(57)【要約】  本発明の１つの態様は、実質的に同様な染色条件下で患者及び異種移植誘導対照サンプル双方を染色し、そして染色液が患者のサンプルに対して有効であったかどうかを決定するために二者の染色結果を評価する工程、を含んでなる、組織学のための対照組織として異種移植片を使用する方法である。異種移植片は本発明者が知る限り、組織学においてこれまで対照として使用されたことはない。対照として異種移植片を使用する結果は驚くほど有利である。第１に、細胞株がヒトと同様に増殖し、分化して、実際の組織サンプルの全般的形態を呈する。第２に、同一の形質転換細胞株はＳＣＩＤマウスにおいて無限回、増殖することができるので、異種移植対照は、著しく再生可能であり、高度に製造可能でありそして、抗原又は遺伝要素を組織中に包埋することができるように遺伝操作をうける恒常的な人工の対照をもたらす。本発明のもう１つの態様は概括的に、宿主動物中で哺乳動物の形質転換細胞株からの異種移植片を増殖させ、宿主動物から異種移植片を取り出し、異種移植片を処理して、それにより異種移植組織を包埋媒質中に包埋し、そして最後に包埋異種移植サンプルを基体上に張り付ける工程を含んでなる、組織の対照基体を製造する方法に関する。基体は一般に顕微鏡スライドである。次に異種移植対照スライドを自動化スライド染色装置中で検体サンプルと並べて染色することができ、そしてそれに対して染色の質を比較することができる対照として働くことができる。異種移植対照はまた、徒手染色の対照としても使用することができる。染色が患者の検体に対して有効であったかどうかを決定する工程は、対照において期待された染色度及び染色型が実現したかどうかを決定するために、異種移植対照サンプルの染色度を判定する工程を含んでなる。染色の期待された型（核、膜又は細胞質）及び度合い（０〜４段階）が実験中に取得される場合は、異種移植対照は、染色法及び試薬が適切に作動しており、従って患者の検体における結果が信頼できることを示す。本発明の更なる態様は、組織学的使用のために準備された少なくとも１種の異種移植対照サンプル及び、その上に少なくとも１種の異種移植対照サンプルが張り付けられたサンプルのスライド、を含んでなる、組織化学的使用のための異種移植誘導対照スライドである。
2008541019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主動物中で哺乳動物の形質転換細胞株からの異種移植片を増殖させる工程、
宿主動物から異種移植片を取り出す工程、及び
異種移植片を処理し、それにより包埋媒質中に異種移植組織を包埋する工程、
を含んでなる組織対照基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の製法。
【請求項２】
組織対照基体が顕微鏡スライドを含んでなる請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳動物の形質転換細胞株がＳｉＨａ、Ｃａｓｋｉ、ＨｅＬａ、Ｔ２４、ＢＴ４７４及びＭＣＦ７よりなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項４】
宿主動物が免疫不全マウスである請求項１の方法。
【請求項５】
免疫不全マウスがＳＣＩＤマウスである請求項４の方法。
【請求項６】
異種移植片からいずれかの宿主組織を識別し、そして取り出す工程を更に含んでなる請求項１の方法。
【請求項７】
異種移植片を処理する工程がパラフィン基剤の包埋媒質中に異種移植片を包埋する工程を含んでなる請求項１の方法。
【請求項８】
方法が更に、包埋された異種移植サンプルを基体上に張り付ける（ａｆｆｉｘ）工程を含んでなる請求項１の方法。
【請求項９】
患者の検体及び異種移植片から誘導された対照サンプルの両方を実質的に同様な染色条件下で染色する工程、及び
染色が患者の検体に対して有効であったかどうかを決定するために前記二つの染色の結果を評価する工程、
を含んでなる、組織学上の対照組織としての異種移植片の使用方法。
【請求項１０】
染色の工程がインサイチューのハイブリッド形成プローブ、免疫組織化学的染料及び特殊染料よりなる群から選択される染料と、患者の検体及び異種移植対照サンプルの両者を接触させる工程を含んでなる請求項９の方法。
【請求項１１】
実質的に同様な染色条件が同一スライド上の患者の検体及び異種移植対照の両者を染色する工程を含んでなる請求項９の方法。
【請求項１２】
実質的に同様な染色条件が同一実験又は同一バッチ中に患者の検体及び異種移植対照の両者を染色する工程を含んでなる請求項９の方法。
【請求項１３】
染色が患者の検体に有効であったかどうかを決定する工程が異種移植対照の実際の染色を異種移植対照の期待された染色と比較する工程を含んでなる請求項９の方法。
【請求項１４】
染色度が０〜３＋の段階で評価される請求項１３の方法。
【請求項１５】
組織学的使用のために準備された少なくとも１種の異種移植対照サンプル及び、
その上に少なくとも１種の異種移植対照サンプルが張り付けられたサンプルのスライド、を含んでなる、
組織化学的使用のための異種移植誘導の対照スライド。
【請求項１６】
少なくとも１種の異種移植対照サンプルが少なくとも１種のネガティブ異種移植対照サンプル及び少なくとも１種のポジティブ異種移植対照サンプルを含んでなる請求項１５の異種移植誘導の対照スライド。
【請求項１７】
少なくとも１種の異種移植対照サンプルが少なくとも１種のネガティブ異種移植対照サンプル及び複数のポジティブ異種移植対照サンプルを含んでなる請求項１５の異種移植誘導の対照スライド。
【請求項１８】
ポジティブ異種移植対照サンプルがＣａｓｋｉ異種移植片を含んでなる請求項１７の対照スライド。
【請求項１９】
ポジティブ異種移植対照サンプルがＨｅＬａ異種移植片を含んでなる請求項１７の対照スライド。
【請求項２０】
ネガティブ異種移植対照サンプルがＣ３３Ａ及びＴ２４細胞株よりなる群から選択される請求項１７の対照スライド。
【請求項２１】
ポジティブ異種移植対照サンプルがＢＴ−４７４異種移植片を含んでなる請求項１７の対照スライド。
【請求項２２】
ポジティブ異種移植対照サンプルがＺＲ７５−１異種移植片を含んでなる請求項１７の対照スライド。
【請求項２３】
ネガティブ異種移植対照サンプルがＭＣＦ７異種移植片を含んでなる請求項１７の対照スライド。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、４／２９／０５出願の米国特許仮出願第６０／６７６，０５６号に対し優先権を請求し、その全体の内容が本明細書に引用により取り込まれている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は概括的に組織学の分野に関し、特に患者のサンプルの組織化学的処理のための組織の対照の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
