(57)【要約】ナノ担体、治療剤または画像化剤、およびターゲティング剤を含む結合体が本明細書に開示される。そのような結合体を含む組成物、ならびに治療剤および/または画像化剤を細胞へ送達するために結合体を用いる方法もまた本明細書に開示される。増殖性障害のような特定の障害を処置するために結合体を用いる方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ担体、治療剤または画像化剤、およびターゲティング剤を含む結合体。
【請求項２】
ナノ担体が、ナノ粒子、有機ポリマー、または両方を含む、請求項1記載の結合体。
【請求項３】
結合体が、以下の式を有する化合物である、請求項2記載の結合体：
2008515915.tif 000015
式中、Aは、化学療法剤または画像化剤を表し；Xは、ナノ粒子、有機ポリマーまたは両方を表し、有機ポリマーは少なくとも約1,000ダルトンの平均分子量を有し；およびYは、ターゲティング剤を表す。
【請求項４】
有機ポリマーが、ポリアミノ酸、多糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項3記載の結合体。
【請求項５】
有機ポリマーがポリイオン性ポリマーである、請求項3記載の結合体。
【請求項６】
有機ポリマーが、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミドコポリマー、ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ(ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレートコメタクリレート)、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキサマー、ポリオキサミン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ブチル2-シアノアクリレート)、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、キトサン、それらのコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む、請求項3記載の結合体。
【請求項７】
Xが有機ポリマーを表し、かつ結合体が生理学的条件下で自己組織化して、自己組織化ナノ粒子を生じる、請求項3記載の結合体。
【請求項８】
有機ポリマーがヘパリンを含む、請求項7記載の結合体。
【請求項９】
自己組織化ナノ粒子が、約1ナノメートルから約1500ナノメートルの直径を有する、請求項7記載の結合体。
【請求項１０】
自己組織化ナノ粒子が、約1ナノメートルから約1200ナノメートルの直径を有する、請求項7記載の結合体。
【請求項１１】
自己組織化ナノ粒子が、約10ナノメートルから約400ナノメートルの直径を有する、請求項7記載の結合体。
【請求項１２】
自己組織化ナノ粒子が、約100ナノメートルから約250ナノメートルの直径を有する、請求項7記載の結合体。
【請求項１３】
ナノ粒子がポリマー性ナノ粒子である、請求項3記載の結合体。
【請求項１４】
ナノ粒子が、ヘパリン、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート、N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミドコポリマー、ポリ(ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレートコメタクリレート)、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキサマー、ポリオキサミン、ポリホスファゼン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ブチル2-シアノアクリレート)、それらのコポリマーおよびそれらの組み合わせを含む、請求項13記載の結合体。
【請求項１５】
ナノ粒子がヘパリンを含む、請求項14記載の結合体。
【請求項１６】
有機ポリマーが約1,000ダルトンから約150,000ダルトンの分子量を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項１７】
有機ポリマーが約5,000ダルトンから約100,000ダルトンの分子量を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項１８】
有機ポリマーが約10,000ダルトンから約50,000ダルトンの分子量を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項１９】
ナノ粒子が金属クラスターを含む、請求項3記載の結合体。
【請求項２０】
金属クラスターが、銀、金、白金、パラジウム、コバルト、および/または鉄を含む、請求項19記載の結合体。
【請求項２１】
ナノ粒子が約1ナノメートルから約1500ナノメートルの直径を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項２２】
ナノ粒子が約1ナノメートルから約1200ナノメートルの直径を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項２３】
ナノ粒子が約10ナノメートルから約400ナノメートルの直径を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項２４】
ナノ粒子が約100ナノメートルから約250ナノメートルの直径を有する、請求項3記載の結合体。
【請求項２５】
複数の治療剤をさらに含む、請求項3記載の結合体。
【請求項２６】
複数の治療剤が同じである、請求項3記載の結合体。
【請求項２７】
少なくとも2つの治療剤が異なる、請求項25記載の結合体。
【請求項２８】
治療剤が、微小管結合性作用物質、DNA挿入剤もしくは架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよび/もしくはRNA転写阻害剤、酵素阻害剤、遺伝子レギュレーター、抗アテローム性動脈硬化剤、ならびに/または血管形成阻害剤からなる群より選択される、請求項3記載の結合体。
【請求項２９】
治療剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、コルヒチン、ドラスタチン15、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、リゾキシン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン(ナベルビン)、エポチロン、マイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブシル、カルムスチン、メルファラン、ミトキサントロン、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テノポシド、ゲルダナマイシン、メトトレキセート、アドリアマイシン、アクチノマイシンD、ミフェプリストン、ラロキシフェン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、ゼブラリン、タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、アピゲニン、ラパマイシン、アンギオスタチンK1-3、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、エンドスタチン、サリドマイド、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3記載の結合体。
【請求項３０】
ターゲティング剤が、葉酸、ビオチン、ビタミンB12、およびそれらの誘導体からなる群より選択される、請求項3記載の結合体。
【請求項３１】
ターゲティング剤が、成長因子、サイトカイン、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片を含む、請求項3記載の結合体。
【請求項３２】
化合物が以下の式を有する、請求項3記載の結合体：
2008515915.tif 000016
A、XおよびYは上記の通りであり；ならびに、nおよびmは独立して、2から約500の整数である。
【請求項３３】
化合物が以下の式を有する、請求項3記載の結合体：
2008515915.tif 000017
A、XおよびYは上記の通りであり；mは2から約500までであり；ならびに、nは1である。
【請求項３４】
化学療法剤および画像化剤を含む、請求項33記載の結合体。
【請求項３５】
化合物が以下の式を有する、請求項3記載の結合体：
2008515915.tif 000018
A、XおよびYは上記の通りであり；mは1であり；ならびに、nは2から約500までである。
【請求項３６】
AからX、およびXからYの少なくとも1つを連結するリンカーをさらに含む、請求項3記載の結合体。
【請求項３７】
リンカーが、AからX、およびXからYの少なくとも1つを共有結合性に連結する、請求項36記載の結合体。
【請求項３８】
リンカーが、炭化水素鎖、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、多糖、ポリプロピレンオキシド、ヒドロキシエチルアミン、ポリヒドロキシエチルアミン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項36記載の結合体。
【請求項３９】
画像化剤をさらに含む、請求項28記載の結合体。
【請求項４０】
画像化剤を含む、請求項3記載の結合体。
【請求項４１】
画像化剤が、磁気共鳴コントラスト試薬、光学的画像化剤、放射性同位元素、またはそれらの組み合わせを含む、請求項40記載の結合体。
【請求項４２】
薬学的に許容される担体、および請求項3記載の結合体の治療的有効量を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
有機ポリマーが、ポリアミノ酸、多糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
有機ポリマーが、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミドコポリマー、ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ(ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレートコメタクリレート)、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキサマー、ポリオキサミン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ブチル2-シアノアクリレート)、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、キトサン、それらのコポリマーまたはそれらの組み合わせを含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４５】
Xが有機ポリマーを表し、かつ化合物が生理学的条件下で自己組織化して、自己組織化ナノ粒子を生じる、請求項42記載の組成物。
【請求項４６】
結合体が画像化剤を含む、請求項42記載の組成物。
【請求項４７】
過剰増殖性障害を有する被験体を処置するための方法であって、被験体に請求項2記載の結合体を投与し、それにより被験体を処置する段階を含む、方法。
【請求項４８】
被験体が、乳癌、膀胱癌、骨癌、子宮頚癌、結腸癌、中枢神経系癌、食道癌、胆嚢癌、消化管癌、頭頸部癌、喉頭癌、白血病、肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、または腎臓癌を含む状態を有する、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
被験体が乳癌である、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
治療剤を細胞へ送達するための方法であって、細胞を請求項1記載の結合体に接触させ、それにより治療剤を送達する段階を含む、方法。
【請求項５１】
治療剤が生理学的に不安定な結合を介してナノ担体に結合している、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
結合がエステル結合である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
化学療法剤を送達する段階が受容体媒介性エンドサイトーシスを含む、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
請求項3記載の結合体を含む複数の自己組織化ナノ粒子を含む、組成物。
【請求項５５】
溶媒をさらに含む、請求項54記載の組成物。
【請求項５６】
薬学的に許容される緩衝溶液をさらに含む、請求項54記載の組成物。
【請求項５７】
自己組織化ナノ粒子が、約1ナノメートルから約1500ナノメートルの直径を有する、請求項54記載の組成物。
【請求項５８】
自己組織化ナノ粒子が、約1ナノメートルから約1200ナノメートルの直径を有する、請求項54記載の組成物。
【請求項５９】
自己組織化ナノ粒子が、約10ナノメートルから約250ナノメートルの直径を有する、請求項54記載の組成物。
【請求項６０】
自己組織化ナノ粒子が、約100ナノメートルから約400ナノメートルの直径を有する、請求項54記載の組成物。
【請求項６１】
ヘパリン、パクリタキセル、および葉酸を含む化合物。
【請求項６２】
複数のパクリタキセル部分および複数の葉酸部分を含む、請求項61記載の化合物。
【請求項６３】
結合体が以下の式の1つを有する、請求項1記載の結合体：
2008515915.tif 000019
式中、Aは、化学療法剤または画像化剤を表し；Xは、ナノ粒子、有機ポリマーまたは両方を表し、有機ポリマーは、少なくとも約1,000ダルトンの平均分子量を有し；およびYは、ターゲティング剤を表す。
【請求項６４】
以下の式を有する、請求項63記載の結合体：
2008515915.tif 000020
式中、A、XおよびYは上記の通りであり、nおよびmは独立して、2から約500の整数である。
【請求項６５】
AからX、XからY、およびAからYの少なくとも1つを連結するリンカーをさらに含む、請求項64記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、治療剤または画像化剤の標的組織への薬物送達に関する。一般的に、開示された化合物は、ターゲティング構成要素、治療用または画像化構成要素、およびナノ担体構成要素を含む。本開示はまた、そのような化合物を含む組成物、ならびにそのような化合物および組成物を用いるための方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2004年10月7日に出願された、米国仮出願第60/617,158号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
