及び４に示す。
【００４６】
本発明によって提供されるもう１つの抗体を、本明細書では抗体「４６３」と呼ぶ。ラット抗体「４６３」のＨ鎖可変領域の完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号１９及び２０に示し、ラット抗体「４６３」のＬ鎖可変領域の完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。ラットのリーダー配列を含むこの抗体のＨ鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号１５及び１６に示し、Ｌ鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を、配列番号１７及び１８に示す。
【００４７】
本発明はまた、抗体がｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制することを特徴とする、ＣＤＲ移植（又はヒト化）抗ＴＮＦα抗体を提供する。一実施形態では、ＣＤＲ移植抗体分子の中の１つ若しくは複数のＣＤＲが、ラット抗体４６２か又は４６３のいずれかから得られた。ラット抗体４６２のＣＤＲは、配列番号９、１０、１１、１２、１３及び１４で提供される。ラット抗体４６３のＣＤＲは、配列番号９、２１、１１、１２、１３及び１４で提供される。本明細書で用いる用語、「ＣＤＲ移植抗体分子」とは、Ｈ鎖及び／又はＬ鎖が、ドナー抗体（例えば本明細書に記載した抗体「４６２」又は「４６３」のようなラット抗体）から、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）のＨ鎖及び／又はＬ鎖可変領域のフレームワークに移植された、１つ若しくは複数のＣＤＲ（必要に応じて、１つ若しくは複数の改変されたＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照することができる。
【００４８】
ＣＤＲを移植する場合、ＣＤＲの由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む任意の適切なアクセプターの可変領域フレームワーク配列を用いてもよい。本発明のＣＤＲ移植抗体は、ヒトのアクセプターフレームワーク領域を含む可変領域、並びに１つ若しくは複数の上記のようなドナー抗体由来のＣＤＲを有するのが好ましい。それゆえ、可変領域は、ヒトのアクセプターフレームワーク領域及びヒト以外の、好ましくはラットのドナーＣＤＲを含むＣＤＲ移植抗体が提供される。
【００４９】
本発明で用いうるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭが挙げられる（Ｋａｂａｔら、上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭはＨ鎖に用いることができ、ＲＥＩはＬ鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭはＨ鎖及びＬ鎖に用いることができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を用いてもよい。これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で利用可能である。
【００５０】
本発明のＣＤＲ移植抗体において、アクセプターＨ鎖及びＬ鎖は、必ずしも同じ抗体から由来する必要はなく、所望であれば異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００５１】
また、本発明のＣＤＲ移植抗体において、フレームワーク領域はアクセプター抗体のフレームワーク領域と正確に同じ配列を有している必要はない。例えば、普通でない残基をそのアクセプター鎖クラス又はタイプにおいて、より高頻度に現れる残基に変えてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択した残基を、ドナー抗体において同じ位置に見られる残基に一致するよう変えてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４を参照）。そのような交換はドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限にとどめるべきである。アクセプターフレームワーク領域において、変更する必要がある残基を選択するためのプロトコルが、ＷＯ９１／０９９６７に述べられている。
【００５２】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲがもともと由来する抗体から由来する残基であり、ドナー抗体は、本発明の一実施形態では、本明細書に記載されるようなラット抗体「４６２」又は「４６３」のいずれでもよい。
【００５３】
本発明のいずれかの態様における抗体分子は、ＴＮＦαに対する高い結合親和性を有するのが好ましく、ピコモルでの結合親和性を有するのが好ましい。本発明の抗体分子は、約１〜５００ｐＭの間の結合親和性を有するのが好ましい。一実施形態において、本発明の抗体分子は、約１０〜４００ｐＭの間の結合親和性を有する。本発明によって提供される抗体の親和性を、当分野で知られている任意の適当な方法を用いて変更することができることは理解されるであろう。したがって本発明はまた、本発明の抗体分子の変異体であってＴＮＦαに対する改善された親和性を有するものに関する。必要な場合には、本発明に用いる抗体の親和性を、ＣＤＲの変異導入（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９〜７８３，１９９２）、大腸菌の変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９〜３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４〜７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２５６，７７〜８８，１９９６）及び有性のＰＣＲ（ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ）（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８〜２９１，１９９８）などの当分野において知られている親和性成熟プロトコルを用いて改善してもよい。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）はこれらの親和性成熟プロトコルについて論じている。
【００５４】
本発明によって提供される抗ＴＮＦα抗体は、例えばＴＮＦαのｐ５５Ｒへの結合を選択的に抑制することによって、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する。すなわち抗ＴＮＦα抗体は、このレセプターを介するシグナル伝達を減少させる。「選択的に抑制する」という用語は、本発明の抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制するよりもはるかに強く、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制することを意味する。それゆえ、一実施形態において、本発明は、ｐ７５Ｒに比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を提供する。本抗体は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を実質的に減少させるのが好ましい。一例では、本発明の抗体は、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を実質的に減少させる。一例では、本発明の抗体は、ｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制するよりも強く、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制する。本明細書で用いる用語、「抑制する」とは、完全な及び部分的な抑制を含むことは理解されるであろう。したがって、この用語は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達の完全な及び部分的な抑制を含む。抑制の程度は、用いた抗体量によって影響され得ることは理解されるであろう。
【００５５】
一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を４０％よりも強く、好ましく４０〜１００％、より好ましくは、４５〜１００％抑制する。一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、５０％又はそれ以上ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制する。一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、６０％又はそれ以上ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制する。一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、７０％又はそれ以上ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制する。一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、８０％又はそれ以上ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制する。一実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、９０％又はそれ以上ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制する。
【００５６】
