(57)【要約】本発明は、以下の中での新規に単離した抗体およびそれらの使用と合わせた、クロストリジウム・ディフィシル感染のための化合物、薬剤および治療に関する。本発明はまた、Ｅ．フェシウムおよびＥ．フェカリス感染の治療および予防に関し、これらのための薬剤および治療剤を提供する。 【その他】国際段階において住所を誤記したにもかかわらず、訂正の手続がされない状態で、国内書面上は訂正後の住所となっている出願人の識別番号を記載するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療または予防のための薬剤の製造におけるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤の使用。
【請求項２】
前記アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼがクロストリジウム・ディフィシル由来である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記阻害剤が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１または２のいずれか１項記載の使用。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号４７の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有する、請求項３または４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号１の配列を有するＶＨ鎖である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１７〜１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有する、請求項３〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖である、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号４１の配列を有する、請求項３記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つ
を含む、クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療のための組み合わせ製剤。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３；および
（ｉｉ）配列番号１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３
からなる群の少なくとも１つを含む、単離および／または精製された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ＶＨ鎖が配列番号１の配列を有する、請求項１２記載の単離および／または精製された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記ＶＬ鎖が配列番号１６の配列を有する、請求項１２または１３のいずれかに記載の単離および／または精製された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記抗体が配列番号４１の配列を有する、請求項１２に記載の単離および／または精製された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項１７】
配列番号４６の配列を有する、請求項１６記載の核酸分子。
【請求項１８】
エンテロコッカス・フェシウムおよびエンテロコッカス・フェカリスによる感染の予防または治療のための薬剤の製造におけるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤およびバンコマイシンの使用。
【請求項１９】
前記エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスがバンコマイシン耐性である、請求項８記載の使用。
【請求項２０】
前記アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼがクロストリジウム・ディフィシル由来である、請求項１８または１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記阻害剤が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号４７の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的である、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有する、請求項２１または２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
前記ＶＨ鎖の抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号１の配列を有する、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３を有する、請求項２１〜２４のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖である、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが配列番号４１の配列を有する、請求項２１記載の使用。
【請求項２８】
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）バンコマイシン
を含む、エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスによる感染の治療のための組み合わせ製剤。
【請求項２９】
クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療方法であって、その必要がある患者に治療有効量のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤を投与することを包含する方法。
【請求項３０】
治療有効量の、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つを投与することをさらに包含する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスによる感染の治療方法であって、
治療有効量の、
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）バンコマイシン
を、その必要がある患者に投与する工程を包含する方法。
【請求項３２】
エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスがバンコマイシン耐性である、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の中での新規に単離した抗体およびそれらの使用と合わせた、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染のための化合物、薬剤および治療に関する。本発明はまた、Ｅ．フェシウム（ｆａｅｃｉｕｍ）およびＥ．フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）感染の治療および予防に関し、これらのための薬剤および治療剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ．ディフィシルは、グラム陽性嫌気性細菌であり、軽度の下痢から劇症の偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）までの範囲の一連の疾患−集合的に、Ｃ．ディフィシル抗生物質関連下痢症（ＣＤＡＤ）と呼ばれる−を引き起こす重要なヒト病原体と見なされている。ＣＤＡＤは、とりわけ高齢者において、実質的な罹患率および死亡率と関係する、一般的な医原性の院内疾患である。２つの要因−抗生物質の投与による常在性腸内フローラの抑制、ならびに細菌による２つの高分子量毒素、外毒素Ａおよび外毒素Ｂの産生−がＣＤＡＤの病理における主要な役割に割り当てられてきた。
【０００３】
細菌は病院中では固有であり、研究は、救急医療病棟において抗生物質治療を受ける患者のほぼ３分の１が、病院内にいながらＣ．ディフィシルにより細菌感染されたことを示している（Ｋｙｎｅ，Ｌ．ら、２００２，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３４（３），ｐｐ３４６−５３，ＰＭＩＤ：１１７７４０８２）。これらの患者のうち、過半数がＣＤＡＤを発症したのに対して、残りは無症候性キャリアであった。ＣＤＡＤは、患者の入院時間を延長させる主要な要因であり、見積もりにより、米国におけるこの疾患のコストは年間１１億ドルを超えると示唆されている（Ｋｙｎｅ，Ｌ．ら、上記参照）。ＣＤＡＤを罹患している患者は、誘発する抗生物質の中断ならびに抗生物質メトロニダゾールおよびバンコマイシンのいずれかを用いる治療を含む治療に対して良好に応答する。初期の抗生物質療法に対する応答速度は高い可能性があるが（９５％まで）、しかし２０％までの患者が、各々の再発の発症と複合する発症のリスクを伴って、最初の治療の１週間または２週間以内に再発し得る。再発は、通常は抗生物質を用いて治療可能であり、このことは、異なるＣ．ディフィシル株との感染に起因することを示す。さらに、Ｃ．ディフィシルが、メトロニダゾールに対する耐性を持ちつつあり、また、部分的にバンコマイシンに対する耐性を持ちつつあるという証拠が存在し、これにより、ＣＤＡＤの治療において新規な代替物が必要であることが実証される。