重要な研究は、薬学的作用物質が、所望の解剖学的位置；すなわち、処置を必要としている部位、へ選択的に送達されうる系を発見することに向けられてきた。この領域におけるかなりの進歩にも関わらず、様々な疾患または健康リスクの多くの薬学的処置は、選択的薬物送達の欠如のために患者へ実質的なリスクを与える。リスクは、薬理学的活性抗癌薬が弱い特異性および用量規定毒性を以て腫瘍組織へ達するため、癌治療において、特に深刻である。
【０００４】
癌の処置に関して、悪性細胞を攻撃して、それらを破壊する、または少なくともそれらの増殖を制限するにおいて効果的である薬物は、一般的に、良性細胞も同様に攻撃する。細胞毒性作用物質を標的部位に集中することが望ましいが、それどころか現在の癌処置プロトコールは、患者を注意深くモニタリングしながらの非特異的または全身性投薬を含む。用量は、生命に関わる心筋症、骨髄毒性、肝毒性、または腎毒性へ導きうる急性(および、時々、慢性)毒性を生じる量よりほんの少し下回っているように選択される。脱毛(毛髪喪失)、粘膜炎、および吐き気は、これらの用量において、他のよく起こる、しかし一般的には生命に関わるものではない、副作用である。
【０００５】
悪性腫瘍を有する器官の位置への直接的注入により細胞毒性薬物を投与しようとする以前の試みは、その位置からの薬物の分散のために、部分的のみ効果的である。そのような分散を、完全に防ぐことはできず、その結果として、過剰量の薬物が所望の結果を得るために投与される必要がある。注意深い臨床的モニタリングは、生存組織の広範な損傷または損失を最小限にしうるが、細胞毒性作用物質の活性化の前に処置部位へ標準的生物学的系を通して能動的に輸送される化合物が、大いに望ましいと思われる。従って、標的細胞、組織、または器官における治療剤の部位特異的放出を達成しうる薬物送達系の必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
開示の概要
ナノ担体、治療剤または画像化剤、およびターゲティング剤を含む化合物が本明細書に開示される。ナノ担体は、ナノ粒子、有機ポリマー、または両方でありうる。一つの態様において、三部性化合物は、以下の式の1つにより表されうる：
2008515915.tif 000002
式中、Aは化学療法剤または画像化剤を表し；Xはナノ粒子、有機ポリマーまたは両方であるナノ担体を表し；およびYはターゲティング剤を表す。
【０００７】
開示された化合物は、特定の細胞または組織を標的化するように設計されて、治療剤または画像化剤が、所望の位置へより効果的に送達されうる。例えば、本開示の一つの態様は、癌組織を標的化する化合物を含む。それとして、これらの化合物の特定の例は、癌細胞上により高い濃度で存在する受容体に結合するターゲティング剤Yを含む。例えば、癌細胞の特定の型は、正常細胞より高い濃度で葉酸、ビオチンまたはビタミンB12についての受容体を発現させる。開示された化合物の態様は、治療剤を癌細胞へ選択的に送達するために上方制御された受容体を利用することができる。
【０００８】
開示された化合物の特定の態様は、治療剤または画像化剤のそのような組織への選択的送達を与えるために癌組織のもう一つの特徴を利用する。例えば、ナノ粒子を含む、または自己組織化してナノ粒子を形成する化合物の態様は、増強した透過性および保持(enhanced permeability and retention)効果(EPR効果)から恩恵を受けて、腫瘍に蓄積することができる。
【０００９】
特定の有機ポリマーは、有効多価種を提供する、自己組織化して、自己組織化ナノ粒子を形成するように化合物を誘導しうる。そのような態様において、自己組織化ナノ粒子は、同じまたは異なる化合物を含むことができる。例えば、自己組織化ナノ粒子は、異なるターゲティング剤、画像化剤、治療剤およびナノ担体構成要素を有する化合物を含むことができる。
【００１０】
開示された化合物の態様はまた、複数の治療剤、画像化剤、および/またはターゲティング剤を含む。そのような態様において、化合物は、異なる治療剤、画像化剤、およびターゲティング剤を含みうる。特定の態様において、複数のターゲティング剤を有する化合物は、多価性効果のためにそれらの標的に対する増加した親和性を有する。
【００１１】
一つの態様において、開示された化合物は、被験体への投与のために薬学的組成物へ製剤化される。例えば、本開示の一つの局面は、開示された化合物を用いて増殖性障害を有する被験体を処置することに関し、それゆえに、薬学的組成物は、この目的のために本明細書に提供される。
【００１２】
詳細な説明
以下の用語および方法の説明は、本化合物、組成物および方法をより良く記載するために、かつ本開示の実施において当業者を導くために、提供される。本開示において用いられる用語が、特定の態様および例のみを記載することを目的とし、限定することを意図されないこともまた理解されるべきである。
【００１３】
範囲は、「約」一つの特定値から、および/または「約」もう一つの特定値までとして本明細書に表されうる。そのような範囲が表される場合、もう一つの態様は、その一つの特定値から、および/またはその他方の特定値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により、近似値として表される場合、その特定値がもう一つの態様を形成することは、理解されるものと思われる。各範囲の端点が、他方の端点に関して、および他方の端点とは無関係の両方で意味があることは、さらに理解されるものと思われる。
【００１４】
本明細書において、および特許請求の範囲において、言及は、以下の意味を有すると理解されるはずであるいくつかの用語になされる。
【００１５】
「任意の」または「任意で」は、実質的に記載された事象または状況が、生じうるが、生じる必要がないこと、ならびにその記載が、その事象または状況が生じている例およびそれが生じていない例を含むことを意味する。
【００１６】
用語「抗体」は、天然であろうが、全体的もしくは部分的に合成によって作製されていようが、免疫グロブリンを意味する。特異的結合能力を維持するそれらのすべての誘導体もまた、その用語に含まれる。その用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同的である、または大部分相同的である、結合ドメインを有する任意のタンパク質を網羅する。これらのタンパク質は、天然源由来でありうる、または部分的もしくは全体的に合成によって作製されうる。本明細書に用いられる抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。
【００１７】
用語「抗体断片」は、完全長未満である、抗体の任意の誘導体を指す。例示的態様において、抗体断片は、完全長抗体の特異的結合能力の少なくとも有意な部分を保持する。抗体断片は、任意で、一本鎖抗体断片でありうる。または、断片は、例えば、ジスルフィド結合により、共に連結される複数の鎖を含みうる。断片はまた、任意で、多分子性複合体でありうる。機能性抗体断片は、典型的には、少なくとも約50アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約200アミノ酸を含む。
【００１８】
「アテローム性動脈硬化症」とは、長い期間をかけての血管の進行性狭窄および硬化を指す。アテローム性動脈硬化症は、コレステロール、類脂質物質、および脂肪貧食細胞を含む黄色斑(アテローム)の沈着が、大および中サイズの動脈の内膜および内部中膜内に形成される。
【００１９】
「誘導体」とは、親化合物に由来する、もしくは親化合物から理論的に導き出せる、化合物または化合物の部分を指す。
【００２０】
「生理学的に不安定な結合」とは、生理学的条件下で(例えば、代謝的に、加溶媒分解的に、または別の様式で)切断されうる結合を指す。そのような結合は、当技術分野において周知であり、例は、Drugs of Today, Volume 19, Number 9, 1983, pp 499-538およびTopics in Chemistry, Chapter 31, pp 306-316およびH. Bundgaardによる「Design of Prodrugs」, Elsevier, 1985, Chapter 1に記載される(これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００２１】
本明細書に用いられる場合、用語「生理学的条件」とは、温度、pH、イオン強度、粘度、ならびに生存可能な生物体と適合性のある、および/または典型的には、生存可能な哺乳動物細胞において細胞内に存在する、同種の生化学的パラメーターを指す。
【００２２】
本明細書に用いられる場合、用語「自己組織化」とは、2つまたはそれ以上の分子の任意の非共有結合性会合を指す。典型的には、自己組織化は、生理学的条件下のような水性溶媒において起こる。自己組織化構造の例は、非限定的に、ミセルおよびリポソームを含む。
【００２３】
用語「被験体」は、ヒトおよび獣医学的被験体の両方を含む。
【００２４】
用語「疾患を処置すること」とは、例えば、腫瘍(例えば、白血病またはリンパ腫)のような疾患のリスクがある被験体において、疾患または状態の完全な進行を抑制することを指す。「処置」は、疾患もしくは病的状態の徴候または症状を、それが発症し始めた後で、寛解させる治療的介入を指す。本明細書に用いられる場合、疾患または病的状態に関しての用語「寛解させること」とは、処置の任意の観察できる有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、罹りやすい被験体における疾患の臨床症状の発生の遅延、疾患の一部もしくは全部の臨床症状の重症度における低下、疾患のより遅い進行、転移の数の低下、被験体の全体的な健康もしくは安寧における改善により、または特定の疾患に特異的である当技術分野において周知の他のパラメーターにより、証明されうる。「予防的」処置は、病態を発生するリスクを減少させることを目的として、疾患の徴候を示していない、または初期徴候のみを示している被験体に施される処置である。
【００２５】
「新生組織形成」は、異常および無制御の細胞増殖の過程を指す。新生組織形成は、増殖性障害の一つの例である。新生組織形成の産物は、新生物(腫瘍)であり、過剰細胞分裂に起因する組織の異常増殖である。転移しない腫瘍は、「良性」と呼ばれる。周囲の組織を浸潤する、および/または転移できる腫瘍は、「悪性」と呼ばれる。血液学的腫瘍の例は、急性白血病(急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病のような)、慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病のような)を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(緩慢性型および重症型)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、および骨髄異形成を含む。
【００２６】
非上皮性悪性腫瘍および上皮性悪性腫瘍のような固形腫瘍の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の非上皮性悪性腫瘍、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびCNS腫瘍(神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫のような)を含む。
【００２７】
水溶性ポリアミノ酸は、非限定的に、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のコポリマーなどを含む。ポリアミノ酸は、アミノ酸のD-型、L-型、または両方の型を含みうる。例えば、「ポリグルタミン酸」は、ポリ-D-グルタミン酸、ポリ-L-グルタミン酸、またはポリ-D,L-グルタミン酸を指す。ポリグルタミン酸は、本明細書で、「PG」と省略されうる。
【００２８】
他に説明がない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈がはっきりと他に規定しない限り、複数形の言及を含む。同様に、単語「または(or)」は、文脈がはっきりと他に規定しない限り、「および(and)」を含むことを意図される。核酸またはポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量(molecular weight)または分子量(molecular mass)値は、近似であり、説明のために提供される。本明細書に記載されたものと類似または等価の方法および材料は、本開示の実施または試験に用いられうるが、適した方法および材料は下に記載される。用語「含む(comprises)」は「含む(includes)」を意味する。
【００２９】
本明細書に挙げられたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、全体として参照により組み入れられる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配するものとする。加えて、材料、方法および実施例は、例証となるのみであり、限定することを意図されない。
【００３０】
特定の組織、特に過剰増殖性組織を選択的に処置するための結合体、化合物、および方法が本明細書に開示される。一般的に、結合体は、少なくとも3つの構成要素、すなわち、化学療法剤または画像化剤、ナノ粒子、有機ポリマーまたは両方であるナノ担体；およびターゲティング剤を含む。3つの構成要素は、共有結合性に、または非共有結合性に会合されうる。
【００３１】
一つの態様において、開示された結合体の構成要素は、共有結合して、ナノ担体結合体化合物を形成する。そのような化合物の例は、少なくとも1つのナノ担体、ターゲティング剤、および治療剤を含む三元性または三部性分子を含む。一つの態様において、開示された化合物は、以下の式の1つを有する。
2008515915.tif 000003
一般式に関して、Aは、化学療法剤または画像化剤を表し；Xは、ナノ粒子、有機ポリマーまたは両方であるナノ担体を表し；およびYは、ターゲティング剤を表す。より高次の化合物もまた開示され、四元性結合体化合物を含む。
【００３２】
言及はここで、開示された結合体化合物、組成物および方法の現在好ましい態様に詳細になされる。
【００３３】
I. ナノ担体
本明細書に開示された結合体および化合物のナノ担体構成要素は、治療剤、ターゲティング剤、または両方の多価性ディスプレイを示すように機能しうる。もう一つの局面において、ナノ担体構成要素は、化合物がEPR効果から恩恵を受けるように、化合物に十分なサイズを与えうる。
【００３４】
