(57)【要約】  本発明は、肺高血圧症、肺線維症又は肺外の他の線維症の治療に使用できる化合物の同定のための新規のターゲットとしてのＰＤＥ１Ｃの使用に関する。更に、本発明は、ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、これらの疾患の治療で使用するための医薬組成物の製造において用いる使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、肺高血圧症の予防的もしくは治療的な処置用の医薬組成物の製造のために用いる使用。
【請求項２】
患者における肺高血圧症の予防的もしくは治療的な処置のための方法において、前記患者に、ＰＤＥ１Ｃインヒビターの有効量を投与することを含む方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の使用又は方法であって、肺高血圧症が、突発性の肺動脈高血圧症；家族性の肺動脈高血圧症；膠原血管病、先天性の全身ないし肺シャント、門脈圧亢進症、ＨＩＶ感染、薬物もしくは毒物に関連する肺動脈高血圧症；甲状腺疾患、糖原病、ゴシェ病、遺伝性出血性毛細管拡張症、異常ヘモグロビン症、骨髄増殖性疾患もしくは脾臓除去術に関連する肺高血圧症；肺毛細血管腫症に関連する肺動脈高血圧症；新生児の持続性肺高血圧症；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、低酸素状態により引き起こされる肺胞性低換気疾患、低酸素状態により引き起こされる睡眠障害性呼吸もしくは高標高への慢性的な暴露に関連する肺高血圧症；異常発生に関連する肺高血圧症；並びに遠位の肺動脈の塞栓性の閉塞による肺高血圧症から選択される使用又は方法。
【請求項４】
ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、例えば肺線維症などの肺線維芽細胞の増殖増大に関連する肺疾患の治療用の医薬組成物の製造のために用いる使用。
【請求項５】
ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、ヒトの線維芽細胞の増殖増大と関連する非肺疾患、例えば肺外の線維症、例えば（糖尿病性）腎障害、糸球体腎炎、心筋線維症、心臓弁疾患、肝線維症、膵臓炎、デュピュイトラン病（手掌線維腫症）、腹膜線維症（例えば長期の腹膜透析に基づく）、ペーロニー病又は膠原繊維性大腸炎の治療のための医薬組成物の製造のために用いる使用。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の使用又は方法であって、ＰＤＥ１Ｃインヒビターが、選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビター、例えば他のＰＤＥファミリーの一員よりも少なくとも１０倍も強力に１Ｃ型のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ１Ｃ）を阻害する化合物である使用又は方法。
【請求項７】
ＰＤＥ１Ｃを、肺高血圧症、例えば請求項３に挙げられるいずれかの疾患の処置のために使用できる化合物を同定するために用いる使用。
【請求項８】
ＰＤＥ１Ｃを、肺線維芽細胞の増殖増大と関連する肺疾患、又は線維芽細胞の増殖増大と関連する非肺疾患、例えば請求項４及び５に挙げられるいずれかの疾患の処置のために使用できる化合物を同定するために用いる使用。
【請求項９】
肺高血圧症及び／又は肺線維症の処置のために有用な化合物を同定及び獲得するための方法において、
ＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物、例えばＰＤＥ１阻害活性を有する化合物のＰＤＥ１Ｃの阻害活性及び／又は選択性を測定する工程、及び／又は
ＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物、例えばＰＤＥ１阻害活性を有する化合物を、肺高血圧症が誘発された非ヒト動物に投与する工程、及び
対照で処置された動物と比較して肺高血圧症の程度を測定する工程
を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって同定された化合物と製剤学的に認容性の助剤、希釈剤又は担体とを組み合わせることによって製造される組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって同定された化合物を、肺高血圧症及び／又は肺線維症の処置用の医薬組成物の製造のために用いる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺高血圧症、肺線維症又は肺外の他の線維症の治療に使用できる化合物の同定のための新規のターゲットとしてのＰＤＥ１Ｃの使用に関する。
【０００２】
更に、本発明は、肺高血圧症及び／又は肺線維症、又は肺外の他の線維症の予防的もしくは治療的な処置のための医薬組成物の製造におけるＰＤＥ１Ｃインヒビターの使用に関する。
【０００３】
発明の背景
肺高血圧症（ＰＨ）は、休息時の平均肺動脈圧（ＰＡＰ）＞２５ｍｍＨｇ又は運動時の平均肺動脈圧＞３０ｍｇＨｇによって定義される。２００４年に欧州心臓学会議によって刊行された肺高血圧症の診断と治療における最新のガイドライン（Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ２５：２２４３−２２７８；２００４）によれば、ＰＨの臨床形は、（１）肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、（２）左心疾病に関連するＰＨ、（３）肺呼吸性疾病及び／又は低酸素症に関連するＰＨ、（４）慢性血栓病及び／又は塞栓病によるＰＨ、（５）他の起源（例えばサルコイドーシス）のＰＨとして分類される。グループ（１）は、例えば突発性かつ家族性のＰＡＨに並んで、結合組織疾患（例えば強皮症、ＣＲＥＳＴ）、先天性の全身ないし肺シャント、門脈圧亢進症、ＨＩＶ、薬物及び毒物（例えば食欲不振誘発物）の摂取の状況下でのＰＡＨを含んでいる。ＣＯＰＤにおいて生ずるＰＨは、グループ（３）に属していた。小さい（５００μｍ未満の直径の）肺細動脈の筋化は、ＰＡＨの生理学的な共通項（グループ１）として広く認められているが、ＣＯＰＤ又は血栓病及び／又は塞栓病に基づくような他のＰＨの形においても起こりうる。ＰＨにおける他の病理解剖学的特徴は、（筋）線維芽細胞又は肺平滑筋細胞の移動及び増殖と細胞外マトリクスの過剰発生とに基づく血管内膜の肥厚、内皮損傷及び／又は内皮増殖、及び血管周囲炎症性の細胞浸潤である。共に、遠位の肺動脈血管系のリモデリングは、増強された肺血管抵抗、続発性の左心不全及び死を引き起こす。経口による抗凝固薬、利尿薬、ジゴキシン又は酸素の供給のようなバックグラウンド療法とより一般的な措置は、依然として最新のガイドラインに列記されている一方で、これらの対応策は、肺動脈リモデリングの原因又はメカニズムを妨害することは期待されない。幾らかのＰＡＨ患者は、Ｃａ++アンタゴニスト、特に血管拡張薬に急激に反応を示すものの恩恵を得ることもある。過去十年間にわたり開発された革新的な治療的試みは、分子異常、特に増強されたエンドセリン−１形成、低減されたプロスタサイクリン（ＰＧＩ2）発生、そしてＰＡＨ血管系におけるｅＮＯＳ活性障害を考慮していた。ＥＴA受容体を介して作用するエンドセリン−１は、肺動脈性の平滑筋細胞にとって有糸分裂促進性であり、かつ急激な血管収縮を誘発する。経口用のＥＴA／ＥＴB−アンタゴニストであるボセンタンは、該化合物が平均ＰＡＰ、ＰＶＲ又は６分間歩行テストのような臨床エンドポイントで改善が裏付けられた後に、最近になって欧州と米国においてＰＡＨの治療のために承認された。しかしながら、ボセンタンは肝酵素を増やし、かつ常用の肝臓テストが義務づけられている。近年において、選択的なＥＴAアンタゴニスト、例えばシタキセンタン又はアンブリセンタンは、綿密な調査段階にある。
【０００４】