【０００４】
病原性株の細菌によって産生される外毒素ＡおよびＢは、細胞毒性、腸毒性、および炎症誘発性であり、この非侵襲性微生物の主要な病原性因子であると見なされている。しかし、毒素産生性株でのすべての感染が疾患を生じるわけではなく、さらなる病原性因子の探索を促している。細菌の表面で発現される抗原は、候補である病原性因子を表し、重要であると見なされている。なぜなら、このようなタンパク質は、細菌感染の最初の段階における腸の上皮層への付着、または局所免疫のメディエーターとの相互作用などの必須の機能を媒介すると見られるためである。多くの他の細菌と共通して、Ｃ．ディフィシルは、外側の細胞表面上に、結晶性または準結晶性の表面層（Ｓ層）を発現する。このようなＳ層は、細菌の外部表面上に規則的に配列された格子を形成するタンパク質または糖タンパク質を含み、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍａｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）およびカンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）のような病原体の病原性に必須であることが以前に示されていた。１つのＳ層を含む大部分の細菌とは対照的に、Ｃ．ディフィシルは、２つの重ね合わされた準結晶性Ｓ層を含むことが知られており、各々が、異なるＣ．ディフィシル株間で見かけの分子量がわずかに異なる糖タンパク質サブユニットから構成される。Ｃ．ディフィシルの多くの株は、２つの主要なＳ層タンパク質（ＳＬＰ）、１つは３２〜３８ｋＤａ（低分子量ＳＬＰ）および２番目は４２〜４８ｋＤａ（高分子量ＳＬＰ）を発現する。低分子量ＳＬＰは免疫優勢であるようであり、ＣＤＡＤに罹患している患者によって最も一般的に認識される抗原であり、そして全体のＣ．ディフィシル細胞に対してウサギにおいて惹起された抗血清によって、細菌のＥＤＴＡ抽出物中で認識される唯一の抗原である（Ｃａｌａｂｉ，Ｅ．ら、２００１，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（５）  ｐ１８７−９９，ＰＭＩＤ：１１４０１７２２）。
【０００５】
微生物感染の過程において、種々の適応性ストラテジーが免疫系によって利用される。１つのこのようなストラテジー、および議論の余地はあるが、最も重要なものは、抗体応答の産生である。感染性因子によって提示される抗原を結合可能である抗体が産生され、そして補体の活性化、マクロファージの補充、および微生物自体との直接的相互作用を通して、微生物に結合しかつその微生物を殺傷することを可能にする。所定の抗原を結合可能である抗体の治療効力は変化し、これは、免疫系による抗体産生が感染の過程において成熟し、患者の症例に集中するようになり、感染を首尾よく撃退するという事実に反映される。
【０００６】
抗体応答は、個々のＢ細胞が構造的に多様な抗体分子を各々産生する場合に、Ｂ細胞レパートリーによって誘発される。このＢ細胞／抗体レパートリーの実際のサイズは未知であるが、所定の抗原についての反応性のランダムクローン頻度は、培養されたＢ細胞中で１００，０００中で１つの高さであり得ると推定される（Ｎｏｂｒｅｇａ，Ａ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  Ａｐｒ；２８（４）：１２０４−１５；ＰＭＩＤ：９５６５３６０）。感染の経過中、病原体を結合することが可能な抗体は、Ｂ細胞集団の変化によって選択され、大量に産生される鍵となる抗体を生じる。これらの変化のためのメカニズムには、クローンの増大、イソタイプスイッチ、および免疫グロブリン可変領域の体細胞変異が含まれる。病原体を結合可能である抗体の生成に関与するＢ細胞は増殖し、従って、Ｂ細胞レパートリーをゆがめ、Ｂ細胞の割合を変化させる。
【０００７】
Ｃ．ディフィシル外毒素Ａの細胞結合ドメインに対して特異的な抗体は、マウスモデルにおいて防御的であることが見い出され、Ｃ．ディフィシルに細菌感染したがそれには無症候性（ａｓｙｍｐｔｏｔｉｃ）である患者は、上昇した抗外毒素Ａ  ＩｇＧ力価を有することが見い出されている。細菌感染に応答してこのような上昇した血清抗外毒素Ａ  ＩｇＧ力価を発生する感染患者は、このような上昇した力価を発生しなかった患者よりも、ＣＤＡＤに罹患する可能性が４８倍少ない。それゆえ、Ｃ．ディフィシル外毒素Ａを用いるワクチン接種は、抗Ｃ．ディフィシル外毒素Ａ抗体の使用と同様に、治療方針として示唆されている（Ｇｉａｎｎａｓｃａ  ＰＪおよびＷａｒｎｙ  Ｍ．、Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４  Ｆｅｂ  １７；２２（７）：８４８−５６；ＰＭＩＤ：１５０４０９３７）。
【０００８】
Ｃ．ディフィシル感染の治療／予防のための抗生物質に基づかない治療レジメは、ワクチン接種および受動免疫に基づく。ワクチン接種治療は、Ｃ．ディフィシル表面層タンパク質の免疫原性フラグメントまたはそのバリアントもしくはホモログ、または等価なポリペプチドフラグメントをコードする核酸配列のいずれかを患者に投与することを包含する（特許文献１に開示されるように）。受動免疫療法は、通常は、病原体によって産生される免疫原に特異的なモノクローナル抗体を患者に投与することによって達成される。一般的に、受動免疫療法は、ワクチン接種に対して応答できない免疫無防備状態の患者を治療する際に、および即時の治療を必要とし、かつワクチン投与が効果が出るのを待っていられない患者に対して特に有効である。Ｃ．ディフィシル感染の場合、受動免疫は、毒素を中和するポリクローナル免疫グロブリン（特許文献２に開示されるようなもの）または全細菌および毒素に対して惹起される抗体（特許文献３に開示されるようなもの）の患者への投与に依存する。
【０００９】
それゆえ、Ｃ．ディフィシル感染の有効な治療は極めて重要であり、先行技術は、このような治療のための標的が、Ｃ．ディフィシル外毒素Ａに対して、もしくは表面層タンパク質に対して標的化されるワクチン接種もしくは受動免疫療法であるべきであり、または未同定の細菌毒素に対して特異的であるポリクローナル血清としてであるべきであることを教示する。
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ  ０２／０６２３７９
【特許文献２】ＷＯ  ９９／２０３０４
【特許文献３】ＷＯ  ９６／０７４３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、本発明者は、治療のための特異的標的を同定した。以下の実験は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者がアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）に対して特異的な抗体の力価の上昇を生じること、および抗アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）抗体がそれ自体有用であり、Ｃ．ディフィシル感染を治療する際に有効であることを示す。さらに、抗アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ抗体、特に、Ｃ．ディフィシル感染患者からの大部分のドミナントＣＤＲ配列から構築された合成抗体は、抗生物質バンコマイシンまたはゲンタマイシンとともに使用されたときに、Ｃ．ディフィシル感染の相乗的な療法を生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明の第１の態様に従って、クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療または予防のための薬剤の製造におけるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤の使用が提供される。
【００１３】
本明細書において使用されるように、「治療」という用語は、他に明確に言及されない限り、広い意味を有することが意図される。従って、「治療」または「療法」は、ヒトもしくは動物の身体の障害もしくは機能不全の徴候を治癒、軽減、除去もしくは軽減し、またはこれらの障害もしくは機能不全にかかる可能性を妨害もしくは減少するように設計されている任意の治療を意味する。従って、「治療」という用語によって、疾患状態の治療、ならびにそれらの予防の両方が意味される。
【００１４】
特に、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼはクロストリジウム・ディフィシル由来であってもよく、また、配列番号４３の配列を有してもよい。
