(57)【要約】  心筋梗塞に伴う心室性頻脈の危険度を減少するための方法により、心筋組織の梗塞された領域の境界域内において細胞と細胞のカップリング及び／又は興奮性が増加する。その境界域を治療するために向上された電気伝導が、その境界域における筋細胞を遺伝的に変性してより多くのギャップ結合及び／又はナトリウムチャネル及び／又はカルシウムチャネルを形成することにより行われる。又は、向上された電気伝導が、筋細胞とのギャップ結合を形成し及び／又はナトリウムチャネルを形成し及び／又はカルシウムチャネルを形成する境界域中に細胞を組込むことにより行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋組織の梗塞された領域中の電気伝導の障害を治療する方法であって：
梗塞された領域の境界域内の電気伝導を改良することが可能な生物学的物質を用意し；そして
前記生物学的物質を梗塞された領域の境界域に放出すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記生物学的物質が、内心膜境界域に放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的物質が、少なくとも一つのギャップ結合タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、コネキシン４３タンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が、コネキシン４０タンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的物質が、少なくとも一つのナトリウムチャネルタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ナトリウムチャネルタンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的物質が、少なくとも一つのカルシウムチャネルタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が、少なくとも一つのＬ−型カルシウムチャネルタンパク質及びＴ−型カルシウムチャネルサブユニットタンパク質をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的物質が、ギャップ結合タンパク質の発現を増加するタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
以前に梗塞された組織の領域に伴う、心室性頻脈の危険度を減少するための方法であって：
梗塞の境界域内の電気伝導を向上する複数の細胞を用意し；そして
前記細胞を、前記梗塞の境界域内の筋細胞と接触させること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１２】
前記細胞が：自家性、間葉系幹細胞、同種、異種の一つを含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ギャップ結合による細胞と細胞のカップリングが、電気伝導を向上する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つのナトリウムチャネル及びカルシウムチャネルにより増加された興奮性が、電気伝導を向上する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
以前の心臓発作に伴う電気伝導の障害を治療するための方法であって：
心臓の梗塞の表面下領域の表面の位置を決定し；
梗塞の境界域内の電気伝導を向上することが可能な生物学的物質を用意し；そして
前記生物学的物質を境界域に放出すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
心筋組織の梗塞された領域に伴う心室性頻脈の危険度を減少する方法であって：
梗塞された領域の境界域に放出するために、電気伝導を向上することが可能な少なくとも一つの細胞を用意し；そして
境界域内の少なくとも一つの筋細胞を、前記細胞と接触させて、梗塞された領域の境界域内の電気伝導を向上すること；
を含んでなる、前記方法。
【請求項１７】
前記細胞が、内心膜境界域内の前記筋細胞に放出され、そしてそれと接触する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、前記筋細胞と少なくとも一つのギャップ結合を形成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、少なくとも一つのナトリウムチャネルを形成する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心室性頻脈（ＶＴ）を治療するための方法に関する。特に、本発明は、ＶＴのための基質を抑制又は排除する梗塞を治療するための方法に関する。心筋梗塞の病歴を持つ患者において、急速持続性ＶＴは、突然の心臓死に導くことができ、これは、世界的に主要な問題である。
【０００２】
心筋梗塞に悩んでいる多くの個人は、梗塞に関連する合併症と争うままにされる。これらの個人の主要な合併症の一つは、単形性ＶＴを経験する性質である。
これらの患者における梗塞された心筋（ＶＴＩ）に伴うＶＴを減少するために、多くの治療が現時点で使用される。カテーテル焼灼術は、いくつかの群の不整脈に対して好結果である普通の治療戦略であるが、しかしこの好結果は、心室性不整脈の大部分に対しては見世物以下であった。ＶＴＩ焼灼術は、ＶＴが電気生理学の研究室で容易に誘発することができ、そして血行動態的に安定している場合には、かなり簡単である。不幸なことに、これは、少数のみのＶＴ発症の事例である。更に、ＶＴＩが好結果で焼灼された場合においてさえ、同じＶＴＩ又は異なったＶＴＩが、大多数の患者において再発することができる。
【０００３】
薬物も、更に普通の治療戦略として、限られた成功を伴って使用されている。薬物の毒性及び予期しない副作用のために、通常殆んどの薬理学的アプローチを悩ませる。
