(57)【要約】  本発明は、ＣＤ１４７受容体シグナリングを増強するステップによって神経変性を制御する方法に関する。神経保護は、遺伝子療法を含む様々な手段において投与されるＣＤ１４７受容体に対するリガンドとしてのシクロフィリンＡまたは機能的変異体、アナログもしくは誘導体を用いて達成できる。本方法を用いて治療できる状態には、脳虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患および／または外傷や脊髄損傷に起因する神経細胞消失が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞におけるＣＤ１４７受容体シグナリングを増強するステップによって神経変性を制御する方法。
【請求項２】
ＣＤ１４７受容体シグナリングが、神経細胞上でのＣＤ１４７の発現を増加するステップによって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ１４７受容体シグナリングが、シグナリング効率を増強するステップによって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
神経細胞上でのＣＤ１４７の発現が、ＤＮＡ療法を用いて増加される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ１４７をコードするＤＮＡが、処理されていない細胞に比較してＣＤ１４７発現の増加を生じるように神経細胞内に導入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記導入されたＤＮＡが、高レベルで転写されるように適合される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導入されたＤＮＡが、強化されたリガンド結合親和性を有する修飾されたＣＤ１４７をコードする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ１４７発現が、（ｉ）ＣＤ１４７のＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を増加する、および／または（ｉｉ）ＣＤ１４７をコードするｍＲＮＡの翻訳を増加する物質の使用によって増加される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ１４７受容体シグナリングが、ＣＤ１４７に結合して受容体シグナリングを誘発するために適合したリガンドの使用によって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
神経保護剤としてのシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）またはその機能的変異体の使用。
【請求項１１】
前記機能的変異体がペプチドである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記機能的変異体が、ＣｙＰＡと少なくとも７０〜８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記機能的変異体は、
ａ．神経保護性であり、および／または
ｂ．ＣＤ１４７に結合できる、
ＣｙＰＡの断片である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記断片が、少なくとも１０アミノ酸を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記機能的変異体が、ＣＤ１４７に対するリガンド、シクロフィリンＢおよびシクロフィリンＣからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１６】
前記機能的変異体が非ペプチド模倣物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＣｙＰＡまたはその機能的変異体が、別の有益な特性を付与する別の分子にコンジュゲートされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＣｙＰＡまたはその機能的変異体が、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る輸送を促進する化合物にコンジュゲートされる、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＣｙＰＡまたはその機能的変異体がポリマーにコンジュゲートされる、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
神経刺激活性について化合物をスクリーニングする方法であって、候補物質をＣＤ１４７と接触させるステップと、結合および／または受容体シグナリングを評価するステップとを含む方法。
【請求項２１】
（ｉ）ＣＤ１４７と候補化合物との反応混合物を、これら２つの構成成分が相互作用して結合でき、その結果複合体を形成できるように十分な条件下で十分な時間にわたり調製するステップと、（ｉｉ）前記複合体を検出するステップとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１４７もしくはその融合タンパク質または候補物質が固相に付着されている、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固相がマイクロタイタープレートである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ１４７および候補物質のうちの少なくとも１つが細胞に結合している、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）患者におけるＣＤ１４７、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体のうちの少なくとも１つの存在を検出する、および／またはそのレベルを測定するステップと、（ｉｉ）（ｉ）から得られた結果を正常の指標である参照尺度と比較するステップとを含むスクリーニング法。
【請求項２６】
神経変性を制御する方法であって、神経細胞を有効量のＣｙＰＡまたはその機能的等価物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２７】
前記神経変性の制御が神経変性の完全な除去を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
神経変性と関連する疾患もしくは障害を治療する方法であって、被験者に有効量のＣｙＰＡまたはその機能的等価物を投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
前記疾患または障害が、脳卒中などの脳虚血を特徴とする状態、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患および任意の神経変性および外傷や脊髄損傷に起因する神経細胞消失などの進行性神経細胞変性を特徴とする他の状態からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
神経細胞変性を減少または予防するための予防薬としてのＣｙＰＡまたはその機能的変異体の使用。
【請求項３１】
前記疾患または障害が、脳卒中などの脳虚血を特徴とする状態；ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患および任意の神経変性および外傷や脊髄損傷に起因する神経細胞消失などの進行性神経細胞変性を特徴とする他の状態からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
神経細胞の変性を減少させる方法であって、前記神経細胞を有効量のＣｙＰＡまたはその機能的等価物と接触させるステップを含む方法。
【請求項３３】
前記神経細胞がＣＡ１海馬神経細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＣｙＰＡまたはその機能的変異体が、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体を発現させて分泌させるように遺伝子組換えされている所定の細胞を移植するステップによって送達される、請求項２６〜２９もしくは３２〜３３のいずれか一項に記載の方法または請求項３０もしくは３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
ＣｙＰＡまたはその機能的変異体が、構成性もしくは誘導性プロモータへ機能的に連結されたＣｙＰＡまたはその機能的変異体をコードする遺伝子療法構築物を移植するステップによって送達される、請求項２６〜２９もしくは３２〜３３のいずれか一項に記載の方法または請求項３０もしくは３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
ＣｙＰＡまたはその機能的変異体および医薬上許容される担体を含む医薬または獣医薬組成物。
【請求項３７】
神経細胞変性を減少または予防するための薬剤を調製するためのＣｙＰＡまたはその機能的変異体の使用。
【請求項３８】
脳卒中などの脳虚血を特徴とする神経変性または疾患もしくは障害、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患および任意の神経変性および外傷や脊髄損傷に起因する神経細胞消失などの進行性神経細胞変性を特徴とする他の状態を治療または予防するための薬剤を調製するためのＣｙＰＡまたはその機能的変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護を媒介できる神経細胞上の新規標的の同定に関する。さらに本発明は、神経細胞上のＣＤ１４７受容体シグナリングを誘発または増加させるステップにより神経変性を制御するための方法にも関する。さらに本発明は、神経保護剤としてのシクロフィリンＡおよびその機能的変異体などの、ＣＤ１４７への結合に適合した物質の使用にも関する。さらに本発明は、治療方法およびスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中の研究は、虚血が、直接的ではなくむしろ間接的に、細胞プロセスのカスケードを開始させ、最終的には神経細胞死をもたらすことによって身体障害および死亡を生じさせるという仮説に基づいている。現時点では、死んだ神経細胞に置換するために機能的神経細胞を再生させることは実現不可能であるため、脳卒中のための有効な治療としては、最初の虚血性事象によって誘発される事象のカスケードを中断し逆転する治療によって、不可逆性になる前に迅速に介入することが最も望ましい。
【０００３】
神経細胞のプレコンディショニングは、亜致死性のストレスもしくは刺激によって、神経細胞がそれに続く致死性虚血性発作に対して耐性になる場合に起こる。プレコンディショニングは、急性および遅延性耐性を誘導できる。急性のプレコンディショニングは、急速に始まり、新規なタンパク質合成には依存せず、翻訳後タンパク質活性によって仲介され、短期間である。より広範囲に研究されてきた遅延性プレコンディショニングは、新規なタンパク質合成に依存しており、したがって数時間後に発生し、１〜７日間持続する。プレコンディショニング処理は、インビボで、およびインビトロでは脳切片もしくは単離した神経細胞培養を用いて、神経細胞による虚血耐性を誘導することができ、虚血性傷害に対する神経保護の最も強力な形態の１つである。
【０００４】
プレコンディショニングに関係する経路の研究に関しては、早期の翻訳後シグナリング事象または後期転写（ｍＲＮＡ）および翻訳（タンパク質）事象のどちらかに焦点を当てて研究されてきた。神経保護プレコンディショニング反応は新規に合成されたタンパク質の発現に依存するという証拠があるにもかかわらず、関係があると見なされているのは少数のタンパク質に過ぎず（例、ＩＬ−１、Ｂｃｌ−２、ＨＳＰ７０、ＥＰＯ）、広範囲にわたってタンパク質変化を同定するための研究は全く試みられていない。さらに、虚血性プレコンディショニング以外のプレコンディショニング処理が神経細胞死／生存経路において様々な事象を標的とする追加のタンパク質を含む可能性が高いという事実にもかかわらず、大多数の研究は虚血性プレコンディショニングに集中している。さらに、神経細胞に特異的な虚血耐性において重要なタンパク質変化を同定できる確率を増加させられ得る、ほぼ純粋の神経細胞集団内でのタンパク質発現を試験した研究はない。
【０００５】
本発明は、神経保護剤にとっての新規標的を同定するステップによって、上記の問題を克服する、または少なくとも部分的に解決することを試みる。
【発明の開示】
【０００６】
本出願人らは、神経保護療法のための標的および新規な神経保護剤を同定した。詳細には、本出願人らは、ＣｙＰＡを神経保護剤として同定し、ＣＤ１４７を介するその作用機序を明らかにした。
【０００７】
そこで本発明は、神経細胞へのＣＤ１４７受容体シグナリングを増強するステップによって神経変性を制御する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、神経保護剤としてのシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）またはその機能的変異体の使用をさらに提供する。
【０００９】
神経保護においてＣＤ１４７が果たす役割の同定は、他の神経保護剤を開発するための新規標的を生み出す。そこで本発明は、神経刺激活性（ｎｅｕｒｏａｃｔｉｖｉｔｙ）について化合物をスクリーニングする方法であって、候補物質をＣＤ１４７と接触させるステップと、結合および／または受容体シグナリングを評価するステップとを含む方法をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、神経変性の遺伝的素因について患者をスクリーニングするためにも使用できる。そこで本発明は、（ｉ）患者におけるＣＤ１４７、ＣｙＰＡもしくはその機能的変異体のうちの少なくとも１つの存在を検出する、および／またはそのレベルを測定するステップと、（ｉｉ）（ｉ）からの結果を正常の指標である参照尺度と比較するステップとを含むスクリーニング法をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、治療方法、医薬調製物をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜神経変性を制御する方法＞
本発明は、神経細胞へのＣＤ１４７受容体シグナリングを増強するステップによって神経変性を制御する方法を提供する。
【００１３】
ＣＤ１４７受容体シグナリングは、ＣＤ１４７に結合して受容体シグナリングを誘発するために適合するリガンドの使用によって増強されることができる。
【００１４】
あるいは、ＣＤ１４７受容体シグナリングは、神経細胞におけるＣＤ１４７の発現の増加またはシグナリング効率の増強によって増強されることができる。
【００１５】
神経細胞上のＣＤ１４７発現は、様々な方法で増加されることができる。好ましくは、発現は、以下でより詳細に記載するＤＮＡ療法を介して増加させられる。本質的には、処理されていない細胞に比較してＣＤ１４７発現の増加を生じさせるために、ＣＤ１４７をコードするＤＮＡを神経細胞内に導入する。導入されたＤＮＡは、高レベルで転写されるように適合させることができる。追加して、またはその代わりに、導入されたＤＮＡは、強化されたリガンド結合親和性もしくはＣＤ１４７受容体シグナリングを増加させることを可能にする他のいくつかの特性を有する修飾されたＣＤ１４７をコードできる。
【００１６】
ＣＤ１４７発現は、（ｉ）ＣＤ１４７のＤＮＡからｍＲＮＡ内への転写を増加する、および／または（ｉｉ）ＣＤ１４７をコードするｍＲＮＡの翻訳を増加する物質の使用によって増加されることもできる。
【００１７】
＜神経保護剤としてのシクロフィリンＡおよびその機能的変異体の使用＞
本発明は、神経保護剤としてのシクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）もしくはその機能的変異体の使用を提供する。
【００１８】
本出願人らは、いかなる特定の作用機序にとらわれることを望まないが、ＣｙＰＡは、ＣＤ１４７受容体シグナリングおよび／またはＥＲＫ１／２生存促進経路の活性化によって神経保護活性を発揮するという証拠が存在する。
【００１９】
本発明のための「機能的変異体」には、神経保護活性およびＣＤ１４７受容体シグナリングを誘発する能力などのＣｙＰＡの少なくとも１つの重要な特性を保持しているペプチドおよび非ペプチド類似物が含まれる。シクロフィリンＢおよびＣは、本発明の機能的変異体を含むペプチドの２つの例である。［本出願人らはＣＤ１４７に対する任意の他の特異的リガンドを知っているだろうか？もし知っていれば、ここにそれらを列挙するべきである。］これらのペプチドは、組換え体、天然もしくは合成であってもよい。好ましくは、これらのポリペプチドは組換え体である。以下ではアゴニストを含む機能的変異体についてスクリーニングする方法についてより詳細に記載する。
【００２０】
そこで、本発明の機能的変異体は、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換を備えるＣｙＰＡの変異体もまた含む。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いのかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，ｅｔ  ａｌ，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）の中に見いだすことができる。
【００２１】
ＣｙＰＡの機能的変異体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存された、もしくは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）と置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされてもされなくてもよいアミノ酸残基である機能的変異体、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含む機能的変異体、または（ｉｉｉ）ＣｙＰＡがＣｙＰＡの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリコール）などの他の化合物と融合している機能的変異体、または（ｉｖ）ＣｙＰＡにリーダーもしくは分泌配列もしくは精製のために使用される配列またはプロタンパク質配列などの追加のアミノ酸が融合している機能的変異体であってもよい。そのような断片、誘導体およびアナログは、本発明のための用語「機能的変異体」の範囲内に含まれると見なされる。
【００２２】
特に興味深いのは、ＣｙＰＡの神経刺激活性または結合親和性を変化させるアミノ酸の置換である。そこで、本発明の機能的変異体は、自然突然変異もしくは人為的操作のいずれかにより、天然ＣｙＰＡに比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失もしくは付加を含んでもよい。特定の置換は、以下でより十分に説明するように、当業者が決定することができる。しかし、変化は、好ましくはタンパク質の折りたたみまたは活性には有意な影響を及ぼさない保存的なアミノ酸置換などの軽度のものである（例えば、以下の表を参照されたい）。第２列内の同一ブロック内および好ましくは第３列内の同一行内のアミノ酸は相互に置換されてもよい。
【表１】
2008530029.tif 000002
【００２３】
神経保護性および／またはＣＤ１４７受容体結合などの機能にとって不可欠であるＣｙＰＡ中のアミノ酸は、特定部位突然変異誘発もしくはアラニンスキャニング突然変異誘発などの当分野において公知の方法によって同定できる。後者の方法は、分子内の各残基につき単一アラニン突然変異を導入する。結果として生じる突然変異分子は、その後神経刺激活性またはＣＤ１４７受容体シグナリングを誘発する能力などの生物学的活性について試験される。リガンド−受容体結合について極めて重要な部位もまた、結晶化などの構造分析によって決定できる。機能的変異体を開発する場合には、核磁気共鳴またはフォトアフィニティ標識法もまた使用できる。または、候補機能的変異体に対応する合成ペプチドを生成してもよく、それらがインビトロもしくはインビボで神経刺激活性特性を提示する能力。
【００２４】
ＣｙＰＡの機能的変異体は、ＣｙＰＡの配列に基づくが様々な変化を含む配列を有するライブラリーとして調製できる。ファージディスプレイは、有用な神経保護特性を備える機能的変異体を同定する際にさらに有効な可能性がある。手短には、従来型方法を用いて、４〜約８０アミノ酸残基のインサートを提示する、ファージライブラリー（例えば、ｍｌ３、ｆｄ、もしくはラムダファージ）を調製する。これらのインサートは、例えば、偏りのある縮重アレイを提示してもよいし、またはＣｙＰＡ内の１つ以上の位置におけるアミノ酸に完全に制限してもよい。続いて、神経刺激活性もしくは受容体結合／シグナリングなどのＣｙＰＡの重要な生物学的活性を有するファージ保持インサートを選択できる。このプロセスは、数サイクルのファージの再選択を通して繰り返されることができる。反復ラウンドは、特定配列を保持するファージの濃縮をもたらす。ＤＮＡ配列分析は、発現したポリペプチドの配列を同定するために実施できる。関連する活性を付与するＣｙＰＡ配列の最小直鎖部分を決定できる。一部もしくは全部の最小直鎖部分とその上流もしくは下流の１つまたは複数の追加の縮重残基を含有するインサートを含有する偏りのあるライブラリーを用いてこの手順を繰り返すことができる。
【００２５】
ＣｙＰＡの機能的変異体は、ＣｙＰＡのいかなる有用な特性の保持についても試験できる。例えば、どれが神経刺激活性を維持しているのかを決定するために、最初に神経細胞上でインビトロ特性について試験できる。有用な神経保護剤であることを示す１つのインビトロ特性は、培養中での神経細胞の生存を延長させる機能的変異体の能力である。関連する特性を保持または欠如するペプチドは、例えば次に本明細書の実施例のセクションに記載したインビボおよびインビトロアッセイなどの神経保護についてのインビボアッセイにおいて使用できる。
【００２６】
本発明の好ましい機能的変異体は、ＣｙＰＡと少なくとも７０〜８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
参照アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照ポリペプチドの各１００アミノ酸に付き５つまでのアミノ酸変化を含む可能性があることを除いて、参照配列と同一であることを意味している。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを入手するためには、前記参照配列内の５％までのアミノ酸残基が欠失もしくは別のアミノ酸と置換されてもよく、または前記参照配列内の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が前記参照配列内に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端またはこれらの末端位置の間で発生してもよく、個別に参照配列内の残基間あるいは参照配列内の１つ以上の隣接基間に散在してもよい。
【００２８】
実際的問題として、任意の特定ポリペプチドがＣｙＰＡと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、ワイオミング州マディソン、５３７１１）などの知られているコンピュータプログラムを用いた従来法で決定できる。特定配列が、例えば参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔもしくは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合は、パラメータは、当然ながら、同一性率が前記参照アミノ酸配列の全長にわたって計算されるように、そして相同性におけるギャップが前記参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％まで許容されるように設定される。
