(57)【要約】  本発明は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花から単離される抽出物及び画分の肝細胞癌に対する抗癌活性に関する。具体的には、本発明は、花を極性溶媒、例えばエタノール、メタノール、エタノール水溶液又は水で抽出し、抽出物を溶媒、例えば塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルム又は酢酸エチルでトリチュレートすることにより脂肪非極性成分を除去し、残渣を水中に懸濁し、ｎ−ブタノールで抽出し、水性部分を凍結乾燥することによりブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花から単離された、２〜９重量％の範囲のマークした（ｍａｒｋｅｒｅｄ）フラボノイド配糖体、例えばブトリン及びイソブトリンを含む組成物の肝細胞癌に対する抗癌活性に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分或いは治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る、肝細胞癌の処置に有用な医薬組成物。
【請求項２】
任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分を含んで成る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
組成物の用量が、少なくとも０．５ｇ／ｋｇ体重の単位用量で投与される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
組成物の用量が、０．５ｇ／ｋｇ体重未満の単位用量で投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
組成物の用量が、可溶形態、好ましくは懸濁形態で投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
用いられる担体が、生理食塩水、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース又は任意の他の既知の医薬として許容される担体を含んで成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
投与経路が、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口などを含んで成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分或いは治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る、対象中の肝細胞癌を処置する方法。
【請求項１０】
用いられる対象が、ヒト及び動物から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
投与される組成物の用量が、少なくとも０．５ｇ／ｋｇ体重の単位用量である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
投与される製剤の用量が、０．５ｇ／ｋｇ体重未満の単位用量である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組成物の用量が、可溶形態、好ましくは懸濁形態で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
用いられる担体が、生理食塩水、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース又は任意の他の既知の医薬として許容される担体を含んで成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
投与経路が、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口などから成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
肝細胞癌の処置における、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）から得られる抽出物及び生物活性画分の使用。
【請求項１９】
肝細胞癌の処置における、化合物ブトリン及びイソブトリンの使用。
【請求項２０】
ａ）植物材料を粉末にすること、
ｂ）段階（ａ）から得られた粉末を、エタノール、メタノール、水を含んで成る群から選択される溶媒を個々に又はそれらの組み合わせで用いるパーコレーションにより抽出し、抽出物を得ること、
ｃ）段階（ｂ）から得られた抽出物を、減圧下で、＜５０℃で濃縮すること、
ｄ）段階（ｃ）から得られた抽出物を、塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルム及び／又は酢酸エチルを含んで成る群から選択される溶媒を用いて滴定し、残渣を得ること、
ｅ）段階（ｄ）から得られた残渣を、水相と有機相の間に分配すること、
ｆ）段階（ｅ）から得られた水性部分を乾燥し、既知の方法により所望の活性画分を得ること、
を含んで成る、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分からブトリン及び／又はイソブトリンを含んで成る生物活性画分を単離するための方法。
【請求項２１】
残渣を分画するために用いられる有機相がｎ−ブタノールである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞癌の処置に有用な医薬組成物に関する。
