(57)【要約】本発明は、血清アルブミン結合ペプチド（ＳＡＢＰ）、標的化因子および細胞傷害性因子を含む、毒性の低下した治療剤に関する。また、本発明は、因子の毒性を低下させる方法および毒性の低下した治療剤を用いる処置方法にも関する。本発明により、少なくとも１つの血清アルブミン結合ドメイン（ＳＡＢＭ）、少なくとも１つの標的化因子（ＴＡ）および少なくとも１つの細胞傷害性因子（ＣＡ）を含む、コンジュゲート分子が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの血清アルブミン結合ドメイン（ＳＡＢＭ）、少なくとも１つの標的化因子（ＴＡ）および少なくとも１つの細胞傷害性因子（ＣＡ）を含む、コンジュゲート分子。
【請求項２】
前記ＳＡＢＭがＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号８）の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が２つのＣｙｓ残基を有し、該２つのＣｙｓ残基の間に５つのアミノ酸残基を有する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項３】
該ＳＡＢＭがＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号８）のアミノ酸配列の改変体を含み、ここで、前記Ｃｙｓ残基を除いて、配列番号８の残基のうちの残基のいずれか１〜５残基が異なるアミノ酸残基で置換された、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項４】
前記ＳＡＢＭが：
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ［配列番号１］
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ［配列番号２］
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ［配列番号３］
Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−［配列番号４］
Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｕｃ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ［配列番号５］
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ［配列番号６］
ＣＸＸＧＰＸＸＸＸＣ［配列番号２１］
ＸＸＸＸＣＸＸＧＰＸＸＸＸＣＸＸＸＸ［配列番号２２］
ＣＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣ［配列番号２３］
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣ［配列番号２４］
ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＣ［配列番号２５］
ＣＸＣＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸ［配列番号２６］
ＸＸＸＸＸＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸＸＸＸ［配列番号１５５］
ＸＸＸＸＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸＸＸ［配列番号１５６］
ＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷ［配列番号４２３］
ＸＸＸＸＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＸＸＸ［配列番号４２４］
ＸＸＸＸＸＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＸＸＸＸ［配列番号４２５］
ＸＸＥＭＣＹＦＰＧＩＣＷＭＸＸ［配列番号４２６］
ＸＸＤＬＣＬＲＤＷＧＣＬＷＸＸ［配列番号４２７］
よりなる群から選択される直鎖状または環状のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項５】
前記ＳＡＢＭが、配列番号７〜２０、２７〜１５４および１５７〜４２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項６】
前記ＳＡＢＭが、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８，１９および２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項７】
前記ＳＡＢＭが表１〜９に記載されたペプチド配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項８】
前記ＳＡＢＭが、約１００μＭ以下であるＫｄでもって血清アルブミンに結合する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項９】
前記ＴＡが抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１０】
前記抗体がＦａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖまたはダイアボディーである、請求項９に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１１】
前記ＴＡが、癌において上昇する細胞表面タンパク質に結合する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１２】
前記細胞表面タンパク質がＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＰＣＭＡ、ＫＤＲおよびＦｌｔ−１である、請求項１１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１３】
前記細胞表面タンパク質がＢ細胞表面マーカーである、請求項１１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞表面マーカーである細胞表面タンパク質が、ＣＤ２０またはＢＲ３である、請求項１１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１５】
前記ＴＡが抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１６】
前記ＴＡが、配列番号４２８のＶＬ配列および配列番号４２９のＶＨ配列を有する抗体である、請求項１５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１７】
前記ＴＡが、配列番号４２８および配列番号４２９を含む抗ＨＥＲ２抗体の改変体配列を含む、請求項１５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１８】
前記細胞傷害性因子がモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）である、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項１９】
前記ＳＡＢＭと標的化因子または細胞傷害性因子との間に位置するリンカー部分がＧＧＧＳである、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項２０】
前記ＳＡＢＭがヒトアルブミンに結合する、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項２１】
治療用の薬学的キャリアと混合された請求項１に記載のコンジュゲート分子を含む、組成物。
【請求項２２】
治療剤にコンジュゲートした血清アルブミン結合部分（ＳＡＢＭ）を含む治療剤を生産する工程を包含する、治療剤の毒性を低下させるための方法。
【請求項２３】
治療上有効量の請求項１に記載のコンジュゲート分子を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における治療剤の毒性を低下させるための方法。
【請求項２４】
さらに、インビボにおいて治療剤：ＳＡＢＭコンジュゲートの毒性を測定する工程をさらに包含する、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療上有効量の請求項１記載のコンジュゲート分子によって、癌を有する哺乳動物を処置する工程を包含する、哺乳動物において癌を処置する方法。
【請求項２６】
治療上有効量の、自己免疫障害に寄与するかまたはそれを引き起こすＢ細胞に結合する請求項１記載のコンジュゲート分子によって、自己免疫障害を有する哺乳動物を処置する工程を含む、哺乳動物において自己免疫障害を処置する方法。
【請求項２７】
容器、請求項１記載のコンジュゲート分子を含む該容器内の組成物、治療上有効な用量を投与するための指示を含むパッケージ添付文書を備える、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許施行規則１．５３（ｂ）（１）の下で出願され、米国特許法１１９（ｅ）の下で仮出願第６０／６４１，５３４号（２００５年１月５日出願）および仮出願第６０／６１６，５０７号（２００４年１０月５日）に対する優先権を主張する、通常出願である。仮出願第６０／６４１，５３４号および仮出願第６０／６１６，５０７号の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、インビボでの毒性の低下した新規な治療剤、それを含む組成物、インビボにおいて治療剤の毒性を低下させる方法、および該新規な治療剤を投与することを含む患者を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を用いて、細胞傷害性または静細胞剤、すなわち、癌の処置において腫瘍細胞を殺しまたは阻害する薬物を局所的に送達する試みがなされてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；特許文献１）。理論的には、薬物部位は腫瘍に対して標的化され、内部化され、ここで、これらの未コンジュゲート化薬物剤の全身投与は、正常な細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらしかねない（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は共に、ＡＤＣを作成するのに用いられてきた（非特許文献６）。これらの方法で用いられる薬物は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンデジンを含む（非特許文献６）。抗体−トキシンコンジュゲーとで用いられるトキシンは、ジフテリアトキシン、リシンのような植物トキシン、ゲルダナマイシンのような低分子トキシン（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９），メイタンシノイド（特許文献２：非特許文献１０）、およびカリケアミシン（非特許文献１１；非特許文献１２）を含む。より最近では、オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）およびドラスタチンの合成アナログ（特許文献３）は全長抗体にコンジュゲートされてきた（例えば、非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；特許文献４；特許文献５；非特許文献１４；非特許文献１５；特許文献６；非特許文献１４）。オーリスタチンＥの改変体もまた特許文献７；特許文献８に開示されている。
【０００５】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  Ｉｎｃ．）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対して向けられたネズミＩｇＧ１カッパーモノクローナル抗体、およびチオ尿素リンカー−キレーターによって結合された１１１Ｉｎたまは９０Ｙ放射性同位体から構成される抗体−放射性同位体コンジュゲートである（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）はＢ細胞の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対する活性を有するが、投与の結果、ほとんどの患者においてひどくかつ延長された血球減少症がもたらされる。ＭＹＬＯＴＡＲＧＴＭ（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）カリケアミシンに連結されたＣＤ３３抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートは、注射による急性骨髄性白血病の処置について２０００年に認可された（非特許文献２０；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２；特許文献１３；特許文献１４；特許文献１５；特許文献１６）。カンツズマブメルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、ジスルフィドリンカーＳＰＰを介して、メイタンシノイド薬物部位ＤＭ１に連結されたｈｕＣ２４２抗体から構成される抗体薬物コンジュゲート（非特許文献２１）は、結腸、膵臓、胃その他のような、ＣａｎＡｇを発現する癌の処置に関してＩＩ相試験に進みつつある。ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、メイタンシノイド薬物部位ＤＭ１に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成される抗体薬物コンジュゲートは、前立腺腫瘍の潜在的使用のために開発中である。
【０００６】
低分子または生物学的治療剤の半減期を改良するために、種々の方法が試みられている。例えば、グリコシル化部位が分子に導入されており（非特許文献２２）、分子はＰＥＧとコンジュゲートされて（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）、サイズを増大させ、排出半減期を増大させている。ある者は、ヒト血清アルブミンを用いて、薬物の治療用途を改良しようと試みてきた。例えば、アルブミンは低分子（非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）；ＣＤ４（非特許文献２９）；ＩｇＧのＦｃ部分（非特許文献３０）、ＩＬ−２（非特許文献３１）および抗ｇｐ７２抗体およびメトトレキセート分子の間のブリッジ（非特許文献３２）に結合されてきた。
【０００７】
また、アルブミン結合ポリペプチドの使用も調べられてきた。ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧからのアルブミン結合ドメインに融合されたヒト可溶性補体受容体１型（ｓＣＲ１）の延長されたインビボ半減期が報告されている（非特許文献３３）。プロテインＧの標識されたアルブミン結合ドメインが記載されている（特許文献１７）。いくつかのファージディスプレイ−由来アルブミン結合ペプチドが出願人によって記載されている（特許文献１８、特許文献１９、および非特許文献３４参照。理論においては、血清アルブミン結合ペプチドが、インビボにおいて血清アルブミンと非共有結合的に会合する。それ自体、血清アルブミン結合ペプチドは、必然的に、血清アルブミンそれ自体のインビボサイクリングメカニズムから段階的に除去される。
【特許文献１】米国特許第４９７５２７８号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第１３９１２１３号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／００１８１９４号明細書
【特許文献５】国際公開第０４／０３２８２８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３／０４３５８３号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５７６７２３７号明細書
【特許文献８】米国特許第６１２４４３１号明細書
【特許文献９】米国特許第４９７０１９８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５０７９２３３号明細書
【特許文献１１】米国特許第５５８５０８９号明細書
【特許文献１２】米国特許第５６０６０４０号明細書
【特許文献１３】米国特許第５６９３７６２号明細書
【特許文献１４】米国特許第５７３９１１６号明細書
【特許文献１５】米国特許第５７６７２８５号明細書
【特許文献１６】米国特許第５７７３００１号明細書
【特許文献１７】欧州特許出願公開第４８６５２５号明細書
【特許文献１８】国際公開第０１／４５７４６号パンフレット
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００４／０００１８２７号明細書
【非特許文献１】Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２
【非特許文献２】Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４
【非特許文献３】Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２
【非特許文献４】Ｂａｌｄｗｉｎら，（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５
【非特許文献５】Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら，（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６
【非特許文献６】Ｒｏｗｌａｎｄら，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７
【非特許文献７】Ｍａｎｄｏｅｒら，（２０００）Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１
【非特許文献８】Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８
【非特許文献９】Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１
【非特許文献１０】Ｌｉｕら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３
【非特許文献１１】Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８
【非特許文献１２】Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２
【非特許文献１１】Ｋｌｕｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３
【非特許文献１２】Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４
【非特許文献１３】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５
【非特許文献１４】Ｍａｏ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（３）：７８１−７８８
【非特許文献１５】Ｂｈａｓｋａｒら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６３８７−６３９４
【非特許文献１６】Ｗｉｓｅｍａｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７
【非特許文献１７】Ｗｉｓｅｍａｎら（２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２
【非特許文献１８】Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３
【非特許文献１９】Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９
【非特許文献２０】Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６
【非特許文献２１】Ｘｉｅら（２００４）Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０８（３）：１０７３−１０８２
【非特許文献２２】Ｋｅｙｔら，１９９４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：３６７０−７４
【非特許文献２３】Ｃｌａｒｋら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２１９６９−７７
【非特許文献２４】Ｌｅｅら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：９７３−９８１
【非特許文献２５】Ｔａｎａｋａら，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３７１０−１４
【非特許文献２６】Ｓｙｅｄら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−３２５２
【非特許文献２７】Ｂｕｒｇｅｒら，２００１Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：７１８−７２４
【非特許文献２８】Ｗｏｓｉｋｏｗｓｋｉ  Ｋ，ｅｒ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００３  Ｍａｙ  ９（５）：１９１７−２６
【非特許文献２９】Ｙｅｈら，１９９２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８９：１９０４−１９０８
【非特許文献３０】Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１９５−２００
【非特許文献３１】Ｙａｏ，Ｚら，（２００４  Ｍａｙ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３（５）：４０４−１０
【非特許文献３２】Ａｆｆｌｅｃｋ，Ｋら，（１９９２）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．６５（６）：８３８−４４
【非特許文献３３】Ｍａｋｒｉｄｅｓら１９９６  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｔｌ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３２−５４１
