(57)【要約】  本発明は、筋肉成長を促進し、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を含むミオスタチンスプライス変種、該配列を含む構築物、ならびに筋肉成長を制御し、および筋組織に関連する疾患を治療するための組成物を提供する。スプライス変種は、共通配列Ｘ１ＩＦＬＥＸ２Ｘ３Ｘ４ＱＸ５ＣＳＩＬＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０を含み、式中、Ｘ１はＩまたはＬであり；Ｘ２はＶまたはＬであり；Ｘ３はＹ、Ｃ、ＧまたはＳであり；Ｘ４はＩまたはＦであり；Ｘ５はＦまたはＬであり；Ｘ６はＧまたはＥであり；Ｘ７はＥまたはＶであり；Ｘ８はＡまたはＴであり；Ｘ９はＡまたはＶであり；およびＸ１０は存在しないか、ＦまたはＬである。本発明は、筋肉質量が変化した動物を同定する際の本発明の配列の使用、および筋肉質量が変化した動物を作製する選択的育種プログラムにおける使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ｘ１  Ｉ  Ｆ  Ｌ  Ｅ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｑ  Ｘ５  Ｃ  Ｓ  Ｉ  Ｌ  Ｘ６  Ｘ７  Ｘ８ 
Ｘ９  Ｘ１０
［式中、Ｘ１はＩまたはＬであり；Ｘ２はＶまたはＬであり；Ｘ３はＹ、Ｃ、ＧまたはＳであり；Ｘ４はＩまたはＦであり；Ｘ５はＦまたはＬであり；Ｘ６はＧまたはＥであり；Ｘ７はＥまたはＶであり；Ｘ８はＡまたはＴであり；Ｘ９はＡまたはＶであり；およびＸ１０は存在しないか、ＦまたはＬである］
で示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号４８−９５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのフラグメントまたは変種を含むポリペプチド；および
（ｃ）（ａ）のポリペプチドと９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４８−９５のいずれか１つのアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、筋芽細胞増殖促進能を有するところの、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；
（ｄ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｃ）のいずれか１つの逆相補鎖
から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列あるいは筋芽細胞増殖促進能を有するペプチドをコードする８０％の配列同一性を有するその変種を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項８】
発現ベクターである、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
作動可能な結合にて、
（ａ）プロモーター配列；
（ｂ）請求項４ないし６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）遺伝子終止配列
を含む、請求項７または請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項９記載のベクター。
【請求項１２】
請求項７ないし１１のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項７ないし１１のいずれか一項に記載のベクターを含有する、１つまたは複数の細胞を含む、宿主動物。
【請求項１４】
（ａ）請求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項４ないし６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項７ないし１１のいずれか一項に記載のベクター；
（ｄ）（ａ）のフラグメントまたは変種；
（ｅ）（ｂ）のいずれか１つの相補鎖；
（ｆ）（ｂ）の逆相補鎖；および
（ｇ）（ｂ）、（ｅ）または（ｆ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチド
のいずれか１つの化合物を含む、筋肉の成長を制御する組成物。
【請求項１５】
化合物がアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
化合物が干渉ＲＮＡ分子である、請求項１４または請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
化合物がＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡである、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）請求項１ないし３のいずれか１つに記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１ないし３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに対して９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）（ｉ）ないし（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド；
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター；
（ｅ）発現ベクターであるところの、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター；
（ｆ）作動可能に結合した、プロモーター、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター；および
（ｇ）（ｂ）または（ｃ）によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉の成長を制御する方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１ないし３のいずれか１つに記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１ないし３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに対して９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）（ｉ）ないし（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド；
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター；
（ｅ）発現ベクターであるところの、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター；
（ｆ）作動可能に結合した、プロモーター、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター；および
（ｇ）（ｂ）または（ｃ）によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患の治療方法。
【請求項２０】
筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する症状を含むところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
筋萎縮に付随する症状が筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択されるところの、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
疾患関連筋萎縮症が癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する筋肉消耗を含むところの、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患を含むところの、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１ないし３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ｉ）配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに対して９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）（ｉ）ないし（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群からなる群から選択されるポリヌクレオチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド；および
（ｄ）干渉ＲＮＡ分子
からなる群から選択されるポリヌクレオチドに特異的に結合することのできる組成物を含む、ＭＳＶ遺伝子発現の調節因子。
【請求項２６】
アンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項２５記載のＭＳＶ遺伝子発現の調節因子。
【請求項２７】
化合物がＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子であるところの、請求項２５記載のＭＳＶ遺伝子発現の調節因子。
【請求項２８】
請求項２５ないし２７のいずれか一項に記載の調節因子を患者に投与することを含む、該患者における筋肉組織に関連する疾患の治療方法。
【請求項２９】
筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する疾患であるところの、請求項２９記載の方法。
【請求項３０】
筋萎縮に付随する疾患が筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択されるところの、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
疾患関連筋萎縮症が癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する筋肉消耗を含むところの、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患を含むところの、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
プロペプチド変換酵素がＭＳＶプロペプチドの活性ＭＳＶペプチドへの蛋白分解性プロセッシングを改変させるのに十分な条件下で十分な時間、ＭＳＶプロペプチドをプロペプチド変換酵素と接触させ、それによりＭＳＶ活性を調節することを含む、ＭＳＶ活性の調節方法。
【請求項３５】
接触工程が、ＭＳＶプロペプチドを変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼを含むところの、請求項３４または請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
筋肉組織関連の疾患を有し、ＭＳＶプロペプチドを含む対象に、プロペプチド変換酵素がＭＳＶプロペプチドの活性ＭＳＶペプチドへの蛋白分解性プロセッシングを改変させるのに十分な条件下で十分な時間、該変換酵素を該対象に投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患の治療方法。
【請求項３８】
投与工程が、ＭＳＶプロペプチドを変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることをさらに含むところの、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼであるところの、請求項３７または請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する疾患であるところの、請求項３７ないし３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
筋萎縮に付随する疾患が筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮症、肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のいずれから選択されるところの、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
疾患関連筋萎縮症が癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳと関連する筋肉消耗を含むところの、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患であるところの、請求項３７ないし３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
請求項１４ないし１７のいずれか一項に記載の組成物；請求項２５ないし２７のいずれか一項に記載のＭＳＶ遺伝子発現の調節因子；プロペプチド変換酵素あるいはプロペプチド変換酵素のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれか１つを、動物に投与することを含む、該動物の筋肉成長を制御する方法。
【請求項４６】
プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼであるところの、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
動物が筋肉増量しているところの、請求項４５または請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ｉ）動物から試料を得る工程、
ｉｉ）配列番号１ないし４７または９６のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１ないし４７もしくは９６に対して９５％、９０％、８０％もしくは７０％の同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定する工程、
ｉｉｉ）遺伝子発現レベルを平均と比較する工程、および
ｉｖ）該動物の筋肉量を予測する工程
を含む、動物における筋肉量を予測する方法。
【請求項４９】
遺伝子発現のレベルが、ポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で、核酸をハイブリダイズすることを含む方法により測定されるところの、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
遺伝子発現のレベルがＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用いて測定されるところの、請求項４８または請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ｉ）動物から試料を得る工程、
ｉｉ）配列番号４８ないし９５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド、配列番号４８ないし９５のいずれか１つと９５％、９０％、８０％もしくは７０％の同一性を有するポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種の量を測定する工程、
ｉｉｉ）ポリペプチドの量を平均量と比較する工程、および
ｉｖ）該動物の筋肉量を予測する工程
を含む、動物における筋肉量の予測方法。
【請求項５２】
ポリペプチドの量が該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて該ポリペプチドを検出することを含む方法により測定されるところの、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドの量がＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を用いて測定されるところの、請求項５１または請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
ｉ）請求項４８ないし５３のいずれか１つの方法により筋肉量が増加している予測される１または複数の動物を選択する工程、および
ｉｉ）筋肉量の増加した１または複数の動物を選択して繁殖させて、筋肉量の増加した１または複数の子孫を生成する工程
を含む、動物の１または複数の子孫の筋肉量を増加させる方法。
【請求項５５】
動物が、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラットまたはヒトから選択されるところの、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
（ａ）配列番号４８ないし９５のいずれか１つの配列、または
（ｂ）配列番号４８ないし９５のいずれか１つと９５％、９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有する配列
を有するポリペプチドに優先的に結合する、タンパク質。
【請求項５７】
タンパク質が、抗体；非哺乳類の抗体；細菌免疫タンパク質；または当該分野において知られている任意の他のクラスの結合性タンパク質、配列番号４７ないし９５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号４７ないし９５のいずれか１つに９５％、９０％もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチドに結合することができるようなタンパク質から誘導されるフラグメントもしくは誘導体のいずれか１つから選択されるところの、請求項５６記載のタンパク質。
【請求項５８】
非哺乳類の抗体がサメから由来のＩｇＮＡＲクラスの抗体であるところの、請求項５７記載のタンパク質。
【請求項５９】
細菌免疫タンパク質がイー・コリから由来のＩＭＭ７免疫タンパク質であるところの、請求項５７記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチンの新規なスプライス変種の同定に基づく。特に、本発明は、筋肉の成長およびミオスタチン活性を調節または制御するミオスタチンのスプライス変種の使用に基づく。
【背景技術】
【０００２】
ミオスタチン（すなわちＧＤＦ−８）は、筋肉成長の負の制御因子であり、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーに構造的に関係している（Ｍｃｐｈｅｒｒｏｎら、１９９７ａ）。より具体的には、ミオスタチンは、魚類から哺乳類に至る広範囲の種における発育中の、および成体の生活における骨格筋の強力な負の制御因子である（ＭｃｐｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、１９９７）。ミオスタチンは、それ自体の発現をある機構を介して制御していることが知られているが、その機構は現在のところ不完全にしか解明されていない（Ｂｅｒｒｙら、２００２；Ｓｐｉｌｌｅｒら２００２；Ｒｅｂｂａｐｒａｇａｄａら、２００３）。
【０００３】
ミオスタチンタンパク質は、最初、Ｎ末端に分泌シグナル配列、フューリンエンドプロテアーゼのタンパク質プロセシングシグナル（ＲＳＲＲ）およびＣ末端領域に「システインノット」構造の形成を容易にする９つの保存されたシステイン残基を有する３７５アミノ酸前駆体分子として翻訳される。ミオスタチンは、Ｎ末端、すなわち「潜伏関連ペプチド」（ＬＡＰ）および２量化して活性ミオスタチン分子を形成する成熟Ｃ末端ドメインを遊離させるＡｒｇ２６６でのフューリンエンドプロテアーゼ切断により活性化される。プロセシングの後、不活性な複合体中で、ＬＡＰペプチドのホモダイマーは、成熟ミオスタチンのホモダイマーに非共有結合で結合したままである（Ｌｅｅら、２００１）。他のタンパク質、例えば、フォリスタチン、タイチンキャップ、ＧＤＦＰ１、フォリスタチン関連遺伝子およびｈＳＧＴも、潜在ミオスタチン複合体に結合して、その分泌および活性化を制御することが知られている（Ｌｅｅら２００１；Ｎｉｃｏｌａｓら、２００２；Ｈｉｌｌら、２００２；Ｈｉｌｌら、２００３；Ｗａｎｇら、２００３）。
【０００４】
ミオスタチンは、アポトーシスを誘起したり、または筋肉タンパク質崩壊を起こさせる刺激になることなく、筋芽細胞の増殖および分化を阻害することが示されている（Ｔｈｏｍａｓら、２０００；Ｌａｎｇｌｅｙら、２００２；Ｒｉｏｓら、２００１；Ｔａｙｌｏｒら、２００１）。ミオスタチンに対するノックアウトマウスは、その全身にわたって非常に増加した筋肉質量を有する。ミオスタチンｎｕｌｌマウスは正常マウスよりも約３０％大きい体重を有し、かつ筋線維過形成および肥大に基づく、個々の筋肉重量における２〜３倍の増加を示す。ミオスタチンにおける自然変異が、ベルジャンブルーおよびピエモンテ牛種などの「ダブルマッスルド（ｄｏｕｂｌｅ  ｍｕｓｃｌｅｄ）」表現型の原因であると確認されている（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９７ｂ；Ｋａｍｂａｄｕｒら、１９９７；Ｇｒｏｂｅｔら、１９９７）。
【０００５】
ミオスタチンは多くの他の生物学的過程にも関連している。例えば、ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨形成に役割を示す皮質性骨構造が変化している（Ｈａｍｒｉｃｋ  ２００３）。さらに、ミオスタチンはグルコースおよび脂肪の代謝に関与していることが示されており、それ故、ミオスタチンは、２型糖尿病および肥満に密接に結びついている可能性がある（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、２００２）。
【０００６】
これらの効果に従って、ミオスタチンは、ＨＩＶ、癌、長期にわたる病臥、または筋ジストロフィーに冒された個体に見られるような筋肉消耗または筋萎縮と関連する多数の障害と結びつけられてきた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、１９９８；Ｌａｎｇｌｅｙら、２００４；Ｚａｃｈｗｉｅｊａら、１９９９；Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈら、２００２）。ミオスタチンのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は悪液質、すなわち癌および敗血症に関連する重症型の筋肉消耗を誘起することが示された（Ｚｉｍｍｅｒｓら、２００２）。さらに、グルココルチコイド誘起筋萎縮におけるミオスタチンの上方制御が観察されている（Ｍａら、２００３）。ミオスタチン発現における変化は、他の条件、例えば、心損傷後の心筋細胞における上方制御、および再生筋肉における下方制御で示されている（Ｓｈａｒｍａら、１９９９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
入手し得る情報にもかかわらず、ミオスタチン遺伝子の産生物による生物学的過程の分子制御における複雑性は不完全な理解に留まっている。筋肉の成長と分化、組織再生の制御におけるミオスタチンの役割を考慮すれば、ミオスタチンが役割を演じるこれらの、および他の過程に介入する改良された組成物および方法に対する必要性が明らかにある。本発明は、新規な生物活性ミオスタチンスプライス変種を提供することにより、これらの必要性を一部満たし、他の関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、本発明は、式：
Ｘ１  Ｉ  Ｆ  Ｌ  Ｅ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｑ  Ｘ５  Ｃ  Ｓ  Ｉ  Ｌ  Ｘ６  Ｘ７  Ｘ８  Ｘ９  Ｘ１０
（式中、Ｘ１はＩまたはＬであり、Ｘ２はＶまたはＬであり、Ｘ３はＹ、Ｃ、ＧまたはＳであり、Ｘ４はＩまたはＦであり、Ｘ５はＦまたはＬであり、Ｘ６はＧまたはＥであり、Ｘ７はＥまたはＶであり、Ｘ８はＡまたはＴであり、Ｘ９はＡまたはＶであり、およびＸ１０は存在しないか、ＦまたはＬである）
を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【０００９】
単離されたポリペプチドは、
