(57)【要約】【課題】  ワクチン性質を改良した結核ワクチンを提供する。【解決手段】  組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を惹起する能力を増強されたマイコバクテリウム株類を提供する。このマイコバクテリウム株類を遺伝子工学処理し、中性ｐＨで活性のエンドソーム溶解性タンパク質（例  パーフリンゴライシン）を発現させ、エンドソームから前記細胞の細胞質へのマイコバクテリウムのエスケープを可能とする。本発明はまた、前記マイコバクテリウム株類を含むワクチン調製物類を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ６−８で活性の、発現可能でかつ分泌されることができる機能的エンドソーム溶解性タンパク質を含むように遺伝子工学処理したマイコバクテリウム。
【請求項２】
発現可能でかつ分泌されることができる前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質がパーフリンゴライシンまたはその機能的変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項３】
発現可能でかつ分泌されることができる前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２によって示される請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項４】
発現可能でかつ分泌されることができる前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、パーフリンゴライシンまたはその変異体（ｍｕｔａｎｔ）に特異的な遺伝子配列によってコードされる請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項５】
前記遺伝子配列が、配列番号１および３から構成される群から選択される請求項４記載のマイコバクテリウム。
【請求項６】
前記マイコバクテリウムが、アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤を発現するように遺伝子工学処理される請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項７】
前記アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの前記機能的増強剤がカスパーゼ８、デスレセプター−５（ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５）、ＦａｓおよびＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質から構成される群から選択される請求項６記載のマイコバクテリウム。
【請求項８】
前記マイコバクテリウムが、問題の遺伝子を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項９】
前記マイコバクテリウムが、
アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤；および
問題の遺伝子
を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項１記載のマイコバクテリウム。
【請求項１０】
マイコバクテリウムに感染した細胞のエンドソーム内に存在するｐＨで活性の、発現可能でかつ分泌されることができる機能的エンドソーム溶解性タンパク質を含むように遺伝子工学処理したマイコバクテリウム。
【請求項１１】
発現可能でかつ分泌されることができる前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、パーフリンゴライシンまたはその機能的変異体（ｖａｒｉａｎｔ）である請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１２】
前記発現可能でかつ分泌されることができる機能的エンドソーム溶解性タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２によって示される請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１３】
前記発現可能でかつ分泌されることができる機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、パーフリンゴライシンまたはその変異体（ｍｕｔａｎｔ）に特異的な遺伝子配列によってコードされる請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１４】
前記遺伝子配列が、配列番号１および３から構成される群から選択される請求項１３記載のマイコバクテリウム。
【請求項１５】
前記マイコバクテリウムがＢＣＧである請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１６】
前記マイコバクテリウムが、アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤を発現するように遺伝子工学処理される請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１７】
前記アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの前記機能的増強剤がカスパーゼ８、デスレセプター−５（ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５）、ＦａｓおよびＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質から構成される群から選択される請求項１６記載のマイコバクテリウム。
【請求項１８】
前記マイコバクテリウムが、問題の遺伝子を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項１９】
前記マイコバクテリウムが、
アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤；および
問題の遺伝子
を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項１０記載のマイコバクテリウム。
【請求項２０】
マイコバクテリウムをエンドソームからエスケープできるようにする方法であって、前記マイコバクテリウムを、機能的エンドソーム溶解性タンパク質を含み、発現し、かつ分泌するように遺伝子工学処理する過程を含む方法。
【請求項２１】
前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、パーフリンゴライシンＯまたはその変異体（ｍｕｔａｎｔ）である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、配列番号３によってコードされる変異（ｍｕｔａｎｔ）パーフリンゴライシンＯである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記マイコバクテリウムが、弱毒化マイコバクテリウムである請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記弱毒化マイコバクテリウムがＢＣＧである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記マイコバクテリウムが、アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤を発現するように遺伝子工学処理される請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの前記機能的増強剤がカスパーゼ８、デスレセプター−５（ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５）、ＦａｓおよびＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質から構成される群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記マイコバクテリウムが、問題の遺伝子を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
前記マイコバクテリウムが、
アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤；および
問題の遺伝子
を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
中性ｐＨで活性である機能的エンドソーム溶解性タンパク質を発現しかつ分泌するように遺伝子工学処理したマイコバクテリウムを含むワクチン調製物。
【請求項３０】
前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、パーフリンゴライシンＯである請求項２９記載のワクチン調製物。
【請求項３１】
前記機能的エンドソーム溶解性タンパク質が、配列番号３によってコードされる変異（ｍｕｔａｎｔ）パーフリンゴライシンＯである請求項３０記載のワクチン調製物。
【請求項３２】
前記マイコバクテリウムによって発現される機能的エンドソーム溶解性タンパク質の発現が、前記組換えマイコバクテリウムのエンドソームからのエスケープを可能とする請求項２９記載のワクチン調製物。
【請求項３３】
前記マイコバクテリウムが、弱毒化マイコバクテリウムである請求項２９記載のワクチン調製物。
【請求項３４】
前記弱毒化マイコバクテリウムがＢＣＧである請求項３３記載のワクチン調製物。
【請求項３５】
前記マイコバクテリウムが、アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤を発現するように遺伝子工学処理される請求項２９記載のワクチン調製物。
【請求項３６】
前記アポトーシスタンパク質または前記アポトーシスの機能的増強剤がカスパーゼ８、ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５、ＦａｓおよびＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質から構成される群から選択される請求項３５記載のワクチン調製物。
【請求項３７】
前記マイコバクテリウムが、問題の遺伝子を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項２９記載のワクチン調製物。
【請求項３８】
前記マイコバクテリウムが、
アポトーシスタンパク質またはアポトーシスの機能的増強剤；および
問題の遺伝子
を機能的に発現するように遺伝子工学処理される請求項２９記載のワクチン調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答惹起能力が増強されたマイコバクテリウム株類を提供する。インビボ実験は、例えば、主要組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を明らかにした。特に、本発明は、エンドソームからのマイコバクテリウムのエスケープを可能とするパーフリンゴライシンＯ（ＰｆＯＡ）タンパク質を発現するマイコバクテリウム株類、および前記マイコバクテリウム株類を含むワクチン調製物類を提供する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・チューバキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍ．ｔｂ）は世界人口の３分の１に感染し、８００万人に激烈な疾患を引き起こしかつ毎年１６０万人−２２０万人を死亡させており、そのほとんどは、発展途上国に生活している。結核（ＴＢ）は、世界的にも流行しており、ＨＩＶの拡大と重なるとさらにいっそう致命的となっている。ＴＢは、ＡＩＤＳ患者の最大の死亡原因となっている。
【０００３】
バシル・カルメット・ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）はマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の弱毒株で現在ＴＢワクチンとして広く使用されており、８０年以上前に開発され、試験によると肺結核に対する効果比が大きく変動し、インドで行った最近の大規模治験では全く効果がなかった（Ｆｉｎｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６（２０）：１９２３−１９２８；１９９８；Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．，Ａｕｇ；１１０：５６−６９；１９９９）。にもかかわらず、世界保健機構（ＷＨＯ）は現在、ＴＢ高罹患率の国において（ＨＩＶ疾患／ＡＩＤＳ症状を有するものを除き）全ての小児が出生時においてまたは最初に医療保健サービスに接触してきた際にＢＣＧを勧めている。この方針は、ＢＣＧがＴＢの重篤な小児形態を防御するという知見に基づいている（Ｌａｎｃｋｒｉｅｔほか、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２４（５）：１０４２−１０４９；１９９５；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓほか、Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ４５（１）：７８−８０；１９９１）。小児期を過ぎてまでＴＢをＢＣＧにより防御することは論議を呼ぶ問題となっており、データは限られておりしかもさまざまな結果を示している。しかし、乳児期ＢＣＧ予防接種が広く実施されている発展途上国において小児および成人でＴＢが高罹患率であることは、現在投与されているＢＣＧが、ヒトがＴＢリスクにある長年にわたっては高い効果を有していないことを示している。したがって、ＢＣＧは、ＴＢ介入およびコントロールのための公衆衛生手段としては適切でないと考えられている。
【０００４】
ＴＢ菌に暴露しかつ正常な免疫系を有するヒトの約７０％が感染せず、感染したヒトのうちの約５％しか最初の２年以内に発病しない。感染したヒトの大半は感染を抑制し、このことは、Ｍ．ｔｂ抗原類に対する優れた細胞免疫応答の出現と関連している。さらにもう５％が、後日、免疫が低下すると再活性化される。一次および再活性化疾患の両者ともに、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者ではるかに頻度が高く、このことは、感染予防および制御において免疫の役割を強調している。
【０００５】
多くのヒトはＴＢを制御できるので、適切な種類の長期持続免疫を導入することによって暴露後始めての感染を防御し、疾患への初期進行を予防し、潜伏状態からの再活性化を防御しかつ治療後の再燃を予防する有効なワクチン類を開発できるはずであると期待するだけの十分な理由がある。最終的には、ヒト病原体としてのＭ．ｔｂを結果的に撲滅するだろう系統的ワクチン使用＋化学療法介入の組み合わせとなる。
【０００６】
小児期ＢＣＧワクチンが急性ＴＢ予防に果たした重要な役割を考慮すれば、新しい候補ＴＢワクチンが非常に優れた製品であるとの圧倒的証拠がなければこのＴＢワクチン類を評価するための治験においてＢＣＧに取ってかわることは難しい。問題となっているのは、Ｍ．ｔｂが元来ヒト特異的病原体であること、および動物モデルは宿主−病原体作用の一部を模倣するにすぎないことにある。したがって、新しいＴＢワクチンが改良された能力を有しているという明確な証拠は、ヒトでのコントロール治験からしか得られない。多くの研究者らはこうした現実を考慮して、改良ＴＢワクチンを得るための重要なステップが、ＢＣＧの免疫原性を増強することであろうと結論することになった。
【０００７】
このような戦略の一例は、免疫応答を増強させるためにＴ細胞を誘導または活性化するＢＣＧの能力を向上させることである。Ｍ．ｔｂに対する免疫における主要組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞の重要な役割は、β２マイクログロブリン（β２ｍ）欠失マウスが実験的Ｍ．ｔｂ感染を制御できないことによって実証されている（Ｆｌｙｎｎほか、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９（２４）：１２０１３−１２０１７；１９９２）。主要組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞の重要な役割は、β２マイクログロブリン（β２ｍ）欠失マウスが実験的Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を制御できないことによって実証され確認されている（Ｆｌｙｎｎほか、同上、１９９２）。これらの変異マウスは組織適合Ｉクラスを欠失しているので、機能的ＣＤ８＋Ｔ細胞が発生できない。Ｍ．ｔｂ感染と対比して、β２ｍ欠失マウスは、ＢＣＧワクチン株のある感染性用量を制御できる（Ｆｌｙｎｎほか、同上、１９９２；Ｌａｄｅｌ  Ｃ．Ｈ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：３７７−３８４；１９９５）。さらに、β２ｍ欠失マウスにＢＣＧをワクチン接種すると、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染後の生存を延長させ、一方、ＢＣＧ免疫Ｃ５７ＢＬ／６は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに抵抗した（Ｆｌｙｎｎほか、同上、１９９２）。
【０００８】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとＢＣＧとの間でこのようにＣＤ８＋Ｔ細胞依存性が異なっていることは、下記のように説明することができる：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原が、ＢＣＧ由来抗原類よりも細胞質に対して優れたアクセスを得て、組織適合Ｉクラス提示がより顕著になる（ＨｅｓｓおよびＫａｕｆｍａｎｎ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：９５−１０３；１９９３）。結論として、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓがより効果的なＣＤ８Ｔ細胞応答を生じさせる。この見解は、最近、ＢＣＧよりもむしろＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと抗原提示細胞（ＡＰＣ）を同時感染させることによって、関連のない抗原である卵白アルブミンの組織適合Ｉクラス提示が増加することにより裏付けられた（Ｍａｚｚａｃｃａｒｏほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，Ｏｃｔ  １５：９３（２１）：１１７８６−９１；１９９６）。
【０００９】
したがって、Ｍ．ｔｂ抗原類は、ＢＣＧ由来抗原類よりも宿主細胞質により良好にアクセスし、組織適合Ｉクラス提示増加（Ｈｅｓｓほか、同上、１９９３）とＭ．ｔｂに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答上昇を起こす。さらに、Ｍ．ｔｂは、抗原特異的組織適合ＩＩクラス制限ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞ならびに組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞をマウスおよびヒトにおいて刺激する（Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：１２９−１６３；１９９３）。この事実は、拡大すると、Ｍ．ｔｂ感染細胞が組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞による認識を受けることを示唆している。ＴＢ菌に暴露した免疫適格ヒトの７０％が感染しないことを考慮すると、Ｍ．ｔｂ感染により誘発された免疫が大半の症例においてこの菌を制御する際に非常に有効である。したがって、既存のＴＢワクチン株であるＢＣＧの有効性が、組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発するＢＣＧの能力を高めることによって改善されるだろうと確信される（Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７）。
【００１０】
食細胞に結合したままの病原体により発現された抗原類は、主に組織適合ＩＩクラス分子類によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞による認識は不良であり、それらは、通常、組織適合Ｉクラス分子類の文脈において提示された抗原類を認識する（Ｋａｕｆｍａｎｎ、同上、１９９７）。対比して、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例  ＡＴＣＣ＃１３９３２）のような細胞内細菌類は、食細胞を逃れ宿主細胞の細胞質で複製し、組織適合Ｉクラス抗原提示経路へのアクセスおよびＣＤ８＋Ｔ細胞応答惹起において、効果的である（Ｂｅｒｃｈｅほか、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：２２６６−２２７６；１９８７）。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのこのエンドソームエスケープ機能は、最近、食細胞に通常存在する弱毒サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）にリステリオライシン（Ｌｌｏ）をコードする配列を導入することによって、転移された；結果として生成した株類は、エンドソームをエスケープしＣＤ８＋Ｔ細胞応答誘発においてより効果的であることが明らかになった（Ｂｉｅｌｅｃｋｉほか、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３５４：１７５−１７６；１９９０；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３（１０）：４２０２−４２０５；１９９５；Ｈｅｓｓほか、Ｈｏｓｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，７５−９０；１９９７）。さらに最近になって、このアプローチがＢＣＧにも応用された；したがって、Ｌｌｏを分泌するｒＢＣＧ株類が構築され、組織適合Ｉクラス制限免疫応答を誘発するＢＣＧの能力が改善された（Ｈｅｓｓほか、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９５（９）：５２９９−５３０４；１９９８）。初期の証拠はｒＢＣＧ−Ｌｌｏ＋株が、ＣＤ８＋Ｔ細胞惹起においてより熟練していることを示唆しているものの、この株はエンドソームエスケープができないことが証明された。したがって、このアプローチの限界はといえば、エンドソームエスケープに必要なＬｌｏの溶血機能がｐＨ５．５においてのみ完全に活性であるが、ｐＨ７．０において不活性であることである。マイコバクテリウムはエンドソームのｐＨを約７．０の値に保つので、これまで報告されているｒＢＣＧ−Ｌｌｏ株類中におけるＬｌｏが機能不全となっていること、その理由は、それらが発現する環境が、溶血活性の大きさからして最適以下であると推論することは、論理的である（Ｇｅｏｆｆｒｏｙほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５５（７）：１６４１−１６４６；１９８７）。したがって、このアプローチの免疫増強効果は、ＢＣＧ作用エンドソーム中においてＬｌｏが機能できるような戦略が開発されるまで現実化されないであろう。
