(57)【要約】  本発明は、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151でのヒスチジンによる少なくとももう一つのアミノ酸置換を含む突然変異のトリプシンに関する。かかるトリプシン突然変異体は、アミノ酸Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む好ましい切断部位を有する。本発明はまた、標的ペプチドおよび前記切断部位を含む人工のポリペプチド、ならびにこの突然変異のトリプシンを用いてＣ末端が修飾された標的ペプチドを作製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
K60位およびD189位の両方にアミノ酸置換、ならびにN143位またはE151位にヒスチジンによる少なくとももう１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異トリプシン。
【請求項２】
K60がEまたはDで置換されている、請求項１記載の突然変異トリプシン。
【請求項３】
D189がK、HまたはRで置換されている、請求項１記載の突然変異トリプシン。
【請求項４】
標的ペプチド、および切断部位Xaa1-Xaa2-His（式中、Xaa1はL、YまたはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複する、請求項１〜３いずれか記載のトリプシン突然変異体の基質としてのポリペプチドの使用。
【請求項５】
(a)  標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複するポリペプチドを提供する工程、
(b)  前記ペプチドを、Xaa1後の内部タンパク質分解性切断およびエンドプロテアーゼ標的ペプチドペプチド-アシル-中間体の形成を可能にする条件下で、請求項１〜３いずれか記載のトリプシン突然変異体と接触させる工程、
(c)  適切な求核試薬を添加する工程、および
(d)  求核性攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、エンドプロテアーゼ標的ペプチドアシル-中間体から突然変異トリプシンを放出する工程
を含む、C末端がアシル基転移した標的ペプチドの作製方法。
【請求項６】
前記求核試薬が、第１級アミン、イミン、第２級アミン、チオールおよびヒドロキシル基からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
修飾を含む前記求核試薬が、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、標識、標識されたアミノ酸アミド、標識されたペプチド、標識されたペプチドアミド、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記修飾がポリエチレングリコールである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜３いずれか記載の突然変異トリプシンをコードするヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151でのヒスチジンによる少なくとももう一つのアミノ酸置換を含む突然変異のトリプシンに関する。かかるトリプシン突然変異体は、アミノ酸Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む好ましい切断部位を有する。本発明はまた、標的ペプチドおよび前記切断部位を含む人工のポリペプチド、ならびにこの突然変異のトリプシンを用いてＣ末端が修飾された標的ペプチドを作製する方法に関する。
【０００２】
生物活性のあるペプチドの使用は、例えば医薬的な目的のため、先年の間にますます重要になっている。かかる生物活性のあるペプチドを産生するいくつかの方法があり、例えば、固相もしくは液相ペプチド合成技術に基づく化学合成、またはかかる産生した組み換えタンパク質の単離および精製がその後に続く遺伝子操作された微生物の培養である。
【０００３】
しかしながら、約50以上のアミノ酸のポリペプチドを化学的に合成することは依然として困難で費用がかかる。それはまた、化学的ペプチド合成および／または組み換え技術によって得られたポリペプチドによって得られたペプチドをそのＣ末端において修飾するという重要な課題を意味する。ポリペプチドを修飾する最も有力な方法の一つは、制御タンパク質連結反応を介し、それによってペプチドアナログ、非天然(unnatural)アミノ酸、安定な同位体、蛍光プローブ、および他の生化学的または生物物理学的に重要な分子が特異的にポリペプチドに組み込まれ得る。これらの方法の一つは、化学選択的なアミノ酸、主として、その後にこのアミノ酸残基のSH-側鎖を攻撃するチオ選択的な試薬により修飾されるシステインの、主に合成的な導入に基づく。さらに別の方法は、いわゆるインテインに基づくタンパク質連結反応系で、対応するタンパク質-インテイン融合タンパク質のタンパク質分解によりタンパク質チオエーテルを生成し得る（Blaschke, U.K.ら, Methods Enzymol. 328 (2000) 478-496）。この方法はタンパク質に非天然な修飾を導入するためにうまく適用されている。しかしながら、例えば、標的タンパク質はインテインとの融合タンパク質として発現されなければならないので、依然として困難である。
【０００４】
最近、酵素系のペプチド連結反応および／またはＣ末端修飾のさらにいくつかのやり方が記載されている。Breddamおよび共働者（例えばUS 5,985,627）は、蛍光またはアフィニティーラベルでのペプチドのＣ末端修飾におけるセリンプロテアーゼカルボキシペプチダーゼ Y（CPD-Y）の使用を記載する。この修飾は、ポリペプチドのＣ末端のアミノ酸を段階的に切断するCPD-Yの特殊能力に基づく。従ってこの方法は、ポリペプチドのＣ末端の修飾のための特異的なツールであるとみなされ得る。CPD-Yは、ペプチド-アシル-酵素-中間体の形成下にＣ末端アミノ酸を切断する。このアシル-酵素-中間体は求核攻撃の際、アシル基を除去され、アミノ基転移反応をもたらす。所望のアミノ基転移反応は、加水分解のような（不要な）副反応と同時に起こり得る。また、一つ以上のＣ末端アミノ酸が切断される可能性もあり、一方、またこの方法によってアミノ酸が付加され得る（Stennicke, H. R.ら, Anal. Biochem. 248 (1997) 141-148 および Buchardt, O.ら, US 5,580,751）。
【０００５】
Abrahmsonら（例えばWO 94/18329）は、ペプチドの連結反応へのセリンプロテアーゼバリアントの使用を記載した。改良されたペプチドリガーゼ活性を有するスブチリシンバリアントが開示されている。しかしながら、２つのペプチド基質を効率よく連結するために適当なアミノ末端保護基および適当なカルボキシル末端活性化基をそれぞれ用いることは、効果的なペプチド連結反応に必要である。
【０００６】
