(57)【要約】  本発明は、腺毛を有する植物において目的のテルペン類を産生させるための方法ならびに目的の前記テルペン類を産生させるのに有用な植物に関する。前記植物は、毛状突起においてそれを特異的に発現させることが可能なプロモーターの制御下で異種テルペンシンターゼをコードする配列を含んでなる。さらに、内因性ジテルペン類を産生するための経路は、好ましくは、異種経路における流動を増加するために、植物の毛状突起において阻止される。異種テルペン類の分泌は自発性であり、容易な回収を生じる。本発明はまた、細菌によって増強された効率の形質転換を示す葉の表面において抗生物質特性を有する化合物の阻止された産生を示す植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腺毛を有する植物において目的のテルペンを産生させるための方法であって、
ａ）毛状突起における発現を可能にするプロモーターの制御下にある、前記目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現カセットを含有する構築物を、前記植物の細胞に導入すること、
ｂ）前記細胞から植物を再構築し、前記テルペンシンターゼを発現するトランスジェニック植物を選択すること、次いで、
ｃ）前記トランスジェニック植物の毛状突起に含有される目的のテルペンを回収すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
テルペンシンターゼの発現が毛状突起特異的プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現カセットが、プロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのエンハンサー配列を含んでなる、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記トランスジェニック植物の毛状突起に含有される目的のテルペンの回収が、毛状突起の滲出物に含有される目的のテルペンを回収することによって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
毛状突起において内因性テルペン類を産生させるために経路を阻止することをさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
内因性テルペン産生経路が、内因性テルペンシンターゼの発現を阻止することによって阻止される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｂ）において選択されるトランスジェニック植物が、内因性テルペンを産生するための経路が毛状突起において阻止されるトランスジェニック植物と交配される、請求項５または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記異種テルペンシンターゼがジテルペンシンターゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ジテルペンシンターゼがタキサジエンシンターゼまたはキャスベンシンターゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種テルペンシンターゼがモノテルペンシンターゼであり、構築物が、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種テルペンシンターゼがセスキテルペンシンターゼであり、構築物は、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種テルペンシンターゼがトリテルペンシンターゼであり、構築物は、毛状突起においてそれらを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、スクアレンシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
植物が、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
植物が、タバコ、好ましくは、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
テルペン修飾酵素をコードする導入遺伝子を前記植物の細胞に導入することをさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
毛状突起における発現を可能にするプロモーターの制御下にある目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含んでなり、内因性テルペン類を産生するための経路が、毛状突起において阻止されることを特徴とする、腺毛を有するトランスジェニック種子または植物。
【請求項１７】
内因性テルペン産生経路が、内因性テルペンシンターゼの発現を阻止することによって阻止される、請求項１６に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項１８】
テルペンシンターゼの発現が毛状突起特異的プロモーターの制御下にある、請求項１６または１７のいずれか一項に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項１９】
前記発現カセットが、プロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのエンハンサー配列を含んでなる、請求項１６または１８のいずれか一項に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項２０】
テルペン修飾酵素をコードする導入遺伝子をさらに含んでなる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項２１】
植物が、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物であることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項２２】
植物がニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属であることを特徴とする、請求項２１に記載のトランスジェニック種子または植物。
【請求項２３】
目的のテルペンを産生させるための請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のトランスジェニック種子または植物の使用。
【請求項２４】
ａ）植物の地上部を収穫すること、ｂ）低極性または非極性型の溶媒において前記地上部をインキュベートすること、次いで、ｃ）溶媒を排除することを含んでなる、植物の毛状突起の滲出物中の異種テルペン類を回収するための方法。
【請求項２５】
植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌と、葉表面で抗菌活性を有する化合物を産生するための経路が阻止される植物の細胞とを接触させることを含んでなる、植物細胞を形質転換するための方法。
【請求項２６】
植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌で前記細胞を形質転換するための、葉表面で抗菌活性を有する化合物を産生するための経路が阻止される植物細胞の使用。
【請求項２７】
以下の工程：ａ）導入遺伝子を含んでなる植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする組換え細菌宿主細胞を得る工程、ｂ）葉表面での抗生物質特性を有する化合物を産生するための経路が阻止される植物を、工程ａ）で得られる組換え細菌宿主細胞による感染によって形質転換する工程、次いで、ｃ）導入遺伝子をそれらのゲノムに組込んでいる植物を選択する工程を含んでなること特徴とする、形質転換された植物を得るための方法。
【請求項２８】
抗菌活性を有する化合物がテルペン、好ましくは、ジテルペンである、請求項２５または２７に記載の方法あるいは請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
抗菌活性を有する化合物がＣＢＴ−ジオールである、請求項２８に記載の方法または使用。
【請求項３０】
葉表面で抗菌活性化合物を産生するための経路が、毛状突起における内因性テルペンシンターゼの発現を阻止することによって阻止される、請求項２８または２９のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３１】
植物が、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物、好ましくは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）由来の植物である、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３２】
植物が、トマト、タバコ、ヒマワリおよびポテトからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法または使用。
【請求項３３】
植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、またはメソルヒゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法または使用。
【請求項３４】
テルペノイド生合成遺伝子の機能を同定するために、内因性ジテルペン類、特に、ＣＢＴ−ジオールを産生するための経路が毛状突起において阻止される植物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において目的の化合物を産生させるための方法および該方法における使用のために調製される遺伝的に改変された植物に関する。本方法はまた、形質転換の増強された効率を可能にする遺伝的に改変された植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
毛状突起は、高等植物の地上部の表面に局在する（非特許文献１においてレビューされた）。それらは多様な形態をとり、主に２つのカテゴリーに分類される。第１は、毛、もしくは非分泌性毛状突起（単細胞性または多細胞性）を含む。それらは外部に物質を分泌しないか、または少なくとも感知されるほどの量を分泌しない。第２のグループは、外部に多様な物質を合成および分泌する増加した能力を有する分泌製として記載のすべての毛状突起または顆粒を含んでなる。いくらかのタイプの分泌性毛状突起がこのカテゴリーにおいて見出される。特に、これらは、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の楯形の毛状突起、例えば（ミント、バジル、ラベンダー、タイムなど）ならびに、とりわけ、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トマト、タバコ、ポテト、トウガラシ、ナスなど）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（ヒマワリなど）およびアサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）（例えば、大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））科において見出される腺毛を含む。
【０００３】
シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）の楯形の毛状突起は、モノテルペン類（例えば、メントール、テルピネオール）のような揮発性分子の産生部位である。それらの構造は、揮発油が蓄積する分泌細胞の先端ペリプラズム膜と壁との間に局在する油嚢によって特徴付けられる（非特許文献２）。精油が放出されるのは、これらの嚢が破壊する場合、例えば、葉が捻じ曲げられる場合である。
【０００４】
分泌性として記載される毛状突起は、好ましくは、セスキテルペン類またはジテルペン類のような周囲温度では低いかもしくは全く揮発性を有さない分子を合成する（非特許文献１）。例えば、培養されたタバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））の腺毛は、その半分を超えるものが、２つのクラス、センブラン系およびラブダン系に属するジテルペン類からなる分泌物を産生する（非特許文献３）。ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）のような野生型タバコのいくつかの種では、センブラノイド類のみ、およびより詳細には、センブラトリエン−ジオール（ＣＢＴ−ジオール）が存在し、葉表面に蓄積する量は、葉乾燥物の約１５％を占める（非特許文献４）。
【０００５】
すべてのジテルペン類は、同じ前駆体基質、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から生じる。ジテルペン類の多様性の原因となるものは、ＧＧＰＰを使用して、オレフィン（環式または非環式）を生成するテルペンシンターゼである。ＧＧＰＰはまた、その中にカロテノイド色素が見出されるテトラテルペン類の前駆体である。ジテルペン類として、植物成長ホルモンであるジベレリン類のような一次代謝の分子、およびこれらの分子の代謝多様性のほとんどの原因となる二次代謝物が挙げられる。一次および二次代謝物の間のこのような区分は、ＧＧＰＰの代謝利用率の厳格な調節を介して生じる。この点において、大量のジテルペン類を蓄積する植物種は、その合成専用に分化した器官、分泌性毛状突起を具備することに留意することが妥当である。タバコおよび特に、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）は、典型的な例であり、ここで、高流量のセンブラノイド合成、および従って、地上部の表面におけるその高い蓄積を確実にするために、毛状突起において豊富なＧＧＰＰプールが存在する。
【０００６】
タバコにおいてＣＢＴ−ジオールの生合成をもたらす工程については、部分的に解明されており、２つの部分に分解され得る：
・いわゆる「ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）」経路（非特許文献５）を介するすべてのジテルペン類の普遍的前駆体、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）の生合成が、葉緑体において生じる。
・ＧＧＰＰからのＣＢＴ−ジオールの生合成。非特許文献６は、以下の生合成経路を提唱している：
ＧＧＰＰ→ＣＢＴ−オール→ＣＢＴ−ジオール。
【０００７】
第１の環化工程は、テルペンシンターゼとして公知の大きなファミリーの酵素由来の酵素によって行われる（非特許文献７）。タバコのジテルペンシンターゼは、ＧＧＰＰを基質として使用して、ＣＢＴ−オールを形成する。ＣＢＴ−ジオールがＣＢＴ−オールから生成される第２の工程は、シトクロムＰ４５０ファミリー由来の酵素によって触媒される水酸化である。ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）教授のグループ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）は、サブトラクティブＰＣＲを使用して、これらの工程のそれぞれについてのニコチアナ・タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）候補遺伝子を同定している：
・テルペンシンターゼをコードする配列に高い相同性を示す配列（ＣＹＣ−２；Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＦ４０１２３４．ＮＩＤ：ＡＹ４９５６９４）、
・シトクロムＰ４５０型酵素をコードする配列（ＣＹＰ７１Ｄ１６，ＮＩＤ：ＡＦ１６６３３２）（非特許文献８、非特許文献６）。
【０００８】
Ｎ．タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）における同時抑制およびＲＮＡ干渉によるこれらの遺伝子の発現のサイレンシングの研究により、（ｉ）ＣＢＴ−ジオールおよびＣＢＴ−オールの減少が、ＣＹＣ−２遺伝子発現の減少と相関したこと、ならびに（ｉｉ）ＣＢＴ−オール蓄積の増加およびＣＢＴ−ジオール形成の減少が、毛状突起におけるＣＹＣ７１Ｄ１６遺伝子発現の減少と相関したことが示されている。これらの研究は、（ｉ）ＣＹＣ−２遺伝子が、ＣＢＴ−オール合成を担うＣＢＴ−オールサイクラーゼをコードすること、および（ｉｉ）ＣＹＰ７１Ｄ１６遺伝子が、ＣＢＴ−オールをＣＢＴ−ジオールに変換するＣＢＴ−オールヒドロキシラーゼをコードすることを示唆している。さらに、ＣＹＣ−２  ｍＲＮＡに極めて類似の遺伝子のゲノム配列が、最近、データベースに寄託されており（ＣＹＣ−１、ＮＩＤ：ＡＹ０４９０９０）、１つではなくいくらかのＣＢＴ−オールサイクラーゼ遺伝子の存在が示唆される。
【０００９】