【０００２】
より具体的には、それは、対象中の肝細胞癌を処置する方法に関する。
【０００３】
本発明は、肝細胞癌の処置における、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部位から得られた抽出物又はその活性画分の使用にも関する。
【０００４】
更に、それは、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部位からのブトリン（ｂｕｔｒｉｎ）及び／又はイソブトリン（ｉｓｏｂｕｔｒｉｎ）を含んで成る生物活性画分を単離するための方法にも関する。
【０００５】
より具体的には、それは、肝細胞癌の処置における、生物活性画分及びブトリン及びイソブトリンの使用に関する。
【背景技術】
【０００６】
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）（Ｌａｍ）（ファミリー：マメ科）は、インドの大部分で見られる中型の木であり、インドにおける医薬の固有の系において多くの用途を有することが報告されている。様々な薬理作用は、この植物の花、葉、皮及び根に帰する。葉は、収斂剤、強壮剤、利尿剤及び催淫剤である。それらは、おできを治療するのに用いられる。皮は、収斂性、苦味、刺激性、変質性、催淫性及び駆虫作用を有することが報告されている。根は、象皮病及び夜盲症の治療に有用である。花は、収斂性、浄化作用、催淫性及び強壮作用を有することが報告されている[Ｃｈｏｐｒａ，Ｒ．Ｎ．，Ｎａｙａｒ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃｈｏｐｒａ，Ｉ．Ｃ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ，ＣＳＩＲ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，１９５６，ｐ．４２；Ｗｅａｌｔｈ  ｏｆ  Ｉｎｄｉａ：Ｒａｗ  Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＣＳＩＲ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ，（１９８８）Ｖｏｌ．２Ｂ，ｐ．３４１−４６］。茎の皮の石油エーテル及び酢酸エチル抽出物は、抗真菌活性を示した。（−）−メディカルピンは、有効成分として同定された［Ｒａｔｎａｙａｋｅ  Ｂａｎｄａｒａ，Ｂ．Ｍ．，Ｓａｖｉｔｒｉ  Ｋｕｍａｒ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｗａｒｎａ  Ｓａｍａｒａｎａｙａｋｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈａｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２５（１），７３５（１９８９）］。種子の熱いアルコールの抽出物は、ラット及びウサギそれぞれにおいて、顕著な着床抑制活性及び排卵抑制活性を示した。それは、マウスにおいて流産作用も示した［Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｒ．Ｒ  ａｎｄ  Ｋｈａｎｎａ，Ｕ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（１０）１５７５，（１９６８）］。ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の種子から単離されたブチンは、ラットにおいて、着床抑制活性を有することが報告された［Ｂｈａｒｇａｖａ，Ｓ．Ｋ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈａｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １８，９５−１０１，（１９８６）］。花から単離されたトリテルペンは、実験動物における抗けいれん活性の有効成分として報告された［Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｖ．Ｓ．，Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｈｏｐｄｅ，Ｃ．Ｔ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．７２，９６５−９７２（２００２）］。種子のメタノール抽出物は、インビトロで試験した場合、顕著な駆虫活性を示した［Ｐｒａｓｈａｎｔｈ，Ｄ．Ａｓｈａ，Ｍ．Ｋ．，Ａｍｉｔ，Ａ．ａｎｄ  Ｐａｄｍａｊａ，Ｒ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ  ７２，４２１−４２２（２００１）］。「Ｒａｓａｙａｎａ」がインビトロで寄生虫に殺効果を有さないので、１つの要素としてブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）を含む「Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ Ｒａｓａｙａｎａ」（漢方薬）は、恐らく免疫修飾により、ランブル鞭毛虫症の管理に関して報告された［Ａｇａｒｗａｌ，Ａ．Ｋ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，Ｇｕｐｔａ，Ｎ．，Ｓａｘｅｎａ，Ｒ．，Ｐｕｒｉ，Ａ．，Ｖｅｒｍａ，Ａ．Ｋ．，Ｓａｘｅｎａ  Ｒ．Ｐ．，Ｄｕｂｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｓａｘｅｎａ，Ｋ．