(57)【要約】【課題】哺乳動物の細胞または組織内に投与するワクチンのワクチン性質を改善するとともにワクチン製造を効率化する。【解決手段】組換え二重鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮｓ）の生成に有用なバクテリア・パッケージング株を提供する。このパッケージング株は、ワクチン抗原、生理活性あるタンパク質、免疫調節性のタンパク質、アンチセンスＲＮＡ、および触媒ＲＮＡ類をコードするＲＮＡを真核性の細胞または組織内で産生させるのに有用である。組換えｓｓＲＮＡを上記株に導入しパッケージして、ｒｄｓＲＮｓを新たに形成する。【選択図】図１
2008521434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子またはＲＮＡをパッケージングし、産生しおよび／または輸送するためのバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡと、
ｂ）ヌクレオカプシド（nucleocapsid）の産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージングおよびＲＮＡポリメラーゼの活性を備えるタンパク質からなる一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドと、
ｄ）前記一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドの中に含まれているｄｓＲＮＡ配列であって、少なくとも
ｉ）前記少なくとも一つの選択可能な表現型的変異体を相補する遺伝子産物と、
ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結されている所望のＲＮＡ
とを含むｄｓＲＮＡ配列
とを含むバクテリア株。
【請求項２】
ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配列が前記一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドの中に存在する請求項１記載のバクテリア株。
【請求項３】
ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配列が前記ゲノムＤＮＡの中に存在する請求項１記載のバクテリア株。
【請求項４】
プラスミドをさらに含み、ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配列が前記プラスミドの部分である請求項１記載のバクテリア株。
【請求項５】
ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配がＲＮＡファージまたはその機能性変異体のセグメントＬを含む請求項１記載のバクテリア株。
【請求項６】
前記一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドの中に含まれた前記ｄｓＲＮＡ配列がＲＮＡファージもしくはウイルスもしくはそれらの両方のセグメントＳまたはセグメントＭの少なくとも一部分を含む請求項１記載のバクテリア株。
【請求項７】
前記セグメントＳの前記一部分がセグメントＳ ｐａｃ配列である請求項６記載のバクテリア株。
【請求項８】
前記セグメントＳの前記一部分がセグメントＳ  ＲＮＡ依存のポリメラーゼ認識配列である請求項６記載のバクテリア株。
【請求項９】
前記セグメントＭの前記一部分がセグメントＭ ｐａｃ配列である請求項６記載のバクテリア株。
【請求項１０】
前記セグメントＭの前記一部分がセグメントＭ  ＲＮＡ依存のポリメラーゼ認識配列である請求項記載６のバクテリア株。
【請求項１１】
前記選択可能な表現型変異体が栄養要求性変異体である請求項１記載のバクテリア株。
【請求項１２】
前記栄養要求性変異体をａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ｌｅｕＤ、ａｓｄおよびｍｕｒ１からなる群から選択した請求項１記載のバクテリア株。
【請求項１３】
前記選択可能な表現型変異体が細胞膜合成変異体である請求項１記載のバクテリア株。
【請求項１４】
前記細胞膜合成変異体をａｓｄおよびｍｕｒ１から成る群から選択した請求項１３記載のバクテリア株。
【請求項１５】
前記選択可能な表現型変異体が３２℃以上の温度で成長を止める変異体である請求項１記載のバクテリア株）。
【請求項１６】
前記３２℃以上の温度で成長を止める前記選択可能な表現型変異体がｈｔｒＢである請求項１５記載のバクテリア株。
【請求項１７】
ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備える前記タンパク質並びにファージまたはウイルスのヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配列を、ｐｈｉ−６、ｐｈｉ−７、ｐｈｉ−８、ｐｈｉ−９、ｐｈｉ−１０、ｐｈｉ−１１、ｐｈｉ−１２、およびｐｈｉ−１３から成る群から選択したファージに由来する請求項１記載のバクテリア株。
【請求項１８】
前記バクテリア株を、カンピロバクター（Campylobacter）、ナイセリア（Neisseria）、ヘモフィルス（Haemophilus）、エロモナス（Aeromonas）、フランシセラ（Francisella）、エルシニア（Yersinia）、クレブシエラ（Klebsiella）、ボルデテラ（Bordetella）、レジオネラ（Legionella）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、クラミジア（Chlamydia）、ブルセラ（Brucella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ヘリコバクター（Helicobacter）、シトロバクター（Citrobacter）、ビブリオ（Vibrio）、エシェリキア（Escherichia）、シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）、リステリア(Listeria)、およびマイコバクテリウム(Mycobacterium)から成る群から選択したバクテリア種属に由来する請求項１記載のバクテリア株。
【請求項１９】
前記所望のＲＮＡが、ウイルス抗原、バクテリア抗原、寄生生物抗原、癌抗原、移植抗原、自動免疫抗原、アジュバントおよびサイトカインから成る群から選択したタンパク質をコードする請求項１記載のバクテリア株。
【請求項２０】
組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮ）であって、
ａ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質と、
ｂ）少なくとも、ｉ）遺伝子産生物、およびii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結された所望のＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡ配列と
を含む組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド（ｒｄＲＮ）。
【請求項２１】
ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列をさらに含む請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２２】
前記核酸配列がＲＮＡファージまたはその機能性変異体のセグメントＬから成る請求項２１記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２３】
前記ｄｓＲＮＡ配列が、少なくともＲＮＡファージのセグメントＳの、またはＲＮＡファージのセグメントＭの、またはそれら双方の少なくとも一部分からなる請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２４】
前記セグメントＳの前記一部分がセグメントＳ  ｐａｃ配列、遺伝子８または野生型セグメントＳである請求項２３記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２５】
前記セグメントＳの前記一部分がセグメントＳ  ＲＮＡ依存のポリメラーゼ認識配列である請求項２３記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２６】
前記セグメントＭの前記一部分がセグメントＭ  ｐａｃ配列である請求項２３記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２７】
前記セグメントＭの前記一部分がセグメントＭ  依存のポリメラーゼ認識配列である請求項２３記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２８】
前記遺伝子産生物が宿主細胞の中で選択可能な表現型的変異体を相補する請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項２９】
前記表現型的変異体を、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、およびｌｅｕＤから成る群から選んだ請求項２８記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３０】
前記所望の遺伝子が細胞壁合成変異体をコードする請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３１】
前記細胞壁合成変異体をａｓｄおよびｍｕｒ１から成る群から選んだ請求項３０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３２】
前記所望の遺伝子が、３２℃以上の温度で成長を止める変異体をコードする請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３３】
前記所望の遺伝子がｈｔｒＢである請求項３２記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３４】
前記ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備える前記タンパク質が、ｐｈｉ−６、ｐｈｉ−８、およびｐｈｉ−１３から成る群から選択したファージに由来する請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３５】
前記所望のＲＮＡが、ウイルス抗原、バクテリア抗原、寄生生物抗原、癌抗原、移植片抗原、自己免疫抗原、アジュバントおよびサイトカインから成る群から選択したタンパク質をコードする請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３６】
一つまたはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡ配列がフッ素化されている請求項２０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項３７】
バクテリア細胞を含むワクチン製剤であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡと、
ｂ）ヌクレオカプシドの産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質からなる一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドと、
ｄ）前記ヌクレオカプシドの中に含まれるｄｓＲＮＡ配列であって、少なくとも
ｉ）遺伝子産物、および
ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した免疫原をコードするＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡ配列と
を含むワクチン製剤。
【請求項３８】
一つまたはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡ配列がフッ素化されている請求項３７記載のワクチン製剤。
【請求項３９】
組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシドを含むワクチン製剤であって、
ａ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質と、
ｂ）ｄｓＲＮＡ配列であって、少なくとも
ｉ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結された免疫原をコードするＲＮＡと、
iii）ファージまたはウイルスのヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と
をコードするｄｓＲＮＡ配列と
を含むワクチン製剤。
【請求項４０】
バクテリア・パッケージング株として用いるための組換えバクテリアを生成する方法であって、
少なくとも一つの選択可能な表現型変異体をバクテリアのゲノムＤＮＡに導入する過程と、
前記バクテリアを、機能的な二本鎖ＲＮＡファージ・ヌクレオカプシドタンパク質をコードするＤＮＡを含むように遺伝子操作する過程と、
ｍＲＮＡセグメントであって、ｉ．少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する機能的産生物をコードする少なくとも一つの遺伝子と、ii．機能的な二本鎖ＲＮＡファージ・ヌクレオカプシドタンパク質とをコードするｍＲＮＡセグメントを前記バクテリアに挿入する過程と
を含む方法。
【請求項４１】
前記ｍＲＮＡセグメントが所望の遺伝子をさらにコードする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
ｄｓＲＰプロキャプシドを発現するとともに、ｒｄｓＲＮの選択および維持を可能にする変異体を発現し、前記ｒｄｓＲＮが前記変異体を相補する機能的遺伝子を発現する一つまたはそれ以上のＤＮＡ配列を内部に保持する変異バクテリア。
【請求項４３】
前記細胞膜合成変異体がａｓｄである請求項１４記載のバクテリア株。
【請求項４４】
ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備える前記タンパク質、並びにファージまたはウイルスのヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする前記核酸配列がファージｐｈｉ−８由来であり、ファージｐｈｉ−８の遺伝子８を含む請求項１７記載のバクテリア株。
【請求項４５】
前記バクテリア株がシゲラ（Shigella）由来である請求項１８記載のバクテリア株。
【請求項４６】
前記タンパク質がバクテリア抗原である請求項１９記載のバクテリア株。
【請求項４７】
前記バクテリア抗原が結核抗原である請求項４６記載のバクテリア株。
【請求項４８】
前記細胞壁合成変異体がａｓｄである請求項３１記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項４９】
前記ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備える前記タンパク質がファージｐｈｉ−８由来であり、ファージｐｈｉ−８の遺伝子８を含む請求項３４記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項５０】
前記タンパク質がバクテリア抗原である請求項３５記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項５１】
前記バクテリア抗原が結核抗原である請求項５０記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項５２】
前記所望のＲＮＡがアポトーシス増強タンパク質をコードする請求項１記載のバクテリア株。
【請求項５３】
前記アポトーシス増強タンパク質を、カスパーゼ８、細胞死受容体―５、ＦａｓおよびＦａｓ細胞質領域／ＣＤ４外部ドメイン融合タンパク質から成る群から選択した請求項５２記載のバクテリア株。
【請求項５４】
前記所望のＲＮＡが寛容性誘発タンパク質をコードする請求項１記載のバクテリア株。
【請求項５５】
前記寛容性誘発タンパク質がカスパーゼ９である請求項５４記載のバクテリア株。
【請求項５６】
前記所望のＲＮＡがアポトーシス増強タンパク質をコードする請求項２０記載の組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類。
【請求項５７】
前記所望のＲＮＡが寛容性誘発タンパク質をコードする請求項２０記載の組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類。
【請求項５８】
前記ｄｓＲＮＡが核酸分解酵素抵抗性のＲＮＡを含む請求項１記載のバクテリア株。
【請求項５９】
前記核酸分解酵素抵抗性のＲＮＡがフッ素化ＲＮＡである請求項５８記載のバクテリア株。
【請求項６０】
前記ｄｓＲＮが核酸分解酵素抵抗性のＲＮＡを含む請求項２０記載の組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類。
【請求項６１】
前記核酸分解酵素抵抗性のＲＮＡがフッ素化ＲＮＡである請求項６０記載の組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類。
【請求項６２】
ｒｄｓＲＮをパッケージングし、送り出し、産生するためのバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体から成るゲノムＤＮＡと、
ｂ）プロカプシドの産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質から成る一つまたはそれ以上のプロカプシド類と
を含むバクテリア株。
【請求項６３】
ｒｄｓＲＮの送り出しのためのフッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ｉ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項６４】
フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ｉ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ii）ヌクレオカプシド産生の安定化のための遺伝子８（配列ＩＤ番号：７）と、
iii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項６５】
フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ｉ）ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子と、
ii）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
iii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項６６】
フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ｉ）ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子と、
ii）前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
iii）ヌクレオカプシド産生の安定化のための遺伝子８（配列ＩＤ番号：７）と、
iv）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項６７】
電気穿孔培地であって、
ｉ）ｒｄｓＲＮをパッケージングし、送り出し、および産生するためのバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡと、
ｂ）プロカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質からなる一つまたはそれ以上のプロカプシドと
を含むバクテリア株と、
ii）フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ａ）前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ｂ）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列と
を含む電気穿孔培地。
【請求項６８】
電気穿孔培地であって、
ｉ）ｒｄｓＲＮをパッケージングし、送り出し、および産生するためのバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡと、
ｂ）プロカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質からなる一つまたはそれ以上のプロカプシドと
を含むバクテリア株と、
ii）フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ａ）前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ｂ）ヌクレオカプシド産生の安定化のための遺伝子８（配列ＩＤ番号：７）と、
ｃ）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列と
を含む電気穿孔培地。
【請求項６９】
電気穿孔培地であって、
ｉ）ｒｄｓＲＮをパッケージングし、送り出し、および産生するためのバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡと、
ｂ）プロカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列と、
ｃ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質からなる一つまたはそれ以上のプロカプシドと
を含むバクテリア株と、
ii）フッ素化ＲＮＡ配列であって、少なくとも、
ａ）ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子と、
ｂ）前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体を相補する遺伝子産生物と、
ｃ）ヌクレオカプシド産生の安定化のための遺伝子８（配列ＩＤ番号：７）と、
ｄ）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で連結した所望のＲＮＡと
をコードするフッ素化ＲＮＡ配列と
を含む電気穿孔培地。
【請求項７０】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項１記載のバクテリア株。
【請求項７１】
前記選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項２８記載のｒｄｓＲＮ。
【請求項７２】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項３７記載のワクチン製剤。
【請求項７３】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項３９記載のワクチン製剤。
【請求項７４】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項４０記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６２記載のバクテリア株。
【請求項７６】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６３記載のフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項７７】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６３記載のフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項７８】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６４記載のフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項７９】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６５記載のフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項８０】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６６記載のフッ素化ＲＮＡ配列。
【請求項８１】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６７記載の電気穿孔培地。
【請求項８２】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６８記載の電気穿孔培地。
【請求項８３】
前記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体が非復帰の選択可能な表現型変異体である請求項６９記載の電気穿孔培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換え二重鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮｓ）、すなわちワクチン抗原、生理活性のタンパク質、免疫調節性のタンパク質、アンチセンスＲＮＡ類、および触媒ＲＮＡｓをコードするＲＮＡを真核性の細胞または組織内において産生させるための二重鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮｓ）を生成させるのに有用なバクテリア・パッケージング株を提供する。より詳しくいうと、本発明はバクテリア・パッケージング株、すなわち組換えｓｓＲＮＡを導入しパッケージングするパッケージング株であって所望のＲＮＡを産生するｒｄｓＲＮｓを新たに形成するバクテリア・パッケージング株を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス・ヌクレオカプシド類、ウイルス・ヌクレオカプシドタンパク質コアは生物学的システムにおける異種遺伝子配列の発現に際し価値ある多数の特徴を発揮する。完全なウイルスの外膜や付着因子を欠いた状態では、ヌクレオカプシド類は、核酸配列をカプセル化し複製する能力を保持するウイルスコアのタンパク質と遺伝子物質とからなる非感染性粒子である。従って、感染や環境伝播の危険性は、親ウイルスにおける膜、付着因子、プロテアーゼ、およびそれら以外の感染性または細胞溶解性の要因をコードする配列の除去により和らげ得る。ＲＮＡヌクレオカプシド類はこのような遺伝子発現システムの安全性を、ウイルス複製サイクルにおけるＤＮＡ段階を示さないウイルス前駆物質の選択によりさらに改善し、外来ヌクレオチド配列が前記ＲＮＡヌクレオカプシドの導入先の細胞または器官でゲノムに取り込まれる危険性を少なくする。ＲＮＡに付きものの不安定性は、上記ヌクレオカプシド類発現システムを設計する際に二本鎖ＲＮＡ（以下、“ｄｓＲＮＡ”という）ウイルスを使用すれば解消することができる。更に、非ヌクレオカプシド配列の除去およびｄｓＲＮＡウイルスのゲノムの典型的分節化により、除去配列の代わりに導入される人工ゲノムセグメントの設計および外来遺伝子のコード化の設計が、所望遺伝子の発現または所望ＲＮＡの生物システムへの輸送に魅力的手段となる。このように、組換えヌクレオカプシド発現システムは、追加のヌクレオカプシド類、所望の異種配列、および細胞内におけるそれらの増殖や産生に必要な配列の産生のみをコードするのに必要な配列を含むように設定できる。
【０００３】
シストウイルス（cystoviridae）科の二本鎖ＲＮＡファージ（以下、“ｄｓＲＰ”と表記する）はプロトタイプのｄｓＲＮＡウイルスである(非特許文献１)；(非特許文献２)；(非特許文献３)；(非特許文献４)；(非特許文献５)。シストウイルスｄｓＲＰの顕著な特質は三つの二本鎖ＲＮＡ（以下、“ｄｓＲＮＡ”と表記する）セグメント、すなわちセグメントＬ、セグメントＭ、およびセグメントＳ、並びに脂質含有皮膜と表示されたセグメントからなるゲノムであることである(非特許文献２)；(非特許文献３)；(非特許文献４)；(非特許文献６)；(非特許文献７)。これらゲノムセグメントはタンパク質Ｐｌ、Ｐ２、Ｐ４、およびＰ７から成り、ｄｓＲＮＡセグメントＬ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５１）上にコードされる遺伝子によって産生されるヌクレオカプシドコアの中に収納される。正のストランドＲＮＡ（以下、“ｍＲＮＡ”と表記）の合成はヌクレオカプシド内で生じ、セグメントＬ上の遺伝子２(非特許文献４)により一部コードされたＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼによって実施される(非特許文献８)。セグメントＬ上の遺伝子７もｍＲＮＡ合成に際し役割を果たす(非特許文献５)。
【０００４】
ｄｓＲＮＡファージのこの科の原型株、ｄｓＲＰ  ｐｈｉ−６は通常シリンゲ菌（Pseudomonas
syringae）に感染する(非特許文献５)が、より最近では、分離株ｄｓＲＰ  ｐｈｉ−８、ｐｈｉ−１１、ｐｈｉ−１２およびｐｈｉ−１３が大腸菌（Escherichia
coli）株ＪＭ１０９(American type tissue culture collection(以下、 “ＡＴＣＣ”と表記)＃５３３２３)や、サルモネラ・エンテリカ・セロヴァール・ティフィムリウム（Salmonella
enterica serovar Typhimurium）（以下、“Ｓ． ティフィムリウム”と表記する）のＯ−抗原負の変異株にある程度感染し複製することができる(非特許文献５)；(非特許文献８)；(非特許文献９)；(非特許文献１０)。
【０００５】
バクテリアの中での原型株ｄｓＲＰ  ｐｈｉ−６のライフサイクルは既に文献に記載されている(非特許文献１１)；(非特許文献８)。Ｐｈｉ−６は、宿主細胞膜との接触を許す繊毛に結合することにより宿主に感染し、ヌクレオカプシドのペリプラズムへの融合と導入が生じる。ヌクレオカプシドはそれから細胞質に運ばれ、この現象はタンパク質Ｐ５のエンドペプチダーゼ活性およびタンパク質Ｐ８の輸送能力を必要とする。興味深いことに、完全ｐ８シェルを持つヌクレオカプシドは自然にバクテリア・プロトプラストに入ることができ、プロプラストの調製元となるバクテリア株の自動的形質移入を生じさせる(非特許文献１２)；（非特許文献１３)。
【０００６】
細胞質に入る際に、Ｐ８は取り去られて残存ヌクレオカプシド、すなわち上記三つのｄｓＲＮＡセグメントを含みＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する残存ヌクレオカプシドがｄｓＲＮＡセグメントＬ、Ｍ、およびＳのｍＲＮＡコピーを合成し始める。セグメントＬにより生成されたタンパク質は主にプロキャプシド産生に関与し、セグメントＭは主に付着タンパク質の合成に専ら関与し、セグメントＳはプロキャプシド・シェルタンパク質（Ｐ８）、溶解性エンドペプチダーゼ（Ｐ５）および脂質外皮の生成関与のタンパク質（Ｐ９およびＰ１２）を生成する(非特許文献１４)。ｄｓＲＮＡセグメントのパッケージングは逐次的に行われる。すなわち、セグメントＳが認識されて空のプロキャプシドに取り込まれ、セグメントＳ含有のプロキャプシドがこのセグメントの結合能力を失ってセグメントＭとの結合取り込み能力を取得し、セグメントＳおよびＭ含有のプロキャプシドがこのセグメントとの結合能力を失ってセグメントＬとの結合取り込み能力を取得し、その結果ヌクレオカプシドを生成する。ヌクレオカプシドが三種の一本鎖ＲＮＡ（以下、“ｓｓＲＮＡ”と表記）セグメント全部を含有すると、負のＲＮＡストランドの合成が始まり、ｄｓＲＮＡセグメントを生成する。このヌクレオカプシドは次にタンパク質５と８と結びついて最終的には脂質膜の中に包み込まれ、その結果ファージ集合体が完成する。宿主細胞の溶解は、膜崩壊タンパク質Ｐ１０、すなわちセグメントＭの生成物の蓄積により生じると考えられ、エンドペプチダーゼＰ５を必要とする(非特許文献８)。
【０００７】
セグメントＬのｃＤＮＡ複製物を発現する大腸菌ＪＭｌ０９誘導体から精製されたプロキャプシドは、精製ｓｓＲＮＡセグメントＬ、Ｍ、およびＳをパッケージすることができる(非特許文献８)；(非特許文献１２)ので、ｄｓＲＰプロキャプシドにおけるＲＮＡポリメラーゼ活性の集合体は宿主タンパク質を必要としない。上記生体外（in
vitro）システムへのｓｓＲＮＡセグメントの取り込みに続いてリボヌクレオチドを追加することにより、負のストランドの合成および完成ｄｓＲＮＡセグメントの生成が得られる。更に、ｄｓＲＮＡ合成の完了後、Ｐ８がヌクレオカプシドと結合し、上述のとおり、結果物がバクテリア原形質体に入り、増殖性感染を生じさせ得る(非特許文献１２)。
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願２００４０１３２６７８号
【非特許文献１】Sinclair等、J Virol. 16:685; 1975
【非特許文献２】Mcgraw等、J Virol. 58:142; 1986
【非特許文献３】Gottlieb等、Virology 163:183; 1988
【非特許文献４】Mindich等、J Virol. 62:1180; 1988
【非特許文献５】Mindich、Microbiol. MoI. Biol. Rev. 63、149;1999
【非特許文献６】Sands and Lowlicht, Can J Microbiol,22:154; 1976
【非特許文献７】Bamford, and Palva, Biochem Biophys Acta,601:245; 1980
【非特許文献８】Mindich等、J. Bacteriol, 181:4505; 1999
【非特許文献９】Hoogstraten等、Virology, 272: 218; 2000
【非特許文献１０】Qiao等、Virology 275: 218; 2000
【非特許文献１１】Mindich、Adv Virus Res、35:137; 1988
【非特許文献１２】Qiao等、Virology 227:103; 1997
【非特許文献１３】Olkkonen等、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9173; 1990
【非特許文献１４】Johnson and Mindich, J Bacteriol, 176:4124; 1994
【非特許文献１５】Mindich, Adv Virus Res 53:341; 1999
【非特許文献１６】Onodera等、J Virol 66:190; 1992
【非特許文献１７】Mindich, Adv Virus Res 53:341; 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまでの研究報告は組換えｄｓＲＰ（以下、“ｒｄｓＲＰ”と表記）の生成を記載している(非特許文献１５);(非特許文献１６)。単純なｒｄｓＲＰはカナマイシン耐性の対立遺伝子をｄｓＲＰ  ｐｈｉ−６のセグメントＭに挿入することにより構築された。この組換えセグメントを内部に保持するｒｄｓＲＰが、組換えセグメントＭを発現するプラスミドを内部に保持するＪＭ１０９を野生種のｄｓＲＰ  ｐｈｉ−６で感染させることにより分離された。この手段によりキャリア状態が宿主細胞に定着し、感染性のｒｄｓＲＰがキャリア株によって絶えず産生された(非特許文献１６)；(非特許文献１７)。キャリア株によって生成したファージのプラーク形成能力は３−５プレート継代では維持されたが、追加の継代の後では初期ファージはもはやキャリア株上にプラークを形成せず、低レベルの感染性ファージを生成するに留まった(非特許文献１６)。幾つかの事例では、多数のキャリア株が感染性ファージを生成する能力を一斉に失い、それらのバクテリア株からのｄｓＲＮＡは一つ以上のセグメントで欠失を示した（非特許文献１６）。一つの事例では、セグメントＳを欠く変異体ファージを、ファージ産生能力を失ったそれらキャリア株の一つから分離した。いずれの事例も、このシステムを真核性の細胞または組織での機能に適用するとの明示的目的をもってｒｄｓＲＮを構築したものではない。したがって、この方法により生成したｒｄｓＲＰはもともと不安定であり、ファージ集合体や複製の分析には有用でなく、公知技術の提供するｒｄｓＲＰはバイオテクノロジー用や量産には適合していない。
【００１０】
真核細胞内でｍＲＮＡを発現できるｒｄｓＲＰが開発される可能性があり、そのようなｒｄｓＲＰは、ワクチン抗原、生物活性タンパク質、免疫調節タンパク質、アンチセンスＲＮＡ類、および真核性の細胞または組織における触媒ＲＮＡ類の発現に有用であり得ると最近提言された（特許文献１、米国特許出願番号２００４０１３２６７８、出願人：Hone。ここにこの番号を参照して、その内容を本明細書に組み入れる）。上記米国特願２００４０１３２６７８（特許文献１）はｒｄｓＲＰの有用性について広範囲の情報を提供し、モデルｒｄｓＲＰを記載し、その生成方法および使用方法を提案している。しかし、２００４０１３２６７８（特許文献１）は、如何にしてｒｄｓＲＰを新たに送り出すか、またｒｄｓＲＰを内部に保有し複製する安定なキャリア株を如何にして生成し分離するかについての手引きは何ら提案していない。この２００４０１３２６７８（特許文献１）における一例では、所望の組換えセグメントを発現するプラスミドを有するバクテリア形質転換体において親ｄｓＲＰを複製することにより多数のｒｄｓＲＰを生成できると提案している。このようなｒｄｓＲＰが四つのｄｓＲＮＡセグメント（すなわち、この三つの野生型セグメントおよび組換えセグメント）を内部に保有するかどうか、またはこのようなｒｄｓＲＰが三つのｄｓＲＮＡセグメント、すなわち二つの野生型セグメントおよび組換えセグメントを内部に保有するかどうかについてこの記載は明らかにしていない。いずれの場合も、ｒｄｓＲＰが増殖について野生型ヘルパーファージに如何に依存しているか不明であり、ｒｄｓＲＰが如何に野生型ｄｓＲＰから分離されるかも不明である。さらに、２００４０１３２６７８（特許文献１）は組換えセグメントをｄｓＲＰに安定して導入する特定の方法を提供せず、ｒｄｓＲＰの後続の複製および安定な産生のための特定の方法をごくわずかに留意しているだけである。また、２００４０１３２６７８（特許文献１）は野生型セグメントＭおよびセグメントＳを共に欠く安定なｒｄｓＲＰ組成物を提供しない。また、２００４０１３２６７８（特許文献１）は、セグメントＬを発現しプロキャプシドを生成し、したがってｒｄｓＲＰを新たに送り出し、ｒｄｓＲＰｓを安定的に生成することができるパッケージング株を提供しない。