典型的には、「ナノ担体」は、約1500ナノメートル未満の直径を有するナノ粒子、または約1000ダルトンより大きい分子量を有する有機ポリマーを指す。本明細書に用いられる場合、用語「ナノ粒子」は、約1ナノメートルから約1500ナノメートルの直径を有する粒子を指す。ナノ粒子の例示的な型は、非限定的に、ミセル、リポソームおよび水中油型乳剤のような、コロイドおよび非コロイドの金属クラスターならびにポリマー性ナノ粒子を含む。典型的には、本明細書に用いられるナノ粒子は、直径が、約1ナノメートルから約1200ナノメートルまで、およびより典型的には、約100ナノメートルから約150ナノメートルのような、約10ナノメートルから約400ナノメートルの範囲である。しかしながら、特定のナノ粒子、例えば、金クラスターのような金属クラスターは小さくとも約0.7ナノメートルの直径を有しうる。特定の態様において、400ナノメートル未満、およびさらに、約100ナノメートルのような150ナノメートル未満のナノ粒子サイズは、本化合物に細胞ターゲティングを与える。
【００３５】
原理上は、任意のナノ粒子、有機ポリマー、または集合してナノ粒子を形成する材料が、本明細書に記載された化合物のナノ担体構成要素としての使用に適している。一つの態様において、ナノ担体構成要素が有機ポリマーである場合、ポリマーが、生理学的条件下で自己組織化して、本明細書に記載された有機ポリマー含有分子の複数状態または集合体を含みうる自己組織化ナノ粒子を形成する。しかしながら、そのような自己組織化ナノ粒子はまた、ナノ粒子が生理学的条件下で分解されないとすれば、非生理学的条件下でも形成されうる。一つの態様において、有機ポリマーは、ポリカチオン性またはポリアニオン性ポリマーのようなポリイオン性ポリマーである。一つの態様において、ポリマーは、水溶性ポリアミノ酸、水溶性多糖、または両方を含む。本発明に用いられうるカチオン性ポリマーの例は、限定されるわけではないが、DEAEデキストラン(ジエチレンアミノエチルデキストラン)、ポリエチレンイミン(PEI)、キチン、キトサン(D-アセチル化キチン)、およびポリリシンのような正電荷を有するポリアミノ酸を含む。本発明に用いられうるアニオン性ポリマーの例は、限定されるわけではないが、硫酸デキストラン、ヘパリン、ヒアルロン酸のようなムコ多糖、および負電荷を有するポリアミノ酸を含む。アルギナートおよびカラゲナンのようなゲル形成アニオン性ポリマーもまた、用いられうる。ナノ担体として用いられうる追加の荷電および非荷電有機ポリマーは、非限定的に、N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミドコポリマー、ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ(ポリ-2-ヒドロキシエチルメタクリレートコメタクリレート)、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、ポリオキサマー、ポリオキサミン、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(ブチル2-シアノアクリレート)、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース、およびキトサンを含む。例示的な態様において、ナノ担体は、ヘパリンまたはポリグルタミン酸のようなポリアニオン性物質を含む。
【００３６】
一つの態様において、ナノ担体結合体化合物は、ターゲティング剤に加えて、ポリカチオン性またはポリアニオン性ポリマーのような親水性ナノ担体、および疎水性化学療法剤または画像化剤のような疎水性構成要素を含む。そのような化合物は、結合体化合物の自己組織化を促進する両親媒性である。疎水性化学療法剤を有するそのような両親媒性化合物の一つの態様は、パクリタキセル機能付与ヘパリンポリマーである。そのような両親媒性化合物のもう一つの態様は、エポチロン機能付与ヘパリンポリマーである。特定の態様において、これらの化合物は、ターゲティング剤として葉酸または葉酸誘導体を含む。
【００３７】
一つの態様において、開示された化合物は、治療剤を特定の標的組織または細胞において放出することにより、プロドラッグとして効果的に働く。例えば、治療剤は、標的において切断されるエステル結合のような生理学的に不安定な結合を介してナノ担体またはターゲティング剤に結合されうる。一つの態様において、治療剤が、結合体化合物に含まれていない場合、細胞毒性であるのに対して、結合体化合物は、比較的良性である。
【００３８】
現在、開示される結合体に用いるのに適したナノ粒子および有機ポリマーは、単分散性または多分散性でありうる。典型的には、結合体が有機ポリマーを含む場合、有機ポリマーは多分散性である。一般的に、ポリマーの適切な例は、少なくとも約1,000ダルトンの平均分子量を有する。そのようなポリマーは、典型的には、約1,000ダルトンから約150,000ダルトンの平均分子量を有する。より典型的には、適切なポリマーは、約10,000ダルトンから約50,000ダルトンのような、約5,000ダルトンから約100,000ダルトンの分子量を有する。
【００３９】
ナノ担体構成要素は、治療剤、画像化剤、およびターゲティング剤での誘導体化のための複数の官能基を含みうる。従って、結合体化合物の一つの態様において、化合物は以下の式を有する：
2008515915.tif 000004
式中、A、XおよびYは、上記の通りであり、nおよびmは、独立して、5から約150のような、1から約500の整数である。典型的には、nおよびmは、1から約50の整数である。例示的態様において、mおよびnの合計は、約50のような、約10から約100までである。1より大きいnを有する化合物において、ターゲティング剤は、同じまたは異なりうる。同様に、mが1より大きい化合物において、治療剤は、同じまたは異なりうる。本明細書に開示された化合物の例示的態様は、式Am-X-Ynを有し、Aはパクリタキセル部分であり、Xはヘパリンであり、Yは葉酸部分であり、nおよびmは、独立して、1から約50までである。そのような態様の一つの例は、以下の構造により表される。
2008515915.tif 000005
【００４０】
本明細書に開示された化合物のもう一つの例示的態様は、式Am-X-Ynを有し、Aはエポチロン部分であり、Xはヘパリンであり、Yは葉酸部分であり、nおよびmは、独立して、1から約50までである。一つのそのような態様は、以下の構造により表されうる。
2008515915.tif 000006
【００４１】
もう一つの例示的態様において、開示された化合物は、以下の式を有するものを含む：
2008515915.tif 000007
式中、A、XおよびYは、上記の通りであり、mおよびnは、独立して、1から約5のような、1から約10までである。特定の態様において、mは2であり、nは1である。この態様において、A部分は、同じまたは異なりうる。もう一つの態様において、mは1であり、nは2であり、Y部分は、同じまたは異なりうる。これらの態様において、化合物は、ナノ担体、画像化剤または治療剤、および2つのターゲティング剤を含む四元性化合物である。または、四元性化合物は、ナノ担体、ターゲティング剤、ならびに、2つの治療剤、2つの画像化剤、または治療剤および画像化剤のような、2つのA群を含みうる。
【００４２】
現在開示される結合体化合物、例えば、三元性および四元性結合体の例は以下のように概略的に表されうる：
2008515915.tif 000008
式中、AおよびXは、上記の通りであり、AおよびA'は、異なる化学療法剤または画像化剤を表し、XおよびX'は、異なるターゲティング剤を表す。三元性ナノ担体結合体の一つの態様において、ナノ担体は、Aおよび/またはXの複数のコピーで機能付与される。同様に、四元性ナノ担体結合体は、A、A'、X、および/またはX'の複数のコピーで機能付与される。四元性ナノ担体結合体の特定の例は、少なくとも1つの化学療法剤および少なくとも1つの画像化剤を含む。
【００４３】
一つの態様において、ナノ担体は、金属クラスターのようなナノ粒子であり、それらの例は、Ag、Au、Pt、Pd、Co、Feまたはそれらの混合物を含むクラスターを含む。上で述べられているように、そのような金属クラスターの例は、コロイド物質または非コロイド物質のいずれかでありうる。特定の適切な金属クラスターはまた、異なる金属の合金を含みうる。一つの態様において、金属は、磁気性であり、そのように画像化に用いられうる。典型的には、金属ナノ粒子は、常磁性である。そのようなナノ粒子の例は、Fe2O3、Fe3O4または両方を含む酸化鉄ナノ粒子を含む。
【００４４】
現在開示される化合物の例を調製するのに適した様々な方法は、金属クラスターを集合させ、かつ機能付与するために開発されてきた。これらの方法は、対象となるコロイドに対する化学的親和性で両端に機能性を有する共有結合性リンカー分子の使用に焦点を合わせてきた。このアプローチの例は、Brust et al. Adv. Mater. 1995 7, 795-797により記載されており、金コロイドの使用および十分確立されたチオール吸着化学、Bain & Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1989, 28, 506-512およびDubois & Nuzzo, Annu. Rev. Phys. Chem. 1992, 43, 437-464、を含む。Mirkin et al.の米国特許第6,767,702号および米国特許出願公開第2003/0077625号は、両方とも参照により本明細書に組み入れられるが、金属クラスター、ならびに現在開示される結合体化合物を調製するために用いられうるそのようなクラスターに機能付与するための方法および試薬を開示している。
【００４５】
II. 治療剤および画像化剤
任意の治療剤が、開示された化合物および方法に用いられうる。適切な治療剤は、標的化される特定の組織または細胞型に基づいて選択されうる。すなわち、特定の治療剤の選択は、特定の標的分子または細胞に依存し、生物学的効果は、誘起することが望まれる。例えば、一つの態様において、化合物は、癌細胞のような過剰増殖性細胞を標的化するターゲティング剤を含む。そのような態様において、治療剤は、増殖性疾患または異常な細胞増殖により特徴付けられる疾患の処置における治療的有用性を有する任意の化学物質を含む、抗増殖性剤でありうる。そのような疾患は、腫瘍、新生物、および癌、加えて、乾癬のような過形成性増殖により特徴付けられる疾患を含む。一つの態様において、抗増殖性剤は、リンパ腫、白血病または別の腫瘍を処置するのに用いる作用物質である。一つの態様において、抗増殖性剤は、放射性化合物である。当業者は、用いる抗増殖性剤を容易に同定できる(例えば、Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86, Harrison's Principles of Internal Medicine, 第14版；Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17, Abeloff, Clinical Oncology 第2版, 2000 Churchill Livingstone, Inc；Baltzer, L., Berkery, R. (eds)：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 第2版, St. Louis, Mosby-Year Book, 1995；Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds)：The Cancer Chemotherapy Handbook, 第4版, St. Louis, Mosby-Year Book, 1993を参照)。
【００４６】
本化合物に用いられうる有用な抗増殖性剤のクラスは、非限定的に、微小管結合性作用物質、毒素、DNA挿入剤もしくは架橋剤、DNA合成阻害剤、DNAおよび/もしくはRNA転写阻害剤、酵素阻害剤、遺伝子レギュレーター、エンジイン抗生物質、ならびに/または血管形成阻害剤を含む。一つの態様において、分子は、通常で許容できるよりも高い細胞毒性を有する治療剤が用いられうるように、過剰増殖性組織に対する十分な選択性を有する。
【００４７】
「微小管結合性作用物質」とは、チューブリンと相互作用して、微小管形成を安定化または不安定化し、それにより、細胞分裂を阻害する作用物質を指す。適した微小管結合性作用物質は、非限定的に、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン(ナベルビン)、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン15、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、およびリゾキシンを含む。そのような化合物の類似体および誘導体もまた用いることができ、当業者に公知であると思われる。例えば、本化合物への取り込みに適したエポチロンおよびエポチロン類似体は、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO 2004/018478に記載される。パクリタキセルおよびドセタキセルのようなタキソイドは、これまでのところ、現在開示される化合物における治療剤として特に有用であると考えられる。パクリタキセルの類似体を含む追加の有用なタキソイドの例は、Holtonの米国特許第6,610,860号、Gurram et al.の第5,530,020号、およびWittman et al.の第5,912,264号により教示される。これらの特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
治療剤は、特定の標的細胞の死を引き起こすために用いられる細胞毒素でありうる。例示的な毒素は、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素(PE)、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン、リボヌクレアーゼ、サポリン、加えてボツリヌス毒素A〜Fを含む。これらの毒素は当技術分野において周知であり、多くは、商業的供給源(例えば、Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)から容易に入手できる。
【００４９】
適した治療剤の一つの例、ジフテリア毒素は、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheriae)から単離される。典型的には、免疫毒素に用いるジフテリア毒素は、非特異的毒性を低下させるために、または非特異的毒性を排除するために、突然変異される。完全な酵素活性を有するが、非特異的毒性が著しく低下している、CRM107として知られている突然変異体は、1970年代(Laird and Groman, J. Virol. 1976, 19, 220)から知られており、ヒト臨床試験に用いられている。米国特許第5,792,458号および米国特許第5,208,021号を参照されたい。本明細書に用いられる場合、用語「ジフテリア毒素」とは、必要に応じて、天然のジフテリア毒素、または酵素活性を保持するが、非特異的毒性を低下させるように改変されているジフテリア毒素を指す。
【００５０】
