(57)【要約】アネキシンＶタンパク質配列から同定されて、δプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を調節する能力を有しているペプチドが記載されている。このペプチドおよびその改変体はδＰＫＣと結合し、そしてδＰＫＣ媒介性細胞応答を調節するのに効果的である。特に、アネキシンＶペプチドは、δＰＫＣとのタンパク質−タンパク相互作用を阻害して、δＰＫＣの細胞内のトランスロケーションを妨害し得る。δＰＫＣトランスロケーションの阻害は、虚血もしくは低酸素症へのまたは再灌流障害への曝露の危険がある組織にｓ保護を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１）の完全配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有し、かつ、δ−プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）結合活性を保有する、精製されたペプチド。
【請求項２】
ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１）の完全配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有し、かつ、δ−プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）結合活性を保有するペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項３】
ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、精製されたペプチド。
【請求項４】
一つ以上のＣ末端システイン残基またはＮ末端システイン残基をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたは組成物。
【請求項５】
細胞輸送キャリア部分へと修飾されている、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
δＰＫＣにより媒介される細胞応答を調節するかまたは組織を虚血もしくは低酸素症から保護するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
δＰＫＣにより媒介される細胞応答を調節するか、または組織を虚血もしくは再灌流による損傷から保護するための方法であって、ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１）の完全配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有しかつδ−ＰＫＣ結合活性を保有するペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、一つ以上のＣ末端システイン残基またはＮ末端システイン残基をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、細胞輸送キャリア部分へと修飾されている、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アネキシンＶのアミノ酸配列、およびδプロテインキナーゼＣによって媒介される細胞応答の調節におけるこれらの配列の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
多くの生物プロセスは、特異的なタンパク質−タンパク相互作用を含む。タンパク質−タンパク相互作用は、一時的であってもそうでなくてもよく、二個以上のタンパク質またはサブユニットが会合することを可能にする。タンパク質−タンパク相互作用は、多くの測定可能な効果を有し得る：それらはタンパク質の反応速度特性を変え得る；それらは基質チャネリングを許容する共通の機構である；それらは、新規な結合部の形成をもたらし得る；それらは、タンパク質の活性を変え得る；および／またはその基質についてのタンパク質の特異性を変え得る（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００３】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリーは、多くのシグナル伝達経路において重要な役割を果たしているいくつかの脂質活性化アイソザイムからなる。３つのグループのＰＫＣが区別されている：従来のカルシウム依存性で、リン脂質依存性でかつジアシルグリセロール（ＤＡＧ）依存性のアイソザイムアルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）；新規の形態の、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、シータ（θ）およびイータ（η）（これらは、カルシウム独立性である）；ならびにカルシウム非依存性でかつＤＡＧ非依存性である異型アイソザイムゼータ（ζ）およびイオタ（ι）。これらのアイソザイムは、異なる組織分布およびアクチベータ必要要件を示し、細胞内シグナリングにおいて個々の役割を果たす。ＰＫＣの活性化はしばしば、細胞質ゾル区画から膜区画へのトランスロケーション、または異なる細胞内位置間でのトランスロケーションを含む。そして多くのアイソザイムが細胞刺激によってトランスロケーションされた場合、異なる再分布が観察された。このことは、ＰＫＣ活性化の前およびＰＫＣ活性化の際の膜および細胞骨格タンパク質とのアイソザイム特異的相互作用を示唆し、そしてこのような相違は、様々な部位にすでに区画化された種々のタンパク質のリン酸化を可能にし得る。
【０００４】
ＰＫＣと相互作用する多くのタンパク質が報告されている。例えば、不活性ＰＫＣは、ＡＫＡＰ  ７９のようなスカフォールドタンパク質によって局在され得、そして脂質加水分解によって放出されて、共存するタンパク質をリン酸化し得る（非特許文献３）。スカフォールドタンパク質はまた、他のキナーゼおよびホスファターゼの作用を協調させてクロストークおよびシグナル終了を促進し得る。活性化Ｃキナーゼについてのレセプター（ＲＡＣＫ）（非特許文献４）および細胞骨格タンパク質（例えば、ビンキュリンおよびテーリン（非特許文献５））のような、リン脂質依存様式でＰＫＣを結合するタンパク質が記載されている。いくつかのＲＡＣＫは、アイソザイム特異的であり、そして個々のアイソザイム再局在を防ぐためのＲＡＣＫ由来ペプチドの使用は、特定の細胞機能を妨げる（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００５】
アネキシンは、多様な真核生物（例えば、ショウジョウバエ、海綿、粘菌、高等植物および哺乳動物）において見出される約１０個の構造的に関連したタンパク質のファミリーである（非特許文献８）。このファミリーのタンパク質は、負に荷電したリン脂質（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン）とカルシウム依存様式で可逆的に結合する。アネキシンに起因している機能の多くは、この結合特性の結果であると考えられている。これらの機能としては、以下が挙げられる：（１）ホスホリパーゼＡ２活性の調節、（２）抗凝血活性、（３）細胞性エキソサイトーシスでの役割、（４）膜輸送、（５）細胞骨格組織化、（６）ホスホヒドロラーゼ活性、（７）細胞増殖の様々な局面および（８）カルシウムチャネル活性（非特許文献８）。
【０００６】
アネキシンＶは、ヒトを含めた種々の種において見出される特定のファミリーのメンバーである。アネキシンＶは、様々な細胞および組織において広く分布しており、特に脳で豊富であり、ここで、アネキシンＶは、パラクリン型神経栄養因子として作用すると考えられている（非特許文献９）。アネキシンＶはまた、抗凝血活性を保有すること、リン脂質膜を通してＣａ２＋イオンを輸送すること、およびホスホリパーゼＡ２を阻害することが公知である。
【０００７】
骨格筋からのＰＫＣ−αとアネキシンＶＩとの関連が報告されている（非特許文献１０）。また、アネキシンＩ、アネキシンＩＩおよびアネキシンＩＶは、インビトロでＰＫＣについての基質であることが見出されている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【非特許文献１】ＰｈｉｚｉｃｋｙおよびＦｉｅｌｄｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５９：９４−１２３（１９９５）
【非特許文献２】ＰａｗｓｏｎおよびＮａｓｈ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，１４：１０２７−１０４７（２０００）
【非特許文献３】Ｋｌａｕｃｋ，Ｔ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：１５８９（１９９６）
【非特許文献４】Ｍｏｃｈｌｙ−Ｒｏｓｅｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：２４７（１９９５）
【非特許文献５】Ｊａｋｅｎ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：１６８（１９９６）
【非特許文献６】Ｙｅｄｏｖｉｔｚｋｙ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１４１７（１９９７）
【非特許文献７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２４９６２（１９９６）
【非特許文献８】Ｔｏｗｌｅ，Ｃ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：５４１６（１９９２）
【非特許文献９】Ｏｈｓａｗａ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６７：８９（１９９６）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｐｅｉｆｆｅｒ，Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３０：６７５（１９９８）
【非特許文献１１】Ｖａｒｔｉｃｏｖｓｋｉ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：３６８２（１９８８）
【非特許文献１２】Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｔ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２４３７（１９８５）