【００１１】
したがって、２００４０１３２６７８（特許文献１）はパッケージング株の生成およびｒｄｓＲＰの安定的な生成を当業者に可能にするような十分な情報を提供していない。更に２００４０１３２６７８（特許文献１）は、本発明の課題であるところの、新規ｒｄｓＲＮ組成物もしくはパッケージング株、またはｒｄｓＲＮｓの送り出し、安定的な生成および使用の方法の検討または示唆を含んでいない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮ）は少なくとも一つのｄｓＲＮＡセグメント、すなわち機能性二本鎖ＲＮＡウイルスまたはバクテリアファージのヌクレオカプシドのタンパク質をコードするｄｓＲＮＡセグメントと、一つまたはそれ以上の組換えｄｓＲＮＡセグメント、すなわち宿主（例えばバクテリア）細胞の中で選択可能な栄養要求性変異、細胞壁変異または氷結温度以上での成長を阻止する変異などの表現型変異を相補する機能性物質をコードする少なくとも一つの遺伝子を包含する組換えｄｓＲＮＡセグメントを含む。好ましくは、上記ｄｓＲＮセグメントは、アジュバンド付きまたはアジュバンドなしの免疫原などの所望の異種遺伝子をコードするＲＮＡを包含する。上記ｒｄｓＲＮ’ｓにより生成されるｍＲＮＡの機能は本機能に限られないが、このＲＮＡは免疫応答を引き出すワクチンに本発明を使用することを可能にする。このようにして生成されたＲＮＡはアジュバント類、免疫調節タンパク質、治療タンパク質、その他の生物活性タンパク質をコードでき、このＲＮＡ自身がｓｉＲＮＡまたは触媒ＲＮＡとして機能することもあり得る。ｒｄｓＲＮｓは安定性、取り扱い易さ、および安全性などの点で、ｒｄｓＲＰｓよりも利点を有する。このｒｄｓＲＮは選択可能な表現型変異体を包含するバクテリア・パッケージング株細胞の中で保持され、これによりそのバクテリア・パッケージング株の中でｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にする。
【発明の効果】
【００１３】
バクテリア・パッケージング株であって、その株でプロキャプシドを発現するｄｓＲＰｐｈｉ−８のセグメントＬをコードする配列、並びにその株で機能性ａｓｄ遺伝子を発現するｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にするａｓｄ変異体から構成される株、およびそれと同等の株を提供し、哺乳類用ワクチンの改良を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の具体例を図１−３に概略的に図示する。図１−３の各々において、１０はバクテリア細胞を表し、２０はバクテリア細胞１０のゲノムＤＮＡを表し、３０は（パッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質から成る）ヌクレオカプシドを表し、３１（ヌクレオカプシド３０の中の三本の波状線）はヌクレオカプシド３０の中に含まれるｄｓＲＮＡを表す。同様に、図１−３の各々において、２１はゲノムＤＮＡ２０の中で選択可能な表原型変異体を表す。
【００１５】
図１−３の各々に見られるとおり、二つの要素４０および４１は首尾一貫してｄｓＲＮＡ３１に結びついている。４０は選択可能な表現型変異体２１を相補する遺伝子産物をコードする核酸配列を表し、４１は所望のＲＮＡをコードする核酸配列を表す。
【００１６】
第３の要素４２が図１−３の各々に見られるが、その位置は多様である。４２はヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子（すなわち、パッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子）をコードする核酸配列を表す。図１は核酸配列４２がヌクレオカプシド３０内のｄｓＲＮＡ配列３１の中に存在する本発明の具体例を図解する。図２に示した本発明のもう一つの具体例では、核酸配列４２はバクテリアゲノム２０の中に存在する。図３に示した本発明のさらにもう一つ具体例では、バクテリア細胞１０もプラスミド（７０）を包み、核酸配列４２がプラスミド７０の上に存在する。
【００１７】
本発明の一つの目的は、バクテリア・パッケージング株であって、その株の中のｄｓＲＰプロキャプシド（procapsids）と変異体、すなわちその株の中でその変異体を相補する機能性遺伝子を発現するｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にする変異体をコードする配列からなるバクテリア・パッケージング株を提供することにある。一つの具体例は、遺伝子またはＲＮＡをパッケージし、産生しおよび／または輸送するためのバクテリア株、すなわち（ａ）少なくとも一つの選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ、（ｂ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質からなる一つまたはそれ以上のヌクレオカプシド、（ｃ）上記一つまたはそれ以上のヌクレオカプシドの中に含まれるｄｓＲＮＡ配列であって、（ｉ）少なくとも一つの選択可能な表現型的変異体を相補する遺伝子産物および（ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で結合された所望のＲＮＡを少なくともコードするｄｓＲＮＡ配列、並びに（ｄ）ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列を含むバクテリア株を提供する。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、ｒｄｓＲＮｓを生成する生成方法であって、組換えＲＮＡセグメントをバクテリア・パッケージング株に導入し、パッケージして、真核翻訳発現カセットを包含する組換えヌクレオカプシドを形成し、それによって新たに（de novo）ｒｄｓＲＮｓを生成する生成方法を提供することにある。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの目的はバクテリア株の中で安定的に複製されるｒｄｓＲＮｓを提供することにある。一つの具体例では、組換え二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｒｄｓＲＮＡ）であって、（ａ）ＲＮＡパッケージング活性およびＲＮＡポリメラーゼ活性を備えるタンパク質、並びに（ｂ）少なくとも（ｉ）遺伝子生産物および（ii）真核性の翻訳開始配列に動作可能な形で結合される所望のＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡ配列を含むｒｄｓＲＮＡを提供する。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの目的は、正の選択対立遺伝子や機能性の真核性の翻訳発現カセットをコードする一つまたはそれ以上のｒｄｓＲＮＡセグメントを内部に保持するｒｄｓＲＮを安定的に産生するバクテリア株を提供することである。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの目的はアルファウイルス発現カセットを保持するｒｄｓＲＮｓを安定的に産生するバクテリア株を提供することにある。そのウイルスの例としては、限定的ではないが、セムリキ森林ウイルス（Semliki forest virus）(Berglundほか、Vaccine 17:497; 1999)またはヴェネズエラ馬脳炎（以下、“ＶＥＥ”と表記）ウイルス(Davisほか、J
Virol 70:3781; 1996)；(Caleyほか、J Virol 71:3031; 1997)が挙げられる。
【００２２】
本発明のさらにもう一つの目的は、ｒｄｓＲＮｓを真核細胞および組織に投与する方法、並びにｒｄｓＲＮｓを用いて免疫応答を誘導し、または目標の細胞集団に生物学的効果を発揮させる方法を提供することにある。
【００２３】
本発明のさらにもう一つの目的はｒｄｓＲＮｓをパッケージできる生きたバクテリアベクターを提供することにある。
【００２４】
本発明のさらにもう一つの目的はｒｄｓＲＮｓを安定に維持できる生きたバクテリアベクターを提供することにある。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの目的はバクテリアベクター株の中で複製することができるｒｄｓＲＮｓを提供することにある。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの目的はｒｄｓＲＮｓを哺乳動物の細胞および組織に輸送する方法を提供することにある。
【００２７】
本発明のさらにもう一つの目的はｒｄｓＲＮｓを保持する上記バクテリアベクターを、免疫応答を引き起こし、または、目標の細胞または組織に生物学的効果を生じさせるように使用する方法を提供することにある。
【００２８】
本発明の宿主バクテリアにより囲い込まれた選択可能な表現型変異体は、好ましい具体例では、非復帰性の選択可能な表現型変異体である。
【００２９】
本発明のさらにもう一つの目的は、上記バクテリアやｄｓＲＮｓを含む電気穿孔（エレクトロポレーション）媒体を提供することである。さらにもう一つの具体例では、ｄｓＲＮＡｓの構成物をコードする種々のフッ素化ＲＮＡｓを提供する。
【００３０】
本発明のこれらの目的、およびそれら以外の目的は以下に述べる本発明の詳細な説明により明らかになるであろう。具体例として、バクテリア・パッケージング株であって、その株でプロキャプシドを発現するｄｓＲＰ  ｐｈｉ−８のセグメントＬをコードする配列、並びにその株で機能性ａｓｄ遺伝子を発現するｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にするａｓｄ変異体から構成される株を説明する。また、ワクチン抗原類およびレポーター類をコードするプロトタイプｒｄｓＲＮを説明し、それらｒｄｓＲＮの、コードされた抗原類やレポーター類を哺乳類細胞（context）に発現させる能力を明示する。
【００３１】
［本発明の好ましい具体例の詳細な説明］
１．バクテリア・パッケージング株の構築
本発明は、ＤＮＡ配列を有するバクテリア・パッケージング株であって、そのＤＮＡが機能性の二本鎖ＲＮＡファージ／ウイルス（ｄｓＲＰ）プロキャプシドタンパク質をコードするとともに、その株の中で発現し、プロキャプシドの構築およびｄｓＲＮＡのパッケージングが二本鎖ＲＮＡヌクレオカプシド類（ｄｓＲＮ）を形成できるようにする。また、このｄｓＲＮＡを、例えば導入遺伝子などの機能性の所望遺伝子をコードし発現する配列を含むように遺伝子操作できる。すなわち、ｄｓＲＮＡは組換えｄｓＲＮＡ（ｒｄｓＲＮＡ）であり、ヌクレオカプシド類は組換えｄｓＲＮ（ｒｄｓＲＮ）である。上記パッケージング株は、その株の中に選択可能で致命的な欠陥を生じさせる遺伝子変異体をも含む。それらｒｄｓＲＮｓは、変異により生じた選択可能な欠陥を補い、それによってバクテリア・パッケージング株の中のｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にする機能性の遺伝子をコードし発現するように、遺伝子操作できる。
【００３２】
ｒｄｓＲＮの中には、ｄｓＲＮＡファージの次の要素、すなわちセグメントＬ、セグメントＳ  ｐａｃ配列、セグメントＳ ＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ認識配列、セグメントＭ  ｐａｃ配列、およびセグメントＭ  ＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ認識配列が含まれる。正の選択対立遺伝子は、例えばセグメントＳ上の遺伝子８のリボソーム結合部位またはセグメントＭ上の遺伝子８のリボソーム結合部位、またはそれらの両方に結合するようにファージに遺伝子操作するそれ以外の所望遺伝子を、機能性ｄｓＲＮ類の産生に不要なＳセグメントおよびＭセグメントの領域を置き換えすることによりＳセグメントおよび／またはＭセグメントに遺伝子操作で組み込み得る。代わりに、このＳセグメントおよびＭセグメントを完全に除去して、所望配列で置き換えることもできる。以下の説明において、“組換えセグメント”は遺伝子操作を施したＳセグメントおよび／またはＭセグメント、またはＳセグメントおよび／またはＭセグメントを置き換えた所望配列を意味する。
【００３３】
この明細書に記載するシステムはどの二本鎖ＲＮＡファージまたはウイルスを用いても機能するが、後述の実施例で述べるｐｈｉ−８ｒｄｓＲＮシステムは機能発揮のためにシストウイルス科（cystoviridae）のゲノム（genome(s)）の次の要素を用いるのが好ましい：
（ｉ）セグメントＬおよびその上にある全遺伝子；
（ii）セグメントＳおよびセグメントＭのｐａｃ配列；
（iii）セグメントＳおよびセグメントＭの配列を結合する３−プライム末端ポリメラーゼ；
（iv）セグメントＳの遺伝子８。
【００３４】
上記ｐｈｉ−８の例では、セグメントＳおよびセグメントＭ上の全てのコード化配列を、遺伝子８を除いて欠失し、ｒｄｓＲＮシステムに作動を要求しない。また、所望遺伝子の発現に必要なまたはその発現に望ましい他の外因性の配列を組換えセグメントに含め得る。これらの配列の例としては、ＩＲＥＳ因子、真核生物または原核生物各々における翻訳開始のためのコザック（Kozak）およびシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列のそれぞれ、ポリアデニル化配列、プロモーター配列、エンハンサー、転写ターミネーター、リーダーペプチド配列およびタンパク質精製のためのＨｉｓタグ(tag)などの分子タグが挙げられる。
【００３５】
本発明の実施において、セグメントＬは、染色体外発現ベクターまたはバクテリア染色体への組込みのいずれかによりバクテリア・パッケージング株に導入でき、組換えセグメントは、後述のとおり、電気穿孔によりバクテリア・パッケージング株に導入する。
【００３６】
本発明においてパッケージング株を派生させるバクテリア株としては特定のものが決定的に重要というわけではなく、カンピロバクター属（Campylobacter spp）、ナイセリア属(Neisseria spp）、ヘモフィルス属（Haemophilus spp）、エロモナス属（Aeromonas
spp）、フランシセラ属（Francisella spp）、エルシニア属（Yersinia spp）、クレブシエラ属（Klebsiella spp）、ボルデテラ属（Bordetella
spp）、レジオネラ属（Legionella spp）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium spp）、シトロバクター属（Citrobacter
spp、クラミジア属（Chlamydia spp）、ブルセラ属（Brucella spp）、シュードモナス属（Pseudomonas spp）、ヘリコバクター属（Helicobacter
spp）、またはビブリオ属（Vibrio spp）などを含み、これらに限られない。
【００３７】
ここに使用する特定のカンピロバクター（Campylobacter）株はその特定のものが本発明にとって決定的というわけではない。本発明に使用可能なカンピロバクター株の例としては、Ｃ．ジェジュニ（C.
jejuni）（ＡＴＣＣ 番号４３４３６、４３４３７、４３４３８）、Ｃ．ヒオインテスティナリス（C. hyointestinalis）（ＡＴＣＣ 番号３５２１７）、Ｃ．フェトゥス（C.
fetus）（ＡＴＣＣ 番号１９４３８）、Ｃ．フェカリス（C. fecalis）（ＡＴＣＣ 番号３３７０９）、Ｃ．ドイレイ(C. doylei)（ＡＴＣＣ 番号４９３４９）、大腸菌（C.
coli）（ＡＴＣＣ 番号３３５５９、４３１３３）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
ここに使用する特定のエルシニア（Yersinia）株もその特定のものが本発明に決定的というわけではない。本発明に使用可能なエルシニア（Yersinia）株の例として、Ｙ．エンテロコリティカ（Y.
enterocolitica）(ＡＴＣＣ番号９６１０)またはＹ．ペスティス（Y. pestis）(ＡＴＣＣ番号１９４２８)、Ｙ．エンテロコリティカ  ＹｅＯ３−Ｒ２(al-Hendyほか、Infect.
Immun.、60:870; 1992)または Ｙ．エンテロコリティカ  ａｒｏＡ(O'Gaoraほか、Micro. Path., 9:105; 1990)などが挙げられる。
【００３９】
ここに使用する特定のクレブシエラ（Klebsiella）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なクレブシエラ株の例として、Ｋ．ニューモニエ（K.
pneumoniae）(ＡＴＣＣ番号１３８８４)などがある。
【００４０】
ここに使用する特定のボルデテラ（Bordetella）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なボルデテラ株の例として、Ｂ．ペルトゥシス（B.
pertussis）、Ｂ．ブロンキセプチカ（B. bronchiseptica）(ＡＴＣＣ番号１９３９５)などがある。
【００４１】
ここに使用する特定のナイセリア（Neisseria）株もその特定のものが本発明にとって決定的ではない。本発明に使用可能なナイセリア株の例として、髄膜炎菌（N.
meningitidis）(ＡＴＣＣ番号１３０７７)および淋菌（N. gonorrhoeae）(ＡＴＣＣ番号１９４２４)、淋菌ＭＳ１１  ａｒｏ変異株(Chamberlainほか、Micro.
Path.,15:51-63;
1993)などがある。
【００４２】
ここに使用する特定のエロモナス（Aeromonas）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なエロモナス株の例として、Ａ．サルミノチダA.
salminocida）(ＡＴＣＣ番号３３６５８)、Ａ．スクベリー（A. schuberii）(ＡＴＣＣ番号４３７００)、Ａ．ヒドロフィラ（A.
hydrophila）、Ａ．オイクレノフィァ（A. eucrenophila）(ＡＴＣＣ番号２３３０９)などがある。
【００４３】
ここに使用する特定のフランシセラ（Francisella）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なフランシセラ株の例として、野兎病菌（F.
tularensis）（ＡＴＣＣ番号１５４８２）などがある。
【００４４】
ここに使用する特定のコリネバクテリウム（Corynebacterium）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なコリネバクテリウム株の例として、Ｃ．シュードツベルクローシス（C.
pseudotuberculosis）（ＡＴＣＣ番号１９４１０）などがある。
【００４５】
ここに使用する特定のシトロバクター（Citrobacter）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なシトロバクター株の例として、Ｃ．フロインディ（C.
freundii）（ＡＴＣＣ番号８０９０）などがある。
【００４６】
ここに使用する特定のクラミジア（Chlamydia）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なクラミジア株の例として、肺炎クラミジア（C.
pneumoniae）（ＡＴＣＣ番号ＶＲ１３１０）などがある。
【００４７】
ここに使用する特定のヘモフィルス（Haemophilus）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なヘモフィルス株の例として、インフルエンザ桿菌（H.
influenzae）(Leeほか、J. Biol. Chem. 270:27151; 1995)、Ｈ．ソムヌス（H. somnus）（ＡＴＣＣ番号４３６２５）などがある。
【００４８】
ここに使用する特定のブルセラ（Brucella）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なブルセラ株の例として、ウシ流産菌B.
abortus(ＡＴＣＣ番号２３４４８)などがある。
【００４９】
ここに使用する特定のレジオネラ（Legionella）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なレジオネラ株の例として、Ｌ．ニューモフィラ（L.
pneumophila）（ＡＴＣＣ番号３３１５６）、Ｌ．ニューモフィラｍｉｐ変異株（Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994）などがある。
【００５０】
ここに使用する特定のシュードモナス（Pseudomonas）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なシュードモナス株の例として、緑膿菌（P.
aeruginosa）(ＡＴＣＣ番号２３２６７)などがある。
【００５１】
ここに使用する特定のヘリコバクター（Helicobacter）株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なヘリコバクター株の例として、ピロリ菌H.
pylori(ＡＴＣＣ番号４３５０４)、Ｈ．ムステレ（H. mustelae）(ＡＴＣＣ番号４３７７２)などがある。
【００５２】
ここに使用する特定のビブリオ（Vibrio）株もその特定のものに限られるものではない。本発明に使用可能なビブリオ株の例として、コレラ菌（Vibrio
cholerae）(ＡＴＣＣ番号１４０３５)、ビブリオ  シンシナティエンシス（Vibrio cincinnatiensis）(ＡＴＣＣ番号３５９１２)、コレラ菌（V.
cholerae）ＲＳＩ 毒性変異株(Taylorほか、J. Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994)およびコレラ菌ｃｔｘＡ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｅｐ変異株(Waldor
Jほか、Infect Dis.,170:278-283; 1994)などがある。
【００５３】
好ましい具体例では、本発明においてパッケージング株に発展する基となるバクテリア株は、パッケージング株としてもワクチンベクターとしても作用する潜在能力を有する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）などのバクテリア、すなわち、エシェリキア（Escherichia）属、シゲラ（Shigella）属、およびサルモネラ（Salmonella）属などのバクテリアを含む。グラム陽性で抗酸性のパッケージング株およびベクター株はリステリア菌（Listeria
monocytogenes）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属から同様に構築できよう。
【００５４】
ここに使用する特定のエシェリキア（Escherichia）株はその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なエシェリキア株の例として、大腸菌株ＤΗ５α、ＨＢ  １０１、ＨＳ−４、４６０８−５８、１１８４−６８、５３６３８−Ｃ−１７、１３−８０、および６−８１(例えばSambrookほか、上掲;
Grantほか、上掲；Sansonettiほか、Ann. Microbiol.（Inst. Pasteur）、132A: 351; 1982を参照）、腸内毒素原性大腸菌（enterotoxigenic
E. coli）(例えばEvansほか、Infect. Immun.、12:656; 1975を参照)、腸管病原性大腸菌（enteropathogenic
E. coli)(例えばDonnenbergほか、J. Infect. Dis., 169:831; 1994を参照)、腸内組織侵入性大腸菌（enteroinvasive
E. coli)(例えばSmallほか、Infect Immun., 55:1674; 1987を参照)および腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic
E. coli)(例えば McKee and O'Brien, Infect. Immun., 63:2070; 1995を参照)などがある。
【００５５】
ここに使用する特定のサルモネラ（Salmonella）株はその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なサルモネラ株の例として、チフス菌（S.
typhi）(例えばＡＴＣＣ番号７２５１を参照)、ネズミチフス菌（S. typhimurium）(例えばＡＴＣＣ番号１３３１１を参照)、サルモネラガィナルム（Salmonella
galinarum）(ＡＴＣＣ番号９１８４)、サルモネラ  エンテリディティス（Salmonella enteriditis(例えばＡＴＣＣ番号４９３１)、ネズミチフス菌（Salmonella
typhimurium）(例えばＡＴＣＣ番号６９９４)、チフス菌ａｒｏＣ、ａｒｏＤダブル変異株(例えばHoneほか、Vacc, 9:810-816; 1991を参照)、ネズミチフス菌ａｒｏＡ変異株(例えば
Mastroeniほか、Micro. Pathol, 13:477-491; 1992を参照)などがある。
【００５６】
ここに使用する特定のシゲラ（Shigella）株はその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なシゲラ株の例として、シゲラ  フレックスネリ(Shigella
flexneri)(例えばＡＴＣＣ番号２９９０３参照)、シゲラ  フレクッスネリ  ＣＶＤ１２０３(例えばNoriegaほか、Infect. Immun.
62:5168; 1994参照）、シゲラ  フレックスネリ  １５Ｄ（例えばSizemoreほか、Science 270:299; 1995を参照）、シゲラ  ソンネ菌（Shigella
sonnei）(例えばＡＴＣＣ番号２９９３０参照）、およびシゲラ赤痢菌（Shigella dysenteriae）(例えばＡＴＣＣ番号１３３１３参照）などがある。
【００５７】
ここに使用する特定のマイコバクテリウム(Mycobacterium)株はその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なマイコバクテリウムの例として、結核菌ＣＤＣ１５５１株(例えばGriffithほか、Am.
J. Respir. Crit. Care Med. Aug;152(2):808; 1995参照)、結核菌北京株(Soolingenほか、1995)、Ｈ３７Ｒｖ株(ＡＴＣＣ番号２５６１８)、結核菌パントテン酸要求性株(Sambandamurthy、Nat.
Med. 2002 8(10): 1171; 2002）、結核菌rpo V 変性株（Collinsほか、Proc Natl Acad Sci USA.
92(17): 8036; 1995）、結核菌ロイシン要求性株（Hondalusほか、Infect. Immun. 68(5): 2888; 2000）、ＢＣＧデンマーク株（ＡＴＣＣ番号３５７３３）、ＢＣＧ日本株（ＡＴＣＣ番号３５７３７）、ＢＣＧシカゴ株（ＡＴＣＣ番号２７２８９）、ＢＣＧコペンハーゲン株（ＡＴＣＣ番号２７２９０）、ＢＣＧパスツール株（ＡＴＣＣ番号３５７３４）、ＢＣＧグラクソ株（ＡＴＣＣ番号３５７４１）、ＢＣＧコンノート株（ＡＴＣＣ番号３５７４５）、ＢＣＧモントリオール株（ＡＴＣＣ番号３５７４６）などがある。
【００５８】
ここに使用する特定のリステリア菌(Listeria monocytogenes)株もその特定のものが本発明に決定的ではない。本発明に使用可能なリステリア菌の例として、リステリア菌(L.
monocytogenes)株１０３Ｓ(例えばStevensほか、J .Virol 78:8210-8218; 2004参照)、または（ｉ）ａｃｔＡ  ｐｌｃＢダブル変異株(Petersほか、FEMS
Immunology and Medical Microbiology 35: 243-253; 2003)、(Angelakopoulousほか、Infect
and Immunity 70: 3592-3601; 2002)並びに（ii）アラニン・ラセミ化酵素遺伝子およびＤ−アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子のためのｄａｌ
ｄａｔダブル変異株(Thompsonほか、Infect and Immunity 66: 3552-3561; 1998)などのリステリア菌変異株などがある。
【００５９】
パッケージング株の親として働く株を選択し、その株を次に遺伝子操作してその株にｄｓＲＰプロキャプシドを発現するＤＮＡ配列を導入するとともに、その株の変異体を相補する機能性の遺伝子を発現するｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にする変異体を導入する。
【００６０】
概括的にいうと、セグメントＬにおける遺伝子は、殻コード化タンパク質遺伝子８を含み、十分な機能性を備えるプロキャプシドの生成に必要なタンパク質をコードする。しかし、ｐｈｉ−８ファージでは、この遺伝子８はセグメントＳ上に位置する。この遺伝子８の産生物はｐｈｉ−８プロキャプシドの構築に必須ではないが、効率的に自己複製するｐｈｉ−８ヌクレオカプシドは機能性の遺伝子８の産生物を必要とする。従って、ｐｈｉ−８ファージを本発明の実施に用いる際には、セグメントＳの遺伝子８をその構築物の中に含めるのが好ましい。他のファージについては、遺伝子８活性をセグメントＬ上にコードし従ってセグメントＬ  ｍＲＮＡを発現する能力は機能性ヌクレオカプシドの産生に十分である。セグメントＬのもととなる特定のｄｓＲＰはこの発明に決定的ではなく、Ｐｈｉ−６セグメントＬの一つ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクッセッションＮｏ．Ｍ１７４６１）、Ｐｈｉ−１３セグメントＬ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクッセッションＮｏ．ＡＦ２６１６６８）またはＰｈｉ−８セグメントＬ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクッセッションＮｏ．ＡＦ２２６８５１）などでもよく、これらはニューヨーク州ニューヨーク市の公衆衛生研究所、微生物学部のＬ．Ｍｉｎｄｉｃｈ博士から入手できる。
【００６１】
セグメントＬをコードするｃＤＮＡ配列を、アプライド  バイオシステムズ(Applied
Biosystems)社ＡＢＩ（登録商標）３９００ ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザー（Foster City, CA 94404 U.S.A）、およびそのメーカー提供の手順を用いて合成で生成することもできる。セグメントＬおよび組換えセグメントＳやＭのｃＤＮＡコピーをを合成するために、完全長配列の一連の部分セグメントをＰＣＲで生成し、それらを連結して、当業者に周知の手順で完全長セグメントを形成する(Ausubelほか、上掲、1990)。端的に言うと、ヌクレオチド１００個乃至２００個分の長さの合成オリゴヌクレオチド（すなわち、好ましくは隣接配列をコードするオリゴヌクレオチドの５’−および３’末端でマッチする５’−および３’末端での配列をもつ）を自動化ＤＮＡシンセサイザー（例えば、上記メーカー製ＡＢＩ３９００
ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザー）で産生する。同じ手法で、相補オリゴヌクレオチドを合成し、相補パートナーとアニールして、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドの対（すなわち、互いに隣接する配列をコードする対）を連結反応により結合し、より大きい断片を形成する。これらのより大きい断片をアガロース・ゲル電気泳動法により精製し、ゲル精製キット（例えばカリフォルニア州サンタクルーズ（Santa
Cruz、CA）のキアーゲン（Qiagen）社 がカタログＮｏ.１２３８５で市販しているキアエックス（登録商標）（QIAEXR）IIゲル エクストラクション システム）を用いて分離する。この手順を、完全長ＤＮＡ分子の生成まで繰り返す。連結反応の各段階の終了の度ごとに、上記断片をＰＣＲにより増幅し、収量を増すことができる。新規合成遺伝子構築の手順は当業者に周知であり、上記以外の文献にも記載されている(Andreほか、上掲、1998)、(Haasほか、上掲、1996)。代わりに、合成遺伝子は市販されているもの、例えば、the  Midland Certified Reagent社(Midland、TX）から市販されているものを購入できる。
【００６２】
本発明は変更なしのセグメントＬ配列の使用を特定しているが、この配列の切断されまたは変位された誘導体に至る改変であって機能性プロキャプシドの形成を妨げない改変も本明細書に述べた本発明の真意を実質的に逸脱することなく可能であることは当業者に明らかであろう。
【００６３】
本発明でセグメントＬを発現するのに用いる特定のプロモーターはその特定のものがこの発明に重要というわけではなく、標的株で働くプロモーターであれば如何なるものでも差し支えない。例えばＰＢＡＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ８１８３８）およびＰｐａｇＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｍ５５５４６）などの誘導プロモーターまたはＲｌｐｐ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｖ００３０２）およびＰｏｍｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ０２００６）などの構成性プロモーター（constitutive promoters）が例として挙げられるが、これらの例に限定されるわけではない。
【００６４】
セグメントＬはｐＴ７／Ｔ３−１８（Ambion、Austin、TX、カタログ番号７２０１）などの発現ベクターにおいて、当業者に周知の方法（例えばＰＣＲ、ＤＮＡ精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロース・ゲル電気泳動、結合反応）を用いて対立遺伝子交換によりパッケージング株への導入または染色体への組込みが可能である。染色体への組込みの位置は、好ましい具体例では遺伝子を不活性化し確定培養条件下で選択可能な表現型を生じさせる（例えば、ａｒｏＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ００５５７）、ａｒｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＹ１４２２３１）、ｌｅｕＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｌ０６６６６）、ａｓｄ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｖ００２６２）、ｍｕｒｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＹ５２０９７０）、ｋｄｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＹ１７４１０１）およびｈｔｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＦ４０１５２９））ようにセグメントＬ発現カセットをコードするＤＮＡを染色体に組み込むものの、本発明では重要でない。染色体への組込みの手順および変異体の培養の方法は文献に記載されている(Hamiltonほか,
J. Bacteriol. 171: 4617; 1989)、(Blomfieldほか, MoI. Microbiol. 5: 1447; 1991)。
【００６５】
ここでパッケージング株に導入した特定の変異体はその特定のものがこの発明に重要であるわけではなく、確定培養条件下で選択可能な表現型を生じさせることができる変異体、例えば、ａｒｏＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ００５５７）、ａｒｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＹ１４２２３１）、ｌｅｕＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｌ０６６６６）などの栄養要求性変異体、またはａｓｄ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｖ００２６２）もしくはｍｕｒｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＹ５２０９７０）などの細胞壁合成に必須の遺伝子における変異体、またはｈｔｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＡＦ４０１５２９）などの３２℃以上の温度で成長を止める変異体などでもよい。
【００６６】
変異体は周知の遺伝子操作技術を用いてバクテリア中に導入することができる。それら周知の手法の例としては、これに限定されるわけではないが、Ｎメチル−Ｎ’ニトロ−Ｎニトロソグアニジン、アクリジンオレンジ、臭化エチジウムなどの化学試薬または非致死量の紫外線照射(Miller(Ed), 1991, In: バクテリア遺伝子学の短期講習会、Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY)を用いた非特異的変異誘発が挙げられる。また、変異体を標準的遺伝子工学手法、すなわち、Ｔｎ１０変異誘発、バクテリオファージ媒介の形質導入、ラムダファージ媒介の対立遺伝子交換または共役伝達などの手法により導入することができる(Miller(Ed)、上掲、1991)；(Honeほか、J.
