(57)【要約】【課題】炎症、喘息及び癌等の様々な疾患の治療に有用なキメラタンパク質治療薬の提供。【解決手段】融合タンパク質のアミノ末端に位置し、第１のサイトカイン又は増殖因子と特異的に結合し無力化する第１の部分、及び、融合タンパク質のカルボキシル末端に位置し、特異的に、疾患部位（例えばＩＬ−１受容体を多く含む炎症部位）にしばしば多く含まれる第２のサイトカイン受容体と結合する第２の部分、を含む融合タンパク質。更に、上記第２の部分は、通常受容体アンタゴニスト（例えばＩＬ−１受容体アンタゴニスト）及びその機能的に等価な類似体である。また、融合タンパク質をコードする核酸、ベクター及び核酸を有する宿主細胞、及び関連する組成物及び炎症性疾患及び炎症と共存する適応症を標的とする方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質のアミノ末端に位置し、第１のサイトカイン又は増殖因子と特異的に結合して無力化する、第１の部分、及び、
前記融合タンパク質のカルボキシル末端に位置し、第２のサイトカイン又は増殖因子の受容体と特異的に結合し、ドメインが機能的に連結され、前記第２のサイトカインの受容体が炎症部位又は疾患部位に多く含まれる、第２の部分を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１の部分及び前記第２の部分を結合するリンカー部分を更に含んでなり、前記リンカー部分が二量体化させる能力を有する、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカー部分が免疫グロブリンのＦｃ断片又はその機能等価物を含む、請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記免疫グロブリンがＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ又はＩｇＭである、請求項３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記Ｆｃ断片が配列番号２を含む、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第１の部分が、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ４若しくはＩＬ−１３、又はその機能等価物と結合し無力化する、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記第１の部分が、特異的にＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１３若しくはＩｇＥ、又はその機能等価物と結合し無力化する免疫グロブリン鎖の配列を含む、請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記免疫グロブリン鎖が、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２３若しくは配列番号２４、又はその機能等価物を含む、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記第１の部分がＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に対する受容体又は結合蛋白質の配列を含む、請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記第１の部分が配列番号３、配列番号６、配列番号１５又は配列番号１９を含む、請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質がグリコシル化されている、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記第２のサイトカインがＩＬ−１である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第２の部分がＩＬ−１のアンタゴニストである、請求項１３記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記第２の部分がＩＬ−１ｒａ（配列番号１）又はその機能的に等価の類似体の配列を含む、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２５を含む、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１の融合タンパク質をコードする配列を含んでなる、単離された核酸。
【請求項１８】
前記核酸が、配列番号１から配列番号２５のいずれか一つをコードする配列を含む、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
請求項１７記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】
請求項１７記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
ポリペプチドの製造方法であって、請求項２０の宿主細胞を前記核酸がコードするポリペプチドの発現ができる条件下で培地で培養し、その培養細胞又はその細胞培地からポリペプチドを精製することを含んでなる、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】
請求項１の融合タンパク質又はその融合タンパク質をコードする核酸、並びに薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項２３】
患者の免疫反応の調節方法であって、過剰な免疫反応により特徴づけられる症状を有する又は有する危険性のある患者を診断し、前記患者に請求項１の融合タンパク質又はその融合タンパク質をコードする核酸の有効量を投与することを含む免疫反応の調節方法。
【請求項２４】
前記患者が、同種間移植又は異種間移植を受けた、又は受ける予定である、請求項２３記載の免疫反応の調節方法。
【請求項２５】
前記症状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患又は血管形成依存性の癌である、請求項２３記載の免疫反応の調節方法。
【請求項２６】
前記症状が癌であり、前記融合タンパク質が配列番号２２、配列番号２４及び配列番号２５を含む、請求項２５記載の免疫反応の調節方法。
【請求項２７】
患者における組換えタンパク質の半減期の延長方法であって、
組換えタンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラを形成し、
患者における融合タンパク質の半減期を左右させることを含んでなり、前記組換えタンパク質がサイトカイン又は増殖因子と結合し無力化する、患者における組換えタンパク質の半減期の延長方法。
【請求項２８】
患者における組換えタンパク質の効能の増強方法であって、
前記組換えタンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラとし、患者における前記融合タンパク質の効能を左右させることを含む、患者における組換えタンパク質の効能の増強方法。
【請求項２９】
治療用タンパク質の患者の標的部位への輸送方法であって、
前記治療用タンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラとし、
前記融合タンパク質キメラを、それを必要とする患者に投与することを含んでなり、前記治療用タンパク質がＩＬ−１受容体を多く含む炎症部位を標的とする、治療用タンパク質の患者の標的部位への輸送方法。
【請求項３０】
配列番号１又はその機能等価物を含む部分がＩＬ−１受容体と結合し、前記組換えタンパク質が、サイトカイン又は増殖因子と結合し無力化する治療用タンパク質である、請求項２８記載の患者における組換えタンパク質の効能の増強方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質キメラが、患者の炎症部位又はＩＬ−１で受容体を多く含む疾患部位においてＩＬ−１受容体及びサイトカイン又は増殖因子に同時に結合し、無力化する、請求項３０記載の患者における組換えタンパク質の効能の増強方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質キメラが、患者の炎症部位又はＩＬ−１受容体を多く含む疾患部位でＩＬ−１及びサイトカイン又は増殖因子の活性を無力化又は拮抗阻害する、請求項３０記載の患者における組換えタンパク質の効能の増強方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、米国特許仮出願番号第６０／６１８，４７６号（２００４年１０月１２日出願）、米国特許仮出願番号第６０／６２８，９９４号（２００４年１１月１７日出願）、及び２００５年２月１日に出願された米国特許仮出願（発明の名称“ＩＬ−１ｒａ  ａｓ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ”）の優先権を主張し、その開示内容は参照により本発明に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、様々な疾患（例えば炎症、喘息及び癌）の治療に有用なキメラタンパク質治療薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、物理的な傷害、感染又は抗原刺激により生じた損傷に対する生体防御反応である。病理学的には、炎症反応は自己抗原のような不適当な刺激により誘発されて生じ、異常な態様で発症するか、又は有害物質の除去の後長期間持続することもある。炎症は、しばしば喘息及び血管形成関連の適応症と共に表れる。多くの治療用タンパク質が、炎症反応の阻害、炎症関連の喘息の治療、病理学的な血管形成の軽減のために開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、それらの多くは低い効能、副作用の危険又は不安定性のため、満足できるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）又はその機能等価物の、生理活性タンパク質若しくは治療用タンパク質に対する融合パートナーとしての使用に関する。生理活性タンパク質若しくは治療用タンパク質の例としては、限定されないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）無力化物質、ＩＬ−１８無力化物質、ＩＬ−４／ＩＬ−１３無力化物質、ＶＧＥＦ無力化物質、アンジオポエチン無力化物質及びその他炎症、喘息及び血管形成関連の適応症の治療に有用な物質が挙げられる。
【０００６】
本発明の一態様は、融合タンパク質を特徴とし、該融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に位置し、第１のサイトカイン又は増殖因子と特異的に結合して無力化する第１の部分、及び融合タンパク質のＣ末端に位置し、特異的に、第２のサイトカイン又は増殖因子の受容体（例えば炎症部位に多く存在するＩＬ−１受容体）と結合する第２の部分を含む。それらのドメインは機能的に連結し、第１又は第２のサイトカインは炎症部位に多く存在する。
【０００７】
本明細書に記載の融合タンパク質は、グリコシル化することができる。更に、上記第１の部分及び第２の部分を結合させるリンカー部分を含めることができる。リンカー部分は、二量体化をすることができる。一例において、リンカー部分には免疫グロブリンのＦｃ断片又はその機能等価物が含まれる。好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧ又はＩｇＭである。より好ましくは、免疫グロブリンはＩｇＧ又はそのＦｃ断片（例えば配列番号２）である。免疫グロブリン鎖は配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２３若しくは配列番号２４、又はその機能等価物を含む。
【０００８】
上述の融合タンパク質において、第１の部分はＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４若しくはＩＬ−６、又はその機能等価物と結合し、それらを無力化することができる。例えば、第１の部分は、特異的にＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＩＬ−１３若しくはＩｇＥ、又はその機能等価物と結合し、それらを無力化する免疫グロブリンの配列を含む。第１の部分はまた、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン、ＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１３又はＩｇＥの受容体の配列（例えば配列番号３、配列番号６、配列番号１５又は配列番号１９）を含むことができる。
【０００９】
