(57)【要約】  本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法において使用するためのタンパク質トキソイドであって、可逆的変性条件下において遊離である該タンパク質トキソイド中の全てのシステイン残基がアルキル化されているタンパク質トキソイドを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物体の治療方法において使用するためのタンパク質トキソイドであって、可逆的変性条件下において遊離である該タンパク質トキソイド中の全てのシステイン残基がアルキル化されている、該トキソイド。
【請求項２】
細菌毒素由来である、請求項１記載のトキソイド。
【請求項３】
細菌毒素がジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、シュードモナス外毒素Ａ、シガ毒素、コレラ毒素および大腸菌熱不安定性毒素（HLT）から選択される、請求項２記載のトキソイド。
【請求項４】
植物毒素由来である、請求項１〜３のいずれか１項記載のトキソイド。
【請求項５】
植物毒素がリシンまたはアブリンである、請求項４記載のトキソイド。
【請求項６】
ヘビ、クモまたはサソリの毒由来である、請求項１〜３のいずれか１項記載のトキソイド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドの製造方法であって、
(i)   可逆的変性条件下でタンパク質毒素中のシステイン残基をアルキル化し、
(ii)  該タンパク質を再生し、
(iii) 場合によって、段階(i)および(ii)を１回以上繰り返し、そして
(iv)  該タンパク質トキソイドを製薬上許容し得る希釈剤または担体と共に製剤化する、
ことを含む、上記方法。
【請求項８】
前記システイン残基が、タンパク質毒素をヨードアセトアミド、ヨード酢酸、N-エチルマレイミドまたはN-イソプロピルヨードアセトアミドから選択されるアルキル化剤と共にインキュベートすることによってアルキル化される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
タンパク質毒素が尿素および／またはグアニジンを用いて変性される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
アルキル化剤を段階(ii)で除去する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法によって得られたまたは得られるタンパク質トキソイド。
【請求項１２】
ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための、請求項１１記載のタンパク質トキソイド。
【請求項１３】
請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドを、製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と共に含有する医薬またはワクチン組成物。
【請求項１４】
更にアジュバントを含有する、請求項１３記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
細菌感染を治療または予防するための医薬の製造における、請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドの使用。
【請求項１６】
細菌感染が、ジフテリア、ボツリヌス中毒症、破傷風、コレラ、大腸菌熱不安定性毒素による食中毒、シュードモナス感染または大腸菌感染の１種以上である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
タンパク質毒素による被毒の治療または予防に使用するための医薬の製造における、請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドの使用。
【請求項１８】
上記被毒が大腸菌熱不安定性毒素による食中毒またはボツリヌス中毒症である、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
上記被毒が生物兵器の病原物質によって引き起こされる、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
タンパク質トキソイドがボツリヌス毒素、リシンまたはアブリン由来である、請求項１７または１９記載の使用。
【請求項２１】
実験室試薬としての、請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドの使用。
【請求項２２】
上記タンパク質トキソイドがモノクローナル抗毒素抗体を誘導または選択するために使用される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質に対するワクチン接種方法であって、請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドを、該トキソイドに対する免疫応答を誘導するのに有効な量で、その必要のある被験者に投与することを含む、上記方法。
【請求項２４】
治療に有効な量の請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドをその必要のある個体に投与することを含む、細菌感染の治療方法。
【請求項２５】
有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療方法であって、治療に有効な量の請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドをその必要のある個体に投与することを含む、上記方法。
【請求項２６】
抗毒素の製造に使用するための医薬の製造における、請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドの使用。
【請求項２７】
請求項１〜６および１１のいずれか１項記載のタンパク質トキソイドを抗トキソイド抗体を誘導するのに有効な量で個体に投与し、該個体から血液を採取し、該血液から血清を分離することを含む抗毒素の製造方法であって、該血清が該抗体を含有する、上記方法。
【請求項２８】
個体が動物である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
更に動物を犠牲にすることを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体を前記血清から精製する、請求項２７〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体を処理して抗毒素抗体フラグメントを作製する、請求項２７〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれか１項記載の方法によって製造される抗毒素。
【請求項３３】
有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質にさらされた個体を治療するための医薬の製造における、請求項３２記載の抗毒素の使用。
【請求項３４】