所定のジテルペノイド類は、特に、薬学的区域において商業的に開発されている。このことは、特に、乳および卵巣癌の処置において使用されるタキサンクラスのジテルペノイド類、パクリタキセルおよびドセタキセルについては、正しい。パクリタキセルは、イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｓｐ．）から抽出される天然の分子である一方、ドセタキセルは、位置からも抽出されるパクリタキセル前駆体、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（または１０−ＤＡＢ  ＩＩＩ）から誘導される半合成分子である。イチイのパクリタキセル生合成遺伝子のほとんどについては、説明されている（非特許文献９；非特許文献１０）。これらの分子は、イチイ抽出物における１０−ＤＡＢ  ＩＩＩおよび具体的に、パクリタキセルの存在量が比較的低いため、ならびに分子構造の複雑さにより、工業的に大規模化することができる合成方法がないため、生成するための費用が高い。
【００１０】
このように、より低い費用で目的のテルペン類を産生させるため、しかしまた、依然としてまだ容易に合成に至ることができないでいるテルペン誘導体を産生させるための方法に対する高い要求が存在する。
【非特許文献１】ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）、ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、シェパード  ＲＷ（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ＲＷ）（２００４年）Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ａｎ  ｏｌｄ  ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ，ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ９３：３−１１
【非特許文献２】ターナー  ＧＷ（Ｔｕｒｎｅｒ  ＧＷ）、ガーシェンゾン  Ｊ（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎ  Ｊ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２０００年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｌｔａｔｅ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１２４：６６５−６８０
【非特許文献３】ヒーマン  Ｖ（Ｈｅｅｍａｎｎ  Ｖ）、ブレーマー  Ｕ（Ｂｒｕｅｍｍｅｒ  Ｕ）、パウルゼン  Ｃ（Ｐａｕｌｓｅｎ  Ｃ）、シーホファー  Ｆ（Ｓｅｅｈｏｆｅｒ  Ｆ）（１９８３年）  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅａｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｕｍ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．２２：１３３−１３５
【非特許文献４】セバーソン  ＲＦ（Ｓｅｖｅｒｓｏｎ  ＲＦ）、ジョンソン  ＡＷ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＡＷ）、ジャクソン  ＤＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＤＭ）（１９８５年）Ｃｕｔｉｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ：ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｍｏｋｅ  ｑｕａｌｉｔｙ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：１０５−１７３
【非特許文献５】ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、１９９６年
【非特許文献６】ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）（２００３年）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｏ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌａｎｔａ  ２１６：６８６−６９１
【非特許文献７】ボールマン  Ｊ（Ｂｏｈｌｍａｎｎ  Ｊ）、マイヤー−ガウエン（Ｍｅｙｅｒ−Ｇａｕｅｎ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（１９９８年）Ｐｌａｎｔ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４１２６−３３
【非特許文献８】ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、ワング  Ｒ（Ｗａｎｇ  Ｒ）、デパラシス  Ｊ（ＤｅＰａｒａｓｉｓ  Ｊ）、ラフリン  ＪＨ（Ｌｏｕｇｈｒｉｎ  ＪＨ）、ガン  Ｓ（Ｇａｎ  Ｓ）、ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）（２００１年）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐ４５０  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ｇｌａｎｄｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ−ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂａｓｅｄ  ａｐｈｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７１−３７４
【非特許文献９】ジェンバイン  Ｓ（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  Ｓ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２００１年）Ｔａｘｏｌ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：１３−９
【非特許文献１０】ジェンバイン  Ｓ（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  Ｓ）、ワイルデュング  ＭＲ（Ｗｉｌｄｕｎｇ  ＭＲ）、チョー  Ｍ（Ｃｈａｕ  Ｍ）、ウォーカー  Ｋ（Ｗａｌｋｅｒ  Ｋ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２００４年）Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔａｘｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｔａｘｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９１４９−９１５４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、腺毛を有する植物において目的のテルペン類を産生させるための新規の方法ならびに前記産生に有用な植物について説明する。前記新規方法は、目的のテルペンの産生を可能にする異種テルペンシンターゼを植物に導入することに基づく。前記異種テルペンシンターゼの発現は、好ましくは、特に、植物の腺毛における発現を可能にするプロモーターによって制御される。収量を増加するためには、植物の毛状突起における内因性ジテルペン類の合成を阻止することが好ましい。
【００１２】
本発明の第１の目的は、
ａ）好ましくは、特に、毛状突起における発現を可能にするプロモーターの制御下にある、前記目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現カセットを含有する構築物を、前記植物の細胞に導入すること、
ｂ）前記細胞から植物を再構築し、前記テルペンシンターゼを発現するトランスジェニック植物を選択すること、次いで、
ｃ）前記トランスジェニック植物の毛状突起に含有される目的のテルペンを回収すること
を含んでなる腺毛を有する植物において目的のテルペンを産生させるための方法に関する。
【００１３】
好ましくは、テルペンシンターゼの発現は、毛状突起特異的プロモーターの制御下にある。
【００１４】
好ましくは、前記トランスジェニック植物の毛状突起における目的のテルペンの回収は、毛状突起滲出物に含有される目的のテルペンを回収することによって行われる。
【００１５】
特に好適な実施態様では、前記発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのエンハンサー配列を含んでなる。特定の実施態様では、エンハンサー配列は配列番号９の配列を含んでなる。
【００１６】
好ましくは、本方法は、毛状突起における内因性ジテルペン産生の経路を阻止することをさらに含んでなる。より詳細には、内因性ジテルペン産生経路は、内因性ジテルペンシンターゼの発現を阻止することによって、阻止することができる。好ましくは、毛状突起における内因性ジテルペン産生経路を阻止することは、ｂ）において選択されるトランスジェニック植物と、内因性ジテルペン産生経路が毛状突起において阻止されるトランスジェニック植物とを交配させることによって行われる。特定の実施態様では、内因性ジテルペンシンターゼの１つは、センブラトリエン−オールシンターゼである。
【００１７】
好適な実施態様では、異種テルペンシンターゼはジテルペンシンターゼである。好ましくは、ジテルペンシンターゼは、タキサジエンシンターゼまたはキャスベンシンターゼである。
【００１８】
別の好適な実施態様では、異種テルペンシンターゼはモノテルペンシンターゼであり、構築物は、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる。あるいは、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列は、第１とは異なる第２の構築物によって担持され得る。
【００１９】
さらなる好適な実施態様では、異種テルペンシンターゼはセスキテルペンシンターゼであり、構築物は、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下で、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる。あるいは、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列は、第１とは異なる第２の構築物によって担持され得る。
【００２０】
なお別の好適な実施態様では、異種テルペンシンターゼはトリテルペンシンターゼであり、構築物は、毛状突起においてそれらを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、スクアレンシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含んでなる。あるいは、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、スクアレンシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、第１とは異なる１つもしくはそれ以上の構築物によって担持され得る。
【００２１】
好適な実施態様では、腺毛を有する植物は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物である。好ましくは、植物はタバコ、およびより詳細には、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）である。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、内因性ジテルペン産生経路が毛状突起において阻止されることを特徴とする、腺毛を有するトランスジェニック植物の植物または種子に関する。より詳細には、内因性ジテルペン産生経路は、内因性ジテルペンシンターゼの発現を阻止することによって、阻止することができる。好ましくは、腺毛を有する植物は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物である。さらにより好ましくは、植物はタバコ、およびより詳細には、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）である。特定の実施態様では、内因性ジテルペンシンターゼは、センブラトリエン−オールシンターゼである。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、それが、好ましくは、特に、毛状突起において、発現を可能にするプロモーターの制御下にある、目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含んでなることを特徴とする、腺毛を有するトランスジェニック種子または植物に関する。好ましくは、テルペンシンターゼの発現は、毛状突起特異的プロモーターの制御下にある。好適な実施態様では、前記発現カセットは、プロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つのエンハンサー配列を含んでなる。好ましくは、内因性ジテルペン類を産生させるための経路は、前記植物の毛状突起において阻止される。より詳細には、内因性ジテルペン産生経路は、内因性ジテルペンシンターゼの発現を阻止することによって、阻止することができる。好ましくは、腺毛を有する植物は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物である。さらにより好ましくは、植物はタバコ、およびより詳細には、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）である。特定の実施態様では、内因性ジテルペンシンターゼは、センブラトリエン−オールシンターゼである。
【００２４】
本発明の第４の態様は、目的のテルペン類を産生させるための本発明に従う植物の使用に関する。
【００２５】
本発明の第５の態様は、ａ）植物の地上部を収穫すること、ｂ）低極性または非極性型の溶媒において前記地上部をインキュベートすること、次いで、ｃ）溶媒を排除することとを含んでなる、植物の毛状突起の滲出物中の異種テルペン類を回収するための方法に関する。
【００２６】
本発明の第６の態様は、植物細胞へのＤＮＡのトランスファーを可能にする細菌による形質転換の増加された効率を示す植物、およびその使用にさらに関する。従って、本発明は、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌で前記細胞を形質転換するために、葉表面における抗菌活性を有する化合物の阻止された産生を示す植物の細胞に関する。本発明はまた、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌と、葉表面で抗菌活性を有する化合物の阻止された産生を示す植物の細胞とを接触させることを含んでなる、植物細胞を形質転換するための方法に関する。本発明は、それが、次の工程：ａ）導入遺伝子を含んでなる植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする組換え細菌宿主細胞を得る工程、ｂ）葉表面での抗生物質特性を有する化合物の阻止された産生を示す植物を、工程ａ）で得られる組換え細菌宿主細胞による感染によって形質転換する工程、ｃ）導入遺伝子をそれらのゲノムに組込んでいる植物を選択する工程、を含んでなることを特徴とする、形質転換された植物を得るための方法にさらに関する。好ましくは、細菌は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、またはメソルヒゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する。好ましくは、植物は、腺毛を有する植物である。好適な実施態様では、腺毛を有する植物は、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物である。好ましくは、それは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）由来であり、タバコ、トマト、ヒマワリおよびポテトの中から選択することができる。好ましくは、抗菌活性を有する化合物は、テルペンおよび特に、ジテルペンである。特に、化合物はＣＢＴ−ジオールである。好ましくは、テルペン類、特に、ＣＢＴ−ジオールのようなジテルペン類の産生を阻止することは、毛状突起における内因性テルペンシンターゼ、特に、センブラトリエン−オールシンターゼの発現を阻止することによって行われる。阻止することはまた、ゲラニルゲラニルピロリン酸、すべてのジテルペン類の前駆体を産生するゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）の発現を、毛状突起において特異的に阻止することによっても行うことができる。