【００２９】
一般に、本発明の機能的変異体は、直接的に合成するか、またはより大きな分子の化学的もしくは機械的破壊によって入手することができ、分画化され、さらに神経刺激活性などの天然分子の１つ以上の活性について試験されることができる。有用な特性を備える機能的変異体は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドの特定領域の突然変異誘発によって入手することができ、発現させ、その神経刺激活性および／または受容体結合を評価するために発現産物を神経細胞上でのインビトロ試験にかけるステップなどによって発現産物の試験を行うことができる。機能的変異体は、全細胞ＲＮＡのノーザンブロット分析と、それに続いて様々な組織／細胞由来の同定されたバンドをクローニングおよびシーケンシングするステップによって、または、そのようなＲＮＡのＰＣＲ分析の後に同様にクローニングおよびシーケンシングするステップによって生成することもできる。このように、極めて大規模な数の機能的変異体の合成もしくは精製が、本明細書に含めた情報を用いると可能である。
【００３０】
機能的変異体は、立体配座的に制限されたペプチドをさらに含む。立体配座制限とは、ペプチドが取る三次元形の安定性かつ好ましい立体配座を意味する。立体配座制限には、ペプチド内の単一残基の立体配座的移動度を制限することを含む局所的制限と、一部の二次構造単位を形成し得る１群の残基の立体配座的移動度を制限することを含む区域的制限と、全ペプチド構造を含む全体的制限とが含まれる。
【００３１】
ペプチドの活性立体配座は、環化などの共有結合修飾またはγ−ラクタムもしくは他のタイプの架橋の組み込みによって安定化させることができる。例えば、側鎖は、相互作用部位の両側でＬ−γ−ラクタム部分を形成するために主鎖へ環化されることができる。環化は、例えば、システイン架橋の形成、各末端アミノ酸のアミノおよびカルボキシ末端基の結合、またはＬｙｓ残基のアミノ基もしくは関連ホモログとＡｓｐ、Ｇｌｕもしくは関連ホモログのカルボキシ基との結合によって達成できる。ヨード酢酸無水物を用いて、ポリペプチドのα−アミノ基とリシン残基のε−アミノ基とを結合させることもできる。
【００３２】
また別のアプローチは、ペプチド構造内に金属イオン錯化骨格を含めることである。典型的には、好ましい金属−ペプチド骨格は、所与の錯化金属イオンの配位圏によって必要とされる必要数の特定配位基に基づいている。一般に、有用であると証明できる金属イオンの大多数は、４〜６の配位数を有する。ペプチド鎖内の配位基の性質には、アミン、アミド、イミダゾール、もしくはグアニジノ官能基を備える窒素原子；チオールもしくはジスルフィドの硫黄原子；およびヒドロキシ、フェノール、カルボニル、もしくはカルボキシル官能基の酸素原子が含まれる。さらに、ペプチド鎖もしくは個別アミノ酸は、例えばオキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、もしくはモルホリノなどの配位基を含むように化学的に変化させることができる。ペプチド構築物は、直鎖状もしくは環状のいずれであってもよい。しかし、典型的には直鎖状構築物が好ましい。小さな直鎖状ペプチドの１つの例は、配位数４を備える金属イオンへ錯化できる主鎖内に４つの窒素（Ｎ4錯化系）を有するＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。
【００３３】
本発明の機能的変異体は、潜在的エピトープと比較できるアミノ酸配列モチーフの発生に依存することによって決定することもできる。各モチーフは、各（相対）位置の残基を（ａ）単一残基に制限できる、（ｂ）制限されたセットの残基間で変動させることができる、または（ｃ）全部の可能性のある残基間で変動させることができる有限セットのアミノ酸配列を記載する。例えば、モチーフは、第１位にある残基はバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、もしくはフェニルアラニンのうちのいずれか１つであってもよい；第２位にある残基はヒスチジンでなければならない；第３位にある残基は任意のアミノ酸残基であってもよい；第４位にある残基はバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのうちのいずれか１つであってもよい；第５位にある残基はリシンでなければならない、などを規定できる。
【００３４】
ＣｙＰＡのための配列モチーフは、さらにその構造および立体配座の分析によって発展させることができる。ペプチドの接触面を形成することに関与する残基の詳細な構造解析を提供することによって、類似の結合特性を有する配列モチーフを予測することが可能になる。
【００３５】
これらの配列モチーフを研究、評価もしくは設計基準として用いると、標的に結合して所望の生物学的作用を誘導する合理的可能性を有するＣｙＰＡの機能的変異体を表すペプチドの分類を同定することが可能になる。これらのペプチドは、本明細書に記載したように合成することができ活性について試験できる。これらのモチーフの使用は、純粋配列相同性あるいは限定されない「保存的」置換を備える配列相同性とは対照的に、当業者が心血管虚血、脳卒中などの神経変性作用の治療における潜在的適用についてペプチドを詳細に評価できる方法を代表している。
【００３６】
したがって本発明は、ＣｙＰＡの機能的変異体を同定するための方法をさらに提供する。一般に、ＣｙＰＡの第１アミノ酸残基は、変異体ペプチドを調製するために変異させられる。１つの実施形態では、アミノ酸残基は、ペプチド立体配座のコンピュータモデルによって指示されるように選択して突然変異させることができる。類似の立体配剤（例えば二次構造）を維持している変異され得る残基を有するペプチドは、本明細書に記載したアッセイを用いて機能について試験できる潜在的機能的変異体であると見なすことができる。変異体ペプチドの合成、変異した核酸分子を用いて変異体ペプチドを組換え生成するなどの、変異体ペプチドを調製するための任意の方法を使用できる。ＣｙＰＡに関連する変異体ペプチドの特性は次に、本明細書に記載した標準方法にしたがって決定される。
【００３７】
上記の方法のいずれかによって調製した機能的変異体は、必要であればアミノ酸配列を決定するためにシーケンシングすることができ、それによってそのような変異体をコードするヌクレオチド配列を推定することができる。
【００３８】
ＣｙＰＡの機能的変異体は、ＣｙＰＡ断片にも適用される。好ましくは、断片は、神経保護などの神経刺激活性を維持している、または故意に前記ポリペプチドの生物学的活性を減少もしくは除去することができる。
【００３９】
本発明のその他のポリペプチド断片は、ＣｙＰＡのアミノ酸配列を含みアミノ末端を含む連続する一連の残基（すなわち、連続する領域、部分、一部）、もしくはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基が欠けている、または二重短縮変異体におけるように、一方はアミノ末端を含み他方はカルボキシル末端を含む２つの連続する一連の残基が欠失しているポリペプチド断片である。さらに、これらの末端短縮変異体は、好ましくはそれらの神経刺激活性もしくは受容体に結合する能力などの完全ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している。
【００４０】
好ましくは、ＣｙＰＡの断片は、少なくとも１０、２０、３０、５０もしくは１００アミノ酸残基を含む。好ましくは、これらの断片は、神経刺激活性および／または分子全体にとっての受容体もしくはそれに対する抗体に結合する能力などの、完全ＣｙＰＡの少なくとも１つの生物学的活性を含む。
【００４１】
本発明のポリペプチドの断片もしくは部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチドを生成するために使用でき、すなわちこれらの断片は全長ポリペプチドを生成するための中間体として使用できる。
【００４２】
本発明のポリペプチド断片の代表的な例には、長さが約５〜１５、１０〜２０、１５〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１００〜１２５および１１０〜１３０アミノ酸であるポリペプチド断片が含まれる。この状況において、「約」は、一方の端もしくは両端で、特別に言及された範囲および数個、少数個、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸残基までのより多数もしくはより少数の範囲を含む。例えば、この状況における約４０〜９０個のアミノ酸は、４０±数個、少数個、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸残基から９０±数個、少数個、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸残基、すなわち、４０−数個のアミノ酸から９０＋数個のアミノ酸という広い範囲から４０＋数個のアミノ酸から９０−数個のアミノ酸という狭い範囲を意味している。これに関して極めて好ましいのは、一方の端もしくは両端での言及した範囲±５個のアミノ酸である。特に極めて好ましいのは、一方の端もしくは両方の言及した端での言及した範囲±３個のアミノ酸である。さらに特別に極めて好ましいのは、付加もしくは欠失を伴わずに言及した範囲の一方もしくは両端で範囲±１個のアミノ酸である。これに関して最も極めて好ましいのは、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜１１５、１００〜１２５および１１０〜１３０アミノ酸長の断片である。
【００４３】
本発明のその他の断片は、ＣｙＰＡの部分を保持するエピトープを含む。好ましくは、エピトープは、ポリペプチドの免疫原性もしくは抗原性エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、全タンパク質が免疫原である場合に抗体反応を引き出すタンパク質の部分として定義される。他方、抗体が結合できるタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。
【００４４】
抗原性エピトープを保持している（すなわち、抗体が結合できるタンパク質の領域を含有する）断片の選択に関しては、タンパク質配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を通常誘出できることは、当分野において周知である。タンパク質反応性血清を誘発できるペプチドは、しばしばタンパク質の一次配列Ｚ−１に表されており、１セットの単純な化学規則によって特徴付けることができ、無傷タンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にもアミノもしくはカルボキシル末端にも限定されない。本発明の断片を保持している抗原性エピトープは、このためにＣｙＰＡに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を誘起するために有用である。
【００４５】
ＣｙＰＡの断片を保持する抗原性エピトープは、好ましくは少なくとも７、９の配列、またはＣｙＰＡのアミノ酸配列内に含まれた少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含有しており、連続もしくは立体配剤エピトープであってもよい。本発明の断片を保持するエピトープは、当業者には明白な任意の従来手段によって生成できる。
【００４６】
本発明のための機能的変異体は、模倣物をさらに含む。例えば安定化構造または生分解が減少されたものを提供する非ペプチドアナログのＣｙＰＡペプチドが企図される。ペプチド模倣物アナログは、１つまたは複数の残基を非ペプチド部分で置換することにより選択されたペプチドに基づいて調製できる。好ましくは、非ペプチド成分は、そのペプチドがその天然立体配座を保持する、または例えば生物活性のような好ましい立体配座を安定化することを可能にする。
【００４７】
広範囲の有用な技術を使用すると、ペプチドの正確な構造を解明することができる。これらの技術には、アミノ酸シーケンシング、Ｘ線結晶学、質量分析、核磁気共鳴分析、コンピュータ援用分子モデリング、ペプチドマッピング、およびそれらの組み合わせが含まれる。ペプチドの構造分析は、一般に、ペプチドのアミノ酸配列ならびにその原子成分の三次元位置検出を含む極めて大量のデータを提供する。これらの情報から、治療活性にとって必要な化学的官能基を有することがより安定性である、例えば生分解に対して低感受性である非ペプチドペプチド模倣物を設計できる。
【００４８】
ＣｙＰＡおよびその機能的変異体は、また別の有益な特性を付与する他の分子にコンジュゲートされて提供されてもよい。抽出および精製に役立つようにまた別のペプチド配列がＣｙＰＡに融合している融合タンパク質は、１つの例である。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列を除去できるように、融合タンパク質パートナーとＣｙＰＡまたはその機能的変異体との間のタンパク質分解性開裂部位を適宜含めてもよい。好ましくは、融合タンパク質は、神経刺激活性および／または受容体結合などのタンパク質の重要な活性を妨害しない。ＣｙＰＡを標的とするように適応されたペプチドまたは細胞種もしくは組織に対して同等である機能を含む融合タンパク質は、また別の例である。
【００４９】
ＣｙＰＡおよびその機能的変異体は、蛍光、放射性、もしくは酵素性標識（例えば、緑色蛍光タンパク質などの検出可能成分）などの成分に、またはアッセイ条件下でＣｙＰＡもしくはその機能的変異体の安定性を強化する分子にコンジュゲートされることもできる。
【００５０】
好ましくは、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通る輸送を促進する化合物にコンジュゲートされる。本明細書で使用するように、ＢＢＢを通る輸送を促進する化合物は、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体にコンジュゲートされたときに、非コンジュゲート化ペプチドと比較して脳へ送達されるペプチドの量を促進する化合物である。この化合物は、受容体媒介性輸送、および拡散を含む、任意の機序によってＢＢＢを越える輸送を誘導できる。
【００５１】
ＢＢＢを越える輸送を促進する化合物にはトランスフェリン受容体結合抗体；ジヒドロピリジンの所定のリポイド形；カチオン化アルブミンもしくはＭｅｔ−エンケファリンなどの担体ペプチド；カチオン化抗体；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）および０〜６個の二重結合を備えるＣ８〜Ｃ２４脂肪酸、グリセリル脂質、コレステロール、ポリアルギニン（例えば、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ）およびポリリシン（例えば、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ）などの脂肪酸が含まれる。本発明によって含まれる非分枝状の天然型脂肪酸には、Ｃ８：０（カプリル酸）、Ｃ１０：０（カプリン酸）、Ｃ１２：０（ラウリン酸）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸）、Ｃ１６：０（パルミチン酸）、Ｃ１６：１（パルミトオレイン酸）、Ｃ１６：２、Ｃ１８：０（ステアリン酸）、Ｃ１８：１（オレイン酸）、Ｃ１８：１〜７（バクセン酸）、Ｃ１８：２〜６（リノール酸）、Ｃ１８：３〜３（α−リノール酸）、Ｃ１８：３〜５（エレオステアリン酸）、Ｃ１８：３〜６（＆−リノール酸）、Ｃ１８：４〜３、Ｃ２０：１（ゴンド酸）、Ｃ２０：２〜６、Ｃ２０：３〜６（ジホモ−ｙ−リノレン酸）、Ｃ２０：４〜３、Ｃ２０：４〜６（アラキドン酸）、Ｃ２０：５〜３（エイコサペンタエン酸）、Ｃ２２：１（ドコセン酸）、Ｃ２２：４〜６（ドコサテトラエン酸）、Ｃ２２：５〜６（ドコサペンタエン酸）、Ｃ２２：５〜３（ドコサペンタエン酸）、Ｃ２２：６〜３（ドコサヘキサエン酸）およびＣ２４：１〜９（ネルボン酸）が含まれる。極めて好ましい非分枝状の天然型脂肪酸は、１４〜２２炭素原子を備える脂肪酸である。最も好ましい脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸である。そのような担体をペプチドにコンジュゲートするための他のＢＢＢ担体分子および方法は、当業者には知られている。そのようなＢＢＢ輸送分子は、ペプチドの１つまたは複数の末端にコンジュゲートされることができる。
【００５２】
ＣｙＰＡは、上記のような化合物に対し、二官能性リンカー、融合ポリペプチドの形成、ならびにビオチンもしくはストレプトアビジン／アビジンのペプチドへの結合および相補的分子のＢＢＢ輸送促進化合物への結合のいずれかによるビオチン／ストレプトアビジンもしくはビオチン／アビジン複合体の形成を含む周知の方法によってコンジュゲートされることができる。単離したペプチドおよびターゲティング物質または血液脳関門輸送化合物中での反応性基の性質に依存して、コンジュゲートは、上述した成分の官能基を同時もしくは連続的に相互に反応させるステップによって形成できる。例えば、輸送媒介性化合物は、例えば、その後に担体分子を形成するために誘導体化剤へ結合されるカルボキシル末端でスルフヒドリル基を用いて調製できる。次に、担体分子はそのスルフヒドリル基を介してペプチドへ結合させられる。多数の他の可能性のある結合は、当業者には知られている。
【００５３】
ＣｙＰＡおよびターゲティング物質もしくはＢＢＢ輸送促進化合物のコンジュゲートは、当業者には知られている結合化学を用いて、物質もしくは化合物の官能基およびペプチドに結合を、好ましくは共有結合を形成させることによって形成される。共有結合を形成するための極めて多数の当分野において認識された方法を使用できる。例えば、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９８５），ｐｐ．３２６−１１２０を参照されたい。
【００５４】
ＣｙＰＡがコンジュゲート化型において減少した活性を示す場合は、ＣｙＰＡとＢＢＢ輸送媒介性化合物との間の共有結合は（例えば、脳内に存在する酵素による酵素的開裂にとって）十分に不安定性であるように選択できるので、共有結合はＢＢＢを通るペプチド輸送後に開裂され、それにより脳内へ遊離ペプチドが遊離される。生物学的に不安定な共有結合、例えばイミノ結合、および「活性」エステルを使用すると、共有結合したペプチドがそのペプチド単独の活性に比較して減少した活性を示すことが見いだされるプロドラッグを形成することができる。
【００５５】
本明細書に記載したＣｙＰＡおよび機能的変異体は、部位特異的手段によって神経細胞に送達できると構想されている。細胞種特異的な送達は、ペプチドをターゲティング分子へ、例えば標的神経細胞へ選択的に結合する分子へコンジュゲートされるステップによって提供できる。周知であるターゲティング媒体の１つの例はリポソームである。リポソームは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社（メリーランド州ゲーサーズバーグ）から市販で入手できる。標的対象のリポソームを作製するためには多数の方法が公表されている。リポソームの送達は、細胞種特異的なターゲティング分子を含むリポソーム内に本発明の単離されたポリペプチドをカプセル封入するステップによって提供できる。特定細胞種へ化合物を標的化送達するための方法は、当業者には周知である。
【００５６】
結合反応に関与する可能性がある遊離アミノもしくはカルボキシル末端官能基の非存在下では、そのような基は、例えば合成もしくは特定部位突然変異誘発によってシステイン（反応性チオール基を含有する）をペプチドに導入するステップによって、導入できる。ジスルフィド結合は、例えば、ペプチドおよびＢＢＢ輸送媒介性化合物内のチオール基間に形成できる。または、共有結合は、ビスマレイミドヘキサン（チオール反応性マレイミド基を含有し、遊離チオールとの共有結合を形成する）などの二官能性架橋剤を用いて形成できる。さらに、代表的なホモおよびヘテロ二官能性架橋剤、チオール含有アミンおよび反応性基を備える他の分子のリストについては、Ｐｉｅｒｃｅ社のＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｖｏｌ．１も参照されたい。
【００５７】
一般に、本発明のコンジュゲート化ペプチドは、各コンジュゲート化ペプチド成分上の酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ、もしくはヒドラゾ基間でアミド、エステルもしくはイミノ結合を形成するための周知である方法を使用することによって調製できる。当業者には明白であるように、ペプチド（およびおそらくはＢＢＢ輸送媒介性化合物内）のアミノ酸側鎖内に存在する反応性官能基は、好ましくはペプチドを誘導体化剤および／または細胞外物質へ結合させる前に望ましくない副反応を最小限に抑えるために保護される。本明細書で使用する「保護基」は、官能基に結合しており、反応型にある官能基を露出させるためにそこから選択的に除去できる分子を意味する。好ましくは、保護基は官能基に可逆的に結合され、例えば、化学的もしくは他の開裂方法を用いてそこから除去できる。そこで、例えば、本発明のペプチドは、市販で入手できる側鎖がブロックされたアミノ酸（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ社（ケンタッキー州ルイスビル）からのＦＭＯＣ誘導体化アミノ酸）を用いて合成できる。または、ペプチド側鎖は、ペプチド合成後に、しかし共有結合反応の前に保護基と反応させることができる。この方法で、ペプチドのＢＢＢ輸送媒介性化合物もしくは細胞種特異的なターゲティング物質への結合反応にアミノ酸側鎖がほとんど影響しない本発明のコンジュゲート化ペプチドを調製できる。
【００５８】
神経刺激活性および／または受容体結合のために必要とされる本発明のペプチド内のアミノ酸は、より大きなペプチド内に組み込むことができ、それでもそれらの機能を維持できることは当然理解される。好ましくは、神経刺激活性のために必要とされるアミノ酸は、約５〜２０アミノ酸、およびより好ましくは約６〜１５アミノ酸の連続配列である。
【００５９】
好ましくは、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体は、ペプチドのアミノ酸を連結する結合がＬ−アミノ酸間で形成されたペプチド結合より容易には加水分解されない点で非加水分解性である。そのようなペプチドを提供するために、１つ以上のＤアミノ酸を含有するペプチドまたはアミノ酸を連結する１つ以上の非加水分解性ペプチド結合を含有するペプチドなどの非加水分解性ペプチドのライブラリーから単離されたペプチドを選択できる。
【００６０】
または、実施例に記載したアッセイシステムにおいて好ましい機能（例、神経保護作用）にとって最適であるペプチドを選択し、次にプロテアーゼによる加水分解の可能性を低下させるために必要に応じてそのようなペプチドを修飾することができる。例えば、タンパク質分解性開裂に対する感受性を決定するためには、ペプチドを標識して細胞抽出物もしくは精製されたプロテアーゼと一緒にインキュベートして、例えば、ペプチドおよびタンパク質分解性断片をシーケンシングするステップによって、どのペプチド結合がタンパク質分解に感受性であるのかを決定するために単離されてもよい。または、潜在的に感受性のペプチド結合は、単離されたペプチドのアミノ酸配列を１パネルのプロテアーゼの知られている開裂部位特異性と比較するステップによって同定できる。そのようなアッセイの結果に基づくと、タンパク質分解に感受性である個々のペプチド結合は、ペプチドのインビトロ合成によって非加水分解性ペプチド結合と置換することができる。
【００６１】
多数の非加水分解性ペプチド結合は、そのような結合を含有するペプチドを合成するための方法とともに、当分野において知られている。非加水分解性結合には、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ2］−ケトメチレンペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｏ］−ペプチド結合、および−ｐｓｉ［ＣＨ2Ｓ］−チオメチレンペプチド結合が含まれる。
【００６２】