Ｃ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈａｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４４，１４３−１４６（１９９４）］。イソブトリン及びブトリンは、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花からの抗肝毒性成分として同定された［Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｇｅｙｅｒ，Ｂ．，Ｆｉｅｂｉｇ，Ｍ．，Ｋｉｓｏ，Ｙ．ａｎｄ  Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ７７−７９（１９８６）］。ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花は、抗ストレス活性を有することが報告された［Ｂｈａｔｗａｄｅｋａｒ，Ａ．Ｄ．，Ｃｈｉｎｔａｗａｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｌｏｇａｄｅ，Ｎ．Ａ．，Ｓｏｍａｎｉ，Ｒ．Ｓ．，Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｖ．Ｓ．ａｎｄ  Ｋａｓｔｕｒｅ，Ｓ．Ｂ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３１，１５３−１５５（１９９９）］。我々の知る限りでは、今までのところ、任意の植物部分又はその単離物／成分の抗癌活性は報告されていない。
【０００７】
多くのフラボノイド、すなわちブテイン、ブチン、ブトリン、イソブトリン、パラシトリン（ｐａｌａｓｉｔｒｉｎ）、コレオプシン（ｃｏｒｅｏｐｓｉｎ）、イソコレオプシン（ｉｓｏｃｏｒｅｏｐｓｉｎ）、スルフレチン（ｓｕｌｐｈｕｒｅｔｉｎ）、モノスペルモシド（ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｏｓｉｄｅ）及びプルネチンは、この植物の花から単離された［Ｇｕｐｔａ，Ｓ．Ｒ．，Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｒｔｙ  ９，２２３１−３５（１９７０）；Ｐｕｒｉ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓｅｓｈａｄｒｉ，Ｔ．Ｒ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄ．Ｒｅｓ．（Ｉｎｄｉａ）１２Ｂ，４６２（１９５３）；Ｌａｌ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ｄｕｔｔ，Ｓ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２，２６２（１９３５）］。いくつかの窒素成分も報告され、これは、パラソニン（ｐａｌａｓｏｎｉｎ）［Ｒａｊ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ  Ｋａｒｕｐ，Ｐ．Ａ．，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５，８６−８７（１９６７）］、モノスペルミン（ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｉｎ）［Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．ａｎｄ  Ｂｏｋａｄｉａ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｈｅｍ．＆Ｉｎｄ．３，９８（１９８１）］、アロファン酸誘導体［Ｐｏｒｗａｌ，Ｍ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｋ．，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２７Ｂ，２８１−８２（１９８８）］及びパラシミド（ｐａｌａｓｉｍｉｄｅ）［Ｇｕｈａ，Ｐ．Ｋ．，Ｐｏｉ，Ｒ．ａｎｄ  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，２０１７（１９９０）を含む。種子は、α−アミリン、β−シトステロール、β−シトステロールグルコシドを含むことも報告された［Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．，Ｌａｌ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓａｂｉｒ，Ｍ，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ  ３５，７９−８０，１９７７］及びヘキセイコサノイック酸（ｈｅｘｅｉｃｏｓａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）δ−ラクトン［Ｂｉｓｈｎｏｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ，Ｐ．Ｃ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ３５，２８６−８８，（１９７９）］。種子から単離されたパラソニン（Ｐａｌａｓｏｎｉｎ）は、駆虫活性を示した［Ｋａｌｅｙｓａ  Ｒａｊ，Ｒ．ａｎｄ  Ｋａｒｕｐ，Ｐ．Ａ．Ｉｎｄ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．５６，１２，（１９６８）］。