(57)【要約】  本発明はブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のＯＲＦ３遺伝子に基づく、及びそのアポトーシスへの役割の検証に基づく。本発明はＰＣＶ２に対する弱毒化生ワクチンの開発を導く。  【選択図】    なし
2008541780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的に異常ＯＲＦ３発現により弱毒化された免疫原性弱毒化ＰＣＶ２ウイルス。
【請求項２】
ＯＲＦ３から発現するタンパク質が減少又は欠如した請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
ＯＲＦ３タンパク質の発現が減少又は欠如した請求項１に記載のウイルス。
【請求項４】
少なくとも一つの突然変異がウイルスのＯＲＦ３に存在し、且つＯＲＦ３における突然変異がＯＲＦ１によってコードされたタンパク質にいかなる変化ももたらさない突然変異である請求項１又は２に記載のウイルス。
【請求項５】
ＯＲＦ３の開始コドンが突然変異し、該開始コドンが非機能的であり、且つＯＲＦ１によってコードされたタンパク質に変化がない請求項４に記載のウイルス。
【請求項６】
前記突然変異がＯＲＦ３内に挿入された終止コドンを含む請求項４に記載のウイルス。
【請求項７】
ＯＲＦ３内に挿入された前記終止コドンが配列番号１９に記載されている請求項６に記載のウイルス。
【請求項８】
前記突然変異が配列番号２１に記載のＯＲＦ３のアルファ−ヘリックス領域の突然変異からなる請求項４に記載のウイルス。
【請求項９】
ＯＲＦ３内に２以上の突然変異を含む請求項４に記載のウイルス。
【請求項１０】
前記２以上の突然変異が、開始コドン、Ａｌａ２７終止、及びＧｌｕ６１Ｌｙｓの突然変異から成る群から選択される請求項９に記載のウイルス。
【請求項１１】
２つの突然変異を含み、この突然変異が停止コドンの突然変異、及び配列番号１９に記載の停止コドンの挿入又は配列番号２１に記載のアルファ−ヘリックス領域の突然変異から選択される第２の突然変異から成る請求項４に記載のウイルス。
【請求項１２】
前記ＯＲＦ３が、配列番号２３又は２４に記載のヌクレオチド配列からなる請求項１１に記載のウイルス。
【請求項１３】
開始コドンの突然変異、配列番号１９に記載の終止コドンの挿入、及び配列番号２１に記載のアルファ−ヘリックス領域の突然変異を含む請求項４に記載のウイルス。
【請求項１４】
前記ＯＲＦ３が配列番号２５に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１３に記載のウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のウイルスの免疫学的有効量を含むワクチン。
【請求項１６】
請求項１〜１のいずれか一項に記載のウイルスの免疫学的有効量を含み、更に医薬的に許容しうる担体、賦形剤、アジュバント又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５のワクチンを患畜に投与することから成る、ＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項１８】
患畜にＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発するために、医薬に使用するための請求項１〜１４のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項１９】
患畜にＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発させるための医薬の製造における請求項１〜１４いずれか一項に記載のウイルスの使用方法。
【請求項２０】
前記患畜がブタである請求項１７に記載の方法、請求項１８に記載のウイルス、又は請求項１９に記載の使用方法。
【請求項２１】
請求項１〜１４いずれか一項に記載のウイルスを産生ずるための宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１４に記載のウイルスの免疫学的有効量を動物に投与することから成る、動物における疾病の治療又は予防のための方法。
【請求項２３】
前記動物がブタである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾病が離乳後多臓器消耗症候群である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のウイルスを産生する方法であって、ウイルス産生方法が可能である適切な条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することから成るウイルスの産生方法。
【請求項２６】
更に培地からウイルスを単離することを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号１に記載のアミノ酸配列から成る、アポトーシス誘発能を持つタンパク質。
【請求項２８】
配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、８０％、又は９０％の相同性をもつ、アポトーシス誘発能を持つタンパク質。
【請求項２９】
請求項２７又は２８に記載のタンパク質の活性断片である、アポトーシス誘発能を持つタンパク質。
【請求項３０】
融合タンパク質の形で提供される請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３２】
前記核酸分子が、配列番号２に記載の配列、又は遺伝子コードの縮重の範囲内で配列番号２に対応する配列から成る請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記核酸分子が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性をもつ配列、又は遺伝子コードの縮重の範囲内で該配列に対応する配列から成る請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３４】
配列番号２に定義された核酸配列、又は遺伝子コードの縮重範囲内で該配列に対応する配列に、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３５】
請求項３２〜３４いずれか一項に記載の核酸分子の突然変異型から成り、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるタンパク質が異常発現するように突然変異した核酸分子。
【請求項３６】
配列番号３に記載の核酸分子配列、又はその縮重バージョンからなる請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸分子によってコード化されるタンパク質。
【請求項３８】
請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター、ウイルス又は宿主細胞。
【請求項３９】
請求項２７〜３０、又は３７のいずれか一項に記載のタンパク質に結合可能な抗体。
【請求項４０】
請求項２７〜３０、又は３７のいずれか一項に記載のタンパク質を動物に投与し、該動物から抗体を採取することから成る、請求項３９に記載の抗体を生成する方法。
【請求項４１】
アポトーシス誘発能を高める、又は減少させるかどうかを測定することから成る、請求項２７〜３０、又は３７のいずれか一項に記載のタンパク質の作用剤又は拮抗剤を同定する方法。
【請求項４２】
（ａ）少なくとも1つの候補分子を生体サンプルに接触させる段階、及び（ｂ）前記少なくとも1つの候補分子による生体サンプルに誘発されたアポトーシスのレベルを検定する段階から成る、離乳後多臓器消耗症候群誘発能を有する少なくとも1つの候補分子をスクリーニングする方法であって、該アポトーシスのレベルが、少なくとも1個の候補分子の離乳後多臓器消耗症候群誘発能を表示するスクリーニング方法。
【請求項４３】
更に、候補分子がアポトーシス誘発能を高める又は減少させるかどうかを測定することを含む請求項４２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、本発明は新規のブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）ウイルスの作成、及び同ウイルスに対するワクチンの準備に関する。
本明細書本文で引用されている全ての文献（"本明細書では、以下引用した文献"）、及び本明細書に引用した文献内で引用又は参照した全ての文献は、全ての目的について参考のため本明細書に組み込まれる。
本明細書本文で引用したいずれの文献も本発明に関しては従来技術であるという承認はない。
【背景技術】
【０００２】
離乳後多臓器消耗症候群（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome:PMWS）
ＰＭＷＳは養ブタ場及び離乳後のブタに影響を与える新しい疾病である。いまや多くの養ブタ生産国で風土病となっており、世界中の養ブタ産業において、潜在的に経済的影響を引き起こしうる。ＰＭＷＳは４〜２０週齢のブタに発症するとされているが（４２）、主に５〜１８週齢のブタが感染する。ＰＭＷＳの臨床症状としては、進行性体重減少、呼吸困難、頻呼吸、貧血、下痢、及び黄疸がある。死亡率は１〜２％から合併症が起こった場合は最大３０％まで変わるかも知れない。
ブタサーコウイルス（Porcine circovirus:PCV）は当初ブタの腎細胞培養（PK15 ATCC CCL-33）の汚染物質として同定された（４７）。このＰＣＶビリオン（ウイルス粒子）は正二十面体のエンベロープを欠いた直径１７ｎｍの粒子で、１．７６ｋｂの単鎖の環状ＤＮＡを持つ。ＰＣＶはオウム科の嘴羽毛病ウイルス、ガチョウサーコウイルス、カナリアサーコウイルス、ハトサーコウイルスのような他の動物サーコウイルスが属する、サーコウイルス科（Circoviridae）サーコウイルス属（Circovirus）に分類されている（３５，３８，５０，５１，５２）。ＰＣＶには二つの遺伝子型があることが分かっている。ＰＫ１５細胞由来のＰＣＶは、ブタに対し非病原性であるとみなされ（３，４８）、ＰＣＶ１型（ＰＣＶ１）と命名された。血清調査によると、ＰＣＶ１はブタに広く存在していることが示されたが、ＰＣＶ１が関連する動物の疾病は認められていない。一方、ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）は、いまや離乳後多臓器消耗症候群（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome:PMWS）に関係する主要な感染因子として認められている（２、６、２０）。ＰＭＷＳは新たに出現したブタの疾病であり、１９９１年にカナダで発生して以来、世界中に広まった（１，８）。
【０００３】
ＰＣＶ２とその作用形態
アポトーシスは、特有の形態変化や生化学変化を伴って細胞が自壊するという能動的な生理学的過程である（３９）。多くのウイルスは、自然界のライフサイクルの一環としてアポトーシスを誘発する（３９）。一方でアポトーシスは、ウイルス因子に応答する炎症又は免疫反応を最小限に押さえることによって、宿主細胞が産生した子孫ビリオンの放出と散布に重要なメカニズムを果たしているかも知れない。またその反面、ウイルスが誘発したアポトーシスを、感染した細胞を意図的に破壊するという多細胞宿主生物の防衛戦略としてみなすことが可能である。アポトーシス細胞死の原因となるウイルスの大部分は、プログラム死の実行過程としてのカスパーゼカスケードの活性化を誘発する。アポトーシスは、ＰＭＷＳに自然感染したブタにおけるＢ細胞枯渇の原因となるメカニズムとして提議された（４３）が、リンパ球アポトーシスがＰＭＷＳリンパ球枯渇病変の発生における一般的な現象ではない、という矛盾する結果が近年報告されている（２４、３７）。
ＰＣＶ１又はＰＣＶ２分離株夫々の株内の全体としてのＤＮＡ配列相同性は９０％を超える。一方ＰＣＶ１とＰＣＶ２分離株間の配列相同性は６８〜７６％である。２種の主要なオープンリーディングフレーム（読み取り枠：ＯＲＦｓ）が識別されている。そのうち、ｒｅｐ遺伝子として知られている、ＰＣＶ−ＯＲＦ１はウイルス複製に関わる３５．７ｋＤａのタンパク質をコードする（２６）、またＯＲＦ２；すなわちｃａｐ遺伝子は、主要免疫原性がある２７．８ｋＤａのカプシドタンパク質をコードする（９，３０，３１）。レプリカーゼＯＲＦ１とカプシドタンパク質ＯＲＦ２に加えて、コンピューター調査では５ｋＤａより大きいタンパク質をコードする潜在性ＯＲＦを他に５種含むと予測される（２７）。これらの潜在性ＯＲＦが発現するかどうか、発現されたタンパク質がウイルス複製に必要であるかどうかは今後の説明が待たれる。
【０００４】
ＰＣＶ２について、前記５種のＯＲＦｓのうち最大のＯＲＦは、本明細書でＯＲＦ３と命名された、長さ３１５ｂｐの断片である。ＯＲＦ３は既知のいずれのタンパク質とも類似性がない。対照的にＰＣＶ１のその対応領域に位置するＯＲＦ断片は長さ６１２ｂｐであり、ＰＣＶ２のＯＲＦ３より長い。さらにＰＣＶ２のＯＲＦ３とＰＣＶ１の対応領域間のアミノ酸同一性は６１．５％にすぎない。この差異がＰＣＶ２病原性に関連があるかどうかについてはまだ決定されていない。
ＰＭＷＳに感染したブタからの組織病理学的所見と疾病の特徴は、いくつかの条件下では、ＰＣＶ２がブタにおける２次的免疫不全の原因となる可能性を示唆している。顕微鏡病変では、ＰＭＷＳに感染したブタのリンパ系組織のマクロファージ侵入と共に、濾胞性と内濾胞領域のリンパ球枯渇が特徴的である。さらにＰＣＶ２と共に他の感染因子による共同感染が、疾病の発生と重篤度を増大させる（２，３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
いくつかの農場においては死亡率が無視できないので、ＰＭＷＳは現在なお世界中の養ブタ産業において主要な問題である。ＰＣＶ２に対するＤＮＡワクチン又はサブユニットワクチンの開発情報がいくつかあるが、特定の病原体への弱毒化ワクチンの有効性及び予防効果は依然として重要な検討材料である。この疾病の広がりを予防する効果的な弱毒化生ワクチンはまだ知られていない。
現在のところ、二種類の有効な既知のワクチンがある：ＯＲＦ２組換え型サブユニットワクチンとＤＮＡワクチンである。両ワクチンともＰＣＶ２複製を完全に抑制するには有効であるが、有利な特性に欠くため、ＰＣＶ２に対する効果的なワクチンとしての商品価値は低い。ＤＮＡワクチンはブタの液性応答と細胞性応答を誘発可能であるが、ワクチンの適正投与を可能にする適切な輸送システムを欠いている。このワクチンの影響により、感染後３週間にのみ現れるＰＣＶ２感染を有効に減らすことが出来るはずである（５）。サブユニットワクチンは、ＰＣＶ２に対しより効果的に働くが、液性免疫を刺激するのみである。バキュロウイルスシステム、を用いて得たタンパク質濃度が低いので、ＰＣＶ２に対して動物を免役するためには複数回の投与が必要となり、従って効率が減少する。また、ＰＣＶ２感染後３〜４週間の間、実験動物の深刻な成長遅延が依然として顕著である。さらに両ワクチンに対するプライム・ブーストプロトコールはまだ決められていない。
その結果、ＰＭＷＳに効く改善されたワクチンの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ウイルスにおけるＯＲＦ３遺伝子の検出、及びアポトーシスにおける役割の検証に基づく。本発見はＰＣＶ２に対する弱毒化生ワクチンの開発を導く。
本発明の第１態様は、少なくとも部分的に異常ＯＲＦ３発現により弱毒化された免疫原性弱毒化ＰＣＶ２ウイルスを提供する。
本発明の第２態様は上記本発明の第１態様のウイルスの免疫学的有効量を含むワクチンを提供する。
本発明の第３態様は、上記本発明の第２態様のワクチンを患畜（subject）に投与することから成る、ＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発する方法である。
本発明の第４態様は、医薬への使用の為に本発明の第１態様のウイルスを提供する。
本発明の第５態様は、患畜におけるＰＣＶ２に対する液性及び細胞性免疫応答を誘発するウイルスを提供する。
本発明の第６態様は、患畜においてＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発する医薬品の製造における、本発明の第１態様に基づくウイルスの使用を提供する。
本発明の第７態様は、本発明の第１態様に基づくウイルス産生のための宿主細胞を提供する。
本発明の第８態様は、本発明の第１態様に基づくウイルスを用いた治療の方法の提供であり、該方法は、該患畜に対して、免疫的有効量のウイルスを投与することを含む。
本発明の第９態様は、本発明の第１態様に基づくウイルス産生の方法の提供であり、該方法は、ウイルス産生を可能にする手順の適切な条件下で、本発明の第７態様の宿主細胞を培養することを含む。
【０００７】
本発明の第１０態様は、アポトーシス誘発が可能なタンパク質を提供する。１実施態様において、該タンパク質は配列番号１に記載のアミノ酸配列ＭＶＴＩＰＰＬＶＳＲＷＦＰＶＣＧＦＲＶＣＫＩＳＳＰＦＡＦＴＴＴＲＷＰＨＮＤＶＹＩＲＬＰＩＴＬＬＨＦＰＡＨＦＱＫＦＳＱＰＡＥＩＳＤＫＲＹＲＶＬＬＣＮＧＨＱＴＰＡＬＱＱＧＴＨＳＳＲＱＶＴＰＬＳＬＲＳＲＳＳＴＦＹＱを含む。
本発明の第１１態様は、本発明の第１０態様のタンパク質をコードする核酸分子を提供する。１実施態様において、該核酸分子は配列番号２に記載の配列ＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡを含む。
本発明の第１２態様は、第１１態様に基づく核酸分子の突然変異型を含む核酸分子を提供する。該核酸分子は、核酸分子によってコード化されたタンパク質が異常発現する突然変異である。
本発明の第１３態様は、本発明の第１２態様に基づく核酸分子によってコード化されたタンパク質を提供する。
本発明の第１４態様は、本発明の第１１態様又は１２態様に基づく核酸分子を含むベクター、ウイルス又は宿主細胞を提供する。
本発明の第１５態様は、本発明の第１０又は１３態様のタンパク質と結合可能な抗体を提供する。
本発明の第１６態様は、本発明１０又は１３態様のタンパク質と結合可能な抗体を産生する方法を提供する。
【０００８】
本発明の第１７態様は、本発明の核酸分子、タンパク質、抗体、拮抗剤、作用剤、ウイルス、ベクター、又は宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
本発明の第１８態様は、本発明の第１０態様のタンパク質の作用剤又は拮抗剤を検証する方法を提供する。
該方法は以下：
（ｉ）本発明の第１０態様のタンパク質を試験化合物と接触させ、その試験化合物が該タンパク質のアポトーシス誘発能を強めるか、減少させるかどうかを吟味すること；又は
（ｉｉ）細胞内で本発明の第１０態様のタンパク質を発現させ、該細胞を試験化合物に暴露し、その試験化合物が該タンパク質のアポトーシス誘発能を強めるか、減少させるかどうかを吟味すること、
を含んでもよい。
本発明の第１９態様は、本発明の第１８態様によって検証された作用剤又は拮抗剤を提供する。
本発明の第２０態様は、離乳後多臓器消耗症候群の誘発能のある、少なくとも１つの候補分子をスクリーニングする方法を提供する。その方法は以下： 
（ｉ）生体サンプルと少なくとも１つの候補分子を接触させること；及び
（ｉｉ）少なくとも１つの候補分子によって生体サンプルに誘発されたアポトーシスのレベルを検定すること。アポトーシスの該レベルは、少なくとも１つの候補分子による離乳後多臓器消耗症候群誘発能を表示する、
を含んでもよい。
ある実施態様において、該方法は、さらに候補分子がタンパク質のアポトーシス誘発能を強めるか減少させるかどうかを測定する段階を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本節では、以下に記載した用語の解釈と熟語の指針（及び、その適切な文法上の変化）の提供を意図する。
本明細書において使用する際、単数形「ａ」「ａｎ」そして「ｔｈｅ」は本文に明確に特記のない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「一つの因子（an agent）」はその混合物を含む複数の因子を含む。