Infect. Dis.l56:167; 1987)；(Noriegaほか、Infect. Immun., 62:5168; 1994)；(Honeほか、Vaccine,
9:810; 1991)；(Chatfieldほか、Vaccine 10:53; 1992)；(Pickardほか、Infect. Immun.,
62:3984; 1994)；(Odegaardほか、J Biol Chem 272:19688; 1997)；(Leeほか、J. Biol. Chem.,
270:27151; 1995)；(Garrettほか、J. Biol. Chem., 273:12457; 1998)。変異は点突然変異、コドン置換または好ましくは、非復帰の欠失変異であり得る。欠失変異は一塩基変異から完全コーディング配列までがあり得る。欠失変異は、この種の変異が産生物に高い安定性をもたらすので、大規模の変異に有利である。
【００６７】
変異体は構成的に発現でき、また温度感受性のヒートショック系統群のプロモーターもしくは嫌気性下に誘導されるｎｉｒＢプロモーター(Harborneほか、MoI. Micro., 6:2805; 1992)もしくはｕａｐＡ(Gorfinkielほか、J. Biol.
Chem., 268:23376; 1993)またはｇｃｖ（Staufferほか、J. Bact, 176:6159; 1994）などの抑制プロモーターによる制御の下に発現できる。適当な方法の選択は標的株によって決まり、その点は当業者によく理解されよう。
【００６８】
安定的にｒｄｓＲＮｓを内部に保持するバクテリアベクターの成長のための特定の培養条件はその特定のものがこの発明に決定的というわけではない。説明目的のために言うと、変異体は、成長するバクテリア株に適した通常の培養手法(Miller、上掲、1991)を用いて、ＴＳ培地(ディフコ（Difco）社、Detroit、MI、カタログ番号２４４６２０)、栄養ブロス(同社、カタログ番号２３３０００)、トリプシン大豆ブロス(同社、カタログ番号２１１８２２)などの液体培地で成長させることができる。代替的には、バクテリアを、栄養寒天(同社、カタログ番号２１２０００)、トリプシン大豆寒天(同社、カタログ番号２３６９２０)またはＭ９ミニマル寒天(同社、カタログ番号２４８５１０)などの固体培地上で培養することもできる。
【００６９】
マイコバクテリウムワクチンベクトル株は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９（同社、カタログ番号２７１３１０）、またはＳａｕｌｔｏｎ合成培地などの液体培地で、好ましくは３７℃で培養する。これらの株は靜置または攪拌培地として維持できる。また、マイコバクテリウムの成長速度はオレイン酸（０．０５ｖ／ｖ；Research Diagnostics社、カタログ番号０１２５７）およびチロキサポール(Tyloxapol）(０．０５％ｖ／ｖ；同社 、カタログ番号７０４００)などの洗剤の添加により高めることができる。マイコバクテリウム培養物の純度は、リン酸塩緩衝の生理食塩水（以下、“ＰＢＳ”と表記）に逐次的に（例えば、Neat−１０−８から１０倍ずつのステップで）希釈したマイコバクテリウム培養物の１００μｌ分取品を、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１０(BD
Microbiology社, Cockeyesville, MD、カタログ番号２２１１７４)などの固体培地２５−３０ｍｌを含む３．５インチの皿に均等に拡げることにより評価できる。
【００７０】
バクテリアを回収する６００ｎｍの光学密度は決定的に重要ではなく、この光学密度は０．１から５．０の幅を有し、特定の株、培地および使用培養条件によって決まる。
【００７１】
２．ｒｄｓＲＮＡセグメントの構築
先に強調したとおり、ＵＳ２００１３２６７８はｒｄｓＲＰの産生の着手においてヘルパーファージ（すなわち、野生型ｄｓＲＰ）に依存している。これらの条件下でＵＳ２００１３２６７８による方法は野生型セグメントＳまたは野生型セグメントＭのいずれかを有するｒｄｓＲＰを産生する。ｄｓＲＰの細胞溶解機能はセグメントＳおよびセグメントＭに含まれているから、上述の構成が大規模産生において安定であるか否か不明確である。また、この方法が如何にして上記ｒｄｓＲＰから野生型ｄｓＲＰを分離するか不明確である。さらに、ＵＳ２００１３２６７８は如何にして新たにｒｄｓＲＮｓを作り出すか、ｒｄｓＲＮｓを内部に保持し複製する安定な担持株を如何にして生成し分離するかについて手引きを提供していない。これと対照的に、本発明はｒｄｓＲＮｓを安定的に産生することを対象とする。
【００７２】
通常は、約１０％までのウイルス・ゲノムのサイズのばらつきを許容するが、これによって組換えウイルスベクターのサイズにある程度の柔軟性がもたらされる(Domingo and Holland, Annu. Rev. Microbiol. 51:151;1997)。本発明の実施においては、ｒｄｓＲＮｓの中のｒｄｓＲＮＡセグメントのサイズはセグメントＬ、ＳおよびＭの合計±約１０％に等しい。この点を説明するために、ｐｈｉ−８を例として用いる。ｐｈｉ−８のセグメントＬを発現するパッケージング株の中で安定なｒｄｓＲＮｓを生成するには、したがって、ｐｈｉ−８  のゲノムサイズは１４、９８４ｂｐであり、このｒｄｓＲＮｓにおける組換えセグメントのサイズはおよそ７９３３±１５００ｂｐである。
【００７３】
後述のとおり、この規則は厳密には適用されない。すなわち、セグメントＬおよび４．５ｋｂのｒｄｓＲＮＡセグメントＳのみを内部に保持するｐｈｉ−８に由来するｒｄｓＲＮｓを得ることができるからである(Sunほか、Virology, 308: 354; 2003)。このことは、ｒｄｓＲＮｓが驚くほどのゲノムの柔軟性を発揮することを示唆している。上述の実施例においては、組換えセグメントＳは野生型セグメントＳおよび野生型セグメントＭの両方から抽出したセグメントで構成した。この特定の文献例では、用語「から抽出した（derived
from）」（例えば、「野生型のセグメントＳから抽出した」）は野生型ファージゲノム配列を起源とし、これら野生型遺伝子または翻訳領域ｆｅａｔｕｒｅ順序を再配置した組換えｒｄｓＲＮＡ構造の中に存在する配列を記述する。このような配列はＲＴ−ＰＣＲにより野生型のファージから増幅してクローン化することができ、また野生型ファージに生ずる既知の配列を基礎として化学的に合成することもできる。
【００７４】
野生型ゲノムサイズに匹敵するゲノムサイズを有する組成物を提供することも可能である。一つの手法では、７９３３±１５００ｂｐのサイズの組換えセグメントＳを生成する。もう一つの方法は、二つのｒｄｓＲＮＡセグメント、すなわちセグメントＳパッケージング配列を含むものとセグメントＭパッケージング配列を含むものとの二つのｒｄｓＲＮＡセグメントを用い、組換えセグメントの全体のサイズを７９３３±１５００ｂｐとする（図４）。これら手法のいずれの場合も、少なくとも一つのセグメントが正の選択対立遺伝子を含み、一方または両方の組換えセグメントが真核の発現カセットを有する。
【００７５】
好ましい具体例では、ｒｄｓＲＮＡセグメントの構成物を例えば次のｃＤＮＡとＤＮＡ配列との結合により集積できる（図４）：
ｒｄｓＲＮＡセグメントＳ：
１．φ―８セグメントＳ  ｐａｃ配列および遺伝子８（Hoogstratenほか、上掲、２０００）。
２．野生型セグメントＳの遺伝子８のリボソーム結合部位に連鎖した正の選択対立遺伝子。遺伝子８はヌクレオカプシドとの会合状態に留まる膜タンパク質をコードし野生型セグメントＳの第一翻訳領域（first open reading froam）である。
３．ＩＲＥＳ配列への３−プライムに位置する、ＨｐａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位を備えるＩＲＥＳ配列。これにより、このＨｐａＩ（平滑末端ＲＥ）が、ＩＲＥＳに機能的に連鎖されるＡＴＧ開始コドンを提供する。
４．ウシ・ポリアデニル化配列（ｐｃＤＮＡ３．１から得られた（インヴィトロゲン(Invitrogen)社、Carsbad、CA、カタログ番号Ｖ８６０−２０）。
５．φ−８セグメントＳ  ＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ認識配列(Hoogstratenほか、上掲、2000)：
ｒｄｓＲＮＡセグメントＭ：
６．φ−８セグメントＭ ｐａｃ配列(Hoogstratenほか、上掲、2000)。
７．遺伝子１０のリボソーム結合部位に連鎖した正の選択対立遺伝子。遺伝子１０は野生型セグメントＭの第一翻訳領域であり、φ−８の膜タンパク質をコードする。
８．ＩＲＥＳ配列への３−プライムに位置する、ＨｐａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）部位を備えるＩＲＥＳ配列。これにより、ＨｐａＩ（平滑末端ＲＥ）がＩＲＥＳに機能的に連鎖されるＡＴＧ開始コドンを提供する。
９．ウシ・ポリアデニル化配列（ｐｃＤＮＡ３．１から得られたインヴィトロゲン社、Carlsbad, CA、カタログ番号Ｖ８６０−２０)。
１０．φ−８セグメントＳ  ＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼ認識配列(Hoogstratenほか、上掲、2000)。
【００７６】
理論で範囲を限定することは望まないが、ｒｄｓＲＮＡセグメントＳの大きさが７９００＋／−１５００ｂｐ以上の場合はｒｄｓＲＮＡセグメントＭはそれ以上は充填されないようである。すなわち、７９００＋／−１５００ｂｐ以上の大きさのｒｄｓＲＮＡセグメントＳはプロキャプシドの中で構造変化を引き起こし、セグメントＬの認識と取込みを可能にし、その結果、野生型ゲノムの＋／−１０％ゲノムサイズを有するｒｄｓＲＮＡを生成するからである。
【００７７】
ｒｄｓＲＮＡセグメントをコードするｃＤＮＡ配列は、上記アプライド  バイオシステムズ社製ＡＢＩ３９００ ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザーとそのメーカーが提供する手順とを用いて合成生成することができる。セグメントＬのｃＤＮＡコピーおよび組換えセグメントを合成するように、当業者に周知の方法を用いて、完全長の配列の一連のセグメントをＰＣＲで生成し互いに結合して完全長セグメントを形成する。端的に言うと、長さがヌクレオチド１００−２００個分の合成オリゴヌクレオチドが（すなわち、好ましくは隣接配列をコードするオリゴヌクレオチドの５’−および３’末端でマッチする５’−および３’末端での配列を備える）自動化ＤＮＡシンセサイザー（例えば上記アプライド  バイオシステムズ社製ＡＢＩ３９００
ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザー）を用いて産生する。同じ手法により、相補オリゴヌクレオチドを合成し、相補パートナーとアニールして、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。二本鎖オリゴヌクレオチドの対（すなわち、隣接配列をコードする対）を連結反応により結合してより大きい断片を形成する。これらのより大きい断片を寒天ゲル電気泳動法により精製し、ゲル精製キット（例えば、上記QIAEX II ゲル抽出システム、カタログ番号１２３８５）を用いて分離する。この手順を完全長ＤＮＡ分子の形成まで繰り返す。連結反応のラウンドの度ごとに、上記断片をＰＣＲにより増幅し、収量を増すことができる。新規合成遺伝子構築の手順は当業者に周知であり、他文献にも記載されている(Andreほか、上掲、1998)；(Haasほか、上掲、1996)。代案として、合成遺伝子を市場で、例えば
The Midland Certified Reagent社（Midland、TX）から購入することもできる。
【００７８】
正の選択対立遺伝子
ｒｄｓＲＮＡセグメントに組み入れられる特定の正の選択対立遺伝子は、その特定のものが本発明にとくに重要というわけではなく、ａｒｏＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号．Ｘ００５５７）、ａｒｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１４２２３１）、ｌｅｕＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０６６６６）などの栄養要求性変異体を相補する遺伝子、またはａｓｄ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２６２）もしくはｍｕｒｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５２０９７０）などの細胞壁合成に必須の遺伝子変異体を相補する遺伝子、またはｆｉｓＺ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２２１９４６）などの細胞分割に必須の遺伝子変異体を相補する遺伝子など優勢の負の変異体をパッケージング株内で再建できる対立遺伝子とすることもできる。
【００７９】
ＩＲＥＳ配列ｍＲＮＡ分子の入手源
細胞核内で核のｍＲＮＡ転写物に正常に加えられてリボソーム認識を増強する５’キャップ修飾因子を欠くｍＲＮＡ分子は、ＩＲＥＳ配列が所望遺伝子の上流に存在しなければ真核細胞において不十分に翻訳されるに留まる。本発明で用いる特定のＩＲＥＳは、その特定のものが決定的ではなく、ＩＲＥＳ配列を含む任意の市販のベクターから、または入手に支障のない任意の配列から選択できる。すなわち、ＩＲＥＳ配列は広く入手でき、pIRES2-EGFP内のヌクレオチド６６５−１２５１に位置するＩＲＥＳの５’および３’末端に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより市販のプラスミドpIRES2-EGFP(クロンテック（Clontech）社、Palo
Alto, CA、カタログ番号６３２０６)から得られる。プラスミドpIRES-EGFPにおけるこれらの配列はメーカーから入手できる(www.clontech.comを参照)。類似のＩＲＥＳ配列は、プラスミドｐＣＴＴＥ４ａの中のヌクレオチド１６乃至５１８からのＣＩＴＥの５’および３’末端に特有のプライマーを用いたＰＣＲにより、プラスミドｐＣＩＴＥ４ａ（ノヴァゲン（Novagen）社、Madison,
WI、カタログ番号６９９１３および米国特許４，９３７，１９０号参照）から得られる（ｐＣＩＴＥ４ａの完全配列はnovagen.com/docs/NDIS/69913-000.HTMに存在するウエブサイトから得られる）プラスミド上にもある。プラスミドｐＣＩＴＥ４ａ−ｃ（米国特許第４,９３７,１９０号）、ｐＳＬＩＲＥＳ１１（アクセッション：ＡＦ１７１２２７）、ｐＰＶ(アクセッション番号＃Ｙ０７７０２)、ｐＳＶＩＲＥＳ−Ｎ(アクセッション番号＃：ＡＪ０００１５６)からも得られ(Creancierほか、J.
Cell Biol., 10: 275-281; 2000)；(Ramos and Martinez-Sala, RNA, 10:1374-1383;
1999)；(Morganほか、Nucleic Acids Res., 20:1293-1299; 1992)；(Tsukiyama-Koharaほか、J.
Virol., 66: 1476-1483; 1992)；(Jang and Wimmerほか、Genes Dev., 4: 1560-1572; 1990)、また、ジシストロン性のレトロウイルスベクター（アクセッション番号＃：Ｄ８８６２２）上にもあり、厳密な組織特異性の調節のための線維芽細胞成長因子２ＩＲＥＳ(Creancierほか、上掲、2000)またはミトコンドリアのＨ＋ＡＴＰ合成酵素(Izquierdo
and Cuezva, Biochem. J., 346:849; 2000)のベータ・サブユニットのｍＲＮＡの３’非翻訳領域における内部リボソーム入り口部位（Internal-ribosome-entry-site）などの真核細胞にも見出される。ＨＣＶ・ＩＲＥＳ上にはＩＰはないので、プラスミドｐＩＲＥＳ−Ｇ(Hobbs,
S.M. CRC Centre for Cancer Therapeutics, Institute of Cancer Research, Block F,
15, Cotswold Road, Belmont, Sutton, Surrey SM2 5NG, UK)はＩＲＥＳの提供源になり、このプラスミドは入手可能である（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｙ１１０３４）。
【００８０】
さらに、ncbi.nlm.nih.govにあるＮＣＢＩヌクレオチドデータベースを、検索パラメータ「IRES
not patent」を用いてインターネット検索した結果ＩＲＥＳ配列を含む１４０のファイルが得られた。最後に、ＩＲＥＳｃＤＮＡは、上記アプライド  バイオシステムズ社製ＡＢＩ３９００型ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザーと同メーカー提供の手順とを用いて合成できる。ｐＣＩＴＥ４ａの中で５０２ｂｐＩＲＥなどの大きいＳＩＲＥＳ配列を合成するために、当業者に周知の手法(Ausubelほか、上掲、1990)を用いて一連のセグメントをＰＣＲにより生成して互いに連結し、完全長のセグメントを形成する。Ｃ型肝炎ウイルス（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号１ＫＨ６Ａ）の中の５３ｂｐＩＲＥＳなどのより小さいＩＲＥＳ配列は、上記アプライド  バイオシステムズ社製ＡＢＩ３９００型ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザーと同メーカー提供の手順とにより一ラウンドで合成できる。
【００８１】
ｒｄｓＲＮｓに挿入できる所望の異種遺伝子の例
本発明において、真核翻訳発現カセット上でｒｄｓＲＮに導入された所望遺伝子は免疫原をコードすることができ、したがってこのｒｄｓＲＮは免疫原に対する免疫応答を誘発するワクチンとして作用する。その免疫原はウイルス性、バクテリア性および寄生性病原体からの外来性免疫原であるか、自己免疫性の抗原または癌抗原などの内因性免疫原であるかのいずれかであり得る。この免疫原は完全長の未変性タンパク質、外来免疫原と内在タンパク質または模倣品との間のキメラ融合品、ウイルス性、バクテリア性または寄生性病原体起源の免疫原の断片または断片類であり得る。
【００８２】
この明細書における用語「外来免疫原」は、受入れ動物細胞または組織内には通常発現しないウイルスタンパク質、バクテリアタンパク質、寄生生物タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節薬または治療薬などのタンパク質またはその断片を意味する。
【００８３】
また、用語「内因性免疫原」は、受入れ動物細胞または組織に自然に存在する内在細胞タンパク質、免疫調節薬または治療薬などのタンパク質またはその部分を意味する。
【００８４】
アポトーシスはプログラムした細胞死であり、その誘導および結果の点から見て壊死性細胞死とは大幅に異なる。外来性抗原を含む細胞のアポトーシスはその抗原に対する細胞免疫の強力な既知の刺激である。抗原含有細胞のアポトーシスが細胞免疫に導くプロセスは交差提示（cross-priming）と呼ばれることもある(Heath, W.R.ほか、Immunol Rev 199:9; 2004；Gallucci,
S. Mほか、Nature Biotechnology. 5:1249; 1999；Albert, M.L.ほか、Nature 392:86; 1988)。増強された抗原特異性の細胞の介在による免疫に導くアポトーシスの誘導には幾つかのメカニズムがある。カスパーゼ８介在のアポトーシスは抗原特異性の細胞免疫の保護に導く(Heath、W.R.ほか、Immunol
Rev 199:9; 2004)。細胞質内でのｒｄｓＲＮｓによるカスパーゼ８の発現は、ｒｄｓＲＮによって発現された外来抗原が抗原特異性の細胞免疫に導くこととの関連で、プログラム細胞死を誘発する強力な方法となるであろう。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＲＡＩＬ
受容体２）またはＴＮＦＲ−ＳＦ−１０Ｂ（腫瘍壊死因子−スーパーファミリー・メンバー１０Ｂ）としても知られる細胞死受容体５（ＤＲ−５）もまたカスパーゼ８介在のアポトーシスを仲介する(Sheridan,
J.P.ほか、Science 277:818; 1997)。レオウイルス誘導のアポトーシスはＴＲＡＩＬ−ＤＲ５により仲介され、そのウイルスのクリアランスに導く(Clarke,
P. S.ほか、J. Virol; 2000)。ｒｄｓＲＮｓによるＤＲ−５の発現は、ｒｄｓＲＮ発現抗原に対する抗原特異性細胞免疫を誘発する強力なアジュバント効果をもたらす。抗原を発現する細胞もＦａｓ連結反応、すなわち抗原特異性細胞免疫応答の誘発への強力な刺激であるＦａｓ連結反応を通じてアポトーシスを受けるように誘発され得る
(Chattergoon、M. A.ほか、Nat Biotechnology 18:974; 2000)。ＦａｓまたＦａｓ細胞質領域／ＣＤ４エクストドメイン融合タンパク質を発現するｒｄｓＲＮｓは、ｒｄｓＲＮ発現の抗原に対してアポトーシスおよび抗原特異性細胞免疫応答を誘発する。
【００８５】
上述のｒｄｓＲＮｓ介在のアポトーシスによる細胞免疫の増強は、ｒｄｓＲＮそのものによりコードされた抗原に限られず、ｒｄｓＲＮｓがアポトーシスの特定の介在物質を発現する細胞の中のあらゆる抗原を含む。例として、ｒｄｓＲＮｓをアポトーシス誘発ずみの腫瘍細胞に輸送した場合は、重要な腫瘍抗原に対する細胞免疫が腫瘍および／または転移の除去、減少または予防を伴って誘発される。
【００８６】
本発明のさらに他の具体例において、アポトーシスを引き起こす能力を伴うか否かを問わず、強い細胞免疫応答を開始させる外来抗原をコードし産生する能力を伴うｒｄｓＲＮｓを腫瘍内またはそれ以外の細胞内に輸送した場合は、これらの細胞に対する強い応答が引き起こされる。これらの細胞応答は免疫仲介の腫瘍細胞破壊、腫瘍や転移の除去、減少または予防を伴う腫瘍またはそれ以外の重要な抗原に対する細胞免疫の交差提示および誘発に導く。上述の外来抗原の例としては、宿主細胞のＨＬＡとは異なるＨＬＡ抗原、すなわち強い異種細胞応答の開始を伴うＨＬＡ抗原が挙げられる。
【００８７】
アポトーシスを引き起こし特定の腫瘍抗原を輸送する能力を有する組換えｒｄｓＲＮｓは、これら腫瘍抗原に対する強い抗原特異性細胞応答、すなわちこれら抗原に対するある程度の寛容性の破壊、ｒｄｓＲＮｓの腫瘍自体への直接の輸送を要しない腫瘍や転移の除去、減少または予防などの応答を引き起こす。
【００８８】
ＤＮＡ損傷またはカスパーゼ９に続いて起こるアポトーシスは或る種の抗原への寛容性を誘発する(Hugues,
S. E.ほか、Immunity 16:169; 2002)。寛容性の誘発は、糖尿病、関節リウマチ、クローン病、炎症性腸疾患および多発性硬化症などの自己免疫疾患の制御または阻止に重要である。β膵臓細胞、結腸直腸および神経細胞などの細胞内におけるカスパーゼ９またはそれ以外のアポトーシス介在寛容性誘発タンパク質のｒｄｓＲＮｓによる産生は、それら細胞内で自己免疫の抗原標的に対する寛容性を引き起こし、自己免疫疾患状態の治療または予防に導く限定アポトーシスを産生する。自己免疫反応に関与する特異抗原の同定は、これら抗原およびカスパーゼ９またはそれら以外の自己免疫疾患の治療や予防をもたらすアポトーシス介在の寛容性を引き起こす能力を有する分子をｒｄｓＲＮｓが産生することを通じて、これら自己免疫標的抗原に対する寛容性の誘発を可能にする。
【００８９】
したがって、本発明のもう一つの具体例は、宿主細胞の細胞質においてアポトーシスを促進するタンパク質を発現し少なくとも一つの遺伝子をコードするｒｄｓＲＮを提供する。そのような宿主細胞の細胞質における発現は、例えばサルモネラ（Salmonella）ＳｏｐＥ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ５４２３９、ＡＡＢ５１４２９またはＡＡＣ０２０７１)、シゲラ（Shigella）ＩｐａＢ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＭ８９５５３またはＡＡＭ８９５３６)、カスパーゼ−８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２４９６２またはＡＡＨ０６７３７）等の発現であるが、これらに限られない。本発明の上記具体例は上記ｒｄｓＲＮの発現した抗原の枠組みの中で、プログラムされた細胞死を誘発し、それによって高レベルＴセル介在の免疫を標的抗原に対して呼び起こす強力な方法をもたらす。代わりに、ヒトＤＲ−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＢＡＡ３３７２３）ヘルペスウイルス−６（ＨＨＶ−６）ＤＲ−５相同体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＣＡＡ５８４２３）などのＤＲ−５を発現する少なくとも一つの遺伝子をコードするｒｄｓＲＮを産生し、それによって標的抗原に対する抗原特異性の細胞免疫の強力なアジュバント効果を提供することもできる。
【００９０】
さらに代替的または追加的に、上記免疫原は合成遺伝子によりコードすることができ、通常の組換えＤＮＡ方法を用いて構築することができる（上掲文献参照）。
【００９１】
上記外来免疫原は、それら動物宿主への導入、動物宿主におけるコロニー形成または複製の前、またはその期間中にウイルス性、バクテリア性または寄生性病原体により発現された任意の分子で構成され得る。このｒｄｓＲＮはウイルス性、バクテリア性または寄生性病原体を起源とする免疫原またはその部分を発現し得る。これら病原体はヒト、家畜または野生動物宿主に感染し得る。
【００９２】
ウイルス抗原派生のもととなるウイルス病原体は、インフルエンザウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：５９７７１）などのオルソミクソウイルス類（Orthomyxoviruses）、ＲＳＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３９０１５）およびＨＴＬＶ−Ｈ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１９０９）などのレトロウイルス類（Retroviruses）、ＨＰＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３３７０４３）などのパピローマウイルス科（Papillomaviridae）、ＥＢＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２９５）；ＣＭＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０３５８）またはherpes
simplex virus（ＡＴＣＣ＃：ＶＲ−１４８７）などのヘルペスウイルス類（Herpesviruses）、ＨＩＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２７２１）およびＨＴＶ−２（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１７０９）などのレンチウイルス類（Lentiviruses）、狂犬病ウイルス（rabies）などのラブドウイルス類（Rhabdoviruses）、ポリオウイルス（Poliovirus）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２０８０）などのピコルノウイルス類（Picornoviruses）、ワクシニア(vaccinia)（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２４５）；ロタウイルス（Rotavirus）（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０９１２）などのポックスウイルス類（Poxviruses）、並びにアデノ随伴ウイルス（adeno-
associated virus）１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：８５１０６）などのパルボウイルス類（Parvoviruses）などである。
【００９３】
ウイルス抗原の例は、ヒト免疫不全ウイルス抗原Ｎｅｆ（国立アレルギー、感染性疾患研究所ＨＩＶ寄託カタログ番号１８３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃ＡＦ２３８２７８）、Ｇａｇ、Ｅｎｖ（上掲研究所ＨＩＶ寄託カタログ番号２４３３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３９３６２）、Ｔａｔ（上掲研究所ＨＩＶ寄託カタログ番号８２７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＩ３１３７）、Ｔａｔ−Δ３１−４５(Agwaleほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10037; 2002)などのＴａｔの変異誘導体、Ｒｅｖ（上掲研究所ＨＩＶ寄託カタログ番号２０８８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１４５７２）、Ｐｏｌ（上掲研究所ＨＩＶ寄託カタログ番号２３８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３７５６８）およびｇｐ１２０のＴおよびＢ細胞エピトープ(Hanke
and McMichael, AIDS Immunol Lett., 66:177; 1999);(Hankeほか、Vaccine, 17:589;
1999);(Palkerほか、J. Immunol., 142:3612-3619; 1989)、ｇｐｌ２０とＣＤ４との融合体(Foutsほか、J.
Virol. 2000, 74:11427-11436; 2000)などのＨＩＶ−１  Ｅｎｖおよびｇｐｌ２０のキメラ誘導体、ｇｐｌ４０(Stamatosほか、J
Virol, 72:9656-9667; 1998)などのＨＩＶ−１ ｅｎｖの切断誘導体および修飾誘導体またはＨＩＶ−１ Ｅｎｖおよび／または ｇｐ１４０の誘導体(Binleyほか、J
Virol, 76:2606-2616; 2002);(Sanders等、J Virol, 74:5091-5100(2000);(Binleyほか、J
Virol, 74:627-643; 2000)；Ｂ型肝炎表面抗原（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３５７８）；(Wuほか、Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989)、ＶＰ４(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２９３７２１)；(Mackowほか、Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522; 1990)およびＶＰ７(ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号ＡＹ００３８７１);(Greenほか、J.
Virol., 62:1819-1823; 1988)などのロタウイルス抗原、血球凝集素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ４０４６２７）；(Pertmer
and Robinson, Virology, 257:6; 1999)；核タンパク質(ＧｅｎＢａｎｋ accession # AJ289872);(Linほか、Proc.
Natl. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000)などのインフルエンザウイルス（Influenza virus）抗原、チミジンキナーゼなどの単純ヘルペスウイルス抗原（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４７３７８）；(Whitleyほか、In:
New Generation Vaccines, pages 825-854)などから成るグループに含まれる。
【００９４】
バクテリア抗原派生のもととなるバクテリア病原体には、マイコバクテリウム(Mycobacterium)
属、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、サルモネラ(Salmonella)属、シゲラ(Shigella)属、大腸菌(E. coli)、リケッチャ(Rickettsia)属、リステリア(Listeria)属、レジオネラ
ニューモニエ(Legionella pneumoniae)、シュードモナス(Pseudomonas)属、ビブリオ(Vibrio)属、炭疽菌(Bacillus
anthracis)およびライム病菌(Borellia burgdorferi)などがある。
【００９５】
バクテリア病原菌の感染防御抗原の例として、ＣＦＡ／Ｉ海馬采抗原(Yamamotoほか、Infect.
Immun., 50:925-928; 1985)および熱不安定な毒素の非毒性Ｂ−サブユニット(Klipsteinほか、Infect. Immun.,:
888-893; 1983)などの腸内毒素原性大腸菌の体細胞抗原、百日咳菌のパータクチン（pertactin）(Robertsほか、Vacc,
10:43-48; 1992),百日咳菌のアデニル酸環化酵素溶血素 (Guisoほか、Micro. Path., 11:423-431; 1991)、破傷風菌の破傷風毒素の断片Ｃ(Fairweatherほか、Infect.