植込み型除細動器（ＩＣＤ）は、現時点で、心室性頻脈／心室細動の病歴を持つ患者に対して最も有効な療法である。最も最新のＩＣＤで利用可能な抗頻脈ペーシング（ＡＴＰ）療法は、心室性不整脈に苦しむＩＣＤ患者の最も普通の形態である、単形性ＶＴを無痛で治療することにおいて極めて有効である。Ｍ  Ｓ．Ｗａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（７）：７９６−８０１を参照されたい。然しながら、ＡＴＰ療法を取巻く各種の認識は、ＶＴを治療するためのＡＴＰ療法の受入れを、比較的低くしている。これらの中で最も蔓延していることは、ＡＴＰの失敗が、最終的に高電圧療法の放出の遅れに、そして恐らくは患者の失神の発生頻度の増加に導くという考えである。従って、高電圧療法は、なお、ＶＴを治療するために使用されるＩＣＤ療法の頼みの綱である。
【０００４】
まれなＶＴ発症を体験している患者においては、ＡＴＰの代わりに高電圧療法を使用することは、高電圧療法が不快であり、そしてより大きい患者の不安及び入院を伴うことができることを除いて、わずかな有害な結果しか有しない。然しながら、ＶＴ発症の襲撃を体験している患者においては、高電圧療法の急速な連続した放出は、患者の増加する不快感及び入換え方法を必要とする装置の電池のより早い枯渇に導くことができる。従って、改良されたＶＴＩの治療に対する必要性が存在する。
【０００５】
本発明は、心筋梗塞後に発生する電気伝導の障害を治療する。梗塞の境界域に放出された生物学的物質は、増加された細胞−細胞間のカップリング及び／又は改良された細胞の興奮性によって電気伝導を向上することによって、ＶＴのための基質を排除又は回復させる。
【０００６】
本発明者は、単形性ＶＴの起源及び病原性の維持は、典型的には基本的に梗塞の周辺の周囲の興奮回帰性活性の形態の、疾病の心筋の梗塞された領域を伴うことを示唆する。興奮旋回は、一つ又はそれより多いサイクルに対して連続して与えられた活動電位による、心臓組織の領域の再興奮である。興奮旋回は、緩慢にされた伝導の解剖学的部分にわたって存在し、そしてここで組織は、刺激に対する異常な不応性を示し、従って一方向性の伝導の遮断のための基質を産生する。ＶＴの開始及び維持の機構は、図１に示した８の字モデル１０を使用して理解することができる。モデル１０は、環１２及び１４を含む。環１２の腕１２ａ及び１２ｂ並びに環１４の腕１４ａ及び１４ｂは、心筋組織内の別個の（仮定上の）心筋路を表す。図１は、腕１２ａ、１２ｂ、１４ａ、及び１４ｂ中の電気的活性の伝播が急速で、そして殆んど同期的である正常な心筋中の電気的活性を例示する。結果として、波面は、興奮回帰性活性として説明されるものである環１２及び１４を回り続ける代わりに、衝突し、そして心筋を下り続ける。更に、興奮回帰性活性がある程度開始されたとしても、これは、正常な心筋中の、活動電位持続時間（ＡＰＤ）及び伝導速度（ｃ）の積である波長（□□ＡＰＤ＊ｃ）が、正常な大きさの心臓の物理的寸法をはるかに超えるために、継続されないものである。
【０００７】
然しながら、ＶＴＩに関連する不均一性を持つ疾病の心臓において、興奮回帰性活性を開始し、そして継続されることを可能にするいくつかの変化が起こる。図２ａ及び２ｂは、梗塞された心筋における電気的活性を示す。図２ａ及び２ｂは、上記のようなモデル１０を示すが、しかし更に梗塞された領域１６も含む。梗塞された領域１６によって起こされた一方向性遮断は、先行する下向きの腕１２ｂ及び１４ｂからの波面を防止し、一方腕１２ａ及び１４ａからの波面が、腕１２ｂ及び１４ｂを通って進行することを可能にする。梗塞された領域１６を通る波面の緩慢にされた伝播は、波面の波長、□、を有効に短くし、興奮回帰性活性が正常な大きさの心臓の寸法内に適合することを可能にする。従って、興奮回帰性活性は継続される。
【０００８】
ＶＴＩの開始及び永続化の主たる原因は、梗塞の境界域における減少した電気伝導である。細胞の水準では、心筋組織は、電気生理学的に正常な細胞の層が、心内膜及び／又は心外膜領域において生存するように再構築する。この組織の生存可能な層は、中心壊死コアに隣接し、そして境界域と呼ばれる。形態学的には、境界域における組織の錯綜配列は、突然の拡大及び縮小を伴う生存可能な細胞の管を形成する。このような幾何学的配列は、供給−吸入のミスマッチのために、ＶＴの開始のために必要な成分である一方向性の遮断を誘導することを示している。Ｓ．Ｒｏｈｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：８４１−４を参照されたい。
【０００９】
分子の水準では、境界域中の細胞は、ギャップ結合において錯綜配列を示し、これによって細胞と細胞のカップリングが減少することとなる。減少されたカップリングは、巨視的な規模で、電気的活性の緩慢にされた伝播として顕在化される。
【００１０】
ギャップ結合は、主としてコネキシンと呼ばれるタンパク質のサブユニットから構成される。典型的には、細胞の表面で６個のコネキシンがコネクソン、又はヘミチャネルを形成する。隣接する細胞間のコネクソンのカップリングが、ギャップ結合を形成する。コネキシンは、Ｃｘ遺伝子ファミリーによってコードされ、そして多くのアイソフォームが含まれる。例えば、Ｃｘ４３は、心臓の心房及び心室の組織中に見出される主要なアイソフォームである。然しながら、他のアイソフォームも、更に心臓の組織中に見出される。
【００１１】
境界域におけるギャップ結合の変化を、図３に略図的に示す。図３は、心内膜１８を持つ梗塞領域１６の断面を示す。梗塞領域１６は、更に壊死層２０、ギャップ結合の錯綜配列層２２、及び正常な層２４をも含む。境界域２６は、二つの層−−正常なカップリングを持つ正常な層２４、及び通常より深く、そしてギャップ結合の異常性を示すギャップ結合錯綜配列層２２からなる。ＶＴに対して最も敏感である梗塞領域１６の部分において、層２４は、連続ではなく、そして代わりに、より深い層２２が心内膜１８に達した所で中断している。
【００１２】
従来の研究は、興奮回帰性のＶＴ回路の狭部（図１の梗塞領域１６）及び最大のギャップ結合錯綜配列の心内膜／心外膜領域が、空間的に相関することを示した。電気的なマッピングは、狭部及び一連の区分を同定し、そして免疫組織化学的検査は、ギャップ結合の錯綜配列を持つ領域を同定した。二つの領域は、同じ部分に対応した。Ｎ．Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：１７４６−５４，１９９８を参照されたい。
【００１３】