ＰＡＨの管理におけるもう一つの戦略としては、不足したプロスタサイクリンをＰＧＩ2類似体、例えばエポプロステノール、トレプロスチニル、経口のベラプロスト又はイロプロストによって置き換えることが浮上している。プロスタサイクリンは、血管性の平滑筋細胞の過剰の有糸分裂促進に歯止めをかけて、ｃＡＭＰ発生の増大よって作用する働きがある。静脈内のプロスタサイクリン（エポプロステノール）は、突発性の肺高血圧症における生存率並びに運動能を著しく高め、北米と幾つかの欧州の国々で１９９０年代半ばに承認されている。しかしながら、その短い半減期のゆえに、エポプロステノールは、連続的な静注を介して投与する必要があり、それは可能であっても心地よいものではなく、煩雑かつ費用のかかるものである。更に、プロスタサイクリンの全身作用のため不利な事象が頻繁に起こる。代替的なプロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル（これは最近になって米国でＰＡＨ治療のために承認され、そしてそれは連続的な皮下注入を介して送達される）及びベラプロスト（これは初めての生物学的に活性かつ経口で活性のＰＧＩ2類似体であり、日本でＰＡＨの治療のために承認されている）である。その治療プロフィールは、他の形態の肺高血圧症と比較して突発性のＰＡＨを伴う患者においてより好ましいとされ、ベラプロスト投与後に生ずる全身性の血管拡張に結びついた副作用とトレプロスチニル治療下の点滴部位での局所的な痛みが頻繁にある。プロスタサイクリン類似体であるイロプロストの吸入経路を介した投与は、欧州において近年に承認された。その運動能と血行動態パラメータに対する有利な作用は、好適な機器から１日あたり６〜１２コースの吸入を含むかなり面倒な投与計画と均衡を保つべきである。
【０００５】
肺動脈高血圧で報告されるような内皮での窒素酸化物形成の障害の機能的な結果は、肺動脈性の平滑筋細胞において発現されるホスホジエステラーゼ−５（ＰＤＥ５）の選択的インヒビターによって克服することができる。従って、選択的ＰＤＥ５インヒビターであるシルデナフィルは、肺の血行動態及び運動能をＰＡＨにおいて改善することが裏付けられた。
【０００６】
これらの新規の治療の殆どは、主として平滑筋細胞機能に向けたものであるが、肺血管線維芽細胞、内皮細胞の他にも、血管周囲マクロファージとＴリンパ球が、肺高血圧症の進行に寄与することが考えられる。
【０００７】
前記の種々の治療的試みにもかかわらず、肺高血圧症において疾病負荷を改善する医学的必要性は高く、これらの疾病を扱う代替的なターゲットが必要とされている。
【０００８】
ホスホジエステラーゼ１Ｃは、ＰＤＥ１ファミリーのメンバーの一員であり、かつｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを同等の効率で加水分解することが示されている。組織と細胞の局在化の他に、これは、ＰＤＥ１Ａ及びＰＤＥ１Ｂと比較した、ＰＤＥ１Ｃの最も顕著な差異である。ＰＤＥ１Ｃの５種類の変異体（１Ｃ１、１Ｃ２、１Ｃ３、１Ｃ４、１Ｃ５）が、今までに同定されており、それらは組織特異的に発現される（Ｙａｎ他著のＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２５６９９−２５７０９，１９９６）。ＰＤＥ１Ｃは、大動脈の増殖している平滑筋細胞において誘導されることが示されており（Ｒｙｂａｌｋｉｎ他著のＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，１００，２６１１−２６２１，１９９７）、アンチセンス技術によるＰＤＥ１Ｃのダウンレギュレーションは、前記細胞における増殖を低下させることが示されている（Ｒｙｂａｌｋｉｎ他著のＣｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９０，１５１−１５７，２００２）。他の器官の平滑筋細胞におけるＰＤＥ１Ｃの発現は、今まで解析されていない。本発明では、ＰＤＥ１Ｃが、肺高血圧症の処置のための治療的ターゲットであることが裏付けられている。
【０００９】
国際出願ＷＯ２００４／０３１３７５号は、ヒトのＰＤＥ１Ｃ（及びその使用）を記載しており、これらに制限されないが、癌、糖尿病、神経学的疾患、喘息、肥満又は心血管疾患を含む疾病の治療に役割を担いうることを示している。
【００１０】
国際出願ＷＯ２００４／０８０３４７号は、ヒトのＰＤＥ１Ｃ（及びその使用）を記載しており、心血管疾患、胃腸疾病及び肝臓疾病、癌疾患、神経学的疾患、呼吸器疾患及び泌尿器学的疾患に関連することを示している。
【００１１】
米国出願ＵＳ２００２１６０９３９号は、膵島細胞におけるグルコース依存性インスリン分泌を増大させる新規剤を同定する方法並びに膵島細胞ＰＤＥ酵素、すなわちＰＤＥ１Ｃの活性に対する阻害作用を有する剤を用いた糖尿病の治療方法を記載している。
【００１２】
発明の開示
予期せずに、かつ予測されないことに、ここで、肺高血圧症の処置は、ホスホジエステラーゼ１Ｃ（ＰＤＥ１Ｃ）のインヒビターの使用によって達成できることが判明した。
【００１３】
更に予期せずに、かつ予測されないことに、ここで、肺線維症の処置は、ホスホジエステラーゼ１Ｃ（ＰＤＥ１Ｃ）のインヒビターの使用によって達成できることが判明した。
【００１４】
更に、初めて、本発明は、本願に挙げられる疾病の処置についてのＰＤＥ１Ｃのインヒビターの効力に関する証拠とデータを提供している。
【００１５】
なおも更に、初めて、本発明は、本願に挙げられる疾病におけるＰＤＥ１Ｃの機械論的併発についての証拠とデータを提供している。
【００１６】
このように例えば、本発明において、ＰＤＥ１Ｃインヒビターが、肺高血圧症において観察される再構築プロセスに関与する細胞増殖を遮断することが示され、またインビボデータも提供されている。
【００１７】
従って、本発明は、初めて、本願に挙げられる疾病のいずれか１つの治療のための選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターの利用性を開示している。
【００１８】
更に、初めて、本発明は、選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターの代表する一定の構造を開示している。
【００１９】
更に、本発明は、肺高血圧症、肺線維芽細胞の増殖向上と関連する肺疾患又は線維芽細胞の増殖向上と関連する非肺疾患、例えば本願に挙げられる疾病のいずれか、特に肺高血圧症又は肺線維症の治療のために使用できる化合物を同定するためのＰＤＥ１Ｃの適性を開示している。
【００２０】
本発明によれば、ある物質が、１μＭ未満もしくは約１μＭの、もう一つの実施態様においては、０．１μＭもしくは約１μＭの、更にもう一つの実施態様においては、０．０１μＭ未満もしくは約０．０１μＭの、なおも更なる別の実施態様においては、１ｎＭ未満もしくは約１ｎＭのＰＤＥ１Ｃに対するＩＣ50を有する場合に、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターと見なす。
【００２１】
本発明の一実施態様においては、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、他の公知の型のホスホジエステラーゼ、例えばＰＤＥファミリーの任意の酵素と比較して、優勢的に、１Ｃ型のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ１Ｃ）を阻害するＰＤＥインヒビターを指す。本発明の態様ｃによれば、ＰＤＥ１Ｃを優勢的に阻害するＰＤＥインヒビターとは、公知の種類の他のホスホジエステラーゼの阻害についてのＩＣ50と比較してより低い１Ｃ型のホスホジエステラーゼについてのＩＣ50を有する化合物を指し、例えばその際に、ＰＤＥ１Ｃ阻害についてのＩＣ50は、他の公知の種類のホスホジエステラーゼのＩＣ50より約１０倍低く、従ってＰＤＥ１Ｃの阻害がより強力である。
【００２２】
