(57)【要約】  本発明は少なくとも一部はＴ−ｂｅｔがＴｈ２サイトカインの生産を直接調節するメカニズムの同定に基づく。本発明はＴｅｃ−キナーゼ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との相互作用を調節する作用物質の同定方法、ならびにその使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物の同定方法であって、化合物の存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＴｅｃキナーゼ分子をキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔとキナーゼ分子との相互作用を検出することを含んでなり、Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される、上記同定方法。
【請求項２】
Ｔ−ｂｅｔおよびキナーゼ分子の相互作用がＴ−ｂｅｔとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子の相互作用がＴ−ｂｅｔのリン酸化を測定することにより決定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ−ｂｅｔのリン酸化がＴ−ｂｅｔのアミノ酸５２５（Ｙ５２５）位のチロシン残基のリン酸化を測定することにより決定される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
キナーゼ分子がＩＴＫである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加させるために有用な化合物の同定方法であって、
ａ）ＩＴＫ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を含んでなる指標組成物を準備し；
ｂ）指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；
ｃ）試験化合物のライブラリーから、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加させる化合物を同定する上記同定方法。
【請求項７】
相互作用がＴ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産を測定することにより決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サイトカインがＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＩＴＫ−媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が、Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との間の複合体の形成を測定することにより決定される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が、ＤＮＡへのＧＡＴＡ３の結合の低下を測定することにより決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
指標組成物が、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現する細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がＴ細胞系譜コミットメントを有する請求項１１に記載方法。
【請求項１３】
細胞が未だＴ細胞系譜コミットメントを持たない請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を調節する化合物の同定方法であって、化合物およびＩＴＫの存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔのＧＡＴＡ３への結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでＩＴＫおよび化合物の存在下でＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、ＩＴＫおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時の複合体の形成の低下により示される、上記同定方法。
【請求項１５】
化合物が複合体の形成または安定性を上昇させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化合物が複合体の形成または安定性を減少させる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞による少なくとも１つのＴｈ２サイトカインの生産を直接的に増加させるために有用な化合物の同定法であって、
ａ）ＩＴＫ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を含んでなる指標組成物を準備し；
ｂ）指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；
ｃ）試験化合物のライブラリーから、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を減少する目的化合物を選択し、これにより少なくとも１つのサイトカインの生産を直接的に上昇させる化合物を同定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項１８】
Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が少なくとも１つのサイトカインの生産を測定することにより決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が１より多くのサイトカインの生産を測定することにより決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
細胞がＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカインの生産を直接的に増加させる作用物質を用いた処置から利益を受ける障害を処置または防止する方法であって、障害を処置または防止するように、該障害を持つ個体にＴ細胞においてＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合を減少させる作用物質を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２２】
作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産を直接的に増加させる方法であって、Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産が直接的に増加するように、Ｔ細胞中におけるＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加させる方法であって、Ｔ細胞分化間中のＴｈ２系譜コミットメントが直接的に増加するような、Ｔ細胞中でのＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「Ｔ−ｂｅｔによるＴｈ２系譜コミットメントの調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈ２  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｂｙ  Ｔ−ｂｅｔ）」という表題の２００５年１月２０日に出願された特許文献１の利益を主張する。本出願は１９９９年６月２日に出願された特許文献２の優先権を主張する英語のＰＣＴ条項２１に従い公開された２０００年（失効）６月１日に出願された特許文献３の一部継続出願である２００１年１２月３日に出願された特許文献４（係属中）の一部継続出願である２００２年１２月３日に出願された特許文献５（係属中）に関し、これら各々の全内容は引用により本明細書に編入する。
【０００２】
政府の補助金
本明細書に記載する本研究は、少なくともその一部分が米国立衛生研究所により供与された補助金ＡＩ／ＡＧ３７８３３、ＡＩ３９６４６、ＡＩ３６５３５、ＡＲ６−２２２７、ＴＧＡＩ０７２９０およびＡＩ４８１２６により支援された。従って、米国政府は本発明における一定の権利を有することができる。
【０００３】
［背景技術］
発明の背景
免疫系の細胞は、細胞外および細胞内シグナルに反応して遺伝子発現のパターンを変化させる。幾つかの細胞型において一連の生物学的活性に影響するサイトカインまたはリンホカインと名付けられたポリペプチド群は、これらのシグナルの中で最も重要なものに属する。免疫系内の多数の細胞型がサイトカインを分泌するが、Ｔヘルパー（Ｔｈ）リンパ球はこれらのポリペプチドの主要な供給源である。１０年以上前に、Ｔｈ細胞は、Ｔ細胞受容体連結（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の際に２種の異なるサブセット、Ｔｈ１およびＴｈ２に分化し、これらの異なる機能的能力および独自のサイトカインプロファイルにより両者に定義されることが発見された（非特許文献１：非特許文献２；非特許文献３：非特許文献４）。Ｔｈ１細胞は遅延型過敏性反応およびマクロファージ活性化を媒介し、一方Ｔｈ２細胞はＢ細胞を支援し、そしてアレルギー反応に重要である（非特許文献５：非特許文献６；非特許文献７：非特許文献８；非特許文献９）。Ｔｈ１細胞が細胞性免疫を指令し、一方Ｔｈ２細胞が体液性応答に関与するという証拠は、生物体が、病原に反応して細胞性または体液性応答のいずれかを有する傾向があり、しかし両方ではないという観察に良く適合する。Ｔｈサブセット間のこれらの機能的な相違は、サイトカイン自体の活性により最も容易に説明できる。Ｔｈ１細胞はＩＬ−２、ＴＮＦおよびＬＴも生産するが、ＩＦＮ−γがＴｈ１細胞の「特徴（ｓｉｇｎａｔｕｔｅ）」サイトカインである。Ｔｈ２の相当する「特徴」サイトカインはＩＬ−４である。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３も分泌する。
【０００４】
抗原に遭遇すると、ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー前駆体（Ｔｈｐ）細胞は発生プログラムを開始し、最終的にはこれをＴｈ１またはＴｈ２系列に送る。極性化は抗原および同時刺激シグナル、すなわちＴｈｐが受ける「シグナル強さ」を操作して達成できるが（非特許文献１０）、エフェクターＴｈ細胞の最も強力な誘導物質は、疑いなくサイトカイン自体である。ＩＬ−４はＴｈ２分化を促進し、そして同時にＴｈ１発生を遮断し、これはＳｔａｔ６シグナリング経路により媒介される効果である。従って、ＩＬ−４またはＳｔａｔ６を欠失するマウスは、Ｔｈ２細胞を発生しない（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。反対に、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＦＮ−γは、Ｔｈ１細胞発生に重要なサイトカインである（非特許文献１６；非
特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。Ｓｔａｔ１経路を介して作用するＩＦＮ−γ（非特許文献１９）、およびＳｔａｔ４シグナリング経路を介して作用するＩＬ−１２（非特許文献２１）は、一緒になってＴｈ１細胞の分化を促進し、そしてＴｈ２系譜コミットメントを遮断する（非特許文献２２；非特許文献２３）。ＩＬ−１２またはＳｔａｔ４を欠失するマウスは、Ｔｈ１細胞を持っていない（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）。別の重要なＴｈ１誘導サイトカインはＩＬ−１８であり、その受容体はＩＬ−１受容体ファミリーに関連する（非特許文献２７）。ＩＬ−１８を欠失するマウスは、生体内Ｔｈ１反応を欠き（非特許文献２８）そしてＩＬ−１２およびＩＬ−１８の両者はＩＦＮ−γ発現を調節する（非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１）。次いでこれらのサイトカイン自体はＴｈ極性化を駆動する正および負のフィードバック系を形成する（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６；非特許文献３７；非特許文献３８；非特許文献３９；非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２）（総説は（非特許文献４３；非特許文献４４；非特許文献４５を参照にされたい）。
【０００５】
最近数年間に、Ｔｈ２細胞へのＴｈ中の転移を制御する転写因子の同定に著しい進歩がなされ、これはＩＬ−４生産を駆動するこのような因子の能力により証明され（非特許文献４６；非特許文献４７を検討されたい）。３種の異なるタンパク質、すなわちｃ−Ｍａｆプロト腫瘍遺伝子、転写因子である活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、および新規の核抗原であるＮＦＡＴ−相互作用タンパク質４５ｋＤ（ＮＩＰ４５）の生産が、非−Ｔ細胞に内因性ＩＬ−４生産能力を与えることが示された（非特許文献４８；非特許文献４９）。これらの因子およびその他、例えばＧＡＴＡ−３（非特許文献５０）およびＳｔａｔ６は、明らかにＩＬ−４の生産、従ってＴｈ２細胞の発生を、生体外および生体内の両方で駆動できる。
【０００６】
反対に、Ｔｈ１分化の分子的基礎はほとんど知られていない。例えば、その不在がＴｈ１細胞生成を不能とする既知のわずかな転写因子は、Ｓｔａｔ４（非特許文献５１；非特許文献５２）およびＩＲＦ−１（非特許文献５３；非特許文献５４）であり、これらはいずれもＴｈ１特異性ではない。Ｓｔａｔ４依存の様式でＩＬ−１２中に導入されるＥｔｓファミリーメンバーＥＲＭは、最近Ｔｈ１特異性であると報告されたが、しかしこれはＴｈ１サイトカインの生産に影響しない（非特許文献５５）。Ｓｔａｔ４欠失マウス中のＴｈ１細胞の不在は、Ｔｈ１プログラムを駆動するＩＬ−１２の欠損の結果であり、一方、ＩＲＦ−１欠失マウス中のＴｈ１細胞の欠失は、ＩＬ−１２遺伝子の転写制御における直接的効果によるものであるらしい（非特許文献５６；非特許文献５７）。しかし、このような推定Ｔｈ１−特異性調節因子の上流にあるシグナリング経路の幾らかは、解明され始めている。
【０００７】
ｐ３８キナーゼは、このようなシグナリング分子の一つであり、これはＩＦＮ−γ生産をブーストする構成的活性化ＭＡＰキナーゼキナーゼ６（ＭＫＫ−６）の能力により証明される。反対に、ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｐ３８ＭＡＰキナーゼの過剰発現またはＪｎｋ２もしくはＪｎｋ１の標的破壊は、Ｔｈ１応答を低下させる（非特許文献５８；非特許文献５９；非特許文献６０）。ＪＮＫシグナリング経路は、ＩＮＦ−γ遺伝子の転写への直接作用によりＴｈ発生に影響するかもしれないが、しかしこれは証明されていない。例えば、ＡＴＦ−２およびＡＰ−１転写因子は、両者共にＪＮＫキナーゼの基質であり、そしてこれらの因子ならびにＮＦκＢおよびＳｔａｔ４タンパク質はＩＦＮ−γプロモーター内の部位に結合することが知られている（非特許文献６１；非特許文献６２；非特許文献６３；非特許文献６４）。しかし、ＩＦＮ−γの生産は、ＡＴＦ−２を欠失するマウスでは正常である。Ｔ−ｂｅｔはＩＦＮγ遺伝子ならびにＩＬ−１２Ｒβ２鎖の転写を直接駆動することにより前者を達成する。しかしＴ−ｂｅｔはＩＬ−４プロモーター活性を直接的に抑えないので、後者が達成されるメカニズムに対する手掛かりは存在しない。Ｔ−ｂｅｔがＴｈ２サイトカイン生産を直接調節するメカニズムの同定は、これらサイトカインの生産の調節を可能とし、甚大な利益となるだろう。
【参考文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６４５，６９８号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／１３７，０８５号明細書
【特許文献３】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５３４５号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願第１０／００８，２６４号明細書
【特許文献５】米国特許出願第１０／３０９，７４７号明細書
【非特許文献１】Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１，１９９４
【非特許文献２】Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，１４５−１７３，１９８９
【非特許文献３】Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６，２３４８−２３５７，１９８６
【非特許文献４】Ｓｎａｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６，９４４−９４７，１９８７
【非特許文献５】Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，１４５−１７３，１９８９
【非特許文献６】Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１，１９９４
【非特許文献７】Ａｒｔｈｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３，７７４−７８６，１９８６
【非特許文献８】Ｐａｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，８４９−８５５，１９８８
【非特許文献９】Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，２３３５−２３４１，１９８８
【非特許文献１０】Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２９７−３２２，１９９７
【非特許文献１１】Ｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，２４５−２４８，１９９３
【非特許文献１２】Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，７０７−７１０，１９９１
【非特許文献１３】Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，３１３−３１９、１９９６
【非特許文献１４】Ｓｈｉｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，６３０−６３３，１９９６
【非特許文献１５】Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，６２７−６３０，１９９６
【非特許文献１６】Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，５４７−５４９，１９９３
【非特許文献１７】Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８−９１，１９９５
【非特許文献１８】Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，２０６−２０９，１９９７
【非特許文献１９】Ｍｅｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８４，４３１−４４２，１９９６
【非特許文献２０】Ｍａｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，４７１−４８１，１９９６
【非特許文献２１】Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｎｅｄ．１８１，１７５５−６１７６２，１９９５
【非特許文献２２】Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２，６６５−６７５，１９９５
【非特許文献２３】Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：８１７−８２５，１９９７
【非特許文献２４】Ｍａｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４，４７１−４８１，１９９６
【非特許文献２５】Ｔａｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，６２７−６３０，１９９６
【非特許文献２６】Ｓｈｉｍｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，６３０−６３３，１９９６
【非特許文献２７】Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，９７−１００，１９９２
【非特許文献２８】Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，３８３−３９０，１９９８
【非特許文献２９】Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１０９８−１１０７，１９９８
【非特許文献３０】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７，５７１−５８１，１９９７
【非特許文献３１】Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，２１２５−２１３１，１９９７。
【非特許文献３２】Ｐｏｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４，２７０−２７４，１９９３
【非特許文献３３】Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，３１４９，１９９１
【非特許文献３４】Ｍａｇｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，２１４２，１９９２
【非特許文献３５】Ｐａｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９，２９７７，１９９２
【非特許文献３６】Ｆａｒｇｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２９７７
【非特許文献３７】Ｍｅｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１１９９，１９９３
【非特許文献３８】Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，１４，３３５−３３８，１９９３
【非特許文献３９】Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１１１９，１９９３
【非特許文献４０】Ｓｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，，１０１８８−１０１９２，１９９３
【非特許文献４１】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，１９３８
【非特許文献４２】Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０．５４７−５４９，１９９３
【非特許文献４３】Ｓｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ，Ｉｎ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，６３５−６７３，１９９４
【非特許文献４４】Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１，  １９９４
【非特許文献４５】Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，２７５−２８３，１９９８
【非特許文献４６】Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｈ，Ｃｅｌｌ  ９６，１３−２３，１９９９
【非特許文献４７】Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９，７７６−７８１，１９９７
【非特許文献４８】Ｈｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１９０３−１９０５，１９９６
【非特許文献４９】Ｈｏｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１８５９−１８６６，１９９８
【非特許文献５０】Ｚｈｅｎｇ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｃｅｌｌ  ８９，５８７−５９６，１９９７
【非特許文献５１】Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，１７１−１７４，１９９６
【非特許文献５２】Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，１７４−１７７，１９９６
【非特許文献５３】Ｌｏｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６８１−６８９，１９９７
【非特許文献５４】Ｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：６７３−６７９，１９９７
【非特許文献５５】Ｏｕｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３８８８，１９９９
【非特許文献５６】Ｌｏｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６，６８１−６８９，１９９７
【非特許文献５７】Ｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：６７３−６７９，１９９７
【非特許文献５８】Ｒｉｎｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７，２８１７−２８２９，１９９８
【非特許文献５９】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｕｎｉｔｙ  ９，５７５−５８５，１９９８
【非特許文献６０】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｃｅｎｃｅ  ２８２，２０９２−２０９５，１９９８
【非特許文献６１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１，６１０５−６１１２，１９９８
【非特許文献６２】Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７４４，１９９６
【非特許文献６３】Ｂａｒｂｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７，１０９８−１１０７，１９９７
【非特許文献６４】Ｓｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３０４１２−３０４２０，１９９７
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明は、少なくともその一部分は、Ｔ−ｂｅｔがＴｈ２サイトカイン生産を直接的に抑制するメカニズムの同定に基づく。
【００１０】
本発明の１つの観点は、Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＴｅｃキナーゼ分子をキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでＴ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子との相互作用は、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼとの間の複合体の形成を測定することにより決定される。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔとキナーゼ分子の存在作用がＴ−ｂｅｔのリン酸化を測定することにより決定される。さらなる態様では、Ｔ−ｂｅｔのリン酸化がＴ−ｂｅｔのアミノ酸５２５（Ｙ５２５）位のチロシン残基のリン酸化を測定することにより決定される。１つの態様では、キナーゼ分子がＩＴＫである。
【００１１】
本発明の別の観点は、Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを増加させるために有用な化合物の同定法であり、この方法は：ａ）ＩＴＫ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を含んでなる指標組成物を準備し；ｂ）指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；ｃ）試験化合物のライブラリーから、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３のする相互作用を減少させる目的化合物を選択し、これによりＴｈ２系譜コミットメントを増加させる化合物を同定することを含んでなる。１つの態様では、相互作用がＴ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産を測定することにより決定される。さらなる態様では、サイトカインがＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０からなる群から選択される。１つの態様では、ＩＴＫ−媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が、Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との間の複合体の形成を測定することにより決定される。別の態様では、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が、ＤＮＡへのＧＡＴＡ３の結合の低下を測定することにより決定される。さらに別の態様では、指標組成物がＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現する細胞である。さらなる態様では、細胞がＴ細胞系譜へコミットする。さらに別の態様では、細胞は未だＴ細胞系譜へコミットしない。
【００１２】
本発明の別の観点は、Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する化合物の同定方法を特徴とし、化合物およびＩＴＫの存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでＩＴＫおよび化合物の存在下でＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との間の相互作用を阻害する化合物の能力が、ＩＴＫおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた時に複合体の形成の低下により示される。１つの態様では化合物が複合体の形成または安定性を上昇させる。別の態様では、化合物が複合体の形成または安定性を減少させる。
【００１３】
本発明の別の観点では、Ｔ細胞による少なくとも１つのＴｈ２サイトカインの生産を直接的に上昇させるために有用な化合物の同定方法を特徴とし、この方法は：ａ）ＩＴＫ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を含んでなる指標組成物を提供し；ｂ）指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；ｃ）試験化合物のライブラリーから、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を減少する目的化合物を選択し、これにより少なくとも１つのサイトカインの生産を上昇させる化合物を同定することを含んでなる。１つの態様ではＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が少なくとも１つのサイトカインの生産を測定することにより決定される。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用が１より多くのサイトカインの生産を測定することにより決定される。さらに別の態様では、細胞がＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の１つの観点では、Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカインの生産を直接的に増加する作用物質を用いた処置から利益を受ける障害を処置または防止する方法を特徴とし、この方法は障害を処置または防止するように、該障害を持つ個体にＴ細胞におけるＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合を減少させる作用物質を投与することを含んでなる。１つの態様では、作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である。
【００１５】
本発明の別の観点は、Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産を直接的に増加させる方法を特徴とし、この方法はＴ細胞によるＴｈ２サイトカイン生産が直接的に増加するように
、Ｔ細胞におけるＩＴＫが媒介するＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。１つの態様では、作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である。
【００１６】
本発明のさらに別の観点は、Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加する方法を特徴とし、この方法はＴ細胞分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントが増加するように、Ｔ細胞中でのＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３結合を減少させる作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。１つの態様では、作用物質がＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化を阻害する。別の態様では、Ｔ細胞がＴｈｐ細胞である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくともその一部分は、Ｔ−ｂｅｔによりＴｈ２サイトカイン生産が直接的に調節されるメカニズムの同定に基づく。本発明は、とりわけＴｅｃキナーゼが媒介するＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との相互作用を調節する作用物質の同定法、ならびにその使用法に関する（添付する実施例を参照にされたい）。以下に詳細に検討するように、Ｔ−ｂｅｔは種々の細胞外シグナルの重要な細胞内トランスデューサーまたはメディエーターである。より詳細には、Ｔ−ｂｅｔは異なる細胞型で細胞外シグナルを遺伝子発現の特異的パターンに伝達するために作動する転写因子である。特にＴ−ｂｅｔはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の遺伝子発現において中枢的役割を果たすことが証明された。種々の細胞応答を調節するために役立つ種々の細胞型および種々の遺伝子が、Ｔ−ｂｅｔに応答する。またＴ−ｂｅｔは数種の遺伝子、これら遺伝子の発現および同様に影響を受ける他のものの発現も、Ｔ−ｂｅｔの発現および／または活性を制御することにより調節することができる（例えば強化または減少）。
【００１８】
ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＴは、Ｔ−ｂｏｘと呼ばれる２００アミノ酸ＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子のファミリーの創始メンバーである（総説は、（Ｓｍｉｔｈ，１９９７；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，１９９７；Ｍｅｉｓｌｅｒ，１９９７中）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短尾」のギリシャ語）突然変異は、短くて少しねじれた尾を持った異型接合変異動物内で、１９２７年に最初に記載された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ  Ｔ−ｂｏｘタンパク質のアミノ−末端の半分（アミノ酸１〜２２９）は、配列特異的なＤＮＡ結合活性を表すことが示されたＴ−ｂｏｘとして知られる保存ドメインを含む（Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．＆  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３２１１；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９：２０１；Ｋｉｓｐｅｒｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７６３）。Ｃ−末端の半分は、トランス活性化および抑制ドメインの２対を含む。オルソログ種内のＴ−ｂｏｘ領域の間の配列の類似性は、９９％と高くそして非オルソログ遺伝子間では４０〜７０％である。Ｔ−ｂｏｘドメインは最近ＤＮＡと同時結晶化され、そしてタンパク質がＤＮＡと大溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）および小溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）内の両方で接触する新規の配列特異性ＤＮＡ認識構造を示す（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．＆  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９，８８４）。
【００１９】
酵母ワンハイブリッド（ｙｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｈｙｂｒｉｄ）法を、Ｔｈ−１特異性転写因子を同定するために使用した。酵母細胞は、ＩＬ−２プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するように作製され、そして抗−ＣＤ３活性化Ｔｈ１細胞クローンから作製されたｃＤＮＡライブラリーを用いて形質転換された。ＩＬ−２プロモーターの検査は、ＮＦκＢ部位の５’−２４０−２２０丁度の優れたＴ−ｂｏｘ結合部位を明らかにした。添付の実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターを結合する能力に基づいて酵母ワンハイブリッドスクリーニングアッセイで単離された。
【００２０】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘタンパク質と相同性を有する。現在、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを含まずにマウスにおいて８種より多くのＴ−ｂｏｘ遺伝子が存在する。これらには、Ｔｂｘ１〜６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｐｉｔおよびＴ−ｂｅｔを含み、それぞれ明確で通常は複雑な発現パターンを有する。例えば、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１発現は、大部分が大脳皮質内の明確なドメインに限定される（Ｂｕｌｆｏｎｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｅｕｒｏｎ  １５，６３）。Ｔ−ｂｅｔはＴｂｒ−１の配列に最も類似している。Ｔ−ｂｏｘの外で、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は他のＴ−ｂｏｘタンパク質と一致性を有していない。
【００２１】
Ｔ−ｂｅｔは、Ｔ細胞内のみで発現されるＴ−ｂｏｘタンパク質であり、そしてＴｂｒ−１に配列が最も類似している。他の種もＢｒａｃｈｙｕｒｙ様の遺伝子を発現する。そのような脊椎動物種は、ゼノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ミノカサゴ（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、ヒヨコおよびヒトであり（Ｒａｏ，１９９４；Ｈｏｒｂ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｅｎ，１９９７；Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃａｍｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）ならびにさらに遠位の種、例えばナメクジウオ（ａｍｐｈｉｏｘｕｓ）、ホヤ（ａｓｃｉｄｉａｎｓ）、キョク皮動物（ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ）、Ｃ．エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）などの昆虫である（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これらの遺伝子は配列でも発現パターンでも保存されている。
【００２２】
Ｔ−ｂｅｔはチロシンリン酸化される唯一のＴ−ｂｏｘタンパク質という点で特異である。３個の予想されるチロシンリン酸化部位がヒトＴ−ｂｅｔのＴｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９およびＴｙｒ５３１、およびネズミＴ−ｂｅｔのＴｒｒ５２５に存在する。また核局在化配列も、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８−５０１およびマウスＴ−ｂｅｔの４９３−４９６にも存在する。マッピング実験は、２個のトランス活性化ドメイン、すなわち１つはＴ−ｂｏｘドメインの５’、そして１つは３’に位置決定した。Ｔ−ｂｅｔは共通Ｔ−ボックス部位に（標的部位選択（すなわちＥＭＳＡおよびＤＮＡ免疫沈降アッセイ）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、５’−ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣ−３’と決定）、およびヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩに結合し、およびマウスＩＦＮ−γ近位プロモーター内の２つの結合部位に部位を示した（Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９）。Ｔ−ｂｅｔは胸腺内および末梢リンパ系内で発現する。末梢系においてＴ−ｂｅｔはＴｈ１細胞内のみで発現され、ここでこれはＴｃＲ刺激およびＩＬ−１２の両方に応答して誘導される。胸腺内においてＴ−ｂｅｔのレベルは、ＤＮおよびＲａｇ２−／−胸腺細胞内で最高である。