一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を４０％よりも大きく、好ましく４０〜１００％に、より好ましくは４５〜１００％に減少させる。
【００５７】
本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達が殆ど変化しないのが好ましい。本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を好ましくは約５０％以下、好ましくは０〜５０％に減少させる。一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を約４０％以下に減少させる。一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を約３０％以下に減少させる。一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を約２０％以下に減少させる。一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を約１０％以下に減少させる。
【００５８】
一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合が殆ど変化しないのが好ましい。本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合を、約３０％以下に、好ましくは０〜３０％に、より好ましくは０〜２０％に、さらにより好ましくは０〜１５％に減少させる。
【００５９】
したがって、一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体が、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を５０％抑制する濃度で、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を、４０％以下に、一般には３０％以下に、通常は２５％以下に、概しては２０％以下に、理想的には１０％以下に減少する。
【００６０】
一例では、ＴＮＦαシグナル伝達を５０％抑制するために必要とされる抗体量は、ＩＣ５０として示される。したがって、一例では、本発明の抗ＴＮＦα抗体は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達に対するＩＣ５０よりも、少なくとも５倍低い、一般には少なくとも１０倍低い、概しては少なくとも１５倍低い、通常は少なくとも２０倍低い、理想的には少なくとも５０倍低い、好ましくは少なくとも１００倍低い、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達に対するＩＣ５０を有する。ＩＣ５０の数が低ければ低いほど、より高い活性の化合物を意味することを当業者には理解できよう。
【００６１】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制することによって抑制する抗ＴＮＦα抗体を同定するために、当業者によって多くの異なる方法がとられてもよい。一例では、これらの特性を有する抗体を、ＴＮＦαと相互作用する抗体をまず特定することにより同定し、次いでそれらの抗体を調べて、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗体を同定する。他の例では、ＴＮＦαと相互作用する抗体をまず特定し、次いでそれらの抗体を調べてｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制する抗体を同定し、必要に応じてシグナル伝達の選択的抑制に関して、それらの抗体さらにスクリーニングすることにより、抗体を同定する。或いは、ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介したＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗体を同定するために、抗体を直接スクリーニングしてもよく、例えばシグナル伝達及び／又は結合実験で直接スクリーニングすることによって抗体を直接スクリーニングしてもよい。
【００６２】
任意の適当な方法、例えばＴＮＦαポリペプチドが、候補抗体と接触し、候補抗体がＴＮＦαポリペプチドと相互作用する能力が測定されるアッセイ方式を用いて、ＴＮＦαと相互作用する抗体を同定できる。ＴＮＦαポリペプチドと相互作用する候補抗体の能力は、レファレンスレンジ又は対照と比較するのが好ましい。必要に応じて、複数の候補抗体をスクリーニングするために、このアッセイを用いることができる。一例では、天然の又は組換え型のＴＮＦαポリペプチドを含む第１試料及び第２試料を、候補抗体又は対照物質と接触し、ＴＮＦαポリペプチドと相互作用する候補抗体の能力を、候補抗体と対照物質とでの相互作用の差異を比較することによって測定する。例えば、特異的にＴＮＦαポリペプチドを認識して結合する固定化した抗体と、ポリペプチドを接触させるか又は、ＴＮＦαポリペプチドの精製調製物を、タンパク質を結合するように設計された表面に接触させて、ＴＮＦαポリペプチドをまず固定化するのが好ましい。ＴＮＦαポリペプチドは、部分的に又は完全に精製（例えば、部分的に又は完全に他ポリペプチドを含まない）されていてもよく、或いは細胞可溶化物の部分であってもよい。さらに、ポリペプチドは、ＴＮＦαポリペプチド又はＴＮＦαポリペプチドの生物学的に活性な部分、及びグルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの領域又はＩｇＧ１のＦｃ領域を含む融合タンパク質であってもよい。或いは、当業者によく知られた技法を用いて、ポリペプチドをビオチン標識してもよい（例えばｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。場合によっては、ＴＮＦαポリペプチド又は候補抗体を、例えば放射性標識（３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなど）、或いは蛍光標識（例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フトアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）又はフルオレサミン）で標識して、ＴＮＦαポリペプチドと候補抗体間での相互作用の検出を可能にする。ＴＮＦαポリペプチドと相互作用する候補抗体の能力は、当業者に既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、フローサイトメトリー又は応用技術（ＦＭＡＴ）によって測定することができる。
【００６３】
上記のように、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗体の能力に関して、ＴＮＦαを結合する抗体をスクリーニングする前に、抗体を予備スクリーニングして、ＴＮＦαを結合する抗体を同定してもよい。
【００６４】
一実施形態では、本発明の抗体は、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制することによって、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する。ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制する抗体を、任意の適当な方法によって同定することができ、例えば、
（ｉ）候補抗体の存在下でのｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合と、候補抗体の非存在下又は対照物質の存在下でのｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合とを比較すること、及び
（ｉｉ）候補抗体の存在下でのｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合と、候補抗体の非存在下又は対照物質の存在下でのｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合とを比較すること、及び
（ｉｉｉ）候補抗体が、ｐ７５Ｒと比べてｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を実質的に抑制するかどうかを測定することによって同定することができる。
【００６５】
このようなアッセイは、臨床モニタリング及び／又は薬剤開発において、候補物質のスクリーニングに用いることができる。
【００６６】
適切なＴＮＦαレセプター（ｐ５５Ｒ及びｐ７５Ｒ）の結合抑制アッセイの例が記載されている。例えばＵＳ５，６０６，０２３及びＬｏｅｔｓｃｈｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６８，２６３５０〜２６３５７を参照。適切な無細胞系アッセイ及び細胞ベースのアッセイのその他の例が、実施例で提供される。
【００６７】
ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制する候補抗体の能力を、レファレンスレンジ又は対照と比較するのが好ましい。必要に応じて、このアッセイは複数のレセプター結合抑制アッセイを用いて、複数の候補抗体のスクリーニングに用いることができる。無細胞系アッセイの１つの実施例では、天然又は組換え型のＴＮＦαポリペプチドを含む第１試料及び第２試料を、候補抗体又は対照物質と接触させ、ｐ５５Ｒ又はｐ７５ＲのいずれかへのＴＮＦαポリペプチドの結合を抑制する候補抗体の能力を、候補抗体及び対照物質の存在下で、それぞれのレセプターへのＴＮＦαの結合の差を比較することによって測定する。このようなアッセイの一例では、例えば、レセプターの細胞外ドメインを特異的に認識して結合する、固定化した抗体と適切なレセプターの細胞外ドメインを接触させることによって、又はレセプターポリペプチドの精製調製物を、タンパク質を結合するように設計した表面と接触させることによって、レセプターポリペプチドの細胞外ドメインを、まず固定化する。レセプターポリペプチドは、部分的に又は完全に精製（例えば、部分的に又は完全に他ポリペプチドを含まない）されていてもよく、或いは細胞可溶化物の部分であってもよい。さらに、レセプターポリペプチドは、レセプターの細胞外ドメイン又はレセプターの細胞外ドメインの生物学的に活性な部分、及びグルタチオニン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの領域又はＩｇＧ１のＦｃ部分を含む融合タンパク質であってもよい。或いは、当業者によく知られた技法を用いて、レセプターポリペプチドをビオチン標識してもよい（例えばｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。固定化されたｐ５５又はｐ７５レセプターへのＴＮＦαの結合を抑制する候補抗体の能力は、当業者に既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、フローサイトメトリー又は蛍光応用技術（ＦＭＡＴ）によって測定することができる。
