(57)【要約】  本発明は、新規タンパク質、特にプロテアーゼ活性を示し、細菌（特に、バークホルデリアタイプの細菌）による細胞外リパーゼの産生を促進する新規タンパク質；コード核酸配列、前記配列を含む発現構築物、それにより改変された宿主；プロテアーゼ活性を示すタンパク質の産生方法；及び特にバークホルデリアタイプの細菌によるリパーゼの産生方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性：
ａ）コンセンサス配列ＡＩＣＨＧＰ（配列番号７）を含むアミノ酸配列；
ｂ）ヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）ＤＮＡ結合ドメインがない；
ｃ）変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約２０〜２２ｋＤａである；
の少なくとも１つにより特徴づけられるタンパク質。
【請求項２】
５．４〜５．５の範囲のｐＩ値を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌から得られ得る、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）から得られ得る、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
細胞外リパーゼ産生細菌宿主において発現後、標準条件下で測定した細胞外脂肪分解活性を上昇させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
宿主がバークホルデリア・グルメである、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
細胞外脂肪分解活性が基準値に比して少なくとも約５％上昇している、請求項５または６に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号１または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む核酸によりコードされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸配列。
【請求項１１】
プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１０に記載の核酸配列を、少なくとも１つの調節核酸配列の遺伝的制御下に含む発現構築物。
【請求項１２】
少なくとも１つの請求項１１に記載の発現構築物で遺伝的に改変されている組換え微生物。
【請求項１３】
組換え微生物をタンパク質を発現する条件で培養し、形成するタンパク質を単離する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロテアーゼ活性を有するタンパク質の産生方法。
【請求項１４】
リパーゼを産生し得る宿主により請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロテアーゼ活性を有する機能性タンパク質を発現させ、同時または異なる時にリパーゼを発現させ、形成するリパーゼを単離する、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の産生方法。
【請求項１５】
宿主がバークホルデリア属の細菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リパーゼが配列番号６のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
リパーゼが配列番号５の配列を含む核酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、特にバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌による細胞外リパーゼの産生を促進する新規タンパク質、特にプロテアーゼ活性を有するタンパク質；前記タンパク質をコードする核酸配列；前記核酸配列を含む発現構築物；前記構築物で形質転換されてなる宿主；プロテアーゼ活性を有するタンパク質の産生方法；及び特にバークホルデリア属の細菌によるリパーゼの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは自然界に広く存在しており、各種生理学的機能を有している。プロテアーゼはペプチド結合の切断を触媒する分解酵素である。細胞外プロテアーゼはその後の吸収のために大きいタンパク質を小さいタンパク質に分断し、細胞内プロテアーゼは代謝調節において重要な役割を果たす。タンパク質分解活性の例には、酵素の酵素原形態の限定されたタンパク質分解による活性化、分泌タンパク質の膜を介するプロセシング及び輸送、または調節タンパク質の分解またはリボソームタンパク質の改変による遺伝子発現の調節が含まれる（非特許文献１）。
【０００３】
２０００年に、大腸菌のプロテアーゼＤｅｇＰ、Ｐｒｃ、プロテアーゼＩＩＩ及びＳｏｈＢとかなりの相同性を示した各種プロテアーゼが緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のゲノムで同定された。対応する遺伝子を緑膿菌のゲノムにおいて不活化すると、３つの変異体がより高いリパーゼ活性を示したのに対して、１つの変異体は上清中により低いリパーゼ活性を有していた。更なる実験でＬｉｐＡＢオペロンの遺伝子発現が影響されなかったことが判明し、このことから前記プロテアーゼは緑膿菌におけるリパーゼＬｉｐＡの折りたたみ及び／または分泌に影響を与えることが確認された（非特許文献２）。
【０００４】
バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）は、稲の苗条及び穂に殻腐敗病及びうどん粉病を引き起こす植物病原菌である。多くの他の細菌と同様に、バークホルデリア・グルメは細胞外リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を産生する。このリパーゼは多種多様なバイオテクノロジー分野において有用であることが分かっている（非特許文献３）。
【０００５】
従って、前記リパーゼを高収率で産生させることが望ましい。適当な過剰発現菌株を構築するためには、リパーゼ産生における潜在的な障害を同定しなければならない。前記障害は、遺伝子発現、折りたたみ及び酵素の培地への分泌のレベルにあると予想される。
【非特許文献１】Rao M.B.ら、 (1998) Molecular and biotechnological aspects of micobial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 597-635
【非特許文献２】Windgassen M. (200) Proteinsekretion in Pseudomonas aeruginosa: Untersuchung der Rolle periplasmatischer Proteasen durch Insertionsmutagenese. Diplomarbeit, Ruhr-Universitaet Bochum
【非特許文献３】Schmid A.ら、 (2001) Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature insight 409: 258-268
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明により解決しようとする課題は、バークホルデリア・グルメによる細胞外リパーゼ産生を改善する方法を見つけることであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記した課題は、バークホルデリア・グルメにおけるリパーゼｌｉｐＡの発現及び／または折りたたみ及び分泌に対して有利な効果を発揮する、プロテアーゼ活性を含むタンパク質を提供することにより解決された。
【０００８】
本発明によれば、まずバークホルデリア・グルメＰＧ１のコスミドライブラリーを広い宿主特異性を有するベクターｐＬＡＦＲ３［２０］を用いて構築した。約２５００個のクローンをスクリーニングした後、リパーゼ産生に対して影響を有する１５個のコスミドを同定した。２個のコスミドの対応ＤＮＡ断片を広い宿主特異性を有するベクターにサブクローニングして、５個の異なるプラスミドを得た。これらのプラスミドをバークホルデリア・グルメにおいて発現させると、高いリパーゼ活性を示したクローンが生じた。対応のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を決定した後、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のオープンリーディングフレームサーチプログラム（ＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒ）を用いて同定した。最長のＯＲＦは５４０塩基対を含み、そこから誘導されるアミノ酸配列はＴｈｉＪ／ＰｆｐＩ−Ｇファミリー中に見られる保存ドメインを含んでいた。このファミリーはプロテアーゼ、転写調節因子、ＲＮＡ結合タンパク質またはシャペロンのような各種タンパク質を含む［３］。従って、このＯＲＦは、バークホルデリア・グルメにおけるリパーゼｌｉｐＡの発現及び／または折りたたみ及び分泌に対して有利な効果を有する細胞質プロテアーゼを構成する未だ解析されていないタンパク質をコードすると推定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．好ましい実施形態
本発明の第１の目的は、以下の特性：
ａ）コンセンサス配列ＡＩＣＨＧＰ（配列番号７）を含むアミノ酸配列；
ｂ）ヘリックス−ターン−ヘリックス（ＨＴＨ）ＤＮＡ結合ドメインがない；
ｃ）変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約２０〜２２ｋＤａである；
の少なくとも１つにより特徴づけられるタンパク質に関する。
【００１０】
例えば、上記特性ａ）、ｂ）及びｃ）の１つ、２つまたは３つは組み合わせて存在し得、特にこれらの特性は同時に存在し得る。
【００１１】
更に、本発明のタンパク質はプロテアーゼ活性を有し得る。
【００１２】
本発明のタンパク質が５．４〜５．５の範囲のｐＩ値を有していることが好ましい。前記タンパク質はバークホルデリア属、特にバークホルデリア・グルメの細菌から得られ得る。
【００１３】
更に、本発明のタンパク質は、細胞外リパーゼを産生する細菌宿主（例えば、バークホルデリア属の細菌、特にバークホルデリア・グルメ）において発現後、標準条件下で測定した細胞外脂肪分解活性を上昇させる。細胞外脂肪分解活性を基準値と比べて、少なくとも約１％（例えば、約５〜２００％、１０〜１００％または２０〜５０％）ほど上昇させる。
【００１４】
特に、本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む核酸によりコードされるタンパク質、及びこれらのコード核酸配列そのものに関する。
【００１６】
本発明の別の目的は、上の定義に従うプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を少なくとも１つの調節核酸配列の遺伝的制御下に含む発現ベクターに関する。
【００１７】
本発明の別の目的は、少なくとも１つの上に定義した発現ベクターを用いて遺伝的に改変した組換え微生物である。
【００１８】
本発明は更に、上に定義したプロテアーゼ活性を有するタンパク質を発現する条件下で組換え微生物を培養し、形成するタンパク質を単離することを含む、前記タンパク質の産生方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、好ましくは細胞外リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を産生し得る宿主により上に定義したプロテアーゼ活性を有する機能的タンパク質を発現させ、同時にまたは異なる時にリパーゼを発現させ、形成するリパーゼを単離することを含む、細胞外リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の産生方法に関する。特に、宿主はバークホルデリア属の細菌、特にバークホルデリア・グルメである。
【００２０】
好ましい変更例によれば、産生されるリパーゼは配列番号６のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、或いは配列番号５の配列を含む核酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によりコードされる。
【００２１】
２．一般用語の説明
「プロテアーゼ活性」とは、本明細書中に記載されている試験方法の少なくとも１つにおけるプロテアーゼの酵素活性（タンパク質分解活性）を指し、その例には少なくとも１つの適当なプロテアーゼ基質を用いて測定されるタンパク質分解活性が含まれるが、これに限定されない。本発明者らは、非限定例としてアミノペプチダーゼ基質（例えば、リシン−β−Ｎａ、アルギニン−β−Ｎａ、Ｌ−アラニン−β−Ｎａ、グルタメート（βＮａ）−ＯＨ）を挙げることができる。しかしながら、タンパク質の酵素活性をタンパク質分解活性に限定する必要はない。
【００２２】
「ＨＴＨ結合ドメイン」とは、本明細書中に明確に言及されているＤｏｄｄら（１９９０）［２６］に記載されているタンパク質配列中のヘリックス・ターン・ヘリックスＤＮＡ結合モチーフを意味する。
【００２３】