組織学における対照の使用は必須である。対照は、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、インサイチューのハイブリッド形成（「ＩＳＨ」）及び特別染色（「ＳＳ」）を包含する３種すべての副専門分野（ｓｕｂ−ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ）において使用される。伝統的には、ポジティブ及びネガティブ２種の対照が使用される。組織の対照は通常、実験される患者の組織片又は、知られた、特徴のよく調べられた、記録保存された組織片のいずれかから作製される。
【０００４】
ＩＨＣにおいて、ポジティブ対照試験は、患者組織と同様な固定、エピトープ回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）及び免疫染色プロトコールを使用して処理された、標的抗原を含有することが知られる組織切片上で実施される。別の組織切片をポジティブ対照として使用することができるが、試験切片はしばしば、興味のある抗原を発現する正常な要素（内部対照）を含有する。内部のポジティブ対照はこれらの抗原には許容できるが、内部対照組織が非常に十分に特徴を調べられない限り、常に、内部対照が信頼できないかも知れないという、なんらかの懸念が残る。
【０００５】
患者の組織と同一スライド上に包含されるポジティブ対照切片は、それが患者の試験スライドに一次抗体又は他の重要な試薬を適用するための何かの失敗を認識する補助になるので、最適な方法である、しかし、対照スライドが資格を有する観察者により精査される場合は、実験（バッチコントーロール）中の各抗体に対する染色実験１回につき１個の別のポジティブ対照で十分であるかも知れない。
【０００６】
理想的には、ポジティブ対照組織は癌組織及び／又は感染性疾患でしばしば認められるように低レベルの抗原発現を有する。高レベルの抗原発現を有する正常組織の独占的使用は、誤ったネガティブ結果をもたらして、不十分な感受性の抗体滴定値（濃度）をもたらすかも知れない。
【０００７】
患者組織中の非特異的染色を評価するためにはネガティブ試薬対照を使用する。一次抗体を省き、以下：一次抗体（モノクローナル一次抗体に対する）と同一アイソタイプの非関連抗体、一次抗体（ポリクローナル一次抗体に対する）と同一動物種からの非関連抗体又は染色キット中に包含されるネガティブ対照試薬、のいずれかと置き換えることを除き、患者の組織の別々の切片を、患者の試験スライドと同様な試薬及びエピトープ回収プロトコールを使用して処理する。
【０００８】
別々のネガティブ試薬対照は免疫染色される患者組織の各ブロックにつき実施しなければならない。
【０００９】
ネガティブ試薬対照は理想的には各試薬プロトコール及び抗体回収条件に対して対照になるであろうが、しかし、大型抗体パネルはしばしば、多数の抗体回収法を使用する。こ
のような場合には、適度に最少の対照が、特定の抗体パネルにおける大部分の攻撃的回収法を使用するネガティブ試薬対照試験を実施することができるであろう。
【００１０】
更に、抗原に欠けることが知られた組織の染色を示さないにちがいない、ネガティブ組織対照により、各抗体の特異性を評価することが重要である。ネガティブ組織対照は患者の組織と同様な固定、エピトープ回収及び免疫染色プロトコールを使用して処理される。このような組織の予期されないポジティブ染色は、恐らく、不適切な抗体濃度又は過剰な抗原回収のために、試験が特異性を喪失したことを示す。試験組織の内在する特性はまた「非特異的」染色の原因であるかも知れない。例えば、肝臓又は細尿管のような内在する高いビオチン活性をもつ組織は、ビオチン標識に基づく検出方法を使用すると、ポジティブ染色を刺激するかも知れない。
【００１１】
各抗体に別々のネガティブ組織対照スライドを使用しても、又はそれが標的抗原をもたないことが知られた適当な組織成分を含有する場合は、この目的のために患者の試験スライド自体を使用してもよい。多組織の対照ブロックはポジティブ及びネガティブ組織対照両者として役立つことができる（非特許文献１〜５参照）。
【００１２】
ネガティブ組織対照は問題の抗原を発現しないことが知られている組織っであり、従って染色アッセイが正しく機能している場合は染色を示さないにちがいない。しかし、使用される組織は共通化されていない（ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄａｉｚｅｄ）ので、ポジティブ及びネガティブ対照両者においてそれは完全には特徴を明らかにされず、そのため、常に対照の有用性につきなにか疑念が存在する。
【００１３】
重症複合免疫不全（「ＳＣＩＤ」）マウスはＴ−及びＢ−細胞両者の産生に欠損であるように変異されたマウスの株である。この欠損はそれらの免疫系が通常拒絶したであろう広範な生物学的物質に対してそれらを「宿主（ｈｏｓｔ）」にさせる。特許文献６におけるＢｏｓｍａ等によるその発見以来、ＳＣＩＤマウスは、疾患の生物学を理解し、そして更に処置を評価する両者のためにインビボの治療的組織モデルを集中して作製するために使用されてきた（非特許文献６参照）。主要なモデルの１つは固形腫瘍増殖物、特にヒト由来の腫瘍である。これらの腫瘍は細胞株自体のように、ヒトに由来し（遺伝的に）そしてヒトの患者における実際の腫瘍と同様に増殖するが、この方法で形成される組織にはいくつかの利点が存在する。第１に、該腫瘍はそれらが単一源から誘導される形質転換細胞株から制御された条件下で増殖し、そして正常な宿主中の腫瘍がさらされる、同様な選択的圧力下にはないために、より均一な特徴を有する。第２に、該細胞株は典型的には十分に説明され、多数の特徴を規定させる。第３に、「同様な」腫瘍は多数回増殖し、著しく恒常的サンプルを提供することができる。最後に、患者の信頼性又は同意性に関して、問題がない。細胞株はまた、ほとんどすべての頸部癌の原因のＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）のような感染性物質により死滅させることができる。
【００１４】
必要とされるものは、製造可能性がより大きく、著しく特徴が明白に示され、そしてどんな対照の状況にも最適化することができるように遺伝的操作を受けやすい、より良い組織の対照である。
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｅｏｎｇ  ＡＳ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｋ，Ｌｅｏｎｇ  ＦＪ．Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｙ．Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ；１９９９
【非特許文献２】Ｄａｂｂｓ  ＤＪ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｓｔｏｎｅ（２００２）
【非特許文献３】Ｂｕｒｒｙ  ＲＷ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４８：１６３−１６６（２０００）
【非特許文献４】Ｗｅｉｒａｕｃｈ  Ｍ．，Ｍｕｌｔｉｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂｌｏｃｋ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３０：４４８−４４９（１９９９）