【００６８】
このようなアッセイの他の例では、例えばＴＮＦαポリペプチドを、本ポリペプチドを特異的に認識して結合する、固定化した抗体と接触させることによって、又はＴＮＦαポリペプチドの精製調製物を、タンパク質を結合するように設計した表面と接触させることによって、ＴＮＦαポリペプチドをまず固定化する。ｐ５５Ｒ又はｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制する候補抗体の能力を、候補抗体を固定化したＴＮＦαポリペプチドと共にインキュベートし、ｐ５５Ｒ又はｐ７５ＲポリペプチドのいずれかとＴＮＦαポリペプチドを接触させ、レセプターがＴＮＦαポリペプチドに結合いるかどうかを検出することにより測定することができる。ｐ５５Ｒ及びｐ７５Ｒポリペプチドは、それぞれレセプターの細胞外のドメイン又はレセプターの細胞外のドメインの生物学的に活性な部分、及びＩｇＧ１のＦｃ部分などのドメインを含む融合タンパク質であってもよい。例えばペルオキシダーゼなどのレポーター基にコンジュゲートした、レセプター融合タンパク質のＦｃ部分に結合する抗ＩｇＧ  Ｆｃ抗体を用いて、レセプター結合が検出できる。レセプター結合の存否が、候補抗体がｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に遮断したかどうかを測定するために用いられる。
【００６９】
細胞ベースのアッセイを用いる他の例では、ｐ５５Ｒか又はｐ７５Ｒを発現している細胞集団をＴＮＦα及び候補抗体と接触させ、レセプターへのＴＮＦαの結合を抑制する候補抗体の能力を測定する。ＴＮＦα結合を抑制する候補抗体の能力を、レファレンスレンジ又は対照と比較するのが好ましい。細胞は、例えば真核生物由来（例えば哺乳動物又は酵母菌）でもよく、ｐ５５Ｒ又はｐ７５Ｒを内因的に発現してもよく、又は本ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されていてもよい。場合によっては、ＴＮＦαポリペプチドを、例えば放射性標識（３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉなど）、或いは蛍光標識（例えば、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フトアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）又はフルオレサミン）で標識して、ＴＮＦαポリペプチドとレセプター間での相互作用の検出を可能にする。ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及びＦＭＡＴなどの代替法も使用できる。
【００７０】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制することによって抑制する抗体が、細胞ベースのシグナル伝達アッセイを用いて同定できる。
【００７１】
一例では、マウスのｐ５５Ｒを発現するが、ｐ７５Ｒは発現しないＬ９２９細胞（マウス線維芽細胞株）が、候補抗体がｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を、例えばｐ５５Ｒへの結合を抑制することによって遮断するかどうかを決定するために用いられる。それゆえ、アクチノマイシンＤのようなタンパク合成阻害剤で感作された場合、これらの細胞はヒトＴＮＦαによって殺され、例えば候補抗体がｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を遮断する場合、タンパク合成阻害剤が細胞をＴＮＦα媒介細胞毒性から守る。したがって、アッセイの終わりに、細胞生存度測定して阻止抗体を検出できる。アッセイは、本明細書及びＷＯ９２／１１３８３で提供される実施例に詳述されている。
【００７２】
或いは、ＴＮＦαの結合に続く下流領域の遺伝子発現を検出するために、ＴＮＦαレセプターｐ５５又はｐ７５の少なくとも細胞外領域（又は細胞外領域のＴＮＦα結合部分）に連結したルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質等のリポーター遺伝子を用いる細胞ベースでのリポーター遺伝子アッセイにより、そのレセプターのうちの１つへのＴＮＦαの結合及びその結果生じたレセプターシグナル伝達を検出できる。このようなアッセイ例の詳細は、実施例の中に示されている。リポーター遺伝子発現の減少は、候補抗体がレセプターを介するＴＮＦαシグナル伝達を、例えばレセプターへの結合を抑制して遮断していることを示唆している。
【００７３】
ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を見つけるために、上述した方法を用いて、任意の適切な供給源からの多くの異なる抗ＴＮＦα抗体をスクリーニングする必要がある。したがって、本発明はｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を得る、
ａ）少なくとも１つの抗ＴＮＦα抗体を得ること、
ｂ）抗体が、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制することによって抑制するか否かを判定するために、ステップ（ａ）で得られる抗体をスクリーニングすること、及び必要な場合は、少なくとも１つの選択的な抗体が見つかるまでステップ（ａ）と（ｂ）を繰り返すことを含む方法を提供する。本方法のステップ（ｂ）で同定された抗体は、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に４５％よりも大きく抑制し、かつｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合を３０％以下に抑制するのが好ましい。
【００７４】
好ましい一実施形態では、本方法のステップ（ａ）で得る抗体は、免疫された動物から得られ、好ましくは、例えばＢａｂｃｏｏｋら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３〜７８４８；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及び国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７に記載される方法を用いて得られる。
【００７５】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制することを介して選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体が、例えば１つ若しくは複数の動物モデルで治療有効量を決定するために同定されるか、さらに試験されるであろう。適切な動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ及びネコが含まれるがそれに限定されない。用いる動物は、自己免疫又は炎症性疾患、例えばＭＳ、糖尿病、ＳＬＥ、関節リウマチ、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、バセドウ病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット疾病、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎又はクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患のモデルであるのが好ましい。
【００７６】
一例では、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達の選択的抑制は、疾病症状の回復又は改善、疾病の発症の遅れ又は緩徐性進行、例えば限定はされないが、臨床スコアの減少をモニターすることによって判定することがでる。自己免疫疾患に通じた医師に知られた技法は、候補物質が疾病に伴う１つ若しくは複数の症状を変更したかどうかの判定に用いることができる。
【００７７】
自己免疫性疾患の多くの異なるモデルが、当該技術分野において知られており、例えばＭＳに対する多くの疾病モデルがある（’ｔ  ＨａｒｔとＡｍｏｒ  ２００３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １６：３７５〜８３）。特に、ＡＢＨマウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ヒトのＭＳのモデルとして適当であるとみなされている（Ｂａｋｅｒら、１９９０．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８：２６１〜２７０）。急性及び再発寛解型のモデルが開発されている。
【００７８】