同じグループは、境界域からの酵素的に解離された細胞の対における細胞間のコンダクタンスを、二電極膜電極固定技術を使用して測定した。コンダクタンスの測定値は、境界域から誘導された細胞間のカップリングが、一桁減少された（境界域の筋細胞において１０ｎｓに対して正常な筋細胞において１００ｎｓ）ことを証明した。Ｊ．Ａ．Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９２：４３７−４３，２００３を参照されたい。
【００１４】
ギャップ結合に加えて、境界域領域の減少された興奮性は、更に伝導の異常性において役割を演じる。ナトリウム及びカルシウムチャネルは、興奮に対して寄与する。電位開口型ナトリウムチャネルは、心臓による興奮の伝導を決定する、心臓作用電位の初期の脱分極相を刺激する。心臓のナトリウムチャネル遺伝子、ＳＣＮ５Ａ中に遺伝子欠損又は機能喪失変異を持つ個人は、心室細動に対する増加した危険度にある。Ｇ．Ａ．Ｐａｐａｄａｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９９（９）：６２１０−１５を参照されたい。心臓組織中のナトリウムチャネルの増加した発現は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，６６５，５６３号に記載されている。
【００１５】
ギャップ結合の錯綜配列は、境界域の細胞間のカップリングの減少を起こし、損なわれた波面の伝導となる。本発明は、ギャップ結合による細胞間のカップリングを増加することによって、境界域における有効な電気伝導を向上する。更に、本発明は、梗塞境界域中のナトリウム及び／又はカルシウムチャネルの発現を向上して、境界域の細胞の興奮性を改良する。改良された細胞と細胞のカップリング及び興奮性は、境界息領域における伝導を向上することにおいて相乗的に作用すると推定される。
【００１６】
細胞の興奮性は、境界域中の細胞を遺伝子的に設計して、心臓のナトリウム及び／又はカルシウムチャネルのサブユニットを過剰発現させることによって、向上することができる。ナトリウムチャネル及び少なくともいくつかのカルシウムチャネルの□−サブユニットが、これらのヘテロマーのチャネルの主たる膜孔形成単位である。
【００１７】
境界域中の細胞間の細胞のカップリング及び興奮性は、次の二つの方法の一つ又は組合せを使用して向上することができる。第１の方法において、境界域の心臓の細胞、又は筋細胞は、遺伝子的に設計されて、コネキシン及び／又はナトリウムチャネル及び／又はカルシウムチャネルタンパク質の発現を増加する。コネキシン４３は、これが心室中に最も豊富にあるコネキシンであるために、本発明で使用される。コネキシン４０も、これが恐らく最大の単位コンダクタンスを有するために、更に使用される。然しながら、心臓のコネキシン４５及び他の非心臓のアイソフォームを含む他のコネキシンのアイソフォームのいずれもを、更に境界域を修復するために使用することができる。ナトリウム及び少なくともいくつかのカルシウムチャネルの□−サブユニットも、これらがチャネルを形成する主たるサブユニットであるために、更に使用することができる。□−サブユニット以外のサブユニットも、更にチャネルを形成するために使用することができる。
【００１８】
更に、内因性ギャップ結合チャネルの発現を増加することが知られているペプチド（アンギオテンシンＩＩ又はエンドセリンのような）のような、ギャップ結合のコンダクタンスを間接的に増加することが知られた方法を使用することができる。これは、アンギオテンシンＩＩ又はエンドセリンをコードする遺伝子によるｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子導入によって、或いはアンギオテンシンＩＩ又はエンドセリンをコードする遺伝子の直接の遺伝子導入によって達成することができる。Ｓ．Ｄｈｅｉｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２３（９）：１７０１−９を参照されたい。
【００１９】
第２の方法において、筋細胞及び／又はナトリウム及び／又はカルシウムチャネルを発現する細胞とギャップ結合を形成することが可能な細胞が、境界域に導入される。ギャップ結合を形成する細胞は、筋細胞とカップリングし、そして電流の流れのために別の経路を提供し、そして境界域領域における有効なカップリングを向上するための橋として作用する。ナトリウム及び／又はカルシウムチャネルを発現する細胞は、境界域中の興奮性を増加する。
【００２０】
修復のために使用される生物学的物質は、梗塞の境界域に特異的に放出される。特に、生物学的物質は、ＶＴを開始し、そして継続する緩慢な伝導の領域が最も起こる可能性がある心内膜境界域に放出される。然しながら、本発明は、心内膜境界域の修復にのみ制約されず、そして異常な伝導を有し、そして興奮回帰性活性のための基質を形成することができる他の心筋の心筋中央又は心外膜領域に拡大することができる。更に、本発明は、伝導遮断（例えばＡＶ結節性遮断）に伴う他の形態の不整脈を治療するためにも、更に使用することができる。
【００２１】
生物学的物質は、核酸、タンパク質、細胞、又はこれらの組合せから構成される。生物学的物質の機能は、その形態に関係なく、心臓細胞中の細胞の興奮性の原因となる一次電流である、ギャップ結合及び／又はナトリウム／カルシウム電流の数を増加することによって、境界域内の伝導を向上する。これは、遺伝子的又は細胞的介入のいずれかによって達成することができる。
【００２２】
図４は、遺伝子的介入の略図である。心臓細胞又は心筋２８は、遺伝子的介入に先立つ境界域中の細胞を表す。心臓細胞２８は、ギャップ結合３０ａ及びナトリウム／カルシウムチャネル３０ｂを含む。ギャップ結合３０ａ及びチャネル３０ｂの重複が存在することができる。事実、ナトリウムチャネルは、心臓の筋肉細胞中にコネキシン４３アイソフォームと介在板において共存していることを示した。Ｓ．Ｋ．Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９（１１）：１４２１−７を参照されたい。心臓細胞２８は修飾され、これは組替え細胞３２となる。組替え細胞３２は、細胞３２及び更なるチャネル３０ｂ間の相互接続の増加された幅によって表される更なるギャップ結合３０ａを含む。細胞３２によって形成された更なるギャップ結合３０ａは、細胞の末端で形成することに対して増加された性質を有することができ、又は細胞の末梢部の周りでより無作為に形成することができる。ナトリウム／カルシウムチャネル３０ｂは、コネキシン４３のようなコネキシンタンパク質との組合せで発現することができるか、又は発現することができない。いずれの場合も、増加されたカップリング及び／又は興奮性は、向上された電気伝導となる。