最近、ソルターゼ-媒介タンパク質連結反応が、タンパク質工学における別の方法として記載されている（Mao, H.ら, J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 2670-2671）。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）から単離された酵素であるソルターゼは、アミノ酸LPXTGからなる認識モチーフにおけるトレオニンとグリシンの間を切断し、続いてトレオニンのカルボキシル基をＮ末端グリシンに結合することによって、ペプチド転移反応を触媒する。事実上ソルターゼは、細胞壁ペプチドグリカン上のペンタグリシンのアミノ基にトレオニンがペプチド転移するのを触媒する。
【０００７】
ソルターゼ認識モチーフLPXTGにおいて、Xはアミノ酸D、E、A、N、Q、またはKであり得る。この酵素は、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシル末端トレオニン残基を、2番目のペプチドであるＮ末端グリシンに連結するのに用いられている。言及したように、ソルターゼは、そのうちの４つのアミノ酸（LPXT）が連結反応生成物内に存在するであろう５つのアミノ酸の認識モチーフを必要とする。
【０００８】
従って、ポリペプチドのＣ末端修飾にはいくつかの方法が存在するが、代替の、または改善された、ポリペプチドのＣ末端修飾の方法には、多大な必要性がある。本発明の発明者達は、ポリペプチドのＣ末端修飾において特別なトリプシン突然変異体を用いることが可能であることを発見している。
【０００９】
従って一態様において、本発明は、キモトリプシン命名法によると配列番号１に所定の配列の、それぞれ位置43、171、123、および131に対応する、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151でのヒスチジンによる少なくとも一つのアミノ酸置換を含む突然変異のトリプシンに関する。
【００１０】
当業者は、いわゆるキモトリプシン命名法を、例えばHartley, B.S.および Shotton, D.M., The Enzymes, P.D. Boyer (編), 第3巻, (1971), 323-373ページに記載されるものとしてよく知っており、配列番号１のトリプシン配列に対応する位置に、キモトリプシン命名法により所定された位置にトリプシンバリアントの位置を調整することに全く問題はないであろう。
【００１１】
キモトリプシン命名法による位置60は、配列番号１に示すドブネズミ(Rattus norvegicus)由来の成熟陰イオンラットトリプシンIIの配列の位置43に対応する。
【００１２】
キモトリプシン命名法による位置143は、配列番号１に示すドブネズミ由来の成熟陰イオンラットトリプシンIIの配列の位置123に対応する。
【００１３】
キモトリプシン命名法による位置151は、配列番号１に示すドブネズミ由来の成熟陰イオンラットトリプシンIIの配列の位置131に対応する。
【００１４】
キモトリプシン命名法による位置189は、配列番号１に示すドブネズミ由来の成熟陰イオンラットトリプシンIIの配列の位置171に対応する。
【００１５】
当業者はキモトリプシン命名法を参照して位置を表現することに慣れているため、以下は具体的な配列位置の参照であり、例えば、位置K60または単に位置60は、もっぱらキモトリプシン命名法による位置に基づく。
【００１６】
本発明はまた、標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのＣ末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複する、本発明に開示されるようなトリプシン突然変異体の基質としての人工のポリペプチドの使用に関する。
【００１７】
また、(a)標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのＣ末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複するポリペプチドを提供する工程、(b)前記ペプチドを、Xaa1後の内部タンパク質分解性(endoproteolytic)切断およびエンドプロテアーゼ標的ペプチド-アシル-中間体の形成を可能にするような条件下で、本発明によるトリプシン突然変異体と接触させる工程、(c)適当な求核試薬を添加する工程、および(d)求核性攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、エンドプロテアーゼ標的ペプチドアシル-中間体から突然変異トリプシンを放出する工程を含む、Ｃ末端アシル基転移した標的ペプチドを生成する方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、新規トリプシン突然変異体をコードするヌクレオチド配列、かかる突然変異体を含むベクター、およびかかるベクターを含む形質転換した宿主細胞に関する。
【００１９】
本発明による突然変異のトリプシンは、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151でのヒスチジンによる少なくとも一つのアミノ酸置換を含むトリプシンである。位置143および／または位置151での置換はヒスチジン（His）による。
【００２０】
好ましくは、本発明による突然変異のトリプシンは、位置60においてアミノ酸Eまたはアミノ酸Dのいずれかを含み、従って、通常は位置60にあるアミノ酸Kと置き換わる。
【００２１】
本発明による突然変異のトリプシンはまた、位置189においてアミノ酸K、アミノ酸H、またはアミノ酸Rのいずれかを含み、従って、通常その位置にあるアミノ酸Dと置き換わることが好ましい。非常に好ましい置換は位置189でKとの置換である。
【００２２】
さらに好ましい態様において、本発明による突然変異のトリプシンは、位置60、143、151および189における突然変異を含む。この突然変異の酵素における好ましい置換は、K60EまたはD、N143H、E151HおよびD189KまたはRである。
【００２３】
上述のトリプシンの突然変異体は、非常に興味深く、重要な性質を有する。かかる突然変異体は、3つのアミノ酸Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）からなる結合または切断部位を選択的に認識するように思われる。この制限部位は、上記の突然変異体によってXaa1の後で切断される。新規トリプシン突然変異体を用いることにより、たった１つのアミノ酸、すなわちＣ末端のXaa1が修飾された標的ポリペプチド内に残るため、これは非常に重要な特徴である。
【００２４】
本発明の理解を容易にするために、本発明に関連して用いられる専門用語についての簡単な論考をする。本開示は、ペプチド基質上および対応するタンパク質分解酵素の活性部位内の様々なアミノ酸残基の位置を記載するために、Schechter, J.およびBerger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967) 157-162の専門用語を用いる。
【００２５】
上記のSchechter, J.およびBerger, A.により提案される専門用語によると、ペプチド基質のアミノ酸残基は文字「P」によって指定される。切断されるペプチド結合（「切断部位」）のＮ末端側の基質のアミノ酸は、Pn…P3、P2、P1と指定され、Pnは切断部位から最も遠いアミノ酸残基である。切断部位のＣ末端側のペプチド基質のアミノ酸残基はP1`、P2`、P3`…Pn`と指定され、Pn`は切断部位から最も遠いアミノ酸残基である。従って、切断される結合（「切断部位」）はP1_P1`結合である。
