(57)【要約】  本発明は、哺乳類の炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬剤としての式（Ｉ）の化合物の使用に関し、式中、点線（ｃｌｏｔｔｅｄ  ｌｉｎｅ）は任意の結合であり、Ｒ１は、Ｒ２がヒドロキシルの場合にはブチルまたはブチリルであるが、Ｒ２が水素の場合にはブチルであり、あるいはＲ１およびＲ２は一緒に１−ブチリデンであり、任意で、ヒドロキシル、メチル、または３−（α，β−ジメチルアクリリルオキシ）−ペンチリデニルにより置換される。Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５からなる群から選択される残基であり、式（Ｉ）中の点線が不在であればＸはＸ２、Ｘ３またはＸ５であり、点線が上記式（Ｉ）中の結合を表す場合にはＸはＸ１、Ｘ４またはＸ５であり、Ｒ３はヒドロキシルまたはブチリルであり、ｎは１または２である。もう１つの態様では、本発明は、炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬物／組成物の製造における活性成分としての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。上記で定義したような式（Ｉ）の化合物は、痛み、発熱および損傷、特にスポーツ損傷への対応のため（の組成物の製造のため）にも有用であり得る。さらに、上記で定義したような式（Ｉ）の化合物は、関節軟骨の維持および再生のため（の組成物の製造のため）にも有用であり得る。2008542226.tif 000019【選択図】なし
2008542226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬剤としての、式（Ｉ）
【化１】
2008542226.tif 000017
（式中、点線は任意の結合であり、
Ｒ１は、Ｒ２がヒドロキシルの場合にはブチルまたはブチリルであるが、Ｒ２が水素の場合にはブチルであり、あるいはＲ１およびＲ２は一緒に１−ブチリデンであり、任意で、ヒドロキシル、メチル、または３−（α，β−ジメチルアクリリルオキシ）−ペンチリデニルにより置換され、
Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５
【化２】
2008542226.tif 000018
からなる群から選択される残基であり、式（Ｉ）中の点線が不在であればＸはＸ２、Ｘ３またはＸ５であり、点線が上記式（Ｉ）中の結合を表す場合にはＸはＸ１、Ｘ４またはＸ５であり、
Ｒ３はヒドロキシルまたはブチリルであり、そして
ｎは１または２である）によって表される化合物の使用。
【請求項２】
前記式（Ｉ）の化合物が、（Ｅ）−センキュノリドＥ、センキュノリドＣ、センキュノリドＢ、３−ブチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−３，６，７−トリヒドロキシ−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、３−ブチル−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、３−ブチルフタリド、３−ブチリデンフタリド、チュアンキシノール（ｃｈｕａｎｇｘｉｎｏｌ）、リグスチリジオール、センキュノリドＦ、３−ヒドロキシ−センキュノリドＡ、アンゲロイルセンキュノリドＦ、センキュノリドＭ、３−ヒドロキシ−８−オキソ−センキュノリドＡ、リグスチリド、６，７−ジヒドロ−（６Ｓ，７Ｒ）−ジヒドロキシリグスチリド、３ａ，４−ジヒドロ−３−（３−メチルブチリデン）−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、セダノリド、およびクニジリドからなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が、（Ｅ）−センキュノリドＥ、センキュノリドＣ、リグスチリド、セダノリドおよび３−ブチリデンフタリドからなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物がリグスチリドである請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物が、精製植物抽出物の形である請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記精製植物抽出物が、欧州特許出願第０５００２３３３．２号明細書に開示される方法によって得ることができるＬ．ワリチー（ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）からの抽出物である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