本発明はまた、ＴＮＦαポリペプチドの特異的な領域への抗体の結合が、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ７５Ｒと比べてｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制することにより抑制するＴＮＦαポリペプチドの特異的な領域を提供する。ＴＮＦαポリペプチドのこの特異的な領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体と組み合わせて、当分野において知られている任意の適切なエピトープマッピング法によって同定できる。このような方法の実施例には、抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合することができる最小フラグメントの本発明の抗体への結合に対して、さまざまな長さのＴＮＦα由来するペプチドをスクリーニングすることが含まれる。ＴＮＦαペプチドは、合成的に又はＴＮＦαポリペプチドのタンパク分解によって作製されてもよい。抗体を結合するペプチドは、質量分析によって同定できる。他の例では、ＮＭＲスペクトル法が本発明のエピトープの同定に用いられる。一度同定されると、本発明の抗体と結合するエピトープのフラグメントを、必要に応じて、同じエピトープと結合する新たな抗体を得るために用いることができる。
【００７９】
一実施形態では、抗体「４６２」若しくは「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１に示した１つ若しくは複数のＣＤＲを含む抗体の、ヒトＴＮＦαの特異的な領域又はエピトープへの結合が、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、ヒトＴＮＦαの特異的な領域又はエピトープが提供される。
【００８０】
ＴＮＦαへの本発明の抗体の結合を交差ブロックする抗体は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達の選択的抑制において同様に有効であろう。したがって、一実施形態では、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体がヒトＴＮＦαに結合するのを交差ブロックする及び／又はそれらの抗体のいずれか１つによってヒトＴＮＦαに結合することを交差ブロックする、ヒトＴＮＦαに特異性を有する抗体が提供される。一実施形態では、本発明のこの側面による抗体は、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体と結合したエピトープと境を接する及び／又は重なる１つのエピトープに結合する。或いは、本発明のこの側面による抗体は、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体又は前記エピトープと境を接する及び／又は重なるエピトープと同じエピトープに結合しない。
【００８１】
ヒトＴＮＦαへの交差ブロック抗体の結合が、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体の結合を妨げる場合又はその逆の場合、本発明のこの側面に記載の交差ブロック抗体を、当業界で公知の任意の適当な方法を用いて、例えば競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅを用いて同定できる。
【００８２】
本発明のこの側面の一実施形態では、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制し、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体の、ヒトＴＮＦαへの結合を交差ブロックする抗ＴＮＦα抗体が提供される。一実施形態では、本発明のこの側面によって提供される交差−遮断抗体は、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体の、ヒトＴＮＦαへの結合を、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上抑制する。
【００８３】
これに代えて、又はこれに加えて、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体によって、本発明のこの側面による抗体は、ヒトＴＮＦαに結合することが交差ブロックされる。したがって、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制し、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体によって、ヒトＴＮＦαへ結合することが交差ブロックされる抗ＴＮＦα抗体も提供される。一実施形態では、発明のこの側面によって提供される交差ブロック抗体は、抗体「４６２」又は抗体「４６３」又は配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４及び２１で提供される１つ若しくは複数のＣＤＲを含む任意の抗体によって、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上ヒトＴＮＦαへの結合が抑制される。
【００８４】
本発明に使用する抗体は、必要に応じてエフェクター分子にコンジュゲートすることができる。本明細書で用いる用語エフェクター分子は、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬剤、トキシン、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然のポリマー、核酸及び核酸のフラグメント例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子、並びに蛍光化合物又はＮＭＲ又はＥＳＲ分光法で検出できる化合物等のレポーター基である。一例では、抗ＴＮＦα抗体を、細胞障害性の物質、放射性核種又は薬剤部分などのエフェクター分子にコンジュゲートして、所定の生物反応を改変することができる。例えば、治療薬は、望ましい生物活性を持つタンパク質又はポリペプチドである薬剤部分であってもよい。上記の部分は、例としてであって限定するものではないが、トキシン例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン若しくはジフテリア毒素、タンパク質例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓性薬剤若しくは抗血管新生薬剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン、又は、生体応答調整物質例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の成長因子が含まれる。
【００８５】
他の例では、エフェクター分子は、細胞に有害（例えば、殺す）である任意の因子を含む細胞毒素又は細胞障害性因子であってもよい。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、並びにピューロマイシン及びピューロマイシンの類似物又は相同物が挙げられる。さらに、エフェクター分子には、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００８６】
他エフェクター分子には、放射性核種例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８、又は薬剤例えば限定するものではないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンを挙げることができる。
【００８７】
抗体に上記のエフェクター分子をコンジュゲートする技法は、当分野においてよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７，ｐｐ．６２３〜５３；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７〜１２３を参照）。一例では、抗体又は抗体のフラグメントを、必要に応じて、他のタンパク質のアミノ酸配列（又はそれらの部分で、好ましくはタンパク質の少なくとも１０個、２０個若しくは５０個のアミノ酸部分）にＮ末端又はＣ末端で共有結合（例えばペプチド結合）により融合する。抗体又は抗体のフラグメントが、抗体の定常ドメインのＮ末端で他タンパク質に結合されるのが好ましい。組換えＤＮＡ手法は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載される融合を作製するために用いることができる。
【００８８】
他の例では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を増大してもよく及び／又は免疫系に対する上皮性関門を越えて抗体の供給を増強してもよい。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２０８４で記載される分子のような、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が挙げられる。
【００８９】
一例では、本発明の抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着できる。１つの特定の例では、抗体は、抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体フラグメント中にある末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して付着できる。上記のアミノ酸は、天然に抗体フラグメントに存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いてフラグメントに加工してもよい。例えばＵＳ５，２１９，９９６を参照のこと。複数の部位を、２つ以上のＰＥＧ分子を付着するために用いることができる。ＰＥＧ分子は、抗体フラグメント中にある少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合で結合されるのが好ましい。チオール基を付着部位として用いる場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミド並びにシステイン誘導体などのチオールに選択的な誘導体を用いることができる。
【００９０】
