(57)【要約】  電子感知素子（２０、２１、２２）の集積アレイ（３７）は、検体の生体指紋を出力する。システム（１０）は、好ましくは、一続きの３層（３５、７５、１００）からなるが、そのように５配列する必要はない。上層（１００）は、流体体積又は検体槽（４０）を定め、中層（３５）は、感知素子（２０、２１、２２）を含み、第３層（７５）は、電子的読出し素子を含む。検体槽（４０）は、電解質及び検出すべき検体を含む。感知素子（２０、２１、２２）は、最小の応答時間で、最大１０の検出感度となるように最適化される。それぞれの感知素子（２０、２１、２２）の応答は、専用感知電極（３０、３１、３２）により読み出される。それぞれの電極（３０、３１、３２）の周りに制御リング７０がある。制御リング（７０）の電位は、注目する検体を感知素子（２０、２１、２２）に引き付けるように設定される。
2008517268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を同定するための感知システムであって、
検体を含む電解質の体積を定める検体槽と、
関連するバリアと、電解質を含む感知部分と、前記感知部分内に配置された感知電極と、を持つ感知素子と、
前記検体槽内に配置された基準電極と、
前記検体槽と前記感知部分との間で流れる発振電流を誘導するための発生源と、
前記検体槽と前記感知部分との間の電流の時間変動を測定するための読出し回路及び復調器と、
を備える感知システム。
【請求項２】
請求項１に記載の感知システムであって、前記感知電極は、前記感知部分内の前記電解質への主に容量性の結合を有する、感知システム。
【請求項３】
請求項１に記載の感知システムであって、前記基準電極は、前記検体槽内の前記電解質への主に容量性の結合を有する、感知システム。
【請求項４】
請求項１に記載の感知システムであって、前記感知電極は、前記感知部分内の前記電解質への主に抵抗性の結合を有する、感知システム。
【請求項５】
請求項１に記載の感知システムであって、前記基準電極は、前記検体槽内の前記電解質への主に抵抗性の結合を有する、感知システム。
【請求項６】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記読出し回路とともに使用する電気的接地をなす、前記検体層内に配置された別の電極を、
更に備える感知システム。
【請求項７】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記バリアに沿って用意された基材であって、前記基材の少なくとも一部は、前記感知素子の一部を形成する、基材を、
更に備える感知システム。
【請求項８】
請求項１に記載の感知システムであって、前記バリアは、脂質二重層膜である、感知システム。
【請求項９】
請求項１に記載の感知システムであって、前記バリアは、ポリジメチルシロキサンである、感知システム。
【請求項１０】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記バリアに架かる微細孔を、
更に備える感知システム。
【請求項１１】
請求項１０に記載の感知システムであって、前記微細孔は、タンパク質微細孔と、イオン・チャネルと、トランスポーターと、からなる群から選択される、感知システム。
【請求項１２】
請求項１０に記載の感知システムであって、前記微細孔は、バリア内に用意された貫通孔をなす、感知システム。
【請求項１３】
請求項１に記載の感知システムであって、前記バリアは、少なくとも３倍の前記感知電極の領域に重なる領域を持つ、感知システム。
【請求項１４】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記感知素子の周りに配置された実質的に円環状の電極を、
更に備える感知システム。
【請求項１５】
請求項１４に記載の感知システムであって、
前記実質的に円環状の電極の電圧を制御するための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項１６】
請求項１５に記載の感知システムであって、
前記感知システムの他の部分からの前記感知電極の電気的分離を高めるための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項１７】
請求項１５に記載の感知システムであって、
前記微細孔のところで検体分子の到着速度を高めるための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項１８】
請求項１５に記載の感知システムであって、前記実質的に円環状の電極の前記電圧は、前記感知システムの製造時に、前記感知電極の前記膜内への特定の微細孔の挿入に影響を及ぼす、感知システム。
【請求項１９】
請求項１０に記載の感知システムであって、前記微細孔は、特異的タガントを付着している、感知システム。
【請求項２０】
請求項１に記載の感知システムであって、前記基材の平面内の前記感知部分の面積は、１０，０００μｍ２である、感知システム。
【請求項２１】
請求項１に記載の感知システムであって、前記基材の平面内の前記感知部分の面積は、１，０００μｍ２である、感知システム。
【請求項２２】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記感知システム上の計測器ノイズの効果を低減するために出力信号の２つの直交成分を組み合わせるための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項２３】
請求項１に記載の感知システムであって、前記感知素子に関連する前記バリアは、実質的に固体の物質内のおおよそ一定の断面積を持つ狭いチャネル上に懸架される、感知システム。
【請求項２４】
請求項２３に記載の感知システムであって、前記狭いチャネルの直径と長さの両方及び前記電解質の伝導性は、２ＧΩよりも大きい電気的インピーダンスを生じるように選択される、感知システム。
【請求項２５】
請求項２３に記載の感知システムであって、前記狭いチャネルの直径は、前記微細孔の直径の４倍よりも大きい、感知システム。
【請求項２６】
請求項１に記載の感知システムであって、前記発振電流の基本周波数は、１ｋＨｚよりも高い、感知システム。
【請求項２７】
請求項１に記載の感知システムであって、前記バリアは、その中に５個以下の微細孔が配置されている、感知システム。
【請求項２８】
請求項１に記載の感知システムであって、
前記検体の生体指紋を発生する読出し回路とともに、前記感知素子が集積アレイを形成するように配列されている追加感知素子を、
更に備える感知システム。
【請求項２９】
請求項２８に記載の感知システムであって、前記バリアは、前記感知素子のうちの２つ又はそれ以上にわたる、感知システム。
【請求項３０】
請求項２８に記載の感知システムであって、前記感知素子のうちの少なくとも２つは、異なる検体を感知するように設計されている、感知システム。
【請求項３１】
請求項２８に記載の感知システムであって、
前記感知素子のうちの少なくとも２つの周りに配置されている実質的に円環状の電極を、
更に備える感知システム。
【請求項３２】
請求項３１に記載の感知システムであって、