【非特許文献３４】Ｄｅｎｎｉｓ，ＭＳ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  ＪＢＣ  ２７７（３８）：３５０３５−４３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以下に記載する発明は、標的化因子／細胞傷害性因子とのコンジュゲートの関係で、アルブミン結合ペプチドの予期せぬことに有利な用途に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも１つの血清アルブミン−結合部位（ＳＡＢＭ）、標的化因子（ＴＡ）および細胞傷害性因子（ＣＡ）の共有結合組合せを含むコンジュゲート分子に関する。１つの実施形態によると、該コンジュゲート分子は２以上のＣＡを含む。実施形態によると、該コンジュゲート分子は２以上のＴＡを含む。
【００１０】
本発明の１つの実施形態によると、ＳＡＢＭはＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷの配列（配列番号８）に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列はＣｙｓ残基の間に５つのアミノ酸残基と共に２つのＣｙｓ残基を有する。１つの実施形態によると、該アミノ酸残基は少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９８％同一性および少なくとも９９％同一性からなる群から選択される配列番号８に対するパーセント同一性を有する。
【００１１】
もう１つの実施形態になると、該ＳＡＢＭはＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷのアミノ酸配列（配列番号８）の改変体を含み、そこでは、配列番号８の残基のうちの残基のいずれか１〜５残基が、Ｃｙｓ残基を除いて、異なるアミノ酸残基で置換されている。
【００１２】
もう１つの実施形態によると、該ＳＡＢＭは：
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ［配列番号１］
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ［配列番号２］
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ［配列番号３］
Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−［配列番号４］
Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｕｃ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ［配列番号５］
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ［配列番号６］
ＣＸＸＧＰＸＸＸＸＣ［配列番号２１］
ＸＸＸＸＣＸＸＧＰＸＸＸＸＣＸＸＸＸ［配列番号２２］
ＣＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣ［配列番号２３］
ＣＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸＣ［配列番号２４］
ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＣ［配列番号２５］
ＣＸＣＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＣＸＸＸＸＸＸ［配列番号２６］
ＸＸＸＸＸＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸＸＸＸ［配列番号１５５］
ＸＸＸＸＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷＸＸＸ［配列番号１５６］
ＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷ［配列番号４２３］
ＸＸＸＸＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＸＸＸ［配列番号４２４］
ＸＸＸＸＸＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＸＸＸＸ［配列番号４２５］
ＸＸＥＭＣＹＦＰＧＩＣＷＭＸＸ［配列番号４２６］
ＸＸＤＬＣＬＲＤＷＧＣＬＷＸＸ［配列番号４２７］
よりなる群から選択される直鎖状または環状アミノ酸配列を含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である。
【００１３】
１つの好ましい実施形態によると、前記した一般式のＳＡＢＭ配列、特に配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４は、Ｎ末端（Ｘａａ）ｘにおけるさらなるアミノ酸およびＣ末端（Ｘａａ）ｚにおけるさらなるアミノ酸を含み、ここで、Ｘａａはアミノ酸であって、ｘおよびｚは０（ゼロ）よりも大きい、またはそれに等しい、一般には１００未満、好ましくは１０未満、より好ましくは０、１、２、３、４または５、より好ましくは４または５の合計数であり、Ｘａａ１はＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＶａｌよりなる群から選択される。１つの実施形態において、本発明は、配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ［配列番号８］を含むアルブミン結合ペプチドの使用に関する。１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは配列番号７〜２０，２７〜１５４および１５７〜４２１よりなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを含む。１つの好ましい実施形態によると、ＳＡＢＭは配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
もう１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは以下のアミノ酸配列：Ｘａａｉ−Ｃｙｓ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋを含み、ここで、ｉ、ｊおよびｋの合計は約２５以下であって、Ｘａａは任意のアミノ酸残基である。１つの好ましい実施形態によると、ｉ、ｊおよびｋの合計は約１８残基以下である。もう１つの好ましい実施形態によると、ｉ、ｊおよびｋの合計は約１１残基以下である。
【００１５】
もう１つの実施形態によると、ＳＡＭＢは表１〜９に記載されたペプチド配列のいずれか１つを含む。
【００１６】
本発明の１つの実施形態によると、前記ＳＡＢＭ配列は、約１００μＭ以下であるＫｄでもって血清アルブミンに結合する。もう１つの実施形態によると、Ｋｄは約１０μＭ以下、約１μＭ以下、約５００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、および約１０ｎＭ以下よりなる群から選択される。
【００１７】
もう１つの実施形態によると、ＴＡは標的細胞表面タンパク質に結合することができるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ここで、ＴＡは細胞表面タンパク質、接着または抗体、または細胞表面タンパク質に結合することができる前記のいずれかの１つの断片に対するリガンドであるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態によると、標的とすべき細胞表面タンパク質はＢ細胞表面マーカーである。もう１つの実施形態によると、標的とすべき受容体はＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＢＲ３、Ｆｌｔ−１、ＫＤＲおよびＥｐｈＢ２よりなる群から選択される。もう１つの実施形態によると、ＴＡはそれらの受容体のいずれか１つに対して向けられる抗体である。好ましい実施形態によると、該抗体は以下の：Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖおよびダイアボディーのうちのいずれか１つの形態である。もう１つの実施形態によると、ＴＡは本明細書中に記載されたＶＨまたはＶＬ配列（例えば、配列番号４２８および４２９の抗原−結合部分を含む抗ＨＥＲ２抗体）を含む。
【００１８】
１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２８および４２９の可変領域を含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２８の軽鎖可変領域の改変体を含み、ここで、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けしたＱ２７（ＶＬ）；Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）およびＴ９４（ＶＬ）よりなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１以上はアラニン以外の任意のアミノ酸で置換されている。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２８の軽鎖可変領域の改変体を含み、ここで、Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ；Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ；Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ；Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ；Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ；Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ；Ｙ９２（ＶＬ）ＷおよびＴ９４（ＶＬ）Ｓよりなる群から選択される置換を有する。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２８の軽鎖可変領域の改変体を含み、ここで、該可変領域は少なくとも３つの置換Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ；Ｆ５３（ＶＬ）ＷおよびＹ５５（ＶＬ）Ｗを含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２８の軽鎖可変領域の改変体を含み、ここで、該可変領域は少なくとも３つの置換Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｈ９１（ＶＬ）ＦおよびＹ９２（ＶＬ）Ｗを含む。
【００１９】
１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２９の重鎖可変領域の改変体を含み、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って番号付けしたＷ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）Ｆ１００（ＶＨ）Ｙ１００ａ（ＶＨ）およびＹ１０２（ＶＨ）よりなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１以上は、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換されている。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２９の重鎖可変領域の改変体を含み、ここで、該可変領域はＷ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｗ、Ｙ１００（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌよりなる群から選択される少なくとも１以上の置換を含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２９の重鎖可変配列の改変体を含み、ここで、該可変領域は少なくとも置換Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は配列番号４２９の重鎖可変配列の改変体を含み、ここで、該可変領域は、少なくとも、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌの置換を含む。
【００２０】
１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は、軽鎖可変配列の配列番号４２８および重鎖可変配列の配列番号４２９の改変体を含み、ここで、Ｋａｄａｔナンバリングシステムに従って番号付けした、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｎ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）；Ａ３２（ＶＬ）；Ｙ４９（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｙ５５（ＶＬ）、Ｒ６６（ＶＬ）、Ｈ９１（ＶＬ）、Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、Ｗ９５（ＶＨ）、Ｄ９８（ＶＨ）、Ｆ１００（ＶＨ）；Ｙ１００ａ（ＶＨ）およびＹ１０２（ＶＨ）よりなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも１以上は、アラニン以外の任意のアミノ酸で置換されている。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は、軽鎖可変配列の配列番号４２８および重鎖可変配列の配列番号４２９の改変体を含み、それは、以下の置換Ｄ２８（ＶＬ）Ｑ；Ｄ２８（ＶＬ）Ｇ；Ｎ３０（ＶＬ）Ｓ；Ｔ３１（ＶＬ）Ｓ；Ａ３２（ＶＬ）Ｇ；Ｙ４９（ＶＬ）Ｗ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｙ４９（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｖ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｑ、Ｙ５５（ＶＨ）Ｗ、Ｒ６６（ＶＬ）Ｎ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｆ、Ｈ９１（ＶＬ）Ｙ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｗ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｓ、Ｗ９５（ＶＨ）Ｙ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｗ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｒ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｋ、Ｄ９８（ＶＨ）Ｈ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｐ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｌ、Ｆ１００（ＶＨ）Ｍ、Ｙ１００ａ（ＶＨ）Ｆ、Ｙ１０２（ＶＨ）Ｖ、Ｙ１０２（ＶＨ）ＫおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌの少なくとも１以上を含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は軽鎖可変配列の配列番号４２８および重鎖可変配列の配列番号４２９の改変体を含み、これは、以下の置換Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｋを少なくとも含む。１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は軽鎖可変配列の配列番号４２８および重鎖可変配列の配列番号４２９の改変体を含み、これは、少なくとも以下の置換Ｙ４９（ＶＬ）Ｄ、Ｆ５３（ＶＬ）Ｗ、Ｙ５５（ＶＬ）Ｗ、Ｆ１００（ＶＨ）ＰおよびＹ１０２（ＶＨ）Ｌを含む。もう１つの実施形態によると、該抗ＨＥＲ２抗体は２００３年４月９日に出願された米国特許公開番号第２００３／０２２８６６３  Ａ１；ＷＯ  ０３／０８７１３１；Ｃａｒｔｅｒら，（１９９２）ＰＮＡＳ８９：４２８５−４２８９に開示されたいずれかの抗ＨＥＲ２抗体であり、その刊行物をここに引用して明示的に援用する。
【００２１】
１つの実施形態によると、ＴＡは、細胞の外側表面のタンパク質に結合する能力以外のさらなる生物活性を有する。もう１つの実施形態によると、該他の生物活性は、該細胞を介するリガンド−媒介細胞シグナリングブロックする能力である。もう１つの実施形態によると、該他の生物活性は、標的化細胞のアポトーシスを誘導する能力である。もう１つの実施形態によるとＴＡは、１０ｕＭ以下、１ｕＭ以下、５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下および１０ｎｍ以下よりなる群から選択されるＫｄでもって、注目する細胞上のタンパク質に結合するポリペプチドである。
【００２２】
１つの実施形態において、ＴＡが結合する注目する細胞上のタンパク質は、通常の細胞と比較して癌細胞で過剰発現される。もう１つの実施形態によると、ＴＡによって標的化される細胞は腫瘍細胞のような病原性細胞である。
【００２３】
１つの好ましい実施形態によると、該細胞傷害性因子はモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）である。
【００２４】
もう１つの好ましい実施形態によると、該コンジュゲート分子は、該ＳＡＢＭおよび標的化因子または細胞傷害性因子の間に位置するリンカー部分を含む。１つの実施形態において、外リンカー部分はアミノ酸配列：ＧＧＧＳ（配列番号４２２）を含む。
【００２５】
もう１つの実施形態によると、該ＳＡＢＭはヒトアルブミンに結合する。もう１つの実施形態によると該ＳＡＢＭは、ＴＡの可変重鎖または可変軽鎖のＮ−またはＣ末端領域にコンジュゲートしている。
【００２６】
本発明は、薬学的キャリアに混合されたコンジュゲート分子を含む組成物を提供する。また、本発明は、医薬の製造における該コンジュゲート分子の使用も提供する。
【００２７】
また、本発明は、治療剤にコンジュゲートした血清アルブミン結合部分（ＳＡＢＭ）を持つ治療剤を生産する工程を含む治療剤の毒性を低下させる方法も提供する。該方法は、さらに、ＳＡＢＭを含まない治療剤と、ＳＡＢＭを有する治療剤の毒性を比較する工程を含むことができる。１つの実施形態によると該方法は、さらに、治療剤：ＳＡＢＭコンジュゲートの毒性を測定する工程を含む。
【００２８】
本発明は、治療上有効量の本発明によるコンジュゲート分子を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物において治療剤の毒性を低下させる方法を提供する。１つの実施形態によると、該方法は、さらに、治療剤：ＳＡＢＭコンジュゲートの毒性を測定する工程を含む。１つの好ましい実施形態によると、該哺乳動物は自己免疫疾患または癌に罹っている。
【００２９】
本発明は、腫瘍を有する哺乳動物を、腫瘍細胞または種陽の周囲の血管系に結合する本発明のコンジュゲート分子の治療上有効量で処置する工程を含む哺乳動物において腫瘍を処置する方法を提供する。また、本発明は、治療上有効量の本発明のコンジュゲート分子で、自己免疫疾患を有する哺乳動物を処置する工程を含む哺乳動物において自己免疫障害を処置する方法を提供する。１つの好ましい実施形態によると、該コンジュゲート分子は、自己免疫障害に寄与する、またはそれを引き起こすＢ細胞に結合する。また、本発明は、治療上有効量の本発明のコンジュゲート分子で、自己免疫障害を有する哺乳動物を処置する工程を含む、哺乳動物において細胞増殖性障害を処置する方法を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、治療上有効量の、Ｂ細胞に結合する本発明のコンジュゲート分子で哺乳動物を処置する工程を含む、哺乳動物においてＢ細胞を枯渇させる方法を提供する。
【００３０】
１つの実施形態によると、本発明の処置方法は、さらに、哺乳動物においてコンジュゲート分子の毒性を測定する工程を含む。
【００３１】
１つの実施形態によると、毒性は、体重喪失、造血系毒性、腎臓毒性、肝臓毒性、胃腸毒性、骨髄細胞から末梢血液への造血系先祖細胞の減少した動員、貧血、骨髄抑制、汎血球減少症、血小板減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、口内炎、脱毛症、頭痛、および筋肉痛よりなる群のいずれか１つとして発現される。
【００３２】
また、本発明は、容器、本発明のコンジュゲート分子を含む該容器内の組成物、治療上有効量を投与するための指示を含むパッケージ添付文書を備える製品も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「血清アルブミン結合ペプチド」または「血清アルブミン結合部分」（「ＳＡＢＭ」）とは、血清アルブミンに結合するアミノ酸配列を含む化合物またはポリペプチドをいう。１つの好ましい実施形態によると、ＳＡＢＭはヒト血清アルブミンに結合する。１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは、ウサギ、ラット、マウスまたはヒト血清アルブミンに結合する配列表に引用された配列のいずれか１つの少なくとも１つを含む。もう１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは、血清アルブミンの複数種に結合する配列表に引用された配列のいずれか１つの少なくとも１つを含む。１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは、ウサギ、ラット、マウスおよびヒト血清アルブミンのいずれか１つ、または組合せに結合する、表１〜９に引用された配列のいずれか１つの少なくとも１つを含む。もう１つの実施形態によると、ＳＡＢＭは、血清アルブミンの複数種に結合する、表１〜９に引用された配列のいずれか１つの少なくとも１つを含む。多種バインダーの例は、少なくともヒトおよびラット血清アルブミンに結合するＳＡＢＭ；少なくともヒト、ラットおよびウサギ血清アルブミンに結合するもの；少なくともヒトおよびウサギ血清アルブミンに結合するもの；および少なくともヒトおよびマウス血清アルブミンに結合するものを含む。
【００３４】
１つの好ましい実施形態によると、ＳＡＢＭペプチドは、アルブミンに結合することができる非天然アミノ酸配列である。本発明に関連するＳＡＢＭは、約５０未満のアミノ酸残基、好ましくは約４０未満のアミノ酸残基の拘束された（すなわち、例えば、ベータ−ターンまたはベータ−プリーツシートを開始するアミノ酸の存在としての構造のいくつかのエレメントを有する、あるいは例えば、ジスルフィド−結合Ｃｙｓ残基の存在によって環化された）、または拘束されていない（直鎖状）アミノ酸配列であり得る。約４０未満のアミノ酸残基のＳＡＢＭのうち、好ましいのは、約１０および約３０の間のアミノ酸残基のＳＡＢＭ、特に、約２０アミノ酸残基のＳＡＢＭである。しかしながら、本開示を読むに際して、当業者であれば、それは特定のＳＡＢＭの長さではなく、本発明のＳＡＢＭを区別するアルブミンに結合するその能力であることを認識するであろう。