【非特許文献１３】Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１５９９（１９８７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今日まで、アネキシンＶとδＰＫＣとの間の関連はない。δＰＫＣが虚血および／または再灌流の間、組織の損傷に関係していることが知られている。より詳しくは、単離されたラット心臓におけるシミュレーションされた虚血／再灌流の間、δＰＫＣペプチドインヒビター（アンタゴニスト）を投与することによるδＰＫＣの阻害は、心臓保護的である（Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０８（１９）：２３０４（２００３）；Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０８（７）：８６９（２００３））。当該分野では、虚血および再灌流障害の有害な効果を減らすために、特に虚血と関連したその役割のδＰＫＣの活性を調節するために、δＰＫＣの活性を調節し得る治療薬用が必要とされている。
【０００９】
関連技術の前述の例およびそれに関連する制限は、例示であって排他的でないことが意図される。関連技術の他の制限は、明細書を読み、そして図面を検討すれば当業者にとって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（要旨）
第１の局面において、実質的に純粋であるか、単離されたか、組換えのポリペチドが提供され、このポリペチドは、以下からなる群より選択される：（ｉ）配列番号１または配列番号１１として本明細書で同定されるアミノ酸配列を含むかまたはこのアミノ酸配列からなる、アミノ酸配列；ならびに（ｉｉ）配列番号１として同定されるアミノ酸配列に対して一つ以上のアミノ酸の置換、改変、欠失または挿入を有する改変体であって、この改変体は、配列番号１と少なくとも約５０％同一であり、かつ配列番号１の少なくとも一定の割合の活性を保持している。
【００１１】
別の局面においては、これらのペプチドのうちの一つ以上を含んでいる薬学的組成物が提供される。この組成物は、虚血性事象もしくは低酸素事象に起因する組織損傷、または再灌流障害に起因する組織損傷を処置するかまたは防止する際の使用に適しており、プレコンディショニング保護を提供するために適しており、δＰＫＣにより媒介される細胞プロセスを調節するために適している。
【００１２】
別の局面においては、虚血性事象もしくは低酸素事象に起因する組織損傷、または再灌流障害に起因する組織損傷を処置するかまたは防止する方法が記載されている。この方法において、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはその改変体を有する実質的に精製されたポリペチドを含んでいる有効量の薬学的組成物は、このような処置を必要とする被験体に投与される。
【００１３】
別の局面においては、上述したペプチドのうちの１つを投与することによって、虚血または再灌流障害の危険にさらされている組織をプレコンディショニングするための方法が記載されている。
【００１４】
さらに別の局面において、上述したペプチドのうちの１つを投与することによって、アネキシンＶとδＰＫＣとの相互作用を調節するための方法が提供される。
【００１５】
以下の発明の詳細な説明が添付の図面に関連して読まれる場合、本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、より完全に認識される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、アネキシンＶ１からのペプチド（残基１５７〜１６４）（本明細書において、「アネキシンＶペプチド」とも言及される）である。
【００１７】
配列番号２は、ヒトアネキシンＶタンパク質（「アネキシンＶタンパク質」）のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、ラットδＰＫＣ（登録番号ＫＩＲＴＣＤ）のＶ１ドメインからの残基１〜１４１のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号４は、δＰＫＣのＶ１領域についてのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５は、δＰＫＣのＶ５領域についてのアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号６は、ヒトεＰＫＣのアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号７は、ヒトεＰＫＣのＶ１領域のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号８は、εＰＫＣのＶ５領域のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号９は、ヒトアネキシンＩタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１０は、δＰＫＣからのアミノ酸配列（アミノ酸残基７４〜８１）であり、本明細書において「偽デルタ」ＲＡＣＫまたはΨδＲＡＣＫと言及される。
【００２６】
配列番号１１は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００２７】
配列番号１２は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００２８】
配列番号１３は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００２９】
配列番号１４は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３０】
配列番号１５は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３１】
配列番号１６は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３２】
配列番号１７は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３３】
配列番号１８は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３４】
配列番号１９は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３５】
配列番号２０は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３６】
配列番号２１は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３７】
配列番号２２は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３８】
配列番号２３は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００３９】
配列番号２４は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００４０】
配列番号２５は、配列番号１のペプチド改変体である。
【００４１】
配列番号２６は、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインから誘導されたキャリアペプチドである。
【００４２】
配列番号２７は、Ｔａｔから誘導されたキャリアペプチド（Ｔａｔ４７〜５７）である。
【００４３】
配列番号２８は、δＰＫＣの第１の可変領域（アミノ酸残基８〜１７）からのアミノ酸配列であり、本明細書において「デルタＶ１−１」またはδＶ１−１と言及される。
【００４４】
配列番号２９は、Ｎ末端システイン−システイン結合を通してＴＡＴキャリアペプチド（配列番号２７）に連結された配列番号１の結合体（本明細書においてＴＡＴ−ＡｎｘＶとも言及される）である。
【００４５】
配列番号３０は、配列番号１の修飾物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。
【００４６】
配列番号３１は、Ｎ末端システイン−システイン結合によってＴＡＴキャリアペプチド（配列番号２７）に連結された配列番号３０の結合体（ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）とも言及される）（そしていくつかの図のいては「ＥｐＡｎｘＶ」と表される）である。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明らかにそうでないことを文脈が示していない限り、複数形の言及を包含することに留意しなければならない。
【００４８】
他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されている方法および材料と類似するか等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において用いられ得るが、好適な方法、デバイスおよび材料をここで記載している。本明細書において言及されるすべての刊行物は、本発明と関連して使われるかもしれない刊行物において報告される方法論を記載して開示する目的で本明細書中に参考として援用される。
【００４９】
タンパク質配列は、当該分野で一般に、そしてＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎの推奨に従って使用されている通りの１文字アミノ酸記号または３文字アミノ酸記号を使用して本明細書において提示される。
【００５０】
用語「実質的に精製された」とは、本明細書において使用される場合、それらの自然環境から取り出されているか、単離されているかまたは分離されており、かつ、天然では会合している他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、好ましくは９０％含まない、そして最も好ましくは９５％含まない、核酸配列またはアミノ酸配列をいう。
【００５１】
「ペプチド」および「ポリペチド」は、本明細書において交換可能に使用され、そしてペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の鎖から作製される化合物を言及する。他に示さない限り、ペプチドについての配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への順序で与えられる。
【００５２】
「置換」は、本明細書において使用される場合、それぞれ異なるアミノ酸による、一つ以上のアミノ酸の置換をいう。
【００５３】
「挿入」または「付加」は、本明細書において使用される場合、天然に存在する分子と比較して、一つ以上のアミノ酸残基の付加をもたらすアミノ酸配列の変化をいう。