前記感知システムの性能を改善するように前記実質的に円環状の電極の電圧を制御するための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項３３】
請求項２８に記載の感知システムであって、
前記感知システムの他の部分からの前記電極のうちの１つの分離を高めるための手段を、
更に備える感知システム。
【請求項３４】
請求項２８に記載の感知システムであって、前記集積アレイの中心間距離は、１００μｍ未満である、感知システム。
【請求項３５】
請求項２８に記載の感知システムであって、前記集積アレイ内の感知素子の個数は、１６個よりも多い、感知システム。
【請求項３６】
請求項２８に記載の感知システムであって、前記感知素子はそれぞれ、関連する感知部分を備え、前記感知部分の１つ又は複数は、狭い流体チャネルにより１つに接続されるが、単一の狭い充填チャネルは、それぞれの感知部分を前記検体槽に接続する、感知システム。
【請求項３７】
請求項３６に記載の感知システムであって、
前記充填チャネル内に配列された電極と、
前記充填チャネル電極の電圧を制御し、前記充填チャネルに接続されている前記感知部分の、前記検体槽からの電気的分離を高めるための帰還手段と、
を更に備える感知システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載）
本発明は、国防総省国防高等研究事業局（ＤＡＲＰＡ）により発注された契約ＤＡＭＤ１７−０３−Ｃ−００８５に基づいてなされた。政府は、本発明の全額支払い済み非排他的実施権を有する。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
本出願は、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ａｒｒａｙ  ｔｏ  Ｏｂｔａｉｎ  ａ  Ｂｉｏｆｍｇｅｒｐｒｉｎｔ」という表題の２００４年１０月１４日に出願された米国仮出願第６０／６１８，２５９号、及び「Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ａｒｒａｙ」という表題の２００４年１１月８日に出願された米国仮出願第６０／６２５，７２１号の利益を主張するものである。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、生体物質を識別する技術に関するものであり、より具体的には、検体の生体指紋を出力する電子感知素子の集積アレイに関する。
【背景技術】
【０００４】
（従来技術の検討）
或る範囲の分子の非常に低い濃度を迅速に同定することは、科学技術の多くの分野において重要である。有望な方法としては、細胞アレイの電気的記録、関連するレポーター分子がある表面上の分子受容体、及び蛍光ベースの技術がある。しかし、本発明の感知アーキテクチャは、組み立てるのが難しく、費用がかかり、非特異的結合事象からのノイズにより制限される、特異性の高い受容体（例えば、抗体）を必要とし、更に、感度が高まると、選択性が損なわれ、誤った同定が行われるという困った性質を有する。
【０００５】
部分的に特異的な単一分子感知素子のアレイの使用は、ごく少数の標的分子から生体指紋を生成する一手段となる。初期の研究では、非生物学的チューブを使用し、単一分子を検出するためのフィルタとして作用させた。Ｍａｒｔｉｎらは、チューブに入り、印加された電圧の下で流れる電解質イオンの流量を低減する十分に小さな単一分子により生成される電流を測定しようと小さな金ナノチューブを開発した。チューブは、数１０ナノメートルのオーダーであった。それらは単一分子を検出できるくらい十分小さな直径であったが、チューブの長さについては、一度に複数の分子が入るのを許し、そのため、単一分子検出を妨げた。
【０００６】
Ｂａｙｌｅｙは、単一分子に結合する人工的生体タンパク質微細孔を使用した。微細孔のサイズが小さいため、一度に１つの分子しか入ることができないが、その一方で、人工的共有結合感知構成成分により、或るクラスの検体に関して或る範囲の分子結合応答が使用可能になる。検体分子が捕捉されると、ｐＡ範囲における特性時間間隔及び電流減少は、測定されることができる。この研究はバイオセンサーに向けて大きく前進したが、電子的読出し方法及び二重脂質膜の安定性の研究は、この種のバイオセンサーを成功させるうえで不可欠である。更に、この用途における精度、感度レベル、及び使用範囲を向上させるために複数の微細孔をアレイ内に入れることができるシステムが必要である。
【０００７】
現在この分野において足らない大きなものとしては、利用可能な電子的読出し方法がある。電流黄金律である、パッチクランプ等の電流法では、ＤＣ法及び抵抗性電極を使用して、測定を行う。ギガシールが必要であるため、アレイはきわめて厄介なものとなり、この種のセンサに必要なアレイシステムの実行可能な選択肢とはいえない。アレイは、複数の感知素子が複数の検体を一度に捕捉できるようにするために必要である。それに加えて、複数の感知素子が同じ検体を検出するように設計されれば、応答時間を短縮し、精度を向上させることが可能になる。
【０００８】
電子読出しの他の方法は、電気化学的インピーダンス分光法である。この方法では、周波数領域のデータを使用して、等価回路をモデル化する。このシステムの大きな欠点は、時間領域内で電流信号測定できないことである。この情報は、タンパク質微細孔法及び単一分子検出を使用するうえで不可欠である。上述のタンパク質微細孔に対する電流信号は、ｐＡのオーダーであり、持続時間は、５ｍｓ程度である。そのため、これらの事象を見るためには、時間領域測定が重要である。提案されているシステムでは、ＡＣ読出し法を使用して、これらの事象をはっきり見られるようにし、それにより、感度の増大及び応答時間の高速化をもたらすことができる。
【０００９】
電流法の重要な他の問題は、二重脂質膜を中心に展開している。多くのグループが示しているように、二重脂質膜は、孔に架けられている基質上に置くことができ、これにより、タンパク質微細孔の挿入が可能になる。しかし、これらの膜は、数ミクロンを超える大きな孔に架けた場合、きわめて壊れやすく、振動に敏感である。この特徴が、堅牢なシステムを難しくしている。しかし、膜が架かる孔のサイズを縮小する方法があれば、膜の寿命を大幅に、恐らく限界なく、延ばせるであろう。それに加えて、２０ナノメートルのオーダーのこれらの微細孔に膜を架け、必要なギガシール抵抗を維持することができるシステムは、ここで提案されているアレイ設計にとって不可欠であろう。それに加えて、これらの小さな膜を使用することで、システムの感度も向上する。
【００１０】
他のグループは、金電極に繋留することにより二重脂質の安定性を高めることを試みた。しかし、どの研究も、タンパク質微細孔が膜内に挿入され、以下の電極により測定される結果として行われる電流測定を示していない。効果的な読出しシステムを欠いていることに加えて、繋留された膜は、膜と電極との間の体積が小さいため急速なＮｅｒｓｎｔ電位効果に曝される。この技術を実現可能にするために、これらの電位効果を小さくする手段が必要である。電流システムでこの技術を使用する場合、これらのＮｅｒｎｓｔ電位効果を低減するためにＡＣ微細孔電流の革新的方法を有する。それに加えて、この設計をアレイにする方法は、この技術の有用性を高める。
【００１１】