【００３５】
本発明の「標的化因子」「ＴＡ」は、もしＴＡがインビトロおよび好ましくはインビボで標的分子を担う特異的細胞型のような標的分子に「進む」、「結合する」または「標的化する」のであれば、十分な親和性および特異性でもって、細胞の表面の標的分子に結合するであろう（例えば、ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍ  “ｈｏｍｅｓ  ｔｏ”，“ｈｏｍｅｉｎｇ”，ａｎｄ  “ｔａｒｇｅｔｓ”ｉｎ  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ，１９９６  Ｎａｔｕｒｅ，３８０：３６４−３６６およびＡｒａｐら，１９９８  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９：３７７−３８０参照）。一般に、ＴＡは、約１０マイクロＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満の解離定数Ｋｄによって特徴付けられる親和性でもって標的分子に結合するであろう。しかしながら、約１ｎＭ未満、好ましくは約１ｐＭおよび１ｎＭの間の標的分子に対する親和性を有するポリペプチドまたは低分子は、等しく、本発明の関係内のＴＡであるようである。好ましくは、ＴＡはポリペプチド（例えば、抗体）である。一般に、前記したように特定の標的分子に結合するＴＡは、当該分野で公知の多数の技術のいずれかによって単離し、同定することができる。
【００３６】
ＴＡは、ファージ−ディスプレイ由来抗体のような、天然に生じる、ならびに天然に生じないアミノ酸残基を含有し得る前記したアミノ酸配列である。特定のアミノ酸またはペプチドの構造を模倣する非アミノ酸化学構造を含むいわゆる「ペプチドミメティック」および「ペプチドアナログ」は、本発明の関係内のＴＡであり得る。そのようなミメティックまたはアナログは、一般には、それらのペプチドカウンターパートに見出される適切な空間的向きで存在する、サイズ、電荷または疎水性のような同様な物理的特徴を呈するものとして特徴付けられる。ペプチドミメティック化合物の具体的な例は、アミノ酸の１以上の間のアミド結合が、例えば、当外分野で良く知られたように炭素−炭素結合または他の結合によって置き換えられた化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ，１９９５、Ｉｎ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．３７８−４２２，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ参照）。
【００３７】
「Ｂ細胞表面マーカー」または「Ｂ細胞表面抗原」は、本明細書中においては、それに結合するアンタゴニストで標的化できるＢ細胞の表面で発現される抗原である。例示的なＢ細胞表面マーカーはＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５およびＣＤ８６白血球表面マーカーを含む（記載については、Ｔｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、第二版、１９９７年編、ＢａｒｃｌａｙらＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。他のＢ細胞表面マーカーは、ＲＰ１０５、ＦｃＲＨ２、ＣＤ７９Ａ、Ｃ７９Ｂ、ＣＲ２、ＣＣＲ６、ＣＤ７２、Ｐ２Ｘ５、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＣＸＣＲ５、ＦＣＥＲ２、ＢＲ３、ＢＴＬＡ、ＮＡＧ１４（ａｋａ  ＬＲＲＣ４）、ＳＬＧＣ１６２７０（ａｌａ  ＬＯＣ２８３６６３）、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＡＴＷＤ５７８（ａｋａ  ＭＧＣ１５６１９）、ＦｃＲＨ３、ＩＲＴＡ１、ＦｃＲＨ６（ａｋａ  ＬＯＣ３４３４１３）およびＢＣＭＡ（ａｋａ  ＴＮＦＲＳＦ１７）を含む。
【００３８】
特に注目するＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比較して、Ｂ細胞で優先的に発現され、前駆体Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞双方で発現され得る。好ましいＢ細胞表面マーカーは、本明細書中においては、ＣＤ２０およびＣＤ２２である。
【００３９】
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血液またはリンパ系器官からのＢ細胞の９０％を超えるものの表面に見出される非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、初期プレ−Ｂ細胞発生の間に発現され、原形質分化まで留まる。ＣＤ２０は正常なＢ細胞ならびに悪性Ｂ細胞双方上に存在する。文献中でのＣＤ２０に対する他の名称は「Ｂ−リンパ球−制限抗原」Ｂ１および「Ｂｐ３５」を含む。ＣＤ２０抗原は、例えば、ＣｌａｒｋらＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：１７６６（１９８５）に記載されている。ヒトＣＤ２０アミノ酸配列はＴｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ，Ｂａｒｃｌａｙらｓｕｐｒａ、１８２頁、およびＥＭＢＬ  Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号第Ｘ１２５３０およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔＰ１１８３６に示される。
【００４０】
ＢＬ−ＣＡＭ  Ｌｙｂ８としても知られた「ＣＤ２２」抗原は、約１３０（還元）〜１４０ｋＤ（非還元）の分子量を持つ１型の一体的膜糖タンパク質である。それはＢ−リンパ球の細胞質および細胞膜双方で発現される。ＣＤ２２抗原は、初期に、ＣＤ１９抗原とほぼ同一段階でＢ細胞リンパ球分化で出現する。他のＢ細胞マーカーとは異なり、ＣＤ２２膜発現は、成熟Ｂ細胞（ＣＤ２２＋）および原形質細胞（ＣＤ２２−）の間よりなる後期分化段階に制限される。ＣＤ２２抗原は、例えば、ＷｉｌｓｏｎらＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７（１９９１）およびＷｉｌｓｏｎらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５０１３（１９９３）に記載されている。
【００４１】
「ＣＤ１９」抗原とは、例えば、ＨＤ２３７−ＣＤ１９またはＢ４抗体によって同定される抗原をいう（ＫｉｅｓｅｌらＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＩ、１２：１１１９（１９８７））。ＣＤ１９は、原形質細胞への最終分化に丁度先立った時点まで、プロ−Ｂ、プレ−Ｂ、未成熟および成熟、活性化およびメモリーＢ細胞で見出される。ＣＤ１９またはＣＤ２０は造血幹細胞または原形質細胞で発現される。ＣＤ１９へのアンタゴニストの結合は、ＣＤ１９抗原の内部化を引き起こし得る。ヒトＣＤ１９アミノ酸配列はＴｈｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ，Ｂａｒｃｌａｙらｓｕｐｒａ、１８０頁、およびＥＭＢＬ  Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号第Ｍ２８１７０およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔＰ１１８３６に示される。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、「Ｂ細胞枯渇」とは、処理前のレベルと比較して、薬物または抗体処理後における動物またはヒトでのＢ細胞レベルの低下をいう。Ｂ細胞レベルは、完全な血液カウントを得ることによって、公知のＢ細胞マーカーについてのＦＡＣＳ分析染色によって、および実験実施例に記載されたような方法によって、よく知られたアッセイを用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は部分的または完全であり得る。１つの実施形態において、Ｂ細胞を発現するＣＤ２０の枯渇は少なくとも２５％である。薬物を枯渇させるＢ細胞を受ける患者において、薬物が患者の体の中を循環している時間の間、およびＢ細胞の回復の時間の間にはＢ細胞は一般に枯渇している。
【００４３】
従って、本発明の範囲内にある用語「アミノ酸」はその最も広い意味で用いられ、天然に生じるＬアルファ−アミノ酸もしくは残基を含むことを意味する。天然に生ずるアミノ酸についての通常に用いられる１文字３文字略語がここでは用いられる（Ｌｅｈｎｉｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２編、ｐｐ．７１−９２、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標準的な１文字暗号および標準的な３文字暗号の間の対応性は当業者によく知られており、ここに再度掲げる：Ａ＝Ａｌａ；Ｃ＝Ｃｙｓ；Ｄ＝Ａｓｐ；Ｅ＝Ｇｌｕ；Ｆ＝Ｐｈｅ；Ｇ＝Ｇｌｙ；Ｈ＝Ｈｉｓ；Ｉ＝Ｉｌｅ；Ｋ＝Ｌｙｓ；Ｌ＝Ｌｅｕ；Ｍ＝Ｍｅｔ；Ｎ＝Ａｓｎ；Ｐ＝Ｐｒｏ；Ｑ＝Ｇｌｎ；Ｒ＝Ａｒｇ；Ｓ＝Ｓｅｒ；Ｔ＝Ｔｈｒ；Ｖ＝Ｖａｌ；Ｗ＝Ｔｒｐ；Ｙ＝Ｔｙｒ。該用語は、アミノ酸アナログ、ノルロイシンのような通常はタンパク質に取り込まれない天然に生じるアミノ酸、およびアミノ酸に特徴的は当該分野で知られた特性を有する化学的に合成された化合物のような、Ｄ−アミノ酸ならびに化学的に修飾されたアミノ酸を含む。例えば、天然ＰｈｅまたはＰｒｏと、ペプチド化合物の同一立体配座制限を可能とするフェニルアラニンまたはプロリンのアナログまたはミメティックは、アミノ酸の定義内に含まれる。そのようなアナログおよびミメティックは、本明細書中においては、アミノ酸の「機能的同等体」をいう。アミノ酸の他の例は、ここに引用して援用する、Ｒｏｂｃｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，１９８３，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ、ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５ｐ．３４１、Ａｃａｄｅｍｉｃ−Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．によってリストされている。
【００４４】
例えば、標準的な固相合成技術によって合成されたＳＡＢＭおよびＴＡは、遺伝子によってコードされたアミノ酸に制限されない。遺伝暗号によってコードされない通常に遭遇するアミノ酸は、例えば、ＧｌｕおよびＡｓｐの代わりの２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；ＧｌｕおよびＡｓｐの代わりの２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、および他の脂肪族アミノ酸の代わりの２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸の代わりの２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙの代わりの２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、およびＬｅｕおよびＩｌｅの代わりのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ＡｒｇおよびＬｙｓの代わりのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの代わりの２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌｌａの代わりのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、ＰｒｏおよびＡｌａの代わりのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、およびＧｌｎの代わりのＮ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓの代わりのヒドロキシルリシン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓの代わりのアロヒドロキシルリシン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒの代わりの３−（および４）−ヒロドキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌの代わりのアローイソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａの代わりのｐ−アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌａの代わりのＮ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；Ｉｌｅの代わりのＮ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸の代わりのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸の代わりのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの代わりのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎの代わりのシトルリン（Ｃｉｔ）およびメチオニンスルフォキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅの代わりのＮ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニンのような国際公開番号ＷＯ  ９０／０１９４０に記載されたものを含む。
【００４５】
本発明の関係内にあるＳＡＢＭおよびＴＡは「作成する」ことができ、すなわち、非天然または天然に生じないＴＡであり得る。「非天然」または「天然に生じない」とは、特定のＳＡＢＭのアミノ酸配列が天然で見出されないことを意味する。すなわち、非天然または天然に生じないＴＡまたはＳＡＢＭのアミノ酸配列は、天然に生じるタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列に対応する必要はない。この変形のＴＡまたはＳＡＢＭは、当業者によく知られたものを含めた種々の技術を用いて製造し、または選択することができる。例えば、拘束された、または拘束されていないペプチドライブラリーは、例えば、当該分野で標準的な技術を利用してランダムに生じさせ、ディスプレイさせることができる。Ｌｏｗｍａｎら，１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８８７０−８８７８。
【００４６】
ＳＡＢＭおよびＴＡ、および細胞傷害性因子は、本発明の関係で用いる場合、相互に「コンジュゲート」することができる。用語「コンジュゲートされた」は、当該分野で知られた共有結合または付着または連結の全ての方法を含むようにその最も広い意味で用いられる。例えば、典型的な実施形態において、ＳＡＢＭはタンパク質であって、ＴＡはＳＡＢＭに対してＣ末端側またはＮ末端側のアミノ酸延長である。加えて、短いアミノ酸リンカー配列は、タンパク質治療剤およびＳＡＢＭの間に存在することができる。このシナリオにおいて、ＳＡＢＭ、任意のリンカーおよびＴＡは、後に記載する短いポリペプチドをコードする任意のリンカー配列に（ＤＮＡ配列が連続的であって、読枠内にある意味で）操作可能に連結されたＳＡＢＭをコードする配列、およびＴＡをコードする配列を含む核酸によってコードされるであろう。この典型的なシナリオにおいて、ＳＡＢＭは、所望により、リンカー配列を介して、ＴＡに「コンジュゲート」していると考えられる。関連する実施形態において、ＳＡＢＭアミノ酸配列はＴＡアミノ酸配列のセクションを中断し、または置き換えることができ、但し、もちろん、ＳＡＢＭアミノ酸配列の挿入はタンパク質治療剤の機能に干渉しないものとする。さらなる典型的な実施形態において、ＳＡＢＭは、化学的なコンジュゲーションによってＴＡに、または所望によりリンカー配列を介して他の治療剤に連結される。典型的には、本発明によると、ＳＡＢＭは、標的活性を認識するＴＡの能力に干渉しないＴＡの中央のどこかの箇所にあるアミノ酸の側鎖を介してＴＡに連結される。ここで、再度、ＳＡＢＭはＴＡに「コンジュゲート」していると考えられる。
【００４７】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、それらが所望の生物学的活性を呈する限りは、（全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、および抗体断片を具体的にはカバーする。
【００４８】
本発明の抗体の「機能的断片」は、一般には、無傷抗体の抗原結合もしくは可変領域、またはＦｃＲ結合能力を保有する抗体のＦｃ領域を含めた、無傷抗体の部分を含む。抗体断片の例は、直鎖状抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【００４９】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在できる可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、各々は、１または２の抗原性部位、典型的には１つの部位に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対していくつかの異なる抗体が向けられるように、抗原に対する動物に由来する慣用的な（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンによって汚染されないハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきできない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５  （１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成することができるか、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００５０】
モノクローナル抗体は、本明細書中においては、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一である、またはそれに対して相同であり、他方、鎖の残りはもう一つの種に由来する、またはもう１つの抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であり、またはそれに対して相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。キメラ抗体を作成する方法は当該分野で公知である。
【００５１】
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原−結合サブ配列のような）その断片である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の相補性−決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体において、または輸入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列いずれにおいても見出されない残基を含むことができる。これらの修飾を行って、さらに抗体の性能を磨き、最大化する。一般には、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改良する１以上のアミノ酸置換を含むことができる。少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、典型的には、Ｈ鎖においては６以下であり、Ｌ鎖のおいては３以下である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）参照。ヒト化抗体は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含み、そこでは、抗体の抗原−結合領域は、例えば、注目する抗原でマカック属サルを免疫化することによって生産される抗体に由来する。ヒト化抗体を作成する方法は当該分野で公知である。
【００５２】
ヒト抗体は、ファージ−ディスプレーライブラリーを含めた、当該分野で公知の種々の技術を用いて生産することもできる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用できる。Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、用語「イムノアドヘシン」は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子を示す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を持つアミノ酸配列、および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合を含む。免疫イムノアドヘシンのアドヘシン部分は、典型的には、受容体またはリガンドの少なくとも結合部位を含む連続アミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメインは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのようないずれかの免疫グロブリンから得ることができる。
【００５４】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」とは、一緒に共有結合した少なくとも２つの部分を有するポリペプチドをいい、ここで、該部分の各々は異なる特性を有するポリペプチドである。該特性はインビトロまたはインビボのような生物学的特性であり得る。該特性は標的分子への結合、反応の触媒などのような単純な化学的または物理的特性でもあり得る。該部分は、単一の結合したペプチドによって直接的に、または１以上のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介して連結することができる。一般には、該部分およびリンカーは相互に読枠内にあるであろう。
【００５５】
