(57)【要約】本発明は、ボツリヌス神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）に特異的に結合し、そしてそれを中和する抗体およびそれらの抗体によって結合されるエピトープを提供する。上記抗体および尾の誘導体ならびに／または本明細書中に提供される中和エピトープに特異的に結合する他の抗体は、ボツリヌス神経毒素を中和するために使用され得、したがってまたボツリヌス中毒の処置に有用である。本発明において、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型の特に有効な中和は、特定の神経毒素血清型の２種以上のサブタイプを、高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成され得ることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてボツリヌス神経毒素を中和する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、ＢｏＮＴ血清型に対する少なくとも２種の異なる中和抗−抗体を投与する工程を包含し、該２種の抗体のうちの少なくとも１種は、該ＢｏＮＴ血清型のうちの少なくとも２種の異なるサブタイプを、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、方法。
【請求項２】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、およびＢｏＮＴ／Ｆからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／Ａである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ３からなる群より選択される少なくとも２種の異なるサブタイプを、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体は、１ｍｇの抗体あたり少なくとも１０，０００マウスＬＤ５０を中和する、請求項１、２、３、または４に記載の方法。
【請求項８】
両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも１種を同時に結合する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体は、１ｍｇの抗体あたり少なくとも１０，０００マウスＬＤ５０を中和する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、それぞれ、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも１種のＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、それぞれ、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも３種のＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、それぞれ、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、それぞれ、
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに
ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択され、
該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される抗体より選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＩｇＧである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、Ｆａｂである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、（Ｆａｂ’）２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、（ｓｃＦｖ’）２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体のうちの少なくとも２種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を中和するための組成物であって、該組成物は、
ＢｏＮＴ血清型に対する少なくとも２種の異なる中和抗体
を含み、該２種の抗体のうちの少なくとも１種は、該ＢｏＮＴ血清型の少なくとも２種の異なるサブタイプを、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、組成物。
【請求項２４】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、およびＢｏＮＴ／Ｆからなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ｂである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＢｏＮＴ血清型は、ＢｏＮＴ／Ａである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、およびＢｏＮＴ／Ａ３からなる群より選択される少なくとも２種の異なるサブタイプを、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、請求項２３に記載の組成物。、
【請求項２９】
両方の抗体は、前記サブタイプのうちの少なくとも１種を同時に結合する、請求項２３または２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体は、それぞれ、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも１種のＣＤＲを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体は、それぞれ、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも３種のＣＤＲを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体は、それぞれ、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体は、それぞれ、
ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメイン；ならびに
ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される抗体より選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＩｇＧである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、Ｆａｂである、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、（Ｆａｂ’）２である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、（ｓｃＦｖ’）２である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４２】
前記抗体のうちの少なくとも２種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４３】
前記抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤中にある、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４４】
前記組成物は、単位投薬処方物である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏｎｔＡ）を中和する抗体であって、該抗体は、少なくとも２種の異なるＢｏｎｔＡサブタイプを、各サブタイプに対して約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、抗体。
【請求項４６】
前記抗体は、前記Ｂｏｎｔ  Ａ１サブタイプおよび前記Ｂｏｎｔ  Ａ２サブタイプの両方を、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体は、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも１種のＣＤＲを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４８】
前記抗体は、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも３種のＣＤＲを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択される、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体は、
ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメイン；ならびに
ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５２】
前記抗体は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される抗体より選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５３】
前記抗体は、ＲＡＺ１  ＶＨおよびＲＡＺ１  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５４】
前記抗体は、ＣＲ１  ＶＨおよびＣＲ１  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５５】
前記抗体は、ＣＲ２  ＶＨおよびＣＲ２  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５６】
前記抗体は、ＩＮＧ１  ＶＨおよびＩＮＧ１  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５７】
前記抗体は、ＩＮＧ２  ＶＨおよびＩＮＧ２  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５８】
前記抗体は、１Ｄ１１  ＶＨおよび１Ｄ１１  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項５９】
前記抗体は、２Ｇ１１  ＶＨおよび１Ｇ１１  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６０】
前記抗体は、５Ｇ４  ＶＨおよび５Ｇ４  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６１】
前記抗体は、３Ｄ１２  ＶＨおよび３Ｄ１２  ＶＬを含む、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６２】
前記抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６３】
前記抗体は、ＩｇＧである、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６４】
前記抗体は、Ｆａｂである、請求項５２に記載の抗体。
【請求項６５】
前記抗体は、（Ｆａｂ’）２である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６６】
前記抗体は、（ｓｃＦｖ’）２である、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６７】
前記抗体は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、３Ｄ１２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、および５Ｇ４からなる群より選択される、請求項４５に記載の抗体。
【請求項６８】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏｎｔＡ）を結合する抗体であって、該抗体は、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも１種のＣＤＲを含む、抗体。
【請求項６９】
前記抗体は、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ３  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＡＲ３  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＡＲ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＡＲ４  ＶＨ  ＣＤＲ３からなる群より選択される少なくとも３種のＣＤＲを含む、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７０】
前記抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＡＲ２  ＶＨドメイン、ＡＲ３  ＶＨドメイン、およびＡＲ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択される、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７１】
前記抗体は、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＡＲ２  ＶＬドメイン、ＡＲ３  ＶＬドメイン、およびＡＲ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７２】
前記抗体は、
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに
ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、
該ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＡＲ２  ＶＨドメイン、ＡＲ３  ＶＨドメイン、およびＡＲ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択され、
該ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＡＲ２  ＶＬドメイン、ＡＲ３  ＶＬドメイン、およびＡＲ４  ＶＬからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７３】
前記抗体は、ＡＲ２、ＡＲ３およびＡＲ４からなる群より選択される抗体より選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７４】
前記抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７５】
前記抗体は、ＩｇＧである、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７６】
前記抗体は、Ｆａｂである、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７７】
前記抗体は、（Ｆａｂ’）２である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７８】
前記抗体は、（ｓｃＦｖ’）２である、請求項６８に記載の抗体。
【請求項７９】
前記抗体は、ＡＲ２、ＡＲ３およびＡＲ４からなる群より選択される、請求項６８に記載の抗体。
【請求項８０】
請求項４５〜７９のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
【請求項８１】
請求項４５〜７９のいずれかに記載の抗体をコードする核酸を含む細胞。
【請求項８２】
ボツリヌス神経毒素を中和するためのキットであって、該キットは、
請求項２３〜４４のいずれかに記載の組成物；および
ボツリヌス神経毒素を中和するための該組成物の使用を教示する指示資料；
を備える、キット。
【請求項８３】
前記組成物は、使い捨て可能な注射器中に保存される、請求項８２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、米国特許出願第６０／６４８，２５６号（２００５年１月２７日出願）（これは、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）に基づく優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
（政府支援の研究および開発の下でなされた発明に対する権利についての記述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号：ＡＩ５３３８９およびＡＩ５６４９３、ならびにＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｇｒａｎｔｓ  ＤＡＭＤ１７−０３−Ｃ−００７６およびＤＡＭＤ１７−９８−Ｃ−８０３０による政府支援によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ボツリヌス神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）を中和する抗体、およびボツリヌス中毒の処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ボツリヌス中毒は、クロストリジウム属のメンバーによって分泌されるボツリヌス神経毒素によって引き起こされ、そしてボツリヌス中毒は、弛緩性麻痺によって特徴付けられ、直ちに致命的でない場合、ボツリヌス中毒は、集中治療室および機械換気における長期の入院を必要とする。天然に存在するボツリヌス中毒は、胃腸管がクロストリジウム属の細菌によってコロニー形成される乳児または成人（乳児ボツリヌス中毒または腸管ボツリヌス中毒）、汚染された食品の摂取後（食物ボツリヌス中毒）、あるいは嫌気性の創傷感染（創傷ボツリヌス中毒）に見出される（非特許文献１：「ｗｗｗ．ｂｔ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｇｅｎｔ／Ｂｏｔｕｌｉｓｍ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ」にてダウンロード可能）。ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）はまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性（非特許文献２）に起因して、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する６種の脅威因子（ｔｈｒｅａｔ  ａｇｅｎｔ）（「Ｃａｔｅｇｏｒｙ  Ａ  ａｇｅｎｔ」）のうちの１種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにＢｏＮＴを生産し（非特許文献３；非特許文献４）、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにＢｏＮＴを使用することを試みた（Ａｒｎｏｎら（２００１）前出）。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。
【０００５】
ボツリヌス中毒の予防または処置のための特定の低分子薬物は、存在しないが、研究的な五価トキソイドワクチンは、ＣＤＣから利用可能であり（非特許文献５）、そして組換えワクチンが、開発中である（非特許文献６）。それにもかかわらず、多くの民間人または軍人のワクチン接種は、疾患または曝露の希少性、およびワクチン接種がＢｏＮＴのその後の医学的使用を妨げるという事実に起因して行われない。曝露後のワクチン接種は、疾患の迅速な発症に起因して役に立たない。毒素中和抗体（Ａｂ）は、曝露前または曝露後の予防のためか、あるいは処置のために使用され得る（非特許文献７）。少量のウマ抗毒素およびヒトボツリヌス免疫グロブリンの両方が、存在し、そして現在、それらは、それぞれ、成人ボツリヌス中毒（非特許文献８；非特許文献９）および乳児ボツリヌス中毒（非特許文献１０）を処置するために使用される。
【０００６】
組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、感染症の危険性を含まず、かつ血漿瀉血にヒトドナーを必要としない抗毒素の無制限の供給を提供し得る。ＢｏＮＴの極度の死亡率を鑑みて、ｍＡｂは、妥当なコストにおける適切な数の用量を提供するために、高い効力でなければならない。このようなｍＡｂの開発は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓの最優先の研究目標となった。現在までに、単一の非常に強力なｍＡｂは記載されていないが、本発明者らは、最近、２種〜３種のｍＡｂを組み合わせることが非常に強力ＢｏＮＴ中和をもたらし得ることを報告した（非特許文献１１）。
【０００７】
ボツリヌス中毒に対するｍＡｂ治療の開発は、あっても抗体交差反応性をほとんど示さない少なくとも７種のＢｏＮＴ血清型（Ａ〜Ｇ）が存在するという事実によって企図される（非特許文献１２）。ＢｏＮＴ血清型のうちの４種だけが、決まってヒト疾患を引き起こし（Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ）、一方で、ＢｏＮＴ  Ｃによって引き起こされる乳児ボツリヌス中毒の１つの報告された事例（非特許文献１３）、ＢｏＮＴ  Ｄに関連する食物媒介性ボツリヌス中毒の１つの流行（非特許文献１４）、およびＢｏＮＴ  Ｇが単離された異常死の数種の事例（非特許文献１５）が存在している。エアロゾル化したＢｏＮＴ／Ｃ、Ｄ、およびＧはまた、霊長類において吸入経路によってボツリヌス中毒をもたらすことが示されている（非特許文献１６）、そしてそれらは、ヒトに最も影響しやすい。したがって、７種のＢｏＮＴ血清型のうちのいずれか１種が、生命を脅かす因子として使用され得る可能性がある。
【０００８】
血清型内のＢｏＮＴ遺伝子配列およびＢｏＮＴタンパク質配列の相違もまた、報告されており、そしてこのような相違がＢｏＮＴ／Ａに対するモノクローナル抗体の結合に影響し得るという証拠が存在する（非特許文献１７；非特許文献１８）。現在、異なる血清型内のこのような毒素変異性の程度も、モノクローナル抗体パネルの結合能および中和能に対するその影響も、明確ではない。
【非特許文献１】Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、（１９９８）、Ｂｏｔｕｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，１８９９−１９９８，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｏｒｋｅｒｓ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ
【非特許文献２】Ａｒｎｏｎら、ＪＡＭＡ、２００１年、第２８５巻、ｐ．１０５９−１０７０
【非特許文献３】Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、（１９９５）、Ｔｅｎｔｈ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔａｒｙ−ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｕｒｓｕａｎｔ  ｔｏ  ｐａｒａｇｒａｐｈ  ９（ｂ）（Ｉ）ｏｆ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ｃｏｕｎｃｉｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６８７（１９９１）、ａｎｄ  ｐａｒａｇｒａｐｈ  ３  ｏｆ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６９９（１９９１）ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ
【非特許文献４】Ｂｏｚｈｅｙｅｖａら、（１９９９）、Ｆｏｒｍｅｒ  ｓｏｖｉｅｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗｅａｐｏｎｓ  ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ：ｐａｓｔ、ｐｒｅｓｅｎｔ、ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ
【非特許文献５】Ｓｉｅｇｅｌ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８８年、第２６巻、ｐ．２３５１−２３５６
【非特許文献６】Ｓｍｉｔｈ、Ｔｏｘｉｃｏｎ、１９９８年、第３６巻、ｐ．１５３９−１５４８
【非特許文献７】Ｆｒａｎｚら、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｂ．Ｒ．ＤａｓＧｕｐｔａ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年、ｐ．４７３−４７６、
【非特許文献８】ＢｌａｃｋおよびＧｕｎｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８０年、第６９巻、ｐ．５６７−５７０
【非特許文献９】Ｈｉｂｂｓら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９６年、第２３巻、ｐ．３３７−３４０
【非特許文献１０】Ａｒｎｏｎ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ  ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ．、、Ｂ．Ｒ．ＤａｓＧｕｐｔａ（編）、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年、ｐ．４７７−４８２．
【非特許文献１１】Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、２００２年、第９９巻、ｐ．１１３４６−５０
【非特許文献１２】Ｈａｔｈｅｗａｙ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９５年、第１９５巻、ｐ．５５−７５
【非特許文献１３】Ｏｇｕｍａら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９０年、第３３６巻、ｐ．１４４９−１４５０
【非特許文献１４】Ｄｅｍａｒｃｈｉら、Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９５８年、第１４２巻、ｐ．５８０−５８２
【非特許文献１５】Ｓｏｎｎａｂｅｎｄら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９８１年、第１４３巻、ｐ．２２−２７
【非特許文献１６】ＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋおよびＦｒａｎｚ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎｓ、第３３章、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ．ＴＭＭ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９７年、Ｆ．Ｒ．Ｓｉｄｅｌｌ、Ｅ．Ｔ．Ｔａｋａｆｕｊｉ、Ｄ．Ｒ．Ｆｒａｎｚ（編）
【非特許文献１７】Ｋｏｚａｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、１９９８年、第６６巻、ｐ．４８１１−４８１６
【非特許文献１８】Ｋｏｚａｋｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５年、第３９巻、ｐ．７６７−７７４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ボツリヌス神経毒素に結合し、かつボツリヌス神経毒素を中和する抗体に関する。本発明者らは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型の特に有効な中和は、特定の神経毒素血清型の２種以上のサブタイプを、高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成され得ることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する２種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得るが、特定の実施形態において、各々の抗体が少なくとも２種のＢｏＮＴサブタイプと交差反応性である場合、よりさらに効率的な中和が、１種以上の抗体の使用によって達成される。特定の実施形態において、本発明は、２種以上のＢｏＮＴサブタイプ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３など）を高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。
【００１０】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）においてボツリヌス神経毒素を中和する方法を提供する。この方法は、代表的に、上記哺乳動物にＢｏＮＴ血清型に対する少なくとも２種の異なる中和抗体を投与する工程を包含し、上記２種の抗体のうちの少なくとも１種は、上記ＢｏＮＴ血清型（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆなど）のうちの少なくとも２種の異なるサブタイプを、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３、およびＢｏＮＴ／Ａ４からなる群より選択される少なくとも２種の異なるサブタイプを、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも１種は、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を、それぞれ、約１０ｎＭより大きい親和性で結合する。特定の実施形態において、両方の抗体は、上記サブタイプのうちの少なくとも１種、好ましくは上記サブタイプのうちの少なくとも２種を、同時に結合する。特定の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＲＡＺ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、１Ｄ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＬ  ＣＤＲ３、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ１、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ２、２Ｇ１１  ＶＨ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＬ  ＣＤＲ３、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ１、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ２、５Ｇ４  ＶＨ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＬ  ＣＤＲ３、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ１、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ２、３Ｄ１２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＣＲ２  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ２、ＩＮＧ２  ＶＬ  ＣＤＲ３、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ１、ＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＩＮＧ２  ＶＨ  ＣＤＲ３（例えば、図１８および図２６、表２および／または表１３を参照のこと）からなる群より選択される少なくとも１種のＣＤＲ、少なくとも２種のＣＤＲ、少なくとも３種のＣＤＲ、少なくとも４種のＣＤＲ、少なくとも５種のＣＤＲ、または少なくとも６種のＣＤＲを含む。種々の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含み、このＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およ��ＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択される。種々の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、このＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される。特定の実施形態において、上記抗体は、それぞれ、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含み、このＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＨドメイン、ＣＲ１  ＶＨドメイン、ＣＲ２  ＶＨドメイン、ＩＮＧ１  ＶＨドメイン、ＩＮＧ２  ＶＨドメイン、１Ｄ１１  ＶＨドメイン、２Ｇ１１  ＶＨドメイン、３Ｄ１２  ＶＨドメイン、および５Ｇ４  ＶＨドメインからなる群より選択されるＶＨドメインより選択され、このＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３は全て、ＲＡＺ１  ＶＬドメイン、ＣＲ１  ＶＬドメイン、ＣＲ２  ＶＬドメイン、ＩＮＧ１  ＶＬドメイン、ＩＮＧ２  ＶＬドメイン、１Ｄ１１  ＶＬドメイン、２Ｇ１１  ＶＬドメイン、３Ｄ１２  ＶＬドメイン、および５Ｇ４  ＶＬドメインからなる群より選択されるＶＬドメインより選択される。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＩＮＧ１、およびＩＮＧ２からなる群より選択される抗体より選択されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む。種々の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも１種は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または（ｓｃＦｖ’）２である。特定の実施形態において、上記抗体のうちの少なくとも１種は、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および５Ｇ４からなる群より選択される。