本明細書で使用する際、用語「からなる（comprising）」は「含む（including）」という意味である。本明細書の文脈において、用語「からなる」は、"主に含むこと"であり、必ずしも"唯一である"意味ではない。「comprise」や「comprises」のような「comprising」という用語のバリエーションは、同様に様々な意味を持つ。
本明細書で使用する際、用語「ワクチン（vaccine）」は、動物の免疫システムを刺激するために使用してもよい因子を含む。このように、免疫予防を、免疫システムによって自己抗原と認識されていない、抗原に対して提供してもよい。
用語「免疫化（immunization）」は、患畜へ免疫原を運搬するプロセスを含む。例えば、免疫化は、継続する高レベルの抗体、及び／又は細胞応答を可能にし、そこではＴリンパ球が、免疫処置した動物体内で病原体を殺す又は抑制することが出来て、また、過去にその動物が暴露を受けた病原体や抗原に対して向けられる。
【００１０】
用語「タンパク質（protein）」は、ペプチド結合で連結したアミノ酸で構成されたポリマーを意味する。本発明の目的上、「ポリペプチド」は、機能的又は活性を有するその断片などとして、全長タンパク質の一部を構成してもよいが、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書では交互に使用されている。あるいは用語「タンパク質」は、機能的な変異体を構成してもよい。
本明細書で用いる際、用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチド塩基、又は既知の類似体、又は天然ヌクレオチド、又はそれらの混合物からなる単鎖又は２重鎖ポリマーを示す。
本開示全体に渡って、本発明の様々な態様を、レンジフォーマットに示すことができる。レンジフォーマットにおける記述は、単に便宜上と簡潔さのためであり、本発明の範囲を柔軟性無く制限するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、記述の範囲は、その範囲内にある個々の数値のみならず、すべての可能性がある部分的な範囲を特別に開示したとみなすべきである。例えば、１〜６のような範囲の説明は、対象範囲内の個々の数、例えば１，２，３，４，５，６のみならず、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの、特定の開示した部分範囲とみなすべきである。これはその範囲の幅に関わらず適用される。
特記のない限り、本明細書内の全ての専門用語と科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されているのと同じ意味である。
【００１１】
弱毒化ウイルス
本発明は免疫原性のＰＣＶ２弱毒化ウイルスを提供するものであり、その弱毒化は少なくとも部分的に、異常ＯＲＦ３の発現に起因する。
本発明の弱毒化ウイルスは免疫原性がある；すなわちこのウイルスは免疫応答を誘発することができる。弱毒化ウイルスを、ワクチン組成物に用いてもよい。何故ならば以下で説明するように、その後の野生型ＰＣＶ２ウイルスによる攻撃に対する防御的免疫応答を誘発するためである。
本発明のウイルスは免疫応答を誘発することができ、また感染性を有するが、免疫化された宿主内において許容できないＰＭＷＳ症状（又はＰＣＶ２によって生じる可能性のある他の疾病）を引き起こさないように、ウイルスは十分に弱毒化されている。ある実施態様において、ウイルスは十分に弱毒化されているため、ほとんどの免疫化された個体において感染症状は生じない。
その弱毒化は、異常ＯＲＦ３発現に少なくとも部分的に起因する。それ故、本発明のウイルスのアポトーシス誘発能は、減少又は欠如している。ある実施態様において、その弱毒化は、異常ＯＲＦ３発現に完全に起因する。
疑義の回避のために、本明細書で使用する用語「減少（reduced）」は、文脈上明らかに特記ない限り、用語「欠如」を含む。
【００１２】
ある実施態様において、異常ＯＲＦ３発現は定性的である。従って、ＯＲＦ３から発現したタンパク質は、例えば、野生型ＯＲＦ３タンパク質と比較すると、機能が減少又は欠如している。
「機能の減少又は欠如」によって、１又は２の突然変異を持ち、その結果、野生型ＯＲＦ３タンパク質と比較してアポトーシスを誘発能が減少又は欠如する、コード化されたタンパク質が作られるＯＲＦ３タンパク質を含む。
ある実施態様において、異常ＯＲＦ３発現は定量的である。従って、野性型で病原性のＰＣＶ２と比較するとＯＲＦ３由来タンパク質の発現が減少又は欠如してもよい。
ある実施態様において、異常ＯＲＦ３発現は、定性的、及び定量的であってもよく；すなわち、野生型ＯＲＦ３タンパク質と比較して、ＯＲＦ３タンパク質の機能が減少又は欠如し、及びそのＯＲＦ３タンパク質発現量が、野性型ＰＣＶ２ウイルス由来のＯＲＦ３タンパク質の発現量より少ない。
ある実施態様において、ＯＲＦ３配列内に突然変異が存在する。
ある実施態様において、ＯＲＦ３配列内に２重突然変異が存在する。
一実施携帯において、ＯＲＦ３配列内に３重突然変異が存在する。
ある実施態様において、そのウイルスのＯＲＦ３発現に影響を与える他の領域（すなわちＯＲＦ３以外の領域）内に、突然変異が存在する。
本発明のウイルスにおける突然変異（複数）は、ウイルス複製が引き続き生じるようにすべきである。
【００１３】
ある実施態様において、突然変異は機能的ＯＲＦ１が引き続き産生されるようなものであり；すなわち、ＯＲＦ１によってコードされたタンパク質は、その複製時の役割を果たすことを引き続き可能にする。そのようなある実施態様において、ＯＲＦ３配列における突然変異は、ＯＲＦ１によってコードされたタンパク質にいかなる変化も生じさせない突然変異である。
ある実施態様において、ＯＲＦ３の開始コドンが非機能性になるように変異する。ＯＲＦ３の開始コドンＡＴＧが、例えば、ＡがＧに置き換わるといった突然変異である；すなわち、開始コドンＡＴＧはＧＴＧへと変異する。そのような突然変異は、遺伝子コードの縮重に基づいて、ＯＲＦ１によってコードされたタンパク質にいずれの変化も生じさせないという利点を有する。
ある実施態様において、終止コドンは、ＯＲＦ３において非機能性短縮型２６アミノ酸ＯＲＦ３タンパク質の産生を引き起こすアラニンに置換される。
ある実施態様において、ＯＲＦ３のアミノ酸配列の置換によって、タンパク質のアルファ領域で選択されたアミノ酸の電荷が逆になるか、又は中性になり、それによって、生じるタンパク質が、折り畳まれなくなり、非機能的になる。１つの突然変異体においては、アミノ酸６１のＧｌｕｔａｍｉｎｅ−がＬｙｓｉｎｅ＋に変化する。
【００１４】
以下の実施例のセクションで説明するように、そのような突然変異体を、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（部位特異的突然変異誘発法キット、Stratagene）を使用し、ＰＣＶ２クローンのゲノムに特異的な突然変異を導入することによって作成する。製造業者の説明書に基づき、突然変異プラミスドを、突然変異誘発プライマー（前方プライマー、５´−ＧＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＡ−３´、逆方向プライマー、ＴＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣ−３´）のセットで作成する。突然変異体［図１Ｂにおいて太字で示した（ｎｔ６７１）（ヌクレオチド番号６７１）］は、その位置におけるＯＲＦ１タンパク質のアミノ酸配列を変更していないが、ＯＲＦ３タンパク質の発現を抑制するであろう。
本発明において用いてもよい突然変異の実施例は：終止コドンの導入；組み換え；置換変異（すなわち、ミスセンス突然変異やナンセンス突然変異）；欠失型突然変異（１又はそれ以上のヌクレオチドの欠失、又は１又はそれ以上のコドンの欠失）；フレームシフト突然変異；挿入（１又はそれ以上のヌクレオチドの挿入、又は１又はそれ以上のコドンの挿入）を含む。突然変異導入方法は、当技術分野でよく知られており、当業者により容易に行われることが可能である。例えば、部位特異的突然変異は、１又はそれ以上のヌクレオチドを添加するか、欠失するか、又は変えることが可能である。
【００１５】
突然変異のＯＲＦ３の機能／発現への効果は、例えば、以下の材料と方法セクションで説明するアポトーシス測定法を用いて評価されるであろう。
ある実施態様において、ＯＲＦ１タンパク質に関して、突然変異はサイレント突然変異（すなわち、ＯＲＦ１機能上、重大な悪影響をもたない突然変異であり、ある実施態様において、ＯＲＦ１機能にまったく影響を与えない突然変異）である。
異常ＯＲＦ３機能の原因となる突然変異がウイルス内に１又はそれ以上存在することに加えて、ウイルス内に１つ又はさらに多くの突然変異が任意に生じてもよい。その突然変異は、例えば、前記に記載された欠失型突然変異のような、いずれのタイプの突然変異であってもよい。
ある実施態様において、ウイルスは、ＰＣＶ２に対する免疫応答誘発能を阻害するいかなる変化もゲノム上に持たない。
ある実施態様において、ウイルスは、コードされたＯＲＦ２タンパク質の変化の原因となるいかなる変化もＯＲＦ２配列上に持たない。
【００１６】
本発明のある実施態様において、異常ＯＲＦ３発現を引き起こすウイルスの１又はそれ以上の突然変異導入を除き、ＰＣＶ２ウイルスは、野性型（病原性）ＰＣＶ２ウイルスと差異、又は実質的な差異はない。
本発明のＰＣＶ２ウイルスは、ある実施態様において、単離した形態で提供される。単離されたということにより、野性型ウイルスの自然環境以外に存在するＰＣＶ２を示すことを意味する。例えば、ウイルスは、制御された環境で増殖し、特徴づけられ得る細胞培養又は他の人工的培地の成分；細胞培養上清の成分；医薬組成物の成分；又はその自然環境から部分的、又は完全に精製された成分であってもよい。
前記の検討は本発明の弱毒化ウイルスに関係する一方、前記の特定部分はまた、本発明の核酸分子のように、適時、本発明の他の態様に関係する（下記を参照されたい。）。
【００１７】
ワクチン
本発明は本発明のウイルスからなるワクチンを提供する。そのような構成物は、獣医学や医薬品業界で周知の標準的技術に従って製造される。
本発明のワクチンは免疫学的有効量のウイルスからなる。本明細書に記載されたように産生された免疫原性として有効量のＰＣＶ２を用いたワクチン接種の結果として、患畜は少なくとも部分的に、又は完全にＰＣＶ２感染に対し免疫性となり、又は、中程度又は重症のＰＣＶ２感染への進行に対し耐性を示す。本発明のウイルスは液性応答、細胞性応答を誘発するために使用されてもよい。
好ましくは、患畜は、ＰＭＷＳの有害な生理的症状、又は有害な影響のうち、１つから全てまでが顕著に減少し、改善し、又は完全に予防される程度に保護される。
実際には、免疫学的有効量に必要となる正確な量は患畜の年齢、全身状態、調合物の性質、投与様式その他のような要因が関与するため、患畜により様々である。従って、正確な「有効量」を規定するのは不可能である。しかしながら、いずれの所定の症例に対しても、適切な「有効量」は日常的実験に限り使用する当業者によって決定されてもよい。
【００１８】
例として、ブタの体重、抗原と他の典型的な因子の濃度に基づいて最小有効量を見つけるために、活性抗原性試薬の適切な投与量を決定、又は滴定するための方法は、当技術分野において周知である。適切な免疫応答を誘導する、組成物（複数）の投与量、組成物中の構成成分の濃度、及び組成物（複数）を投与する時期の決定は、例えばＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和検定分析のような、血清の抗体滴定、及び／又はブタにおけるワクチン投与評価のような方法で行うことが出来る。
本発明のワクチンは医薬的に許容しうる担体を含んでもよい。語句「医薬的に許容しうる担体」は、患畜に投与したとき、生理的に許容されうる、及び通常アレルギー、又は例えば急性胃蠕動、目まいの類などの、同様の有害な反応を起こさない化合物及び組成物を示す。有用な担体としては、当技術分野で周知であり、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等々がある。
【００１９】
本発明のある実施態様において、そのワクチンはアジュバントから成る。そのアジュバントは、ワクチンに対する患畜（例えば、ブタ）の免疫応答を増大させる物質である。適切なアジュバントは、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、非イオン性ブロックポリマー又はコポリマー、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γなどのような）、サポニン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）等々が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適切なアジュバントは、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）から単離された易熱性又は熱安定性エンテロトキシン、コレラトキシン又はコレラトキシンＢサブユニット、ジフテリアトキシン、テタヌストキシン（破傷風毒素）、百日咳毒素、フロイント不完全アジュバント又は完全アジュバントなどが含まれる。ジフテリアトキシン、テタヌストキシン、百日咳毒素などのトキシンをベースとしたアジュバントは、例えばホルムアルデヒドで処理することにより、使用前に不活性化してもよい。
【００２０】
ある実施態様において、例えばブタ繁殖呼吸器障害症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome:PRRS)、Mycoplasma hyopneumoniae、Actinobacillus pleuropneumoniae、E. coli,Bordetella bronchiseptica(気管支敗血症菌)Pasteurella multocida、Erysipelothrix rhusiopathiae(フ゛タ丹毒菌)、仮性狂犬病、フ゛タコレラ、フ゛タインフルエンサ゛、フ゛タハ゜ルホ゛ウイルス(Porcine Parvovirus)などの、少なくとも１種の追加的ブタ病原体由来の、少なくとも１種の免疫抗原を付加的に含むワクチンが提供される。追加病原体由来の免疫抗原は、本発明のウイルスゲノムに含まれても、又は本発明のワクチン組成物内の別個の成分として存在してもよい。
本発明に従って産生されたＰＣＶ２は、他のＰＣＶ２株等のウイルスと組み合わせることも可能である。あるいは、複数タイプの防御エピトープ（抗原基）を１種のウイルス内に作成してもよい。そのような技術は当技術分野で周知であり、当業者によって容易に達成されうる。
本発明のワクチンは、便宜上、鼻腔内に、経皮的に（すなわち、全身性吸収のため皮膚表面上又は皮膚表面へ塗布される）、非経口、その他、で投与することができる。非経口投与経路には筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内（すなわち、皮下注入又は別のやり方で皮下へ置く）投与経路、等々で投与されるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明のワクチンを前記投与経路のいずれか１つの投与に適合できる。
液体で投与する場合、本発明ワクチンを水溶性液体、シロップ剤、エリキシル剤、チンキ剤などの形態で製造してもよい。そのような処方物は、当技術分野では周知であり、通常、抗原と他の一般的な添加物を、適当な担体又は溶媒系に溶解することで製造される。医薬的に許容しうる担体、賦形剤、又は希釈剤の例は、脱塩又は蒸留した水；生理食塩水；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、アラキス油又はココナツ油などの植物ベースの油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、メチルフェニルポリソルポキサンなどのポリシロキサン類を含むシリコン油；揮発性のシリコン剤；流動パラフィン、ソフトパラフィン又はスクワランなどの鉱物油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；例えばエタノールやイソプロパノールなどの低級アルカノール類；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール１，３−ブチレングリコール又はグリセリンのような低級ポリアルキレングリコール類又は低級アルキレングリコール類；イソプロピルパルミチン酸塩、イソプロピルミリスチン酸塩又はエチルオレイン酸塩などの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラゲナン；トラガカントガム又はアカシアゴム、及び石油ゼリーなどである。一般的に、担体又は担体類は、組成物の１０重量％から９９．９重量％を形成し、及びリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、これらの混合物などの、当技術分野では周知の試薬を用いる従来の方法で緩衝化されてもよい。
【００２２】
液体処方物はまた、他の標準的共処方物と組み合わせて、懸濁剤又は乳化剤を含む、懸濁液及び乳液を含んでもよい。これらのタイプの液体処方物は従来の方法で製造されてもよい。懸濁剤は、例えば、コロイドミルを用いて製造してもよい。乳化剤は、例えば、ホモジナイザーを用いて製造してもよい。
一般的に、本発明のワクチンは、ウイルス及び安定剤の懸濁剤を含む。
本発明のワクチンを、単回投薬又は反復投薬として投与することが可能である。
本発明のワクチンは、単独で投与する、又は１又は２種以上の構成成分（例えば、他のブタ免疫原性又はワクチン組成物）と同時に投与する（すなわち、一緒に）、又は順次に投与する（すなわち、異なる時期に）ことが可能である。前記組成物を異なる時期（すなわち順次に）に投与する場合には、お互いに別々に、又は時間的に重ねて投与を行うことが可能である。
本発明のある実施態様において、患畜に本発明のウイルスによる単回投与を用いて免疫化した。
【００２３】
ある実施態様において、本発明のＰＣＶ２を含むワクチン組成物はＰＣＶに感染しやすい、又はＰＣＶ２感染の危険性がある患畜の自己免疫応答能を亢進するために患畜へ投与される。
ワクチン投与の患畜は、ある実施態様において、ブタである。しかしながら、患畜は体内でウイルスに対する免疫応答を誘導させることが望まれるいずれの動物（例えば哺乳類）であってもよい。動物は、ＰＣＶ又は近縁のウイルスによる感染に感受性があってもよい。
患畜がブタであると通常予想されるけれども、他の動物種に本発明のワクチンを投与することが望まれる。例えば、「試験」動物には、ブタに対する最終的な使用又はワクチン開発を視野に入れて、そのワクチンの性能を評価するために、本発明のワクチンを投与してもよい。
望ましくは、ワクチンはＰＣＶ２ウイルスにまだ暴露されていない患畜に投与される。
ある実施態様において、患畜は離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対するワクチン接種を必要とするブタである。
ワクチンは成体ブタへの投与だけではなく、若年ブタ又は妊娠した雌ブタへの投与においても有益であると予想される。後者のワクチン接種は新生児へ受動免疫（母親由来の抗体）を生じさせる可能性がある。ある実施態様において、ブタは７，６，５，４，３，２、又は１週齢に満たない。
ある実施態様において、ブタは１〜６週齢；２〜５週齢；又は３〜４週齢である。
【００２４】
ウイルスの産生
本発明の一態様は、本発明の弱毒化ＰＣＶ２産生のための宿主細胞を提供する。
多種多様な宿主細胞が本発明のウイルス産生に有用であってもよく、例えばブタの腎細胞、例えばＰＫ１５細胞、などブタの細胞を含んでもよい。
本発明はまた、本発明の弱毒化ＰＣＶ２の産生方法；すなわち弱毒化ＰＣＶ２産生を許容する様態を用いて適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養することからなる、方法を提供する。その方法は培地から弱毒化ＰＣＶ２を単離すること、及び任意に弱毒化ＰＣＶ２を処理することをさらに含んでいてもよい。
