(57)【要約】  (a)カルレティキュリンもしくはそのドメインおよび(b)無毒化形態のヒトパピローマウイルス癌タンパク質E7もしくはE6などの抗原をコードする配列を含む新規核酸ベクター、ならびに抗原特異的免疫応答を誘導し、腫瘍の発達を治療または予防するためにそのようなベクターを使用する方法を、開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において発現可能な発現ベクターであり、かつキメラまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
(a)カルレティキュリン(CRT)またはその生物学的に活性な相同体、ドメインもしくは断片である第1のポリペプチドをコードする第1の核酸配列であり、ここで該相同体、ドメインもしくは断片が、(i)in vitroでペプチドとの複合体を形成する；(ii)細胞中で発現された場合、新生糖タンパク質の折畳みおよび組立てに関与する、(iii)細胞中で発現された場合、抗原プロセッシングに関連する輸送体により小胞体中に輸送されるペプチドと結合する、ならびに／または(iv)血管新生を阻害する、前記第1の核酸配列、
(b)前記第1の核酸配列に読み枠を合わせて連結され、かつ抗原ポリペプチドまたはペプチドをコードする第2の核酸配列、ならびに
(c)それらに機能し得る形で連結された、前記真核細胞中で活性なプロモーターおよび、必要に応じて、前記細胞中で前記核酸の発現を増強する1個以上の調節エレメント、
を含む、前記核酸分子。
【請求項２】
前記抗原ペプチドが、MHCクラスIタンパク質に結合するエピトープを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第1のポリペプチドが、前記ポリペプチドの生物学的に活性なドメインまたは断片をコードする配列番号10またはその断片によりコードされる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記第1の核酸配列が、(a)N-CRT、(b)P-CRT、(c)S-CRTおよび(d)該(a)、(b)もしくは(c)の生物学的に活性な変異体からなる群より選択される1個以上のCRT断片またはドメインをコードするが、完全長CRTをコードしない、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記第1の核酸配列が、N-CRT(配列番号14)、P-CRT(配列番号15)、S-CRT(配列番号16)またはN-CRT、P-CRTもしくはS-CRTの相同体をコードする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記第1の核酸配列が、N-CRT(配列番号14)をコードする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記第1の核酸配列が、N-CRT(配列番号14)、P-CRT(配列番号15)、S-CRT(配列番号16)のうちの任意の2つ以上またはその任意の組合せをコードする、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記抗原が、病原性生物、細胞、もしくはウイルス上に存在するか、またはそれらのエピトープと交叉反応するものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記ウイルスが、ヒトパピローマウイルスである、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記抗原が、それぞれ配列番号3もしくは配列番号6の配列を有するHPV-16のE7もしくはE6ポリペプチド、読み枠を合わせて連結されたE6とE7の組合せ、E6もしくはE7の抗原性断片、またはE6もしくはE7の非発癌性突然変異体もしくは変異体、またはE6およびE7の非発癌性突然変異体もしくは変異体の読み枠を合わせて連結された組合せである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
HPV-16 E7ポリペプチドが、前記E7ポリペプチドの非発癌性突然変異体もしくは変異体である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
非発癌性突然変異体または変異体E7ポリペプチドの配列が、１個以上の以下の置換：
(a)位置24のCysからGlyまたはAlaへの置換；
(b)位置26のGluからGlyまたはAlaへの置換；および
(c)位置91のCysからGlyまたはAlaへの置換、
により配列番号3とは異なる、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１３】
非発癌性突然変異体または変異体E7ポリペプチドの配列が、配列番号4の配列である、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記抗原が、配列番号6の配列を有するE6ポリペプチドまたはその抗原性断片である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１５】
HPV-16 E6ポリペプチドが、前記E6ポリペプチドの非発癌性突然変異体もしくは変異体である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
非発癌性突然変異体もしくは変異体E6ポリペプチドの配列が、1個以上の以下の置換：
(a)位置63のCysからGlyまたはAlaへの置換；
(b)位置106のCysからGlyまたはAlaへの置換；および
(c)位置128のIleからThrへの置換、
により配列番号6とは異なる、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
配列番号7の配列を有する請求項１５に記載の非発癌性突然変異体E6ポリペプチド。
【請求項１８】
前記抗原が、連結された、E7およびE6ポリペプチドの読み枠を合わせた組合せ、その抗原性断片、またはE7およびE6の非発癌性突然変異体もしくは変異体である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１９】
プラスミドの一部である請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記プラスミドがpNGV4aである、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
pNGVL4a/CRT/E7(detox)として特徴付けられ、かつ配列番号20の配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a)製薬上および免疫学的に許容し得る賦形剤、およびそれと組み合わせて
(b)請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組成物、
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２３】
抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a)製薬上および免疫学的に許容し得る賦形剤、およびそれと組み合わせて
(b)請求項１９に記載の核酸分子、
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２４】
抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a)製薬上および免疫学的に許容し得る賦形剤、およびそれと組み合わせて
(b)請求項２０に記載の核酸分子、
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２５】
抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a)製薬上および免疫学的に許容し得る賦形剤、およびそれと組み合わせて
(b)請求項２１に記載の核酸分子、
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２６】
被験体において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、請求項２２に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該応答を誘導または増強する前記方法。
【請求項２７】
被験体において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、請求項２３に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該応答を誘導または増強する前記方法。
【請求項２８】
被験体において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該応答を誘導または増強する前記方法。
【請求項２９】
被験体において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、請求項２５に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該応答を誘導または増強する前記方法。
【請求項３０】
前記応答が、少なくとも部分的にはCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)により媒介される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記応答が、少なくとも部分的にはCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)により媒介される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与が、筋肉内注入によるか、遺伝子銃投与によるか、または無針ジェット式注射によるものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記投与が、筋肉内注入によるか、遺伝子銃投与によるか、または無針ジェット式注射によるものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記投与が、筋肉内注入によるか、遺伝子銃投与によるか、または無針ジェット式注射によるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与が、筋肉内注入によるか、遺伝子銃投与によるか、または無針ジェット式注射によるものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与が、筋肉内注入によるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止する方法であって、第2の核酸配列がそれぞれE7もしくはE6のエピトープの1個以上をコードする請求項２２に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該増殖を阻害するか、または該再増殖を防止することを含む、前記方法。
【請求項４２】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止する方法であって、第2の核酸配列がそれぞれE7もしくはE6のエピトープの1個以上をコードする請求項２３に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該増殖を阻害するか、または該再増殖を防止することを含む、前記方法。
【請求項４３】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止する方法であって、第2の核酸配列がそれぞれE7もしくはE6のエピトープの1個以上をコードする請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該増殖を阻害するか、または該再増殖を防止することを含む、前記方法。
【請求項４４】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止する方法であって、第2の核酸配列がそれぞれE7もしくはE6のエピトープの1個以上をコードする請求項２５に記載の医薬組成物の有効量を該被験体に投与し、それによって該増殖を阻害するか、または該再増殖を防止することを含む、前記方法。
【請求項４５】
被験体における抗原特異的免疫応答を誘導または増強するための薬剤の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項４６】
被験体における抗原特異的免疫応答を誘導または増強するための薬剤の製造のための、請求項１９に記載の核酸分子の使用。
【請求項４７】
被験体における抗原特異的免疫応答を誘導または増強するための薬剤の製造のための、請求項２１に記載の核酸分子の使用。
【請求項４８】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止するための薬剤の製造のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸分子の使用。
【請求項４９】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止するための薬剤の製造のための、請求項１９に記載の核酸分子の使用。
【請求項５０】
被験体におけるHPV E7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止するための薬剤の製造のための、請求項２１に記載の核酸分子の使用。
【請求項５１】
前記被験体がヒトである、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５２】
前記薬剤を、筋肉内注入、遺伝子銃投与、または無針ジェット式注射により前記被験体に投与する、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
前記薬剤を、筋肉内注入により前記被験体に投与する、請求項５１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学、免疫学および医学の分野における本発明は、抗原、必要に応じてシグナルペプチド、およびカルレティキュリン(CRT)などの免疫原性増強性ポリペプチド(「IPP」)をコードするキメラ核酸分子、ならびに腫瘍またはウイルス抗原などの特定の抗原に対する免疫応答、主に細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導および増強するための免疫原性組成物としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、抗ウイルスおよび抗腫瘍応答の重要なエフェクターである(Chen, CHら、J Biomed Sci. 5: 231-52, 1998; Pardoll, DM. Nature Med 4:525-31, 1998; Wang, RFら、Immunol Rev. 170:85-100, 1999で概説されている)。活性化されたCTLは、それらの標的である腫瘍細胞もしくはウイルスに感染した細胞の直接的溶解により、ならびに腫瘍増殖もしくは転移、またはウイルス拡散を妨げる免疫応答および炎症応答を組織化するサイトカインの放出により、抗腫瘍免疫を媒介するエフェクター細胞である。CD8+ CTLの枯渇は、いくつかの癌ワクチンの抗腫瘍作用の喪失をもたらす(Lin, K-Yら、Canc Res. 56:21-6, 1996; Chen, C-Hら、Canc Res. 60: 035-42, 2000)。従って、CD8+ T細胞に対するMHCクラスI経路を介する抗原提示の増強は、癌の免疫治療の主要な焦点である。
【０００３】
DNAワクチンは、抗原特異的な癌の免疫治療のための魅力的な手法として出現した。DNAワクチンは、ペプチドまたは弱毒化生病原体などのより従来的なワクチンよりも多くの利点を提供する。1つの利点は、DNAワクチンがかなり安定であり、大量でも容易に調製および収集することができることである。さらに、裸のプラスミドDNAは比較的安全であり、副作用なしに反復投与することができる。さらに、コードされた抗原の長期間の発現のために、DNAを細胞中で維持することができるため、免疫学的記憶の維持が可能である(Donnelly, JJら、Annu Rev Immunol 1997, 15:617-648; Pardoll, 上掲; Robinson, HL, Vaccine 15:85-787, 1997; Gurunathan, Sら、 Annu Rev Immunol 18:927-74, 2000を参照)。
【０００４】
しかしながら、DNAワクチンベクターは、一般的には、いくつかの複製性ウイルスワクチンベクターが有するような、in vivoで増幅および拡散される本来の能力を有さないため、これらのワクチンの1つの制限は、その効力が欠如していることである。さらに、ヒトパピローマウイルス-16(「HPV-16」)のE7タンパク質などのいくつかの腫瘍抗原は、弱い免疫原である(Chenら、2000, 上掲)。従って、DNAワクチンの効力を増強するための戦略、特に、より有効な癌およびウイルスの免疫治療に対する必要性が当業界に存在する。
【０００５】
CD8+ T細胞に対するMHCクラスI経路を介する抗原の提示を増強するために、本発明において本発明者らにより取られた1つの戦略は、ある種のポリペプチドの、それらの融合相手の抗原ポリペプチドを標的とする特徴を利用することである。そのようなポリペプチドを、本明細書では総称的に「免疫原性増強性(もしくは促進性)ポリペプチド」または「IPP」と呼ぶが、それは、それらIPPが、共通の工程を共有してもしなくてもよい多数の細胞機構および分子機構のいかなるものにより機能し得る場合であってもこの一般的特性を表すものである。この命名は、用語「標的化ポリペプチド」と互換的であることを意図される。分子ワクチンによりコードされる抗原を「受容」または「処理」するやり方を変更するポリペプチドをコードする核酸配列の免疫系への組み入れは、ワクチンの効力を増強するための基礎として機能する。
【０００６】
カルレティキュリン
細胞の小胞体(ER)の内腔に位置する豊富な46キロダルトン(kDa)のタンパク質であるカルレティキュリン(CRT)は、レクチン活性を示し、新生糖タンパク質の折畳みおよび組立に関与する。例えば、Nash., Mol Cell Biochem 135:71-8, 1994; Hebert,  J Cell Biol 139:613-23, 1997; Vassilakos, A, Biochemistry 37:3480-90, 1998; Spiro, J Biol Chem 271:11588-94, 1996を参照されたい。ウサギ、ヒト、マウス、およびラットのCRTは、90％を超える配列同一性を示す(Michalak, Mら、Biochem J, 344 Pt 2:281-92, 1999)。
【０００７】
CRTは、TAP-1およびTAP-2などの抗原プロセッシングに関連する輸送体によりER中に輸送されるペプチドと結合する(Spee , Eur J Immunol 27:2441-9, 1997)。CRTはまた、in vitroでペプチドと複合体を形成する。マウスへの投与に際して、これらの複合体は、ペプチド特異的CD8+ T細胞応答を惹起した(Basu, J Exp Med 189:797-802, 1999; Nair, J Immunol 162:6426-32, 1999)。マウス腫瘍から精製されたCRTは、抗原性の異なる腫瘍に対してではなく、CRTを取得した腫瘍に対して特異的な免疫を惹起した(Basu, 上掲)。CRT-ペプチド複合体を用いてin vitroでマウス樹状細胞(DC)をパルスすることにより、該ペプチドをDC上にMHCクラスI分子により再提示して、ペプチド特異的CTL応答を誘発した(Nair, 上掲)。
【０００８】
CRTタンパク質は、N-ドメイン、P-ドメインおよびC-ドメインの3個のドメインから構成される。バソスタチンとしても知られる、N-ドメイン(残基1〜180)は、異なる種に由来するCRT間で高度に保存されている(Krause, KHら、Cell 88:439-43, 1997)。N-ドメインは、in vitroで糖質コルチコイド受容体のDNA結合ドメインと、風疹ウイルスRNA(Singh, NKら、Proc Natl Acad Sci USA 91:12770-74, 1994)と、α-インテグリン(Rojiani, MVら、Biochemistry 30:9859-66, 1991)と、ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)およびERタンパク質57(ERp57)(Corbett, EFら、J Biol Chem 1999, 274:6203-11, 1999)と相互作用する。カルレティキュリンのN-ドメインはまた、内皮細胞の増殖を阻害し、血管新生を抑制する(Pike, SEら、J Exp Med 188:2349-56, 1998)。P-ドメイン(残基181〜280)は、Proに富み、2セットの3個の反復配列を含む。このドメインは、高い親和性でCa++と結合する(Baksh, Sら、J Biol Chem 266:21458-65, 1991)。P-ドメインは、CRTのレクチン様シャペロン活性にとって重要であると考えられ(Vassilakosら、上掲)、PDIおよびパーフォリンとも相互作用する(Andrin, Cら、Biochemistry 37:10386-94, 1998; Fraser, SAら、Biochem Cell Biol 76:881-7, 1998)。CRTのC末端領域は高度に酸性であり、KDEL ER検索配列で終わる(Michalak, Mら、J Biol Chem 271:29436-45, 1996)。CRTのCドメインはCaに結合し(Bakshら、上掲)、および血液凝固因子に結合し(Kuwabara, Kら、J Biol Chem 270:8179-87, 1995)、損傷により誘導された再狭窄を阻害する(Dai, Eら、Arterioscler Thromb Vasc Biol 17:2359-68, 1997)。
【０００９】
CRTは、抗血管新生作用も有する。CRTおよびそのNドメインは、腫瘍増殖を抑制することができる内皮細胞阻害剤である(Pike, SE, Blood 94:2461-8, 1999)。腫瘍の増殖および転移は、十分な血液供給の存在に依存する。腫瘍が大きくなるにつれて、十分な血液供給は血管新生と呼ばれるプロセスである新血管形成により確保されることが多い。腫瘍の血管系を標的化し、これを損傷する治療剤は、腫瘍増殖を防止するか、または遅延させ、退化もしくは休眠を促進さえすることができる。
【００１０】
モデル抗原としてのHPV E7を含む免疫原性構築物
本発明者らおよびその同僚は、様々な免疫原性増強性ポリペプチド(「IPP」)を用いてDNAワクチンの効力を増強するためのいくつかの細胞内標的化戦略および細胞間拡散戦略を以前に開発した。例えば、本発明者らおよびその同僚の刊行物：Hung, CFら、J Virol 76:2676-82, 2002; Cheng, WFら、J Clin Invest 108:669-78, 2001; Hung, CFら、J Immunol  166:5733-40, 2001; Chen, CHら、Gene Ther 6:1972-81, 1999; Ji,Hら、Hum Gene Ther 10:2727-40, 1999; Chen, CHら、Cancer Res 60:1035-42, 2000; 米国特許第6,734,173号, WO 01/29233; WO03/085085; WO 02/012281; WO 02/061113を参照されたい。
【００１１】