上述の融合タンパク質において、第２の部分は特異的にＩＬ−１受容体と結合する。第２の部分は、ＩＬ−１のアンタゴニスト（例えばＩＬ−１ｒａ（配列番号１）の配列を含む部分）又はその機能等価物の類似体とすることができる。したがって、上記融合タンパク質には、配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２５のものが含まれる。本発明の別の態様は、上記融合タンパク質をコードする配列を含む単離された核酸を特徴とする。それは配列番号１から配列番号２５のうちの一つをコードする配列を含むことができる。
【００１０】
（ｉ）上記融合タンパク質又はそれをコードする核酸、及び（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含む組成物は、本発明の範囲に含まれる。また、患者の免疫反応の調節方法もまた本発明の範囲に含まれる。上記方法は、過剰な炎症反応、免疫反応及び血管形成反応により特徴づけられる症状を有する、又は、その危険性のある患者を診断し、該患者に有効量の上記融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸を投与することを含む。患者は、同種間移植若しくは異種間移植を受けた、又は受ける予定の患者とすることができる。症状の例としては、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患又は癌が挙げられる。症状が血管形成依存性の癌である場合は、配列番号２４を含む融合タンパク質が好ましい。
【００１１】
別の態様において、本発明は、患者の体内における組換えタンパク質の半減期を延長する方法を特徴とする。上記方法は、組換えタンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラとし、患者の体内における融合タンパク質の半減期を左右させることを含む。組換えタンパク質は、サイトカイン又は増殖因子と結合する。
【００１２】
また本発明は、患者における組換えタンパク質の効能の増強方法を特徴とする。上記方法は、組換えタンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラとし、患者における融合タンパク質の効能を左右させることを含む。一実施態様において、融合タンパク質キメラは、患者の炎症部位又はＩＬ−１受容体が多く含まれる疾患部位において、ＩＬ−１受容体及びサイトカイン又は増殖因子と結合し、同時に無力化する。他の実施態様において、融合タンパク質キメラは、患者の炎症部位又はＩＬ−１受容体が多く含まれる疾患部位において、ＩＬ−１及びサイトカイン又は増殖因子の活性を無力化又は拮抗阻害する。他の態様において、本発明は、治療用タンパク質を患者の標的部位に輸送する方法を特徴とし、該方法は、治療用タンパク質を配列番号１又はその機能等価物を含む部分に結合させて融合タンパク質キメラとし、その融合タンパク質キメラを、それを必要とする患者に投与することを含む。治療用タンパク質は、ＩＬ−１受容体が多く含まれる炎症部位を標的とする。一実施態様において、配列番号１又はその機能等価物を含む部分がＩＬ−１受容体と結合し、その組換えタンパク質が治療用タンパク質でありサイトカイン又は増殖因子と結合し、無力化する。
【００１３】
単離されたポリペプチドとは、実質的に天然に存在する関連分子を含まないポリペプチドを指し、それは乾燥重量で少なくとも７５％（すなわち７５％以上１００％以下のいかなる数値）の純度である。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又はＨＰＬＣ等の、あらゆる適切な標準的方法で測定できる。本発明の単離されたポリペプチドは、天然の給源（野生型ポリペプチド）から精製してもよく、また組換えＤＮＡ技術又は化学合成法により製造してもよい。
【００１４】
核酸とは、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの類似体を指す。ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体は、ヌクレオチド類似体から合成されることができる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された核酸」とは、天然に存在するいかなる核酸、又は、天然に存在するいかなるゲノム核酸の断片とも同一でない構造を有する核酸を指す。したがって、該用語には例えば以下のものが含まれる。
（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の配列の一部分を有するＤＮＡ（但し、天然に存在する生物のゲノム分子中における、該一部分に隣接するコード配列のいかなるものも、それに隣接しない）；
（ｂ）ベクター又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに結合した核酸（但し、得られる分子がいかなる天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡとも同一でない態様である）；
（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた断片、又は制限酵素分解産物等の分離された分子；及び
（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部をなす組換えヌクレオチド配列。
上記の核酸は、本発明のポリペプチドの発現に用いることができる。この目的のために、核酸を適切な制御配列に機能的に連結し、発現ベクターを構築することができる。
【００１５】
ベクターとは、それに連結した他の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターは自律複製ができ、又は宿主ＤＮＡに組み込まれることができる。ベクターの例としては、プラスミド、コスミド又はウィルスベクターが挙げられる。ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適する形で核酸を含む。好ましくは、ベクターは発現する核酸配列に機能的に連結した一つ以上の制御配列を含む。「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節因子（例えばポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列としては、組織特異的調節型及び／又は誘導型の配列のみならず、ヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導するものも含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、タンパク質又はＲＮＡの要求される発現レベル等の要因に依存し得る。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを産生させるために宿主細胞に導入することができる。また、上記の核酸を含む宿主細胞は本発明の範囲内である。例えば、大腸菌細胞、（例えばバキュロウイルス発現ベクターを使用した）昆虫細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞が挙げられる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．を参照のこと。本発明のポリペプチドの産生のため、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドの発現ができる条件下で宿主細胞を培地中で培養し、培養細胞又は細胞培養用培地からそのポリペプチドを精製できる。あるいは、本発明の核酸を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて転写及び翻訳させることができる。
【００１６】
タンパク質性の要素の「機能等価物」とは、タンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、一つ以上の点突然変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質又はそれらの組み合わせを意味する。それは実質的に、その因子の活性（例えばサイトカイン、増殖因子又はその受容体と結合する能力）を保持している。本発明の一つ以上の実施態様の詳細は、下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的及び効果は、下記の説明及び請求項から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、少なくとも部分的に、ＩＬ−Ｉｒａ又はその機能等価物が、融合パートナーとして、生体内寿命及び多くの生理活性タンパク質（例えば抗炎症タンパク質、抗喘息タンパク質及び抗血管形成タンパク質）の効能を延長するという発見に基づく。これらのタンパク質の例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）無力化物質、ＩＬ−１８無力化物質、ＩＬ−４／ＩＬ−１３無力化物質、ＶＥＧＦ無力化物質、アンジオポエチン無力化物質が挙げられる。
【００１８】
生理活性タンパク質のＮ末端へのタンパク質融合（特に大型のタンパク質融合パートナーの場合）は、しばしば完全な活性の喪失につながる。例えば、プロ酵素及びプロホルモンは、Ｎ末端でのプロペプチドと融合していることにより活性を有さない。これらの消化前のプロ酵素及びプロホルモンは、それらのプロペプチドが切断されてはじめて生物学的に活性を有するようになる。更に、大型のタンパク質との融合は、しばしば発現収率の低下につながる。予想外にも、ＩＬ−１ｒａ融合タンパク質は、哺乳動物由来の宿主細胞において、産業的レベルで製造できる。融合によっても、ＩＬ−１ｒａが有するＩＬ−１受容体との結合及び無力化活性が妨害されず、又はそれが融合している生理活性タンパク質の結合及び無力化活性が妨害されない。また、予想外にもＩＬ−１ｒａ（例えば、哺乳動物由来のグリコシル化したもの）又はその機能等価物は、生理活性タンパク質の生体内寿命を延長するだけでなく、それらをＩＬ−１受容体が多く含まれる炎症部位に導く。
【００１９】
ＩＬ−１ｒａ
ＩＬ−１はマクロファージ／単球系の細胞により産生されるサイトカインである。それは、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの２つの形態で産生される。ＩＬ−１タンパク質は、ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）に特異的に結合することにより、細胞に対するその生物学的効果を生じさせる。ＩＬ−１Ｒは通常、ＩＬ−１感受性細胞の細胞膜上に発現する。
【００２０】
ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、天然のＩＬ−１阻害剤として作用するヒトタンパク質である。ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１により生じる生理活性を抑制するために用いられている。それは細胞膜結合型ＩＬ−１受容体と結合し、そのＩＬ−１受容体のＩＬ−１との結合を妨げる。ＩＬ−１受容体の大部分は、炎症部位（Ｄｅｌｅｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２；Ｌａｋｅｎ  ＶＤ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）及びリンパ球（Ｄｏｗｅｒ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）にて発現する。ゆえにＩＬ−１ｒａは、それに融合している治療用タンパク質（例えば後述するＴＮＦを無力化している物質）を、ＩＬ−１受容体を多く含む炎症部位に導くことができる。このターゲッティング効果のため、治療用タンパク質の有効量の減少が必要となり、ゆえに副作用が減少し、又は効能が増強される。更に、ＩＬ−１ｒａ及び融合パートナーによる相乗効果は、２つのタンパク質の各々単独又は組み合わせよりも高い治療効果につながり、それは（少なくとも一部の）融合タンパク質が同じ部位に向かうことに起因する。
【００２１】
ＩＬ−１ｒａ及びその機能等価物は、本発明の実施に用いることができる。ＩＬ−１ｒａの機能等価物とは、［発明が解決しようとする課題］にて説明したような、ＩＬ−１ｒａ（配列番号１）のポリペプチド誘導体を指す。それは実質的にＩＬ−１ｒａの活性（例えばＩＬ−１受容体に対する結合活性、及びそのＩＬ−１受容体のＩＬ−１との結合を妨げる活性）を有する。ＩＬ−１ｒａ及びその機能等価物は、少なくとも一つのインターロイキン１受容体アンタゴニストドメインを含み、それはＩＬ−１受容体ファミリーに特異的に結合でき、ＩＬ−１及びそのファミリーによる細胞受容体の活性化を妨害できるドメインを指す。ＩＬ−１受容体ファミリーには、幾つかの受容体メンバーが含まれる。したがって、幾つかの異なるＩＬ−１ファミリーのアゴニスト及びアンタゴニストが存在する。これらのＩＬ−１アンタゴニストは、同じＩＬ−１受容体ファミリーのメンバーと必ずしも結合できるわけではない。ここで、ＩＬ−１ｒａとは、ＩＬ−１受容体ファミリーと結合し、及び／又はＩＬ−１ファミリーのメンバーの活性を無力化する全てのＩＬ−１アンタゴニストを表すために用いる。