本発明の好ましい一実施態様においては、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターを指す。
【００２３】
本発明の一詳細においては、本発明で使用される選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、他のＰＤＥファミリーの一員よりも少なくとも１０倍も強力に１Ｃ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ１Ｃ）を阻害する化合物を指す。
【００２４】
本発明の更なる一詳細においては、本発明で使用される選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、ＰＤＥ２〜１１のファミリーの任意の酵素よりも少なくとも１０倍も強力に１Ｃ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ１Ｃ）を阻害する化合物を指す。
【００２５】
本発明のなおも更なる一詳細においては、本発明で使用される選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、ＰＤＥ１〜１１のファミリーの任意の他の酵素よりも少なくとも１０倍も強力に１Ｃ型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ１Ｃ）を阻害する化合物を指す。
【００２６】
本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターは、当業者に公知のように又は本発明に記載されるように、例えば挙げられる方法、工程及び／又はアッセイを使用することを含んで同定することができる。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様においては、本願で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターの意味は、ＰＤＥ１Ｃ酵素のみ又は実質的にその酵素のみを阻害する化合物を意味し、他のＰＤＥ酵素ファミリーの一員をも、治療効果を示す程度までに阻害する化合物を意味するものではない。
【００２８】
ホスホジエステラーゼ阻害剤の活性及び選択性を決定するための方法は、当業者に公知である。この関連において、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｃｙｃｌ Ｎｕｃｌ Ｒｅｓ １０：６９−９２．１９７９）、Ｇｉｅｍｂｙｃｚ ｅｔ ａｌ（Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １１８：１９４５−１９５８，１９９６）及びＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈのホスホジエステラーゼシンチレーション近接アッセイにより説明された方法を挙げてよい。
【００２９】
本発明の範囲内では、ヒトの肺動脈性の平滑筋細胞及びヒトの肺線維芽細胞が、ＰＤＥ１Ｃの発現のため、ｃＡＭＰ並びにｃＧＭＰ−カルモジュリン刺激によるホスホジエステラーゼ活性を発現するデータが提供される。更に、本発明は、驚くべきことに、ＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡ及びタンパク質の、突発性の肺高血圧症を伴う患者の肺組織中でのアップレギュレーションが、健康なドナーの肺組織と比較して強いことを裏付けている。更に、ＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡとタンパク質の同じアップレギュレーションは、低酸素状態が保持されて、肺高血圧症が発生し、肺高血圧症を伴う患者に観察される病態生理学的状態をある程度まで反映しているマウスの肺組織において示されている。患者における、及び動物モデルの肺内での増強されたＰＤＥ１Ｃ発現は、最終的に血管抵抗の増大をもたらし、こうして肺高血圧症を引き起こす強い再構築プロセスを受けている小さい肺血管の内壁の肺平滑筋細胞に局在化することを示している。更に、ＰＤＥ１Ｃの発現増大は、肺動脈圧の程度と相関している。更に、本発明で示されるＰＤＥ１Ｃインヒビターは、以下に示されるように、ＰＤＥ１Ｃを発現するヒトの肺線維芽細胞及びヒトの肺動脈性の平滑筋細胞の増殖を阻害する。
【００３０】
このデータと増殖の制御におけるＰＤＥ１Ｃの公知の機能とに基づき、ＰＤＥ１Ｃの選択的インヒビターを使用して、一次及び二次の肺高血圧症を伴う患者の肺血管（及び隣接組織）の増殖により媒介される再構築プロセスを阻害することができる。
【００３１】
本願で使用される表現"肺高血圧症"は、種々の形の肺高血圧症を含む。この関連で挙げることができる制限されない例は、突発性の肺動脈高血圧症；家族性の肺動脈高血圧症；膠原血管病、先天性の全身ないし肺シャント、門脈圧亢進症、ＨＩＶ感染、薬物もしくは毒物に関連する肺動脈高血圧症；甲状腺疾患、糖原病、ゴシェ病、遺伝性出血性毛細管拡張症、異常ヘモグロビン症、骨髄増殖性疾患もしくは脾臓除去術に関連する肺高血圧症；肺毛細血管腫症に関連する肺動脈高血圧症；新生児の持続性肺高血圧症；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、低酸素状態により引き起こされる肺胞性低換気疾患、低酸素状態により引き起こされる睡眠障害性呼吸もしくは高標高への慢性的な暴露に関連する肺高血圧症；異常発生に関連する肺高血圧症；並びに遠位の肺動脈の塞栓性の閉塞による肺高血圧症である。
【００３２】
ヒトの肺線維芽細胞における予測されないＰＤＥ１Ｃの発現に基づいて、ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、ヒトの肺線維芽細胞の増殖増大と関連する肺疾患、例えば肺線維症の処置のために使用することができる。
【００３３】
この知見に関連して、ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、一般にヒトの線維芽細胞の増殖増大と関連する他の疾病、例えば肺外の線維症、例えば（糖尿病性）腎障害、糸球体腎炎、心筋線維症、心臓弁疾患、肝線維症、膵臓炎、デュピュイトラン病（手掌線維腫症）、腹膜線維症（例えば長期の腹膜透析に基づく）、ペーロニー病又は膠原繊維性大腸炎の治療のために使用することもできる。
【００３４】
更に、本発明に開示されるデータに従って、本発明は、肺高血圧症及び／又は肺線維症、又は前記のような肺外の線維症の治療のために使用できる化合物の同定のためのＰＤＥ１Ｃの新規の使用を提供する。
【００３５】
また、本発明は、肺高血圧症及び／又は肺線維症の治療のための化合物を同定及び獲得するための方法であって、前記方法は、ＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物のＰＤＥ１Ｃ阻害活性及び／又は選択性を測定することを含む方法並びに前記方法によって同定された化合物を提供する。好ましくは、前記化合物は、選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターであってよい。
【００３６】
前記方法は、また、ＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物を、肺高血圧が誘発されている動物、好ましくは非ヒトの動物に投与して、コントロール処理された動物と比較して肺高血圧の程度を測定することを含む。好ましくは、前記化合物は、選択的ＰＤＥ１Ｃインヒビターであってよい。相応の手順は、当該技術分野でよく知られており、かつ以下の実施例において例として記載される。
【００３７】
場合により本方法に含んで、第一の選択肢において、前記のように同定された化合物を、製剤学的に認容性の担体又は希釈剤と一緒に製剤化することができる。
【００３８】
