(57)【要約】  本発明は、リポソーム内での治療剤の保持性を高めるために銅イオンを使用することに関する。本発明は、抗癌剤又はその他の療法において、インビトロ及びインビボにおける標的部位にリポソームで封入された治療剤をより効果的に送達するために使用され得る。リポソームは、治療剤を含有する内部緩衝溶液からなり、同溶液は６．５未満のｐＨ、最も好ましくは約３．５のｐＨを有する。銅イオンの少なくとも幾らかは内部溶液内に保持される。特定の実施形態において、治療剤はイリノテカンのような化学療法剤であり得る。本発明はまた、薬物のリポソームへの装填を容易にするためのイオノフォアも含む。特定の一実施形態において、イオノフォアＡ２３１８７と封入された二価銅イオン（Ｃｕ２＋）との組み合わせは、非常に改善された薬物保持特性を示すイリノテカン製剤を提供する。
2008515817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療剤を封入したリポソームからなる組成物であって、前記治療剤はリポソーム内に銅イオンが存在した状態にて前記リポソームに装填され、かつ前記銅イオンは前記リポソーム内での前記治療剤の保持性を高めるものである、組成物。
【請求項２】
前記治療剤は抗癌薬剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記薬剤はトポイソメラーゼ阻害剤である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記薬剤は、カンプトテシン又はその類似体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記薬剤はイリノテカンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記イリノテカンは、主としてラクトン形にて存在している、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記薬剤はチューブリンと結合する、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記薬剤はビンカアルカロイド又はその誘導体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記薬剤は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンからなる群より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リポソームは前記治療剤を含有する内部緩衝溶液を含み、前記溶液は６．５より小さいｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ｐＨは約２乃至５の範囲内に維持される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ｐＨは約３．５である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記溶液は、前記銅イオンの少なくとも幾らかを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リポソームは、同リポソームの脂質二重層内に二価のプロトンカチオン交換イオノフォアを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記イオノフォアはＡ２３１８７、イオノマイシン及びＸ−５３７Ａからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記リポソームは、フォスフォグリセリド及びスフィンゴ脂質からなる群より選択される脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記脂質は、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジル酸、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン及びジリノレオイルフォスファチジルコリンからなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＳＰＣ）／コレステロールを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物を癌の治療に使用する方法。
【請求項２０】
治療剤のリポソーム内での保持性を高めるための方法であって、
（ａ）銅イオンを含むリポソーム内部溶液を、内部又は前記リポソーム内に提供する工程と、
（ｂ）前記リポソーム内部溶液のｐＨを６．５未満に維持する工程と、
（ｃ）治療剤を外部溶液に提供する工程と、
を備え、前記治療剤は、前記内部に拡散し、かつ前記リポソーム内に封入され、かつ前記銅イオンの存在は前記治療剤のリポソーム内での保持性を高める、方法。
【請求項２１】
前記リポソーム内部溶液のｐＨを６．５未満に維持する工程は、前記リポソーム内部溶液に緩衝液を提供することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記リポソーム内部溶液のｐＨを６．５未満に維持する工程は、前記内部と前記外部溶液との間でのイオン交換を容易にするためにイオノフォアを提供することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記イオノフォアは前記前記内部からの二価の銅イオンを前記外部溶液のプロトンと交換する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記イオノフォアは、Ａ２３１８７、イオノマイシン及びＸ−５３７Ａからなる群より選択される二価のプロトンカチオン交換イオノフォアである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記イオノフォアは、前記治療剤を前記外部溶液に提供する前に同外部溶液に加えられる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｐＨは約２乃至５の範囲に維持される、請求項２０乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｐＨは約３．