「単離された」ポリペプチドまたは抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収されたものである。その天然環境の汚染成分はポリペプチドまたは抗体についての診断または治療用途に干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む事ができる。好ましい実施形態において、抗体は（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって測定して、抗体の９５重量％よりも大、最も好ましくは、９９重量％よりも大まで、（２）スピンニングカップセケネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用い、還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質となるまで精製されるであろう。単離された抗体は、組換え細胞内にイン・サイチュで抗体を含む。というのは、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。
【００５６】
ヒト化抗ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）抗体は、引用してここに明示的に援用する米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ７）；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ  ９３／２１３１９）および同時係属出願第０９／８１１１１５号に記載されたヒト化２Ｃ４抗体、およびここに引用して援用するＷＯ  ０３／０８７１３１および米国特許公開番号２００３／０２２８６６３に開示された抗ＨＥＲ２改変体の可変領域を含む抗体を含む。開示を通じて、用語「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」および「ｈｕ４Ｄ５−８」は相互交換可能に用いられる。
【００５７】
用語「細胞傷害性因子」は、本明細書中で用いられる場合、細胞の機能を阻害し、妨げ、および／または細胞の破壊を引き起こす物質をいう。細胞傷害性因子は、細胞表面に必ずしも結合することなく、内部化でき、および／または細胞の外側から細胞増殖を阻害することができるべきである。１つの好ましい実施形態によると、該剤は小さな分子である。もう１つの実施形態によると、細胞傷害性因子の活性な部分は１１００ｋＤ以下である。該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｂｉ２１３、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレーティング剤、ヌクレオ溶解性酵素のような酵素およびその断片、抗体、および低分子トキシンまたは細菌、真菌、または植物または動物起源の酵素的に活性なトキシンのようなトキシン（その断片および／またはその改変体を含む（例えば、ＭＭＡＥ））、および後に開示する種々の抗腫瘍または抗癌剤または増殖阻害剤を含むことを意図する。他の細胞傷害性因子は後に記載する。一つの好ましい実施形態によると、細胞傷害性因子は放射性同位体ではない。
【００５８】
「化学療法剤」は、癌の処置で有用な化学化合物である。化学療法剤の例はチオテパＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパのようなアジリジン；代替物、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメルアミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；（合成アナログトポテカンを含めた）カンプトテシン；ブセリオスタチン；カリスタチン；（そのアドゼレシン、カルデレシンおよびビゼレシン合成アナログを含めた）ＣＣ−１０６５；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）ドラスタチン；（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含めた）ドゥオカルマイシン；エレウテロギン；パンクラチスタチン；サルコジックチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、シフオスファミド、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸オキサイド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドミムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ドムスチン、ニムスチン、およびラミムヌスチンのようなニトロ尿素；エネジーン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンガンマ１ＩおよびカリケアミシンオメガＩ１）（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４））のような抗生物質；ジネミシンＡを含めたジネミシン；クロドロネートのようなビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチンクロモフオーレおよび関連クロモタンパク質エネジーン抗生物質クロモフオーレ）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オオテラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＭＹＣＩＮ（登録商標）、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピウロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チュウバーシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸アナログ；フルダダビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなピリンアナログ；アンシタビン、���ザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルルビジン、クノシタビン、フロクオリジンのようなビリミジンアナログ；カルスペロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗アドレナール；フロリン酸のような葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；レフオファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニイルアセテート；アネポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンのようなメイテンシノイド；マイトグアゾン；マイトキサントロン；モピダンモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリム酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）、多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；マイトブロニトール；マイトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭクロモフオール−フリー、パクリタキセルのアルブミン−作成ナノ粒子処方（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフオスフアミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロンネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタピン；オキサリプラチン処理養生法を含めたオキサリプラチン（ＦＬＯＦＯＸ）；ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−ＲａｓおよびＥＧＦＲ（例えば、エルドチミブ（ＴａｒｃｅｖａＴＭ））の阻害剤、および前記のいずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体を含む。
【００５９】
「増殖阻害剤」は、本明細書中で用いる場合、インビトロおよび／またはインビボで細胞の増殖を阻害する化合物または組成物をいう。かくして、増殖阻害剤は、Ｓ相において細胞のパーセンテージを有意に低下させるものであり得る。増殖阻害剤の例は、ＧＩ阻止およびＭ−相阻止を誘導する剤のような、（Ｓ相以外の箇所で）細胞周期の進行をブロックする剤を含む。古典的なＭ−相ブロッカーはビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセルおよびドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンのようなトポＩＩ阻害剤を含む。ＧＩを阻止するそれらの剤はＳ−相阻止に溢れる。例えば、タノキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣのようなＤＮＡアルキル化剤。さらなる情報は、Ｍｕｒａｋａｉｎｉら（Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、特に１３ページによるＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ．ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ  “Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｅｉｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ”に見出すことができる。
【００６０】
「増殖阻害」剤の例は、上皮増殖因子阻害剤（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴａｒｃｃｖａＴＭ））、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、ＧｌｅｃｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシル）、および他の生物活性および有機化学剤などを含む。
【００６１】
用語「治療上有効量」とは、対象において病気または障害を「緩和」または「処置］するのに有効なコンジュゲート分子の量をいう。コンジュゲート分子が成長を妨げ、および／または存在する癌細胞を殺傷する程度に、それは静細胞的および／または細胞傷害性であり得る。
【００６２】
「処置」とは、病気または障害の軽減または緩和をいう。処置を必要とする者は、障害をすでに持つ者、ならびに障害を予防すべきものを含む。もし治療量の本発明の方法によるコンジュゲートを受けた後に、対象が特定の病気の１以上の症状および徴候の観察可能なおよび／または測定可能な低下または不存在を示すならば、対象は癌または自己免疫疾患について首尾よく「処置」されている。例えば、癌では、癌細胞の数の低下または癌細胞の不存在；腫瘍サイズの低下；腫瘍転移の阻害（すなわち、幾分示し、好ましくは停止させることを）；幾分の、腫瘍成長の阻害；特定の癌に関連する徴候の１以上の、幾分の、緩解の長さの増加、および／または救済の長さの増加；低下した罹患率および死亡率および生活論点の質の改善。病気の症状または徴候の低下もまた患者によって感じることができる。処置は、消失と定義される完全な応答、または部分的応答を達成することかでき、こに、腫瘍のサイズは、好ましくは５０％を超えて、より好ましくは７５％だけ減少する。もし患者が安定な病気を経験すれば、患者はやはり処置され例えば、考えられる。好ましい実施形態において、癌患者は１年後に、好ましくは１５ヶ月後に癌において依然として進行がない。病気における成功した処置および改善を評価するためのこれらのパラメータは、当該分野において適切な技量の医師が精通したルーチン的手法によって容易に測定できる。好ましい実施形態において、ＳＡＢＭを欠く同一コンジュゲート分子を受けて処置できる対象よりも小さな副作用を経験しつつ、対象は病気からの改善を示す。
【００６３】
用語「癌」および「癌性」とは、調節されていない細胞増殖によって典型的には特徴付けられる哺乳動物における生理学的疾患をいい、またはそれを記載する。癌の例は、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患を含む。そのような癌のより特別な例は扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）小細胞肺癌、非小細胞を含めた肺癌、肺の腺癌および肺の扁平細胞癌腫、腹膜の癌、肝臓細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、生殖系管の癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌種、肛門癌腫、陰茎癌、メラノーマ、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳、ならびに頭部および首癌、および関連する転移を含む。
【００６４】
用語「細胞増殖障害」および「増殖性障害」とは、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害をいう。一つの実施形態において、細胞増殖性障害は癌である。
【００６５】
「腫瘍」とは、本明細書中で用いられる場合、悪性または良性であるかを問わず、全ての新形成細胞成長および増殖、および全てのプレー癌性および癌性細胞および組織をいう。
【００６６】
Ｂ細胞調節自己免疫疾患は関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含めた皮膚炎；慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連する応答（クローン病、潰瘍性結腸炎）、呼吸逼迫症候群、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ブドウ膜炎、結腸炎、糸球体腎炎、アレルギー疾患、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答に関連する疾患、アテローム性動脈硬化症、自己免疫心筋炎、白血球接着不全、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、狼瘡（腎炎、非腎臓、ジスコイド、脱毛症を含む）、若年性開始糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性および遅延過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウエグナー肉芽腫症を含めた肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎（ＡＮＣＡを含む）、再生不良性貧血、クーム陽性貧血、ダイヤモンドブラックファン貧血、免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた免疫溶血性貧血、悪性貧血、純粋赤血球細胞形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子不全、ヘモフィリアＡ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出に関連する病気、ＣＮＳ炎症障害、多発性器官負傷症候群、重症筋無力症、抗原−抗体複合体媒介病、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスツール症候群、ランバート−イートン筋無力症症候群、レイノルド症候群、シェーングレン症候群、スティーブン−ジョンソン症候群、固体器官トランスプラント拒絶（高パネル反応性抗体力価、組織におけるＩｇＡ沈積に対する予備処理を含む）、移植片−対−宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡（全て尋常性、葉状を含む）、自己免疫多発性内分泌障害、ライター病、スティフマン症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎臓障害、ＩｇＭ多発性腎臓障害またはＩｇＭ媒介神経障害、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少症、自己免疫精巣炎および卵巣炎を含めた精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫甲状腺炎を含めた自己免疫内分泌病、慢性甲状腺炎（橋本甲状線炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グラーベ病、自己免疫多腺症候群（または多腺内分泌障害症候群）、インスリン−依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）ともいわれるＩ型糖尿病、およびシェーハン症候群；自己免疫肝炎、リンパ性間隙性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非トランスプラント）  ｖｓ  ＮＳＩＰ、ギアン−バレー症候群、大血管の脈管炎（リウマチ性多筋痛および巨細胞（高安）動脈炎）、中血管脈管炎（川崎病および結節性多動脈炎を含む）、強直性脊椎炎、ベルガー病（ＩｇＡ腎臓障害）、迅速進行糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、腹腔スプルー（グルテン腸障害）、クリオグロブリン血証、ＡＬＳ，冠動脈病を含む。
【００６７】
Ｂ細胞新生物はリンパ球支配ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含めたＣＤ２０−陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小胞中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫；急性リンパ球白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病を含む。該非ホジキンリンパ腫は低グレード／小胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中グレード／小胞ＮＨＬ、中グレード散漫ＮＨＬ、高グレード免疫芽球ＮＨＬ、高グレードリンパ芽球ＮＨＬ、高グレード小非切断細胞ＮＨＬ、バルキー病ＮＨＬ、形質細胞性リンパ球リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ−関連リンパ腫およびワルデンルトロムマクログロブリン血症を含む。これらの癌の再発の処置もまた考えられる。ＬＰＨＤは、放射線または化学療法治療にもかかわらず頻繁に再発する傾向があるホジキン病のタイプであり、ＣＤ２０−陽性悪性細胞によって特徴付けられる。ＣＬＬは４つの主なタイプの白血病の１つである。リンパ球と呼ばれる成熟Ｂ細胞の癌であるＣＬＬは、血液、骨髄およびリンパ組織中への細胞の進行性蓄積によって発現される。無痛リンパ腫はゆっくりと成長する治癒できない病気であり、ここで、平均的な患者は緩解および再発の多数時期の後６年および１０年の間生存する。
【００６８】
処置の目的では、「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような、家畜動物および農場動物、および動物園、スポーツまたはペット動物を含めた哺乳動物として分類されるいずれの動物もいう。好ましくは、該哺乳動物はヒトである。本発明に従って処置されるべき対象は哺乳動物である。
【００６９】
「障害」は、本発明のコンジュゲート分子を含む組成物での処置から利益を受けるいずれかの疾患である。これは、問題とする障害について哺乳動物で素因となる病理学的状態を含めた慢性および急性障害または病気を含む。
【００７０】
Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｐｐ．２１−２５  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｌｏｕｉｓ  Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ，ａｎｄ  Ａｌｆｒｅｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，６ｔｈ  ｅｄ．１９８０に記載されているように、「排泄半減期」をその通常の意味で用いる。簡単に述べると、該用語は、薬物排泄のタイムコースの定量的尺度を含むことを意味する。ほとんどの薬物の排泄は指数関数的である（すなわち、一次キネティックスに従う）。というのは、薬物の濃度は、通常、排泄プロセスの飽和に必要なものに近づかないからである。指数関数的プロセスの速度は、単位時間当たりの分率変化を表すその速度定数ｋによって、またはプロセスの５０％完了に必要な時間であるその半減期ｔ１／２によって表すことができる。これらの２つの定数の単位は、各々、時間−１および時間である。一次速度定数および反応の半減期は単純に関連し（ｋｘｔ  １／２＝０．６９３）、それに従って相互交換可能である。一次排泄キメティックスは、薬物の一定分率が単位時間当たりに失われるので、薬物濃度  ｖｓ  時間のｌｏｇのプロットは、全ての時点において、最初の分布相に続いて（すなわち、薬物の吸収および分布が完了した後）直鎖状である。薬物排泄のための半減期は、そのようなグラフから正確に決定することができる。本発明の１つの好ましい実施形態によると、本発明のコンジュゲート分子は、ＳＡＢＭを欠くコンジュゲート分子よりも長い半減期および低い毒性を有する。
【００７１】
「トランスフェクション」とは、いずれかのコーディング配列が事実発現されるか否かを問わず、宿主細胞による発現ベクターの摂取をいう。トランスフェクションの多数の方法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿およびエレクトロポレーションが当業者に知られている。成功したトランスフェクションは、このベクターの操作のいずれかの表示が宿主細胞内で起こる場合に一般的には認識される。
【００７２】