茎からの２つの新規の化合物３α−ヒドロキシエウフ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｕｐｈ）−２５−エン及び２，１４−ジヒドロキシ−１１，１２−ジメチル−８−オキソ−オクタデカ−１１−エニルシクロヘキサン（ｅｎｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）の単離が報告された［Ｍｉｓｈｒａ，Ｍ．，Ｓｈｕｋｌａ，Ｙ．Ｎ．ａｎｄ  Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４（８），８３５−３８，（２０００）］。種子−ラック（ｌａｃ）の樹脂画分から、ジャラール酸エステル（ｊａｌａｒｉｃ ｅｓｔｅｒ）Ｉ、ジャラール酸エステルＩＩ、ラクシジャラール酸エステル（ｌａｃｃｉｊａｌａｒｉｃ ｅｓｔｅｒ）Ｉ及びラクシジャラール酸エステル（ｌａｃｃｉｊａｌａｒｉｃ ｅｓｔｅｒ）ＩＩと呼ばれる４つの酸エステルの単離が報告された［Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ｎ．，Ｕｐａｄｈｙｅ，Ｖ．，Ｍｈａｓｋａｒ，Ｖ．Ｖ．ａｎｄ  Ｄｅｖ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３０，８６７−７４，（１９７４）］。
【０００８】
植物は、ＩＳＭ中の肝疾患の処置に関して周知である。花からの活性化合物（ブトリン及びイソブトリン）は、肝臓保護活性に関して報告された。「Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔｓ  ｂｙ  Ａ．Ｓｅｈｒａｗａｔ，Ｔ  Ｈ  Ｋｈａｎ，Ｌ．Ｐｒａｓａｄ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｌｔａｎａ（Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３．１５７−１６３，２００６）」という題名の最近の研究論文において、これらの化合物を有する植物抽出物の肝臓保護作用は、チオアクタマイド（ｔｈｉｏａｃｔａｍｉｄｅ）誘導性肝毒性に対して試験された。チオアクタマイドは、有害、毒性及び発癌性である。同じ論文において、さらに２つのパラメータ、すなわちＤＯＣ及びＨ３チミジンの組み込みが試験され、それは、これらの２つのパラメータを阻害することにより腫瘍形成を阻害し得ることを実証した。ブテア（Ｂｕｔｅａ）抽出物の直接的な抗癌作用に関する示唆は存在しない。対照動物における癌の進行でさえ実証されてなく、どのパラメータも癌への保護作用を示さず、せいぜい、それは化学予防／抗癌作用として考慮され得る。筆者自身、「全体的な結果は、Ｂ．モノスペルマ（Ｂ．Ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）のメタノール抽出物が肝臓保護作用を有し、それは酸化ストレス及びポリアミン生合成経路の阻害により促進段階も抑制し得ることを示唆している」と結論づけた。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の主な目的は、肝細胞癌の処置に有用な医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、対象中の肝細胞癌を処置する方法を提供することである。
【００１１】
更に、本発明の別の目的は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分からのブトリン及び／又はイソブトリンを含んで成る生物活性画分を単離するための方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、肝細胞癌の処置における、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物又はその生物活性画分の使用を提供することである。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、肝細胞癌の処置におけるブトリン及びイソブトリンの使用を提供することである。
【００１４】
発明の概要
本発明は、対象中の肝細胞癌の処置に有用な医薬組成物を扱い、ここで、当該組成物は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物又はその活性画分或いは治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る。更に、それは、対象中の肝細胞癌を処置する方法、及びブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分からのブトリン及び／又はイソブトリンを含んで成る生物活性画分を単離するための方法、及び肝細胞癌の処置におけるその使用にも関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
従って、本発明は、肝細胞癌の処置に有用な医薬組成物を提供し、当該組成物は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分或いは治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る。
【００１６】
本発明の実施態様において、組成物は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分を含んで成る。
【００１７】
本発明の別の実施態様において、組成物の用量は、少なくとも０．５ｇ／ｋｇ体重の単位用量で投与される。
【００１８】
更に、本発明の別の実施態様において、組成物は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る。