【００２３】
修飾は、典型的には核酸修飾によるが、しかしコネキシン及び／又はナトリウム／カルシウムチャネルタンパク質も更に細胞に放出されて、心臓細胞の表面上にチャネルを形成する。例えば、コネキシン４３タンパク質；コネキシン４０タンパク質；ナトリウムチャネル（□−サブユニット）；Ｌ−型カルシウムチャネル（□−サブユニット）又はＴ−型カルシウムチャネルサブユニットのようなカルシウムチャネルサブユニット；或いはこれらの組合せを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させ、そしてその後、境界域の細胞に放出することができる。
【００２４】
核酸修飾のために、一つ又はそれより多いＣｘ４３遺伝子、Ｃｘ４０遺伝子、他のＣｘアイソフォーム遺伝子、ナトリウムチャネル（□−サブユニット）遺伝子、又はカルシウムチャネルサブユニット遺伝子を含む、一つ又はそれより多いベクターを、境界域に放出して、心臓細胞２８に形質移入することができる。得られた組替え細胞３２は、細胞のゲノムに組込まれた外因性核酸を有するか、或いはエピソームの因子として過渡的に又は安定的に維持されるかのいずれかである。組替え細胞３２は、コネキシン及び／又はナトリウム／カルシウムチャネルタンパク質発現の水準を、正常な水準まで向上することができるか、又はタンパク質を過剰発現することができる。核酸修飾は、当業者にとって既知である多くの方法のいずれかによって、そしてＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形態を使用して行うことができる。更に、心臓細胞２８は、プロモーター、エンハンサー、等のような更なる調節因子で形質移入、又は形質転換することができる。
【００２５】
図５は、遺伝子的介入のために、細胞２８にウイルスベクターによって放出することができる、遺伝子発現のための核酸構築物の一般的な形態を、略図的に示す。構築物３４は、ウイルスベクターの放出に続く導入遺伝子（単数又は複数）の高い水準の発現を確実にする、ウイルスゲノムからの５’及び３’逆位末端配列（ＩＴＲ）、及び発現カセット４０を示す。
【００２６】
発現カセット４０は、Ｃｘ４３、Ｃｘ４０、又はナトリウム／カルシウムチャネルサブユニットをコードする遺伝子のような、関心のある導入遺伝子（単数又は複数）４２を含む。発現カセット４０は、更にプロモーター４４及びエンハンサー又は薬物感受性因子のような発現を調節する調節因子（ＲＥ）４６も含む。いくつかの調節因子は、作用の特異的機構によるが、導入遺伝子（単数又は複数）の下流に位置することができる。構築物は、更に例えば終結シグナルをコードする調節後因子（ＰＲＥ）４８を含む。
【００２７】
図６は、本発明で使用するためのＣｘ４３ウイルス構築物５０を略図的に示す。構築物５０は、再び５’並びに３’ＩＴＲ３６及び３８を含む。Ｃｘ４３導入遺伝子５２は、構築物中で使用されるプロモーター及び調節因子であるニワトリ□−アクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサー（ＣＡＧ）５４によって発現する。調節後因子は、ポリＡ尾部（ｐＡ）５６をコードする。構築物５０において使用されるポリＡ尾部５６の例は、ウシ成長ホルモンポリＡ尾部（ＢＧＨｐＡ）である。ウイルス構築物のパッケージの大きさに基づけば、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ウイルス、レンチウイルス、又はいずれもの同様なウイルスであることができる。
【００２８】
例えば、ニワトリ□−アクチンプロモーターの代わりに、導入遺伝子（単数又は複数）の心臓の筋細胞に特異的な発現を可能にする、心臓組織に特異的なプロモーターを使用することが好ましいことであることができる。他の態様において、恒常的活性型のプロモーターに対して誘導可能／抑制可能なプロモーターを使用することが好ましい。本発明で使用することができるプロモーター又は制御因子を有する心臓組織中に特異的に発現する遺伝子又は因子の例は：心臓アンキリン反復配列タンパク質、□−ミオシン重鎖、□−ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖エンハンサー、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖２ａ、心臓□−アクチン遺伝子、心臓Ｍ２ムスカリン性アセチルコリン、心房性ナトリウム利尿因子／ペプチド（ＡＮＦ／Ｐ）、心筋トロポニンＣ、心筋トロポニンＩ、心筋トロポニンＴ、及び心臓筋小胞体Ｃａ−ＡＴＰアーゼを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、薬物反応性プロモーターを使用することが好ましい。プロモーターは、例えば、エクジソン又はエリスロマイシン（マクロライド）によって導入することができる。テトラサイクリン反応性因子を抑制可能なプロモーターのために使用することができる。
【００３０】
別の方法として、電気的刺激に続いて遺伝子の発現が起こる、電気的反応性プロモーターが使用される。Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願２００３／０２０４２０６は、本発明において使用することができる電気的反応性プロモーターを開示している。
【００３１】
先に記載した遺伝子的因子及び構築物は、例として提供されている。他のベクター、構築物、因子、等も、更に本発明において使用することができる。
図７は、細胞的介入の略図である。図４のように、境界域は、ギャップ結合３０ａ及びナトリウム／カルシウムチャネル３０ｂを持つ心臓細胞２８を有して示されている。然しながら、ここでコネキシン及び／又はナトリウムチャネルサブユニット及び／又はカルシウムチャネルサブユニットを発現し、そしてギャップ結合３０ａ及び／又はチャネル３０ｂを形成することが可能である細胞３４は、境界域に放出される。外因的に放出された細胞のヘミチャネルは、ネイチブな心筋細胞とカップリングし、そしてお互いに電流の流れのために別の経路を与え、このように有効な細胞間カップリングを向上する。放出された細胞中のナトリウム／カルシウムチャネルは、興奮中に更なる電流を与え、そして境界域領域の巨視的興奮性を改良することを補助する。