【００５４】
「欠失」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列の変化をいい、そして一つ以上のアミノ酸残基の非存在をもたらす。
【００５５】
第１のアミノ酸配列の「改変体」とは、第１のアミノ酸配列と比較して一つ以上のアミノ酸の置換または欠失を有する第２のアミノ酸配列をいう。
【００５６】
アミノ酸配列の「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」アミノ酸配列とは、配列のＮ末端またはＣ末端への一つ以上のアミノ酸残基の付加から生じるアミノ酸配列をいう。
【００５７】
用語「調節する」とは、本明細書において使用される場合、δプロテインキナーゼＣの活性の変化をいう。例えば、調節は、δＰＫＣのタンパク質活性、結合特徴または他の任意の生物学的、機能的、もしくは免疫学的な特性の増加または減少を引き起こし得る。
【００５８】
本明細書において、別の配列を有する、「『ｘ』パーセントの同一性を有するアミノ酸配列」との言及は、これらの配列が、後述の様に決定される指定された同一性パーセント（『ｘ』）を有し、そして共通の機能活性を共有することを意図する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、これらの配列は、最適比較の目的で整列される（例えば、最適な整列のために第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列の一方または両方において、ギャップが導入され得、そして、非相同的配列は比較目的で無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％である。本明細書において記載されている比較的短いペプチド配列については、同一性パーセントは、第１の配列および第２の配列のうちのより長い方の残基の総数に対する、第１の配列と第２の配列との間で同様の残基の数とされる。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用しても達成され得る。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用できる）においてＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて決定され得る。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２というギャップ長さペナルティおよび４というギャップペナルティを使用して決定され得る。タンパク質配列は、公共データベースに対して検索を実行するために「問い合わせ配列」としてさらに用いられ得る（例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３により実行され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと）。
【００５９】
「虚血」は、特定の器官または組織に対する血液の不充分な供給と定義される。血液供給減少の結果は、器官または組織に対する酸素および栄養分の不適切な供給（低酸素症）である。長期にわたる低酸素症は、影響を受けた器官または組織に損傷をもたらし得る。
【００６０】
「無酸素症」とは、器官または組織の実質的に完全な無酸素状態をいい、これが長期にわたると、器官または組織の死をもたらし得る。
【００６１】
「低酸素状態」は、特定の器官または組織が不適切な酸素供給を受ける状態と定義される。
【００６２】
「無酸素状態」とは、特定の器官または組織に対する酸素の供給が止められる状態をいう。
【００６３】
「虚血損傷」とは、一定期間の虚血の結果として、器官または組織への細胞および／または分子の損害をいう。
【００６４】
（ＩＩ．ペプチドおよびペプチド組成物）
本発明は、δＰＫＣに結合し得、それにより、δＰＫＣ媒介性細胞活性を調節し得るペプチド配列の同定に基づく。上記のように、δ−ＰＫＣの活性化および原形質膜に対するそのトランスロケーションは、心臓組織のプレコンディショニングを誘導する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｂ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，７６：７３（１９９５））。虚血の短いエピソードを有する心臓組織のプレコンディショニングは、その後の長期にわたる虚血の間、不可逆性の組織損傷を減らす有力な手段である。以下で例示されるように、本明細書において記載されているペプチド配列は、δ−ＰＫＣの活性化を誘導してその抗虚血効果を発揮させ得る薬理学的物質として作用する。アミノ酸配列ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１）を有するペプチド（「アネキシンＶペプチド」とも言及される）およびこの配列の改変体は、δＰＫＣへの結合親和性を有すること、およびδＰＫＣの活性化を誘導することがわかった。従って、１つの実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含んでいる単離されたペプチド、配列番号１の改変体および配列番号１の修飾物を包含する。好適な改変体は、配列番号１との少なくとも約８０％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、、さらにより好ましくは少なくとも約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号１の少なくとも一つの生物学的、免疫学的、または他の機能特徴もしくは活性を保持するペプチドである。これらの配列およびδＰＫＣとのそれらの相互作用を同定するために実施される研究についてここで説明する。
【００６５】
（アネキシンＶ−δＰＫＣ相互作用）
最初の研究は、δＰＫＣへの、δＰＫＣの特定の領域（Ｖ１領域およびＶ５領域）への、そしてεＰＫＣへのアネキシンＶの結合を評価するために設計された。実施例１において詳述される研究において、固定されたアネキシンＶ（配列番号２）および組換え全長δＰＫＣ（配列番号３）、精製された全長εＰＫＣ（配列番号６）、δＰＫＣの組換えＶ１領域（「Ｖ１  δＰＫＣ」、配列番号４）、ならびにδＰＫＣの組換え型Ｖ５領域（「Ｖ５  δＰＫＣ」、配列番号５）を使用したオーバレイアッセイを行った。Ｖ１  δＰＫＣペプチドをミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に結合して融合タンパク質を形成し、そして、Ｖ５  δＰＫＣペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ結合して融合タンパク質を形成した。結果を図１に示す。この結果は、全長δＰＫＣ、ならびにそのＶ１ドメインおよびＶ５ドメインがアネキシンＶと結合したことを示す。対照的に、εＰＫＣはアネキシンＶに結合しなかった。このことは、この相互作用のアイソザイム選択性を示す。
【００６６】
別の研究では、εＰＫＣ（配列番号７）およびδＰＫＣ（配列番号４）のＶ１領域に対するアネキシンＶタンパク質の結合を、実施例２にて説明したように、ＥＬＩＳＡを使用して調べた。図２は、アネキシンＶアクチベータであるカルシウムの存在下および非存在下での、示されたドメイン（ε  Ｖ１  ＰＫＣおよびδ  Ｖ１  ＰＫＣ）のアネキシンＶ（配列番号２）に対する結合パーセントを示す。カルシウムの非存在下でのδ  Ｖ１  ＰＫＣに対するアネキシンＶタンパク質（配列番号２）の結合は、約５５％であった。カルシウムの存在下では、結合は、１００％に増加した。カルシウムの存在下では、ε  Ｖ１  ＰＫＣに対するアネキシンＶタンパク質の結合の程度は、カルシウムの非存在下での結合の程度と統計学的に異ならなかった。従って、アネキシンＶタンパク質は、インビトロにおいてアイソザイム特異的様式で、全長ＰＣＫに結合し、そしてδ  ＰＫＣのＶ１ドメインおよびＶ５ドメインに結合する。
【００６７】
アネキシンＶは、図３に示される別の研究において示されたように、アネキシンＩ（配列番号９）よりも高い親和性でδＰＫＣに結合する。カルシウムの存在下および非存在下でのδＰＫＣ（配列番号３）に対するアネキシン１およびアネキシンＶの結合パーセントを、ＥＬＩＳＡ（実施例２）を使用して調査した。カルシウムの非存在下でのアネキシンＶタンパク質（配列番号２）は、δＰＫＣ（配列番号３）に対して約７５％の結合を有した。カルシウムの存在下では、結合は、１００％へと増加した。対照的に、δＰＫＣに対するアネキシンＩの結合は、カルシウムの存在によって影響を受けず、カルシウムの非存在下および存在下の両方において約７０％残った。
【００６８】
別の研究において、アネキシンＶがインビトロでδＰＫＣの触媒活性を増加させる能力が評価された。全長の組換えδＰＫＣ（配列番号３）およびεＰＫＣ（配列番号６）は、実施例３にて説明したように、キナーゼ緩衝液、ＡＴＰまたはヒストンの存在下で別々にインキュベートされた。ＰＫＣのアクチベータであるホスファチジルセリン（ＰＳ）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）は、δＰＫＣを活性化する１，４ベンゾジアゼピン誘導体であるＪＴＶ−５１９（Ｉｎａｇａｋｉ，Ｋ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１：７９７（２０００））をアネキシンＶとともに、またはアネキシンＶおよびＪＴＶ−５１９の混合物とともに添加した。ヒストンリン酸化の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価された。そして、結果は図４Ａ〜図４Ｂに示される。
【００６９】
図４Ａは、δＰＫＣ（レーン１）単独の、またはホスファチジルセリン（ＰＳ）およびジアシルグリセロールの存在下（ＤＡＧ、レーン２）での、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。ＰＳ／ＤＡＧはδＰＫＣを刺激して、ヒストンのリン酸化がもたらされる（レーン２）。ＰＳ／ＤＡＧの存在下でδＰＫＣにアネキシンＶを添加する（レーン３）と、δＰＫＣの触媒活性が増大する。ＰＳ／ＤＡＧの存在下でδＰＫＣにＪＴＶ−５１９を添加する（レーン４）と、ＰＳ／ＤＡＧ単独の存在下でδＰＫＣについて観察された（レーン２）のとほぼ同じ程度のヒストンのリン酸化がもたらされる。アネキシンＶおよびＰＳ／ＤＡＧの存在下でδＰＫＣにＪＴＶ−５１９を添加する（レーン５）と、アネキシンＶについて観察される触媒活性の増大（レーン３）が妨害された。
【００７０】