【００１９】
本発明の更に別の実施態様において、組成物の用量は、０．５ｇ／ｋｇ体重未満の単位用量で投与される。
【００２０】
本発明の更に別の実施態様において、組成物の用量は、可溶形態、好ましくは懸濁形態で投与される。
【００２１】
本発明の更に別の実施態様において、用いられる担体は、生理食塩水、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース又は任意の他の既知の医薬として許容される担体から成る群から選択される。
【００２２】
本発明の更に別の実施態様において、組成物は、全身的、経口的、又は任意の臨床的、医学的に許容される方法により用いられる。
【００２３】
本発明の更に別の実施態様において、投与経路は、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口などを含んで成る群から選択される。
【００２４】
本発明の更に別の実施態様において、組成物は、予防及び治療の双方の目的で用いられる。
【００２５】
更に、本発明は、対象中の肝細胞癌を処置する方法も提供し、当該方法は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分或いは治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る。
【００２６】
本発明の実施態様において、対象は、ヒト及び動物から成る群から選択され、好ましくはヒトである。
【００２７】
本発明の実施態様において、方法は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量のブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分から得られる抽出物及び／又はその活性画分を含んで成る医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、投与される組成物の用量は、少なくとも０．５ｇ／ｋｇ体重の単位用量である。
【００２９】
更に、本発明の別の実施態様において、方法は、任意に１つ以上の医薬として許容される担体と共に、治療有効量の化合物ブトリン及び／若しくはイソブトリン又はその誘導体若しくは類似体又はその医薬として許容される塩を含んで成る医薬組成物を対象に投与する段階を含んで成る。
【００３０】
本発明の更なる実施態様において、投与される組成物の用量は、０．５ｇ／ｋｇ体重未満の単位用量である。
【００３１】
本発明の更なる実施態様において、組成物の用量は、可溶形態、好ましくは懸濁形態で投与される。
【００３２】
本発明の更なる実施態様において、用いられる担体は、生理食塩水、アカシアガム、カルボキシメチルセルロース又は任意の他の既知の医薬として許容される担体から成る群から選択される。
【００３３】
本発明の更に別の実施態様において、組成物は、全身的、経口的、又は任意の臨床的、医学的に許容される方法により用いられる。
【００３４】
本発明の更なる実施態様において、投与経路は、腹腔内、静脈内、筋肉内、経口などから成る群から選択される。
【００３５】
本発明は、肝細胞癌の処置における、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）から得られる抽出物及び生物活性画分の使用も提供する。
【００３６】
本発明の実施態様において、化合物ブトリン及びイソブトリンの使用は、肝細胞癌の処置においてである。
【００３７】
更に、本発明は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の任意の植物部分からブトリン及び／又はイソブトリンを含んで成る生物活性画分を単離するための方法を提供し、当該方法は、
ａ）植物材料を粉末にすること、
ｂ）段階（ａ）から得られた粉末を、エタノール、メタノール、水を含んで成る群から選択される溶媒を個々に又はそれらの組み合わせで用いるパーコレーションにより抽出し、抽出物を得ること、
ｃ）段階（ｂ）から得られた抽出物を、減圧下で、＜５０℃で濃縮すること、
ｄ）段階（ｃ）から得られた抽出物を、塩化エチレン、塩化メチレン、クロロホルム及び／又は酢酸エチルを含んで成る群から選択される溶媒を用いて滴定し、残渣を得ること、
ｅ）段階（ｄ）から得られた残渣を、水相と有機相の間に分配すること、
ｆ）段階（ｅ）から得られた水性部分を乾燥し、既知の方法により所望の活性画分を得ること、
を含んで成る。
【００３８】
本発明の実施態様において、残渣を分配するために用いられる有機相は、ｎ−ブタノールである。
【００３９】
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）からの活性画分の単離に関する流れ図
【化１】
2008542254.tif 000002
【００４０】
以下の実施例は、本発明の例示によって与えられ、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の５００ｇｍの乾燥粉末化した花を、３Ｌの蒸留水中に浸し、スチームバス上で４時間加熱した。水性抽出物をセライトに通して濾過し、ロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）上で５０℃において２５０ｍｌまで濃縮した。この抽出工程を更に３回繰り返し、混ぜ合わせた濃縮水性抽出物（１Ｌ）を凍結乾燥して、乾燥粉末を得た（１４５ｇ）。この抽出物を酢酸エチルでトリチュレートし、残渣を水（７５０ｍｌ）に取り入れ、ｎ−ブタノールで抽出した（４×２００ｍｌ）。水性画分を凍結乾燥して、活性画分を得た（８８ｇ）。
【００４２】
実施例２
