(57)【要約】  本発明は、１種または複数のミオスタチン拮抗物質を用いてミオスタチンの活性を阻害することによりヒトまたは動物患者においてサルコペニアを治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルコペニアを治療する方法であって、これを必要とするヒトまたはヒト以外の患者に、有効量の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質を投与する工程を含む方法。
【請求項２】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が：
・抗ミオスタチン抗体；
・免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を遮断できるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーまたはミオスタチン免疫抱合体；
・切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびホリスタチンから選択されるミオスタチンのタンパク質阻害物質、あるいは該タンパク質阻害物質の機能的フラグメント；
・ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質；
・ピエドモンテーゼ対立遺伝子および３３５ないし３７５のアミノ酸位置でまたはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質；
・アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンと結合でき、ミオスタチンを阻害できる小ペプチド；
・ミオスタチンのスプライス変異体；
・ミオスタチン経路の調節物質；および
・アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗ミオスタチンリボザイムであって、ミオスタチン遺伝子発現の阻害によりミオスタチン活性を阻害できるもの
からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質がピエドモンテーゼ対立遺伝子あるいは３３５ないし３７５のアミノ酸位置で、またはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質である請求項２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質がアミノ酸位置３３５または３５０でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドである請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、配列番号８〜１４のポリペプチド、またはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列から選択されるミオスタチンのスプライス変異体である請求項２記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、配列番号１６または配列番号１８の「マイティー」ペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有する配列を含むミオスタチン経路の調節物質である請求項２記載の方法。
【請求項７】
衛星細胞の活性化、ならびに再生筋肉における筋芽細胞およびマクロファージの移動を増大させるための請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
筋肉再生をさらに促進するために、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦおよび成長ホルモンからなる群から選択される１種または複数の追加の成長促進化合物が、別々に、連続して、または同時のいずれかで、少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質と併用される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
局所または全身投与のために少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が処方される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、鼻、肺、筋肉内または腹腔内投与用に処方される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
これを必要とするヒトまたはヒト以外の患者におけるサルコペニアの治療用医薬の製造における少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質の使用。
【請求項１２】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が：
・抗ミオスタチン抗体；
・免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を遮断できるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーまたはミオスタチン免疫抱合体；
・切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびホリスタチンから選択されるミオスタチンのタンパク質阻害物質、あるいは該タンパク質阻害物質の機能的フラグメント；
・ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質；
・ピエドモンテーゼ対立遺伝子あるいは３３５ないし３７５のアミノ酸位置またはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質；
・アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンと結合でき、ミオスタチンを阻害できる小ペプチド；
・ミオスタチンのスプライス変異体；
・ミオスタチン経路の調節物質；および
・アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗ミオスタチンリボザイムであって、ミオスタチン遺伝子発現の阻害によりミオスタチン活性を阻害できるもの
からなる群から選択される請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、ピエドモンテーゼ対立遺伝子あるいは３３５ないし３７５のアミノ酸位置で、またはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が３３５または３５０のアミノ酸位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドである請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、配列番号８〜１４のポリペプチド、またはその機能的フラグメントまたは変異体、またはこれと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列から選択されるミオスタチンのスプライス変異体である請求項１２記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が配列番号１６または配列番号１８の「マイティー」ペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有する配列を含むミオスタチン経路の調節物質である請求項１２記載の使用。
【請求項１７】
医薬が、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦおよび成長ホルモンからなる群から選択される１種または複数の追加の筋肉成長促進化合物をさらに含み、その医薬が少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質および追加の化合物の分離、連続、または同時投与用に処方される請求項１１〜１７のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
医薬が局所または全身投与用に処方される請求項１１〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
医薬が経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、鼻、肺、筋肉内または腹腔内投与用に処方される請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
これを必要とするヒトまたはヒト以外の患者においてサルコペニアを治療する方法において用いられる、少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が：
・抗ミオスタチン抗体；
・免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を遮断できるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーまたはミオスタチン免疫抱合体；
・切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびホリスタチンから選択されるミオスタチンのタンパク質阻害物質、あるいは該タンパク質阻害物質の機能的フラグメント；
・ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質；
・ピエドモンテーゼ対立遺伝子または３３５ないし３７５のアミノ酸位置で、またはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質；
・アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンと結合でき、ミオスタチンを阻害できる小ペプチド；
・ミオスタチンのスプライス変異体；
・ミオスタチン経路の調節物質；および
・アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗ミオスタチンリボザイムであって、ミオスタチン遺伝子発現の阻害によりミオスタチン活性を阻害できるもの
からなる群から選択される請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、ピエドモンテーゼ対立遺伝子および成熟ミオスタチンペプチドであって、３３５〜３７５のアミノ酸位置で、またはその間でＣ末端切断を有するものから選択されるミオスタチンの優性阻害物質である請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、成熟ミオスタチンペプチドであって、３３５〜３５０のアミノ酸位置で、またはその間でＣ末端切断を有するミオスタチンの優性阻害物質である請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、配列番号８〜１４のポリペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれに対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列から選択されるミオスタチンのスプライス変異体である請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質が、配列番号１６または配列番号１８の「マイティー」ポリペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれに対して９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列を含むミオスタチン経路の調節物質である請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦおよび成長ホルモンからなる群から選択される１種または複数の追加の筋肉成長促進化合物をさらに含む請求項２０〜２５のいずれか１項記載の医薬組成物であって、組成物が少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質との分離、連続、または同時投与用に処方される医薬組成物。
【請求項２７】
局所または全身性投与のために処方される請求項２０〜２５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２８】
経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、鼻、肺、筋肉内または腹腔内投与のために処方される、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
これを必要とするヒトまたはヒト以外の患者においてサルコペニアを治療する方法において用いられる少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３０】
・抗ミオスタチン抗体；
・免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を遮断できるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーまたはミオスタチン免疫抱合体；
・切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびホリスタチンから選択されるミオスタチンのタンパク質阻害物質、あるいは該タンパク質阻害物質の機能的フラグメント；
・ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質；