炎症の調節を必要とする前記状態が、関節リュウマチを含む関節炎、変形性関節症、痛風および強直性脊椎炎を含む変性関節疾患、腱炎（ｔｅｎｄｉｎｉｔｓ）、滑液包炎、骨粗鬆症などの骨障害、乾癬、湿疹、熱傷および皮膚炎などの皮膚関連状態、アレルギー、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎および呼吸窮迫症候群などの呼吸器疾患、全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、炎症性神経障害（ギラン・バレー、炎症性多発神経障害）、血管炎、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などの消化管炎症、癌、腫瘍成長および正常組織の癌性浸潤などの腫瘍学的疾患、アテローム硬化症などの炎症性要素を有するその他の慢性疾患、心疾患、パーキンソン病、運動緩徐、筋硬直、多発性硬化症、うつ病、記憶障害、アルツハイマー病およびその前段階（軽度認知機能障害、特に年齢に関連する記憶障害など）などの中枢神経系障害から選択される請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬物の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項９】
炎症の調節を必要とする前記状態が、請求項７に記載される状態である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の式（Ｉ）の化合物を含む、炎症の調節を必要とする状態の予防、制御および治療において使用するための医薬品または食品組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載される状態の予防、制御および治療において使用するための請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳類の炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための方法であって、前記治療を必要としている哺乳類に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の状態を予防、制御および治療するための請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の鎮痛薬としての使用。
【請求項１５】
痛み、発熱および損傷に対応するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１６】
痛み、発熱および損傷への対応のための組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１７】
前記損傷がスポーツ損傷である請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
哺乳類の痛み、発熱および損傷に対応するための方法であって、前記対応を必要としている哺乳類に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記損傷がスポーツ損傷である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の軟骨再生および維持剤としての使用。
【請求項２１】
関節軟骨を維持および再生するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２２】
関節軟骨の維持および再生のための組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２３】
哺乳類の（関節）軟骨を再生および／または維持するための方法であって、前記再生および／または維持を必要としている哺乳類に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の有効量の式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳類の炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬剤としての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。もう１つの態様では、本発明は、炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための薬物の製造における活性成分としての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０００２】
本発明によると、特定の化合物は、エイコサノイド（プロスタグランジン、ロイコトリエン）、サイトカイン、ケモカインおよび一酸化窒素などの炎症性メディエーターの生合成を調節することが分かった。そのため、このような化合物は、炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するために有用である。炎症を制御する能力は、健康のために不可欠である。炎症の制御の欠如、あるいは過度の制御されない炎症は多数の疾患をもたらし、その多くは一般的な疾患および状態である。
【０００３】
従って、１つの態様では、本発明は、炎症性障害の治療および予防のための、式（Ｉ）
【化１】
2008542226.tif 000003
で表される化合物の使用に関し、
式中、点線は任意の結合であり、
Ｒ１は、Ｒ２がヒドロキシルの場合にはブチルまたはブチリルであるが、Ｒ２が水素の場合にはブチルであり、あるいはＲ１およびＲ２は一緒に１−ブチリデンであり、任意で、ヒドロキシル、メチル、または３−（α，β−ジメチルアクリリルオキシ）−ペンチリデニルにより置換される。
Ｘは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５
【化２】
2008542226.tif 000004
からなる群から選択される残基であり、点線が不在であればＸはＸ２、Ｘ３またはＸ５であり、点線が結合を表す場合にはＸはＸ１、Ｘ４またはＸ５であり、
