(57)【要約】  本発明は、精巣特異的キナーゼ(TSSKファミリー)のファミリーおよびTSSKの基質(TSKS)、それらのキナーゼおよび基質をコードしている核酸配列、キナーゼおよび基質に対する抗体およびアンタゴニスト、これらタンパク質の調節方法、そして避妊薬の標的としてのその使用に関する。
2008515797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
tsskキナーゼ阻害剤、tsks阻害剤、およびtsskキナーゼとtsksとの相互作用に関する阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を含む組成物と、精子を接触させ、それによって受精を阻害することを含む、受精を阻害する方法。
【請求項２】
tsskキナーゼが、配列番号:4、5、6および20からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびそのフラグメントおよびその相同体を含む、請求項1の方法。
【請求項３】
tsksは、配列番号:40を含むアミノ酸配列、そのフラグメントおよびその相同体を含む、請求項1の方法。
【請求項４】
tsskキナーゼの阻害剤が、tsskキナーゼの合成、産生、形成、蓄積または機能を阻害する、請求項1の方法。
【請求項５】
tsskキナーゼ阻害剤が、tsskキナーゼによるtsksのリン酸化を阻害する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
tsksの阻害剤が、tsksの合成、産生、形成、蓄積または機能を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
精子がヒト精子である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
対象に、tsskキナーゼ阻害剤、tsks阻害剤、およびtsskキナーゼとtsksとの相互作用に関する阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤を有効量で含む医薬組成物を投与すること、それによって該対象における受精を阻害することを含む、該対象における受精を低下させる方法。
【請求項９】
阻害剤が、局部的、局所的、口腔内、膣内、筋肉内、鼻腔内および静脈内からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
医薬組成物が、ローション、エアロゾル、クリーム、ゲル、リニメント剤、軟膏、ペースト、溶液、粉末、錠剤および懸濁液からなる群から選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤が徐放製剤として投与される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
tsskキナーゼ阻害剤が、tsskキナーゼとtsksとの相互作用を阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
tsskキナーゼ阻害剤が、tsksのリン酸化を阻害する、請求項12記載の方法
【請求項１４】
対象がオスである、請求項8記載の方法。
【請求項１５】
tsksの阻害剤が、tsksの合成、産生、形成、蓄積および機能からなる群から選択される機能を阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１６】
tsskキナーゼの阻害剤が、配列番号:4、5、6および20からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびそのフラグメントおよびその相同体を含むtsskキナーゼを阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１７】
tsksの阻害剤が、配列番号:40、およびそのフラグメントおよびその相同体を含むアミノ酸配列を有するtsksを阻害する、請求項8記載の方法。
【請求項１８】
阻害剤が抗体である、請求項8記載の方法。
【請求項１９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
tsskまたはtsksタンパク質の少なくとも一つのタンパク質またはその免疫原性フラグメントを免疫原的量にて含む医薬組成物を該対象に投与し、それにより対象における受精を低下させることを含む、該対象における受精を低下させる方法。
【請求項２１】
タンパク質が、配列番号:4、５、６、２０、および４０からなる群から選択される配列を有する、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
二重ノックアウトを調製する際に使用するための組換え遺伝子構築体であって、該構築体が、組換え野生型TSSK1およびTSSK2遺伝子座を含んでおり、その遺伝子座では該TSSK1および該TSSK2が欠失しており、さらに残っている近接した5'および3'核酸がノックアウト構築体中に結合されており、該ノックアウト構築体が相同組み換えおよび新規遺伝子の除去を受けている、構築体。
【請求項２３】
請求項22記載の構築体を含むトランスジェニック細胞。
【請求項２４】
細胞が胚幹細胞である、請求項23記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２５】
対象においてtssk機能を阻害するためのキットであって、tssk機能の少なくとも一つの阻害剤を有効量にて含み、該tssk機能の阻害剤、標準、アプリケーター、その使用のための指示書を含んでいる、キット。
【請求項２６】
対象におけるtsks機能を阻害するためのキットであって、tsks機能の少なくとも一つの阻害剤を有効量にて含み、該tsks機能の阻害剤、標準、アプリケーター、その使用のための指示書を含んでいる、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する参照）
本出願は、２００４年９月３０日出願の米国仮出願番号第60/614647号についての35USC§119（e）に基づく優先権を主張し、それらの開示内容は出展明示により本発明の一部とされる。
【０００２】
（米国合衆国政府の権利）
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号HD38082およびU54 29099のもと、アメリカ合衆国政府の支援により成された。米国合衆国政府は本発明の一定の権利を所有する。
【０００３】
（背景技術）
精子形成、すなわち機能的な精細胞が精巣内で生成される過程には、分化中の生殖細胞とそれらの支持体であるセルトリ細胞との間の特異的相互作用、並びにアンドロゲンを産生するライディッヒ細胞によるホルモン調節が関与する。精子形成の一般的機構は、全ての哺乳動物において本質的に同じであり、３つの異なる段階：１）最初の段階は、精原細胞が有糸分裂し、精母細胞のプールを形成する増殖段階または精原段階；２）ハプロイドの精細胞が生じる減数分裂段階；および３）それぞれ球形の精細胞が精子に分化する精子変態段階、に分けることができる。初めの2つの段階を調節する分子機構は比較的よく特徴付けられているが、精子変態の分子的な基礎は、ほとんど知られていない。
【０００４】
哺乳類の精子変態、すなわち精子形成における減数分裂後の段階は、ハプロイド精細胞に生じる劇的な形態変化により特徴付けられる。この変化には、アクロソームおよびその含有物の形成、クロマチンの凝縮および再構成、細胞の伸長および種特異的な再形成、並びに鞭毛の組み立てが含まれる。これらの事象は、発生期間中に生じる遺伝子転写とタンパク質翻訳の両方の変化に起因する。ハプロイド精細胞中で翻訳されるタンパク質の幾つかは、精巣から離れた後の形態的に成熟した精子中に残留している。この点を考慮すると、精子形成中に合成されるタンパク質は、精細胞分化に、および／または受精時の精子機能に必要かもしれない。
【０００５】
本発明の1つの態様は、哺乳動物の精子における高度に分化した細胞の機能を調節するシグナル伝達事象に関する。より詳細には、一実施態様において、本発明は本発明は精子の受精能獲得を調節するシグナル伝達に関する。射精後、精子は活発に動くことができるが、受精能力を欠いている。それら精子は、女性生殖管中で受精能獲得と称される時間に依存性の過程で受精能を獲得する。受精能獲得は、幾つかのタンパク質のセリン／スレオニンおよびチロシン残基両方のリン酸化に伴って提示され、このタンパク質のチロシンのリン酸化は、cAMP/PKA経路により下流調節されており、これら2つのシグナル伝達経路間の相互干渉に関与する。PKAを除いては、受精能獲得の調節に関与する他のキナーゼ（群）は、未だ知られていない。
【０００６】
精巣-特異的キナーゼの具体例として、最近示されたマウス遺伝子、tssk1、2および3(Bielke et al., 1994, Gene 139, 235-9; Kueng et al, 1997, J Cell Biol 139, 1851-9; Zuercher et al., 2000, Mech Dev 93, 175-7) が挙げられる。酵母ハイブリッド技術および免疫共沈降法の2つを組み合わせて用いることによって、Kueng (1997)らは、マウスtssk1および2が54 Kdaのタンパク質と結合し、リン酸化することを見出した。54 Kda タンパク質は、tsskの基質であって、tsksと呼ばれる。tsksタンパク質も、精巣に豊富に存在し、この発生的発現により生殖細胞中で減数分裂後に発現されることが示される。tssk基質のマウスcDNA配列は既に報告されており(Kueng et al., 1997)、ESTデータベース検索に用いられた。ヒトEST相同体AL041339が見出され、ヒト精巣マラソンレディー（marathon ready）cDNA(Clontech, Inc.)を用いて5'および3'RACEにより完全長クローンを得るためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを作製するために使用された。
【０００７】
tsskキナーゼファミリーの機能は大部分が未知である。しかしながら、このファミリーのメンバーは減数分裂後の精子変態段階で発現されるため、それらは生殖細胞分化に、または分化後の精子機能に役割を果たすことが仮定される。
【０００８】
Spiridonovらは、精細胞を伸長させる際に発現し、特異的にヒストンH1、H2A、H2AXおよびH3をリン酸化する低分子のセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ「SSTK」は、オスの避妊にとって重要であることが示された(Spiridonov et al., 2005, MolecularおよびCellular Biology, 25:10:4250-4261)。マウスにおけるSSTK 遺伝子の標的化した欠失により、精子の著しい運動性および形態学不全(Spiridonov et al., 2005, MolecularおよびCellular Biology, 25:10:4250-4261)を理由にオスが不妊となる。
【０００９】
各種の避妊方法が利用できるにもかかわらず、世界中および米国合衆国における妊娠の50%以上は意図されたものでない。従って、女性および男性の多様な要求に、より適した避妊法、ならびに種々の民族、文化および宗教的価値が考慮された避妊法の必要性は大きい。コンドームの使用または精管切除を除いては、男性用避妊方法の利用は非常に限定されている。
【００１０】
受精に関連があるタンパク質を同定すること、そしてこの過程を調節するための方法が、この分野において長い間必要性を感じられてきた。
【００１１】
（本発明の要約）
本発明は、精子または精巣特異的キナーゼ (tssk)遺伝子のファミリー、各々コードされたそのタンパク質に関するものであって、避妊におけるその役割に関するものである。また、本発明は精子特異的キナーゼのタンパク質基質に関するものである。さらに具体的には、本発明は、ヒトキナーゼ1、2、3および4(tssks)、該tsskキナーゼ基質のtsksに関する。
【００１２】
本発明は、tssksおよびtsksのアンタゴニストである化合物に関するものである。tssk活性、tsskとtsksとの相互作用、およびtsks活性のアンタゴニストは、避妊薬としての利用性を有すると予測される。一態様において、本発明は、tssk活性を遮断する避妊方法に関する。別の態様において、本発明は、tsks活性の遮断を包含する避妊方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、tssksおよびtsksの合成、産生、蓄積および機能低下の方法に関するものである。
【００１４】
一実施態様において、tsskタンパク質は、ヒトtssk1(配列番号:4)、tssk2(配列番号:5)、tssk3 (配列番号:6)、およびtssk4(配列番号:20)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、または生物学的に活性なそのフラグメントまたはその相同体を含むタンパク質からなる群から選択されるである。
【００１５】
一実施態様において、ヒトtsksタンパク質は、配列番号:40、または生物学的活性なそのフラグメントまたはその相同体を含む。一態様において、配列番号:40は、配列番号:39の配列を有する核酸によってコードされる。
【００１６】
一実施態様において、本発明は、精子とtsskまたはtsksの阻害剤とを接触させることを含む受精を阻害する方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、有効量のtsskまたはtsksの阻害剤を投与することを含む、対象における受精を低下させる方法を提供する。一実施態様において、本発明は、1以上のtsskおよび／またはtsksタンパク質、またはその免疫原性フラグメントを投与することを含む、避妊薬ワクチンを提供する。 
【００１７】
本発明は、tssksまたはtsksのノックアウト構築体を調製するための方法を提供する。一実施態様において、構築体は、ノックアウトマウスを調製するために有用である。一態様において、構築体は二重ノックアウトである。
【００１８】
本発明は、tsskおよびtsks機能を阻害するためのキットを提供する。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
図1はTSSK1、TSSK2、TSSK3およびTSSK4アミノ酸配列の配列アラインメント比較である。4つの整列させた配列の内の少なくとも２つにおいて見出されたアミノ酸に、同一性を示すために暗色を付けた。最も高い相同性は、TSSK1およびTSSK2(キナーゼドメインにおいて83%、完全なORFにわたって72%)との間で見出される。TSSK3は、TSSK1およびTSSK2各々に対して47.5%および49%同一である。TSSK4は、TSSK3に対して49%同一である。セリン/スレオニンキナーゼに対するコンセンサス「DLKXXN」に適する高度に保存されたシグニチャー配列に下線を引いた。12のキナーゼサブドメインをローマ数字にて上記アラインメントに記した。
【００２０】
図2は哺乳類TSSKサブファミリーのドメイン構造のスキーム表示である。TSSK1-4は、活性なキナーゼであることが予測されており、該キナーゼドメインはTSSKの主要部分を含む。TSSK1およびTSSK2は、それらのカルボキシル末端では、TSSK3およびTSSK4よりも長い。予測されるATP結合部位を記した。
【００２１】
図3はTSSKとその他のキナーゼの系統発生的関係、TSSKファミリーのメンバー間の関係を示す略図である。TSSK1およびTSSK2は、TSSKファミリーにおけるサブグループを形成する。
【００２２】
図4は図4Aおよび4Bを含み、ヒトTSSK1発現のノーザン(4A)およびドットブロット(4B)分析を示す。図4Aは、８つのヒト組織においてTSSK1発現のノーザンブロット分析の結果を示す。β-アクチンは、泳動レーンの泳動用コントロールとして働く。TSSK1転写物は、精巣においてのみ存在し、精巣においてわずかに速く移動する低分子のバンドがTSSK-偽遺伝子mRNAであり得る。図4Bは、ストリンジェント洗浄条件下での７２のヒト組織においてTSSK1発現のドットブロット分析を示す。
【００２３】
図5は図5Aおよび5Bを含み、ヒトTSSK2 発現のノーザン(5A)およびドットブロット(5B)分析を示す。図5Aは、８つのヒト組織中のTSSK2発現のノーザンブロット分析の結果を示す。β−アクチンは、泳動レーンの泳動用コントロールとして働く。図5Bは72のヒト組織におけるTSSK2発現のドットブロット分析を示す。TSSK2転写物は精巣にのみ存在した。
【００２４】
図6は図6Aおよび6Bを含み、８つのヒト組織におけるTSSK3(図6A)発現および８つのマウス組織におけるTSSK4(図6B)発現のノーザンブロット分析を示す。各々のTSSKは、精巣においてのみ発現した。TSSK3 mRNAは複数のスプライス部位を有し得ることが図6Aにおいて見出される。
【００２５】
図7は図7A、7B、7C、および7Dを含み、１５のヒト組織においてTSSK1(7A)、TSSK2(7B)、TSSK3(7C)およびTSSK4(7D)発現のリアルタイムPCR分析をグラフに示したものである。TSSK3および4の転写物は精巣でのみ検出される。一方、TSSK1は、膵臓においてのみ検出でき、TSSK2は、心臓、脳、胎盤および肝臓において検出され得る。
【００２６】
図8は、精巣におけるヒトTSSK1-4の相対的発現レベルのリアルタイムPCR定量法をグラフにより示す。mRNAの存在量は対数スケールで示される。TSSK1および2の転写物は、ヒト精巣におけるTSSK3および4よりもおおよそ10倍多い。実験は３回行った(黒、淡灰色および暗灰色の棒)。
【００２７】
図9は、1つの構築体を用いて、TSSK1およびTSSK2のダブルノックアウトのストラテジーをグラフに示した。
【００２８】
図10は、パネル1〜6(図10Ａ〜10B)を含んでおり、成体マウス精巣におけるTSSK2 mRNA発現のインサイチュ分析の顕微鏡画像であり、TSSK2の減数分裂後の発現および精子のエクアトリアルセグメントの局在性を示している。TSSK2転写物のインサイチュハイブリダイゼーションを放射標識したマウスTSSK2cRNAを用いて行った。センスＴＳＳＫ２(１０Ａ)またはアンチセンスTSSK2(10B)とハイブリダイズした輸精管の低倍率(x100)の視界を暗視野で示し、アンチセンスTSSK2とハイブリダイズした輸精管のより高倍率(x200, x400)の視界を、明視野(10Cおよび10D)および暗視野(10Eおよび10F)の両方に示した。TSSK2転写物は減数分裂後の精細胞で主に発現され、一方一次精母細胞上の標識はバックグラウンドほど大きくない。
【００２９】