図４Ｂは、εＰＫＣ単独（レーン２）についての、ならびにホスファチジルセリン（ＰＳ）およびジアシルグリセロールの存在下でのεＰＫＣ（ＤＡＧ、レーン１）についての、ならびにＰＳ／ＤＡＧおよびアネキシンＶの存在下でのεＰＫＣ（レーン３）についての結果を示す。わかるように、アネキシンＶは、εＰＫＣの活性を増大させない。
【００７１】
図４Ａ〜図４Ｂの結果は、アネキシンＶがδＰＫＣの触媒活性を選択的に増大させること、およびこの増大がＪＴＶ−５１９によって妨害されることを示す。
【００７２】
実施例４は、選択された薬剤により心臓筋細胞が刺激されて、次いで架橋後に抗δＰＫＣを用いて免疫沈降された研究を記載する。次いで、細胞溶解産物は、抗アネキシンＶを用いてプローブされ、そしてＥＣＬウェスタンブロッティングを用いて可視化された。心筋細胞を刺激するために選択された薬剤は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ＪＴＶ−５１９およびδＰＫＣのペプチドインヒビター（δＶ１−１ペプチド、配列番号２８）とＪＴＶ−５１９との組合せであった。溶解する前に、刺激薬剤は、３０秒間〜２０分間の間の時間にわたって細胞に適用された。結果は、図５に示される。アネキシンＶは、ＰＭＡによる刺激後、すぐにδＰＫＣと相互作用する（３０秒間のＰＭＡ刺激および１分間のＰＭＡ刺激に対応するレーン２およびレーン３を参照のこと）。同じことはＨ２Ｏ２により刺激された細胞について観察され、ここで、３０秒間および１分間の曝露（それぞれ、レーン６およびレーン７）は、２分間の曝露（レーン８）よりも大きな程度までδＰＫＣを刺激した。アネキシンＶおよびδＰＫＣの相互作用は、ＪＴＶ−５１９の存在により大いに強化された（レーン９）。レーン８に見られる１００ｋＤの架橋したバンドは、δＰＫＣ（７３ｋＤ）とアネキシンＶ（３５ｋＤ）との合計に対応する。しかしながら、細胞をδＶ１−１ペプチドで２０分間事前に処理し、次いでＪＴＶ−５１９を用いて２０分間処理した場合（レーン１０）、アネキシンＶとδＰＫＣとの相互作用は妨害された。
【００７３】
δＰＫＣとアネキシンＶとのインビトロでの細胞内相互作用をさらに評価するために、類似の研究が実施された。ＣＨＯ細胞内でのδＰＫＣ／アネキシンＶ相互作用の細胞相互作用は、１０ｎＭのＰＭＡを用いた刺激後、架橋剤を用いて安定化された。次いで、δＰＫＣを用いて形成された複合体は、免疫沈降され、そしてアネキシンＶの存在について試験された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは図６Ａに示され、そして時間の関数として、アネキシンＶとδＰＫＣとの会合パーセントを定量化する対応するグラフは図６Ｂに示される。これらの図は、非選択的ＰＫＣアクチベータであるＰＭＡを用いた刺激が、処理の最初の３０秒間以内にアネキシンＶとδＰＫＣとの相互作用を誘導したことを示す。この相互作用は比較的短期であり、タンパク質は１分間の刺激の後、解離した。
【００７４】
架橋され分画された細胞溶解産物は、抗δＰＫＣを用いてプローブされ、このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図６Ｃに示される。δＰＫＣのトランスロケーションの発生は、１分間のＰＭＡ刺激後に２つのタンパク質が解離する後まで観察されなかった。このことは、アネキシンＶとδＰＫＣとの会合がδＰＫＣのトランスロケーションの上流にあることを示す。抗εＰＫＣ抗体を用いたプルダウンは、εＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の存在を示さなかった（データは示さず）。このこともまた、アイソザイム特異性を示す。
【００７５】
アネキシンＶとδＰＫＣとの会合に対するＪＴＶ−５１９（δＰＫＣのアクチベータ）の影響もまた、この研究において評価された。細胞はＪＴＶ−５１９を用いて処理され、そしてアネキシンＶとδＰＫＣとの会合は、上記の免疫共沈降手順を使用して調べられた。図６Ａ〜図６Ｂに示すように、３０秒間のＰＭＡ刺激で見られる最大の相互作用と同様に、ＪＴＶ−５１９によって基底条件でアネキシンＶとδＰＫＣとの完全な会合が生じる。ＰＭＡによって、３０秒間（ＰＭＡにより誘発された最大の会合の時間）で、ＪＴＶにより誘発された複合体の解離が生じた。δＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の細胞局在のより近い評価により、ＰＭＡによる刺激によって、図６Ｄに示すように、細胞の顆粒画分に最大の複合体蓄積が生じることが明らかにされた。細胞の細胞質ゾル画分が定常の低レベルの複合体を含んだのに対し、大多数の複合体は細胞の顆粒画分で見つかり、そして顆粒画分からの消失は、細胞全体の溶解産物において観察されたのと同じ時間経過に従った（図６Ｄの下のパネルを図６Ｂと比較する）。ＪＴＶ−５１９処理の後、細胞顆粒画分においてはごくわずかしか観察されなかったが、大部分のδＰＫＣ−アネキシンＶ複合体は可溶性分画に残っていた。従って、δＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の形成は、δＰＫＣトランスロケーションに先行し、そしてＪＴＶ−５１９によってδＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の事前会合が生じるにもかかわらず、それはその適切な局在を許容しない。
【００７６】
複合体の解離およびその後のトランスロケーションの必要条件を決定するために、δＰＫＣ−アネキシンＶ複合体のＰＭＡにより誘導される形成が、２−デオキシグルコースを使用したＡＴＰ枯渇（Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ，９４：６１７−２３（１９７９））およびアクチン脱分極剤サイトカラシンＤまたは微小管不安定化剤ノコダゾールを用いた前処理による細胞骨格撹乱によって引き起こされるエネルギー的に制限された条件下で実施された。実験の詳細は実施例５に示され、そして結果は図７に示される。
【００７７】
図７は、デオキシグルコース、ノコダゾールおよびサイトカラシンの存在下でのδ−ＰＫＣとアネキシンＶとの複合体の解離を図示する一連のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ネイティブな条件（３７℃）では、複合体の解離は、１０ｎＭ  ＰＭＡを用いた１分間の処理により完了した。しかしながら、細胞が２−デオキシグルコースまたはノコダゾールにより処理された場合、５分間のＰＭＡ刺激後でさえ、相当なレベルの複合体が存在した。対照的に、サイトカラシンＤは、δＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の解離のプロフィールに影響を及ぼさなかった。これらのデータは、アネキシンＶとのその会合によるδＰＫＣトランスロケーションの最初のステップがエネルギー非依存性であることを示唆する。しかしながら、複合体の解離は、インタクトな微小管フィラメントを必要とし、ＡＴＰ依存性プロセスであるようである。
【００７８】
集合的に、上記のデータは、アネキシンＶがアイソザイム依存様式でδＰＫＣと相互作用することを示す。この相互作用は、カルシウム依存性であって、アネキシンＶと相互作用する低分子であるＪＴＶ−５９１により促進される。δＰＫＣとアネキシンＶとの相互作用は、δ−ＰＫＣ特異的インヒビターであるδＶ１−１によって阻害される。アネキシンＶはδＰＫＣ触媒活性を増大させ、そしてＪＴＶ−５１９はその活性のアネキシン依存性増大を防止する。このデータもまた、アネキシンＶとδＰＫＣとが刺激の初期の時点で相互作用することを示す。
【００７９】
（アネキシンＶペプチド）
アネキシンＶタンパク質配列（配列番号２）、δＰＫＣ配列（配列番号３）、および偽δＲＡＣＫ配列（配列番号１０、米国特許第６，８５５，６９３号）の分析は、アネキシンＶ（配列番号２）には存在するが他のアネキシンタンパク質には存在しない配列ＬＱＡＮＲＤＰＤ（配列番号１、アネキシンＶの残基１５７〜１６４）を明らかにした。δＰＫＣに対するアネキシンＶペプチド（配列番号１）の結合およびこのペプチドの改変体の結合は、実施例６に詳述されたＥＬＩＳＡプロトコルを使用して調べられた。δＰＫＣ（配列番号３）は、マイクロタイタープレートのウェルに固定され、次いで、アルカリホスファターゼに結合されたアネキシンＶペプチドとともに、または、アネキシンＶペプチドの改変体（これもまた、アルカリホスファターゼに結合された）とともにインキュベートされた。
【００８０】
研究に使用するために合成されたアネキシンＶペプチド（配列番号１）の改変体は、
ＬＱＡＮＲＤＰ（配列番号１１）、ＭＱＡＡＲＤＰ（配列番号１２）、ＭＲＡＡＥＮＰ（配列番号１３）、ＭＲＡＡＱＤＰ（配列番号１４）、ＭＥＡＡＥＤＰ（配列番号１５）、ＭＲＡＡＡＤＰ（配列番号１６）、ＭＡＡＡＥＤＰ（配列番号１７）およびＭＲＡＡＥＤＰ（配列番号１８）を含んだ。相対的な結合は、表１において、「＋」および「−」の指標によって示される。
【００８１】
【表１】
2008508363.tif 000002
このデータは、配列番号１のペプチド改変体（具体的には、ペプチドＭＱＡＡＲＤＰ（配列番号１２）、ＭＲＡＡＥＮＰ（配列番号１３）、ＭＲＡＡＱＤＰ（配列番号１４）およびＭＥＡＡＥＤＰ（配列番号１５））がδＰＫＣと結合することを示す。特に、これらの改変体は、アネキシンＶペプチドの電荷を逆にするかまたはなくす類似の配列（例えば、配列番号１６、配列番号１７）よりも高い親和性でδＰＫＣに結合する。
【００８２】
意図される他の改変体は、本明細書において配列番号１９（ＭＱＡＡＲＤＰＤ）、配列番号２０（ＭＲＡＡＥＮＰＤ）、配列番号２１（ＭＲＡＡＱＤＰＤ）、配列番号２２（ＭＥＡＡＥＤＰＤ）、配列番号２３（ＭＲＡＡＡＤＰＤ）、配列番号２４（ＭＡＡＡＥＤＰＤ）および配列番号２５（ＭＲＡＡＥＤＰＤ）と同定される配列を含む。
【００８３】
アネキシンＶペプチドがδＰＫＣとアネキシンＶとの細胞内相互作用を妨害する能力は、以下の研究において例示された。アネキシンＶペプチド（配列番号１）は、前述された（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：１１１１４−９（２００１））ようにＮ末端Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合によってＴＡＴ４７−５７キャリアペプチド（配列番号２６）に結合された。このペプチド（本明細書において配列番号２９と同定され、ＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドと呼ばれる）は、ＰＭＡ（１０ｎＭで５分間）を用いた刺激の前にＣＨＯ細胞を前処理（１μＭで１５分間）するために用いられた。比較するために、アネキシンＶペプチド配列は、ＧＩｕ（Ｅ）残基を用いてＡｒｇ（Ｒ）残基が修飾されて、配列ＬＱＡＮＥＤＰＤ（本明細書において配列番号３０と同定される）を有するペプチドが形成された。ＲについてのＥの置換は、アネキシンＶとδＰＫＣとの電荷の相違を与える。このペプチドもまた、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を用いてＮ末端修飾を介してＴＡＴキャリアペプチドに取り付けられた。この結合体は、本明細書において、ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）（配列番号３１）と言及され、そしていくつかの図では「ＥｐＡｎｘＶ」と示される。細胞は、ＰＭＡによる刺激より前にＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）によって同じように前処理された。コントロールとして、いくつかの細胞は未処理のままにされ、そして他の細胞はＰＭＡのみに曝露された。