【非特許文献５】Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＴＪ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．９：３−８（２００１）
【非特許文献６】Ｂｏｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０１（５９００）：５２７−３０，１９８３
【発明の開示】
【００１６】
本発明の１つの態様は実質的に同様な染色条件下で患者及び異種移植誘導対照サンプル両者を染色し、そして２種の染色結果を評価して、染色が患者のサンプルに対して有効であったかどうかを決定する工程を含んでなる、組織学のための対照組織として異種移植片を使用する方法である。異種移植片は本発明者が知る限り、組織学において対照として使用されたことはなかった。対照として異種移植片を使用する結果は驚くほど有利である。第１に、細胞株がヒトと同様に増殖し、分化して、実際の組織サンプルの全般的形態を呈する。第２に、同一の形質転換細胞株はＳＣＩＤ又は他の免疫不全マウスにおいて無限回数増殖することができるので、異種移植対照は著しく再生可能であり、著しく製造可能性の高い一貫性のある人工の対照をもたらす。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は概括的に、宿主動物中で哺乳動物の形質転換細胞株からの異種移植片を増殖させ、宿主動物から異種移植片を取り出し、異種移植片を処理し、それにより異種移植組織を包埋媒質中に包埋し、そして最後に基体上に包埋異種移植サンプルを張り付ける工程を含んでなる、組織の対照基体を製造する方法に関する。基体は一般に顕微鏡スライドである。次に異種移植対照スライドを自動化スライド染色装置中で検体サンプルと並べて染色することができ、そしてそれに対して染色の質を比較することができる対照として働くことができる。異種移植対照はまた、徒手染色の対照としても使用することができる。染色が患者の検体に対して有効であったかどうかを決定する工程は、対照において期待された染色度及び型が実現したかどうかを決定するために異種移植対照サンプルの染色度を判定する工程を含んでなる。染色の期待された型（核、膜又は細胞質）及び度合い（０〜４段階）が実験中に取得される場合は、異種移植対照は、染色法及び試薬が適切に作動しており、従って患者の検体における結果が信頼できることを示す。
【００１８】
本発明の更なる態様は、組織学的使用のために準備された少なくとも１種の異種移植対照サンプル及び、その上に少なくとも１種の異種移植対照サンプルが張り付けられたサンプルのスライドを含んでなる、組織化学的使用のための異種移植片誘導対照スライドである。
【００１９】
好ましい態様の説明
本発明の１つの態様は、実質的に同様な染色条件下で患者のサンプル及び異種移植誘導対照サンプル両者を染色し、そして染色が患者のサンプルに対して有効であったかどうかを決定するために二者の染色結果を評価する工程を含んでなる、組織学のための対照組織として異種移植片を使用する方法である。異種移植片は本発明者が知る限り、組織学においてこれまで対照として使用されたことはなかった。対照として異種移植片を使用する結果は驚くほど有利である。第１に、細胞株がヒトと同様に増殖し、分化して、実際の組織サンプルの全般的形態を呈する。第２に、同一の形質転換細胞株はＳＣＩＤマウス又は他の免疫不全マウスにおいて無限回数、増殖することができるので、異種移植対照は著しく
再生可能であり、著しく製造可能性の高い、そして抗原又は遺伝要素を組織中に包埋することができるような遺伝操作を受ける、一貫性のある人工の対照をもたらす。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は概括的に、宿主動物中で、腫瘍形成過程又は感染性物質のいずれかにより不死化される哺乳動物の形質転換細胞株からの異種移植片を増殖させ、宿主動物から異種移植片を取り出し、異種移植片を処理し、それにより異種移植組織を包埋媒質中に包埋し、そして最後に包埋異種移植サンプルを基体上に張り付ける工程を含んでなる、組織対照基体を製造する方法に関する。基体は一般に顕微鏡スライドである。次に異種移植対照スライドを自動化スライド染色装置中で検体サンプルと並べて染色することができ、そしてそれに対して染色の質を比較することができる対照として働くことができる。異種移植対照はまた、徒手の染色の対照としても使用することができる。染色が患者の検体に対して有効であったかどうかを決定する工程は、対照において期待された染色の度合い及び型が実現したかどうかを決定するために異種移植対照サンプルの染色度を判定する工程を含んでなる。染色の期待された型（核、膜膜又は細胞質）及び度合い（０〜４段階）が実験中に取得される場合は、異種移植対照は、染色法及び試薬が適切に作動しており、従って患者の検体における結果が信頼できることを示す。
【００２１】
本発明の更なる態様は、組織学的使用のために調製された少なくとも１種の異種移植対照サンプル及び、その上に少なくとも１種の異種移植対照サンプルが張り付けられたサンプルのスライドを含んでなる、組織化学的使用のための異種移植片誘導対照スライドである。
【００２２】
以下の定義は本明細書中に使用され、以下の意味を与えることができる。
定義
ＤＮＡ−デオキシリボ核酸。生存生物の遺伝子構造をコードする分子的物質。
【００２３】
Ｈ＆Ｅ−当業者に顕微鏡検査により形態を区別させるヘマトキシリン及びエオシンを使用する組織の化学基剤染料の染色。
【００２４】
宿主−異種移植物を支持し、増殖させることができるいずれかの生物学的実体、例えば、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス又は他の免疫不全宿主動物。
【００２５】
ＨＰＶ−ヒトパピローマウイルス。
【００２６】
ＩＨＣ−免疫組織化学。病理学的状態を診断しそして／又は処理する目的のための形態学的構造物における特定の検体（典型的にはタンパク質様の性状）の存在又は不在を検出するために使用される抗体に基づくアッセイシステム。
【００２７】
ＩＳＨ−インサイチューのハイブリッド形成。病理学的状態を診断しそして／又は処理する目的のための形態学的構造物における特定の検体（典型的には遺伝性、転写又は翻訳の性状）の存在又は不在を検出するために使用されるＤＮＡ又はＲＮＡプローブに基づくアッセイシステム。
【００２８】
保存／固定−組織がもはや生存していない時の分解を防止するために組織サンプルを処理する化学的方法。保存の例は中性の−バッファーホルマリン又は亜鉛−ホルマリン中のホルマリン固定あるいはメタノール又はエタノール基剤の混合物中のアルコール固定である。
【００２９】
一次細胞株−インビトロで限定された増殖だけが可能であり、そして無限に増殖するようには修飾されていない天然源から取り出した細胞。
【００３０】
処理−病理学実験室で現在定常的に実施されている、そして将来使用されるかも知れない、異種移植検体の試験のための収穫、保存、包埋、コア作製、切片作製、固定及び調製（ｐｒｅｐａｒｉｎｇ）に関与するありとあらゆる活動を説明するために使用される。