更に場合により本方法に含めて、代替的な選択肢において、前記のように同定された化合物を改変させて、（ｉ）作用部位、活性範囲の変更、及び／又は（ｉｉ）効力の向上、及び／又は（ｉｉｉ）毒性の低下（治療指数の改善）、及び／又は（ｉｖ）副作用の低下、及び／又は（ｖ）作用開始、作用期間の改変、及び／又は（ｖｉ）動力学的パラメータの変更（再吸収、分布、代謝及び分泌）、及び／又は（ｖｉｉ）生理学的パラメータの改変（可溶性、吸湿性、色、味覚、臭い、安定性、状態）、及び／又は（ｖｉｉｉ）一般的特異性、器官／組織特異性の改善、及び／又は（ｉｘ）適用形及び経路の最適化を、（ｉ）カルボキシル基のエステル化、又は（ｉｉ）ヒドロキシル基と炭素酸とのエステル化、又は（ｉｉｉ）ヒドロキシル基の、リン酸エステル、ピロリン酸エステルもしくは硫酸エステルもしくはヘミコハク酸エステルへのエステル化、又は（ｉｖ）製剤学的に認容性の塩の形成、又は（ｖ）製剤学的に認容性の錯体の形成、又は（ｖｉ）薬理学的な活性ポリマーの合成、又は（ｖｉｉ）親水性部の導入、又は（ｖｉｉｉ）芳香族もしくは側鎖での置換基の導入／交換、置換型の変更、又は（ｉｘ）等配電子又は生物学的等配電子部の導入による改変、又は（ｘ）相同化合物の合成、又は（ｘｉ）分枝側鎖の導入、又は（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への転化、又は（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、又は（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、又は（ｘｖ）マンニッヒ塩基、イミンの合成、又は（ｘｖｉ）ケトンもしくはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジンもしくはその組み合わせへの変換によって、場合により前記の改変生成物と製剤学的に認容性の担体もしくは希釈剤との製剤化によって達成できる。
【００３９】
本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物は、例えばこれらに制限されないが、当該技術分野から公知の選択的ＰＤＥ１インヒビター、例えば他のＰＤＥファミリーの一員よりも少なくとも１０倍もＰＤＥ１を阻害する任意の化合物であってよい。
【００４０】
更に、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物は、例えばこれらに制限されないが、ＰＤＥインヒビターとして開発されている任意の化合物、例えばＰＤＥ１阻害活性が見出される化合物であってよい。
【００４１】
なおも更に、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物は、例えばこれらに制限されないが、ＰＤＥ阻害プロフィールがアッセイされるべき任意の化合物であってよい。
【００４２】
またなおも更に、本発明で使用されるＰＤＥ１Ｃインヒビターであると疑われる化合物は、例えばこれらに制限されないが、市販の化合物ライブラリーに含まれる任意の化合物であってよい。
【００４３】
また、本発明は、本発明に記載されるいずれかの方法によって同定された化合物に関する。
【００４４】
医薬品（医薬品調剤、製剤もしくは組成物とも本発明において以後呼称される）として、前記ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、それ自体として、又は有利には適した製剤学的な助剤及び／又は賦形剤と組み合わせて、錠剤、被覆された錠剤、カプセル、カプレット、坐剤、パッチ（例えばＴＴＳとして）、エマルション、懸濁物、ゲル、又は溶液の形態で使用される。本発明の医薬品調剤は典型的には、活性化合物の全量を、総製剤に対して、０．０５〜９９％ｗ（質量％）の範囲で、より有利には０，１０〜７０％ｗの範囲で、更により有利には０．１０〜５０％ｗの範囲で含有する（全てのパーセンテージは質量に対する）。助剤及び／又は賦形剤の適切な選択により、前記活性化合物に及び／又は作用の所望の開始に、正確に適合した投与剤形（例えば、遅延性放出形、又は腸溶形）を達成することが可能である。
【００４５】
当業者はその専門知識により所望の医薬品製剤に適した助剤、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、担体又はアジュバントに精通している。溶剤、ゲル形成剤、軟膏基材及び他の活性化合物の他に、賦形剤、例えば酸化防止剤、分散剤、乳化剤、保存剤、溶解剤、着色剤、錯化剤、フレーバー、緩衝剤、粘性調節剤、界面活性剤、結合剤、滑沢剤、安定剤又は侵透促進剤を使用してよい。
【００４６】
ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、治療が必要な患者に、当該技術分野で利用できる一般に許容される任意の投与様式で投与することができる。適当な投与様式の概略的な例は、経口、静脈内、経鼻、非経口、経皮及び直腸内での送達並びに吸引による投与である。好ましい投与様式は、経口及び吸入である。
【００４７】
治療効果の達成に必要なＰＤＥ１Ｃインヒビターの量は当然のように、特定の化合物、投与経路、治療される被験者、及び治療される特定の疾患又は疾病により変化する。一般に、日用量は、通常、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。一例として、ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、経口で成人に、約０．１〜約１０００ｍｇ（１日）の用量で、単独でもしくは分けて（すなわち複数回）投与することができる。
【００４８】
このように、本発明の第一の態様は、肺高血圧症の予防的もしくは治療的な処置のための医薬組成物の製造のためのＰＤＥ１Ｃインヒビターの使用である。
【００４９】
第二の態様においては、本発明は、患者における肺高血圧症の予防的もしくは治療的な処置のための方法であって、前記患者にＰＤＥ１Ｃインヒビターの有効量を投与することを含む方法に関する。
【００５０】
第三の態様においては、本発明は、ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、ヒトの肺線維芽細胞の増殖増大に関連する肺疾患、例えば肺線維症の処置のための医薬組成物の製造のために用いる使用に関する。
【００５１】
第四の態様においては、本発明は、ヒトの肺線維芽細胞の増殖増大に関連する肺疾患、例えば肺線維症の、患者における処置方法において、前記患者に、ＰＤＥ１Ｃインヒビターの有効量を投与することを含む方法に関する。
【００５２】
第五の態様においては、本発明は、ＰＤＥ１Ｃインヒビターを、ヒトの線維芽細胞の増殖増大と関連する非肺疾患、例えば肺外の線維症、例えば（糖尿病性）腎障害、糸球体腎炎、心筋線維症、心臓弁疾患、肝線維症、膵臓炎、デュピュイトラン病（手掌線維腫症）、腹膜線維症（例えば長期の腹膜透析に基づく）、ペーロニー病又は膠原繊維性大腸炎の治療のための医薬組成物の製造のために用いる使用に関する。
【００５３】
第六の態様においては、本発明は、ヒトの線維芽細胞の増殖増大と関連する非肺疾患、例えば肺外の線維症、例えば（糖尿病性）腎障害、糸球体腎炎、心筋線維症、心臓弁疾患、肝線維症、膵臓炎、デュピュイトラン病（手掌線維腫症）、腹膜線維症（例えば長期の腹膜透析に基づく）、ペーロニー病又は膠原繊維性大腸炎の、患者における処置方法において、前記患者に、ＰＤＥ１Ｃインヒビターの有効量を投与することを含む方法に関する。
【００５４】
第八の態様においては、本発明は、ＰＤＥ１Ｃを、肺高血圧症、肺線維症、又は肺外の線維症の処置のために使用できる化合物を同定するために用いる使用に関する。
【００５５】
第九の態様においては、本発明は、肺高血圧症及び／又は肺線維症の処置に有用な化合物を同定するための方法において、前記化合物について、そのＰＤＥ１Ｃ阻害活性及び／又は選択性を測定することを含む方法に関する。
【００５６】
用語"有効量"は、ＰＤＥ１Ｃインヒビターの治療学的に有効な量を指す。"患者"は、ヒトと他の哺乳動物の両方を含む。