同様に、ペプチドが機能する方法に影響を及ぼさない、またはペプチドが機能する方法に好都合な影響を及ぼす様々な側鎖基の付加を含む様々な変化を加えることができる。そのような変化は、荷電基の付加もしくは減少、アミノ酸の置換、結合には影響を及ぼさないが血液脳関門などを通る送達を促進する分子の全体的荷電特性には影響を及ぼす脂肪親和性成分の付加を含むことができる。そのような各変化に対しては、分子が本発明にしたがって機能するかどうかを試験するためにもはや通常の実験は必要とされない。所望の変化を加える、または所望のペプチドを選択し、それを実施例において詳述した方法で適用しさえすればよい。
【００６３】
１つのアプローチは、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体を例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの様々なポリマーに結合させることである。天然型アミノ酸と例えばＤ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの様々なコードされていない、もしくは修飾されたアミノ酸との置換もまたペプシドを修飾するために使用できる。また別のアプローチは、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートなどの二官能性架橋剤を使用することである。
【００６４】
＜スクリーニング方法、アゴニストおよびアンタゴニスト＞
本発明は、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体の結合を強化もしくは遮断する物質を同定する化合物を同定するためのアゴニスト、アンタゴニストおよびスクリーニング方法もさらに提供する。
【００６５】
例えば、神経細胞、または例えばＣＤ１４７などのＣｙＰＡに対する単離された受容体を含有する調製物は、アゴニストもしくはアンタゴニストであってもよい候補分子の不在下または存在下で、標識したＣｙＰＡと接触させることができる。候補分子が受容体自体に結合する能力は、標識したＣｙＰＡの減少した結合として反映される。効果を示さずに、すなわち神経保護を付与せずに結合する分子は、優れたアンタゴニストである可能性が極めて高い。結合して神経保護を付与する分子は、優れたアゴニストである可能性が高い。
【００６６】
潜在的アゴニストおよびアンタゴニストが神経細胞に及ぼす作用は、例えば神経細胞をアンタゴニストもしくはアゴニストの投与と同時に、または投与前に虚血へ曝露させるステップと、その作用を適切な対照と比較するステップとによって測定できる。
【００６７】
アンタゴニストについてのアッセイのまた別の例は、競合阻害アッセイのために適切な条件下で、ＣｙＰＡおよび潜在的アンタゴニストを神経細胞もしくはＣＤ１４７などの受容体を結合する競合アッセイである。ＣｙＰＡは、放射能などによって、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために神経細胞もしくは受容体へのその結合を正確に決定できるように、標識できる。
【００６８】
潜在的アンタゴニストには、ＣｙＰＡと同一部位で神経細胞に結合するので、したがってＣｙＰＡの結合、およびそれが付与する生物学的作用を防止する有機低分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体が含まれる。潜在的アンタゴニストは、神経細胞上のまた別の部位に結合する、そしてポリペプチド結合を排除することによってＣｙＰＡの作用を防止する密接に関連するタンパク質もしくは抗体などの有機低分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。
【００６９】
そこで本発明は、神経刺激活性について化合物をスクリーニングする方法であって、候補物質をＣＤ１４７と接触させるステップと結合および／または受容体シグナリングを評価するステップとを含む方法をさらに提供する。
【００７０】
本発明によってスクリーニングできる化合物には、ペプチド、抗体およびその断片、ならびに他の有機化合物（例、ペプチド模倣物）が含まれるがそれらに限定されない。スクリーニングによって見いだされた有用な化合物は、ＣｙＰＡによって誘発される活性を模倣でき（すなわち、アゴニスト）、したがって神経保護剤として有用である可能性がある、またはＣｙＰＡによって誘発される活性を阻害できる（すなわち、アンタゴニスト）。
【００７１】
コンピュータモデリングおよび探索テクノロジーは、結合できる、および／またはＣＤ１４７受容体シグナリングを誘導できる候補物質の同定、または既に同定された候補物質の改善を可能にする。そのような候補物質が同定されると、活性部位もしくは領域が同定される。そのような活性部位は、典型的には、ＣｙＰＡとＣＤ１４７自体との相互作用ドメインなどの、リガンド結合部位であってもよい。活性部位は、例えば、ＣｙＰＡとＣＤ１４７との複合体の研究からの方法を含む、当分野において知られている方法を用いて同定できる。この関連で、化学的もしくはＸ線結晶学的方法は、因子上で複合体を形成したリガンドが検出される場所を探すことによって活性部位を見いだすために使用できる。次に、活性部位の三次元幾何学的構造が決定される。これは、完全分子構造を決定できるＸ線結晶学を含む公知の方法によって実施できる。他方、固相もしくは液相ＮＭＲを使用すると所定の分子内距離を決定できる。
【００７２】
実験、モデリング、または組み合わせのいずれかによって活性部位の構造が決定されると、候補変調化合物は、分子構造に関する情報を伴った化合物のデータベースを検索することによって同定できる。そのような検索は、決定された活性部位構造に適合し、その活性部位を規定する基と相互作用する構造を有する化合物を探し出す。そのような検索は手動であってもよいが、好ましくはコンピューターの支援により行う。この検索から見いだされたこれらの化合物は、潜在的神経刺激活性化合物である。
【００７３】
または、これらの方法を使用すると、既に知られている神経刺激活性化合物から改良された神経刺激活性化合物を同定することができる。既知の化合物は修飾され、修飾の構造的作用は、新規組成物に適用された上述した実験的およびコンピュータモデリング法を用いて決定できる。変化した構造は、続いて改良された適合もしくは相互作用が生じるかどうかを決定するために化合物の活性部位構造と比較される。この方法で、側鎖基を変化させることなどによる組成物における体系的変化は、改良された特異性もしくは活性を備える修飾された神経刺激活性化合物を入手するために迅速に評価され得る。
【００７４】
ＣｙＰＡおよびＣＤ１４７の活性部位の同定に基づいて神経刺激活性化合物を同定するために有用である、さらなる実験的およびコンピュータモデリング法は、当業者には明白である。
【００７５】
ＣＤ１４７（ＣＤ１４７の細胞外ドメインを含むがそれらに限定されない）と相互作用する（例えばそれに結合する）ことができる化合物を同定するために、インビトロシステムを設計できる。これらの化合物は、例えば、野生型および／または変異体ＣＤ１４７の活性を変調する；ＣＤ１４７の生物学的機能を詳述する；正常なＣＤ１４７相互作用を崩壊させる化合物についてスクリーニングする際に有用なことがある；またはそれ自体でそのような相互作用を崩壊させることがある。または、脳卒中モデル動物を使用すると機能的変異体についてスクリーニングできる。
【００７６】
ＣＤ１４７に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、ＣＤ１４７と候補化合物との反応混合物を、これら２つの構成成分が相互作用して結合でき、その結果複合体を形成できるように十分な条件下で十分な時間にわたり調製するステップと、そこで前記反応混合物中で除去および／または検出できる複合体を形成するステップとを含む。使用されるＣＤ１４７種は、スクリーニングアッセイの目標に依存して変動してもよい。例えば、ＣｙＰＡのアゴニストが探し求められる場合は、全長ＣＤ１４７、または例えば分子から膜貫通もしくは細胞ドメインが欠失している可溶性の末端が短縮されたＣＤ１４７、細胞外ドメインに対応するペプチド、または本アッセイシステムにおいて長所（例えば、結果として生じる複合体の標識、単離など）を与えるタンパク質もしくはポリペプチドに融合したＣＤ１４７細胞外ドメインを含む融合タンパク質を利用できる。
【００７７】
これらのスクリーニングアッセイは、様々な方法で実施できる。例えば、そのようなアッセイを実施する１つの方法は、ＣＤ１４７またはその融合タンパク質または候補物質を固相上に固定するステップと、反応終了時に固相上に固定されたＣＤ１４７／候補複合体を検出するステップとを含む。そのような方法の１つの実施形態では、ＣＤ１４７は固相表面上に固定することができ、そして固定されていない試験化合物は、直接的または間接的のいずれかで標識できる。
【００７８】
実際には、マイクロタイタープレートを固相として便宜的に利用できる。固定された成分は、非共有結合または共有結合によって固定化できる。非共有結合は、固体表面をＣＤ１４７もしくは候補物質の溶液で単純に被覆して乾燥させるステップによって遂行できる。または、固定化されるべきタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体などの固定化された抗体は、そのタンパク質を固体表面に固定させるために使用できる。
【００７９】
アッセイを実施するためには、固定化されていない成分が固定された成分を含有する被覆表面に加えられる。反応が完了した後、未反応成分は、形成された任意の複合体が固体表面上に固定化されたままになるような条件下で（例えば、洗浄によって）除去される。固体表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で遂行できる。事前に固定化されていない成分が事前に標識される場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に固定化されていない成分が事前に標識されない場合は、例えば事前に固定化されていない成分に対して特異的な標識された抗体を用いて、表面上に固定された複合体を検出するために間接的標識を使用できる（抗体は、順に、直接的に標識できる、または標識した抗Ｉｇ抗体を用いて間接的に標識できる）。
【００８０】
または、反応は液相中で実施でき、例えば、溶液中で形成される任意の複合体を固定するためにＣＤ１４７もしくは候補物質に対して特異的な固定化された抗体、および固定された複合体を検出するために可能性のある複合体の他の成分に対して特異的な標識された抗体を用いて、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体が検出される。
【００８１】
細胞を使用したアッセイもまた、ＣＤ１４７と相互作用する化合物を同定するために使用できる。この目的で、ＣＤ１４７を発現する細胞系を使用できる。候補物質と、例えば宿主細胞によって発現されたＣＤ１４７の細胞外ドメインとの相互作用は、天然ＣｙＰＡとの比較もしくは競合によって決定できる。
【００８２】
ＣＤ１４７、ＣｙＰＡおよびその機能的変異体が神経保護を与えることにおける役割を仮定すると、脳卒中などの脳虚血を特徴とする状態；ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患、外傷および脊髄損傷に起因する任意の神経変性および神経細胞消失、ハンチントン病、外傷性脳障害、多発性硬化症、てんかん、虚血性視神経障害および網膜変性障害を特徴とする状態からの予後不良に素因がある可能性がある患者をスクリーニングすることもまた可能である。
【００８３】
そこで本発明は、（ｉ）患者におけるＣＤ１４７、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体のうちの少なくとも１つの存在を検出する、および／またはそのレベルを測定するステップと、（ｉｉ）（ｉ）からの結果を正常の指標である参照尺度と比較するステップとを含むスクリーニング法をさらに提供する。
【００８４】
＜神経変性を制御する方法＞
本発明は、神経変性を制御する方法であって、神経細胞を有効量のＣｙＰＡもしくはその機能的等価物と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００８５】
神経変性の制御は、神経変性の減少および除去を含む。そこで本発明は、部分もしくは完全神経保護剤としてのＣｙＰＡまたはその機能的等価物の使用を含む。
【００８６】
神経変性と関連する多数の障害があり、ＣｙＰＡおよびその機能的等価物はその活性により治療選択肢として有用なものになる。そこで本発明は、神経変性と関連する疾患もしくは障害を治療する方法であって、被験者に有効量のＣｙＰＡまたはその機能的等価物を投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【００８７】
この疾患もしくは障害は、脳卒中などの脳虚血を特徴とする状態；および脳卒中などの脳虚血を特徴とする他の状態；ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患、外傷および脊髄損傷に起因する任意の神経変性および神経細胞消失、ハンチントン病、外傷性脳障害、多発性硬化症、てんかん、虚血性視神経障害および網膜変性障害を特徴とする状態からなる群から選択されてもよい。
【００８８】
神経保護性ポリペプチドは、特定の状況に依存して、そして医療従事者によって適切に判断されて治療薬もしくは予防薬として投与されることができる。
【００８９】
このように本発明は、脳卒中などの脳虚血を特徴とする状態；ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患、外傷および脊髄損傷に起因する任意の神経変性および神経細胞消失、ハンチントン病、外傷性脳障害、多発性硬化症、てんかん、虚血性視神経障害および網膜変性障害を特徴とする状態からなる群から選択される疾患もしくは障害によって誘発されるような神経変性を減少もしくは防止するためのＣｙＰＡまたはその機能的変異体の予防的使用をさらに提供する。
【００９０】
投与された治療用組成物の作用は、標準的診断方法によって監視できる。例えば、脳卒中後の神経変性の治療においては、神経保護性ペプチドを含む組成物の投与はＣＡ１海馬神経細胞の変性を減少させることができる。治療後のＣＡ１海馬神経細胞の変性の減少は、ＭＲＩおよびＣＴスキャンを用いて評価できる。神経変性の他の指標を入手できる場合は、そのような指標は、ポリペプチド組成物を用いた治療後の神経変性を診断する際にも使用できる。
【００９１】
すなわち本発明は、ＣＡ１海馬神経細胞の変性を減少させる方法であって、前記神経細胞を有効量のＣｙＰＡまたはその機能的等価物と接触させるステップを含む方法をさらに提供する。
【００９２】
＜医薬組成物＞
本発明は、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体および医薬上許容される担体を含む医薬もしくは獣医薬組成物をさらに提供する。
【００９３】
本発明のタンパク質（ｐｒｏｔｅａｃｅｏｕｓ）薬の医薬組成物は、非経口投与のために、すなわち皮下、筋肉内もしくは静脈内投与に特に有用である。非経口投与用の組成物は、一般に、容認できる溶媒中、好ましくは水性溶媒中に溶解させた本発明の化合物の溶液もしくはそのカクテルを含む。様々な水性溶媒、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩液、０．３％グリシンなどを使用できる。これらの溶液は無菌であり、そして一般に微粒子状物質を含んでいない。これらの溶液は、従来型の、周知である滅菌技術によって滅菌することができる。本組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤などの生理学的状態に近付けるための必要に応じて医薬上許容される補助物質をさらに含有してもよい。
【００９４】
そのような医薬調製物中の本発明の化合物の濃度は、広範囲に、すなわち重量で約０．５％未満から、通常は少なくとも約１％から１５もしくは２０％まで変動してよく、選択された特定の投与様式によって、主として流体容積、粘度などに基づいて選択される。
【００９５】
そこで、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および５０ｍｇの本発明の化合物を含有するように調製できる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの無菌リンガー液、および１５０ｍｇの本発明の化合物を含有するように作製できる。非経口的に投与できる組成物を調製する実際的方法は周知である、または当業者には明白である。そして例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａの中でより詳細に記載されている。
【００９６】
本明細書に記載した化合物は、貯蔵するために凍結乾燥し、使用前に適切な溶媒中で復元することができる。この技術は従来型タンパク質を用いて有効であると証明されており、当分野において知られている凍結乾燥および復元技術を使用できる。
【００９７】
本機能的変異体が非タンパク質性である状況では、これは単独で、または医薬上許容される担体と組み合わせて投与できる。任意の調製物中の構成成分の比率は、化合物の溶解度および化学的性質、選択された投与経路および標準製薬実践によって決定される。例えば、それらはデンプン、乳糖、所定タイプの粘土などの賦形剤を含有する錠剤もしくはカプセル剤の形状で経口投与できる。有効成分が糖およびコーンシロップ、フレーバー剤および色素と混合され、続いて固体形に圧縮するのに適するように十分に脱水されたトローチ剤もしくはロゼンジ剤の形状で舌下投与されてもよい。それらは、非経口、すなわち筋肉内、静脈内もしくは皮下注射できる溶液の形状で経口投与できる。非経口投与するためには、それらは他の溶質、例えば溶液を等張性にするために十分な食塩液もしくは糖を含有する無菌溶液の形状で使用できる。
【００９８】
医師もしくは獣医は、最も適合する本治療物質の用量を決定するが、その用量は投与の形態、選択された特定化合物に伴って変動し、さらに、それは治療下の特定被験者に伴って変動する。医師は、一般に本化合物の最適用量より実質的に少ない低用量で治療を開始し、その状況下で最適作用に達するまで少しずつ用量を増加しようと考える。一般には、本組成物が経口投与される場合は、より低用量が非経口投与された場合と同一作用を生成するためにはより高用量の活性物質が必要とされることが見いだされる。本化合物は他のセロトニン作動薬と同一方法で有用であり、用量レベルは、一般に他のこれらの他の治療薬が使用される場合と同様規模にある。治療用量は、一般に１日当たり１〜１０ｍｇ以上であるが、これは数種の相違する用量単位で投与できる。０．５〜１０ｍｇの活性物質を含有する錠剤は、特に有用である。
【００９９】
上述したように、そして被験者の状態に依存して、本発明の組成物は、予防的および／または治療的治療のために投与できる。治療適用では、組成物は、神経変性と関連する、および／または虚血を含む事象に罹患している被験者に、前記事象の神経細胞の関わり合いを克服するために十分な量で投与される。予防適用では、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体を含有する組成物は、前記事象中に前記被験者が被った傷害を減少させるために虚血性事象などの神経細胞変性と関連する状態に素因のある被験者に投与される。
【０１００】
本組成物の一回もしくは複数回投与は、治療を行う医師もしくは獣医によって選択される用量レベルおよびパターンを用いて実施できる。任意の事象では、本発明の組成物は、前記被験者を効果的に治療するために十分な量の本発明の化合物を提供するはずである。
【０１０１】
用語「医薬上許容される」は、有効成分の生物活性の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。担体の特性は、投与経路に依存する。医薬上許容される担体には、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、および当分野において周知である他の物質が含まれる。
【０１０２】
その他の送達系は、持続放出型、遅延放出型もしくは徐放型送達系を含むことができる。そのような系は、本発明の活性化合物の反復投与を回避することができ、被験者および医師にとっての便宜性を増加させる。多数のタイプの放出送達系を利用することができ、当業者には知られている。それらは、ポリ乳酸およびポリグリコール酸などのポリマーを基剤とする系；コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸などのステロール類またはモノ、ジおよびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマー系；親水性ゲル送達系；シラスティック系；ペプチドを基剤とする系；ワックスコーティング、従来型結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤、部分融合インプラントなどが含まれる。さらに、ポンプに基づくハードウエア送達系を使用することができ、それらの一部は植え込みのために適応する。
【０１０３】
長時間持続性放出型インプラントもまた使用できる。本明細書で使用する「長時間」放出は、少なくとも３０日間、および好ましくは６０日間にわたり治療レベルの有効成分を送達するように構築されて配置されることを意味する。長時間持続放出型インプラントは当業者に周知であり、上述した放出系の一部が含まれる。そのようなインプラントは、再発性脳虚血を特徴とする状態を治療する際に、特に有用な可能性があり、それにより本発明の局所的な高用量を作用させる。
【０１０４】
本発明は、脳卒中などの脳虚血；ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、運動神経細胞疾患、外傷および脊髄損傷に起因する任意の神経変性および神経細胞消失、ハンチントン病、外傷性脳障害、多発性硬化症、てんかん、虚血性視神経障害および網膜変性障害などの他の状態を特徴とする神経変性または疾患もしくは障害を治療もしくは予防するための薬剤を調製するためのＣｙＰＡまたはその機能的変異体の使用をさらに提供する。
【０１０５】
＜抗体＞
本発明は、本明細書に開示したペプチドのエピトープに向けられたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をさらに提供する。免疫学的目的に特に重要なペプチドの領域は、タンパク質のリガンド結合ドメインと結び付いた領域である。これらの領域に向けられた抗体は、それらがタンパク質−リガンド相互作用に及ぼす作用のために、診断および治療用途において特に有用である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成方法は、当業者には周知である。
【０１０６】
本発明は、その結合を遮断するために本明細書に記載したポリペプチドに対して向けられた有効量の抗体もしくはその断片を含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１０７】
本発明のポリペプチドもしくは少なくとも１つのエピトープを含むそれらの断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体を生成するために使用できる。ポリクローナル抗体が所望である場合は、選択された哺乳動物（例、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、本発明のポリペプチド、もしくはその断片、または突然変異した結合タンパク質を用いて免疫される。免疫された動物由来の血清は、公知の方法によって採取および処理される。ポリクローナル抗体を含有する血清が使用される場合は、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティクロマトグラフィもしくは他の公知の方法によって精製できる。
【０１０８】
本発明のポリペプチド、およびそれらの断片に対するモノクローナル抗体もまた、当業者であれば容易に生成することができる。ハイブリドーマ技術を用いることによってモノクローナル抗体を作製するための一般的方法は周知である。不死抗体生成細胞系は細胞融合によって、そしてさらに発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接的形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技術によって作製することができる。