【００２３】
これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔの組選択的発現が組織特異性ＩＦＮ−γ発現の原因となることを証明する。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１内でのみ発現されＴｈ２細胞内では発現されず、そしてＴ細胞受容体を介するシグナルの伝達に応じて前者内で誘導される。
【００２４】
さらにＴ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ遺伝子の有力なトランス活性化剤である。Ｔ−ｂｅｔの発現は、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞を含む適応および先天性免疫系の細胞でＩＦＮ−γ発現と相関する。Ｔ−ｂｅｔはナイーブなＴｈｐ細胞からＴｈ１系列発生を開始する発生プログラムの原因であり、そしてＴｈ１発生プログラムを開始することにより、およびＴｈ２細胞中の対立プログラムを抑制することの両方により作用する。
【００２５】
本発明がより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。
【００２６】
本明細書でＴ−ｂｅｔに関連して使用する用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」には、Ｔ−ｂｅｔの発現、活性または機能を、同じ条件下で自然に生じるＴ−ｂｅｔの発現、機能または活性とは異なる様式に変化させることを含む。例えば発現、機能または活性は、例えば結合特異性における変化により自然に生じるＴ−ｂｅｔの発現、機能または活性よりも大きく、または小さくなることができる。本明細書で使用するように、様々な形の用語「調節する」には、刺激（例えば特定の応答または活性の増加またはアップレギュレーション）、および阻害（例えば特定の応答又は活性の減少またはダウンレギュレーション）を含む。
【００２７】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔ分子」には、配列番号１および３に記載の核酸分子と構造的特徴を共有するＴ−ｂｅｔ核酸分子および配列番号２および４に記載のＴ−ｂｅｔタンパク質の際立った構造および機能的特徴を共有するＴ−ｂｅｔタンパク質を含む。Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、タンパク質のＴ−ｂｏｘファミリーのメンバーであり、そしてＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘｌ−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）といくらかのアミノ酸配列相同を共有する。Ｔ−ｂｏｘタンパク質は、Ｔ−ｂｏｘ結合部位でＤＮＡに結合するＴ−ｂｏｘドメインを含んでなる。さらにＴ−ｂｅｔタンパク質の構造および機能的特徴は以下に記載する。
【００２８】
本明細書で使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を含むと考える。核酸分子は、一本鎖状または二本鎖状でもよいが、しかし好ましくは二本鎖状ＤＮＡである。核酸散分子という用語は、それらのフラグメントまたは等価物（例えばＴ−ｂｅｔ、Ｉｔｋおよび／またはＧＡＴＡ３のフラグメントまたは等価物）も含むことを意図している。用語「等価物」とは、機能的に等価のＴ−ｂｅｔタンパク質、すなわち相互作用、例えばＴ−ｂｅｔの自然な結合パートナーへ結合する能力を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを意図している。
【００２９】
本明細書中に使用するところの、「単離された核酸分子」は、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の核酸に本来的に近接する遺伝子配列（すなわち、核酸が誘導された生物体のゲノムＤＮＡ内の単離された核分子に対する遺伝子に近接して位置する遺伝子配列）を含まない核酸分子を呼ぶ。例えば、種々の態様において、単離されたＴ−ｂｅｔ核酸分子は、典型的には、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に本来的に近接するヌクレオチド配列の約１０ｋｂ以下を含み、そしてさらに好ましくは、本来的に近接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ以下を含む。しかし、「単離された」Ｔ−ｂｅｔ核酸分子は、ゲノムＤＮＡ内のＴ−ｂｅｔ配列に正常では近接しない他のヌクレオチド配列に連結してもよい（例えば、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列はベクター配列に連結してもよい）。特定の好適な態様では、「単離された」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、他の細胞物質を含まなくてもよい。しかし、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子が「単離された」と考えられるために他の細胞物質を含まないという必要はない（例えば、他の哺乳類から分離されそして細菌細胞内に挿入されたＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡ分子は、まだ「単離された」と考えられる）。
【００３０】
本発明の核酸は、例えば標準的な組換えＤＮＡ技法により調製することができる。本発明の核酸は、標準的技法を使用して化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られており、そしてそれらには市販されているＤＮＡ合成器で自動化された固相合成がある（例えばＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，５９８，０４９号明細書；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４５８，０６６号明細書；およびＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号明細書を参照にされたい。これらは引用により編入する）。
【００３１】
本明細書で使用する用語「高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」は、たがいに実質的な相同性（例えば典型的には７０％相同以上）を有するヌクレオチド配列が互いに安定してハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図する。高いストリンジェンシー条件の好ましい非限定的例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムを含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＳＣ）中、温度約４５℃で数時間から一晩ハイブリダイゼーションし、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄緩衝液中、温度約５０〜６５℃での１もしくは複数回の洗浄である。
【００３２】
用語「パーセント（％）一致」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の内容で使用される場合（例えば、一つのアミノ酸配列が他のアミノ酸配列にＸ％一致である場合）に、最適に配列された場合に２個の配列の間で共有する同一の残基の百分率を呼ぶ。２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性の百分率を決定するために、配列を最適比較の目的で整列する（例えば一つの配列を他の配列と最適に整列するためにギャップを挿入してもよい）。次いで、相当する位置にある残基を比較しそして一方の配列内の位置が他の配列の相当する位置に相当して同じ残基で占められている場合に、分子はその位置で一致する。従って、２個の配列の間の一致百分率は、２個の配列が共有する一致した位置の数の関数である（すなわち、％一致＝（一致した位置の数＃／位置の全数＃）ｘ１００）。
【００３３】
当該技術分野で公知のコンピューターアルゴリズムは、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を最適に整列しそして比較して、２個の配列間の一致百分率を決定するために使用できる。２個の配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの好ましいが非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、変更はＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。比較のためにギャップ入りの整列を得るためには、ギャップ入りＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびギャップ入りＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合に、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターが使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ギャップペナルティーをｅｘｉｓｔａｎｃｅ  ５およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２に設定したデフォルトＢｌａｓｔｉｎマトリックス１−３を使用してＢＬＡＳＴ処理した。本発明のアミノ酸配列は、下記のデフォールト設定を用いてＢＬＡＳＴ処理した：ギャップペナルティーをｅｘｉｓｔａｎｃｅ  １１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １に設定したＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス。
【００３４】
配列の比較のために使用した数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合には、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のｇギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティが使用できる。配列比較のために複数のプログラムを使用する場合には、最適の整列（例えば２個の配列間の最高の一致パーセント）を与えるプログラムが比較の目的で使用される。
【００３５】
本明細書で使用するところの、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す（例えば天然タンパク質をコードする）。
【００３６】
本明細書で使用するように、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的または遺伝子のコーディング鎖に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。
【００３７】
１つの態様では、本発明の核酸分子はｓｉＲＮＡ分子である。１つの態様では、本発明の核酸分子はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡと同じ配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に分解するために、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用する翻訳後の標的化遺伝子サイレンシング法である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７，２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１３，３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲ，ａｎｄ  Ｄｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。このプロセスは、内因性のリボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを短い、例えば２１−もしくは２２−ヌクレオチド長のＲＮＡ（小干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを呼ばれる）に分解する場合に起こる。次いで、より短いＲＮＡセグメントは、標的をｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉ合成のためのキットは、例えばニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）またはアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）から市販されている。１つの態様では、アンチセンスＲＮＡに使用するための上記の１もしくは複数の化学を、ＲＮＡｉを媒介する分子に使用することができる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指し、一方用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す（例えば５’および３’非翻訳領域）。
【００３９】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが連結している他の核酸を輸送できる核酸分子を呼ぶ。ベクターの一つの種類は、「プラスミド」であり、これはその中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを称する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製することができる（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非−エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてこれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結している遺伝子の発現を指令できる。そのようなベクターは、本明細書中では「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用されるが、それはプラスミドがベクターの最も普通に使用される形であるからである。しかし本発明は、同等の機能に役立つ発現ベクター、例えばウイルスベクター（例えば複製欠失レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形も含むと考える。
【００４０】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、本発明の核酸、例えば本発明の組換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中では互換的に使用される。このような用語は、特定の主題の細胞を指すだけでなく、そのような細胞の後代または可能な後代も指すものとする。ある種の変化が、突然変異または環境の影響により後続世代に起こるかもしれないので、このような後代は実際には親細胞と同等ではないが、しかし本明細書中に使用される用語の範囲内に含まれる。
【００４１】
本明細書で使用するところの、「トランスジェニック動物」は動物の１個もしくは複数の細胞が「導入遺伝子」を含む非−ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。用語「導入遺伝子」は、これからトランスジェニック動物が発生し、そして成熟動物のゲノム内に残る細胞のゲノム内に組み込まれる外因性ＤＮＡを指し、例えばトランスジェニック動物の１もしくは複数の細胞タイプまたは組織内にコードされた遺伝子産物の発現を指令する。
【００４２】
本明細書で使用するところの、「相同的組換え動物」は、動物の発生に先立って、内因性遺伝子が、その中で内因性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同性組換えにより改変されている種類をトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスを指す。
【００４３】
本明細書中に使用される場合に、「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、細胞から単離されるかまたは組換えＤＮＡ技術により生産された場合に他のタンパク質、ポリペプチド、細胞物質および培地を、または化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質またはポリペプチドを呼ぶ。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、タンパク質が誘導された細胞または組織源から細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」とは、タンパク質が単離または組換え的に生産された細胞の細胞成分から分離されているＴ−ｂｅｔタンパク質の調製物を含む。
【００４４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子、すなわちＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子である。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の一種のみを含む抗体分子の集団を指し、一方「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用可能な抗原結合部位の複数の種類を含む抗体分子の集団を呼ぶ。従って、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を示す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」は、細胞内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を指す。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ドミナントネガティブＴ−ｂｅｔタンパク質」は、天然の（すなわち天然に生じる野生型）Ｔ−ｂｅｔ分子と競合するがしかしＴ−ｂｅｔ活性を有しないＴ−ｂｅｔ分子（例えばその部分もしくはバリアント）を含む。そのような分子は細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を効果的に減少させる。本明細書で使用する「ドミナントネガティブのＴ−ｂｅｔタンパク質」は、Ｔ−ｂｅｔ活性の強力なインヒビターである修飾された形態のＴ−ｂｅｔを指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「細胞」は、原核生物および真核生物細胞を含む。１つの態様では本発明の細胞は細菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様では本発明の細胞は脊椎動物細胞、例えばトリもしくは哺乳動物細胞である。好適な態様では、本発明の細胞はマウスもしくはヒト細胞である。
【００４８】
本明細書で使用する用語「免疫細胞」は造血起源の細胞であり、そして免疫応答に役割を果たす細胞を含む。免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞のようなリンパ球；ナチュラルキラー細胞；および単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球のような骨髄性細胞を含む。
【００４９】
本明細書で使用する用語「樹状細胞」は、Ｔ細胞の刺激においてとりわけ活性である１つの型の抗原提示細胞を指す。樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄細胞を培養すること、ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ１１ｃを発現する細胞を選択することにより得ることができる。樹状細胞はＣＤ１１ｂ＋、ＤＥＣ−２０５＋、ＣＤ８−アルファ＋もまた発現することができる。
【００５０】
本明細書で使用する用語「ナイーブなＴ細胞への抗原提示の部位」は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏの初期免疫応答の間に樹状細胞を相互連結することにより提示される抗原とナイーブなＣＤ４  Ｔ細胞が最初に接触するようになるリンパ組織内の部位を含む。
【００５１】
用語「抗原提示細胞」および「ＡＰＣ」は、本明細書では互換的に使用し、専門的な抗原提示細胞（例えばＢリンパ球、単球、樹状細胞およびランゾルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞および希突起膠細胞）を含む。
【００５２】
本明細書で使用する用語「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、哺乳動物（例えばヒト）からの胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞などを包含するＴ細胞系列内のすべての細胞を含むものとする。Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれか（しかし両方ではない）、およびＴ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞を含む。本明細書に記載する種々のＴ細胞群は、それらのサイトカインプロファイルおよびそれらの機能に基づき定義することができる。
【００５３】
本明細書で使用する「前駆Ｔ細胞」（“Ｔｈｐ”）は、ＣＤ４を発現するナイーブな多能性細胞である。
【００５４】
本明細書で使用する用語「ナイーブなＴ細胞」には、コグネイト抗原に暴露されたことがなく、したがって活性化されないＴ細胞または記憶細胞を含む。ナイーブなＴ細胞は循環せず、そしてヒトのナイーブなＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋である。ナイーブなＴ細胞が限定するわけではないが抗原の量、投与の経路および投与時期に依存して抗原を認識し、そしてさらなるシグナルを受けるならば、それらは増殖し、そしてＴ細胞の種々のサブセット、例えばエフェクターＴ細胞に分化する可能性がある。
【００５５】
本明細書で使用する用語「末梢Ｔ細胞」は、胸腺を離れかつ末梢循環に進入する成熟シングルポジティブＴ細胞を指す。
【００５６】
本明細書で使用する用語「分化した」とは、刺激剤と接触したＴ細胞を指し、そしてエフェクターＴ細胞（例えばＴｈ１、Ｔｈ２）および記憶Ｔ細胞を含む。分化したＴ細胞はナイーブなＴ細胞と比べて数種の表面タンパク質の発現が異なり、そして他の細胞を活性化するサイトカインを分泌する。
【００５７】
本明細書で使用する用語「記憶Ｔ細胞」は、抗原への暴露後に機能的に静止となり、そして抗原の不存在下で長期間、生存することができるリンパ球を含む。ヒトの記憶Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ−である。
【００５８】
本明細書で使用する用語「エフェクターＴ細胞」には、抗原を排除するために機能するＴ細胞を含む（例えば他の細胞の活性化を調節するサイトカインを生産することにより、または細胞傷害活性により）。用語「エフェクターＴ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（例えばＴｈ１およびＴｈ２細胞）および細胞傷害性Ｔ細胞を含む。Ｔｈ１細胞は遅延型の過敏応答およびマクロファージの活性化を媒介し、一方Ｔｈ２細胞はＢ細胞に対する援助を提供し、そしてアレルギー性応答に重要である（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，１４５−１７３；Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１；Ａｒｔｈｕｒ  ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３，７７４−７８６；Ｐａｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，８４９−８５５；Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１，２３３５−２３４１）。本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー１型応答」（Ｔｈ１応答）は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ならびにリンホトキシン（ＬＴ）、およびＴｈ２細胞よりむしろＴｈ１細胞により優先的にもしくは独占的に生産される他のサイトカインから選択される１もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とする応答を指す。
【００５９】
本明細書で使用する用語「調節Ｔ細胞」には、低レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２を生産するＴ細胞を含む。調節Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞よりも低レベルにもかかわらずＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を生産する。ＴＧＦβは調節Ｔ細胞により生産される優勢なサイトカインであるが、このサイトカインはＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも低いレベルで生産され、例えばその規模はＴｈ１またはＴｈ２細胞よりも１次元低い。調節Ｔ細胞は細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋群に見い出すことができる（例えばＷａｌｄｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｃｏｂｂｏｌｄ．２００１．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：３９９を参照にされたい）。調節Ｔ細胞は培養中に活性化シグナル（例えば抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣの内容において抗原を模するシグナルを用いて、例えば−ＣＤ３抗体に−ＣＤ２８抗体を加えて）で刺激されたＴｈ１またはＴｈ２またはナイーブなＴ細胞の分化およびサイトカイン生産を活発に抑制する。
【００６０】
本明細書で使用する用語「細胞分化」には、細胞の発生能が制限され、そして細胞が特異的な発生の運命を獲得するプロセスを含む。分化した細胞は他の細胞型から異なって認識できるように分化する。
【００６１】
本明細書で使用する用語「系譜コミットメント（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）」という用語は、前駆細胞例えばＴｈｐ細胞から特異的な１系列の完全に分化したエフェクター細胞、例えばＴｈ１もしくはＴｈ２細胞のような受容体媒介性の刺激に際してサイトカインの特異的プロファイルを分泌するＴ細胞へのＴ細胞系列の発生を開始するプログラムを指す。
【００６２】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ２系譜コミットメント（Ｔｈ２  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）」は、前駆細胞例えばＴｈｐ細胞から特異的な１系譜の完全に分化したＴｈ２エフェクター細胞へのＴ細胞系譜への発生を開始する発生プログラムを指し、例えばＴｈ２発生プログラムを駆動すると同時に、反対のＴｈ１発生プログラムの発生を抑えることを指す。本明細書に記載するように、例えばＴ−ｂｅｔとキナーゼ分子、例えばチロシンキナーゼ分子、例えばＴｅｃ分子、例えばＩｔｋとの相互作用はＴ−ｂｅｔのリン酸化を導き、そして引き続いてＴｈ２系譜コミットメントの減少を導く。Ｔｈ２系譜コ
ミットメントの減少は、例えばＴｈ２−特異的サイトカイン、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０またはＴｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮγを測定することにより測定することができる。
【００６３】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ２系譜コミットメントを直接的に調節する」とは、キナーゼが媒介するＴ−ｂｅｔのＧＡＴＡ−３への結合を調節することにより、Ｔｈ２系譜コミットメントを調節し、これによりＴｈ２サイトカイン遺伝子の転写を制御することを指す。例えば上記で検討したように、未コミットメント（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｔｅｄ）、またはナイーブなＴ細胞の分化され、コミットされたＴ細胞への分極は、ポジティブおよびネガティブフィードバックシステムを形成することにより、サイトカイン自体により制御されると以前は考えられていた（Ｐｏｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４，２７０−２７４；Ｓｃｏｔｔ，１９９１，ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７，３１４９；Ｍａｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，２１４２；Ｐａｒｒｏｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２９７７；Ｆａｒｇｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２９７７；Ｍａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１１９９；Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４，３３５−３３８；Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，１１１９；Ｓｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，１０１８８−１０１９２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，１９３８；Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０，５４７−５４９）（Ｓｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ，１９９４，Ｉｎ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，６３５−６７３；Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７６，２４１−２５１；Ｏ’Ｇａｒｒａ，１９９８，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，２７５−２８３を再考されたい）。しかし本明細書に記載するように、Ｔｈ１またはＴｈ２サイトカイン自体の、またはＴｈ１サイトカインの活性化には反対しないが、これはむしろＴｈ２サイトカインの発現を促進する転写因子であるＧＡＴＡ３の抑制指令である。さらに詳細には、Ｔｈ２系譜コミットメントは、キナーゼが媒介するＧＡＴＡ−３とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用により抑制される。逆に、Ｔｈ２系譜コミットメントは、キナーゼが媒介するＧＡＴＡ−３とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用の減少により上昇する。キナーゼ−例えばチロシンキナーゼ−が媒介するＧＡＴＡ−３とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用、またはキナーゼ、例えばチロシンキナーゼ、例えばＩｔｋによるＴ−ｂｅｔのリン酸化を強化または低下する作用物質は、Ｔｈ２サイトカイン生産を調節することによりＴｈ２系譜コミットメントを直接調節する作用物質である。
【００６４】
本明細書で使用するところの用語「Ｔｈ２系譜コミットメントを間接的に調節する」とは、キナーゼが媒介するＴ−ｂｅｔＧＡＴＡ−３相互作用の直接的調節によるのではなく、サイトカイン環境（ｍｉｌｉｅｕ）を調節することにより、例えばＴｈ１サイトカイン生産を調節することにより、またはＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の他の成分を調節することによりＴｈ２系譜コミットメントの調節を指す。
【００６５】
本明細書で使用する用語「受容体」は、抗原、複合化抗原（例えばＭＨＣ分子の内容において）、または抗体に結合する免疫細胞受容体を含む。活性化受容体には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、サイトカイン受容体、ＬＰＳ受容体、補体受容体およびＦｃ受容体を含む。例えばＴ細胞受容体はＴ細胞上に提示され、そしてＣＤ３分子と会合する。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子の内容では抗原により刺激される（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）。ＴＣＲを介するＴ細胞の活性化は多くの変化、例えばタンパク質リン酸化、膜脂質の変化、イオンの流動、環式ヌクレオチドの改変、ＲＮＡ転写の変化、タンパク質合成の変化、および細胞容量の変化をもたらす。
【００６６】
本明細書で使用する用語「免疫応答」は、免疫細胞活性化の調節により影響を受ける免疫細胞媒介型の（例えばＴ細胞媒介型および／もしくはＢ細胞媒介型）免疫応答を含む。例示的免疫応答はＢ細胞応答（例えば抗体生産、例えばＩｇＡ生産）、Ｔ細胞応答（例えば増殖、サイトカイン生産および細胞傷害性）、およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。本発明の１つの態様では、免疫応答はＴ細胞媒介型である。本発明の別の態様では、免疫応答はＢ細胞媒介型である。免疫応答と関連して本明細書で使用する用語「ダウンレギュレーション」は、任意の１もしくは複数の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答における減損を含むが、免疫応答と関連して用語「アップレギュレーション」は、任意の１もしくは複数の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答における上昇を含む。１つのタイプの免疫応答のアップレギュレーションは、別のタイプの免疫応答において対応するダウンレギュレーションを導く可能性がある。例えば特定のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）の生産のアップレギュレーションは、細胞性免疫応答のダウンレギュレーションを導く可能性がある。
【００６７】
本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー１型応答」は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）、およびＴｈ２細胞よりむしろＴｈ１細胞により優先的に、または排他的に生産される他のサイトカインから選択される１もしくは複数のサイトカインの生産により特徴つけられる応答を称する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー２型応答」（Ｔｈ２応答）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１もしくは複数のサイトカインの生産を特徴とし、かつＴｈ２細胞により提供される効率的なＢ細胞の「援助（ｈｅｌｐ）」（例えば高められたＩｇＧ１および／もしくはＩｇＥ生産）を特徴とするＣＤ４＋Ｔ細胞による応答を称する。
【００６９】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ２系譜コミットメントを増す作用物質での処置から利益を得る障害」とは、Ｔ−ｂｅｔ活性が異常であるか、またはＴ−ｂｅｔ活性の調節から利益を得る障害を含む。作用物質はＴｈ２系譜への発生を直接的に、または間接的に増すことができる。
【００７０】
本明細書で使用する用語「接触させること」（すなわち細胞、たとえば１個の細胞を化合物と接触させること）という用語は、化合物および細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで一緒にインキュベーションすること（例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること）、ならびに化合物および個体の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触するように個体に化合物を投与することを含む。「接触させること」という用語は個体中に天然に存在しうるＴ−ｂｅｔ調節物質への細胞の曝露（すなわち天然の生理学的過程の結果として起こりうる曝露）を含まない。
【００７１】
添付する実施例に記載するように、Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの生産を調節する。加えてＴ−ｂｅｔが阻害される場合（例えばＴ−ｂｅｔ欠損細胞において）、これはＴｈ２系譜コミットメントの増加をもたらす。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ−標的分子またはＴ−ｂｅｔと結合パートナー例えばＧＡＴＡ３およびＴｅｃキナーゼとの複合体との会合のような直接的活性である。本明細書で使用する用語「標的分子」または「結合パートナー」は、Ｔ−ｂｅｔが自然に結合または相互作用し、そしてその相互作用が生物学的応答を生じる分子である。標的分子はタンパク質または核酸分子であることができる。本発明の例示的標的分子には、Ｔ−ｂｅｔタンパク質と同じシグナリング経路中のタンパク質、例えば上流（活性の刺激物質および阻害物質の両方を含む）、または例えばＴ細胞系譜コミットメントの調節、サイトカイン生産の調節、ＴＧＦ−β媒介型シグナリングの調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチングの調節、Ｂリンパ球機能の調節、および自己免疫疾患の調節に関与する経路におけるＴ−ｂｅｔタンパク質の下流で機能することができるタンパク質を含む。Ｔ−ｂｅｔ標的分子の例には、Ｔ−ｂｅｔが相互作用して遺伝子の転写を調節するチロシンキナーゼ、例えばＩＴＫまたはＲｌｋのようなＴｅｃキナーゼまたはＤＮＡ配列を含む。
【００７２】
本明細書で使用する用語「その転写がＴ−ｂｅｔにより調節される遺伝子」には、Ｔ−ｂｅｔにより調節される制御領域を有する遺伝子を含む。そのような遺伝子はＴ−ｂｅｔにより正もしくは負に調節される可能性がある。この用語は、Ｔ−ｂｅｔにより間接的に調節される、すなわちＴ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路の活性化の結果として調節される遺伝子も包含する。Ｔ−ｂｅｔにより調節される例示的遺伝子は例えばＧＡＴＡ３、およびサイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、ＴＧＦ−β、ＬＴ（リンホトキシン）およびＩＬ−１０を含む。
【００７３】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ１−関連サイトカイン」とは、Ｔｈ２細胞というよりはむしろＴｈ１細胞により優先的または専ら生産されるサイトカインを指すものとする。Ｔｈ１−関連サイトカインの例には、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）を含む。
【００７４】
本明細書で使用する用語「Ｔｈ２−関連サイトカイン」とは、Ｔｈ１細胞というよりはむしろＴｈ２細胞により優先的または排他的に生産されるサイトカインを指すものとする。Ｔｈ１−関連サイトカインの例には、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を含む。
【００７５】
本明細書で使用する用語「相互作用」とは、例えば酵母２ハイブリッドアッセイもしくは同時免疫沈降を使用して検出できるような分子間の検出可能な相互作用を含むことを意味する。また相互作用するという用語は、分子間の「結合」相互作用も含む。相互作用は自然なタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸でよい。
【００７６】
「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、本発明の方法もしくはアッセイで使用されるか、または組成物中に存在する試薬もしくは試験作用物質を含む。「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語は、Ｔ−ｂｅｔ発現もしくは活性の調節物質として以前に同定もしくは認識されていない化合物を含む。１つの態様では、１種以上の化合物、例えば複数の化合物を、Ｔ−ｂｅｔまたはシグナル伝達経路中のＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する分子の発現および／もしくは活性を調節するそれらの能力についてのスクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「試験化合物のライブラリー」という用語は多数の試験化合物を含んでなる一団を指す。
【００７７】
１つの態様において、「作用物質」もしくは「化合物」もしくは「試験化合物」という用語はサイトカインのような自然に存在する化合物を除外する。別の態様において、作用物質という用語は自然に存在するサイトカインに結合する抗体を除外する。別の態様において、「作用物質」という用語はサイトカイン受容体に結合する抗体を除外する。さらに別の態様において、「作用物質」という用語はＴ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質、例えばＴ細胞受容体複合体の成分に対するＭＨＣ分子もしくは抗体の情況における抗原を除外する。１つの態様では、作用物質もしくは試験化合物は、Ｔ−ｂｅｔと直接相互作用するか、もしくはＴ−ｂｅｔが相互作用する分子と直接相互作用する化合物（例えばＴ−ｂｅｔとＴ−ｂｅｔ標的分子との間の相互作用を阻害もしくは刺激する化合物、例えばＤＮＡもしくは他のタンパク質）である。別の態様において、化合物は例えばＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流にある分子の活性を調節することによりＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を間接的に調節するものである。そのような化合物は下に詳細に記述するように、そのような化合物を選択するスクリーニングアッセイを使用して同定可能である。