【００５７】
本発明は、また、実質的に前記される、特に実施例に参照される化合物、方法、使用及び組成物を提供する。
【００５８】
薬理学
健康なヒト、突発的な肺高血圧症を伴う患者、及び低酸素／常酸素のマウスの肺におけるＰＤＥ１Ｃ発現の特徴付け
目的
薬理学的調査の目的は、突発的な肺高血圧症を伴う患者の肺におけるＰＤＥ１Ｃの発現と局在化を特徴付け、それらと健康なヒトのそれとを比較することであった。ＰＤＥ１Ｃ発現は、患者グループにおける肺高血圧症の程度と相関していた。同様の分析を、肺高血圧症のための動物モデルとして使用される低酸素／常酸素のマウスで実施した。
【００５９】
患者の特性
ヒトの肺組織は、５人の健康な肺ドナーと、肺移植を受けた５人のＰＡＨ患者（全ては突発的なＰＡＨ）とから得た。患者の肺組織は、ｍＲＮＡ及びタンパク質の抽出のための外植の直後にスナップ凍結させるか、又は直接的に４％の緩衝されたパラホルムアルデヒド中に移し、４℃で２４時間固定し、そしてパラフィン中に埋包させた。調査されるＩＰＡＨ患者の平均肺動脈圧は、６８．４±８．５ｍｍＨｇであった。組織供与は、ジャスタス−リービッヒ大学の倫理委員会と国内法によって統制された。
【００６０】
細胞培養
ヒトの肺平滑筋細胞は、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＧｍｂＨ社（ドイツ・ハイデルベルク在）から得られ、そしてヒト平滑筋細胞培地ＩＩ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＧｍｂＨ社、ドイツ・ハイデルベルク在）中で３継代まで培養した。ヒトの肺線維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から得られ、そして線維芽細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）中で培養した。Ａ５４９細胞は、１０％の仔ウシ血清を含有するダルベッコ変性イーグル培地中で培養した。
【００６１】
動物
全ての動物実験は、成体の雄マウス（８週齢、ＢＡＬＢ／ｃ）を用いて、国別仕様と国際仕様を遵守した機関内ガイドラインに従って実施した。
【００６２】
慢性低酸素状態への暴露
マウスを、慢性低酸素状態（１０％のＯ2）に、前記のような通風チャンバ中で暴露した16。低酸素状態の水準は、自動制御コントロール装置（モデル４０１０、Ｏ2コントローラ、Ｌａｂｏｔｅｃｔ；ドイツ・ゲッティンゲン在）によって、窒素か酸素のいずれかを供給して保持した。再循環システム中の過剰の湿分は、冷却システム中での凝結によって防止した。ＣＯ2は、ソーダ石灰によって連続的に除去した。ケージは、清掃と、食料及び水の供給のために、一日一回開放した。チャンバ温度を、２２〜２４℃に保持した。常酸素のマウスを、常酸素条件下で同じチャンバ中に保持した。
【００６３】
血流力学的測定
マウスに、ケタミン（６ｍｇ／１００ｇ、腹腔内）及びキシラジン（１ｍｇ／１００ｇ、腹腔内）で麻酔した。気管にカニューレ挿入し、そして肺を空気内空気で０．２ｍｌの１回換気量及び１分間あたり１２０回の呼吸数で換気した。全身性動脈圧を、頸動脈のカテーテル挿入によって測定した。右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の測定のために、ＰＥ８０製のチューブを、右頚静脈を介して右心室中に挿入した。
【００６４】
薬理学的処置
急性の低酸素性の血管収縮に対するＰＤＥ１Ｃインヒビターの作用を調査するために、４グループのマウス（各グループに６匹）を、単離肺実験で調査する。２つのグループは、急性の低酸素性の血管収縮に対する試験化合物又はプラセボの用量増加の効果を調査する常酸素の動物である。従って、繰り返しの低酸素誘発を実施し、そして試験化合物又はプラセボを常酸素期間で適用する。他の２つのグループは、慢性的な低酸素状態のマウス（１０％のＯ2で２１日）からなり、そこで試験化合物又はプラセボを用いて同じ実験を行った。ＰＤＥ１Ｃ阻害の慢性的な効果を、３５日間にわたり低酸素状態に暴露したマウスで評価する。簡潔には、２０匹の動物を、低酸素条件に保持して、肺高血圧症を生じさせる。２１日後に、動物に、試験化合物かプラセボのいずれかを、浸透圧ミニポンプの移植による連続的な注入を介して受けさせて無作為化する。それらの動物にケタミン／キシラジンで麻酔し、頚動脈中にカテーテル挿入した。それらの動物に、２０μｇの試験化合物／ｋｇ／分又はプラセボを、１４日間にわたり受けさせる。
【００６５】
右心肥大と血管再構築の評価
低酸素状態又は室内空気に３又は５週間にわたり暴露したマウスの血行力学を、前記のように記録した。全身性の動脈圧及び右心室圧を記録した後に、動物を全採血し、肺と心臓を単離した。右心室（ＲＶ）を、左心室と中隔（ＬＶ＋Ｓ）から解剖し、これらの解剖されたサンプルの重さを量って、右心室対左心室と中隔とを足した比率（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）を得た。
【００６６】
肺を、１０％のリン酸緩衝されたホルマリン（ｐＨ７．４）の溶液で潅流させた。同時に、１０％のリン酸緩衝されたホルマリン（ｐＨ７．４）を、肺内に、２０ｃｍのＨ2Ｏの圧力で気管内チューブを介して適用し、そして光学顕微鏡用に処理した。小さい末梢の肺動脈の筋化の度合いを、３μｍ切片を、抗平滑筋アクチン抗体（希釈１：９００、クローン１Ａ４、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）及び抗ヒトのフォンヴィレブランド因子抗体（ｖＷＦ、希釈１：９００、Ｄａｋｏ、ドイツ・ハンブルク在）で、他に記載されるプロトコールから変更して二重染色することによって評価した。ウサギにおいて生じたヒトＰＤＥ１Ｃに対するポリクローナル抗体（ＦａｂＧｅｎｎｉｘ、Ｓｈｒｅｖｅｐｒｏｔ、米国）を、ＰＤＥ１Ｃ染色のために使用した。脱蝋及び脱水した切片を、０．１％塩化カルシウム中の０．１％トリプシン（ｐＨ７．６）で３７℃で８分間にわたりタンパク質分解性抗体での検索に供し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、米国）法で、基質として３，３−ジアミノベンジジンを用いて免疫染色した。それらのセクションを、ヘマトキシリンで対比染色し、光学顕微鏡によってコンピュータ化された形態測定システム（Ｑｗｉｎ，Ｌｅｉｃａ，ａｎｄ Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を用いて調査した。４０倍の拡大で、肺胞管もしくは肺胞のいずれかに付随する５０〜６０の腺胞細胞内血管を、各マウスにおける処置を知らない観察者によって分析した。前記のように、各血管を、非筋化と、部分筋化と、又は完全筋化としてカテゴリー分けした20。各筋化カテゴリーにおける肺血管のパーセンテージを、そのカテゴリーにおける血管数を、同じ実験グループで数えられた全数によって割り算することによって決定した。
【００６７】
ウェスタンブロット
凍結された肺組織を、組織ホモジナイザーで、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＣａＣｌ2、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＮ3及び０．１％（ｗ／ｖ）のトライトンＸ−１００と一緒にプロテアーゼカクテルインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ・マンハイム在）を含有するトリス溶解バッファー中で均質化させた。均質化されたサンプルを、１００００ｇで３０分間遠心分離させ、そして上清を回収し、そのタンパク質含有率を、ブラッドフォードの色素試薬法によって見積もった。簡単に、同量のタンパク質を、１２％のＳＤＳ ＰＡＧＥ上に、サンプルを、β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳサンプルバッファー中で９５℃で５分間煮沸した後にロードした。次いで、ゲルを、ニトロセルロースメンブレンに転写し、そのメンブレンを、ＰＤＥ１Ｃ（ＦａｂＧｅｎｎｉｘ、Ｓｈｒｅｖｅｐｒｏｔ，米国）及び平滑筋アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ，ドイツ・ミュンヘン在）のそれぞれと一緒にインキュベートした。メンブレンを、ＥＣＬ化学発光キット（アマシャム、ドイツ・フライブルク在）を使用して現像した。