・ピエドモンテーゼ対立遺伝子あるいは３３５ないし３７５のアミノ酸位置で、またはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質；
・アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンと結合でき、ミオスタチンを阻害できる小ペプチド；
・ミオスタチンのスプライス変異体；
・ミオスタチン経路の調節物質；および
・アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗ミオスタチンリボザイムであって、ミオスタチン遺伝子発現によりミオスタチン活性を阻害できるもの
からなる群から選択される請求項２９記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３１】
ピエドモンテーゼ対立遺伝子あるいは３３５ないし３７５のアミノ酸位置で、あるいはその間の位置でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択されるミオスタチンの優性阻害物質を含む請求項３０記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３２】
アミノ酸位置３３５または３５０でＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを含む請求項３１記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３３】
配列番号８〜１４のポリペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列から選択されるミオスタチンのスプライス変異体を含む請求項３０記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３４】
配列番号１６または配列番号１８の「マイティー」ペプチド、あるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％の配列同一性を有する配列を含むミオスタチン経路の調節剤を含む請求項３０記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３５】
筋肉再生をさらに改善するために、少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質との分離、連続または同時投与用の、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦおよび成長ホルモンからなる群から選択される１種または複数の追加の筋肉成長促進化合物との組み合わせにおける、請求項２９〜３４のいずれか１項記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３６】
局所または全身性投与のために処方される請求項２９〜３４のいずれか１項記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【請求項３７】
経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、鼻、肺、筋肉内または腹腔内投与用に処方される請求項３２記載の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、衛星細胞の活性化により、特に、これに限定されないが、サルコペニアを治療するために筋肉再生を誘発する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋組織再生において関与する正常なメカニズムは最初に衛星細胞の補充を含む。筋肉衛星細胞は成熟筋原線維の基底膜と筋鞘の間に位置する独立した系統の筋原性前駆細胞である。（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、１９９４；ＧｒｏｕｎｄｓおよびＹａｂｌｏｎｋａ−Ｒｅｕｖｅｎｉ、１９９３）。再生サイクルの間、衛星細胞は活性化され、筋線維から再生部位まで移動して、筋芽細胞を生じさせる。ほとんどの増殖筋芽細胞は分化して筋管になる。筋管は成熟し、筋繊維中に組み入れられる。残りの筋芽細胞は筋繊維に戻り、衛星細胞集団を回復し、このようにして再生サイクルを継続する能力を回復する（図１−概略図）。
【０００３】
最近の研究は、骨格筋再生の初期変化の間のマクロファージの役割も証明している（Ｍｅｒｌｙら、１９９９）。移植モデルは、マクロファージ浸潤の刺激の結果、衛星細胞の初期活性化がもたらされることを示し、このことはマクロファージが実際に筋肉再生において直接的役割を果たすことを示す（Ｌｅｓｃａｕｄｒｏｎら、１９９７；Ｌｅｓｃａｕｄｒｏｎら、１９９３）。
【０００４】
筋肉再生サイクルは、個人の一生を通して連続して疲弊または損傷した筋肉組織が置換される場合に起こる。しかしながら、身体が老化するにつれ、筋肉再生サイクルは効率が悪くなる。サルコペニアは、その結果、筋肉の量および性能が低下するが、正常な老化に関連する。骨格筋はそれ自体まだ再生できるが、中高年の筋肉における環境は、筋肉衛星細胞活性化、増殖および分化に対して有効でなくなり、その結果、筋肉組織の純損失が出る（ＧｒｅｅｎｌｕｎｄおよびＮａｉｒ、２００３）。
【０００５】
骨格筋再生の間のマクロファージ、衛星細胞および筋芽細胞の移動を指示する化学シグナルの性質は完全には理解されていない。
【０００６】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および機械成長因子（ＭＧＦ）を包含するいくつかの成長因子は、衛星細胞活性化を調整することにより筋肉再生に積極的な影響を及ぼすことが証明されている（Ｆｌｏｓｓら、１９９７；  Ｍｉｌｌｅｒら、２０００、ＧｏｌｄｓｐｉｎｋおよびＨａｒｒｉｄｇｅ、２００４）。しかしながら、現在、成長因子は臨床的に用いられておらず、サルコペニアの治療は体操、または成長ホルモン補給に限定されている（ＧｒｅｅｎｌｕｎｄおよびＮａｉｒ、２００３）。これらの治療法は限られた効果しか上げていない。
【非特許文献１】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、１９９４
【非特許文献２】ＧｒｏｕｎｄｓおよびＹａｂｌｏｎｋａ−Ｒｅｕｖｅｎｉ、１９９３
【非特許文献３】Ｍｅｒｌｙら、１９９９
【非特許文献４】Ｌｅｓｃａｕｄｒｏｎら、１９９７
【非特許文献５】Ｌｅｓｃａｕｄｒｏｎら、１９９３
【非特許文献６】ＧｒｅｅｎｌｕｎｄおよびＮａｉｒ、２００３
【非特許文献７】Ｆｌｏｓｓら、１９９７
【非特許文献８】Ｍｉｌｌｅｒら、２０００
【非特許文献９】ＧｏｌｄｓｐｉｎｋおよびＨａｒｒｉｄｇｅ、２００４
【非特許文献１０】ＧｒｅｅｎｌｕｎｄおよびＮａｉｒ、２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、サルコペニアにおいて衛星細胞活性化、増殖および分化により筋肉再生の有効な臨床治療を提供する必要がある。
【０００８】
本発明の一つの目的は、この必要性を何らかの形で満足させること、および／または少なくとも有用な選択をもたらすことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
意外にも、成長因子のＴＧＥ−ベータファミリーのメンバーである成長因子ミオスタチンは、はじめてサルコペニアの病因と関係があることが証明された。ミオスタチン活性の阻害はサルコペニアの動物モデルにおいて衛星細胞の活性化を著しく改善することが判明している。
【００１０】
従って、本発明は、サルコペニアの治療法であって、有効量の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質を、これを必要とする患者に投与する段階を含む方法を提供する。本発明は、ヒトおよびヒト以外の患者の両方のサルコペニア、ならびに筋肉萎縮および衛星細胞が活性化するようになる能力の低下により特徴づけられるサルコペニア関連疾患の治療に有用である。
【００１１】
ミオスタチン拮抗物質は、１種または複数の公知ミオスタチン阻害物質から選択することができる。例えば、米国特許第６０９６５０６号および米国特許第６４６８５３５号は、抗ミオスタチン抗体を開示している。米国特許第６３６９２０１号およびＷＯ０１／０５８２０は、免疫反応を惹起し、ミオスタチン活性を遮断することができるミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーおよびミオスタチン免疫抱合体を教唆している。ミオスタチンのタンパク質阻害物質がＷＯ０２／０８５３０６において開示されており、これは、切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメイン、およびホリスタチンを含む。ミオスタチンペプチド由来の他のミオスタチン阻害物質が公知であり、例えば、ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質（ＷＯ００／４３７８１）；ミオスタチンの優性阻害物質（ＷＯ０１／５３３５０）を含み、ピエドモンテーゼ対立遺伝子（３１３位のシステインがチロシンで置換されている）およびアミノ酸位置３３５から３７５またはその間の位置のいずれかでＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを含む。ＵＳ２００４／０１８１０３３も、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含む小ペプチドであって、ミオスタチンと結合でき、ミオスタチンを阻害できる小ペプチドを教唆している。
【００１２】
好ましくは、１種または複数のミオスタチン拮抗物質は、アミノ酸３３５、３５０の位置またはその間にＣ末端切断を有するミオスタチンペプチドおよびピエドモンテーゼ対立遺伝子からなる群から選択される１種または複数の優性阻害を含む。
【００１３】
１種または複数のミオスタチン拮抗物質は、配列番号８〜１４のいずれか一つのポリペプチドあるいはその機能的フラグメントまたは変異体、あるいはこれと９５％、９０％  ８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列を含むミオスタチンスプライス変異体も含むことができる。
【００１４】
１種または複数のミオスタチン拮抗物質は、配列番号１６または配列番号１８のポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体、あるいはこれと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路に関与する調節剤も含むことができる。
【００１５】
ミオスタチン拮抗物質は、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ分子、例えば、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ、あるいは抗ミオスタチンリボザイムであって、ミオスタチン遺伝子発現を阻害することによりミオスタチン活性を阻害するものも含むことができる。
【００１６】
１種または複数のミオスタチン拮抗物質が抗体を含む場合、前記抗体は哺乳動物または非哺乳動物由来の抗体、例えば、サメ由来のＩｇＮＡＲ抗体であるか、あるいは抗体はヒト化抗体であるか、あるいは抗体由来の機能性フラグメントを含む。
【００１７】
本発明はさらに、これを必要とする患者においてサルコペニアを治療するための医薬の製造における１種または複数のミオスタチン拮抗物質の使用を提供する。
【００１８】
１種または複数のミオスタチン拮抗物質は、前記で開示されたミオスタチン拮抗物質の群から選択することができる。
【００１９】
医薬は、局所または全身性投与用に処方することができ、例えば、医薬は筋肉中に直接注射するために処方することができるか、あるいは筋肉への全身性投与のための経口投与用に処方することができる。
【００２０】
本発明はさらに、１種または複数のミオスタチン拮抗物質を医薬上許容される担体とともに含む組成物であって、これを必要とする患者におけるサルコペニアの治療において用いられる組成物を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、これを必要とする患者におけるサルコペニアの治療において用いられる１種または複数のミオスタチン拮抗物質を提供する。
【００２２】
定義
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「サルコペニア」とは、老いにより引き起こされる筋肉量および性能における減退、ならびに筋肉萎縮および衛星細胞の活性化されるようになる能力の低下により特徴づけられるサルコペニア関連状態を意味する。
【００２３】
本明細書および請求の範囲全体庭田って用いられる「肥大」とは、細胞サイズの増加を意味する。
【００２４】
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「過形成」とは、細胞数の増加を意味する。
【００２５】
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「筋肉萎縮」とは、使用しない結果起こる筋肉組織の消耗または喪失を意味する。
【００２６】
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「阻害物質」または「拮抗物質」とは、タンパク質の活性を全体として、または一部のいずれかで減少させる働きをする任意の化合物を意味する。これは、タンパク質に結合し、タンパク質の活性を直接阻害するか、またはタンパク質の産生を減少させるか、またはその産生を増大させる働きをして、これにより存在するタンパク質の量に影響を及ぼし、その活性を減少させる化合物を包含する。
【００２７】
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「遺伝子発現」とは、転写の開始、ＤＮＡの切片をｍＲＮＡ中に転写すること、およびｍＲＮＡをポリペプチド中に翻訳することを意味する。
