(57)【要約】  本発明は、単一の活性剤か又は他の活性剤との併用かのいずれかで、増大されたシクロフィリン結合活性を有し、かつ免疫抑制活性を本質的に欠如するシクロスポリンの、ＨＣＶ感染における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＨＣＶ感染の治療を目的とした医薬品の製造のための［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの使用。
【請求項２】
前記患者におけるＨＣＶ感染の併用療法の利益を得ることを目的とした適切な用法の一環として、前記［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡが、ＨＣＶ感染に対し活性を有する少なくとも１つの第２成分と併用投与されること又は別々に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ、及びＨＣＶ感染に対して活性を有する第２成分を含む、医薬組成物。
【請求項４】
医薬として許容される担体、及び場合により希釈剤をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
患者におけるＨＣＶ感染の治療方法であって、前記患者に、治療有効量の［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡを投与するステップを含む、前記治療方法。
【請求項６】
ＨＣＶ感染の治療のための請求項５に記載の方法であって、併用療法の利益を得ることを目的とした適切な用法の一環として、治療有効量の［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ、及びＨＣＶ感染に対して活性を有する治療有効量の第２成分を併用投与する又は別々に投与するステップ、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療のためのシクロスポリンの使用、及び当該シクロスポリンを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、約１５年前に、Ｃｈｏｏ等によりクロ−ン化され特徴付けられた（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４,（１９８９）,３５９−３６２を参照のこと。）。ＨＣＶは、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーに属し、エンベロープ・ヌクレオキャプシド、及びポジティブ極性の１本鎖ＲＮＡゲノムを含む（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ.６０, （２００３）,９１−１０２を参照のこと。）。ＨＣＶは、血液、血液製剤、及び妊娠期間の垂直感染により主に感染される。血液製剤をスクリーニングするための診断試験の導入は、新たな感染比率を著しく低減させた。
【０００３】
それでもやはり、ＨＣＶは、重大な医学的問題を残している。現在もＨＣＶに感染した１億７０００万人の人々がいる。感染の初期過程は、通常穏やかである。しかしながら、免疫系は、しばしばウイルスを除去することができず、感染している人間は、肝硬変及び肝細胞がんの高い危険性を有する（Ｐｏｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４９,（１９９７）,８２５−８３２を参照のこと。）。
【０００４】
有用なワクチンはなく、治療上の選択肢は非常に限られる（Ｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ.  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ.２０（Ｓｕｐｐｌ. １）,（２００１）,Ｃ４７−５１;Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ.Ｒｅｖ.Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ.１,（２００２）,８６７−８８１を参照のこと。）。
【０００５】
現在の治療は、インターフェロンα及びリバビリンの併用に基づく。この治療は、遺伝子型２及び３に感染した患者の８５〜９０％に持続的抗ウイルス反応をもたらすが、不運なことに、遺伝子型１に感染した患者については約４５％しか当該反応をもたらさない。さらに、副作用は重大であり、筋肉痛、関節痛、発熱、憂うつ症、白血球減少症、及び溶血性貧血を含む。
【０００６】
明らかに、より高い抗ウイルス活性及びより良い安全性プロフィールを伴う付加療法が、特にＨＣＶ再発を妨害する場合の如きＨＣＶ感染の治療のために必要とされる。当該安全性プロフィールを確立するために、低い細胞毒性及び細胞増殖抑制性の如き基準、並びに高い選択性指標は、特に、ＨＣＶ感染の臨床治療に関係する。
【０００７】
シクロスポリンを使用するＨＣＶ感染の治療のための新たなアプローチが、最近臨床的観察により記載された（Ｔｅｒａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ，１９８８，２０（３  ｓｕｐｐｌ  ３）,８６８−８７６,  ａｎｄ  ｌｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ,２００３,３８,５６７−５７２を参照のこと。）。最近、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は臨床的に達成可能な薬物濃度でＨＣＶサブゲノムレプリコンの細胞内複製を阻害することが示された。（Ｗａｔａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８,２００３,１２８２−１２８８、及びＮａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＢＲＣ  ３１３,２００４,４２−４７を参照のこと。）。双方のグループが提示したことには、ＣｓＡの抗ＨＣＶ効果は、免疫抑制マクロライド、すなわち、ＮＩＭ８１１又は［Ｍｅｌｌｅ］４−ＣＳＡの名で知られる化合物のそれぞれの使用からなる観察に基づく免疫抑制活性とは関係しない。Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ.は、ＣｓＡの拡大使用が、そのよく知られた免疫抑制特性に起因する実質的な問題を生ずると考え、そして、この問題を克服する１つの解決法は、非免疫抑制性シクロスポリン類似体の使用を考慮することにあると提示した。
【０００８】
ここ１５年の間、多くの医薬品化学の実験が、かかる非免疫抑制性シクロスポリン類似体、及びＮＩＭ８１１が、かかる特性を有する最も代表的な化合物の内の１つであると特定することを目的として実施されてきた。
【０００９】
ＮＩＭ８１１は、９つの他のシクロスポリンＡ誘導体と共に、それらの非免疫抑制性特性について、Ｋｏ等により欧州特許出願第ＥＰ０４８４０２８１号に報告され、そして、ＨＩＶ感染の治療及びＡＩＤＳの予防において潜在的に有用であると考慮された。それらの誘導体のデザインは、シクロスポリンＡの４−及び／又は５−位置におけるアミノ酸の改変により生じた。
【００１０】
シクロスポリンＡの２−及び／又は６−位置におけるアミノ酸の改変により、Ｓｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，は、計６１のシクロスポリン類似体を合成し、そしてかかる化学修飾が、免疫抑制活性における低減を導くことを観察した（Ｓｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３,１９９１,６１９−６２８を参照のこと）。
【００１１】
非免疫抑制性化合物を得るためのシクロスポリンＡの３の位置におけるアミノ酸を改変するさらなる試みが、国際特許公開第ＷＯ９８/２８３２８号、同第ＷＯ９８/２８３２９号、及び同第ＷＯ９８/２８３３０号において、Ｂａｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，により特に記載された。
【００１２】
Ｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、位置３において、グリシン以外の、Ｎ−メチル化された、大きくない疎水性又は中性アミノ酸を含み、そして位置４において、ロイシン以外の、Ｎ−メチル化された又はＮ−エチル化された、疎水性又は中性アミノ酸を含むことで、シクロスポリンＡと異なる一連の化合物をデザインし、そして彼らは、それらの化合物がＨＩＶ−１複製を阻害する高い潜在性を有し、かつ本質的に免疫抑制活性欠如することを報告した（国際特許公開第ＷＯ００/０１７１５号、及びＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４１,（２０００）,７１９３−６を参照のこと）。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の目的は、特に例えば、ＨＣＶ再発を予防する場合における、ＨＣＶ感染の治療のための新たな治療を臨床医学者に提供することである。この治療は、既に認可された治療又は新たに提供される治療と比較して、より高い抗ウイルス活性、及びより優れた安全性プロフィールを提供すべきである。
【００１４】
本発明者等は、驚くべきことに、ＨＣＶに感染している患者に対する、非常に特異的な化合物、すなわち、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの投与が、上記要求を満たすことを見出した。彼らは、その非免疫抑制性特性に加えて、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡが、シクロフィリンに対する著しく増大した親和力を有し、そしてその増大した親和力は、ＨＣＶ複製の阻害への高い有効性と関連することを観察した。