【００１５】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに対して特異的である広い範囲の阻害剤が使用されてもよい。特に、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、阻害剤と特異的結合対（ｓｂｐ）を形成してもよく、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、対の第１のメンバーであり、阻害剤は第２のメンバーである。
【００１６】
本明細書において、「特異的結合対のメンバー」とは、特異的に結合し、かつそれによって、他の分子の特定の空間的および極性の機構と相補的であると定義される、表面上または腔における領域を有する２つの異なる分子のうちの１つである。特異的結合対のメンバーは、リガンドおよび受容体（アンチリガンド）、ｓｂｐメンバーおよびｓｂｐパートナー、ｓｂｐメンバーなどと呼ばれる。これらは、通常、抗原−抗体のような免疫対のメンバーであるが、この用語は、ＲＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−タンパク質などの他の特異的結合対を含むより広い意味を有する。
【００１７】
従って、阻害剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよく、また、配列番号４７のペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的であってもよい。
【００１８】
実験のセクションにおいて以下に詳述されるように、配列番号４７の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープは、種々の抗原の間で保存されていると同定され、それゆえに、これらの抗原によって共有される保存エピトープを提示するペプチドであると同定される。
【００１９】
「抗体」という用語は、その種々の文法的な形において、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位つまりパラトープを含む分子をいうために本明細書で使用される。このような分子はまた、免疫グロブリン分子の「抗原結合フラグメント」と呼ばれる。
【００２０】
例示的な抗体分子は、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含む免疫グロブリン分子の部分であり、これらには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦ（ｖ）のような当分野において公知である部分が含まれる。抗体、それらの産生および使用は当分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）。
【００２１】
以下の実験において詳述されるように、Ｃ．ディフィシルに感染した患者によって産生された抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）はクローニングおよび配列決定され、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）が同定された。これは、高度に免疫優勢のＶＨ鎖ＣＤＲ１〜３（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）、および高度に免疫優勢のＶＬ鎖ＣＤＲ１〜３（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）が存在することを示した。
【００２２】
従って、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有してもよい。特に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１の配列を有するＶＨ鎖を有してもよい。
【００２３】
同様に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７〜１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有してもよい。特に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１６の配列を有するＶＬ鎖を有してもよい。
【００２４】
上記の配列を有する合成抗体が作製および使用され、従って、この抗体は、配列番号４１の配列を有してもよい。配列番号４１を有する以下に詳述される抗体はまた、Ｎ末端ＳタグおよびＣ末端Ｈｉｓタグを含む。これらのタグ（または他のタグ）は有用であると見なされる可能性があるが、これらは実験目的のために有用であるが、しかし治療用抗体には必要ではない。従って抗体は、例えば、さらにＨｉｓタグ、例えば、Ｃ末端Ｈｉｓタグを含んでもよい。
【００２５】
以下の実験は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤が、クロストリジウム・ディフィシル感染の治療をもたらす際にそれ自体に対して有効であるのみならず、既存の抗生物質、特に、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンと組み合わせて使用する際にもまた有用であること、およびこのような使用が相乗効果を提供することができることを示した。予備的な実験結果はまた、相乗効果がメトロニダゾールを用いて達成されることを示す。
【００２６】
従って、本薬剤は、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つをさらに含んでもよい。
【００２７】
必然的に、本発明の医薬製剤は、薬学的に許容しうるキャリア、希釈剤または賦形剤を含んでもよい（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ＵＳ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，１９８４，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，ＩＳＢＮ：１８８９７８８０３１）。
【００２８】
上記に詳述されるように、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤は、クロストリジウム・ディフィシル感染の治療をもたらす際にそれ自体に対して有効である。従って、
（ｉ）配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３；および
（ｉｉ）配列番号１７〜１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３、
からなる群の少なくとも１つを含む、単離および／または精製された抗体もまた、本発明に従って提供される。
【００２９】
上記のように、ＶＨ鎖は配列番号１の配列を有してもよい。ＶＬ鎖は、配列番号１６の配列を有してもよい。抗体は、配列番号４１の配列を有してもよい。
【００３０】
このような抗体をコードする核酸分子もまた提供される。この核酸分子は、単離および／または精製されてもよい。特に、核酸分子は、配列番号４６の配列を有してもよい。
【００３１】
本発明に従って、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）またはエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、特に、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウムによる感染の予防または治療のための薬剤の製造におけるアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤およびバンコマイシンの使用もまた提供される。
【００３２】
以下の実験は、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤およびバンコマイシンの使用が、Ｃ．ディフィシル感染の相乗的な療法を生じるのみならず、Ｅ．フェシウム感染、特にバンコマイシン耐性Ｅ．フェシウム感染の相乗的な療法もまた生じることを示す。予備的な実験はまた、相乗効果がまた、Ｅ．フェカリス感染の治療においても観察されることを示した。
【００３３】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム・ディフィシル由来であってもよい。
【００３４】
阻害剤が抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよく、また、配列番号４７の配列を有するペプチドによって提示されるエピトープに対して特異的であってもよい。
【００３５】
本発明の他の態様と同様に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２〜４の配列をそれぞれ有するＶＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有してもよい。このＶＨ鎖の抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号１の配列を有してもよい。