【００１１】
【非特許文献１】Ｆｉｎｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６（２０）：１９２３−１９２８；１９９８
【非特許文献２】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．，Ａｕｇ；１１０：５６−６９；１９９９
【非特許文献３】Ｌａｎｃｋｒｉｅｔほか、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２４（５）：１０４２−１０４９；１９９５
【非特許文献４】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓほか、Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ４５（１）：７８−８０；１９９１
【非特許文献５】Ｆｌｙｎｎほか、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９（２４）：１２０１３−１２０１７；１９９２
【非特許文献６】Ｌａｄｅｌ  Ｃ．Ｈ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２５：３７７−３８４；１９９５
【非特許文献７】Ｍａｚｚａｃｃａｒｏほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，Ｏｃｔ  １５：９３（２１）：１１７８６−９１；１９９６
【非特許文献８】Ｋａｕｆｍａｎｎ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：１２９−１６３；１９９３
【非特許文献９】Ｂｅｒｃｈｅほか、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：２２６６−２２７６；１９８７
【非特許文献１０】Ｂｉｅｌｅｃｋｉほか、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３５４：１７５−１７６；１９９０
【非特許文献１１】Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３（１０）：４２０２−４２０５；１９９５
【非特許文献１２】Ｈｅｓｓほか、Ｈｏｓｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，７５−９０；１９９７
【非特許文献１３】Ｈｅｓｓほか、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９５（９）：５２９９−５３０４；１９９８
【非特許文献１４】Ｇｅｏｆｆｒｏｙほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５５（７）：１６４１−１６４６；１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、これまで、先行技術は、エンドソームエスケープ能力が増強されそれによって、例えば主要組織適合Ｉクラス制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答誘導を増強できるｒＢＣＧを提供することができなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の例示的面は、主要組織適合（ＭＨＣ）Ｉクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答能力が増強された組換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）株類を提供することである。これらの新規ｒＢＣＧ株類は、中性に近いｐＨ（例  約ｐＨ６−８または約６．５乃至７．５）で生物活性である機能的エンドソーム溶解性タンパク質を発現するように遺伝子工学で処理されている。このエンドソーム溶解性タンパク質は、従って、マイコバクテリア含有エンドソーム内部で活性であり、それらは、通常、中性に近い内部ｐＨを有している。ｒＢＣＧによって産生されたエンドソーム溶解性タンパク質の活性の結果、エンドソームが破壊され、ｒＢＣＧがエンドソームからエスケープし、細胞の細胞質に侵入できるようになる。このｒＢＣＧは従って、細胞質に暴露され、強力なＴ細胞応答を惹起し、特に強力なＭＨＣ−Ｉ制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答を惹起する。本発明の１態様において、遺伝子工学処理によりｒＢＣＧに導入したエンドソーム溶解性タンパク質は、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）由来パーフリンゴライシンＯ（ＰｆｏＡ）である。
【００１４】
本発明は、従って、遺伝子工学処理によって中性ｐＨで活性の機能的エンドソーム溶解性タンパク質を発現分泌するようにさせたマイコバクテリウムを提供する。いくつかの態様において、前記の機能的エンドソーム溶解性孔形成性タンパク質は、ＰｆｏＡまたは配列番号３によりコードされる変異ＰｆｏＡである（本文では、ＰｆｏＡＧ１３７Ｑと称する）。マイコバクテリウムによる機能的エンドソーム溶解性タンパク質の発現は、エンドソームからのｒＢＣＧエスケープを可能とする。このように遺伝子工学処理したマイコバクテリウムは、ＢＣＧのような弱毒化マイコバクテリウムであることもできる。本発明はまた、遺伝子工学処理でＰｆｏＡを発現分泌するようにしたマイコバクテリウム、および遺伝子工学処理により配列番号３でコードされるＰｆｏＡＧ１３７Ｑを発現分泌するようにしたマイコバクテリウムを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、マイコバクテリウム誘導体をエンドソームエスケープができるようにする方法を提供する。この方法は、前記マイコバクテリウムを遺伝子工学処理してＰｆｏＡまたは配列番号３によってコードされるもののようなＰｆｏＡＧ１３７Ｑのような機能的エンドソーム溶解性タンパク質を含み、発現させかつ分泌させる段階を含む。いくつかの態様において、前記マイコバクテリウムは、ＢＣＧなどの弱毒化マイコバクテリウムである。
【００１６】
本発明はさらに、遺伝子工学処理によって中性ｐＨで活性の機能的エンドソーム溶解性タンパク質を発現分泌するようにさせたマイコバクテリウムを含むワクチン調製物を提供する。前記の機能的エンドソーム溶解性タンパク質は、例えば、ＰｆｏＡまたは配列番号３によってコードされるようなＰｆｏＡＧ１３７Ｑであることもできる。マイコバクテリウムによる前記の機能的エンドソーム溶解性タンパク質の発現は、組換えマイコバクテリウムのエンドソームエスケープを可能とする。いくつかの態様において、前記マイコバクテリウムは、ＢＣＧなどの弱毒化マイコバクテリウムである。
【発明の効果】
【００１７】
ワクチン機能を改良した結核ワクチンなどのワクチン剤の製造を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、エンドソームエスケープが可能で感染した細胞類の宿主細胞の細胞質にアクセスできるｒＢＣＧを提供する。結果としてｒＢＣＧに対して優れたＣＤ８＋Ｔ細胞応答が細胞中で惹起される。
【００１９】
ｒＢＣＧは、ｒＢＣＧにより発現し分泌されかつｒＢＣＧのエンドソームエスケープを媒介する機能的エンドソーマライシンを含むように遺伝子工学処理されている。本明細書では、用語エンドソーマライシンとは、エンドソーム膜を十分に破壊でき菌細胞がエンドソームを通過して細胞質ゾル中に入るタンパク質を意味する。また、用語エンドソーム溶解性タンパク質は、前記破壊活性を有するタンパク質を意味する。また、エンドソーム溶解は、エンドソーム膜を十分に破壊し菌細胞がエンドソームを通過して細胞質ゾル中に入るようにさせるプロセスを意味する。前記のエンドソーム溶解性タンパク質は、マイコバクテリア感染細胞のエンドソーム内部などの中性に近いｐＨ値の環境中で活性であり、従って、細胞質への菌エスケープを媒介する。
【００２０】
本発明の１態様において、本発明のｒＢＣＧ株類中に導入される機能的エンドソーム溶解性タンパク質は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来ＰｆｏＡまたはその機能的変異体である。ＰｆｏＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓにより分泌されたサイトライシンであり、ｐｆｏＡ遺伝子によってコードされている（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  アクセス＃ＣＰＥ０１６３）。この遺伝子およびそのタンパク質配列を、図２ＡおよびＢにそれぞれ示した。ＰｆｏＡは、食細胞からの菌エスケープをＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ中においておよびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）により発現されたときの両方の場合において、媒介する（Ｐｏｒｔｎｏｙほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．Ｊｕｌ；６０（７）：２７１０−７；１９９２）。ＰｆｏＡはＬｌｏと異なり、ｐＨ５．０およびｐＨ７．０の両方の場合において活性であり、サイトゾル中で活性のままであり、感染した宿主細胞に傷害を及ぼす（Ｐｏｒｔｎｏｙほか、同上、１９９２）。したがって、ＰｆｏＡがＬｌｏの代わりにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ中において発現すると、それは、前記株を食細胞からエスケープさせることができた（ＪｏｎｅｓおよびＰｏｒｔｎｏｙ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．Ｄｅｃ；６２（１２）：５６０８−１３；１９９４）。しかし、その発現はまた、宿主細胞に対しても傷害の原因となった。Ｌｌｏは、ＬｌｏがｐＨ５．５で最適活性でありｐＨ７．０ではほとんど活性を示さないということを除いて、ＰｆｏＡと同様の性質を示す。したがって、Ｌｌｏは、エンドソームのｐＨがｐＨ５．５までいったん低下するとエンドソームエスケープを媒介するが、宿主細胞には影響を及ぼさず、その理由は、中性に近いサイトゾルのｐＨがＬｌｏ活性を妨害するからである。
【００２１】
Ｐｏｒｔｎｏｙらは、さらに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ中でアミノ酸１個のみが変化している変異体形態としてＰｆｏＡが発現すると、ＰｆｏＡの変異体形態は宿主細胞に対してもはや有毒ではなく、にもかかわらず、小胞からの菌エスケープを媒介できかつ細胞内増殖を実行できることを実証した（Ｐｏｒｔｎｏｙほか、同上、１９９２）。特定の株ＤＰ−１２７９１は、Ｐｆｏ中のＧｌｙ１３７をＧｌｎ１３７に変化させた変異（すなわち、ＰｆｏＡＧ１３７Ｑ）を有しており、野生型と同様の方法で食細胞からエスケープできるが、宿主細胞に毒性効果をもたらさない。さらに、ＰｆｏＡＧ１３７Ｑは、ｐＨ５．６およびｐＨ７．４の両者で活性であり、サイトゾルの半減期が短くなる。ＰｆｏＡＧ１３７Ｑの遺伝子配列は、図３に示した（配列番号３）。
【００２２】
ＰｆｏＡの発現はエンドソームからのエスケープを可能とし、その理由としては、ＰｆｏＡの孔形成活性が、真核細胞膜傷害につながるからである。ＰｆｏＡは、コレステロール含有膜中においてそのドメインを二重層に自然挿入することによって孔を形成する。これは、レセプターとして作用するコレステロールへの結合により起こる。結合後、次に、トキシンは、モノマーモノマー界面（オリゴマーアセンブリに必要）を形成し、その構造を変化させることにより膜中でオリゴマー化しかつ分配されるが、それは、膜結合依存性である。膜結合オリゴマーの形成により膜傷害が生じ、条件次第では溶解が起こることもある（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎほか、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１（８）、６９７−７０５（１９９５）。ＰｆｏＡＧ１３７Ｑは、このようにして小胞の溶解を媒介できるようになる。好適なＰｆｏＡＧ１３７Ｑは、宿主タンパク質溶解酵素に対するその感度ゆえに感染宿主細胞の細胞質で限定された活性を有している。
【００２３】
本発明の１態様において、ｒＢＣＧにより発現される機能的エンドソーム溶解性酵素は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに由来するかまたはそれから単離されたＰｆｏＡである。しかし、当業者は、中性または中性に近いところで活性の他のエンドソーム溶解性タンパク質類も同様に存在すると認識し、それらも本発明の用途に適切であろうということを認識するだろう。このようなエンドソーム溶解性タンパク質類の例にはニューモライシン（ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により産生される）、ストレプトライシンＯ（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）により産生）、セロライシン（バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）により産生される）、α−ヘモライシン（スタフィロコッカス・オーレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により産生される）等およびその機能的変異体類（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含むがそれらに限定されない。
【００２４】
“機能的エンドソーム溶解性タンパク質”またはタンパク質（または、ある遺伝子の“機能するように発現された”遺伝子産物）の“機能的形態”とは、ｒＢＣＧ菌により産生されたタンパク質の形状が、天然すなわち自然の（“野生型”）タンパク質がその天然生物中で公知となっている特徴的大きさの活性を示すことを意味している。ｒＢＣＧにより産生されたタンパク質の機能的形態の活性の大きさは、一般的に、当業者が認めるような標準的条件下でアッセイすると野生型タンパク質の通常活性の少なくとも約５０％である。タンパク質の活性の大きさは、リガンドへの結合、ｒＢＣＧのエンドソームエスケープのような効果の産生のようないかなる観察可能な物理的項目を測定することによっても、決定することもできる。好適には、活性の大きさは、当業者が認めるような標準的条件下でアッセイすると野生型タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上である。
【００２５】
発明者らは、タンパク質の“機能的変異体（ｖａｒｉａｎｔ）”とは、野生型“参考”タンパク質のアミノ酸配列に少なくとも７０％相同でかつ野生型タンパク質（上に述べたとおり）の機能的大きさの活性を保持しているポリペプチドを意味していると考えている。参考野生型タンパク質のアミノ酸配列を通常、遺伝子工学により行われる変異および改変の出発点として用いる。
【００２６】
好適には、機能的変異体は、標準アミノ酸配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチドである。このような機能的変異体類には、１個以上の保存的アミノ酸置換が行われているポリペプチド配列類が含まれるが、それらに限定されない。保存的アミノ酸置換は当業者に周知であり、例えば、１個の陽電荷アミノ酸を別のものと置換すること、陰電荷アミノ酸を別のものと置換すること、疎水性アミノ酸を別のものと置換すること等が含まれる。変異ポリペプチド類は、生成した変異ポリペプチドが本文で記載したような機能的大きさの活性を保持する限りにおいて、このような置換を１個以上含むことができる。“機能性変異体類”はまた、問題のポリペプチドの一次配列に対する他の変化も含む。変化の例には、アミノ酸類の欠失および付加またはアミノ酸類の修飾（例  スルホン化、脱アミノ化、リン酸化、ヒドロキシル化等）等を含むが、それらに限定されない。このような変化は、参考アミノ酸配列の遺伝子工学処理の結果であることもでき、あるいは、タンパク質の翻訳後修飾の結果、またはその両者であることもできる。さらに、酵素の機能的変異体類は、ある種の異なる株類、または異なる種、またはある種内の異なるそれぞれの生物から単離された同一または類似活性を有する同族タンパク質類の間で起こる自然変異の結果であることもできる。このような自然に起こる変異体類由来のタンパク質類はまた、標準タンパク質として作用することもでき、このような天然変異体のアミノ酸配列は、標準配列として作用することもできる。いずれにせよ、標準タンパク質のこのような機能性変異体類は全て、前記タンパク質の活性強度を保持し、それについては、本明細書に記載してある。
【００２７】
上述のとおりの配列相同性と同一性は、標準配列以外の起源に由来しかつさまざまな他の目的のためにタンパク質のポリペプチド配列に結合させてあるかまたは含まれている非相同性アミノ酸配列類を含むことを意図していない。このような非相同性配列類の例には、ポリペプチド単離を促進する配列類（例  ヒスチジンタグ）、細胞内部においてポリペプチドの分泌または局在を促進する配列類（例  さまざまなリーダーまたは標的配列類）、およびグリコシル化部位をコードする配列類（グリコシル化配列類）等を含むが、それらに限定されない。
【００２８】
いずれにせよ、前記の機能的変異体は、変異体のもとであるタンパク質の活性強度を保持するだろうが、この機能性変異体は、当業者が認識しているような標準的条件下でアッセイした時、少なくとも、そのもととなるタンパク質の活性強度の少なくとも約５０％、および好適には約６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上を示す程度の変異体である。
【００２９】
さらに、本発明には、本発明で使用するタンパク質類およびタンパク質類の機能的変異体類をコードする核酸配列類を含む。前記核酸配列類は、デオキシリボヌクレオチド類、リボヌクレオチド類、またはいずれかの修飾形態類であることができ、さらに、一重鎖または二重鎖であることができる。本発明の核酸配列類には、本明細書で列挙したもののいずれをも含み、また、その変異体類も含むものとする。たとえば、核酸類の変異体類は列挙した配列類と同一でないこともあり、それでもなお遺伝子コードの冗長性により同一のアミノ酸配列をコードすることもできる。これとは別に、本発明の配列においていくつかの変更も行われ（例  置換、欠失または付加）、それにより、結果として、コードしたアミノ酸配列が本文で述べたような標準アミノ酸配列の機能的変異体である限り、コードしたアミノ酸配列に変化が起こる。例には、酵素に保存的アミノ酸置換を起こす変化およびアミノ酸配列類における非保存的置換、またはアミノ酸配列の欠失または付加が結果として起こるような変化を含むが、それらに限定されない。このような変化は、例えば酵素の翻訳後修飾を改変するため；溶解性を高めるためまたは低くするため；翻訳ポリペプチドにおける立体的相互作用を防止するためまたはそのポリペプチド中に導入するためなど、任意の理由のために導入できる。一般的に、本発明の核酸配列類の変異体は、標準配列類に対して少なくとも約５０％、好適には、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の相同性を示すであろうが、そのことは、当業者に周知の比較操作により決定する。このような変異体類はまた、高緊縮性の条件下で本発明で用いた配列類に結合する能力を示すことを特徴とする。高緊縮性結合アッセイは当業者に周知で、本発明の配列類の潜在的変異体類を試験するために容易に適用できる。
【００３０】
本明細書で述べたような配列相同性が、標準アミノ酸配列以外の起源に由来しかつさまざまな他の目的のためにタンパク質のポリペプチド配列に結合させるかまたはそれに含まれる非相同アミノ酸配列類をコードする核酸配列類を称するとは、意図していない。例えば、このような核酸配列類には、ポリペプチド単離を促進する配列類（例  ヒスチジンタグ）、細胞内部においてポリペプチドの分泌または局在を促進する配列類（例  さまざまなリーダーまたは標的配列類）、およびグリコシル化部位をコードする配列類（グリコシル化配列類）等を含むが、それらに限定されない。
【００３１】
本発明の核酸配列類の他の変異体類で本発明に包含することを意図している変異体類は、前記核酸配列類の遺伝子工学処理またはそれらがコードするアミノ酸配列類の発現における便宜または改善のため改変された配列類である。一般的に、このような改変は、核酸配列から最終的に翻訳されたポリペプチド配列に影響を及ぼさないであろう；または、前記ポリペプチドは、それでもなお、機能的変異体について上記で述べた基準を満たすであろう。このタイプの改変の例には、核酸配列中に便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を含ませること（例  ベクター中に配列を挿入するため）；アミノ酸配列発現に関与する配列または配列類における組み込み、欠失または他の変化（例  さまざまなプロモータおよび／またはエンハンサー配列類、停止シグナル類、スーパープロモータ類、誘導可能プロモータ類、および核酸配列の発現を修飾するさまざまな他の配列類のいずれかを組み込ませること）；宿主生物の核酸配列とベクターの相互作用を促進する配列類を含ませること；等を含むが、それらに限定されない。
【００３２】
さらに、本発明の核酸配列類は、化学的に修飾することもできまたは当業者に周知の多くの理由のいずれかによりこれまでにない塩基類を含むことができ、例えば、核酸安定性の促進のためあるいは所望の立体構造を付与するために行われる。
【００３３】
“中性ｐＨにおいて活性”および“約７．０のｐＨにおいて活性”とは、酵素が約６．０乃至約８．０の範囲、好適には約６．５乃至約７．５の範囲のｐＨ値で活性であることを意味する。
【００３４】
本発明は、組換えマイコバクテリアを提供する。本発明の好適な態様において、ＢＣＧにより例示するとおり、前記マイコバクテリアは、弱毒化される。しかし、当業者は、他の弱毒化および非弱毒化マイコバクテリアも存在し、それらもまた本発明の用途に適しているだろうということがわかるであろう。マイコバクテリアの他のタイプの例には、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＣＤＣ１５５１株（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈほか、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．Ａｕｇ；１５２（２）：８０８；１９９５を参照）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｂｅｉｊｉｎｇ株（Ｓｏｏｌｉｎｇｅｎほか、１９９５）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ株（ＡＴＣＣ＃：２５１７７）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ株（ＡＴＣＣ＃：２５６１８）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）（ＡＴＣＣ＃：１９２１１および２７２９１）、Ｍ．フォーチュイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１５０７３）、Ｍ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ＃：１２０５１および１２５４９）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＡＴＣＣ＃：３５７７２および１３２０９）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＡＴＣＣ＃：２１９８２および３５７７５）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１９４２１および２５２９１）、Ｍ．ガリナルム（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１９７１１）、Ｍ．ヴァカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）（ＡＴＣＣ＃：１５４８３および２３０２４）、Ｍ．レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）（ＡＴＣＣ＃：）、Ｍ．マリナルム（Ｍ．ｍａｒｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１１５６６および１１５６７）、およびＭ．ミクロチ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｔｉ）（ＡＴＣＣ＃：１１１５２）が含まれるが、それらに限定されない。