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の日陰で乾燥した粉末化した花（１ｋｇ）を最高濃度アルコール（ｒｅｃｔｉｆｉｅｄ ｓｐｉｒｉｔ）に浸し、一晩保持した。抽出物を流し、セライトに通して濾過した。この抽出工程を更に３回繰り返した。最高濃度アルコールを減圧下で蒸発させ、暗褐色の塊を得、この抽出物を酢酸エチルで滴定した。残った残渣を水に溶解し、ｎ−ブタノールで抽出した（３×４００ｍｌ）。水性画分を凍結乾燥し、活性画分を得た（１５６ｇ）。
【００４３】
実施例３
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の日陰で乾燥した粉末化した花（１ｋｇ）を、メタノールに浸し、一晩保持した。抽出物を流し、セライトに通して濾過した。この抽出工程を更に３回繰り返した。メタノールを減圧下で蒸発させ、暗褐色の塊を得、この抽出物を酢酸エチルでトリチュレート。残った残渣を水（１Ｌ）に溶解し、ｎ−ブタノールで抽出した（３×４００ｍｌ）。水性画分を凍結乾燥し、乾燥粉末を得た（１４２ｇ）。
【００４４】
実施例４
活性画分のＨＰＬＣ分析：
活性画分は、イソブトリン及びブトリンを最小で、全抽出物の２〜４．５重量％及び９〜１２重量％の範囲で含む。
【００４５】
溶媒系アセトニトリル：０．００１Ｍのリン酸（３０：７０）、カラムＲＰ１８ｅ（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、５ｕｍ、４．０×２５０ｍｍ）、カラム温度３０℃、流速０．６ｍｌ／分、波長２５４。
【００４６】
実施例５
化合物１及び２の特性：
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の水性抽出からの水性画分（２５ｇ）を、シリカゲル（６００ｇ）のカラム上でクロマトグラフした。酢酸エチルによる溶出：メタノール（８５：１５）は、１５０ｍｇのイソブトリン（１）、続いて１．２ｇのブトリン（２）を与えた。
【００４７】
【化２】
2008542254.tif 000003
【００４８】
【化３】
2008542254.tif 000004
【００４９】
実施例６
ヒト癌細胞株に対する水性抽出物及び水性画分のインビトロでの細胞毒性：
国立癌研究所（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｕ．Ｓ．Ａ）又はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａ）から入手したヒト癌細胞株を、本試験において用いた。細胞を、組織培養フラスコ中で、完全成長培地（２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地、ｐＨ７．４、使用の前に、濾過により滅菌し、１０％のウシ胎仔血清及び１００ユニット／ｍｌのペニシリンを加えた）中で、３７℃で、５％のＣＯ2及び９０％の相対湿度の雰囲気中で、二酸化炭素インキュベーター中で培養した。サブコンフルエント段階の細胞を、細胞毒性の決定のために、トリプシン（０．０２％のＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で０．５％）を用いた処理によりフラスコから回収した。トリパンブルー排除により決定した場合に９８％超の生存率を有する細胞を、試験に用いた。必要とされる細胞密度の細胞懸濁液を、細胞毒性の決定のために、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む完全成長培地中で調製した。
【００５０】
２０ｍｇ／ｍｌの試験物質のストック溶液を、蒸留水中で調製した。ストック溶液を、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む完全成長培地により連続希釈し、必要とされる濃度の作業用の試験溶液を得た。
【００５１】
９６ウエルの組織培養プレートを用いて、インビトロでのヒト癌細胞株に対する細胞毒性を決定した(Ｍｏｎｋｓ，Ａ．，Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ｄ．，Ｓｋｅｈａｎ，Ｐ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｒ．，Ｐａｕｌｌ，Ｋ．，Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｄ．，Ｈｏｓｅ，Ｃ，Ｌａｎｇｌｅｙ，ｊ．，Ｃｒｏｎｉｓｅ，Ｐ．，Ｖａｉｇｒｏ−Ｗｏｌｆｆ，Ａ．，Ｇｒａｙ−Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｍ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｈ．，Ｍａｙｏ，Ｊ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，Ｍ．（１９９１）．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ−ｆｌｕｘ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３，７５７−７６６．)。１００μｌの細胞懸濁液を、９６ウエルの組織培養プレートの各ウエルに添加した。細胞を２４時間インキュベートした。完全成長培地（１００μｌ）中の試験物質を、細胞懸濁液を含むウエルに、２４時間のインキュベーション後に添加した。試験物質の添加後に、プレートを４８時間更にインキュベートし（３７℃で、５％及び９０％の相対湿度の雰囲気中で、二酸化炭素インキュベーター中で）、その後、全てのウエル中の培地の上にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ、５０μｌ、５０％）を穏やかに重ねることにより、細胞成長を止めた。