【０１０９】
当該のタンパク質、またはその断片に対して生成されたモノクローナル抗体のパネルは、様々な特性について、すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。または、当該のモノクローナル抗体をコードする遺伝子は、当分野において知られているＰＣＲ技術によってハイブリドーマから単離され、適切なベクター内にクローニングされ、発現されることができる。モノクローナル抗体は、イムノアフィニティ技術を用いて、個々のタンパク質の精製に有用である。本発明の抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルのいずれであっても、イムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどにおいて試薬として使用できるという点で追加の有用性を有する。
【０１１０】
＜ポリヌクレオチド＞
本発明は、ＣｙＰＡまたはその機能的変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態、または例えば、クローニングによって入手もしくは合成により生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態にあってもよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。
【０１１２】
「単離された」ポリヌクレオチドは、その天然環境から取り除かれたポリヌクレオチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡであることが意図されている。例えば、ベクター内に含有される組換えＤＮＡ分子は、本発明のために単離されていると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のまた別の例には、異種宿主細胞に維持された組換えＤＮＡ分子もしくは溶液中の精製された（部分的もしくは実質的）ＤＮＡ分子が含まれる。
【０１１３】
単離されたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子のインビボもしくはインビトロＲＮＡ転写産物が含まれる。本発明による単離されたポリヌクレオチドには、さらに合成生成されたそのような分子が含まれる。
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチドには、本明細書に明示的に記載されたものとは相違するが、遺伝子コードの縮重のために同一ポリペプチドもさらにコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。当然ながら、遺伝子コードは当分野において周知である。そこで、本発明のポリヌクレオチドのそのような縮重変異体を生成することは当業者にとっては常套手段である。
【０１１５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの断片をさらに提供する。好ましい断片は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０もしくは７０連続ヌクレオチドを含む。その他の好ましい断片は、全長ポリペプチドまたはより大きなポリペプチドの部分を有するエピトープの少なくとも１つの重要な特性を備えるポリペプチドをコードする。断片を決定する方法は、当業者には容易に明白になり、以下でより詳細に例示する。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明によって、多種多様な用途、特にＣｙＰＡの化学的および生物学的特性を利用する用途のために使用できる。
【０１１７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部分と選択的にハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。本明細書で核酸を記載するために使用する用語「選択的にハイブリダイズする」は、少なくとも中等度のストリンジェンシー条件下で核酸に偶発的かつ無作為にハイブリダイズすることを除外する。そこで、ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするステップは、少なくとも中等度のストリンジェンシー条件下およびより好ましくは高いストリンジェンシー条件下で好ましくはハイブリダイズする。ハイブリダイズしているポリヌクレオチドは、例えば、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＣｙＰＡをコードするポリヌクレオチドの存在を検出するためのプローブもしくはプライマーとして使用できる。
【０１１８】
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形を温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子に対してアニーリングできる場合は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡなどの他の核酸分子へ「ハイブリダイズ可能」である。温度およびイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。同種核酸についての予備スクリーニングのためには、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、０．２５％のミルク、およびホルムアミドなし；または３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳを伴う５５℃のＴmに相当する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用できる。中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、５×もしくは６×ＳＣＣとともに４０％のホルムアミドを伴うより高いＴmに相当する。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、例えば、５×もしくは６×ＳＣＣとともに５０％のホルムアミドを伴う最高Ｔmに相当する。
【０１１９】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズさせるために適切なストリンジェンシーは、核酸の長さ、相補性の程度、当分野において周知である変量に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性および相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴmの数値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴmに対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に減少する。長さが１００ヌクレオチドより長いハイブリッドについては、Ｔmを計算するための方程式が引き出されており、当業者には知られている。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションのためには、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸についての最小長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、最も好ましくは、その長さは少なくとも約２０、３０もしくは４０〜７０ヌクレオチドである。
【０１２０】
当然ながら、ポリＡ配列（例えば、本発明のポリヌクレオチドの３’末端ポリ（Ａ）尾部など）、またはＴ（またはＵ）残基の相補鎖にしかハイブリダイズしないポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドはポリ（Ａ）鎖もしくはその相補鎖（例えば、特に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子にハイブリダイズするから、本発明の選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては含まれない。
【０１２１】
本明細書で教示した核酸配列を用いてクロスハイブリダイゼーションに依拠すると、当業者は、本発明のポリペプチドをコードする他の種においてポリヌクレオチドを同定することができる。プライマーとして使用された場合は、本発明は、所望の領域を増幅できるように、様々な領域の標的核酸と選択的にハイブリダイズする少なくとも２つの核酸を含む組成物を提供する。プローブもしくはプライマーの長さに依存して、標的領域は７０％相補性塩基と完全相補性との範囲に及んでよい。
【０１２２】
本明細書に記載した選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドもしくはそのより特別な部分は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ハイブリダイゼーションなどの方法によって、サンプル中で本発明の核酸を検出するために使用できる。または、これらの配列は、抗原性タンパク質もしくはタンパク質部分、または活性タンパク質もしくはタンパク質部分を生成するために利用できる。
【０１２３】
さらに、本明細書に記載した選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの部分は、他の生物における同種ポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズさせるために選択できる。これらの選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドのホモログのクローニングのための関連配列を同時に検出するために使用できる。
【０１２４】
上記で指摘したように、本発明のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドには、ポリペプチドのアミノ酸配列を単独でコードするポリヌクレオチドが含まれるが、それらに限定されない。むしろ本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチドのためのコーディング配列および追加の配列、例えばリーダー配列もしくは分泌配列、例えばプレタンパク質配列、またはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質配列をコードする配列；追加の非コーディング配列と一緒に、イントロンおよび非コーディング５’および３’配列、例えば転写、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含むｍＲＮＡプロセッシング、例えばリボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性においてある役割を果たす転写された非翻訳配列などを含むがそれらに限定されない追加の非コーディング配列を含む、上記の追加のコーディング配列を含む、もしくは含まないポリペプチドのコーディング配列；追加のアミノ酸、例えば追加の官能基を提供するアミノ酸をコードする追加のコーディング配列を含んでもよい。本発明によるポリヌクレオチドには、さらにまたＮ末端メチオニンが欠如している全タンパク質などのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０１２５】
そこで、本発明のポリヌクレオチドには、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列などの、マーカー配列と融合された本発明のポリペプチドをコードする配列を備えるポリヌクレオチドが含まれる。本発明のこの態様の所定の好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）内で提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは市販で入手できる。「ＨＡ」タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のために有用なもう一つのペプチドである。
【０１２６】
本発明は、本発明のポリペプチドの部分、アナログもしくは誘導体をコードする本発明の核酸分子の変異体にさらに関する。変異体は、天然対立遺伝子変異体などのように自然に発生することがある。「対立遺伝子変異体」は、生物の染色体上の所与の遺伝子座位を占める遺伝子の数種の他の形態の１つを意味する。非天然型変異体は、当業者に公知の突然変異誘発技術を用いて生成できる。
【０１２７】
そのような変異体には、１つ以上のヌクレオチドを含んでもよいヌクレオチド置換、欠失または付加によって生成される変異体が含まれる。これらの変異体は、コーディング領域、非コーディング領域、またはその両方で変化させられてもよい。コーディング領域内の変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生成することがある。これらの中で特別に好ましいのは、コードされたポリペプチドの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である。これに関連してさらに特に好ましいのは、保存的置換である。
【０１２８】
本発明は、配列番号２または４における完全アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０もしくは９０％同一である、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１２９】
本発明のためには、参照配列と９５％同一であるヌクレオチド配列は、それが参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドにつき５つまでの点突然変異を含む可能性があることを除いて参照配列と同一である。言い換えると、参照ヌクレオチド酸配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを入手するためには、前記参照配列内の５％までのヌクレオチドを欠失もしくは別のヌクレオチドと置換されてもよく、または前記参照配列内の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが前記参照配列内に挿入されてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の３’または５’末端位置で発生してもよく、または、これらの末端位置の間、個別に参照配列内のヌクレオチド間もしくは参照配列内の１つ以上の隣接基内のどちらかに散在してもよい。
【０１３０】
実際的問題として、任意の特定核酸分子が例えば図１もしくは２におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも６０、７０、８０、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、ワイオミング州マディソン、５３７１１）などの知られているコンピュータプログラムを用いた従来法で決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最も相同性の高いセグメントを見いだすために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用する。特定配列が、例えば本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔもしくは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合は、パラメータは、当然ながら、同一性率が前記参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして相同性におけるギャップが前記参照配列内のヌクレオチドの総数の５％まで許容されるように設定される。
【０１３１】
当然ながら、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、図１もしくは２におけるポリペプチドの核酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一である配列を有する極めて多数の核酸分子が、本発明の範囲内のポリペプチドをコードするであろうことを直ちに認識できる。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体は全て同一ポリペプチドをコードするので、これは上述した比較を実施しない場合でさえ当業者には明白である。
【０１３２】
当分野では、縮重変異体ではないそのような核酸分子については、合理的数がさらにＭＬ結合活性を有するポリペプチドもコードすることもさらに認識される。これは、当業者であればタンパク質の機能に有意に影響を及ぼす可能性が低い、もしくは可能性がないどちらかであるアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸と置換する）を十分に知っているためである。
【０１３３】
＜遺伝子／細胞療法＞
ＣｙＰＡまたはその機能的変異体は、当該ポリペプチドを発現および分泌させるために、本明細書に記載したような方法を使用して、遺伝子組換えされている所定の細胞を移植することによって送達できる。そのような細胞は動物またはヒト細胞であってよく、自家、異種、または外因性であってもよい。任意で、細胞は不死化されてもよい。免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞は周囲組織の浸潤を回避するためにカプセル封入することができる。カプセル封入材料は、典型的には、タンパク質産物の遊離を可能にするが患者の免疫系または周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の、半透性ポリマー封入物もしくは膜である。
【０１３４】
本発明の追加の実施形態は、治療用ポリペプチドのインビトロ生成ならびに遺伝子療法または細胞療法による治療用ポリペプチドの生成および送達の両方のための細胞および方法（例えば、同種組換えおよび／または他の組換え生成法）に関する。同種およびその他の組換え法は、本明細書に記載したポリペプチドをコードする通常は転写的にサイレントな遺伝子を含有する細胞を修飾するために使用することができ、そしてこれにより治療的に有効な量のポリペプチドを発現する細胞を生成する。
【０１３５】
同種組換えは、最初は転写的に活性な遺伝子において突然変異を誘発また修正するために遺伝子をターゲティングするために開発された技術である。基本技術は、哺乳動物ゲノムの特定領域内に特定突然変異を導入するため、または欠陥遺伝子内の特定突然変異を修正するための方法として開発された。同種組換えを通して、ゲノム内に挿入すべき所与のＤＮＡ配列は、それをターゲティングＤＮＡに付着させることによって当該の遺伝子の特定領域に方向付けることができる。ターゲティングＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（同種）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定領域に対して相補的であるターゲティングＤＮＡの断片は、ＤＮＡ複製プロセス中に親鎖と接触させられる。
【０１３６】
ハイブリダイズするため、そしてこのために共有同種領域を通して内因性ＤＮＡの他の断片と組み換えるために細胞内に挿入されていることがＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖が突然変異もしくは相違する配列または追加のヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドに付着させられる場合は、これはさらに組換えの結果として新規に合成された鎖内に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新規な配列がテンプレートとして機能することは可能である。そこで、転写されたＤＮＡはゲノム内に組み込まれる。ターゲティングＤＮＡのこれらの断片に付着しているのは、本明細書に記載のポリペプチド、例えばフランキング配列の発現と相互作用する、または発現を制御する可能性があるＤＮＡの領域である。例えば、プロモータ／エンハンサエレメント、サプレッサもしくは外因性転写調節エレメントは、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすための十分に近位および方向で企図された宿主細胞のゲノム内に挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム内に存在するＤＮＡの一部分を制御する。そこで、本発明の所望のポリペプチドの発現は、ポリペプチド自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろそのポリペプチドをコードする遺伝子の転写のために認識可能なシグナルを内因性遺伝子配列に供給するＤＮＡ調節セグメントと結合した、ターゲティングＤＮＡ（当該の内因性遺伝子を備える相同性の領域を含有する）の使用によって達成できる。
【０１３７】
代表的な方法では、細胞内のＣｙＰＡまたはその機能的変異体をコードする遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞性遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エクソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、事前に選択された部位での細胞ゲノム内への同種組換えを介して変化させられる。これらの構成成分は、これが実質的に、（その中でＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エクソンおよびスプライスドナー部位はその内因性遺伝子と機能的に連結している）新規の転写単位の産生を生じさせるような方法で染色体（ゲノム）ＤＮＡ内に導入される。これらの構成成分を染色体ＤＮＡ内に導入した結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化させられる。
【０１３８】
本明細書に記載の変化した遺伝子発現は、通常は細胞内でサイレントである（発現していない）遺伝子を活性化する（または発現を誘発する）ステップ、ならびに細胞内で生理学的に有意なレベルでは発現しない遺伝子の発現を増加するステップを含む。これらの実施形態は、細胞内で発生する調節もしくは誘導のパターンとは相違するように調節もしくは誘導のパターンを変化するステップと、そして細胞内で発現する遺伝子の発現を減少する（排除するステップを含む）ステップとをさらに含む。
【０１３９】
細胞の内因性遺伝子から本明細書に記載したポリペプチドの生成を増加させる、もしくは誘導するために同種組換えを使用できる１つの方法は、まず最初に同種組換えを使用して部位特異的組換え系由来の組換え配列（例、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７，１９９４；ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，１９９３を参照されたい）を細胞の内因性ゲノムポリペプチドコーディング領域の上流（すなわち、５’側）に配置するステップである。ゲノムポリペプチドコーディング領域のすぐ上流に配置された部位に同種である組換え部位を含有するプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と一緒に修飾された細胞系内に導入される。このリコンビナーゼ酵素は、プラスミドの組換え部位を介して、細胞系内のゲノムポリペプチドコーディング領域のすぐ上流に配置された組換え部位内にプラスミドが統合されることを誘発する（Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；ａｎｄ  Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写を増加するために知られている任意のフランキング配列（例、エンハンサ／プロモータ、イントロンもしくは翻訳エンハンサ）は、このプラスミド内で適正に配置された場合は、細胞の内因性遺伝子からの新規もしくは増加したポリペプチド生成を生じさせる新規もしくは修正された転写単位を作製できるような方法で統合される。