Ｒ３はヒドロキシルまたはブチリルであり、そして
ｎは１または２である。
【０００４】
もう１つの態様では、本発明は、炎症の調節を必要とする状態の予防、制御および治療のため、特に炎症性障害の治療および予防のための薬物の製造における、上記で定義したような式Ｉの化合物の使用に関する。
【０００５】
本発明において使用するための式（Ｉ）の好ましい化合物は、（Ｅ）−センキュノリドＥ、センキュノリドＣ、センキュノリドＢ、３−ブチル−４，５，６，７−テトラヒドロ−３，６，７−トリヒドロキシ−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、３−ブチル−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、３−ブチルフタリド、３−ブチリデンフタリド、チュアンキシノール（ｃｈｕａｎｇｘｉｎｏｌ）、リグスチリジオール（ｌｉｇｕｓｔｉｌｉｄｉｏｌ）、センキュノリドＦ、３−ヒドロキシ−センキュノリドＡ、アンゲロイルセンキュノリドＦ、センキュノリドＭ、３−ヒドロキシ−８−オキソ−センキュノリドＡ、リグスチリド、６，７−ジヒドロ−（６Ｓ，７Ｒ）−ジヒドロキシリグスチリド、３ａ，４−ジヒドロ−３−（３−メチルブチリデン）−１（３Ｈ）−イソベンゾフラノン、セダノリド、およびクニジリド（ｃｎｉｄｉｌｉｄｅ）からなる群から選択される。最も好ましく使用される化合物は、（Ｅ）−センキュノリドＥ、センキュノリドＣ、リグスチリド、セダノリド、および３−ブチリデンフタリド、特にリグスチリドからなる群から選択される。好ましい実施形態は、以下の表０に記載される。
【０００６】
【表１】
2008542226.tif 000005
【０００７】
【表２】
2008542226.tif 000006
【０００８】
【表３】
2008542226.tif 000007
【０００９】
【表４】
2008542226.tif 000008
【００１０】
本発明の特に好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物はリグスチリドである。「リグスチリド」という用語は、本発明との関連では、Ｚ−リグスチリドおよびＥ−リグスチリドならびにこれらの混合物、特に、混合物の総重量を基準として９０重量％以上のＺ−リグスチリドと、１０重量％以下のＥ−リグスチリドとの混合物を包含する。Ｚ−リグスチリドが特に好ましい。
【００１１】
本発明において使用するために、式（Ｉ）の化合物は、当該技術分野において既知の方法（例えば、ベック（Ｂｅｃｋ）Ｊ．Ｊ．およびステルミッツ（Ｓｔｅｒｍｉｔｚ）Ｆ．Ｒ．のＪ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第５８巻、第７号、１０４７−１０５５頁、１９９５年を参照）によって、アンジェリカ・グラウカ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｇｌａｕｃａ）、アンジェリカ・アクチロバ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ）、アンジェリカ・シネンシス（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アンジェリカエ・ダヒュリカエ（Ａｎｇｅｌｉｃａｅ  ｄａｈｕｒｉｃａｅ）、リグスチクム・アクチロブム（Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ａｃｕｔｉｌｏｂｕｍ）、リグスチクム・オフィシナレ（Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、リグスチクム・シネンセ（Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ｓｉｎｅｎｓｅ）、リグスチクム・ワリチー（Ｌｉｇｕｓｔｉｃｕｍ  ｗａｌｌｉｃｈｉｉ）、クニジウム・オフィシナレ（Ｃｎｉｄｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、リゾーマ・チュアンクション（Ｒｈｉｚｏｍａ  Ｃｈｕａｎｘｉｏｎｇ）、プレウロスペルマム・ホオケリ（Ｐｌｅｕｒｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｈｏｏｋｅｒｉ）、トラチスペルマム・ロクスブルギアヌム（Ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｍ  ｒｏｘｂｕｒｇｈｉａｎｕｍ）、メウム・アサマンチクム（Ｍｅｕｍ  ａｔｈａｍａｎｔｉｃｕｍ）、ロマチウム・トレイ（Ｌｏｍａｔｉｕｍ  ｔｏｒｒｅｙｉ）、スクテラリア・バイカレンシス（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）、オポパナックス・チロニウム（Ｏｐｏｐａｎａｘ  ｃｈｉｒｏｎｉｕｍ）、セノロフィウム・デヌダタム（Ｃｅｎｏｌｏｐｈｉｕｍ  ｄｅｎｕｄａｔｕｍ）、コリアンドラム・サチヴウム（Ｃｏｒｉａｎｄｒｕｍ  ｓａｔｉｖｕｕｍ）、シラウム・シラウス（Ｓｉｌａｕｍ  ｓｉｌａｕｓ）などの種々の植物から単離され得る。本明細書において使用される化合物は、合成的な起源であってもよい。
【００１２】
