(57)【要約】  本発明は、感染性クローンなどの単利された感染性ポリヌクレオチドを提供し、ＶＲ−２３３２、Ｌｅｌｙｓｔａｄなどと同一性を有するヌクレオチド配列を有し、場合により、さらに、ｎｓｐ２ポリペプチドをコードするＯＲＦ１の領域において欠失を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが細胞に導入されると感染性ウイルス粒子を複製及び産生する前記ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む感染性クローン。
【請求項４】
配列番号１４と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１４のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１４と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１４のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが細胞に導入されると感染性ウイルス粒子を複製及び産生する前記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１４と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１４のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５に対応する少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む感染性クローン。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドがベクターに存在する、請求項１、２、４又は５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが２以上の欠失を含み、各欠失が独立して少なくとも３７個の連続したヌクレオチドである、請求項１、２、４又は５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが単離されたウイルス粒子に存在する、請求項１、２、４又は５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡポリヌクレオチドである、請求項１、２、４又は５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが細胞に存在する、請求項１、２、４又は５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがポリヌクレオチドに操作可能に連結される、請求項１、２、４若しくは５に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項３若しくは６に記載の感染性クローン。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、欠失に存在する外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１、２、４若しくは５に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項３若しくは６に記載の感染性クローン。
【請求項１４】
前記外因性ポリヌクレオチドが検出可能なマーカーをコードする、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド又は感染性クローン。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３の塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３の塩基配列を含む感染性ポリヌクレオチドによってコードされるｎｓｐ２ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続出願データ
本出願は、参照により本明細書中に援用される、２００５年６月２４日出願の米国仮特許出願第６０／６９４，０２１号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ブタ繁殖及び呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ：ｐｏｒｃｉｎｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｖｉｒｕｓ）は、幼若ブタにおける呼吸器障害及び雌ブタにおける繁殖不全（Ｂｅｎｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４：１２７−１３３（１９９２）；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４：１１７−１２６（１９９２）；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、Ｖｅｔ．Ｑ．，１３：１２１−１３０（１９９１））によって特徴付けられる疾患の原因物質であり、現在、大部分の国における風土病である。この症候群は、第一に、１９８７年、米国において「ミステリーブタ病」として認識され、１９９０年、欧州において発見された。２種の原型ウイルス菌株（Ｌｅｌｙｓｔａｄ及びＶＲ−２３３２）は、約４０％まで塩基配列が異なり、２種の相違する遺伝子型を表す。これらは、ヨーロッパ菌株（ＥＵ又はタイプ１、Ｌｅｌｙｓｔａｄ；Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：６２−７２（１９９３））及び北アメリカ菌株（ＮＡ又はタイプ２、ＶＲ−２３３２；Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９））と呼ばれる（Ｆａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１００：２２９−２３５（２００４）；Ｍａｒｄａｓｓｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：６８１−５（１９９４）；Ｍｅｎｇら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４０：７４５−５５（１９９５）；Ｒｏｐｐら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７８：３６８４−３７０３（２００４））。この疾患はまた、ウォバシュ（Ｗａｂａｓｈ）症候群、不思議なブタ疾患、ブタ繁殖及び呼吸障害症候群、ブタ伝染病、ブタ流行性堕胎及び呼吸器障害症候群、青色堕胎疾患、青色耳疾患、青色の堕胎（ａｂｏｒｔｕｓ  ｂｌａｕ）及びｓｅｕｃｈｅｎｈａｆｔｅｒ  ｓｐａｔａｂｏｒｔ  ｄｅｒ  ｓｃｈｗｉｎｅとも呼ばれている。該疾患は、妊娠した雌ブタにおける繁殖不全、あらゆる年齢のブタにおける呼吸器問題によって特徴付けられる。
【０００３】
ＰＲＲＳＶは、ニドビラルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のアルテリビリダエ（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科に属するエンベロープを持ったポジティブセンスＲＮＡウイルスである（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４２：６２９：６３３（１９９７））。ＰＲＲＳＶゲノムは、１５．１〜１５．５ｋｂの長さで変化する（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：６２−７２（１９９３）；Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９））。このゲノムの最初の７５％は、ウイルス複製に本質的なレプリカーゼポリプロテインをコードし、実質的にコードされるプロテアーゼによってより小さなタンパク質に同時翻訳的に加工される２つの大きなオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）（１ａ及び１ｂ）で構成される（Ｓｎｉｊｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：９６１−７９（１９９８））。構造タンパク質は、７個の下流ＯＲＦによってコードされ、３’共通末端の入れ子集合的なサブゲノムＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）から翻訳される（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｆら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：６２−７２（１９９３）；Ｐａｔｔｎａｉｋら、Ｃｅｌｌ，６９：１０１１−１０２０（１９９２））。ＶＲ−２３３２菌株では、ゲノム（１５，４１１塩基）のコーディング領域は、それぞれ１８９及び１５１ヌクレオチドの５’及び３’非翻訳領域の側面に配置される。
【０００４】
ＰＲＲＳＶ菌株のＶＲ−２３３２は、その完全なゲノム配列（Ｐａｔｔｎａｉｋら、Ｃｅｌｌ，６９：１０１１−１０２０（１９９２））、ＰＲＲＳＶのｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｅｓ（ラテン語：異常形態）と呼ばれる欠失したサブゲノムＲＮＡ種を構成的に生産する能力（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７５：１５８−１６９（２０００）；Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０５：７５−８７（２００４））、インビトロ及びインビボでのその増殖特性（Ｍｕｒｔａｕｇｈら、Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１０２：１０５−３４９（２００４））に関して十分に特徴付けられている。さらに、この１５．４ｋｂ  ＮＡ  ＰＲＲＳＶゲノムの感染性クローンが生産され、ブタにおける疾患を引き起こす能力について調べられている（ｐＶＲ−ＨＮ；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３７０２−３７１１（２００３））。
【０００５】
ＰＲＲＳＶは、世界中で重大な経済的損失を引き起こし続けている。ワクチンは利用可能であるが、それらは、１つのＰＲＲＳＶ菌株に基づいており、ＰＲＲＳＶ菌株は抗原レベル及びゲノムレベルで変化することが分かっている。
【発明の開示】
【０００６】
従来の報告は、ＰＲＲＳウイルスのいずれかの菌株の欠失及び／又は突然変異は、多くの場合、ウイルス成長に非常に不都合であることが示唆されている。具体的には、個々の研究所は、ウイルスの３’末端において突然変異を行い、得られたウイルスは、不安定であり、野生型配列に直に戻ってしまい、あるいは成長が非常に悪いか又は全く成長しなかった（Ｌｅｅら、Ｖｉｔｏｌ．，３３１：４７−８２（２００５）；Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：７２３−７３６（２００６）；Ｌｅｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇ．，３４６：２３８−２５０（２００５））。したがって、ヨーロッパ（タイプ１遺伝子型）及びＶＲ−２３３２（タイプ２遺伝子型）の塩基配列の比較において、あまり不都合ではなかったＶＲ−２３３２  ＮＳＰ２で突然変異を行うことは知られていない。しかしながら、新規なタイプ２のＰＲＲＳウイルスとＶＲ−２３３２の全長のゲノム配列の整列によって、成長する変異体が作製できたという洞察を提供し始めた。更なる欠失突然変異生成は、ｎｓｐ２アミノ酸３２４〜８１３との間の領域は、インビトロでの成長に関して必要ではないことを示した。
【０００７】
本発明は、配列番号１と少なくとも８８％の同一性を有する塩基配列、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する単離された感染性ポリヌクレオチドを提供する。また、配列番号１４と少なくとも８８％の同一性を有する塩基配列、及び配列番号１４のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する単離された感染性ポリヌクレオチドが提供される。単離されたポリヌクレオチドは、ベクター、単離されたウイルス粒子、細胞、又はそれらの組合せに存在することができる。ベクターに存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。単離されたポリヌクレオチドは、２以上の欠失を含む、各欠失は、独立して、少なくとも３７個の連続したヌクレオチドであってもよい。単離されたポリヌクレオチドは、さらに、欠失に存在する外因性のポリヌクレオチドを含むことができ、外因性のポリヌクレオチドは、検出可能なマーカーなどのポリペプチドをコードしてもよい。
【０００８】
本発明はまた、配列番号１と少なくとも８８％の同一性を有する塩基配列、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは、細胞内に導入された場合に感染性ウイルス粒子を複製及び産生する。配列番号１４と少なくとも８８％の同一性を有する塩基配列、及び配列番号１４のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの欠失を有する単離されたポリヌクレオチドが提供され、該ポリヌクレオチドは、細胞内に導入された場合に感染性ウイルス粒子を複製及び産生する。単離されたポリヌクレオチドは、ベクター、単離されたウイルス粒子、細胞、又はそれらの組合せに存在することができる。ベクターに存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよい。単離されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。単離されたポリヌクレオチドは、２以上の欠失を含む、各欠失は、独立して、少なくとも３７個の連続したヌクレオチドであってもよい。単離されたポリヌクレオチドは、さらに、欠失に存在する外因性のポリヌクレオチドを含むことができ、外因性のポリヌクレオチドは、検出可能なマーカーなどのポリペプチドをコードしてもよい。
【０００９】
本発明は、さらに、配列番号１と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１のヌクレオチド２０６２〜ヌクレオチド３８６４から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの欠失を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを有する感染性クローンを提供する。また、配列番号１４と少なくとも８８％の同一性、及び配列番号１のヌクレオチド２０６１〜ヌクレオチド３５４５から選択される少なくとも３９個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つの欠失を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを有する感染性クローンが提供される。感染性クローンは、細胞に存在してもよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ポリヌクレオチドに操作可能に連結されてもよい。感染性クローンは、２以上の欠失を含んでもよく、各欠失は、独立して、少なくとも３７個の連続したヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは、さらに、その欠失に存在する外因性のポリヌクレオチドを含むことができ、外因性のポリヌクレオチドは、検出可能なマーカーなどのポリペプチドをコードしてもよい。
【００１０】
また、本発明によって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の塩基配列を含む単離された感染性ポリヌクレオチド、及び、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３の塩基配列を含む感染性ポリヌクレオチドによってコードされるｎｓｐ２ポリペプチドが提供される。
【００１１】
本明細書及び特許請求の範囲に出現する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変形体は、制限的な意味ではない。他に特定されなければ、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つの」は、交換可能に使用され、１以上を意味する。
【００１２】
実施態様の詳細な説明
本発明は、ブタ繁殖および呼吸器疾患症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ＶＲ−２３３２の感染性クローンを含む。本明細書中で使用するとき、用語「感染性クローン」は、２つの構成要素；原核生物の宿主細胞において複製するベクター配列、本明細書中では感染性ポリヌクレオチドと呼ばれる第二のポリヌクレオチドを有するポリヌクレオチドである。インビトロで転写し、ＲＮＡポリヌクレオチドを得て、許容細胞に導入した場合、感染性ポリヌクレオチドは（ＲＮＡとして）複製され、感染性ウイルス粒子を産生する。したがって、感染性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして、ウイルス粒子中のＲＮＡとして、又は単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡとしてベクターに存在することができる。用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドの多量体形態を指し、二重鎖及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。他に注釈がなければ、ポリヌクレオチドは、その相補体を含む。ポリヌクレオチドの相補体の塩基配列は、当業者によって容易に決定することができる。ポリヌクレオチドは、種々の機能を有する塩基配列、例えば、コード配列、及び制御配列及び／又は非転写領域などの非コード配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、天然源から直接得ることができ、又は組換え、酵素的若しくは化学的技術の援助で調製することができる。ポリヌクレオチドは、トポロジーにおいて直鎖状又は環状であり得る。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクター、又は断片などのベクター部分であり得る。
【００１３】
天然に存在していれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは単離され、より好ましくは精製される。「単離された」化合物、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又はウイルス粒子は、天然環境から分離及び別々にされるものである。「精製された」化合物は、天然に関係付けられている他の化合物が少なくとも６０％存在しない、好ましくは７５％存在しない、最も好ましくは９０％存在しないものである。例えば、化学的又は組換え手段を通じて、天然に存在している生物外に生産されるポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの化合物は、それらが天然環境に決して存在しないため、本質的に単離され、精製されていると考えられる。
【００１４】
本発明の感染性ポリヌクレオチドの一例では、感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ７（配列番号１）が含まれる。ＶＲ−Ｖ７はまた本明細書中ではＶ６Ｇ７４７５Ａと呼ばれる。本発明の感染性ポリヌクレオチドの他の例では、ＶＲ−Ｖ５（配列番号２）、ＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ（配列番号３）、及びＶＲ−Ｖ６（配列番号４）が含まれる。配列番号１、２、３、４、５、６及び他のウイルス分子配列はＤＮＡ配列として本明細書中に開示されているが、本発明は、対応するＲＮＡ配列、そのＲＮＡ及びＤＮＡ相補体も同様に意図していることを留意すべきである。
【００１５】