図11は、パネル1から6(図11A〜11B)を含み、成体マウス精巣におけるTSSK4mRNA発現のインサイチュ分析の顕微鏡画像であり、TSSK4の減数分裂後の発現および精子エクアトリアルセグメント局在性を示す。TSSK4転写物のインサイチュハイブリダイゼーションを、放射標識したマウスTSSK4 cRNAを用いて行った。センスTSSK4 (11A)またはアンチセンス TSSK4 (11B)とハイブリダイズした輸精管の低倍率(x100)の視界を暗視野で示した、アンチセンスTSSK4とハイブリダイズした輸精管のより高倍率(x200, x400)の視界は、明視野(11Cおよび11D)および暗視野(11Eおよび11F)の両方で示した。TSSK4転写物は、減数分裂後の精細胞で主に発現される。
【００３０】
図12は、ヒト精巣および精子中のTSSK2発現のウェスタン・ブロット分析の画像を示す。
【００３１】
図13は、コンピューターによりモデル化したマウスTSSK4の3D構造の概略図を示す。マウスおよびヒトTSSK4タンパク質において同一のペプチド(RRAPPDFVNKFLPRE)を用いて、TSSK4に対する抗体を生成させた。マウスTSSK4構造をモデル化し、このペプチドがフォールディング後の分子表面上に存在することを示す。
【００３２】
図14は図14Aおよび14Bを含み、射精された精子中のTSSK2の免疫蛍光局在性(14A)の顕微鏡画像を示す。TSSK2は、アクロソーマル・キャップ（acrosomal cap）に若干局在しており、エクアトリアルセグメントにより強く局在している。精子のエクアトリアルセグメントにおけるその局在性は、受精におけるTSSK2に対する役割を示唆する。
【００３３】
図15はマウス精巣、マウス精子およびヒト精子においてTSSK4 発現のウェスタン・ブロット分析を示す。TSSK4の予測された分子サイズを持つ一本のバンドを、ウサギTSSK4抗血清を用いてマウス精子タンパク質抽出物中で検出し、一方で低分子量TSSK4タンパク質(「?」で示した)、おそらくタンパク質分解産物類似物を、ヒト精子タンパク質抽出物において検出した。マウス精巣由来のタンパク質抽出物中の高分子量バンドはTSSK4ダイマーであり得る。
【００３４】
図16は6つのパネル(図16A〜16F)を含み、マウスおよびヒト精子中のTSSK4の免疫蛍光局在性の顕微鏡画像を示す。上方の2つのパネル(図16Aおよび16B)において、ヒト精子の免疫蛍光染色をアフィニティー精製した抗-TSSK4 抗体および二次抗体のみを用いて行った。下方の4つのパネル(図16C、D、EおよびF)において、マウス精子の免疫蛍光染色を、アフィニティー精製した抗TSSK4抗体(16Cおよび16D)および正常なウサギIgG(16Eおよび16F)を用いて行った。TSSK4は、マウスおよびヒト精子両方においてエクアトリアルセグメントに局在する。精子のエクアトリアルセグメントにおけるその局在性は、受精中TSSK4についての役割を示す。
【００３５】
図17は図17Aおよび17Bを示しており、ヒトTSKSの精巣特異的および減数分裂後発現を示す、TSKS発現に関するノーザンブロット(17A;８つのヒト組織)およびドットブロット(17B;72人のヒト組織)分析の画像を示している。TSKS転写物を精巣でのみ検出した。
【００３６】
図18はTSKS発現のウェスタン・ブロット分析の画像を示す。ヒトTSKSタンパク質は、ヒト精巣において見出されたが、成熟精子においては検出されなかった。
【００３７】
図19は6つのパネルを含んでおり、成体マウス精巣中のTSKS mRNA 発現の分析の顕微鏡画像を示す。TSKS 転写物のインサイチュハイブリダイゼーションを、放射標識したマウスTSKS cRNAを用いて行った。センスTSKS(1)またはアンチセンスTSKS(2)とハイブリダイズした輸精管の低倍率(x100)の視界を暗視野に示し、アンチセンスTSKSとハイブリダイズした輸精管のより高倍率(x200、x400)の視界を明視野(3,5)および暗視野(4,6)の両方に示した。TSKS転写物を、減数分裂後の精細胞中で主に発現し、一次精母細胞または精原細胞の標識は、バックグラウンドほど大きくない。
【００３８】
図20は、図20A、20Bおよび20Cを含んでおり、ヒト精巣から分離した細胞におけるTSKSの免疫蛍光染色の顕微鏡画像を示す。ヒトTSKSの赤色シグナルを、アクロソーマルポールで核[青色、DAPI染色]から分離した小さな免疫蛍光ドットとして円形の精細胞(A)において検出した。初期および後期の伸長精細胞(B)において、TSKS免疫蛍光は、アクロソーマルポールと同様に隣接しており、そのピーク強度およびサイズに達しており、TSKSとゴルジ体との会合を示唆するものであった。TSKS免疫蛍光は、成熟睾丸精子(C)において、実質的に存在しなかった。
【００３９】
図21は図21A(左側4つのパネル)および21B(右側パネル/ゲル)を含み、酵母のツー・ハイブリッド系(21A)におけるヒトTSSK2およびTSKSの相互作用に対する試験結果に関する顕微鏡画像およびウェスタン・ブロッティング(21B)によるハイブリッドタンパク質の同時発現の評価を示す。
【００４０】
図21Aは、酵母のツー・ハイブリッド系におけるTSSK2およびTSKSの相互作用を示す。宿主株AH109を、後記プラスミドの対または一つのプラスミドのいずれかを用いて形質転換した：pGAD、pGBK-TSSK2(1);pGAD-TSKS、pGBK-TSSK2 (2); pGAD、pGBKp53 (3); pGAD-lgT、pGBK-p53 (4); pGAD (5); pGAD-TSKS (6);およびpGAD-LgT(7)。形質転換体を、ヒスチジン原栄養体について試験するために、ロイシンおよびトリプトファン(SCM-L-T)の両方、ロイシン(SCM-L)、ロイシンおよびヒスチジン(SCM-L-H)の両方、またはロイシン、トリプトファンおよびヒスチジン(SCM-L-T-H)を欠いた完全なドロップアウト培地上にひろげる。p53およびSV40のラージT抗原コントロール(4)に加え、TSSK2およびTSKS(2)は、酵母のツー・ハイブリッド系において相互作用した。
【００４１】
図21Bは、ウェスタンブロッティングによるハイブリッドタンパク質の同時発現の確認を示す。TSSK2およびTSKSのORFを、GalDBDおよびGalAD各々と融合させて、AH109 宿主株中へ同時形質転換した。該株を、DBD-TSSK2 (mycタグ化)、AD-TSKS (HAタグ化)の発現について試験した。DBD-P53(mycタグ化)およびGAD-LgT(HAタグ化)をポジティブコントロールとして使用した。TSSK2およびTSKS両方をAH109において同時発現させ、結合相互作用に関するさらなる研究のためにこのモデルを評価する。
【００４２】
図22はTSSK2とTSKSの結合強度に関する評価法によって計量したハイブリッドタンパク質の各対を担持する酵母株のレポーター遺伝子の活性アッセイ（α-ガラクトシダーゼ)をグラフにより示したものである。α−ガラクトシダーゼ活性を、基質としてr-ニトロフェニル-a-D-ガラクトピラノシドを用いて、図示したプラスミドの各対を担持するAH109の培養上清をインキュベートすることによってOD410で測定した。該活性を、培養物上清の光学密度校正後の任意単位として表現した。TSSK2とTSKSとの結合強度は、ネガティブコントロールよりも12倍強く、一方p53とLgTとのポジティブコントロールの相互作用よりも1.5倍強いものであった。
【００４３】
図23はインビトロでヒトTSSK2とヒトTSKSとの共免疫沈降を示す電気泳動分析の画像を示す。TSSK2(mycタグ化)およびTSKS(HAタグ化)を、プロメガ・インビトロ翻訳キットで同時翻訳した。該混合物を、myc(マウス)またはHA(ラット)に対するモノクローナル抗体のいずれかに結合したアガロースビーズを用いて免疫沈降させた。免疫沈降をSDS-PAGEにより分離し、抗-HA(左)または抗-myc(右)いずれかでブロッティグした:1.インビトロの翻訳混合物;2. インビトロの翻訳コントロール;3. IP (抗-HA ); 4. HA-IP コントロール; 5. IP (抗-myc);および6. Myc-IP コントロール。矢印は抗-mycまたは抗-HAの何れかを用いるTSSKおよびTSKSが同時免疫沈降することを示し、それらの相互作用を確認するものである。
【００４４】
図24は図24Aおよび２4Bからなり、TSSKとの相互作用に必要なTSKSの主要な相互作用性ドメインの分析を示す。図24Aは、TSKS ORF (上方パネル)の概略図を示す。2つの推定コイルド・コイルドメイン[CC1, CC2]を記入した。6つのアミノ酸のリピート部分を斜線で示し、アミノ末端の核局在性シグナルを灰色で示した。TSKSの８つ全ての欠失変異体を構築し、pGADのツー・ハイブリッドベクターにおいてGal4 活性化ドメインと融合させた。各変異体とGal-ADの融合タンパク質を、酵母の宿主株 AH109中にGal-DBDTSSK2を用いて同時形質転換した。図24Bは、α-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした各対の培養上清を示し、各変異体について測定した該活性を完全長TSKSの%として表現した。対応する欠失変異体を縦座標上に示した。第一の48個のアミノ酸の欠失により、TSKS結合が5%に低下し、一方で第一の147個のアミノ酸の欠失によりTSKSの結合が消失する。カルボキシル末端および第二のコイルド・コイル領域の欠失により、相互作用が75%まで低下する。
【００４５】
図25は図25Aおよび25Bからなり、インビトロでのマウスTSKSのリン酸化の試験の画像を示す。TSKSに対するラット抗血清を用いてマウス精巣由来のTSKSの免疫沈降。事前に清澄むにしたマウス精巣抽出物をラットの正常な血清(コントロールIP)またはラット抗-TSKS血清(TSKS IP)のいずれかと共に免疫沈降し、該免疫沈降複合体を１D(図.25A)および２D(図.25B)ゲルで分離し、抗-TSKS 抗体を用いて銀染色および免疫ブロッティングに供した。これは、ラット抗ヒトTSKS血清がマウスTSKSを免疫沈降できることを示すものである。
【００４６】
図26は、TSKSのインビトロのリン酸化の電気泳動分析の画像を示す。免疫複合体のオートラジオグラフは、抗-TSKS(TSKS IP)またはラットの正常な血清(コントロール IP)のいずれかを用いて免疫沈降し、次いでインビトロキナーゼアッセイにおいてγP32 ATPと共にインキュベートしたものである。一般的なキナーゼ、カゼインキナーゼ2(CKII)およびカゼイン、マルトース結合タンパク質(MBP)およびヒストン3を包含するいくつかの一般的なキナーゼ基質をポジティブコントロールとして反応に添加した。抗-TSKS血清を用いて、TSKSは、42KD タンパク質と同様に強力にリン酸化され、一方コントロールの正常なラット血清を用いてリン酸化されたタンパク質はなかった。該42 KD タンパク質は、TSSK1および／またはTSSK2の自己リン酸化であり得る。CKIIの添加により、いずれかのさらなるリン酸化も生じなかった。これは、TSSKおよびTSKSのリン酸化が飽和されているか、またはそれらがCKIIの基質ではないことを示すものである。カゼイン、MBPおよびヒストン3もまた、沈降複合体において該キナーゼによりリン酸化されたが、一方でこれらタンパク質は正常な血清によって免疫沈降したコントロールではリン酸化されなかった。このキナーゼアッセイは、TSKSリン酸化の阻害剤に対するハイ・スルー・プット・スクリーニングを提供し、さらにカゼイン、MBPおよびヒストン3がTSSK1およびTSSK2に対する代替基質として使用できることを示す。
【００４７】
（本発明の詳細な説明）
略語
ウシ血清アルブミン (BSA)
受精能獲得条件または受精能獲得精子(CAP)
カベオリン 1 (CAV1)
界面活性剤-耐性膜(DＲＭ)
ヘキソキナーゼＩ(ＨＫ１)
高密度リポタンパク(ＨDＬ)
セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP)
ヒト精子ＰＲＶ−様タンパク質(hsPRV)
マウス精子ＰＲＶ−様タンパク質(msPRV)
受精能獲得不可能条件または受精能獲得不可能精子(NON)
真性赤血球増加症(ＰＲＶ)
室温(RT)
精子ＰＲＶ様タンパク質(sPRV)
トリス-生理緩衝液, pH 7.3, 0.1% Tween 20 (TBST)
精巣/精子特異的キナーゼ(tsksとしても示す)のTSKS基質
TSSK-精巣/精子特異的セリンキナーゼ
ホワイトン-HEPES緩衝液(WH)
【００４８】
定義
本発明の説明および請求項において、下記の専門用語は下記の定義に従って使用される。
【００４９】
「ある」という冠詞は、本明細書では、１または２以上の(即ち、少なくとも１つ)文法的目的語となるものを示すために使用される。例えば、「あるエレメント」は、１つのエレメントまたは２以上のエレメントを意味する。
【００５０】
疾患または障害の症状の重症度、患者によって経験されるかかる症状の頻度またはそれらの両方が低下する場合に、疾患または障害が「軽減」されるという。
【００５１】
本明細書で使用される場合に、「アミノ酸」は、下記の表に示されるような、正式名称によって、正式名称に対応する３文字コードまたは正式名称に対応する１文字コードによって示される:
【表１】
2008515797.tif 000003
【００５２】
本明細書に示したように「アミノ酸」は、天然のおよび合成アミノ酸の両方、およびDおよびL-アミノ酸の両方を包含することを意味する。「標準アミノ酸」とは、天然ペプチドにおいて共通して見出される２０個の標準的なL-アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」とは、天然源から合成的に調製されるか、または誘導されるかどうかに関わらず、標準的アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を意味する。また、本明細書に示したように、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体(例えば、アミド)および置換基に限定しないが、これを包含する化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。本発明のペプチド内、および特にカルボキシ-またはアミノ末端で含有されるアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化または、それらの活性に悪影響を及ぼさないでペプチドの循環半減期を変化させる他の化学的な群との置換、によって修飾され得る。さらに、ジスルフィド結合は、本発明のペプチドにおいて存在しても、しなくても良い。
【００５３】
用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、また遊離アミノ酸と呼ばれ、ペプチドのアミノ酸残基とも呼ばれ得る。使用される用語が遊離アミノ酸またはペプチドの残基を指すかどうかは、文脈から明らかであろう。
【００５４】
アミノ酸は、下記の一般構造を有する:
【化１】
2008515797.tif 000004
アミノ酸は、側鎖Rに基づいて７つの群に分類され得る：(1)脂肪族側鎖、(2)水酸基(OH)を含有する側鎖、(3)硫黄原子を含有する側鎖、(4)酸性またはアミド基を含有する側鎖、(5)塩基性の基を含有する側鎖、(6)芳香族環を含有する側鎖、および(7)プロリン、イミノ酸、この側鎖はアミノ基に融合される。
【００５５】
本発明のペプチド化合物を説明するために使用した命名法は従来の慣行に従う。各アミノ酸残基に関して、ここでアミノ基は左側に存在しており、カルボキシ基は右側に存在する。本発明の選択された特定の態様を示す式において、該アミノ-およびカルボキシ-末端基は、具体的に示さないが、特記しなければ、生理学的pH値であると考えられる形態をとると解される。
【００５６】
本明細書で使用される場合に、化学的な化合物の「アナログ」は、一例としては、必ずしもアイソマー(例えば、5-フルオロウラシルがチミジンのアナログである)である必要はないが、構造において別の類似する化合物である。
【００５７】
本明細書で使用される場合に、用語「塩基性」または「正電荷」アミノ酸は、R基がpH 7.0で正味の正電荷を有し、後記に限定しないが標準的アミノ酸のリシン、アルギニンおよびヒスチジンを包含するアミノ酸をいう。
【００５８】
本明細書で使用される場合に、用語「抗体」は、イムノグロブリン分子を示し、これは抗原に対す特定のエピトープに特異的に結合できる。抗体は、天然起源または組換え体起源から得られるインタクトな免疫グロブリンであり得るし、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分である。抗体は、通常イムノグロブリン分子のテトラマーである。本発明における該抗体は、多様な形態で存在し得る。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF（ab)２、さらに一本鎖抗体およびヒト化抗体を包含する。
【００５９】
本明細書で使用される場合に、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」またはアンチセンス核酸は、核酸ポリマーを意味し、この少なくとも一部は、正常な細胞または罹患細胞中に存在する核酸と相補的である。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列を示すか、または実質的に非コード鎖に対して相同である配列を示す。本明細書中で定義されたように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列と相補的である。該アンチセンス配列が、DNA分子のコード鎖のコード部分と完全に相補的であることは必要ではない。該アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコード鎖上に特定された調節配列に相補的であり得る、この調節配列がコード配列の発現を制御する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これに制限するものではないが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾を包含する。
【００６０】
本明細書で使用される場合に、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」またはアンチセンス核酸は、核酸ポリマーを意味する。この少なくとも一部は、正常な細胞または罹患細胞において存在する核酸と相補的である。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列を示すか、または実質的に非コード鎖に対して相同である配列を示す。本明細書中で定義されたように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列と相補的である。該アンチセンス配列が、DNA分子のコード鎖のコード部分と単に相補的であることは必要ではない。該アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコード鎖上で特定された調節配列に相補的であり得る、この調節配列がコード配列の発現を制御することができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これに制限するものではないが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの他の修飾を包含する。