他の例では、抗体は、例えばＥＰ  ０９４８５４４に開示された方法により、ＰＥＧ化された、すなわちＦａｂ’フラグメントにＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合で付着させた改変Ｆａｂ’フラグメントである［“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  ＨａｒｒｉｓとＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９８，Ｍ．ＡｓｌａｍとＡ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，５４：５３１〜５４５も参照のこと］。ＰＥＧは、ヒンジ領域でシステインに付着されるのが好ましい。一例では、改変Ｆａｂ’フラグメントは、改変されたヒンジ領域中の単一のチオール基に共有結合的に結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合的に結合されてもよく、リジン残基のそれぞれのアミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが付着されてもよい。したがって、Ｆａｂ’フラグメントに付着したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００のＤａである。
【００９１】
特定のＰＥＧ化された抗体フラグメントは、さらに、国際特許出願ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１中に記載されたものを含む。
【００９２】
本発明はまた、本発明の抗体分子のＨ鎖及び／又はＬ鎖（複数可）をコードする単離したＤＮＡ塩基配列を提供する。本ＤＮＡの塩基配列が、本発明の抗体分子のＨ鎖又はＬ鎖をコードするのが好ましい。本発明のＤＮＡ配列は合成ＤＮＡ、例えば化学的方法によって作製されたもの、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらのどんな組合せを含んでいてもよい。
【００９３】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は当業者によく知られた方法によって得ることができる。例えば、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の１部又は全部をコードするＤＮＡ配列は所望により、決定したＤＮＡ配列又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成することができる。
【００９４】
アクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡは当業者には広く入手可能であり、既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【００９５】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製するために分子生物学の標準的な技法を使用することができる。所望のＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成技法を用いて完全に又は部分的に合成することができる。適切ならば、部位特異的変異導入及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用することができる。
【００９６】
適切なＤＮＡの塩基配列の例が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１９に示されている。
【００９７】
本発明はまた、本発明の１つ若しくは複数のＤＮＡの塩基配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ若しくは複数のＤＮＡの塩基配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターを提供する。本クローニングベクター又は発現ベクターは本発明の抗体分子のＬ鎖及びＨ鎖をそれぞれコードする２つのＤＮＡ配列を含むのが好ましい。
【００９８】
ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は当業者によく知られたものである。この点について、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集），Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇから出版されているＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照することができる。
【００９９】
また、本発明の抗体をコードする１つ若しくは複数のＤＮＡの塩基配列を含む、１つ若しくは複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために、どのような適切な宿主細胞／ベクター系を使用してもよい。細菌系、例えば大腸菌及び他の微生物系を用いてもよく、又は真核生物の、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を用いてもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１００】
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を、本発明による抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質発現を誘導するために適切な条件下で培養し、前記抗体分子を単離することを含む、本発明の抗体分子を製造する方法を提供する。
【０１０１】
抗体分子はＨ鎖又はＬ鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、その場合はＨ鎖又はＬ鎖ポリペプチドコードの配列のみを宿主細胞をトランスフェクションするために使用する必要がある。Ｈ鎖及びＬ鎖の両方を含む産物の産生のためには、細胞株を２つのベクター、Ｌ鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及びＨ鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターでトランスフェクションすればよい。或いは、Ｌ鎖及びＨ鎖ポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを使用してもよい。
【０１０２】
また本発明は、例えば、ｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制することにより、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、抗ＴＮＦα抗体の治療有効量の投与を含む、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防のための方法を提供する。また本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防のための医薬品製造用の、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に抑制することにより、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、抗ＴＮＦα抗体の使用を提供する。
【０１０３】
「治療」という用語は、治療的療法か予防的療法のいずれかを含む。特定の抑制剤又は抑制剤の組合せを用いる、疾病又は症状を治療又は防ぐある方法に言及するとき、上記言及は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防用の医薬品の製造のための、その抑制剤又は抑制剤の組合せの使用を意味することを、理解すべきである。
【０１０４】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する、例えばｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を抑制することを介して選択的に抑制する抗体が、ｐ５５Ｒ媒介シグナル伝達、特に自己免疫疾患及び炎症性疾患の結果として生じる、あらゆる疾病治療用の医薬品の製造に使用できる。特定の自己免疫及び炎症性疾患には、ＣＮＳの脱髄性自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、バセドウ病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット疾病、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患が含まれる。
【０１０５】
ここで述べているように、例えばＴＮＦαのｐ５５Ｒへの結合を選択的に抑制して、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防に使用することができる。上記の使用のために、薬剤は医薬品組成物の形態で一般に投与される。
【０１０６】
また、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体を含む医薬品組成物、及び薬学的に許容し得る担体も提供される。
【０１０７】
薬学的に許容し得る担体を通常は含む無菌の医薬品の組成物の１部として、組成物は通常供給される。この組成物は、任意の適切な形態（組成物を患者に投与する望ましい方法に応じて）であってもよい。
【０１０８】
本発明の抗体は対象に、種々の別の経路で、例えば経口で、経皮的に、皮下に、鼻腔内に、静脈内に、筋肉内に、くも膜下腔内に及び脳室内に投与されるのが好ましい。いずれの場合においても、投与に最も適切な経路は、特定の抗体、対象、並びに疾病の性質と重症度及び対象の体調に依存する。
【０１０９】
本発明で使用する抗体は、例えば、同時に、経時的に又は別々に、１つ若しくは複数の他の治療的に活性な化合物と組み合わせて投与されてもよく、この組合せは、例えば他の抗自己免疫疾患治療又は抗癌治療であってもよい。
【０１１０】