（ａ）配列番号４８〜９５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのフラグメントまたは変種を含むポリペプチド、および
（ｃ）（ａ）のポリペプチドと９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリペプチド
から選択することもできる。
【００１０】
本発明による単離されたポリペプチドは、配列番号４８〜９５のいずれか１つのアミノ酸配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその変種も含み、該ペプチドは筋芽細胞の成長を促進することができる。
【００１１】
本発明は、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００１２】
本発明による単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１から４７、または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドと９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
（ｅ）（ａ）から（ｃ）のいずれか１つの逆相補鎖
から選択することができる。
【００１３】
単離されたポリヌクレオチドは、筋芽細胞の成長を促進することができるペプチドをコードする配列番号１から４７もしくは９６のいずれか１つのヌクレオチド配列または８０％の配列同一性を有するその変種を含む。
【００１４】
本発明は、本発明によるポリヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。該ベクターは発現ベクターであり、作動可能に結合した、
（ａ）プロモーター配列、
（ｂ）本発明によるポリヌクレオチド、および
（ｃ）遺伝子終止配列
を含むことができる。
【００１５】
ポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向のいずれであってもよい。
【００１６】
そのようなベクターを含む宿主細胞も、本発明によるベクターを含有する１つまたは複数の細胞を含む宿主動物と共に含まれる。
【００１７】
本発明は、
（ａ）請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド、
（ｂ）請求項４から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）請求項７から１１のいずれか一項に記載のベクター、
（ｄ）（ａ）の変種のフラグメント、
（ｅ）（ｂ）のいずれか１つの相補鎖、
（ｆ）（ｂ）の逆相補鎖、および
（ｇ）（ｂ）、（ｅ）または（ｆ）のいずれか１つのアンチセンスポリヌクレオチド
のいずれか１つの化合物を含む、筋肉の成長を制御する組成物も提供する。
【００１８】
その組成物は、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ分子を含むアンチセンスポリヌクレオチドを含むことができる。
【００１９】
本発明は、
（ａ）本発明によるポリペプチド、
（ｂ）本発明によるポリペプチドまたはその相補的配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ｉ）配列番号１から４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｅ）発現ベクターである、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｆ）作動可能に結合した、プロモーター、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター、および
（ｇ）（ｂ）または（ｃ）によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉の成長を制御する方法も提供する。
【００２０】
本発明は、
（ａ）本発明によるポリペプチド、
（ｂ）本発明によるポリペプチドまたはその相補的配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）（ｉ）配列番号１から４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
（ｄ）（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｅ）発現ベクターである、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドを含むベクター、
（ｆ）作動可能に結合した、プロモーター、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター、および
（ｇ）（ｂ）または（ｃ）によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患を治療する方法も提供する。
【００２１】
その方法は、筋萎縮症に関連していて、筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択することができる状態を含む筋組織関連疾患を治療するものであってよい。その方法は、癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する疾患関連筋肉消耗の治療も含む。
【００２２】
疾患は、梗塞を含むものなど心筋に関連する疾患を含む。
【００２３】
本発明は、
（ａ）請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列、
（ｂ）（ｉ）配列番号１から４７または９６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）（ｉ）のポリヌクレオチドに９５％、９０％、８０％または７０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれか１つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド、および
（ｄ）干渉ＲＮＡ分子
からなる群から選択されたポリヌクレオチドに特異的に結合することができる組成物を含む、ＭＳＶ遺伝子発現の調節因子も提供する。
【００２４】
ＭＳＶ遺伝子の調節因子は、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子などのアンチセンスポリヌクレオチドを含むことができる。
【００２５】
本発明は、患者における筋組織関連疾患を治療するための、本発明による調節因子を前記患者に投与することを含む方法も提供する。疾患は、筋萎縮症であってよく、筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）からなる群から選択することができる。疾患は、癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する筋肉消耗を含む疾患関連筋萎縮症であってもよい。
【００２６】
疾患は、心筋に関連していてもよく、梗塞を含む。
【００２７】
本発明は、ＭＳＶプロペプチドを活性ＭＳＶペプチドにするタンパク質分解処理をプロペプチド変換酵素が変化させるのに十分な条件下に十分な時間、ＭＳＶプロペプチドとプロペプチド変換酵素とを接触させること、およびそれによりＭＳＶ活性を調節することを含むＭＳＶ活性を調節する方法も提供する。
【００２８】
接触工程は、ＭＳＶプロペプチドを、フューリンエンドプロテアーゼなどの変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることをさらに含む。
【００２９】
本発明は、ＭＳＶプロペプチドを活性ＭＳＶペプチドにするタンパク質分解処理をプロペプチド変換酵素が変化させるのに十分な条件下に十分な時間、筋組織に関連する疾患を有し、ＭＳＶプロペプチドを含む対象者にプロペプチド変換酵素を投与すること、およびそれにより疾患を治療することを含む筋組織に関連する疾患を治療する方法も提供する。
【００３０】
投与工程は、ＭＳＶプロペプチドを、フューリンエンドプロテアーゼなどの変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることをさらに含むことができる。
【００３１】
本発明の方法は、筋萎縮症に関連する疾患の治療を目的にすることができ、筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮症、肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のいずれから選択することもできる。方法は、癌またはＨＩＶ／ＡＩＤＳと関連する筋肉消耗を含む疾患関連筋萎縮症の治療を目的にすることもできる。
【００３２】
前記の方法は、梗塞を含む心筋に関連する疾患の治療を目的にすることもできる。
【００３３】
本発明は、本発明による組成物；本発明によるＭＳＶ遺伝子発現調節因子；プロペプチド変換酵素またはフューリンエンドプロテアーゼなどのプロペプチド変換酵素のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれか１つを、前記動物に投与することを含む動物の筋肉成長を制御する方法も提供する。
【００３４】
前記の方法は、増加した筋肉質量を有する動物を作製するために使用することもできる。
【００３５】
本発明は、
ｉ）動物から試料を得る工程、
ｉｉ）配列番号１から４７または９６のいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１から４７もしくは９６に９５％、９０％、８０％もしくは７０％の相同性を有するポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種からの遺伝子発現レベルを定量する工程、
ｉｉｉ）遺伝子発現レベルを平均と比較する工程、および
ｉｖ）前記動物の筋肉質量を予測する工程
を含む、動物における筋肉質量を予測する方法も提供する。
【００３６】
遺伝子発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を含む、ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下での核酸ハイブリッド形成を含む方法により定量することができる。
【００３７】
本発明は、
ｉ）動物から試料を得る工程、
ｉｉ）配列番号４８から９５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド、配列番号４８から９５のいずれか１つに９５％、９０％、８０％もしくは７０％の相同性を有するポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種の量を定量する工程、
ｉｉｉ）ポリペプチドの量を平均と比較する工程、および
ｉｖ）前記動物の筋肉質量を予測する工程
を含む、動物における筋肉質量を予測する方法も提供する。
【００３８】
ポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析を含む、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体によるポリペプチドの検出を含む方法により定量することができる。
【００３９】
本発明は、
ｉ）上記の方法により筋肉質量が増加していると予測される１頭または複数の動物を選択する工程、および
ｉｉ）増加した筋肉質量を有するように選択した１頭または複数の動物を繁殖させて、増加した筋肉質量を有する１頭または複数の子孫を作製する工程
を含む、動物の１頭または複数の子孫の筋肉質量を増加させる方法も提供する。
【００４０】
前記の方法は、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、またはヒトから選択された動物に実施することができる。
【００４１】
本発明は、
（ａ）配列番号４８から９５のいずれか１つの配列、または
（ｂ）配列番号４８から９５のいずれか１つに９５％、９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有する配列
を有するポリペプチドに優先的に結合する、タンパク質も提供する。
【００４２】
前記のタンパク質は、抗体；非哺乳類の抗体；細菌免疫タンパク質；または当該分野において知られている任意の他のクラスの結合性タンパク質、配列番号４８から９５のいずれか１つの配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号４８から９５のいずれか１つに９５％、９０％、８０％もしくは７０％の配列同一性を有するポリペプチドに結合することができるような任意のタンパク質から誘導されるフラグメントもしくは誘導体のいずれか１つから選択することができる。非哺乳類の抗体はサメのＩｇＮＡＲクラスであってよい。細菌免疫タンパク質はイー・コリのＩＭＭ７免疫タンパク質であってよい。
【００４３】
ここで次の図を参照して、本発明をさらに説明することにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、ある実施形態において、ミオスタチン遺伝子発現の過程における選択的スプライシングの予想外の生成物である機能的で生物活性なミオスタチン変種ｍＲＮＡ分子の驚異的発見に関する。以下にさらに詳細に説明するように、ミオスタチンをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中のおよびそれに隣接するヌクレオチド配列に特異的なフランキングＰＣＲプライマーを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で使用した。この戦略を、そのようにして得られた反応生成物のそれに続くクローニングおよび配列決定に合わせて使用して、３２１アミノ酸のポリペプチド（配列番号４８）をコードする９６６ヌクレオチドのＯＲＦ（配列番号１）を有する新規な予想外のヒツジミオスタチンスプライス変種（ｏＭＳＶ）を同定した。この新規な９６６ｎｔミオスタチンスプライス変種ＯＲＦは、以前に同定されたヒツジミオスタチンＯＲＦ（１１２８ヌクレオチド）と容易に識別できる。ＤＮＡ配列情報およびｏＭＳＶを初めて同定するための本明細書に記載するクローニング戦略に基づいて、予期しない新規なウシのミオスタチンスプライス変種オルソログも、ヘレフォード／フリージアン交配動物の骨格筋から同定された（ｂＭＳＶｈ／ｆ、配列番号５および５２）。以下にも説明するように、その後、多数のその他の哺乳動物種からの他のミオスタチンスプライス変種オルソログが、本明細書に開示したようにして、ミオスタチン遺伝子配列中の選択的スプライス部位の決定により同定された。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のポリマーを意味するものと理解すべきで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、天然または人工的ヌクレオシドまたはヌクレオチドから調製した核酸分子、およびポリヌクレオチドのすべての他の既知の形態を含む、一本鎖および二本鎖両方のポリマーを含むと理解すべきである。ポリヌクレオチドは、天然に生ずる資源から単離し、組換えもしくは分子生物学的技法を使用して生成させ、または合成的に生成させることができる。ポリヌクレオチドは、全遺伝子またはその任意の一部を含んでいてよく、オープンリーディングフレームを含まなくてもよい。
【００４６】
本発明において、配列Ｓ’−ＣＧＴＡＴＴ−３’に対して、相補鎖および逆相補鎖も含まれ、それらは次のようであろう：
相補鎖：３’ＧＣＡＴＡＡ−５’
逆相補鎖：３’ＡＡＴＡＣＧ−５’
【００４７】
本発明によるすべてのポリヌクレオチドの使用には、任意のおよびすべてのオープンリーディングフレームが含まれる。オープンリーディングフレームは、当該分野において知られている技法を使用して構築することができる。これらの技法には、知られている開始および終止コドンを同定するポリヌクレオチド配列の分析が含まれる。この機能を実施することができる多くのコンピュータソフトウェアプログラムが、当該分野において知られている。
【００４８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共有結合で連結した天然産および／または人工のアミノ酸のポリマーを意味すると理解すべきである。ポリペプチドには、天然産の資源から単離されたポリペプチド、組換え技法を使用して作製されたポリペプチド、または合成的に作製されたポリペプチドが含まれる。リーダー配列すなわちプロ配列を含むポリペプチド、または翻訳後修飾を受けるポリペプチドは、ポリペプチドの定義の内に入ることを意味していることを認識すべきである。
【００４９】
「フラグメントまたは変種」という用語は、１つもしくは複数のヌクレオチドまたは１つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失により修飾されているが、未修飾の配列または部分配列と実質的に同じ活性または機能を有する任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列もしくは部分配列を意味すると理解すべきである。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド変種は、報告のあるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％の類似性（好ましくは７０％の配列同一性）、８０％の類似性（好ましくは８０％の配列同一性）、８５％の類似性（好ましくは８５％の配列同一性）、およびより好ましくは９０％の類似性（より好ましくは９０％の配列同一性）を、報告のあるポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、より好ましくは、９５％の類似性（より好ましくは９５％の配列同一性）、およびさらにより好ましくは、９８％の類似性（さらにより好ましくは９８％の配列同一性）を有する。当該分野において知られているように、２つの上記生体ポリマー、例えば、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれへの保存されたアミノ酸置換物を第２のポリペプチドのアミノ酸配列と比較することにより決定される。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子のフラグメントまたは部分を、全長ポリヌクレオチドを合成するために使用することができる。本明細書で使用する「相同性％」は、２つ以上のポリペプチドを配列比較し、それらの配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／ＮＣＢＩデータベース（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ；インターネット：＞ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／ｎｐｈ−ｎｅｗｂｌａｓｔを参照されたい）により提供されるデフォルトの重みづけにより、配列ギャップおよび配列ギャップミスマッチに重みづけをするギャップつきＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７））を使用して分析したときに、配列中で対応するアミノ酸残基位置に位置する同一アミノ酸のパーセンテージを意味する。
【００５０】
変種は保存的置換を含むことが好ましい。「保存的置換」とは、アミノ酸が、類似の性質を有する他のアミノ酸で置換され、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの２次構造および疎水性親水性指標の性質は実質的に不変であると予想するような置換のことである。一般的に、アミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいてなされる。例えば、陰性に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ、陽性に荷電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが挙げられ、類似の親水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシン、およびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。保存的変化を示すことができるアミノ酸の他の群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。
【００５１】
アミノ酸は、その側基の性質によって分類することができる。非極性のアルキル側基を有するアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが挙げられる。セリンおよびトレオニンは側基にヒドロキシル基を有し、ヒドロキシル基は極性であり、水素結合できるので、これらのアミノ酸は親水性である。硫黄基はメチオニンおよびシステインに見出される。カルボン酸基はアスパラギン酸およびグルタミン酸の側基の部分であり、カルボン酸基の酸性のゆえに、そのアミノ酸は極性であるばかりでなく、溶液中で陰性に荷電することができる。グルタミンおよびアスパラギンは、側基がアミド基を含むことを除いてグルタミン酸およびアスパラギン酸に類似している。リジン、アルギニン、およびヒスチジンは側基に１つまたは複数のアミノ基を有し、それがプロトンを受け取ることができるので、これらのアミノ酸は塩基として作用する。芳香族基は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの側基に見出すことができる。チロシンは、そのヒドロキシル基のために極性であるが、トリプトファンおよびフェニルアラニンは非極性である。変種は、もう１つの選択肢として、非保存的変化を含むこともできる。
【００５２】
少なくとも１つの置換、付加、挿入、または欠失のあるＭＳＶ変種は、本明細書に記載し、また当該分野において知られている変異誘起法によって作製することができる。ＭＳＶ変種または誘導体をコードするポリヌクレオチド配列におけるそのような修飾は、オリゴヌクレオチドを標的とした部位特異的変異誘起などの標準的変異誘起技法を使用して導入することができる。天然のアミノ酸配列の変更は、多数の従来の方法のいずれかによって達成することができる。変異は、天然配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位が隣接している変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。連結後に生成した再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードしている。あるいは、本明細書に詳細に記載し、また当該分野において知られているように、所定のコドンを置換、欠失、または挿入により変更することができる、オリゴヌクレオチドを標的とした部位特異的変異誘起手順は、変更したコードするポリオリゴヌクレオチドを提供するために使用することができる。本発明において使用するためのＭＳＶポリペプチドは、本明細書に記載したように、全長ＭＳＶポリペプチドの一部もしくはフラグメントまたは切り詰めたＭＳＶポリペプチドであってよい。本明細書においてさらに詳細に説明したように、切り詰めたＭＳＶポリペプチドは、ＭＳＶポリペプチドの全長版に満たないいかなるＭＳＶポリペプチドの分子であってもよい。本明細書において使用する「欠失」は、当業者に理解されている通常の意味を有し、例えば、本明細書において提供する切り詰めた分子の場合のように、対応する全長分子に比較して、末端からまたは非末端領域から、配列の１つまたは複数の部分を欠く分子を指すことができる。ＭＳＶポリペプチドの一部分またはフラグメントまたは切り詰めた形態は、約３２０、３００、２７５、２５０、２２５、  ２００、１７５、１７０、１６０、１５５、１５０、１４９、１４８、１４７、１４６、１４５、１４４、１４３、１４２、１４１、１４０、１３９、１３８、１３７、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、６５、５０、４５、４０、３５、３５、２５、２０、１５アミノ酸未満の任意の数のアミノ酸を有することができる。
【００５３】
ペプチド配列の３次元構造を非常に正確に予測できるソフトウェアが使用可能であることも認識すべきである（Ｂｒａｄｅｌｙ、２００５）。それ故、当業者は、そのようなソフトウェアを使用して、ペプチド配列の変異のペプチド配列の構造に対する効果、したがって、ペプチド活性に対する何らかの有りそうな効果を予測することが可能であろう。そのような変異も本発明の範囲内に組み込む。