５のｐＨである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療剤は抗癌薬剤である、請求項１乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤はトポイソメラーゼ阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤は、カンプトテシン又はその類似体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤はイリノテカンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤はチューブリンと結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤はビンカアルカロイド又はその誘導体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤は、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及びビノレルビンからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２０乃至３４のいずれか一項に記載の方法により生成されるリポソーム製剤。
【請求項３６】
請求項２０乃至３４のいずれか一項に記載の方法に従って処方化されたリポソームに封入された治療剤をインビボにて癌の治療に使用する方法。
【請求項３７】
前記治療剤のインビボにおけるリポソーム内での保持は、銅イオンが存在しない状態にて前記治療剤のリポソームへの封入製剤と比較して顕著に高められている、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボでの治療用組成物の送達を高めることを可能にする、優れた薬物保持性を提供するリポソーム薬物装填法及びリポソーム薬物装填組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、内部区画を包囲する一つ以上の脂質二重層から構成された微細粒子である。リポソームは、多重膜ベシクル、多重小胞リポソーム、単層膜ベシクル及び巨大リポソームに分類される。リポソームは、薬物、化粧品、診断薬及び遺伝物質のような多岐にわたる作用物質の担体として広く使用されている。リポソームは非毒性の脂質から構成されているので、それらは一般的には低毒性であり、従って多岐にわたる製薬用途において有用である。特に、リポソームは、血流中における半減期の短い作用物質の循環時間を長くするのに有用である。リポソームにて封入された薬物は、多くの場合、同薬物がフリーの場合とは大きく異なる生体内分布及び毒性を有する。特異的なインビボでの送達性のために、これらの担体のサイズ、電荷及び表面特性は、調製法を変更することにより、かつ担体を構成する脂質を調整することにより変更され得る。例えば、担体を構成する脂質のアシル基の鎖の長さを低減することにより、薬物をより迅速に放出するためのリポソームが形成され得る。
【０００３】
リポソームに高装填量にて薬物を封入する最も効率的な方法は能動装填（ａｃｔｉｖｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）を介するものである。この方法は、リポソーム膜を横切るｐＨ勾配（ΔｐＨ）又は金属イオン勾配（ΔＭ２＋）の形成により介在される。例えば、ｐＨ４．０のクエン酸緩衝液中にてリポソームを調製し、その後ｐＨ７．５の緩衝生理食塩水で外側の緩衝液を交換することにより生成したΔｐＨは弱塩基性薬物のリポソームへの蓄積を促進する。中性の薬物は、脂質二重膜を横切って受動的に拡散し、リポソーム内部の低ｐＨ環境にてプロトン化により捕捉される。この方法は、９８％を越える薬物封入率と、薬物（例えば、ビノレルビン）対脂質の高い比率を生ずる。ΔＭ２＋による薬物装填は類似の方法に従い、薬物の蓄積は金属イオン複合体化により促進される（例えば、ドキソルビシン−Ｍｎ２＋）。金属イオン複合体化により促進される薬物装填効率は、ΔｐＨに対して記載されたものに匹敵する。
【０００４】
更なる能動装填処置法は、Ａ２３１８７のようなイオノフォアと二価金属イオン（Ｍ２＋）との組み合わせを使用する。Ａ２３１８７は脂質二重層に組み込まれ、内部リポソーム緩衝液からの１Ｍ２＋を外部緩衝液からの２Ｈ＋と交換し、それによりΔｐＨを発生し、かつ維持する。Ａ２３１８７及び内部Ｍｎ２＋緩衝液は、ビンクリスチン、シプロフロキサシン、トポテカン及びイリノテカンを効率的に封入するものとしてこれまでに使用されてきた。この系におけるＭｎ２＋の役割は、ΔｐＨの形成に対する「不活性な」促進剤であると考えられている。実際に、内部のＭｎ２＋ベースの緩衝液をＣｕ２＋ベースの緩衝液に代えることは、抗癌薬剤の装填の速度論にいかなる差異をも与えていない。
【０００５】
本発明は、リポソーム内の薬物保持特性を顕著に高め、よってインビボにおける治療効果を高める二価銅イオン（Ｃｕ２＋）の使用に関する。例えば、本明細書に記載されているＣｕ２＋／Ａ２３１８７イリノテカンリポソーム処方物は、Ｍｎ２＋／Ａ２３１８７等価物と比較した場合、直腸結腸癌のマウス異種移植モデルに対して顕著に改善された効果を示した。出願人の装填処置は、高封入効率（＞９８％）、薬物対脂質の高い比率及び薬物保持性の向上を組み合わせる。既存の発明は、膜透過ｐＨ勾配を発生させるためのイオノフォアの使用を定義して膜透過ｐＨ勾配の使用を記載するか、或いは代替的に、中性環境の存在下であり、かつ膜透過ｐＨ勾配が不在である場合のＭｎ２＋又はＣｕ２＋のような遷移金属の使用を開示している（フェンスケ（Ｆｅｎｓｋｅ）らによる特許文献１；ターディ（Ｔａｒｄｉ）らによる特許文献２）。従来技術は、低ｐＨ環境において二価銅イオン（Ｃｕ２＋）に依存する方法及び組成物を示唆しておらず、かつそのような組成物が改善された薬物保持特性を得ることも期待していなかった。