【００３５】
弱毒化マイコバクテリウム株類の例には、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓパントテネート栄養素要求体株（Ｓａｍｂａｎｄａｍｕｒｔｈｙ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００２  ８（１０）：１１７１；２００２）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｒｐｏＶ変異株（Ｃｏｌｌｉｎｓほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２（１７）：８０３６；１９９５）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓロイシン栄養素要求体株（Ｈｏｎｄａｌｕｓほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２８８８；２０００）、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ株（ＡＴＣＣ＃３５７３３）、ＢＣＧ  Ｊａｐａｎｅｓｅ株（ＡＴＣＣ＃３５７３７）、ＢＣＧ  Ｃｈｉｃａｇｏ株（ＡＴＣＣ＃２７２８９）、ＢＣＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（ＡＴＣＣ＃：２７２９０）、ＢＣＧ  Ｐａｓｔｅｕｒ株（ＡＴＣＣ＃：３５７３４）、ＢＣＧ  Ｇｌａｘｏ株（ＡＴＣＣ＃：３５７４１）、ＢＣＧ  Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ株（ＡＴＣＣ＃３５７４５）、ＢＣＧ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ株（ＡＴＣＣ＃３５７４６）を含むが、それらに限定されない。
【００３６】
さらに本発明の態様において、弱毒化マイコバクテリウム株類は、アポトーシスを増大させるために修飾され、このような株類は、強い細胞性免疫応答を誘発する。アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、これは、その誘導と結果の観点から壊死性細胞死とは顕著に異なる。実際、抗原含有細胞のアポトーシスが結果として強烈な細胞免疫を誘導することになるプロセスは、クロスプライミングと称されてきた（Ｈｅａｔｈほか、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９；２００４；Ｇａｌｌｕｃｃｉほか、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．５：１２４９；１９９９；Ａｌｂｅｒｔほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６；１９９８）。抗原特異的細胞媒介免疫上昇を起こすアポトーシス誘導のため、いくつか機構がある。カスパーゼ８媒介アポトーシスは、抗原特異的細胞免疫防御につながる（Ｓｈｅｒｉｄａｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：８１８；１９９７）。
【００３７】
したがって、本発明の別の態様では、増強されたプロアポトーシス性を示す弱毒化マイコバクテリウム株類が提供され、それらは、サルモネラ・エンテリダイティス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号１０６８１４７）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号１２５００７０）またはシゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号１０７９９７７）由来のリーダー配列を欠失しているｓｅｃＡ１分泌ＳｏｄＡ、またはこれとは別にＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号９８６７９１）由来ＳｏｄＡなどの天然では分泌されないＳｏｄＡタンパク質などであるが、これらに限定されない。このような弱毒化マイコバクテリウム株類は細胞外Ｓｏｄを産生せず、従って、宿主免疫応答を抑制しないが、それでいてなお、それらは、細胞内Ｓｏｄを実際に発現しそれによって前記マイコバクテリウムの生存を可能とする（Ｅｄｗａｒｄｓほか、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６４（１２）：２２１３−９；２００１）。これとは別に、増強されたプロアポトーシス性質を示す弱毒化マイコバクテリウム株類は、不活性化Ｒｖ３２３８ｃ遺伝子を保有している。
【００３８】
これとは別に、宿主細胞の細胞質中においてのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＳｏｐＥ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃ＡＡＤ５４２３９、ＡＡＢ５１４２９またはＡＡＣ０２０７１）またはカスパーゼ−８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃ＡＡＤ２４９６２またはＡＡＨ０６７３７）の本発明の弱毒化マイコバクテリウムによる発現は、前記弱毒化マイコバクテリウムによって発現された抗原類という文脈でプログラムされた細胞死を誘導する強力な方法を付与し、高レベルの抗原特異的細胞免疫を惹起するだろう。
【００３９】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＲＡＩＬレセプター２）またはＴＮＦＲ−ＳＦ−１０Ｂ（腫瘍壊死因子スーパーファミリメンバー１０Ｂ）としても公知のデスレセプター−５（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−５）（ＤＲ−５）もまた、カスパーゼ８媒介アポトーシスを媒介する（Ｓｈｅｒｉｄａｎほか、１９９７）。レオウイルス誘導アポトーシスは、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５によって媒介され、このウイルスがその後クリアランスされることになる（Ｃｌａｒｋｅほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８１３５；２０００）。ヒトＤＲ−５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃ＢＡＡ３３７２３）、ヘルペスウイルスー６（ＨＨＶ−６）ＤＲ−５ホモログ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃ＣＡＡ５８４２３）等の本発明の弱毒化マイコバクテリウムによる発現は、Ｍｔｂ抗原類に対する抗原特異的免疫誘導のため強力なアジュバント効果を付与する。
【００４０】
さらに、（マクロファージ類および樹状細胞類などの）宿主抗原提示細胞類もまた誘発され、Ｆａｓ連結を介してアポトーシスを受けるよう誘発でき、それは、抗原特異的細胞性免疫応答の誘導に強力な刺激である（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎほか、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９７４；２０００）。したがって、ＦａｓまたはＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質を発現する弱毒化マイコバクテリウムは、アポトーシスおよび加速された抗原特異的細胞性免疫応答を誘導するだろう。
【００４１】
要約すると、アポトーシス誘導を促進する弱毒化マイコバクテリウム株類は、Ｍｔｂ感染細胞の免疫媒介細胞破壊につながる細胞性応答誘導のための強力な手段を提供するが、その後、Ｍｔｂ感染が消失、低下または防御されるだろう。
【００４２】
本発明のさらに別の態様において、２成分ＴＢワクチンには、少なくとも１種のマイコバクテリウム抗原を過剰発現する弱毒化マイコバクテリウム株類を含むことができ、Ｒｖ０１２５、Ｒｖ０２０３、Ｒｖ０２８７、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ０６０３、Ｒｖ１１９６、Ｒｖ１２２３、Ｒｖ１２７１ｃ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３８  Ｒｖ１８０４ｃ、Ｒｖ１８８６、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２２５３、Ｒｖ２２９０、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ２６２７ｃ、Ｒｖ２７７９ｃ、Ｒｖ２８７３、Ｒｖ２８７５、Ｒｖ３０１７ｃ、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ３８０４ｃ、Ｒｖ３８１０またはＲｖ３８４１を含むがそれらに限定されない。これとは別に、過剰発現したマイコバクテリウム抗原類は、１種以上の前記マイコバクテリウム融合タンパク質類を含むＭｔｂ７２ｆ（Ｂｒａｎｄｔほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：６６２２−６６３２；２００４；Ｓｋｅｉｋｙほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：７６１８−７６２８；２００４）、Ｈｙｂｒｉｄ−１（Ｏｌｓｅｎほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，７２：６１４８−６１５０；２００４；Ｌａｎｇｅｒｍａｎｓほか、Ｖａｃｃｉｎｅ，２３：２７４０−２７５０；２００５）、Ｈｙｖａｃ−４（Ｄｉｅｔｒｉｃｈほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：６３３２−６３３９；２００５）等の融合タンパク質の形状であることができる。
【００４３】
本発明は、病原性マイコバクテリウム種に対するワクチン類開発、および抗原運搬ワクチンベクター類の開発に用途を有している。マイコバクテリウムベクターとは、本明細書で、ＤＮＡまたはＲＮＡを含みかつ抗原類、免疫制御因子類またはアジュバント類のいかなる組み合わせをもコードする少なくとも１個のパッセンジャーヌクレオチド配列（本文で“ＰＮＳ”と称する）を発現するように遺伝子工学処理したいかなるマイコバクテリウム株としても定義され、これらについては、下記で述べる。前記ＰＮＳは、染色体中に導入できるかまたは当技術で周知の組成物類および方法類を用いて発現ベクターの一部として導入できる（Ｊａｃｏｂｓほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：５３２−５３５；１９８７；Ｂａｒｌｅｔｔａほか、Ｒｅｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４１：９３１−９３９；１９９０；Ｋａｗａｈａｒａほか、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５：３２６−３３１；２００２；Ｌｉｍほか、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１３：１５７３−１５８１；１９９７；Ｃｈｕｊｏｈほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０：７９７−８０４；２００１；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１４：５４−６０；１９９６；Ｈａｅｓｅｌｅｅｒほか、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，５７：１１７−１２６；１９９３）。
【００４４】
本発明において、前記マイコバクテリウムベクターは、免疫原をコードするＰＮＳを保有でき、それは、ウイルス、細菌および寄生病原体類由来の外来性免疫原または限定するものではないが自己免疫抗原または腫瘍抗原などの内因性免疫原のいずれかであることができる。免疫原類は、全長天然タンパク質、外来性免疫原と内因性タンパク質または模倣物、ウイルス、細菌および寄生病原体類に起源を有する免疫原の断片または断片類とのキメラ融合体であることができる。
【００４５】
本明細書では、“外来性免疫原”とは、受容体動物細胞または組織で通常は発現されないタンパク質またはその断片を意味し、ウイルスタンパク質類、細菌タンパク質類、寄生体タンパク質類、サイトカイン類、ケモカイン類、免疫制御剤類、または治療剤類を含むがそれらに限定されない。
【００４６】
“内因性免疫原”とは、限定するものではないが内因性細胞性タンパク質、免疫制御剤、または治療剤などの受容体動物細胞または組織に天然に存在するタンパク質またはその一部を意味する。これとは別にまたはその他に、前記免疫源は、合成遺伝子によってコードすることもでき、当業者に公知の従来の組換えＤＮＡ法を用いて構築することもできる。
【００４７】
外来性免疫原は、動物宿主中へ入る前または入る時、またはコロニー形成または複製の前またはその間においていかなるウイルス、細菌または寄生病原体によっても発現されるいかなる分子であることもできる；前記マイコバクテリウムベクターは、ウイルス、細菌および寄生病原体類から派生した免疫原類またはその一部を発現することができる。これらの病原体類は、ヒト、家禽または野生動物宿主において感染性であることができる。
【００４８】
ウイルス抗原が由来するウイルス病原体類には、インフルエンザウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：５９７７１のようなオルソミキソウイルス類；ＲＳＶ，ＨＴＬＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３９０１５）およびＨＴＬＶ−ＩＩ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１９０９）などのレトロウイルス類、ＥＢＶ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２９５）などのヘルペスウイルス類；ＣＭＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０３５８）または単純ヘルペスウイルス（ＡＴＣＣ＃：ＶＲ−１４８７）；ＨＩＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２７２１）およびＨＩＶ−２  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１７０９）などのレンチウイルス類；ラビーなどのラブドウイルス類；ポリオウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２０８０）などのピコルノウイルス類；ワクシニア（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２４５）などのポックスウイルス類；ロタウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０９１２）；およびアデノ関連ウイルス１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：８５１０６）などのパルボウイルス類を含むが、それらに限定されない。
【００４９】
ウイルス抗原の例は、ヒト免疫不全ウイルス抗原類Ｎｅｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃１８３；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ２３８２７８）、Ｇａｇ，Ｅｎｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２４３３；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ３９３６２）、Ｔａｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃８２７；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｍ１３１３７）、Ｔａｔ−Δ３１−４５（Ａｇｗａｌｅほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．印刷中、７月８日；２００２）などのＴａｔの変異誘導体類、Ｒｅｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２０８８；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｌ１４５７２）、およびＰｏｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２３８；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２３７５６８）、およびｇｐ１２０のＴおよびＢ細胞エピトープ類（ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ＡＩＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．６６：１７７；１９９９）；（Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：５８９；１９９９）；（Ｐａｌｋｅｒほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９；１９８９）、限定するわけではないがｇｐ１２０とＣＤ４の融合体（Ｆｏｕｔｓほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４：１１４２７−１１４３６；２０００）などのＨＩＶ−１  Ｅｎｖとｇｐ１２０との間のキメラ誘導体；限定するわけではないがｇｐ１４０（Ｓｔａｍａｔｏｓほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：９６５６−９６６７；１９９８）などの短く切断したかまたは修飾したＨＩＶ−１  ｅｎｖの誘導体類、またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖおよび／またはそのｇｐ１４０の誘導体類（Ｂｉｎｌｅｙほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６：２６０６−２６１６；２００２）；（Ｓａｎｄｅｒｓほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７４：５０９１−５１００；２０００）；（Ｂｉｎｌｅｙら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：６２７−６４３；２０００）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ０４３５７８）；（Ｗｕほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４７２６−４７３０；１９８９）；ＶＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２９３７２１）；（Ｍａｃｋｏｗほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８７：５１８−５２２；１９９０）およびＶＰ７（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＹ００３８７１）；（Ｇｒｅｅｎほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１８１９−１８２３；１９８８）のようなロタウイルス抗原類、ヘマグルチニン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ａ��４０４６２７）；（ＰｅｒｔｍｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７：４０６；１９９９）などのインフルエンザウイルス抗原類、ヌクレオプロテイン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２８９８７２）；（Ｌｉｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９６５４−９６５８；２０００）、チミジンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＢ０４７３７８）；（Ｗｈｉｔｌｅｙほか、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，８２５−８５４ページ；２００４）などの単純ヘルペスウイルス抗原類が含まれるが、それらに限定されない。
【００５０】
細菌性抗原類を誘導した細菌病原体類には、マイコバクテリウム種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、大腸菌、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｉａ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、レジオネラ・ニューモニアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種およびボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５１】