【００６８】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
全ＲＮＡを、凍結された肺組織から、ＴＲｉｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ社、ドイツ・カールスルーエ在）によって単離し、そしてＲＮＡの量を、ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、米国）を用いて測定した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、第一鎖ｃＤＮＡを生成するためにオリゴｄｔプライマーを使用して実施した。半定量的ＰＣＲを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施して、ＰＤＥ１Ｃ遺伝子のｍＲＮＡ発現を確認した。ヒトＰＤＥ１Ｃの発現のために、センス配列ＨＰＤＥ１ＣＦ−５′−ＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＡＣＡＧ−３′とアンチセンス配列ＨＰＤＥ１ＣＲ−５′−ＡＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＴＧＴＴＣ−３′を有するプライマーペアを使用した。同様に、マウスにおけるＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡ発現のために、以下の配列：フォワードＭＰＤＥ１Ｃ−５′−ＴＴＧＡＣＧＡＡＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴ−３′及びリバースＭＰＤＥ１Ｃ−５′−ＴＴＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＴＧ−３′を使用した。β−アクチンを、両方の生物についてハウスキーピング遺伝子として、フォワードｐ−ＡＣＴＩＮＦ−５′−ＣＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡ−３′及びリバースｐ−ＡＣＴＩＮＲ−５′−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３′の共通のプライマーセットで使用した。ＰＣＲは、以下の条件下で実施した。初期変性を、９４℃で１分３０秒、アニーリングを５８℃で１分間、重合を２℃で１分２０秒を３２サイクル、最終伸長を、７２℃で２分間。ヒトのＰＤＥ１Ｃプライマーで、３７７ｂｐのアンプリコンサイズが得られ、マウスのＰＤＥ１Ｃプライマーで、４５０ｂｐに増幅されるが、β−アクチンは、４７５ｂｐの産物サイズをもたらした。
【００６９】
ホスホジエステラーゼイソ酵素の活性測定及び細胞抽出物の調製
細胞（１〜３×１０6）を、リン酸緩衝生理食塩水（４℃）中で２回洗浄し、そして１ｍｌの均質化バッファー（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．５ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのメルカプトエタノール、５ｍＭのペプスタチンＡ、１０ｍＭのロイペプチン、５０ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍＭの大豆トリプシンインヒビター、２ｍＭのベンザミジン、ｐＨ８．２）中に再懸濁させた。細胞を超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ，３×１５秒）によって破壊し、そして溶解物を、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）活性測定のために直ちに用いた。ＰＤＥ活性は、記載（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＆Ａｐｐｌｅｍａｎ，１９７９）されるようにして、幾らかの変更（Ｂａｕｅｒ＆Ｓｃｈｗａｂｅ，１９８０）を加えて細胞溶解物で評価した。アッセイ混合物（最終容量２００ｍｌ）は以下のものを含有していた（ｍＭ）：トリス塩酸（ｐＨ７．４）  ３０、ＭｇＣｌ2  ５、基質としての０．５μＭの環状ＡＭＰもしくは環状ＧＭＰ、［3Ｈ］ｃＡＭＰもしくは［3Ｈ］ｃＧＭＰ（１ウェルあたり約３００００ｃ．ｐ．ｍ．）、１００ｍＭのＥＧＴＡ、以下に記載されるＰＤＥイソ酵素特異的アクチベーター及びインヒビター並びに細胞溶解物。インキュベートは、３７℃で６０分間実施し、反応は、５０ｍｌの０．２ＭのＨＣｌを１ウェルあたりに添加することによって止めた。アッセイを、氷上で１０分間放置し、次いで２５ｍｇの５′−ヌクレオチダーゼ（ガラガラヘビ）を添加した。３７℃での１０分間のインキュベート後に、アッセイ混合物を、ＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５カラム（１ｍｌの床容量）上にロードした。カラムを２ｍｌの３０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ６．０）で溶出させ、そして溶出物中の放射活性を計数した。結果を、全放射活性の２％未満であり、環状ＡＭＰ分解が、添加した基質量の２５％を超過しなかったブランク値（変性されたタンパク質の存在下に測定した）について補正した。最終ＤＭＳＯ濃度は、全てのアッセイ中で０．３％（ｖ／ｖ）であった。ＰＤＥイソ酵素の選択的なインヒビター及びアクチベーターを使用して、今までに記載（Ｒａｂｅ他、１９９３）されたことに変更を加えて、ＰＤＥファミリーの活性を測定した。簡単に、ＰＤＥ４を、１μＭのピクラミラストの存在及び不在において、０．５μＭのサイクリックＡＭＰでＰＤＥ活性の差異として計算した。１０μＭのモタピゾンの存在及び不在におけるピクラミラストで阻害されたサイクリックＡＭＰ加水分解の間の差異を、ＰＤＥ３として定義した。１０μＭのモタピゾンの存在下における１００ｎＭのシルデナフィルによって阻害されたサイクリックＧＭＰ（０．５μＭ）加水分解のフラクションは、ＰＤＥ５を反映した。アッセイで使用される濃度で、ピクラミラスト（１μＭ）、モタピゾン（１０μＭ）及びシルデナフィル（１００ｎＭ）は、完全にＰＤＥ４、ＰＤＥ３及びＰＤＥ５の活性を、他のＰＤＥファミリーからの活性と干渉せずに遮断した。ＰＤＥ１は、１ｍＭのＣａ2+及び１００ｎＭのカルモジュリンによって誘発されたサイクリックＡＭＰ加水分解（１μＭのピクラミラスト及び１０μＭのモタピゾンの存在）又はサイクリックＧＭＰ加水分解の増分として定義した。５μＭのサイクリックＧＭＰによって誘発された１μＭのピクラミラスト及び１０μＭのモタピゾンの存在下でのサイクリックＡＭＰ（０．５μＭ）分解活性の増大は、ＰＤＥ２を表した。ＰＤＥ２インヒビターのＰＤＰ（１００ｎＭ）は、完全に、このサイクリックＧＭＰ誘発活性増分を阻害し、更に、この活性はＰＤＥ２として確証された。
【００７０】
増殖測定