【００８４】
４つの細胞集団について可溶性画分および顆粒状細胞画分を示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは図８Ａに示される。そして、総タンパクと比較して、顆粒状（膜）画分に存在するδＰＫＣタンパク質の画分を示している対応する棒グラフは図８Ｂに示される。未処理の細胞は、ダッシュ（オープンバー）によってｘ軸に沿って示され、そしてＰＭＡのみによって処理された細胞はダッシュによって示され、そして線は、ＰＭＡ曝露を示す。ＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドは、ＰＭＡ刺激による細胞膜へのδＰＫＣのトランスロケーションを妨害した。修飾されたペプチド（ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ））は、δＰＫＣトランスロケーションに対するその阻害効果を失った。このことは、アネキシンＶとのδＰＫＣ相互作用がδＰＫＣトランスロケーションに決定的でかつ特異的であることを示す。
【００８５】
δＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の破壊の生理学的影響は、アネキシンＶペプチド、、ＴＡＴ−ＡｎｘＶおよびその変異体（ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ））を使用してエキソビボ虚血／再灌流研究において評価された。実施例７に記載されるように、単離されたラットの心臓は、虚血エピソードの誘導前に、ＴＡＴ−ＡｎｘＶまたはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）を用いて１０分間処理された。虚血エピソードは３０分間持続し、その時点で心臓に対する流れが６０分間戻された（再灌流）。再灌流期間の後、心臓流出液が収集され、そしてクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）について分析された。心臓は染色され、そして生存組織および死んだ組織について目視試験された。梗塞の大きさは、組織片の両側の死んだ（白い）組織の平均をとることにより測定された。結果は、図９Ａ〜図９Ｂに示される。
【００８６】
図９Ａは、虚血および再灌流に供されて、未処理のままかまたは虚血前にＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドもしくはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）で処理された、単離されたラット心臓における梗塞の大きさをパーセントにおいて示す棒グラフである。ＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドで処理した心臓の梗塞の大きさの統計学的に有意な減少により証明されたように、アネキシンＶペプチドにより処理された心臓は、組織の損傷から保護されていた。ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）により処理された心臓は、心臓組織へのδＰＫＣにより誘導された損害を阻害しなかった。虚血エピソードの前に提供された場合のＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドの保護効果はまた、図９Ｂからわかるように、このペプチドを用いて処理された心臓のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）レベルお低下によっても観察される。
【００８７】
単離された心臓をアネキシンＶペプチドで前処理するのではなく、このペプチドを虚血事象の後、再灌流期間の最初の１０分間の間に投与したこと以外は同様の研究が実行された。心臓は、変異体ペプチドＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）を用いて同様に処理された。梗塞の大きさおよびこの心臓からのＣＰＫ放出は、それぞれ、図１０Ａ〜図１０Ｂにおいて示される。図１０Ａからわかるように、アネキシンＶペプチドが再灌流の開始時にのみ適用される場合、処理された心臓および未処理の心臓の測定された梗塞の大きさが本質的に同じであることによって証明されるように、心臓保護効果は観察されなかった。図１０Ｂに示されるＣＰＫレベルもまた、再灌流の開始時に与えられる場合、アネキシンＶペプチドが心臓保護効果を与えないことを示す。この観察は、上記のデータと一貫しており、δＰＫＣ／アネキシンＶ相互作用がδＰＫＣの活性化の際に早く発生すること、およびδＰＫＣトランスロケーションを阻害するために、アネキシンＶインヒビターペプチドがシグナル開始の間必要なことを示している。これらのデータは、δＰＫＣ−アネキシンＶ相互作用の阻害がδＰＫＣ機能の必須の工程であることを示しており、そしてδＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の形成がδＰＫＣの活性化経路の初期に発生することを確認する。
【００８８】
要約すると、これらデータは、ＰＫＣトランスロケーションに先行するタンパク質−タンパク相互作用を例示する。この相互作用はδＰＫＣおよびアネキシンＶに選択的である。従って、１つの実施形態において、実質的に純粋であるか、単離されたか、または組換えのポリペチドが提供され、これは、以下からなる群より選択される：（ｉ）本明細書において配列番号１または配列番号１１と同定される配列を含んでいるかまたはこのからなるアミノ酸配列；ならびに（ｉｉ）配列番号１と同定されるアミノ酸配列に対して一つ以上のアミノ酸の置換、修飾、欠失または挿入を有する改変体であって、配列番号と少なくとも約５０％同一でかつ配列番号１の活性の少なくとも一部を保持する、改変体。このペプチドは、アネキシンＶとのδＰＫＣの会合を阻害することによって、δＰＫＣのトランスロケーションを阻害するように作用し、それによって、虚血に曝露される危険がある細胞に保護効果を与える。
【００８９】
上記の（ｉ）の範囲内のペプチドは、配列番号１もしは配列番号１１と同定される特定のアミノ酸配列からなってもよく、または配列番号１および配列番号１１と同定される配列と比較してさらなるＮ末端のアミノ酸配列および／またはさらなるＣ末端のアミノ酸配列を有してもよい。
【００９０】
上記の（ｉｉ）の範囲内のペプチドは、配列番号１により同定されるペプチドの改変体であるペプチドであり、ただし、このような改変体は、配列番号１により同定されるペプチドの少なくとも一定の生物学的活性を示し、そして配列番号１により同定されるペプチドに少なくとも約５０％同一である。配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４（表１）と同定されるペプチドによって例示されるような、ペプチドの機能に影響を及ぼさない、ペプチドのアミノ酸配列の変更が起こり得ることが認識される。これらは、アミノ酸の欠失、挿入、修飾および置換を含み、そして選択的スプライシングならびに／または複数の翻訳開始部位および翻訳停止部位の存在から生じることができる。多型は、翻訳プロセスの不確実さの結果として起こり得る。従って、タンパク質の機能に影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化は許容され得る。
【００９１】
当業者は、特定の活性を有するポリペチドのアミノ酸配列に様々な変化がしばしばなされて、少なくとも一定の割合の所望の生物学的活性を有する（好ましくは相当の割合の上記活性を有する）改変体（時々、誘導体または「ムテイン」として公知）が生成され得ることを認識する。当業者は、様々なアミノ酸が類似の特性を有することを知っている。物質の一つ以上のこのようなアミノ酸は、その物質の所望の活性を除去することなく、一つ以上の他のこのようなアミノ酸によって置換され得る。例えば、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、互い（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）にしばしば置換され得る。これらのありうる置換のうち、グリシンおよびアラニンは（これらが比較的短い側鎖を有するので）互いに置換するために用いられることが好ましく、そして、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは（これらは疎水性であるより大きい脂肪族側鎖を有するので）互いに置換するために用いられることが好ましい。互いにしばしば置換され得る他のアミノ酸としては、以下が挙げられる：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパルテートおよびグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。この性質の置換は、「保守的」置換または「半保存的」アミノ酸置換としばしば言及される。
【００９２】
アミノ酸の欠失または挿入はまた、配列番号１と同定されるアミノ酸配列に対してなされ得る。従って、例えば、ペプチドの活性に実質的な影響を及ぼさないか、または、このような活性を少なくとも除去しないアミノ酸を欠失し得る。このような欠失は有利であり得る。なぜなら、依然として活性を保持しながらも、分子の全体の長さおよび分子量が低減され得るからである。これは、特定の目的に必要とされるペプチド量を低減し得る（例えば、投与量レベルが低減され得る）。
【００９３】
どのようなアミノ酸の変化が（置換、挿入または欠失によって）作製されようとも、本発明の好適なペプチドは、配列番号１と同定されるペプチドと少なくとも５０％の配列同一性を有し、好ましくは、配列同一性の程度は、少なくとも７５％である。少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の配列同一性が最も好ましい。
【００９４】