【００５４】
ポリヌクレオチドのフラグメントは、ストリンジェントな条件で配列番号１〜７のいずれか１つの配列に特異的にハイブリダイズする、十分な長さのポリヌクレオチドフラグメントも含む。「ストリンジェントな条件」の例には、６５℃、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳでのプレハイブリダイゼーション；６５℃、５×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、一晩でのハイブリッド形成の実施；各々６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３０分間の２回の洗浄；それに続く各々６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでやはり３０分間の２回のさらなる洗浄が挙げられる。
【００５５】
ポリペプチドフラグメントには、筋肉成長を促進する活性を保持するフラグメントも含まれる。このフラグメントは、変更された活性、すなわち、適当な対照ポリペプチド（例えば、全長ポリペプチド）に対して統計的に有意なように増大または減少した活性、例えば、フラグメントが細胞に導入され、または発現したときに、筋肉成長を促進する能力が上昇する結果になるような（例えば、統計的有意性をもって）増強された活性を有することができる。あるいは、フラグメントは、機能における統計的に有意な減少、例えば、優勢な負の効果として顕在化する変更された活性を有することができる。本発明によるペプチドが筋肉成長を促進することができるかどうかの決定は、本明細書に記載したペプチドの存在または不存在下に筋芽細胞を成長させることにより試験することができる。筋芽細胞の成長の増大は、ペプチドが筋肉成長促進活性をもつことを示す。適当な細胞ラインは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７７２）であってよいが、しかし、本明細書に記載した始原のヒツジまたはヒト筋芽細胞などの任意の適当な筋芽細胞の細胞ラインを使用することができるということは理解されるであろう。
【００５６】
本明細書において使用する「単離された」という用語は、ＭＳＶポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドなどの分子を、その天然の供給源、環境または生物的環境から取り出すこと（例えば、無傷の細胞という供給源からタンパク質を取り出すこと）を指す。また、本明細書において使用する「精製した」という用語は、ＭＳＶポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドが、例えば、組換え宿主細胞培養の精製産物として、または非組換え供給源からの精製産物として、他のポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドを本質的に伴わないということを意味する。「単離された」ポリペプチドは、それ故、その本来の環境から取り出されたものである。そのようなポリペプチドは、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％または９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも約９９％純粋であることが、例えば、上記の純度が調製物中に存在する検出可能なＭＳＶポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを他の検出可能なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドと比較したときのパーセンテージを指す場合に、好ましい。本明細書において使用する「実質的に精製された」または「実質的に単離された」という用語は、特異的抗体またはリガンドを用いるアフィニティクロマトグラフィーなど通常の方法を使用して除去できる既知のタンパク質の存在は例外として、他のポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドを本質的に伴わないＭＳＶポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドなどの分子を含む混合物を意味し、かつ、その実質的に精製されたまたは実質的に単離されたＭＳＶポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドが、本明細書に記載したその生化学的特徴を保持しているか、またはその検出可能な機能的生物活性の少なくとも１つを保持していることを意味する。
【００５７】
「遺伝子発現」は、転写開始、ＤＮＡの一区域のｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味すると理解すべきである。「遺伝子発現の調節因子」は、遺伝子発現における増加または減少を、統計的に有意なように惹起することができ、かつ、遺伝子発現経路のどこかのポイントで作用することができる任意の化合物として定義される。
【００５８】
「筋肉成長」は、筋細胞の分裂および／または分化を意味すると理解すべきであり、任意の前駆細胞の分裂および／または分化、そのような細胞相互の融合、および／または存在する筋線維との融合を含み、この用語はまた、より高いタンパク質含有量およびより大きい筋線維量（筋線維肥大）に至る筋線維に増加したタンパク質合成も含む。
【００５９】
「タンパク質活性調節因子」は、タンパク質活性または機能（例えば、ミオスタチン生物活性）を、統計的に有意なように増大または減少させることができる作用剤、化合物または組成物を意味すると理解すべきである。
【００６０】
本明細書で開示したミオスタチンスプライス変種（ＭＳＶ）は、選択的スプライシング事象の結果であると考えられる。図１に示したように、標準的ミオスタチン前駆体ｍＲＮＡはミオスタチン遺伝子の３つのエクソンすべてのポリヌクレオチド配列を含むように転写され得る。３つのエクソンは、スプライスドナーおよびアクセプター部位、ＳＤ１およびＳＡ１、ならびにＳＤ２およびＳＡ２によってそれぞれ結合されている。２つのイントロン、１つはＳＤ１とＳＡ１との間、もう１つはＳＤ２とＳＡ２との間であるが、それらの除去は標準的ミオスタチンｍＲＮＡを生ずる。翻訳開始部位は、エクソン１に位置し、終止コドンはエクソン３に入って途中約３分の１に位置していて、そのことは通常エクソン３の中に大きな３’非翻訳領域があることを意味している。
【００６１】
本明細書で初めて開示したように、ミオスタチン遺伝子発現の途中で、ＳＤ３とＳＡ３との間またはＳＤ２とＳＡ３との間（図１）で余分なスプライシング事象が起こる過程によって、選択的スプライシング事象も起こって、標準的エクソン３の正常に翻訳される部分の大部分が切り取られて、エクソン３の正常では翻訳されない３’部分で置き換えられることが惹起されることがある。この予想外の事象は、ＭＳＶタンパク質が翻訳され得る新規なオープンリーディングフレームを創出する。
【００６２】
その結果生成するＭＳＶポリペプチド、ヒツジＭＳＶ（ｏＭＳＶ；配列番号４８）およびウシＭＳＶ（ｂＭＳＶ；配列番号５２）は、天然ミオスタチンポリペプチドと最初の２５７アミノ酸を共有するが、独自の６４アミノ酸Ｃ末端を有する（ヒツジｏＭＳＶ６５、配列番号４９、およびウシｂＭＳＶ、配列番号５２）。ｍＲＮＡレベルで、ＭＳＶのＯＲＦ独自の３’末端が１９５ヌクレオチド相違していることに注目することが大切である。ＭＳＶタンパク質中の２５７位におけるバリン残基は標準的ミオスタチン配列中において完全に一致して同一であり、その理由は、スプライシング部位が、ＭＳＶの翻訳された配列の一部であるバリン残基に対するヌクレオチドトリプレットのコーディングに丁度そこで先行していることである。それ故、スプライスは、実際には６５アミノ酸フラグメントを生ずる結果となり、その６４アミノ酸だけが標準的ミオスタチン配列と異なる。
【００６３】
同定された選択的スプライス部位に基づいて、次の配列も確立されている：ウシ（ｂｔ）（ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）；ｂ１（ｂｔ）ＭＳＶ６５、配列番号６および５３；ｂ２（ｂｔ）ＭＳＶ６５、配列番号９および５６、ｂ３（ｂｔ）ＭＳＶ６５、配列番号ａ２および５９およびｂ４（ｂｔ）ＭＳＶ６５、配列番号１５および６２）、ウシ（ｂｉ）（コブウシ（Ｂｏｓ  ｉｎｄｉｃｕｓ）ｂ（ｂｉ）ＭＳＶ６５、配列番号１８および６５）、ウシ（ｂｇ）（ヤク（Ｂｏｓ  ｇｒｕｎｎｉｅｎｓ）、ｂ（ｂｇ）ＭＳＶ６５配列番号２１および６８）、ブタ（ブタ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ｐＭＳＶ６８、配列番号２４および７１）、ヒト（ホモサピエンス、ｈ１ＭＳＶ３８、配列番号２７および７４ならびにｈ２ＭＳＶ３８、配列番号７７）、チンパンジー（ナミチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、ｃｈＭＳＶ３８、配列番号３３および８０）、イヌ（イエイヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ｄ１ＭＳＶ３６、配列番号３６および８３、ならびにｄ２ＭＳＶ３６、配列番号３９および８６、ならびにｄ３ＭＳＶ３６、配列番号４２および８９）、およびネコ（イエネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ）、ｃａＭＳＶ３８、配列番号４５および９２）。
【００６４】
同定されている配列の比較を図１５に示す。ブタの配列（ｐＭＳＶ６８、配列番号７１）は余分な３アミノ酸残基を有して、合計６８になることは注目すべきである。さらにヒト、チンパンジー、およびネコはすべて切り詰められており３８アミノ酸残基のみを備えている。イヌの配列はさらに短く、３６だけのアミノ酸長である。
【００６５】
種々の配列の分析により、多数の多形も同定されている。２つのヒト異形が同定されており、１位にグリシン残基を有するｈ１ＭＳＶ３８（配列番号７４）、および１位にバリン残基を有するｈ２ＭＳＶ３８（配列番号７７）がある。イヌでは、３つの多形が同定されている；２６位にイソロイシン残基を、２８位にフェニルアラニンを有するｄ１ＭＳＶ３６（配列番号８３）、２６位にイソロイシンの代わりにフェニルアラニン残基を有するｄ２ＭＳＶ３６（配列番号８６）、および２８位にフェニルアラニンの代わりにロイシンを有するｄ３ＭＳＶ３６（配列番号８９）である。
【００６６】
ウシでも、４つの別々の多形が同定されている。（家畜種ウシ）ｂ１（ｂｔ）ＭＳＶ６５（配列番号５３）は、２１位にフェニルアラニンを、３４位にグルタミン酸を、および４８位にグルタミンを有し；ｂ２（ｂｔ）ＭＳＶ６５（配列番号５６）は、２１位にロイシンを、３４位にバリンを、および４８位にグルタミンを有し；ｂ３（ｂｔ）ＭＳＶ６５（配列番号５９）は、２１位にロイシンを、３４位にグルタミン酸を、および４８位にグルタミンを有し；およびｂ４（ｂｔ）ＭＳＶ６５（配列番号６２）は、２１位にフェニルアラニンを、３４位にグルタミン酸を、および４８位にセリンを有する。
【００６７】
それ故、本発明は、下に並べたようなウシ、ヒツジ、ブタ、ヒト、チンパンジー、イヌおよびネコのＭＳＶポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列（多形を含む）を含む。
【００６８】
【表１−１】
2008514227.tif 000002
【表１−２】
2008514227.tif 000003
【００６９】
本発明のポリヌクレオチドはベクターに導入することができる。ベクターは、本発明による配列を、宿主細胞への導入および／またはその中での維持を助けるプラスミドおよび／またはウィルスに導入することを含むことを意図している。適当なベクターは当該分野において知られており、発現ベクターを含む。発現ベクターには、特定の宿主細胞中で目的のタンパク質を特異的に発現させるためのベクターが含まれる。通常、そのようなベクターには、作動可能に結合したプロモーター配列、目的のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止を含み、プロモーターが目的のポリヌクレオチドの遺伝子発現を生じさせ、一方遺伝子終止が転写を終止させることを意味する。遺伝子発現に有効に作用する適当なプロモーターは、当該分野におい周知であり、ミオスタチンプロモーターを含んでよいが、これに限定はされない。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれも含むことができる。真核細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにあってもよく、始原のまたは組換えの細胞ラインであってよい。
【００７０】
本発明の新規なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドに基づく組成物も考慮される。１つまたは２つ以上の組成物を、ミオスタチンを制御するために、または筋肉成長を制御するために使用することができる。筋肉成長の制御は、筋肉の成長および／または発達の速度における何らかの変化を含み、かつ任意の筋前駆細胞の成長および／または分化を含むことを意図している。これは、前駆筋細胞が分裂する速度におけるいかなる変化、および前駆筋細胞が分化する速度におけるいかなる変化をも含む。変化は増大または減少のいずれでもよい。
【００７１】
組成物は、配列番号１から４７もしくは９６のいずれか１つを含む本発明によるポリヌクレオチド配列、上記ポリヌクレオチドのいずれか１つに９５％、９０％、８０％もしくは７５％の相同性を有するポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種を含んでいてよい。配列は、ミオスタチンプロモーターまたは任意の他の適当なプロモーターのいずれかのプロモーターの制御下にある適当なベクター中への導入によって細胞中に導入することができる。プロモーターは本発明によるＭＳＶタンパク質の発現を起こさせ、それにより細胞中における遺伝子発現およびＭＳＶ活性の両方を増大させることに使用することができる。
【００７２】
組成物は、本発明によるポリヌクレオチドの相補鎖、逆相補鎖、またはアンチセンスポリヌクレオチドも含むことができる。
【００７３】
組成物は、配列番号４８から９５のいずれか１つを含む本発明によるポリペプチド配列、上記ポリペプチドのいずれか１つに９５％、９０％、８０％もしくは７５％の相同性を有するポリペプチドも含んでいてよい。ペプチドは、対象者に投与するために適当な組成物中に直接導入してよい。適当な組成物は、経口または局所投与、吸入、注射による投与または他の適当な形態のための組成物を含むことができる。
【００７４】
配列の相同性は、配列をアラインして一致する残基数を定量することにより定量することができる。配列同一性を定量するための多くのコンピュータアルゴリズム、例えば、ポリヌクレオチド配列間の相同性を定量するためのＢＬＡＳＴＮ、およびポリペプチド配列間の相同性を定量するためのＢＬＡＳＴＰが、当該分野において知られている。
【００７５】
組成物はＭＳＶ活性の調節因子も含んでいてよい。これは、ＭＳＶ遺伝子発現の調節因子またはＭＳＶタンパク質活性の調節因子を含んでいてよい。
【００７６】
ＭＳＶ発現の調節因子は、本発明によるポリヌクレオチドに特異的に結合して、ＭＳＶ遺伝子発現の速度に影響を与えることができる化合物であってよい。遺伝子発現における変化は、細胞または対象者におけるＭＳＶタンパク質の増加または減少のいずれかによって決定することができる。ＭＳＶ発現の調節因子はＭＳＶプロモーターに特異的に結合することができて、それにより遺伝子転写が開始される速度に影響を与えることができる。あるいは、ＭＳＶ遺伝子発現の調節因子はＭＳＶ遺伝子またはＭＳＶ  ｍＲＮＡに結合して、遺伝子が発現する速度に直接影響することもできる。ＭＳＶ遺伝子発現の調節因子はＭＳＶ遺伝子に結合して、例えば、相同性の組換えによって配列中に変化を導入することもできて、配列中の変化は遺伝子が発現する速度に影響することができるか、またはＭＳＶタンパク質の活性を変化させることができる。配列における変更は、生成するポリペプチド中におけるアミノ酸変更、挿入または欠失を生じてもよく生じなくてもよいヌクレオチド変更、挿入または欠失を含む。変更の例には、切り詰められたポリペプチドが生成するような終止コドンの挿入、または１つまたは２つ以上のアミノ酸残基が変更されるような１つまたは２つ以上のコドンの変更を挙げることができる。あるいは、変異は野生型ＭＳＶ遺伝子の区域欠失またはＭＳＶ遺伝子中への区域導入であってもよい。そのような変更をなすための技法は当該分野において周知である。さらに、そのような変更をＭＳＶ遺伝子に導入して、それからＭＳＶ活性における変化を、例えば、実施例に記載した筋芽細胞増殖を使用して試験することは、当業者の領域内である。
【００７７】
あるいは、ＭＳＶ発現の調節因子はＲＮＡプロセシング工程を変更することにより作用することができる。それにより、ＲＮＡプロセシングの調節因子はミオスタチンのＭＳＶに対する比を変更するであろう。ＲＮＡ転写の調節因子は、ＲＮＡプロセシングの調節因子と一緒に使用して、天然ＲＮＡ分子が転写される速度およびその結果生ずるＭＳＶ量の両者を制御することができる。例えば、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ技法を使用して、標準的ミオスタチンとＭＳＶとの比を変更することができる。それを行うときに、例えば、ミオスタチンの筋肉成長に対する阻害効果を減少させることができ、同時にＭＳＶの筋肉成長増強効果を増大させることができる。干渉ＲＮＡ分子の効果は、ＭＳＶペプチドの量における減少により立証することができる。
【００７８】
ＭＳＶ遺伝子発現は、転写および／または翻訳に干渉するポリヌクレオチドを導入することにより改変することもできる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドを導入することができ、それにはアンチセンス発現ベクター、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスポリヌクレオチドの有効性を増強する化学修飾の使用を含む当該分野において知られているいかなる他の手段が含まれてもよい。
【００７９】
いかなるアンチセンスポリヌクレオチドも目的のポリヌクレオチドに１００％相補的である必要はなくて、遺伝子またはｍＲＮＡに結合して、他の遺伝子の発現を実質的に妨げることなく、遺伝子発現を妨げるのに十分な相同性を有することを必要とするだけであることは理解されるであろう。５’非翻訳領域を含む、遺伝子に相補的であるポリヌクレオチドは、ＭＳＶタンパク質の翻訳を妨げるために使用することができることも理解されるであろう。同様に、これらの相補的ポリヌクレオチドは、１００％相補的である必要はなくて、他の遺伝子の翻訳を実質的に妨げることなく、ｍＲＮＡに結合して、翻訳を妨げるのに十分であることが必要なのである。
【００８０】
遺伝子発現の調節は、当該分野において知られているように干渉ＲＮＡ分子の使用を含むこともでき、またＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。
【００８１】
干渉ＲＮＡの使用は当該分野において今や周知であって、本発明で開示された配列を考慮すれば、適当な干渉ＲＮＡを設計し、試験することができる。治療的ＲＮＡ干渉の使用は、当該分野において知られていて（Ｕｐｒｉｃｈａｒｄ、２００５）、選択的スプライシングを変更するエクソン特異的干渉ＲＮＡ（Ｃｅｌｏｌｔｏ、２００２）の使用である。
【００８２】
遺伝子発現の調節は、触媒的ＲＮＡ分子すなわちリボザイムの使用によっても達成することができる。そのようなリボザイムは、特異的に標的とするＲＮＡ分子と対になるように設計することができることが当該分野において知られている。リボザイムは標的とするＲＮＡに結合して分解する。
【００８３】
遺伝子発現の調節およびＲＮＡプロセシングの、当該分野において知られているいかなる他の技法も、ＭＳＶ遺伝子発現の調節に使用することができる。
【００８４】
組成物はＭＳＶ活性の調節因子も含んでよい。組成物中のＭＳＶ活性の調節因子は、ＭＳＶの筋肉成長を促進する能力を増大または減少させることができる。ＭＳＶの調節因子は、本発明によるポリペプチドの優勢阻害変種を含んでよい。優勢阻害効果は、変種が野生型タンパク質の生理学的活性を遮断するように作用する場合に生ずる。この効果は、優勢阻害タンパク質が受容体に結合はするがそれを活性化せず、一方では野生型タンパク質の結合も防止することにより生じ得る。あるいは、優勢阻害変種は、野生型タンパク質に直接結合して不活性化することにより作用し得る。このように、本発明のポリヌクレオチドは、適当な組成物を作製するために使用することができ、またはＭＳＶ遺伝子発現を制御して、それにより筋肉成長を制御する適当な組成物をデザインするために使用することができる。そのような技法は、細胞内、例えば、始原のまたはトランスフォームされた細胞内におけるＭＳＶ遺伝子発現を制御するために、または動物内における筋肉成長を制御するために使用することができる。
【００８５】
ＭＳＶ活性の調節因子は、プロペプチドのタンパク質分解プロセシングの調節因子を含むこともできる。そのような調節因子は、プロペプチド変換酵素、例えば、フューリンエンドペプチダーゼ、またはプロペプチド変換酵素のアゴニストもしくはアンタゴニストを含むことができる。
【００８６】
本発明の１つまたは２つ以上の組成物の１つの可能性は、筋細胞の成長および／または分化を促進または阻害することである。筋細胞は始原のまたはトランスフォームされた細胞ラインのいずれかであってよく、あるいは細胞が宿主動物のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞であってもよい。適当な宿主動物には、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽類、ブタ、魚類、ウマ、マウス、ラットまたはヒトを挙げることができる。
【００８７】
本発明の１つまたは２つ以上の組成物は、筋組織に関連する疾患の治療に使用することもできる。筋組織に関連する疾患には、正常な筋組織に比較して筋組織中の変化を含むいかなる疾患または医学的状態も含まれる。そのような変化は筋肉質量における増加もしくは減少を、または筋線維における増加もしくは減少を示すことがある。そのような疾患には、筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、および癌またはＨＩＶなどの疾患に関連する筋肉消耗、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。梗塞を含む心筋肉成長に関連する疾患もまた考慮される。そのような疾患を診断するための適当な方法は、当該分野において周知であり、被験者の身体的検査または筋肉もしくは他の身体試料のより詳細な分析の両方を含むことができる。上で列記したような疾患または類似の疾患は適当な臨床医ならば診断することができる。
【００８８】
組成物は、任意の適当な形態で投与することができ、その形態は、経口、局所、吸入、注射または当該分野において知られているいかなる他の適当な投与形態も含むことができる。組成物は、状態における改善に効果がある十分な時間および量で適用することができる。
【００８９】
同様に、トランスジェニック動物を作製するために１つまたは２つ以上の組成物を使用することができる。筋肉質量の増加を有するトランスジェニック動物を作製するために、組成物を使用することができる。適当な動物には、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽類、ブタ、魚類、ウマ、マウス、ラットまたはヒトを挙げることができる。トランスジェニック動物を作製するために多くの技法が当該分野において知られていて、任意の適当な方法を使用することができる。
【００９０】
本発明の他の応用は、動物の筋肉質量を予測することであってもよい。それを行うためには、試料を動物から得る。代表的な量のＭＳＶを含む何らかの身体試料が適当であり、試料には、血液試料、生検試料、または筋肉組織試料を挙げることができる。次に、ＭＳＶ遺伝子発現、またはＭＳＶタンパク質のレベルを求めるために、試料を分析する。遺伝子発現またはタンパク質量を測定するために多くの技法が当該分野において知られている。例えば、遺伝子発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析を使用して分析することができる。タンパク質含有量はＥＬＩＳＡ［酵素結合免疫吸着アッセイ］またはウェスタンブロット分析を使用して定量することができる。そのような適当な方法も、例えば、どのようなテキストにも、例えば、マニアティス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）にも出ているような方法も使用することができる。