細菌性病原体の防御性抗原類の例には、ＣＦＡ／Ｉ  フィンブリアル抗原（Ｙａｍａｍｏｔｏほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０：９２５−９２８；１９８５）および熱に不安定な毒物の非毒性Ｂサブユニット（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４０：８８８−８９３；１９８３）などのエンテロトキシン性大腸菌の全身抗原類；ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のペルタクチン（Ｒｏｂｅｒｔｓほか、Ｖａｃｃ．，１０：４３−４８；１９９２）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニレートシクラーゼ−ヘモライシン（Ｇｕｉｓｏほか、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１１：４２３−４３１；１９９１）、クロストリジウム・テトラニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｎｉ）の破傷風毒素断片Ｃ（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１３２３−１３２６；１９９０）、ボレリア・ブルガドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のＯｓｐＡ（Ｓｉｋａｎｄほか、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１０８：１２３−１２８；２００１）；（Ｗａｌｌｉｃｈほか，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，６９：２１３０−２１３６；２００１）、リケッチア・プロワゼッキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）およびリケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）の防御性パラクリスタリン−表面層（Ｃａｒｌほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７：８２３７−８２４１；１９９０）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオライシン（“Ｌｌｏ”および“Ｈｌｙ“としても公知）および／またはスーパーオキサイドディスムターゼ（“ＳＯＤ”および“ｐ６０”としても公知）（Ｈｅｓｓ  Ｊ．ほか，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１２８６−９２；１９９７）；（Ｈｅｓｓ  Ｊ．ほか，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４５８−１４６３；１９９６）；（Ｂｏｕｗｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１４６７−７１；１９９２）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のウレアーゼ（Ｇｏｒｎｅｚ−Ｄｕａｒｔｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、４６０−７１；１９９８）；Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚほか、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６，５８１−６；１９９８）、および致死的毒素のレセプター結合ドメインおよび／またはバシラス・アンスラックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｘ）の防御性抗原（Ｐｒｉｃｅほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９、４５０９−４５１５；２００１）を含む。
【００５２】
寄生抗原類を誘導する寄生病原体類には、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｓｉｐａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３０１４５）などのプラスモジウム種；トリパノソム・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）（ＡＴＣＣ＃５０７９７）などのトリパノソム種；ジアルジア・インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃３０８８８Ｄ）などのジアルジア種；ブウフィラス（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、バベシア・ミクロティ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）（ＡＴＣＣ＃３０２２１）などのバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種；エンタモエバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃３００１５）などのエンタモエバ種；エイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）（ＡＴＣＣ＃４０３５７）などのエイメリア種；リューシュマニア種（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３８５６８）；シストソム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）種、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）種、ファスシダ（Ｆａｓｃｉｄａ）種、ディロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）種、ウチェレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）種およびオンコセレア（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｅａ）種が含まれるが、それらに限定されない。
【００５３】
寄生病原体の防御性抗原類の例には、Ｐ．ベルゲリ（Ｐ．ｂｅｒｇｅｒｉｉ）のサーカムスポロゾイテ抗原またはＰ．ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイテ抗原などのプラスモジウム種のサーカムスポロゾイテ抗原類（Ｓａｄｏｆｆほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：３３６−３３７；１９８８）；プラスモジウム種のメロゾイテ表面抗原（Ｓｐｅｔｚｌｅｒほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４３：３５１−３５８；１９９４）；エンタモエバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のガラクトース特異的レクチン（Ｍａｎｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８８：３２４８−３２５２；１９９１）、リューシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）のｇｐ６３（Ｒｕｓｓｅｌｌほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１２７４−１２７８；１９８８）；（ＸｕおよびＬｉｅｗ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：１７３−１７６；１９９５）、リューシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のｇｐ４６（Ｈａｎｄｍａｎほか、Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：３０１１−３０１７；２０００）、ブルジア・マライ（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）のパラミオシン（Ｌｉほか、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，４９：３１５−３２３；１９９１）、シストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）のトリオース−ホスフェートイソメラーゼ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８９：１８４２−１８４６；１９９２）；トリコストロンガイラス・コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の分泌グロビン様タンパク質（Ｆｒｅｎｋｅｌほか、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，５０：２７−３６；１９９２）；フラスシオラ・ヘパチカ（Ｆｒａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）（Ｈｉｌｌｙｅｒほか、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，７５：１７６−１８６；１９９２）、シストソマ・ボビス（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓ）およびＳ・ジャポニクム（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）（Ｂａｓｈｉｒほか、Ｔｒｏｐ．Ｇｅｏｇ．Ｍｅｄ．，４６：２５５−２５８；１９９４）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓおよびＳ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのＫＬＨ（Ｂａｓｈｉｒほか、同上、１９９４）を含む。
【００５４】
先にも述べたとおり、マイコバクテリウムベクターは、内因性免疫原をコードするＰＮＳを保有でき、それは、いかなる細胞性タンパク質、免疫制御剤または治療剤、またはその部分類であることができ、それらは、限定するわけではないが腫瘍、移植および自己免疫の免疫原類または腫瘍、移植および自己免疫原類の断片類および誘導体類を含む受容体細胞で発現できる。したがって、本発明において、マイコバクテリウムベクターは、腫瘍、移植または自己免疫の免疫原類またはその部分類または誘導体類をコードするＰＮＳを保有できる。これとは別に、前記マイコバクテリウムベクターは、腫瘍特異的、移植または自己免疫抗原類またはその部分類をコードする合成ＰＮＳ類（先に述べた）を保有することもできる。
【００５５】
腫瘍特異的抗原類の例には、前立腺特異的抗原（Ｇａｔｔｕｓｏほか、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，２６：１２３−１２６；１９９５）、ＴＡＧ−７２およびＣＥＡ（Ｇｕａｄａｇｎｉほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ、９：５３−６０；１９９４）、ＭＡＧＥ−１およびチロシナーゼ（Ｃｏｕｌｉｅほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ．，１４：１０４−１０９；１９９３）を含む。最近、マウスにおいて腫瘍抗原を発現する非悪性細胞による免疫でワクチン効果が得られたこと、およびそれがまた、前記動物が免疫応答を身に着け同一抗原を示す悪性腫瘍細胞を一掃するのに役立つことが明らかになった（Ｋｏｅｐｐｅｎほか、Ａｎａｌ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９０：２４４−２５５；１９９３）。
【００５６】
移植抗原類の例には、Ｔ細胞上のＣＤ３分子が含まれる（Ａｌｅｇｒｅほか、Ｄｉｇｅｓｔ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．，４０：５８−６４；１９９５）。ＣＤ３レセプターに対する抗体で処理すると、循環しているＴ細胞を迅速に一掃し、かつ、逆細胞媒介移植拒絶を一掃することが明らかになった（Ａｌｅｇrｅほか、ｓｕｐｒａ、１９９５）。
【００５７】
自己免疫抗原類の例には、ＩＡＳ  β鎖が含まれる（Ｔｏｐｈａｍほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：８００５−８００９；１９９４）。マウスをＩＡＳ  β鎖由来アミノ酸１８個のポリペプチドでワクチン接種すると、実験的自己免疫脳脊髄炎マウスに対して防御と処置を付与することが明確になった（Ｔｏｐｈａｍほか、同上、１９９４）。
【００５８】
アジュバント発現マイコバクテリウムベクター類
免疫原およびアジュバントをコードするＰＮＳを保有するマイコバクテリウムベクター類を構築することが可能で、それらは、前記ベクターおよびＰＮＳがコードした免疫原に対して強化宿主応答を惹起する点で有用である。これとは別に、アジュバントをコードするＰＮＳを保有するマイコバクテリウムベクター類を構築することが可能で、それらは、少なくとも１個の免疫原をコードするＰＮＳを保有する他のマイコバクテリウムベクター類と混合して投与することが可能で、パートナーの前記マイコバクテリウムベクターによってコードされた前記免疫原に対する宿主応答を高める。
【００５９】
前記マイコバクテリウムベクター中に挿入したＰＮＳによってコードされる特定アジュバントは、本発明において重大というわけではなく、コレラトキシンのサブユニットＡ（すなわち、ＣｔｘＡ；Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ００１７１，ＡＦ１７５７０８、Ｄ３００５３，Ｄ３００５２）またはその部分類および／または変異誘導体類（例  ＣｔｘのサブユニットＡのＡ１ドメイン（すなわち、ＣｔｘＡ１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｋ０２６７９））であることもでき、それらは、任意の従来のＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（例  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株３９５、ＡＴＣＣ＃３９５４１）またはＥ１  ＴまたはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（例  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ２１２５株、ＡＴＣＣ＃３９０５０）株由来である。これとは別に、細菌アデノシンジホスフェート−リボシル化エクソトキシン類のファミリメンバーである任意の細菌トキシン（ＫｒｕｅｇｅｒおよびＢａｒｂｉｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８：３４；１９９５）も、ＣｔｘＡの代わりに使用でき、例えば、腸毒素Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃３５５８１）の熱不安定トキシンのサブユニットＡ（ＥｌｔＡと本明細書で称する）、百日咳トキシンＳ１サブユニット（例  ｐｔｘＳ１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス＃ＡＪ００７３６４，ＡＪ００７３６３、ＡＪ００６１５９、ＡＪ００６１５７等）である；さらにこれとは別に、前記アジュバントは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ＃８４６７）、Ｂｏｒｄｅｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（ＡＴＣＣ＃７７７３）またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ＃１５２３７）のアデニレートシクラーゼヘモライシン類のひとつであることができ、例えばＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ１４１９９）、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＪ２４９８３５）またはＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｚ３７１１２）のｃｙａＡ遺伝子である。
【００６０】
免疫制御剤を発現するマイコバクテリウムベクター
さらに別のアプローチでは、免疫原およびサイトカインをコードする少なくとも１個のＰＮＳを保有するマイコバクテリウムベクターの用途を包含し、それらを用いて、ＰＮＳがコードした免疫原マイコバクテリウムベクターに対する強化宿主応答を惹起する。これとは別に、サイトカインのみをコードするＰＮＳを保有するマイコバクテリウムベクターを構築することもでき、免疫原をコードするＰＮＳを保有する少なくとも１個の他のマイコバクテリウムベクターとそれらを混合し用いて、パートナーであるマイコバクテリウムベクターによって発現されたＰＮＳがコードした免疫原類に対する宿主応答を高めることもできる。
【００６１】
マイコバクテリウムベクターによってコードされた特定のサイトカインは本発明にとって重大というわけではなく、インタロイキン−４（本明細書で“ＩＬ−４”と称する；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ３５２７８３（マウスＩＬ−４）またはＮＭ＿０００５８９（ヒトＩＬ―４））、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１０５５８（マウスＩＬ−５）またはＮＭ＿０００８７９（ヒトＩＬ−５））、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｍ２０５７２（マウスＩＬ−６）またはＭ２９１５０（ヒトＩＬ−６））、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１０５４８（マウスＩＬ−１０）またはＡＦ４１８２７１（ヒトＩＬ−１０））、ＩＬ−１２ｐ４０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００８３５２（マウスＩＬ−１２  ｐ４０）またはＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２  ｐ４０））、ＩＬ−１２ｐ７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００８３５１／ＮＭ＿００８３５２（マウスＩＬ−１２  ｐ３５／４０）またはＡＦ０９３０６５／ＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２  ｐ３５／４０））、ＴＧＦβ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１１５７７（マウスＴＧＦβ１）またはＭ６０３１６（ヒトＴＧＦβ１））、およびＴＮＦα  ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ０２６１１（マウスＴＮＦα）またはＭ２６３３１（ヒトＴＮＦα））を含むが、それらに限定されない。
【００６２】
ＢＣＧゲノム中へＰｆｏ遺伝子をコードする遺伝子を導入するために用いた具体的方法は、本発明の重大な特性というわけではなく、当業者に周知の方法から選択することもできる（Ｐａｒｉｓｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５：３４９７−３５０３；１９９９）。好適な方法では、Ｐｆｏ遺伝子をｕｒｅＣ座に対して標的化し、それによって、後者遺伝子の不活性化を起こし、修飾株選択のためのマーカーを新たに作製することを含む（Ｏａｄｒｉほか、Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏ．２０（６）、１１９８−１１９９；１９８４）。これを達成するため、下記の実施例の章で説明したプラスミドのような合成対立遺伝子交換プラスミドを修飾して、ｕｒｅＣ遺伝子の５−プライムおよび３−プライム末端に隣接する１ｋｂの配列類を運搬させることができる（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ＃Ｍｂ１８８１）。ＰｆｏＡ遺伝子（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ＃ＣＰＥ０１６３）を次に、Ａｇ８５Ｂプロモータの制御下に前記の隣接配列の間に挿入する。ＰｆｏＡタンパク質を分泌させるため、Ａｇ８５Ｂリーダーペプチド配列を天然のＰｆｏＡシグナル配列の代わりに用いて、組換えＢＣＧ株類から確実に効率的に分泌されるようにする。
【００６３】
対立遺伝子交換プラスミド類を標的ＢＣＧ株類中に導入する方法は、本発明の重大な特徴というわけではなく、マイコバクテリウムのための標準的エレクトロポレーションプロトコールによって達成できる。同様に、対立遺伝子交換に影響を及ぼしかつＰｆｏ対立遺伝子をｕｒｅＣ座に導入する方法は、本発明の重大な特徴というわけではなく、当業者に周知の方法から選択できる。図１に示したもののような自殺ベクターは好適な方法を提供するが、このプラスミドが、２個の抗生物質選択マーカー類を含み従って自然発生抗生物質耐性変異体選択を模倣するからである。対立遺伝子交換の間に、ＰｆｏＡ遺伝子セグメントが、左および右隣接配列類の相同組換えの結果としてｕｒｅＣ遺伝子に置き換わり、それによってＰｆｏＡの安定な染色体組み込みと発現が結果として生じる。このアプローチの利点は、最終産物維持に抗生物質を全く必要としないことであり、および最終株中に抗生物質耐性遺伝子型すなわち表現型が全く存在しない。このことが、ヒトでの使用のための製品にとって好適な態様である（それらは、”抗生物質非含有”である）。ＵｒｅＣ陰性表現型は、対立遺伝子交換を受けＰｆｏＡでｕｒｅＣを置き換えた株類をマークするだろうが、そのことは、ＵｒｅＣ陽性表現型もまた、ある適用では使用可能であることを示す。
【００６４】
本発明において、ＢＣＧにおけるｐｆｏＡの位置はｕｒｅＣに限定されない。他の位置にはプラスミド中に組み込まれたｐｆｏＡ、および染色体上のａｔｔＢ部位が含まれるが、それらに限定されない。当業者は、ｐｆｏＡ組み込みおよび発現のための潜在的部位である他の染色体位置をわかるだろう。
【００６５】
本発明はまた、結核に対して免疫応答を惹起する際の用途のためのワクチン調製物類を提供する。このワクチン調製物類は、本明細書で述べたとおり少なくとも１種のｒＢＣＧ株と薬理学的に適切な担体を含む。ワクチンとしての用途のためのこのような組成物類の調製は当業者に周知である。通常は、このような組成物類は、液状溶液類または懸濁液類のいずれかとして調製するが、錠剤、丸剤、粉剤等のような固体形状もまた、検討される。液体中の溶液または懸濁液に適した固体形状も、また、投与前に調製することができる。前記調製物は、また、乳化することもできる。活性成分類を、薬理学的に許容できかつ活性成分類と両立できる賦形剤類と混合することもできる。適切な賦形剤類は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、ラフィノース、グリセロール、エタノール等またはそれらの配合物類である。さらに、前記組成物は、湿潤剤または懸濁化剤、ｐＨ緩衝剤等のような助剤も少量、含むことができる。さらに、前記組成物は、他のアジュバント類も含むことができる。
【００６６】