グループは、膜のサイズを何とかミクロン・レベルにまで下げて、実験を行い、サブミクロン電極の使用を説明したが、現在使用されている装置の全体的サイズは、センチメートルスケールである。単一の感知チャネル又は微細孔の活性度を感知する重要な特徴の１つは、感知システムの検体溶液を保持する流体槽の寸法を、理論上、サブミクロンスケールにまで縮小できるという点である。一定量の検体が利用可能であると仮定すると、感知システムの感度は、実験に必要な検体の体積に反比例する。そのため、重大な問題点は、検体体積をどれだけ小さくできるかということである。
【００１２】
システムのトレードオフの関係の一例として、すべての感知ユニットを覆うために単一の検体槽が使用されるアレイ内の感知チャネル又はユニットの間の間隔が挙げられる。この場合、アレイ間隔が小さければ小さいほど、検体槽の体積は小さく、従って、必要な検体の量は少なくて済む。しかし、或る時点に、感知ユニットの間の中心から中心までの間隔を狭めるには、感知ユニット自体のサイズを縮小する必要がある。感知ユニットのサイズを縮小すると、Ｎｅｒｎｓｔ電位関連濃度効果が生じるまでにシステムが動作できる時間が短縮される。システム内のイオン流の符号を反転する等、幾つかの補償対策が講じられるが、そうしても、システムの複雑度を増加させる。全体として、感知ユニット・アレイのサイズ及び感知ユニット間の間隔を設定することは、多数の競合効果のトレードオフの関係を伴う複雑な問題である。
【００１３】
システムの他のトレードオフの関係としては、システムの感度と応答時間の関係がある。システムの感度が高ければ高いほど、肯定応答が生じる、又は否定応答を確認するまでに要する時間が長くなる。例えば、１ｎＭの検体濃度に対する応答時間が、１ｐＭの検体濃度に対する応答時間よりも１０００倍高速である場合である。そのため、用途に基づく重大な決定は、感度と応答時間のバランスを生み出すことに関して下される。それに加えて、試料体積を減らす等の提案されている是正処置では、システム内の実効濃度を高め、それにより、感度を高める一方で応答時間を短縮することができる。
【００１４】
更に、膜感知システムの製造からは面倒な問題が生じる。生体膜及びタンパク質微細孔は、前者が形成され、後者が挿入されるようにするために、物理的条件の慎重で正確な制御を必要とする。人工膜が使用される場合、微細孔の挿入は、きちんと制御された流体を使用するだけでなく、電位及び電界も使用する必要がある複雑なプロセスである。システムの全体的なサイズが小さければ小さいほど、これらのパラメータを制御することは困難になり、また膜感知システムの製造も難しくなる。
【００１５】
膜容量の変化又は膜内のチャネル若しくは微細孔を通るイオン流の変化により媒介されるシステムの解釈は、それぞれの感知ユニットに関連する膜、チャネル、又は微細孔の先験的知識に依存する。特定の感知ユニット内に特定のタンパク質微細孔を直接挿入する操作を行う以前の方法では、個々のタンパク質微細孔又は複数種類のタンパク質微細孔を順次挿入する方法、及び／又は個々の感知配置を扱うために使用される複雑な微小流体システムを必要としていた。この要件は、任意の感知ユニットに拡大適用される。このような技術は、システム製造及びシステム組み立ての両方の観点から複雑なものである。
【００１６】
上記に基づき、システムを妥当なコストで製造できるようにしつつ、必要な検体の量を最小限に抑えるように膜及び微細孔感知ユニットのアレイを組み込んだシステムが必要である。更に、単一検体又は複数の検体を同時に測定して生体指紋を作成するように適合されている膜及び微細孔感知ユニットのアレイが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、単一分子の存在を測定する個別感知素子を、最短の応答時間内に最大の検出感度となるように最適化されたアレイに組み込むことができるようにすることを対象とする。
【００１８】
感知素子のアレイは、検体槽内に配置される。それぞれの感知素子の応答は、専用感知電極により読み出される。システムは、最も簡単に構築することができ、一続きの３層としてみなされるが、そのように配列する必要はない。上層は、流体体積又は検体槽を定める。中間層は、感知素子を含み、第３層は、電子的読出し素子を含む。
【００１９】
検体槽は、電解質及び、もし存在するならば検出すべき検体、及び任意の干渉化学種を含む。一般に、検体は、注目する環境又は発生源から収集され、本発明に特有ではないさまざまな知られている手段により水性形態に変えられる。
【００２０】
感知素子は、検体槽と接触している。感知素子は、薄いバリアにより検体槽から隔てられている感知槽を含む。このバリアに小さな孔が開けられており、これにより電解質イオンの電流が適当な印加電圧の下で流れる。好ましくは、分子特異的受容体は、これらの孔の中に配置され、特定分子の存在下で電解質電流を変調する。しかし、幾つかの検体及び用途では、孔内に特定分子が存在することによる阻害効果だけで、十分な信号を発生しうる。更に、バリア自体のコンダクタンスの変化、又は検体により直接媒介されるバリア内へのタンパク質微細孔の挿入は、感知槽に入る電解質電流の変化を引き起こす可能性があり、従って、可能な検出メカニズムであることは理解されるであろう。便宜上、これらの電流変調実体及びメカニズムは、これ以降、「微細孔」という用語の下でひとくくりにされる。
【００２１】
アレイ内では、それぞれの感知素子は、注目する検体に対し或るレベルの特異性を有するように設計されている。感知素子の性質に応じて、特異性は、ただ１つの検体への応答から、１つのクラスの検体への応答、又は注目する検体ではなく干渉物質への応答までさまざまなものがあり得る。応答は、微細孔の自然な特性であるか、又は微細孔に人工的に組み込むことができる。アレイの出力は、検体槽内に存在する検体又は検体群の指紋を与える。個々の感知素子出力は、好適なアルゴリズムにより組み合わされ、それにより、１つ又は複数の標的検体への最適化された応答を発生することができる。
【００２２】
２つのパラダイム・バリア構成がある。つまり、より大きな体積のものの上のオリフィスにバリアが架かる懸架構成、並びに微細孔の組み込み及び微細孔の機能と親和性のある高分子又は水性担体とバリアが連続的に接触する支持構成である。膜又は微細孔がない固形物の単純なオリフィスの場合は、固形物が、一般に薄い、比較的大きな横方向距離を覆い感知槽の容積を定めるオリフィスを定める、懸架構成のサブセットである。
【００２３】
好ましくは、感知素子のバリアは、脂質二重層膜（ＢＬＭ）又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作られている膜等の生物学的に適合する薄い膜からなる。α溶血素又はＭａｘｉ  Ｋ等のタンパク質微細孔は、膜内に組み込まれるが、他のイオン・チャネル、トランスポーター、又は他の好適な生体物質を使用することが可能である。懸架と支持の両方の場合において、膜は、一般に、感知素子の感知槽よりも大きく、微細孔は、膜内の必要な場所に留まるように導入及び／又は制約されなければならない。
【００２４】