本発明において「細胞外リパーゼ」とは、特に酵素クラスＥ．Ｃ．３．１．１．３の細胞外リパーゼである。好ましくは、細胞外リパーゼはバークホルデリア属の細菌、特にバークホルデリア・グルメにより産生され、例えば特にリパーゼｌｉｐＡである。前記リパーゼは、例えば本明細書中に明確に言及されているＢｒｅｕｅｒら（２００４）［２７］、Ｊａｅｇｅｒら（２００２）［２８］及びＳｃｈｍｉｄら（２００１）［２９］に記載されているように特にバイオテクノロジー方法において使用される。
【００２４】
「標準条件下で測定した細胞外脂肪分解活性」とは、実験例に記載されているようにＷｉｎｋｌｅｒら［３１］（最終基質濃度０．８ｍＭ，３７℃，ゼーレンセンホスフェートバッファー中）に従って基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテートを用いる標準の分光光度的測定方法を用いて測定した活性を意味する。
【００２５】
本発明によれば「誘導された」配列、例えば誘導されたアミノ酸または核酸配列とは、特記しない限り、出発配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する配列を意味する。
【００２６】
２つの核酸間の「同一性」は、各々核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性、特に以下の設定でＣｌｕｓｔａｌ方法（Ｄ．Ｇ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ，Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，５（２）：１５１−１（１９８９年４月））を用いるＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ７．１プログラムにより計算した同一性を意味する。
【００２７】
マルチプルアラインメントパラメーター：
ギャップ開始ペナルティー            １０
ギャップ伸長ペナルティー            １０
ギャップ分離ペナルティー範囲        ８
ギャップ分離ペナルティー            オフ
アラインメントディレイの同一％      ４０
残基特異的ギャップ                  オフ
親水性残基ギャップ                  オフ
トランジション秤量                  ０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
ＦＡＳＴアルゴリズム                オン
Ｋ−タプルサイズ                    １
ギャップペナルティー                ３
ウィンドウサイズ                    ５
ベストダイアゴナル数                ５
３．本発明の他の実施形態
３．１  本発明のタンパク質
本発明は、具体的に開示されているプロテアーゼ活性を有するタンパク質または酵素に限定されず、その機能的均等物にも及ぶ。
【００２８】
具体的に開示されている酵素の「機能的均等物」、すなわちアナログは、本発明の範囲内にあり、更に所望の生物学的活性（例えば、タンパク質分解活性）を有する各種ポリペプチドである。
【００２９】
例えば、「機能的均等物」とは、タンパク質分解活性のために使用される試験において、配列番号２のアミノ酸配列を含む酵素の活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、特に好ましくは７５％、非常に好ましくは９０％を示す酵素を意味する。更に、機能的均等物は好ましくはｐＨ４〜１０で安定であり、有利にはｐＨ５〜８の範囲に最適ｐＨ及び２０〜８０℃の範囲に最適温度を有する。
【００３０】
タンパク質分解活性は、タンパク質分解活性を測定するための各種公知試験を用いて立証され得る。非限定的ではあるが、１リッターあたり３０ｇの脱脂粉乳、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのトリプトン、１５ｇの寒天及び１ｍＭのＩＰＴＧを含有している脱脂乳寒天プレートを用いる試験を挙げることができる。発現培養物の各コロニーまたは５μｌの各精製ステップの１つを寒天プレートに播種し、３０℃（バークホルデリア・グルメ）または３７℃（大腸菌）で一晩インキュベートした。タンパク質分解活性はコロニーまたはサンプルの周囲にハローが形成されることから検出し得る。
【００３１】
本発明において、「機能的均等物」とは特に、上記したアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置中に具体的に記載されているものとは異なるが上記した生物学的活性の１つを有しているアミノ酸を有している変異体をも意味する。よって、「機能的均等物」には、本発明の特性のプロフィールを有する変異体をもたらす限り任意の配列位置で起こり得る１つ以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／または逆位により得られ得る変異体が含まれる。特に、変異体と未変化のポリペプチド間の反応性パターンが質的に一致している場合、例えば同一基質が異なる程度で変換される場合、機能的均等物が提供される。適当なアミノ酸置換のを例を、下表に示す：
オリジナル残基          置換の例
Ａｌａ              Ｓｅｒ
Ａｒｇ              Ｌｙｓ
Ａｓｎ              Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ              Ｇｌｕ
Ｃｙｓ              Ｓｅｒ
Ｇｌｎ              Ａｓｎ
Ｇｌｕ              Ａｓｐ
Ｇｌｙ              Ｐｒｏ
Ｈｉｓ              Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ              Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ              Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ              Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ              Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ              Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ              Ｔｈｒ
Ｔｈｒ              Ｓｅｒ
Ｔｒｐ              Ｔｙｒ
Ｔｙｒ              Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ              Ｉｌｅ；Ｌｅｕ。
【００３２】
上記した意味で「機能的均等物」は、記載されているポリペプチドの「前駆体」、並びにポリペプチドの「機能的均等物」及び「塩」でもある。
【００３３】
「前駆体」は、場合により所望の生物学的活性を有するかまたは有していない、ポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【００３４】
「塩」とは、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は公知の方法で製造され、無機塩（例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛の塩）及び有機塩基（例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、リシン、ピペリジン等のアミン）の塩からなる。酸付加塩、例えば無機酸（例えば、塩酸または硫酸）との塩及び有機酸（例えば、酢酸及びシュウ酸）との塩も本発明に包含される。
【００３５】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」はまた、機能的アミノ酸側基或いはＮ末端またはＣ末端にて公知技術を用いて製造し得る。前記誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル；アンモニアまたは第１級もしくは第２級アミンと反応させることにより得られ得るカルボン酸基のアミド；アシル基との反応により製造される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；またはアシル基との反応により製造される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体からなる。
【００３６】
「機能的均等物」は本来他の生物から得られ得るポリペプチド及び天然の変異体からなる。例えば、相同配列領域のエリアは配列比較により確立され、均等の酵素は本発明の具体的パラメーターに基づいて決定し得る。
【００３７】
また、「機能的均等物」は、例えば所望の生物学的機能を発揮する本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフからなる。
【００３８】
更に、「機能的均等物」は、上記したポリペプチド配列またはそこから誘導される機能的均等物の１つ及び機能的Ｎ末端またはＣ末端会合で（すなわち、融合タンパク質部分の実質的に突然変異機能的低下を生ずることなく）機能的に異なる異種配列を少なくとも１つ有する融合タンパク質である。前記異種配列の非限定的な例は、シグナルペプチド、ヒチジンアンカーまたは酵素である。
【００３９】
具体的に開示されているタンパク質のホモログも本発明に含まれる「機能的均等物」である。この機能的均等物は、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８５（８）：２４４４−２４４８（１９８８））のアルゴリズムに従って計算して具体的に開示されているアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８５％（例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の相同性を有している。本発明の相同ポリペプチドの相同％とは、特に本明細書中に具体的に記載されているアミノ酸配列の１つの全長に対するアミノ酸残基の同一％を意味する。
【００４０】
可能なタンパク質グリコシル化の場合、本発明の「機能的均等物」は脱グリコシル化またはグリコシル化形態、及びグリコシル化パターンを変えることにより得ることができる改変型形態の上記したタイプのタンパク質からなる。
【００４１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドのホモログは突然変異誘発により、例えばタンパク質を点突然変異、伸長または短縮することにより製造し得る。
【００４２】
本発明のタンパク質のホモログは、変異体（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることにより同定し得る。例えば、タンパク質変異体の多様なデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチド混合物を酵素によってライゲーションすることにより作成し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列からの可能なホモログのデータベースの作成に使用し得る方法は非常に多数ある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置において実施し得、その後合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲーションし得る。縮重ゲノムを使用することによって、可能なタンパク質配列の所望の組をコードするすべての配列を、混合物で供給し得る。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である（例えば、Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，３９：３（１９８３）；Ｉｔａｋｕｒａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５３：３２３（１９８４）；Ｉｔａｋｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８：１０５６（１９８４）；Ｉｋｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：４７７（１９８３））。
【００４３】
従来技術で、点突然変異または短縮により作成したコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物をスクリーニングするため、及び選択した特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために幾つかの技術が公知である。これらの技術は、本発明のホモログをコンビナトリアル突然変異誘発することにより作成した遺伝子バンクを迅速にスクリーニングするために適合し得る。大遺伝子バンクをスクリーニングするために最も頻繁に使用されている、ハイスループット分析に基づく技術は、遺伝子バンクを複製し得る発現ベクターにクローニングし、適当な細胞を得られたベクターデータベースを用いて形質転換し、所望される活性の検出により、産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を促す条件下にてコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ホモログを同定するために、データベース中の機能的変異体の頻度を高める技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニング試験と一緒に使用し得る（Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｒｖａｎ，ＰＮＡＳ，８９：７８１１−７８１５（１９９２）；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６（３）：３２７−３３１（１９９３））。