【０００６】
ベシクルの内部に封入された金属イオンを含むリポソームは、診断の用途ではこれまで使用されていた。例えば、被検者の体内の所望の部位に造影剤を蓄積する目的にて、同造影剤を送達するためにリポソームを使用していた。この用途において、リポソームは主として、ガンマ画像及び磁気共鳴画像における診断用のラジオヌクレオチド及び常磁性金属イオンをそれぞれ送達するために使用されていた。しかしながら、これらの用途においてリポソームに封入された金属イオンは薬物の保持の目的には使用されていない。
【０００７】
カンプトテシンは、核酵素、トポイソメラーゼＩ（トポＩ）を阻害するあるクラスの抗癌剤である。トポＩは細胞周期のＳ相時に、ＤＮＡ二重らせん中の一時的な一本鎖切断を誘導することによりＤＮＡ複製を容易にする。ＤＮＡ及びトポＩの間に形成された複合体は、「開裂可能な複合体」として参照されている。カンプトテシンは、この開裂可能な複合体を安定化させることにより、カスパーゼ介在細胞アポトーシスを誘導する。イリノテカンのようなカンプトテシン類はラクトン環を保有している。ラクトン環は細胞毒活性に不可欠である。カンプトテシンのリポソーム製剤は、活性閉環ラクトン形を好む環境中にて薬物を維持するためにこれらの担体系に対する可能性に基づいて魅力的な選択肢である。カンプトテシンのラクトンの閉環形と不活性なカルボン酸の開環形との間には平衡状態が存在する（図１）。この平衡状態はｐＨにより影響される。酸性のｐＨにおいて、平衡状態は、閉環ラクトン形に移動する。中性又はアルカリ性のｐＨ（例えば、生理学的な状態）では、平衡は不活性な開環形となりやすい。
【特許文献１】米国特許第５８３７２８２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３００９１６２１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
封入された薬物の保持性を高めるとともにその活性形にて薬物を好ましくは維持する改善されたリポソーム製剤であって、送達性及び標的部位における効率の改善された製剤の必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、本発明は治療剤を封入するリポソームからなる組成物に関し、同治療剤はリポソーム内銅イオンの存在下にて同リポソームに装填され、かつ銅イオンは同治療剤のリポソーム内での保持性を高めるものである。リポソームは治療剤を含む内部緩衝溶液を含み、同溶液は６．５未満のｐＨを有し、最も好ましくは約３．５のｐＨである。銅イオンの少なくとも幾らかは、内部溶液内に保持される。特定の実施形態において、治療剤はイリノテカン又はビノレルビンのような抗癌薬剤であり得る。
【００１０】
本発明は、リポソーム内における治療剤の保持性を高めるための方法に関し、同方法は、（ａ）リポソームの内部に銅イオンを含むリポソーム内部溶液を提供する工程と、（ｂ）リポソーム内部溶液のｐＨを６．５以下に維持する工程と、（ｃ）治療剤を外部溶液に提供する工程と、からなり、同治療剤は内部に拡散されるとともに、リポソーム内に封入され、銅イオンの存在は同治療剤のリポソーム内における保持性を高める。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
図面は本発明の実施形態を記載しているが、本発明の精神又は範囲をいかなる方法においても制限するものとして解釈されるべきではない。
以下の記載を通して、本発明をより完全に理解するために特定の詳細な説明を記載した。しかしながら、本発明はこれらの詳細な説明がなくても実施され得る。本発明を不必要に曖昧にすることを回避するために、別の場合において、周知の要素は詳細に示されていないし、又は記載されていない。従って、明細書及び図面は、限定的な意味よりはむしろ例示的なものとしてみなされるべきである。
【００１２】
出願人の発明は、リポソームによる薬物送達の効果を改善するための新規な方法及び組成物を提供する。本発明は、薬物を装填するために二価の金属カチオンを使用するリポソームの薬物保持特性は使用される金属に非常に依存するという知見に基づくものである。最適な金属、特に二価の銅を選択することにより、保持特性が調整され、リポソームからの選択された薬剤の所望の放出が達成される。
【００１３】
上記したように、薬物をリポソームに能動的に装填するための種々の方法が従来から公知である。本発明は治療剤を外部溶液からリポソームの内部に移動させるためにリポソーム膜を横切って形成されたｐＨ勾配を使用する。ｐＨ勾配は当業者により理解されている種々の様式にて形成され、かつ維持され得る。本発明の一実施形態において、リポソーム内部溶液は約６．５以下に維持される。特定の実施形態において、リポソーム内部溶液のｐＨは約２乃至５の範囲、最も好ましくは約３．５のｐＨに維持される。これは、例えば、リポソーム内部溶液に緩衝液を提供することにより、或いは内部溶液と外部溶液との間のイオン交換を容易にするためのイオノフォアを提供することにより、達成され得る。イオノフォアは二つの外部プロトンと内部金属イオンとの交換を可能にする任意の化学的分類である。好ましい一実施形態において、それはＡ２３１８７から構成される。代替的な実施形態において、イオノフォアはイオノマイシン又はＸ−５３７Ａから構成され得る。
【００１４】
治療剤がリポソームに能動的に装填される方法に関係なく（即ち、ｐＨ勾配が形成される方法に関係なく）、本発明は、封入された治療剤の保持性を高めるためにリポソーム内部溶液内に二価の銅イオンを使用することに関する。銅イオンが機能する正確なメカニズムは未だに解明されていない。例えば、銅は治療剤と結合する、及び／又はリポソーム膜の透過性を改質する。イオノフォアが二価の形である銅イオンのリポソームの内部から外部溶液までの交換を容易にする場合においてさえも、少なくとも幾らかの銅イオンはリポソームの内部に保持されていた。更に以下に記載するように、リポソーム内部溶液中における銅イオンの存在は、インビボにおける薬剤の保持性及び治療効果を顕著に高めるものである。当業者には明らかなように、治療剤の保持性は銅を欠く同様のリポソーム製剤と比較して「高められている」。以下に詳細に記載するように、薬物の保持性の向上は、血漿での薬物保持のようなインビボ試験によって確認できる（図１９及び２０）。