本発明の他の感染性ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと構造的類似性を有するポリヌクレオチドを有する。参照ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、ＰＲＲＳウイルスのヨーロッパプロトタイプ菌株、Ｌｅｌｙｓｔａｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ９６２６２；配列番号１４）、及びＰＲＲＳウイルスの北アメリカプロトタイプ菌株、ＶＲ−２３３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８７３９２；配列番号１５）を含む。類似性は「同一性パーセント」を指し、配列の長さに沿って同一のヌクレオチドの数を最適化するために２つのポリヌクレオチド（即ち、候補感染性ポリヌクレオチドの塩基配列及び参照ポリヌクレオチドの塩基配列）の残基を整列させることによって決定する；共通のヌクレオチドの数を最適化するために、これら配列のいずれか又はその両方におけるギャップは、その整列を作るのに許容されるが、各配列のヌクレオチドは、それでもなお適切な順番で残らなければならない。本発明のいくつかの側面では、ギャップ（欠失とも呼ばれる）は、候補感染性ポリヌクレオチド配列に存在する。候補感染性ポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドと比較されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。候補感染性ポリヌクレオチドは、ＰＲＲＳＶに感染したブタなどの動物から単離され、培養細胞株から単離され、又は組換え技術を用いて生成され、又は化学的若しくは酵素的に合成することができる。２つのヌクレオチド配列は、塩基配列の整列を生成するために日常的に用いられる市販のコンピュータアルゴリズムのいずれかを用いて比較することができる。好ましくは、２つの塩基配列は、ＧＣＧウィスコンシンパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）バージョン１０．３（２００１）のＧＡＰプログラムを用いて比較される。ＧＡＰプログラムは、マッチ数を最大にし、ギャップ数を最小にする２つの完全な配列の整列を見出すためのＮｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用する。好ましくは、全てのＧＡＰサーチパラメータのデフォルト値を使用し、得点マトリックス＝ＮｅｗｓｇａｐＤＮＡ．ｃｍｐ、ギャップ重量＝５０、長さ重量＝３、平均マッチ＝１０、平均ミスマッチ＝０を含む。ＧＡＰサーチアルゴリズムを用いた２つのヌクレオチド配列の比較では、構造類似性は、「同一性パーセント」と呼ばれる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、構造類似性がＧＡＰプログラムを用いて測定した場合、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性の参照ポリヌクレオチドとの構造類似性を有する。
【００１６】
ポリヌクレオチドが感染性ポリヌクレオチドであるかどうかは、ベクターに候補感染性ポリヌクレオチドを挿入し、インビトロで候補感染性ポリヌクレオチドを転写し、得られるＲＮＡ分子で許容細胞をトランスフェクトし、子孫ウイルスＲＮＡ、子孫ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を検出し、感染性ウイルス粒子を検出すること、又はそれらの組合せによって測定することができる。ベクターは、好ましくは、低コピー数であること、大きな（例えば、１５ｋｂ）インサートの挿入後に安定のままであるという特徴を有する。適したベクターの例としては、ｐＯＫ及びｐＯＫ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入ＡＦ２２３６３９、Ｖｉｅｉｒａら、Ｇｅｎｅ，１００：１８９−１９４（１９９１））であり、これらの特徴を有する他のベクターは知られ、利用することができる。ベクターでは、候補感染性ポリヌクレオチドは、プロモーターのすぐ下流にある。有用なプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの高レベルの転写を得るために導入することができるものであり、例えば、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ（配列番号１６）、又はＲＮＡポリメラーゼプロモーターＳＰ６及びＴ３である。候補感染性ポリヌクレオチドの転写は、典型的には、それを直鎖にするためにベクターの制限エンドヌクレアーゼ消化を含み、日常的であり周知なインビトロの転写法を用いてＲＮＡ転写物を生成させる。インビトロの転写のためのキットは、市販されている（例えば、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸから利用可能である）。
【００１７】
インビトロ転写後、ＲＮＡは、日常的な方法を用いて精製し、次に、それを用いて許容細胞にトランスフェクトする。許容細胞の例には、例えば、ＢＨＫ−２１（１ラウンドのウイルス粒子産生を可能にする）、ＣＬ−２６２１、ＭＡ−１０４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３７８）、ＭＡＲＣ−１４５（Ｋｉｍら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３３：４７７−４８３（１９９３））、これらの細胞株からクローニングした細胞株、又は初代ブタ肺胞マクロファージが含まれる。細胞を効率的にトランスフェクトする方法は、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド及びコレステロール（ＤＭＲＩＥ−Ｃ）、及び他の市販されている生産物、好ましくはＤＭＲＩＥ−Ｃの使用を含む。初代ブタ肺胞マクロファージを効率的にトランスフェクトする方法は、当業者に知られている（Ｇｒｏｏｔ  Ｂｒａｍｅｌ−Ｖｅｒｈｅｉｇｅら、Ｖｉｒｏｌ．，２７８：３８０−３８９（２０００））。一般的に、２〜３μｇのＲＮＡをトランスフェクションに用いることができるが、より少量及び多量を用いてもよい。適した期間後、子孫ウイルスＲＮＡの存在は、例えば、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。同様に、子孫ウイルスヌクレオカプシドタンパク質は、例えば、ヌクレオカプシド特異的抗体によって検出することができる。さらに、候補感染性ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞によって産生されるウイルスが別の細胞を感染するかどうかは、感染した細胞からの上清に感染していない許容細胞を晒すことによって検出することができる。場合により、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察してもよい。候補感染性ポリヌクレオチドは、それが子孫ウイルスＲＮＡ、子孫ウイルスタンパク質（ヌクレオカプシド、膜、ＧＰ５など）を産生し、他の許容細胞を感染する場合、感染性ポリヌクレオチドであると考えられる。
【００１８】
本発明のいくつかの側面では、感染性ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ１によってコードされるポリプロテインに存在するいくつかの（１２個であると予測される）ポリペプチドの１つである非構造タンパク質２（ｎｓｐ２）をコードするヌクレオチドの検出を含む。ＰＲＲＳウイルス、及びその感染性ポリヌクレオチドでは、ｎｓｐ２の第一アミノ酸をコードするヌクレオチドは、ＶＲ−２３３２の３８３位のＯＲＦ１アミノ酸グリシン後であると予測される、パパイン様プロテアーゼ１ベータの切断部位を同定することによって決定することができる。
【００１９】
ｎｓｐ２の最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドの同定に関して、ＯＲＦ１ａをコードされるポリプロテインの正確なｎｓｐ２のＣ末端切断部位は、実験的に決定されておらず、したがって、コード領域の３’末端に対応するヌクレオチドは未知である。しかしながら、Ｃ末端切断部位の２つの予測が提案され、１つは、ＶＲ−２３３２のアミノ酸９８０のＧｌｙ｜Ｇｌｙ（２つのグリシン残基の間の縦線は開裂位置を指す）、及び、他はＶＲ−２３３２のアミノ酸１１９７である。全ての利用可能なＰＲＲＳＶ配列の整列では、ＶＲ−２３３２のポリプロテインのｎｓｐ２  Ｃ末端開裂部位（アミノ酸６４６、９８０、１１１６、１１９６、１１９７）でもあり得るこのタンパク質内に、いくつかの完全に保存されたＧｌｙ｜Ｇｌｙダブレットが存在する。他のウイルス及び感染性ポリヌクレオチドのＧｌｙ｜Ｇｌｙダブレットの位置は、図１２に開示されるｎｓｐ２の配列とＧｌｙ｜Ｇｌｙダブレットの比較によって同定することができる。本研究は、アミノ酸９８０、１１６、１１９６又は１１９７に対応するｎｓｐ２の少なくとも３つの切断部位が存在し得ることを示唆している。
【００２０】
ｎｓｐ２ポリペプチドは、Ｎ末端に存在する非常に保存されたキモトリプシン様システインプロテアーゼドメイン（図３ではＣＰ、図９ではＰＬ２として同定される）、及びｎｓｐ２のＣ末端近傍の３〜４個の膜貫通ドメイン（膜貫通ドメインの数はＣ末端切断部位の位置に依存して変化する）を含む。典型的には、ＰＬ２ドメインのアミノ酸をコードするヌクレオチド又は予測される膜貫通ドメインの全ての欠失は、許容細胞において複製し得るが、感染性ウイルス粒子を産生しないポリヌクレオチドをもたらす。したがって、本発明の感染性クローンは、典型的には、完全なＰＬ２ドメイン又は予測される膜貫通ドメインの全ての欠失を含まない。
【００２１】
キモトリプシン様システインプロテアーゼドメインをコードするヌクレオチドは、ＶＲ−Ｖ７（配列番号１）のヌクレオチド１４７４〜１７７６、ＶＲ−２３３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８７３９２）のヌクレオチド１４７４〜１７７６、及びＬｅｌｙｓｔａｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入れ番号Ｍ９６２６２）のヌクレオチド１４８２〜１７８４である。他のＰＲＲＳウイルスの塩基配列のキモトリプシン様システインプロテアーゼドメイン位置は、ＰＲＲＳウイルスによってコードされるｎｓｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列を図１２に開示されるアミノ酸整列を並べ、キモトリプシン様システインプロテアーゼドメインと適合するアミノ酸を核酸がコードするかを決定することによって同定することができる。あるいは、他のＰＲＲＳウイルスのｎｓｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＰＲＲＳウイルスによってコードされるｎｓｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列を、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及び乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）などの他の動脈炎ウイルスによって産生されるｎｓｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列と並べることによって同定することができる。
【００２２】
ＶＲ−Ｖ７（配列番号１）、ＶＲ−２３３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８７３９２）、及びＬｅｌｙｓｔａｄ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ９６２６２）の予測される膜貫通ドメインをコードするヌクレオチドは表１に示される。
【００２３】
【表１】
2008543342.tif 000002
【００２４】
他のＰＲＲＳウイルスのヌクレオチド配列における膜貫通ドメインの位置は、ＰＲＲＳウイルスによってコードされるｎｓｐ２ポリペプチドのアミノ酸配列を図１２に開示されるアミノ酸配列整列と並べ、膜貫通ドメインと適合するアミノ酸をヌクレオチドがコードするかを決定することによって同定することができる。あるいは、膜貫通ドメインの位置は、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂを通じて利用可能である、Ｒｏｓｔら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ３２１−３２６（２００４）によって記載されるＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎアルゴリズム、又はＫｒｏｇｈら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０５：５６７−５８０（２００１））によって記載されるＴＭＨＭＭアルゴリズムなどのコンピュータプログラムを用いて同定することができる。
【００２５】
本発明の感染性ポリヌクレオチドに存在する欠失は、典型的には、キモトリプシン様システインプロテアーゼドメインをコードするヌクレオチドと膜貫通ドメインをコードする核酸との間にあり、ＯＲＦ１のリーディングフレームにおいてフレームシフトを起こさない。上記で検討されるように、欠失は、典型的には、キモトリプシン様システインプロテアーゼドメインをコードする全てのヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードする全てのヌクレオチド、及びそれらの組合せを含まない。いくつかの側面では、例えば、感染性ポリヌクレオチドが配列番号１と構造類似性を有する場合、欠失の５’境界は、ヌクレオチド２３０５、ヌクレオチド２２０５、ヌクレオチド２１０５、又はヌクレオチド２０６２であり、欠失の３’境界は、ヌクレオチド３７７４、ヌクレオチド３８０４、ヌクレオチド３８３４、又はヌクレオチド３８６４である。他の側面では、例えば、感染性ポリヌクレオチドが配列番号１４と構造類似性を有する場合、欠失の５’境界は、ヌクレオチド２３０４、ヌクレオチド２２０４、ヌクレオチド２１０４、又はヌクレオチド２０６１であり、欠失の３’境界は、ヌクレオチド３４５５、ヌクレオチド３４９５、ヌクレオチド３５２５、又はヌクレオチド３５４５である。この欠失は、少なくとも３９個のヌクレオチド、４８個のヌクレオチド、又は５７個のヌクレオチドであり得る。いくつかの側面では、この欠失は、少なくとも２６７個のヌクレオチド、少なくとも２７６個のヌクレオチド、又は少なくとも２８５個のヌクレオチドであり得る。いくつかの側面では、この欠失は、４８９個未満のヌクレオチド、４５９個未満、４２９個未満、又は４０２個未満のヌクレオチドである。感染性ポリヌクレオチドは、ｎｓｐ２領域に１を超える欠失を有してもよい。
ＶＲ−Ｖ７由来であり、欠失を含む感染性ポリヌクレオチドの実施例を表２に開示する。
【００２６】
【表２】
2008543342.tif 000003
【００２７】
＊欠失は、例えば、ウイルスＮｓｐ２デルタ１８０−３２３で削除されるｎｓｐ２のアミノ酸を意味し、ｎｓｐ２のアミノ酸１８０−３２３が削除される。
＊＊プラークサイズは野生型ＶＲ−２３３２によって生成されるプラークと対比される。
【００２８】
欠失を含む感染性ポリヌクレオチドは、欠失の位置に挿入される外因性ポリヌクレオチドを含むことができる。「外因性」ポリヌクレオチドは、外来のヌクレオチド配列、即ち、ＰＲＲＳウイルス及びその感染性クローンに通常は存在しないヌクレオチド配列を意味する。外因性ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、好ましくはコードしている。適切な外因性ポリヌクレオチドは、検出可能なマーカー、例えば、種々の方法によって容易に検出される分子をコードするものを含む。例としては、蛍光性ポリペプチド（例えば、緑色、黄色、青色又は赤色蛍光性タンパク質）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及び、蛍光、酵素活性又は免疫学的特徴によって検出可能な他の分子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｆｌａｇ、６×ｈｉｓ、ＨｉｓＧｌｎ（ＨＱ）金属結合ペプチド、及びＶ５エピトープ）を含み、典型的には、細胞、例えば、培養細胞、動物から取り出した組織試料において検出される場合に有用である。用いることができる他の外因性ポリヌクレオチドは、細胞及び病原体などの他の実体によって発現されるポリペプチドをコードするものである。外因性ポリヌクレオチドの発現は、外来抗原を発現する感染性ポリヌクレオチドをもたらす。外因性ヌクレオチド配列の例としては、病原体、好ましくはブタ病原体、例えば、ブタサーコウイルス・タイプ２、マイコプラズマ・ヒオニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（例えば、Ｍ．ヒオニューモニアエのＰ４６及びＰ６５タンパク質）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）（例えば、Ｌ．イントラセルラリスの外膜タンパク質）、ＰＲＲＳＶの異なる菌株のＯＲＦ５、及びストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）（例えば、Ｓ．スイスの３８ｋＤａタンパク質）によって発現されるタンパク質をコードするものが含まれる。ｎｓｐ２ポリペプチドは、Ｂ細胞エピトープを融資、免疫原生であることが期待される。外来エピトープのｎｓｐ２ポリペプチドへの封入は、外来エピトープの免疫応答をもたらすことが期待されている。外因性ポリヌクレオチドの追加の実施例は、例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６などの生物学的応答変更因子をコードするものを含む。
【００２９】
外因性ポリヌクレオチドは、ｎｓｐ１α及びｎｓｐ１βをコードしているオープン・リーディング・フレームを含むフレーム中にある欠失領域に挿入され、１を超える外因性ポリヌクレオチドは、タンデムに挿入され得て、例えば、３つのｃ−ｍｙｃエピトープをコードする塩基配列が存在し得る。この欠失の位置に挿入される外因性ポリヌクレオチドを含む感染性ポリヌクレオチドの全サイズは、典型的には、（ポリＡテールを含む）１６，０００塩基未満、１５，８００塩基未満、１５，６００塩基未満、１５，４００塩基未満、又は１５，２００塩基未満である。インサートは、Ｎｓｐ２Δ３２４−４３４、Ｎｓｐ２Δ３２４−５２３、Ｎｓｐ２Δ５４３−６３２、Ｎｓｐ２Δ６３３−７２６、Ｎｓｐ２Δ５４３−７２６、Ｎｓｐ２Δ７２７−８１３、又はＮｓｐ２Δ３２４−７２６欠失、好ましくは、Ｎｓｐ２Δ３２４−４３４、Ｎｓｐ２Δ５４３−６３２、Ｎｓｐ２Δ６３３−７２６、Ｎｓｐ２Δ５４３−７２６、Ｎｓｐ２Δ７２７−８１３、又はＮｓｐΔ３２４−７２６欠失を有する感染性ポリヌクレオチドに存在し得る。欠失の位置に外因性ポリヌクレオチドを含む感染性クローンの好ましい例には、２３８個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質をコードするコード領域を含むＮｓｐ２Δ３２４−４３４欠失を有する感染性ポリヌクレオチド、２３８個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質をコードするコード領域を含むＮｓｐ２Δ５４３−６３２欠失を有する感染性ポリヌクレオチド、１０個のアミノ酸のｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、配列番号１７）をコードするコード領域を含むＮｓｐ２Δ３２４−４３４欠失を有する感染性ポリヌクレオチド、１０個のアミノ酸のｃ−ｍｙｃエピトープをコードするコード領域を含むＮｓｐ２Δ３２４−４３４欠失を有する感染性ポリヌクレオチド、１０個のアミノ酸のｃ−ｍｙｃエピトープのタンデムリピートをコードするコード領域をそれぞれ含むＮｓｐ２Δ３２４−７２６又はＮｓｐΔ５４３−７２６欠失を有する感染性ポリヌクレオチドが含まれる。
【００３０】
感染性ポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターに存在し、感染性ポリヌクレオチド及びベクターの組合せは、感染性クローンと呼ばれ、逆遺伝学を通じて作製される。ベクターは、接合したポリヌクレオチドの複製をもたらすように別のポリヌクレオチドが接合さえてもよいプラスミド、ファージ又はコスミドなどの複製ポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの構築は、当該技術分野において知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を採用する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。さらにクローニング（ポリヌクレオチドの増幅）するためのベクター、即ちクローニングベクターが提供され、又はコード領域によってコードされるポリペプチドを発現させるためのベクター、即ち発現ベクターが提供され、あるいはそれらの組合せが提供される。用語「ベクター」は、限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、又は人工染色ベクターを含む。典型的には、ベクターは、細菌宿主、例えば、大腸菌に複製することができる。好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【００３１】