Immun., 58:1323-1326; 1990)、ボレリア ブルグドルフェリ(Borellia burgdorferi)のＯｓｐＡ(Sikandほか、Pediatrics,
108:123-128; 2001)；(Wallichほか、Infect Immun, 69:2130-2136; 2001)、発疹チフスリケッチア（Rickettsia
prowazekii）および発疹熱リケッチア（Rickettsia typhi）の保護性の準結晶表面層(Carlほか、Proc Natl Acad Sci U
S A, 87:8237-8241; 1990)、リステリア菌（Listeria monocytogenes）のリステリオリシン(“Ｌ１ｏ”および“ＨＩｙ”としても知られる)および／またはスーパーオキサシドジスムターゼ(“ＳＯＤ”および“ｐ６０”としても知られる)(Hess,
J.ほか、Infect. Immun. 65:1286-92; 1997)；（Hess, J.ほか、Proc. Natl. Acad. Sci.
93:1458-1463; 1996）；(Bouwerほか、J. Exp. Med. 175:1467-71; 1992)、ピロリ菌（Helicobacter
pylori）のウレアーゼ(Gomez- Duarteほか、Vaccine 16, 460-71; 1998)；(Corthesy-Theulazほか、Infection
& Immunity 66, 581-6; 1998)および炭疽菌（Bacillus anthracis）感染防御抗原および致死因子受容体結合領域(Priceほか、Infect.
Immun. 69, 4509-4515; 2001)などが挙げられる。
【００９６】
寄生生物抗原を派生させる寄生性病原体は、熱帯熱マラリア原虫(ＡＴＣＣ＃：３０１４５)などのプラスモディウム(Plasmodium)属；クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma
cruzi) (ＡＴＣＣ＃：５０７９７)などのトリパノソーマ(Trypanosome)属；腸鞭毛虫(Giardia intestinalis)（ＡＴＣＣ＃：３０８８８Ｄ）などのジアルジア(Giardia)
属； ブープフィルス(Boophilus)属、ネズミバベシア（Babesia microti)（ＡＴＣＣ＃：３０２１１）などのバベシア(Babesi)属；赤痢アメーバ（ＡＴＣＣ＃：３００１５）などのエントアメーバ(Entamoeba)
属；エイマリア マキシマ(Eimeria maxima)（ＡＴＣＣ＃：３５７）などのエイメリア(Eimeria)属；リーシュマニア(Leishmania )属(Taxonomy
ED: 38568)；スキトソーマ(Schistosome)属、ブルギア(Brugia)属、ファスキダ(Fascida)属、イヌ糸状虫(Dirofilaria)属、ウケレリア(Wuchereria)属、およびオンコセレア(Onchocerea)属を含む。
【００９７】
寄生性病原体の感染防御抗原の例としては、Ｐ．ベルゲリ(P. bergerii)のスポロゾイト周囲（circumsporozoite）抗原または、Ｐ．ファルキパルム(P.
falciparum)のスポロゾイト周囲抗原などのムプラスモディウム (Plasmodium) 属のスポロゾイト周囲（circumsporozoite）抗原(Sadoffほか、Science、2:336-337;
1988)、プラスモディウム (Plasmodium) 属のメロゾイト（merozoite）表面抗原(Spetzlerほか、Int. J. Pept.
Prot. Res., 43:351-358; 1994)；赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)のガラクトース特異性レクチン(Mannほか、Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248-3252; 1991)、リーシュマニア(Leishmania)属のgp63(Russellほか、J.
Immunol. 1:1274-1278; 1988);(Xu and Liew, Immunol., 84: 173-176; 1995)、森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania
major)のｇｐ４６(Handmanほか、Vaccine, 18:3011-3017; 2000)、マレー糸状虫(Brugia malayi)のパラミオシン（paramyosin）
(Liほか, MoI. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991)、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）のトリオースリン酸・イソメラーゼ異性化酵素(Shoemakerほか、Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 89:1842-1846; 1992)、トリコストロンギルス コルブリフォルミス(Trichostrongylus
colubriformis)の分泌性グロブリン類似のタンパク質(Frenkelほか、MoI. Biochem. Parasitol., 50:27-36;
1992)、肝蛭（Frasciola hepatica）(Hillyerほか、Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992)、スキトソーマ  ボビス（Schitosoma
bovis）および日本住血吸虫 (Bashirほか、Trop. Geog. Med., 46:255-258; 1994)のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ類(Hillyerほか、Exp.
Parasitol., 75:176-186; 1992)；およびスキトソーマ  ボビス（Schitosoma bovis）または日本住血吸虫(S.japonicum)のＫＬＨ(Bashirほか、上掲、1994)などがある。
【００９８】
先に述べたとおり、ｒｄｓＲＮワクチンは、レシピエント細胞内で発現され得るあらゆる細胞タンパク質、免疫調節剤、または治療剤であって、腫瘍、移植片、および自己免疫の免疫原、またはこれら腫瘍、移植、および自己免疫の免疫原の断片もしくは誘導体を含む内因性免疫原をコードし得る。したがって、本発明では、ｄｓＲＰは腫瘍、移植片、自己免疫の免疫原、またはそれらの断片もしくは誘導体をコードし得る。代替的には、ｄｓＲＰは腫瘍特異性抗原、移植抗原もしくは自己免疫抗原またはそれらの部分をコードする合成遺伝子（上述のとおり生成）をコードし得る。
【００９９】
腫瘍特異性抗原の例としては、前立腺特異性抗原(Gattusoほか、Human Pathol.,
26:123-126; 1995)、ＴＡＧ―７２およびＣＥＡ(Guadagniほか、Int. J. Biol. Markers, 9:53- 60; 1994)並びにＭＡＧＥ−Ｉおよびチロシナーゼ(Coulieほか、J.
Immunothera., 14:104-109; 1993)などがある。マウスにおいて腫瘍抗原を発現する非悪性細胞による免疫がワクチン効果をもたらし、同じ抗原を示す明白な悪性腫瘍細胞に対してそのマウスが免疫応答を開始するのを援助することが最近見出された(Koeppenほか、Anal.
N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993)。
【０１００】
移植抗原の例としては、Ｔ細胞上のＣＤ３分子(Alegreほか、Digest. Dis. Sci.,
:58-64; 1995)などがある。ＣＤ３受容体に対する抗体で処置すると、循環するＴ細胞を速やかに除去でき、細胞介在の移植拒絶を覆し得ることが見出された(Alegreほか、上掲、1995)。
【０１０１】
自己免疫抗原の例としては、ＩＡＳβ鎖(Tophamほか、Proc. Natl. Acad.
Sci., USA,
91:8005-8009; 1994)などがある。ＩＡＳβ鎖からの１８のアミノ酸ペプチドをマウスにワクチン投与すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎（encephalomyelitis）を発症中のマウスを保護し治療することが証明された（Tophamほか、上掲、199４）。
【０１０２】
ｒｄｓＲＮＡセグメントはアジュバントをコードするように構築でき、免疫原に対する宿主免疫応答を増強するように用いることができる。ｒｄｓＲＮＡによりコードされた特定のアジュバントはその特定のものが本発明に決定的ではなく、コレラ毒のＡサブユニット（すなわちＣｔｘＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ００１７１、ＡＦ１７５７０８、Ｄ３００５３、Ｄ３００５２）、またはそれらの部分や変異誘導体(たとえば古典的なコレラ菌(たとえばコレラ菌株３９５、ＡＴＣＣ＃３９５４１)またはＥ１ Ｔｏｒコレラ菌（たとえば、Ｖ．コレラ菌株２１２５、ＡＴＣＣ＃３９０５０）株からのＣｔｘのサブユニットのＡ１領域（すなわちＣｔｘＡ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０２６７９）でもよい。代替的には、バクテリア・アデノシン・二リン酸・リボシル化外毒素のファミリーの一員(Krueger
and Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995)であれば、どのバクテリア毒素でもＣｔｘＡの代わりに用いることができる。たとえば、腸内毒素性大腸菌の熱不安定性の毒素のサブユニット（以下、ＥＩｔａと表記）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３５３８１）、百日咳毒素Ｓ１サブユニット（例えばｐｔｘＳ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００７３６４、ＡＪ００７３６３、ＡＪ００６１５９、ＡＪ００６１５７など）があり、更には、上記アジュバントを百日咳菌（ＡＴＣＣ＃８４６７）、気管支敗血症菌（ＡＴＣＣ＃７７７３）またはパラ百日咳菌（ＡＴＣＣ＃１５２３７）のアデニル・シクラーゼ溶血素類の一つ、たとえば、百日咳菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１４１９９）、パラ百日咳菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４９８３５）または気管支敗血症菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ３７１１２）のｃｙａＡ遺伝子とすることもできる。
【０１０３】
ｒｄｓＲＮＡセグメントをコードするサイトカインも構築できる。ｒｄｓＲＮＡセグメントでコードした特定のサイトカインはその特定のものが本発明に決定的というわけではなく、インターロイキン−４（以下、“ＩＬ−４”と表記）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３５２７８３（マウスＩＬ−４）またはＮＭ＿０００５８９（ヒトＩＬ―４））、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１０５５８（マウスＩＬ−５）またはＮＭ＿０００８７９（ヒトＩＬ−５））、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２０５７２（マウスＩＬ−６）またはＭ２９１５０（ヒトＩＬ−６））、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１０５４８(マウス ＩＬ−１０)またはＡＦ４１８２７１(ヒトＩＬ−１０)）、ＩＬ−１２ｐ４０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８３５２（
マウスＩＬ−１２ｐ４０）またはＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２ｐ４０））、ＩＬ−１２ｐ７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００８３５１／ＮＭ＿００８３５２（
マウスＩＬ−１２ｐ３５／４０）またはＡＦ０９３０６５／ＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２ｐ３５／４０））、ＴＧＦβ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１１５７７(マウスＴＧＦβ１)またはＭ６０３１６(ヒトＴＧＦβ１)）およびＴＮＦα（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０２６１１(マウスＴＮＦα)またはＭ２６３３１(ヒトＴＮＦα)）などでもよい。
【０１０４】
また、小さい抑制ＲＮＡ’ｓまたはアンチセンスＲＮＡ’ｓもｒｄｓＲＮＡセグメントにおいて標的組織類の中のタンパク質の発現の調製のためにコードされる。
【０１０５】
真核性の細胞または組織の中で免疫調整物質を発現させることのできるｒｄｓＲＮＡを生成させるための機能性発現カセットの導入に備えた組換えＤＮＡおよび組換えＲＮＡ手法を上に述べた。
【０１０６】
ワクチンを真核発現カセットにおいてコード化に備えて構築する際に、ウイルス類似の粒子（以下、“ＶＬＰ”と表記）を構築し、ウイルス病原に対する保護免疫応答の産生を誘発するようにすることができる。インフルエンザＶＬＰ’ｓはヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミダーゼ（ＮＡ）および基質タンパク質（Ｍ１およびＭ２）をコードする遺伝子配列のプラスミド発現に引き続いて自己集合することが判った（Lathamほか、J, Virol. 75:6154-6165; 2001）。このようにして構築されたＶＬＰ’ｓは膜融合および出芽の能力を有し、動物モデルにおける抗原産生免疫応答および保護免疫を更に増強する(Pushkoほか、Vaccine.
2005 Sep 2; [印刷に先行する電子出版])。ＨＩＶのＶＬＰ’ｓも同様にして、キャプシドタンパク質のアミノ酸配列１４６−２３１をコードする最小配列、６アミノ酸ミリスチル化配列、Ｐ２ペプチドをコードする配列、ＧＣＮ４ロイシン・ジッパー領域およびｇｐ１６０外皮前駆物質から集積することができる（Accolaほか、J.
Virol, 74:5395-5402; 2000）。ＨＰＶ’ｓの主なタンパク質Ｌ１は、種々の株細胞をＶＬＰ’ｓに自己集積することが示されており、この魅力的な免疫原たるタンパク質をコードする遺伝子を作りつつ、体液性および細胞性の免疫を産生する(Shiほか、J
Virol., 75(21): 10139-10148;2001)。
【０１０７】
３．アルファウイルス発現カセット類を保持するｒｄｓＲＮＡセグメントの構築
上述のとおり、ｒｄｓＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（以下、“ＳＦＶ”と表記）の所望遺伝子が作動するように連結したプラスミドｐＳＦＶｌ(インヴィトロゲン(Invitrogen)社、Carlsbad, CA)による自己増幅レプリコンからなる哺乳動物翻訳発現カセットを内部に保持する。ＳＦＶ非構造タンパク質１−４（以下、“ｎｓｐ−４”と表記）およびＰＳＦＶｌのリプリカーゼ認識部位（図５）をＰＣＲにより増幅し、平滑末端結合反応により直近の下流側のＨｐａＩ部位に挿入し、ｒＳｅｇ−Ｓの中のＩＲＥＳに機能的に連結し、ｒＳｅｇ−
Ｓ：：ＳＦＶ１とする（図５）。プラスミドｒＳｅｇ−Ｓ：：ＳＦＶｌのＳｍａＩ  ＲＥ部位は如何なる外来のまたは内在の所望遺伝子の導入部位としても機能できる。
【０１０８】
なお、正の選択対立遺伝子、アルファウイルスｎｓｐｌ−４および約８１００ｂｐの単位複製配列を含むｒｄｓＲＮＡセグメントＳを内部に保持するｒｄｓＲＮｓにおいて、所望遺伝子が８００ｂｐを越える（すなわちゲノムサイズが野生型ゲノムより１０％以上大きい）ときは、セグメントＬの取込みが邪魔される。また、正の選択対立遺伝子、アルファウイルスｎｓｐｌ−４および単位複製配列を含むｒｄｓＲＮＡセグメントＳを内部に保持するｒｄｓＲＮｓはどんな環境でもｒｄｓＲＮＡセグメントＭを必要としない。
【０１０９】
このような容量限界は、５−プライムｐａｃ配列を欠くセグメントＬの修飾誘導体を発現するパッケージング株を生成することにより解決できる。そのような配列は、プロキャプシドの産生に必要なタンパク質を発現するであろうが、ヌクレオカプシドにはパッケージされず、それによって、その株内のｒｄｓＲＮに７０００ｂｐの追加容量をもたらす。
【０１１０】
上記構造の中の修飾セグメントＬは、ｐＴ７／Ｔ３−１８（アンビオン（Ambion）社、Austin,
TX、カタログ番号７２０１）などの発現ベクターによりパッケージング株に導入し、当業者に周知の方法（Hamiltonほか、上掲、1989）；（Blomfieldほか、上掲、1991）を用いた対立遺伝子交換により染色体に組み込むことができる。好ましい具体例においては、遺伝子を不活性化し、特定の培地条件、すなわちａｒｏＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ００５５７）、ａｒｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１４２２３１）、ｌｅｕＤ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０６６６６）、ａｓｄ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２６２）、ｍｕｒｌ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５２０９７０）、ｋｄｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ１７４１０１）およびｈｔｒＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５２９）などの下で選択可能な形質を生じさせるようにセグメントＬ発現カセットをコードするＤＮＡを染色体対に組み込むが、この染色体組込みの場所は本発明にとって重要でない。染色体の組込みの手段および上記変異体の培養方法は文献で十分に報告されている(Hamiltonほか、J.
Bacteriol. 171: 4617; 1989);(Blomfield等、MoI. Microbiol. 5: 1447; 1991)。
【０１１１】
４．ｒｄｓＲＮｓを新たに生成する方法
ｒｄｓＲＮｓは、ｒｄｓＲＮＡの産生に必要な全ての情報をコードするＲＮＡをプロキャプシドへの取込みのあと導入することにより、パッケージング株の中で産生される。ｒＲＮＡは直接に導入するか、またはパッケージング株に共に導入可能な非複製プラスミド上でコード化する。セグメントＬおよびプロキャプシドをコードする遺伝子はパッケージング株の中のプラスミド上に存在するか、パッケージング株の染色体に組み込まれる。上記以外のオプションとして、セグメントＬをコードする正の鎖ＲＮＡを、組換えセグメントＳおよびＭをコードする正の鎖ＲＮＡと呼応してパッケージング株に導入することもできる。プロキャプシドがセグメントＳおよびＭの組換えｓｓＲＮＡ’ｓ（以下、“ｓｓＲＮＡ”と表記）を取り込むと、セグメントＬ  ｍＲＮＡが取り込まれて、全てパッケージされたｓｓＲＮＡがｄｓＲＮＡに変換され、結果としてｒｄｓＲＮが産生される。ここで、上記セグメントＳおよびＭの組換えｓｓＲＮＡ’ｓは、セグメントＬのｍＲＮＡの取込みのための信号の産生に十分なサイズを備え、適切なパッケージング配列を示さねばならない。この段階で、ｒｄｓＲＮは組換えセグメントＳおよびＭ  ｍＲＮＡ並びにセグメントＬ  ｍＲＮＡを生成する能力を有し、後者は組換えセグメントおよびセグメントＬ  ｍＲＮＡを取り入れて、組み込むプロキャプシドを構築するタンパク質を発現し、その結果上記ｒｄｓＲＮはｄｓＲＮＡに変換され、それによって追加のｒｄｓＲＮｓを生成する（図６）。
【０１１２】
生体外で合成された組換えセグメントｍＲＮＡを電気穿孔、すなわちエレクトロポレーションによりパッケージング株に導入する。好ましくは、このＲＮＡをフッ素化ｒＮＴＰ’ｓ(Durascribe社，Picentre, Madison, WI)を用いて直鎖上のＤＮＡ鋳型から生体外転写し、核酸分解酵素抵抗性のＲＮＡであるフッ素化ＲＮＡを産生する。フッ素化ｄＵＴＰおよびｄＣＴＰを最終濃度が各々５ｍＭの反応混合物に混合する。ｆＮＴＰ’ｓが好ましいが、任意の修飾ずみのｒＮＴＰ、すなわちチオールまたはアミノヘキシル置換ｒＮＴＰ’ｓなど置換核酸分解酵素に抵抗性を示す修飾ずみのｒＮＴＰも本発明に有用である。従って、当業者にはフッ素化ｒＮＴＰ’ｓの代わりに核酸分解酵素に抵抗性を示す修飾ずみのＮＴＰで置換することが可能であろう。
【０１１３】
ＲＮＡまたは、好ましくは、フッ素化ＲＮＡは、上記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体および作動可能な形で真核性翻訳開始配列に連結した所望のＲＮＡを相補する少なくとも一つの遺伝子産物をコードする。好ましい具体例では、フッ素化ＲＮＡは上記少なくとも一つの選択可能な表現型変異体、ヌクレオカプシド産生の安定化のための遺伝子８（配列番号：７）、および真核性翻訳開始配列に作動可能な形で連結した所望のＲＮＡを相補する少なくとも一つの遺伝子産物をコードする。
【０１１４】
上記パッケージング株にｒｄｓＲＮ送り出すために、次のｉ）およびii）からなる電気穿孔培地を生成する：
ｉ）ｒｄｓＲＮＡのパッケージング、送り出しおよび産生のための密度１０８−１０１１ｃｆｕ／ｍｌのエレクトロコンピテントバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの非復帰性の選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ、
ｂ）プロキャプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列、および
ｃ）ＲＮＡパッケージングおよびＲＮＡポリメラーゼ能を有するタンパク質を含む一つまたはそれ以上のプロキャプシド
を含むバクテリア株；および
ii）１ｎｇ−１ｍｇ、好ましく１ｍｃｇ−１００ｍｃｇ、より好ましくは５ｍｃｇ−４０ｍｃｇのＲＮＡであって、少なくとも一つの選択可能な表現型の変異体および真核翻訳開始配列に作動可能な形で連結される所望のＲＮＡを相補する少なくとも一つの遺伝子産生物をコードするＲＮＡ。
【０１１５】
好ましい具体例では、上記ｒｄｓＲＮを次のｉ）およびii）からなる電気穿孔培地を用いて前記パッケージング株に送り出す：
ｉ）ｒｄｓＲＮＡのパッケージング、送り出しおよび産生のための密度１０８−１０１１ｃｆｕ／ｍｌのエレクトロコンピテントバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの非復帰性の選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ、
ｂ）プロキャプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列、および
ｃ）ＲＮＡパッケージングおよびＲＮＡポリメラーゼ能を有する一つまたはそれ以上のプロキャプシド
を含むバクテリア株；および
ii）１ｎｇ−１ｍｇ、好ましくは１ｍｃｇ−１００ｍｃｇ、より好ましくは５ｍｃｇ−４０ｍｃｇのＲＮＡであって、ヌクレオカプシド産生の安定のための上記少なくとも一つの選択可能な表現型の変異体、遺伝子８(配列番号：７)を相補する少なくとも一つの遺伝子産生物をコードＲＮＡ、および真核翻訳開始配列に作動可能な形で連結した所望ＲＮＡ。
【０１１６】
代替的には、ｒｄｓＲＮを次のｉ）およびii）からなる電気穿孔培地を用いて上記パッケージング株に送り出す：
ｉ）ｒｄｓＲＮＡのパッケージング、送り出しおよび産生のための密度１０８−１０１１ｃｆｕ／ｍｌのエレクトロコンピテントバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの非復帰性の選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ、
を含むバクテリア株；および
ii）１ｎｇ−１ｍｇ、好ましくは１ｍｃｇ−１００ｍｃｇ、より好ましくは５ｍｃｇ−４０ｍｃｇのＲＮＡであって、ヌクレオカプシド産生の安定のための上記少なくとも一つの選択可能な表現型の変異体、プロキャプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列、遺伝子８(配列番号：7)
を相補する少なくとも一つの遺伝子産生物をコードするＲＮＡ、および真核翻訳開始配列に作動可能な形で連結した所望のＲＮＡ。
【０１１７】
さらに好ましい具体例では、ｒｄｓＲＮを次のｉ）およびii）からなる電気穿孔培地を用いて上記バッケージング株に送り出す：
ｉ）ｒｄｓＲＮＡのパッケージング、送り出しおよび産生のための密度１０８−１０１１ｃｆｕ／ｍｌのエレクトロコンピテントバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの非復帰性の選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ、
ｂ）プロキャプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列、および
ｃ）ＲＮＡパッケージングおよびＲＮＡポリメラーゼ能を有する一つまたはそれ以上のプロキャプシド
を含むバクテリア株；および
ii）１ｎｇ−１ｍｇ、好ましく１ｍｃｇ−１００ｍｃｇ、より好ましくは５ｍｃｇ−４０ｍｃｇのフッ素化ＲＮＡであって、ヌクレオカプシド産生の安定のための上記少なくとも一つの選択可能な表現型の変異体、遺伝子８(配列番号：7)
を相補する少なくとも一つの遺伝子産生物をコードするフッ素化ＲＮＡ、および真核翻訳開始配列に作動可能な形で連結した所望のＲＮＡ。
【０１１８】
さらに好ましい具体例では、ｒｄｓＲＮを次のｉ）およびii）からなる電気穿孔培地を用いて上記パッケージング株に送り出す：
ｉ）ｒｄｓＲＮＡのパッケージング、送り出しおよび産生のための密度１０８−１０１１ｃｆｕ／ｍｌのエレクトロコンピテントバクテリア株であって、
ａ）少なくとも一つの非復帰の選択可能な表現型変異体からなるゲノムＤＮＡ
を含むバクテリア株；および
ii）１ｎｇ−１ｍｇ、好ましく１ｍｃｇ−１００ｍｃｇ、より好ましくは５ｍｃｇ−４０ｍｃｇのフッ素化ＲＮＡであって、ヌクレオカプシド産生の安定のための、上記少なくとも一つの選択可能な表現型の変異体、プロキャプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列、遺伝子８(配列番号：7)
を相補する少なくとも一つの遺伝子産生物をコードするフッ素化ＲＮＡ、および真核翻訳開始配列に作動可能な形で連結した所望のＲＮＡ。
【０１１９】
上記ＲＮＡまたは好ましくはフッ素化ＲＮＡを上記パッケージング株に電気穿孔する方法は本発明において重要ではなく、当業者に周知の標準の手順により達成できる(Ausubelほか、上掲、1990; Sambrook、上掲)。電気穿孔のあと、電気穿孔培地を回収培地とを上記文献 (Ausubelほか、上掲、1990)；（Sambrook、上掲）記載のとおり混合し、３７℃で３０分−４時間、好ましくは２時間、インキュベートする。
【０１２０】
電気形質転換体を、組換えセグメント中で正の選択対立遺伝子を内部に保持し発現する株の成長を可能にする条件下で固体培地上で分離する（たとえばトリプシン大豆寒天（以下、“ＴＳＡと”と表記）、ディフコ（Difco）社、Detroit、MI）。
【０１２１】
ｒｄｓＲＮｓを含有するバクテリア分離体を２５℃から４４℃の範囲の温度で１６時間乃至９６時間培養する。しかし、この形質転換体類を初めに２８℃で４８時間培養するのが好ましい。次に、選択固体培地上で成長するコロニーを標準的手法により分離して精製する(Ausubelほか、上掲、1990)；（Sambrook、上掲）。選択した分離体が機能性の所望のｒｄｓＲＮを保持していることを確認するために、個々の分離体を、ストランド特異性の配列、正の選択対立遺伝子、ＩＲＥＳおよび所望遺伝子の正および負の（第２）ストランドＲＮＡ配列を特異的に増幅するよう設計したプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより選別する。分析のためのＲＮＡ調製の方法は次に述べるとおり、当業者に周知である。すなわち、個々の分離体を液体培地で培養し（たとえばトリプチックソイ寒天肉汁（以下、“ＴＳＢ”と表記）、ディフコ（Difco）社）、その培養物を、光学密度が無菌ＴＢＳ対照と比較して６００ｎｍ（ＯＤβ６００）で０．００１〜４．０になったあと回収する。諸文献に報告され、当業者に周知の方法(Gottliebほか、J.
Bacteriol 172:5774; 1990);(Sunほか、上掲、2003)を用いて、ヌクレオカプシドを上記培養物から分離する。上記分析のためのＰＣＲプライマーは、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウエア・バージョン４．１(Scientific
and Educational Software Inc.、Durham, NC)またはＯＬＩＧＯ４．０プライマー解析ソフトウエア(著作権 Wojciech
Rychlik)を用いて設計した。このソフトウエアは、操作対象の特定のＤＮＡ断片に適合したＰＣＲプライマーの設計を可能にする。ＲＴ−ＰＣＲ法はＢｉｏ  Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ（Hercules,
CA）において行い、ＲＴ−ＰＣＲ法ににおけるプライマー・アニーリング、伸長、および変性時間は標準的手順(Ausubelほか、上掲)に従って設定した。次に、ＲＴ−ＰＣＲ法による産生物を標準的手順(Ausubelほか、上掲、1990);(Sambrook、上掲)を用いてアガロース・ゲル電気泳動法により解析した。正のクローンは、ｒｄｓＲＮＡセグメントが安定的にその株に保持されていることを示す適当な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ)パターンを示すものと定義される。ＲＴ−ＰＣＲ法による上記産生物は次に述べる標準的ＤＮＡ配列決定手段を用いて評価できる。
【０１２２】
所望の形質転換体を特定したのち、個々の株を１０−３０（ｖ／ｖ）グリセロール含有のＴＳである保存培地に保存する。バクテリア単離体を無菌の綿ウールのスワブを用いて固体培地から回収し、保存培地に密度１０８−１０９
ｃｆｕ／ｍｌで懸濁し、その懸濁液を−８０℃で保存する。
【０１２３】
精製したｒｄｓＲＮｓの各バッチを当業者に周知で諸文献に広く詳細に報告されている方法(Mindichほか、J
Virol 66, 2605- 10; 1992)；(Mindichほか、Virology 212:213-217; 1995)；(Mindichほか、J
Bacteriol 181:4505- 4508; 1999)；(Qiaoほか、Virology 275:218-224; 2000)；(Qiaoほか、Virology
227:103-110; 1997)；(Olkkonenほか、Proc Natl Acad Sci U S A 87:9173-9177; 1990)；(Onoderaほか、J
Virol 66, 190-196; 1992)を用いて上記キャリア株から精製する。
【０１２４】
５．生体内で生物効果を引き起こすｒｄｓＲＮｓの使用
ここに述べる新規ｒｄｓＲＮＡ発現システムの処方に用いる特定の方法は、その特定のものが本発明に決定的ではなく、生理的緩衝液、(Feignerほか、米国特許第５５８９４６６号（１９９６）)；アルミニウムリン酸またはアルミニウムヒドロキシリン酸(たとえばUlmerほか、Vaccine,
18:18; 2000)、モノフォスフォリル−リピッドＡ(以下MPLまたはMPLAとする； Schneersonほか、J. Immunol., 147:
2136-21; 1991)；(例えば、Sasakiほか、Inf. Immunol., 65: 3520- 3528; 1997);(Lodmellほか、Vaccine,
18:1059-1066; 2000)、ＱＳ−２１サポニン (例えばSasakiほか、J. Virol., 72:4931; 1998)；デキサメタゾン (例えば、Maloneほか、J.