【００２６】
エンドペプチダーゼ（例えばトリプシンのような）の基質のアミノ酸を表す一般的な式は、以下の通りである：
Pn_P3_P2_P1_P1`_P2`_P3`_Pn`
【００２７】
エンドペプチダーゼの基質結合部位の指定は、ペプチド基質のアミノ酸残基の指定に似ている。しかしながら、エンドペプチダーゼの結合下位部位は、文字「S」によって指定され、一つ以上のアミノ酸残基を含み得る。切断部位のＮ末端部位上のアミノ酸の基質結合部位はSn…S3、S2、S1と標示される。切断部位のカルボキシル側上のアミノ酸の基質結合下位部位はS1`、S2`、S3`、Sn`と指定される。従って、エンドペプチダーゼにおいて、S1`下位部位はペプチド基質のP1`基およびこの次の求核試薬と相互作用する。エンドペプチダーゼの基質結合部位を表す一般式は：
Sn_S3_S2_S1_S1`_S2`_S3`_Sn`
【００２８】
本発明によるトリプシン突然変異体がアミノ酸Xaa1の場合、S1結合部位は、ペプチド基質の最後から2番目のアミノ酸であるP1の側鎖に結合する。Xaa2の場合、S1`結合部位は、P1`の側鎖と相互作用する。同様に、S2`結合部位は、位置P2`におけるヒスチジン残基の側鎖と相互作用する。
【００２９】
当業者が認識するように、本発明はまた、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151でのヒスチジンによる少なくとももう一つのアミノ酸置換を含むトリプシンバリアントで行われ得る。
【００３０】
用語「バリアント」とは、天然のポリペプチド配列とはある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常、バリアントのアミノ酸配列は、対応する親トリプシン配列と少なくとも約80％の相同性を持ち、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95％がかかる対応する親トリプシン配列と相同するであろう。アミノ酸配列突然バリアントは、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列中のある位置で、置換、欠失、および／または挿入を持つ。配列相同性は、好ましくは少なくとも96％または97％であろう。
【００３１】
「相同性」は、必要に応じて最大の相同性割合にするために、配列を整列し隙間を導入した後の、同一なアミノ酸配列バリアントにおける残基の割合と定義される。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で周知である。1つのかかるコンピュータープログラムは、1991年12月10日にユーザー文書と共に米国著作権局、Washington, DC 20559に提出された、Genentech, Inc.による「Align 2」である。
【００３２】
好ましくは、対応する野生型配列と比較して本発明において開示されるトリプシンのバリアントは、20以下のアミノ酸置換、より好ましくは15以下のアミノ酸置換、同様に好ましくは10以下のアミノ酸置換、および同様に好ましくは6以下のアミノ酸置換を含む。
【００３３】
本発明の修飾されたトリプシンは、対応する天然のトリプシンと比較した時に改良されたアシル基転移をすることができる。本明細書で使用される場合、「アシル基転移」は、求核試薬により、ペプチドフラグメントＣ末端からトリプシン切断部位へ変換される反応である。アシル基転移反応としては、チオール交換反応、エステル交換反応およびアミノ基転移反応が挙げられる。「アミノ基転移反応」は、アミノ結合が求核試薬と標的ペプチド基質の間で形成される時に起こる。アミノ基転移反応において、求核試薬はアミノ酸である必要はない。アミノ基転移の重要な下位群としての「ペプチド転移」は、求核試薬が、アミノ酸、またはアミノ酸エステルもしくはアミノ酸アミド等のアミノ酸の誘導体である時に起こる。
【００３４】
本発明による一般的なアシル基転移反応は以下に示される：
2008508871.tif 000002
【００３５】
第一段階において、酵素がXaa1とXaa2の間のペプチド結合に攻撃し、より多くのＣ末端アミノ酸を置き換え、標的ペプチドのP1残基（Xaa1）と酵素の間に共有（アシル）結合を形成する。この中間体は、標的ペプチド「ペプチド-アシル-酵素中間体」または簡潔にアシル-酵素中間体といわれる。適当な求核試薬の存在のもと、適切な条件下で、酵素は求核試薬を切断ペプチド基質に添加させ、アシル基転移生成物を生成する。求核試薬がアシル-酵素中間体のカルボキシル基に結合し、アシル-酵素中間体から酵素を移動させると思われる。このように、求核試薬はペプチド基質のカルボキシル基に結合する。
【００３６】
アシル基転移反応を起こす替わりに、アシル-酵素中間体は、水によってアシル基を除去され、加水分解生成物を生成し得る。本発明の突然変異のトリプシンは、加水分解生成物より多くのアシル基転移生成物を選択的に生成するように設計されている。
【００３７】
本発明はまた、標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのＣ末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複する人工のポリペプチドに関する。言い換えると、制限部位ペプチドおよび標的ペプチドが、標的ペプチドのＣ末端のアミノ酸Xaa1を共有し、前記標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む前記制限部位ペプチドを含む人工のポリペプチドに関する。より好ましくは、Xaa1はYまたはFであり、特に好ましくは、Xaa1はYである。
【００３８】
標的ペプチドという用語は従って、配列Pn_P3_P2_Xaa1のペプチドまたはポリペプチドをいう。従って、標的ペプチドとしては、本発明の突然変異のトリプシンの切断部位の1つのアミノ酸、すなわちL、Y、またはFであるアミノ酸Xaa1が挙げられる。ペプチドという用語はポリペプチドを含まない。
【００３９】
人工という用語は、ペプチド配列が人工的であること、例えば、科学者によって、またはコンピューターによって設計されていることを示すのに用いられる。本発明は、上述の配列モチーフXaa1_Xaa2_Hisを含む天然由来のポリペプチドには関しない。本発明はただ人工のものだけに関し、例えば、標的ポリペプチドならびに制限部位ペプチドの両方を含むように設計され、Xaa1およびXaa2が上述のような切断部位Xaa1_Xaa2_Hisを含む、合成的または組み換えによって生成されたポリペプチドに関する。我々の定義によると、標的ポリペプチドはアミノ酸Xaa1をそのＣ末端アミノ酸として有する。制限部位ペプチドは、少なくともアミノ酸Xaa2_His、および任意にそれに加えてＣ末端、さらにアミノ酸を含む。従って、Xaa1_Xaa2_Hisからなる切断部位は、標的ポリペプチドと1つのアミノ酸（Xaa1）で、および2つのアミノ酸（Xaa2_His）で制限部位ペプチドと重複する。当業者がおおむね認識するように、Xaa1およびXaa2が上述のように定義されるXaa1_Xaa2_Hisを含む任意のポリペプチドが、例えば修飾および／または標識化目的のために、例えばペプチド連結反応をするため、またはＣ末端ペプチドアシル基転移をするため、本発明によるトリプシン突然変異体の基質として用いられ得る。