【００３１】
ＲＮＡ−リボ核酸。処理のためにＤＮＡ中でコードされる情報を転写して細胞に移動させるために生体により使用される分子。
【００３２】
試料台−組織の試験及びその後の分析を許すために組織サンプルを固定するために使用されるいずれかの基材又は媒質。顕微鏡のスライドが典型的である。
【００３３】
ＳＳ−特別染料。当業者に対する正常な及び病理学的特徴物の識別を許す細胞及び継代細胞（ｓｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）レベルにおいて形態学的構造物を優先的に染色するために、組織切片の染色に使用される化学色素又は色素の組み合わせ物。例はアルシアンイエロー、アルシアンブルー、ギームザ、コンゴレッド、ムチカルミン、ジョーンズライトグリーン、等を包含する。
【００３４】
試験−当業者による顕微鏡検査により組織サンプルの病理学的特徴を決定するために使用されるありとあらゆる方法。今日使用される例はＨ＆Ｅ、ＩＨＣ、ＩＳＨ及びＳＳである。試験は徒手で又は自動化装置を使用することにより実施することができる。典型的には試験は試験サンプルにある型の染色又は色彩変化をもたらす。例はＨ＆Ｅ染料において使用されるような化学色素あるいは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のような検体の存在又は不在を決定するために酵素基剤の反応物を使用する比色アッセイである。
【００３５】
形質転換細胞株−インビトロで無限に増殖するように修飾された細胞の均一なそして／又はクローンの集団。修飾は感染性ウイルス物質によるか又は新生細胞増殖過程によるかも知れない。それらは例えば、ヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス、等を包含する哺乳動物源であることができる。
【００３６】
異種移植片−宿主動物中に移植されたもう１種の動物又は種からのいずれかの組織又は組織の型。組織は同一の又は異なる種からのものでよく、限定はされないが、固形の塊又は個々の細胞からなる、限定はされないが、１種又は複数の異種移植片の最終形態を含む形質転換された及び／又は一次細胞株からなることができる。
【００３７】
方法
異種移植法を使用して対照サンプルを作製し、診断試験による使用のためそして顕微鏡検査による分析のためにそれを準備する方法は以下に説明され、図１〜３に示される。
【００３８】
異種移植対照スライドを作製する方法の概括的説明が、本発明の概略を与えるために図１に示される。図１の左上部に特に注目すると、インビボで増殖することができる細胞又は組織（細胞の集合物）１２を宿主１１中に注入することにより異種移植組織を生成する。細胞は形質転換細胞株から誘導しても又は一次細胞株であってもよい。細胞株は宿主動物と同一の遺伝背景をもっても又は異なってもよい。この相異は１代の遺伝的突然変異のように小さいものでも又は宿主及び異種移植片が別の種からであるほど十分大きいものであってもよい。細胞株は、細胞の型が同様な条件下で異種移植組織に増殖できる限り、２種以上の細胞の型からなることができる。
【００３９】
異種移植組織１０は限定はされないが、細胞（腫瘍）の固形塊であっても又はサンプルを生成する目的のために収集され、そして一緒に凝集された（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）個々の細胞であってもよい。固形腫瘍の一例は、未分化ヒト乳癌から誘導されたＢＴ−４７
４のような付着した形質転換細胞株がＳＣＩＤマウスにおいて増殖される時に形成される塊又は物体である。注入される細胞は組織の固形塊に増殖し、それが次に外科的に切除される。集合した異種移植細胞の例は、リンパ源の一次細胞が宿主動物の血中に注入され、後に採取される時である。異種移植細胞は宿主血液細胞から分離され、保存される。保存された異種移植細胞集合物は当業者に周知の定常的組織学的方法を使用して包埋し、処理される。
【００４０】
再度図１において、異種移植組織は所望の程度に増殖されて、宿主から外科的に切除され１３、固定剤１４中に保存され、更に処理される。固定は当業者に周知の定常的組織学的方法と一致したいずれかの適当な方法で実施される。異種移植組織が適当に固定された後、パラフィンワックス１６のような包埋媒質中に包埋される。これは、自動化組織処理装置１５を包含するいずれかの定常的組織学的方法を使用して実施することができる。次に包埋異種移植対照サンプル１６を試験のために分配する（ａｐｐｏｒｔｉｏｎ）。典型的には、分配は、マイクロトーム又は同様な装置を使用して薄片に切断し、そしてガラスのスライド１７上に切片を浮かせ、その上で、切片が焼き付け（ｂａｋｉｎｇ）又は他の定常的組織学的実験室の方法により接着される。分配のもう１つの例は，その詳細は当業者に周知の、ガラススライド上に異種移植組織の単層のスメアを作製することである。
【００４１】
この時点で、異種移植ブロックが染色のための対照として有用であると考えられるものから組織切片を切断するために使用することができるかも知れないが、異種移植片は不均一であるため、最初にスクリーニングしなければならない。より最適な方法は、それから切片を切除するための異種移植の「マルチブロック」を形成することである。受け入れマルチブロックは単に、その中に配置する包埋される対照コアのための、１組の空の受け入れウエルを形成するためにパラフィンコアを除去されたパラフィンブロックである。それらの所望される特徴に対して異種移植組織の部分が選択され、次に異種移植片の望ましい部分からコアを取り出され、マルチブロックのウエル中に入れられる。
【００４２】
第１の工程は異種移植片に「地図を描く（ｍａｐ）」ことである。これは、異種移植組織の固定された薄い切片が「望ましい特徴」につき、分析され、試験されて、どの領域又は部分が許容できる試験結果を有するかを決定することを必要とする。「望ましい特徴」はそれらに限定はされないが、異種移植組織のどの領域が異種移植対照スライド中への使用に最適であるかを明白にする、Ｈ＆Ｅ、ＩＨＣ、ＩＳＨ及びＳＳのような試験により決定される。「望ましい特徴」はそれらに限定はされないが、壊死の不在、正しい形態、存在する最少の宿主組織をもつ異種移植組織の領域、最適な固定及び、化学染料によるかあるいはＩＨＣ又はＩＳＨのような酵素基剤の比色アッセイを使用することによるかに拘わらず、適当な染色、のような性質を包含すると考えられる。適当な染色の例はＨｅＬａ異種移植組織におけるＨＰＶに対するポジティブＩＳＨシグナル、又はＧＩＳＴ  ８８９異種移植組織におけるｃ−キットに対する３＋のポジティブＩＨＣ染色、又はＭＣＦ７異種移植組織におけるｈｅｒ−２に対するネガティブ（０＋）ＩＨＣ染色である。
【００４３】