ベクターの選択は、選択マーカー、ベクター複製速度などの得られる構築体における様々な所望の特徴に依存する。好ましくは、感染性クローンの一部として用いるのに適したベクターは、クローニングベクター及び発現ベクターの両方である。有用なベクターは、宿主細胞に低コピー数を有する。本明細書中でベクターをクローニング又は発現するために適切な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞である。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌する。適切な原核細胞は、真正細菌、例えば、グラム陰性生物、例えば、大腸菌又はＳ．チフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。感染性クローンを作製し、操作し、維持するのに有用な例示的な宿主細胞あ、ＤＨ−５α、ＤＨ−１（ＡＴＣＣ３３８４９）、及びＡＧ−１、好ましくは、ＤＨ−１又はＡＧ−１である。
【００３２】
ベクターは、感染性ポリヌクレオチドに操作可能に連結した制御配列を含む。用語「操作可能に連結される」とは、成分の並列を意味し、それらは、意図された様式で機能するように許可された関係にある。制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合可能な条件下で達成されるような方法で接続されると、本発明の感染性ポリヌクレオチドに「操作可能に連結される」。典型的には、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの非常な特異的結合を提供するものであり、このようなプロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６、及びＴ３を含む。典型的には、プロモーターは、感染性ポリヌクレオチドの第一のヌクレオチドのすぐ上流に位置される。好ましくは、ＧＧＴは、プロモーターと感染性ポリヌクレオチドの第一のヌクレオチドとの間に挿入される。場合により及び好ましくは、ベクターはまた、ポリＡ領域の下流の肝炎デルタウイルスリボザイムを含む。
【００３３】
ベクターは、場合により及び好ましくは、典型的には、不活性化若しくは検出する、又は成長培地で化合物によって検出される分子をコードする１以上の選択マーカーを含む。例えば、選択マーカー配列の封入は、形質転換された細胞を抗生物質に耐性にさせ、又は形質転換した細胞における化合物の特異的な代謝を与えることができる。選択マーカー配列の例は、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、及びネオマイシンに対する耐性を与える配列である。
【００３４】
感染性クローンにおいてｎｓｐ２ポリペプチドをコードするヌクレオチドの欠失を生じさせる場合、当該技術分野において知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。当業者は認識するように、欠失又は他の変更などの期待されるヌクレオチド配列の存在及び他の突然変異の不存在を塩基配列分析によって検証することは、感染性クローの構築中（及び、感染性クローンの構成欠失で場合には）の標準的な実施である。同様に、候補感染性ポリヌクレオチドは、感染性であるかどうかを決定するために試験される場合、野生型ウイルスの不在を塩基配列分析によって検証することが標準的な実施である。
【００３５】
本発明はまた、配列番号５及び配列番号６に開示される単離された感染性ポリヌクレオチド、及び配列番号５又は配列番号６と構造類似性を有する感染性ポリヌクレオチドを含む。構造類似性を測定する方法は、本明細書中に記載される。好ましくは、本発明のこの側面の感染性ポリヌクレオチドは、配列番号５又は配列番号６と比較して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の構造類似性を有する。配列番号５又は配列番号６と構造類似性を有するポリヌクレオチドは、ウイルス粒子に存在し、許容細胞に晒される場合、ポリプロピレンが許容細胞において複製され、感染性ウイルス粒子を生産するとすれば、感染性ポリヌクレオチドであると考えられる。
【００３６】
本発明はまた、単離されたウイルス粒子を含む。本明細書中で使用するとき、用語「ウイルス粒子」及び「ウイルスの粒子」は、互換可能に用いられ、エンベロープによって囲まれた本発明のポリヌクレオチドを意味する。本発明のウイルス粒子は、許容培養細胞に添加される場合、複製され、より多くのウイルス粒子の産生をもたらすことができる。
【００３７】
ウイルス粒子は、インビボ又は細胞培養における継代によって成長することができる。インビボでの継代は、ブタの接種を含む（Ｆａａｂｅｒｇら、米国特許第７，０４１，４４３号）。細胞培養における継代は、培養細胞にウイルス粒子を晒し、ウイルスがより多くのウイルス粒子を複製及び産生するような安定な条件下で細胞をインキュベートすることを含む。好ましくは、培養細胞は、不死化又は形質転換した細胞株（即ち、細胞は無限に分裂できない）ではない。好ましくは、初代ブタ肺胞マクロファージは、細胞培養における継代に用いられる（Ｆａａｂｅｒｇら、米国特許第７，０４１，４４３号）。
【００３８】
本発明のウイルスは、不活性であり得て、即ちインビボ及び／又は細胞培養において再生できないようにさせる。不活性の方法は、当業者に知られ、例えば、本発明のウイルス粒子をホルマリン、アセトアルデヒドなどを含むアルデヒド試薬；クレゾール、フェノールなどの反応性酸性アルコール；安息香酸、ベンゼンスルホン酸などの酸；ベータ−プロピオラクトン及びカプロラクトンなどのラクトン；活性化ラクタム、カルボジイミド及びカルボニルジヘテロ芳香族化合物、例えば、カルボニルジイミダゾールなどの標準的な化学的不活性化剤で処理することを含む。紫外線照射及びγ線照射などの照射はまた、ウイルスを不活化させるために用いることができる。
【００３９】
弱毒化ウイルス粒子（即ち、ブタにおけるミステリーブタ病の症状を引き起こす能力が減少したウイルス）、及び弱毒化ウイルス粒子を作製する方法もまた本発明において提供される。弱毒化ウイルスを製造する方法は、当業者に知られている。典型的には、本発明のウイルスは、継代され、即ち、使用して、培養中の細胞を感染させ、再生させ、次に回収する。このプロセスは、ブタにおけるウイルスの毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）が減少するまで繰り返される。例えば、ウイルスは、細胞培養において１０回継代され、ウイルスの毒性を測定する。毒性が減少しなかった場合、動物に注射しなかったウイルスは、細胞培養にさらに１０回継代する。このプロセスは、毒性が減少するまで繰り返される。一般的に、毒性は、ウイルスをブタに接種し、臨床的症状の存在及び／又はＬＤ５０を評価することによって測定される（例えば、Ｈａｌｂｕｒら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８：１１−２０（１９９６）、Ｈａｌｂｕｒら、Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，３２：２００−２０４（１９９５）、及びＰａｒｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，５７：３２０−３２３（１９９６）を参照されたい）。好ましくは、毒性は、弱毒化されたウイルスが動物の死を引き起こさず、好ましくは疾患の臨床的症状を引き起こさない程度に減少される。
【００４０】
典型的には、本発明の弱毒化ウイルスを生成するのに有用な細胞培養は、ブタ以外の哺乳動物起源の細胞を含む。ブタ以外の哺乳動物細胞培養の例としては、例えば、細胞株ＭＡ−１０４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３７８）、細胞株ＭＡＲＣ−１４５（Ｋｉｍら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３３：４７７−４８３（１９９３））、及び細胞株ＣＬ−２６２１（Ｂａｕｓｔｉｔａら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５：１６３−１６５（１９９３））を含む。好ましくは、混合した細胞培養は、本発明の弱毒化ウイルス粒子を生成するために用いられる。混合した細胞培養において、少なくとも２種の細胞が存在する。好ましくは、混合した細胞培養は、不死化又は形質転換した細胞株及び初代細胞培養を含む。混合した細胞培養は、不死化又は形質転換した細胞株においてウイルスがゆっくり再生し、あるいは全く再生しない場合に特に有用である。混合細胞培養における使用のための不死化又は形質転換した細胞株の好ましい例としては、例えば、細胞株ＭＡＲＣ−１４５（Ｋｉｍら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３３：４７７−４８３（１９９３））、及び細胞株ＭＡ−１０４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３７８）が挙げられる。好ましくは、混合した細胞培養における使用のための初代細胞培養の好ましい例としては、初代ブタ肺胞マクロファージが挙げられる。
【００４１】
本発明は、実行可能であるものを含む、表２に開示されるポリヌクレオチドに存在するｎｓｐ２コード領域によってコードされるポリペプチドをさらに含む。表２に開示されるポリヌクレオチドに存在するｎｓｐ２コードによってコードされるポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む抗体はまた、本発明に含まれる。用語「抗体」は、それとは反対に特定されていなければ、標的抗原に対して結合特異性を保持している全抗体の断片を含む。このような断片は、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）を含む。本明細書中で使用するとき、ポリペプチドに「特異的に結合する」ことができる抗体は、抗体の合成を誘導する抗原のエピトープだけと相互作用し、又は構造的に関連したエピトープと相互作用する抗体である。エピトープに「特異的に結合する」抗体は、適切な条件下で、潜在的な結合標的の多様性の存在下でさえそのエピトープと相互作用する。本明細書中で使用するとき、用語「ポリペプチド：抗体複合体」とは、抗体が、ポリペプチド、又はそのサブユニット若しくは類似体に特異的に結合する場合に生じる複合体を意味する。いくつかの態様では、本発明の抗体は、ＶＲ−２３３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８７３９２、ＯＲＦ１アミノ酸３８４−１３６３（Ａｌｌｅｎｄｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：３０７−３１５（１９９９）を併せて参照されたい）又はＯＲＦ１アミノ酸３８４−１５８０（同様に、Ｚｉｅｂｕｈｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：８５３−８７９（２０００）を併せて参照されたい））によってコードされる全長ｎｓｐ２ポリペプチドに特異的に結合しないものを含む。このような抗体は、当該技術分野において知られる日常的な方法を用いて同定することができる。
【００４２】
本発明の抗体は、無傷のポリペプチドを用いて調製することができる。場合により、本明細書中に記載されるｎｓｐ２ポリペプチドは、ポリペプチドの免疫学的な特性を改善するための担体ポリペプチドに共有結合又はコンジュゲートすることができる。有用な担体ポリペプチドは、当該技術分野において知られている。
【００４３】
ポリクローナル抗体の調製は周知である。ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、トリ、ウサギ、マウス、ハムスター、モルモット及びラットなどの種々の温血動物、並びにトランスジェニックヒツジ、ウシ、ヤギ又はブタなどのトランスジェニック動物を免疫原で免疫することによって得ることができる。得られる抗体は、プロテインＡなどのＦｃ結合部分を有するアフィニティーカラムを用いることによって他のタンパク質から分離することができる。
【００４４】
モノクローナル抗体は、当業者に馴染みの有る様々な技術によって得ることができる。簡単には、所望の抗原で免疫した動物由来の脾臓細胞は、通常、ミエローマ細胞と融合させて不死化される（例えば、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照されたい）。モノクローナル抗体は、当該技術分野において周知な技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。
【００４５】
いくつかの態様では、抗体は、例えば、ファージディスプレイによって、又はコンビナトリアル法によって組換え的に生成することができる。ファージディスプレイ及びコンビナトリアル法は、本明細書に記載されるポリペプチド、又は生物学的に活性なそのサブユニット又は類似体に結合する組換え抗体を分離するために用いることができる（例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号を参照されたい）。このような方法は、ヒトモノクローナル抗体を生じさせるために用いることができる。
【００４６】
本発明はまた、感染性ポリヌクレオチド、ＰＲＲＳポリヌクレオチド、ウイルス粒子、又は本発明の抗体を含む組成物を提供する。このような組成物は、典型的には、医薬として許容される担体を含む。本明細書中で使用するとき、「医薬として許容される担体」には、医薬製剤と適合可能な生理食塩水、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗生剤及び抗真菌剤、等浸透圧及び吸収遅延剤などが含まれる。付加的な活性化合物はまた、組成物に導入することができる。
【００４７】
組成物は、製薬の技術分野において周知な方法によって調製されてもよい。一般的には、組成物は、意図された投与経路と適合するように調合され得る。投与経路の例には、灌流及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮的（局所的）、及び経粘膜的な投与が含まれる。溶液及び懸濁液は、下記の成分：投与用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗生物質；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤；ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオンなどの電解質；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤を含むことができる。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いて調整することができる。組成物は、アンプル、使い捨てシリンジ又はガラス製若しくはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００４８】
組成物は、無菌水溶液（水溶性である場合）又は分散液、及び無菌溶液又は分散液の即座の調整のための無菌的な粉末を含むことができる。静脈内投与に関しては、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は、典型的には、注射可能な使用に適している場合、容易なシリンジ注入可能性が存在する程度まで流動的でなければならない。製造及び貯蔵の条件下で安定であり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適した混合物を含む溶媒又は分散媒体であり得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことが可能である。
【００４９】
無菌溶液は、上記で列挙した成分の１つ又は組合せを含む適した溶媒に必要量で活性化合物（即ち、本発明の感染性ポリヌクレオチド又はＰＲＲＳウイルス）を導入することによって、必要に応じて、ろ過滅菌することによって調製することができる。一般的には、分散剤は、塩基性分散媒体及び上記で列挙した成分から必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに活性化合物を導入することによって調製される。無菌の注入液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、活性成分、及び予め滅菌ろ過したその溶液から任意の所望の成分の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥である。
【００５０】
経口組成物は、一般的には、不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口的治療投与の目的のために、活性成分は、賦形剤を組み込み、錠剤、トローチ、又はカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で用いることができる。これらの組成物はまた、粉剤に形成させ、又は無菌溶液に懸濁してもよく、その結果、これらの粉剤及び／又は溶液は、動物用食餌又は動物の飲料水に添加することができる。これらの組成物は、ブタに経口的にワクチン摂取を促進するための種々の既知の薬物によって適切に甘くし又は風味付けることができる。
【００５１】
活性な化合物はまた、ポリヌクレオチド剤の投与に適した任意の方法、例えば、遺伝子銃、バイオインジェクター、及びパッチ、並びに無針注射法、例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（米国特許第６，１９４，３８９号）によって開示されるマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術によって投与することができる。さらに、鼻腔内輸送は、例えば、Ｈａｍａｊｉｍａら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８：２０５−２１０（１９９８）に記載されるように可能である。リポソーム及びマイクロカプセル化もまた使用可能である。
【００５２】
活性化合物は、制御放出製剤などの体内から迅速な排出に対する化合物を保護するであろう担体と共に調製されてもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような調合物は、標準的な技術を用いて調製することができる。この材料はまた、例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販され入手可能である。リポゾーム懸濁液はまた、医薬として許容される担体として使用することもできる。これらは、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【００５３】
このような活性化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％までの致死投薬量）及びＥＤ５０（個体群の５０％における治療的に有効な投薬量）を決定するために、細胞培養又は実験動物において標準的な医薬的手法によって測定することができる。毒性効果と治療効果との間の投薬量の比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現することができる。高い治療指標を提示する化合物が好ましい。
【００５４】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、この分野における使用のための投薬量範囲を調製するために用いられる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性たほんどないか又は毒性がないＥＤ５０を含む血中濃度範囲内にある。投薬量は、採用される剤形及び使用される投薬経路に依存して、この範囲内で変化することができる。
【００５５】
組成物は、１日１回以上〜１日おきに１回を含む１週間当り１回以上で投与することができる。当業者は、ある種の因子は、限定されないが、疾患又は障害の重症度、前回の値治療、患者の一般的な健康及び／又は年齢、及び他の既存の疾患を含む、患者を効果的に治療するのに必要な投薬量及び時間に影響を与えるかもしれないことを理解するであろう。さらに、有効量のポリペプチドでの患者の治療は、１回治療を含むことができ、又は、好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【００５６】
本発明は、本明細書中に記載される組成物を用いる方法を含む。一側面では、本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染によって引き起こされ得る動物におけるミステリーブタ病の１以上の症候を治療する方法を含む。この方法は、ミステリーブタ病、又はミステリーブタ病の症候を有するか又はその危険性のある動物に有効量の本発明の組成物を投与することを含む。
【００５７】