「形質転換」は、ＤＮＡが染色体外エレメントとして、または染色体インテグラントによってのいずれかの複製可能なように該ＤＮＡを生物に導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に対して適切な標準的技術を用いてなされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （第二編）、Ｃｏｌｏｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹのセクション１．８２に記載された、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理が、一般には、原核生物、または実質的細胞壁バリアーを含有する他の細胞で用いられる。Ｓｈａｗら，１９８３  Ｇｅｎｅ，２３：３１５および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ８９／０５８５９によって記載されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの感染がある種の植物細胞の形質転換で用いられる。そのような細胞壁なくしての哺乳動物細胞では、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｓｕｐｒａのセクション１６．３０〜１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈殿方法が好ましい。哺乳動物宿主細胞系形質転換の一般的態様は、１９８３年８月１６日に発酵された米国特許第４，３９９，２１６号においてＡｘｅｌによって記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６およびＨｓｉａｏら，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９の方法に従って行われる。しかしながら、核注入、エレクトロポレーションによる、またはプロトプラスト融合によるなどの、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法を用いることもできる。
【００７３】
本明細書中で用いられる場合、用語「肺投与」とは、吸入による肺を通じての本発明の処方の投与をいう。本明細書中で用いられる場合、用語「吸入」とは、空気の肺胞への摂取をいう。特別な例において、摂取は、吸入しつつ本発明の処方の自己−投与によって、または、例えば、レスピレーターを着用した患者へのレスピレーターを介しての投与によって行うことができる。本発明の処方に関連して用いられる用語「吸入」は、「肺投与」と同義である。
【００７４】
本明細書中で用いられる場合、用語「非経口」とは、腸以外による身体への本発明の化合物の導入、特に、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、心室内、および皮下（ｓ．ｃ．）経路をいう。
【００７５】
本明細書中で用いられる場合、用語「エアロゾル」とは、空気中の懸濁液をいう。特に、エアロゾルとは、本発明の処方の粒子化、および空気中へのその懸濁をいう。本発明によると、エアロゾル処方は、エアロゾル化、すなわち、吸入または肺投与のための空気中への粒子化および懸濁に適した本発明の化合物を含む処方である。
【００７６】
（ＩＩ．発明を実施するための態様）
（Ａ．ＳＡＢＭ）
本発明の関係内でのＳＡＢＭはアルブミンに結合する。血清アルブミンに結合する好ましいＳＡＢＭは直鎖状および環状ペプチド、好ましくは、以下の式を含む環状ペプチド化合物を含み、あるいは以下の式のペプチドと、特定の哺乳動物種の血清アルブミンを結合させるにつき競合するペプチドである：
Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ
Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ［配列番号１］
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ［配列番号２］
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｃｙｓ［配列番号３］
およびＡｓｐ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−［配列番号４］。
【００７７】
好ましいのは、Ｎ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｘａａ）ｘ、およびＣ末端におけるさらなるアミノ酸（Ｘａａ）ｚを含む前記一般式のペプチド化合物であり、ここで、Ｘａａはアミノ酸であってｘおよびｚは０（ゼロ）よりも大きな、またはそれに等しい、一般には１００未満の、好ましくは１０未満の全数、より好ましくは０、１、２、３、４または５、より好ましくは４または５であり、ここで、Ｘａａ１はＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＶａｌよりなる群から選択される。
【００７８】
血清アルブミンに結合するさらに好ましいＳＡＢＭは、以下の一般式の関係で本明細書中に記載されたように同定され：
Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｅｃ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ［配列番号５］およびＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ［配列番号６］
ここで、さらなるアミノ酸はＮ末端に存在でき（Ｘａａ）ｘ、さらなるアミノ酸はＣ末端に存在でき（Ｘａａ）ｚ、およびここで、Ｘａａはアミノ酸であって、ｘおよびｚはゼロよりも大きいかまたは等しい、一般には１００未満、好ましくは１０未満の全数、より好ましくは０、１、２、３、４または５、より好ましくは４または５である。
【００７９】
本発明のこの態様に従って、以下の実施例、特に、哺乳動物血清アルブミンに結合するペプチドリガンドを選択するための特別な例示的ペプチドおよび適したアミノ酸を示すそこに含まれる表を参照する。好ましい態様において、いくつかの種にわたる血清アルブミンに結合するＳＡＢＭを選択するための表７を参照する。
【００８０】
本発明のこの態様に従う好ましい化合物は：
ＤＬＣＬＲＤＷＧＣＬＷ［配列番号７］
ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ［配列番号８］
ＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＧＤ［配列番号９］
ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＥ［配列番号１０］
ＱＧＬＩＧＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＧＲＳＶ［配列番号１１］
ＱＧＬＩＧＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＧＲＳＶＫ［配列番号１２］
ＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ［配列番号１３］
ＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ［配列番号１４］
ＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ［配列番号１５］
ＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤ［配列番号１６］
ＲＬＭＥＤＩＣＬＡＲＷＧＣＬＷＥＤＤ［配列番号１７］
ＥＶＲＳＦＣＴＲＷＰＡＥＫＳＣＫＰＬＲＧ［配列番号１８］
ＲＡＰＥＳＦＶＣＹＷＥＴＩＣＦＥＲＳＥＱ［配列番号１９］
ＥＭＣＹＦＰＧＩＣＷＭ［配列番号２０］
を含む。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明のＳＡＢＭはヒト血清アルブミンに結合し、以下に示す一般式を有するＳＡＢＭとインビトロアッセイにおいてヒト血清アルブミンの結合につき競合するそれらの能力によって同定することができ、ここで、さらなるアミノ酸はＮ末端に（Ｘａａ）ｘおよびＣ末端に（Ｘａａ）ｚに存在でき：
ＤＸＣＬＰＸＷＧＣＬＷ［配列番号４］
ＦＣＸＤＷＰＸＸＸＳＣ［配列番号１］
ＶＣＹＸＸＸＩＣＦ［配列番号２］
ＣＹＸ１ＰＧＸＣＸ［配列番号３］
ここで、Ｘａａはアミノ酸であり、ｘおよびｚは好ましくは４または５であって、Ｘａａ１はＩｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＶａｌよりなる群から選択される。
【００８２】
特別な実施形態において、本発明のＳＡＢＭは前記にて本明細書中に記載された配列番号７〜２０に表されたＳＡＢＭのいずれかと競合し、好ましくは、ヒト血清アルブミンへの結合につき配列番号１０と競合するであろう。
【００８３】
前記から認識されるように、用語「競合する」および「競合する能力」は相対的用語である。かくして、該用語は、本発明のＳＡＢＭを記載するのに用いる場合、本明細書中に記載された標準的な競合アッセイにおいて、５０μＭで存在する場合、好ましくは１μＭ、より好ましくは１００ｎＭで存在する場合、好ましくは、１ｎＭ以下で存在する場合、配列酢番号：１０によって表されるペプチドの結合の５０％阻害を生じるＳＡＢＭをいう。しかしながら、約１ｎＭ未満の、好ましくは約１ｐＭおよび１ｎＭの間の血清アルブミンに対する親和性を有するＳＡＢＭは、同等に、本発明の関係内のＳＡＢＭであるようである。
【００８４】
ペプチドまたは他の化合物が本明細書中に記載されたように血清アルブミンへの結合につきＳＡＢＭと競合する「能力」を有するか否かを判断するためのインビトロアッセイ系では、当業者は、多数の標準的な競合アッセイのいずれかを使用することができる。競合結合アッセイは、限定された量のリガンドとの競合につきテスト試料分析物と競合する標識された標準の能力に依拠する。テスト試料中の分析物の量は、リガンドに結合するようになる標準の量に逆比例する。
【００８５】
かくして、当業者は、限定されるものではないが、少数の名称を挙げれば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、好ましくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合アッセイシステムを含む手法をしようして、アルブミンへの結合についてＳＡＢＭと競合する能力を有するか否かを決定することができる。
【００８６】
これらの目的では、選択されたＳＡＢＭを検出可能な部位で標識し（検出可能に標識されたＳＡＢＭを以後「トレーサー」と呼ぶ）、アルブミンへの結合についての候補化合物との競合アッセイで用いる。多数の検出可能な標識が入手可能であり、これは好ましくは以下のカテゴリーに分類することができる：
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉのような放射性同位体。ＳＡＢＭは、例えば、Ｃｏｌｉｇｅｎら，１９９１，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を用いて放射性同位体で標識することができる。放射能はシンチレーションカウンティングを用いて測定することができる。
【００８７】
（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リスサミン、フィコエリスリン、およびテキサスレッドのような蛍光標識が入手可能である。蛍光標識は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａに開示された技術を用いてペプチド化合物にコンジュゲートすることができる。蛍光はフルオリメーターを用いて定量することができる。
【００８８】
（ｃ）種々の酵素−基質標識が入手可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号はこれらのいくつかのレビューを提供する。該酵素は好ましくは、種々の技術を用いて測定することができる発色性基質の化学的変化を触媒する。例えば、該酵素は、分光学的に測定できる基質における色の変化を触媒することができる。別法として、該酵素は基質の蛍光またはケミルミネセンスを変化させることができる。蛍光の変化を定量する技術は先に記載した。ケミルミネセント基質は化学反応によって電子的に励起されたようになり、次いで、光を発することができ、これは（例えば、ケミルミノメーターを用いて）測定することができ、あるいはエネルギーを蛍光アクセプターに与える。酵素標識の例はルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチウム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのような）複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。
【００８９】
酵素−基質組合せの例は、例えば：
（ｉ）基質としての水素ペルオキシダーゼとホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ここで、該水素ペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、ＡＢＴＳ、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）発色性基質としてのリン酸パラ−ニトロフェニルとアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）；および
（ｉｉｉ）発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または発蛍光性基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼとβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）。
【００９０】
特別なアッセイによると、種々の濃度の未標識候補化合物の存在下で、トレーサーを固定化標的と共にインキュベートする。増大する濃度の成功した候補化合物は、トレーサーの固定化標への結合と効果的に競合する。最大−結合とトレーサーの５０％が置き換わる未標識候補化合物の濃度を「ＩＣ５０」といい、候補化合物のＩｇＧ結合親和性を反映する。従って、１ｍＭのＩＣ５０を持つ候補化合物は、１μＭのＩＣ５０を持つ候補化合物よりも標的に対する実質的に弱い相互作用を呈する。
【００９１】
いくつかのファージディスプレイＥＬＩＳＡアッセイにおいて、突然変異した（「ｍｕｔ」）配列の結合親和性を、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：２５０８に記載された方法を用いて対照（「ｃｏｎ」）ペプチドと直接的に比較し、パラメータＥＣ５０によって特徴付けられる。アッセイは、ＥＣ５０（ｃｏｎ）／ＥＣ５０（ｍｕｔ）がＫｄ（ｃｏｎ）／Ｋｄ（ｍｕｔ）に近似する条件下で行った。
【００９２】
従って、本発明は、記載されたインビトロアッセイにおけるヒト血清アルブミン結合のようなアルブミンにつき「競合する能力を有する」化合物を提供する。好ましくは、該化合物は１μＭ未満のヒト血清アルブミンのような標的につきＩＣ５０を有する。これらの化合物の中で好ましいのは、約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する化合物である。本発明のこの態様によるより好ましい実施形態において、化合物は、約１００ｐＭ未満、より好ましくは約１０ｐＭ未満のヒト血清アルブミンのような標的分子についてのＩＣ５０を呈する。
【００９３】
本明細書中に記載したＳＡＢＭと競合する候補化合物の能力の測定のための好ましいインビトロアッセイは以下の通りであり、実施例により十分に記載する。好ましい実施形態において、候補化合物はペプチドである。ヒト血清アルブミンへの結合につき標識されたＳＡＢＭトレーサーと競合する候補化合物の能力は、ＥＬＩＳＡを用いてモニターする。緩衝液中の候補化合物の希釈物を、トレーサーと共に（実施例セクションに記載した）ヒト血清アルブミンを被覆したマイクロタイタプレートに１時間で加える。マイクロタイタプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ヒト血清アルブミンに結合したトレーサーの量を測地する。
【００９４】
（Ｂ．ＳＡＢＭ：ＴＡ：細胞傷害性因子の組合せ）
ＳＡＢＭをＴＡ：細胞傷害性因子に連結させて、各成分（すなわち、少なくとも３つの異なる成分）の少なくとも１つを含むコンジュゲート分子を形成する。各成分を、所望により、フレキシブルなリンカードメインを介して相互に連結することができる。
【００９５】
結合のタイプおよびその製造方法に依存して、ＳＡＢＭドメインはそのＮ−またはＣ末端を介してＴＡのＮ−またはＣ末端に連結することができる。例えば、組換え技術を介して本発明のコンジュゲート分子を調製する場合、ＳＡＢＭをコードする核酸を、所望により、リンカードメインを介して、ＴＡ配列をコードする核酸に操作可能に連結する。典型的には、構築物は、ＳＡＢＭのＣ末端をＴＡのＮ末端に連結した融合タンパク質をコードする。しかしながら、特に、合成技術を使用する場合、例えば、ＳＡＢＭのＮ末端をＴＡのＮ−またはＣ末端に連結する融合も可能である。
【００９６】
いくつかの場合、ＳＡＢＭドメインは、そのＮ−またはＣ末端においてＴＡに連結されるよりはむしろＴＡ分子内に挿入しても良い。この立体配置を用いて、ＳＡＢＭドメインおよびＴＡの機能が維持される限りは、本発明を実施することができる。例えば、その標的に結合する免疫グロブリンの能力に干渉することなく、ＳＡＢＭを免疫グロブリンの非結合軽鎖ＣＤＲに挿入することができる。ＳＡＢＭドメイン挿入を収容することができるＴＡ分子の領域は、経験的に（すなわち、ランダムに挿入部位を選択し、ＴＡの機能につき得られたコンジュゲートをアッセイすることによって）、あるいは（例えば、タンパク質であるＴＡにつき）関連ＴＡ分子のファミリー内の配列比較によって同定して、低配列相同性の領域を突き止めることができる。低配列相同性領域は、よく保存された領域よりもＳＡＢＭドメインの挿入をより許容するようである。その三次元構造が（例えば、Ｘ−線結晶学またはＮＭＲ実験から）知られたＴＡでは、三次元構造は、ＳＡＢＭ挿入部位に関するガイドラインを提供することができる。例えば、高移動性（すなわち、高温または「Ｂ」因子）を持つループまたは領域は、構造の高度に秩序だった領域、またはリガンド結合または触媒に関与する領域よりもＳＡＢＭドメイン挿入を収容するようである。
【００９７】
（Ｃ．リンカードメイン）
ＳＡＢＭドメインは、所望により、リンカーを介してＴＡに連結される。本発明のコンジュゲート分子のリンカー成分は必ずしも参画しないが、コンジュゲート分子の機能に寄与することができる。従って、リンカードメインは、ＴＡおよびＳＡＢＭドメインの間の空間的ブリッジを供する分子のいずれかの群と定義される。
【００９８】
リンカードメインは可変長さおよび造りのものとすることができるが、空間ブリッジを作り出すのに重要なのはリンカードメインの長さであって、その構造ではない。リンカードメインは、好ましくは、コンジュゲート分子のＳＡＢＭを、立体および／または立体配座制限が実質的になくして、標的分子に結合させる。従って、リンカードメインの長さは、コンジュゲート分子の２つの「機能的」ドメイン、すなわち、ＳＡＢＭおよびＴＡの特徴に依存する。
【００９９】
当業者であれば、原子の種々の組合せが、種々の結合の間の既知の距離に基づいて可変長の分子を供することは認識するであろう。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，１９９７，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ａｌｌｙｎ  ａｎｄ  Ｂａｃｏｎ，Ｉｎｅ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ参照。リンカードメインは、可変長のペプチドであって良い。ペプチドのアミノ酸組成は、リンカーの特徴および長さを決定する。好ましい実施形態において、リンカー分子はフレキシブルな親水性ポリペプチド鎖を含む。例示的なリンカードメインは、後の実施例セクションに記載されたもののような１以上のＧｌｙおよび／またはＳｅｒ残基を含む。
【０１００】
（Ｄ．組換え合成）
本発明は、ＳＡＢＭ、あるいはＳＡＢＭおよび本明細書中に記載したポリペプチドＴＡを含むコンジュゲート分子をコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む組成物を含む。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、当該分野で公知の種々の方法によって調製することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミド、およびＨ・ホスホネート化学合成方法のような、（その全開示をここに引用して援用する）Ｅｎｇｅｌｓら１９８９，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２８：７１６−７３４に記載された方法のいずれかによる化学合成を含む。１つの実施形態において、発現宿主細胞により好まれるコドンを、コーディングＤＮＡの設計で用いる。別法として、該ペプチドをコードするＤＮＡは、部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０４：１２５−１３９；Ｃａｒｔｅｒら１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒら１９８２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら１９８５，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５）、制限選択突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ，１９９１，Ｉｎ：Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）等のような、組換えＤＮＡ技術を用いることによって１以上の改変体をコードするように改変することができる。
【０１０１】
前記した好ましい態様によると、核酸は、標的分子に結合できるＳＡＢＭをコードする。標的分子は、例えば、限定されるものではないが、血清アルブミン、免疫グロブリン、アトリポタンパク質またはトランスフェリンのような血漿タンパク質または赤血球またはリンパ球の表面に見出されるタンパク質を含めた、種々の血清因子のような細胞外分子を含み、但し、勿論、細胞表面タンパク質へのＳＡＢＭの結合は、細胞の正常な機能に実質的に干渉しないものとする。本発明で用いるのに好ましいものは、所望の親和性でもって、例えば、高親和性でもって、またはＳＡＢＭに融合した生物活性分子の有用な組織摂取および核酸を容易とする親和性でもって、血清アルブミンに結合するＳＡＢＭである。
【０１０２】
本発明のもう１つの好ましい態様によると、核酸は、ＳＡＢＭ配列およびＴＡを含むコンジュゲート分子をコードする。本発明のこの態様において、ＴＡは、処置または診断剤として有用ないずれかのポリペプチド化合物、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、または抗体断片を含むことができる。本発明のこの態様に従う核酸分子はコンジュゲート分子をコードし、ＳＡＢＭ配列をコードする核酸分子は、生物学的に活性な剤をコードする核酸に（ＤＮＡ配列が連続的であって、読枠内にある意味で）操作可能に連結している。所望により、これらのＤＮＡ配列は、リンカードメインアミノ酸配列をコードする核酸配列を介して連結することができる。
【０１０３】