宿主細胞の適切な培養条件は当技術分野の業者には周知であり、又は当技術分野の業者が容易に決定することが可能で、そして、とりわけ適切な栄養条件の選択を含む。ある実施態様において、少なくとも水、塩類、栄養物類、必須アミノ酸類、ビタミン類、抗生物質類からなる培地で、さらに１又は２種以上の成長因子類を含んでいてもよい。
【００２５】
アポトーシスを誘発できるタンパク質
本発明の第１０態様では、アポトーシスを誘発できるタンパク質を提供する。
ある実施態様において、そのタンパク質は配列番号１に記載されたアミノ酸配列：ＭＶＴＩＰＰＬＶＳＲＷＦＰＶＣＧＦＲＶＣＫＩＳＳＰＦＡＦＴＴＴＲＷＰＨＮＤＶＹＩＲＬＰＩＴＬＬＨＦＰＡＨＦＱＫＦＳＱＰＡＥＩＳＤＫＲＹＲＶＬＬＣＮＧＨＱＴＰＡＬＱＱＧＴＨＳＳＲＱＶＴＰＬＳＬＲＳＲＳＳＴＦＹＱからなる。
ある実施態様において、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質が提供される。
本発明のタンパク質は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる、又は同配列のみからなる、これらのタンパク質の機能的等価物、突然変異体、活性断片、融合タンパク質を含む。疑義の回避のため、下記の事項が本発明の範囲内に含まれる：すなわち活性断片及び融合タンパク質の機能的等価物；機能的等価物及び融合タンパク質の活性断片；及び機能的等価物又は活性断片からなる融合タンパク質である。
【００２６】
用語「断片」は、全長のタンパク質の構成成分をコードする核酸、又は同タンパク質の構成成分であるポリペプチド配列を示す。ポリペプチドに関して、断片は全長のタンパク質と同様の定性的生化学活性を有している。本発明に従って用いられた生物学的活性断片は、全長タンパク質に相当する活性の一般的には少なくとも約５０％、より一般的には少なくともその活性の約６０％、さらに一般的には少なくともその活性の約７０％、より一般的にはその活性の少なくとも約８０％、より一般的には少なくともその活性の約９０％、及び、より一般的には少なくともその活性の約９５％を有している。
本明細書における用語「突然変異体」は、実質的に類似分子を示す。通常、核酸配列突然変異体は共通の定性的生化学活性を有するポリペプチドをコードする。通常、ポリペプチド配列突然変異体もまた、共通の定性的生化学活性を有する。さらに、これらのポリペプチド配列突然変異体は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、９０％、９５％、９６％，９７％，９８％又は９９％の配列同一性を共有する。
【００２７】
本発明の第８態様における機能的等価物、活性断片、融合タンパク質は、野性型ＯＲＦ３タンパク質（配列番号１）のアポトーシスを誘発能を保持する。アポトーシス活性は、例えば、以下の材料と方法セクションで説明するアポトーシス測定法を用いて検定出来る。当業者は、しかしながら、アポトーシス活性を検定する代替又は追加的な、測定法又は手段を考案することができる。
本発明のある実施態様において、例えば、単一又は多重のアミノ酸置換（複数）、付加（複数）、挿入（複数）、及び／又は欠失（複数）、及び／又は化学修飾されたアミノ酸置換を含む、配列番号１の機能性等価物を提供する。しかしながら、前記のように、そのような機能性等価物はアポトーシス誘発能を保持する。
本発明のこの態様に従って、機能的等価タンパク質は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に対し少なくとも６５％の配列同一性があるタンパク質を含む。
【００２８】
タンパク質配列同一性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書の文脈において、配列同一性はアミノ酸同一性（時に、「ハードホモロジー（硬相同性）」と呼ばれる）に基づいて計算されることは、当業者により理解される。例えばＵＷＧＣＧソフトウェアは配列同一性を計算する（例えば、そのデフォルト設定を使用して）ために用いることが出来るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12 p387-395）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列同一性を計算する、又は配列を並べる（一般的に、デフォルト設定上で）ために用いることが出来て、例えばAltschul S.F.(1993)J Mol Evol 36、290-300、又はAltschul S.F.他(1990)J Mol Biol 215、403で説明しているように、ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、インターネットの、例えば「www.ncbi.nlm.nih.gov/」を介してワールドワイドウェブ上の国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さのワード（文字列）と位置あわせを行う際、正値の閾値スコアＴを一致又は満足させる、問い合わせ配列の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列ペア（ＨＳＰｓ）を最初に同定する。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰｓの検索開始シードとして機能する。ワードヒットは累積アラインメントスコアが上昇出来る範囲で各配列に沿って両方向に拡張される。拡張は両鎖で行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性の統計学的解析を行う。例えばKarlin and Altschul(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90、5873を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムで提供された類似性の尺度は、最小総和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、互いに置換された２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致による確率の指標となる。
【００２９】
ある実施態様において、本発明のこの態様に従って、機能性等価タンパク質は、配列番号１に記載されたタンパク質、又はその断片と６５％より大きな、配列同一性を示す。そのタンパク質は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％程度の配列同一性を有してもよい。
本発明に従って、機能性等価タンパク質はそれ故、突然変異体（アミノ酸置換、挿入又は欠失を含む突然変異体など）を含むことを意図する。そのような突然変異体は、１又はそれ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されているタンパク質を含んでもよく、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコード化されたものであってもよいし、そうでなくてもよい。典型的なそのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ間；ＳｅｒとＴｈｒ間；酸性残基のＡｓｐとＧｌｕ間；ＡｓｎとＧｌｎ間；塩基性残基のＬｙｓとＡｒｇ；芳香族残基のＰｈｅとＴｙｒ間である。
特に好ましいのは、数個：すなわち５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は単に１個、のアミノ酸がいずれかの組み合わせで置換、欠失、又は付加されたタンパク質である。またとりわけ好ましいのは、タンパク質の特性や活性を変化させないサイレント置換、付加及び欠失である。またこの点において、とりわけ好ましいのは保存的置換である。「突然変異体」タンパク質はまた、１又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むタンパク質を含む。
【００３０】
また本発明の範囲内に含まれるものは、活性断片であり、この「活性断片」は、野生型ＯＲＦ３タンパク質（配列番号１）のアポトーシス誘発能を保持する短縮型タンパク質を示す。
本発明の活性断片は、少なくとも本発明のタンパク質由来（例えば、配列番号１又はその機能性等価物由来）のｎ個の連続アミノ酸からなることが望ましい。ｎは一般的に５０、７５、８５、９０、９５又は１００又はそれ以上である。
ある実施態様において、活性断片は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列番号１又は機能性等価物の配列からなる。
そのような断片は「独立している」状態であってもよく；すなわち他のアミノ酸やタンパク質の一部でなく、又はそれらに融合していなくてもよく、あるいは、部分又は領域を形成するより大きなタンパク質に含まれていてもよい。より大きなタンパク質に含まれる場合、本発明の断片は、ある実施態様において、単一の連続した領域を形成する。さらに、いくつかの断片が単一のより大きなタンパク質に含まれていてもよい。
本発明のある実施態様において、本発明のタンパク質が、例えば、生理活性、放射性、酵素又は蛍光性、又は抗体でもよい標識の様な、ペプチドや他のタンパク質と融合した、融合タンパク質を提供する。
例えば、分泌性又はリーダー配列；プロ配列；精製に役立つ配列；又は例えば組み替え体産生中により高度なタンパク質安定性を与える配列を含む、１又はそれ以上の追加アミノ酸配列を取り入れることはしばしば有利である。代わりに、又は追加的に、成熟型タンパク質は他の化合物、例えばタンパク質の半減期を増大させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などと融合してもよい。
【００３１】
本発明第１０態様のタンパク質をコードする核酸分子
本発明の第１１態様は、本発明第１０態様のタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
ある実施態様において、核酸分子は、配列番号２に記載された配列からなる。
ある実施態様において、核酸分子は、配列番号２に記載された配列のみからなる。
遺伝子コード縮重の結果として、本発明第８態様のタンパク質をコードする多数の核酸分子中には配列番号２と最小配列同一性を持つものが製造されてもよいということは、当技術分野の業者には容易に理解されうる。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づいた組み合わせを選択して作ることが出来るポリヌクレオチド配列の各々及び、全ての可能な突然変異物を意図している。
本発明のある実施態様において、配列番号２の縮重型を含む核酸分子を提供する；すなわちその核酸分子は、配列番号２の１又はそれ以上のコドンが、配列番号２の本来のコドンと同じアミノ酸をコードする縮重コドンに置換されている核酸配列からなる。
【００３２】
本発明の核酸分子は、例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、又は例えばクローニング又は合成的に作成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは２重鎖又は単鎖であってもよい。単鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、センス鎖とも呼ばれるコード鎖であってもよいし、又はアンチセンス鎖と呼ばれる非コード鎖であってもよい。
用語「核酸分子」（及び「核酸」「核酸配列」などという類似表現）は、修飾された骨格を含むものなどの、ＤＮＡ及びＲＮＡ類似体も含む。
概して、本発明の核酸分子はまた、核酸配列の機能性等価物又は断片も本発明の範囲内に含むが、該機能性等価物又は断片は、野生型ＯＲＦ３のアポトーシス誘発能を保持するタンパク質をコードする。必要以上の試験や実験をすることなく、そのような機能性等価物及び断片を、分子生物学における標準的な技術を用いて見つけ出し、及び単離出来る。
機能性等価物は、（ｉ）配列番号２に相同性があってもよい、又は（ｉｉ）アポトーシス誘発能を保持するタンパク質を依然としてコードしながら遺伝子コードの縮重内で配列番号２に対応する配列と相同性があってもよい。本発明のある実施態様において、核酸分子は、（ｉ）配列番号２に従う核酸配列、又は（ｉｉ）依然としてアポトーシス誘発能保持するタンパク質をコードしながら遺伝子コードの縮重内でそれに対応する配列に対し、少なくとも７０％，８０％，８５％，９０％，９２％，９５％，９７％，９８％、又は９９％の相同性を有する配列からなる。
【００３３】
２個の核酸配列間の相同性度は、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰ(Program Manual for the Wisconsin Package,第8版,August 1996,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA,53711)(Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.,(1970),Journal of Molecular Biology,48,443-453)などを用いて決定してもよい。ＤＮＡ配列比較のため以下の設定：５．０のＧＡＰ生成ペナルティ及び０．３のＧＡＰ伸長ペナルティで、ＧＡＰを使用する。
核酸分子は、ＧＣＧプログラムパッケージの一部として利用可能な、Ｐｉｌｅｕｐ配列ソフトウェアを用いて、例えば、５．０のギャップ生成ペナルティ及び０．３のギャップ幅ペナルティのデフォルト設定を用いて、互いに配列してもよい。
本発明の核酸分子はまた、低ストリンジェントな、さらに好ましくは中ストリンジェントな、なおさら好ましくは高ストリンジェントな条件下で、
（ｉ）配列番号２に定義された核酸配列；又は（ｉｉ）遺伝子コードの縮重内で配列番号２に対応する配列と、ハイブリダイズ可能な機能性等価物をまた本発明の範囲内に含んでもよい。低ストリンジェントなハイブリダイズの条件は、２×ＳＳＣ中５０℃で行ったハイブリッド形成と対応してもよい。
【００３４】
サムブルックらの著書(1989;Molecular Cloning、A Laboratory Manual第2版,Cold Spring Harbour, New York)に記載されているハイブリダイズの方法に基づき、所定の核酸分子が特定の核酸へハイブリダイズするかどうかを決定する適切な実験条件は、調べたい当該核酸サンプルを含むフィルターを５×ＳＳＣに１０分間予備浸漬し、次ぎに５×ＳＳＣ、５×デンハルト（Denhardt’s）溶液、０．５％ＳＤＳ及び変性した超音波処理サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの溶液中でフィルターのプレハイブリダイズを行い、その後、約４５℃で１２時間、１０ｎｇ／ｍｌ濃度の３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブの濃度溶液中でハイブリダイズを行ってもよい。
その後、フィルターを、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー）、少なくとも６５℃（中／高ストリンジェンシー）、少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー）又は少なくとも７５℃（超高ストリンジェンシー）で、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で３０分間で２回洗浄する。ハイブリダイズは、フィルターをｘ線フィルムへ暴露することによって検出できる。
【００３５】
さらに、当技術分野の業者によく知られている、ハイブリダイズのストリンジェンシーを変更するために使われる無数の条件及び因子がある。例えば、特定の核酸へハイブリッドする核酸の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）；塩類及び他の成分の濃度：すなわちホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールなどの有無；及びハイブリダイズ及び／又は洗浄段階の温度変更などである。
さらに、２個の所定の核酸配列が、ある特定の条件下でハイブリダイズするかどうか理論的に予測することも可能である。従って、前述の経験法の代替として、突然変異核酸配列が、配列番号２で定義された核酸分子、又は遺伝子コードの縮重内で配列番号２の核酸分子の対応する配列とハイブリダイズするかどうかの決定は、例えば塩分濃度及び温度などの特定の条件下で、２個の非相同性核酸配列が既知の配列とハイブリダイズするＴｍ（融解温度）の理論計算に基づくことが可能である。
【００３６】
非相同性核酸配列の融解温度（Tm（ヘテロ））の決定において、最初に相同性核酸配列の融解温度（Tm（ホモ））を決定することが必要である。２本の完全相補的核酸鎖（ホモ二本鎖形成）間の融解温度（Tm（ホモ））については、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,1995に従い、次の公式に従って決定してもよい。
Tm（ホモ）＝81.5%+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(％ホルム)-500/L
Ｍ＝一価カチオンのモル濃度を示す
％ＧＣ＝配列における全塩基数のグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）％
％ホルム＝ハイブリダイズ緩衝液中のホルムアミド％、及び
Ｌ＝核酸配列の長さ
前記の式によって決定されたＴｍは２本の完全相補的核酸配列間のホモ２本鎖形成のＴｍ（Tm（ホモ））である。２本の非相同性核酸配列のＴｍに対するＴｍ数値に適合するために、２本の完全非相同性配列間のヌクレオチド配列における１％の差異はＴｍにおける１℃減少に相当すると仮定する。従って、ヘテロ２本鎖形成のＴｍ（ヘテロ）は、問題とする類似配列と前記のTm（ホモ）由来のヌクレオチドプローブ間の相同性％の差異を差し引くことで得られる。
【００３７】
突然変異核酸分子
本発明の第１２態様は、本発明の第１１態様に基づく突然変異型核酸分子、及び、本発明第９態様の核酸分子によってコードされたタンパク質の異常発現である突然変異型核酸分子、からなる核酸分子を提供する。
本発明のこの態様に関しては、「弱毒化ウイルス」と題された前述のセクションの関連部分を参照されたい。しかしながら、本発明第１２態様の核酸分子は、ウイルス形態で提供されるだけではなく、他の形態、例えば、核酸分子自体、ベクター等で提供されてもよいこと、及び「弱毒化ウイルス」と題されたセクションの関連部分は、従って、ウイルス以外の形態における本発明第１２態様の核酸分子の提供を必要に応じて修正して（mutatis mutandis）適用することを強調する。
【００３８】
「本発明第９態様の核酸分子によってコードされたタンパク質の異常発現」によって：（ｉ）（本発明第１１態様の核酸分子と比較し）減少又は欠失タンパク質が突然変異型核酸分子から発現され；及び（ｉｉ）突然変異型核酸分子によって発現したタンパク質はアポトーシス機能を（本発明第１１態様の核酸分子によってコードされたタンパク質と比較し）減少又は欠失している、という２点を含むことを理解するべきである。
ある実施態様において、ＯＲＦ３は、ＯＲＦ３タンパク質の減少又は欠失発現を生じさせる突然変異（例えば、ＯＲＦ３開始コドンにおける点突然変異による）；又は、結果的に減少又は欠失機能をもつＯＲＦ３タンパク質；すなわちアポトーシス誘発能が減少した（及びある実施態様において、アポトーシス誘発ができない）タンパク質をコードする突然変異であってもよい。
【００３９】
本発明の第１２態様のある実施態様において、配列番号３：
ＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡ、からなる、又は、のみからなる核酸配列；又はその縮重型が提供される。この配列は、開始コドンにおける点突然変異をもつＯＲＦ３突然変異配列を示し、その結果ＯＲＦ３タンパク質は発現しない。
【００４０】
本発明の第１２態様のもう１つの実施態様において、配列番号１９：
ＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴｔｇａＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡ、を含む、又は、のみからなる核酸配列；又はその縮重型が提供される。アミノ酸配列第２７位の終止コドンに挿入される点突然変異をもつ配列はＯＲＦ３突然変異配列を示し、その結果ＯＲＦ３タンパク質は短縮型で発現する。
【００４１】
本発明第１２態様のもう１つの実施態様において、配列番号２１：
ＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＧａＡＡＡＴＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＡＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＣＴＡＴＣＡＧＴＡＡ、を含む、又は、のみからなる核酸配列、又はその縮重型が提供される。この配列は、アミノ酸のＧｌｕ−がＬｙｓ＋に変化した点突然変異をもつＯＲＦ３変異配列を示し、その結果ＯＲＦ３タンパク質の２次構造の配座に影響する。
【００４２】
本発明の突然変異核酸分子によってコードされたタンパク質
上述から、いくつかの事例において、本発明の第１２態様の核酸分子によってタンパク質はコードされないことが理解される。しかしながら、あるタンパク質が本発明第１２態様の核酸分子によってコードされる場合、コードされないタンパク質は本発明のさらなる態様として提供される。そのようなタンパク質は野性型核酸配列（配列番号２）によりコードされたタンパク質より低いレベルで発現してもよいし、又は野性型タンパク質（配列番号１）に対し（アポトーシス誘発能に関して）減少又は欠失機能をもつタンパク質であることも可能である。
【００４３】
様々な形態の核酸分子の提供
本発明の核酸分子は、様々な形態で提供される。核酸分子を、核酸分子自体（「裸の」核酸分子）；ベクター；ウイルス又は宿主細胞他の形態で提供してもよい。
ベクターは、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを含む。本発明のベクターは、例えば、転写プロモーター、及び転写ターミネーター（転写終結区）を含んでもよい。そのプロモーターは、作動可能になるように核酸分子と連結され、及びその核酸分子は、作動可能になるように転写ターミネーターと連結される。
本発明の第１１又は１２態様に基づいて、核酸分子で形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞の適切な実施例は、当技術分野の業者に周知であり、又は当技術分野の業者により容易に選択可能である。宿主細胞は、例えば、真核及び原核細胞を含んでもよい。真核細胞の実施例は、哺乳類（例えば、ブタ）、真菌（例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））、昆虫及び植物細胞を含む。原核細胞は例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）を含む。
本発明の核酸分子（例えばベクターやウイルス、宿主細胞などを含んでもよい様々な部分を含んでいる）を、本発明のタンパク質産生に利用してもよい。従って、例えば、本発明は、本発明のタンパク質産生方法、本発明のタンパク質発現のため適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。
代替の実施態様において、本発明のタンパク質を、タンパク質の化学合成によって産生してもよい。化学合成を、例えば、固相ペプチド合成により達成しもよい。そのような技術は当技術分野で周知であり、当業者により容易に実施可能である。
本発明のタンパク質産生は、タンパク質の精製後行ってもよい。タンパク質精製の方法は当技術分野で周知であり、当業者により容易に実施されうる。
【００４４】
抗体と抗体の産生方法
本発明の第１５態様は、本発明第１０又は１３態様のタンパク質と結合可能な抗体を提供する。
本発明第１６態様は、本発明第１０又は１３態様のタンパク質と結合可能な抗体の産生方法を提供する。その方法は本発明第１０又は１３態様のタンパク質を用いて、動物（例えば、ウサギ、モルモット、齧歯動物など）を免疫化すること、又は免疫化よって産生された抗体を採取することを含んでもよい。
本発明第１５及び１６態様のある実施態様において、抗体は配列番号１に記載された配列内に含まれたアミノ酸配列と結合可能である。
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体調製物、単一特異性抗血清、ヒト抗体であってもよく、又は、例えばヒト化抗体、変性抗体である（Ｆａｂ‘）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ断片、単独ドメイン抗体、２量体又は３量体抗体断片又は構築物、ミニボディ（minibodies）、又は問題となる抗原と結合する抗体の機能性断片などの、ハイブリッド又はキメラ抗体であってもよい。
【００４５】
抗体は当技術分野で周知の技術、及び、例えば米国特許第4,011,308号、第4,722,890号、第4,016,043号、第3,876,504号、第3,770,380号、及び第4,372,745号に開示された技術を用いて産生してもよい。またAntibodies-A Laboratory Manual,Harlow and Lane,編.,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1988)も参照されたい。例えば、ポリクローナル抗体は、関心のある抗原を用いて、適切な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、又はヤギを免疫化することによって生成する。免疫原性を強化するため、抗原は免疫化に先立ち担体に結合可能である。そのような担体は当業者には周知である。免疫化は、通常生理的食塩水、好ましくはフロイント完全アジュバントなどのアジュバントに抗原を混合又は乳化し、非経口で（通常皮下又は筋肉内に）混合物又は乳濁物を注射することにより行われる。動物には、通常２−６週間後に生理的食塩水、好ましくはフロイント不完全アジュバントを用いた抗原注射で１又は２回以上追加免疫する。抗体を、当技術分野で知られている方法を用いて、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、試験管内）の免疫化により生成してもよい。次いで、ポリクローナル抗血清を免疫化された動物から得る。
【００４６】
モノクローナル抗体は通常、Kohler及びMilstein(1975)Nature 256:495-497の方法、又はその修正方法を用いて調製する。一般的に、上述したマウス又はラットが免疫化される。ウサギもまた用いられる。しかしながら、動物から採血して血清を抽出するよりもむしろ、その脾臓（及び任意にいくつかの大きなリンパ節）を取り出し、単一の細胞に解離する。（非特異性付着細胞の除去後）細胞懸濁物を抗原でコーティングしたプレート又はウェルに加えるによって、脾臓細胞をスクリーニングしもよい。抗原に対して特異的な膜結合性免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、残りの懸濁液とともに洗い流されない。次いで、結果得られたＢ細胞、又は全ての解離した脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成のためにミエローマ細胞と融合させ、選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地「ＨＡＴ」）で培養する。結果得られたハイブリドーマは、限界希釈でプレートに置かれ、免疫抗原に特異的に結合する（及び関係のない抗原に結合しない）抗体産生について測定する。次いで、選択されたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを、インビトロ（例えば、組織培養ビン又は中空繊維反応器）又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ、生体内）（例えば、マウス内の腹水）で培養する。 
【００４７】
ヒト化及びキメラ抗体もまた本発明において有益である。ハイブリッド（キメラ）抗体分子は通常Winter他(1991)Nature 349:293-299、及び米国特許第4,816,567号で説明されている。ヒト化抗体分子は通常Riechmann他(1988)Nature 332:323-327、Verhoeyan他(1988)Science 239:1534-1536、及び英国特許公開番号GB2,276,169号、1994年9月21日公開)を参照されたい。
抗体へ分子を結合するため、それによって分子と特異的に反応することが可能な場合、抗体は分子を「結合可能」であると言う。
ある実施態様において、抗体又はその断片は約１０５Ｍ−１より大きい、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１より大きい、さらに好ましくはやはり約１０７Ｍ−１より大きい、及び最も好ましくは約１０８Ｍ−１又は１０９Ｍ−１より大きい結合親和性又は結合活性を持つ。抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析（Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51:660(1949))によって、当業者により容易に測定されうる。
【００４８】
本発明の分子部分の単離された形態での提供
本発明のタンパク質、核酸分子及び抗体は「単離された」状態でもよい。本明細書で用いられるように、用語単離されたは自然の状態から「人の手によって」変更されたことを意味する；すなわち、自然に起こった場合、その自然宿主又は環境から変化している、又は取り除かれるということである。関連した不純物を減らし、又は除去してもよい。
本発明の様々な分子部分は、例えばワクチン処方物などの医薬組成物の形態で提供されてもよい。従って、本発明の一態様において、本発明の核酸分子、タンパク質、抗体、拮抗剤、作用剤、ウイルス、ベクター、又は宿主細胞を含む医薬組成物が提供される。
医薬組成物及びワクチンに関しては、読者は前記の関連部分を参照されたい。
【００４９】
作用剤又は拮抗剤のスクリーニング
本発明は、本発明のタンパク質の作用剤又は拮抗剤のスクリーニングのための方法を提供する。そのような作用剤及び拮抗剤は様々な有用性を持つ。例えば、ＯＲＦ３タンパク質の拮抗剤は、ＰＭＷＳの治療に有用性があってもよい。そのような拮抗剤は、ＯＲＦ３タンパク質のアポトーシス誘発能を減少させ、それ故、ＰＣＶ２の病原性や症状を減少させることが可能である。
本発明のタンパク質は、様々な薬剤スクリーニング技術の何れかを、化合物ライブラリーのスクリーニングのために使用することが可能である。そのような化合物は、本発明のタンパク質（例えば、本発明の第１０又は第１３態様に基づくタンパク質）の活性を調節（作用又は拮抗）してもよい。
ある実施態様において、その方法は、本発明のタンパク質と試験化合物を接触させること、及びその試験化合物が本発明のタンパク質に結合するかどうかを測定することを含む。さらに、その方法は、その試験化合物が本発明のタンパク質の活性（例えば、アポトーシス誘発能）を高める、又は減少させるかどうかの測定含んでもよい。
試験化合物が本発明のタンパク質の活性を高める又は減少させるかどうかの測定方法については、当技術分野の業者は周知であり、例えば、実験／ソフトウェア又はＸ線結晶解析を結びつけることを含む。
本発明のスクリーニング方法において使用される本発明のタンパク質は、溶液中に遊離してもよく、固体担体に固定してもよく、細胞表面に在ってもよく、又は細胞内に位置してもよい。
【００５０】
試験化合物（すなわち、潜在的作用剤又は拮抗剤化合物）は、天然の、又は修飾された基質；酵素；レセプター；例えば最大２０００Ｄａ、好ましくは８００Ｄａ又はより小さい、小さな天然の、又は合成の有機分子のような小さな有機分子；ペプチド擬似体；無機分子；ペプチド；タンパク質；抗体；上述の構造的又は機能的な模倣物を含む様々な形態で提供しもよい。
ＯＲＦ３タンパク質の拮抗剤又は作用剤を同定するためのさらなる方法は、アポトーシス誘発能がある本発明第１０態様のタンパク質を細胞内で発現させ、試験化合物に細胞を暴露し、その試験化合物が該タンパク質のアポトーシス誘発能に影響を与えるかどうかを測定し、それによって試験化合物が拮抗的、又は作用的な活性を持つかどうか測定することを含んでいてもよい。
試験化合物を、例えば、細胞、無細胞標品、化合物ライブラリー又は天然生成混合物から単離してもよい。これらの作用剤、又は拮抗剤は、天然の又は修飾された基質、リガンド、酵素、レセプター又は、構造的又は機能的な模倣物であってもよい。そのようなスクリーニング技術の適切な総説に関しては、Coligan他、Current Protocols in Immunology1(2):5章(1991)を参照されたい。
【００５１】
最もよい拮抗剤又は作用剤となり得る化合物は、本発明のタンパク質に結合する分子である（結合時にタンパク質の生物学的効果を誘発することがない拮抗剤の場合）。
拮抗剤は、あるいは、本発明のタンパク質に対するレセプターとの競合的結合に基づいて機能してもよい。
作用剤は、あるいは、本発明のタンパク質に対するレセプターに結合し、本発明のレセプターとタンパク質間を結合する親和性を増大させるように機能してもよい。
潜在的拮抗剤としては、小さな有機分子、ペプチド、タンパク質及び抗体があり、これらは本発明のタンパク質に結合し、それによってタンパク質の活性を抑制又は消去する。このような方法で、該タンパク質の正常な細胞内結合分子への結合が抑制され、そのようにして該タンパク質の本来の生物学的活性が抑制されるかもしれない。
上述された所定の実施態様において、簡単な結合測定法が用いられ、１つの測定法では、試験化合物に直接又は間接的に結合した標識を用いて、表面に付着するタンパク質に結合する試験化合物を検出し、又は別な測定法では、標識した競合物質との競合を用いる。
用いられてもよいもう１つの薬剤スクリーニング技術は、タンパク質に対して適切な結合親和性を持つ化合物の高処理量スクリーニングの提供である（Ｗ０８４／０３５６４を参照されたい。）。この方法において、多数の異なる小さな試験化合物を固体基質上で合成し、次にタンパク質と反応させ、洗浄する。タンパク質を固定する１つの方法は、非中和抗体を使用することである。結合したタンパク質は次に、当技術分野で周知である方法を用いて検出できる。精製されたタンパク質を前述の薬剤スクリーニング技術を用いてプレート上に直接塗布することも可能である。
【００５２】
インシリコ（コンピューター内）方法も作用剤及び拮抗剤を同定するために用いることが可能である。作用剤及び拮抗剤部分の活性は次に、必要な場合には、実験で確認してもよい。
本発明のさらなる態様において、本発明のスクリーニング方法によって同定した作用剤又は拮抗剤が提供される。
本発明をある箇所において、本発明の特定の態様に関して説明する場合、精通した読者は、そのコメントは本発明の他の態様において同じく適用できて、説明は適宜に解釈するべきであることを理解する。
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、免疫学、当技術分野内の遺伝子組み換えＤＮＡ技術を用いることが可能である。
そのような技術は文献に詳細に説明されている。例えばSambrook他「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(第3版、2001);「Current Protocols in Molecular Biology」I-III巻[Ausubel,R.M.編(1999及び隔月更新);「Cell Biology:A Laboratory Handbook」第I-III巻[J.E.Celis編(1994)];「Current Protocols in Immunology」第I-IV巻[Coligan,J.E.編(1999 及び隔月更新)];「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編 1984);「Nucleic Acid Hybridization」[B.D.Hames及びS.J.Higgins編(1985)];「Transcription And Translation」[B.D.Hames及びS.J.Higgins編(1984));「Culture of Animal Cells 第4版」[R.I.Freshney編(2000));「Immobilized Cells And Enzymes」[IRL Press(1986));B.Perbal,「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1988);Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No.I,Harlow,Ed及びLane,David(Cold Spring Harbor Press,1998);Using Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow,Ed及びLane,David(Cold Spring Harbor Press,1999).を参照されたい。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
本発明者は、ＰＫ１５細胞におけるＰＣＶ２の増殖感染中に、新種のウイルス遺伝子、ＯＲＦ３、を発見した。部位特異的突然変異誘発法によるＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２での感染結果により、該タンパク質はウイルス複製に必須ではないことが分かった。
細胞にＯＲＦ３単独のトランスフェクトにより、ウイルス感染領域での説明と類似の経路によりアポトーシスが誘発される。このことはさらにＯＲＦ３発現を欠いた感染細胞のアポトーシス活性が明らかに減少することで確認出来て、該タンパク質がウイルス誘発性アポトーシス誘導において主要な役割を果たすこと、及び該タンパク質がウイルス性病因に関わっている可能性があることが示唆される。
野性型ＰＣＶ２を感染させたマウスと比較すると、ＯＲＦ３遺伝子発現を欠く突然変異体ＰＣＶ２をＢａｌｂ／Ｃマウスに感染後これらマウスに病理変化は認められなかった。従って、突然変異体ＰＣＶ２が、ＰＭＷＳを誘発するＰＣＶ２に対する弱毒化生ワクチンになる可能性を持つことが示唆される。
【００５４】
本発明において、ＯＲＦ３に対する特異的抗体を用いて、ＯＲＦ３タンパク質が、ＰＣＶ２感染細胞で実際に発現すること、及び該タンパク質が培養細胞におけるＰＣＶ２複製に必須ではないことが示された。さらに、ＯＲＦ３タンパク質は、ウイルス感染の文脈で説明したのと類似の経路を用いて、ＰＣＶ２誘発性アポトーシスにおいて主要な役割を果たすことが示された。ＯＲＦ３発現を欠く感染細胞のアポトーシス活性の明らかな減少により、このことはさらに確認される。
本発明において、陰性対照としての健康マウス、及び陽性対照としてのＰＣＶ２感染マウスを用い、突然変異体ＰＣＶ２接種原を８週齢の実験用マウス群に投与した。１０５ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）の単回投与を各実験用マウスに行った。実験セットは一方で、顕著に、より軽度な顕微鏡的病変、及び軽度な身体的効果を示したが、他方陽性対照のように、多量のＰＣＶ２抗原に対する細胞質標識を示した。
【００５５】
材料と方法
ウイルスと細胞