ミステリーブタ病、又はミステリーブタ病の症候の処置は、予防的であり得て、又は、代替的に、その疾患又は症候の後から開始することができる。本明細書中で使用するとき、用語「症候」は、ミステリーブタ病の対象に物的証拠を意味する。ミステリーブタ病と関連した症候、及びこのような症候の評価は、技術分野において日常的であり、知られている。症候の例には、堕胎、発熱、昏睡、肺炎、耳の赤／青変色、強制呼吸（呼吸不全）、及び呼吸数の増加（頻呼吸）が挙げられる。予防的、例えば、ＰＲＲＲＳウイルスによって引き起こされる状態の対象の顕性症状の前に開始される処置は、本明細書中では、その疾患又は症候を発症する「危険性」のある対象の処置を意味する。典型的には、「危険な状態にある」動物は、その疾患または症候を有する動物が、ＰＲＲＳウイルスに晒されていると診断された及び／又はその可能性がある領域にいる動物である。したがって、組成物の投与は、本明細書に記載される状態の出現の前、出現中、出現後に実行することができる。状態の発生後に開始した治療は、状態の１つの症候の重症度の減少、又は症候の完全な除去をもたらすかもしれない。
【００５８】
いくつかの側面では、この方法は、典型的には、有効量の本発明のウイルス粒子を含む組成物を動物に投与することを含む。「有効量」とは、ミステリーブタ疾患の症候の発現を妨げ、疾患の症候の重症度を減少させ、及び／又は完全に症候を取り除くために有効な量である。典型的には、有効量は、ＰＲＲＳウイルスにさらに晒されている最中に動物を保護する体液性及び／又は細胞性免疫応答をもたらす量である。組成物に使用されるウイルス粒子は、本明細書中に記載される欠失を有する感染性ポリヌクレオチドを含むことができる。場合により、感染性ポリヌクレオチドはまた、欠失位置にある外因性ポリプロピレン瑛ヌクレオチドを含む。欠失を有するウイルス粒子（又は欠失の位置に存在する外因性ポリヌクレオチド）を用いる利点は、それが、その領域に存在する野生型ＰＲＲＳウイルスを含む他のＰＲＲＳから容易に区別できることである。ウイルス粒子は、動物からウイルスの分離、その後、例えば、配列決定、制限酵素消化、又はＰＣＲを基礎とした特定のヌクレオチドのゾウフルによって同定することができる。このような「マークされた」ウイルス粒子は、多くの場合、当該技術分野において、マーカーワクチンを意味する。
【００５９】
本発明の他の側面では、本明細書中に記載される感染性クローン及び／又は感染性ポリヌクレオチドは、可変遺伝子挿入を調査し、全長のウイルスというよりはむしろ二者択一的に発現ＲＡＮ又はタンパク質のいずれかを調査し、ウイルス組換えを調査し、及び一部切断のｎｓｐ２と比べた全長ｎｓｐ２の免疫原性を調査するために用いることができる。
【実施例】
【００６０】
実施例１
北アメリカブタ繁殖及び呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）プロトタイプＶＲ−２３３２を開発し、各進歩的バージョンは、ｗｔ株のＶＲ−２３３２と比較した場合、従来バージョンよりも少ないヌクレオチド変化を有する。各感染性クローンの子孫ウイルスを回収し、ヌクレオチド配列の確認、インビトロでの増殖率、及びプラークサイズについて分析した。１つの感染性クローンからの子孫は、強固なインビボ複製を確実にし、ｗｔウイルスと比べてα−ＰＲＲＳＶ抗体の出現によって見られた。インビボの子孫のノーザンブロット分析はまた、異常形態（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｅｓ）（稀な形態）と呼ばれる不完全なサブゲノムＲＮＡ種は、全長ゲノムと共に存在していることを明らかにした。継代の感染したＭＡ−１０４細胞の一致したノーザンブロット分析は、組換えウイルスだけが、インビボ感染に見られるＲＮＡ種と類似した全長及び異常なＲＮＡの両方を徐々に得られることを示した。
【００６１】
材料及び方法
細胞及びウイルス菌株。ＭＡ−１０４細胞又はその子孫のＭＡＲＣ−１４５細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１１７１）、ＰＲＲＳＶ複製を支持するアフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８：３７４−８１（１９９６））は、１ｍｇ／ｍｌ  ＮａＨＣＯ３、及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したイーグル最小エッセンシャル培地（ＥＭＥＭ）（ＪＰＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５６４１６）中で、５％ＣＯ２下、３７℃で維持した。培養細胞は、ＲＮＡを用いてトランスフェクトし、又は単相増殖により７０〜８０％コンフルエントに到達した場合に、ウイルスで感染させた。ＰＲＲＳＶの北アメリカプロトタイプ菌株ＶＲ−２３３２及びＩｎｇｅｖａｃ（登録商標）ＭＬＶは、前述した（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，７９：１８９−２００（２００１））。菌株ＶＲ−２３３２は、両細胞株で均等なタイターになるまで増殖させる。
【００６２】
ウイルスＲＮＡ精製。ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、記載されるように精製した（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：９２５−９３０（１９９４）；Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，７９：１８９−２００（２００１））。簡単には、ＶＲ−２３３２で感染させたＭＡＲＣ−１４５細胞からの上清は、感染の４日後（ｐ．ｉ．）に回収した。１２，０００ｒｐｍでの遠心分離による細胞残屑の除去後、その上清を２ｍｌの０．５Ｍスクロースクッション上に播種し、７６，０００×ｇで４時間遠心分離した。ペレットにしたビリオンｈ、０．５ｍｌ  ＬＥＳ（０．１Ｍ  ＬｉＣｌ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１．０％  ＳＤＳ）に再懸濁させ、さらに、１００μｇのプロテイナーゼＫの添加によって、５６℃で消化し、全てのタンパク質を除去した。インキュベーションの１０分後、ｖＲＮＡは、酸性フェノール及びフェノール／クロロホルムを用いて数回抽出し、次に、７０％ｖ／ｖエタノールで沈殿させた。ペレット化したｖＲＮＡは、即座に、５０μｌ  Ｈ２Ｏ又はＲＮａｓｅ不含ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【００６３】
全長ウイルスｃＤＮＡの構築。ｃＤＮＡ合成は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｖｉａｎ  ＨＳ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｓｉｇｍａ，ＨＳＲＴ−１００）を用いて行った。８個のＰＣＲプライマー（表３）は、完全なＶＲ−２３３２ゲノムを変換する４個の重複するｃＤＮＡ断片を増幅するために使用した（図２）。サイクル条件は、９４℃、２分、次に、９４℃１５秒、６８℃４〜５秒を３５サイクル、次に６８℃５分であった。各ＰＣＲ断片は、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ４５０００１）を用いてｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングした。各断片を示すプラスミドは、ヌクレオチド配列分析した。親のＶＲ−２３３２配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８７３９２）と比較して最小のヌクレオチド変異体を含む断片を用いて、図２に示されるように、全長ｃＤＮＡを組み立てた。各重複領域では、固有の制限酵素部位を利用して、隣接断片を繋げた。４個の消化した断片は、全長ゲノム配列を代表し、修飾した低コピーのプラスミドベクター（ｐＯＫ１２ＨＤＶ−ＰａｃＩ）に段階的に正確に組み立てた。このベクターは、ｐＯＫ１２（Ｖｉｅｉｒａら、Ｇｅｎｅ，１００：１８９−１９４（１９９１））の対応する部位に、ＨＤＶアンチゲノムリボザイム及び転写ベクター２．０（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３３２３−３３２７（１９９７）；Ｐａｔｔｎａｉｋら、Ｃｅｌｌ，６９：１０１１−１０２０（１９９２）由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼターミネーターを含む２４４ｂｐのＳｍａＩ−ＳａｃＩＩを挿入することによって、ＨＤＶリボザイムを含むように修飾した。この２４４ｂｐ断片のＮｃｏＩ制限酵素部位は、プライマーセット５’ｐＯＫ１２ＨＤＶ−２１５７／３’ｐＯＫ１２ＨＤＶ−２５７及び５’ｐＯＫ１２ＨＤＶ−２５７／ポリＡ−修飾（表３）でオリゴヌクレオチド変異、次に、融合ＰＣＲによって、固有のＰａｃＩ部位に置換した。全長ｃＤＮＡクローンでは、ウイルスゲノム配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、１又は２個のＧ残基及びＴ残基によって、次に、５０個のヌクレオチドのポリアデニル酸テールによって先行させた。組み立てられたクローンは、大腸菌ＤＨ５α菌株において増殖させ、次に、全ゲノムヌクレオチド配列を決定した。
【００６４】
【表３】
2008543342.tif 000004
【００６５】
全長ｃＤＮＡクローンの修飾及び配列分析。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｐＶＲ−Ｖ４〜ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａからの全てのｃＤＮＡクローンを修飾した。次に、完全なゲノムｃＤＮＡプラスミドインサートは、適切な配列プライマー（表３）を用いて、塩基配列分析のためにミネソタ大学のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＧＡＣ）に寄託した。ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７５７５Ａを通じたｐＶＲ−Ｖ４、親のＶＲ−２３３３２のそれら、その対応する弱毒化ワクチン菌株、Ｉｎｇｌｅｖａｃ  ＭＬＶ、及びｐＶＲ−ＨＮ、ＶＲ−２３３２の第一の感染性クローンの間の配列の相違を表４に列挙する（Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９）；Ｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，７９：１８９−２００（２００１）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｔｏｒｌ．７７：３７０２−３７１１（２００３））。
【００６６】
【表４Ａ】
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【００６７】
【表４Ｂ】
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【００６８】
【表４Ｃ】
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【００６９】
インビトロ転写。全長ｃＤＮＡクローンは、ポリ（Ａ）テールの下流で切断するＰａｃＩでの切断により直鎖状にした。キャップ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体］ＲＮＡ転写物は、ｍＭＥＳＳＡＧＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）及び最適化した２：１の比のメチル化キャップ類似体：ＧＴＰを用いて生成した。約５０〜６０μｇのＲＮＡは、２０μｌの反応混合物中で２μｇのＤＮＡ鋳型から生成した。キャップ類似体とＧＴＰの比率の増加により、実質的にＲＮＡ収率が減少した。その後、ＲＮＡを酸性フェノールクロロホルム、その後のイソプロパノール沈殿によって精製し、ヌクレアーゼ不含ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。ＲＮＡは、１％グリオキサール変性アガロースゲル上で野生型ＶＲ−２３３２ウイルスＲＮＡを用いてサイズ比較により質について評価し、ＯＤ２６０で分光光度計により定量した。
【００７０】
ＭＡＲＣ−１４５細胞トランスフェクション。修飾した転写法は、Ｎｉｅｌｓｅｎ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３７０２−３７１１（２００３））に記載されるアプローチに基づいて生成した。トランスフェクションに関して、ＭＡＲＣ−１４５細胞は、３ｍｌの完全培地［１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補足したＥＭＥＭ］中の６ウェルプレート（２〜３×１０５細胞／ウェル）に播種し、次に、約８０％のコンフルエントになるまで、２０〜２４時間、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，４：１１７−１２６（１９９２））。５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈した４μｇのインビトロの転写されたＲＮＡ、及び１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＮ（登録商標）培地に希釈した２μｌの１，２−ジミリストリルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド及びコレステロール（ＤＭＲＩＥ−Ｃ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を組合せ、手短にボルテックスにより撹拌した。ＭＡＲＣ−１４５細胞を２ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地で１回洗浄し、次に、直に、脂質：ＲＮＡ複合体溶液で覆った。ＲＮＡを含まないＤＭＲＩＥ−Ｃ（２μｌ）を負の対照として用い、１０〜１００ｎｇの菌株（野生型）ｗｔ  ＶＲ−２３３２精製ウイルスＲＮＡを含むＤＭＲＩＥ−Ｃを正の対照として用いた。脂質：ＲＮＡ複合体に４時間晒した後、単層を洗浄し、新鮮な完全培地（１０％ＦＢＳを含む）ＥＭＥＭを添加した。トランスフェクトした細胞の上清、細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現のために毎日監視し、トランスフェクションの７２〜９６時間後に新鮮なＭＡＲＣ−１４５に継代させた。
【００７１】
子孫ウイルスＲＮＡの検出。子孫ウイルスＲＮＡを検出するために、トランスフェクトされ、感染されたＭＡＲＣ−１４５細胞の細胞培養上清を回収した。ＲＮＡは、ＱｉａＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、感染性クローン変異残基を示すＶＲ−２３３２菌株ヌクレオチドに特異的なセレクトマーカー対を用いて行った（表３）。感染性クローン子孫の確認は、ＲＴ−ＰＣＲ産物に存在するクローン特異的ヌクレオチドの塩基配列の検査によって得た。
【００７２】
子孫ウイルスヌクレオカプシドタンパク質の検出。間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を用いて、カバースリップ上で調製した、インビトロ転写物ＲＮＡ転写された、又は子孫ウイルス感染したＭＡＲＣ−１４５細胞におけるウイルス発現を検出した。感染した細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む３．７％パラホルムアルデヒドで、１０分間室温で固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＲＲＳＶヌクレオカプシドタンパク質特異的なモノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｍａｇａｒら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．，５９：２３２−２３４（１９９５））中で３７℃４５分間インキュベートし、さらに、フルオレセインイソチオシアネートを結合させたヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（１：１００希釈）（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、ゲルマウントオイルを用いてスライドにマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【００７３】
ウイルスプラークアッセイ。６ウェルプレート上のＭＡＲＣ−１４５細胞の単層は、トランスフェクト又は感染させたＭＡＲＣ−１４５細胞の細胞上清（１０倍希釈）で、室温１時間インキュベートすることによって感染させた。感染させた単層は、次に、新鮮なＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳで１回洗浄し、直に、１×ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｍ４１４４）／１０％ＦＢＳ／２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３／１×グルタミン／１×非必須アミノ酸／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／２％（ｖ／ｖ）ゲンタマイシン中の無菌の１％ＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）で覆い、反転させて３７℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。アガロースを注意深く取り除き、細胞をプラークサイズの視覚化のために、２０％エタノール中の５％クリスタルバイオレットで１０〜３０分間染色した。
【００７４】
ウイルス増殖曲線。Ｔ−７５フラスコ中のＭＡＲＣ−１４５単層は、感染の多重度（ＭＯＩ）０．００１で血清不含ＥＭＥＭに希釈した親又は組換えＰＲＲＳＶで接種した。室温でゆるやかに撹拌しながら１時間接着後、接種物を除去し、単層を血清不含ＥＭＥＭで３回洗浄した。洗浄後、４ｍｌの完全培地を添加し、その後、フラスコは、最大５日間、３７℃で５％ＣＯ２にインキュベートした。アリコート（０．５ｍｌ）を回収し、培地の添加（０時間点）後に、２４、４８、７２、９６及び１２０時間で即座に回収し、−８０℃で保存した。試料の連続希釈を用いて、新鮮なＭＡＲＣ−１４５細胞を感染させ、次に、細胞を処理した。アガロースを除去後、プラークを視覚化し、カウントした。増殖曲線の結果は、ＰＦＵ／ｍｌとして表した。
【００７５】
子孫ウイルスのインビボ接種。ＰＲＲＳＶ血清反応陰性群由来の混血及び性別を混ぜた１０匹の４週齢ブタを３つのグループに分け、各グループは２匹の動物からなる。第一グループは、１０３．５  ５０％組織培養感染性投薬量（ＴＣＩＤ５０）のクローン性ウイルス（ｐＶＲ−Ｖ５、ＭＡＲＣ−１４５細胞の第三継代）／ｍｌを受け、第二のグループは、親菌株ＶＲ−２３３２の１０５．４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（ＭＡＲＣ−１４５細胞の第四継代）を受け、第三のグループは、模擬的にＥＭＥＭを接種した。全ての動物は、筋内注射により２ｍｌの接種材料を受けた。動物は、実験全体で別々の部屋に置かれ、臨床兆候に関して毎日観察された。全てのブタは、接種後の第２８日で安楽死させた。ウイルスを回収するために、個々の血清試料を完全なＥＭＥＭで５倍に希釈し、新鮮なＭＡＲＣ−１４５単層上に緩やかに撹拌しながら、室温で１〜２時間置いた。次に、接種材料を除去し、完全ＥＭＥＭを添加した。感染した細胞は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、毎日観察した。ＣＰＥが認められと、感染細胞の上清をさらに特徴付けするまで−８０℃で凍結した。
【００７６】
ノーザンブロット解析。ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ転写物をＭＡ１０４細胞にトランスフェクトし、次に、いくつかの継代のために新鮮な細胞に継代させた。続くノーザンブロット解析に関して、継代１（Ｐ１）、Ｐ３、Ｐ６、Ｐ８及びＰ１０の上清を１：５０に希釈し、次に、同日、感染細胞（１ｍｌ／Ｔ７５フラスコ）に用いた。同時に、感染したブタの血清を１０倍に希釈し、次に、別々のＴ７５フラスコを感染させるために用いた（１ｍｌ）。細胞変性効果は、全てのフラスコについて、感染後３日で見られた。細胞内ＲＮＡは、以前に記載されるように（Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９））、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、及びグリオキサール変性ゲル上で電気泳動を行った（１５μｇ／試料）。ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ転写ＲＮＡ（１００ｎｇ）を対照として泳動した。ＲＮＡを０．４５ミクロンのＭａｇｎａＧｒａｐｈ  Ｎｙｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ）に移した後、このメンブレンは、以前に記載されるように（Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９））、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で末端標識した標識化オリゴヌクレオチド／１ａ−ｐ２２２を用いて探査した。