【００１５】
従って、本発明の主題の内の１つは、患者におけるＨＣＶ感染の治療を目的とする医薬品の製造のための［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの使用に関する。
【００１６】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、国際特許公開第ＷＯ００／０１７１５号において、Ｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，により報告され、ＣＡＳ登録番号第２５４４３５−９５−５号に由来する。環状ウンデカペプチドは、以下の式：
【化１】
2008514690.tif 000002
により記載され、ここで、式中、
ＭｅＢｍｔはＮ−メチル−（４Ｒ）−４−ブト−２Ｅ−エン−１−イル−４−メチル−（Ｌ）スレオニンであり、αＡｂｕはＬ−α−アミノ酪酸であり、Ｄ−ＭｅＡｌａはＮ−メチル−Ｄ−アリニン（ａｌｉｎｉｎｅ）であり、ＥｔＶａｌは、Ｎ−エチル−Ｌ−バリンであり、ＶａｌはＬ−バリンであり、ＭｅＬｅｕはＮ−メチル−Ｌ−ロイシンであり、ＡｌａはＬ−アラニンであり、（Ｄ）ＡｌａはＤ−アラニンであり、及びＭｅＶａｌはＮ−メチル−Ｌ−バリンである。シクロスポリンＡに関して通常使用されるアミノ酸の位置の番号は、当該式の下に示される。これは、シクロスポリンＡにおける残基と異なる残基の身元を表示し、及びそれらの位置を提供する第１部分、並びに全ての他の残基がシクロスポリンＡにおける残基と同一であることを表示する第２部分を含む、複合名を使用することにより達成される。例えば、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡは、位置４におけるＭｅＬｅｕがＭｅＩｌｅ（Ｎ−メチル−Ｌ−イソロイシン）により置換されることを除いてシクロスポリンＡと同一であるシクロスポリンである。
【００１７】
本発明は、以下の実施例、及び以下の図面により、さらに説明されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
シクロスポリンＡの最近の医学的用途は、活性化Ｔ細胞からの、インターロイキン２（ＩＬ−２）を含むいくつかの自己分泌Ｔ細胞成長因子の産生及び放出を予防することにより、細胞媒介免疫応答を抑制するようなこの化合物の能力に関する（Ｂｏｒｅｌ（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．２１，８１０−８１５；Ｋｒｏｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１,５２１４−５２１８；Ｆａｕｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｒｕｇｓ  ４５,９５３−１０４０を参照のこと。）。細胞内への侵入に関して、シクロスポリンＡは、高い親和力により、シクロフィリンと結合する（Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ.（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６，５４４−５４７を参照のこと。）。
【００１９】
異なる生物学的機能間について、シクロフィリンは、生体内で測定され得るペプチジル−プロピル  シス−トランス  イソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）活性を有する（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７, ４７６− ４７８；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７,４７３−４７５を参照のこと。）。シクロスポリンＡの免疫抑制効果について重要であることは、シクロフィリン−シクロスポリンＡ複合体と、カルシウム−及びカルモジュリン−依存性セリン／スレオニンホスファターゼ２Ｂ（カルシニューリン）との間の相互作用である（Ｈａｕｓｋｅ（１９９３）ＤＮ＆Ｐ  ６，７０５−７１１，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６，７９９−８０６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６６，８０７−８１５を参照のこと。）。この３重複合体は、カルシニューリンの当該ホスファターゼ活性の阻害をもたらす（Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，３５２−３５５；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ.（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５，７０７−７４７;Ｃｒａｂｔｒｅｅ（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６，６１１−６１４を参照のこと。）。カルシニューリンは、ＮＦ−ＡＴの選択的脱リン酸化を促進し、次いで、当該ＮＦ−ＡＴは、活性化タンパク質１に関連する核小体に転位し、そしてＩＬ−２遺伝子を含む標的遺伝子を転写活性化する。
【００２０】
３−及び４−位置におけるアミノ酸に起因して、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、転写及び免疫アッセイにより示されるように、劇的に低減された、カルシニューリンと相互作用する能力、並びに、ペプチジル−プロピル・シス−トランス・イソメラーゼ活性の阻害アッセイにより示されるように、シクロフィリンについての著しく低減された親和力を有することが信じられる。
【００２１】
シクロフィリンのペプチジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）活性を、Ｋｏｆｒｏｎ等から適応される手順を使用して測定した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，６１２７−６１３４（１９９１）;Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，２６７０−２６７５（１９９２）を参照のこと。）。Ｎ−コハク酸化Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロ−アニリン（Ｓｕｃ-ＡＡＰＦ-ｐＮＡ，Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を基質として使用した。当該アッセイは、テトラペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ中の当該Ｐｈｅ−ｐＮＡ結合のトランスイソ型の選択的キモトリプシン開裂に基づいた。この開裂は、３９０ｎｍ（ε＝１１，８１４Ｍ−１ｃｍ−１）で検出され及び定量され得るパラ−ニトロアニリン部分を遊離させる（Ｓｃｈｕｔｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４,１３０１６−１３０２６）。
【００２２】
シス−トランス異性化は、シクロフィリンにより触媒される（ＰＰＩアーゼ，ＥＣ  ５.２.１.８）。ＣｓＡ又は他のシクロスポリン（１０００倍に濃縮されたエタノール中のストック溶液から生成された１０−９〜２×１０−５Ｍの最終濃度）と、０．１μｇのシクロフィリン（Ｓｉｇｍａ）を、総量１．５ｍｌのｐＨ７．９、４０ｍＭのＨｅｐｅｓ中に混合し、そして氷上で５０分間インキュベートした後、当該反応混物を、バリアン分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）中の１０℃に保たれたキュベットに移した。キモトリプシンの３．７５ｍｇの添加に続いて（１０ｍＭのＨＣｌ中のキモトリプシンの溶液７０μｌ）、当該反応を０．５ＭのＬｉＣｌ／トリフルオロエタノール中のＳｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡの３．２ｍＭの溶液の１０μｌの添加により開始した。当該反応を、３分間測定し、得られたデータから開始速度定数を測定した。制御について、開始速度定数を、シクロフィリンを欠如した並列制御についても測定した。濃度−反応曲線を、シクロスポリンＡ及び他のシクロスポリンについて定め、そして、異なるシクロスポリンのＩＣ５０（５０％の阻害濃度）の値を、シクロスポリンＡの値（１．０）と比較して示した。１未満の値は、当該化合物がＣｓＡより高いシクロフィリン親和力を有することを意味する。
【００２３】
ＮＦ−ＡＴ依存性受容体アッセイを、最初に使用し、シクロスポリンの免疫抑制活性を測定した（Ｂａｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ.（１９９２）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２４，４３−４８）。ＩＬ−２遺伝子のプロモーターの制御下で、細菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む受容体構築物で安定的に形質転換されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、Ｇ．Ｚｅｎｋｅ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手した。当該細胞を、１０％の加熱不活性化したウシ胎仔血清、１００μ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１００μ／ｍｌのハイグロマイシンＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【００２４】