本発明のさらに特に好ましい実施形態では、リグスチリドは、例えばリグスチクム種、特にＬ．ワリチーから、欧州特許出願第０５００２３３３．２号明細書およびそれに基づくＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００６４８号明細書（その内容は参照によって本明細書中に援用される）において開示される方法によって得ることができるような、少なくとも約５０重量％のリグスチリド、ならびに１０重量％以下の脂肪酸およびトリグリセリドを含む精製植物抽出物の形で使用される。
【００１３】
ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００６４８号明細書に開示される発明の態様によると、５０重量％未満のリグスチリドならびに５重量％よりも多い脂肪酸およびグリセリドを含有するリグスチクム種の抽出物は精留を受ける。精留は、１３０℃〜４００℃の範囲の温度および０．１ｍｂａｒ〜２５ｍｂａｒの範囲の圧力で適切に実行される。好ましい実施形態では、精留は、２００℃〜２３０℃の範囲の加熱温度および０．１ｍｂａｒ〜３ｍｂａｒの範囲の精留塔の最高圧力で実行される。適切には、この方法で出発材料として使用される抽出物は、リグスチクム種の根、特にＬ．ワリチーの乾燥した根からの抽出物であり、例えば二酸化炭素を用いる超臨界流体抽出によって得られる。好ましい実施形態では、抽出物は、精留の前に、脱気装置において脱気を受ける。脱気装置は、加熱および減圧を付与することによって抽出物からの水の除去を可能にするどんな蒸発システムでもよい。脱気は、１０〜５０ｍｂａｒにおいて１２０〜１８０℃の範囲の温度で実行されるのが好都合である。
【００１４】
この方法によって、リグスチリド、およびセンキュノリド、３−ｎ−ブチルフタリド、セダノリド、３−ブチリデンフタリドのような式（Ｉ）の他の化合物は、得られる留出物中で、留出物の重量を基準として９０％を超えて濃縮され得る。出発材料とは対照的に、この方法で得られる留出物は快い匂いがあり、淡黄色を示す。グリセリドおよび遊離脂肪酸は、蒸留残渣中に濃縮される。
【００１５】
精留は、全ての種類の蒸発装置のタイプと共に実施することができるが、好ましい装置は、滞留時間が短く、好ましくは３分以下であり、圧力降下が小さいワイプ型薄膜エバポレータ（ｗｉｐｅｄ  ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）である。
【００１６】
精留塔には、トレイ、ランダムまたは構造化パッキングのような全ての種類の異なるカラム内在物を備えることができるが、好ましい内在物は、圧力降下が小さく、液体の残留が少ない構造化パッキングである。これは、より高い温度およびより長い滞留時間における式（Ｉ）の化合物の分解を防止する。
【００１７】
上記の方法に従う好ましい精留塔設備には、カラムの精留セクションに液体サイドドロー（ｓｉｄｅ  ｄｒａｗ）が備えられる。得られる精製リグスチクム抽出物が、液体サイドドローとして精留塔から取り出される場合、フタリドと比べてその他の低沸点成分を留出物ストリームと分離することができるので、より高いフタリド濃度がもたらされる。精留に分離壁カラムが備えられている場合には、同じ効果を達成することができる。この場合も、得られる精製リグスチクム抽出物は、サイドドローとしてカラムから取り出される。
【００１８】
フタリドが熱的に不安定であるため、この方法はバッチ式、好ましくは連続モードで実行され得る。この方法によって得られる精製抽出物は、従来の技法によって固体製剤に変化させることができる。
【００１９】
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０００６４８号明細書に開示される方法の好ましい例は、実施例１１および１２に記載されている。
【００２０】
式（Ｉ）の化合物、特にリグスチリドまたはリグスチリドを含有する植物抽出物は、栄養補助組成物、すなわち食品組成物（すなわち、食料または飲料）の補足として、あるいは、潤滑剤、着色剤、湿潤剤、充填剤、崩壊剤およびフラボラント（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）を含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる医薬品組成物、例えば、錠剤またはカプセルなどの単位剤形における組成物として使用されてもよい。
【００２１】
医薬品または食品組成物は、強化食料または飼料、飲料、錠剤、顆粒、カプセル、ペースト、および発泡製剤からなる群から選択される形態でよい。ペーストは、硬または軟ゼラチンカプセルに充填されてもよい。
【００２２】
式（Ｉ）によって表される化合物は、好ましくは、ヒトを含む動物に少なくとも０．００５ｍｇ／ｋｇ体重／日が投与されるような濃度で使用される。
【００２３】
好ましくは、本発明に従う使用のために、ヒトを含む動物に対する式（Ｉ）の化合物、特にリグスチリドの有効用量は、式（Ｉ）の純粋な化合物の重量を基準として、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であり、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、さらにより好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、最も好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【００２４】