【００７７】
子孫ウイルスの核酸配列解析。ｃＤＮＡ末端の５’−及び３’−迅速複製（ＲＡＣＥ）は、ＱＩＡｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単利したウイルスＲＮＡ上で、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ複製キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は５’若しくは３’−Ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ Ｉｎｃ）を用いて行った。残った塩基配列は、以前に記載されるように（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，７９：１８９−２００（２００１））菌株ＶＲ−２３３２の全ゲノム（表３）をカバーするように開発したプライマー対のＲＴ−ＰＣＲ産物から決定した。この産物は、核酸配列の決定のために、ミネソタ大学のＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託した。少なくとも３倍のカバーである完全なウイルス配列は、初期には、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商法）配列分析ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）のＳｅｑＭａｎスーツと一緒に組み立て、さらに、ＧＣＣ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３ソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を用いて解析した。菌株ＶＲ−２３３２（ＧｅｎＢａｎｋ受入Ｕ８７３９２）菌株Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受入ＡＦ０６６１８３）及びｃＤＮＡクローンｐＶＲ−ＨＮ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＡＹ１５０５６４；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３７０２−３７１１（２００３））は、組換えウイルス菌株との全てのヌクレオチド比較に用いた。
【００７８】
結果
ｐＯＫ１２ベクターの修飾。ｐＯＫ１２（ＧｅｎＢａｎｋ受入ＡＦ２２３６３９；Ｖｉｅｉｒａら、Ｇｅｎｅ，１００：１８９−１９４（１９９１））、低コピークローニングベクターは、ＳｍａＩ（ｐＯＫ１２の２７３ｂｐの酵素部位）及びＳａｌＩ（３０７ｂｐの部位）で消化し、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムを含むベクター２．０（７）の２４４ｂｐのＳｍａＩ−ＳａｌＩ断片を挿入することによって修飾した。次に、ベクター（ｐＯＫ１２ＨＤＶ）は、さらに、既存のＫｐｎＩ部位（２７３ｂｐでのＰＯＫ１２ＨＤＶ）の突然変異によって修飾し、プライマー対５’−ｐＯＫ１２ＨＤＶ−２５７ＳｐｈＩＰａｃＩ／３’−ｐＯＫ１２ＨＤＶ−２５７ＳｐｈＩＰａｃＩの使用を通じてＰａｃＩ制限酵素部位を挿入した。ＨＤＶリボザイムは、ポリＡ領域の３’末端で正確に効果的な切断を提供するために添加された。この試験は、修飾は、感染性子孫ウイルスを得るには必要ないことを示した。
【００７９】
全長ｃＤＮＡクローンの構築。クローニングストラテジーは、図２に示される。４つの重複するゲノム断片は、示されたプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲによって精製したＶＲ−２３３２ウイルスＲＮＡから増幅した（図２、表３）。各断片は、個別にｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングし、中間体クローンｐＣＲ−ＳｐｈＩ−ＦｓｅＩ（セグメントＩ）、ｐＣＲ−ＦｓｅＩ−ＡｖｒＩＩ（セグメントＩＩ）、ｐＣＲ−ＡｖｒＩＩ−ＢｓｒＧｉ（セグメントＩＩＩ）、及びｐＣＲ−ＢｓｒＧｉ−ＰａｃＩ（セグメントＩＶ）を生成した。次に、ｃＤＮＡクローンは、クローン名によって示されるように、２つの固有の制限酵素を用いて消化した。４つの断片をゲル精製し、段階的にベクターｐＯＫ１２ＨＤＶ−ＰａｃＩにライゲートし、ＰＲＲＳＶの全長ｃＤＮＡクローン（ｐＶＲ−Ｖ４）を生成した。全長ｃＤＮＡクローンでは、ウイルスゲノム配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによって、次に５０ヌクレオチドのポリアデニル酸によって駆動した。クローンｐＶＲ−Ｖ４のＲＮＡ転写物は、透過性を上げた細胞にトランスフェクトした場合には典型的なＰＲＲＳＶ感染力を示さなかったが、ウイルスＲＮＡはいくつかの継代を通じて検出された。菌株ＶＲ−２３３２と比較すると、２１アミノ酸変化をもたらす４５ヌクレオチド突然変異の全部（表４）は検出され（表５）、いくるかの突然変異は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶにおいて以前に同定されたのと同じであった（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，６１：８７−９８（１９９９））。
【００８０】
【表５Ａ】
2008543342.tif 000008
【００８１】
【表５Ｂ】
2008543342.tif 000009
【００８２】
【表５Ｃ】
2008543342.tif 000010
【００８３】
ｐＶＲ−Ｖ４における多くの突然変異が推定上のヘリカーゼをコードする臨界領域に現れるため、ゲノムセグメントＩＩＩの追加のクローン（ｐＣＲ−ＡｖｒＩＩ−ＢｓｒＧＩ）を生成し、完全に配列決定した。得られた最も配列に正確な断片でｐＶＲ−Ｖ４のセグメントＩＩＩを置換した後、本出願人は、再度、完全なゲノム全長クローン（ｐＶＲ−Ｖ５）の塩基配列を決定した。置換された部位及び自然発生の突然変異（ヌクレオチド１５９５、１３８６０、１４３３６、及び１４４０４）を除いて、これらの２つのゲノムクローンを同定した（表４）。ｐＶＲ−Ｖ５の配列解析は、このクローンが菌株ＶＲ−２３３２と比較して全部で２３個の突然変異を有していることを示した。これらの２３個の変化のうち、たった８個のヌクレオチドがアミノ酸の変化をコードし、アミノ酸残基突然変異の５個は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶと同じであり、したがって、すでにインビトロでの複製に影響を与えるとは予測しなかった（表４）。
【００８４】
クローンｐＶＲ−Ｖ６は、それぞれプライマー１３８６０Ｃ２Ｔ／及び１４９７９Ａ２Ｇ／を用いてヌクレオチド１３８６０及び１４９７９を修復するために、ゲノムセグメントＩＶの部位特異的突然変異誘発から誘導した。これらの２つのヌクレオチドの突然変異は、ＧＰ５のアミノ酸残基（Ｌ→Ｆ）及びヌクレオカプシドタンパク質の残基３１（Ｔ→Ａ）を修正する。クローンｐＶＲ−Ｖ６の配列解析は、ヌクレオチドが、野生型（ｗｔ）ＶＲ−２３３２ヌクレオチドの戻すように修正され、ｐＶＲ−Ｖ５と比較した場合に、ゲノムの任意の他のヌクレオチド変化をもたらさないことを確認した（表４及び５）。最後に、オリゴマー７４７５Ｇ２Ａを用いたゲノムセグメントＩＩＩにおける部位特異的突然変異誘発は、ｎｔ７４７５でｗｔＶＲ−２３３２からの変更を修正するために、ｐＶＲ−Ｖ５及びｐＶＲ−Ｖ６の両方において修正された。ｎｔ７４７５のＧ→Ａの変化は、親のＶＲ−２３３２ウイルス菌株において見られるグルタミン酸（Ｅ）に対して、２つの組換えクローンのＯＲＦ１アミノ酸２４２９のグリシン（Ｇ）をもたらした。最終の２つのクローンであるｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａを全体として再度配列決定し、それぞれ元々の組換えプラスミドｐＶＲ−Ｖ５及びｐＶＲ−Ｖ６から変更した（ｎｔ７４７５）のみを有することを見出した（表５）。したがって、ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａは、１１個のヌクレオチドを含み、菌株ＶＲ−２３３２からのアミノ酸変化はなく、さらに、それらはまた、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶに見られた。
【００８５】
最終構築物（ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ）に関する図３で概略的に見ることができ、表４及び５において詳述されるように、全ての全長クローンは、なお、主として、きちんとは定義されていないＯＲＦ１の領域において、ゲノムを通じて散乱したヌクレオチド変化を有する。しかしながら、ウイルス複製の完了からｐＶＲ−Ｖ４を推定上妨げたＯＲＦ１ｂヌクレオチド変化の大きなクラスターは、全長ゲノムクローンの後者のバージョンで修復された。たった１つのヌクレオチド突然変異（Ｇ３７３９Ａ変異をコードするｎｔ１１３２９）は、ｐＶＲ−Ｖ５及び後者のクローンのＯＲＦ１ｂに残り、この変異は、培養細胞における感染及び効率的な複製からＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶを妨げない。表４及び５はまた、動物において複製することが示されている、以前に公開された感染性クローンであるｐＶＲ−ＨＮ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３７０２−３７１１（２００３））に関する残基情報を示す。最終の構築物であるｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ（７個のヌクレオチド）に対してＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶを直接的に示すｐＶＲ−ＨＮ（１５個のヌクレオチド）における残基数の実質的な増加がある。
【００８６】
組換えウイルスの特徴付け。各ｃＤＮＡクローンの全長ＲＮＡ転写物を生成した。ｃＤＮＡ転写物又はｗｔ  ＶＲ−２３３２ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を用いたＭＡＲＣ−１４５細胞トランスフェクションは、ＣＰＥをもたらし、トランスフェクション後の４８〜７２時間で、細胞クランピング、続く溶解によって特徴付けられた。組換え転写物によって引き起こされるＣＰＥは進行が遅れ、強制的な凝集、脱着、及び崩壊としてＣＰＥが提示するｗｔ  ＶＲ−２３３２によって誘導されるものと比較して幾分区別された。トランスフェクション後９６時間で、ＶＲ−２３３２  ｖＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の大部分は、溶解を受け、プレートから脱着したが、一方、比較的軽度のＣＰＥは、クローニングしたインビトロで誘導したＲＮＡ転写物で転写した細胞に見られた。
【００８７】
ウイルス（Ｐ０）は、トランスフェクトした細胞から回収し、アリコート（培養液で１ｍｌまで希釈した１０μｌ）を用いて、子孫ウイルス増幅のためにＭＡＲＣ−１４５細胞に感染させた。ＣＰＥが検出された後、ウイルス（Ｐ１）を再度回収し、アリコートを用いてＭＡＲＣ−１４５細胞を感染させた。細胞上清中の組換えウイルス（Ｐ２）は、ウイルスＲＮＡの精製に利用し、次に、これを用いて、プライマー対５’−６８００／３’−ＯＲＦ１ｂ（ｎｔ６７９６−７６１４）及びＰ５１／０５Ｐ４（ｎｔ１３７５７−１４３４１）を用いたＲＴ−ＰＣＲ断片を得た。得られたＰＣＲ断片は、塩基配列解析のために寄託し、観察された感染度が感染性構築物のトランスフェクトされた全長ＲＮＡ転写物に起因し、ｗｔウイルスによる汚染の結果ではないことを確認した。残基７３２９、７４７５、７５５４、及び１３８６０でのヌクレオチド相違の突然変異は、ｐＶＲ−Ｖ５由来の子孫ウイルスに見られ、７３２９、７５５４、及び１３８６０は、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ由来のウイルスで検出された。同様に、残基７３２９、７４７５、及び７５５４の変異は、ｐＶＲ−Ｖ６子孫において検出され、７３２９及び７５５４での変異は、ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａから得られるウイルスにおいて検出された（表４及び５）。対応する変異は、ｗｔ  ｖＲＮＡ転写物由来のＰ２ウイルスには見られなかった。
【００８８】
組換えウイルスの免疫蛍光分析。直接的免疫蛍光分析を用いて、感染したＭＡＲＣ−１４５細胞におけるＰＲＲＳＶヌクレオチドの発現を検出した。組換えウイルス転写物（Ｐ２及びオン）並びにｖＲＡＮによって感染した全ての細胞は、この方法で陽性であった。以前にＲｏｗｌａｎｄら（Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，６４：１−１２（１９９９））によって報告されたように、ヌクレオカプシドタンパク質の巨大な仁蓄積が迅速に出現した。
【００８９】
ｐＶＲ−Ｖ５誘導の組換えウイルスによるインビボ感染。ｃＤＮＡクローンｐＶＲ−Ｖ５のＲＮＡ転写物でトランスフェクトしたＭＡＲＣ−１４５細胞のＰ３から回収した組換えウイルスは、ｗｔ  ＶＲ−２３３２、ワクチンウイルスＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）Ｍ、及び生理食塩水（負の対照）と並行して若いブタに接種した。血液試料は、感染後の０、３、５、７、１４、２１及び２８日に回収し、ＨｅｒｄＣｈｅｋ  ＰＲＲＳ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）によるセロコンバージョンについて、及びウイルス回復について分析した。２８日に、全ての感染した動物は、大体同じ動力学でセロコンバージョンを受け、ｐＶＲ−Ｖ５組買えウイルスは、インビボで十分に複製したことを示した（図４）。臨床兆候は、実験期間中には全ての動物では見られなかったが、これは、ｗｔ筋株ＶＲ−２３３２が、多くの場合、若いブタに明白な疾患を生成せず、一時的に、典型的には感染後１４日でのみリンパ節の拡大をもたらしたために期待されないことではなかった。
【００９０】
ｐＶＲ−Ｖ５（Ｓｗ６１２）の子孫で感染させた１匹の動物からの血清試料は、感染後１４日で回収し、インビボ継代の組換えウイルスの回収のために新鮮なＭＡＲＣ−１４５単層を感染させるために使用した。以前に記載されるように、クローンｐＶＲ−Ｖ５  ＲＡＮ転写物のインビトロトランスフェクション由来のウイルスは、単に最小のＣＰＥを引き起こし（感染した細胞の凝集によって裏づけられる）、試験動物の第１４日の血清から回収したウイルスは、感染後の９６時間で典型的なＣＰＥ（細胞凝集、脱着、及び崩壊）を引き起こした。これは、ウイルス遺伝型又は表現型のシフトが発生し、ｐＶＲ−Ｖ５がインビボで複製したことを示唆した。
【００９１】
表現型の見掛けの変化の理由を明らかにするために、全ゲノム配列分析は、１匹のブタ（Ｓｗ６１２）から回収したウイルスで完結し、次に、ＭＡＲＣ−１４５細胞に１回継代させ、Ｓｗ６１２子孫を増幅した（図３、表４及び５）。ブタを感染させるために使用したウイルスであるｐＶＲ−Ｖ５と対比すると、１７個の感染性ｃＤＮＡクローン特異的なヌクレオチド変化は、Ｓｗ６１２に残存し、そのいくつかはまた、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶに見られる（７／１７ヌクレオチド）。元のｐＶＲ−Ｖ５クローン転写物の５’末端に存在する２つの非ウイルス性Ｇ残基、続くＴ残基は、インビボ感染由来のウイルスには見られなかった。縮重は、ヌクレオチド位置９９５８（Ｒ）、１４３３６（Ｙ）及び１５４１１（Ｙ）で見られた。位置９９５８のｗｔ  ＶＲ２３３２様ヌクレオチド（Ｇ）は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶ様ヌクレオチド（Ａ）との縮重を示した。この変化は、そらぞれ、グリシン残基のグルタミン酸残基への変異をもたらす（表２）。位置１４３３６で、縮重は、感染性クローン特異的な塩基（Ｃ）及びｗｔ  ＶＲ−２３３２特異的塩基（Ｔ）として検出され、サイレント変異を反映した。Ｇ残基がｗｔ残基Ａに復帰する別の変異（ｎｔ７４５４）が起こった。しかしながら、この試験において、他のウイルスのいずれにも見られない別の５個のヌクレオチド相違（ｎｔ１０２、８２７、１３７９、１４６８６及び１５４１１）があった。ヌクレオチド１０２は、リーダー配列に位置するが、翻訳されない。しかしながら、リーダー配列が翻訳されると、コートされたＯＲＦ（ＶＲ−２３３２ヌクレオチド１−１００）は、１アミノ酸残基（Ｗ）によって伸長される。残基８２７及び１３７９での変異は、ＯＲＦ１ａにおける変異を導き、両方の場合において、Ｓｗ６１２バリンに対してアラニンをコードするｗｔ  ＶＲ−２３３２のアミノ酸変化をもたらす。ｐＶＲ−Ｖ５のｎｔ７４７５のグアニン残基はｗｔアデニンに変異した。これは、Ｇ３２９４Ａ非保存的アミノ酸変異をもたらし、ＯＲＦ１ａに位置し、予期されたプロテアーゼ切断産物ＮＳＰ７及びこのゲノム領域はこれまで定義された機能はない。ヌクレオチド１４６８６は、ＯＲＦ６に位置し、Ｓｗ６１２におけるｗｔ  ＶＲ−２３３２グアニンからアラニンへの変化を示し、やはり、アミノ酸グリシンをコードしている。他の固有のヌクレオチド変化は、ポリＡテールの開始前に、ウイルス配列のまさに３’末端（ｎｔ１５４１１）で起こった。この場合、以前に保存されたチミジン残基は、シトシン残基との縮重を示した。これらの遺伝的変化は、参考にはなるが、即座には、観察された成長表現型の変化の原因（単数又は複数）を示さなかった。しかしながら、インビボでのＰＲＲＳＶ複製の誤った性質を示し、ｗｔ  ＶＲ−２３３２由来の適度に異なったウイルスゲノム配列は、効率的に複製できたことを示唆する（図３）。
【００９２】
ウイルスプラークサイズの比較。組換えウイルス及びｗｔ  ＶＲ−２３３２のプラークサイズの測定は、感染後の１２０時間でＭＡＲＣ−１４５細胞で並行して完了させた（図５Ａ）。菌株ＶＲ−２３３２は、３ｍｍサイズを平均とするプラークを形成し、ｐＶＲ−ＨＮ  ｃＤＮＡ区の継代３の子孫は僅かに小さなプラークを形成した（２．５ｍｍ平均）。対照的に、ピンポイントのプラークだけが、ｐＶＲ−Ｖ５及びｐＶＲ−Ｖ６由来の組換えウイルスから得られ、これらは、単に容易に、顕微鏡試験を通じて明らかとなった（図５Ａ）。クローンｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａから回収した組換えウイルスは、平均して、それぞれ１．５ｍｍ及び２ｍｍプラークを形成した。しかしながら、別のアッセイでは、ＶＲ−ＦＬＶ５由来の組換えウイルスのインビボ感染から回収したウイルス子孫（Ｓｗ６１２）によって生成したプラークは、非常に大きく、ｗｔ  ＶＲ２３３２由来のものとほぼ等しいサイズと数であった。
【００９３】
各組換えウイルスを含む細胞上清のほんの最小体積が残存した。したがって、プラークサイズの測定のヌクレオチド変化の役割を十分に調べるために、本出願人は、ｐＶＲ−Ｖ５、ｐＶＲ−Ｖ６、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａから生成した新鮮なＲＮＡ転写物をＭＡＲＣ−１４５細胞にトランスフェクトした（第二系統と呼ぶ）。感染後５日での各感染性クローンの継代３の子孫ウイルスは、再度、ｗｔ  ＶＲ−２３３２、ＶＲ−ＨＮ及びＳｗ６１２と比較してプラークサイズについて分析した。以前のプラークアッセイとは対照的に、全てのサイズは同じようであり、ｐＶＲ−Ｖ５、ｐＶＲ−Ｖ６、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａから得た組換えウイルスは、インビボ由来のｗｔ  ＶＲ−２３３２、Ｓｗ６１２、ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａウイルスよりほんの僅かに小さかった（図６Ａ）。しかしながら、組換えウイルスは、まだ、ブタ（Ｓｗ６１２）を継代させたｗｔ  ＶＲ−２３３２又はｐＶＲ−Ｖ５組換えウイルスと比較した場合、約１０倍低いタイターによって示される真のウイルス感染を直接は模倣していなかった（図６Ｂ）。
【００９４】