プレートを４℃で１時間インキュベートし、細胞をウエルの底に結合させ固定した。全てのウエルの液体を穏やかにピペットで取り、捨てた。プレートを蒸留水で５回洗い、ＴＣＡ，成長培地の低分子量の代謝物、血清タンパク質などを除去し、風乾した。スルホローダミンＢ色素を用いて染色することにより、細胞成長を測定した（Ｐ．Ｓｋｅｈａｎ，Ｒ．Ｓｔｏｒｅｎｇ，Ｄ．Ｓｃｕｄｉｅｒｏ，Ａ．Ｍｏｎｋｓ，Ｊ．ＭｃＭｏｈａｎ，Ｄ．Ｖｉｓｔｉｃａ，Ｊ．Ｔ．Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｂｏｋｅｓｃｈ，Ｓ．Ｋｅｎｎｅｙ，Ｍ．Ｒ．Ｂｏｙｄ（１９９０）Ｎｅｗ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ−Ｄｒｕｇ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８２，１１０７−１１１２）。吸着色素をトリス緩衝液（１００μｌ、０．０１Ｍ、ｐＨ１０．４）に溶解し、プレートを機械撹拌器上で５分間穏やかに撹拌した。吸光度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡ読取機で５４０ｎｍにおいて記録した。
【００５２】
実験セットの平均ＯＤ値から各ブランクの平均ＯＤ値を引くことにより、細胞成長を計算した。任意の試験物質の不在下での成長を１００％と見なして、試験物質の存在下での成長率が計算され、同様に、試験物質の存在下での成長阻害率が計算されるだろう。
【００５３】
ヒト癌細胞株に対するブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の水性抽出物及び水性画分のインビトロでの細胞毒性（成長阻害率）を、表１にまとめる。
【００５４】
表１：ヒト癌細胞株に対するブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の抽出物及び画分のインビトロでの細胞毒性（成長阻害率）。
【表１】
2008542254.tif 000005
【００５５】
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の水性抽出物を、１００μｇ／ｍｌの濃度で、多くのヒト癌細胞株、すなわち乳房（ＭＣＦ−７、Ｔ−４７−Ｄ及びＺＲ−７５−１）、頸部（ＨｅＬａ及びＳｉＨａ）、ＣＮＳ（ＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＳＮＢ−７８）、結腸（Ｃｏｌｏ−２０５及びＳＷ−６２０）、肝臓（Ｈｅｐ−２）、肺（Ａ−５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３）、口腔（ＫＢ）、卵巣（ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−３及びＯＶＣＡＲ−５）及び前立腺（ＤＵ−１４５）に対する、そのインビトロでの細胞毒性に関して評価した。それは、ＳＷ−６２０、Ｃｏｌｏ−２０５及びＩＭＲ−３２ヒト癌細胞株それぞれに対して、高度の成長阻害（すなわち９５、８７及び８１％）を示した。Ｈｅｐ−２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ及びＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト癌細胞株は、それぞれ５１、４３及び２３％の緩やかな効果を示した。Ａ−５４９（１９％）及びＫＢ（１６％）のヒト癌細胞株に対する応答は、低度であった。残りのヒト癌細胞株は、乏しい応答であるか又は全く応答を示さなかった。
【００５６】
ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の水性画分も、１００μｇ／ｍｌの濃度で、多くのヒト癌細胞株、すなわち乳房（Ｔ−４７−Ｄ）、頸部（ＳｉＨａ）、ＣＮＳ（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）、結腸（Ｃｏｌｏ−２０５、ＨＣＴ−１５及びＨＴ−２９）、肝臓（Ｈｅｐ−２）、肺（Ａ−５４９）、口腔（ＫＢ）及び卵巣（ＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−５及びＯＶＣＡＲ−５）に対する、そのインビトロでの細胞毒性に関して評価した。それは、Ｈｅｐ−２（３５％）、続いてＮＩＨ−ＯＶＣＡＲ−５（２７％）及びＡ−５４９（１１％）に対して最大の成長阻害を示した。残りのヒト癌細胞株は、更に小さい応答であるか又は全く応答を示さなかった。
【００５７】
実施例７
水性抽出物及び水性画分のインビトロでの抗癌活性：
遺伝子組み換えマウス：Ｘ−ｍｙｃ遺伝子組み換えマウスの開発は、他に記載されている［Ｋｕｍａｒ，Ｖ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．，Ｔｏｔｅｙ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｎａｎｄ，Ｒ．Ｋ．（２００１）．Ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｘ−ｍｙｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｓｏ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ．米国特許第６，２７４，７８８Ｂ１］。この動物は、ＣＰＣＳＥＡのガイドラインにより交配し、世話をした（プロジェクトＮｏ．ＶＩＲ−２，ＩＣＧＥＢ，２００１）。遺伝子導入陽性動物を、４週齢において、ＰＣＲを用いた尾のゲノムＤＮＡ分析により選抜した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【００５８】