【００６１】
本明細書で使用される場合に、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合規則に関連のあるポリヌクレオチド(即ち、ヌクレオチドの配列)を参照して使用される。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と相補的である。
【００６２】
本明細書で使用される場合に、ポリペプチドの用語「生物学的に活性フラグメント」または「生物活性フラグメント」は、それらの天然リガンドに特異的に結合し得るか、またはタンパク質の機能を果たし得る、完全長タンパク質の天然または合成部分を包含する。
「相補的」とは、2つの核酸鎖の領域間、または同一核酸鎖の2つの領域間の配列相補性に関する広い概念を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第一領域と逆平行である第二の核酸領域の残基と、該残基がチミンまたはウラシルである場合に、特異的水素結合(「塩基対合」)を形成できることが知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基が、第一鎖と逆平行である第二の核酸鎖の残基と、該残基がグアニンである場合に塩基対合できる。核酸の第一の領域は、第一と第二の2つの領域が、逆平行様式において配置されており、第一の領域の少なくとも一つのヌクレオチド残基が第二の領域の残基と塩基対合できる場合に、同一または異なる核酸の第二の領域と相補的である。好ましくは、第一の領域は第一の部分を含み、そして第二の領域は第二の部分を含み、これにより、第一および第二の部分が逆平行様式において配置される場合、第一の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約50%、および好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%は、第二の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合できる。より好ましくは、第一の部分の全てのヌクレオチド残基は、第二の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合できる。
【００６３】
本明細書で使用される場合に、「化合物」とは、本発明の方法で使用されるポリペプチド、単離核酸、またその他の薬剤をさす。
【００６４】
本明細書で使用される場合に、用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書中では以下の５つの群のいずれかの範囲内でのアミノ酸置換として定義される:
Ｉ．      小さい脂肪族、非極性もしくは僅かに極性のある残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
ＩＩ．    極性、負電荷の残基およびそのアミド：
Asp、Asn、Glu、Gln;
ＩＩＩ．  極性、正電荷の残基：
His、Arg、Lys;
ＩＶ．    大きい脂肪族、非極性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys
Ｖ．      大きい芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp
【００６５】
「コントロール」の細胞、組織、サンプルまたは対象とは、試験される細胞、組織、サンプルまたは対象と同一タイプの、細胞、組織、サンプルまたは対象である。該コントロールは、例えば該試験される細胞、組織、サンプルまたは対象が調べられるのと、正確に同時にまたはほとんど同時に調べられ得る。該コントロールはまた、例えば試験される細胞、組織、サンプルは、試験される細胞、組織、サンプルまたは対象が調べられる時間とは異なる時間で調べられ、このコントロールの調べた結果を記録し、該記録結果を、試験される細胞、組織、サンプルまたは対象の調査によって得られた結果と比較することができる。該コントロールは、疾患または障害を有する疑いのある対象から得られる試験サンプルに対して試験が行われる場合、試験群または試験対象以外の別の起源または類似起源からも得られる。
【００６６】
「試験」細胞、組織、サンプルまたは対象は、調べられるか、または処置されるものである。
【００６７】
「疾病指標」の細胞、組織またはサンプルとは、存在する場合に、動物中にある細胞、組織またはサンプル(または該組織から得られた）が疾患または障害に罹患していることを示す指標であるもの。例えば、動物の肺組織における1以上の胸部細胞の存在は、その動物が転移性の乳癌に罹っているという指標である。
【００６８】
1以上の細胞が疾患または障害に罹っていない動物中の組織に存在している場合に、組織は、細胞を「正常に含む」という。
【００６９】
本明細書で使用される場合に、「化合物」とは、薬物または薬物として使用する候補物質と、上記の組合せ物および混合物として一般的に考えられるあらゆるタイプの物質または薬剤、その組合せおよび混合物、さらに本発明のペプチドおよび抗体を示す。
【００７０】
「検出」という単語およびその文法学的改変の使用は、定量化を伴わない種類の測定を示すことを意味し、一方で「決定」または「測定」なる用語の使用は、それらの文法学的改変と共に、定量化を伴う種類の測定を示すことを意味する。用語「検出」および「同定」は、本明細書では互換的に使用される。
【００７１】
本明細書で使用される場合に、「検出し得るマーカー」または「レポーター分子」は、マーカーを含まない類似化合物の存在においてマーカーを含む化合物を特異的に検出できる原子または分子である。検出し得るマーカーまたはレポーター分子は、例えば放射性同位体、抗原性決定因子、酵素、ハイブリダイゼーションに利用できる核酸、発色団、蛍光プローブ、化学発光分子、電気化学的に検出し得る分子、および変化した蛍光分極または変化した光散乱を提供する分子を包含する。
【００７２】
「疾患」とは、該動物がホメオスタシスを維持することができない状態、また該疾患が改善されない場合に動物の健康が低下し続ける動物の健康状態である。
【００７３】
これに対して、動物中の「障害」とは、動物がホメオスタシスを維持できるが、障害が存在しない場合よりもその動物の健康状態が好ましくない健康状態である。処置しないまま放置する場合、障害が必ずしも動物の健康状態をさらなる低下をもたらすわけではない。
【００７４】
「コードしている」とは、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子、cDNAまたはmRNA中のヌクレオチドの特異的配列の遺伝的性質を示す。ヌクレオチドの定義された配列(即ち、rRNA、tRNAおよびmRNA)またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的過程における、およびそれらから得られる生物学特性において、他の高分子および巨大分子の合成の為のテンプレートとして働く。このように、遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物系において該タンパク質が産生される場合、遺伝子はタンパク質をコードしている。コード鎖のヌクレオチド配列が、mRNA配列と同一であり、通常配列表に示される鎖、そして非コード鎖、即ち遺伝子またはcDNAの転写のテンプレートとして使用される鎖の両方が、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の生成物をコードするものとして示され得る。
【００７５】
特記しなければ、「アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列」は、互いに縮重型でありおよび同一アミノ酸配列をコードするあらゆるヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびRNAをコードしているヌクレオチド配列はイントロンを包含し得る。
【００７６】
「エンハンサー」とは、転写開始部位に対してエンハンサーの距離や配向に関係なく、転写効率を増加させ得るDNA調節エレメントである。 
【００７７】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも一つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部であるか、または少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。「フラグメント」および「セグメント」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００７８】
「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも一つのアミノ酸を含むアミノ酸配列の一部か、または少なくとも一つのヌクレオチドを含む核酸配列の一部である。「フラグメント」および「セグメント」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。
本明細書で用いる場合、「機能的な」生物学分子とは、それが特徴付けられることによって、特性または活性を示す形態にある生物学的分子である。例えば、機能的酵素とは、該酵素が特徴づけられることによって特徴的な触媒活性を示すものである。
【００７９】
本明細書で使用される場合に、「相同な」とは、例えば2つの核酸分子の間、例えば2つのDNA分子または2つのRNA分子の間、または2つのポリペプチド分子の間の2つの重合分子との間のサブユニットの配列類似性を指す。この2つの分子の両方においてサブユニット部位が同一の単量体サブユニットによって占有されている場合、例えば各2つのDNA分子中の部位がアデニンに占有されている場合、それらはその部位で相同である。2つの配列の間の相同性は、一致部位または相同部位の数の直接的な相関である。例えば、2つの化合物の配列の半分の部位が相同であれば(例えば、ポリマー１０個のサブユニットの長さのうち５個)、この2つの配列は50%相同性であって、部位の90%、例えば10個のうち9個が一致するか相同である場合、2つの配列は90%相同性を共有している。例えば該DNA配列の3'ATTGCC5'および3'TATGGCは50%相同性を共有している。
【００８０】
本明細書で使用される場合に、「相同性」とは「同一性」と同義的に使用される。
【００８１】
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の%同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、2つの配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムであって、KarlinおよびAltschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)らによって改変された。アルゴリズムは、Altschulら(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれており、例えばNational Center for Biotechnology Information（NCBI) world wide web siteから利用できる。BLASTヌクレオチド探索は、次のパラメーター:ギャップペナルティ= 5;ギャップ伸張ペナルティ= 2;ミスマッチペナルティ= 3; マッチ・リワード= 1；期待値10.0;およびワードサイズ = 11 を用いてNBLAST プログラム(NCBI ウェブサイトでは「blastn」と称する)を用いて実行でき、本明細書に記載した核酸と相同なヌクレオチド配列を得ることが可能である。BLAST タンパク質探索は、次のパラメーター；期待値 10.0, BLOSUM62 スコアリング・マトリックスを用いて、XBLAST プログラム(NCBI ウェブサイトでは「blastn」と呼ぶ)またはNCBI「blastp」プログラムにより実施でき、本明細書に記載したタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることが可能である。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul ら(1997, Nucleid Acids Res. 25:3389-3402)において説明されたとおりに用い得る。あるいは、PSI-BlastまたはPHI-Blastを使用して、分子(Id.)間の距離関係および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する反復探索を行い得る。BLAST、Gapped BLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blast プログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメーター(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を使用してもよい。
【００８２】
2つの配列の間の%同一性は、ギャップを用いるか、またはギャップを用いないで上記のものと同様の技術を用いて決定され得る。%同一性を計算する際に、通常、正確な一致が計測される。
【００８３】
本明細書で使用される場合に、「阻害」なる用語は、記載した機能、例えば受精能獲得または受精を低下させるか、妨げるような本発明の化合物の能力をいう。好ましくは、阻害は、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも25%、さらに好ましくは少なくとも50%であり、および最も好ましくはこの機能が少なくとも75%まで阻害される。
【００８４】
本明細書で使用される場合に、「tssk キナーゼ活性の阻害剤」は、非tsskキナーゼの活性を顕著に妨げずに全体のtsskキナーゼ活性を低下させる化合物、組成物または環境ファクターを包含することを意図する。即ち、阻害剤は、キナーゼの特異的活性を低下させるファクター、さらに反応に利用し得る活性なキナーゼ分子の数を低下させるファクターを包含する（即ち、インビボの環境に対する転写および翻訳阻害剤)。
【００８５】
本明細書で使用される場合に、「tsks 活性の阻害剤」とは、非tsskキナーゼの活性を顕著に妨げずにtsksとtsskキナーゼの全体的な相互作用を低下させるか、またはtsskによってリン酸化された場合にtsksの活性を阻害するあらゆる化合物、組成物または環境ファクターを包含することを意図する。
【００８６】
本明細書で使用される場合に、「tsskを阻害すること」または「tsksを阻害すること」とは、tsskまたはtsksの合成、産生、形成、蓄積または機能を阻害するあらゆる方法または技術、さらにtsskまたはtsksの合成、形成、蓄積または機能の誘導または刺激を阻害する方法を示す。tsskまたはtsks機能または変動を調節できるあらゆる代謝経路も示す。阻害は直接的または間接的であり得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合に、「説明書」には、出版物、録画音声、ダイアグラムまたは本明細書中で引用された多様な疾患または障害の緩和を有効にするためのキットにおいて、本発明のペプチドの実用性を伝達するために使用できるあらゆる表現媒体を包含する。所望により、あるいは代わりに、説明書は、哺乳動物の細胞または組織において多様な疾患または障害を緩和する1以上の方法を説明し得る。本発明のキットに関する説明書は、例えば、同定化合物を含有する容器に添付されているか、または同定化合物を含有する容器と共に発送され得る。あるいは、説明書は、説明書および化合物がレピシエントにより協同的に使用され得るという意図によって、容器とは別に発送され得る。
【００８８】
「単離された核酸」とは、天然状態でそれが隣接する配列と分離されている核酸セグメントまたはフラグメント、例えばフラグメントに通常隣接している配列から除去されたDNAフラグメント、例えば天然で生じるゲノムにおいて該フラグメントに隣接する配列をいう。該用語は、核酸、例えばRNAまたはDNAまたはタンパク質を天然に伴うか、または細胞中でそれを天然に伴う他の成分から実質的に精製された核酸にもあてはまる。それ故、この用語には、例えば、ベクターに、自発的な複製プラスミドまたはウイルスに、または原核生物または真核生物のゲノムDNA中に導入されるか、または他の配列と独立して別の分子(例えば、PCRまたは制限酵素消化によって産生したcDNAまたはゲノムまたはcDNAフラグメントとして)として存在する組換えDNAを包含する。また、さらなるポリペプチド配列をコードする一部のハイブリッド遺伝子である組換えDNAを包含する。
【００８９】
特記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」とは、それぞれが縮重型であって、同一アミノ酸配列をコードするあらゆるヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを包含し得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合に、「リガンド」は、標的化合物に特異的に結合する化合物である。リガンドが、異種化合物のサンプル中の化合物の存在の決定要因である結合反応において機能する場合、リガンド(例えば、抗体)は、化合物と「特異的に結合する」かまたは「特異的に免疫活性である」。従って、特定のアッセイ(例えば、イムノアッセイ)条件下では、該リガンドは、特定化合物に優先的に結合し、サンプル中に存在する他の化合物と有意な程度まで結合しない。例えば、抗体は、イムノアッセイ条件下で生じた抗体に対してエピトープを持つ抗原と特異的に結合する。多様なイムノアッセイフォーマットは、特定抗原と特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、抗原と特異的な免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために通例的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件については、Harlow and Lane, 1988,  Antibodys, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい。
【００９１】
本明細書で使用される場合に、「結合」なる用語は、2つの群との連結を示すものである。該連結は、共有または非共有のいずれかであり、イオン結合、水素結合および疎水性/親水性相互作用を包含し得るが、これに限定するものではない。