【０１４０】
部位特異的組換え配列が細胞の内因性ゲノムポリペプチドコーディング領域のすぐ上流に配置されている細胞系を使用するためのさらなる別の方法は、その細胞系のゲノム内のいずれかの場所に第２組換え部位を導入するために同種組換えを使用する方法である。適切なリコンビナーゼ酵素は、次に２組換え部位細胞系内に導入され、その細胞の内因性遺伝子由来の新規もしくは増加したポリペプチド生成を生じさせる新規もしくは修飾された転写単位を作製する組換え事象（欠失、逆転もしくは転置）を引き起こす（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ，１９９４  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ，１９９３）。
【０１４１】
細胞の内因性遺伝子由来のポリペプチドの発現を増加または誘発するためのさらなる別のアプローチは、１つ以上の遺伝子（例、転写因子）の発現を増加もしくは誘発するステップおよび／または前記細胞の内因性遺伝子由来の新規もしくは増加したポリペプチド生成を生じさせる方法で１つまたは複数の遺伝子（例、転写リプレッサ）の発現を減少させるステップを含む。本方法は、前記細胞の内因性遺伝子由来の新規もしくは増加したポリペプチド生成が結果として生じるように、細胞内への非天然型ポリペプチド（例、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）の導入を含む。
【０１４２】
本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。所定の実施形態では、代表的なＤＮＡ構築物は、（ａ）１つまたは複数のターゲティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソンおよび（ｄ）非対称スプライス−ドナー部位を含む。ＤＮＡ構築物中のターゲティング配列は、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性標的遺伝子の配列へ機能的に連結しているように細胞内の標的遺伝子内へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の統合を指示する。また別の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、（ａ）１つまたは複数のターゲティング配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エクソン、（ｄ）スプライス−ドナー部位、（ｅ）イントロンおよび（ｆ）スプライスアクセプター部位を含むが、このとき前記ターゲティング配列は、エレメント（ｂ）〜（ｆ）が内因性遺伝子へ機能的に連結しているようにエレメント（ａ）〜（ｆ）の統合を指示する。ターゲティング配列は、それとともに同種組換えが発生しなければならない細胞染色体ＤＮＡ内の事前に選択された部位と同種である。前記構築物中では、エクソンは、一般に調節配列の３’側であり、スプライス−ドナー部位はエクソンの３’側である。
【０１４３】
例えば本明細書に提示したポリペプチドの核酸配列などの特定遺伝子の配列が知られている場合は、遺伝子の選択された領域に相補的であるＤＮＡの断片は合成できる、またはさもなければ当該領域と境を接している特定認識部位で天然ＤＮＡの適切な制限切断によるなどによって入手できる。この断片は、細胞内に挿入されるとターゲティング配列として機能するので、ゲノム内の同種領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製中に発生する場合は、ＤＮＡのこの断片、およびそれに付着した任意の追加の配列は、Ｏｋａｚａｋｉ断片として機能し、新規に合成されたＤＮＡの娘鎖内に組み込まれる。このため本発明は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドはターゲティング配列として使用できる。
【０１４４】
ポリペプチド細胞療法、例えば本明細書に記載したポリペプチドを生成する細胞の移植もまた企図されている。本実施形態は、合成できる細胞を移植するステップと生物活性型のポリペプチドを分泌するステップとを含む。そのようなポリペプチド生成細胞は、ポリペプチドの天然の産生細胞であってもよいし、またはそれがポリペプチドを生成する能力が所望のポリペプチドをコードする遺伝子を用いた、もしくは前記ポリペプチドの発現を強化する遺伝子を用いた形質転換によって強化されている組換え細胞であってもよい。そのような修飾は、遺伝子を送達するため、ならびにその発現および分泌を促進するために適合するベクターによって遂行できる。異種のポリペプチドの投与に伴って発生するような、ポリペプチドが投与されている患者における潜在的免疫学的応答を最小限に抑えるために、ポリペプチドを生成する天然細胞はヒト起源であり、ヒトポリペプチドを生成することが好ましい。同様に、ポリペプチドを生成する組換え細胞はヒトポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターを用いて形質転換されることが好ましい。
【０１４５】
移植された細胞は、周囲組織の浸潤を回避するためにカプセル封入されてもよい。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、ポリペプチドの遊離を可能にするが、患者の免疫系もしくは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜に入れて患者に移植することができる。または、エクスビボでポリペプチドを生成するために形質転換された患者の固有細胞は、そのようなカプセル封入を行わずに患者内へ直接的に植え込むことができる。
【０１４６】
生きている細胞をカプセル封入するための技術は当分野において知られており、そしてカプセル封入された細胞の調製および患者へのそれらの植え込みは常套手段として遂行できる。例えば、Ｂａｅｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物活性分子の効果的送達のために遺伝子組換えされた細胞を含有する膜カプセルについて記載している。カプセルは生体適合性であり、容易に回収可能である。カプセルは、哺乳動物宿主内に移植されたときにインビボでダウンレギュレートされないプロモータに機能的に連結した生物活性分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル封入する。本器具は、レシピエント内の特定部位へ生きている細胞由来の分子の送達を提供する。生きている細胞をカプセル封入するためのシステムは、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７に記載されている。例えば、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５５；Ｗｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−３２９（１９９１），Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５（１９９１）；ａｎｄ  Ｔｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３（１９９２）を参照されたい。
【０１４７】
ポリペプチドのインビボおよびインビトロ遺伝子療法送達は、本発明の一部でもある。遺伝子療法技術の１つの例は、「遺伝子療法ＤＮＡ構築物」を形成するために構成性または誘導性プロモータへ機能的に連結してもよい本明細書に記載したポリペプチドをコードする遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用する方法である。このプロモータは、その中に構築物が挿入される細胞もしくは組織種内で活性であることを前提に、内因性遺伝子に対して同種または異種であってもよい。遺伝子療法ＤＮＡ構築物の他の構成成分には、任意で、部位特異的統合のために設計されたＤＮＡ分子（例、同種組換えのために有用な内因性配列）；組織特異的プロモータ、エンハンサもしくはサイレンサ；親細胞に比較して選択的長所を提供できるＤＮＡ分子；形質転換細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子；ネガティブ選択系、細胞特異的系；細胞特異的結合剤（例えば、細胞ターゲティングのため）；細胞特異的内在化因子；およびベクターによる発現を強化するための転写因子、ならびにベクター製造を可能にするための因子が含まれてもよい。
【０１４８】
遺伝子療法ＤＮＡ構築物は、次にウイルスもしくは非ウイルスベクターを用いて細胞内へ（エクスビボもしくはインビボのいずれかで）導入できる。レトロウイルスベクターなどの所定のベクターは、細胞の染色体ＤＮＡへＤＮＡ構築物を送達することができ、前記遺伝子を染色体ＤＮＡ内に統合できる。その他のベクターはエピソームとして機能し、そして遺伝子療法ＤＮＡ構築物は細胞質内に保持される。
【０１４９】
さらにまた別の実施形態では、標的細胞内での遺伝子の制御された発現のために調節エレメントを含めることができる。そのようなエレメントは、適切なエフェクタに応答して作動される。この方法で、治療用ポリペプチドを所望の場合に発現することができる。１つの従来型制御手段は、低分子結合ドメインならびにＤＮＡ結合タンパク質もしくは転写活性化タンパク質などの生物学的プロセスを開始できるドメインを含有するキメラタンパク質を二量体化するために使用される低分子二量体化剤もしくはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＷＯ９６４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６）；ＷＯ９７３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）およびＷＯ９７３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７に記載）の使用を含む。これらのタンパク質の二量体化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用できる。
【０１５０】
また別の調節技術は、細胞内の当該の遺伝子から発現したタンパク質を凝集物またはクラスターとして保存する方法を使用する。当該の遺伝子は、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を結果として生じさせる条件付き凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現する。保存されたタンパク質は、細胞の内部では安定性かつ不活性である。しかしこれらのタンパク質は、条件付き凝集ドメインを除去し、それにより結果としてタンパク質が細胞から分泌されるように凝集物もしくはクラスターを特にバラバラに破壊する薬物（例、低分子リガンド）を投与することによって遊離させることができる。
【０１５１】
また別の制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン制御性転写活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結した突然変異ｔｅｔリプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節転写活性化タンパク質を生じさせる突然変異したｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわちテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレータに結合する）を含む。
【０１５２】
インビボ遺伝子療法は、核酸分子の局所注射を介してポリペプチドをコードする遺伝子を細胞内へ導入するステップ、または他の適切なウイルスもしくは非−非ウイルス送達ベクターによって遂行できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は標的細胞へ送達するためにアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）内に含まれてもよい（例、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際特許公開ＷＯ９５／３４６７０；および国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的には機能的プロモータに機能的に連結されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列とポリアデニル化配列をフランキングするＡＡＶ逆方向末端反復を含有する。
【０１５３】
また別の適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、および乳頭種ウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介性遺伝子導入系について記載している。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療用タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されているヒト細胞の送達によって患者に治療用タンパク質を提供するためのプロセスの例を提供している。遺伝子療法技術を実践するための追加の方法および材料は、アデノウイルスベクターを含む米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターを含む米国特許第５，６７２，５１０号；およびサイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。
【０１５４】
非ウイルス送達方法には、リポソーム媒介性導入法、裸ＤＮＡ送達法（直接注射）、受容体媒介性導入法（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈降法、および微粒子衝撃法（例、遺伝子銃）が含まれるが、それらに限定されない。遺伝子療法および方法は、さらに誘導性プロモータ、組織特異的エンハンサ−プロモータ、部位特異的統合のために設計されたＤＮＡ配列、親細胞に比した選択的長所を提供できるＤＮＡ配列、形質転換細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全性手段）、細胞特異的結合剤（細胞ターゲティングのため）、細胞特異的内在化因子、および発現を強化するための転写因子ならびにベクター製造方法をさらに含むことができる。遺伝子療法技術を実践するためのそのような追加の方法および材料は、エレクトロポレーション技術を含む米国特許第４，９７０，１５４号；核リガンドを含むＷＯ９６／４０９５８；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載している米国特許第５，６７９，５５９号；リポソーム担体を含む米国特許第５，６７６，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；および生物活性粒子が、それにより粒子が細胞表面に浸透して細胞の内部に組み込まれるようになる速度で細胞へ推進させられる米国特許第４，９４５，０５０号に記載されている。
【０１５５】
本発明による遺伝子療法または細胞療法は、同一または相違する細胞中の１つ以上の追加のポリペプチドの送達をさらに含むことができることもまた企図されている。そのような細胞は患者に個別に導入できる、または細胞は上述したカプセル封入膜などの単一の移植デバイス内に含有されてもよい、または細胞はウイルスベクターによって個別に修飾されてもよい。
【０１５６】
遺伝子療法を介しての細胞内での内因性ポリペプチド発現を増加させるための手段は、１つ以上のエンハンサエレメントをポリペプチドプロモータ内に挿入する方法であるが、このとき前記エンハンサエレメントは前記遺伝子の転写活性を増加させるために機能できる。使用されるエンハンサエレメントは、その中で遺伝子を活性化したいと望む組織に基づいて選択され、組織内でプロモータ活性化を付与することが知られているエンハンサエレメントが選択される。ここで、付加されるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いて、ポリペプチドプロモータを含有するＤＮＡの断片内に挿入（および任意で、ベクターおよび／または５’および／または３’フランキング配列などの中に挿入）することができる。「同種組換え構築物」として知られるこの構築物は、次にエクスビボもしくはインビボのいずれかで所望の細胞内へ導入することができる。
【０１５７】
遺伝子療法は、さらにまた内因性プロモータのヌクレオチド配列を修飾するステップによってポリペプチド発現を減少させるためにも使用できる。そのような修飾は、典型的には同種組換え法によって遂行される。例えば、不活性化のために選択された遺伝子のプロモータの全部もしくは部分を含有するＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモータの断片を除去および／または置換するために遺伝子組換えすることができる。例えば、前記プロモータのＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子の結合部位は、標準分子生物学技術を用いて欠失させることができ、そのような欠失は、プロモータ活性を阻害してそれにより対応する遺伝子の転写を抑制できる。前記プロモータ内のＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位の欠失は、その中でＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位の１つまたは複数のヌクレオチドが１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して突然変異させられているポリペプチドプロモータの全部もしくは関連部分（調節されるべきポリペプチド遺伝子と同一種もしくは関連種由来）を含むＤＮＡ構築物を生成するステップによって遂行され得る。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は減少した活性を有する、または完全に不活性にさせられる。この構築物は、典型的には、修飾されているプロモータセグメントに隣接する天然（内因性）５’および３’ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含有する。この構築物は、直接的に、または本明細書に記載したようにウイルスベクターを介して適切な細胞内へ（エクスビボもしくはインビボのいずれかで）導入できる。典型的には、細胞のゲノムＤＮＡ内への構築物の統合は、同種組換えを介してであるが、プロモータ構築物中の５’および３’ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを介して修飾されたプロモータ領域を統合するのに役立つように機能できる。
【０１５８】
＜ベクター、宿主細胞および発現＞
本発明において使用されたポリペプチドは、好ましくは組換え遺伝子操作技術によって作製される。単離されたポリヌクレオチド、特別にはＤＮＡは、遺伝子発現のために必要とされる必須の発現制御領域（例、調節領域）へＤＮＡを機能的に連結させるステップによって発現ベクター内に導入できる。これらのベクターは、当分野において周知である方法によって原核（例、細菌）、もしくは真核（例、酵母もしくは哺乳動物）細胞などの適切な宿主細胞中に導入できる。
【０１５９】
調製もしくは単離されている本発明のポリペプチドのためのコーディング配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコン内にクローニングできる。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターの選択はそれぞれの好みの問題である。クローニングするための組換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換できる宿主細胞の例には、バクテリオファージラムダ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（非大腸菌グラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ｐＢＤ９（枯草菌）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、バキュロウイルス昆虫細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）が含まれる。例えば、一般には、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」：Ｖｏｌｓ．Ｉ  ＆  ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）（１９８７）ａｎｄ；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）を参照されたい。
【０１６０】
本明細書に記載したポリヌクレオチドは、プロモータ（例えばファージラムダＰＬプロモータ、大腸菌ｌａｃおよびｔｒｐプロモータならびにＳＶ４０早期および後期プロモータなど）、リボソーム結合部位（例えば、細菌発現のため）、および任意でオペレータ（本明細書では、集合的に「制御」エレメントと呼ぶ）の制御下に置くことができるので、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現構築を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞内のＲＮＡ内に転写される。コーディング配列は、シグナルペプチドもしくはリーダー配列を含有しても含有しなくてもよい。
【０１６１】
発現構築物は、転写開始および終了のための部位をさらに含有してもよい。これらの構築物によって発現した成熟転写産物のコーディング部分は、好ましくは開始コドンから開始する翻訳と、翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡもしくはＵＡＧ）とを含む。
【０１６２】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に比較してタンパク質配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましいことがある。調節配列は当業者には知られており、その例としては、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答して遺伝子の発現を開始または終了することを引き起こす配列が含まれる。他のタイプの調節エレメントは、ベクター内、例えばエンハンサ配列内に存在してもよい。
【０１６３】
発現ベクターは、特定のコーディング配列が適切な調節配列を備えるベクター内に位置するように構築され、制御配列に比較したコーディング配列のポジショニングおよび方向付けは、コーディング配列が制御配列の「制御」下で転写されるように行われる（すなわち、制御配列でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写する）。このためには、当該の特定タンパク質をコードする配列の修飾が望ましいことがある。例えば、一部の場合には、それが適切な方向付けで制御配列に付着させられるように、すなわちリーディングフレームを維持するために、配列を修飾することが必要になることがある。制御配列およびその他の調節配列は、上述したクローニングベクターなどの、ベクター内に挿入する前にコーディング配列に連結することができる。または、コーディング配列は、制御配列および適切な制限部位を既に含有する発現ベクター内に直接的にクローニングすることができる。