毒素、有毒細菌または生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療方法であって、治療に有効な量の請求項３２記載の抗毒素をその必要のある個体に投与することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒素を不活化してタンパク質トキソイドを製造する方法、タンパク質トキソイドを含有するワクチン、並びにタンパク質トキソイドを投与することを含む、毒素によって引き起こされる疾患の治療および予防方法に関する。タンパク質トキソイドは、実験室試薬として、また治療用抗毒素の製造において使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
トキソイド（不活化毒素）は、伝統的には、毒素タンパク質中に存在する多数のリシン残基と主として反応するホルムアルデヒド（ホルマリン）を用いた化学的不活化もしくは架橋によって製造されてきた。例えば、ボツリヌス毒素Ａの72個までのリシン残基を毒性に影響することなくメチル化することができるが、更に３個の残基を修飾すると活性が急激に消失する（Sathyamoorthy ＆ DasGupta、1988）。一方、ボツリヌスＡ毒素はシステイン残基を９個だけ有しており、そのうち４個がジスルフィド結合によって架橋している。Ｂ型およびＥ型毒素はそれぞれ10個および８個のシステイン残基を有している（Antharavallyら、1998；AntharavallyおよびDasGupta、1998）。
【０００３】
ホルムアルデヒド処理によって製造されるトキソイドが以前に報告され、ワクチンとして、また抗毒素の産生において利用されてきた。治療用抗毒素の速やかな投与は現在、ボツリヌス中毒症および破傷風の唯一の特効的治療である。毒素のホルムアルデヒド不活化によって製造される現在のワクチンは、ヒトにおいては抗体応答が乏しいことがしばしばである。
【０００４】
ボツリヌス抗毒素の産生は、例えば、典型的にはホルムアルデヒド（ホルマリン）無毒化によって製造されるボツリヌストキソイドを高用量で用いて動物（ウマまたはヒツジ）を免疫することを含む。より高度の中和抗体は、高用量のボツリヌス毒素で動物を追加免疫することで産生することができる。しかしながら、健康および安全（および保護）上の制約のために、免疫感作手順において活性な毒素で動物を免疫することは今や事実上不可能である。
【０００５】
Ｂ型ボツリヌス毒素は、ヨードアセトアミド単独によるシステイン残基の持続的アルキル化によって部分的にのみ不活化（13倍の低下）させることができる（BeersおよびReich、1969）。ボツリヌスＡ型毒素および破傷風毒素は、影響されないか、その毒性が処理の後に50％まで低下することも報告されている（Knoxら、1970、Schiavioら、1990、de Paviaら、1993）。ボツリヌスＡ型毒素の還元およびアルキル化もしくはカルボキシメチル化の後、毒性がおよそ1,000倍低下したことが先に報告されている（de Paviaら、1993）。還元に続いて還元剤の存在下でホルムアルデヒド（0.5％）処理を行うと、ホルムアルデヒド処理のみで製造した従来のトキソイドと比較して免疫原性（中和抗体の産生）が顕著に低下することが実証されている（Sugiyamaら、1974）。
【発明の開示】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、可逆的変性条件下で毒素中のシステイン残基をアルキル化することによってボツリヌス毒素の毒性を無視できるレベルにまで低減させることができることを見出した。このボツリヌス毒素の不活化方法は、毒素分子に大きなコンフォーメーション変化を引き起こさず、従って新しいトキソイドは、毒性の危険なく、もとの活性毒素の免疫原性のほとんどを保持している。
【０００７】
この可逆的変性条件下でのシステイン残基のアルキル化方法は、他のタンパク質毒素を不活化するために使用することができる。従って本発明者らは、タンパク質毒素に一般的に応用してタンパク質トキソイドを製造できる毒素不活化の穏やかな方法を提供する。このタンパク質トキソイドは治療用抗毒素の製造において、ワクチンとして、また安全な実験室試薬として有用である。
【０００８】
従って、本発明は、以下のものを提供する：
−ヒトまたは動物体の治療方法において使用するためのタンパク質トキソイドであって、可逆的変性条件下において遊離である該タンパク質トキソイド中の全てのシステイン残基がアルキル化されている、該トキソイド；
−本発明に係るタンパク質トキソイドの製造方法であって、
(i)   可逆的変性条件下でタンパク質毒素中のシステイン残基をアルキル化し、
(ii)  該タンパク質を再生し、
(iii) 場合によって、段階(i)および(ii)を１回以上繰り返し、そして
(iv)  タンパク質トキソイドを製薬上許容し得る希釈剤または担体と共に製剤化する、
ことを含む方法；
−本発明に係る方法によって得られた、または得られるタンパク質トキソイド；
−ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための、本発明に係るタンパク質トキソイド；
−本発明に係るタンパク質トキソイドを製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と共に含有する医薬またはワクチン組成物；
−細菌感染を治療または予防するための医薬の製造における、本発明に係るタンパク質トキソイドの使用；
−タンパク質毒素による被毒の治療または予防において使用するための医薬の製造における、本発明に係るタンパク質トキソイドの使用；
−実験室試薬としての、本発明に係るタンパク質トキソイドの使用；
−有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質に対するワクチン接種方法であって、本発明に係るタンパク質トキソイドを、該トキソイドに対する免疫応答を誘導するのに有効な量で、その必要のある被験者に投与することを含む、該方法；
−治療的有効量の本発明に係るタンパク質トキソイドをその必要のある個体に投与することを含む、細菌感染の治療方法；
−有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療方法であって、治療的有効量の本発明に係るタンパク質トキソイドをその必要のある個体に投与することを含む、該方法；
−抗毒素の製造に使用するための医薬の製造における、本発明に係るタンパク質トキソイドの使用；
−本発明に係るタンパク質トキソイドを抗トキソイド抗体を誘導するのに有効な量で個体に投与し、該個体から血液を採取し、該血液から血清を分離することを含む抗毒素の製造方法であって、該血清が該抗体を含有する、該方法；
−本発明に係る方法によって製造される抗毒素；
−有毒細菌、毒素または生物兵器の病原物質にさらされた個体を治療するための医薬の製造における、本発明に係る抗毒素の使用；および
−毒素、有毒細菌または生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療方法であって、その必要のある個体に治療的有効量の本発明に係る抗毒素を投与することを含む、該方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
トキソイド