【００９２】
本明細書で使用される場合に、「リンカー」なる用語は、共有的にまたは非共有的いずれか、例えばイオンまたは水素結合またはファンデルワールス相互作用を介して、2つの他の分子を結合する分子を示す。
【００９３】
「避妊を調節すること」とは、避妊を減少または増加させることを意味する。例えば、受精を阻害することは、避妊を調節することを意味する。
【００９４】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドを含む、ホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、シロキサン、炭酸塩、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋したホスホロアミデート、架橋したメチレンホスホネート、架橋したホスホロアミデート、架橋したホスホロアミデート、架橋したメチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋したホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびかかる結合の組合せを含む、あらゆる核酸を意味する。また、核酸なる用語は、生物学的に生じる５つの塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基を含む核酸を包含する。従来の表記は、ポリヌクレオチド配列を説明するために本明細書において使用される：１本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は5'末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を5'方向と言う。新生RNA転写物に対する5'から3'方向へのヌクレオチドの付加を、転写方向という。mRNAと同一配列を持つDNA鎖を「コード鎖」と称す；DNA上の参照点に対して5'に位置するDNA鎖上の配列を「上流配列」と称す；DNA上の参照点に対して3'であるDNA 鎖上の配列を「下流配列」と称す。
【００９５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一般的に約50個以下のヌクレオチドを一般的に短鎖ポリヌクレオチドという。ヌクレオチド配列がDNA 配列(即ちA、T、G、C)によって示される場合に、この配列が「U」が「T」に置換したRNA 配列 (即ちA、U、G、C)をも包含することは、理解されるであろう。
【００９６】
「操作可能に結合した」は、構成要素が通常の機能を果たすように構成された並列を表す。従って、コード配列に操作可能に結合した制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現に効果を発揮できる。2つのポリヌクレオチドを説明することによって、「操作可能に結合した」は、一本鎖または二本鎖核酸部分が、2つのポリヌクレオチドの少なくとも一つがもう片方に対して特徴付けられることによって生理学的な効果を発揮し得るような方法で、該核酸部分内に配置された2つのポリヌクレオチドを含むということを意味する。例示としては、遺伝子のコード領域に操作可能に結合されたプロモーターは、コード領域の転写を促進できる。
【００９７】
本明細書で使用される場合に、「ペプチド」とは、2以上のアミノ酸残基の配列からなり、該アミノ酸は、ペプチド結合によって共有結合している天然または合成(非天然)アミノ酸である。タンパク質のまたはペプチドの配列を含み得るアミノ酸残基の数に対する制限はない。本明細書に用いたように、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる用語は互換的に使用される。ペプチド擬体には、次に示す1以上の修飾を有するペプチドが包含される：
１．1つまたはそれ以上のペプチジル-C(O)NR-連結（結合）が、非ペプチジル連結、例えば-CH２-カルバメート連結（-CH２OC(O)NR-）、ホスホネート連結、-CH２-スルホンアミド（-CH２-S(O)２NR-）連結、尿素（-NHC(O)NH-）連結、-CH２-第二級アミン連結によって、あるいはアルキル化ペプチジル連結（-C(O)NR-）（ここで、Rは、C１-C４アルキルである）で置換されているペプチド；
２．N末端が、-NRR１基に、-NRC(O)R基に、-NRC(O)OR基に、-NRS(O)２R基に、−NHC（O)NHR基（ここで、RおよびR１は水素であるか、またはRおよびR１の両方が水素でない場合にはC１-C４アルキルである）に誘導されているペプチド；
３．C末端が、R２がC１-C４アルコキシからなる群から選択される-C(O)R２、およびR３およびR４が水素およびC１-C４アルキルからなる群から独立して選択される-NR３R４に誘導されているペプチド。
【００９８】
ペプチドの天然アミノ酸残基は、次のようにIUPAC IUB 生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される以下の略語により略される：フェニルアラニンはPheまたはFであり；ロイシンはLeuまたはLであり；イソロイシンはIleまたはIであり；メチオニンはMetまたはMであり；ノルロイシンはNleであり；バリンはValまたはVであり；セリンはSerまたはSであり；プロリンはProまたはPであり；スレオニンはThrまたはTであり；アラニンはAlaまたはAであり；チロシンはTyrまたはYであり；ヒスチジンはHisまたはHであり；グルタミンはGlnまたはQであり；アスパラギンはAsnまたはNであり；リシンはLysまたはKであり；アスパラギン酸はAspまたはDであり；グルタミン酸はGluまたはEであり；システインはCysまたはCであり；トリプトファンはTrpまたはWであり；アルギニンはArgまたはRであり；グリシンはGlyまたはG、およびXはすべてのアミノ酸である。その他の天然のアミン酸としては、例えば4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリジン、および類似物がある。
【００９９】
合成または非天然アミノ酸は、インビボで天然に存在しないアミノ酸のことをいうが、いずれにしても本明細書に記載のペプチド構造に組み込まれ得る。得られる「合成ペプチド」は、ペプチド中の1箇所、2箇所またはそれ以上の箇所でアミノ酸を遺伝子的にコードされた、20個の天然アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。例えば、合成を容易にするためにトリプトファンにナフチルアラニンを置換してもよい。ペプチド中に置換され得る他の合成アミノ酸には、L-ヒドロキシプロピル、L-３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、α−アミノ酸、例えばL-α-ヒドロキシリシル（hydroxylysyl）およびD-α-メチルアラニル、L-α-メチルアラニル、β-アミノ酸およびイソキノリルが含まれる。Dアミノ酸および非天然合成アミノ酸もまた、ペプチド中に組み込むことができる。他の誘導体には、２０個の遺伝子にコードされたアミノ酸（またはすべてのLもしくはDアミノ酸）の天然の側鎖をその他の側鎖で置換されたものが含まれる。
【０１００】
本明細書で使用される場合に、「医薬上許容し得る担体」なる用語は、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水などの標準的な医薬担体、エマルジョン、例えば油／水または水／油乳剤など、および様々な潤滑剤のいずれをも含む。該用語には、この用語はまた、ヒトを含む哺乳動物における使用について、アメリカ合衆国連邦政府の規制機関により承認された、またはアメリカ薬局方に列記されているあらゆる薬剤を包含する。
【０１０１】
「ポリリンカー」は、3つまたはそれ以上の連結した一連の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む核酸配列である(即ち、各部位の間が10未満のヌクレオチド)。
【０１０２】
「ポリヌクレオチド」とは、核酸の一本鎖または平行および逆平行鎖をいう。即ち、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合に、用語「プロモーター/調節配列」とは、プロモーター/調節配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。幾つかの例において、この配列はコアプロモーター配列であり得るし、別の例においてはこの配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列およびその他の調節エレメントも包含し得る。プロモーター/調節配列は、例えば組織特異性様式において遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１０４】
「構成的プロモーター」とは、細胞内で一定の様式で操作可能に結合し得る遺伝子の発現を促進するプロモーターをいう。例を上げると、細胞性のハウスキーピング遺伝子の発現を促進するプロモーターは、構成的プロモーターであると考えられる。
【０１０５】
「コアプロモーター」とは、プロモーター機能にとって重要なヌクレオチド配列を含有し、TATA ボックスおよび転写開始部位を包含する。この定義によると、コアプロモーターは、活性を強めるかまたは組織特異性活性を付与する特異的配列の非存在下で、検出し得る活性を有していてもいなくてもよい。
【０１０６】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするか、または特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合した場合に、プロモーターに対応するインデューサーが細胞中に存在する場合にのみ実質的に生存細胞で産生される遺伝子産物をもたらすヌクレオチド配列である。
【０１０７】
本明細書で使用される場合に、「非天然プロモーター」なる用語は、コード配列と操作可能に結合された任意のプロモーターを示し、該コード配列および該プロモーターは天然には関係していないプロモーター（すなわち組換えプロモーター／コード配列構築体）を意味する。
【０１０８】
「組織特異的」プロモーターは、遺伝産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと操作可能に結合した場合に、実質的には該細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞型である場合にのみ、実質的に生存細胞中で産生されるべき遺伝産物をもたらすヌクレオチド配列である。
【０１０９】
本明細書で使用される場合に、「核酸」、「DNA」および類義語にはまた、核酸アナログ、すなわちリン酸ジエステル主鎖以外の主鎖を有するアナログが含まれる。例えば、当分野で既知であり、リン酸ジエステル結合の代わりに主鎖にペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合に、核酸に用いたような「フラグメント」なる用語は、通常、少なくとも約20個のヌクレオチド長であり、一般的には少なくとも約50個のヌクレオチドであり得る、より典型的には、約50〜約100個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100〜約200個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約200個のヌクレオチド〜約300個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約300〜約350、さらに好ましくは少なくとも約350〜約500ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約500〜約600、さらに好ましくは少なくとも約600ヌクレオチド〜約620ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約620〜約650、および最も好ましくは核酸フラグメントが約650以上のヌクレオチド長である。
【０１１１】
特記しなければ、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重型であって、同一アミノ酸配列をコードするあらゆるヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびRNAを包含するヌクレオチド配列は、イントロンを包含し得る。
【０１１２】
本明細書で使用される場合に、末端アミノ基に関する「保護基」は、ペプチドの末端アミノ基をいい、この末端アミノ基は、従来的にペプチド合成で用いた任意の多様なアミノ末端保護基と結合する。かかる保護基は、例えばアシル保護基、例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニルおよびメオキシスクシニルを包含する；芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル；および脂肪族ウレタン保護基、例えばtert-ブトキシカルボニルまたはアダマンチルオキシカルボニルを包含する。適切な保護基については、GrossおよびMienhofer, eds., The Peptides, vol. 3, pp. 3-88 (Academic Press, New York, 1981)を参照されたい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合に、末端カルボキシ基に関する「保護基」は、ペプチドの末端カルボキシルをいい、この末端カルボキシル基は、任意の多様なカルボキシル末端保護基と結合する。かかる保護基には、例えばtert-ブチル、ベンジルまたはエステル、またはエーテル結合を介して末端カルボキシル基に結合した他の許容し得る基を包含する。
【０１１４】
本明細書で使用される場合に、用語「精製された」および類義語は、天然環境中の分子または化合物と一般的に関係する他の構成成分と比べて、該分子または該化合物を多く含むことに関する。「精製された」なる用語は、処理中に特定分子の完全な精製が達成されること示す必要はない。本明細書で用いたように「高度に精製された」化合物とは、90%以上の純度である化合物をいう。特に、精製された精細胞DNAは、精製された精細胞DNAのPCR増幅に対して、および増幅したDNAの連続分析に対して非精細胞DNAの有意な検出できるレベルを生じないDNAをいう。
【０１１５】
「組換えポリヌクレオチド」とは、互いに天然では連結しない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅されたか、またはアッセンブルした組換えポリヌクレオチドは、適当なベクターに包含され得るし、該ベクターは適当な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。組換えポリヌクレオチドは、非コード機能(例えば、プロモーター、複製起源、リボゾーム結合部位など)も果たし得る。
【０１１６】
組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、「組換え宿主細胞」という。遺伝子は組換え宿主細胞において発現され、該遺伝子は「組換えポリペプチド」を産生する組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１１７】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドの発現に対して産生されるものである。
【０１１８】
本明細書に使用したように、「サンプル」とは、好ましくは対象由来の生物学なサンプルを示し、正常な組織サンプル、罹患組織サンプル、生検、血液、唾液、糞便、精子、涙および尿を包含するが、これらに限定しない。サンプルは、目的とする細胞、組織または液体を含む対象から得られた物質のあらゆる起源であり得る。サンプルは細胞または組織培養物から得られ得る。
【０１１９】
本明細書で使用される場合に、「二次抗体」なる用語は、別の抗体(一次抗体)の定常領域に結合する抗体をいう。
【０１２０】
「シグナル配列」なる用語は、細胞内でペプチドがとる経路を導く、即ち細胞内のポリペプチドの細胞プロセシングを指示するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味する、細胞からのポリペプチドの最終的な分泌を包含するが、これに限定するものではない。シグナル配列は、小胞体へのポリペプチドの合成を標的とするポリペプチドのアミノ末端で通常（独占的というわけではないが）見出されるアミノ酸配列である。いくつかの例において、該シグナルペプチドは、タンパク質分解的にポリペプチドから除去される、従って成熟タンパク質には存在しない。
【０１２１】
本明細書で使用される場合に、「固体支持体」は、多様な化合物と連結(好ましくは共有結合)を形成し得る、溶媒の不溶性基質に関する。該支持体は、天然生物学的なもの、例えばこれに限定するものではないが細胞またはバクテリオファージ粒子など、あるいは合成のもの、例えばアクリルアミド誘導体、アガロース、セルロース、ナイロン、シリカまたは磁性粒子であるがこれに限定するものではない。
【０１２２】
本明細書で使用される場合に、「特異的に結合する」なる用語は、特定（対象とする）分子(例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体)を認識し、結合するが、サンプル中の特定分子以外を実質的に認識または結合しない抗体または化合物を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用される場合に、「精子特異的」とは、その他の細胞よりも精子でより高いレベルで存在するか、または精子中に独占的に存在する抗原を意味する。
【０１２４】
本明細書で使用される場合に、「標準」なる用語は、比較のために使用される何らかのものをいう。例えば、標準とは、コントロールサンプルに対して用いられるかまたは添加され、そして試験サンプル中の該化合物を測定する場合に結果を比較するために使用される既知の標準薬剤または化合物であり得る。標準とは、例えば、サンプルに既知の量で添加される薬剤または化合物などおよびサンプルが処理されるか、また目的のマーカーが測定される前に精製あるいは抽出方法に供される場合に、精製または回収率としてかかるものを決定する際に有用である「内部標準」とも言うことができる。
【０１２５】
分析、診断または処置の「対象」は動物である。かかる動物は哺乳動物、好ましくはヒトを包含する。
【０１２６】