【００７８】
「低分子」という用語は当該技術分野の１用語であり、かつ約１０００分子量未満もしくは約５００分子量未満である分子を含む。１つの態様において、低分子はペプチド結合を排他的に含むわけではない。別の態様において、低分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニング可能な例示的低分子化合物には、限定するわけではないがペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、低有機分子（例えばポリケチド）（Ｃａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３）および天然産物抽出物ライブラリーを挙げることができる。さらなる態様において、低分子は生合成的でない。
【００７９】
本明細書で使用する用語「試験化合物」は、Ｔ−ｂｅｔ活性および／または発現の調節物質、および／または細胞増殖、生存、分化および／または運動の調節物質とこれまでに同定されたことがないか、または認識されるべき化合物を含む。
【００８０】
用語「試験化合物のライブラリー」は、複数の試験化合物を含んでなる一団を指すものとする。
【００８１】
本明細書で使用する用語「工作された」（工作された細胞でのような）は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞を指す。
【００８２】
本明細書で使用する用語「レポーター遺伝子」という用語は検出可能な遺伝子産物、例えばＲＮＡもしくはタンパク質を発現する任意の遺伝子を指す。好適なレポーター遺伝子は容易に検出可能であるものである。またレポーター遺伝子は、所望の転写制御配列を含む、または他の所望の特性を表す遺伝子との融合遺伝子の形態の構築物中に包含されてもよい。レポーター遺伝子の例は、限定するわけではないがＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｖａｐｎｅｋ（１９７９）、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、ならびにベータ−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌のルシフェラーゼ（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４）、ＰＮＡＳ  １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８、Ｈａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）、および緑色蛍光タンパク質（米国特許第５，４９１，０８４号明細書；国際公開第９６／２３８９８号パンフレット）のような他の酵素検出系を挙げることができる。
【００８３】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔ−応答要素」とは、Ｔ−ｂｅｔの活性により直接的または間接的に調節されるＤＮＡ配列を指す（これにより例えばレポーター遺伝子の転写を介してＴ−ｂｅｔの活性を監視することができる）。
【００８４】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語は、Ｔ−ｂｅｔが自然に欠損である個体の細胞、ならびに非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、例えばそれらがＴ−ｂｅｔが欠損であるような変えられたマウスの細胞を含むことを意図している。また「Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞」という用語はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される非ヒトのＴ−ｂｅｔ欠損動物もしくは個体から単離された細胞も包含することを意図している。
【００８５】
本明細書で使用する用語「無細胞組成物」は、無欠の細胞を含有しない単離された組成物を指す。無細胞組成物の例には、細胞抽出物および単離されたタンパク質を含有する組成物を含む。
【００８６】
本明細書で使用する用語「指標組成物」という用語は目的のタンパク質（例えばＴ−ｂｅｔ）を含む組成物、例えばタンパク質を自然に発現する細胞、タンパク質をコードする発現ベクターを細胞中に導入することによりタンパク質を発現するよう工作された細胞、または該タンパク質を含有する無細胞組成物（例えば精製された天然に生じるタンパク質もしくは組換え的に工作されたタンパク質）を指す。
【００８７】
本明細書で使用する用語「Ｔ−ｂｅｔの調節物質」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾もしくは活性の調節物質を包含する。この用語は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の転写、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのプロセシング、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）またはＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する作用物質、例えば化合物（１もしくは複数）を含む。「Ｔ−ｂｅｔ活性の調節物質」はＴ−ｂｅｔ活性を直接もしくは間接的に調節する化合物を包含する。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性の間接的調節物質はＴ−ｂｅｔを含むシグナル伝達経路を調節することができる。Ｔ−ｂｅｔ活性を直接調節する調節物質の例は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡに結合するアンチセンス核酸分子、Ｔ−ｂｅｔに細胞内で結合しかつＴ−ｂｅｔ活性を調節（すなわち阻害）する細胞内抗体、標的分子とＴ−ｂｅｔの相互作用を阻害するＴ−ｂｅｔペプチド、および細胞中でのＴ−ｂｅｔ活性の増大された発現を可能とするＴ−ｂｅｔをコードする発現ベクター、ドミナントネガティブの形態のＴ−ｂｅｔ、Ｔ−ｂｅｔの活性を特異的に調節するよう作用する化合物、ならびにチロシン残基５２５（Ｙ５２５）でリン酸化するＴｅｃキナーゼであるＩｔｋを（例えばチロシンはＴ−ｂｅｔをリン酸化する）包含する。
【００８８】
本明細書で使用するＴ−ｂｅｔタンパク質の「アゴニスト」は、自然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の生物学的活性と同じ生物学的活性もしくはその１サブセットを実質的保持し得る。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の「アンタゴニスト」は、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質の細胞活性を競合的に調節することにより自然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質活性の１種もしくはそれ以上を阻害することができる。
【００８９】
本明細書で互換的に使用されるように、「Ｔ−ｂｅｔ活性」、「Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性」または「Ｔ−ｂｅｔの機能的活性」には、標準的な技術に従いｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるようなＴ−ｂｅｔタンパク質がＴ−ｂｅｔ応答細胞もしくは組織（例えばＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞）、またはＴ−ｂｅｔ標的分子（例えば核酸分子もしくはタンパク質標的分子）に発揮する活性を含む。１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ−標的分子との会合のような直接的活性である。あるいはＴ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質とＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用に媒介される下流の生物学的な出来事のような間接的活性である。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は本明細書に記載され、そして限定するわけではないが：調節、例えばＴｈ２細胞系譜コミットメントの減少、先天的および適応免疫系の細胞でのＩＦＮ−γ生産の調節、サイトカイン生産の調節、ＴＧＦ−β媒介型シグナリングの調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチングの調節、Ｂリンパ球機能の調節、およびＴ−ｂｅｔの調節から利益を得る障害、例えば自己免疫疾患、多発性硬化症または慢性関節リウマチ、例えばウイルスもしくは細菌の感染、喘息およびＴｈ１もしくはＴｈ２サイトカインがかかわる他の障害もしくは望ましくない状態、例えば炎症の調節を含む。これらの知見は薬剤標的および種々の疾患、障害もしくは状態における治療的介入としてのＴ−ｂｅｔ（およびＴ−ｂｅｔが関与する経路の他の分子）の使用を提供する。さらに本発明は、ワクチンのようなＴ−ｂｅｔ活性を調節する作用物質を含んでなる免疫調節組成物を提供する。
【００９０】
本明細書で使用する用語「シグナル伝達経路」は、細胞が細胞外の影響すなわちシグナル（例えばサイトカイン受容体もしくは抗原受容体のような細胞の表面上の受容体により
伝達されるシグナル）を細胞応答（例えば遺伝子転写の調節）に転換する手段を含む。例示的シグナル伝達経路は、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ−１経路（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．２００１．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２７１）およびＴＧＦ−β経路（ＡｔｔｉｓａｎｏとＷｒａｎａ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６：１６４６）を含む。「Ｔ−ｂｅｔがかかわるシグナル伝達経路」は、Ｔ−ｂｅｔがシグナルを伝達する１シグナル伝達分子であるものである。
【００９１】
本明細書で使用する用語「Ｔｅｃキナーゼ」とは、チロシンキナーゼ（ホスホチロシンキナーゼ（ＰＴＫ））のファミリーを指す。Ｓｒｃファミリーのキナーゼと構造は類似するが、ＴｅｃキナーゼはＣ−末端の調節チロシンおよびＳｒｃファミリーの特徴であるＮ−末端ミリストイル化シグナルを欠いている。代わりにＴｅｃキナーゼはＳＨ３ドメインのすぐ上流にプロリン−リッチ領域を有する。このようにＴｅｃキナーゼは、ＮＨ２−末端ホスファチジルイノシトールホスフェート結合プレクストリン相同ドメイン、（ＰＨ）ドメイン（Ｔｘｋが不存在）、続いてプロリンリッチ領域、Ｓｒｃ−相同３（ＳＨ３）およびＳＨ２相互作用ドイメン、そしてＣＯＯＨ−末端および触媒ドメイン（ＰＴＫまたはＳＨ１ドメイン、すなわち配列番号１４のアミノ酸残基３５５〜６１５）を特徴とする。ＴｅｃキナーゼはＴ細胞中で発現され、そしてサイトカイン受容体、抗原受容体およびＴ細胞のＴ細胞抗原受容体媒介型の活性化のような他のリンパ系細胞表面受容体から放出されるシグナルに関与する（Ｍ．Ｊ．Ｃｚａｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２９：８６３−８６７）。
【００９２】
Ｔｅｃファミリーのタンパク質チロシンキナーゼは、ＴＣＲ、ＢＣＲおよびＦｃε受容体のような抗原受容体を介するシグナリングにおいて重要な役割を演じている。チロシンキナーゼのＴｅｃキナーゼファミリーのメンバーは例えばＴｅｃ、Ｂｔｋ、Ｉｔｋ、ＲｌｋおよびＢｍｘを含む。ヒトＴｅｃのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：４５０７４２８およびｇｉ：４５０７４２９（配列番号５および６）に記載されている。マウスＴｅｃのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：２４４７５９４８およびｇｉ：７３０５５６９（配列番号７および８）に記載されている。ヒトＩＴＫのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：２１６１４５４９およびｇｉ：１５７１８６８０（配列番号１３および１４）に記載されている。マウスＩｔｋのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：６７５４３８５およびｇｉ：６７５４３８６（配列番号１５および１６）に記載されている。ヒトＲＬＫのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：４５０７７４２およびｇｉ：４５０７７４３（配列番号１８および１９）に記載されている。マウスＲＬｋのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：７３０５６００よびｇｉ：７３０５６０１（配列番号１５および１６）に記載されている。
【００９３】
「ＧＡＴＡ３」はＴｈ２細胞の発生に必要なＴｈ２特異的転写因子である。ＧＡＴＡ−結合タンパク質は、コンセンサスＷＧＡＴＡＲ（Ｗ＝ＡまたはＴそしてＲ＝ＡまたはＧ）と確認される標的部位を認識する転写因子のファミリーを構成する。ヒトＧＡＴＡ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：４５０３９２８、ｇｉ：５０５４１９５７およびｇｉ：４５０３９２９（配列番号９、１０および１７）に記載されている。マウスＧＡＴＡ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ｇｉ：４０２５４６３８およびｇｉ：６６７９９５１（配列番号１１および１２）に記載されている。特異的なＤＮＡ結合部位の認識（アミノ酸３０３〜３４８）およびトランス活性化（アミノ酸３０〜７４）の原因となるＧＡＴＡ３のドメインが同定された。ヒトＧＡＴＡ−３の核局在化に関するシグナリング配列は、タンパク質のアミノ酸フィンガー（アミノ酸２４９〜３１１）内およびその周りの配列により付与された特性である。転写がＧＡＴＡ３により調節される遺伝子の例には、ＩＬ−５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＬ−１２Ｒβ２を含む。
本発明の多様な観点を以下の小区分でさらに詳細に記述する：
【００９４】
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の１つの観点はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子に関する。そのような分子は、本方法に使用するための例えばＴ−ｂｅｔポリペプチドまたはその部分を作成するために使用することができる。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の最低約７００の連続するヌクレオチドもしくは配列番号３の最低約５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号１の少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００もしくは少なくとも約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる。別の好適な態様において、本発明の核酸分子は配列番号３の少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００もしくは少なくとも約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【００９５】
他の態様において、核酸分子は：配列番号１の少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００、少なくとも約１４００もしくは少なくとも約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９０％の同一性を有する。他の態様において、核酸分子は：配列番号３の少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約１０００、少なくとも約１２００もしくは少なくとも約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と少なくとも７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９０％のヌクレオチド同一性を有する。
【００９６】
遺伝暗号の縮重により配列番号１もしくは３と異なり、かつ従って配列番号１および３によりコードされるものと同一のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が本発明に含まれる。従って、別の態様では、本発明の単離された核酸分子は配列番号２もしくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９７】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子は標準的な分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して他の供給源から単離され得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１もしくは３の全部もしくは部分、および標準的ハイブリダイゼーション技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らモレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述される）を使用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。さらにＴ−ｂｅｔ遺伝子の全部もしくは一部分を包含する核酸分子は配列番号１もしくは３の配列に基づき設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。例えば、ｍＲＮＡを（例えばＣｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９のチオシアン酸グアニジウム抽出手順により）細胞から単離し得、そして逆転写酵素（例えばギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、メリーランド州ベセスダから入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；もしくはセイカガクアメリカインク（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）、フロリダ州セントピーターズバーグから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを調製し得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列に基づき設計が可能である。本発明の核酸は標準的ＰＣＲ増幅技術に従い、鋳型としてのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅し得る。そのように増幅した核酸を適切なベクターにクローン化し、そしてＤＮＡ配列分析により特徴づけが可能である。さらに、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは例えば自動ＤＮＡ合成装置を使用する標準的合成技術により製造し得る。
【００９８】
配列番号１および３に示されるＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に加え、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の小さな変化につながるＤＮＡ配列多形が集団内に存在しうることが当業者により認識されるであろう。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子中のこうした遺伝子多形は自然な対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在しうる。こうした自然の対立遺伝子変異は典型的には１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜２％の変化をもたらし得る。自然の対立遺伝子変異の結果でありかつＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えないＴ−ｂｅｔ中のいかなるそして全部のこうしたヌクレオチド変異および生じるアミノ酸の多形も、本発明の範囲内にあることを意図している。
【００９９】
本発明のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡの自然な対立遺伝子バリアントに対応する核酸分子は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＤＮＡもしくはその一部分を使用して本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ核酸分子に対するそれらの相同性に基づき単離が可能である。例示的な高ストリンジェンシー条件は、約４５℃の温度で数時間ないし一夜の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中でのハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液中での１回もしくは複数回の洗浄を含む。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。好ましくは、配列番号１もしくは３の配列番号の配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子。１つの態様では、こうした核酸分子は長さが少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００ヌクレオチドである。別の態様では、こうした核酸分子は配列番号１の少なくとも約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００もしくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子はＴ−ｂｅｔ核酸分子の自然に生じる対立遺伝子バリアントに対応する。
【０１００】
集団中に存在しうるＴ−ｂｅｔ配列の自然に生じる対立遺伝子バリアントに加え、当業者は、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に突然変異により小さな変化を導入してそれによりＴ−ｂｅｔタンパク質の機能的活性を変えることなくコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須の」アミノ酸残基のアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列番号１もしくは３の配列中に作成することができる。１個の「非必須の」アミノ酸残基はＤＮＡと相互作用するその能力もしくはＩＦＮ−γプロモーターからの転写を高めるその能力のようなＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えることなくＴ−ｂｅｔの野性型配列（例えば配列番号１もしくは３の配列）から変えることができる残基である一方、「必須の」アミノ酸残基は機能的活性に必要とされる。
【０１０１】
従って本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有するＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＴ−ｂｅｔタンパク質は配列番号２もしくは４とアミノ酸配列が異なるがそれでもなおＴ−ｂｅｔ活性を保持する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の非天然のバリアントをコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１もしくは複数のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失が導入さ
れるような配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中に１もしくは複数のヌクレオチドの置換、付加もしくは欠失を導入することにより創製することができる。突然変異は部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発のような標準的技術により配列番号１もしくは３に導入可能である。好ましくは、保存的アミノ酸置換を１もしくは複数の非必須アミノ酸残基で行う。「保存的アミノ酸置換」はアミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義されている。従って、Ｔ−ｂｅｔ中の非必須なアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換える。
【０１０２】
あるいは別の態様では、突然変異は飽和突然変異誘発によるようにＴ−ｂｅｔのコーディング配列の全部もしくは一部に沿って無作為に導入可能であり、そして結果として生じる変異体は、ＤＮＡに結合するおよび／もしくは転写を活性化するそれらの能力についてスクリーニングして機能的活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるＴ−ｂｅｔ変異体タンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現させることができ、そしてＴ−ｂｅｔ活性を評価するための当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して（例えばＤＮＡ中に存在するＴボックス結合配列に結合する該タンパク質の能力を測定することにより、またはＴ細胞のＴｈ１もしくはＴｈ２表現型を調節する該タンパク質の能力を測定することにより突然変異体タンパク質の機能的活性を測定し得る。
【０１０３】
本発明の別の観点はＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡもしくは遺伝子のコーディング鎖に対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸はＴ−ｂｅｔコーディング鎖全体もしくはその一部分のみに相補的であり得る。１つの態様では、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖のコーディング領域に対しアンチセンスである。別の態様において、アンチセンス核酸分子はタンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるかもしくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対しアンチセンスである。好適な態様では、本発明のアンチセンス分子は配列番号１の非コーディング鎖の少なくとも約７００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号１の非コーディング鎖の少なくとも８００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の非コーディング鎖の少なくとも約５００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号３の非コーディング鎖の少なくとも６００、８００、１０００、１２００もしくは１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１０４】
本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１および３が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸はワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計が可能である。アンチセンス核酸分子はＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的であってよく、あるいはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング領域の一部分のみに対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることができる。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的である可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば長さが約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は当該技術分野で
既知の手順を使用した化学合成および酵素的連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、自然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるかもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的合成が可能であり、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンスの向きでサブクローニングした発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下の小区分にさらに記述される目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる）。
【０１０５】
別の態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列がＴ−ｂｅｔをコードするｍＲＮＡ中の切断されるべき塩基配列に相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えばＣｅｃｈら米国特許第４，９８７，０７１号明細書；およびＣｅｃｈら  米国特許第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡを使用してＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択し得る。例えばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
【０１０６】
別の態様では、ＲＮＡｉを使用してＴ−ｂｅｔ発現を阻害することができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用してｄｓＲＮＡと同一の配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解する転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。このプロセスは、内因性リボヌクレアーゼがより長いｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い２１もしくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。このより小さいＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。
【０１０７】
ＲＮＡｉのアンチセンスＲＮＡ鎖は、Ｔ−ｂｅｔのコーディング領域の少なくとも一部分またはＴ−ｂｅｔ遺伝子の５’もしくは３’非翻訳領域の少なくとも一部分に対しアンチセンスであり得る。１つの態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は２ｎｔの３’オーバーハングを有するための様式で対にされた２１ｎｔのセンスおよび２１ｎｔのアンチセンス鎖から構成される。１つの態様ではオーバーハング中にＴＴを伴うｓｉＲＮＡ配列。標的領域は例えば開始コドンの５０ないし１００ｎｔ下流であり得、３’−ＵＴＲもまた標的とされうる。１つの態様において、２３ｎｔの配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎ、任意のヌクレオチド）を探索し、そして約３０〜７０％の間のＧ／Ｃ含量を伴うヒットを選択し得る。適する配列が見出されない場合は、モチーフＮＡ（Ｎ２１）を使用して検索を拡大する。ｓｉＲＮＡは好ましくは適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび通例のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して化学的に合成する。ｓｉＲＮＡは例えばダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ゼラゴンインク社（Ｘｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ）、プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）およびアムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）から商業的に入手可能である。１つの態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用について上述された化学の１もしくは複数を使用することができる。
【０１０８】
本発明のさらに別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。非Ｔ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列に操作可能に連結されたＴ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする少なくとも１種の第一のヌクレオチド配列を含んでなるこうした核酸分子が、標準的組換えＤＮＡ技術により製造可能である。Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質は下の小区分ＩＩＩにさらに詳細に記述する。
【０１０９】
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔ（もしくはその一部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは宿主細胞中での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に操作可能に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１もしくは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系でもしくはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞中で）、ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御配列（１もしくは複数）に連結されることを意味することを意図している。「制御配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節領域（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。そのような制御配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されている。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある宿主細胞中でのみ該ヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的制御配列）を含む。発現ベクターの設計は形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル等のような因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入し、それにより本明細書に記述される核酸によりコードされる融合タンパク質もしくはペプチド（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質、突然変異体の形態のＴ−ｂｅｔタンパク質、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質など）を含むタンパク質またはペプチドを生産することができる。
【０１１０】
本発明の組換え発現ベクターは原核生物もしくは真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の発現のために設計することができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）にさらに論考されている。あるいは、組換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、そして翻訳してもよい。
【０１１１】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合もしくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的もしくは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で最も多く行われる。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常は該組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは１もしくは複数の目的すなわち：１）組換えタンパク質の発現を増大させる；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させる；３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する；４）タンパク質の検出および／もしくは精製を補助するためのエピトープ標識を提供する；かつ／または５）タンパク質の検出を補助するためのマーカー（例えばβ−ガラクトシダーゼ融合物を使用する色マーカー）を提供する、にかなう可能性がある。しばしば、融合発現ベクターにおいてタンパク質分解性切断部位が融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製後に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。そのような酵素およびそれらのコグネイト認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質もしくはプロテインＡをそれぞれ融合するｐＧＥＸ（ファルマシアバイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を含む。また組換えタンパク質は、上で検討されたもの同じ目的に融合タンパク質として真核生物細胞中でも発現させることができる。
【０１１２】
適切な誘導性の非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎｌ）により媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスのポリメラーゼはｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎｌ遺伝子をもつ常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１１３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での組換えタンパク質発現を最大にする１つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する損なわれた能力をもつ宿主細菌中で該タンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）１１９−１２８）。別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技術により実施可能である。
【０１１４】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（インビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を含む。
【０１１５】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を含む。
【０１１６】
さらに別の態様では、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を含む。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルスの調節要素により提供される。例えば、通常に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。
【０１１７】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは特定の細胞型中で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば核酸を発現させために組織特異的調節要素を使用する）。組織特異的調節要素は当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの非限定的例には、リンパ組織特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経細糸プロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を含Ｎ。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓとＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
【０１１８】
さらに、哺乳動物細胞中で使用するための誘導性の調節系、例えば遺伝子発現が重金属イオン（例えばＭａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照されたい）、熱ショック（例えばＮｏｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボカレイトン中、ｐｐ１６７−２２０を参照されたい）、ホルモン（例えばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−７３６；Ｉｓｒａｅｌ  ａｎｄ  Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ国際公開第Ｏ  ９３／２３４３１号パンフレットを参照されたい）、ＦＫ−５０６関連分子（例えばＰＣＴ国際公開第Ｏ  ９４／１８３１７号パンフレットを参照されたい）、もしくはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ国際公開第９４／２９４４２号パンフレット；およびＰＣＴ国際公開第９６／０１３１３号パンフレットを参照されたい）により調節される系が当該技術分野で既知である。従って別の態様では、本発明はＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡが誘導性の真核生物プロモーターに操作可能に連結されてそれにより真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の誘導性発現を可能にする組換え発現ベクターを提供する。