【００２２】
ＩＬ−１ｒａ機能等価物は、インターロイキン１受容体アンタゴニストドメインを含む。このドメインは、ＩＬ−１受容体ファミリーと特異的に結合し、ＩＬ−１及びそのファミリーに対する細胞受容体の活性化を阻害できるドメインを指す。インターロイキン１受容体アンタゴニストの例としては、ＩＬ−１ｒａ（米国特許第６，０９６，７２８号）、ＩＬ−１  ＨＹｌ又はＩＬ−１ファミリーメンバー５（米国特許第６，５４１，６２３号）、ＩＬ−１Ｈｙ２又はＩＬ−１ファミリーメンバー１０（米国特許第６，３６５，７２６号）、ＩＬ−１ｒａβ（米国特許第６，３９９，５７３号）、他のＩＬ−１アンタゴニストメンバー及びそれらの機能等価物（ＩＬ−１ｒａに由来するポリペプチド（例えば一つ以上の点突然変異を有するタンパク質、挿入、欠失、切断又はそれらの組み合わせ））が挙げられる。それらは、実質的にＩＬ−１受容体への特異的に結合する活性、及びＩＬ−１に対する細胞受容体の活性化を阻害する活性を保持する。それらは、配列番号１又は配列番号１の断片を含むことができる。好ましくは、ＩＬ−１ｒａは、グリコシル化された哺乳動物由来のポリペプチドである。インターロイキン１受容体アンタゴニストの活性は、ＩＬ−１に依存するＤ１０細胞（実施例３参照）を使用した細胞ベースのＩＬ−１無力化アッセイ及び他のＩＬ−１ファミリーによる無力化アッセイにより測定できる。
【００２３】
好ましくは、ＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物は、グリコシル化ポリペプチドである。天然のＩＬ−１ｒａは、２つのＮ−結合グリコシル化部位によりグリコシル化される（米国特許第６０９６７２８号）。これらの２つのＮ−結合グリコシル化部位は、ＩＬ−１ｒａのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性、特にその生体内寿命、及びその血清蛋白質との結合性にとり重要である。Ｋｉｎｅｒｅｔ（大腸菌が産生するＩＬ−１ｒａ）は、翻訳後修飾が行われない。その結果、それは顕著にヒト血清蛋白質と結合する傾向を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの効能が低い。
【００２４】
ＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物のアンタゴニスト活性は、ＩＬ−１に依存するＤ１０細胞（実施例３参照）を使用した細胞ベースのＩＬ−１無力化アッセイ及び他の標準的なＩＬ−１ファミリーによる無力化アッセイにより測定できる。ＩＬ−１ｒａのいかなるタンパク質性の物質への融合によりも、分子量の増加及びｉｎ  ｖｉｖｏでの生体内寿命の延長がなされる。免疫グロビンＦｃ（例えばＩｇＧ１  Ｆｃ）を介した、他の分子へのＩＬ−１ｒａの融合は、分子量を更に増加させうる。免疫グロビンＦｃが二量体化能を有するため、その存在により、標的部位での融合タンパク質濃度を２倍にすることができる。
【００２５】
ＴＮＦ
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）は、多種の細胞に対して多様な効果を誘導できる、哺乳動物の分泌タンパク質である。これらの２つのサイトカインの構造及び機能を有する特徴の顕著な類似点より、「ＴＮＦ」としてそれらが総括される。
【００２６】
ＴＮＦ応答性の細胞の細胞膜上に発現するＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）にＴＮＦが特異的に結合することにより、その細胞へのその生理的効果が生じる。ＴＮＦＲｓの２つの異なるタイプ：Ｉ型ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲＩ）（約５５キロダルトン（ｋｄ）の分子量）、タイプＩＩ型ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲＩＩ）（約７５ｋｄの分子量）が公知である。ＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩＩは各々ＴＮＦα及びＴＮＦβと結合する。
【００２７】
炎症性疾患におけるＴＮＦの役割は広く解明されている。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片に融合したＴＮＦＲＩＩ（商品名「Ｅｎｂｒｅｌ」）は、特定のＴＮＦ依存性の疾患（例えば慢性関節リウマチ及び乾癬）の治療に使用されている。可溶性ＴＮＦＲＩ（Ｏｎｅｒｃｅｐｔ、Ｓｅｒｏｎｏ社）は、乾癬治療のための臨床試験がなされている。
【００２８】
ＴＮＦのアンタゴニストが同定されている。これらのアンタゴニスト（例えば可溶なＴＮＦＲＩＩ及びＴＮＦＲＩ）は、ＴＮＦと結合し、ＴＮＦ受容体に対するＴＮＦの結合を妨げる。かかるタンパク質をＴＮＦにより生じる生物的活性の抑制に用いることができる。タンパク質ベースのＴＮＦ無力化物質を、ＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物に融合させることができる。ＩＬ−１と同様に、ＴＮＦは炎症反応の重要な調節物質である。上記のＴＮＦ無力化物質には、ＴＮＦ及びその機能等価物が挙げられる。それらの各々は一つ以上のＴＮＦ無力化物質ドメインを含み、該ドメインはＴＮＦを無力化、すなわちＴＮＦの活性の阻害をすることができる。ＴＮＦ無力化物質ドメインには、ヒトＴＮＦＲＩＩの細胞外のドメイン、ＴＮＦＲＩの細胞外のドメイン又は抗ＴＮＦ抗体の可変ドメインを含めてもよい。例えば、ＩＩ型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲＩＩ）の細胞外のドメイン、ＴＮＦ結合タンパク質１（ｒｈＴＢＰ−１）又はＩ型ＴＮＦ受容体タイプ（ＴＮＦＲＩ）、ヒト化抗ＴＮＦ抗体（例えばヒュミラ（登録商標），Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びキメラ抗ＴＮＦ抗体（例えばＲｅｍｉｃａｄｅ  ｏｆ  Ｊｏｈｎｓｏｎｓ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）が挙げられる。
【００２９】
ＴＮＦα及びＩＬ−１の２つは炎症性疾患において主要な役割を果たすため、ＴＮＦアンタゴニストとＩＬ−１ｒａ若しくはその機能等価物との融合物又はキメラは、ＴＮＦα及びＩＬ−１経路のブロックに用いることができ、ゆえに各々個別に効果的に急性及び慢性炎症に関連する疾患の治療に用いることができる。キメラタンパク質のＴＮＦ無力化活性は、ＴＮＦ依存性の細胞（例えばＬ９７９細胞（ＡＴＴＣ））を使用して測定できる。具体的には、ＴＮＦ依存性の細胞を有効量の組換えＴＮＦαで殺すことができる。このＴＮＦ依存性の活性は、これらのＴＮＦ無力化物質の反応系への添加により無力化できる。これらのＴＮＦ無力化物質の活性は、ＴＮＦを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合試験により測定できる。ＩＬ−１ｒａ及びＩ型ＴＮＦ受容体（ＩＩ型ではない）の併用が、ＴＮＦα及びＩＬ−１が媒介する疾患の治療のために提案されている。しかしながら、２００３年の、２４２人の患者による、２４週にわたる臨床試験の結果がＩｍｍｕｎｅｘ  Ｉｎｃ社及び、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ社により公表されており、その結論は、ＥｎｂｒｅｌとＫｉｎｅｒｅｔの併用（個々の投与量（隔週でＥｎｂｒｅｌを２５ｍｇずつ、及び毎日１：１２のモル比にてＫｉｎｅｒｅｔを１０ｍｇずつ）は増加させない）は、Ｅｎｂｒｅｌ又はＫｉｎｅｒｅｔ単一投与による治療と比較し、効能を増加させず、むしろ感染症及び好中球減少症の発症率を高めるというものであった。
【００３０】
ＩＬ−１８及びＩＬ−４
上記のＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物はまた、他の抗炎症、抗喘息又は抗血管形成タンパク質と融合させることができる。例えば、以下のものが挙げられる。
（ｉ）ＩＬ−１８結合蛋白質（ＩＬ−１８ｂｐ）、ＩＬ−１８受容体（ＩＬ−１８Ｒ）細胞外のドメイン及びヒト化抗ＩＬ−１８抗体等のＩＬ−１８無力化物質
（ｉｉ）ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）細胞外のドメイン（商品名「Ｎｕｖａｎｃｅ」、Ｉｍｍｕｎｅｘ社）、及びヒト化抗ＩＬ−４抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）等のＩＬ−４無力化物質
（ｉｉｉ）抗ＶＥＧＦ抗体及びエリスロポエチン無力化物質の可溶性Ｔｉｅ２細胞外ドメイン。
上記のように、これらのタンパク質のＣ末端へのＩＬ−１ｒａの結合により、
（１）その分子量が増加し、
（２）哺乳動物由来の宿主において産生されるときには、更に２つのグリコシル化部位が付加され、
（３）それらを、ＩＬ−１受容体を多く含む炎症部位を目標とする輸送に向け、
（４）１：１のモル比で同時にＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＶＢＥＧＦ、又はアンジオポエチン及びＩＬ−１をブロックする。
【００３１】
組換えＩＬ−１８ｂｐによる、皮膚炎症性の適応症の乾癬の治療のための臨床試験（Ｓｅｒｏｎｏ）がなされている。このＩＬ−１８ｂｐの良好な安全性が示されている。ＩＬ−１ｒａのＣ末端への融合により、その生体内寿命を顕著に増加できる。ＩＬ−１ｒａ融合を介した炎症部位ターゲッティングにより、その効能を顕著に増加できる。ＩＬ−１ｒａ融合によるＩＬ−１８及びＩＬ−１の二重無力化はまた、炎症依存性疾患（例えば乾癬）の治療において相乗効果を発揮する（Ｙｕｄｏｈ  Ｋら、（２００４））。興味深いことにＩＬ−１８及びＩＬ−１は、同じＩＬ−１受容体ファミリー、及びほぼ同じ細胞情報伝達経路を使用する。ＩＬ−１及びＩＬ−１８の二重ブロックは、全部のＩＬ−１受容体ファミリーにより媒介される炎症機構をほぼ完全にブロックする。本発明のキメラタンパク質によるＩＬ−１及びＩＬ−１８の二重ブロックは、最も有効な抗炎症性治療薬となる。
【００３２】
ＩＬ−１８ｂｐの機能等価物はまた、本発明の実施のために用いることができる。ＩＬ−１８ｂｐ又はその機能等価物はＩＬ−１８無力化ドメインを含み、該ドメインはＩＬ−１８を無力化、すなわちＩＬ−１８の活性を阻害できる。例えば、ＩＬ−１８無力化物質ドメインとしては、ヒトＩＬ−１８受容体の細胞外のドメイン（米国特許第６，５８９，７６４号）、ＩＬ−１８ｂｐ、抗ＩＬ−１８抗体、又はＩＬ−１８変異アンタゴニストタンパク質が挙げられる。
【００３３】
本発明のキメラタンパク質のＩＬ−１８無力化活性は、ＩＬ−１８依存性のＫＧ−１細胞を使用して測定できる。例えば、ヒトＩＬ−１８は、投与量依存的に（ＴＮＦａが存在する場合）ＫＧ−１細胞からのＩＦＮ−ｇの分泌を誘導する。このＩＬ−１８依存性のＩＦＮ−ｇ分泌は、有効量のＩＬ−１８無力化物質により阻害できる。これらのＩＬ−１８無力化活性は、ＩＬ−１８／ＩＬ−１８受容体結合試験で測定することもできる。
【００３４】
可溶性の組換えＩＬ−４受容体に関する、喘息の治療のための臨床試験がなされている。高い安全性プロファイルが示されている。しかしながら、その効能は十分でない。興味深いことに、ＩＬ−１は、アレルゲン特異的なＴｈ２細胞活性化及び空気感染による過敏性反応の発症に必要であると報告されている（Ｉｗａｋｕｒａ  Ｙら、２００３）。更に、喘息及び慢性炎症の共存又は相互依存、及びそれらの相互作用は、臨床においては公知である。ＩＬ−１のブロックにより、少なくともモデル動物において、喘息に対する明らかな治療効果が得られる。ＩＬ−１ｒａと可溶性ＩＬ−４受容体との１：１モル比の融合物による、ＩＬ−４及びＩＬ−１の同時ブロックにより、重度の喘息の治療効果を顕著に高めることが可能となる。ＩＬ−１ｒａによる炎症部位ターゲッティングは、炎症により悪化した重度の喘息の治療における、可溶性ＩＬ−４受容体の治療的な価値を高めるものとなりうる。更に、ＩＬ−１ｒａ融合により可溶性ＩＬ−４受容体の生体内寿命を顕著に増加できる。
【００３５】
可溶性ＩＬ−４受容体又はその機能等価物を、ＩＬ−１ｒａと融合することができる。ＩＬ−４受容体又はその機能等価物はＩＬ−４無力化ドメインを含み、該ドメインはＩＬ−４を無力化、すなわちＩＬ−４の活動を阻害できる。例えば、ＩＬ−４無力化物質ドメインとしては、ヒトＩＬ−４受容体、抗ＩＬ−４抗体、又は二重突然変異Ｒ１２１Ｄ／Ｙ１２４Ｄを有するＩＬ−４変異タンパク質アンタゴニストの細胞外のドメイン（Ｓｃｈｎａｒｒら、１９９７）が挙げられる。興味深いことに、このＩＬ−４Ｒサブユニットは、ＩＬ−４と結合するだけでなく、ＩＬ−４及びＩＬ−１３に共通するサブユニットの性質のため、ＩＬ−１３受容体とも結合する。本発明のキメラタンパク質のＩＬ−４無力化活性は、ＩＬ−４依存性のＴＦ−１細胞をベースとするアッセイにより測定できる。例えば、ヒトＴＦ−１細胞のＩＬ−４依存性の増殖は、有効量のＩＬ−４無力化物質の添加により阻害できる。ＩＬ−４無力化物質の活性は、ＩＬ−４／ＩＬ−４受容体結合試験により測定できる。
【００３６】
ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン
上記の方法は、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンのアンタゴニスト、並びにその機能等価物にも適用できる。ＶＥＧＦは血管形成にとり重要である。抗ＶＥＧＦ抗体（商品名Ａｖａｓｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が癌の適応症の治療に用いられている。同様に、ＩｇＧ１Ｆｃが融合した可溶性ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインもまた、血管形成関連の適応症におけるＶＥＧＦの無力化に用いられている。ＶＥＧＦの機能等価物はＶＥＧＦ無力化ドメインを含み、該ドメインはＶＥＧＦを無力化、すなわちＶＥＧＦの活性を阻害できる。例えば、ＶＥＧＦ無力化物質ドメインは、ヒトＶＥＧＦの細胞外ドメイン及び抗ＶＥＧＦ抗体の可変ドメインを含んでもよい。
【００３７】
本発明のキメラタンパク質のＶＥＧＦ無力化活性は、ＶＥＧＦ依存性のＨＵＶＥＣ細胞を用いて測定できる。例えば、ヒトＶＥＧＦはＨＵＶＥＣ細胞の増殖を誘導する。ＨＵＶＥＣ細胞のこのＶＥＧＦ依存性の増殖は、有効量のＶＥＧＦ無力化物質により阻害できる。ＶＥＧＦ無力化物質の活性は、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体結合試験を用いて測定できる。
【００３８】
アンジオポエチン可溶性受容体Ｔｉｅ２もまた、癌又は血管形成関連の慢性関節リウマチに対する抗血管形成治療薬として提案されている。血管形成と炎症との共存及び相互依存は、臨床分野においてこれまで観察されている。最も一般的な例が、血管形成と炎症が共存する慢性関節リウマチである。アンジオポエチン可溶性受容体Ｔｉｅ２又はその機能等価物は、アンジオポエチン無力化ドメインを含み、該ドメインは、アンジオポエチンを無力化、すなわちアンジオポエチン１の活性を阻害できる。例えば、アンジオポエチン無力化物質ドメインとしては、ヒトＴｉｅ２の細胞外のドメイン、及び抗Ｔｉｅ２又は抗アンジオポエチン抗体が挙げられる。
【００３９】
本発明のキメラタンパク質のＴｉｅ−２無力化活性は、Ｔｉｅ−２依存性のＨＵＶＥＣ細胞により測定できる。例えば、ヒトアンジオポエチン１は、ＨＵＶＥＣ細胞の細胞内リン酸化を誘導する。このＴｉｅ−２依存性のＨＵＶＥＣ細胞のリン酸化は、有効量のＴｉｅ−２無力化物質により阻害できる。Ｔｉｅ−２無力化物質の活性は、Ｔｉｅ−２／アンジオポエチン２結合アッセイを用いて測定できる。
【００４０】
ＩＬ−１が重要な病理学上の血管形成刺激因子であることが公知である。ＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物によりＩＬ−１を無力化することは、モデル動物における血管形成及び腫瘍成長を阻害し、それは、炎症が血管形成を強化することを示唆するものである。例えば、乳癌の中で最も悪性のものは、炎症性乳癌である。ＩＬ−１ｒａと血管形成物質（例えば抗ＶＥＧＦ抗体、可溶性のＶＥＧＦ受容体細胞外ドメイン又は可溶性のＴｉｅ２細胞外ドメイン）の融合体の使用により、癌又は慢性関節リウマチ関連の適応症の治療の際に、抗血管形成物質単独よりも顕著な効能が得られるのが好適である。
【００４１】
上記の治療薬の他に、ＩＬ−１ｒａ又はその機能等価物に融合できる他の適切なタンパク質治療薬を以下に列挙する。
１．Ｅ２５（ｏｌｉｚｕｍａｂ）。Ｅ２５は、ヒト化抗ＩｇＥ抗体（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）であり、アレルギー性喘息（季節的なアレルギー性鼻炎）の治療に用いられる。
２．Ｈ５Ｇ１．１。Ｈ５Ｇ１．１は、ヒト化抗Ｃ５抗体（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）であり、乾癬及び自己免疫疾患の治療に使用できる。
３．ＴＰ１０。ＴＰ１０は、急性呼吸不全症候群及び臓器移植術（ＡＶＡＮＴ免疫治療）の治療に使用する、可溶性の補体受容体１（ｓＣＲ１）である。
４．ＡＢＸ−ＩＬ８。ＡＢＸ−ＩＬ８は、抗ＩＬ−８モノクローナル抗体（Ａｂｇｅｎｉｘ）であり、乾癬の治療に使用できる。
５．ＣＴＬＡ４Ｉｇ。ＣＴＬＡ４Ｉｇは可溶性の組換え受容体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）であり、免疫抑制に使用できる。
【００４２】
上記の物質とＩＬ−１ｒａ／その機能等価物パートナーとの融合において、２つの融合パートナーは相互に相乗的、又は相補的に活性を発揮する。ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１受容体と結合し、ＩＬ−１受容体が多く含まれる炎症部位に融合した治療薬を導く。それはまたＩＬ−１活性を無力化する。ＩＬ−ｌｒａとこれらのタンパク質のいずれかとの融合体は、炎症、喘息及び血管形成関連の疾患、又は内皮細胞増殖関連の疾患の治療に使用できる。
【００４３】
血管形成関連の疾患とは、血管形成を必要とするか又は異常な血管形成を呈するあらゆる障害を指す。例えば、限定されないが、癌、固形癌、腫瘍転移、良性腫瘍（例えば血管腫）、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫、慢性関節リウマチ、乾癬、眼性血管由来の疾患（例えば糖尿病性網膜症）、未熟児網膜症、黄斑部変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症及びルベオーシス、Ｏｓｉｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、心筋血管形成、斑血管新生、末梢血管拡張症、血友病性関節症、血管線維腫及び損傷肉芽が挙げられる。本発明において、内皮細胞増殖関連の疾患は、腸癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕が挙げられるが、これに限定されない。本明細書において記載されている融合タンパク質はまた、胚移植に必要な血管新生を阻害することにより、上記で挙げられた疾患の治療に使用できる。
【００４４】
好ましくは、本発明の融合タンパク質は二量体化ドメインを含む。「二量体化ドメイン」とは、２つのポリペプチドを結合できるドメインを指す。例えば、二量体化ドメインとして、ＩｇＧ  Ｆｃ断片（例えばヒトＩｇＧ重鎖定常領域）が挙げられる。かかるＦｃ断片は、例えば配列番号２を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ断片は、鎖間におけるシステイン残基によるジスルフィド結合（共有結合）の形成により二量体化する。また、ジスルフィド結合を含まない、非共有結合による二量体化が生じることもある。二量体化したＩｇＧ  Ｆｃ断片は、例えば、２機能を有するＴＮＦＲＩＩ又は可溶性のＩＬ−４Ｒ又はＩＬ−１８ｂｐ又は可溶性Ｔｉｅ−２分子をＮ末端に、並びに２機能を有するＩＬ−１ｒａ分子をＣ末端に示すことができる。この構成は、ＴＮＦα又はＩＬ−４又はＩＬ−１８又はアンジオポエチン、及びＩＬ−１受容体のいずれをも無力化するための、ｉｎ  ｖｉｖｏでの受容体／リガンド結合の可能性を増加させる。
【００４５】
ジスルフィド結合を介した共有結合による二量体化の活性は、還元及び非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定できる。タンパク質の分子量は、還元条件においては半分に減少していなければならない。非共有結合による二量体化は、非変性条件下及び変性条件下での電気泳動を用いて測定できる。タンパク質の分子量は、変性条件においては半分に減少していなければならない。
【００４６】
本発明のポリペプチドにおいて、（ＮＦ無力化ドメイン又はＩＬ−４／ＩＬ−１３無力化ドメイン又はＩＬ−１８無力化ドメイン又はＶＥＧＦ無力化ドメイン又はアンジオポエチン無力化ドメイン、二量体化ドメイン、及びＩＬ−１受容体アンタゴニストドメインは、機能的に連結される。本発明における「機能的に連結された」の用語は、各ドメインの活性を妨げない態様でポリペプチド構造が構成されていることを指す。例えば、ＩＬ−４無力化ドメインはそのＩＬ−４を無力化する能力を保持し、インターロイキン１受容体アンタゴニストドメインはそのＩＬ−１受容体に特異的に結合してＩＬ−１の細胞受容体の活性化を阻害する能力を保持し、二量体化ドメインはその本発明の２つのポリペプチドを結合させ、例えば、２機能を有するＩＬ−４受容体細胞外のドメインをそのＮ末端に、２機能を有するＩＬ−１ｒａ分子をそのＣ末端に示す能力を保持する。
【００４７】
上記のＴＮＦ無力化物質、ＩＬ−１８無力化物質、ＩＬ−４無力化物質、ＶＥＧＦ無力化物質又はアンジオポエチン無力化物質のＣ末端へのＩＬ−１ｒａの融合により、
（１）その分子量が増加し、
（２）哺乳動物由来の宿主において産生されるときには、更に２つのグリコシル化部位がＩＬ−１ｒａに付加され、
（３）無力化物質を、ＩＬ−１受容体を多く含む炎症部位を標的とする輸送に向け、
（４）１：１のモル比で同時にＩＬ−１、並びにＴＮＦ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩｇＥ、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンをブロックする。
その結果なされる二重ブロックにより、炎症性疾患の治療の効能が増強し、より完全な炎症性疾患プロセスに対するブロックが与えられる。ＩＬ−４／ＩＬ−１３／ＶＥＧＦ／アンジオポエチンとＩＬ−１との同時の二重ブロックにより、炎症及び喘息又は血管形成の共存及び相互依存が疾患プロセスにおいて重要な役割を果たす疾患の治療効果が、より向上し、完全となる。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、合成又は組換えポリペプチドとして得られる。組換えポリペプチドを調製するために、それをコードする核酸を、融合パートナー（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓエピトープタグ、又はＭ１３遺伝子３タンパク質）をコードする他の核酸と連結してもよい。得られる融合核酸は、適切な宿主細胞において融合タンパク質を発現させ、公知の方法により単離できる。様々な宿主−発現ベクター系が使用できる。それらは、限定されないが、微生物（例えば組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡの発現ベクターにより形質転換した細菌）、組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母、組換えウイルス又はプラスミド発現ベクターによりトランスフェクションしたヒト由来細胞株が挙げられる。組換えポリペプチド又はその断片の単離及び精製は、モノクローナル又はポリクローナル抗体を含むクロマトグラフィー調製及び免疫学的分離方法等の従来の手段により実施できる。単離された融合タンパク質は例えば、更に酵素処理してもよく、融合パートナーを除去して本発明の組換えポリペプチドを得ることができる。
【００４９】
組成物及び治療方法
過剰な免疫反応又は血管形成関連の疾患によって特徴づけられる疾患を、有効量の本発明の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与して治療する方法もまた、本発明の範囲内である。治療を受ける患者（例えば自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患又は免疫細胞から派生した癌に罹患する患者）は、過剰又は不必要な免疫反応によって特徴づけられる症状を有し、又は症状となる危険性を有するものと診断されうる。この方法は単独で、又は他の薬剤又は他の治療法と併用して実施できる。
【００５０】
「治療する」という用語は、疾患、疾患の症状、疾患から派生する疾病状態又は疾患の傾向を治癒、軽減、緩和、治療、予防又は改善する目的で、患者に対して組成物を投与することを指す。「有効量」とは、治療を受ける患者に対して医学的に望ましい結果を与えることができる程の組成物の量を指す。医学的に望ましい結果とは、客観的（すなわち試験又は標識により測定可能）なものでもよく、また主観的な（すなわち患者がその効果を示し、又は感じる）ものでもよい。治療の対象となる典型的な疾患としては、急性及び慢性炎症、真性糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身紅斑性エリテマトーデス、自己免疫性甲状線炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹を伴う皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚の紅斑性狼瘡、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい病反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫のブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性累進性感覚神経性聴力損失、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活性性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変症、後部ブドウ膜炎、介在性の肺線維症、移植片対宿主疾患、骨髄移植、肝臓移植等の移植（同種又は異種の組織を使用している移植を含む）又はいかなる器官又は組織の移植、アトピー性アレルギー等のアレルギー、エイズ、Ｔ細胞腫瘍（例えば白血病又はリンパ腫）、急性肝炎、血管形成に関する疾患（例えば慢性関節リウマチ及び癌）、並びに心臓血管疾患、が挙げられる。