この態様によると、本発明は、さらに、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子に操作可能に連結した発現制御配列、ＤＮＡ分子を含むプラスミドのような発現ベクターを含み、ここで、該制御配列は、該ベクターで形質転換された宿主細胞、および該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞に適合する腫に由来する複製および制御配列を含有する。該ベクターは、通常、複製部位、並びに形質転換された細胞において表現型選択を供することができるタンパク質をコードする配列を担う。
【０１０４】
原核生物宿主での発現のためには、適切なベクターはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ番号３７，０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ番号４０，０１１）、ｐＢＯ４７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０もしくはｐＲＩＴ３０シリーズにおけるいずれかのベクター（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  １９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：１４４−１６１）、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０、およびｐＰＬ−ラムダを含む。本発明の発現ベクターを含有する原核生物宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇら１９８１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３０９）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ株 １７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃ６００、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ−、プロトトロフィー、ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ  ＥＩ５、（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第５，２８８，９３１号、ＡＴＣＣ番号５５，２４４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種を含む。
【０１０５】
原核生物に加えて、酵母のような真核生物、または多細胞生物に由来する細胞を宿主細胞として用いることができる。通常のベーカーズ酵母またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母宿主細胞での発現では、適切なベクターは２−ミクロンプラスミドに基づくエピソームにより複製するベクター、組込みベクター、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを含む。Ｓｆ９細胞のような昆虫宿主細胞における発現では、適切なベクターはバキュロウイルスベクターを含む。植物宿主細胞、特にタバコのような双子葉植物宿主での発現では、適切な発現ベクターはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するベクターを含む。
【０１０６】
有用な哺乳動物宿主細胞の例はＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト肺性腎臓系（２９３、または懸濁培養での増殖のためにサブクローンされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ  １９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）；マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ  １９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；サル乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら１９８２，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓腫細胞系（Ｈｅｐ  Ｇ２）を含む。哺乳動物宿主細胞の発現では、有用なベクターはＳＶ４０に由来するベクター、ｐＲＫ５およびｐＲＫ７（Ｓｕｖａら１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７：８９３−８９６；ＥＰ  ３０７，２４７（３／１５／８９）、ＥＰ  ２７８，７７６（８／１７／８８））を含めた、ｐＲＫベクターのようなサイトメガロウイルスに由来するベクター、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルスに由来するベクター、およびモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するベクターのようなレトロウイルスベクターを含む。
【０１０７】
所望により、注目するペプチドをコードするＤＮＡは、分泌リーダー配列に操作可能に連結され、宿主細胞による発現産物の培養基への分泌をもたらす。分泌リーダー配列の例はＳＴＩＩ、ｅｃｏｔｉｎ、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリ性ホスファターゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子を含む。また、本明細書中で用いるのに適したのは、プロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら１９８５，ＢＭＢＯ  Ｊ．４：３９０１）。
【０１０８】
宿主細胞は、本発明の前記した発現またはクローニングベクターでトランスフェクトし、好ましくは形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切には修飾された慣用的栄養培地中で培養する。
【０１０９】
本発明のペプチドを生産するのに用いられる原核生物宿主細胞は、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｓｕｐｒａに記載されているように培養することができる。
【０１１０】
本発明のペプチドを生産するのに用いる哺乳動物宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ハムのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇａｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコの修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、のような商業的に入手可能な培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、当該分野で記載された培地のいずれか（例えば、ここに引用して各々の開示を援用するＨａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ  １９８０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；または第４，５６０，６５５号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；米国再発行特許第３０，９８５号；または米国特許第５，１２２，４６９号）を、宿主細胞のための培養基として用いることができる。これらの培地のいずれも必要であれば、ホルモンおよび／または（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子のような）他の増殖因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートのような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝液、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオシド、（ゲンタマイシンＴＭ薬物のような）抗生物質、（マイクロモラー範囲の最終濃度で通常存在させる無機化合物として提示される）痕跡量元素、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を補足することができる。いずれの他の必要な補充物も、当業者に知られているであろう適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従前に用いられていたものであり、当業者に明らかであろう。
【０１１１】
本開示で言及される宿主細胞は、インビトロ培養、ならびに宿主動物内にある細胞を含む。
【０１１２】
（Ｅ．化学合成）
本発明のＳＡＢＭを生産するもう１つの方法は化学合成を含む。これは当該分野でよく知られた方法を用いることによって達成することができる（Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｌｅｒ，１９９０，Ｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ  １−１９；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍ．Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．参照；また、米国特許第４，１０５，６０３号；第３，９７２，８５９号；第３，８４２，０６７号；および第３，８６２，９２５号参照）。
【０１１３】
本発明のＳＡＢＭは、固相ペプチド合成を用いて便宜には調製することができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２。また、固相ペプチド合成を用いて、もしＴＡがポリペプチドであるか、またはそれを含むならば、本発明のコンジュゲート分子組成物を調製することができる。
【０１１４】
固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性な固体支持体にカップリングさせることによって、生成直後のペプチドのカルボキシ末端で起こる。不活性な固体支持体は、初期アミノ酸のＣ末端用のアンカーとして働くことができるいずれかのマクロ分子であり得る。典型的には、マクロ分子支持体は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，ｓｕｐｒａの第２ページおよび第４ページの図−１および１−２に示された架橋ポリマー樹脂（例えば、ポリアミドまたはポリスチレン樹脂）である。１つの実施形態において、Ｃ末端アミノ酸をポリスチレン樹脂にカップリングさせて、ベンジルエステルを形成する。マクロ分子支持体は、ペプチドアンカーリンクが、ペプチド合成においてブロックされたアミノ酸のアルファ−アミノ基を保護するのに用いる条件下で安定するように選択される。もし塩基−不安定アルファ−保護基を用いるならば、ペプチドおよび固体支持体の間で酸−不安定リンクを用いるのが望ましい。例えば、酸−不安定エーテル樹脂は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，ｓｕｐｒａの第１６ページに記載された塩基−不安定Ｆｍｏｃ−アミノ酸ペプチド合成で効果的である。別法として、酸分解に異なって不安定なペプチドアンカーリンクおよびα−保護基を用いることができる。例えば、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）樹脂のようなアミノメチル樹脂は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，ｓｕｐｒａの第１１〜１２ページに記載されたＢｏｃ−アミノ酸ペプチド合成と一緒になってよく働く。
【０１１５】
初期アミノ酸を不活性な固体支持体にカップリングさせた後、初期アミノ酸のアルファ−アミノ保護基を、例えば、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えば、トリエチルアミン（ＴＥＡ）中で中和する。初期アミノ酸のアルファ−アミノ基の脱保護に続いて、合成中の次のアルファ−アミノおよび側鎖保護基を加える。残りのアルファ−アミノ酸およびもし必要であれば、側鎖保護アミノ酸を、次いで、縮合によって所望の順序で順次カップリングさせて、固体支持体に連結された中間体化合物を得る。別法として、アミノ酸をもう１つのアミノ酸にカップリングさせて、所望のペプチドの断片を形成し、続いて、ペプチド断片を成長する固相ペプチド鎖に加えることができる。
【０１１６】
２つのアミノ酸、またはアミノ酸およびペプチド、またはペプチドおよびペプチドの間の縮合反応は、アキサイド（ａｘｉｄｅ）方法、混合酸無水物方法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）方法、活性エステル方法、ｐ−ニトロフェニルエステル方法、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス［ジメチルアミノ］ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）方法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル方法等、およびＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ方法のような通常の縮合方法に従って行うことができる。
【０１１７】
アミノ酸のいずれの反応性側鎖基も適切な保護基で保護するのはペプチドの化学合成において通常である。結局は、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が順次組み立てられた後に除去される。また、アミノ酸またはペプチド断片のＣ末端カルボキシ基が、成長する固相ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端アミノ基と反応する間は、アミノ酸またはポリペプチド断片上のアルファ−アミノ基の保護は通常であり、続いて、アルファ−アミノ基を選択的に除去して、次のアミノ酸またはペプチド断片を固相ポリペプチド鎖に加える。従って、ペプチド合成においては、ペプチド鎖中の所望の配列に位置するアミノ酸残基の各々を含有する中間体化合物が精製され、ここで、残りの残基は依然として側鎖保護基を運ぶのは通常である。これらの保護基は実質的に同時に除去して、固相からの除去に続いて所望のポリペプチド産物を生じさせることができる。
【０１１８】
アルファ−およびイプシロン−アミノ側鎖はベンジルオキシカルボニル（Ｚと省略される）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（２Ｃｌ）］、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、およびジメチルホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基等で保護することができる。
【０１１９】
カルボキシ官能基についての保護基は、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等によって例示される。しばしば、アミノおよびカルボキシル基以外の官能基を保有するアルギニン、システインおよびセリンのような特別なアミノ酸は適切な保護基によって保護される。例えば、アルギニンのグアニジノ基はニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護することができる。システインのチオール基はｐ−メトキシベンジル、トリチル等で保護することができる。
【０１２０】
前記したブロックされたアミノ酸の多くは、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｂａｃｈｅｍ  ＣＡ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）またはＰｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）のような商業的源から得ることができる。
【０１２１】
Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，ｓｕｐｒａは、ペプチドを調製するための手法に関する詳細な情報を提供する。アルファ−アミノ基の保護は第１４〜１８頁に記載されており、側鎖のブロックは第１８〜２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリル機能についての保護基の表は第１４９〜１５１頁に供される。
【０１２２】
所望のアミノ酸配列が完成された後、ペプチドを固体支持体から切断し、回収し、精製することができる。ペプチドは、ペプチド−固相連結を破壊することができる試薬によって支持体から除去し、所望により、ペプチド上のブロックされた側鎖官能基を脱保護する。１つの実施形態において、ペプチドは、いずれの残りの側鎖保護基も除去する液体フッ化水素酸（ＨＦ）での酸分解によって固相から切断される。好ましくは、ペプチドにおける残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システインおよびチロシン残基のアルキル化）を回避するために、酸分解反応混合物はチオ−ルレゾールおよびクレゾールスカベンジャーを含有する。ＨＦ切断に続き、樹脂をエーテルで洗浄し、遊離ペプチドを、酢酸溶液の順次の洗液で固相から抽出する。合わせた洗液を凍結乾燥し、ペプチドを精製する。
【０１２３】
（Ｆ．コンジュゲート分子の化学的コンジュゲーション）
ある実施形態において、コンジュゲート分子は、診断または治療的用途、あるいは別法として、単一核酸においてコードすることができない立体配置にて、ＳＡＢＭおよびポリペプチドＴＡの間の融合を有する有機化合物であるＴＡを含むことができる。後者の実施形態は、ＳＡＢＭのアミノ末端およびＴＡのアミノ末端の間の融合、またはＳＡＢＭのカルボキシ−末端およびＴＡのカルボキシ−末端の間の融合を含む。
【０１２４】
化学的コンジュゲーションを使用して、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣｌのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トルエン、２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いてコンジュゲート分子のこれらの実施形態を調製することができる。細胞傷害性因子を抗体のようなポリペプチドにコンジュゲートするのに有用な方法は知られている。
【０１２５】
（Ｇ．ジスルフィド連結ペプチド）
前記したように、本発明のいくつかの実施形態は環化ＳＡＢＭを含む。ＳＡＢＭは、システイン残基の間のジスルフィド結合の形成によって環化できる。そのようなペプチドは、前記した化学合成によって作成し、次いで、ジスルフィド結合の形成で用いるいずれかの便宜な方法によって環化することができる。例えば、ペプチドは、還元形態のスルフヒドリルでの固相合成から回収し、分子内システイン濃度が分子間システイン濃度を超えて、２５ｍＭ〜１ｕＭ、好ましくは５００ｕＭ〜１ｕＭ、より好ましくは２５ｕＭ〜１ｕＭのペプチド濃度のように、分子内ジスルフィド結合形成を最適化した希薄溶液に溶解させ、次いで、金属カチオン、フェリシアン化カリウム、ナトリウムテトラチオネート等のような触媒にて、またはそれなくして、分子内ジスルフィド結合を生じさせるのに十分な温和な酸化剤、例えば、分子状酸素に遊離スルフヒドリル基を暴露することによって酸化することができる。別法として、ペプチドは、Ｐｅｌｔｏｎら，１９８６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：２３７０−２３７５に記載されたように環化することができる。
【０１２６】
環化は、例えば、ジスルフィド結合を形成できる第一および第二の残基、例えば、Ｃｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、およびＭｐｐおよびその２−アミノ基−含有同等物の間のジスルフィド結合またはラクタム結合の形成によって達成することができる。ラクタムブリッジ形成できる残基は、例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、αβ−ジアミノ酪酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸、およびメルカプト安息香酸を含む。該化合物は、ここでは、例えば、非隣接残基の側鎖基を利用して、Ｃｙｓまたは他のアミノ酸のＮ末端アミノ基への共有結合を形成できるラクタム結合を介して環化することができる。代替ブリッジ構造を用いて、例えば、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、ラクタムエステルまたは他の結合を介して環化できるペプチドおよびペプチドミメティックスを含めた本発明の化合物を環化することもできる。
【０１２７】
（Ｈ．医薬組成物）
本発明のコンジュゲート分子を含む医薬組成物は、非経口、局所、経口または（エアロゾルまたは経皮のような）局所的、またはそのいずれかの組合せを含めた適切な方法で投与することができる。
【０１２８】
本発明の他の適切な組成物は、医薬上許容されるキャリアと共に前記したコンジュゲート分子のいずれかを含む。キャリアの性質は、投与の態様で異なる。例えば、経口投与では、固体キャリアが好ましく；静脈内投与では、液体塩溶液キャリアが一般には用いられる。
【０１２９】
本発明の組成物は、対象に適合する医薬上許容される成分、および本発明のタンパク質を含む。これらは、一般には、懸濁液、溶液、およびエリキシル、ならびに最も特別には、リン酸緩衝化生理食塩水、生理食塩水、ダルベッコの培地等のような生物学的緩衝液を含む。エアロゾル、あるいは澱粉、糖類、マイクロクリスタリンセルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、バインダー、崩壊剤（経口固体製剤の場合には、粉末、カプセルおよび錠剤）のようなキャリアを用いることもできる。
【０１３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「医薬上許容される」とは、一般には、連邦または州政府の取締当局によって認可された、または米国薬局方、もしくは動物、より特別にはヒトで用いるための他の一般的に認められた薬局方でリストされたことを意味する。
【０１３１】
選択した処方は、種々の前記した緩衝液、あるいは例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリンセルロース、炭酸マグネシウム等を含めた賦形剤でさえを用いて達成することができる。組成物の「ＰＥＧ化」は、当該分野で公知の技術を用いて達成することができる（例えば、国際特許公開番号ＷＯ  ９２／１６５５５、Ｅｎｚｏｎに対する米国特許第５，１２２，６１４号、および国際特許公開番号ＷＯ  ９２／００７４８参照）。
【０１３２】