【０１１９】
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンスの向きでクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子はＴ−ｂｅｔ
ｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能とする様式で制御配列に操作可能に連結される。多様な細胞型でのアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンス方向でクローン化された核酸に操作可能に連結された制御配列を選ぶことができ、例えばアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を指図するウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサーまたは制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の制御領域の制御下にアンチセンス核酸が生産される組換えプラスミド、ファジェミドもしくは弱毒化ウイルスの形態にあることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考についてはＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，遺伝子分析用の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
【０１２０】
本発明の別の観点は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入されている組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は任意の原核生物もしくは真核生物細胞でよい。例えば、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞のような）中で発現させることができる。他の適する宿主細胞が当業者に既知である。ベクターＤＮＡは通常の形質転換もしくはトランスフェクション技術を介して原核生物もしくは真核生物細胞中に導入し得る。本明細書で使用される用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法を含め、宿主細胞中に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための多様な技術的に認識される技術を指すことを意図している。宿主細胞の適切な形質転換もしくはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ）（１９８９））および他の実験室手引き書に見出すことができる。
【０１２１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小部分のみがそれらのゲノム中に外来ＤＮＡを組込み得ることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を一般に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーはＧ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートのような化合物に対する耐性を賦与するものを含む。選択可能なマーカーをコードする核酸は、Ｔ−ｂｅｔをコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入してよく、または別個のベクター上で導入してよい。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は化合物選択により同定可能である（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組込んだ細胞は生き残ることができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【０１２２】
培養物中の原核生物もしくは真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を使用して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を生産（すなわち発現）させることができる。従って本発明はさら
に、本発明の宿主細胞を使用したＴ−ｂｅｔタンパク質の製造方法を提供する。１つの態様では、この方法は本発明の宿主細胞（Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクターが導入されている）をＴ−ｂｅｔが生産されるまで適する培地中で培養することを含んでなる。別の態様では、この方法は培地もしくは宿主細胞からＴ−ｂｅｔを単離することをさらに含んでなる。自然な形態で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は細胞内タンパク質であり、従って組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は組換え宿主細胞中で細胞内で発現され得、そして次いで例えば宿主細胞を溶解すること、そしてライセートから組換えＴ−ｂｅｔタンパク質を回収することにより宿主細胞から単離することができる。あるいは、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質はタンパク質が宿主細胞から分泌されるように、タンパク質のアミノ末端に異種シグナル配列を操作可能に連結することにより細胞外タンパク質として調製することができる。この場合、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は細胞を培養する培地基から回収可能である。
【０１２３】
本発明のある宿主細胞は非ヒトトランスジェニック動物を作出するためにもまた使用可能である。例えば１つの態様において、本発明の宿主細胞は、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列が導入されている受精卵母細胞もしくは胚幹細胞である。次いでそのような宿主細胞を使用して、外因性のＴ−ｂｅｔ配列がそれらのゲノム中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、もしくは内因性のＴ−ｂｅｔ配列が変えられている相同的組換え動物を作出し得る。こうした動物はＴ−ｂｅｔの機能および／または活性を研究するため、ならびにＴ−ｂｅｔ活性の調節物質を同定かつ／または評価するために有用である。従って本発明の別の観点は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質の一部分をコードする導入遺伝子を運ぶ細胞を含有する非ヒトトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物の一下位態様（ｓｕｂｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）において、導入遺伝子は内因性のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする内因性遺伝子を改変する（例えば、内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊もしくは「ノックアウト」されているか、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列が突然変異されているか、または内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写制御領域が改変されている相同的組換え動物）。
【０１２４】
本発明のトランスジェニック動物は、Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸を例えば微小注入法により受精卵母細胞の雄性前核中に導入すること、そしてこの卵母細胞を偽妊娠の雌性育成動物中で発生させることにより作出し得る。配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列を導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効率を増大させるために導入遺伝子ン中に包含し得る。組織特異的調節配列（１もしくは複数）をＴ−ｂｅｔ導入遺伝子に操作可能に連結してＴ−ｂｅｔタンパク質の発現を特定の細胞に向かわせることが可能である。胚操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の作出方法は当該技術分野で常法となっており、そして例えば、双方ともＬｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号明細書、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，による米国特許第４，８７３，１９１号明細書、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．、マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）、（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８６）に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の作出で使用する。トランスジェニック創始体動物はそのゲノム中のＴ−ｂｅｔ導入遺伝子の存在および／または動物の組織もしくは細胞中でのＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの発現に基づき同定することができる。次いでトランスジェニック創始体動物を使用して導入遺伝子を運搬するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、Ｔ−ｂｅｔをコードする導入遺伝子を運搬するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を運搬する他のトランスジェニック動物とさらに交配させることができる。
【０１２５】
相同的組換え動物を作出するために、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより
内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を改変する、例えば機能的に破壊する、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。１つの態様では、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊される（すなわちもはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）ように、相同的組換えベクターを設計する。あるいは相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が該Ｔ−ｂｅｔ遺伝子で置き換えるためにベクターを設計することができる。相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の改変された部分は、その５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子のさらなる核酸により隣接され、該ベクターにより運搬される外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを起こさせる。さらなる隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクター中に包含される（例えば、相同的組換えベクターの記載についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを（例えば電気穿孔法により）胚幹細胞系に導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。次いで選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、奇形ガンおよび胚性幹細胞：実践的取り組み（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物に埋植しかつ胚を分娩までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖することができる。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９０／１１３５４号パンフレット；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９１／０１１４０号パンフレット；Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．による同第９２／０９６８号パンフレット；およびＢｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９３／０４１６９号パンフレットにさらに記載されている。
【０１２６】
前述に加え、当業者は相同的組換えのための当該技術分野で既知の他の取り組みが本発明に適用し得ることを認識するであろう。酵素支援型の部位特異的組込み系が当該技術分野で既知であり、そして第二の標的ＤＮＡ分子中の予め決められた位置にＤＮＡ分子を組込むために応用可能である。こうした酵素支援型の組込み系の例は、Ｃｒｅリコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えばＢａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７９０５−７９０９に記載されているような）、ならびにＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えばＤａｎｇ，Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７−３７５：およびＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８４６９−８４７３に記載されているような）を含む。ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９４４２号パンフレットおよびＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０１３１３号パンフレットに記載されるようなテトラサイクリン調節型の誘導性の相同的組換え系もまた使用し得る。
【０１２７】
別の態様では、Ｔ−ｂｅｔが例えばＣＤ４エンハンサーを使用して全Ｔ細胞中で発現されるトランスジェニック動物を作出し得る（Ｚｈｅｎｇ，Ｗ−Ｐ．＆  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．１９９７．Ｃｅｌｌ  ８９、５８７）。最近の研究は，ＣＤ２エンハンサーもま
た使用し得ることを示唆している。事実、それはＴ細胞中での高レベル発現を達成するためにさらに有力であり、発現は変動せず、しかも導入遺伝子発現はコピー数依存性である（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１８５、１３３；Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７，６０９）。Ｔ−ｂｅｔ  ＲＮＡの高レベル発現を伴うマウス（導入遺伝子に駆動されるＴ−ｂｅｔ  ＲＮＡを内因性のＴ−ｂｅｔと識別するためのプローブとしてヒト成長ホルモンイントロンを使用する）は、十分な数の創始体をスクリーニングすることにより同定可能である。
【０１２８】
別の取り組みにおいて、ドミナントリプレッサー（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）トランスジェニックを作出し得る。例えば、ドミナントリプレッサーのＴ−ｂｅｔは近位ｌｃｋエンハンサーを使用することにより作成することができ（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉｌａ，Ｊ．ら１９９６  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４、９）、Ｔ−ｂｅｔおよびｅｎｇｒａｉｌｅｄの融合の駆動を作成することができる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．，１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０，２７３２；Ｌｉ，Ｊ．，Ｔｈｕｒｍ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０８８５）。この構築物は多量体化したＴ−ｂｅｔレポーターのＴ−ｂｅｔトランス活性化を特異的に抑制し、しかもＮＦＡＴ依存性のレポーターのトランス活性化に影響を及ぼさない。
【０１２９】
あるいは、無発現変異をＥＳ細胞中での標的を定めた突然変異誘発により生成し得る（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２、１８６；Ｈｏｄｇｅ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４：１．、１４４；Ｇｒｕｓｂｙ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３、１４１７；Ｒｅｉｍｏｌｄ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：２６２；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．、１９９６．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ：３１３；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８２、１７４；Ｓｍｉｌｅｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．  １９９７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５、９７７）。例えば当該技術分野で既知である技術を使用して、ゲノムＴ−ｂｅｔクローンをゲノムライブラリーから単離し、イントロン−エキソンの構成を描き、そして第一のエキソンおよび上流のプロモーター配列の４５０ｂｐが欠失されているはずであるｃｒｅ−ｌｏｘベクター（下の検討を参照されたい）中のターゲッティング構築物を作成することができる。本構築物をＥＳ細胞系中に電気穿孔しそしてサザンブロット分析により二重化合物耐性（例えばネオマイシン、ガンシクロビル）クローンを同定することができる。次いでＴ−ｂｅｔ遺伝子座に相同的組換え事象をもつクローンを同定し、そして第３．５日のＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスから得られた胚盤胞に注入することができる。次いでキメラマウスを作出することができ、そして野性型ＢＡＬＢ／ｃマウスと交配して破壊されたＴ−ｂｅｔ遺伝子の生殖系列伝達を生成できる。
【０１３０】
別の態様では、ＲＡＧ−２欠損胚盤胞中への埋植（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、４５２８）もしくはｃｒｅ−ｌｏｘ誘導性の欠失取り組みを使用して、免疫系中でのみＴ−ｂｅｔを欠いているマウスを発生させることができる。例えば、ターゲッティング構築物をｃｒｅ−ｌｏｘベクター中で作成し得る。胚盤胞補完系を使用してＮＦＡＴｃ（胚の致死的表現型）が研究されている（Ｒａｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．ら１９９８．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１２５）。この取り組みはＥＳ細胞中の双方の染色体上のＴ−ｂｅｔ遺伝子を破壊させることを必要とし、それは例えば記載されている（Ｃｈｅｎ，Ｊ．１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０；４５２８）とおり、変異体ネオマイシン遺伝子を使用すること、およびＥＳ培養物中のＧ４１８濃度を上昇させることにより、あるいはｎｅｏ遺伝子にｃｒｅ−ｌｏｘ部位を隣接させることにより達成することができる。第二の対立遺伝子を破壊するために、ＥＳクローンをｃｒｅリコンビナーゼでトランスフェクトすることによりネオマイシン遺伝子を欠失させることができ、次いでＥＳクローンを同一のターゲッティング構築物で再トランスフェクトして双方の対立遺伝子上にＴ−ｂｅｔ欠失を伴うクローンを選択し得る。ｃｒｅリコンビナーゼでの第三のトランスフェクションが所望の二重欠損ＥＳ細胞を生じる。次いでそのような二重にターゲッティングしたＥＳ細胞をＲＡＧ２胚盤胞に埋植し、そしてこのように生成させたキメラマウスのリンパ系器官は移入されたＥＳ細胞により完全にコロニー形成される。これはＴ−ｂｅｔの不存在が致死性を引き起こすかもしれない他の器官系に影響を及ぼすことなくリンパ系の細胞に対するＴ−ｂｅｔの不存在の影響の評価を可能にする。
【０１３１】
ｃｒｅ−ｌｏｘ系を使用する条件消失（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ）の取り組みもまた使用可能である。簡単に説明すると、欠失されるべきエキソンに隣接するイントロン領域中に、ｌｏｘ組換え配列が置かれているターゲッティング構築物を生成する。次いでこの構築物をＥＳ細胞にトランスフェクトし、そして変異体マウスを上記のとおり作出する。生じる変異体マウスは次いで、誘導性プロモーターにより駆動されるｃｒｅリコンビナーゼに関してトランスジェニックのマウスと交配させる。ｃｒｅが発現される場合にそれはＴ−ｂｅｔ遺伝子中に導入されたｌｏｘ部位間の組換えを誘導し、従って遺伝子機能を効果的に破壊する。このアプローチの重要な特徴は、ｃｒｅリコンビナーゼを活性化することにより、成体動物中で随意に遺伝子破壊を誘導し得ることである。
【０１３２】
組織特異的プロモーターは免疫系の外の器官の異常を回避するために使用することができる。ｃｒｅを発現する導入遺伝子は誘導可能なプロモーターにより駆動され得る。いくつかの誘導性の系が現在ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え法で使用されており、最も一般的なものはテトラサイクリンおよびエクダイソン系である。Ｔ−ｂｅｔヌルマウスで胚の致死性が存在する場合には、組織特異的な誘導性プロモーターの使用が可能である。
【０１３３】
代替的取り組みは、調節されたＴ−ｂｅｔ遺伝子をもつトランスジェニックマウスを作出し（例えばテトラサイクリンオフプロモーターを使用して；例えばＳｔ−Ｏｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２４、３８７５−３８７７）、次いでこのトランスジェニックをＴ−ｂｅｔ欠損マウスと交配させることである。この取り組みは正常なＴ−ｂｅｔ機能をもつマウスの作出を可能にし；テトラサイクリンを成体動物に投与して末梢Ｔ細胞でのＴ−ｂｅｔ機能の破壊を誘導することができ、次いでＴ−ｂｅｔ欠損の影響を長期間にわたり検査することができる。化合物（テトラサイクリン）の供給およびその後の除去の反復周期が、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のスイッチを随意に入れるおよび切ることを可能にする。
【０１３４】
ＩＩＩ．単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質および抗Ｔ−ｂｅｔ抗体
本発明の別の局面は単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は配列番号１もしくは３によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様において、該タンパク質は配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様において、該タンパク質は配列に番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列と最低６０％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８０％、およびなおより好ましくは９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１３５】
他の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明はＴボックスドメインを含むＴ−ｂｅｔのアミノ末端部分をさらに包含する。多様な態様において、このアミノ末端部分はヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３８〜３２７、またはマウスＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３７〜３２６を包含する。本発明により提供されるＴ−ｂｅｔの別の単離された部分は、チロシンリン酸化部位を包含する一部分である。この部分はＴ−ｂｅｔの少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、または少なくとも約２００アミノ酸を含んでなり、またヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸Ｔｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９および／もしくはＴｙｒ５３１、または
マウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｔｙｒ５２５を含む。本明細書で提供されるＴ−ｂｅｔのなお別の単離された部分は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８〜５０１、またはマウスＴ−ｂｅｔの４９３〜４９６に示される核局在化配列を包含する一部分である。
【０１３６】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は好ましくは組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター（上記のような）にクローン化し、発現ベクターを宿主細胞（上記のような）に導入し、そしてＴ−ｂｅｔタンパク質を宿主細胞中で発現させる。次いで標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによりＴ−ｂｅｔタンパク質を細胞から単離することができる。組換え発現に代わり、標準的ペプチド合成技術を使用してＴ−ｂｅｔポリペプチドを化学的に合成し得る。さらに、天然のＴ−ｂｅｔタンパク質は例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用する免疫沈降により細胞（例えばＴ細胞）から単離することができる。
【０１３７】
本発明はＴ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントにもまた関する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントはＴ−ｂｅｔタンパク質の突然変異誘発、例えば別個の点突然変異もしくは短縮により生成させることができる。すなわち制限された機能のバリアントでの処置により特異的な生物学的影響を誘導することができる。１つの態様において、自然に生じる形態のタンパク質の生物学的活性の１サブセットを有する変異体での個体の処置は、天然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質での処置に比べて個体中でより少ない副作用を有する。１つの態様において、本発明は酸化、還元もしくは当該技術分野で既知の他の誘導体化方法によりＴ−ｂｅｔの少なくとも１個のアミノ酸残基を修飾することにより形成し得るＴ−ｂｅｔの誘導体に関する。
【０１３８】
１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）もしくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストのいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の突然変異体、例えば短縮突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、Ｔ−ｂｅｔタンパク質アゴニストもしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔバリアントの多様なライブラリーは核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによりコードされる。Ｔ−ｂｅｔバリアントの多様なライブラリーは例えば潜在的なＴ−ｂｅｔ配列の縮重組を個々のポリペプチドとしてあるいはその中にＴ−ｂｅｔ配列の組を含有する一組のより大きい融合タンパク質（例えばファージディスプレイのために）として発現可能となるように、遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的Ｔ−ｂｅｔバリアントのライブラリーを製造するために使用できる多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行い、そして合成遺伝子をその後に適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重組の使用は所望の組の潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列をコードする配列の全部の一混合物での供給を可能とする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
【０１３９】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためにＴ−ｂｅｔフラグメントの多様な集団を生成させることができる。１つの態様において、ニッキングが１分子あたり約１回のみ起こる条件下で、Ｔ−ｂｅｔコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること
、ＤＮＡを再生させて多様なニックの生成物からセンス／アンチセンス対を包含し得る二本鎖ＤＮＡを形成させること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コーディング配列のフラグメントのライブラリーを生成させることができる。この方法により、多様な大きさのＴ−ｂｅｔタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内的フラグメントをコードする発現ライブラリーを生成することができる。
【０１４０】
点突然変異もしくは短縮により作成したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。そのような技術はＴ−ｂｅｔタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により生成させた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高処理量分析に応じやすい最も広範に使用される技術には、典型的には遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的突然変異体の頻度を高める新たな技術である再帰アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、Ｔ−ｂｅｔバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイとともに使用し得る（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１４１】
本発明はまたＴ−ｂｅｔ融合タンパク質も提供する。本明細書で使用するように、Ｔ−ｂｅｔ「融合タンパク質」はＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドに操作可能に連結されたＴ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる。「Ｔ−ｂｅｔポリペプチド」はＴ−ｂｅｔタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特であるそのペプチドフラグメントを指す一方、「Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチド」は別のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内で、「操作可能に連結される」という用語はＴ−ｂｅｔポリペプチドおよび他のポリペプチドが相互に同じ読み枠で融合されることを示すことを意図している。他のポリペプチドはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合されてよい。例えば、１つの態様において、融合タンパク質はＴ−ｂｅｔ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質である。別の態様において融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープ標識に同じ読み枠で融合されているようなｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：３０６７−３０８２）のようなベクター中に、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列が挿入されるＴ−ｂｅｔ−ＨＡ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は組換えＴ−ｂｅｔの精製を促進することができる。
【０１４２】
好ましくは、本発明のＴ−ｂｅｔ融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造する。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、通常の技術（例えば連結のための平滑端もしくはねじれ型の（ｓｔａｇｇｅｒ）端にされた末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切なように付着端を埋めること、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理および酵素的連結を使用すること）に従って一緒に同じ読み枠で連結する。別の態様では、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成装置を含む通常技術により合成し得る。あるいは、２種の連続した遺伝子フラグメント間で相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施することができ、これはその後アニーリングし、そして再増幅してキメラ
遺伝子配列を生成することができる（例えば分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチドもしくはＨＡエピトープ標識）を既にコードしている多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、融合部分がＴ−ｂｅｔタンパク質に同じ読み枠で連結されているようなこうした発現ベクターにクローン化し得る。
【０１４３】
単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合する抗体を生成させるための免疫原として使用可能である。Ｔ−ｂｅｔタンパク質を使用して抗体を生成することができる。例えばポリクローナル抗血清は、完全長の組換えの細菌で生産されたＴ−ｂｅｔを免疫原として使用してウサギで生産することができる。この同じ免疫原を使用してマウスを免疫感作し、そして免疫感作したマウスから脾細胞を取り出すことによりｍＡｂを製造することができる。Ｔ−ｂｅｔに対する免疫応答が高まったマウスからの脾細胞を、骨髄腫細胞例えばＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫に融合することができる。付属として付けられる実施例に記述されるとおり、本方法を使用してＴ−ｂｅｔに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体が作成された。１つの態様では、該抗体はＴ−ｂｅｔノックアウト動物のようなＴ−ｂｅｔを発現しない動物中で生産され得る。別の態様では、抗体は例えば戻し交雑することにより達成されるとおり、特定の遺伝的バックグラウンドを有する非ヒト動物中で生成することができる。
【０１４４】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として使用することができる。Ｔ−ｂｅｔの抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を典型的に含んでなり、そしてペプチドに対し生じた抗体がＴ−ｂｅｔと特異的免疫複合体を形成するようなＴ−ｂｅｔのエピトープを包含する。好ましくは抗原性ペプチドは少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、および最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含んでなる。抗原性ペプチドにより包含される好適なエピトープはタンパク質の表面（例えば親水性領域）上に位置し、そしてＴ−ｂｅｔに独特であるＴ−ｂｅｔの領域である。１つの態様では、そのようなエピトープはマウスもしくはヒトのような１種からのＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的であり得る（すなわち、種を横断して保存されないＴ−ｂｅｔの一領域にわたる抗原性ペプチドを免疫原として使用する；こうした保存されない残基は本明細書に提供されるもののような整列を使用して決定可能である）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の標準的疎水性分析を実施して親水性領域を同定することができる。
【０１４５】
Ｔ−ｂｅｔ免疫原は、典型的には適切な個体（例えばウサギ、ヤギ、マウスもしくは他の哺乳動物）を該免疫原で免疫することにより抗体を調製するのに使用する。適切な免疫原性調製物は、例えば組換え的に発現されたＴ−ｂｅｔタンパク質もしくは化学的に合成されたＴ−ｂｅｔペプチドを含有し得る。該調製物はフロイントの完全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫賦活剤をさらに含むことができる。免疫原性Ｔ−ｂｅｔ調製物での適する個体の免疫感作は、ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体応答を誘導する。
【０１４６】
従って、本発明の別の観点は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は上記のように適する個体をＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫することにより調製可能である。免疫鑑査された個体中での抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価は、固定化したＴ−ｂｅｔを使用する酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的技術により長期間にわたって監視することができる。所望の場合は、Ｔ−ｂｅｔに対し向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し、そしてＩｇＧ画分を得るためプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製することができる。免疫感作後の適切な時点で、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価が最高である時に、抗体生産細胞を個体から得、そしてＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により元々は記述されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照されたい）、より最近ではヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）、モノクローナル抗体および癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、アランＲ．リス社（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、ｐｐ．７７−９６）もしくはトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は周知である（全般的に、モノクローナル抗体：生物学的分析における新規ひろがり（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ）、プレナム出版社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡単に説明すると、不死化細胞系（典型的には骨髄腫）を上記のＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫感作した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）と融合し、そして生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを同定する。
【０１４７】