【００３２】
多くの種類の細胞３４を、細胞的介入のために使用することができる。細胞３４は、自家性、同種、又は異種であることができる。一つの態様において、細胞３４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成人の幹細胞と統合され、そしてギャップ結合を形成することが示されている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。Ｖ．Ｖａｌｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６：６を参照されたい。自家性ＭＳＣを使用する利益は、例えば、細胞が宿主によって拒絶されないことである。然しながら、ＭＳＣを収集し、そして拡大することは困難である。確立された細胞系からの同種のＭＳＣは、収集し、そして拡大する必要性を克服するが、然しながら、宿主による拒絶の危険性が存在する。異種ＭＳＣも、更に宿主による拒絶の危険性を与える。同種及び異種ＭＳＣは、拒絶の危険性を減少するために、移植に先立って培養し、そして処理することができる。
【００３３】
細胞３４の他の例は、各種の起源（心臓、皮膚、等）の線維芽細胞又は骨格筋細胞を含む。細胞３４は、更にｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、一つ又はそれより多いコネキシン及び／又はナトリウムチャネルサブユニット及び／又はカルシウムチャネルサブユニットを発現し、そして次いで境界域に放出するために形質移入することもできる。
【００３４】
本発明において有用な細胞の種類の他の例は、制約されるものではないが：１）自家性細胞：骨髄及び血液に由来する幹細胞及び前駆細胞；骨格筋前駆細胞（骨格筋筋芽細胞又は骨格筋に由来する成人幹細胞は同義語である）；心筋前駆細胞（ｃ−ｋｉｔ＋）；他の幹細胞；他の細胞；２）同種細胞：間葉系幹細胞；骨髄又は血液に由来する他の幹細胞；胚性幹細胞；電気的にカップリングし、そして心臓の活動電位を伝導することが可能な他の拡大可能な細胞である。
【００３５】
細胞３４は、先に記載した細胞又は同様な種類の細胞のいずれもの組合せを含むことができる。例えば、Ｃｘ遺伝子で形質移入された幹細胞及び線維芽細胞の組合せは、別個に又はいっしょに注入することができる。ここで、幹細胞は、ギャップ結合を形成しないかもしれないが、しかし代わりに線維芽細胞のホーミング及びその後の筋細胞へのカップリングのために必要な成長因子及び走化性因子を与える。
【００３６】
もう一つの態様において、一つ又はそれより多い成長因子を、細胞の放出に先立って境界域組織に注入することができる。成長因子は、異種細胞を維持するために、更に最適な環境を与えることによって境界域組織を用意する。
【００３７】
生物学的物質のｉｎ  ｖｉｖｏの放出は、いくつかの問題を伴う。従来の技術は、機械的、血管性、又はリンパ性の機構による、放出された物質の約８０ないし９０％の損失を示し、これは、全ての場合において、潜在的に無効な治療又は有害な効果となる全身性循環内に、生物学的物質を運搬することができる。放出された物質が細胞である場合、放出された細胞の約８０ないし９０％が、標的組織内で脈管構造の欠如によって、典型的には細胞死を起こす。本発明者は、細胞の死が、必要な栄養及びガスの交換の欠如に伴うと断定する。これらの問題点に立向かうために、境界域への生物学的物質の放出において足場を使用することができる。ある場合には、自己定着足場を使用することが好ましいことであることができる。本発明において使用される足場はポリマーであり、そして生分解性である。自己定着足場は、足場を固着するための縫合を必要としないために、より観血的ではない放出方法を可能にする。図８は、本発明において使用される足場の第１の態様である。図８は、支持体６０及び定着要素６２を有する足場５８を含む。支持体６０は、生物学的物質を保持し、一方定着要素６２は、足場５８を境界域ＢＺの組織に固着する。
【００３８】
示された態様において、足場５８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて製造され、そして生物学的物質が含浸される。然しながら、生物学的物質は、足場５８に、その境界域ＢＺへの放出後に放出することができる。足場５８は、培養培地６４中で培養される。培養培地６４は、伝導を向上するための遺伝子的又は細胞的な生物学的物質を含有する。これは、更に成長因子のような他の因子及び細胞の生存率を向上する栄養分も含有することができる。培養された後、足場６６は、境界域の組織ＢＺに放出される。
【００３９】
境界域ＢＺへの放出に先立って足場５８を含浸することは、いくつかの利益を与える。これは、組織中に導入された場合、その中で細胞が成長するための基質を提供する。これは、生物学的物質を保持し、それによって漏洩を減少するものである。核酸は、足場５８の表面に付着するように優しく扱うことができる。含浸された細胞が、組織への放出に先立って足場５８の環境に適合させられているために、細胞はこれらが直接組織に注入された場合に受けるものであるより少ないストレスに直面する。
【００４０】
細胞的介入を使用した好結果な処理は、部分的に、境界域ＢＺを形成する細胞間に移植された細胞の組込みによる。従って、一つの態様において、細胞を領域ＢＺに誘引するために、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のような走化性因子が境界域組織ＢＺに注入される。定着要素６２は、足場５８が更に注入デバイスであるように、中空にすることができる。修復が最近の梗塞に対して行われる場合、組織ＢＺが有効な量の走化性因子を十分に産生するために、走化性因子の注入は必要ないかもしれない。
【００４１】
図９は、足場の第２の態様を示す。足場６８は、支持体７０及び腕７２を含む。腕７２は、スプリング付きであるか、又はニチノールのような形状記憶物質から製造される。放出後、腕７２が開き、そして足場６８を境界域組織ＢＺに固着する。