「実質的に純粋」なる用語は、自然にはそれに伴う成分とは分離されている化合物、例えばタンパク質またはポリペプチドを説明するものである。通常、化合物は、サンプル中の物質(重量、湿重量または乾燥重量、またはモル%またはモル分画)の少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも75%、さらに好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも99%が、目的とする化合物である場合に実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法、例えばポリペプチドの場合には、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定されうる。化合物、例えばタンパク質は、また天然に関連のある成分を主に含まない場合、またはその天然状態ではそれを伴う天然の混在物から分離される場合にも、実質的に精製されている。
【０１２７】
本明細書で使用される場合に、「実質的に純粋な核酸」は、天然状態においてそれを挟む配列から精製されている核酸配列、セグメント、またはフラグメント、例えば、そのフラグメントに通常隣接する配列、例えば天然に生じるゲノムにおいて該フラグメントに隣接する配列が除去されたDNAフラグメントをいう。この用語は、天然には核酸、例えばRNAまたはDNAを伴う他成分または細胞中で核酸が天然に伴うタンパク質から実質的に精製されている核酸にもあてはまる。
【０１２８】
「治療的」処置とは、病理的徴候の減退または排除を目的とした病理徴候を示す対象に用いた処置である。
【０１２９】
化合物の「治療上有効量」とは、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
【０１３０】
本明細書で使用される場合に、用語「トランスジーン」とは、アミノ酸配列をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーター/調節配列をコードする核酸を含む外来核酸配列を意味し、この外来核酸は、トランスジェニック哺乳動物によってコードされる。
【０１３１】
本明細書に使用したように、「トランスジェニック哺乳動物」なる用語は、該哺乳動物の胚細胞が外来核酸を含む哺乳動物を意味する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合に、「トランスジェニック細胞は、導入された核酸配列にコードされた遺伝子を発現できるように細胞に導入された、核酸配列を含む任意の細胞であって。
【０１３３】
本明細書で使用される場合に、「処置する」なる用語は、特定の障害または症状の予防、または特定の障害または症状に関連する徴候の緩和、および／または該徴候の予防または排除を包含する。「予防的」処置は、該疾患に関連のある病理学的進行のリスクを低下することを目的とする、疾患の徴候を示さないか、または疾患の初期徴候のみを示す対象に投与された処置である。本明細書に使用したように、「処置する」なる用語は、特異的疾患、障害または症状と関連のある徴候を緩和すること、および／または該徴候を予防または排除することを包含する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合に、「ワクチン」なる用語は、哺乳動物に該物質を投与し、免疫性を付与した後に、免疫応答を起こすために使用した物質として定義される。哺乳動物中に接種した場合に、該物質は、T細胞応答を含む細胞性免疫応答または一般的に抗体産生をもたらすB 細胞応答を含む体液性免疫応答を刺激するのに効果的である。このT細胞応答とは、細菌によって産生された巨大分子に対する細胞毒性T細胞応答であり得る。しかしながら、本発明のワクチンによるT 細胞の他の型を含むT細胞応答の誘導もまた意図される。B細胞応答は、組成物に結合する抗体の産生をもたらす。ワクチンなる用語は、予防用だけでなく治療用ワクチンも包含する。組合せワクチンとは、2以上のワクチンを組み合わせたものである。用語「抗原に対する対象を免疫化すること」とは、対象に組成物、タンパク質複合体、タンパク質複合体をコードするDNA、抗体または抗体をコードするDNAを投与すること、抗原に対する保護をヒトに提供するヒトにおける免疫応答を誘導することを意味する。 
【０１３５】
「ベクター」とは、単離核酸を含み、該単離核酸を細胞の内部に送達させるために使用され得る物体（matter）の構成を意味する。多くのベクターは、当業者には知られており、直線状のポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性の化合物、プラスミドおよびウイルスと関連のあるポリヌクレオチドを包含するが、これらに限定するものではない。このように、「ベクター」なる用語とは、自発性複製プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語は、核酸を細胞に移送するのに有効な非プラスミドおよび非ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどを包含すると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例示には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ラムダファージベクターなどが包含されるが、これに制限するものではない。
【０１３６】
「発現ベクター」とは、発現されるべきヌクレオチド配列と作動可能に結合した発現コントロール配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なcis作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、当業者にはよく知られている全てのものを包含する、例えばコスミド、プラスミド(例えば、そのままで、またはリポソーム中に含有された)および組換えポリヌクレオチドを組み込んだウイルスである。
【０１３７】
本発明は、もしヒトおよびマウスのオスの胚細胞に限らなければ、精巣に豊富であり、および優先的に発現されるキナーゼのファミリー(tsskキナーゼファミリー)に関する。さらに具体的には、本発明は、避妊を調節する際のtssksおよびこれらタンパク質の使用に関する。
【０１３８】
本発明は、キナーゼファミリーの基質にもまた関する。一態様において、基質はtsksである。一態様において、このtsksは、アミノ酸配列、配列番号:30、またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその相同体を含む。
【０１３９】
tsskキナーゼの発生時の発現パターンならびに生理学的過程におけるキナーゼの一般的な関連性により、出願人は精巣に豊富に存在するこのキナーゼのこのファミリーが精子形成の一端を担うと考える。tsskキナーゼファミリーおよび推定基質の1つが精子形成中の同時期に発現するという知見は、避妊薬の標的としてこれらタンパク質の使用可能性に繋がる。従って、本発明の一態様は、ヒトtssk相同体の単離、およびtsskキナーゼ活性を阻害する薬剤を単離する際のそれらの使用に関する。次いで、かかる阻害剤は、受精を阻害するための避妊薬剤として使用できる。
【０１４０】
ヒトtssk3のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列番号:3および配列番号:6として各々提供される。近年、同様のマウスタンパク質キナーゼが述べられており、そして精巣特異的セリンキナーゼ3(マウスtssk3) (Zuercher et al., 2000, Mech Dev 93, 175-7)、精巣特異的タンパク質キナーゼのスモールファミリー(Bielke et al., 1994, Gene 139, 235-9; Kueng et al., 1997, J Cell Biol 139, 1851-9)のメンバーとして同定された。この相同性にもかかわらず、ヒトtssk3およびマウスtssk3bのcDNAの両方が、マウスtssk3といくつかのアミノ酸において相違を示す。
【０１４１】
ヒトtssk1の核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号:1および配列番号:4として各々提供される。ヒトtssk 2の核酸配列およびアミノ酸配列は、配列番号:2および配列番号:5として各々提供される。ヒトtsskファミリーの第４のメンバーは、tssk 4と称される。tssk 4の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号:19および配列番号:20として各々提供する。
【０１４２】
ヒトtsksの核酸およびアミノ酸配列は、配列番号:39および40として各々提供される。
【０１４３】
本発明の一実施態様に従って、精製ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号：5、配列番号:6、配列番号:20または配列番号:40のアミノ酸配列、あるいは1つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換により配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:20または配列番号:40とは異なるアミノ酸配列を含んで提供される。他の実施形態において、精製ポリペプチドは、５個未満の保存的アミノ酸置換、更なる実施形態においては、2以下の保存的アミノ酸置換により配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:20または配列番号:40とは異なるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、精製ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号：5、配列番号:6、配列番号:20または配列番号:40のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
本発明のポリペプチドは、組換え技術により産生されるポリペプチドの安定化および／または精製を補助する付加的なアミノ酸配列を含んでいても良い。このような付加的な配列は、当業者に既知の細胞内−または細胞間の標的ペプチドもしくは様々なペプチドタグを含んでいても良い。一実施態様において、精製ポリペプチドは、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:20および配列番号:40からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびに、該ペプチド配列に連結されたペプチドタグを含む。かかる融合タンパク質および適当なペプチドタグを発現するための適当な発現ベクターは、当業者に既知であり、商業的に購入し得る。一実施態様において、該タグはHisタグを含む。
【０１４５】
別の実施態様において、本発明は、tsskまたはtsksポリペプチドのフラグメントを含む精製ポリペプチドに関する。さらに具体的には、このtssk ポリペプチドフラグメントは、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:9、配列番号:20からなる群から選択される完全長ポリペプチドの天然または合成タンパク質から成り、それらはその天然リガンドに特異的に結合できる。一実施態様において、このヒトtsskフラグメントは、tsksへの結合能を維持している。一態様において、該tsksは、配列番号:40、またはその生物学的に活性なフラグメントまたはその相同体からなるポリペプチドを含む。
【０１４６】
本発明は、ヒトtsskをコードする核酸配列を包含する。一実施態様において、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:10、配列番号:19またはそれらのフラグメントの核酸配列を含んで提供される。別の実施態様において、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3および配列番号:19からなる群から選択される、精製核酸配列が提供される。
【０１４７】
一実施態様において、本発明は、tsksをコードする核酸配列を含む単離核酸を提供する。一実施態様において、核酸配列は、配列番号:40、またはそのフラグメントまたは相同体からなるアミノ酸配列を含むtsksをコードする。一態様において、核酸配列は配列番号:39を含む。
【０１４８】
本発明は、組換え体ヒトtsskおよびtsks遺伝子構築体に関する。一実施態様において、組換え遺伝子構築体は、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:19および配列番号:39からなる群から選択される核酸配列と操作可能に結合した非天然プロモーターを含む。非天然プロモーターは、予め決定された宿主細胞での発現を可能にする強力な構成的プロモーターが好ましい。これらの組換え遺伝子構築体は、tssk遺伝子産物を合成するトランスジェニック細胞系を作り出すために宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、多種多様な真核生物および原核生物から選択可能であり、2つの好ましい宿主細胞はE. coliおよび酵母細胞である。
【０１４９】
一実施態様に従って、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:19および配列番号:39からなる群から選択される核酸配列を、適当な調節配列に操作可能に関連させる形式で真核生物または原核生物発現ベクター中に挿入し、およびヒトtsskまたはtsksが適当な真核生物または原核生物細胞宿主細胞において発現される。適当な真核生物宿主細胞およびベクターは当業者に既知である。バキュロウイルス系もまた、本発明のトランスジェニック細胞を作成すること、および本発明のtssk遺伝子を合成することに適している。本発明の一態様は、ヒトtssksまたはtsksおよびヒトtssksまたはヒトtsksのフラグメントを発現する組換え遺伝子を含有するトランスジェニック細胞系に関する。本明細書に示したように、トランスジェニック細胞は、外来から導入された核酸配列を含むあらゆる細胞である。
【０１５０】
一実施態様において、導入された核酸は、トランスジェニック細胞中で十分に安定であり（すなわち、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはハイコピープラスミドに存在する）、子孫細胞に受け継がれる。該細胞は、標準的な細胞培養法を用いてインビトロ増殖させてもよいし、または別の実施形態においては、宿主細胞が真核細胞であり、例えばトランスジェニック動物を含む動物の一部として増殖させてもよい。一実施態様において、トランスジェニック細胞はヒト細胞であり、および配列番号:1、配列番号：2、配列番号:3、配列番号:7、配列番号:19および配列番号:39からなる群から選択される核酸配列を含む。一実施態様において、トランスジェニック細胞は、組換え体核酸配列を含んでおり、ここで、該組換え体核酸配列またはそのフラグメントは非天然プロモーターと操作可能に連結される。本発明は、ヒト以外のトランスジェニック生物であって、このトランスジェニック生物の1つまたはそれ以上の細胞が、ヒトtsskおよび／またはtsks産物を発現する組換え遺伝子を含む。
【０１５１】
本発明は、ヒトtssksおよびtsksを産生する方法を包含する。該方法は、ヒトtsskをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸配列を宿主細胞に導入する工程、および該導入されたヒトtssk遺伝子の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。一実施態様において、プロモーターは条件付きまたは誘導可能なプロモーターであるか、あるいはプロモーターは組織特異的または時間的に制限されたプロモーター（すなわち、操作可能に連結された遺伝子が特定の組織においてまたは特定の時間でのみ発現する）であってもよい。合成されたtssksおよびtsksは、標準的な技術を用いて精製することができ、これをハイスループット・スクリーニングに用いてtsskおよび／またはtsks活性阻害剤を同定することができる。あるいは、一実施態様において、組換え技術により生成されたポリペプチドまたはそのフラグメントは、このポリペプチドに対する抗体の産生に使用される。組換え技術により生成されたタンパク質は、結晶構造を得るために用いることもできる。かかる構造を結晶学的分析することにより、tsskまたはtsksを阻害する特異的な薬剤の設計が可能となろう。
【０１５２】
好ましくは、精子特異的キナーゼまたはtsksをコードする核酸配列を、予め選択された宿主細胞で発現させるために適当な調節配列と該遺伝子配列を操作可能に連結させる形式で、適当な発現ベクター中に挿入する。好適な宿主細胞、ベクターおよび細胞へのDＮＡ構築体の導入方法は、当業者に既知である。特に、精子特異的キナーゼをコードする核酸配列を、送達手段、例えば、リポソーム、ウイルスベクターまたはマイクロインジェクションなどを用いて、インビトロまたはインビボにて細胞または細胞群に加えることができる。
【０１５３】
本発明は、tsskおよびtsksタンパク質の発現を阻害するために有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１５４】
一実施態様に従って、組成物は、精製された本発明のtsskまたはtsksペプチド、またはその抗原性フラグメントを含んで提供される。該組成物は、免疫応答を誘導するために、医薬上許容し得る担体またはアジュバンドと組合せ得るし、哺乳類に投与されてもよい。
【０１５５】
本発明の別の実施態様は、個々のtsskまたはtsksアイソタイプに特異的な抗体に関する。一実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の抗体または抗体フラグメントは、担体または希釈液と組み合わせて組成物を形成できる。一実施態様において、該担体は医薬上許容される担体である。かかる担体および希釈液は、水および油などの滅菌液を包含し、所望により界面活性剤、ならびに補助剤、賦形剤または安定剤を含む他の医薬上および生理学上許容される担体をさらに含んでもよい。油の例示として、石油性、動物性、植物性、または合成性の油、例えば落花生油、ダイズ油または鉱物油がある。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが液体担体として、特に注射可能な溶液として好ましい。
【０１５６】
ヒトtssksおよびtsksに対する抗体は、当分野で周知の方法にて産生することができる。一実施態様に従って、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:20および配列番号:40からなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。該抗体は、修飾有りか修飾無しで用いることができるし、抗体とレポーター分子を共有結合で若しくは非共有結合で連結させて標識されてもよい。加えて、抗体は、治療上または診断上の組成物を調製するために標準的な担体と共に処方され、場合によっては標識されても良い。