【００９１】
次に、ＭＳＶ遺伝子発現のレベル、またはＭＳＶタンパク質の量を、平均と比較する。ＭＳＶ遺伝子発現の平均レベルは、平均的筋肉質量の動物の試料から得た平均レベルである。同様に、ＭＳＶタンパク質の平均量は、平均的筋肉質量の動物の試料で測定されたタンパク質の量である。
【００９２】
平均と比較したＭＳＶ遺伝子発現またはＭＳＶタンパク質の増加したレベルは、動物の筋肉質量が平均を超える筋肉質量を有すると予測されるであろうということを意味する。平均と比較したＭＳＶ遺伝子発現またはＭＳＶタンパク質の減少したレベルは、筋肉質量が平均未満であると予測されるであろうということを意味する。
【００９３】
この方法は、増加または減少した筋肉質量を有する子孫を作出する品種改良プログラムに含めるべき動物を選抜するために使用することができる。
【００９４】
本発明は、本発明によるポリペプチドの任意の１つに優先的に結合することができるポリペプチドも提供する。多くのそのようなポリペプチドが当該分野において知られていて、抗体；非哺乳動物抗体、例えば、サメのＩｇＮＡＲクラスの抗体；細菌の免疫タンパク質、例えば、イー・コリの免疫タンパク質ＩＭＭ７、または当該分野において知られている任意の他のクラスの結合性タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で開示した配列が与えられれば、当業者は、本発明のポリペプチドに選択的に結合するポリペプチドを得るために、そのようなポリペプチドを作製することができ、または既知の結合性ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることができるであろう。ハイブリドーマ細胞の作製を含め、いかにして抗体を作製することができるかの例は、Ｅｒｙｌ  ＬｉｄｄｅｌｌおよびＣｒｙｅｒまたはＪａｖｏｉｓに見出される。ポリペプチドが、選択的結合活性を与えるようなポリペプチドからのフラグメント、例えば、抗体の可変ドメインを含むことは理解されるであろう。
【００９５】
実験：
ヒツジＭＳＶの新規なＣ末端配列の生物学的機能を探索するために、６５アミノ酸ペプチド（配列番号４９）をイー・コリ中で組換えタンパク質として発現させ（組換えヒツジミオスタチンスプライス変種６５（ｒｏＭＳＶ６５）と称する）、その機能を筋細胞培養系で試験した。
【００９６】
ノーザンブロット分析は、組織から単離した全体としてのＭＳＶ  ｍＲＮＡ種またはｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを同定するために実施した。ヒツジＭＳＶがヒツジ骨格筋でＲＴ−ＰＣＲにより最初に同定されたので、ＲＮＡ全体をノーザンブロット分析するために半腱様筋から単離し、続いて放射性標識ＤＮＡプローブのリボソームＲＮＡ関連非特異的結合を排除してｍＲＮＡ含有率を高めるために、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。最初に、エクソン１／２に相補的なプローブを使用した。図２に示したように、このＥｘ１／２プローブは、２．９ｋｂで標準的ミオスタチンｍＲＮＡに、およびＭＳＶを同定するより大きい４．５ｋｂのｍＲＮＡ種に対応する２本のバンドを検出した。標準的ミオスタチンおよびＭＳＶのｍＲＮＡは同じエクソン１および２の配列を共有するので、この結果は期待される２つの陽性ハイブリッド形成シグナルと矛盾しない。ＭＳＶ  ｍＲＮＡを標準的ミオスタチンと分離して同定するために、標準的ミオスタチンのポリアデニル化部位の３’ＵＴＲ配列下流に相同性の２つのプローブを使用した。標準的ミオスタチンｍＲＮＡはポリアデニル化シグナルに非常に隣接して終止するので、これらのプローブは標準的ミオスタチンｍＲＮＡ（２．９ｋｂ）にハイブリダイズしないはずである。期待したように、これらのハイブリッド形成シグナルは、両方のプローブで同じ４．５ｋｂサイズで検出され、それがＭＳＶ  ｍＲＮＡに対応することを示唆した（ＭＳＶ１および２、図２）。このノーザンブロット分析により、ヒツジ筋肉中のヒツジミオスタチン遺伝子から転写された２つのｍＲＮＡ種の存在が確認された。小さい方の２．９ｋｂのｍＲＮＡ種は標準的ミオスタチンに対応しており、一方大きい方の４．５ｋｂのｍＲＮＡ種はＭＳＶの同定になる。
【００９７】
図３に示したように、６５アミノ酸ペプチド（ｒｏＭＳＶ６５；配列番号４９）は、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（図３ａ）および始原ヒツジ筋芽細胞（図３Ｂ）に加えたときに、用量に依存して筋芽細胞の成長を促進することができる。このことにより、ＭＳＶが筋細胞成長の促進剤またはミオスタチンに対するアンタゴニストとして作用していることが確認される。
【００９８】
ＭＳＶペプチドが筋肉発達を促進するか否かを調べるために、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を分化の途中でｒｏＭＳＶ６５により処理して、次に初期および晩期の筋芽細胞分化の分子マーカーであるミオゲニンおよびミオスタチン重鎖タンパク質のレベルをウェスタンブロット法により測定した。興味あることに、ｒｏＭＳＶ６５は用量に依存してＣ２Ｃ１２筋管中のミオゲニンタンパク質レベルを増加させることが見出された（図４）。このことは、ｒｏＭＳＶ６５が、最終分化プログラムに関連する筋肉特異的遺伝子の誘起の原因になる塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス型転写因子であるミオゲニンの上方制御により、筋芽細胞分化も誘起することを示す（Ｍｏｎｔａｒｒａｓら、１９９１年）。ミオスタチンは、Ｓｍａｄ３により媒介される機構によりミオゲニン、ＭｙｏＤおよびｐ２１を下方制御することにより筋芽細胞分化を阻害する（ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙら、２００３年；Ｊｏｕｌｉａら、２００３年；Ｌａｎｇｌｅｙら、２００２年）。ここで、ＭＳＶ６５がＣ２Ｃ１２筋管中のミオゲニンレベルを反対方向に制御することによりミオスタチンを相殺することが示された。
【００９９】
ミオシン重鎖（ＭＨＣ）タンパク質は、筋線維の収縮性のユニットであるサルコメアの必須の構造構成要素である。２３０ｋＤａのこれらの大きなタンパク質は、最終分化した単核筋芽細胞の融合により形成されて筋肉組織の筋線維中にある筋管中で大量に発現する。図５に示したように、発生ミオシン重鎖（ｄＭＨＣ）タンパク質発現はＣ２Ｃ１２筋管中でｒｏＭＳＶ処理に反応して大きく上方制御される。興味あることに、０．１および１μｇ／ｍｌのｒｏＭＳＶ６５濃度で、未処理の対照に比較して、ｄＭＨＣ存在比でそれぞれ１８から２０倍の増加がある。しかしながら、最高のｒｏＭＳＶ６５用量（１０μｇ／ｍｌ）で、ｄＭＨＣ存在比における２倍の増加が検出されただけであった。これらのデータは、ｒｏＭＳＶ６５はＭＨＣタンパク質合成の上方制御により筋線維肥大を誘起できる可能性があることを示唆する。ＭＨＣ上方制御が何故濃度依存性でないのかは不明で、１０μｇ／ｍｌでの結果は単なるアーチファクトである可能性がある。ＭＨＣ発現の原因となる分子的経路は、今後確認すべきことである。このことにより、ＭＳＶが筋芽細胞の分化を促進できるだけでなく、細胞が筋線維に分化することも促進していることが確認される。
【０１００】
筋肉発達の間、筋芽細胞は最初に筋発生中に細胞分裂を経て後に細胞周期から離脱する。細胞周期から離脱すると、筋芽細胞は筋管に分化し始める。細胞周期の進行およびその終止は、サイクリン依存性キナーゼおよびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫ／ＣＫＩ）複合体により制御される。ミオスタチンは、ｐ２１ｃｉｐ１およびＣｄｋ２タンパク質レベルの調節を通じて筋芽細胞のＧ１からＳへの移行およびＧ２からＭへの移行を制御することが示されている。Ｃｄｋ２を下方発現するのと同様に、ミオスタチンは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１の上方制御もして、それにより、Ｇ１からＳ期への進行を促進するサイクリン／ＣＤＫ複合体を不活性化する（Ｔｈｏｍａｓら、２０００年）。
【０１０１】
図６に示したように、ウェスタンブロット分析により、ｒｏＭＳＶ６５は、ｐ２１発現に対して成熟ミオスタチンと反対の効果を有する、増殖中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞内のｐ２１タンパク質レベルを用量依存的に減少させることが明らかにされた。ｐ２１の低めのレベルでＧ１期からＳ期へ、およびＧ２期からＭ期への細胞周期の進行が可能になり、細胞複製が促進される。このことにより、成熟ミオスタチンおよびＭＳＶは、同じ下流の標的分子ｐ２１であるが、それを異なった方法で制御することが確認される。この発見は、ＭＳＶはミオスタチンの生物活性の天然に生ずるアンタゴニストであるという仮説と一致する。
【０１０２】
ｒｏＭＳＶの分裂誘起活性は、細胞増殖の正の分子マーカーである増殖中の細胞の核抗原（ＰＣＮＡ）で確認される。ＰＣＮＡタンパク質発現の高めのレベルは、細胞周期のＤＮＡ複製期に入っている細胞数が多いことに関連している。図７に示したように、ｒｏＭＳＶ６５で処理したＣ２Ｃ１２筋芽細胞のウェスタンイムノブロットは、ＰＣＮＡタンパク質レベルにおける濃度依存性増加を示した。
【０１０３】
ＭＳＶがミオスタチン活性を制御することができることをさらに確認するために、Ｃ２Ｃ１２増殖アッセイにおけるｒｏＭＳＶ６５のミオスタチンを打ち負かす能力を試験した。図９に示したように、ｒｏＭＳＶ６５は、１．５μｇ／ｍｌのミオスタチン濃度において１：２０（ミオスタチン：ｒｏＭＳＶ６５）モル比で、ミオスタチンにより阻害された筋芽細胞増殖を回復させることができた（図９）。これらのデータにより、ＭＳＶ６５は成熟ミオスタチンのアンタゴニストとして作用していることが確認される。
【０１０４】
これらのデータにより、ＭＳＶ６５は筋肉成長および分化を促進することができ、かつミオスタチンの阻害的効果を制御すなわち妨害することができることが確認される。
【０１０５】
ＭＳＶのタンパク質分解プロセシング
選択的スプライシングの間に正常ミオスタチンｍＲＮＡから切り出されたフラグメントは、Ａｒｇ２６６における正常な触媒的切断部位を含む。しかしながら、フューリンエンドペプチダーゼを含むプロペプチド変換酵素（ＰＣ１〜７）による強力な（ＫＥＲＫ／ＲＸＸＲ）切断部位が２７１位から２７４位に存在することが決定されている（Ｓｔｅｉｎｅｒ、１９９８年）。フューリンタンパク質前駆体変換酵素（ＰＣ）には（Ｋ／Ｒ）−（Ｘ）ｎ−（Ｋ／Ｒ）↓共通モチーフがなければならない（ここで、ｎ＝０、２、４、または６、およびＸはアミノ酸であるが、通常Ｃｙｓではない）（Ｓｅｉｄａｈ、１９９９年、Ｓｅｉｄａｈ、１９９７年）。ＴＧＦ−βファミリーにもっと共通的なのはＲ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒモチーフであり、その場合、ＫおよびＲは互換性であるが、Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ配列が最適である（Ｄｕｂｏｉｓ、２００１年）。２７４位における切断は、ヒツジおよびウシ配列から４７アミノ酸Ｃ末端成熟ＭＳＶフラグメント（ヒツジ：ｏＭＳＶ４７、配列番号５０およびウシ：ｂＭＳＶ４７、配列番号５４）を遊離させるであろう。ブタの配列の切断は５０アミノ酸のフラグメント（ｐＭＳＶ５０、配列番号７２）の遊離という結果を生じ、ヒト、チンパンジーおよびネコに対しては２０アミノ酸フラグメント（ｈ１〜２ＭＳＶ２０、配列番号７５おおよび７８；ｃｈＭＳＶ２０、配列番号８１；およびｃａＭＳＶ２０、配列番号９３）、およびイヌの配列からは１８アミノ酸ペプチド（ｄ１〜３ＭＳＶ１８、配列番号８４、８７、および９０）が遊離される。成熟Ｃ末端ペプチドの存在は、ＭＳＶ４７ペプチドに対する抗体を使用して確認された（図８Ｃ）。
【０１０６】
図１０に示したように、組換えヒツジＭＳＶ４７（ｒｏＭＳＶ４７）はマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖を促進する。図１０の細胞複製曲線は、約０．１〜０．５μｇ／ｍｌの濃度で最大増殖増強活性に達する特徴的なｒｏＭＳＶ４７タンパク質への用量応答を示す。ｒｏＭＳＶ４７処理の結果は筋芽細胞増殖における２倍を超える増加である。
【０１０７】
Ｃ２Ｃ１２増殖アッセイにおいてミオスタチンに打ち勝つｒｏＭＳＶ４７の能力は、図１１に示す。ｒｏＭＳＶ４７は、１．５μｇ／ｍｌのミオスタチン濃度において１：１（標準的ミオスタチン：ｒｏＭＳＶ４７）モル比で、ミオスタチンにより阻害された筋芽細胞増殖を回復させることができた。この回復は、ミオスタチンにより阻害された増殖からの回復にミオスタチン：ｒｏＭＳＶ６５のモル比１：２０が必要であったｒｏＭＳＶ６５に対して見られたものより大である。これらのデータはＭＳＶ４７が成熟ミオスタチンの強力なアンタゴニストとして作用することを示す。
【０１０８】
ミオスタチンのＭＳＶに対する１：１０のモル比が、図１１において増殖を回復させることに何故無効であるかは不明であり、ミオスタチンのｒｈＭＳＶ３８に対するモル比１：１０がミオスタチンの作用に拮抗するだけでなく、対照の増殖を越えて増殖を増大させること（図１３）を考慮すると、これは誤った観察であると推測される。あるいは、ｒｏＭＳＶ４７はｒｈＭＳＶ３８よりも長いペプチドであり、２つの推定αヘリックスを有していて（ｒｈＭＳＶ３８の１つに対して）、長いペプチドは、立体障害のために高濃度では、同族の受容体に対するミオスタチンの作用に同じように効果的に拮抗することができないということはあり得る。
【０１０９】
組換えヒツジＭＳＶ４７（ｒｏＭＳＶ４７）および組換えヒトＭＳＶ３８（ｒｈＭＳＶ３８）筋芽細胞増殖を促進する能力を図１２に示す。図１２ＡはｒｏＭＳＶ４７およびｒｈＭＳＶ３８のマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の８０時間にわたる増殖に対する効果を示し、一方図１２Ｂはヒト筋芽細胞の９６時間にわたる増殖に対する効果を示す。これらの結果から、１つの種のＭＳＶが異なる種の筋芽細胞に対して活性であること、およびより重要なこととして、成熟ペプチドが活性で、ヒト筋芽細胞増殖を促進することができて、ペプチドがヒトならびに他の動物の筋肉疾患の治療に対する治療的活性を提供することを示すことがわかる。図１２は、ｒｏＭＳＶ４７が活性なので、切断後にＬＡＰペプチドと共に残る先行する新規な１８アミノ酸は増殖にとって必要ではないことも示す。
【０１１０】
ヒト始原筋芽細胞増殖アッセイにおいてミオスタチンに打ち勝つｒｈＭＳＶ３８の能力を図１３に示す。最初の４本の棒グラフは、ｒｈＭＳＶ３８が用量に依存してヒト始原筋芽細胞の増殖を促進できることを示す。中央の５本の棒グラフは、ｒｈＭＳＶ３８が、ミオスタチン処理を受けない対照に対する回復を越えて、ヒト筋芽細胞の増殖に対するミオスタチンの阻害的効果に打ち勝つことができることを示す。図１３の最後の２本の棒グラフで示したように、ｒｈＭＳＶ３８の１×モル比で、ミオスタチンの濃度が２倍でも回復が達成された。これらの結果は、ｈＭＳＶ３８がヒト筋肉に対して活性であり、筋肉成長および発達に対するミオスタチンの阻害効果を相殺することができることをさらに示す。
【０１１１】
増殖を促進することおよびミオスタチンの作用に拮抗することに加えて、ミオスタチンの発現に対するＭＳＶの効果も研究した。図１４は、ＭＳＶ（ｒｏＭＳＶ４７）が、増殖しているマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞で、慢性的にも（接種から４８時間）急性的にも（４８時間から５４時間までの６時間）ミオスタチンの発現を抑制することを示す（図１４）。これらのデータは、単にミオスタチンに対して競合するよりも、ミオスタチンの効果を直接相殺し、かつミオスタチンの発現を直接制御するように作用するＭＳＶの作用を支持する。
【０１１２】
機能的ドメイン
種々の配列の比較を、示した種々のフラグメントと共に図１５に示す。コンピュータシミュレーションによる分析（ＧＣＧソフトウェア）を使用する配列の分析は、成熟ペプチド中に、６アミノ酸残基リンカーにより分離された２つのαヘリックスの存在を予測した。興味あることに、ヒト、チンパンジー、ネコおよびイヌはすべて第１αヘリックスのみを含み、一方ウシ、ヒツジおよびブタはすべて両方のαヘリックスを含む。ヒト、チンパンジー、ネコおよびイヌはすべて第１αヘリックスのみを含むので、これは、第１αヘリックスがＭＳＶペプチドの成長促進活性の原因である可能性があることを意味する。これを支持するのは、比較において、推定αヘリックス中に残基のより大なる保存があるという事実である（第１ヘリックス中に５８％および第２ヘリックス中に８９％）。ＭＳＶの生物活性ドメインを同定するための努力において、多数の組換えおよび合成ペプチドが作製された。組換えαヘリックス１（ＭＳＶα１、配列番号５１）および組換えαヘリックス２（ＭＳＶα２、配列番号９８）を作製した。第３リンカーペプチド（ＭＳＶＬ１８、配列番号１００）も第１αヘリックスのＣ末端６残基、リンカー６残基、および第２αヘリックスのＮ末端６残基を含んで構築した。
【０１１３】
ＭＳＶα１が筋肉増殖を促進することができるか否かを試験するために、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞をペプチドの存在下に成長させた。図１６に示したように、ＭＳＶα１は用量に依存してＣ２Ｃ１２細胞の成長を大いに促進した。Ｃ２Ｃ１２の増殖に対するＭＳＶα１、ＭＳＶα２、ＭＳＶＬ１８およびｒｏＭＳＶ４７の効果の比較を図１７に示す。ｒｏＭＳＶ４７およびＭＳＶα１は両方とも用量に依存してＣ２Ｃ１２細胞の成長を促進することができたが、一方ＭＳＶα２およびＭＳＶＬ１８は効果がなかった。
【０１１４】
これらの結果は、ＭＳＶの筋肉成長促進活性が第１αヘリックスに位置していることを示す。さらに、ＭＳＶ４７およびＭＳＶ６５の両方とも活性であったので、それはこのαヘリックスを含むいかなるペプチドも筋促進活性を有するであろうということを意味している。
【０１１５】
図１４に示した配列のアラインメントは、第１αヘリックスについて共通配列：
ＩＩＦＬＥＶＸＩＱＦＣＳＩＬＧＥＴＡＬ
が決定されることを可能にする。
【０１１６】
さらに、同定された種々の配列および種々の多形を比較することにより、第１αヘリックスの基本配列に対する式を確立することができて、それは次の通りである：
Ｘ１  Ｉ  Ｆ  Ｌ  Ｅ  Ｘ２  Ｘ３  Ｘ４  Ｑ  Ｘ５  Ｃ  Ｓ  Ｉ  Ｌ  Ｘ６  Ｘ７  Ｘ８  Ｘ９  Ｘ１０
式中、Ｘ１はＩまたはＬであり；Ｘ２はＶまたはＬであり；Ｘ３はＹ、Ｃ、ＧまたはＳであり；Ｘ４はＩまたはＦであり；Ｘ５はＦまたはＬであり；Ｘ６はＧまたはＥであり；Ｘ７はＥまたはＶであり；Ｘ８はＡまたはＴであり；Ｘ９はＡまたはＶであり；およびＸ１０は存在しないか、ＦまたはＬである。
【０１１７】
第１αヘリックス中の全アミノ酸残基のイオン電荷が配列のすべてに対して一貫したパターンを有することも注目すべきである。すなわち、置換がある場合、異なったアミノ酸が電荷において同様であることが見出されている。例外は１７番残基であって、そこではヒツジおよびウシの両者が極性残基ではなく疎水性残基を有する。それ故、ペプチドの活性を実質的に変化させることなく、その位置のイオン電荷を保持して、配列をさらに変更することは可能であろう。そのような変更は本発明の範囲内に組み込まれることは理解されるであろう。１９アミノ酸αヘリックスについてのイオン電荷は次の通りである：
Ｈ  Ｈ  Ｈ  Ｈ  Ａ  Ｈ  Ｐ  Ｈ  Ｐ  Ｈ  Ｐ  Ｐ  Ｈ  Ｈ  Ｐ  Ａ  Ｐ／Ｈ  Ｈ  Ｈ
（式中、Ｈ＝疎水性、Ｐ＝極性、Ａ＝酸性、Ｂ＝塩基性）。
【０１１８】
癌が誘起した筋肉消耗
ＭＳＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ミオスタチンのその作用に拮抗すること、および筋肉成長を促進することにおいて有効であることが示されている。それ故、ＭＳＶは、筋肉消耗状態のための治療または予防のための良い候補であると思われる。これを試験する目的で、癌悪液質のラットモデルにおける筋肉消耗に対するｒｏＭＳＶ４７の効果を試験した。
【０１１９】
この検討においては、２１匹の雄ラット（３カ月齢）を無作為に各群７匹の３群に配分した。第１群には無菌食塩水を腹腔内に注射し（非癌対照）、第２および第３群には１００μｌのＡＨ１３０腫瘍を腹腔内に接種した（Ｂａｒａｃｏｓら、１９９５年）。第１および第２群には、６日間毎日２回無菌食塩水を皮下注射し、一方第３群には、６日間毎日２回１μｇ／ｇ体質量でｒｏＭＳＶ４７を皮下注射した。第６日にラットを殺して、死亡時に、各ラットの右後肢から骨格筋（大腿二頭筋、腓腹筋、前脛骨筋、大腿四頭筋、足底筋およびヒラメ筋）を切除して、湿質量を第０日の初期体質量に対するパーセントとして表した。
【０１２０】
図１８に示したように、癌により誘起された全身性の骨格筋消耗は２０％減少した。それ故、これらのデータは、ｒｏＭＳＶ４７がｉｎ  ｖｉｖｏで有効であり、癌悪液質における筋肉消耗の重症度を減少させることができることを示す。
【０１２１】
クレアチンキナーゼはＡＴＰとクレアチンとの間の高エネルギーリン酸エステル基の可逆的移動の触媒となり、代謝要求の増大した状態における骨格筋および心筋中の重要なエネルギー発生酵素である（ＷｙｓｓおよびＫａｄｄｕｒａｈ−Ｄａｏｕｋ、２０００年）。筋肉が損傷したとき、しばしばＣＫが血中に遊離するので、それ故、ＣＫ濃度の増大は、心筋梗塞後および筋ジストロフィー中に起こる損傷のマーカーとして使用されてきた（ＷｙｓｓおよびＫａｄｄｕｒａｈ−Ｄａｏｕｋ、２０００年）。しかしながら、癌期中の骨格筋においては、ＣＫの発現は低下することが見出されている（ＢｕｃｋおよびＣｈｏｊｋｉｅｒ、１９９６年）。
【０１２２】
図１９に示したように、ＡＨ１３０細胞を接種しなかった対照ラットに比較して、治療しなかったＡＨ１３０ラットにおいて、ＣＫのレベルが低下した。しかしながら、ｒｏＭＳＶ４７での治療は、ＣＫ濃度を非癌対照のＣＫ濃度に一部回復させている。
【０１２３】
これらの結果は、ＭＳＶが病的状態における筋肉消耗を防止することができることを示す。ＡＨ１３０は極端に攻撃的な癌モデルで、それは非常に短期間（日）に重症の悪液質を誘起することにも留意すべきである。ＭＳＶがそのような急速な筋肉消耗を抑制することができたということは非常に驚異的で、それ故、ＭＳＶは攻撃性のより低い他の癌および筋肉消耗状態において有効であるらしく思われる。
【０１２４】
ベルジャンブルー：
ミオスタチンにおける欠失が、ウシのベルジャンブルー種で観察される、通常ダブルマッスルと称せられる筋肥大の原因であることが見出されている。ベルジャンブルー牛は、成熟ミオスタチンのコード領域中に、フレームシフトおよびエクソン３中の早発の終止コドンの原因になる１１ｂｐ欠失を有することが示されていて、その結果ミオスタチン活性が消滅する。ベルジャン牛のＭＳＶ（ｂＭＳＶｂｂ）も単離され、キャラクタライズされている（配列番号９６および９５）。ｂＭＳＶｂｂ遺伝子（配列番号９６）は、ｂＭＳＶ（配列番号５）のヌクレオチド７４９〜７７０の間に２１ヌクレオチド欠失を含む。ｂＭＳＶｂｂタンパク質（配列番号９５）はアミノ酸長３１４で、ｂＭＳＶ（配列番号５２）より７アミノ酸短い。しかしながら、７アミノ酸欠失は独自の６５アミノ酸Ｃ末端ペプチド内では起こらず、それ故、ｂＭＳＶ６５（配列番号５３）およびｂＭＳＶ４７（配列番号５４）は、正常ウシとベルジャンブルー種の間で同一である。独自の６５アミノ酸Ｃ末端ペプチドの保存は、ＭＳＶタンパク質の機能的重要性を示す。
【０１２５】
ヒツジＭＳＶのプロペプチド（Ｎ末端）領域および成熟（Ｃ末端）領域に特異的なオリゴペプチドを使用して、２つのＭＳＶ特異的ポリクローナル抗体をウサギで発生させた。オリゴペプチドの局所化は、フューリンエンドペプチダーゼを含むプロペプチド変換酵素（ＰＣ１〜７）によるＫＥＲＫアミノ酸モチーフでの前駆体ＭＳＶの提案されているプロセシングに基づく（Ｓｔｅｉｎｅｒ、１９９８年）。ＭＳＶプロペプチド特異的抗体（ＭＰＳＡ）はＭＳＶ前駆体（３７ｋＤａ）およびプロペプチド（２９ｋＤａ）を同定することができる。成熟ＭＳＶ特異的抗体（ＭＭＳＡ）は、前駆体（３７ｋＤａ）および成熟（５．４ｋＤａモノマーまたは推定１１ｋＤａホモダイマー）ＭＳＶを検出することができる。ＭＰＳＡを使用するウェスタンイムノブロット法は、ヒツジ骨格筋および脳中にＭＳＶの前駆体およびプロペプチドを一貫して検出するが、しかしそれらの比はこれらの組織で相違する（図８Ａ）。このことは、プロペプチドプロセシングの効率が筋肉と脳で大きく相違していることを示唆している可能性がある。
【０１２６】