【００４２】
図１０は、足場の第３の態様を示す。ここで、足場７４は、境界域ＢＺの組織に移植される。足場７４は、図１０に示すように、移植の容易さのために形作られる。移植後、足場７２の部分７４は拡大して、足場７２を組織ＢＺに固着する。
【００４３】
図１１は、足場の第４の態様である。図１１は、足場７８及び骨格８０を持つ足場デバイス７６を示す。骨格８０は、金属又は同様な物質から形成される。操作において、足場デバイス７６は、境界域ＢＺに移植される。骨格８０は、足場７８が組織ＢＺに貫入するための硬さを与える。移植後、骨格８０は除去され、足場７８の部分７８ａ及び７８ｂの形態が変化する。部分７８ａ及び７８ｂは、移植後、足場７８を組織ＢＺ内に固着する。
【００４４】
図１２は、足場の第５の態様を示す。足場系８２は、針８４、カテーテル８６、及び足場８８を含む。操作において、足場系８２は、足場８８が、組織の表面に殆んど平行であるように境界域ＢＺに挿入される。針８４が抜出され、続いてカテーテル８６が抜出される。足場８８は、境界域ＢＺの組織内に移植されたままである。
【００４５】
上記に示した態様は、全てｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造され、そして境界域への放出に先立って生物学的物質で含浸することができるか、又は含浸することができない。態様は、自己定着足場の例であり、そして制約することを意味するものではない。
【００４６】
生物学的物質が注入によって放出される場合、同様な物質で製作され、そして生物学的物質で含浸された球形の足場が、境界域に注入される。生物学的物質に対する足場の大きさは、足場が、それ自体の洗い出し経路を妨害するために、洗い流される機会は減少する。球形の足場も、初期に、生物学的物質を組織の環境から緩衝する。
【００４７】
別の態様において、足場は、ｉｎ  ｖｉｖｏで製作することができる。注入可能なポリマーが境界域に注入される。注入可能なポリマーは、高分子の、そして生分解性の足場を形成し、そして注入に先立って、生物学的物質と混合又は含浸することができる。
【００４８】
注入後、注入可能なポリマーは、例えば、温度又はカルシウムイオンの存在によって刺激されることができる相転移を起こす。従って、形成後、足場は、組織内に自己定着される。
【００４９】
先に記載したいずれもの足場は、他の生物学的物質と使用することができ、そしてここに記載したもの以外の他の組織に放出することができる。本発明による足場の使用は、いくつかの利益を提供する。足場は、所定の量の生物学的物質を境界域に有効に放出し、そして焦点を合わせた、局所的放出を可能にする。足場中に含浸された細胞は、その中に成長するための基質を有し、そして強烈な環境の変化の遮蔽物を足場が提供するために、境界域に放出された場合、より少ないストレスに直面するものである。最後に、足場は、生物学的物質の漏洩を減少するための生体力学的骨格として作用する。
【００５０】
心臓組織は、異等方性の伝播−−心筋繊維の方向に沿ってその横方向より速い活動電位の伝播を示す。異等方性の軸は、心筋の厚さに沿って内心膜層から外心膜層へ回転する。足場は、境界域の細胞が、所望する異等方性を有するように、特異的格子構造で設計することができる。足場を伴わずに注入された生物学的物質は、恐らくは組織中に無作為に統合され、従って等方性の構造を形成する。足場は、無作為の統合を克服することを補助して、細胞を適切に位置させ、そして梗塞の境界域を電気的に修復する成功を増加する。
【００５１】
本発明で使用される足場は、多くのポリマーのいずれか一つ又はそれより多くから製作することができる。足場の定着要素は、組織に貫入し、そして組織から追出されることに対して抵抗するために十分に頑強である必要があるために、これらは、生物学的物質を保持する支持体のものとは異なったポリマーから製作される。いくつかの事例において、定着要素は、白金のような金属物質から製作される。足場を製作するために使用することができるポリマーの例は、次の：ＰＬＡ：ポリ（乳酸）、ＰＧＡ：ポリ（グリコール酸）、ＰＬＧＡ：ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチック−コ−グリコリド）、ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、ＰＣＬ：ポリ（ｅ−カプロラクトン）、ＰＬＬＡ、ポリウレタン−ＰＣＬ、ポリウレタン−ＰＥＯ：ポリエチレンオキシド、ＰＣＬＡ：編まれたポリ−Ｌ−ラクチド繊維で強化されたｅ−カプロラクトン−コ−Ｌ−ラクチドのポリマー、並びに上記のジブロック、トリブロック、及びペンタブロックポリマー変種のような合成ポリマー；アルギン酸塩、コラーゲン、デンプン／セルロース、酢酸セルロース、フィブリン、血小板ゲル、ゼラチン、キチン、ペクチン、及びヒアルロン酸ポリマーのような天然のポリマー；コラーゲン／ＰＬＡ、ペクチン／ＰＬＧＡ、及びキチン／ＰＬＧＡのような組合せ産物；並びにオリゴペプチド、アルギン酸塩、フィブリン、及び血小板ゲル（トロンビン及び血小板の組合せ）のような注入可能なポリマーを含む。
【００５２】
更に、足場が境界域に移植されている間、心臓の組織を安定化することが好ましい。これは、心臓の不全収縮の導入、又は足場を受入れる心臓の局所領域の安定化を含む多くの方法のいずれかによって行うことができる。
【００５３】
図１３は、本発明の各種の態様を使用するための経路９０を例示する。それぞれの経路は、梗塞を位置決めし、そしてマッピングすることによって、段階９２から始まる。心臓内心電図検査技術、電気生理学（ＥＰ）研究、又はマッピングカテーテルを、心臓の活動電位情報及び伝導を分析するために使用することができる。多くの心臓マッピング技術のいずれかを使用することができる。使用することができるマッピング及び放出技術は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願１０／８３７，９４７中に記載されている。これらの及び他のマッピング技術は、包含する境界域を伴う梗塞を同定するものである。
【００５４】
段階９４は、生物学的物質が用意されることを示す。生物学的物質は、核酸、タンパク質、又は細胞であることができる。