当該細胞を、シクロスポリンＡ又は他のシクロスポリン（１０００倍に濃縮されたエタノール中のストック溶液から生成された１０−９〜２×１０−５Ｍの最終濃度）の存在又は不存在下において、２．４μＭのホルボール−１２−ミリスチン酸−１３−アセテート、及び７５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチンの添加により刺激した。３７℃で２０時間のインキュベートに続いて、細胞を、収穫し、そして、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．０）、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に溶解した。
【００２５】
当該β−ガラクトシダーゼ反応を可能とし、室温、暗闇で、１時間開始した。蛍光性４−メチル−ウンベリフェロンを、上澄み液中において蛍光分析的に分析した（励起：３５５ｎｍ；発光：４６０ｎｍ）。濃度−反応曲線を、シクロスポリンＡ及び他のシクロスポリンについて測定し、そして、異なるシクロスポリンのＩＣ５０の値を、シクロスポリンＡの値（１．０）と比較して、計算した。１より高い値は、その化合物がＣｓＡよりも少ない免疫抑制性であることを意味する。
【００２６】
例示の結果を以下の表１に示す。
【表１】
2008514690.tif 000003
【００２７】
表１に示されたデータは、位置４における特定の置換（すなわち、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）が免疫抑制活性（ＩＬ−２発現の阻害として測定された。）を劇的に低減すること、並びに、シクロフィリン結合活性（シクロフィリンのＰＰＩアーゼの阻害として測定された。）を促進することを明らかにした。位置３における置換は、シクロフィリン結合活性における実質的にさらなる増大（２倍又はそれ超；ｃｆ［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ）をもたらした。それは、文献から入手可能な最も参照される化合物である［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡと比較して、より高いシクロフィリン結合活性及びより低い残留免疫抑制活性を有する。［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡは、ＮＩＭ８１１としても知られる。
【００２８】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの非免疫抑制活性
確認分析において、ＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの免疫抑制活性を、リンパ球反応を使用して測定した。このアッセイにおいて、シクロスポリンを、エタノール中に溶解した（１０ｍｇ／ｍｌ）。２人の健康な提供者からの新鮮な単離されたＣＤ４＋ＰＢＭＣｓを混合し、その後、当該個体群の内の１つを照射により不活性化した（刺激細胞；Ｓ）。シクロスポリン（１μｇ／ｍｌ）の存在又は不存在下、５日間の共培養後、当該非不活性化細胞群（キラー細胞；Ｒ）の増殖反応を、［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより測定した。
【００２９】
当該アッセイを、相互に２つの細胞群、各々不活性化された細胞及び刺激された細胞と共に順番に実施した。キラー細胞の刺激（％）を、以下の式により計算した。
刺激パーセント＝１００×（シクロスポリンを有するサンプル−バックグラウンド）／（シクロスポリンを有しないシクロスポリン−バックグラウンド）
【００３０】
上記サンプルは、刺激細胞及びキラー細胞の混合物を言及する。上記バックグラウンドは、刺激細胞のみを混合した場合のコントロールを示す。結果を表２に示す。それらから、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの双方は、免疫抑制活性を本質的に欠いていることを意味すると解釈した。
【００３１】
【表２】
2008514690.tif 000004
【００３２】
上記Ｒ１×Ｓ２は、提供者１からのキラー細胞と提供者２からの刺激細胞の共培養を言及する。上記Ｎは測定の回数である。
【００３３】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの高い抗ＨＣＶ活性及び低い細胞毒性／細胞抑制効果
前記の通り、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染は、重大な健康上の問題であり、というのは、持続的に、感染した患者は、肝硬変及び肝細胞がんを含む慢性肝疾患を発達させる高い危険性があるからである。現在有用な治療法は、後期の個体群の大部分に対しては不十分であり、並びに、重大な副作用に関連する。最近まで、より有効な治療法の開発は、臨床試験における評価の前に潜在的な活性化合物のスクリーニングを可能とするＨＣＶ複製の適切な生体外モデルの欠如により遅れていた。この障害は、遺伝子操作されたＨＣＶミニゲノム（レプリコン）であって、培養された肝臓がん細胞において高いレベルまで自己増幅するものの開発により克服された（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５,（１９９９），１１０−１１３）。このＨＣＶレプリコン系は、素早く、ＨＣＶ複製、発症、及び持続性を研究するための標準的道具となった（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．６０,（２００３）,９１−１０２）。
【００３４】
当該ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸のポリタンパク質の単一のオープンリーディングフレームを含む１本鎖ＲＮＡからなる。このポリタンパク質の翻訳は、当該ＲＮＡの５’末端にあるインターナルリボソーマルエントリー部位（ＩＲＥＳ）で開始される。当該ＨＣＶポリタンパク質は、少なくとも１０のタンパク質に開裂される。それらは、キャップシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２、可能性のあるヴァイロポリン（ｖｉｒｏｐｏｒｉｎ）タンパク質ｐ７、セリンプロテアーゼ及びＡＴＰアーゼ／ヘリカーゼ活性を有する非構造的タンパク質ＮＳ２及びＮＳ３、ＮＳ４Ａ、膜形成繊維誘導タンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、並びにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＮＳ５Ｂを含む。
【００３５】
最初に成功したレプリコンは、５’から３’方向へのＨＣＶ・ＩＲＥＳを含む２シストロン性のＲＮＡ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのコーディング配列、脳心臓炎ウイルス由来のＩＲＥＳ、及びＮＳ３からＮＳ５のＨＣＶタンパク質のコーディング配列を含む。Ｈｕｈ−７細胞への導入、及びＧ４１８（ジェネティシン）を使用する選択の後、このレプリコンは、高レベル（１０００〜５０００コピー／細胞）まで自発的に複製することが示され得た（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当該系の特性として、複製効率は、宿主細胞の寛容性、及び重要なことに、ＨＣＶタンパク質コーディング配列における細胞培養適合性変異の選択に依存することが明らかであった。
【００３６】
複製は、生体内効率を有する薬物をスクリーニングするための当該系の妥当性の証拠を提示し、インターフェロンαに感受性であることが見出された。変異体レプリコンも、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする配列が、ルシフェラーゼをコードする配列により、又はルシフェラーゼ−ユビキチン−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードする配列により置換されるように構築された。当該後者の変異体レプリコンの複製は、慣習的なルシフェラーゼアッセイにより分析され得、一方、当該前者のレプリコンの複製は、ＲＮＡコピー数の測定を必要とする。
【００３７】
Ｗａｔａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）は、ノーザンブロット、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）により、ＨＣＶレプリコン含有ＭＨ−１４細胞において、ＨＣＶのＲＮＡ蓄積がＣｓＡにより阻害されるが、免疫抑制性マクロリドＦＫ５０６及び非免疫抑制性ＣｓＡ誘導体ＰＳＣ８３３によっては阻害されないことを明示した。活性剤への細胞の７日間の暴露を伴うそれらのアッセイは、ＨＣＶのＲＮＡタイターが、１μｇ／ｍｌのシクロスポリンＡの存在下、約２００倍まで低減されることを明らかとした。それらは、非免疫抑制性シクロスポリン［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡもＨＣＶ複製を阻害することをさらに見出した。かかる結果として、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡは、ＨＣＶのＲＮＡタイターを低減する際のＣｓＡと約同程度効果的であることが示された。