【００２７】
本発明の第７の態様は、テルペノイド生合成遺伝子の機能を同定するために、特に、ＣＢＴ−ジオールの内因性ジテルペン産生が毛状突起において阻止される植物の使用に関する。より詳細には、ＣＢＴ−ジオール産生経路を阻止することは、センブラトリエン−オールシンターゼの発現を阻止することによって行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明者らは、上記の代謝特徴によるタバコ、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）が、内因性ＧＧＰＰプールにタキソール生合成経路をグラフトするのに理想的な宿主であることを示した。より一般的には、任意のテルペンシンターゼ、およびより詳細には、任意のジテルペンシンターゼは、そのコーディング配列が公知である限り、それから誘導されるジテルペノイド類の豊富な産生を得るために、タバコゲノムに組込まれ得る。これは、腺毛を有する植物に対する他のテルペンクラス（例えば、モノテルペン類、セスキテルペン類、またはトリテルペン類）について一般化することができる。
【００２９】
本発明は、本質的に、以下に要約される３つの要素を含んでなる。
（１）分泌性毛状突起における異種テルペンシンターゼのデノボ発現を可能にするためのタバコの遺伝子操作。本明細書に記載の実施例は、それぞれ、タキサジエンおよびキャスベンをもたらすタキサジエンシンターゼおよびキャスベンシンターゼの実施例である。これらの実施例は、タバコ毛状突起によるジテルペノイド類を産生させるための可能性を制限するものとみなされるべきではない。さらに、構成性発現に対してタバコ毛状突起においてジテルペンシンターゼを特異的に発現させることの重要性が強調される。
（２）タバコにおける内因性ジテルペン合成を阻害することによって得られるジテルペン産生の増加。分泌性毛状突起によるジテルペン産生のレベルを増加するために、内因性ジテルペン産生経路は、テルペンシンターゼ工程において阻止される。これにより、ＧＧＰＰ、すべてのジテルペンシンターゼに共通の基質に対する任意の競合を、排除しないとしても、減少することが可能である。テルペンシンターゼ活性（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）の場合、センブラトリエン−オールシンターゼ）をコードする遺伝子の不活化は、内因性ジテルペン類の産生を事実上排除するのに十分である。
（３）毛状突起滲出物における目的のジテルペン類の分泌および低極性（塩化メチレン、クロロホルムなど）または非極性型（例えば、ペンタン、ヘキサンなど）の溶媒を使用することによる毛状突起によって産生されるジテルペノイド含有滲出物の回収。実際、本発明者らは、毛状突起の滲出物において、内因性テルペン類以外のテルペン類を分泌する明白でないかつ予測できない可能性を発見した。
【００３０】
本発明者らはまた、葉表面で抗菌活性を有する化合物の産生が阻止される植物が、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌によるより高い効率の形質転換を示すことを発見した。事実、Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）の葉表面での毛状突起によるＣＢＴ−ジオール産生の排除は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による遺伝的形質転換の効率の高度に有意な増強をもたらす。これは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の増殖および従って、Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）細胞の形質転換を防止するＣＢＴ−ジオールの抗細菌活性によって説明することができる。
【００３１】
さらに、本発明者らは、ＣＢＴ−ジオール合成経路が毛状突起において阻止される植物のいくらかの興味深い特性を同定した。事実、ＣＢＴ−ジオールは、産生される量を考慮すると、主要な混入物である。その存在は、少数成分の検出を困難にする。従って、ＣＢＴ−ジオールをほとんどまたは全く産生しない植物は、遺伝子導入による毛状突起において産生される分子の精製を容易にする。さらに、そのような植物は、テルペノイド生合成遺伝子の機能を同定するのに極めて有用である。事実、そのような植物の葉滲出物における低いレベルのＣＢＴ−ジオールは、例えば、テルペンシンターゼ、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ベンゾイルトランスフェラーゼまたはＮ−ベンゾイルトランスフェラーゼのようなテルペン生合成に関与する遺伝子の機能の「インビボ」同定を容易にする。
【００３２】
従って、本発明は、腺毛を有する植物においてジテルペン類、モノテルペン類、セスキテルペン類およびトリテルペン類よりなる群において選択される目的のテルペン類を産生させるためのシステムにある。
【００３３】
第１の実施態様では、本発明は、目的のジテルペン類、およびより詳細には、タキサン系薬剤を腺毛より産生させるためのシステムにある。
【００３４】
ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）におけるジテルペンシンターゼ発現の研究は、タバコ毛状突起が、ジテルペノイド類、および特に、タキサジエンまたはキャスベンのデノボ産生に適した天然のプラットフォームを構成することを示す。毛状突起滲出物におけるタキサジエンまたはキャスベンの産生は、毛状突起分泌系がジテルペン類のクラスに特有でないことを示す。前記ジテルペン類の産生のための培養を考慮すると、毛状突起におけるジテルペンシンターゼの特異的発現は、より遅い成長によって特徴付けられる構成性発現より顕著な利点を付与する。
【００３５】
タバコおよび特に、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）ならびに腺毛を有する植物の選択は、ジテルペン類の豊富な産生に同等に適応される。事実、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）種における構成性プロモーター（３５Ｓ）の制御下でのタキサジエンシンターゼの発現は、葉に限定されかつ少量（Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）におけるものより１００倍少ない）でのタキサジエンの蓄積をもたらす（ベスムベス（Ｂｅｓｕｍｂｅｓ）ら、２００４年；ボテラ−パビア（Ｂｏｔｅｌｌａ−Ｐａｖｉａ）ら、２００４年）。この差異は、腺ではないシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）毛状突起の生理に関連する。
【００３６】
本発明者らによって示されるように、系統発生学的に遠位の植物（それぞれ、トウゴマおよびイチイ）から誘導されるキャスベンおよびタキサジエンシンターゼは、両方とも、タバコ毛状突起において機能的である。これらの観察から見て、本発明者らは、タバコ毛状突起は、それらの起源にかかわらず、すべての種類のジテルペンシンターゼを発現することが可能な生物学的工場を構成すると考えている。
【００３７】
内因性テルペンシンターゼ遺伝子のためのサイレンシングストラテジーの使用は、毛状突起におけるタキサジエン蓄積の有意な増加をもたらす。従って、前記ストラテジーは、特に、タバコ毛状突起によるジテルペン産生のレベルを増加するために適応される。一般的に、グラフトされた遺伝子操作された経路の生合成を増加するための何らかの手段によって、内因性ジテルペノイド経路をサイレンシングすることは、高い収量の目的のジテルペノイド類を産生させるための明らかな利点を表す。
【００３８】
一般的様式では、発現カセットは、転写開始を可能にするプロモーター、イントロンを含有するかまたは含有せず、その翻訳は異種テルペンシンターゼの産生を可能にする転写される核酸、および転写ターミネーターから構成される。転写される核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または合成ＤＮＡであり得る。本発明の範囲において、転写される核酸は、好ましくは、イントロンを欠くｃＤＮＡである。転写される核酸は、合成または半合成の組換え分子であり得、おそらく、増幅されるかまたはベクターにクローニングされ、化学的に改変されるかまたは非天然の塩基を含んでなる。典型的に、それらは単離されたＤＮＡ分子であり、当業者に周知の組換え方法によって合成される。それらは、典型的に、それらの全長で、即ち、起源の遺伝子のＡＴＧ開始コドンおよび葉緑体輸送ペプチドのそれらのコーディング配列を伴って使用される。一般的に、植物のジテルペンシンターゼは葉緑体に輸送され、従って、輸送ペプチドを所有する一方、細菌または真菌のような葉緑体を所有しない生物体のジテルペンシンターゼは、葉緑体輸送ペプチドを所有しない。植物および特に、タバコの葉緑体において前記ジテルペンシンターゼを正確に発現するためには、当業者に周知のルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットのもののような輸送ペプチドとの融合を作製する必要がある。
【００３９】
発現カセットという用語は、作動可能に連結されるコーディング領域および調節領域を含んでなる核酸構築物を示す。表現「作動可能に連結される」は、エレメントが、コーディング配列（目的の遺伝子）の発現および／またはコードされるタンパク質のターゲッティングが、転写プロモーターおよび／または輸送ペプチドの制御下にあるような方法で組み合わされることを示す。典型的に、プロモーター配列は、発現の制御と両立する距離をもって、目的の遺伝子の上流に配置される。同様に、輸送ペプチド配列は、一般的に、目的の遺伝子の配列の上流に、およびそれを伴うフレーム内に、および任意のプロモーターの下流に融合される。スペーサー配列は、それらが発現および／またはターゲッティングを防止しない限り、調節エレメントと遺伝子との間に存在し得る。
【００４０】
発現カセットは、好ましくは、特に、植物の毛状突起における発現を可能にするプロモーターを含んでなる。そのようなプロモーターは、当業者に公知である。
【００４１】
本発明の趣旨において、「特異的」プロモーターは、所定の組織または細胞グループにおいて主に活性であるプロモーターを意味すると理解されるべきである。他の組織または細胞において一般的により低い残留発現は、全体的に除外され得ると理解されるべきである。本発明の特定の特徴は、植物の葉分泌の組成の改変を可能にし、および特に、目的のテルペンの調製を可能にするテルペンシンターゼのそこでの発現を可能にする腺毛の分泌細胞に特有なプロモーターを構築する能力に基づく。
【００４２】
例えば、ＣＹＰ７１Ｄ１６遺伝子のＡＴＧの上流に局在する１８５２ｂｐの調節配列は、タバコ毛状突起の分泌細胞におけるｕｉｄＡレポーター遺伝子の発現を特異的に指令することが示されている（米国特許出願公開第２００３／０１０００５０Ａ１号明細書、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら、２００３年）。さらに、異なる種から抽出されるいくらかのプロモーター配列が、タバコ毛状突起における異種遺伝子の発現を指令することが示されている（表１）。
【００４３】
前記プロモーターのうち、脂質転送に関与するワタタンパク質（ＬＴＰ）をコードするＬＴＰ３遺伝子のものは、ワタ線維細胞において特異的に発現される。タバコにおける遺伝子の調節配列（１５４８ｂｐ）が研究されている。前記配列は、葉の毛状突起におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現を特異的に指令する。ＡＴＧの−６１４〜−３００位上流に局在する３１５ｂｐの配列は、プロモーターの特異性の基礎になると考えられる。ＬＴＰ６遺伝子のプロモーターはまた、ワタにおける毛状突起特異的発現を可能にすることができる。しかし、文献に基づけば、発現は、毛状突起の基部の細胞において生じ、分泌細胞においては生じないようである。さらに、前記プロモーターがタバコに導入される場合、発現は、もはやそれほど高度には特異的でなく、特に、表皮細胞おけるシグナルを伴う（表１を参照のこと）。
【００４４】
本発明の好適な実施態様では、これが、カセットにおいて使用されるプロモーターが、ＣＹＣ−２（ＣＢＴ−オールサイクラーゼ；ＮＩＤ：ＡＦ４０１２３４）に高い配列相同性を示すニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）種のＮｓＴＰＳ−０２ａ、０２ｂ、０３、および０４遺伝子から誘導される理由である。前記プロモーターの配列を配列番号５〜８に示す。従って、発現カセットに含有されるプロモーターは、それが、配列番号５、６、７もしくは８またはその機能的変種の配列のすべてまたは一部を含んでなることを特徴とする、腺毛において機能的転写プロモーター活性を有する核酸を含んでなる。より詳細には、その機能的変種は、［ｂｌａｓｔＮ配列アラインメントソフトウェア（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０年によって得られる）］前記配列の１つに少なくとも８０、８５もしくは９０％同一性を示す配列を意味することが理解されるべきであり、腺毛、特に、腺毛の分泌細胞に特有である。前記プロモーター配列については、２００４年１０月１３日に出願されたＦＲ第０４１０７９９号明細書においてより詳細に記載されている。
【００４５】
ターミネーター配列のうち、ＮＯＳターミネーター（ベバン（Ｂｅｖａｎ）ら、ｌ９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（２），３６９−３８５）、およびヒストン遺伝子ターミネーター（ＥＰＯ第６３３３１７号明細書）を引用することができる。
【００４６】
特定の実施態様では、発現カセットは、増加した発現（「エンハンサー」）を可能にする配列、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびオクトピンシンターゼ遺伝子の所定のエレメント（米国特許第５２９０９２４号明細書）を含んでなることができる。好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハンサーが使用される。エンハンサーの例を配列番号９の配列に示す。
【００４７】
転写される核酸は、目的のテルペンを合成することが可能なテルペンシンターゼをコードする。
【００４８】
本発明の特定の実施態様では、目的のテルペンはジテルペンである。好ましくは、目的のジテルペンはタキサンである。より詳細には、タキサンはタキサジエンであり得る。植物に導入される異種テルペンシンターゼは、ジテルペンシンターゼ、より詳細には、目的のジテルペンを合成することが可能なジテルペンシンターゼである。例えば、タキサジエンについては、ジテルペンシンターゼはタキサジエンシンターゼである。より詳細には、タキサジエンシンターゼはイチイのものである。図８は、タバコ毛状突起においてタキサジエンを産生させるためのストラテジーを例示する。イチイのタキサジエンシンターゼについての多くのコーディング配列およびタンパク質配列が公知である。参考の非網羅的リストを以下に示す。
【００４９】
【表１】
2008528016.tif 000002
【００５０】
さらに、キャスベンについては、ジテルペンシンターゼはキャスベンシンターゼである。より詳細には、キャスベンシンターゼはトウゴマのものである。非制限的例として、コーディング配列について参照Ｌ３２１３４およびタンパク質配列について参照Ｐ５９２８７を引用することができる。
【００５１】
より一般的には、本発明は、公知であるか、またはその配列が下記のようなジテルペンシンターゼの特徴に対応する任意のジテルペンシンターゼに関する。
【００５２】
いくらかのジテルペン類シンターゼの遺伝子がクローニングされ、それらの機能が確認されている。これらは：タキサジエンシンターゼ（ワイルダング（Ｗｉｌｄｕｎｇ）およびクロテアウ（Ｃｒｏｔｅａｕ）、１９９６年）、アビエタジエンシンターゼ（ペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）ら、２０００年）、レボピマラジエンシンターゼ（シェプマン（Ｓｃｈｅｐｍａｎｎ）ら、２００１年）、イソピマラジエンシンターゼ（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、２００４年）、キャスベンシンターゼ（マウ（Ｍａｕ）およびウエスト（Ｗｅｓｔ）、１９９４年）、センブラトリエン−オールシンターゼ（ワング（Ｗａｎｇ）およびワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）、２００３年）、ｅｎｔ−キャスサジエン（ｃａｓｓａｄｉｅｎｅ）シンターゼ（チョ（Ｃｈｏ）ら、２００４年）、ラブデン（ｌａｂｄｅｎｅ）シンターゼ（セオ（Ｓｅｏ）ら、２００３年）、ｓｙｎ−ピマラジエンシンターゼ（ワイルダーマン（Ｗｉｌｄｅｒｍａｎ）ら、２００４年）、ｅｎｔ−コパルイル（ｃｏｐａｌｙｌ）二リン酸シンターゼならびにｅｎｔ−カウレンシンターゼ（サン（Ｓｕｎ）ら、１９９４年、プリシク（Ｐｒｉｓｉｃ）ら、２００４年）を含む。他のジテルペンシンターゼ遺伝子は、現在、イネ（ｓｙｎ−ステマレン（ｓｔｅｍａｒｅｎｅ）シンターゼ、ｓｙｎ−ピマラジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼおよびｅｎｔ−キャスサジエン（ｃａｓｓａｄｉｅｎｅ）シンターゼ）ならびにタバコ（ｃｉｓ−アビエノールシンターゼ）において特徴付けられている。