【００１１】
種々の実施形態において、本発明は、Ｃ２５、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、ＩＮＧ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＲＡＺ１、および／またはＩＮＧ２からなる群より選択される抗体によって特異的に結合されるエピトープに特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態において、上記抗体は、１種または好ましくは２種以上のボツリヌス神経毒素サブタイプ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３など）に結合し、そしてそれを中和する。上記抗体は、実質的に任意の哺乳動物の動物型（例えば、マウス、ヒト、ヤギ、ウサギ）の抗体またはキメラ（例えば、ヒト化）の抗体であり得るが、この抗体は、最も好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００１２】
１つの実施形態において、上記抗体は、表２および／または表６、および／または表９および／または表１３、および／または図２６に記載される重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）あるいはその保存的置換体のうちの少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、および最も好ましくは少なくとも３種）を含む。別の実施形態において、上記抗体は、表２および／または表６、および／または表９および／または表１３、および／または図２６に記載される軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）あるいはその保存的置換体のうちの少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、および最も好ましくは少なくとも３種）を含む。なお別の実施形態において、上記抗体は、表２および／もしくは表６、および／もしくは表９および／もしくは表１３、および／もしくは図２６に記載される重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその保存的置換体のうちの少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、および最も好ましくは少なくとも３種）、および表２および／もしくは表６、および／もしくは表９および／もしくは表１３、および／もしくは図２６に記載される軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはその保存的置換体のうちの少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、および最も好ましくは少なくとも３種）、ならびに／あるいは表２および／もしくは表６、および／もしくは表９および／もしくは表１３、および／もしくは図２６に記載されるＶＬフレームワーク領域またはＶＨフレームワーク領域のうちの１種、２種もしくは３種を含む。特定の好ましい抗体としては、Ｃ２５、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、ＩＮＧ１、ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および／または５Ｇ４が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい抗体としては、ＩｇＧ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる一方で、他の好ましい抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ’）２などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、上記抗体は、多価であり得る。上記抗体は、２種のｓｃＦｖフラグメントから構成される融合タンパク質を含み得る。
【００１３】
本発明はまた、薬理学的賦形剤中に本明細書中に記載されるボツリヌス神経毒素−中和抗体の１種以上を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明はまた、ＢｏＮＴ−中和エピトープを提供する。特定の好ましいエピトープとしては、Ｃ２５、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、ＩＮＧ１、ＣＲ１、ＣＲ２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ２、１Ｄ１１、２Ｇ１１、３Ｄ１２、および／または５Ｇ４によって特異的に結合されるＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣエピトープが挙げられる。特定の好ましいポリペプチドは、完全長ＢｏＮＴではなく、そしてより特に好ましいポリペプチドは、完全長ＢｏＮＴ  Ｈｃフラグメントではない。したがって、最も好ましいエピトープは、少なくともアミノ酸４、好ましくは少なくとも６アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも１０アミノ酸、１２アミノ酸、１４アミノ酸、または１５アミノ酸さえもの長さを有する好ましい下位配列を有するＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣの下位配列またはフラグメントである。この関連において、ＨｕＣ２５およびその誘導体（ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、およびＣＲ１）が、Ｎ末端であるＨＣドメインを結合する一方で、３Ｄ１２／ＲＡＺ１は、Ｃ末端であるＨＣドメインを結合することに、留意する。これらのエピトープは、いずれも直鎖ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（定義）
「ＢｏＮＴポリペプチド」とは、ボツリヌス神経毒素ポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド、ＢｏＮＴ／Ｂポリペプチド、ＢｏＮＴ／Ｃポリペプチドなど）をいう。ＢｏＮＴポリペプチドとは、完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントをいい得る。したがって、例えば、用語「ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド」とは、完全長ＢｏＮＴ／Ａ（Ａ型の血清型のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される神経毒素）またはそのフラグメント（例えば、Ｈｃフラグメント）のいずれかをいう。ＨＣフラグメントは、ＢｏＮＴ／Ａの約５０ＤａのＣ末端フラグメント（残基８７３〜１２９６）である（ＬａｃｙおよびＳｔｅｖｅｎｓ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９１：１０９１−１１０４）である。
【００１６】
「ＢｏＮＴ」血清型とは、標準的な公知のＢｏＮＴ血清型（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆなど）のうちの１種をいう。ＢｏＮＴ血清型は、アミノ酸レベルにて約３５％程度の低さ（例えば、ＢｏＮＴ／ＥとＢｏＮＴ／Ｆとの間で）から最大でアミノ酸レベルにて約６６％（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ対ＢｏＮＴ／ＣまたはＢｏＮＴ／Ｄについて）で互いに異なる。したがって、ＢｏＮＴ血清型は、アミノ酸レベルにて約３５〜６６％で互いに異なる。
【００１７】
用語「ＢｏＮＴサブタイプ」（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１Ａサブタイプ）とは、示差的な抗体結合をもたらすのに互いに十分に異なる、特定の血清型（例えば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆなど）のボツリヌス神経毒素遺伝子配列をいう。特定の実施形態において、上記サブタイプは、アミノ酸レベルにて、少なくとも２．５％、好ましくは少なくとも５％、または１０％、より好ましくは少なくとも１５％または２０％で互いに異なる。特定の実施形態において、上記サブタイプは、アミノ酸レベルにて、３５％以下、好ましくは３１．６％以下、より好ましくは３０％以下または２５％以下、より好ましくは約２０％未満または約１６％未満で互いに異なる。特定の実施形態において、ＢｏＮＴサブタイプは、アミノ酸レベルにて、少なくとも２．６％、より好ましくは少なくとも３％、そして最も好ましくは少なくとも３．６％で互いに異なる。ＢｏＮＴサブタイプは、代表的に、アミノ酸レベルにて、約３１．６％未満、より好ましくは約１６％未満で互いに異なる。
【００１８】
「中和」とは、ボツリヌス神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）の毒性の測定可能な減少をいう。
【００１９】
用語「高親和性」は、抗体に関連して使用される場合、少なくとも約１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−９Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−１０Ｍ、そして最も好ましくは少なくとも約１０−１１Ｍの親和性（ＫＤ）でその標的に特異的に結合する抗体をいう。特定の実施形態において、「高親和性」抗体は、約１ｎＭ〜約５ｐＭの範囲のＫＤを有する。
【００２０】
以下の略語が、本明細書中で使用される：ＡＭＰ、アンピシリン；ＢＩＧ、ボツリヌス免疫グロブリン；ＢｏＮＴ、ボツリヌス神経毒素；ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ  Ａ型；ＣＤＲ、相補性決定領域；ＥＬＩＳＡ、酵素結合イムノソルベントアッセイ；ＧＬＵ、グルコース；ＨＢＳ、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ［ｐＨ７．４］）；Ｈｃ、ＢｏＮＴ重鎖のｃ末端ドメイン（結合ドメイン）；ＨＮ、ＢｏＮＴ重鎖のＮ末端ドメイン（トランスロケーションドメイン）；ＩｇＧ、免疫グロブリンＧ；ＩＭＡＣ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー；ＩＰＴＧ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；ＫＡＮ、カナマイシン；Ｋｄ、平衡定数；ｋｏｆｆ、解離速度定数；ｋｏｎ、会合速度定数；ＭＰＢＳ、ＰＢＳ中の脱脂粉乳；ＮＴＡ、ニトリロ三酢酸；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食塩水（２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ［ｐＨ７．０］；ＲＵ、共鳴単位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）；ｓｃＦｖ、単鎖Ｆｖ抗体フラグメント；ＴＰＢＳ、ＰＢＳ中の０．０５％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ  ２０；ＴＭＰＢＳ、ＭＰＢＳ中の０．０５％（容量／容量）Ｔｗｅｅｎ  ２０；ＴＵ、形質導入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔ）；ＶＨ、免疫グロブリン重鎖可変領域；ＶＫ、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域；ＶＬ免疫グロブリン軽鎖可変領域；ｗｔ、野生型。
【００２１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、または「タンパク質」は、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基の線系列を示すために、本明細書中で交換可能に使用される。アミノ酸残基は、好ましくは、天然において「Ｌ」異性体形態である。しかし、「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性がそのポリペプチドによって維持される限り、任意のＬ−アミノ酸残基を置換し得る。さらに、２０種の「標準的な」アミノ酸に加えて、アミノ酸は、改変されたアミノ酸および異常（ｕｎｕｓｕａｌ）なアミノ酸を含み、それらのアミノ酸としては、３７  ＣＦＲ（１．８２２（ｂ）（４））に列挙されるものが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸残基配列の始まりまたは終わりにおけるダッシュが、個以上のアミノ酸残基からなるさらなる配列に対するペプチド結合、またはカルボキシル末端基またはヒドロキシル末端基に対する共有結合のいずれかを示すことに留意すべきである。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１種以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ定常領域遺伝子、λ定常領域遺伝子、α定常領域遺伝子、γ定常領域遺伝子、δ定常領域遺伝子、ε定常領域遺伝子およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、それらは、次に、免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを、それぞれ、規定する。
【００２３】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを構成することが公知である。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１個の「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。それぞれの鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）」および「可変重鎖（ＶＨ）」とは、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００２４】
抗体は、インタクトな免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる分解によってもたらされる十分に特徴付けられた多くのフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結より下流で抗体を分解してＦ（ａｂ）’２をもたらし、Ｆａｂのダイマーそれ自体は、ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖である。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で還元されて、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結が破壊され得、それによって、（Ｆａｂ’）２ダイマーは、Ｆａｂ’モノマーへと変換される。そのＦａｂ’モノマーは、本質的に、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の分解の用語において定義される一方で、当業者は、このようなＦａｂ’フラグメントは、化学的か、または組換えＤＮＡ方法論を利用することによるかのいずれかで、デノボで合成され得ることを認識する。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」はまた、完全な抗体の改変によって産生される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボで合成される抗体フラグメントを含む。好ましい抗体としては、Ｆａｂ’２、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、および単鎖抗体（より好ましくは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体）が挙げられ、ここで可変重鎖および可変軽鎖は、（直接的か、またはペプチドリンカーを介して）一緒に連結されて、連続したポリペプチドを形成する。
【００２５】
「抗原結合部位」または「結合部分」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分をいう。抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端の可変領域（「Ｖ」）のアミノ酸残基によって形成される。重鎖のＶ領域内および軽鎖のＶ領域内の３個の高度に分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）したストレッチは、「超可変領域」と称され、それは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間におかれる。したがって、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリン中の超可変領域の間であり、かつ免疫グロブリン中の超可変領域に隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３個の超可変領域および重鎖の３個の超可変領域は、三次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合「表面」を形成する。この表面は、標的の抗原の認識およびそれに対する結合を媒介する。重鎖および軽鎖の各々の３個の超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称され、そしてそれらの超可変領域は、例えば、Ｋａｂａｔら．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７）によって特徴付けられる。
【００２６】
Ｓ２５抗体とは、クローンＳ２５によって発現される抗体、またはクローンｓ２５によって発現される抗体と同一のＣＤＲを有し、そして好ましくはクローン２５によって発現される抗体と同一のフレームワーク領域を必ずしも有することはない他の様式において合成される抗体をいう。同様に、抗体Ｃ２５、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、ＩＮＧ１、ＣＲ１、ＲＡＺ１、またはＩＮＧ２とは、対応するクローンによって発現される抗体、および／または参照された抗体と同一のＣＤＲを有し、そして好ましくは参照された抗体と同一のフレームワーク領域を必ずしも有することはない他の様式において合成される抗体をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」とは、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共有結合的相互作用の型をいう。免疫学的結合の相互作用の強度および親和性は、その相互作用の解離定数（Ｋｄ）に関して表され得、ここでより小さいＫｄは、より大きい親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを伴い、ここでこの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向における速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。したがって、「会合速度（ｏｎ  ｒａｔｅ）定数」（Ｋｏｎ）および「解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの消去を可能にし、したがって、解離定数Ｋｄに等しい。一般に、Ｄａｖｉｅｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９：４３９−４７３（１９９０）を参照のこと。
【００２８】
「ＢｏＮＴ−中和抗体」とは、１種以上のボツリヌス神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２など）に結合し、かつその結合によってＢｏＮＴ神経毒素の毒性を減少させる抗体をいう。したがって、例えば、用語「ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体」は、本明細書中で使用される場合、ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１ポリペプチド）（特定の実施形態において、ＢｏＮＴ／ＡポリペプチドのＨＣドメイン）に特異的に結合し、かつその結合によってＢｏＮＴ／Ａポリペプチドの毒性を減少させる抗体をいう。減少した毒性は、麻痺が発生した回数の増加および／または本明細書中に記載されるような致死投薬量（例えば、ＬＤ５０）として測定され得る。ＢｏＮＴ−中和抗体に由来する抗体としては、その配列が本明細書中で明確に提供される抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
ＢｏＮＴ−中和抗体に由来する抗体は、好ましくは、約１．６×１０−８またはそれより良好な結合親和性を有し、そしてその抗体は、ボツリヌストキソイド、ボツリヌス毒素、またはＢｏＮＴフラグメントによって免疫化された哺乳動物（マウスおよびヒトが挙げられる）から得られた重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子および軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子から構築された、ファージまたは酵母上に提示される単鎖Ｆｖフラグメントのライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得、このライブラリーにおいて、公知のＢｏＮＴ−中和可変重鎖（ＶＨ）が、多様な可変軽鎖（ＶＬ）と組み合わせて発現されるか、または逆に、公知のＢｏＮＴ−中和可変軽鎖が、多様な可変重鎖（ＶＨ）と組み合わせて発現される。ＢｏＮＴ−中和抗体としてはまた、本明細書中に記載されるような可変重鎖または可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）に変異を導入することによってもたらされる抗体が挙げられる。最終的に、ＢｏＮＴ−中和抗体としては、本明細書中に記載されるＢｏＮＴ−中和抗体およびそれらの誘導体に適用されるようなこれらの改変方法の任意の組み合わせによってもたらされる抗体が挙げられる。
【００３０】
中和エピトープとは、中和抗体によって特異的に結合されるエピトープをいう。
【００３１】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接連結されたかまたはペプチドをコードするリンカーによって連結されたかのいずれかであるＶＨ−コード配列とＶＬ−コード配列とを含む核酸から発現され得る、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−５８８３。天然に集合するが化学的に分離した抗体Ｖ領域由来の軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、三次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子に変換するための多くの構造は、実質的に、抗原結合部位の構造に類似する。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号を参照のこと。
【００３２】
１つの分類の実施形態において、組換え体設計方法は、抗体可変領域由来の２つの天然に結合するが化学的に分離した重ポリペプチド鎖および軽ポリペプチド鎖を、ネイティブな抗体構造に実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子に変換するのに適した化学構造（リンカー）を開発するために使用され得る。
【００３３】
設計の基準は、一方の鎖のＣ末端と他方の鎖のＮ末端との間に距離を空ける適切な長さの決定を含み、ここでリンカーは、一般に、コイルする傾向にないか、または二次構造を形成する傾向にない小さい親水性アミノ酸残基から形成される。このような方法は、当該分野において記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらに対する米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらに対する米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと。
【００３４】
この関連で、リンカーの設計の第１の一般的な工程は、連結されるのにふさわしい部位の同定を包含する。ＶＨポリペプチドドメインおよびＶＬポリペプチドドメインの各々における適切な連結部位としては、そのポリペプチドドメインからの残基の最小限の損失を生じる部位、分子の安定性に対する必要性と一致する最小限の数の残基を含むリンカーを必要とする部位が挙げられる。部位の対は、連結される「ギャップ」を定義する。１つのドメインのＣ末端を次のドメインにＮ末端に対する連結するリンカーは、一般に、非構造立体配置を仮定する生理学的溶液中の疎水性アミノ酸を含み、そして好ましくはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の適切な折り畳みを妨げ得る大きな側鎖を有する残基を含まない。したがって、本発明における適切なリンカーは、一般に、グリシン残基およびセリン残基の交互のセットのポリペプチド鎖を含み、そして可溶性を増強するために挿入されるグルタミン酸残基およびリジン残基を含み得る。本発明における１つの特定のリンカーは、アミノ酸配列［（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ］３（配列番号１）を有する。別の特に好ましいリンカーは、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］（配列番号２）の２回または３回の繰り返しを含むアミノ酸配列（例えば、［（Ｓｅｒ）４Ｇｌｙ］３（配列番号３）など）を有する。このようなリンカー部分をコードするヌクレオチド配列は、当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を使用して容易に提供され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと。
【００３５】
抗体に関する場合、語句「タンパク質に特異的に結合する」または「と特異的に免疫反応性」とは、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団の存在下において上記タンパク質の存在を決定する結合反応をいう。したがって、設計されたイムノアッセイ条件下において、特定の抗体は、特定のタンパク質に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に顕著な量で結合しない。このような条件下におけるタンパク質に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体は、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質に対して惹起され得、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質に特異的に結合し、そして組織サンプル中に存在する他のタンパク質に結合しない。種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式およびイムノアッセイ条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００３６】
用語「保存的置換」は、分子の活性（特異性または結合親和性）を実質的に変化させないアミノ酸置換を反映するために、タンパク質またはペプチドに対する参照において使用される。代表的に、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸での置換を含む。以下の６種の群は、それぞれ、互いに対する代表的な保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３７】
（詳細な説明）
本発明は、ボツリヌス神経毒素Ａ型（特定の実施形態において、他のボツリヌス神経毒素血清型（例えば、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆなど））に特異的に結合し、そしてそれを中和する新規の抗体を提供する。ボツリヌス神経毒素は、嫌気性細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍによって産生される。ボツリヌス神経毒素中毒（ボツリヌス中毒）は、多くの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）において生じ、その状況としては、食中毒（食物媒介性ボツリヌス中毒）、感染した創傷（創傷ボツリヌス中毒）、ならびに芽胞の摂取および乳児の腸管における毒素の産生に由来する「乳児ボツリヌス中毒」が挙げられるが、これらに限定されない。ボツリヌス中毒は、代表的に脳神経の関与によって始まり、そして四肢を含んで末端に進行する麻痺性疾患である。急性の場合において、ボツリヌス中毒は、致命的であり得る。
【００３８】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）はまた、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）はまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性（Ａｒｎｏｎら、（２００１）ＪＡＭＡ  ２８５：１０５９−１０７０）に起因して、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する６種の脅威因子（「Ｃａｔｅｇｏｒｙ  Ａ  ａｇｅｎｔ」）のうちの１種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにＢｏＮＴを生産し（ＵＮ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（１９９５）、前出；Ｂｏｚｈｅｙｅｖａ（１９９９）、前出）、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにＢｏＮＴを使用することを試みた（Ａｒｎｏｎら（２００１）、前出）。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。
【００３９】
最近、種々のＢｏＮＴ血清型の複数のサブタイプが存在することが見出されている。さらに、本発明者らは、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプを結合する多くの抗体がＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプを結合しないことなどが、さらに見出した。
【００４０】
本発明者らは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）のサブタイプの特に効率的な中和が、特定のＢｏＮＴ血清型の２種以上のサブタイプを高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成されることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する２種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得る一方で、これは、より低い有効性であり、効率的ではなく、そして実用的ではない。ＢｏＮＴ治療は、ＢｏＮＴの高い毒性を鑑みると、望ましくは、非常に強力である。所与のＢｏＮＴ血清型を、必要とされる効力（以下ならびに図５、６、１６、および１７を参照のこと）によって中和するために複数の抗体を使用することが、一般的には必要であるので、必要とされる抗体の数は、各サブタイプに対して異なる抗体を使用することが必要である場合、製造の観点から、非常に大きいものである。混合物中の抗体の数の増加はまた、効力を減少さる。したがって、例えば、４種の抗体（２種がＡ１毒素を中和し、そして２種がＡ２毒素を中和する）の混合物の場合、それらの抗体の５０％のみが、所与の毒素を中和する。対照的に、２種の抗体（その両方が、Ａ１毒素およびＡ２毒素を中和する）の混合物は、いずれの毒素に対しても１００％の活性を有し、そして製造がより簡単である。例えば、２種のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ（Ａ１、Ａ２）に対して、強力な中和は、２種〜３種の抗体によって達成され得る。異なる抗体が、ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／Ａ２との中和に必要とされる場合、４種〜６種の抗体が、必要とされる。その複雑性は、さらなるサブタイプに対してさらに増大する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、２種以上のＢｏＮＴサブタイプ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２など）を高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。
【００４１】
ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の両方を高親和性で結合する抗体の例としては、本明細書中に記載されるＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、およびＩＮＧ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