【００４０】
好ましくは、本発明による標的ポリペプチドは20から2000のアミノ酸から構成される。また好ましくは、標的ペプチドは30から1500のアミノ酸から構成される。より好ましくは、かかる標的ポリペプチドは40から1000のアミノ酸から構成される。
【００４１】
好ましい標的ポリペプチドは、診断用途においてまたは治療用途において用いられるポリペプチドである。
【００４２】
好ましい標的ポリペプチドは、例えば抗体およびそのフラグメントのような特異的結合剤を含む。また好ましいのは、ファージディスプレイによって得られる特異的結合剤である（例えばAllen, J.B.ら、TIBS 20 (1995) 511-516を参照されたい）。
【００４３】
抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体のフラグメント、ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物をいう。親抗体と本質的に同じ結合特性を保持する任意の抗体フラグメントもまた、用いられ得る。
【００４４】
好ましくは、本発明による組み換えポリペプチドに含まれる標的ポリペプチドは、治療効果のあるポリペプチドである。かかる治療効果のあるポリペプチドは、好ましくは、治療用抗体、エリスロポエチンおよびインターフェロンからなる群より選ばれる。好ましくは、治療用タンパク質はエリスロポエチンまたはインターフェロンである。
【００４５】
Ｎ末端からこの所望の切断部位への配列の一部として、Xaa1およびXaa2が上述のような配列モチーフXaa1_Xaa2_Hisを含まない標的ポリペプチドとしてかかるポリペプチドのみが用いられるであろうことは、当業者には明白である。当業者は、本発明の突然変異のトリプシンの潜在的な切断部位を有するポリペプチドを排除することに全く問題はないであろう。別の方法として、かかる潜在的な内部の切断部位配列は、通常の突然変異および／またはクローン技術により修飾され、かかる望ましくない内部の切断部位を変化および／または排除し得る。
【００４６】
好ましい態様において、Xaa1およびXaa2が上述の通りの、そのＣ末端に、または近くにXaa1_Xaa2_His配列を含む本発明によるポリペプチドは、組み換え手法によって生成される。当業者は、Ｃ末端に、または近くに上述されるXaa1_Xaa2_Hisの制限部位を含むことによる組み換え体生成に利用しやすい任意の所望の標的ポリペプチドを作製することに全く問題はないであろう。
【００４７】
本発明による制限部位ペプチドは、少なくともアミノ酸Xaa2（RまたはK）-HisをそのＮ末端のXaa2と共に含む。それに加えて、例えば組み換え体生成または簡単な精製を容易にするさらなるアミノ酸Ｃ末端を含み得る。さらに好ましい態様において、組み換えポリペプチドは制限部位ペプチドの一部として、定着したクロマトグラフ法による簡単な精製法、例えばhexa-HisおよびNi-NTA-クロマトグラフ法の使用（Hochuli, E.ら, J. Chromatogr. 411 (1987) 177-184）を可能にするそのＣ末端に、いわゆるHis-tagを含むであろう。
【００４８】
好ましくは、上述のトリプシン突然変異体は、ペプチド基質のＣ末端アシル化方法において用いられる。当業者が認識するように、かかるペプチド基質は本発明による突然変異のトリプシンのための切断部位を含み、方法は適当なペプチド基質を提供する工程、Xaa1後の内部タンパク質分解性切断およびエンドプロテアーゼ標的ペプチド-アシル-中間体の形成を可能にするような条件下で、かかるペプチド基質を本発明によるトリプシン突然変異体と接触させる工程、適当な求核試薬を添加する工程、および求核性攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、エンドプロテアーゼ標的ペプチドアシル-中間体から突然変異トリプシンを放出する工程を含むであろう。
【００４９】
好ましくは、Xaa1およびXaa2が上述のようなXaa1_Xaa2_Hisを含む、上述の突然変異のトリプシンおよび上述のポリペプチドは、アシル基転移によるＣ末端ポリペプチド修飾の方法において、例えばペプチド連結反応の方法において、用いられる。好ましい態様において、本発明は従って、(a)標的ペプチド、および切断部位Xaa1_Xaa2_His（式中、Xaa1はL、Y、またはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含む制限部位ペプチドを含むポリペプチドを提供する工程、(b)前記ペプチドを、Xaa1後の内部タンパク質分解性切断およびエンドプロテアーゼ標的ペプチド-アシル-中間体の形成を可能にするような条件下で、本発明によるトリプシン突然変異体と接触させる工程、(c)適当な求核試薬を添加する工程、および(d)求核性攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、エンドプロテアーゼ標的ペプチドアシル-中間体から突然変異トリプシンを放出する工程を含む、Ｃ末端アシル基転移標的ペプチドを生成する方法に関する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、求核試薬は共有結合を形成するために、電子受容体、この場合はペプチド-アシル-酵素中間体のα-カルボキシル炭素、に電子対を供与する分子である。
【００５１】
求核試薬は好ましくは、第一アミン、イミン、第二アミン、チオール、ヒドロキシル基からなる群より選ばれる。好適な求核試薬としては、例えばアミノ酸；アミノ酸エステル、アミノ酸アミド等のアミノ酸誘導体；アンモニアアミンまたはベンジルアミン等のアミン類が挙げられる。
【００５２】
「アシル化転移」または「アシル化転移した」という用語は、標的ペプチド（Xaa1）のＣ末端アミノ酸が求核試薬に共有結合を介して結合することを示すのに用いられる。求核試薬がチオールである場合は、アシル化転移はチオレーションであり、求核試薬がヒドロキシル基を含む場合は、アシル化転移はエステル化であり、求核試薬がアミンである場合は、アシル化転移はアミノ基転移である。アミノ基転移反応は非常に重要で、本発明による好ましい態様を代表する。
【００５３】
当業者が容易に認識するように、適当な求核試薬は、適当な標的ポリペプチドのＣ末端に所望の性質を導入する修飾をさらに含み得る。本発明は好ましくは、ペプチド、ペプチドアミド、標識、標識されたアミノ酸アミド、標識されたペプチド、標識されたペプチドアミド、非天然アミノ酸、およびポリエチレングリコールからなる群より選ばれる修飾を含む求核試薬に関する。
【００５４】
標識という用語は当業者に周知であり、目的の任意の所望の構造であり得る。好ましくはかかる標識は、色素、例えばアクリジニウムエステル類やジオキセタン等の化学発光基等の発光標識基、または、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体である蛍光色素等の、任意の公知の検出可能な基から選ばれ得る。標識基の他の例は、ルテニウム錯体またはユーロピウム錯体、CEDIA（Cloned Enzyme Donor Immunoassay, 例えばEP-A-0 061 888）に用いられる酵素、および放射性同位体等の発光金属錯体である。
【００５５】