細胞内標的化部分CRTに対する連結抗原の連結もこれらの戦略の中にあった。本発明者らおよびその同僚は、CRT(または他のIPP)を組込んだ裸のDNAおよび自己複製性RNAワクチンを提供した初めての者であった。本発明者らおよびその同僚はまた、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)の熱ショックタンパク質70(HSP70)もしくはそのC末端ドメイン、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)の外毒素AのドメインII(ETA(dII))、またはリソソーム結合膜タンパク質1型の選別シグナル(Sig/LAMP-1)に対する連結抗原が、目的の抗原をコードするDNAのみを含む組成物と比較して、DNAワクチンの効力を増強することを証明した。MHCクラスII抗原プロセッシングを増強するために、本発明者らの同僚(Lin, KYら、Cancer Res 56: 21-6, 1996)は、細胞質／核のヒトパピローマウイルス(HPV-16)E7抗原に、リソソーム結合膜タンパク質(LAMP-1)の選別シグナルを連結し、キメラ(Sig/E7/LAMP-1)を作製した。これらの知見は、組換えDNAワクチンのin vivoでの効力を増強するために、「エレメント」をDNAレベルで抗原組成物に加えることの重要性を指摘している。
【００１２】
in vivoでの遺伝子銃によるDNAワクチンの皮内投与は、T細胞への抗原の取込み、プロセッシング、および提示において機能する、専門的抗原提示細胞(APC)、主に樹状細胞(DC)にそのようなワクチンを送達するための有効な手段であると証明された。APCとT細胞の間の相互作用は、強力な特異的免疫応答の開発にとって重要である。
【００１３】
本発明者らまたは従来技術における他者によって記載された種々のDNA構築物は、実験動物において増大した免疫応答を誘導する特定の組合せをもたらした。しかしながら、これらのワクチンはいずれも、投与が実用的な理由または他の理由で筋肉内(i.m.)注射に限定され得るヒトでの使用のために理想的に設計されてはいない。筋肉組織における専門的APCの直接的形質導入が、筋肉中のそのような細胞の不足に起因して生じることはなさそうだからである。それは、ヒトにおける増大した免疫の誘導のための最も可能性の高い機構として交叉プライミングを放置する。交叉プライミングのためのワクチン構築物の最適化には、好ましくはMHCクラスI経路を介して抗原プロセッシングを促進する分子との融合ポリペプチドとして、発現されるポリペプチド抗原部分の分泌を促進するエレメントを付加することが必要である。さらに、ヒトにおいて安全かつ有効であることが知られるプラスミド構築物を用いることが最良である。最後に、HPV癌タンパク質抗原の場合、発現させようとするタンパク質が発癌性の形質転換剤として作用しないように、それを「解毒」することも重要である。本発明は、上記の有利な特性を有するそのような構築物に関する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明者らは、ヒトCRTまたはその相同体、そのドメインもしくは断片、またはMHCクラスI経路を介する抗原のプロセッシングを促進し、免疫原性を増強する他の機能的誘導体に抗原をコードするDNAを連結した、抗原をコードするDNAワクチン組成物を組合わせる免疫治療戦略を設計し、本明細書に開示した。
【００１５】
本発明は、真核細胞中で発現可能な発現ベクターであり、キメラもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
(a) カルレティキュリン(CRT)であり、好ましくは配列番号10である第1のポリペプチド、またはその生物学的に活性な相同体、ドメインもしくは断片をコードする第1の核酸配列、好ましくは配列番号9であり、ここで相同体、ドメインもしくは断片が、(i)in vitroでペプチドとの複合体を形成し；(ii)細胞中で発現される場合、新生糖タンパク質の折畳みおよび組立てに関与し、(iii)細胞中で発現される場合、抗原プロセッシングに関連する輸送体により小胞体中に輸送されるペプチドと結合し、ならびに／または(iv)血管新生を阻害する、前記第1の核酸配列；
(b) 第1の核酸配列に読み枠を合わせて連結され、かつ好ましくはMHCクラスIタンパク質に結合するエピトープを含む抗原ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第2の核酸配列、ならびに
(c) それらに機能し得る形で連結された、真核細胞において活性であるプロモーター、および必要に応じて、細胞中での核酸の発現を増強する1個以上の調節エレメント、
を含む、前記核酸分子に関する。
【００１６】
第1の核酸配列は、(a) N-CRT、(b) P-CRT、(c) S-CRTおよび(d) 該(a)、(b)もしくは(c)の生物学的に活性な変異体からなる群より選択される1個以上のCRT断片またはドメインをコードしてもよい。好ましくは、N-CRTは配列番号14であり、P-CRTは配列番号15であり、S-CRTは配列番号16であるか、またはドメインの各々はN-CRT、P-CRTもしくはS-CRTの相同体である。CRTドメインをコードする上記核酸分子の好ましい実施形態においては、第1の核酸配列は配列番号17であるか、またはN-CRT(配列番号14)をコードする。第1の核酸配列はN-CRT(配列番号14)、P-CRT(配列番号15)、C-CRT(配列番号16)のうちの任意の2個以上またはその任意の組合せをコードしてもよい。
【００１７】
上記の核酸分子中、前記抗原は、病原性生物、細胞、もしくはウイルス上に存在するものであるか、またはそれらのエピトープと交叉反応するものであるのが好ましく、該ウイルスはHPV-16などのヒトパピローマウイルスであり、該抗原は(a)配列番号3の配列を有するHPVのE7ポリペプチド；(b)配列番号6の配列を有するHPVのE6ポリペプチド；(c)いずれかの向きでE6とE7を読み枠を合わせて連結した組合せ；(d)E6もしくはE7の抗原性断片；(e)E6もしくはE7の非発癌性突然変異体もしくは変異体；または(f)いずれかの向きで読み枠を合わせて連結した非発癌性突然変異体／変異体E7-E6の組合せであるのが最も好ましい。前記核酸分子の好ましい実施形態においては、前記抗原はE7ポリペプチドの非発癌性突然変異体または変異体である。
【００１８】
E7ポリペプチドの好ましい突然変異体／変異体は、以下の置換：(a)位置24のCysからGlyもしくはAlaへの置換；(b)位置26のGluからGlyもしくはAlaへの置換；および(c)位置91のCysからGlyもしくはAlaへの置換のうち1個以上により、配列番号3とは異なっており、最も好ましくは、配列番号4の配列を有するポリペプチドである。
【００１９】
好ましい突然変異E6ポリペプチドは、配列番号6の配列を有する。E6の好ましい非発癌性突然変異体／変異体は、以下の置換：(a)位置63のCysからGlyもしくはAlaへの置換；(b)位置106のCysからGlyもしくはAlaへの置換；および(c)位置128のIleからThrへの置換のうち1個以上により、配列番号6とは行っており、最も好ましくは配列番号7の配列を有するポリペプチドである。
【００２０】
上記の核酸分子は、プラスミドの一部であるのが好ましく、プラスミドpNGV4aの一部であるのが最も好ましい。最も好ましい実施形態においては、前記核酸はプラスミドpNGVL4a/CRT/E7(detox)として特徴付けられ、かつ配列番号20の配列を有する。
【００２１】
また、抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
(a) 製薬上および免疫学上許容し得る賦形剤、およびそれと組み合わせて
(b) 上記の核酸分子を含む組成物、
を含む、前記医薬組成物も提供する。
【００２２】
本発明はまた、有効量の上記医薬組成物を被験体に投与し、それによって、抗原特異的免疫応答を誘導または増強することを含む、該被験体において該応答を誘導または増強する方法にも関する。この免疫応答は、少なくとも部分的にはCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)により媒介されるものであるのが好ましい。
【００２３】
また、第2の核酸配列がそれぞれE7もしくはE6のエピトープの1個以上をコードする有効量の上記医薬組成物を被験体に投与し、それによって、増殖を阻害するか、または再増殖を防止することを含む、該被験体においてHPVのE7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止する方法も提供する。
【００２４】
上記方法の全てにおいて、投与は、筋肉内注射、遺伝子銃による皮内投与、または無針ジェット式注射によるものであってよい。
【００２５】
上記方法の全てにおいて、被験体は好ましくはヒトであり、投与は筋肉内注射によるものである。
【００２６】
また、本明細書において、(1)被験体において抗原特異的免疫応答を誘導または増強するための薬剤の製造のための上記核酸分子の使用、および(2)被験体においてHPVのE7もしくはE6タンパク質を発現する腫瘍の増殖を阻害するか、またはその再増殖を防止するための薬剤の製造のための上記核酸分子の使用も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましい実施形態の説明
用いた省略語の部分的一覧
APC、抗原提示細胞；CRT、カルレティキュリン；CTL、細胞傷害性Tリンパ球；DC、樹状細胞；ECD、細胞外ドメイン；E6、HPV癌タンパク質E6；E7、HPV癌タンパク質E7；ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ；HPV、ヒトパピローマウイルス；HSP、熱ショックタンパク質；Hsp70、マイコバクテリアの熱ショックタンパク質70；IFNγ、インターフェロン-γ；i.m.、筋肉内；i.v.、静脈内；MHC、主要組織適合複合体；PBS、リン酸緩衝生理食塩水；PCR、ポリメラーゼ連鎖反応；β-gal、β-ガラクトシダーゼ。
【００２８】
本発明者らおよびその同僚は、ヒトパピローマウイルス16型(HPV-16)癌タンパク質E7へのCRTおよびその相同体の連結が、E7-特異的CD8+ T細胞前駆体を劇的に増加させ、ワクチン接種したマウスにおいてE7を発現する腫瘍に対する抗腫瘍作用を増強することを示した。これは、以下の実施例、ならびに本発明者らおよびその同僚による他の刊行物中に示されている(例えば、Wu & Hung, WO00212281A1 (2002年2月14日発行); Peng Sら、J Virol. 2004 78:8468-76, 2004; Kim JWら、Gene Ther. 11:1011-8, 2004; Peng Sら、Gene Ther. 2005, Sep 22; Epub; Cheng WFら、Vaccine 23:3864-74, 2005)。
【００２９】
彼らは現在、頸部のHPV-16に関連する高悪性度扁平上皮内病変を有する患者、ならびに進行したHPVに関連する頭部および頸部の扁平上皮細胞癌を有する患者における臨床試験のためにこの戦略を採用している。そうするために、適正製造基準(GMP)の要件に整合する等級のCRT/E7 DNAワクチンを、ヒトにおける使用に関して認可されたNational Gene Vector Labにより開発されたpNGVL4aプラスミドに基づいて、裸のDNA調製物の形態で製造した。本発明のDNA分子を、「pNGVL4a/CRT/E7(detox)」と呼ぶことにした。E6タンパク質についての同様のDNAワクチンも以下に記載するが、これを「pNGVL4a/CRT/E6(detox)」と呼ぶ。
【００３０】
pNGVL4a/CRT/E7(detox)DNAワクチン(以下を参照)を、骨格としてpNGVL4aベクターを用いて作製した。このベクターは元々、ヒトのワクチン試験に関して認可されたpNGVL3ベクターから誘導されたものである。pNGVL4aベクターは、非コード領域中に2個の免疫賦活配列(CpGジヌクレオチドのタンデムリピート)を含む。APCまたは交叉プライミングによりAPCに抗原性成分を導入する他の細胞を形質転換することができる任意の他のプラスミドDNAが本発明において有用であるが、pNGVLA4はヒトにおける治療的使用に関して既に認可されているため好ましい。
【００３１】
分泌形態の抗原または、本明細書に記載のような、CRTと共に該抗原をコードするDNAワクチンを用いる筋肉内免疫化は、「細胞質」形態の抗原を用いる筋肉内免疫化よりも強いCTL応答を生成するであろうが、これは筋肉内DNA免疫化後のCTL応答の誘発が、間接的に免疫原／抗原を獲得したトランスフェクトされていない専門的APCによる抗原の交叉提示により促進されることを示している。例えば、Boyle, JSら、Int Immunol 1997, 9:1897-1906を参照されたい。
【００３２】
さらに、癌タンパク質またはそのエピトープが免疫化部分である場合、ワクチン自身の腫瘍原性の危険性を低減させるのが好ましい。重要な標的抗原であるHPV E7およびE6は発癌性である。本明細書に記載の好ましい実施形態においては、E7タンパク質をコードするDNAを、以下に詳細に説明するように、ヌクレオチドを置換して、位置C24G(Cys→Gly)およびE26G(Glu→Gly)の2個のアミノ酸の置換を得ることにより、「E7(detox)」として知られる形態に二重突然変異させた。これらの置換は、E7がRbに結合する能力、ならびに形質転換活性を完全に排除する。同じ効果を達成することができる他の置換を、当業者であれば容易に為すことができる。
【００３３】
この例はE7に焦点を当てたが、本発明の別の実施形態は、好ましくはHPV-16に由来する、HPV E6タンパク質の抗原性エピトープを含む。HPV-16などの子宮頸癌に関連するHPV型に由来するE6タンパク質は、E6-APとの相互作用を介してp53腫瘍抑制因子タンパク質のタンパク質溶解を誘導する。E6により不死化されたヒト乳房上皮細胞(MEC)は、低レベルのp53を展示する。HPV-16のE6ならびに他の癌に関連するパピローマウイルスのE6タンパク質は、細胞タンパク質E6BP(ERC-55)にも結合する。いくつかの異なるE6突然変異を、「野生型」配列を示した後、以下に述べる。これらの突然変異体を記載する研究(参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)も、その節で考察する。
【００３４】
本発明はまた、癌タンパク質をin vivoでその発癌能力に関して不活性にさせるための本明細書に記載の1個以上の突然変異を用いる、タンデムE6-E7ワクチンの使用を含む。MC Cassettiら(Vaccine 22:520-7, 2004)は、E6およびE7遺伝子を融合させて1個のオープンリーディングフレームを作製し、4もしくは5個のアミノ酸位置で突然変異させたHPV16のE6およびE7遺伝子をコードするベネズエラ馬脳炎ウイルスレプリコン粒子(VRP)ワクチンを記載した(以下を参照)。かくして、本発明の構築物は、E6-E7もしくはE7-E6配列をもたらすように天然の順序で配置されてもよいし、または発現されたタンパク質が免疫原形態でE6およびE7抗原性エピトープを担持できる任意の方法でシャッフリングされていてもよいE6およびE7の1個以上のエピトープを含んでもよく、それはワクチン接種されたレシピエントの免疫化をもたらす。再度、E6とE7の間またはこれらのタンパク質の個々のエピトープの間のアミノ酸スペーサーが、それらを形質導入された宿主細胞により発現させた後、免疫原性様式で前記エピトープの発現および提示を可能にする限り、該スペーサーをコードするDNAを前記ベクター中に導入することができる。
【００３５】
融合タンパク質の2個(またはそれ以上)の成分ポリペプチドを配置する配向、および従って、核酸ベクター中での核酸断片をコードする順序を、所定の場合に融合ポリペプチドタンパク質の免疫原性およびDNAワクチンの有効性に影響を及ぼすことなく変更することができるが、一方の配向が他方の配向よりも良好な結果を与え得る。例えば、HSP70をコードするDNA配列を、標的抗原をコードする配列の5'または3'に配置することができるが、E7(もしくはE6)-HSP70の配向(NからC末端へ)が好ましい。CRTについては、本明細書に開示されるように、CRT-E7(もしくはE6)の配向(NからC末端へ)が好ましい。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、本明細書に記載の方法および当業界で従来的な方法を用いて、代替的な配向を通常通りに試験し、比較することができる。
【００３６】
好ましい実施形態においては、これらのIPPをコードする核酸ドメインを、キメラDNA構築物がIPPのN(もしくはC)末端に抗原を有する組換え融合ポリペプチドをコードするように、抗原DNAと読み枠を合わせて融合させる。勿論、シグナルペプチドを含有させる場合、それは新生タンパク質のN末端にあるべきである。
【００３７】
本発明者らの特許および他の刊行物に開示された通り、および当業者により理解されるであろうが、本発明のDNA構築物は、突然変異(detox)E7により本明細書に例示される、任意のMHCクラスI拘束性抗原をコードする組換えポリペプチドをコードする。
【００３８】
ポリペプチドおよび核酸の配列
プラスミドおよびベクターの配列
野生型HPV E7配列(ヌクレオチド配列は、いくつかの突然変異を含むが、本発明において用いられる配列番号1であり、野生型アミノ酸配列は配列番号2である)を以下に示す。下線を付したコドンおよびアミノ酸は、本発明の構築物中で突然変異させるのが好ましいものである。
【００３９】
2008528004.tif 000002
【００４０】
上記配列は、
2008528004.tif 000003
であるE7タンパク質についてのGENEBANKアクセッション番号NC_001526とは異なる。
【００４１】
HPV16 E7タンパク質は、L-X-C-X-Eモチーフを介して、その標的であるRbに結合する。このモチーフの位置Cys24およびGlu26での突然変異は、Rbの結合および分解を損なう。E7におけるこれらの2つの点突然変異に加えて、第3のアミノ酸であるCys91での突然変異は、E7中の唯一の亜鉛フィンガーを破壊する。好ましい実施形態においては、全ての野生型アミノ酸をGlyに突然変異させる。別の実施形態においては、これらの残基をAlaに突然変異させる。実際、これらを、前記タンパク質が形質導入された細胞中で発現させ、免疫原性形態で分泌させ、専門的APCにより取り込ませ、そして、抗原特異性を保持するが同時に該タンパク質が発癌性の形質転換能力を有する可能性を阻止または低下させる方法でT細胞に提示されるようにする任意の残基に突然変異させることができる。上記の記述は、以下に記載のHPV E6タンパク質に関しても言える。
【００４２】
本発明の構築物においてE7の発癌性を低下させるために、E7の以下の位置のうち1個以上を突然変異させる。  
2008528004.tif 000004
【００４３】
好ましいワクチンベクターによりコードされるE7(detox)突然変異アミノ酸配列(以下の配列番号4)は、上記に示された突然変異、すなわち、配列番号2の位置24でのCys→Gly置換をもたらすtgt→ggt突然変異および位置26でのGlu→Glyをもたらすgag→ggg突然変異を有する。
【００４４】
2008528004.tif 000005
【００４５】
E6タンパク質
野生型HPV E6アミノ酸配列(GENEBANKアクセッション番号NC_001526)(配列番号5)を以下に示す。この配列は158個のアミノ酸を有する。  
2008528004.tif 000006
【００４６】
突然変異させる好ましいアミノ酸残基に、上記で下線を付す。以下に述べるE6突然変異体の研究はより短いE6に基づくものであり、そのより短いE6のコード配列は151個のアミノ酸をコードし、そのN末端残基は配列番号5においてMet-8と数えられた。そのより短いバージョンのE6を、配列番号6として以下に示す。  
2008528004.tif 000007
同様に、突然変異させる好ましいアミノ酸残基に下線を付す。
【００４７】
このE6ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列、または好ましくは、以下に述べるその突然変異体の１つ、またはその抗原性断片もしくはエピトープを、本発明のベクター中で用いることができる。典型的なコドン使用規則により、コドンを選択することができる。他の突然変異を、本明細書に記載の方法、またはCassettiら、上掲により記載された方法に従って試験および使用することができる。
【００４８】
本発明の構築物中のE6の発癌性を低下させるために、E6の以下の位置のうちの1個以上を突然変異させる。
【００４９】
2008528004.tif 000008
【００５０】
これらの3個の突然変異を有するE6(detox)の形態を、配列番号7として以下に示す。 
2008528004.tif 000009
これらの突然変異を、コードDNAの突然変異により、任意の好適なコード配列を用いて達成することができる。
【００５１】
これらの突然変異体について述べている研究(参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を、以下に考察する。M.Nguyenら(J Virol. 6:13039-48, 2002)は、in vivoで発癌性の低下を示すα-ヘリックスパートナーの結合が欠損したHPV-16 E6の突然変異体を記載した。(配列番号6の)位置128でのThrによるIleの置換を含むこの突然変異体を、本発明に従って用いて、発癌性である危険性がより低いE6 DNAワクチンを作製することができる。このE6(I128T)突然変異体は、E6AP、p53タンパク質のE6依存的分解を媒介するユビキチンリガーゼなどの、α-ヘリックスパートナーの少なくとも一部セットへの結合に関して欠損している。
【００５２】
Cassettiら、上掲は、E6およびE7における4または5個のアミノ酸位置の突然変異がその発癌性を不活化する効果を試験した。以下の突然変異を試験した(配列番号3または5に基づく位置)：E6-C63G；E6-C106G；E7-C24G；E7-E26GおよびE7-C91G。突然変異型または野生型E6およびE7タンパク質をコードするワクチンは、いくつかのHPV16 E6+E7+腫瘍チャレンジモデルにおいて同程度のCTL応答を惹起し、同程度の抗腫瘍応答を生成した。すなわち、C3またはTC-1腫瘍チャレンジからの防御が、ワクチン接種したマウスの100％において観察された。C3腫瘍の根絶が、約90％において観察された。E6およびE7発癌性の予測される不活化を、突然変異E6およびE7遺伝子を発現するVRPを感染させたヒト乳房上皮細胞においてp53およびRbタンパク質の両方が正常レベルであることを証明することにより確認した。
【００５３】
E6およびE7の突然変異誘発のための手法
HPV16 E6タンパク質は、構造および機能にとって重要な2個の亜鉛フィンガーを含む；C-X-X-C(式中、Xは任意のアミノ酸である)亜鉛フィンガーモチーフの各対における1個のシステイン(C)アミノ酸位置を、E6の位置63および106(配列番号5に基づく)で突然変異させるのが好ましい。突然変異を、例えば、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, LA Jolla, CA)を用いて作製する。HPV16 E6は、Cys106(配列番号5についてはCys113)に単一点突然変異を含む。Cysは、p53に結合せず、またその分解を促進することもなく、またp53分解に依存する表現型であるヒト乳房上皮細胞(MEC)を不死化することができない。配列番号6の位置Cys63(＝配列番号5中のCys70)での単一アミノ酸置換は、いくつかのHPV16 E6機能：p53分解、E6TP-1分解、テロメラーゼの活性化、および結果として、初代上皮細胞の不死化を、損なう。
【００５４】
免疫原性増強性ポリペプチドCRTならびにその相同体およびドメイン／断片をコードするDNAの配列