中和抗体を組み合わせ始めるときに、上記抗体の組み合わせの効力が劇的に増大することもまた、驚くべき発見であった。この増大は、治療用途に必要とされる効力のボツリヌス抗体をもたらすことを可能にする。２種のモノクローナル抗体および３種のモノクローナル抗体を組み合わせ始める場合、認識される特定のＢｏＮＴエピトープは、重要ではなくなることもまた、驚くべきことであった。したがって、例えば、実施例５に示されるように、ＢｏＮＴのトランスロケーションドメインおよび／または触媒ドメインに結合する抗体が、中和活性を有し、互いと組み合わせた場合、またはＢｏＮＴレセプター結合ドメイン（ＨＣ）を認識するｍＡｂと組み合わせた場合のいずれかが、ＢｏＮＴ活性の中和に有効であった。したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＢｏＮＴ上の重複しないエピトープを結合する少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種）の高親和性抗体を含む組成物を企図する。
【００４３】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、および／またはこれらの抗体由来の１種以上のＣＤＲを含む抗体、および／またはこれらの抗体の変異体（例えば、ＩＮＧ１の１Ｄ１１変異体、２Ｇ１１変異体、および５Ｇ４変異体）（例えば、図１９Ｂを参照のこと）を含む１種以上の抗体からなる群より選択される、２種以上（好ましくは、３種以上）の異なる抗体を含む組成物を企図する。
【００４４】
上に示されるように、特定の実施形態において、本発明によって提供される抗体は、１種以上のボツリヌス神経毒素Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）サブタイプに結合し、そしてそれを中和する。この文脈において、中和とは、ＢｏＮＴ／Ａの毒性の測定可能な減少をいう。毒性のこのような減少は、当業者に周知の多くの方法によってインビトロで測定され得る。１つのこのようなアッセイは、片側横隔膜調製物における単収縮張力の減少の所与の％（例えば、５０％）までの時間を測定することを包含する。毒性は、例えば、１種以上の推定上の中和抗体の存在下での試験動物（例えば、マウス）のボツリヌス神経毒素Ａ型におけるＬＤ５０としてインビボで決定され得る。上記中和抗体は、投与前にボツリヌス神経毒素と組み合せられ得るか、あるいは上記動物は、その神経毒素の投与前か、その神経毒素の投与と同時か、またはその神経毒素の投与後に上記抗体を投与され得る。
【００４５】
本発明の抗体が、ボツリヌス神経毒素Ａ型を中和するように作用する場合、それらの抗体は、ボツリヌス神経毒素中毒に関連する病理の処置において有用である。上記処置は、本質的に、中毒になった生物体（例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物）に、ＢｏＮＴ中毒の症状を中和（例えば、緩和または排除）するのに十分な１種以上の中和抗体の量を投与することを包含する。
【００４６】
このような処置は、最も所望され、かつ急性症例（例えば、肺活量が、３０〜４０％未満であり、そして／あるいは麻痺が、迅速に進行しており、そして／あるいは絶対的または相対的な高炭酸ガス血症を伴う低酸素血症が、存在する場合）において有効である。これらの抗体はまた、示されるよりも穏やかな症状を伴う初期症例を処置するため（進行を予防するため）に使用されえるか、または予防的（軍隊が危険な状況に向かう兵士について想定する使用）にさえ使用され得る。上記中和抗体による処置は、他の治療（例えば、抗生物質による処置）に対する補助として提供され得る。
【００４７】
本発明によって提供される抗体は、ボツリヌス中毒（Ａ型毒素）の迅速な検出／診断のために使用され得、そしてそれによって、先の検査室診断を補完および／または置換し得る。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス神経毒素Ａ型中和抗体によって特異的に結合されるエピトープを提供する。これらのエピトープは、他の抗体（本明細書中に記載されるようなＢｏＮＴ／Ａ中和抗体）を、単離および／または同定および／またはスクリーニングするために使用され得る。
【００４９】
（Ｉ．ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）中和抗体の効力）
特定の理論に拘束されることはないが、ボツリヌス中毒（ウマおよびヒト）を処置するために使用される現在の抗毒素は、約５０００マウスＬＤ５０／ｍｇ（ヒト）の効力および５５，０００マウスＬＤ５０ｍｇ（ウマ）の効力を有すると考えられる。
【００５０】
本発明者らの計算に基づいて、本発明者らは、商業的に望ましい抗毒素は約１０，０００〜１００，０００ＬＤ５０／ｍｇより大きい効力を有すると考える。本明細書中に記載される抗体の組み合わせ（例えば、２種または３種の抗体）は、この効力を満たす。したがって、特定の実施形態において、本発明は、１ｍｇの抗体あたり少なくとも約１０，０００マウスＬＤ５０、好ましくは１ｍｇの抗体あたり少なくとも約１５，０００マウスＬＤ５０、より好ましくは１ｍｇの抗体あたり少なくとも約２０，０００マウスＬＤ５０、そして最も好ましくは１ｍｇの抗体あたり少なくとも約２５，０００マウスＬＤ５０を中和する抗体および／または抗体の組み合わせを提供する。
【００５１】
（ＩＩ．ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）中和抗体）
特定の好ましい実施形態において、１種（しかし、より好ましくは少なくとも２種）のＢｏＮＴサブタイプに結合するＢｏＮＴ中和抗体が、選択される。多くのサブタイプが、各ＢｏＮＴ血清型に関して公知である。したがって、例えば、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプとしては、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３などが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、図１１を参照のこと）。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプとしては、６２Ａ、ＮＣＴＣ  ２９１６、ＡＴＣＣ  ３５０２、およびＨａｌｌ  ｈｙｐｅｒ（Ｈａｌｌ  Ａｌｌｅｒｇａｎ）が挙げられるが、これらに限定されないこと、ならびにＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプは、同一（アミノ酸で９９．９〜１００％の同一性）であること、ならびにＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプは、サブタイプＡ１として分類されていることもまた、示される（図１２Ａ）。ＢｏＮＴ／Ａ２配列（Ｋｙｏｔｏ−ＦおよびＦＲＩ−Ａ２Ｈ）（Ｗｉｌｌｅｍｓら、（１９９３）Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：５４７−５５６）は、アミノ酸レベルで１００％同一である。（本発明者らがＡ３と称している）別のＢｏＮＴ／Ａサブタイプは、スコットランドにおける感染で多くの者を殺したＬｏｃｈ  Ｍａｒｅｅと称される株によって産生される。本発明者らは、Ａ１毒素およびＡ２毒素の両方と交差反応する本明細書中に記載される３種の抗体（表１を参照のこと）がまたＡ３毒素と交差反応するというデータを有する（これらは、ＣＲ１、ＩＮＧ１、およびＲＡＺ１である）。別のＢｏＮＴ／Ａ毒素（本発明者らがを同定した）を、本発明者らは、Ａ４と称する。それは、Ｂ毒素およびＡ毒素の両方を産生するクロストリジウム属の二価の株によって産生される。
【００５２】
同様に、図１１に示されるように、多くのサブタイプはまた、血清型Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＦに関して公知である。本明細書中に記載される方法を使用して、血清型内の２種以上のサブタイプと交差反応性である（例えば、選択された／操作された）高親和性抗体が産生され得ることが、見出された。さらに、特定の理論に拘束されることはないが、これらの交差反応性である抗体は、実質的に、ボツリヌス神経毒素の中和においてより効率的である（１種以上の異なる中和抗体を組み合わせて使用した場合）ことが、明らかである。
【００５３】
多くの原始的に「交差反応性」である抗体についての可変重（ＶＨ）ドメインの配列および可変軽（ＶＬ）ドメインの配列は、表２ならびに図１８および図１９に示される。上に示されるように、抗体ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、およびＩＮＧ２が、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプおよびＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプに対して交差反応性である一方で、抗体ＣＲ１、ＩＮＧ１、およびＲＡＺ１は、さらに、ＢｏＮＴ／Ａ３サブタイプに対して交差反応性である。
【００５４】
抗体ＣＲ１は、例えば、実施例４に記載されるように、ヒト化Ｃ２５（ＨｕＣ２５）の変異および選択によって産生された（ＡＲ２の誘導体）。上記抗体は、Ａ１サブタイプおよびＡ２サブタイプの両方に対して変異ならびに選択された。同様に、抗体３Ｄ１２の変異（例えば、実施例２を参照のこと）は、ＲＡＺ１をもたらした。酵母における免疫性ｓｃＦｖライブラリーの選択は、ＩＮＧ１およびＩＮＧ２をもたらした。
【００５５】
（表１．操作した抗体についての結合データ）
【００５６】
【表１】
2008528060.tif 000002
表２ならびに図１８および図１９は、交差反応性である抗体ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＩＮＧ１、およびＩＮＧ２のＶＨ領域ならびにＶＬ領域についてのアミノ酸配列情報を提供する。同様の情報が、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプに特異的に結合する抗体ＡＲ２およびＡＲ３について提供される。さらに、配列情報が、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、および／または３−１０について本明細書中で提供される（例えば、表６ならびに／または表１１および／もしくは表１３を参照のこと）。
【００５７】
（表２．成熟した親和性であり、交差反応性であり、かつ／または改変された抗体についてのアミノ酸配列）
【００５８】
【表２−１】
2008528060.tif 000003
【００５９】
【表２−２】
2008528060.tif 000004
＊完全な重鎖についての配列は、重鎖フレームワーク１＋重鎖ＣＤＲ１＋重鎖フレームワーク２＋重鎖ＣＤＲ２＋重鎖フレームワーク３＋重鎖ＣＤＲ３＋重鎖フレームワーク４である。
完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク１＋軽鎖ＣＤＲ１＋軽鎖フレームワーク２＋軽鎖ＣＤＲ２＋軽鎖フレームワーク３＋軽鎖ＣＤＲ３＋軽鎖フレームワーク４である。
【００６０】
本明細書中に提供される教示および配列情報を用いて、可変軽鎖および可変重鎖は、単鎖Ｆｖ抗体を形成するために、直接的か、またはリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３、配列番号１８１））を介して連結され得る。種々のＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域は、完全ヒト抗体、キメラ抗体、抗体フラグメント、多価抗体などを形成するために使用され得る。
【００６１】
（ＩＩＩ．ＢｏＮＴ中和抗体の調製）
（Ａ．ＢｏＮＴ中和抗体の組換え発現）
本明細書中に提供される情報を用いて、本発明のボツリヌス神経毒素中和抗体は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製される。
【００６２】
例えば、本明細書中に提供されるポリペプチド配列（例えば、表２および／または表６および／または表９および／または表１３を参照のこと）は、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体をコードする適切な核酸配列を決定するために使用され得、次いでその核酸配列は、１種以上のＢｏＮＴ−中和抗体を発現するために使用される。上記核酸配列は、当業者に周知の標準的な方法にしたがって、種々の発現系に対して「好ましい」特定のコドンを反映するために最適化され得る。
【００６３】
提供される配列情報を用いて、上記核酸は、当業者に公知の多くの標準的な方法にしたがって合成され得る。オリゴヌクレオチド合成は、好ましくは、市販の固相オリゴヌクレオチド合成機において実施される（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８）か、またはオリゴヌクレオチドは、Ｂｅａｕｃａｇｅらによって記載される固相ホスホラミダイトトリエステル法（Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２）を使用して手動で合成される。
【００６４】
一旦ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体をコードする核酸が合成されると、その核酸は、標準的な方法にしたがって増幅および／またはクローニングされ得る。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は、当該分野において公知である。組換え核酸の構築に適した広範な種々のクローニング法およびインビトロ増幅法は、当業者に公知である。多くのクローニング実行により当業者を導くのに十分なこれらの教示および説明の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１巻〜第３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同企業体、（１９９４、補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。組換え免疫グロブリンを産生する方法はまた、当該分野において公知である。Ｃａｂｉｌｌｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅｎら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３を参照のこと。
【００６５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼを媒介する技術を含むインビトロ増幅法により当業者を導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３、８１−９４；Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６、１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら、（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５、１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１、１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８、２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４、５６０；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら、（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９、１１７に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。
【００６６】
一旦ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体についての核酸が単離およびクローニングされると、当業者に公知である種々の組換え的に操作された細胞においてその遺伝子を発現し得る。このような細胞の例としては、細菌、酵母、糸状真菌、（特に、バキュロウイルスベクターを利用する）昆虫、および哺乳動物細胞が挙げられる。当業者はＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体の発現に利用可能な多くの発現系に精通していることが、予想される。
【００６７】
簡単にまとめると、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体をコードする天然の核酸または合成の核酸の発現は、代表的に、その抗体をコードする核酸をプロモーター（これは、構成的または誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、そしてこの構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。上記ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製および組込みに適切であり得る。代表的なクローニングベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体をコードする核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。上記ベクターは、必要に応じて、一般的な発現カセットを含有し、その発現カセットは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方においてそのカセットの複製を可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）、ならびに原核生物系および真核生物系の両方に対する選択マーカーを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。
【００６８】
クローニングされた核酸の高い発現レベルを得るために、代表的には転写を指揮する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが、一般的である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてこの目的に適した調節領域の例は、Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５８：１０１８−１０２４によって記載されるようなＥ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター領域およびオペレーター領域、ならびにＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＨａｇｅｎ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１４：３９９−４４５によって記載されるようなλファージの左方向プロモーター（ｌｅｆｔｗａｒｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（ＰＬ）である。Ｅ．ｃｏｌｉ中に形質転換されたＤＮＡベクター中に選択マーカーを含むこともまた、有用である。このようなマーカーの例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を特定する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用するための選択マーカーに関する詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。
【００６９】
ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体を発現するための発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ、バシラス種（Ｐａｌｖａら、（１９８３）Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３０２：５４３−５４５）およびサルモネラ属を使用して利用可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ系が、好ましい。
【００７０】
原核生物細胞によって産生されるＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体は、適切な折り畳みのために、カオトロピック剤への曝露を必要とし得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製の間に、発現したタンパク質は、必要に応じて、変性され、次いで復元される。これは、例えば、上記細菌によって産生された抗体をカオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ）において可溶化することによって達成される。次いで上記抗体は、緩徐な透析またはゲル濾過のいずれかによって復元される。米国特許第４，５１１，５０３号を参照のこと。
【００７１】
哺乳動物細胞中に遺伝子をトランスフェクトし、そして哺乳動物細胞中で発現させる方法は、当該分野において公知である。核酸を用いて細胞を形質導入することは、例えば、ベクターの宿主範囲内の細胞によってＢｏＮＴ／Ａ−中和核酸を含むウイルスベクターを培養（ｉｎｃｕｂａｔｅ）することを含み得る。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡまたはＫｒｉｅｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．およびその中に引用される参考文献を参照のこと。
【００７２】
組織サンプルまたは血液サンプル由来の細胞株および培養細胞を含む本発明において使用される細胞の培養は、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．およびその中に引用される参考文献を参照のこと）。
【００７３】
抗体を使用および操作するための方法は、Ｃｏｌｉｇａｎ、（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびその中に引用される参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に見出される。ボツリヌス神経毒素Ａ型に対して特異的であるＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体は、１×１０−８  Ｍまたはそれより良好なＫＤを有し、好ましい実施形態では、１ｎＭまたはそれより良好なＫＤを有し、そして最も好ましい実施形態では、０．１ｎＭまたはそれより良好なＫＤを有する。
【００７４】
１つの好ましい実施形態において、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体遺伝子（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和ｓｃＦｖ遺伝子）は、発現ベクターｐＵＣ１１９ｍｙｃＨｉｓ（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６：８１３−８１７）または発現ベクターｐＳＹＮ３中にサブクローニングされ、これらの発現ベクターは、そのｓｃＦｖのＣ末端にヘキサヒスチジンタグの付加をもたらして、精製を容易にする。ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体のクローニングおよび精製のための詳細なプロトコルは、実施例１に提供される。
【００７５】
（Ｂ．全ポリクロ−ナル抗体または全モノクロ−ナル抗体の調製）
本発明のＢｏＮＴ中和抗体は、個体、対立遺伝子、株、または種の改変体、およびそのフラグメント（それらの天然に存在する（完全長）形態および組換え形態の両方において）を含む。特定の実施形態において、好ましくは抗体は、本明細書中に記載される抗体（例えば、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、ＣＲ１、ＲＡＺ１、１Ｄ１１、２Ｇ１１、５Ｇ４、ＩＮＧ１、および／またはＩＮＧ２）によって結合される１種以上のエピトープを結合するために選択される。特定の好ましい抗体は、２種以上のＢｏＮＴサブタイプ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３など）と交差反応性である。上記抗体は、それらのネイティブな構造またはネイティブではない構造において生じ得る。抗イデオタイプ抗体もまた、産生され得る。特定のエピトープに特異的に結合する抗体を作製する多くの方法は、当業者に公知である。以下の考察は、利用可能な技術の一般的な外観として存在する；しかし、当業者は、以下の方法における多くのバリエーションが公知であることを認識する。
【００７６】
１）ポリクロ−ナル抗体の産生
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。簡単にいうと、免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１もしくはＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ１  ＨｃもしくはＢｏＮＴ／Ａ２  Ｈｃ、またはＢｏＮＴ／Ａ１下位配列もしくはＢｏＮＴ／Ａ２下位配列（本明細書中に開示されるクローンＳ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、および／もしくはＣＲ１、ＲＡＺ１、１Ｄ１１、２Ｇ１１、５Ｇ４、ＩＮＧ１、ならびに／またはＩＮＧ２によって発現される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列が挙げられるが、これに限定されない））、好ましくは精製されたポリペプチド、適切なキャリア（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニンなど）とカップリングされたポリペプチド、または組換えワクシニアウイルス（米国特許第４，７２２，８４８号を参照のこと）などの免疫化ベクターに組み込まれるポリペプチドは、アジュバントと混合され、そして動物は、その混合物によって免疫化される。上記免疫原調製物に対する哺乳動物の免疫応答は、試験採血（ｔｅｓｔ  ｂｌｅｅｄ）を行い、そして目的のポリペプチドに対する反応性の力価を決定することによってモニタリングされる。免疫原に対して適切に抗体の高い力価が得られる場合、血液が動物から回収され、そして抗血清が調製される。さらに上記ＢｏＮＴ／Ａポリペプチドに対して反応性である抗体を濃縮するために、上記抗血清の分別が、行われる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと）。
【００７７】
本明細書中に記載される中和エピトープに特異的に結合する抗体は、本明細書中に記載される選択技術を使用してポリクローナル血清から選択される。
【００７８】
２）モノクロ−ナル抗体の産生
いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、げっ歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが、望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術の説明は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、ＣＡ、およびその中に引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に見出される。
【００７９】
簡単にまとめると、モノクローナル抗体の産生は、免疫原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ、またはＢｏＮＴ／Ａ下位配列（本明細書中に開示されるクローンＳ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、３Ｄ１２、Ｂ４、１Ｆ３、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＷＲ１（Ｖ）、ＷＲ１（Ｔ）、３−１、３−８、３−１０、および／もしくはＣＲ１、ＲＡＺ１、１Ｄ１１、２Ｇ１１、５Ｇ４、ＩＮＧ１、ならびに／またはＩＮＧ２によって発現される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列が挙げられるが、これに限定されない））を動物に注射することによって進行する。次いで動物は、屠殺され、および細胞が、その脾臓から採取され、その細胞は、骨髄腫細胞と融合される。その結果は、インビトロで再生可能であるハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いでそのハイブリドーマの集団は、個々のクローン（その各々は、上記免疫原に対して単一の抗体種を分泌する）を単離するためにスクリーニングされる。この様式において、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質において認識される特定の部位に応じてもたらされる免疫動物由来の、不死化されかつクローニングされた単一のＢ細胞の産物である。
【００８０】
不死化の代替方法は、エプスタイン−バーウイルス、癌遺伝子、もしくは、レトロウイルス、または当該分野で公知の他の方法を用いた形質転換を含む。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、ＢｏＮＴ抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物（好ましくは、哺乳動物）宿主の腹膜腔への注入を含む種々の技術によって向上する。本発明の抗体は、改変を伴ってか、または改変を伴わずに使用され、そしてその抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）を含む。
【００８１】
（ＩＶ．ＢｏＮＴ中和抗体の改変）
（Ａ．ファ−ジディスプレイは抗体の親和性を増大させるために使用され得る）
より高い親和性の抗体を作製するために、結合ｓｃＦｖ（例えば、表２、および／または表６、および／または表９および／または１３）の配列に基づく変異ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーが、作製され得、そしてファージの表面上に発現され得る。細菌に感染するウイルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面上での抗体フラグメントの提示は、広範な親和性および動態特性を有するヒトまたは他の哺乳動物の抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を産生することを可能にする。ファージの表面上に抗体フラグメントを提示する（ファージディスプレイ）ために、抗体フラグメント遺伝子は、ファージ表面タンパク質（例えば、ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子中に挿入され、そして抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質は、そのファージ表面上に発現される（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７）。
【００８２】
上記ファージの表面上の抗体フラグメントは機能的であるので、抗原結合性抗体フラグメントを有するファージは、抗原親和性クロマトグラフィーによって、結合しないファージまたはより低い親和性のファージから分離され得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４）。ファージの混合物は、アフィニティーマトリックスに結合され得、結合しないファージまたはより低い親和性のファージは、洗浄することによって除去され、そして結合したファージは、酸またはアルカリを用いた処理によって溶出される。抗体フラグメントの親和性に依存して、２０倍〜１，０００，０００倍の濃縮係数が、単一のラウンドの親和性選択によって得られる。
【００８３】
溶出したファージまたは下に記載されるような溶出したファージの改変された改変体を細菌に感染させることによって、より多くのファージが、増殖し得、そしてそのファージは、別のラウンドの選択に供され得る。この方法において、１ラウンドにおける１０００倍の濃縮は、２ラウンドの選択において１，０００，０００倍になる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４）。したがって、各ラウンドにおける濃縮が低い場合でも、複数のラウンドの親和性選択は、稀なファージ、および結合性抗体の配列をコードする含まれる遺伝子材料の単離をもたらす（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７）。ファージディスプレイによって提供される遺伝子型と表現型との間の物理的関連は、１００，０００，０００クローン程度の大きさのライブラリーを用いた場合でさえ、抗原に対する結合について抗体フラグメントライブラリーの全てのメンバーを試験することを可能にする。例えば、抗原に対する複数のラウンドの選択の後、３０，０００，０００クローンあたり１クローンのみの頻度で生じた結合性ｓｃＦｖは、回収された（Ｉｄ．）。
【００８４】
１）鎖のシャッフリング
変異ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製するための１つのアプローチは、結合性ｓｃＦｖ由来のＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のいずれかをＶＨ遺伝子のレパートリーまたはＶＬ遺伝子のレパートリーで置換すること（鎖シャッフリング）を包含する（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８）。このような遺伝子レパートリーは、結合性ｓｃＦｖと同じであるが、点変異を有する生殖系列遺伝子に由来する多くの変異する遺伝子を含む（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３）。軽鎖シャッフリングまたは重鎖シャッフリングおよびファージディスプレイを使用して、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１／ＢｏＮＴ／Ａ２−中和抗体フラグメントの結合アビディティは、劇的に増大され得る（例えば、Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８５（ハプテンフェニルオキサゾロン（ｐｈｏｘ）を結合したヒトｓｃＦｖ抗体フラグメントの親和性が、３００ｎＭから１５ｎＭ（２０倍）に増大した）を参照のこと）。
【００８５】