本発明の好ましい投与の経路はエアロゾルまたは吸入形態である。分散剤または分散試薬と組み合わせた本発明の化合物は、乾燥粉末としてのエアロゾル処方にて、または希釈剤を含む溶液または懸濁液にて投与することができる。
【０１３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「分散剤」とは、化合物のエアロゾル化、または肺組織におけるタンパク質の吸収、または双方を助ける剤を言う。好ましくは、分散剤は医薬上許容される。適切な分散剤は当該分野でよく知られており、限定されるものではないが、界面活性剤等を含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液のアトマイゼーションによって引き起こされる、化合物、特にペプチド化合物の表面誘導凝集を低下させるのに当該分野で一般的に使用される界面活性剤を用いることができる。そのような界面活性剤の非限定的例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような界面活性剤である。用いる界面活性剤の量は変化し、一般には、処方の約０．００１重量％〜約４重量％の範囲内にある。特別な態様において、界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートまたはソルビタントリオレエートである。適切な界面活性剤は当該分野でよく知られており、特定の処方、化合物の濃度、（液体処方中の）希釈剤、または（乾燥粉末処方中の）粉末の形態等に応じて、所望の特性に基づいて選択することができる。
【０１３４】
さらに、コンジュゲート分子、所望の治療効果、肺組織（例えば、病気になったまたは健康な肺）の質、および多数の他の因子の選択に応じて、液体または乾燥処方は後にさらに議論するさらなる成分を含むことができる。
【０１３５】
液体エアロゾル処方は、一般には、生理学上許容される希釈剤中にコンジュゲート分子および分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル処方は、コンジュゲート分子の微粉砕固体形態、および分散剤よりなる。液体または乾燥粉末エアロゾル処方いずれかでは、該処方はエアロゾル化しなければならない。すなわち、それは液体または固体粒子に粉砕して、エアロゾル化された用量が現実に肺胞に到達するのを保証しなければならない。一般に、質量メジアン動的直径は、薬物粒子が肺胞に到達するのを保証するためには５μメートル以下であろう（Ｗｅａｒｌｅｙ，１９９１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ８：３３３）。用語「エアロゾル粒子」は、肺投与に適した、すなわち、肺胞に到達する液体または固体粒子を記載するのに用いる。送達デバイスの構成、処方中のさらなる成分、および粒子特徴のような他の考慮が重要である。薬物の肺投与のこれらの態様は当該分野でよく知られており、処方の走査、エアロゾル化手段または送達デバイスの構築は、せいぜい、当業者によるルーチン的実験を必要とする。
【０１３６】
送達デバイスの構成に関しては、限定されるものではないが、液体処方の噴霧化、アトマイゼーションまたはポンプエアロゾル化、および乾燥粉末処方のエアロゾル化を含めた当該分野で公知のエアロゾル化のいずれかの形態を本発明の実施で用いることができる。固体処方の投与のために広く設計される送達デバイスが考えられる。もちろん、液体または乾燥粉末処方のエアロゾル化はプロペラントを必要とするであろう。プロペラントは当該分野で一般に用いられるいずれのプロペラントであっても良い。そのような有用なプロペラントの特別な非限定的例はクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、あるいはトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含めた炭化水素、またはその組合せである。
【０１３７】
本発明の好ましい態様において、エアロゾル化のためのデバイスは計量用量吸入器である。計量用量吸入器は、投与に応じての可変用量よりはむしろ、投与する場合の特定の用量を提供する。そのような計量用量吸入器は、液体または乾燥粉末エアロゾル処方いずれかと共に用いることができる。計量用量吸入器は当該分野でよく知られている。
【０１３８】
一旦コンジュゲート分子が肺に到達すれば、多数の処方−依存性因子が薬物吸収に影響する。循環レベルの化合物を必要とする病気または障害の処置においては、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形状、注入の存在または不存在、肺病または塞栓のような因子が化合物の吸収に影響し得るのは認識されるであろう。本明細書中で記載された処方の各々については、ある種の滑沢剤、吸収促進剤、タンパク質安定化剤または懸濁化剤が適切であり得る。これらのさらなる剤の選択は目標に応じて変化するであろう。例えば、化合物の局所送達が望まれ、または求められる場合には、吸収促進剤のような変数はあまり重要ではないであろうと認識される。
【０１３９】
（Ｉ．液体エアロゾル処方）
本発明の液体エアロゾル処方は、典型的には、ネブライザーで用いることができる。該ネブライザーは圧縮空気駆動性または超音波性いずれかであり得る。限定されるものではないが：Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ，Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ｔｈｅ  Ａｃｏｒｎ  ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  ＣＯ）のような、当該分野で公知のいずれのネブライザーを本発明と共に用いることもできる。本発明と組み合わせて有用である他のネブライザーは１９８６年１１月２５日に発行された米国特許第４，６２４，２５１号；１９７２年１１月２１日に発行された第３，７０３，１７３号；１９７１年２月９日に発行された第３，５６１，４４４号、および１９７１年１月１３日に発行された第４，６３５，６２７号に記載されている。
【０１４０】
該処方物は、キャリアを含むことができる。該キャリアは、循環系に可溶性であって、生理学的に許容されるマクロ分子であり、ここで、生理学的許容性は、当業者が治療養生法の一部として患者への該キャリアの注入を許容することを意味する。該キャリアは、好ましくは、許容される排出半減期にて循環系で比較的安定である。そのようなマクロ分子は、限定されるものではないが、大豆レシチン、オレイン酸、ソルビタントリオリエートを含み、ソルビタントリオリエートが好ましい。
【０１４１】
本実施形態の処方物は、タンパク質安定化に、または浸透圧の調節で有用な他の薬剤を含むこともできる。薬該剤の例は、限定されるものではないが、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムのような塩、およびグルコース、ガラクトースまたはマンノース等のような炭水化物を含む。
【０１４２】
（Ｊ．エアロゾル乾燥粉末処方）
また、本医薬処方は、ＳＡＢＭおよび分散剤の微粉砕粉末形態を含む乾燥粉末吸入器処方として用いられるであろうことも考えられる。化合物の形態は一般には凍結乾燥粉末であろう。コンジュゲート分子の凍結乾燥形態は標準的な技術を通じて得ることができる。
【０１４３】
もう１つの実施形態において、乾燥粉末処方は、本発明の１以上の化合物、分散剤および増量剤を含む微粉砕粉末を含むであろう。本発明の処方と組み合わせて有用な増量剤は、デバイスからの粉末の分散を容易とする量の、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトールのような剤を含む。
【０１４４】
本明細書中で引用した（特許および特許出願を含めた）全ての刊行物は、ここに引用してその全体を援用する。
【０１４５】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」あるいは「含んでいる」のような変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味するが、他のいずれかの整数または整数の群を排除しないと理解されるであろう。
【０１４６】
以下の実施例は説明のために掲げるのであって、限定するものではない。明細書中における全ての引用の開示はここに明示的に引用して援用する。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１−材料）
これらの実験では、ｐ１８５ＨＥＲ２（ＨＥＲ２）の細胞外ドメインに結合するヒト化抗体のＦａｂを、アルブミン結合ペプチド（ＡＢ）を含むように組換えにより作成した。本実験で用いた抗体の可変領域の配列、ｈｕｒｎＡｂ４Ｄ５−８はＣａｒｔｅｒら，（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：４２８５−４２８９に見出すことができる。以前、ヒト化Ｆａｂはネズミモノクローナル抗体ｍｕＭＡｂ４Ｄ５（ここでは、４Ｄ５）から誘導されており、このモノクローナル抗体は、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶｉｒｇｉｎｉａのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたハイブリドーマによって生産され、ＡＴＣＣアクセション番号ＣＲＬ  １０４６３を有する。ヒト化抗Ｈｅｒ−２抗体を作成する方法、および例示的可変ドメイン配列の同一性は、例えば、米国特許第５，８２１，３３７号および第６，０５４，２９７号、およびＣａｒｔｅｒら，（１９９２）  ＰＮＡＳ  ８９：４２８５−４２８９に提供される。
【０１４８】
アルブミン結合ペプチド（「ＡＢ」）、ＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ（配列番号１）をコードするアミノ酸配列は、リンカー配列ＧＧＧＳ（配列番号４２２）をコードする核酸配列を介して、Ｆａｂをコードする核酸配列に連結された。リンカーをコードする核酸配列はＦａｂの重鎖Ｃ末端ＫＴＨＴ残基に連結された。対照として、その軽鎖を通じてＡＢに融合したＤ３Ｈ４４抗体の可変領域を含有する抗組織因子Ｆａｂは、組換えＤＮＡエンジニアリングによって構築した。Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：３７９−３８９  ｆｏｒ  Ｄ３Ｈ４４  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ参照。
【０１４９】
得られた構築物を発現させ、融合タンパク質（「ＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ」または「ｒｈｕＡＢＦａｂＡＴＦＬ」）としてＥ．Ｃｏｌｉから分泌させ、次いで、単離し、精製した。次に、融合タンパク質をモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートさせた。腫瘍効率実験では、融合タンパク質を、マレイミド部位およびパラ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）スペーサーを有するバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔまたはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬を介してＭＭＡＥに連結させた。ＭＭＡＥを抗体に結合させる方法の例については、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｋら，（２００４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：７６５：７７３参照。毒性実験では、融合タンパク質を、例えば、アセチルチオ酢酸スクシンイミジル（Ｓａｔａ）を用いてそれらのリジンを通じてマレイミドカプロイルの活性化された誘導体で修飾されたＭＭＡＥとのコンジュゲーションを介してＭＭＡＥに結合させて、遊離チオールを生じさせ、続いて、バリン−シトルリン−ＭＭＡＥ（「ｖｃ−ＭＭＡＥ」）にコンジュゲートさせた。得られたＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈに対するＭＭＡＥの比率は一般には４：１と高いおよび０．１と低い比率にてほぼ１：１の平均であり、従って、０〜４のＭＭＡＥ部位の間は露出したリジン上にランダムに分布しており、総じての平均はＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ当たり約１のＭＭＡＥである。
【０１５０】
（実施例２−ＭＭＡＥコンジュゲートでの効率実験）
ＡＢ．Ｆａｂ−４Ｄ５−Ｈ−ＭＭＡＥコンジュゲートは、確立されたＭＭＴＢ−ＨＥＲ２トランスジェニック乳房腫瘍（Ｆｏ５）に対してテストした。この腫瘍系はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）に対しては非応答性であるが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥコンジュゲートに対してはよく応答する。
【０１５１】
１６５０μｇのＭＭＡＥ／ｍ２  ｒｈｕＡＢ．Ｆａｂ−４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（すなわち、ＡＢを含む）、ｒｈｕＦａｂ４Ｄ５ｖｃＭＭＡＥ（すなわち、ＡＢを含まない）、またはｒｈｕＡＢＦａｂＡＴＦＬ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（陰性対照）の単一静脈内用量を、ｍＭＭＴＶ−ＨＥＲ２  Ｆｏ５腫瘍担持マウスに与えた。各処理マウスは１００および２００ｍｍ３の間の平均腫瘍容量を有した。ＭＭＡＥ−コンジュゲーテッド分子またはリン酸緩衝生理食塩水（「ビヒクル」）を実験の０日目に投与し、腫瘍測定を１週間に２回１７日間行った。公知の効果的なＭＭＡＥコンジュゲートであるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、１２４５μｇ／ｍ２のＭＭＡＥの用量において比較のために実行した。腫瘍倍化時間に基づく対数細胞殺傷分析を行った。該対数細胞殺傷分析は、腫瘍が、処理が対照と比較して開始される後にサイズが倍となるのに必要な時間に基づいて腫瘍成長遅延の数学的計算を用いる。数学的方程式は：
｛（腫瘍倍化時間）−（対照についての平均倍化時間）｝／｛３．３２×（対照についての平均倍化時間）｝
である。
【０１５２】
図１は、ｒｈｕＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ群の間で有意な差を示さず（ｐ＝０．０００１）、他方、陰性ＭＭＡＥ対照Ｆａｂ、ｒｈｕＡＢＦａｂＡＴＦＬ−ｖｃ−ＭＭＡＥはフィッシャーのＰＳＬＤによってビヒクル対照とは有意に異ならなかった（ｐ＝０．６）。
【０１５３】
（実施例３−ＩｇＧ−ＭＭＡＥ、Ｆ（ａｂ’）２−ＭＭＡＥコンジュゲートおよび遊離ＭＭＡＥの毒性）
７５〜８０グラムの間の体重のメスＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を以下の実験で用いて、遊離ＭＭＡＥ、Ｆａｂ−ＭＭＡＥおよびＦ（ａｂ’）２−ＭＭＡＥコンジュゲートの毒性を比較した。
【０１５４】
投与群：
【０１５５】
【表１Ａ】
2008515889.tif 000002
投与群：
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥでは、μｇ  ＭＭＡＥ／ｍ２はＭＭＡＥのＭＷとして７１８、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のＭＷとして１４５１６７を用いて計算した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ＡＢ’）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥでは、μｇ  ＭＭＡＥ／ｍ２はＭＭＡＥのＭＷとして７１８、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２のＭＷとして１０００００を用いて計算した。体表面積は以下のように計算した：［｛（グラムで表した体重に０．６６７を掛ける）×１１．８｝／１００００］。（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＣＤＥＲ），Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ），２００２年１２月）。
【０１５６】
該用量溶液は、（ＰＢＳ中に希釈した）１０ｍＬ／ｋｇの用量容量にて実験１日目に単一静脈内ボーラスを尾−静脈注射によって投与した。一般的な臨床的観察は毎日行った。罹患率および死亡率チェックは毎日２回行った（ＡＭおよびＰＭ）。動物の体重は実験１日目およびその後毎日投与前に測定した。全血は、血液学パラメータ（例えば、平均血清ＡＳＴレベル、ＡＬＴレベル、ＧＧＴレベルおよびビリルビンレベル）および異なる細胞カウント（例えば、平均白血球細胞カウントおよび血小板カウント）のために、ＥＤＴＡ含有チューブ中に集めた。全血は臨床的化学パラメータのために血清セパレータチューブに集めた。血液試料は、実験−４日目、実験３日目および検視において５日目に投与前に集めた。また、全血は検死においてリチウムヘパリン含有チューブに集め、血漿を後の分析のために−７０℃で凍結した。以下の組織を検死において集めた：肝臓、腎臓、心臓、胸腺、脾臓、脳、胸骨、および胃、大腸および小腸を含めたＧＩ管のセクション。検視において脾臓および胸腺のみを秤量した。全ての統計学的分析は、片側ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ検定（ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ２．０３  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて５日目の体重に対して行った。
【０１５７】
実験３日目に、投与群４および５（各々、２７．１４ｍｇ／ｋｇのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよび５１６ｕｇ／ｋｇ遊離ＭＭＡＥ）の動物は死にかけていた。全ての群４および５の動物はひどく昏睡しており、ほとんどは尿生殖器領域において黄色の排出物を有した。これらの投与群における動物を３日目に検死した。実験５日目に、投与群３（１０．８３ｍｇ／ｋｇ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）における動物もまた尿生殖器領域において黄色の排出物を有した。
【０１５８】
臨床化学および血液学データの完全な組（ベースライン、３日目および５日目）は群１〜３に対して利用できるに過ぎず；５日目のデータは群４および５については利用できない。というのは、これらの動物は、有意な罹患率または体重喪失のため３日目に検視したからである。また、これは、５日目に終えた動物で観察されたものと知見を比較する場合に、これらの動物の組織学変化の解釈で考慮されなければならない。
【０１５９】
３日目に、群４（高用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ）’２）および群５（遊離ＭＭＡＥ）の動物は、肝臓関連血清酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴおよびＧＧＴ）における最高の上昇、および最低の血小板および白血球細胞のカウントを示した。ＡＳＴおよびＡＬＴにおける上昇は２つの群において同様であったが、群４は、群５よりもＧＧＴおよび全ビリルビンにおいて有意に高い上昇を示した。ＧＧＴおよび全ビリルビンの上昇は、分泌肝臓機能または胆汁系に関する問題を示し得る。組織学的評価は、この観察に対する形態学的相関を示さず、遊離ＭＭＡＥ  ｖｓ  イムノコンジュゲートのＰＫ特徴の差がこの知見を説明できるか否かは明らかでない。低用量Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖｃ−ＭＭＡＥ群３は、３日目において肝臓機能テストの一過性上昇を示し、これは、５日目までにベースラインレベルに戻った。しかしながら、血小板および白血球細胞カウントは回復の徴候なくして５日目に減少したままであった。全長イムノコンジュゲートＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖｃ−ＭＭＡＥ（ＭＭＡＥの用量は群４および５に合致する）で処理した動物は、減少した肝臓機能テストおよび白血球減少症および血小板減少症の典型的な毒物学プロフィールを示した。ビリルビンを例外として、全てのパラメータは５日間の期間にわたって進行を示したが、３日目に変化は群４および５におけるよりも群２においてひどくはなかった。形態学的には群２〜５で観察された毒性のパターンは同一であって、以前の実験で見られたものに合致した。限定された数の器官のみを評価したが、臨床的病理学データは、他の部位における有意な器官−特異的損傷を示唆しない。形態学的変化は群３（低用量Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２）において最もひどくなく、群４および５（高用量Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２および遊離ＭＭＡＥ）において最もひどかった。該変化は骨髄低細胞性、顕著なアポトーシス活性を伴う胸腺萎縮、変化する程度の粘膜変性および萎縮を伴う腸粘膜での増大した数の有糸分裂およびアポトーシス細胞、および肝細胞および胆管上皮中の増大した数の有糸分裂およびアポトーシス細胞を含んだ。また、群２、４および５の動物は、肝臓細胞の脱落、および肝臓壊死の偶然の領域の証拠を示した。
【０１６０】
投与群４および５（各々２７．１４ｍｇ／ｋｇ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよび５１６ｕｇ／ｋｇ遊離ＭＭＡＥ）における動物は、各々、１日目の体重と比較して、３日目までに１４．５および１２グラムの体重を喪失した。匹敵する量のＭＭＡＥ（２１０５ｕｇ  ＭＭＡＥ／ｍ２）を投与した群２動物での体重の減少は、群４および５の動物程はひどくなかった。図２に示すように、遊離ＭＭＡＥの養生法の結果、（血清アルブミン結合タンパク質無しの）Ｆａ（ｂ’）２養生法と同様な体重喪失プロフィールをもたらした。体重の喪失は毒性のインジケータである。
【０１６１】
まとめると、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（リジン）は用量依存的に急性毒性を引き起こした。高用量Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥにおける動物は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥと同一の薬物の量を受けた動物と比較して有意に大きな体重喪失を示した。高用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆ（ａｂ’）２−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥと匹敵する用量（２１５０ｕｇ／ｍ２）で遊離ＭＭＡＥを投与した動物は、匹敵する体重喪失、および肝臓関連血清酵素レベルおよび白血球細胞および血小板カウントの変化を有した。該知見は、チューブリン形成を阻害する剤の投与と合致する（Ｗｏｏｄ  ＫＷ，Ｃｏｒｎｗｈｅｌｌ  ＷＤ，ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＪＲ．Ｐａｓｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｔａｒｇｅｔ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１：３７０−３７７，２００１）。