アネキシンＶペプチドおよびアネキシンＶペプチドの記載されている改変体は、アミノ酸配列を合成する化学的方法を使用して作製され得る。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：２０２（１９９５））を使用して実行され得、そして、例えばＡＢＩ  ４３１  Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化合成が達成され得る。合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）によって実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析または配列決定により確認され得る（例えば、エドマン分解手順；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、前出）。さらに、アネキシンＶペプチドのアミノ酸配列またはその任意の一部分も、直接合成の間に変更され得、そして／または他のタンパク質からの配列またはその任意の一部分と化学的方法を使用して結合されて改変体ポリペプチドが生成され得る。
【００９５】
本発明はまた、修飾されたアネキシンＶペプチドを意図し、ここで、アネキシンＶペプチドおよびその改変体のいずれかは、多数のアミノ酸によってＣ末端またはＮ末端が延長されている。本発明において用いられる好適な修飾されたアネキシンは、アクセス可能なスルフヒドリル基を提供するアミノ酸残基を用いてＮ末端が延長されている。このような修飾されたアネキシンは、細胞膜をまたがるアネキシンＶペプチドまたはアネキシンＶペプチド改変体の輸送を補助する任意の数のキャリアペプチドへと結合され得る。例えば、アネキシンＶペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に付加された一つ以上のシステイン残基を含み得る。付与されたシステイン残基のスルフヒドリル基は、公知のキャリアペプチド（例えば、ＴＡＴ（配列番号２６）またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン（配列番号２７；Ｔｈｅ’ｏｄｏｒｅ，Ｌ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：７１５８（１９９５）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９：１０８６（１９９６））またはポリアルギニン（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，５６：３１８−３２５（２０００）；Ｒｏｔｈｂａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，６：１２５３−１２５７（２０００））に連結され得る。
【００９６】
本発明がまた、配列番号１として記載されるペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび配列番号１の改変体をコードするポリヌクレオチドを包含することが認識される。したがって、アミノ酸配列ＬＱＡＮＲＤＰＤをコードするいかなる核酸配列も、ＬＱＡＮＲＤＰＤを発現する組換え分子を生成するために用いられ得る。遺伝暗号の縮重の結果、配列番号１をコードする多数のヌクレオチド配列（いくつかは、任意の公知のおよび天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小の相同性を保有する）が生成され得ることが当業者によって認識される。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づいて組合せを選択することによって作製され得るヌクレオチド配列の各々の、およびあらゆる可能なバリエーションを意図する。これらの組合せは、標準的なトリプレットの遺伝暗号に従って作製され、そしてこのようなバリエーションのすべては、具体的に開示されたものとみなされる。
【００９７】
（ＩＩＩ．組成物および処置方法）
本発明はまた、配列番号１に対応する配列または配列番号１に対して約５０％より高いかもしくは少なくとも約５０％の同一性を有する配列、より好ましくは、配列番号１に対して７５％の同一性、さらにより好ましくは８０％、８５％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列を有するアネキシンＶペプチドを投与することにより、δＰＫＣ媒介性の細胞応答を調節する方法を意図する。この方法において、ペプチドは適切な処方において投与され、ここで、このペプチドは、インビボでδＰＫＣと結合してアネキシンＶとδＰＫＣとの間の相互作用を調節するのに効果的である。
【００９８】
本発明はまた、虚血または再灌流障害に起因する損害から組織を保護する方法を意図する。この方法では、虚血の危険性がある患者は、アネキシンＶペプチド（配列番号１）またはその改変体もしくは修飾物を用いて処置されて、プレコンディショニングおよび虚血からの保護が誘導される。
【００９９】
アネキシンＶペプチドまたはその改変体を含んでいる薬学的組成物もまた意図される。薬学的組成物は、所望の投与経路に従って部分的に選択されるキャリアと組み合わせたペプチドを含む。経口手段、静脈手段、筋肉内手段、動脈内手段、骨髄内手段、クモ膜下手段、心室内手段、経皮手段、皮下手段、腹腔内手段、鼻腔内手段、経腸手段、局所手段、舌下手段または直腸手段を含むがこれらに限定されない、多数の投与経路が意図される。
【０１００】
適切な薬学的に受容可能なキャリアは、活性化合物の調製物への加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む。処方および投与についての技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）において見出され得る。例えば、非経口投与に適している薬学的組成物は、水溶液において（好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理学的緩衝化食塩水のような生理的に適合性の緩衝液において）処方され得る。水性の注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。さらに、活性な化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。必要に応じて、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解性を増大させる適切な安定剤または薬剤を含み得る。局所投与または鼻投与については、透過されるべき特定のバリアに適切な浸透剤が処方物に使用される。このような浸透剤は、当該分野で一般に公知である。
【０１０１】
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、すりつぶし、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥によって、当該分野で公知の様式で製造され得る。
【０１０２】
薬学的組成物が調製されたあと、それらは、適切な容器に入れられ得、そして示された状態の処置についてラベルされ得る。アネキシンＶペプチドの投与のために、このようなラベルは、投与の量、頻度および方法を含む。
【０１０３】
本発明の使用に適している薬学的組成物は、意図される目的を達成するために有効な量で活性成分が含まれる組成物を含む。有効用量の決定は、充分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイにおいて、または、動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタ）において、まず最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために用いられ得る。次いで、このような情報は、ヒトでの投与に役立つ用量および経路を決定するために用いられ得る。治療的に有効な用量は、症状または状態を改善する活性成分（例えば、アネキシンＶペプチドまたはその改変体）の量をいう。細胞培養アッセイおよび動物での研究から得られるデータは、ヒトでの使用のためのある範囲の投与量を処方する際に使われる。このような組成物に含まれる投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性なしで治療効力を提供する循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形、患者の感受性および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【０１０４】
正確な投与量は、処置を必要とする被験体に関連した要因を考慮して、実施者によって決定される。投与量および投与は、充分なレベルの活性部分を提供するかまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る要因としては、疾患状態の重篤度、被験体の全般的な健康状態、被験体の年齢、体重および性別、食事、投与の時期および頻度、薬物の組合せ、反応感受性および治療への寛容性／応答が挙げられる。持効性の薬学的組成物は、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して、３〜４日毎に、毎週または二週間に一度投与され得る。通常の投与量の総計は、投与経路に依存して、０．１から１００，０００マイクログラムから、約１ｇの総用量まで変化し得る。特定の投与量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されており、一般に、当該分野の実施者が利用し得る。ペプチドの例示的な治療有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にわたり、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、そしてさらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇまたは５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にわたる。治療有効量のペプチドを用いた被験体の処置は、１回の処置を含んでもよく、または、好ましくは一連の処置を含み得る。
【実施例】
【０１０５】
（ＩＶ．実施例）
以下の実施例は、本明細書において記載されている本発明をさらに例示し、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【０１０６】
（実施例１：ヒトのアネキシンＶがδＰＫＣに結合することを示すオーバレイアッセイ）