したがって、ＢｏＮＴ−中和抗体の親和性を変化させるために、公知のＢｏＮＴ−中和抗体（例えば、ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２）のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子レパートリー（軽鎖シャッフリング）とを含む変異ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーが、作製される。あるいは、公知のＢｏＮＴ−中和抗体（例えば、ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２）のＶＬ遺伝子と、ＶＨ遺伝子レパートリー（重鎖シャッフリング）とを含むｓｃＦｖ遺伝子レパートリーが、作製される。上記ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージディスプレイベクター中にクローニングされ（例えば、ｐＨＥＮ−１、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７）、そして形質転換後に、形質転換体のライブラリーが、得られる。ファージは、調製および濃縮され、そして選択は、実施例に記載される通りに行われる。
【００８６】
抗原の濃度は、選択の各ラウンドにおいて減少され、選択の最後のラウンドで所望のＫｄより低い濃度に達する。これは、親和性に基づくファージの選択をもたらす（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６）。
【００８７】
２）位置指定突然変異誘発によるＢｏＮＴ中和抗体の親和性の増大
抗原に接触するアミノ酸側鎖の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＶＨにおいて３個（ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）およびＶＬにおいて３個（ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３））に位置する（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７５５−８；Ｎｈａｎら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１７：１３３−１５１）。これらの残基は、抗原に対する抗体の親和性を担う大部分の結合エネルギー論に寄与する。他の分子において、リガンドに接触するアミノ酸を変異させることは、１つのタンパク質分子の、その結合パートナーに対する親和性を増大させる有効な手段であることが、示されている（Ｌｏｗｍａｎら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４：５６４−５７８；Ｗｅｌｌｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：８５０９−８５１６）。したがって、ＣＤＲの変異（ランダム化）、およびＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣまたは本明細書中で同定されるそれらのエピトープに対するスクリーニングは、改良された結合親和性を有するＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体を産生するために使用され得る。
【００８８】
特定の実施形態において、各ＣＤＲは、例えば、テンプレートとしてＳ２５（Ｋｄ＝７．３×１０−８Ｍ）を使用して、別個のライブラリーにおいてランダム化される。親和性の測定を単純化するために、より高い親和性のｓｃＦｖよりもむしろ、Ｓ２５または他のより低い親和性のＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体が、テンプレートとして使用される。各ＣＤＲライブラリー由来の最も高い親和性の変異体のＣＤＲ配列は、親和性の相加的な増大を得るために組み合わせられる。同様のアプローチは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の成長ホルモンレセプターに対する親和性を、増大（１５００倍を上回る（３．４×１０−１０から９．０×１０−１３Ｍ））させるために使用されている（Ｌｏｗｍａｎら、（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３４：５６４−５７８）。
【００８９】
ＢｏＮＴ−中和抗体の親和性を増大させるために、１個以上のＣＤＲに位置するアミノ酸残基（例えば、ＶＬ  ＣＤＲ３に位置する９個のアミノ酸残基）は、「混ぜられた（ｄｏｐｅｄ）」オリゴヌクレオチドを合成することによって部分的にランダム化され、このオリゴヌクレオチドにおいて、野生型ヌクレオチドが、例えば、４９％の頻度で生じた。上記オリゴヌクレオチドは、ＢｏＮＴ−中和ｓｃＦｖ遺伝子の残部を、ＰＣＲを用いて増幅するために使用される。
【００９０】
例えば、１つの実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ３がランダム化されるライブラリーを作製するために、ＢｏＮＴ−中和抗体のＶＨフレームワーク３にアニーリングし、そしてＢｏＮＴ−中和抗体のＶＨ  ＣＤＲ３とフレームワーク４の一部とをコードするオリゴヌクレオチドが合成される。ランダム化される４つの位置において、配列ＮＮＳが、使用され得、Ｎは、任意の４個のヌクレオチドであり、そしてＳは、「Ｃ」または「Ｔ」である。このオリゴヌクレオチドは、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体のＶＨ遺伝子を、ＰＣＲを使用して増幅するために使用され、このことは、変異ＢｏＮＴ−中和抗体ＶＨ遺伝子レパートリーを作製する。ＰＣＲは、ＢｏＮＴ−中和抗体軽鎖遺伝子によってＶＨ遺伝子レパートリーをスプライシングするために使用され、そして得られたｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージディスプレイベクター（例えば、ｐＨＥＮ−１またはｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ）中にクローニングされる。ライゲーションされたベクターＤＮＡは、エレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換してファージ抗体ライブラリーを産生するために使用される。
【００９１】
より高い親和性の変異ｓｃＦｖを選択するために、ファージ抗体ライブラリーの選択の各ラウンドは、実施例に記載されるように、１種以上のＢｏＮＴサブタイプの漸減量に対して行なわれる。代表的に、選択の第３ラウンドおよび第４ラウンドから得た９６個のクローンは、９６ウェルプレートにおけるＥＬＩＳＡによって、所望の抗原（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１および／またはＢｏＮＴ／Ａ２）に対する結合についてスクリーニングされ得る。例えば、１０ｍｌ培養において、例えば、２０個〜４０個のＥＬＩＳＡポジティブクローンからｓｃＦｖが、発現され、ペリプラズムが、回収され、そしてｓｃＦｖのｋｏｆｆが、ＢＩＡｃｏｒｅによって決定される。最も遅いｋｏｆｆを有するクローンは、配列決定され、そしてそれぞれ固有のｓｃＦｖは、適切なベクター（例えば、ｐＵＣ１１９  ｍｙｃＨｉｓ）中にサブクローニングされる。そのｓｃＦｖは、培養において発現され、そして本明細書中に記載されるように精製される。精製されたｓｃＦｖの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅによって決定される。
【００９２】
３）ＢｏＮＴ中和（ｓｃＦｖ’）２ホモダイマ−の作製
ＢｏＮＴ−中和（ｓｃＦｖ’）２抗体を作製するために、２種のＢｏＮＴ−中和ｓｃＦｖが、リンカー（例えば、炭素リンカー、ペプチドなど）または例えば、２つのシステインの間のジスルフィド結合のいずれかを介して連結される。したがって、例えば、ジスルフィド結合したＢｏＮＴ／Ａ−中和ｓｃＦｖを作製するために、システイン残基が、ＢｏＮＴ／Ａ−中和ｓｃＦｖのカルボキシ末端におけるｍｙｃタグとヘキサヒスチジンタグとの間の位置指定突然変異誘発によって導入され得る。正しい配列の導入は、ＤＮＡ配列決定によって検証される。好ましい実施形態において、上記構築物は、ｐｅｌＢリーダーが発現したｓｃＦｖをペリプラズムに指向させ、かつＢｏＮＴ／Ａ−中和変異ｓｃＦｖを導入するためのクローニング部位（ＮｃｏｌおよびＮｏｔｌ）が存在するようなｐＵＣ１１９中にある。発現したｓｃＦｖは、そのＣ末端にｍｙｃタグを有し、その後ろに２個のグリシン、システイン、次いでＩＭＡＣによる精製を容易にする６個のヒスチジンを有する。２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成後、２つのｓｃＦｖは、互いから２６アミノ酸（２つの１１アミノ酸のｍｙｃタグおよび４個のグリシン）によって隔てられる。この構築物から発現され、ＩＭＡＣによって精製されたｓｃＦｖは、モノマーのｓｃＦｖを優勢に含み得る。（ｓｃＦｖ’）２ダイマーを産生するために、そのシステインは、１ＭＭ  β−メルカプトエタノールと一緒にインキュベートすることによって還元され、そしてそのｓｃＦｖの半分は、ＤＴＮＢの添加によってブロックされる。ブロックされたｓｃＦｖおよびブロックされていないｓｃＦｖは、一緒にインキュベートされて（ｓｃＦｖ’）２を形成し、そして得られた物質は、必要に応じて、ゲル濾過によって分析され得る。ＢｏＮＴ−中和ｓｃＦｖ’モノマーおよびＢｏＮＴ−中和（ｓｃＦｖ’）２ダイマーの親和性は、必要に応じて、本明細書中に記載されるようにＢＩＡｃｏｒｅによって決定され得る。
【００９３】
特に好ましい実施形態において、上記（ｓｃＦｖ’）２ダイマーは、リンカー（より好ましくは、ペプチドリンカー）を介して上記ｓｃＦｖフラグメントを連結することによって作製される。これは、当業者に周知の広範な種々の手段によって達成され得る。例えば、１つの好ましいアプローチは、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８によって記載される（ＷＯ  ９４／１３８０４もまた参照のこと）。
【００９４】
代表的に、リンカーは、ＰＣＲクローニングによって導入される。例えば、５アミノ酸のリンカー（Ｇ４Ｓ、配列番号４）をコードする合成オリゴヌクレオチドが、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体ＶＨ遺伝子およびＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体ＶＬ遺伝子をＰＣＲ増幅するために使用され得、次いでこれらの遺伝子は、ＢｏＮＴ／Ａ−中和ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）遺伝子を作製するために一緒にスプライシングされる。次いでこれらの遺伝子は、適切なベクター中にクローニングされ、発現され、そして当業者に周知の標準的な方法によって精製される。
【００９５】
４）ＢｏＮＴ中和（ｓｃＦｖ）２分子、ＢｏＮＴ中和Ｆａｂ分子、およびＢｏＮＴ中和（Ｆａｂ’）２分子の調製
ＢｏＮＴ−中和抗体（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１−Ａ２−中和ｓｃＦｖ）またはより高い親和性を有する改変体は、サイズおよび価についての改変体を作製するのに適したテンプレートである。例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１−Ａ２−中和（ｓｃＦｖ’）２は、上に記載されるような親ｓｃＦｖ（例えば、ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２など）から作製され得る。ｓｃＦｖ遺伝子は、適切な制限酵素を使用して切除され得、そして本明細書中に記載されるような別のベクター中にクローニングされ得る。
【００９６】
１つの実施形態において、発現したｓｃＦｖは、そのＣ末端にｍｙｃタグを有し、その後ろに２個のグリシン、システイン、次いでＩＭＡＣによる精製を容易にする６個のヒスチジンを有する。２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成後、２つのｓｃＦｖは、互いから２６アミノ酸（２つの１１アミノ酸のｍｙｃタグおよび４個のグリシン）によって隔てられるはずである。
【００９７】
（ｓｃＦｖ’）２ダイマーを産生するために、そのシステインは、１ｍＭ  β−メルカプトエタノールと一緒にインキュベートすることによって還元され、そしてそのｓｃＦｖの半分は、ＤＴＮＢの添加によってブロックされる。ブロックされたｓｃＦｖおよびブロックされていないｓｃＦｖは、一緒にインキュベートされて（ｓｃＦｖ’）２を形成し、その（ｓｃＦｖ’）２は、精製される。より高い親和性のｓｃＦｖが単離される場合、それらの遺伝子は、同様に、（ｓｃＦｖ’）２を構築するために使用される。
【００９８】
ＢｏＮＴ／Ａ−中和Ｆａｂは、Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１−１０４３によって記載されるベクターと同様の発現ベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される。ＢｏＮＴ／Ａ−中和Ｆａｂを作製するために、そのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、ＰＣＲを使用してｓｃＦｖから増幅される。そのＶＨ遺伝子は、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインをＶＨ遺伝子の下流かつＶＨ遺伝子とインフレームで提供する発現ベクター（例えば、細菌発現ベクターに基づくＰＵＣ１１９）中にクローニングされる。そのベクターはまた、ｌａｃプロモーター、発現したＶＨ−ＣＨ１ドメインをペリプラズムに指向させるｐｅｌｂリーダー配列、発現した軽鎖をペリプラズムに指向させる遺伝子３リーダー配列、および軽鎖遺伝子のためのクローニング部位を含む。正しいＶＨ遺伝子を含むクローンは、例えば、ＰＣＲフィンガープリントによって同定される。上記ＶＬ遺伝子は、ＰＣＲを使用してＣＬ遺伝子に対してスプライシングされ、そしてＶＨ  ＣＨ１遺伝子を含むベクター中にクローニングされる。
【００９９】
（Ｂ．中和抗体の選択）
好ましい実施形態において、ＢｏＮＴ−中和抗体の選択（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、免疫法、ハイブリドーマ技術などによって産生されたかにかかわらず）は、得られた抗体を、適切な抗原に対する特異的結合についてスクリーニングすることを包含する。簡単な場合において、適切な抗原としては、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３  ＨＣ、ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端ドメイン（結合ドメイン）、ＢｏＮＴ／Ａ３ホロ毒素、または組換えＢｏＮＴドメイン（例えば、ＨＣ（結合ドメイン）、ＨＮ（輸送ドメイン）、またはＬＣ（軽鎖））が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、上記中和抗体は、１種以上の本明細書中に記載される抗体によって認識されるエピトープの特異的結合に関して選択される。
【０１００】
選択は、当業者に周知の多くの方法のうちのいずれかによるものであり得る。好ましい実施形態において、選択は、所望の標的（例えば、ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ）に対する（例えば、イムノチューブ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を使用した）免疫クロマトグラフィーによるものである。別の実施形態において、選択は、表面プラズモン共鳴システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）単独、または１種以上の本明細書中に記載される抗体によって特異的に結合されるエピトープに結合する抗体との組み合わせのいずれかにおける、ＢｏＮＴ  ＨＣに対するものである。選択はまた、酵母ディスプレイライブラリーに対してフローサイトメトリーを使用して行われ得る。１つの好ましい実施形態において、酵母ディスプレイライブラリーは、ＢｏＮＴ／Ａの両方のサブタイプに高親和性で結合する抗体を得るために、最初にＢｏＮＴ／Ａ１、次いでＢｏＮＴ／Ａ２に対して連続的に選択される。このことは、他のサブタイプについて繰り返され得る。
【０１０１】
ファージディスプレイに関して、結合の分析は、抗体フラグメント遺伝子と抗体フラグメント遺伝子ＩＩＩとの間にアンバーコドンを含めることによって単純化され得る。これは、単に宿主細菌株を変化させることによって、提示された抗体フラグメントと可溶性抗体フラグメントとの間で容易に切り換えることを可能にする。ファージがＥ．ｃｏｌｉのｓｕｐＥサプレッサ株中で増殖される場合、抗体遺伝子と抗体遺伝子ＩＩＩとの間のアンバー終止コドンは、グルタミンとして読み取られ、そして抗体フラグメントは、ファージの表面上に提示される。溶出したファージが非サプレッサ株に感染させるために使用される場合、上記アンバーコドンは、終止コドンとして読み取られ、そして可溶性抗体は、その細菌からペリプラズムおよび培養培地中に分泌される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７）。抗原に対する可溶性ｓｃＦｖの結合は、ＥＬＩＳＡ（例えば、そのｓｃＦｖにおけるＣ末端のｍｙｃペプチドタグを認識するマウスＩｇＧモノクローナル抗体（例えば、９Ｅｌ０）を使用し、例えば、次いで検出可能な標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）と結合体化したポリクローナル抗マウスＦｃと一緒にインキュベートする）によって、検出され得る（Ｅｖａｎら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：３６１０−３６１６；Ｍｕｎｒｏら、（１９８６）Ｃｅｌｌ、４６：２９１−３００）。
【０１０２】
上に示されるように、ＢｏＮＴ−中和抗体の精製は、ｓｃＦｖ遺伝子を、そのｓｃＦｖのＣ末端の端におけるｍｙｃペプチドタグ（その後にヘキサヒスチジンタグを伴う）の付加を生じる発現ベクター（例えば、発現ベクターｐＵＣ１１９ｍｙｃＨＩＳ）中にクローニングすることによって容易にされ得る。上記ベクターはまた、好ましくは、上記ｓｃＦｖの発現を細菌のペリプラズム（リーダー配列が、切断される）に指向させるペクチン酸リアーゼリーダー配列をコードする。これは、ネイティブの適切に折り畳まれたｓｃＦｖを細菌のペリプラズムから直接回収することを可能にする。次いで上記ＢｏＮＴ−中和抗体は、発現され、そして固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用して細菌の上清から精製される。
【０１０３】
（Ｃ．１種以上のＢｏＮＴサブタイプに対するＢｏＮＴ中和抗体の親和性の増大）
上で説明される通り、増大したアビディティについての選択は、目的とする１種以上の標的（例えば、ＢｏＮＴ／Ａサブタイプまたはそのドメイン（例えば、Ｈｃまたは他のエピトープ）に対するＢｏＮＴ−中和抗体（または改変されたＢｏＮＴ−中和抗体）の親和性を測定することを包含する。このような測定を行なう方法は、本明細書中に提供される実施例において詳細に記載される。簡潔には、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体のＫｄおよびＢｏＮＴ／Ａに対する結合の動態は、ＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサー）において決定される。この技術に関して、抗原は、質量における変化を検出し得る誘導体化されたセンサーチップにカップリングされる。抗体が上記センサーチップ上に通される場合、抗体は、定量可能である質量の増加を生じる抗原に結合する。抗体濃度の関数としての会合速度の測定が、会合速度定数（ｋｏｎ）を計算する為に使用され得る。会合相の後、緩衝液が、上記チップ上に通され、そして抗体の解離の速度（ｋｏｆｆ）が決定される。Ｋｏｎは、代表的に、１．０×１０２〜５．０×１０６の範囲で測定され、そしてｋｏｆｆは、１．０×１０−１〜１．０×１０−６の範囲で測定される。次いで平衡定数Ｋｄが、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出され、したがって平衡定数Ｋｄは、代表的に、１０−５〜１０−１２の範囲で測定される。この様式で測定された親和性は、蛍光消光滴定によって溶液において測定された親和性と良好に相関する。
【０１０４】
ファージディスプレイおよび選択は、一般に、より高い親和性の変異ｓｃＦｖの選択をもたらす（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３；Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：８８４８−８８５５；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８）が、それらは恐らく、親和性において６倍未満の差を有する変異体の分離をもたらさない（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：８８４８−８８５５）。したがって、迅速な方法、選択後に単離された変異ｓｃＦｖの相対的親和性を推定するために必要とされる。増大した親和性は、主にｋｏｆｆの減少から生じるので、ｋｏｆｆの測定は、より高い親和性のｓｃＦｖを同定するはずである。ｋｏｆｆは、細菌のペリプラズム中の精製されていないｓｃＦｖに対するＢＩＡｃｏｒｅにおいて測定され得る。なぜなら発現レベルは、適当な結合シグナルを与えるのに十分高く、そしてｋｏｆｆは、濃度とは無関係であるからである。ペリプラズムのｓｃＦｖと精製されたｓｃＦｖとについてのｋｏｆｆの値は、代表的に、ほぼ一致する。
【０１０５】
（Ｖ．ヒト抗体またはヒト化（キメラ）抗体の産生）
上に示されるように、本発明のＢｏＮＴ−中和抗体は、治療目的（例えば、ボツリヌス中毒の処置）のために、生物体（例えば、ヒト患者）に投与され得る。それらが惹起された種以外の生物体に投与された抗体は、免疫原性であり得る。したがって、例えば、ヒトに繰り返し投与されたマウス抗体は、しばしばその抗体に対する免疫学的応答（例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答）を誘導する。これは、代表的に、それらの抗体が繰り返し利用されないので、本発明の非ヒト抗体に関して問題ではないが、その抗体の免疫原特性は、その抗体の一部または全部を、特徴的に、ヒト配列へと変え、それによってそれぞれキメラ抗体またはヒト抗体を産生することによって減少される。
【０１０６】
（Ａ．キメラ抗体）
キメラ抗体は、ヒト部分と非ヒト部分とを含む免疫グロブリン分子である。より具体的に、キメラ抗体の抗原結合領域（または可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）に由来し、そして（生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに与える）そのキメラ抗体の定常領域は、ヒト供給源に由来する。上記キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって与えられるエフェクター機能とを有するべきである。抗体をもたらす多数の方法は、当業者に周知である（例えば、米港特許第５，５０２，１６７号、同第５，５００，３６２号、同第５，４９１，０８８号、同第５，４８２，８５６号、同第５，４７２，６９３号、同第５，３５４，８４７号、同第５，２９２，８６７号、同第５，２３１，０２６号、同第５，２０４，２４４号、同第５，２０２，２３８号、同第５，１６９，９３９号、同第５，０８１，２３５号、同第５，０７５，４３１号、および同第４，９７５，３６９号を参照のこと）。
【０１０７】
一般に、キメラ抗体を産生するために使用される手順は、以下の工程（いくつかの工程の順序は、交換され得る）からなる：（ａ）抗体分子の抗原結合部分をコードする正しい遺伝子セグメントを同定およびクローニングする工程；この遺伝子セグメント（ＶＤＪとして公知の、重鎖についての可変性であり、多様性であり、そして連結性の領域、またはＶＪ、軽鎖についての可変性であり、結合性である領域（あるいは単純にＶ領域または可変領域））は、ｃＤＮＡ形態またはゲノム形態のいずれかであり得る；（ｂ）定常領域またはその所望の部分をコードする遺伝子セグメントをクローニングする工程；（ｃ）完全なキメラ抗体が転写可能な形態および翻訳可能な形態でコードされるように、可変領域をその定常領域にライゲーションする工程；（ｄ）この構築物を、選択マーカーおよび遺伝子制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびポリ（Ａ）付加シグナル）を含むベクター中にライゲーションする工程；（ｅ）宿主細胞（例えば、細菌）中でこの構築物を増幅する工程；（ｆ）そのＤＮＡを真核生物細胞（ほとんどの場合、哺乳動物のリンパ球）中に導入する工程（トランスフェクション）；ならびにキメラ抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程。
【０１０８】
いくつかの異なる抗原結合特異性の抗体は、キメラタンパク質を産生するためにこれらのプロトコルによって操作された（例えば、抗ＴＮＰ：Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６４３；および抗腫瘍抗原：Ｓａｈａｇａｎら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７：１０６６）。同様に、数種の異なるエフェクター機能は、新しい配列をその抗原結合領域をコードする配列に結合することによって達成された。これらのうちのいくつかは、酵素（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４）、別の種由来の免疫グロブリン定常領域、および別の免疫グロブリン鎖の定常領域（Ｓｈａｒｏｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：３６４；Ｔａｎら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：３５６５−３５６７）を含む。
【０１０９】
１つの好ましい実施形態において、組換えＤＮＡベクターは、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用される。新規の組換えＤＮＡベクターは、上記細胞株において免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子の全部または一部を置換するために「置換遺伝子」（例えば、置換遺伝子は、ヒト免疫グロブリンの定常領域、特定の免疫グロブリンのクラス、または酵素、毒素、生物学的に活性なペプチド、増殖因子、インヒビター、または薬物、毒素、もしくは他の分子などへの結合体化を容易にするリンカーペプチドの全部あるいは一部をコードし得る）、および抗体産生細胞内での免疫グロブリン配列に関する標的化された相同組換えを可能にする「標的配列」を含む。
【０１１０】
別の実施形態において、組換えＤＮＡベクターは、所望のエフェクター機能（例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域）を有する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用され、この場合において、その組換えベクター中に含まれる置換遺伝子は、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体の領域の全部または一部をコードし得、そして組換えベクター中に含まれる標的配列は、抗体産生細胞内での相同組換えおよび標的化された遺伝子改変を可能にする。いずれかの実施形態において、可変領域または定常領域の一部のみが置換される場合、得られたキメラ抗体は、同じ抗原を規定し得、そして／あるいは変更または改良されたにもかかわらず同じエフェクター機能を有し、その結果、そのキメラ抗体は、より大きい抗原特異性、より大きい親和性結合定数、増大したエフェクター機能、またはトランスフェクトされた抗体産生細胞株による増大した分泌および産生などを示し得る。
【０１１１】
実施される実施形態に関係なく、（選択マーカーによる）組み込まれたＤＮＡについての選択の工程、キメラ抗体産生についてのスクリーニングの工程、および細胞クローニングの工程は、そのキメラ抗体を産生する細胞のクローンを得るために使用され得る。
【０１１２】
したがって、モノクローナル抗体に対する改変をコードするＤＮＡの一部は、Ｂ細胞株またはハイブリドーマ細胞株内で、発現される免疫グロブリン遺伝子の部位を直接的に標的化し得る。任意の特定の改変についてのＤＮＡ構築物は、任意のモノクローナル細胞株またはハイブリドーマのタンパク質産物を変化させるために使用され得る。このような手順は、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子の両方を、有用な抗原特異性を発現する各Ｂ細胞クローンからクローニングするという、コストと時間の掛かる作業を回避する。可変領域遺伝子をクローニングする工程を回避することに加えて、キメラ抗体の発現のレベルは、その遺伝子が、ランダムな位置にある場合よりもむしろ、その天然の染色体の場所にある場合に、より高いはずである。キメラ（ヒト化）抗体の調製のための詳細な方法は、米国特許第５，４８２，８５６号に見出され得る。
【０１１３】
（Ｂ．ヒト抗体およびヒト化抗体）
別の実施形態において、本発明は、ヒト化抗ＢｏＮＴ−中和抗体または完全ヒト抗ＢｏＮＴ−中和抗体（例えば、ＨｕＣ２５、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２など）を提供する。ヒト抗体は、全体的に、特徴としてヒトポリペプチド配列からなる。本発明のヒトＢｏＮＴ−中和抗体は、広範な種々の方法を使用して産生され得る（概説については、例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、米国特許第５，００１，０６５号を参照のこと）。
【０１１４】
特定の好ましい実施形態において、本発明の完全ヒトｓｃＦｖ抗体は、完全ヒト単鎖（例えば、ｓｃＦｖ）ライブラリーの改変およびスクリーニングによって得られる。したがって、特定の実施形態において、完全ヒト抗体は、本明細書中に記載されるようなファージディスプレイ法および／または酵母ディスプレイ法を使用して産生される。完全ヒト遺伝子ライブラリーを産生する方法は、当業者に周知である（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４、Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明のヒトＢｏＮＴ−中和抗体は、トリオーマ細胞において産生され得る。次いで上記抗体をコードする遺伝子は、クローニングされ、そして他の細胞（特に、非ヒト哺乳動物細胞）において発現される。
【０１１６】
トリオーマ技術によってヒト抗体を産生するための一般的アプローチは、Ｏｓｔｂｅｒｇら、（１９８３）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７；Ｏｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｅｌｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号によって記載されている。この方法によって得られた抗体産生細胞株は、トリオーマと称される。なぜならそれらは、３種の細胞；２種のヒト細胞および１種のマウス細胞に由来するからである。トリオーマは、ヒト細胞から作製された通常のハイブリドーマよりも安定に抗体を産生することが見出されている。
【０１１７】
トリオーマ細胞の調製は、最初に、マウス骨髄腫細胞株と免疫化されていないヒト末梢Ｂリンパ球との融合を必要とする。この融合は、ヒト染色体およびマウス染色体の両方を含む外因性ハイブリドーマ細胞をもたらす（Ｅｎｇｅｌｍａｎ、前出を参照のこと）。抗体を分泌する能力を失った外因性細胞が、選択される。好ましくは、８−アザグアニンに耐性である外因性細胞が、選択される。このような細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地またはアザセリン−ヒポキサンチン（ＡＨ）培地において増殖できない。
【０１１８】
抗体を分泌する能力は、上記外因性細胞と、ＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ、ＢｏＮＴ／Ａ下位配列（本明細書中に記載される抗体によって特異的に結合されるエピトープを含む下位配列などが挙げられるが、これらに限定されない））に対して免疫化されたＢリンパ球との間のさらなる融合によって与えられる。上記Ｂリンパ球は、ヒトドナーの脾臓、血液またはリンパ節から得られる。特定の抗原またはエピトープに対する抗体が所望される場合、免疫原として、ポリペプチド全体よりもむしろ抗原またはそのエピトープを使用することが、好ましい。あるいは、Ｂリンパ球は、免疫化されていない個体から得られ、そしてそのＢリンパ球は、インビトロでＢｏＮＴポリペプチド、またはそのエピトープによって刺激される。さらなるバリエーションにおいて、Ｂリンパ球は、感染した個体、またはそうでなければ免疫化された個体から得られ、次いでＢリンパ球は、約７日間〜１４日間にわたるＢｏＮＴポリペプチドに対する曝露によってインビトロで超免疫化される。
【０１１９】
上記手順のうちの１つによって調製された免疫化されたＢリンパ球は、周知の方法によって外因性ハイブリッド細胞と融合される。例えば、その細胞は、４０〜５０％のＭＷ１０００〜４０００のポリエチレングリコールによって約３７℃にて約５〜１０分間処理される。細胞は、上記融合混合物から分離され、そして所望のハイブリッドに対して選択的な培地中で増殖される。上記外因性ハイブリッド細胞が８−アザグアニンに対して耐性である場合、不死化トリオーマ細胞は、ＨＡＴ培地またはＡＨ培地における継代によって簡便に選択される。他の選択手順は、当然に、融合に使用された細胞の性質に依存して可能である。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンは、ＢｏＮＴポリペプチドまたはそのエピトープに結合する能力について、トリオーマ培養培地をアッセイすることによって同定される。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマは、限界希釈技術によってサブクローニングされ、そしてそのトリオーマは、培養培地中でインビトロで増殖されるか、または選択された宿主動物中に注射され、そしてインビボで増殖される。
【０１２０】
次いで得られたトリオーマ細胞株は、ＢｏＮＴポリペプチドまたはそのエピトープを結合する能力について試験される。抗体は、得られた培養培地または体液から、従来の抗体分別手順（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー）によって分離される。
【０１２１】