【００５３】
ジテルペンシンターゼのタンパク質配列は共通の特徴を共有する。未成熟タンパク質はすべて、Ｎ末端に葉緑体輸送ペプチドを含有する。すべてのジテルペンシンターゼは、２つの特徴的なドメインを含有する。Ｎ末端ドメインはグリコシルヒドロラーゼ様ドメインと呼ばれ；Ｃ−末端ドメインは触媒部位を含有する。
【００５４】
ジテルペンシンターゼは、３つの大きなクラスに再分割される。クラス１の酵素は、Ｃ−末端ドメインにおいてＤＤＸＸＤコンセンサスモチーフを有する。クラスＩＩの酵素は、Ｎ末端ドメインに局在する（Ｄ／Ｅ）ＸＤ（Ｄ／Ｎ）コンセンサスモチーフを有する（プリシク（Ｐｒｉｓｉｃ）ら、２００４年）。クラスＩおよびＩＩの酵素は、連続的に反応して、ラブダン型の炭素骨格を作製し、一般的に、一次代謝（例えば：ｅｎｔ−コパルイル（ｃｏｐａｌｙｌ）二リン酸シンターゼおよびｅｎｔ−カウレンシンターゼ）の特徴であるが、また、イネ（例えば：ｅｎｔ−コパルイル（ｃｏｐａｌｙｌ）二リン酸シンターゼおよびｅｎｔ−キャスサジエン（ｃａｓｓａｄｉｅｎｅ）シンターゼ）におけるような二次代謝にも参加する。裸子植物の二次代謝に特有の他の酵素は、これらの２つのモチーフを含有し、従って、２つの触媒部位を伴う二官能性である（例えば：アビエタジエンシンターゼ）。二機能性であるにもかかわらず、それらはクラスＩに列挙される。これらのすべての酵素（クラスＩおよびＩＩ）は、ＣＤＩＳ（針葉樹ジテルペン内部配列）と呼ばれるＮ末端ドメインにおける配列によってさらに特徴付けられる。前記配列は、一般的に約２１５アミノ酸であり、シグナルペプチドとグリコシルヒドロラーゼ様ドメインとの間に局在する（トラップ（Ｔｒａｐｐ）およびクロテアウ（Ｃｒｏｔｅａｕ）、２００１年）。
【００５５】
被子植物では、クラスＩＩＩの酵素は、Ｃ末端領域においてＤＤＸＸＤコンセンサスを有するが、クラスＩおよびＩＩのＣＤＩＳを有さない。前記酵素は、単一の反応工程で反応する。キャスベンシンターゼは、クラスＩＩＩジテルペンシンターゼの例である。
【００５６】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ゲノムは、クラスＩＩＩジテルペンシンターゼの基準（アウボーグ（Ａｕｂｏｕｒｇ）ら、２００２年）に一致する２１の配列を含有する。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子の国際命名法に従うそれらのゲノム座標は次のとおりである：Ａｔ５ｇ４８１１０、Ａｔ３ｇ２９４１０、Ａｔ３ｇ１４４９０、Ａｔ１ｇ３１９５０、Ａｔ４ｇ１５８７０、Ａｔ２ｇ２３２３０、Ａｔ１ｇ４８８００、Ａｔ１ｇ６６０２０、Ａｔ３ｇ２９１１０、Ａｔ１ｇ７００８０、Ａｔ１ｇ３３７５０、Ａｔ３ｇ３２０３０、Ａｔ３ｇ１４５２０、Ａｔ３ｇ１４５４０、Ａｔ５ｇ４４６３０、Ａｔ４ｇ１３２８０、Ａｔ４ｇ１３３００、Ａｔ４ｇ２０２１０、Ａｔ３ｇ２９１９０、Ａｔ４ｇ２０２３０、Ａｔ４ｇ２０２００。遺伝子Ａｔ３ｇ２９４１０、Ａｔ３ｇ１４５４０、Ａｔ１ｇ３３７５０、Ａｔ３ｇ３２０３０およびＡｔ１ｇ４８８００によってコードされるタンパク質はまた、それらをクラスＩの二官能性ジテルペンシンターゼに類似にするＮ末端ドメインにおけるクラスＩＩ型の（Ｄ／Ｅ）ＥＤＤモチーフを有する。従って、前記酵素は、単一の工程においてラブダノイド（ｌａｂｄａｎｏｉｄ）型ジテルペン類を産生することができる。これらの配列によってコードされるタンパク質のうち、認められているものはない。しかし、本発明者らは、遺伝子Ａｔ３ｇ２９４１０、Ａｔ３ｇ１４５４０によってコードされる２つのタンパク質を特徴付けることを試みた。
【００５７】
本発明の別の特定の実施態様では、目的のテルペンはモノテルペンである。例えば、目的のモノテルペンはリモネンであり得る。非制限的例はまた、ピネン、ツジェン（ｔｈｕｊｅｎｅ）、またはリナロールである。植物に導入される異種テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼ、より詳細には、目的のモノテルペンを合成することが可能なモノテルペンシンターゼである。しかし、モノテルペン産生はまた、毛状突起において発現されるゲラニルピロリン酸シンターゼの導入を必要とする。ゲラニルピロリン酸シンターゼの非制限的例を以下に参考として示す。
【００５８】
【表２】
2008528016.tif 000003
【００５９】
図９は、タバコ毛状突起においてモノテルペン類を産生させるためのストラテジーを例示する。例えば、リモネンについては、モノテルペンシンターゼはリモネンシンターゼである。リモネンシンターゼについての多くのコーディング配列およびタンパク質配列が公知である。参照の非網羅的例を以下に示す。
【００６０】
【表３】
2008528016.tif 000004
【００６１】
キャレネ（ｃａｒｅｎｅ）シンターゼ、ピネンシンターゼ、ツジェン（ｔｈｕｊｅｎｅ）シンターゼ、およびリナロールシンターゼは、モノテルペンシンターゼの他の例である。
【００６２】
本発明の別の特定の実施態様では、目的のテルペンはセスキテルペンである。例えば、目的のセスキテルペンは、バレンセン、サンタレン、ゲルマクレンまたはｅｐｉ−アリストロチェンであり得る。
【００６３】
植物に導入される異種テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼ、より詳細には、目的のセスキテルペンを合成することが可能なセスキテルペンシンターゼである。しかし、セスキテルペン産生はまた、毛状突起において発現されるファルネシルピロリン酸シンターゼの導入を必要とする。
【００６４】
【表４】
2008528016.tif 000005
【００６５】
図１０は、タバコ毛状突起においてセスキテルペン類を産生させるためのストラテジーを例示する。例えば、バレンセンについては、セスキテルペンシンターゼはバレンセンシンターゼである。より詳細には、バレンセンシンターゼは、スイートオレンジのものである。非制限的例として、コーディング配列について参照ＡＦ４４１１２４およびタンパク質配列について参照ＡＡＧ０４６０８．１を引用することができる。
【００６６】
ゲルマクレンシンターゼ（ＳＳＴＬＨ１遺伝子、参照ＡＦ２７９４５５）およびｅｐｉ−アリストロチェンシンターゼ（参照ＡＡＡ１９２１６）は、セスキテルペンシンターゼの他の例である。
【００６７】
本発明の別の特定の実施態様では、目的のテルペンはトリテルペンである。例えば、目的のトリテルペンは、ラノステロール、シクロアルテノール、ルペオールまたはβ−アミリンであり得る。
【００６８】
植物に導入される異種テルペンシンターゼは、トリテルペンシンターゼ、より詳細には、目的のトリテルペンを合成することが可能なトリテルペンシンターゼである。しかし、トリテルペン産生はまた、毛状突起において産生されるファルネシルピロリン酸シンターゼ、スクアレンシンターゼ、およびスクアレンエポキシダーゼの導入を必要とする。
【００６９】
【表５】
2008528016.tif 000006
【００７０】
図１１は、タバコ毛状突起においてトリテルペン類を産生させるためのストラテジーを例示する。例えば、ラノステロールについては、トリテルペンシンターゼはラノステロールシンターゼである。ラノステロールシンターゼについての多くのコーディング配列およびタンパク質配列が公知である。
【００７１】
ラノステロールシンターゼ、シクロアルテノールシンターゼ、ルペオールシンターゼおよびβ−アミリンシンターゼは、トリテルペンシンターゼの他の例である。
【００７２】
異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現カセットを含有する構築物の導入に加えて、方法は、それぞれテルペン修飾酵素をコードする１つもしくはそれ以上の導入遺伝子の植物細胞への導入を含んでなることができる。特に、テルペン修飾は、水酸化、アシル化および特に、アセチル化、ベンゾイル化、脱水素化などであり得る。導入遺伝子の導入は、好ましくは、テルペン修飾酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現カセットを導入することによって生じる。テルペン修飾酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、毛状突起において、好ましくは、毛状突起特異的な発現を可能にするプロモーターの制御下にある。導入遺伝子は、異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる構築物または異なる構築物によって担持され得る。例えば、前記修飾酵素は、とりわけ、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ベンゾイルトランスフェラーゼ、レダクターゼであり得る。テルペン修飾酵素をコードする遺伝子の非網羅的リストを以下の表に示す。
【００７３】
【表６】
2008528016.tif 000007
【００７４】
そのようにして形成される発現カセットは、ベクターに挿入される。ベクターは、ＤＮＡあるいはＲＮＡであり得、環状または非環状、一本鎖もしくは二本鎖である。典型的に、それは、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、人工染色体などである。有利なことに、それは、即ち、植物細胞を形質転換することが可能な植物ベクターである。植物ベクターの例は、特に、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡプラスミドｐＢＩＮ１９（ベバン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４年）、ｐＰＺＰ１００（ハジュケウィクズ（Ｈａｊｄｕｋｅｗｉｃｚ）ら、１９９４年）、ｐＣＡＭＢＩＡシリーズ（Ｒ．ジェファソン（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、ＣＡＭＢＩＡ、豪州）を含む文献に記載されている。本発明のベクターは、複製開始点および／または選択遺伝子および／または植物組換え配列などをさらに含んでなり得る。ベクターは、例えば、制限酵素、連結、クローニング、複製などを使用して、当業者に周知の従来の分子生物学的方法によって、構築することができる。
【００７５】
選択遺伝子は、非排他的様式で、抗生物質もしくは除草剤に対する耐性を付与する遺伝子のようなマーカー遺伝子、またはポジティブ選択システム、特に、ＭＰＩ選択遺伝子の存在下でのマンノースに対する選択に基づくシステム（マンノース−６−リン酸イソメラーゼ）（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、１９９９年）、または選択後のマーカー遺伝子の排除に接続する選択システム（エビヌマ（Ｅｂｉｎｕｍａ）ら、１９９７年）の使用を含んでなる。最終的に、形質転換された植物はまた、選択マーカー遺伝子の非存在下でのＰＣＲスクリーニングによって選択することができる（マックガーベイ（ＭｃＧａｒｖｅｙ）およびケーパー（Ｋａｐｅｒ）、１９９１年）。
【００７６】
本構築物の種子または植物を含む植物細胞もしくは組織への導入は、当業者に既知の任意の方法によって担持され得、例えば、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、エレクトロポレーション、接合伝達、遺伝子銃法、特に、ウイルスベクターによるトランスフェクションおよび当業者に公知の他の任意の方法を含んでなることができる。
【００７７】
一般的に使用される方法は、主に、目的の構築物（核酸、カセット、ベクターなど）を細菌Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、次いで、前記細菌と選択された植物のリーフディスクとを接触させることにある細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用に基づく。発現カセットは、典型的に、ベクターとして、例えば、熱ショックによって細菌に伝達することができるＴｉプラスミド（またはＴ−ＤＮＡ）を使用することによって、細菌に導入される。形質転換された細菌とリーフディスクとのインキュベーションは、Ｔｉプラスミドのディスク細胞のゲノムへの伝達をもたらす。その細胞が本発明の構築物を含んでなるトランスジェニック植物を再生するために、場合により、後者を、適切な条件で培養することができる。Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）形質転換方法のさらなる詳細または変形の実施については、例えば、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、１９８５年またはホーカス（Ｈｏｏｙｋａａｓ）およびシルペルート（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ）、１９９２年を参照することができる。
【００７８】
従って、特定の実施態様では、そのようにして形成される発現カセットは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による植物細胞への伝達のためのディスアーム型ＴｉプラスミドのトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の左および右境界の間に挿入される。Ｔ−ＤＮＡはまた、その発現が抗生物質に対する耐性を付与し、形質転換体の選択を可能にする遺伝子を含んでなる。
【００７９】
植物形質転換の別の方法は、直接植物細胞上に遺伝子構築物が付着される微粒子（典型的にマイクロビーズ）を投射し、次いで、トランスジェニック植物を再構成するために前記細胞を培養することに基づく。使用される粒子は、典型的に金粒子であり、典型的にパーティクルガンによって投射される（特に、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１９９２年、２８Ｐ、９７−１０５頁を参照のこと）。
【００８０】
マイクロインジェクション法は、主に、遺伝子構築物を植物プロトプラストまたは胚に注入し、次いで、植物体全体を再生するように前記組織を培養することに基づく。他の植物遺伝子導入法は周知であるか、または上記の方法を実施する他のプロトコルについては、先行技術（ジーメンス，Ｊ（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｊ）およびシーダー（Ｓｃｈｉｅｄｅｒ）、１９９６年）に記載されており、本発明において用いることができる。
【００８１】