第一及び第二系統ウイルス調製物のヌクレオチド配列分析。ブタに接種した継代３のｐＶＲ−Ｖ由来のウイルス（Ｖ５−１−Ｐ３）の制限されたヌクレオチド配列分析（ウイルス保存制限による）及び上記で得られた継代３のｐＶＲ−Ｖ５由来のウイルス（Ｖ５−２−Ｐ３）の完全なヌクレオチド配列分析は、プラークサイズ相違の遺伝的理由を明らかにするために完了した。このような分析は、２つの個別に調製したＶ５ウイルスは、５’末端の配列で異なっているこをと示した（表４）。ピンポイントプラークを生成したウイルス（Ｖ５−１−Ｐ３）は、ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２のヌクレオチド配列に示されるように、外来の５’末端ヌクレオチドがなく、より大きなプラークを生成するもの（Ｖ５−２−Ｐ３）は、５’末端の４個の非鋳型のチミジン残基を有していた（表４）。本出願人が得ることができた残ったＶ５−１−Ｐ３ウイルスヌクレオチド配列は、親のクローンのものと同様に、Ｖ５−２−Ｐ３のものと正確に適合した。しかしながら、Ｖ５−２−Ｐ３ウイルスの完全な配列は、ウイルスが、いくつかの遺伝部位でヌクレオチド縮重を提示するこをと示した。同様の見解は、第二系統ウイルスのＶＲ−ＦＬＶ５Ｇ７４５４Ａ−Ｐ３及びＶＲ−ＦＬＶ６Ｇ７４５４−Ｐ３の制限された領域を分析する場合に得られた。これらの最後の２つの感染性クローン子孫は、異なる５’末端を提示し、配列の縮重を示した。
【００９５】
ウイルス増殖曲線。同時の１工程ウイルス増殖曲線決定は、ＭＡＲＣ−１４５細胞及び継代３ウイルス（第二系統）を用いて完了した（図７）。ｐＶＲ−５、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ、ｐＶＲ−Ｖ６、及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−ＨＮから回収した組換えウイルスは、同様の１工程ウイルス増殖速度を示したが、それらの複製ピークは全て、ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２及びＳｗ６１２、インビボ子孫のｐＶＲ−Ｖ５より有意に低かった。また、ｐＶＲ−５、ｐＶＲ−６及びｐＶＲ−ＨＮ由来の組換えウイルス調製物の複製速度は、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ由来のウイルスと比較して幾分減少した。最後の２つの感染性クローンは、それぞれ、１３個及び１１個と同程度に少ないヌクレオチド相違をコードし、ｗｔ  ＶＲ−２３３２配列から２個又は０個のアミノ酸変化をもたらし、その上、この変化は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶで見られた。次に、これらのデータは、ｗｔ  ＶＲ−２３３２及びその弱毒化子孫Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶから１１個と同程度に少ないヌクレオチド変化を有するウイルスは、複製においてどういうわけか損なわれることを示す。一致して、ｗｔ  ＶＲ−２３３２及びＳｗ６１２ウイルスの得られたタイターは、ブタにおいて継代させなかった組換えウイルスのそれよりも約６〜１５倍高かった（図７）。
【００９６】
ｖＲＮＡのノーザン分析。ＰＲＲＳＶ欠損ｓｇＲＮＡ種は、異常形態のサブゲノムＲＮＡ（ラテン：異常な形態）として以前に同定され、ＰＲＲＳＶ感染の構成成分であることを示し、感染の低い多重度又はスクロース勾配遠心分離で、培養細胞継代などの標準的な方法によって全長ウイルスゲノムから分離できなかった（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７５：１５８−１６９；３０（２０００）；Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１０５：７５−８７（２００４））。ＰＲＲＳＶ異常が全長ｃＤＮＡゲノムクローンのインビトロ転写中に生じるか、又はその後のトランスフェクション／感染後に見られるのかどうかを探索するために、ノーザンブロット分析を完了した。トランスフェクトしたＭＡ−１０４細胞から生じたウイルスの全長ＲＮＡ転写物及び継代１、３、６、８及び１０を用いて、１０μｌの１：１００に希釈した上清、及び１：１０に希釈したＳｗ６１２血清でＭＡ−１０４の新鮮なＴ−７５フラスコを接種した（２ｍｌ全量／フラスコ）。４日後、細胞奈ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡを回収し、各調製物１５μｇは変性アガロースゲルを通じて電気泳動により分離され、ナイロンメンブレンに移した。ＲＮＡ架橋後、メンブレンを全長ＶＲ−２３３２ゲノム及び異常形態（／１ａ−２２２；２９）について選択するＯＲＦ１あの５’末端に相補的な３２Ｐ−放射線標識プローブを用いてハイブリダイズした。図８に示されるように、ＲＮＡ転写物は、大部分、一本のバンドであり、全長ｖＲＮＡとして移動し、継代１及び後者からのＰＲＲＳＶ  ＲＮＡ種は、異常形態として以前に同定された全長及びサブゲノムサイズの種の両方として移動する。さらに、ハイブリダイゼーションの強度は、継代全体で増加する。ウイルスは、同じ時間点で感染した細胞上清の等量から回収したので、この観察は、経時的に複製でより効率的となる。最後に、Ｓｗ６１２から生じたウイルスと細胞培養から生じたウイルスとを比較すると、ＲＮＡ結合パターンは、区別がつかず、欠損ＲＮＡ種が容易に形成され、インビトロ及びインビボで複製し、したがって、ＰＲＲＳＶ感染の自然な部分であることを強く示唆している。
【００９７】
検討
理論的には、ウイルスの感染性ｃＤＮＡクローンは、野生型感染を模倣する逆の遺伝的システムを生じるために、親配列と同一でなければならない。相当な努力を発揮して、十分に信頼できるＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２を再生し、いくつかの部位での予期せぬ同時変異により、本出願人は、実験室で配列決定したｗｔ菌株ＶＲ−２３３２との相違がない感染性クローンを誘導することに成功していない。非常に信頼のあるＤＮＡポリメラーゼは、この試験で使用され、人工的な変異を減らすために利用するが、このような変異は、逆転写中にさけることができない（Ｍａｌｅｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０９：１６１−７０（２００３））。さらに、ＰＲＲＳＶが驚くウイルス進化を示し、菌株バリエーション（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：４７５０−６（２００２）；Ｍｕｒｔａｕｇｈら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４４０：７８７−９４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４９４：２５−３０（２００１））が菌株（Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，６１：８７−９８（１９９９））の間の遺伝子間組換えをもたらすように高頻度で容易に再結合するという事実は、ＰＲＲＳＶサブゲノムＲＮＡ及び異常形態（Ｎｅｌｓｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２７０−８０（１９９９）；Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７５：１５８−１６９（２０００）；Ｙｕａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０５：７５−８７（２００４））を形成する遺伝子内組換えを受け、多くの場合、当初の目的は時間がかかり、ごくわずかな利益をもたらすのに役立つ野生分離体において予期せぬヌクレオチド部位のヌクレオチド縮重を示す。菌株ＶＲ−２３３２と比較して、１１個程度に少ないヌクレオチド変異を有する感染性ＤＮＡ構築体は、ウイルス複製（５’及び３’末端、ＯＲＦ１ｂ）に関与することで知られているドメインの外側であり、ｗｔウイルス産生には十分であると考えられ、感染性クローンの顆粒の目的は、発症クエリー及び構造：機能試験のための使用である。ｐＶＲ−ＨＮは、ヘリカーゼモチーフをコードするウイルスに対する領域（ＮＳＰ  １０）におけるＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶにより類似する。これら２つの感染性クローンの更なる病理的比較は、親菌株、ＶＲ−２３３２、及びそのワクチン菌株子孫、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶとの間の差異に明らかになるかもしれない。
【００９８】
有用な情報は、ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２に対する感染性クローンの構築及び評価から誘導され得る。第一に、ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２は、生存に関して全ての変異を寛容することができない。特定のヌクレオチド又はアミノ酸変異は、ウイルス複製を助けるか又は遅らせるかもしれないし、チャレンジは、どれが生存に致命的であるかを確かめるためである。クローンｐＶＲ−Ｖ４においては、感染性ビリオンを生産せず、ｗｔ親菌株ＶＲ−２３３２との全４２個のヌクレオチド相違であった。これらの４２個のヌクレオチド変化では、いくつかのヌクレオチドは、サイレント変異（２０残基）をもたらし、又は他の吉のＰＲＲＳＶ菌株（９個のアミノ酸残基変異は直接的にＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶを模倣する）における存在し、これらの変化がウイルス複製に非致命的であってもよいことを予測させる。１２個のアミノ酸変化及び２つの３’ＵＴＲヌクレオチド変異へと導く１１個のヌクレオチド変化は、各々がＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶには見られず、したがって、ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２に致命的であることが予期された。ｐＶＲ−Ｖ５及び後者の構築体では、１９個の変化が修正され、いくつかのサイレントな変異を含む、９個の異常なアミノ酸変化は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶのゲノムには見られず、８個のほかの変化は、ワクチン菌株に見られた。これは、構築体が感染性であるという第一の証拠へと導くが、ｐＶＲ−Ｖ５において、２個のアミノ酸変異はやはり存在し、その１つは、部位特異的突然変異誘発を通じて変化し、ｐＶＲ−Ｖ６を生成する。残りのアミノ酸変化は、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ及びｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａにおいて修復されるが、これらのクローンは、やはり、菌株ＶＲ−２３３２及びその誘導されたワクチン菌株に見出されないサイレント変異を有する。
【００９９】
いくつかの固有の観察は、この試験から得られた。第一に、生成されたウイルスの各系統は、ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２において検出されなかった固有の５’末端配列をもたらすかもしれない。本出願人はまた、未だに、プラークサイズとヌクレオチド配列とを相関させることができていない。第二に、本出願人は、ブタにおける複製後の固有のヌクレオチド変化を見つけ、それはＰＲＲＳＶポリメラーゼの固有の性質を反映するかもしれない。全てのヌクレオチド変化は、天然では過渡的であり、バイアスを示さなかった（５Ａ／Ｇ及び４Ｃ／Ｔ）。ヌクレオチド７４５４でのＧＡ転換は、インビボ継代で見られたが、この部位とその後の増加したプラークサイズとを相関させることはできず、これは、他の非鋳型変化が発生しないためである。さらに、より大きなプラーク（Ｖ５−２−Ｐ３）を生成したＶ５由来のウイルスの継代３の全ゲノム配列分析は、ブタを感染させるために使用されるピンポイントプラークを生成するＶ５ウイルス（Ｖ５−１−Ｐ３）とは異なる５’末端配列を示した。しかしながら、本出願人は、これらの変異は、ウイルス複製に致命的ではないことを結論づけ、何故なら、このウイルスは、ブタでの継代後、親のウイルスとほぼ同じ速度の成長でＭＡＲＣ−１４５細胞におけるｗｔサイズのプラークを生成したためである（図５Ａ、６及び７）。
【０１００】
非常に興味深いのは、Ｖ５、Ｖ５Ｇ７４５４Ａ及びＶ６Ｇ７４５４Ａの第三のインビトロ継代の配列分析が、ＰＲＲＳＶレプリカーゼ複合体が、ウイルス複製を受けながら、頻繁な移行、及び頻繁でない移行を発生させるようにすることを示唆するように思われるという事実である。これは、進化したウイルスレプリカーゼを反映しているようであり、その結果、ＰＲＲＳＶゲノムの新規なゲノム形態を生成し、次に、最適に「フィットする」ウイルスをもたらす、他の変異体の中でそれらのコンピテンスを評価する。これらの観察はまた、インビボでのＰＲＲＳＶの連続的な継代中に見られた（Ｃｈａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：４７５０−６３（２００２））。現在の配列決定の努力は、より強固な複製が検出される場合、後期の継代の全長ゲノムを調べることである。最後に、現在、ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２レプリカーゼは、全長ｖＲＮＡを生成するのと同時に容易に異常形態を合成することは明らかである。このプロトタイプの菌株は、１９９２年に単離され特徴づけられているが、複製適性の段階的な獲得において独特であってもよく、より最近の感染性クローンを生成する他の研究者は、同じ効果を観察していない（Ｔｒｕｏｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３０８−３１９（２００４））。異常形態の役割、及び活発なウイルス複製の同時出現は、ＰＲＲＳＶ進化における異常形態の有意な役割があることを示唆する。
【０１０１】
実施例２
一見したところ新規なＰＲＲＳＶの多くの毒性分離体は、最近、米国ミネソタ州において同定された。ＯＲＦ５ヌクレオチド配列分析及びＭｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰＲＲＳＶデータベース（＞５０００分離体）との比較は、分離体がタイプ２系統であるが、以前の分離体より有意に異なっていたことを示した。さらに、それらは、以前に、１９９０年代初めにカナダ（Ｍａｒｄａｓｓｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：６８１−６８５（１９９４））及び１９９８年にミネソタ州で見られた分離体と最も密接して関連していた。ＯＲＦ５の制限断片の長さ多形（ＲＦＬＰ）分析はまた、それらが、１−８−４分離体（Ｗｅｓｌｅｙら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０：１４０−１４４（１９９８））として知られるこれらの初期の場合と同じウイルス群に属することを示し、したがって、ＭＮ１８４と命名された。以前に単離された１つのＭＮ  ＰＲＲＳＶ分離体を除いて全てとは顕著に異なっているため、これらの新規な分離体の２つは、ブタの肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）、宿主細胞にちょうど１回増幅し、全長ゲノム分析は、ＭＮ１８４Ａ及びＭＮ１８４Ｂとして記されるウイルスにおいて完了した。これらの２つの分離体は、２つの分離形態から異なる時間に回収した。
【０１０２】
材料及び方法
ＭＮ１８４分離体を配列決定するために、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）をＰＲＲＳＶ感染させた細胞上清から、ＱＩＡｍｐ（登録商標）Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ）。プライマー（必要に応じて利用可能である）は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されているＰＲＲＳＶの異なる菌株の公開された配列及び新規に生成したＭＮ１８４配列に基づいて、設計した。２つのＰＲＲＳＶ分離体の５’ヌクレオチド配列は、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて誘導した。３’−ＲＡＣＥは、ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ゲル精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）、Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングし、各ＲＴ−ＰＣＲについて３〜５個のクローンを配列決定に選んだ。ヌクレオチド配列決定は、ＰＣＲ特異的プライマー又はＳＰ６及びＴ７プロモータープライマーをコードするベクターを用いて両方法で完結した。産物をＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡ断片解析装置を用いた配列決定のためにミネソタ大学のＡｄｖａｎｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託した。少なくとも３倍のゲノム範囲を示す質の高い配列を得た。配列データを集め、ＧｅｎｅＴｏｏｌ配列分析プログラム（ＢｉｏＴｏｏｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ  ＣＡ）及びＬａｓｅｒｇｅｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を用いて解析した。
【０１０３】
複数の配列整列は、ＣＬＵＳＴＡＬＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：４８７６−４８８２（１９９７））又はＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて生成した。全長ＰＲＲＳＶ配列は、ＣｌｕｓｔａｌＸ（バージョン１．８３．１；ＩＵＢ  ＤＮＡ重量マトリックス、ギャップペナルティ１５．００、ギャップ長ペナルティ６．６６）を用いて整列させた。得られた整列は、さらに、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３  Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ間隔法、考慮される退化シンボルによる部分的マッチ）を用いて分析した。図１０に関して、配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅのＰｉｌｅｕｐプログラム（Ｂｌｏｓｕｍ６２  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝８，Ｌｅｎｇｈｔ  Ｗｅｉｇｈｔ＝２，Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｅｎｄｓ）を用いて整列させた。整列は、Ｊａｌｖｉｅｗ（Ｃｌａｍｐら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１２：４２６−４２７（２００４）を用いて、過剰について得点をとり、同一性パーセントについて特色を与えた。次に、グレースケール移行のためにＡｄｏｂｅ（登録商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ＣＳ、バージョン８．０に移した。図１１については、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｂｌｏｓｕｍ６２  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝８，Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝２，Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｅｎｄｓ）のＰｉｌｅｕｐプログラムを用いて整列させた。図１２については、単一ペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰサーバー（Ｂｅｎｄｔｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４０：７８３−７９５（２００４））を用いて予測した。膜貫通領域は、ＰＨＤｈｔｍ（Ｒｏｓｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，５：１７０４−１７１８（１９９６））によって誘導し、潜在的なＮ−グリコシル化部位は、ＰＲＯＳＩＴＥ（Ｂａｉｒｏｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２１７−２２１（１９９７））によって、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎサーバー（Ｒｏｓｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２：Ｗ３２１−Ｗ３２６（２００３））を用いて同定した。配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｂｌｏｓｕｍ６２  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｇａｐ  Ｗｅｉｇｈｔ＝８，Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ＝２，Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｅｎｄｓ）のＰｉｌｅｕｐプログラムを用いて整列させた。