トリオーマは、遺伝的に安定であるが、それらは、非常に高いレベルで抗体を産生しない。発現レベルは、そのトリオーマ由来の抗体遺伝子を１つ以上の発現ベクター中にクローニングし、そしてそのベクターを、細胞株（例えは、組換え免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンの発現に代表的に使用される細胞株）に形質転換することによって増大し得る。抗体の収量の増加とともに、このストラテジーは、免疫グロブリンが、ヒトの成分を有ず、それによってヒト細胞株のために必要とされる特に大規模なウイルススクリーニングに供される必要がない細胞株から得られるというさらなる利点を提供する。
【０１２２】
トリオーマ細胞株によって分泌される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、当該分野で公知であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない方法によってクローニングされる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７；Ｃｏら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１１４９を参照のこと）。例えば、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、トリオーマのゲノムＤＮＡまたは上記トリオーマのＲＮＡの逆転写によって産生されたｃＤＮＡからクローニングされる。クローニングは、クローニングされるべき遺伝子もしくは遺伝子のセグメントと隣接（ｆｌａｎｋ）するかまたは重複する配列とハイブリダイズする、ＰＣＲプライマーの使用を含む従来の技術によって達成される。
【０１２３】
代表的に、組換え構築物は、トリオーマ細胞株によって発現される免疫グロブリンの完全なヒト免疫グロブリン重鎖および／または完全なヒト免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを含む。あるいは、一次抗体遺伝子の一部のみをコードするＤＮＡセグメントが、産生され、その部分は、結合活性および／またはエフェクター活性を有する。他の組換え構築物は、他の免疫グロブリン遺伝子のセグメント（特に、他のヒト定常領域配列（重鎖および／または軽鎖）のセグメント）に融合されたトリオーマ細胞株免疫グロブリン遺伝子のセグメントを含む。ヒト定常領域配列は、種々の参照供給源から選択され得、その供給源としては、Ｋａｂａｔら、（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓに列挙される供給源が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
ＢｏＮＴ／Ａ−中和免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡセグメントに加えて、他の実質的に同種の改変された免疫グロブリンは、当業者に公知の種々の組換えＤＮＡ技術（例えば、位置指定突然変異誘発）を利用して容易に設計および製造され得る（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ、（１９７９）Ｇｅｎｅ、８：８１−９７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４）。このような改変されたセグメントは、通常、抗原結合能および／またはエフェクター機能を保持する。さらに、上記改変されたセグメントは、通常、ストリンジェントな条件下でこれらの配列に対するハイブリダイゼーションを妨げるために、本来のトリオーマゲノム配列からそれほど違わずに変えられる。なぜならば、多くの遺伝子のように、免疫グロブリン遺伝子は、分離した機能的領域（各々が、１つ以上の異なる生物学的活性を有する）を含み、その遺伝子は、新規の特性または特性の新規の組み合わせを有する融合タンパク質（例えば、免疫毒素）を産生するために、他の遺伝子由来の機能的領域に融合され得る。
【０１２５】
上記ゲノム配列は、本明細書中に記載されるような標準的な方法によってクローニングおよび発現され得る。
【０１２６】
抗体産生のための他のアプローチは、ヒト血液のインビトロでの免疫化を含む。このアプローチにおいて、ヒト抗体を産生し得るヒト血液リンパ球が、産生される。ヒト末梢血液が、患者から収集され、そしてそのヒト末梢血液は、単核細胞を回収するために処理される。次いでサプレッサＴ細胞が、除去され、そして残りの細胞は、組織培養培地に懸濁され、その組織培養培地は、抗原および自己血清、ならびに好ましくは、非特異的なリンパ球活性化因子を添加される。次いで細胞は、それらが所望の特異的抗体を産生するような時間の期間にわたってインキュベートされる。次いで細胞は、その細胞株を不死化し、それによって抗体の継続的な産生を可能にするためにヒト骨髄腫細胞に融合され得る（米国特許第４，７１６，１１１号を参照のこと）。
【０１２７】
別のアプローチにおいて、ヒトＢｏＮＴ−中和抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマが、調製される（例えば、米国特許第５，５０６，１３２号を参照のこと）。他のアプローチとしては、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように形質転換されたマウスの免疫化、およびファージディスプレイのスクリーニングが挙げられる（Ｖａｕｇｈａｎら、前出）。
【０１２８】
（ＶＩ．中和エピト−プにおける交差反応性についてのアッセイ）
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載される抗体（例えば、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、１Ｆ３、ＣＲ１、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２など）によって認識される１種以上のエピトープに特異的に結合する。換言すれば、特に好ましい抗体は、これらの抗体のうちの１種以上と交差反応性である。交差反応性についてアッセイする手段は、当業者に周知である（例えば、Ｄｏｗｂｅｎｋｏら、（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４７０３−４７１１を参照のこと）。
【０１２９】
これは、固体支持体に結合した１種以上の単離された標的ＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１および／またはＢｏＮＴ／Ａ２、またはその毒素の組換えドメイン（例えば、Ｈｃ））を提供し、そして標的ＢｏＮＴペプチドに対する結合について、試験抗体の、例えば、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、１Ｆ３、ＣＲ１、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、および／またはＩＮＧ２などと競合する能力をアッセイすることによって確認され得る。したがって、競合結合形式のイムノアッセイは、好ましくは、交差反応性の決定のために使用される。例えば、１つの実施形態において、ＢｏＮＴ／Ａ１および／またはＢｏＮＴ／Ａ２  ＨＣポリペプチドは、固体支持体に固定化される。上記アッセイに加えられる試験されるべき抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリーからの選択によってもたらされる）は、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、１Ｆ３、ＣＲ１、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２などの、固定化されたＢｏＮＴポリペプチドに結合する抗体と競合する。上記固定化されたタンパク質に対するＳ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、１Ｆ３、ＣＲ１、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、および／またはＩＮＧ２などの抗体の結合と競合する試験抗体の能力が、比較される。次いで上記タンパク質の交差反応性の％が、標準的な計算法を使用して算出される。
【０１３０】
試験抗体が、Ｓ２５、Ｃ２５、Ｃ３９、１Ｃ６、１Ｆ３、ＣＲ１、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、および／またはＩＮＧ２などの抗体のうちの１種以上と競合し、そして約１×１０−８Ｍに匹敵するかまたはそれ以上の、同じ標的との結合親和性を有する場合、その試験抗体は、ＢｏＮＴ−中和抗体であると予想される。
【０１３１】
特に好ましい実施形態において、交差反応性は、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて表面プラズモン共鳴を使用して行なわれる。ＢｌＡｃｏｒｅフローセルにおいて、上記ＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１および／またはＢｏＮＴ／Ａ２  Ｈｃ）は、実施例に記載されるようなセンサーチップ（例えば、ＣＭ５）にカップリングされる。５μｌ／分の流速を用いて、１００ｎＭ〜１μＭの抗体の滴定が、ほぼ飽和した表面を生じる抗体濃度を決定するために、約５分間にわたってフローセル表面上に注入される。次いでエピトープマッピングまたは交差反応性が、完全に近い飽和および少なくとも１００ＲＵの結合された抗体を生じる濃度にて、抗体の対を使用して評価される。結合された抗体の量は、対の各メンバーについて決定され、次いでその２種の抗体は、個々の抗体の測定のために使用された濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合される。異なるエピトープを認識する抗体は、一緒に注入された場合に、ＲＵ結合において本質的に相加的な増加を示す一方で、同一のエピトープを認識する抗体は、ＲＵの最小限の増加のみを示す（実施例を参照のこと）。特に好ましい実施形態において、抗体は、一緒に「注入された」ときに、それらが本質的に相加的な増加（好ましくは、少なくとも約１．４の因数による増加、より好ましくは、少なくとも約１．６の因数による増加、および最も好ましくは、少なくとも約１．８または２の因数による増加）を示す場合、交差反応性であるといわれる。
【０１３２】
所望のエピトープにおける交差反応性は、多くの他の標準的な技術によって確認され得る（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０２、２５９−２７４を参照のこと）。この技術は、多数の重複するＢｏＮＴペプチドの合成を包含する。次いでその合成されたペプチドは、原型の抗体（例えば、ＣＲ１、ＲＡＺ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２など）のうちの１種以上に対してスクリーニングされ、そしてこれらの抗体によって特異的に結合される特徴的なエピトープは、結合特異性および結合親和性によって同定され得る。そのようにして同定されたエピトープは、交差反応する抗体を同定するために、本明細書中に記載されるような競合アッセイに都合よく使用され得る。
【０１３３】
エピトープマッピングのためのペプチドは、「マルチピン（Ｍｕｌｔｉｐｉｎ）」ペプチド合成技術を使用して好都合に調製され得る（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：１１８４−１１９０）。１種以上のＢｏＮＴサブタイプの公知の配列（例えば、Ａｔａｓｓｉら、（１９９６）Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．、７：６９１−７００およびその中に引用される参考文献を参照のこと）を使用して、重複するＢｏＮＴポリペプチド配列は、１つ以上の９６ウェル微量試験プレートのアレイ中のプラスチックピン上に、連続的な様式で個別に合成され得る。
【０１３４】
このマルチピンペプチドシステムを使用したエピトープマッピングのための手段は、米国特許第５，７３９，３０６号に記載される。簡潔には、上記ピンは、最初に、ＰＢＳ中に２％のウシ血清アルブミンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むプレコーティング緩衝液を用いて、室温にて１時間処理される。次いで上記ピンは、プレコーティング緩衝液中の抗体（例えば、２μｇ／ｍｌ）を含む９６ウェル微量試験プレートの個々のウェルに挿入される。インキュベーションは、好ましくは、室温にて約１時間である。上記ピンは、ＰＢＳＴ中で洗浄（例えば、１０分間ごとに３回のリンス）され、次いで１：４，０００希釈にて１００μｌのＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む９６ウェル微量試験プレートのウェル中で、室温にて１時間インキュベートされる。上記のようにピンが洗浄された後、そのピンは、呈色反応のために、ジアンモニウム２，２’−アジノ−ビス［３−エチルベンズチアゾリン−ｂ−スルホネート］（ＡＢＴＳ）とＨ２Ｏ２とのペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）を含むウェル中に室温にて３０分間置かれる。そのプレートは、４９２ｎｍのバックグラウンド吸収波長に対して、４０５ｎｍにてプレートリーダー（例えば、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬＩＳＡプレートリーダー）によって読み取られる。発色を示すウェルは、Ｓ２５抗体、Ｃ２５抗体、Ｃ３９抗体、１Ｃ６抗体、または１Ｆ３抗体を含むこのようなウェルにおけるＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣペプチドの反応性を示した。
【０１３５】
（ＶＩＩ．抗ＢｏＮＴ抗体の中和活性についてのアッセイ）
本発明の好ましい抗体は、ボツリヌス神経毒素Ａ型の毒性を中和（減少または排除）するために、個別かまたは組み合わせで作用する。中和は、インビボまたはインビトロで評価され得る。インビボ中和測定は、単純に、ＢｏＮＴ神経毒素の投与に起因する死亡率（例えば、ＬＤ５０または他の標準的な測定基準）における、中和活性について試験される１種以上の抗体の存在に起因する変化を測定することを包含する。上記神経毒素は、試験生物体（例えば、マウス）に直接投与され得るか、またはその生物体は、ボツリヌス中毒感染を有し得る（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍに感染する）。上記抗体は、ＢｏＮＴ神経毒素の感染もしくは試験動物の感染の前、その間、またはその後に投与され得る。進行の速度、または死亡率の減少は、上記抗体が中和活性を有すること示す。
【０１３６】
中和活性についての１つの適切なインビトロアッセイは、片側横隔膜調製物を用いる（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｎ、３３：５５１−５５７）。簡潔には、左右の横隔神経の片側横隔膜調製物は、生理的溶液中に懸濁され、そして一定温度（例えば、３６℃）に維持される。横隔神経は、（例えば、０．２ｍｓ持続時間の四角波で０．０５Ｈｚにて）超最大に刺激される。等尺性単収縮張力が、チャートレコーダーに接続された力変位変換器（例えば、ＧｒａｓｓＭｏｄｅｌ  ＦＴ０３）によって測定される。
【０１３７】
精製された抗体は、精製されたＢｏＮＴ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ｂなど）と一緒に室温にて３０分間インキュベートされ、次いで組織のバス（ｔｉｓｓｕｅ  ｂａｔｈ）に添加され、約２．０×１０−８Ｍの抗体最終濃度および約２．０×１０−１１ＭのＢｏＮＴ最終濃度を生じる。研究された各抗体について、５０％の単収縮張力減少までの時間が、決定される（例えば、ＢｏＮＴ単独に対して３回および抗体＋ＢｏＮＴに対して３回）。所定（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）の％（例えば、５０％）単収縮の減少までの時間の間の差が、標準的なレベルの有意性（例えば、０．０５未満のＰ値が、有意と見なされる）における標準的な統計分析（例えば、両側ｔ検定）によって決定される。
【０１３８】
（ＶＩＩＩ．診断アッセイ）
上で説明されるように、本発明の抗ＢｏＮＴ抗体は、ＢｏＮＴ毒素（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素）のインビボ検出またはインビトロ検出に使用され得、したがって、本発明の抗ＢｏＮＴ抗体は、ボツリヌス中毒の診断（例えば、確認診断）において有用である。生物体から得られた生物学的サンプル中のＢｏＮＴの検出および／または定量は、その生物体のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ感染を示す。
【０１３９】
ＢｏＮＴ抗原は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、細胞）、または患者から得られた組織サンプルにおいて定量され得る。本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルは、ＢｏＮＴ濃度を含む生物学的組織または生物学的流体のサンプルであり、そのＢｏＮＴ濃度は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ感染と相関し得、そしてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ感染を示し得る。好ましい生物学的サンプルとしては、血液、尿、唾液、および組織生検が挙げられる。
【０１４０】
上記サンプルは、代表的に、ヒト患者から採取されるが、上記アッセイは、一般には哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシおよびブタ）、ならびに最も具体的には霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク、およびヒヒ）およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）に由来する細胞中のＢｏＮＴ抗原を検出するために使用され得る。
【０１４１】
組織サンプルまたは流体サンプルは、当業者に周知の標準的な方法（最も代表的には、生検または静脈穿刺）によって患者から単離される。上記サンプルは、必要に応じて、適切な緩衝溶液中に希釈することによって前処理（必要な場合）されるか、または濃縮される（所望される場合）。種々の緩衝剤（例えば、リン酸塩、Ｔｒｉｓなど）のうちの１つを生理的ｐＨにおいて用いる任意の多くの標準的な緩衝水溶液が、使用され得る。
【０１４２】
（Ａ．免疫学的結合アッセイ）
ＢｏＮＴポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２など）は、本発明の抗ＢｏＮＡ抗体のうちの１種以上をそのＢｏＮＴポリペプチドに特異的に結合する捕捉因子として利用するイムノアッセイにおいて検出され得る。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、イムノアッセイは、分析物（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）を特異的に結合する抗体（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体）を利用するアッセイである。上記イムノアッセイは、他の物理的特性または化学的特性とは対照的に標的（例えば、１種以上のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ）に対する１種以上の抗ＢｏＮＴ抗体の結合によって特徴付けられて、そのＢｏＮＴ分析物を単離し、標的とし、そして定量する。
【０１４４】
ＢｏＮＴマーカーは、多くの十分に認識される任意の免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号などを参照のこと）を使用して、検出および定量され得る。一般的なイムノアッセイの概説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３７巻：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｓａｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７版、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、（１９９１）も参照のこと。  
【０１４５】
本発明のイムノアッセイは、任意の多くの構成において行われ得る（例えば、Ｍａｇｇｉｏ（編）（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｔｉｊａｎ（１９８５）「Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出；Ｃｈａｎ（編）、（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｒｌａｎｄｏ、ＦＬ；ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ（編）、（１９９１）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ならびにＮｇｏ（編）、（１９８８）Ｎｏｎ  ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹに概説されるものを参照のこと）。
【０１４６】
イムノアッセイは、しばしば、捕捉因子と分析物とによって形成された結合性複合体（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体／ＢｏＮＴ／Ａ複合体）に特異的に結合し、そしてそれを標識する標識因子を利用する。上記標識因子は、それ自体、抗体／分析物複合体を含む部分の１つであり得る。したがって、例えば、上記標識因子は、標識されたＢｏＮＴ／Ａ  ポリペプチドまたは標識された抗ＢｏＮＴ／Ａ抗体であり得る。あるいは、上記標識因子は、必要に応じて、ＢｏＮＴ抗体、ＢｏＮＴペプチド、抗体／ポリペプチド複合体、またはＢｏＮＴポリペプチドもしくは抗ＢｏＮＴ抗体に共有結合される改変された捕捉基（例えば、ビオチン）に特異的に結合する第３の部分（例えば、別の抗体）である。
【０１４７】
１つの実施形態において、上記標識因子は、抗ＢｏＮＴ抗体に特異的に結合する抗体である。このような因子は、当業者に周知であり、そしてこの因子は、最も代表的に、抗ＢｏＮＴ抗体が得られる特定の動物種の抗体を特異的に結合する標識された抗体（例えば、抗種抗体）を含む。したがって、例えば、上記捕捉因子がヒト由来のＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体である場合、上記標識因子は、マウス抗ヒトＩｇＧ（すなわち、ヒト抗体の定常領域に特異的な抗体）であり得る。
【０１４８】
免疫グロブリン定常領域を特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、連鎖球菌性プロテインＡまたは連鎖球菌性プロテインＧ）もまた、上記標識因子として使用される。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、多様な種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性の反応性を示す（一般に、Ｋｒｏｎｖａｌら、（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４０１−１４０６、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍら、（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５８９−２５４２などを参照のこと）。
【０１４９】
上記アッセイ全体を通して、インキュベーション工程および／または洗浄工程は、試薬の各組み合わせの後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間〜数時間（好ましくは約５分間〜約２４時間）で変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、上記アッセイは、周囲温度にて実施されるが、そのアッセイは、５℃〜４５℃のような温度の範囲にわたって行われ得る。
【０１５０】
１）非競合的アッセイ形式
ＢｏＮＴ神経毒素（例えば、ＢｏＮＴ血清型および／またはＢｏＮＴサブタイプ）を検出するためのイムノアッセイは、特定の実施形態において、競合的かまたは非競合的かのいずれかである。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物（この場合において、ＢｏＮＴポリペプチド）の量が直接測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、上記捕捉因子（例えば、抗ＢｏＮＴ抗体）は、その捕捉因子が固定化される固体基材に、直接的かまたは間接的に結合される。これらの固定化された抗ＢｏＮＴ抗体は、試験サンプル（例えば、血液サンプル）中に存在するＢｏＮＴポリペプチドを捕捉する。そのようにして固定化されたＢｏＮＴポリペプチドは、次いで、標識因子（例えば、標識を有するＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体）によって結合される。あるいは、二次抗体は、標識を欠き得るが、その二次抗体は、次に、第２の抗体が得られる種の抗体に特異的な標識された第３の抗体によって結合され得る。遊離の標識された抗体は、洗い流され、そして残りの、結合され、標識された抗体が、検出される（例えば、その標識が放射性である場合、γ線検出器を使用する）。
【０１５１】
２）競合的アッセイ形式
競合的アッセイにおいて、サンプル中に存在する分析物（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）の量は、そのサンプル中に存在する分析物によって捕捉因子（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体）から置換された（または追い出された（ｃｏｍｐｅｔｅｄ  ａｗａｙ））、添加された（外因性）分析物の量を測定することによって間接的に測定される。例えば、１つの競合的アッセイにおいて、既知の量のＢｏＮＴ／Ａが、定量されていない量のＢｏＮＴ／Ａを含む試験サンプルに添加され、そしてそのサンプルは、捕捉因子（例えば、ＢｏＮＴ／Ａを特異的に結合するＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体）と接触される。ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体に結合する添加されたＢｏＮＴ／Ａの量は、試験サンプル中に存在するＢｏＮＴ／Ａの濃度に反比例する。
【０１５２】
上記ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体は、固体基材上に固定化され得る。上記ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体に結合されたＢｏＮＴ／Ａの量は、ＢｏＮＴ／Ａ−ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体複合体に存在するＢｏＮＴ／Ａの量を測定すること、あるいは残りの複合体形成していないＢｏＮＴ／Ａの量を測定することのいずれかによって決定される。
【０１５３】
（Ｂ．非特異的結合の減少）
当業者は、イムノアッセイ中および分析物の精製の間に非特異的結合を減少させることがしばしば望ましいということを、認識する。上記アッセイが、例えば、ＢｏＮＴ／Ａポリペプチド、ＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体、または固体基材上に固定化された他の捕捉因子を含む場合、その基材の非特異的結合の量を最小限にすることが、望ましい。このような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。代表的に、これは、上記基材をタンパク質様組成物によってコーティングすることを包含する。特に、タンパク質組成物（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチン）が、広く使用される。
【０１５４】
（Ｃ．基材）
上述の通り、上記アッセイに依存して、ＢｏＮＴポリペプチド、抗ＢｏＮＴ抗体などを含む種々の成分は、必要に応じて、固体表面に結合される。種々の固体表面に生体分子を固定化するための多くの方法は、当該分野で公知である。例えば、上記固体表面は、膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレン、またはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）（例えば、ガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、微量遠心管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属ビーズもしくはポリマービーズであり得る。所望の成分は、非特異的結合によって、共有結合されても、非共有結合的に連結されてもよい。
【０１５５】
広範な種々の有機ポリマーおよび無機ポリマー（天然および合成の両方）は、上記固体表面のための材料として用いられ得る。例示のポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、ニトロセルロースなどが挙げられる。用いられ得る他の材料としては、紙、ガラス、セラミック、金属、半金属、半伝導性材料、セメントなどが挙げられる。さらに、ゲルを形成する物質（例えば、タンパク質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミド）が、使用され得る。いくつかの水相を形成するポリマー（例えば、デキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤（例えば、リン脂質、長鎖（１２〜２４個の炭素原子）のアルキルアンモニウム塩など））もまた、適切である。固体表面が有孔である場合、種々の孔径が、その系の性質に依存して用いられ得る。
【０１５６】
上記表面の調製において、複数の異なる材料が、例えば、種々の特性を得るために積層（ｌａｍｉｎａｔｅ）として用いられ得る。例えば、タンパク質コーティング（例えば、ゼラチン）は、非特異的結合を回避するため、共有結合による結合体化を容易にするため、シグナル検出を増強するためなどに使用され得る。
【０１５７】
化合物と上記表面との間に共有結合が望まれる場合、その表面は、通常、多官能性（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であるか、または多官能性にされ得る。上記表面上に存在しかつ連結のために使用され得る官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられ得る。広範な種々の化合物を種々の表面に連結する様式は、周知であり、そして文献において十分に例示される。例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｉｃｈｉｒｏ  Ｃｈｉｂａｔａ、Ｈａｌｓｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８、およびＣｕａｔｒｅｃａｓａｓ、（１９７０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５  ３０５９を参照のこと。
【０１５８】
共有結合に加えて、アッセイ成分を非共有結合するための種々の方法が、使用され得る。非共有結合は、代表的に、上記表面への化合物の非特異的吸着である。代表的に、上記表面は、標識されたアッセイ成分の非特異的結合を防止するために、第２の化合物によってブロックされる。あるいは、上記表面は、その表面が、１つの成分を非特異的に結合するが、別の成分を顕著に結合しないように設計される。例えば、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）を有する表面は、炭水化物含有化合物を結合するが、糖化を欠く標識されたタンパク質を結合しない。アッセイ成分の非共有結合に使用するための種々の固体表面は、米国特許第４，４４７，５７６号および同第４，２５４，０８２号に概説される。
【０１５９】
（Ｄ．他のアッセイ形式）
ＢｏＮＴポリペプチドまたは抗ＢｏＮＴ抗体（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ中和抗体）はまた、当業者に周知である任意の多くの他の手段によって検出および定量され得る。これらとしては、分析に関する生化学的方法（例えば、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーなど）、および種々の免疫学的方法（例えば、流体沈降反応またはゲル沈降反応、免疫拡散法（一次元または二次元）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなど）が挙げられる。
【０１６０】
ウェスタンブロット分析および関連する方法もまた、サンプル中のＢｏＮＴポリペプチドの存在を検出および定量するために使用され得る。上記技術は、一般に、ゲル電気泳動によって、分子量に基づいてサンプル産物を分離すること、分離した産物を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルター）に転写すること、およびいずれかのＢｏＮＴポリペプチドを特異的に結合する抗体と一緒にそのサンプルをインキュベートすることを包含する。その抗体は、固体支持体上の目的とする生物学的因子に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識されるか、あるいはこれらの抗体は、ＢｏＮＴポリペプチドを結合する抗体に特異的に結合する標識された抗体（例えば、マーカー遺伝子に対する抗体がヒト抗体である標識されたヒツジ抗ヒト抗体）を使用して、続いて検出される。
【０１６１】
他のアッセイ形式としては、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられ、リポソームイムノアッセイは、特定の分子（例えば、抗体）を結合し、かつ封入した試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。放出された化学物質は、次いで、標準的な技術によって検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、（１９８６）Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１を参照のこと）。
【０１６２】
（Ｅ．抗ＢｏＮＴ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ中和）抗体の標識化）