よく特性評価された約46 kDaのタンパク質であるカルレティキュリン(CRT)を、いくつかのその生物学的および生化学的活性と同様に、上記で簡単に説明した。本明細書で用いられる「カルレティキュリン」または「CRT」とは、当業界でよく知られた本明細書に記載の例示的なヒトCRT配列またはその相同体、例えばウサギおよびラットのCRT、に対して実質的な同一性(本明細書で定義される)を有するポリペプチドおよび核酸分子を指す。CRTポリペプチドは、CRTのアミノ酸配列と同一であるか、または実質的に同一である(本明細書で定義される)配列を含むポリペプチドである。本発明の組成物および方法において用いられるCRTの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、下記に示す。用語「カルレティキュリン」または「CRT」は、天然のタンパク質、ならびに抗原と融合した場合(DNAまたはタンパク質レベルで)には免疫応答の誘導を促進し、CTL応答などの血管新生を促進する組換え産生された改変タンパク質を、包含する。かくして、用語「カルレティキュリン」または「CRT」は、in vitroでの技術により構築された天然のタンパク質の変異体、および天然の起源から単離されたタンパク質などの、ヒトCRTの相同体および対立遺伝子変異体を包含する。本発明のCRTポリペプチドおよびそれをコードする配列は、非CRT配列、特に、MHCクラスI結合ペプチドを含み、また他のドメイン、例えば、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどをさらに含む融合タンパク質をも包含する。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「小胞体シャペロンポリペプチド」は、例示的なシャペロンタンパク質CRT、タパシン、ER60またはカルネキシンと実質的に同じERシャペロン機能を有する任意のポリペプチドを意味する。かくして、この用語は、全ての機能的断片またはその変異体もしくは模倣体を含む。ポリペプチドまたはペプチドを、実施例1に記載のものなどの当業界で公知のアッセイを用いて、ERシャペロンとしてのその活性について通常通りにスクリーニングすることができる。本発明はいかなる特定の作用機構によっても限定されないが、in vivoでのシャペロンは、MHCクラスIヘテロ三量体分子(重鎖(H)、β2m、およびペプチド)の組立てなどの、ERにおける多くの糖タンパク質の正確な折畳みおよびオリゴマー化を促進する。これらはまた、ER中で不完全に組立てられたMHCクラスIへテロ三量体複合体をも保持する(Hauri, FEBS Lett. 476:32-37, 2000)。
【００５６】
ヒトCRTなどのCRTの配列は、当業界でよく知られている(McCauliffe, J. Clin. Invest. 86:332-5, 1990; Burns, Nature 367:476-80, 1994; Coppolino, Int. J. Biochem. Cell Biol. 30:553-8, 2000)。CRTコード配列を含むCRT遺伝子の配列は、GenBankアクセッション番号NM 004343として現れ、以下の配列番号8である。CRTタンパク質をコードするこの配列の一部は、残基68〜1319である(以下に大文字で示される)。この配列を終わらせる停止コドンをイタリック体で示す／下線を付す。
【００５７】
2008528004.tif 000010
【００５８】
ヒトCRTコード配列を以下に示す(配列番号9)。
【００５９】
2008528004.tif 000011
【００６０】
ヒトCRTタンパク質のアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号NM 004343)(配列番号10)を以下に示す。
【００６１】
2008528004.tif 000012
【００６２】
ウサギCRTタンパク質のアミノ酸配列(GenBankアクセッション番号P15253)(配列番号11)を以下に示す。
【００６３】
2008528004.tif 000013
【００６４】
CRTをコードするウサギのヌクレオチド配列を以下に示す(配列番号12)(下線を付し、カウントしない停止コドンを含む)。
【００６５】
2008528004.tif 000014
【００６６】
ラットCRTタンパク質(GenBankアクセッション番号NM 022399)(配列番号13)を以下に示す。
【００６７】
2008528004.tif 000015
【００６８】
対応するコード配列は簡潔さのために示さないものとする。
【００６９】
表1は、ヒト、ウサギおよびラットのそれぞれのCRT(配列番号11、12および13)のアラインメントした配列を比較する。ヒトからウサギ、およびヒトからラットへの変化に下線を付す。上述の通り、これらのタンパク質は高度に保存されており、種間のアミノ酸差異の多くは実際に保存的である。この変異の多くは、約36個のC末端残基のアラインメントにおいて認められる。かくして、本発明にとっては、ヒトCRTが好ましいが、必要な生物学的活性(IPPとしての)を有する任意の種に由来するCRTの任意の相同体またはその任意の活性なドメインもしくは断片をコードするDNAを、ヒトCRTまたはそのドメインの代わりに用いることができる。
【表１】
2008528004.tif 000016
【００７０】
CRTドメイン
本発明者らおよび同僚(Chengら、上掲；参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)は、HPV-16 E7にキメラ的に連結されたCRTのN、PおよびCドメインの各々をコードするDNAワクチンが、遺伝子銃投与により皮内的にワクチン接種されたマウスにおいて、強力な抗原特異的CD8+T細胞応答および抗腫瘍免疫を惹起することを見出した。N-CRT/E7、P-CRT/E7またはC-CRT/E7 DNAはそれぞれ、E7特異的CD8+ T細胞前駆体の数の有意な増加を示し、またおよびE7 DNA(抗原のみ)をワクチン接種したマウスと比較した場合、E7発現性腫瘍に対する優れた抗腫瘍作用を示した。N-CRT DNA投与は、抗血管新生性抗腫瘍作用をももたらした。かくして、腫瘍抗原に連結されたN-CRTをコードするDNAを用いる癌治療を、抗原特異的免疫治療と血管新生の阻害の組合せによって腫瘍を治療するために用いることができる。
【００７１】
CRT、またはE7に連結されたそのドメインの1つを含む、構築物を、以下に図示する。
【００７２】
2008528004.tif 000017
【００７３】
3つのヒトCRTドメインのアミノ酸配列を、完全長タンパク質(配列番号10)の注釈として示す。Nドメインは残基1〜170(標準文字)を含み；Pドメインは残基171〜269(下線付き)を含み；およびCドメインは残基270〜417(太字／イタリック体)を含む。 
2008528004.tif 000018
【００７４】
3つのドメインの配列を、以下に別々のポリペプチドとして示す。
【００７５】
2008528004.tif 000019
【００７６】
本発明のベクターは、以下の配列番号9の注釈により示されるこれらのドメイン配列のうち1個以上をコードするDNAを含んでもよく、ここでNドメイン配列は大文字であり、Pドメイン配列は小文字／イタリック体／下線であり、およびCドメイン配列は小文字である。停止コドンも示すが、これは数に入れないものとする。
【００７７】
2008528004.tif 000020
【００７８】
それぞれ個々のドメインのコード配列を、以下に示す。
【００７９】
2008528004.tif 000021
【００８０】
あるいは、これらのドメインをコードする任意のヌクレオチド配列を、本発明の構築物中で用いることができる。かくして、ヒトにおける使用のためには、この配列をさらにコドン最適化することができる。
【００８１】
本発明の構築物は、いくつかの配向のいずれかにおける、1個以上のCRTドメインの組合せを用いることができる。前記ドメインを指定するための記号NCRT、PCRTおよびCCRTを用いれば、以下のものはほんの数例に過ぎないが、本発明のDNAワクチンベクター中で用いることができる組合せである(式中、Agは任意の抗原であってよく、好ましくはE7(detox)またはE6(detox)であると理解される)。
【００８２】
2008528004.tif 000022
【００８３】
本発明では、CRTのより短い断片を、それらがその対になる抗原に対する免疫応答を増強することができる限り、用いてもよい。MHC-1クラスI経路を介するタンパク質プロセッシングを促進する能力を有する上記に示されたCRTまたはドメイン配列に由来するより短いペプチドも含まれ、それは日常的な実験により定めることができる。
【００８４】
本発明の完全なキメラ核酸の最も好ましいベクター構築物を、以下に示す(配列番号20)。この配列を、プラスミド由来ヌクレオチド(小文字)、CRT由来ヌクレオチド(大文字の太字)、およびHPV-E7由来ヌクレオチド(大文字、イタリック体／下線付き)を示すように注釈付けする。5つのプラスミドヌクレオチドがCRTとE7コード配列の間に認められたこと、およびE7配列のための停止コドンに二重下線を付したことに留意されたい。このプラスミドをpNGVL-4a-CRT/E7(detox)とも呼ぶ。
【００８５】
2008528004.tif 000023
2008528004.tif 000024
【００８６】
以下の表2は、上記のプラスミドの構造を説明するものである(図式については図12も参照)。
【表２】
2008528004.tif 000025
【００８７】
本明細書に記載のCRTの相同体または変異体を、必要な生物学的活性を有するという条件で、用いることもできる。これらはアミノ酸または核酸配列の様々な置換、欠失、または付加を含む。コードの縮重性に起因して、例えば、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列におけるかなりの変動が存在してもよい。
【００８８】
CRTの機能的誘導体は、測定可能なCRT様活性、好ましくは、クラスI経路による提示を促進することにより、それに融合された1個以上の抗原性エピトープの免疫原性を促進する活性を保持する。「機能的誘導体」は、この用語が本明細書で結合的または代替的に用いられるかどうかに拘らず、「変異体」および「断片」を包含する。
【００８９】
用語「キメラ」または「融合」ポリペプチドまたはタンパク質とは、第2のポリペプチドまたはペプチドドメインに線状の様式で化学的に結合された少なくとも1個のポリペプチドまたはペプチド配列またはドメインを含む組成物を指す。本発明の一実施形態は、第1のドメインがIPPを含み、第2のドメインが抗原性エピトープ、例えば、MHCクラスI結合ぺプチドエピトープを含む、少なくとも2個のドメインを含む融合タンパク質をコードする単離または組換え核酸分子である。「融合物」は、ペプチド結合、化学的連結、電荷相互作用(例えば、塩架橋、H結合などの静電気的引力)などにより生成された結合であってよい。ポリペプチドが組換え体である場合、「融合タンパク質」を一般的なmRNAから翻訳することができる。あるいは、前記ドメインの組成物を、任意の化学的または静電気的手段により連結することができる。本発明のキメラ分子(例えば、標的化ポリペプチド融合タンパク質)は、追加の配列、例えば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含んでもよい。あるいは、ペプチドを、該ペプチドの操作または同定／配置を単に容易にするために担体に連結することができる。
【００９０】
また、タンパク質のアミノ酸置換変異体（「断片」など）を指すIPP、好ましくはCRT(またはそのコード配列のもの)の「機能的誘導体」も含まれ、その用語を以下に定義する。IPPの機能的誘導体は、好ましくは、それに融合されるか、またはそれと共に同時投与された1個以上の抗原性エピトープの免疫原性を促進することが明らかである、測定可能な活性を保持する。「機能的誘導体」は、この用語が本明細書で結合的または代替的に用いられるかどうかに拘らず、「変異体」および「断片」を包含する。
【００９１】
機能的相同体は、上記の生化学的活性および生物学的活性を有さなければならない。この機能的特性評価を考慮すれば、未だ発見されていないタンパク質などの相同タンパク質の使用は、これらのタンパク質が配列類似性ならびに列挙された生化学的活性および生物学的活性を有する場合、本発明の範囲内にある。
【００９２】
2個のアミノ酸配列または2個の核酸配列の同一性％を決定するために、これらの配列を、最適な比較目的のためにアラインメントする(例えば、最適なアラインメントのために、第1および第2のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、非相同配列を比較目的のために無視することができる)。アラインメントの好ましい方法においては、Cys残基を整列させる。
【００９３】
好ましい実施形態においては、比較する配列の長さは、参照配列(例えば、CRT、配列番号10)の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも60％、およびさらにより好ましくは少なくとも70％、80％、または90％である。次いで、対応するアミノ酸(またはヌクレオチド)位置のアミノ酸残基(またはヌクレオチド)を比較する。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基(またはヌクレオチド)により占められる場合、この分子はその位置で同一である(本明細書で用いられる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同意義である)。2個の配列間の同一性％は、該配列により共有される同一の位置の数の関数であり、2個の配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れる。
【００９４】
2個の配列間の配列の比較および同一性％の決定を、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましい実施形態においては、2個のアミノ酸配列間の同一性％を、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、ならびに16、14、12、10、8、6、もしくは4のギャップ加重および1、2、3、4、5、もしくは6の長さ加重を用いるGCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラムに組込まれたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)のアルゴリズムを用いて決定する。さらに別の好ましい実施形態においては、2個のヌクレオチド配列間の同一性％を、NWSgapdna.CMPマトリックスならびに40、50、60、70、もしくは80のギャップ加重および1、2、3、4、5、もしくは6の長さ加重を用いる、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラムを用いて決定する。別の実施形態においては、2個のアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性％を、PAM120加重残基表、12のギャップ長ペナルティおよび4のギャップペナルティを用いる、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組込まれたE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(CABIOS, 4:11-17 (1989))を用いて決定する。
【００９５】
本発明の核酸およびタンパク質配列を、「問合せ配列」としてさらに用いて、公共データベースに対する検索を実行して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。そのような検索を、Altschulら(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア＝100、ワード長＝12を用いて実施して、CRT核酸分子と相同なヌクレオチド配列を取得することができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3を用いて実施して、HVP22タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。比較目的のためのギャップ挿入アラインメントを取得するために、ギャップ挿入BLASTを、Altschulら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のように用いることができる。BLASTおよびギャップ挿入BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００９６】
かくして、上記のCRTの相同体は、(a)天然のCRTの機能的活性および(b)上記のように決定する場合、天然のCRTタンパク質(配列番号9など)に対して少なくとも約20％(アミノ酸レベルで)、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは約70％、さらにより好ましくは約90％の配列類似性、を有するものとして特徴付けられる。
【００９７】
CRTの開示された配列に基づくDNAプローブを用いてそのようなタンパク質を取得し、発現させることは当業界における技術の範囲内にある。次いで、融合タンパク質の生化学的活性および生物学的活性を、例えば、T細胞増殖、サイトカイン分泌もしくは細胞溶解アッセイ、または腫瘍防御もしくは腫瘍治療のin vivoアッセイなどの本明細書に記載のものなどの当業界で認められている方法を用いて容易に試験することができる。抗原特異的T細胞反応性の刺激の生物学的アッセイは、前記相同体が「機能的」相同体として定量するのに必要な活性を有するかどうかを示すであろう。
【００９８】
「変異体」とは、1個以上のアミノ酸残基が置換されている(置換変異体)か、または1もしくは数個の欠失した残基(欠失変異体)もしくは付加された残基(付加変異体)を有する、完全長タンパク質またはその断片と実質的に同一の分子を指す。CRTの「断片」とは、該分子の任意のサブセット、すなわち、完全長タンパク質のより短いポリペプチドを指す。
【００９９】
いくつかのプロセスを用いて、単離されたDNA配列の断片、突然変異体および変異体を作製することができる。拡散性タンパク質をコードする核酸の小さいサブ領域または断片、例えば、1〜30塩基長を、標準的な化学合成により調製することができる。より大きい合成断片の作製において、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマーを用いることができる。
【０１００】
変異体の好ましい群は、少なくとも1個のアミノ酸残基、好ましくは1個のみが異なる残基により置換されたものである。タンパク質の化学および構造の詳細な説明については、Schulz, GEら、Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978,およびCreighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983(参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。タンパク質分子中に作製することができる置換の種類は、Schulzら(上掲)の表1〜2およびCreighton(上掲)の図3〜9に示されたものなどの、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度の分析に基づくものであってよい。そのような分析に基づいて、保存的置換は、以下の5つの群のうちの1つの範囲内での交換として本明細書では定義される：
1. 小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基  Ala、Ser、Thr (Pro、Gly)；
2. 極性で、負に荷電した残基およびそれらのアミド  Asp、Asn、Glu、Gln；
3. 極性で、正に荷電した残基                      His、Arg、Lys；
4. 大きい脂肪族、非極性残基                      Met、Leu、Ile、Val (Cys)；
5. 大きい芳香族残基                              Phe、Tyr、Trp。
【０１０１】
上記の()内の3個のアミノ酸残基は、タンパク質構造において特殊な役割を有する。Glyは、側鎖を欠き、そのため鎖に対して可撓性を与える唯一の残基である。Proは、その通常でない形状のため、鎖を強固に拘束する。Cysは、タンパク質の折畳みにおいて重要であるジスルフィド結合形成に参加し得る。
【０１０２】
生化学的、機能的(または免疫学的)特性のより実質的な変化は、上記の5群の内部ではなく群間での置換のような保存性の低い置換を選択することにより作製する。そのような変化は、(a)例えば、シートもしくはらせんコンフォメーションとしての、置換の領域中のペプチド骨格の構造、(b)標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさ、を維持することに対するその効果においてより顕著に異なるであろう。そのような置換の例は、(i)別のアミノ酸によるGlyおよび／もしくはProの置換、またはGlyもしくはProの欠失もしくは挿入；(ii)親水性残基、例えば、SerもしくはThrの、疎水性残基、例えば、Leu、Ile、Phe、ValもしくはAlaへの(すなわち、それによる)置換；(iii)Cys残基の、任意の他の残基への(すなわち、それによる)置換；(iv)陽性電荷側鎖を有する残基、例えば、Lys、ArgもしくはHisの、陰性電荷残基を有する残基、例えば、GluもしくはAspへの(すなわち、それによる)置換；または(v)かさ高い側鎖を有する残基、例えば、Pheの、そのような側鎖を有さない残基、例えば、Glyへの(すなわち、それによる)置換である。
【０１０３】
本発明に従う最も許容し得る欠失、挿入および置換は、その細胞間拡散活性および抗原性エピトープもしくは拡散性タンパク質に融合されたエピトープに対する抗原特異的T細胞反応性を刺激するその能力の点で、野生型もしくは天然のタンパク質の特性において極端な変化をもたらさないものである。しかしながら、そうする前に置換、欠失もしくは挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者であれば、過度の実験を要することなく、本明細書に記載のものなどの日常的なスクリーニングアッセイにより、その効果を評価することができることは理解するであろう。
【０１０４】
より短い鎖の変異体を化学合成により作製することができるが、本発明について、好ましいより長い鎖の変異体は、典型的には、該ポリペプチドをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、細胞培養物中での変異体核酸の発現、および、必要に応じて、例えば、カラムに固定された特異的抗体(少なくとも1個のエピトープへの結合により該変異体を吸収させるため)を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによる、細胞培養物からの該ポリペプチドの精製により、作製する。
【０１０５】
上記組成物において、CRTまたは他のストレスタンパク質は、MHCクラスI経路により連結された抗原ポリペプチドのプロセッシングまたは該プロセッシングを増加させる細胞区画の標的化を促進することにより、免疫応答を増強させるのに働くのが好ましい。この基本戦略を、一般的には、「標的化ポリペプチド」と呼ばれる別のタンパク質をコードするDNAを、抗原をコードするDNAに連結することを含む、本発明者らおよび同僚により開拓されたさらなる戦略と組合わせることができる。同様に、簡潔にするために、そのような標的化ポリペプチドをコードするDNAを、本明細書では「標的化DNA」と呼ぶことにする。その戦略は、抗原をコードするDNAのみを担持するベクターの効力を増強するのに有効であることが示された。例えば、Wuらによる以下のPCT公報：WO 01/29233; WO 02/009645; WO 02/061113; WO 02/074920; およびWO 02/12281(これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。他の戦略は、以下：