医薬品組成物は、本発明の活性因子の１回あたりの所定量を含む便利な単位投与剤形で提供することができる。治療されている症状、投与経路並びに対象の年齢、重量及び体調に応じて、例えばこれらに限定されないが、上述のある単位は７５０ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇを含んでもよい。
【０１１１】
本発明に使用する薬学的に許容し得る担体は、例えば投与経路に応じて様々な形態をとってもよい。
【０１１２】
経口投与用の組成物は、液体又は固体であってもよい。経口液状製剤は、例えば水性又は油性懸濁液、溶液、乳化液、シロップ又はエリキシル剤の形態であってもよく、又は使用前に水若しくはその他の適当なビヒクルで再形成するための乾燥製品であってよい。経口液状製剤は、当技術分野で既知の懸濁剤を含んでもよい。
【０１１３】
経口固形剤の場合、例えば粉末、カプセル及び錠剤、澱粉などの担体、糖類、微結晶性セルロース、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが含まれてもよい。投与の容易性から、錠剤とカプセルが最も有利な経口的投与単位形態であり、この場合には一般に固体調剤担体が使用される。上記で説明した一般的な投与形態に加えて、本発明の活性因子は、調節した放出手段及び／又は送達手段によって投与されてもよい。錠剤及びカプセルは、結着剤例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカンタ、又はポリビニルピロリドン；賦形剤、例えばラクトース、糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン；錠剤成形用潤滑剤例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、ポリエチレングリコール又はシリカ；崩壊剤、例えばジャガイモ澱粉；又はドデシル硫酸ナトリウムのような許容可能な湿潤剤のような、従来の担体又は賦形剤を含んでもよい。錠剤は、標準の医薬調製法で周知の方法に従って標準的水性又は非水性技術で被覆することができる。
【０１１４】
経口投与に適切な本発明の医薬品組成物は、粉末若しくは顆粒剤として、又は溶液若しくは水性液体中の懸濁液、非水溶液体、水中油型乳剤又は油中水型乳濁液として、それぞれ活性因子の所定量を含むカプセル、カシェ剤若しくは錠剤のような区分された単位として提供できる。このような組成物は任意の調剤方法で調製し得るが，それらの方法はいずれも活性因子と、１つ若しくは複数の必要な成分から成るキャリヤとを結合するステップを含む。一般に、上記組成物は、活性因子を液体キャリヤ若しくは微粉状固体キャリヤ、又はこれらのキャリヤの両方と均一かつ十分に混合し、その後必要であれば得られた混合物を所望の形状に成形することによって調製する。例えば、必要に応じて１つ若しくは複数の補助成分と共に圧縮又は成形によって錠剤を製造することができる。
【０１１５】
非経口投与のために適切な医薬品組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と十分に混合した、水中の本発明の活性因子の溶液又は懸濁液として調製することができる。分散液はまた、グリセロール，液体ポリエチレングリコール及びオイル中のそれらの混合物で調製することができる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【０１１６】
注射剤に適した薬剤形態は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び組成物を予定されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよいし又は非水性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤及び粘稠化剤を含んでもよい水性又は非水性滅菌懸濁液を含む。即席注射用液類、分散剤及び懸濁液を、無菌の粉末類、顆粒類及び錠剤類から調製することができる。
【０１１７】
医薬品組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与できる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の医薬品組成物は、ＵＳ５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４又は４，５９６，５５６に開示される装置のような針のない皮下注入装置を用いて投与することができる。本発明で有用な公知の埋込物及びモジュールの例は、制御された速度で薬物を分配するための埋込可能な微小注入ポンプを開示するＵＳ４，４８７，６０３、皮膚を通して薬剤を投与する治療装置を開示するＵＳ４，４８６，１９４、正確な注入速度で薬物を供給する薬剤注入ポンプを開示するＵＳ４，４４７，２３３、連続的薬物送達のための可変流量の埋込可能な注入装置を開示するＵＳ４，４４７，２２４、多チャンバー区画を有する浸透性薬物送達系を開示するＵＳ４，４３９，１９６、及び浸透性薬物送達系を開示するＵＳ４，４７５，１９６を包含する。多くの他のこうした埋込物、送達系、及びモジュールは当業者に公知である。
【０１１８】
局所的適用に適した医薬品組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション剤、粉末、溶液、ペースト、ゲル、含浸包帯剤、スプレー、エアゾール又はオイル、経皮的装置、散布剤その他として製剤化することができる。これらの組成物は、活性因子を含む従来の方法で調製できる。したがって、また組成物は、例えば防腐剤、薬剤浸透を促進する溶媒、クリームの皮膚軟化薬又は軟膏並びにローション剤用のエタノール又はオレイルアルコールなどの適合した通常の担体及び添加剤を含んでもよい。上記担体は組成物の約１％〜約９８％の範囲の量で存在することができる。より一般には、担体は、組成物の最高約８０％を構成する。例のみとして、クリーム又は軟膏は、所望の濃度のクリーム又は軟膏の製造には十分量で、化合物の約５〜１０重量％範囲の量を含む、十分な量の親水性材料及び水を混合して調製する。
【０１１９】
経皮投与するのに適した医薬品組成物は、長時間にわたって、受容者の表皮と密接に接触しつづけることを意図した分離したパッチとして提供することができる。例えば、活性因子が、イオン泳動によってパッチから供給されてもよい。
【０１２０】
外部組織例えば口及び皮膚への使用のためには、組成物を、局所用の軟膏又はクリームとして適用するのが好ましい。軟膏で製剤化した場合は、活性因子をパラフィン又は水溶性軟膏基剤のいずれかと共に用いてもよい。或いは、活性因子を、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤をもつクリームに製剤化してもよい。
【０１２１】
口腔内への局所投与に適する医薬品組成物は、舐剤、香錠及び口内洗剤を含む。
【０１２２】
眼への局所投与に適する医薬品組成物は、適切な担体、特に水溶性の溶媒中に活性因子が溶解又は懸濁されている点眼剤を含む。また上記のように、眼への局所投与に適する医薬品組成物には、局所用の軟膏又はクリームを含む。
【０１２３】
直腸内適用に適する担体が固体である医薬品組成物は、単位服用量の坐剤として、提供されるのが最も好ましい。適切な担体は、カカオバター又は他グリセリド又は当該技術分野で一般的に使用されている物質が含まれ、坐剤は軟化又は溶解した担体（複数可）を有する化合物の混合物を、冷却して成型することにより都合よく形成することができる。また医薬品組成物は、浣腸剤として投与されてもよい。
【０１２４】
ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する抗ＴＮＦα抗体の投与される用量は、特定の抗体、自己免疫疾患又は炎症性疾患のタイプ、対象、並びに疾病の性状及び疾病の重症度、並びに対象の体調、並びに選択された投与経路によって変わり、適切な用量は、当業者によって容易に決定することができる。ヒト及び動物での、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療及び／又は予防のために、抗体を含む医薬品組成物を、治療的又は予防的に有効な用量（例えば、自己免疫疾患又は炎症性疾患の抑制及び／又は自己免疫疾患症状又は炎症性疾患症状の軽減に結びつく用量）で、抗体ベースの臨床製剤のような臨床製剤に対する任意の適切な投与経路、例えば注射及び当分野において知られている他の投与経路を用いて、患者（例えば、ヒト被験者）に投与することができる。
【０１２５】
本組成物は、投与方法に依存して、本発明の抑制剤を０．１重量％から、好ましくは１０〜６０又はそれ以上の重量％含んでもよい。
【０１２６】
最適量及び本発明１つの抑制剤個々の用量の間隔は、治療している性状及び症状の程度、剤形、投与経路及び投与部位、並びに治療を受ける特定対象の年齢及び症状によって決定され、医師が用いる適切な用量が最終的に決定されることは当業者には認識されよう。この用量は、適切になるまで繰り返すことができる。副作用が生じる場合、標準の医療に従って用量の量及び／又は回数を変更又は減らすことができる。
【０１２７】
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例において例示としてのみ記載される。
【実施例】
【０１２８】
（実施例１）抗ＴＮＦα抗体パネルの分離
ラットを可溶性ヒト組換え型ＴＮＦαで免疫した。３〜４週間間隔で４×５μｇを最初は完全フロインドアジュバント中、皮下経路で投与。
【０１２９】
次いで、１匹のラットの脾臓細胞を、すべて検出されるＴＮＦα結合抗体が、クローン抗体であることを保証する細胞密度で、４０個のマイクロタイタープレートに播種した。それから細胞を７日間、Ｔ細胞馴化培地（３％）及びＥＬ−４細胞（５×１０４／ウェル）で培養した。７日後に免疫反応板上にコーティングしたヒツジポリクローナルによって捕捉されたヒトＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、これらのプレートの上清を、抗ＴＮＦα抗体についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。次いで陽性のウェルから上清を、下記のＬ９２９バイオアッセイ並びにｐ５５及びｐ７５レセプター特異的タンパク質アッセイでさらに試験した。