【００３８】
本発明のシクロスポリンが抗ＨＣＶ活性を有しているのかどうか、かかる活性をもし有しているならば、当該活性はどのようにＣｓＡと［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡとの活性を比較するのかを測定するために、ＨＣＶレプリコン系において、ＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの阻害効果を比較する実験を実施した。
【００３９】
アッセイは、蛍ルシフェラーゼ−ユビキチン−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質、及びＨＣＶタンパク質ＮＳ３−５をコードする２シストロン性のＲＮＡを含むＨｕｈ５−２細胞を使用した。当該ウイルス配列は、１ｂ遺伝子型のＨＣＶウイルスに由来した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのグルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネティシン、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。抗ウイルス性（複製）アッセイのために、細胞を、Ｇ４１８を除いた同様の培地において、９６−ｗｅｌｌ  Ｖｉｅｗ  Ｐｌａｔｅｓ（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）中、７０００細胞個／ウェルの密度で蒔いた。２４時間培養後、培地を除去し、培地中の試験化合物の連続希釈物を添加し、そして細胞をさらに７２時間培養した。
【００４０】
抗ウイルス効果を、ルシフェラーゼアッセイ又は定量的ＲＴ−ＰＣＲのいずれかにより評価した。ルシフェラーゼアッセイを実施するために、培地を除去し、そして細胞を、ＰＢＳで洗浄した。Ｇｌｏ−ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）の５０μｌ中で１５分間の溶解に続いて、Ｓｔｅａｄ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の５０μｌを細胞溶解物に添加した。ルシフェラーゼ活性を、照時計を使用して測定し、そして、各試験ウェルからのシグナルを、当該試験化合物に暴露されていない培養物のウェルにおいて測定されたシグナルに対するパーセンテージとして表した。
【００４１】
細胞密度及び細胞増殖抑制効果を、ＭＴＴアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＲＡＱＵＥＯＵＳ非放射性細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、標準９６ウェルプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において評価した。このアッセイにおいて、３−（４,５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシ−フェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）を、プレートリーダーにおいて４９８ｎｍで定量されるｆｏｒｍａｚａｎに生体還元した。Ｆｏｒｍａｚａｎ産生量は、生存細胞の数と直接対応する。
【００４２】
ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、当該レプリコンのネオマイシン領域を定量した。使用したフォワード及びリバースプライマーは、各々、５’−ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣ−３’及び５'−ＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧ−３'であった。当該蛍光プローブは、５’−ＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣ−３’だった。内部対照として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子配列の一部を含むプラスミドを使用した。
【００４３】
これらの実験からの結果は、当該異なるシクロスポリンについて、ＥＣ５０（ＨＣＶレプリコン複製を５０％まで阻害するために要求される濃度を示す。）、ＣＣ５０（対数増殖期細胞の増殖を５０％まで阻害するために要求される濃度を示す。）、及び選択的指数ＳＩ（ＣＣ５０とＥＣ５０の比率を示す。）の計算を可能とした。
【００４４】
表３は、複製効率を評価するためのルシフェラーゼ活性アッセイ、並びにルシフェラーゼアッセイの較正、及び化合物の細胞増殖抑制効果の評価のためのＭＴＴアッセイを使用して、Ｈｕｈ５−２細胞から得られる値を示す。Ｗａｔａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）による上記結果と一致して、ＣｓＡ及び［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡは、似たような抗ＨＣＶ（複製）活性を有した。
【００４５】
驚くべきことに、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、ＣｓＡ及び［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡよりも、非常に強力だった。［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡについての５０％細胞増殖抑制濃度（ＣＣ５０）は、ＣｓＡ、及び［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡについて測定された値よりも著しく高いことにも留意すべきである。その結果として、２つの他のシクロスポリンと比較して、非常に高い選択的指数を、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡについて見出した。ＥＣ５０値が定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用するＲＮＡタイターの測定から導かれるといった類似実験は、似たような結論を出した。４５＊、７３、及び６２５＊のＳＩ値を、それぞれ、ＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡから得た。当該アスタリスクは、２つの独立して測定された値の低い値が存在することを示す。
【００４６】
表３：ルシフェラーゼ含有ＨＣＶミニレプリコンを含むＨｕｈ５−２細胞における、ＨＣＶのＲＮＡ複製のルシフェラーゼアッセイ、及び細胞毒性のＭＴＴアッセイから測定されたＥＣ５０、ＣＣ５０、及びＳＩ値。
【表３】
2008514690.tif 000005
【００４７】
組み換えＨＣＶで感染させた目的細胞において測定された［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの抗ウイルス活性
ＣｓＡと比較した［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの抗ＨＣＶ活性を、生体内の状態に近づける培養系においてさらに測定した。当該方法は、感染性全長キメラＨＣＶコンストラクト又はルシフェラーゼ受容体をのせるよう改変された同様のウイルスで感染させた肝細胞癌の細胞を使用した。本発明のシクロスポリン又はＣｓＡによる当該感染細胞の処理後、当該ウイルス複製の阻害に直接的に関連するような当該ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００４８】
ＨＣＶ株Ｊ６及びＪＦＨ１（Ｊｃ１）間の全長キメラゲノムの感染性ＨＣＶウイルスを使用して、当該アッセイの肝細胞がんの細胞を培養した。当該Ｊｃ１ウイルスのコンストラクトも改変し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｊｃ１−Ｌｕｃ）をのせる２シストロン性ゲノムを得た。Ｈｕｈ−７．５細胞のエレクトロポレーションによる当該ゲノムのＲＮＡ転写物のトランスフェクション後２４時間及び９６時間、細胞培養上清を回収した。当該上清をろ過し（０．４５μＭ）、そして、１ｍｌあたり細胞培養感染性用量５０（ＣＣＩＤ５０）を、Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ  ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ, ３０９, （２００５）, ６２３−６２６）に従い、希釈アッセイを制限することにより測定した。当該ＣＣＩＤ５０は、Ｊｃ１について１.３×１０５、及びＪｃ１−Ｌｕｃについて４.２×１０３だった。
【００４９】
当該アッセイは、Ｈｕｈ−７−Ｌｕｎｅｔ又はＨｕｈ−７．５細胞のいずれも使用した（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４２４）,（１９９９）,１１０−１１３）。当該細胞を、１０％加熱不活性化したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｔｅｒｇｒｏ）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）又はＨｕｈ−モノ細胞のために２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｇｉｂｃｏ）で補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。抗ウイルス（複製）アッセイについて、Ｈｕｈ−７−Ｌｕｎｅｔ及びＨｕｈ−７．５細胞を、２×１０４又は４×１０４細胞個／１２穴プレートの１ウェルの密度で蒔いた。２４時間後、当該培地を、Ｊｃ１−Ｌｕｃウイルスストック（１２穴プレート）の０．５ｍｌ又はＪｃ１ウイルスストック（１２穴プレート）の０．２５ｍｌにより置き換えた。４時間後、当該ウイルス接種を、ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの異なる濃度を含む培地により置き換え、そしてさらに７２時間培養した。