【０１５７】
抗体の産生のために、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを包含する様々な宿主動物を、本発明のポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントを注射して免疫することもできる。免疫応答を増大させるために、様々なアジュバンドを宿主種に応じて使用してもよく、フロインド（Freund's）（完全または不完全）、無機ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールなど、および潜在的に有用なヒトアジュバンド、例えばBCG カルメット・ゲラン(Calmette-Guerin)桿菌）およびコリネバクテリウム-パルバム（corynebacterium parvum）などが含まれるが、これに限定するものではない。
【０１５８】
モノクローナル抗体の調製について、培地中の継代細胞系による抗体分子の産生を提供するあらゆる技術を用いることができる。例えば、初めにKohlerおよびMilsteinにより開発されたハイブリドーマ技術（1975, Nature 256:495-497)並びにトリオーマ（trioma）技術、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) が挙げられる。本発明のさらなる実施態様において、モノクローナル抗体は、最新の技術を利用した無菌動物にて産生することもできる(PCT/US90/02545)。本発明に従って、ヒト抗体を使用し得るし、ヒトハイブリドーマを用いることによって(Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)またはヒトB細胞をインビトロにてEBVウイルスで形質転換させることによって(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96)獲得し得る。実際に、本発明に従って、目的とするペプチドのエピトープに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分詞由来の遺伝子と共にスプライシングすることによって「キメラ抗体」(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)の産生について開発された技術を用いることもできる；そのような抗体は本発明の範囲内にある。
【０１５９】
本発明に従って、一本鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第4,946,778)を、卵細胞表面のタンパク質特異的一本鎖抗体を生成するために適応することもできる。本発明のさらなる実施態様は、tsskエピトープに関して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とするための、Fab発現ライブラリーの構築について記載された技術(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)を利用する。
【０１６０】
分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントを、既知技術により生成することができる。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成することができるF(ab')2フラグメント；F(ab')2 フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるFab'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成することができるFabフラグメント、およびFvフラグメントが挙げられるが、これに限定するものではない。
【０１６１】
抗体の産生において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当分野で既知の技術、ELISA (酵素結合免疫吸着アッセイ)により達成することができる。前記抗体は、本発明のtsskまたはtsksタンパク質の局在および活性のための、例えばこれらのタンパク質のイメージング、適当な生理学的サンプルにおける診断方法におけるそれらのレベル測定に関する当分野で既知の方法に用いることができる。本発明に従って生成された抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（すなわち「ヒト化」抗体）一本鎖（組換え体）、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーにより生成されるフラグメントを包含し得るが、これに限定されない。
【０１６２】
本発明はまた、ヒトtsskおよびtsksの存在を検出する方法を提供する。この方法には、サンプルをヒトtsskまたはtsksと特異的に結合する標識抗体と接触させる工程、結合していない物質および非特異的結合物質を除去する工程、および標識抗体の存在を検出する工程が含まれる。一実施態様において、標識化合物は、直接または間接的に（すなわち、標識二次抗体を介して）標識される抗体を含む。特に、本発明のtssk抗体は、tsskおよび／またはtsksの発現、並びにその細胞内局在性を確認するために用いることができ、または避妊手段としてtsskおよび／またはtsks抑制組成物を受容する患者をモニターするアッセイに用いることができる。
【０１６３】
tssksおよびtsksは、精巣にのみ産生されるわけではないが、精巣に非常に豊富に存在する。これにより、tsskキナーゼおよびtsksは、精子変態におけるtssksのの役割を研究するためにその活性を制御する薬剤の同定および開発のための最適な標的となる。さらに、tsskおよび／またはtsks合成、レベルおよび活性の阻害剤は避妊薬剤として有用であると予想される。本発明の一態様に従って、新tsskキナーゼファミリーは、新規薬剤、即ちtsskの合成、レベルまたは活性を阻害する薬剤の同定および開発のための標的として使用される。一態様において、該標的はtsksである。ハイスループット・スクリーニングと組み合わせた組合せ化学的方法を用いた低分子ライブラリィー生成分野の発展により、理想的な細胞浸透性阻害剤の探索が促進された。さらに、結晶学的方法を用いた構造に基づく設計により、リガンド設計に活用できるリガンド−タンパク質相互作用部位を詳細に特徴付ける能力が向上している。
【０１６４】
一実施態様において、本発明は、tssk1、tssk2、tssk3、tssk4またはtsks、またはその生物活性フラグメントの配列を含むポリペプチドと相互作用する薬剤、低分子またはタンパク質、またはその生物活性断片をスクリーニングする方法を提供する。本明細書に示したように、tssk1、tssk2、tssk3およびtssk4およびtsksの「生物学的に活性なフラグメント」または「生物活性フラグメント」なる用語は、tsksを包含するそれぞれの天然tssk1、tssk2、tssk3およびtssk4ポリペプチドの少なくとも一つの天然リガンドに特異的に結合できる天然ペプチドの天然または合成の部分を包含する。本発明は、tssk1、tssk2、tssk3およびtssk4と結合するかまたはその活性を調節し、それゆえ治療上または診断上の避妊についてのマーカーとして有用である低分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーニングするためのインビボおよびインビトロのアッセイ両方を包含する。
【０１６５】
本発明の一実施態様において、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6および配列番号:20からなる群から選択されるtssk ポリペプチドは、生理学的条件下でtsskと結合するリガンドを単離するために使用される。スクリーニング方法には、tsskまたはtsksポリペプチドを生理学的条件下で化合物の混合物と接触させる工程、結合していない物質および非特異的に結合している物質を除去する工程、tsskポリペプチドと結合して残留する化合物を単離する工程が含まれる。一般的に、標準的な技術を用いて、tsskまたはtsksポリペプチドを固体支持体に結合させることで化合物を迅速にスクリーニングできる。固体支持体は、生物学的化合物を固定するのに使用される表面のいずれかから選択することができ、ポリスチレン、アガロース、シリカまたはニトロセルロースを含むが、これに限定するものではない。一実施態様において、固体表面には、機能化されたシリカまたはアガロースビーズが含まれる。かかる化合物についてのスクリーニングは、当業者に既知の医薬製剤のライブラリーおよび標準的な技術を用いて達成することができる。
【０１６６】
次いで、tsskおよびtsksポリペプチドと結合するリガンドは、インビトロ・キナーゼアッセイ、例えば本明細書で説明されるか、または当業者には既知のアッセイの使用を通じて、アゴニストおよびアンタゴニスト活性についてさらに分析することができる。tsskキナーゼおよびtsksの合成、レベルおよび活性の阻害剤は、精子の成熟/受精能獲得を妨害する薬剤として使用する可能性を有する。一実施態様に従って、tssksおよびtsksの阻害剤は、潜在的な避妊薬剤として単離される。かかる阻害剤は、医薬組成物として処方され、精子形成を阻害するために対象に投与されることで、避妊のための手段を提供し得る。
【０１６７】
一実施態様に従って、ヒトtsskキナーゼ活性の特異的阻害剤は、リン酸化事情を検出することができるインビトロキナーゼアッセイの使用を通じて同定される。一実施態様において、tsskキナーゼ活性の阻害剤の同定方法は、標識されたリン酸塩供給源を、1つまたはそれ以上の潜在的阻害化合物の存在下で、1つまたはそれ以上のヒトtsskポリペプチドと組み合わせることを含む。該反応は、潜在的阻害化合物の非存在下で、tssk基質(即ちtsks)またはtssk酵素それ自身のリン酸化を開始するのに適切な標準条件下で実行される。
【０１６８】
tssk活性の低下は、時間に対するキナーゼ活性をプロットした標準曲線とアッセイ中のリン酸化されたtssk基質の量とを比較することにより検出することができる。あるいは、キナーゼ活性における阻害低下は、第2のキナーゼ反応を実施することによって検出することもでき、ここで標識されたリン酸化供給源、tssk基質およびtsskキナーゼを含むインビトロ キナーゼアッセイ組成物を、試験アッセイ（このアッセイは潜在的な阻害化合物の存在下で実施される）で用いて条件と同一の条件を用いたキナーゼ活性が発揮される条件下でインキュベートする。次いで、試験アッセイにより生成したリン酸化されたtssk基質の量と、第二のキナーゼアッセイ（候補阻害剤の非存在下で実施される）により生成したリン酸化されたtssk基質の量を比較し、候補化合物のtssk阻害効果を検出する。
【０１６９】
一実施態様において、tsskおよびtsksの合成およびレベルの特異的阻害剤は、当業者には既知のアッセイを用いて同定される。
【０１７０】
化合物がtsskおよび／またはtsksの合成、レベルおよび活性を阻害することが同定されると、これらの化合物を単離するためにさらなる試験を行う必要があろう。一実施態様に従って、tsskおよびtsks阻害剤を同定する方法は、候補化合物が、リン酸標識源、キナーゼ基質および非tsskキナーゼを含むコントロール組成物と接触させる第二の反応を行う工程、および該候補化合物が非tsskキナーゼ活性を低下させるかどうかを決定する工程が含まれる。
【０１７１】
本発明の一実施態様には、オスの哺乳動物の受精能力を低下させることに関するものであって、該方法は、tsskキナーゼファミリー(tssk1、tssk2、tssk3およびtssk4を包含する)および／またはtsksの合成、レベルおよび活性を阻害するステップを含む。一実施態様において、オスの哺乳動物の受精能力は、tssk活性を特異的に干渉する物質を含む医薬組成物の投与により低下される。
【０１７２】
一実施態様において、受精能阻害組成物は、1つまたはそれ以上のtsskキナーゼの酵素活性を特異的に阻害する化学的構成要素を含む。別の実施形態において、該阻害組成物は、1つまたはそれ以上のtsskキナーゼに対する抗体を包含していてもよく、あるいは該組成物は、動物においてtsskキナーゼの発現を妨げるか中断させるアンチセンスまたは干渉RNAを含んでいてもよい。哺乳動物系における干渉ＲＮＡには、19-22ntの二本鎖RNA分子からなる短い干渉RNA (siRNA)、またはループ配列で連結した19-22ntのパリンドローム配列からなるshRNAの存在が必要とされる。遺伝子発現のダウンレギュレーシヨンは、相同なsiRNAおよび標的RNAとを組み合わせる配列特異的様式で達成される。siRNAまたはshRNAの安定な発現系は、トランスジェニック動物を作出するのに利用され(Hasuwa et al. FEBS Lett 532, 227-30 (2002), Rubinson et al. Nat Genet 33, 401 6 (2003)およびCarmell et al. Nat Struct Biol 10, 91-2 (2003))、受精能力を調節することができる動物を生成するために本発明に従って使用することができる。条件付RNAiに基づくトランスジェニック系は、動物の一生中の所定段階での遺伝子発現レベルを制御できるさらなる利点を提供するであろう。
【０１７３】
実施例１-オスの避妊の標的としてのTSSKの評価
方法
本明細書で使用した方法は当業者には知られており、次の文献に記載されている；米国特許番号6,946,275、6,924,121、6,355,480および6,258,364、米国特許公開番号20050032146、20040161825、20040161824、20040030112および20030211563、Hao ら、Molecular Human Reproduction, 10:6:433-444, 2004, Scorilasら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 285:2:400-408, 2001およびSpiridonov ら、2005, Molecular and Cellular Biology, 25:10:4250-4261、これらは出典明示により本明細書の一部として包含される。
【０１７４】
結果
TSSK 1-4である精巣特異的セリン/スレオニン キナーゼのファミリーを、オスの避妊用標的としてこれらの遺伝子/タンパク質を評価する目的でもって試験した。TSSK1、TSSK2、TSSK3およびTSSK4は、現在までにヒトおよびマウスの両方でクローニングされている特異なキナーゼのサブファミリーの4つのメンバーを構成する。各メンバーは、12のキナーゼ・サブドメインを含有し、各々は活性なキナーゼであることが予測される。TSSK1およびTSSK2は、TSSK3およびTSSK4よりも相同性が高く、かつ長いカルボキシル末端を有する。さらなる偽遺伝子と共に染色体5、22、1および19各々に対するヒトTSSK1、TSSK2、TSSK3およびTSSK4マップは、TSSK2の3kb上流に位置する。マウスTSSK1およびTSSK2はたった3 kbの遺伝子間領域にて染色体16上で接近しているため、一つの標的構築体によってTSSK1およびTSSK2両方のノックアウトマウスを作成する可能性がある。マウスTSSK3およびTSSK4は、染色体5および19に各々マッピングされる。
【０１７５】
発現プロファイリングにより、厳密には精巣特異的でなくても、全ての4つのキナーゼが精巣に豊富に含まれること、組織特異的な避妊用標的化が可能であり得るという徴候が示された。リアルタイムPCRは、TSSK1およびTSSK2の転写物が、ヒト精巣中のTSSK3およびTSSK4よりも約10倍以上豊富であることを示した。
【０１７６】
イン・シチュ・ハイブリダイゼーションにおいては、TSSK2およびTSSK4キナーゼが、それらの発現パターンにおいて減数分裂後に存在し得ること、精原細胞および精母細胞を保存することによって、可逆的な避妊診断における適用可能性を支持する知見がさらに示唆された。ポリクローナル抗体は、精巣および精子中のTSSK2およびTSSK4タンパク質をウェスタン分析により示し、そして免疫蛍光ではそれらが精子中のエクアトリアルセグメントに局在した。
【０１７７】
マウスにおいてダブルノックアウトTSSK1およびTSSK2を標的化したプラスミドを構築した。ES細胞のトランスフェクションおよび変異体マウス作成を行う。次なる研究は、精子形成および精子機能に対するマウスTSSK1およびTSSK2遺伝子の標的とされた妨害効果を試験した。
【０１７８】
TSSK1-4は、精巣特異的セリン/スレオニンキナーゼサブファミリー(表1を参照されたい）を構成する。
【０１７９】
表１
ゲノムにおける哺乳類のTSSK
【表２】
2008515797.tif 000005
【０１８０】
図1は、TSSK1、TSSK2、TSSK3およびTSSK4のアミノ酸配列の配列アルゴリズム比較をさらに提供する。最も高い相同性は、TSSK1およびTSSK2(キナーゼドメインでは83%および完全なORFの全域で72%)の間で見出される。TSSK3は、TSSK1およびTSSK2各々に47.5%および49%同一である。TSSK4は、TSSK3と49%同一である。セリン/スレオニンキナーゼについての保存配列「DLKXXN」と高度に保存されたシグニチャー配列に下線を引いた。
【０１８１】
哺乳類TSSKサブファミリーのドメイン構造を図2に示した。TSSK1-4は、活性なキナーゼであることが予測され、該キナーゼドメインは、TSSKの主要部を構成する。TSSK1およびTSSK2は、それらのカルボキシル末端でTSSK3およびTSSK4よりも長い。TSSKと他のキナーゼとのこの系統発生的関係、およびTSSKファミリーメンバー間のその関係は、図3に示される。TSSK1およびTSSK2は、TSSKファミリー内のサブファミリーを形成する。
【０１８２】
72の組織における発現の結果は、TSSK1転写物が精巣にのみ位置しており、TSSK2転写物(図5)も同様であったことを示す(図4参照)。
【０１８３】
８つの組織における発現の結果は、ヒトTSSK3(図6A)およびマウスTSSK4(図6B)は、精巣にのみ発現されたことを示す。図6Aにおいて、TSSK3 mRNAが複数のスプライス部位を持ち得ると思われる。
【０１８４】
リアルタイムPCR分析(図7A、7B、7Cおよび7D)では、15のヒト組織におけるTSSK1(7A)、TSSK2(7B)、TSSK3(7C)およびTSSK4(7D)発現を試験した。TSSK3および4の転写物を精巣においてのみ検出でき、一方でTSSK1は膵臓においても検出でき、TSSK2は心臓、脳、胎盤および肝臓においても検出できた。
【０１８５】
精巣におけるヒトTSSK1-4の相対的な発現レベルのリアルタイムPCR定量法により、ヒト精巣においてtssk1および2転写物は、TSSK3および4よりもおよそ10倍以上豊富であることを示した。(図8参照).