現在開示される結合体の治療用構成要素として用いるのに適したもう一つの例示的な毒素は、リシンである。リシンは、リシヌス・コムニス(Ricinus communis)(トウゴマの実)から単離されるレクチンである。用語「リシン」はまた、その毒性変異体も参照する。例えば、米国特許第5,079,163号および米国特許第4,689,401号を参照されたい。リシヌス・コムニス凝集素(RCA)は、およそ65kDおよび120kDのそれらの分子量により、それぞれRCA60およびRCA120と名付けられた2つの型で存在する(Nicholson & Blaustein, J. Biochim. Biophys. Acta 1972, 266, 543)。A鎖は、タンパク質合成を不活性化し、かつ細胞を殺害することに関与する。B鎖は、リシンを細胞表面ガラクトース残基に結合させ、A鎖のサイトゾルへの輸送を促進する(Olsnes et al. Nature 1974, 249, 627-631および米国特許第3,060,165号)。もう一つの毒性レクチン、アブリンは、トウアズキ(Abrus precatorius)由来の毒性レクチンを含む。毒性の本源、アブリンa、b、c、およびdは、約63kDから67kDの分子量を有し、2つのジスルフィド結合ポリペプチド、A鎖およびB鎖で構成される。A鎖は、タンパク質合成を阻害する；B鎖(アブリン-b)はD-ガラクトース残基に結合する(Funatsu, et al. Agr. Biol. Chem. 1988, 52, 1095；およびOlsnes, Methods Enzymol. 1978, 50, 330-335)。
【００５１】
一つの態様において、標的細胞を終わらせるために用いられる毒素は、シュードモナス外毒素(PE)である。天然のシュードモナス外毒素A(「PE」)は、真核細胞においてタンパク質合成を阻害する、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)により分泌される極めて活性の高い単量体タンパク質である。天然のPE配列および改変PEの配列は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,602,095号に提供される。PEの作用の方法は、伸長因子2(EF-2)のADP-リボシル化の不活性化である。外毒素は、一斉に作用して、細胞毒性を引き起こす3つの構造的ドメインを含む。ドメインIa(アミノ酸1位〜252位)は、細胞結合を媒介する。ドメインII(アミノ酸253位〜364位)は、サイトゾルへの移行に関与し、ドメインIII(アミノ酸400位〜613位)は、伸長因子2のADPリボシル化を媒介する。ドメインIb(アミノ酸365位〜399位)の機能は、定義されていないままであるが、その大部分、アミノ酸365位〜380位は細胞毒性の損失なしに除去されうる。Siegall et al. J. Biol. Chem. 1989, 264, 14256-14261参照されたい。
【００５２】
本明細書に用いられる場合、用語「シュードモナス外毒素」(「PE」)は、必要に応じて、完全長天然(天然に存在する)PEを、または改変されているPEを指す。そのような改変は、限定されるわけではないが、ドメインIaの除去、ドメインIb、IIおよびIIIにおける様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端における1つまたは複数の配列の付加を含みうる。Siegall et al., 前記を参照されたい。いくつかの例において、PEの細胞毒性断片は、天然PEの細胞毒性の少なくとも50％、好ましくは75％、より好ましくは少なくとも90％、および最も好ましくは95％を保持する。一つの態様において、細胞毒性断片は、天然PEより毒性が高い。
【００５３】
従って、本明細書に開示された標的化される結合体に用いられるPEは、天然配列、天然配列の細胞毒性断片、ならびに天然PEおよびその細胞毒性断片の保存的に改変された変異体を含む。PEの細胞毒性断片は、標的細胞におけるその後のタンパク分解性もしくは他のプロセッシングを伴うまたは伴わずに(例えば、タンパク質またはプレタンパク質として)細胞毒性であるものを含む。当技術分野において公知のPEの細胞毒性断片は、PE40、PE38およびPE35を含む。
【００５４】
いくつかの態様において、PEは、典型的には、米国特許第4,892,827号に教示されるように、ドメインIaを除去することにより、非特異的細胞結合を低下または排除するように改変されているが、これはまた、例えば、ドメインIaの特定の残基を突然変異させることにより、達成されうる。例えば、米国特許第5,512,658号は、ドメインIaが存在しているが、57位、246位、247位および249位におけるドメインIaの塩基性残基が酸性残基(グルタミン酸、すなわち「E」)と置換される、突然変異されたPEが、大いに減少した非特異的毒性を示すことを開示している。このPEの突然変異体型は、PE4Eと呼ばれることもある。
【００５５】
PE40は、PEの切り詰められた誘導体である(Pai et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1991, 88, 3358-62；およびKondo et al. J. Biol. Chem. 1988, 263, 9470-9475参照)。PE35は、アミノ酸残基1位〜279位が欠失しており、分子は、天然PEの280位におけるmetから始まり、その後に、アミノ酸281位〜364位、および381位〜613位が続く、PEの35kDのカルボキシル末端断片である。PE35およびPE40は、例えば、米国特許第5,602,095号、および米国特許第4,892,827号に開示される。いくつかの態様において、細胞毒性断片PE38が用いられる。PE38は、細胞内でのプロセシングによりその細胞毒性型へ活性化されるアミノ酸253位〜364位、および381位〜613位で構成される切り詰められたPEプレタンパク質である(例えば、米国特許第5,608,039号、およびPastan et al., Biochim. Biophys. Acta 1333：C1-C6, 1997参照)。いくつかの態様において、PEは、PE4E、PE40、またはPE38であり、非特異的細胞毒性が排除されたか、または非標的細胞への有意な毒性が生じないレベルまで低下させたPEの任意の型が、それが標的細胞における移行およびEF-2リボシル化が可能である限り、本明細書に開示された免疫毒素に用いられうる。
【００５６】
PEまたはその細胞毒性断片の保存的に改変された変異体は、PE38のような、対象となるPEとアミノ酸レベルで、少なくとも80％配列類似性、好ましくは少なくとも85％配列類似性、より好ましくは少なくとも90％配列類似性、および最も好ましくは少なくとも95％配列類似性を有する。
【００５７】
リボヌクレアーゼもまた、開示された標的化される結合体化合物における毒素として用いられうる(Suzuki et al. Nat Biotech. 1999, 17, 265-70参照)。α-サルシンのような例示的なリボトキシンおよび制限は、例えば、Rathore et al. Gene 1997, 190, 31-35；およびGoyal and Batra, Biochem. 2000, 345 Pt 2 247-54に考察される。
【００５８】
開示された化合物へ取り込まれうるDNA挿入剤および架橋剤は、非限定的に、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ならびにそれらの誘導体および類似体を含む。
【００５９】
治療剤として用いるのに適したDNA合成阻害剤は、非限定的に、メトトレキセート、5-フルオロ-5'-デオキシウリジン、5-フルオロウラシル、およびそれらの類似体を含む。
【００６０】
現在開示される結合体に用いる適切な酵素阻害剤の例は、非限定的に、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン、ならびにそれらの誘導体および類似体を含む。
【００６１】
遺伝子制御に影響を及ぼす適切な治療用物質は、非限定的に、ラロキシフェン、5-アザシチジン、5-アザ-2'-デオキシシチジン、タモキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン、ならびにそれらの誘導体および類似体のような、結果として、1つまたは複数の遺伝子の発現の増加または減少を生じる作用物質を含む。
【００６２】
開示された結合体への取り込みに適したエンジイン抗生物質は、天然に存在するエンジイン含有化合物、非天然化合物、およびそれらの誘導体を含む。ダイネマイシン(Konishi, et al. J. Chem. Soc. 1990, 112, 3715-3716)、エスペラマイシン(Golik et al. J. Amer. Chem. Soc. 1987 109, 3462-3464)、およびカリケアマイシン(Lee et al. J. Amer. Chem. Soc. 1987, 109, 3464-3466)を含む天然に存在するエンジイン抗生物質は、非常に強力な細胞毒素であり、低いピコモル範囲における腫瘍細胞培養物の増殖の阻害についてのIC50値を有する。現在開示される結合体への取り込みに適した非天然のエンジイン抗生物質化合物の例は、Nicolaou, K.C. et al, Science 1992, 256, 1172-1178；Nicolaou et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 1993, 90, 5881-5888；J. Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 8890-8907；J. Amer. Chem. Soc. 1993, 115, 7944-7953；J Amer. Chem. Soc. 1992, 114, 8908-8921；Wender et al. J. Org. Chem. 1993, 58, 5867-5869；Synthesis, 1994, 1279-1282；Denny et al.の米国特許第6,124,310号およびZaleski and Rawatの第6,514,995号により開示される。これらの開示のそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６３】
非限定的に、アクチノマイシンD、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ならびにそれらの誘導体および類似体を含む適切なDNAおよび/またはRNA転写レギュレーターもまた、現在開示される化合物に用いるのに適している。
【００６４】
用語「血管形成阻害剤」は、限定されるわけではないが、血管成長を阻害するように機能する、ペプチド、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、組換えベクター、および低分子のような生体分子を含む分子を意味するために本明細書で用いられる。血管形成は、糖尿病性網膜症、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍、およびヒト固形腫瘍のほとんどの型のような障害に関与するもののような、特定の病理学的過程に結びつけられる。
【００６５】
血管形成阻害剤は、当技術分野において公知であり、適切な血管形成阻害剤の例は、非限定的に、アンギオスタチンK1-3、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン-α、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板因子4、ソマトスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、サリドマイド、ならびにそれらの誘導体および類似体を含む。
【００６６】
上の分類の1つまたは複数に該当する場合もあるし、該当しない場合もある、他の治療剤、特に抗腫瘍剤もまた現在開示される化合物への取り込みに適している。例として、そのような作用物質は、アドリアマイシン、アピゲニン、ラパマイシン、ゼブラリン、シメチジン、ならびにそれらの誘導体および類似体を含む。
【００６７】
特定の態様において、化合物は、アテローム硬化性病変へ標的化される。そのような態様において、治療剤は、血管による脂質蓄積を低減させるもしくは防ぐために、アテローム硬化性病変のプラーク安定性を増加させるために、アテローム硬化性病変形成もしくは発達を阻害するために、またはアテローム硬化性病変退行を誘導するために、効果的である。適切な治療剤の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Grainger et al.,の米国特許第6,734,208号により教示されたものを含む。
【００６８】
追加の適切な治療剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど；ムラミルペプチドのような生物学的応答調節剤；ケトコナゾール、ナイスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン、ミコナゾール、またはアンホテリシンBのような抗真菌剤；成長ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ベクロメタゾン、ジプロピオネート、ベタメタゾン、酢酸コルチゾン、デキサメタゾン、フルニソリド、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、もしくは酢酸フルドロコルチゾンのようなホルモンまたはホルモン類似体；シアノコバラミンまたはレチノイドのようなビタミン；アルカリホスファターゼまたはマンガンスーパーオキシドディスムターゼのような酵素；アメレキサノックスのような抗アレルギー剤；モノクローナル抗体およびそのFab断片、合成ペプチド、非ペプチド、ならびに組織因子発現を下方制御する化合物のような組織因子の阻害剤； GPIa、GPIbおよびGPIIb〜IIIa、ADP受容体、トロンビン受容体、フォンビルブランド因子、プロスタグランジン、アスピリン、チクロピジン、クロピゴグレルおよびレオプロのような血小板の阻害剤；プロプラノロールのような循環性薬物；グルタチオンのような代謝増強剤；p-アミノサリチル酸、イソニアジド、硫酸カプレオマイシン、シクロセキシン、エタンブトール、エチオナミド、ピラジナミド、リファンピンまたは硫酸ストレプトマイシンのような抗結核剤；アシクロビル、アマンタジン、アジドチミジン、リバビリンまたはビダラビンのような抗ウイルス剤；ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、四硝酸エリトリトール、二硝酸イソソルビド、ニトログリセリン、または四硝酸ペンタエリトリトールのような血管拡張剤；ダプソーン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、セファクロール、セファドロキシル、セファレキシン、セファラジン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ジクロキサシリン、シクラシリン、ピクロキサシリン、ヘタシリン、メチシリン、ナフシリン、ペニシリン、ポリミキシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質；ジフルーニサル、イブプロフェン、インドメタシン、メクレフェナメート、メフェナム酸、ナプロキセン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、トルメチン、アスピリンまたはサリチレートのような抗炎症剤；クロロキン、メトロニダゾール、キニーネ、またはアンチモン酸メグルミンのような抗原虫剤；ペニシラミンのような抗リウマチ剤；アヘン安息香チンキのような麻酔剤；コデイン、モルヒネおよびそれらの類似体のようなアヘン剤；デスラネシド、ジギトキシン、ジゴキシン、ジギタリン、またはジギタリスのような強心配糖体；アトラクリウムメシレート、ガラミントリエチオダイド、臭化ヘキサフルオレニウム、ヨウ化メトクリン、臭化パンクロニウム、塩化スクシニルコリン、塩化ツボクラリン、または臭化ベクロニウムのような神経筋遮断剤；アモバルビタール、アモバルビタールナトリウム、アプロプバルビタール、ブタバルビタールナトリウム、抱水クロラール、エトクロルビノール、エチナメート、塩酸フルラゼパム、グルテチミド、塩酸メトトリメプラジン、メチプリロン、塩酸ミダゾラム、パラアルデヒド、ペントバルビタール、セコバルビタールナトリウム、タルブタール、テマゼパム、またはトリアゾラムのような鎮痛剤を含む。