【００５０】
ウイルス複製の阻害を、ルシフェラーゼアッセイにより評価した。ルシフェラーゼアッセイを実施するために、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、そしてルシフェラーゼ溶解緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５ｍＭのグリシルグリシン、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、４ｍＭのＥＧＴＡ、及び１ｍＭのＤＴＴ）で溶解した。蛍ルシフェラーゼ活性を、Ｋｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ,７５（１０）,（２００１）,４６１４−４６２４）に従って測定した。一回の凍結／融解サイクル後、簡単に細胞を懸濁し、１００μｌの細胞溶解物を、３６０μｌのアッセイ緩衝液（２５ｍＭのグリシルグリシン、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＡＴＰ、１５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８）及び２００μｌの基質溶液（２００ｍＭのル視フェリン、２５ｍＭのグリシルグリシン）と混合した。最終的に、２０サンプルについて、発光を、ＬｕｍａｔＬＢ９５０７照合計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用することにより、測定した。
【００５１】
これらの例（図１及び２）において、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ（黒色棒）とＣｓＡ（白色棒）の両方は、用量依存性抗ウイルス活性をもたらし、一方、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、再度、ＣｓＡより優れていることを示し、それ故、当該サブゲノムレプリコンにより得られたデータが確証された。本発明のシクロスポリンと同程度の複製阻害効果を得るために、ＣｓＡは約１０倍高い濃度を必要とした。
【００５２】
シクロフィリンに対する本発明のシクロスポリンの高親和力
Ｗａｔａｓｈｉ等（２００３）及びＮａｇａｋａｗａ等（２００３）による上記観察において、抗ＨＣＶ効果は、当該シクロフィリンへのシクロスポリンの結合能に関連した。ＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡのＰＰＩアーゼに関する効果を、シクロスポリンについて測定し、シクロフィリンＡの如きシクロフィリンのＰＰＩアーゼ活性の有力な阻害剤、結果的にはＨＣＶ複製のより有力な阻害剤を決定した。
【００５３】
商業的ヒト組み換えシクロフィリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を、当該アッセイに使用した。シクロフィリンのＰＰＩアーゼ活性を、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｖｅｒｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＢＲＣ,１９１,（１９９３）,７０−７５）によるキモトリプシン結合分光学的定量法を使用し測定した。この方法は、Ｎ−スクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド型のペプチドに対するキモトリプシンの高トランス選択性に基づく。当該ペプチド開裂は、３９０ｎｍで検出及び定量され得るパラ−ニトロアニリンを遊離させた。当該シス型の加水分解を、シクロフィリンＡにより実施されたシス−トランス異性化の比率により制限した。当該ペプチドを、４７０ｍＭで２，２，２−トリフルオロエタノールにおける２５ｎＭのＬｉＣｌの溶液中に作成し、当該シス配座異性体ペプチド数を高めた。
【００５４】
当該アッセイを、スプリットビーム分光光度計上で実施し、水槽を５℃にセットした。シクロフィリンＡ（７５００／ｐｍｏｌ／ｍｇの総酵素濃度；Ｓｉｇｍａ）を、緩衝液｛３５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び０．２６ｍｇ／ｍｌのキモトリプシン（比活性度、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）、ＫＯＨによってｐＨ７．８｝中に２０ｎＭで溶解し、室温で６分間インキュベートし、その後５４分間当該水槽中に置いた。ＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、又は［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡを、これらに、２〜５０ｎＭの濃度幅を使用して、適切に添加した。次いで、当該インキュベートされたシクロフィリンの３．５ｍｌを、当該サンプルキュベットに添加した。
【００５５】
基準キュベットは、基準ビームと平衡を保つために、完全に反応した反応物を含んだ。ペプチドを、２５μＭで添加し、当該反応を開始し、そして、吸光度の変化を１０データポイント／秒で測定した。対照として、シクロフィリンの欠如した併発反応について速度をも測定した。ペプチド加水分解のない（すなわち、シクロフィリンのない場合）これらの速度を、シクロフィリンＡのある場合における速度から差し引いた。
【００５６】
当該ＰＰＩアーゼアッセイから得られた開始速度を、３９０ｎｍでの吸光度における経時変化のトレースの一次変換を使用することによる一次回帰分析により分析した。総酵素濃度（Ｅｔ）、阻害剤解離定数（Ｋｉ）、及び速度限定反応の速度定数を、強力結合阻害剤多タンパク質方程式における回帰分析から得られたデータを適合することにより、ソフトウエアＦｉｇＳｙＳ（２００３，Ｂｉｏｓｏｆｔ）によって計算した。
【００５７】
当該強力結合多タンパク質方程式は、以下の式：
【化２】
2008514690.tif 000006
であり、式中、
ｂは、ｂ＝−（Ｅｔ＊Ｐ＋Ｉ＋Ｋｉ）として定義され、そして
ｃは、ｃ＝Ｅｔ＊Ｐ＊Ｉ
である。
【００５８】
いったんＥｔ、Ｋｉ、及びｋを、与えられた一連のデータについてコンピューターにより計算したら、当該データのグラフで示したものをプロットし、そして、単一タンパク質への強力な阻害剤結合と仮定する点に合わせた線を、以下の式：
【化３】
2008514690.tif 000007
であり、式中、
Ｂ＝Ｅｔ＊Ｐ＋Ｉ＋Ｋｉであり、そして
Ｃ＝Ｅｔ＊Ｐ＊Ｉである、
により定義した。
【００５９】
表４：ＰＰＩアーゼ活性アッセイから測定されたＣｓＡ、［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡ、及び［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡのシクロフィリンＡのＥｔ、Ｋｉ、及びｋの値
【表４】
2008514690.tif 000008
【００６０】
本発明のシクロスポリンについて観察されたシクロフィリンＡの最も低いＫｉは、ＣｓＡ、及び［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡと比較して、抗ウイルス活性の最も高い潜在性、選択性、及び選択指数（上記のように）を裏付けた。驚くべきことに、非免疫抑制性［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、他の非免疫抑制性シクロスポリン［ＭｅＩｌｅ］４−ＣｓＡと比較した例のシクロフィリンに対して約６倍より高い親和力を示した。
【００６１】
上記実験は、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡが、他に試験されたシクロスポリンのいずれより、ＨＣＶ複製のより効果的な阻害剤であることを提供した。この増大した抗ＨＣＶ活性は、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの増大したシクロフィリン結合活性に相関する。
【００６２】
ＨＣＶレプリコンのクリアランス及びリバウンド
ＨＣＶ感染の再発は、特に潜在的に効果のある治療、例えば、シクロスポリン、及び／又はインターフェロンを使用しても、当該疾患の重大な問題である。ＣｓＡと比較して、本発明のシクロスポリンのより強力な抗ＨＣＶ活性が、当該化合物がＨＣＶレプリコンを製造する細胞をより効果的に治す能力に反映されるかどうかを試験するために、生体外細胞アッセイを、組み換え製造されたレプリコンに対する選択薬Ｇ４１８の存在に基づき実施した。
【００６３】