微細孔の応答は、標的検体への応答として微細孔を通り関連付けられている感知槽内に流れ込む電解質電流を変調することである。場合によっては、感知槽は、固形物内にエッチングされた、又は他の何らかの方法で加工された部分により定められる。他の場合には、感知槽の上側境界、下側境界、及び縁境界は、脂質二重層膜、シリコンウェハ、及び高分子等の異なる材料によりそれぞれ形成される。電解質電流は、感知槽内の電解質に結合された電極を介して測定される。感知槽及びその特定の実施形態の全厚さは、バリア構成、及び感知素子の全体的構造に依存する。検体槽内で必要な検体の体積を最小にするために、感知素子は、できる限り密集し、できる限り小さくなければならない。クロストークを最小限に抑えるために、他のアレイ素子及び検体槽への感知電極インピーダンスは、慎重に制御されなければならない。
【００２５】
コンパクトなシステムにする必要があれば、シリコン、ガラス、又は他の何らかの使いやすい基材上に標準微細加工技術を使用して電極を形成するのが好都合である。電極は、感知素子の特定の設計に応じて、感知層内に作り込まれるか、又は検体槽の底面に加工される。必要ならば、１つ又は複数の能動増幅素子（例えば、トランジスタ）が、関連する感知電極のすぐ近くの構造全体内に加工される。
【００２６】
それぞれの電極の周りに、電子回路層上に加工された、又は感知層の上側のバリアのすぐ近くに加工された制御リングがある。このリングの電位は、好ましくは、適切な電圧を印加して注目する検体を感知素子に引き付けることによりシステムの応答時間を最小にするよう設定される。更に、誤報性能は、干渉種を追い払うことにより改善することができる。また、リングの電位は、帰還により制御され、それにより感知電極の漂遊電位への結合を最小にして感度を向上させることができる。制御リングは更に、システムを組み立てる最終段階でも使用され、その場合、リングの電位は、特定の微細孔を引き付けるか、又は反発することで特定の種類の微細孔をアレイの特定の素子に送ることができるように設定される。このために、微細孔は、当業者に知られている方法で電荷群をタグ付けされる。微細孔が挿入されると、ＤＣ電位が、リングに印加され、微細孔を膜内に固定する。
【００２７】
感知槽の体積をできる限り小さくするために、その中のイオン濃度を制御する必要がある。２つの効果に対処しなければならない。第１に、検体槽に関係する特定のイオン（例えば、Ｋ＋）の濃度の増加は、バリアと微細孔との間にＮｅｒｎｓｔ電位を生じさせる。第２に、容量性電極では、電流を運ぶイオンの電荷は、電極で交換されず、また電極で更にイオン遊離が生じることにより相殺されることもなく、従って、イオンに関連する正味荷電の増加があり、検体槽に関する（つまり、微細孔間に）関連する電圧が生じる。小さな感知素子の場合、感知槽のキャパシタンスは、バリア及び感知電極のキャパシタンスに支配される。その結果、異なる感知素子構成は大いに異なる感知槽体積を有することが予想されるが、キャパシタンスは実質的に同じである。
【００２８】
ＡＣ微細孔電流に結合された容量性電極は、Ｎｅｒｎｓｔ電位及び準静電圧に関連する問題を解消するために使用することができる。２００５年７月２２日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ａ  Ｔｉｍｅ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ」という表題の国際特許出願ＰＣＴ  ＵＳ２００５／０２６１８１において教示されているような微細孔信号周波数よりもかなり低い周波数で微細孔電流方向を逆転することに加えて、微細孔信号周波数よりもかなり高い周波数で微細孔電流を駆動し、この搬送波周波数を復調することにより微細孔信号の時間依存性を回復することも可能である。これら２つの技術により、領域内の微細孔電流信号のピコアンペア範囲の変動を、０．１ｍｓのオーダーの時間分解能で測定することができる。
【００２９】
それに加えて、電解質との電気化学的反応がないことで安定性が高まるため容量性感知電極が好ましいが、場合によっては、感知部分に抵抗性電極を、また検体部分に抵抗性基準電極を組み込むと有益である。このような電極は、感知電極の電位を増幅する（読み出す）ために使用される電子回路のＤＣ電圧基準を供給し、また微細孔間のＤＣ電位の増大を制限する手段ともなる。更に、アレイの長い稼働寿命が重要でない場合、電解質に抵抗性電気的接続を行う感知電極を使用することが可能である。
【００３０】
なお、本発明の追加の目的、特徴、及び利点は、複数の図面内で類似の参照番号は対応する部品を指している図面とともに読むと好ましい実施形態の以下の詳細な説明からますますたやすく理解できるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図１〜４を参照すると、システム１０は、全体として、感知素子２０、２１、及び２２を備え、それぞれ感知層３５を形成する感知電極３０、３１、及び３２を備えるように示されている。これらの素子は、アレイ３７に配列することができる。検体槽４０は、感知層３５の上に形成される。感知電極３０、３１、及び３２は、それぞれ感知槽５０、５１、及び５２内に配置される。それぞれの槽５０、５１、５２は、電解質の感知部分５５、５６、５７を含む。バリア又は膜６０は、感知槽５０内に配置されたオリフィス６５を覆い、更に、他の感知槽５１及び５２の上にも広がる。それぞれの電極３０、３１、３２の周りに制御リング７０、７１、７２がある。感知素子２０、２１、及び２２は、電子回路層７５、感知素子２０と微細孔８０が中に配置されている中心領域７８を有する膜６０とを含む感知層３５、及び流動体層１００の３つの層からなる。電子回路層７５及び感知層３５は、好ましくは、システム１０の製造の際の都合のよい時点に異なる基材内に構築され、ボンディングされ一体になる。流動体層１００は、更に、感知層３５の上に別に構築又は組み立てることもできる。これらの個別の層３５、７５、及び１００のシステム１０を構築することで、一定レベルのモジュール性が得られ、また製造もしやすくなるが、本発明は、個々の層には制限されず、必要ならば単一基材として構築することができる。ほとんどの場合、膜６０は、検体槽４０内に導入される流体を使用してその場で加工されることが予想される。同様に、微細孔８０は、検体槽４０内に挿入され、膜６０内で自動挿入又は自動組み立てが行われる。
【００３２】
本発明により教示されるようなシステムは、好ましくは、懸架及び支持の２つのパラダイム・バリア構成の何れかとともに使用される。以下で更に詳しく説明されるように、代替え構成を使用するシステム間の著しい違いは、ほぼ同じ面積を有するが感知槽５０は懸架構成ではかなり深く、後述のように懸架構成の感知部分５５に充填するために流体アクセス管路及び充填管路が必要であるという点のみである。懸架構成を使用するか、又は支持構成を使用するかの選択は、注目している（複数の）検体、環境干渉物、必要なシステム・ロバスト性、及び所望の感度を含む多数の因子に依存する。この分野では科学の進歩が続いているため、この２つの構成の相対的メリットは、変わる可能性がある。そのため、好ましい実施形態では、システム１０は、両方の代替えバリア構成に対応することができる。
【００３３】
図２及び３を参照すると、懸架構成及び支持構成がそれぞれ示されている。好ましい実施形態では、システム１０は、感知層３５内の感知槽５０上に封止された、脂質二重層膜６０等の膜６０を備える。膜６０は、好ましくは、アレイ３７のすべての要素２０、２１、２２を覆うように連続的であるか、又は１つ若しくは複数の感知槽５０、５１、５２を覆うより小さな膜の集まりが使用される。最大５つまでの微細孔８０が、膜６０の領域７８内にある。微細孔８０は、タンパク質微細孔、イオン・チャネル、トランスポーター、又は他のそのような実体とすることができる。