【００６９】
追加の治療剤は、本明細書の検討により当業者にとって明らかであるように、開示された化合物への取り込みについて選択されうる。
【００７０】
一つの態様において、本明細書に開示された化合物は、画像化剤を含みうる。本明細書に用いられる場合、用語「画像化剤」は、検出されうる化合物を指す。画像化剤の例は、磁気共鳴画像コントラスト剤、コンピュータ断層撮影(CTスキャン)画像化剤、光学的画像化剤、および放射性同位元素を含む。この態様による特定の化合物において、画像化剤は、任意で、治療剤の代わりに用いられうる。従って、現在開示される化合物は、標的組織を選択的に画像化するために用いられうる。
【００７１】
適切な画像化剤の特定の例は、非限定的に、ガドリニウム-DTPA(Gd-DTPA)のようなガドリニウムキレート剤、鉄キレートのような重金属を含むもののようなCTスキャン画像化剤；Cy 5.5、インドシアニングリーン(ICG)およびその誘導体のような近赤外光学的画像化剤、ならびに放射性核種、インジウム-111、テクネチウム-99m、イットリウム-90、およびホルミウム-166を含む。さらに、陽電子放出断層撮影法(PET)は、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子エミッターを用いて可能でありうる。
【００７２】
一つの態様において、開示された化合物は、治療剤および画像化剤の両方を有するものを含む。そのような化合物の一つの例は、以下の式を有する：
2008515915.tif 000009
式中、mは、2またはそれ以上、例えば、5から約150のような2から約500である。典型的には、mは、2から約10のような2から約50である。そのような化合物の例は、単一の画像化剤および複数の治療剤、または単一の治療剤および複数の画像化剤を含みうる。しかしながら、一つの態様において、mは2であり、式は単一の治療剤および単一の画像化剤を含む。
【００７３】
III. ターゲティング剤
ターゲティング剤は、細胞、典型的には特定の細胞受容体に結合する、抗体、成長因子、サイトカイン、細胞接着分子、それらの受容体、受容体アゴニスト、アンタゴニストもしくは酵素阻害剤のようなペプチド、タンパク質または低分子のような、任意のリガンド部分でありうる。特定のターゲティング剤が言及される場合、それらの断片、残基および誘導体もまた意図されることは理解される。
【００７４】
一つの態様において、化合物は、同じまたは異なりうる複数のターゲティング剤を含む。例えば、化合物は、ナノ担体治療用物質の親和性、結合活性、または選択性を増強するように、複数のターゲティング剤の効果的多価ディスプレイを示すことができる。または、開示された化合物は、例えば、異なる細胞型または組織を標的化するために、異なるターゲティング剤を含みうる。具体的には、化合物は、以下の式のものを含む：
2008515915.tif 000010
式中、A、X、Yおよびmは、上記の通りであり、nは、5から約150のような2から約500までである。そのような化合物は、2から約10のような2から約50の整数であるnを有するものを含む。そのような化合物の一つの態様において、nは2であり、式は、2つの異なるY部分を含む。
【００７５】
通常の抗体および遺伝子操作された抗体の両方が、ターゲティング剤として用いられうる。ヒト抗体の使用は、可能性のある免疫反応を避けるために好まれうる。一つの態様において、ターゲティング剤は、ヒト上皮細胞成長因子受容体(EGFR)ファミリーのメンバーに結合する抗体である。ヒトEGFRファミリーは、EGFR-1(HER-1)、EGFR-2(HER-2)、EGFR-3(HER-3)およびEGFR4(HER-4)を含む。EGFR発現は、肺、頭頸部、結腸、乳房、および前立腺などを含む幅広い種類の悪性腫瘍において広範に実証されている。いくつかの研究50-56は、EGFRの過剰発現が、全体の生存度の低下、疾患再発および転移のリスクの増加と相関していることを立証している。(例えば、Grandis JR, Melhem MF, Gooding WE, et al. Levels of TGF-α and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival. J Natl Cancer Inst 1998, 90：824-32；Mauizi M, Almadori G, Ferrandina G, et al. Prognostic significance of epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma. Br J Cancer 1996, 74：1253-7；Yamanaka Y, Friess H, Kobrin MS, Buchlen M, Beger HG, Korc M. Coexpression of epidermal growth factor receptor and ligands in human pancreatic cancer is associated with enhanced tumor aggressiveness. Anticancer Res 1993, 13：565-70；Neal DE, Sharples L, Smith K, Fennelly J, Hall RR, Harns AL. The epidermal growth factor receptor and the prognosis of bladder cancer. Cancer 1993, 65：1619-25を参照されたい。)EGFRの過剰発現はまた、治療剤に対する弱い応答にも相関する。Aziz SA, Pervez S, Khan S, Kayani N, Rahbar MH. Epidermal growth factor receptor (EGFR) as a prognostic marker：an immunohistochemical study on 315 consecutive breast carcinoma patients. J Pak Med Assoc 2002, 52：104-10；Tsutsui S, Ohno S, Murakami S, Hachitanda Y, Oda S. Prognostic value of epidermal growth factor receptor (EGFR) and its relationship to the estrogen receptor status in 1029 patients with breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2002, 71：67-75；Nicholson RI, Gee JM, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer 2001, 37 Suppl 4：S9-15を参照されたい。特定の態様において、一本鎖EGFR抗体(ScFv EGFR)は、本明細書に開示されたナノ担体結合体の製剤化のためのターゲティング剤として用いられる。
【００７６】
一つの態様において、ターゲティング剤は、細胞表面受容体についてのリガンドである。この態様の一つの局面において、ターゲティング剤は、ポトサイトーシスのような受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導する。受容体媒介性エンドサイトーシスを誘導しうる適切なターゲティング剤の例は、非限定的に、葉酸、インスリン、神経成長因子、黄体形成ホルモン、カルシトニンおよびカテコールアミンを含む。
【００７７】
本明細書に開示された化合物の一つの態様において、選択されたターゲティング剤は、標的細胞上により高い密度で存在する受容体に結合する。例えば、特定の腫瘍細胞は、葉酸、ビオチン、および/またはビタミンB12のようなビタミンの取り込みに関与する受容体を過剰発現する。腫瘍細胞上で標的化されうる他の受容体は、非限定的に、トランスフェリン受容体、ムチン、マルチプルP-糖タンパク質、カテプシンBおよびCD44を含む。従って、上で列挙された受容体に向けられる抗体を用いる化合物、加えて、葉酸、ビタミンB12および/またはビオチン、ならびにそれらの誘導体のような低分子ターゲティング剤を、そのような細胞へ治療剤を向けるためのターゲティング剤として用いる化合物が本明細書に開示される。例えば、葉酸受容体は、ほとんどの正常組織においてそれが非常に低いレベルで発現されるのに対して、卵巣癌、結腸直腸癌、および乳癌のような上皮悪性腫瘍の場合において、癌細胞の表面上に過剰発現されることが知られている。Leamon and Reddy Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 1127-1141；Lee and Low J. Biol. Chem. 1994, 269, 3198-3204を参照されたい。葉酸受容体へ向けられるターゲティング剤の態様は、非限定的に、葉酸、葉酸誘導体および類似体、葉酸代謝拮抗薬、ならびにデアザ葉酸(deazafolate)を含む。本明細書に用いられる場合、用語「葉酸」は、すべてのそのような構造を含むものとする。そのような葉酸の例は、葉酸(folic acid)、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、ホリニン酸、プテロポリグルタミン酸、ジヒドロ葉酸(dihydrofolate)、テトラヒドロ葉酸(tetrahydrofolate)、テトラヒドロプテリン、1-デアザ、3-デアザ、5-デアザ、8-デアザ、10-デアザ、1,5-ジデアザ、5,10-ジデアザ、8,10-ジデアザ、および5,8-ジデアザ葉酸類似体、ならびに葉酸代謝拮抗薬を含む。
【００７８】
一つの態様において、ペプチドターゲティング剤は、当業者が精通しているものと思われる、ファージディスプレイ(米国特許第5,223,409号参照)またはファージディスプレイの変形のようなコンビナトリアル技術を用いて選択される。同様に、ターゲティング剤として用いるのに適した、受容体アゴニスト、アンタゴニスト、および阻害剤のような低分子リガンドが、コンビナトリアル技術を用いて調製および選択されうる。
【００７９】
現在開示される化合物におけるターゲティング構成要素として用いられうるサイトカイン、成長因子、およびペプチドホルモンは、上皮細胞成長因子、神経成長因子、ソマトスタチン、エンドテリン、インターロイキン-1、インターロイキン-2、腫瘍壊死因子、副甲状腺ホルモン、インスリン様成長因子I、およびそれらの断片を含む。
【００８０】
一つの態様において、開示された化合物は、インターフェロン-α、インターフェロン-γ、トロンボスポンジン、アンギオゲニン、ブラジキニン、塩基性線維芽細胞成長因子、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒスタミン、ニコチンアミド、血小板活性化因子、プロスタグランジン、スペルミン、サブスタンスP、トランスフォーミング成長因子-α、トランスフォーミング成長因子-β、ビトロネクチン、およびそれらの断片のような、ターゲティング剤として抗血管形成性因子を用いる。ターゲティング剤はまた、アテローム硬化性病変を標的化するように選択されることができ、例えば、YRALVDTLK、YAKFRETLEDTRDRMY、およびRALVDTEFKVKQEAGAKのようなアネキシンVアテローム硬化性プラーク結合ペプチドが、そのような病変を標的化するために用いられうる。用いられうる追加のターゲティング剤は、血管形成に関連した受容体を標的化するが、血管形成因子ではない場合があり、そのような作用物質は、非限定的に、抗体、アンギオポイエチン、α2-抗プラスミン、エンドシアリン、肝細胞成長因子、白血病抑制因子、環状RGDDFVRGD-ペプチド、胎盤成長因子、セレクチン、プレイオトロピン、チミジンホスホリラーゼ、腫瘍成長因子、シアリルルイスX、オステオポンチン、シンデカン、組織因子、VCAM、血管内皮成長因子関連タンパク質、血管内皮成長因子-A受容体、フォンビルブランド因子関連抗原、およびそれらの断片を含む。
【００８１】
現在開示される化合物および組成物においてそれらのリガンドを用いることにより標的化されうる追加の過剰発現受容体は、当業者に公知である。
【００８２】
IV. 結合化学
現在開示される結合体の構成要素を結合するための多数の方法および試薬は、当業者に周知である。表1は、ポリマー、ナノ粒子、治療剤、画像化剤、ターゲティング剤、またはリンカー上に存在しうる代表的な適した官能基を列挙しており、これらの材料を結合するために用いられうる。
【００８３】
(表１)結合化学のための官能基ペア
2008515915.tif 000011
【００８４】
参照により本明細書に組み入れられる、Olsen et al.,の米国特許第6,303,752号は、リンカー、ポリマーおよびタンパク質を結合するための、とりわけ表1に列挙された官能基の使用を記載している。
【００８５】
表1における例示的な結合パートナー以外の試薬は、本明細書に開示された化合物の構成要素を結合するために用いられうる。例えば、アジド含有化合物は、シュタウディンガー結合を介して他の分子に結合されうる。シュタウディンガー結合に適した試薬は、米国特許第6,570,040号においてSaxon and Bertozziにより、および米国特許公開第20040087779号においてRaines et al.により、開示された方法に従って、調製されうる。'040の特許および'779の公開は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００８６】