特に、本発明は、高等植物（特に、被子植物）の腺毛の分泌細胞において特異的に目的のテルペン類を産生させるのに使用することができる。本発明は、特に、腺毛を有する科由来のすべての植物、例えば、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（ヒマワリなど）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トマト、タバコ、ポテト、トウガラシ、ナスなど）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）（例えば、大麻（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｓａｔｉｖａ））およびシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）（ミント、バジル、ラベンダー、タイムなど）に適用可能である。本発明は、特に、例えば、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）属、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）属、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）属、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）属、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ）属などのようなナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）ならびにタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎｅａｅ）、例えば、タバコ、およびより詳細には、野生型タバコニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）由来の植物に適応される。非制限的様式では、本発明は、次の属由来の植物に適用され得る：ハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、アサガオ（Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ）、アプテリア（Ａｐｔｅｒｉａ）、ボチョウジ（Ｐｓｙｃｈｏｔｒｉａ）、ヤマアイ（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、ポリポディウム（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ）、テンジクアオイ（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、ミゾホウズキ（Ｍｉｍｕｌｕｓ）、シカギク（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、モナルダ（Ｍｏｎａｒｄａ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ）、カノコソウ（Ｖａｌｅｒｉａｎａ）、メボウキ（Ｏｃｉｍｕｍ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、トチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）、ルリマツリ（Ｐｌｕｍｂａｇｏ）、ギンシダ（Ｐｉｔｙｒｏｇｒａｍｍａ）、ファセリア（Ｐｈａｃｅｌｉａ）、ヒルギダマシ（Ａｖｉｃｅｎｎｉａ）、ギョリュウ（Ｔａｍａｒｉｘ）、フランケニア（Ｆｒａｎｋｅｎｉａ）、イソマツ（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ）、ウイキョウ（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ）、イブキジャコウソウ属（Ｔｈｙｍｕｓ）、アキギリ（Ｓａｌｖｉａ）、サネカズラ（Ｋａｄｓｕｒａ）、ベイェリア（Ｂｅｙｅｒｉａ）、カラハナソウ（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、ハッカ（Ｍｅｎｔｈａ）、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ネペタ（Ｎｅｐｅｔａ）、ガラエア（Ｇｅｒａｅａ）、ポゴステモン（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ）、マヨラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、クレオメ（Ｃｌｅｏｍｅ）、サントリソウ（Ｃｎｉｃｕｓ）、パルセニウム（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、リシノカルポス（Ｒｉｃｉｎｏｃａｒｐｏｓ）、ヒメンナエア（Ｈｙｍｅｎｎａｅａ）、ラレア（Ｌａｒｒｅａ）、サクラソウ（Ｐｒｉｍｕｌａ）、ファセリア（Ｐｈａｃｅｌｉａ）、オシダ（Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ）、プレクトランサス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ）、アツモリソウ（Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）、トビカズラ（Ｍｕｃｕｎａ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、オ��ギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ）、ハマジンチョウ（Ｍｙｏｐｏｒｕｍ）、アカシア（Ａｃａｃｉａ）、ジプロペルティス（Ｄｉｐｌｏｐｅｌｔｉｓ）、ハウチワノキ（Ｄｏｄｏｎａｅａ）、ハルガニア（Ｈａｌｇａｎｉａ）、シアノステジア（Ｃｙａｎｏｓｔｅｇｉａ）、プロスタンテラ（Ｐｒｏｓｔａｎｔｈｅｒａ）、アントセルシス（Ａｎｔｈｏｃｅｒｃｉｓ）、オレアリア（Ｏｌｅａｒｉａ）、ビスカリア（Ｖｉｓｃａｒｉａ）。
【００８２】
一旦再生されたら、異種テルペンシンターゼの発現または毛状突起における目的のテルペンの産生について、トランスジェニック植物を試験することができる。これは、葉滲出物を回収し、目的のテルペンが分泌されることが意図される場合、前記滲出物における目的のテルペンについて試験することによって行うことができる。これはまた、葉、およびより詳細には、毛状突起細胞における異種テルペンシンターゼの存在を分析することによって（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを特異的プライマーもしくはプローブで分析することによって）行うことができる。場合により、改善されたレベルの発現を示す植物を得るために、植物を、選択、交配、処置などすることができる。
【００８３】
この点について、本発明の別の目的は、上記で規定されるようなカセットまたはベクターを含んでなる改変された細胞に基づく。例えば、それは、特に、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）またはシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）由来の植物細胞であり得る。細胞は、インビトロで培養し、培養において目的のテルペン類を産生させるか、あるいは（例えば、機能ゲノム学によって）異種テルペンシンターゼの特性を研究するために、組織または植物体全体を再構成するのに使用することができる。
【００８４】
本発明の別の目的はまた、上記において規定されるような発現カセットもしくはベクターを含んでなる植物また播種しに基づく。より詳細には、本発明は、腺毛を有し、好ましくは、特に、毛状突起において、発現を可能にするプロモーターの制御下で、目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含んでなるトランスジェニック種子または植物に関する。テルペンシンターゼがモノテルペンシンターゼである場合、トランスジェニック種子または植物は、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下にある、ゲラニルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットをさらに含んでなる。テルペンシンターゼがセスキテルペンシンターゼである場合、トランスジェニック種子または植物は、毛状突起においてそれを発現させることが可能なプロモーターの制御下で、ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットをさらに含んでなる。テルペンシンターゼがトリテルペンシンターゼである場合、トランスジェニック種子または植物は、毛状突起においてそれらを発現させることが可能なプロモーターの制御下で、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、スクアレンシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットをさらに含んでなる。
【００８５】
本発明の好適な実施態様では、植物は、さらに、毛状突起において阻止された内因性テルペン産生経路を示す。好適な実施態様では、内因性テルペン産生経路は、毛状突起において特異的に阻止され、植物の他の部分において影響を受けるとしてもほとんど認められないことを意味する。内因性テルペン産生経路は、好ましくは、内因性テルペンシンターゼの発現を阻止することによって阻止される。しかし、本発明はまた、別のレベルで内因性テルペンを産生する経路を阻止することを提供する。
【００８６】
内因性テルペンシンターゼの発現は、当業者に公知の多くの利用可能な技術によって阻止することができる。テルペンシンターゼ遺伝子は、欠失、変異（例えば、ＥＭＳによる化学変異もしくは放射線）または分断（挿入変異誘発）することができる。さらに、内因性テルペンシンターゼの発現は、転写物インヒビターを発現することによる遺伝子サイレンシングによって阻止することができる。転写物インヒビターは、二本鎖ＲＮＡの形態をとることができるＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重鎖を形成することができるＲＮＡ、および内因性ジテルペンの転写物にいくらかの相補性または特異性を有するＲＮＡである。
【００８７】
本発明の特定の実施態様に従えば、転写物インヒビターは、アンチセンスＲＮＡの形態である。後者は、一般的に、内因性テルペンシンターゼの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含んでなり、古典的ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型相互作用を介して前記転写物に選択的にハイブリダイズする。従って、アンチセンスＲＮＡ型の転写物インヒビターは、テルペンシンターゼの転写物に結合し、後者がｍＲＮＡである場合、例えば、目的の転写物の５’末端における細胞翻訳機構へのアクセスを阻止し、タンパク質へのその翻訳を妨害し、目的の導入遺伝子の発現のインビボでの抑制を可能にすることができる（クマー（Ｋｕｍａｒ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ，６２（１９９３年）１４１５−１４３４）。例えば、そのようなポリヌクレオチドについては、欧州特許第９２５７４号明細書および同第１４０３０８号明細書に記載されている。転写物インヒビターがアンチセンスＲＮＡ型である場合、それは、ジテルペンシンターゼ転写物のコーディング配列のすべてもしくは一部、または３’もしくは５’非コーディング配列のすべてもしくは一部を含み得る。好適な様式では、アンチセンス転写物インヒビターは、リボソーム結合性および翻訳開始配列に相補的である。好適な様式では、転写物インヒビターは、少なくとも１０リボヌクレオチドの長さを有する。
【００８８】
好適な実施態様では、転写物インヒビターは、ＲＮＡ干渉の機構を利用する（バウルコンベ（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）、２００４年においてレビューされている）。好ましくは、前記サイレンシングは、イントロン−スプライスドヘアピン（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡまたはｉｈｐＲＮＡ法（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、２０００年）によって行われる。このことは、センスフラグメントおよびアンチセンス配向でこの同じフラグメント（２つはイントロンによって分離される）を含んでなる構築物によって、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡを産生させることにある（ウェスリー（Ｗｅｓｌｅｙ）ら、２００１年；ワング（Ｗａｎｇ）ら、特許出願、１９９９年）。前記構築物は、好ましくは、毛状突起特異的発現を可能にするプロモーターの制御下にある。
【００８９】
しかし、本発明はまた、毛状突起において内因性テルペン産生経路を阻止するための当業者に公知の任意の手段を考慮する。事実、他のアプローチによってＴＰＳ遺伝子サイレンシング方法が達成され得ることを明記することは重要である。例えば、それは、放射線、例えば、γ線または高速中性子照射による欠失変異のライブラリーを作製することにあり得る。所定の遺伝子座に影響を及ぼす欠失は、変異体から抽出されるＤＮＡに対する多様な方法によって検出することができる（チッシサー（Ｔｉｓｓｉｅｒ）およびモンタネ（Ｍｏｎｔａｎｅ）、１９９９年）。放射線変異誘発の１つの利点は、遺伝子クラスター全体を含む欠失を単離する可能性である。これらの酵素を形成する遺伝子は、１つの遺伝子座に対してクラスター形成される極めて類似の遺伝子のファミリーを形成する（チッシサー（Ｔｉｓｓｉｅｒ）ら、２００４年；サラウド（Ｓａｌｌａｕｄ）ら、非公開データ）ため、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）のセンブランシンターゼ場合、これは特に関連性がある。
【００９０】
本発明はまた、テルペン修飾酵素をコードする導入遺伝子をさらに含んでなる本発明に従うトランスジェニック種子または植物に関する。
【００９１】
特に、本発明は、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止される植物に関する。前記植物は、目的のテルペンを産生することが可能な最終植物を調製するための重要な中間体を表す。事実、前記植物は、目的のテルペンを産生することが可能な植物と、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止される植物とを交配させることによって得ることができる。次いで、より詳細には、本発明は、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止される植物に関する。本発明はまた、毛状突起における発現を可能にするプロモーターの制御下にある目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含んでなるトランスジェニック種子または植物を調製するための、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止されるトランスジェニック植物の使用に関する。本発明は、さらに、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止され、目的のテルペンを産生することが可能であるトランスジェニック種子または植物を調製するための方法であって、内因性ジテルペン合成経路が毛状突起において阻止されるトランスジェニック植物と、毛状突起における発現を可能にするプロモーターの制御下にある目的のテルペンの合成を可能にする異種テルペンシンターゼをコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現カセットを含んでなるトランスジェニック植物とを交配させることを含んでなる上記方法に関する。
【００９２】
本発明のなお別の目的は、それが、次の工程：ａ）本発明に従う発現カセットを含んでなる組換え植物宿主細胞を得る工程、ｂ）工程ａ）において得られる組換え宿主細胞から植物全体を再生する工程、ｃ）本明細書において規定されるような発現カセットを組込んでいる工程ｂ）において得られうる植物を選択する工程、を含んでなることを特徴とする、形質転換された植物を得るための方法である。
【００９３】
本発明はまた、それが、次の工程：ａ）本発明に従うアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の組換え宿主細胞を得る工程、ｂ）工程ａ）において得られるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）組換え宿主細胞による感染によって目的の植物を形質転換する工程、ｃ）本明細書において規定されるような発現カセットをそれらのゲノムに組込んでいる植物を選択する工程、を含んでなることを特徴とする、形質転換された植物を得るための方法を目的とする。
【００９４】
本発明はまた、それが、次の工程：ａ）本発明に従う発現カセットまたは組換えベクターで少なくとも１つの植物細胞をトランスフェクトする工程、ｂ）工程ａ）において得られる組換え植物細胞から植物全体を再生する工程、ｃ）本発明に従う発現カセットをそれらのゲノムに組込んでいる植物を選択する工程、を含んでなることを特徴とする、形質転換された植物を得るための方法を目的とする。
【００９５】
形質転換された植物を得るための上記の方法のいずれか１つは、次のさらなる工程：ｄ）工程ｃ）において得られるような２つの形質転換された植物と、同じ種の植物とを交配させる工程、ｅ）導入遺伝子についてホモ接合である植物を選択する工程とを含んでなることもできる。
【００９６】
第２の特定の実施態様では、形質転換された植物を得るための上記の方法のいずれか１つは、次のさらなる工程：ｆ）工程ｃ）において得られる形質転換された植物と、同じ種の植物とを交配させる工程、ｇ）導入遺伝子を保存している工程ｆ）における交配から生じる植物を選択する工程を含んでなることもできる。
【００９７】
本発明に従う少なくとも１つの植物と、別のものとを交配させることによって得られるハイブリッドトランスジェニック植物もまた、本発明の一部である。
【００９８】
第１に、本発明は、ａ）植物の地上部を収穫すること、ｂ）低極性または非極性型の溶媒において前記地上部をインキュベートすること、次いで、ｃ）溶媒を排除することを含んでなる、植物の毛状突起の滲出物中の異種テルペン類または目的のテルペン類を回収するための方法に関する。好ましくは、前記植物は、本発明に従うトランスジェニック植物および特にタバコである。地上部は、好ましくは、葉および茎を意味すると理解されるべきである。低極性溶媒は塩化メチレンまたはクロロホルムであり得る。特定の実施態様では、溶媒は非極性、好ましくは、極めて非極性（ｖｅｒｙ  ａｐｏｌａｒ）である。例えば、溶媒は、ペンタンもしくはヘキサンまたは同じ極性を有する任意の溶媒、好ましくは、ペンタンであり得る。インキュベーション工程は、振盪を伴う数秒間〜振盪を伴わない浴中でのいくらかの時間、持続し得る。好ましくは、選択される溶媒は室温で揮発性であり、目的のテルペン類に対して化学的に不活性である。好ましくは、溶媒は、そのエバポレーションによって排除される。しかし、溶媒が排除されるあらゆる方法が本発明に包含される。