(a) 抗原提示細胞の発達、蓄積もしくは活性または抗原提示の増強をもたらす抗原提示細胞の区画に対する抗原の標的化；
(b) 該抗原の細胞間輸送および拡散；または
(c) (a)および(b)の任意の組合せ；
(d) リソソーム関連膜タンパク質1型の選別(Sig/LAMP-1)、
を促進または増強するポリペプチドをコードするDNAの使用を含む。
【０１０６】
この戦略は、以下：
(e) 単純ヘルペスウイルス-1のVP22タンパク質、Marek病ウイルスのUL49(WO 02/09645を参照)タンパク質またはその機能的相同体もしくは誘導体の群から選択されるウイルス細胞間拡散性タンパク質；
(f) CRT様分子ER60、GRP94、gp96、またはその機能的相同体もしくは誘導体(参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 02/12281を参照)の群から選択される他の小胞体シャペロンポリペプチド；
(g) シュードモナス外毒素ETAのドメインIIまたはその機能的相同体もしくは誘導体の群から選択される病原体毒素の細胞質移行ポリペプチドドメイン；
(h) γ-チューブリンまたはその機能的相同体もしくは誘導体から選択される細胞の中心体区画を標的化するポリペプチド；または
(i) GM-CSF、Flt3-リガンド細胞外ドメイン、またはその機能的相同体もしくは誘導体の群から選択される、樹状細胞前駆体を刺激するか、または樹状細胞活性を活性化するポリペプチド；または
(j) B7-DC(米国特許出願第09/794,210号を参照、B7.1、B7.2、可溶性CD40など)を含むB7ファミリータンパク質などの共刺激シグナル；
(k) 好ましくは、(1)BCL-xL、(2)BCL2、(3)XIAP、(4)FLICEc-s、(5)ドミナント・ネガティブキャスパーゼ8、(6)ドミナント・ネガティブキャスパーゼ9、(7)SPI-6、および(8)(1)〜(7)のいずれかの機能的相同体もしくは誘導体、からなる群より選択される抗アポトーシスポリペプチド、
の使用を含む(WO 2005/047501を参照)。
【０１０７】
種々の標的化ポリペプチド戦略の詳細は、本明細書では詳細に考察しないことにする。上記のIPPのうち、CRTに対する好ましい代替物は、ER60、GRP94もしくはgp96により例示される他のERシャペロンポリペプチド、HSP90ファミリーのストレス誘導性タンパク質に代表されるよく特性評価されたERシャペロンポリペプチド(WO 02/012281を参照)である。
【０１０８】
本明細書に記載の実験は、本発明の方法がヒト病原体のエピトープをコードするDNAワクチンにより誘導される、細胞性免疫応答、特に、腫瘍破壊性CTL反応を増強することができることを証明するものである。ヒトパピローマウイルス(HPV)、特に、HPV-16は大部分のヒト子宮頸癌と関連するため、ヒトHPV-16 E7をワクチン開発のためのモデル抗原として用いた。発癌性HPVタンパク質E7およびE6は、細胞の形質転換の誘導および維持において重要であり、HPVを含む子宮頸癌の大部分およびその前駆病変において同時発現される。従って、E7またはE6を標的化する、本発明の組成物などの癌ワクチンを用いて、HPV関連新生物を制御することができる(Wu, T-C, Curr Opin Immunol. 6:746-54, 1994)。
【０１０９】
しかしながら、記載したように、本発明は例示された抗原に限定されるものではない。むしろ、当業者であれば、T細胞媒介応答が望ましい任意の抗原(およびそのエピトープ)について、同じ結果が予想されることを理解できるであろう。そのように生成された応答は、エピトープもしくは抗原性決定基が(例えば、病原性細胞の細胞表面抗原もしくは病原性ウイルスのエンベロープもしくは他の抗原として、または細菌抗原、または病原性分子としてもしくはその一部として発現された抗原として)含まれる生物または疾患に対する、保護免疫もしくは治療的免疫、またはその両方を提供するのに有効であろう。
【０１１０】
かくして、一実施形態においては、前記抗原(例えば、MHCクラスI結合ペプチドエピトープ)を、病原体から誘導し、例えば、それは病原体により発現されるペプチドを含む。この病原体は、例えば、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス(例えば、HIV-1などの免疫不全ウイルス)、アデノウイルスなどのウイルスであってよい。パピローマウイルスは、ヒトパピローマウイルスであってよく、例えば、前記抗原(例えば、クラスI結合ペプチド)を、HPV-16 E6またはE7ポリペプチドから誘導することができる。好ましい実施形態においては、免疫原として用いられるHPV-16 E6またはE7ポリペプチドは、実質的に非発癌性であり、すなわち、それは網膜芽細胞腫ポリペプチド(pRB)に結合しないか、またはHPV-16 E7ポリペプチドがin vivoで発現もしくは送達される場合には事実上非発癌性であるような低い親和性でpRBに結合するが、それは本明細書に記載のようにして達成される。
【０１１１】
代替的な実施形態においては、前記病原体は、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis); エールリヒア・チャフェエンシス(Ehrlichia chaffeensis); スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus); トキソプラズマ・ゴンジ(Toxoplasma gondii); レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila); ブルセラ・スイス(Brucella suis); サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica); マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium); マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis); リステリア・モノサイトジェンス(Listeria monocytogenes); クラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis); クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae); リケッチア・リケッチ(Rickettsia rickettsii)などの細菌; または、例えば、パラコッキジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)などの真菌; または、例えば、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)などの他の病原体である。
【０１１２】
別の実施形態においては、MHCクラスI結合性抗原ペプチドエピトープを、腫瘍細胞から誘導する。腫瘍細胞に由来するペプチドエピトープは、腫瘍関連抗原、例えば、HER-2/neu抗原などの腫瘍特異的抗原、または公知のメラノーマ抗原のメンバーの1つなどを含んでもよい。
【０１１３】
一実施形態においては、単離されたか、または組換えの核酸分子を、例えば、構成性、誘導性または組織特異的プロモーターなどのプロモーターに機能し得る形で連結する。このプロモーターを、例えば、構成性、誘導性または組織特異的様式で、例えば、抗原提示細胞(APC)などの免疫系の細胞を含む任意の細胞中で発現させることができる。
【０１１４】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書で用いられる以下の用語は、特に特定しない限り、それらに属する意味を有する。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語「抗原」または「免疫原」とは、好適な量(「免疫原的に有効な量」)で、すなわち、単独でまたは別の物質(1回または数回の間隔で投与することができる)との組合せにおいて、またはそれに連結もしくは融合させて、細胞性および／または体液性免疫応答を誘導し、惹起し、増加させ、または追加免疫することができる量で、投与する(または、例えば、DNAワクチンなどの投与される核酸によりin vivoで発現させる)場合、「抗原性」または「免疫原性」であるぺプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を指す。免疫原性組成物は、少なくとも約5個のアミノ酸の抗原ペプチド、長さ10個のアミノ酸のペプチド、長さ15個のアミノ酸のポリペプチド断片、長さ20個以上のアミノ酸を含んでもよい。より小さい免疫原は、例えば、好ましくは免疫原に(化学的に、または別の方法で)連結された、融合タンパク質、凝集物、コンジュゲートまたは混合物としての「担体」ポリペプチドの存在を必要とし得る。この免疫原を、プロモーター、例えば、本明細書に記載の発現カセットに機能し得る形で連結された免疫原のコード配列を含む裸のDNAでありうるワクチンベクターから、組換え的に発現させることができる。免疫原は、大きさが約3〜約15個のアミノ酸でサイズが様々でありうる1個以上の抗原性決定基またはエピトープを含む。
【０１１６】
用語「ワクチン」は、本発明のDNA組成物に言及する場合、「免疫原」と互換的に用いられる。同様に、用語「ワクチン接種する」および「免疫する」は、本明細書では互換的に用いられる。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」とは、抗体またはT細胞受容体(TCR)、例えば、本発明の方法において用いられるMHCクラスI結合ペプチド組成物(または本発明の核酸組成物の発現産物)と相互作用する抗原性決定基または抗原性部位を指す。「抗原」は、免疫応答を誘導するか、または抗体もしくはCTLなどの、免疫応答の産物もしくはメディエーターにより特異的に認識もしくは結合される分子または化学的構造体である。抗体またはTCRが結合する特定のコンフォメーション的または立体化学的な「ドメイン」は、「抗原性決定基」または「エピトープ」である。TCRは、第3の分子、主要組織適合複合体(MHC)クラスIまたはクラスIIタンパク質に物理的に結合するペプチドエピトープに結合する。
【０１１８】
用語「組換え」とは、(1)in vitroで合成されたか、もしくはさもなければ操作された核酸もしくはポリヌクレオチド、(2)細胞もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生させるための組換えDNA技術を用いる方法、または(3)組換え核酸によりコードされるポリペプチドを指す。例えば、CRTをコードする核酸もしくはポリペプチド、MHCクラスI結合ペプチドエピトープ(抗原)をコードする核酸または該ペプチド自身が組換えであるのが好ましい。「組換え手段」は、異なる起源に由来する種々のコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を、コードされたポリペプチドの産生をもたらすベクター中のコード配列の発現のための発現カセットまたはベクターの形態で単一単位で連結することを含む。
【０１１９】
一般的な組換えDNA方法
分子生物学の一般的方法を開示する基本的な教科書としては、Sambrook, Jら、Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel, FMら、Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2,  Wiley-Interscience, New York, (現代版); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Glover, DM(編)、DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II,  IRL Press, 1985; Albers, B.ら、Molecular Biology of the Cell, 第2版, Garland Publishing, Inc., New York, NY (1989); Watson, JDら、Recombinant DNA, 第2版, Scientific American Books, New York, 1992; およびOld, RWら、Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 第2版, University of California Press, Berkeley, CA (1981)が挙げられ、それらは全て参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１２０】
例えば、配列中の突然変異の作製、サブクローニング、標識プローブ、配列決定、ハイブリダイゼーションなどの核酸の操作のための技術は、科学文献および特許文献によく記載されている。例えば、Sambrook(編)、Molecular Cloning: a Laboratory Manual (第2版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel(編)、John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Tijssen(編)、Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。
【０１２１】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどを、当業者にはよく知られたいくつかの一般的な手段のいずれかにより分析および定量することができる。これらのものとしては、例えば、NMR、分光分析、X線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、および超拡散クロマトグラフィーなどの分析的生化学的方法、例えば、液体もしくはゲル沈降反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動(例えば、SDS-PAGE)、RT-PCR、定量的PCR、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射性標識化、シンチレーション計測、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの種々の免疫学的方法が挙げられる。
【０１２２】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅することにより、本発明を実施し、in vivoでの投与後のワクチンのレベル(例えば、プラスミドもしくはウイルスのレベル)をモニターし、活性化されたCTLの存在および表現型を確認するためなどに用いられる融合タンパク質コード配列を作製することができる。当業者であれば、公知の技術を用いて好適なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計することができる。増幅方法もまた当業界でよく知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis(編), Academic Press, N.Y. (1990)およびPCR Strategies (1995),Innis(編), Academic Press, Inc., N.Y.)、リガーゼ連鎖反応(LCR) (Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); 転写増幅(Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173);および、自己持続型配列複製(Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); Qβレプリカーゼ増幅(Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491; Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271)および他のRNAポリメラーゼを介する技術(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; 米国特許第4,683,195号および第4,683,202号; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564)が挙げられる。
【０１２３】
特に指摘しない限り、特定の核酸配列は、その保存的置換変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補配列を包含すると意図される。用語「核酸」は、「ポリヌクレオチド」と同義であり、遺伝子、cDNA分子、mRNA分子、ならびにオリゴヌクレオチドなどのこれらのいずれかの断片、およびさらにその等価物(以下でより完全に説明される)を含むと意図される。核酸の大きさを、キロ塩基(kb)または塩基対(bp)として記述する。これらは、使用者により決定されるか、または公開された核酸配列からの、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)から誘導された算出値である。タンパク質の大きさは、PAGE、配列決定、コード核酸配列に基づく推定アミノ酸配列、または公開されたアミノ酸配列から見積もられる。
【０１２４】
具体的には、本発明の融合ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体に対応するアミノ酸配列をコードするcDNA分子を、本明細書に開示されるタンパク質の配列を誘導したプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により合成することができる(例えば、米国特許第4,683,202号を参照)。次いで、これらのcDNA配列を、真核または原核発現ベクター中に構築し、得られるベクターを用いて好適な宿主細胞、例えば、COSもしくはCHO細胞による前記融合ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体の合成を誘導することができる。
【０１２５】
本発明は、移行ポリペプチドおよび抗原、その断片もしくはその等価物を含む新規融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸を含む。本明細書で用いられる用語「核酸」は、そのような断片または等価物を含むことが意図される。本発明の核酸配列はDNAまたはRNAであってよい。
【０１２６】
融合ポリペプチドのcDNAヌクレオチド配列を、好適な細胞系から全mRNAを単離することにより取得することができる。二本鎖cDNAを、全mRNAから調製する。cDNAを、いくつかの公知の技術のいずれか1つを用いて、好適なプラスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター中に挿入することができる。
【０１２７】
ヌクレオチド配列を参照する場合、用語「等価物」は、構造的に相同な、および／または機能的に等価なタンパク質をコードする配列を含むと意図される。例えば、本発明に従う抗アポトーシスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の天然の多型性(特に、コドンの3番目の塩基での)は、アミノ酸配列を変化させない「サイレント」突然変異として出現しうる。さらに、これらのタンパク質の1個以上の天然のアイソフォームまたは関連する免疫学的に交叉反応するファミリーメンバーが存在してもよい。そのようなアイソフォームまたはファミリーメンバーは、参照ポリペプチドに対して機能とアミノ酸配列類似性を共有するタンパク質として定義される。
【０１２８】
核酸の断片
核酸配列の断片は、完全長CRTポリペプチド、抗原性ポリペプチド、またはその融合物をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列と定義される。本発明は、(1)前記融合ポリペプチドが、該融合ポリペプチドの抗原部分に特異的である、T細胞、好ましくはCD8+ T細胞の頻度または反応性の増加を誘導する能力を保持するポリペプチドをコードするそのような核酸断片を含む。
【０１２９】
例えば、本明細書で意図される核酸断片は、抗原をコードするか、または抗原をコードする配列とのキメラDNAとして投与する場合、抗原のみのDNAワクチンの免疫原性を改善する能力を保持する、CRTまたはその相同体、ドメイン、もしくは断片をコードする。
【０１３０】
一般的には、抗アポトーシスポリペプチドの断片をコードする核酸配列は、成熟タンパク質(またはその活性な断片)をコードする配列に由来するヌクレオチドを含む。
【０１３１】
本発明の核酸配列は、リンカー配列、天然の、または改変された制限エンドヌクレアーゼ部位およびコードされたタンパク質もしくは断片のクローニング、発現もしくは精製に関連する操作にとって有用である他の配列をも含んでもよい。核酸配列のこれらの改変および他の改変は、本明細書に記載されているか、または当業界でよく知られている。
【０１３２】
移行型のタンパク質の配列をコードするDNA、および抗原性ポリペプチドの配列をコードするDNAを組み立て、発現させるための技術としては、オリゴヌクレオチド合成、PCR、細胞形質転換、ベクターの構築、発現系などが挙げられるが、これらは当業界でよく確立されており、当業者が標準的な資源材料、特定の条件および手順に精通している。
【０１３３】
発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、(b)IPPに連結され、かつ真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞中で発現可能なプロモーターを含む少なくとも1個の調節配列に機能し得る形で連結された(a)抗原をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
【０１３４】
本明細書で用いられる用語「発現ベクター」または「発現カセット」とは、タンパク質をコードする配列と適合性のある宿主中でそのような配列の発現を行うことができるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、ポリペプチドをコードする配列、および必要に応じて、例えば、転写終結シグナルなどの他の配列に機能し得る形で連結された少なくとも1個のプロモーターを含む。発現を行うのに必要な、または役立つさらなる因子、例えば、エンハンサーを含ませてもよい。
【０１３５】
「機能し得る形で連結された」とは、コード配列を、該コード配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結することを意味する。公知の調節配列を、好適な宿主細胞中で所望のタンパク質の発現を指令するように選択する。従って、用語「調節配列」としては、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントが挙げられる。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。
【０１３６】