本発明のタンパク質トキソイド、または不活性毒素は、可逆的変性条件下でシステイン残基がアルキル化されたタンパク質毒素である。本発明のタンパク質トキソイドは、可逆的変性条件下で遊離である全てのシステイン残基がアルキル化されたものである。遊離のシステイン残基とは、典型的には可逆的変性条件下でシステインアルキル化剤に接近可能なもの、またはジスルフィド結合していないシステイン残基である。典型的には、ジスルフィド結合していない全ての遊離システイン残基がアルキル化されるが、毒素中でジスルフィド結合しているシステイン残基がアルキル化されても良い。特に、トキソイドの由来となる毒素中に存在するジスルフィド結合を変性させるために還元剤を用いる場合には、毒素中でジスルフィド結合している全てのシステイン残基がアルキル化されても良い。
【００１０】
タンパク質トキソイドは、変性条件下でアルキル化剤と単回のインキュベーションを行い、次いで再生段階を行うことで製造することができる。タンパク質トキソイドは、可逆的変性条件下でのアルキル化および再生のサイクルを２回以上行うことで製造しても良い。１回目の変性、アルキル化および再生により、非修飾毒素と比較して毒性の低下が生じる。次回で毒性の更なる低下が達成され得る。従って、本発明の不活性毒素製剤は、実質的に全ての毒素分子が不活化されたものである。
【００１１】
典型的には、トキソイド製剤が検出不能な毒素活性を示すか、または等量の非修飾毒素を含む製剤の毒性の約1万倍もしくは約100万倍低い毒性、例えば200万倍、300万倍、400万倍、500万倍、1,000万倍、もしくは1億倍または10億倍低い毒性を示す場合、トキソイド製剤における実質的に全ての毒素分子が不活化されている。
【００１２】
本発明のトキソイドは、エンドペプチダーゼ活性をいくらか保持しうるが、in vivoでの毒性を示さない。従って、本発明のトキソイドは、エンドペプチダーゼ活性をもたないホルムアルデヒドトキソイドよりも、もとの毒素の構造を多く保持している。
【００１３】
アルキル化段階は、毒素分子中のジスルフィド結合を減少させるために、還元剤を用いて、または用いずに行うことができる。
【００１４】
安全上の理由から、タンパク質トキソイドは残留毒性について検査しても良い。その物質に毒性がないことを確認するために、適切な感度の、十分に機能的なモデルを１つ以上使用することができる。例えば、単離されたマウス横隔神経による片側横隔膜アッセイ（Jonesら、1999）またはマウスの局所弛緩性麻痺アッセイ（Sesardicら、1996）を使用することができる。
【００１５】
本発明の方法によって製造されたタンパク質トキソイドは、毒性が無視できる程であり、かつ天然の毒性への逆戻りを実質的に示さず（天然の毒素よりも少なくとも約1万倍低い毒性）、従ってワクチン、治療薬、実験室試薬として、また抗毒素の製造において使用するのに安全である。
【００１６】
本発明のタンパク質トキソイドは、トキソイドの由来となる天然の毒素に対する中和抗体を作製するのに用いることができる。典型的には、本発明のトキソイドを用いた免疫によって、ホルムアルデヒドトキソイドによる免疫よりもより高レベルの中和抗体の製造が達成される。
【００１７】
本発明に係る不活性毒素を含有するワクチンは、細菌感染の治療もしくは予防において、または毒素もしくは生物兵器の病原物質の影響の治療もしくは予防において使用することができる。
【００１８】
不活化方法
本発明は、免疫原として使用するのに安全なタンパク質トキソイドの製造方法を提供する。タンパク質トキソイドを製造するためのタンパク質毒素の不活化方法は、以下の段階を含む：
(i)   可逆的変性条件下でタンパク質毒素内のシステイン残基をアルキル化し；
(ii)  該タンパク質を再生し；そして
(iii) 場合により、必要であれば段階(i)および(ii)を１回以上繰り返す。
【００１９】
段階(i)および(ii)は、１回行うか、または１回、１回より多く、例えば２回、３回、４回、５回もしくは１０回繰り返すことができる。単回のインキュベーション後に毒性の実質的な低下が得られる場合があり、こうした場合には更に反復する必要はない。毒性の実質的な低下とは、好ましくは完全な不活化である。毒素が検出可能な毒性を示さない場合、例えば片側横隔膜アッセイ（Jonesら、1999）または局所弛緩性麻痺アッセイ（Seardicら、1996）において毒性が検出されない場合、毒素は完全に不活化されている。
【００２０】
非修飾毒素の検出可能な毒素活性を示さないトキソイドは、本発明の目的のためには不活性毒素であると見なされる。
【００２１】
不活化方法は、１以上の還元段階を含み得る。本発明の方法の還元段階は、ジスルフィド結合を還元するのに適した条件下で実施し得る。典型的には、毒素を還元剤にさらす。還元剤を毒素と混合し、約30分間〜約12時間（一晩）、例えば約1、2、3、または4時間、約4℃〜約37℃の温度、例えば約20℃（室温）、25℃、30℃または35℃でインキュベートする。典型的には、還元はアルキル化の前に行うが、還元剤をアルキル化剤と同時に添加しても良い。
【００２２】
毒素は、還元剤に対して透析しても良い。透析は、約4℃〜約37℃、例えば20℃、25℃、30℃または35℃の温度で、約30分間〜約12時間（一晩）、例えば約1、2、3または4時間実施することができる。温度は透析の進行中にある程度変えても良い。例えば、透析を室温で約2時間、次いで37℃で約1時間行う。透析の間、反応混合物を暗所におくことができる。
【００２３】
任意の適切な還元剤を使用することができる。還元剤は、ジチオスレイトール（DTT）、2-メルカプトエタノール、グルタチオン、L-システイン、TCEP-HCLおよび水素化ホウ素ナトリウムから選択することができる。還元段階は、可逆的変性条件下で行うことができる。
【００２４】
毒素中のシステイン残基はアルキル化される。アルキル化段階は、アルキル化に適した条件下でアルキル化剤を添加することによって実施される。適切なアルキル化剤として、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、N-エチルマレイミドおよびN-イソプロピルヨードアセトアミドが挙げられる。アルキル化段階は、典型的には効果的なアルキル化が起こるが、タンパク質に悪影響を与えない適切なpHで実施される。例えば、ヨードアセトアミドはpH8.0かその近辺で最適に使用されるが、それより低いpHではその有効性が低下し得る。pHを効果的に調節することができ、しかも毒素、アルキル化剤もしくはアルキル化のプロセスと有害な反応をしない適切な緩衝剤を使用することができる。
【００２５】
アルキル化は、可逆的変性条件下で実施する。毒素を変性させるために、アルキル化段階の間、尿素および／またはグアニジンなどのカオトロピック剤を添加することができる。カオトロピック剤は、任意の適切な濃度で添加することができ、例えば2M、4Mもしくは8Mの尿素またはグアニジンを使用することができる。
【００２６】
典型的には、還元した毒素をアルキル化剤と共に、約30分間から約12〜14時間（一晩）、例えば約1、1 1/2、2、3もしくは4時間、約4℃〜約37℃、例えば約20℃の温度でインキュベートする。インキュベーションは暗所で実施することができる。
【００２７】
透析によって、例えば反応混合物を変性試薬の不存在下でTris NaClに対して透析することによって、過剰のアルキル化剤を除去し、そして／またはタンパク質を再生することができる。Tris NaClに対する透析は、任意の適切な条件下で実施することができ、典型的には、初回容量の、例えば約3000倍容量（例えば1リットル）のTris NaClに対して2時間、次いで新たな容量の、例えば約3000倍容量（例えば1リットル）のTris NaClに対して一晩、4℃の暗所で実施する。