【００１５】
治療剤は、リポソーム内に銅が存在した状態にて装填された場合、リポソーム内の保持性が改善される任意のクラスのものであり得る。好ましい一実施形態において、化合物は任意の弱塩基性化合物である。別の好ましい実施形態において、治療用化合物は、好ましくはカンプトテシン又はその類似体、最も好ましくはイリノテカン（ＣＰＴ−１１）であるトポイソメラーゼ阻害剤であり得る。代替的な実施形態において、治療用化合物は、好ましくはビンカアルカロイドのクラスからのチューブリンと結合する化合物であり得る。ビンブラスチン及びビンクリスチンは、ニチニチソウ（英名：Ｍａｄａｇａｓｃａｒ  ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ、学名：Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ（かつてはＶｉｎｃａ  ｒｏｓｅａとして分類されており、ビンカアルカロイドと称されるようになった化合物を得る）に見出されるアルカロイドである。それらはビンデシン及びビノレルビン、ビンブラスチンの半合成誘導体であり、それらの全ては分裂中期における有糸分裂（細胞分割）を阻害することにより作用する。本発明において好ましいビンカアルカロイドはビノレルビンである。
【００１６】
別の代替的な実施形態において、本発明は、優れた保持特性を達成するために、二価の銅イオンと組み合わせてリポソームに封入されるべき、小分子（化学的な化合物）、蛋白質、抗体、若しくはペプチド、或いは物質の任意の新たな若しくは周知の組成物又はその製薬的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００１７】
リポソーム組成物は、脂質：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＳＰＣ）／コレステロール（５５：４５モル％）から構成されており、その脂質の比率は、リポソームを調製する当業者には想起される実施形態に従って変更可能である。代替的な実施形態において、リポソームはフォスフォグリセリド及びスフィンゴ脂質を含む脂質から構成されており、その代表的な例としては、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジル酸、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン又はジリノレオイルフォスファチジルコリンを含む。例えば、スフィンゴ脂質及びグリコスフィンゴ脂質ファミリーのようなリンを欠くその他の化合物も考慮される。加えて、上記した両性脂質はトリアシルグリセロール及びステロールを含むその他の脂質と混合され得る。
【００１８】
本発明の範囲内と解釈される更なる修正は、例えば体内のその他の部位に広がる転移性癌細胞のような疾患の領域へのリポソームの特異的な局在化を可能にするリポソーム表面への抗体の標的化を含む。
【００１９】
薬物保持性を増大させるリポソームから利益を得る種々の疾病及び症状が考慮され、優れたＡＤＭＥＴ（吸収、分布、代謝、排泄及び毒性）特性を備えた治療薬の介入を可能にする。そのような疾患としては癌の治療を含むが、それに限定されるものではない。
【００２０】
好ましくは、リポソームの製薬組成物は非経口的に、即ち、関節内に、静脈内に、皮下に、又は筋肉内に、投与され得る。その他の実施形態において、製剤は局所的に投与され得る。
【００２１】
本発明の特定の一実施形態において、Ａ２３１８７イオノフォアの存在下にて銅とともに封入されたイリノテカンは、インビボにおいて同イリノテカンがリポソーム内で非常に良好に保持されており、加えて、Ａ２３１８７イオノフォアが存在しない場合の銅介在装填により調製されたイリノテカンと比較してその能力が向上していた。加えて、封入されたイリノテカンは臨床的に活性を示すラクトン形にて主として存在している。
【００２２】
以下の実施例は本発明を更に詳細に例示するものである。とはいえ、本発明はその特定の実施例に制限されるものではないことは理解されるであろう。
【実施例１】
【００２３】
１．１  材料及び方法  
１．１．１  リポソームの形成
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）の巨大単層ベシクル（ＬＵＶｓ）は押出法により調製した。簡潔に述べると、脂質を必要とされるモル比にてクロロホルム中に溶解し、交換不能かつ代謝不能な脂質マーカである３Ｈ−ＣＨＥでラベルして、窒素ガス流下に薄膜に乾燥した。続いて、同脂質を高真空下に３時間放置して、いかなる残渣溶媒をも除去した。次に、脂質フィルムを６５℃にて適切な緩衝液（３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４、３００ｍＭ  ＣｏＳＯ４、３００ｍＭ  ＺｎＳＯ４及び３００ｍＭ  ＭｎＳＯ４）と混合させることにより水和した。混合物に５回の凍結融解サイクルを実施した（各々が５分間で、液体窒素にて凍結し、６５℃にて融解した）。形成された多層ベシクル（ＭＬＶ’ｓ）は、６５℃にて、孔径が０．１μｍである積層型ポリカーボネートフィルタより１０回押し出した（押出機、ノーザンリピッズ（Ｎｏｔｈｅｒｎ  ｌｉｐｉｄｓ））。得られたＬＵＶ’ｓは、典型的には１１０ｎｍ±３０ｎｍの範囲の平均ベシクル径を有していた。ＬＵＶ’ｓの外部緩衝液は、ｓｅｐｈａｄｅｘＧ−５０サイズ排除クロマトグラフィーを使用してｐＨ７．５のＳＨＥ（３００ｍＭショ糖、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ）と交換した。
【００２４】
１．１．２  金属イオン勾配形成