特に、開示された結合体を集合させるのに適した結合方法は、非限定的に、それぞれ、安定な尿素およびチオ尿素誘導体を形成する、イソシアネートおよびイソチオシアネートのようなアミノ反応性アシル化試薬を含む。そのような化合物の例は、Schick, A.F. et al. J. Biol. Chem. 1961 236, 2477により記載されるように、タンパク質架橋に用いられている。活性エステルは、開示された結合体化合物を調製するために特に有用であり、例えば、ニトロフェニルエステル、またはN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。活性エステルを用いてアミノ基をアシル化するために適した試薬および条件は、Bodanszky, M. and Bodanszky, A.；The Practice of Peptide Synthesis；Springer Verlag, New York, 1994により；およびJones, J.；Amino Acid and Peptide Synthesis；第2版；Oxford University Press, 2002により記載されており、両方は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
表1に列挙される試薬を用いて形成される他の適切な結合は、2つのスルフィドリル含有分子の酸化的結合により形成されるジスルフィド結合を含む。もう一つの例示的な結合技術は、Hisタグ付き抗体を含むHisタグ付きペプチドおよびタンパク質と結合するニッケルニトリロ酢酸のようなキレート化ニッケル部分を用いる。例えば、一つの態様において、ScFv EGFRのようなC末端Hisタグ付き抗体は、ニッケルニトリロ酢酸部分で誘導体化されるヘパリンまたはポリグルタミン酸のようなナノ担体に結合される。そのような構造の一つの例は、以下の式を有するヘパリン-ScFv EGFR-Taxotere(商標)結合体である。
2008515915.tif 000012
【００８８】
抗体を含むペプチドおよびタンパク質はまた、ナノ担体に共有結合されうる。例えば、Chemical protein synthesis by solid phase ligation of unprotected peptide segments. J. Am. Chem. Soc. 121, 8720-27 (1999)におけるKent et al.により記載されるような天然の化学結合技術が、上で考察されたシュタウディンガー結合プロトコールが用いられるように、用いられうる。
【００８９】
表1に列挙された官能基を有するものを含む材料を結合するための追加の技術は、R.F. Taylor, (1991), 「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, Marcel Dekker, N.Y.；S.S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」, CRC Press, Boca Raton；およびG.T. Hermanson et al., (1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, Academic Press, N.Y.により教示される。これらの刊行物のそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられる。
【００９０】
典型的には、ナノ担体化合物の構成要素は、スペーサーまたはリンカーの構成要素の使用なしに直接的に共に結合される。例えば、治療剤、画像化剤、および/またはターゲティング剤は、ナノ担体に直接的に結合される。しかしながら、特定の態様において、本明細書に開示された結合体の結合は、治療剤の少なくとも1つをナノ担体へ、ナノ担体をターゲティング剤へ、および治療剤をターゲティング剤へ、共有結合性にまたは非共有結合性に連結するリンカーを含む。特定の例において、リンカーは、これらの作用物質間に共有結合を形成し、それゆえに、スペーサー要素により接続される、例えば上記のような、2つまたはそれ以上の反応部分を含む。そのようなスペーサーの存在は、二官能性リンカーが分子内、または2つの異なる分子間の特定の官能基と反応するのを可能にし、結果として、これらの2つの構成要素間に結合を生じ、外因性リンカー由来物質を結合体へ導入する。結合剤における反応部分は、同じ(ホモ二官能性剤)でも異なって(ヘテロ二官能性剤、またはいくつかの異なる反応部分が存在する場合、ヘテロ多官能性剤)いてもよく、任意の化学種間に分子内的または分子間的のいずれかで共有結合をもたらしうる可能性のある試薬の多様性を与える。
【００９１】
特定の態様において、開示された結合体化合物は、治療剤を標的に送達するプロドラッグとして用いられる。従って、例えば、生分解性もしくは化学的感受性である、または酵素的切断部位を組み入れている、不安定な結合を導入することが望ましくありうる。一般的に、現在開示される結合体は、ターゲティング構成要素、ナノ担体構成要素、および治療用構成要素または画像化構成要素の2つまたはそれ以上を連結する、ビシナルグリコール、アゾ、スルホン、エステル、チオエステル、またはジスルフィド基のような切断可能な基を含みうる。一つの態様において、そのような基は、インビボでエステラーゼの存在下で容易に生分解されるが、そのような酵素の非存在下では安定である。従って、リンカーは、そのような不安定な基を含みうる。
【００９２】
リンカーは、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールアミン、エチレンジアミン、それらのオリゴマーおよび誘導体を含みうる。他の代表的なスペーサー要素は、ポリガラクツロン酸、グリコサミノグリカン、ヘパリノイド、セルロース、アルギナート、キトサン、カラゲナン、デキストラン、アミノデキストランのようなオリゴ糖および多糖；ペプチド、リシン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のホモポリマーならびにコポリマーにおけるような、ポリアミノ酸およびそれらのエステル；ならびにオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様において、そのようなリンカーは、酵素切断部位を含みうる。
【００９３】
スペーサー要素は、典型的には、任意で1つまたは複数のヘテロ原子によって中断される脂肪族鎖からなり、かつ約0.5ナノメートルと300ナノメートルの間の距離でリンカーの反応部分を効果的に分離しうる。一つの態様において、スペーサー要素は、オリゴエチレングリコールおよびポリエチレングリコールのようなポリエチレングリコール誘導体を含む。そのようなポリマー構造は、以下、PEGと呼ぶが、生物工学的および生物医学的適用において多く目を向けられてきた単純な、天然ポリエーテルである(Milton Harris, J.(ed)「Poly(ethylene glycol)chemistry, biotechnical and biomedical applications」 Plenum Press, New York, 1992)。PEGは、水を含むほとんどの溶媒において可溶性であり、水性環境において高度に水和され、2つまたは3つの水分子が各エチレングリコール区分に結合する；この水和現象は、他のポリマーかまたはタンパク質のいずれかのPEG改変表面上への吸着を防ぐ効果を有する。さらになお、PEGは、それらの化学的性質にほとんど効果を生じずに、容易に、改変され、かつ他の分子に結合されうる。それらの有利な溶解性および生物学的性質は、PEG、ならびにPEG-ポリウレタンおよびPEG-ポリプロピレンのようなブロックコポリマーを含むそれらのコポリマーの多くの可能な使用から明らかである。現在開示される結合体に用いられるPEGスペーサーについての適切な分子量は、典型的には、約120ダルトンから約20キロダルトンまでである。
【００９４】
V. 組成物および方法
開示のもう一つの局面は、被験体への投与のために調製され、現在開示される化合物の1つまたは複数の治療的有効量を含む薬学的組成物を含む。開示された化合物および組成物を投与するための方法もまた開示される。開示された化合物の治療的有効量は、投与経路、被験体である哺乳動物のタイプ、および処置される被験体の身体的特徴に依存するものである。考慮されうる特定の因子は、疾患重症度および病期、体重、食事、ならびに併用の薬物療法を含む。開示された化合物の治療的有効量を決定するためのこれらの因子の関係は、当業者により理解される。
【００９５】
異常なまたは病理学的な増殖性活性により特徴付けられる状態を処置するための方法が、本明細書に開示される。開示された方法に従って処置されうるそのような状態は、癌および他の新生物性状態のような、異常な細胞増殖および/または分化により特徴付けられるものを含む。開示された化合物および組成物を用いて処置されうる増殖性障害の典型的例は、急性白血病(急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病のような)、慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病のような)を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(緩慢性型および重症型)、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、骨髄異形成、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の非上皮性悪性腫瘍、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、膀胱癌、およびCNS腫瘍(神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫のような)を含む非上皮性悪性腫瘍および上皮性悪性腫瘍などを含む。
【００９６】
非癌性状態を処置するための方法もまた開示される。例えば、被験体において血管機能を改善するための方法が本明細書に開示される。方法は、血管機能を改善するために本明細書に開示された化合物の治療的有効量を被験体に投与する段階を含む。一つの態様において、被験体はアテローム性動脈硬化症を有する。
【００９７】
投与される化合物の治療的有効量は、所望の効果および上記の因子に依存して変わりうる。典型的には、用量は、被験体の体重の約0.01mg/kgと250mg/kgの間、およびより典型的には、被験体の体重の約0.2mg/kgから約80mg/kgまで、または約5mg/kgから約40mg/kgのような、約0.05mg/kgと100mg/kgの間である。従って、単位剤形は、上で列挙された適切な範囲および被験体の体重に基づいて製剤化されうる。一つの態様において、治療的有効量は、心血管機能障害(例えば、アテローム性動脈硬化症)に関連した状態を処置するのに有効である。一つのそのような態様において、治療的有効量は、血流を増加させるのに十分な量である。
【００９８】
本明細書に開示された化合物は、経口で、局所的に、経皮的に、非経口で、吸入またはスプレーを介して投与され得、通常の無毒性の薬学的に許容される担体、補助剤および媒体を含む用量単位製剤で投与されうる。
【００９９】
典型的には、経口投与または注射による投与が好ましい。阻害剤は、特定の疾患、患者の状態、化合物の毒性、および当業者により認識されるような他の因子に依存して、単回投与でまたは長期に渡って、供給されうる。
【０１００】
投与される化合物の治療的有効量は、所望の効果および上記の因子に依存して変わりうる。
【０１０１】
被験体への投与のための薬学的組成物は、選択の分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含みうる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような1つまたは複数の追加の活性成分を含みうる。薬学的製剤は、担体のような追加の構成要素を含みうる。これらの製剤に有用な薬学的に許容される担体は従来どおりである。E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第19版 (1995)によるRemington's Pharmaceutical Sciencesは、本明細書に開示された化合物の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載している。
【０１０２】
一般的に、担体の性質は、用いられる投与の特定の様式に依存するものである。例えば、非経口製剤は、通常媒体として、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどのような薬学的および生理学的に許容される液体を含む注射可能な液体を含む。固体組成物(例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル型)について、通常の無毒性固体担体は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムの医薬品グレードを含みうる。生物学的中性の担体に加えて、投与されるべき薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートのような微量の無毒性補助剤を含みうる。
【０１０３】
阻害剤送達は、例えば、DepoFoam(SkyePharma, Inc, San Diego, CA)におけるような多小胞性リポソームを含む、注射されるおよび/または埋め込まれる薬物デポーを介すことが、いくつかの態様において具体的に企図される(例えば、Chamberlain et al. Arch. Neuro. 1993, 50, 261-264；Katri et al. J. Pharm. Sci. 1998, 87, 1341-1346；Ye et al., J. Control Release 2000, 64, 155-166；およびHowell, Cancer J. 2001, 7, 219-227参照)。
【０１０４】
特定の組織もしくは細胞のインビボまたはインビトロの検出のための方法が、本明細書に提供される。インビボの検出方法は、適切なターゲティング剤の選択により選ばれる、アテローム硬化性病変、新血管新生化および炎症性組織領域、または腫瘍のような任意の標的組織または細胞を特定できる。一つの態様において、癌を有する、または癌を有することが疑われる被験体は、画像化剤を含む結合体化合物で処置される。結合体を被験体における腫瘍または細胞へ局在化させるのに十分な時間の後、腫瘍または細胞は検出されうる。一つの特定の非限定的例において、癌細胞の検出は、テクネチウム-99m標識結合体を用いて達成される。検出の他の特定の非限定的例は、蛍光画像化を含む。
【０１０５】
一つの特定の態様において、検出段階は、手術の前に行われる。もう一つの態様において、検出段階は、放射性免疫誘導手術におけるように、例えば、腫瘍の位置をそれを除去する前に検出するために、手術中に行われる。
【０１０６】
さらにもう一つの態様において、検出段階は、腫瘍の完全な除去を保証するために、または腫瘍の再発を検出するために、手術後に行われる。一つの特定の非限定的例において、放射標識免疫複合体は、手持ちサイズのガンマ検出探測機を用いて検出される。
【０１０７】