【００３６】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７〜１９の配列を有するＶＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３を有してもよい。このＶＬ鎖の抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号１６の配列を有してもよい。
【００３７】
抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４１の配列を有してもよい。
【００３８】
本発明が、２種以上の活性成分（例えば、抗体および抗生物質）を含む薬剤の供給に関する場合、本発明はまた、このような活性成分を含む組み合わせ製剤を提供する。例えば、２パック製剤が提供されてもよい。
【００３９】
従って、本発明に従って、
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つ
を含む、クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療のための組み合わせ製剤もまた提供される。
【００４０】
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）バンコマイシン
を含む、エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスによる感染の治療のための組み合わせ製剤もまた提供される。
【００４１】
エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスは、バンコマイシン耐性であってよい。
【００４２】
本発明はまた、患者の治療方法に拡張される。従って、本発明に従って、その必要がある患者に治療有効量のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤を投与する工程を包含する、クロストリジウム・ディフィシルによる感染の治療方法もまた提供される。この方法は、治療有効量の、ゲンタマイシン、バンコマイシンおよびメトロニダゾールからなる抗生物質の群の少なくとも１つを投与する工程をさらに包含してもよい。
【００４３】
本発明に従って、治療有効量の、
（ｉ）アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの阻害剤；および
（ｉｉ）バンコマイシン
を、その必要がある患者に投与する工程を包含する、エンテロコッカス・フェシウムまたはエンテロコッカス・フェカリスによる感染の治療方法もまた提供される。
【００４４】
エンテロコッカス・フェシウムはバンコマイシン耐性であってよい。
【００４５】
本発明は、Ｃ．ディフィシルおよびＥ．フェシウム感染の治療の型を例示としてのみ示す、以下の説明からさらに明らかである。
【００４６】
実験
以下の実験において、合成抗体は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者からの大部分の優勢なＶＨ抗体配列およびＶＬ抗体配列を使用して構築した。この合成抗体を用いて、抗原を単離および精製し、そしてエレクトロスプレー質量分析を使用して、単離したタンパク質についての推定の部分配列を決定した。マッチについてＣ．ディフィシルのゲノム配列を検索することによって、可能性のある候補マッチング配列を同定した。候補Ｃ．ディフィシル配列の比較によって、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）酵素として分類され、この配列をこのファミリーのメンバーとして確認する多数の相同タンパク質を同定した。最も密接したマッチは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からのＮＰ＿３４９３７６であり、これは、３９１個のアミノ酸にわたって６８％の相同性を示した。候補タンパク質のクローニング、発現、および精製により、合成抗体と強く結合するタンパク質を得た。さらなる実験により、Ｃ．ディフィシルのアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）に対して特異的な抗体が、Ｃ．ディフィシル感染を治療する際に、バンコマイシンおよびゲンタマイシンと相乗効果を示すことが示された。予備的な実験はまた、相乗効果がメトロニダゾールを用いてもまた達成可能であることを示す。
【００４７】
実験はまた、バンコマイシン耐性Ｅ．フェシウムの治療における、合成抗体とバンコマイシンの間の相乗効果を示す。予備的な実験（示さず）はまた、Ｅ．フェカリス感染の治療における合成抗体とバンコマイシンの間の相乗効果を示す。
【００４８】
他に言及されない限り、すべての手順は、標準的なプロトコルを使用して、および適用可能な場合、メーカーの使用説明書に従って実行した。ＰＣＲ、分子クローニング、操作および配列決定、抗体の製造、エピトープマッピングおよびミモトープ設計、細胞培養ならびにファージディスプレイを含む種々の技術についての標準的なプロトコルは、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９１，ＰＣＲ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＨｕｙｎｈおよびＤａｖｉｅｓ（１９８５，「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＶｏＩ  Ｉ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら（１９７７，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７４（１２）：５４６３−５４６７）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）、Ｊｕｎｇ，Ｇ．およびＢｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｇ．（１９９２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．，３１：３６７−４８６）、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ａ．およびＲａｅ，Ｉ．Ｆ．（「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」，１９９７，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０５２１  ５７３６４５）、「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．，およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９９６，ＩＳＢＮ  ０−１２−４０２３８０−０）などのテキストに記載されている。
【００４９】
とりわけ、本明細書に詳述される方法において有用である試薬および装置は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ｗｗｗ．ａｍｅｒｓｈａｍ．ｃｏ．ｕｋ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ｗｗｗ．ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｉｎｇｅｌｔｈｅｉｍ．ｃｏｍ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｏｓｙｓ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏｍ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）、Ｎｏｖａｇｅｎ  （ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（ｗｗｗ．ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ．ｃｏｍ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ｗｗｗ．ｐｈａｒｍａｃｉａ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ）、Ｑｉａｇｅｎ（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）、Ｓｉｇｍａ（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）等の業者から入手可能である。
【００５０】
ここに引用される参考文献を含む、本明細書において議論される各々の参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