前記組成物の経口形態を投与することを望むならば、さまざまな粘稠剤類、芳香剤類、希釈剤類、懸濁化剤類、分散剤類または結合剤類等を添加することもできる。本発明の組成物は、投与に適した形状で前記組成物を提供するため、任意のこのような付加的成分類をも含むことができる。前記製剤類におけるｒＢＣＧ菌の最終量は、変えることができる。しかし、一般的に、前記製剤類における量は、１−９９％であろう。本発明のワクチン調製物類はさらに、アジュバントを含むことができ、その適切な例は、セピック（Ｓｅｐｐｉｃ），クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ），アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）等を含むが、それらに限定されない。さらに、本発明のワクチン調製物類は、単一タイプのｒＢＣＧを含むこともできる。これとは別に、２種以上のｒＢＣＧをワクチンで利用することもできる。
【００６７】
本発明はさらに、結核に対する免疫応答を惹起する方法類および結核に対して哺乳類をワクチン接種する方法類を提供する。免疫応答を惹起するとは、本発明のワクチン調製物を投与することが（１乃至１×１０６、好適には１×１０３、さらに好適には約１×１０３から約１×１０６の範囲にあり、最も好適には１×１０６を超える力価の）特異的抗体類の合成および／または細胞増殖を引き起こすことを意味しており、それは、例えば、３Ｈチミジン取り込みによって測定する。前記方法では、本発明のｒＢＣＧ株を薬理学的に許容できる担体中に含む組成物を哺乳類に投与することを含む。本発明のワクチン調製物類は、当業者に周知の多くの適切な手段のいずれかによって投与することができ、それらには、注射によって、経口投与、鼻腔投与、このｒＢＣＧを含む食製品の摂取によって等が含まれるがそれらに限定されない。好適な態様においては、投与様式は、皮下または筋肉内である。
【００６８】
［実施例］
下記の実施例は、本発明のさまざまな面を例示するためとみなすべきであり、本発明の実施に関して限定することを意図していない。当業者は、これらとは別の材料類、条件類、および操作に変化させることもでき、それら変形が、本明細書の教示として本発明の概括的範囲から逸脱することなく可能であることを認識するであろう。
【００６９】
ＴＢ免疫防御におけるＭＨＣＩクラス制限ＣＤ８＋Ｔ細胞の重要な役割が明らかになっている（Ｆｌｙｎｎほか、同上、１９９２）。ＣＤ８Ｔ細胞応答を改善しようとして、組換えｒＢＣＧ株を遺伝子工学的に処理し、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのリステリオライシンを発現させた。しかし、この組換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）はエンドソームエスケープのための高い能力を示すことができなかったので、例えば、ＭＨＣＩクラス制限ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答誘導を高めない。検討してみると、前記株はエンドソームから１％未満のエスケープしか示していない。このことは、リステリオライシンの活性がｐＨに対して極めて高い感受性を備え、従って、この酵素がエンドソーム内部において前記ｐＨで活性でないようであるので、驚くべきことではない。この欠点にもかかわらず、この組換え株の防御および安全性は、両者ともに顕著に改善された。この観察に基づき、我々は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＰｆｏＡＧ１３７ＱをＢＣＧ染色体に導入することによって、新しいｒＢＣＧ株を構築した。ＰｆｏＡＧ１３７Ｑは、１３７位においてＧからＱへのアミノ酸１個の変化を有している。このアミノ酸１個の変化の結果、哺乳類細胞において野生型ＰｆｏＡの毒性が失われることになり、しかし、酵素は、そのエンドソーム溶解機能を保持したままである。結果として生成した株は、マウスモデルで安全かつ免疫性であることが明らかとなった。
【００７０】
材料類および方法類：全般
下記の章で述べた各実験のため、制限エンドヌクレアーゼ類（本文で、“ＲＥｓ”）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびＴａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造業者の指示に従い用いた；プラスミドＤＮＡは、小型（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）または大型（Ｑｉａｇｅｎ  ＭａｘｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）プラスミドＤＮＡ精製キット類を製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従い用いて、調製した；ヌクレアーゼを含まない分子生物学等級のｍｉｌｌｉ−Ｑ水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＭｇＣｌ２，１００％（ｖ／ｖ）エタノール、超純粋アガロース、およびアガロースゲル電気泳動緩衝液は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから購入した。ＲＥ消化、ＰＣＲｓ、ＤＮＡ連結反応およびアガロースゲル電気泳動は、周知の操作に従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１，２，３；１９８９）；（Ｓｔｒａｕｓほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、Ｍａｒ；８７（５）：１８８９−９３；１９９０）。下記の章で述べる各組換えプラスミドのＤＮＡ配列を検証するためのヌクレオチド配列決定は、従来の自動化ＤＮＡ配列決定法によりＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｓｙｓｔｅｍｓ自動化シークエンサー、モデル３７３Ａを用いて完了した。
【００７１】
ＰＣＲプライマー類は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの市販業者から購入するかまたはＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡシンセサイザー（モデル３７３Ａ）を用いて合成した。ＰＣＲプライマー類は、濃度１５０−２５０μＭで使用し、ＰＣＲ反応のためのアニーリング温度は、Ｃｌｏｎｅ  マネジャーソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて決定した。ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、モデル４００８８０（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で行った。増幅のためのＰＣＲプライマー類は、Ｃｌｏｎｅ  ＭａｎａｇｅｒＲソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて、作製した。このソフトウェアは、ＰＣＲプライマー類の設計ができ、操作しようとしている具体的ＤＮＡ断片類と両立できるＲＥ部位を同定する。ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ、モデル４００８８０（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などのサーモサイクラー中で行い、ＰＣＲにおけるプライマーアニーリング、伸長および変性は、標準操作に従って設定した（Ｓｔｒａｕｓほか、同上１９９０）。ＲＥ消化およびＰＣＲは、標準操作を用いてアガロースゲル電気泳動によって、その後分析した（Ｓｔｒａｕｓほか、同上１９９０；およびＳａｍｂｒｏｏｋほか、同上１９８９）。陽性クローンは、適切なＲＥパターンおよび／またはＰＣＲパターンを示すものと定義する。この操作により同定したプラスミド類は、さらに、上に述べたとおり標準的ＤＮＡ配列決定操作を用いて評価した。
【００７２】
ＤＨ５αおよびＳａｂｌｅ２Ｒなどの大腸菌株類は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入し、下記の実施例に述べた組み換えプラスミド類の最初の宿主として作用させる。組み換えプラスミド類は、ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）などの高電圧電気パルス装置を周知のとおり（Ｓｔｒａｕｓほか、同上、１９９０）１００−２００Ω、１５−２５μＦおよび１．０−２．５ｋＶに設定し、これを用いるエレクロポレーションにより大腸菌株類中に導入する。最適エレクトロポレーション条件は、最大形質転換速度／ＤＮＡ  ｍｅｇ／菌をもたらす設定を定めることによって、同定する。
【００７３】
菌株類は、トリプチックソーイ寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）またはトリプチックソーイ培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）で増殖させ、製造業者の指示に従い、調製する。特に断りがなければ、全ての菌は、静かに攪拌しながら５％ＣＯ２（ｖ／ｖ）中３７℃で増殖させる。適している場合には、前記培地に抗生物質類（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加する。菌株類は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有（Ｄｉｆｃｏ）中におよそ１０９コロニー形成単位（本文で“ｃｆｕ”と称する）／ｍｌで懸濁させ、‐８０℃で保存する。
【００７４】
ＢＣＧにおける対立遺伝子交換
先行技術では、マイコバクテリウム株類に改変対立遺伝子類を導入する方法を教示しており、当業者は、このような方法を理解しかつ実行できるだろう（Ｐａｒｉｓｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１９６９−１９７５；２０００）。対立遺伝子交換プラスミドを調製するための新しい方法では、合成ＤＮＡを用いることを含む。この手法の利点はといえば、調製プラスミドが極めて明らかな調製の経緯を有しており政府規制に沿ったコンプライアンスを有していることであろう。一方これまでに用いられてきた方法は効果的ではあるが、ラボでの培養記録記載は満足のいくものではなく、したがって米連邦規則に適合しているとはいえないであろう。上記規制へのコンプライアンスは、もしヒトでの使用のために製品のライセンスを米国および欧州政府当局から取得しようとするならば、必須である。
【００７５】
マイコバクテリウムにおける対立遺伝子交換のための自殺ベクターは、大腸菌で置き換わる能力を有しているがＭ．ｔｂのようなマイコバクテリウム種およびＢＣＧにおいて複製できないプラスミドである。本発明における対立遺伝子交換操作における用途のための特異的自殺ベクターは、学界（Ｐａｒｉｓｈほか、同上、２０００）および市販業者から取得できるものから選択できる。対立遺伝子交換のための自殺プラスミドの好適な設計を図１に示した。このプラスミドは、下記のＤＮＡセグメントから構成されている：大腸菌中での複製のためのプラスミド用ｏｒｉＥ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号＃Ｌ０９１３７）、大腸菌およびマイコバクテリウム両者における選択のためのカナマイシン耐性配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号  ＃ＡＡＭ９７３４５）、および追加の抗生物質選択マーカー（例  マイコバクテリウムプロモータ（例  ｈｓｐ６０プロモータ）の制御下にあるだろうゼオシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号＃ＡＡＵ０６６１０））。第二の抗生物質選択マーカーは必須というわけではないが、対立遺伝子交換プロセスにおいて自然発生カナマイシン耐性単離物の過剰増殖を防止するための二重選択を可能とするために含ませる。
【００７６】
このような自殺ベクター類の構築は、本明細書に述べたような標準的組み換えＤＮＡ手法を用いて、行うことができる。しかし、現在の規制基準（例えば、米連邦規則）では、ＢＳＥ感染物を含むウシ製品に暴露したものから得たプリオン粒子を導入してしまうという恐ろしい問題が生じている。したがって、物質（例  ＤＮＡ配列類）を起源が不明の標的株に導入してしまうのを避けるため、自殺ベクター中の全てのＤＮＡが市販業者（例  Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社）により合成されることが望ましい。したがって、自殺ベクターを構築するための好適な方法は、ＤＮＡソフトウェア（例  Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いてＤＮＡ配列計画を立て、その後、サービスの都度随時費用が発生する方式でこのようなサービスを行う商業的業者（例  Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社）によりＤＮＡを合成してもらうことである。この方法を用いて、下記の実施例で用いた自殺ベクターを設計作製した。
【００７７】
上に述べた構造の自殺ベクター（図１）は２種の抗生物質選択マーカー類を含み従って１種の抗生物質に耐性を示す自然発生変異体選択を最小とするなどの利点を有している。こうした選択は、１世代あたり約１／１０８で起こる。２種の抗生物質に対する自然発生的耐性は非常にまれで、１世代あたり約１／１０１６でしか起こらない。したがって、対立遺伝子交換操作実施に用いた培養物中における二重耐性株の発生確率は、１／１０６未満である。
【００７８】
対立遺伝子交換プロセス時における陰性選択のため、ショ糖感受性表現型を付与するｓａｃＢ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス＃ＮＴ０１ＢＳ４３５４）を含ませ、最終ＤＮＡ組み換え段階を受けた株類の培養物を濃厚にし、対立遺伝子交換を完了した。
【００７９】
マイコバクテリウムの培養
選択したＢＣＧ株類は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９またはＳａｕｌｔｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍのような液体培地中で好適には３７℃において培養する。前記株類は、静止または攪拌培養物として維持できる。さらに、ＢＣＧの増殖速度は、オレイン酸添加（０．０６％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  カタログ番号０１２５７）およびＴｙｌｏｘａｐｏｌのような界面活性剤類の添加（０．０５％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号７０４００）によって高めることができる。ＢＣＧ培養物の純度は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと称する）中で系列希釈（例えば、原液〜１０−８の１０段階）したＢＣＧ培養物のアリコット１００ｍｃｌを、２５−３０ｍｌのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０のような固体培地を含む３．５インチのプレート上に均等に塗擦することによって、評価できる。さらに、前記培養物の純度は、チオグリケート培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ、カタログ番号１８９１）およびダイズ−カシン培地（ＢＤ、カタログ番号２１１７６８）などの市販培地を用いて、評価できる。
【００８０】
ＢＣＧ種ロットは、密度０．１−２×１０７ｃｆｕ／ｍｌで−８０℃で保存する。通常は、前記液体培養物を、無菌対照に対して光学密度（６００ｎｍ）０．２−４．０で採取する；培養物を適当な大きさの遠心管中に入れ、菌を８、０００×ｇで５−１０分間遠心する。上清を捨て、菌を１０−３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９保存溶液中に再度、密度０．１−２×１０７ｃｆｕ／ｍｌで懸濁させる。これらの懸濁液を、アリコット１ｍｌとして無菌の１．５ｍｌボロンシリケートフリーザーバイアルに入れ、−８０℃で置いておく。
【実施例１】
【００８１】
エンドソームエスケープ可能なｒＢＣＧ−ＰｆｏＡ株類の構築
エンドソームエスケープ可能なｒＢＣＧ−ＰｆｏＡ株類の構築は、ｕｒｅＣ遺伝子の隣接領域の対立遺伝子交換によって実施した。結果として、ＰｆｏＡ遺伝子セグメントはｕｒｅＣ遺伝子に置き換わり、ＰｆｏＡの安定な染色体発現が可能となった。具体的詳細は下記に述べる。
【００８２】
対立遺伝子交換プラスミドの構築
対立遺伝子交換プラスミドは、下記のＤＮＡセグメント類から構成されている：大腸菌中でプラスミドが複製するためのｏｒｉＥ配列、大腸菌およびマイコバクテリウムの両者において選択するためのカナマイシン耐性遺伝子、およびＨｓｐ６０プロモータによって発現される付加的抗生物質選択マーカー（ゼオシン耐性遺伝子）。第２のマーカーを用いて二重選択を行い、従って、このプロセスにおいてカナマイシン自然耐性を防止する。対立遺伝子交換プロセスにおいて陰性選択のため、ショ糖感受性遺伝子を用いた。最後に、標的ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株のためのｕｒｅＣ遺伝子の１ｋｂ左および右隣接配列類を、ＰｆｏＡ遺伝子とともにその間に含めた。ＰｆｏＡ遺伝子は、Ａｇ８５Ｂプロモータの制御下に発現する。Ａｇ８５Ｂリーダーペプチド配列をＰｆｏＡオリジナル分泌シグナル配列の代わりにＰｆｏＡ分泌のために用いた。最後に、これらの成分類全てを、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）により合成し組み立てた。生成したプラスミドはマイコバクテリウム自殺ベクターで、得られたプラスミドについてそのマップを図１に示した。生成したプラスミド構築体を、図５で示したものであると確認した。
【００８３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株中への対立遺伝子交換プラスミド導入
対立遺伝子交換プロセスを図４に概略示し、本操作の主要段階を概略示している。それらの段階について、詳細に説明する。
【００８４】
ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１は、１０％ＯＡＤＣ（オレイン酸―アルブミン−デキストロース−カタラーゼ）（ＢＤ  Ｇｉｂｃｏ）および０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ）を添加した７Ｈ９培地で培養した。培養物がｌｏｇ相に到達した時、菌を採取しエレクトロポレーションについて先に述べたと同じく調製した（Ｓｕｎら、２００４）。対立遺伝子交換プラスミド５μｇを、標準的方法を用いて、調製したばかりのエレクトロコンピタント細胞中に導入した。
【００８５】
上記で構築した対立遺伝子交換プラスミドを、マイコバクテリウムのための標準的マイコバクテリウムエレクトロポレーションプロトコールによってＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株に導入した。エレクトロポレーション後、細胞を、１０％ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌを添加した７Ｈ９培地中で一晩培養した。次に細胞を、カナマイシンおよびゼオシンを両者ともに５０μｇ／ｍｌで含む７Ｈ１０プレート上に接種した。生成したコロニーを摘み上げ、１０％（ｖ／ｖ）ショ糖を含む７Ｈ９培地中で培養した。得られた培養物を、クローニング用７Ｈ１０プレート上に接種し、それぞれのコロニーを得て、それらは、ｕｒｅＣの代わりにＰｆｏＡ遺伝子の存在について同定識別した。この操作の主要段階を概説したフローチャートを、図４に示し、表１は、自殺ベクターｐＡＦ１０２を説明し、それも同様に図１に示してある。
【００８６】
【表１】
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【００８７】
実施例１は、マイコバクテリウムＢＣＧ株を遺伝子工学処理して、中性ｐＨで活性の選択したエンドソーム溶解性タンパク質を発現させ、エンドソームから細胞の細胞質へのマイコバクテリウムのエスケープを可能としたことを示している。
【実施例２】
【００８８】
ｒＢＣＧ−ＰｆｏＡ株の証明
実施例２のための材料類および方法類
マイコバクテリウムの培養
下記の実験のため、ＢＣＧ株類を、１０％ＯＡＤＣ添加Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中３７℃で培養した。Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ（０．０５％ｖ／ｖ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，カタログ番号７０４００）を用いて、菌を分散させた。増殖を異なる株間で比較する実験において、接種後異なる時点で光学密度（６００ｎｍ）を測定した。カナマイシンに対する感受性を試験するため、培養物を調製し増殖を上記のように測定したが、ただし、カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌで添加した。固体培地を用いて菌を培養する時、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。適切である時には、カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌで添加し、ショ糖を最終濃度３％で添加した。
【００８９】
ウレアーゼ活性試験
実施例１に述べたショ糖プレートから生成したコロニーを最初に、ウレアーゼ活性欠損について、ウレアーゼ試験キット（ＢＤ  Ｄｉｆｉｃｏ）を用いて製造業者の指示に従いスクリーニングした。簡単に述べると、１ループの菌を透明試験管中の製造業者供給試験緩衝液中に再懸濁させた。ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株をウレアーゼ陽性コントロールとして用いた。緩衝液単独は、陰性コントロールとして用いた。反応混合物を室温で３０分間、インキュベーションし、結果を、製造業者の指示に従い判定した。
【００９０】
ΔｕｒｅＣ：ｐｆｏＡを保有するｒＢＣＧ株類の遺伝子型の分析
フォワードプライマー〔ａｃｇｇｃｔａｃｃｇｔｃｔｇｇａｃａｔ〕（配列番号４）およびリバースプライマー〔ｃｇａｔｇｇｃｔｔｃｔｔｃｇａｔｇｃ〕（配列番号５）によるＰＣＲを行い、Ｐｆｏ特異的挿入対立遺伝子のＤＮＡ配列とｕｒｅＣ遺伝子に隣接するＢＣＧゲノムＤＮＡ配列類を増幅した。ＰＣＲパラメータは下記のようであった：段階１：９５℃で４分間を１サイクル；段階２：９５℃で１分間、６０℃で１分間、およびその後７２℃で１分間を総計３０サイクル；段階３：７２℃で１０分間を１サイクル；段階４：４℃で保存。生成したＰＣＲ生成物はアガロースゲル電気泳動で分析し、自動化ジデオキシヌクレオチド配列決定法により配列を決定し、ｕｒｅＣ遺伝子の代わり全長ＰｆｏＡ遺伝子の存在（すなわち、ΔｕｒｅＣ：：ＰｆｏＡ）を確認した。
【００９１】
マクロファージ中におけるＡＦＶ１０２の増殖
ｒＢＣＧ  ＡＦＶ１０２株のインサイチュにおける増殖を、感染マクロファージ中におけるマイコバクテリウムコロニー形成単位（ＣＦＵ）を定量することによって、Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ様細胞中で試験した。マイコバクテリウム貪食の効果は、Ｊ７７４Ａ．１細胞の感染３時間後、細胞内ＣＦＵを試験することによって、決定した。その後の長期細胞内生存は、先行文献にも説明されているとおり（Ｓｕｎほか、２００４）ＰＢＳで５回洗浄後、細胞を溶解させ細胞内菌を放出させ、ＣＦＵを計数することによって実行した。