かくして、発現カセットとしては、プラスミド、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のDNA」ベクターなどが挙げられる。「ベクター」は、細胞に感染し、これをトランスフェクトし、一過的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは裸の核酸であってもよく、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化された核酸であってもよいことが認識されるであろう。ベクターは、必要に応じて、ウイルスもしくは細菌の核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／または膜(例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターは、DNAの断片を結合させることができ、複製されるようになるレプリコン(例えば、RNAレプリコン、バクテリオファージ)を含む。かくして、ベクターとしては、限定されるものではないが、RNA、自律的に自己複製する環状もしくは線状DNAもしくはRNA、例えば、プラスミド、ウイルスなどが挙げられ(米国特許第5,217,879号)、発現および非発現プラスミドの両方を含む。組換え細胞または培養物を、「発現ベクター」を担持するものとして記載する場合、これは染色体外の環状および線状DNAと、宿主の染色体中に組込まれたDNAの両方を含む。ベクターを宿主細胞により維持する場合、ベクターを、自律的構造物として有糸分裂中の細胞により安定に複製させるか、または宿主のゲノム内に組込むことができる。
【０１３７】
当業者であれば、本発明の発現ベクターの個々の設計は、トランスフェクトしようとする宿主細胞および／または発現させようとするタンパク質の種類などの考慮に依存することを理解できる。
【０１３８】
本発明の発現ベクターは、融合ポリペプチドおよびその機能的誘導体(本明細書で定義される)、例えば、ポリペプチド断片、変異体などの種々の実施形態をコードする核酸分子の範囲全体を含む。
【０１３９】
そのような発現ベクターを用いて、DNAの発現および融合タンパク質またはペプチドを含むコードされたタンパク質の産生のために宿主細胞を(in vitro、ex vivo、もしくはin vivoで)トランスフェクトすることができる。前記融合ポリペプチドを発現する遺伝的に改変された細胞は、該細胞がその記述された目的にとって有用であるのに十分な時間、外因性DNAを一過的に発現することができることが理解されるであろう。
【０１４０】
本発明は、融合ポリペプチド、断片および誘導体を製造する方法を提供する。例えば、前記融合ポリペプチドをコードする核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする好適な条件下で培養する。
【０１４１】
宿主細胞がさらなる融合ポリペプチドを産生するように、(a)前記融合ポリペプチドの少なくとも一部をコードするDNAおよび(b)第2のタンパク質、好ましくは抗原の少なくとも一部をコードするDNAを、単独でまたは組合せて含む、1個以上の発現ベクターを用いて、該宿主細胞をトランスフェクトすることもできる。
【０１４２】
典型的には、培養物は、宿主細胞、好適な増殖培地および他の副生成物を含む。好適な培養培地は、当業界でよく知られている。前記融合ポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈降、分画カラムクロマトグラフィー(例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなど)および／または電気泳動などの、タンパク質およびペプチドを精製するための従来の技術を用いて、培地または細胞溶解物から単離することができる(一般的には、「酵素の精製および関連技術(Enzyme Purification and Related Techniques)」、Meth Enzymol, 22:233-577 (1971)を参照)。いったん部分的にまたは均一に精製されれば、本発明の組換えポリペプチドを、本明細書により詳細に記載された医薬組成物中で用いることができる。
【０１４３】
移行ポリペプチドまたはそれをコードする核酸などの、分子または組成物に言及する場合、本明細書で用いられる用語「単離された」とは、該分子または組成物を、少なくとも1種の他の化合物(タンパク質、他の核酸など)から、またはプロセッシング中に天然で結合するか、もしくは結合するようになる他の夾雑物から分離することを意味する。単離された組成物は、実質的に純粋であってもよい。単離された組成物は、均質な状態にあってもよく、乾燥していてもよく、もしくは水性溶液中にあってもよい。純度および均質性を、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの分析的化学技術を用いて決定することができる。均質なバンドまたは主要なバンドとして出現するようにタンパク質を単離した場合でさえ、それと共に同時精製される微量の夾雑物が存在する。
【０１４４】
前記融合ポリペプチドまたはその相同体もしくは機能的誘導体を発現させるために形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、本発明の範囲内にある。例えば、前記融合ポリペプチドを、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞、または好ましくはヒト細胞中で発現させることができる。本発明に従う発現のための好ましい細胞は、APCであり、最も好ましくは、DCである。他の好適な宿主細胞は、当業界で公知である。
【０１４５】
真核細胞における発現は、部分的もしくは完全なグリコシル化および／または組換えタンパク質の対応する鎖間または鎖内ジスルフィド結合の形成をもたらす。
【０１４６】
融合発現ベクターにおいては、タンパク質溶解切断部位をコードするヌクレオチド配列を、リポーター基と、標的タンパク質との接続部に導入して、該リポーター基からの該標的タンパク質の分離を可能にした後、前記融合タンパク質を精製することが多い。そのような切断のためのタンパク質溶解酵素およびその認識配列としては、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを、標的組換えタンパク質に融合させるpGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia)、pMAL (New England Biolabs)およびpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)が挙げられる。誘導性非融合発現ベクターとしては、pTrc (Amannら、Gene 69:301-15, 1988)およびpET 11d (Studierら、Gene Expression Technology: Meth Enzymol 185:60-89, Academic Press, 1990)が挙げられる。
【０１４７】
ベクターの構築
所望のコード配列および制御配列を含む好適なベクターの構築には、当業界でよく理解されている標準的な連結および制限技術を用いる。単離されたプラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドを、切断し、調整し、および所望の形態で再連結する。挿入されたコード配列を含む、および含まないいくつかの好ましいプラスミドベクターの配列を、上記に開示した。
【０１４８】
前記ベクターを形成するDNA配列は、多くの起源から入手可能である。一般的には、骨格ベクターおよび制御系は、構築物中の多くの配列に用いる入手可能な「宿主」ベクター上に認められる。関連コード配列については、最初の構築は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーから好適な配列を回収することであってよく、および通常は、それである。しかしながら、一度配列が開示されたら、個々のヌクレオチド誘導体から開始して、in vitroで遺伝子配列全体を合成することが可能である。かなりの長さ、例えば、500〜1000 bpの遺伝子の遺伝子配列全体を、個々の重複する相補オリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼを用いて一本鎖の非重複部分を充填することにより調製することができる。この手法は、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築において成功裏に用いられてきた。
【０１４９】
合成オリゴヌクレオチドを、上記の参考文献により記載されたホスホトリエステル法またはホスホルアミダイト法(Beaucage, SLら、Tet Lett 22:1859, 1981; Matteucci, MDら、J Am Chem Soc 103:3185, 1981)により調製し、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製することができる。アニーリングまたは標識化の前の一本鎖のキナーゼ処理は、従来の方法によるものである。
【０１５０】
かくして、所望のベクターの成分が入手可能になったら、これらを標準的な制限切断法および連結法を用いて切り出し、連結することができる。部位特異的DNA切断を、当業界で理解される条件下で、好適な制限酵素(または複数の酵素)で処理することにより行い、その詳細はこれらの市販の制限酵素の製造業者により特定されている。例えば、New England Biolabs, Product Catalog; Meth Enzymol. 65:499-560, 1980を参照されたい。
【０１５１】
制限切断された断片を、従来の方法および条件を用いて4種のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の存在下で大腸菌のDNAポリメラーゼIの大きい断片(Klenow)で処理することにより平滑末端化することができる。連結を、従来の方法を用いて実施する。「ベクター断片」を用いるベクター構築物においては、該断片を細菌または哺乳動物のアルカリホスファターゼを用いて一般的に処理して、5'リン酸を除去し、自己連結を防止する。あるいは、追加の制限酵素により二重消化し、望ましくない断片を分離したベクター中で再連結を防止することができる。
【０１５２】
多くの方法のいずれかを用いて、コード配列中に突然変異を導入して、本発明の変異体を作製する。これらの突然変異としては、単純な欠失または挿入、塩基のクラスターの体系的な欠失、挿入もしくは置換または単一の塩基の置換が挙げられる。
【０１５３】
例えば、DNA配列の改変を、プロトコルおよび試薬が商業的に入手可能であるよく知られた技術である部位特異的突然変異誘発により作製する(Zoller, MJら、Nucleic Acids Res 10:6487-500, 1982; Adelman, JPら、DNA 2:183-193, 1983)。従来の方法を用いて、プラスミド構築物の様式に基づいて、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーの存在に基づいて、形質転換体を選択する。
【０１５４】
ベクターDNAを、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降法、DEAE-デキストランを介するトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションなどの従来の技術を介して哺乳動物細胞中に導入することができる。宿主細胞を形質転換するための好適な方法を、Sambrookら、上掲および他の標準的な教科書に見出すことができる。融合発現ベクターにおいては、タンパク質溶解切断部位を、2つの配列(リポーター基ならびに該リポーター基からの標的タンパク質の分離およびその後の融合タンパク質の精製を可能にする該標的タンパク質など)の接続部に導入することができる。そのような切断のためのタンパク質溶解酵素およびその認識配列としては、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１５５】
プロモーターおよびエンハンサー
DNAまたはRNA分子のプロモーター領域はRNAポリメラーゼに結合し、「機能し得る形で連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書で用いられる「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼにより転写されるDNAまたはRNAの鎖上に認められるプロモーターのヌクレオチド配列である。プロモーターおよびコード配列などの核酸分子の2つの配列は、それらが、両配列が同じRNA転写物上で転写することができるか、または1つの配列中で始まるRNA転写物が第2の配列中に伸長することができる様式で互いに連結されている場合、「機能し得る形で連結」されている。かくして、プロモーター配列およびDNAまたはRNAのコード配列などの2つの配列は、該プロモーター配列中で開始する転写が、機能し得る形で連結されたコード配列のRNA転写物を産生する場合、機能し得る形で連結されている。「機能し得る形で連結」するためには、2つの配列を線状配列中で互いにすぐ近くに配置することが必要であるわけではない。
【０１５６】
本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳動物細胞中で操作可能でなければならず、これは真核プロモーターであっても、ウイルスプロモーターであってもよい。好ましいプロモーターを実施例中に記載するが、他の有用なプロモーターおよび調節エレメントを以下に考察する。好適なプロモーターは、誘導性、抑制性、または構成性であってよい。「構成性」プロモーターは、細胞の環境中で、および発達を通して遭遇する多くの条件下で活性であるものである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発達的調節の下にあるものである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型において活性である。構成性プロモーターの例は、種々の細胞型において有効であり、活性であり、多くの他のプロモーターと対照的に、停止した細胞および増殖している細胞において同じ増強活性を有する、ウイルスプロモーターMSV-LTRである。他の好ましいウイルスプロモーターとしては、CMV-LTR(サイトメガロウイルス由来)(Bashart, M.ら、Cell 41:521, 1985)またはRSV-LTR(ラウス肉腫ウイルス)(Gorman, C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982)中に存在するものが挙げられる。また、マウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer, D,ら、J. Mol. Appl. Gen. 1:273-88, 1982; ヘルペスウイルスのTKプロモーター(McKnight, S, Cell 31:355-65, 1982); SV40初期プロモーター(Benoist, C.ら、Nature 290:304-10, 1981);および酵母ga14遺伝子プロモーター(Johnston, SAら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6971-5, 1982); Silver, PAら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5, 1984))も有用である。プロモーター領域に関連する転写因子ならびに転写因子の個別の活性化およびDNA結合の他の例示的な記載としては、Keeganら、Nature 231:699, 1986; Fieldsら、Nature 340:245, 1989; Jones, Cell 61:9, 1990; Lewin, Cell 61:1161, 1990; Ptashneら、Nature 346:329, 1990; Adamsら、Cell 72:306, 1993が挙げられる。
【０１５７】
プロモーター領域はさらに、特定の組織中に認められる特定のタンパク質と相互作用することにより、組織特異的エンハンサーとしても機能し得るオクタマー領域を含んでもよい。本発明のDNA構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトしようとする標的細胞にとって特異的であるか、またはそのような標的細胞の細胞因子により高度に活性化されるものである。ベクターの例(プラスミドまたはレトロウイルス)はRoy-Burmanら、米国特許第5,112,767号に開示されている。エンハンサーおよび転写におけるその作用の一般的な考察については、Lewin, BM, Genes IV, Oxford University Press pp. 552-576, 1990(または後の版)を参照されたい。特に有用なものは、遺伝子発現を刺激するように相互作用するプロモーターから上流に配置するのが好ましいレトロウイルスエンハンサー(例えば、ウイルスLTR)である。レトロウイルスベクターと共に用いるために、内因性ウイルスLTRはエンハンサーを含まないようにし、それを組織特異性または転写効率などの他の所望の特性を付与する他の所望のエンハンサー配列で置換することができる。
【０１５８】
本発明の核酸を、ペプチド合成と同様、市販のDNA合成装置を用いて完全に自動化された固相合成などの標準的な技術を用いて化学的に合成することもできる(Itakura、米国特許第4,598,049号、第4,401,796号および第4,373,071号; Caruthersら、米国特許第4,458,066号)。
【０１５９】
治療用組成物およびその投与
IPPとの融合ポリペプチドとして抗原をコードする核酸を含むワクチン組成物、本明細書ではCRTまたはその相同体もしくは誘導体、該核酸を含む粒子またはこの核酸を発現する細胞を、哺乳動物被験体に投与する。このワクチン組成物は、生物学的に有効な量または治療上有効量で製薬上許容し得る担体中で投与する。
【０１６０】
特定の好ましい条件を、実施例中に開示する。前記組成物を単独で与えるか、または免疫刺激分子などの別のタンパク質もしくはペプチドと組合わせて与えることができる。治療は、その最も広い意味においてインターフェロンなどの任意の非特異的免疫刺激化合物を含むように用いられる、アジュバントの投与を含んでもよい。本明細書において意図されるアジュバントとしては、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn-ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１６１】
治療上有効量は、有効な期間与えた場合、所望の免疫学的または臨床的効果を達成する用量である。
【０１６２】
前記融合ポリペプチドをコードする核酸の治療上活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出すペプチドの能力などの因子に応じて変化してもよい。投薬計画を調整して、最適な治療応答を提供することができる。例えば、数回に分割された用量を毎日投与するか、またはこの用量を、治療状況の危急度により示されるように比例的に減少させることができる。細胞に結合した形態の前記タンパク質の治療上有効量を、タンパク質または細胞等価物の点で記述することができる。
【０１６３】
かくして、前記ワクチンの有効量は、レシピエントの体重1キログラムあたり約1ナノグラム〜約1グラムであり、より好ましくは、約0.1μg/kg〜約10 mg/kg、より好ましくは、約1μg/kg〜約1 mg/kgである。内部投与にとって好適な剤形は、好ましくは、単位あたり約0.1μg〜100μgの活性成分を含む(後者の用量範囲について)。活性成分は、前記組成物の総重量に基づいて、0.5〜95重量％で変化してもよい。あるいは、本発明のDNAワクチン構築物を用いてトランスフェクトされた細胞の有効量は、約104〜108個の細胞である。免疫治療の当業者であれば、過度の実験を行うことなくこれらの用量を調整することができるであろう。
【０１６４】
前記組成物を、例えば便利で効率的な経路による注入などの、便利な様式で投与することができる。
【０１６５】
DNAのための好ましい経路としては、(a)有効量のDNAをコーティングした金粒子を、公知のレベル、例えば、400 p.s.i.に設定した吐出圧を用いるヘリウムにより駆動される遺伝子銃(BioRad, Hercules, CA)を用いて送達する皮内「遺伝子銃」送達；(b)従来のシリンジ針を用いる筋肉内注入；および(c)注射器および使い捨てのシリンジからなる注入装置であるBiojector 2000(Bioject Inc., Portland, OR)などの無針バイオジェクターの使用が挙げられる。開口部の大きさは貫通の深さを制御する。例えば、50μgのDNAを、2番のシリンジノズルを有するバイオジェクターを用いて送達することができる。
【０１６６】
投与経路に応じて、前記化合物を不活性化し得る、酵素、酸および他の天然の条件の作用から、該化合物を保護するための材料で前記組成物をコーティングすることができる。かくして、前記組成物を、その不活性化を防止するための材料と共にコーティングするか、または該組成物をそれと共に投与することが必要となり得る。例えば、ヌクレアーゼもしくはプロテアーゼの酵素阻害剤(例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸およびトラシロール)、またはリポソームなどの好適な担体(水中油中水乳濁液ならびに従来のリポソーム(Strejanら、J. Neuroimmunol. 7:27, 1984)など)。
【０１６７】
本明細書で用いられる「製薬上許容し得る担体」は、任意の、および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。製薬上活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業界でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が前記活性化合物と適合性でない場合以外は、治療用組成物におけるその使用が意図される。追加的な活性化合物を前記組成物中に組み入れることもできる。
【０１６８】
好ましい製薬上許容し得る希釈剤としては、塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。注入にとって好適な医薬組成物としては、滅菌水性溶液(水溶性である場合)または分散液および滅菌注入可能な溶液または分散液の即時の調製のための滅菌粉末が挙げられる。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを、前記医薬組成物中に含有させることができる。全ての場合、前記組成物は滅菌されたものであるべきであり、液体であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および菌類などの微生物の夾雑を防止する保存剤を含有しなければならない。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、および油中で調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための保存剤を含んでもよい。
【０１６９】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合は必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１７０】
医薬組成物における微生物の活動の防止を、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗細菌剤および抗真菌剤により達成することができる。
【０１７１】
組成物を、投与の容易さおよび剤形の均一性のために単位投与剤形中で製剤化するのが好ましい。単位投与剤形とは、哺乳動物被験体のための単回剤形として適合させた物理的に別個の単位を指す。すなわち各単位は、必要とされる製薬担体と共に、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性物質(例えば、核酸ワクチン)を含む。本発明の単位投与剤形に関する仕様は、(a)活性物質および達成しようとする特定の治療効果のユニークな特徴、および(b)個々の被験体の治療、およびその感度のためのそのような活性化合物を混合する当業界で固有の制限により影響され、およびそれに直接依存する。
【０１７２】