目的の標識の好ましい別の群は、例えばバイオアフィン(bioaffine)結合対の一方の相手を含む。アッセイを実行している間、この種の標識は特異的に相互作用し、好ましくはバイオアフィン結合対の他の相手と非共有結合する。バイオアフィン結合対の好適な結合相手の例は、ハプテンまたは抗原／抗体、ビオチンまたはアミノビオチン、イミノビオチンもしくはデスチオビオチン(destheiobiotin)等のビオチンアナログ／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸アナログ／相補的核酸、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである受容体／リガンドである。この基のうちで好ましい標識は、ハプテン、抗原およびホルモンから選ばれる。特に好ましい標識は、ジゴキシンおよびビオチンのようなハプテンならびにそれらのアナログである。
【００５６】
好ましい修飾の別の群は、非天然アミノ酸およびそれらの誘導体である。最も興味深いのは、天然アミノ酸、例えばアルデヒド官能基、ヒドラジン類、ヒドラジド類、アジド類、α-ハロゲン-ケトン類、に対してオルソゴナルな(orthogonal)官能基を含む非天然アミノ酸である。
【００５７】
求核試薬がポリエチレングリコール（PEG）を含む場合、このPEGは、好ましくは2,000 Daから50,000 Daの範囲の分子量を有する。PEGは、直鎖状または枝状であり得る。より好ましくは、PEGは10,000 Daから40,000 Daの範囲の分子量であろう。好ましくはPEGを含むかかる求核試薬の求核基は、遊離のＮ末端のα-アミノ基を有するアルギニンまたはリシンであろう。このアルギニンまたはこのリシンもまた、ペプチドのＮ末端であり得る。好ましくはかかるペグ化された求核試薬は、Arg-His-PEG、Arg-His-Ala-PEG、Lys-His-PEG、Lys-His-Ala-PEGおよびXaaが任意の天然または非天然ジアミノカルボン酸であるArg-His-Xaa-PEGからなる群より選ばれる。PEG-修飾ジアミノカルボン酸は、これらのアミノ基のそれぞれ１つまたは両方に結合する、１つまたは２つのPEG分子を含み得る。当業者は、ペグ化されたシステインおよび他のような、他の適当なPEG-修飾求核試薬を選択または策定し得る。
【００５８】
当該分野の水準で公知の手順によると、または実施例項に示され本発明の教示で用意された手順によると、本発明のトリプシン突然変異体をコードするポリヌクレオチド配列を得ることが、今や可能である。好ましくは本発明による突然変異のトリプシンは、酵素的に切断され活性酵素をもたらす不活性前駆体（チモーゲン）として表現される。さらなる態様において、本発明は、K60およびD189の両位置でのアミノ酸置換、ならびに位置N143または位置E151のそれぞれでのヒスチジンによる少なくとももう一つのアミノ酸置換を含む突然変異のトリプシンをコードするヌクレオチド配列に関する。
【００５９】
本発明はさらに、宿主細胞中における発現を導くことができるプロモーター配列に実施可能に結合した、本発明による核酸配列を含む発現ベクターを含む。
【００６０】
本発明はさらに、宿主細胞中における発現を導くことができるプロモーター配列に実施可能に結合した、本発明による核酸配列を含む発現ベクターを含む。好ましいベクターは図１に示されるpSTおよびpYT等のプラスミドである。
【００６１】
本発明において有用な発現ベクターは、DNA配列の上流に位置するプロモーターである複製起点を典型的には含み、転写終結配列および残りのベクターが後に続くトリプシン突然変異体をコードするDNA配列が後に続く。発現ベクターはまた、当該分野で公知の他のDNA配列、例えば、発現産物の安定性を提供する安定リーダー配列、発現産物の分泌を供給する分泌リーダー配列、調節する構造遺伝子の発現を可能にする配列（例えば、成長培地における栄養または他の誘導因子の有無によって）、形質転換された宿主細胞における表現型選択を提供できるマーキング配列、および制限エンドヌクレアーゼによる切断の位置を提供する配列を含み得る。
【００６２】
用いられる実際の発現ベクターの性質は、使用される宿主細胞と適合する必要がある。例えば、大腸菌(E.coli)細胞系においてクローニングする場合、発現ベクターは大腸菌細胞（例えばlacまたはtrp）のゲノムから単離されたプロモーターを含むべきである。大腸菌の様々な宿主における適切な複製の起源としては、例えばColE1プラスミド複製起源が挙げられる。適切なプロモーターとしては、例えばlacおよびtrpが挙げられる。発現ベクターが各種のマーカーをコードする配列を含むこともまた好ましい。各種のマーカーは好ましくは、抗生物質抵抗性遺伝子である。各種のマーカーとして、アンピシリン耐性、またはカナマイシン耐性は、好都合に使用され得る。これらの物質の全ては当該分野で公知であり、市販されている。
【００６３】
所望のコード配列および制御配列を含む適切な発現ベクターは、その多くがSambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)に記載される当該分野で公知の標準的な組み換えDNA技術を用いて構築され得る。
【００６４】
本発明はさらに、本発明による突然変異のトリプシンをコードするDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましいのは、複製および／または発現を導くことができ、突然変異のトリプシンの全てまたは機能的部分(functional part)をコードするDNA配列に動作可能に結合する1つ以上の調節DNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞である。適切な宿主細胞としては、例えば、Promega（2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, USA）から入手可能な大腸菌 HB101 (ATCC 33694)、Stratagene（11011 North Torrey Pine Road, La Jolla, CA, USA）から入手可能なXL1-Blue MRF等が挙げられる。
【００６５】
発現ベクターは当該分野で公知の様々な方法により、宿主細胞に導入され得る。例えば、発現ベクターを有する宿主細胞の形質転換はポリエチレングリコール媒介プロトプラスト形質転換法（Sambrookら、1989）により実施され得る。しかしながら、宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、例えば、エレクトロポレーション、遺伝子銃(bolistic)注入、または原形質融合がまた用いられ得る。
【００６６】
いったん発現ベクターを含むトリプシン突然変異体が適当な宿主細胞に導入されると、所望のトリプシン突然変異体の発現を可能にする条件下で宿主細胞が培養され得る。トリプシン突然変異体をコードするDNA配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞は、例えば以下の一般的なやり方：DNAハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子機能の有無、宿主細胞におけるトリプシンmRNA転写物の生成により測定される転写レベルの評価、および遺伝子産物の免疫学的な検出、の一つ以上により特定される。