【０１６２】
（実施例４−ＭＭＡＥ−Ｆａｂコンジュゲートでの毒性実験）
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−モノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）イムノコンジュゲート、Ｆａｂ４Ｄ５−ＭＭＡＥおよびＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ＭＭＡＥイムノコンジュゲートの毒性を雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８０〜１００ｇ）において比較した。
【０１６３】
雌ラットに、（ＰＢＳ中に希釈した）１０ｍｇ／ｋｇの投与容量にて尾−静脈注射を介して同等の用量（２１０５ｕｇ  ＭＭＡＥ／ｍ２）を投与した。全ての投与溶液は単一ボーラス注射として投与した。
投与群：
１＝ＰＢＳ、６匹の雌
２＝２０．２ｍｇ／ｋｇのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、６匹の雌
３＝５．７ｍｇ／ｋｇのＦａｂ４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥ
４＝１４．２４ｍｇ／ｋｇのＦａｂ４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥ、６匹の雌
５＝７．８５ｍｇ／ｋｇのＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥ
６＝１９．６２ｍｇ／ｋｇのＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥ、６匹の雌
先の実験において、２１０５ｕｇ  ＭＭＡＥ／ｍ２用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥの結果、中程度にひどかった肝臓関連血清酵素レベルおよび血液学パラメータの変化がもたらされた。また、５．７ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよび７．８５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥの用量を本実験で投与してほぼ８４０ｕｇのＭＭＡＥ／ｍ２のＭＭＡＥ暴露を与えた。
【０１６４】
これらのアッセイにおいて、血液試料（ほぼ５００ｕｌ）は、一般には臨床化学および血液学のために研究−３日目（投与前）および３日目に、イソフルオラン麻酔下で眼窩後洞を介して集めた。また、ケタミン麻酔下で下大静脈を介して検死において５日目に血液を集めた。臨床的観察および体重の記録を毎日１回行い、ケージ側死亡率チェックは毎日２回行った（ａｍ−ｐｍ）。死にかけた動物を安楽死させた。
【０１６５】
実験５日目の検死の間に、ラットの血液を、臨床化学および血液学のために腹部大動脈を介して集めた。以下の組織を集めた：心臓、肺、気管、肝臓、腎臓、胸腺、脾臓、脳、腋窩リンパ節、全胃腸管、皮膚、泌尿器系膀胱、および骨髄。加えて、肝臓、胸腺、脾臓、および脳について器官重量を記録した。検死において、肝臓、脾臓および胸腺を秤量した。テストは、動物体重、白血球細胞カウント、血小板カウント、ＡＳＴレベル、ＡＬＴレベル、ＧＧＴレベル、血清ビリルビンレベルの群平均変化についてのテストを含んだ。
【０１６６】
実験４日目に、投与群３および４（５．７および１４．２５ｍｇ／ｋｇ  ｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）における動物は中程度の立毛を有し、動物の多くは昏睡していた。１４．２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ投与群における２匹の動物は４日目に死にかけており、検死した。
【０１６７】
オーリスタチンＥコンジュゲーテッド全長抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、群２）は、先の実験で見られた同一の毒性プロフィールを示した：肝臓機能テストは３日目および５日目に上昇しＧＧＴを例外として、５日目までに回復の証拠を示した。同一動物は、５日目の実験の間に進行性好中球減少症および血小板減少症を示した。２つのタイプの抗体断片（ｒｈｕＦａｂ４Ｄ５およびｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５−Ｈ）で処理した動物は用量−依存性毒性を示した。３日目および５日目の肝臓関連血清酵素レベルは、群３および５（各々、低用量のｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５およびｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５−Ｈ）についてのビヒクル−処理動物と実質的に同一である。群５（ｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）の動物においてＡＳＴおよびＡＬＴの非常に温和な上昇があったが、この変化が統計学的に有意であるか否かおよびそれが現実に肝臓毒性を表すか否かは明らかではない。群３（低用量のｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）における動物は、５日目に非常に温和な血小板減少症、および白血球の５０％減少を示し、他方、群５における動物は５日目に（３日目における温和な一過的な減衰後）正常な白血球カウントおよび５日目に温和な血小板減少症を示した。群４および６（各々、高用量のｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５およびｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５−Ｈ）における動物は３日目および５日目に毒性の明瞭な徴候を示した。毒性は群４においてよりひどいように見え、２匹の動物は罹患の徴候に基づいて４日目に安楽死させた。ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴのレベルは、双方の時点において、群２または６（匹敵する薬物用量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよびｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）よりも群４の動物においてより高い。該レベルは群２よりも群６の動物において僅かに低い。群４および６の動物は、５日目に顕著な血小板減少症および白血球減少症を示した。該レベルは群２の動物において観察されたものよりも低く、群６における動物は群４における動物よりもわずかに良好であるように見える。
【０１６８】
組織病理学的評価の結果は、臨床的観察（体重測定）および臨床病理学データと非常によく相関する。群２、３、４および６における動物は顕著に低細胞骨髄を示し；再生の徴候は群３の動物において存在するに過ぎない。対照的に、群５における動物は正常近くの細胞性の骨髄を示す。同様な知見は胸腺で観察され；群２、４および６の動物は顕著な萎縮およびアポトーシス活性を示し、他方、群３および５の動物は有意なアポトーシス活性のない温和な萎縮を示す。肝臓、小腸および大腸における変化は定量するのがより困難であるが、これらの器官における有糸分裂および／またはアポトーシス細胞の数は、群３および５におけるよりも群２、４および６の動物で大きいように見える。壊死の小さな領域は群４の２匹の動物で観察されるに過ぎない。興味深いことに、（ビヒクル−処理動物に加えて）群５における動物のみが、肝臓での髄質外造血の小さな病巣を保有し、これらの動物における遊離薬物のより低いレベルを示唆する。臨床病理学または組織病理学データは、全長抗体コンジュゲートで処理した動物と比較して、Ｆａｂイムノコンジュゲートで処理した動物における毒性の異なるパターンのいずれの証拠も示さない。
【０１６９】
抗体断片の２つの型で処理した動物は用量−依存性毒性を示した。高用量のｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよびｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ（アルブミン結合ペプチドを含有）を投与した動物は、３日目および５日目に毒性の明瞭な徴候を示した。毒性はｒｈｕＦａｂ  ４Ｄ５群においてよりひどいように見え、２匹の動物は死にかけていたので４日目に安楽死させた。組織病理学評価の結果は、臨床的観察（体重測定）および臨床病理学データと非常によく相関する。臨床病理学または組織病理学データは、全長抗体コンジュゲートで処理した動物と比較して、Ｆａｂイムノコンジュゲートで処理した動物における毒性の異なるパターンのいずれの証拠も示さなかった。該知見は、チューブリン形成を阻害する剤の投与と合致する（Ｗｏｏｄら，２００１）。
【０１７０】
図３は、アルブミン結合ペプチドは薬物コンジュゲートの毒性を改変できることを示す。Ａｂ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（アルブミン結合ペプチドを含有）実験５日目にＦａｂ４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥよりもラットにおいて有意に毒性が低かった。５．７ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥおよび７．８５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥを投与した動物（群３および５）における体重の群平均変化は、相互に有意に異ならなかった。投与群２、４および６（各々、２０．２ｍｇ／ｋｇのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、１４．２４ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ、および１９．６２ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＦａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＭＭＡＥ）は、全て、２１０５ｕｇ／Ｍ２のＭＭＡＥを受けた。群２および４の動物における体重の群平均減少は、群６の動物よりもひどかった。
【０１７１】
（実施例５−表面プラズモン共鳴による親和性測定）
ＳＡペプチドおよびアルブムの間の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて得られた。アルブミンは、ほぼ５０００共鳴ユニット（ＲＵ）でのアミンカップリングを用いてＣＭ５チップ中に捕獲した。ＳＡペプチド（０、０．６２５、１，２５、２．５、５および１０μＭ）は、３０秒間で、２０μｌ／分の流速で注入した。結合したペプチドは、１０ｍＭグリシン、ｐＨ３を用いるマトリックス再生前に５分間解離させた。
【０１７２】
カップリングしていない細胞を通過する注入からのシグナルを、時間の関数としての結合したペプチドの量に対応するセンソングランを生じさせるために固定化細胞のそれから差し引いた。０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０Ｔを含有するＰＢＳである実行緩衝液を全ての試料の希釈で用いた。ＢＩＡｃｏｒｅキネティック評価ソフトウェア（ｖ３．１）を用いて、１対１の結合モデルを用い、会合および解離速度から解離定数（Ｋｄ）を決定した。
【０１７３】
ヒト（ＨＡＳ）、ウサギ（ＢｕＳＡ）、ラット（ＲＳＡ）、およびマウス（ＭＳＡ）アルブミンを結合させるための選択されたペプチドの親和性はＢＩＡｃｏｒｅアッセイならびにＳＡ０８ペプチド競合アッセイによって評価した。表８にて以下に示されたデータは、競合アッセイで得られたＩＣ５０値がＢＩＡｃｏｒｅアッセイで得られたＫｄと好都合に匹敵したことを示す。ウサギアルブミンを結合させるためのコンセンサスペプチドを表すペプチドＳＡ１５は、競合アッセイにおいて最低のＩＣ５０値、およびウサギアルブミンでの表面プラズモン共鳴による最高の親和性を有した。ＳＡ０６と同一であるが、Ａｌａに改変された双方のＣｙｓ残基を有する直鎖状ペプチドは、５０μＭよりも大きなＩＣ５０を有し、ジスルフィドの重要性を示す。
【０１７４】
（実施例６−相対的Ｋｄの測定）
（緒言：）
タンパク質間の結合能力を評価するにおいて、ＥＬＩＳＡは選り抜きの方法である。高度に特異的でかつ定量的なアッセイを開発することが容易であることから、ＥＬＩＳＡは広く適用される。しかしながら、タンパク質が固体表面に直接的に固定化される様式では、変性または曖昧な結合エピトープによる潜在的人工物が起こり得る。
【０１７５】
アルブミンに対するＦａｂ分子（Ｆａｂ−Ｈ）にコンジュゲートしたアルブミン結合ペプチドの親和性を測定するために、我々は２つのタイプのＥＬＩＳＡを開発した。最初の様式はウェル表面へのアルブミンの吸着を含むものであり、結合したＦａｂはヤギ−抗ｈｕＦａｂ−ＨＲＰで検出される。第２の様式は、溶液中のアルブミンとＦａｂ−Ｈとの結合を含み、解離定数（Ｋｄ）を測定する。第２のアッセイの基本的な原理は、一定濃度のＦａｂ−Ｈを変化させる量のアルブミンに結合させて、溶液中で平衡に到達させ、アルブミンで被覆されたＥＬＩＳＡウェル中の未結合Ｆａｂ−Ｈを測定するものである。Ｋｄ値は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いてデータを分析することによって決定することができる（Ｍｕｎｓｏｎら，１９８０、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０）。
【０１７６】
（材料および方法：）
（材料：）
マウスアルブミン−凍結乾燥形態、カタログ番号Ａ３１３９
ラットアルブミン−凍結乾燥形態、カタログ番号Ａ６４１４
ウサギアルブミン−凍結乾燥形態、カタログ番号Ａ０６３９
１ｍｇ／ｍｌのアルブミン溶液は、１０ｍｇを１０ｍｌのＰＢＳに溶解させることによって調製した。溶液は４℃で貯蔵する。
アッセイ緩衝液：ＰＢＳ＋０．５％鶏卵アルブミン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ５５０３（＋）５％Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＨ７．４）。
【０１７７】
（直接的結合ＥＬＩＳＡアッセイ）
マウス、ラットまたはウサギアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を、２μｇ／ｍｌにて、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｓｉｏｒｐ９６−ウェルプレートに４℃にて一晩固定化した。コーティング溶液の除去の後、プレートを結合緩衝液（ＰＢＳ，０．５％オボアルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２５℃にて１時間ブロックした。結合緩衝液中の系列希釈Ｆａｂ−Ｈｘをウェル当たり１００ｕｌで加え、被覆されたアルブミンに２５℃にて３０分間結合させた。ウェルを０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄することによって未結合Ｆａｂ−Ｈｘを除去し、結合したＦａｂ−Ｈｘ分子を、２５℃でのヤギ抗ヒトＦａｂ’２−ＨＲＰとの１時間のインキュベーションによって検出した。次いで、結合したＨＲＰを、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｈ２Ｏ２の溶液で測定した。１５分のインキュベーションの後、１Ｍリン酸を加えることによって反応をクエンチした。４５０ｎｍにおける吸光度を、６５０ｎｍの参照波長で読んだ。
【０１７８】
（Ｋｄ（プレインキュベーションでの溶液結合）ＥＬＩＳＡアッセイ）
固定された濃度のＦａｂ−Ｈ（前記結合ＥＬＩＳＡにおいて測定）を、まず、アッセイ緩衝液中の変化させる濃度のアルブミンと共に溶液中でインキュベートした。室温での２時間以上のインキュベーションの後、１００μｌの混合物をアルブミン被覆ＥＬＩＳＡプレートに移した。次いで、前記したように、直接的結合ＥＬＩＳＡによって、遊離Ｆａｂ−Ｈｘの濃度を測定した。
【０１７９】
Ｆａｂ−Ｈの固定された濃度およびアルブミンの出発濃度を以下の表にリストする。アルブミンは８つのポイントで１：３系列希釈した。
【０１８０】
【表１Ｂ】
2008515889.tif 000003
結果：
ＥＬＩＳＡを用いる親和性測定は、最初、１９８５年にＦｒｉｇｕｅｔらによって公開された。我々は、Ｋｄを測定するにおいて、およびＨＥＲ２  ＥＣＤに対するヒト化抗体を選択するにおいてこの技術を用いてきた（Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，４２８５，１９９２）。
【０１８１】
一般に、結合平衡実験は、抗体の濃度は解離定数の値近くまたはそれよりも低いことを必要とする。解離定数は先験的に未知であるので、従って、遊離Ｆａｂ−Ｈｘを測定するのに用いる結合ＥＬＩＳＡにおいて十分な吸光度を与える全Ｆａｂ−Ｈ濃度を選択するのがベストである。この濃度は、直接的結合ＥＬＩＳＡにおいてＦａｂ−Ｈｘを滴定することができることによって決定した。
【０１８２】
抗体−アルブミンが平衡に到達したことを確認するために、Ｆａｂ−Ｈをウサギアルブミンと共に１時間、２時間および一晩インキュベートし、次いで、反応混合物を結合ＥＬＩＳＡにおいて検定した。平衡は２時間のインキュベーションの後に到達した。
【０１８３】
遊離Ｆａｂ−Ｈがウェル中の被覆されたアルブミンに結合するのに必要な最適時間を決定するために、Ａｂ−アルブミン混合物をウェル中の被覆アルブミンと共に１５、３０、４５、６０および１２０分インキュベートした。このアッセイに基づき、３０分は、全ての遊離Ｆａｂ−Ｈに結合するのに必要な時間の最小量であると判断された。Ｋｄ（プレインキュベーションでの溶液結合）ＥＬＩＳＡアッセイの結果を表１０に示す。
【０１８４】
【表１Ｃ】
2008515889.tif 000004
【０１８５】
【表１Ｄ】
2008515889.tif 000005
【０１８６】
【表１Ｅ】
2008515889.tif 000006
【０１８７】
【表１Ｆ】
2008515889.tif 000007
【０１８８】
【表１Ｇ】
2008515889.tif 000008
【０１８９】
【表１Ｈ】
2008515889.tif 000009
【０１９０】
【表１Ｉ】
2008515889.tif 000010
【０１９１】
【表１Ｊ】
2008515889.tif 000011
【０１９２】
【表１Ｋ】
2008515889.tif 000012
【０１９３】
【表１Ｌ】
2008515889.tif 000013
【０１９４】
【表１Ｍ】
2008515889.tif 000014
【０１９５】
【表１Ｎ】
2008515889.tif 000015
【０１９６】
【表１】
2008515889.tif 000016
【０１９７】
【表２−１】
2008515889.tif 000017
【０１９８】
【表２−２】
2008515889.tif 000018
【０１９９】
【表２−３】
2008515889.tif 000019
【０２００】
【表２−４】
2008515889.tif 000020
【０２０１】
【表２−５】
2008515889.tif 000021
【０２０２】
【表３】
2008515889.tif 000022
【０２０３】
【表４−１】
2008515889.tif 000023
【０２０４】
【表４−２】
2008515889.tif 000024
【０２０５】
【表４−３】
2008515889.tif 000025
【０２０６】
【表４−４】
2008515889.tif 000026
【０２０７】
【表５−１】
2008515889.tif 000027
【０２０８】
【表５−２】
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【０２０９】
【表５−３】
2008515889.tif 000029
【０２１０】
【表６】
2008515889.tif 000030
【０２１１】
【表７】
2008515889.tif 000031
【０２１２】
【表８】
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【０２１３】
【表９】
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【０２１４】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】図１は、対照ビヒクル（丸）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖｃ−Ｐａｂ−ＭＭＡＥ（四角）、Ａｂ．Ｆａｂ４Ｄ５−Ｈ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（菱形）、Ｆａｂ３Ｄ４−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（三角）およびＡｂ．ＦａｂＣｏｎｔｒｏｌ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（塗り潰ぶしていない丸）の注射後の経時的な腫瘍容量を示す。
【図２】図２は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖｃ−ＭＭＡＥ（四角）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−Ｆ（ａｂ’）２４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥ（十字形）、遊離ＭＭＡＥ（丸）の投与後における体重の群変化を示す。
【図３】図３は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−ｖｃ−ＭＭＡＥ（菱形）、Ｆａｂ４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥ（三角）、ＡＢ．Ｆａｂ４Ｄ５−ｖｃ−ＭＭＡＥ（丸）およびＰＢＳ（四角）の投与後における体重の変化を示す。
【図４】図４は、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖可変ドメイン［配列番号４２８］およびヒト化抗ＨＥＲ２抗体の重鎖可変ドメイン［配列番号４２９］のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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