【００２８】
本明細書および請求の範囲全体にわたって用いられる「含む」とは、「少なくとも一部において〜からなる」、すなわち、この語を含む独立した請求項を解釈する場合、各請求項においてこの語より始まる特性はすべて存在する必要があるが、他の特性も存在し得ることを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、最初に、ミオスタチンがサルコペニアの病因に関連することを示す。特に、ミオスタチンは衛星細胞活性化、増殖および分化、したがってサルコペニアならびに骨格筋萎縮および衛星細胞の活性化されるようになる能力の減少により特徴づけられるサルコペニア関連疾患における筋肉再生の負の調節因子である。
【００３０】
ミオスタチンは筋肉成長の調節に関与する公知成長因子である。特に、ミオスタチンは成長因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーであり、筋形成の有効な負の調節因子である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７）。
【００３１】
ミオスタチンに関するノックアウトマウスは、その全身にわたって筋肉量が著しく増大している。ミオスタチンゼロマウスは正常なマウスよりもほぼ３０％重い体重を有し、筋繊維過形成および肥大のために個々の筋肉重量において２〜３倍の増加を示す。ミオスタチンにおける自然突然変異は、例えば、ベルギー・ブルーおよびピエドモンテーゼ種のウシなどの「筋肉倍増」表現型の原因として特定されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７ｂ、Ｋａｍｂａｄｕｒら、１９９７、Ｇｒｏｂｅｔら、１９９７）。
【００３２】
最近の研究は、ミオスタチンが、筋形成の増殖および分化段階の両方を調節することによる細胞周期の進行および機能の有効な調節物質であることを示唆している（Ｌａｎｇｌｅｙら、２００２；Ｔｈｏｍａｓら、２０００）。幾つかの研究は、胚筋形成の間だけでなく、出産後の筋肉成長おいてのミオスタチンの役割を証明している。Ｗｅｈｌｉｎｇらによる研究（Ｗｅｈｌｉｎｇら、２０００）およびＣａｒｌｓｏｎらによる研究（Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９９）は、マウスにおける後肢懸垂による萎縮関連筋肉喪失はエム・プランタリス（Ｍ．ｐｌａｎｔａｒｉｓ）における増加したミオスタチンレベルと関連することを示唆した。増加したミオスタチンレベルは、ＨＩＶ患者において見られる重度の筋肉の萎縮にも関連する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、１９９８）。筋肉不使用中に観察される高レベルのミオスタチンの一つの説明は、ミオスタチンが衛星細胞活性化の阻害物質として機能し得ることである。実際、これは、ミオスタチンがない結果、インビボにおける活性化衛星細胞のプールが増大し、衛星細胞の自己再生が向上することを証明する最近の研究により裏付けされている（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、２００３）。
【００３３】
今まで、動物の全身量の調節を助けるためのミオスタチン阻害物質の開発、または全身性筋肉萎縮に関連する状態の治療における使用をはじめとするミオスタチンの多くの潜在的用途が示唆されてきた。しかしながら、現在、臨床または獣医学的に使用されているミオスタチン阻害物質はない。加えて、ミオスタチンは老化において見られる筋肉量および機能の自然な減少（サルコペニア）に関連づけられていない。
【００３４】
本発明は、したがって、サルコペニアの治療法であって、これを必要とする患者に有効量の少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質を投与する段階を含む方法に関する。患者は好ましくはヒト患者であるが、本発明の方法はヒト以外の動物におけるサルコペニアを治療するためにも用いることができる。
【００３５】
ミオスタチン拮抗物質は、全体としてまたは一部分においてミオスタチンの活性を阻害できる１種または複数の分子から選択することができる。
【００３６】
特に、ミオスタチン拮抗物質は、任意の１種または複数の公知ミオスタチン拮抗物質から選択することができる。例えば、ＵＳ６０９６５０６およびＵＳ６４６８５３５は、抗ミオスタチン抗体を開示している。ＵＳ６３６９２０１およびＷＯ０１／０５８２０は、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチンマルチマーおよびミオスタチン免疫抱合体であって、免疫反応を惹起し、ミオスタチン活性を遮断できるものを示唆している。ミオスタチンのタンパク質阻害物質は、ＷＯ０２／０８５３０６において開示され、これは、切断アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメイン、およびホリスタチンを包含する。ミオスタチンペプチド由来の他のミオスタチン阻害物質は公知であり、例えば、ミオスタチンを過剰発現する細胞からの培養物中に放出されるミオスタチン阻害物質（ＷＯ００／４３７８１）；ミオスタチンの優性阻害物質（ＷＯ０１／５３３５０）を包含し、これはピエドモンテーゼ対立遺伝子（３１３位のシステインはチロシンで置換されている）および３３５〜３７５のアミノ酸位置、またはその間の位置のいずれかでＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを包含する。ＵＳ２００４／０１８１０３３は、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンと結合し、ミオスタチンを阻害できる小ペプチドも示唆している。
【００３７】
好ましくは、ミオスタチン拮抗物質は優性阻害ペプチドである。これらは、親タンパク質の生物学的活性を阻害する働きをする親患者由来のペプチドである。前述のように、ミオスタチンの優性阻害ペプチドは公知であり、アミノ酸３３５、３５０の位置またはその間でＣ末端切断されている成熟ミオスタチンペプチドおよびピエドモンテーゼ対立遺伝子を含む（ここで、３位のシステインがチロシンで置換されている）。
【００３８】
ミオスタチンは、最初は、Ｎ末端でセクレタリーシグナル配列を有する３７５アミノ酸前駆体分子として産生され、これは開裂されて、不活性プロフォームが残る。ミオスタチンはＡｒｇ２６６でのフリンエンドプロテアーゼ開裂により活性化され、Ｎ末端プロドメイン（または潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）ドメイン）および成熟ミオスタチンドメインを放出するしかしながら、開裂後、プロドメインは不活性複合体中の成熟ドメインと結合したままであり得る（Ｌｅｅら、２００１）。従って、プロドメイン、またはそのフラグメントは本発明においてサルコペニアを治療するためのミオスタチン拮抗物質として用いることもできる。
【００３９】
ミオスタチン拮抗物質としての働きもするミオスタチンのスプライス変異体が特定されている（ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０）。ミオスタチンスプライス変異体（ＭＳＶ）は、第三エクソンの大部分を除去する余分なスプライス事象に起因する。結果として得られるＭＳＶポリペプチド、ヒツジ（ｏＭＳＶ；配列番号８）およびウシＭＳＶ（ｂＭＳＶ；配列番号１１）は最初の２５７アミノ酸を天然のミオスタチンプロペプチドと共有するが、独自の６４アミノ酸Ｃ末端（ヒツジｏＭＳＶ６５、配列番号９およびウシｂＭＳＶ６５、配列番号１２）を有する。ｍＲＮＡは１９５ヌクレオチドで異なるが、ＭＳＶにおける２５７位のバリン残基は標準ミオスタチン配列と同じである。ベルギー・ブルーウシのＭＳＶ（ｂＭＳＶｂｂ；配列番号７）は７ａａ短い３１４ａａタンパク質（配列番号１４）をコードするが、タンパク質配列の残りは調べた２種において完全な相同性を示した。独自の６５ａａＣ末端ペプチド（配列番号１２）がｂＭＳＶｂｂにおいて保存される。
【００４０】
フリンエンドペプチダーゼを含むプロペプチド転換酵素（ＰＣ１−７）の（ＫＥＲＫ）開裂部位が２７１〜２７４位で存在することも判明している。２７４位での開裂により、４７アミノ酸Ｃ末端成熟ＭＳＶフラグメント（ヒツジｏＭＳＶ４７、配列番号１０およびウシｂＭＳＶ４７、配列番号１３）が放出される。
【００４１】
６５アミノ酸ＭＳＶフラグメント（配列番号１２）はインビトロでミオスタチン拮抗物質としての働きをすることが証明されており（ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０）、ＭＳＶはインビトロでミオスタチン活性を調節する働きをすることが予想される。従って、本発明において開示されるＭＳＶポリペプチドはミオスタチンを阻害し、かくして本発明に従ってサルコペニアを治療するために用いることができる。
【００４２】
もう一つ別のミオスタチン拮抗物質は、ミオスタチン遺伝子発現のモジュレーターである。ミオスタチン遺伝子発現は、転写および／または翻訳を妨害するポリヌクレオチドを導入することにより変更することができる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを導入することができ、これは；アンチセンス発現ベクター、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、または当該分野において公知の任意の他の手段であって、アンチセンスポリヌクレオチドの有効性を向上させるための化学的修飾の使用を含むものを包含する。ミオスタチンのアンチセンス分子は、当該分野において公知の方法、例えば、（Ｒａｙｂｕｒｎら、２００５）において記載されているもの、およびミオスタチン遺伝子配列の知見（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７）により産生することができる。
【００４３】
任意のアンチセンスポリペプチドは問題になっているポリヌクレオチドに対して１００％相補性である必要はないが、アンチセンスポリヌクレオチドが遺伝子と結合するか、または他の遺伝子の発現を実質的に中断することなく、ｍＲＮＡが遺伝子発現を中断させることを可能にするために十分な同一性を有する必要があるだけであると理解される。５’未翻訳領域を含む、遺伝子に対して相補性であるポリヌクレオチドも、ミオスタチンタンパク質の翻訳を中断するために用いることができると理解される。同様に、これらの相補性ポリヌクレオチドは１００％相補性である必要はなく、ｍＲＮＡと結合し、他の遺伝子の翻訳を実質的に中断することなく翻訳を中断するために十分である必要がある。
【００４４】
遺伝子発現の調節は公知技術に準拠することにより、当業者により理解されるように、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をはじめとする干渉ＲＮＡ分子の使用も含む（Ｒｅｎら、２００６）。
【００４５】
遺伝子発現の調節は、触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムの使用により行うこともできる。かかるリボザイムは、特異的に標的とされるＲＮＡ分子と組み合わせるために設計できることは当該分野において公知である。リボザイムは標的ＲＮＡと結合し、開裂させる（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００５）。
【００４６】
遺伝子発現の調節およびＲＮＡ処理の分野において公知の任意の他の技術は、ミオスタチン遺伝子発現を調節するためにも用いることができる。
【００４７】
ミオスタチンのさらなる拮抗物質は、ミオスタチン受容体由来のペプチドである。このような受容体由来のフラグメントは一般に、ミオスタチン結合ドメインを含み、これはその後、野生型ミオスタチンと結合し、阻害する。ミオスタチン受容体はアクチビンＩＩＢ型であり、そのペプチド配列は（Ｌｅｅら、２００１）において記載されている。従って、当業者らは、不必要な実験を行うことなく、かかる受容体拮抗物質を製造できる。
【００４８】
別のミオスタチン拮抗物質は、抗ミオスタチン抗体を含む。ミオスタチンに対する抗体は、前述のように、かかる抗体の製造法同様、当該分野において公知である。抗体は、哺乳動物または非哺乳動物抗体、例えば、サメから得られるＩｇＮＡＲクラスの抗体；またはミオスタチンと結合できる、かかるタンパク質由来のフラグメントまたは誘導体などである。
【００４９】
ミオスタチンシグナル伝達経路に関与する他の分子、特に、ミオスタチンに対して拮抗作用を有する分子は本発明における使用に適していると理解される。「マイティー」と呼ばれ、ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８に開示されているこのようなペプチドは、筋肉成長を促進する働きをする。「マイティー」発現は、ミオスタチンにより抑制され、従って、同じシグナル伝達経路に関与する。従って、ミオスタチンを直接阻害する代わりに、ミオスタチンのシグナル伝達作用に対抗するペプチド、例えば、「マイティー」を用いてサルコペニアを治療できると理解される。
【００５０】
「マイティー」遺伝子（ヒツジ；配列番号１５およびウシ；配列番号１７）をコードするポリヌクレオチドを、「マイティー」の永久的または一過性発現のいずれかを有する筋肉部位で、局所遺伝子療法に用いることができるか、あるいは「マイティー」タンパク質（ヒツジ；配列番号１６およびウシ；配列番号１８）を直接使用できることが期待される。遺伝子コードにおける余剰のために、本質的に同じ活性を有し、配列番号１５〜１８において開示されているものと同一でな配列を製造できる。さらに、同じ本質的機能を有する重要なドメインのいずれにおいても変化を有さないペプチドも作成できる。変化は、挿入、欠失、または１つのアミノ酸残基からもう一つ別のものへの変化を含むことができる。このようなバリエーションは本発明の範囲内に含まれる。
【００５１】