【００２８】
不活化手順には、不活性な安定化剤およびEDTAもしくはEGTAなどのキレート剤の使用も組み込むことができる。
【００２９】
最終回のアルキル化の後、典型的には上記したようなTris NaClを用いた透析によって、反応混合物から試薬を除去し、トキソイドを再生させる。
【００３０】
得られた不活性毒素は、毒素が安定している任意の条件下で、典型的には約4℃の暗所で、保存することができる。
【００３１】
本方法は、最後に化学的安定化段階を含むことができる。あるいはまた、全体的な不活化手順を、１種以上の適切な安定化剤の存在下で実施することができる。不活化された毒素は、適切な方法によって、例えば低濃度のホルムアルデヒド処理によって、安定化することができる。安定化剤またはキレート剤は、不活化方法の前、間、または後に添加してもよい。適切な安定化剤としては、高濃度のNaCl（例えば約1M〜約4M、約1.5M、2M、2.5Mもしくは3MのNaCl）、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、グリセロールおよびゼラチンが挙げられる。適切なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（EGTA）が挙げられる。
【００３２】
本方法は更に、毒素を製薬上許容し得る担体または希釈剤、および場合によってアジュバントと共に製剤化することを含み得る。
【００３３】
毒素
毒素は、１個以上のシステイン残基を有するいずれのタンパク質毒素であっても良い。毒素は、例えば鎖間ジスルフィド結合によって共有結合した２本の鎖から構成される、細胞内で作用する毒素であっても良い。
【００３４】
毒素は好適な生物由来であって良い。例えば、毒素は植物由来であっても良い。好適な植物毒素にはアブリンおよびリシンがある。
【００３５】
毒素は動物毒素であっても良く、例えばヘビ毒（α−ブンガロトキシン、β−ブンガロトキシン、コブラトキシン、クロトキシン、エラブトキシン、タイカトキシンもしくはテクスチロトキシン等）、クモ毒（アガトキシン、アトラコトキシン、グラモトキシン、ラトロトキシン、フォニュートリアトキシン、フリクソトキシンおよびバーストキシン等）、またはサソリ毒（マーガトキシン、イベリオトキシンもしくはノキシウストキシン等）であっても良い。
【００３６】
毒素は好ましくは細菌毒素であり、例えばクロストリジウム神経毒、例えばボツリヌス毒素もしくは破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、百日咳毒素、シュードモナス外毒素Ａ、シガ毒素、シガ様毒素および大腸菌熱不安定性毒素（HLT）である。毒素がボツリヌス毒素である場合、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型であって良い。
【００３７】
シガ様毒素は大腸菌によって産生されるものであって良い。毒素の由来となる細菌は典型的には疾患の原因に関連するものであり、例えば破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、大腸菌（Escherichia coli）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）である。毒素、または毒素の由来となる細菌は、生物兵器の病原物質として使用されるものであってもよい。
【００３８】
トキソイドの調製に使用するための毒素は、任意の適切な方法で得られるものであって良い。こうした方法は当分野において周知である。本発明の方法において使用するための細菌毒素は、典型的には培養した細菌から得られる。例えば、破傷風毒素は破傷風菌（Clostridium tetani）の培養物から、ボツリヌス毒素はボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の培養物から、ジフテリア毒素はジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）の培養物から、熱不安定性因子は大腸菌（Escherichia coli）の培養物から、コレラ毒素はコレラ菌（Vibrio cholerae）の培養物から、シュードモナス外毒素Ａは緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の培養物から、そしてシガ毒素は大腸菌または志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）の培養物から得ることができる。細菌培養物から毒素を抽出する方法は当分野において周知である。
【００３９】
本発明の方法において使用するための植物毒素は、公知の方法に従って適切な植物材料、例えば豆または種子から得ることができる。例えば、リシンはヒマ（Ricinus communis）の豆から、アブリンはトウアズキ（Abrus precatorius）の種子から得ることができる。
【００４０】
本発明の方法において使用する毒素は、好ましくは単離された形態である。毒素は担体または希釈剤と混合することができる。例えば、毒素をリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、pH7.4緩衝液と混合することができる。ボツリヌス毒素などの毒素は、他の非毒性タンパク質と複合化もしくは会合させることができる。ゼラチンなどの保護タンパク質は場合によって毒素中のジスルフィド結合の還元を妨害することがあり、従って一般的には少なくとも最初の不活化段階の間、毒素はゼラチンなどの保護タンパク質を伴わない。不活化方法の後の段階においては、安定化剤としてゼラチンを添加しても良い。毒素は実質的に純粋な形態でありうる。実質的に純粋な形態の毒素は、一般的に、他の細菌または植物成分から少なくとも約70％、例えば少なくとも約80％、90％、95％、98％または99％遊離している。
【００４１】
実験室試薬
本発明のタンパク質トキソイドは、実験室試薬として有用である。例えば、本発明のトキソイドは、抗毒素モノクローナル抗体を誘導または選択する方法において有用である。モノクローナル抗体を誘導および選択する方法は当分野において周知である。
【００４２】
本発明のトキソイドの実験室での使用には、イムノアッセイにおける使用も含まれる。種々の好適なイムノアッセイ技術が当分野において公知である。
【００４３】
ワクチン
本発明は、本発明の方法によって得られるアルキル化システイン残基を含むタンパク質トキソイド、製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤、および場合によってアジュバントを含むワクチン組成物を提供する。また、細菌感染の予防のためのワクチン、または毒素もしくは生物兵器の病原物質に対する防御のためのワクチンの製造における本発明のトキソイドの使用が提供される。
【００４４】
本発明のワクチンは、トキソイドの由来となる毒素に対する免疫応答を誘導するのに有効な量で、その必要のある個体に投与することができる。免疫応答は毒素に対する抗体応答であってもＴ細胞応答であっても良い。その後にその毒素にさらされると、毒素に対するワクチン接種を受けた個体では毒素に対する免疫応答が引き出される。ワクチン接種を受けた個体は、その後、毒素を発現する細菌による感染に対して、または毒素もしくは毒素を発現する細菌を含む生物兵器の病原物質に対して防御される。