インビトロの検出方法は、下で考察されるように、標的群を発現させる任意の腫瘍または細胞を含む任意の生体試料をスクリーニングするために用いられうる。そのような試料は、限定されるわけではないが、生検、剖検、および病理学検体からの組織を含む。生体試料はまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含む。生体試料はさらに、血液、血清、唾液または尿のような体液を含む。生体試料は、典型的には、ヒト被験体のような哺乳動物から得られる。一つの態様において、被験体は、乳癌、膀胱癌、骨癌、子宮頚癌、結腸癌、中枢神経系癌、食道癌、胆嚢癌、消化管癌、頭頸部癌、喉頭癌、白血病、肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、または腎臓癌を含む状態を有する。
【０１０８】
実施例
前述の開示は、以下の非限定的実施例によりさらに説明される。
【０１０９】
一般的方法
すべての試薬は分析グレードであった。パクリタキセルは、Hande Tech(Houston, TX)から購入された。異なる分子量(15,000ダルトンおよび5,000ダルトン)のヘパリンナトリウムは、Celsus Laboratories, Inc.(Cincinnati, OH)から購入された。ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、FA、エチレンジアミン、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、およびピリジンは、Sigma(Milwaukee, WI)から入手された。無水ジエチルエーテル、アセトニトリル、ホルムアミド、およびジメチルスルホキシド(DMSO)は、Merck(Darmstadt, Germany)から購入された。ペニシリン-ストレプトマイシン、ウシ胎児血清(FBS)、0.25％(w/v)トリプシン-0.03％(w/v)EDTA溶液、およびEMGM培地は、American Type Culture Collection(Rockville, MD)から購入された。RPMI-1640培地(FAを含まない)は、Invitrogen(Carlsbad, CA)から入手された。Sephadex A-25は、Pharmacia Biotech AB(Uppsala, Sweden)から購入された。パクリタキセル-Oregon Green 488は、Molecular Probes(Eugene, OR)から購入された。
【０１１０】
実施例1
結合体化合物の合成
この実施例は、下のスキーム1に図解されるように、パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の合成を記載する。ヘパリン(1mmol)を、DCC(20mmol)およびNHS(22mmol)を用いてホルムアミド中、4℃で一晩、活性化した。ジシクロヘキシル尿素(DCU)を、濾過により除去し、その後、ヘパリン-NHSを再結晶により得た。活性化ヘパリン-NHS(1mmol)およびアミノ化FA(20mmol)を、室温で1日間、反応させた。FAを、エチレンジアミンとの結合を用いてアミノ化した。未反応のアミノ化FAを透析により除去した(分子量カットオフ2000)。最終の黄色がかった生成物を、凍結乾燥により得た。結合の収率は、95％(w/w)であった。ヘパリン-FA結合体(1mmol)をホルムアミドに溶解した後、DMSO中のパクリタキセル(30mmol)およびDCC(30mmol)を添加した。混合物を、室温で一晩、反応させた。反応後、未反応のDCCを除去するために再結晶および濾過を行った。さらなる精製のために、この生成物を、過剰容量のアセトニトリルを添加することにより沈殿させた。濾過後、黄色粉末を真空内で乾燥させた。反応を、TLC分析(シリカプレート；溶離剤、2-プロパノール/クロロホルム  10：90  容量：容量)および1H-NMR(D2O中、400MHz)により確認した。FAをアミノ化するために、30ml DMSOに溶解されたFA(1mmol)を、DCC(1mmol)およびNHS(2mmol)と60℃で8時間、反応させた。結果として生じたFA-NHSを、エチレンジアミン(10mmol)および200μlピリジンと混合し、室温で一晩、反応するようにさせておいた。反応を、TLC分析(シリカゲルプレート、2-プロパノール/クロロホルム、70：30v/v％)により確認した。粗生成物を、過剰アセトニトリルの添加により沈殿させ、濾過し、真空下での乾燥の前に、ジエチルエーテルで3回、洗浄した。さらなる精製のために、この生成物を、2N HClに溶解し、過剰容量のアセトニトリルを添加することにより沈殿させた。濾過後、細かい、暗い黄色の粉末を真空内で乾燥させた。未反応のFAおよびジアミノ化FA(FA-(NH2)2)を、イオン交換クロマトグラフィーにより分離した。カラム(10×200mm)に、0.5M四ホウ酸カリウム溶液中で膨張したDEAE Sephadex A-25を充填した。30mlの脱イオン水に溶解した後、生成物(0.03mg/ml)をカラムへ添加し、重炭酸アンモニウム溶液の線形イオン勾配(10mM〜30mM)を適用した。FA-NH2溶液を、上記のように連続的TLC分析後、分画的に収集した。アミノ化FA溶液を蒸発させた。
【０１１１】
スキーム1
2008515915.tif 000013
パクリタキセル(CDCl3)の1H-NMRについて観察されたシグナルは以下であった。
2008515915.tif 000014
ヘパリン(D2O)の1H-NMRについての値は以下であった：δ5.38[グルコサミン残基(A)のH1]、δ5.04[イズロン酸残基(I)のH1]、δ4.84[I-5]、δ4.36-4.23[A-6]、δ4.12-4.40[I-3]、δ4.08[I-4]、δ4.02[A-5]、δ3.78[I-2]、δ3.71[A-4]、δ3.65-3.69[A-3]、δ3.24[A-2]。アミノ化FA(DMSO)の1H-NMRについての値は以下であった：δ1.1[s, FAのC7-H, 1H]、δ4.28-4.16[m, FAのグルタメートのα-CH2, 1H]、δ6.64[d, FAの3',5'-H, 2H]、δ7.64[d, FAの2',6'-H, 2H]、δ8.1-8.17[CONHのH]。パクリタキセル-ヘパリン-FA(D2O)の1H-NMRの値は、δ1.11-2.4[パクリタキセルのCH3またはOAc]、δ3.24-5.38[ヘパリンのAまたはI]、δ7.5-7.64[パクリタキセルの2-OBzおよびNBz]、7.64[FAのH, 2H]、δ8.1-8.45[ヘパリンとFAの間のCONH]、およびδ5.6[ヘパリンとパクリタキセルの間のCOO]であった。
【０１１２】
実施例2
結合体化合物の特徴付け
この実施例は、実施例1に従って作製されたパクリタキセル-ヘパリン-FAの特徴付けを記載する。UV-vis吸収スペクトルは、1.0nmのスリット幅において作動するShimadzu UV-2401PCスキャニング分光光度計において記録された。ヘパリン-FAに結合したパクリタキセルの含有量は、メタノールにおけるパクリタキセルの既知の濃度で作成された標準曲線に基づいてUV測定値により推定された(λ=228nm)。パクリタキセル-ヘパリン-FAのIRスペクトルは、Perkin Elmer system 2000分光計を用いてフーリエ変換赤外分光(FT-IR)において得られ、試料は、KBrペレットとして分析された。
【０１１３】
ヘパリン-FAの合成は、ヘパリン-FAの1H-NMRスペクトルにおけるδ6.75-8.77ppmにおけるシグナルの存在により、およびヘパリン-FAのUVスペクトルにおけるλ＝280nmにおける吸光度により、確認された。パクリタキセルのヘパリン-FAへの結合は、パクリタキセルのヒドロキシル基およびヘパリンのカルボキシル基のDCC媒介性反応により達成された。結合の形成は、1H-NMRスペクトルにおけるδ5.6ppmにおけるシグナルの存在により確認された。C-2'プロトンおよびC-7プロトンの両方は、ヘパリンのピークでぴったり重なっていた。パクリタキセルとヘパリンの間のエステル化の特定部位は、C-2'位およびC-7位の両方でありうる。FT-IRスペクトルから、ヘパリン-FAおよびパクリタキセルの結合は、パクリタキセル-ヘパリン-FAにおける1732cm-1あたりのエステル基(C=Oエステル結合)の存在により確認された。水におけるパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体のUVスペクトルは、メタノールにおけるパクリタキセルのそれと比較して、わずかなシフト(λmax=210nm)を示した。水におけるパクリタキセル-ヘパリン-FAは、50mg/mlの濃度において透明な溶液を生じた。標準曲線に基づいてUVスペクトルにより推定されたヘパリン-FAに結合したパクリタキセルの量は、重量で15.4％であった。ヘパリン(分子量：15000ダルトン)において50個のCOOH基があり、すべては、パクリタキセルおよびFAにより完全に機能付与されていた。
【０１１４】
平均粒子サイズ、サイズ分布、および形態は、粒子サイズアナライザー(Brookhaven Instruments Co., model 90Plus, Holtsville, NY)および80kVの電圧でのTEM(Hitachi, model H-600, Japan)を用いて調べられた。粒子の水中分散は、炭素コーティング化銅グリッド上へ滴投下され、グリッドを、顕微鏡へ載せる前に室温で空気乾燥させた。サイズ測定のための試料は、水中に少量のパクリタキセル-ヘパリン-FA粉末を分散させ、超音波浴において1分間、処理することにより調製された。測定条件は、656nmの波長、0.89cpの粘度、および1.33の屈折率を用いた。
【０１１５】
図1に関して、光散乱により測定される場合、ナノ粒子の平均直径は、2.4nmの標準偏差で118.3nmであった。パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体のTEM顕微鏡写真を、粒子の形および均一性を測定するために撮り、TEM顕微鏡写真は、粒子が均一な球状を有することを実証した(顕微鏡写真を示さず)。低分子量ヘパリン(分子量5000)は、パクリタキセルおよびFAで修飾され、水における粒子のサイズ分布は、直径が約1200nmであった(データを示さず)。
【０１１６】
第Xa因子色素生産性アッセイにより測定されたヘパリンおよびパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の生物活性は、図2に示されるように、それぞれ、179IU/mgおよび68IU/mgであった。パクリタキセル-ヘパリン-FAの相対的生物活性は、非修飾ヘパリンの38％であった。ヘパリンの活性部位におけるスルホニル基、カルボキシル基およびヒドロキシル基の存在のために、パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の活性は、劇的に減少した。パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の抗凝固活性は低いことから、より多くの結合体が、非特異的結合親和性が減少するために、癌細胞へ達することができる。過剰用量のヘパリンに関連した出血および血小板減少のような副作用は、問題にならないはずである。さらになお、成長因子についての結合部位は、2-O-硫酸としてまだ無傷であり、ヘパリンにおける6-O-硫酸は、VEGFおよびFGFとの結合に有効である。Ashikari-Hada S.；Habuchi H.；Kariya Y.；Itoh N.；Reddi A.H.；Kimata K. J. Biol. Chem. 2004, 279, 12346およびLeamon CP.；Cooper SR.；Hardee GE. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 738-747を参照されたい。
【０１１７】
実施例3
チューブリン結合活性の特徴付け
この実施例は、開示された化合物を評価するために用いられるチューブリン重合アッセイを記載する。チューブリン集合反応は、G-PEM緩衝液(1mM GTP、80mM PIPES、1mM EGTA、0.5mM塩化マグネシウム；pH6.8)において、薬物(10μM)の存在下で1mg/ml(10μM)のチューブリン(Cytoskeleton Inc., Boulder, CO)濃度で行われた。装置を、4℃においてこの溶液で0の目盛に合わせた。パクリタキセルまたはヘパリン-パクリタキセル結合体を、その後、迅速に、チューブリン溶液へ10μMの最終濃度まで混合し、吸光度を、80分間に渡って連続的にモニターした。これらの試料を石英キュベット中に置き、32℃でインキュベートした。チューブリン重合は、溶液の吸光度を測定することにより観察された(340nm)。
【０１１８】
図3に関して、パクリタキセルおよびパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体のインビトロで微小管集合を誘導する能力を、10μMのパクリタキセルまたはヘパリン-パクリタキセル結合体において測定した。集合緩衝液におけるチューブリンの溶液へのパクリタキセルの添加は、チューブリンの微小管への重合に起因する光散乱における増加のために吸光度の明らかな増加を引き起こした。他方、ヘパリン-パクリタキセルの10μMパクリタキセル等価量は、図3に示されるように、重合に影響を及ぼさなかった。従って、パクリタキセルの微小管集合を誘導する能力は、ヒドロキシル基のヘパリンでのアシル化により、劇的に減少した。とはいえ、現在開示されるパクリタキセル結合体は、パクリタキセル-ヘパリン-FAから切断された後で活性薬物としてパクリタキセルを放出するように設計される。
【０１１９】
実施例4
細胞毒性の評価
この実施例は、本明細書に開示された化合物を評価するために用いられる細胞毒性アッセイを記載する。ヒト鼻咽頭類表皮癌、KB細胞、およびヒト乳房細胞、MCF-10Aの細胞系はAmerican Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から購入された。これらの細胞系は、陽性FR過剰発現(KB)、または検出可能なFR発現の欠如(MCF-10A)を理由として選択された。KB細胞系を、10％ウシ胎児血清を含むFA欠損培地RPMI 1640において5％CO2を含む加湿雰囲気下37℃で培養した。MCF-10A細胞系は、コレラ毒素を追加した培地MEGM(乳房上皮増殖培地、無血清)において5％CO2を含む加湿雰囲気下37℃で培養した。単層として増殖した細胞(4x104細胞/ml)を0.25％トリプシン-0.03％EDTA溶液により収集した。それらのそれぞれの培地における細胞(200μl)を、96ウェルプレートに播種し、アッセイの前に24時間、プレインキュベートした。MTTアッセイを、KB細胞およびMCF-10A細胞において、4連で、各化合物の5つの異なる濃度(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/mlおよび100ng/ml)で37℃で2日間、インキュベートすることにより行った。対照は、薬物を加えないで、37℃で2日間、インキュベートされた。このアッセイは、黄色テトラゾリウム成分(MTT)の、生存細胞のミトコンドリアにより産生される不溶性紫色のホルマザンへの還元に基づいている。48時間のインキュベーション後、20ulのMTT溶液を含む100ulを、各ウェルへ添加し、プレートをさらに4時間、インキュベートし、続いて、100ulのMTT可溶化溶液(無水イソプロパノールにおける10％Triton X-100プラス0.1N HCl、Sigma, Milwaukee, WI)を各ウェルへ添加した。溶液を、MTTホルマザン結晶を溶解するように穏やかに混合した。各ウェルの吸光度を、570nmの波長においてマイクロプレートリーダーで読み取った。690nmにおけるウェルプレートのバックグラウンド吸光度を測定し、570nm測定値から引き算した。結果は、％細胞生存度として表され、処理群(T)の光学密度値(OD)を対照(C)のODで割ることにより得られた(T/C×100％、図4)。50％細胞毒性を引き起こす作用物質の濃度(IC50)および95％信頼区間は、対数変換データの非線形回帰により計算された。統計学的解析は、ANOVAを用いて行われた。p<0.01が統計学的に有意として認められた。誤差バーは標準誤差(SEM)を表す。