ＰＳＡは、ヒト、ブタ、マウス、およびラットの筋肉および／または脳で、ＭＳＶオルソログも同定した。ウェスタンブロットには他の免疫反応性のバンドがあり、それはＭＳＶ前駆体すなわちＭＳＶタンパク質の共有結合で連結した複合体の切断生成物である可能性がある（Ｊｉａｎｇら、２００４年）。ＭＭＳＡはヒツジ筋肉および脳で前駆タンパク質を同定するが、しかし成熟モノマー（５．４ｋＤａ）またはホモダイマー（１１ｋＤａ）のいずれも検出されない（図８Ｂ）。
【０１２７】
図８Ｂはヒトおよびラットの筋肉中の成熟ＭＳＶのホモダイマーに対応する１１〜１２ｋＤａに免疫反応性のバンドも示す。このことはＭＳＶタンパク質発現およびプロセシングがヒツジおよびウシ以外の種においても起こることを示す。ＭＭＳＡはある範囲のヒツジ血清試料中の成熟ＭＳＶタンパク質を同定した（図８ｃ）。これらのデータは、
１）成熟ＭＳＶタンパク質は血液に分泌されて他のペプチドホルモンと同様に循環することができる、および
２）成熟ＭＳＶのホモダイマーは血液中に存在することができる
ことを示す。
【０１２８】
データを総合すると、ＭＳＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて筋芽細胞複製および分化における成熟ミオスタチンの強力なアンタゴニストであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌筋肉悪液質を減少させることができることが示された。ＭＳＶタンパク質はヒツジおよび他の種（ウシ、ヒト、ブタ、ラットおよびマウス）の筋肉中に検出されていて、それらの存在比は性および種々の生理学的状態で異なる。成熟ＭＳＶはヒツジにおける循環中にも存在する。さらに、ｏＭＳＶおよびｈＭＳＶの両方とも異種の細胞で活性であることが示された。これらの特徴によりＭＳＶは、筋肉成長、再生を増強し、筋ジストロフィーに対処し、身体組成、骨およびグルコース代謝を変化させるための有用な組成物になる。さらに、損傷後の脳および脊髄再生を促進できる可能性がある。
【０１２９】
実験手順：
【実施例１】
【０１３０】
ヒツジおよびウシＭＳＶの同定およびクローニング
ヒツジＭＳＶ：
ミオスタチンｃＤＮＡ（ミオスタチンメッセンジャーＲＮＡの相補的ＤＮＡ配列）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）周辺の側方ＰＣＲプライマーを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ヒツジミオスタチンスプライス変種を最初に同定した。順方向プライマー（５’−ＴＣＡＧＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＣＧ−３’、配列番号１０１）は５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に、逆方法プライマー（５’−ＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＡＡＧＡＣＣＡ−３’、配列番号１０２）は離れた３’ＵＴＲに位置した。ＰＣＲ反応は、２μｌのヒツジ筋肉ｃＤＮＡ（Ｔｅｘｅｌ種ヒツジの半腱様筋のｍＲＮＡから逆転写した）をテンプレートとして、増幅前変性のために９４℃の温度で２分間、それから４５サイクルの、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間で実施した。ＰＣＲ産物は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｐｒｅｐキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ所在）を使用してゲルで精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙイー・コリプラスミドベクターに、メーカーの使用説明（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国所在）に従って、クローニングした。プラスミドクローンはｐＦＪ１０６／３と命名して、挿入物をＷａｉｋａｔｏ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ニュージーランド所在）において、Ｔ７およびＳｐ６プライマーから双方向塩基配列決定により分析した。ｐＦＪ１０６／３の完全な挿入物はＧＳＧ／ＳｅｑＬａｂソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．米国所在、配列番号１）で再構築した。
【０１３１】
次に、完成した配列をミオスタチンの標準的ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０１９６２２）とアラインした。アラインメントにより、ヌクレオチド１（エクソン１における翻訳開始部位ＡＴＧ）からヌクレオチド７７０（エクソン３）まで、４３５番目のヌクレオチドの位置における唯一の非表現突然変異（Ｇ→Ａ遷移）を例外として、標準的ミオスタチンｃＤＮＡとの１００％の配列同一性が明らかになった。さらに、アラインメントにより、１９５ヌクレオチドの新規な翻訳ＤＮＡ領域および新規な翻訳終止部位（ＴＡＡ）が同定された。ＤＮＡ配列分析から、クローンｐＦＪ１０６／３は、標準的ヒツジミオスタチンｍＲＮＡのエクソン３配列内の潜在性イントロンの選択的スプライシングにより生じた新規なヒツジミオスタチンのイソ型を同定したと結論した。新規ミオスタチンイソ型はヒツジミオシンスプライス変種（ｏＭＳＶ）と命名した。ｏＭＳＶ（配列番号１）の配列同定は、ｏＭＳＶの全長ＯＲＦの４つの独立クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅、クローニングおよび塩基配列決定により確認された。
【０１３２】
標準的ヒツジミオスタチンｃＤＮＡの３’ＵＴＲのさらなるクローニングおよび配列決定により、ヌクレオチド７６８におけるスプライシング部位の位置、潜在性イントロンのコンセンサススプライシングドナー（ＳＤ３、ＧＴ）およびアクセプター（ＳＡ３、ＡＧ）部位が同定された（図１）。
【０１３３】
ｏＭＳＶのＯＲＦは３２１アミノ酸タンパク質（配列番号４８）をコードしている。アミノ酸１から２５７は標準的ミオスタチンプロペプチドすなわちＬＡＰ配列と同一である。しかしながら、アミノ酸２５７から３２１（６５ａａ）は、標準的ミオスタチンタンパク質とは類似でないｏＭＳＶの新規なＣ末端ポリペプチド配列を形成する。タンパク質配列およびｏＭＳＶ特異的抗体を使用するウェスタンブロット分析により、３２１ａａ全長ｏＭＳＶタンパク質がＫＥＲＫモチーフに続くアミノ酸２７５でプロセスされて２７４ａａのｏＭＳＶプロペプチドすなわちＬＡＰおよび４７ａａ成熟ｏＭＳＶポリペプチドを生ずることが示唆される。
【０１３４】
ウシＭＳＶ：
ウシミオスタチンスプライス変種（ｂＭＳＶ）を、ＲＴ−ＰＣＲ、およびそれに続く全長ＯＲＦのクローニングおよび塩基配列決定により同定した。順方向プライマー（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴ−３’、配列番号１０３）は、ウシミオスタチンの翻訳開始部位に、逆方向プライマー（５’−ＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＴ−３’、配列番号１０４）はｂＭＳＶの予測された翻訳終止部位に位置した。ＰＣＲ反応は、２μｌのウシ筋肉ｃＤＮＡ（ヘレフォード／フリージアン交配種またはダブルマッスルベルジャンブルー牛の胎児半腱様筋ｍＲＮＡから逆転写した）をテンプレートとして、増幅前変性のために９４℃の温度で２分間、それから４５サイクルの、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で１分間で実施した。ＰＣＲ産物は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｐｒｅｐキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ所在）を使用してゲルで精製し、ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯプラスミドベクターに、メーカーの使用説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）に従って、クローニングした。挿入物をＷａｉｋａｔｏ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ニュージーランド所在）において、ＭＴＦ１およびＢＧＨプライマーから双方向塩基配列決定により分析した。完全な挿入物の配列はＧＳＧ／ＳｅｑＬａｂソフトウェアで構築した（配列番号４）。
【０１３５】
完成した配列ｂＭＳＶ（配列番号４）をミオスタチンの標準的ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ０１９６２０）とアラインした。アラインメントにより、ヌクレオチド１（エクソン１における翻訳開始部位ＡＴＧ）からヌクレオチド７７０（エクソン３）までの、ヘレフォード／フリージアン交配種の標準的ミオスタチンｃＤＮＡとの１００％のＤＮＡ配列同一性、およびベルジャンブルー牛の標準的ミオスタチンｃＤＮＡとのヌクレオチド１（エクソン１中の翻訳開始部位ＡＴＧ）からヌクレオチド７４９（エクソン３）までの１００％のＤＮＡ配列同一性が明らかになった。アラインメントにより、両ウシ種における１９５ヌクレオチドの新規翻訳ＤＮＡ領域および新規翻訳終止部位（ＴＡＡ）も同定された。
【０１３６】
全長ヘレフォード／フリージアン交配種配列（配列番号５）とベルジャンブルー配列（配列番号９６）とのアラインメントにより、ｂＭＳＶのベルジャンブルーイソ型におけるヌクレオチド７４９〜７７０に位置する２１ヌクレオチドの欠失が同定された。新規ウシミオスタチンスプライス変種（ｂＭＳＶ）は、それらの種に従ってヘレフォード／フリージアン交配種ウシミオスタチンスプライス変種（ｂＭＳＶｈ／ｆ、配列番号５）およびベルジャンブルーウシミオスタチンスプライス変種（ｂＭＳＶｂｂ、配列番号９６）と命名した。ｂＭＳＶの配列同定は、ｂＭＳＶの全長ＯＲＦの２つの独立クローンのＲＴ−ＰＣＲ増幅、クローニングおよび塩基配列決定ならびに選択的スプライシング部位をまたぐ部分配列により確認した。ｂＭＳＶｃＤＮＡとウシミオスタチン遺伝子のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦ３２０９９８）とのアラインメントにより、潜在性イントロンのコンセンサススプライシングドナー部位（ＳＤ３：ＧＴ）およびアクセプター部位（ＳＡ３：ＡＧ）が同定された（図１）。
【０１３７】
ｂＭＳＶｈ／ｆのＯＲＦは３２１アミノ酸タンパク質（配列番号５２）をコードしているが、ｂＭＳＶｂｂのＯＲＦは７ａａ短い３１４ａａタンパク質（配列番号９５）をコードしている。しかしタンパク質配列の残部は、調べた２つの種において完全な相同性を示した。興味あることに、独自の６５ａａ  Ｃ末端ペプチド（配列番号５３）がｂＭＳＶｂｂに保存され、それはこのタンパク質配列領域の機能的重要性を示す可能性がある。ｂＭＳＶｈ／ｆ中のアミノ酸１から２５７（配列番号５２）およびｂｂＭＳＶｂｂ中のアミノ酸１から２５０（配列番号９５）は、標準的ミオスタチンプロペプチドすなわちＬＡＰ配列と同じである。しかしながら、ｂＭＳＶｈ／ｆ中の２５７から３２１（６５ａａ）（配列番号５２）およびｂＭＳＶｂｂ中の２５０から３１４（配列番号９５）は、標準的ウシミオスタチンタンパク質に類似でない新規なｂＭＳＶのＣ末端ポリペプチド配列を表す。ｏＭＳＶ特異的抗体を使用するタンパク質配列およびウェスタンブロット分析は、３２１ａａ全長ｂＭＳＶｈ／ｆ（３１４ａａ全長ｂＭＳＶｂｂ）タンパク質がＲＥＲＫモチーフに続くアミノ酸２７５（２６８）でプロセスされて２７４ａａ  ｂＭＳＶｈ／ｆ（２６７ａａ  ｂＭＳＶｂｂ）プロペプチドすなわちＬＡＰおよび同じ４７ａａ成熟ｂＭＳＶｈ／ｆまたはｂＭＳＶｂｂポリペプチド（配列番号５４）を生ずることができることを示唆する。
【実施例２】
【０１３８】
ヒツジＭＳＶのノーザンブロット分析
ヒツジＭＳＶのサイズおよび存在比を確認するために、ｍＲＮＡノーザンブロット分析を使用した。６頭の成体雄Ｒｏｍｎｅｙヒツジの凍結半腱様筋をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）中氷上で、ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘホモジナイザー（Ｊａｎｋｅ  ＆  Ｋｕｎｋｅｌ  ＧｍｂＨ、ドイツ所在）を使用して１３，５００ｒｐｍで３０秒間ホモジナイズした。残屑を１０，０００ｇで１０分間の遠心分離により除去して、全ＲＮＡをメーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）の実施要領に従って単離した。ＲＮＡをジエチルピロカーボネート処理した水に再懸濁して、全ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍで吸光度を測定することにより定量した。約６００マイクログラムの全ＲＮＡをプールして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、英国所在）を使用し、メーカーの使用説明に従って精製した。全体の１０マイクログラムおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの５マイクログラムを１．２％ホルムアルデヒド−アガロースゲルで分離し、次に非荷電ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国）に、毛管作用により移した。膜は紫外線照射を使用して架橋し、メチレンブルーで染色してＲＮＡの完全性および移行の均一性を検証した。
【０１３９】
標準的ヒツジミオスタチンおよびＭＳＶ  ｍＲＮＡ種をノーザンブロットで同定するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、特異的ＤＮＡプローブを作製した。ヒツジ骨格筋からの５マイクログラムの全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）をメーカーの実施要領に従って使用して、逆転写した。ＰＣＲは、２μｌで逆転写反応（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で２分間）の３５サイクルおよび７２℃で５分間の最後の伸長で実施した。ヒツジミオスタチンのエクソン１／２に相同性のオリゴヌクレオチドプライマーは５’−ＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１１６）（順方向、ｎｔ１〜２２）および５’−ＡＴＣＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣ−３’（配列番号１１７）（逆方向、ｎｔ６０１〜６２１）であった。２つのプライマー対を、ヒツジミオスタチン遺伝子の遠隔３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に相補的な配列を有するｍＲＮＡ種を同定するために使用した。これらのプローブは、ＭＳＶ１およびＭＳＶ２と呼ばれ、標準的ヒツジミオスタチンｍＲＮＡ（２．９ｋｂ）にハイブリダイズできなかった。ＰＣＲプライマーは次の通りであった：５’−ＧＣＡＡＧＧＧＴＡＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＡＧ−３’エクソン１／２  ＯＭＳＶ  Ｐ１（配列番号１１８）（順方向、ｎｔ２９１１〜２９３２、ＭＳＶ１）、５’−ＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＡＧＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１１９）（逆方向、ｎｔ３１７７〜３１９８、ＭＳＶ１）、５’−ＴＡＡＡＡＧＴＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１２０）（順方向、ｎｔ３４６１〜３４７９、ＭＳＶ２）および５’−ＧＣＡＡＡＡＴＡＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧ−３’（配列番号１２１）（逆方向、ｎｔ３７３１〜３７５０、ＭＳＶ２）。放射性標識ｃＤＮＡプローブは、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびＲｅｄｉｐｒｉｍｅＩＩ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、英国所在）をメーカーの使用説明に従って使用して調製した。膜はＣｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中５５℃で２時間プレハイブリダイズした。この膜を新鮮Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中で適当な放射性標識プローブと５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリッド形成に続いて、それらを２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ、および０．２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳの各々の中５５℃で１５分間洗浄し、ＢｉｏＭａｘ  Ｘ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク州所在）に−８０℃で露光させた。デンシトメーター（ＧＳ８００、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州所在）およびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、オートラジオグラフをスキャンした。ブロットは０．５％ＳＤＳを使用して８０℃でストリップし、オートラジオグラフィーでチェックし、それから再度プローブにかけた。
【実施例３】
【０１４０】
筋芽細胞の増殖および分化に対する組換えＭＳＶの効果
ＭＳＶタンパク質の組換え発現および精製
ＭＳＶタンパク質の生物学的効果を試験するために、次の組換えペプチドを作製した：ヒツジＭＳＶ６５（ａａ２５７〜３２１）、ウシＭＳＶ４７（ａａ２７５〜３２１）、ヒツジＭＳＶα１ヘリックス（ａａ２７５〜２９３）、ヒツジＭＳＶ連結配列（ａａ２８７〜３０５）、ヒツジＭＳＶα２ヘリックス（ａａ３００〜３２１）、ヒトＭＳＶ３８（ａａ２５７〜２９８）。各々に対する適当なＤＮＡ挿入物をイー・コリでクローニングし、組換えタンパク質として発現させて精製した。ヒトまたはヒツジ（Ｒｏｍｎｅｙ）骨格筋のプールしたｃＤＮＡを、テンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＭＳＶ  ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物は、次の順方向および逆方向のプライマーをそれぞれ使用して得た：
ヒツジＭＳＶ６５（ａａ２５７〜３２１）５’−ＣＡＣＣＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１２２）、５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１２３）；ヒツジＭＳＶ４７（ａａ２７５〜３２１）５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１２４）、５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１２５）；ヒツジＭＳＶα１ヘリックス（ａａ２７５〜２９７）５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１０６）、５’−ＴＴＡＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号１０７）；ヒツジＭＳＶ連結配列（ａａ２８７〜３０６）５’−ＣＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴ−３’（配列番号１２６）、５’−ＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１２７）；ヒツジＭＳＶα２ヘリックス（ａａ２９８〜３２１）５’−ＣＡＣＣＡＡＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号１２８）、５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１２９）；ヒトＭＳＶ３８（ａａ２５７〜２９８）５’−ＣＡＣＣＧＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１３０）、５’−ＴＴＡＡＧＡＴＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１３１）。
ＰＣＲは、２μｌのヒツジ筋肉ｃＤＮＡを使用して、増幅前変性として９４℃で２分間、次に３５〜４５サイクルの、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間で実施した。
【０１４１】
ＰＣＲ産物は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｐｒｅｐキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ所在）を使用してゲルで精製し、ｐＥＴ１００／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）イー・コリタンパク質発現ベクターに、メーカーの使用説明に従ってクローニングした。タンパク質発現構築物は、エンテロキナーゼ切断部位、ＸｐｒｅｓｓエピトープおよびポリＨｉｓ配列を含む３６アミノ酸Ｎ末端タグを含む。生じたプラスミドＤＮＡ構築物を、配列同一性を確認するために、Ｗａｉｋａｔｏ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ニュージーランド所在）で配列決定した。２５ナノグラムのプラスミドをＢＬ２１Ａ１または化学的コンピテントタンパク質発現イー・コリ株であるＢＬ２１Ｓｔａｒイー・コリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）にトランスフォームして、メーカーの実施要領（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）に従って、タンパク質発現のパイロット実験を実施した。誘起されたＢＬ２１ＳｔａｒまたはＢＬ２１Ａ１イー・コリ細胞抽出物中に組換えタンパク質の発現を確認するために、マウスモノクローナル抗Ｘｐｒｅｓｓ−ＨＲＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）および／またはウサギポリクローナル抗ＭＳＶ６５または抗ＭＳＶ４７抗体（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｇｒｏｕｐ、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ、ニュージーランド所在）を使用するウェスタンブロット分析を使用した。組換えタンパク質のより高い収率を与えるイー・コリ宿主を大規模発現のために選択した。
【０１４２】
組換えタンパク質の大規模な発現のために、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、カリフォルニア州所在）で補充した１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）に、前記タンパク質発現イー・コリ株の一晩培養液１００ｍｌを接種した。ＢＬ２１Ａ１イー・コリに対して１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．２０％アラビノースを、またはＢＬ２１Ｓｔａｒイー・コリに対して１ｍＭ  ＩＰＴＧを、ＢＬ２１Ａ１イー・コリに対しては０．４ＯＤ６００またはＢＬ２１Ｓｔａｒイー・コリに対しては０．８０ＯＤ６００の密度で、培地に添加することにより、タンパク質発現を誘起した。３７℃で４時間２５０ｒｐｍで振盪して、細胞に組換えタンパク質を発現させた。培地を４℃、６０００×ｇで１５分間遠心分離にかけることにより、タンパク質を発現している細胞を捕集して、蒸留水で洗浄した。次にイー・コリ細胞を−８０℃で凍結した。翌日、２５ｍｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＨＰＯ４でｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０μｌプロテアーゼ阻害剤［Ｐ８８４９、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在］）中に細胞（５ｇ）を溶解し、回転円板上４℃で３０分間混合した。次に溶解物をドライアイス／エタノール浴中で凍結／解凍した。溶解物は氷水に漬けて、超音波処理を強度８０で、中間に１分間の中断をおいて１分に１秒間の集中照射で１０回行い、次に、１８ゲージのニードルに通してゲノムＤＮＡを破壊した。細胞破片は、４℃、１６０００×ｇで２０分間遠心分離にかけることにより除去して、上清を３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂と共に４℃で１時間穏やかに振盪してインキュベートした。溶解物／樹脂混合物をカラムにかけて、溶解物を貫流させた。残留した樹脂は１０ｍｌの洗浄緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＨＰＯ４でｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）で４回洗浄した。