【００６７】
もちろん、全ての発現ベクターおよびDNA調節配列が、本発明のDNA配列を発現するために一様にうまく機能するわけではないことを理解されたい。また全ての宿主細胞が同じ発現系で一様にうまく機能するわけでもないだろう。しかしながら当業者は、必要以上に実験することなく、本明細書中で提供される手引きを用いて発現ベクター、DNA調節配列、および宿主細胞の中から選択するであろう。
【００６８】
以下の実施例、参考文献、配列表、および図面は本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲において述べられる。変更は発明の意図から逸脱することなく、示された手順で行うことができることを理解されたい。
【実施例】
【００６９】
実施例1
トリプシンバリアント作製の一般的手順:
1.  トリプシンまたはトリプシノーゲンをコードするDNAを含む適当なベクター、例えばpSTベクター(図1参照)を用いるトリプシンまたはトリプシノーゲン内への所望の突然変異の導入。大腸菌ベクターpSTは、もともと、L. Hedstromから構築され、ADH/GAPDH-プロモーターおよびトリプシノーゲンをコードする配列と融合させたα-因子リーダー配列を含有する酵母シャトルベクターを表す; Hedstrom, Lら, Science 255 (1992) 1249-1253を参照のこと。
2.  構築されたベクターの、例えば大腸菌内での形質転換。
3.  それぞれ適当な発現ベクター、例えば酵母ベクターpYT (図1参照)を用いた、修飾トリプシン配列およびトリプシノーゲン配列のサブクローニング。所望の突然変異をこの発現ベクターに直接導入した場合、この工程は必要でない。
4.  大腸菌または酵母での修飾トリプシンまたはトリプシノーゲンの発現。
5.  適当な分離法、例えばカチオン交換クロマトグラフィーを用いる、修飾トリプシンまたはトリプシノーゲンの単離。
6.  トリプシノーゲンが発現された場合は、単離されたチモーゲンは、エンテロキナーゼによる限定的なタンパク質分解によって活性化する必要がある。
7. 適当な精製法、例えばアフィニティクロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーを適用する活性化されたトリプシンの最終精製。
8.  透析
【００７０】
表1に、トリプシンバリアントTn K60E、E151H、N143H、D189K (突然変異アニオン性ラットトリプシンIIに対応し、シグナル配列およびプロ配列はない)の一次配列を示す。
【００７１】
【表１】
2008508871.tif 000003
【００７２】
理論的ペプチド質量:
[理論的pI: 5.41/Mw (平均質量): 23843.00/Mw (モノアイソトピック質量): 23827.59]
【００７３】
実施例2
固相ペプチド合成によるペプチドの調製
別途指定する場合を除き、本出願において記載するペプチドは、バッチペプチド合成装置、例えばApplied BiosystemsのA433で、フルオレニルメチルオキシカルボニル-(Fmoc)-固相ペプチド合成により合成した。この方法では、各場合において、表2に示すアミノ酸誘導体4.0当量を使用した。
【００７４】
【表２】
2008508871.tif 000004
【００７５】
アミノ酸誘導体をN-メチル-2-ピロリジノンに溶解した。ペプチドを、Wang樹脂 (Wang, S.-S., J. Am. Chem. Soc. 95 (1973) 1328-1333)または塩化2-クロルトリチル樹脂 (Barlos, Kら, Tetrahedron Lett. 30 (1989) 3947-3950)において合成した。樹脂は0.5〜1.0 mMol/gで加えた。反応媒体としてのジメチルホルムアミド中のFmoc-アミノ酸誘導体に対し、ジメチルホルムアミド中、4当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよび4当量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールを用い、カップリング反応を20分間行なった。合成の各工程後、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジンによりFmoc基を20分間切断した。固相上の末端アミノ基を、任意に無水酢酸によってアセチル化した。
【００７６】
標識、例えば金属キレート標識もしくはフルオレセイン標識への導入、またはC末端へのPEGの導入は、例えば、金属キレートまたはフルオレセイン結合アミノ酸誘導体(WO 96/03409に記載)の直接取込みにより、固相合成中に行なった。
【００７７】
ペプチドを支持体から離し、20 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlのエタンジオール、1mlのチオアニソール、1.5 gのフェノールおよび1mlの水を用いて、酸不安定性保護基を40分以内に室温で切断した。使用したアミノ酸誘導体に応じて、より少ないラジカル捕捉体を含むカクテルを使用することも可能である。続いて、ペプチドを完全に沈殿させるため、300 mlの冷却ジイソプロピルエーテルを反応溶液に添加し、40分間0℃で維持した。沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、少量の50%酢酸に溶解し、凍結乾燥した。得られた粗製物を、約120分間以内に、適当な勾配(溶離液A: 水、0.1%トリフルオロ酢酸、溶離液B: アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸) で、Vydac RP C18 218TP152050 (カラム50 x 250 mm, 300Å; 15μm)での調製用HPLCにより精製した。溶出された物質を質量分析により同定した。
【００７８】
あるいは、樹脂からペプチドを切断後に、標識、例えばPEGが導入され得る。このため、塩化クロルトリチル(chlortrityl)樹脂を使用することが有利であった。保護されたペプチドを、20分間室温で、10 mlのジクロロメタン中の1%トリフルオロ酢酸を用いて樹脂から切断した。次いで、反応媒体としてのジメチルホルムアミド中、2当量のジシクロヘキシルカルボジイミド、2当量のN-ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび2当量のトリエチルアミンによってペプチドのC末端を活性化し、標識基またはエフェクター基のアミノ酸誘導体1当量を添加した。保護基を、40分間以内に室温で、20 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlのエタンジオール、1mlのチオアニソール、1.5 gのフェノールおよび1mlの水を用いることにより除去する。使用したアミノ酸誘導体に応じて、より少ないラジカル捕捉体を含むカクテルを使用することも可能である。続いて、ペプチドを完全に沈殿させるため、300 mlの冷却ジイソプロピルエーテルを反応溶液に添加し、反応溶液を40分間0℃で維持した。HPLC精製を上記のようにして行なった。
【００７９】
実施例3