１０μｇのアネキシンＶ（配列番号２）を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、そしてニトロセルロースに転写し、次いで切断してストリップにした。これらのストリップを、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、３％のウシ血清アルブミン、０．１％のＰＥＧ２０）とともにインキュベートした。次いで、これらのストリップを、適切な場合にはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）−δＶ１  ＰＫＣの融合タンパク質（ＭＢＰ−δＶ１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−δＶ５  ＰＫＣの融合タンパク質（ＧＳＴ−δＶ５）、およびδの全長配列（δＰＫＣ、配列番号３）またはラットの精製されたεの全長配列（εＰＫＣ、配列番号６）を含んでいる３０μｇ粗製細菌細胞溶解産物の存在下で、オーバレイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％のＰＥＧ２０、１２ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中で、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、これらのストリップを洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＰＥＧ２０、１２ｍＭのβ−メルカプトエタノール）で洗浄し、次いで、固定液（ＰＢＳ中０．２％のホルムアルデヒド）および中和溶液（ＰＢＳ中０．２Ｍのグリシン）とともに室温でそれぞれ２０分間インキュベートした。緩衝液での洗浄後、ストリップをオーバレイタンパク質に従って抗体でプローブし、そして得られたバンドを、ＥＣＬウェスタンブロッティングを使用して可視化した。結果を図１に示す。
【０１０７】
（実施例２：アネキシンＶに対するδＰＫＣドメインの結合の分析）
（Ａ．ＥＬＩＳＡ結合アッセイ）
アネキシンＶ（配列番号２）を１００ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ＝９．６）中に希釈し、そして希釈溶液のうちの１００μｌをマイクロタイタープレート中の各ウェルに入れて、１ウェルあたり０．１μｇのアネキシンＶとした。このプレートを４℃にて一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、プレートを、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μＬ／ウェルを用いて室温で１時間にわたってブロックした。
【０１０８】
相互作用のパートナーであるδＰＫＣ（配列番号３）、δＶ１  ＰＫＣ（配列番号４）およびδＶ５  ＰＫＣ（配列番号５）を、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中に希釈した。全長δＰＫＣについては、ほぼ１．５μｇ／ウェル（１：２０希釈の細胞溶解産物）を添加した。δＶ１  ＰＫＣ領域およびδＶ５  ＰＫＣ領域については、約８０００〜８０ｎｇ／ウェルを添加し、中間の濃度で充分であった。シグナル対ノイズは、より高い濃度で劇的に増加した；従って、８μｇ／ウェルが好適であった（これは、１：４０希釈の細胞溶解産物に対応する）。１００μＬ／ウェル、振盪しながら１時間。結合は３７℃で加速されたが、室温もまた結合に充分であった。
【０１０９】
１時間の振盪後、プレートを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（２００μＬ／ウェル×３）を用いて３回、各洗浄につき５分間、振盪しながら洗浄した。
【０１１０】
次に、乳中の一次抗体（通常、１０００：１希釈）を添加し、続いて室温で１時間振盪した。次いで、このプレートを、振盪しながら１回の洗浄あたり５分間、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．１％のＴｗｅｅｎ）により３回（２００μＬ／ウェル×３）洗浄した。
【０１１１】
次いで、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中に希釈した二次抗体（通常１０００：１）を添加し、続いて室温で１時間振盪した。次いで、このプレートを、振盪しながら１回の洗浄あたり５分間、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎにより３回（２００μＬ／ウェル×３）洗浄した。
【０１１２】
発色試薬を添加した（１００μＬ／ウェル）：５ｍＬの希釈された緩衝液あたり１  ＰＮＰＰ錠剤。２Ｎ  ＮａＯＨを添加し、そしてこのプレートを発色させ、次いで４０５ｎｍ（１波長）で読み取った。結果を図２に示す。
【０１１３】
（実施例３：キナーゼアッセイ）
２００ｎｇの純粋なδＰＫＣまたはεＰＫＣ（Ｐａｎｖｅｒａ  ＬＬＣ、現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１００μＬキナーゼ緩衝液中でインキュベートした（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３μＣｉ／反応［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、９μＭ／反応ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、３０μｇ／反応ミエリン塩基性タンパク質またはヒストンＡ１（Ｓｉｇｍａ）；１００μＭ脂肪小胞混合物（９０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）：１０％のジアシルグリセロール（ＤＡＧ））、１ｍＭのＣａＣｌ２、１μＭ  ＪＴＶ５１９、および／または２０ｎｇのアネキシンＶ／反応を、該当する場合に加えた。キナーゼ反応をＳＤＳサンプル緩衝液の添加によって停止させ、そして１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離およびニトロセルロース膜上への転写後、ヒストンリン酸化の程度をオートラジオグラフィーによって評価した。結果を図４Ａ〜図４Ｂに示す。
【０１１４】
（実施例４：架橋免疫沈降）
心筋細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；１０ｎＭ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、５ｍＭ）、ＪＴＶ−５１９またはδＶ１−１ペプチド（１μＭ）およびＪＴＶ−５１９（１μＭ）により３０秒間〜５分間の間の時間処理した。時間経過後、細胞を冷ＰＢＳにより洗浄し、ホモジナイゼーション緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、０．２５Ｍのスクロース、１２ｍＭβ−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）、０．１％のホルムアルデヒド中で粉砕して氷上で均質にした。４℃にて３０分後、溶解産物を４℃の０．１４Ｍグリシンで２０分間クエンチし、そしてサンプルを１４Ｋｒｐｍで４℃にてスピンした。上清を、１μｇの抗δＰＫＣ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とともに４℃にて１時間インキュベートし、次いで４℃にて３時間のプロテインＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともにインキュベートした。次いでビーズを洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）で洗浄し、そして、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに転写し、そして抗アネキシンＶ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、続いてＥＣＬウェスタンブロッティングによって可視化した。結果を図５に示す。
【０１１５】
（実施例５：δ−ＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の解離）
ＣＨＯ細胞を、以下のうちの１つによって前処理した：（１）グルコースを含まない緩衝液中の２−デオキシグルコース（２０ｍＭ）で４時間；（２）ノコダゾール（１０μＭ）で２時間；または（３）サイトカラシンＤ（２μＭ）で１時間。次いで、細胞をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、１０ｎＭ）により３０秒間〜５分間の間の時間にわたって処理した。時間が経過した後、細胞を冷ＰＢＳにより洗浄し、そしてホモジナイゼーション緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、０．２５Ｍのスクロース、１２ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）、０．１％のホルムアルデヒド）中での粉砕を用いて氷上で均質化した。４℃にて３０分間後、溶解産物を０．１４Ｍのグリシンによって４℃にて２０分間クエンチし、そしてサンプルを４℃にて１４Ｋｒｐｍでスピンした。上清を１μｇの抗δＰＫＣ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とともに１時間インキュベートし、次いでプロテインＧビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともに４℃にて３時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、２ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１２ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．１％のＴｒｉｔｏｎ）を洗浄し、そして７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースに転写し、そして抗アネキシンＶ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、続いてＥＣＬウェスタンブロッティングによって可視化した。結果を図７に示す。
【０１１６】
（実施例６：アルカリホスファターゼに融合したアネキシンＶペプチドのためのＥＬＩＳＡプロトコル）
組換え型δＰＫＣタンパク質（配列番号３）を、炭酸緩衝液ｐＨ９．６中で室温にて１時間にわたってＦａｌｃｏｎプレートに結合させた。グリセロールストックからの１：１０〜１：１００希釈のＰＫＣ酵素または１００μｇを調製した。１μＬ／ｍＬのβ−メルカプトエタノールをＰＫＣに添加した。各ウェルは、約１００μＬのＰＫＣを含んでいた；ＰＫＣのないいくつかのウェルは、非特異的結合を補正するために存在した。