リンパ球および不死化細胞系を融合するのに使用される多くの公知のプロトコールのいずれも、抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を生成させる目的上応用することができる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、同上に引用される；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、同上；Ｋｅｎｎｅｔｈ、モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、同上を参照されたい）。さらに当業者はこうした方法の多くの変法が存在し、それらもまた有用であると考えるであろう。典型的には、不死細胞系（例えば骨髄腫細胞系）はリンパ球と同じ哺乳動物種由来である。例えばマウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫感作したマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞系と融合することにより作成し得る。好適な不死化細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞系である。多数の任意の骨髄腫細胞系、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３もしくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統を標準的技術に従って融合パートナーとして使用してよい。これらの骨髄腫系統はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的にはＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、融合されていない、および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地を使用して選択する（融合されない脾細胞は形質転換されていないためそれらは数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＴ−ｂｅｔに結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出される。
【０１４８】
こうした方法を使用してＴ−ｂｅｔに対する数種の抗体が生成されてきた。完全長の組換えの細菌に生産されたＴ−ｂｅｔタンパク質に対するモノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体が生成された。３Ｄ１０抗体はＩｇＧサブタイプのものであり、また４Ｂ１０抗体はＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫へのマウス脾細胞の融合により製造され、そしてＩｇＧサブタイプのものである。３９Ｄ抗体はヒトおよびマウス双方のＴ−ｂｅｔを認識する。
【０１４９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することに代わり、モノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＴ−ｂｅｔでスクリーニングしてそれによりＴ−ｂｅｔを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより同定かつ単離可能である。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットが市販されている（例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の組換えファージ抗体系（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）、カタログ番号２７−９４００−０１；およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット（Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ）、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用にとりわけ応じやすい方法および試薬の例は、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  国際公開第  ９２／１８６１９号明細書；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第  ９１／１７２７１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／２０７９１号明細書；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／１５６７９号明細書；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９３／０１２８８号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０１０４７号明細書；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０９６９０号明細書；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９０／０２８０９号明細書；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見出すことができる。
【０１５０】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよび非ヒト双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗Ｔ−ｂｅｔ抗体が本発明の範囲内にある。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ出願第ＷＯ  ８６／０１５３３号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を使用して製造可能である。
【０１５１】
別の態様において、完全にヒトの抗体を当該技術分野で既知である技術を使用して作成することができる。例えば、特定の１抗原に対する完全にヒトの抗体は、抗原対抗に応答してこうした抗体を生産するよう修飾されているが、その内因性の遺伝子座が不能にされているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製することができる。抗体を作成するために使用できる例示的技術は米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号明細書に記載されている。他の技術は当該技術分野で既知である。
【０１５２】
抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）を使用して、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降法のような標準的技術によりＴ−ｂｅｔを単離することができる。抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は細胞からの天然のＴ−ｂｅｔおよび宿主細胞中で発現された組換え的に生産されたＴ−ｂｅｔの精製を促進する可能性がある。さらに、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用して（例えば細胞ライセートもしくは細胞上清中の）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出できる。検出可能な基質に抗体をカップリング（すなわち物理的に連結）することにより検出が促進されうる。従って、１つの態様において、本発明の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を検出可能な基質で標識する。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および放射活性物質を含む。適する酵素の例は西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼを含み；適する補欠分子団複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適する蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンを含み；発光物質の一例はルミノールを含み；そして適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓもしくは３Ｈを含む。
【０１５３】
さらに別の本発明の観点は：
（ａ）免疫原性のＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特のその免疫原性の部分で動物を免疫感作し；そして
（ｂ）動物からＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体を単離する
ことを含んでなる方法により得られる抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。
【０１５４】
免疫感作および特異的抗Ｔ−ｂｅｔ抗体の回収方法は上にさらに記載されている。
【０１５５】
さらに別の観点では、本発明はＴ−ｂｅｔイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）に関する。イントラボディは細胞の内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に対し向けられた細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉ
ｏｌ．１５（１）：１８２−９１）。例えば、イントラボディ（例えばおよびｓｃＦｖ）は柔軟性リンカーにより連結され、そして単一遺伝子から発現された重鎖および軽鎖の可変領域を含むことができる。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、ｓｃＦｖの特異性を決定する親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）すなわち主抗原結合ドメインを含む。ｓｃＦｖ遺伝子を細胞中に移入することができ、ここでｓｃＦｖタンパク質発現はその標的例えばＴ−ｂｅｔの特性を調節することができる。従って１つの態様では、本発明は例えば細胞
をこうしたイントラボディを発現するよう改変するｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏの取り組みにおいて、細胞中でＴ−ｂｅｔ活性を防止するためのこうしたＴ−ｂｅｔイントラボディの使用方法を提供する。１つの特定の態様において、本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔ活性を直接阻害することができる。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔイントラボディを使用してＴ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｅｔが相互作用するタンパク質の相互作用を阻害することができる。このように本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディは、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路の調節において有用である。
【０１５６】
Ｔ−ｂｅｔイントラボディは当該技術分野で既知の技術を使用して製造可能である。例えば、ファージディスプレイ技術を使用してｓｃＦｖをライブラリーから単離できる（Ｌｏｗｍａｎ，ＨＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（１０）：８３２−８）。特定の抗原に結合するｓｃＦｖを選択するために、ｓｃＦｖを外被タンパク質、典型的には繊維状Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ（ｇ３ｐ）に融合する。固定化された抗原に結合するファージ上のｓｃＦｖが、結合、溶出および増幅の連続周期の間に濃縮される。別の例において、リボソームディスプレイを使用してＴ−ｂｅｔイントラボディを調製できる（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１）：９３７−４４）。リボソームディスプレイはペプチドを遺伝情報（ｍＲＮＡ）に直接連結するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。転写翻訳系を使用してｓｃＦｖ  ＣＤＮＡライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させる。翻訳されたＳｃＦｖを、コーディングｍＲＮＡに連結されたリボソームに閉入する。次いで固定された抗原にｓｃＦｖを結合させ、そして非特異的リボソーム複合体を徹底的な洗浄により除去する。残存する複合体を溶出し、そしてＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、そしてその後ＰＣＲにより再増幅する。さらに別の例では、タンパク質フラグメント補完アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（ＰＣＡ）を使用して本発明のＴ−ｂｅｔイントラボディを調製できる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，ＪＮ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５（１２）：１４１−６．）これはマウスタンパク質（ｍＤＨＦＲ）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の変異体ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の補完に基づく細胞選択手順である。マウスＤＨＦＲを２部分に切断し、これらを潜在的に相互作用性のペプチドとの融合タンパク質として発現させる。融合タンパク質の相互作用がｍＤＨＦＲの酵素活性、および従って細菌増殖を復帰させる。抗体および抗原の特定の１相互作用のみがｓｃＦｖの選択に応じやすい系を作成するＤＨＦＲの機能補完を可能にする（Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５−２２）。
【０１５７】
ＩＶ．製薬学的組成物
本発明の調節物質（例えば、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを直接刺激するか、または減少する）は、投与に適する製薬学的組成物中に組込むことができる。そのような組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」は、製薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的に活性な物質のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野で周知である。通常の媒体もしくは作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的な活性化合物もまた組成物中に組込むことができる。
【０１５８】
本発明の製薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように配合される。例えば、非経口、皮内もしくは皮下適用に使用される溶液もしくは懸濁剤には、以下の成分；すなわち注射用水、生理的食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくは他の合成溶媒のような滅菌の希釈剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝剤および塩化ナトリウムもしくはデキトロースのような張性の調節のための作用物質を含むことができる。ｐＨは塩酸もしくは水酸化ナトリウムのような酸もしくは塩基で調節できる。非経口調製物はガラスもしくはプラスチックから作成されるアンプル、使い捨てシリンジもしくは多回用量バイアル中に封入し得る。
【０１５９】
注入可能な使用に適する製薬学的組成物には、滅菌の水性溶液（水に可溶性の場合）もしくは分散剤、および滅菌の注入可能な溶液もしくは分散剤の即座の調製のための無菌粉末を包含する。静脈内投与に適する担体は、生理学的生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）もしくはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を包含する。すべての場合で、組成物は滅菌でなくてはならず、そして容易なシリンジ操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性であるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、しかも細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびにそれらの適する混合物を含有する溶媒もしくは分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は多様な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合で等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましい。注入可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に包含することによりもたらすことができる。
【０１６０】
滅菌の注入可能な溶液は、必要とされ上で挙げた成分の１種もしくは組合せを含む適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物を包含し、次いで濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散剤は上で挙げられたものからの基礎分散媒質および必要とされる他の成分を含有する滅菌賦形剤中に活性化合物を包含することにより調製する。滅菌の注入可能な溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好適な調製方法は真空乾燥、および以前に滅菌濾過されたその溶液からのさらなる所望の成分に加えて活性化合物の粉末を生じる凍結乾燥である。
【０１６１】
経口組成物は一般に不活性希釈剤もしくは可食担体を含む。それらはゼラチンカプセル中に封入し得るか、または錠剤に圧縮し得る。経口の治療的投与の目的に、活性化合物を賦形剤と包含し、そして錠剤、トローチ剤もしくはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はマウスウォッシュとしての使用のため液体担体を使用しても調製可能であり、ここでは液体担体中の化合物を口腔に適用し、そして音をたてかつ喀出もしくは嚥下する。製薬学的に適合性の結合剤および／もしくは補助物質を組成物の一部として包含し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分もしくは類似の性質の化合物：すなわち微晶質セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）もしくはトウモロコシデンプンのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香料のような香味料のいずれかを含有することができる。
【０１６２】
１つの態様において、活性化合物はインプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のような身体からの迅速な排泄に対し化合物を保護することができる担体とともに調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを使用できる。こうした製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。物質はまたアルザコーポレーション（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞に標的を定めたリポソームを包含する）もまた製薬学的に許容できる担体として使用可能である。これらは例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記述されるところの当業者に既知の方法に従い調製できる。
【０１６３】
１つの態様において、調節剤を含んでなる組成物はＴ−ｂｅｔにより影響を受ける細胞応答を調節するために有用な第二の作用物質を含んでなることができる。例えば１つの態様において、Ｔｈ２系譜コミットメントをダウンイジュレートする作用物質を、液性免疫応答をダウンレギュレートする第二の作用物質と組み合わせて投与することができる。あるいは例えば別の態様で、Ｔｈ２系譜コミットメントをアップモジュレートする作用物質を、細胞性免疫応答をダウンモジュレートする作用物質と一緒に投与することができる。こうした作用物質はＴ−ｂｅｔ調節剤と同じ製薬学的組成物の一部として投与してもよく、または別個の投与のために配合してよい。
【０１６４】
Ｖ．本発明の方法
Ａ．診断アッセイ／予後アッセイ
本発明の別の観点は、本発明の多様なＴ−ｂｅｔ組成物の使用方法に関する。例えば、本発明は生物学的サンプル中のＴ−ｂｅｔ活性の存在の検出方法を提供する。そのようなアッセイは、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを調節することが望ましい可能性がある細胞の同定に有用となり得る。この方法はＴ−ｂｅｔ活性の存在が生物学的サンプル中で検出されるようなＴ−ｂｅｔタンパク質もしくはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのようなＴ−ｂｅｔ活性を検出することが可能な作用物質と生物学的サンプルを接触させることが関与する。
【０１６５】
Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの検出のための好ましい作用物質は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。核酸プローブは例えば長さが少なくとも約５００、６００、８００、９００、１０００、１２００、１４００もしくは１６００ヌクレオチドで、しかもストリンジェントな条件下でＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのような、配列番号１もしくは３のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡであることができる。
【０１６６】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための好ましい作用物質は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に結合することが可能な標識抗体である。抗体はポリクローナルもしくはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブもしくは抗体に関して「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブもしくは抗体にカップリング（すなわち物理的に連結）することによるプローブもしくは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブもしくは抗体の間接標識を包含することを意図している。間接標識の例は蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は組織、細胞および生物学的流体を包含することを意図している。例えばＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの検出のための技術には、ノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。
【０１６７】
こうしたアッセイは発生欠陥を特徴とする症候群の検出において有用である。例えばヒトＴボックス遺伝子ＴＢＸ５およびＴＢＸ３（マウスＴｂｘ５およびＴｂｘ３のオルソログ）中の突然変異はそれぞれ常染色体優性遺伝疾患ホールト−オーラム症候群および尺骨乳腺症候群の原因である（Ｂａｍｓｈａｄ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：３１１；Ｂａｓｓｏｎ，Ｃ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：３０；Ｌｉ，Ｑ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：２１；Ｓｐｒａｎｇｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３：９７８）。これらの症候群は発生欠陥を特徴とし、そしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。ホールト−オーラム症候群は心および上肢を冒す一方、尺骨乳腺症候群は四肢、アポクリン腺、歯および生殖器の発生に影響を及ぼす。双方の症候群は発生欠陥を特徴とし、そしてそれぞれＴｂｘ５およびＴｂｘ３の発現のパターンにより予測されていたかもしれない。これらの患者における突然変異はＴボックス遺伝子中の一対立遺伝子のみを関わらせ、従ってＴｂｘ３およびＴｂｘ５のハプロ不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）がこれら２疾患を引き起こすと仮定されている。最近、発生中のニワトリ胚へのＴｂｘ４およびＴｂｘ５の供給が肢芽の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を制御することが示された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。これらの発見は脊椎動物の発生におけるこのファミリーの決定的な重要性を強調する。
【０１６８】
加えて、多くの種におけるＴ−ｂｅｔ遺伝子相同物の存在は、中胚葉発生に関与する今のところは未知の一組の標的遺伝子を調節する転写因子としてのその機能に関する強力な証拠を提供する。Ｔボックスファミリーの最近の突出は、ヒト疾患においてＴボックス突然変異により最も劇的に例示される多彩な発生過程におけるその明らかな重要性から生じる。胸腺細胞幹細胞からの成熟Ｔ細胞およびナイーブな前駆細胞からの分化したＴｈ細胞の生成もまた厳格に調節される発生過程としてみることができる。Ｔ−ｂｅｔがＴｈ１系列の発生を司るというこの発見は、リンパ系におけるこの最新のＴボックスファミリーメンバーの重要な役割を示している。
【０１６９】
Ｂ．スクリーニング法
本発明はさらに、Ｔｈ２系譜コミットメントを直接的に調節、例えば増加または減少させ、かつ／またはＴｈ２サイトカイン生産を直接的に調節、例えば増加または減少させる化合物、すなわち候補または試験化合物または作用物質（例えばペプチド模造物、低分子（例えば低有機分子または他の薬剤））を同定する方法を提供する。Ｔｈ２系譜コミットメントの調節物質は知ることができ（例えばＴ−ｂｅｔ活性のドミナントネガティブインヒビター、ＧＡＴＡ３または１もしくは複数のＴｅｃキナーゼ、アンチセンスＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３またはＴｅｃキナーゼ、Ｔ−ｂｅｔを妨害する細胞内抗体、またはＴｅｃキナーゼ活性、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３またはＴｅｃキナーゼに由来するペプチドインヒビター）、核酸もしくはタンパク質Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３もしくはＴｅｃキナーゼ分子、キナーゼのアクチベーターまたはインヒビター（例えばチロシンキナーゼアクチベーターもしくはインヒビター）、あるいは本明細書に記載する方法を使用して同定することができる。
【０１７０】
例えば１つの態様では、相互作用、例えばＴ−ｂｅｔのキナーゼ分子、例えばＴｅｃキナーゼへの結合を調節する分子を同定することができる。例えばＴｅｃキナーゼ、例えば
ＩｔｋはＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を媒介し、したがって任意のこれらの分子を本スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。以下のこの章および他の章で記載する特定の態様は、例としてこれら分子の１つを挙げるが、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路と相互作用し、かつ／または関与する他の分子も本スクリーニングアッセイに使用することができる。
【０１７１】
１つの態様では、化合物がＴ−ｂｅｔとＴｅｃキナーゼとの間の複合体の形成を直接調節する、例えば増加するかまたは安定化する、または不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅ）する能力を測定する。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔの翻訳後修飾（例えばリン酸化）またはＩｔｋもしくはＴ−ｂｅｔの発現および／または活性が、本発明のスクリーニングアッセイを使用して指標組成物中で測定される。さらに別の態様では、ＧＡＴＡ３とＴ−ｂｅｔとの間の複合体の形成が測定される。さらなる態様では、Ｔｈ２サイトカイン生産が測定される。
【０１７２】
指標組成物は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質またはＴ−ｂｅｔと相互作用する分子またはＴ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の分子を発現する細胞、例えば自然に発現される細胞、さらに好ましくはタンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することによりタンパク質を発現するように工作された細胞であり得る。好ましくは細胞は哺乳動物細胞、例えばヒトの細胞である。１つの態様では、細胞はＴ細胞である。１つの好適な態様では、細胞はＴ細胞系譜コミットメントを有する（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）。別の好適な態様では、細胞は未だＴ細胞系譜コミットメントをもたない。別の態様では細胞はＢ細胞である。さらに別の態様では、細胞はＮＫ細胞である。あるいは指標組成物は、タンパク質（例えば細胞抽出物または例えば精製された天然もしくは組換えタンパク質のいずれかを含む組成物）を含む無細胞組成物である。
【０１７３】
Ｔｈ２系譜コミットメントを直接調節する化合物の能力は、例えばＴｈ２特異的サイトカインの生産を測定することにより決定することができる。また化合物がＴｈ２系譜コミットメントを直接調節する能力は、例えばＩｔｋの発現および／または活性を測定することにより決定することができる。例えばＩｔｋは、Ｔ−ｂｅｔのような標的分子を、Ｔ−ｂｅｔのチロシン残基５２５（Ｙ５２５）でリン酸化、例えばチロシンリン酸化するＴｅｃキナーゼである。さらに化合物がＴｈ２系譜コミットメントを直接調節する能力は、例えばＴ−ｂｅｔの発現および／または活性を測定することによっても決定することができる。例えばＴ−ｂｅｔは転写因子であり、したがってＤＮＡに結合し、そして遺伝子、例えばサイトカイン遺伝子の発現を実施例に教示するように調節する。したがって本発明のスクリーニング法の具体的態様では、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドがＤＮＡまたは他の標的分子（例えばＧＡＴＡ３、Ｔｅｃキナーゼ、またはＩＬ−２もしくはＩＦＮ−γプロモーター）に結合する能力を活用して、遺伝子発現を調節する（例えばＩＬ−２遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子のトランス活性化を抑制することにより例えばＴｈ１関連サイトカイン遺伝子の発現を調節するか、あるいはＴｈ２関連サイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−４遺伝子またはＩＬ−１０遺伝子の発現を調節するか（例えばＧＡＴＡ３がＤＮＡに結合する能力を下げることにより）、あるいは他の遺伝子の発現を調節する（例えばＴＧＦ−βまたはＴＬＲ６のようなＴｏｌｌ−様受容体遺伝子を抑制することにより））。
【０１７４】
１つの態様において、本発明は調節物質、すなわちＴ−ｂｅｔポリペプチドに結合する；Ｔ−ｂｅｔ発現に刺激または阻害効果を有する；Ｔ−ｂｅｔプロセシング；Ｔ−ｂｅｔ翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化もしくはリン酸化）；またはＴ−ｂｅｔ活性；あるいはＴ−ｂｅｔ結合パートナーまたは標的分子の発現、プロセシングもしくは活性に刺激もしくは阻害効果を有する候補もしくは試験化合物もしくは作用物質（例えば酵素、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、リボザイムもしくはＴ−ｂｅｔアンチセンス分子）の同定方法を提供する。
【０１７５】
１つの好適な態様では、本発明はＴ細胞分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の同定法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＴｅｃキナーゼ分子をキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでＴ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に増加する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の減少により示される。
【０１７６】
別の態様では、本発明はＴ細胞分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に減少する化合物の同定法を特徴とし、この方法は化合物の存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＴｅｃキナーゼ分子をキナーゼ分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔおよびキナーゼ分子の相互作用を検出することを含んでなり、ここでＴ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に減少する化合物の能力が、化合物の不存在下での相互作用の量と比べた時の相互作用の上昇により示される。
【０１７７】
別の好適な態様では、Ｔ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接的に調節（例えば増加または減少）するために有用な化合物の同定方法を特徴とし；
ａ）ＩＴＫ、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を含んでなる指標組成物を準備し；
ｂ）指標組成物を試験化合物のライブラリーの各メンバーと接触させ；
ｃ）試験化合物のライブラリーから、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３のＩＴＫが媒介する相互作用を調節する（例えば減少または増加）目的化合物（１もしくは複数）を選択し、これによりＴｈ２系譜コミットメントを直接的に調節する化合物を同定することを含んでなる。
【０１７８】
さらに別の好適な態様では、Ｔ細胞中のＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との相互作用を調節する化合物の同定方法を特徴とし、この方法は化合物およびＩＴＫの存在下で、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３を、ＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔのＧＡＴＡ３への結合により複合体を形成することを可能とする条件下で接触させ；そしてＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との複合体の形成を検出することを含んでなり、ここでＩＴＫおよび化合物の存在下でＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３との間の相互作用を調節（例えば増加または減少）する化合物の能力が、ＩＴＫおよび化合物の不存在下で形成される複合体の量と比べた複合体の形成の調節に示される。
【０１７９】
さらに別の好適な態様では、本発明はＴ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントを直接調節（例えば増加または減少）する方法を特徴とし、この方法はＴ細胞の分化の間中のＴｈ２系譜コミットメントが直接調節されるように、Ｔ細胞中でＩＴＫ媒介型のＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３結合を直接する（例えば減少または増加）する作用物質と細胞を接触させることを含んでなる。
【０１８０】
本明細書に記載するアッセイを使用して同定される化合物は、異常なＴ−ｂｅｔ発現、プロセシング、翻訳後修飾、またはＴ細胞系譜コミットメントの活性、調節、サイトカイン生産の調節、ＴＧＦ−β媒介型シグナリングの調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチングの調節、Ｂリンパ球機能の調節に関連する障害を処置するために有用となり得る。
【０１８１】
Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３および／またはキナーゼとの間の複合体の形成および／または安定性を減少させることによりＴｈ２サイトカイン生産のアップモジュレーションから利益を得ることができる状態には、特定の免疫不全障害の障害またはＴｈ１サイトカインの生産が高すぎる可能性がある障害を含む。
【０１８２】
Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３および／またはキナーゼとの間の複合体の形成および／または安定性を増加させることによりＴｈ２サイトカイン生産のダウンレギュレーションから利益を得る可能性がある状態には：糖尿病、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎、乾癬、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）ならびに間隙性肺線維症を包含する自己免疫障害を包含する。
【０１８３】
個体のスクリーニングアッセイを他の作用物質の存在もしくは非存在下で実施することができる。例えば、スクリーニングされている細胞の活性化状態を調節する様々な作用物質の存在下で個体のアッセイを実施することができる。例えば１つの態様において、Ｔ細胞受容体を介してシグナルを伝達する作用物質が含まれる。別の態様において、サイトカインもしくはサイトカイン受容体に対する抗体が含まれる。別の態様では、リン酸化、例えばチロシンリン酸化を阻害する作用物質も含まれる。
【０１８４】
別の観点では、本発明は本明細書に記載する２以上のアッセイの組合せに関する。例えば、細胞に基づくもしくは無細胞アッセイを使用して調節剤を同定することができ、そして系列への分離を調節する作用物質の能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば多発性硬化症（ＥＡＥ）、慢性関節リウマチもしくは感染症の動物モデルのような動物で確認し得る。
【０１８５】
さらに本明細書に記載するように同定されたＴｈ２系譜コミットメントおよび／またはＴｈ２サイトカイン生産の調節物質（例えばドミナントネガティブＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３もしくはＴｅｃキナーゼ分子、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３もしくはＴｅｃキナーゼ核酸もしくはポリペプチド分子、アンチセンスＴ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３もしくはＴｅｃキナーゼ核酸分子、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡもしくはＴｅｃキナーゼ特異的抗体、または低分子）を動物モデルで使用して、こうした調節物質での処置の効力、毒性もしくは副作用を決定し得る。あるいは本明細書に記載するように同定された調節物質を動物モデルで使用して、そのような調節物質の作用機序を決定することができる。
【０１８６】
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを使用して、例えば上記のようなスクリーニングアッセイを行うが、しかしＴ−ｂｅｔが相互作用する分子、すなわちＴｅｃキナーゼまたはＧＡＴＡ３のようなシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流いずれかで作用する分子を使用することにより、Ｔｈ２系列への分化を調節する化合物を同定することができる。
【０１８７】
従って以下に記載するように、本発明はＴ−ｂｅｔおよびＴボックス結合領域（例えばＩＬ−２もしくはＩＦＮ−γ遺伝子制御領域のようなサイトカイン遺伝子制御領域）の相互作用、あるいはＧＡＴＡ３（またはＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ３およびＴｅｃキナーゼとの間の複合体）がＤＮＡに結合する能力を調節する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を検出するアッセイは当該技術分野で既知である（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイ等）。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用してその標的ＤＮＡ配列とのＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定し得る。
【０１８８】
本発明の細胞に基づくおよび無細胞アッセイを以下により詳細に記載する。
【０１８９】
ｉ．細胞に基づくアッセイ
本発明の指標組成物は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド（および／またはＴｅｃキナーゼ、例えばＩｔｋのような１もしくは複数の非−Ｔ−ｂｅｔポリペプチド）を発現する細胞、例えば内因性のＴ−ｂｅｔを天然に発現する細胞、またはより好ましくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより外因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞であり得る。あるいは、指標組成物はＴ−ｂｅｔおよび／またはＴｅｃキナーゼ、例えばＩｔｋのような非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを含む無細胞組成物（例えばＴ−ｂｅｔ発現細胞からの細胞抽出物または精製されたＴ−ｂｅｔ（天然もしくは組換えいずれかのポリペプチド）を包含する組成物）であり得る。
【０１９０】
Ｔｈ２系譜コミットメントおよび／またはＴｈ２サイトカインの生産を調節、例えば直接する化合物は、様々な「読み出し」を使用して同定することができる。
【０１９１】