【００５１】
治療を受ける患者は、上記の一つ以上の障害の治療が必要であると診断されてもよい。かかる治療を必要とする患者の診断は、患者又は保健専門家の判断によりなされ、主観的なもの（例えば意見）でも、又は客観的なもの（例えば、試験又は診断法により測定可能な）でもよい。
【００５２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの態様において、治療用組成物（例えば本発明の融合タンパク質を含む組成物）は患者に投与される。通常、タンパク質を薬学的に許容できる担体（例えば生理食塩水）中に懸濁し、経口投与若しくは静脈内注射により投与し、又は、皮下、筋肉内、クモ膜下腔内、腹膜内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内若しくは肺内に注入若しくは移植される。
【００５３】
必要な投与量は、投与経路の選択、製剤の性質、患者の疾患の性質、患者の身長、体重、表面積、年齢及び性別、投与している他の薬剤、及び主治医の診断に依存する。適切な投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要となる投与量の変化は、利用可能な組成物の種類、及び様々な投与経路における効率の違いを考慮に入れて予想される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも多くの投与量を必要とすると思われる。これらの投与量レベルにおける変化は、従来技術において周知の、経験的に得られた最適化のための標準的なルーチン操作を用いて調節できる。適切な輸送担体（例えばポリマー性の微粒子又は移植可能な手段）中への組成物の封入により、特に経口輸送において、輸送効率を向上させることができる。
【００５４】
また、薬学的に許容できる担体及び有効量の本発明の融合タンパク質を含む医薬品組成物は、本発明の範囲に含まれる。医薬品組成物は、上記の疾患の治療に使用できる。薬学的に許容できる担体としては、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、防かび剤、等張剤及び吸収遅延剤が挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬品組成物は、従来法を利用している異なる投与ルートのための剤形に処方されることができる。例えば経口投与用カプセル、ゲル包埋又は錠剤として製剤化できる。カプセルには、薬学的に許容できるいかなる標準的な材料（例えばゼラチン又はセルロース）を含めることもできる。従来法に従って、固形担体及び潤滑油と共に組成物の混合物を圧縮することにより、錠剤として製剤化できる。固形担体の例としては、澱粉及び糖ベントナイトが挙げられる。組成物はまた、結合剤（例えばラクトース又はマンニトール、通常の充填材及び打錠剤）を含む硬いコーティング錠剤又はカプセルの形にて投与できる。医薬品組成物は、腸管外の経路を介して投与できる。腸管外投与における剤形の例としては、活性薬剤を水、等張性の生理食塩水又は５％のグルコース液へ溶解させた溶液、又は他の周知の薬学的に許容できる添加剤を含むものが挙げられる。シクロデキストリン、又は当業者に公知の他の可溶化剤を、治療化合物の輸送のための医薬用賦形剤として利用できる。
【００５６】
本発明の組成物の効能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで評価できる。下記の実施例を参照のこと。手短には、組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてその免疫反応の抑制能力を試験できる。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験においては、組成物を動物（例えばモデルマウス）に注入し、更にその治療効果を観察できる。結果に基づき、適当な投与量の範囲及び投与経路を決定できる。
【００５７】
下記の実施例は単なる例示を目的として開示され、いかなる形であれ、この開示部分以外の箇所の内容を制限するものと解釈するべきではない。当業者であれば、本明細書の説明に基づいて、更に推敲することなく、本発明の実施を完遂できると考えられる。本明細書において引用される全ての刊行物は、それらの全開示内容が本明細書に参照により援用される。
【００５８】
我々の結果はまた、哺乳動物の宿主において産生されるＩＬ−１ｒａ融合分子は、グリコシル化されたＩＬ−１ｒａを含み、非−ＩＬ−１ｒａ融合分子よりも大きい分子量を有することを示す。それらは、より長い生体内寿命を有し、頻繁な投与を要することのない、有効な注入量を与える。その炎症部位特異的な性質、及び少ない有効量及びより少ない投薬頻度のため、ＩＬ−１ｒａ融合分子は、非−ＩＬ−１ｒａ融合分子、又は非−ＩＬ−１ｒａ融合分子とＩＬ−１ｒａとの併用よりも副作用が少ない。
【実施例１】
【００５９】
様々な発現ベクターを構築した。ベクターは、それぞれ以下のタンパク質をコードする。
Ａ）  ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号５）、ＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号８）、及びコントロールのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（配列番号４）又はＴＮＦＲＩ−Ｆｃ（配列番号７）、
Ｂ）  ヒュミラ（登録商標）（Ｄ２Ｅ７）−ＩＬ−１ｒａ（配列番号１０及び１１）、レミケード（登録商標）（ｃＡ２）−ＩＬ−１ｒａ（配列番号１３及び１４）、並びにコントロールの二量体化ヒュミラ（登録商標）（Ｄ２Ｅ７）（配列番号９及び配列番号１１）及びレミケード（登録商標）（ｃＡ２）（配列番号１２及び配列番号１４）、
Ｃ）  ＩＬ−１８ｂｐ（配列番号１５）、二量体化ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ（配列番号１６）及び二量体化ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号１７）、
Ｄ）  可溶性ＩＬ−４Ｒの細胞外ドメイン（配列番号１９）、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ（配列番号１９）及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号２１）；
Ｅ）  ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及び軽鎖（配列番号２４及び配列番号２３）及び抗ＶＥＧＦ  重鎖−ＩＬ−１ｒａ及び軽鎖（配列番号２５及び配列番号２３）。
【００６０】
タンパク質をコードする大部分のコンストラクト（配列番号４から配列番号２５）を配列決定し、哺乳動物由来の細胞株にて発現させた。配列番号４から配列番号２５は、哺乳類宿主を適応させた懸濁液中にて、天然の又は最適化したコドン、並びに人工の又は天然の分泌シグナル配列を用いて発現させた。二量体化した抗体製品を、非加熱のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより検出した。
【００６１】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（配列番号４）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号５）の、２４穴プレートにおける無血清培地中の発現力価は、それぞれ５０ｍｇ／ｌ〜１００ｍｇ／ｌ（図１）であった。ＣＨＯＫ１細胞の懸濁液において、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃと比較し、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの高発現を観察した（調整培地をクマシーブルーにより直接タンパク染色して推定）。この結果は、哺乳動物由来の宿主を用い、ＩＬ−１ｒａ融合キメラタンパク質を産業的規模で製造できることを示す。
【実施例２】
【００６２】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのスケールアップ及び精製を実施した。細胞株を、ＣＨＯ−ＣＤ４媒体（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び自製の供給培地で調整した無血清懸濁液で培養し、３Ｌのバイオリアクター（Ｅｐｌｉｋｏｎ社製）においてスケールアップした。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号５）、ＩＬ−４Ｒ−ＥＣＤ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号２０）及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（配列番号１７）を、産業的規模で製造した。これらのタンパク質はプロテインＡにより直接捕捉して精製し、その後イオン交換及び疎水性クロマトグラフィーを実施した（図２、３及び４）。バルク精製されたタンパク質を製剤化し、凍結乾燥し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析した。
【実施例３】
【００６３】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの活性をバイオアッセイにより試験した。
【００６４】
細胞ベースのＩＬ−１無力化アッセイのために、ＩＬ−１依存性のＤ１０細胞（ＡＴＣＣ）を用い、組換えヒトＩＬ−１依存性のＤ１０細胞の増殖に対する、ＩＬ−１ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−ｌｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのブロック活性を試験した。
【００６５】
手短には：
ヒトＩＬ−１αは投与量依存的にＤ１０細胞増殖を誘発し、
ＩＬ−１ａが全細胞増殖の５０％を誘発する濃度（すなわちＥＣ５０）を測定した。
Ｄ１０細胞に対するｈＩＬ−１ａのＥＣ５０の範囲は、通常１ｐｇ／ｍｌ〜５ｐｇ／ｍｌである。細胞を有効量のＩＬ−１受容体アンタゴニストとインキュベートすると、ＩＬ−１ｒａは細胞表面ＩＬ−１受容体のブロックにより細胞増殖を阻害した。このブロック効果も投与量依存的であった。受容体アンタゴニストの濃度が低いときは、細胞表面受容体をブロックしなかった。その後、ＩＬ−１は細胞増殖の回復を誘導した。ＩＬ−１活性の５０％がブロックされる受容体アンタゴニストの濃度を、アンタゴニストのＥＣ５０とした。
【００６６】
組換えタンパク質（ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬｌｒａ、ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ又はＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ）は、ＩＬ−１受容体アンタゴニストと同様に、可溶性ＴＮＦＲＩＩ、ＩＬ−１８、ＩＬ−４又はＶＥＧＦ無力化物質のような機能を発揮した。細胞ベースのバイオアッセイにより、これらのキメラ分子の生物的活性を確認した（図６、８、１０及び１１）。
【００６７】
細胞ベースのＴＮＦ無力化アッセイにおいて、Ｌ９２９細胞（マウス継代細胞株、ＡＴＣＣ）を用い、ＴＮＦαに対するＴＮＦＲＩＩのブロック活性を試験した。手短には、ＴＮＦαを用い、投与量依存的な急速な細胞死を誘導した。ＴＮＦαのＥＣ５０（ＴＮＦαが全細胞死の５０％を誘発する濃度）は、５０ｐｇ／ｍｌ未満であった。ＴＮＦα分子と高濃度の可溶性ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦＲ）とをプレインキュベートすると、可溶性の受容体はＴＮＦαと結合し、細胞表面の受容体とのその結合を阻害した。これは細胞死を誘発するＴＮＦα活性をブロックした。このブロック効果も投与量依存的だった。ｓＴＮＦＲが一定濃度まで希釈されると、ＴＮＦα活性のブロックが観察されず、細胞死の度合いが減少した。以上より、ｓＴＮＦＲのＥＣ５０（すなわちＴＮＦα活性の５０％をブロックする濃度）を決定した。
【００６８】