【０１１７】
次に、全てのウェルを、２００μＬのスーパーブロックまたは炭酸緩衝液中の０．５％乳によってブロックした。ブロッキングを、各回５分間にわたり二回行った。
【０１１８】
ウェルを洗浄することなく、アルカリホスファターゼタンパク質に融合したペプチド（すなわち、ペプチド−アルカリホスファターゼ融合物）（１００μＬ）をこれらのウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、これらのウェルをＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．１％）によって各回２分間にわたって３回洗浄した。これらのウェルを一晩発色させ、その後、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。結果を表１に示す。
【０１１９】
（実施例７：アネキシンＶペプチドを用いた心臓のエキソビボ処理）
ラットに麻酔をかけ、そしてそれらの心臓を迅速に取り出し、そして、逆行灌流のために大動脈を経てカニューレを挿入した（Ｃｏｌｂｅｒｔ，Ｍ．らＪ．Ｃｌｉｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：１９５８（１９９７））。心臓を未処置のままにしたか、またはＴＡＴに結合されたアネキシンＶペプチド（ＴＡＴ−ＡｎｘＶ、配列番号２９）もしくはその変異体（ＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）（配列番号３１））によって１０分間前処置し、その後、３０分間虚血させた。流れを３０分間遮断し、次いで流れを６０分間回復させること（再灌流）により虚血を誘導した。心臓の流出液を再灌流後１５分間収集し、そしてＳｉｇｍａのキットを使用してクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）についてアッセイした。心臓を２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）により染色して生きた組織（赤色）および死んだ組織（白色）を可視化し、そして組織片の両側の白色面積の平均をとる（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）ことにより梗塞の大きさを測定した。結果を図９Ａ〜図９Ｂおよび図１０Ａ〜図１０Ｂに示す。
【０１２０】
多くの例示的な局面および実施形態を上記で考察したが、当業者は特定の改変、置換、付加およびそれらの副次的組み合わせを認識する。それゆえ、それらは真の趣旨および範囲にあるので、添付の特許請求の範囲およびその後導入される請求項がすべてのこのような改変、置換、付加および副次的な組合せを含むと解釈されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、アネキシンＶタンパク質に対する、δＰＫＣ、ＰＫＣのδＶ１ドメイン、δＰＫＣのδＶ５ドメインおよびεＰＫＣの結合を評価するためのオーバレイアッセイからの結果を示す。ここで、ウエスタンブロットは、それぞれのＰＫＣアイソザイムについてプローブされた。
【図２】図２は、カルシウムの存在下および非存在下での、アネキシンＶタンパク質に対する、示されたドメイン、εＶ１  ＰＫＣおよびδＶ１  ＰＫＣの結合パーセントを示す、
【図３】図３は、カルシウムの存在下および非存在下での、δＰＫＣに対する、アネキシン１およびアネキシンＶの結合パーセントを示す。
【図４】図４Ａは、δＰＫＣ単独で（レーン１）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の存在下で（レーン２）、ＰＳ／ＤＡＧおよびアネキシンＶの存在下で（レーン３）、ＰＳ／ＤＡＧおよびＪＴＶ−５１９の存在下で（レーン４）、ＰＳ／ＤＡＧ、ＪＴＶ−５１９およびアネキシンＶの存在下で（レーン５）行われた、基質としてのヒストン２Ａとのインビトロキナーゼ反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図４Ｂは、εＰＫＣ単独で（レーン２）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の存在下で（レーン１）、そしてＰＳ／ＤＡＧおよびアネキシンＶの存在下で（レーン３）行われた、基質としてのヒストン２Ａとのインビトロキナーゼ反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図５】図５は、抗アネキシンＶによりプローブした免疫沈降された架橋δＰＫＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、細胞は、溶解の前に、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ＪＴＶ−５１９またはδＶ１−１ペプチドおよびＪＴＶ−５１９により３０秒間〜２０分間の間の時間にわたって刺激された。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＭＡでの細胞の刺激後またはＪＴＶ−５１９での処理後の、細胞におけるアネキシンＶおよびδＰＫＣの免疫共降を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＭＡでの細胞の刺激後またはＪＴＶ−５１９での処理後の、アネキシンＶおよびδＰＫＣの最大会合パーセントの対応する棒グラフを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗δＰＫＣによりプローブされた、分画されたＰＭＡ刺激細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、抗δＰＫＣによってプルダウンされ、抗アネキシンＶによりプローブされた、分画され架橋された細胞溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図７】図７は、デオキシグルコース、ノコダゾールおよびサイトカラシンの存在下での、δ−ＰＫＣ−アネキシンＶ複合体の解離を図示する一連のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図８Ａ】図８Ａは、未処理の細胞、ならびにＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドに曝露しＰＭＡにより刺激した細胞およびＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）（図において、それぞれ、「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）に曝露しＰＭＡにより刺激した細胞について、ＣＨＯ細胞の可溶性画分から膜画分へのδＰＫＣのトランスロケーションを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（図８Ａ）および
【図８Ｂ】図８Ｂは、未処理の細胞、ならびにＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドに曝露しＰＭＡにより刺激した細胞およびＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）（図において、それぞれ、「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）に曝露しＰＭＡにより刺激した細胞について、総タンパク質と比較した膜分画のδＰＫＣタンパク質の割合の対応する棒グラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、エキソビボで虚血／再灌流を受け、そして無処置のままにされるかまたは虚血前にＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドもしくはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）により処置された（図において、それぞれ「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）、単離されたラット心臓における、梗塞の大きさをパーセントにおいて示す棒グラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、エキソビボで虚血／再灌流を受け、そして無処置のままにされるかまたは虚血前にＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドもしくはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）により処置された（図において、それぞれ「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）、単離されたラット心臓における、放出されたクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の量をＵにおいて示す棒グラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、エキソビボで虚血／再灌流を受け、そして無処置のままにされるかまたは虚血後および再灌流の最初の期間の間にＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドもしくはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）により処置された（図において、それぞれ「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）、単離されたラット心臓における、梗塞の大きさをパーセントにおいて示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、エキソビボで虚血／再灌流を受け、そして無処置のままにされるかまたは虚血後および再灌流の最初の期間の間にＴＡＴ−ＡｎｘＶペプチドもしくはＴＡＴ−ＡｎｘＶ（Ｒ→Ｅ）により処置された（図において、それぞれ「ｐＡｎｘ」および「ＥｐＡｎｘＶ」と示される）、単離されたラット心臓における、放出されたクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の量をＵにおいて示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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