アッセイは、Ｈｕｈ−９−１３細胞、肝細胞がんの細胞（Ｈｕｈ−７）を使用した（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４２４）,（１９９９）,１１０−１１３）。細胞を、Ｇ４１８のプレッシャーのない通常の完全培地ＤＭＥＭにて育てた。当該細胞を、ＣｓＡ又は［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡのいずれか（双方共に０．５又は１μｇ／ｍｌ）の存在下、培養し、あるいは７連続パッセージの間未処理のままだった。対照を実施し、Ｇ４１８選択プレッシャーが、数回のパッセージ間においてＨＣＶレプリコン含量に影響を与えないことを保証した。［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡと共に７日間処理されたＨｕｈ−９−１３細胞がそれらのレプリコンから本当に除去されるのかを確認するために、Ｇ４１８選択（１０００μｇ／ｍｌ）をさらに２パッセージ再開した。当該ＨＣＶレプリコンをいまだに有する細胞のみが、これらの条件下で増殖され得、そしてレプリコンのない細胞はリバウンド期の間、Ｇ４１８の存在下で死んだ。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲを、異なるパッセージ時点で入手されたサンプルのウイルス性ＲＮＡサンプルの抽出物に関して、実施した。使用したフォワード及びリバースプライマーは、各々、５'−ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣ−３’及び５’−ＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧ−３’だった。当該蛍光プローブは、５’−ＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣ−３'だった。内部対照として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子配列の一部を含むプラスミドを使用した。得られたものを、分析し、レプリコンＲＮＡ（ｎｇ）の量／１０００細胞個として表示し、そしてグラフを作成するために使用した。
【００６５】
これらの実験からの結果（図３）は、この標準生体外細胞アッセイにおけるＣｓＡに対する［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの優れた抗ウイルス性効果を明らかとした。驚くべきことに、本発明のシクロスポリンは、他の免疫抑制性ＣｓＡのようなウイルス増殖抑制作用のみでなく、殺ウイルス作用を示した。実際には、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡで処理したＨｕｈ−９−１３細胞（図３における丸型及び四角形）をＧ４１８の存在下で再度培養したとき（リバウンド期）、死んだ培養物は、ＣｓＡで処理した細胞と比較した（ひし形及び三角形）。７連続パッセージの間、ＣｓＡで処理された培養物の双方は、Ｇ４１８の存在下で、増殖され得た。このことは、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、Ｈｕｈ−９−１３細胞を、それらのＨＣＶレプリコンから治し得ることを確たるものとした。
【００６６】
混合薬
インターフェロン（ＩＦＮ）は、ＨＣＶ感染の現在の治療の一部である。［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ／ＩＦＮ−α２ａの混合薬の効果を、Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ,１９９０,１４,１８１−２０５）の方法を使用して評価した。簡単に、理論的相加効果は、それぞれの化合物の用量−反応曲線から、以下の方程式：
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ（１−Ｘ）
｛式中、Ｘは［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡのみにより産出される阻害を示し、Ｙは、ＩＦＮ−α２ａのみによるものを示す。｝により計算する。Ｚは、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡとＩＦＮ−α２ａとの混合により産出される効果を示す。理論的相加面が、実際の実験的面から差し引かれ、結果として、当該混合が相加のときのゼロ面と等しい水平面を得、当該ゼロ面の上にある面は、当該混合の相乗効果を示し、地面より低い面はアンタゴニズムを示す。
【００６７】
当該抗ウイルス性アッセイを、化合物を格子状形式において添加した以外は本質的に上記のように、Ｈｕｈ５−２細胞について実施した。各化合物について、３つの複製プレートを使用し、各個別の化合物の用量反応曲線を測定した。全３つの面から得られたデータを使用し、理論的相加面を計算した。化合物の各対についての混合試験も、３回実施した。データを、ＡＮＯＶＡ試験により、分散について分析した。
【００６８】
使用されたＩＦＮ−α２ａの最も高い濃度で、僅かな相乗効果が見られたが、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡとＩＦＮ−α２ａの組み合わされた抗ＨＣＶ活性の全ては、相加として考慮され得る（図４）。
【００６９】
当該［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡについて見出されたことは、以下のように要約される。
・ＨＣＶサブゲノムレプリコン系において示されたように、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、より強力な抗ＨＣＶ活性を有し、かつ、ＣｓＡより低い細胞毒性である。
・このことは、ＨＣＶ株Ｊ６及びＪＦＨ１の間の全長感染性キメラ遺伝子に感染させられた肝細胞がんの細胞培養物において確認された。
・［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、ＣｓＡより効果的に、ＨＣＶレプリコンから細胞を治し得る。
・これらの効果は、より顕著なシクロフィリン結合親和力に関連する。
・［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ／ＩＦＮ−α２ａの混合の抗ＨＣＶ活性は、相加的である。
【００７０】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡは、ＨＣＶに感染されている患者を治療するために使用され得る。当該活性化合物は、いかなる慣習的経路により投与され得る。それは、注射可能な溶液又は懸濁液の型で、あるいは注射可能な堆積物配合の型の如き、非経口に投与され得る。好ましくは、飲むための溶液又は懸濁液、タブレットあるいはカプセルの型で経口投与されるだろう。本発明のシクロスポリンを含む経口投与のための医薬組成物は、実施例に記載される。当該実施例に記載されるとおり、かかる医薬組成物は、通常、本発明のシクロスポリン、及び１又は複数の医薬として許容される担体基質を含む。
【００７１】
通常、これらの組成物は、濃縮され、そして、投与の前に、水のごとき適切な希釈剤と混合される必要がある。非経口投与のための医薬組成物は、通常、１又は複数の賦形剤も含む。任意の賦形剤は、等張剤、緩衝液又はｐＨ調整剤、及び防腐剤を含む。これらの賦形剤は、当該成分の維持のために、及び好ましい範囲のｐＨ（約６．５〜７．５）、及び浸透圧（約３００ｍｏｓｍ／Ｌ）の獲得のために添加され得る。
【００７２】
経口投与のためのシクロスポリン製剤のさらなる実施例は、米国特許第５,５２５,５９０号、及び同第５,６３９,７２４号、そして米国特許出願公開２００３/０１０４９９２号に記載される。経口経路に関して、毎日の投与から週２回の投与のための本発明のシクロスポリンの示された用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇとなる。静脈内経路に関して、示される対応する用量は、、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇとなる。
【００７３】
本発明のシクロスポリンの有効量は、ＨＣＶ感染の治療を必要とする患者に対する治療計画の過程で繰り返し投与されたときに、血清ＨＣＶタイターにおける統計的に著しい減少又は患者における血清ＡＬＴ活性の著しい減少の如き、他覚的臨床反応を生じる量と理解される。
【００７４】
初期Ｉ臨床試験を実施し、［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの経口薬の安全性を評価し、そして当該薬物基質の薬物動態プロフィール及び安全性プロフィールを決定した。試験は、水中のマイクロエマルジョン中に５０〜１６００ｍｇ用量を許容することを示した。軽度で長続きしない副作用を、吐き気、嘔吐、腹痛、及び軽度の頭痛を含み観察した。これらの副作用は用量関連性ではなかった。
【００７５】
ＨＣＶ感染に対する本発明のシクロスポリンを含む医薬組成物の効果を試験するための臨床用量を決定する際には、臨床医学者により多くの要因が考慮されるだろう。これらの主要なものは、本発明の選択されたシクロスポリンの毒性及び半減期である。さらなる要因は、患者の大きさ、患者の年齢、患者の通常の症状（非代償性肝疾患、重大な先行骨髄欠陥、及び他のウイルス性感染症を含む全身性疾患又は重病を含む。）、例えば血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値により示されるＨＣＶ感染のステージ（急性対慢性）、ＨＣＶの特定の遺伝子型、ＨＣＶ感染の薬歴、患者における他の薬物の存在などを含む。
【００７６】