ヒトＴＮＦα（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を２倍希釈系列により、一定数のＬ９２９細胞（１０％ウマ血清、Ｌ−グルタミン及び１μｇ／ｍｌ  アクチノマイシンＤを添加したＤＭＥＭ培地中）を予め総体積１５０μｌ／ウェルで播種した９６穴アッセイプレートに添加した。培地のみの中に細胞を含む対照ウエルも準備した。アッセイプレートを、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベータの湿潤チャンバーにおいて１日間インキュベートした。その後、各々のウェル中の細胞を１０％パラホルムアルデヒドで固定し、１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。色素を３０％  酢酸で可溶化した。その後、アッセイプレートの各ウェルの光学密度（Ｏ．Ｄ．）（細胞の総数に正比例）を、５４０ｎｍの波長にてプレートリーダーを用いて測定した。Ｏ．Ｄ．対ＴＮＦα濃度の関係を、細胞毒性曲線としてプロットした。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを２倍希釈系列により、一定濃度のヒトＴＮＦ−α（１０％ウマ血清、Ｌ−グルタミン及び１μｇ／ｍｌ  アクチノマイシンＤを添加したＤＭＥＭ培地中）を予め総体積１５０μｌ／ウェルで播種した９６穴アッセイプレートにて混合した。アッセイプレートを１時間、３７℃でプレインキュベートした。アッセイプレートの各ウェルの混合物を、一定数のＬ９２９細胞を予め播接種した他の９６穴プレートに移した。各ウェル当たりのヒトＴＮＦαの最終濃度は、１５０μｌ／ウェルの総体積にて５００ｐｇ／ｍｌであった。アッセイプレートを、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベータの湿潤チャンバーにおいて１日間インキュベートした。その後、各々のウェル中の細胞を１０％パラホルムアルデヒドで固定し、１％クリスタルバイオレット溶液で染色した。色素を３０％  酢酸で可溶化した。その後、アッセイプレートの各ウェルの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を、５４０ｎｍの波長にてプレートリーダーを用いて測定した。Ｏ．Ｄ．対ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの濃度の関係を、無力化曲線としてプロットした。
【００６９】
試験結果は、ヒトＴＮＦαが投与量依存的にＬ９２９の細胞死を誘導したことを示す。アクチノマイシンＤと細胞のみを含むバックグラウンドのＯ．Ｄは０．５であった。ヒトＴＮＦαの投与量曲線は、０．５のベースのレベルから０．１の最低レベルに減少した。更に、１００ｐｇ／ｍｌ以上のヒトＴＮＦα濃度ではＯ．Ｄ．が減少せず、ヒトＴＮＦαの飽和段階を示した。全ての試験を２度実施し、各位置でのＣＶ％は＜９％であった。この条件下でのヒトＴＮＦαのＥＣ５０は、８ｐｇ／ｍｌであった。
【００７０】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａは、投与量依存的にＬ９２９細胞においてヒトＴＮＦα活性を阻害することが明らかとなった。ベースのレベル（ヒトＴＮＦα（５００ｐｇ／ｍｌ）及びアクチノマイシンＤ存在下の細胞の場合）のＯ．Ｄは０．１であった。異なる濃度のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの存在下で、Ｏ．Ｄ．は０．１〜０．５のベースのレベルまで増加し、完全な無力化が観察された。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａは、５０ｎｇ／ｍｌの濃度で完全にヒトＴＮＦα活性を無力化した。全ての希釈試験を２度実施し、各位置でのＣＶ％は＜１０％であった。この条件下でのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのＥＣ５０は、３ｎｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌであった。
【００７１】
ヒトＩＬ−４誘導によるＴＦ−１細胞増殖を用い、細胞ベースのＩＬ−４無力化アッセイを行った。ＴＦ−１細胞を、異なる濃度のヒトＩＬ−４を含む培地でインキュベートし、９６穴プレートを３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で３日間インキュベータで培養した。ＭＴＳを培養組織に添加し、５時間インキュベートした。プレートの光学密度（ＯＤ）を、プレートリーダーを用い４９０ｎｍにて測定した。細胞増殖曲線（ＯＤ対ヒトＩＬ−４濃度の関係）をプロットした。無力化において、希釈系列により調製したＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを、一定濃度のヒトＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）と共に培地に添加し、９６穴プレート中で１時間、３７℃の条件下でプレインキュベートした。同じ細胞数のＴＦ−１細胞を、９６穴プレートの各ウェルに、培養終了後に添加した。プレートを、３７℃、５％  ＣＯ２の条件のインキュベータにおいて３日間インキュベートした。ＭＴＳを添加し、５時間インキュベートした。プレートのＯＤを、プレートリーダーを用い４９０ｎｍで測定した。ＯＤ対ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ濃度の関係を、細胞増殖阻止曲線としてプロットした。
【００７２】
ＩＬ−１無力化アッセイの結果（図８）と併せると、図７の結果は、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａが機能的で、ＩＬ−４Ｒ及びＩＬ−１の無力化活性を有することを示すものであった。
【００７３】
細胞ベースのＩＬ−１８無力化アッセイにおいて、ＫＧ−１細胞（ＴＮＦαがある場合には）からの投与量依存的なヒトＩＬ−１８誘導ＩＦＮ−ｇ分泌を解析した。ヒトＩＬ−１８のＥＣ５０（ＫＧ−１細胞からの最大ＩＦＮｇ分泌量の５０％を誘導する濃度）は、通常２０ｎｇ／ｍｌ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌである。培養細胞への添加前にヒトＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ｂｐ）をヒトＩＬ−１８とプレインキュベートすると、ＩＬ−１８ｂｐはＩＬ−１８と結合し、その活性をブロックした。このブロック効果は、投与量依存的であった。最大のＩＦＮｇ分泌の５０％が妨げられる結合蛋白質の濃度を、そのＥＣ５０とした。
【００７４】
系列希釈により調製したＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びコントロールとしてＩＬ−ｌ８ｂｐ−Ｆｃを２サンプルずつ、一定濃度のヒトＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、５０ｎｇ／ｍｌ）と共に培地に添加し、９６穴プレート中で１時間、３７℃の条件下でプレインキュベートした。ポジティブコントロールとして、系列希釈により調製したヒトＩＬ−１８のみを含むプレートを２サンプルずつ作製した。一定量のヒトＴＮＦａ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）と共に同じ細胞数のＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４６）を、培養終了後に９６穴アッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイプレートを、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベータにて更に２４時間インキュベートした。アッセイプレートの各ウェルから培養液５０μｌ／ウェルをＥＬＩＳＡプレートに移した。ヒトＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＡ（バイオソース社）を用い、キットの説明書に従い試験した。プレートリーダーを用い、プレートの光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。ＯＤ対ヒトＩＬ−１８濃度の関係を、ヒトＩＬ−１８により誘導されるＩＦＮｇ分泌曲線としてプロットした。ＯＤ対ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＯＤ対ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ（コントロール）の濃度の関係を、ＩＬ−１８ｂｐ無力化曲線としてプロットした。
【００７５】
細胞ベースのアッセイの結果を図９に示す。ＩＬ−１無力化アッセイ（図１０）の結果と併せると、機能を有するＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａキメラが効率よく得られたことが示された。ＩＬ−１８及びＩＬ−１両方の無力化活性が維持されていた。ヒトＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）は、投与量依存的にＨＵＶＥ（ヒト臍帯静脈内皮細胞性）細胞の増殖を誘導する。ヒトＶＥＧＦのＥＣ５０ＨＵＶＥ細胞の最大の増殖の５０％を誘導する濃度は、通常２ｎｇ／ｍｌ〜６ｎｇ／ｍｌである。培養細胞への添加前に可溶性のヒトＶＥＧＦ受容体−１とヒトＶＥＧＦをプレインキュベートすると、この可溶性ヒトＶＥＧＦ受容体−１はヒトＶＥＧＦと結合し、細胞におけるその活性を妨害した。この可溶性受容体のブロック効果もまた投与量依存的であった。最大細胞増殖の５０％がブロックされる可溶性受容体の濃度を、そのＥＣ５０とした。可溶性ＶＥＧＦ受容体及びＩＬ−１受容体アンタゴニストを同じ分子上に有する組換えタンパク質ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを作製した。したがって、それはＩＬ−１受容体アンタゴニストとして、また同様に可溶性ＶＥＧＦＲ１として作用しうる。
【００７６】
系列希釈により調製したＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを２サンプルずつ、一定濃度のＶＥＧＦ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培地に添加し、９６穴アッセイプレート中で１時間、３７℃の条件下でプレインキュベートした。ポジティブコントロールとして、系列希釈により調製したヒトＶＥＧＦのみを含むプレートを２サンプルずつ作製した。同じ細胞数のＨＵＶＥ細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ、ＣＣ−２５１７）を、培養終了後に９６穴アッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイプレートを、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベータにて更に９６時間インキュベートした。ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、培養終了前４時間において、アッセイプレートの各ウェルに添加した。その後、プレートリーダーを用い、プレートの光学密度（Ｏ．Ｄ．）を４９０ｎｍの波長で測定した。ＯＤ対ＶＥＧＦ濃度の関係を、ＶＥＧＦによる細胞増殖曲線としてプロットした。ＯＤ対ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ濃度の関係を、ＶＥＧＦ−Ｒ無力化曲線としてプロットした。
【００７７】
ヒトＶＥＧＦは、投与量依存的にＨＵＶＥ細胞の増殖を刺激した。ＥＤ５０は３ｎｇ／ｍｌであった。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを、細胞への投与前に系列希釈により調製したＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａとプレインキュベートすると、ＶＥＧＦ依存性の細胞増殖が、投与量依存的に阻害された。ＶＥＧＦＲ１のＥＣ５０−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａは、１５ｎｇ／ｍｌであった（図１２）。ＩＬ−１無力化アッセイの結果（図１１）を併せると、機能を有するＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａキメラが効率よく産出されることが示された。ＶＥＧＦ及びＩＬ−１の無力化活性が維持されていた。
【実施例４】
【００７８】
喘息モデルマウスを用いたＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの動物実験を実施した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢〜８週齢）を用いた。端的には、これらのマウスに、０日及び１４日目に、４０μｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む、２．２５ｍｇの水酸化アルミニウム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によるエマルジョン（総体積１００μｌ）を腹腔内注入した。