【００４４】
３．２  コード核酸配列
本発明は、プロテイナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸配列にも関する。配列番号１の配列を含む核酸配列または配列番号２のアミノ酸配列から誘導される核酸配列が好ましい。
【００４５】
本明細書中に記載されているすべての核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成による公知の方法で、例えば二重ヘリックスの個々の重複相補核酸ビルディングブロックを断片縮合することにより作成し得る。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えばホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，第２版，ニューヨークに所在のＷｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ発行，ｐ．８９６−８９７）により公知の方法で実施し得る。ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片及びライゲーション反応による合成オリゴヌクレオチドの蓄積及びギャップの充填、並びに一般的なクローニング技術はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。
【００４６】
本発明はまた、上記ポリペプチドの１つをコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ）並びにその機能的均等物にも関し、これらは例えば人工ヌクレオチドアナログを用いて得ることができる。
【００４７】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質、或いはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離核酸分子及び核酸断片に関し、これらは例えば本発明のコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用し得る。
【００４８】
本発明の核酸分子は、更にコード遺伝子領域の３’及び／または５’末端由来の未翻訳配列を含み得る。
【００４９】
本発明は更に、具体的に記載されているヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的である核酸分子に関する。
【００５０】
本発明のヌクレオチド配列により、他の細胞型及び生物において相同配列を同定及び／またはクローニングするために使用し得るプローブ及びプライマーを作成することができる。前記プローブまたはプライマーは通常、本発明の核酸配列のセンス鎖またはその対応アンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５（例えば、約４０、５０または７５）個の連続ヌクレオチドに対して“ストリンジェントな”条件（以下参照）下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００５１】
「単離」核酸分子は、核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離され、組換え技術により産生されるならば他の細胞材料または培地を実質的に含有している恐れがないか、または化学的に合成されるならば化学前駆体または他の化学物質を含有している恐れがない。
【００５２】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準技術及び本発明により供給される配列情報を用いて単離し得る。例えば、ｃＤＮＡはハイブリダイゼーションプローブとして具体的に開示されている完全配列またはそのセグメントの１つ及び（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されているような）標準的なハイブリダイゼーション技術を用いて適当なｃＤＮＡライブラリーから単離し得る。加えて、開示されている配列またはそのセグメントの１つを含む核酸分子は、前記配列に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。このようにして増幅した核酸は適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列決定により解析し得る。本発明のオリゴヌクレオチドは標準的な合成方法によっても、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて作成し得る。
【００５３】
本発明の核酸配列（例えば、配列番号１またはその誘導体、前記配列のホモログまたはその一部）は、例えば一般的なハイブリダイゼーション技術または例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを用いる他の細菌からＰＣＲ技術により単離し得る。前記ＤＮＡ配列は標準条件下で本発明の配列とハイブリダイズする。
【００５４】
「ハイブリダイズ」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが標準条件下で殆ど相補的な配列と結合し得る能力を意味する。前記条件下では非相補的パートナー間の非特異的結合は生じない。このために、配列は９０〜１００％相補的であり得る。相補性配列が相互に特異的に結合し得る特性は、例えばノーザンブロットまたはサザンブロット法またはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおけるプライマー結合で使用される。
【００５５】
保存領域の短オリゴヌクレオチドは有利にはハイブリダイゼーションのために使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのために、本発明の核酸のより長い断片または完全配列を使用することもできる。標準条件は使用する核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片または完全配列）に依存して、またはハイブリダイゼーションのために使用する核酸のタイプ、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに依存して異なる。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融点は同一の長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融点よりも約１０℃低い。
【００５６】
例えば、特定の核酸に依存して、標準条件は０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．２）の濃度のバッファー水溶液中、または更に５０％  ホルムアルデヒドの存在下、４２〜５８℃の温度、例えば５×ＳＳＣ、５０％  ホルムアミド中４２℃を意味する。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣ及び約２０〜４５℃の温度、好ましくは約３０〜４５℃の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合のハイブリダイゼーション条件は有利には０．１×ＳＳＣ及び約３０〜５５℃、好ましくは約４５〜５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのための前記した温度は、ホルムアミドの非存在下で約１００ヌクレオチドの長さ及び５０％のＧ＋Ｃ含量の核酸について計算した融点の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は関連する遺伝学教書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）発行に記載されており、当業者に公知の式を用いて、例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプまたはＧ＋Ｃ含量に応じて計算し得る。当業者は以下の教書からハイブリダイゼーションに関する追加情報を得ることができる：Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークに所在のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８５年）発行；Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ編，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，オックスフォードに所在のオックスフォード大学出版のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５年）発行；Ｂｒｏｗｎ編，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，オックスフォードに所在のオックスフォード大学出版のＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行。
【００５７】
「ハイブリダイゼーション」は特にストリンジェントな条件下で実施し得る。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行，ｐ．９．３１−９．５７またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークに所在のＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８９年）発行，６．３．１−６．３．６．に記載されている。
【００５８】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、具体的には５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  クエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％  硫酸デキストラン及び２０ｇ／ｍｌ  変性剪断サケ精子ＤＮＡからなる溶液中にて４２℃で一晩インキュベートした後、フィルターを０．１×ＳＳＣを用いて６５℃で洗浄することを意味する。
【００５９】
本発明は、具体的に開示されているかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。
【００６０】
よって、本発明の別の核酸配列は例えば配列番号１から誘導され得、個々のまたは幾つかのヌクレオチドを付加、置換、挿入または欠失することにより前記配列と異なり得、更に所望の特性プロフィールを有するポリペプチドをコードし得る。
【００６１】
本発明は、いわゆるサイレント突然変異を含むかまたは特定のオリジナルまたは宿主生物のコドン使用頻度に従って具体的に記載されている配列に比して変更されている核酸配列、及びその天然に存在する変異体（例えば、スプライシング変異体またはアレリック変異体）をも包含する。
【００６２】
本発明は、保存的ヌクレオチド置換（すなわち、当該アミノ酸が同一の荷電、サイズ、極性及び／または溶解性を有するアミノ酸で置換されている）により得られ得る配列にも関する。
【００６３】
本発明は、具体的に開示されている核酸から配列多型により誘導される分子にも関する。遺伝的多形は自然変異のために集団中の個体間に存在し得る。自然変異は通常遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変異を生ずる。
【００６４】
本発明の配列番号１を有する核酸配列の誘導体は、例えば全配列範囲にわたり誘導されたアミノ酸のレベルで少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、非常に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有するアレリック変異体を意味する（アミノ酸レベルでの相同性に関係なく、ポリペプチドについて上記した詳細が言及されなければならない）。有利には、相同性は配列の部分領域にわたり高いことがある。
【００６５】
更に、誘導体は本発明の核酸配列、特に配列番号１の核酸配列のホモログ（例えば、真菌性または細菌性ホモログ、短縮配列、コード及び非コードＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）であるとも理解される。例えば、配列番号１のホモログは、配列番号１中の全ＤＮＡ領域にわたりＤＮＡレベルで少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有している。
【００６６】