図２において、異種移植片のこれらの望ましい領域が識別された後に、コア作製された異種移植サンプル１８を、前以て穴を明けた受け入れパラフィンブロック２０中に入れる。異種移植サンプルのコアは徒手で又は、包埋された異種移植組織サンプル中に、それを貫通して切断するように規定サイズの穴明け機１９を使用することにより微細アレー装置のような計測器（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用して形成することができる。穴明け機は一連の直径の、種々の形態をもってもよく、そして金属、プラスチック又は、固定媒質の有効な貫通を許すであろう他の硬い物質で製造されもよい。異種移植サンプルのコアは規定されたウエルの前以て穴を空けた受け入れブロック中に移した。異種移植サンプルコアの位置及び識別が知られるように、多数のコア又は小片をこの準備された受け入れブロック（マルチブロック）１７中に配置することができる。最終段階は通常、コア
がその場所で融解して均一なマルチブロックを形成するように十分に、パラフィンを軟化させるためにマルチブロックを加熱する工程を伴う。
【００４４】
これらのコアは試験結果の評価を容易にするであろう一連の特徴を提供する。例えば、マルチブロックは一連のＩＨＣ染色強度をもち、そして与えられる試験に対して期待される結果の範囲を規定するいくつかのコア（ｃｏｒｉｎｇｓ）からなることができる。
【００４５】
図３において、異種移植対照スライドを作製するために、異種移植マルチブロックから切片を切断し、スライド１７上に固定する。図３ａはそれらの上に異種移植対照１８を配置された４種の異なる顕微鏡スライドを示す。最初のスライドはスライド上に縦列に配列された４種の異なる対照を示す。第２のスライドは第１に似ているが、２個の縦の対照切片を示す。第３のスライドは患者のサンプルのためにスライド上に空間を許すためにスライドの上部に配列された３個の対照を示し、そして第４は第３に似ているが、４個の対照を使用している。患者のサンプルと一緒の第３及び第４のスライドの使用はできるだけ理想に近い、良好な「オン−ボード」対照を提供する。異種移植対照スライドはまた、誤ったポジティブ及び誤ったネガティブ試験結果の発生率の決定を容易にする。
【００４６】
実際の試験条件は、試験のためのサンプルを準備するための脱パラフィン化、抗原回収（ｒｅｔｒｉｖａｌ）又は細胞条件調整を包含する。ＩＨＣ及び／又はＩＳＨのような診断試験は、試験サンプル及び異種移植片対照サンプル上で実施される。試験は徒手で又は自動化システム上で実施することができる。異種移植対照スライドは図３ａに示すように患者のサンプルと別にしかし同様に実施するか又は、患者のサンプルを図３ｂに示すように異種移植対照と同一スライド上に固定し、そして同一条件下で一緒に試験することができる。次に各サンプルの結果が病原学又は組織学分野の専門家により顕微鏡検査を使用して比較される。
【００４７】
異種移植対照サンプルは、期待値からずれたいずれかの試験結果が診断試験による失敗を示すであろうように、前以て規定され、特徴を明らかにされる。例えば、ポジティブであることが知られる異種移植対照の染色又は反応の欠如は、誤ったネガティブ結果を示すと考えられる。反対に、知られたネガティブサンプル（０＋）における染色事象又は反応は誤ったポジティブ結果を示すであろう。異種移植対照スライドの結果は当業者に診断試験の性能及び有効性を評価させ、そして結果が許容できるか又は試験を反復する必要があるかどうかを決定させる。
【００４８】
異種移植対照の結果のもう１つの使用は、試験サンプルの結果と、対照中に存在する結果の強度又は型を比較することであろう。この例は、対照サンプルが、４種の各サンプル中に存在する一連のＩＨＣ染色の強度（例えば、０、１＋、２＋、３＋）をもつ場合であろう。患者のサンプルの染色強度がこの範囲に比較され、応答率が決定される。強度レベルを使用して診断し、そして／又は予後及び、提示される病原の処置を決定する。例えば、乳癌患者の亜母集団において、細胞膜中にＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の過剰発現が見られる場合、それはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）治療を適用することができるという兆しであることは周知である。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）からの抗Ｈｅｒ−２  ＣＢ１１抗体を使用するＩＨＣ試験において、患者のサンプルがＨｅｒ−２／ｎｅｕアッセイで３＋の応答を示す場合は、患者は恐らくＨＥＲＣＥＰＴＩＮ治療の候補者であろう。しかし、患者のサンプルが対照に比較して０又は１＋のみの読み取り値を示す場合は、閾値は合わないかも知れない。
【００４９】
異種移植対照サンプルは、他の製造された対照サンプルよりも、より天然の又は自然の形態の、そして従って患者の材料をよりよく表わす対照サンプルを提供することにより、従来の対照サンプルより大きな利点を有する。異種移植対照はまた、著しく特徴が明らか
であり、組成が均一で、再生可能である利点を有し、やがては従来の方法で製造することができる。患者のサンプルが対照サンプルとして使用されていた時は、それらは量及び／又は存在が限定され、均一性に欠け、そして特徴がよく示されない。更に患者の同意及び信頼性の必要から生ずる制約が存在する。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は本発明の態様を示すことが意味されるが、どんな方法でもそれを限定することは意図されない。
【００５１】
実施例１−ＨＰＶ異種移植組織の対照の増殖及び特徴付け
インサイチューのＨＰＶアッセイのための異種移植対照スライドの例は、４種の異なる量の組み込みＨＰＶ  ＤＮＡ：ＣａＳｋｉ（２５０〜５００コピーのＨＰＶタイプ１６）、ＨｅＬａ（２５〜５０コピー、ＨＰＶタイプ１８）、ＳｉＨａ（１〜２コピー、ＨＰＶタイプ１６）及びＴ−２４（０コピー）を含有する異種移植組織の４個のコアを含有するスライドである。異種移植対照スライドは標準的実験室の方法（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００）を使用して形質転換された頸部（ＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ及びＳｉＨａ）及び膀胱癌（Ｔ２４）細胞株を増殖させることにより作製した。ＣａＳｋｉ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃１６０００−０４４）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃ＳＨ３０２３７．０１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，Ｃａｔ．＃２５−０００−ＣＩ）、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃２５−０３５−ＣＩ）及び１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃１５１４０−１２２）を添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地プラスＬ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，Ｃａｔ．＃１０−０４０−ＣＶ）中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃ＳＨ３０２３８．０１）、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加されたイーグルの最少必須培地プラスＬ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，Ｃａｔ．＃１０−０１０−ＣＶ）中で増殖させた。ＳｉＨａ細胞は１０％ＦＢＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加したイーグルの最少必須培地プラスＬ−グルタミン中で増殖させた。Ｔ−２４細胞は１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加されたＭｃＣｏｙの５ａ培地プラスＬ−グルタミン（ＭｅｄｉａＴｅｃｈ，Ｃａｔ．＃１０−０５０−ＣＶ）中で増殖させた。細胞株は３７℃で５％ＣＯ２を含有する湿った条件下で維持した。細胞を９０〜１００％の密集度に増殖させる。付着細胞を離すためにＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．＃２５２００−０７２）を含むトリプシン（０．２５％）を添加した。細胞（９０〜１００％生存率）を計測し、１０×１０６細胞／２００μｌの濃度の滅菌１Ｘ濃厚ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ．＃ＳＨ３００２８）に再懸濁させる。
【００５２】
Ｐａｉｎｅ−Ｍｕｒｒｉｅｔａ，ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２０９−２１４（１９９７）に記載のように発育させ、維持されたＳＣＩＤマウスの脇腹に腫瘍細胞（２００μｌ）を皮下注射（ｓ．ｃ．）する。腫瘍発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）後、腫瘍の容量（ｃｍ２）を式に従って算定する（腫瘍の幅２×腫瘍の長さ／２）。腫瘍が５００ｍｍ２の大体のサイズに達すると、マウスを殺し、腫瘍を外科的に切除する。腫瘍を１０％の中性のバッファーホルマリン（ＶＷＲ，Ｃａｔ．＃ＶＷ３２３９）中に室温で（ＲＴ）２４時間入れる。固定腫瘍を組織カセットに入れ、Ｃａｒｓｏｎ，Ｆ．，Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ  Ｓｅｌｆ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｘｔ，ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ（１９９７）に記載の標準の組織学的方法を使用してパラフィン中に処理する。
【００５３】
パラフィン包埋異種移植組織をガラスのスライド（ＶＷＲ，Ｃａｔ．＃４８３１１−７０３）上に薄い切片に切断し、使用のために特徴を調べる。スライドをＨ＆Ｅを使用して染色して、あらゆる壊死部分の形態学的型及び位置を決定する。更に、異種移植組織がどのように染色するかを決定するために、各２種のＨＰＶポジティブ及びネガティブプローブによる、自動化インサイチューＨＰＶアッセイを使用して染色した。更に異種移植組織を、腫瘍のどの領域がヒトに由来するかそしてどれがマウスに由来するかを確認するために、ヒトに見いだされる著しく反復性のＤＮＡ配列のａｌｕに対してプローブで染色した。種々に染色したスライドを使用して、Ｈ＆Ｅスライド上のコア作製のための領域が特定される。
【００５４】
実施例２−マルチブロック構造物
異種移植対照マルチブロックを作製するために、最初にミクロアレイヤー装置を使用して受け入れブロックを作製する。受け入れブロックは受け入れブロックホールダー中に上を向けて配置された。組織ミクロアレイヤー及び２ｍｍのコアを使用して、第１の組織片が包埋されるべき正確な領域に穿孔機を配置した。受け入れブロックからコアを取り出した。受け入れブロックから４個のパラフィンコアが取り出されるまでコア作製法を繰り返した。受け入れブロックをミクロアレイヤーから外し、コア作製される異種移植組織ブロックと入れ替えた。Ｈ＆Ｅスライドを使用し、異種移植組織をコア作製される異種移植組織ブロック上の正確な地点に穿孔機と整列させた。異種移植組織ブロックはコアを作製され、穿孔機から離された（ｒｅｌｅａｓｅｄ）。異種移植組織ブロックを受け入れブロックと置き換え、そして受け入れブロックの穴が異種移植組織コアを伴う穿孔機に整列した。異種移植組織コアを受け入れブロック穴中に射出した。これらの工程を４個の組織サンプルすべてが受け入れブロック中のこれらの指定領域（ブロックマップによる）中に配置されてマルチブロックを形成するまで反復する。完成したマルチブロックを一部融解してブロックとコアを単一の物体に融合させる。融合したマルチブロックを室温（ＲＴ）で硬化させ、薄い切片作製の準備ができた。薄い切片はＣａｒｓｏｎ，Ｆ．（１９９７）に記載の標準法を使用してガラススライド薄切りで準備した。
【００５５】
実施例３−ＶｅｎｔａｎａのＨＰＶアッセイによる異種移植対照の実験
図４Ａ〜ＣはＨＰＶ  ＤＮＡプローブを使用してＩＳＨアッセイにより試験された３枚のＨＰＶ異種移植対照スライドの顕微鏡写真である。ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｒ）連続自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して、ＨＰＶ異種移植対照を含有するスライドをＩＮＦＯＲＭ（Ｒ）ＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６  ＤＮＡプローブ（ＰＮ７８０−２８３８）を使用して染色し、ＩＳＨ  ｉＶｉｅｗ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＮ７６０−０９２）で検出し、そしてＩＳＨ  Ｒｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎで対比染色した。ＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ１６プローブはリスクの大きいＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８及び６６に対して特異性をもつＤＮＡプローブのカクテルである。ＣａＳｋｉ（図４ａ）及びＨｅＬａ（図４ｂ）の異種移植組織は核組み込みＨＰＶ  ＤＮＡによりポジティブ染色（青色のパンクチュエート模様）を示す。ネガティブ染色（青色のパンクチュエート模様がない）はＴ２４（図４ｃ）の異種移植片に見られる。
【００５６】
実施例４−ＶｅｎｔａｎａのＨｅｒ−２／ｎｅｕアッセイによる異種移植対照の実験
免疫組織化学のＨｅｒ−２アッセイのための異種移植対照スライドのもう１つの例は、以下の形質転換ヒト乳癌細胞株：すべてＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手できる、ＢＴ４７４（３＋染色強度）、形質転換癌（２＋染色強度）、ＺＲ−７５−１（１＋染色強度）及びＭＣＦ７（０＋染色強度）、中の４種の異なるレベルのＨｅｒ−２タンパク質を含有する異種移植組織の４個のコアを含有するスライドである。異種移植対照スライドは標準的実験室の方法（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２０００中に記載のような）を