【００４５】
ワクチン接種が必要な個体は、典型的には毒素に対する能動免疫を有しない個体である。従ってワクチンは、乳児または幼児に投与することができる。あるいはまた、個体が以前にワクチン接種を受けていたか、あるいは毒素にさらされた場合、追加免疫ワクチンとしてより年齢の高い子供や成人に対してワクチンを投与することができる。個体は毒素または毒素を発現する細菌にさらされる危険にある場合でも良い。ワクチンはまた、毒素を発現する細菌にさらされて間もないかもしれないと考えられる個体にも投与することができる。例えば、毒素が破傷風毒素であって個体に開口した傷口がある場合や、個体が、毒素を発現する細菌に感染したことが明らかな別の個体と接触した場合などである。
【００４６】
ワクチンを生物兵器の病原物質に対する防御のために使用する場合、ワクチン接種が必要な個体は、典型的には戦争地帯に、もしくはその近くに居住または勤務する個体である。例えば、個体は軍隊のメンバーであり得る。
【００４７】
ワクチン接種が必要な個体は、その仕事の結果として毒素を発現する細菌、または活性毒素と接触することになり得る個体であっても良い。個体は、実験室での作業者、獣医、または看護師もしくは医師などの医療従事者であり得る。
【００４８】
本発明のワクチン組成物は、本発明のトキソイドの１種以上を、場合によって１種以上の他の活性ワクチン成分と組み合わせて含有することができる。例えば、本発明の破傷風トキソイドは、本発明のジフテリアトキソイドと組み合わせても良く、および／または本発明の破傷風／ジフテリアトキソイドは、全細胞もしくは無細胞百日咳ワクチン（例えば本発明に係る不活化百日咳毒素）、不活化ポリオウイルスワクチン、三価の経口ポリオウイルスワクチンもしくはインフルエンザ菌ｂ型（Hib）コンジュゲートワクチンと組み合わせても良い。こうした混合ワクチンは、乳児または幼児への投与において特に好適である。
【００４９】
治療
本発明に係るトキソイドはまた、細菌感染の治療において有用である。従って、本発明は、アルキル化システイン残基を有するトキソイドを製薬上許容し得る担体もしくは希釈剤と共に含有する医薬組成物を提供する。また、生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療のための医薬の製造における本発明のトキソイドの使用が提供される。
【００５０】
細菌感染は、ボツリヌス中毒症、破傷風、ジフテリア、コレラもしくはシュードモナス、赤痢菌もしくは大腸菌感染または他のいずれかの有毒細菌によって引き起こされる感染であっても良い。細菌感染は、血液もしくは他の内臓中への細菌の侵入によって引き起こされる場合があり、あるいは皮膚もしくは消化管の感染の場合がある（例えばボツリヌス中毒症もしくは大腸菌による食中毒）。生物兵器の病原物質はボツリヌス毒素、リシン、アブリン、またはタンパク質毒素の毒性を利用した他の物質であり得る。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、１種以上の本発明のトキソイド、例えばリシン、アブリンおよび／またはボツリヌストキソイドを含有することができる。医薬組成物は更に、１種以上の抗生物質、例えばドキシサイクリン、シプロフロキサシン、ペニシリン、リファンピン、バンコマイシン、クリンダマイシン、クラリスロマイシンまたはアモキシシリンを含有していても良い。
【００５２】
本発明のトキソイドを使用して、感染性細菌によって生成された活性毒素の侵入を阻止することができ、従って投与が必要な個体への本発明の医薬組成物の投与は、好ましくはその個体が感染性物質または毒素にさらされた後できるだけ速やかに行う。本発明の医薬組成物を使用して、感染性細菌または毒素に対する個体の免疫応答を高めることもできる。
【００５３】
本発明によって提供される細菌感染、毒素による中毒、例えば大腸菌HLTの中毒もしくはボツリヌス中毒症、または生物兵器の病原物質の作用に対する治療方法には、治療的有効量の本発明のトキソイドをそれが必要な個体に投与することが含まれる。治療的有効量とは、個体の細胞中への活性細菌毒素の侵入を阻止し、および／または毒素に対する免疫応答を刺激する量である。
【００５４】
治療が必要な個体とは、毒素を発現する細菌もしくは毒素、例えば毒素もしくは毒素を発現する細菌を含む生物兵器の病原物質に最近さらされた個体であって、トキソイドはこの毒素に由来するものである。好ましくは不活性な毒素を、毒素、細菌もしくは病原物質にさらされた後できるだけ速やかに個体に投与する。
【００５５】
抗毒素の製造
本発明のトキソイドは抗毒素の製造において有用である。従って、本発明は、アルキル化システイン残基を有するトキソイドを抗毒素抗体を誘導するのに有効な量で個体に投与し、該個体から血液を採取し、該血液から血清を分離することを含む、抗毒素の製造方法を提供する。抗毒素抗体は血清（または血漿）中に存在し、場合によっては血清から精製することができる。個体はヒトまたは動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジもしくはヤギであって良い。個体が非ヒト動物である場合、上記方法は動物を犠牲にすることを含んでいても良い。抗毒素抗体は血清から精製することができる。抗体を処理してF(ab')2、Fab'、FabまたはFvなどの抗毒素抗体フラグメントを製造してもよい。本発明の抗毒素は、本発明の不活化毒素でワクチン接種を終えた後のヒトから献血された血液または血漿から製造することもできる。
【００５６】
本発明のこのような方法によって製造された抗毒素は、毒素を発現する細菌による細菌感染の治療において、また毒素、例えば毒素もしくは毒素を発現する細菌を含む生物兵器の病原物質にさらされた個体の治療において使用することができる。抗毒素は、好ましくは細菌感染の臨床診断の後速やかに、または物質もしくは細菌にさらされた後できるだけ速やかに個体に投与する。
【００５７】
投与
標準的な製薬上許容し得る担体および／または希釈剤および／または安定化剤を用いる製剤化は、薬学分野で慣用の方法を用いて行うことができる。例えば、トキソイドは注射のために生理食塩水または水に溶解させることができる。製剤の正確な性質は、所要の投与経路を含むいくつかの要因に依存するであろう。製剤の適切な型については、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, 第17版 1985に十分に記載されており、参照によりその開示を全体として本明細書に組み入れる。
【００５８】
トキソイドは、典型的には非経口的経路で投与される。不活性毒素は、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、胸骨下に、経皮的にまたは注入技術によって投与することができる。皮下または筋肉内投与には典型的にはアジュバントの使用が必要である。皮下または筋肉内投与は、アナフィラキシーショックの危険を低減するために、静脈内または腹腔内経路を介したワクチンの初期投与に続く追加免疫に用いることができる。
【００５９】