【００９９】
さらに、本発明者らは、葉表面で抗菌特性を有する化合物の産生が阻止される植物が、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌による増強された効率の形質転換を示すことを発見した。化合物は、抗細菌特性を有することができる。好適な実施態様では、化合物の阻止された産生は毛状突起に特有である。
【０１００】
事実、テルペン類、特に、葉表面において分泌されるものは、しばしば、抗菌活性を有する化合物である（例えば、参考文献：トロンベッタ（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ）ら、２００５年；チョリアノプウロス（Ｃｈｏｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ）ら、２００４年；フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）ら、２００４年；リオス（Ｒｉｏｓ）およびレシオ（Ｒｅｃｉｏ）、２００５年；サログロウ（Ｓａｒｏｇｌｏｕ）ら、２００５年）。その結果、抗菌活性を有する前記テルペン類の存在は、この目的のために使用される細菌、特に、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、メソルヒゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）またはシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）による前記植物の形質転換の障害となる（ブルートハーツ（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ）ら、２００５年）。それは、前記分子が、形質転換中の細菌の増殖を阻害し、従って、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを阻害するからである。結果として、抗菌活性を有する前記テルペン類の排除は、不応な種を形質転換することを可能にするか、または形質転換が困難な種の形質転換頻度を増加するかのいずれかであり得る。
【０１０１】
好ましくは、前記細菌は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、またはメソルヒゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）に属する。
【０１０２】
抗生物質特性を有する化合物はテルペンであり得る。例えば、それはジテルペンであり得る。好適な実施態様では、化合物はＣＢＴ−ジオールである。この場合、このテルペンの産生は、毛状突起における内因性テルペンシンターゼ、特に、ジテルペンシンターゼ、好ましくは、センブラトリエン−オールシンターゼの発現を阻止することによって、阻止することができる。この阻止を行うのに利用可能な手段については、上記で詳細に説明した。特に、これらには、遺伝子の物理化学的変異誘発、遺伝子の欠失、その挿入変異または「遺伝子サイレンシング」が含まれる。後者の方法が好適である。
【０１０３】
あるいは、抗生物質特性を有する化合物は、そのリストが網羅的でない次の化合物のうちの１つであり得る：α−ピネン、ミルセン、オシメン、α−テルピネン、ｐ−シメン、カルバクロール、チモール、リナロール、カンファー、テルピネオール、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、パチョロール、ゲルマクレン類（Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）、β−セリネン、カジネン、ビサボレン類（α、β、γ）、ビサボロール、サンタレン類（αおよびβ）、サンタロール類など、但しまた、多くのキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）種に存在するセスキテルペンラクトン類。
【０１０４】
従って、本発明は、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする細菌によって前記植物を形質転換するための１つのそのようなトランスジェニック植物の使用に関する。本発明はまた、植物を形質転換するための方法に関し、前記植物は、葉表面で抗生物質特性を有する化合物の阻止された産生を示し、植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にし、導入遺伝子を担持する細菌と、前記植物の細胞とを接触させることを含んでなる、上記方法に関する。好ましくは、前記植物の細胞は、葉断片、特に、リーフディスクに含まれる。本発明のなお別の目的は、それが、次の工程：ａ）導入遺伝子を含んでなる植物細胞へのＤＮＡトランスファーを可能にする組換え宿主細胞、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を得る工程、ｂ）葉表面での抗生物質特性を有する化合物の阻止された産生を示す植物を、工程ａ）で得られる組換え細菌宿主細胞による感染によって形質転換する工程、ｃ）導入遺伝子をそれらのゲノムに組込んでいる植物を選択する工程を含んでなることを特徴とする、形質転換された植物を得るための方法である。形質転換された植物を得るための上記の方法はまた、次のさらなる工程：ｄ）工程ｃ）において得られるような２つの形質転換された植物と、同じ種の植物とを交配させる工程、ｅ）導入遺伝子についてホモ接合である植物を選択する工程を含んでなる。さらに、本方法は、さらなる次の工程：ｆ）工程ｃ）において得られる形質転換された植物と、同じ種の植物とを交配させる工程、ｇ）導入遺伝子を保存している工程ｆ）における交配から生じる植物を選択する工程を含んでなることができる。
【０１０５】
本発明は、テルペノイド生合成遺伝子の機能を同定するために、内因性ジテルペン類、特に、ＣＢＴ−ジオールを産生するための経路が毛状突起において阻止される植物の使用に関する。より詳細には、ＣＢＴ−ジオール産生経路は、センブラトリエン−オールシンターゼの発現を阻止することによって阻止することができる。
【０１０６】
本発明の他の態様および利点は、例示の目的のためであって、制限的方法によるものではない以下の実施例において理解されよう。
【実施例】
【０１０７】
非特異的プロモーターの制御下でのタキサジエンシンターゼの発現によるタバコ植物ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）におけるタキサジエンの産生
下記の構築物は、毛状突起において含む植物のすべての細胞における発現を可能にした。前記発現は、毛状突起に非特有であるものとして説明する。
【０１０８】
発現ベクター
発現カセットを以下のとおりに構築した（図１の概念図を参照のこと）：
３５Ｓ型の構成性プロモーター（カリフラワーモザイクウイルスから抽出される）は当業者に周知である。
タキサジエンシンターゼｃＤＮＡ。
当業者に周知の（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｔｉプラスミドのオクトピンシンターゼ遺伝子から抽出される）ＯＣＳターミネーター。
この構築物の配列を配列番号１の配列に示す。
【０１０９】
形質転換された植物の分析
再生プロセスにより、タキサジエンシンターゼを発現するトランスジェニック植物の単離がもたらされた。導入遺伝子の単一のコピーを含有する植物を選択し、ガスクロマトグラフィー質量分析検出（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。前記植物の滲出物は、１４±３μｇ／１ｇのＦＭ（新鮮物）を含有した（図５）。これらの植物の成長は、野生型コントロール（形質転換されていない）より遅かったため、それを培養に不適切にした。これらの効果は、トマトまたはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるジテルペンシンターゼ過剰発現の場合において先に観察されており、トランスジェニック植物において利用可能なＧＧＰＰプールの減少に帰する（フライ（Ｆｒａｙ）ら、１９９５年；ベスムベス（Ｂｅｓｕｍｂｅｓ）ら、２００４年）。ＧＧＰＰは、ジベレリン類およびアブシジン酸のようなホルモンの合成における重要な代謝物である。
【０１１０】
タバコ、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）におけるタキサジエンの毛状突起特異的産生
本実施例では、タキサジエンの産生を毛状突起に制限するように、タキサジエンシンターゼを、毛状突起特異的プロモーターＮｓＣＢＴＳ−０２ａ（チッシサー（Ｔｉｓｓｉｅｒ）ら、２００４年；仏国特許第０４１０７９９号明細書）の制御下に配置した。
【０１１１】
発現ベクター
発現カセットを以下のとおりに構築した（図２の概念図を参照のこと）：
１キロベースのＮｓＣＢＴＳ−０２ａプロモーター。
タキサジエンシンターゼｃＤＮＡ。
ＮｓＣＢＴＳ−０２ａ遺伝子ターミネーター
この構築物の配列を配列番号２の配列に示す。
【０１１２】
形質転換された植物の分析
再生プロセスにより、毛状突起分泌細胞において特異的にタキサジエンシンターゼを発現するトランスジェニックタバコ植物の単離がもたらされた。単一コピーの導入遺伝子を含有する植物を選択した。滲出物のＧＣ−ＭＳ分析は、３５Ｓプロモーターの制御下でのタキサジエンシンターゼの非特異的発現の場合に測定されるものに類似のタキサジエン含有量（１０±１μｇ／１ｇのＦＭ、図５）を示した。これらの植物の成長は、野生型（形質転換されていない）植物のものと同一であった。さらに、花は正常な受粉を有した。これは、タキサジエンの毛状突起特異的合成が植物に対して何ら有害な影響を及ぼさないことを示し、従って、非特異的発現を超える毛状突起特異的発現の優位性を実証する。
【０１１３】
ＮｓＣＢＴＳ遺伝子の発現の阻害によるニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）毛状突起における増加したタキサジエン産生
ＮｓＣＢＴＳ遺伝子を、ＲＮＡ干渉の機構に関与する遺伝子サイレンシングによって不活化した（バウルコンベ（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）、２００４年においてレビューされている）。サイレンシングは、イントロン−スプライスドヘアピン（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡまたはｉｈｐＲＮＡ法（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、２０００年）によって行った。それは、センスフラグメントおよびアンチセンス配向でこの同じフラグメント（２つのフラグメントはイントロンによって分離される）を含んでなる構築物によって、標的遺伝子（単数または複数）の二本鎖ＲＮＡを産生させることにある（ウェスリー（Ｗｅｓｌｅｙ）ら、２００１年；ワング（Ｗａｎｇ）ら、特許出願、１９９９年）。より具体的には、以下のとおりにカセットを構築した（図３）：
ＮｓＣＢＴＳ−０２ａプロモーター（仏国特許第０４１０７９９号明細書）の１．７ｋｂのフラグメント。
ＮｓＣＢＴＳ−０２ａ遺伝子のエキソン２およびイントロン２、続いて、アンチセンス配向でこの同じ遺伝子のエキソン２を含んでなるフラグメント。
ＮＯＳターミネーター。
【０１１４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による前記カセットの形質転換により、ＣＢＴＳ遺伝子のｉｈｐＲＮＡ構築物を発現するトランスジェニック植物が得られた。単一コピーの導入遺伝子を含有する植物を選択した。これらの植物の子孫を、ＣＢＴ−ジオール含有量について分析した。図６は、ＣＢＴ−ジオール分泌が、ｉｈｐＴＰＳ植物においてほぼ完全に阻止された（ＷＴの０．１〜１％）ことを示す。
【０１１５】
次いで、前記植物を、毛状突起において特異的にタキサジエンシンターゼを発現する植物と交配させた（上記を参照のこと）。この交配の子孫において、選択培地上で両方の構築物を担持する植物を選択し、ＧＣ−ＭＳによりタキサジエン含有量について分析した。
【０１１６】
これらの植物におけるタキサジエン産生は、毛状突起特異的プロモーターの制御下でタキサジエン発現カセットのみを発現する植物より約３０倍高かった。
【０１１７】
タバコ、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）におけるキャスベンの毛状突起特異的産生
発現ベクター
キャスベンシンターゼの毛状突起特異的発現は、以下のような発現カセット（図４：概念図および配列）における特異的プロモーターＮｓＣＢＴＳ−０２ａの使用を必要とした。
１キロベースのＮｓＣＢＴＳ−０２ａプロモーター。
キャスベンシンターゼの完全なｃＤＮＡ。
ＮｓＣＢＴＳ−０２ａターミネーター
【０１１８】
形質転換された植物の分析
再生プロセスにより、毛状突起分泌細胞において特異的にキャスベンシンターゼを発現するトランスジェニック植物の単離がもたらされた。単一コピーの導入遺伝子を含有する植物のＧＣ−ＭＳ分析により、約１５μｇ／１ｇのＦＭのキャスベン含有量が示された。これらの植物の成長は、野生型（形質転換されていない）植物のものと同一であった。このことから、タキサジエンについて、毛状突起におけるキャスベンシンターゼの特異的合成は、植物に対して有害な影響を及ぼさないことが確認される。
【０１１９】
３５Ｓ転写アクチベーター（エンハンサー）を使用することによる導入遺伝子の増加した発現
ＣＹＰ７１Ｄ１６遺伝子の１．８ｋｂプロモーターの制御下でのタキサジエンシンターゼの発現を、同じプロモーター（但し、その前方に、３５Ｓプロモーターのエンハンサー（配列番号９）がある）の制御下でタキサジエン−５α−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現と比較した。発現の定量分析を、リアルタイム定量ＰＣＲおよび遺伝子に特有なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの使用によって行った。
【０１２０】
図７の結果は、タキサジエン−５α−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現がタキサジエンシンターゼ遺伝子の発現より１０００倍高かったことを示す。プロモーターは他のすべての点において、同一であったため、３５Ｓプロモーターエンハンサーは、この活性化を担ったことが推論され得る。
【０１２１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による遺伝子形質転換の増加した効率
ｉｈｐＴＰＳ導入遺伝子を担持するホモ接合体系統（系統番号８０４）を、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）から作製した。この系統は、葉表面においてもはやＣＢＴ−ジオールを産生しない（図６を参照のこと）。Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）の葉および系統番号８０４から得られるリーフディスクを、カナマイシン耐性遺伝子および目的の異なる導入遺伝子を担持するＴ−ＤＮＡを含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の異なる株に感染させた（表２）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）との共培養の３日後、リーフディスクを、カナマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）を含有する選択培地に移した。選択の４週間後、多数の耐性カルスが、系統番号８０４由来のリーフディスク上に出現した（図１２）。全体から見て、系統番号８０４によって得られる形質転換された植物の数は、Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）コントロールの５〜１０倍であった。これらの所見は、異なる導入遺伝子を担持するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を使用するいくらかの実験によって確認された（表２）。結論として、葉表面でのＣＢＴ−ジオール分泌を排除することは、遺伝子形質転換の効率を改善する。
【０１２２】
イチイ由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の機能の同定