本発明は、ミオスタチン拮抗物質がサルコペニアを治療でき、従って、公知または開発された任意のミオスタチン拮抗物質はこの方法における使用に適しているという知見に基づく。これは、ミオスタチンと結合できる任意の分子、例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られるＩＭＭ７免疫タンパク質、または当該分野において公知の任意の他の種類の結合タンパク質を包含する。ミオスタチンと結合し、阻害できる他のペプチドは公知であり、例えば、アミノ酸ＷＭＣＰＰを含有するペプチドである（ＵＳ２００４／０１８１０３３）。ミオスタチンを阻害できる任意の化合物は本発明の方法および医薬において有用であると理解される。
【００５２】
本発明の方法において有用なミオスタチン拮抗物質は、以下に議論されるようにサルコペニアを包含する筋肉再生の動物モデルにおいて、またはインビトロモデルにおいて生物学的活性について試験することができ、医薬組成物中に処方される適切に活性な化合物である。本発明の医薬組成物は、本明細書において記載される１種または複数のミオスタチン拮抗物質に加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当該分野において周知の他の物質を含むことができる。このような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきでない。担体または他の物質の厳密な性質は、医薬組成物の所望の性質、および、例えば、経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所、鼻、肺、筋肉内または腹腔内などの投与経路に依存するであろう。
【００５３】
経口投与用医薬組成物は、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、顆粒または液体形態であり得る。錠剤または他の固体投与形態は通常、固体担体、例えば、ゼラチン、デンプン、マンニトール、結晶性セルロース、または医薬製造において一般的に用いられる他の不活性物質を含む。同様に、液状医薬組成物、たとえば、シロップまたはエマルジョンは、一般的に、液体担体、例えば、水、石油、動物性または植物性油、鉱油または合成油を含む。
【００５４】
静脈内、皮膚、皮下、皮内または腹腔内注射に関して、活性成分は、非経口的に許容される水溶液であって、発熱因子を含まず、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する水溶液の形態である。
【００５５】
鼻または肺投与に関して、活性成分は、吸入に適した微粉末または溶液または懸濁液の形態である。あるいは、活性成分は、鼻粘膜への直接適用に適した形態、例えば、軟膏またはクリーム、鼻スプレー、点鼻薬またはエアゾルの形態であってよい。
【００５６】
１種または複数のミオスタチン拮抗物質のサルコペニアを治療する能力は、Ｋｉｒｋ（２０００）の方法に従った高齢マウスモデルにおいて証明することができる。
【００５７】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の医薬組成物と同時投与して、治療計画に対して相加効果または相乗効果をもたらすことができる１種または複数の筋肉成長因子の使用を想定している。このような成長因子は、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦ、成長ホルモンなどからなる群から選択することができる。このような物質は、本明細書において記載される少なくとも１つのミオスタチン拮抗物質と分離、連続、または同時のいずれかで投与することができる。
【００５８】
本発明の医薬組成物の投与は、好ましくは「予防上有効な量」または「治療上有効な量」であり、これは個体に対して有益性を示すために十分である。投与される実際の量、ならびに投与速度および時間経過は、治療されるサルコペニアの性質および重さに依存する。治療の処方、例えば、用量の決定などは、一般的な開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および実施者に公知の他の因子を考慮する。前述の技術およびプロトコルの例は、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版、Ｏｓｌｏ、Ａ．（編）、１９８０において見出すことができる。
【００５９】
本発明はさらに、これを必要とする患者においてサルコペニアを治療するための医薬の製造における１種または複数のミオスタチン阻害物質の使用にも関する。１種または複数のミオスタチン拮抗物質は前記のミオスタチン拮抗物質の群から選択することができる。
【００６０】
医薬は、局所または全身性投与用に処方することができ、例えば、医薬は筋肉中に直接注射するために処方することができるか、または筋肉に全身性送達するための経口投与用に処方することができる。
【００６１】
医薬は、さらに、サルコペニアの治療に対して相加効果または相乗効果をもたらすために、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＭＧＦ、成長ホルモンなどからなる群から選択される１種または複数の追加の筋肉成長促進化合物を含むことができる。医薬は、１種または複数のミオスタチン拮抗物質および１種または複数の筋肉成長促進化合物と分離、連続または同時投与するために処方することができる。
【００６２】
理論に拘束されないが、ミオスタチン拮抗物質は、衛星細胞活性化、増殖および分化を惹起することにより、サルコペニアの治療において有効であると考えられる。
【００６３】
例えば、ミオスタチン活性の阻害は、筋肉再生に対して直接影響を及ぼす。特に、衛星細胞および筋芽細胞移動は、ミオスタチンが存在しないか（ミオスタチンゼロマウス）、またはミオスタチン拮抗物質を用いて阻害される場合に増大する。加えて、衛星細胞活性化は、はじめて、老化筋肉において顕著に増加することが証明された。
【００６４】
加えて、ミオスタチン活性の阻害は、マクロファージ補充に対して直接影響を及ぼすことがはじめて証明されている。特に、マクロファージの数および再生部位への移動時間は、ミオスタチンが存在しないか（ミオスタチンゼロマウス）、またはミオスタチン拮抗物質を用いて阻害される場合に増大する。前述のように、マクロファージは衛星細胞活性化に関与すると考えられる。
【００６５】
従って、ミオスタチンの阻害は、衛星細胞移動および活性化を増加させるために直接作用し、またマクロファージ補充により衛星細胞活性化に対して間接的に作用するようである。
【００６６】
ミオスタチンゼロマウスにおける結果は、ミオスタチン活性の阻害の結果、衛星細胞活性化、増殖および分化が増大することを間接的に証明する。これは、ミオスタチンの阻害が、正常なミオスタチンレベルを有する動物において衛星細胞活性化の増大に有用であることを示唆する。しかしながら、衛星細胞は胚起源であり、ミオスタチンゼロマウスは胚形成期で衛星細胞の有意に高次の集団を有するので、ミオスタチンゼロ表現型は野生型動物において複製することができる。これは、衛星細胞の実際の数がミオスタチンゼロ基底レベルまで増大させることができないためだけでなく、筋肉細胞再生サイクルそれ自体がミオスタチンゼロマウスにおいてさらに有効であるためである。加えて、ミオスタチンは筋肉以外の組織において見出されるので、ミオスタチン活性の部分的ノックアウトは不都合な副作用を有し得る。従って、ミオスタチン拮抗物質の使用によるミオスタチン活性の阻害の、高齢者における出産後の筋肉再生サイクルに対する効果は、予想するのが困難である。これは、示唆されたサルコペニアの治療は、正常な機能が損なわれた呼吸器および心血管機能の結果であるので、ミオスタチンの部分的ノックアウトでないことを示す、ＧｏｌｄｓｐｉｎｋおよびＨａｒｒｉｄｇｅ、２００４により立証されている。しかしながら、驚くべきことに、本発明はまず、ミオスタチン拮抗物質は不都合な副作用なしにサルコペニアを首尾よく治療するために使用できることを見出した。
【００６７】
本発明は、概して、本出願の明細書において個々に、またはまとめて記載または指示されている部分、要素および特徴、および前記部分、要素または特性の任意の２つまたはそれ以上のいずれかまたはすべての組み合わせからなると言われ、本明細書において、本発明が関連する分野において公知の同等物を有する具体的な整数が記載されている場合、このような公知同等物は個々に記載されているように本発明に組み入れられると見なされる。
【００６８】
本発明は、前記事項にあり、また以下の実施例において記載されている構造も想定する。
［実施例］
【実施例１】
【００６９】
ミオスタチンは衛星細胞活性化を調節する。
方法
衛星細胞のインビボＢｒｄＵ標識
衛星細胞活性化を、インビボでの５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）標識により調査した。野生型およびミオスタチンゼロマウスにＢｒｄＵ（Ｒｏｃｈｅ）（３０  ｍｇ／ｋｇ）を単一パルスとして２時間腹腔内投与した後、安楽死させた。Ｙａｂｌｏｎｋａ−ＲｅｕｖｅｎｉおよびＮａｍｅｒｏｆｆ（１９８７）の適応プロトコに従って衛星細胞を単離した。簡単にいうと、１および６月齢の野生型およびミオスタチンゼロマウス（１群あたりｎ＝１０）をＣＯ２ガス、続いて頸椎脱臼により殺した。後肢筋肉をばらばらにし、細かく切り刻み、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中０．２％（ｗ／ｖ）１Ａ型コラゲナーゼ（＞２６０  ＣＤＵ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）中で９０分間３７℃で消化した。筋肉スラリーを摩砕し、次いで７０μＭフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通した後、７０％および４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配（Ｓｉｇｍａ）上にロードし、２０００×ｇで２０分間２５℃で遠心分離した。２つの勾配溶液間の界面を回収し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁させた。ＢｒｄＵ取り込みを検出するために、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＦＬＵＯＳ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。細胞を３０分間、氷上７０％エタノール中に固定し、２Ｎ  ＨＣＬ  ＋  ０．５  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間室温（ＲＴ）で処理した後、０．１  Ｍ四ホウ酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ８．５）中で中和した。細胞を０．５％ＰＢＳ中Ｔｗｅｅｎ−２０中に透過化させ、４５分間モノクローナル抗ＢｒｄＵ−ＦＬＵＯＳ抗体（１：２５、Ｒｏｃｈｅ）とともにインキュベーション緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中、３７℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターにより分析した。
【００７０】
単一筋原線維単離および培養
単繊維をすでに記載したＲｏｓｅｎｂｌａｔｔら（１９９５）と同様にして単離した。  簡単に言うと、１および２４月齢野生型およびミオスタチンゼロマウスをＣＯ２ガス、次いで頸椎脱臼により安楽死させた。ＴＡをばらばらにし、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中０．２％（ｗ／ｖ）１Ａ型コラゲナーゼ（＞２６０  ＣＤＵ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）中で６０分間３７℃で消化した。筋肉をＤＭＥＭ  ＋  １０％ウマ血清（ＨＳ）  ＋  ０．５％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）に移し、穏やかに摩砕することにより繊維を分離した。単離された繊維を、１０％マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でコーティングされた４穴チャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、３７℃で１０分間４％ＰＢＳ中パラホルムアルデヒド中で固定するか、またはＤＭＥＭ  ＋  １０％  ＨＳ  ＋  ０．５％  ＣＥＥ  ＋  ＢｒｄＵ（１：１０００）（Ｒｏｃｈｅ）中、４８時間３７℃、ＣＯ２で培養した。
【００７１】
ミオスタチン拮抗物質（アミノ酸３５０でＣ末端切断されたミオスタチンの優性阻害ペプチド、本明細書において、以下「３５０」または「３５０タンパク質」と称する）の衛星細胞活性化に対する影響を決定するために、６月齢野生型マウスのＴＡ筋肉から得られる単一筋繊維を５μｇ／ｍｌまたは１０μ／ｍｌのいずれかの３５０の存在下、培地中、３２時間培養し、メタノールで固定し、ＰＢＳ中で洗浄した。固定された繊維を１：５０希釈度の抗ＰＣＮＡ抗体で０．３５％カラギーナンラムダ中一夜インキュベートした。ヤギ抗マウス−ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５４６を用いて初代抗体を検出した。ＰＣＮＡ陽性活性化衛星細胞を顕微鏡下で計数し、合計筋核のパーセントとして表した。
【００７２】