更に、誘導体は、例えばプロモーターとの融合物であると理解される。記載されているヌクレオチド配列に付加されるプロモーターは、該プロモーターの機能性または有効性を損なうことなく少なくとも１つのヌクレオチド置換、少なくとも１つの挿入、逆位及び／または欠失により改変し得る。更に、プロモーターの有効性は配列を変化することにより向上し得、または異なる属の生物のより効果的なプロモーターを用いて完全に交換してもよい。
【００６７】
３．３  本発明の構築物
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を調節核酸配列の遺伝的制御下に含む発現構築物及び前記発現構築物の少なくとも１つを含むベクターにも関する。
【００６８】
本発明によれば、「発現単位」とは本明細書中に定義したプロモーターを含み、発現させようとする核酸または遺伝子と機能的に結合させた後、発現（すなわち、前記核酸または前記遺伝子の転写及び翻訳）を調節する発現活性を有する核酸を意味する。従って、この関係で「調節核酸配列」とも称する。プロモーターに加えて、他の調節要素（例えば、エンエンサー）が存在してもよい。
【００６９】
本発明によれば、「発現カセット」または「発現構築物」とは、発現させようとする核酸または発現させようとする遺伝子と機能的に結合した発現単位を意味する。発現単位とは対照的に、発現カセットは転写及び翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写及び翻訳の結果としてタンパク質として発現されるべき核酸配列をも含む。
【００７０】
本発明に関連して、用語「発現」または「過剰発現」とは、対応するＤＮＡによりコードされる１つ以上の酵素の微生物における細胞内活性の産生または上昇を意味する。このために、生物中に遺伝子を挿入すること、既存の遺伝子を別の遺伝子で置換すること、遺伝子のコピー数を増加させること、強力なプロモーターを使用すること、または高活性を有する対応酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、場合により前記手段を組み合わせてもよい。
【００７１】
好ましくは、本発明の構築物は、各コード配列の５’上流にプロモーター及び３’下流にターミネーター配列、場合により更に通常の調節配列を含み、いずれもコード配列と機能的に結合している。
【００７２】
本発明によれば、「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」とは、転写させようとする核酸と機能的に結合している核酸が該核酸の転写を調節することを意味する。
【００７３】
この関係で、「機能的」または「操作的」結合とは、例えばプロモーター活性を有する核酸及び転写させようとする核酸配列の１つ、及び場合により別の調節要素（例えば、核酸を転写できる核酸配列およびターミネーター）が前記調節要素の各々が核酸配列の転写においてその機能を果たすことができるように順次配置されていることを意味する。これは、化学的意味で直接結合している必要はない。遺伝的制御配列（例えば、エンハンサー配列）は、より遠くの位置または他のＤＮＡ分子の標的配列上でその機能を発揮し得る。２つの配列が相互に共有結合するように転写しようとする核酸配列がプロモーター配列の後に（すなわち、３’末端に）位置している配置が好ましい。プロモーター配列とトランスジェニック的に発現させようとする核酸配列の間の距離は２００ｂｐ（塩基対）未満、または１００ｂｐ未満、または５０ｂｐ未満であり得る。
【００７４】
プロモーター及びターミネーターとは別に、他の調節要素の例として標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起源等を挙げることができる。適当な調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，カリフォルニア州サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）発行に記載されている。
【００７５】
本発明の核酸構築物は、特に配列番号１の配列またはその誘導体及びホモログ、及び配列番号２から誘導され得る核酸配列を含み、これらが遺伝子発現をコントロール（例えば、増加）するために１つ以上の調節シグナルと操作的または機能的に結合していることが有利である。
【００７６】
前記調節配列に加えて、これらの配列による天然の調節は実際の構造遺伝子の前に存在し得、場合により天然の調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増加するように遺伝的に改変されていてもよい。核酸構築物は簡単に、すなわち追加の調節シグナルをコード配列（例えば、配列番号１またはそのホモログ）の前に挿入することなく、その調節で天然のプロモーターを除去することなく設計し得る。その代わりに、調節がもはや起こらず、遺伝子発現が増加するように天然の調節配列は沈黙している。
【００７７】
好ましい核酸構築物は、有利にはプロモーターと機能的に結合している１つ以上の上記エンハンサー配列をも含み、これにより核酸配列の発現が増加し得る。追加の有利な配列（例えば、他の調節要素またはターミネーター）をＤＮＡ配列の３’末端に挿入することも可能である。本発明の核酸の１つ以上のコピーを構築物に含めることもできる。構築物は、場合により選択するために他のマーカー（例えば、抗生物質耐性または栄養要求性補充遺伝子）をも含み得る。
【００７８】
適当な調節配列の例は、ｃｏｓ−、ｔａｃ−、ｔｒｐ−、ｔｅｔ−、ｔｒｐ−ｔｅｔ−、ｌｐｐ−、ｌａｃ−、ｌｐｐ−ｌａｃ−、ｌａｃＩｑ−、Ｔ７−、Ｔ５−、Ｔ３−、ｇａｌ−、ｔｒｃ−、ａｒａ−、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６−、ｌａｍｂｄａ−ＰＲ−のようなプロモーター中、またはグラム陰性細胞中で有利に使用し得るラムダ−ＰＬプロモーター中に含まれている。他の有利な調節配列は、例えばグラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２中、酵母または真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ中に含まれる。人工プロモーターも調節のために使用し得る。
【００７９】
発現のために、核酸構築物を宿主生物中、有利には宿主において遺伝子を最適発現し得るプラスミドまたはファージのようなベクター中に挿入する。プラスミドおよびファージに加えて、ベクターは当業者に公知の他のすべてのベクター、例えばウイルス（例：ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス）、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミド、及び線状または環状ＤＮＡを意味すると理解されたい。前記ベクターは宿主生物において自律的に複製され得るか、または染色体複製され得る。これらのベクターは本発明の別の実施形態を構成する。
【００８０】
適当なプラスミドは、例えば大腸菌中ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩ；ストレプトマイセス中ｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バシラス中ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム中ｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；真菌中ｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６；酵母中２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３；あるいは植物中ｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。上記プラスミドは可能なプラスミドを小規模に集めたものである。他のプラスミドは当業者に公知であり、例えば書籍Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓら編，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−ＯｘｆｏｒｄのＥｌｓｅｖｉｅｒ（１９８５年）発行，ＩＳＢＮ０ ４４４ ９０４０１８）に記載されている。
【００８１】
ベクターの別の実施形態では、本発明の核酸構築物または本発明の核酸を含むベクターを微生物中に有利には線状ＤＮＡの形態で挿入し、非相同または相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込む。この線状ＤＮＡはプラスミドのような線状化ベクターまたは本発明の核酸構築物または核酸そのものからなり得る。
【００８２】
生物において異種遺伝子を最適に発現するためには、当該生物中に使用されている特定のコドン使用頻度に従って核酸配列を変化させることが有利である。コドン使用頻度は当該生物の他の公知遺伝子のコンピューター評価に基づいて容易に決定し得る。
【００８３】
本発明の発現カセットの作成は、適当なプロモーターと適当なコードヌクレオチド配列及びターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルの融合に基づく。このためには、例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）発行；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８４年）発行；及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７年）発行に記載されているような一般的な組換え及びクローニング技術を使用する。
【００８４】
有利には、宿主において遺伝子を最適に発現することができるように、組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、適当な宿主生物において発現するために宿主特異的ベクター中に挿入する。ベクターは当業者に周知であり、例えばＰ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓら，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｕｂｌ（１９８５年）発行）に記載されている。
【００８５】
３．４  本発明に従って使用し得る宿主
内容に応じて、用語「微生物」とは、出発微生物（野生型）及び／または本発明の遺伝的に改変されてなる微生物を意味する。
【００８６】
本発明によれば、用語「野生型」とは、対応の出発微生物を意味し、必ずしも天然に存在する微生物に対応している必要はない。
【００８７】
本発明のベクターを用いることにより、例えば少なくとも１つの本発明のベクターを用いて形質転換した組換え微生物を産生し得、本発明のポリペプチドを製造するために使用し得る。有利には、上記した本発明の組換え構築物を適当な宿主系に挿入し、発現する。好ましくは、各発現系において記載されている核酸を確実に発現するために当業者に周知の一般的なクローニング及びトランスフェクション方法、例えば共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等を使用する。適当な系は、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ニューヨークに所在のＰｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７年）発行；またはＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行に記載されている。
【００８８】
原則として、すべての原核または真核生物を、本発明の核酸または核酸構築物のための組換え宿主生物と見なし得る。微生物（例えば、細菌、真菌または酵母）を宿主生物として使用することが有利である。グラム陽性またはグラム陰性細菌を使用することが有利であり、好ましくはエンテロバクテリア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）またはノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ）科の細菌、特に好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、バークホルデリア、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはロードコックス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌を使用する。大腸菌の属及び種が非常に好ましい。他に有利な細菌はα−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリアまたはγ−プロテオバクテリアにも見つけられる。
【００８９】
本発明の宿主生物が上の定義に従うプロテアーゼ活性を有する酵素をコードする本明細書中に記載されている核酸配列、核酸構築物またはベクターの少なくとも１つを含むことが好ましい。
【００９０】
本発明の方法において使用する生物を、宿主生物に応じて当業者に周知の方法で増殖または繁殖させる。概して、微生物を炭素源（通常、糖の形態で）、窒素源（通常、酵母抽出物のような窒素の有機源；硫酸アンモニウムのような塩の形態で）、微量元素（例えば、鉄、マンガン及びマグネシウム塩）及び場合によりビタミンを含有する液体培地において酸素を通気しながら０〜１００℃、好ましくは１０〜６０℃の温度で増殖させる。液体栄養培地のｐＨは一定値に維持し得る。すなわち、増殖中ｐＨを調節してもしなくてもよい。増殖はバッチ式、半バッチ式または連続的に実施し得る。栄養素を発酵開始時に供給しても、またはその後に供給してもよく、供給は半連続的でも連続的であってもよい。ケトンを増殖中に直接添加してもよいが、増殖後に添加することが有利である。酵素は実施例に記載されている方法により生物から単離し得、または反応のために生抽出物として使用し得る。