【００７９】
マウスを、８時間群及び４８時間群に分けた。８時間群は、生理食塩水コントロール−８時間、ＯＶＡ−８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−８時間の群からなり、一方４８時間群は、生理食塩水コントロール−４８時間、ＯＶＡ−４８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−４８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−４８時間の群からなる。
【００８０】
２８日目に、生理食塩水のコントロール群を除く全ての分割群に対し、鼻腔内経路により、通常の生理食塩水０．０５ｍｌに溶解した１００μｇ  ＯＶＡを投与した。生理食塩水のコントロール群には、０日及び１４日目にアルミニウムを有する通常の生理食塩水を腹腔内経路から投与し、２８日目に通常の食塩水０．０５ｍｌを鼻腔内経路から投与した。
【００８１】
２９日目に、生理食塩水のコントロール群を除く４８時間の分割群に対し、鼻腔内経路により、通常の生理食塩水０．０５ｍｌに溶解した１００μｇ  ＯＶＡを更に投与した。生理食塩水のコントロール群にも、２９日目に、鼻腔内経路により、通常の生理食塩水０．０５ｍｌを更に投与した。
【００８２】
ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの投与
ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−４８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−４８時間の群に、２８日目に２００μｇ／マウス／日で投与した。２８日目にＯＶＡを腹腔内注入する６０分前にそれらを投与した。ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−４８時間、及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−４８時間群には、２９日目に更に２００μｇ／マウス／日で投与した。
【００８３】
気管支肺胞洗浄（ＢＬＡ）の細胞数の測定
８時間の分割群において、２８日目における鼻腔へのＯＶＡの単回投与の８時間後にマウスを殺し、バル液を調製し、組織学的解析を行った。４８時間の分割群において、２８日及び２９日目における２度の鼻腔へのＯＶＡ投与の４８時間後にマウスを屠殺した。
【００８４】
左肺をｍａｉｎｓｔｅｍ気管支にて結束した後、右肺を通常の生理食塩水１．０ｍｌにより、気管カニューレを用いて洗浄した。血球計数器を使用して白血球の全個数を測定した。細胞数の差動は、細胞を遠心分離して得た調製物を、ｌｅｕｋｏｓｔａｔ（ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）により染色して計測した。標準的な血液学的方法により、細胞はマクロファージ、好酸球、好中球及びリンパ球と確認され、×４００の拡大により少なくとも２００細胞を計測した。
【００８５】
肺組織
気管及び左の肺（上下のローブ）を回収し、１５時間、２０℃で、カーノイズ溶液で固定した。パラフィンの包埋の後、５μｍ毎に組織切片を作製した。マウス毎に、左肺の全体にわたって無作為に分布する１０の気道部を用い、細胞炎症反応及び粘液閉塞の重症度を解析した。肺血管及び気道周辺の細胞浸潤の度合いを、０〜４＋までの半定量的スケールでの評価を行った。
【００８６】
結果
１．ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを用いた治療による、初期の肺炎の阻害。
表１：鼻腔内へのＯＶＡの単回投与後８時間における、ＢＡＬ液中の細胞の差動を示す。細胞数の差動を、生理食塩水のコントロール−８時間、ＯＶＡ−８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−８時間の群（各群ｎ＝５；平均値±ＳＥＭで表す）において評価した。
【表１】
2008515970.tif 000002
【００８７】
２．ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを用いた治療による、後期の肺炎の阻害。
表２：２度の鼻腔内のＯＶＡ投与後４８時間における、ＢＡＬ液中の細胞数の差動を示す。細胞数の差動を、生理食塩水のコントロール−４８時間、ＯＶＡ−４８時間、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−４８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ／ＯＶＡ−４８時間の群（各群：ｎ＝５）において評価した。平均値±ＳＥＭで示す。Ｐ＜０．０１。
【表２】
2008515970.tif 000003
【００８８】
肺組織学的解析
肺血管及び気道周辺における顕著な細胞浸潤が、ＯＶＡ−８時間及びＯＶＡ−４８時間の群において観察された。ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ／ＯＶＡ−４８時間の群と比較し、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−ｌｒａ−８時間及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ−４８時間の群において肺血管及び気道周辺の細胞浸潤の顕著な現象が観察された。この結果は、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬｌｒａがこのモデル動物の喘息を最も良く治療したことを示唆する。
【実施例５】
【００８９】
マウスＣＩＡモデルを用いたＩＬ−１８ｂｐ−ＩｇＧ１Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの動物実験を実施した。最近公表された標準プロトコル（Ｂａｎａｄａら、２００２）に従って、８週齢から１０週齢のＤＢＡ／ＩＪマウスに牛のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を皮内注射し、ＣＩＡを誘導した。各マウスにつき、０日及び２１日目に、２００μｇのＣＩＩ及び２００μｇの不活化結核菌（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を含むＩＦＡを１００μｌ注入した。マウス（ｎ＝５）を、２１日目から３６日目の間に、３日毎に、２度のうち１度、腹腔内注入（コントロールのＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及び３ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ）による治療的介入を行い治療した。マウスを３６日目に頚椎脱臼により屠殺した。同時に通常のＤＢＡ／１Ｊマウス３匹（コントロール）を屠殺した。臨床的なＣＩＡの疾患活動性を、２１日目から３６日目の間に、一日おきに、肢毎に三点において、２人のオブザーバーにより盲検により評価した：
０＝通常の関節；
１＝軽い炎症及び赤み；
２＝全ての肢に影響を及ぼす程の高度の紅斑及び膨張（使用の抑制を伴う）；
３＝肢又は関節の変形（関節強直症、関節の剛性及び機能の損失）。
臨床的な疾患活動性に関する全てのスコアは、各動物における４つの肢全てをベースにした（最大スコア：１２）（Ｂａｎｄａら、２００２）。
【００９０】
前肢及び右の後肢を、外科的に３６日目に全てのマウスから除去し、１０％  緩衝化ホルマリンにより固定し、上述したように組織サンプルの調製及び組織の分析（Ｂｅｎｄｅｌｅら、２０００）に供した。盲検化した経験豊かなオブザーバーにより、肢関節及び膝の組織学的所見が記録された。データは、上述（Ｂｅｎｄｅｌｅら、２０００）のように動物１個体あたり０から５のスコアにて、５つの関節を用い、炎症、パンヌス、軟骨傷害及び骨傷害における平均スコア及び総スコアとして表した。
【００９１】
結果
ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる臨床的な疾患活動性及び関節の組織学的解析
全ての群において、関節炎の発生率が１００％であった。コントロールのＰＢＳ単独と比較して、２１日目から３６日目に３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及び３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−ｌｒａのいずれで処理したマウスでも、臨床疾患活動性のスコアの減少が示された（表１）。関節の組織学的解析によっても、３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及び３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのいずれで処理した場合も、ＰＢＳ群と比較して関節の傷害が抑制された。臨床疾患活動性スコア又は組織学的スコアのいずれの場合も、３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及び３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａとの間で有意差が観察された。ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃよりも顕著に良好な結果を示した（表１）。表３：ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａで処理されたＣＩＡマウスの臨床疾患活動性。
【００９２】
０日目及び２１日目に、結核菌２００μｇ及び２００μｇのＣＩＩを含むＩＦＡでＤＢＡ／１Ｊマウスを免疫した。マウスを３週間、２１日目及び３６日目の３日毎に腹腔内注入し、２度のうち１度、腹腔内注入（コントロールのＰＢＳ、３ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及び３ｍｇ／ｋｇ  ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ。）による治療的介入を行い治療した。臨床的なＣＩＡの疾患活動性を、一日おきに、肢毎に三点において、２人のオブザーバーにより、治療に対する及びオブザーバー相互における盲検により評価した。各治療群対最初のコラーゲン注入後の日数による臨床疾患活動性スコア（平均±ＳＥＭ）としてデータを表した。
【表３】
2008515970.tif 000004
【実施例６】
【００９３】
接触過敏症（ＣＨＳ）マウスモデルを用いたＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａのｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実施した。ＣＨＳの誘導及びＩＬ−１８ｂｐキメラによるＣ５７ＢＬ／６マウス（８及び１４週齢）の治療により行った。ＤＮＦＢ、アセトン、エバンスブルー、ホルムアミド、ＢＳＡ、ＰＭＡ、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ及びＬＰＳ（大腸菌０２６：Ｂ６由来）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）から購入した。ＤＮＦＢは、使用直前にアセトン／オリーブ油（４／１）で希釈した。剃毛した背中の皮膚に０．５％のＤＮＦＢ溶液２５μｌを塗布して感作した、又は無処置（コントロール）のマウスを用意した。５日後に、０．２％のＤＮＦＢの１０μｌ（非刺激投与量）を右耳に、及び同一量の溶媒を左耳に投与した。５日目以降、毎日、カリパス副木を使用して投与前に耳厚をモニターした。耳の膨張を（（Ｔｎ−Ｔ５）右耳−（Ｔｎ−Ｔ５）左耳）により算出した（Ｔｎ及びＴ５の値はそれぞれ、試験のｎ日目及び５日目の投与前の耳厚を表す）。観察された膨張が非特異性の刺激ではなくＤＮＦＢ特異的な炎症によるものであることを証明するため、非感作であるが曝露されたコントロール群を各試験に含めた。５日目から、曝露６０分前に、動物あたり２５０μｇのＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ又はＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを毎日腹腔内注入し、ＩＬ−１８及び／又はＩＬ−１を無力化した。コントロールの動物には、担体である生理食塩水を単独で投与した。最初の再曝露期間中の処理を、７日目に停止した。
【００９４】
結果
ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる治療的な処理により、ＣＨＳ保護効果が得られる。実験的にＣＨＳを誘導するために、マウスの剃毛した背部にハプテンＤＮＦＢを感作した。５日後に、耳にＤＮＦＢを塗布しＣＨＳを誘導した。炎症を、溶媒だけを塗布されたコントロール耳の膨張に対する、ＤＮＦＢ曝露耳の膨張として記録した。