【０１３０】
（実施例２）ＴＮＦαレセプター結合阻害アッセイ
Ｌ９２９  アッセイ
マウスのｐ５５ＴＮＦαレセプターを発現するがｐ７５ＴＮＦαレセプターは発現しないＬ９２９細胞（マウス線維芽細胞細胞系）を、このレセプターへのＴＮＦαの結合を遮断する抗ＴＮＦα抗体のアッセイに用いた。タンパク合成阻害剤で感作した場合、これらの細胞はヒトＴＮＦαによって殺される。
【０１３１】
アッセイで必要になる前日まで、細胞を標準的組織培養培地で増殖させ、９６ウェル組織培養プレートに播種した。培地を除去し、試験する上清を、個々のウェルに添加した。次いでヒト組換え型のＴＮＦαを、アクチノマイシンＤ１μｇ／ｍｌ（最終濃度）の存在下、２００〜４００ｐｇ／ｍｌで各ウェルに添加した後、プレートを３７℃で１夜インキュベートした。
【０１３２】
翌日、プレートを、ＰＢＳで穏やかに洗浄し、細胞をメタノールで固定した。続いて細胞を、１％のクリスタルバイオレットで染色した（生存細胞は、プレートに付着して残り、色素を取り込む）。余分の染色液を洗い落とし、残存する染色された細胞を、３０％酢酸で可溶化した後、プレートを５７０／４０５ｎＭで読み取った。
【０１３３】
マウスｐ５５ＴＮＦＲへのＴＮＦαの結合を遮断する抗体が入っているウェルは、細胞をＴＮＦα媒介細胞毒性から保護し、陰性対照ウェルと比べシグナル増強を示す。
【０１３４】
陽性のウェルは、ｐ５５Ｒ及びｐ７５Ｒアッセイでさらに試験した。
【０１３５】
ｐ５５ＴＮＦＲ及びｐ７５ＴＮＦＲ結合阻害アッセイ
標準的ＥＬＩＳＡプレートを、１／１０，０００希釈したヒツジ抗ヒトＴＮＦαポリクローナル抗体でコーティングした。続いて、プレートをＰＢＳ＋１％  ＢＳＡでブロックした。それから、ヒトＴＮＦαを、２５〜５０ｎｇ／ｍｌで各ウェルに添加した。１時間後に、遊離のＴＮＦαを洗い流した後、抗ＴＮＦα抗体を含む上清を、レプリカウェルに添加した。各レプリカの１つのウェルに追加して、ヒトｐ５５ＴＮＦＲ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ融合タンパク質か又はヒトｐ７５ＴＮＦＲ−Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ融合タンパク質を添加した。これらを１時間インキュベート後に、洗浄して遊離のレセプターを除去した。このステップに続き、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナル抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１／２０００希釈して添加した。プレートを１時間放置後、洗浄して遊離のコンジュゲートを除去した。次いで、ＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、色を発色させた。したがって、抗ＴＮＦα抗体がレセプター（複数可）への結合を遮断したウェルは可視化できる。
【０１３６】
図１は、４つの異なる抗ＴＮＦ抗体による、ｐ５５ＴＮＦＲ及びｐ７５ＴＮＦＲへのＴＮＦαの結合抑制パーセンテージを示す。抗体「３Ｄ６」は、ｐ５５ＴＮＦＲへのＴＮＦαの結合を４９．３％抑制したが、ｐ７５ＴＮＦＲへのＴＮＦαの結合は１４．６％抑制しただけであった。これと対照的に、例えば抗体２２Ｈ３は、ｐ５５Ｒ及びｐ７５ＲへのＴＮＦαの結合を、それぞれ７８．９及び７１．９％抑制した。したがって、抗体３Ｄ６はｐ５５ＲへのＴＮＦαの結合を選択的に遮断する。
【０１３７】
（実施例３）さらに選択的な抗体の分離
実施例１と同じラット集団を用いて、培養したＢ細胞を、ＴＮＦα選択的抗体を同定するためにスクリーニングした。
【０１３８】
製造業者のプロトコルに従って、ヒトＴＮＦα（Ｓｔｒａｔｈｍａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を、室温で１時間、１０倍モル過剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で、ビオチン標識した。５μｇのビオチン化ＴＮＦαを、５０μｌの９．９５ミクロンスーパーアビジンをコーティングした微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｂｅａｄｓ）と、室温で１時間、５００μｌの容量（１×３８４ウェルプレートに混合）で混合した。次いで、ビーズをＰＥＧブロック（１％のＰＥＧ／０．１％のトゥイーン／ＰＢＳ）中で、５回洗浄して遊離のＴＮＦαを除去した。続いてＴＮＦαコートビーズを、約４ｍｌのＰＥＧブロックに再懸濁し、１０μｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した。ラット抗体及び１０μｌの１：１６６６希釈ヤギ−抗−ラットＩｇＧ  Ｆｃ  ガンマ特異的Ｃｙ５コンジュゲートを含む１０μｌのＢ細胞培養を、ビーズを含有するウェルに添加した。プレートを室温、暗所で１時間インキュベート後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００  ｍａｃｈｉｎｅで読み取った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのソフトウェアを用いて陽性のウェルを同定した。
【０１３９】
約１４００枚のＢ細胞培養プレートをスクリーニングした。このプレートには、約２×１０８のＢ細胞に相当する約１４００００ウェルが存在する。
【０１４０】
スクリーニングした２５００のウェルは、ＴＮＦαに結合した抗体を有していた。
【０１４１】
これらを、実施例４で記載されるアッセイを用いて、ｐ７５Ｒと比べてｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に遮断する能力に関してさらにスクリーニングした。まず抗体を、ｐ５５Ｒシグナル伝達の遮断に関してスクリーニングし、シグナル伝達を遮断したものについて、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達遮断能力を試験した。ｐ５５Ｒを介するシグナル伝達を選択的に遮断するそれらの抗体を、ＷＯ２００４／０５１２６８に記載されたホモジニアス蛍光アッセイを用いて分離し、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域遺伝子を、単１のラットＢ細胞から逆転写ＰＣＲでクローニングした。ヒト抗体定常領域遺伝子（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，３０（１），１０５〜１０８に記載の２４１位のセリンがプロリンに変更されたヒトカッパＬ鎖及びガンマ−４Ｈ鎖）を含む発現ベクターにサブクローニングすることにより、シグナル伝達アッセイで、可変領域を組換え型ＩｇＧ形式で発現させて、結合及び活性を確かめ、ラット／ヒトキメラ抗体がＣＨＯ細胞で一過性に発現した。ＣＨＯ細胞のトランスフェクションは、製造業者の指示書（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ．１８３２４）に従い、リポフェクタミン手法を用いて実施した。
【０１４２】
２つの抗体配列が得られ、「４６２」及び「４６３」と名付けた。「４６２」のＶ−領域配列は、配列番号１、２、３及び４に示されている。リーダー配列を伴わない可変領域配列は、配列番号５、６、７及び８に示されている。「４６３」のＶ−領域配列は、配列番号１５、１６、１７及び１８に示されている。リーダー配列を伴わない可変領域配列は、配列番号１９、２０、７及び８に示されている。
【０１４３】
（実施例４）ＴＮＦＲシグナル伝達アッセイ
４．１  ｐ５５Ｒシグナル伝達アッセイ
ｐ５５  ＮＦｋＢルシフェラーゼアッセイ
Ａ５４９−ＥＳ−Ｌｕｃ細胞を、このリポーター遺伝子アッセイに用いた。Ａ５４９細胞は、ｐ５５  ＴＮＦレセプターを発現し、ルシフェラーゼ遺伝子に結合したＥセレクチンプロモーター（３×ＮＦｋＢ結合部位を含む）及び安定な細胞系生成のための選択可能なマーカーを含むベクターで安定にトランスフェクションしている上皮肺細胞癌である。Ａ５４９−ＥＳ−Ｌｕｃは、次の培地に増殖させた。
ＲＰＭＩ  １６４０（フェノールを含まない）
＋１０％ＦＣＳ
＋２Ｍｍ  グルタミン
＋１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ，５０ｍｇ／ｍｌ原液）
【０１４４】
Ａ５４９−ＥＳ−ｌｕｃ細胞を、１．５×１０５細胞／ｍｌの細胞懸濁液を用い、１００μｌ／ウェル＝  １５，０００細胞／ウェルで、白色不透明な９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に播種した。細胞を１夜、３７℃／５％ＣＯ２で付着させた。翌日、培地を吸引し、３０分間、最終濃度３ｎｇ／ｍｌのヒトＴＮＦαと共にプレインキュベートしたアッセイ培地中の抗体１００μｌで置換した。細胞を、３７℃／５％のＣＯ２で、５時間インキュベートした。次いで、ルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのＬｕｃＬｉｔｅ）を用いてアッセイし、プレートはルミネセンスプレートリーダーｔｈｅ  ＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔで読み取った。
【０１４５】
４．２  ｐ７５シグナル伝達アッセイ
ＣＤ２８及びＴＣＲゼータの細胞内シグナル伝達領域に結合した、ｐ７５Ｒ細胞外ドメインをコードするカセット含む、ベクターで安定にトランスフェクションしたＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、ｐ７５シグナル伝達をアッセイした。同じベクターの中に、最小限のＥセレクチンプロモーター領域を有するＮＦｋＢに対する５つの結合部位があり、これがリポーター遺伝子ルシフェラーゼと安定な細胞系生成のための選択可能なマーカーの発現を推進する。そのリガンドであるヒトＴＮＦαを有するｐ７５バイオアッセイレセプターの刺激作用が、バイオアッセイレセプターのＣＤ２８／ゼータ領域を介して細胞内でシグナル伝達カスケードの開始に導く。シグナル伝達カスケードは、ＮＦｋＢ活性化を誘導し、ルシフェラーゼリポーター遺伝子の転写を可能にする。次いで、活性化レベルがルシフェラーゼアッセイで測定できる。この活性化を遮断できる抗体は、ルシフェラーゼの発現を妨げる。