Biol. Chem. 269:29903; 1994)；ＣｐＧ  ＤＮＡ配列(Davisほか、J. Immunol., 15:870; 1998)；またはリポ多糖類（ＬＰＳ）拮抗剤(Honeほか、上掲、1997)から選択できる。
【０１２５】
ｒｄｓＲＮは、静脈内、筋肉内、皮内、腸腔内、鼻腔内および経口接種ルートにより直接に真核細胞動物組織またはヒト組織に投与できる。ｒｄｓＲＮ構築物を標的の細胞または組織に導入する本明細書記載の特定の方法は、その特定のものが本発明に決定的に重要というわけではなく、上述のワクチン接種手法から選択できる(Wolffほか、Biotechniques 11:474-85; 1991)；(Johnston and Tang, Methods
Cell Biol 43:353-365; 1994)；(Yang and Sun, Nat Med 1:481-483; 1995)；(Qiuほか、Gene
Ther. 3:262-8; 1996)；(Larsenほか、J. Virol. 72:1704-8; 1998)；(Shata and Hone, J.
Virol. 75:9665-9670; 2001)；(Shataほか、Vaccine 20:623-629; 2001)；(Ograほか、J Virol
71:3031-3038; 1997)；(Bugeほか、J. Virol. 71:8531-8541; 1997)；(Belyakovほか、Nat. Med.
7, 1320-1326; 2001)；(Lambertほか、Vaccine 19:3033-3042; 2001)；(Kanekoほか、Virology
267: 8-16; 2000)；(Belyakovほか、Proc Natl Acad Sci USA 96:4512-4517; 1999)。
【０１２６】
本発明がもたらす本明細書記載の特定の生物学的効果には、保護的または調節的な免疫応答、治療応答および宿主タンパク質の発現低下(例えばｓｉＲＮＡ)または発現上昇(例えばサイトカイン発現)などが含まれる。ｒｄｓＲＮｓは初め１０２−１０９ヌクレオカプシド粒子の投与量で経口的に、鼻腔に、皮下に、筋肉内に、または侵襲性のバクテリアベクター経由で投与される（Sizemoreほか、Science.
1995 Oct 13;270(5234):299-302）。投与回数は個々のｒｄｓＲＮｓの効能に応じて変化し、２−４週間隔の１回、２回または３回投与とすることができる。各発現研究は所望遺伝子を持たない負の対照ｒｄｓＲＮを含み、所望遺伝子をコードするＤＮＡワクチンベクターは正の対照として作用できる。
【０１２７】
生物学的なシステムにおいて遺伝子発現をコードするｒｄｓＲＮの生物学的効果を測る方法は当業者に周知である。一例として、血清ＩｇＧおよびＩｇＡのｇｐ１２０への応答を測るには、血清をワクチン接種の前、およびワクチン接種の１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日および８０日後に集める。約４００−５００μｌの血液を各マウスの尾血管から採取して個々の管に集め、氷上で４時間インキュベートして凝固させる。微量遠心管で５分間遠心分離した後、血清を新しい管に移して−８０℃で保存する。所望遺伝子により発現された抗原に対する粘膜ＩｇＧおよびＩｇＡの応答を、ワクチン接種前および接種後の一定間隔で回収した糞便ペレットおよび膣洗浄処理液を用いて測定する(Srinivasanほか、Biol. Reprod. 53: 462; 1995)；(Staatsほか、J. Immunol.
157: 462; 1996)。標準ＥＬＩＳＡ法を、血清サンプルおよび粘膜サンプルでのｇｐ１２０に対するＩｇＧおよびＩｇＡの応答を定量するのに用いる(Abaciogluほか、ADDS
Res. Hum. Retrovir. 10: 371; 1994);(Pincusほか、AIDS Res. Hum. Retrovir. 12:
1041;1996)。卵白アルブミンを負の対照抗原として各ＥＬＩＳＡに含めることができる。また、各ＥＬＩＳＡ法には、正の対照血清、糞便ペレットまたは膣洗浄処理液サンプルを含めることができる。文献(Yamamotoほか、Proc.
Natl. Acad. Sci. 94: 5267; 1997)記載のとおり、正の対照サンプルを、コレラ毒１０μｇと混合した所望遺伝子により発現された抗原１０μｇで鼻腔内にワクチン接種した動物から回収した。終点力価を、波長４９０ｎｍでの吸光度であって負の対照列プラス三つの標準誤差値の平均より大きい吸光度の増加をもたらした最後の血清の希釈度の逆数を取ることによりの計算する。
【０１２８】
細胞免疫を測るために、サイトカイン特異性のエリスポット（ELISPOT）アッセイにより抗体特異性Ｔ細胞応答を測るようにリンパ組織からの濃縮ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞懸濁を用いた(Wuほか、AIDS
Res. Hum. Retrovir. 13:1187; 1997)。上記アッセイから、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを分泌する抗原特異性のＴ細胞の数を算定できる。文献(Wuほか、Infect.
Immun. 63:4933; 1995)に記載されているとおり、また従来用いられてきたとおり(Xu-Amanoほか、J. Exp. Med.
178:1309; 1993)；(Okahashiほか、Infect. Immun. 64: 1516; 1996)、上記エリスポット（ELISPOT）アッセイは市販の捕獲および検知モノクローナル抗体ｍＡｂｓ(R&D
Systems and Pharmingen)を用いて行う。各アッセイは分裂促進因子（mitogen）(Con A)およびを卵白アルブミン対照を含む。
【０１２９】
６．免疫応答を引き起こす、または標的の細胞または組織において生物効果を生じさせるｒｄｓＲＮｓを保持するバクテリアベクターの使用
ｒｄｓＲＮの、標的真核細胞、組織または器官への輸送、および標的真核細胞、組織または器官でのコードされた配列の発現は、非病原性のまたは弱毒性のバクテリア・ワクチン・ベクターに保持されるｒｄｓＲＮｓの接種により達成できる。所望の生物学的応答としては、これらに限られないが、保護的または調節的な免疫応答、治療応答、および宿主タンパク質の発現低下(たとえばｓｉＲＮＡ)または発現上昇(例えばサイトカイン発現)などがある。
【０１３０】
バクテリアワクチンの誘導の基となるバクテリア種は本発明に決定的ではなく、カンピロバクター(Campylobacter)属、ナイセリア(Neisseria)属.、ヘモフィルス(Haemophilus)属、エロモナス(Aeromonas)属、フランシセラ(Francisella)属、エルシニア(Yersinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、ボルデテラ(Bordetella)属、レジオネラ(Legionella)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シトロバクター(Citrobacter)属、クラミジア（Chlamydia）属、ブルセラ(Brucella)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ヘリコバクター(Helicobacter)属、またはビブリオ(Vibrio)属などを含み、これらに限定されない。
【０１３１】
使用する特定のカンピロバクター株はその特定のものが決定的ではなく、Ｃ．ジェジュニ(C.
jejuni)(ＡＴＣＣ番号４３４３６、４３４３７、４３４３８)、Ｃ．ヒオインテスティナリス(C. hyointestinalis)(ＡＴＣＣ番号３５２１７)、Ｃ．フェトゥス(C.
fetus)(ＡＴＣＣ番号１９４３８)Ｃ．フェカリスC.fecalis(ＡＴＣＣ番号３３７０９)Ｃ．ドイレイ(C. doylei)(ＡＴＣＣ番号４９３４９)およびＣ．コリ(C.
coli)(ＡＴＣＣ番号３３５５９、４３１３３)なども使用でき、これらに限定されない。
【０１３２】
使用する特定のエルシニア株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｙ．エンテロコリティカ（Y.
enterocolitica）(ＡＴＣＣ番号９６１０)、Ｙ．ペスティス（Y. pestis）(ＡＴＣＣ番号19428)、Ｙ．エンテロコリティカ（Y.
enterocolitica）ＹｅＯ３−Ｒ２(al-Hendyほか、Infect. Immun., 60:870; 1992)または Ｙ．エンテロコリティカａｒｏＡ(O'Gaoraほか、Micro.
Path., 9:105; 1990)なども使用できる。
【０１３３】
使用する特定のクレブシエラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｋ．ニューモニエ（K.
pneumoniae）（ＡＴＣＣ番号１３８８４）も使用できる。
【０１３４】
使用する特定のボルデテラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｂ．ペルトゥシス（B.
pertussis）、およびＢ．ブロンキセプチカ（B. bronchiseptica）(ＡＴＣＣ番号１９３９５)も使用できる。
【０１３５】
使用する特定のナイセリア株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、髄膜炎菌（N.
meningitidis）（ＡＴＣＣ番号１３０７７）、淋菌(N. gonorrhoeae)（ＡＴＣＣ番号１９４２４）、 淋菌ＭＳ１１  ａｒｏ変異株(Chamberlainほか、Micro.
Path., 15:51-63;
1993)も使用できる。
【０１３６】
使用する特定のエロモナス株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ａ．サルミノチダ(A.
salminocida) (ＡＴＣＣ番号３３６５８)、Ａ．スクベリー(A. schuberii) (ＡＴＣＣ番号４３７００)、 Ａ．ヒドロフィラ(A.
hydrophila)、 Ａ．オイクレノフィァ(A. eucrenophila) (ＡＴＣＣ番号２３３０９)なども使用できる。
【０１３７】
使用する特定のフランシセラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、野兎病菌(F.
tularensis)（ＡＴＣＣ番号１５４８２）なども使用できる。
【０１３８】
使用する特定のコリネバクテリウム株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｃ．シュードツベルクローシス(C. pseudotuberculosis)（ＡＴＣＣ番号１９４１０）なども使用できる。
【０１３９】
使用する特定のシトロバクター株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｃ．フロインディ（C.
freundii）（ＡＴＣＣ番号８０９０）なども使用できる。
【０１４０】
使用する特定のクラミジア株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、肺炎クラミジア（C.
pneumoniae）（ＡＴＣＣ番号ＶＲ１３１０）なども使用できる。
【０１４１】
使用する特定のヘモフィルス株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、インフルエンザ桿菌（H.
influenzae）(Leeほか、J. Biol. Chem. 270:27151; 1995)、Ｈ．ソムヌス（H. somnus）（ＡＴＣＣ番号４３６２５）なども使用できる。
【０１４２】
使用する特定のブルセラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、ウシ流産菌（B.
abortus)(ＡＴＣＣ番号２３４４８)なども使用できる。
【０１４３】
使用する特定のレジオネラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、Ｌ．ニューモフィラ（L.
pneumophila）（ＡＴＣＣ番号３３１５６）またはＬ．ニューモフィラｍｉｐ変異株（Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994）なども使用できる。
【０１４４】
使用する特定のシュードモナス株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、緑膿菌（P.
aeruginosa）(ＡＴＣＣ番号２３２６７)なども使用できる。
【０１４５】
使用する特定のヘリコバクター株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、ピロリ菌（H. pylori）(ＡＴＣＣ番号４３５０４)、Ｈ．ムステレ（H.
mustelae）(ＡＴＣＣ番号４３７７２)なども使用できる。
【０１４６】
使用する特定のビブリオ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、コレラ菌（Vibrio
cholerae）(ＡＴＣＣ番号１４０３５)、ビブリオ  シンシナティエンシス（Vibrio cincinnatiensis）(ＡＴＣＣ番号３５９１２)、 コレラ菌ＲＳＩ毒性変異株(Taylorほか、J.
Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994)およびコレラ菌ｃｔｘＡ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｅｐ変異株(Waldor Jほか、Infect
Dis.,170:278-283; 1994)なども使用できる。
【０１４７】
好ましい具体例では、本発明でバクテリア・ワクチン・ベクター派生の基となるバクテリア種として、ワクチンベクターとして作用する潜在力を有するとして先に挙げた、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）などのバクテリアの弱毒誘導体、すなわちエシェリキア（Escherichia）属、シゲラ（Shigella）属、およびサルモネラ（Salmonella）属などが挙げられる。グラム陽性および抗酸性の高速パッケージングおよびベクター株は同様にしてリステリア菌（Listeria
monocytogenes）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属から構築できよう。
【０１４８】
使用する特定のエシェリキア株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、大腸菌株ＤΗ５α、ＨＢ１０１、ＨＳ−４、４６０８−５８、１１８４−６８、５３６３８−Ｃ−１７、１３−８０、および６−８１(Sambrookほか、上掲、2001)；（Sansonettiほか、Ann. Microbiol.(Inst. Pasteur)、132A:
351; 1982）、腸内毒素原性大腸菌(Evansほか、Infect. Immun、12:656; 1975)、腸管病原性大腸菌(Donnenbergほか、J.
Infect. Dis., 169:831; 1994)、および腸管出血性大腸菌(McKee and O'Brien, Infect. Immun.,
63:2070; 1995)なども使用できる。
【０１４９】
使用する特定のサルモネラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、チフス菌（S. typhi）(ＡＴＣＣ番号７２５１)、ネズミチフス菌（S.
typhimurium）(ＡＴＣＣ番号１３３１１)、サルモネラ  ガリナルム（Salmonella galinarum)(ＡＴＣＣ番号９１８４)、サルモネラ  エンテリディティス（Salmonella
enteriditis）(ＡＴＣＣ番号４９３１)およびネズミチフス菌(ＡＴＣＣ番号６９９４)、チフス菌ａｒｏＣ、ａｒｏＤダブル変異株(例えば Honeほか、Vacc,
9:810-816; 1991)、ネズミチフス菌ａｒｏＡ変異株(Mastroeniほか、Micro. Pathol, 13:477-491; 1992)なども使用できる。
【０１５０】
使用する特定のシゲラ株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、シゲラ  フレックスネリ（Shigella
flexneri）(ＡＴＣＣ番号２９９０３)、シゲラ  フレックスネリＣＶＤ１２０３(Noriegaほか、Infect. Immun. 62:5168;
1994)、シゲラ  フレックスネリ１５Ｄ(Vecinoほか、Immunol Lett 82:197; 2002)、ソンネ菌（Shigella sonnei）(ＡＴＣＣ番号２９９３０)、およびシゲラ赤痢菌（Shigella
dysenteriae)(ＡＴＣＣ番号１３３１３)なども使用できる。
【０１５１】
使用する特定のマイコバクテリウム株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、結核菌ＣＤＣ１５５１株(Griffithほか、Am.
J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2): 808; 1995)、結核菌北京株(Soolingenほか、1995)、結核菌Ｈ３７Ｒｖ株(ＡＴＣＣ番号２５６１８)、結核菌パントテン酸要求性株(Sambandamurthy,
Nat. Med. 2002 8(10): 1171; 2002)、 結核菌ｒｐｏＶ変性株(Collinsほか、Proc Natl Acad Sci USA.
92(17):8036; 1995)、結核菌ロイシン要求性株(Hondalusほか、Infect. Immun. 68(5): 2888; 2000)、ＢＣＧデンマーク株（ＡＴＣＣ番号３５７３３）、ＢＣＧ日本株(ＡＴＣＣ番号３５７３７)、ＢＣＧシカゴ株(ＡＴＣＣ番号２７２８９)、ＢＣＧコペンハーゲン（Copenhagen）株(ＡＴＣＣ番号２７２９０)、ＢＣＧパスツール（Pasteur）株(ＡＴＣＣ番号３５７３４)、ＢＣＧグラクソ(Glaxo)株(ＡＴＣＣ番号３５７４１)、ＢＣＧコンノート（Connaught）株(ＡＴＣＣ番号３５７４５)、ＢＣＧモントリオール（Montreal）株(ＡＴＣＣ番号３５７４６)なども使用できる。
【０１５２】
使用する特定のリステリア菌株はその特定のものが本発明に決定的ではなく、リステリア菌株１０４０３Ｓ(例えばStevensほか、J
.Virol 78:8210-8218; 2004)または（ｉ）ａｃｔＡ  ｐｌｃＢダブル変異株(Petersほか、FEMS Immunology and
Medical Microbiology 35: 243-253; 2003)；(Angelakopoulousほか、Infect and Immunity
70: 3592-3601; 2002)；（ii）アラニン・ラセミ化酵素遺伝子やＤ−アミノ酸アミノ基転移酵素遺伝子のためのｄａｌ ｄａｔダブル変異株(Thompsonほか、Infect
and Immunity 66: 3552-3561; 1998)などのリステリア菌変異株なども使用できる。
【０１５３】
大腸菌、サルモネラ、マイコバクテリア、シゲラおよびリステリアを弱毒化する方法は本発明にとって重要ではなく、当業者に周知である(Evansほか、上掲、1975)；(Noriegaほか、上掲、1994)；(Honeほか、上掲、1991)。
【０１５４】
非病原性または弱毒化されたバクテリア・ワクチン・ベクターは選択後すぐにｒｄｓＲＮパッケージング株として使用するように修飾される。この修飾は、先に詳細に述べた方策、すなわち上述の株および変異体の中でｄｓＲＰプロキャプシドを発現して、ｒｄｓＲＮｓ、すなわち上述の株の中に変異により生じた欠陥を補完する機能性遺伝子を発現するｒｄｓＲＮｓの選択および維持を可能にするセグメントＬ配列の導入を伴う方策により達成する。
【０１５５】
所望ｒｄｓＲＮをパッケージし安定に維持する株を生成するために、生体外で合成した組換えセグメントＲＮＡ（ｓ）を電気穿孔法によりパッケージング株に導入し、形質転換体を、組換えセグメント中に正の選択対立遺伝子を内在させ発現する株だけ成長させる条件の下で固体培地で分離する(例えば、トリプシン大豆寒天（ディフコ(Difco)社、カタログ番号２４４５２０）は、野生型遺伝子が遺伝的欠陥を補完するとき、ａｓｄおよびｍｕｒ１
変異株の成長だけを可能にする)。ｒｄｓＲＮＡセグメントの生成、生体外ｍＲＮＡ合成、および電気穿孔の方法はすべて上述したとおりである。分離体が所望のｒｄｓＲＮを保持していることを確かめるために、個々の分離体を液体培地中で培養し（同社、カタログ番号２４４６２０）、その培地からヌクレオカプシドを周知の方法(Gottliebほか、上掲、1990)；(Sunほか、上掲、2003)で分離する。そのヌクレオカプシドからｄｓＲＮＡを市販のＲＮＡ抽出キットにより分離し、組換えセグメントの中で所定断片を増幅するプライマー、すなわち上述の正の選択対立遺伝子、ＩＲＥＳおよび所望の遺伝子を増幅するＲＣＲプライマーなどのプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）法により選別する。正のクローンは、ｒｄｓＲＮＡセグメントが上記株の中で安定に維持されていることを示す適切な逆転写ＰＣＲ（RT-PCR)パターンを表すものとして定義される。逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）産生物を、後述の標準的ＤＮＡ配列手順により更に評価することができる。
【０１５６】
ｒｄｓＲＮｓを内部に保持する上述のバクテリア・ワクチン・ベクター株の成長のための上述の特定の培養条件はその特定のものが本発明に決定的ではない。上記変異体は、ＬＢ培地(同社、カタログ番号２４４６２０)、栄養ブロス(同社、カタログ番号２３３０００)、またはトリプシン大豆ブロス(同社、カタログ番号２１１８２２)などの液体培地の中で、成長中のバクテリア株に適切な通常の培養技術(Miller、上掲、1991)を用いて成長させることができる。代替的には、バクテリアを栄養寒天培地(同社、カタログ番号２１２０００)、トリプシン大豆寒天(同社、カタログ番号２３６９２０)、またはＭ９栄養寒天培地(ディフコ社、カタログ番号２４８５１０)などの固体培地で培養することもできる。
【０１５７】
マイコバクテリアワクチンベクターは、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９(同社、カタログ番号２７１３１０)またはＳａｕｌｔｏｎ合成培地などの液体培地で、好ましくは３７℃で培養する。また、マイコバクテリアの成長速度はオレイン酸(０．０６％
ｖ／ｖ、Research Diagnostics社、カタログ番号０１２５７)およびチロキサポール（Tyloxapol）(０．０５％ ｖ／ｖ、 同社、カタログ番号７０４００)などの界面活性剤の添加により増強することができる。マイコバクテリア培養物の純度は、リン酸緩衝の生理食塩水（以下、“ＰＢＳ”と表記）に逐次的に（例えば、１０−８から１０倍ずつ）希釈したマイコバクテリア培養物１００μｌ分取品を２５−３０ｍｌのＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ１０(BD
Microbiology社, Cockeyesville, MD、カタログ番号２２１１７４)などの固体培地を含む３．５インチの皿に均等に拡げることにより、評価できる。
【０１５８】
本発明のｒｄｓＲＮと共に接種されるバクテリア・ワクチン・ベクターの量は接種対象の種類、治療対象の疾患または状態によって変わる。概括的にいうと、投与量は約１０３から１０１１個の微生物、好ましくは１０３から１０９個の微生物である。
【０１５９】
ｒｄｓＲＮｓを内部に保持するバクテリアベクターは薬学的に許容される担体または希釈剤と共に投与される。特定の薬学的受容担体または希釈剤は本発明に決定的に重要ではない。それら希釈剤の例としては、リン酸塩緩衝液生理食塩水、胃内で胃酸を緩衝するたとえばショ糖含有クエン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸塩単独含有緩衝液（ｐＨ７．０）(Levineほか、J. Clin. Invest, 79:888-902; 1987)；(Blackほか、J. Infect.
Dis., 155:1260-1265; 1987)などの緩衝液、またはアスコルビン酸含有、ラクトース含有、およびオプションとしてアスバルテーム含有(Levineほか、Lancet,
II: 467-470; 1988)の重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）がある。担体の例としては、スキムミルクに含まれるタンパク質、ショ糖などの糖類またはポリビニルピロリドンなどがある。通常は、これらの担体を約０．１−９０％（ｗ／ｖ）の濃度で、好ましくは１−１０％（ｗ／ｖ）の範囲で用いる。
【０１６０】
ベクター株の生物学的活動を適切な動物モデル（例えばＢＡＴＳ／ｃＪマウス、ウサギ、モルモットまたはアカゲザル）で評価する。初めに、ｒｄｓＲＮベクター株を適切な経路により投与量１０２−１０９ｃｆｕで投与する（すなわち大腸菌、サルモネラおよびシゲラは胃内にまたは鼻腔内に投与し、ｒＢＣＧベクターは皮下注射で投与する）。投与量は、各ベクター株の薬効やコード化された所望の組換え産物の結合価にしたがって変える。
【０１６１】
ｒｄｓＲＮによりコード化された産生物への免疫およびそれ以外の生物応答を測る方法は当業者に周知である。血清ＩｇＧおよびＩｇＡのｇｐ１２０への応答を測るには、血清をワクチン接種の前、およびワクチン接種後１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日および８０日に収集する。約４００−５００μｌの血液を各マウスの尾血管から採取して個々の管に集め、４時間氷上でインキュベートして凝固させる。微量遠心管の中で５分間遠心分離にかけた後、血清を新しい管に移して−８０℃に保存する。所望遺伝子により発現された抗原に対する粘膜ＩｇＧおよびＩｇＡの応答は、ワクチン接種前、および接種後一定時間間隔で回収した糞便ペレットおよび膣洗浄処理液を用いて測定する(Srinivasanほか、Biol. Reprod. 53: 462; 1995)；(Staatsほか、J. Immunol.
157: 462; 1996)。標準的なＥＬＩＳＡ法を、血清中や粘膜サンプル中でのｇｐ１２０へのＩｇＧおよびＩｇＡ応答の定量のために用いる(Abaciogluほか、ADDS
Res. Hum. Retrovir. 10: 371; 1994)；(Pincusほか、AIDS Res. Hum. Retrovir. 12:
1041;1996)。卵白アルブミンを負の対照抗原として各ＥＬＩＳＡに含めることができる。また、各ＥＬＩＳＡには、正の対照血清、糞便ペレットまたは膣洗浄処理液サンプルを含めることができる。文献(Yamamotoほか、Proc.
Natl. Acad. Sci. 94: 5267; 1997)記載のとおり、正の対照サンプルを、コレラ毒１０μｇと混合した所望遺伝子により発現された抗原１０μｇで鼻腔内にワクチン接種した動物から回収した。終点力価を、波長４９０ｎｍでの吸光度であって、負の対照列プラス三つの標準誤差値の平均よりも大きい吸光度増加をもたらす最後の血清の希釈度の逆数を取ることにより計算する。
【０１６２】
細胞免疫は、細胞内サイトカイン染色（以下、細胞内サイトカイン細胞数測定と表記）またはエリスポット（ELISPOT）(Letsch
A.ほか、Methods 31:143-49; 2003)によって測定できる。両方法とも抗原特異性の免疫応答の定量を可能とする。ただし、ＩＣＳも抗原特異性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を表現型的に特徴づけるように同時的能力を付加することができる。このようなアッセイ法によりＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−を分泌する抗原特異性のＴ細胞の数を算定できる(Wuほか、AIDS
Res. Hum. Retrovir. 13: 1187; 1997)。文献(Wuほか、Infect. Immun. 63:4933; 1995)に記載されるとおり、また既に使用されているとおり(Xu-Amanoほか、J.
Exp. Med. 178:1309; 1993)；(Okahashiほか、Infect. Immun. 64: 1516; 1996)、エリスポットELISPOTアッセイを市販の捕獲検知モノクローナル抗体（mAbs）(R&D
Systems and Pharmingen)を用いて実施する。各アッセイは分裂促進因子（mitogen）（ＣｏｎＡ）および卵白アルブミン対照を含む。
【０１６３】
７．組換えＤＮＡ技術
パッケージング株、バクテリアベクターおよびｒｄｓＲＮｓの構築に用いられる組換えＤＮＡ手順であって、ＰＣＲ、制限酵素（以下、“ＲＥ”と表記）消化、ＤＮＡ連結反応、アガロース・ゲル電気泳動、ＤＮＡ精製、およびジデオキシヌクレオチド配列決定などの手段は既に文献で報告されている(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992)；(Bothwellほか、上掲)；(Ausubelほか、上掲)。バクテリオファージ仲介の形質導入(de
Boer、上掲)；(Miller、上掲、1992)および(Ausubelほか、上掲)、または化学的(Bothwellほか、上掲)；(Ausubel等、上掲)；(Feignerほか、上掲)；（Farhood、上掲）、電気穿孔(Bothwellほか、上掲)；(Ausubelほか、上掲)；(Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY; 1992)および物理的形質転換(Johnstonほか、上掲)；(Bothwellほか、上掲)も諸文献に既出である。遺伝子はファージ(de
Boerほか、Cell, 56:641-649; 1989)、プラスミドベクター(Curtissほか、上掲)上に組み入れることができ、または標的株の染色体(Honeほか、上掲)にスプライスで組み込むことができる。
【０１６４】
遺伝子配列はアプライド  バイオシステムズ社製の上記ＡＢＩ３９００型ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザーおよびそのメーカー提供の手順を用いて合成できる。大きい配列、すなわち２００ｂｐよりも大きい配列の合成のために、完全長配列の一連のセグメントをＰＣＲにより当業者に周知の手順を用いて生成して統合し、完全長配列を形成する。しかし、より小さい配列、すなわち２００ｂｐより小さい配列は、上記３９００
ハイ−スループットＤＮＡシンセサイザーおよび同メーカー提供の手順を用いて一ラウンドで合成する。
【０１６５】
組換えプラスミドは、２００Ω、２５μＦおよび２５ｋＶに設定したBioRad Gene-Pulser（登録商標）(BioRad
Laboratories社, Hercules, CA)を用いた電気穿孔法によりバクテリア株に導入する。ｃＤＮＡ配列を確かめるためにヌクレオチド配列決定を標準的な自動化配列決定手法（アプライド  バイオシステムズ社３７３Ａ型自動シークエンサー）により行う。ＤＮＡ配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応法（以下、“ＰＣＲ”と表記）のためのＤＮＡプライマーは上記ＡＢＩ３９００型ハイ−スループットＤＮＡシンシセサイザーを用いて合成する。
【０１６６】
次の実施例は説明のみを意図するものであり本発明の範囲の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【０１６７】
実施例１：組換えＤＮＡ手順
制限酵素（以下、“ＲＥ”と表記）；（ニュー・イングランド・バイオラブス(New England
Biolabs)社、Beverly, MA）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（同社）およびＴａｑポリメラーゼ(Life Technologies、Gaithersburg、MD)を各メーカーのプロトコルに従って用いた。プラスミドＤＮＡを小スケール(Qiagen
Miniprep（登録商標）キット)または大スケール(Qiagen Miniprepキット)のプラスミドＤＮＡ精製キットを用いて、同メーカーのプロトコルに従って調製した。核酸分解酵素の無い分子生物学的グレイドの脱イオン化した水、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１Ｍ
ＭｇＣｌ２、１００％（ｖ／ｖ）、エタノール、超純度アガロース、およびアガロース・ゲル電気泳動緩衝液をライフ・テクノロジー社（Life Technologies、Gaitherburg、MD）から購入した。ＲＥ消化、ＰＣＲ法、ＤＮＡ連結反応やアガロース・ゲル電気泳動法を当業者に周知の手法を用いて実施した(Sambrookほか、上掲、1989);(Ausubelほか、上掲、1990)。次の実施例における各組換えプラスミドのＤＮＡ配列を確かめるためのヌクレオチド配列決定を、アプライド  バイオシステムズ社製自動化シンセサイザー３７３Ａ型を用いて通常の自動化ＤＮＡ配列決定手法により行った。
【０１６８】
ＰＣＲプライマーをインテグレイティドＤＮＡテクノロジー社(Coralville、IA)またはメアリーランド・バイオポリマー機能大学（University
of Maryland Biopolymer Facility）(Baltimore、MD)から購入し、上記ＤＮＡシンセサイザー３７３Ａ型を用いて合成した。ＰＣＲプライマーを２００μＭの濃度で用い、ＰＣＲ反応のアニーリング温度をクローンマネジャー（Clone
manager）ソフトウエア・バージョン４．１（サイエンティフィック・アンド・エデュケイショナル・ソフトウエア社（Durham、NC）またはＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエア・バージョン４．０を用いて決定した。ＰＣＲ法をバイオ・ラド・アイサイクラー（Bio
Rad iCycler）（Hercules、CA）で実施した。増幅のためのＰＣＲプライマーを上記クローンマネジャーソフトウエア・バージョン４．１、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウエア・バージョン４．０を用いて決定した。このソフトウエアはＰＣＲプライマーのデザインを可能にし、特定の巧みに細工されたＤＮＡ断片に適合するＲＥ部位を特定する。ＰＣＲ法は上記バイオ・ラド・アイサイクラーで行い、ＰＣＲ法におけるプライマー・アニーリング、伸長、および変性のための時間は標準的手順(Ausubelほか、上掲)に従って設定した。次に、ＲＥ消化およびＰＣＲを標準的手順(Ausubelほか、上掲);(Sambrook、上掲)を用いて、アガロース・ゲル電気泳動法により解析した。
正のクローンを、適切なＲＥパターンおよび／またはＰＣＲパターンを示すものとして定義した。この手順により特定したプラスミドは、上述のとおり更に標準のＤＮＡ配列決定操作により評価できる。
【０１６９】
大腸菌株Ｔｏｐ１０およびＤＨ５’αをインヴィトロゲン社（Carsbad、CA）から、株ＳＣＳＩ１０をストラタジーン社（La
Jolla、CA）からそれぞれ購入した。これらの株は、下記実施例に記載のとおり、組換えプラスミドの宿主として用いた。組換えプラスミドは、文献(Ausubelほか、上掲)記載のとおり、２００Ω、２５μＦおよび１．８ｋＶに設定した上記ジーンパルサーを用いた電気穿孔法または化学的形質転換により大腸菌（E.