ワクチンおよび医薬組成物は、本明細書において定義する１種以上のトキソイドおよび／または抗毒素、および生理学的に許容し得る担体もしくは希釈剤から調製することができる。典型的には、こうしたワクチンは、溶液もしくは懸濁液のような注射液として調製される；注射に先立って液体に溶解もしくは懸濁させるのに適切な固体形態も調製することができる。調製物は乳化することもでき、タンパク質をリポソーム中に封入しても良い。活性な免疫原性成分を、製薬上許容でき、かつ活性成分と混和し得る担体もしくは希釈剤と混合することができる。適切な担体および希釈剤は、例えば滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。好ましくは、ワクチンまたは医薬組成物は、無菌の水性等張生理食塩溶液の形態である。必要な場合には担体タンパク質を用いることができる。
【００６０】
更に、必要な場合、ワクチンは湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、および／またはワクチンの効力を高めるアジュバントなどの補助物質を少量含有しても良い。効果的であり得るアジュバントの例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン（thr-MDP）、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CGP 11637、nor-MDPという）、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシフォスフォリルオキシ)-エチルアミン（CGP 19835A、MTP-PEという）、および2％スクアレン/Tween 80エマルジョン中に細菌から抽出された3成分、モノフォスフォリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（MPL+TDM+CWS）を含有するRIBI。アジュバントの有効性は、アジュバントも含有するワクチン中のトキソイドの投与の結果生成する抗毒素抗体の量を測定することによって決定できる。
【００６１】
ワクチンは、伝統的には例えば皮下、皮内または筋肉内などの注射による非経口投与がなされる。あるいはまた、ワクチンは、例えば皮内または皮下投与によって皮膚に局所投与され得る。他の投与方法に適した更なる製剤として、座剤、経口用製剤および経皮投与のための製剤が挙げられる。座剤においては、伝統的な結合剤および担体として、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを挙げることができる。こうした座剤は、0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％の範囲の活性成分を含有する混合物から成型することができる。経口用製剤には、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとり、10％〜95％、好ましくは25％〜70％の活性成分を含有する。ワクチン組成物が凍結乾燥されている場合には、凍結乾燥した物質を投与の前に例えば懸濁液に再調製することができる。再調製は好ましくは緩衝液中で行う。
【００６２】
患者への経口投与のためのカプセル剤、錠剤および丸剤には、例えばオイドラギット「Ｓ」、オイドラギット「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶性コーティングを施すことができる。
【００６３】
例えば経皮的な無針注射による送達に適したワクチン組成物を使用することもできる。
【００６４】
投与量は、種々のパラメーターに従って、特に治療すべき患者の年齢、体重および状態；投与経路；および必要な投与計画に従って決定することができる。医師は、特定の患者のために必要な投与経路および投与量を決定することができるであろう。
【００６５】
ワクチンは、その投薬処方に適合した方法で、かつ予防的および／または治療的に有効な量で投与される。投与される量は、一般に１回の投与あたり5μg〜100mg、好ましくは250μg〜10mg、より好ましくは1mg〜3mgの範囲の抗原であるが、治療すべき被験個体、個体の抗体を合成する免疫系の能力、および必要とされる保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、個々の個体に特有の量であり得る。
【００６６】
ワクチンは、単回投与計画で、または好ましくは複数回投与計画で投与することができる。複数回投与計画は、最初のワクチン接種コースが1〜10回の別個の投与、例えば3、4、5、6、7または8回であって良く、続いて第二の投与として免疫応答を維持および／または補強するために必要な間隔、例えば1〜4ヶ月をおいて投与される別の投与、そして必要であれば数ヵ月後に次の投与がなされるものである。投薬計画はまた、少なくとも部分的には、個人の必要に応じて決定され、そして医師の判断に依存する。
【００６７】
本発明の不活化毒素の治療的または予防的有効量の例示的・非限定的な範囲は、1ng/kg〜20mg/kg、例えば1μg/kg〜10mg/kg、10μg/kg〜1mg/kgである。組成物は、約1〜100mg/m2または約5〜30mg/m2の投与量に達するために、30、20、10、5または1mg/分未満の速度で静脈内注入によって投与され得る。投与量の値は、個体の症状の重篤度によって変動し得る。
【００６８】
本発明の抗毒素は、約10U〜約500,000U、例えば約20,000U、約10,000Uまたは約1,000Uの投与量で投与することができる。的確な投与量は、医師により経験的に決定することができる。抗毒素は筋肉内もしくは静脈内に投与することができ、あるいは、抗毒素が破傷風の治療のためのものである場合には、創傷部内に直接注入しても良い。抗毒素がウマもしくは他の動物の血清である場合には、患者は投与に先立って皮膚試験を用いて過敏症について調べることができる。皮膚試験において過敏症が示される場合には、個体は適切な緊急支援手段を用い、段階的な投与量で与えられる希釈抗毒素で脱感作することができる。
【００６９】
本発明を、以下の非限定的実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００７０】
実施例１：ボツリヌスＢ型毒素の不活化
Ｂ毒素（100μl、1mg/ml、8×107 LD50/ml）を、等量（100μl）の(a)0.0M尿素または(b)2M尿素を含有するTris緩衝液（50mM Tris、１mM EDTA、0.9% NaCl、pH8.0）と混合した。次いでこの物質（200μl）を、等量（200μl）の(a)0M尿素または(b)2M尿素を含有するTris緩衝液中の250mMヨードアセトアミドと混合し、室温（RT）の暗所で90分間インキュベートした。次いでこれを4℃の暗所で0M尿素を含有する冷Tris緩衝液に対して透析（10kDaMWCO）した。サンプル（約50μl）1aおよび1bを取り出し、4℃で保存した。次に残った物質を、(a)0.0M尿素または(b)2M尿素を含有するTris緩衝液中の125mMヨードアセトアミド250mlに対して室温で3時間、暗所で透析した。続いて0M尿素を含有する冷Tris緩衝液に対して4℃の暗所で透析した。サンプル（約50μl）2aおよび2bを取り出し、4℃で保存した。この手順をもう一度繰り返し、最終物質3aおよび3bを回収した。
【００７１】
単離されたマウス横隔神経による片側横隔膜アッセイを用いて残留毒性を試験した。簡潔に述べると、アッセイは、0.2％ゼラチンを含有するKrebs（NaCl 118mM、KCl 4.83mM、KH2PO4 1.19mM、NaHCO3 25mM、MgSO4.7H2O 1.2mM、D-グルコース11.1mM、CaCl2.2H2O 2.54mM）を使用して、先に記載されたように（Jonesら、1999）実施し、37℃の6ml組織浴を用い、神経を１Hzで0.2ms刺激した。結果を図１に示す。