肺点滴のために、エアロゾル化された溶液を用いる。噴霧可能なエアロゾル調製物においては、前記活性タンパク質は、固体または液体の不活性担体材料と組合わせたものであってよい。これを、小型容器中に詰めるか、または加圧した揮発性の、通常は気体の推進剤と混合して詰めることもできる。このエアロゾル調製物は、本発明のタンパク質に加えて、溶媒、バッファー、界面活性剤、および酸化防止剤を含んでもよい。
【０１７３】
本発明による核酸ワクチン組成物のための他の製薬上許容し得る担体は、脂質層に付着した水性同心円層からなる小体中に分散するか、またはその中に種々存在して活性タンパク質が含まれる医薬組成物であるリポソームである。この活性タンパク質は、水層および脂質層の内側もしくは外側、または、任意の事象においては、リポソーム懸濁液として一般的に知られる非均質系に存在するのが好ましい。疎水性層、または脂質層は、一般的には、排他的ではないが、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、ジセチルリン酸、ステアリルアミンもしくはホスファチジン酸などの多かれ少なかれイオン性の界面活性物質、ならびに／または疎水性の他の材料を含む。当業者であれば、本発明のリポソーム製剤の他の好適な実施形態を理解できるであろう。
【０１７４】
細胞および動物へのワクチン核酸の送達
以下の参考文献は、基礎、医学および獣医ウイルス学の分野における原理および現在の情報を説明するものであり、参照により本明細書に組み入れられるものとする：Fields Virology, Fields, BNら(編)、Lippincott Williams & Wilkins, NY, 1996; 「ウイルス学の原理：分子生物学、病因、および制御(Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control)」、Flint, S.J.ら(編)、Amer Soc Microbiol, Washington DC, 1999; 「臨床ウイルス学の原理および実施(Principles and Practice of Clinical Virology)」、第4版, Zuckerman. A.J.ら(編)、John Wiley & Sons, NY, 1999;「C型肝炎ウイルス(The Hepatitis C Viruses)」、Hagedorn, CHら(編)、Springer Verlag, 1999;「B型肝炎ウイルス：疾患における分子機構および治療のための新規戦略(Hepatitis B Virus: Molecular Mechanisms in Disease and Novel Strategies for Therapy)」、Koshy, R.ら(編)、World Scientific Pub Co, 1998;「獣医ウイルス学(Veterinary Virology)」、Murphy, F.A.ら(編)、Academic Press, NY, 1999;「鳥類のウイルス：機能および制御(Avian Viruses: Function and Control)」、Ritchie, B.W., Iowa State University Press, Ames, 2000;「ウイルス分類法：ウイルスの分類および命名：ウイルスの分類法に関する国際委員会の第7次報告(Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)」、M. H. V. Van Regenmortel, MHVら(編)、Academic Press; NY, 2000。
【０１７５】
下記実施例は、遺伝子銃により皮内的に、または筋肉内的に、本発明のワクチンおよび組合せ物を送達するための特定の好ましい手法を記載する。ウイルスおよび非ウイルスベクターおよび送達機構などの他の手法のより広い記載は以下の通りである。
【０１７６】
DNA送達は、ex vivoで細胞に、および究極的には、生きた動物に、もしくは直接的に動物に、「外来」DNAを導入することを含む。「遺伝子治療」を含む目的のための遺伝子送達(＝核酸ベクターの送達)のためのいくつかの一般的戦略が研究されており、広範囲に概説されている(Yang, N-S., Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-356 (1992); Anderson, WF, Science 256:808-13, 1992; Miller, AS, Nature 357:455-60, 1992; Crystal, RG, Amer. J. Med. 92(suppl 6A):44-52S, 1992; Zwiebel, JAら、Ann NY Acad Sc. 618:394-404, 1991; McLachlin, JRら、Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 38:91-135, 1990; Kohn, DBら、Cancer Invest. 7:179-92, 1989(これらの参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする))。
【０１７７】
1つの手法は、培養物中の一次細胞中に核酸を導入すること、次いで、全身的に宿主に、または特定の器官もしくは組織に、ex vivoで形質転換された細胞を自己移植することを含む。
【０１７８】
用語「全身投与」とは、被験体の循環系への、本明細書に記載のDNAワクチンなどの組成物または薬剤の導入をもたらすか、またはさもなければ体中へのその拡散を可能にする様式で、該組成物を投与することを指す。
【０１７９】
「領域的」投与とは、腹腔内、鞘内、硬膜下などの、特定の、かついくらかより限定された解剖学的空間、または特定の器官への投与を指す。
【０１８０】
「局所投与」とは、腫瘍塊中への腫瘍内注入、皮下注入、皮内もしくは筋肉内注入などの、限定された、または制限された解剖学的空間中への組成物または薬剤の投与を指す。
【０１８１】
当業者であれば、局所投与または領域的投与は、循環系への組成物の進入をもたらしてもよく、すなわち、それを多かれ少なかれ全身的にするものであってもよい。
【０１８２】
本発明の課題を達成するために、in vivoで哺乳動物の体組織または器官に機能的に活性なDNAを直接的に導入することにより、核酸治療を達成することができる。DNAの導入を、以下に記載のいくつかの手法を用いて達成することができる。これらの系を、前記DNAを発現するトランスフェクトされたクローンを選択するための選択マーカー(例えば、G418耐性)の使用の後、好適な免疫アッセイにおいて抗原を含む発現産物に対する抗体を用いて該産物の存在を検出することにより(誘導系の場合、誘導因子を用いる処理の後)、in vitroでの発現の成功について試験することができる。DNAの取込み、プラスミドの組込みおよび組込まれたプラスミドの安定性などのこの手順の効率を、公知の方法を用いてプラスミドDNAを線状化し、「担体」として高分子量の哺乳動物DNAを用いて同時トランスフェクトすることにより改善することができる。
【０１８３】
本発明の融合ポリペプチドをコードするDNA分子を、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞系を用いてレトロウイルスベクター中にパッケージングすることもできるが、これは当業界でよく知られている通りである(例えば、Cone, R.D.ら、Proc Natl Acad Sci USA  81:6349-53, 1984; Mann, RFら、Cell 33:153-9, 1983; Miller, ADら、Molec Cell Biol 5:431-7, 1985; Sorge, J,ら、Molec Cell Biol 4:1730-7, 1984; Hock, RAら、Nature 320:257, 1986; Miller, ADら、Molec Cell Biol 6:2895-2902 (1986))。遺伝子導入のための効率的かつ安全であるより新しいパッケージング細胞系も記載されている(Bankら、米国特許第5,278,056号)。
【０１８４】
上記の手法を部位特異的様式で用いて、前記レトロウイルスベクターを選択した組織または器官に送達することができる。かくして、例えば、カテーテル送達系を用いることができる(Nabel, EGら、Science 244:1342(1989))。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターを用いるそのような方法は、発現させようとする核酸を血管壁に、または腫瘍の血液循環中に送達するのに特に有用である。
【０１８５】
ニューロン特異的送達および持続のために、組換えアデノウイルス(Horowitz, MS, In: Virology, Fields, BNら(編)、Raven Press, NY, 1990, p. 1679; Berkner, KL, Biotechniques 6:616-29, 1988; Strauss, SE, The Adenoviruses, Ginsberg, HS(編)、Plenum Press, NY, 1984, 第11章)、単純ヘルペスウイルス(HSV)などの他のウイルスベクターを用いることもできる。ヒト遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの利点としては、組換えが稀であり、ヒトの悪性度がそのようなウイルスと関連することが知られており、アデノウイルスゲノムが最大7.5 kbの大きさの外来遺伝子を許容するように操作することができる二本鎖DNAであり、および生のアデノウイルスが安全なヒトワクチン生物であるという事実が挙げられる。アデノ随伴ウイルスも、本発明に従うヒト治療にとって有用である(Samulski, RJら、EMBO J. 10:3941, 1991)。
【０１８６】
本発明のDNA分子を発現することができ、本発明の治療設定において有用である別のベクターは、非複製にさせ得るワクシニアウイルスである(米国特許第5,225,336号; 第5,204,243号; 第5,155,020号; 第4,769,330号; Fuerst, TRら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-53, 1992; Chakrabarti, Sら、Mol Cell Biol 5:3403-9, 1985)。組換えワクシニアウイルスおよび異種DNAを含む他のウイルスならびに免疫化およびDNA治療におけるその使用の記載は、Moss, B, Curr Opin Genet Dev 3:86-90, 1993; Moss, B, Biotechnol. 20:345-62, 1992に概説されている。
【０１８７】
裸のDNAまたはウイルスベクターに加えて、遺伝子操作された細菌をベクターとして用いることができる。サルモネラ、BCGおよびリステリア・モノサイトジェンス(Listeria monocytogenes)(LM)などのいくつかの細菌株が挙げられる(Hoisethら、Nature 291:238-9, 1981; Poirier, TPら、J Exp Med 168:25-32, 1988; Sadoff, JCら、Science 240:336-8, 1988; Stover, CKら、Nature 351:456-60, 1991; Aldovini, Aら、Nature 351:479-82, 1991)。これらの生物は、ワクチンベクターとしての使用のための2つの有望な特徴：(1)経口ワクチン送達の可能性を提供する、腸経路の感染；および(2)それによって専門的APCに抗原を標的化する単球／マクロファージの感染、を示す。
【０１８８】
in vivoでのウイルスを介する遺伝子導入に加えて、プラスミドDNAの投与(Wolffら、1990、上掲)および粒子ボンバードメント媒介遺伝子導入(Yang, N-S,ら、Proc Natl Acad Sci USA 87:9568, 1990; Williams, RSら、Proc Natl Acad Sci USA  88:2726, 1991; Zelenin, AVら、FEBS Lett 280:94 , 1991; Zelenin, AVら、FEBS Lett 244:65, 1989; Johnston, SAら、In Vitro Cell Dev Biol 27:11, 1991)などの当業界でよく知られた物理的手段をDNAの直接的導入に用いることができる。さらに、in vitroで細胞に遺伝子を導入するためのよく知られた手段であるエレクトロポレーションを用いて、本発明に従うDNA分子をin vivoで組織に導入することができる(Titomirov, AVら、Biochim Biophys Acta 1088:131, 1991)。
【０１８９】
「担体媒介遺伝子導入」も記載されている(Wu, CHら、J Biol Chem 264:16985, 1989; Wu, GYら、J Biol Chem 263:14621, 1988; Soriano, Pら、Proc Nat. Acad Sci USA 80:7128, 1983; Wang, C-Yら、Pro. Natl Acad Sci USA 84:7851, 1982; Wilson, JMら、J Biol Chem 267:963, 1992)。好ましい担体は、アシル化されたmAbを脂質二重層に組込むことができる(Wangら、上掲)、免疫リポソームなどの標的化されたリポソーム(Nicolau, Cら、Proc Natl Acad Sci USA 80:1068, 1983; Sorianoら、上掲)である。コンジュゲートが標的組織を認識する分子(例えば、肝臓についてはアシアロ-オロソムコイド)およびポリリジンなどの、損傷を引き起こすことなく、トランスフェクトしようとするDNAに結合するDNA結合化合物を含む場合、アシアロ糖タンパク質／ポリリジン(Wuら、1989、上掲)などのポリカチオンを用いることができる。次いで、このコンジュゲートを、本発明のプラスミドDNAを複合体化させる。
【０１９０】
トランスフェクションまたはマイクロインジェクションに用いられるプラスミドDNAを、例えば、Quiagen法(Quiagen)を用いるなど、当業界でよく知られた方法を用いて調製した後、本明細書に例示される方法などの公知の方法を用いてDNA精製することができる。
【実施例】
【０１９１】
実施例1
材料および方法
プラスミドDNAの構築
pcDNA3、pcDNA3-E7、pcDNA3-CRT/E7 (Chengら、上掲)、pcDNA3-E7/HSP70 (Chen CHら、Cancer Res 60:1035-42, 2000)およびpcDNA3-ETA(dII)/E7 (Hung CFら、Cancer Res 2001; 61:3698-3703)の作製は以前に記載されている。pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1を作製するために、Sig/E7/LAMP-1を、pCMV(neo)-Sig/E7/LAMP-1 (Ji Hら、Hum Gene Ther 10:2727-40, 1999)からEcoRI/BamHI部位で切断し、pcDNA3中にクローニングした。
【０１９２】
pNGVL4a-E7(detox)の作製のために、EcoRIおよびKpnI制限部位を用いてE7遺伝子をpNGVL4a(National Gene Vector Laboratory)中にクローニングした。部位特異的突然変異誘発を用いて、Rb結合を減少させることが以前に見出された(Munger Kら、EMBO J 8:4099-4105, 1989)2個の点突然変異を、E7遺伝子中に導入した。これらの突然変異を導入するのに用いられたプライマーは以下の通りである：
E7(detox)フォワード：5'ctgatctctacggttatgggcaattaaatgacagctc 3'(配列番号21)および
E7(detox)リバース：5'gagctgtcatttaattgcccataaccgtagagatca 3'(配列番号22)。
【０１９３】
pNGVL4a-CRT/E7(detox)の作製のために、CRTを、鋳型としてヒトCRTプラスミド(Dept. Medical Biochemistry at University of Wales College of Medicine at Cardiff, U.K.のDavid Llewellyn博士により親切にも提供された)を用いて、以下のプライマー：
5’ aaagtcgacatgctgctatccgtgccgctgc 3’ (配列番号23)および
5’ gaattcgttgtctggccgcacaatca 3’(配列番号24)
を用いてPCR増幅した。PCR産物をSalI/EcoRIで切断し、pNGVL4a-E7(detox)のSalI/EcoRI部位にクローニングした。DNA構築物の正確性を、DNA配列決定により確認した。
【０１９４】
pcDNA3-N-CRTの作製のために、まず、CRTのNドメインであるN-CRTをコードするDNAを、鋳型としてのウサギCRT cDNA(Michalak, M.ら、Biochem Cell Biol 76:779-85, 1998)ならびに以下のプライマーのセット：
5’-ccggtctagaacgctgctccctgtgccgct-3’   [配列番号25]および
5’-cccgaattcgttgtccgggccgcacgatca-3’   [配列番号26]
を用いることにより、PCR増幅した。増幅産物を、pcDNA3(Invitrogen Corp)のXbaI/EcoRI部位にさらにクローニングした。
【０１９５】
pcDNA3-P-CRTの作製のために、まず、CRTのPドメインをコードするDNAを、鋳型としてのウサギCRT cDNAならびに以下のプライマーのセット：
5’-tgctctagaatgtacaagggtgagtggaagcc-3’   [配列番号27]および
5’-ccggaattccagctcgtccttggcctggcc-3’   [配列番号28]
を用いて、PCR増幅した。増幅産物を、pcDNA3のXbaI/EcoRI部位にさらにクローニングした。
【０１９６】
pcDNA3-C-CRTの作製のために、まず、CRTのCドメインをコードするDNAを、鋳型としてのウサギCRT cDNAならびに以下のプライマーのセット：
5’-tgctctagaatgtacaagggtgagtggaagc-3’  [配列番号29]および
5’-ccggaattccagctcgtccttggcctggc-3’          [配列番号30]
を用いて、PCR増幅した。次いで、増幅産物を、pcDNA3のXbaI/EcoRI部位にクローニングした。
【０１９７】
pcDNA3-N-CRT/E7、P-CRT/E7、およびC-CRT/E7の作製のために、まず、E7をコードするDNAを、鋳型としてのpcDNA3-E7ならびに以下のプライマーのセット：
5’-ggggaattcatggagatacaccta-3’   [配列番号31]および
5’-ggtggatccttgagaacagatgg-3’   [配列番号32]
を用いて増幅した後、pcDNA3-N-CRT、pcDNA3-P-CRT、またはpcDNA3-C-CRTのEcoRI/BamHI部位にクローニングして、pcDNA3-N-CRT/E7、pcDNA3-P-CRT/E7、またはpcDNA3-C-CRT/E7を作製した。
【０１９８】
マウス
6〜8週齢の雌のC57BL/6マウスを、National Cancer Institute (Frederick, Maryland)から購入し、Johns Hopkins Hospital (Baltimore, Maryland)の癌動物施設中で飼育した。IFN-γノックアウトマウスを、Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)から取得した。全ての動物手順を、認可されたプロトコルに従って、および実験動物の適切な使用および世話に関する勧告に従って実施した。
【０１９９】
TC-1およびTC-1 P3(A15)腫瘍細胞系の作製
TC-1細胞の作製および維持は、Linら、上掲により記載されている。
【０２００】
TC-1 P3(A15)の作製のために、Vac-Sig/E7/LAMP-1ワクチン接種されたマウスを、TC-1腫瘍細胞を用いてチャレンジした。Vac-Sig/E7/LAMP-1を用いるワクチン接種は、HPV-16 E7発現腫瘍(TC-1)に対するE7特異的抗腫瘍応答を引き出すが、このワクチンは、ワクチン接種されたマウスの約20％で腫瘍形成を防止できない(Linら、上掲)。Vac-Sig/E7/LAMP-1をワクチン接種されたマウスに由来する増殖したTC-1腫瘍を外植し、直径1 mm未満の小片に切断し、DMEM(GIBCO BRL, Rockville, MD)中、1 mg/mlの濃度のコラゲナーゼで消化し、in vitroで増殖させた。これらの増殖させた細胞系をTC-1 P1と呼ぶことにした。次いで、Vac-Sig/E7/LAMP-1ワクチン接種されたマウスを、TC-1 P1腫瘍細胞を用いてチャレンジした。ワクチン接種されたマウスの約40％が腫瘍を発生した(データは示さない)。次いで、これらのワクチン接種されたマウスに由来する増殖した腫瘍を外植し、in vitroで増殖させて、TC-1 P2腫瘍細胞系を作製した。次いで、Vac-Sig/E7/LAMP-1ワクチン接種されたマウスを、TC-1 P2腫瘍細胞を用いてチャレンジした。今回はワクチン接種されたマウスの約60〜80％が、腫瘍を発生させた(データは示さない)。これらのワクチン接種されたマウスに由来する増殖した腫瘍を、さらに外植し、in vitroで増殖させて、TC-1 P3腫瘍細胞系を作製した。50個のTC-1 P3クローンを、限界希釈により作製した。TC-1 P3クローンのうち、MHCクラスI発現の顕著な下方調節を示す代表的なクローンを単離し、増殖させ、TC-1 P3(A15)腫瘍細胞系を作製した。本発明者らは、90％を超えるTC-1 P3(A15)細胞がMHCクラスI発現の下方調節を示したことを確認した。10％未満のTC-1 P3(A15)細胞が、いずれかのMHCクラスI分子を発現した。モノクローナル抗体(mAb)抗H-2Kb/H-2Db(クローン28-8-6)(BD Bioscience, San Diego, CA)を用いて、MHCクラスI発現を検出した。TC-1およびTC-1 P3(A15)細胞の両方を、10％(v/v)ウシ胎児血清、50ユニット／mlのペニシリン／ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、2 mM非必須アミノ酸、および0.4 mg/ml G418を添加したRPMI1640中、37℃で、5％CO2を用いて増殖させた。腫瘍チャレンジの日に、腫瘍細胞をトリプシン処理により収集し、1X Hanks緩衝塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、注入のための所定濃度まで1X HBSS中に再懸濁した。
【０２０１】
DNAワクチン接種
遺伝子銃媒介皮内ワクチン接種のために、DNAをコーティングした金粒子(1μg DNA/弾丸)を、以前に記載のように(Chen CHら、Cancer Res 60: 1035-42, 2000)、400 p.s.i.の吐出圧を用いるヘリウムにより駆動される遺伝子銃(BioRad, Hercules, CA)を用いて、C57BL/6マウスの毛剃りした腹部に送達した。C57BL/6マウスを、2μgのpcDNA3、pcDNA3-E7、pcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA(dII)/E7、pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1、pNGVL4a、pNGVL4a- E7(detox)、またはpNGVL4a-CRT/E7(detox)を用いて、遺伝子銃によりワクチン接種した。これらのマウスは1週間後に同じ投薬計画を用いる追加免疫を受けた。
【０２０２】
筋肉内(i.m.)DNAワクチン接種のために、50μg／マウスのpNGVL4a、pNGVL4a- E7(detox)、およびpNGVL4a-CRT/E7(detox)DNAワクチンを、シリンジ針注入により筋肉内送達した。これらのマウスは、1週間後に同じ投薬計画を用いる追加免疫を受けた。