Coli）に導入した。
【０１７０】
バクテリア株は、とくに他の条件に言及しない限り、トリプシン大豆寒天（ディフコ（Difco）社）またはトリプシン大豆ブロス（同社）で、しかるべき温度で成長させた。培地の必要に応じて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび／または２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（chloramphenicole）（シグマ社、St
Louise、MO）を補充した。バクテリア株は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール（同社）を含むトリプシン大豆ブロス（ディフコ社）に、ｍｌあたりおよそ１０９個のコロニー形成単位（以下、“ｄｆｕ”と表記）で懸濁し−８０℃で保存した。
【０１７１】
試薬リスト
ＫｐｎＩ(ニュー・イングランド・バイオラブス社、Beverly、MA、カタログ番号Ｒ０１４２Ｓ)、ＰｓｔＩ(同社、カタログ番号Ｒ０１４０Ｓ)、トリプシン大豆ブロス(ディフコ社、Detroit、MI、カタログ番号２１１８２２)、トリプシン大豆寒天(同社、カタログ番号２３６９２０)、ミニプレップ（Miniprep）（登録商標）プラスミドＤＮＡ精製キット(キアーゲン社、Valencia、CA、カタログ番号２７１０６)、グリセロール(シグマ社、St.
Louis、MO、カタログ番号Ｇ５５１６)、ＨｐａＩ(ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ０１０５Ｓ)、子ウシ腸管アルカリフォスファターゼ(同社、カタログ番号Ｍ０２９０Ｓ)、ヴェントＲ（VentR）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ(同社、カタログ番号Ｍ０２５４Ｓ)、キュー・アイ・エー・クイックＰＣＲ精製キット(キアーゲン社、カタログ番号２８１０６、Valencia、CA)、ジアミピメリン酸(シグマ−アルドリッチ社、St.
Louis、MO、カタログ番号Ｄ１３７７)、ＢｇｌII(ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ０１４４Ｓ)、ＩＰＴＧ(インヴィトロゲン社、Carsbad、CA、カタログ番号１５５２９−０１９)、細胞培養溶解剤(プロメガ社、Madison,
WI、カタログ番号Ｅ１５３１)、リゾチーム(シグマ社、St. Louis、MO、カタログ番号Ｌ６８７６)、リン酸カリウム(同社、カタログ番号Ｐ５３７９)、塩化マグネシウム(同社、カタログ番号Ｍ１０２８)、ＤｒａIII(ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ０５１０Ｓ)、ＰｓｉＩ(同社、カタログ番号Ｖ０２７９Ｓ)、プロテイナーゼＫ(アンビオン社、Austin、TX、カタログ番号２５４２−２５４８)、デュラスクライブ（Durascribe）Ｔ７転写キット(エピセンター社、Madison,
WI)、デュラスクライブ（Durascribe）ＳＰ６転写キット(同社)、メガスクリプト（登録商標）ＳＰ６転写キット(アンビオン社、Austin、TX、カタログ番号１３３０)、メガクリアーカラム(同社、カタログ番号１９０８)、ブライトスタービオチン化（biotinylated）ＲＮＡミレニアム・マーカー（millennium
marker）(同社、カタログ番号７１７０)、ブライトスターナイロン膜(同社、カタログ番号１０１０２)、ブライトスター・バイオ検知（Biodetect）キット(同社、カタログ番号１９３０)、トリス塩酸緩衝液(クオリティ・バイオロジカル社、Gaitherburg、MD、カタログ番号３５１−００７−１００)、塩化マグネシウム(シグマ−アドリッチ社、St.
Louis、カタログ番号Ｍ１７８７)、酢酸アンモニウム (同社、カタログ番号Ａ２７０６)、塩化ナトリウム(同社、カタログ番号Ｓ７６５３)、塩化カリウム(同社、カタログ番号Ｐ３９１１)、ジチオスレイトール(同社、カタログ番号Ｄ９７７９)、ＥＤＴＡ(同社、カタログ番号Ｅ８００８)、ポリエチレン・グリコール４０００(フルカ社、Buchs、Switzerland、スイスカタログ番号９５９０４)、スーパラーゼＲＮＡ分解酵素阻害剤（SUPERase
RNase inhibitor）(アンビオン社、Austin、TX、カタログ番号２６９４、)、ビオチン−１４−ＣＴＰ(インヴィトロゲン社、カタログ番号１９５１９−０１６)、ＲＮＡ分解酵素ワン（RNase
ONE）リボヌクレアーゼ(プロメガ社、Madison, WI、カタログ番号Ｍ４２６１)。
【実施例２】
【０１７２】
ａｓｄ変異体を相補し蛍光レポ−ター、結核菌抗原、およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原を発現するｒｄｓＲＮＡセグメントの構築
本研究の目標はｐｈｉ−８のｄｓＲＮＡゲノムに基づきプロトタイプｒｄｓＲＮに導入できる組換えセグメントを開発することであった(Mindichほか、J. Bacterid、181: 4505; 1999)；(Mindich、Microbiol. MoI.
Biol. Rev、63: 149; 1999)；(Hoogstratenほか、Virology、272: 218; 2000)；(Sunほか、Virology、308:
354; 2003)。上述のとおり、ｐｈｉ−８ゲノムは三つのセグメントＳ、ＭおよびＬからなる。野生タイプのセグメントＬ（以下、“ｗｔＬ”と表記）をコード化するＲＮＡ依存のＲＮＡポリメラーゼが、組換えセグメントＭおよびＳ（以下、それぞれ“ｒＭ”および“ｒＳ”と表記）にクローン化されたパッセンジャー遺伝子を発現するように、プロトタイプｒｄｓＲＮＡを構築した。ｒＭおよびｒＳの両方は、遺伝子１０および遺伝子８のバクテリア・リボソーム結合部位にそれぞれ連結された野生型のアスパルギン酸セミアルデヒド脱水酵素遺伝子（以下、“ａｓｄ”と表記。ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００２６２）（図４を参照）、およびＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳに機能的に連結された所望遺伝子（すなわち、蛍光タンパク質ＨｃＲｅｄおよびマイコバクテリア抗原（ＴＢＳ））をコードする。なお、ｒＳのａｓｄ対立遺伝子はｒｄｓＲＮ’ｓの安定化のために後述の具体化例においては野生型のセグメントＳの遺伝子８で置き換えたが、セグメントＭおよびＳ上のどのファージ構成遺伝子も当初はｒＭまたはｒＳに組み入れなかった。上記ａｓｄ対立遺伝子、ＩＲＥＳ：：ＨｃＲｅｄおよびＭｔｂ抗原をコードする配列には、ｐａｃおよび負のストランドＲＮＡの合成開始配列をそれぞれコードする５−プライムおよび３−プライム非翻訳配列が隣接する。言い換えれば、ｒＭ上のレポートされた遺伝子にはセグメントＭの５−プライムｐａｃ配列およびセグメントＭの３−プライム末端配列が隣接する。同様に、ｒＳは、セグメントＳの５−プライムｐａｃ配列およびセグメントＳの３−プライム末端配列が隣接したレポート対象の遺伝子からなる（図５）。なお、ｒｄｓＲＮｓの産生を可能にするのはこの配置のみであり、ファージもｒｄｓＲＰ粒子も形成されない。
【０１７３】
組換えセグメントの構築は、合成ＤＮＡおよび標準の組換えＤＮＡ手法、すなわち実施例１で述べたとおりのＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、部位特異的変異誘発、制限酵素消化、ゲル電気泳動、連結反応、ジデオキシヌクレオチド配列決定、およびバクテリア形質転換などを用いて行った。
【０１７４】
組換えセグメントＳ（ｒＳ）はミドランド・サーティファイド社（Midland、TX）が合成した。５−および３−プライム配列は後述の修飾を伴ってｐｈｉ−８のセグメントＳ（Leonard
Mindich博士提供。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション（accession）番号ＡＦ２２６８５３）のｃＤＮＡコピーから引き出した。５−および３−プライムのオリエンテーションにおいて、ｒＳ（配列番号：１）は次の融合構成要素から成る（図４）。
（ｉ）遺伝子８のＳ ｐａｃ配列およびリボソームの結合サイトは（本明細書では、“ＲＢＳ”という）はセグメントＳの最初の１８７個のヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３）であり、プロキャプシドによる取り込みが要求される(Hoogstratenほか、上掲、; 2000)。ＲＢＳは原核細胞における翻訳開始のために要求される。
（ii）Δａｓｄ大腸菌株Ｘ６２１２における正の選択のために上述のＲＢＳに機能的に連結されるａｓｄ遺伝子。このａｓｄ配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２６２の２４０−１３４３塩基から得た。
（iii）真核細胞における翻訳開始のためのＣ型肝炎ウイルス配列内リボソーム侵入部位。この配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４２６５１の塩基３６−３４１に跨る。
（iv）パッセンジャー遺伝子の挿入のための多重クローニング部位（ＭＣＳ）。
（ｖ）ｒＳ  ｍＲＮＡのポリアデニル化のためのセムリキ森林ウイルス３’非翻訳領域；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ０１３９８のヌクレオチド１−２６１。
（vi）ｐｈｉ−８セグメントＳ  ３―プライム終末配列、すなわちセグメントＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３）の、ＲＮＡ安定化、および負のストランドＲＮＡ合成開始前のｐｈｉ―８ポリメラーゼ結合のために必要な塩基３０８１−３１９２。
上述の成分からなる合成ＤＮＡ断片（配列番号：１）を実施例１記載のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｐｓｔｆ消化のｐＴ７／Ｔ３−１８ＤＮＡ(アンビオン社、Austin、TX、カタログ番号７２０１)に結合した。連結反応のあと、ＤＮＡを電子穿孔法（実施例１）を用いて大腸菌株ＤＨ５α−Ｅ（インヴィトロゲン社、カタログ番号１１３１９−０１９）に導入し、形質転換体をアンピシリン
(１００μｇ／ｍｌ)を補ったＴＳＡで３７℃１６−２４時間培養することにより分離した。首尾よく進行した連結反応の産生物を、２ｍｌの培養物から高次コイルＤＮＡ分離により特定した。その培養物は、殺菌ずみのつま楊子を単独コロニーに突き刺したのち、このつま楊子をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補った殺菌ずみのＴＢＳに置き、３７℃１６−２４時間攪拌し（２００ｏｐｍ）培養して生成した。遠心分離の後、液状の上澄みを捨て、バクテリア・ペレットを再度１００μｌのミニプレップ（Miniprep）（登録商標）プラスミドＤＮＡ精製キット（キアーゲン社、カタログ番号２７１０６）のＰ１溶液に再懸濁した。次に、プラスミドＤＮＡを製造業者の取扱説明書に従って抽出し、精製した（同社、カタログ番号２７１０６取扱説明書）。次に、精製ずみのプラスミドＤＮＡを、取扱説明書に従うとともに上記メーカー提供の緩衝液を用いて、制限酵素ＰｓｔI（ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ０１４０Ｓ）で消化し、３７℃１時間培養した。得られたＤＮＡ断片を、実施例１に記載したとおりアガロース・ゲル電気泳動法により分画し、正しいパターンを示すプラスミドをジデオキシヌクレオチド配列決定（実施例１）によって更に特徴づけた。この手法により、ｒＳをコードするＤＮＡを保持するプラスミドｐＴ７／Ｔ３−１８を保持した４つの独立の分離体を特定した。これらの分離体の中のプラスミドをＡＦ１と表示した。このプラスミドを内部に保持する４つの分離体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補ったＴＳＡ上に画線培養し、３７℃で１６−２４時間培養した。次に、このバクテリアを殺菌綿ウール・スワブ(Puritan社、Guilford、ME、カタログ番号２５−８０６１ＷＣ)を用いて回収し、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール(シグマ社、カタログ番号Ｇ５５１６)含有のＴＢＳに１０９ｃｆｕ／ｍｌの密度で懸濁して、分画量１ｍｌにし−８０℃で保存した。
【０１７５】
第二のｒＳ（ｒＳ２）を、上述のとおり（ｒＳ、配列番号：３）ＢｇｌII部位でＣ型肝炎ウイルスＩＲＥＳに連結するとともにｒＳの下流配列（ｂｐ１３０１−２０２０）に連結するｐｈｉ−８
ｗｔセグメントＳ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３）のｂｐ１−１２９４をＰＣＲ増幅することにより構築した。この構造を、ｐＴ７Ｔ３−１８のＰｓｔＩ部位に連結し、大腸菌Top
10に形質転換した。形質転換体を上述のとおり解析し、六つの正しい分離体をｐＡＦｌＳ２と名付けた。
【０１７６】
組換えセグメントＭ（ｒＭ、配列番号：２）は、５−プライムｐａｃおよび３−プライム終末配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５２のｗｔセグメントＭ、ヌクレオチド１−２６２および４６７７−４７４１からそれぞれ抽出したものであること以外は、ｒＳと同じである。すなわち、ｒＳと同様に、ｒＭはｐｈｉ−８の５−プライムｐａｃおよび３−プライム終末配列の隣接した外来配列から成る（図４）。２０６０ｂｐのｒＭ（配列番号：２）はプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋） (インヴィトロゲン社、カタログ番号Ｖ８６０−２０）のＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラブス社、それぞれのカタログ番号Ｒ１４２ＳおよびＲ１４０Ｓ)の認識部位にクローン化した。適切な挿入部を内部に保持する組換えプラスミドをｒＳのための手順を用いて特定し、この新規プラスミドをｐＡＦ１９と名付けた。
【０１７７】
真核発現カセットを構築するために、ｐＡＦ１をＨｐａｌおよびＮｏｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ１０５Ｓ）で消化した。一旦連結されると、Ｈｅ−Ｒｅｄ遺伝子およびマイコバクテリア抗原のパッケージがＨＣＶ・ＩＲＥＳのすぐ下流に直接に機能的に連結されるように、このＲＥ消化産生物はＭＣＳの中の定方向性のクローニングサイトをもたらした。消化のあと、直線化されたプラスミドの端末部を、再循環阻止のために、子ウシ腸管アルカリフォスファターゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｍ０２９０Ｓ)で脱リン酸処理した。次に、脱リン酸処理したプラスミドを０．８％アガロース・ゲル中で電気泳動し、ゲル抽出することにより精製した。
【０１７８】
上記２．０ｋｂマイコバクテリア抗原融合配列（ＴＢＳ）をアキュプライムＤＮＡポリメラーゼ(インヴィトロゲン社)およびＨｐａＩサイトおよびＮｏｔＩ  ＲＥサイト付きのプライマーを用いてプラスミドｐＡｄＡｐｔ３５．Ｂｓｕ．ＴＢ．Ｓ(Crucell)からＰＣＲ増幅した。増幅ずみの配列の大きさをアガロース・ゲル電気泳動法により確かめ、QIAquick
ＰＣＲ精製キット(キアーゲン社、カタログ番号２８１０６)を用いてメーカーの取扱説明書に従って精製した。
【０１７９】
ＴＢＳをコードする上記断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ(ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号.
Ｍ２０２Ｓ)により脱リン酸処理ずみのｐＡＦ１に連結し、その結果得られたプラスミドをｐＳＴＢ２と名付けた。
【０１８０】
ＴＢＳ抗原融合配列およびＨＣ−Ｒコード化配列を、同様にして、上述の組換えＤＮＡ手順を用いてｐＡＦ１９上に保持ずみのｒＭ（図４）のＨｐａＩサイトに挿入した。その結果得られたプラスミドをｐＭＴＢ７およびｐＭＨｃ−Ｒｅｄと名付けた。
【０１８１】
プラスミドｐＳＴＢ２およびｐＬＭ２７７５（野生型セグメントＳをコードする）をＲＥのＳｐｈＩおよびＰｓｉｌにより直線化し、その結果得られた直線化ずみの断片をアガロース・ゲル電気泳動および抽出によって精製した。プラスミドｐＭＴＢ７およびｐＭＨｃ−ＲｅｄをＳｐｈＩおよびＰｓｉｌにより同様に直線化した。四つのＲＥ消化物の各々からの直線化ずみのＤＮＡ配列を上記メーカーの取扱説明書に従ってデュラスクライブ(Durascribe)Ｔ７(Epicentre社)生体外転写反応における鋳型として用い、ＴＢＳをコードするｗｔＳ、ｒＳ、抗原ＴＢＳをコードするｒＭ、およびＨｅ−ＲｅｄをコードするｒＭのフッ素化ＲＮＡ転写物を産生した。
【０１８２】
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomenengitis virus）
(以下、“ＬＣＭＶ”と表記）のグリコプロテイン抗原ＧＰ−ＩおよびＧＰ−２を発現するように、ｒｄｓＲＮＡセグメントの第３のセットを同様にして構築した。１５１１ｂｐ断片をＬＣＭＶゲノムの大きい染色体上に位置するＧＰポリプロテイン前駆体をコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＧＰからｐＰＣＲ増幅した。アキュプライムＤＮＡポリメラーゼ（インヴィトロゲン社）およびＨｐａＩおよびＮｏｔＩ
ＲＥサイトを含むプライマーを用いて、上記配列を増幅した。増幅した配列の大きさを、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット(キアーゲン社、カタログ番号２８１０６)を用いてメーカーの取扱説明書に従ってアガロース・ゲル電気泳動によって確かめた。プラスミドｐＡＦｌＳ２およびｐＡＦ１９を、ＲＥのＨｐａＩおよびＮｏｔＩ（ニュー・イングランド・バイオラブス社、カタログ番号Ｒ０１０５Ｓ）を用いて直線化し、子ウシ腸管フォスファターゼ（同社、カタログ番号Ｍ０２９０Ｓ）を用いて脱ホスホリレートした。ＧＰをコードする配列を同様にＨｐａＩおよびＮｏｔＩで消化し、直線化ずみのｐＡＦｌＳ２およびＡＦ１９プラスミドに連結し、ｐＳＧｐ１およびｐＭＧＰ２を生じさせた。これらのプラスミドは、ｒＳ２およびｒＭのＨＣＶ・ＩＲＥＳに機能的にそれぞれ連結されたＧＰポリプロテイン前駆体遺伝子をこのようにしてコードする。
【０１８３】
ｐＳＧＰ１およびｐＭＧＰ２が生体外（in vitro）転写鋳型として作用するように、ＲＥのＫｐｎＩおよびＰｓｉＩでそれぞれ消化する。デュラスクライブ(Durascribe)Ｔ７(Epicentre社、Madison,
WI)生体外転写キットを用い上記メーカーの取扱説明書に従って、フッ素化ＲＮＡ転写物を各プラスミドから生成した。従って、結果物として得られる転写物は、ｒＳ２およびｒＭ双方におけるＧＰ−１およびＧＰ−２抗原配列をコードした。
【実施例３】
【０１８４】
原型パッケージングおよび輸送株の構築
この研究の目的は原型のバクテリア・パッケージング株を作り出すことにあった。シゲラ・フレックスネリ１５Ｄは非復帰の染色体ａｓｄ標識挿入・削除変異体を保持しており、この変異体はアスパルギン酸セミアルデヒド・脱水素酵素（以下、“ＡＳＤ”と表記）の産生における欠陥および、細胞壁構成要素ジアミノピメリン酸（以下、“ＤＡＰ”と表記）の合成能力の欠落をもたらす(Sizemoreほか、Vaccine. 1997 Jun; 15(8): 804-7)。遺伝子相補のない成長では培地に５０μｇ／ｍｌのＤＡＰ(シグマ−アドリッチ社、St.