【００９１】
本発明に従って使用し得る宿主は、特にバークホルデリア属の細菌、特にバークホルデリア・グルメ種の細菌である。バークホルデリア・グルメ（シュードモナス・グルメと同義）の通常入手可能な株ＤＳＭ番号９５１２が非限定例として挙げられ得る。
【００９２】
３．５  プロテアーゼの組換え産生
本発明は、本発明のポリペプチドまたはその機能的生物学的に活性な断片を、ポリペプチド産生微生物を培養し、所要によりポリペプチドの発現を誘導し、ポリペプチドを培養物から単離することにより、組換え的に産生するための方法にも関する。ポリペプチドは所望ならばこのように工業的規模でも産生し得る。
【００９３】
本発明に従って産生される微生物はバッチ方法、または流加培養または反復培養方法で連続または非連続的に培養し得る。公知の培養方法の説明はＣｈｍｉｅｌの教書（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に記載されている。
【００９４】
使用する培地は適当な方法で特定の株の要件を満たしていなければならない。各種微生物に対する培地は米国ワシントン・ディー・シーに所在の米国細菌学会のハンドブック“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”（１９８１年）発行に記載されている。
【００９５】
本発明に従って使用し得る培地は通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／または微量元素を含んでいる。
【００９６】
好ましい炭素源は糖、例えば単糖、二糖または多糖である。非常に良好な炭素源の例はグルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖を複合化合物（例えば、モラセスまたは糖精製からの他の副生成物）の形態で培地に添加してもよい。各種炭素源の混合物を添加することが有利なこともあり得る。他の可能な炭素源は、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びヤシ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール、メタノールまたはエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸または乳酸）である。
【００９７】
窒素源は通常、有機または無機窒素化合物または前記化合物を含む材料である。窒素源の例には、アンモニアガスまたはアンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム）、硝酸塩、尿素、アミノ酸または窒素の複合源（例えば、コーン・スティープ・リカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、ミート抽出物等）を含む。窒素源は別々にまたは混合物として使用し得る。
【００９８】
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩からなる。
【００９９】
無機の硫黄含有化合物（例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、スルフィド）及び有機硫黄化合物（例えば、メルカプタン及びチオール）が硫黄源として使用し得る。
【０１００】
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素ジカリウム、または対応のナトリウム含有塩がリン源として使用し得る。
【０１０１】
金属イオンを溶液中に維持するために、培地にキレート剤を添加してもよい。特に適当なキレート剤はジヒドロキシフェノール（例えば、カテコールまたはプロトカテクエート）または有機酸（例えば、クエン酸）からなる。
【０１０２】
本発明に従って使用する発酵培地は通常、他の増殖因子、例えばビタミンまたは増殖促進剤をも含み、この例にはビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテネート及びピリドキシンが含まれる。増殖因子及び塩はしばしば、培地の複合成分（例えば、酵母抽出物、モラセス、コーン・スティープ・リカー等）に由来している。加えて、培地に適当な前駆体を添加してもよい。培地中の化合物の正確な組成は、特定の実験に大きく依存し、それぞれの具体的なケースに対して個別に決定しなければならない。培地最適化に関する情報は、教書“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｐｕｂｌ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）発行，ｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）に記載されている。増殖培地は商業的な供給業者、例えばＳｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）等から入手可能である。
【０１０３】
培地のすべての成分は加熱（１．５バール及び１２１℃で２０分間）または滅菌濾過により滅菌する。成分を一緒に滅菌してもよく、所要により別々に滅菌してもよい。培地のすべての成分が増殖の開始時に存在していてもよく、または場合により連続的にまたはバッチ供給により添加してもよい。
【０１０４】
培養温度は通常１５〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃であり、実験中一定に保ってもまたは変化させてもよい。培地のｐＨ値は５〜８．５の範囲、好ましくは約７．０でなければならない。増殖のためにｐＨ値は増殖中塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を添加することにより制御し得る。発泡を抑えるために消泡剤（例えば、脂肪酸ポリグリコールエステル）を使用してもよい。プラスミドの安定性を維持するために選択作用を有する適当な物質、例えば抗生物質を培地に添加してもよい。好気性条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス化合物（例えば、大気）を培養物に供給する。培養物の温度は通常２０〜４５℃である。所望産物の形成が最大になるまで培養を継続する。これは通常１０〜１６０時間内で達成し得る。
【０１０５】
次いで、発酵ブロスを更に処理する。要件に応じて、バイオマスを発酵ブロスから分離技術（例えば、遠心分離、濾過、デカントまたは前記方法の組合せ）により完全または部分的に除去しても、または発酵ブロス中にまるごと残してもよい。
【０１０６】
ポリペプチドが培地中に分泌されないならば、細胞を破壊し、産物を、タンパク質を単離するための公知技術によりライセートから得ることができる。細胞は場合により高周波数超音波により、例えばフレンチ圧力セルにおいて高圧により、オスモリシスにより、界面活性剤、溶解酵素または有機溶媒を用いることにより、ホモジナイザーにより、またはここに列挙した方法の幾つかの組合せにより破壊し得る。
【０１０７】
ポリペプチドは公知のクロマトグラフィー方法（例えば、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲル濾過）、Ｑ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー）を用いて、他の一般的な方法（例えば、限外濾過、結晶化、塩析、透析及び未変性ゲル電気泳動）により精製し得る。適当な方法は、例えばＦ．Ｇ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，Ｖｅｒｌａｇ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋまたはＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０１０８】
組換えタンパク質を単離するためには、ｃＤＮＡを規定のヌクレオチド配列により伸長し、それによって改変ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、例えばより簡単な精製のために使用し得るベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得る。この種の適当な改変は、例えばアンカー（例えば、ヘキサ−ヒスチジンアンカーとして公知の改変）または（例えばＥ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）発行に記載されている）抗体により抗原として認識され得るエピトープとして機能する、いわゆる「タグ」である。前記アンカーは、例えばクロマトグラフカラムをパッキングするために固体支持体（例えば、ポリマーマトリックス）にタンパク質を付着させても、またはマイクロタイタープレートまたは幾つかの他の支持体上で使用してもよい。
【０１０９】
同時に、前記アンカーはタンパク質を認識するためにも使用し得る。タンパク質を認識するためには、通常のマーカー（例えば、基質と反応させた後検出可能な反応生成物を形成する蛍光色素及び酵素マーカー）または放射性マーカーを単独でまたはタンパク質の誘導化のためのアンカーと組み合わせて使用することも可能である。
【０１１０】
３．６  バークホルデリア・グルメを用いてリパーゼを産生するための本発明方法の実行
本質的には、リパーゼはバークホルデリア・グルメの発酵により産生される。生物を特定の産生培地において増殖させる。活性形態のバークホルデリア・グルメによりリパーゼを培地中に分泌させる。発酵の終了時に、細胞をデカント／遠心分離により培地から分離する。得られた残留物を乾燥し、リパーゼを乾燥調製物として得ることができる。リパーゼを適当なクロマトグラフィー方法により培地から超純粋な形態で得ることもできる。最後に、培地から固定化により適当な支持体上に直接吸着させることも可能である。タンパク質の専門家に周知の標準的な方法を、このために使用する。
【０１１１】
或いは、細胞外リパーゼの微生物産生及び単離はプロテアーゼに対するように実施する（上記参照）。
【０１１２】
本発明において、より容易に入手可能なリパーゼは、例えばファインケミカルの製造のために使用し得る。特に、前記リパーゼを、ラセミ化合物を分解することにより光学的に活性な化合物を得るために使用する。しかしながら、エナンチオ選択的合成用触媒としての使用も考えられる。最後に、前記酵素はその立体選択性だけでなく位置選択性のための用途を有し得る。考えられる使用分野には、エステル結合を位置選択的に分割または結合させるポリマーまたは低分子量化合物の修飾が含まれる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ役立つ。当業者に自明の多数の可能な変更も本発明の範囲内に入る。
【０１１４】
本発明の範囲内で実施されるクローニングステップ、例えば制限酵素による切断、アガロースゲルにおける電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、核酸のニトロセルロース及びナイロンメンブレンへのトランスファー、ＤＮＡ断片の結合、大腸菌細胞の形質転換、細菌の増殖、ファージの複製及び組換えＤＮＡの配列決定は上掲したＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているように実施した。
【０１１５】
１．  実験の説明
ａ）細菌株及び増殖条件
大腸菌ＤＨ５αを常用のクローニング実験のために使用した。この株をルリア・ベルターニ培地（ＬＢ）において３７℃で培養した（ＬＢ培地（ｐＨ７．０）：１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１０ｇ／ｌのバクトトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら［１７］）。プラスミドの保存のためにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）またはクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を使用した。（オランダ国ユトレヒト大学のＪａｎ  Ｔｏｍｍａｓｓｅｎ氏から入手した）野生株バークホルデリア・グルメＰＧ１及び産生株バークホルデリア・グルメＬＵ８０９３を発現研究のために使用した。
【０１１６】
上記株を、１リッターあたり６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、３．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．０２ｇのＣａＣｌ２、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び２ｇの酵母抽出物を含有するｐＨ６．５のＰＧ培地［６］において３０℃で培養した。リバーゼ産生を誘導するために、１％（ｖ／ｖ）オリーブ油（Ｓｉｇｍａ）を添加し、発現プラスミドを保存するために培地にクロラムフェニコール（２００μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１１７】
ｂ）本発明のプラスミド及びコスミド構築物の作製
ＤＮＡ操作の一般的方法をＳａｍｂｒｏｏｋら［１７］に従って、またはＤＮＡ修飾酵素に対する製造業者の指示に従って実施した。