「ＰＭＩＤ」参照番号が文献に与えられる場合、これらは、国立医学図書館（ｔｈｅ  ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）によって文献に割り当てられたＰｕｂＭｅｄ識別番号であり、そこから、各刊行物についての書誌情報および要約が、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて利用可能である。またこれによって、特に、例えば、ＰＮＡＳ、ＪＢＣおよびＭＢＣの刊行物の場合、完全な刊行物の電子コピーへ直接アクセスすることが可能となる。配列相同性は、全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）におけるＢＬＡＳＴ２プログラム（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＴＡら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１９９９  Ｍａｙ  １５；１７４（２）：２４７−５０；ＰＭＩＤ：１０３３９８１５）を、デフォルトパラメータと共に使用して決定される。
【００５２】
Ｃ．ディフィシルに感染した患者からの優性ＶＨおよびＶＬ抗体配列の同定
Ｃ．ディフィシルに感染した患者からの抗体配列を同定するため、および優性抗体配列、特にＣＤＲ配列を決定するために、ＷＯ  ０３／０５２４１６に詳述されている方法を使用した。以下の基本工程を使用して、抗体を産生するＢ細胞を同定し、配列決定し、そして分析した（ＷＯ  ０３／０５２４１６を参照のこと）：
（１）ヒト患者の循環Ｂ細胞からのＶＨおよび／またはＶＬコード領域の単離。
【００５３】
（２）ＶＨおよび／またはＶＬレパートリーのヌクレオチド配列の決定。
【００５４】
（３）ＶＨおよび／またはＶＬ一次アミノ酸配列の決定。
【００５５】
（４）インシリコでのＣＤＲ領域の抽出−データベースへの取り込み。
【００５６】
（５）ＶＨおよび／またはＶＬレパートリーにおける優性ＣＤＲおよびフレームワーク領域の検出。
【００５７】
（６）優性抗体配列からの治療組換え抗体の構築および産生。
【００５８】
抗体のフラグメントを、４例の感染患者（Ｄ０１、Ｄ０２、Ｄ０３およびＤ０４）から配列決定した。
【００５９】
重鎖（ＣＤＨ１）
ＣＤＨ１は、Ｃ．ディフィシル感染患者からの最も共通して存在するＶＨ鎖であった。これは、患者の抗体ＶＨ鎖からのＣＤＲ３配列の分析から同定された。Ｃ．ディフィシル感染患者からクローニングされた抗体の２２６／１０１１（２２．４％）が、同じＣＤＲ３配列（ＣＤＲ−Ｈ３、下記）を有した。ＣＤＨ１は、患者の４分の３において存在することが見い出された。そのＣＤＲ３配列は、患者Ｄ０１からのクローンの１８４／３１８（５７．９％）において出現し；Ｄ０３においてクローンの４０／２９１（１３．７％）において出現し；Ｄ０４においてクローンの２／２５２（０．８％）において出現した。最も一般的な全長ＶＨ配列は配列番号１である。
【００６０】
このＶＨ鎖配列中で、ＣＤＲ（相補性決定領域）配列は以下の通りである：
ＣＤＲ−Ｈ１  配列番号２
ＣＤＲ−Ｈ２  配列番号３
ＣＤＲ−Ｈ３  配列番号４。
【００６１】
相同性検索により、ＣＤＲ−Ｈ３配列（配列番号４）に対する７０％より高い相同性を有するいくつかの他のＣＤＲ３配列を同定し、これらはすべてＣ．ディフィシル患者からであった。ＣＤＲ３配列は配列番号５〜１５である。
【００６２】
軽鎖（ＣＤＬ１）
Ｈ１Ｌ１についての軽鎖は、Ｃ．ディフィシル感染患者からの最も共通するＣＤＲ３配列を有するクローンに由来した。ＣＤＬ１は、８４／２５１（３３．５％）の頻度で、患者Ｄ０１において存在した。このＣＤＲ３配列を含む最も共通するＶＬ配列は配列番号１６であった。
【００６３】
このＶＬ鎖配列中で、ＣＤＲ（相補性決定領域）配列は以下の通りである：
ＣＤＲ−Ｌ１  配列番号１７
ＣＤＲ−Ｌ２  配列番号１８
ＣＤＲ−Ｌ３  配列番号１９。
【００６４】
相同性検索により、ＣＤＲ−Ｌ３配列に対する７０％より高い相同性を有するいくつかの他のＣＤＲ３配列を同定し、これらはすべてＣ．ディフィシル患者からであった。ＣＤＲ３配列は配列番号２０〜４０である。
【００６５】
抗体Ｈ１Ｌ１の構築およびクローニング
合成抗体Ｈ１Ｌ１を以下のようにして構築した：ＣＤＨ１およびＣＤＬ１を配列決定ベクターから別々にＰＣＲ増幅し、ＤＮＡ配列決定を容易にするためにクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にクローニングした。このために、３μｇのＰＣＲ産物を、メーカーの使用説明書に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＫ）を使用して制限のために調製した。ＤＮＡを４０μＬ緩衝液ＥＢ中でスピンカラムから溶出した。精製したＰＣＲ産物（２μｌ）を１μＬのｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター、６μＬの水および１μＬのＤＮＡリガーゼと混合し、この混合物を１時間室温でライゲーションした。次いで、ライゲーションをエレクトロコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に、エレクトロポレーションによって形質転換し、アンピシリン１００μｇ  ｍｌ−１、ＩＰＴＧ（１００μＭ）およびＸ−ｇａｌ（０．００６％  ｗ／ｖ）を含む寒天プレート上にプレートした。コロニーを３７℃で一晩成長させ、次いで、４℃で保存した。組換えコロニーを、この培地上の白色コロニーとして同定する。
【００６６】
これにより、Ｎ末端ＳタグおよびＣ末端Ｈｉｓタグを有する、配列番号４１のアミノ酸配列を有する一般的構造：
Ｓタグ−ＣＤＨ１−リンカー−ＣＤＬ１−Ｈｉｓタグ
を有する抗体を得た。
【００６７】
抗体Ｈ１Ｌ１についての標的−アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）の同定
材料および方法
サンプル調製
血液寒天プレート上で成長させたクロストリジウム・ディフィシル細胞（ＮＣＴＣ  １１２０４）を、１０ｍＭのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中に懸濁し、５×１分間、氷上で超音波処理した。細胞溶解物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３００μｌの上清を、２０ｍＬの冷アセトン中１０％トリクロロ酢酸および２０ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）中で４５分間沈殿させた。タンパク質を遠心分離によって回収し、ペレットを、２０ｍＭ  ＤＴＴを含む冷アセトンで３回洗浄した。
【００６８】
２Ｄ−ゲル電気泳動
タンパク質ペレットを、サンプル再水和溶液（水中の７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、３％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー）に溶解し、同じ溶液で希釈して等電点電気泳動にかけた。等電点電気泳動は、３〜１０の非線形ｐＨ範囲（７ｃｍ）にわたって、Ｚｏｏｍ  ＩＰＧＲｕｎｎｅｒ（ＲＴＭ）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ（米国、カリフォルニア州、カールズバッド（Ｃｈａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して、全体で１７００Ｖｈで、各ストリップ上に約１５μｇのタンパク質をロードして実行した。二次元目の分離の前に、ストリップを、６５ｍＭ  ＤＴＴを含む平衡化緩衝液（水中の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．００２％ブロモフェノールブルー）中で、１５分間平衡化し、次いで、１２５ｍＭヨードアセトアミドを含む同じ緩衝液中で、さらに１５分間平衡化した。
【００６９】
二次元目の分離を、ＮｕＰａｇｅ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＺｏｏｍゲルおよびＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ（米国、カリフォルニア州、カールズバッド））を使用して実行した。タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ（米国、カリフォルニア州、カールズバッド））に転写ブロッティングし、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％スキムミルク中で１時間ブロックした。
【００７０】
イムノブロッティング
抗体Ｈ１Ｌ１の標的を同定するために、膜を、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の５％スキムミルク中の精製Ｈ１Ｌ１抗体とともに１時間インキュベートした。洗浄後、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：５００の比率で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と結合体化した抗Ｈｉｓ抗体を使用して、結合したＨ１Ｌ１を検出した。１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄後、ブロットをＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，（英国、リトル・チャルフォント（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ））を使用して発色させた。