押し出されたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームは、銅、亜鉛、マンガン又はコバルトの硫酸塩非緩衝溶液中にて調製した。外部緩衝液は、金属イオン勾配を作製するために、ｐＨ７．５のショ糖／ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）緩衝液と交換した。５０℃におけるイリノテカン装填（薬物対脂質比は０．２モル：モル）の効率を６０分間にわたり測定した。薬物装填の効率に対する内部リポソームのｐＨの作用は、（ＣｕＳＯ４／ＨＥＰＥＳ／ＴＥＡ  ｐＨ７．５）からなる内部緩衝液又はＣＵＳＯ４＋Ａ２３１８７イオノフォア非緩衝液を使用して評価した。Ａ２３１８７を使用した場合、リポソーム内部からのＣｕ２＋イオンは外部緩衝液からの二つのプロトンと交換され、それにより低い内部ｐＨが維持される。膜非透過性ｐＨ感受性蛍光プローブであるＨＰＴＳを、銅介在イリノテカン封入による内部ｐＨの任意の変化を調べるために使用した（７．５又は３．５の初期内部ｐＨでイオノフォアなし）。ＨＰＬＣ及びＴＬＣ法を使用して、イリノテカンリポソームのカルボキシ含量及びラクトン含量を評価した。
【００２５】
１．１．３  イリノテカンの装填
薬物と脂質とを、薬物：脂質＝０．２：１（モル：モル）の比率にて、５０℃にてインキュベートした。薬物の取り込みは、種々の時点でのアリコートをサンプリングし、かつ適切な緩衝液で平衡化された１ｍｌのｓｅｐｈａｄｅｘＧ−５０スピンカラム（６８０ｇ×３分）を使用して未封入薬物を封入薬物と分離することにより測定した。リポソームを含む排除されたフラクションは薬物：脂質比を測定するために分析した。液体シンチレーションカウンタを使用して脂質の濃度を測定した。イリノテカン濃度は３７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。
【００２６】
１．２  結果
１．２．１  イリノテカンの装填効率
押し出されたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームは、銅、亜鉛、マンガン又はコバルトの硫酸塩非緩衝溶液中にて調製した。外部緩衝液は、金属イオン勾配を作製するために、ｐＨ７．５のショ糖／ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ（ＳＨＥ）緩衝液と交換した。５０℃におけるイリノテカン装填（薬物対脂質比は０．２モル：モル）の効率を６０分間にわたり測定した。薬物装填の効率における内部リポソームのｐＨの作用は、（ＣｕＳＯ４／ＨＥＰＥＳ／ＴＥＡ  ｐＨ７．５）からなる内部緩衝液又はＣＵＳＯ４＋Ａ２３１８７イオノフォア非緩衝液を使用して評価した。Ａ２３１８７を使用した場合、リポソーム内部からのＣｕ２＋イオンは外部緩衝液からの二つのプロトンと交換され、それにより低い内部ｐＨが維持される。膜非透過性ｐＨ感受性蛍光プローブであるＨＰＴＳを、銅介在イリノテカン封入による内部ｐＨの任意の変化を調べるために使用した（７．５又は３．５の初期内部ｐＨでイオノフォアなし）。ＨＰＬＣ及びＴＬＣ法を使用して、イリノテカンリポソームのカルボキシ含量及びラクトン含量を評価した。
【００２７】
イリノテカンの装填効率は、ＣｕＳＯ４及びＺｎＳＯ４の封入された非緩衝溶液を備えるリポソームを使用した場合は９０％を超えていた。内部の低ｐＨを維持するためにＡ２３１８７イオノフォアを含めることは銅を介在した装填の挙動に影響を与えなかった。内部及び外部の緩衝液をｐＨ７．５（内部緩衝液−ＣｕＳＯ４／ＨＥＰＥＳ／ＴＥＡ  ｐＨ７．５）に調整した場合、イリノテカンの装填は再び９０％を超えることが明らかとなった。ＨＰＴＳの測定は、内部ｐＨがＣｕＳＯ４非緩衝液を介する装填に従い増大することを示唆している。ＨＰＬＣ及びＴＬＣは、遷移金属溶液の初期の内部ｐＨに関係なく、封入されたイリノテカンが主としてラクトン形にて存在していることを示している（図５及び図６）。
【００２８】
１．２．２  ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームへのイリノテカンの能動的な薬物装填
薬物と脂質とを、薬物：脂質＝０．２：１（モル：モル）の比率にて、５０℃にてインキュベートした。薬物の取り込みは、種々の時点でのアリコートをサンプリングし、かつ適切な緩衝液で平衡化された１ｍｌのｓｅｐｈａｄｅｘＧ−５０スピンカラム（６８０ｇ×３分）を使用して未封入薬物を封入薬物と分離することにより測定した。リポソームを含む排除されたフラクションは薬物：脂質比を測定するために分析した。液体シンチレーションカウンタを使用して脂質の濃度を測定した。イリノテカン濃度は３７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した（図２）。
【００２９】
１．２．３  リポソーム及びイオノフォアの調製
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）の巨大単層ベシクル（ＬＵＶｓ）を上記したように調製した。この場合、封入された緩衝液は、３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４（非緩衝液）、３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２２０ｍＭ  ＴＥＡ（ｐＨ７．５）又は３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４＋Ａ２３１８７イオノフォアを含む。イオノフォアは、イリノテカンを装填する直前に、５０℃にて１０分間インキュベートすることによりリポソーム膜に組み込まれる。Ａ２３１８７の存在は、外部緩衝液からの２個のＨ＋の内向きの移動とリポソーム内部からの１個のＣｕ２＋の外向きへの移動との交換を容易にする。結果として、リポソームの内部は低ｐＨに維持される。
【００３０】
１．２．４  ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームへのイリノテカンの能動的な薬物装填