抗ＢｏＮＴ抗体は、当業者に公知である任意の多くの方法によって標識され得る。したがって、例えば、上記標識因子は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質もしくは複合体（例えば、本明細書中に記載されるもの）、またはポリマー（例えば、親和性マトリックス、炭水化物または脂質）であり得る。検出は、任意の公知の方法によって進行し、その方法としては、免疫ブロット法、ウェスタン分析、ゲル易動度シフトアッセイ、放射性マーカーまたは生物発光マーカーの追跡、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、ストップトフロー分光法、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、またはサイズおよび／また電荷の変化に基づいて分子を追跡する他の方法が挙げられる。上記アッセイにおいて使用される特定の標識または検出可能な群は、本発明の重要な局面ではない。上記検出可能な群は、検出可能な物理特性または化学特性を有するあらゆる材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、そして一般に、このような方法において有用な任意の標識は、本発明に適用され得る。したがって、標識は、分光器的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、ＬａｃＺ、ＣＡＴ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびマーカー遺伝子産物としてかまたはＥＬＩＳＡにおいてのいずれかで検出可能な酵素として一般に使用される他の酵素）、および比色定量標識（例えば、金コロイドまたは有色ガラスビーズまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。
【０１６３】
上記標識は、当該分野で周知の方法によって、直接的かまたは間接的に上記アッセイの所望の成分にカップリングされ得る。上に示されるように、広範な種々の標識が、使用され得、標識の選択は、必要とされる感度、化合物の結合体化の容易さ、安定性の必要条件、利用可能な器械使用、および廃棄の規定に依存する。
【０１６４】
非放射性ラベルは、しばしば、間接的手段によって連結される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いでそのリガンドは、固有に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合されるかのいずれかである抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドが、使用され得る。リガンドが天然の抗リガンド（例えば、ビオチン、チロキシン、およびコルチソル）を有する場合、そのリガンドは、標識された天然に存在する抗リガンドと関連して使用され得る。あるいは、任意のハプテン化合物または抗原化合物は、抗体と組み合わせて使用され得る。
【０１６５】
上記分子はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとの結合体化によってシグナルを発生する化合物に直接的に結合体化され得る。標識として目的の酵素は、主に、ヒドロラーゼ（特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）、またはオキシドレダクターゼ（特に、ペルオキシダーゼ）である。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）が挙げられる。使用され得る種々の標識化システムまたはシグナル生成システムの概説については、米国特許第４，３９１，９０４号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１６６】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、上記標識が放射性標識である場合、検出のための手段は、シンチレーション計数器または写真フィルム（オートラジオグラフィーなどの場合）を含む。上記標識が蛍光標識である場合、それは、光の適切な波長を用いてその蛍光色素を励起し、そして得られた蛍光を、例えば、顕微鏡、視診、写真フィルム、電子的検出器（例えば、電子結合素子（ＣＣＤ）または光電子倍増器など）の使用により検出することによって検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に対して適切な基質を提供し、そして得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色定量標識は、その標識に付随する色を観察することによって簡単に検出され得る。したがって、種々のディップスティックアッセイにおいて、結合体化された金は、しばしば、桃色を示すが、種々の結合体化されたビーズは、そのビーズの色を示す。
【０１６７】
いくつかのアッセイ形式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、ＢｏＮＴペプチドの存在を検出するために使用され得る。この場合において、抗原でコーティングされた粒子は、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式において、その成分は、標識される必要がなく、そして上記標的抗体の存在は、単純な視診によって検出される。
【０１６８】
（ＩＸ．薬学的組成物）
本発明のＢｏＮＴ−中和抗体は、例えば、内因性の疾患プロセスによってか、または化学的／生物学的な兵器によってもたらされたボツリヌス中毒の進行を緩和するのに有用である。代表的に、１種の抗体または好ましくは２種以上の異なる抗体を含む組成物は、その必要がある哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される。
【０１６９】
本発明者らは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）のサブタイプの特に効率的な中和が、特定のＢｏＮＴ血清型の２種以上のサブタイプを高親和性で結合する中和抗体の使用によって達成されることを見出した。これは、上記サブタイプの各々に対する２種以上の異なる抗体を使用することによって達成され得る一方で、これは、より低い有効性であり、効率的ではなく、そして実用的ではない。ＢｏＮＴ治療は、ＢｏＮＴの高い毒性を鑑みると、望ましくは、非常に強力である。所与のＢｏＮＴ血清型を、必要とされる効力（以下ならびに図５、６、１６、および１７を参照のこと）によって中和するために複数の抗体を使用することが、一般的には必要であるので、必要とされる抗体の数は、各サブタイプに対して異なる抗体を使用することが必要である場合、製造の観点から、非常に大きいものである。混合物中の抗体の数の増加はまた、効力を減少させ、したがって４種の抗体（２種がＡ１毒素を中和し、そして２種がＡ２毒素を中和する）の混合物の場合、それらの抗体の５０％のみが、所与の毒素を中和する。対照的に、２種の抗体（その両方が、Ａ１毒素およびＡ２毒素を中和する）の混合物は、いずれの毒素に対しても１００％の活性を有し、そして製造がより簡単である。例えば、２種のＢｏＮＴ／Ａサブタイプ（Ａ１、Ａ２）に対して、強力な中和は、２種〜３種の抗体によって達成され得る。異なる抗体が、ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／Ａ２との中和に必要とされる場合、４種〜６種の抗体が、必要とされる。その複雑性は、さらなるサブタイプに対してさらに増大する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、２種以上のＢｏＮＴサブタイプ（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ１、ＢｏＮＴ／Ａ２、ＢｏＮＴ／Ａ３など）を高親和性で結合する中和抗体を含む組成物を提供する。
【０１７０】
中和抗体を組み合わせ始めたとき、上記抗体の組み合わせの効力が劇的に増大することもまた、驚くべき発見であった。これはこの増大は、治療用途に必要とされる効力のボツリヌス抗体をもたらすことを可能にする。２種のモノクローナル抗体および３種のモノクローナル抗体を組み合わせ始める場合、認識される特定のＢｏＮＴエピトープは、重要ではなくなることもまた、驚くべきことであり、したがって、例えば、実施例５に示されるように、ＢｏＮＴのトランスロケーションドメインおよび／または触媒ドメインに結合する抗体が、中和活性を有し、互いと組み合わせた場合、またはＢｏＮＴレセプター結合ドメイン（ＨＣ）を認識するｍＡｂと組み合わせた場合のいずれかが、ＢｏＮＴ活性の中和に有効であった。したがって、特定の実施形態において、本発明は、ＢｏＮＴ上の重複しないエピトープを結合する少なくとも２種（より好ましくは、少なくとも３種）の高親和性抗体を含む組成物を企図する。
【０１７１】
特定の実施形態において、本発明は、３Ｄ１２、ＲＡＺ１、ＣＲ１、ＩＮＧ１、ＩＮＧ２、および／またはこれらの抗体由来の１種以上のＣＤＲを含む抗体、および／またはこれらの抗体の変異体（例えば、ＩＮＧ１の１Ｄ１１変異体、２Ｇ１１変異体、および５Ｇ４変異体）を含む１種以上の抗体からなる群より選択される、２種以上（好ましくは、３種以上）の異なる抗体を含む組成物を企図する。
【０１７２】
本発明のＢｏＮＴ−中和抗体は、予防的処置および／または治療的処置について、非経口投与、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、または局所（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、エアロゾルによるか、または経皮的である）に有用である。薬学的組成物は、投与の方法に依存して、種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位投薬形態としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジが挙げられる。本発明の薬学的組成物を含む抗体は、経口で投与される場合、好ましくは分解から保護される。これは、代表的に、抗体を組成物と複合体形成させて酸による加水分解および酵素による加水分解に対して抵抗性にすること、または適切に抵抗性であるキャリア（例えば、リポソーム）中にその抗体をパッケージ化することのいずれかによって達成される。分解からタンパク質を保護する手段は、当該分野において周知である。
【０１７３】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与（例えば、静脈内投与あるいは体腔または器官の管腔への投与）に関して特に有用である。投与のための組成物は、一般的に、薬学的に受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解された１種以上のＢｏＮＴ−中和抗体の溶液を含む。種々の水性キャリアが、使用され得る（例えば、緩衝化した生理食塩水など）。これらの溶液は、無菌であり、そしてその溶液は、一般に、望まれない溶液を含まない。これらの組成物は、従来の周知である滅菌技術によって滅菌され得る。その組成物は、生理学的組成物に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可能な補助的な物質（例えば、ｐＨを調整しかつ緩衝化する薬剤、毒性を調整する薬剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含み得る。これらの処方物中のＢｏＮＴ／Ａ−中和抗体の濃度は、広範に変動し得、そしてその濃度は、選択させた特定の投与様式および患者のニーズに従って、主に流体容量、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０１７４】
したがって、静脈内投与のための代表的な薬学的組成物は、１日に患者１個体あたり約０．１〜１０ｍｇである。１日に患者１個体あたり約１ｍｇから最大で約２００ｍｇの投薬量が、使用され得る。非経口投与が可能な組成物を調製する方法は、当業者にとって公知であるか、または当業者にとって明らかであり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のような刊行物においてより詳細に記載される。
【０１７５】
本発明のＢｏＮＴ−中和抗体またはそのカクテルを含む組成物は、一般に、治療的処置のために投与される。好ましい薬学的組成物は、ＢｏＮＴ毒素を中和（緩和または排除）するのに十分な投薬量で投与される（すなわち、ＢｏＮＴ中毒（ボツリヌス中毒）の症状を減少させるか、または排除する）。このことを達成するのに適した量は、「治療有効量」として定義される。この用途に有効な量は、疾患の重症度および患者の健康の一般的状態に依存する。
【０１７６】
上記組成物の単回投与または複数回投与は、患者に必要とされかつ許容されるような投薬量および頻度に依存して投与され得る。あらゆる事象において、上記組成物は、患者を有効に処置するために、本発明の抗体の十分な定量を提供するべきである。
【０１７７】
（Ｘ．診断または処置のためのキット）
別の実施形態において、本発明は、ボツリヌス中毒の処置またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ感染の検出／確認のためのキットを提供する。キットは、代表的に、本発明の１種以上の抗ＢｏＮＴ抗体（例えば、薬学的用途のためのＢｏＮＴ−中和抗体）を含む。診断用途に関して、抗体は、必要に応じて、標識され得る。さらに、上記キットは、代表的に、ボツリヌス中毒の症状の処置においてＢｏＮＴ−中和抗体を使用する手段を開示する指示資料を備える。上記キットはまた、そのキットが設計される特定の用途を容易にするために、さらなる成分を含み得る。したがって、例えば、キットがＢｏＮＴサブタイプの診断の検出のために１種以上の抗ＢｏＮＴ抗体を含む場合、その抗体は標識され得、そしてそのキットはその標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次標識（例えば、ヒツジ抗ヒト抗体）など）をさらに含み得る。上記キットは、特定の方法の実施のために慣用的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含み得る。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【０１７８】
特定の実施形態において、ボツリヌス中毒の処置のために提供されるキットは、１種以上のＢｏＮＴ中和抗体を含む。上記抗体は、別個に提供されても、一緒に混合されてもよい。代表的に、抗体は、無菌の薬学的に受容可能な賦形剤中に提供される。特定の実施形態において、上記抗体は、送達デバイス（例えば、使い捨て可能な注射器）に予め充填されて提供され得る。
【０１７９】
上記キットは、必要に応じて、抗体の使用、推奨される投薬量、禁忌（ｃｏｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）などを教示する指示資料を備え得る。
【実施例】
【０１８０】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、そして限定を目的として提供されない。当業者は、本質的に同様の結果を生じるように変更または改変され得る種々の決定的ではないパラメータを容易に認識する。
【０１８１】
（実施例１：ボツリヌス神経毒素中和抗体）
（材料および方法）
（Ａ．オリゴヌクレオチドの設計）
科特異的なマウスＶＨおよびマウスＶＫのプライマーを、再配列した完全長Ｖ遺伝子を増幅するために、ヒトＶ遺伝子プライマーについて先に記載（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：９８５−９９１）されるように設計した。簡潔には、マウスＶＨ  ＤＮＡ配列およびＶＫ  ＤＮＡ配列を、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびＧｅｎＢａｎｋデータベースから収集し、アライメントし、そして科によって分類し、そして科特異的プライマーを、フレームワーク１を含む第１の２３ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。同様に、ＪＨ遺伝子セグメントに特異的なプライマーおよびＪＫ遺伝子セグメントに特異的なプライマーを、４種のＪＨ遺伝子セグメントおよび５種のＪＫ遺伝子セグメント（Ｋａｂａｔら、前出）の各々を含む最後の２４ヌクレオチドにアニーリングするように設計した。
【０１８２】
（Ｂ．ベクターの構築）
ベクターｐＳＹＮ３を構築するために、１．５ｋｂのスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントを、プライマーＬＭＢ３（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：９８５−９９１）、およびＥ−タグバック（ｔａｇｂａｃｋ）（５’−ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  Ｇ−３’、（配列番号５））を用いたＰＣＲを使用して、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ．）から増幅した。上記ＤＮＡフラグメントを、ＳｆｉＩおよびＮｏｔｆを用いて設計し、ゲル濾過し、そしてＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって消化したｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにライゲーションした。ライゲーションしたＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧｌ（Ｇｉｂｓｏｎ、（１９９１）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）を形質転換するために使用し、そして正しい挿入物を含むクローンを、ＤＮＡ配列決定することによって同定した。得られたベクターは、ファージに提示されたｓｃＦｖを、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムにＣ末端Ｅエピトープタグ（その後にヘキサヒスチジンタグを伴う）を有するネイティブなｓｃＦｖとして分泌させるためのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントまたはＭｃｏｌ−ＮｏｔＩフラグメントとしてサブクローニングすることを可能にする。
【０１８３】
（Ｃ．免疫法）
ライブラリー１の構築のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１６ｇ〜２２ｇ）を、純粋なＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ（Ｏｐｈｉｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ．）を用いて、０週間目、２週間目、および４週間目に免疫化した。各動物に、ミョウバンに吸着された材料の１μｇ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．）を、０．５ｍｌの容量で皮下に与えた。マウスを、第２の免疫化の２週間後に、純粋なＢｏＮＴ／Ａの１００，０００の５０％致死量によってチャレンジし、そしてその１週間後に屠殺した。
【０１８４】
ライブラリー２の構築のために、ＣＤ−１マウス（１６ｇ〜２２ｇ）を、純粋なＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを用いて、０週間目、２週間目、および４週間目に免疫化し、そして第３の免疫化の２週間後に屠殺した。両方のライブラリーに関して、脾臓を、屠殺の直後に取り出し、そして全ＲＮＡを、Ｃａｔｈａｌａら、（１９９３）ＤＮＡ  ２：３２９の方法によって抽出した。
【０１８５】
（Ｄ．ライブラリーの構築）
第１のｃＤＮＡ鎖を、免疫グロブリンｍＲＮＡをそれぞれ１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＭＩｇＧｌ、ＭＩｇＧ３、およびＭＣＫ（表３）と特異的にプライミングさせたことを除いて、Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７において先に記載される通りに約１０μｇの全ＲＮＡから合成した。ライブラリー１の構築のために、再配列したＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子を、市販のＶＨ逆方向プライマーおよびＶＫ逆方向プライマーならびにＪＨ順方向プライマーおよびＪＫ順方向プライマー（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用することによって第１のｃＤＮＡ鎖から増幅した。ライブラリー２のために、科特異的なＶＨ逆方向プライマーとＶＫ逆方向プライマーとの等モル混合物を、ライブラリーの多様性を増大させる試みにおいて、ＪＨ遺伝子セグメントに特異的なプライマーまたはＪＫ遺伝子セグメントに特異的なプライマーの等モル混合物と組み合わせて使用した（上記の「オリゴヌクレオチドの設計」を参照のこと）。再配列したＶＨ遺伝子および再配列したＶＫ遺伝子を、５μｌの第１のｃＤＮＡ鎖反応混合物、適切な逆方向プライマーの２０ｐｍｏｌの等モル混合物、適切な順方向プライマーの２０ｐｍｏｌの等モル混合物、（各）２５０μｍのデオキシヌクレオチド三リン酸、１．５ｍｍのＭｇＣＩ２、１ｍｌあたり１０μｇのウシ血清アルブミン、および１μｌ（５Ｕ）の製造業者によって供給される緩衝液中のＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む５０μｌの反応混合物中で、別々に増幅した。その反応混合物に、パラフィン油（Ｓｉｇｍａ）を積層（ｏｖｅｒｌａｙ）し、そしてそれを、（９５℃にて１分間、６０℃にて１分間、および７２℃にて１分間で）３０回のサイクルに供した。反応生成物を、ゲルで精製し、ＤＥＡＥ膜を使用することによってそのゲルから単離し、高塩濃度の緩衝液を用いてその膜から溶出させ、エタノール沈殿し、そして２０μＬの水に再懸濁した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。
【０１８６】
（表３．マウス免疫グロブリン遺伝子のＰＣＲのために使用されたオリゴヌクレオチドプライマー）
【０１８７】
【表３−１】
2008528060.tif 000005
【０１８８】
【表３−２】
2008528060.tif 000006
ＳｃＦｖ遺伝子レパートリーを、オーバーラップ伸長によるスプライシングを使用することによって、精製したＶＨ遺伝子レパートリーおよび精製したＶＫ遺伝子レパートリーならびにリンカーＤＮＡから組み立てた。リンカーＤＮＡは、ペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ３、（配列番号１８１）（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３））をコードし、そしてそのリンカーＤＮＡは、再配列したＶＨ遺伝子の３’末端および再配列したＶ．遺伝子の５’末端に相補的であった。そのＶＨＤＮＡおよびＶＫＤＮＡ（各１．５μｇ）を、（各）２５０μｍのデオキシヌクレオチド三リン酸を含む２５μｌのＰＣＲ混合物、１．５ｍＭのＭｇＣｌ、１ｍｌあたり１０μｇのウシ血清アルブミン、および１μｌ（５Ｕ）の製造業者によって供給された緩衝液中のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む混合物中で、５００ｎｇのリンカーＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と合わせ、そしてその混合物を、これらのフラグメントを連結するために、（９４℃にて１分間、６２℃にて１分間、および７２℃にて１分間で）１０回のサイクルに供した。フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＳ、ライブラリーＩについては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍキットにおいて提供され、そしてライブラリー２については、ＶＨＳｆｉプライマーとＪＫＮｏｔプライマー［表３］との等モル混合物において提供される）を、添加し、そしてその反応混合物を、（９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、および７２℃にて１分間で）３３サイクルに供して制限酵素部位を付与した。
【０１８９】
ＳｃＦｖ遺伝子レパートリーを、上に記載したようにゲルで精製し、ＳｆｉｆおよびＮｏｔｌを用いて消化し、そして電気溶出によって精製し、そして１μｇの各レパートリーを、ＳｆｉｌおよびＮｏｔｌを用いて消化した１μｇのｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ライブラリー１）または１μｇのｐＨＥＮ−１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）（ライブラリー２）のいずれかにライゲーションした。そのライゲーション混合物をフェノール−クロロホルム抽出によって精製し、エタノール沈殿し、２０μｌの水に再懸濁し、そして２．５μｌのサンプルを、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧＩ（Ｇｉｂｓｏｎ、（１９８４）、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）にエレクトロポレーションした（Ｄｏｗｅｒら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５）。細胞を、１ｍｌのＳＯＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）中で３０分間増殖させ、次いで１ｍｌあたり１００μｇのＡＭＰおよび１％（重量／容量）のＧＬＵ（ＴＹＥ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を含むＴＹＥ（Ｍｉｌｌｅｒ、（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）培地上にプレーティングした。コロニーを、−７０℃にて保存するために、上記プレートから、１００μｇのＡＭＰ／ｍｌ、１％  ＧＬＵ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）、および１５％（容量／容量）のグリセロールを含む５ｍｌの２×ＴＹブロス（Ｍｉｌｌｅｒ、（１９７２）、前出）中にこすり落とした。ライブラリーのクローニング効率および多様性を、Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：９８５−９９１によって記載されるように、ＰＣＲスクリーニング（Ｇｕｓｓｏｗら、（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４０００）によって決定した。
【０１９０】
（Ｅ．ファージの調製）
上記ライブラリーからプラスミド粒子をレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）するために、１０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに、上記ライブラリーストック由来の適切な容量の細菌（約５０〜１００μｌ）を接種して０．３〜０．５のＡ６００を与え、そして細菌を、３７℃にて振盪しながら３０分間増殖させた。約１０１２ＰＦＵのＶＣＳ−Ｍｌ３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）粒子を、添加し、そしてその混合物を、４℃にて一晩インキュベートした。チューブを、２％  ＭＰＢＳを用いて３７℃にて１時間ブロックし、そして選択、洗浄、および溶出を、５．０×１０１２ＴＵ／ｍｌの濃度にてファージを使用することにより、参考文献３５に記載される通りに正確に行った。溶出したファージの３分の１を使用して対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧＩの１０ｍｌに感染させ、そのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧＩを、上に記載したようにＴＹＥ−ＡＭＰ−ＧＬＵ上にプレーティングした。
【０１９１】
レスキュー−選択−プレーティングの周期を、３回繰り返し、その後、クローンを、ＥＬＩＳＡによって結合について分析した。ライブラリーをまた、可溶性ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃに対して選択した。ライブラリー１について、１．０ｍｇのＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ（７００μｇ／ｍｌ）を、ビオチン化（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）し、そして製造業者によって推奨される通りに精製した。選択の各ラウンドについて、１ｍｌのファージ（約１０１３ＴＵ）を、４％の脱脂粉乳、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、および１ｍｌあたり１０μｇのビオチン化ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを含む１ｍｌのＰＢＳと混合した。室温にて１時間おいた後、抗原に結合したファージを、Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５５：２８−４３によって記載されるように、ブロックされたストレプトアビジンによってコーティングしたＭ２８０磁性ビーズ（ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）；Ｄｙｎａｌ）上に捕捉した。ダイナビーズを、合計で１０回（ＴＰＢＳ中で３回、ＴＭＰＢＳ中で２回、ＰＢＳ中で２回、ＭＰＢＳ中で１回、およびＰＢＳ中で２回以上）洗浄した。結合したファージを、１００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンと一緒に５分間インキュベートすることによってダイナビーズから溶出させ、そしてそのファージを、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によって中和し、そしてその溶出物の３分の１を使用して、対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させた。
【０１９２】
ライブラリー２について、親和性によって駆動する選択（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）、前出））を、選択のために使用される可溶性ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃの濃度を減少させる（ラウンド１については１０μｇ／ｍｌ、ラウンド２については１μｇ／ｍｌ、およびラウンド３については１０ｎｇ／ｍｌ）ことによって行なった。可溶性ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを、Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグを介して２００μｌのＮｉ２＋−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）に捕捉した。捕捉後、そのＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂を、合計で１０回（ＴＰＢＳ中で５回およびＰＢＳ中で５回）洗浄し、結合したファージを、上に記載したように溶出させ、そしてその溶出物を、対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧＩに感染させるために使用した。
【０１９３】
（Ｆ．結合物（ｂｉｎｄｅｒ）の初回の特徴付け）
ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ、およびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮに対する結合についての初回分析（Ｃｈｅｎら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１６２６−１６３０）を、発現したｓｃＦｖを含む細菌の上清を使用したＥＬＩＳＡによって行なった。ｓｃＦｖの発現（Ｄｅ  Ｂｅｌｌｉｓら、（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１３１１）を、ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７によって記載される通りに、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行なった。ＥＬＩＳＡのために、マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３９１２）を、ＰＢＳ（１０μｇ／ｍｌ）中のＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ、またはＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮのいずれかによって４℃にて一晩コーティングし、次いで２％  ＭＰＢＳを用いて室温にて１時間ブロックした。発現したｓｃＦｖを含む細胞の上清を、ウェルに添加し、そして室温にて１．５時間インキュベートした。プレートを、６回（ＴＰＢＳで３回およびＰＢＳで３回）洗浄し、そしてｓｃＦｖの結合を、Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７およびＳｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５によって記載される通りに、抗ｍｙｃタグ抗体（９Ｅ１０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗Ｅ抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびペルオキシダーゼ結合体化抗マウスＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）のいずれかを使用することによってそれらのＣ末端ペプチドタグ（ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中のライブラリー１については、Ｅエピトープタグ、およびｐＨＥＮ−１中のライブラリー２については、ｍｙｃエピトープタグ［Ｍｕｎｒｏ、ら、（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４６：２９１−３００］）によって検出した。固有に結合するｓｃＦｖの数を、ＢｓｔＮ１のフィンガープリントおよびＤＮＡ配列決定によって決定した。
【０１９４】
（Ｇ．ｓｃＦｖのサブクローニング、発現、および精製）