例えば、指標細胞をＴ−ｂｅｔ発現ベクターでトランスフェクトし、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートし、そして分子の発現またはＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答に対する化合物の影響を測定することができる。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は、標準的技術に従ってｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される活性を含む。Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子（例えばサイトカイン遺伝子またはポリペプチド、例えばキナーゼ（例えばＴｅｃキナーゼ）または転写因子（ＧＡＴＡ３）の転写制御領域のようなＴ−ｂｅｔが結合する核酸分子）と、Ｔ−ｂｅｔとの会合のような直接の活性であり得る。あるいはＴ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドとＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用の下流で起こる細胞のシグナル伝達活性、またはその相互作用により誘発されたシグナリングカスケードの結果として起こる生物学的影響のような下流の活性である。例えば、本明細書に記載されるＴ−ｂｅｔの生物学的活性は：例えばサイトカインの生産を直接的に調節することによるＴ細胞系譜コミットメントの調節、生産されたサイトカインの下流への効果の調節を含む。Ｔ−ｂｅｔの多様な生物学的活性は当該技術分野で既知である技術を使用して測定可能である。例示的技術は実施例により詳細に記載する。
【０１９２】
試験化合物がサイトカイン発現を調節するかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイを行うことができる。そのようなアッセイを実施するために、サイトカインの完全長のプロモーターおよびエンハンサー（またはその一部）をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）もしくはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に操作可能に連結し、そして宿主細胞中に導入することができる。
【０１９３】
本明細書で互換的に使用する用語「操作可能に連結される」および「効果的に連結される」とは、ヌクレオチド配列が宿主細胞中での（もしくは細胞抽出物による）このヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味することを意図している。制御配列は技術的に認識され、かつ適切な宿主細胞中での所望のポリペプチドの発現を指図するように選択し得る。制御配列という用語はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現制御要素を包含することを意図している。そのような制御配列は当業者に既知であり、そしてＧｏｅｄｄｅｌ、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの設計はトランスフェクトされるべき宿主細胞の選択および／または発現されるべき所望のポリペプチドの型および／または量のような因子に依存しうることが理解されるべきである。
【０１９４】
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知でありかつ本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼをコードするものを含む。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
【０１９５】
様々な細胞型が該スクリーニングアッセイでの指標細胞としての使用に適する。好ましくは、Ｔｈ２細胞クローンもしくはノックアウト動物からの細胞のような通常はＴ−ｂｅｔを発現しない細胞系を使用する。ＨｅｐＧ２肝癌細胞株のような非リンパ系細胞系もまた指標細胞として使用可能である。酵母細胞もまた指標細胞として使用可能である。
【０１９６】
本アッセイで使用する細胞は、真核生物または原核生物起源であり得る。例えば、１つの態様では細胞は細菌細胞である。別の態様では細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ細胞または哺乳動物細胞である。好適な態様では、細胞はヒトの細胞である。
【０１９７】
１つの態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現レベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を刺激する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の不存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を阻害する化合物と同定される。
【０１９８】
１つの態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方法を提供する。
【０１９９】
標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する、またはＴ−ｂｅｔに結合する試験化合物の能力もまた測定し得る。標的分子（例えば結合パートナー）へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ標的分子を検出することによりＴ−ｂｅｔへのＴ−ｂｅｔ標的分子の結合が測定可能であるように、放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識とＴ−ｂｅｔ標的分子をカップリングすることにより達成し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔを放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識とカップリングして、複合体中のＴ−ｂｅｔ標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を監視することができる。Ｔ−ｂｅｔを結合する試験化合物の能力を測定することは、例えば複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ化合物を検出することによりＴ−ｂｅｔへの化合物の結合が測定可能であるように、放射性同位元素、酵素もしくは蛍光標識と化合物をカップリングすることにより達成することができる。例えば、Ｔ−ｂｅｔ標的は直接もしくは間接のいずれかで１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３Ｈで標識可能であり、そして放射能発射の直接計数もしくはシンチレーション計数により放射性同位元素を検出できる。あるいは化合物を例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはルシフェラーゼで酵素的に標識可能でき、そして適切な基質の産物への転換の測定により酵素標識を検出し得る。
【０２００】
相互作用体のいずれの標識も伴わずに、Ｔ−ｂｅｔと相互作用する化合物の能力を測定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理機能測定器を使用して化合物もしくはＴ−ｂｅｔいずれの標識も伴わずにＴ−ｂｅｔとの化合物の相互作用を検出することができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  
２５７：１９０６−１９１２）。本明細書で使用されように「微小生理機能測定器」（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、光接近可能な電位測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とＴ−ｂｅｔとの間の相互作用の指標として使用できる。
【０２０１】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する、Ｔ−ｂｅｔが関与する経路中で作用する異なる（すなわち非Ｔ−ｂｅｔ）分子を、スクリーニングアッセイでの使用に指標組成物中に含むことができる。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、間接的にではあろうともＴ−ｂｅｔ活性の調節において有用となり得る。Ｔ−ｂｅｔが相互作用する例示的一分子はＴｅｃキナーゼ、例えばＩＴＫもしくはＲＬＫおよび／またはＧＡＴＡ３を包含する。
【０２０２】
本発明の細胞は内因性のＴ−ｂｅｔ（もしくはＴ−ｂｅｔが関与するシグナリング経路中の別のポリペプチド）を発現し得るか、またはそうするように工作してもよい。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを発現するよう工作されている細胞は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用する非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞中に導入することにより生成することができる。
【０２０３】
指標細胞中でＴ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用するＴ−ｂｅｔポリペプチドまたは非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現に使用し得る組換え発現ベクターは、当該技術分野で既知である。１つの態様では、発現ベクター内で指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導性または構成的発現を可能にする制御配列（例えばサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーのようなウイルス制御配列を使用できる）にＴ−ｂｅｔコーディング配列を効果的に連結する。指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導性または構成的発現を可能にする組換え発現ベクターの使用が、Ｔ−ｂｅｔの活性を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。代替の一態様において、発現ベクター内でＴ−ｂｅｔコーディング配列を内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子の制御配列（すなわち内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子由来のプロモーター制御領域）に操作可能に連結する。Ｔ−ｂｅｔ発現が内因性制御配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、Ｔ−ｂｅｔの転写発現を高めるもしくは阻害する化合物の同定に好ましい。
【０２０４】
Ｔｈ１関連サイトカイン遺伝子を（例えばレポーター遺伝子として、またはＴ−ｂｅｔ活性を評価するための読み取りとして）利用する方法では、好ましくはＴｈ１関連サイトカインがインターフェロン−γもしくはＩＬ−２である。添付する実施例に記載されるとおり、Ｔ−ｂｅｔはＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づく酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。従って、１つの態様では、本発明の一方法は近位ＩＬ−２プロモーターのこの領域、最も好ましくはＩＬ−２プロモーターのヌクレオチド−２４０ないし−２２０を含有するレポーター遺伝子構築物を利用する。使用し得る他の配列は：コンセンサスＴボックス部位、ヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩ、マウスＩＦＮ−γ近位プロモーター中の２個の結合部位を包含する。（Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９）。
【０２０５】
１つの態様では、誘導性の系を構築し、そして高処理量の細胞に基づくスクリーニングに使用して、Ｔ−ｂｅｔの発現および／もしくは活性に影響を及ぼす標的化合物を同定かつ特徴づけることができる。誘導性の系は、例えば、エクダイソンに駆動されるＴ−ｂｅｔ発現プラスミドとコトランスフェクトしたエクダイソン受容体およびＩＦＮ−γプロモータールシフェラーゼレポーターを発現する接着性２９３Ｔヒト胚腎細胞株のサブクローンを使用することにより、通常はＩＦＮ−γを生産しない細胞株を使用して構築可能である。（Ｗａｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：４１４；Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：３３４６；Ｇｒａｈａｍ．２００２  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５２５）。昆虫ホルモンエクジソンでの処理に際してＴ−ｂｅｔが発現され、ＩＦＮ−γレポーターが活性化され、そしてルシフェラーゼ活性が生成される。この系において、Ｔ−ｂｅｔは細胞株に内因性のＩＦＮ−γを産生する能力を与える。
【０２０６】
ｉｉ．無細胞アッセイ
別の態様において、指標組成物は無細胞組成物である。宿主細胞もしくは培地中で組換え法により発現されたＴ−ｂｅｔが関与する経路においてＴ−ｂｅｔの上流もしくは下流で作用するＴ−ｂｅｔもしくは非Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを、ポリペプチドの標準的精製方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＴ−ｂｅｔに特異的な抗体との免疫親和性精製を使用して宿主細胞もしくは細胞培地から単離して無細胞組成物中で使用できるタンパク質を生成することが可能である。あるいは、無細胞組成物として使用するために、Ｔ−ｂｅｔもしくは非Ｔ−ｂｅｔ発現細胞の抽出物を調製することができる。
【０２０７】
１つの態様では、Ｔ−ｂｅｔ活性を特異的に調節する化合物は、Ｔ−ｂｅｔが結合する標的分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を調節するそれらの能力に基づき同定される。標的分子はＤＮＡ分子、例えばサイトカイン遺伝子の制御領域のようなＴ−ｂｅｔ応答性要素）、またはポリペプチド分子、例えばＴｅｃキナーゼであり得る。タンパク質−タンパク質相互作用（例えば免疫沈降、蛍光偏光もしくはエネルギー伝達、２ハイブリッドアッセイ等）の検出を可能とする、または標的ＤＮＡ配列とＤＮＡ結合タンパク質との間の相互作用の検出を可能とする（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリンティングアッセイ等）適切なアッセイが当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および不存在下でそのようなアッセイを行うことにより、これらのアッセイを使用して標的分子とＴ−ｂｅｔとの相互作用を調節する（例えば阻害するもしくは高める）化合物を同定することができる。
【０２０８】
１つの態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より大きく、この場合は試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を高める、または安定化する化合物と同定される。別の態様では、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の不存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より少なく、この場合は試験化合物がＴ−ｂｅｔの結合を阻害する、または不安定化する化合物と同定される。
【０２０９】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドへの試験化合物の結合は、上記のように直接もしくは間接的いずれかで測定できる。試験化合物に結合するＴ−ｂｅｔポリペプチドの能力を測定することはまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）のような技術を使用しても達成し得る（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。本明細書で使用されるところの「ＢＩＡ」は相互作用体のいずれも標識することなくリアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である（例えばバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ））。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用することができる。
【０２１０】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を調節する試験化合物を同定する
本発明の方法において、完全長のＴ−ｂｅｔポリペプチドを方法で使用することができ、あるいはＴ−ｂｅｔの部分のみを使用することができる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度は、例えばポリペプチドの一方を検出可能な物質（例えば放射標識）で標識し、非標識ポリペプチドを単離し、そして非標識ポリペプチドと会合するようになった検出可能な物質の量を定量することにより測定可能である。このアッセイを使用してＴ−ｂｅｔタンパク質と標的分子との間の相互作用を刺激もしくは阻害するいずれかの試験化合物を同定することができる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を刺激する試験化合物は、試験化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づいて同定される。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用を阻害する試験化合物は、化合物の不存在下での相互作用の程度と比較して、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子との間の相互作用の程度を減少させるその能力に基づいて同定される。
【０２１１】
本発明の上記アッセイ方法の１より多くの態様において、例えば複合体形成されない形態のポリペプチドの一方もしくは双方からの複合体形成された形態の分離を促進するため、またはアッセイの自動化に適応させるために、Ｔ−ｂｅｔもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子のいずれか、例えばキナーゼのいずれかを固定することが望ましいかもしれない。試験化合物の存在および不存在下での試験化合物のＴ−ｂｅｔポリペプチドへの結合、またはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器中で行うことができる。こうした容器の例にはマイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を含む。１つの態様において、ポリペプチドの一方もしくは双方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミズーリ州セントルイス）もしくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させることができ、これらは次いで試験化合物または試験化合物および吸着されない標的ポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドのいずれかと組合せ、そして混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベーションする。インキュベーション後にビーズもしくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の化合物も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして例えば上記のような直接もしくは間接的のいずれかで複合体形成を測定する。あるいは複合体をマトリックスから解離させ、そして標準的技術を使用してＴ−ｂｅｔ結合もしくは活性のレベルを測定できる。
【０２１２】
マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。例えば、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子を、当該技術分野で既知の技術（例えばビオチニル化キット、ピアスケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製することができ、そしてストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（ピアス  ケミカル）のウェル中に固定化することができる。あるいは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性であるが、しかしＴ−ｂｅｔポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そして未結合の標的もしくはＴ−ｂｅｔポリペプチドを抗体結合によりウェル中で捕捉する。そのような複合体の検出方法は、ＧＳＴ固定化複合体について上記のものに加え、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを含む。
【０２１３】
本発明のさらに別の観点では、Ｔ−ｂｅｔに結合するかもしくはそれと相互作用し（「Ｔ−ｂｅｔ結合タンパク質」もしくは「Ｔ−ｂｅｔ」）、そしてＴ−ｂｅｔ活性に関与する他のポリペプチドを同定するための２ハイブリッドアッセイもしくは３ハイブリッドアッセイ（例えば米国特許第５，２８３，３１７号明細書；Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  第ＷＯ９４／１０３００号明細書を参照されたい）において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはそのフラグメントを「餌（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用することができる。そのようなＴ−ｂｅｔ結合タンパク質もまた、例えばＴ−ｂｅｔ媒介型のシグナリング経路の下流の要素としてＴ−ｂｅｔポリペプチドもしくはＴ−ｂｅｔ標的によるシグナルの伝播に関与していると思われる。あるいは、そのようなＴ−ｂｅｔ結合ポリペプチドはＴ−ｂｅｔインヒビターであるらしい。
【０２１４】
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡単に説明すると、このアッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする遺伝子を既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう１つの構築物において、未同定のタンパク質（「餌食（ｐｒｅｙ）」もしくは「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからのＤＮＡ配列を既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「餌」および「餌食」タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用することが可能であり、Ｔ−ｂｅｔ依存性の複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインが近い近接にもたらされる。この近接が、転写因子に応答性の転写調節部位に操作可能に連結されているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、そして機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離することができ、そしてＴ−ｂｅｔポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用することができる。
【０２１５】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的遺伝子を単離するための発現差解析法（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）およびマイクロチップＤＮＡアレイ分析。例えば、減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）もしくは未減算プローブを使用するＰＣＲと結合したディファレンシャルディスプレイもしくはサブトラクション法（ＲＤＡ；例えばＨｕｂａｎｋ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｇ．１９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、５６４０−５６４８；Ｃｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、１８６５；ｖｏｎ  Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５、２５９８；Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎ．ａｎｄ  Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９、９４６を参照されたい）、またはより最近ではＤＮＡマイクロチップアレイハイブリダイゼーション（Ｗｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：３０５９）を使用することができる。こうしたアッセイの実施において多様な細胞を使用でき、例えば正常細胞、Ｔ−ｂｅｔを発現するよう工作された細胞、またはＴ−ｂｅｔを欠くもしくはＴ−ｂｅｔを過剰発現するマウスから（例えばトランスジェニック非ヒト動物から）の細胞を使用することができる。
【０２１６】
さらに別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的タンパク質を記載するためのプロテオミクスのアプローチを実施することができる。例えば、減算分析、発現パターンの分析、タンパク質レベルでの遺伝子型変異の同定およびタンパク質同定ならびに翻訳後修飾の検出を、
例えばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：２９１−３０６；Ｌｕｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：１８３−９６；およびＲａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２６（１２）：１５１８−２６に記載されているとおりに行うことができる。
【０２１７】
Ｃ．Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用したＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節する化合物の同定方法を提供する。前に記載したとおり、Ｂ細胞における（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の破壊による）Ｔ−ｂｅｔ活性の阻害は、ＩｇＧ２ａ産生の欠損をもたらす。従ってＴ−ｂｅｔが欠損の細胞を使用して、Ｔ−ｂｅｔそれ自身を調節すること以外の手段によりＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する作用物質を同定し得る（すなわちＴ−ｂｅｔ欠損表現型を「救助する」化合物）。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が条件付様式で非機能的にされている「条件付ノックアウト」系を使用して、スクリーニングアッセイでの使用のためのＴ−ｂｅｔ欠損細胞を作成し得る。例えば国際公開第９４／２９４４２号明細書および米国特許第５，６５０，２９８号明細書に記載されている遺伝子の条件付破壊のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して細胞もしくはそれから細胞を単離可能であるＴ−ｂｅｔ欠損動物を作出することができ、それらは細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節を介して制御された様式でＴ−ｂｅｔ欠損にされることができる。Ｔ−ｂｅｔの他の生物学的効果に関するアッセイに、類似の条件付破壊の取り組みを使用することができ、あるいはＲＡＧ−２欠損胚盤胞補完系を使用して、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のホモ接合性突然変異を伴う胚幹細胞から生じるリンパ系器官をもつマウスを作出することができる。こうした動物からのＴ−ｂｅｔ欠損リンパ系細胞（例えば胸腺、脾および／もしくはリンパ節細胞）または精製されたＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞をスクリーニングアッセイで使用し得る。
【０２１８】
スクリーニング法では、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を試験化合物と接触させ、そしてＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を監視する。Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞における応答の調節（例えば未処理細胞もしくは対照作用物質で処理した細胞のような適切な対照と比較した）が、試験化合物をＴ−ｂｅｔに調節される応答の調節物質と同定する。
【０２１９】
１つの態様において、試験化合物を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物、好ましくはマウス（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子が上記の手段により条件付で破壊されているマウス、もしくはリンパ系器官が上記のようＴ−ｂｅｔが欠損であるキメラマウス）に直接投与して、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様では、Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞を非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物から単離し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させてＴ−ｂｅｔが欠損の細胞中でＴ−ｂｅｔにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
【０２２０】
Ｔ−ｂｅｔが欠損の細胞はＴ−ｂｅｔが欠損であるように作出された非ヒト動物から得ることができる。好適な非ヒト動物にはサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを含む。好適な態様では、Ｔ−ｂｅｔ欠損動物はマウスである。Ｔ−ｂｅｔが欠損のマウスは実施例に記述されるとおり作出し得る。特定の１遺伝子産物が欠損の非ヒト動物は、典型的には相同的組換えにより作出する。簡単に説明すると、欠失、付加もしくは置換が導入され、それにより内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を変える、例えば機能的に破壊するＴ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを調製する。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は好ましくはマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子である。例えば、マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子はマウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡをプローブとして使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。次いでマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子を使用してマウスゲノム中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子を改変するのに適する相同的組換えベクターを構築し得る。好適な態様では、相同的組換えに際して内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊されるようなベクターを設計する（すなわち、機能的ポリペプチドをもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）。あるいは相同的組換えに際して、内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子が突然変異されるか、またはそうではなく改変されるがしかし機能的ポリペプチドをなおコードするようなベクターを設計し得る（例えば上流の制御領域を変えてそれにより内因性のＴ−ｂｅｔポリペプチドの発現を変えることができる）。相同的組換えベクターにおいて、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の改変部分はその５’および３’端でＴ−ｂｅｔ遺伝子の付加的な核酸により隣接されて、該ベクターにより運ばれ外因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と胚幹細胞中の内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子との間で相同的組換えを可能とする。付加的な隣接するＴ−ｂｅｔ核酸は内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端で）がベクターに包含される（例えば、相同的組換えベクターの記述についてＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを胚幹細胞株に（例えば電気穿孔法により）導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性のＴ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。次いで選択された細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成させる（例えば、奇形ガンおよび胚性幹細胞：実践的取り組み（Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。次いでキメラ胚を適する偽妊娠雌性育成動物中に埋植し、そして胚を分娩までもたらすことができる。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡをもつ子孫を使用して、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９ならびにＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ国際公開第９０／１１３５４号明細書；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９１／０１１４０号明細書；Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．による同第９２／０９６８号明細書；およびＢｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．による同第９３／０４１６９号明細書にさらに記載されている。
【０２２１】
別の態様において、野性型およびＴ−ｂｅｔヌル双方のマウスからのドナー骨髄細胞のレトロウイルス形質導入を、照射されたＲＡＧレシピエントを再構成するためにＤＮすなわちドミナントネガティブ構築物を用いて行うことができる。これは、そのリンパ系細胞がドミナントネガティブバージョンのＴ−ｂｅｔのみを発現するマウスの生産をもたらすことができる。次いでこれらのマウスからのＢ細胞を、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する化合物について試験することができる。
【０２２２】
スクリーニングアッセイの１つの態様において、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験された化合物を、非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に試験化合物をｉｎ  ｖｉｖｏで投与することによりＴ−ｂｅｔ欠損細胞と接触させ、そして該動物における応答に対する該試験化合物の影響を評価する。試験化合物は製薬学的組成物として非ヒトＴ−ｂｅｔ欠損動物に投与できる。こうした組成物は、典型的には試験化合物および製薬学的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容できる担体」は、製薬学的投与と適合性のありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌性化合物、等張および吸収を遅らせる化合物等を含むことを意図している。製薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は当該技術分野で周知である。任意の通常の媒体もしくは化合物が有効成分と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的に活性な化合物もまた組成物中に包含することが可能である。
【０２２３】
Ｄ．試験化合物
本明細書に記載するスクリーニングアッセイを使用して、種々の試験化合物を評価することができる。ある態様では、試験されるべき化合物はライブラリーに由来することができる（すなわち化合物の１ライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用が当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン（Ｂｕｎｉｎ  ｅｔ
ａｌ．（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９）ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）オリゴカルバメート（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）、およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．上記）のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。１０４〜１０５の多様性をもつ低有機分子の分子ライブラリーの合成のための１つの取り組みが記載されている（Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−）。
【０２２４】
本発明の化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みは、ペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は当該技術分野において、例えば：Ｅｒｂら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−；Ｈｏｒｗｅｌｌら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−に見出し得る。
【０２２５】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）に提示されているかもしれない；さらに別の態様において、コンビナトリアルポリペプチドはｃＤＮＡライブラリーから作成される。
【０２２６】
活性についてスクリーニングできる例示的化合物は、限定するわけではないがペプチド、核酸、炭水化物、低有機分子および天然産物抽出物ライブラリーを含む。
【０２２７】
候補／試験化合物は、例えば、１）Ｉｇ尾部をつけられた（ｔａｉｌｅｄ）融合ペプチ
ドならびにＤ−および／もしくはＬ−配置アミノ酸より作成されるランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照されたい）およびコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド；２）ホスホペプチド（例えば無作為かつ部分的に縮重の定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラおよび一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよび抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）低有機および無機分子（例えばコンビナトリアルおよび天然産物のライブラリーから得られる分子）；５）酵素（例えばエンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびＡＴＰアーゼ）、ならびに６）変異体の形態もしくはＴ−ｂｅｔ分子、例えばドミナントネガティブ突然変異体の形態の分子を含む。
【０２２８】
本発明の試験化合物は：生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相もしくは液相ライブラリー；デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法：およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の取り組みのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーの取り組みはペプチドのライブラリーに制限される一方、他の４つの取り組みは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは低分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２２９】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で例えば：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出し得る。
【０２３０】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、スポア（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ  上記）に提示されているかもしれない。
【０２３１】
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物は、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の１もしくは複数の調節方法で使用することができる。こうした化合物（１も
しくは複数）を細胞と接触させる前にそれらを製薬学的組成物（上記のような）として配合することが望ましいかもしれないことが理解されるであろう。
【０２３２】