リポソームは上記したようにイリノテカンが装填された。イリノテカンの装填効率は、図３に示されるように、封入されたＣｕＳＯ４を含むｐＨ７．５の緩衝液又はＣｕＳＯ４＋Ａ２３１８７イオノフォア非緩衝液（同イオノフォアは低ｐＨ環境を維持する）を備えたリポソームを使用して、９０％を超えて維持された。
【００３１】
１．２．５  薬物装填に続くリポソーム内部ｐＨの測定
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５モル％）リポソームは上記したように調製した。リポソームを以下に記載の内部緩衝液とともに処方化した：蛍光染料であるＨＰＴＳ（１２．５ｍＭ）の存在下又は非存在下における、３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４非緩衝液、３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２２０ｍＭ  ＴＥＡ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３．５）及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）。押出に続いて、外部緩衝液は、上記したようにカラムクロマトグラフィーを使用してｐＨ７．５のＳＨＥと交換した。
【００３２】
イリノテカンは、３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４（ｐＨ３．５）ＨＰＴＳ及び３００ｍＭ  ＣｕＳＯ４／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＴＥＡ（ｐＨ７．５）ＨＰＴＳで処方化されたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームに能動的に装填された。装填条件は既に記載したとおりであり、ＨＰＴＳの存在はイリノテカンの装填効率の障害となることはなかった。
【００３３】
ＨＰＴＳの検出は、ＬＳ−５０Ｂ発光分光計（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社）を使用して実施した。リポソーム溶液は、ｐＨ７．５のＨＢＳで希釈して、脂質に誘導される干渉を排除するために、最終的な脂質濃度を０．５ｍＭとした。アニオン性蛍光プローブＨＰＴＳは水溶性かつ膜非透過性であり、従って、リポソームの内部区域に捕捉され得る。ＨＰＴＳの励起特性はｐＨに依存し、酸性の条件下では同染料は４０５ｎｍにて最大励起波長となる一方、ｐＨの増大に伴い４０５ｎｍにおける蛍光強度が減少し、４５０ｎｍにおける強度が増大する。これは図４Ａに示されるスキャンに例示されており、同図４Ａは２つの対照ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム製剤に対する３５０−４９０ｎｍの励起に続いて、５１０ｎｍにおけるＨＰＴＳの蛍光発光を示す。内部緩衝液がｐＨ３．５であるクエン酸塩である場合、ＨＰＴＳの励起は４０５ｎｍにおいて最大波長である。これに対し、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ内部緩衝液は４０５ｎｍにおけるシグナルを減少させ、４５０ｎｍにおいて顕著な励起が出現した。Ｃｕの存在は、ＨＰＴＳシグナルを顕著に抑制し、銅が存在しない状態と比較して、約２０％まで抑制が認められた（図４Ｂ）。
【００３４】
この実験の一つの目的は、イリノテカンのＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームへの装填に続く内部の任意のｐＨの変化を解明することである。図４Ｃは、図４Ｂに記載されたものと同一のＣｕ含有リポソームの励起スキャンを示し、イリノテカンが既に記載された条件にて能動的に装填された点が例外である。４００ｎｍ未満において観察された励起強度の増大は、イリノテカン装填のアーチファクトである。イリノテカンは蛍光活性化合物であり、３６８ｎｍに励起波長を備えるとともに４２３ｎｍに発光波長を備える。この励起スキャンの注目すべき点は、ＣｕＳＯ４（ｐＨ３．５未満）非緩衝液を含むリポソーム製剤により約４５０ｎｍを中心として主要なシグナルが出現することである。これまでのスキャンから我々が観察できるように、ｐＨ３．５における我々の対照リポソーム製剤ではこの波長においては顕著なシグナルは存在していない（図４Ａ、図４Ｂ）。
【００３５】
図４Ｃに示されるイリノテカンの励起スキャンにおける効果を説明すると、ｐＨ７．５におけるＣｕ含有リポソームへのこの薬物の装填は、薬物が存在していない対照物と比較した場合、スキャンにおける明らかな変化は生じなかった（図４Ｂ）。
【００３６】
１．２．６  イリノテカンラクトン環の検出
イリノテカンは、７８％のトリエタノールアミン溶液（３ｖ／ｖ％）及び２２％のアセトニトリルを含む移動層を使用するＣ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ）にて分離した。薬物は蛍光発光により定量化した（ｌｅｘｃｉｔ＝３６３ｎｍ；ｌｅｍｉｓｓ＝４２５ｎｍ）。ピーク面積の分析結果は、ＣｕＳＯ４非緩衝液を含有するリポソームにおいてはイリノテカンの９６％がラクトン形として存在しており、４％がカルボキシレート形として存在していることを示している（図５）。ｐＨ７．５でＣｕＳＯ４の内部緩衝液を保有するリポソームに対する同様の値は、８３％のラクトンと１７％のカルボキシレートである。
【００３７】
イリノテカン対照及びイリノテカンリポソームのサンプルを、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１：１ｖ／ｖ）にて溶解し、ＴＬＣプレートにスポットした。薬物のラクトン形とカルボキシ形とは最初にＴＬＣプレートをＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：アセトン（９：３：１ｖ／ｖ／ｖ）の移動層にさらし、次にブタノール：酢酸：水：アセトン（４：２：１：１ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の移動層にさらすことにより分離した。薬物をＵＶ光にて視認化し、イリノテカンが主としてラクトン形にて存在していることを確認した（図６）。