【０１６４】
一部の場合には、その後の分泌シグナルの開裂を伴う、宿主生物からのポリペプチドの分泌を誘発する配列を加えるのが望ましいことがある。または、それにより他の所望の特性を備える生成物をコードする遺伝子に本発明のポリペプチドをコードする遺伝子が融合される遺伝子融合を作製することができる。例えば、融合パートナーは、前記ポリペプチドを選択するまた別の手段として使用できることが知られているアッセイ可能な活性（例えば酵素的）を提供できる。融合パートナーは、前記ポリペプチドを融合タンパク質の形状において細胞表面上で提示できるような細胞表面エレメントなどの構造的エレメントでもあろう。または、それは特異的抗体および試薬を用いて検出できる、そして精製のための補助物質として機能できるペプチドもしくはタンパク質断片である（例えば、Ｈｉｓ尾部、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合）。
【０１６５】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーをさらに含むことができる。そのようなマーカーには、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性および大腸菌および他の細菌中で培養するためのテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【０１６６】
当該タンパク質の突然変異体もしくはアナログを生成することが望ましいことがある。突然変異体もしくはアナログは、タンパク質をコードする配列の一部分の欠失によって、配列の挿入によって、および／またはその配列内での１つまたは複数のヌクレオチドの置換によって調製できる。特定部位突然変異誘発および融合タンパク質の形成などのヌクレオチド配列を修飾するための技術は、当業者には周知である。
【０１６７】
適切な宿主の他の代表的な例には、例えば大腸菌、ストレプトマイセスおよびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの心筋細胞；ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２などの昆虫細胞が含まれるがそれらに限定されない。
【０１６８】
選択された発現系および宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、それにより当該のポリペプチドが発現する条件下で、上述した発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることによって生成できる。前記ポリペプチドは、次に宿主細胞から単離されて精製される。発現系が増殖培地中へポリペプチドを分泌する場合は、前記ポリペプチドは培地から直接的に精製できる。前記ポリペプチドが分泌されない場合は、それは細胞溶解液から単離できる、または細胞膜分画から回収できる。適切な増殖条件の選択および回収方法は、当業者には知られている。
【０１６９】
＜一般＞
当業者は、本明細書に記載した発明は、詳細に記載したもの以外の変化および修飾を当然理解し得る。本発明がすべてのそのような変化および修飾を含むことが理解されなければならない。本発明は、さらに本明細書で言及もしくは指示したステップ、特徴、組成物および化合物の全部を個別的もしくは集合的に、ならびに任意および全部の、または任意の２つ以上のステップもしくは特徴の組み合わせを含む。
【０１７０】
本発明は、本明細書に記載の、例示する目的でのみ企図されている特定の実施形態によって範囲が限定されてはならない。機能的に同等の生成物、組成物および方法は、本明細書に記載したように明らかに本発明の範囲内に含まれる。
【０１７１】
本明細書に言及した全出版物（特許、特許出願、雑誌文献、実験マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。参考文献のいずれかが先行技術を構成する、またはそれに本発明が関する分野における研究についての一般的知識の一部であることは是認されない。
【０１７２】
本明細書を通して、状況が他のことを必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された物もしくは物の集合の包含を意味するが、任意の他の物もしくは物の集合を排除しないことは理解される。
【０１７３】
本明細書に使用した選択された用語についての他の定義は、本発明の詳細な説明内で見いだすことができ、全体を通して適用できる。他に規定しない限り、本明細書で使用した全部の他の科学および技術用語は、それに本発明が属する分野の当業者には一般に理解される意味と同一の意味を有する。
【実施例】
【０１７４】
［実施例１］
プレコンディショニングされた神経系細胞中での示差的タンパク質発現
＜材料および方法＞
（１）皮質神経細胞の培養
皮質培養の樹立については以前に記載されており、以下で手短に略述する（Ｍｅｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。
【０１７５】
Ｅ１８〜Ｅ１９ラット由来の皮質組織は、１．３ｍＭのＬ−システイン、１０単位／ｍＬのパパイン（ＩＣＮ社、米国カリフォルニア州コスタメサ）および５０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス）を補給したＨｉｂｅｒｎａｔｅ  Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）中に解離させ、低温ダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）／１０％ウマ血清中で洗浄した。
【０１７６】
神経細胞はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）／２％  Ｂ２７補給液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に再懸濁させ、細胞濃度を１，８００，０００神経細胞／２ｍＬへ調整し、以下で記載するように前処理した６ウェルプレートの各ウェル内に２ｍＬずつ接種した。
【０１７７】
神経細胞培養は、３７℃のＣＯ2培養器（５％のＣＯ2、９５％の空気平衡、湿度９８％）中で維持した。インビトロ培養第４日（ｄａｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ）４）に、培養培地の３分の１を取り除き、有糸分裂阻害剤であるシトシンアラビノフラノシド（最終濃度１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）を含有する新鮮ＮＢ／２％  Ｂ２７と取り換え、ＤＩＶ８には培養培地の２分の１をＮＢ／２％のＢ２７と取り換えた。
【０１７８】
神経細胞培養をＤＩＶ１１にプレコンディショニング処理した。ＤＩＶ１１には、神経細胞培養中の１〜２％の細胞は、グリア神経膠原線維酸性タンパク質に対して陽性に染色する。
【０１７９】
（２）培養ウェルの調製
ウェルは、室温で一晩７００μＬのポリ−Ｄ−リシン（４０μｇ／ｍＬ；７０〜１５０Ｋ；Ｓｉｇｍａ社）で被覆した。ポリ−Ｄ−リシンを除去し、２％のＢ２７、４％のウシ胎児血清、１％のウマ血清、６２．５μＭのグルタミン酸塩、２５μＭの２−メルカプトエタノール、３０μｇ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する１．２５ｍＬのＮＢを各ウェルに加え、１〜３時間にわたりＣＯ2培養器中で培養し、その後に２ｍＬの解離した神経細胞懸濁液を加えた。
【０１８０】
（３）プレコンディショニング処理
熱ストレス（ＨＳ）プレコンディショニングは、１時間にわたり４２．５℃のＣＯ2培養器中で神経細胞培養をインキュベートするステップと、その後に培養を２４時間にわたり３７℃のＣＯ2培養器へ戻すステップとから構成した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ；Ｓｉｇｍａ社）プレコンディショニングのためには、最終濃度０．３μｇ／ｍＬを達成するために培養ウェルにこの物質の濃縮ストック液を加えた。シクロヘキシミド曝露は２４時間にわたった。本発明者らは、Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，７１８３−７１９２）によって記載された方法に類似する一過性ＮＭＤＡ受容体不活性化法を使用した。ＭＫ８０１（１μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ社、米国ミズーリ州ボールウィン）プレコンディショニングは、ＭＫ８０１をウェルに加え、３０分間にわたり３７℃でインキュベートするステップによって実施した。ＭＫ８０１は、平衡生理食塩液（ＢＳＳ；１１６ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；ｐＨ７．３）中での２回の洗浄、馴化培地中での１回の洗浄、およびウェルに馴化培地を再適用してその後１２時間にわたりＣＯ2インキュベーションすることで除去した。対照は、ＤＩＶ１２に処理されていない皮質神経細胞培養から構成した。
【０１８１】
（４）タンパク質の単離
全タンパク質は上述した時点に、ウェルから全培地を除去し、１回はリン酸緩衝生理食塩液で洗浄し、その後に溶解バッファ（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４０ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％スルホベタイン３〜１０、２％のＣＨＡＰＳ、６５ｍＭのＤＴＴ、１％のＢｉｏ−Ｌｙｔｅ担体両性電解質（ｐＨ３〜１０）；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を添加することによって、対照およびプレコンディショニングされた神経系細胞から単離した。サンプルを培養容器から回収し、プローブを３０秒間超音波処理した（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、固定負荷サイクル４５０）。不溶性物質は、室温で１０分間にわたり２０，０００ｇでの遠心分離によって除去した。サンプルは、−８０℃で保存した。タンパク質含量は、以前に記載されたようにＷａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ  Ｔａｇ化学（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いるアミノ酸分析によって決定した（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ｉｎ：Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒ．Ｈ．（Ｅｄ．），Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【０１８２】
（５）２Ｄゲル電気泳動法
二次元電気泳動法は、ｐＨ範囲が各々４〜７、４．５〜５．５および６〜１１を備える１８ｃｍの固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いるＭｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩフラットベッド電気泳動システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で実施した。８０μｇのタンパク質に対応するサンプルはゲル内再水和によってｐＨ４〜７およびｐＨ４．５〜５．５のＩＰＧストリップ上に装填したが、ｐＨ６〜１１のストリップはサンプルカップを用いて陽極に装填した。等電点電気泳動は、２０℃で計９５，０００Ｖ／時について実施した。電圧は８時間をかけて３００Ｖ〜５，０００Ｖへ緩徐に増加させ、最終Ｖ／時の生成物が達成するまで５，０００Ｖで維持した。各タンパク質サンプルの実験は、３回ずつ実施した。
【０１８３】
等電点電気泳動後にストリップは３０分間にわたり６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．３７５Ｍのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５ｍＭのトリブチルホスフィン、２．５％のアクリルアミド中で平衡化させた。二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４℃でＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ＸＬマルチセル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で泳動した８〜１８％  Ｔの１６×１８ｃｍポリアクリルアミドスラブゲルを用いて実施した。電流条件は、６時間にわたる１ゲル当たり３ｍＡ、その後の１４時間にわたる１ゲル当たり１５ｍＡであった。二次元電気泳動の後に、タンパク質はＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州ユージーン）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて蛍光染色した。
【０１８４】
（６）２Ｄゲルの画像分析
ゲルは４８８ｎｍ外部レーザーを装備したＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてスキャニングした。示差的タンパク質発現プロファイルは、Ｚ３  Ｖ  ２．０画像分析ソフトウエア（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社、イスラエル）を用いて分析した。プレコンディショニング処理（ＨＳ、ＣＨＸ、およびＭＫ８０１）および対照サンプルの各々からの３枚の画像を使用して、生マスター参照ゲル複合物のデータを取得した。次に各群から生成された複合ゲルおよびｐＨ勾配を用いて、対照処理とプレコンディショニング処理間とのタンパク質プロファイルを比較した。獲得された画像分析データは、ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ質量分析法によるその後の同定のためにプレコンディショニングにおいてダウン／アップレギュレートされたタンパク質スポットを同定するために使用された。対照に比較してタンパク質発現における１．７倍を超える変化は有意と考察された。対応のないｔ−検定によって分析した１．７倍のレベルでのタンパク質発現における差は、９５％信頼限界での統計的有意性を確証した。
【０１８５】
（７）タンパク質スポットのトリプシン消化
タンパク質スポットを切除し、消化のために９６ウェルマイクロタイタープレート内に配置した。ゲルピースは５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、２５ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．８）中で３回洗浄し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離器を用いて乾燥させた。ゲルピース中のタンパク質は、８μＬ（２５ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ７．８）中で０．０１４μｇ／μＬ）のシーケンシング用トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ワイオミング州マディソン）液中で１６時間にわたり３７℃でトリプシン消化にかけた。ペプチドは８μＬの１０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸溶液を用いてゲルピースから抽出し、次にＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて脱塩して濃縮した。１μＬのアリコートは１μＬのマトリックス（５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中で８ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−ヒドロキシ桂皮酸）を用いてＭＡＬＤＩサンプルプレート上にスポッティングし、風乾させた。
【０１８６】
（８）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法
ＭＡＬＤＩ質量分析法は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＴｏｆＳｐｅｃ  ２Ｅ飛行時間質量分析計を用いて実施した。サンプルを照射するためには窒素レーザー（３３７ｎｍ）を使用した。スペクトルは、６００〜３，５００Ｄａの質量範囲内のリフレクトロンモードで獲得した。近点キャリブレーションを適用し、５０ｐｐｍの質量公差を使用した。生成したペプチド質量を使用して、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｂｅ  ｏｎ  ＭａｓｓＬｙｎｘを用いるＳｗｉｓｓＰｒｏｔ内の齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）登録に対して検索した。
【０１８７】
＜結果＞
全ＣＨＸおよびＭＫ８０１プレコンディショニングはタンパク質のダウンレギュレーションを生じさせたが、ＨＳはタンパク質のアップレギュレーションを生じさせた。複合ゲル画像から、ＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ質量分析法によるタンパク質同定のために１５８の最も示差的に発現したタンパク質を選択した。
【０１８８】
選択した１５８のタンパク質スポット中、本タンパク質もしくは暫定タンパク質は９４例で同定され、これらは５１の相違するタンパク質を表していた（図１を参照）。*≧１．７であるアップ／ダウンレギュレーションの倍率値は統計的有意であり（ｐ＜０．５）、太字で強調されている。
【０１８９】
４つの相違する密接に関連するタンパク質ファミリー（ＡＣＴＢ／ＡＣＴＧ、ＡＲＦ１−３、ＨＳＣ７０／ＨＳＰＡ２、ＴＵＢＡ１−３／ＴＵＢＡ６）については、タンパク質スポットから生成したペプチド質量は、特異的タンパク質を識別することができなかった。同一タンパク質もしくは密接に関連するタンパク質を表す相違するタンパク質スポットは２２種の同定されたタンパク質について発生したが、これらはこのタンパク質の翻訳後修飾またはタンパク質溶解性断片を表す可能性が高い。
【０１９０】
［実施例２］
ＥＰＯ（エリスロポエチン）プレコンディショニングされた神経系細胞中での示差的タンパク質発現
＜材料および方法＞
（１）皮質神経細胞の培養およびＥＰＯプレコンディショニング
皮質培養の樹立は、上記の実施例１に記載した通りであるが、以下で手短に記載する。
【０１９１】
Ｅ１８−Ｅ１９ラット由来の皮質組織は、１．３ｍＭのＬ−システイン、０．９ｍＭのＮａＨＣＯ3、１０単位／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス）および５０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）を補給したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）中に解離させ、低温ＤＭＥＭ／１０％ウマ血清中で洗浄した。神経細胞は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）／２％のＢ２７補給液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１．６％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．４％ウマ血清、２５μＭグルタミン酸塩、１０μＭの２−メルカプトエタノール、１２μｇ／ｍＬのペニシリンおよび２０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン中に再懸濁させた。神経系細胞懸濁液を使用して、６ウェルプレート（９ｃｍ2；Ｃｏｓｔａｒ社、米国）のウェル、３５ｍｍ径のガラス皿もしくはポリ−Ｄ−リシン（４０μｇ／ｍＬ；７０〜１５０Ｋ；Ｓｉｇｍａ社）が事前に被覆された９６ウェルプレートのサイズのプラスチック／ガラスウェルへ播種した。６ウェルプレートおよび３５ｍｍ径ガラス皿に１，５００，０００個の神経細胞を播種し、９６ウェルプレートサイズの容器には５０，０００個の神経細胞を播種した。神経細胞培養は、３７℃のＣＯ2培養器（５％のＣＯ2、９５％の空気平衡、湿度９８％）中で維持した。ＤＩＶ４に、培養培地の３分の１を取り除き、有糸分裂阻害剤であるシトシンアラビノフラノシド（最終濃度１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）を含有する新鮮ＮＢ／２％のＢ２７と取り換え、ＤＩＶ８には培養培地の２分の１をＮＢ／２％のＢ２７と取り換えた。ＤＩＶ１２には、神経細胞培養中の１〜２％の細胞は、グリア神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対して陽性に染色する。エリスロポエチン（ＥＰＯ：０．５単位／ｍＬ）プレコンディショニングは、ＤＩＶ１１もしくは１２に神経細胞培養へＥＰＯを直接的に加えることから構成した。ＥＰＯ曝露は、インビトロ虚血法前の８、１２もしくは２４時間であり、２Ｄ電気泳動法のためにはタンパク質単離前の１２時間であった。対照は、ＤＩＶ１２の処理されていない皮質神経細胞培養から構成した。
【０１９２】
（２）組換えアデノウイルス構築および神経細胞培養のトランスフェクション
組換えアデノウイルスを使用して、一次皮質神経細胞培養中でのＥＰＯ発現をアップレギュレートさせた。ＥＰＯを発現するアデノウイルスは、最初にＲＴ−ＰＣＲによってＥＰＯタンパク質のためのｃＤＮＡを入手し、次にｐＧＥＭ内へクローニングすることによって生成した。配列を検証したｃＤＮＡクローンを次に修飾ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内へサブクローニングしたので、ＥＰＯ−ｃＤＮＡ発現はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータおよびウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＥ）の制御下にあった。修飾されたｐＳｈｕｔｔｌｅベクターは、ＣＭＶプロモータの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をさらに発現した。次に、修飾されたｐＳｈｕｔｔｌｅベクターを使用して、ＡｄＥａｓｙ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてＥＰＯおよびＧＦＰを発現する組換えアデノウイルス（ＲＳＶ：ＥＰＯ−ＷＥ／ＣＭＶ：ＧＦＰ）を生成した。対照アデノウイルスもまた構築したが、これは赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するアデノウイルス（ＲＳＶ：ＲＦＰ−ＷＥ／ＣＭＶ：ＧＦＰ）、遺伝子なし（ＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ−ＷＥ／ＣＭＶ：ＧＦＰ）および抗アポトーシス性遺伝子Ｂｃｌ−ｘｌ（ＲＳＶ：Ｂｃｌ−ｘｌ−ＷＥ／ＣＭＶ：ＧＦＰ）から構成された。組換えアデノウイルスをＨＥＫ２９３細胞中で増幅させ、ＢＤ  Ａｄｅｎｏ−Ｘウイルス精製キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国カリフォルニア州）を用いて精製した。組換えアデノウイルスにおけるタンパク質発現は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３および皮質神経細胞培養中においてＲＦＰおよびＢｃｌｘｌについてはウェスタン分析によって、そしてＥＰＯについてはＥＬＩＳＡによって確証した（データは示していない）。