増殖は、3Ｈ−チミジン導入によって測定した。２．４×１０4のヒトの肺動脈性の平滑筋細胞又はヒトの肺線維芽細胞を、２４ウェルプレート中に１ウェルごとに播種した。播種の１日後に、ＰＤＥ１Ｃインヒビター（化合物Ａ及び化合物Ｂ）を添加した。この実験に応じて、化合物を添加した１日後又は３日後に、3Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し、そして細胞を更に少なくとも１０時間にわたりインキュベートした。培地上清を廃棄した後に、細胞を１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１０％ＴＣＡを３０分間添加した。これに引き続き、０．５ｍｌの０．２ＭのＮａＯＨを、４℃で少なくとも１５時間添加した。次いで、サンプルを、シンチレーションバイアルに移し、５ｍｌのシンチレーション液を添加し、バイアルを、多目的シンチレーションカウンターＬＳ６５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で計数した。
【００７１】
Ａ５４９細胞での増殖アッセイは、種々の様式で９６ウェルプレート中で実施した。簡単に、５０００個の細胞を１ウェルあたりに１００μｌで播種した。１日後に、ＰＤＥ１Ｃインヒビター（化合物Ａ及び化合物Ｂ）を８時間添加し、それに引き続き3Ｈ−チミジンを２時間添加した。次いで、上清を廃棄し、細胞をトリプシン処理し、９６ウェルフィルタプレートにおいてｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって吸引した。次いで、３０μｌのシンチレーション液をフィルタプレートの各ウェルに添加し、そのプレートをプレートの上にフィルムを付すことによって覆い、プレートをＴｏｐ Ｃｏｕｎｔ ＮＸＴ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。
【００７２】
ホスホジエステラーゼ活性の阻害の測定
ホスホジエステラーゼ活性を、アマシャムバイオサイエンス（手順説明書"ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ［3Ｈ］ｃＡＭＰ ＳＰＡ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ，ｃｏｄｅ ＴＲＫＱ ７０９０"を参照のこと）によって提供された改変されたＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ）試験において、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で実施して阻害する。試験容量は１００μｌであり、これは２０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ７．４）、０．１ｍｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ｍｌ、５ｍＭのＭｇ2+、０．５μＭのｃＧＭＰ又はｃＡＭＰ（約５００００ｃｐｍのトレーサーとしての［3Ｈ］ｃＧＭＰ又は［3Ｈ］ｃＡＭＰを含む；ｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを使用するかは、測定されるホスホジエステラーゼの基質特異性に応ずる）、１μＭのそれぞれのＤＭＳＯ中希釈物及び効率的な組み換えＰＤＥを含有し、１０〜２０％のｃＧＭＰ又はｃＡＭＰが前記の試験条件下に変換されることを保証した。アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度（１％ｖ／ｖ）は実質的に調査されるＰＤＥの活性に影響を及ぼさない。３７℃で５分間プレインキュベートした後に、基質（ｃＧＭＰ）を添加することによって反応を開始させ、そしてアッセイ物を更に１５分間インキュベートし、次いでＳＰＡビーズ（５０μｌ）を添加することによって反応を停止させた。製造元の説明に従って、ＳＰＡビーズを事前に水中に再懸濁させるが、次いで水中で１：３（ｖ／ｖ）に希釈し、希釈された溶液も３ｍＭのＩＢＭＸを含有し、それによりＰＤＥ活性の完全な停止を保証した。該ビーズが沈殿した後に（＞３０分）、ＭＴＰの分析を市販のルミネッセンス検出装置において行う。化合物のＰＤＥ活性の阻害についての相応のＩＣ50値を濃度−作用曲線から非線形回帰によって測定する。
【００７３】
結果
低酸素状態のマウス肺におけるＰＤＥ１Ｃの発現
ＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡ（図１Ａ）及びタンパク質レベル（図１Ｂ）の両方は、低酸素状態に暴露したマウス肺（暴露時間３５日まで）において時間に依存して増大した。常酸素状態の動物においては、ＰＤＥ１Ｃに特異的な免疫活性は、相応のアクチン染色（図２Ｂ）から明らかなように、血管と非血管の平滑筋細胞の両者において裏付けられた（図２Ａ）。免疫活性は、非筋肉の微小血管、内皮及び気道上皮では見られなかった。低酸素への暴露後に、ＰＤＥ１Ｃは、肺胞壁に付随する遠位の筋化された動脈（図２Ｃ）に顕著に発現され、再びα型の平滑筋アクチンと重複している（図２Ｄ）。
【００７４】
図１
2008543807.tif 000002
【００７５】
図１．  マウスにおける、低酸素状態で誘発された肺高血圧症での高められたＰＤＥ１Ｃ発現
ＲＴ−ＰＣＲとウェスタン分析を使用して、対照動物と低酸素誘発された動物からの肺におけるＰＤＥ１Ｃの発現を評価した。ＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡ（Ａ，Ｂ）及びタンパク質（Ｃ，Ｄ）の含量は、経時的に増大した（慢性低酸素状態を与えた３日後、１４日後、２１日後、３５日後のＰＤＥ１Ｃ発現の値）。ＰＤＥ１Ｃ発現の比重分析を示す（Ｂ，Ｄ）。イムノブロットは、各グループについてのｎ＝４ブロットの代表であり、同じ結果を示している。全てのサンプルは、β−アクチンに標準化させる。
【００７６】
図２
2008543807.tif 000003
【００７７】
図２．  対照マウス（常酸素状態）及び低酸素マウスからの肺動脈におけるＰＤＥ１Ｃの免疫染色
ＰＤＥ１Ｃ様の免疫活性は、主に、全てのグループにおける肺動脈の平滑筋細胞に制限された。スケールバー：１００μｍ。
【００７８】
低酸素マウスは、肺高血圧症と右心肥厚を生ずる。
【００７９】
低酸素マウスは、２１日以内に重度の肺高血圧症を生じ、それは３５日目まで持続した。従って、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）は、常酸素状態の動物と比較して大きく高まった（図３）。
【００８０】
図３
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【００８１】
図３．  右心室収縮期圧と右心肥厚に対する２１日の効果
動物は、２１日間低酸素状態に暴露するか、又は常酸素状態に全体をとおして維持した（対照）。右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ、ｍｍＨｇ）及び右心室対左心室と中隔とを足した比率（ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ）を、右心肥厚の測定として示す。*、対照に対するｐ＜０．０５。
【００８２】
低酸素マウスは、肺動脈の筋化を示す。
【００８３】
ここで、常酸素状態／低酸素状態のマウスにおいて２０〜７０μｍの直径を有する肺動脈の筋化の程度を定性的に評価した。対照において、この直径の大多数の血管は、筋化されておらず（５４％）、より低い割合が部分的に筋化された血管（３７％）と完全に筋化された血管（９％）である（図４）。低酸素状態の動物（２１日目）において、筋化されていない肺動脈に大きな減少が生じ、それに伴い、完全に筋化された肺動脈に増大が生ずる。８ＭＭ−ＩＢＭＸでの処置は、両方の低酸素グループ（２１日目、すなわち８ＭＭ−ＩＢＭＸ処置の開始前及び３５日目）と比較して完全に筋化された動脈が大きく減少し、そして筋化されていない肺動脈の割合が増大した。
【００８４】
図４
2008543807.tif 000005
【００８５】
図４．  低酸素状態は、肺動脈の筋化を誘発する。
【００８６】
動物は、２１日間低酸素状態に暴露するか、又は常酸素状態に全体をとおして維持した（対照）。筋化されていない肺動脈（Ｎ）、部分的に筋化された肺動脈（Ｐ）又は完全に筋化された肺動脈（Ｍ）の割合を、全肺動脈断面（２０〜７０μｍサイズ）の割合として示す。全部で６０〜８０の腺胞内血管を各肺において分析した。