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒される、Arg-NH2によるAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミノ基転移
ペプチドAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyを、実施例2に記載のようにFmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂によって合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-NH2は、Bachem (スイス)の市販品であった。
【００８０】
0.1M HepesバッファーpH 8.0に溶解された1 mM Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly (配列番号：2)および5 mM Arg-NH2; 20μM トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K; 100μM ZnCl2または代わりに100μM EDTAを含む1mlの反応容量を25℃で攪拌した。規定した時間間隔後、アリコートを抜き出し、メタノール/水(1:1, v/v)中1%トリフルオロ酢酸の添加により反応を停止させ、抜き出した試料の最終pHを2とした。後者を分析用HPLCによって解析し、図2に示すような反応の経過が示された。合成の最終生成物の同定を質量分析によって確認した。
【００８１】
実施例4
トリプシンバリアントTn K60E、E151H、N143H、D189Kの特異性に対するZn2+イオンの影響
ペプチド基質Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly、およびBz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Glyを、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂によって合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。
【００８２】
0.1M Pipes/Tris-バッファーpH 8.0に溶解した、1 mMの以下のペプチドBz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Ala-Gly (配列番号：3)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly (配列番号：4)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Asp-Ala-Gly (配列番号：5)、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg-Ala-Gly (配列番号：6)またはBz-Ala-Ala-Tyr-Asp-His-Ala-Gly (配列番号：7)の１つ; 20μM トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K、100μM ZnCl2 または代わりにEDTAを含む1mlの反応容量を、30℃で攪拌した。規定の時間間隔後、メタノール/水(1:1、v/v)中1%トリフルオロ酢酸の添加により反応を終了させた。停止させた反応混合物を、分析用HPLCにより分析した。反応の反応速度を図3に示す。最終生成物の同定を質量分析によって確認した。
【００８３】
実施例5
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kにより触媒される反応速度に対する認識配列の影響
配列番号: 3〜19のNα-ベンゾイル化ペプチドを、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂により合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。
【００８４】
0.1M Pipes/Tris-バッファーpH 8.0に溶解した1 mM Nα-ベンゾイル化ペプチド; 20μM トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K; 100μM ZnCl2 を含む1mlの反応容量を30℃で攪拌した。規定の時間間隔後、メタノール/水(1:1、v/v)中1%トリフルオロ酢酸の添加により反応を終了させた。停止させた反応混合物を、分析用HPLCにより分析した。反応の反応速度を図4に示す。最終生成物の同定を質量分析によって確認した。
【００８５】
図4から容易にわかるように、トリプシンバリアント Tn (=K60E、E151H、N143HおよびD189K)は、位置P1にL、Fまたは Y、位置P1´にRまたはK、および位置P2´にHisを含む切断部位に強い優先性を有する。
【００８６】
実施例6
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Ala-Lys(6-CF)-OHによるBz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyのアミノ基転移
Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Glyは、Fmoc-化学を用いた従来の固相ペプチド合成および予め加えたWang-樹脂により合成した。それぞれのアミノ酸構成ブロックは市販されており、種々の供給業者から購入した。Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH を、フラグメント縮合(fragment condensation)によって合成した。保護されたトリペプチドBoc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Ala-OHを、従来の固相ペプチド合成を用いてクロロトリチル-樹脂上で合成した。塩化メチレン/酢酸/トリフルオロ酢酸 (v/v/v 8/1/1)を含む40 mlのカクテルで２回、ペプチドを樹脂から切断した。粗製物を、逆相HPLCにより精製した。他のフラグメントFmoc-Lys(6-カルボキシ-フルオレセイン)の合成を、3 mlのジオキシンおよび3 mlのDMF中、0.6 mmol Fmoc-Lys*HCl、0,655 mMol 6-カルボキシフルオレセイン (Molecular Probesから購入)から行なった。ピペリジンおよび逆相HPLCにより精製した粗製物を用いてFmoc-基を切断した。次いで、保護されたトリペプチドを、DMF中1当量のHBTU (Iris Biotech)および3当量のジイソプロピルエチルアミンで活性化した。1当量のLys(6-カルボキシ-フルオレセイン)を添加し、混合物を室温で2時間攪拌した。次いで、脱保護カクテル(18 mlのトリフルオロ酢酸、0.5 mlの水および0.5 mlのエタンジチオール)を用いて脱保護を行なった。ペプチドを、ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿させ、RP-HPLCにより精製し、良好な収率で得た。
【００８７】