【００９２】
ＡＦＶ１０２による発現Ｐｆｏの溶血活性の分析
ＡＦＶ１０２によるＰｆｏＡの分泌を評価するため、本株を上記のように、対数相中期になるまで増殖させた。次に、培養上清と菌を採取した。ＡＦＶ１０２菌ペレットを、９６ウェルのＶ底プレート中０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．０）１００μｌ中に再懸濁させた。ＰｆｏＡタンパク質が培養上清に分泌されたかどうかを試験するため、液体培養物を回転して落とし、この上清を試験に用いた。発現ＰｆｏＡをそのｐＨ非依存性溶血活性について試験するため、サンプルを上記のように調製したが、ただし、反応緩衝液として異なるｐＨ値のＰＢＳ緩衝液を用いた。１％洗浄ヒツジ赤血球１００μｌを各ウェルに添加した。反応物をゆっくりと混合し、３７℃で１時間、攪拌しながらインキュベーションした。ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株の菌を、溶血陰性コントロールとして用いた。ヘモライシン活性が公知単位となっているα−ヘモライシン（Ｓｉｇｍａ）を、溶血陽性コントロールとして系列希釈して用いた。インキュベーション終了時点で、反応物を５００ｇで１５分間遠心しペレットとし、次に、Ｖ底プレートからの上清を平底９６ウェルプレートの同じ位置に移し、光学密度を測定した（４５０ｎｍの吸光度マイナス５４０ｎｍにおける吸光度）。ＰｆｏＡ分子の溶血活性は、赤血球溶解後の色変化の光学密度を測定することによって、定量した。測定した色の強度は、赤血球溶解量に比例しており、それは、ヘモライシンの量に比例することになる。公知標準を用いることで、サンプルの値を標準曲線で読み取る。溶血単位は、ヒツジ赤血球の５０％が溶解したサンプル希釈度として定義した。
【００９３】
ＡＦＶ１０２のマクロファージに対する細胞毒性：
組換え株のＪ７７４Ａ．１マクロファージ（ＡＴＣＣ番号Ａ  ＴＩＢ−６７）の細胞毒性を、“Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ”キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｇ３５８０）を製造業者の指示に従い用いて、感染細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定することによって、求めた。簡単に述べると、細胞にＡＦＶ１０２菌を感染多重度１０で感染させた。感染後異なる時点で、上清について細胞から放出されたＬＤＨ量を測定し、それを、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株の値と比較した。非感染正常細胞は、陰性コントロールとして用いた。生細胞の百分率は、陰性コントロール細胞（１００％細胞生存）から放出されたＬＤＨ量に対する感染細胞からのそれに基づいて、計算した。
【００９４】
実施例２の結果
ＡＦＶ１０２構築：
ＡＦＶ１０２構築時において、ノックアウトプラスミドとの相同ＤＮＡセグメントの対立遺伝子交換によりその染色体上に全ノックアウトプラスミドを保有している選択メロジプロイド菌を、ショ糖含有Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０プレート上で培養し、最終的な対立遺伝子交換を行い、ｕｒｅＣ遺伝子をＰｆｏＡ発現カセットにより置き換えた。ショ糖プレート上で産生されたコロニーのうち、コロニー１個Ｐｆｏ−１０５−５（ＡＦＶ１０２と再度命名）がウレアーゼ陰性で、このことは、ｕｒｅＣ遺伝子がＰｆｏＡ発現カセットにより置き換えられたことを示唆している。この菌コロニーをさらにＰＣＲにより、ΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型について遺伝子型分析に供した。生成したＰＣＲ反応物を、１．２％アガロースゲル上でゲル電気泳動により分析し、その結果を図６に示した。明らかであろうが、この菌をテンプレートとして用いたＰＣＲにより、予測した大きさのＰＣＲ産物が産生され、それは、親ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株のそれよりも大きい。ΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型についてＤＮＡバンドについて予測した大きさは、２１８０ｂｐｓであり、親ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株についての大きさは、１９６７ｂｐｓである。コロニー１０５−５についてのＰＣＲ産物をさらにゲルで精製し、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）の市販配列決定機器で配列を決定した。配列決定結果は、このコロニーが予測したΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型を有していることを明らかに示した。さらに、ＡＦＶ１０２株由来のカナマイシン遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を増幅することを目的としたＰＣＲは、いかなるＰＣＲ産物も産生できなかった（データを示さず）。これらの知見は、ＡＦＶ１０２が最終的対立遺伝子交換段階を受けたこと、そして所望のΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型を有していることを示唆している。
【００９５】
ＡＦＶ１０２についての増殖特性解析とカナマイシン感受性：
ウレアーゼ活性試験と遺伝子型決定結果に基づき、クローン１０５−５（ＡＶ１０２と再度命名）が、予測した表現型と所望のΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型を示した。ＡＦＶ１０２をさらに、親ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株と比較して７Ｈ９増殖培地で増殖する能力について試験した。結果を図７に示した。明らかであるように、ＡＦＶ１０２構築体は、７Ｈ９増殖培地中で親株と非常に類似した増殖曲線を有している。さらに、カナマイシン存在下において、ＡＦＶ１０２増殖は、親ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株と同程度に低下し、このことは、予測したとおり、それがカナマイシンに対して同様の感受性を有していることを示唆している。
【００９６】
ＡＦＶ１０２の細胞毒性：
ＰｆｏＡタンパク質における１個のアミノ酸置換（コドン１３７のＧｌｙをコードするｇｇａからのＧｌｎをコードするｃａｇへの置換変異）の結果、哺乳類細胞に対する毒性が消失した。しかしながら、前記タンパク質は、小胞から菌エスケープを媒介する能力を保持したままである（Ｐｏｒｔｎｏｙ同上、１９９６）。ＡＦＶ１０２から発現したタンパク質の毒性は、Ｊ７７４１Ａ細胞にＡＦＶ１０２菌を感染させることによって評価した。感染後異なる時点で非感染正常細胞コントロールと比較すると、ＡＦＶ１０２は、現在使用されているＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１ワクチン株よりも優れた有意な細胞死を起こすことはなかった（図８）。
【００９７】
肺胞マクロファージ細胞株中における生存：
前記構築体がマクロファージ内部で生存できるかどうかを調べるため、対数相中期の培養物を用いて、Ｊ７７４Ａ．１肺胞マクロファージに感染させた。細胞は、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。マイコバクテリウムの細胞内生存を、感染後さまざまな時点で菌をプレート計数し、モニタリングした。図９からわかるように、ＡＦＶ１０２構築体は、親株のそれと同様の持続的表現型を示し、このことは、Ｊ７７４Ａ．１細胞中においてこの構築体の細胞内生存に全く傷害がないことを示している。
【００９８】
ＡＦＶ１０２によるＰｆｏＡタンパク質の分泌：
ＡＦＶ１０２構築体を含む菌によるＰｆｏＡタンパク質の分泌は、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株と比較して溶血活性が増強されているか、菌培養上清を測定することによって、試験した。ＡＦＶ１０２およびＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株両者の培養上清を、同一光学密度で採取し、それらの赤血球溶解能力を比較した。結果を図１０に示した。これまでの報告と同じく、ＢＣＧ培養上清は、増殖時における菌放出代謝物の結果として溶血活性が基準値レベルを示し、それが赤血球溶解を起こすことになるだろう（Ｇｒｏｄｅほか、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１５：２４７２−２４７９；２００５）。対比して、ＡＦＶ１０２培養上清は、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株と比較して有意に高いレベルの溶血活性を示し、それは、培養上清中ＰｆｏＡ分子の分泌と一致していた。さらに、ＰｆｏＡのｐＨ非依存性溶血活性をさらに試験し、ｐＨ５．５と７．０の両者で比較し、結果を図１０に示した。この図から理解されるとおり、ＡＦＶ１０２由来上清は、ｐＨ５．５と７．０の両者で同様の溶血能力を有しており、このことは、ｐｆｏＡタンパク質によって分泌された溶血活性が予測どおりｐＨ非依存性であることを示唆している。
【００９９】
実施例２は、構築株が予測した生物活性を有していること、およびこの株が産生したＰｆｏが分泌されｐＨ非依存性の活性を有していることを示している。
【実施例３】
【０１００】
ｒＢＣＧ−ＰｆｏＡエンドソームエスケープおよび動物免疫試験
マイコバクテリウム病原体の中心的パラダイムは食細胞成熟の停止である。ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＨａｒｔ（１９７１）は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ食細胞がフェリチン標識リソソームと混合しないことを確立し、そのことは、食細胞−リソソーム融合阻害と称されている。ワクチン株Ｍ．ｂｏｖｉｓ（ＢＣＧ）はまた、食細胞コンパートメント中に存在していることが見出され、このコンパートメントは、末端エンドサイトーシスオルガネラから隔離されている（Ｃｌｅｍｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９５；Ｈａｓａｎほか、１９９７；Ｖｉａほか、１９９７）。ＣｌｅｍｅｎｓおよびＨｏｗｉｔｚ（１９９５）は、マイコバクテリウム食細胞が形質膜上のものと同等の密度でトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）を持続的に染色することを見出した。トランスフェリンレセプターは、一般的に、エンドソームから迅速に除去され（半減期ｔ１／２は分単位）、形質膜に再度運ばれる；しかし、マイコバクテリウム食細胞中において、このプロセスが停止し、食細胞がトランスフェリンレセプターを含有するだろう。発明者らがマイコバクテリアを含む食細胞を可視化できたのは、この現象による。食細胞をトランスフェリンレセプターに対する抗体で染色した。同時に、このマイコバクテリアを、食細胞内部にいったん入った後の菌のその後を可視的にモニタリング可能とする蛍光色素により染色した。結果は、ｒＢＣＧ−Ｐｆｏ構築体が細胞感染後、エンドソームエスケープができるようになったことを明らかに示している。
【０１０１】
エンドソームエスケープ試験のための材料および方法：
菌および細胞：ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１およびｒＢＣＧ−ΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡＧ１３７Ｑ（ＡＦＶ１０２）を、１０％（ｖ／ｖ）ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ（を増殖培地に）添加した７Ｈ９培地中でＯＤ６００が約０．８−１．０になるまで増殖させた。感染後、菌体をＰＢＳ中Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５６８スクシンイミジルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で製造業者の指示に従い、室温で１−１．５時間標識した。この色素は、菌表面上のタンパク質に局在する一級アミン類に対して非常に安定なアミド結合を形成する。簡単に述べると、菌培養物１０ｍｌをペレットとし、ＰＢＳ中０．６２５μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５６８  ２５ｍＬ中に再懸濁させ、室温で１−１．５時間インキュベーシンし、菌を標識した。標識した菌体を次にＰＢＳで３回洗浄、７Ｈ９増殖培地中に再懸濁後、冷蔵庫で一晩保存した。Ｊ７７４Ａ．１細胞は、文献既出のとおり（Ｓｕｎほか、２００４）、ヒトフィブロネクチン塗布カバースリップを有する６ウェル細胞培養プレート中ＤＭＥＭ培地中で培養した。細胞を３×１０６細胞／ウェルの密度で塗布し、５％ＣＯ２および湿度を有する３７℃のインキュベーター中で２日間、培養した。感染中標識菌はペレット化し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中に再懸濁させ、各細胞について感染多重度（ＭＯＩ）１０でＪ７７４Ａ．１に直接添加した。２０分、８時間および２４時間後、細胞を室温（ＲＴ）でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）により洗浄した。細胞を次に、ＲＴでＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２％パラホルムアルデヒドで２０分間、固定した。固定細胞を次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でＲＴにおいて１０分間、透析し、次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。ＲＴで少なくとも２時間ブロッキングを行うかまたは４℃でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５％健常ヤギ血清（ＮＧＳ）および０．５％アジ化ナトリウムにより一晩、ブロッキングを行った。ブロッキング緩衝液を除去後、ラット抗マウストラスフェリンレセプター−ＦＩＴＣ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ）を、１％ＢＳＡ，３％ＮＧＳおよび０．５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ（ｐＨ７．２）による１：５０希釈で添加し、その後、ＲＴで少なくとも１時間、インキュベーションした。細胞を次にＰＢＳで２−３回洗浄し、ガラススライド上のヴェクトシールド（ｖｅｃｔｓｈｅｉｌｄ）マウンティングメディアにより載せた。分析は、Ｒｅｔｉｇａ  ＥＸＩ  Ｍｏｎｏを付属させたＮｉｋｏｎ  ＴＥ２０００倒立顕微鏡、１２ビット冷却ＩＲフィルター付きデジタルカメラを用いて、倍率１５００倍でイメージングを行った。
【０１０２】
結果：
顕微鏡で調べると、ＢＣＧおよびｒＢＣＧ−ＰｆｏＡ菌の両者ともに感染１５分後に宿主細胞によって取り入れられたことがわかった。しかし、感染８時間後において、ＢＣＧ菌と対比してｒＢＣＧ−ＰｆｏＡ菌がエンドソーム外部で観察され、それらは、ほとんどが宿主食細胞内部に局在していることがわかった。これらの結果を図１１Ａ−Ｄに概略示したが、それらは、マクロファージの菌侵入（図１１Ａ）、エンドソーム内部におけるＢＣＧの持続（図１１Ｂ）、初期エンドソーム内部におけるＡＦＶ１０２菌（図１１Ｃ）および、組換えＰｆｏＡの分泌によるエンドソームからのＡＦＶ１０２菌の細胞の細胞質へのエスケープ（図１１Ｄ）を示している。菌の計数は、１３８個中１００個（７２％）のＡＦＶ１０２が感染後８時間でエンドソームをエスケープし、一方、１００個中２９個（２６％）のＢＣＧが食細胞をエスケープしたことを示していた。感染サンプル２４時間後において菌を調べ、同様の結果が得られた。この知見は、ＰｆｏＡ発現が、食細胞からのＡＦＶ１０２放出を増加させることを示している。
【０１０３】
さらにこの結果は、ｐＨ感受性色素を用いて上記と同様の実験設定と操作によりエンドソームおよびリソソーム（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ−Ｒｅｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ｃａｔａｌｏｇ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｌ−７５２８）を標識する異なるシステムを用いて、確認した。菌は、波長放出５６８で可視化し、一方、食細胞は、波長放出４８８で可視化した。この結果は、上記観察と矛盾していなかった。
【０１０４】
実施例３は、組換え株ＡＦＶ１０２がエンドソームをエスケープでき、一方、ＢＣＧ株はエンドソームエスケープ効率がはるかに低いことを示している。したがって、株ＡＦＶ１０２は、ＢＣＧよりも組織適合Ｉクラス免疫応答を惹起する可能性が高く、ワクチン適用で有用であろう。
【０１０５】
実施例３のための参考文献
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  Ｊ，Ｈａｒｔ  ＰＤ．１９７１．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｗｉｔｈ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ．（マイコバクテリウム・チューバキュローシスに対する培養マクロファージの応答ならびに食細胞とリソソームの融合についての観察）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３４：７１３−４０．
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｒｒｅｓｔｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｂ７［マイコバクテリウム・チューバキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）食細胞は、Ｒａｂ７取得にもかかわらず、停止成熟を示す］。  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６８（９）：５１５４−６６．Ｈａｓａｎ  Ｚ，Ｓｃｈｌａｘ  Ｃ，Ｋｕｈｎ  Ｌ，Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  Ｉ，Ｙｏｕｎｇ  Ｄ，Ｔｈｏｌｅ  Ｊ，Ｐｉｅｔｅｒｓ  Ｊ．１９９７．
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ；ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ（マイコバクテリウム食細胞の単離と特性解析；エンドソーム／リソソーム経路からの分離）．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２５（２）：４２７  Ｖｉａ  ＬＥ，Ｄｅｒｅｔｉｃ  Ｄ，Ｕｌｍｅｒ  ＲＪ，Ｈｉｂｌｅｒ  ＮＳ，Ｈｕｂｅｒ  ＬＡ，Ｄｅｒｅｔｉｃ  Ｖ．
Ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｔａｇｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｒａｂ５  ａｎｄ  ｒａｂ７（マイコバクテリウム食細胞成熟の停止がｒａｂ５およびｒａｂ７により制御される段階の間の小胞融合ブロックにより引き起こされる）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７．２７２（２０）：１３３２６−３１．
Ｓｕｎ  Ｒ，Ｃｏｎｖｅｒｓｅ  ＰＪ，Ｋｏ  Ｃ，Ｔｙａｇｉ  Ｓ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＮＥ，Ｂｉｓｈａｉ  ＷＲ．２００４．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＥＣＦ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇＣ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｅｔ．（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＥＣＦシグマファクターｓｉｇＣがマウス致死および規定の遺伝子セットの条件付発現のために必要である。）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２（１）：２５−３８
【実施例４】
【０１０６】
処方およびワクチン戦略
ワクチン処方の戦略は、製造プロセス全てにおいて、最大の生存度と安定性を求めるための研究に基づいて、作成する。これには、マイコバクテリウム菌の培養のために一般的に用いられるさまざまな培地を利用した培養時において、最大菌生存度（生きているか死んでいるか）を調べることが含まれ、培養には、グリセロール、糖類、アミノ酸類、および界面活性剤類または塩類の添加を含む。培養後、遠心分離または接線フローろ過により培養細胞を採取した後、凍結または凍結乾燥プロセスにおいて細胞を保護できる安定化培地に再懸濁する。一般的に用いられる安定化剤には、グルタミン酸ナトリウム、またはアミノ酸またはアミノ酸誘導体類、グリセロール、糖類または一般的に使用される塩類が挙げられる。最終処方は、筋肉内、経皮注入、潅流または経口投与により運搬されるだけの十分な生存菌を提供し、それらは、維持のための十分な安定性と市販および使用のための適切な保存期間を有しているだろう。
【０１０７】
ＴＢワクチン類の前臨床評価
一般的安全性試験
１群６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、問題のｒＢＣＧ株（類）および同族の親株類２×１０６ＣＦＵで腹腔内感染させる。感染後１４日間、前記動物を全身健康と体重についてモニタリングする。ＢＣＧおよびｒＢＣＧ株類を投与した動物は健康のままであり、観察期間中体重減少を起こすこともなく、あるいは病気の明らかな症状も示さない。
【０１０８】
免疫能力を有するマウスにおける新規ｒＢＣＧ株類の毒性
ＢＡＬＢ／ｃマウス１５匹を１群とし、これらに静注でそれぞれｒＢＣＧおよびＢＣＧ親株  ２×１０６ＣＦＵを感染させる。感染第１日において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肺および肝臓におけるＣＦＵを分析し、各動物が同等の感染量であるようにする。感染後第４、８、１２および１６週において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肝臓および肺におけるＣＦＵを得て、親ＢＣＧ株と比較してｒＢＣＧ株類のインビボ増殖を評価する。
【０１０９】
免疫妥協マウスにおける厳密な安全試験