【０１０４】
結果
ゲノム整列は、これらの２つのＰＲＲＳＶが、他の北アメリカタイプ２全長配列を決定したゲノムとは全く異なっていた（＞１４．５％のヌクレオチド非類似性）ことを示した。タイプ１（ヨーロッパ）全長配列との比較は、分離体が単にタイプ２の遺伝型起源であることを確かめた。それらは、ＥｕｒｏＰＲＲＳＶ及びＬｅｌｙｓｔａｄ菌株と約５９％のヌクレオチドレベルの類似していただけであった。顕著には、これらのタイプ２のＭＮ１８４分離株は、今日までに検出された最短のＰＲＲＳＶゲノムを示した（１５０１９ヌクレオチド、ポリＡテールを含まない）。さらに、これらの分離体がタイプ１とタイプ２の菌株との間でウイルス組換えから誘導されたことを示唆する特定領域は識別されなかった。
【０１０５】
全長配列分析は、２つのＭＮ１８４分離体が、現実的に遺伝的に異なることを示した。それらは、９８．０％のヌクレオチド類似性又は２％の相違を共有した。非類似性のこの割合は、ミネソタにおいてそれらの突然の同時出現により期待されなかった。明確な最近の関連した分離体は、当時、本出願人のＰＲＲＳＶデータベースでは見られなかった。表６は、２つの分離体の間の詳細なヌクレオチド及びアミノ酸比較を示し、図９は、これらの２つの菌株の間で見られたアミノ酸相違を記す。これらの分離体の両方は、ゲノムのいくつかの領域で、主に、ＯＲＦ１の予測したｎｓｐ２流域にヌクレオチド縮重を有していた（表６）。ヌクレオチド縮重がこれらの分離体で見られたという事実は、ＰＲＲＳＶが、しばしば関連はするが区別されるウイルス配列と呼ばれるいくつかの個々の種で、感染した動物で作られることを示唆した。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
他のＰＲＲＳＶ菌株とは最も非類似性を示したこれらのＭＮ１８４分離体の個別の領域をより密接に特定するために、タイプ２のウイルスゲノムの長さにおける相違を説明する領域を与えるために、これらの２つの分離体は、プロトタイプのタイプ２菌株ＶＲ−２３３２の配列と比較した。２つの分離体との間の相違は、分離株ＭＮ１８４Ａより菌株ＶＲ−２３３２に僅かに増加した類似性を有する分離体ＭＮ１８４Ｂと再度識別することができる。ＶＲ−２３３２とのヌクレオチド及びアミン酸比較は、個々のＭＮ１８４分離株領域がそれぞれ８１．５〜９４．７％及び７８．４〜１００％まで変化したが、ＯＲＦ５（それぞれ８６．４〜８６．７％及び８７．０〜８７．５％）、予測されたｎｓｐ１β（それぞれ８３．８〜８４．０％及び８４．８％〜８５．４％）及びｎｓｐ２（それぞれ８１．５〜８５．５％及び７８．４〜７９．５％）に対応する領域は、最も変化可能である。最も興味深いのは、予測されたｎｓｐ２ゲノム領域だけが、ヌクレオチドの長さにおいて相違を示し、下記に詳述するように、ＭＮ１８４分離株の両方が同じｎｓｐ２欠失を有したことを示したことである。この比較はまた、５’及び３’ＵＴＲが、ゲノムの最も保存された領域（それぞれ９４．７％及び９４．０％）であることを示し、ウイルス複製及び転写に重要な領域における配列保存を示す。
【０１０８】
ＯＲＦは、異種のＰＲＲＳＶ構造タンパク質（ＧＰ５）をコードし、多くの場合、ＰＲＲＳＶ診断的同定（Ｋａｐｕｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：１２７１−１２７６（１９９６））に用いられる。ＧＰ５は、エンドドメイン及びエクトドメインを含む予測される３つの膜貫通型タンパク質である。３０個のアミノ酸エクトドメインは、通常、２つの超可変領域によって結合される少なくとも２つのＮ−グリコシル化部位を含む短い高度に保存されたドメインから構成される。この３０個のアミノ酸領域の高度に保存されたドメインは、タイプ２菌株におけるウイルス接着エピトープをコードすることで示されている（Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９０：１１−２０（２００１）；Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：４２４１−４２５０（２００２）；Ｐｌａｇｅｍａｎｎら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４７：２３２７−２３４７（２００２））。同じセットの全長ゲノムのＧＰ５、及びカナダ（ＩＡＦ−９３−６５３，ＩＡＦ−Ｋｌｏｐ）及びミネソタで１９９８−１９９９に（９８−３２９８、９８−３４０３、９９−３５８４）で同定された元のＲＦＬＰ１８４分離体を整列させる（図１０）。ＰＲＲＳＶ  ＧＰ５の整列は、新規なＭＮ１８４分離体及び他の非ＲＦＬＰ１８４タイプ２菌株との間で８２．５％〜８７．７％の範囲でアミノ酸同一性を示した。興味深いことに、新規なＭＮ１８４分離体及び従来のＲＦＬＰ１８４分離体との間のアミノ酸の相違は、極めて大きく（５．７％〜１２．２％）、したがって、新規なＲＦＬＰ１８４ウイルスの明確な起源を検出しなかった。この制限的な整列は、観察された大部分のアミノ酸の相違が、超可変領域に見出されたことを示す（図１０）。２つの保存されたＮ−グリコシル化部位は、分離体ＭＮ１８４Ｂにおけるアミノ酸４４をコードする検出されたヌクレオチド縮重を除いて、ＭＮ１８４分離体で維持されていた。
【０１０９】
Ｎｓｐ１βは、パパイン様システインプロテアーゼ（ｄｅｎ  Ｂｏｏｎら、Ｊ．Ｖｉｔｒｏｌ．，６９：４５００−４５０５（１９９５））をコードする。ＭＮ１８４分離体と必須的なセットの利用可能なタイプ２のｎｓｐ１β配列、並びにタイプ１菌株ＥｕｒｏＰＲＲＳＶ及びＬｅｌｙｓｔａｄのアミノ酸整列は、完了した（図１１）。ｎｓｐ１βタンパク質は、多数の完全に保存されたアミノ酸を有し、保存された触媒残基は、全ての配列決定されたゲノムで維持されていたｄｅｎ  Ｂｏｏｎら、Ｊ．Ｖｉｔｒｏｌ．，６９：４５００−４５０５（１９９５））。整列は、アミノ酸類似性によって整理され、ＭＮ１８４分離体は、他の配列決定された全長タイプ２配列よりもタイプ１菌株に類似していることを示す。特に、５個のアミノ酸（図１１のボックス）は、直接的にタイプ１菌株を模倣する。しかしながら、他の必須的なタイプ２配列において保存されたアミノ酸はまた、大部分、ＭＮ１８４分離体に保存されていたが、散在したアミノ酸及びアミノ酸類似性（８４．８〜８５．４％）はこれまで明らかにされたというよりはより発散的なタイプ２タンパク質を示した。したがって、この整列は、ＰＲＲＳＶの複製サイクルに重要であってもよいｎｓｐ１βの維持された残基をさらに定義する。
【０１１０】
ｎｓｐ２の必須的な配列のアミノ酸整列は、対の同定によって整列され、図１２に示される。高度に保存されたコモトリプシン様システインプロテアーゼ（ＰＬ２）ドメインは、Ｎ末端に存在し、従来、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）ｎｓｐ２との整列によって予期された（Ｓｎｉｊｄｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：９６１−９７９（１９９８）；Ｚｉｅｂｕｈｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：８５３−８７９（２０００））。このタンパク質のＣ末端近傍に３〜４個の予想される膜貫通ドメインがあるが（ＭｃＧｕｆｆｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１６：４０４−４０５（２０００））、正確なＣ末端切断部位は、実験的には決定されていない。Ｃ末端切断部位の２つの予想が提案され、１つは、ＶＲ−２３３２  ｎａｐ２アミノ酸９８０のＧ｜Ｇ（Ａｌｌｅｎｄｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：３０７−３１５（１９９９））、及び他は、アミノ酸１１９７（Ｚｉｅｂｕｈｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：８５３−８７９（２０００））であるが、このタンパク質内にはいくつかの完全に保存されたＧ｜Ｇダブレットが存在する（ＶＲ−２３３２  ｎｓｐ２アミノ酸６４６、９８０、１１１６、１１９６、１１９７；図１２の下向きの矢印）。従来の作業はまた、予測されたｎｓｐ２タンパク質は、プロリンに富み、複数の潜在的なＢ細胞エピトープを含むことを示した（Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：３２７７−３２９０（２００１）；Ｆａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１００：２２９−２３５（２００４）；Ｒｏｐｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：３６８４−３７０３（２００４））。ＰＲＲＳＶ  ｎｓｐ２（ＶＲ−２３３２  ｎｓｐ２アミノ酸１４８−８８０）の大きな中間の領域は、指定された機能はないが、長さにおいて非常に可変的である。さらに、配列決定されたＰＲＲＳＶのタイプ１とタイプ２菌株との間の長さの相違は、ｎｓｐ２のこの可変の中間領域に対してマップした（図１２）。これまで、配列決定されたタイプ１ゲノムは、最大のタイプ２ＰＲＲＳＶ（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９２：６２−７２（１９９３）；Ｆａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１００：２２９−２３５（２００４）、Ｒｏｐｐｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：３６８４−３７０３（２００４））よりも３１３−３６４塩基短いことが示された。しかしながら、複数の配列整列は、ＭＮ１８４ゲノムがこれまで最短の予測されたｎｓｐ２（２５４７ｂｐ）を含み、プロトタイプのタイプ２菌株ＶＲ−２３３２よりも３９３ｂｐ短いことを確実にした。さらに、それは、１１１、１及び１９個のアミノ酸からなる欠失サイズを有する翻訳タンパク質における３つの不連続な欠失を含み、それぞれ、ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２  ｎｓｐ２におけるアミノ酸位置３２４−４３４、４８６及び５０５−５２３に対応する（図１２）。３つの欠失は、いくつかのプロリン残基及びＢ細胞エピトープの欠失をもたらす。これらの欠失に加えて、他のタイプ２菌株由来のｎｓｐ２アミノ酸配列における有意な変更はまた見られ、時として、同じ相対的位置で見られるタイプ１アミノ酸に対応する（図１２）。２つのＰＲＲＳＶ遺伝子型のｎｓ���２の予期されたタンパク質の比較は、タイプ２ウイルスのアミノ酸同一性が６６％〜９９％の範囲であり、タイプ１では８８〜９０％であったことを示し、遺伝子型の間では非常にことなっていた（＜４５％類似性）。特に、ＭＮ１８４分離体は、全てのタイプ２ｎｓｐ２の予期されたタンパク質に対して６６〜８０％アミノ酸同一性を示し、タイプ１菌株に対してはたった４３〜４５％同一性であった。図１２における複数の配列整列を調査すると、両遺伝子型における挿入又は欠失の全ての場合が、この超可変中間領域で発生することにも気が付いた。この点については、Ｓｈｅｎら（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４５：８７１−８８３（２０００））は、最初に、ＰＲＲＳＶ北アメリカタイプ２菌株ＳＰが、ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２  ｎｓｐ２のアミノ酸８１３と８１４との間の位置に対して３６のアミノ酸の独特な挿入を有することを報告した。別の研究者は、ＰＲＲＳＶ分離体ＨＢ−２（ｓｈ）／２００２ｎｓｐ２におきえる４６６〜４７７位置で独特の１２アミノ酸欠失を見出した（Ｇａｏら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４９：１３４１−１３５１（２００４））。１７アミノ酸欠失は、菌株ＬＶと比較すると、新規に同定したヨーロッパ様ＰＲＲＳＶ分離体で起こった（Ｆａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１００；２２９−２３５（２００４）；Ｒｏｐｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：３６８４−３７０３（２００４））。変異の例は、アミノ酸の同じストレッチに沿って常に発生しなかったが、ＭＮ１８４分離体及び他のタイプ２ウイルスの間に見られる欠失は、タイプ１と他のタイプ２ＰＲＲＳＶとの間で検出された最大の欠失の大部分を包含する。これらのデータの全ては、ｎｓｐ２  ＯＲＦが、ＰＲＲＳＶの複製に必要であり得る保存されたプロテアーゼモチーフ及び予測された膜貫通の長さの領域を含むが、大きな中間セクションにおける変異に非常に感受性であることを示唆した。
【０１１１】
１８４ＲＦＬＰパターンを反映するミネソタにおけるＰＲＲＳＶのフィールド分離体の突然の出現は、未だにミステリーであるが、このイベントの因果関係は、現在でも実現されている。Ｍｉｎｅｎｅｓｏｔａ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙは、現在、ＯＲＦ５配列リクエストの全体数の約４分の１由来の類似した１８４ＲＦＬＰ分離体の日常的な配列決定を行っている。さらに、１８４ＲＦＬＰパターンは、現在、ミネソタだけでなく、アイオワ、ウィスコンシン、サウスダコタ、カンザス、ミズーリ、イリノイ、ネブラスカ、ケンタッキー、オクラハマ、及びワイオミングでも同定されている。２つの分離体からの全長の配列を誘導するために選択し、それは、これが単独以上のウイルスタイプであり得るかどうを理解し、そして、担当の病理学者によって報告されるように、分離体ＭＮ１８４Ａと診断されたブタの群れが、分離体ＭＮ１８４Ｂで感染した群れよりもＰＲＲＳの穏やかなケースで示されたという事実を理解するために必要であったためである。菌株は、ケース提示を確実にするために無傷の動物に接種され、分離体ＭＮ１８４Ｂが、ゲノムを解析する場合に検出されたより多くの縮重を有し、これが報告された疾患の重症度を反映するかもしれないことに気が付くことは興味深い。
【０１１２】
このゲノム解析は、この分野に存在する巨大なヌクレオチド及びアミノ酸配列バリエーションの理解を増した。このバリエーションを駆動する因子は、ブタが現在管理される方法、ブタ及びイノシシの州間及び国際的な輸送、異なるＰＲＲＳＶ分離体の群れ内での混合、及びウイルスそれ自体の性質と関連してもよい、全ゲノム配列発生はまた、ゲノムバリエーション上のどこが容認されるのか、及びどの領域がより保存されているかの監視を可能にする。この試験の結果として、以前の公開（Ｒｏｐｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：３６８４−３７０３（２００４））と同様に、ｎｓｐ２、ｎｓｐ１β及びＯＲＦ５が異常に汎用なタンパク質であることを示す理解が浮かび上がっている。
【０１１３】
この試験はまた、ｎｓｐ２サイズが、もはや２つのＰＲＲＳＶ遺伝子型の間で区別するために用いることができないという明確な証拠を提供している。ｎｓｐ２は、３つの不連続な欠損を有するタイプ２ゲノムを示すように進化し、これまで最短のゲノム（１５，０１９ｋｂ）へと導くという新規な見解は、ＰＲＲＳＶが、重要でないゲノム領域を排除し、ゲノムをよりコンパクトにするように進化していることを示唆する。最後に、ＰＲＲＳＶにおける遺伝子バリエーションの重要性は、現在、推量され得るだけであるが、ＯＲＦ５、ｎｓｐ１β、及びｎｓｐ２に見られる進化的変化は、選択圧中のＰＲＲＳＶの生物学的適性に合理的には関連しなければならない。
【０１１４】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物の完全な開示、及び電気的に利用可能な材料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑへのヌクレオチド配列の寄託、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢへのアミノ酸配列の寄託、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｄｆＳｅｑへの注釈付きのコード領域からの翻訳）は、参照により援用される。前述の詳細な説明及び実施例は、理解の明快さだけのために与えられる。不要な限定はそこから理解されるべきものではない。本発明は、示され及び記載された正確な詳述に限定されず、当業者に明確なバリエーションは、特許請求の範囲によって定義される発明に含まれる。
【０１１５】
他に指示がなければ、明細書及び特許請求の範囲に用いられる成分量、分子量などを示す全ての数は、用語「約」によって全ての場合に修飾されるものと理解されるべきである。したがって、これに反して他に指示がなければ、明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られるべき所望の特性に依存して変化し得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲に均等論を限定する試みほどでなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有意な桁の数値に照らして、一般的な多数の技術の適用によって、構築されるべきである。
【０１１６】
本発明の広範囲を記載する数値範囲及びパラメータは近似であるにもかかわらず、測定の実施例に記載される数値は、できるだけ正確に報告される。しかしながら、全ての数値は、本質的に、それぞれの試験測定に見出される標準的な誤差から必然的に得られる範囲を含む。
【０１１７】
全ての見出しは、読者の利便性のためであって、そのように特定されなければ、見出しに続くテキストの意味を限定するために用いられるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ−１】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ７（本明細書中ではＶ６Ｇ７４７５Ａとも呼ばれる）の塩基配列（配列番号１）。
【図１Ａ−２】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ７（本明細書中ではＶ６Ｇ７４７５Ａとも呼ばれる）の塩基配列（配列番号１）。
【図１Ａ−３】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ７（本明細書中ではＶ６Ｇ７４７５Ａとも呼ばれる）の塩基配列（配列番号１）。
【図１Ａ−４】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ７（本明細書中ではＶ６Ｇ７４７５Ａとも呼ばれる）の塩基配列（配列番号１）。
【図１Ｂ−１】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５の塩基配列（配列番号２）。
【図１Ｂ−２】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５の塩基配列（配列番号２）。
【図１Ｂ−３】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５の塩基配列（配列番号２）。
【図１Ｂ−４】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５の塩基配列（配列番号２）。
【図１Ｂ−５】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５の塩基配列（配列番号２）。
【図１Ｃ−１】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａの塩基配列（配列番号３）。
【図１Ｃ−２】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａの塩基配列（配列番号３）。
【図１Ｃ−３】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａの塩基配列（配列番号３）。
【図１Ｃ−４】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａの塩基配列（配列番号３）。
【図１Ｃ−５】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａの塩基配列（配列番号３）。
【図１Ｄ−１】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ６の塩基配列（配列番号４）。