毛状突起特異的プロモーター（仏国特許出願第０４１０７９９号明細書）の制御下にあるタキサジエンシンターゼをコードする導入遺伝子（ＮＩＤ：Ｕ４８７９６）および同じプロモーターの制御下にあるタキサジエン５−ヒドロキシラーゼをコードする導入遺伝子（Ｔ５Ｈ、ＮＩＤ：ＡＹ２８９２０９）を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によって、Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）および系統ｉｈｐＴＰＳ（番号８０４）に導入した。形質転換された植物の滲出物を、葉をペンタンに浸漬することによって抽出した。滲出物中に存在する化合物を、ガスクロマトグラフィー、続いて、質量分析検出（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。タキサジエンシンターゼ導入遺伝子のみを含有する植物は、滲出物中にタキサジエンを産生した（図１３Ａ）。両方の導入遺伝子を含有する植物は、タキサジエンを産生せず、タキサジエンがＴ５Ｈの基質であることが確認された。ｉｈｐＴＰＳ植物では、主要な新たな産物がＧＣ−ＭＳクロマトグラム上で高度に認められるようになった（図１３Ｄ）。Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）植物の滲出物における豊富なＣＢＴ−ジオールのため、前記産物は、２つの導入遺伝子をもまた含有するこれらの植物において検出されなかった（図１３Ｂ）。結論として、ｉｈｐＴＰＳ系統の滲出物における極めて低いレベルのＣＢＴ−ジオールにより、毛状突起において発現される酵素の産物を同定し、従って、対応する遺伝子の機能を決定することがより容易になった。さらに、産物を容易に精製することができ、それによって、その特徴付けおよび産生を可能にする。
【０１２３】
参考文献
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ボテラ−パビア  Ｐ（Ｂｏｔｅｌｌａ−Ｐａｖｉａ  Ｐ）、ベスムベス  Ｏ（Ｂｅｓｕｍｂｅｓ  Ｏ）、フィリップス  ＭＡ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＭＡ）、カルレテロ−ポーレット  Ｌ（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ−Ｐａｕｌｅｔ  Ｌ）、ボロナット  Ａ（Ｂｏｒｏｎａｔ  Ａ）、ロドリゲス−コンセプシオン  Ｍ（Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ  Ｍ）（２００４年）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｋｅｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｕｔｅｎｙｌ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｄｉａｌ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４０：１８８−９９
ブルートハーツ  Ｗ（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ  Ｗ）、ミッチェル  ＨＪ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＨＪ）、ウィア  Ｂ（Ｗｅｉｒ  Ｂ）、ケインズ  Ｓ（Ｋａｉｎｅｓ  Ｓ）、スミス  ＬＭ（Ｓｍｉｔｈ  ＬＭ）、ヤン  Ｗ（Ｙａｎｇ  Ｗ）、メイヤー  ＪＥ（Ｍａｙｅｒ  ＪＥ）、ロア−ロドリゲス  Ｃ（Ｒｏａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｃ）、ジェファソン  ＲＡ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ＲＡ）（２００５年）．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：６２９−６３３
チョ  ＥＭ（Ｃｈｏ  ＥＭ）、オカダ  Ａ（Ｏｋａｄａ  Ａ）、ケンモク  Ｈ（Ｋｅｎｍｏｋｕ  Ｈ）、オオトモ  Ｋ（Ｏｔｏｍｏ  Ｋ）、トヨマス  Ｔ（Ｔｏｙｏｍａｓｕ  Ｔ）、ミツハシ  Ｗ（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ  Ｗ）、サッサ  Ｔ（Ｓａｓｓａ  Ｔ）、ヤジマ  Ａ（Ｙａｊｉｍａ  Ａ）、ヤブタ  Ｇ（Ｙａｂｕｔａ  Ｇ）、モリ  Ｋ（Ｍｏｒｉ  Ｋ）、オイカワ  Ｈ（Ｏｉｋａｗａ  Ｈ）、トシマ  Ｈ（Ｔｏｓｈｉｍａ  Ｈ）、シブヤ  Ｎ（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｎ）、ノジリ  Ｈ（Ｎｏｊｉｒｉ  Ｈ）、オオモリ  Ｔ（Ｏｍｏｒｉ  Ｔ）、ニシヤマ  Ｍ（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｍ）、ヤマネ  Ｈ（Ｙａｍａｎｅ  Ｈ）（２００４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｅｎｔ−ｃａｓｓａ−１２，１５−ｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ，ｆｒｏｍ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｔｉｎ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３７：１−８
チョリアノプウロス  Ｎ（Ｃｈｏｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ）、カルポートザキス  Ｅ（Ｋａｌｐｏｕｔｚａｋｉｓ  Ｅ）、アリギアニス  Ｎ（Ａｌｉｇｉａｎｎｉｓ  Ｎ）、ミタク  Ｓ（Ｍｉｔａｋｕ  Ｓ）、ナイチャス  ＧＪ（Ｎｙｃｈａｓ  ＧＪ）、ハロウトーニアン  ＳＡ（Ｈａｒｏｕｔｏｕｎｉａｎ  ＳＡ）（２００４年）．  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌｓ  ｏｆ  Ｓａｔｕｒｅｊａ，  Ｏｒｉｇａｎｕｍ，  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ：  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ５２：８２６１−８２６７
エビヌマ  Ｈ（Ｅｂｉｎｕｍａ  Ｈ）、スギタ  Ｋ（Ｓｕｇｉｔａ  Ｋ）、マツナガ  Ｅ（Ｍａｔｓｕｎａｇａ  Ｅ）、ヤマカド  Ｍ（Ｙａｍａｋａｄｏ  Ｍ）（１９９７年）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ３月１８日；９４（６）：２１１７−２１２１
フライ  ＲＧ（Ｆｒａｙ  ＲＧ）、ウォーレス  Ａ（Ｗａｌｌａｃｅ  Ａ）、フレーザー  ＰＤ（Ｆｒａｓｅｒ  ＰＤ）、バレロ  Ｄ（Ｖａｌｅｒｏ  Ｄ）、ヘッデン  Ｐ（Ｈｅｄｄｅｎ  Ｐ）、ブラムリー  ＰＭ（Ｂｒａｍｌｅｙ  ＰＭ）、グリアソン  Ｄ（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  Ｄ）（１９９５年）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｒｕｉｔ  ｐｈｙｔｏｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｍａｔｏｅｓ  ｃａｕｓｅｓ  ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｂｙ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：６９３−７０１
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ヒーマン  Ｖ（Ｈｅｅｍａｎｎ  Ｖ）、ブレーマー  Ｕ（Ｂｒａｕｍｍｅｒ  Ｕ）、パウルゼン  Ｃ（Ｐａｕｌｓｅｎ  Ｃ）、シーホファー  Ｆ（Ｓｅｅｈｏｆｅｒ  Ｆ）（１９８３年）  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅａｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｕｍ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．２２：１３３−１３５
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ホーシュ  ＲＢ（Ｈｏｒｓｃｈ  ＲＢ）、ロジャーズ  ＳＧ（Ｒｏｇｅｒｓ  ＳＧ）、フレイリィ  ＲＴ（Ｆｒａｌｅｙ  ＲＴ）（１９８５年）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：４３３−７
ジェンバイン  Ｓ（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  Ｓ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２００１年）Ｔａｘｏｌ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５７：１３−９
ジェンバイン  Ｓ（Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ  Ｓ）、ワイルデュング  ＭＲ（Ｗｉｌｄｕｎｇ  ＭＲ）、チョー  Ｍ（Ｃｈａｕ  Ｍ）、ウォーカー  Ｋ（Ｗａｌｋｅｒ  Ｋ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２００４年）Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔａｘｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｔａｘｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：９１４９−９１５４
マーティン  ＤＭ（Ｍａｒｔｉｎ  ＤＭ）、ファルド  Ｊ（Ｆａｌｄｔ  Ｊ）、ボールマン  Ｊ（Ｂｏｈｌｍａｎｎ  Ｊ）（２００４年）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｎｅ  Ｎｏｒｗａｙ  Ｓｐｒｕｃｅ  ＴＰＳ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍ  ｔｅｒｐｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＰＳ−ｄ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５：１９０８−１９２７
マウ  ＣＪ（Ｍａｕ  ＣＪ）、ウエスト  Ｃ（Ｗｅｓｔ  Ｃ）（１９９４年）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｓｂｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｃＤＮＡ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｃｙｃｌａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８４９７−８５０１
マックガーベイ  Ｐ（ＭｃＧａｒｖｅｙ  Ｐ）、ケーパー  ＪＭ（Ｋａｐｅｒ  ＪＭ）（１９９１年）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１０月；１１（４）：４２８−３２
ペータース  ＲＪ（Ｐｅｔｅｒｓ  ＲＪ）、フローリ  ＪＥ（Ｆｌｏｒｙ  ＪＥ）、ジェッター  Ｒ（Ｊｅｔｔｅｒ  Ｒ）、ラビン  ＭＭ（Ｒａｖｎ  ＭＭ）、リー  ＨＪ（Ｌｅｅ  ＨＪ）、コーツ  ＲＭ（Ｃｏａｔｅｓ  ＲＭ）、クロテアウ  ＲＢ（Ｃｒｏｔｅａｕ  ＲＢ）（２０００年）Ａｂｉｅｔａｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｎｄ  ｆｉｒ（Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  “ｐｓｅｕｄｏｍａｔｕｒｅ”  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５５９２−１５６０２
プリシク  Ｓ（Ｐｒｉｓｉｃ  Ｓ）、クー  Ｍ（Ｘｕ  Ｍ）、ワイルダーマン  ＰＲ（Ｗｉｌｄｅｒｍａｎ  ＰＲ）、ペータース  ＲＪ（Ｐｅｔｅｒｓ  ＲＪ）（２００４年）Ｒｉｃｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  Ｔｗｏ  Ｄｉｓｐａｒａｔｅ  ｅｎｔ−Ｃｏｐａｌｙｌ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３６：４２２８−４２３６
リオス  ＪＬ（Ｒｉｏｓ  ＪＬ）、レシオ  ＭＣ（Ｒｅｃｉｏ  ＭＣ）（２００５年）．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１００：８０−８４
サログロウ  Ｖ（Ｓａｒｏｇｌｏｕ  Ｖ）、カリオチ  Ａ（Ｋａｒｉｏｔｉ  Ａ）、デメヅォス  Ｃ（Ｄｅｍｅｔｚｏｓ  Ｃ）、ディマス  Ｋ（Ｄｉｍａｓ  Ｋ）、スカルツサ  Ｈ（Ｓｋａｌｔｓａ  Ｈ）（２００５年）Ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｌａｃｔｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｎｔａｕｒｅａ  ｓｐｉｎｏｓａ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．６８：１４０４−１４０７
シェプマン  ＨＧ（Ｓｃｈｅｐｍａｎｎ  ＨＧ）、パング  Ｊ（Ｐａｎｇ  Ｊ）、マツダ  ＳＰ（Ｍａｔｓｕｄａ  ＳＰ）（２００１年）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ  ｌｅｖｏｐｉｍａｒａｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｗｈｉｃｈ  ｃａｔａｌｙｚｅｓ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｐ  ｉｎ  ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９２：２６３−２６９
セオ  Ｓ（Ｓｅｏ  Ｓ）、セト  Ｈ（Ｓｅｔｏ  Ｈ）、コシノ  Ｈ（Ｋｏｓｈｉｎｏ  Ｈ）、ヨシダ  Ｓ（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｓ）、オオハシ  Ｙ（Ｏｈａｓｈｉ  Ｙ）（２００３年）Ａ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｆｅｎｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．１５：８６３−８７３
セバーソン  ＲＦ（Ｓｅｖｅｒｓｏｎ  ＲＦ）、ジョンソン  ＡＷ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＡＷ）、ジャクソン  ＤＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＤＭ）（１９８５年）Ｃｕｔｉｃｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ：ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｍｏｋｅ  ｑｕａｌｉｔｙ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１：１０５−１７３
ジーメンス  Ｊ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｊ）、およびシーダー  Ａ（Ｓｃｈｉｅｄｅｒ  Ａ）（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓ．Ｃｕｌｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：６６−７５
スミス  ＮＡ（Ｓｍｉｔｈ  ＮＡ）、シング  ＳＰ（Ｓｉｎｇｈ  ＳＰ）、ワング  ＭＢ（Ｗａｎｇ  ＭＢ）、ストートジェスヂジュク  ＰＡ（Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ  ＰＡ）、グリーン  ＡＧ（Ｇｒｅｅｎ  ＡＧ）、ウォーターハウス  ＰＭ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ）（２０００年）Ｔｏｔａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−２０
サン  ＴＰ（Ｓｕｎ  ＴＰ）、カミヤ  Ｙ（Ｋａｍｉｙａ  Ｙ）（１９９４年）Ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＧＡ１  ｌｏｃｕｓ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｅｎｔ−ｋａｕｒｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ａ  ｏｆ  ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．６：１５０９−１５１８