各群１０匹としてＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）を有する免疫妥協マウスに、静注でそれぞれｒＢＣＧおよびＢＣＧ親株  ２×１０６ｃｆｕを感染させる。感染後第１日において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肝臓および肺におけるｃｆｕを分析し、接種用量を確認する。各群７匹の残りの動物は、全身状態および体重をモニタリングする。これらのマウスの生存を追跡し、全観察期間において親株感染動物とｒＢＣＧ感染マウスの生存を比較する。
【０１１０】
モルモット安全性試験
ｒＢＣＧ株類の安全性をまた、ヒトにおける十分に確立された安全性を有している親ＢＣＧワクチンと比較しモルモットモデルで評価する。最初に、動物の全般健康状態に及ぼすワクチンの効果を検討するが、それには、体重も含める。モルモットは、組み換えおよび親株類を１０７（ワクチン用量の１００倍）ＣＦＵだけ筋肉注射で免疫し、６週間、全般健康状態と体重をモニタリングする。この６週間という期間の前に死亡した動物については、死後検査も行う。感染後６週間の期間が終わった時点で、動物は全て屠殺し、総合病理検査を行う。この試験中確認すると体重減少および異常行動は全くなく、この６週時剖検において全ての臓器は正常のように見え、ｒＢＣＧ−ＰｆｏＡワクチンについて、全く健康に対する悪影響が見られず、しかも、親株を接種した動物に比較してｒＢＣＧ−ＰｆｏＡワクチン接種動物は、正常速度で動物が体重を増やしている。
【０１１１】
同時に、動物臓器における細菌レベルをモニタリングする。親または組み換えワクチンのいずれかで免疫したモルモットを、接種後さまざまな時点で安楽死させ、その後、肺、脾臓および局所（鼠径部）リンパ節について、ＢＣＧまたはｒＢＣＧのＣＦＵをアッセイする。
【０１１２】
毒性試験
ｒＢＣＧ株類の毒性を評価するため、（各群１２匹の）モルモットを、それぞれ、ヒト用ｒＢＣＧ株類、ＢＣＧ親株または生理食塩水の単回投与量よりも４倍の１回投与量または４分の１の１回投与量で、筋肉内投与によりワクチン接種する。ワクチン後第３日において、動物６匹を屠殺し、これらの動物に及ぼすワクチンの急性効果を評価する。ワクチン後第２８日において、残りの動物６匹を屠殺し、動物に及ぼす慢性効果を評価する。両方の時点で各動物の体重を調べ、全般病理状態と注射部位の様子を調べる。血液を採取し、血液検査を行い、内臓および注射部位の組織病理を調べる。
【０１１３】
マウス防御研究
１群１３匹としたＣ５７Ｂｌ／６マウス（雌性、５−６週齢）を、皮下から１０６ＣＦＵのｒＢＣＧ、親ＢＣＧまたは生理食塩水で免疫する。別のマウス群は、健常対照として使用する。免疫後８週時点で、マウスに対して、Ｍ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株（または、Ｈ３７Ｒｖ  Ｋａｎ耐性株）を総計１０７ＣＦＵ含む１０ｍｌの単細胞懸濁液から作製したエアゾールとして、このチャレンジ株によりチャレンジするが、この量は、文献に既出のとおり（Ｂｒｏｄｉｎほか、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９０（１）：１１５−１２２；２００４）各動物の肺におよそ１００個の生きている菌を伝播する。チャレンジしていない動物とともに、実験動物の生存をモニタリングする。チャレンジ後、体重減少と全般健康状態についても動物をモニタリングする。チャレンジ後第１日において、各群３匹のマウスを屠殺し、肺におけるＣＦＵを調べ、チャレンジ用量を確認し、動物１匹は、脾臓および肺の組織病理検査のために屠殺する。チャレンジ後第５週において、各群の動物９匹を屠殺し、動物の組織病理検査と顕微鏡検査を行う。マウス６匹の肺と脾臓組織を、ＣＦＵ計測のために評価する（選択サプリメントを有するプレートを用いて、チャレンジ株からワクチン株を識別する）。もしＨ３７Ｒｖ−ｋａｎ耐性株でチャレンジするならば、ＫａｎまたはＴＣＨ（チオフェン−２−カルボン酸ヒドラジド）を用いてワクチン株からチャレンジ株を識別する。もしＭ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株をチャレンジに使用するならば、ＴＣＨを用いてチャレンジ株からワクチン株を識別する（ＢＣＧは感受性であるが、Ｍ．ｔｂは本来耐性である）。
【０１１４】
皮膚遅延型過敏症（ＤＴＨ）の誘導
ＳＰＦモルモットを、ｒＢＣＧまたは親ＢＣＧ株１０３により筋肉注射で免疫する。免疫後９週で、動物背部の毛を剃り、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌ中ＰＰＤ（タンパク質精製誘導体）１０μｇを筋肉注射する。２４時間後、硬い硬変部の直径（ＤＴＨ）を測定する。ｒＢＣＧ株は、親ＢＣＧ株類で誘導したものに等しいかそれよりも大きいＤＴＨを誘発する。
【０１１５】
モルモットチャレンジ研究
Ｍ．ｔｂチャレンジに対してのｒＢＣＧワクチン類の有効性を調べるため、各群１２匹のモルモット（若い成熟ＳＰＦハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）、２５０−３００グラム、雄性）を、それぞれ、ｒＢＣＧ、親ＢＣＧ株または生理食塩水で免疫する。ワクチン類および対照は、１０６ｃｆｕを筋肉注射で投与する。免疫後１０週時点で、ｒＢＣＧ免疫動物、ＢＣＧ免疫動物および偽免疫動物に対して、Ｍ．ｔｂを総計１０７ＣＦＵ含む１０ｍｌの単細胞懸濁液から作製したエアゾールでチャレンジする；この操作では、文献に既出のとおり（Ｂｒｏｄｉｎほか、２００４）各動物の肺に約１００個の生きている菌を伝播する。チャレンジ後、ワクチン接種していない未チャレンジの健常群とともに、動物の生存、体重減少および全般健康状態をモニタリングする。各群から６匹のマウスをチャレンジ後第１０週で屠殺し、各群中残りの６匹は、チャレンジ後第７０週で長期評価のため屠殺した。両方の時点において、動物の組織病理検査と顕微鏡検査を行う。肺および脾臓組織を、組織病理検査とＣＦＵ計測のために評価する（選択サプリメントを有するプレートを用いて、チャレンジ株からワクチン株を識別する）。もしＨ３７Ｒｖ−ｋａｎ耐性株でチャレンジするならば、ＫａｎまたはＴＣＨを用いてワクチン株からチャレンジ株を識別する。もしＭ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株をチャレンジに使用するならば、ＴＣＨを用いてチャレンジ株からワクチン株を識別する（ＢＣＧは感受性であるが、Ｍ．ｔｂは本来耐性である）。チャレンジ後偽免疫動物が最も早く死亡し、一方、ｒＢＣＧ免疫動物がＢＣＧ親株免疫動物よりも長く生存すれば、チャレンジ研究が成功したことになる。
【０１１６】
霊長類安全性とチャレンジ研究
さらに最近になって非ヒト霊長類を用いてＭ．ｔｂに対するワクチン接種の評価が行われた。ヒトと非ヒト霊長類の進化上の関係とこれらの種における結核の臨床および病理的表れ方が似ていることにより、ＴＢとワクチン効果についての実験的研究にとってこの非ヒト霊長類モデルが魅力的となっている。
【０１１７】
このモデルは肺空洞形成が進行することを特徴とし、ヒトＴＢに適用できるように思われる。感染と疾病の過程を、Ｘ線および体重減少、ならびに赤沈速度（ＥＳＲ）、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）増殖およびサイトカイン産生、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性、および抗体応答を含むさまざまな血液検査により追跡する。感染後、カニクイザルは特徴的病巣を有する肺病理を示し、チャレンジ用量に応じて急性呼吸器感染による死が、感染後４乃至６ヶ月以内に起こる。低感染用量では、ヒトと非常によく似て慢性感染を起こすが、病状はでない。
【０１１８】
本研究では、組み換えＢＣＧ単独投与またはｒＢＣＧ構築物中に過剰発現される配列類を含むワクチンをその後２回追加接種する投与を、さまざまな用量のＢＣＧ親株投与と直接比較するだろう。後者は、適当なアジュバント処方に基づく組み換えタンパク質、ＤＮＡまたはＡｄ３５構築物類を含むがそれらに限定されない、いくつかの公知手段のいずれかにより運搬される。
【０１１９】
最初の研究では、ブースターを行わず親ＢＣＧ対ｒＢＣＧ構築物類の防御効果を評価する。本研究では１０匹１群とした３群を含むが、各群には、それぞれＢＣＧ，ｒＢＣＧおよび生理食塩水を割り当てた。各群中２匹は、ｒＢＣＧ構築物類中における過剰発現抗原により皮膚試験を行い、さらに、対照として標準的ＰＰＤと生理食塩水で皮膚試験する。ＢＣＧに比較してｒＢＣＧ群における陽性でかつ大きな硬変部は、インビボにおけるワクチン取り込みと免疫応答惹起を示唆する。各群中残りの８匹について、低用量Ｍ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株でエアゾールチャレンジし、防御を、チャレンジ後１６週において菌負荷の減少または終点における生存により、測定する。
【０１２０】
追跡ＢＣＧプライムプロトコールは上記と本質的に同一であるが、ただし、動物を最初にＢＣＧ，ｒＢＣＧおよび生理食塩水でワクチンし、その後、過剰発現抗原で２回、追加接種する。
【０１２１】
非ヒト霊長類モデルにおける免疫原性および防御研究では、ｒＢＣＧ構築物についての有効性を研究するためのアカゲザルにおいて、結核の免疫生物学的側面および免疫病理側面を調べることを目的とするだろう。この動物は、実験開始前に十分に体調を調整し平均体重２乃至３ｋｇの閉じ込めて育てた若年アカゲザル乃至若いが大人のアカゲザルである。接種前研究は、通常の血液検査と赤沈速度ならびにリンパ球増殖アッセイを含む標準血液検査で構成する。皮膚試験はＰＰＤで行い、ツベルクリンに対する感受性がないことを確認し、胸部Ｘ線を感染前プロフィールの一部として得る。免疫期間は総計２１週間とし、０週におけるＢＣＧまたはｒＢＣＧによる最初のワクチン接種、第１２週および第１６週における抗原追加接種を含むであろう。抗原特異的免疫性は、リンパ球刺激試験において増殖およびインタフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を測定することによって評価する。ＩＦＮγ産生リンパ球の出現頻度は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により求める。この目的のため、血液サンプルを最初のワクチン接種後第０、４、８、１２、１６および２０週で採取する。
【０１２２】
最終免疫後第４乃至６週において、同日に同一処方でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｅｒｄｍａｎを３ｍｌ（１，０００ｃｆｕ）、気管内留置によりチャレンジさせる。感染過程は、体重減少、発熱、ＥＳＲ上昇、ＰＰＤに対するＤＴＨ、ＰＰＤ刺激ＰＢＭＣのインビトロ増殖性応答、およびｒＢＣＧ中に過剰発現した抗原類について評価し、その後、ＩＦＮ−ｇ産生レベルを測定する。胸部Ｘ線は、肺ＴＢと一致する異常を検出するために行い、剖検は、チャレンジ後第１２−１６週に行う。
【０１２３】
ＴＢベクターとワクチン類の臨床評価
安全性と毒性試験
規制ガイドラインにより規制されている前臨床安全性および毒性試験を、上記のような前臨床毒性および安全性試験として行う。これらを調べた後、ヒト安全性試験を行う。これらの研究は、健常クアンティフェロン（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ）陰性成人で当初行い、その後、小児および新生児に年齢を低下させて行う。
【０１２４】
免疫原性研究
マウスおよび霊長類における免疫原性研究では、ＩＮＦγのような細胞免疫評価のための標準的手法類、ＥＬＩＳＰＯＴおよび／またはフローサイトメトリを短期および長期抗原またはペプチド刺激とともに用いるが、これらに限定されない。同様の方法論は、ヒト応答を評価するために利用する。テトラマー研究を、ヒトワクチン後のＣＤ４およびＣＤ８応答を評価するために用いる。
【０１２５】
プライム−ブースト戦略の最適化
ｒＢＣＧは、ＴＢまたは関連トランスジーン類を発現するように遺伝子工学的に作製した他の疾患に対する単独ワクチンとしても、良好に作用する。本文でＴＢに対するワクチンとしてまたは他の疾患に対する防御のための抗原類を発現するワクチンとして述べたｒＢＣＧは、また、アジュバントまたはウイルスまたは細菌ベクター抗原類と混合した組み換えタンパク質類による追加免疫のための免疫系をプライムするためにも、非常によく作用する。動物前臨床研究およびヒト前臨床研究の両者において、ＢＣＧプライムとその後の組み換えタンパク質／アジュバントまたはベクターブーストを、投与法および用量の観点から最適化する。これらのプライムブースト戦略は、特に本発明の態様にあるＢＣＧのプライム能力のゆえにヒトにおいて免疫を誘発するためおよびその後組み換えタンパク質またはベクターが免疫系のブースター応答を集束させ増強させるための最も強力な手段である。
【０１２６】
動物における暴露後治療ワクチン研究
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて、潜伏感染を確立し；低用量感染によって無視可能なＭ．ｔｂ特異的免疫性が誘発された時点およびＭ．ｔｂ特異的免疫性がメモリＴ細胞で低下され圧倒される別の時点で、治療用ワクチンをマウスに投与する。その後ワクチン類の治療上の利点が、最終処置用ワクチン投与後２ヶ月および５ヶ月にマウスで、各マウスの肺および脾臓におけるｃｆｕを計数することにより、評価する。このｃｆｕ計数値を、マウス群で標準的統計方法により分析し、その結果を用いて治療的ワクチン接種がマウスにおいて潜伏Ｍ．ｔｂ感染を有意に低下させるかどうかを分析する。同様の方法論を、必要に応じて、他の動物の応答評価のために利用する。
【０１２７】
ＢＣＧベクターの臨床評価：ｒＢＣＧワクチンの経口投与
本発明のｒＢＣＧによる標的動物の経口ワクチン投与はまた、文献に既出の方法類を用いて行うことができる（Ｍｉｌｌｅｒほか、Ｃａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ  １２１（１）：４５−５４；１９７９）。経口投与した本発明ｒＢＣＧの量は、対象の種により、ならびに治療しようとしている疾患または状態に応じて変わる。一般的に、使用した投与量は、生きている菌体約１０３乃至１０１１個であり、好適には生きている菌体約１０５乃至１０９個であろう。
【０１２８】
ｒＢＣＧは一般的に、薬学的に許容できる担体または希釈剤とともに投与する。使用した特定の薬学的に許容できる担体または希釈剤は、本発明にとって重要ではない。希釈剤類の例には、リン酸緩衝生理食塩水、ショ糖を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）単独（Ｌｅｖｉｎｅほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，７９：８８８−９０２；１９８７；およびＢｌａｃｋほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：１２６０−１２６５；１９８７）またはアスコルビン酸、ラクトースおよび適宜アスパルテームを含む重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）（Ｌｅｖｉｎｅほか、Ｌａｎｃｅｔ、ＩＩ：４６７−４７０；１９８８）などの胃内胃酸に対して緩衝するための緩衝液が含まれる。担体の例には、スキムミルク中にあるタンパク質類、ショ糖などの糖類、またはポリビニルピロリドンが含まれる。これらの担体類は、通常は、濃度約０．１−９０％（ｗ／ｖ）で使用するが、好適には範囲１−１０％（ｗ／ｖ）である。
【実施例５】
【０１２９】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける安全性
先にも述べたとおり、ＢＣＧにおけるＬｌｏの発現は、エンドソームエスケープ促進において実質的に有効でないことが証明されており、それはおそらく、ＢＣＧが存在する修飾エンドソームというミクロな環境での中性ｐＨでＬｌｏの活性が低いことによるのであろう（Ｈｅｓｓほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９５：５２９９；１９９８；Ｇｒｏｄｅほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５（９）：２４７２；２００５）。にもかかわらず、Ｌｌｏの発現は、エンドソームを十分に修飾し、ＳＣＩＤマウスにおいてＢＣＧ−Ｌｌｏ＋の毒性を低下させた（Ｇｒｏｄｅら、２００５）。この観察は、宿主細胞の細胞質にＢＣＧを再度標的化させることが、この昔からの生ＴＢワクチンの免疫原性と安全性を両方ともに改善する潜在力を有していることを示唆している。本研究の目的は、従って、ＳＣＩＤマウスでＰｆｏＡＧ１３７Ｑを発現するエンドソームエスケープ株ＡＦＶ１０２の安全性を決定することである。
【０１３０】
この目的のため、親株ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株（ＢＣＧ１３３１）およびＢＣＧ１３３１の誘導体でＰｆｏＡＧ１３７Ｑを発現するＡＦＶ１０２株を、（１分当たり１５０回振動させ）攪拌しながら２Ｌのフラスコ中で対数相後期となるまで（５４０ｎｍにおける光学密度６．５−７．５）増殖させた。菌を遠心分離で採取し、生理食塩水＋０．０５％（ｖ／ｖ）タイロキサポル＋１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中−８０℃で、１．５×１０９ｃｆｕ／ｍｌとして保存した。
【０１３１】
接種物は、氷で上記バルクバイアルを融解させエンドトキシン非含有（＜０．０５ＥＵ／ｍｌ）正常生理食塩水（０．８５％ｗ／ｖＮａＣｌ）で系列希釈したセットを調製し、作製した。これらの希釈物を用いて、容量０．１ｍｌとなるように懸濁した表２に示したそれぞれの用量を皮下からＳＣＩＤマウス６匹の群に接種した。
【０１３２】
【表２】
2008521449.tif 000004
【０１３３】
接種後、マウスを、感染後１００日の期間にわたりその生存をモニタリングした。本研究の結果は、ＡＦＶ１０２を接種したマウスが同用量のＢＣＧ１３３１を投与されるマウスよりも長期生存することを明らかにしている。
【０１３４】
ＢＣＧにより惹起された免疫を強化するための非相同ブースターワクチンの使用が、最近注目を集めている。したがって、ＢＣＧをプライムした実験動物およびヒトは、Ｍｔｂ抗原８５Ａ（本文で、“Ａｇ８５Ａ”；Ｒｖ３８０４ｃとしても公知；Ｖｏｒｄｅｍｅｉｅｒほか、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２（３）：４６１；２００４；ＭｃＳｈａｎｅほか、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１０（１１）；１２４０；２００４）をコードする修飾ワクチニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）から構成される非相同ブースト後に印象的な細胞性免疫応答を生じさせ；対比して、何もしていない各動物およびヒトは、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａベクターに対して比較的印象がない応答を生じさせる（ＭｃＳｈａｎｅほか、２００４）。さらに、ＢＣＧでプライムしかつＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ（Ｗｉｌｌｉａｍｓほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７３（６）：３８１４；２００５）またはサブユニットワクチンＭｔｂ７２ｆ（Ｂｒａｎｄｔほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２（１１）：６６２２；２００４）のいずれかでブーストした実験動物が、ＢＣＧ単独でワクチン接種することで得られるものよりもＭｔｂチャレンジに対して高レベルの耐性を示すことを明らかにしたそれぞれの研究があり、このアプローチに対する裏づけを強固にした。これらの研究は防御の相関を明確にしなかったが、非相同プライム−ブーストワクチン接種戦略が、Ｍｔｂに対して防御惹起のための効果的手段を提供することは明らかである。
【０１３５】
これおよび下記の実施例の目標は、従って、プライム−ブーストワクチン化処方でエンドソームエスケープ株ＡＦＶ１０２を評価することである。この実施例における実験の目的は、プライムブースト処方でプライムとしてエンドソームエスケープ株ＡＦＶ１０２を用い、ブーストとしてサイトメガロウイルス初期プロモータ（Ｖｏｇｅｌｓほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（１５）：８２６３−７１；２００３）の制御下にＭｔｂ遺伝子類Ｒｖ３８０４ｃ−Ｒｖ１８８６−Ｒｖ０２８８から構成される融合タンパク質をコードする発現カセットを保有する複製欠失アデノウイルスセロタイプ３５ワクチンベクター（Ｖｏｇｅｌｓほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（１５）：８２６３−７１；２００３；Ｂａｒｏｕｃｈほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（１０）：６２９０；２００４）を用い、このプライム−ブースト処方における間隔を最適化することである。このブーストは、鼻腔内（中）経路で投与するが、その理由は、ＴＢ抗原類を発現するアデノウイルス類は、この経路で従来の非経口投与経路よりも効果がより高いからである（Ｗａｎｇほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（１０）：６３５７；２００４）。
【０１３６】
したがって、プライム−ブースト間隔１４、１８および２１週を評価するため、ＳＰＦ  ｍａｌｅ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモット１０匹（２５０−３００グラム）を表３に示したように免疫する。
【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
前記プライムは、１０％グリセロール０．１ｍｌ中用量１０６ｃｆｕで皮内投与する。コントロールマウスには、１０％グリセロールのみを０．１ｍｌ投与する。プライム１４週後、モルモットにＡｄ３５−ＴＢＳを含むブーストを投与し、１０μｌのＰＢＳに懸濁させた１０９プラーク形成単位の用量（すなわち、Ｖｏｇｅｌｓほか、２００３；Ｂａｒｏｕｃｈら２００４）で鼻腔内に投与する。
【０１３９】
ブースト１４週後、これら動物に対して、総計１０７ｃｆｕのＭｔｂを含む１０ｍｌの単一細胞懸濁液から発生させたエアゾールによりＭｔｂ株Ｅｒｄｍａｎによるエアゾールでチャレンジする；文献に既出のとおり（Ｂｒｏｄｉｎほか、２００４）、この操作で各動物の肺におよそ１００個の生細胞を運搬する。チャレンジ５週後各群の動物を屠殺し、肺および脾臓を採取し組織および微生物分析を行った。後者の例では、モルモット由来肺と脾臓組織について、ｃｆｕを計数するために評価する。Ｍｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株をチャレンジに用いたので、ＴＣＨを培地に添加して、チャレンジ株からＴＣＨに感受性のワクチン株を識別する。
【０１４０】
本研究の結果により、ｒＢＣＧプライムとＡｄ３５−ＴＢＳブーストの間の最適間隔がわかる。
【実施例６】
【０１４１】
免疫チャレンジ
候補ＴＢワクチン株ＡＦＶ１０２のＭｔｂチャレンジに対する能力を測定するため、８匹（若い大人のＳＰＦ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（２５０−３００グラム）による群を表４に示したように免疫する。
【０１４２】
【表４】
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【０１４３】