治療方針は、本発明の医薬組成物の繰り返し投与を必要とするだろう。通常、十分な薬剤投与量は１週間あたり３〜７回の投与であり、そして治療の持続時間は約４週間〜６ヶ月、好ましくは、約４週間〜約１２ヶ月だろう。治療は、その後、血清中のＨＣＶを測定し、血清ＡＬＴ値を測定し得る。治療の終点は、ウイルス学的応答、すなわち、治療手順の終点でのＨＣＶの非存在、治療開始後数ヶ月、又は治療完了後数ヶ月である。血清中のＨＣＶは、定量的ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロットの如き方法により、ＲＮＡ値で、あるいは、酵素免疫学的アッセイ又はウイルス性タンパク質の強化化学発光免疫学的アッセイによりタンパク質値で測定され得る。当該終点は、通常の範囲における血清ＡＬＴ値の測定をも含み得る。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、本発明のシクロスポリンに加えて、リバビリン、又はインターフェロンαの如き他の抗ウイルス性基質の如きＨＣＶ感染に対する１又は複数の他の活性成分を含む。本発明のシクロスポリン及びかかる他の活性成分は、同じ医薬組成物の一部として一緒に投与され得、又は併用治療の利益を得るためにデザインされた適切な用法として別々に投与され得る。当該適切な用法、当該投与された各用量、及び各活性剤の投与間の特定の間隔は、使用された活性剤の特定の組み合わせ、治療をうける患者の症状、及び以下に記載される他の要因に依存するだろう。かかる追加の活性成分は、一般的に、単一治療薬として有効な量よりも少なく、又は等量を投与されるだろう。ＦＤＡがヒトへの投与のためのＦＤＡの認可を受けた、かかる活性剤についての用量は、広く一般に有用である。
【００７８】
本明細書中に引用される全ての特許、特許出願及び刊行物について、その全内容を本願明細書中に援用する。
【００７９】
本発明は、以下の実施例により、さらに詳細に述べられる。当該実施例は、当業者への例証のために提供され、本願の特許請求の範囲に記載されるような本発明の範囲を限定することを意図するものではない。それ故、本発明は、提供された当該実施例に限定するように解釈されるべきでなく、本明細書中に提供される教示の結果として明らかとなるいかなる及び全ての変形を含むように解釈すべきである。
【実施例】
【００８０】
実施例１：［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの合成
（ａ  Ｐｈ.Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｊｅａｎ  Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｇｕｉｃｈｏｕ  ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ”Ｄｅ  ｎｏｕｖｅａｕｘ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｄｅ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｃｏｍｍｅ  ａｇｅｎｔ  ａｎｔｉ-ＶＩＨ-１”，Ｆａｃｕｌｔｅ  ｄｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｕｓａｎｎｅ，ＣＨ−１０１５  Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（２００１）からの翻訳。）
【００８１】
Ｈ−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（Ｏａｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの合成:
４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（４１．５ｍｍｏｌ；５．８ｇ）を、１００ｍｌの無水酢酸中のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（８．３ｍｍｏｌ；１０ｇ）の溶液に添加した。当該溶液を、室温で１８時間撹拌した。次いで、当該反応混合物を、６００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄し、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で４回洗浄した。当該有機相を、無水ＮＡ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を、減圧下、蒸発させた。得られた黄色の残留物を、シリカゲル上のクロマトグラフにかけ（溶出剤：９８：２のジクロロメタン／メタノール）、エーテル中に再結晶化した。ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−ＣｓＡの９．５ｇ、白色粉末を得た、９２％の収率を示した。
【００８２】
トリメチルオキソニウム・テトラフルオロボラート（２２．５ｍｍｏｌ；３．３ｇ）を、６０ｍｌのジクロロメタン中のＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ｃｓ（７．５ｍｍｏｌ；９．４ｇ）の９．５ｇ溶液に添加した。１６時間後、室温で、メタノール中の０．２６Ｍのソジウムメタノラートの３５ｍｌを添加した。１時間後、メタノール３５ｍｌと２Ｎの硫酸３５ｍｌを添加し、そして当該混合物を、さらに１５分間撹拌し、飽和ＫＨＣＯ３（２８ｍｌ）でｐＨ６．０に中和し、酢酸エチルで２回抽出した。当該有機相を、飽和ＮａＣｌで２回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した。続いて、溶媒を、減圧下、蒸発させた。当該黄色の残留物を、シリカゲル上のクロマトグラフにかけた（溶出剤：５：１の酢酸エチル／メタノール）。Ｈ−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの７．３ｇを得た（収率：７６％）。
【００８３】
【化４】
2008514690.tif 000009
【００８４】
Ｈ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの合成:
ＤＭＡＰ（２．３ｍｍｏｌ；３３４ｍｇ）及びフェニルイソチオシアナート（６．９ｍｍｏｌ；０．７５ｍｌ）を、４８ｍｌのテトラヒドロフラン中のＨ−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅ（４．６ｍｍｏｌ；７ｇ）の溶液に添加した。２時間後、溶媒を蒸発させ、そして当該粗生成物をシリカゲル上のクロマトグラフにかけた（溶出剤：９：１のｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）／酢酸エチル（１）；９：１のＭＴＢＥ／メタノール（２））。Ｐｈ−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＭｅＬｅｕ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの５．８ｇを得た（収率９０％）。
【００８５】
１３．８ｍｌのトリフルオロ酢酸を、２９０ｍｌのジクロロメタン中の当該最終化合物（４ｍｍｏｌ；５．６ｇ）に添加した。１時間の反応後、当該混合物を、ＫＨＣＯ３を使用して中和し、５００ｍｌのジクロロメタンで希釈した。当該有機相を、飽和ＮａＣｌで２回洗浄し、無水ＮＡ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過した。続いて、溶媒を、減圧下、蒸発させた。当該残留物を、シリカゲル上のクロマトグラフにかけた（溶出剤：９：１のＭＴＢＥ／酢酸エチル（１）；３：１のＭＴＢＥ／メタノール（２））。Ｈ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの２．８ｇを得た（収率：６１％）。
【００８６】
【化５】
2008514690.tif 000010
【００８７】
Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−ＮＭｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨの合成：
フルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’−テトラメチルホルムアミジニウム・ヘキサフルオロホスフェイト（ＴＦＦＨ）（０．９６ｍｍｏｌ；０．２５ｇ）を、不活性雰囲気下、１５ｍｌのジクロロメタン中におけるＨ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅ（０.８７ｍｍｏｌ；１.００ｇ）、ＤＩＰＥＡ（２.７８ｍｍｏｌ；０.４８ｍｌ）、及びＢｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−ＯＨ（０.９６ｍｍｏｌ；０.３２ｇ）の溶液に添加した。１５分後、ジクロロメタンを蒸発させ、そして、残留物を酢酸エチル中に回収した。当該有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、クエン酸の１０％溶液、及び飽和ＮａＣｌ溶液で逐次的に洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。シリカゲル上のクロマトグラフフィ（９８：２の酢酸エチル／メタノール）は、Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅの１．１４ｇ（９０％）を得た。
【００８８】
当該最終生成物（０．６４ｍｍｏｌ；０．９３ｇ）を、４５ｍｌの無水メタノール中に回収し、水素化ホウ素ナトリウム（２５．５ｍｍｏｌ；０．９６ｇ）を、１５分間隔で、３時間３０分超に渡り、少量ずつ添加した。４時間で、当該反応混合物を、０℃まで冷却し、１０％のクエン酸の添加により加水分解させ、そして濃縮した。残留物を酢酸エチル中に回収した。当該有機相を、クエン酸の１０％溶液、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。シリカゲル上のクロマトグラフフィ（９５：５の酢酸エチル／メタノール）後、Ｂｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−ＮＭｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨの０．６３ｇ（８１％）を得た。