チッシサー  Ａ（Ｔｉｓｓｉｅｒ  Ａ）、モンタネ  Ｍ−Ｈ（Ｍｏｎｔａｎｅ  Ｍ−Ｈ）（１９９９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ．仏国特許第９９１３５１５号明細書
チッシサー  Ａ（Ｔｉｓｓｉｅｒ  Ａ）、サラウド  Ｃ（Ｓａｌｌａｕｄ  Ｃ）、ロンテイン  Ｄ（Ｒｏｎｔｅｉｎ  Ｄ）（２００４年）Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ．仏国特許出願第０４１０７９９号明細書
トラップ  ＳＣ（Ｔｒａｐｐ  ＳＣ）、クロテアウ  ＲＢ（Ｃｒｏｔｅａｕ  ＲＢ）（２００１年）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｔｅｒｐｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５８：８１１−８３２
トロンベッタ  Ｄ（Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ  Ｄ）、キャステリ  Ｆ（Ｃａｓｔｅｌｌｉ  Ｆ）、サーピートロ  ＭＧ（Ｓａｒｐｉｅｔｒｏ  ＭＧ）、ヴェヌーティ  Ｖ（Ｖｅｎｕｔｉ  Ｖ）、クリスタニ  Ｍ（Ｃｒｉｓｔａｎｉ  Ｍ）、ダニエル  Ｃ（Ｄａｎｉｅｌｅ  Ｃ）、サイジャ  Ａ（Ｓａｉｊａ  Ａ）、マッザンチ  Ｇ（Ｍａｚｚａｎｔｉ  Ｇ）、ビシグナノ  Ｇ（Ｂｉｓｉｇｎａｎｏ  Ｇ）（２００５年）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４９：２４７４−２４７８
ターナー  ＧＷ（Ｔｕｒｎｅｒ  ＧＷ）、ガーシェンゾン  Ｊ（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎ  Ｊ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（２０００年）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｌｔａｔｅ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｐｅｒｍｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１２４：６６５−６８０
ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）、ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、シェパード  ＲＷ（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ＲＷ）（２００４年）Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ａｎ  ｏｌｄ  ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ，ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ９３：３−１１
ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、ワング  Ｒ（Ｗａｎｇ  Ｒ）、デパラシス  Ｊ（ＤｅＰａｒａｓｉｓ  Ｊ）、ラフリン  ＪＨ（Ｌｏｕｇｈｒｉｎ  ＪＨ）、ガン  Ｓ（Ｇａｎ  Ｓ）、ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）（２００１年）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐ４５０  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ｇｌａｎｄｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ−ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂａｓｅｄ  ａｐｈｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７１−３７４
ワング  Ｅ（Ｗａｎｇ  Ｅ）、ワーグナー  ＧＪ（Ｗａｇｎｅｒ  ＧＪ）（２００３年）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｏ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌａｎｔａ  ２１６：６８６−６９１
ワング  Ｍ−Ｂ（Ｗａｎｇ  Ｍ−Ｂ）、グレアム  ＭＷ（Ｇｒａｈａｍ  ＭＷ）、ウォーターハウス  ＰＭ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ）（１９９９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．特許出願国際公開第９９５３０５０号パンフレット
ウェスリー  ＳＶ（Ｗｅｓｌｅｙ  ＳＶ）、ヘリウェル  ＣＡ（Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ  ＣＡ）、スミス  ＮＡ（Ｓｍｉｔｈ  ＮＡ）、ワング  ＭＢ（Ｗａｎｇ  ＭＢ）、ラウス  ＤＴ（Ｒｏｕｓｅ  ＤＴ）、リュウ  Ｑ（Ｌｉｕ  Ｑ）、グッディング  ＰＳ（Ｇｏｏｄｉｎｇ  ＰＳ）、シング  ＳＰ（Ｓｉｎｇｈ  ＳＰ）、アボット  Ｄ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄ）、ストートジェスヂジュク  ＰＡ（Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ  ＰＡ）、ロビンソン  ＳＰ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＳＰ）、グリーブ  ＡＰ（Ｇｌｅａｖｅ  ＡＰ）、グリーン  ＡＧ（Ｇｒｅｅｎ  ＡＧ）、ウォーターハウス  ＰＭ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ＰＭ）（２００１年）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：５８１−９０
ワイルダーマン  ＰＲ（Ｗｉｌｄｅｒｍａｎ  ＰＲ）、クー  Ｍ（Ｘｕ  Ｍ）、ジン  Ｙ（Ｊｉｎ  Ｙ）、コーツ  ＲＭ（Ｃｏａｔｅｓ  ＲＭ）、ペータース  ＲＪ（Ｐｅｔｅｒｓ  ＲＪ）（２００４年）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎ−ｐｉｍａｒａ−７，１５−ｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｅｒｐｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ／ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５：２０９８−２１０５
ワイルデュング  ＭＲ（Ｗｉｌｄｕｎｇ  ＭＲ）、クロテアウ  Ｒ（Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｒ）（１９９４年）Ａ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔａｘａｄｉｅｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｔｈｅ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃａｔａｌｙｓｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｓｔｅｐ  ｏｆ  ｔａｘｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９２０１−９２０４
【０１２４】
【表７】
2008528016.tif 000008
【０１２５】
表２．
Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）対系統番号８０４の形質転換効率の比較。Ｋｍ：カナマイシン；Ｎｏ．：数；番号８０４：ｉｈｐＴＰＳ導入遺伝子を担持するＮ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）導入遺伝子の説明。ＦＰＳ：トマトのファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０４８７４７）；ＴＰＦＰＳ：葉緑体輸送ペプチドを伴うＦＰＳ。ＳＳＴＬＨ：トマトのゲルマクレンシンターゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７９４５５）。ＴＰＳＳＴＬＨ：葉緑体輸送ペプチドを伴うＳＳＴＬＨ。キャスベン：トウゴマのキャスベンシンターゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ３２１３４）。ＧＵＳｉ：細菌における発現を防止するためのイントロンを伴う大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子。
【０１２６】
【表８】
2008528016.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】タバコの細胞における非特異的タキサジエンシンターゼ発現カセット。
【図２】タバコ毛状突起におけるタキサジエンシンターゼ発現カセット。
【図３】ＮｓＴＰＳ遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ構築物。
【図４】タバコ毛状突起におけるキャスベンシンターゼ発現カセット。
【図５】３５ＳまたはＮｓＴＰＳ−０２ａプロモーターの制御下でタキサジエンシンターゼを発現する系統におけるタキサジエン分泌。タキサジエンシンターゼ発現を制御する３５ＳまたはＮｓＴＰＳ−０２ａプロモーターを伴う構築物を、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）のゲノムにクローニングした。導入遺伝子の単一のコピーを担持する植物の滲出物において分泌されるタキサジエンをペンタンで抽出し、ＧＣ−ＭＳにより定量した。タキサジエン含有量をμｇ／１ｇの新鮮物で表す。それぞれ３５ＳおよびＮｓＴＰＳ−０２ａプロモーターについて、合計で１２および５つの植物を分析した。（ＴＳ：タキサジエンシンターゼ、ＷＴ：野生型）
【図６】ｉｈｐＴＰＳ  ＲＮＡｉを発現する植物におけるＣＢＴ−ジオール分泌。ＣＢＴ−ジオールを、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）滲出物からペンタンで抽出し、ＧＣ−ＭＳにより定量した。ＷＴのＣＢＴ−ジオール含有量を１００％に設定した。形質転換体の子孫由来の植物（Ｔ１）をｉｈｐＴＰＳによって表す。
【図７】毛状突起における発現に対する３５Ｓプロモーターエンハンサーの効果。タバコ葉（Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））由来の全ＲＮＡを抽出し、逆転写によって相補的ＤＮＡに変換した。発現比を、定量的デュプレックスＰＣＲ（ＣＹＰ７１Ｄ１６に対してＶＩＣフルオロフォアおよび導入遺伝子に対してＦＡＭ）によって決定した。Ｎ＝５の植物を分析した。（ｅ３５Ｓ：プロモーター３５Ｓのエンハンサー、ｐ：プロモーター）。
【図８】タバコ毛状突起（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））におけるタキサジエン産生をもたらす工程の概説。ＧＧＰＰ：ゲラニルゲラニルピロリン酸；ＣＢＴ−オール：センブラトリエン−オール；ＣＢＴ−ジオール：センブラトリエン−ジオール；ＣＢＴＳ：センブラトリエン−オールシンターゼ；ＣＢＴｏｌ−ＯＨ：センブラトリエン−オールヒドロキシラーゼ。Ｐｒｏｍ：好ましくは、特異的様式で、毛状突起における発現を可能にするプロモーターを示す。ＴＳ：タキサジエンシンターゼ；ｔｅｒｍ：転写ターミネーター。ＣＢＴＳ  ＲＮＡｉ：ＣＢＴＳ合成を可能にする遺伝子が、ｉｈｐＲＮＡ型の構築物によってサイレンシングされているタバコ植物を示す（実施例を参照のこと）。
【図９】タバコ毛状突起（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））におけるモノテルペン産生をもたらす工程の概説。説明：ＧＧＳ：ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ；ＧＳ：ゲラニルピロリン酸シンターゼおよび図７に同じ。
【図１０】タバコ毛状突起（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））におけるセスキテルペン産生をもたらす工程の概説。説明：ＦＳ：ファルネシルピロリン酸シンターゼならびに図７および８に同じ。
【図１１】タバコ毛状突起（ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ））におけるトリテルペン産生をもたらす工程の概説。
【図１２】ＣＢＴ−ジオール産生が鋭敏に減少したＮ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）植物の葉由来のリーフディスクに対して得られる遺伝子形質転換の増加した効率の例示。カナマイシン耐性遺伝子および目的の導入遺伝子を含有する同じアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株との共培養の３週間後に、写真を撮影した。ＷＴ：Ｎ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）；ｉｈｐＴＰＳ：ｉｈｐＴＰＳ導入遺伝子を含有するＮ．シルベストリス（Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）。
【図１３】図１３Ａ。ＴＳ：タキサジエンシンターゼのみを発現する植物由来の滲出物のクロマトグラム。タキサジエンに特徴的なイオン１２２を抽出することによって、ＧＣ／ＭＳにより、滲出物において、タキサジエンを検出した。図１３Ｂ。ＴＳ＋Ｔ５Ｈ：タキサジエンシンターゼ（ＴＳ）およびタキサジエン５−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５Ｈ）を発現する植物由来の滲出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラム（抽出されたイオン：１９１）。タキサジエンはもはや認められず、ＣＢＴ−ジオール以外の他の産物が認められた。図１３Ｃ。ＴＳ＋ｉｈｐＴＰＳ。ｉｈｐＴＰＳバックグランドにおいてＴＳを発現する植物由来の滲出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラム（抽出されたイオン：１２２）。ＣＢＴ−ジオールが排除され、タキサジエンの検出を容易にした。図１３Ｄ。ＴＳ＋Ｔ５Ｈ＋ｉｈｐＴＰＳ。ｉｈｐＴＰＳバックグランドにおいてＴＳおよびＴ５Ｈを発現する植物由来の滲出物のＧＣ−ＭＳクロマトグラム（抽出されたイオン：１９１）。ＣＢＴ−ジオールはもはや検出されなかったが、酸化型タキサジエン（タキサジエンに対するタキサジエン５−ヒドロキシラーゼの反応の産物）に対応するピークは容易に検出された。
【図１】
2008528016.tif 000010
【図２】
2008528016.tif 000011
【図３】
2008528016.tif 000012
【図４】
2008528016.tif 000013
【図５】
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【図６】
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【図７】
2008528016.tif 000016
【図８】
2008528016.tif 000017
【図９】
2008528016.tif 000018
【図１０】
2008528016.tif 000019
【図１１】
2008528016.tif 000020
【図１２】
2008528016.tif 000021
【図１３】
2008528016.tif 000022
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008528016000001.app
【国際調査報告】
2008528016.tif 000036
2008528016.tif 000037
2008528016.tif 000038
2008528016.tif 000039
2008528016.tif 000040
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2008528016.tif 000043
2008528016.tif 000044
2008528016.tif 000045