Ｔ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性を直接もしくは間接的に調節する試験化合物が、上記の多様な方法の１つによりいったん同定されれば、選択された試験化合物（もしくは「目的の化合物」）を次いで例えばｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば目的の化合物を個体に投与することにより）もしくはｅｘ  ｖｉｖｏ（例えば個体から細胞を単離し、そして単離された細胞を目的の化合物と接触させることにより、あるいは目的の化合物を細胞株と接触させることにより）のいずれかで細胞と目的の化合物を接触させること、および適切な対照（未処理の細胞または生物学的応答を調節しない対照化合物もしくは担体で処理した細胞のような）と比較して細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響についてさらに評価することができる。目的の化合物はまた当該技術分野で既知の技術を使用した構造に基づく薬物設計を使用しても同定可能である。
【０２３３】
また本発明は上のアッセイで同定される化合物に関する。
【０２３４】
ＶＩ．Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の調節方法
本発明の別の観点は、細胞中でのＴ−ｂｅｔ発現および／または活性の調節方法に関する。本発明の調節方法は、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントが調節されるようなＴｈ２細胞系譜コミットメントを調節する作用物質と細胞を接触させることが関与する。Ｔ−ｂｅｔ発現および／または活性が細胞中で調節されるために、Ｔ−ｂｅｔの発現および／または活性を調節するのに十分な量の調節剤と細胞を接触させる。
【０２３５】
１つの態様では、本発明の調節方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。別の態様では、本発明の調節方法はｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＴｈ２細胞系譜コミットメントの調節から利益を得る障害もしくは状態を有する個体中で実施される。
【０２３６】
作用物質は、（例えば、細胞を例えばそれが相互作用する分子へのＴ−ｂｅｔの結合を妨害する、Ｔ−ｂｅｔの結合特異性を変える、またはＴ−ｂｅｔを翻訳後修飾する作用物質と接触させることにより）細胞中でのＴ−ｂｅｔポリペプチドの活性、または（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の転写もしくはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳を調節することにより）Ｔ−ｂｅｔもしくは結合パートナーの発現を調節することにより作用することができる。
【０２３７】
従って本発明は、生物学的応答が調節されるように、調節物質と細胞を接触させることによる、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを調製する方法を特徴とする。
【０２３８】
別の態様では、Ｔ−ｂｅｔにより転写が直接調節される遺伝子を、本発明の方法を使用して調節することができる。１つの態様では、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施し得る。好ましい態様では、Ｔ−ｂｅｔはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞中で調節可能であり、次いで処理された細胞を個体に投与することができる。
【０２３９】
また主題の発明はＴｈ２細胞系譜コミットメントの調節から利益を得る多様な状態もしくは障害を治療するためにも使用することができる。Ｔｈ２細胞系譜コミットメントの調節によって利益を得る例示的障害を本明細書で説明する。１つの態様において本発明は、障害を処置または防止するように、Ｔ細胞中でＩｔｋ媒介型のＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ３の結合を減少させる調節から利益を得る障害を持つ個体に、治療に有効な量の作用物質を投与することによりｉｎ  ｖｉｖｏでのＴｈ２サイトカイン生産の直接的調節を提供する。例えば、自己免疫障害もしくは免疫不全を処置するためにＴｈ２サイトカイン生産を調節することができる。
【０２４０】
「個体」という用語は免疫応答を導き出すことができる生存生物体を含むことを意図している。好ましい個体は哺乳動物である。とりわけ好ましい個体はヒトである。個体の他の例はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ならびに他の家畜および同伴動物を含む。ヒトならびに家畜の応用におけるＴ−ｂｅｔ発現および／または活性の調節は多様な疾患状態において異常なＴ−ｂｅｔ発現および／もしくは活性から生じる障害を調節する手段を提供し、そして本発明により包含される。
【０２４１】
化合物のような調節剤は製薬学的組成物として個体に投与し得る。こうした組成物は典型的に調節剤および製薬学的に許容し得る担体を含んでなる。本明細書で使用する用語「製薬学的に許容し得る担体」とは、製薬学的投与と適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図している。製薬学的に活性な物質のためのこうした媒体および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の通例の媒体もしくは作用物質が活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物中でのそれらの使用が企図されている。補助的な有効成分もまた組成物中に包含することができる。製薬学的組成物は上の小区分ＩＶで記載されたとおり調製できる。
【０２４２】
本明細書に記載するＴｈ１細胞の発生の、およびＴｈ２表現型の直接的抑制における重要な調節物質としてのＴ−ｂｅｔの同定は、本発明の調節方法を使用する多様な臨床状況におけるＴ細胞サブセットの選択的操作を可能とする。本発明の１つの方法は（すなわち、Ｔｂｅｔ／ＧＡＴＡ３／Ｔｅｃキナーゼ間の複合体の形成または安定性を上げる方法）、Ｔｈ２サイトカインの生産の減少、すなわちＴｈ２応答のダウンモジュレーションをもたらす。対照的に本発明の別の方法では（すなわちＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ３／Ｔｅｃキナーゼ間の複合体の形成または安定性を下げる方法）、Ｔｈ２サイトカインの生産が上昇し、これによりＴｈ２応答が促進する。このようにＴｈ２応答が有害な疾患状態を処置するために、Ｔｈ２応答がダウンレギュレートされるような複合体の形成を安定化または増す方法（刺激法）が選択される。あるいはＴｈ２応答が有益である疾患状態を処置するために、Ｔｈ２応答が促進されるような複合体の安定性を下げ、または形成を下げる方法（阻害法）が選択される。疾患または状態の処置に対する本発明の方法の適用は、該状態の治癒、長期もしくは短期いずれかの該状態と関連する症状のタイプもしくは数の減少（すなわち状態の軽減）または単純に個体に対して一過性の有益な効果をもたらすかもしれない。
【０２４３】
優勢なＴｈ１もしくはＴｈ２型応答を伴う多数の疾患もしくは状態が同定されており、そして疾患状態に罹っている個体に高まった応答の型の調節によって利益を得ることができる。こうした疾患もしくは状態への本発明の免疫調節方法の応用を下にさらに詳細に記述する。
【０２４４】
Ａ．アレルギー
アレルギーは、その生産がＴｈ２細胞の活性およびそれにより生産されるサイトカインにより調節されるＩｇＥ抗体により媒介される。アレルギー反応では、ＩＬ−４がＴｈ２細胞により生産され、これはＩｇＥ抗体の生産およびアレルギー反応を媒介する細胞すなわち肥満細胞および好塩基球の活性化をさらに刺激する。またＩＬ−４は好酸球媒介性の炎症反応でも重要な役割を演じる。従って病原となるＩｇＥ抗体の生産をダウンレギュレートする手段として、アレルギー患者におけるＴｈ２関連サイトカインおよびとりわけＩＬ−４の生産を阻害するために本発明の刺激方法を使用し得る。刺激剤は個体に直接投与でき、または細胞（例えばＴｈｐ細胞もしくはＴｈ２細胞）を個体から得、ｅｘ  ｖｉｖｏで刺激剤と接触させ、そして個体への再投与を必要とする可能性がある。さらに、ある状況においては、刺激剤、もしくはアレルゲン特異的応答を阻害（例えば脱感作）するよう刺激剤で処理した細胞と一緒にアレルゲンを個体に共投与することが有益であるかもしれない。処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインＩＬ−１２もしくはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をアレルギーの個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２４５】
Ｂ．癌
Ｔｈ２を促進するサイトカインの発現が癌患者で上昇されることが報告されており（例えばＹａｍａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：１００５−１０１０；Ｐｉｓａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７７０８−７７１２を参照されたい）、そして悪性疾患は疾患の経過の悪化と一緒にＴｈ１型応答からＴｈ２型応答への移動をしばしば伴う。従って本発明の刺激方法は、Ｔｈ１からＴｈ２への移動を打ち消し、そしてそれにより癌患者における進行中のＴｈ１応答を促進して疾患の経過を改善する手段として、癌患者におけるＴｈ２関連サイトカインの生産を阻害するために使用することができる。この刺激方法は、癌を有する個体への刺激剤の直接投与、または個体から得られた細胞（例えばＴｈｐもしくはＴｈ２細胞）の刺激剤でのｅｘ  ｖｉｖｏ処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のＩＬ−１２またはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２４６】
Ｃ．感染性疾患
またＴｈ２を促進するサイトカインの発現は、ＨＩＶ感染症、結核、リーシュマニア症、住血吸虫病、糸状線虫感染症および腸管寄生線虫感染症を包含する多様な感染性疾患の間に増大することも報告されており（例えば；Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｃｌｅｒｉｃｉ，Ｍ．（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４：２１−４３；Ｃｌｅｒｉｃｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｍ．（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４：１０７−１１１；Ｆａｕｃｉ，Ａ．Ｓ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：６１７−６２３；Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １：Ａ５８−Ａ６１；Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１５９−１６６；Ｇｒｚｙｃｈ，Ｊ−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１３２２−１３２７；Ｋｕｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３２６４−３２７０；Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１３９５−１４０２；Ｐｅａｒｌｍａｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１１０５−１１１２；Ｅｌｓｅ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：３４７−３５１を参照されたい）、そしてこうした感染性疾患もまた免疫応答のＴｈ１からＴｈ２への移動を伴う。従って、本発明の刺激方法は、Ｔｈ１からＴｈ２への移動を打ち消し，そしてそれにより患者における進行中のＴｈ１応答を促進して疾患の経過を改善する手段として感染性疾患を有する個体におけるＴｈ２関連サイトカインの生産を阻害するために使用することができる。この刺激方法は、感染性疾患を有する個体への阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞（例えばＴｈｐもしくはＴｈ２細胞）の刺激剤でのｅｘ  ｖｉｖｏ処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかが関与し得る。処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のサイトカインＩＬ−１２もしくはＴｈ２関連サイトカインに対する抗体（例えば抗ＩＬ−４抗体）のような他のＴｈ１促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２４７】
Ｄ．自己免疫疾患
本発明の阻害方法は、Ｔｈ２型の機能不全を伴う自己免疫疾患の処置において治療的に使用することができる。多くの自己免疫障害は自己組織に対し反応性であり、シかモ疾患
の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の生産を促進するＴ細胞の不適切な活性化の結果である。Ｔヘルパー型応答の調節は自己免疫疾患の経過に対する影響を有する可能性がある。例えば、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、疾患の誘導の時点でのＩＬ−４の投与によるＴｈ２型応答の刺激は、自己免疫疾患の強度を減少させる（Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７６：２４１−２５１）。さらに、疾患からの動物の回復は、Ｔｈ２特異的サイトカインの増大により示されるＴｈ２型応答の増大を伴うことが示された（Ｋｏｕｒｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１３５５−１３６４）。さらに、ＥＡＥ分抑制し得るＴ細胞はＴｈ２特異的サイトカインを分泌する（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：１４７−１５４）。ＥＡＥにおけるＴｈ２型応答の刺激は疾患に対する保護効果を有するため、多発性硬化症（ＥＡＥはそのモデルである）を有する個体におけるＴｈ２応答の刺激は治療上有益であると思われる。本発明の阻害方法はそのような減少を遂げるために使用し得る。
【０２４８】
同様にマウスのＩ型糖尿病におけるＴｈ２型応答の刺激は、疾患に対する保護効果を提供する。事実、ＩＬ−４（Ｔｈ２応答を促進する）でのＮＯＤマウスの処置は、これらのマウスで通常発症するＩ型糖尿病の発症を予防するかもしくは遅らせる（Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：８７−９９）。従って、糖尿病に罹患しているか、もしくはそれに罹患し易い個体において、例えば複合体のインヒビターを使用したＴｈ２応答の刺激は、疾患の影響を改善するかもしくは疾患の発症を抑制するかもしれない。
【０２４９】
Ｔｈ２型応答の刺激が有益であるかもしれないさらに別の自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）である。研究は慢性関節リウマチを持つ患者が滑膜組織中で顕著にＴｈ１細胞を有することを示した（Ｓｉｍｏｎ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８５６２−８５６６）。ＲＡを伴う個体においてＴｈ２応答を刺激することにより、有害なＴｈ１応答が同時にダウンレギュレートされ、それにより該疾患の影響を改善する可能性がある。
【０２５０】
従って本発明の阻害方法を使用して、Ｔｈ２型応答が疾患の経過に対し有益である自己免疫疾患に罹患しているか、もしくはそれに罹患し易い個体におけるＴｈ２関連サイトカインの生産を刺激することができる。該阻害方法には、個体への阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ系細胞）の阻害剤でのｅｘ  ｖｉｖｏ処置、次いで細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。該処置は、Ｔｈ２型応答をさらに刺激するのに十分な量のＩＬ−４それ自体、またはＴｈ１関連サイトカインに対する抗体のような他のＴｈ２促進剤を個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２５１】
Ｔｈ２応答が望ましい上記の自己免疫疾患と対照的に、他の自己免疫疾患はＴｈ１型応答により改善されるかもしれない。そのような疾患は本発明の刺激剤（癌および感染性疾患について上記したような）を使用して治療することができる。該処置は、Ｔｈ１型応答をさらに刺激するのに十分な量のＴｈ１を促進するサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を個体に投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２５２】
自己免疫疾患を治療するための作用物質の効力は、上記のヒト疾患の動物モデル（例えば多発性硬化症のモデルとしてのＥＡＥおよび糖尿病のモデルとしてのＮＯＤマウス）、またはヒト自己免疫疾患の他の十分に特徴づけられた動物モデルで試験することができる。こうした動物モデルは紅斑性狼瘡のモデルとしてのｍｒｌ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウス、慢性関節リウマチのモデルとしてのマウスコラーゲン誘発性関節炎およびマウス実験的重症筋無力症を含む（Ｐａｕｌ編、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、レイバンプレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８９、ｐｐ．８４０−８５６を参照されたい）。本発明の調節（すなわち刺激もしくは阻害）剤を試験動物に投与し、そして該試験動物における疾患の経過を、次いで使用されている特定のモデルについての標準的方法により監視する。調節剤の効力は、未処理の動物（もしくは対照作用物質で処理された動物）と比較して、作用物質で処理された動物における疾患状態の改善により示される。
【０２５３】
本発明に従い処置されうる自己免疫成分を有する自己免疫疾患、障害および状態の非制限的例には、糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続発性の乾性角結膜炎を包含するシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物の咬傷反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、化合物発疹、らい境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴覚障害、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェグナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎ならびに間隙性肺線維症がある。
【０２５４】
特定の態様において、本発明の方法により治療され得る疾患、障害および状態は、ヒトにおける炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の２つの主要な形態であるクローン病および潰瘍性大腸炎を含む。Ｔリンパ球により生産されるサイトカインが慢性の腸の炎症を開始かつ永続させるようである。クローン病はＩＦＮ−γおよびＴＮＦのようなＴヘルパー１（Ｔｈ１）型サイトカインの増大された生産を伴う。潰瘍性大腸炎は一般に大量のＴｈ２型サイトカインを生産するＴ細胞を伴い、そして本明細書で「Ｔｈ２媒介型大腸炎」と称される。「Ｔｈ１媒介型大腸炎」は、クローン病のプロファイルならびに潰瘍永大腸炎で起こり得るＴｈ１型応答を指す。Ｔｈ１媒介型大腸炎においてはＴ−ｂｅｔの活性を阻害する作用物質が保護効果を提供する。Ｔｈ２媒介型大腸炎においてはＴ−ｂｅｔの活性を刺激する作用物質が保護効果を提供する。
【０２５５】
別の特定の態様において、本発明の方法により治療され得る疾患、障害および状態は喘息を包含し、これはこれらの気道の狭窄を特徴とする気管支管もしくは肺の気道の疾患である。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の生産が喘息様表現型の発生と関連づけられている。従って、Ｔ−ｂｅｔの活性を刺激する本発明の作用物質は、喘息に対する保護効果を提供する。
【０２５６】
Ｅ．移植
移植片拒絶もしくは移植片受容は、移植片レシピエントにおけるの特定のＴ細胞サブセット（すなわちＴｈ１もしくはＴｈ２細胞）の作用に独占的に帰されないかもしれないが（論考について、Ｄａｌｌｍａｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６３２−６３８を参照されたい）、一方、多数の研究が長期の移植片生存における優勢なＴｈ２応答または移植片拒絶における優勢なＴｈ１応答と結び付けられてきた。例えば、移植片受容はＴｈ２サイトカインパターンの生産を伴い、かつ／もしくは移植片拒絶はＴｈ１サイトカインパターンの生産を伴う（例えばＴａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５３：１２８１−１２９１；Ｔｚａｋｉｓ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２９：７５４−７５６；Ｔｈａｉ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５９：２７４−２８１を参照されたい）。加えて、Ｔｈ２サイトカイン表現型を有する細胞の養子移入は皮膚移植片の生存を延長させ（Ｍａｅｄａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８５５−８６２）、しかも対宿主性移植片病を低下させる（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：３５４０−３５４９；Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３８９：５３３−５４０）。さらに、Ｔｈ２分化を促進するＩＬ−４の投与は心同種移植片の生存を延長させる（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：４０５−４０６）一方、抗ＩＬ−１０抗体（Ｔｈ１分化を促進する）と共にＩＬ−１２の投与は皮膚同種移植片の拒絶を高める（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｌａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：１３３７−１３４１）。
【０２５７】
従って、本発明の阻害方法を使用して、移植レシピエントにおけるＴｈ２関連サイトカインの生産を刺激して移植片の生存を延長させることができる。該阻害方法は充実性臓器移植および骨髄移植（例えば対宿主性移植片病を阻害するための）の双方で使用し得る。この阻害方法は、移植レシピエントへの阻害剤の直接投与、または個体から得られた細胞（例えばＴｈｐ、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、非リンパ系細胞）の阻害剤でのｅｘ  ｖｉｖｏ処置、続いて細胞の個体への再投与のいずれかを必要とする可能性がある。この処置は、Ｔｈ２型応答をさらに阻害するのに十分な量のＩＬ−４それ自身もしくはＴｈ１関連サイトカインに対する抗体のような他のＴｈ２促進剤をレシピエントに投与することによりさらに高められるかもしれない。
【０２５８】
前記の疾患状況に加え、本発明の調節方法は他の目的にもまた有用である。例えば、本発明の刺激方法（すなわち刺激剤を使用する方法）を使用して、Ｔｈ１を促進するサイトカイン（例えばインターフェロン−γ）の商業的生産のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらのサイトカインの生産を刺激し得る（例えば、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激剤と接触させてインターフェロン−γ生産を刺激することができ、そして、インターフェロン−γを培養上清から回収し、必要な場合はさらに精製しかつ商業的使用のため包装できる）。
【０２５９】
さらに、本発明の調節方法は個体における目的の抗原に対するＴｈ１もしくはＴｈ２いずれかの応答を促進するためのワクチン接種に応用可能である。すなわち、本発明の作用物質はＴｈ１応答もしくはＴｈ２応答いずれかに対するワクチンに免疫応答を向けるためのアジュバントとして作用し得る。例えば、目的の抗原に対する抗体応答を促進するために（すなわちワクチン接種の目的上）、本発明の抗原および阻害剤を個体に共投与して、個体における抗原に対するＴｈ２応答を促進することが可能である。Ｔｈ２応答は効率的なＢ細胞援助（ｈｅｌｐ）を提供し、しかもＩｇＧ１生産を促進するためである。あるいは、目的の抗原に対する細胞性免疫応答を促進するために、本発明の抗原および刺激剤を個体に共投与して個体における抗原に対するＴｈ１応答を促進することが可能である。Ｔｈ１応答は細胞媒介性免疫応答（例えば遅延型過敏性応答）の発生に好都合であるためである。目的の抗原および調節剤は一緒に単一の製薬学的組成物に、または別個の組成物に配合することができる。好ましい態様では、目的の抗原および調節剤は個体に同時に投与する。あるいは特定の状況では、抗原を最初に、次いで調節剤を投与することが望ましいかもしれないか、もしくは逆もまた真である（例えば、Ｔｈ１応答を天然に惹起する抗原の場合、最初に該抗原を単独で投与してＴｈ１応答を刺激し、そしてその後阻害剤を単独でもしくは抗原の追加免疫と一緒に投与して免疫応答をＴｈ２応答に移動させることが有益であるかもしれない）。
【０２６０】
ＶＩＩ．本発明のキット
本発明の別の観点は、本発明のスクリーニングアッセイ、調節方法または診断アッセイを行うためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットには、Ｔ−ｂｅｔを含有する指標組成物、読み取り（例えばポリペプチド分泌）
を測定するための手段、およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含むことができる。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞、読み出しを測定するための手段およびＴ−ｂｅｔの生物学的影響の調節物質を同定するためのキットの使用説明書を含んでなる。
【０２６１】
別の態様において、本発明は本発明の調節方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、例えばＴ−ｂｅｔの生物学的影響を調節するための調節物質の使用説明書とともに、適する担体中および適する容器中に包装された本発明の調節剤（例えばＴ−ｂｅｔ阻害もしくは刺激剤）を包含し得る。
【０２６２】
本発明の別の観点は、個体におけるＴ−ｂｅｔの生物学的活性と関連する障害を診断するためのキットに関する。このキットは、Ｔ−ｂｅｔの発現を測定するための試薬（例えばＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブまたはＴ−ｂｅｔポリペプチドの検出のための抗体）、個体の結果を比較する対照および診断目的上の該キットの使用説明書を包含し得る。
【０２６３】
ＶＩＩＩ．免疫調節組成物
Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを調節する作用物質は、免疫調節組成物での使用にもまた適切である。本発明の刺激または阻害剤は、個体における免疫応答をアップもしくはダウンレギュレートするのに使用可能である。好適な態様において、体液性免疫応答が調節される。
【０２６４】
Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを調節する作用物質は、単独で、またはそれに対する高められた免疫応答もしくは低下した免疫応答が望ましい抗原とともに投与し得る。
【０２６５】
別の態様において、既知のアジュバントである作用物質を主題の調節剤とともに投与可能である。現時点で、ヒトで広範に使用されている唯一のアジュバントはミョウバン（リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウム）である。サポニンおよびその精製された成分Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイントの完全アジュバントならびに研究および獣医学の応用で使用される他のアジュバントが、ヒトワクチンにおける潜在的使用を有する。しかしながらムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）により記載されるもののようなリン脂質複合物、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、酵素阻害剤は膵トリプシンインヒビターを含み、フルオロリン酸ジイソプロピル（ＤＥＰ）およびトラシロールのような新たな化学的に定義された製剤もまた使用し得る。抗原が投与される態様においては、抗原は例えばＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９−１７４４（１９９２）により記載され、そして本明細書で引用することにより編入されるプロテオリポソーム内に、もしくはノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）ＴＭ脂質小胞（マイクロベシキュラーシステムズインク（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ニューハンプシャー州ナシュア）のような脂質小胞中に被包化して免疫応答をさらに高めることができる。
【０２６６】
１つの態様において、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントをコードする核酸分子をＤＮＡワクチンとして投与する。これはレポーターもしくは治療用遺伝子の送達に用いられるものに類似するプラスミドＤＮＡ構築物を使用して行うことができる。そのような構築物は、好ましくは、大量の該プラスミドＤＮＡの増幅を可能にする細菌の複製起点；原核生物の選択可能なマーカー遺伝子；Ｔ−ｂｅｔポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸配列；宿主細胞中での遺伝子発現を指図する真核生物転写調節要素；および発現されるｍ
ＲＮＡの適切な終了を確実にするポリアデニル化配列を含んでなる（Ｄａｖｉｓ．１９９７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：６５３）。ＤＮＡ免疫感作に使用されるベクターは場合によってはシグナル配列を含んでもよい（Ｍｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９２：５３０７；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１７３：３１４）。ＤＮＡワクチンは多様な手段により、例えば注入により（例えば、筋肉内、皮内、もしくは皮膚中に粒子を注入するのに粒子加速器もしくは加圧ガスを使用する遺伝子銃を用いる表皮中へのＤＮＡ被覆された金粒子の微粒子銃注入（Ｈａｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：３７））投与し得る。あるいは、ＤＮＡワクチンは非侵襲的手段により投与することができる。例えば純粋なもしくは脂質で処方されたＤＮＡは、呼吸器系に送達し得るか、もしくはＤＮＡの経口送達により別の場所に（例えばＰｅｙｅｒｓ貼付剤）標的を定めることができる（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ．１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９６１）。弱毒化微生物は粘膜表面への送達に使用することができる。（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：２９）。
【０２６７】
１つの態様において、ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドは、Ｔｈ２細胞系譜コミットメントを調節する作用物質、ならびに望ましい免疫応答に対する抗原を発現し得るか、またはリンホカイン遺伝子もしくは共刺激分子のような免疫応答の調節物質をコードし得る（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：４５９１）。
【０２６８】
別の態様では、レトロウイルスベクターもまたＴ−ｂｅｔ免疫調節組成物の発現に適切である。組換えレトロウイルスベクターは宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組込みを可能とする。分裂細胞に形質導入するために、レンチウイルスベクターを免疫調節組成物として使用することができ、そして、本発明により包含することを意図している。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、それらのより高レベルの複雑さに基づけば、潜伏感染の経過でのように非増殖細胞のゲノム中に組込み、そしてそれらの生活環を調節することができる。これらのウイルスにはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶを含む。他のレトロウイルスと同様、レンチウイルスはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有し、それらは２個の末端反復配列（ＬＴＲ）の配列により隣接される。これらの遺伝子のそれぞれは、最初は１個の前駆体ポリタンパク質として発現される複数のポリペプチドをコードする。ｇａｇ遺伝子は内的構造（マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシド）ポリペプチドをコードする。ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡに指図されるＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素、組込み酵素およびプロテアーゼ）をコードする。ｅｎｖ遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードし、そして付加的にウイルスＲＮＡの核輸出を司るシス作用性エレメント（ＲＲＥ）を含有する。
【０２６９】
５’および３’ＬＴＲはビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するよう働き、そしてウイルス複製に必要な全ての他のシス作用性配列を含む。ゲノムの逆転写（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子中への効率的な被包化（Ｐｓｉ部位）に必要な配列が５’ＬＴＲに隣接する。被包化（すなわちレトロウイルスＲＮＡの感染性ビリオンへのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠けている場合、その結果はゲノムＲＮＡの被包化を予防するシス欠損である。しかしながら、生じる突然変異体は全ビリオンタンパク質の合成を指図することがなお可能である。ＨＩＶのようなレンチウイルスの包括的な総説は例えばＦｉｅｌｄ’ｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（レイバンパブリッシャーズ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．編、１９９６に提供されている。
【０２７０】
本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明され、これらは制限すると解釈される
べきでない。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図および配列表は引用することにより本明細書に編入する。
【０２７１】
ｐＪＧ４−５ベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化されたマウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡを含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナッサス）に、１９９９年１１月９日に寄託し、そして寄託番号ＰＴＡ−９３０を得たＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化されたヒトＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡ（ヒトＴｈ１クローンＲＯＴ−１０に由来するＲＮＡから調製した）を含んでなる核酸分子を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（バージニア州、マナッサス）に、２０００年１月２８日に寄託し、そして寄託番号ＰＴＡ−１３３９を得た。両寄託ともブダペスト条約の下になされた。
【実施例】
【０２７２】
実施例１．新規転写因子Ｔ−ｂｅｔのクローニング
ＩＬ−２プロモーターのＴｈ１特異的領域は十分に限局されているため（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１８９−１９７；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６２９９−６３１０；Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、７７−８６；Ｄｕｒａｎｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９８８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１７１５−１７２４；Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、４５７−４５０）、Ｔｈ１特異的転写因子を同定するためにＩＬ−２プロモーター−レポーター、およびＯＦ６  Ｔｈ１クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーを使用する酵母１ハイブリッドアプローチを選んだ。この取り組みを検証するために、ＩＬ−４プロモーターのＴｈ２特異的領域を酵母中で発現させ、そしてｃ−Ｍａｆの導入によりトランス活性化されることが示されたが、しかし数種の他の転写因子（例えばＮＦＡＴ）によってはされなかった。ｃ−Ｍａｆ応答因子（ＭＡＲＥ）を突然変異させた場合にｃ−Ｍａｆのトランス活性化は起こらなかった。すなわち酵母１ハイブリッドアプローチを利用した。
【０２７３】
ＥＧＹ４８酵母株をＩＬ−２プロモーター／ヒスチジン構築物で安定に組込み、そして抗ＣＤ３で活性化したＴｈ１細胞クローンＯＦ６から作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。スクリーニングした５．６×１０６クローンのうち４８８個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニング中に試験した２１０クローンのうち７２個がＩＬ−２プロモーターに特異的であることが判明した。陽性クローンの数を減少させるため、我々はＴｈ１およびＴｈ２細胞株で差別的に発現されたｃＤＮＡと酵母クローンｃＤＮＡをハイブリダイズさせた。これらのＴｈ１−Ｔｈ２およびＴｈ２−Ｔｈ１  ｃＤＮＡは、放射標識し、かつ１６個の最も強く陽性の酵母クローンをスクリーニングするためのパイロット実験で最初に使用したクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＰＣＲ選択キットを使用して作成した。それら１６クローンのうち８個がＴｈ１（ＰＬ１７）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性であり、そしてＴｈ２（Ｄ１０）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性でなかった。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４へのプローブの対照ハイブリダイゼーションを用いた１６個の陽性クローンでのＴｈ１−Ｔｈ２プローブを用いる発現差解析法（ＲＤＡ；例えばＬｉｓｉｔｓｙｎ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６；Ｏ’Ｎｅｉｌ  ａｎｄ  Ｓｉｎｃｌａｉｒ．１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２６８１；Ｈｕｂａｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２：５６４０；Ｗｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２６：３０５９）を実施した。Ｔｈ１およびＴｈ２を減算したｃＤＮＡプローブの特異性はＩＬ−４に対するそれぞれＩＬ−２およびＩＦＮ−γのそれらの検出により示される。
【０２７４】
制限酵素分析およびシークエンシングデータは、全部で８個のクローンが関係づけられたことを示した。それらは５’および３’非翻訳領域中の差異に基づき３つのグループ分けに入り、これらの範疇のそれぞれは独立したｃＤＮＡ分子を表した。これらのクローンの配列をＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースと比較することにより、転写因子のＴボックスファミリーとの相同性を生じた。図１にはＴ−ｂｅｔのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が示されている。
【０２７５】
実施例２．Ｔ−ｂｅｔはＴボックスファミリーのメンバーＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）と相同な１領域を共有する