段階９６に示すように、生物学的物質を標的部位で保持するために、自己定着足場を使用することができるか、又は使用することができない。自己定着足場が使用されない場合、遺伝子的物質は、典型的には段階９８に示すように、境界域の標的組織に直接注入される。然しながら、多くの方法のいずれかを、生物学的物質を境界域に放出するために使用することができ、そしてこれらの方法は当技術において公知である。
【００５５】
足場が使用される場合、段階１００の足場の製作方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかであることができる。一つの経路において、ｉｎ  ｖｉｖｏで製作された足場は、組織への放出に先立って、段階１０２で、生物学的物質で含浸することができるか、又は含浸することができない。段階１０４において、生物学的物質が、先に検討した形態のいずれかで調製される。注入可能なポリマーが用意され、そして生物学的物質と段階１０４で混合される。段階１０６において、注入可能なポリマー及び生物学的物質は、境界域に放出される。
【００５６】
もう一つの経路において、生物学的物質は、注入可能なポリマー中に含浸されない。注入可能なポリマーは、境界域に、段階１０８に示すように放出される。注入可能なポリマーが、相転移を起こして、足場となった後、生物学的物質が、段階１１０に示すように境界域に放出される。
【００５７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製作された足場は、放出に先立って、段階１１２で、物質で含浸することができるか、又は含浸することができない。段階１１４において、足場が用意され、そして生物学的物質で含浸される。次いで、生物学的物質で含浸された足場は、段階１１６に示すように、境界域に放出される。
【００５８】
別の経路において、足場は、放出に先立って含浸されない。足場は、段階１１８に示すように、境界域に放出される。生物学的物質は、その後、境界域で足場に放出される。これは、段階１２０に示すとおりである。
【００５９】
本発明は、ＶＴのために現時点で利用可能な治療の多くの制約を克服する。これは、ＶＴを経験する性質を、特にＶＴの襲撃を受けやすい個人において減少し、これは、ＩＣＤへの依存性を減少し、そしてＩＣＤの寿命の延長となる。
【００６０】
本明細書中に開示された全ての特許、特許出願、及び文献は、参考文献として援用される。本発明は、好ましい態様を参照して記載されてきたが、当業者は、本発明の境界及び限界並びに範囲から逸脱することなく、変更が、形態及び詳細において行うことができることを認識するものである。
【００６１】
系列Ａの例：
前記タンパク質が、少なくとも一つのアンギオテンシンＩＩ及びエンドセリンを含む、前記のもの。
【００６２】
前記生物学的物質が、筋細胞とギャップ結合を形成することが可能な細胞を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、ナトリウムチャネルを形成することが可能な細胞を含む、前記のもの。
【００６３】
前記生物学的物質が、カルシウムチャネルを形成することが可能な細胞を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、自家性細胞を含む、前記のもの。
【００６４】
前記生物学的物質が、同種細胞を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、異種細胞を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、間葉系幹細胞を含む、前記のもの。
【００６５】
前記生物学的物質が、遺伝子的に設計された細胞を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、少なくとも一つのギャップ結合タンパク質を含む、前記のもの。
前記生物学的物質が、少なくとも一つのナトリウムチャネルタンパク質を含む、前記のもの。
【００６６】
前記生物学的物質が、少なくとも一つのカルシウムチャネルタンパク質を含む、前記のもの。
そして更に生物学的物質を、足場中に含浸することを含んでなる、前記のもの。
【００６７】
前記足場の少なくとも一部が、生分解性ポリマーから製作される、前記のもの。
前記足場が、自己定着足場である、前記のもの。
前記自己定着足場が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで製作される、前記のもの。
【００６８】
前記自己定着足場が、少なくとも一つの：ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＣＬ、ポリウレタン−ＰＣＬ、ポリウレタン−ＰＥＯ、ＰＣＬＡ、アルギン酸塩、コラーゲン、デンプン／セルロース、酢酸セルロース、フィブリン、血小板ゲル、ゼラチン、キチン、ペクチン、及びヒアルロン酸から製作される、前記のもの。
【００６９】
前記自己定着足場が、ｉｎ  ｖｉｖｏで製作される、前記のもの。
前記自己定着足場が、少なくとも一つの：オリゴペプチド、アルギン酸塩、フィブリン、及び血小板ゲルから製作される、前記のもの。
【００７０】
そして更に少なくとも一つの走化性因子を、境界域に放出することを含んでなる、前記のもの。
そして更に少なくとも一つの幹細胞を、境界域に放出して、少なくとも一つの走化性因子を与えることを含んでなる、前記のもの。
【００７１】
系列Ｂの例
心筋組織の梗塞された領域に伴う心室性頻脈の危険度を減少する方法であって、前記方法は：
梗塞された領域の境界域に放出するために電気伝導を向上することが可能な少なくとも一つの細胞を用意し；そして
境界域内の少なくとも一つの筋細胞を、梗塞された領域の境界域内の電気伝導を向上する細胞と接触させること；
を含んでなる。
【００７２】
前記細胞が、心内膜境界域に放出され、そしてそれ内の筋細胞と接触する、前記方法。
前記細胞が、間葉系幹細胞である、前記方法。
前記細胞が、筋細胞と少なくとも一つのギャップ結合を形成する、前記方法。
【００７３】
前記細胞が、少なくとも一つのナトリウムチャネルを形成する、前記方法。
前記細胞が、少なくとも一つのカルシウムチャネルを形成する、前記方法。
前記細胞が、遺伝子的に設計されて、少なくとも一つのコネキシンタンパク質を発現する、前記方法。
【００７４】
前記細胞が、遺伝子的に設計されて、少なくとも一つのナトリウムチャネルタンパク質を発現する、前記方法。