【００７１】
クロストリジウム・ディフィシルに感染した患者におけるＩｇＧ抗体についての標的を可視化するために、膜を、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：２０〜１：５０に希釈した血清とともに１時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＥＣＬ用）、または膜がＳｉｇｍａＦａｓｔ（ＲＴＭ）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムタブレット（Ｓｉｇｍａ）を使用して発色される、アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【００７２】
エレクトロスプレー質量分析
ゲルから切り出されたタンパク質のバンドまたはスポットを、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム中で１０分間洗浄し、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムとアセトニトリル（１：２）を使用して１５分間脱水した。炭酸水素アンモニウムを用いる洗浄および脱水の工程を繰り返した後、ゲルの小片をＳｐｅｅｄＶａｃ（ＲＴＭ）中で乾燥させた。少量のトリプシン（２５ｍＭ炭酸アンモニウム中１０μｇ／ｍｌ）を、ゲルの小片がそれらのもともとのサイズに戻るまで加え、少量の２５ｍＭ炭酸アンモニウムを加えて、消化の間にゲル小片が濡れた状態を保持した。サンプルを３７℃で４．５時間消化し、ペプチドを、８０μｌアセトニトリルを加えることによって１５分間抽出した。上清を、すべてのアセトニトリルが蒸発するまで、ＳｐｅｅｄＶａｃ中で乾燥させた。サンプルを、Ｃ−１８  Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して脱塩し、ナノスプレー飛行時間（ｎａｎｏ−ｓｐｒａｙ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）質量分析（Ｑ−ＴＯＦ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（英国、マンチェスター（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ））を使用して分析した。
【００７３】
結果：
２Ｄゲルおよびイムノブロッティングを使用する抗体Ｈ１Ｌ１についての標的の単離
イムノブロッティングと組み合わせた２Ｄゲルを使用して、２Ｄゲル上の抗原を特定した。２つのブロットは、比較する場合、１つは、最も豊富な抗体がＨ１Ｌ１の鋳型であった患者からの血清を使用し、１つは発現および精製されたＨ１Ｌ１を使用する。両方が同じタンパク質スポットと反応した。同じタンパク質は、Ｃ．ディフィシルに起因する下痢から回復した４例の患者において抗原性であった。
【００７４】
カラム法を使用する標的タンパク質の単離
Ｃ．ディフィシルの臨床分離株（本明細書では、Ｃ．ディフィシル感染患者から単離した、株ＣＤ  １４０００２８７と呼ぶ）を、チオグリコール酸およびＬ−システイン−ＨＣｌを補充したブレインハートインフュージョンブロス中で、３７℃で４８時間、嫌気的に成長させた。この細胞懸濁液をＳｏｒｖａｌ  ＲＣ−３Ｂ遠心分離機で、５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞をペレット化し、この細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、上記のように再遠心分離した。洗浄した細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、さらなる使用まで−２０℃で保存した。凍結細胞懸濁液の２ｍｌアリコートを融解し、卓上微量遠心分離機で、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、このペレット化した細胞を４ｍｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。グアニジン抽出したタンパク質を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−７０Ｍ遠心分離機で、２０℃で１時間、４５０００ｒｐｍで遠心分離して清澄化した。上清を、２リットルの２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に対して３回、室温で透析し、抽出タンパク質をＡｍｉｎｏＬｉｎｋ（Ｐｅｒｂｉｏにより供給される）カラムに対して適合する緩衝液に交換した。２０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中の２ｍｌのＨ１Ｌ１抗体溶液（〜２ｍｇ／ｍｌ）を、メーカーの使用説明書（Ｐｅｒｂｉｏ）に従って、プレパック２ｍｌカラム中で、２０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）で平衡化したＡｍｉｎｏＬｉｎｋ樹脂に、共有結合した。次いで、Ｃ．ディフィシル抗原含有抽出物（１．５ｍｌ）を、共有結合したＨ１Ｌ１カラムに塗布し、室温で１時間、樹脂とともにインキュベートした。未結合物質を、１２ｍｌの２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）でカラムから洗浄し、結合した抗原を、８ｍｌの０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５〜３．０）を適用することによって溶出した。溶出したタンパク質を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和し、その後Ａｍｉｃｏｎ  １５ｍｌ濃縮器アダプター上で〜２００μｌまで濃縮を行った。次いで、この濃縮したタンパク質材料を１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色によって可視化した。次いで、Ｈ１Ｌ１相互作用タンパク質バンドを、質量分析によって同定した。
【００７５】
質量分析を使用する単離したタンパク質の同定
タンパク質のバンドまたはスポットをゲルから切り出し、トリプシンを用いて３７℃で消化した。サンプルを、ナノエレクトロスプレー飛行時間質量分析を使用して分析し、これにより配列番号４２の配列を得た。
【００７６】
カラムベースの方法を使用して単離したタンパク質と同じペプチドを、２Ｄゲル実験からのサンプルにおいて見い出した。
【００７７】
Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ／）でＢＬＳＴ検索を使用してクロストリジウム・ディフィシルゲノムを検索することにより、マッチとして配列番号４３が得られる。
【００７８】
理論的ｐＩ：５．７４、分子量：４３４３０．３０  Ｄａは、分子量が約４４ｋＤでありｐＩが５．５〜６であった２Ｄゲル上のタンパク質の位置とよく相関する。
【００７９】
デフォルト設定を使用する、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／におけるタンパク質−タンパク質ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索において配列番号４３のタンパク質配列を使用すると、アセチル−ＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）アクセッション番号ＮＰ＿３４９３７６と、３９１個のアミノ酸にわたって６８％の同一性で高い類似性が示される。
【００８０】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼのクローニング
クローニングおよび大腸菌中での発現のために、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードする配列を、Ｃ．ディフィシルゲノムＤＮＡから直接的にＰＣＲ増幅し、メーカーの使用説明書に従って、ＤＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製した。
【００８１】