【０１４３】
組換えタンパク質は、５ｍｌの溶離緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＨＰＯ４でｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）で樹脂から溶離して、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析管中（ＭＷＣＯ  ３，５００、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州所在）で、５００ｍｌの透析緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌでｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で一晩透析した。次に、エンドトキシンを除去するために、タンパク質を２５μｌのポリミキシン（ＢｉｏＲａｄ）と混合し、回転円板上で一晩インキュベートした。カラムを使用して試料からポリミキシンを除去し、得られたタンパク質を透析緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌでｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でさらに２回透析した。エンドトキシンを含まない組換えタンパク質は、０．２２μｍフィルターユニット（ＭｉｌｌｅｘＧＳ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アイルランド所在）を通してろ過滅菌した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）タンパク質アッセイを使用して定量した。組換えタンパク質のサイズ、純度および同定は、ウェスタンブロット分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクーマシーブリリアントブルー染色により検証し、その生物活性はマウスＣ２Ｃ１２またはヒト始原筋芽細胞増殖アッセイで試験した。
【０１４４】
Ｃ２Ｃ１２マウスまたは始原ヒツジ筋芽細胞を使用する増殖アッセイ
ＭＳＶが筋細胞の増殖を促進することを示すために、Ｃ２Ｃ１２マウスおよび始原ヒツジ筋芽細胞を使用した。９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）で、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）中に、筋芽細胞を、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ６５を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した（図３ａおよび３ｂ）。吸光度対細胞数のプロットは、知りたい範囲で直線的であることが見出された（１ｃｍ２当たり４０００から３００００細胞、Ｏｌｉｖｅｒら、１９８９年）。
【０１４５】
ｒｏＭＳＶ６５処理して増殖中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるｐ２１およびＰＣＮＡの発現
ｒｏＭＳＶ６５が筋細胞の細胞周期を制御していることをさらに示すために、２つの分子マーカー、すなわちｐ２１およびＰＣＮＡを使用した。ｐ２１は周期依存性のキナーゼ阻害剤であり、それはＧ１終止を誘起することにより細胞周期の進行を制御して、Ｃｄｋｓを不活性化することにより、または増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の活性を阻害することによりＳ期への移行を遮断する。したがって、ｐ２１タンパク質発現の減少は、細胞増殖速度の増大を示すことができる。ＰＣＮＡは細胞増殖の正のマーカーである。それは、細胞周期におけるＤＮＡ複製中のＤＮＡポリメラーゼδのサブユニットである。ＰＣＮＡタンパク質発現のレベルの高まりは、細胞周期のＤＮＡ複製期へ移行する細胞数の高まりに随伴している。
【０１４６】
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、直径１０ｃｍの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）中で、１ｃｍ２当たり３０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。試験培地、すなわち０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ６５で補充し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで、培地を置換した（ｎ＝３）。次にプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理によりプレートから剥離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄して、１００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ＮＰ４０、５０ｍｌの緩衝液当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国］）に再懸濁した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）タンパク質アッセイを使用して測定した。全タンパク質の２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分離して、エレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。ブロットは、均等な移行を確認するためにＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色液で染色した。ブロットをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、それらを少なくとも１時間ＴＢＳＴ／５％脱脂乳中でブロッキングし、次に１：１０００希釈マウスモノクローナル抗ｐ２１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）または１：５００希釈ウサギポリクローナル抗ＰＣＮＡ（ｓｃ−７９０７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）１次抗体と４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し（５×５分）、１：２０００希釈ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐ０１６１、ＤＡＫＯ）または１：２０００希釈ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐ０４４８、ＤＡＫＯ）２次抗体のいずれかと、室温で１時間インキュベートした。膜を再びＴＢＳＴで洗浄して（５×５分）、強化化学発光で発光させた。バンド強度は、ＧＳ８００デンシトメーター（ＢｉｏＲａｄ、米国所在）で測定した。
【０１４７】
ｒｏＭＳＶ６５処理分化Ｃ２Ｃ１２筋管における発生ミオシン重鎖（ｄＭＨＣ）およびミオゲニンタンパク質発現：
ｒｏＭＳＶ６５が筋芽細胞分化または筋管肥大を制御するかどうかを調べるために、Ｃ２Ｃ１２筋管培養を使用した。ミオゲニンおよびｄＭＨＣのような十分確立された初期および晩期のミオゲニン分化の分子マーカーのレベルを、ｒｏＭＨＣ６５タンパク質の存在下または不存在下に測定した。
【０１４８】
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、直径１０ｃｍの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）中で、１ｃｍ２当たり２５，０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４９】
筋芽細胞の分化を検討するために、培地を、試験培地、すなわち０、０．１、１、または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ６５で補充し、２％ウマ血清を含むＤＭＥＭによって、各濃度について３つの複製で置換した（ｎ＝３）。３７℃、５％ＣＯ２で７２時間プレートをインキュベートした。
【０１５０】
細胞をトリプシン処理によりプレートから剥離し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄して、２００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨｅｐｅｓでｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ＮＰ４０、５０ｍｌの緩衝液当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国］）に再懸濁した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）タンパク質アッセイを使用して測定した。全タンパク質の２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＭＨＣには８％またはミオゲニンには１２％）により分離して、エレクトロブロッティングによってニトロセルロース膜に移した。ブロットは、均等な移行を確認するためにＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色液で染色した。ブロットをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、それらを少なくとも１時間、ミオゲニンに対してはＴＢＳＴ／５％脱脂乳中に、またはｄＭＨＣおよびＭＨＣに対しては１％ＰＶＰ−１０、１％ＰＥＧ４０００、０．３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で補充したＴＢＳ緩衝液中でブロッキングし、それから次の１次抗体と４℃で一晩インキュベートした：１：１０００希釈ウサギポリクローナル抗ミオゲニン抗体（ｓｃ−５７６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州所在）、１：５００希釈マウスモノクローナル抗ラットｄＭＨＣ抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ  英国所在）。膜をＴＢＳＴで洗浄し（５×５分）、１：２０００希釈ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐ０１６１、ＤＡＫＯ）または１：２０００希釈ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐ０４４８、ＤＡＫＯ）２次抗体のいずれかと、室温で１時間インキュベートした。膜を再びＴＢＳＴで洗浄して（５×５分）、強化化学発光で発光させた。バンド強度は、ＧＳ８００デンシトメーター（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州所在）で測定した。
【実施例４】
【０１５１】
ｏＭＳＶ６５は標準的ミオスタチンと競合する
ｒｏＭＳＶ６５と標準的ミオスタチンとの競合は、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞で実施した。筋芽細胞は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）中で、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない；１．５または２．５μｇ／ｍｌの組換えミオスタチンを単独で含む、およびそれにｒｏＭＳＶ６５を１、２、４、１０、２０のモル比で組み合わせて含む；ならびにミオスタチンなしで前記と同量のｒｏＭＳＶ６５含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを、各ウェルに添加して室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【実施例５】
【０１５２】
ＭＳＶ特異的抗体ならびに組織および血液中のＭＳＶタンパク質検出のためのその使用
ＭＳＶタンパク質を特異的に検出および定量的に測定するために、２つのポリクローナル抗ＭＳＶ抗体をウサギで生成させた。
【０１５３】
ヒツジＭＳＶのＣ末端に位置するオリゴペプチドを合成、精製して、免疫するために、Ａｕｓｐｅｐ（Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、オーストラリア所在）によりキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、ＣＹＴＰＰＹＧＱＷＩＦＨＫＥＲＫ（ａａ２６０〜２７４（配列番号１、ＭＳＶ−ＦＪ１）およびＣＫＲＱＳＫＳＩＨＦＧＱＮＦＫ（ａａ２９４〜３０７（配列番号１、ＭＳＶ−ＦＪ３）であった。地方動物倫理委員会（Ｒｕａｋｕｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ニュージーランド所在）の承認を得て、２頭の雌ニュージーランド白色ウサギに各抗原を別々に注射した。最初の注射は、フロイント完全アジュバント中の等量の２００μｇの試験ペプチドからなり、続いて４週間の間隔でフロイント不完全アジュバント中の２本のブースターを注射した。次にウサギから採血して、凝血させるために採血チューブを室温で４時間放置し、血清を４℃、１０００×ｇで３０分間の遠心により分離した。血清は精製するまで−８０℃で保存した。
【０１５４】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は２段階で精製した。まず、それは硫酸アンモニウム沈殿により濃縮し、さらにプロテインＡカラムを使用して精製した。簡単に述べると、１０ｍｌの血清をｐＨ８．０の１００ｍＭトリスにより１：１で希釈し、氷上で連続的に攪拌しながら、固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を最終濃度５％（ｍ／ｖ）になるまで加えた。氷上で３０分間インキュベーション後、溶液を４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離にかけ、透明な上清をビーカーに移した。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を上記と同様に加えて（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を５０％（ｍ／ｖ）に増加させた。その溶液を氷上で３０分間インキュベートして、沈殿したタンパク質を４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離にかけた。タンパク質ペレットをｐＨ８．０の０．１Ｍトリス１０ｍｌ中に再溶解して、平衡させたプロテインＡカラム（Ｐ９４２４、Ｓｉｇｍａ、米国所在）に負荷した。ｐＨ８．０の０．１Ｍグリシン２０ｍｌでカラムを洗浄し、ｐＨ４．０の０．１Ｍグリシン１０ｍｌで、続いてｐＨ３．０の０．１Ｍグリシン１０ｍｌでＩｇＧをカラムから溶離させた。０．５ｍｌずつの分画を捕集して、氷上でｐＨ８．０の１Ｍトリス１００μｌと混合した。
【０１５５】
タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ、米国所在）を使用して各分画で測定した。タンパク質を含む分画をプールして２リットルの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して透析した。透析後、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｓｉｇｍａ、米国所在）を使用してタンパク質濃度を定量し、ＩｇＧを凍結損傷から保護するために、抗体溶液をグリセロールと１：１で混合し、−２０℃で貯蔵した。精製したＩｇＧは、ウェスタンイムノブロット法における１次抗体として、一連の希釈液（１：３００から１：３０，０００）を使用して試験した。
【０１５６】
これら２つのＭＳＶ特異的抗体は、ヒツジ、ウシおよびことによると他の種における前駆体（３７ｋＤａ）、プロペプチド（２９ｋＤａ）、および成熟（５．４ｋＤａ）ＭＳＶタンパク質の検出を可能にする。この抗体は、ウェスタンブロット法、免疫沈殿、組織化学、細胞化学およびＥＬＩＳＡアッセイで、複雑なタンパク質抽出物、細胞、組織および血液試料中のＭＳＶタンパク質を、比較して測定、局在化および定量化するために使用することができる。
【０１５７】
抗体の特異性を調べるために、ウェスタンブロット法を使用した。簡単に述べると、１００ｍｇの組織（例えば筋肉または脳）を１．０ｍｌの溶解緩衝液（ｐＨ７．９の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％ＮＰ４０、５０ｍｌの緩衝液当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国］プロテアーゼ阻害剤）中、氷上、１３，５００ｒｐｍで３０秒間ホモジナイズした。ホモジネートを４℃、１０，０００×ｇで５分間遠心分離にかけて組織破片を除去した。上清のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）タンパク質アッセイを使用してＢＳＡ標準で測定した。タンパク質抽出物は３×Ｌａｅｍｍｌｉ試料（６％ＳＤＳ、１５％の２−メルカプトエタノール、３０％グリセロール、ｐＨ６．８の１８７．５ｍＭトリス、０．０５％ブロモフェノールブルー）緩衝液と２：１で混合して、沸騰水中で５分間インキュベートした。全タンパク質の２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（成熟ＭＳＶには１５％またはＭＳＶプロペプチドには１０％）により分離して、エレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。血液試料に対しては、血清を無菌水および３×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液と１：１：１で混合して、沸騰水中で５分間インキュベートした。２μｌの無希釈血清に等価の血清タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、エレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。均等なローディングを確認するために、ブロットをＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ染色液で染色した。ブロットをＴＢＳＴ緩衝液で洗浄後、それらを少なくとも１時間、１％ＰＶＰ−１０、１％ＰＥＧ４０００、０．３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で補充したＴＢＳ緩衝液中でブロッキングし、それからＭＳＶ特異的１次抗体（ＭＰＳＡまたはＭＭＳＡ）と、上記ブロッキング緩衝液中に１：１０００希釈して４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し（５×５分）、１：５０００希釈ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（Ｐ０４４８、ＤＡＫＯ）２次抗体と、室温で２時間インキュベートした。膜を再びＴＢＳＴで洗浄して（５×５分）、強化化学発光で発光させた。
【実施例６】
【０１５８】
ＭＳＶフラグメントの効果
ヒツジＭＳＶ４７のクローニング、発現および精製：
ｏＭＳＶ４７の筋芽細胞増殖に対する生物学的影響を試験するために、ｏＭＳＶ４７をクローニングし、イー・コリで組換えタンパク質として発現させて精製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｏＭＳＶ４７を増幅させるためのテンプレートとして、プールしたヒツジ（Ｒｏｍｎｅｙ）骨格筋ｃＤＮＡを使用した。次の順方向および逆方向プライマーでＰＣＲ産物を得た：
５’−ＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１０６）および
５’−ＴＴＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧ−３（配列番号１０７）。ＰＣＲは、２μｌのヒツジ筋肉ｃＤＮＡで、Ｐｆｘ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）を使用して、増幅前変性のために９４℃の温度で２分間、それから４０サイクルの、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で３０秒間で実施した。
【０１５９】
ＰＣＲ産物は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｐｒｅｐキット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ所在）を使用してゲルで精製し、ｐＥＴ１００／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）イー・コリタンパク質発現ベクターに、メーカーの使用説明に従って、クローニングした。タンパク質発現構築物は、エンテロキナーゼ切断部位、ＸｐｒｅｓｓエピトープおよびヘキサＨｉｓ配列を含む３６アミノ酸Ｎ末端タグを含む。生成ｐＦＪＭＳＶ４７．３／８プラスミドＤＮＡ構築物をＷａｉｋａｔｏ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ニュージーランド所在）において配列決定して、配列同一性を確認した。４６ｎｇのｐＦＪＭＳＶ４７．３／８プラスミドＤＮＡでＢＬ２１Ｓｔａｒ化学的コンピテントタンパク質発現イー・コリ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）を形質転換して、メーカーの実施要領（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）に従って、タンパク質発現のパイロット実験を実施した。マウスモノクローナル抗Ｘｐｒｅｓｓ−ＨＲＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）および抗ＭＳＶ−ウサギポリクローナル抗体（Ａｇｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用するウェスタンブロット分析により、ＩＰＴＧに誘起されたＢＬ２１Ｓｔａｒイー・コリ細胞抽出物中のｒｏＭＳＶ４７タンパク質の発現を確認した。
【０１６０】