精製を容易にするために、ｓｃＦｖ遺伝子を、上記ｓｃＦｖのＣ末端の端におけるヘキサヒスチジンタグの付加を生じる発現ベクターｐＵＣ１１９ｍｙｃＨｉｓ（Ｓｃｈｉｅｒ  ら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：５５１−５６７）またはｐＳＹＮ３中にサブクローニングした。適切なファージミドのうちの１つを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１の２００ミリリットル培養物を、増殖させ、ｓｃＦｖの発現を、ＩＰＴＧ（Ｄｅ  Ｂｅｌｌｉｓ、ら、（１９９０）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１３１１）を用いて誘導し、そしてその培養物を、２５℃にて一晩増殖させた。ｓｃＦｖを、ペリプラズムから回収し（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ、ら、（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０４：１４７−１５３）、ＩＭＡＣローディング緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム［ｐＨ７．５］、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）に対して４℃にて一晩透析し、次いで０．２μｍ孔径のフィルターを通して濾過した。ｓｃＦｖを、Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）、前出によって記載される通りに、ＩＭＡＣ（Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１３２１−１３２５）によって精製した。
【０１９５】
ダイマーでありかつ凝集したｓｃＦｖからモノマーのｓｃＦｖを分離するために、サンプルを、遠心濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０；Ａｍｉｃｏｎ）において１ｍｌ未満の容量まで濃縮し、そしてＨＢＳを使用することによってＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分画した。最終調製物の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってアリコートをアッセイすることによって評価した。タンパク質バンドを、クマーシーブルー染色によって検出した。濃度を、１．０のＡ２８０が０．７ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ濃度に対応すると仮定して分光測光法によって決定した。
【０１９６】
（Ｈ．親和性および結合動態の測定）
精製したｓｃＦｖのＫｄを、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）における表面プラズモン共鳴を使用することによって決定した。ＢＩＡｃｏｒｅフローセルにおいて、約６００ＲＵのＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム［ｐＨ４．５］中に１５μｇ／ｍｌ）を、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド化学（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７）を使用することによってＣＭ５センサーチップにカップリングした。このカップリングしたＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃの量は、１００〜１７５の最大ＲＵの結合されたｓｃＦｖをもたらした。ｓｃＦｖの結合後の表面の再生のために、５μｌの４Ｍ  ＭｇＣｌ２を注入し、ベースラインへの回帰をもたらした。上記表面を、これらの再生条件下で２０〜３０回再使用した。会合を、５０〜１，０００ｎＭの範囲の濃度で５μｌ／分の連続的な流れにおいて測定した。ｋｏｎを、ｌｎ（ｄＲ／ｄｔ）／ｔ対濃度のプロットから決定した。ここでＲは、応答であり、そしてｔは、時間である（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−２４０）。ｋｏｆｆを、３０μｌ／分の流速を使用することによって、分析したｓｃＦｖの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−２４０）。Ｋｄを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
【０１９７】
（Ｉ．エピトープマッピング）
エピトープマッピングを、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって行なった。ＢｌＡｃｏｒｅフローセルにおいて、約１，２００ＲＵのＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを、上に記載したようにＣＭ５センサーチップにカップリングさせる。５μｌ／分の流速を用いて、１００ｎＭ〜１μＭのｓｃＦｖの滴定を、ほぼ飽和した表面を生じる抗体濃度を決定するために、約５分間にわたってフローセル表面上に注入した。エピトープマッピングを、完全に近い飽和および少なくとも１００ＲＵの結合された抗体を生じる濃度にて、ｓｃＦｖの対を使用して行った。結合されたｓｃＦｖの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその２種のｓｃＦｖを、個々のｓｃＦｖの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するｓｃＦｖは、一緒に注入した場合に、ＲＵ結合において相加的な増加を示し（図２パネルＡ）、一方で、同一のエピトープを認識するｓｃＦｖは、ＲＵの最小限の増加のみを示した（図２パネルＢ）。
【０１９８】
（Ｊ．インビトロ中和研究）
適切なインビトロ中和研究はを、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３３：５５１−５５７によって記載されるように、マウス片側横隔膜調製物を使用することによって行った。簡潔には、左右の横隔神経の片側横隔膜調製物を、雄ＣＤ／１マウス（２５〜３３ｇ）から切除し、そして生理的溶液（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１１ｍＭ  ＧＬＵ）に懸濁した。インキュベーションバスを、９５％  Ｏ２−５％  ＣＯ２を用いて泡立て、そして３６℃の一定温度に維持した。横隔神経を、０．２ｍｓ持続時間の四角波で０．０５Ｈｚにて超最大に刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器（Ｍｏｄｅｌ  ＦＴ０３；Ｇｒａｓｓ）によって測定した。精製したｓｃＦｖを、精製したＢｏＮＴ／Ａと一緒に室温にて３０分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、２．０×１０−８ＭのｓｃＦｖ最終濃度および２．０×１０−１１ＭのＢｏＮＴ／Ａ最終濃度をもたらした。研究した各ｓｃＦｖについて、５０％の単収縮張力減少までの時間を、ＢｏＮＴ／Ａ単独について３回測定し、そしてｓｃＦｖ＋ＢｏＮＴ／Ａについて３回測定した。Ｓ２５とＣ２５との組み合わせを、各２．０×１０−８Ｍの最終濃度にて研究した。５０％の単収縮減少までの時間の間の差を、有意と見なされる０．０５未満のＰ値を用いて両側ｔ検定によって決定した。
【０１９９】
（表４．ファージ抗体ライブラリー由来のクローンの結合の頻度）
【０２００】
【表４】
2008528060.tif 000007
ａポジティブクローンの数／クローンの総数として表される。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃに対する選択について、ＥＬＩＳＡを、それぞれ、固定化したＢｏＮＴ／Ａおよび固定化したＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃに対して行った。ＮＤ、行った選択から決定されなかったデータ。
ｂＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃで２回、かつＢｏＮＴ／Ａで１回免疫化したマウスに由来する。
ｃイムノチューブ選択を、イムノチューブ上に吸着させた抗原を用いて行った。
ｄビオチン化選択を、ストレプトアビジン磁性ビーズ上の捕捉を用いて、溶液中で行った。
ｅＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃで３回免疫化したマウスに由来する。
ｆＮｉ２＋−ＮＴＡ選択を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ上の捕捉を用いて、溶液中で行った。
【０２０１】
（結果）
（Ａ．ファ−ジ抗体ライブラリーの構築および特徴付け）
２つのファージ抗体ライブラリーを、免疫化したマウスのＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子から構築した（図１）。ライブラリー１について、マウスを、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣを用いて２回免疫化し、そして１００，０００のＢｏＮＴ／Ａの５０％致死量を用いた第２の免疫化の２週間後にチャレンジした。ＢｏＮＴ／Ａチャレンジで生存したマウスを、１週間後に屠殺した。その脾臓を、屠殺直後に取り出し、そして全ＲＮＡを、調製した。ライブラリー構築のために、ＩｇＧ重鎖ｍＲＮＡおよびκ軽鎖ｍＲＮＡを、特異的にプライムし、第１のｃＤＮＡ鎖を、合成した。ＶＨ遺伝子レパートリーおよびＶＫ遺伝子レパートリーを、ＰＣＲによって増幅し、そしてＶＨプライマー、ＪＨプライマー、ＶＫプライマー、およびＪＫプライマーを、ファージ抗体システムにおいて提供した。
【０２０２】
ＶＨ遺伝子レパートリーおよびＶＫ遺伝子レパートリーを、１５アミノ酸のペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１８２）をコードする合成ＤＮＡを使用することによって、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製するためにランダムに一緒にスプライシングした。各ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを、ファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に別個にクローニングした。形質転換後、２．１×１０６メンバーのライブラリーを得た。上記クローンのうちの９０％は、ＰＣＲスクリーニングによって決定したところ、ｓｃＦｖ遺伝子に関して適切なサイズの挿入物を有し、そしてそのクローンされたｓｃＦｖ遺伝子は、ＰＣＲフィンガープリントによって決定したところ、多様性であった。ライブラリー１からの１０個の非選択的なクローンのＤＮＡ配列決定は、全てのＶＨ遺伝子が、マウスＶＨ２ファミリーに由来すること、ならびに全てのＶＫ遺伝子がマウスＶＫ４ファミリーおよびマウスＶＫ６ファミリーに由来することを示した（Ｋａｂａｔら、（１９９１）、前出）。この観察されたＶ遺伝子の偏りに基づいて、科特異的ＶＨプライマーおよび科特異的ＶＫプライマーを、ＪＨ遺伝子セグメント特異的プライマーおよびＪＫ遺伝子セグメント特異的プライマーと一緒に設計した（表３）。次いでこれらのプライマーを、第２のファージ抗体ライブラリーを構築するために使用した。
【０２０３】
ライブラリー２について、マウスを、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃで３回免疫化し、そして第３の免疫化の２週間後に屠殺した。そのマウスは、脾臓を回収される前にＢｏＮＴ／Ａによってチャレンジされなかった。なぜならこれは、非Ｈｃ結合抗体の産生を生じるからである（以下の「ファージ抗体の選択および最初の特徴付け」を参照のこと）。上記脾臓を回収し、そしてファージ抗体ライブラリーを、ＶＨ特異的プライマー、ＪＨ特異的プライマー、ＶＫ特異的プライマー、およびＪＫ特異的プライマーを使用したことを除いて、上に記載したように構築した。形質転換後、１．０×１０６メンバーのライブラリーを得た。９５％のクローンは、ＰＣＲスクリーニングによって決定したところ、ｓｃＦｖ遺伝子についての適切なサイズの挿入物を有し、そして上記クローンしたｓｃＦｖ遺伝子は、ＰＣＲフィンガープリントによって決定したところ多様性であった（データ示さず）。ライブラリー２由来の１０種の選択されていないクローンのＤＮＡ配列決定は、ライブラリー１において観察されるよりも大きい多様性を示し；ＶＨ遺伝子は、ＶＨ１、ＶＫ２ファミリー、およびＶＫ３ファミリーに由来し、そしてＶＫ遺伝子は、ＶＫ２ファミリー、ＶＫ３ファミリー、ＶＫ４ファミリー、およびＶＫ６ファミリー（Ｋａｂａｔら、（１９９１）前出）に由来した。
【０２０４】
（Ｂ．ファ−ジ抗体の選択および最初の特徴付け）
ＢｏＮＴ／Ａ結合ファージ抗体を単離するために、ファージを、上記ライブラリーからレスキューし、そして精製したＢｏＮＴ／Ａまたは精製したＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃのいずれかに対して選択した。選択を、Ｈｃに加えてホロ毒素に対して行った。なぜなら組換え毒素Ｈｃホロ毒素におけるＨｃの立体構造を模倣する程度が明確でなかったからである。ＢｏＮＴ／ＡバインダーおよびＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃバインダーについての選択を、ポリスチレンに吸着させた抗原に対して行った。さらに、Ｈｃ結合ファージを、ビオチン化Ｈｃについて、ストレプトアビジン磁性ビーズに対する捕捉（ライブラリー１について）またはヘキサヒスチジンタグ化Ｈｃに対する捕捉、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースに対する捕捉（ライブラリー２について）を用いて溶液中で選択した。溶液中の選択を、ポリスチレンに吸着されたタンパク質に対する選択がネイティブなタンパク質を認識しないファージ抗体をもたらし得るという本発明者らの先の観察（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：７３−８１）に基づいて利用した。溶液中の選択を、本発明者らが上記毒素を、交差反応性を破壊せずに首尾よくビオチン化できなかったことに起因して、ホロ毒素に対して行わなかった。
【０２０５】
２〜３ラウンドの選択後、少なくとも６７％の分析したｓｃＦｖは、選択のために使用した抗原に結合した（表２）。固有のｓｃＦｖの数を、ＤＮＡフィンガープリント、その後のＤＮＡ配列決定によって決定し、そして各ｓｃＦｖの特異性を、純粋なＢｏＮＴ／Ａおよび組換えＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃに対するＥＬＩＳＡによって決定し、そしてＢｏＮＴ／Ａに結合するが、ＨｃまたはＨＮに結合しないＨＮ  ｓｃＦｖを、その軽鎖（触媒ドメイン）に結合すると仮定した。合計で３３種の固有のｓｃＦｖを、Ｈｃによって免疫化し、かつＢｏＮＴ／Ａによってチャレンジしたマウスから単離した（表５、ライブラリー１）。ライブラリー１をホロ毒素について選択した場合、２５種の固有のｓｃＦｖが、単離された。しかし、これらおｓｃＦｖのうちの２種のみが、Ｈｃを結合し、軽鎖を結合し、かつＨＮを結合する部分を有した（Ｈａｔｈａｗａｙら、（１９８４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５０：４０７−４１２）。上記２種のＨｃ結合ｓｃＦｖは、同様のエピトープを認識する他のｓｃＦｖと同じく発現せず、したがってそれらは、親和性または中和能に関して特徴付けられなかった（以下を参照のこと）。
【０２０６】
Ｈｃについてのライブラリー１の選択は、８種のさらなる固有のｓｃＦｖをもたらした（表３および４）。全体として、しかし、Ｈｃについて選択されたｓｃＦｖの５０％だけがまた、ホロ毒素を結合した。この結果は、Ｈｃ表面のかなりの部分がホロ毒素に到達できない可能性があることを示唆する。あるいは、ｓｃＦｖは、ホロ毒素に存在しないＨｃ立体構造を結合し得る。Ｈｃのみによって免疫化したマウス由来（ライブラリー２）の、ホロ毒素ついて選択した全てのｓｃＦｖはまた、Ｈｃを結合した。しかし、ライブラリー１に関するように、Ｈｃについて選択したｓｃＦｖの５０％だけが、ホロ毒素を結合した。全てにおいて、１８種の固有のＨｃ結合ｓｃＦｖを、ライブラリー２から単離し、合計で２８種の固有のＨｃ結合ｓｃＦｖをもたらした（表５および６）。同一の配列または関連した配列のｓｃＦｖを、溶液中で、ポリスチレンおよびＨｃに対して固定化したＨｃの両方について単離した。したがって、Ｈｃの場合において、選択の方法は、重要ではなかった。
【０２０７】
（表５．ファージ抗体ライブラリーから選択されたＢｏＮＴ結合ｓｃＦｖの特異性）
【０２０８】
【表５】
2008528060.tif 000008
（Ｃ．エピトープマッピング）
全２８種の固有のＨｃ結合ｓｃＦｖを、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を使用してエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも１００ＲＵの結合されたｓｃＦｖを生じる濃度にてｓｃＦｖの対を用いて行った。結合されたｓｃＦｖの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその２種のｓｃＦｖを、個々のｓｃＦｖの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。異なるエピトープを認識するｓｃＦｖは、一緒に注入した場合に、ＲＵ結合において相加的な増加を示し（図２パネルＡ）、一方で、同一のエピトープを認識するｓｃＦｖは、ＲＵの最小限の増加のみを示した（図２パネルＢ）。この技術によって、２８種のｓｃＦｖのマッピングは、Ｈｃに対して認識される４種の重複しないエピトープをもたらした（表６）。エピトープ１およびエピトープ２のみを認識するｓｃＦｖを、ライブラリー１から得たが、全４種のエピトープを認識するｓｃＦｖを、ライブラリー２から得た。
【０２０９】
同じエピトープを認識するｓｃＦｖ（Ｃ１およびＳ２５；Ｃ９およびＣ１５；１Ｅ８および１Ｇ７；１Ｂ６および１Ｃ９；Ｃ２５およびＣ３９；２Ｇ５、３Ｃ３、３Ｆ４、および３Ｈ４；１Ａ１および１Ｆ１；１Ｂ３および１Ｃ６；１Ｇ５および１Ｈ６；１Ｆ３および２Ｅ８）の多くは、ＶＨＣＤＲ３およびＶＨ遺伝子セグメントの高レベルの相同性によって証明されるような、同じＶ−Ｄ−Ｊ再配列に由来するＶＨドメインを有した（表６）。これらのｓｃＦｖは、体細胞超変異またはＰＣＲエラーによって導入される置換によってのみ異なる。エピトープ１およびエピトープ２について、同じエピトープを認識するｓｃＦｖの大部分または全ては、同一か、または非常に類似したＶＨ遺伝子セグメントに由来するが、ＶＨＣＤＲ３の長さおよび配列に関して著しく異なる（エピトープ１については９種のｓｃＦｖのうちの５種；エピトープ２については８種のｓｃＦｖのうちの８種）（表６）。これらは、異なるマウス由来のｓｃＦｖを含む。主要なレパートリーにおけるＶＨＣＤＲ２配列中の多様性の大きな程度（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．ｂｉｏｌ．、２５６：８１３−８１７）に鑑みて、特定のＶＨ遺伝子セグメントは、特定の病原性の抗原性形状を認識し得る結合部位を形成するそれらの能力に関して進化した可能性がある。対照的に、より大きい構造のバリエーションは、再配列したＹＫ遺伝子において生じるようである。例えば、３種の異なる生殖系列遺伝子およびＣＤＲ１主鎖の立体構造（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）は、全てのＶＨ遺伝子が同じ生殖系列遺伝子に由来するエピトープ２１について観察される。鎖の対形成におけるこのような「乱雑」は、以前に報告されている（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８）。
【０２１０】
（Ｄ．親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和）
親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和を、各エピトープに対する１つの代表的なｓｃＦｖ結合について決定した。各エピトープに関して、さらなる研究のために選択したｓｃＦｖは、エピトープマッピング研究の間に決定したように、高い発現レベルと緩徐なｋｏｆｆとの最適な組み合わせを有した。研究した４種のｓｃＦｖについてのＫｄは、７．３×１０−８Ｍと１．１×１０−９Ｍとの間の範囲であり（表７）、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルＩｇＧについて報告されたもの（Ｆｏｏｔｅら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：５３０−５３２）に匹敵する値であった。Ｃ２５は、抗ボツリヌス毒素抗体について報告された最も高い親和性（Ｋｄ＝１．１×１０−９Ｍ）を有する。ｓｃＦｖの間で、ｋｏｎは、８４倍を上回って異なり、そしてｋｏｆｆは、３３倍を上回って異なった（表７）。インビトロ毒素中和を、マウス片側横隔膜調製物を使用し、そしてＢｏＮＴ／Ａ単独および２．０×１０−８ＭのｓｃＦｖの存在下において、５０％の単収縮張力減少までの時間を測定することによって決定した。値を、５０％の単収縮減少までの時間において報告する。エピトープ１（Ｓ２５）およびエピトープ２（Ｃ２５）に対するｓｃＦｖの結合は、神経麻痺までの時間を著しく延長させた：それぞれ、１．５倍（１５２％）および２．７倍（２７０％）（表７および図３）。対照的に、エピトープ３およびエピトープ４に対するｓｃＦｖの結合は、神経麻痺までの時間に対する有意な効果を有さなかった。Ｓ２５とＣ２５との混合物は、神経麻痺までの時間に対して有意な相加的効果を有し、５０％の単収縮減少までの時間を３．９倍（３９０％）増大させた。
【０２１１】
（表６．認識したエピトープによって分類したＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ結合ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの推定タンパク質配列）
【０２１２】
【表６】
2008528060.tif 000009
（表７．ファージ抗体ライブラリーから選択されたｓｃＦｖの、親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和の結果）
【０２１３】
【表７】
2008528060.tif 000010
ａｋｏｎおよびｋｏｆｆを、表面プラズモン共鳴によって測定し、そしてＫｄを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
ｂ２０ｎＭ  ｓｃＦｖ＋２０ｐＭ  ＢｏＮＴ／Ａを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける、ＢｏＮＴ／Ａ単独についての時間と比較した５０％の単収縮減少までの時間（分）。Ｃ２５＋Ｓ２５組み合わせに関して、各２０ｎＭのｓｃＦｖを使用した。各値は、少なくとも３回の観察の平均±ＳＥＭである。
ｃＢｏＮＴ／Ａと比較してｐ＜０．０１。
ｄＣ２５と比較してｐ＜０．０５。
【０２１４】
（考察）
ＢｏＮＴは、単一のジスルフィド結合によって連結した重鎖および軽鎖からなる。その毒素のそのカルボキシ末端半部は、特定の膜レセプターに結合して内部移行をもたらす一方で、そのアミノ末端半部は、エンドソームからサイトゾルへの毒素のトランスロケーションを媒介する。その軽鎖は、シナプス伝達の不全および麻痺を生じる、必須のシナプトソームタンパク質を切断する亜鉛エンドペプチダーゼである。有効な免疫療法は、そのレセプターに対する毒素の結合を阻害しなければならない。なぜならば他の２つの毒素分画は、細胞内で発生するからである。結合を媒介するＨｃ上のエピトープの同定は、受動免疫療法のためのより良好なワクチンの設計および高力価の中和モノクローナル抗体（または中和抗体）の開発の両方のために、必須の第１工程である。
【０２１５】
この研究のために、本発明者らは、組換えＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃを用いた免疫化によって中和エピトープに対する免疫応答を導くことを試みた。これは、その細胞レセプターに対する毒素の結合を妨げる抗体の産生をもたらすべきである。このアプローチの１つの制限は、組換えＨｃがホロ毒素におけるＨｃの立体構造を模倣する程度である。Ｈｃについて選択された抗体の５０％がホロ毒素を認識するという事実は、その分子の大部分に対する著しい構造的相同性を示唆する。Ｈｃについて選択された抗体の５０％は、ホロ毒素を結合しないが、これは、他の毒素ドメインに対するＨｃ表面のかなりの部分のパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）から生じ得る。しかし、本発明者らの結果は、これらの抗体のいくつかがホロ毒素に存在しないＨｃ立体構造を結合しているという可能性、またはホロ毒素中に存在する立体構造的なエピトープが組換えＨｃに存在しないという可能性を除外しない。これは、特定の立体構造的なエピトープに対する抗体の産生の失敗を生じ得る。それにもかかわらず、Ｈｃを用いた免疫化および選択は、ホロ毒素を結合するモノクローナル抗体の大きなパネルの単離をもたらした。対照的に、ホロ毒素またはトキソイドを用いた免疫化後に単離されたモノクローナル抗体は、他の毒素ドメイン（ＨＮまたは軽鎖）、または粗毒素調製物およびトキソイド中に存在する非毒素タンパク質に結合する（上記のライブラリー１からの結果、およびＥｍａｎｕｅｌら、（１９９６）ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１９３：１８９−１９７を参照のこと）。
【０２１６】
最も大きい数の可能なモノクローナル抗体を産生および特徴付けするために、本発明者らは、ファージディスプレイを使用した。このアプローチは、結合に関して、数百万の抗体の作製およびスクリーニングを可能にする。得られた抗体フラグメントは、既にクローニングされ、そして固有の抗体の数を同定するために容易に配列決定され得る。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルは、代表的に、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを付与するベクター中にサブクローニングした後、ＩＭＡＣによって容易に精製され得るミリグラムの量のｓｃＦｖを産生するのに適切である。最終的に、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、完全なＩｃＧ分子を構築するためにサブクローニングされ得、ヒト化抗体を構築するためにグラフトされるか、または超高親和性の抗体を作製するために変異させられる。このアプローチによって、２８種の固有のモノクローナル抗ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ抗体を、産生および特徴付けした。
【０２１７】
上記抗体の配列は、様々であり、３種の異なるＶＨ遺伝子ファミリー、少なくとも１３種の固有のＶ−Ｄ−Ｊ再配列、および３種のＶＫ遺伝子ファミリーからなる。ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ抗体のこの大きなパネルの産生は、免疫化および選択に使用した抗原（ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ）の選択の結果であった。例えば、五価トキソイドによって免疫化したマウスのＶ遺伝子から構築したＦａｂファージ抗体ライブラリーは、純粋な毒素（この場合では、ＢｏＮＴ／Ｂ）を結合する２種のみのＦａｂをもたらした。そのＦａｂの大部分は、トキソイド中に存在する非毒素タンパク質（Ｅｍａｎｕｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９３：１８９−１９７（１９９６））を結合した。
【０２１８】
上記抗体の配列多様性にかかわらず、エピトープマッピングは、４種のみの重複しないエピトープを示した。エピトープ１およびエピトープ２は、免疫優勢であり、２８種の上記抗体のうちの２１種（７５％）によって認識された。興味深いことに、免疫優勢なＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃペプチドの（非立体構造的な）エピトープのほぼ同じ数（３種〜５種）が、五価トキソイドによる免疫化後のマウスポリクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体、ならびにホルムアルデヒドで不活化したＢｏＮＴ／Ａによる免疫化後のウマポリクローナル抗体（Ａｔａｓｓｉ、（１９９６）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．、１５：６９１−６９９）によって認識される。
【０２１９】
ｓｃＦｖ結合エピトープ１およびｓｃＦｖ結合エピトープ２は、マウス神経筋接合部における毒素誘導性の神経麻痺の部分的拮抗をもたらした。一緒に投与した場合、上記２種のｓｃＦｖは、神経麻痺までの顕著に増加する時間を伴う相加的効果を有した。これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃ上の２つの固有のレセプター結合部位の存在と一致する。ＢｏＮＴ／Ａレセプターは、正式に同定されていなかったが、この結果は、リガンド結合研究の結果と一致し、この結果はまた、毒素上のレセプター結合部位の２つのクラス（高親和性および低親和性）を示し、そして毒素結合についての「二重レセプター」モデル（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ、（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：３１４−３１７）をもたらした。しかし、これらの部位の両方がＨｃ上にあるか否かは、議論の余地がある。２つの研究において、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃは、結合および神経筋麻痺を阻害（Ｂｌａｃｋら、（１９８６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０３：５２１−５３４；Ｂｌａｃｋら、（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．６９：５６７−５７０）したのに対して、Ｄａｎｉｅｌｓ−Ｈｏｌｇａｔｅら、（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．４４：２６３−２７１は、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｈｃは運動神経末端における結合を阻害したが、マウス神経筋接合部における毒素誘導性の神経麻痺に対する拮抗作用を有さなかったことを示した。本発明者らの結果は、毒素の内部移行および毒性をもたらすＨｃ上の２つの「生産的な」レセプター結合部位の存在と一致する。ｓｃＦｖの効力における差は、レセプター結合部位に対するＨｃの親和性における差を反映し得るか、またはＨｃに対するｓｃＦｖの親和性における１０倍より大きい差を反映し得る。最後に、本発明者らは、任意の上記ｓｃＦｖが細胞表面に対する毒素の結合を実際にブロックすることを正式に示さなかった。神経麻痺までの時間において観察された効果は結合後の事象の妨害によって生じることが、考えられる。
【０２２０】
マウス片側横隔膜アッセイにおける毒素誘導性の神経麻痺のｓｃＦｖ拮抗は、２．０×１０−９Ｍのポリクローナルウマ抗毒素（ＰｅｒＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．）について観察されたもの（神経麻痺までの時間の７．５倍の延長）より低かった。この差は、さらなる結合部位をブロックする必要性、抗体の親和性もしくはアビディティにおける差、または結合できない凝集した毒素をもたらす交差反応効果に起因し得る。抗体結合の親和性はまた、重要な因子であるようである。なぜならば、上記毒素は、高親和性でそのレセプターに結合し（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１：４３７−４４５）、そして内部移行によって細胞の内側に濃縮され得るからである。注目すべきは、最も強力なｓｃＦｖがＨｃに対する最も高い親和性を有することである。同じ中和エピトープを認識するが、異なるＫｄを有する本明細書に記載される他のｓｃＦｖの有用性は、親和性の重要性を規定することに役立つはずである。しかし、これらのｓｃＦｖは、多くのアミノ酸によって異なり、そしてまた良好な特異性において異なり得、それは、結果の解釈を困難にする。あるいは、ファージディスプレイと組み合わせた突然変異誘発は、配列中の数個のアミノ酸のみによって異なるが、親和性において数桁で変動するｓｃＦｖの産生をもたらし得る（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：５５１−５６７）。同じアプローチは、抗体親和性をピコモル範囲（Ｉｄ．）に増大させるために使用され得る。
【０２２１】
中和についての「判断基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」は、抗体と同時注入した毒素の致死的効果に対するマウスの保護である。インビトロ保護とインビボ保護との間の関係は、正式に確立されていないが、ウマ抗毒素は、両方の型のアッセイにおいて毒素を強力に中和する（上記、およびＨａｔｈｅｗａｙら、（１９８４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５０：４０７−４１２を参照のこと）。この関係は本明細書中で報告されるｓｃＦｖに関して保たれると考えられ、そしてこれは、実験的に検証され得る。
【０２２２】
このような研究は、小さい（２５ｋＤａ）ｓｃＦｖ抗体フラグメントによって可能ではない。小さいサイズのｓｃＦｖは、迅速な再分布（相における半減期は２．４〜１２分間である）、およびクリアランス（β相における半減期は、１．５〜４時間である）、および迅速に検出不可能になる抗体レベルをもたらし（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：３２０；Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：７３−８１）、一方で、毒素レベルは、おそらく高いままである（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄら、（１９６１）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０７−２８４−２８９）。インビボ研究の実施は、ｓｃＦｖのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子から完全なＩｇＧ分子を構築することによって容易にされる。ヒト定常領域の使用は、マウスモノクローナルよりも低い免疫原性であり、かつ現在使用されるウマ抗毒素よりもずっと低い免疫原性であるキメラ抗体をもたらす。免疫原性は、ヒト化抗体を産生するために、ＣＤＲグラフティングによってさらに減少され得る。