【化６】
2008514690.tif 000011
【００８９】
Ｈ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ−Ａｂｕ−ＯＨの合成：
メタンスルホン酸（３．１８ｍｍｏｌ；２．０６０ｍｌ）を、４２．５ｍｌのメタノール中のＢｏｃ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−ＮＭｅ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ（０．４２５ｍｍｏｌ；６１０ｍｇ）の溶液に添加し、そして、当該混合物を５０℃まで加熱し、維持した。当該反応の進展を、ＨＰＬＣ及び質量分析法により測定した。８０時間後、当該混合物を０℃まで冷却し、そして１ＭのＮａＨＣＯ３の添加により加水分解させた。メタノールを除去し、そして当該残留物を酢酸エチル中に回収した。当該有機相を１ＭのＮａＨＣＯ３で洗浄し、次いで、飽和ＮａＣｌで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。当該生成物、Ｈ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（ＯＡｃ）−Ａｂｕ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨＭｅ（５５７ｍｇ）を、精製することなく、次のステップに使用した。
【００９０】
当該生成物（０．４２ｍｍｏｌ；５５７ｍｇ）を、２０ｍｌのメタノール中に溶解し、不活性雰囲気下、１．２６ｍｌメタノール中のソジウムメタノラート（１．２６ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。室温で１８時間後、当該反応混合物を、０℃まで冷却し、そして、５ｍｌの水中の水酸化ナトリウム（４．２ｍｍｏｌ；１６８ｍｇ）を、滴下で添加した。室温で２１時間後、当該反応混合物を、再度０℃まで冷却し、そして、１ＭのＫＨＳＯ４で中和した。メタノールを除去し、そして残留物を酢酸エチル中に溶解した。当該有機相を、半飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして濃縮した。当該生成物、Ｈ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ−Ａｂｕ−ＯＨ（３３５ｍｇ；６４％）を、精製することなく、次のステップに使用した。
【００９１】
【化７】
2008514690.tif 000012
【００９２】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの合成
不活性雰囲気下、５０ｍｌのジクロロメタン中におけるＨ−Ｄ−ＭｅＡｌａ−ＥｔＶａｌ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ−Ａｂｕ−ＯＨ（０．１６２ｍｍｏｌ；２００ｍｇ）及びｓｙｍ．コリジン（１．７８ｍｍｏｌ；０．２４ｍｌ）の溶液を、３．２リットルのジクロロメタン中の（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェイト（ＰｙＡＯＰ、０．４８６ｍｍｏｌ；２５４ｍｇ）の溶液に滴下で添加した。７２時間後、当該反応混合物を、１０％Ｎａ２ＣＯ３溶液の添加により加水分解させた。ジクロロメタンを蒸発させ、そして残留物を酢酸エチル中に回収した。当該有機相を、続いて、０．１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄し、そしてＮａＣｌの飽和溶液で洗浄し、１１０ｍｇ（５９％）の［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡを得た。
【化８】
2008514690.tif 000013
【００９３】
実施例２：本発明のシクロスポリンの経口製剤
量を重量％として表示した。
例Ａ：
本発明のシクロスポリン                          １０
グリコフロール７５                              ３５．９５
マイグリコール（Ｍｉｇｌｙｃｏｌ）８１２        １８
クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＲＨ４０    ３５．９５
アルファ−トコフェロール                        ０．１
【００９４】
例Ｂ：
本発明のシクロスポリン                          １０
テトラグリコール                                ２
Ｃａｐｔｅｘ８００                              ２
Ｎｉｋｋｏｌ  ＨＣＯ−４０                      ８５．９
ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）              ０．１
【００９５】
例Ｃ：
本発明のシクロスポリン                          １０
グリコフロール７５                              ３５．９５
マイグリコール（Ｍｉｇｌｙｃｏｌ）８１２        １４
クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＲＨ４０    ３６
ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）            ０．０５〜０．１
【００９６】
例Ｄ：
本発明のシクロスポリン                          １０
テトラグリコール                                １０
ミリトール（Ｍｙｒｉｔｏｌ）                    ５
クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＲＨ４０    ７４．９
アルファ−トコフェロール                        ０．１
【００９７】
例Ｅ：
本発明のシクロスポリン                          １０
エタノール                                      ９
プロピレングリコール                            ８
クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＲＨ４０    ４１
グリセロールモノリノレアート                    ３２
【００９８】
製剤Ａ〜Ｄの各成分、及び製造方法について、英国特許出願第２，２２２，７７０号を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、感染したＨｕｈ−７−Ｌｕｎｅｔ細胞において、ルシフェラーゼアッセイにより測定された用量反応ヒストグラムを示す。
【図２】図２は、感染したＨｕｈ−７．５細胞において、ルシフェラーゼアッセイにより測定された用量反応ヒストグラムを示す。
【図３】図３は、感染したＨｕｈ−９−１３細胞のクリアランス応答曲線を示す。
【図４】図４は、ＩＦＮ／［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡの併用に関する用量反応の３Ｄ表示を示す。
【図１】
2008514690.tif 000014
【図２】
2008514690.tif 000015
【図３】
2008514690.tif 000016
【図４】
2008514690.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月12日(2007.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
明らかに、より高い抗ウイルス活性及びより良い安全性プロフィールを伴う付加療法が、特にＨＣＶ再発を妨害する場合の如きＨＣＶ感染の治療のために必要とされる。当該安全性プロフィールを確立するために、低い細胞毒性及び細胞増殖抑制性効果の如き基準、並びに高い選択性指標は、特に、ＨＣＶ感染の臨床治療に関係する。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡを含む、患者におけるＨＣＶ感染の治療を目的とした医薬品。
【請求項２】
前記患者におけるＨＣＶ感染の併用療法の利益を得ることを目的とした適切な用法の一環として、前記［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡが、ＨＣＶ感染に対し活性を有する少なくとも１つの第２成分と併用投与されること又は別々に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬品。
【請求項３】
［Ｄ−ＭｅＡｌａ］３−［ＥｔＶａｌ］４−ＣｓＡ、及びＨＣＶ感染に対して活性を有する第２成分を含む、医薬組成物。
【請求項４】
医薬として許容される担体、及び場合により希釈剤をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2008514690.tif 000018
2008514690.tif 000019
2008514690.tif 000020
2008514690.tif 000021