ｏＭＳＶ４７組換えタンパク質の大規模な発現のために、３．６リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）を１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）および１％グルコースで補充して、それにタンパク質発現イー・コリ株の一晩培養物４００ｍｌを接種した。０．８ＯＤ６００の密度でＩＰＴＧを培養培地に添加することにより（１ｍＭの最終濃度で）、タンパク質発現を誘起し、３７℃、２５０ｒｐｍで４時間振盪して、細胞に組換えタンパク質を発現させた。培地を４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離にかけることにより、タンパク質を発現している細胞を捕集して、蒸留水で洗浄した。イー・コリ細胞は１００ｍｌの溶解緩衝液（６ＭグアニジンＨＣｌ、ｐＨ７．８の２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、米国所在］）に溶解し、氷上で超音波処理して細胞を完全に溶解させた。イー・コリ細胞溶解物は１８ゲージのニードルに５回通してゲノムＤＮＡを破壊した。細胞破片を、４℃、３０００×ｇで１５分間の遠心分離により除去した。次に溶解物を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂と共に室温で１時間穏やかに振盪してインキュベートした。樹脂を細胞溶解物から分離して、１０ｍｌの変性結合緩衝液（８Ｍ尿素、ｐＨ７．８の２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で２回洗浄した。樹脂は、変性洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、ｐＨ６．０の２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）でさらに４回洗浄した。
【０１６１】
組換えタンパク質は、１０ｍｌの変性溶離緩衝液（８Ｍ尿素、ｐＨ４．０の２０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）で樹脂から溶離させて、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ透析管中（ＭＷＣＯ  ３，５００、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州所在）で、５００容の透析緩衝液（ｐＨ８．５の２０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で２４時間透析した。透析したタンパク質のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州所在）タンパク質アッセイを使用して定量した。組換えタンパク質のサイズ、純度および同定は、ウェスタンブロット分析により検証し、その生物活性はマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞増殖アッセイで試験した。
【０１６２】
Ｃ２Ｃ１２マウスおよび始原ヒツジ筋芽細胞を使用する増殖アッセイ：
ｒｏＭＳＶ４７が筋細胞の増殖を促進することを示すために、Ｃ２Ｃ１２マウスおよび始原ヒツジ筋芽細胞を使用した。筋芽細胞は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、０、０．０１、０．１、１または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ４７を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６０時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した（図９）。吸光度対細胞数のプロットは、知りたい範囲で直線的であることが見出された（１ｃｍ２当たり４０００から３００００細胞、Ｏｌｉｖｅｒら、１９８９年）。
【０１６３】
ｒｏＭＳＶ４７／標準的ミオスタチン競合アッセイ：
ｒｏＭＳＶ４７と標準的ミオスタチンとの競合は、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞で実施した。筋芽細胞は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない、１．５μｇ／ｍｌの組換えウシミオスタチンを単独でならびにｒｏＭＳＶ４７を１、５および１０のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のｒｏＭＳＶ４７を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６０時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）緩衝液で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６４】
ｒｏＭＳＶ４７、ｒｏＭＳＶα１、ｒｏＭＳＶα２、ｒｏＭＳＶＬ１８、ｒｈＭＳＶ３８のＣ２Ｃ１２マウス筋芽細胞増殖に対する効果
ＭＳＶペプチドそれぞれが筋細胞の増殖を促進することを示すために、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞を使用した。筋芽細胞は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、０、０．０１、０．１、１、５または１０μｇ／ｍｌのそれぞれのペプチドを含むＤＭＥＭ２．５％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で８０時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６５】
ｒｈＭＳＶ３８およびｒｏＭＳＶ４７はヒト始原筋芽細胞を刺激して増殖させる
ｒｈＭＳＶ３８およびｒｏＭＳＶ４７がヒト骨格筋細胞を刺激して複製することができることを示すために、それらを増殖アッセイで試験した。ヒト骨格筋細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）で補充した２００μｌの骨格筋基礎培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）中で、ウェル当たり２０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させ、各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、０、０．１、１、５または１０μｇ／ｍｌのｒｈＭＳＶ３８またはｒｏＭＳＶ４７タンパク質を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６６】
ｒｏＭＳＶ４７は、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖アッセイで成熟ミオスタチンに打ち勝つ
筋芽細胞は、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ウェル当たり１０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない、１．５μｇ／ｍｌの組換えミオスタチンを単独でならびにｒｏＭＳＶ４７を１、５および１０のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のｒｏＭＳＶ４７を含むＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ試験培地で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６９時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）緩衝液で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６７】
ｒｈＭＳＶ３８は、ヒト始原筋芽細胞の増殖アッセイで成熟ミオスタチンに打ち勝つ
ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）を、９６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）で補充した２００μｌの骨格筋基本培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、オーストラリア所在）中で、ウェル当たり２０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた、添加したタンパク質を含まない、１．５または３．０μｇ／ｍｌの組換えウシ成熟ミオスタチンを単独でおよびｒｈＭＳＶ３８をミオスタチンに対して０．３、１、３、１０のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のｒｈＭＳＶ３８含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、各試験培地について８複製の（ｎ＝８）セミランダム配置で、培地を置換した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを２００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ、英国所在）緩衝液で洗浄し、１００μｌの１０％ホルムアルデヒド、０．９％ＮａＣｌ溶液で少なくとも１時間固定した。次に固定液を除去して、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中１％のメチレンブルー染色液１００μｌを各ウェルに添加して、室温で３０分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で４回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、１００μｌの１：１（ｖ／ｖ）エタノール／０．１ＨＣｌの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州所在）を使用して６５５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１６８】
ｒｏＭＳＶ４７は、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞におけるミオスタチンｍＲＮＡ発現を急性的におよび慢性的に下方制御する
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、直径１０ｃｍの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク所在）に、胎児ウシ血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）、ペニシリン（１×１０５ＩＵ／ｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、米国所在）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ、Ｓｉｇｍａ）で補充し、ｐＨ指示薬としてフェノールレッド（７．２２ｎｍｏｌ／ｌ）を含むＮａＨＣＯ３で緩衝させた１０ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１ｃｍ２当たり３０００細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。８プレートの１セット（慢性処置、「Ａ」と命名した）に対して、培地を試験培地、すなわち０または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ４７で補充し、２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで置換した（ｎ＝４）。次にプレート「Ａ」を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。他の８プレートの１セット（急性処置、「Ｂ」と命名した）については、プレート培地を２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで置換して、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートし、続いて新鮮な試験培地、すなわち０または１０μｇ／ｍｌのｏＭＳＶ４７で補充し、２．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで置換した（ｎ＝４）。次に、プレート「Ｂ」を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。処理をした後、プレートを１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、細胞を２ｍｌのトリゾール試薬で補集した。メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）の手順書に従って、全ＲＮＡをトリゾール試薬で単離した。ＲＮＡをジエチルピロカーボネートで処理した水に再懸濁して、全ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度を測定することにより（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、デラウェア州、米国所在）定量した。５μｇの全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｒｅ−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州所在）を使用して、メーカーの手順書に従って逆転写した。マウスミオスタチン（ｎｔ７１５〜７９６）のエクソン２／３境界にまたがる範囲を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。順方向プライマー：５’−ＧＣＴＧＴＡＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号１３２）および逆方向プライマー：５’−ＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号１３３）。ＰＣＲは、各ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ反応に対して次のマスター混合物と２．５μｌの逆転写酵素反応液で実施した：４．５μｌの水、０．５μｌの１０μＭプライマーおよび２．０μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ｐｌｕｓ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。マウス筋肉の逆転写酵素反応液の一連の希釈液を標準として使用した。次の実験実施手順を使用した：変性（９５℃で５分間）、増幅（９５℃で５秒間、６２℃で１０秒間、７２℃で２０秒間、単回蛍光測定、５０サイクル）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０  ＰＣＲ機（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）での溶融曲線（連続的に蛍光測定しながら毎秒０．１℃の加熱速度で６０〜９５℃）。標準曲線（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒソフトウェアにより、任意単位の濃度を計算した。
【０１６９】
１１．癌が誘起した悪液質の期間における筋肉質量に対するＭＳＶの影響
腹水肝癌１３０（ＡＨ１３０）はＶｉｃｋｉ  Ｂａｒａｃｏｓ博士（アルバータ大学、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州、カナダ所在）からのギフトとして入手し、５０％ＤＭＳＯおよび１０％ＢＳＡの溶液で液体窒素中クライオバイアルに入れて保存した。一定分量を取り出して解凍し、３匹のドナーラットの各々に１ｍｌを腹腔中に注射して、７日間増殖させた。ラットはＣＯ２窒息とそれに続く頸椎脱臼により殺した。腹水を回収して、１００μｌを１４匹のレシピエント雄ラット（２８０±６ｇ）の各々の腹腔内に注射した。等量の食塩水を７匹の対照ラットの腹腔内に注射した。ＡＨ１３０腫瘍を接種した１４匹のラットのうち７匹に毎日２回、ｒｏＭＳＶ４７を、１μｇ／ｇ体質量の用量で無菌食塩水により希釈して１ｍｌの容量にして皮下注射した。腫瘍を接種した残りの７匹のラットおよび７匹の対照ラットには、各々毎日２回、１ｍｌの無菌食塩水を皮下注射した。腫瘍の成長は６日間進行させるに任せて、その時点ですべてのラットを上記のようにして殺した。死亡時に各ラットから血液試料を心臓穿刺により採取して、抗凝血剤としてＥＤＴＡを含むチューブに入れた。血清を回収して、一定分量をクレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイのために−２０℃で凍結保存した。腹腔内の腹水は注射器で取り出し、容量を記録した。右後肢の６カ所の筋肉（大腿二頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋および大腿四頭筋）を切り出して、それらの質量を記録した。
【０１７０】
ＡＨ１３０実験における骨格筋の質量は、初期体重（ｄ０）に対する比率として合計して表し、データは対照ラット（腫瘍を接種しなかったラット）の筋肉質量と比較して表した。
【０１７１】
クレアチンキナーゼアッセイ
ＣＫ−ＮＡＣは市販キット（Ｒａｎｄｏｘ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ、英国所在）でアッセイした。反応容量は、アッセイを９６ウェルのマイクロタイタープレートで実施できるように比例的に規模を縮小して、試料は３重にアッセイして（ＣＫ−ＮＡＣ）、メーカーの取扱い説明に従って１分当たりのＵ／Ｌ変化として読み取った。
【０１７２】
アッセイ、増殖および競合の検討は、スチューデントｔ検定またはＧｅｎｓｔａｔ８．０（１）の統計ソフトウェアパッケージによるＡＮＯＶＡを使用して分析した。
【０１７３】
前出の記載が、既知の同等物を有する構成物全体または構成要素を参照している場合には、そのような同等物を個々に説明したかのように本明細書に組み込む。
【０１７４】
本発明を、実施例により、およびその可能な実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく改良および／または変更を行うことができることは理解されるべきである。
参考文献
Baracos VE, C DeVivo, DHR Hoyle and AL Goldberg. Activation of the ATP-ubiquitin-proteasome pathway in skeletal muscle of cachectic rats bearing a hepatoma. Am J Physiol 268:E996-E1006, 1995.
Bogdanovich S, Krag TO, Barton ER, Morris LD, Whittemore LA, Ahima RS, Khurana TS. (2002) Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420: 418-21.
Bradley, P., Misura, K.M.S. and Baker, D. (2005) Toward High-Resolution de Novo Structure Prediction for Small Proteins.  Science 309, 1868 -1871.
Buck M and M Chojkier. Muscle wasting and dedifferentiation induced by oxidative stress in a murine model of cachexia is prevented by inhibitors of nitric oxide synthesis and antioxidants. EMBO J 15: 1753-1765, 1996.
Celolto, A.M. and Graveley B.R. (2002) Exon- specific RNAi: A tool for dissecting the functional relevance of alternate splicing.  RNA 8:718-724.
Dubois CM, Blanchette F, Laprise MH, Leduc R, Grondin F, Seidah NG (2001) Evidence that furin is an authentic transforming growth factor-beta1-converting enzyme. Am J Pathol 158:305-16.
Dubois CM, Blanchette F, Laprise MH, Leduc R, Grondin F, Seidah NG. (2001) Evidence that furin is an authentic transforming growth factor-beta1-converting enzyme. Am J Pathol 158: 305-16. 
Gonzalez-Cadavid NF, Taylor WE, Yarasheski K, Sinha-Hikim I, Ma K, Ezzat S, Shen R, Lalani R, Asa S, Mamita M, Nair G, Arver S, Bhasin S. (1998) Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14938-43.
Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, et al. (1997) A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17:71-74.
Hamrick MW (2003) Increased bone mineral density in the femora of GDF8 knockout mice. Anat Rec 272A(1): 388-91.
Hill JJ, Davies MV, Pearson AA, et al. (2002) The myostatin propeptide and the follistatin-related gene are inhibitory binding proteins of myostatin in normal serum. J Biol Chem 277: 40735-40741.
Hill JJ, Qiu Y, Hewick RM. (2003) Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1: a novel protein with protease inhibitor and follistatin domains. Mol Endocrinol 17: 1144-1154.
Jiang MS, Liang LF, Wang S, Ratovitski T, Holmstrom J, Barker C, Stotish R. (2004) Characterization and identification of the inhibitory domain of GDF-8 propeptide. Biochem Biophys Res Commun 315: 525-31.
Joulia D, Bernardi H, Garandel V, Rabenoelina F, Vernus B, Cabello G. (2003) Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and differentiation by myostatin. Exp Cell Res 286: 263-75.
Kambadur, R., Sharma, M., Smith, T.P. and Bass, J.J. (1997) Mutations in myostatin (GDF-8) in double muscled Belgian Blue and Piedmontese Cattle. Genome Res 7: 910-916.
Langley B, Thomas M, Bishop A, et al. (2002) Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J Biol Chem 277: 49831-49840.
Langley B, Thomas M, McFarlane C, Gilmour S, Sharma M, Kambadur R. (2004) Myostatin inhibits rhabdomyosarcoma cell proliferation through an Rb-independent pathway. Oncogene 23: 524-34.