【０１９３】
ＤＩＶ９に、神経細胞培養細胞（９６ウェルプレートフォーマット）は組換えアデノウイルスを用いてウェルから馴化培地を取り除き、７５の感染多重度（ＭＯＩ）である組換えアデノウイルスおよび０．４％のＢｏｏｓｔｅｒ  １試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有する５０μＬの新鮮ＮＢ／２％  Ｂ２７を加えることによってトランスフェクトした。予備試験では、７５ＭＯＩでの神経細胞培養のトランスフェクションが最小毒性を伴う高度の導入遺伝子発現（ＲＦＰの直接検出に基づく）を生成することが決定された。３時間のインキュベーション後に、アデノウイルスを含有する培地を除去し、馴化培地と新鮮ＮＢ／２％のＢ２７培地の１００μＬの混合培地（５０％／５０％）と取り換えた。アデノウイルストランスフェクションの７２時間後に、神経細胞培養は以下に記載するようにインビトロ虚血法もしくはクメン法を受けさせた。
【０１９４】
（３）インビトロ虚血法およびクメン傷害モデル
インビトロ虚血法は、９６ウェルプレートサイズの特注ガラスウェル内で実施した。このモデルでは、ウェルから培地を除去し、ウェルに３１５μＬの平衡生理食塩液Ｂ（ＢＳＳ；１１６ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；ｐＨ７．０）を添加して除去し、さらに５０μＬのＢＳＳＢを再添加することによって洗浄した。神経細胞培養は、５％のＣＯ2、１０％のＨ2および８５％アルゴン、湿度９８％の雰囲気を備える嫌気性チャンバ（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｅｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国）内に３７℃で６０分間にわたり配置した。嫌気性インキュベーション後に、２％  Ｎ２が補給された等量のＤＭＥＭを加え、その後に培養ウェルをＣＯ2培養器中でプレーティングした。両方のインビトロ虚血法モデルのための対照培養には虚血培養と同一のＢＳＳ洗浄方法および培地添加を行ったが、ＣＯ2培養器中で維持した。
【０１９５】
クメン誘導性酸化ストレスは、９６ウェルプレート神経細胞培養細胞から培地を除去し、クメン（２０ｍＭ）を含有する１００μＬのＤＭＥＭ／Ｎ２培地を加えることによって実施した。培養ウェルは次に１６〜２４時間にわたりＣＯ2培養器中でインキュベートした。以下に記載するように、神経細胞生育性を測定して分析した。
【０１９６】
（４）神経細胞生育性の評価および統計的分析
神経細胞生育性は、インビトロ虚血法の２４時間後に、蛍光色素、ヨウ化プロピジウムを用いた染色後に核形態によって定性的に、そしてＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって定量的に評価した。ＭＴＳ生育性アッセイは、テトラゾリウム塩から、分光測光法（４９５ｎｍ）により測定される水溶性の褐色ホルマザン塩へのミトコンドリア変換を測定する。本発明者らはインビトロ虚血後にアポトーシス性と壊死性の細胞死を識別しなかったが、それは光線顕微鏡および核染色に基づいて以前に指摘されたように（Ｍｅｌｏｎｉ  ２００１；Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）インビトロモデルは主としてアポトーシス様神経細胞死を生じさせるからである。対照培養中の神経細胞生育性は、１００％として処理した。生育性データは、ＡＮＯＶＡ、次に事後フィッシャーのＰＬＳＤ検定によって分析した。＜０．０５％のＰ値を統計的有意と見なした。
【０１９７】
（５）タンパク質の単離
実施例１のセクション４を参照されたい。
【０１９８】
（６）二次元ゲル電気泳動法
実施例１のセクション５を参照されたい。
【０１９９】
（７）２Ｄゲルの画像分析
実施例１のセクション６を参照されたい。
【０２００】
（８）タンパク質スポットのトリプシン消化
実施例１のセクション７を参照されたい。
【０２０１】
（９）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法
実施例１のセクション８を参照されたい。
【０２０２】
（１０）ウェスタンブロッティング
全タンパク質溶解物（２μｇ）は４〜２０％ポリアクリルアミド勾配ＳＤＳゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の各レーン内に装填し、電気泳動にかけ、ＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）について記載されたプロトコルを用いてＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。膜を一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体と一緒に室温で１時間インキュベートした。二次抗体は、強化化学発光（ＥＣＬ）免疫検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて検出した。使用した抗体は、抗Ｂｃｌ−ｘｌ（ＳＰＡ−７６０、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ社）、抗ＤｓＲｅｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、および抗β−チューブリン（６０１８１Ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）であった。各タンパク質の発現を定量するために、オートラジオグラフはＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏ−Ｐｒｏｓｈｏｐ  ５．０内でスキャニングし、バンド強度の定量はＮＩＨ画像１．６２コンピュータソフトウエアを用いて決定した。各サンプルに対して装填対照としてチューブリンを使用し、各タンパク質の発現はチューブリンタンパク質レベルに標準化した。
【０２０３】
＜結果＞
（１）ＥＰＯプレコンディショニングおよび２Ｄゲル電気泳動法
全ＥＰＯプレコンディショニングはタンパク質のアップレギュレーションを生じさせた。複合ゲル画像から、８４の最も示差的に発現したタンパク質をＭＡＤＬＩ−ＴＯＦ質量分析法によるタンパク質同定のために選択し、本タンパク質もしくは暫定タンパク質を５７例で同定したが、これは４０種のタンパク質を表していた（図２を参照）。≧１．７であるアップ／ダウンレギュレーションの倍率値は統計的有意である（ｐ＜０．５）。Ａ＝処理群ゲル中に不在のタンパク質スポット。Ｎ＝処理群ゲル中で新規のタンパク質スポット。
【０２０４】
同一タンパク質もしくは密接に関連するタンパク質を表す相違するタンパク質スポットは１３種の同定されたタンパク質について発生したが、これらはこのタンパク質の翻訳後修飾もしくはタンパク質溶解性断片を表す可能性が高い。３種のタンパク質（ＨＳＣ７０、ＳＴＭＮ１、ＴＰＭ５）については、同一タンパク質の翻訳後もしくはタンパク質溶解性修飾を表す様々なタンパク質スポットがアップおよびダウンレギュレートされることが観察された。
【０２０５】
（２）ＥＰＯアデノウイルストランスフェクションおよび神経保護
アデノウイルス媒介性ＥＰＯ過剰発現は、神経細胞生存率を５％〜４５％へ増加させることによってクメン誘導性酸化傷害から神経細胞を保護した。
【０２０６】
［実施例３］
ＥＰＯプレコンディショニングされた神経系細胞中での示差的タンパク質発現
＜材料および方法＞
（１）神経細胞の培養
実施例１および２に記載した通りである。
【０２０７】
（２）アデノウイルスの構築
アデノウイルスベクターを使用して一次皮質神経細胞培養中での特定タンパク質をアップレギュレートした。当該のタンパク質のためのｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって入手し、ｐＧＥＭ内へクローニングした。次に配列を検証したｃＤＮＡクローンを使用して、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータおよびウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の制御下で、当該の組換えアデノウイルス発現遺伝子を構築した。これらの組換えウイルスは、ＣＭＶプロモータの制御下でレポータＧＦＰもまた発現する。組換えアデノウイルス内での当該のタンパク質の発現は、トランスフェクトされたＨＥＫおよび／または神経細胞培養中で確証された。対照ウイルスは、ＲＦＰ、遺伝子なし（空ベクター）および抗アポトーシス遺伝子Ｂｃｌ−ｘｌを発現するアデノウイルスから構成した。以下の遺伝子を発現する組換えアデノウイルスが構築されており、そのうちの数種は機能的試験において使用されている：アクチン細胞質１（ＡＣＴＢ）、ＡＴＰシンターゼα鎖（ＡＴＰ５Ａ）、伸長因子１−α（ＥＦ１Ａ１）、脂肪酸結合タンパク質−脳（ＦＡＢＰ７）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｏ）（ＧＮＡＯ１）、タンパク質キナーゼＣζ型（ＰＫＣＺ）、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質（ＰＥＢＰ）、ペルオキシレドキシン２／チオレドキシンペルオキシダーゼ１（ＰＲＤＸ２）、ペプチジル−プロピルシス−トランスイソメラーゼＡ／シクロフィリンＡ（ＣｙＰＡ）、ρグアニン解離阻害剤（ＧＤＩ−１）、ＳＯＤ  Ｃｕ／Ｚｎ（ＳＯＤ１）、スタスミン（Ｓｔａｔｈｍｉｎ）（ＳＴＭＮ１）、電圧依存性アニオンチャネル／ポリン（ＶＤＡＣ１）および１４−３−３タンパク質γ（ＹＷＨＡＧ）。
【０２０８】
構築したアデノウイルスについて、本発明者らはＰＲＤＸ２、ＣｙＰＡ、ＳＯＤ１を用いて機能的実験を実施した。
【０２０９】
（３）神経細胞培養のアデノウイルストランスフェクションおよびＣｙＰＡタンパク質インキュベーション
ＤＩＶ９に、神経細胞培養細胞（９６ウェルプレートフォーマット）は、組換えアデノウイルスを用いてウェルから馴化培地を取り除き、所望の用量のウイルス（ＭＯＩ２５〜１００）および０．４％のＢｏｏｓｔｅｒ  １試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する５０μＬの新鮮ＮＢ／２％のＢ２７を加えることによってトランスフェクトさせた。３時間のインキュベーション後に、アデノウイルスを含有する培地を除去し、馴化培地と新鮮培地の１００μＬの混合培地（５０％／５０％）と取り換えた。アデノウイルストランスフェクションの８〜７２時間後に、神経細胞培養は以下に記載するようにインビトロ虚血法もしくはクメン法を受けさせた。
【０２１０】
タンパク質インキュベーションのために、ＰＢＳ中に懸濁させたＣｙＰＡタンパク質をインビトロ虚血法もしくはクメン曝露法の開始時に神経細胞培養（０．１〜１００ｎＭ、最終濃度）へ加えた。ＣｙＰＡタンパク質は、実験の期間にわたって神経細胞培養中に残留した。
【０２１１】
（４）インビトロ虚血法／脳卒中モデル（一過性酸素ブドウ糖剥脱）
インビトロ虚血を誘導するために、ウェル内の培養培地を最初に除去し、３１５μＬの糖無含有平衡生理食塩液（ＢＳＳ；１１６ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；ｐＨ７．３）を各ウェルに加えた。次に３１５μＬのＢＳＳを取り除き、５０μＬのＢＳＳをウェルに再添加し、その後に培養ウェルは、５％のＣＯ2、１０％のＨ2および８５％アルゴン、湿度９８％の雰囲気を備える嫌気性チャンバ（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｅｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国）内に３７℃で６０分間にわたり配置した。再還流は、神経細胞培養を嫌気性チャンバから取り除き、直ちに２％のＮ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が補給された等量（５０μＬ）のＤＭＥＭ／Ｎ２（２５ｍＭグルコース、０．５ｍＭグルタミン、２６ｍＭのＮａＨＣＯ3、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する）を加え、その後に３７℃で５％のＣＯ2、９５％空気、９８％湿度のＣＯ2培養器中でインキュベーションによって実施した。インビトロ虚血法の２４時間後に、神経細胞生育性はＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。当該の遺伝子を発現するアデノウイルスを用いて処理された神経細胞培養中の神経細胞生存率を空ベクターで処理された対照と比較し、これらのデータはＡＮＯＶＡ、次にフィッシャーの検定を用いて分析した。
【０２１２】
（５）クメン酸化ストレス傷害モデル
クメン誘導性酸化ストレスは、神経細胞培養ウェルから培地を除去し、様々な濃度のクメン（２０〜２５μＭ）を含有する１００μＬのＤＭＥＭ／Ｎ２培地を加えることによって実施した。培養ウェルは次に１６〜２４時間にわたりＣＯ2培養器中でインキュベートした。神経細胞生育性は、上述したように測定して分析した。
【０２１３】
（６）ラット脳中での虚血性プレコンディショニング後のＰＰＩＡタンパク質（シクロフィリンＡ＝ＣｙＰＡ）およびＣｙＰＡ受容体（ＣＤ１４７）発現。
ラットには３分間の一過性広汎性虚血のプレコンディショニングを受けさせ、虚血後の様々な時点（６、１２、２４、４８時間後）にラットを致死させ、海馬脳領域を採取した。全タンパク質を海馬組織から単離し、ＣｙＰＡタンパク質発現をウェスタン分析によって分析した。
【０２１４】
＜結果＞
インビトロ虚血法およびクメン法前の神経細胞培養中で様々なタンパク質を過剰発現させるために組換えアデノウイルスを用いて、本発明者らは以下を見いだした。
ａ）ＣｙＰＡ、ＰＲＤＸ２およびＳＯＤ１はクメン曝露後の神経細胞生存率を改善し、ＣｙＰＡはインビトロ虚血後の神経細胞生存率を改善する、
ｂ）インビトロ虚血およびクメン発作の時点でのＣｙＰＡタンパク質の添加（タンパク質インキュベーション）もまた神経保護性である、および
ｃ）ＣｙＰＡタンパク質およびＣｙＰＡ受容体は、ラット脳中での虚血性プレコンディショニング後にアップレギュレートされる。
【０２１５】
神経細胞培養にＰＰＩＡ（シクロフィリンＡ）タンパク質が及ぼす直接的神経保護作用は、ＣｙＰＡの神経保護作用がその受容体（ＣＤ１４７）を介して形質導入されることを指示している。
【０２１６】
［実施例４］
シクロフィリンＡの神経保護作用
＜材料および方法＞
（１）ラットＣｙＰＡのｃＤＮＡをコードするシャトルプラスミドの調製
全ラット脳ＲＮＡは、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系ラットから精製し、逆転写し、ＳａｌＩ制限部位（下線付き）およびＫｏｚａｋ配列（太字）を含有するオリゴヌクレオチド
【化１】
2008530029.tif 000003
ならびにＸｈｏＩ制限部位（下線付き）を含有する
【化２】
2008530029.tif 000004
を用いるＰＣＲによって増幅させた。
【０２１７】
結果として生じたＰＣＲ産物をゲル精製し、次に二方向配列検証のためにｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）内へクローニングした。シクロフィリンＡ  ｃＤＮＡはＳａｌＩおよびＸｈｏＩ消化によって遊離させ、シャトルプラスミドｐＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥを作製するためにｐＲＳＶ／ＷＰＲＥと称する本発明者らが修飾したシャトルプラスミドベクターへ指向性でサブクローニングした（図３Ａ）。
【０２１８】
（２）組換えアデノウイルスの調製
組換えアデノウイルスは、一部の変更を加えて、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）の方法にしたがって調製した。手短には、ｐＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥはＰｍｅＩ消化によって線状化し、エレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ、Ｂｉｏｒａｄ社）によって、ｐＡｄｅａｓｙを有する大腸菌株ＢＪ５１８３（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００１）内へ導入した。組換え体は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する培地上で選択し、それらのプラスミドＤＮＡをＰａｃＩ消化によって検査した。２５ｃｍ2フラスコ内で９０％のコンフルエンスへ増殖させたＨＥＫ２９３細胞は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３μｇのＰａｃＩ線状化組換えプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ウイルスプラークが５〜１０日間以内に出現したので、ウイルス材料を使用してＨＥＫ２９３内でウイルスを増幅させ、その後にアデノ−Ｘウイルス精製キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて精製および濃縮した。感染性ウイルス力価は、ＥＧＦＰ受容体発現によって指示されるように、エンドポイント希釈アッセイによって決定した。
【０２１９】
（３）皮質神経細胞培養の調製
動物を使用するすべての方法は、西オーストラリア大学動物倫理委員会によって承認された。皮質培養の樹立は以前に記載されている（Ｍｅｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）が、手短には、Ｅ１８−Ｅ１９ラット由来の皮質組織は、１．３ｍＭのＬ−システイン、０．９ｍＭのＮａＨＣＯ3、１０単位／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ社、米国）および５０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）を補給したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に解離させ、低温ＤＭＥＭ／１０％ウマ血清中で洗浄した。神経細胞は、２％のＢ２７補給液（Ｂ２７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中に再懸濁させた。播種する前に、９６ウェルサイズのプラスチックもしくはガラス製ウェル（６ｍｍ径）のどちらかからなる培養容器をポリ−Ｄ−リシン（５０μｇ／ｍＬ；７０〜１５０Ｋ；Ｓｉｇｍａ社）で被覆し、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした。ポリ−Ｄ−リシンを除去し、ＮＢ（２％のＢ２７；４％ウシ胎児血清；１％ウマ血清；６２．５μＭのグルタミン酸塩；２５μＭの２−メルカプトエタノール；および３０μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび３０μｇ／ｍＬのペニシリンを含有する）で取り換えた。神経細胞をプレーティングして、ＤＩＶ９に１ウェル当たり約１０，０００個の生育性神経細胞を入手した。
【０２２０】
神経細胞培養は、３７℃のＣＯ2培養器（５％のＣＯ2、９５％の空気平衡、湿度９８％）中で維持した。ＤＩＶ４に、培養培地の３分の１を取り除き、有糸分裂阻害剤であるシトシンアラビノフラノシド（ＣＡＲＡ；Ｓｉｇｍａ社）を１μＭで含有する新鮮ＮＢ／２％  Ｂ２７と取り換え、ＤＩＶ８には培養培地の２分の１をＮＢ／２％  Ｂ２７と取り換えた。ＤＩＶ１１には、神経細胞培養中の０．５〜２％の細胞は、グリア神経膠原線維酸性タンパク質に対して陽性に染色する（Ｍｅｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。星状細胞が富裕な神経細胞培養については、ＣＡＲＡを培養中に除外した。
【０２２１】
（４）アデノウイルストランスフェクション
ＤＩＶ９に、培地を皮質神経細胞培養から取り出し、精製したウイルスを５０μＬのＮＢ／２％  Ｂ２７中で希釈させて必要な感染多重度（ｍｏｉ）を達成し、各ウェルに加え、３７℃で３時間にわたりインキュベートした。ウイルスを含有する培地を除去し、馴化培地と新鮮ＮＢ／２％のＢ２７の等量混合物と取り換えた。他に規定しない限り、トランスフェクトさせた神経細胞培養をＤＩＶ１２に使用した。
【０２２２】
（５）ＲＴ−ＰＣＲ
ＤＩＶ９にラット皮質神経細胞培養は１００および５００のｍｏｉでＡｄＲＳＶ：ＥｍｐｔｙまたはＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥのいずれかを用いてトランスフェクトした。ＤＩＶ１２に全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）法によって抽出し、１００ｎｇはＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）およびＲｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、米国）を用いて逆転写させた。ＰＣＲ産物は、次の条件下での増幅によって引き出した；内因性ＣｙＰＡのｍＲＮＡ発現（４６５ｂｐのバンド）およびウイルス媒介性のＣｙＰＡのｍＲＮＡ発現（５３５ｂｐのバンド）を識別するために設計された３セットのプライマーを用いて２５サイクル（９４℃×３０秒、５０℃×３０秒、７２℃×４５秒）。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通りであった；コモンセンスプライマーは５’−ｔｇｇｇｔｃｇｃｇｔｃｔｇｃｔｔｃ−３’（ラットＣｙＰＡオープンリーディングフレーム由来）であり、２つのアンチセンスプライマーは５’−ａａｔｇｃｃｃｇｃａａｇｔｃａａａｇａａ−３’（ラットＣｙＰＡ  ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ由来）および５’−ｇｔａａａａｇｇａｇｃａａｃａｔａｇ−３’（ＷＰＲＥ配列の５’末端由来）であった。
【０２２３】
（６）ラット海馬ＣｙＰＡ  ｍＲＮＡの半定量的分析
全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて冷凍脳の全海馬から抽出した。ＤＮａｓｅ処理後、２μｇの全ＲＮＡは、２０μＬの反応液中でＭＭＬＶ−ＲＴおよびランダムデカマー（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて逆転写した。半定量的ＰＣＲのために、ＣｙＰＡはＵｎｉｖｅｒｓａｌ−１８Ｓ内部標準物質（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて共増幅させた。ＣｙＰＡのためのプライマー配列は次の通りである：フォワード５’−ＴＧＧＧＴＣＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＣ−３’およびリバース５’−ＡＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＡ−３’。全反応は、総量５０μＬ中で２μＬのｃＤＮＡを用いて実施した。フォワードおよびリバースプライマーの濃度は２００ｎＭであった。９４℃での３分間の変性ステップ後に、ＰＣＲ産物は次の条件下での増幅によって引き出した；１９サイクルの（９４℃×２０秒、５７℃×３０秒、７２℃×６０秒）。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル中で電気泳動にかけ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）を用いて染色した。ゲルは、Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、米国）を用いてデジタル化し、ＮＩＨ画像を用いて定量した。
【０２２４】
（７）ウェスタンブロッティング