上記のように、式（Ｉ）の化合物は、炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するために有用である。これらは、炎症が伴われる様々な疾患および障害の治療のための補助剤としても使用することができる。
【００２５】
炎症の調節を必要とする状態には、関節リュウマチを含む関節炎、変形性関節症、痛風および強直性脊椎炎を含む変性関節疾患、腱炎、滑液包炎、骨粗鬆症などの骨障害、乾癬、湿疹、熱傷および皮膚炎などの皮膚関連状態、アレルギー、喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎および呼吸窮迫症候群などの呼吸器疾患、全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、炎症性神経障害（ギラン・バレー、炎症性多発神経障害）、血管炎、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などの消化管炎症、癌、腫瘍成長および正常組織の癌性浸潤などの腫瘍学的疾患、アテローム硬化症などの炎症性要素を有するその他の慢性疾患、心疾患、パーキンソン病、運動緩徐、筋硬直、多発性硬化症、うつ病、記憶障害、アルツハイマー病およびその前段階（軽度認知機能障害、特に年齢に関連する記憶障害など）などの中枢神経系障害のような急性および慢性の炎症性疾患が含まれる。また化合物は鎮痛特性も有し、スポーツ損傷などの痛み、発熱、損傷に対応するために使用することもできる。
【００２６】
従って、本発明は特に、炎症の調節を必要とする状態、特に上記のような状態を予防、制御および治療するための（薬物／組成物の製造における）上記で定義したような式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、次のとおりである。
・  炎症の調節を必要とする状態の予防、制御および治療において使用するための、有効量の上記で定義した式（Ｉ）の化合物を含む医薬品または食品組成物。この組成物は好ましくは、上記で定義した状態の予防、制御および治療において使用される。
・  哺乳類の炎症の調節を必要とする状態を予防、制御および治療するための方法であって、有効量の上記で定義した式（Ｉ）の化合物を、特に上記のような状態の治療を必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
・  上記で定義した式（Ｉ）の化合物の鎮痛薬としての使用。
・  痛み、発熱および損傷に対応するための（組成物の製造のための）上記で定義した式（Ｉ）の化合物の使用。このような損傷は、特にスポーツ損傷である。
・  哺乳類の痛み、発熱および損傷（特に、スポーツ損傷）に対応するための方法であって、前記対応を必要としている哺乳類に、有効量の上記で定義した式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
・  上記で定義した式（Ｉ）の化合物の軟骨再生および維持剤としての使用。
・  関節軟骨の維持および再生のための（組成物の製造のための）上記で定義した式（Ｉ）の化合物の使用。
・  哺乳類の（関節）軟骨を再生および／または維持するための方法であって、前記再生および／または維持を必要としている哺乳類に、有効量の上記で定義した式（Ｉ）の化合物を投与することを含む方法。
【００２８】
最後に、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ）の化合物の投与の前、同時、または後に投与することによって、炎症性障害の治療または予防のために当業者に既知の他の栄養補助組成物または治療薬と組み合わせて使用されてもよい。
【００２９】
以下の実施例は実例であるが、本発明を限定するものではない。
【００３０】
［実施例］
［実施例１：軟ゼラチンカプセル］
軟ゼラチンカプセルを従来の手順によって調製し、１００ｍｇのリグスチリド／リグスチリド抽出物の用量を提供する。
他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物油。
【００３１】
［実施例２：硬ゼラチンカプセル］
硬ゼラチンカプセルを従来の手順によって調製し、２００ｍｇのリグスチリド／リグスチリド抽出物の用量を提供する。
他の成分：
充填剤：ラクトースまたはセルロースまたはセルロース誘導体  適量
潤滑剤：必要であればステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓｔｅｒａｔｅ）（０．５％）
【００３２】
［実施例３：錠剤］
錠剤を従来の手順によって調製し、活性成分として錠剤あたり５０ｍｇのリグスチリドと、賦形剤として２００ｍｇまでの、微結晶性セルロース、二酸化ケイ素（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｄｉｏｘｉｄｅ）（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウムとを提供する。
【００３３】
［実施例４：ソフトドリンク］
リグスチリドまたはリグスチリド抽出物を含有するソフトドリンクは、以下のように調製することができる。
Ｉ．ソフトドリンク化合物を以下の成分から調製する。
【００３４】
【表５】
2008542226.tif 000009
【００３５】
空気を取り込まないように果実ジュース濃縮物および水溶性フレーバーを混合する。色を脱イオン水中に溶解させる。アスコルビン酸およびクエン酸を水に溶解させる。安息香酸ナトリウムを水に溶解させる。ペクチンを攪拌しながら添加し、沸騰させながら溶解させる。溶液を冷却する。オレンジ油および油溶性フレーバーを予め混合する。１．６で示されるような活性成分を果実ジュース濃縮混合物（１．１）中に攪拌する。