グループ４および５において、０．１ｍｌの１０％グリセロール中用量１０６ｃｆｕで皮内投与する。グループ１および３において、コントロールマウスに対して、０．１ｍｌの１０％グリセロールのみを皮内投与する。グループ２のコントロールマウスに対しては、１０％グリセロール０．１ｍｌ中ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１を１０６ｃｆｕ、投与する。
【０１４４】
プライム１４週後、モルモットをブーストする。グループ５において、ブーストはＡＦＶ１０２を含み、０．１ｍｌの１０％グリセロール中用量１０６ｃｆｕで皮内投与する。グループ４および６において、ブーストは、Ａｄ３５−ＴＢＳを含み、１０μｌのＰＢＳ中に懸濁させた用量１０９プラーク形成単位（すなわち、Ｖｏｇｅｌｓ、２００３；Ｂａｒｏｕｃｈほか２００４）で皮内投与する。
【０１４５】
最終免疫１４週後、これら動物に対して、総計１０７ｃｆｕのＭｔｂを含む１０ｍｌの単一細胞懸濁液から発生させたエアゾールによりＭｔｂによるエアゾールでチャレンジする；この操作で、文献に既出のとおり各動物の肺におよそ１００個の生細胞を運搬する（Ｂｒｏｄｉｎほか、２００４）。チャレンジ後、動物の生存を、ワクチン非接種未チャレンジ動物の健常群とともにモニタリングする。また、体重減少と全般的健康についても、動物をモニタリングする。
【０１４６】
本研究の結果により、偽免疫動物はチャレンジ後非常に早く死亡するが、ブーストを行わずにＢＣＧ皮内ワクチン接種した動物は、死亡までの中間的平均時間を示し、ＡＦＶ１０２で免疫し鼻腔内にＡｄ３５−ＴＢＳをブーストした動物は、一番長く生きていることが判る。
【実施例７】
【０１４７】
アポトーシス
アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、その誘導と結果という観点からして壊死性細胞死とは大きく異なる。外来性抗原類を含む細胞のアポトーシスは、このような抗原類に対する細胞性免疫の公知の強力な刺激物である。抗原含有細胞のアポトーシスが細胞性免疫につながるプロセスは、クロスプライミングと称されることもある。１，２，３抗原特異的細胞媒介免疫増強を起こすアポトーシス誘導メカニズムにはいくつかある。カスパーゼ８媒介アポトーシスは、抗原特異的細胞性免疫防御につながる。４  エンドソームエスケープを行った組換えＢＣＧによる細胞の細胞質におけるカスパーゼ８の産生は、組換えＢＣＧ発現外来性抗原という文脈において、ＢＣＧに対しておよび組換えＢＣＧにより過剰発現した他の結核抗原類に対してならびに高レベルの抗原特異的細胞免疫につながるＢＣＧそれ自体の抗原類に対して、プログラムされた細胞死を誘導する強力なもうひとつの方法であろう。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＲＡＩＬレセプター２）またはＴＮＦＲ−ＳＦ−１０Ｂ（腫瘍壊死因子−スーパーファミリメンバー１０Ｂ）としても公知のデスレセプター−５（ＤＲ−５）はまた、カスパーゼ８媒介アポトーシスを媒介する。４  レオウイルス誘発アポトーシスは、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５により媒介され、このウイルスがその後クリアランスされることになる。５  組み換えＢＣＧによるＤＲ−５発現は、ｒＢＣＧ発現抗原類に対する抗原特異的細胞性免疫の誘導に対して強力なアジュバント効果を付与する。抗原発現細胞はまた、抗原特異的細胞性免疫応答の誘導に強力な刺激物であるＦａｓ連結を介してアポトーシスを受けるように誘導することができる。６  ＦａｓまたはＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質を発現する組み換えＢＣＧは、アポトーシスおよび抗原特異的細胞性免疫応答を誘発するであろう。
【０１４８】
ｒＢＣＧエンドソームエスケープ株類によるかまたは上記のアポトーシスの付加的増強剤を産生するｒＢＣＧエンドソームエスケープ株類による細胞性免疫の増強は、ＢＣＧ抗原類またはｒＢＣＧによる過剰発現を特異的にコードされた抗原類に限定されず、上記ｒＢＣＧが侵入できる真核細胞のいかなる抗原をも含む。アポトーシスが誘発された腫瘍細胞にこのようなｒＢＣＧが運搬されるならば一例として、重要な腫瘍抗原類に対する細胞性免疫が誘発され、腫瘍および／または転移の消失、低下または予防を伴うであろう。この抗腫瘍効果は、膀胱癌症例でのように局所投与されるとＢＣＧが産生する一般的抗腫瘍効果に付加されるであろう。
【０１４９】
さらに本発明の一つの態様において、エンドソームエスケープを有するｒＢＣＧまたはアポトーシスの特異的伝達物質の産生により増強されたエンドソームエスケープを有するｒＢＣＧは、腫瘍細胞内部または強力な細胞性免疫応答が起こる外来性抗原類をこのようなｒＢＣＧが産生する場所である他の細胞類の内部に運搬し、それらの腫瘍細胞またはこれらの抗原類を含む他の真核細胞類に対して強力な細胞性応答の産生を誘発する。これらの細胞性応答は、免疫媒介腫瘍細胞破壊、さらにクロスプライミングおよび腫瘍細胞または他の重要な抗原類に対する細胞性免疫の誘導にもつながり、腫瘍および／または転移の消失、低下または予防を伴う。このような外来性抗原の例は、宿主細胞ＨＬＡと異なるＨＬＡ抗原で、それに対して、強力な非相同細胞性応答が付与されるであろう。
【０１５０】
エンドソームエスケープを有するｒＢＣＧまたは特異的腫瘍抗原類もまた運搬するアポトーシスの特異的伝達物質の発現により増強されるアポトーシス誘導性のエンドソームエスケープｒＢＣＧは、これらの腫瘍抗原類に対して強力な抗原特異的細胞性応答を誘導し、それらには、これらの抗原類のある寛容性を破壊し、腫瘍および／または転移の消失、低下または予防につながり、腫瘍自体に前記ｒＢＣＧを直接運搬する必要はない。
【０１５１】
ＤＮＡ損傷後のアポトーシスまたはカスパーゼ９は、ある抗原類に対して寛容性を誘発する。寛容性の誘導は、限定されるわけではないが糖尿病、関節リューマチ、クローン病、炎症性腸疾患および多発性硬化症などの自己免疫疾患を制御または予防する際に重要である。限定するわけではないがβ膵細胞、結腸直腸および神経細胞を含む細胞中でエンドソームをエスケープするｒＢＣＧによるカスパーゼ９の産生または他のアポトーシス媒介寛容性誘発タンパク質類の産生は、限定されたアポトーシスをもたらし、それらの細胞中で自己免疫の抗原標的類に対する寛容性をそれが誘導し、それによって、自己免疫疾患状態を処置または予防する。自己免疫反応に関与する特異的抗原類の同定識別により、これらの両方の抗原類およびカスパーゼ９またはアポトーシス媒介寛容性を誘導できる他の分子類のエンドソームエスケープｒＢＣＧ産生を介して、これらの自己免疫標的抗原類に対する寛容性誘導を可能とするであろう。このようなｒＢＣＧは、これらの自己免疫疾患を治療しおよび／または予防するであろう。
【０１５２】
（実施例７の参考文献）
１．Ｈｅａｔｈ，Ｗ．Ｒ．，Ｇ．Ｔ．Ｂｅｌｚ、Ｇ．Ｍ．Ｂｅｈｒｅｎｓ、Ｃ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｐ．Ｆｏｒｅｈａｎ，Ｉ．Ａ．，Ｐａｒｉｓｈ，Ｇ．Ｍ．Ｄａｖｅｙ、Ｎ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｆ．Ｒ．ＣａｒｂｏｎｅおよびＪ．Ａ．Ｖｉｌｌａｎｄａｎｇｏｓ．２００４。Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，  ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  （クロスプレゼンテーション、樹状細胞サブセット類、および細胞性抗原類に対する免疫の発生。）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ  １９９：９．
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３．Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｂ．ＳａｕｔｅｒおよびＮ．Ｂｈａｄｒｄｗａｊ．１９９８．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｑｕｉｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬｓ．（樹状細胞は、アポトーシス細胞から抗原を獲得し、Ｉクラス制限ＣＴＬｓを誘発する。）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６．
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５．Ｃｌａｒｋｅ，Ｐ．、Ｓ．Ｍ．Ｍｅｉｎｔｚｅｒ、Ｓ．Ｇｉｂｓｏｎ、Ｃ．Ｗｉｄｍａｎｎ、Ｔ．Ｐ．Ｇａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｇ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、およびＫ．Ｌ．Ｔｙｌｅｒ。２０００．Ｒｅｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＴＲＡＩＬ．（レオウイルス誘発アポトーシスは、ＴＲＡＩＬにより媒介される。）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８１３５．
６．Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ、Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｙａｎｇ、Ｔ．Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｄ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｔ．Ｄｅｎｔｃｈｅｖ、Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｖ．Ａｙｙａｖｏｏ、およびＤ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ．２０００．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ａｎｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．（工学的に作製したＦａｓ媒介アポトーシスによる樹状細胞を含む抗原提示細胞類に対する標的抗原運搬。）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：９７４．
７．Ｈｕｇｕｅｓ，Ｓ．、Ｅ．Ｍｏｕｇｎｅａｕ、Ｗ．Ｆｅｒｌｉｎ、Ｄ．Ｊｅｓｋｅ、Ｐ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｄ．Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｌ．Ｂｅａｕｄｏｉｎ、Ｄ．Ｓｃｈｒｉｋｅ、Ｍ．Ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ、Ａ．Ｌｅｈｕｅｎ、および  Ｎ．Ｇｌａｉｃｈｅｎｅｎｈａｕｓ．２００２．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｎｌｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ    ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．（ランゲルハンス島抗原類に対する寛容性ならびに膵β細胞の限定的アポトーシスにより誘導された糖尿病の予防）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１６９．
【実施例８】
【０１５３】
エンドソームエスケープ可能なｒＢＣＧ株におけるワクチン抗原類の過剰発現
ｒＢＣＧ株ＡＦＶ１０２中にＴＢ抗原類を過剰発現させるため、Ｒｖ３８０４ｃ（Ａｇ８５Ａとしても公知）、Ｒｖ１８８６（Ａｇ８５Ｂとしても公知）、およびＲｖ０２８８（ＴＢ１０．４としても公知）をコードする配列類に機能的に連結させたＲｖ３０３１プロモータをコードする配列類を、ｐＡＦ１００のＰａｃＩ部位に挿入した。生成したプラスミドｐＡＦ１０５（図１２）をその後、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩにより消化し、Ｅ．ｃｏｌｉレプリコンおよびカナマイシン耐性遺伝子を除去し、Ｔ４リガーゼにより連結により再度環状とした。このＤＮＡ（１−２μｇ）を、エレクトロポレーションによりｒＢＣＧ株ＡＦＶ１０２に導入した。菌は、固体培地（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０）を２５−３０ｍｌ含む８．７５ｃｍのプレート中で培養した。ＰＣＲによるプレスクリーニングにより抗原発現プラスミドを保有しているコロニーを検出した後、ＰｆｏＡ陽性でかつＴＢ抗原発現カセットを含むｒＢＣＧコロニーを選択し、それをＡＦＶ１１２と命名し、３７℃で攪拌液体培地（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９）により５００ｍｌに増量する。培養物が対数相後期に到達したら、グリセロールをこの５００ｍｌの培養物に添加し最終濃度１０％（ｖ／ｖ）とし、プレマスター種を５ｍｌのアリコットとして−８０℃で保存する。
【０１５４】
ＢＣＧおよびｒＢＣＧ培養物の純度は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で系列希釈したＢＣＧ培養物のアリコット１００μｌを、固体培地（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｏｋ  ７Ｈ１０）を２５−３０ｍｌ含む８．７５ｃｍのプレートに均等に塗擦することによって、評価する。プラスミドＤＮＡのＰＣＲおよび制限エンドヌクレアーゼ分析を用いて、所望の遺伝子型が各ｒＢＣＧ単離物中に存在することを確認する。さらに、ＰＣＲ産生ＤＮＡ断片類は、自動化ジデオキシヌクエオチド配列決定法によって配列決定し、全長遺伝子類の存在を確認する。
【０１５５】
ＡＦＶ１０２およびＴＢ抗原発現プラスミドを保有しているＡＦＶ１１２によるＰｆｏＡの分泌を評価するため、両方の株を上記に述べたようにして対数相中期まで増殖させた。これらの培養物の培養上清を採取し、先に述べられているように（Ｈｅｓｓほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：５２９９−３０４；１９９８）、０．２ｍｍの膜フィルターでろ過する。次に、この培養ろ液タンパク質類について、上記に述べたように溶血活性を評価する。結果は、ＡＦＶ１０２およびＡＦＶ１１２が同様の溶血活性を示すことおよびＡＦＶ１１２がΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡＧ１３７Ｑ対立遺伝子を保有しかつ機能的ＰｆｏＡタンパク質を発現することを明らかにした。
【０１５６】
最後に、ＴＢ抗原類の発現を、１０−１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した培養上清タンパク質類で評価する。結果は、Ｒｖ３８０４ｃおよびＲｖ１８８６の発現上昇を示す。Ｒｖ０２８８は培養上清で過剰発現するとは予測していないので、同一ｍＲＮＡでＲｖ３８０４ｃならびにＲｖ１８８６として発現されたこの１０ｋＤａのタンパク質の過剰発現は、Ｒｖ３８０４ｃとＲｖ１８８６が過剰発現されるという観察により推定される。
【０１５７】
全体として眺めると、この実施例は、ＰｆｏＡを発現しかつＴＢ抗原類を過剰発現するｒＢＣＧ株を産生可能であることを実証している。このような株は、第２世代のＴＢワクチンとして作用する潜在力を有している。
【０１５８】
本発明を詳細にその具体的態様を参照して上に述べてきたが、当業者には、本発明の真意と範囲から逸脱することなくさまざまな変更および修飾が可能であることが明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
結核などの病原体に対するワクチン作用を高めたワクチン剤の効率的製造に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】自殺ベクターｐＡＦ１０２のためのマップ。各ＤＮＡセグメントの意味は、次のとおりである：Ｌ−ｆｌａｎｋおよびＲ−ｆｌａｎｋ：それぞれｕｒｅＣ遺伝子の左側および右側の隣接領域である；ｐｆｏＡは、パーフリンゴライシンＯ（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：ＢＡ００００１６）の変異体でアミノ酸１個の置換１３７Ｇ（Ｑ）を有する変異体をコードする遺伝子である；ＬＰＰＡｇ８５Ｂは、抗原８５Ｂ（すなわち、Ｒｖ１８８６ｃ）リーダー配列をコードするＤＮＡ配列である；ＰＡｇ８５Ａは、抗原８５Ａ遺伝子（すなわち、Ｒｖ３８０４ｃ）のプロモータ配列である；ａｐｈは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：Ｘ０６４０２）であり、プラスミドにカナマイシン耐性を付与する；ＯｒｉＥは、ｐＵＣ複製開始点である（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号ＡＹ２３４３３１）；Ｂｌｅは、プラスミドに対してゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性を付与する遺伝子（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号Ｌ３６８５０）である；ＳａｃＢは、レバンシュークラーゼをコードする遺伝子であり（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号Ｙ４８９０４８）、ショ糖に対する感受性を前記菌に付与する；Ｐｈｓｐ６０は、熱ショックタンパク質遺伝子（すなわち、Ｒｖ０４４０）のプロモータ配列である；ＭＣＳは、示した制限酵素類の複数クローニング部位である。２個のＰａｃＩ部位間のカセットが、適用可能な際には、他のエンドソーム溶解性の酵素類遺伝子で置き換えることができることに注意。
【図２Ａ】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来ＰｆｏＡの遺伝子配列（配列番号１）
【図２Ｂ】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来ＰｆｏＡのタンパク質配列（配列番号２）。
【図３】好適な変異体ＰｆｏＡＧ１３７Ｑの遺伝子配列（配列番号３）。
【図４】対立遺伝子交換の主要段階のフローチャート。
【図５】対立遺伝子交換プラスミドｐＡＦ１０２の制限酵素消化。レーン１：１ｋｂ＋ＤＮＡラダー；レーン２：制限酵素ＥｃｏＲＩによって消化したプラスミドｐＡＦ１０２；レーン３：プラスミドｐＡＦ１０２非消化コントロール；レーン４：制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したＰＦＯカセット挿入物を有していないベクタープラスミドｐＡＦ１００。レーン５：ＰＦＯカセット挿入物非消化コントロールを有していないベクタープラスミドｐＡＦ１００。この図から、プラスミドｐＡＦが直線状となり、予測したとおり制限酵素ＥｃｏＲＩにより大きさが４．４ｋｂの単一バンドを生ずることがわかる。プラスミドｐＡＦ１０２は、予測したとおり、制限酵素ＥｃｏＲＩによりそれぞれ、２．３ｋｂと６．０ｋｂの２個のバンドを産生した。
【図６】ΔｕｒｅＣ：：ΩｐｆｏＡ遺伝子型について選択したコロニーのＰＣＲ分析。このＰＣＲは、材料および方法で述べたように実施した。ＰＣＲ産物は、１．２％アガロースゲル中でゲル電気泳動によって分析した。使用したＤＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した１Ｋｂ＋ＤＮＡ標準であった。レーン１−６：コロニー番号１０５−１から１０５−６までのそれぞれのＰＣＲ；レーン７＆８：コロニー番号１４２−７から１４２−１０までのそれぞれのＰＣＲ。レーン９：ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株のＰＣＲ。
【図７】ＡＦＶ１０２の増殖およびカナマイシン感受性。ＡＦＶ１０２、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株およびＰｆｏＡ構築体メロジプロイド（Ｐｆｏ１０５ＭＩ）由来菌を、７Ｈ９増殖培地に接種し、各株の増殖を、異なる時点で６００ｎｍにおける光学密度を測定することによって比較した。カナマイシン感受性試験のため、最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように抗生物質を添加し、増殖を上記のように測定した。図説明中の略語：Ｃｔｒｌ：菌を全く接種しなかったコントロール培地；＋Ｋａｎまたは−Ｋａｎ：培地中にカナマイシンを含むかまたは含まない。
【図８】Ｊ７７４Ａ．１細胞中におけるＡＦＶ１０２の細胞毒性試験。細胞にＡＦＶ１０２またはＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１株のいずれかを感染させた。感染後示した時点で、細胞生存を材料および方法で述べたように測定し、非感染コントロールと比較した。
【図９】マクロファージ中におけるＡＦＶ１０２の生存能力試験。Ｊ７７４Ａ．１単層細胞に、ＡＦＶ１０２またはＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ１３３１を感染させ、感染後示した時点で、細胞内菌を、材料および方法で述べたようにして計数した。
【図１０】ｐＨ非依存性溶血活性を有するＰｆｏタンパク質を分泌する能力について、ＡＦＶ１０２を試験。ＡＦＶ１０２培養物は、先に述べたように調製し、上清の赤血球溶解性をｐＨ７．０と５．５で試験した。溶血活性は、材料および方法で述べたように測定した。
【図１１】実施例３の結果を概略示した。Ａにおいて、菌（黒っぽい楕円形）は細胞（八角形）内マクロファージ（灰色楕円形）に侵入し、初期エンドソーム形成を刺激することを示している；Ｂにおいて、ＢＣＧがエンドソーム成熟を停止し、ＢＣＧが早期エンドソーム内で防御されることを示している；Ｃにおいて、ＰｆｏＡを発現するＡＦＶ１０２菌が侵入後早期エンドソーム内で最初に見られることを示している；しかし、それらは、ＰｆｏＡ分泌を開始し、エンドソームエスケープを始める；Ｄにおいて、ＰｆｏＡ発現ＡＦＶ１０２菌が、エンドソームから出てきて細胞内で遊離されることを示している。
【図１２】抗原過剰発現ベクターｐＡＦ１０５のマップ。ＤＮＡセグメントそれぞれの記号を次に示す：ＰＲｖ３１３０は、抗原Ｒｖ３１３０ｃのプロモータ配列である；ＰＡｇ８５Ｂは、Ｒｖ１８８６ｃのプロモータ配列である。発現カセット中遺伝子類は、Ｒｖ０２８８；Ｒｖ１８８６ｃおよびＲｖ３８０４ｃである；ａｐｈは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：Ｘ０６４０２）であり、それは、前記プラスミドにカナマイシン耐性を付与する；ＯｒｉＥは、ｐＵＣ複製開始点である（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ２３４３３１）；ｌｅｕＤは、３−イソプロピルマレートデハイドラターゼをコードする遺伝子である（すなわち、Ｒｖ２９８７ｃ）；ＯｒｉＭは、マイコバクテリウム中の複製開始点である（Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：Ｍ２３５５７）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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