【０１１８】
バークホルデリア・グルメＰＧ１のゲノムライブラリーの構築は本質的にＳｔａｓｋａｗｉｃｚら［２０］に記載されているように実施した。一晩培養した培養物からゲノムＤＮＡを単離した後、ＤＮＡをＳａｕ３Ａを用いて部分的に加水分解した。ＤＮＡ断片を標準化トリスアセテート−ＥＤＴＡバッファー中で０．５％アガロースゲルを用いる電気泳動により分離し、１５ｋｂより大きい断片を切断し、精製した。コスミドｐＬＡＦＲ３（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら［２０］）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩを用いる２つの異なる反応で加水分解した後、脱リン酸化した。第２ステップにおいて、２つの制限チャージをＢａｍＨＩを用いて消化して、Ｓａｕ３Ａ適合末端を得た。ゲノムＤＮＡ及びｐＬＡＦＲ３の２つのＤＮＡ断片のライゲーションを、Ｔ４  ＤＮＡ−リガーゼを用いて１６℃で一晩実施した。最後に、コスミドをインビトロでパッケージし、大腸菌ＪＭ１０１に導入した。コスミドｐＬＡＦＲ３はブルー／ホワイトによるスクリーニングが可能であるため、陽性クローンをテトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ，最終濃度２５０μｇ／ｍｌ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４０−Ｇａｌ，最終濃度４０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレートにおいて同定し得る。いずれにおいても、９３００クローンを選択し、マイクロタイタープレートに移すと、バークホルデリア・グルメＰＧ１ゲノムの４倍被覆度が生じた。
【０１１９】
こうして得たコスミドｐＬＡＦＲＰＧ５及びｐＬＡＦＲＰＧ８のＤＮＡ断片は、バークホルデリア・グルメにおけるリパーゼ産生に影響を及ぼした。後者を、そのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢＢＲ１ｍｃｓ（Ｍ．Ｅ．Ｋｏｖａｃｈら［３０］）に挿入することによりサブクローニングした。こうすると、プラスミドｐＢＢＲＰＧ  ５／１、５／３、５／７、８／１＋８／３が得られ、これらをＤＮＡ配列決定に供した。
【０１２０】
本発明のプロテアーゼの１７９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片を、鋳型としてバークホルデリア・グルメＰＧ１由来のゲノムＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。ＢａｍＨＩ認識配列を有する増幅ＤＮＡの５’末端に相当するオリゴヌクレオチドプライマーＰｒｏｕｐ（ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡ）（配列番号８）を用意し、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を有する第２プライマーＰｒｏｄｏｗｎ（ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣ）（配列番号９）を用意した。５４０ｂｐのサイズを有する増幅ＤＮＡ断片を、ｐＢＢＲ１ｍｃｓのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、その発現はｌａｃプロモーターの制御下にあった。得られたプラスミドをｐＢＢＲｐｒｏ（図２Ｂ参照）と称するが、このプラスミドを接合によりバークホルデリア・グルメにトランスファーした。大腸菌での過剰発現のために、ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ認識配列を有するプライマーＰｒｏｕｐＮ（ＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣ）（配列番号１０）及びＸｈｏＩ認識配列を有するＰｒｏｄｏｗｎＸ（ＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣ）（配列番号１１）を用いて再増幅した。次いで、ＤＮＡ断片をｐＥＴ２２ｂ（米国ウィスコンシン州マディソンに所在のＮｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，（１９９７））のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ位置にクローニングした。従って、この断片は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、ニッケル−ニトリロトリ酢酸金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能とするＣ末端６ｘＨｉｓ−タグを有していた。得られたプラスミドをｐＥＴｐｒｏ（図２Ａ参照）と称し、このプラスミドを大腸菌での形質転換によりトランスファーした。
【０１２１】
ｃ）コスミドまたはプラスミドのバークホルデリア・グルメにおける接合性トランスファー
コスミドの接合性トランスファーはドナーとして大腸菌ＪＭ１０１、ヘルパー株として大腸菌ｐＲＫ２０１３［６］を用いて生起した。広い宿主特異性を有するプラスミドｐＢＢＲ１ｍｃｓ及びｐＢＢＲｐｒｏ（切断部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを介するプロ遺伝子のクローニングインによりｐＢＢＲ１ｍｃｓから作成）を用いる接合性トランスファーは、ドナー株として大腸菌Ｓ１７−１［１９］を用いて実施した。レシピエント（バークホルデリア・グルメＰＧ１またはＬＵ８０９３）を一晩培養した培養物並びにドナー及びヘルパー株の対数培養物を遠心分離し、洗浄し、０．９％ＮａＣｌ中に再懸濁した。各培養物の１ｍｌ画分を合わせ、遠心分離し、５０μｌの０．９％ＮａＣｌ中に再懸濁した。混合物をＬＢ寒天プレートに滴下し、乾燥した。プレートを３０℃で一晩インキュベートした。翌日、スポットを０．９％ＮａＣｌ中に再懸濁し、コスミドスクリーニングのためにはテトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１００μｍ／ｍｌ）を含有する選択ＰＧ培地、広い宿主特異性を有するベクターを選択するためにはクロラムフェニコール（２００μｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する選択ＰＧ培地に播種した。
【０１２２】
ｄ）同種宿主バークホルデリア・グルメにおける発現研究及び異種宿主大腸菌における組換えタンパク質の過剰発現
ｐＢＢＲｐｒｏのバークホルデリア・グルメ株ＰＧ１及びＬｕ８０９３における発現はＰＧ培地＋１％オリーブ油を用いて２４時間実施した。対照として空ベクターｐＢＢＲ１ｍｃｓを発現させた。２４時間後、サンプルを採取し、遠心分離し、０．９％ＮａＣｌで２回洗浄した。ペレットの適当な希釈物を光学密度（ＯＤ５８０）を測定するために使用し、上清をリパーゼ活性を測定するために使用した。
【０１２３】
本発明のプロテアーゼの過剰発現は、Ｔ７発現宿主大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３を用いて大腸菌において実施した。この株を過剰発現ベクターｐＥＴｐｒｏを保存するために１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地において増殖した。ベクターｐＥＴｐｒｏの大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３での形質転換は、形質転換コンピテント細胞のバッチにＴＭＦバッファー５０μｌ中１μｌのベクターを添加し、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で９０秒間熱ショックし、７００μｌのＬＢ培地を添加し、充填物を３７℃で３０分間インキュベートすることによる熱ショック（Ｈａｎａｈａｎ，１９８３［３２］のＲｂＣｌ２方法に従う）により実施する。次いで、充填物を選択寒天プレート（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天）上に播種した。
【０１２４】
３７℃で２時間インキュベートした後、ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度で添加することによりＴ７プロモーターによる発現を誘導した。２、４及び６時間後に培養物のサンプルを採取し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【０１２５】
ｅ）細胞抽出物の産生
細胞を０．１５の光学密度に調節し、１５μｌのＳＤＳバッファー中に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートした。
【０１２６】
ｆ）ＴＣＡ沈降
１／１０量の１％ドデシル硫酸ナトリウムを上清に添加し、室温で１０分間インキュベートした。１／１０量の７０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いてタンパク質を沈降し、氷上で１時間インキュベートした。１０分間遠心分離（１３０００ｒｅｖ／分，室温）した後、サンプルを氷冷８０％アセトンで２回洗浄し、真空乾燥機において乾燥した。最後に、タンパク質を１５μｌのＳＤＳバッファー中に再懸濁し、９５℃で５分間インキュベートした。
【０１２７】
ｇ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＬａｅｍｍｌｉ［１３］に従って１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。
【０１２８】
ｈ）未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動は製造業者のプロトコルに従って４→１２％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＧ２５０で染色した。
【０１２９】
ｉ）本発明のプロテアーゼの精製
本発明のプロテアーゼはニッケル−ニトリロトリ酢酸金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。このために、５８０ｎｍでの光学密度が５．０となるまで６Ｌの大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴｐｒｏの液体培養物を３７℃で増殖した。次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより細胞を誘導し、３７℃で更に４時間増殖させた。細胞を遠心分離（５０００ｒｅｖ／分，１５分間，４℃）により収集した後、ペレットを２５ｍｌの氷冷バッファー（５０ｍＭ  Ｋｐｉ，１０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８．０）中に再懸濁した。リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ，氷上３０分間）とインキュベートした後、ソニケーション（１０×３０秒間）により細胞を破壊した。細胞断片を除去するために、サンプルを再び遠心分離（１４０００ｒｅｖ／分，２０分間，４℃）し、濾過した。透明なライセートをニッケル−ニトリロトリ酢酸カラムにアプライし、リン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  Ｋｐｉ，２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ８．０）で洗浄した。組換えタンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で溶離した後、対応する画分を合わせ、セファデックスＧ２５カラムを用いて脱塩した。各精製ステップについて５０μｌの容量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びタンパク質分解酵素活性の測定のために取り置いた。次いで、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ［４］を用い、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて測定した。
【０１３０】
ｊ）酵素活性アッセイ
脂肪分解活性は、トリブチリンエマルジョン（７．５ｍｌのトリブチリン，０．７５ｇのアラビアゴム、蒸留水で１５ｍｌとする）を含むインジケータープレートにおいて測定するか、またはＳｔｕｅｒら［２１］に記載されているように基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を用いて分光光度的に測定した。
【０１３１】
ｐＮＰＰ：最終濃度０．８ｍＭ。
【０１３２】
ゼーレンセンリン酸バッファー：
溶液Ａ：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ
溶液Ｂ：５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４。
【０１３３】
溶液Ａ及びＢを１７：１の比率で混合する。
【０１３４】
基質エマルジョン：
溶液Ｉ：２０７ｍｇのデオキシコール酸ナトリウム、１００ｍｇのアラビアガム、９０ｍｌのゼーレンセンリン酸バッファー
溶液ＩＩ：３０ｍｇのｐ−ニトロフェニルパルミテート、１０ｍｌのイソプロパノール。
【０１３５】