ＢｒａｃｈｙｕｒｙもしくはＴはＴボックスと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．１９９７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７、４７４−４８０；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒ．１９９８．Ｂｉｏｅｓｓａｙ．２０：９；Ｍｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．１９９７．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ８、７９９−８００に総説される。）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短い尾」のギリシア語）突然変異は、短いわずかにもつれた尾部を有したヘテロ接合性の変異体動物で１９２７年に最初に記載された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ  ３４３、６１７−６２２）。マウスでＢｒａｃｈｙｕｒｙを包含せずに今や８種のＴボックス遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）および今やＴ−ｂｅｔを包含し、それぞれまるで異なり、しかも通常は複雑な発現パターンをもつ。転写因子のＴボックスファミリーはＤＮＡ結合ドメイン中のファミリーメンバーの相同性により定義される。Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡ結合ドメイン（マウスＴ−ｂｅｔの残基１３８〜３２７）は、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴボックスドメインに最も類似し、従ってＴ−ｂｅｔをＴボックス遺伝子ファミリーのＴｂｒ１サブファミリーに置く。マウスＴ−ｂｅｔタンパク質のヒト相同物はマウスＴ−ｂｅｔにおよそ８８％同一である。図１ＡはＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎのタンパク質アライメント（４に設定されたＧペナルティ（Ｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）および１２に設定されたギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）で）を使用して得た。類似性指数は８６．６であると計算され；ギャップ数（ｇａｐ  ｎｕｍｂｅｒ）２、ギャップ長（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ）５およびコンセンサス長（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｌｅｎｇｔｈ）５３５）。Ｔ−ｂｅｔはＴボックスファミリーメンバーのＴ−ｂｒａｉｎおよびエオメソデルミンと相同な１領域を共有する。マウスＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡ結合ドメインは、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）エオメソデルミンのＴボックスドメインに最も類似である。３種のＴボックス領域間におよそ６９％のアミノ酸の同一性が存在する。Ｔ−ｂｅｔはＴボックスドメイン以外では他のＴボックスファミリーメンバーに対する配列の相同性をもたない。
【０２７６】
実施例３．ＴｅｃキナーゼによるＴ−ｂｅｔのリン酸化
Ｔ−ｂｅｔタンパク質はリン酸化される。Ｔ−ｂｅｔをリン酸化するキナーゼはチロシンキナーゼのＴｅｃファミリーの１メンバーとして同定されている。ＩＴＫおよびＲｌｋ／ＴｘｋがＴ細胞中で発現されるチロシンキナーゼの優勢なＴｅｃファミリーである。図２はＴｅｃファミリーメンバーの保存された構造を示す。Ｔｅｃファミリーキナーゼはサイトカイン分泌において重要であることが示されている。Ｒｌｋ／ｉｔｋはＴｈｙ特異的であり、しかもＩＦＮ−γ生産の制御である役割を演じている。Ｉｔｋ−／−マウスは減少したＩＬ−４産生を有する一方、ｒｌｋ／ｉｔｋ−／−マウスは減少したＴｈ１およびＴｈ２サイトカインを示した。ＲＩＢＰはｒｌｋおよびｉｔｋを結合するアダプタータンパク質である。ＲＩＢＰ−／−マウスは減少されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を表す。
【０２７７】
ＩＴＫおよびＲｌｋ／ｔｘｋ双方のキナーゼがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ−ｂｅｔをリン酸
化することが見出されている。ヒトＴ−ｂｅｔの予測されるチロシンリン酸化部位を図３に示す。修飾された形態のＴ−ｂｅｔタンパク質を作成し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで基質として使用した（図４）。ＩＴＫおよびＲｌｋ双方がｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイでＴ−ｂｅｔのＮ末端およびＣ末端をリン酸化したが、しかしＤＮＡ結合領域はしなかった（図５）。
【０２７８】
Ｔｅｃキナーゼの重要性をさらに示す、Ｔ−ｂｅｔの縮小されたチロシンリン酸化がＩＴＫノックアウト動物で観察された。Ｂ６、Ｂａｌｂ／Ｃ、ＩＴＫノックアウトおよびＲＬＫノックアウト動物に由来するＴ細胞からＴ−ｂｅｔを免疫沈降させた。免疫沈降物のウェスタンブロットを抗ホスホチロシン抗体もしくは抗Ｔ−ｂｅｔ抗体いずれかでプロービングした。図６に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔはＩＴＫノックアウト動物のＴ細胞中に存在するとは言え、その分子のチロシンリン酸化は低減される。対照的に、Ｔ−ｂｅｔはＲｌｋノックアウトＴ細胞中で過剰リン酸化され（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）、Ｔ−ｂｅｔチロシンリン酸化の阻害におけるＲｌｋの役割を示す。
【０２７９】
実施例４．Ｔ−ｂｅｔはチロシンリン酸化される
リン酸化、ユビキチン化またはメチル化による転写因子の翻訳後修飾はそれらの活性化を導くことができ、そしてしばしば表面受容体からのシグナリングにより開始される。チロシンの可逆的リン酸化は、細胞周期の制御、成長および分化のような多くの基本的生理学的プロセス、ならびに遺伝子転写を調節する（Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ｊ．（１９９９）Ｊ
Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １８０：１７３−８１；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．（１９９８）Ｈａｒｖｅｙ  Ｌｅｃｔ  ９４：８１−１１９）。Ｔ細胞では、ＴＣＲを介する刺激が細胞タンパク質のチロシンリン酸化を生じ、活性化を導く。Ｔ−ｂｅｔはＴＣＲの下流に位置し、したがってＴＣＲとの結び付きがＴ−ｂｅｔタンパク質の修飾を生じるのかどうかが決定された。組換えヒトＩＬ−２（２００Ｕ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０で維持したＡＥ７Ｔｈ１クローンまたは対照Ｄ１０Ｔｈ２クローンからの全細胞ライゼートを、抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）で（＋）または無しで（−）一晩刺激し、そして全ライゼートが調製される前の１５分間、過バナジウム酸塩で処理した。全ライゼートをモノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（４Ｂ１０）と免疫沈降させ、そして免疫複合体を７．５％のＴｒｉｓ−グリシンゲルで解析した。これらの複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースに移し、そして抗−ホスホチロシンｍＡｂ４Ｇ１０（アップステートＵＳＡ社（Ｕｐｓｔａｔｅ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）、シャーロッテスビル）でプローブを付け、そして化学発光をアッセイした（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ピスカタウェイ）。暴露後、ブロットを小片とし、そして抗−Ｔ−ｂｅｔ抗血清で再度プローブを付けた。ブロットの視覚による調査は、Ｄ１０細胞中には存在しないＡＥ７細胞中の特異的なリン酸化免疫反応種を明らかとし、これは抗−ＣＤ３処理により誘導された（図７Ａ）。
【０２８０】
Ｔ−ｂｅｔは初期のＴｈ１分化で迅速に誘導され、そして後期に次第に減少する（図７Ｂ、下パネル）。分化しているＴｈ細胞におけるＴ−ｂｅｔチロシンリン酸化の時期を調査した。ＣＤ４＋Ｔｈｐ細胞はリンパ節および脾臓から単離し、そしてＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）および抗−ＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、プレートに結合した抗−ＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて刺激した。全細胞抽出物は、初回刺激から０、２、３、４日後および２回目の刺激から１日後に調製した。過バナジウム酸塩（１００ｍＭ）を細胞の溶解の１５分前に加えた。Ｔ−ｂｅｔのチロシンリン酸化は、ＴＣＲとの結合で初代Ｔｈｐ細胞で起こり、そして分化の初期で最も顕著となり（２日目）、４日目までに下降し、そして２回目の刺激では検出できなかった（図３７Ｂ）。報告されているように、チロシンリン酸化は過バナジウム酸塩の存在下で強化されたが、過バナジウム酸塩の不存在下でも抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で４８時間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて刺激した初代Ｔｈ細胞でも明らかに検出された（図７Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔｈｐ細胞由来の全細胞ライゼートは、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８で４８時間刺激し、そして７Ｂに記載したように調製した。したがってＴ−ｂｅｔはＴｈｐ分化において早期にチロシンリン酸化され、これはＴｈ祖先細胞におけるこの修飾に関する規則と一致し、系譜コミットメントが決定する分化の段階である。
【０２８１】
ＴＣＲはシグナル伝達カスケードを、細胞質ＰＴＫ、Ｌｃｋ、ＦｙｎおよびＺＡＰ−７０の少なくとも３つと相互作用し、そして活性化することにより開始し（Ａｌｂｅｒｏｌａ−Ｉ１ａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１２５−１５４）、その合わせた作用がＩＬ−２誘導性Ｔ細胞チロシンキナーゼ（ＩＴＫ）、ホスホリパーゼ−Ｃγ１、Ｖａｖ原癌遺伝子およびアダプタータンパク質ＳＬＰ−７６のような下流の細胞物質のチロシンリン酸化をもたらす（Ｉｗａｓｈｉｍａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３，１１３６−１１３９；Ｃｈａｎ  Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１，６４９−６２；Ｃｏｏｋｅ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５，２８１−２９１；Ｗｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５，３０３９−４８）。抗−ＣＤ３で刺激したＴｈ１細胞の核および細胞質画分のウエスタンブロット分析では、Ｔ−ｂｅｔが構成的に核にあることが明らかとなった。このようにＴ−ｂｅｔリン酸化の原因となるチロシンキナーゼは、Ｔ細胞で同定される大変少ない核のチロシンキナーゼの１つであるにちがいない。これらにはｃ−Ａｂ１キナーゼおよびＴｅｃキナーゼファミリーのメンバーであるＩＴＫ、静止リンパ球キナーゼ（ｒｅｓｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＲＬＫ）およびＴＥＣがある（Ｔａｋｅｓｏｎｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５，３０３９−４８；Ｌｕｃａｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９１，１１９−３８）。特異的なプロテインキナーゼによりリン酸化されると思われるタンパク質内の残基を同定するために設計されたスカンジット（ｓｃａｎｓｉｔｅ）プログラムは（Ｙａｆｆｅ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９，３４８−５３）、Ｔ−ｂｅｔ（Ｙ５２５）のＣ−末端、ヒトとマウスのＴ−ｂｅｔ間で保存されたモチーフ、ならびに３つの保存されたｃ−Ａｂ１部位（Ｙ７６、Ｙ１０７およびＹ１１７）にＩＴＫリン酸化部位を予想した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを、短縮化ＧＳＴ−融合Ｔ−ｂｅｔタンパク質およびＰＴＫおよびｃ−Ａｂ１をインキュベーションし、続いて抗−ＰＴＫまたはｃ−Ａｂ１  Ａｂｓ、および１０μＣｉの（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍＭ）と免疫沈降することにより行った。エノラーゼは陽性対照の外因性基質として使用した。反応混合物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、そして生じたゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーにかけた。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、当初はＴ−ｂｅｔがこれらのキナーゼに基質として役立つことを確認するために行ったものであったが、Ｔ−ｂｅｔ、ＮおよびＣ末端フラグメントの両方（しかしＤＮＡ結合ドメインではない）がｃ−Ａｂ１ではなくＴｅｃキナーゼ、ＩＴＫおよびＲＬＫによりリン酸化されることができたことを示した（図７Ｄ）。しかし２９３Ｔ細胞中でＰＴＫとＴ−ｂｅｔの同時発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイよりも信頼性がある読み取りであり、ＴＥＣまたはＲＬＫによるよりもＩＴＫによるＴ−ｂｅ���のより効率的なリン酸化を明らかにした（図７Ｅ）。これはＴ−ｂｅｔとＴｅｃキナーゼであるＴＥＣ、ＩＴＫまたはＲＬＫの２９３Ｔ細胞中でのコートランスフェクションにより測定され、そして全細胞ライゼートは、過バナジウム酸塩と１５分間インキュベーションした後に調製された。
【０２８２】
ＩＴＫが関連するキナーゼであることのより決定的な証拠は、ＩＴＫもしくはＲＬＫまたは二重ＩＴＫ／ＲＬＫ欠損マウスから単離した初代ＣＤ４Ｔ細胞の分析から来たものであった（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１１８３−１１８８）。キナーゼ欠損マウスのリンパ節から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ１−歪み（ｓｋｅｗｉｎｇ）条件下で２日間、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８処置の組み合わせにより刺激した。Ｔ−ｂｅｔは免疫沈降により単離し、そしてチロシンリン酸化状態は４Ｇ１０を用いたウエスタンブロットにより評価した。Ｔ−ｂｅｔのチロシンリン酸化は、ＩＴＫまたはＩＴＫとＲＬＫの両方を欠く細胞で大きく縮小したが、ＲＬＫのみの不存在では正常であった（図７Ｆ）。これらのデータはＩＴＫが初代Ｔ細胞においてＴ−ｂｅｔの上流のチロシンキナーゼであることを示す。それにもかかわらず、少量のＴ−ｂｅｔの残存リン酸化がＩｔｋ−／−ＣＤ４細胞で観察される。これは他のＴｅｃキナーゼまたは他のチロシンキナーゼによるリン酸化を反映しているのかもしれない。スカンジットにより予想されるように、ＩＴＫによるリン酸化がＴ−ｂｅｔ中のチロシン残基５２５に特異的であるかどうかを決定するために、チロシン残基５２５ならびに対照チロシン残基４３７をフェニルアラニンに変異させ、そしてこれらの変異体がＩＴＫによりリン酸化される能力を評価した。２９３Ｔ細胞中の野生型（ｗｔ）または変異体Ｔ−ｂｅｔのみの全細胞ライゼートを使用したウエスタンブロットにより検出されるような発現は、検出可能なチロシンリン酸化を生じなかったが、ＩＴＫとの同時発現でｗｔＴ−ｂｅｔのリン酸化、およびＹ５２５Ｆ変異体の顕著に縮小されたリン酸化が生じた。さらに対照変異体Ｙ４３７ＦのＩＴＫによるリン酸化は減少しなかった（図７Ｇ）。したがってＩＴＫはＴ−ｂｅｔを残基Ｙ５２５でリン酸化する。
【０２８３】
実施例５．Ｔ−ｂｅｔのチロシンリン酸化は、Ｔｈ２サイトカイン生産の最適な抑制に必要である。
【０２８４】
幾つかの転写因子の活性は細胞での局在化により制御され、これは次いでリン酸化により調節される（ＮＦＡＴ、スタッツ（Ｓｔａｔｓ））（Ｗｅｎ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８２，２４１−２５０；Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，２９９−３０７）。しかしＴ−ｂｅｔの細胞下の局在化は、内因性のＴ−ｂｅｔがＩｔｋ−／−細胞中の核にあり、そしてＹ５２５Ｆ変異体が構成的に核にあったので、チロシンリン酸化により影響を受けない。ＩＴＫ誘導型のＴ−ｂｅｔリン酸化の機能を評価するために、Ｔ−ｂｅｔ  ｗｔ（ＲＶ−Ｔ−ｂｅｔ）およびＹ５２５Ｆ（ＲＶ−Ｔ−ｂｅｔ  Ｙ５２５Ｆ）変異体ＧＦＰレトロウイルスを、抗ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で刺激したＣＤ４＋Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈｐ細胞に２４〜３６時間形質導入し、そしてＴｈ２歪み条件下で培養した。ＧＦＰ陽性細胞は５日で分類し、さらに２日間、ＩＬ−２の存在下で拡大し、抗−ＣＤ３で再刺激し、そして２４時間後、サイトカイン生産をＥＬＩＳＡにより評価した。ｗｔおよび変異体Ｔ−ｂｅｔの発現を、ＦＡＣＳ（図８Ａ）により、および抗−Ｔ−ｂｅｔｍＡｂ、４Ｂ１０（図８Ｂ）を使用したウエスタンブロット分析により測定し、形質導入した細胞中のｗｔおよびＹ５２５ＦＴ−ｂｅｔの均等な発現を明らかにした。ＧＦＰを発現する分類された細胞の割合は、９８％を越えた。予想どおり、ｗｔＴ−ｂｅｔで形質導入したＴ−ｂｅｔ−／−Ｔｈｐ細胞は、ＩＬ−２生産の抑制により、および対照のＲＶベクターで形質導入した細胞に比べて１００倍までのＩＦＮγ生産の誘導により証明されるように、Ｔ−ｂｅｔ−／−Ｔｈ細胞でＴ−ｂｅｔ機能を保存した（図８Ｃ）。Ｙ５２５ＦＴ−ｂｅｔはｗｔ  Ｔ−ｂｅｔと同様にＩＬ−２の抑制およびＩＦＮγ生産の誘導に効果的であった。しかし驚くことに、ｗｔＴ−ｂｅｔはＴｈ２サイトカイン生産の有意な抑制を現したが（図８Ｄ）、Ｙ５２５ＦＴ−ｂｅｔはＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３のようなＴｈ２サイトカインの発現の抑制にはｗｔＴ−ｂｅｔよりも効果が一層低かった（図８Ｄ）。６回の独立した実験で、ｗｔＴ−ｂｅｔによるＩＬ−４生産の抑制は、２９〜５６％の範囲であり、平均は４１％であった。対照的に、Ｙ５２５Ｆ変異体によるＩＬ−４の抑制は、１〜２２％であり、１１％の平均であり、これは０．０００２のＰ値で統計的に有意であった。同様な差異がｗｔとＹ５２５ＦＴ−ｂｅｔとの間でＩＬ−５およびＩＬ−１３について見られた。ＩＬ−５についてｗｔの抑制は３９〜８７％（平均６３％）であり、一方変異体Ｔ−ｂｅｔは−１８〜３８％抑制し（平均１１．５％）、０．００７４のＰ値で統計的に有意であった。ＩＬ−１３について、ｗｔの抑制は６回の実験で３４〜７１％の範囲であり（平均５３％）、一方Ｙ５２５Ｆ変異体の抑制は２〜４０％の範囲であり（平均２２％）、０．００２のＰ値であった。細胞内サイトカイン分析はＥＬＩＳＡの結果と一致し、そして類似の結果がペプチドおよびＡＰＣで刺激したＴＣＲトランスジェニックＤＯ１１．１０／Ｔ−ｂｅｔ−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用した形質導入実験で得られた。
【０２８５】
Ｙ５２５ＦＴ−ｂｅｔ変異体はＩＦＮγ生産の保存においてはｗｔＴ−ｂｅｔのように効果的となるようだが、正式にはＩＦＮγにおける大変小さい差異がしっかりとした（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）Ｔｈ２分化に影響を及ぼすかもしれない。さらにＴｈ２分化の阻害におけるＩＦＮγの効果を排除するために、これらの同じ実験をＴ−ｂｅｔ−／−ｘＩＦＮγ−／−ＣＤ４＋Ｔｈ細胞で行い、そして類似の結果を得た（図８Ｅ：結果はＲＶ対照のパーセントとして表す。ＩＦＮγ生産については対数尺度を使用していることに留意されたい）。このようにＴｈ２サイトカインの抑制におけるＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化の役割は、ＩＦＮγから独立している。サイトカイン転写産物もｗｔまたはＹ５２５Ｆ変異体Ｔ−ｂｅｔレトロウイルスでの形質導入後に測定し、そしてＴｈ２サイトカインｍＲＮＡの抑制において後者の同様な減損が観察された。故にＴ−ｂｅｔの２つの主要な機能は生化学的には分離可能である：ＩＴＫによるＹ５２５のリン酸化は、Ｔｈ２分化のＴ−ｂｅｔの抑制に選択的に必要とされるが、サイトカインのプロファイルにより測定されるように、Ｔｈ１系統への分化能の発生にその機能は必要とされない。
【０２８６】
実施例６．Ｔ−ｂｅｔはＩＴＫと物理的に相互作用する
ＩＴＫは、Ｓｒｃ相同（ＳＨ）、ＳＨ２、ＳＨ３、キナーゼ（ＳＨ１）、Ｔｅｃ相同（ＴＨ）およびプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含むモジュラー７２ｋＤａのタンパク質である（Ｌｕｃａｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｃ  １９１，１１９−３８）。Ｔ細胞の活性化で、ＩＴＫはアダプタータンパク質ＬＡＴおよびＳＬＰ７６と会合し、Ｌｃｋによりトランスリン酸化され、自己リン酸化し、そして細胞膜にＴＣＲとそのＰＨドメインを介して局在する（Ｂｕｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，２２１９−３０；Ｓｕ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９，３７０２−１１）。しかしＩＴＫはＴ−ｂｅｔが位置する核にも存在する。したがってＩＴＫがＴ−ｂｅｔと物理的に会合するのかどうかを決定した。Ｔ−ｂｅｔとエピトープ標的付きＴｅｃキナーゼとの同時発現（ＩＴＫ−ＦＬＡＧ、ＲＬＫ−ＭＹＣまたはＴＥＣ−ＨＡ）、続いて抗−ＦＬＡＧ、ＭＹＣまたはＨＡ抗体との免疫沈降、そして免疫複合体を７．５％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで解像した。生じたタンパク質ブロットに抗−Ｔ−ｂｅｔＡｂでプローブを付けた。Ｔ−ｂｅｔまたはＴＥＣキナーゼの発現は、全細胞ライゼートを使用したウエスタンブロットによりアッセイした。データはＩＴＫとＴ−ｂｅｔとの選択的な会合を明らかにした（図９Ａ）。同様のアッセイでそれらがＴ−ｂｅｔをリン酸化できないことと一致して、ＲＬＫもＴＥＣもＴ−ｂｅｔと同時に免疫沈降しなかった（図９Ｂおよび９Ｃ）。一連のＩＴＫ変異体を使用したマッピング実験では、Ｔ−ｂｅｔとの相互作用の部位がＩＴＫ  ＳＨ１ドメインであることが明らかとなった。ＦＬＡＧ−標識ＩＴＫ短縮物をＴ−ｂｅｔと２９３Ｔ細胞にコートランスフェクトし、そして抗−ＦＬＡＧ  Ａｂと免疫沈降させた。免疫複合体中のＴ−ｂｅｔの存在は、抗−Ｔ−ｂｅｔ  Ａｂでアッセイした。ＳＨ１ドメインのみ、またはＳＨ１、ＳＨ２およびＳＨ３ドメインのいずれかを含むＴＫ短縮物は、Ｔ−ｂｅｔならびに完全長のＩＴＫと会合し、ＰＨおよびＩＴＨドメインは必要ではなかったが、ＳＨ１ドメインはＴ−ｂｅｔとの相互作用に必要であったことを示す（図９Ｄ）。さらにＦＬＡＧ−標識ＩＴＫと、Ｔ−ｂｅｔのｗｔまたはチロシン変異体（Ｙ５２５ＦまたはＹ４３７Ｆ）との同時発現、ＦＬＡＧ−Ｍ２アガロース（シグマ、セントルイス）で免疫沈降、そして続いて解像したタンパク質ブロットの抗−Ｔ−ｂｅｔ  Ａｂでのプロービングブにより示されるように、ＩＴＫ／Ｔ−ｂｅｔの相互作用は、Ｔ−ｂｅｔ中のチロシン５２５の存在に大きく依存した。これらの実験の結果は、ＩＴＫがＹ５２５Ｆ  Ｔ−ｂｅｔ変異体とそれほどよくは同時免疫沈降しないことを示した（図９Ｅ）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質およびＩＴＫの同様の発現レベルが３０μｇの全細胞ライゼートで検出された。
【０２８７】
最も重要であるのは、初代胸腺細胞における内因性の関連を決定することによりＩＴＫがＴ−ｂｅｔと生理学的条件下で相互作用するかどうかを決定したことである。単一細胞懸濁液をＢＡＬＢ／ｃ  ｗｔ，Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＩＴＫ−／−マウスの胸腺から得、そして核抽出物を製造元の使用説明に従いＮＥ−ＰＥＲ（ピアス、ロックホールド）を用いて調製した。２ｍｇの核抽出物を抗−Ｔ−ｂｅｔ  ｍＡｂ、４Ｂ１０と１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中でインキュベーションした。免疫複合体を解像し、そしてストリップ後に抗−ＩＴＫ  ｍＡｂ（２Ｆ１２）、そして順次４Ｂ１０でプローブを付けた。ＩＴＫ発現は３０μｇの核抽出物中でアッセイした。ＴＣＲ刺激から２４および４８時間後にナイーブなＴｈｐ細胞中の同時免疫沈降実験を行う初期の試みは失敗し、恐らくこの初期時点での低レベルの内因性Ｔ−ｂｅｔ発現および活性化細胞中で起こっているリン酸化および脱リン酸化の競合プロセスの両方から派生するものだろう。しかしＢＡＬＢ／ｃ  ｗｔ，Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＩＴＫ−／−胸腺細胞の核抽出物に由来するＴ−ｂｅｔの免疫沈降、続いて抗−ＩＴＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、Ｔ−ｂｅｔ−／−またはＩＴＫ−／−胸腺細胞ではなくＢａｌｂ／ｃ  ｗｔからの免疫複合体中の内因性ＩＴＫの存在が明らかとなった（図９Ｆ）。このデータはＩＴＫのキナーゼドメインがＴ−ｂｅｔとチロシン５２５依存的様式で相互作用し、Ｔ−ｂｅｔのリン酸化および引き続いてＴｈ２サイトカイン生産の調節をもたらすことを示す。
【０２８８】
理論に結び付けられることは望まないが、上記結果の１つの説明は、Ｔ−ｂｅｔが直接的または間接的にチロシン５２５に依存する様式でＴｈｐからＴｈ２系譜コミットメントを支配することが知られている１もしくは複数の転写因子の発現を阻害するということである。ＩＬ−４サイトカイン発現と比べて、さらに顕著なＴ−ｂｅｔＹ５２５のＴｈ２ＩＬ−５およびＩＬ−１３に及ぼす効果は、Ｔｈ２−特異的転写因子であるＧＡＴＡ−３の機能の記憶（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）であった（Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．−Ｐ．ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，５８７−５９６；Ｄａｓ，Ｊ．，ｅｔ
ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４５−５０）。しかしｗｔ  Ｔ−ｂｅｔまたはＹ５２５Ｆ変異体で形質導入されたＴｈｐ細胞中で、ＧＡＴＡ−３またはｃ−Ｍａｆ、ＪｕｎＢ、Ｓｔａｔ６またはＮＦＡＴのような他のＴｈ２関連転写因子のｍＲＮＡ発現レベルに差異は観察されず、そしてＴ−ｂｅｔは一時的なレポーターアッセイにおいてＧＡＴＡ−３プロモーターを抑制しなかった。他の潜在的なメカニズムは、Ｔ−ｂｅｔがＧＡＴＡ−３のようにＴｈ２転写因子と物理的に会合して、Ｔｈ２サイトカイン座中でＧＡＴＡ−３がその標的部位への接近を制御し、そしてこの会合が残基５２５により調節されるということであった。最近の報告は他のＧＡＴＡファミリーメンバーであるＧＡＴＡ−４とＴＢＸ５（症候性の心中隔欠損のサブセットの原因であるＴ−ボックスタンパク質の１つ）との相互作用を記載する（Ｇａｒｇ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２４，４４３−７）。ＦＬＡＧ−標識ＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔを２９３Ｔ細胞中で同時発現し、続いて抗−ＦＬＡＧアガロースでのＩＰ、そして全細胞ライゼートの抗Ｔ−ｂｅｔｍＡｂ、４Ｂ１０でのウエスタンブロットの初期の実験では、２つのタンパク質の物理的相互作用を明らかにしたが、Ｔ−ｂｅｔとｃ−ＭａｆまたはＮＦＡＴｃ２との相互作用は検出されなかった（図１０Ａ）。興味深いことに、Ｙ５２５ＦＴ−ｂｅｔは、ｗｔまたはＹ４３７ＦＴ−ｂｅｔに比べて低い結合親和性でＧＡＴＡ−３と相互作用した（図１０Ａ）。Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３短縮変異体との同時発現は、ＧＡＴＡ−３のＮ−末端（２５７ａａ）ドメインがＴ−ｂｅｔと特異的に相互作用したことを明らかにした（図１０Ｂ）。これはＭＹＣ−標識ＧＡＴＡ−３短縮物をＴ−ｂｅｔとコートランスフェクションし、そしてＭＹＣ−ＡＧ結合体と沈殿させることにより証明された（サンタクルズバイオテック社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、サンタクルズ）。タンパク質ブロットは抗−Ｔ−ｂｅｔＡｂでプローブをつけた。ＧＡＴＡ−３短縮物は抗−ＭＹＣｍＡｂで検出された（９Ｅ１０）。
【０２８９】
内因性のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３会合を直接試験するために、Ｔ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３の両方を発現する胸腺細胞を調査した。Ｂ６ｗｔおよびＴ−ｂｅｔ−／−の胸腺から単離した核抽出物を、抗−ＧＡＴＡ−３ｍＡｂ、ＨＧ３−３１とインキュベーションし、そして続いてプロテインＡ／Ｇアガロースとインキュベーションした。免疫複合体を解像し、そして抗−Ｔ−ｂｅｔＡｂでプローブを付けた。ＧＡＴＡ−３発現は抗−ＧＡＴＡ−３ｍＡｂで検出した。胸腺細胞ライゼートと抗−ＧＡＴＡ−３  Ａｂとの免疫沈降、続いて抗−Ｔ−ｂｅｔｍＡｂでのウエスタンブロットは、ｗｔでは２つのタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで会合するが、Ｔ−ｂｅｔ−／−胸腺では会合せず、この相互作用の部位が生理学的にも意味があるのかもしれないことを明らかにした（図１０Ｃ）。この会合にはＩＴＫの存在が必要であることは注目に値し（これはＩｔｋ−／−胸腺中には検出されなかったので）（図１０Ｄ、レーン３）（過剰発現実験ではＩＴＫの不存在下でＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３は相互作用できたが）、Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との会合はＩＴＫにより助長されることを示す。
【０２９０】
Ｔ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３との内因的会合も調査した。ナイーブなＴｈｐ細胞を抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８で２４時間刺激し、そして核抽出を免疫沈降のために調製した。ＬｅｘＡ  ＡｂをＧＡＴＡ−３  Ａｂの同位体対照として使用した。ＢＡＬＢ／Ｃ  ｗｔ、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＩｔｋ−／−マウスからのナイーブなＴｈｐを、抗−ＣＤ３に抗−ＣＤ２８およびＩＬ−２を加えたものと２４時間、ｒＩＬ−４およびｒＩＦＮγおよび上記のような核調製物と培養し、そして免疫沈降およびイムノブロット分析も上記のように行った。結果は２４時間の培養中、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびｒＩＬ−２のみで処理したＴｈｐ細胞中でＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３の内因性の会合があり（図１０Ｅ）、そしてＩＬ−４およびＩＦＮγの存在下で上記のように２４時間処置したＴｈｐではＴ−ｂｅｔおよびＧＡＴＡ−３のより高い発現が誘導された（図１０Ｆ）。さらに内因性Ｔ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３会合は、両タンパク質を発現することが知られているヒトナチュラルキラー細胞株ＹＴで検出された（図１０Ｇ）。
【０２９１】
Ｔｈｐ由来細胞におけるこのＩｔｋ媒介型のＴ−ｂｅｔ／ＧＡＴＡ−３相互作用をさらに調査するために、再構成されたＴ−ｂｅｔ−／−をｗｔまたはＹ５２５ＦＴ−ｂｅｔとＴｈｐ細胞に導入した。ＩＦＮγがＧＡＴＡ−３発現に及ぼす効果を排除し、そしてＩＴＫに関する要件が相互作用に重要であるのかどうかを調査するために、ｗｔおよびＹ５２５Ｆ変異体Ｔ−ｂｅｔを形質導入したＴ−ｂｅｔ−／−ｘＩＦＮγ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−ｘＩｔｋ−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔｈｐ細胞もそれぞれ単離した。形質導入した細胞は抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８でＴｈ２−歪み条件下で刺激し、そしてライゼートをＧＡＴＡ−３ａｂと免疫沈降させ、次いでＴ−ｂｅｔｍＡｂでウエスタンブロッティングした。対照、ｗｔまたはＹ５２５ＦＴ−ｂｅｔレトロウイルスで形質導入したＴｈ細胞中で、比較可能なＧＡＴＡ−３の発現が観察された。胸腺細胞ですでに観察したように、Ｙ５２５Ｆ変異体ではなくｗｔＴ−ｂｅｔがＧＡＴＡ−３と会合し、そしてこの相互作用にはＴｈ細胞中でＩＴＫの存在が必要であった（図１０Ｈ）。
【０２９２】
Ｔ−ｂｅｔがＴｈ２因子のＧＡＴＡ−３との相互作用を介してＴｈ２系譜コミットメントを制御するならば、これはＴｈ２サイトカイン座中の結合部位からＧＡＴＡ−３を封鎖することによりそうするだろう。ＥＬ４細胞をｗｔ、Ｙ５２５ＦまたはＹ４３７ＦＴ−ｂｅｔでトランスフェクトし、そして核抽出物をＩＬ−５プロモーターからの放射標識ＧＡＴＡ−３結合部位とインキュベーションするか、または放射標識ＳＰＩ結合部位とインキュベーションし、未変性６％ポリアクリルアミドゲルで解析し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。実際にこれらのＥＭＳＡ分析は、ＧＡＴＡ−３の規範的ＧＡＴＡ−３標的配列への、およびＩＬ−５プロモーター中のＧＡＴＡ−３標的配列への縮小した結合を明らかとした（図１０）。対照的に、Ｔ−ｂｅｔＹ５２５Ｆ変異体の発現はＧＡＴＡ−３／ＤＮＡ複合体の形成に影響を及ぼさなかった（図１０Ｉ、左パネル）。これら同じ抽出物の対照ＳＰ１プローブへの結合は均等であった（図１０Ｉ、右パネル）。ｗｔ、Ｙ５２５ＦおよびＹ４３７ＦＴ−ｂｅｔの発現レベルは比較可能であり、そして内因性ＧＡＴＡ−３発現はｗｔ、Ｙ５２５ＦまたはＹ４３７ＦＴ−ｂｅｔの発現により実質的な影響の受けず（図１０Ｊ）、ＧＡＴＡ−３／ＤＮＡ複合体の低下した量は、減少したＧＡＴＡ−３タンパク質によるものではないことを示す。エフェクターＴｈ２細胞からの核抽出物をＧＡＴＡ−３タンパク質の陽性対照として使用した。ＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔタンパク質のレベルについて制御された一過性のレポーター遺伝子アッセイは（図１０Ｌ）、ＥＬ４細胞をＧＡＴＡ−３およびＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡと、ならびにβ−ｇａｌレポーター遺伝子を含むＩＬ−５プロモーターレポーター遺伝子でコートランスフェクトし、そして誘導倍数で表されるβ−ガラクトシダーゼ活性で標準化した相対的ルシフェラーゼ活性をアッセイすることにより行い、Ｙ５２５ＦＴ−ｂｅｔではなくＴ−ｂｅｔがＧＡＴＡ−３依存的なＩＬ−５プロモーターの活性を抑制することを示し、この仮定を支持し（図１０Ｋ）、そしてＴ−ｂｅｔＹ５２５Ｆ変異体が初代Ｔｈ細胞でのＴｈ２サイトカイン生産の抑制に失敗したことと一致する。
【０２９３】
これらのデータとＩＴＫを欠くマウスの表現型を記載する以前の報告との関連は複雑である。ＩＴＫは、ホスホリパーゼＣγ１のリン酸化を介してＴＣＲ誘導型の細胞内Ｃａ＋の可動化を調節する（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２，９８７−１０００；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，６３８−６４１）。ＩＴＫを欠くマウスは減損したＴ細胞の活性化があり、Ｃａ＋＋の可動化が低下し、ＰＬＣ−γおよびＭＡＰキナーゼの活性化はＮＦＡＴおよびＡＰ−１転写因子の減損した活性化を導く。かなりの研究がＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞分化の支配にＩＴＫおよびＲＬＫを結び付けてきた。しかし様々な実験およびモデル系を１つの一体化したモデルに組み込むことは複雑であり、しかも問題が多い（Ｗｅｎ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８２，２４１−２５０；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，６３８−６４１；Ｆｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，３９９−４０９）。ＩＴＫ欠失ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リーシュマニア（Ｌ．Ｍａｊｏｒ）、Ｎ．ストロンギロイデス（Ｎ．Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）および喘息のモデルに対するそれらの免疫応答で観察されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで減損したＴｈ２分化能を有することが報告された（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１１８３−１１８８；Ｆｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，３９９−４０９；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．ａｎｄ  Ａ．Ａｕｇｕｓｔ（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０，５０５６−６３）。Ｉｔｋ−／−マウスはマンソン住血吸虫（Ｓ．Ｍａｎｓｏｎｉ）感染後に肉芽腫も発生できなかった（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１１８３−１１８８）。明らかにこれらの知見は、Ｔｈ２応答のＴ−ｂｅｔ媒介型阻害の促進におけるＩＴＫの役割と矛盾する。しかしＩｔｋ−／−マウスは休止している好酸球尿症および上昇したレベルのＩｇＥを表し、明確な抗原刺激前の強化されたＴｈ２発生を示唆し（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１１８３−１１８８）、そしてＩｔｋ−／−記憶細胞は実際に上昇したレベルのＴｈ２サイトカインを生産する。さらにＩＴＫおよびＲＬＫの両方が２倍欠失したマウスは、ｗｔおよびＲｌｋ−／−対（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）に匹敵するＴｈ２媒介型の肉芽腫を形成する（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１１８３−１１８８）。このような後者の観察は、Ｔ−ｂｅｔリン酸化の不存在により説明することができた。最後に、ヒトＩＬ−２の存在下で、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＩｔｋ−／−Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来するナイーブなＴｈｐを使用した我々の未だ報告していない実験では、わずかに減少したＩＬ−４レベルが観察されただけで、そしてこれまでの報告とは対照的に、対照ｗｔＴｈｐと比べてＩＬ−５���よびＩＬ−１３のレベルが減少よりもむしろ上昇した。これはＴ細胞よりはむしろ非Ｔ細胞からのＴｈ２サイトカインの生産がＩｔｋ−／−マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ表現型に貢献するのかもしれない。
【０２９４】
理論に結び付けられることは望まないが、これらのデータは、シグナルの強度がＴヘルパー細胞の発生を調節する１つのメカニズムを提供することができ、これはＴｅｃキナーゼが欠損しているマウスの分析からの結果と矛盾する可能性がある説明として示唆された（Ａｕｇｕｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．３４，１１８４−１１８９）。主に細胞質ゾルではあるが、ＩＴＫは休止Ｔ細胞の核に見い出される。この核にある集団は、おそらくＴ−ｂｅｔのリン酸化を介して休止（ｃｈｅｃｋ）中の基本的Ｔｈ２活性を維持するために役立つことができる。いったん有力で、しかも持続的な抗原性刺激状態が生じれば、ＰＬＣγ誘導型のＣａ２＋流入およびＮＦＡＴ活性化のようなＩＴＫに依存的であるものを含め多くの因子がＴ−ｂｅｔ抑制をくつがえし、そしてＴｈ２発生を促進する。
【０２９５】
等価物
当業者は日常的な実験を行うだけで、本明細書に記載する本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるだろう。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２９６】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｅａｒｓｏｎのタンパク質アライメントプログラムを使用して準備したマウスおよびヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸配列アライメントを示す。図１ＣはマウスおよびヒトＴ−ｂｅｔの核酸配列アライメントを示す。アライメントはＡＬＩＧＮプログラムを使用して準備した。Ｔ−ボックス配列は太字で示す。チロシンリン酸化部位に下線を付す。核局在化部位に矢印を付ける。
【図２】Ｔｅｃファミリーメンバーの保存された構造を示す。
【図３】ヒトＴ−ｂｅｔの予想されるチロシンリン酸化部位を示す。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで基質として作成し、そして使用したＴ−ｂｅｔの修飾形を示す。
【図５】ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで、ＩＴＫおよびＲｌｋの両方がＮ−末端およびＣ−末端がリン酸化されたが、Ｔ−ｂｅｔのＤＮＡ結合領域はリン酸化されていないことを示す。
【図６】Ｔ−ｂｅｔはＩＴＫノックアウト動物に由来するＴ細胞に存在するが、分子のチロシンリン酸化は減少していることを示す。対照的に、Ｔ−ｂｅｔはＲ１ｋノックアウトＴ細胞で過リン酸化された。
【図７】７Ａ〜７ＧはＴ−ｂｅｔがチロシンリン酸化されることを示す。
【図８】８Ａ〜８ＥはＴ−ｂｅｔのチロシンリン酸化がＴｈ２サイトカイン生産の最適な抑制に必要であることを示す。
【図９】９Ａ〜９ＦはＴｈ２が物理的にＩＴＫと相互作用することを示す。
【図１０】１０Ａ〜１０ＬはＴ−ｂｅｔが標的ＤＮＡへの結合からＧＡＴＡ−３を直接封鎖することを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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