【００３８】
１．２．７  インビボにおけるリポソーム安定性試験
リポソームの安定性の分析は、特定の時間における血漿中のフリーの脂質及びフリーの薬物のレベルを測定することにより決定した（図７乃至１０）。これらの結果は、ｐＨ３．５においてイオノフォアＡ２３１８７を備えたＣｕ２＋は、Ｍｇ２＋の使用、イオノフォアが存在しない場合、或いはｐＨ７．５における場合と比較して、リポソーム中にて優れた薬物保持性を提供することを示している（図９及び図１０）。
【００３９】
１．２．８  有効性試験
薬物イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を封入することの腫瘍体積に対する効果を図１１乃至１７に示した。ｐＨ７．５又はｐＨ３．５又はイオノフォアを伴うｐＨ３．５においてＣｕ２＋が存在する場合における封入化の効果を２種類の用量でのイリノテカン（ＣＰＴ−１１）にて比較した。ｐＨ３．５における封入化或いはイオノフォアを備えたｐＨ３．５における封入化はいずれもかなり効果的な治療計画を提供する。より詳細な分析（図１８による）では、イオノフォアを伴うｐＨ３．５におけるＣｕ２＋の存在下における封入は腫瘍の成長を最も遅延させ、殺細胞数の最も高い対数及び最も低用量（５０μモル／ｋｇ））にて優れた殺細胞数を示した。図１８において、Ｔ−Ｃは、対照腫瘍と比較して、処置された腫瘍の体積が４００％に増大するまでに要する日にちの差であり、成長遅延％＝（Ｔ−Ｃ）／Ｃ×１００であり、ここでＣは対照腫瘍が４００％に到達するのに要する実験日数であり；殺細胞数の対数（Ｌｏｇ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｌｌ）＝（Ｔ−Ｃ）／（３．３２×Ｔｄ）であり、ここでＴｄは対照腫瘍が二倍とのなるのに要する時間であり、かつ殺細胞％＝（１−（１／１０Ｘ））×１００であり、ここでｘは殺細胞数の対数である。
【００４０】
これらを合わせて考察すると、これらの有効性の結果は、イオノフォアを伴うＣｕ２＋とイリノテカンとからなる組成物は最も有用な組成物を提供することを示している。これは、この組成物が血漿中で最も安定しているという観察結果と一致する。
【００４１】
イリノテカン装填効率は、ＣｕＳＯ４を伴うリポソームを使用すると９０％を超えていた。内部の低ｐＨを維持するべくＡ２３１８７イオノフォアを組み込んだことは、銅を介在する装填の挙動に影響を与えないばかりか、血漿中で測定された場合にリポソームの薬物保持効果を顕著に高めた。更に、ＨＰＬＣ及びＴＬＣ試験は、遷移金属溶液の初期の内部ｐＨに関係なく、封入されたイリノテカンが臨床的に活性であるラクトン形にて主として存在していることを示す。この組成物は、血漿中での薬物の保持性を高め、インビボでの薬物の露出を増大させ、マウス異種移植モデルにおいて低用量のイリノテカンにて有効性を高めることができた。
【００４２】
要約すると、イリノテカンは、組成物中に、遷移金属Ｃｕ２＋及びイオノフォアを使用して、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソーム内に封入され、その組成物は優れた薬物保持性とインビボでの有効性とを提供する。
【実施例２】
【００４３】
２．１  血漿での薬物保持
図１９及び２０は、Ｒａｇ−２Ｍマウスにインビボで投与した後の血漿中の薬物対脂質の比を示す。各々の場合、投与された製剤は、図面の記号に示されているように、異なる内部溶液からなる同一のリポソーム組成物から構成されている。薬物がイリノテカンである場合（図１９）及びビノレルビンである場合（図２０）のいずれの場合においても、Ｃｕ２＋／Ａ２３１８７薬物装填技術により調製された製剤は、薬物対脂質のより高い相対比に示されるように、顕著に優れた血漿中での薬物保持性を示した。
【００４４】
２．２  異なるイリノテカン処置の薬物動態パラメータ
図２１は図１８に類似する表であり、異なるイリノテカン処置に対する薬物動態パラメータが要約されている。腫瘍成長の遅延は、Ｃｕ２＋／Ａ２３１８７薬物装填技術により調製された製剤の場合に最も効果的であった。図２１において、イリノテカンの血漿濃度曲線下面積（ＡＵＣ）は、Ｒａｇ−２Ｍマウスに対して単回量を静脈ボーラス投与（ｎ＝３／時点）した後に、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ薬物動態ソフトウェア（非コンパートメントモデル）を使用して計算した。イリノテカンの血漿平均滞留時間（ＭＲＴ）はＲａｇ−２Ｍマウスに対して一回量を静脈ボーラス投与（ｎ＝３／時点）した後に、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ薬物動態ソフトウェア（非コンパートメントモデル）を使用して計算した。成長遅延率（％）は、形成されたｓ．ｃ．ＬＳ１８０腫瘍（ヒト直腸結腸癌マウス異種移植）を有するＲａｇ−２Ｍマウスに一回量のイリノテカンを投与した後に計算した。成長遅延率（％）＝（Ｔ−Ｃ）／Ｃ×１００であり、ここでＣは対照腫瘍が４００％に到達するのに要する日にちであり、Ｔ−Ｃは対照腫瘍と比較した、処置腫瘍の体積が４００％に増大した日にちとの差である。イリノテカンリポソーム（３００ｍＭ  ＭｎＳＯ４＋Ａ２３１８７非緩衝液）に対する有効量の値は記載されていない。その理由は一対一の試験が実施されていないからである。われわれはこのマウスモデル及びこのリポソーム製剤に関する有効性のデータを既に発表した（メッセラー（Ｍｅｓｓｅｒｅｒ）他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第１０巻、６６３８−４９頁、２００４年）。
【００４５】