薬物処理：各動物は、週２回、生理食塩水（対照群）又は薬物を含有する生理食塩水（５００ｍｇ／Ｋｇ）（処理群）のいずれかの９回の腹腔内注射を受けた。
【００５９】
実施例８
組織病理学的試験及び他のパラメータ：
対照群及び処理群両方の動物を、１２週齢又は２０週齢で屠殺し、肝臓の肉眼的外観を記録した。組織病理学的調査のために、試料を１０％の緩衝化ホルマリン中に回収し、パラフィン・ブロックを調製した。肝臓の形態学的及び細胞学的詳細を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した組織切片（２〜５ｍｍの厚さ）の光学顕微鏡検査により調べた。
【００６０】
対照及び処理マウスの血清中のＶＥＧＦの濃度を、マウス特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ＃ＱＩＡ５２）を用いて測定した。全ての操作は、供給者の指示どおりに行った。ＶＥＧＦ濃度を、ピコグラム／ｍｌ血清として表した；
【００６１】
組織病理学的試験及び血清ＶＥＧＦ濃度の結果を、それぞれ図１〜３及び表２に示す。
【００６２】
表２：ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の抽出物の処理後のＸ−ｍｙｃマウス中の血清ＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）。
【表２】
2008542254.tif 000006
【００６３】
対照動物の肝臓（図１）は、異型分裂、異形成及び正常な肝臓構造の喪失を示した。悪性肝細胞索は、多核細胞化及び大核小体を有する大きな多形核を示した。図２及び３は、それぞれ、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の水性抽出物（Ａ００３）及び水性画分（Ｆ００９）による処理の効果を示す。ここで、肝臓は、処理後１２及び２０週の両方において正常であるように見えた。処理動物の血清ＶＥＧＦ濃度（表２）が有意に減少したので（ｐ＜０．００１〜０．０１）、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の抗癌活性は、抗血管新生機能に関連するようである。
【００６４】
実施例９
ヒト癌細胞株に対する水性画分から単離された化合物のインビトロでの細胞毒性：
方法論は、２０ｍｇ／ｍｌの代わりに１×１０-2Ｍのストック溶液を調製したこと除いて、実施例６で与えられるものと同じである。
【００６５】
化合物を、１×１０-4、１×１０-5及び１×１０-6Ｍの濃度で、多くのヒト癌細胞株、すなわち頸部（ＳｉＨａ）、ＣＮＳ（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）、結腸（ＨＴ−２９、ＨＣＴ−１５、Ｃｏｌｏ−２０５及びＳＷ−６２０）、肺（ＨＯＰ−６２）に対する、そのインビトロでの細胞毒性に関して評価した。両方の化合物は、高度の成長阻害、すなわち用いた細胞株に対して１×１０-4Ｍで４０〜９９％を示した。１×１０-5Ｍでの最大の成長阻害は、２６％であった。化合物は、１×１０-6Ｍで不活性であった。
【００６６】
化合物のインビトロでの細胞毒性（成長阻害率）を、表３にまとめる。
【００６７】
表３：ヒト癌細胞株に対する化合物（ブトリン及びイソブトリン）のインビトロでの細胞毒性（成長阻害率）
【表３】
2008542254.tif 000007
【００６８】
利点：
本発明の主な利点：
２．本発明は、肝細胞癌に対する抗癌活性を有する新規の抽出物／画分の単離に関する。
３．本方法は、天然において豊富な高度に経済的な原材料を利用する。
４．本方法で用いられる概念は、向上するために、それを望ましく、最も容易にする。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、化合物イソブトリン及びブトリンの一般構造を示す。
【化４】
2008542254.tif 000008
【化５】
2008542254.tif 000009
【図２】図２は、ｘ−ｍｙｃマウス（対照、非処理）（Ａ．１２週及びＢ．２０週）の肝組織像を示す（全て、１００×）。対照動物の肝臓は、異型分裂、異形成及び正常な肝臓構造の喪失を示した。悪性肝細胞索は、多核細胞化及び大核小体を有する大きな多形核を示した。
【図３】図３は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の水性抽出物により処理したｘ−マウス（Ａ．１２週及びＢ．２０週）の肝組織像を示す（全て、１００×）。肝臓は、処理後１２及び２０週の両方において正常であるように見えた。
【図４】図４は、ブテア・モノスペルマ（Ｂｕｔｅａ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍａ）の花の画分により処理したｘ−マウス（Ａ．１２週及びＢ．２０週）の肝組織像を示す（全て、１００×）。肝臓は、処理後１２及び２０週の両方において正常であるように見えた。
【図１】
2008542254.tif 000010
【図２】
2008542254.tif 000011
【図３】
2008542254.tif 000012
【図４】
2008542254.tif 000013
【国際調査報告】
2008542254.tif 000014
2008542254.tif 000015
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