【００７２】
実施例２：ボツリヌス毒素Ｂの安定性に対する塩の効果
Ｂ毒素（100μl、1mg/ml、8×107LD50/ml）を、等量（100μl）のTris緩衝液（50mM Tris、1mM EDTA、pH8.0）と混合した。次いでこの物質（200μl）を、等量（200μl）の、4M尿素および(a)300mM、(b)600mM、または(c)2000mMのNaClを含有するTris緩衝液中の250mMヨードアセトアミドと混合し、RTで4時間、暗所でインキュベートした。次にこの物質を(a)150mM、(b)300mM、または(c)1MのNaClを含有する冷Tris緩衝液に対して4℃の暗所で透析（10kDaMWCO）した。サンプル（約50μl）1a、bおよびcを取り出し、4℃で保存した。次いで残りの物質を、2M尿素および(a)150mM、(b)300mM、または(c)1MのNaClを含有するTris緩衝液中の125mMヨードアセトアミド250mlに対してRTで3時間、暗所で透析した。続いて0M尿素を含有する冷Tris緩衝液に対して4℃の暗所で透析した。サンプル2a、b、cを取り出し、4℃で保存した。
【００７３】
サンプルを遠心分離した後、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって残存可溶性タンパク質を評価した（Coomassie PlusTM）。結果を図２に示す。
【００７４】
実施例３：ボツリヌス毒素Ｂの不活化に対する塩および反復的アルキル化の効果
１容量のボツリヌスＢ型毒素（100μl、1mg/mlもしくは8×107 LD50U/mlを含有する約6.7μM）を３容量（300μl）の新たに調製したアルキル化剤（266.7mMの新たに溶解したヨードアセトアミド、および(a)666.7mM、(b)1,333mMもしくは(c)2667mMのNaClを含有する66.67mM Tris、1.33mM EDTA、2.67M 尿素、NaCl pH8.0）と共にクラス１の安全キャビネット内で混合し、37℃で3時間、暗所でインキュベートした。
【００７５】
次いでこの物質を、10kDaMWCO透析膜を利用して(a)500mM、(b)1Mもしくは(c)2MのNaClを含有する冷Tris緩衝液、pH8.0に対して透析（1L×2、4℃の暗所で一晩）した。サンプル1a、bおよびc（それぞれ約50μl）を取り出し、4℃で保存した。
【００７６】
次に残りの物質を、(a)0.5M、(b)1M、または(c)2MのNaClを含有する50mM Tris中の125mMヨードアセトアミド250mlに対して、室温で攪拌しながら3時間、暗所で透析した(250ml)。これに次いで、(a)500mM、(b)1Mもしくは(c)2MのNaClを含有する冷Tris緩衝液、pH8.0に対して透析（1L×2、4℃の暗所で一晩）した。サンプル2a、bおよびc（それぞれ約50μl）を取り出し、4℃で保存した。この手順を繰り返し、残りの物質を取り出し（サンプル3a、bおよびc）、4℃で保存した。
【００７７】
局所弛緩性麻痺アッセイを用いて試験した結果、高濃度のNaClは毒素の不活化に対して悪影響を及ぼさないことが見出された（図３）。しかしながら、ブラッドフォードタンパク質アッセイを用いて判定されたように、高濃度はトキソイドの安定性を改善した（図４）。
【００７８】
実施例４：ボツリヌストキソイドＢの安定性に対するpHの影響
１容量のボツリヌスＢ型毒素（75μl、1mg/mlもしくは8×107 LD50U/mlを含有する約6.7μM）を３容量（225μl）の新たに調製したアルキル化剤（266.7mMの新たに溶解したヨードアセトアミドを含有する66.67mM Tris、1.33mM EDTA、2667mM NaCl、2.67M 尿素、pH8.0）と共にクラス１の安全キャビネット内で混合し、37℃で3時間、暗所でインキュベートした。
【００７９】
次いでこの物質を、10kDaMWCO透析膜を利用して、50mMの冷Tris緩衝液pH8.0、または2MのNaClを含有する150mMリン酸緩衝液pH6.0もしくは150mMリン酸緩衝液pH5.0に対して透析（3×1L）した。得られたトキソイドを取り出し、4℃で保存した。毒性の消失を確認するためにサンプルを試験し、続いて安定性のために4℃で1ヶ月、種々のpHで保存した。pH6および8と比較して、pH5においてより多量の沈殿が形成された（図５）。
【００８０】
実施例５：ボツリヌストキソイドＢを用いた免疫
１容量のボツリヌスＢ型毒素（750μl、1mg/mlもしくは8×107 LD50U/mlを含有する約6.7μM）を３容量（2,250μl）の新たに調製したアルキル化剤（266.7mMの新たに溶解したヨードアセトアミドを含有する66.67mM Tris、1.33mM EDTA、2667mM NaCl、2.67M 尿素、pH8.0）と共にクラス１の安全キャビネット内で混合し、37℃で3時間、暗所でインキュベートした。
【００８１】
次いでこの物質を、10kDaMWCO透析膜を利用して、リン酸緩衝液に対して透析（3×1L、150mM Na2HPO4.2H2O、2M NaCl、pH7.0、室温）し、得られたトキソイドを取り出し、4℃で保存した。
【００８２】
片側横隔膜アッセイ
不活化に続き、少量のサンプルを、単離された横隔神経片側横隔膜調製物（先に概略されている）に対する初期試験の前に、限定的不活化が想定される安全な濃度にまで適切に希釈し、次いで陰性であればより高濃度（1:200希釈まで）にした。片側横隔膜アッセイでは毒性が明らかでなかった（データは示さない）ため、より感度の高いin vivo局所弛緩性麻痺毒素アッセイを利用した。
【００８３】
局所弛緩性麻痺アッセイ
手順はTakahashiら（1990；Sesardicら、1996）の方法に基づく。簡潔に述べると、雌の非近交系白色マウス（MF1、Harlan）の左側鼡径大腿部に0.1mlの希釈した毒素Ｂまたは不活化した物質を皮下注射（SC）した。動物は、２名以上の訓練を受けたスコアラーによって、腹部の弛緩性麻痺の程度、または形成された隆起／下垂症の大きさについて、0〜4までで独立して記録された。希釈は全てゼラチンリン酸緩衝液（0.2％w/vゼラチン、50mMオルトリン酸水素二ナトリウム、pH6.5）で行った。不活化物質では毒性の徴候は見られず（図６参照）、毒性がおよそ4,000万倍以上低下したことが示された。
【００８４】
沈降物を除去するためにトキソイド物質を遠心分離し、ビシンコニン酸（bicinchoninic acid；BCA）タンパク質アッセイをウシ血清アルブミン（BSA）標準曲線に対して可溶性物質に実施した。BCAアッセイにおいて、既知の濃度のホルムアルデヒド不活化Ｂトキソイドの３つのバッチを用いて、0.63の補正係数が算出された。このことから、新トキソイドについておよそ67％の回収率が計算された。
【００８５】
エンドペプチダーゼ活性