ＰＣＶを含まないＰＫ１５永久細胞株を、５％濃度ＣＯ２加湿インキュベーターにおいて、３７℃で、５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５％Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、及び１００μｌ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した最小必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で維持した。一過性発現アッセイで用いるＣｏｓ−７細胞を、１０％のＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で維持した。実験に用いるＢＪＷ株ＰＣＶ２ウイルスは、最初中国北部地域で自然に発生したＰＭＷＳ感染ブタ腎組織サンプルから単離されたものである。腎組織を処理し、ＰＫ１５細胞に接種した。またそのゲノム配列を、ＧｅｎＢａｎｋに寄託した（アクセス番号：ＡＹ８４７７４８）。
【００５６】
ＯＲＦ３に対する抗体の産生
図１Ａに示すように、ＯＲＦ３と同様、ＯＲＦ１とＯＲＦ２遺伝子を、ＢＪＷ株ＰＣＶ２の遺伝子地図に表示する。ＯＲＦ３全長をコードするＤＮＡを、ＰＱＥ３０中にクローニングし、大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１細胞に導入し形質転換した。これらの細胞を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を用いてＯＲＦ３の発現を誘導し、３７℃で４時間増殖させた。Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質を精製し、その調合液をポリクローナル抗体産生のためにマウスへ投与した。４回の投与後、マウスを採血し、ＯＲＦ３に対する血清の反応性について検定した。該抗体は、ＰＣＶ２ウイルスに感染した、又はＯＲＦ３発現構築物を導入した、ＰＫ１５細胞内で発現したＯＲＦ３に対して特異的反応性を示した。
【００５７】
ＰＣＶ２突然変異体及びプラスミドの構築
一対のＰＣＲプライマー：前方プライマー、Ｆ−ＰＣＶＰＳＴ（５′−ＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＴＴＡＣ−３′）及び逆方向プライマー、Ｒ−ＰＣＶＰＳＴ（５′−ＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＧＣＴＧ−３′）を、ＢＪＷ分離株ＰＣＶ２配列に基づいて設計した。この一対のプライマーは唯一のＰｓｔ１制限酵素部位を含む重複領域を持つＰＣＶ２完全ゲノムを増幅する（図１Ａ及びＣ）。要約すると、QIAampDNA Minikit(Qiagen)を用いて、自然発生ＰＭＷＳ感染ブタ腎組織サンプルから、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをＰＣＲ（Perkin-Elmer）により下記の条件で増幅した：９４℃、５分間の初期酵素活性化段階、それに続く９４℃、１分間の変性段階、４８℃、１分間のアニーリング段階、７２℃、２分間の伸長段階を３５サイクル、及び７２℃、１０分間の最終伸長段階。予定サイズのＰＣＲ産物をゲル電気泳動法で分離して、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて精製した。
ＰＣＶ２ゲノムを含むＤＮＡクローン分子を構築するために、ＰＣＲ産物をpBlueScript SK(pSK)ベクターにクローニングした。該クローンを、ＰＣＶ２ゲノムの特異的プライマーと同じく、Ｍ１３前方及び逆方向ユニバーサルプライマー；及びABI Prism Dye terminator cycle sequencing kit(PE Biosystems)を用いて、両鎖の配列を決定した。
【００５８】
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、クローン化したＰＣＶ２ゲノムに、特異的な突然変異を導入した。製造業者の説明書に基づき、一組の突然変異誘発性プライマー（前方プライマー、５´−ＧＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＣＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＡ−３´、逆方向プライマー、ＴＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣ−３´）を用いて突然変異プラスミドを産生する。突然変異（ｎｔ６７１）をイタリック体太文字で示し（図１Ｂ）、その部位でＯＲＦ１タンパク質のアミノ酸配列の変更はできない。ＰＣＶ２ゲノムをｐＳＫプラスミドから切り出し、連結反応により環状化した後、連結したＤＮＡ混合物を６０〜８０％程度の集密状態のＰＫ１５細胞内へトランスフェクトした。
【００５９】
組み換え真核細胞発現プラスミドを作成するため、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３遺伝子のコード配列をＰＣＶ２ゲノムから増幅した。下記のプライマー：ＧＦＰ−ＯＲＦｌ（５）：５´−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧ−３´及びＧＦＰ−ＯＲＦｌ（３）：５´−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧ−３´、ＧＦＰ−ＯＲＦ２（５）：５´−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＡＣＧＴＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧ−３´及びＧＦＰ−ＯＲＦ２（３）：５´−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＴＣ−３´、ＧＦＰ−ＯＲＦ３（５）：５´−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧ−３´及びＧＦＰ−ＯＲＦ３（３）：５´−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＣＴＣ−３´、を各々、これらの３つの遺伝子を増幅するのに用いた。ＧＦＰ−ＯＲＦ１、ＧＦＰ―ＯＲＦ２、及びＧＦＰ−ＯＲＦ３を得るために、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ断片ＯＲＦ１、及びＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ断片ＯＲＦ２及びＯＲＦ３を、夫々真核細胞発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の対応部位に、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターの下流方向にクローニングした。これらをＰＣＲ増幅の結果として、エラーが生じていないことを確認するために配列決定した。
【００６０】
トランスフェクト及び感染
ＰｓｔＩ消化ＰＣＶ２、又はＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２は、夫々組み換え体ＰＣＶ２（ｒＰＣＶ２）又は突然変異体ＰＣＶ２（ｒＰＣＶ２ＯＲＦ３△）を産生するために作成したものであるが、ゲノムトランスフェクトのため、これらを対応するクローンゲノムから単離し、ゲル精製し、トランスフェクトする前に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂ）の存在下１６℃で一晩再環化した。先に記載したトランスフェクト後（４９）、細胞をさらに３００ｍＭ  Ｄ−グルコサミンで２４時間処理した。ゲノムをトランスフェクトした細胞を、感染検査のため３回連続の凍結・融解サイクルへかけた。全溶解物を集め、ＰＣＶ汚染のないＰＫ１５細胞を感染させるために使用した。次にそれらを上述したグルコサミン処理し、感染後ＩＦＡで解析を行った。
ＧＦＰ−ＯＲＦ１、―ＯＲＦ２、−ＯＲＦ３構築物のインビトロ発現を、ＰＫ１５細胞を用いた一過性発現実験で検査した。２５×２５ｍｍフラスコで培養された細胞に、製造業者のプロトコルに記載されたようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、ＵＳＡ）を用いて、ＧＦＰベクターのみ、ＧＦＰ−ＯＲＦ１、ＧＦＰ―ＯＲＦ２、又はＧＦＰ−ＯＲＦ３（フラスコ当たり２μｇプラスミド）をトランスフェクトした。トランスフェクト２４時間後、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３の発現を、マウス抗ＯＲＦ１、ＯＲＦ２（Ｌｉｕ及びＫｗａｎｇ、個人データ）、又はＯＲＦ３ポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティング解析により証明した。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＯＲＦ３遺伝子の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のために、全細胞ＲＮＡを、ウイルス感染したＰＫ１５細胞からＴｒｉｚｏｌＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。該ＲＮＡサンプルを、ＤＮａｓｅＩで３７℃、６０分間インキュベートし、全ての汚染ウイルスＤＮＡを除去した。センスプライマーとアンチセンスプライマーは、それぞれＲ６７１：５´−ＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧ−３´及びＦ３５７：５´−ＴＴＡＣＴＧＡＴＡＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＣ−３´であった。オリゴヌクレオチドの接尾辞（Ｆ又はＲ）は、プライマーの方向性を示す。Ｆはｎｔ０から１７６７への前方向を表示し、一方Ｒはｎｔ１７６７から０への逆方向を表示する。ＲＴ−ＰＣＲを、AMV Reverse Taranscriptase kit(Roche)及びExpand High Fidelity PCR kit(Roche)を用いて行い、ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、撮影した。
【００６２】
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
ＩＳＨを以下のように行った。簡単に説明すると、８０％の集密度になるまでチャンバースライド（ＩＷＡＫＩ）で培養されたＰＫ１５細胞に、１ＭＯＩのＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）で野生型ＰＣＶ２又は突然変異ＰＣＶ２を感染させた。感染２４、４８、７２及び９６時間後のスライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド溶液で３０分間室温（ＲＴ）で固定し、乾燥させた。０．１Ｍトリエタノールアミン、０．２Ｎ  ＨＣｌ及び０．５％無水酢酸でアセチル化した後、スライドをハイブリダイズ溶液（５０％ホルムアミド；５×ＳＳＣ；５０μｇサケ精子ＤＮＡ／ｍｌ）中に６０℃で２時間プレハイブリダイズし、その後１μｇ／ｍｌ濃度のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＲＮＡプローブで６０℃で一晩ハイブリダイズした。スライドを洗浄後、Ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）（緩衝液［１０％ウシ胎児血清；１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５］で１：５０００に希釈した１５０μｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。
スライドを洗浄し、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ混合物とインキュベートし、検定のため顕微鏡下に取り付けた。
ＫｐｎＩで線状化したＯＲＦ３のｃＤＮＡを含むｐＳＫプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用いたインビトロ転写によって、センスリボプローブを合成した。アンチセンスリボプローブについては、ＯＲＦ３断片を一組のプライマー（前方プライマー：５´−ＡＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＴＴＣＴＡＧＧＴＧＧＴＴＴＣＣＡＧ−３´、逆方向プライマー：５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＣＧＣＧＧＧＣＴＧＧ−３´、Ｔ７プロモーターは下線を付した）を用いて増幅し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写した。NTP-DIG label mix(Roche)を用いて、両ＲＮＡプローブを標識した。
【００６３】
ＰＣＶ２複製検定法
ＰＣＶ２の増殖特性を解析するため、集密状態のＰＫ１５細胞に野性型、組み換え型、又は突然変異ＰＣＶ２ウイルス株（ＰＫ１５細胞で３継代後生成した）を１ＭＯＩ  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）で感染させた。感染した培養細胞を、３サイクルの凍結融解により、様々な時間間隔で細胞から採取し、上清を得た。培養細胞内に存在する感染ウイルス価を、先に記載したＰＫ１５細胞上のＩＦＡ（１４）によって測定した。
【００６４】
アポトーシス検定法
感染後２４、４８、７２及び９６時間チャンバースライド（ＩＷＡＫＩ）で培養したＰＫ１５細胞を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ブタ抗ＰＣＶ２血清及びＦＩＴＣ−結合抗体で染色した。ＧＦＰ−ＯＲＦ１、ＧＦＰ―ＯＲＦ２、又はＧＦＰ−ＯＲＦ３プラスミドをトランスフェクトしたＰＫ１５又はＣｏｓ−７細胞を、それぞれトランスフェクト２４及び４８時間後に４％ＰＦＡで固定した。次にそのスライドを１μｇ／ｍｌ濃度のＤＡＰＩ（２，４−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と３７℃、３０分間インキュベートし、Ｐｌａｎ−Ｎｏｖｏｆｌｕａｒ６３×／１．４油浸レンズを用いてＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下で検査した。
感染したＰＫ１５細胞（２〜３×１０６）を感染後様々な間隔で採取し、４℃、１０分間１０００×ｇで遠心分離した。沈殿物をＰＢＳ中で洗浄し、２．５％グルタールアルデヒドで固定した。次ぎに、細胞を１％Ｓ２Ｏ４で後固定し、ＥＰＯＮ−８１２に包埋した。超薄切片を切りとり、日立Ｈ−７００電子顕微鏡で検査した。
【００６５】
７５×７５ｍｍフラスコで培養したＰＫ１５細胞に、野生型ＰＣＶ２を感染させた。処理後、浮遊及びトリプシン分離細胞をプールし、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、７０％の冷エタノールで固定し、その後ＰＢＳで２回洗浄した。遠心分離後、細胞沈殿物をＰＢＳヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）で染色し、ＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍｌ）で４５分間処理した。ＰＫ１５細胞のＤＮＡ含量を蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。少なくとも１００００個の事象を解析し、ｓｕｂ−Ｇ１期集団内の細胞の割合を計算した。ヒストグラムの基点で細胞残屑の凝集をｓｕｂ−Ｇ１細胞解析から除外した。各実験において、擬似感染ＰＫ１５細胞を対照として使用し、ＰＣＶ２に感染した細胞と比較した。
野性型ＰＣＶ２で感染した細胞、又はＧＦＰ−ＯＲＦ１、ＧＦＰ―ＯＲＦ２、又はＧＦＰ−ＯＲＦ３プラスミドをトランスフェクトした細胞から、付着及び非付着細胞を別々に収集し、１０分間２００×ｇで沈殿させ、氷冷ＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡で検査した。最低限３００細胞／サンプルをアポトーシス変化（核が多数の小片に断片化）のために計数した。
【００６６】
間接蛍光法（ＩＦＡ）
チャンバースライド（ＩＷＡＫＩ）で増殖したＰＫ１５細胞に、１ＭＯＩ  ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）量の、野生型、組み換え体、又は突然変異体ＰＣＶ２を、感染のため、３７℃、６０分間インキュベートし、培養のためＭＥＭを添加した。３７℃での培養し、感染２４、４８、７２及び９６時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中４％のＰＦＡで室温で３０分間固定した。固定後、細胞を３％ＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔ中で、室温で一時間ブロッキングした。一次抗体、マウス抗ＯＲＦ３ポリクローナル抗体、又はブタ抗ＰＣＶ２抗体を１％のＢＳＡを含むＰＢＳ―Ｔ中で希釈し、３７℃、１時間、細胞とインキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞を１％のＢＳＡを含むＰＢＳ−Ｔで希釈したラビット抗マウス又は抗ブタＦＩＴＣ結合抗体（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃、１時間インキュベートした。細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、ｄＨ２Ｏ内ですすぎ、乾かし、蛍光封入媒体でマウントし、蛍光顕微鏡を用いて検査した。
【００６７】
ウエスタンブロット解析
野性型ＰＣＶ２に感染したＰＫ１５細胞由来の全細胞溶解物を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、セミドライトランスファー装置（Bio-Rad Trans-Blot SD）を用いてニトロセルロース（ＮＣ）膜（Stratagene）に転写した。膜への非特異的結合を防ぐために、膜を、５％の脱脂粉乳を含むブロッキング緩衝液ＴＢＳＴ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、室温で２時間ブロックし、次にマウス抗ＯＲＦ３抗体と室温で２時間インキュベートした。次に、膜を３回ＴＢＳＴで洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈（１：２，０００）した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ）を用いて室温で１時間インキュベートした。洗浄後、膜を３，３´―ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド（Pierce、Rockford、III.USA）基質（２０ｍｌ０．１Ｍ  ｐＨ７．４  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；２０ｍｇ  ＤＡＢ、及び６．８μｌ  Ｈ２Ｏ２）で反応させ、次にその反応を蒸留水で止めた。
【００６８】
免疫化及び生ワクチン用量
本研究において、ＴＣＩＤ５０弱毒化突然変異ＰＣＶ２細胞を、実験用Ｂａｌｂ／ｃ白色マウスの鼻腔内経路と腹腔内経路両方で各群に投与した。
【００６９】
病理学及び免疫組織化学研究
選択した器官の剖検を、全ての動物について行った。肺、肝臓、リンパ節のサンプルを収集し、４％ＤＥＰＣ処理リン酸緩衝のパラホルムアルデヒドに浸して固定した。固定したサンプルを脱水し、パラフィン蝋に埋め込み、６μｍの厚さに切り、次にヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）によって染色した。全てのサンプルについて、物理的損傷、又は顕微鏡的病変のいずれの徴候についても吟味した。リンパ球様細胞の欠乏、組織球細胞、及び／又は多核細胞の存在による浸潤についても、またリンパ系器官を吟味した。
アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術を免疫組織化学研究に用いた。５μｍの厚さに切った組織を、シランコートしたスライド上に置いた。１％Ｔｒｉｔｏｎを含むリン酸緩衝生理食塩水中３％のＨ２Ｏ２に１０分間、スライドを浸して、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。ブロッキングに５％の正常マウス血清を用い、室温で１時間行った。次いで、ブタから産生した精製ＰＣＶ２一次抗体のＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎによる１００分の１希釈液を用いて、切断片を室温で、一晩インキュベートし、ビオチン化抗ブタ抗体、及びペルオキシダーゼ結合アビジンを２００分の１の稀釈率で、室温で一時間スライドに塗布した。次にジアミノベンジジン（ＤＡＢ）―過酸化水素溶液中で切断片を５分間インキュベートし、１％のメチルグリーンで対比染色し、脱水し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）でマウントし、顕微鏡検査を行った。
【００７０】
実施例１：ＰＣＶ２感染細胞内の新しいウイルスタンパク質ＯＲＦ３の同定
感染又は擬似感染したＰＫ１５細胞の全細胞核酸を、逆転写（ＲＴ）―ＰＣＲにより解析した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分離した（図１Ｄ）。３１５ｂｐ断片であるＯＲＦ３遺伝子を、指定した時刻にＰＣＶ２感染細胞から単離したＲＮＡを用いて増幅したが、このことは、ＰＣＶ２感染細胞において、ＯＲＦ３遺伝子は、転写レベルで発現出来ることを示す。さらにＯＲＦ３ｍＲＮＡの相対分布を測定するために、ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞の解析を行った。図１Ｅ（パネルａ〜ｄ）で示すように、アンチセンスリボプローブを用いて、ＯＲＦ３ｍＲＮＡのシグナルが、指定した時刻にＰＣＶ２感染細胞内で検出でき、また感染細胞の核内に主に位置することが分かった。興味深いことに、センスＯＲＦ３リボプローブを用いても、ｍＲＮＡシグナルが感染細胞内で検出された（図１Ｅ  パネルｅ）。このことは、ＰＣＶ２全ゲノム内の反対方向で、全ＯＲＦ３遺伝子が完全にＯＲＦ１遺伝子と重複しており（図１Ｃ）、従ってＯＲＦ１ｍＲＮＡシグナルを検出したと説明可能である。さらに、ＰＣＶ２に非感染の対照細胞内ではシグナルが検出されなかった（図１Ｅ、パネルｆ）。この結果は、ＰＣＶ２感染細胞内でＯＲＦ３ｍＲＮＡを検出することが出来て、核内に位置することをさらに示した。
【００７１】
ＯＲＦ３遺伝子をＥ．ｃｏｌｉベクターＰＱＥ３０内でクローニングし、発現させた（データ省略）。さらに、この組み換えタンパク質を、抗ヒスチジンモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティング法により確認し（データ省略）、以下の実験で使用したタンパク質ＯＲＦ３に対する単一特異性抗体の産生のために調製した。
ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞内でＯＲＦ３タンパク質が発現したかどうかを測定するため、材料と方法に記載されたＰＣＶ２（ＢＪＷ株）を細胞に感染させた。ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞内のＯＲＦ３の発現と分布（位置）を測定するため、抗ＯＲＦ３マウスポリクローナル抗体を直接免疫蛍光法実験において使用した。感染２４，４８，７２及び９６時間後にＰＣＶ２感染した細胞内でＯＲＦ３を発現する細胞集団を検出した（図２Ａ、パネルｂ〜ｄ、データ省略）。ＯＲＦ３タンパク質は、主に感染した細胞の核内に局在し、細胞質内には少なかった。図２Ａ（パネルｃ）で示すように、ＯＲＦ３タンパク質は感染４８時間後に感染細胞内で最も強く発現した。擬似感染細胞ではＯＲＦ３に対するマウス抗体の特性を示す顕著な染色は観察されず（図２Ａパネルａ）、マウス抗体がＯＲＦ３に対して特異的であることを示した。さらに感染後指示された時間に、全タンパク質をＰＫ１５細胞から採取し、ウエスタンブロッティング法にかけた（図２Ｂ）。マウス抗ＯＲＦ３抗体を用いることにより、感染２４時間後にＰＣＶ２感染細胞内に、淡いが、明らかに認識出来るタンパク質のシグナルを検出した。バンドの強度はその後大幅に増大したが、感染７２時間後に減少した。擬似感染細胞ではシグナルを検出しなかった（図２Ｂ）。同時に、これらの結果から、ＰＣＶ２感染細胞において、転写及び翻訳レベル両方で発現するという理由から、ＯＲＦ３は新規のウイルス性タンパク質であると考えられる。
【００７２】
２個の主要な読み取り枠（ＯＲＦ）をＰＣＶのゲノム内に同定した。ウイルスのカプシドをコードするｃａｐ遺伝子ＯＲＦ２は、主要な構造タンパク質である。他方の遺伝子はｒｅｐ遺伝子（ＯＲＦ１）であり、２個のＲｅｐイソ型、Ｒｅｐ及びＲｅｐ´の合成を導き、これらイソ型はウイルス複製に必須である（９、２５）。さらに、ブタ腎細胞内で増殖感染中に、ＰＣＶ２のさらに６種のＲＮＡ（３種のＲｅｐ関連ＲＮＡであるＲｅｐ３ａ、Ｒｅｐ３ｂ、Ｒｅｐ３ｃ、及び３種のＮＳ関連ＲＮＡであるＮＳ５１５、ＮＳ６７２、ＮＳ０）を検出した（９、１０）が、これらの転写単位は、ウイルスタンパク質合成又はＤＮＡ複製へ影響を持たないと示唆される。ＮＳ５１５、ＮＳ６７２、及びＮＳ０はＲｅｐプロモーターの下流のＯＲＦ１内部で３種の異なるプロモーターから転写されたと考えられ（９）、他のタンパク質又は機能性タンパク質をコードしていないようである。同定された９種のＰＣＶ２特異的ＲＮＡのうち、ＯＲＦ２ＲＮＡのみが相補的なＤＮＡ鎖から転写され、ウイルスのカプシドタンパク質ＯＲＦ２をコードする。本研究において、ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞内の相補的ＤＮＡ鎖ゲノムから転写された新規ウイルスＲＮＡを検出し、さらにＰＣＶが培養細胞内でＰＣＶ２誘発性アポトーシスに関与する新規ウイルス性タンパク質（本明細書でＯＲＦ３と命名された）をコードすることを実証した。
【００７３】
この新規転写物ＯＲＦ３ＲＮＡを、ＰＣＶ２感染細胞内においてＲＴ―ＰＣＲにより容易に検出し（図１Ｄ）、さらにＩＳＨ測定法を用いて感染細胞の核内部において検出した（図１Ｅ）。さらに、ＯＲＦ３抗原に対する特異的抗体を用いて、タンパク質は、ＰＣＶ２に感染したＰＫ１５細胞内で発現し（図２Ａ）、感染細胞の核内に主に局在し、細胞質内には少ない（図２Ａ）ことを免疫蛍光法によって示した。また感染細胞のタンパク質発現を、ウエスタンブロット解析により検出することが可能であった（図２Ｂ）。地理学的に異なる２０種以上のＰＣＶ２分離株の配列解析（ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手した）によると、ＯＲＦ３タンパク質は研究されたＰＣＶ２株内において高度に保存されており、アミノ酸のレベルで９４．５％を超える同一性があることが示唆された（データ省略）。しかしながら、ＰＣＶ１株の対応領域では異なっているようであり、６１．５％のアミノ酸配列同一性しか示さない。ＰＣＶ１ウイルスは自然界に非病原菌で存在し、またブタのいかなる病理学的損傷の原因にもならないので（３，４８）、これらの残渣が、ウイルスの病原性発現に関与しているかもしれない。
【００７４】
実施例２：ＯＲＦ３はウイルス複製に必須ではない
前述のように、点突然変異によりＯＲＦ３遺伝子の開始コドンＡＴＧがＧＴＧへ変わり、ＯＲＦ３遺伝子を欠くＰＣＶ２突然変異体を作成した（図１Ｂ）。ウイルス複製におけるＯＲＦ３タンパク質機能の研究のため、ＰＫ１５細胞を野生型ＰＣＶ２又は突然変異体ＰＣＶ２の感染性クローンＤＮＡでトランスフェクトした。野性型ＰＣＶ２のＤＮＡは予想通り組み換え体ＰＣＶ２（ｒＰＣＶ２）を生成したが、突然変異体ＰＣＶ２のＤＮＡでトランスフェクトしたＰＫ１５細胞も成育可能な突然変異体ウイルス（ｒＰＣＶ２ＯＲＦ３Δ）を生成した。ウイルス力価を上昇させるため、その突然変異体ウイルスをＰＫ１５細胞内で３回継代した。その後、感染又は擬似感染の全細胞核酸をＲＴ−ＰＣＲによって解析した。反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離した（データ省略）。野性型ＰＣＶ２感染細胞にみられるように、突然変異ＰＣＶ２感染細胞から単離されたＲＮＡを用いて３１５ｂｐ断片を増幅したが、このことはＯＲＦ３遺伝子の開始コドンで生じる点変異はその転写に作用しないことが示され、さらにＯＲＦ３転写の開始部位は上流に位置するかもしれないことが示唆された。擬似感染ＰＫ１５細胞を用いた場合、ＰＣＲ生成物は得られなかった。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列解析の結果、生成したＰＣＶ２突然変異体において予期した変化の存在を確認した（データ省略）。さらに、アンチセンスＯＲＦ３リボプローブを用いることにより、ＯＲＦ３遺伝子のｍＲＮＡシグナルを突然変異ＰＣＶ２感染細胞の核内に検出した（データ省略）。
【００７５】
ＯＲＦ３タンパク質の発現を検出するため、ＰＫ１５細胞を回収ウイルスで感染させ、ＯＲＦ３特異的抗血清を用いてＩＦＡで解析した。図３は組み換え体又は突然変異体ＰＣＶ２感染細胞の免疫蛍光染色の結果を示している。ｒＰＣＶ２ウイルスに感染した細胞はＯＲＦ３タンパク質を発現し、陽性の免疫蛍光シグナルを示した（図３Ａ）。しかしながら、突然変異体ｒＰＣＶ２ＯＲＦ３Δウィルスに感染した細胞は、１２継代後でさえ何らの蛍光シグナルも示さず（図３Ｄ）、このことは、ＯＲＦ３タンパク質発現の欠如を示している（データ省略）。対照的に、抗ＰＣＶ２ブタ血清は突然変異体ＰＣＶ２感染細胞と同様、組み換え体ＰＣＶ２感染細胞の核内のウイルス性抗原を容易に検出した（図３Ｂ及びＥ）。抗ＯＲＦ３マウス血清（図３Ｃ）又は抗ＰＣＶ２ブタ血清を用いて、擬似感染細胞においては蛍光性が検出されなかった（図３Ｆ）。
野性型、組み換え体、及びＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２の複製動特性を測定するため、ＰＫ１５細胞に各種ウイルスを感染させ、ＩＦＡ測定法により、そのウイルス力価を感染５日後に測定した。図４Ａは感染後異なる時点での各ウイルスの増殖曲線を示している（ＴＣＩＤ５０／ミリリットルで示す）。感染後種々の時点でのＴＣＩＤ５０によると、突然変異体ウイルス（ＯＲＦ３タンパク質発現を欠いている）は、親株ウイルスＰＣＶ２又は回収組み換え体ＰＣＶ２（ｒＰＣＶ２）ウイルスより、ややより遅く複製されたことを示した。感染３６時間後に、ＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２ウイルスは親株ウイルスＰＣＶ２又は回収ｒＰＣＶ２ウイルス力価より、それぞれおよそ３３倍又は３１倍低い力価を示した。しかしながら、感染７２時間後では、ＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２ウイルスは１０５．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に到達し、親株ウイルスＰＣＶ２（１０５．８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）及び回収ｒＰＣＶ２ウイルス（１０５．６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の力価と差がなくなった。これらの結果はＯＲＦ３タンパク質が細胞培養における複製に必須ではないことを示している。
【００７６】
ＯＲＦ３を欠く場合、ＰＣＶ２のインビトロ複製は遅延した（図４）。しかしながら、最大力価は野性型ウイルス複製後に検出した値と同様に高かった。複製における遅延はインビボでの弱毒化に飜訳され、ワクチンの可能性をもつウイルス株に通じることが考えられる。ＰＣＶ２に対し、ＯＲＦ２タンパク質は主要な免疫原性カプシドタンパク質（９、３０、３１）とみなされ、またバキュロウイルス発現の組み換え体ＯＲＦ２を接種した（５）又はＯＲＦ２由来のＤＮＡワクチンを注射したブタにおいて防御応答を促進出来る。非病原性ＰＣＶ１ゲノムのバックボーン内にクローニングしたＰＣＶ２のＯＲＦ２遺伝子を持つキメラＰＣＶ１〜２ウイルスも、ＰＣＶ２が弱い病原性である場合、それに対して強い免疫応答を誘導することが可能であり（５）、このことはＰＣＶ２のＯＲＦ２タンパク質が良い宿主防御免疫原であることを示唆している。ＯＲＦ２タンパク質の免疫優勢エピトープが、タンパク質のアミノ酸残基４７から８４、１６５から２００、及び最後の４個のアミノ酸におそらく位置することが報告されている（２２）。これらはＯＲＦ３タンパク質によって誘発される抗体は、宿主に対する防御免疫応答に関与していないであろうを示す。また、ＯＲＦ３タンパク質を欠くＰＣＶ２突然変異体は、動物において対応する抗体を誘発しないという結果になるであろうし、野性型ＰＣＶ２のような、適切な免疫応答を誘導することが期待される。
【００７７】
実施例３：ＰＣＶ２感染は培養細胞におけるアポトーシスを誘発する
感染後期において、ＰＫ１５細胞におけるＰＣＶ２複製の結果、例えば円形化や、培養フラスコからの感染細胞の分離のような細胞変性効果（ＣＰＥ）、及び細胞溶解や死がもたらされた。ＰＣＶ２感染細胞の死を導くメカニズムは、まだ十分に分かっていない。ＰＣＶ２感染が培養細胞においてアポトーシスを誘発するかどうかを決定するため、１ＭＯＩのＴＣＩＤ５０で野生型ＰＣＶ２をＰＫ１５細胞に接種し、感染後、異なった、指示された時点で、ＩＦＡによって、ＰＣＶ２ウイルス性抗原発現を解析し、及びＤＡＰＩ染色によって、アポトーシスの解析を行った。無傷の核は均一に染色されるが、アポトーシス核はしばしば断片化し、ＤＮＡ凝縮及び断片化に起因する不規則又は弱いＤＮＡ染色を示す（４５）。図５Ａは、クロマチンの凝縮及び断片化が感染後の４８時間（上部パネル）、及び７２時間（下部パネル）のＰＣＶ２感染細胞内に見えることを示す。対照的に、感染後の擬似感染細胞内には明白な核の形態学的変化は観察されなかった（データ省略）。
【００７８】
感染した、及び擬似感染したＰＫ１５細胞を、超微細構造特性について解析した。感染４８時間後、ＰＣＶ２感染細胞は、クロマチンの密度及び分布の変化のようなプログラムされた細胞死の典型的な特徴を示し、クロマチンは例えば三日月型の塊内の周囲に凝集し、及び核嚢の膨張が観測された（図５Ｂ、パネルｂ）。感染後７２時間で、細胞は、例えばアポトーシス小体形成に関与する核の断片化及び細胞質攪乱などのアポトーシス細胞死の典型的なマーカーを示した（図５Ｂ、パネルｃ）。９６時間で、細胞は、さらにアポトーシス小体の広範な散布につながる核の断片化を示した（データ省略）。対照的に擬似感染細胞は超微細構造のレベルで検出可能な変化を示さなかった（図５Ｂ、パネルａ）。
ＰＣＶ２感染アポトーシスを、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色し、固定したＰＫ１５細胞をフローサイトメトリーすることにより、低二倍体細胞の割合を決定することで検定した。アポトーシス細胞は、正常細胞より低いＤＮＡ含有量を持ち、その存在は低蛍光での低二倍体ピーク値の発現により識別された。ＰＩ染色細胞の蛍光励起細胞分取分析の結果、擬似感染細胞には、〜１％の細胞が低二倍体で存在した。（図６Ａ）。低二倍体細胞は、感染後７２時間で顕著に増加し、その後減少した（図６Ａ及びデータ省略）。ＰＣＶ２によるアポトーシス誘発を、材料と方法で説明したように、ＤＡＰＩ染色により核形態学解析により検定した。染色細胞の実験により、フローサイトメトリー解析で説明したように、感染後アポトーシス細胞が同様の様態を示すことを実証した（図６Ｂ）。図６Ｃで示したように、擬似接種した細胞より、接種した細胞において、より多くの細胞が培養フラスコから離脱し、基盤の一部になった。
【００７９】
ウイルス誘発細胞死は、ウイルス感染の病原性において、重要な役割を果たす。アポトーシスは宿主免疫系を逃れて、近隣の細胞に後代のウイルスを拡散する上で重要な段階を示すかも知れない、またＤＮＡ損傷によって作成された異常細胞、又はウイルス性病原体によって感染した細胞を除去する機能を示しているかもしれない（３９）。ウイルスの多くが、その複製周期中に直接的又は間接的のいずれかでアポトーシスを発現又は抑制することが実証されている（３９）。サーコウイルス（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）科においては、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は感染後、胸腺細胞及び細胞株でアポトーシスを誘発し（１８）、ＶＰ３タンパク質、ＣＡＶによってコードされたアポプチン（ａｐｏｐｔｉｎ）は、様々な培養形質転換細胞株においてアポトーシスを誘発する（３４）。ＰＣＶ２については、感染したブタのＢリンパ球においてアポトーシス、続いてＢリンパ球の選択的な枯渇を誘発すること（４３）、及びＰＣＶ２感染マウスモデルのリンパ系組織にある組織球細胞においてもアポトーシスを誘発することが示されている（２１）。しかし、正常な対照と比較して、自然感染のブタにおいて、リンパ球アポトーシスが顕著に誘発されず、及びカスパーゼ３活性が顕著に刺激されない（２４，３７）という矛盾した結果が最近報告されており、リンパ系組織の枯渇は、リンパ系組織における増殖活性の減少に主として関わることが示唆された。しかしながら、本明細書において、ＤＡＰＩ染色、電子顕微鏡観察、及びフローサイトメトリー解析を用いて、ＰＣＶ２が培養ＰＫ１５細胞内でアポトーシスを誘発することを実証した。ＤＡＰＩ染色では、ＤＮＡの凝縮及び断片化に起因する不規則又は弱いＤＮＡ染色を示したが（図５Ａ）（４５）、これは大量のクロマチン凝縮とアポトーシス小体の出現を示す電子顕微鏡観察下での形態学的変化と一致している（図５Ｂ）。
ＰＣＶ２感染後、擬似感染対照と比較すると、ＤＡＰＩ染色の検定で観測されたアポトーシス細胞（図６Ｂ）、及びフローサイトメトリーで解析された低二倍体細胞（図６Ａ）は顕著に増加した。ＰＣＶ２感染後４０％の細胞が離脱し、基盤へ浮遊したが、擬似感染対照の浮遊細胞は５％未満であった（図６Ｃ）。培養細胞株において個々のウイルスタンパク質の発現させることで、ＯＲＦ３遺伝子によってコードされた新規のウイルスタンパク質が、ＰＣＶ２感染中のアポトーシス誘発の一因になるという更なる証拠を提供した。
【００８０】
実施例４：ＯＲＦ３タンパク質は単独でアポトーシスを誘発する