使用して形質転換乳癌細胞株を増殖させることにより作製した。ＢＴ−４７４細胞を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加されたＨｙｂｒｉ−Ｃａｒｅ培地プラスＬ−グルタミン（ＡＴＣＣ，Ｃａｔ．＃４６Ｘ）中で増殖させた。ＺＲ７５−１細胞を１０％ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１％のペニシリンストレプトマイシンを添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地プラスＬ−グルタミン中で増殖させた。ＭＣＦ７細胞を１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２０ｕｌ／ｍｌのインスリン及び１％ペニシリンストレプトマイシンを添加されたイーグルの最少必須培地プラスＬ−グルタミン中で増殖させた。細胞株を３７℃で５％ＣＯ２含有の湿った条件下で維持した。細胞を９０〜１００％の密集度に増殖させる。付着細胞を離すためにＥＤＴＡを含むトリプシン（０．２５％）を添加した。細胞（９０〜１００％生存率）を計測し、１０×１０６細胞／２００μｌの濃度の滅菌１Ｘ濃厚ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳに再懸濁させる。前記と同様に腫瘍を増殖させ、処理し、異種移植マルチブロックを前記と同様な方法で集めた。
【００５７】
Ｈｅｒ−２異種移植対照スライドは、使用者に感受性及び発現レベル（染色強度の範囲）を調節させ、処置を決定させ（２＋を超える染色強度をもつ場合に、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮによる処置が適用される）、疾病の予後（増幅されたＨｅｒ−２は多数の処置に抵抗性である悪性癌を示す）及び過剰染色（ネガティブサンプル）を決定させる。異種移植対照サンプルのいずれかが規定された強度に染色されない場合は、当業者は患者のサンプルの可能な誤診を警告される。失敗の種類はまた、機能不全の問題解決及び是正を容易にする診断試験における機能不全の原因の表示であることができる。例えば、ネガティブサンプルがポジティブに見える場合は、これは試験によるすすぎの問題があったか又は誤った型の試験が使用されたことを示すかも知れない。
【００５８】
図５は抗−Ｈｅｒ−２抗体４Ｂ５（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用するＩＨＣアッセイと平行して試験されたＢＴ４７４異種移植対照スライドの顕微鏡写真である。ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｒ）連続自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して、Ｈｅｒ−２異種移植対照を含有するスライドをＰＡＴＨＷＡＹ（Ｒ）抗−Ｈｅｒ−２抗体４Ｂ５（Ｖｅｎｔａｎａ）を使用して染色し、ｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ  ＰＮ７６０−０９１）で検出し、ヘマトキシリンで対比染色した。図５ａは、ＢＴ−４７４異種移植組織がポジティブ染色（褐色／ＤＡＢ細胞膜）を示すことを表わす。図５ｂはネガティブ染色（すなわち褐色の模様がない）がＭＣＦ７（ｂ）異種移植組織中に見られることを示す。
【００５９】
実施例５−スリーインワンＨＰＶ対照スライド
図６は実際の患者のサンプルを包含する２枚の染色されたスリーインワンＨＰＶ対照スライドの写真である。スライドの上部にある異種移植対照コアはＣａＳｋｉ（左側、２５０〜５００コピー）、ＨｅＬａ（中央、２５〜５０コピー）及びＣ３３ａ（右側、０コピー）の異種移植片からなる。患者の試験サンプル（外科的切除頸部組織）はスライド中央のコアの下部に配置される。左側のスライドはネガティブＨＰＶ  ＩＳＨプローブ（バッファーのみ）で染色され、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで対比染色する。Ｃ３３ａ細胞株はＰＣＲによりＨＰＶネガティブであることが知られているヒト頸部癌株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３１）である。
【００６０】
図６Ａ〜ＤはＩＳＨネガティブ対照プローブで染色された、連続順の上部３個の対照細胞株及びサンプルの４０Ｘ倍率の拡大図を示す。患者のものを包含するすべてのサンプルが青色のパンクチュエート染色をもたず、それは試験が正確に実施され、システムが期待どおり機能していることを示す。
【００６１】
図６Ｅ〜ＨはＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６  ＤＮＡプローブで染色された、連続順の上
部３個の対照細胞株及びサンプルの４０Ｘ倍率の拡大図を示す。図６Ｅ（ＣａＳｋｉ）は期待通りにポジティブＨＰＶ  ＤＮＡを示す大量の青色のパンクチュエート染色を表わす。図６Ｆ（ＨｅＬａ）は細胞当たり２５〜５０コピー存在するＨＰＶ  ＤＮＡを示す、中程度の青色のパンクチュエート染色を表わす。図６Ｇ（ネガティブ対照、Ｃ３３Ａ）はネガティブ細胞株に期待されるように、青色のパンクチュエート染色をもたない。これらの結果はＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６試験及びＢｅｎｃｈＭａｒｋ（Ｒ）連続自動染色装置が期待通りに実施されたことを示す。患者の試験サンプルはまた、ＨＰＶによる感染を示す頸部の上皮細胞に青色のパンクチュエート染色を含有する。
【００６２】
これらのスライドはＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｒ）連続自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して作製した。スリーインワンＨＰＶ異種移植対照スライドをＩＮＦＯＲＭ（Ｒ）ＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６  ＤＮＡプローブ（ＰＮ７８０−２８３８）又はＩＳＨネガティブ対照プローブのいずれかを使用して染色し、ＩＳＨ  ｉＶｉｅｗ  Ｂｌｕｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＮ７６０−０９２）で検出し、ＩＳＨ  Ｒｅｄ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎで対比染色した。ＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６プローブはリスクの大きいＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８及び６６に対して特異性をもつＤＮＡプローブのカクテルである。ＩＳＨネガティブ対照プローブはプローブバッファーのみからなり、ＤＮＡを含まない。