基質エマルジョンは、各活性測定の前に新しく調製し、１時間以内に使用する。酵素試験は３７℃の一定温度で実施する。１０〜５０μｌの上清を２ｍｌの予め加熱した基質エマルジョンに添加し、ＯＤ４１０の変化（ΔＯＤ４１０）を５分間にわたり測定する。相対的な脂肪分解活性を培養物のＯＤ５８０とΔＯＤ４１０／分の相関から求める。
【０１３６】
タンパク質分解活性は、１リッターあたり３０ｇの脱脂粉乳、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのトリプトン、１５ｇの寒天及び１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する脱脂乳寒天プレートを用いて測定した。発現培養物の各コロニーまたは５μｌの各精製ステップを寒天プレートに播種し、３０℃（バークホルデリア・グルメ）または３７℃（大腸菌）で一晩インキュベートした。タンパク質分解活性はコロニーまたはサンプルの周囲のハロー形成により検出し得る。
【０１３７】
ｋ）コンピューターによる分析
配列アラインメント、ＯＲＦ及びデータベース検索は国立バイオテクノロジー情報センターの標準ソフトウェア、すなわちＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［１，２］、Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ−Ｆｉｎｄｅｒ（ＯＲＦ−Ｆｉｎｄｅｒ）、またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌバージョン２．０（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２，ｄｂ  Ｃｌｕｓｔａｌ）［１，２１０］を用いて実施した。タンパク質の可能な位置確認の予測及びコンピューター分析は予測プログラム、すなわちＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＥｘＰＡＳＹ）のＰｒｏｔＰａｒａｍツール［９］、ＰＳＯＲＴ−Ｂ［８］、ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒ［１４］、及びＰｏｌｅ  ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃ，Ｌｙｏｎｓ，Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＢＩＬ，ＮＰＳ，フランス）のヘリックス−ターン−ヘリックス予測サーバー［５］を用いて実施した。
【０１３８】
２．試験結果
ａ）バークホルデリア・グルメのリパーゼ産生における障害の同定
バークホルデリア・グルメＰＧ１のゲノムライブラリーを広い宿主特異性を有するコスミドｐＬＡＦＲ３［１９］を用いて上記したように構築した。バークホルデリア・グルメにおいてＰＧ１及び  ＬＵ８０９３を接合した後、コスミドデータベースをリパーゼインジケータープレート及びリパーゼ活性アッセイ［２１］を用いてスクリーニングした。
【０１３９】
約２５００個のクローンのライブラリー中、リパーゼ産生に影響を及ぼす１５個のコスミドを同定した。これらのコスミドの２つからの対応ＤＮＡ断片を、ｐＢＢＲ１ｍｃｓにおいてサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により同定した。バークホルデリア・グルメでの別の発現研究により、最後に細胞外リパーゼ活性を２０〜３０％上昇させるプラスミドを得た（図３参照）。
【０１４０】
ｂ）ＴｈｉＪ／ＰｆｐＩタンパク質の発現によって、バークホルデリア・グルメでのリパーゼ活性が上昇する
プラスミドｐＢＢＲＰＧ  ８／１（図３）の制限酵素による分析及びインサートのＤＮＡ配列決定は約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を示した（図４のレーン４参照）。
【０１４１】
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のオープンリーディングフレーム検索プログラム（ＯＲＦ−Ｆｉｎｄｅｒ）を用いて、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検出し、その最大（５４０ｂｐ）はＴｈｉｉＪ／Ｐｆｐｌファミリーのタンパク質の特徴である保存ドメインを有するタンパク質をコードする。他の２つのＯＲＦは４４４ｂｐまたは３４８ｂｐからなり、データベースの他の注釈付きタンパク質との有意な類似性を示さなかった。
【０１４２】
アミノ酸配列とデータベース中の他のタンパク質をＥＭＢＬ−ＥＢＩのＷＵ−Ｂｌａｓｔ２プログラムを用いて比較すると、幾つかの例で、特に推定細胞内プロテアーゼ及びストレスタンパク質に対して有意な類似性を示した（図１参照）。例えば、アミノ酸配列の６９％が大腸菌由来の細胞内プロテアーゼＹＨＢＯ［１５］と類似している。バシラス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）由来の通常ストレスタンパク質ＹＦＫＭ［２２］との類似性は４９％であり、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のプロテアーゼＩ［１１］との類似性は４４％であり、好熱性細菌ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びピロコッカス・ホリコシ（Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）のプロテアーゼＰｆｐＩ及びプロテアーゼＰＨ１７０４［２５］とは４４％一致した。ＤＪ−Ｉ／ＴｈｉＪ／ＰｆｐＩスーパーファミリー内の進化的及び機能的関連について最近発表された論文から、このスーパーファミリーはプロテアーゼ、転写調節因子、シグマ−交差反応タンパク質、カタラーゼ等のような各種機能を有するタンパク質を含むことが判明している［３］。
【０１４３】
遺伝性パーキンソン病に関与するヒトＤＪ−１タンパク質及び植物由来のＴｈｉＪまたはプロテアーゼ関連タンパク質に加えて、ＤＪ−１／ＴｈｉＪ様ドメインを有する細菌性タンパク質も多数あり、その例はカタラーゼドメイン及びＤＪ−１／ＴｈｉＪドメインを含む大サブユニット−カタラーゼまたはＡｒａＣタイプの転写調節因子である。後者はタンパク質のＣ末端部分中に１つ以上のヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフが存在することから同定し得る。ＨＴＨモチーフはおそらくＤＮＡ結合を媒介し、ＴｈｉＪ様ドメインはアミダーゼである［３］。隣接ファミリーと区別されるシグマ交差反応性タンパク質のファミリーにより著しく保存された組成（９１．４％同一性）が示される。これらのタンパク質は明確なＥｌｂＢドメイン（ＥｌｂＢ＝大腸菌由来のエンハンシングリコペン生合成タンパク質２）を有し、ＴｈｉＪタンパク質と比較的中程度の相同性を示す。最後に、アミノ酸配列レベルで高い類似性を有する２つのグループがあり、これには上記アラインメント（図１）を有するタンパク質が含まれる。第１のグループはＰｆｐＩプロテアーゼからなり、好熱性細菌ピロコッカス・フリオサスまたはピロコッカス・ホリコシ由来の２つのプロテアーゼＰｆＰＩ及びＰＨ１７０４を含む。これらのプロテアーゼは六量体環構造を形成し、オリゴマー形態でのみであるがＡＴＰ非依存性プロテアーゼ活性を示す。ヒスチジン残基に隣接するシステイン残基（１００）の存在により、これらのタンパク質はシステインプロテアーゼとして分類される。ＰＨ１７０４の結晶構造では、対応のＣｙｓ１００残基が求核性エルボーモチーフ中に配置されており、Ｈｉｓ１０１と一緒にモノマーの３つの対間のインターフェースで触媒トライアドの一部を形成している［２３］。非プロテアーゼメンバーではＣｙｓ／Ｘによる置換が見られるのに対して、公知のプロテアーゼはすべて隣接Ｃｙｓ／Ｈｉｓ残基を有しているので、隣接グループの多くのタンパク質、すなわちＴｈｉＪ／ＰｆｐＩ様タンパク質の多くのタンパク質はそれらの多くが同一位置にＣｙｓ／Ｈｉｓ対を有しているようにプロテアーゼ活性を示す確率は高い。更に、コンセンサス配列、すなわちＡＩＣＨＧＰ（配列番号７）をＣｙｓ／Ｈｉｓ対の周囲で同定した。このグループに属するタンパク質には、例えば大腸菌由来の細胞内プロテアーゼＹｈｂＯ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のストレスタンパク質ＧＳＰ１８、大腸菌由来のシャペロンＨｓｐ３１及び酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の細胞内プロテアーゼＹＤＲ５３３Ｃが含まれる［３］。
【０１４４】
本発明のプロテアーゼを上記したクラスターの１つに分類するために、コンピューターを利用した調査を、ＥｘＰＡＳｙウェブサイトを用いて実施した。約１９．６ｋＤａの分子量及び５．４５の理論的ｐＩ（ＰｒｏｔＰａｒａｍ  Ｔｏｏｌ［９］）を測定した。ＳｉｇｎａｌＰ  ３．０予測プログラム［１４］によれば、前記アミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列を含んでいない。これは細胞質局在化を暗示し、このことを細菌性タンパク質の細胞内局在についての予測プログラム（ＰＳＯＲＴ−Ｂ［８］）によって確認した。ＨＴＨ予測プログラム（Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ［５］）を用いる更なる構造比較から、本発明のプロテアーゼはＨＴＨ−ＤＮＡ−結合ドメインを有していないことが判明した。従って、このタンパク質は転写調節因子でないようである。
【０１４５】
アミノ酸配列レベルで大腸菌由来の細胞内プロテアーゼＹｈｂＯとの高い類似性に基づいて、本発明のバークホルデリア・グルメ由来のプロテアーゼはＹｈｂＯに対して高い類似性を有し、ＴｈｉＪ／ＰｆｐＩ様タンパク質のファミリーに属する可能性がより高い。アラインメント（図１）から分かるように、ＹｈｂＯ及びこのグループの他のタンパク質において同定され得る保存されたアミノ酸残基のすべてが本発明のプロテアーゼ中にも存在している。ＹｈｂＯの結晶構造についても調べ、タンパク質がホモダイマー［２５］を形成することが判明した。未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いると、大腸菌において融合タンパク質として発現する本発明のプロテアーゼのサブユニットがマルチマー構造を形成することが判明した（データ示さず）。
【０１４６】
ｃ）本発明のプロテアーゼのバークホルデリア・グルメにおける発現
ＤＮＡ配列の分析によって、バークホルデリア・グルメＰＧ１のゲノムから直接本発明のプロテアーゼの遺伝子を増幅するための２つのプライマーを得た。得られたＰＣＲ産物を制限酵素部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて広い宿主特異性を有するｐＢＢＲ１ｍｃｓベクターに挿入した。構築物をｐＢＢＲｐｒｏと称するが、この構築物をドナー株として大腸菌Ｓ１７−１、レシピエントとしてバークホルデリア・グルメＰＧ１またはＬＵ８０９３を用いてトランスファーした。全部で４つの異なる発現研究を上記したように実施した。
【０１４７】
野生株バークホルデリア・グルメＰＧ１ではプラスミドｐＢＢＲｐｒｏを追加発現することによって、リパーゼ活性が２〜３倍上昇するのに対して、産生株ＬＵ８０９３では０．３倍の上昇しか観察されなかった（図５ａ及びｂ参照）。こうした差が生じた原因は、産生株が既に野生株に比して約１０倍多い量のリパーゼを産生しており、そのためにプラスミドを発現させても野生株で観察されるのと同程度しかリパーゼを産生し得ないからである。
【０１４８】
発現培養物由来のコロニーを脱脂乳寒天プレートにおいて増殖させる場合、ハロー形成に差は認められない（データ示さず）。本発明のプロテアーゼはおそらく細胞質に局在化しており、ベクターｐＢＢＲ１ｍｃｓは比較的少ないコピー数しか有していないので、インジケータープレート上の簡単なプレート培養はおそらくタンパク質分解活性の検出にとって十分でない。
【０１４９】
ｄ）本発明のプロテアーゼの大腸菌における過剰発現
本発明のプロテアーゼを過剰発現するために、遺伝子をプロモーターＴ７の制御下でベクターｐＥＴ２２ｂにクローニングし、得られた構築物を用いて、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３を形質転換した。予備的な過剰発現研究を、２５ｍｌの培養物を用いて小規模にて、上記したように実施し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図６参照）。誘導から２〜６時間後タンパク質の良好な過剰発現を検出した。使用したタンパク質標準に基づいて、本発明のプロテアーゼは約２１ｋＤａの分子量を有しており、算出した分子量である約１９．６ｋＤより僅かに大きい。発現培養物から得たコロニーを脱脂乳寒天プレートで増殖した場合、ハロー形成に差は観察されない（データ示さず）。本発明のプロテアーゼの過剰発現により封入体が形成されないことが判明したので、タンパク質は大腸菌での発現に対して不活性であるかまたは脱脂乳が適当な基質でないと推定される。
【０１５０】
ｅ）本発明のプロテアーゼの精製