【０２０３】
細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析
細胞表面CD8および細胞内IFN-γの染色ならびにFACScan分析を、以前に記載(Chenら、上掲)のように実施した。FACScanの前に、異なる群のマウスから得た脾臓細胞を回収し、E7特異的CD8+ T細胞前駆体を検出するためのMHCクラスIエピトープを含む1μg/mlのE7ペプチド(アミノ酸49〜57、RAHYNIVTF、配列番号33)(Feltkamp MCら、Eur J Immunol 23:2242-49, 1993)と共に20時間インキュベートした。Golgistop(Brefeldin A)を、培養物から細胞を収集する6時間前に添加した。同じワクチン構築物を用いてワクチン接種されたマウス群から得た脾臓細胞のプールを用いて、3回の実験を行った。IFN-γを分泌するCD8+ T細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて分析した。分析を、CELLQuestソフトウェア(Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA)を用いて、Becton-Dickinson FACScan上で行った。
【０２０４】
in vivoでの腫瘍治療(TC-1腫瘍を使用)
E7発現性腫瘍(TC-1)を用いるin vivoでの腫瘍治療実験のために、マウス(5匹／群)を、104個のTC-1細胞を用いて尾静脈を通じて静脈内投与(iv)でチャレンジした。腫瘍チャレンジの7日後、マウスに、遺伝子銃により2μgの種々のDNAワクチンまたは対照プラスミドを投与した。最初のワクチン接種の1週間後、マウスを、同じ投薬計画を用いて追加免疫した。28日目に、マウスを屠殺し、肺を外植した。各マウスの肺の表面上の肺結節を、以前に記載(Jiら、上掲)のようにサンプルの内容について盲検状態にした実験者により計測した。
【０２０５】
長期(8週間)のin vivoでの腫瘍防御実験
マウス(5匹／群)を、2μgの種々のDNAワクチンまたは対照プラスミドを用いて、遺伝子銃によりワクチン接種した。1週間後、マウスを同じ投薬計画を用いて追加免疫した。最初のワクチン接種の8週間後、マウスを105個のTC-1細胞を用いて尾静脈を通じて静脈内投与でチャレンジした。マウスを、腫瘍チャレンジの28日後に屠殺し、各マウス中の肺表面肺結節を、サンプルの内容について盲検状態にした実験者により計測した。
【０２０６】
TC-1 P3(A15)クラスIを下方調節した腫瘍に対するin vivoでの腫瘍防御
C57BL/6マウス(5匹／群)を、遺伝子銃注入により、以下に記載のような種々のDNAワクチンまたは対照プラスミドを用いてワクチン接種した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、右脚への皮下(s.c.)注入により、5 x 104個のTC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いてチャレンジした。以前に記載(Linら、上掲)のように、週に2回、目視および触診により腫瘍の成長をモニターした。
【０２０７】
野生型マウスとIFN-γノックアウトC57BL/6マウスとを比較する試験のために、マウス(5匹／群)を、2μgのpcDNA3-CRT/E7 DNAを用いて遺伝子銃によりワクチン接種した後、1週間後に同じ投薬計画を用いて追加免疫した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを右脚への皮下注入により5 x 104個のTC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いてチャレンジした。週に2回、目視および触診により腫瘍成長をモニターした。
【０２０８】
微小血管密度の定量のための免疫組織化学的標識化
腫瘍内微小血管の標識化を、公知の方法(Cheng, WFら、Cancer 85:651-7, 1999)を用いて、ラット抗マウスCD31 mAb(1:30希釈率、Bioscience)、次いで、VECTOR(登録商標)M.O.M Immunodetection Kit(VECTOR; Burlingame, CA)を用いて実施した。各切片において、3つの最も血管形成された領域を選択し、200倍で微小血管を計測した。すなわち、各腫瘍の3つの視野の平均MVD計測数を算出した。厚い筋肉壁を有する大きい血管および約8個を上回る血液細胞に対応する直径を有する内腔を除外した。類似する大きさの腫瘍においてMVDを評価した。全測定を、サンプル内容について盲検状態にした1人の病理学者により実施した。
【０２０９】
Matrigel(登録商標)を用いるin vivo血管新生アッセイ
in vivoでの血管新生を、基本的にはChengら、2001、上掲およびCoughlin, CMら、J Clin Invest 101:1441-52, 1998に従って、Matrigel(登録商標)プラグアッセイを用いて評価した。いかなる挿入物も含まない16μgのプラスミドDNA(陰性対照)、または野生型E7、N-CRT、N-CRT/E7、P-CRT/E7、C-CRT/E7もしくはCRT/E7 DNAを用いて、0日目にマウスを免疫し、7日目に同じ投薬計画を用いて追加免疫した。Matrigel(登録商標)(Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ)を、ヘパリン(最終濃度50 U/ml)、bFGF(最終濃度20 ng/ml)、およびVEGF(最終濃度200 ng/ml)と、4℃で混合した。合計0.5 mlのこのMatrigel(登録商標)混合物を、7日目に、DNAワクチンを接種したマウスの腹部正中線に皮下注入した。ヘパリン、bFGFおよびVEGFと混合したMatrigel(登録商標)を注入したナイーブなマウスは、陽性対照として機能した。Matrigel(登録商標)単独を注入したナイーブなマウスは陰性対照であった。マウスを、16日目に安楽死させた。Matrigel(登録商標)プラグを、周囲の結合組織から切除した。プラグの半分を、10％ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に埋め込み、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色するか、またはギムザ染色して、MVDを算出した。各切片において、5つの最も血管性の領域を選択し、微小血管を400倍で評価し、Matrigel(登録商標)プラグについて5つの視野での平均数を算出した(MVD計数)。各プラグの残りの半分は、製造業者の説明書(Drabkin's試薬キット；Sigma Diagnostics Co., St. Louis, MO)に従ってヘモグロビン含量についてアッセイした。
【０２１０】
統計学的分析
全ての結果は、平均±SEとして表され、少なくとも2つの別個の実験の代表である。フローサイトメトリー分析および腫瘍治療実験に関するICCSのデータを、分散分析(ANOVA)により分析した。個々のデータ点間の比較は、スチューデントt検定を用いて行った。Kaplan-Meierの生存曲線を、腫瘍防御実験について曲線間の差異に対して用い、ログランク検定を用いてp値を算出した。0.05未満のpを、有意であると考えた。
【０２１１】
実施例2
E7に連結した他のIPPを用いるCRT/E7 DNAワクチンの比較分析
CD8+ T細胞媒介免疫応答は、HPV感染およびHPVに関連する新生物の両方を制御する上で重要である。種々のDNAベクターに対する免疫応答、pcDNA3、pcDNA3-E7、pcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA(dII)/E7、およびpcDNA3-Sig/E7/LAMP-1ワクチン構築物により生成されたE7特異的CD8+ T細胞前駆体の頻度を評価するために、フローサイトメトリー分析を用いるICCSを、最後のワクチン接種の1週間後にワクチン接種されたマウスから得た脾臓細胞を用いて行った。図1および2に示されるように、pcDNA3-CRT/E7 DNAをワクチン接種されたマウスは、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA(dII)/E7、pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1、pcDNA3-E7、またはpcDNA3を用いてワクチン接種されたマウスと比較して、最も多い数のE7特異的IFN-γ+CD8+ T細胞前駆体(3 x 105個の脾臓細胞当たり)(655個)を示した(p<0.05)。
【０２１２】
実施例3
CRT/E7ワクチンで免疫したマウスは強力な抗腫瘍応答を生成する
種々のキメラDNA構築物の治療能力を、以前に記載された肺血行性散布モデル(Jiら、上掲)を用いて、E7発現性腫瘍であるTC-1の治療について試験した。図3に示されるように、pcDNA3-CRT/E7ワクチンを与えたマウスは、TC-1チャレンジ後にpcDNA3(陰性対照)またはpcDNA3-E7をワクチン接種されたマウスと比較して、有意により少ない数の肺結節を示した(p<0.05)。pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA(dII)/E7、またはpcDNA3-Sig/E7/LAMP-1ワクチンとpcDNA3-CRT/E7を比較する場合、pcDNA3-CRT/E7で免疫したマウスは、他のものよりも少ない平均数の肺結節を示した(p<0.95)。
【０２１３】
実施例4
CRT/E7を用いるワクチン接種はより多い数の抗原特異的記憶T細胞を生成し、長期間の腫瘍防御を提供する
種々のDNAワクチンにより生成されたE7特異的CD8+記憶T細胞前駆体を測定するために、pcDNA3 (陰性対照)、pcDNA3-E7 (抗原対照)、pcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA(dII)/E7、およびpcDNA3-Sig/E7/LAMP-1 DNAを用いて動物をワクチン接種した。ICCSフローサイトメトリーを、最初のワクチン接種の8週間後に、ワクチン接種されたマウスから誘導された脾臓細胞に対して実施した。図4および5に示されるように、マウスpcDNA3-CRT/E7 DNAは、他のDNA構築物をワクチン接種されたマウスと比較して、最も多い数のE7特異的IFN-γ+CD8+記憶T細胞前駆体を誘導した(p<0.05)。
【０２１４】
このワクチンはまた、E7発現性腫瘍に対する最良の長期間防御を提供した。さらにより多数のIPP-Agワクチン構築物、すなわちpcDNA3 (陰性対照)、pcDNA3-E7 (抗原対照)、pcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-VP22/E7 (単純ヘルペスウイルスタンパク質VP22)、pcDNA3-ETA(dII)/E7、およびpcDNA3-Sig/E7/LAMP-1 DNAをも比較する長期間の腫瘍防御試験を行った。図6に示されるように、pcDNA3-CRT/E7 DNAをワクチン接種されたマウスは、pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1、pcDNA3-E7、またはpcDNA3をワクチン接種されたマウスと比較して有意に少ない肺結節を示した(p<0.05)。統計学的に有意ではないが、pcDNA3-CRT/E7をワクチン接種されたマウスも、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-VP22/E7、pcDNA3-ETA(dII)/E7をワクチン接種されたマウスよりも少ない平均数の肺結節を示した(p<0.70)。
【０２１５】
実施例5
CRT/E7 DNAを用いるワクチン接種は、MHCクラスIが下方調節されたE7発現性腫瘍を制御する免疫をもたらす
MHCクラスI発現は多くの子宮頸癌において下方調節されるため、MHCクラスI発現が低い腫瘍に対する防御におけるCRT/E7 DNAワクチンの有効性を決定することが重要である。TC-1 P3(A15)と呼ばれる、MHCクラスI発現が下方調節されたE7発現性マウス腫瘍モデルを、実施例1に記載のように開発した。TC-1 P0およびTC-1 P3腫瘍細胞におけるMHCクラスI発現を、フローサイトメトリー分析により行った。図7に示されるように、MHCクラスI発現は、TC-1と比較してTC-1 P3(A15)において顕著に下方調節された。
【０２１６】
この後、2μgのCRT/E7 DNA、CRT DNA (CRTのみ、対照)、E7 DNA(抗原対照)、またはベクターのみ(陰性対照)をマウスにワクチン接種し、次いで、1週間後に5 x 104個のTC-1 P3(A15)腫瘍細胞でチャレンジするC57BL/6マウスにおける腫瘍防御試験を行った。図8に示されるように、pcDNA3-CRT/E7 DNAをワクチン接種された全てのマウスは、腫瘍チャレンジ後の最大45日間、TC-1 P3(A15)による腫瘍チャレンジに対して保護された。対照的に、全ての対照マウス(pcDNA3-CRT、pcDNA3-E7、またはpcDNA3ベクターでワクチン接種したもの)は、14日以内に腫瘍を生じた。
【０２１７】
本発明者らおよび同僚は、E7に連結されたマイコバクテリウム・ツベルクロシスのHSP70を用いるDNAワクチンにより生成される抗腫瘍作用(MHCクラスIが下方調節されたE7発現性腫瘍細胞系に対するもの)にとって、IFN-γが必須であることを以前に示した(Cheng WFら、Gene Ther 10:1311-20, 2003)。IFN-γが、CRT/E7 DNAをワクチン接種する場合にも必須であるかどうかを判定するために、野生型およびIFN-γノックアウトマウスにTC-1 P3(A15)をワクチン接種およびチャレンジする実験を行った。図9に示されるように、CRT/E7をワクチン接種された野生型マウスの100％が、TC-1 P3(A15)によるチャレンジに対して100％保護されたが、そのようにE7をワクチン接種されたIFN-γノックアウトマウスは20％のみが保護された。
【０２１８】
これらの前記結果は、(a)CRT/E7 DNAを用いる免疫化は、MHCクラスI発現が下方調節されたE7発現性腫瘍を制御することができること、および(b)この防御はIFN-γを生産するか、発現するか、または上方調節する(おそらくはT細胞において)能力に依存することを示唆している。
【０２１９】
実施例6
pNGVL4a-CRT/E7(detox)DNAを用いる筋肉内および遺伝子銃免疫化は、E7特異的CD8+ T細胞免疫応答を増強する
pcDNA3-CRT/E7 DNAベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、野生型E7は宿主細胞を腫瘍形成的に形質転換する危険性がより大きいため、ヒトでの使用にとってより好適な別のベクターを用いた。本発明者らは、pNGVL4aベクター(例えば、本発明者らの特許公開WO 2004/098526A2を参照)を用いて、臨床設定における使用のために「pNGVL4a-CRT/E7(detox)」と命名した新しいCRT/E7ベクターを作製した。さらに、ヒトの免疫化を筋肉内注入により実施することができる可能性があるため、試験を行って、マウスにおけるpNGVL4a-CRT/E7(detox)を用いる筋肉内ワクチン接種がE7特異的CD8+ T細胞免疫応答を増強することができることを証明した。図10および11に示されるように、pNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAを用いるマウスの筋肉内免疫化および遺伝子銃免疫化は、抗原対照(pNGVL4a-E7(detox))または陰性ベクター対照(pNGVL4aベクターのみ)を用いるワクチン接種と比較して、E7特異的CD8+ T細胞前駆体の数を有意に増加させた(p<0.05)。
【０２２０】
pNGVL4a-CRT/E7(detox)を用いる遺伝子銃媒介免疫化は、筋肉内免疫化よりも多い抗原特異的CD8+ T細胞前駆体を生成した(p<0.05)。
【０２２１】
さらに、MHCクラスI発現が下方調節されたE7発現性腫瘍(TC-1 P3(A15))を用いる腫瘍防御実験において、結果は、pNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAをワクチン接種されたマウスが、腫瘍チャレンジ後最大45日間、TC-1 P3(A15)に対する100％の防御を示した(データは示さない)ことを示していた。
【０２２２】
これらの結果は、pcDNA3-CRT/E7 DNAと同様、pNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAは、E7特異的CD8+ T細胞の数を顕著に増強することができ、また、MHCクラスI発現が下方調節されても、E7発現性腫瘍が免疫系により制御される状態をもたらすことができることを示している。かくして、pNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAは、HPV感染およびHPVに関連する病変の制御のためのヒトにおける使用にとって有用なワクチン構築物である。
【０２２３】
実施例7
実施例1〜6の考察
DNAが抗原とIPPの融合タンパク質をコードする5種の有効なキメラDNAワクチンにより生成されたE7特異的CD8+ T細胞免疫応答および抗腫瘍作用を互いに比較した。試験したキメラの組合せは、本発明者らの研究室が以前に開発したCRT/E7、E7/HSP70、ETA(dII)/E7、Sig/E7/LAMP-1/E7であった。
【０２２４】
pcDNA3-CRT/E7構築物をワクチン接種されたマウスは、最も多量の抗原特異的CD8+ T細胞前駆体および記憶T細胞を生成し、それは強力な腫瘍治療効果および長期腫瘍防御効果をもたらした。
【０２２５】
CRT/E7 DNAワクチンにより誘導された、増強された免疫応答は、MHCクラスI発現が下方調節された腫瘍を制御することさえできた。これは、このワクチンが、MHCクラスI発現も下方調節された頸部病変を有し、腫瘍によるCD8+ CTL応答の回避を通常促進する状態を示す患者を治療するのに有用であることを示している。
【０２２６】
また、本明細書で証明されるのは、pNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAワクチンが、上記で考察されたpcDNA3ワクチンよりも優れた、臨床使用のためのいくつかの利点を有することである。遺伝子銃を介して、または筋肉内に投与されたpNGVL4a-CRT/E7(detox) DNAワクチンは、E7特異的CD8+ T細胞免疫応答を増強し、下方調節されたクラスIを有する腫瘍を制御することができた。
【０２２７】
実際、免疫治療の効率に関する1つの関心は、腫瘍がMHCクラスI下方調節などの種々の機構を介して免疫応答を回避することができることである。メラノーマ(Ferrone Sら、Immunol Today 16:487-94, 1995)；肺癌(Korkolopoulou Pら、Br J Cancer 73:148-53, 1996)、前立腺癌(Sanda MGら、J Natl Cancer Inst 87:280-5, 1995)、乳癌(Cabrera Tら、「侵襲的乳癌における高頻度の変化したHLAクラスI表現型(High frequency of altered HLA class I phenotypes in invasive breast carcinomas.)」、Hum Immunol 50:127-34, 1996; Vitale Mら、Cancer Res; 58: 737-42, 1998)、卵巣癌および結腸癌(Vegh Zら、Cancer Res 53:2416-20, 1993)ならびに子宮頸癌(Connor MEら、Int J Cancer 46:1029-34, 1990; Cromme FVら、Oncogene 8:2969-75, 1993; Koopman LAら、J Exp Med 191: 961-76, 2000)などの多くのヒトの癌が、MHCクラスI発現を下方調節することが示された。
【０２２８】
MHCクラスI発現を下方調節することにより、腫瘍細胞は免疫認識を逃れ、かくして、抗原特異的CD8+ T細胞による殺傷を回避する。本発明は、MHCクラスI発現が低い腫瘍に対してCRT/E7 DNAワクチンを用いて、そのような回避を克服することもでき、かくして、MHCクラスI発現が下方調節された進行した子宮頸癌を有する患者を治療するのに用いることもできるより強力な免疫応答を生成する組成物および方法を提供する。
【０２２９】
E7/HSP70に関する本発明者らの以前の研究に基づき、腫瘍防御にはIFN-γが必要であると結論付けられた。IFN-γは実際に、「野生型」TC-1 P0細胞と等価なレベルまで、TC-1 P3(A15)腫瘍細胞上でのMHCクラスI発現を上方調節することができた。本発明は、その免疫増強作用および抗腫瘍作用のためにIFNγを必要としたCRT/E7 DNAワクチンが、IFNγ発現の刺激(または、MHCクラスI発現が下方調節された腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答における、細胞質性IFNγを発現するCD8+ T細胞の数の増加)のための役割をさらに支援することを発見した。
【０２３０】
新規免疫原性ベクターpNGVL4a-CRT/E7(detox)の試験により、筋肉内経路および皮内遺伝子銃投与の両方により免疫化の成功を達成することができ、それによりMHCクラスIが下方調節された腫瘍に対するCD8+ T細胞の数および効率の両方の増加をもたらすことが示された。遺伝子銃媒介皮内免疫化は、専門的APC、ランゲルハンス細胞に対する抗原を直接的に標的化し、DNAをトランスフェクトしたDCによるT細胞に対する抗原の直接的提示をさらに改善するための細胞内戦略を可能にする。比較すると、筋肉内免疫化は、単球に対する抗原を標的化するようであり、DNAワクチンによりコードされる抗原は交叉プライミング機構により骨髄由来APCを介して最終的に提示される。pNGVL4a-CRT/E7(detox)を用いるワクチン接種は、キメラCRT/E7(detox)タンパク質の分泌またはCRT/E7(detox)抗原を発現する細胞の溶解を誘導し、MHCクラスI拘束性経路により近隣のAPCにより取り込まれ、処理される細胞からキメラタンパク質を放出させるようである。E7へのCRTの連結は、E7抗原の交叉プライミングを容易にする。1つの最近の研究により、専門的APC上で共通に発現されるα2マクログロブリン受容体であるCD91は、HSPおよびCRTの受容体として働き、交叉プライミングを容易にすることが見出された(Basu Sら、Immunity 14:303-13, 2001)。CRT/E7(detox)をコードするDNAワクチンの筋肉内免疫化は、トランスフェクトされた細胞から標的へのCRT/E7(detox)タンパク質の持続放出を促進して、専門的APCに対してCRT/E7(detox)を濃縮し、そしてE7特異的応答の交叉プライミングを容易にすることができる。従って、異なる投与経路は、同じワクチンにより異なる程度の免疫応答性を生成し得る。
【０２３１】
まとめると、CRT/E7 DNAワクチンは、E7発現性腫瘍に対する有効な抗腫瘍免疫を生成し、ワクチン接種されたマウスにおいてMHCクラスI発現が下方調節されたE7発現性腫瘍を制御する能力を持つだけでなく、腫瘍血管系を標的化することにより腫瘍増殖を防止するか、または遅延させる能力を持つため、魅力的な治療用ワクチンである。
【０２３２】
CRT/E7 DNAワクチン(特に、E7(detox)を用いる)の有用性は、E7を発現する子宮頸癌を有する患者を治療することに限定されず、連結された抗原とは関係なくCRTにより媒介される抗血管新生治療を必要とする被験体を治療するのにも有用であることが明らかなはずである。同じことは、CRT/E6、またはついでに言えば任意の他の抗原を用いる関連ワクチンについても言える。
【０２３３】
実施例8