【０１８６】
ノックアウトマウスを構築するための実験は図9の方法を利用する。
イン・シチュにおける発現を決定する実験結果を図10に示した、これは成体マウス精巣における顕微鏡TSSK2 mRNA発現のイン・シチュでの分析の画像を示し、減数分裂後のTSSK2の発現後および精子エクアトリアルセグメントの局在性を示す。TSSK2転写物のイン・シチュ・ハイブリダイゼーションを、標識したマウスTSSK2cRNAを用いて行った。センスTSSK2(10A)またはアンチセンスTSSK2(10B)とハイブリダイズした輸精管の低倍率 (x100)視界は、暗視野で示され、アンチセンスTSSK2とハイブリダイズした輸精管の高倍率(x200、x400)視界は、明視野(10Cおよび10D)および暗視野(10Eおよび10F)の両方に示される。TSSK2転写物は、減数分裂後の精細胞で主に発現し、一方で一次精母細胞上の標識化は、バックグラウンドほど大きくない。TSSK4の発現は、図11に示され、TSSK4 mRNA 発現(成体マウス精巣において)減数分裂後の発現およびTSSK4の精子エクアトリアルセグメントの局在性を示す。TSSK4 転写物のイン・シチュ・ハイブリダイゼーションを、放射標識したマウスTSSK4 cRNAを用いて行った。センスTSSK4(11A)またはアンチセンスTSSK4 (11B)とハイブリダイズした輸精管のこの低倍率(x100)の視界は、暗視野に示され、アンチセンスTSSK4とハイブリダイズした輸精管の高倍率(x200、x400)の視界は、明視野(11Cおよび11D)および暗視野(11Eおよび11F)の両方に示される。TSSK4転写物は減数分裂後精細胞において主に発現された。
【０１８７】
ヒト精巣および精子におけるTSSK2発現のウェスタン・ブロット分析の結果を図12に示す。
【０１８８】
分析は、モデルTSSK4に対して行った。図13は、コンピューターによりモデル化したマウスTSSK4の3D構造を図示する。マウスおよびヒトTSSK4タンパク質において同じペプチド(RRAPPDFVNKFLPRE)を用いて、TSSK4に対する抗体を作成した。このペプチドがホールディグ後に分子表面上にあることを示すためにマウスTSSK4構造をモデル化した。
【０１８９】
射精された精子中のTSSK2の免疫蛍光局在化を行った(図14)。TSSK2は、アクロソーマル・キャップに若干局在しており、エクアトリアルセグメントにより強く局在した。精子のエクアトリアルセグメントにおけるTSSK2の局在性から、受精中のTSSK2の役割を示唆するものであった。
【０１９０】
マウス精巣、マウス精子およびヒト精子中のTSSK4発現のウェスタン・ブロット分析を行った(図15)。TSSK4の予測された分子サイズを有するシングルバンドを、ウサギTSSK4抗血清を用いて、マウス精子タンパク質抽出物中で検出した。一方、低分子量TSSK4タンパク質、類似のタンパク質分解生成物を、ヒト精子タンパク質抽出物中で検出した。マウス精巣由来のタンパク質抽出物における高分子量バンドは、おそらくTSSK4ダイマーである。
【０１９１】
マウスおよびヒト精子中のTSSK4の免疫蛍光局在化を行った。TSSK4は、マウスおよびヒト精子の両方でエクアトリアルセグメントに局在した。精子のエクアトリアルセグメントにおけるTSSK4の局在決定から、受精中のTSSK4の役割が示唆される。
【０１９２】
TSSKの要約
・TSSK1、2、3および4は、セリン/スレオニンキナーゼの特異なサブファミリーを構成する。
【０１９３】
・TSSK3およびTSSK4は精巣特異的遺伝子であって、組織特異的な避妊用標的化が可能であることを示唆している。
【０１９４】
・膵臓におけるTSSK1メッセンジャーおよび心臓、脳および胎盤におけるTSSK2メッセンジャーは、タンパク質レベルでの確認を要する。
【０１９５】
・TSSK2および4キナーゼは、それらの発現パターンにおいて減数分裂後に存在しており、精原細胞および精母細胞を保存することによって可逆的な避妊診断における適用可能性を強調するものである。
【０１９６】
TSSK2および4は、ウェスタン分析により精巣および精子中に見出され、免疫蛍光によって精子におけるエクアトリアルセグメントに局在していた。精子のエクアトリアルセグメントにおけるそれらの局在性から、受精中の役割が示唆されるだろう。
【０１９７】
マウスにおけるダブルノックアウトTSSK1および2を標的としたプラスミドを構築した。ES細胞のトランスフェクションおよび変異体マウス作成は進行中である。
【０１９８】
実施例２-オスの避妊用標的としてのTSKSの評価
TSKS、TSSK1およびTSSK2の基質をこれらのキナーゼとそれらの基質との相互作用を標的とし得る低分子阻害剤を同定することを目的として試験した。ヒトTSKSを、クローニングし、染色体19にマッピングした。ノーザンおよびRNAドットブロット分析は、TSKS転写物が精巣において独占的に発現されたこと、組織特異的な避妊用標的化が可能であり得るという示唆を示した。
【０１９９】
ヒトおよびマウスTSKSの両方に対するポリクローナル抗体を作成した。ウェスタン分析は、TSKSが精巣に限定され、そして成熟精子中に存在していないことを示した。分離されたヒト睾丸細胞内のTSKSの免疫蛍光局在決定により、円形の、伸張中および伸張後の精細胞内にTSKSが存在すること、一方成熟睾丸精細胞中には事実上存在しないことが明らかとなった。TSKSタンパク質は円形の精細胞中で最初に検出され、最大蛍光は伸張中の精細胞で最も高い。TSKSは、2つの蛍光スポットとして精細胞の濃縮頭部の基部に位置しており、精子の首部分の中心小体に対応している。インサイチュハイブリダイゼーションから、TSKSメッセンジャーはその発現パターンにおいて減数分裂後に存在することがさらに示唆された。この結果は、精原細胞および精母細胞を保存している間に、TSKSまたはそのTSSK1または2との相互作用を標的とする可逆的な避妊診断の可能性を強調するものである。ヒトTSKSおよびTSSK2の結合相互作用を、酵母のツー・ハイブリッド系およびインビトロ共免疫沈降によって確認した。TSKSのN末端はTSSK2との相互作用に重要であることが示された。E. coliにおいてヒト組換えTSKSおよび酵母においてはTSSK2が発現し、リン酸ペプチドマッピングのための方法をひらくものであった。
【０２００】
精巣由来の免疫沈降マウスTSKSは、インビトロキナーゼアッセイにおいてリン酸化されることが示され、これはTSKSリン酸化の阻害剤についてのハイ・スルー・プット・スクリーニングを提供する。TSSK2は、インビトロキナーゼアッセイにおいて自己リン酸化される。まとめると、TSKS/TSSK1および2基質/キナーゼは、減数分裂後の睾丸標的化の可能性を提示するものである。
【０２０１】
ヒトTSKS核酸配列(配列番号:39)およびアミノ酸配列(配列番号:40)を下記に提供する。マウス核酸配列(配列番号:42)およびアミノ酸配列(配列番号:41) を下記に提供する。ヒトおよびマウスTSKSについての核酸およびアミノ酸配列は次のとおりである:
ヒトTSKS、NCBIアクセッション番号NM_021733 (配列番号:39)
1 acccccacac catggcgagc gtggtggtga agacgatctg gcagtccaaa gagatccatg
61 aggccgggga cacccccacg ggggtggaga gctgctccca gctagtccca gaggctcccc
121 ggagggtgac cagccgggcc aaggggatcc cgaagaaaaa gaaggccgtg tcgttccacg
181 gggtggagcc ccagatgtcc catcagccca tgcactggtg cctgaacctc aaacggtcct
241 cggcctgcac caacgtgtca ctgctcaacc tggccgccat ggagcccact gactccacgg
301 ggacagactc cacagtggaa gacctcagcg gccaactcac actggctggg ccccctgcct
361 cccctaccct accctgggat ccggatgacg cagacatcac ggaaatcctg agtggggtca
421 acagtggatt ggtccgcgcc aaagactcca tcaccagctt gaaggaaaag accaaccggg
481 ttaaccagca cgtgcagtct ctgcagagcg agtgttctgt gctgagcgag aatctggaga
541 gaaggcggca agaggcagaa gagttggagg ggtactgcat tcaactcaag gagaactgct
601 ggaaggtgac ccggtctgtg gaagatgctg aaatcaaaac caacgtcttg aagcagaatt
661 ctgccctgct ggaggagaag ctgcgctacc tccagcagca gctgcaggat gagacgccgc
721 gacggcagga ggccgagctg caggagccgg aggagaagca ggagccggag gagaagcagg
781 agccggagga gaagcagaag ccggaggctg gcctctcctg gaacagcctg ggccccgccg
841 ccacgtccca gggctgcccc ggcccgccag ggagtcccga caaaccctcg cggccacacg
901 gcctggtccc cgcaggctgg ggaatggggc ctcgggctgg cgagggcccc tacgtgagcg
961 agcaggaatt gcagaagctg ttcaccggca tcgaagagct gaggagagag gtgtcctcac
1021 tgaccgcccg gtggcatcag gaggaggggg cggtgcagga agccctgcgg ctgctcgggg
1081 gcctgggcgg cagggtcgac ggcttcctag gccagtggga gcgggcacag cgcgaacagg
1141 cacagacggc gcgggacttg caggagctgc gaggtcgggc ggatgagctg tgcaccatgg
1201 tggagcggtc agcagtgtct gtggcttcac tgaggagcga actggagggg ctgggcccac
1261 tgaaacccat tctggaggag ttcgggcggc aatttcagaa ctctcgaaga gggcctgacc
1321 tctccatgaa cctggatcgg tcccaccaag gcaactgtgc ccgctgtgcc agccaggggt
1381 cgcagttgtc tacggagtcc ctgcagcagc tgctggaccg agcactgacc tcactagtgg
1441 acgaggtgaa gcagaggggc ctgactcctg cctgtcccag ctgtcagagg ctacacaaga
1501 agattctgga gctggagcgc caggccttag ccaaacacgt cagggcagag gccctgagct
1561 ccacccttcg gctggcccaa gacgaggccc tgcgggccaa gaacctactg ctgacagaca
1621 agatgaagcc agaggagaag atggccactc tggaccatct acacttgaag atgtgctccc
1681 tccacgatca tctcagcaac ctgccacttg aggggtccac gggaacaatg gggggaggca
1741 gcagtgcagg aaccccccca aaacaggggg gctcagcccc tgaacaataa atggcctctc
1801 atgctagcat ga
【０２０２】
(配列番号:40)
MASVVVKTIWQSKEIHEAGDTPTGVESCSQLVPEAPRRVTSRAK
GIPKKKKAVSFHGVEPQMSHQPMHWCLNLKRSSACTNVSLLNLAAMEPTDSTGTDSTV
EDLSGQLTLAGPPASPTLPWDPDDADITEILSGVNSGLVRAKDSITSLKEKTNRVNQH
VQSLQSECSVLSENLERRRQEAEELEGYCIQLKENCWKVTRSVEDAEIKTNVLKQNSA
LLEEKLRYLQQQLQDETPRRQEAELQEPEEKQEPEEKQEPEEKQKPEAGLSWNSLGPA
ATSQGCPGPPGSPDKPSRPHGLVPAGWGMGPRAGEGPYVSEQELQKLFTGIEELRREV
SSLTARWHQEEGAVQEALRLLGGLGGRVDGFLGQWERAQREQAQTARDLQELRGRADE
LCTMVERSAVSVASLRSELEGLGPLKPILEEFGRQFQNSRRGPDLSMNLDRSHQGNCA
RCASQGSQLSTESLQQLLDRALTSLVDEVKQRGLTPACPSCQRLHKKILELERQALAK
HVRAEALSSTLRLAQDEALRAKNLLLTDKMKPEEKMATLDHLHLKMCSLHDHLSNLPL
EGSTGTMGGGSSAGTPPKQGGSAPEQ
【０２０３】
マウスTSKS、NCBIアクセッション番号NM_011651-(配列番号:41)
MASVVVKTIWQSKEIHEAGDPPAGVESRAQLVPEAPGGVTSPAK
GITKKKKAVSFHGVEPRMSHEPMHWCLNLKRSSACTNVSLLNLAAVEPDSSGTDSTTE
DSGPLALPGTPASPTTPWAPEDPDITELLSGVNSGLVRAKDSITSLKEKTTRVNQHVQ
TLQSECSVLSENLERRRQEAEELEGYCSQLKGPRPDVLTQENCRKVTRSVEDAEIKTN
VLKQNSALLEEKLRYLQQQLQDETPRRQEAELQELEQKLEAGLSRHGLSPATPIQGCS
GPPGSPEEPPRQRGLSFSGWGMAVRTGEGPSLSEQELQKVSTGLEELRREVSSLAARW
HQEEGAVQEPLRLLGGLGGRLDGFLGQWERAQREQAQSARGLQELRARADELCTMVER
SAVSVASLRSELEALGPVKPILEELGRQLQNSRRGADHVLNLDRSAQGPCARCASQGQ
QLSTESLQQLLERALTPLVDEVKQKGLAPASPSCQRLHKKILELERQALAKHVRAEAL
SSTFGWPKTRPFGPRTYC
【０２０４】
(配列番号:42)
1 acctgggagc aggccccccg caccatggca agcgtggtgg tgaagacaat ctggcaatcc
61 aaagagatcc acgaagcggg ggacccacct gcgggggtag aaagccgtgc ccagctggtc
121 cccgaggctc ccgggggggt gaccagccct gccaaaggga taacgaaaaa aaagaaggct
181 gtgtccttcc atggggtgga gccccggatg tcccacgagc cgatgcactg gtgcctgaac
241 ctcaagcggt cctctgcctg caccaacgtg tccttgctca acctggctgc cgtggagccc
301 gactcctcgg gcacagactc gaccacagag gacagtggtc cactggcact gccagggaca
361 cctgcttccc ctacaacacc ctgggctcca gaggaccctg acatcacaga actactgagt
421 ggggtcaaca gtggattggt acgtgccaaa gactccatca ccagcttgaa ggaaaagacc
481 acgcgggtta atcagcacgt tcagactctg cagagcgagt gctctgtgct gagtgagaat
541 ctggaaagaa gacggcagga ggcagaagag ttggaggggt actgcagtca gttgaagggc
601 ccccgccctg atgtcctgac ccaggagaac tgccgcaagg tgacccgttc agtggaagac
661 gctgaaatca aaaccaatgt cctgaagcag aactctgcct tgctggagga gaagctaaga
721 tacctccagc agcaactgca ggatgagacg ccccggagac aggaggccga gttgcaggag
781 ttggagcaaa aactggaggc tggcctctcc cgacatggtc tgagccctgc cactcccatt
841 cagggctgct cgggtcctcc tggcagcccc gaggaacccc cgcggcagcg aggcctgtcc
901 ttcagtggct ggggcatggc agtccgcaca ggggagggac cctcgctgag cgagcaggag
961 ttgcagaagg tctccaccgg cctggaggag ctgaggaggg aggtgtcctc gctggcagcc
1021 cggtggcatc aggaggaggg ggcagtgcag gagcccctga ggttgctggg aggccttggc
1081 ggccgtctgg atggcttcct gggccagtgg gagcgcgcgc agcgggaaca ggcacagtcc
1141 gcaaggggct tgcaggagct gcgagcacga gcagatgagt tgtgcactat ggtggagagg
1201 tcagcagtgt ctgtcgcctc actgaggagt gaactggagg cactgggccc agtaaaaccc
1261 attctggagg agctgggacg gcaacttcag aactcccgga ggggagctga ccatgtcttg
1321 aacttggatc ggtctgccca aggcccctgt gcgcgctgtg ccagccaggg gcagcagtta
1381 tccacggagt ccctgcagca gctgctggaa cgtgcgctga ccccgctggt ggatgaggtg
1441 aagcagaagg gtctggctcc tgccagcccc agttgccaga ggctacacaa gaagattctg
1501 gagctggagc gccaggcctt ggccaaacac gtcagggcag aggccctgag ctccaccttc
1561 ggttggccca agacgaggcc gttcgggcca agaacctact gctgacggac aagatgaagc
1621 cggaggagaa ggtggccact ttggactata tgcatttgaa gatgtgctcc ctccacgacc