過剰発現したタンパク質をニッケル−ニトリロ酢酸金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴｐｒｏの６リットル培養物を光学密度ＯＤ５８０が０．６になるまで３７℃で一晩増殖し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによりタンパク質の過剰発現を誘導した。４時間後、細胞を回収し、２５ｍｌの氷冷バッファー（５０ｍＭ  Ｋｐｉ，１０ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ８．０）中に再懸濁した。リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ，氷上３０分間）とインキュベートした後、ソニケーション（１０×３０秒間）より細胞を破壊した。サンプルを遠心し（１４０００ｒｅｖ／分，２０分間，４℃）、濾過して、細胞断片を除去した。次いで、透明なライセートをニッケル−アセトニトリルカラムにアプライし、リン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ  Ｋｐｉ，１０ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ８．０）で洗浄した。組換えタンパク質を２５０ｍＭ  イミダゾールを含有する５０ｍＭ  Ｋｐｉバッファー（ｐＨ８．０）で溶出した後、対応する画分を合わせ、セファデックスＧ２５カラムを用いて脱塩した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図７）のために各精製ステップにつき５０μｌの容量を採取した。溶出液を脱塩した後の精製タンパク質の全容量は９０ｍｌであった。標準物質としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォードアッセイを実施した後、サンプル中のタンパク質濃度は３ｍｇ／ｍｌと測定され、これは２７０ｍｇというタンパク質の全収量に相当した。この精製タンパク質を更に酵素活性試験に供することができる。
【０１５１】
ｆ）マイクロタイタープレート試験でのプロテアーゼ活性の測定
精製タンパク質のプロテアーゼ活性を酵素プレート試験（Ｔａｘａｐｒｏｆｉｌｅ  Ｅ，ボルンハイム−ハーゼルに所在のＭｅｒｌｉｎ）で試験した。本試験で、調べようとするタンパク質を９５アミノペプチダーゼ及びプロテアーゼ、７６グリコシダーゼ、ホスファターゼ及びエステラーゼに対する基質中、ｐＨ８．２、ｐＨ７．５，ｐＨ５．５及びｐＨ４．０での１７個の古典的反応において試験した。使用した方法はＭｅｒｌｉｎ社から供給されたものであった。精製タンパク質に対して使用したバッファー（１０ｍＭ  Ｋｐｉバッファー，ｐＨ６．５）は対照として使用した。プレートを３０℃で２４時間インキュベートした後、視覚的評価を実施した。本試験を全部で３回実施し、以下の基質を用いて明白に陽性な反応物を見つけた。
【０１５２】
４つのアミノペプチダーゼ基質：リシン−β−Ｎａ、アルギニン−β−Ｎａ、Ｌ−アラニン−β−Ｎａ、グルタメート（βＮａ）−ＯＨ。
【０１５３】
２つのグリコシダーゼ基質：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド。
【０１５４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】バークホルデリア・グルメ由来のプロテアーゼをコードするＯＲＦとデータベースからのタンパク質のマルチプル配列アラインメントを示す。まず、プロテアーゼのアミノ酸配列をＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを含むＥＢＬ−ＥＭＢＩのＷＵ−ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いて配列類似性検索にかけた。次いで、プロテアーゼに対して高い類似性を有するタンパク質をＥＢＬ−ＥＭＢＩのＤｂ−Ｃｌｕｓｔａｌを用いるマルチプル配列アラインメントを構築するために選択した。アラインメントのすべての配列において同一である列内の残基に星印を付した。コロンは保存的置換を表す。半同類置換には一点を付す。本発明のプロテアーゼは第１行に示す。その次の行は、Ｑ８ＸＡ９９：大腸菌由来の仮定タンパク質ｙｈｂＯ、Ｑ７ＣＰＱ５：ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来の推定細胞内プロテイナーゼＸＨＢＯ、Ｑ８ＸＨ０７：サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来の仮定タンパク質ＳＴＹ３４５２、Ｑ５ＷＥＲ６：バシラス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）由来の通常ストレスタンパク質ＧＳＰ１８、Ｑ６５ＭＧ４：バシラス・リケンフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｆｏｒｍｉｓ）由来のＹｆｋＭ、Ｑ９Ｋ８Ｉ１：バシラス・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）ＢＨ３０２５由来の通常ストレスタンパク質、Ｑ３７０ＣＸ９：バシラス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）（株ＡＴＣＣ  １０９８７）ＢＣＥ０９３５由来のＴｈｉＪ／ＰｆｐＩ−ファミリータンパク質、Ｑ６５ＦＧ２：バシラス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）由来のプロテアーゼＩ，ＴｈｉＪ／ＰｆｐＩ−ファミリータンパク質、ＰＦＩ＿ＰＹＲＨＯ：ピロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＯＴ３由来のプロテアーゼＩ、ＰＦＰＩ＿ＰＹＲＦＵ：ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のプロテアーゼＩを示す。
【図２Ａ】本発明において使用されるプラスミド構築物のプラスミドのタイプを示す。プラスミドｐＩＴｐｒｏである。
【図２Ｂ】本発明において使用されるプラスミド構築物のプラスミドのタイプを示す。プラスミドｐＢＢＲｐｒｏである。
【図３】バークホルデリア・グルメＰＧ１由来のサブクローン化ＤＮＡを含む各種プラスミドの発現時に観察された相対脂肪分解活性を示す。エラーバーは４つの別々の実験の標準偏差を示す。リパーゼ活性は、基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテートを用いて分光光度的に測定し、野生株［２１］に対する相対脂肪分解活性として示す。空発現ベクターｐＢＢＲ１ｍｃｓを対照として使用した。本発明のプロテアーゼに対する遺伝子を含んでいたプラスミドｐＢＢＲＰＧ８／１を発現させることによって、リパーゼ活性が２０〜３０％ほど上昇した。
【図４】プラスミドｐＢＢＲＰＰＧ  ５／１、５／３、５／７、８／１及び８／３の制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｃＩＩを用いた、制限酵素による分析。１μｇのＤＮＡを単離し、０．８％アガロースゲルにかけた。ＤＮＡマーカーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【図５】推定プロテアーゼのバークホルデリア・グルメＰＧ１（ａ）及びＬＵ８０９３（ｂ）における相同発現を示す。発現をリパーゼ産生の誘導物質として１％オリーブ油を含むＰＧ培地を用いて４つの別々の実験で実施した。２４時間後、培養物を回収し、ＯＤ５８０を測定した。細胞外リパーゼ活性を（Ｗｉｎｋｌｅｒら，１９７８［３１］に従って）基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテートを用いて分光光度的に測定した。相対脂肪分解活性をΔ４１０／分をＯＤ５８０と相関させることにより計算した。対照として、前記株を空ベクターｐＢＢＲ１ｍｃｓを用いて形質転換し、同時に試験した。
【図６】本発明のプロテアーゼの大腸菌ＢＬ１２ＤＥ３における過剰発現を示す。サンプルを０、２及び４時間後（Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４）に採取し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画化した。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色した。レーン１：タンパク質標準物質Ｍ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２：Ｔ０  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴ２２ｂ、３：Ｔ０  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴｐｒｏ、４：Ｔ２  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴ２２ｂ、５：Ｔ０  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴｐｒｏ、６：Ｔ４  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴ２２ｂ、７：Ｔ４  ＢＬ２１ＤＥ３  ｐＥＴｐｒｏ。
【図７】各精製ステップについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：タンパク質標準物質ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２：１０μｌの細胞ライセート（１：５）、３：１０μｌのパーコレーション、４：１０μｌの洗浄画分、５：１０μｌの溶出液（１：１３）。
【図１】
2008543294.tif 000002
【図２Ａ】
2008543294.tif 000003
【図２Ｂ】
2008543294.tif 000004
【図３】
2008543294.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2008543294.tif 000008
【図７】
2008543294.tif 000009
【配列表】
2008543294000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月30日(2007.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項２】
変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約２０〜２２ｋＤａであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
５．４〜５．５の範囲のｐＩ値を有し、および／またはプロテアーゼ活性を有する、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の細菌から得られ得る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｌｕｍａｅ）から得られ得る、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
細胞外リパーゼ産生細菌宿主において発現後、標準条件下で測定した細胞外脂肪分解活性を上昇させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
宿主がバークホルデリア・グルメである、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
細胞外脂肪分解活性が基準値に比して少なくとも約５％上昇している、請求項６または７に記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号１または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む核酸によりコードされる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸配列。
【請求項１１】
プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする請求項１０に記載の核酸配列を、少なくとも１つの調節核酸配列の遺伝的制御下に含む発現構築物。
【請求項１２】
少なくとも１つの請求項１１に記載の発現構築物で遺伝的に改変されている組換え微生物。
【請求項１３】
組換え微生物をタンパク質を発現する条件で培養し、形成するタンパク質を単離する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロテアーゼ活性を有するタンパク質の産生方法。
【請求項１４】
リパーゼを産生し得る宿主により請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロテアーゼ活性を有する機能性タンパク質を発現させ、同時または異なる時にリパーゼを発現させ、形成するリパーゼを単離する、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）の産生方法。
【請求項１５】
宿主がバークホルデリア属の細菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リパーゼが配列番号６のアミノ酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
リパーゼが配列番号５の配列を含む核酸配列または前記配列から誘導される少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列によりコードされる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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