衛星細胞は、ＣＤ３４抗体で、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら（２０００）の適応法に準拠して検出された。簡単にいうと、繊維をパラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で１０分間透過化し、ＰＢＳ中１０％正常ヤギ血清中で３０分間室温で遮断した。ラット抗マウスＣＤ３４モノクローナル抗体（クローンＲＡＭ３４；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（ＰＢＳ中０．３５％カラギーナンラムダ（Ｓｉｇｍａ）中１：１００）を一夜導入した。ビオチニル化ヤギ抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＰＢＳ中０．３５％カラギーナンラムダ（Ｓｉｇｍａ）中１：３００で、２時間室温で用い、続いてストレプトアビジン接合Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をＰＢＳ中０．３５％カラギーナンラムダ（Ｓｉｇｍａ）中１：４で、１時間室温で用いて、初代抗体を検出した。繊維をＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１０００）で５分間対比染色した後、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）でマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡およびＳＰＯＴ  ＲＴカメラおよびソフトウェアを用いて調べた。
【００７３】
ＢｒｄＵを組み入れた細胞を検出するために、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン標識および検出キット（Ｒｏｃｈｅ）プロトコルに従った。繊維をＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：１０００）で５分間対比染色した後、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ）でマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡およびＳＰＯＴ  ＲＴカメラおよびソフトウェアを用いて調べた。
【００７４】
ミオスタチンによる衛星細胞活性化の阻害。
前述のようにして単一筋繊維を４週齢野生型マウス（ｎ＝３）から単離した。繊維を３分間付着させたままにし、次いで５００μｌの繊維媒体（ＦＭ）［ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清（ＨＳ）、０．５％  （ｖ／ｖ）ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）、（ペニシリン／ストレプトマイシン）］またはＦＭと増加する量の組み換えミオスタチン（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）を添加した。イー・コリからの組み換えミオスタチンの精製は他のところに記載されている（Ｔｈｏｍａｓら、２０００）。細胞を７２時間、３７℃／５％ＣＯ２で繊維から移動させた。各ウェル中の移動した衛星細胞の数を倒立顕微鏡下で計数した。統計分析のために少なくとも３０単繊維の複製を用いた。グループ間の差を、ＧｅｎＳｔａｔ６を用いた二項分布を有する一般化線型モデルにより分析した。
【００７５】
繊維上の活性化ＳＣ中のインビトロＢｒｄＵ取り込み：
前述の方法により、４週齢野生型マウス（ｎ＝６）から筋繊維を単離し、１０％マトリゲルコーティングされた４穴Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライドに付着させた。１０μＭ  ＢｒｄＵ（増加する濃度のミオスタチンを含むか、または含まない）を含むＦＭ培地をウェルに添加し、繊維を４８時間インキュベートした。救済実験において、単離された繊維を、１μｇ／ｍｌミオスタチンを含有するＦＭ中で２４時間培養し、次いで半分を穏やかに洗浄し、ＦＭに変え、一方、組み換えミオスタチンを有する培地中でもう半分をさらに２４時間放置した。繊維をＣａｒｎｏｙｓ固定剤で一夜−２０℃で固定した。Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）細胞増殖キット１プロトコルを用いてＢｒｄＵ取り込みおよび検出を行った。ＤＡＰＩ染色を用いてすべての筋核を可視化した。繊維上のＢｒｄＵ陽性核（ｎ＝３０）を計数し、１００  ＤＡＰＩ陽性核あたりのＢｒｄＵ陽性核の数を計算した。グループ間の差を、ＧｅｎＳｔａｔ６を用いて、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を有する一般化線型モデルにより分析した。
【００７６】
結果
ミオスタチンは衛星細胞の活性化を阻害する
ミオスタチンの衛星細胞活性化に対する直接的影響を証明するために、本発明者らはミオスタチン処理後の衛星細胞増殖を評価した。野生型マウスから単離された個々の筋細胞を培養して、ＢｒｄＵ取り込みにより示されるように衛星細胞を活性化させ、増殖させた（ＣｏｎｂｏｙおよびＲａｎｄ、２００２；Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら、１９９５）。組み換えミオスタチンの不在下で、衛星細胞が増殖し、計数された６％の核におけるＢｒｄＵの取り込みに至った。しかしながら、濃度を増大させながら組み換えミオスタチンを培地に添加すると、衛星細胞の増殖は少なくなった。５μｇ／ｍｌの濃度のミオスタチンで、１％未満の計数された核がＢｒｄＵを取り込んだ（Ｐ＜０．００１）。ミオスタチンの衛星細胞増殖に対する影響が可逆的であることを証明するために、添加された組み換えミオスタチンを除去し、組み換えミオスタチンの除去に際して、有意に多数の衛星細胞が増殖した（Ｐ＜０．００１、図２ＡおよびＢ）。
【００７７】
これらの結果は、静止衛星細胞が細胞周期に参加することをミオスタチンが直接阻害することを示す。ミオスタチンの衛星細胞増殖に対する影響をさらに研究するために、衛星細胞を繊維から分離し、移動させ、その後増殖させた。図２Ｃは、組み換えミオスタチンを培地に添加しない場合、平均３０の筋芽細胞が検出されたことを示す。しかしながら、移動した筋芽細胞の数は、ミオスタチンの濃度が増加するにつれて減少した。これらの結果は、ミオスタチンが衛星細胞の活性化を直接阻害することを明らかに示す。
【００７８】
老化の間の衛星細胞数および活性化に対するミオスタチンの影響
ミオスタチンを衛星細胞において発現させ、幼齢ミオスタチンゼロマウスを用いた研究は、ミオスタチンがないと、単位繊維長あたりの衛星細胞数が多くなり、またその活性化される傾向が増加することを示した（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、２００３）。ミオスタチンおよび加齢の衛星細胞挙動に対する影響を解明するために、衛星細胞の合計数およびその活性化されるようになる能力を１〜２４月齢野生型およびミオスタチンゼロマウスから定量化した。
【００７９】
単位繊維長あたりの衛星細胞数を分析するために、１および２４月齢の野生型およびミオスタチンゼロＴＡマウスから単離された単繊維に付着した衛星細胞を、細胞表面マーカーＣＤ３４を用いて計数した（図３Ａ）。結果は、繊維１００筋核あたりの衛星細胞の平均数は、１月齢野生型繊維において観察された５匹から１月齢ミオスタチンゼロ繊維において観察された１１匹まで有意に増加したことを示す（図３Ａ）。１および２４月齢野生型またはミオスタチンゼロ繊維間で顕著な変化は観察されないので、老化は衛星細胞数にほとんど影響を及ぼさないようである（図３Ａ）。
【００８０】
衛星細胞の数だけでなく、衛星細胞の活性も、筋肉が再生する能力に関連するので、インビトロおよびインビボＢｒｄＵ標識を用いて、衛星細胞活性を調査した。単離された繊維に付着したインビトロＢｒｄＵ標識衛星細胞は、１月齢野生型ＴＡにおける繊維あたりの活性化された衛星細胞の平均パーセンテージは６．５％であるのに対して、１月齢のミオスタチンゼロＴＡ筋肉においては１０％であったことを示す（図３Ｂ）。しかしながら、老化の間に、衛星細胞活性化は、野生型およびミオスタチンゼロの両方の２４月齢マウスにおいて減少した（図３Ｂ）。２４月で、野生型繊維に比べて、ミオスタチンゼロ繊維において依然として２倍の数の活性化された衛星細胞があることは注目に値する。最後に、衛星細胞が活性化されるようになる傾向も、インビボＢｒｄＵ取り込みを用いて測定した。ＢｒｄＵ標識された衛星細胞のＦＡＣＳ分析は、インビトロ標識衛星細胞と類似した傾向を示した。１月齢野生型筋肉からの活性化衛星細胞のパーセンテージは８．５％であるのに対して、１月齢ミオスタチンゼロ繊維においては１４．８％であった。年齢が増加するにつれ、野生型およびミオスタチンゼロの両方の６月齢筋肉における活性化衛星細胞のパーセンテージはそれぞれ２％および５％まで有意に減少した（図３Ｃ）。ミオスタチンゼロマウスにおいて、対照と比較して２倍の数の活性化可能な衛星細胞があることは注目に値する。
【００８１】
３５０は衛星細胞を活性化できる
ゼロマウスにおける衛星細胞の筋繊維あたりの数および活性化の程度をはじめとする生理学的特性は、出産後にミオスタチンと接触しないことよりも、胎児発育の間に介在する影響のためであるので、本発明者らは、ミオスタチン拮抗物質の野生型マウスからの衛星細胞活性化に対する影響を試験した。衛星細胞を含有する野生型マウスからの単一筋繊維を、増加する濃度の３５０とともにインキュベートした場合、衛星細胞活性化の数も増大することが観察された。この結果は、３５０が野生型筋肉において衛星細胞の有効なアクチベーターであることを裏付ける。これはさらに、ミオスタチンゼロマウスにおける増大した衛星細胞活性化が観察されることは、胎児のミオスタチンに対する非接触から生じる効果よりも、引き続き出産後もミオスタチンに非接触であるためであるらしいことを示す。３５０が静止野生型衛星細胞を活性化できるという知見は、ミオスタチンゼロマウスが老化に際して活性化衛星細胞のレベルを増大させるという観察と併せて、３５０または他のミオスタチン拮抗物質の投与は、高齢者におけるサルコペニアなどの疾患の開始を防止することが期待できることを示す。さらに、活性化された衛星細胞の割合がすでに有効である場合において、状態の重さを軽減することが期待できる（図４）。
【実施例２】
【００８２】
ミオスタチン拮抗物質は、衛星細胞の炎症反応および走化性を増加させる
サルコペニアは加齢に関連する筋肉萎縮の形態である。加齢に伴って、筋肉量の減少は、筋繊維の萎縮を伴う。これらの事象は、筋繊維だけでなく、衛星細胞にも影響を及ぼし、筋肉が再生する能力の低下に至る。これは主に、衛星細胞が損傷および筋繊維の正常な補充の必要性に反応して活性化する傾向の喪失による。加えて、もう一つ別の再生の主な段階である筋肉損傷に対する反応も、高齢者において減少し、サルコペニアの症状の部分的原因である。ミオスタチンは筋形成の有効な負の調節剤であり、老化中の循環において増加することが証明されている。本発明者らは、増加したミオスタチンレベルは衛星細胞の活性化および炎症細胞の走化性に対して抑制的であることを裏付けるデータを提示する。本発明者らはさらに、強力なミオスタチン拮抗物質は衛星細胞活性化および炎症細胞の走化性のミオスタチンによる阻害を逆転または救済するという証拠も提供する。これらの驚くべき知見は、ミオスタチン阻害物質がサルコペニアの治療法としての働きをすることができることを示す。
【００８３】
材料および方法
３５０の発現および精製
ウシミオスタチンの２６７〜３５０アミノ酸に対応するｃＤＮＡ（以下、３５０または３５０タンパク質と称する）をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ１６−Ｂベクター中にクローンした。３５０タンパク質の発現および精製を製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って、自然条件下で行った。
【００８４】
ノテキシンモデル
２５％Ｈｙｐｎｏｒｍ（クエン酸フェンタニル０．３１５  ｍｇ／ｍｌおよびフルアニゾン１０  ｍｇ／ｍｌ）および１０％Ｈｙｐｎｏｖｅｌ（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ、５  ｍｇ／ｍｌ）の混合物を体重１０ｇあたり０．１  ｍｌで使用して、６〜８週令オスＣ５７ＢＬ／１０およびＭｓｔｎ−／−マウス（ｎ＝２７／群）を麻酔した。１００μｌシリンジ（ＳＧＥ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、右足の前脛骨筋に１０μｌの１０μｇ／ｍｌノテキシンを筋肉注射した。０日（対照）、および１、２、３、５、７、１０、１４または２８（ｎ＝３／日）で安楽死させたマウスから前脛骨筋を取り出した。前脛骨筋をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃ中にマウントし、液体窒素中で冷却されたイソペンタン中で凍結させた。老化した筋肉に対する３５０の試験に関して、１才の野生型マウスに前記のようなノテキシンを左前脛骨（ＴＡ）筋中に注射した。ノテキシンを注射されたマウスに、ミオスタチン拮抗物質、３５０を体重１グラムあたり６μｇのミオスタチン拮抗物質、３５０、または等量の食塩水（対照マウス）を１、３、５、および７日に皮下注射するかのいずれかであった。３５０の筋肉治癒に対する影響を評価するために、マウスをノテキシンの注射後１、３、７、１０および２８日に安楽死させ、ＴＡ筋肉をばらばらにし、タンパク質単離または組織切断のために処理した。凍結された筋肉サンプルを−８０℃で貯蔵した。７μｍの横断面（ｎ＝３）を３レベルで、１００μｍ離れて切り出した。切片を次いでヘマトキシリン、エオシンまたはＶａｎ  Ｇｅｉｓｅｎで染色した。切片を次いで、ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  ＤＣ−３３０カラーカメラ（ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  Ｉｎｃ．）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて調べ、撮影した。  
【００８５】
免疫組織化学