前記細胞が、遺伝子的に設計されて、少なくとも一つのカルシウムチャネルタンパク質を発現する、前記方法。
【００７５】
前記細胞が、自家性である、前記方法。
前記細胞が、同種である、前記方法。
前記細胞が、異種である、前記方法３３。
【００７６】
そして更に足場を、境界域に移植することを含んでなる、前記方法。
そして更に少なくとも一つの走化性因子を、足場を囲む組織中に注入することを含んでなる、前記方法。
【００７７】
前記足場が、自己定着足場である、前記方法。
そして更に自己定着足場を、少なくとも一つの細胞で含浸することを含んでなる、前記方法３３。
【００７８】
系列Ｃの例
心筋組織の梗塞領域に伴う心臓の伝導の障害を治療する方法であって、前記方法は：
梗塞された領域の心内膜境界域内の電気伝導を向上することが可能な生物学的物質を用意し；そして
前記生物学的物質を心内膜境界域に放出すること；
を含んでなる。
【００７９】
前記生物学的物質が、心内膜境界域内の細胞中のコネキシンの発現を増加する、前記方法。
前記生物学的物質が、心内膜境界域内のナトリウムチャネルタンパク質の発現を増加する、前記方法。
【００８０】
前記生物学的物質が、心内膜境界域内のカルシウムチャネルタンパク質の発現を増加する、前記方法。
前記生物学的物質が、心内膜境界域内の筋細胞とギャップ結合を形成することが可能な細胞である、前記方法。
【００８１】
前記生物学的物質が、心内膜境界域内でナトリウムチャネルを形成することが可能な細胞である、前記方法。
前記生物学的物質が、心内膜境界域内でカルシウムチャネルを形成することが可能な細胞である、前記方法。
【００８２】
放出することが、生物学的物質を伴う注入可能なポリマーを含浸し；そして生物学的物質で含浸された注入可能なポリマーを、心内膜境界域中に注入することを更に含んでなり；ここにおいて注入可能なポリマーは、相転移を起こして、自己定着足場を形成する、前記方法。
【００８３】
Ｄ系列の例
心筋梗塞された組織の領域に伴う将来の心室性頻脈の危険度を減少するための方法であって、前記方法は：
足場を、電気伝導を向上する生物学的物質で含浸し；そして
生物学的物質で含浸された足場を、伝導障害を伴う梗塞の心内膜境界域に放出すること；を含んでなる。
【００８４】
前記生物学的物質が、心内膜境界域内で筋細胞とギャップ結合を形成する細胞である、前記方法。
前記生物学的物質が、心内膜境界域内でナトリウムチャネルを形成する細胞である、前記方法。
【００８５】
前記生物学的物質が、心内膜境界域内でカルシウムチャネルを形成する細胞である、前記方法５７。
前記足場が、心内膜境界域内で異等方性を保存する格子構造を有する、前記方法。
【００８６】
そして更に足場を囲む組織中に少なくとも一つの走化性因子を注入することを含んでなる、前記方法。
前記注入することが、自己定着足場の定着要素を経由する、前記方法５７。
【００８７】
系列Ｅの例
以前に梗塞された組織の領域に伴う心室性頻脈の危険度を減少するための方法であって、前記方法は：
梗塞の境界域内の電気伝導を向上する複数の細胞を用意し；そして
前記細胞を、梗塞の境界域内の筋細胞と接触させること；
を含んでなる。
【００８８】
前記細胞が、間葉系幹細胞である、前記方法。
前記細胞が、自家性である、前記方法。
前記細胞が、同種である、前記方法６４。
【００８９】
前記細胞が、異種である、前記方法。
ギャップ結合による細胞と細胞のカップリングが、電気伝導を向上する、前記方法。
少なくとも一つのナトリウムチャネル及びカルシウムチャネルによる増加された興奮性が、電気伝導を向上する、前記方法。
【００９０】
系列Ｆの例
以前の心臓発作に伴う電気伝導の障害を治療するための方法であって、前記方法は：
心臓の梗塞の表面下領域の表面の位置を決定し；
梗塞の境界域内の電気伝導を向上することが可能な生物学的物質を用意し；そして
前記生物学的物質を境界域に放出すること；
を含んでなる。
【００９１】
前記生物学的物質が、境界域中のギャップ結合を増加する、前記方法。
前記生物学的物質が、境界域中のナトリウムチャネルを増加する、前記方法。
前記生物学的物質が、境界域中のカルシウムチャネルを増加する、前記方法。
【００９２】
前記生物学的物質が、一つの内心膜境界域の心筋中央の心筋に放出される、前記方法。
前記生物学的物質が、心外膜心筋に放出される、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、正常な心筋における８の字モデル及び伝導の略図である。
【図２】図２ａ及び２ｂは、疾病の心筋におけるＶＴを開始する波面に対する８の字モデル及び伝導の略図である。
【図３】図３は、梗塞された心筋を通る断面の略図である。
【図４】図４は、遺伝子的介入を例示する略図である。
【図５】図５は、発現カセットの略図である。
【図６】図６は、ウイルス発現構築物の略図である。
【図７】図７は、細胞的介入を例示する略図である。
【図８】図８は、自己定着足場の第１の態様の略図である。
【図９】図９は、自己定着足場の第２の態様の略図である。
【図１０】図１０は、自己定着足場の第３の態様の略図である。
【図１１】図１１は、自己定着足場の第４の態様の略図である。
【図１２】図１２は、自己定着足場の第５の態様の略図である。
【図１３】図１３は、本発明の態様を表すフローチャートである。
【図１】
2008515997.tif 000002
【図２ａ】
2008515997.tif 000003
【図２ｂ】
2008515997.tif 000004
【図３】
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【図４】
2008515997.tif 000006
【図５】
2008515997.tif 000007
【図６】
2008515997.tif 000008
【図７】
2008515997.tif 000009
【図８】
2008515997.tif 000010
【図９】
2008515997.tif 000011
【図１０】
2008515997.tif 000012
【図１１】
2008515997.tif 000013
【図１２】
2008515997.tif 000014
【図１３】
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