使用したＰＣＲプライマーを、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに対して候補マッチをコードするＣ．ディフィシルのゲノムＤＮＡ配列と直接比較することによって同定および設計し、これらはＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成された配列番号４４および４５である。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して増幅を実行し、発現ベクターｐＢＡＤ−ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への直接的ライゲーション非依存的クローニングが可能となり、アラビノース誘導性プロモーターａｒａＢＡＤの制御下で、発現されたアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼにＣ末端融合したＨｉｓ６−ｔａｇを付加した。クローニング混合物を、発現株ＴＯＰｌＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、組換え体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクローナル抗Ｈｉｓタグペルオキシダーゼ共役抗体（ＳＩＧＭＡ）を使用するイムノブロッティングを使用して同定した。得られたプラスミドをｐＴｈｉｏｌｌと称する。
【００８２】
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの発現および精製
６Ｈｉｓタグチオラーゼ融合タンパク質の過剰発現のために、大腸菌株ＴＯＰｌＯ（ｐＴｈｉｏｌｌ）を、対数増殖後期まで成長させ（２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でＯＤ６００  １．０）、タンパク質発現を、アラビノースの添加によって、０．２％の最終濃度まで誘導した。さらに２４０分間成長させた後、細菌を遠心分離（５００ｇ、１０分間、４℃）によって収集し、ペレットを溶解緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））中に、開始体積の１／２０で再懸濁し、室温で１時間混合して可溶化した。不溶性物質を、さらなる遠心分離工程（１００００ｇ、室温にて１０分間）によって除去し、上清を、メーカーの使用説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  ｓｐｉｎ−ｐｒｅｐ  Ｎｉ−ＮＴＡカラムに塗布した。このカラムを６００μｌの溶解緩衝液で３回洗浄し、続いて６００μｌの洗浄緩衝液１（８Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８））で３回、および６００μｌの洗浄緩衝液２（８Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８）、２５ｍＭイミダゾール）で３回洗浄を行った。Ｈｉｓタグタンパク質を、１００μｌの溶出緩衝液（８Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）、２５０ｍＭイミダゾール）を用いてカラムから溶出し、この溶出工程を繰り返し、両方の画分をプールした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００８３】
クローニングしたアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに対する抗体Ｈ１Ｌ１の試験
クローニングしかつ精製したアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼを、ローディング緩衝液およびＤＴＴと１：１に混合し、９０℃で５分間加熱ブロック上に置いた。５〜１５μｌを、ＮｕＰＡＧＥ−ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１０％  ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で３５分間分離した。
【００８４】
タンパク質を、Ｉｎｖｉｔｒｏｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ（米国、カリフォルニア州、カールズバッド））上に転写ブロッティングし、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の５％スキムミルクに１時間ブロットした。この膜を、１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で、Ｈ１Ｌ１とともに１：１０で（約４００μｇ／ｍｌの濃度）でインキュベートした。１０ｍＭ  ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５分間、３回洗浄し、次いで、Ｓタンパク質ＨＲＰ複合体（Ｎｏｖａｇｅｎ）とともに、１：１０００で、１時間インキュベートした。ブロットを、Ｓｉｇｍａ−Ｆａｓｔ  ＤＡＢステインを使用して発色させ、５０ｋＤａマーカーのすぐ下にあるチオラーゼバンドに対して強力な応答を示す。
【００８５】
それゆえ、Ｃ．ディフィシル感染した患者からの抗体は、Ｃ．ディフィシルアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに対して集中されており、これらの患者の優性な軽鎖および重鎖ＣＤＲから構築された合成抗体は、Ｃ．ディフィシルアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼに対して特異的である。従って、Ｃ．ディフィシルアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは強力な抗原であり、抗体Ｈ１Ｌ１はそれを結合する際に有用である。
【００８６】
保存エピトープ
クロストリジウム  アセトブチリカムのブタノール／酪酸産生経路において３つの連続した酵素が存在しており、これはまた、クロストリジウム・ディフィシル染色体上にも存在する。これらは、クロストリジウム・ディフィシルからの上清タンパク質に対して惹起されたウサギ抗血清と反応することが分かっている（Ｍｕｌｌａｎｙ  Ｐら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９４  Ｎｏｖ  １５；１２４（１）：６１−７；ＰＭＩＤ：８００１７７１）。
【００８７】
酵素が保存エピトープを共有すると仮定すると、唯一の相同領域はチオラーゼ（アクセッション番号Ｐ４５３６２）における残基９〜１２において見い出すことができ、これはクロトナーゼ（アクセッション番号Ｐ４５３６１）残基５〜８に存在し、そしてこの保存配列は配列番号４７である。
【００８８】
エンテロコッカス・フェシウムおよびクロストリジウム・ディフィシル組み合わせ薬物ＭＩＣ
アッセイ前製剤
生物をＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒプレート（ＣＢＡ）上で培養し、単一コロニーを得て、３７℃で２４時間（Ｅ．フェシウム）または嫌気的に４８時間（Ｃ．ディフィシル）インキュベートした。
【００８９】
抗微生物剤を、ＮＣＣＬＳ方法論（Ｍ７−６Ａ）に従って調製し、バンコマイシンおよびゲンタマイシンについては全体で１４通りの濃度、ならびにＨ１Ｌ１については１１通りの濃度を得た。バンコマイシンおよびゲンタマイシンの初期の希釈は、ｄＨ２Ｏ中で作製し、Ｈ１Ｌ１は初期には製剤緩衝液（１００ｍｌ中：３．４８４ｇアルギニン（２００ｍＭ）、３．００６ｇ尿素（０．５Ｍ）、ｐＨ９．５）中で希釈した。引き続く希釈を、使用する生物にとって適切な成長培地中で作製した。この薬剤を−２０℃でアリコートに保存し、使用する日に融解した。
【００９０】
濃度は、必要とされる最終濃度の２倍であった。
【００９１】
１．培地の調製
Ｅ．フェシウム培地−カチオン調整ミュラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ）ブロス（ＮＣＣＬＳ  Ｍ７−６Ａ）：１リットルのミュラーヒントンブロス（ＯＸＯＩＤ，ＭＨＢ）、２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２および５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２を加えた。
【００９２】
Ｃ．ディフィシル培地−
（１）補充ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）ブロス（ＮＣＣＬＳ  Ｍ１１−Ａ５）：９００ｍｌのブルセラブロス粉末（ＳＩＧＭＡ）に、１ｍｌのヘミン（５ｍｇ／ｍｌ）および１ｍｌのビタミンＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。オートクレーブ後、１００ｍｌの溶解ウシ血液（５％）を加えた。
【００９３】
（２）強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）を、メーカーの使用説明書に従って、１リットルのｄＨ２Ｏ中３８ｇで調製した。
【００９４】
２．ＭＩＣプレート調製−表１。
【００９５】
薬物１−バンコマイシンまたはゲンタマイシン（０．０６２５μｇ／ｍｌ〜５１２μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度）
Ｕ型９６ウェルマイクロタイタープレートに、必要とされる濃度の２倍のバンコマイシンまたはゲンタマイシン（５０μｌ）をマイクロタイタープレートの最初の行に沿って、左から右に加え、最後のウェルをブランクのままにする。これを、２倍の減少濃度のバンコマイシンを使用して、他の行で繰り返した。