凍結筋肉切片（厚さ７μｍ）を２％パラホルムアルデヒド中で後固定し、次いでＰＢＳ中０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で透過化し、次いで１０％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清−Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液（ＮＧＳ−ＴＢＳ）で１時間室温で遮断した。切片を５％  ＮＧＳ−ＴＢＳ中で希釈された抗体とともに一夜４℃でインキュベートした。使用した抗体は、マウス抗ＭｙｏＤ、１：２５希釈（５５４１３０；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）活性化筋芽細胞の特異的マーカー（Ｃｏｏｐｅｒら、１９９９；  Ｋｏｉｓｈｉら、１９９５）；ヤギ抗Ｍａｃ−１、１：４００希釈（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍ−１９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）浸潤末梢マクロファージについて特異的な抗体（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９７９）；１：３００希釈度のマウス抗ビメンチン抗体、線維芽細胞のマーカーであった。切片を３回ＰＢＳで洗浄し、次いでロバ抗マウスＣｙ３接合体、１：４００希釈度（７１５−１６５−１５０；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）またはビオチニル化ロバ抗ヒツジ／ヤギＩｇＧ抗体１：４００希釈度（ＲＰＮ  １０２５；  Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかとともにインキュベートした。二次抗体インキュベーションに続いて、５％  ＮＧＳ−ＴＢＳ中で希釈されたフルオレセイン（１：４００希釈度（Ｓ−８６９；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））と接合したストレプトアビジンとともに３０分間室温でインキュベートした。切片をＰＢＳ中で３回リンスし、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｄａｋｏ（登録商標）蛍光封入剤でマウントした。前脛骨筋切片を落射蛍光顕微鏡により調べた。代表的な顕微鏡写真を、ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  ＤＣ−３３０カラーカメラ（ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  Ｉｎｃ．、ＩＮ、ＵＳＡ）を取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影した。Ｓｃｉｏｎ画像化プログラム（ＮＩＨ）を用いて、Ｍｓｔｎ−／−および野生型マウスから、あらかじめ免疫組織化学について使用した５つのランダム筋肉切片について平均筋肉面積を測定した。
【００８６】
走化性分析
一次筋芽細胞を４〜６週齢マウスの後肢筋肉から、公開されたプロトコル（Ａｌｌｅｎ  ら、１９９７；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ、１９９７）に従って培養した。簡単に言うと、筋肉を細かく刻み、０．２％コラゲナーゼ１Ａ型中で９０分間消化した。コーティングされていないプレート上で３時間プレプレートすることにより培養物を筋芽細胞について濃縮した。筋芽細胞培養物を１０％マトリゲルコーティングされたプレート上、３７℃／５％  ＣＯ２で２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０％ＨＳおよび１％  ＣＥＥで補足された成長培地（ＧＭ）中に保持した。培養物純度の程度を培養物中４８時間後のＭｙｏＤ発現のフローサイトメトリー分析により評価した。トリプシンを用いて細胞を収穫し、１０６細胞／２００μｌの濃度で懸濁し、一夜５ｍｌの７０％エタノール中、−２０℃で固定した。染色は、３０分間室温で、ウサギポリクローナル抗ＭｙｏＤ、１：２００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用い、続いてＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗ウサギ抱合体、１：５００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて行った。分析は、各分析において集められた１０４細胞的事象に関して２通りで行われた。順方向および側面散乱特性に関してゲートでコントロールすることにより、デブリスを除外した。細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。マクロファージを腹腔洗浄技術により単離した。ザイモサン活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）を公開されたプロトコル（ＣｏｌｄｉｔｚおよびＭｏｖａｔ、１９８４）に従って調製した。直径７ｍｍのウェルを用いたシングルブラインド−ウェルボイデン型チャンバー（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ  ＵＳＡ）中で走化性実験を行った。８μｍ穴を有する標準的ポリカーボネートフィルター（Ｎｅｕｒｏプローブ；穴＝表面積の６％）を完全に洗浄し、筋芽細胞分析に関しては、フィルターを１％ＤＭＥＭ中マトリゲルで３０分間処理した。フィルターを次いで乾燥し、チャンバーの最上部および底部の間に置いた。
【００８７】
筋芽細胞の走化性分析に関して、５％ニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ）＋透析緩衝液を含有するＤＭＥＭを正の対照として使用した。組み換えミオスタチン（２．５および５μｇ／ｍｌのミオスタチン）および３５０タンパク質（５倍ミオスタチン濃度、すなわち、１２．５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌ）を正の対照培地に添加した。プレーンＤＭＥＭを負の対照として使用した。２４穴プレート上で、最下部ウェルを試験培地または対照培地で満たした。７５０００細胞を最上ウェルに添加した。プレートを７時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。膜の上面をあらかじめ湿らせた綿棒で洗浄して、移動しなかった細胞を除去した。膜を次いで固定し、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン中で染色し、スライド上にウェットマウントした。移動した細胞を膜ごとに４つの代表的領域で計数し、平均数をプロットした。
【００８８】
マクロファージの走化性分析のために、３３％ザイモサン活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）＋透析緩衝液を含有するＤＭＥＭを正の対照として使用した。組み換えミオスタチン（５μｇ／ｍｌミオスタチン）および３５０タンパク質（２および５倍ミオスタチン濃度、すなわち、１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌ）を正の対照培地またはプレーンＤＭＥＭに添加した。２４穴プレート上で、最下部ウェルを試験培地または対照培地で満たした。７５０００細胞を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）０．８μｍ膜を含有する最上ウェルに添加した。プレートを４時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。膜の上面をあらかじめ湿らせた綿棒で洗浄して、移動しなかった細胞を除去した。膜を次いで固定し、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン中で染色し、スライド上にウェットマウントした。移動した細胞を膜ごとに４つの代表的な領域で計数し、平均数をプロットした。
【００８９】
一次線維芽細胞を子羊皮膚外植片から得た。１０ｐｇ／ｍｌの組み換えＴＧＦ−βを含有するＤＭＥＭを正の対照として使用した。組み換えミオスタチン（５μｇ／ｍｌミオスタチン）を正の対照培地に添加した。２４穴プレート上で、最下部ウェルを試験培地または対照培地で満たした。８８０００細胞を、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）０．８μｍ膜を含有する最上ウェルに添加した。プレートを４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。膜の上面をあらかじめ湿らせた綿棒で洗浄して、移動しなかった細胞を除去した。膜を次いで固定し、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン中で染色し、スライド上にウェットマウントした。移動した細胞を膜ごとに４つの代表的な領域で計数し、平均数をプロットした。
【００９０】
遺伝子発現のＲＴ  ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、全ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ前値増幅キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行った。１μｌの逆転写反応を用いてＰＣＲを９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で３０秒行った。各遺伝子について、指数関数的増幅に必要なサイクル数を、様々なサイクルを用いて決定した。アガロースゲル上で、単位複製配列を分離し、ナイロン膜に移した。ＰＣＲ産物をサザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。各データポイントを多数のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡにより標準化した。
【００９１】
結果
ミオスタチンは筋芽細胞、マクロファージおよび線維芽細胞の走化性に影響を及ぼす。
炎症反応は、例えば、損傷を受けたか、あるいは疲弊した筋肉細胞に反応した再生サイクルに関与する。免疫反応は、好酸球の存在により特徴づけられ、野生型およびＭｓｔｎ−／−筋肉の両方においてノテキシン注射後２４時間以内に筋芽細胞移動が見られた（図５Ｃ）。２日までに、炎症反応および衛星細胞移動における野生型およびＭｓｔｎ−／−反応間の差は顕著であり、Ｍｓｔｎ−／−筋肉片の再生の部位で核の付着が顕著に増大していた（図５Ｄ、矢印）。観察された核の数の増加は、マクロファージおよび筋芽細胞の数の増加のためである。核の最高密度は、壊死性筋原線維の縁に沿って（図５Ｄ、矢印）、特に、Ｍｓｔｎ−／−部分において見られた。３日までに、再生野生型筋肉部分も核の数が増大したが、依然としてＭｓｔｎ−／−マウスから集められた匹敵する組織においてよりもずっと少なかった（図５Ｅ）。ノテキシン注射後の単核細胞の付着は、野生型およびＭｓｔｎ−／−筋肉片の両方において５日で最高であった（図５Ｆ）。認められる主な効果は、マクロファージおよび筋芽細胞のＭｓｔｎ−／−筋肉片における再生部位への移動の促進であった。
【００９２】
筋肉再生の間に、炎症細胞および衛星細胞は再生の部位へ移動する（Ｗａｔｔら、１９９４）。ミオスタチンの欠損が活性化衛星細胞または炎症細胞のいずれかの移動を促進するかどうかを究明するために、再生の部位での炎症細胞および筋芽細胞の割合を定量化した。免疫組織化学を使用して、筋芽細胞の特異的マーカーであるＭｙｏＤを検出し（Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、２０００）、浸潤末梢マクロファージに関して、Ｍａｃ−１を検出した（Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９５）。対照未処理筋肉片はＭｙｏＤ免疫染色に関して陰性であることが判明した。筋肉片をＤＡＰＩで染色して、核の合計数を計数した。定量化の結果は、Ｍｓｔｎ−／−再生筋肉において、野生型切片と比較して、２倍の数の筋原性細胞（ＭｙｏＤ陽性）（図６Ａ）およびマクロファージ（Ｍａｃ−１陽性）（図６Ｂ）が２日に再生の部位で存在することを示す。注射後２日から５日まで、Ｍｓｔｎ−／−筋肉片は野生型筋肉よりも多くの筋芽細胞を有していた（図６Ａ）。ＭｙｏＤ陽性細胞と同様に、ノテキシン損傷に反応して、Ｍｓｔｎ−／−筋肉においてマクロファージの増大した再生部位への浸潤が、ずっと早期に見られた（２日）（図６Ｂ）。加えて、炎症細胞数は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉においてより迅速に減少し、このことは、炎症細胞反応の全プロセスがＭｓｔｎ−／−マウスにおいて加速されたことを示す（図６Ｂ）。
【００９３】
Ｇｒｏｕｎｄｓら（Ｇｒｏｕｎｄｓら、１９９２）は、ＭｙｏＤおよびミオゲニン遺伝子発現を筋肉再生の間の移動する筋芽細胞の非常に早期の検出のためのマーカーとして使用できることを証明した。従って、ＭｙｏＤおよびミオゲニンの発現が再生組織において検出された。定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果は、筋肉調節因子ｍｙｏＤおよびミオゲニンの発現は、野生型筋肉と比較して、Ｍｓｔｎ−／−筋肉においてより早期に発現されたことを裏付ける。高レベルのＭｙｏＤ  ｍＲＮＡがＭｓｔｎ−／−筋肉においてノテキシン注射後１２時間以内に検出された。しかしながら、野生型筋肉において、ＭｙｏＤ発現は、ノテキシン注射後１日までは検出不可能であった（図６Ｃ）。同様に、ミオゲニンについてのより高レベルのｍＲＮＡも再生Ｍｓｔｎ−／−筋肉においてノテキシン注射後１２時間以内に非常に早期に検出された。しかしながら、野生型再生筋肉において、ミオゲニンｍＲＮＡはノテキシン注射により引き起こされる筋肉損傷後１日まで検出されなかった（図６Ｃ）。このように、免疫組織化学および遺伝子発現分析からの結果は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉における再生部位への筋原性細胞の移動が増大し、促進されるということと一致する。