【００８７】
2008543807.tif 000006
【００８８】
突発性肺動脈高血圧（ＩＰＡＨ）を伴う患者におけるＰＤＥ１Ｃ発現
ドナーの肺組織においては、少量だけのＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡが見出されたに過ぎない（図５）。しかしながら、ＩＰＡＨを伴う患者においてはＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡが大きく増大した。ｍＲＮＡ発現と一致するように、ＰＤＥ１Ｃタンパク質レベルは、ドナーの肺においては、非常に低く、又は事実上検出できないが、一方で、ＰＤＥ１Ｃタンパク質の豊富な発現は、ＩＰＡＨを伴う患者において見出された。免疫組織化学的に、ＩＰＡＨ患者からの肺動脈におけるＰＤＥ１Ｃの大規模な発現が裏付けられ、それは内壁中に局在化していた（図６）。それに対して、ＰＤＥ１Ｃの発現は、健康なドナーの肺組織の肺血管中には事実上検出されなかった。更に、気管支と気道の上皮においてＰＤＥ１Ｃの発現は見出されなかった。
【００８９】
図５
2008543807.tif 000007
【００９０】
図５．  ＩＰＡＨを伴う患者における増大したＰＤＥ１Ｃ発現
ＲＴ−ＰＣＲとウェスタン分析を使用して、健康なドナー（対照）とＩＰＡＨ患者からの肺におけるＰＤＥ１Ｃの発現を評価した。ＰＤＥ１ＣのｍＲＮＡ（Ａ，Ｂ）及びタンパク質（Ｃ，Ｄ）の両方の含量は、ＩＰＡＨ患者において大きく増大した。ＰＤＥ１Ｃ発現の比重分析を示す（Ｂ，Ｄ）。イムノブロットは、各グループについてのｎ＝４ブロットの代表であり、同じ結果を示している。全てのサンプルは、β−アクチンに標準化させる。*、対照に対するｐ＜０．０５；**、対照に対するｐ＜０．０５。
【００９１】
図６
2008543807.tif 000008
【００９２】
図６．  健康なドナーとＩＰＡＨ患者からの肺動脈におけるＰＤＥ１Ｃの免疫染色
ＰＤＥ１Ｃ様の免疫活性は、主に、全てのグループにおける肺動脈の平滑筋細胞に制限された。スケールバー：１００μｍ。
【００９３】
ＰＤＥ１Ｃ発現は、ＩＰＡＨ患者において平均肺動脈圧と相関している。
【００９４】
この研究における注目すべき考察は、ＩＰＡＨ患者の肺からのＰＤＥ１Ｃ発現が、これらの患者の平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）と大きく相関していることであった（図７）。
【００９５】
図７
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【００９６】
図７．  ＩＰＡＨ患者からのＰＤＥ１Ｃ発現と平均肺動脈圧との相関
ＰＤＥ１Ｃの発現は、任意の単位で示され、かつ平均肺動脈圧と相関している。
【００９７】
ＰＤＥ１Ｃ活性は、ヒトの肺動脈平滑筋細胞と肺線維芽細胞において検出できる。
【００９８】
示される免疫組織化学的データによれば、ＰＤＥ１Ｃ活性は、肺平滑筋細胞（図８Ａ）並びにヒトの線維芽細胞（図８Ｂ）の溶解物中で測定され、それらはまた、肺高血圧症又は線維症を生ずる再構築プロセスに関与していることも議論される。
【００９９】
図８
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【０１００】
図８．  ＰＤＥ１Ｃ活性
ヒトの肺動脈平滑筋細胞（Ａ，ｎ＝２±ＳＥＭ）及びヒトの肺線維芽細胞（Ｂ）の溶解物において、カルモジュリン刺激されるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの加水分解活性が測定され（ＰＤＥ１ｃＧ及びＰＤＥ１ｃＡ）、それはＰＤＥ１Ｃ発現の原因である。更に、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４及びＰＤＥ５の活性が検出された。
【０１０１】
ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、ＰＤＥ１Ｃを発現する肺細胞の増殖を阻害する。
【０１０２】
ＰＤＥ１Ｃの活性を阻害する化合物を同定する。その化合物は、以下に示される式を有する化合物Ａ及びＢを含む。化合物Ａ及びＢを、以下に記載されるＰＤＥファミリーの一員の阻害について分析する。両方の化合物は、ナノモラー範囲のＩＣ50値でヒト組み換えＰＤＥ１Ｃ１を阻害することと、試験された他のＰＤＥファミリーの一員に対して選択的であることが判明した。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
化合物Ａ：
【化１】
2008543807.tif 000012
【０１０５】
化合物Ｂ：
【化２】
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【０１０６】
４−［ヒドロキシ（４−メチルフェニル）メチリデン］−１−フェニル−５−チオキソピロリジン−２，３−ジオン
第１表．  化合物Ａ及びＢの構造並びにヒトの組み換えホスホジエステラーゼ酵素に対するＩＣ50値
ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、ＰＤＥ１Ｃを発現する肺細胞の増殖を阻害する。
【０１０７】
図１０、１１及び１２に示されるように、ＰＤＥ１Ｃを阻害する化合物Ａは、ウェスタンブロットによってＰＤＥ１Ｃを発現することが示されているヒトの肺線維芽細胞（図１０）、ヒトの肺動脈平滑筋細胞（図１１）及びヒトの上皮肺細胞Ａ５４９（図１２）の増殖を阻害した。化合物Ａとは構造的に異なる、ＰＤＥ１Ｃ阻害性化合物Ｂも、ヒト上皮肺細胞Ａ５４９（図１２）の増殖を阻害した。
【０１０８】
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【０１０９】
図１０．  化合物Ａは、ヒトの肺線維芽細胞の増殖を阻害する。
【０１１０】
ヒトの肺線維芽細胞を、種々の濃度の化合物Ａで３日間処理した。次いで、増殖を、3Ｈ−チミジン導入アッセイ（ｎ＝２±ＳＤ）によって測定した。
【０１１１】
2008543807.tif 000015
【０１１２】
図１１．  化合物Ａは、ヒトの肺動脈平滑筋細胞の増殖を阻害する。
【０１１３】
ヒトの肺動脈平滑筋細胞を、種々の濃度の化合物Ａで１日間にわたって処理した。次いで、増殖を、3Ｈ−チミジン導入アッセイ（ｎ＝２±ＳＤ）によって測定した。
【０１１４】
2008543807.tif 000016
【０１１５】
図１２．  化合物Ａ及び化合物Ｂは、ヒト肺上皮細胞の増殖を阻害する。
【０１１６】
Ａ５４９細胞を、種々の濃度の化合物Ａ及び化合物Ｂで８時間にわたり処理した。次いで、増殖を、3Ｈ−チミジン導入アッセイ（ｎ＝２±ＳＤ）によって測定した。
【０１１７】
まとめ
その発現により平滑筋細胞の細胞増殖を促進することが示されたＰＤＥ１Ｃは、動物モデルの肺血管系と肺高血圧症を伴う患者において高度に過剰発現される。その発現は、肺高血圧症の程度と相関し、そして肺高血圧症において観察される血管再構築プロセスの領域内に局在化している。この領域内で、ＰＤＥ１Ｃは、肺動脈平滑筋細胞と肺線維芽細胞中に局在化している。ＰＤＥ１Ｃインヒビターは、肺線維芽細胞と肺動脈平滑筋細胞の増殖を遮断する。このように、ＰＤＥ１Ｃのインヒビターは、肺高血圧症及び肺線維症を生ずる再構築プロセスの処置のための治療剤として使用することができる。
【０１１８】
本発明は、その精神又は必須の特徴から逸脱しない限りは、他の特定の形態を実施態様とすることができる。上記実施例は、説明としてのみ包含されるに過ぎない。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲の範囲によって制限されるものではない。
【国際調査報告】
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