【００９６】
薬物２−Ｈ１Ｌ１抗体（０．２５μｇ／ｍｌ〜２５６μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度）
Ｈ１Ｌ１（５０ｍｌ）を列に加える。必要とされる濃度の２倍を第１の列に加えた。２倍の減少濃度のＨ１Ｌ１でプレートに沿って移動して（左から右に）、他の列についてこれを繰り返した。最後の列はブランクのままである。
【００９７】
最後の列は１００μｌの成長培地のみを含む。
【００９８】
バンコマイシンおよびゲンタマイシンの連続濃度を、上記と同じ様式であるが第２のマイクロタイタープレートで実施した。Ｈ１Ｌ１濃度は上記と全く同じであり、培地のみのコントロールは列１２であった。
【００９９】
接種材料の調製−直接コロニー懸濁液
−接種材料を、細菌の使用の直前に調製した。
【０１００】
−１８〜２４時間（Ｅ．フェシウム）または４８時間（Ｃ．ディフィシル）寒天プレートからのコロニーを、適切な成長培地または滅菌生理食塩水に再懸濁することによって、直接コロニー懸濁液を作製した。
【０１０１】
−次いで、これを０．５  ＭａｃＦａｒｌａｎｄｓ標準に調整し、ＮＣＣＬＳ  Ｍ７−６Ａ（Ｅ．フェシウム）およびＮＣＣＬＳ  Ｍ１１−Ａ５（Ｃ．ディフィシル）に従って、成長培地中で１：１０に希釈した（およそ１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ）。
【０１０２】
プレート接種
−上記のように調製した１：１０接種懸濁液を５μｌ使用して各ウェルに接種した（最終接種材料５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ）。
【０１０３】
−プレートはウェル１２〜ウェル１まで接種した。
【０１０４】
インキュベーション
−プレートを、３７℃で２４時間（Ｅ．フェシウム）または嫌気的に４８時間（Ｃ．ディフィシル）インキュベートした。
【０１０５】
−接種をチェックするために、成長コントロールから１０μｌを１０ｍｌ滅菌生理食塩水中で希釈し（１：１０００）、１００μｌをＣＢＡプレート上に配置し、３７℃で２４時間（Ｅ．フェシウム）または嫌気的に４８時間（Ｃ．ディフィシル）インキュベートした。５０個のコロニーが、５×１０４ｃｆｕ／ｍｌと等価であった。
【０１０６】
読み取りの結果
ＭＩＣを、生物の成長を実質的に阻害する薬物の最低濃度として取った。
【０１０７】
第２の薬物の存在下でのＭＩＣを、その薬物の非存在下でのＩＭＣによって除算することによって、各薬物についてＦＩＣ（フラクション阻害濃度）を計算した。各組合わせについて、これは、２つのフラクションを生じ、これを合計してＦＩＣＩ（フラクション阻害濃度指数）を生じた：相乗効果を、≦０．５の値によって定義し、無差別を＞０．５から＜４の値によって定義し、そして拮抗作用を≧４．０の値によって定義した。
【０１０８】
結果
これらの結果は、Ｈ１Ｌ１とバンコマイシンおよびゲンタマイシンとの間の相乗効果を実証する。
【０１０９】
結論
これらの結果は、（ｉ）Ｈ１Ｌ１とバンコマイシンとの間、および（ｉｉ）Ｈ１Ｌ１とゲンタマイシンとの間の両方で、Ｃ．ディフィシル１４０００２８７およびＣ．ディフィシルＮＣＴＣ  １１２０４に対して相乗効果を実証した。これは、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウムにおけるバンコマイシンとＨ１Ｌ１の間の相乗効果を示した。
【０１１０】
可変単鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）およびＨ１Ｌ１抗体濃度の存在下におけるクロストリジウム・ディフィシルの成長
ＳＣＦＡの調製
使用した３つのＳＣＦＡは酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩であった。
【０１１１】
各々を以下のようにして１Ｍの濃度で調製した：
酢酸ナトリウムＦＷ８２．０３−１リットルｄＨ２Ｏ中８２．０３ｇ
酪酸ナトリウムＦＷ１１０．０９−１リットルｄＨ２Ｏ中１１０．０９ｇ
プロピオン酸ナトリウムＦＷ９６．０６−１リットルｄＨ２Ｏ中９６．０６ｇ。
【０１１２】
これらの３つの溶液を、それぞれ７０：２０：１０の比率で一緒にした。従って、最終溶液中では、濃度は、酢酸ナトリウム０．７Ｍ、酪酸ナトリウム０．２Ｍ、およびプロピオン酸ナトリウム０．１Ｍであった。全体のＳＣＦＡの最終濃度は１Ｍであった。
【０１１３】
このストック溶液から、強化クロストリジウム用培地（ＲＣＭ，ＤＩＦＣＯ）を使用して、５、１０、２０、３０、４０および５０ｍＭの濃度の全体のＳＣＦＡを調製した。
【０１１４】
培地の調製
強化クロストリジウム用培地（ＲＣＭ）をメーカーの使用説明書に従って調製した：１リットルのｄＨ２Ｏ中に３８ｇ。
【０１１５】
成長曲線
アッセイ前日
培養物を、使用直前に嫌気的条件からのみ取り出した。好気的条件への曝露は３０分間以内とした。
【０１１６】
Ｃ．ディフィシルの一晩培養を、４８時間齢のＣｏｌｕｍｂｉａ  Ｂｌｏｏｄ  Ａｇａｒプレートの生物からのコロニーを用いる１０ｍｌのＲＣＭ培地への接種により作製した。この懸濁液を嫌気的条件下で、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１１７】
アッセイ当日
コントロールプレート
平底９６ウェルマイクロタイタープレート中で、表４において以下に概説されるように、コントロール溶液（２００μｌ）をウェル中に配置した。各コントロールは３ウェルを使用した。
【０１１８】
試験プレート
平底９６ウェルマイクロタイタープレート中で（行をＡ〜Ｈとラベルし、列を１〜１２とラベルする）、試験溶液（１００μｌ）を、以下に詳述するようにウェル中に配置した。２つの試験溶液、ＳＣＦＡプラスＨ１Ｌ１、を合わせた体積は２００μｌである。各試験は２ウェルを使用した。ウェルは、行Ａに５０ｍＭ  ＳＣＦＡを含み；行Ｂに４０ｍＭ  ＳＣＦＡを含み；行Ｃに３０ｍＭ  ＳＣＦＡを含み；行Ｄにおいて２０ｍＭ  ＳＣＦＡを含み；行Ｅに１０ｍＭ  ＳＣＦＡを含み；行Ｆに０．５ｍＭ  ＳＣＦＡを含んだ。ウェルは、列１および２に１６μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含み；列３および４に８μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含み；列５および６に４μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含み；列７および８に２μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含み；列９および１０に１μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含み；列１１および１２に０．５μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｌ１を含んだ。行Ｇは空である。２００μｌＲＣＭは、プレートについての成長コントロールとして、行Ｈにおけるすべてのウェルに配置した。
【０１１９】
接種材料の調製
培養物を、使用直前に嫌気的条件からのみ取り出した。好気的条件への曝露は３０分間以内とした。
【０１２０】
対数増殖後期の一晩懸濁培養物を使用して、マイクロタイタープレートを接種した。コントロールプレート上の培地／ネガティブコントロールを除いて、２０μｌ（約１０％接種材料）をすべてのウェルに加えた。
【０１２１】
プレートを、嫌気的条件下で２４時間、３７℃にてインキュベートした。
【０１２２】
光学密度の読み取り（ＯＤ６００ｎｍ）を０時間および２４時間の時点で行った。平均ＯＤ６００ｎｍの読み取りを決定した。
【０１２３】
結果
コントロール−表５を参照のこと。
【０１２４】
結論−
１．１０、２０、３０、および４０ｍＭのＳＣＦＡはそれ自体効果がなかったが、５０ｍＭ  ＳＣＦＡを用いるとある程度の減少が見られた。
【０１２５】
２．０．５、１、２、４、および８μｇ／ｍｌのＨ１Ｌ１を用いても効果がなかったが、１６μｇ／ｍｌのＨ１Ｌ１を用いると阻害が見られた。
【０１２６】
試験−表６を参照のこと。
【０１２７】
結論−
１、２、および４μｇ／ｍｌのＨ１Ｌ１ならびに５ｍＭのＳＣＦＡ（データ示さず）を用いても違いが見られなかった。８μｇ／ｍｌのＨ１Ｌ１および１０〜５０ｍＭのＳＣＦＡを用いて相乗効果が見られ、２４時間での光学密度は０．２９６〜０．３３０の範囲にあった。この効果は、１６μｇ／ｍｌのＨ１Ｌ１および５０ｍＭのＳＣＦＡを用いた場合最も明白であった。
【０１２８】
【表１】
2008505621.tif 000002
【０１２９】
【表２】
2008505621.tif 000003
【０１３０】
【表３】
2008505621.tif 000004
【０１３１】
【表４】
2008505621.tif 000005
【０１３２】
【表５】
2008505621.tif 000006
【０１３３】
【表６】
2008505621.tif 000007
【配列表】
2008505621000001.xml
【国際調査報告】
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