Lee SJ, McPherron AC. (2001) Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9306-9311.
Ma K, Mallidis C, Bhasin S, Mahabadi V, Artaza J, Gonzalez-Cadavid N, Arias J, Salehian B. (2003) Glucocorticoid-induced skeletal muscle atrophy is associated with upregulation of myostatin gene expression. Am J Physiol Endocrinol Metab 285: E363-E371.
McCroskery S, Thomas M, Maxwell L, Sharma M, Kambadur R. (2003) Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol 162: 1135-47.
McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. (1997) Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83-90.
McPherron AC, Lee SJ. (1997) Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci USA 94:12457-12461.
McPherron AC, Lee SJ (2002) Suppression of body fat accumulation in myostatin-deficient mice. J Clin Invest 109: 595-601.
Montarras D, Chelly J, Bober E, Arnold H, Ott MO, Gros F, Pinset C.(1991) Developmental patterns in the expression of Myf5, MyoD, myogenin, and MRF4
during myogenesis. New Biol 3: 592-600.
Nicholas G, Thomas M, Langley B, et al. (2002) Titin-cap associates with, and regulates secretion of, myostatin. J Cell Physiol 193: 120-131.
Oliver MH, Harrison NK, Bishop JE, Cole PJ, Laurent GJ. (1989) A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. J Cell Sci 92: 513-518.
Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana JL, Celeste AJ, Attisano L. (2003) Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to block adipogenesis. Mol Cell Biol 23: 7230-42.
Rios R, Carneiro I, Arce VM, Devesa J. (2001) Myostatin regulates cell survival during C2C12 myogenesis. Biochem Biophys Res Commun 280: 561-566.
Seidah NG, Chretien M (1997) Eukaryotic protein processing: endoproteolysis of precursor proteins. Curr Opin Biotechnol 8:602-7.
Seidah NG, Chretien M (1999) Proprotein and prohormone convertases: a family of subtilases generating diverse bioactive polypeptides. Brain Res 848:45-62.
Sharma M, Kambadur R, Matthews KG, Somers WG, Devlin GP, Conaglen JV, Fowke PJ, Bass JJ. (1999) Myostatin, a transforming growth factor-beta superfamily member, is expressed in heart muscle and is upregulated in cardiomyocytes after infarct. J Cell Physiol 180:1-9.
Spiller MP, Kambadur R, Jeanplong F, Thomas M, Martyn JK, Bass JJ, Sharma M. (2002) The myostatin gene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factor MyoD. Mol Cell Biol 22: 7066-82.
Steiner FD (1998) The protein convertases. Curr Opin Chem Biol 2:31-39.
Taylor WE, Bashin S, Artaza J, et al. (2001) Myostatin inhibits cell proliferation and protein synthesis in C2C12 muscle cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 280: E221-E228.
Thies RS, Chen T, Davies MV, Tomkinson KN, Pearson AA, Shakey QA, Wolfman NM. (2001) GDF-8 propeptide binds to GDF-8 and antagonizes biological activity by
inhibiting GDF-8 receptor binding. Growth Factors 18:251-9.
Thomas M, Langley B, Berry C, et al. (2000) Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. J Biol Chem 275: 40235-40243.
Uprichard, S.L. (In Press) The therapeutic potential of RNA interference.  Febs letters.
Wang H, Zhang Q, Zhu D. (2003) hSGT interacts with tha N-terminal region of myostatin. Biochem Biophys Res Commun 311: 877-883.
Wyss M and R Kaddurah-Daouk. Creatine and creatinine metabolism. Physiological Reviews 80: 1107-1213, 2000.
Yang J, Ratovitski T, Brady JP, Solomon MB, Wells KD, Wall RJ. (2001) Expression of myostatin pro domain results in muscular transgenic mice. Mol Reprod Dev 60: 351-61.
Zachwieja JJ, Smith SR, Sinha-Hikim I, Gonzalez-Cadavid N, Bhasin S (1999) Plasma myostatin-immunoreactive protein is increased after prolonged bed rest with low-dose T3 administration. J Gravit Physiol 6: 11-5.
Zimmers TA, Davies MV, Koniaris LG, Haynes P, Esquela AF, Tomkinson KN, McPherron AC, Wolfman NM, Lee SJ. (2002) Induction of cachexia in mice by systemically administered myostatin. Science 296:1486-s8.
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】ミオスタチン遺伝子、ならびに標準的ｍＲＮＡおよび変異ｍＲＮＡ（ｏＭＳＶ、ｂＭＳＶｈ／ｆおよびｂＭＳＶｂｂ）を生成させるＲＮＡスプライシングの模式的表示を示す図である。
【図２】エクソン１および２の境界を越えて伸びるプローブ（Ｅｘ１／２）および標準的ミオスタチンのポリアデニル化部位を越えてヒツジミオスタチン遺伝子の３’−ＵＴＲに相補的なプローブ（ＭＳＶ１およびＭＳＶ２と命名）を使用して、標準的ヒツジミオスタチン（Ｍｓｔｎ）およびＭＳＶ  ｍＲＮＡの存在を検出するノーザンブロットを示す図である。これらのデータは、２つのｍＲＮＡ種が、両方のｍＲＮＡ種に共通のプローブ配列が使用されたときに、検出されたことを示す。しかしながら、標準的ミオスタチンのポリアデニル化部位の３’−ＵＴＲに遠位であるが、ＭＳＶの長い方の３’−ＵＴＲ内にある領域に特異的なプローブを使用したときに、単一のｍＲＮＡ種のみが存在した（Ａ＝ポリアデニル化ＲＮＡ、Ｔ＝ＲＮＡ全体）。これらのデータは、ヒツジＭＳＶタンパク質が４．５ｋｂのｍＲＮＡ分子によってコードされていることを示唆する。
【図３】マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞（３Ａ）およびヒツジ始原筋芽細胞（３Ｂ）の増殖に対する組換えヒツジＭＳＶ６５タンパク質の効果を示す図である。筋芽細胞は、ｒｏＭＳＶ６５を濃度を増加させて存在させ（０から１０μｇ／ｍｌ）、７２時間増殖させた。細胞増殖はメチレンブルーアッセイにより定量した（６５５ｎｍにおける光学密度で）。値は平均±ＳＥＭ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）である。
【図４】分化したＣ２Ｃ１２筋管中のミオゲニンタンパク質の量（平均±ＳＥＭ）に対する組換えヒツジＭＳＶ６５タンパク質の効果を示す図である。筋芽細胞は、ＭＳＶ６５を濃度を増加させて存在させ（０、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ、ｎ＝３）、またはそれを存在させずに（対照、ｎ＝３）、７２時間分化させた。全タンパク質を細胞から抽出し、ミオゲニンの存在比をウェスタンブロット分析により定量した（†ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図５】Ｃ２Ｃ１２筋管中の発性ミオシン重鎖（ｄＭＨＣ）タンパク質発現量に対する組換えヒツジＭＳＶ６５の効果を示す図である。筋芽細胞は、分化培地中で、０、０．１、１および１０μｇ／ｍｌ（ｎ＝３）のｒｏＭＳＶ６５で７２時間処理し、ｄＭＨＣタンパク質レベルを、筋細胞から抽出した全タンパク質についてウェスタンブロット分析を使用して検出した。値は平均±ＳＥＭＳＥＭ（＊＊＊ｐ＜０．００１）である。
【図６】増殖中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞におけるｐ２１タンパク質量レベル（平均±ＳＥＭ）に対する組換えヒツジＭＳＶ６５の効果を示す図である。筋芽細胞は、ｒｏＭＳＶ６５を濃度を増加させて存在させ（０、０．１、１および１０μｇ／ｍｌ、ｎ＝３）、またはそれを存在させずに（対照、ｎ＝２）、４８時間成長させた。全タンパク質を細胞から抽出し、ｐ２１のレベルをウェスタンブロット分析により定量した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図７】増殖中のＣ２Ｃ１２筋芽細胞における増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）タンパク質量レベル（平均±ＳＥＭ）に対する組換えヒツジＭＳＶ６５の効果を示す図である。筋芽細胞は、ｏＭＳＶ６５を濃度を増加させて存在させ（０、０．１、１および１０μｇ／ｍｌ、ｎ＝３）、またはそれを存在させずに（対照、ｎ＝２）、４８時間成長させた。全タンパク質を細胞から抽出し、ＰＣＮＡのレベルをウェスタンブロット分析により定量した（†ｐ＜０．１、＊＊ｐ＜０．０５）。
【図８】ウェスタンイムノブロットを使用する、種々の種の組織中のＭＳＶタンパク質の同定を示す図である。タンパク質試料は、１０％（８Ａ）または１５％（８Ｂ、Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、ニトロセルロース膜に移行させた。ブロットを、プロペプチド特異的（８Ａ）または成熟ＭＳＶ特異的ポリクローナル抗体（８ＢおよびＣ）でプロービングした。ヒツジにおける前駆体（３７ｋＤａ）、プロペプチド（２９ｋＤａ）および推定成熟型の２量体（１１ｋＤａ）のＭＳＶタンパク質の予想されるサイズを矢印で示す。  使用した略記号：ｈｙｐｏｔｈ−視床下部、ｈｕ−ヒト、ｓｈ−ヒツジ、ｍｏ−マウス（８Ａ、Ｂ）、ｍｏ−月（８Ｃ）、ＵＮ−栄養不良の、ｙ−年、♀−雌、♂−雄
【図９】ミオスタチン（Ｍｓｔｎ）およびｒｏＭＳＶ６５で、およびそれらなしで指示したように処理したマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の４８時間増殖の平均（±ＳＥＭ）を示す図である。これらのデータは、ｒｏＭＳＶ６５が、第１にマウス筋芽細胞の増殖を促進したこと、第２に始原ヒト筋芽細胞増殖のミオスタチン誘起阻害に打ち勝って、回復を越える増殖を促進したことを示す。ｒｏＭＳＶ６５の用量は、アッセイの第２部で使用する１．５μｇ／ｍｌＭｓｔｎに対するモル比（ｘ）で表す。不等号は有意性を示す（ａ、ｂ  Ｐ＜０．１）。記号およびアステリスクは、各群におけるＴ字バーに対する有意性を示す（†Ｐ＜０．１、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。
【図１０】マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の増殖に対するｒｏＭＳＶ４７タンパク質の効果を示す図である。筋芽細胞はｒｏＭＳＶ４７を濃度を増加させて（１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ）存在させ、６０時間成長させた。細胞の増殖はメチレンブルーアッセイにより定量した（６６５ｎｍにおける吸光度）。ダガーおよびアステリスクは時間０からの有意な差を示す（†Ｐ＜０．１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図１１】ミオスタチン（Ｍｓｔｎ）およびｒｏＭＳＶ４７で、およびそれらなしで指示したように処理したマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の６９時間の増殖の平均（±ＳＥＭ）を示す図である。ｒｏＭＳＶ４７の用量は、アッセイの第２部で使用する１．５μｇ／ｍｌＭｓｔｎに対するモル比（ｘ）で表してある。不等号は有意性を示す（ａ、ｂ  Ｐ＜０．００１）。アステリスクは、各群におけるＴ字バーに対する有意性を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝８）。
【図１２】Ａは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の８０時間にわたる増殖に対するｒｏＭＳＶ４７およびｒｈＭＳＶ３８の効果を示す図である。Ｂは、ヒト筋芽細胞の９６時間にわたる増殖に対するｒｏＭＳＶ４７およびｒｈＭＳＶ３８の効果を示す図である（ｎ＝８）。細胞の増殖はメチレンブルーアッセイにより定量した（６６５ｎｍにおける吸光度）。記号は対照（０μｇ／ｍｌ  ＭＳＶ）からの有意性を示し（ＮＳ＝有意性なし、†Ｐ＜０．１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、特定の濃度に対してアステリスクが１つだけ使用されている場合、その有意性はｒｏＭＳＶ４７およびｒｈＭＳＶ３８の両方に適用される。
【図１３】ミオスタチン（Ｍｓｔｎ）およびｒｈＭＳＶ３８で、およびそれらなしで指示したように処理した始原ヒト筋芽細胞の４８時間の増殖の平均（±ＳＥＭ）を示す図である。ｒｈＭＳＶ３８の用量は、第２部で使用する１．５μｇ／ｍｌＭｓｔｎ、または第３部で使用する３μｇ／ｍｌＭｓｔｎに対するモル比（ｘ）で表してある。不等号は有意性を示す（ａ、ｂ  Ｐ＜０．１、ａ、ｃ  Ｐ＜０．０１）。アステリスクは、各群におけるＴ字バーに対する有意性を示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝８）。
【図１４】２．５％のウシ胎児血清で補充したＤＭＥＭ培地で４８時間成長させたＣ２Ｃ１２筋芽細胞の別々の集団において、ｒｏＭＳＶ４７（ＭＳＶ）で、およびそれなしで処理したマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞を長期間（接種から４８時間、ｎ＝４）または短期で６時間（４８時間から５４時間まで、ｎ＝４）増殖させる間に、リアルタイムＰＣＲにより定量したミオスタチン発現の平均（±ＳＥＭ）を示す図である。アステリスクは、対照からの有意な差を示す（Ｃｏｎ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図１５】ＭＳＶの推定生物活性ドメインを示す図である。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析（ＧＣＧソフトウェア、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国所在）は、ウシ（家畜ウシ）、ヒツジおよびブタＭＳＶ配列における２つのαヘリックスを予測した。対照的に、示したその他の種において、ペプチド配列は、第１のαヘリックスのＣ末端で終止している。推定タンパク質分解的切断部位（Ｒ−（Ｒ／Ｋ）↑Ｘ−Ｉ）をコンセンサス配列の下に示すが、それはペプチドＣ末端を矢印のところで切断するタンパク質前駆体変換酵素ＳＫＩ−Ｉにより認識される部位と一致した（ＳｅｉｄａｈおよびＣｈｒｅｔｉｅｎ、１９９９年）。双方向矢印およびそれに付随する表示は、本明細書で開示したように合成されたかまたは組換えで発現させて試験したペプチドの同定を示す（ｓ＝合成された、ｒ＝イー・コリ中で組換えにより発現させた、ｈ＝ヒトの、ｏ＝ヒツジの、ｓｏＭＳＶＰ１８＝推定切断部位に先行する１８アミノ酸、ｒｏＭＳＶＬ１８＝第１ヘリックスのＣ末端６アミノ酸から第２αヘリックス中の最初のＮ末端６アミノ酸を含むまでの１８アミノ酸リンカー）。ヘリックス中のアミノ酸のイオン電荷は、α−ヘリックス１が掲載したすべての配列に対して一貫したパターンを有し、アミノ酸が相違するところで、それらのアミノ酸は同一の電荷を有することを示している。例外はヒツジおよびウシＭＳＶで、それらはαヘリックス１の残基１７（図１５の３５位）で、極性（Ｔ）よりも疎水性（Ａ）残基を有していた。イオン電荷の一貫したパターンは、αヘリックス２に対しても明らかであった（αヘリックス１は塩基性残基を有さず、αヘリックス２は酸性残基を有しない（Ｈ＝疎水性、Ｐ＝極性、Ａ＝酸性、Ｂ＝塩基性））。
【図１６】ヒツジＭＳＶの第１アルファヘリックス（ｒｏＭＳＶα１）で、その量を増加させて処理したマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の７２時間増殖の平均（±ＳＥＭ）を示す図である（ｎ＝８）。細胞の増殖はメチレンブルーアッセイにより定量した（６５５ｎｍにおける吸光度）。アステリスクは、対照からの有意性を示す（ｒｏＭＳＶα１無添加、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図１７】ｒｏＭＳＶ４７、ｒｏＭＳＶα１、ｒｏＭＳＶα２およびｒｏＭＳＶＬ１８で、それらの量を増加させて処理したマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の８０時間増殖の平均（±ＳＥＭ）を示す図である（ｎ＝８）。細胞の増殖はメチレンブルーアッセイにより定量した（６５５ｎｍにおける吸光度）。アステリスクは、対照からの有意性を示す（ペプチド無添加、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図１８】ＡＨ１３０腫瘍を注射されたラットにおける筋肉消耗度に対する組換えヒツジ（ｒｏ）ＭＳＶ４７タンパク質の効果を示す図である。ラットは第０日に無菌食塩水を接種し（対照、ｎ＝７）、２群に１００μｌのＡＨ１３０を腹腔内に注射し第６日に殺した。対照およびＡＨ１３０処理ラットの１群（ＡＨ１３０対照、ｎ＝７）に、６日間毎日２回無菌食塩水を皮下注射し、一方ＡＨ１３０接種ラットの第２群には１μｇのｒｏＭＳＶ４７／ｇ体質量を毎日２回皮下注射した（ｎ＝７）。大腿二頭筋、腓腹筋、前脛骨筋、大腿四頭筋、足底筋およびヒラメ筋の合計湿潤質量からの筋肉質量を、初期体質量に対する比率（％）として非癌対照に比較して表した。アステリスクは、ＡＨ１３０癌対照からの有意差があることを示す（＊Ｐ＜０．０５）。
【図１９】ＡＨ１３０腫瘍を担持するラットにおいて、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）平均濃度が、対照ラットに比較して、第６日に低下していたことを示す図である。対照的に、ＡＨ１３０腫瘍を担持するが、６日間毎日２回ｒｏＭＳＶ４７（ＭＳＶ）を注射した（１μｇ／ｇ体質量、皮下注射）ラットにおいては、ＣＫ濃度はそれほど顕著に低下しなかった。不等号は有意性を示す（ａ、ｂ  Ｐ＜０．０１；ａ、ｃ  Ｐ＜０．０１；ｂ、ｃ  Ｐ＜０．０５）。
【図１】
2008514227.tif 000004
【図２】
2008514227.tif 000005
【図３】
2008514227.tif 000006
【図４】
2008514227.tif 000007
【図５】
2008514227.tif 000008
【図６】
2008514227.tif 000009
【図７】
2008514227.tif 000010
【図８】
2008514227.tif 000011
【図９】
2008514227.tif 000012
【図１０】
2008514227.tif 000013
【図１１】
2008514227.tif 000014
【図１２】
2008514227.tif 000015
【図１３】
2008514227.tif 000016
【図１４】
2008514227.tif 000017
【図１５】
2008514227.tif 000018
【図１６】
2008514227.tif 000019
【図１７】
2008514227.tif 000020
【図１８】
2008514227.tif 000021
【図１９】
2008514227.tif 000022
【配列表】
2008514227000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月30日(2007.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008514227000001.app
【国際調査報告】
2008514227.tif 000064
2008514227.tif 000065
2008514227.tif 000066
2008514227.tif 000067