【００６３】
実施例６−スリーインワンＨｅｒ２対照スライド
図７は２枚の染色スリーインワンＨＥＲ２対照スライドの写真である。上部のスライドはウサギのネガティブ対照抗体（ウサギＩｇＧ）（ＶｅｎｔａｎａＰ／Ｎ  ７６０−１０２９）で染色し、（ヘマトキシリン及び青色試薬）で対比染色した。下部のスライドは抗Ｈｅｒ２ウサギモノクローナル抗体４Ｂ５（ＶｅｎｔａｎａＰ／Ｎ  ７６０−２９９６）で染色する。図７Ａ〜Ｃは上部スライドからの３種の異種移植対照細胞株の４０Ｘ倍率の顕微鏡写真である。図７Ｄ〜Ｆはこの場合はポジティブ染色を示す同様な３種の細胞株対照の４０Ｘ倍率の顕微鏡写真である。
【００６４】
スライドの上部に配置された異種移植対照コアはＢＴ−４７４（左側）、ＺＲ７５−１（中央）及びＭＣＦ７（右側）の異種移植片からなる。上部のスライドはウサギのネガティブ対照抗体（ウサギＩｇＧ）で染色し、ヘマトキシリン及び青色試薬で対比染色する。下部のスライドはウサギ抗−ＨＥＲ２（４Ｂ５）で染色し、ヘマトキシリン及び青み試薬で対比染色する。
【００６５】
図７Ａ〜Ｃはウサギネガティブ対照抗体で染色された、連続順の３種の対照細胞株の４０Ｘ倍率の拡大図を示す。すべてのサンプルが褐色染色をもたず、試験が正確に実施され、システムが期待どおり機能していることを示す。
【００６６】
図７Ｄ〜Ｆはウサギ抗−Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（４Ｂ５）で染色された、連続順の３種の対照細胞株の４０Ｘ倍率の拡大図を示す。図７ＤはポジティブＨＥＲ２タンパク質の存在を示す大量の褐色の核膜染色を表わす。図７Ｅはより少量レベルのＨｅｒ２タンパク質を示す少量の褐色核膜染色を表わす。図７Ｆはネガティブ細胞株で期待通りに褐色の染色をもたない。これらの結果は、ＨＥＲ２試験及びＢｅｎｃｈＭａｒｋ（Ｒ）連続自動染色装置が期待通りに実施されたことを示す。
【００６７】
これらのスライドはＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（Ｒ）連続自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して作製された。スリーインワンＨＥＲ２異種移植対照スライドはウサギ抗−ＨＥＲ２（４Ｂ５）（ＰＮ７８０−２８３８）又はウサギネガティブ対照抗体（Ｐ／Ｎ７６０−１０２９）のいずれかを使用し
て染色し、ｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＮ７６０−０９１）で検出し、そしてヘマトキシリン及び青み試薬で対比染色した。抗−ＨＥＲ２（４Ｂ５）抗体は、プロテアン様Ｔｒｉｓ−基剤バッファー中で適当な濃度に希釈されたＨＥＲ２タンパク質に特異的なウサギモノクローナル抗体である。ウサギネガティブ対照抗体はプロテアン様トリス基剤のバッファー中に適当な濃度に希釈された非免疫ウサギからのポリクローナル抗体である。
【００６８】
本発明は具体的な態様に関して説明されてきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、種々の変更、省略及び／又は追加を実施することができ、そして同等物をそれらの要素と置き換えることができることは当業者には理解されるであろう。更に、本発明の範囲から逸脱せずに、本発明の説に対して特定の状況又は物質を適合させるために多数の修飾を実施することができる。従って、本発明は、本発明を実施するために想定される最良の方法として開示された特定の態様に限定されず、本発明は付記の請求項の範囲内に入るすべての態様を包含するであろうことが意図される。本明細書に参照されたいずれの刊行物又は特許もそれらの全体を引用により取り込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ヒト誘導形質転換細胞によるＳＣＩＤマウスの接種で開始する、異種移植組織を製造する工程の絵による説明である。
【図２】異種移植ブロックのコア作製で開始し、異種移植マルチブロックの形成で終結する図１の連続工程の絵による説明である。
【図３ａ−３ｂ】いくつかの顕微鏡スライドを示し、図３ａにおいて、それらの上に異種移植対照組織を配列された４枚のスライドを示し、そして図３ｂはそれらの上に更に患者の検体を配列された２枚のこれらのスライドを示す。
【図４ａ−４ｃ】ＨＰＶ  ＤＮＡプローブを使用してＩＳＨアッセイにより試験されたＨＰＶ異種移植対照スライドの顕微鏡写真である。ＣａＳｋｉ（ａ）及びＨｅＬａ（ｂ）の異種移植組織はポジティブ染色（青色のパンクチュエート模様）を示す。ネガティブ染色（青色のパンクチュエート模様なし）はＴ２４（ｃ）の異種移植片に見られる。
【図５Ａ−５Ｂ】抗Ｈｅｒ−２ウサギモノクローナル抗体４Ｂ５を使用してＩＨＣアッセイにより試験されたＨｅｒ−２異種移植対照スライドの顕微鏡写真である。ＢＴ−４７４（ａ）の乳癌異種移植組織はポジティブ染色（褐色の細胞膜）を示す。ネガティブ染色（褐色の模様なし）はＭＣＦ７（ｂ）の異種移植組織に見られる。
【図６】患者のサンプルを含有し、ＨＰＶ  ＤＮＡプローブを使用してＩＳＨアッセイにより試験されたＨＰＶ異種移植対照スライドの写真である。ネガティブに染色されたスライドが左側に示され、青色のパンクチュエート模様を示さない。右側のスライドはＩＮＦＯＲＭ（Ｒ）  ＨＰＶ  Ｆａｍｉｌｙ  １６プローブでポジティブに染色され、ネガティブコア（Ｃ３３ａ）を除きすべてのサンプルで青色のパンクチュエート模様を示す。
【図６Ａ−６Ｈ】図６からの２枚のスライドの顕微鏡写真（２０Ｘ）である。図６Ａ〜６Ｄはそれぞれ、図６のネガティブに染色された左側のスライドからのＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ及びＣ３３ａの異種移植対照コア及び患者の検体である。図６Ｅ〜６Ｈはそれぞれ、ポジティブに染色された右側のスライドのＣａＳｋｉ、ＨｅＬａ、Ｃ３３ａ及び患者の検体の顕微鏡写真である。
【図７】抗Ｈｅｒ−２ウサギモノクローナル抗体４Ｂ５を使用してＩＨＣアッセイにより試験されたＨｅｒ−２異種移植対照スライドの写真である。ＢＴ−４７４（下のスライド）乳癌異種移植組織はポジティブ染色（褐色の細胞膜）を示す。
【図７Ａ−７Ｆ】図７からの２枚のスライドの顕微鏡写真（２０Ｘ）である。図７Ａ−７Ｃはそれぞれ、図７のネガティブに染色された上側のスライドからのＢＴ４７４、ＺＲ７５−１及びＭＣＦ７の異種移植対照コアである。図７Ｄ−７Ｆは図７のポジティブに染色された下側のスライドからのそれぞれ、ＢＴ４７４、ＺＲ７５−１及びＭＣＦ７の異種移植対照コアである。
【図１】
2008541019.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【国際調査報告】
2008541019.tif 000028
2008541019.tif 000029
2008541019.tif 000030