ＰＣＶ２感染が、ＰＣＶ２感染に対する許容細胞株である、ＰＫ１５細胞においてアポトーシスを誘発することの確認後、アポトーシス誘発の原因になる可能性のあるＰＣＶ２にコードされたタンパク質（ウイルスがコードしたアポトーシス促進タンパク質）に対するスクリーニングを試みた。ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３遺伝子をヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下、哺乳類発現ベクター、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１内にクローニングした。ＰＫ１５及びＣｏｓ−７細胞をこれらのプラスミドによりトランスフェクトし、各タンパク質の発現を蛍光顕微鏡下で直接検査し、さらにマウスの抗ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３抗体を用いて、免疫ブロッティング解析により確認した（データ省略）。タンパク質ＯＲＦ１、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３は感染した細胞で見られたと同様に、トランスフェクトした細胞の核領域に局在した（データ省略）。個々の構築物で細胞をトランスフェクトした後、その細胞を感染２４時間後及び４８時間後にＤＡＰＩで染色した。図７Ａに示したように、感染２４時間後の核ＤＡＰＩ染色により、アポトーシスの典型的な特徴であるクロマチンの凝縮及び断片化がＯＲＦ３発現ＰＫ１５細胞（上部パネル）及びＣｏｓ−７細胞（下部パネル）内で見られた。対照的に、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２をトランスフェクトした細胞内では明らかな核の形態学的変化は観察されなかった（データ省略）。さらに、全ＧＦＰ陽性細胞及びＧＦＰ陽性細胞間で断片化及び凝縮した核を持つ細胞数を計測し、死細胞の割合を計算した。図７Ｂで示したように、トランスフェクトしたＰＫ１５細胞内におけるＧＦＰ融合構築物としてのＯＲＦ３タンパク質の発現により、感染後２４時間及び４８時間目でそれぞれ１０％及び２５％の死細胞を誘発した。Ｃｏｓ−７細胞内にトランスフェクトされた場合は、ＯＲＦ３タンパク質は、夫々の時点で１２％及び２８％の細胞死をもたらした（データ省略）。このスクリーニングにおいて、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２タンパク質の発現により、トランスフェクトしたＰＫ１５（図７Ｂ）又はＣｏｓ−７細胞（データ省略）に関わらず対照よりも顕著な細胞死に至らなかった。対照的にＧＦＰ単独では、ＰＫ１５及びＣｏｓ−７細胞にトランスフェクトした場合、感染後の夫々の時点で、４％未満の細胞死を誘発した（図７Ｂ及びデータ省略）。さらに、ＯＲＦ３をトランスフェクトしたＰＫ１５（図７Ｃ）及びＣｏｓ−７細胞（データ省略）においては、ＯＲＦ１又はＯＲＦ２をトランスフェクトした細胞（図７Ｃ及びデータ省略）及びＧＦＰ単独トランスフェクト対照よりも、多くの細胞が培養フラスコから離脱し、基盤の一部になった。
【００８１】
ＰＫ１５細胞において、ｒＰＣＶ２ＯＲＦ３Δのアポトーシス効果を測定するため、１ＭＯＩのＴＣＩＤ５０で細胞にこの突然変異体ウイルスを感染させ、様々な時間間隔で採取し、カスパーゼ３活性によって解析した。感染後、突然変異体ウイルスによって誘発されたアポトーシス活性は、野性型ＰＣＶ２ウイルスによって誘発されたものより顕著に低かった（図９Ｃ）。擬似感染細胞においては、検知できるレベルのアポトーシスは検出されなかった（図９Ｃ）。結果はＯＲＦ３タンパク質発現の欠如によって、ＰＣＶ２感染細胞死が顕著に減少することを示す。
ブタがＰＣＶ２に感染すると、リンパ系組織のマクロファージの浸潤を伴い、濾胞及び濾胞間細胞部位のリンパ球枯渇がもたらされ、その後免疫抑制という結果になる（４２）。ＯＲＦ２はＰＣＶ２の主要なカプシドタンパク質と考えられており、バキュロウイルス発現システムにより、発現後ウイルス様粒子を形成することが出来て（３１）、ＰＣＶ２の他のウイルスタンパク質は、ビリオン集合に必要でない非構造タンパク質であってもよいと予想されてきた。さらに、ＰＣＶ２をＶＩＤＯ  Ｒ１細胞へ接種した場合、ＯＲＦ２タンパク質は感染後期に高レベルで発現することが示された（２３）。本発明者等により実証されたように、ＯＲＦ２タンパク質発現はＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞内において感染７２〜９６時間後でピークになった（データ省略）。本研究において、ＯＲＦ３はＰＣＶ２感染細胞内において感染４８時間後に転写及び翻訳レベル両方で、より高い発現を示し（図１及び２）、ＯＲＦ３もまたＰＣＶ２の非構造タンパク質であってもよいことを示唆した。動物ウイルスの非構造タンパク質はウイルス複製及び／又は病原性に重要な役割を果たしていてもよい。免疫抑制ウイルスについて、ＣＡＶの非構造タンパク質ＶＰ３はリンパ芽球Ｔ細胞においてアポトーシスを引き起こし、病原性に関与していることが示された（３４）；ニワトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの非構造タンパク質ＶＰ５はウイルス複製に必須ではないが（２９）、そのアポトーシス活性があるためにウイルス病原体に含まれることが発見された（５３）。発明者等の研究において、ＰＣＶ２のＯＲＦ３タンパク質はインビトロのウイルス複製に必要ではなく、ＰＣＶ２感染アポトーシス活性はＯＲＦ３タンパク質発現の欠如によって顕著に減少することを示した。発明者等のデータによると、ＯＲＦ３タンパク質単独発現が、ＰＣＶ２感染細胞の時と同様に、イニシエーターカスパーゼ８を活性させ、その後カスパーゼ３エフェクター経路を活性化することによって、トランスフェクトした細胞のアポトーシスを誘発することを示唆する。同時に、ＯＲＦ３タンパク質はそのアポトーシス活性によってウイルス病原性における役割を果たすであろう。免疫系細胞のアポトーシス誘発は、ウイルス誘発免疫抑制の必要条件の一つであろう（１２）、このことはＰＣＶ２感染に対する潜在的生ワクチン株としてＯＲＦ３欠失突然変異体の使用を促進してもよい。しかしながら、そのようなＯＲＦ３タンパク質欠失ウイルスの使用がブタの免疫抑制を引き起こす可能性があるかどうかについては依然として決定されていない。
【００８２】
実施例５：  病原学及び免疫組織化学の研究
本実験セットにおいて、８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウス群にＯＲＦ３欠失ＰＣＶ２突然変異体（ｍＰＣＶ２）を感染させ、一方別の群には野性型ＰＣＶ２を感染させた。本実験において、健常マウスを陰性対照として使用した。感染７日後及び１４日後にマウスの剖検を実施した。リンパ節のサンプルを４％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定した。組織病理学検査のため、その組織を乾燥し、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色した。次にタンパク質発現について、連続切片をＰＣＶ２免疫組織化学技術により染色した。
感染７日後及び１４日後に陰性対照マウスと突然変異体ＰＣＶ２感染マウス全てに身体的な劣化の徴候は見られないか、又はわずかに見られた。しかしながら、感染１４日後に鼠径リンパ節は僅かに肥大していた。野性型ＰＣＶ２感染マウスについては、感染７日後に、肝臓にかすかな変色及び鼠径リンパ節のわずかな肥大が観察された。感染１４日後に、肝臓及び非虚脱肺の顕著な変色、及び腸間膜及び鼠径リンパ節の顕著な肥大が、ほとんどの野性型感染マウスの観察された。図８Ａにおいて、３実験群の鼠径リンパ節の組織病理学検査による感染７日後及び１４日後の、陰性対照とｍＰＣＶ２群の胚中心の正常及び密集したリンパ球を示した。野性型ＰＣＶ２では、感染７日後でリンパ球減少のかすかな徴候を示したが、感染１４日後に異なる野性型ＰＣＶ２感染マウスにおいて、様々な程度のリンパ球減少及び顕著な多数のアポトーシス細胞もまた観察された（矢印）。
【００８３】
突然変異体ＰＣＶ２感染マウスと野性型感染マウス両方に、ＰＣＶ２抗原を検出した。検査された全ての組織において、ＰＣＶ２抗原の免疫標識がリンパ球とマクロファージの細胞質内で最も豊富に見られた。しかしながら、突然変異体ＰＣＶ２感染マウスと比較すると感染１４日後の野性型ＰＣＶ２感染マウスにおける免疫標識は顕著に弱かった（図８Ｂに示されるように）。
顕微鏡的病変及び身体的劣化の欠如は、低水準のリンパ球減少及び高水準のＰＣＶ２抗原の蓄積に加えて、突然変異体ＰＣＶ２株の予防効果及び複製能を示した。本事実は、この突然変異体の持つ、ＰＣＶ２誘発性ＰＭＷＳに対する有効なワクチンの産生に対する適切な候補物質としての潜在能力を明らかにした。
本弱毒化生ワクチンｍＰＣＶ２は、実験用マウスにおいて液性及び細胞性応答両者を誘発することが出来る。毒性が減少されただけではなく、そのウイルス複製に影響を与えない；すなわちＰＣＶ２に対し持続的な予防効果を提供し、ワクチン商品化に対する第一候補であろう。
【００８４】
実施例６：アポトーシス欠失ＰＣＶ２突然変異体の生成
アポトーシス欠失ウイルスを生成する際のＯＲＦ３開始コドンにおける点変異の機能については上述した。本実施例において、本発明者は開始コドン突然変異以外のＯＲＦ３の機能性易変部位を同定した。
ＯＲＦ３はＯＲＦ１内に反対の方向に位置している。ＯＲＦ１はウイルス複製に必須なレプリカーゼをコードするので、ＯＲＦ１のタンパク質転写機能を保存することが必須である。従って、ＯＲＦ１内の縮重コドンをＯＲＦ３突然変異体生成のために選択した。
異常ＯＲＦ３発現を作り出すために、本発明者らは得られるタンパク質の２次構造に影響を与えるため、アミノ酸配列における電荷のパターンを変化させる手法を選択した。例えば、本発明者は電荷を逆にし、又は配列の特定位置で特定のアミノ酸において電荷を中性にした。この様にして、タンパク質の機能は無効になることがある。本研究において、部位特異的突然変異誘発法を用いて、ウイルスゲノムに上述突然変異を導入した。
５つの突然変異体を設計し、突然変異アミノ酸番号により命名した。突然変異体２７は配列番号１９に示されるように、アラニンが終止コドンに変化した。その結果として、この突然変異体は短縮型２６アミノ酸ＯＲＦ３タンパク質を発現する。
【００８５】
他の突然変異は上述したようにタンパク質の配座を変えることにより、ＯＲＦ３タンパク質の機能を変化させた。タンパク質の配座を変えるために、タンパク質内の荷電アミノ酸が突然変異の対象になった。多数の荷電アミノ酸があるので、ＯＲＦ３タンパク質のアルファヘリックス領域が適切である。突然変異体５２及び６１において、アミノ酸電荷は逆となり、タンパク質の２重構造が変わり、タンパク質のアルファ領域のタンパク質がほどかれた。突然変異体５２において、配列番号２０に示すようにヌクレオチド配列が変化した影響により、アミノ酸Ｈｉｓ＋はＡｓｐ−へ変わった。突然変異体６１において、配列番号２１に示すようにヌクレオチド配列が変化した影響により、アミノ酸Ｇｌｕ−がＬｙｓ＋へ変わった。突然変異体８５において、配列番号２２に示すようにヌクレオチド配列が変化した影響により、Ｈｉｓ＋がＴｙｒに変わったことにより、正電荷が中性電荷へと変わった。以上のことから、突然変異体８５の２次構造は、タンパク質の１つのコイル領域が開くように変わった。
欠失５０〜６２突然変異体はアミノ酸５０からアミノ酸６２が欠失し、対照の役割を果たす。上述のように、生成した突然変異体は、ＯＲＦ１のアミノ酸配列に作用せず、従って、突然変異部位がＯＲＦ１の縮重コドンにあるので、レプリカーゼの転写への影響を持たない。図１０を参照されたい。
【００８６】
突然変異ウイルスゲノムをＰＫ１５細胞にトランスフェクトし、５日間培養した。５日後、細胞を採取し、３回の凍結融解法で溶解した。次に全細胞溶解物を新しいＰＫ１５細胞感染のために用いる。細胞を５継代培養すると、突然変異体５２及び８５は野性型ＰＣＶ２と同様に細胞死を示し始めた。約７０〜９０％の細胞死が野性型ＰＣＶ２、突然変異体５２又は突然変異体８５感染ＰＫ１５細胞で観察された。対照的に、突然変異体６１、突然変異体２７又はＯＲＦ３のＡＴＧ開始コドンの欠失型突然変異に由来する突然変異体は、全て細胞死の顕著な減少（約１０％）を示した。図１１を参照されたい。
低アポトーシス率を持つこれらの突然変異体は、生弱毒化ワクチンの製造に適切である。従って本発明者らは、核酸レベルで特定のアミノ酸の配座を変えることは、ワクチン製造のための生弱毒化ウイルスの産生に適している突然変異体の作成を可能にすることを発見した。
上記の突然変異体さらに２重又は３重の突然変異として組み合わせることにより、ウイルスが野生型である毒性型へ戻る可能性を減少させること出来る。例えば、配列番号２３で示されるようにＡＴＧ突然変異と突然変異体２７、又は配列番号２４で示されるようにＡＴＧ突然変異と突然変異体６１を組み合わせることが出来る。前記の突然変異体は、配列番号２５に示すようにＡＴＧ突然変異体、突然変異体２７、突然変異体６１のみからなる３重突然変異に一体化することが出来る。
以上の開示の読後、当技術分野の業者にとって、本発明の様々な修正及び変更が、本発明の精神と範囲から離れていないことは自明であり、また全てのそのような修正及び変更は添付されている請求項の範囲内に属することを意図する。
【００８７】
参考文献
1 . Allan, G. M., and J. A. Ellis. 2000. Porcine cicoviruses: a review. J. Vet. Diagn. Investig. 12:3-14. 
2. Allan, G. M., S. Kennedy, F. McNeilly, J. C. Foster, J. A. Ellis, S. J. Krakowka, B. M. Meehan, and B. M. Adair. 1999. Experimental reproduction of sever wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus. J. Comp. Pathol. 121:1-1l. 
3. Allan, G. M., F. McNeilly, J. P. Cassidy, G. A. Reilly, B. Adair, W. A. Ellis, and M. S. McNulty. 1995. Pathogenesis of porcine circovirus: experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 44:49-64. 
4. Ashkenazi, A., and V. M. Dixit. 1998. Death receptors: signalling and modulation. Science 281: 1305-1308. 
5. Blanehard, P., D. Mahe, R. Cariolet A. Keranflec'h, M. A. Baudouard, P. Cordioli, E. Albina, aud A. Jestin. 2003. Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins. Vaccine 21:4565-4575. 
6. Bolin. S. R., W. C. Stoffregen, G. P. Nayar, and A. L. Hamel. 2001. Postweaning multisystemic wasting syndrome induced after experimental inoculation of cesarean-derived, colostrum-deprived piglets with type 2 porcine circovirus. J. Vet. Diagn. Invest. 13:185-194. 
7. Budihardjo, I., H. Oliver. M. Lutter, and X. D. Wang. 1999. Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 15:269-290. 
8 . Chae, C. 2004. Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology; diagnosis and pathology. Vet. J. 168:41-49. 
9. Cheung, A. K. 2003. Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2. Virology 305: 168-180. 
10. Cheung, A.K. 2003 . Comparative analysis of the transcriptional patterns of pathogenic and nonpathogenic porcine circoviruses. Virology 310:41-49. 
11. Cohen, G. M. 1997. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J. 326:1-16.
12. Drew, T. W. 2000. A review of evidence for immunosuppression due to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Res. 31:27-39. 
【００８８】
13. Earshaw, W, C., L. M. Martins, and Kaufmann. 1999. Mannmalian caspases : structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Ann. Rev. Biochem. 69:383-424. 
14. Fenaux, M., P. G. Halbur, G. Haqshenas, R. Royer, P. Thomas, P. Nawagitgul. M. Gill, T. E. Toth, and X. J. Meng. 2002. Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus in infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions. J. Virol. 76:541-551. 
15. Fenaux, M. T. Opriessnig; P. G. Halbur, and X. J. Meng. 2003. Imunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type (PCV2) and nonpathogenic PCVl in weaning pigs. J. Virol. 77:11232-11243. 
16. Green, D. R. 1998. Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell 94:695-698. 
17. Janicke, R.U., M.L.Sprengart, M.R.Wati, and A. G. Porter. 1998. Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J. Biol. Chem. 273:9357-9360. 
18. Jeurissen S. H., F. Wagenaar, J. M. POL A. J. Van der Eb, and M. H. M. Noteborn. 1992. Chicken anemia virus causes apoptosis of thymocyies after in vivo infection and of cell lines after in vitro infection. J. Virol. 66:7383-7388. 
19. Kamstrup. S., A. M. Barfoed, T. H. Frimann, A. -S. Ladekjaer-Mikkelsen, aud A. Betner. 2004. Immunisation against PCV2 structural protein by DNA vaccine of mice. Vaccine 22:1358-1361. 
20. Kennedy, S., D. Moffett, F. McNeilly, B. Meehan, J. Ellis, S. Krakowka, and G. M. Allan. 2000. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus. J. Comp. Pathol. 122:9-24. 
21 . KiupeL M., G. W. Stevenson, J. Choi, K S. Latimer, C. L. Kanitz, and S. K Mittal. 2001. Viral replication and lesions in BALB/c mice experimentally inoculated with porcine circovirus isolated from a pig with postweaning multisystemic wasting disease. Vet. Pathol. 38:74-82. 