Louis, MO、カタログ番号Ｄ１３７７)の補充が必要である。
【０１８５】
シゲラを実施例として選んだが、その侵襲的特徴および粘膜免疫細胞への自然な指向のために理想的な輸送ベクターにもなり得る。ａｓｄ変異体はａｓｄ対立遺伝子をコードするｒｄｓＲＮにより相補されることになっているので、その株を弱毒化してほ乳類細胞への導入後溶解するようにし、ｒｄｓＲＮ’ｓを遊離させるために、第２の染色体障害を生じさせる必要もあった。ｍｕｒ１遺伝子（グルタミン酸塩ラセマーゼをコードする）の上流および下流のおよそ１ｋｂの領域を、ＮｈｅＩサイトをコードしたＰＣＲプライマーの連結反応と協動したＰＣＲにより増幅し、ＳｓｔＩおよびＸｂａＩをコードするプライマーにおいてｐＣＶＤ４４２（Ｘを参照）に連結した。得られたプラスミドを抱合によってＳ．フレクスネリ１５Ｄに導入した。融合体を抗生物質抵抗性、ショ糖感受性、およびＰＣＲ解析により特定し、当業者に周知の方法を用いて分離し、ａｓｄ、ｍｕｒ１株ＭＰＣ５１を産生した。ｍｕｒ１変異体は細胞がペプチドグリカン成分であるＤ−グルタミン酸塩を合成できないようにし、正常成長達成のためにＭ９最少成長培地への５０μｇ／ｍｌのＤ−グルタミン酸塩の補充を必要とする。さらに、Ｈｅｌａ細胞侵襲アッセイにより、この株が侵襲性を有するものの、細胞内で長期にわたり生き延びることはできないことが明らかになった（図７）。
【０１８６】
この栄養要求性がｒｄｓＲＮにおいてコードされたａｓｄの発現によりトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）相補され得るか否かを判定するために、Ｓ．フレックスネリＭＰＣ５１をｐＬＭ２６５３、すなわちＳＰ６プロモーターによる制御の下でｗｔＬ  ｍＲＮＡを発現しプロキャプシドを集積するのに必要かつ十分なｐｈｉ−８タンパク質を産生するプラスミドで形質転換した(Sunほか、Virology、308: 354; 2003)。このプラスミドｐＬＭ２６５３を電気穿孔により導入し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンの添加により選択した。
【０１８７】
ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３におけるプロキャプシド集合を天然のおよびＳＤＳ−変性の細胞ライセートの分画濾過により評価した。それらのライセートをプロキャプシドに特異的な抗血清による免疫ブロット法によって解析した（図８）。端的にいうと、各プロキャプシドの分子量（ＭＷ）の期待値は１５ＭＤａに対して、プロキャプシドタンパク質（８７ｋＤａおよび３４Ｄａ）は、ライセートを１０％ＳＤＳで処理しない場合は、１００ｋＤａカットオフ膜を通過できず、集合であることを示した（図８）。さらに、薄く切片化したＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３の透過性電子顕微鏡写真はおよそ６０ｎＭの多数のプロキャプシド粒子を鮮明に示した（図９）。
【実施例４】
【０１８８】
ｒｄｓＲＮＡセグメントをコードするｓｓＲＮＡをプロトタイプパッケージング株に導入することおよび機能的な自己複製ｒｄｓＲＮ’ｓを上記株へ送り出すこと
本実施例の研究目標はバクテリア・パッケージング株の中にｒｄｓＲＮｓを送り出し維持する方法を開発することであった。そのために選択した戦略は、生体外で合成した実施例２記載のｒＭおよびｒＳ構築物をコードするｓｓＲＮＡ（＋）でパッケージング株、すなわちＳ．フレックスネリＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３（実施例３）を形質転換することを含む。ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３への導入のあと、ｓｓＲＮＡ（＋）をプロキャプシドにパッケージして負のストランド合成を達成し、ｒｄｓＲＮｓを生成する（図６）。次に、このｒｄｓＲＮは、ｗｔＬ、ｒＭおよびｒＳ  ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡ（すなわち、ｓｓＲＮＡ（＋）であって受動的にｒｄｓＲＮから保持株の細胞質に分泌されるｓｓＲＮＡ（＋）（図６））を合成する。これらの転写物は、ｗｔＬ、ｒＭ、およびｒＳ、すなわち共に機能性ａｓｄ遺伝子を保持しＭＰＣ５１の中のａｓｄ変異体を相補するｗｔＬ、ｒＭおよびｒＳの発現を通してより多くのプロキャプシドを産生し、それによって成長へのＤＡＰ要求を除く。これらｗｔＬ、ｒＭ、およびｒＳ  ｍＲＮＡをプロキャプシドにパッケージングし、追加のｒｄｓＲＮｓを形成する。
【０１８９】
ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３の電気形質転換能細胞を標準的な技術(Ausubelほか、上掲)を用いて作成した。要点を述べると、単独クローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および５０μｇ／ｍｌＤＡＰ(シグマ−アドリッチ社、カタログ番号Ｄ１３７７)を添加したＭ９培地で３７℃で成長させた。５０ｍｌの培養液をＯＤ６００＜０．１から開始し、細胞をＯＤ６０００．３および０．６の間の指数関数的成長の期間中に回収した。それら細胞を氷冷の５ｍＭのＤＥＴＡ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）で一度水洗し、次に氷冷の１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで３回洗浄した。各洗浄に続いて、４０００ｘｇの遠心分離を行った。最後の水洗および遠心分離操作のあと、それら細胞を１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに再懸濁した。２００ｍｌの分画量に分配し、−８０℃で保存した。
【０１９０】
ＭＰＣ５１  ｐＬＭ２６５３を電気穿孔する際に用いたｒＳおよびｒＭのｓｓＲＮＡ（＋）は、実施例２に記載したとおり、直線化したｐＳＴＢ２およびｐＭＴＢ７をＤＮＡ鋳型としてそれぞれ用いて生体外で合成した。ＭＰＣ５１  ｐＬＭ２６５３細胞を２μｇ／ｍｌのｓｓＲＮＡ（＋）で電気穿孔した（１．０μｇのｒＳ＋１．０μｇのｒＭ）。電気穿孔を２００Ω、２５ｍｃＦおよび１．８ｋＶにセットしたＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ(BioRad社、Hercules、CA)を用いて行った。これらの細胞を５０μｇ／ｍｌのＤＡＰを補充した抗生物質無添加のＳＯＣ培地（インヴィトロゲン社、カタログ番号＃１５５４４―０３４）の中で２８℃で２時間にわたり回復可能とした。次に、これら細胞を適切な抗生物質入りで５０μｇ／ｍｌのＤ−グルタミン酸塩および０．１μｇ／ｍｌ（ＭＰＣ５１  ｐＬＭ２６５３の成長の支援に必要なＤＡＰの最低濃度以下）のＤＡＰを補充したＭ９寒天の上に広げた。これらの細胞を２５−２７℃で成長させ、次にＭ９Ａｐ／Ｋｎ／Ｄ−グルタミン酸塩に移し、ＤＡＰを添加して０．０１μｇ／ｍｌとするか、ＤＡＰを回収した。これらの細胞を２２℃−２５℃で培養し、得られたコロニーはｐＬＭ２６５３のためにアンピシリン抵抗性を示し、ｒＳおよびｒＭ上のａｓｄ遺伝子の発現のためにＤＡＰ非依存性を示した。
【０１９１】
成長特性を改良するために、ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３を、遺伝子８の供給源としてｐＭＴＢ７およびプラスミド−ｐＬＭ２７７５をコードする野生型セグメントＳから生体外で転写したｓｓＲＮＡを用いて電気穿孔した。上述の手順およびそれに続く成長過程を上述のとおり行い、ｒｄｓＲＮを有するＤＡＰ非依存のＭＰＣ５１株を得、これをＬＳＭｔｂ４と名付けた（図１０）。
【０１９２】
同様にして、ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３を、遺伝子８を供給源としてプラスミドｐＬＭ２７７５をコードする野生型セグメントＳおよびｐＭＨｃ−Ｒｅｄ、すなわち機能的にｒＭのＩＲＥＳに連結したＨｅ−Ｒｅｄタンパク質をコードするｐＭＨｃ−Ｒｅｄから生体外で転写したｓｓＲＮＡを用いて電気穿孔した。この手順およびそれに続く成長過程を上述のとおり行い、ｒｄｓＲＰを有するＤＡＰ非依存のＭＰＣ５１株を得、これをＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄと名付けた。
【０１９３】
第３の例では、ＬＣＭＶ  ＧＰ抗原をコードするｒＳ２（遺伝子８を含む）構築物ｐＳＧＰ１から生体外で転写したｓｓＲＮＡをｗｔＳからの遺伝子８配列の必要性の緩和のために用いた。Ｓ．フレックスネリＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３を、上述の例の場合と同様に、ｐＳＧＰ１およびｐＭＧＰ２から生体外で転写されたＲＮＡで電気穿孔した。そのあとの成長段階を上述のとおり進めて、ｒｄｓＲＮを有するＤＡＰ非依存のＭＰＣ５１株を得、これをＬＳｇｐＭｇｐと名付けた。ｒｄｓＲＮの存在を、ヌクレオカプシド特異性の抗血清による細胞ライセート全体への免疫ブロット法の適用、およびｒＳ２およびｒＭの（＋）および（−）結合鎖双方に特異的なプライマーによるＲＴ−ＰＣＲ法の適用により確かめた。
【０１９４】
生体外転写したｓｓＲＮＡのｒＳおよびｒＭの任意の組み合わせを用いたＭＰＣ５１の電気穿孔が、ｗｔＬ  ｓｓＲＮＡまたはｗｔＬをコードするプラスミドを伴わない限り、また標的株がプラスミドｗｔＬをコードするプラスミドで予め形質転換されてない限り、結果として形質転換体を何らもたらさなかったことは注目に値する。さらに、ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３の電気穿孔の前に生体外転写ずみのｓｓＲＮＡ’ｓをＲＮＡ分解酵素Ａで処理しても、形質転換体の回収は何ら得られなかった。ｒｄｓＲＮ’ｓを作る手段としてのＲＮＡ電気穿孔の効率と効能を明示する追加例として、三つの野生型セグメント全ての生体外転写物を上述の方法と同じ方法でシリンゲ菌（ｐｈｉ−８の元々の宿主）に電気穿孔した。その結果、野生型溶解性バクテリアファージｐｈｉ−８が再び得られた。このことは、電気穿孔による菌叢中のバクテリア溶解斑形成、および電気穿孔により誘発されたシリンゲ菌細胞内の野生型ファージ粒子の透過型電子顕微観察で証拠づけられた（図１２）。
【０１９５】
ＤＡＰ非依存性はそれぞれのｒｄｓＲＮによりコードされたｒＳやｒＭ ＲＮＡ上のａｓｄ＋遺伝子を増幅することから得られるものとみられる。負または正の結合鎖ＲＮＡのいずれかの増幅に特有なプライマーを用いて上述のｒｄｓＲＮを保持する株からの全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ解析すれば、ｒＳおよびｒＭのｃＤＮＡを回収することになるのは確かである。ファージにおける負の鎖合成が三つ全てのゲノムセグメントを取込んだ後にのみ起こることを想起されたい。ｒｄｓＲＮのＬＳＭｔｂ４およびＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄを有するＳ．フレックスネリＭＰＣ５１は、この明細書作成の時までの３か月間の連続培養で、ＤＡＰ非依存性を保持していた。結局、これらの構築物は免疫ブロット法により検出可能なカプシドタンパク質、および透過電子顕微鏡法により可視化可能な集積されたヌクレオカプシドを産生し続ける（図１１）。
【０１９６】
したがって、これらの結果は、要するに、ＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３におけるａｓｄ除去の相補がＲＮＡ取込みおよびパッケージング株へのｒｄｓＮＣのパッケージングおよび自己複製機能である。これらの知見は更に、これらの手順によって、産生株の中に保持されるｒｄｓＲＮ’類が産生されることをさらに示すものである。
【実施例５】
【０１９７】
ほ乳類細胞におけるｒｄｓＲＮの発現
本発明の範囲は、バクテリア・パッケージング株の使用によるｒｄｓＲＮ’ｓのほ乳動物組織または器官への輸送だけに限定されないが、説明の目的で、減弱した侵襲性バクテリアＳ．フレックスネリＭＰＣ５１の利用（実施例３および４）を決めた。すなわち、このバクテリアが多くの組織培養株化細胞や動物モデルにおいて本来侵襲的であるからである。実施例３に記載したとおり、ｒｄｓＲＮ’ｓを真核細胞細胞質に遊離させるために、真核細胞の侵襲と細胞内小胞の逸脱のあとバクテリア細胞の溶解を生じさせるようにこの株を操作した。
【０１９８】
第一線の証拠として、ｒｄｓＲＮ  ＬＳＭｔｂ４を有するＭＰＣ５１を選んだ。このｒｄｓＲＮ構築物がＴＢＳと名付けた結核菌抗原パッケージをコードする。このパッケージの正確な組成は本発明に重要ではないが、説明目的のために、この抗原パッケージの組成をタンパク質抗原８５Ａをコードする配列としてある。実施例２に記載したとおり、抗原パッケージをＨＣＶ  ＩＲＥＳ配列に連結反応させ、この配列の翻訳制御の下に置いた。このｒｄｓＲＮ（ＭＰＣ５１＋ＬＳＭｔｂ４）を有するバクテリア株内にＴＢＳ構築物の発現がないことを、ポリクローナル抗血清(Abeam社、Cambridge、UK)で抗原８５Ａを精査する細胞溶解液全体の免疫ブロットによって確かめた。
【０１９９】
ＨｅＬａ細胞(インヴィトロゲン社)を、６個の組織培養フラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２の中のＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％抗生物質／抗真菌剤溶液(インヴィトロゲン社)で成長させ、カバーガラス上少なくとも６０％の培養密度とした。同時に、Ｓ．フレックスネリＭＰＣ５１＋ＬＳＭｔｂ４を５０ｍｌのＭ９の中で、２８℃で振盪し、少なくとも０．６のＯＤ６００になるまで成長させた。侵襲アッセイの２４時間前に、ＨｅＬａ細胞から培地を除去してＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで置き換えた。侵襲の２時間前にＨｅＬａ細胞培地をＤＭＥＭで置き換え、バクテリア培養物を希釈し、静的に３７℃で成長させた。次に、組織培養恒温器中のＯ２濃度をＮ２で１％に低下させ、ＰＢＳで洗浄したＭＰＣ５１＋ＬＳＭｔｂ４のＤＭＥＭ懸濁液を感染効率（ＭＯＩ）１００でＨｅＬａ培養物に添加し、１時間培養した。同様に調製したＳ．フレックスネリ１５Ｄ（ａｓｄ）およびＭＰＣ５１ｐＬM２６５３のバクテリア懸濁液を同じ方法でＨｅＬａ細胞のウエルに同時に加えた。
【０２００】
１時間の侵襲保温のあと、ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地（ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ）を１５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン硫酸鉛(シグマ社)で１時間にわたり置き換えて補充し、未侵襲でＨｅＬａ細胞による保護を受けていなかった残存バクテリア細胞すべて殺菌した。ゲンタマイシンは上記濃度で広範囲にわたる抗菌性を示すが、真核細胞膜を通過しない。１時間後、培地を新しいＤＭＥＭ＋ＦＢＳで置換し、組織培養細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１４時間培養した。
【０２０１】
次に、ＨｅＬａ細胞付きのカバーガラスを取り外してＰＢＳの２％パラフォルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で固定し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００により透過処理し、２時間にわたりＰＢＳ（ｐｈ７．４）中で３％ＢＳＡ、５％正常ヤギ血清、０．０５％アジ化ナトリウムによりブロックし、ＰＢＳ（ｐｈ７．４）中で１％ＢＳＡ、３％ＮＧＳに１：１００で希釈した抗原８５Ａ特異性の抗血清（ＩｇＹ）(Abeam社、Cambridge、MA)、０．０５％アジ化ナトリウムでプローブした。次に、それら細胞をＰＢＳ（ｐｈ７．４）の中で１％ＢＳＡ、３％ＮＧＳ、０．０５％アジ化ナトリウムの１：１００に希釈したＦＩＴＣ複合のウサギ抗ＩｇＹ(同社)でカウンタープローブしたうえ、蛍光顕微鏡で精査した。バクテリア、すなわちＳ．フレックスネリ１５ＤおよびＭＰＣ５１ｐＬM２６５３のいずれにも曝されなかった対照ＨｅＬａ細胞グループは、抗原８５Ａ発現を示す蛍光を何ら生じなかった。侵襲性のＭＰＣ５１＋ＬＳＭｔｂ４に曝されたＨｅＬａ細胞は細胞中での抗原８５Ａの発現をＴＢＳ抗原融合タンパク質の一部として示す高輝度の蛍光を生じた（図１３）。なお、抗原８５Ａ発現がシゲラ菌パッケージング／キャリア株では検出できなかったこと、および生きたシゲラ菌は１４時間のインキュベーションの後では全く回収できなかったことは重要である。これはｒｄｓＲＮの生成した組換えセグメントｍＲＮＡが哺乳動物で翻訳されることの明らかな証拠である。
【０２０２】
上述の方法と類似の方法で、ＨｅＬａ細胞への侵襲を、直接に蛍光を発するＨｃ−Ｒｅｄ遺伝子の配列をそのｒＭセグメント上に有しているＭＰＣ５１＋ＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄで生じさせた。侵襲に曝して１２時間のちにＨｅＬａ細胞カバーグラスを固定し、蛍光顕微鏡強で精査した。Ｓ．フレックスネリ１５ＤおよびＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３対照グループはＨｃ−Ｒｅｄ蛍光を何ら示さなかったが、ＭＰＣ５１＋ＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄに曝されたＨｅＬａ細胞は直接に蛍光を発した（図１４）。この蛍光がＨｃ−Ｒｅｄ発現に起因することを示す追加の証拠として、ＨｅＬａ細胞を固定し、Ｈｃ−Ｒｅｄに特異的な抗原でプローブし、二次抗体複合物でカウンタープローブした。この場合も、ＭＰＣ５１＋ＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄに曝された細胞のみが蛍光を発した（図１５）。また、Ｈｃ−Ｒｅｄ発現は、ＭＰＣ５１＋ＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄのみの免疫ブロットまたは直接の蛍光顕微鏡分析で検出できなかった。これらの結果を総合すると、蛍光の直接観察およびタンパク質の免疫検出により、哺乳動物細胞において、ＲＮＡをコードするｒｄｓＲＮが翻訳されてタンパク質になることが証拠づけられたことになる。また、この段階で回収できた生きたシゲラ菌はほとんどまたは全くなく、裸のＲＮＡは有限の半減期を有し、（＋）連結鎖またはｍＲＮＡのみがコード化されたタンパク質に翻訳され得たので、翻訳情報の源はＨｅＬａ細胞内でのパッケージング／輸送株の溶解後にｒｄｓＲＮにより産生されたｍＲＮＡであることが明らかであるとみられる。
【実施例６】
【０２０３】
組換えセグメントＳおよび組換えセグメントＳ２の配列の例
実施例４を参照して、組換えセグメントＳ（ｒＳ）の構築のために本発明の実施に用いた模範的な配列の例を次に示す。
Ｐｓｔｌ： 
ｃｔｇｃａｇ
バクテリオファージｐｈｉ−８セグメントＳｐａｃおよびリボソームの結合部位（セグメントＳ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３の塩基１−１８７）：
ｇａａａｔｔｔｔｃａ  ａａｔｃｔｔｔｔｇａ  ｃｔａｔｔｔｃｇｃｔ  
ｇｇｃａｔａｇｃｔｃ  ｔｔｃｇｇａｇｔｇａ  ａｇｃｃｔｔｃｃｃｔ  
ｇａａａｇｇｃｇｃｇ  ａａｇｇｔｃｃｃｃａ  ｃｃａｇｃｔｃｇｇｇ  
ｇｔｇａｔｔｃｇｔｇ  ａｃａｔｔｔｃｃｔｇ  ｇｇａｔｃｔｃｇｇａ  
ｇｔｃａｇｃｔｔｔｇ  ｔｃｔｃｔａｇｇａｇ  ａｃｔｇａｇｃｇｔｔ  
ｃｇｇｔｃｔｃａｇｇ  ｔｔｔａａａｃｔｇａ  ｇａｔｔｇａｇｇａｔ  
ａａａｇａｃａ（配列ＩＤ番号：１）→ａｓｄ遺伝子に接続
大腸菌ａｓｄ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２６２の塩基２４０−１３４３)：
ａｔｇａａａａａｔｇｔ  ｔｇｇｔｔｔｔａｔｃ  ｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇ  
ｇｔａｔｇｇｔｃｇｇ    ｃｔｃｃｇｔｔｃｔｃ  ａｔｇｃａａｃｇｃａ  
ｔｇｇｔｔｇａａｇａ    ｇｃｇｃｇａｃｔｔｃ  ｇａｃｇｃｃａｔｔｃ  
ｇｃｃｃｔｇｔｃｔｔ    ｃｔｔｔｔｃｔａｃｔ  ｔｃｔｃａｇｃｔｔｇ  
ｇｃｃａｇｇｃｔｇｃ    ｇｃｃｇｔｃｔｔｔｔ  ｇｇｃｇｇａａｃｃａ  
ｃｔｇｇｃａｃａｃｔ    ｔｃａｇｇａｔｇｃｃ  ｔｔｔｇａｔｃｔｇｇ  
ａｇｇｃｇｃｔａａａ    ｇｇｃｃｃｔｃｇａｔ  ａｔｃａｔｔｇｔｇａ  
ｃｃｔｇｔｃａｇｇｇ    ｃｇｇｃｇａｔｔａｔ  ａｃｃａａｃｇａａａ  
ｔｃｔａｔｃｃａａａ    ｇｃｔｔｃｇｔｇａａ  ａｇｃｇｇａｔｇｇｃ  
ａａｇｇｔｔａｃｔｇ    ｇａｔｔｇａｃｇｃａ  ｇｃａｔｃｇｔｃｔｃ  
ｔｇｃｇｃａｔｇａａ    ａｇａｔｇａｃｇｃｃ  ａｔｃａｔｃａｔｔｃ  
ｔｔｇａｃｃｃｃｇｔ    ｃａａｔｃａｇｇａｃ  ｇｔｃａｔｔａｃｃｇ  
ａｃｇｇａｔｔａａａ    ｔａａｔｇｇｃａｔｃ  ａｇｇａｃｔｔｔｔｇ  
ｔｔｇｇｃｇｇｔａａ    ｃｔｇｔａｃｃｇｔａ  ａｇｃｃｔｇａｔｇｔ  
ｔｇａｔｇｔｃｇｔｔ    ｇｇｇｔｇｇｔｔｔａ  ｔｔｃｇｃｃａａｔｇ  
ａｔｃｔｔｇｔｔｇａ    ｔｔｇｇｇｔｇｔｃｃ  ｇｔｔｇｃａａｃｃｔ  
ａｃｃａｇｇｃｃｇｃ    ｔｔｃｃｇｇｃｇｇｔ  ｇｇｔｇｃｇｃｇａｃ  
ａｔａｔｇｃｇｔｇａ    ｇｔｔａｔｔａａｃｃ  ｃａｇａｔｇｇｇｃｃ  
ａｔｃｔｇｔａｔｇｇ    ｃｃａｔｇｔｇｇｃａ  ｇａｔｇａａｃｔｃｇ  
ｃｇａｃｃｃｃｇｔｃ    ｃｔｃｔｇｃｔａｔｔ  ｃｔｃｇａｔａｔｃｇ  
ａａｃｇｃａａａｇｔ    ｃａｃａａｃｃｔｔａ  ａｃｃｃｇｔａｇｃｇ  
ｇｔｇａｇｃｔｇｃｃ    ｇｇｔｇｇａｔａａｃ  ｔｔｔｇｇｃｇｔｇｃ  
ｃｇｃｔｇｇｃｇｇｇ    ｔａｇｃｃｔｇａｔｔ  ｃｃｇｔｇｇａｔｃｇ  
ａｃａａａｃａｇｃｔ    ｃｇａｔａａｃｇｇｔ  ｃａｇａｇｃｃｇｃｇ  
ａａｇａｇｔｇｇａａ    ａｇｇｇｃａｇｇｃｇ  ｇａａａｃｃａａｃａ  
ａｇａｔｃｃｔｃａａ    ｃａｃａｔｃｔｔｃｃ  ｇｔａａｔｔｃｃｇｇ  
ｔａｇａｔｇｇｔｔｔ    ａｔｇｔｇｔｇｃｇｔ  ｇｔｃｇｇｇｇｃａｔ  
ｔｇｃｇｃｔｇｃｃａ    ｃａｇｃｃａｇｇｃａ  ｔｔｃａｃｔａｔｔａ  
ａａｔｔｇａａａａａ    ａｇａｔｇｔｇｔｃｔ  ａｔｔｃｃｇａｃｃｇ  
ｔｇｇａａｇａａｃｔ    ｇｃｔｇｇｃｔｇｃｇ  ｃａｃａａｔｃｃｇｔ  
ｇｇｇｃｇａａａｇｔ    ｃｇｔｔｃｃｇａａｃ  ｇａｔｃｇｇｇａａａ  
ｔｃａｃｔａｔｇｃｇ    ｔｇａｇｃｔａａｃｃ  ｃｃａｇｃｔｇｃｃｇ  
ｔｔａｃｃｇｇｃａｃ    ｇｃｔｇａｃｃａｃｇ  ｃｃｇｇｔａｇｇｃｃ  
ｇｃｃｔｇｃｇｔａａ    ｇｃｔｇａａｔａｔｇ  ｇｇａｃｃａｇａｇｔ  
ｔｃｃｔｇｔｃａｇｃ    ｃｔｔｔａｃｃｇｔｇ  ｇｇｃｇａｃｃａｇｃ  
ｔｇｃｔｇｔｇｇｇｇ    ｇｇｃｃｇｃｇｇａｇ  ｃｃｇｃｔｇｃｇｔｃ  
ｇｇａｔｇｃｔｔｃｇ    ｔｃａａｃｔｇｇｃｇ  ｔａａ(配列ＩＤ番号：２)  
→ＩＲＥＳに接続
Ｃ型肝炎ウイルス−ＩＲＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４２６５１の塩基３６−３４１）
ａｔｃａｃｔｃｃｃｃ  ｔｇｔｇａｇｇａａｃ  ｔａｃｔｇｔｃｔｔｃ  
ａｃｇｃａｇａａａｇ  ｃｇｃｃｔａｇｃｃａ  ｔｇｇｃｇｔｔａｇｔ  
ａｔｇａｇｔｇｔｃｇ  ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃ  ａｇｇａｃｃｃｃｃｃ  
ｃｔｃｃｃｇｇｇａｇ  ａｇｃｃａｔａｇｔｇ  ｇｔｃｔｇｃｇｇａａ  
ｃｃｇｇｔｇａｇｔａ  ｃａｃｃｇｇａａｔｔ  ｇｃｃａｇｇａｃｇａ  
ｃｃｇｇｇｔｃｃｔｔ  ｔｃｔｔｇｇａｔｃａ  ａｃｃｃｇｃｔｃａａ  
ｔｇｃｃｔｇｇａｇａ  ｔｔｔｇｇｇｃｇｔｇ  ｃｃｃｃｃｇｃｃａｇ  
ａｃｔｇｃｔａｇｃｃ  ｇａｇｔａｇｔｇｔｔ  ｇｇｇｔｃｇｃｇａａ  
ａｇｇｃｃｔｔｇｔｇ  ｇｔａｃｔｇｃｃｔｇ  ａｔａｇｇｇｔｇｃｔ  
ｔｇｃｇａｇｔｇｃｃ  ｃｃｇｇｇａｇｇｔｃ  ｔｃｇｔａｇａｃｃｇ  
ｔｇｃａｃｃａｔｇ(配列ＩＤ番号：３)→多重クローニング部位に接続
多重クローニング部位および終止コドン：
ａｔｇ  ｇｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｃｔ  ｔａａ  ｔｔａ  ａｔａ  ａａｔ  ａａａ  ｔａａ(配列ＩＤ番号：４）→ＳＦＶ−３’非翻訳に接続
セムリキ森林ウイルス（Semliki forest virus）−３−プライム非翻訳領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ０１３９８の塩基１−２６２）：
ｇｒｔａｇｇｇｔａ    ｇｇｃａａｔｇｇｃａ  ｔｔｇａｔａｔａｇｃ  
ａａｇａａａａｔｔｇ  ａａａａｃａｇａａａ  ａａｇｔｔａｇｇｇｔ  
ａａｇｃａａｔｇｇｃ  ａｔａｔａａｃｃａｔ  ａａｃｔｇｔａｔａａ  
ｃｔｔｇｔａａｃａａ  ａｇｃｇｃａａｃａａ  ｇａｃｃｔｇｃｇｃａ  
ａｔｔｇｇｃｃｃｃｇ  ｔｇｇｔｃｃｇｃｃｔ  ｃａｃｇｇａａａｃｔ  
ｃｇｇｇｇｃａａｃｔ  ｃａｔａｔｔｇａｃａ  ｃａｔｔａａｔｔｇｇ  
ｃａａｔａａｔｔｇｇ  ａａｇｃｔｔａｃａｔ  ａａｇｃｔｔａａｔｔ  
ｃｇａｃｇａａｔａａ  ｔｔｇｇａｔｔｔｔｔ  ａｔｔｔｔａｔｔｔｔ  
ｇｃａａｔｔｇｇｔｔ  ｔｔｔａａｔａｔｔｔ  ｃｃ(配列ＩＤ番号：５)→φ８セグメントＳ  ３’ＲＮＡ  ｐｏｌ結合部位に接続
ｐｈｉ−８セグメントＳ ３−プライム ポリメラーゼ結合部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３の塩基３０８１−３１９２）： 
ｇｃｔｔａｇｃｇｇｃ  ａａｔｃｇａａｃｃｃ  ｔｃｃｇ  ｘｃａｔａａｇｇ  
ａｇｇｔｔｔａｇｃａ  ａａｔｃｃｇｃｇｇｃ  ｔｃｔｔａｔｇａｇｃ  
ｔｇｔｃｃｇａａａｇ  ｇａｃａａｃｃｃｇａ  ａａｇｇｇｇｇａｇｃ  
ｇａｇｇａｃｔｔｃｇ  ｇｔｃｃｔｃｃｇｃｔ  ｃｃ(配列ＩＤ番号：６）
ＰｓｔＩ：  
ｃｔｇｃａｇ
図４について、野生型ファージｐｈｉ−８（ｒＳ２）の遺伝子８をコードする組換えセグメントＳ２の構築のため本発明の実施に用いた配列の例は次のとおりである。
ＰｓｔＩ：  
ｃｔｇｃａｇ  
バクテリオファージｐｈｉ−８セグメントＳ  ｐａｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３のｂｐ１−１８７）：  
ｇａａａｔｔｔｔｃａ  ａａｔｃｔｔｔｔｇａ  ｃｔａｔｔｔｃｇｃｔ  
ｇｇｃａｔａｇｃｔｃ  ｔｔｃｇｇａｇｔｇａ  ａｇｃｃｔｔｃｃｃｔ  
ｇａａａｇｇｃｇｃｇ  ａａｇｇｔｃｃｃｃａ  ｃｃａｇｃｔｃｇｇｇ  
ｇｔｇａｔｔｃｇｔｇ  ａｃａｔｔｔｃｃｔｇ  ｇｇａｔｃｔｃｇｇａ  
ｇｔｃａｇｃｔｔｔｇ  ｔｃｔｃｔａｇｇａｇ  ａｃｔｇａｇｃｇｔｔ  
ｃｇｇｔｃｔｃａｇｇ  ｔｔｔａａａｃｔｇａ  ｇａｔｔｇａｇｇａｔ  
ａａａｇａｃａ（配列ＩＤ番号：１)
セグメントＳのバクテリオファージｐｈｉ−８遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３のｂｐｌ８８−１２９１)：  
ａｔｇｇｇｔａｇａａ  ｔｃｔｔｔｃａａｃｔ  ｇｔｔｇａｔｇｃｇｃ  
ｔｔａｇｇｃｇｔｔａ  ａａｃａｇｇｇｔｇｃ  ａｇｃａａｇｔｇｔｔ  
ｇｇｔａａａｇｃｃｇ  ｇｇａｔｃｇａｔｇｃ  ｔｇｇｔａｇｃａａｇ  
ｃｇａｔｔｇｃｔｃｃ  ａｇｃａｇａｔｃａｔ  ｇｔｃｃａａａｇａｃ  
ｇｇｔｇｃｔａｔｔｃ  ａｇｃｔｇｔｃｔａａ  ｇｇｃａｃｔｃｇｇｔ  
ｔｔｃａｃｃｇｃｔｇ  ｔｇｇａｇｃａｇａｔ  ｇｔｃｇａｇｔｇａａ  
ｇｔｇｃｔｃｇａａｇ  ｃｇｔａｔｃｔｃｔａ  ｔｇａｇａｔｃｇｔｔ  
ｇａｇｃａｔｃｔｔｃ  ｔｇｃｔｃｇｔｃｇａ  ｃｇａｇｇｃｃａｃｇ  
ｔｔｇｇｃｃｇａｔｇ  ｃｇｃｔｔａｔｇｇｃ  ｇｔｇｔａｔｃａｃｃ  
ｇａｔｇｃａｇｇｔｇ  ａｔａｔｃｇｃｃａｔ  ｔｇａｇｃｇｔｃｔｇ  
ｃｔｔｃｃｔｔｃｃｇ  ｔａｇａｇｇａｔｇｔ  ｃｇａｃａａａｇｇｃ  
ｇａｇｇｃｇｃｔｔｇ  ｃｃｇｃｃａｃｇｃｔ  ｇａｃｔｇｔｃｇｔｃ  
ｔｔｇｇｃｔｃｔｃｔ  ｔｃｔｃｇａｔｇａａ  ｃａａａｇａａｃａａ  
ｇｃｔｇａａｇａｇｃ  ｔｔａａａｃｇｔｔｃ  ｇａｔｇｇｃａｔｃｇ  
ａａａｇｇｃｔｔｇａ  ｇｔｃｃｇｇａｃｃｇ  ｇｇｔｔａｃｃｃｔｃ  
ｇｇａｇｇａｃａｇａ  ｃｃｃｔｇｔｔｇａｃ  ｃｇｔｃａａｇｔｃｃ  
ａｃｔｇｇｔａｃｔｇ  ｇｃｃｔｇａｃａｇａ  ｇｔａｔｇａｃｇｃｔ  
ｃａａｇｇｃａａｇａ  ａｔｇｇｃｇｔｃｃｃ  ｔｃｇｃｇｇｇａｔｇ  
ｔｃｔｇｃｔａａｃａ  ａｇｃｇｔａｃｔｇｃ  ａｔｔｇｔｔｃｔｔｃ  
ｇｔｇｃｔｇｔａｃａ  ｃａｇｔｇａｔｃａｇ  ｔａｃｔｔｃｃｔｇｇ  
ｔｃｃｇｔａｔａｃｇ  ａｔｃａｃｔａｔｇｇ  ｔｇａｇｇｔｔａａａ  
ｇｃｔｇｇｔｃｔｃｇ  ｃａｃｇａｇｇｃｇａ  ｇｃｔａｃｃｔｃｃｃ  
ａｇｔｇｃｔｇａｔｃ  ｇｔｇｔｔｇａａｔｔ  ｇｃｇｇｇｃｃｃｃｃ  
ｇｇｔｔｃｃｔｃｃｇ  ｔａａｇｔｇｃｇａｔ  ｃｇａｇｃｇｔｇａｇ  
ａｃａｃａａｃｇｃｇ  ｃａｃｔｇｃａａｇａ  ａｇａａｃａｇｃｃｇ  