【０１２０】
図4および図5は、パクリタキセル、葉酸、およびパクリタキセル-ヘパリン-FAとの48時間のインキュベーション後のそれぞれの、MCF-10A細胞(正常な乳房細胞)およびKB細胞(癌細胞)の細胞生存度を記録する。図4および図5に記録されたデータは、開示された化合物が、正常細胞に優先して、悪性細胞に対して細胞毒性であり、かつ選択性である。観察されたIC50値により、パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体が、パクリタキセル単独より増加した細胞毒性の可能性、および正常細胞に優先して、悪性細胞に対するより大きな選択性を有し、パクリタキセル放出に基づいた活性と一致していることが明らかにされた。全体的に見て、MTTアッセイの結果は、パクリタキセル-ヘパリン-FAが、正常細胞に対して細胞毒性ではないが、癌細胞に対して毒性が高いことを示している。
【０１２１】
陰性応答を有するパクリタキセル-ヘパリン-FAは、癌細胞において＞0.1ng/mlのIC50を有し、ナノ粒子が、葉酸受容体媒介性エンドサイトーシスを介してKB細胞により取り込まれうることを示している。パクリタキセル-ヘパリン-FAナノ粒子は、正常細胞がより低い葉酸受容体濃度を発現させ、このゆえに、パクリタキセル結合体により標的化されないため、正常細胞に対して細胞毒性ではない。正常細胞が遊離葉酸で処理された場合、細胞の生存度は、パクリタキセル-ヘパリン-FAで処理された細胞と比較して、相対的に低かった。従って、本ストラテジーは、ターゲティング剤および治療剤の両方の毒性を最小にする。
【０１２２】
実施例5
細胞の取り込みの可視化
この実施例は、標識パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の細胞の取り込みおよび細胞内分布の可視化を記載する。共焦点レーザースキャニング顕微鏡法(Zeiss LSM510, Germany)が、Lab-Tek(登録商標)チャンバースライド(Nalge Nunc, Naperville, IL)上で増殖したKB細胞について行われた。パクリタキセル-Oregon Green(登録商標)488結合体(Molecular Probes, Eugene, OR)は、上記のように、ヘパリンまたはヘパリン-FAと結合させるために用いられた。標識パクリタキセル-ヘパリン-FA結合体の濃度は、培地RPMI-1640において1μg/mlであった。1時間のインキュベーション後、複合体を含む培地を、ウェルから吸引した。細胞は、その後、PBS緩衝液(pH7.4)で3回、洗浄し、最後に、リン酸緩衝食塩水における4％ホルムアルデヒドの200μlを加えた。試料は、できるだけ迅速に観察された。組織切片の最初のスキャニングは、通常の蛍光顕微鏡法およびFITCフィルターを用いて低倍率(10xレンズ)下で行われた。FITC標識領域を、その後、より高い倍率(100xレンズ)の共焦点顕微鏡(励起/発光波長：488nmおよび510nm)を用いてスキャンした。
【０１２３】
標識パクリタキセル-ヘパリン-FAの有意な量が、KB細胞と会合しているのが明らかに観察された。大きくかつ多数の斑点状の蛍光構造が、すべての観察された細胞に見出された。他方、細胞会合における劇的な低下が、結合されたFA部分を欠くFITC-ヘパリンまたはFITC-ヘパリン-パクリタキセル結合体について観察された。これらのデータは、パクリタキセル-ヘパリン-FAが、FR陽性細胞を効果的に標的化することができることを実証している。10μg/mlの遊離FAと混合した1μg/mlのパクリタキセル-ヘパリン-FAでのKB細胞の処理は、結果として、パクリタキセル-ヘパリン-FAのほとんど完全な置換を生じ、結合体の受容体特異的結合を与えていることを実証した。
【０１２４】
実施例6
結合体のインビボ評価
この実施例は、ヒト腫瘍細胞を移植されたマウスにおける腫瘍増殖の阻害を記載する。
【０１２５】
ヒト腫瘍異種移植片：
6〜7週齢Crl：NU/NU-nuBR雌ヌードマウス(21〜25g)は、Charles River Laboratories Inc.(Wilmington, MA)から購入され、特定病原体未感染の条件下で維持された。すべての実験は、NIHガイドラインに従ったEmory University's Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。培養されたKB細胞(ATCC, Rockville, MD)を、トリプシン処理し、無血清RPMI1640で2回洗浄し、5x107細胞/ml PBSで懸濁させた。懸濁された細胞の100μlの量を、マウスの背中へ皮下注射した。腫瘍注射後12日目〜15日目において、結果として生じた腫瘍は、80〜100mm3の容積に達した。体重および腫瘍サイズにより、動物は、各5匹のマウスの5つの実験群へ分けられた：群A、B、C、DおよびEは、それぞれ、対照として100μlの生理食塩水(群A、n=4)、パクリタキセル(80mg/kg、群B、n=4)、ヘパリン(またはPG)-パクリタキセル-FA(40mg/kgおよび80mg/kg、群CおよびD、n=4)、およびヘパリン(またはPG)-パクリタキセル(80mg/kg)プラス遊離FA(20mg/kg、群F、n=4)での静脈内尾静脈注射により処理された。
【０１２６】
各薬物は、腫瘍接種後、7日間隔で、合計4回の注射として与えられた。マウスは、それらが腫瘍負荷量のために瀕死になった場合、またはそれらが＞25％の体重減少があった場合、屠殺された。実験は、25日目に終了した。腫瘍増殖は、3つの直交腫瘍直径を測定することにより決定された。腫瘍容積は、以下のように計算された：容積＝π/6×長さ(mm)×幅(mm)×高さ(mm)。腫瘍をもたないマウスにおいて薬物毒性を評価するために、ヘパリン(またはPG)-パクリタキセル-FAまたはパクリタキセルの2つの用量(50mg/kgおよび100mg/kg)を、それぞれ、7日間ごとに静脈注射し、マウスの体重を2〜3日間ごとに測定した。
【０１２７】
免疫組織学的染色および組織学的分析：
腫瘍組織を、O.C.T.コンパウンド(Miles, Elkhart, IN, USA)に包埋し、液体窒素中に凍結させた。5μmの組織切片をスライドガラス上に調製した。脈管構造を同定するための免疫組織化学的染色は、凍結包埋されたディスクの切片上において内皮特異的マーカーCD31(PECAM-1)を用いて、ラット抗マウスPECAM-1(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)、続いてFITC X(RRX)標識ヤギ抗ラットIgG(Jackson Immuno Research Laboratories Inc, West Grove, PA)を使って行われた。核対比染色は、細胞浸潤の領域を同定するためにHoechst 33258(Sigma)で行われた。血管形成の測定のように、緑色PECAM-1陽性領域が、測定され、青色核染色により決定された総細胞領域により標準化された。
【０１２８】
図6Aおよび図6Bに関して、パクリタキセル-PG-FAのマウスへの投与は、結果として、腫瘍増殖を最小にし、マウス体重を維持する。これらのデータは、パクリタキセル-PG-FAが、パクリタキセル単独よりかなり効果的であることを実証している。図7Aは、パクリタキセル-PG-FAの効力の増強が、葉酸受容体ターゲティングに起因することを実証している。図7Bに記録されたデータは、パクリタキセル-PG-FAがマウスにおいて選択的毒性を示すことを実証している。図8は、パクリタキセル-PG-FAが腫瘍において血管形成を低下させることを示している。図9Aおよび図9Bは、パクリタキセル-ヘパリン-FAのマウスへの投与が、結果として、腫瘍増殖を最小にし、マウス体重を維持することを実証している。図10Aおよび図10Bは、パクリタキセル-ヘパリン-FAが、非癌性細胞に対して比較的無毒性であることを実証している。図11Aは、パクリタキセル-ヘパリン-FAが、パクリタキセル-PG-FAより効果的に腫瘍増殖を防いでいることを実証している。図11Bは、パクリタキセル-ヘパリン-FAが、腫瘍増殖を防ぐにおいて、より高い用量で、より効果的であることを実証している。図11Cは、パクリタキセル-ヘパリン-FAの効力の増強が、葉酸受容体ターゲティングに起因することを実証している。図12は、パクリタキセル-ヘパリン-FAが腫瘍において血管形成を低下させることを実証している。
【０１２９】
様々な改変および変化が、本開示の範囲または真意から逸脱することなく、本化合物、組成物および方法においてなされうることは、当業者にとって明らかであると思われる。本化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書の考慮、および本明細書に開示された手順の実施から当業者にとって明らかであると思われる。本明細書および実施例は例示的のみとしてみなされ、本発明の本当の範囲および真意は特許請求の範囲により示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】強度(％)対、動的光散乱により測定される場合のパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体のサイズ分布を示す直径(ナノメートル)のグラフである。
【図２】遊離ヘパリンおよびパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体についての観察される抗第Xa因子ヘパリン活性(IU/mg)を示す棒グラフである。
【図３】チューブリン重合を促進することにおけるパクリタキセルおよびヘパリン-パクリタキセル結合体の生物活性を示すグラフである。
【図４】パクリタキセル、葉酸およびパクリタキセル-ヘパリン-FA結合体との48時間のインキュベーション後のMCF-10A細胞(正常な乳房細胞)の細胞生存度を記録する棒グラフである。
【図５】パクリタキセル、葉酸およびパクリタキセル-ヘパリン-FAとの48時間のインキュベーション後のKB細胞(癌細胞)の細胞生存度を記録する棒グラフである。
【図６Ａ】生理食塩水、パクリタキセル、またはFA-PG-パクリタキセル結合体で処理されるヒトKB腫瘍を移植されたマウスについての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図６Ｂ】図6Aのマウスについて体重(グラム)対時間(日)のグラフである。
【図７Ａ】FA-PG-パクリタキセル結合体で処理されるマウスと比較した、PG-パクリタキセルおよび葉酸で処理されるヒトKB腫瘍を移植されたマウスについての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図７Ｂ】腫瘍を移植され、かつ生理食塩水、パクリタキセル、またはFA-PG-パクリタキセル結合体で処理されるマウスについての、体重(グラム)対時間(日)のグラフである。
【図８】生理食塩水、パクリタキセル、PG-パクリタキセルおよび葉酸、またはFA-PG-パクリタキセル結合体で処理されたマウスにおける移植された腫瘍について、血管形成の観察された量を定量化した(PECAM陽性領域/腫瘍領域)棒グラフである。
【図９Ａ】生理食塩水、パクリタキセル、またはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体で処理されるマウスにおける、移植された腫瘍容積(mm3)対時間(日)を記録するグラフである。
【図９Ｂ】図9Aのマウスの体重(グラム)対時間(日)を記録するグラフである。
【図１０Ａ】パクリタキセルまたはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体の様々な濃度とインキュベートされた細胞の観察された細胞生存度を記録する棒グラフである。
【図１０Ｂ】生理食塩水、パクリタキセル、またはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体で処理される癌を移植されたマウスの、体重(グラム)対時間(日)を記録するグラフである。
【図１１Ａ】FA-PG-パクリタキセル結合体またはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体で処理されるマウスにおける移植された腫瘍についての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図１１Ｂ】FA-ヘパリン-パクリタキセル結合体の異なる量を受けたマウスにおける移植された腫瘍についての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図１１Ｃ】ヘパリン-パクリタキセルおよび葉酸か、またはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体のいずれかを受けたマウスにおける移植された腫瘍についての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図１２】生理食塩水、パクリタキセル、ヘパリン-パクリタキセルおよび葉酸、またはFA-ヘパリン-パクリタキセル結合体で処理されたマウスにおける移植された腫瘍についての、血管形成の観察された量を定量化した(PECAM陽性領域/腫瘍領域)棒グラフである。
【図１３Ａ】1kg体重あたり80mg タキソール等価量の用量で、葉酸標的化薬物、すなわちAbraxane(商標)(タキソール結合アルブミンナノ粒子)を受けた、移植されたKB腫瘍についての、腫瘍容積(mm3)対時間(日)のグラフである。
【図１３Ｂ】リン酸緩衝食塩水(PBS)における、ウシ胎児血清(FCS)における、およびプロテアーゼ酵素(カテプシンD)の存在下における、Abraxane(Abx)ナノ粒子およびタキソール-ヘパリン-葉酸(THF)ナノ粒子についての薬物放出プロファイルの比較である。
【図１４】THF80は80mg/kg用量におけるタキソール-ヘパリン-葉酸結合体を示す；TH80＋FAは、80mg/kgにおけるタキソール-ヘパリン、プラス葉酸との物理的混合物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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