【図１Ｄ−２】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ６の塩基配列（配列番号４）。
【図１Ｄ−３】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ６の塩基配列（配列番号４）。
【図１Ｄ−４】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ６の塩基配列（配列番号４）。
【図１Ｄ−５】感染性ポリヌクレオチドＶＲ−Ｖ６の塩基配列（配列番号４）。
【図１Ｅ−１】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ａの塩基配列（配列番号５）。
【図１Ｅ−２】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ａの塩基配列（配列番号５）。
【図１Ｅ−３】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ａの塩基配列（配列番号５）。
【図１Ｅ−４】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ａの塩基配列（配列番号５）。
【図１Ｆ−１】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ｂの塩基配列（配列番号６）。
【図１Ｆ−２】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ｂの塩基配列（配列番号６）。
【図１Ｆ−３】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ｂの塩基配列（配列番号６）。
【図１Ｆ−４】感染性ポリヌクレオチドＭＮ１８４Ｂの塩基配列（配列番号６）。
【図１Ｇ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−４３４の塩基配列（配列番号７）。
【図１Ｇ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−４３４の塩基配列（配列番号７）。
【図１Ｇ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−４３４の塩基配列（配列番号７）。
【図１Ｇ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−４３４の塩基配列（配列番号７）。
【図１Ｈ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−５２３の塩基配列（配列番号８）。
【図１Ｈ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−５２３の塩基配列（配列番号８）。
【図１Ｈ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−５２３の塩基配列（配列番号８）。
【図１Ｈ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−５２３の塩基配列（配列番号８）。
【図１Ｉ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−６３２の塩基配列（配列番号９）。
【図１Ｉ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−６３２の塩基配列（配列番号９）。
【図１Ｉ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−６３２の塩基配列（配列番号９）。
【図１Ｉ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−６３２の塩基配列（配列番号９）。
【図１Ｊ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ６３３−７２６の塩基配列（配列番号１０）。
【図１Ｊ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ６３３−７２６の塩基配列（配列番号１０）。
【図１Ｊ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ６３３−７２６の塩基配列（配列番号１０）。
【図１Ｊ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ６３３−７２６の塩基配列（配列番号１０）。
【図１Ｋ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−７２６の塩基配列（配列番号１１）。
【図１Ｋ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−７２６の塩基配列（配列番号１１）。
【図１Ｋ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−７２６の塩基配列（配列番号１１）。
【図１Ｋ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ５４３−７２６の塩基配列（配列番号１１）。
【図１Ｌ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ７２７−８１３の塩基配列（配列番号１２）。
【図１Ｌ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ７２７−８１３の塩基配列（配列番号１２）。
【図１Ｌ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ７２７−８１３の塩基配列（配列番号１２）。
【図１Ｌ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ７２７−８１３の塩基配列（配列番号１２）。
【図１Ｍ−１】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−７２６の塩基配列（配列番号１３）。
【図１Ｍ−２】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−７２６の塩基配列（配列番号１３）。
【図１Ｍ−３】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−７２６の塩基配列（配列番号１３）。
【図１Ｍ−４】感染性ポリヌクレオチドＮｓｐ２  Δ３２４−７２６の塩基配列（配列番号１３）。
【図２】ＰＲＲＳＶ菌株ＶＲ−２３３２の全長クローンのアセンブリー。１５．４ゲノムは、ウイルスのｃＤＮＡに存在する固有の制限酵素部位（ＦｓｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢｓｒＧＩ）を組み込んだ２つのセクション（Ｉ−ＩＶ）に増幅されるか又は挿入突然変異生成による５’及び３’末端（それぞれＳｐｈＩ、ＰａｃＩ）でＰＲＲＳＶ配列に加えられた。Ｔ７ポリメラーゼプロモーター及び２つの鋳型でないＧ残基及びＴ残基は、ウイルス配列の前に鉢した。ｐＯＫ１２ベクター（２４）は、ＰａｃＩ部位、及び５０個のヌクレオチドのポリアデノシンテールの肝炎デルタリボザイム下流を含むように修飾した。
【図３】感染性クローン又はブタ子孫のヌクレオチド変化の概略図。ＰＲＲＳＶゲノム構成の図は、全長ゲノム比較で示される。推定上の非構造タンパク質切断は、下向きの矢印で示されるＯＲＦ１ａ及び１ｂの下に特定される。符号モチーフは、上向きの矢印のＯＲＦ１ａ及び１ｂの下に特定され、ＰＲＲＳＶゲノム［パパイン様システインプロテアーゼα及びβ（ＰＣＰα、ＰＣＰβ）；システインプロテアーゼ（ＣＰ）；セリン／３Ｃプロテアーゼ（ＳＰ／３ＣＰ）；ポリメラーゼ（ＰＯＬ）；システイン／ヒスチジンリッチ（Ｃ／Ｈ）；ヘリカーゼ（Ｈｅｌ）；アフリカツメガエルホモログ・ポリ（Ｕ）特異的エンドリボヌクレアーゼ（ＸｅｎｄｏＵ）；Ｉｖａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１２６９４−１２６９９（２００４）；Ｚｉｅｂｕｈｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：８５３−８７９（２０００）］においてそれらの配置を示す。ヌクレオチドの相違は、縦棒によって示される。１．ＶＲ−２３３２誘導ワクチン（Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶ又はＲｅｓｐＰＲＲＳ，ＡＦ０６６１８３）と比較したｗｔ菌株ＶＲ−２３３２（Ｕ８７３９２）。２．ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａと比較したｗｔ菌株ＶＲ−２３３２。３．インビボ継代のＶ５−１−Ｐ３（Ｓｗ６１２）と比較したｐＶＲ−Ｖ５。４．Ｓｗ６１２と比較したｗｔ菌株ＶＲ−２３３２。詳細なヌクレオチド変化は、表４及び５に列挙される。
【図４】ＰＲＲＳＶ感染後のブタのセロコンバージョン。成長しているブタに天然のｗｔ菌株ＶＲ−２３３２（□）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶ（×）、Ｖ５−１  Ｐ３（Ｏ）又は感染しな状態のもの（黒四角）で感染させた。指定した日に、血清試料を採取し、ヌクレオカプシドタンパク質に対する抗ＰＲＲＳＶ抗体によるセロコンバージョンの指示に関してＩＤＥＸＸ  Ｅｌｉｓａによって試験した。
【図５】Ａ．全ての感染性クローン及びｗｔ菌株ＶＲ−２３３２のＰ３子孫（第一系統）のプラークアッセイは、好ましくはと成るプラークサイズを示した。Ｂ．ブタ（Ｓｗ６１２）の成長後のＶ５−１ Ｐ３の子孫は、ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２に類似したプラークを生成した。
【図６】Ａ．全ての感染性クローン及びｗｔ菌株ＶＲ−２３３２のＰ３子孫（第二系統）のプラークアッセイは、第一系統ウイルス調製物とは異なるプラークサイズを示した。Ｂ．Ｐ４ウイルスの力価は、感染性クローン子孫が、類似のプラークサイズにもかかわらず、ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２又はＳｗ６１２のように複製していなかった。
【図７】ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２（◆）、Ｓｗ６１２（黒三角）、ｐＶＲ−ＨＮ（□）、ｐＶＲ−Ｖ５（×）、ｐＶＲ−Ｖ５Ｇ７４７５Ａ（＊）、ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ（○）のＰ３子孫は、実施例１に概説されるように一工程成長動力学について同時に調べた。ｗｔ菌株ＶＲ−２３３２及びＳｗ６１２ウイルスは、全ての時間点で約１０倍高い力価まで複製した。ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａは、天然のウイルス又はワクチンと比較してアミノ酸変化はなく、全ての他の感染性クローン子孫よりも全ての時間点でより高い力価まで複製するウイルスを生成した。各ウイルス調製に関する最終的な力価は、関連した表に列挙される。
【図８】ｐＶＲ−Ｖ６Ｇ７４７５Ａ及びＳｗ６１２の異なる子孫経過のノーザンブロット分析。初期のインビトロ転写は、異常性が、Ｐ１と同定の初期に生産させ、ゲノムＲＮＡとともに、経過とともにより富むことを示す。しかしながら、転写物ＲＮＡ（Ｔｘ）は、容易に検出可能な異常種を含まない。
【図９】Ａ．ＰＲＲＳＶゲノムの図表示。推定の非構造タンパク質分解は、下向きの矢印によって表されるＯＲＦ１ａ及び１ｂ上に示される。符号モチーフは、ＯＲＦ１ａ及び１ｂの下に特定され、ＰＲＲＳＶゲノム［パパイン様システインプロテアーゼα及びβ（ＰＬ１）；システインプロテアーゼ（ＰＬ２）；セリン／３Ｃプロテアーゼ（３ＣＬ）；ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）；ヘリカーゼ（Ｈｅｌ）；アフリカツメガエルホモログ・ポリ（Ｕ）特異的エンドリボヌクレアーゼ（Ｎ）；Ｚｉｅｂｕｈｒら、２０００年；Ｉｖａｎｏｖら、２００４年；Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら、２００６年においてそれらの配置を示す。Ｂ．ＭＮ１８４Ａ及びＭＮ１８４ＢのＯＲＦ１タンパク質（レプリカーゼ）の比較及び推定のプロセッシングの概略図。ｎｓｐ２に見られる縮重は、比較に含まれる。Ｃ．ＭＮ１８４Ａ及びＭＮ１８４ＢのＯＲＦ２−７タンパク質（レプリカーゼ）の比較の概略図。
【図１０】発散ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５アミノ酸配列。ダークグレーのボックスは、高いアミノ酸保存（＞８０％；１６〜１９残基の間が同一である）であり、中間グレー（＞６０％；１２〜１５残基の間が同一である）、明るいグレー（＞４０％；８〜１１残基の間が同一である）、影のない（＜４０％；８残基未満が同一である）ボックスは、より少ない保存された残基を特定する。破線領域は、推定のシグナル配列を示し、ボックスの領域は、推奨される膜貫通領域を特定し、超可変領域が示され（ＨＶ−１及びＨＶ−２）、ビリオン中のタンパク質の推奨配向は、ボールドイタリックにおいて同定されている。Ｍタンパク質と相互作用することが提案される保存されたシステイン残基は、下向きの矢印（↓）で特定される。１つの保存された推定のＮ−グリコシル化部位は、星によって特定され、超可変領域１は、菌株／分離株特異的なＮ−グリコシル化部位（ＮｘＳ／Ｔ）を含む。下記のＧｅｎＢａｎｋ全長配列は比較のために用いた：ＶＲ−２３３２（Ｕ８７３９２）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ（ＡＦ０６６１８３）、０１ＮＰ１．２（ＤＱ０５６３７３）、ＰＬ９７−１（ＡＹ５８５２４）、ＰＬ９７−１（ＡＹ５８５２４）、ＰＡ−８（ＡＦ１８６３４８）、ＳＰ（ＡＦ１８４２１２）、ＢＪ−４（ＡＦ３３１８３１）、ＨＮ１（ＡＹ４５７６３５）、１６２４４Ｂ（ＡＦ０４６８６９）、ＨＢ−１（ＡＹ１５０３１２）、ＨＢ−２（ＡＹ２６２３５２）、ＣＨ−１ａ（ＡＹ０３２６２６）、Ｐ１２９（ＡＤ９４０４２）、ＪＡ１４２（ＡＹ４２４２７１）、ＳＤＰＲＲＳ−０１−０８（ＡＹ３７５４７４）、ＥｕｒｏＰＲＲＳＶ（ＡＹ３６６５２５）、Ｌｅｌｙｓｔａｄ（Ｍ９６２６２）、ＩＡＦ−９３−６５３（Ｕ６４９３１）、ＩＡＦ−Ｋｌｏｐ（ＡＹ１８４２０９）、９８−３２９８（ＤＱ３０６８７７）、９８−３４０３（ＤＱ３０６８７８）、９９−３５８４（ＤＱ３０６８７９）。
【図１１】発散ＰＲＲＳＶのＮｓｐ１βアミノ酸配列整列。図の誘導及び色スキームは、図１０の凡例に説明されている。２つの完全に保存された推定の触媒残基は星によって特定され、ボックスのアミノ酸は、タイプ１分離体及びＥＡＶを含むＭＮ１８４配列保存を特定する。提案される切断部位は、下向きの矢印（↓）によって特定される。
【図１２Ａ】発散ＰＲＲＳＶのＮｓｐ２アミノ酸配列。完全に保存された推定のシステインプロテアーゼ触媒残基（Ｃｙｓ及びＨｉｓ）は星によって特定され、ボックスのアミノ酸は、ＰＲＲＳＶ及びＥＡＶ内のプロテアーゼ配列保存を意味する。提案される切断部位は、塗りつぶした矢印（↓）によって特定される；追加の可能性のある切断部位は、破線の矢印にｙって特定される；シグナルペプチド、塗りつぶされたグレーのボックス；膜貫通領域、破線の黒色のボックス；潜在的なＮ−グリコシル化部位、アステリスク（＊）によって特定される。図の誘導及びカラースキームは図１０の凡例に説明されている。
【図１２Ｂ】発散ＰＲＲＳＶのＮｓｐ２アミノ酸配列。完全に保存された推定のシステインプロテアーゼ触媒残基（Ｃｙｓ及びＨｉｓ）は星によって特定され、ボックスのアミノ酸は、ＰＲＲＳＶ及びＥＡＶ内のプロテアーゼ配列保存を意味する。提案される切断部位は、塗りつぶした矢印（↓）によって特定される；追加の可能性のある切断部位は、破線の矢印にｙって特定される；シグナルペプチド、塗りつぶされたグレーのボックス；膜貫通領域、破線の黒色のボックス；潜在的なＮ−グリコシル化部位、アステリスク（＊）によって特定される。図の誘導及びカラースキームは図１０の凡例に説明されている。
【図１Ａ−１】
2008543342.tif 000012
【図１Ａ−２】
2008543342.tif 000013
【図１Ａ−３】
2008543342.tif 000014
【図１Ａ−４】
2008543342.tif 000015
【図１Ｂ−１】
2008543342.tif 000016
【図１Ｂ−２】
2008543342.tif 000017
【図１Ｂ−３】
2008543342.tif 000018
【図１Ｂ−４】
2008543342.tif 000019
【図１Ｂ−５】
2008543342.tif 000020
【図１Ｃ−１】
2008543342.tif 000021
【図１Ｃ−２】
2008543342.tif 000022
【図１Ｃ−３】
2008543342.tif 000023
【図１Ｃ−４】
2008543342.tif 000024
【図１Ｃ−５】
2008543342.tif 000025
【図１Ｄ−１】
2008543342.tif 000026
【図１Ｄ−２】
2008543342.tif 000027
【図１Ｄ−３】
2008543342.tif 000028
【図１Ｄ−４】
2008543342.tif 000029
【図１Ｄ−５】
2008543342.tif 000030
【図１Ｅ−１】
2008543342.tif 000031
【図１Ｅ−２】
2008543342.tif 000032
【図１Ｅ−３】
2008543342.tif 000033
【図１Ｅ−４】
2008543342.tif 000034
【図１Ｆ−１】
2008543342.tif 000035
【図１Ｆ−２】
2008543342.tif 000036
【図１Ｆ−３】
2008543342.tif 000037
【図１Ｆ−４】
2008543342.tif 000038
【図１Ｇ−１】
2008543342.tif 000039
【図１Ｇ−２】
2008543342.tif 000040
【図１Ｇ−３】
2008543342.tif 000041
【図１Ｇ−４】
2008543342.tif 000042
【図１Ｈ−１】
2008543342.tif 000043
【図１Ｈ−２】
2008543342.tif 000044
【図１Ｈ−３】
2008543342.tif 000045
【図１Ｈ−４】
2008543342.tif 000046
【図１Ｉ−１】
2008543342.tif 000047
【図１Ｉ−２】
2008543342.tif 000048
【図１Ｉ−３】
2008543342.tif 000049
【図１Ｉ−４】
2008543342.tif 000050
【図１Ｊ−１】
2008543342.tif 000051
【図１Ｊ−２】
2008543342.tif 000052
【図１Ｊ−３】
2008543342.tif 000053
【図１Ｊ−４】
2008543342.tif 000054
【図１Ｋ−１】
2008543342.tif 000055
【図１Ｋ−２】
2008543342.tif 000056
【図１Ｋ−３】
2008543342.tif 000057
【図１Ｋ−４】
2008543342.tif 000058
【図１Ｌ−１】
2008543342.tif 000059
【図１Ｌ−２】
2008543342.tif 000060
【図１Ｌ−３】
2008543342.tif 000061
【図１Ｌ−４】
2008543342.tif 000062
【図１Ｍ−１】
2008543342.tif 000063
【図１Ｍ−２】
2008543342.tif 000064
【図１Ｍ−３】
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【図１Ｍ−４】
2008543342.tif 000066
【図２】
2008543342.tif 000067
【図３】
2008543342.tif 000068
【図４】
2008543342.tif 000069
【図５】
2008543342.tif 000070
【図６】
2008543342.tif 000071
【図７】
2008543342.tif 000072
【図８】
2008543342.tif 000073
【図９Ａ】
2008543342.tif 000074
【図９Ｂ】
2008543342.tif 000075
【図９Ｃ】
2008543342.tif 000076
【図１１】
2008543342.tif 000077
【図１２Ａ】
2008543342.tif 000078
【図１２Ｂ】
2008543342.tif 000079
【図１０】
2008543342.tif 000080
【配列表】
2008543342000001.app
【国際調査報告】
2008543342.tif 000081
2008543342.tif 000082
2008543342.tif 000083
2008543342.tif 000084
2008543342.tif 000085