【００３４】
それぞれの感知部分５５、５６、５７には、一般に感知槽５０、５１、５２上に中心を置く、膜６０の領域７８に関連付けられており、微細孔８０は、正しい動作となるように配置されなければならない。微細孔８０は、正しい位置に来るまで、拡散により領域７８内に配置されるか、又は電気泳動若しくは電気浸透力により誘導される。粘着力は、好ましくは、印加された電界による静電気によるものであるか、又は微細孔８０は、固定分子（図に示されていない）により結合することができる。
【００３５】
通常動作では、溶解された検体及び干渉種を含む電解質は、もし存在すれば、検体槽４０に渡され、十分な回数の検体取り込み事象が生じる高い尤度を与える十分に長い期間の間、槽４０内に留まる、即ち十分な数の微細孔８０が検体分子に係合されることになる。次に、電解質媒体は、新鮮な電解質媒体／検体で置き換えられる。そのため、検体槽４０内の電解質、一般にシステム１０は、数分以下のオーダーの時間スケールで開始濃度に繰り返しリセットされる。
【００３６】
微細孔８０を通して電解質電流を発生させるために、システム１０では、更に、図５に示されているように検体槽４０内の都合のよい位置に置かれている基準電極１５０を備える。例えば、感知電極３０及び基準電極１５０の両方を電子回路層７５上に置くと、システム１０とデータ収集及び記録電子回路（図に示されていない）との電気的相互接続が簡素化される。それとともに、感知槽５０、微細孔８０を含むバリア６０の領域７８、及び感知電極３０は、単一感知ユニット２０を構成する。感知及び基準電極は、システム１０の電解質媒体に抵抗（ファラデー）又は容量結合される。抵抗性電極は、直流（ＤＣ）結合の利点を有しているが、電極自体が電解質媒体中に溶解する腐食反応を伴うという欠点を有する。対照的に、容量性電極は、電解質媒体とのイオン交換を受けず、そのように腐食することはない。容量性電極を使用する場合、電流を微細孔８０に通し交流（ＡＣ）を得る必要がある。これは、微細孔８０を通るイオン流の方向を逆転することで、後述のように、感知槽５０内のイオン濃度及び帯電の増大を防ぐという他の利点も有する。ＡＣ駆動も、抵抗性電極とともに使用することができ、必要ならば、例えば図５の感知槽５１の３１及び１６０で示されている、容量性と抵抗性の両方の電極が、感知槽５０内に組み込まれ、これにより、実際の動作において利点と欠点を交換することができる。
【００３７】
一方向ＤＣ微細孔電流が印加された場合、感知槽５０内に定常イオン濃度変化が生じる。このような濃度変化があると、膜６０にＮｅｒｎｓｔ電位が発生し、微細孔電流を駆動する電界と逆の作用をする。Ｎｅｒｎｓｔ電位の大きさは、微細孔電流が流れていた時間と初期電解質媒体イオン濃度に依存する。図６の異なる感知槽体積に対する時間の関数として微細孔電流が示されている。図６に示されているように、固定駆動電圧に関して、電流は、直径５０μｍの感知槽について約５日以内にその値の半分に下がるが、直径１０μｍの槽については約１０時間経過した後に半分に下がる。
【００３８】
感知部分５５のサイズが減ると、濃度効果は、制限的なものになりうる。１００ｐＡの一価イオンの微細孔電流と０．１Ｍの初期濃度を有する５ｎｍ×１０μｍ×１０μｍの感知槽の場合、Ｎｅｒｎｓｔ電圧は、１ｍｓ後、駆動電圧の２９％に上昇し、１０ｍｓ後では、８０％となる。
【００３９】
Ｎｅｒｎｓｔ電位の増大に対抗する一方法では、微細孔８０に印加される電圧を高める。必要な電圧は、電流が必ず一定となるように微細孔電流を監視することにより設定される。しかし、この方法は、感知素子２０、２１、２２の稼働寿命を著しく延ばすためにかなりの電圧（＞１０Ｖ）を印加する手段を必要とするという点で制限がある。参照により本明細書に組み込まれている、２００５年７月２２日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ａ  Ｔｉｍｅ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ」という表題の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２６１８１で説明されているように、ＡＣ微細孔電流に結合されている容量性電極は、Ｎｅｒｎｓｔ電位及び準静電圧に関連する問題を解消するために使用される。微細孔信号周波数よりもかなり低い周波数で微細孔電流方向を逆転することに加えて、後述のように、微細孔信号周波数よりもかなり高い周波数で微細孔電流を駆動し、この搬送波周波数を復調することにより微細孔信号の時間依存性を回復することも可能である。
【００４０】
電解質媒体中のイオンに関連する正味電荷の静電気的増大は、問題となる可能性がある。感知部分５５の静電容量は、バリア領域７８から検体槽４０及び感知電極３０の間のキャパシタンスの影響を強く受ける。その結果、異なるシステム構成は大いに異なる感知部分５５を有する可能性があるが、キャパシタンスは実質的に同じである。不平衡帯電イオンが電解質部分５５内に蓄積する場合、検体槽４０に関する電圧（つまり、微細孔にかかる）は、この感知部分のキャパシタンスにより決められる。１０ピコファラッド（ｐＦ）のキャパシタンス及び１００ｐＡのイオン電流の場合、感知槽電圧（つまり、検体槽に関する）は、１ｍｓ後に、１０ミリボルト（ｍＶ）である。
【００４１】
そのため、一方向の微細孔電流について、感知部分５５が小さくされるほど、検体槽が小さいせいで大きくなるシステム感度と稼働寿命との間に固有のトレードオフ関係が生じる。システム１０は、小さければ小さいほど、従って感度が高ければ高いほど、稼働できる時間は短くなる。システム１０では、一方向電流を使用し、感知槽５０によりサイズが制限される場合に、感知槽５０の好ましいサイズは、直径が５０μｍから３００μｍの範囲、深さが１０μｍから３００μｍの範囲である。
【００４２】
ＡＣ電流が使用される場合、微細孔電流の時間平均は、ゼロであり、従って濃度効果は、回避される。好ましくないのは、感知電極３０と基準電極１５０との間の電圧差により生じる平均電気泳動力もゼロであるという点である。これは、微細孔８０への検体の流れを最適化するようにＡＣ波形を手直しすることにより解消される。一実施例では、印加された電界は、検体が微細孔８０内に入ることができるように一定期間比較的低いレベルに維持され、次いで、関連する感知槽５０内への正味イオン流の平衡をとるためにそれに対応して短い時間によい高いレベルに反転される。長い逆転期間の後、電界はオフにされ、これにより、検体分布は、電解質イオンの正味電流が微細孔８０内に流れている間に、拡散を介して電解質媒体において平衡状態に到達することができる。
【００４３】