【００３６】
ソフトドリンク化合物を調製するために、３．１．１〜３．１．６の全ての部分を一緒に混合してから、ツラックス（Ｔｕｒｒａｘ）、そして次に高圧ホモジナイザー（ｐ１＝２００ｂａｒ、ｐ２＝５０ｂａｒ）を用いて均質化する。
【００３７】
［実施例５：炎症性メディエーターの阻害］
一酸化窒素および／またはＰＧＥ２の合成の阻害を決定することによって、活性化マクロファージにおける化合物の抗炎症性効果を評価した。インビトロの「炎症反応」を誘発するために、マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した（段階的な量の試験物質を用いずに、あるいは用いて）。マウスのマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞は、かなりの量のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）および一酸化窒素（ＮＯ）の放出によってＬＰＳ刺激に対して反応し、これは抗炎症性化合物によって損なわれる。プロスタグランジンＰＧＥ２は炎症過程において重要な役割を果たし、一酸化窒素は、関節炎のような状態の炎症の特徴である。従って、ＰＧＥ２およびＮＯの産生に対する化合物の効果を評価した。
【００３８】
１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン酸および非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎｏ．１１１４０）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＲＡＷ２６４．７細胞を培養した。１０〜５０継代の間のＲＡＷ細胞を用いた。実験のために、細胞を６ウェル、１２ウェルまたは９６ウェルプレートにそれぞれ、ウェルあたり２、１および０．０５ｍｉｏ細胞で播種し、前培養の１または２日後に使用した。処理の前に、０．２５％のＦＣＳを含有する完全ＤＭＥＭ培地中で、細胞を１８時間飢餓状態にした。０．２５％のＦＣＳを含有するフェノールフリーのＤＭＥＭ中、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で２４時間細胞を刺激した。試験すべき物質をＤＭＳＯ中に溶解し（通常、１０ｍＭ）、刺激と同時に培地に添加した。適切な場合には、０．５％を超えない媒体濃度を調整するために、ＤＭＳＯを細胞培養液に添加した。２４時間後、グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応によって培養液の上澄みの亜硝酸塩濃度を測定し、非刺激およびＬＰＳ刺激ＲＡＷ２６４．７細胞において分泌されたＰＧＥ２を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）によって決定した。異なる濃度の化合物を同時に試験して、用量反応曲線を得た。ＰＧＥ２またはＮＯの産生の５０％阻害を引き起こす濃度を決定することによって効力を評価し、これはＩＣ５０として報告される。リグスチリドは、一酸化窒素（ＮＯ）の産生を強力に低減し、ＩＣ５０は１２．２±３．１μＭであった。マウスのマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７におけるＰＧＥ２の産生に対する式（Ｉ）の化合物の効果も測定した（表１）。
【００３９】
【表６】
2008542226.tif 000010
【００４０】
［実施例６：炎症性遺伝子の発現レベルの調節］
１０％のＦＣＳ、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ＮＥＡＡおよび２×１０−５Ｍのβ−メルカプトエタノールが追加されたＲＰＭＩ１６４０倍地中で、ＴＨＰ−１細胞、ヒト単球／組織球細胞株を培養した。細胞を５０ｎＭのホルボールミリステートアセテートで３日間処理した。処理の前に、０．２５％ＦＣＳを含有する培地中で、細胞を一晩飢餓状態にした。０．２５％のＦＣＳを含有するフェノールフリーのＲＰＭＩ中、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で４時間細胞を刺激した。リグスチリド（２５μＭ）を刺激と同時に培地に添加した。ＤＭＳＯをコントロール細胞培養液に添加して、０．５％を超えない媒体濃度を調整した。ＬＰＳ刺激は、炎症性経路のものを含む多様な遺伝子の発現を誘発した。刺激の４時間後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）技法を用いて炎症性遺伝子の発現に対するリグスチリドの影響を評価した（表２）。
【００４１】
【表７】
2008542226.tif 000011
【００４２】
表２のデータは、リグスチリドが、炎症反応の調節に関与する多数の遺伝子を下方制御することを示す。サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＬ−８は、急性および慢性の炎症性疾患および骨粗鬆症に関係している。
【００４３】
［実施例７：カラギナン誘発性のラットの足浮腫に対するリグスチリドの効果］