【００９５】
５日〜７日の惹起期間におけるＩＬ−１８ＢＰ−Ｆｃ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの投与は、顕著に反応の全期間のＤＮＦＢ曝露耳の腫張を減少させた（表１）。ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ間の有意差が観察され（表１）、同じ場所におけるＩＬ−１及びＩＬ−１８の二重ブロック、又はＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの受容体を多く含む部位に特異的な性質が、ＩＬ−１効果において重要な役割を果たすことが示唆された。ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃより顕著により良好だった。表４：惹起期間におけるＩＬ−１８ＢＰによる処理により、ＣＨＳ保護効果が得られた。
【００９６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＤＮＦＢで感作し、５日後に耳に曝露させた。耳の膨張を毎日測定し、担体を塗布したコントロール耳の腫張に対するＤＮＦＢ感作した耳の膨張の増加として表した。動物を毎日、ＩＬ−１８ｂｐキメラ又は担体のみで処理した。データは、一群あたり５匹のマウスの平均を示す。
【表４】
2008515970.tif 000005
【実施例７】
【００９７】
ＩＬ−１受容体結合試験を実施した。
【００９８】
端的には、組換えヒトＩＬ−１受容体の細胞外ドメインを最初に発現させ、哺乳類のＣＨＯ細胞を使用して独自に精製した。１００μｌのコーティングバッファー（Ｓｉｇｍａ社）に溶解させた  ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ネガティブコントロールのＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ及びポジティブコントロールのＩＬ−１ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）を用い、１μｇ／ウェルの濃度で９６ウエルプレートを被覆した。精製されたＩＬ−１受容体（０．１μｇ／ウェル）をその後ＰＢＳにおいて４５分間、３７℃でインキュベートした。受容体／リガンド結合を、ウサギ抗ヒトＩＬ−１受容体細胞外ドメイン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ複合体（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用い検出した。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄後、ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ８６６５）と混合して呈色反応をさせた。ＥＬ８００ユニバーサルマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社）を用い、プレートの６５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。希釈時間に対するＯＤ値をプロットした。図１３は、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）がＩＬ−１受容体と結合し、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）は結合しなかったことを示す。興味深いことに、ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ（哺乳動物より調製）は、大腸菌から調製したＩＬ−１ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）より顕著にＩＬ−１受容体と結合した。更に、哺乳動物から得たＩＬ−１ｒａは２つのＮ−結合グリコシル化部位を含み、それにより、大腸菌から得たＩＬ−１ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）よりも少ない血清蛋白質との結合性、及び一貫した異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合性を有する。
【実施例８】
【００９９】
ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、並びにそれらの非−ＩＬ−１ｒａ融合コントロールの１２５−Ｉ標識及び動物実験を実施した。
【０１００】
１２５−Ｉ標識されたＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを、Ｉｏｄｏｇｅｎの方法により調製し、分子篩クロマトグラフィー（Ｍ  Ｈｕｉら、１９８９）により精製した。ＩＬ−１受容体結合試験を、自製の哺乳動物由来の組換えＩＬ−受容体細胞外ドメインの融合体を用いて確立した（上記実施例４を参照）。１２５−Ｉ標識されたＴＮＦＲＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａに対するＩＬ−１受容体の結合を、平行して行った放射性同位元素で識別しないＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの結果と比較した。その結果、１２５−Ｉ標識されたＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａがＩＬ−１受容体結合に関して機能を有することを示すものである。
【０１０１】
６ｎｍｏｌのＴＰＡの２００μｌアセトン溶液を耳に塗布する処理を施されたマウスは、２日〜３日の間一貫して皮膚炎を呈した。１２５−Ｉ標識したＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａは、１２５−Ｉ標識したＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）と共に皮膚炎モデルマウス（下記参照）に注入した。その結果、驚くべきことに、１２５−Ｉ標識ＴＮＦＲＩＩ−ＦｃはＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃより炎症部位で分布されることが示された（表１）。これは、ＩＬ−１受容体の結合親和性に起因するものと考えられる。また、１２５−Ｉ標識ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを、１２５−Ｉ標識ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃと共に皮膚炎モデルマウスに注入した。同様の結果が得られた（表２及び３）。表５：炎症及び非炎症の皮膚組織における、１２５−Ｉ標識ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）の、注入後４時間における分布を示す。
【０１０２】
分布を、組織（ｎ＝６）１ｇ当たりに注入された投与量に対するパーセンテージとして表す。
【表５】
2008515970.tif 000006
表６：炎症及び非炎症の皮膚組織における、１２５−Ｉ標識ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−４Ｒ−Ｆｃの、注入後４時間における分布を示す。
【０１０３】
分布を、組織（ｎ＝６）１ｇ当たりに注入された投与量に対するパーセンテージとして表す。
【表６】
2008515970.tif 000007
表７：炎症及び非炎症の皮膚組織における、１２５−Ｉ標識ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬＫ−１８ｂｐ−Ｆｃの、注入後４時間における分布を示す。
【０１０４】
分布を、組織（ｎ＝６）１ｇ当たりに注入された投与量に対するパーセンテージとして表す。
【表７】
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【実施例９】
【０１０５】
ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａの免疫源性を、二匹のカニクイザルを用いて推定した。１０ｍｇのＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａを毎週、８週間にわたり皮下注射した。注射の前後（１日目及び５６日目）で血清サンプルを採取した。キメラタンパク質上のＩＬ−４及びＩＬ−１の生理活性を無力化する抗キメラＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１抗体の存在を確認するための無力化アッセイにより、上記サンプルを解析した。更に低濃度の無力化抗体を検出するために、血清サンプルをプロテインＡ及び抗ヒトＩｇＭ抗体によりアフィニティー精製した。キメラタンパク質上のＩＬ−４及びＩＬ−１生理活性を無力化する抗体は、処置を受けたサルの未希釈の血清と精製ＩｇＧ及びＩｇＭを用いても検出されなかった。以上の結果は、キメラＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａがサル及びヒトに対する免疫源性を有さないことを示唆するものであった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａキメラの、ＣＨＯ細胞クローン第一世代による産生を示す。２４穴プレート中で、無血清培地で発現させ、クマシーブルーにより直接タンパク質を染色し、全ての組換えタンパク質を０．５μｇ〜１．０μｇの範囲で肉眼で観察した。１レーン当たり１０μｌ〜１５μｌ添加した。
【図２】ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａキメラのアフィニティー精製を示す。還元条件及び非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ；クマシーブルーによるタンパク質染色。
【図３】トラブルシューティング能力の例を示す。第１の精製工程の変更によりＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａキメラの分解の問題を減少させた。ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃをコントロールとし、無傷の及び部分分解したＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−ＩｒａキメラをＨＰＬＣ分析した。
【図４】ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ、ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−ｌｒａのアフィニティー精製を示す。
【図５】ＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａキメラが、市販のＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）と同様に、Ｌ９７９細胞のＴＮＦαの殺傷活性を無力化することを示す、細胞ベースのＴＮＦα無力化試験を示す。
【図６】市販のＩＬ−Ｉｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）及びＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａキメラが、ＩＬ−１のＤ１０細胞増殖への生理活性を無力化することを示す、細胞ベースのＩＬ−１無力化試験を示す。
【図７】ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａ及びコントロールのＩＬ−４Ｒ−Ｆｃによる、ヒトＩＬ−４無力化アッセイを示す。
【図８】ＩＬ−４Ｒ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる、ヒトＩＬ−１無力化アッセイを示す。
【図９】ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる、ＩＬ−１８無力化活性を示す。
【図１０】ＩＬ−１８ｂｐ−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる、ＩＬ−１無力化活性を示す。
【図１１】Ｄ１０細胞における、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−１ｒａによる、ＩＬ−１無力化活性を示す。
【図１２】ＨＵＶＥ細胞における、ＶＥＧＦＲ１−Ｆｃ−ＩＬ−Ｉｒａによる、ＶＥＧＦ無力化活性を示す。
【図１３】ＩＬ−１受容体結合アッセイ。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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