微細孔８０を通る電流のＡＣ測定を実施する方法は、大きく分けて２つある。第１の方法は、別の電極システムを介して電流を駆動し、図５に最もよく示されているように独立した感知電極１６０を使用して図６に示されているように感知槽５０内の電圧の上昇を測定することである。第２の方法は、高い周波数（１ｋＨｚから１００ｋＨｚ）のプローブ電流を利用して、微細孔８０の応答時間に比較して短い時間スケールで微細孔８０のインピーダンスを測定することである。第１の方法（電圧感知法）は、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２６１８１で説明されている。第２の方法（インピーダンス感知法）は、比較的高い周波数で微細孔電流を変調し、次いで微細孔抵抗に応じて流れる電流の変化を測定することに頼る。例えば、０．１ｍｓのオーダーで事象を調べるには、１０ｋＨｚのオーダーの周波数が、好ましい。インピーダンス・プローブ構成では、感知部分において単一電極を使用することができる。
【００４４】
上述のインピーダンス感知法の回路の一実施例は、図７に示されている。図７は、感知電極３０と基準電極１５０との間の直接電解質媒体抵抗Ｒｂ及び領域７８に関連する膜キャパシタンスＣｍを示している。信号は、Ｂ点で電流感知抵抗器Ｒｓに掛かっている電圧として読み出される。Ｂ点の信号は、ミキサーＭ１とオシレータＶ３で復調される。信号の高周波成分は、ローパス・フィルタＵ２により濾波されて取り除かれる。
【００４５】
図７の回路に対する微細孔スイッチングにより生成される電流変調のシミュレート信号は、図８に示されている［わかりやすくするため、微細孔電流は、３ピコボルト（ｐＶ）によりオフセットされている］。微細孔電流は、ほぼゼロから最大１ピコアンペア（ｐＡ）まで変調され、約２倍のソース電流の変化を生じる。４極ベッセル・ローパス・フィルタの後の復調された信号の出力は、図９に示されている。信号は、異なる微細孔電流及び利得について直線的に大きくなる。
【００４６】
インピーダンス感知法は、図９に示されている復調信号が膜キャパシタンスとは無関係であるという重要な特性を有する。しかし、復調前の微細孔開信号と微細孔閉信号との比は、図７に示されている抵抗Ｒｂに著しく左右される。好ましくは、Ｒｂは、１００メガオーム（ＭΩ）よりも大きい。例えば、１００ｐＡｐｐ（ピコアンペア・ピーク・ツー・ピーク）の微細孔電流では、１００ＭΩのＲｂ値から、５ｐＡｐｐの変調電流と０．４８５ｐＡｐｐの雑音が生じ、その結果、信号対雑音比は約１０となる。
【００４７】
本発明の他の態様では、印加された発振微細孔電流に関して変調された微細孔応答の２つの直交する成分を測定する。これにより、読出しシステム内のノイズの他の発生源を明確に決定しなくても抵抗変動のスペクトル密度の測定を改善することができる。この方法を適用して微細孔の時間により変化する抵抗を測定するために、短い重なり合う時間間隔で、スペクトルが、計算され、高コンダクタンス状態と低コンダクタンス状態の間の遷移の頻度のスペクトル・エネルギーの変化について分析される。
【００４８】
微細孔８０を通して電流を駆動するために使用される、感知電極３０及び基準電極１５０は、更に、検体分子が帯電するか、又はシステム１０内のイオン流により引き起こされる電気浸透力を受ける場合に、電解質媒体中の検体分子に対し電気泳動力を与える。本発明のコンパクトなシステム設計の利点の１つは、システム１０内の電解質媒体内に発生される電界が、従来技術に存在する電界よりもかなり大きくなりうるという点である。例えば、１００μｍの距離にわたって１ボルト（Ｖ）が印加される場合、電界は、１０４ボルト／メートル（Ｖ／ｍ）となる。そのため、システム１０内の電解質媒体中に引き起こされる電界は、従来技術で一般に使用されるものに比べてかなり大きくなる場合がある。
【００４９】
更に静電的制御を行うために追加電極が、加えられる。好ましくは、感知部分５０の周りに、導電性制御リング７０がある。リング７０の電位は、検体が帯電している場合に、感知部分５５に向けて検体を引き付けるか、又は反発する電気泳動力をもたらすように制御される。それとは別に、参照として本明細書に組み込まれる２００５年９月２２日に出願された「Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｓｏｕｒｃｅ」という表題のＨｉｂｂｓらの国際関係出願で教示されているように、リング７０の電位を帰還により制御し、感知電極の漂遊電位への結合を最小にすることで感度を改善する。
【００５０】
制御リング７０を更に使用すると、特定の微細孔８０は、アレイ３７の特定の素子２０を対象とすることができる。微細孔８０は、正味電荷を有するか、又は当業者に知られている方法で電荷群のタグ付けをされなければならず、従って、リング７０の電位は、好ましくは、所望の微細孔を引き付けるか、又は反発するように設定される。微細孔８０が挿入されると、ＤＣ電位が、リング７０に印加され、微細孔８０を膜６０内に固定する。この電界法は、個々の感知素子２０、２１、２２を扱える複合微細流体システムを介して特定の感知ユニット内に特定のタンパク質微細孔を直接挿入するための技術よりもかなり単純である。特定の微細孔８０のアレイ位置を決定する代替え法では、微細孔８０で検出された検体を適用し、どの微細孔が予想される応答を与えるかを観察する。更に、適切なタグ付けにより、個々の感知ユニットの位置を決定するために、光学的手段を使用することができる。
【００５１】
こうして説明されている素子は、すべての知られている種類の微細孔及び２つのパラダイム・バリア構成とともに使用される。更に、非常に小さな感知部分を使用できるので、本発明を、将来のバリア及び微細孔構成による応用に利用することができ、システムは、何れかの特定の形態に特異的であると考えるべきではない。懸架及び支持バリア構成とともに使用される本発明及びそれへの特定の追加物を使用することについては、以下で説明される。
【００５２】
（懸架構成）
図１０を最初に参照すると、感知素子２２０は、懸架構成で示されている。好ましい実施形態では、基材２３５は、感知槽２５０が中に配置されるように形成される。槽２５０は、オリフィス２６５の上に形成された膜２６０で覆われる。脂質二重層膜等、場合によっては、膜２６０は、図１１に示されているように、オリフィス２６５又は孔の直径内に形成することができる。すべての場合において、微細孔は、オリフィスによりもたらされる開口部内にある。図１０及び１１は、感知層２３５の上面上の制御リング２７０を示している。
【００５３】
本発明の完全な懸架膜感知システム１０は、検体槽３４０とともに図１２に示されている。これからわかるように、感知槽３５０は、狭い槽間チャネル３５２を介して充填槽３５４に接続される。充填槽３５４は、チャネル３５６を介して検体槽３４０に接続され、感知槽バリア又は膜３６０に掛かる圧力を平衡させ、それによりシステム１０に対する振動効果を最小限に抑える手段となる。更に、槽間チャネル３５２は、オリフィス３６５が非常に小さく、非常に小さい流量しか許さない場合に、電解質媒体で感知槽３５０を充填する手段となる。更に、槽間チャネル３５２は、脂質二重層膜３６０を加工しやすくするために流体レベルの上げ下げを行う手段となる。
【００５４】
槽間チャネル３５２は、流体層３７０を介して感知槽３５０から検体槽３４０までの経路の電気的インピーダンスを最大にするために、できる限りその断面を長く、小さくされる。この経路は、実際に、膜３６０の電気的インピーダンスを短くし、従って、システムの電気的特性を制御する場合に重要である。当業では、懸架膜システム内の膜インピーダンスは、微細孔を除き、１ギガ・オーム（ＧΩ）のオーダーでなければならず、好ましくは、ロバストな測定が可能なように高くなければならないことはよく知られている。注目している周波数範囲にわたって槽間チャネル３５２の正味インピーダンスを高めるために、電圧制御電極３７８は、充填槽３５４内に置かれ、帰還により感知槽３５０の電圧で維持される。簡単な分析から、この方法で、槽間チャネル３５２のインピーダンスを１００倍高められることがわかる。