カラギナン誘発性の足浮腫ラットモデルにおいて、化合物の抗炎症活性をインビボで評価した。このモデルは、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などのプロスタグランジンを阻害する薬剤の抗炎症特性を評価するために使用されている。モデルは、ラットの足の足底下表面へのカラギナン投与の後、時間依存性の浮腫の形成を引き起こす。
【００４４】
２０匹の１３０〜１４６ｇの重さのオスのスプラーグドーリーラットを２つのグループにランダム化した。これらを温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）が制御された部屋の中に１２時間の明／暗サイクルで収容し、研究の間中、ろ過した水道水および標準的なペレット状飼料を自由に利用できるようにした。これらを１つのケージにつき５匹収容し、試験の前に５〜６日間の順化期間を観察した。動物は、尾で個々に識別した。一晩の絶食の後、１％のメチルセルロース（１０ｍＬ／ｋｇの体積）中に懸濁されたリグスチリド（１００ｍｇ／ｋｇ）または媒体のみを、コード化されたランダムな順に経口経路で投与した。１時間後、右足への２％カラギナン懸濁液の足底下注射によって炎症が誘発される。カラギナンの注射後の以下の時点：０時間後、１．５時間後、３時間後、および４．５時間後に各ラットの足の体積（ｍｌ）を測定した。それぞれの時点で各ラットの足浮腫の体積を初期値からの変化として表した。処置グループの浮腫体積に対する抗炎症効果を、％阻害［（媒体処置グループの足浮腫体積の平均−処置グループの足浮腫体積の平均）／媒体処置グループの足浮腫体積の平均）×１００］で表した。
【００４５】
【表８】
2008542226.tif 000012
【００４６】
足浮腫体積の全てのデータは、各グループの１０匹のラットの平均としてｍｌで表される。
媒体処置グループに対する％阻害
リグスチリド（１００ｍｇ／ｋｇ）は、媒体で処置されたコントロールグループと比べて、カラギナン注射の１．５時間後、３時間後および４．５時間後に、平均足浮腫体積を阻害した。
【００４７】
［実施例８：カオリン誘発性のラットの関節炎におけるリグスチリドの効果］
この研究には、２０匹の１０３〜１３２ｇの重さのオスのスプラーグドーリーラットが含まれた。これらを温度（１９．５〜２４．５℃）および相対湿度（４５〜６５％）が制御された部屋の中に１２時間の明／暗サイクルで収容し、研究の間中、ろ過した水道水および標準的なペレット状飼料を自由に利用できるようにした。動物施設から受け取ったら、これらを１つのケージにつき５匹収容し、試験の前に５日間の順化期間を観察した。動物は、尾で個々に識別した。ラット右側後足の膝関節への１０％カオリン懸濁液の注射によって、関節炎が誘発される。媒体処置されたグループでは、ラット右側後足の膝関節へのカオリン懸濁液の注射は、歩行スコア（０〜３のスコア）の上昇で評価される歩行の機能障害を誘発した。動物の歩行は、自発性の痛みを伴う挙動を測定するために使用される。カオリン注射の３０分後に、１％のメチルセルロース（１０ｍＬ／ｋｇの体積）中に懸濁されたリグスチリド（１００ｍｇ／ｋｇ）または媒体のみを、コード化されたランダムな順に経口経路で投与した。薬の投与の１．５時間後〜５．５時間後まで毎時間、スコア挙動の評価をモニターした。それぞれの時間における個々の値から平均歩行スコアを計算した。コントロールグループの平均値と比較して、投薬の１．５、２．５、３．５、４．５時間後および５．５時間後に、平均歩行スコアの阻害の割合を計算した。
【００４８】
【表９】
2008542226.tif 000013
【００４９】
結果は、１グループにつき１０匹の動物の歩行スコアの平均としてグループごとに表される。
【００５０】
リグスチリドは、コントロールグループと比較して、関節炎の誘発後に歩行スコアの改善を誘発した。コントロールグループと比較して、投薬の３．５、４．５および５．５時間後に著しい鎮痛効果を観察した。
【００５１】
［実施例９：軟骨細胞に対するリグスチリドの効果］
関節組織、すなわち関節は軟骨細胞を含有する。これらの生理学的な劣化は、関節組織成分の侵食をもたらし、それに従って、例えば変形性関節症がもたらされる。軟骨細胞における異化現象に対するリグスチリドの効果を評価した。ＳＷ１３５３軟骨肉腫細胞または正常なヒト軟骨細胞（膝に由来）を、段階的な量の試験化合物の存在下でインターロイキン−１βにより４時間活性化した。次にこれらの細胞からＲＮＡを抽出物し、逆転写した。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のような異化現象のためのマーカー遺伝子の発現は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。表５に示されるように、リグスチリドは、細胞外マトリックスの破壊に決定的に関与するいくつかのＭＭＰの発現レベルに影響を与えた。リグスチリドはその発現を低減し、それに従って、骨関節炎疾患における組織侵食を防止するはずである。対照的に、コラーゲンｍＲＮＡレベルが上昇され、これは、細胞外マトリックスの再構成に寄与する現象に有利であることを示唆する。
【００５２】
【表１０】
2008542226.tif 000014
【００５３】
［実施例１０：内皮細胞への細胞接着に対するリグスチリドの効果］