CRTドメインをコードするDNAワクチンは、強力なT細胞媒介免疫応答、抗腫瘍免疫および血管新生の阻害を引き出す
(本実施例は、Chengら、Vaccine 23, 2864-3874, 2005を参照により特に組み入れるものとする)
E7に連結されたN-CRT、P-CRT、またはC-CRTをコードするDNAを用いるワクチン接種は、E7特異的CD8+ T細胞応答を有意に増強する。E7 DNAワクチンと連結した場合、カルレティキュリンの異なるドメインが、マウスにおいてE7に特異的なT細胞媒介免疫応答を増強することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、フローサイトメトリー分析を用いてICCSを実施して、CRT/E7 DNAまたはE7に連結されたCRTドメインをコードするDNAを用いる免疫化の結果として生成されたE7特異的CD8+およびCD4+ T細胞前駆体を特性評価した。N-CRT/E7、P-CRT/E7、およびC-CRT/E7 DNAの各々を用いるワクチン接種は、E7 DNAを用いるワクチン接種と比較した場合、より高い頻度のE7特異的INF-γ分泌性CD8+ T細胞前駆体を生成した(p<0.01)。N-CRTおよびE7 DNAをコードするDNAの混合物の投与はCD8+ T細胞活性を増強しないため、E7へのN-CRTの物理的連結がこの増強にとって必要であった。CRT/E7 DNAを用いるワクチン接種は、N-CRT/E7 (178.0±18.5)、P-CRT/E7 (140.0±16.0)およびC-CRT/E7 (128.0±10.0)と比較した場合、わずかに多い数のE7特異的CD8+ T細胞前駆体(220.5±18.5)を生成した(p<0.01)。かくして、各CRTドメインをコードするDNAは、免疫増強活性を有し、抗原をコードするDNAに連結した場合、IPPとして働くことができる。しかしながら、E7に連結されたCRTドメインはいずれも、E7特異的なIFN-γを分泌するCD4+ T細胞をより強く誘発することはなかった(E7 DNAを用いるワクチン接種と比較して)。
【０２３４】
N-CRT/E7 DNAを用いるワクチン接種は、E7特異的抗体応答を有意に増強した。P-CRT/E7でもC-CRT/E7 DNAでもなく、CRT/E7またはN-CRT/E7を用いるワクチン接種は、野生型E7 DNAを用いるワクチン接種と比較して、ワクチン接種されたマウスにおけるE7特異的抗体応答を増強した(p<0.01)。N-CRT/E7により誘導された抗E7抗体の力価と、CRT/E7に対して誘導された抗E7抗体の力価との間には有意差はなかった。
【０２３５】
N-CRT/E7、P-CRT/E7またはC-CRT/E7 DNAを用いるワクチン接種は、E7特異的腫瘍防御を増強した。in vivoでの腫瘍防御実験を、TC-1腫瘍細胞を用いて上記のように実行した。N-CRT/E7、P-CRT/E7、C-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAの投与を受けたマウスの100％が、TC-1チャレンジの60日後にも腫瘍を含まないままであった。比較すると、野生型E7 DNAのみをワクチン接種された全てのマウスはチャレンジから14日以内に腫瘍を生じた。かくして、CRTの各ドメインは、DNAワクチン中でE7抗原に連結した場合、E7発現性腫瘍細胞を用いる致命的なチャレンジに対して、ワクチン接種されたマウスを保護することができる。
【０２３６】
N-CRT/E7、P-CRT/E7、またはC-CRT/E7 DNAを用いる治療は、C57BL/6マウスにおいて肺腫瘍結節を有意に減少させた。上記ワクチンの治療能力を、上記の肺血行性散布モデルを用いて試験した。N-CRT/E7 DNA (1.0±0.4)、P-CRT/E7 (1.2±0.8)、またはC-CRT/E7 (1.4±0.6)で処理したC57BL/6マウスは全て、一方向ANOVAにより、(a)野生型E7(抗原のみ)(139.0±11.0)または(b)「抗原なし」のN-CRT(34.0±3.2)の「対照」DNAワクチン用いて処理したマウスよりも有意に少ない肺腫瘍結節を示した(p<0.001)。かくして、E7 DNAと連結した場合、3個のCRTドメインの各々をコードするDNAは、肺血行性散布モデルにおいて増強された抗腫瘍作用を生成した。
【０２３７】
N-CRT DNAを用いるマウスの処理はまた、野生型E7 DNAを用いる処理または処理なしよりも有意に少ない腫瘍結節をもたらしたが(一方向ANOVA、p<0.001)、これはN-CRTが非免疫学的抗腫瘍作用を誘導することができることを示している。
【０２３８】
N-CRT/E7 DNAまたはN-CRT DNAを用いる処理は、免疫不全マウスにおいて肺腫瘍結節を有意に減少させた。この明らかにT細胞とは無関係の(おそらく非免疫学的な)抗腫瘍作用を調べるために、N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAを与えた免疫不全BALB/c胸腺欠損ヌードマウス(nu/nu)は、野生型E7 DNA(215.0±10.0)、挿入物を含まないプラスミド(217.5±17.0)で処理したマウス、または未処理のナイーブなマウス(230.0±22.5)と比較して、有意により少ない平均数の肺腫瘍結節(N-CRTについては18.0±2.0、N-CRT/E7については25.0±4.0)を示した(一方向ANOVA、p<0.001)。興味深いことに、P-CRT/E7もC-CRT/E7も、野生型E7 DNAで処理したマウスと比較して、腫瘍結節の有意な減少を誘発しなかった。さらに、N-CRT/E7 DNAで処理したヌードマウスは、CRT/E7 DNAで処理したヌードマウスよりも有意に少ない肺腫瘍結節を示した(一方向ANOVA、p<0.05)。かくして、N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAを用いる処理は、T細胞媒介免疫応答の非存在下でも抗腫瘍作用を生成することができるが、P-CRT/E7およびC-CRT/E7 DNAはこの作用を有しなかった。
【０２３９】
CRT/E7、N-CRT/E7およびN-CRTは、BALB/cヌードマウスの腫瘍における微小血管密度(MVD)を低下させた。血管新生の阻害が上記の非免疫学的抗腫瘍作用を説明することができる可能性を評価するために、種々のDNAワクチンで処理したヌードマウスの肺腫瘍においてMVDを評価した。N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAでのヌードマウスの処理は、野生型E7、P-CRT/E7またはC-CRT/E7群での処理よりも肺腫瘍におけるMVDを有意に低下させた(一方向ANOVA、p<0.001)。N-CRT/E7 DNA処理は、CRT/E7 DNAよりも強力であった(一方向ANOVA、p<0.05)。総合すれば、その結果は、N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAを用いるワクチン接種により引き出されたT細胞とは無関係な抗腫瘍作用が、特にCRTのNドメインと関連した作用である腫瘍血管新生の阻害を介して生じることを示している。
【０２４０】
TC-1腫瘍細胞を用いてチャレンジされ、N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7 DNAで処理されたマウスに由来するMatrigel (登録商標)におけるMVDおよびヘモグロビン(Hb)の減少。上記のDNA構築物で処理されたマウスにおける抗血管新生のより定量的な評価を、Matrigel (登録商標)に基づくin vivoでの血管新生アッセイにおいて実施した。N-CRT、N-CRT/E7、またはCRT/E7処理されたマウスからのMatrigel埋め込み物のHb含量は、挿入物を含まない対照DNA、E7 DNA、P-CRT/E7 DNA、またはC-CRT/E7 DNAで処理されたマウスからのものよりも有意に低かった(p<0.01、ANOVA)。このアッセイは、N-CRTまたはN-CRT/E7 DNAが、bFGFまたはVEGFにより誘導されるin vivo血管新生を阻害することを示していた。N-CRT/E7処理されたマウスからのMatrigel (登録商標)埋め込み物のHbレベルは、CRT/E7処理されたマウスからのものよりも有意に低かった(p<0.01、ANOVA)。
【０２４１】
血管新生は赤血球(Hbの起源)を血管から浸出させるため、これらのMatrigel(登録商標)サンプルにおけるMVDは、血管新生阻害のさらなる尺度として役立つ。N-CRT(23.7±10.4)、N-CRT/E7(21.3±4.7)、およびCRT/E7(29.0±9.2) DNA処理されたマウスからのMatrigel (登録商標)サンプルにおける平均MVDは、互いに類似していたが、対照プラスミドDNA(挿入物なし)(98.3±31.8)、野生型E7 DNA(76.7±12.0)、C-CRT/E7 DNA(77.3±9.6)、またはP-CRT/E7 DNA(76.3±6.7)で処理したマウスからのサンプルよりも有意に低かった。これは、CRTのNドメインが、観察された抗血管新生作用を担うことを確認するものである。
【０２４２】
抗腫瘍作用のためにはN-CRT DNAをE7 DNAに連結しなければならない。E7へのN-CRTの連結が、ワクチン接種されたマウスにおけるE7発現性腫瘍に対する抗腫瘍作用にとって必須であるかどうかを評価するために、本発明者らは、TC-1腫瘍細胞を用いてin vivoでの腫瘍防御実験を実施した。E7 DNAをコードするDNA構築物と、それとは別に、N-CRT DNA、N-CRT/E7またはN-CRT DNAをコードする構築物との混合物を、マウスにワクチン接種した。好適な時点で、E7を担持するTC-1腫瘍細胞を用いてマウスをチャレンジした。N-CRT/E7 DNAをワクチン接種されたマウスは全て、腫瘍を含まないままであった。対照的に、他のDNAワクチン組合せ物(N-CRT DNAとE7 DNAとの混合物など)をワクチン接種した全てのマウスは、チャレンジの2週間以内に腫瘍を生じた。これは、E7へのN-CRTの連結が、ワクチン接種されたマウスにおける観察された抗腫瘍作用にとって必要であったことを示している。
【０２４３】
CD4+ T細胞またはNK細胞ではなく、CD8+ T細胞が、N-CRT/E7 DNAワクチンにより引き起こされる抗腫瘍作用にとって重要である。in vivoでの抗体枯渇実験を行って、個々のT細胞サブセットまたはNK細胞を欠失させた。CD8+ T細胞を枯渇させたN-CRT/E7 DNAワクチン接種されたマウス、ならびに全てのワクチン接種されていないナイーブなマウスは、14日以内に腫瘍を増殖させた。対照的に、CD4+ T細胞またはNK細胞を枯渇させた全てのN-CRT/E7 DNAワクチンを接種されたマウスは、チャレンジの56日後にも腫瘍を含まないままであった。これらの結果は、N-CRT/E7 DNAワクチンに応答して、CD4+ T細胞やNK細胞ではなく、CD8+ T細胞が抗腫瘍免疫を媒介することを示唆することを示していた。
【０２４４】
考察
かくして、本発明者らは、HPV-16 E7抗原をコードするDNAへの、N-CRT、P-CRT、またはC-CRTをコードするDNAの連結が、E7を発現するDNAワクチンの効力を有意に増強することができることを示した。E7 DNAと連結されたCRTの各ドメインは、強力なE7特異的CD8+ T細胞免疫応答を引き出し、皮下のHPV-16 E7発現性腫瘍に対する顕著なCD8+ T細胞依存的防御作用を生成し、さらに致死的な肺腫瘍結節を効果的に治療することができた。比較すると、N-CRT/E7またはCRT/E7 DNAを用いるワクチン接種は、E7特異的抗体応答を有意に増強した。NドメインをコードするDNAワクチンのみが、血管新生を阻害し、免疫応答とは無関係な治療をもたらした。かくして、腫瘍抗原に連結されたN-CRT(完全長CRTなど)をコードするDNAワクチンは、抗腫瘍作用を増加させるために免疫治療手法および抗血管新生手法を組合わせる治療にとって有用な手法を示す。
【０２４５】
CRT(またはCRTドメイン)の免疫学的作用の機構は、DCなどのトランスフェクトされたAPC中で連結された抗原をERへと標的化することにより、抗原のMHCクラスIプロセッシングを増強することを含んでもよい。これらの作用に関する別の可能性のある機構は「交叉プライミング」であり、それにより、キメラタンパク質の分泌またはキメラ抗原を発現する細胞の溶解は、MHCクラスI拘束性経路を介して他のAPCにより外来的に取り込まれ処理されるキメラタンパク質を、放出する。α2マクログロブリン受容体であるCD91は、CRT、gp96、HSP70およびHSP90などの熱ショックタンパク質の受容体として働き、交叉プライミング作用を容易にする。3つのCRTドメインのいずれがCD91に結合するのかということに関する問題は依然として存在する。直接機構および交叉プライミング機構は共に、P-CRT/E7 DNAおよびC-CRT/E7 DNAの免疫増強作用をも説明することができる。
【０２４６】
抗体媒介応答はHPVに関連する悪性腫瘍を制御するのに重要な役割を果たすとは考えられないにもかかわらず、抗原特異的抗体は、HER-2/neu抗原を担持する乳癌細胞の治療などの他の腫瘍疾患において重要である。E7について記載されたキメラN-CRTまたはCRTワクチン戦略を、Her-2/neuエピトープに直接適用して、高レベルの表面HER-2/neuを発現する細胞の増殖を停止させ得るHER-2/neu特異的抗体応答を刺激することができる(Harwerth, IMら、Br J Canc 68:1140-5, 1993)。
【０２４７】
内皮細胞増殖などの血管新生を阻害することにより、任意の他の抗原に連結されたN-CRT DNA、N-CRT/E7 DNAまたはN-CRTを用いて、腫瘍の新血管形成を減少させ、腫瘍増殖を阻害することができる。N-CRT/E7およびCRT/E7は、E7特異的CD8+ T細胞媒介免疫応答を介して、確立された腫瘍細胞を制御し、抗血管新生を介して腫瘍血管の増殖を阻害することができる2個のキメラ分子である。有効な抗血管新生作用には、CRTまたはN-CRTをコードするDNAの反復投与および高用量投与が必要である。1回のDNAワクチン接種は、ワクチン接種後7日でピーク血清CRTレベルをもたらし、次いで、ワクチン接種後14日以内に基底レベルまで漸減する(Xiao, F.ら、Gene Ther 9:1207-13, 2002)。血清CRTのレベルは、与えたCRT DNAの用量に依存する。典型的なDNAワクチン用量(2μg)は、検出可能な血清CRTレベルをもたらさなかった。高用量のCRT DNAの反復ワクチン接種は、ワクチン接種されたマウスにおいて検出可能なレベルの血清CRTおよび抗血管新生作用を誘導する(Chengら、2001、上掲)。血管新生阻害の望ましくない副作用としては、創傷治癒の減退が挙げられる。しかしながら、これは腫瘍を阻害する用量では起こらないようである(Lange-Asschenfeldt, Bら、J Invest Dermatol 117:1036-41, 2001)。さらに、本発明者らによるさらなる実験は、CRT/E7 DNAワクチンを用いるワクチン接種は、創傷治癒を阻害しないか、またはマウスの主要な器官におけるいかなる病理学的変化も引き起こさないことを示した。
【０２４８】
上記で引用された全ての参考文献は全て、特定的に組み入れられるか否かに拘らず、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託は、あらゆる目的で参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
【０２４９】
本発明を完全に説明してきたが、当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、また過度の実験を行うことなく、様々な等価なパラメーター、濃度、および条件の範囲内で同じことを実施することができることを理解できるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】種々の組換えDNAワクチンを用いてワクチン接種されたマウスにおける、IFN-γ分泌性E7特異的CD8+ T細胞前駆体のフローサイトメトリー分析。マウス(4匹／群)を、実施例に記載のようにpcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA/E7、pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1、pcDNA3-E7、およびpcDNA3で免疫した。ワクチン接種したマウスに由来する脾臓細胞を、追加ワクチン接種の7日後に収集し、MHCクラスI拘束性E7(アミノ酸49〜57)ペプチドと共にin vitroで一晩培養し、CD8および細胞内IFN-γの両方について染色した。図1は、代表的なフローサイトメトリーデータを示す。
【図２】種々の組換えDNAワクチンを用いてワクチン接種されたマウスにおける、IFN-γを分泌するE7特異的CD8+ T細胞前駆体のフローサイトメトリー分析。マウス(4匹／群)を、実施例に記載のようにpcDNA3-CRT/E7、pcDNA3-E7/HSP70、pcDNA3-ETA/E7、pcDNA3-Sig/E7/LAMP-1、pcDNA3-E7、およびpcDNA3で免疫した。ワクチン接種したマウスに由来する脾臓細胞を、追加ワクチン接種の7日後に収集し、MHCクラスI拘束性E7(アミノ酸49〜57)ペプチドと共にin vitroで一晩培養し、CD8および細胞内IFN-γの両方について染色した。図2は、抗原特異的なIFN-γ分泌性CD8+ T細胞前駆体の数／3 x 105個の脾臓細胞(平均±SD)を示す棒グラフである。これらの結果は、2回行った実験のうちの代表的な1つの実験から得たものである。
【図３】マウスにおける種々のDNAワクチン構築物により生成された抗腫瘍効果を比較するためのin vivoでの腫瘍治療実験。マウス(5匹／群)を、104個のTC-1腫瘍細胞でチャレンジし、7日後に種々のDNA構築物で免疫した。結果を、肺結節の平均数として表す；バー±SD。これらの結果は、2回行った実験のうちの代表的な1つの実験から得たものである。
【図４】最初のワクチン接種の8週間後にワクチン接種されたマウスにおいて種々のDNAワクチン構築物により生成されたIFN-γ分泌性E7特異的CD8+ T細胞前駆体のフローサイトメトリー分析。マウス(4匹／群)を、図1に記載のようなDNA構築物で免疫した。ワクチン接種されたマウスに由来する脾臓細胞を、最初のワクチン接種の8週間後に収集し、MHCクラスI拘束性E7(アミノ酸49〜57)ペプチドと共にin vitroで一晩培養し、CD8および細胞内IFN-γの両方について染色した。図4は、代表的なフローサイトメトリーの結果を示す。
【図５】最初のワクチン接種の8週間後にワクチン接種されたマウスにおいて種々のDNAワクチン構築物により生成されたIFN-γ分泌性E7特異的CD8+ T細胞前駆体のフローサイトメトリー分析。マウス(4匹／群)を、図1に記載のようなDNA構築物で免疫した。ワクチン接種されたマウスに由来する脾臓細胞を、最初のワクチン接種の8週間後に収集し、MHCクラスI拘束性E7(アミノ酸49〜57)ペプチドと共にin vitroで一晩培養し、CD8および細胞内IFN-γの両方について染色した。図5は、抗原特異的IFN-γ分泌性CD8+ T細胞前駆体の数／3 x 105個の脾臓細胞(平均±SD)を示すグラフである。これらの結果は、2回行った実験のうちの代表的な1つの実験から得たものである。
【図６】最初のワクチン接種の8週間後にワクチン接種されたマウスにおいて種々のDNAワクチン構築物により生成された抗腫瘍作用を比較するための長期間のin vivo腫瘍防御実験。マウス(5匹／群)を、実施例に記載のように105個の細胞／マウスのTC-1腫瘍細胞で免疫およびチャレンジした。結果を、肺結節の平均数として表す；バー±SD。これらの結果は、2回行った実験のうちの代表的な1つの実験から得たものである。
【図７】TC-1 P3(A15)のMHCクラスI発現およびTC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いるin vivo腫瘍防御実験。図7は、TC-1 P0およびTC-1 P3(A15)サブクローン上でのMHCクラスI発現を特性評価するフローサイトメトリー分析の結果を示す。陰性対照として、B16を用いた(点線)。TC-1 P0細胞は、MHCクラスI陽性であるが(太線)、TC-1 P3(A15)は下方調節されたMHCクラスI発現を示す(塗りつぶされた領域)。
【図８】TC-1 P3(A15)のMHCクラスI発現およびTC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いるin vivo腫瘍防御実験。図8は、TC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いるin vivo腫瘍防御実験の結果を示す。マウス(5匹／群)に、2μgのpcDNA3-E7、pcDNA3-CRT、pcDNA3-CRT/E7 DNAまたはpcDNA3の空のプラスミドをワクチン接種した。最後のワクチン接種の1週間後、マウスを、右肢への皮下注入により5 x 104個のTC-1 P3(A15)腫瘍細胞でチャレンジした。CRT/E7 DNAをワクチン接種されたマウスは、他のDNAワクチンをワクチン接種されたマウスと比較した場合、TC-1 P3(A15)に対する100％の防御を提供した(一方向ANOVA、p<0.01)。
【図９】TC-1 P3(A15)のMHCクラスI発現およびTC-1 P3(A15)腫瘍細胞を用いるin vivo腫瘍防御実験。図9は、IFN-γノックアウトマウスを用いるin vivo腫瘍防御実験の結果を示す。野生型C57BL/6マウスおよびIFN-γを枯渇させたC57BL/6マウス(5匹／群)に、2μgのpcDNA3-CRT/E7 DNAをワクチン接種した。最後のワクチン接種の1週間後、上記のように、マウスを、右肢への皮下注入により5 x 104個のTC-1 P3(A15)腫瘍細胞でチャレンジした。野生型C57BL/6マウスの100％およびINF-γを枯渇させたC57BL/6マウスの20％のみが、腫瘍を含まないままであった。
【図１０】pNGVL4a-CRT/E7(detox)をワクチン接種したマウスにおけるE7特異的CD8+ T細胞前駆体の数を示すフローサイトメトリーを用いる細胞内サイトカイン染色。一方の群のC57BL/6マウスを、50μgのDNAワクチンを用いて筋肉内(i.m.)免疫し、1週間後に同じ投薬計画を用いて追加免疫を施した。他方の群を、2μgのDNAワクチンを用いて遺伝子銃により皮内(i.d.)免疫し、1週間後に同じ投薬計画を用いて追加免疫を施した。最後のワクチン接種の1週間後に、脾臓細胞を回収した。E7特異的なIFN-γ分泌性CD8+ T細胞前駆体の数を、ICCS、次いでフローサイトメトリーを用いて分析した。図10は、代表的なフローサイトメトリーの結果を示す(2回行った実験の代表的な1つの実験)。
【図１１】pNGVL4a-CRT/E7(detox)をワクチン接種したマウスにおけるE7特異的CD8+ T細胞前駆体の数を示すフローサイトメトリーを用いる細胞内サイトカイン染色。一方の群のC57BL/6マウスを、50μgのDNAワクチンを用いて筋肉内(i.m.)免疫し、1週間後に同じ投薬計画を用いて追加免疫を施した。他方の群を、2μgのDNAワクチンを用いて遺伝子銃により皮内(i.d.)免疫し、1週間後に同じ投薬計画を用いて追加免疫を施した。最後のワクチン接種の1週間後に、脾臓細胞を回収した。E7特異的なIFN-γ分泌性CD8+ T細胞前駆体の数を、ICCS、次いでフローサイトメトリーを用いて分析した。図11は、インターフェロン分泌性T細胞数／3 x 105個の脾臓細胞を示す棒グラフの形態で結果を示す。
【図１２】図12は、抗腫瘍ワクチン接種に用いられるpNGVL4a/CRT/E7(detox)プラスミドベクターの模式図である。様々なクローニング部位、プロモーターおよびコード配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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