【００５５】
図１３では、貫通孔４４５を持つ層４４０は、感知槽４５０、４５１を定める基材４４７に結合されている。膜４６０は、第２の層４４０上に形成される。検体槽４６５の体積を最小にするために、短い流体経路４５５と単一槽間チャネル４５７及びすべての感知槽４５０、４５１に使用される充填槽（図に示されていない）により、複数の感知槽４５０、４５１が１つに結合される。そうでなければ、複数の槽間チャネルを追加するには、感知素子の間の間隔を増やす必要がある。槽間チャネル自体が非常に狭くても（例えば、＜１０μｍ）、他の素子からギガ・オーム・レベルの分離距離でチャネルを確実に封止することに関連する実用上の加工問題は、感知槽間の分離距離を比較的大きくする必要があることを意味する。この余分なスペースがあると、検体槽４０の体積が増大し、システム１０の感度がそれに対応して減少する。
【００５６】
しかし、複数の感知槽を流体経路により接続することは、従来技術で説明されている単純な微細孔及び膜構成については機能しない、というのも、注目している多くのタンパク質微細孔の多くは、通常、開状態であり、コンダクタンスが、１ナノジーメンス（ｎＳ）と高いか、又は抵抗が、１ＧΩのオーダーであるからである。そのため、１つの感知槽４５０を他の感知槽４５１に接続すると、注目する微細孔と並列に検体槽４４０につながる１ＧΩの電気的経路が得られる。１０個の感知ユニットのアレイでは、他の感知ユニットによる個々の微細光４８０の正味短絡は、１００メガオーム（ＭΩ）のオーダーであり、単一感知ユニットの記録が実現不可能になる。１０００個の素子がある場合、短絡は１ＭΩとなるであろう。
【００５７】
感知素子を１つに結合することの短絡効果を低減するために、図１３に示されているように直径が非常に狭い孔４８５が形成され、それにより、それぞれの関連する微細孔４８０と直列の抵抗を高める。例えば、６μｍの第２の層４４０の直径１０μｍの孔４４５の抵抗は、１００ＧΩのオーダーである。必要な直列抵抗を設定するために、孔４４５の断面積と電解質伝導度の組み合わせが、必要に応じて設定される。何れにせよ、微細孔４８０の十分な分離を得るために、少なくともｎ×１ＧΩの孔４４５の抵抗が好ましく、ｎは、アレイ内の感知素子の個数である。制御された抵抗を使用し、短い素子間流体経路により複数の感知槽を接続し、単一槽間チャネル４５７を使用して外側流体貯蔵容器に接続することが可能である。
【００５８】
更に、ＧΩレベルで個々の感知槽４５０、４５１を絶縁する必要はないので、それぞれの感知槽４５０の上の第２の層４４０を封止する必要はない。その代わりに、検体槽から接続されている感知槽アレイの絶縁を全体として行うために第２の層４４０の外周を封止することのみが、必要である。この封止は、図１３の４９１のところに示されている。本発明の最も好ましい実施形態によれば、第２の層４４０の外縁に、単一の機械的結合が用いられ、これにより、封止プロセスを簡素化しつつ、比較的広い幅を結合領域に使用することができる。より具体的には、複数の小さな封止の代わりに単一の大きな封止４９１を使用することで、システムの製造が大幅に簡素化され、感知槽４５０、４５１の間の分離距離が最小になり、それにより、検体槽内に導入されなければならない検体の量を減らすことができる。本発明によれば、素子間チャネル４４５は、単一感知槽４５０に沿った抵抗よりもかなり高い抵抗を持ち、そのため、特定の微細孔４８０を通る電流の大半は、必ず、その微細孔の関連する電極４９５に到達し、それにより、単一微細孔４８０の活性の同定が可能になる。
【００５９】
典型的には、懸架膜及びパッチ・クランプ・システムにおける微細孔と直列の抵抗は、ノイズを最小にし、システム帯域幅を最大にするように特異的に回避される。本発明の孔４４５に架かる懸架バリアの非常に小さな領域を使用することで、この要件が幾分緩和される。例えば、５０μｍ脂質二重層膜内の微細孔と並列のキャパシタンスは、１００ピコファラッド（ｐＦ）のオーダーであるが、直径５０ナノメートル（ｎｍ）の脂質二重層膜の微細孔と並列のキャパシタンスは、０．０１フェムトファラッド（ｆＦ）のオーダーである。しかし、抵抗の増大は、更に、感知槽４５０内で使用される電解質媒体の電位が、抵抗による方法ではなく、容量による方法で、電解質媒体に結合される電極４９５により測定される容量性読出し方式を使用することにより克服される。容量性電極４９５及びその関連する第１段増幅器のインピーダンスは、高く、従って、与えられた微細孔４８０と直列の孔４４５の高抵抗は、最小効果をもたらす。
【００６０】
本発明の動的システム応答を計算するために使用される回路のモデルは、図１４に示されている。図に示されているように、１０ＧΩのオーダーのチャネル抵抗Ｒａは、図１３に示されている短い流体経路４５５を介して意図的に加えられる。図１４の回路モデルを使用する例示的なＡＣ変調及び復調インピーダンス・プローブ法についてのシミュレートされた応答は、図１５に示されている。膜キャパシタンス（Ｃｍ）は、１ｆＦに設定され、これにより漂遊キャパシタンスの効果に対応している。モデル回路に沿って取られた主点は、図１４には、Ｂ点及びＣ点として示されている。Ｂ点は、ミキサーＭ１とオシレータＶ３で復調される信号を示す。Ｃ点は、復調され、Ｕ２のローパス・フィルタ（ＬＰＦ）を通して濾波された後の信号を示す。復調前にＢ点で測定された変調された入力信号は、図１５に示されている。微細孔の状態のスイッチングは、短い流体経路４５５からの余分な１０ＧΩのアクセス抵抗を加えたとしてもはっきり見て取れる。この信号は、図９に示されている信号と等価な信号を発生するように復調される。
【００６１】
微細孔が開状態（Ｒｐ＝１ＧΩ）の場合のすべてのコンポーネントに対する計算された実効電圧ノイズは、図１６に示されている。閉微細孔状態のノイズは、低く、追加された槽間チャネル抵抗からの寄与は、閉微細孔状態のインピーダンスに比べて無視できるくらい小さい。１ＧΩ（開）と３００ＧΩ（閉）とを切り替える微細孔に対する０．７０７ｐＡｒｍｓの印加された微細孔電流に対する追加抵抗がある場合とない場合の計画された信号、ノイズ、及び信号対雑音比は、表１に示されている。
【００６２】
【表１】
2008517268.tif 000003
【００６３】
表１では、１ｋＨｚの帯域幅のノイズは、ノイズ・スペクトルを９ｋＨｚから１１ｋＨｚまで積分することにより得られ、図１４のＢ点で測定されたノイズと同等である。信号レベルは、異なる微細孔状態についてＢ点の１０ｋＨｚ発信源の振幅とみなせる。表１からわかるように、微細孔と直列に高抵抗を追加すると、アレイ内の感知槽を１つに結合できるようになることに加えて、システムの信号対雑音比が２倍改善される。
【００６４】
（支持構成）
支持構成では、好ましい実施形態は、高分子で作られている、連続する下層により支持される、微細孔５８０が中にある、脂質二重層膜等の膜５６０、水又は他の何らかの好適な物質のクッションを含むシステム５００である。懸架膜構成と対照的に、下層は、微細孔５８０を含め、微細孔５８０を膜５６０に通すことができる孔を含まず、むしろ、微細孔の本体を受け入れる十分な流動性又は弾性を持つ材料である。支持構成では、下層は、図１７に示されているように感知槽を定める。