【００９４】
老齢期で、骨格筋において衛星細胞活性化および炎症反応の減少が見られた。本明細書において提示されたデータに基づいて、本発明者らは、老化筋肉において見られるミオスタチンのレベルの増加は、損傷に反応して、また必要に応じて筋肉塊の減少を予防するために、衛星細胞が活性化される傾向の喪失の一因となることを提案する。サルコペニアにおいて見られるこれらの状態を逆転するために、本発明者らは老齢マウスをミオスタチン拮抗物質で処理した。
【００９５】
３５０によるミオスタチン活性阻害の増大した炎症反応に対する有用な効果を証明するために、ノテキシン注射後に筋肉再生を受けるマウスを３５０タンパク質で処置し、炎症反応を測定した。３５０で処置された２日の損傷筋肉において、より高いパーセンテージのＭａｃ１陽性マクロファージが見られた（図７）。３日までに、パーセンテージは３５０処置筋肉において、食塩水で処置された３日の筋肉よりも低くなり、７日および１０日の筋肉においてさらに低下し続けた。この結果は、３５０処置筋肉における２日までの早期またはより顕著なマクロファージの補充と、それに続く７日および１０日までの補充の減少を示す。これらの結果は、３５０処置で促進された筋肉炎症プロセスを示す。ミオスタチン拮抗物質、例えば３５０が、ミオスタチンの阻害効果を減少させることによりマクロファージ応答を向上させる能力は、ミオスタチン阻害物質または拮抗物質の投与は、サルコペニアにかかっている人々に対して、老齢期の筋肉完全性を保持するために必要な炎症反応の復元により、有益な影響を及ぼすことを示す。
【００９６】
筋芽細胞に加えて、線維芽細胞も再生部位に移動し、占拠する。筋肉再生中の線維芽細胞移動の動力学に対するミオスタチンの影響を調査した。図８において示されるように、ビメンチン抗体（線維芽細胞の特異的マーカー）での染色は、野生型筋肉と比較して、Ｍｓｔｎ−／−マウスにおけるＴＡ筋肉において線維芽細胞の付着が実質的に少ないことを示す。この結果は、線維芽細胞に関する移動分析についての以下のデータと合わせて、ミオスタチンは線維芽細胞の化学誘因物質として作用することを明らかに証明する。
【００９７】
ミオスタチンによる筋芽細胞およびマクロファージの走化性の阻害および３５０によるその救済
２４時間後にノテキシンにより損傷を受けた筋肉組織においてミオスタチンレベルにおいて著しい倍数の増加があることが証明されている（Ｋｉｒｋら、２０００）。
【００９８】
前述の結果は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉で、再生部位へのマクロファージの浸潤が増加し、筋芽細胞の移動が促進されることを示す。両細胞種はその動きを支配する走化性因子により直接影響を受けることが知られているので（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、１９９７；Ｊｏｎｅｓ、２０００）、筋芽細胞由来の衛星細胞およびマクロファージの移動能力に対するミオスタチンの効果を調査した。ミオスタチンが走化性シグナルを妨害するかどうかを試験するために、ブラインドウェル走化性チャンバーを使用した。単離された筋芽細胞またはマクロファージを、フィルターを通って化学誘因物質（筋芽細胞についてＣＥＥ、マクロファージについてＺＡＭＳ活性化血清）へ移動するその能力について評価した。単離された筋芽細胞は、フローサイトメトリーにより評価すると、９０％筋原性（ＭｙｏＤ陽性）であることが判明した。図９において示されるように、５μｇ／ｍｌミオスタチンをＺＡＭＳ培地に添加することは、マクロファージ移動を完全に阻害する。５μｇ／ｍｌミオスタチンを含有する培地に３５０タンパク質を添加する場合、ミオスタチンのマクロファージに対する化学阻害効果の顕著な救済が観察される（２０倍増加）。この結果は、ミオスタチン阻害物質、例えば、３５０の投与は、ミオスタチンによるマクロファージ移動の阻害を減少させることにより、筋肉再生を促進できることを裏付ける。
【００９９】
マクロファージ移動に対する影響に加えて、本発明者らはさらに、ミオスタチン拮抗物質、例えば３５０はミオスタチンの筋芽細胞の走化性移動に対する負の影響も減少させることができることを示す。組み換えミオスタチンを２．５および５μｇ／ｍｌで正の対照培地に添加することは、それぞれ筋芽細胞移動の６６および８２％阻害に至る。３５０タンパク質が組み換えミオスタチンを含有する培地に添加される場合、ミオスタチンの筋芽細胞に対する化学阻害効果は、正の対照において観察されるのと同様のレベルまで救済され、かくして、ミオスタチン拮抗物質、例えば３５０は筋芽細胞移動を向上させることにより筋肉再生を有効に促進できることが示される（図１０Ｂ）。ミオスタチン拮抗物質、例えば３５０がミオスタチンの阻害効果を減少させることにより筋芽細胞移動を向上させる能力は、ミオスタチン阻害物質の投与は、老齢期に筋肉完全性を維持するために必要な筋肉再生反応を再生することにより、サルコペニアにかかっている人々に対して有用な影響を及ぼすことを示す。
【０１００】
ミオスタチンは線維芽細胞の化学誘因物質として作用する
マクロファージおよび筋芽細胞と対照的に、ミオスタチンは線維芽細胞の移動に関して走化性剤として作用する。このことは、ミオスタチンゼロ筋肉において線維芽細胞の再生部位への移動の減少が観察されることにより裏付けられる（図１０Ａ）。ミオスタチンの線維芽細胞に対する走化性効果を直接証明するために、組み換えミオスタチンを用いて移動分析をインビトロで行った。図１０Ａにおいて示されるように、ミオスタチンの添加は、緩衝液対照と比較して、線維芽細胞の走化性移動を増大させる。
【実施例３】
【０１０１】
ミオスタチンに対抗することは、線維症を軽減し、筋肉再生を向上させる
方法
切断損傷モデル
各マウス（野生型およびミオスタチンゼロ）の左前脛骨筋（ＴＡ）で３ｍｍの横切開を行った。損傷後０、３、５、および７日に、野生型のＴＡに、体重１ｇあたり２μｇ／ｇ（合計８５μｇ／マウス）の３５０タンパク質または食塩水のいずれかを損傷部位に注射した（ＴＡ筋肉中）。損傷を受けていない右ＴＡを対照として使用した。損傷および対照筋肉を切断後２、４、７、１０および２１日に集め、その重量を測定した。再生および再生切断筋肉組織におけるコラーゲン沈着の程度もＶａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ染色により測定した。
【０１０２】
ＳＥ顕微鏡法
筋肉サンプルから脂肪および腱を除去し、２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを含有する１０  ｍｌの０．１  Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．４）中に４８時間穏やかに揺動させながら固定した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ中１時間洗浄した後、５０ｍｌの２Ｍ  ＮａＯＨに移し、５日間、一定の２５℃でインキュベートした。サンプルを次いでＰＢＳ中で洗浄し、５０ｍｌの無菌蒸留水に移した。筋肉を一定の２５℃でさらに４日間保持した。最初の３６時間、水を１２時間ごとに替え、次いでその後２４時間ごとに替えた。筋肉を１％タンニン酸に２時間移し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄した。筋肉を１％ＯｓＯ４で２時間洗浄し、続いて上昇勾配のエタノール（５０％〜１００％）中に３回、それぞれ１５分間浸漬することにより脱水した。二酸化炭素を用いて筋肉サンプルを乾燥し、金でコーティングした。１０ｋＶの加速電圧で走査型電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ  ４１００、Ｊａｐａｎ）を用いて試験片を調べ、撮影した。
【０１０３】
コラーゲン蓄積を野生型対ゼロ切断ＴＡにおいて、２１日で、実施例２において記載するようにＶａｎ  Ｇｅｉｓｅｎを用いて評価した。
【０１０４】
結果
ミオスタチンがない結果、筋肉再生が向上し、線維症が軽減される
サルコペニアの特質の１つは、線維症の増進による筋肉強度の喪失である。出産後老化の間の骨格筋の退化および再生の繰り返されるサイクルの結果、繊維性組織が蓄積される。線維症におけるミオスタチンの役割を評価するために、両筋肉遺伝子型の組織学をノテキシン注射後で比較した（実施例２における方法の項を参照）。２８日で、損傷を受けた野生型筋肉からのヘマトキシリンおよびエオシンで染色された部分において瘢痕組織が観察され、一方、Ｍｓｔｎ−／−筋肉部分においてはほとんど見られなかった（図１１Ａ）。結合組織の存在は、Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎの染色によりさらに確認された（図１１Ａ）。２８日での野生型筋肉部分はさらに大きなコラーゲンの部分を有し、従って、Ｍｓｔｎ−／−筋肉と比較して、より多くの瘢痕組織が切断された野生型組織において見られた。この結果をさらに確認するために、走査型電子顕微鏡を用いて再生された筋肉を分析した。０日（対照）および２４日の再生された筋肉走査型電子顕微鏡写真は、筋原線維により占められていた空間を取り巻く結合組織フレームワークを示す（図１１Ａ）。野生型もＭｓｔｎ−／−筋肉も、対照（損傷を受けていない）サンプルにおいて線維空洞のまわり肥厚性結合組織を有していなかった。しかしながら、筋肉再生の２４日までに、緻密な結合組織の束状構造が野生型筋肉において観察されたが（図１１Ａ）、Ｍｓｔｎ−／−筋肉においては観察されなかった。同様に、ミオスタチンゼロ対野生型マウスを比較する切断された筋肉モデルにおいて、２８日の再生筋肉部位でのコラーゲン蓄積の程度は、ミオスタチンゼロマウスにおいて有意に減少した（データは省略）。これらの結果は、ミオスタチンがないと、筋肉再生後の瘢痕組織の減少につながることを裏付ける。これは、老化筋肉において瘢痕組織の減少を助け、かくしてサルコペニアの症状の軽減の助けることが期待できる。
【０１０５】
３５０処置は筋肉再生を増進し、線維症を軽減する
筋肉再生におけるミオスタチン拮抗物質、例えば３５０の有効性を研究するために、１才の野生型マウス（Ｃ５７  Ｂｌａｃｋ）をノテキシンで傷つけ、３５０を注射した（実施例２の方法を参照）。ノテキシン損傷後、典型的には、結果として生じる浮腫のために筋肉重量はまず増加し、続いて損傷を受けた筋繊維が壊死し、損傷の部位から除去されるために減少する。この後、新しい線維の成長により筋肉重量は再び増加し始める。試験の結果は、３５０処置された筋肉は７および１０日で対照の食塩水を注射された筋肉ほど多くの重量が減らないことを示す（図１２）。これは、おそらくは損傷を受けた筋肉におけるより速い修復のためである。示された分子データ（図７）は、実際に３５０処置マウスにおいて、促進され、向上されたマクロファージ移動およびサルコペニアを治療するためのミオスタチン拮抗物質の使用に関連すると先に議論された、他の促進された筋肉再生プロセスの組み合わせのために、損傷を受けた筋肉はずっと速く再生されたという仮説を裏付ける。
【０１０６】
組織学的分析は、食塩水および３５０処置筋肉間の変動を確認した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、食塩水処置筋肉と比較して、３５０で処置された筋肉中の壊死部分における、より早期の発生期筋繊維形成および関連するより早期の減少を示した（図１３）。この結果は、３５０処置マウスにおける促進され、向上された筋肉再生を裏付ける。図９において示される組織学的データを分析して、全筋肉断面図の再生および非再生部分の両方を定量化した。筋肉部分は、一貫して、各筋肉の中腹部分から採取された。図１４において示される分析は、７日で、食塩水処置されたマウスにおいて、３５０処置マウスに比べて非再生部分が増加することを示す。その結果、７日で３５０処置されたマウスと比較して、対照において再生筋肉は比較的少ない。同じ効果が、１０日においても見られる。これらの結果は、食塩水処置対照と比較して、３５０処置筋肉において、非再生部分は減少するが、再生部分は増加することを裏付ける。
【０１０７】
加えて、コラーゲンを検出するＶａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ染色は、ノテキシン投与後１０および２８日で、食塩水処置筋肉と比較して、３５０処置筋肉において、減少したレベルのコラーゲン堆積を示し、このことは、３５０処置は筋肉再生プロセス中に線維症を軽減したことを示す（図１５）。この結果は、ミオスタチン拮抗物質、例えば、３５０は、筋肉再生中の瘢痕組織（線維症）形成を減少させることを示す。これは、ミオスタチン拮抗物質、例えば、３５０の投与は、老化筋肉において瘢痕組織の減少を助け、かくしてサルコペニアの症状を減少させることが期待できることを示す。
【０１０８】
Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ染色された画像を用いて、ランダムに選択された再生繊維部分を測定して、ノテキシン投与後２８日での線維サイズを評価した（図１６）。この分析からの結果は、３５０処置筋肉からの再生された繊維は、食塩水処置された筋肉よりも明らかに大きかったことを示した。修復された筋繊維サイズの増加は、３５０によるミオスタチン機能の阻害による筋肉細胞における肥大の誘発を裏付ける。
【０１０９】