タンパク質抽出のために、脳組織および培養細胞をバッファ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）タンパク質阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社）を含有する、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、０．２％デオキシコール酸）中に溶解させ、ボルテックスミキサーに短時間かけ、４℃での遠心によって清澄化した。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社、米国）によって決定した。等量のタンパク質（１レーン当たり５〜１０μｇ）を装填し、４〜１２％勾配ＳＤＳポリアクリルアミドＢｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル（ＮｕＰＡＧＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で分離し、ＰＶＤＦ膜へ移した。膜は、室温で１分間にわたりオボアルブミン（１ｍｇ／ｍＬ）を含有するＰＢＳ／Ｔ中で遮断し、その後にＰＢＳ／ＴおよびＰＢＳ中で洗浄した。
【０２２５】
膜は、一次抗体を含有する４℃のブロッキング溶液中で一晩インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を含有するブロッキング溶液中で室温で１時間にわたりインキュベートした。タンパク質はＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、英国）を用いて検出し、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に曝露することによって視認し、スキャニングし、ＮＩＨ画像を用いて定量した。使用した一次抗体は次の通りであった；ウサギポリクローナル抗ＣｙＰＡ（１：２５０００；Ｂｉｏｍｏｌ社）、マウスモノクローナル抗β−チューブリン（０．５μｇ／ｍＬ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、米国）、マウスモノクローナル抗ホスホＥＲＫ１／２（１：５０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ１／２（１：１００００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）およびヤギポリクローナル抗ＣＤ１４７（１：１００００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）。二次抗体は、ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：２５，０００〜１：５０，０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）、ヒツジ抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００〜１：２０，０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ社）およびウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）。
【０２２６】
（８）イメージング
明視野および蛍光イメージング：画像取得は、ソフトウエア制御（ＤＰコントローラ、Ｏｌｙｍｐｕｓ社）下で冷却ＣＣＤデジタルカメラ（ＤＰ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を装備したＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０蛍光顕微鏡を用いて実施した。
【０２２７】
（９）免疫細胞化学検査
神経細胞培養はホルマリン（ＰＢＳ中で４％；ｐＨ７．５）を用いて１時間かけて固定し、過酸化水素処理（ＰＢＳ中で３％、５〜１０分間）したＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）中で洗浄した。ウマ血清を用いてブロッキング（２０分間）した後、培養は４℃で一晩一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０中で洗浄し、ビオチンコンジュゲート化二次抗体（ＤＡＫＯ社）を用いて精査した。免疫活性は、ストレプトアビジンにコンジュゲートしたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ社）およびＤＡＢ基質（ＳｉｇｍａＦａｓｔ社）を用いて検出した。使用した一次抗体は；ウサギポリクローナル抗ＣｙＰＡ（１：１０００；Ｂｉｏｍｏｌ社）、クローンＧ−Ａ−％（Ｓｉｇｍａ社）に由来するマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（マウスＩｇＧ１アイソタイプ）、ヤギポリクローナル抗ＣＤ１４７（１：５００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）およびウサギポリクローナル神経細胞特異的エノラーゼ（ＤＡＫＯ社製キット）であった。免疫蛍光検出のためには、使用した二次抗体はヤギポリクローナル抗ＩｇＧ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ５４６（１：１００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８（１：１００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）であった。
【０２２８】
（１０）細胞死のアッセイ
（ａ）インビトロ虚血法
インビトロ虚血法の前に、培養は３７℃で１５分間にわたり、組換えヒトシクロフィリンＡ（ｒｈＣｙＰＡ、Ｂｉｏｍｏｌ社）を用いて処理した。インビトロ虚血への神経細胞培養の曝露は、各ウェルから培地を除去し、３１５μＬの平衡生理食塩液（ＢＳＳ；１１６ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ2、０．８ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4；ｐＨ７．０）中で洗浄し、５０μＬのＢＳＳを再添加した。正常培養もしくは対照ベクターのＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙを用いてトランスフェクトした培養の平行セットにグルタミン酸塩受容体アンタゴニストである１μＭのＭＫ８０１／１０μＭの６−シアノ−７ニトロキノキサリン（ＣＮＱＸ、Ｔｏｃｒｉｓ社、米国）を加えた。
【０２２９】
神経細胞培養は、５％のＣＯ2、１０％  Ｈ2および８５％アルゴン、湿度９８％の雰囲気を備える嫌気性チャンバ（Ｄｏｎ  Ｗｈｉｔｅｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、英国）内に３７℃で５０分間にわたり配置した。嫌気性インキュベーション後に、２％のＮ２補給液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有する等量のＤＭＥＭを各ウェルに加え、その後にウェルをＣＯ2培養器中に３７℃で配置した。対照培養には虚血培養と同一のＢＳＳ洗浄方法および培地添加を行ったが、ＣＯ2培養器中で維持した。
【０２３０】
神経細胞生育性は、インビトロ虚血法の２４時間後にＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて評価した。本発明者らはインビトロ虚血後のアポトーシス性と壊死性の細胞死を識別しなかったが、それは光線顕微鏡検査および核染色に基づいて以前に報告されたように（Ｍｅｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００１；Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、このモデルは主としてアポトーシス様神経細胞死を生じさせるからである。
【０２３１】
（ｂ）過酸化クメン（クメン）処理
正常、もしくはアデノウイルストランスフェクトした神経細胞培養からの培養培地を取り除き、新しく調製したクメン（Ｓｉｇｍａ社）を必要な濃度で含有する１００μＬの１％のＮ２／ＤＭＥＭと取り換えた。正常培養もしくは対照ベクターのＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙを用いてトランスフェクトした培養の平行セットにグルタミン酸塩受容体アンタゴニスト１μＭのＭＫ８０１／１０μＭの６−シアノ−７ニトロキノキサリン（ＣＮＱＸ、Ｔｏｃｒｉｓ社、米国）を加えた。ＣｙＰＡ処理した培養については、組換えヒトｒｈＣｙＰＡ（Ｂｉｏｍｏｌ社）をクメンとともに加えた。クメンはエタノール中に１００×ストック液として希釈した。細胞生存率は、ＭＴＳアッセイを用いて２４時間後に評価した。
【０２３２】
（ｃ）統計学検査
対照培養中の神経細胞生育性は、１００％として処理した。生育性データは、ＡＮＯＶＡ、次に事後フィッシャーのＰＬＳＤ検定によって分析した。＜０．０５％のＰ値を統計的有意と見なした。
【０２３３】
＜結果＞
（１）皮質神経細胞培養中でＣｙＰＡを過剰発現させるための組換えアデノウイルスの構築
対照アデノウイルスおよびＣｙＰＡを過剰発現させるために使用したアデノウイルスのための発現カセットは、図３Ａに略図で示した。神経細胞培養のアデノウイルストランスフェクションの成功は、ＥＧＦＰレポータ発現によって確証された（データは示していない）。引き続いて、皮質神経細胞培養中でのアデノウイルス媒介性ＣｙＰＡ過剰発現は、ＲＴ−ＰＣＲ（図３Ｂ）およびウェスタン分析（図３Ｃ）によって確証された。
【０２３４】
ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥを用いてトランスフェクトした培養の免疫細胞化学検査は、ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙを用いてトランスフェクトした培養中の神経細胞と比較して神経細胞内での変動性だが増加したＣｙＰＡ染色を示した（図３Ｄ）。変動性のＣｙＰＡ染色は、ＥＧＦＰレポータ発現（示していない）がＣｙＰＡ染色強度と相関していたので、神経細胞に感染しているウイルス粒子の数における変動性を反映している可能性が高い。星状細胞が富裕な培養の二重免疫蛍光（図３Ｅに要約した）を用いて、本発明者らは、神経細胞中でＣｙＰＡ染色を検出したが、星状細胞は検出しなかった。
【０２３５】
（２）アデノウイルス媒介性ＣｙＰＡ過剰発現は酸化ストレスおよびインビトロ虚血法により誘発される神経細胞死を軽減する
用量反応実験において、本発明者らは、２５μＭクメンへの皮質神経細胞培養の曝露が細胞生存率をＰＣ１２細胞について報告されたレベル（Ｖｉｍａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）に匹敵するレベルである１５〜３０％（データは示していない）へ減少させることを見いだした。アデノウイルス媒介性ＣｙＰＡ過剰発現は、クメン曝露後の神経細胞生存率を３３％〜７６％へ有意に増加させた（図４Ａ）。さらに、アデノウイルス媒介性ＣｙＰＡ過剰発現は、インビトロ虚血後の神経細胞生存率を２７％〜５３％へ有意に増加させた（図４Ｂ）。クメン法およびインビトロ虚血法モデルの両方において陽性対照として使用したグルタミン酸塩受容体アンタゴニストは、神経細胞生存率を各々７０％および５４％へ増加させた。
【０２３６】
（３）シクロフィリンＡのｍＲＮＡは、虚血のプレコンディショニング後にラット海馬中で増加するが、タンパク質は増加しない
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、本発明者らは、対照群の動物と比較して、虚血プレコンディショニングの２４時間後にラット海馬中でのＣｙＰＡ  ｍＲＮＡ発現の統計的有意な増加を観察した（図５Ａ）。全海馬タンパク質溶解物についてのウェスタン分析は、３分間の虚血プレコンディショニングの２４時間後にＣｙＰＡ発現の増加を全く示さなかった（図５Ｂ）。
【０２３７】
（４）神経細胞培養はＣＤ１４７を発現する
ウェスタン分析を用いて、本発明者らは、全ラット海馬および皮質神経細胞培養から調製した溶解物中でＣＤ１４７免疫応答性タンパク質を検出した（図６Ａ）。どちらのタンパク質標本も類似の分子量を備え、この受容体について報告された範囲である４３〜６６ｋＤａの範囲内に含まれていた（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｕｃｈｉ，２００３）。
【０２３８】
免疫細胞化学検査によって、神経細胞培養中のＣＤ１４７受容体についての強度の染色が明らかになった（図６Ｂ）。ＣＤ１４７について観察された染色パターンは、神経細胞マーカーである神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；図６Ｂ）について観察された染色パターンと密接に相関していた。本発明者らは、神経細胞培養中の細胞の１〜２％は星状細胞マーカーであるＧＦＡＰに対して陽性染色しているにもかかわらず、ＣＤ１４７に対して染色している星状細胞に似た細胞を検出しなかった（図６Ｂ）。星状細胞が富裕な神経細胞培養中でのＣＤ１４７についての免疫細胞化学検査もまた、神経細胞中では陽性染色が依然として入手されたが、星状細胞中での明確なＣＤ１４７染色を明らかにできなかった（図６Ｃ）。
【０２３９】
（５）外因性ＣｙＰＡは神経細胞培養中でＥＲＫ１／２を活性化する
外因性で適用されたＣｙＰＡがＥＲＫ１／２活性化を媒介できるかどうかを決定するために、本発明者らは、神経細胞培養をｒｈＣｙＰＡタンパク質（１００ｎＭ）に曝露させ、結果を図７に要約した。ｒｈＣｙＰＡの添加はＥＲＫ１およびＥＲＫ２の急速なリン酸化を誘導し、これは５分後にピークに達し、その後基底レベルへ戻った。５分後に、ＥＲＫ１（ｐ４４）活性化は２．６倍増加し、ＥＲＫ２（ｐ４２）は３．３倍に増加した。
【０２４０】
（６）外因性ＣｙＰＡは酸化ストレスおよびインビトロ虚血法により誘発される神経細胞死を軽減する
クメン曝露およびインビトロ虚血法の開始前における神経細胞培養へのｒｈＣｙＰＡの外因性適用は、神経細胞生存率を有意に増加させた（図８Ａおよび８Ｂ）。クメン曝露後、１０ｎＭおよび１００ｎＭのＣｙＰＡ用量は、神経細胞生存率を各々１５〜５６％および７０％増加させた。インビトロ虚血後、１００ｎＭのｒｈＣｙＰＡ用量は、神経細胞生存率を２４％〜３５％へ増加させた。グルタミン酸塩受容体アンタゴニストは、クメンおよびインビトロ虚血法への曝露後に神経細胞生存率を各々４２％および３５％へ増加させた。
【０２４１】
［参考文献］
【表２】
2008530029.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１Ａ−Ｄ】熱ストレス、シクロヘキシミドもしくはＭＫ８０１を用いてプレコンディショニングされた神経細胞中でアップもしくはダウンレギュレートされた多数のタンパク質を列挙した表である。
【図２Ａ−Ｄ】ＥＰＯを用いてプレコンディショニングされた神経細胞中でアップもしくはダウンレギュレートされた多数のタンパク質を列挙した表である。
【図３Ａ】ＲＳＶプロモータおよびＷＰＲＥを含有する導入遺伝子発現カセット、ならびにＣＭＶプロモータを含有する独立ＥＧＦＰ受容体カセットの組立体を示している組換えアデノウイルス構築のための発現カセットの略図である。図示したウイルスベクターは、ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ（対照ウイルス）およびＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥであり、影付き長方形はＳＶ４０−ポリアデニル化シグナル配列を示している。
【図３Ｂ】ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ（１００のｍｏｉ）、ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ（１００のｍｏｉ）、ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥ（５００のｍｏｉ）およびＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥ（５００のｍｏｉ）を用いて神経細胞培養のトランスフェクション７２時間後に収集された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によるＣｙＰＡのｍＲＮＡ発現の検出。ＣｙＰＡのｍＲＮＡの内因性発現（４６５ｂｐのＰＣＲ産物によって示される）はＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙを用いてトランスフェクトされた培養中で明白であるが、他方ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥを用いてトランスフェクトされた培養は、内因性ＣｙＰＡ  ｍＲＮＡ発現およびウイルス媒介性ＣｙＰＡのｍＲＮＡ発現（５３５ｂｐのＰＣＲ産物によって示される）の両方を示している。
【図３Ｃ】ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ（５０のｍｏｉ）およびＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥ（５０のｍｏｉ）を用いたトランスフェクション７２時間後に試験した皮質神経細胞培養のウェスタン分析。抗ＣｙＰＡ抗体を用いてタンパク質溶解液を試験すると、ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥを用いてトランスフェクトした神経細胞培養中で増加したＣｙＰＡ発現を示す。
【図３Ｄ】ＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙ（１００のｍｏｉ）およびＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥ（１００のｍｏｉ）を用いてＤＩＶ９にトランスフェクトして、７２時間後に試験した皮質神経細胞培養の免疫組織化学的染色。抗ＣｙＰＡ抗体を用いて培養を試験してＤＡＢを用いて染色すると、ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥを用いてトランスフェクトした神経細胞培養中で増加したＣｙＰＡ発現を示す。
【図３Ｅ】神経細胞（ａ）非特異的ＣｙＰＡ免疫応答性の欠如を示している、ウサギ抗ＣｙＰＡ抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８二次抗体を用いて試験した対照培養；（ｂ）ＣｙＰＡ免疫応答性を示している、ウサギ抗ＣｙＰＡ抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６二次抗体を用いて試験した対照培養；（ｃ）ＧＦＡＰ免疫応答性を示している、マウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｓｉｇｍａ社）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８二次抗体を用いて試験した対照培養；（ｄ）非特異的蛍光の程度を示すためにマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｓｉｇｍａ社）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８を用いて試験した対照培養；（ｅ）ウサギ抗ＣｙＰＡおよびマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｓｉｇｍａ社）を用いて試験し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて検出された対照培養中での、ＣｙＰＡ発現の局在化を示している皮質神経細胞培養の免疫蛍光を示した図である。
【図４】ＡｄＲＳＶ：ＣｙＰＡ／ＷＰＲＥおよび対照ベクターＡｄＲＳＶ：Ｅｍｐｔｙを用いた神経細胞培養のトランスフェクションを示した図である。（Ａ）皮質神経細胞培養はＤＩＶ９に組換えアデノウイルス（７５のｍｏｉ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に、培養は、グルタミン酸塩遮断薬を含めて、もしくは含めずに、クメンヒドロペルオキシド（２５μＭ）に曝露させた、または疑似処理した。神経細胞生存率は、２４時間後に評価した（ｎ＝４、*Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）皮質神経細胞培養は、ＤＩＶ９に組換えアデノウイルス（７５のｍｏｉ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に、培養は、グルタミン酸塩遮断薬を含めて、もしくは含めずに、インビトロ虚血法にかけた、または疑似処理した。神経細胞生存率は、２４時間後に評価した（ｎ＝４、*Ｐ＜０．０５）。
【図５】ラット海馬内での広汎性脳虚血後のＣｙＰＡ  ｍＲＮＡおよびタンパク質のインビボ検出を示した図である。（Ａ）虚血６時間後には見られなかったが虚血２４時間後に有意な増加を示している、３分間のプレコンディショニング虚血後のＣｙＰＡ  ｍＲＮＡの時間経過。（Ｂ）抗ＣｙＰＡ抗体を用いて試験した全タンパク質のウェスタン分析であり、疑似処理群（ａ、ｂ、ｃ；ｎ＝３）と３分間のプレコンディショニング虚血で処理した群（ｄ、ｅ、ｆ；ｎ＝３）との間のＣｙＰＡレベルにおける差を示していない。
【図６】ＣＤ１４７受容体タンパク質の免疫検出。（Ａ）免疫応答性タンパク質を示している、抗ＣＤ１４７抗体を用いて試験した、ラット海馬（ＨＰ）およびラット皮質神経細胞培養（ＣＮＣ）由来の全タンパク質のウェスタンブロット。（Ｂ）ＣＤ１４７の免疫細胞化学染色を示している皮質神経細胞培養の光学顕微鏡写真。培養は、抗体なし（対照）；抗グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体；抗神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）抗体；または抗ＣＤ１４７抗体を用いて試験し、ＤＡＢを用いて染色した。ＮＳＥ抗体および抗ＣＤ１４７を用いて試験した培養は、類似のパターンを示す。（Ｃ）ＣＤ１４７の免疫細胞化学染色を示している星状細胞が富裕な神経細胞培養の光学顕微鏡写真。培養は、抗体なし（対照）；抗グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体；抗神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）抗体；または抗ＣＤ１４７抗体（パネルＤ）のいずれかを用いて試験し、ＤＡＢを用いて染色した。ＮＳＥ抗体および抗ＣＤ１４７を用いて試験した培養は、類似のパターンを示す。
【図７】皮質神経細胞培養中の組換えヒト（ｒｈ）ＣｙＰＡ媒介性ＥＲＫ１／２リン酸化の時間経過を示した図である。神経細胞培養は、指示した時間にわたりｒｈＣｙＰＡ（１００ｎＭ）を用いて処理した。結果として生じるタンパク質溶解液は、リン酸化ＥＲＫ１／２を検出するために抗体を用いて試験し、次に全ＥＲＫ１／２について再試験した。グラフは、各時点について相対的ＥＲＫ１／２活性化を示している、デンシトメトリを用いた免疫ブロットの定量の結果を示している。
【図８】酸化ストレスおよびインビトロ虚血後の神経細胞生存にｒｈＣｙＰＡの外因性適用が及ぼす作用を示した図である。（Ａ）皮質神経細胞培養をクメンヒドロペルオキシドに曝露し、指示した用量でｒｈＣｙＰＡを用いて、またはグルタミン酸塩遮断薬を用いて処理した。神経細胞生存率は、２４時間後に評価した（ｎ＝４、*Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）皮質神経細胞培養をインビトロ虚血法にかけ、指示した用量でｒｈＣｙＰＡを用いて、またはグルタミン酸塩遮断薬を用いて処理した。神経細胞生存率は、２４時間後に評価した（ｎ＝４、*Ｐ＜０．０５）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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