0.1M Pipes/Tris-バッファーpH 8.0に溶解した0.5 mM Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly (配列番号：20)および2.5 mM Arg-His-Ala-Lys(6-CF)-OH; 20μM トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K; 100μM ZnCl2または代わりに100μM EDTAを含む1mlの反応容量を、30℃で攪拌した。規定の時間間隔後、それぞれのアリコートを抜き出し、メタノール/水 (1:1, v/v)中1%トリフルオロ酢酸の添加により停止させ、抜き出した試料の最終pHが2とした。反応経過の解析にHPLCを用い、合成生成物を単離した。後者は、>99%の収率で得られ、図5に示すように質量分析によってさらに解析した。
【００８８】
実施例7
トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒されるArg-His-Gly-PEGによるAKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RHのアミノ基転移
Arg-His-Gly-PEGを、Boc-Arg(Boc)2-His(Trt)-Gly-OHのフラグメント縮合およびNektar/Shearwaterから購入したアミノ-PEG (20kD)により合成した。保護されたトリペプチドの合成およびフラグメントの活性化については実施例6を参照のこと。ここでは、0.5当量のアミノ-PEG (20 kD)を、求核試薬として用いた。脱保護後(カクテルについては実施例6を参照)、RP-HPLCを用いてすべての低分子不純物を分離した。
【００８９】
認識配列Tyr-Arg-HisをそのC末端に含むポリペプチド AKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RH (配列番号：21)を、元のC-末端Asn部分を人工Hisと交換することにより、天然E. coli parvulin 10から産生させる。発現および精製後、それぞれの修飾parvulin 10 (Asn92His)バリアントを、Pipes/Tris-バッファーpH 8.0に溶解する。最終濃度20μMのトリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K、100μM ZnCl2、および過剰のArg-His-Gly-PEGをこの反応混合物に添加する。30℃で攪拌後、メタノール/水 (1:1, v/v)中1%トリフルオロ酢酸の添加により反応を停止させる。HPLC、ゲル電気泳動および／または質量分析により解析を行なう。最終生成物 AKTAAALHIL VKEEKLALDL LEQIKNGADF GKLAKKHSIC PSGKRGGDLG EFRQGQMVPA FDKVVFSCPV LEPTGPLHTQ FGYHIIKVLY RH-Gly-PEGの単離を、従来のタンパク質精製技術、例えばクロマトグラフィー法により行なう。
【００９０】
参考文献のリスト
2008508871.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1は、突然変異トリプシノーゲンの発現に用いたクローニングベクターである。左側に、トリプシノーゲンのコード領域を含む大腸菌シャトルベクターpSTの概略図を示す。該コード領域は、酵母内でのポリペプチド発現に最適化されたpYT-vectorに容易に挿入され得る。トリプシノーゲンのコード領域を含むpYT-ベクターの概略図をこの図の右側に示す。
【図２】図2は、アミノ基転移の速度論であり、a) 100μM EDTAまたはb) 100μM ZnCl2の存在下でのAla-Ala-Tyr-Arg-NH2 (丸)をもたらすトリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによって触媒される、Arg-NH2によるAla-Ala-Tyr-Arg-His-Ala-Gly (三角)のアミノ基転移の時間的経過である。四角は、タンパク質分解による反応の副生成物として形成されるAAYを表す。
【図３】図3は、触媒活性に対するZn2+の影響である。トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189Kによるペプチドターンオーバーの速度に対するZn2+イオンの存在(灰色バー)または非存在(黒いバー)の影響を示す。
【図４】図4は、トリプシンバリアント Tn K60E、E151H、N143H、D189K触媒性(catalyzed)によって触媒される反応速度に対する認識配列の影響である。本発明によるバリアントトリプシンを、切断部位またはその付近に異なるペプチド配列を有するペプチド基質に対する触媒活性について試験した。ペプチド消費の初期速度(v)をnM/分で示す。
【図５】図5は、Bz-Ala-Ala-Tyr-Arg-His-Lys (6-CF)-OHの質量スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
K60位およびD189位の両方にアミノ酸置換、ならびにN143位またはE151位にヒスチジンによる少なくとももう１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異トリプシン。
【請求項２】
K60がEまたはDで置換されている、請求項１記載の突然変異トリプシン。
【請求項３】
D189がK、HまたはRで置換されている、請求項１記載の突然変異トリプシン。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のトリプシン突然変異体の基質としての、標的ペプチドおよび切断部位Xaa1-Xaa2-His（式中、Xaa1はL、YまたはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複する、ポリペプチドの使用。
【請求項５】
(a)  標的ペプチドおよび切断部位Xaa1-Xaa2-His（式中、Xaa1はL、YまたはFであり、Xaa2はRまたはKである）を含み、前記制限部位ペプチドが前記標的ペプチドのC末端のアミノ酸Xaa1で標的ペプチドと重複するポリペプチドを提供する工程、
(b)  前記ペプチドを、Xaa1後の内部タンパク質分解性(endoproteolytic)切断およびエンドプロテアーゼ標的ペプチドペプチド-アシル-中間体の形成を可能にする条件下で請求項１〜３いずれか記載のトリプシン突然変異体と接触させる工程、
(c)  適切な求核試薬を添加する工程、および
(d)  求核性攻撃および標的ペプチドのC末端への前記求核試薬の結合時、エンドプロテアーゼ標的ペプチドアシル-中間体から突然変異トリプシンを放出する工程
を含む、C末端がアシル基転移した標的ペプチドの生成方法。
【請求項６】
修飾を含む前記求核試薬が、アミノ酸アミド、ペプチド、ペプチドアミド、標識、標識されたアミノ酸アミド、標識されたペプチド、標識されたペプチドアミド、およびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜３いずれか記載の突然変異トリプシンをコードするヌクレオチド配列。
【国際調査報告】
2008508871.tif 000011
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