スルフヒドリル結合プレート（96ウェル、Costar、C2509）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH6.5中の合成VAMPペプチド（HV50Cys；46-94aa、またはHV35Cys；60-94aa）基質0.5μg/ウェル（10μg/ml）で37℃、3時間コーティングし、5％脱脂粉乳を含有するPBS-Tweenで2時間かけてブロックし、蒸留水で洗浄した。毒素またはトキソイドは、プレートに添加する前にアッセイ緩衝液（20μM ZnCl2を含有する50mM HEPES、20mM NaCl pH７）中の10mM DTTの存在下で15〜30分間還元し、最終的にプレート上でアッセイ緩衝液中に希釈し、洗浄前に37℃で一晩インキュベートした。切断基質特異的（VAMP77-84aaCys-KLH）ウサギ抗血清を1:200希釈で添加し、37℃で90分間インキュベートし、次いで洗浄した。プレートを1:20k希釈のヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート（Amdex-酵素コンジュゲート；Amersham）と共に37℃で90分間インキュベートした。洗浄後、プレートをABTS/H2O2基質で展開し、405nmでODを測定した。ホルムアルデヒド不活化トキソイド、緩衝液または生理食塩水の対照ではエンドペプチダーゼ活性は明らかではなかった。しかしながら、新トキソイドは、神経毒性活性を有しない（図６）にもかかわらず、本来の毒素のエンドペプチダーゼ活性を多量に保持していた（図７）。
【００８６】
トキソイドによる免疫
雌のBALB/cマウス（6-8週齢）の皮下2ヶ所にそれぞれ0.1mlを用いて免疫した。免疫原は等量のアジュバントと十分に混合して、安定な油中水型エマルジョンを生成させた。一次免疫にはフロイント完全アジュバントを用い、全ての再免疫にはフロイント不完全アジュバントを用いた。5つの群を、第0週、第4週および第8週に2μgのホルムアルデヒドトキソイド（第1群、低用量）もしくは2μgの新トキソイド（第2群、低用量）で免疫し、または第0週および第4週のみに15μgのホルムアルデヒドトキソイド（第3群、高用量）もしくは15μgの新トキソイド（第4群、高用量）で免疫した。各免疫の2週間後に血液サンプルを採取し、第10週に最後の採血を行い、血清を分離した。次に各群5匹のマウスについて物質を等量ずつ保存した。
【００８７】
ELISA
ボツリヌスＢ型毒素をコーティングしたプレートをMetabiologics Inc.から購入した。96ウェルプレート（Nunc-Maxisorb）に炭酸緩衝液pH9.6中でトキソイド（1μg/ml）を37℃で3時間かけてコーティングし、ELISA洗浄緩衝液中の脱脂粉乳（Marvel、5％）（milk-EWB）を用いて37℃で2時間ブロックし、EWBで洗浄した（×5）。サンプルをmilk-EWBで希釈し、37℃で90分間インキュベートし、洗浄し、HRP標識抗マウスIgG（Sigma、A9044）を1:5,000希釈で添加し、インキュベートし、洗浄し、そしてABTS基質溶液を添加した。およそ30分後、プレートを振とうし、405nmで測定した。特異的結合抗体レベルは、免疫に用いたそれぞれのトキソイドに対して最も高かった（図8aおよびb）。一層高いレベルの抗体がホルムアルデヒド不活化トキソイドにより産生され、該抗体レベルはホルムアルデヒド不活化トキソイド被覆プレートを用いて特異的に検出された（図8a）。しかしながら、毒素被覆プレートへの相対的結合量（図8c）は新トキソイド被覆プレートへの結合（図8b）に非常に類似し、新トキソイドが天然の毒素に抗原としてより類似していることが示された。
【００８８】
中和抗体
中和抗体は、上記の局所弛緩性麻痺アッセイを以下の変更を加えて用いて評価した。ほぼ最大の局所弛緩性麻痺をもたらすＢ毒素の一定濃度を選択した。第２のボツリヌスＢ型抗毒素国際標準品（BUSB）を個々のアッセイで並行して用い、毒素を約6LD50U/mlの最終濃度で用いた。各アッセイに陰性対照（GPB）および陽性対照（毒素）を含め、毒素／抗毒素を混合し、注射前に室温で1時間静置した。プロビット平行線解析の原理を用い、国際標準品に対する活性を測定した（図９）。新トキソイドを用いて顕著に高量の中和抗体が生成し、これはホルムアルデヒド不活化トキソイドを用いて生成される量よりも約600倍高い量であった（表１）。
【表１】
2008530067.tif 000002
【００８９】
参考文献
Antharavally ら(1998)「ボツリヌス神経毒Ａ、ＢおよびＥ型の共有結合構造におけるcys残基の状態（Status of cys residues in the covalent structure of botulinum neurotoxin type A, B and E）」 J. Protein Chem. 17:187-196.
Antharavally および DasGupta(1998)「ボツリヌス神経毒Ｂ型の共有結合構造：スルフヒドリル基およびジスルフィド架橋の位置並びに軽鎖および重鎖のC-末端の同定（Covalent structure of botulinum neurotoxin type B; location of sulfhydryl groups and disulfide bridge and identification of C-termni of light and heavy chains）」 J. Protein Chem. 17:417-428.
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】単離されたマウス横隔神経による片側横隔膜アッセイを用いて測定した、可逆的変性条件下における１回（サンプル1b）、２回（サンプル2b）および３回（サンプル3b）のアルキル化後のボツリヌス毒素Ｂの化学的不活化の結果を示す。
【図２】150mM、300mMまたは1MのNaClの存在下での可逆的変性条件下における２回のアルキル化によるボツリヌス毒素Ｂの化学的不活化の後に溶液中に残存したタンパク質の量を示す。
【図３】0.5M、1Mおよび2MのNaClの存在下におけるボツリヌスＢ型毒素の不活化を示す。活性測定のために局所弛緩性麻痺アッセイを用いた。
【図４】0.5M、1Mまたは2MのNaClの存在下での可逆的変性条件下における１回、２回または３回のアルキル化によって不活化されたボツリヌス毒素Ｂを4℃で2ヶ月保存し、遠心分離した後の溶液中のタンパク質の量を示す。
【図５】トキソイドの安定性に対するpHの効果を示す。pH5、pH6またはpH8で1ヶ月間、4℃で保存した後の溶液中のタンパク質の量を示す。
【図６】局所弛緩性麻痺アッセイで測定したボツリヌス毒素Ｂおよび本発明のボツリヌストキソイドＢの活性を示す（注射24時間後）。
【図７】ボツリヌス毒素Ｂ、本発明のトキソイド、ホルムアルデヒドトキソイド、緩衝液対照および生理食塩水対照のエンドペプチダーゼ活性を示す。エンドペプチダーゼ活性はHV50基質を用いて測定した（トキソイドの1:4希釈を初期値とする）。
【図８】15μgのホルムアルデヒドトキソイド、15μgの本発明のトキソイド、2μgのホルムアルデヒドトキソイド、2μgの本発明のトキソイドまたは正常なマウス血清（NMS）で免疫した10週間後のマウスの血清を用いてELISAで検出した特異的抗体レベルを示す。
【図９】ホルムアルデヒドトキソイドと比較した、本発明のトキソイドを用いた免疫の効果を示す。局所弛緩性麻痺アッセイ（注射24時間後）を用いて、免疫したマウスの血清によるボツリヌス毒素Ｂの中和が判定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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