３５０処置マウスにおける増大した筋肉再生が一つには衛星細胞の増大した活性化によることをさらに裏付けるために、本発明者らは、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤタンパク質の発現について分子分析を行った。Ｐａｘ７タンパク質は、衛星細胞のマーカーであり、ＭｙｏＤの発現は、衛星細胞の活性化を示す。タンパク質分析は、衛星細胞および活性化の増大したレベルを裏付けた（図１７）。Ｐａｘ７レベル（図１７Ａ）は、３５０処置で、３、７、１０、および２８日でより高く、このことは、食塩水処置筋肉と比較して、衛星細胞活性化における増加を示す。加えて、３５０処置筋肉において、Ｐａｘ７のレベルは７および１０日間で増加したのに対して、食塩水処置筋肉においては減少が観察された。これは、３５０処置筋肉における１０日付近での衛星細胞活性化の増加を示す。ＭｙｏＤレベル（図１７Ｂ）も、３５０処置で３、７、および１０日で高くなり、このことは、食塩水処置筋肉と比較して筋形成が増大したことを示す。まとめて考えると、３５０処置組織におけるより高いＰａｘ７およびＭｙｏレベルは、衛星細胞の活性化と、従ってその後の筋形成が増大するという観察を裏付ける。この結果は、３５０での処置は筋肉再生を促進し、増進させ、サルコペニアの症状を減少させることを裏付ける。
【０１１０】
３５０の局所適用は筋肉再生を増進させた
筋肉再生の増進において、筋肉再生部位での３５０の直接投与の有効性を評価するために、前記のようにして切断することにより傷を負わせた後で再生しているＴＡ筋肉に３５０タンパク質を適用した。損傷を受けていない右ＴＡを対照として使用した。損傷および対照筋肉を損傷後２、４、７、１０および２１日で集め、その重量を測定した。炎症浸潤による筋肉重量における初期増加は、３５０および食塩水を注射されたＴＡの両方において、切断後２および４日で観察された（図１８）。損傷後７〜１０日で、筋肉は３５０および食塩水注射されたＴＡの両方において、その正常な重量を回復する。しかしながら、損傷後２１日で、３５０注射されたＴＡは食塩水処置筋肉と比較して筋肉重量において反映されるように筋肉サイズにおいて有意な増加を示す。
【０１１１】
考察
サルコペニアは筋肉量および強度の加齢に関連した損失である。筋肉量の減少は、一つには、衛星細胞活性化およびその結果として損傷後に筋肉が再生し、加齢中、長期にわたる筋肉補充の正常なプロセスを維持する能力が減少することにより引き起こされる。炎症反応の遅い反応速度および筋芽細胞反応の減少した数は、高齢期の減少した筋肉再生の主な原因となる因子である。最近、筋肉成長の有効な負の調整物質のレベルは、高齢の男性および女性において高いことが証明されている。ここで記録されているデータは、ミオスタチンが衛星細胞活性化および炎症反応を阻害することを明らかに示す。したがって、本発明者らは、ミオスタチンがサルコペニアの進行に関与することを提案する。ここで示されるデータは、ミオスタチンがないか、または３５０によるミオスタチン活性化の阻害の結果、筋肉萎縮の間の衛星細胞活性化および炎症反応が増加することを示す。３５０は衛星細胞を大いに活性化することができ、３５０の投与の結果、炎症反応が活性化され、衛星細胞活性化により駆動されるプロセスによる加齢の間に筋肉組織が再生され、補充される。これはさらに、再生部分へのマクロファージおよび筋芽細胞の両方の増進された走化性につながる。ミオスタチンがないことはさらに筋芽細胞の増殖の増加につながるので、これはさらに、筋形成の増加、筋損傷の修復および加齢中の筋肉の補充の増加につながる。実際に、本明細書に示されたインビボ試験データは、３５０投与は筋肉再生を増進できることを明らかに示し、従って、３５０および他のミオスタチン拮抗物質がサルコペニアの有益な治療選択肢であることを裏付ける。
【０１１２】
筋肉損傷および再生の繰り返されるサイクルのために、筋肉の繊維過多が増大し、筋肉強度の低下につながる。筋肉再生の間、筋肉再生の間、繊維過多は、浸潤する線維芽細胞が一因となる。本発明者らは、本明細書において、ミオスタチンが線維芽細胞移動の走化性物質としての働きをすることが明らかに示す。反対に、ミオスタチンがない結果、線維芽細胞が減少する。３５０を筋肉再生中に投与した場合、本発明者らは線維症における減少を観察した。従って、サルコペニア中の３５０投与はまた、加齢で起こる筋肉の線維過多を軽減するのを助け、老化筋肉において筋肉強度を増加させるであろう。
【０１１３】
結論
ミオスタチン拮抗物質は、老化筋肉において筋肉再生を増加させ、線維症を軽減することにより、筋肉を首尾よく改善することができる。従って、ミオスタチン拮抗物質は、サルコペニアの治療および／または予防に関して有益な治療選択肢を提供する。
【０１１４】
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Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ．、Ｍｕｒａｔａ  Ｃ．、Ｉｔｏ  Ｍ．、Ｉｗａｍｏｒｉ  Ｔ．、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ．、Ｈｉｓａｍａｔｓｕ  Ｋ．、Ｓｏｎｏｋｉ  Ｓ．、Ｎａｋａｙａｍａ  Ａ．、Ｓｕｙａｍａ  Ｅ．、Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ．、Ｔａｉｒａ  ｋ．、Ｎｉｓｈｉｎｏ  Ｋ．およびＴａｃｈｉ  Ｃ．  （２００５）インビトロおよびインビボでネズミｓｒｙ  ｍＲＮＡを開裂させるシュモクザメリボザイムの設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｓ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅ  ｍｕｒｉｎ  ｓｒｙ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １７：  ｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄ．
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特許文献
ＵＳ  ６  ０９６  ５０６、ＵＳ  ６  ３６９  ２０１、ＵＳ  ６  ４６８  ５３５、ＵＳ  ２００４／０１８１０３３、ＵＳ  ２００２／０１８１０３３、ＷＯ  ０２／０８５３０６、ＷＯ  ０１／５３３５０、ＷＯ  ０１／０５８２０、ＷＯ  ００／４３７８１、ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０、ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８
【０１１５】
本明細書において記載されるすべての文献は出典明示により本明細書の一部とされる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、これを必要とする患者に１種または複数のミオスタチン拮抗物質を投与することにより、サルコペニアを治療する方法を提供する。この方法は、老化した筋肉に改善された筋肉量をもたらし、再生筋肉組織においてコラーゲン形成を減少させ、これにより再生された筋肉組織の全体的な機能を改善する。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
本発明を添付の図面を参照してさらに詳細に説明する。
【図１】筋肉再生における衛星細胞の役割のモデル図である。
【図２】（Ａ）ミオスタチンによる衛星細胞活性化の阻害を表す。
【図２】（Ｂ）ミオスタチンによる衛星細胞活性化の阻害は、ミオスタチンが媒体から除去される場合（Ｒｅｓｃｕｅ）、可逆的であることを示す。
【図２】（Ｃ）衛星細胞の移動に対するミオスタチンの効果を示す。
【図２】（Ｄ）ＢｒｄＵ陽性核を有する典型的な筋線維（ｉ）、およびＤＡＰＩ染色された核を有する同じ筋線維（ｉｉ）の顕微鏡写真を示す。
【図３】（Ａ）１および２４月齢の野生型およびミオスタチンゼロＴＡ筋肉から単離された線維上の、１００筋核あたりの衛星細胞のパーセントを示す。衛星細胞は、ＤＡＰＩ対比染色によりＣＤ３４および全核について免疫染色することにより可視化した。線維を１群あたり３匹の動物から単離し、１群あたり１０００を超える核を計数した（Ｐ  ＜  ０．００１）。
【図３】（Ｂ）１および２４月齢野生型およびミオスタチンゼロＴＡ筋肉から単離された線維上の、１００筋核あたりの活性化された衛星細胞のパーセントを表す。活性化された衛星細胞は、インビトロＢｒｄＵ取り込みおよびＤＡＰＩ対比染色による全核により表される。線維は、１群あたり３匹の動物から単離され、１群あたり１０００核を超えるものを計数した（Ｐ＜０．０５）。
【図３】（Ｃ）フローサイトメトリーにより決定されるＢｒｄＵ陽性細胞のパーセントを表す。衛星細胞はインビトロでＢｒｄＵ標識され、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて１および６月齢野生型およびミオスタチンゼロ後肢筋肉から単離された。１サンプル群あたり最低１００００個の細胞を３通りで分析した（Ｐ＜０．００１）。白抜きの棒グラフは、１月齢マウス、黒い棒グラフは６月齢マウスを表す。異なる小文字は、データ間の有意な差を示す。
【図４】単離された線維上のＰＣＮＡ陽性核の数を表す。単離された線維を５または１０μｇの３５０とともにインキュベートし、ＰＣＮＡ抗体で免疫染色して、１００筋核あたりの活性化された衛星細胞の数を決定した。データは平均±ｓ．ｅ．ｍとして表される（＊＊＝Ｐ＜０．００１）。
【図５】(Ａ)野生型およびミオスタチンゼロマウスからの対照筋肉片のヘマトキシンおよびエオジン染色を示す。
【図５】（Ｂ）ノテキシン注射後１日（Ｄ１）の低倍率図を示す。
【図５】（Ｃ）好酸球性（ｅ）細胞質および、細細胞内空間が増加し、顕著な筋線維破壊（矢印）がある筋線維の微細細胞内空胞形成（ｖ）を示すために染色された（Ｂ）と同じ部分の高倍率図である。
【図５】（Ｄ）ミオスタチンゼロマウスの筋肉中の核（矢印）の数が増加した２日（Ｄ２）の筋肉切片を示す。矢印の先は、壊死性筋線維の端に沿った筋核を示す。
【図５】（Ｅ）野生型およびミオスタチンゼロ筋肉の両方において単核細胞が浸潤しているが、より多数のミオスタチンゼロ部分を有する３日（Ｄ３）の筋肉部分を示す。スケールバーは１０μｍに等しい。
【図５】（Ｆ）ノテキシン処理されたミオスタチンゼロ角切片において核の数が増大した５日切片（Ｄ５）を示す。
【図６】（Ａ）野生型（Ｍｓｔｎ＋／＋）およびミオスタチンゼロ（Ｍｓｔｎ−／−）再生筋肉におけるＭｙｏＤ陽性筋原性前駆細胞のパーセンテージを示す。
【図６】（Ｂ）野生型（Ｍｓｔｎ＋／＋）およびミオスタチンゼロ（Ｍｓｔｎ−／−）再生筋肉におけるＭａｃ−１陽性細胞のパーセンテージを示す。
【図６】（Ｃ）ノテキシン注射後２８日までの対照未損傷筋肉（Ｃ）および再生野生型（ｗｔ）およびミオスタチンゼロ（Ｍｓｔｎ  ｎｕｌｌ）筋肉におけるＭｙｏＤおよびミオゲニン遺伝子の発現特性を示す。使用されたＲＮＡの等しい量を示すためにＧＡＰＤＨを対照として使用した。
【図７】食塩水処理およびミオスタチン阻害物質３５０処理されたマウスにおいてノテキシン注射後２、３、７および１０日の再生された筋肉におけるＭａｃ１陽性細胞の平均数を示す。
【図８】ノテキシン注射後１４日（Ｄ１４）、２１日（Ｄ２１）および２８日（Ｄ２８）のミオスタチンノックアウト（ＫＯ）および野生型（ＷＴ）マウスから得られた組織片に関する免疫蛍光を示す。ＷＴ組織は、染色の強度がより強い。すなわち、ＫＯ組織と比較した場合、より高濃度のビメンチン陽性細胞を示す。
【図９】マクロファージ移動およびミオスタチン拮抗物質（アミノ酸３５０でＣ末端切断された優性阻害ミオスタチンペプチド）を用いた回復に対するミオスタチンの化学阻害効果を示す。
【図１０】（Ａ）ミオスタチンのヒツジ初代線維芽細胞に対するミオスタチンの化学誘因効果を示す。
【図１０】（Ｂ）ヒツジ初代筋芽細胞およびミオスタチン拮抗物質（アミノ酸３５０でＣ末端切断された優性阻害ミオスタチンペプチド）を用いた回復に対するミオスタチンの化学阻害効果を示す。
【図１１】２８日（Ｄ２８）野生型およびミオスタチンゼロ筋肉切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）ならびにＶａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ（ｉｉｉ）染色の低倍率（ｉ）および高倍率（ｉｉ）顕微鏡写真を示す。厚い結合組織Ｔ（矢印）が野生型筋肉切片（ｉｉ）において見られ；コラーゲン（矢印）が野生型筋肉切片（ｉｉｉ）において見られ、スケールバーは１０μｍに等しい；再生の２４日後の野生型およびミオスタチンゼロ筋肉の走査型電子顕微鏡写真を（ｉｖ）において示す；スケールバーは１２０μｍに等しい。
【図１２】ノテキシン注射から回復したマウスにおけるミオスタチン拮抗物質（アミノ酸３５０でＣ末端切断された優性阻害ミオスタチンペプチド）の筋肉重量に対する効果を示す。
【図１３】（Ａ）〜（Ｄ）７日（Ａ−食塩水処理；Ｂ−ミオスタチン拮抗物質３５０処理）および１０日（Ｃ−食塩水処理；Ｄ−ミオスタチン拮抗物質３５０処理）のノテキシン注射後の再生筋肉からの筋肉切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す。星印は壊死性領域を示す。
【図１４】図１３の筋肉切片の未再生（白色）領域および再生（網かけ）領域のパーセンテージを示す。
【図１５】食塩水処理およびミオスタチン阻害物質３５０処理されたマウスにおけるノテキシン注射後１０および２８日の再生筋肉におけるコラーゲン形成（％）を示す。
【図１６】食塩水処理およびミオスタチン阻害物質３５０処理マウスにおけるノテキシン注射後２８日の再生された筋肉線維の平均線維面積を示す。
【図１７】食塩水（ｓａｌ）および３５０処理されたＴＡ筋肉におけるノテキシンの投与後１、３、７、１０および２８日の遺伝子Ｐａｘ７（Ａ）およびＭｙｏＤ（Ｂ）タンパク質レベル（ウェスタンブロッティングにより検出）を示す。
【図１８】損傷後２および４日の再生筋肉における増大した炎症反応および再生された筋肉における増大した筋肉量（２１日）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月9日(2007.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008530004.tif 000028
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