ｃｇｔｇｃａｔｔｇｃ  ｃｔｔｃｇｇｇｃａｇ  ｃｃｇｃａｃｃｇｃｇ  
ｇａａｃｇｇｇｔｔｇ  ｃｔｇｇｇｃｃｇａｃ  ｇｃａｇｇｇｔｇａｔ  
ｇｔｃｃｃｃｇｔｇｃ  ｔｃａｃａｃｃｔｃｃ  ｇｃｃａｇｇｔｃｇａ  
ｔｔｃａｃｃｔｔｃａ  ｃｃｇｇｔｇａｇｇｇ  ｃｇａｃｃａｔｃｇｔ  
ｃｃｃｇａｔｔｔｃｇ  ｃａｃａａｃｔｃｇｃ  ｔｃｇｃｃａｇａａｃ  
ｇａｃａｃｔｇａｔｇ  ｇｃｇｔｔｇｔｇｃｇ  ｇａｔｃａｔｔｇａａ  
ｃｔｇｇａｔｃｇｃａ  ｔｔｃｃａｇａｔｇｃ  ａａｇｇａａａａｔａ  
ｔｔａｇｔｃｇａｔｇ  ｇｔｇａｃｃａｔｇａ  ｃｔａｃｔｔｇｃｔｇ  
ｇａｃｇｃｃｇｃｔｃ  ａａｃａｇｃｇｃｇｔ  ｃｇｃｔｇｃｃｇａｔ  
ａｔｃｇｇｇｇｔａｔ  ｃｇｃｃｃｇａｇｔｃ  ａｇｔａｇｇｔｃｇａ  
ｔｔｃｇｃｔｇｃｔｃ  ｔｇｇｔａｇｃｃａｇ  ｔａｔｃａｔｃａａｃ  
ｇｃｇａａｇｇａｇａ  ａｇｃｇｔｔｃｇｔｇ  ａｔｇｃ（配列ＩＤ番号：７）
ＢｇｌＩＩ：  
ａｇａｔｃｔ
→ＩＲＥＳに接続
Ｃ型肝炎ウイルス−ＩＲＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４２６５１の塩基３６−３４１）：
ａｔｃａｃｔｃｃｃｃ  ｔｇｔｇａｇｇａａｃ  ｔａｃｔｇｔｃｔｔｃ  
ａｃｇｃａｇａａａｇ  ｃｇｃｃｔａｇｃｃａ  ｔｇｇｃｇｔｔａｇｔ
ａｔｇａｇｔｇｔｃｇ  ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃ  ａｇｇａｃｃｃｃｃｃ  
ｃｔｃｃｃｇｇｇａｇ  ａｇｃｃａｔａｇｔｇ  ｇｔｃｔｇｃｇｇａａ  
ｃｃｇｇｔｇａｇｔａ  ｃａｃｃｇｇａａｔｔ  ｇｃｃａｇｇａｃｇａ  
ｃｃｇｇｇｔｃｃｔｔ  ｔｃｔｔｇｇａｔｃａ  ａｃｃｃｇｃｔｃａａ  
ｔｇｃｃｔｇｇａｇａ  ｔｔｔｇｇｇｃｇｔｇ  ｃｃｃｃｃｇｃｃａｇ  
ａｃｔｇｃｔａｇｃｃ  ｇａｇｔａｇｔｇｔｔ  ｇｇｇｔｃｇｃｇａａ  
ａｇｇｃｃｔｔｇｔｇ  ｇｔａｃｔｇｃｃｔｇ  ａｔａｇｇｇｔｇｃｔ  
ｔｇｃｇａｇｔｇｃｃ  ｃｃｇｇｇａｇｇｔｃ  ｔｃｇｔａｇａｃｃｇ  
ｔｇｃａｃｃａｔｇ（配列ＩＤ番号：３）→多重クローニング部位に接続。
多重クローニング部位および終止コドン：
ａｔｇ  ｇｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｅｔ  ｔａａ  ｔｔａ  ａｔａ  ａａｔ  ａａａ  ｔａａ(配列ＩＤ番号：４）→ＳＦＶ−３’非翻訳に接続。
セムリキ森林ウイルス−３−プライム非翻訳領域(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ０１３９８の塩基１−２６２)：  
ｇｔｔａｇｇｇｔａ    ｇｇｃａａｔｇｇｃａ  ｔｔｇａｔａｔａｇｃ  
ａａｇａａａａｔｔｇ  ａａａａｃａｇａａａ  ａａｇｔｔａｇｇｇｔ  
ａａｇｃａａｔｇｇｃ  ａｔａｔａａｃｃａｔ  ａａｃｔｇｔａｔａａ  
ｃｔｔｇｔａａｃａａ  ａｇｃｇｃａａｃａａ  ｇａｃｃｔｇｃｇｃａ  
ａｔｔｇｇｃｃｃｃｇ  ｔｇｇｔｃｃｇｃｃｔ  ｃａｃｇｇａａａｃｔ  
ｃｇｇｇｇｃａａｃｔ  ｃａｔａｔｔｇａｃａ  ｃａｔｔａａｔｔｇｇ  
ｃａａｔａａｔｔｇｇ  ａａｇｃｔｔａｃａｔ  ａａｇｃｔｔａａｔｔ  
ｃｇａｃｇａａｔａａ  ｔｔｇｇａｔｔｔｔｔ  ａｔｔｔｔａｔｔｔｔ  
ｇｃａａｔｔｇｇｔｔ  ｔｔｔａａｔａｔｔｔ  ｃｃ（配列ＩＤ番号：５）→φ８セグメントＳ３’ＲＮＡ  ｐｏｌ結合部位に接続
Ｐｈｉ−８セグメントＳ  ３−プライム ポリメラーゼ結合部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５３ｂの塩基３０８１−３１９２）：  
ｇｃｔｔａｇｃｇｇｃ  ａａｔｃｇａａｃｃｃ  ｔｃｃｇ  ｘｃａｔａａｇｇ  
ａｇｇｔｔｔａｇｃａ  ａａｔｃｃｇｃｇｇｃ  ｔｃｔｔａｔｇａｇｃ  
ｔｇｔｃｃｇａａａｇ  ｇａｃａａｃｃｃｇａ  ａａｇｇｇｇｇａｇｃ  
ｇａｇｇａｃｔｔｃｇ  ｇｔｃｃｔｃｃｇｃｔ  ｃｃ（配列ＩＤ番号：６）
ＰｓｔＩ：  
ｃｔｇｃａｇ
【実施例７】
【０２０４】
組換えセグメントＭのための配列の例
図４を参照して、組換えセグメントＭの構築のために本発明の実施に用いた配列の例。
ＫｐｎＩ：  
ｇｇｔａｃｃ→セグメントＭ  ｐａｃに接続
セグメントＭ  ｐａｃ配列および遺伝子１０のリボソームの結合部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５２の塩基１−２６２）
ｇａａａｔｔｔｔｃａ  ａａｇｔｃｔｔｔｃｇ  ｇｃａａｔａａｇｇｇ  
ｔｇｇａａａｔｔｔｃ  ａａａｇａｇｇｇｔｃ  ｇａｇｃｃｇａｃｇａ  
ａｃｃｔｃｔｇｔａｇ  ａａｃｃｇｇｇａａｇ  ｔｇｃｃｔｇｔｃｔｔ  
ｔａｃｔｔｇｃｇａｇ  ａｇｃａａｔｔｇａａ  ｃｔａｇｇｇｃａｇｃ  
ａｃｃｇｇｇｇｇｔｃ  ｇａｔａａｇｃｇｃａ  ｇａａｇｔｇａｇｇｃ  
ｇｃｇｇｇｇａｔｔｇ  ａａｇｃａａａｔｃａ  ｃｃｔａａｇｃｇｔａ  
ａａｃｇａｃｇｇａｃ  ｃｔｃｇａｇｇｇｔｇ  ｇｃｇｇａｇｔｃｔａ  
ｃａｔａｇｇａｔｃｃ  ｃｃｔａｇｃｔａｃｔ  ａｇａｃａｇａａａｃ  
ｃａｔｔｃｃｔａａｃ  ａａｇｇａｇａｔｇｃ  ａｃ（配列ＩＤ番号：８）→ＢｇｌIIに接続
ＢｇｌII：
ａｇａｔｃｔ→ａｓｄ遺伝子に接続
大腸菌ａｓｄ(ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００２６２の塩基２４０−１３４３)：
ａｔｇａａａａａｔｇｔ  ｔｇｇｔｔｔｔａｔｃ  ｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇ  
ｇｔａｔｇｇｔｃｇｇ    ｃｔｃｃｇｔｔｃｔｃ  ａｔｇｃａａｃｇｃａ  
ｔｇｇｔｔｇａａｇａ    ｇｃｇｃｇａｃｔｔｃ  ｇａｃｇｃｃａｔｔｃ  
ｇｃｃｃｔｇｔｃｔｔ    ｃｔｔｔｔｃｔａｃｔ  ｔｃｔｃａｇｃｔｔｇ  
ｇｃｃａｇｇｃｔｇｃ    ｇｃｃｇｔｃｔｔｔｔ  ｇｇｃｇｇａａｃｃａ  
ｃｔｇｇｃａｃａｃｔ    ｔｃａｇｇａｔｇｃｃ  ｔｔｔｇａｔｃｔｇｇ  
ａｇｇｃｇｃｔａａａ    ｇｇｃｃｃｔｃｇａｔ  ａｔｃａｔｔｇｔｇａ  
ｃｃｔｇｔｃａｇｇｇ    ｃｇｇｃｇａｔｔａｔ  ａｃｃａａｃｇａａａ  
ｔｃｔａｔｃｃａａａ    ｇｃｔｔｃｇｔｇａａ  ａｇｃｇｇａｔｇｇｃ  
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ｔｃａｃｔａｔｇｃｇ    ｔｇａｇｃｔａａｃｃ  ｃｃａｇｃｔｇｃｃｇ  
ｔｔａｃｃｇｇｃａｃ    ｇｃｔｇａｃｃａｃｇ  ｃｃｇｇｔａｇｇｃｃ  
ｇｃｃｔｇｃｇｔａａ    ｇｃｔｇａａｔａｔｇ  ｇｇａｃｃａｇａｇｔ  
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ｔｇｃｔｇｔｇｇｇｇ    ｇｇｃｃｇｃｇｇａｇ  ｃｃｇｃｔｇｃｇｔｃ  
ｇｇａｔｇｃｔｔｃｇ    ｔｃａａｃｔｇｇｃｇ  ｔａａ(配列ＩＤ番号：９)  
→Ａｓｃｌに接続
ＡｓｃＩ：  
ｇｇｃｇｃｇｃｃ→ＨＣＶ−ＩＲＥＳに接続
Ｃ型肝炎−ＩＲＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ２４２６５１の塩基３６−３４１）：  
ａｔｃａｃｔｃｃｃｃ  ｔｇｔｇａｇｇａａｃ  ｔａｃｔｇｔｃｔｔｃ  
ａｃｇｃａｇａａａｇ  ｃｇｃｃｔａｇｃｃａ  ｔｇｇｃｇｔｔａｇｔ  
ａｔｇａｇｔｇｔｃｇ  ｔｇｃａｇｃｃｔｃｃ  ａｇｇａｃｃｃｃｃｃ  
ｃｔｃｃｃｇｇｇａｇ  ａｇｃｃａｔａｇｔｇ  ｇｔｃｔｇｃｇｇａａ  
ｃｃｇｇｔｇａｇｔａ  ｃａｃｃｇｇａａｔｔ  ｇｃｃａｇｇａｃｇａ  
ｃｃｇｇｇｔｃｃｔｔ  ｔｃｔｔｇｇａｔｃａ  ａｃｃｃｇｃｔｃａａ  
ｔｇｃｃｔｇｇａｇａ  ｔｔｔｇｇｇｃｇｔｇ  ｃｃｃｃｃｇｃｃａｇ  
ａｃｔｇｃｔａｇｃｃ  ｇａｇｔａｇｔｇｔｔ  ｇｇｇｔｃｇｃｇａａ  
ａｇｇｃｃｔｔｇｔｇ  ｇｔａｃｔｇｃｃｔｇ  ａｔａｇｇｇｔｇｃｔ  
ｔｇｃｇａｇｔｇｃｃ  ｃｃｇｇｇａｇｇｔｃ  ｔｃｇｔａｇａｃｃｇ  
ｔｇｃａｃｃ（配列ＩＤ番号：１０）→多重クローニング部位に接続
多重クローニング部位（Multiple cloning site）：
ａｔｇ  ｇｔｔ  ａａｃ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｅｔ  ｔａａ  ｔｔａ  ａｔａ  ａａｔ  ａａａ  ｔａａ(配列ＩＤ番号：１１）→ＳＦＶ  ３−プライム非翻訳配列に接続
セムリキ森林ウイルス−３−ｐｒｉｍｅ非翻訳領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ０１３９８の塩基１−２６２）：  
ｇｔｔａｇｇｇｔａ    ｇｇｃａａｔｇｇｃａ  ｔｔｇａｔａｔａｇｃ  
ａａｇａａａａｔｔｇ  ａａａａｃａｇａａａ  ａａｇｔｔａｇｇｇｔ  
ａａｇｃａａｔｇｇｃ  ａｔａｔａａｃｃａｔ  ａａｃｔｇｔａｔａａ  
ｃｔｔｇｔａａｃａａ  ａｇｃｇｃａａｃａａ  ｇａｃｃｔｇｃｇｃａ  
ａｔｔｇｇｃｃｃｃｇ  ｔｇｇｔｃｃｇｃｃｔ  ｃａｃｇｇａａａｃｔ  
ｃｇｇｇｇｃａａｃｔ  ｃａｔａｔｔｇａｃａ  ｃａｔｔａａｔｔｇｇ  
ｃａａｔａａｔｔｇｇ  ａａｇｃｔｔａｃａｔ  ａａｇｃｔｔａａｔｔ  
ｃｇａｃｇａａｔａａ  ｔｔｇｇａｔｔｔｔｔ  ａｔｔｔｔａｔｔｔｔ  
ｇｃａａｔｔｇｇｔｔ  ｔｔｔａａｔａｔｔｔ  ｃｃ（配列ＩＤ番号：１２）→Ｐｈｉ−８  ３−プライム  ポリメラーゼ結合部位に接続
Ｐｈｉ−８セグメントＭ  ３−プライム  ポリメラーゼ結合部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２２６８５２の塩基４６７７−４７４１）：  
ａｃｔｇｔｔｇａｔａ  ａａｃａｇｇａｃｃｃ  ｇｇａａｇｇｇｔａａ  
ｃｃｃｇａｇａｇｇｇ  ｇｇａｇｔｇａｇｇｃ  ｔｔｃｇｇｃｃｔｃｃ  
ａｃｔｔｃ（配列ＩＤ番号：１３）→ＰｓｔＩに接続
ＰｓｔＩ：  
ｃｔｇｃａｇ
【実施例８】
【０２０５】
ｒｄｓＲＮｓの抽出および精製
株ＭＰＣ５１  ＬＳＭｔｂ４がヌクレオカプシドを産生することを示すために、単一クローン類を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＤ−グルタミン酸塩（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＭ９培地中２８℃で成長させた。この培養物をＯＤ６００＜０．１で攪拌し、細胞をＯＤ６０００．６および０．８の間の指数関数的成長の期間内に回収した。細胞を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により回収した。細胞を溶解するために、このバクテリアを５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ(Thermo Electron)の中で２０００ｐｓｉで溶解させた。溶解物を８，０００ｘｇ、５分の遠心分離にかけ、上澄み液を１０ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ  ７．３；シグマ社、カタログ番号Ｐ５３７９)および１ｍＭ塩化マグネシウム(同社、カタログ番号Ｍｌ０２８)を含む１０−３０％(ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配にかけた。各溶離液をＡｖａｎｔｉ  Ｊ−３０ｉ遠心器(Beckman
Coulter、Fullerton、CA、カタログ番号３６３１１８)の中のＪＳ２４．１５ローターに載置した。２３、０００ｒｐｍ、２３℃、９０分の遠心分離ののちには、ヌクレオカプシドが鋭いバンドを形成し、そのバンドの部分を集めて別々に−８０℃で保存した。管の残りの内容物は１ｍｌ分分画量に分取し、−８０℃で保存した。これら分画液中にｒｄｓＲＮ’ｓが存在することは、キャプシド特異性の抗血清を用いて免疫ブロットすることと、ＬＳＭｔｂ４  ＲＮＡの（＋）および（−）ストランドを増幅するように設計したプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲとにより確かめた。
【０２０６】
改良されたｒｄｓＲＮ精製手順を次のようにデザインした。ｒｄｓＲＮ  ＬＳＭｔ４を有するＳ．フレックスネリＭＰＣ５１の培養物５００ｍｌを２８℃で成長させＯＤ６００＝０．８とし、この細胞をペレット化する。ｒｄｓＲＮ’ｓを多段階濾過および遠心分離手順を用いて精製する。この細胞ペレットをまずＩｎｖｅｎｓｙｓ  ＡＰＶ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｙｚｅｒ（Lake Wills, WI）を用いて溶解し、遠心分離により澄明化する。次に、澄明化した上澄み液を０．４５μｍ細孔サイズ素子（ミリポア社＃P2HV  ＭＰＣ０５、またはその均等物）を備えるＰｅｌｌｉｃｏｎシステム（同社）を用いたタンジェンシャル−フロー濾過（ＴＦＦ）にかける。次に、遊離核酸をＢｅｎｚｏｎａｓｅで消化する（２５℃で３０分）。
【０２０７】
次に、第２の濾過過程を用いてｒｄｓＲＮ’ｓの濃縮、および培地成分、消化ずみの核酸および核酸分解酵素を洗い流す。１００ｋＤａ spiral wound限外濾過モジュール(ミリポア（Millipore）社＃ＣＤＵＦ  ００６  ＬＨ、またはそれと同等のもの)を用いた接線流濾過により産生物を濃縮し、緩衝液をリン酸塩緩衝生理食塩水またはそれ以外の顧客特定の被選択緩衝液と交換する。接線流濾過に続いて、部分精製ずみのｒｄｓＲＮ’ｓの半分をＮａＣｌおよびＰＥＧの添加により沈殿させ、小容量のリン酸塩緩衝液に再懸濁させる(Hoogstratenほか、Virology,
272:218-224、2000)。次に、二つの小分析スケールの勾配精製を、ＰＥＧ中に沈殿させ再懸濁させた物質の一部（１０−２５％）を用いて行う。再懸濁させたｒｄｓＲＮ’ｓを予め形成したショ糖およびオプティプレップ（opti-prep）の勾配の両方に層状に配置しひと晩遠心分離にかける。ｒｄｓＲＮバンド（免疫ブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ分析により特定する）を集めて勾配物質を受託実験所の特定した緩衝液に対する透析で除去する。次に、精製物質（勾配前のおよび勾配後双方の）を、（必要ならば）残存エンドトキシン除去のために、Ｑ−イオン交換クロマトグラフィやアクティクリーン・イートックス(Acticlean
Etox)（商標）(Sterogene、Carlsbad, CA)で処理する。最終の精製ずみのｒｄｓＲＮ’ｓを分画して４℃で保存する。
【０２０８】
分画を精製プロセスの各段階の取り、それを免疫分画およびＲＴ−ＰＣＲにより分析する。
【実施例９】
【０２０９】
マウスにおけるｒｄｓＲＮｓの免疫原性
本発明はバクテリアファージのＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼに基づいているので、ｐｈｉ−８ポリメラーゼが真核生物で機能するかどうかの判定が問題になる。精製ヌクレオカプシドの、ｒＳおよびｒＭ上にコードされたマイコバクテリア抗原パッケージＴＢＳに対する抗体応答を誘発する能力を、６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ザ・ジャクソン研究所、カタログ番号０００６５１）を精製ヌクレオカプシドでワクチン接種することにより試験する。各々が５匹のマウスからなる五つのグループを次のように、すなわち１０μｇの空のプロキャプシド、１０ｎｇのヌクレオカプシド、１００ｎｇのヌクレオカプシド、１μｇのヌクレオカプシド、および１０μｇのヌクレオカプシドでワクチン接種する。これらのマウスは第０日に初回のワクチン接種を受け、１４日目と４２日目とに二回の追加のワクチン接種を受ける。全てのワクチン接種はヌクレオカプシドを各マウスの後ろ足に筋肉内注射することにより行う。
【０２１０】
ＴＢＳ抗原に対するヒトの体液応答の測定のために、血清を各ワクチン接種の前および接種の後に１０日目ごとに集める。マウス当たり約１００μｇの血を各マウスの尾から個々の管にそれぞれ集め、４時間氷上でインキュベートすることにより凝血させる。微量遠心管内で５分間の遠心分離にかけたのち、血清を新しい管に移し、−２０℃で保存する。
【０２１１】
固相ＥＬＩＺＡ法によりＴＢＳ抗原に対するＩｇＧ応答を定量化する。精製した可溶性マイコバクテリア抗原をＰＢＳに懸濁して濃度２μｇ／ｍｌとし、その抗原を用いて９６穴のマイクロリットルのＥＬＩＺＡプレートを被覆する。これらのプレートを一晩４℃でインキュベートし、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄する。次に、これらプレートを室温で１時間、ブロット（blotto）（ＴＢＳ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミルク）でブロックする。次に、それらプレートを上述の場合と同様にＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄する。血清はブロット中で希釈し、１：３０から始めて３倍の逐次血清希釈液を複製してそれらプレートに加えて、ウエル（well）当たりの容量が１００μｌとなるようにする。免疫前の血清を各ＥＬＩＺＡにおいて、負の対照として含める。プレートは２時間室温でインキュベートし、続いて、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄する。検出のための２次抗体はアルカリフォスファターゼ標識のアフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇＧである（Ｈ鎖特異性）(Accurate
Chemical and Scientific 社、Westbury、NY、カタログ番号ＳＢＡ１０３００４)。この２次抗体をＴＢＳ、２％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミルク、および５％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清中１：２０００に希釈し、この希釈液１００μｌを各ウエルに加え、室温で１時間にわたりインキュベートする。インヴィトロゲン(Invitrogen)社のＥＬＩＳＡ増幅システム（カタログ番号１９５８９−０１９）の１００μｌの増幅器（amplifier）処理を伴う１００μｌの基質の中でのインキュベーションにおいて色が１５分毎に増してくる。吸光度はＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  マイクロプレート分光光度計(Molecular
Devices社, Sunnyvale, CA)により波長４９０ｎｍで測定する。終点力価は、波長４９０ｎｍにおける吸光度増加であって、負の対照列プラス三つの標準誤差値の平均より大きい吸光度増加をもたらした最後の血清の希釈度の逆数をとることにより計算される。
【０２１２】
細胞免疫は細胞内サイトカイン染色（細胞内サイトカイン細胞数測定ともいう）またはエリスポット(Letsch
A.ほか、Methods 31:143-49; 2003)により測定できる。ＩＣＳも同時に抗原特異性のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を表現型的に特徴づける同時の能力をつけているけれども、上記両方法とも抗原特異性免疫応答の測定を可能にする。このようなアッセイ法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−を分泌する抗原特異性のＴ細胞の数を評価できる(Wuほか、AIDS
Res. Hum. Retrovir. 13: 1187; 1997)。エリスポットアッセイ法は、文献(Wuほか、Infect. Immun.
63:4933; 1995)に記載されているとおり、また以前から使用されているとおり(Xu-Amanoほか、J. Exp. Med. 178:1309;
1993)；(Okahashiほか、Infect. Immun. 64: 1516; 1996)、市販の捕獲および検出モノクローナル抗体（mAbs）(R&D
Systems and Pharmingen)を使って実施できる。各アッセイ法は分裂促進因子（Ｃｏｎ  Ａ)および卵白アルブミンの対照を含む。
【実施例１０】
【０２１３】
セグメントＬの発現
上述の実施例３および４で記載したとおり、セグメントｗｔＬをバクテリア・パッケージング株に、染色体外で複製されるプラスミドとして、導入する。ｗｔＬを発現するより安定な方法は明らかにバクテリア染色体への組み込みによるものである。ｐａｃ配列を欠くｗｔＬの切りつめられたコピーは染色体に組んで、プロキャプシド株を産生するようにすることができる。その場合、完全長野生型の組換えセグメントＬ  ＲＮＡを引き続き電気穿孔にかけ、ｒＭおよびｒｓＲＮＡと共に組み込んで全部で三つのセグメントのパッケージングを完成する。代替的には、完全長ｗｔＬを染色体に組み込み、それによって、電気穿孔によるｗｔＬ  ＲＮＡへの導入が不要になる。
【０２１４】
染色体への組込みは、温度感受性（以下、“ＴＳ”と表記）のプラスミド、すなわち許容温度（３０℃）でのみ複製でき、必要な許容性の温度（４２℃またはそれ以上）では複製できない(Kretschmerほか、J. Bacterid. 124:225; 1975)；(Hashimoto and Sekiguchi、J.
Bacterid. 127:1561; 1976)プラスミドを用いた相同的な組換えにより達成できる。上記例としては、ｐＭＡＫ７０５、ｐＴＳＡ２９、ｐＴＳＣ２９、ｐＴＳＫ２９などがあり、これら全てが、ｐＳＣｌ０ｌ誘導体(Hamiltonほか、J.
Bacterid. 171:4617; 1989)；(Phillips、Plasmid 41:78; 1999)である。
【０２１５】
対立遺伝子交換におけるＴＳプラスミドの使用は他の文献に詳細に記載されている(Hashimoto
and Sekiguchi、J. Bacteriol. 127:1561; 1976)；(Hamiltonほか、J. Bacteriol. 171:4617;
1989)；(Phillips、Plasmid 41:78; 1999)。要するに、ｗｔＬ配列は、除去対象の遺伝子配列がそれに隣接するようにＴＳプラスミドにクローン化される。次に、クローン化ずみの遺伝子を保持するこのプラスミドを標的バクテリアに電子穿孔で導入し、これら細胞を４２℃で成長させ、融合体形成、すなわち染色体の相同配列と上記プラスミドとの間の初期の組換え現象を可能にする。融合体は、プラスミド上に保持される抗生物質標識を補充した培地中でこれら細胞を成長させることにより選択される。このプラスミドは４２℃では複製しないので、融合体のみが抗生物質耐性を備える。融合体は染色体の中のプラスミド複製、すなわちそこからの複製が融合体が３０℃で抗生物質の存在下に成長させられるとき、細胞に有害となるプラスミド複製の開始点を有する。すなわち、３０℃で第２の組換え現象（融解）が生じ、プラスミド再生となる。次に、コロニーを４２℃での抗生物質耐性について試験し、その結果、抗生物質感受性のコロニーは染色体に組み込みずみのプラスミドを含まない。第２の組換えにより生成されたプラスミドの細胞を治療するために、上記細胞を抗生物質なしに４２℃で成長させる。
【０２１６】
他の手法では、ＴＳプラスミドを実施例３と同様にｗｔＬを発現するように用いることができるが、バクテリアは最初に許容温度でのみ成長させる。３０℃でｗｔＬが発現されるもととなるＴ７などのバクテリアプロモーターの制御の下で、このｗｔＬをクローン化する。電気穿孔によるｒＭおよびｒＳ  ＲＮＡの導入のあと、ｗｔＬのコード化するプロキャプシドが両方のＲＮＡをパッケージし複製する。これらの細胞は４２℃抗生物質なしで成長させることにより治療できる。その結果得られるプラスミドなしの細胞はＲＮＡを複製し続け、プラスミド関連の、例えば抗生物質抵抗性の導入などの調節性の懸念を伴わないバクテリア・ワクチン・ベクターとして使用できる。
【０２１７】
本発明を特定の具体例を参照して詳細に説明してきたが、種々の変形や改変が本発明の真意および範囲から逸脱することなく可能であることは当業者に明らかであろう。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
ワクチンの性質を改善した結核ワクチン剤の製造、およびその製造の効率化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】ヌクレオカプシドを含むバクテリア細胞であって、ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列がそのヌクレオカプシド内のｄｓＲＮＡ配列の中に存在するバクテリア細胞の概略的図解。
【図２】ヌクレオカプシドを含むバクテリア細胞であって、ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列がそのヌクレオカプシド内のｄｓＲＮＡ配列の中に存在するバクテリア細胞の概略的図解。
【図３】ヌクレオカプシドを含むバクテリア細胞であって、ヌクレオカプシド産生に必要な遺伝子をコードする核酸配列がそのヌクレオカプシド内のｄｓＲＮＡ配列の中に存在するバクテリア細胞の概略的図解。
【図４】種々のｐｈｉ−８組換えセグメントＳおよびＭ（それぞれｒＳ、ｒＳ２およびｒＭと表記）の発現カセットを示す。後述の実施例の部分で述べるとおり、正の選択対立遺伝子はａｓｄ遺伝子であり、所望の当該遺伝子が候補である結核菌マイコバクテリウムチューバキュロシス、（Mycobacterium tuberculosis）抗原およびＨｃ−Ｒｅｄ蛍光タンパク質（fluorescent protein）をコードする。ｒＳおよびｒＳ２はｐＴ７／Ｔ３−１８のＰｓｔＩ部位にクローンされた。ｒＭはＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ断片としてｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏのそれぞれの部位にクローンされた。全ての組換えセグメントをＴ７プロモーターの転写制御下に置いた。
【図５】アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス（Semliki Forest Virus））の自己増幅レプリコン（replicon）（ｎｓｐｌ−４およびレプリカーゼ結合配列）を含むｒＳ発現カセットを示す。
【図６】バクテリア・パッケージング株の成長と機能の図解。
【図７】明細書に記載したパッケージング株および親株の侵襲特性。
【図８】Ｓ．フレックスネリＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３細胞全体の溶解物の変性の前後における免疫ブロットであって、プロキャプシドの生体内（in vivo）集合を示すプロキャプシド特異性抗血清でプローブした免疫ブロット。
【図９】集合したプロキャプシドを示すＳ．フレックスネリＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３の電子顕微鏡写真。
【図１０】第２ストランド合成を示す（−）ストランドと（＋）のｃＤＮＡ’ｓの存在を実証するＬＳＭｔｂ４と命名されるｒｄｓＲＮを持つパッケージされたＳ．フレックスネリＭＰＣ５１ｐＬＭ２６５３のＲＴ−ＰＣＲ。
【図１１】自己複製するヌクレオカプシドＬＳＭｔｂ４を保持すＳ．フレックスネリＭＰＣ５１の電子顕微鏡写真。
【図１２】エレクトロポレーションにより、野生型セグメントＳ、Ｍ、およびＬをコードするＲＮＡを用いて再構成した野生型バクテリオファージｐｈｉ−８を保持するシリンゲ菌（Pseudomonas syringae）の電子顕微鏡写真。
【図１３】真核細胞による抗原８５Ａの発現を示す抗原８５Ａ特異性の抗血清によりプローブしたＬＳＭｔｂ４と命名されるｄｓＲＮを保持するＳ．フレックスネリＭＰＣ５１による侵襲から１４時間後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真。
【図１４】ＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄと命名されるｒｄｓＲＮを保持するＳ．フレックスネリＭＰＣ５１による侵襲から１２時間後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真であり、真核細胞内でＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄが産生したｍＲＮＡから翻訳されたＨｃ−Ｒｅｄ  タンパク質の直接の蛍光を示す。
【図１５】Ｈｃ−Ｒｅｄ特異性の抗血清でプローブしたＬＳＭＨｃ−Ｒｅｄと命名されるｒｄｓＲＮを保持するＳ．フレックスネリＭＰＣ５１による侵襲から１２時間後のＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡写真であり、真核細胞内でのＨｅ−Ｒｅｄタンパク質の発現の確証となる。
【図１】
2008521434.tif 000003
【図２】
2008521434.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008521434.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2008521434.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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