22. Lekcharoensuk, P., I. Morozov, P. S. PauL N. Thangthumniyom, W. Wajjawalku, and X. J. Meng. 2004. Epitope mapping of the major capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) by using chimeric PCVI and PCV2. J. Virol. 78:8135-8145. 
【００８９】
23. Liu, Q. G., S. K Tikoo, and L. A. Babiuk. 2001. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2. Virology 285:91-99. 
24. Mandrioli, L., G. Sarli, S. Panarese, S. Baldoni, and P. S. Marcato. 2004. Apoptosis and proliferative activity in lymph node reaction in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Vet. Immunol. Immunopathol. 97:25-37. 
25. Mankertz, A., R. Caliskan, K Hattermann, B. Hillenbrand, P. Kurzendoerfer, B. Mueller, C. Schmitt, T. Steinfeldt, and T. Finsterbusch. 2004. Molecular biology of porcine circovirus: analyses of gene expression and viral replication. Vet. Microbiol. 98:81-88. 
26. Mankertz, A., J. Mankertz, K Wolf, and H. J. Buhk. 1998. Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus. J. Gen. Viol. 79:381-383. 
27. Meehan, B. M., J. L. Creelan, M. S. McNulty, and D. Todd. 1997. Sequence of porcine circovirus DNA: Affinities with plant cicoviruses. J. Gen. Virol. 78:221-227. 
28. Miyata, H., H. Tsunoda, A. Kazi; A. Yamada. M. A. Khan, J. Murakami, T. Kamahora, K Shiraki, and S. Hino. 1 999. Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus. J. Virol. 73:3582-3586. 
29. Mundt, E. B. Kollner, and D. Kretzschmar. 1997. Vp5 of infectious bursal disease virus is not essential for viral replication in cell culture. J. Virol. 71:5647-5651. 
30. Nawagitgul, P., P. A. Harms, I. Morozov. B. J. Thacker, S. D. Sorden, C. Lekcharoensuk, and P. S. Paul. 2002. Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Pov. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9:33-40. 
31. Nawagitgul. P., I. Morozov, S. R. Bolin, P. A. Harms, and S. D. Sorden. 2000. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein. J. Gen. Virol. 81:2281-2287. 
32. Nicholson, D. W., A. Ali, N. A. Thornberry, J. P. Vaillancourt, C. K Ding, M. Gallant, Y. Gareau, P. R. Griffin, M. Labelle, Y. A. Lazebnik, N. A. Munday, S. M. Raju, M. E. Smulson, T. -T. Yamin. V. L. Yu, and D. K. Miller. 1995. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for manmalian apoptosis. Nature 376:37-43. 
【００９０】
33. Nishizawa, T., H. Okamoto, K Konishi; H. Yoshizawa, Y. Miyakawa, and M. Mayumi. 1997. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem. Biophys. Res. Conmun. 241:92-97. 
34. Noteborn, M. H. M., D. Todd. C. A. Verschueren, H. W. de Gauw, W. L. Curran, S. Veldkamp, A. J. Douglas, M. S. McNulty, A. J. Van der Eb, and G. Koch. 1994. A  single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J. Virol. 68:346-351. 
35. Phenix, K V., J. H. Weston, I. Ypelaar. A. Lavazza, J. A. Smyth, D. Todd, G. E. Wilcox, and S. R. Raidal. 2001. Nucleotide sequence analysis of a novel circovirus of canaries and its relationship to other members of the genus Circovirus of the  family Circoviridae. J. Gen. Virol. 82:2805-2809. 
36. Pringle, C. R. 1999. Virus taxonomy at the XIth International Congress of Virology; Sydney, Australia. Arch. Virol. 144:2065-2070. 
37. Resendes, A. R.. N. Majo, J. Segales, E. Mateu, M. Calsamiglia, and M. Domingo. 2004. Apoptosis in lymphoid organs of pigs naturally infected by porcine circovirus type 2. J. Gen. Virol. 85:2837-2844. 
38. Ritchie, B. W., F. D. Niagro, P. D. Lukert, W. L. Steffens III, and K. S. Latimer. 1989. Characterization of a new virus fiom cockatoos with psittacine beak and feather disease. Virology 171:83-88. 
39. Roulston, A., R. C. Marcellus, aud P. E. Branton. 1999. Virus and apoptosis. Annu. Rev. Microbiol. 53:577-628. 
40. Salvesen, G. S., and V. M. Dixit. 1997. Caspases: intracellular signaling by proteolysis. Cell 91:443-446. 
41. Schulze-Osthoff, K., D. Ferrari, M. Los, S. Wesselborg, and M. E. Peter. 1998. Apoptosis signalling by death receptors. Eur. J. Biochem. 254:439-459. 
42. Segales, J., M. Domingo, F. Chianini, N. Majo, J. Dominguez, L. Darwich, and E. Mateu. 2004. Immunosuppression in postweaning multisystemic wasting syndrome affected pigs. Vet. Microb. 98:151-158. 
【００９１】
43 . Shibahara, T., K. Sato, Y. Ishikawa, and K. Kadota. 2000. Porcine circovirus induces B Iymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome. J. Vet. Med. Sci. 62:1125-1131. 
44. Takahashi, K, Y. Iwasa, M. Hijikata, and S. Mishiro. 2000. Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus. Arch. Virol. 145:979-993. 
45. Telford, W. G., L. E. King, and P. J. Fraker. 1992. Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry. Cytometry 13:137-143.
46. Teodoro, J. G., and P. E. Branton. 1997. Regulation of apoptosis by viral gene products. J. Virol. 71:1739-1746. 
47. Tischer, I., H. Gelderblom, W. Vettermann, and M. A. Koch. 1982. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA. Nature 295:64-66. 
48. Tischer, I., W. Mields, D. Wolff:, M. Vagt; aud W. Griem. 1986. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus. Arch. Virol. 91:271-276. 
49. Tischer, I., D. Peters, R. Rasch, and S. Pociuli. 1987. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence. Arch. Virol. 96:39-57. 
50. Todd, D., F. D. Niagro, B. W. Ritchie, W. Curran, G. M. Allan., P. D. Lukert., K S. Latimer, W. L. Steffens III, and M. S. McNulty. 1991. Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes. Arch. Virol. 117:129-135. 
51. Todd, D. J. H. Weston, D. Soike, and J. A. Smyth. 2001.Genome sequence determinations and analyses o f novel circoviruses from goose and pigeon. Virology 286:354-362.
52. Woods, L. W., K. S. Latimer, B. C. Barr, F. D. Niagro, R. P. Campagnoli, R. W. Nordhausen, and A. E. Castro. 1993 . Circovirus-like infection in a pigeon. J. Vet. Diagn. Invest. 5:609-612. 
53. Yao, K, and V. N. Vakharia. 2001, Induction of apoptosis in vitro by the 17-kDa nonstructural protein of infectious bursal disease virus: possible role in viral pathogenesis. Virology 285:50-58. 
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】（Ａ）感染性ＰＣＶ２分子のＤＮＡクローンの構造。完全なＰＣＶ２遺伝子を増幅するために使用したプライマー対の相対的位置を（逆方向（リバース）プライマー、Ｒ−ＰＣＶＰＳＴ１；前方（フォワード）プライマー、Ｆ−ＰＣＶＰＳＴ１）矢印によって示す。ＰＣＲによって増幅したＰＣＶ２のゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩ制限酵素で消化し、精製した。分子ＰＣＶ２ＤＮＡクローンを作成するために、精製し、消化したゲノムＤＮＡを、ＰｓｔＩ酵素で前消化したｐＳＫベクター内に連結した。そのＤＮＡクローンを、さらに消化し、ＰＣＶ２の自己連結反応のためゲル状に精製し、その後、環状ＰＣＶ２ＤＮＡを、ＰＫ１５細胞内にトランスフェクト（形質導入）した。（Ｂ）ＯＲＦ３遺伝子を欠くＰＣＶ２突然変異体の構造の説明図。（Ｃ）ＢＪＷ株のＰＣＶ２の遺伝子地図（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＹ８４７７４８）。３種のオープンリーディングフレームのコード配列は、それぞれの遺伝子のヌクレオチド部位を示すｎｔ座標に注釈をつける。ＯＲＦ２及びＯＲＦ３遺伝子は左方向へ転写され、ＯＲＦ１は右方向へ転写される。またＰｓｔＩ制限酵素部位も示す。（Ｄ）ＲＴ−ＰＣＲによるＰＣＶ２感染細胞におけるＯＲＦ３遺伝子の解析。ＲＮＡをＰＣＶ２又は擬似感染細胞から単離し、ｃＤＮＡ内に逆転写した。そのｃＤＮＡを一対のＯＲＦ３プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ反応を用いて陽性断片をＰＣＶ２ゲノムから増幅した。（Ｅ）ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞由来のＩＳＨによるＯＲＦ３ＲＮＡの検出。アンチセンスＯＲＦ３ＤＩＧ標識リボプローブを用いて感染２４（ａ）、４８（ｂ）、７２（ｃ）、９６（ｄ）時間後に、ＯＲＦ３ｍＲＮＡ発現が感染細胞核内に検出された。センスＯＲＦ３ＤＩＧ標識リボプローブを用いて、ＯＲＦ１ｍＲＮＡ発現もまた、感染４８時間後に感染細胞において検出された（ｅ）。アンチセンスＯＲＦ３リボプローブを用いたところ、擬似感染細胞においては何も検出されなかった（ｆ）。バーの長さは１０μｍ。
【図２】ＰＣＶ２感染細胞内のＯＲＦ３タンパク質の発現。（Ａ）ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞をＰＣＶ２のＯＲＦ３タンパク質に対する抗血清でプローブした。ＢＪＷ株ＰＣＶ２感染２４（ｂ）、４８（ｃ）、７２（ｄ）時間後のＰＫ１５細胞のＩＦＡ染色。（ａ）は擬似感染ＰＫ１５細胞をＩＦＡで染色し、陰性対照として使用した。蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化し、撮影した。ＯＲＦ３抗原は、主に感染細胞の核内、及び少量が細胞質内に位置した。バーの長さは１０μｍ。（Ｂ）ＢＪＷ株ＰＣＶ２に感染したＰＫ１５細胞からの全細胞溶解物を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、ＯＲＦ３抗体に対する抗血清で検出した。ＯＲＦ３タンパク質は感染後、ＰＣＶ２に感染した細胞内に発現した。
【図３】ＯＲＦ３タンパク質発現を検出するために使用したＯＲＦ３欠如ＰＣＶ２感染細胞のＩＦＡ染色。ＰＫ１５細胞を、組換えＰＣＶ２ウイルス株（Ａ及びＢ）、又は５継代目のＯＲＦ３欠如ＰＣＶ２ウイルス株（Ｄ及びＥ）に、ＭＯＩ（感染多重度）１で感染させた。擬似感染ＰＫ１５細胞を陰性対照として使用した（Ｃ及びＦ）。感染４８時間後、細胞を固定し、マウス抗ＯＲＦ３血清（Ａ，Ｄ，Ｆ）又はブタ抗ＰＣＶ２血清（Ｂ，Ｃ，Ｅ）で免疫蛍光染色により解析した。バーの長さは１０μｍ。
【図４】組換えＰＣＶ２と野生型ＰＣＶ２、及びＯＲＦ３欠如ＰＣＶ２の複製動特性。ＰＫ１５細胞をＭＯＩ１で指示されたウイルスに感染させ、指示された時点で採取し、ＩＦＡにより、１ｍLあたりのＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）で感染力価を測定した。
【図５】ＰＣＶ２は培養されたＰＫ１５細胞内でアポトーシスを誘発する。（Ａ）ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞は、ＤＡＰＩ染色によってヌクレオソームＤＮＡ断片化を示した。ＢＪＷ株ＰＣＶ２に感染４８（ａとｂ）、７２（ｄとｅ）時間後の細胞を各々ＰＣＶ２に対するブタ血清を用いてＩＦＡにより検出し、ＤＡＰＩ染色を行った。重ね撮り画像をｃ及びｆに示す。バーの長さは１０μｍ。（Ｂ）ＰＣＶ２によって誘発されたアポトーシスを電子顕微鏡で観察した。擬似感染した細胞（ａ）、完全核（Ｎ）は大きな独特の電子密度の高い核小体（ｎ）を示した。感染４８（ｂ）及び７２（ｃ）時間後の細胞は、各々三日月形の塊（短矢印）内の周辺部に凝縮している染色質、及びアポトーシス体を形成する核の断片化などのアポトーシスにおける典型的なマーカーを示した。バーの長さは２μｍ。
【図６】ＰＣＶ２誘発のアポトーシス細胞を定量的に測定した。（Ａ）ヨウ化プロピジウム染色によるアポトーシスの測定、及びＢＪＷ株ＰＣＶ２感染ＰＫ１５細胞のフローサイトメトリーの代表的な図。各パネルは、低２倍体（アポトーシスを起こした）ＤＮＡを含有するＰＫ１５細胞の割合を示す（Ｍ１）。ＢはＡで示されたアポトーシスの３実験の平均割合を示す。Ｃは指示された時間における分離細胞の３実験の平均割合を示す。
【図７】ＯＲＦ３タンパク質は単独でトランスフェクト（形質導入）した細胞にアポトーシスを誘発する。（Ａ）ＧＦＰ−ＯＲＦ３プラスミドをトランスフェクトしたＰＫ１５、及びＣｏｓ−７細胞は、２４時間で各々ＤＡＰＩ染色によるＯＲＦ３発現（ａ及びｄ）、及びヌクレオソームＤＮＡ断片化（ｂ及びｅ）を示した。重ね撮り画像をｃ及びｆに示す。バーの長さは１０ｍｍ。（Ｂ）ＯＲＦ３タンパク質により誘発されたアポトーシスの定量解析。アポトーシス化した細胞の３実験の平均割合をＤＡＰＩ染色による核形態学的解析によって記録した。（Ｃ）Ｂで示された分離細胞の３実験の平均割合を示す。
【図８】（Ａ）感染７日と１４日後の陰性対照、及びｍＰＣＶ２群の胚中心にある正常で密集したリンパ球を示す３実験群の鼠径リンパ節の組織病理学検査。野生型ＰＣＶ２は、感染７日後、リンパ球枯渇を伴った組織球炎症性浸潤の徴候を示したが、感染１４日後、多量のアポトーシス細胞を示した（矢印）。ＨＥ、バーの長さは２００μｍ。（Ｂ）陰性対照の鼠径リンパ節は、ＰＣＶ２抗原の欠如を示したが、他方、突然変異型ＰＣＶ２と野生型ＰＣＶ２は、感染１４日後、リンパ球の細胞質内で大量のＰＣＶ２抗原（暗褐色に染色されている）の存在を示した。免疫組織化学的方法を用い、メチルグリーン対比染色を用いた。バーの長さは２００μｍ。
【図９】ＰＣＶ２ウイルスゲノムの塩基配列情報。
【図１０】ＯＲＦ３の突然変異の位置。突然変異体２７は、Ａｌａを終止コドンへ変化させ、短縮型２６アミノ酸ＯＲＦ３タンパク質が発現した。突然変異体５２、及び６１は、夫々Ｈｉｓ＋からＡｓｐ−、及びＧｌｕ−からＬｙｓ＋への変化させ、アミノ酸の荷電が逆になった。突然変異体８５は、Ｈｉｓ＋からＴｙｒへの変化させ、正の荷電を失った。突然変異したウイルスゲノムをＰＫ１５細胞内にトランスフェクトし、５日間培養する。５日後、細胞を採取し、３Ｘ凍結融解で溶解した。次に、全細胞溶解物を新鮮ＰＫ１５細胞へ感染させるために使用した。
【図１１】細胞培養５継代後、４日目に突然変異体及びＰＣＶ２を導入した細胞のアポトーシスによる細胞死。突然変異体２７，６１、及びＯＲＦ３の開始コドンＡＴＧの欠失及び突然変異で引き起こされた突然変異体は、１０％の細胞死を引き起こした。対照的に、突然変異体５２，８５及びＰＣＶ２は、７０から９０％の細胞死を引き起こした。
【図１２】ＯＲＦ３突然変異体２７のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１３】ＯＲＦ３突然変異体５２のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１４】ＯＲＦ３突然変異体６１のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１５】ＯＲＦ３  突然変異体８５のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１６】ＯＲＦ３  ２重突然変異体ＡＴＧ及び２７のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１７】ＯＲＦ３  ２重突然変異体ＡＴＧ及び６１のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１８】ＯＲＦ３  ３重突然変異体ＡＴＧ、２７、６１のＤＮＡ配列。突然変異点は小文字で示す。
【図１Ａ】
2008541780.tif 000003
【図１Ｂ】
2008541780.tif 000004
【図１Ｃ−Ｅ】
2008541780.tif 000005
【図２】
2008541780.tif 000006
【図３】
2008541780.tif 000007
【図４】
2008541780.tif 000008
【図５】
2008541780.tif 000009
【図６】
2008541780.tif 000010
【図７】
2008541780.tif 000011
【図８Ａ】
2008541780.tif 000012
【図８Ｂ】
2008541780.tif 000013
【図９】
2008541780.tif 000014
【図１０】
2008541780.tif 000015
【図１１】
2008541780.tif 000016
【図１２】
2008541780.tif 000017
【図１３】
2008541780.tif 000018
【図１４】
2008541780.tif 000019
【図１５】
2008541780.tif 000020
【図１６】
2008541780.tif 000021
【図１７】
2008541780.tif 000022
【図１８】
2008541780.tif 000023
【配列表】
2008541780000001.xml
【国際調査報告】
2008541780.tif 000032
2008541780.tif 000033
2008541780.tif 000034
2008541780.tif 000035