1681 aactcagcca cctgccactt gaggggtcca cggggcaatg gggggaggaa gcaatggagg
1741 ggctccccct aaacgtggga gtccaggctc tgaacaataa atggcctctc atgctggcat
1801 gaaaaaaaaa aaaa
【０２０５】
TSKS発現のノーザンブロット(図.17A;８つのヒト組織)およびドットブロット(図.17B;72のヒト組織)分析を行い、ヒトTSKSの精巣特異的および減数分裂後の発現を見い出した。TSKS転写物を、精巣においてのみ検出した。
【０２０６】
TSKS発現のウェスタンブロット分析から、成熟精子中ではないヒト精巣においてTSKSタンパク質を見出した。
【０２０７】
TSKS転写物のイン・シチュ・ハイブリダイゼーションを、成体マウス精巣における放射標識されたマウスTSKScRNAを用いて行った(図.19を参照)。TSKS転写物は、減数分裂後精細胞中に主に発現し、そして一次精母細胞または精原細胞の標識は、バックグラウンドほど高くなかった。
【０２０８】
ヒト精巣から分離された細胞においてTSKSの免疫蛍光染色を行った。ヒトTSKSの赤色シグナルを、アクロソーマルポールで核[青色、DAPI染色]から分離した小さな免疫蛍光ドットとして円形の精細胞(A)中で検出した。初期および後期の伸張精細胞(図20B)において、TSKS免疫蛍光は、アクロソーマルポールと同様に隣接しており、そのピーク強度およびサイズに達しており、TSKSとゴルジ体との会合を示唆するものであった。TSKS免疫蛍光は、実際には成熟睾丸精子(20C)中には含まれていなかった。
【０２０９】
図21Aは、酵母ツー・ハイブリッド系におけるTSSK2およびTSKSの相互作用を図示である。酵母宿主株AH109を、次のような:pGAD, pGBK-TSSK2 (1); pGAD-TSKS, pGBK-TSSK2 (2); pGAD, pGBKp53 (3); pGAD-lgT, pGBK-p53 (4); pGAD (5); pGAD-TSKS (6);およびpGAD-LgT (7)、プラスミドの対または1つのプラスミドのいずれかを用いて形質転換した。この形質転換体を、ロイシンとトリプトファン(SCM-L-T)の両方、ロイシン(SCM-L)、ロイシンとヒスチジン(SCM-L-H)の両方、あるいはロイシン、トリプトファンおよびヒスチジン(SCM-L-T-H)を含まない完全なドロップアウト培地上にひろげて、ヒスチジン栄養要求性について試験した。p53およびSV40 ラージT 抗原コントロール(4)、TSSK2およびTSKS(2)は、酵母ツー・ハイブリッド系において相互作用した。
【０２１０】
図21Bは、ウェスタンブロッティングによるハイブリッドタンパク質の同時発現の確認を示す。TSSK2およびTSKSのORFを、GalDBDおよびGalAD各々と融合し、AH109 宿主株で同時形質転換した。該株を、DBD-TSSK2 (mycタグ化)、AD-TSKS (HAタグ化)の発現について試験した。DBD-P53 (mycタグ化)およびGAD-LgT (HAタグ化)をポジティブコントロールとして用いた。TSSK2およびTSKS両方をAH109において同時発現させ、結合相互作用のさらなる試験のためにこのモデルを評価した。
【０２１１】
図22は、TSSK2およびTSKSとの結合強度の評価方法によって計量した、ハイブリッドタンパク質の各対を担持する酵母株のレポーター遺伝子の活性アッセイ(β-ガラクトシダーゼ)をグラフに示したものである。αガラクトシダーゼ活性を、基質としてr-ニトロフェニル-a-D-ガラクトピラノシドを用いて、プラスミドの各対を担持するAH109の培養上清をインキュベートすることによってOD 410で測定した。この活性を、培養上清の光学密度校正後の任意単位として表した。TSSK2とTSKSとの結合強度は、ネガティブコントロールよりも12倍強く、一方でp53およびLgT間のポジティブコントロールの相互作用よりも1.5倍強い。
【０２１２】
インビトロでのヒトTSSK2とヒトTSKSとの同時免疫沈降を示す電気泳動分析を、図23に示した。TSSK2(mycタグ化)およびTSKS(HAタグ化)を、Promegaインビトロ翻訳キットにおいて同時翻訳した。該混合物を、myc(マウス)またはHA(ラット)に対するモノクローナル抗体と結合したアガロースビーズのいずれかを用いて免疫沈降させた。免疫沈降をSDS-PAGEを用いて分離し、抗-HA(左)または抗-myc(右)でブロッティングした:1.インビトロ翻訳混合物；2. インビトロ 翻訳コントロール；3.IP(抗-HA)；4. HA-IP コントロール；5. IP (抗-myc);および6. Myc-IP コントロール。抗-mycまたは抗-HAのいずれかを用いて、TSSKおよびTSKSを同時免疫沈降し、それらの相互作用を確認することができた。
【０２１３】
TSSKとの相互作用に必要なTSKSの主な相互作用のドメインの分析を行った。図24Aは、TSKS ORF(上方パネル)を略図に示す。2つの推定コイルドコイル・ドメイン[CC1、CC2]を記入した。この6つのアミノ酸の繰り返しに線を引き、アミノ末端核局在性シグナルを灰色で示した。全てのTSKSの8つの欠失変異体を作成し、pGADツー・ハイブリッドベクターにおいてGal4活性化ドメインと融合した。各変異体およびGal-ADの融合タンパク質を、Gal-DBDTSSK2を用いて酵母宿主株AH109中で同時形質転換した。図24Bは、α-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした各対の培養上清を示し、各変異体について測定した活性は、完全長TSKSの%として表現される。対応する欠失変異体は、縦座標上に示される。第一の48個のアミノ酸の欠失は、TSKS結合を5%まで低下させ、一方で第一の147個のアミノ酸の欠失は、TSKS結合を消失させた。カルボキシル末端および第二のコイルド・コイル領域の欠失により、75%まで相互作用が低下する。
【０２１４】
インビトロマウスでのTSKSのリン酸化の試験を行った。TSKSに対するラット抗血清を用いて、マウス精巣由来のTSKSの免疫沈降を行った。事前清澄したマウス精巣抽出物を、ラットの正常血清(コントロールIP)、またはラット抗-TSKS血清(TSKS IP)のいずれかを用いて免疫沈降した。この免疫沈降した複合体を、1D(図25A)および2D (図25B)ゲルで分離し、抗-TSKS抗体を用いて銀染色および免疫ブロッティングに供した。この結果は、ラット抗ヒトTSKS血清がマウスTSKSを免疫沈降できることを示した。
【０２１５】
インビトロのTSKSのリン酸化に関する電気泳動分析を行った(図26)。免疫性複合体は、抗-TSKS(TSKS IP)またはラット正常血清(コントロール IP)の何れかを用いて免疫沈降し、次にインビトロでのキナーゼアッセイにおいてγP32 ATPと共にインキュベートし、オートラジオグラフに供した。共通のキナーゼ、カゼインキナーゼ2(CKII)および、カゼイン、マルトース結合タンパク質(MBP)およびヒストン3を包含するいくつかの一般的なキナーゼ基質をポジティブコントロールとしてこの反応に添加した。抗-TSKS血清を用いると、TSKSは42KDタンパク質と同様に強くリン酸化された。一方で、コントロールの正常なラット血清を用いてリン酸化されたタンパク質はなかった。42 KD タンパク質はTSSK1および／またはTSSK2の自己リン酸化物であり得る。CKIIの添加は、TSKSおよびTSSKのリン酸化が飽和されているか、またはそれらがCKIIの基質ではないかどうかを示す、いかなる追加のリン酸化も生じなかった。カゼイン、MBPおよびヒストン3は、沈殿複合体において該キナーゼによりリン酸化されたが、これらのタンパク質は正常な血清によって免疫沈降したコントロールではリン酸化されなかった。このキナーゼアッセイは、TSKSリン酸化の阻害剤についてハイ・スルー・プット・スクリーンを提供し、カゼイン、MBPおよびヒストン3がTSSK1およびTSSK2に対する代替基質として使用できることを示す。
【０２１６】
要約
・TSKS、すなわちTSSK1および2の基質は、精巣特異的遺伝子産物であり、組織特異的な避妊用標的化が可能であり得ることを示唆している。
【０２１７】
・TSKS タンパク質は、丸形のおよび伸張中の精細胞に限定され、それらの濃度は、伸張中の精細胞において見出されたレベルと比べて成熟精子で有意に低下する。それらが、アクロソームに隣接した精子頭部の先端とは別個のスポットとして局在する[ゴルジ体様]、伸張中の精細胞においてその濃度はピークに達することが判る。伸張中の精細胞におけるこの最も高い発現、そしてその後の発現の減退は、アクロソーム発生におけるTSKSについての役割を示唆するものである。
【０２１８】
・ヒトTSSK2およびTSKSの結合相互作用を、酵母ツー・ハイブリッド系、およびインビトロ同時免疫沈降によって確認した。
【０２１９】
・第一の48個のアミノ酸の欠失は、TSSK2とTSKSとの結合を5%まで低下させ、一方で、第一の147個のアミノ酸の欠失は、TSSK2とTSKSとの結合を完全に消失させる。カルボキシル末端および第二のコイルド・コイル領域の欠失は、相互作用を75%まで低下させる。
【０２２０】
・TSKSは、その発現パターンでは減数分裂後である、これは精原細胞および精母細胞を保存することによって可逆的な避妊診断における適用の可能性を示唆するものである。
【０２２１】
精巣由来の免疫沈降したマウスTSKSは、インビトロキナーゼアッセイにおいてリン酸化されたことを示した。このキナーゼアッセイは、TSKSリン酸化の阻害剤についてハイ・スルー・プット・スクリーンを提供する。
【０２２２】
本発明は、本明細書に記載のアッセイおよび方法にのみ限定されると解されるべきではなく、その他の方法およびアッセイなどを包含すると解するべきである。当業者は、他のアッセイおよび方法が、本明細書にて説明された方法を実施するために利用できるということがわかるであろう。
【０２２３】
標題は、特定の章の位置に関する参照および促進のために本明細書に包含される。これら標題は、その記載された概念を制限する意図はなく、これらの概念は明細書全体を通してその他の章にも適用し得る。
【０２２４】
各々および全ての特許、特許出願および本明細書で引用した文献の開示物は、出典明示により本明細書の一部として、包含される。
【０２２５】
本発明は、特定の実施態様を参照して開示されるが、その他の実施態様および本発明の改変が、あらゆる当業者が本発明を為すか、または本発明を使用することを可能にするために提要された開示した実施態様の前記の説明によって工夫され得ることは明白であろう。これらの実施態様に対する様々な修飾は、当業者には容易に理解されるであろうし、本明細書中で定義した一般的原理は、本発明の精神または範囲を逸脱することなくその他の実施態様に適用され得る。特許請求の範囲は、あらゆるかかる実施態様および等価物を包含すると解すべきであるということを意図する。従って、本発明は、本明細書に示される実施態様に限定されるべきではなく、本明細書に開示された原理および新規特徴と一致する最も広い範囲を提供するものであると解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】図1は、TSSK1、TSSK2、TSSK3およびTSSK4アミノ酸配列の配列アラインメント比較である。
【図２】図2は、哺乳類TSSKサブファミリーのドメイン構造のスキーム表示である。
【図３】図3は、TSSKとその他のキナーゼの系統発生的関係、TSSKファミリーのメンバー間の関係を示す略図である。
【図４】図4は、図4Aおよび4Bを含み、ヒトTSSK1発現のノーザン(4A)およびドットブロット(4B)分析を示したものである。
【図５】図5は図5Aおよび5Bを含み、ヒトTSSK2 発現のノーザン(5A)およびドットブロット(5B)分析を示したものである。
【図６】図6は図6Aおよび6Bを含み、８つのヒト組織におけるTSSK3(図6A)発現および８つのマウス組織におけるTSSK4(図6B)発現のノーザンブロット分析を示したものである。
【図７Ａ】図7Aは１５のヒト組織においてTSSK1発現のリアルタイムPCR分析をグラフに示したものである。
【図７Ｂ】図7Bは、１５のヒト組織においてTSSK2(7B)発現のリアルタイムPCR分析をグラフに示したものである。
【図７Ｃ】図7Cは、１５のヒト組織においてTSSK3(7C)発現のリアルタイムPCR分析をグラフに示したものである。
【図７Ｄ】図7Dは、１５のヒト組織においてTSSK4(7D)発現のリアルタイムPCR分析をグラフに示したものである。
【図８】図8は、精巣におけるヒトTSSK1-4の相対的発現レベルのリアルタイムPCR定量法をグラフにより示したものである。
【図９】図9は、1つの構築体を用いて、TSSK1およびTSSK2のダブルノックアウトのストラテジーをグラフに示したものである。
【図１０】図10は、パネル1〜6(図10Ａ〜10B)を含んでおり、成体マウス精巣におけるTSSK2 mRNA発現のインサイチュ分析の顕微鏡画像であり、TSSK2の減数分裂後の発現および精子のエクアトリアルセグメントの局在性を示している。
【図１１】図11は、パネル1から6(図11A〜11B)を含み、成体マウス精巣におけるTSSK4mRNA発現のインサイチュ分析の顕微鏡画像を示しており、減数分裂後発現および精子エクアトリアルセグメントのTSSK4の局在性を示す。
【図１２】図12は、ヒト精巣および精子中のTSSK2発現のウェスタン・ブロット分析の画像を示す。
【図１３】図13は、コンピューターによりモデル化したマウスTSSK4の3D構造の概略図を示す。
【図１４】図14は図14Aおよび14Bを含み、射精された精子中のTSSK2の免疫蛍光局在性(14A)の顕微鏡画像を示したものである。
【図１５】図15は、マウス精巣、マウス精子およびヒト精子においてTSSK4 発現のウェスタン・ブロット分析を示したものである。
【図１６】図16は、6つのパネル(図16A〜16F)を含み、マウスおよびヒト精子中のTSSK4の免疫蛍光局在性の顕微鏡画像を示したものである。
【図１７】図17は、図17Aおよび17Bを示しており、ヒトTSKSの精巣特異的および減数分裂後発現を示したものである。
【図１８】図18は、TSKS発現のウェスタン・ブロット分析の画像を示す。
【図１９】図19は、6つのパネルを含んでおり、成体マウス精巣中のTSKS mRNA 発現の分析の顕微鏡画像を示したものである。
【図２０】図20は、ヒト精巣から分離した細胞におけるTSKSの免疫蛍光染色の顕微鏡画像を示したものである。
【図２１Ａ】図21Aは、酵母のツー・ハイブリッド系におけるTSSK2およびTSKSの相互作用の顕微鏡画像を示す。
【図２１Ｂ】図21Bは、ウェスタンブロッティングによるハイブリッドタンパク質の同時発現の確認をしたものである。
【図２２】図22は、TSSK2とTSKSの結合強度に関する評価法によって計量した、ハイブリッドタンパク質の各対を担持する酵母株のレポーター遺伝子の活性アッセイ（α-ガラクトシダーゼ)をグラフにより示したものである。
【図２３】図23は、インビトロでヒトTSSK2とヒトTSKSとの共免疫沈降を明示する電気泳動分析の画像を示したものである。
【図２４】図24は、図24Aおよび24Bからなり、TSSKとの相互作用に必要なTSKSの主要な相互作用性ドメインの分析を示したものである。
【図２５】図25は、図25Aおよび25Bからなり、インビトロでのマウスTSKSのリン酸化の試験の画像を示したものである。
【図２６】図26は、TSKSのインビトロのリン酸化の電気泳動分析の画像を示したものである。
【図１】
2008515797.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008515797.tif 000010
【図６】
2008515797.tif 000011
【図７Ａ】
2008515797.tif 000012
【図７Ｂ】
2008515797.tif 000013
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
2008515797.tif 000016
【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
2008515797.tif 000022
【図１０Ｆ】
2008515797.tif 000023
【図１１Ａ】
2008515797.tif 000024
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2008515797.tif 000026
【図１１Ｄ】
2008515797.tif 000027
【図１１Ｅ】
2008515797.tif 000028
【図１１Ｆ】
2008515797.tif 000029
【図１２】
2008515797.tif 000030
【図１３】
2008515797.tif 000031
【図１４Ａ】
2008515797.tif 000032
【図１４Ｂ】
2008515797.tif 000033
【図１５】
2008515797.tif 000034
【図１６Ａ】
2008515797.tif 000035
【図１６Ｂ】
2008515797.tif 000036
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2008515797.tif 000038
【図１６Ｅ】
2008515797.tif 000039
【図１６Ｆ】
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【図１７】
2008515797.tif 000041
【図１８】
2008515797.tif 000042
【図１９Ａ】
2008515797.tif 000043
【図１９Ｂ】
2008515797.tif 000044
【図１９Ｃ】
2008515797.tif 000045
【図１９Ｄ】
2008515797.tif 000046
【図１９Ｅ】
2008515797.tif 000047
【図１９Ｆ】
2008515797.tif 000048
【図２０Ａ】
2008515797.tif 000049
【図２０Ｂ】
2008515797.tif 000050
【図２０Ｃ】
2008515797.tif 000051
【図２１Ａ】
2008515797.tif 000052
【図２１Ｂ】
2008515797.tif 000053
【図２２】
2008515797.tif 000054
【図２３】
2008515797.tif 000055
【図２４】
2008515797.tif 000056
【図２５】
2008515797.tif 000057
【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月4日(2007.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008515797000001.app