【００６５】
支持膜システム５００の主な設計上の特徴は、検体槽５８７の電解質媒体からの感知電極５８５の分離である。感知電極５８５の分離は、好ましくは、膜５６０を感知電極５８５と重なり合うようにし、それにより、感知電極５８５と検体槽５８７内の電解質との間の経路の長さを増やすことにより改善される。分析したところ、膜のサイズが増えると、検体槽５８７への感知電極５８５の直接抵抗（つまり、微細孔５８０を介さない）は、膜５６０が感知電極５８５とサイズの点で等しい場合に見つかる値の約１０倍安定することが示唆される。この限界値を近似するために、膜５６０の直径は、好ましくは、感知電極５８５の直径の５倍のオーダーである。直径１μｍの感知電極の場合、制限（シャント）抵抗は、約５メガオーム（ＭΩ）であり、感知電極が小さければ小さいほど、このシャント抵抗は高くなる。そのため、単に膜５６０の直径を増やすだけで、ギガシールを達成することは困難である。更に、横方向の重なりを増やすと、検体槽５８７のサイズに直接的な影響が生じ、そのため、システム１０の感度に影響が出る。
【００６６】
感知電極５８５の分離は、更に、高分子テザー５９０を架橋するか、又は他の何らかの方法で電子回路層５９４への膜付着のメカニズムを変更し、個々の感知電極５８５の周りの膜５６０の縁を封止することにより改善することもできる。好ましくは、正確な鎖長の高分子テザー５９０の群は、電極５８５に結合され、膜５６０の支持を備える。更に、絶縁材料５９５のバリアは、好ましくは、電極５８５の周りに加工され、それにより、図１８に示されているように、電解質体積で定められる繋留領域と検体槽５８７との間の抵抗性の接触を防ぐ。上述のように、膜５６０の下の横方向抵抗性経路から感知電極５８５を分離する他の方法では、感知電極５８５からの帰還を使用して制御リング５９９の電位を設定する。
【００６７】
（アレイのサイズ及び性能の考慮事項）
その結果得られる感知素子のアレイを使用することで、ユーザーは、或る種の疾病、毒素、生物学的反応等の存在に特徴的な複合生物学的指紋（生体指紋）を得ることができる。このような生体指紋は、単一の種類の検体に限定されない。
【００６８】
ほとんど場合、説明されているようなシステムは、電解質媒体中の検体分子の拡散速度により制限される。そのため、検体と微細孔の相互作用速度は、検体濃度に比例する。そのため、他の効果がなければ、与えられた所望の応答時間は、所望の検体と感知素子の会合定数により決定されるように特定の濃度を必要とする。例えば、１０８（１／Ｍ秒）の平均会合速度定数では、応答時間を速く（１秒）するために、１０ｎＭの溶液が、必要である。この関係が与えられた場合、妥当な期間内に検出される検体の絶対量は、検体槽の体積により設定される。この槽は、好ましくは、感知アレイ全体を覆い、従って、感知ユニットの個数、互いのその分離距離、及びその個別のサイズにより決定される。素子間分離距離が５０μｍであり、アレイ内に２５×４個の感知ユニットがあると仮定すると、最大感知ユニット横方向寸法と１ｎＭの検体に対する結果として得られるシステム感度との関係は、図１９に示されている。
【００６９】
そのため、１００μｍの感知素子寸法では、単一の感知ユニットの感度は、１００ユニット・アレイに対し、１アトモル（ａｍｏｌ）及び１００ａｍｏｌのオーダーと予想される。好ましい実施形態で説明されているような支持膜については、単一感知ユニットについては０．２ａｍｏｌ、及び１００ユニット・アレイについては２ａｍｏｌのオーダーの結果として得られる感度で、１０μｍと小さな横方向サイズにすることが可能である。
【００７０】
この予想では、電気泳動からの許容可能な検体濃度の減少を仮定しない。検体を電気泳動で送ることにより応答時間を１／１０に短縮すると、必要な濃度は、１／１０に低減され、それにより、感度についてはそれに応じた改善が得られる。
【００７１】
本発明の感知システムの特定の構造により、複雑な取り扱い可能なマイクロ流体を使用せずに、シングルチップ、ガラス、又は他の好適な基材上にそれぞれの感知システムを構築することができる。ＡＣ読出しを使用することで、非常に小さな感知素子体積にすることができ、従って、アレイ感度をきわめて高くすることができる。一般的な膜アーキテクチャの使用により、さまざまな微細孔を利用できるようになる。このような柔軟性があるので、異なる微細孔を利用して感知アレイの組成を素早く変更することができる。こうした利点をもたらすことに関して、本発明は、ナノメートル・スケールでの生物学的感知機能とミクロン・スケールでの現代のマイクロエレクトロニクスとの間のギャップを効率よく埋める。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態を参照しつつ説明されているが、本発明の精神から逸脱することなく本発明にさまざまな変更及び／又は修正を加えられることは容易に理解されるであろう。一般に、本発明は、請求項の範囲によってのみ制限されることを意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の好ましい一実施形態による検体の生体指紋を測定するための感知素子を組み込んだ感知システムの概略を示す図である。
【図２】懸架膜構成の図１の感知素子の概略を示す図である。
【図３】支持膜構成の図１の感知素子の概略を示す図である。
【図４】固形物中でオリフィスを使用する懸架膜構成の図１の感知素子の概略を示す図である。
【図５】基準電極を備える図１の感知システムを示す図である。
【図６】異なる感知槽体積に対する時間の関数として表される微細孔電流を示すグラフである。
【図７】比較的高い周波数で微細孔電流を変調し、次いで微細孔抵抗に応じて流れる電流の変化を測定する回路の一実施例を示す回路図である。
【図８】図７の回路で生じる電流変調のシミュレート信号を示すグラフである。
【図９】４極ベッセル・ローパス・フィルタにより復調され、処理された後の図８のシミュレート信号を示す図である。
【図１０】制御リングとともに本発明の懸架構成の感知素子を示す図である。
【図１１】制御リングとともに本発明の懸架構成の感知素子を示す図である。
【図１２】感知槽は、狭い槽間チャネルを通して充填槽に接続される本発明の懸架膜感知システムを示す図である。
【図１３】アレイ内の複数の感知槽を示す図である。
【図１４】本発明の動的システム応答を計算するために使用される回路のモデルの図である。
【図１５】図１４の回路の点Ｂにおいて測定された変調入力信号を示すグラフである。
【図１６】微細孔が開状態の場合のすべてのコンポーネントに対する計算された実効電圧ノイズを示すグラフである（Ｒｐ＝１ＧΩ）。
【図１７】支持構成の感知槽を定める下層を示す図である。
【図１８】追加絶縁層を備える図１７の感知槽を示す図である。
【図１９】５０μｍの分離距離、及び１ｎＭの検体に対するアレイ内の２５×４感知ユニットを想定するシステム感度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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