アテローム硬化性（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）の病変は、内皮障害の結果として発生し得る。これは、単球の内皮層への接着の変化、すなわち増大に反映される。Ｕ９３７単球細胞株のヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）への接着に対するリグスチリドの効果を評価した。リグスチリド（２５または５０μｍｏｌ／Ｌ）の不在または存在下でＨＵＶＥＣをＴＮＦ−αで２０時間刺激し、カールッチョ（Ｃａｒｌｕｃｃｉｏ）ら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ  ２００３年、２３、６２２−６２９頁）に従って、Ｕ９３７の接着性を決定した。表６に示されるように、接着性は、濃度に依存した形でリグスチリドによって著しく妨害された。単球の内皮層への接着は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の発現によって仲介される。そのためさらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＨＵＶＥＣ中のＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡのレベルに対するリグスチリドの効果を分析した。これらの細胞におけるＩＣＡＭ−１遺伝子発現の用量依存性の低下が観察された（表７）。これにより、細胞接着現象に対するリグスチリドの分子効果が明らかにされる。ＩＣＡＭ発現の低下による単球の接着の低下は、内皮の恒常性を再建し、従って、アテローム形成の防止に寄与する。
【００５４】
【表１１】
2008542226.tif 000015
【００５５】
【表１２】
2008542226.tif 000016
【００５６】
［実施例１１］
粗製リグスチクム抽出物、例えば、２９重量％の総フタリド濃度（８．２重量％のセンキュノリド、０．５重量％の３−ｎ−ブチルフタリド、１．２重量％のセダノリド、１８．３のリグスチリド、０．６重量％の３−ブチリデンフタリド）を有するリグスチクムの根から二酸化炭素による超臨界抽出によって得られたままの抽出物を連続真空精留によって精製し、総フタリド濃度を９０重量％（２６．４重量％のセンキュノリド、１．６重量％の３−ｎ−ブチルフタリド、３．７重量％のセダノリド、５６．３重量％のリグスチリド、２．０重量％の３−ブチリデンフタリド）にした。
【００５７】
初めに、粗製抽出物から水を分離するために粗製リグスチクムを脱気した。２５ｍｂａｒの減圧および約１６０℃の加熱温度で、供給量の１．０％を蒸発させた。残渣は、ほとんど水のない粗製リグスチクム抽出物を含む。得られるカラムの留出物ストリーム中のフタリドを濃縮するために、この材料を精留設備（０．０５ｍ２の加熱面積を有するワイプ型薄膜エバポレータ、１ｍの高さの構造化パッキングを有する蒸留塔）に連続的に供給した（図１を参照、液体サイドドローは動作していない）。０．５ｍｂａｒの最高カラム減圧力および２３０℃の加熱温度の条件では、留出物／供給物の比は０．３３：１であった。留出物ストリームの還流比は約１であった。蒸留残渣には、グリセリドおよび遊離脂肪酸が濃縮されている。留出物ストリームは、９０重量％の総フタリド濃度で上記のフタリド全てを含有する。最終の精製リグスチクム抽出物の色は、ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）スケールで４．７であった。
【００５８】
［実施例１２］
粗製リグスチクム抽出物、例えば、３６重量％の総フタリド濃度（１１．４重量％のセンキュノリド、１．１重量％の３−ｎ−ブチルフタリド、１．６重量％のセダノリド、２０．４のリグスチリド、１．３重量％の３−ブチリデンフタリド）を有するリグスチクムの根から二酸化炭素による超臨界抽出によって得られたままの抽出物を、以下のようにして液体サイドドローを有する連続真空精留によって精製し、総フタリド濃度を９４重量％（２９．３重量％のセンキュノリド、３．３重量％の３−ｎ−ブチルフタリド、３．９重量％のセダノリド、５３．５重量％のリグスチリド、３．９重量％の３−ブチリデンフタリド）にした。
【００５９】
初めに、粗製抽出物から水を分離するために粗製リグスチクムを脱気した。２５ｍｂａｒの減圧および約１６０℃の加熱温度で、供給量の１．０％を蒸発させた。残渣は、ほとんど水のない粗製リグスチクム抽出物を含む。得られる液体サイドストリーム中のフタリドを濃縮するために、この材料を精留設備（０．０５ｍ２の加熱面積を有するワイプ型薄膜エバポレータ、１．５ｍの高さの構造化パッキングを有する蒸留塔、下から１ｍのカラム高さにおける液体サイドドロー）に連続的に供給した（図１を参照、液体サイドドローは動作している）。
【００６０】
１ｍｂａｒの減圧および２３０℃の加熱温度において、供給物ストリームを以下のように、３６％の液体サイドストリーム、６２％の残渣および２％の留出物に分離した。留出物の還流比は約１０であり、サイドストリームの還流比は約１であった。蒸留残基にはグリセリドおよび遊離脂肪酸が濃縮されており、留出物中には、低沸点成分が濃縮されている。所望のフタリドは、液体サイドストリーム中に９４％の濃度で濃縮されている。最終の精製リグスチクム抽出物の色は、ガードナースケールで４．６であった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】精留設備。
【図１】
2008542226.tif 000020
【国際調査報告】
2008542226.tif 000021
2008542226.tif 000022
2008542226.tif 000023
2008542226.tif 000024
2008542226.tif 000025