上述の開示を考慮すれば当業者には明らかなように、本発明の精神又は範囲を逸脱することなく、本発明の実施において種々の変更及び修正が可能である。従って、本発明の範囲は以下に記載の特許請求の範囲に定義されている実体に従うものと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】活性を有する閉環ラクトン形と不活性である開環カルボキシ形との間で存在する、ｐＨにより影響を受けるイリノテカンの動的平衡状態を示す化学式である。
【図２】ＣｕＯ４又はＺｎＳＯ４の封入された非緩衝溶液を含むリポソームを使用した場合の９０％を超えるイリノテカンの装填効率（薬物／脂質比）を示すグラフである。
【図３】ｐＨ７．５のＣｕＳＯ４緩衝液又はＣｕＳＯ４＋Ａ２３１８７イオノフォア（低ｐＨ環境を維持するものである）非緩衝液が封入されたリポソームを使用して、９０％を超えるイリノテカンの装填効率（薬物／脂質比）を示すグラフである。
【図４Ａ】薬物イリノテカンの装填に続くリポソーム内ｐＨを示す励起スキャンである。ｐＨ感受性の蛍光プローブであるＨＰＴＳは、ＣｕＳＯ４非緩衝液が封入されたリポソームの内部ｐＨがイリノテカンの能動装填に伴い増大していることを示唆する。
【図４Ｂ】薬物イリノテカンの装填に続くリポソーム内ｐＨを示す励起スキャンである。ｐＨ感受性の蛍光プローブであるＨＰＴＳは、ＣｕＳＯ４非緩衝液が封入されたリポソームの内部ｐＨがイリノテカンの能動装填に伴い増大していることを示唆する。
【図４Ｃ】薬物イリノテカンの装填に続くリポソーム内ｐＨを示す励起スキャンである。ｐＨ感受性の蛍光プローブであるＨＰＴＳは、ＣｕＳＯ４非緩衝液が封入されたリポソームの内部ｐＨがイリノテカンの能動装填に伴い増大していることを示唆する。
【図５】封入されたＣｕＳＯ４溶液が非緩衝液であるか、或いはｐＨ７．５の緩衝液であるかに関わらず、イリノテカンが主としてそのラクトン形として存在していることを示すＨＰＬＣプロットである。
【図６】封入されたＣｕＳＯ４溶液が非緩衝液であるか、或いはｐＨ７．５の緩衝液であるかに関わらず、イリノテカンが主としてそのラクトン形として存在していることを示すＴＬＣ分析結果を示す。
【図７】時間の経過に対する種々のリポソーム製剤の血漿内への脂質の放出を示すグラフである。
【図８】時間の経過に対する種々のリポソーム製剤の血漿内への脂質の放出（％）を示すグラフである。
【図９】時間の経過に対する薬物：脂質の相対比を示すグラフである。
【図１０】時間の経過に対する薬物放出（％）を示すグラフである。
【図１１】一回量のフリーの、又は封入されたＣＰＴ−１１を投与後のｓ．ｃ．ＬＳ１８０腫瘍体積（％）を示すグラフである。
【図１２】５０ｍｇ／ｋｇの一回量の、フリーの又は封入されたＣＰＴ−１１を投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１３】１００ｍｇ／ｋｇの一回量の、フリーの又は封入されたＣＰＴ−１１を投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１４】一回量のフリーのＣＰＴ−１１投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１５】一回量のｐＨ７．５で封入されたＣＰＴ−１１を投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１６】一回量のｐＨ３．５で封入されたＣＰＴ−１１を投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１７】一回量のｐＨ３．５＋イオノフォアで封入されたＣＰＴ−１１を投与後の腫瘍体積における増加（％）を示すグラフである。
【図１８】ＬＳ１８０ヒト腺癌細胞の皮下注射により形成された腫瘍を有するＳＣＩＤ／Ｒａｇ２Ｍマウスを治療するために使用される一回量のＣＰＴ−１１（フリー、またはＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ封入（５５：４４モル％））の分析から得られたデータをまとめた表である。
【図１９】Ｒａｇ−２Ｍマウスに一回量の静脈ボーラス投与（７３．８μモル／ｋｇ；５０ｍｇ／ｋｇ）をした後の血漿中におけるイリノテカン対脂質の相対比を示すグラフである。製剤は、凡例記号で示されているように、異なる内部溶液を備えた同一のリポソーム組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４４モル％））から構成されている。Ｃｕ２＋／Ａ２３１８７薬物装填技術により調製された製剤は、２４時間後におけるイリノテカン対脂質のより高い相対比により示されるように、血漿での薬物保持性に非常に優れていることを示す。
【図２０】Ｒａｇ−２Ｍマウスに一回量の静脈ボーラス投与（１８．５μモル／ｋｇ；２０ｍｇ／ｋｇ）をした後の血漿中におけるビノレルビン対脂質の相対比を示すグラフである。製剤は、凡例記号で示されているように、異なる内部溶液を備えた同一のリポソーム組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４４モル％））から構成されている。Ｃｕ２＋／Ａ２３１８７薬物装填技術により調製された製剤は、８時間後におけるビノレルビン対脂質のより高い相対比により示されるように、血漿での薬物保持性に非常に優れていることを示す。
【図２１】一回量（７３．８μモル／ｋｇ；５０ｍｇ／ｋｇ）の封入されていないイリノテカン又はリポソームイリノテカン（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４４モル％）；異なる技術により介在されたイリノテカン装填）をＲａｇ−２Ｍマウスに投与した分析からのデータをまとめた表である。異なるイリノテカン処置の薬物動態パラメータは、形成されたｓ．ｃ．ＬＳ１８０腫瘍（ヒト直腸結腸癌異種移植片）に対するそれらの治療効果を決定し、同治療効果に関連している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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