【０１４６】
レセプター発現クローニングカセット及びシャトルベクターの構築
バイオアッセイレセプターの発現に必要な完全な発現カセットを含む仲介シャトルベクターを用いた。このベクターは、（Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  １７２：１０４）ですでに記載した、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で考案されたクローニングカセットを含んでいる。このクローニングカセットの５’側には、ＨＣＭＶプロモーターがあり、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、このクローニングカセットの３’側に存在する。クローニングカセットは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合成分、膜貫通成分及びシグナル伝達領域成分から構成され、個々の成分の交換を容易にしている。下記のＤＮＡフラグメントを組み合わせて、シャトルベクターを作製した。
Ａ）ＮｏｔＩ〜Ｘｈｏｌのフラグメント上のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のベクターのバックボーン
Ｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメント上のすでに記載したクローニングカセット
Ｃ）ＮｏｔＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの上のＨＣＭＶプロモーター
Ｄ）ＥｃｏＲＩ〜Ｘｈｏｌフラグメント上のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
このシャトルベクターの生成を図２に示す。
【０１４７】
結合、膜貫通及びシグナル伝達成分フラグメントの構築
ヒトｐ７５  ＴＮＦαレセプター細胞外ドメイン結合成分ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＮａｒＩフラグメント。
【０１４８】
リーダー配列及びヒトｐ７５  ＴＮＦ−αレセプターの細胞外ドメイン残基１〜２５７（ＧｅｎＢａｎｋ参照：ＮＭ  ００１０６６）を含むフラグメントを、プラスミドｐＯＲＦ９−ｈＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）からの、オリゴ４０２３（配列番号２２）及び４０２４（配列番号２３）を用いて、ＰＣＲクローニングした。オリゴ４０２３は、５’側ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＫｏｓａｋ配列を導入する。オリゴ４０２４は、３’側ＮａｒＩ部位を導入する。次いで、ＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮａｒＩで消化した。
【０１４９】
ヒトＣＤ２８膜貫通及びシグナル伝達領域並びにヒトＴＣＲゼータシグナル伝達領域成分ＮａｒＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメント。
【０１５０】
ヒトＣＤ２８膜貫通及びシグナル伝達領域の残基１３５〜２０２並びにヒトＴＣＲゼータ細胞内領域の残基３１〜１４２含むフラグメントを、制限酵素ＮａｒＩ及びＥｃｏＲＩで、（Ｆｉｎｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４  １７２：１０４）ですでに記載したプラスミドから消化した。
【０１５１】
バイオアッセイレセプターリポーター遺伝子ベクターの構築
バイオアッセイレセプター用の完全長発現カセットを、上述のシャトルベクターで上述した結合、膜貫通及びシグナル伝達成分を組み合わせて作製した。次いでこのカセットを、リポーター遺伝子ベクターｐＮｉｆｔｙ２−Ｌｕｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にサブクローニングした。このベクターは、ＮＦ−ｋＢ誘導性プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼリポーター遺伝子及び大腸菌及び哺乳動物細胞の両方での選択用の、選択可能なマーカーＺｅｏｃｉｎ（商標）を含む。バイオアッセイレセプター発現カセットを、ＮｏｔＩ〜ＮｏｔＩフラグメント上のシャトルベクターから取り出し、ｐＮｉｆｔｙ２−ＬｕｃのＮｏｔＩ部位にクローニングした。
【０１５２】
安定なバイオアッセイレセプターリポーター遺伝子細胞系の生成
製造業者の指示書（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置を用いて、ベクターのプラスミドＤＮＡを、ヒトＴ細胞白血病細胞系Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６．１にトランスフェクションした。続いて安定な細胞系を、２００μｇ／ｍｌの濃度のＺｅｏｃｉｎ（商標）で培養して作製した。
【０１５３】
ｐ７５／ＣＤ２８−ＴＣＲゼータバイオアッセイレセプターを用いる抗ヒトのＴＮＦα抗体の分析。
ヒトｐ７５  ＴＮＦαレセプター細胞外ドメイン結合成分、ヒトＣＤ２８膜貫通及びシグナル伝達領域並びにヒトＴＣＲゼータシグナル伝達領域成分を含む、バイオアッセイレセプターを発現している安定な細胞系を上記のように作製した。これらの細胞に対してヒトＴＮＦαの滴定を加え、生成したルシフェラーゼの量を、供給者の指示に従って、Ｌｕｃｌｉｔｅアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４時間後に測定した。ｐ７５／ＣＤ２８−ＴＣＲゼータバイオアッセイレセプターからのＴＮＦα誘導ルシフェラーゼ応答を、図３に示す。ＴＮＦαの濃度をこの滴定から選択し、ｐ７５／ＣＤ２８−ＴＣＲゼータバイオアッセイレセプターを介するルシフェラーゼ生成を遮断する抗ＴＮＦα抗体の能力を評価するために用いた。
【０１５４】
アッセイ培地：
５００ｍｌ  ＤＭＥＭ（フェノールを含まない）
＋１０％ウシ胎仔血清
＋２ｍＭ  グルタミン
＋１ｍｌ  ノルマシン（Ｎｏｒｍａｃｉｎ）
＋２００μｇ／ｍｌ  ｚｅｏｃｉｎ
＋１％のエンハンサー溶液、プロテアーゼ阻害剤
Ｊｕｒｋ細胞を、２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を用いて白色の不透明な９６ウェルプレートに播種した。次いで、抗体を所望の滴定スケールでプレートに加えた。プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、各ウェルに、３０ｎｇ／ｍｌの濃度で１０μｌのヒトＴＮＦαリガンドを加えて、各ウェルでヒトＴＮＦα３ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ発現をルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイキット（Ｌｕｃｌｉｔｅ  １０００  ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてアッセイした。
【０１５５】
結果
抗体「４６２」及び市販の抗ＴＮＦα抗体の効果
ｐ５５Ｒシグナル伝達アッセイにおけるルシフェラーゼ生成に及ぼすアダリムマブ及びインフリキシマブを図４に示す。全て３つの抗体は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制することは明らかである。図５は、抗体「４６３」は、ｐ５５Ｒを介すＴＮＦαシグナル伝達も抑制することを示している。
【０１５６】
ｐ７５Ｒシグナル伝達アッセイにおけるルシフェラーゼ生成に及ぼす、抗体「４６２」並びに市販の抗ＴＮＦα抗体アダリムマブ及びインフリキシマブの効果を図６に示す。抗体「４６２」は、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を殆ど変化させないのに対し、アダリムマブ及びインフリキシマブのみが、ｐ７５Ｒ介するＴＮＦαシグナル伝達を抑制することは明らかである。図７は、抗体「４６３」も、ｐ７５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を殆ど変化させないことを示している。抗体「４６２」及び「４６３」は、ｐ５５Ｒシグナル伝達アッセイと比べて、ｐ７５Ｒシグナル伝達アッセイでは有意に抑制力が低かった。
【０１５７】
したがって、抗体「４６２」及び「４６３」は、ｐ５５Ｒを介するＴＮＦαシグナル伝達を選択的に抑制する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】ｐ５５Ｒ及びｐ７５Ｒに対するＴＮＦαの結合に及ぼす、異なる抗ＴＮＦα抗体の効果を示すｐ５５ＴＮＦＲ及びｐ７５ＴＮＦＲ結合阻害アッセイを示す。
【図２】バイオアッセイレセプターシャトルベクターの作製のために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＳＫ（＋）の大きなＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ制限フラグメントにクローンニングした発現カセットを示す。
【図３】ｐ７５／ＣＤ２８−ＴＣＲゼータバイオアッセイレセプターからの、ＴＮＦα誘発ルシフェラーゼ応答の滴定を示す。
【図４】抗体「４６２」、インフリキシマブ及びアダリムマブのｐ５５Ｒシグナル伝達に及ぼす効果を示す。
【図５】ｐ５５Ｒシグナル伝達に抗体「４６３」の及ぼす効果を示す。
【図６】抗体「４６２」、インフリキシマブ及びアダリムマブのｐ７５Ｒシグナル伝達に及ぼす効果を示す。
【図７】抗体「４６３」のｐ７５Ｒシグナル伝達に及ぼす効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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