【０２２３】
（実施例２：組換えオリゴクロ−ナル抗体によるボツリヌス神経毒素の強力な中和）
芽胞形成細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）（公知である最も有毒な物質（Ｇｉｌｌ、（１９８２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４６：８６−９４））を分泌する。上記タンパク質毒素は、３つの機能的ドメインを含む重鎖および軽鎖からなる（Ｓｉｍｐｓｏｎ、（１９８０）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２１２：１６−２１；ＭｏｎｔｅｃｕｃｃｏおよびＳｃｈｉａｖｏ（１９９５）Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８：４２３−４７２；Ｌａｃｙら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：８９８−９０２）。重鎖の末端部分（ＨＣ）は、シナプス前ニューロン上のシアロガングリオシドレセプターおよび推定上のタンパク質レセプターに結合する結合ドメインを含み、その結合は、毒素のエンドサイトーシスを生じる（Ｄｏｌｌｙら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０７：４５７−４６０；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ、（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：３１５−３１７）。重鎖のＮ末端部分（ＨＮ）は、毒素にエンドソームを回避させるトランスロケーションドメインを含む。軽鎖は、血清型に依存してＳＮＡＲＥ複合体の異なるメンバーを切断する亜鉛エンドペプチダーゼであり、その切断は、神経筋伝達のブロックをもたらす（Ｓｃｈｉａｖｏら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５９：８３２−８３５；Ｓｃｈｉａｖｏら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３７８４−２３７８７）。
【０２２４】
７種のＢｏＮＴ血清型（Ａ〜Ｇ；ＬａｃｙおよびＳｔｅｖｅｎｓ、（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１０９１−１１０４）が存在し、そのうちの４種（Ａ、Ｂ、Ｅ、およびＦ）は、ヒト疾患のボツリヌス中毒を引き起こす（Ａｒｎｏｎら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８５：１０５９−１０７０）。ボツリヌス中毒は、弛緩性麻痺によって特徴付けられ、直ちに致命的でない場合、ボツリヌス中毒は、集中治療室および機械換気における長期の入院を必要とする。上記毒素の強力な麻痺性能は、頸部ジストニア、脳性麻痺、外傷後の脳傷害、および脳卒中後の痙攣を含む過剰活性筋の状態の範囲を処置するための医薬としての低用量での使用をもたらしている（Ｍａｈａｎｔら、（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：３８９−３９４）。ＢｏＮＴはまた、それらの極度の効力および死亡率、生産および輸送の容易性、ならびに長期の集中治療の必要性（Ａｒｎｏｎら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８５：１０５９−１０７０）に起因して、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によって、生物テロリズムに関して最も高い危険性を有する６種の脅威因子（ｔｈｒｅａｔ  ａｇｅｎｔ）（「Ｃａｔｅｇｏｒｙ  Ａ  ａｇｅｎｔ」）のうちの１種として分類される。イラクおよびかつてのソビエト連邦の両方は、兵器として使用するためにＢｏＮＴを生産し（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（１９９５）Ｔｅｎｔｈ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔａｒｙ−ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｕｒｓｕａｎｔ  ｔｏ  ｐａｒａｇｒａｐｈ  ９（ｂ）（Ｉ）ｏｆ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ｃｏｕｎｃｉｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６８７（１９９１），ａｎｄ  ｐａｒａｇｒａｐｈ  ３  ｏｆ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６９９（１９９１）ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｂｏｚｈｅｙｅｖａら（１９９９）Ｆｏｒｍｅｒ  ｓｏｖｉｅｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗｅａｐｏｎｓ  ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ：ｐａｓｔ、ｐｒｅｓｅｎｔ、ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ、ＣＡ））、そして日本のカルトであるオウム真理教は、生物テロリズムにＢｏＮＴを使用することを試みた（Ａｒｎｏｎら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２８５：１０５９−１０７０）。これらの脅威の結果として、特定の薬学的因子は、中毒の予防および処置に必要とされる。
【０２２５】
ボツリヌス中毒の予防または処置のための特定の低分子薬物は、存在しないが、研究的な五価トキソイドワクチンは、ＣＤＣから利用可能であり（Ｓｉｅｇｅｌ（１９８８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：２３５１−２３５６）、そして組換えワクチンが、開発中である（ＢｙｒｎｅおよびＳｍｉｔｈ、（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８２：９５５−９６６）。それにもかかわらず、多くの民間人または軍人のワクチン接種は、疾患または曝露の希少性、およびワクチン接種がＢｏＮＴのその後の医学的使用を妨げるという事実に起因して行われない。曝露後のワクチン接種は、疾患の迅速な発症に起因して役に立たない。毒素中和抗体（Ａｂ）は、曝露前または曝露後の予防のためか、あるいは処置のために使用され得る（Ｆｒａｎｚら、（１９９３）Ｐｐ．４７３−４７６、Ｂ．Ｒ．ＤａｓＧｕｐｔａ（編）、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、編、ＤａｓＧｕｐｔａ、Ｂ．Ｒ．Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。少量のウマ抗毒素およびヒトボツリヌス免疫グロブリンの両方が、存在し、そして現在、それらは、それぞれ、成人ボツリヌス中毒（ＢｌａｃｋおよびＧｕｎｎ、（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、６９：５６７−５７０；Ｈｉｂｂｓら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２３：３３７−３４０）および乳児ボツリヌス中毒（Ａｒｎｏｎ、（１９９３）Ｐｐ．４７７−４８２、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、編、ＤａｓＧｕｐｔａ、Ｂ．Ｒ．Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を処置するために使用される。組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、感染症の危険性を含まず、かつ血漿瀉血にヒトドナーを必要としない抗毒素の無制限の供給を提供し得る。このようなｍＡｂは、妥当なコストにおける適切な数の用量を提供するために、高い効力でなければならない。いくつかの場合において、ポリクローナルＡｂの効力は、単一のｍＡｂにおいて再利用され得る（Ｌａｎｇら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４６６−４７２）。
ＢｏＮＴの場合において、強力な中和ｍＡｂは、依然としてもたらされていない：単一のｍＡｂは、マウスにおける毒素の５０％致死量（ＬＤ５０）の多くても１０倍〜１００倍にて中和する（Ｐｌｅｓｓら、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５７０−５７４；Ｈａｌｌｉｓら、（１９９３）Ｐｐ．４３３−４３６、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、編、ＤａｓＧｕｐｔａ、Ｂ．Ｒ．、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。この例において、本発明者らは、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）が、２種または３種のｍＡｂを組み合わせることによってインビトロおよびインビボで非常に強力に中和され得、このことがボツリヌス中毒ならびに他の病原体および生物学的脅威因子によって引き起こされる疾患を予防および処置するための薬物への手段を提供すること示す。
【０２２６】
（方法）
（ＩｇＧの構築）
Ｃ２５単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｓ２５単鎖可変フラグメント、および３Ｄ１２単鎖可変フラグメントのＶＨ遺伝子を、プライマー対（ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ（配列番号１８３）、およびＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ（Ｃ２５、配列番号１８４）、ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＡ（Ｓ２５、配列番号１８５）、またはＧＴＡ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＧＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ（３Ｄ１２、配列番号１８６）のいずれか）を用いてＰＣＲを使用することによって各ファージミドＤＮＡから増幅した。ＤＮＡを、Ｍｌｕ１およびＮｈｅＩで消化し、Ｎ５ＫＧ１Ｖａｌ−Ｌａｒｋ（Ｍｉｔｃｈ  Ｒｅｆｆ、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏの贈呈）にライゲーションし、正しいＶＨを含むクローンを、ＤＮＡ配列決定によって同定した。Ｃ２５  ｓｃＦｖ、Ｓ２５  ｓｃＦｖ、および３Ｄ１２  ｓｃＦｖのＶ＿遺伝子を、プライマー対（ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＴ（配列番号１８７）およびＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ（Ｃ２５、配列番号１８８）、ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＴ（配列番号１８９）およびＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ（Ｓ２５、配列番号１９０）、またはＴＣＡ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ（配列番号１９１）およびＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ（３Ｄ１２、配列番号１９２））を用いて各ファージミドＤＮＡから増幅し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして正しいＶ＿を含むクローンを、ＤＮＡ配列決定によって同定した。Ｖ＿遺伝子を、ＤｒａＩＩＩおよびＢｓｉＷＩを用いてｐＣＲ−ＴＯＰＯから切り出し、そして適切なＶＨ遺伝子を含むＤｒａＩＩＩ消化およびＢｓｉＷＩ消化を行ったＮ５ＫＧ１Ｖａｌ−Ｌａｒｋ  ＤＮＡにライゲーションした。正しいＶＨ遺伝子と正しいＶκ遺伝子とを含むクローンを、ＤＮＡ配列決定によって同定し、そしてベクターＤＮＡを、エレクトロポレーションによってＣＨＯ  ＤＧ４４細胞をトランスフェクトするために使用した。安定な細胞株を、Ｇ４１８中で選択することによって確立し、そして１Ｌスピナーフラスコ中に拡大培養した。ＩｇＧを含む上清を、回収し、限外濾過によって濃縮し、そしてプロテインＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に対して精製した。
【０２２７】
（ＩｇＧ親和性およびＩｇＧ結合動態の測定）
ＩｇＧ結合動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）における表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてＫｄを算出ために使用した。約２００〜４００応答単位（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ）の精製したＩｇＧ（１０ｍＭアセテート中の１０〜２０μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．５〜４．５）を、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド−Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド化学を使用することによってＣＭ５センサーチップにカップリングさせた。精製したＢｏＮＴ／ＡＨＣについての会合速度定数を、５０〜８００ｎＭの範囲の濃度を使用して、１５μｌ／分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数（ｋｏｎ）を、（ｌｎ（ｄＲ／ｄｔ））／ｔ対濃度のプロットから決定した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、再結合を防止するために３０μｌ／分の流速を使用することによって、分析したｓｃＦｖの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。Ｋｄを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
【０２２８】
（インビトロ毒素中和の測定）
横隔神経片側横隔膜調製物を、雄ＣＤ−１マウス（２５〜３３ｇ）から切除し、そして１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１１ｍＭ  グルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、９５％  Ｏ２、５％  ＣＯ２を用いて泡立て、そして３６℃に維持した。横隔神経を、０．２ｍｓ持続時間の四角波で０．０５Ｈｚにて刺激した。等尺性単収縮張力を、力変位変換器（Ｍｏｄｅｌ  ＦＴ０３、Ｇｒａｓｓ）を用いて測定した。精製したＩｇＧ抗体を、ＢｏＮＴ  Ａと一緒に室温にて３０分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、６．０×１０−８Ｍ（Ｓ２５単独および３Ｄ１２単独）または２．０×１０−８Ｍ（Ｃ２５単独）のＩｇＧ最終濃度および２．０×１０−１１ＭのＢｏＮＴ／Ａ最終濃度をもたらした。ＩｇＧの対に関して、各ＩｇＧの最終濃度を、５０％減少させ、そして全３種のＩｇＧの混合物の研究に関して、各ＩｇＧの濃度を、６７％減少させた。
【０２２９】
（インビボ毒素中和の測定）
５０マイクログラムの適切なＩｇＧを、０．５ｍｌ（総容量）のゼラチンリン酸緩衝液中のＢｏＮＴ／Ａ神経毒素（Ｈａｌｌ株）の示された数のマウスＬＤ５０に添加し、そしてＲＴにて３０分間インキュベートした。Ａｂの対に関して、２５μｇの各Ａｂを添加し、そして３種のＡｂの組み合わせに関して、１６．７μｇの各Ａｂを添加した。次いでその混合物を、雌ＣＤ−１マウス（１６〜２２ｇ）に対してｉ．ｐ．に注射した。マウスを、１０の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の５日後に決定した。
【０２３０】
（ｍＡｂの溶液親和性の測定）
平衡結合研究を、抗体と抗原との反応混合物中の占有されていない結合部位を有する抗体を定量するためにＫｉｎＥｘＡフロー蛍光光度計を使用して行った。１種、２種、または３種の異なる抗体から構成される反応混合物を用いた研究を、それぞれ、３４２ｐＭ、１７．２ｐＭ、および１７．２ｐＭの抗体の総濃度を含むＨｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）において行った。全ての場合において、可溶性の毒素の濃度を、０．１未満から１０倍を超える見かけのＫｄの値まで変化させた（１２の濃度、最小）。１種、２種、または３種の異なる抗体から構成される反応混合物を、平衡が達成されたこと確保するために、２５°Ｃにて、それぞれ０．５時間、３時間、および１７時間インキュベートした。
【０２３１】
（結果）
ＢｏＮＴ／Ａを中和し得るｍＡｂを産生するために、本発明者らは、先に、組換えＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン（ＨＣ）によって免疫化したマウス由来のｓｃＦｖファージ抗体ライブラリー、および五価ボツリヌストキソイド（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３７４３−３７５２；Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１６４０−１６４８）によって免疫化したヒト由来のｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを産生した。これらのライブラリーから１００種より多い固有のｍＡｂをスクリーニングした後、ＢｏＮＴ／ＡＨＣ上の重複しないエピトープを結合し、かつインビトロで毒素を中和する（マウス片側横隔膜モデルにおいて神経麻痺までの時間を延長する；Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３７４３−３７５２；Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１６４０−１６４８）、ｓｃＦｖの３つの群を、同定した。インビトロ毒素中和は、重複しないエピトープを結合する２種のｓｃＦｖを組み合わせた場合、顕著に増大した。インビボ毒素中和は、血清からの２５ｋＤａのｓｃＦｖの迅速なクリアランス（Ｃｏｌｃｈｅｒら、（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１９１−１１９７）に起因して決定できなかった。
【０２３２】
インビボＢｏＮＴ神経毒素中和を評価するために、ＩｇＧを、インビトロで毒素を中和した３種のＢｏＮＴ／Ａ  ｓｃＦｖのＶＨ遺伝子およびＶ＿遺伝子から構築した。ＶＨ遺伝子およびＶκ遺伝子を、哺乳動物発現ベクター中に連続的にクローニングし、ＶκへのヒトＣκ遺伝子の融合およびＶＨへのヒトγ１遺伝子の融合をもたらした。安定に発現する細胞株を確立し、そしてＩｇＧを、マウスＶ−ドメインおよびヒトＣ−ドメインを有するキメラＩｇＧ（マウスｓｃＦｖ  Ｃ２５およびマウスｓｃＦｖ  Ｓ２５について）、ならびに完全ヒトＩｇＧ（ヒトｓｃＦｖ  ３Ｄ１２について）を産生する上清から精製した。ＩｇＧの平衡結合定数（Ｋｄ）を測定し、そしてその平衡結合定数は、それらが由来したｓｃＦｖの結合定数に少なくとも匹敵することが見出された（表８）。上記ＩｇＧのうちの２種（Ｓ２５および３Ｄ１２）の抗原結合親和性は、概して会合速度定数（ｋｏｎ）の増大に起因して、対応するｓｃＦｖについての抗原結合親和性よりも顕著に高かった（より低いＫｄ）。本発明者らは、これは上記分子の安定性の増大を反映し、機能的な抗体の濃度が増加すると仮定する。
【０２３３】
（表８．ＢｏＮＴ／Ａ  ＩｇＧならびに上記ＩｇＧが由来したｓｃＦｖについての、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数（Ｋｄ））
【０２３４】
【表８】
2008528060.tif 000011
ＩｇＧによるインビトロ毒素中和を、マウス片側横隔膜アッセイ（Ｄｅｓｐｈａｎｄｅら、（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３３：５５１−５５７）において決定した。毒素単独と比較して、３種のＩｇＧの各々は、神経麻痺までの時間を顕著に増大させ、Ｃ２５は、最も強力であった（図４）。毒素中和における顕著な相乗効果が、ＩｇＧの対を研究した場合に観察された。これらの研究のために、その高い効力および片側横隔膜調製物が８時間の寿命を有するという事実に起因して、研究したＣ２５  ＩｇＧの濃度を３倍〜２０ｎＭに減少させる必要があった。ＩｇＧの各対は、いずれかの単一のＩｇＧについての時間と比較して、神経麻痺までの時間を顕著に増大させた（図４）。全３種のＩｇＧの混合物は、神経麻痺までの時間をさらに増大させたが、この差は、研究した横隔膜の少ない数に起因して、抗体の対と比較した場合に統計的有意性に到達しなかった。
【０２３５】
インビボ毒素中和を、マウスアッセイを使用して研究し、このアッセイにおいて、毒素およびＡｂを予め混合し、そしてｉ．ｐ．に注射し、そして死亡までの時間および生存するマウスの数を決定した（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：６５１−６５７）。５０マイクログラムの単一の各ｍＡｂは、死亡までの時間を延長したが、２０ＬＤ５０によってチャレンジしたマウスを保護できなかった（図５Ａ）。対照的に、ｍＡｂの任意の対は、１００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジしたマウスを完全に保護した（図５Ｂ）。５００ＬＤ５０において、ｍＡｂの対のうちの２種（Ｓ２５＋３Ｄ１２またはＣ２５＋Ｓ２５）を受容したマウスの大部分が、死亡したのに対し、Ｃ２５＋３Ｄ１２の対を受容したマウスの８０％は、生存した（図３）。全３種のｍＡｂ（オリゴクローナルＡｂ）の混合物を受容した全てのマウス（５００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジした）は、生存した（図６）。これらの研究において、投与したＡｂの総量を、マウス１匹あたり５０μｇにて一定に保った。効力を決定するために、ｍＡｂ対およびオリゴクローナルＡｂを、漸増用量の毒素において研究した（図６）。最も強力なｍＡｂ対（Ｃ２５＋３Ｄ１２）は、２，５００ＬＤ５０によってチャレンジしたマウスの生存を伴わずに、１，０００ＬＤ５０によってチャレンジしたマウスの９０％を保護した。対照的に、オリゴクローナルＡｂは、２０，０００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジした１０匹のマウスのうちの５匹の生存を伴って、５，０００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジした全てのマウスを完全に保護した。上記オリゴクローナルＡｂの効力を、標準的なマウス中和バイオアッセイ（ＨａｔｈｅｗａｙおよびＤａｎｇ、（１９９４）Ｐｐ．９３−１０７、Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ、編、Ｊａｎｋｏｖｉｃ，Ｊ．，Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の改変を使用して滴定し、そして乳児ボツリヌス中毒を処置するために使用されるヒトボツリヌス免疫グロブリン（Ａｒｎｏｎ、（１９９３）Ｐｐ．４７７−４８２、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ：Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、編、ＤａｓＧｕｐｔａ、Ｂ．Ｒ．Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）よりも９０倍強力である４５国際単位（ＩＵ）／ｍｇのＡｂであると決定した。定義によれば、１ＩＵは、１０，０００  ＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ毒素を中和する（Ｂｏｗｍｅｒ（１９６３）Ｂｕｌｌ．Ｗ．Ｈ．Ｏ．２９：７０１−７０９）。
【０２３６】
２つの可能な機構が、ｍＡｂを組み合わせた場合に観察される効力の増大を説明し得る：毒素に対するＡｂ混合物の機能的結合親和性の増大および／または細胞レセプターに結合する毒素表面のブロックの増大。機能的結合親和性に対する抗体を組み合わせることの効果を決定するために、見かけのＫｄを、フロー蛍光光度計を使用して溶液の反応混合物中に残存する遊離の抗体を定量することによって、単一の各ｍＡｂ、ｍＡｂの対、および全３種のｍＡｂの混合物について決定した。単一のｍＡｂについて、均一な溶液において測定した抗原結合親和性（溶液中の抗原および抗体の両方；図７）は、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴（抗体が固定化され、そして抗原のみが溶液中にある）によって測定したものよりも低かった（より高いＫｄ）（表８）。最も大きいインビトロでの効力を示した抗体Ｃ２５を、抗体３Ｄ１２と等モル量で混合し、得られたＡｂの組み合わせは、上記毒素に６５ｐＭの見かけのＫｄ（個々の抗体単独を用いて観察されたものよりも２００倍および１０倍高い親和性（より低いＫｄ））で結合した。その混合物に対する等モル量の第３のｍＡｂ（Ｓ２５）の添加は、見かけの親和性を１８ｐＭまでさらに増大させた。Ｃ２５とＳ２５との等モル混合物は、親和性のより小さい２倍の増大をもたらし、このことは、この対がＣ２５と３Ｄ１２との組み合わせよりもインビボで強力でない理由を説明し得る。複数のｍＡｂによって観察された機能的親和性の増大は、第２のｍＡｂおよび第３のｍＡｂのより高い親和性での結合をもたらす、第１のｍＡｂの結合において生じる毒素の立体構造の変化、または一価抗原から多価抗原へと毒素を変化させるｍＡｂ結合のいずれかに起因し得る（Ｍｏｙｌｅら、（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１９００−１９０５）。これは、「アビディティ効果」、および親和性の増大をもたらす。アビディティ効果は、多価抗原（例えば、細胞表面）に対するＩｇＧ結合に関して十分に認識および特徴付けされている（ＣｒｏｔｈｅｒｓおよびＭｅｔｚｇｅｒ、（１９７２）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９：３４１−３５７）が、溶液中で生じるものとしては十分に理解されていない。
【０２３７】
測定したＫｄの増大は、ｍＡｂ対およびオリゴクローナルＡｂについて観察されたインビボでの効力の増大と一致する。平衡結合方程式の再構成：
遊離の毒素／結合した毒素＝Ｋｄ／［血清抗体］
２ｍｌのマウス血液容量を仮定すると、その血清抗体濃度は、マウスが５０μｇのＡｂを受容する場合、１６０ｎＭである。毒素の投与される量は、ＬＤ５０の高倍数である（結合した毒素〜投与される毒素）。したがって、上記方程式は、
遊離の毒素／投与される毒素＝Ｋｄ／１６０ｎＭ
ヘと単純化される。５０％のマウスの死亡をもたらす投与される毒素の量を決定するために、遊離の毒素の量を１ＬＤ５０に置換し、そして投与される毒素について解き、方程式：
投与される毒素（ＬＤ５０）＝１ＬＤ５０×１６０ｎＭ／Ｋｄ
を得る。Ｃ２５について解Ｋｄを使用して、５０％のマウスが生存する推定される毒素用量は、１６ＬＤ５０である（投与される毒素＝１ＬＤ５０×１６０ｎＭ／１０ｎＭ）。この計算がＣ２５  Ａｂと３Ｄ１２  Ａｂとの対、およびオリゴクローナルＡｂに適用される場合、抗体を組み合わせることにおける効力の増大の大きさは、機能的親和性の増大と平行する（表９）。
【０２３８】
（表９．組換え抗体による、観察された毒素中和および予測される毒素中和）
【０２３９】
【表９】
2008528060.tif 000012
オリゴクローナルＡｂによる強力な毒素中和のための第２の可能な機構は、細胞レセプターに結合する毒素結合ドメイン表面上の複数のエピトープをブロックする必要性である。毒素は、毒素結合ドメイン上の少なくとも２つの部位を介して細胞レセプターに結合すると仮定されている（Ｄｏｌｌｙら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０７：４５７−４６０；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏ、（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：３１５−３１７）。これらとしては、ガングリオシド結合部位および推定上のタンパク質レセプター結合部位が挙げられる。実際に、空間的に離れた２つのガングリオシド結合部位は、類似の破傷風毒素の共結晶構造において観察されており（Ｆｏｔｉｎｏｕら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２７４−３２２８１）、そして重複しない破傷風毒素エピトープを結合するｍＡｂは、ＧＴ１ｂガングリオシドに対する毒素の結合をブロックし得る（Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓら、（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１４−１２１）。本発明者らの先のエピトープマッピング研究は、ＢｏＮＴ結合ドメイン（ＨＣ）の広い部分をブロックする複数のｍＡｂと一致する（Ｍｕｌｌａｎｅｙら、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：６５１１−６５１４）。上記ｍＡｂのうちの２種（Ｓ２５および３Ｄ１２）は、ＢｏＮＴ  ＨＣのＣ末端サブドメインを結合する。Ｃ２５  ｍＡｂは、ＢｏＮＴ  ＨＣのＮ末端サブドメイン由来の配列およびＣ末端サブドメイン由来の配列からなる立体構造的なエピトープを結合する。上記エピトープマッピングと一致する１つのモデルは、上記３種のｍＡｂエピトープを、同じＨＣの面上に配置し、そしてその面は、推定上の細胞ガングリオシドレセプターＧＴ１ｂに対する公知のドッキング部位と重なる（Ｍｕｌｌａｎｅｙら、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：６５１１−６５１４）。
【０２４０】
（考察）
結論として、本発明者らは、６種のクラスＡ細菌兵器のうちの１種であるＢｏＮＴ／Ａが３種のみのｍＡｂからなるオリゴクローナルＡｂによって強力に中和され得ることを示した。オリゴクローナルＡｂは、超免疫ヒトグロブリンよりも９０倍強力であり、そして超免疫モノ血清型ウマＡ型抗毒素の効力に近づく（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、（２００１）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３９：６５１−６５７）。したがって、ポリクローナル血清の効力は、３種のみの重複しないエピトープを結合するｍＡｂに逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）し得るか、またはそのｍＡｂに戻り得る。この相乗効果は、上記３種のｍＡｂに対し、任意の単一のｍＡｂの効力と比較して２０，０００倍よりも大きい効力の増大をもたらす。他のものは、破傷風毒素またはＨＩＶ感染の中和におけるモノクローナル抗体の間の相乗作用を、先に示した。破傷風毒素の場合において、３種〜４種のモノクローナル抗体の組み合わせは、インビボ毒素中和の効力を、２００倍まで増大させた（Ｖｏｌｋら、（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：６０４−６０９）。ＨＩＶの場合において、３種または４種のｍＡｂの組み合わせは、個々のｍＡｂと比較して、ウイルス中和の効力を１０倍に増大させた（Ｚｗｉｃｋら、（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１９８−１２２０８）。したがって、本発明者らの観察は、多くのシステムにおいて一般的であると分かっているようである。しかし、本発明者らは、増大した効力が、毒素中和の場合において、混合抗体の機能的親和性の大きな増大によって生じるようであることを示す。このような機構がウイルス中和について真実のままであるか否かは、不明確である。
【０２４１】
毒素に対するポリクローン性の体液性免疫応答が、数種のみの重複しないエピトープを結合するＡｂによって機能的に優勢になると、仮定し得る。効力の増大は、個々のｍＡｂと比較して、オリゴクローナルＡｂのＫｄの大きな減少から主に生じるようであり、そしてまた細胞レセプターと相互作用する毒素表面のより大きいブロックを表す。このような機構は、溶液中で多くの抗原に対して一般的に適用可能であり得、このことは、オリゴクローナルＡｂがｍＡｂよりも強力な抗原中和のための一般的手段を提供し得ることを示唆する。Ｃ２５  ｍＡｂのＫｄをほぼｐＭに操作することによって同様の効力を達成することは、可能であり得るが、オリゴクローナルＡｂは、強力な抗毒素への、より単純であり、より迅速な手段を提供する。
【０２４２】
オリゴクローナルＡｂはまた、ＢｏＮＴ／Ａ中毒の予防および処置のための薬物の安全かつ無制限な供給を提供する。上記Ａｂは、キメラＩｇＧまたはヒトＩｇＧのいずれかからなるので、生産は、安全な抗毒素の備蓄をもたらすために直ぐに拡大され得る。あるいは、本発明者らは、既に、キメラＳ２５  ＩｇＧを完全ヒトＩｇＧによって置換しており、そしてオリゴクローナルＡｂの効力を２倍よりも大きく増大させた。研究は、キメラＣ２５を完全ヒトホモログによって置換するために行なわれている。キメラｍＡｂ、ヒト化ｍＡｂ、およびヒトｍＡｂは、治療因子（その産生の手段が公知である）のさらに重要になっているクラスを代表する。１０種のｍＡｂが、ＦＤＡによって、ヒトの治療について認可されおり、そして７０種より多い他のｍＡｂ治療薬が、臨床試験中である（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：８１９−８２２）。４週間までの排泄半減期によって、Ａｂは、毒素からの数ヶ月間の保護を提供し得るか、または処置のために使用され得る。オリゴクローナルＡｂは、他のＢｏＮＴ毒素血清型、および他のクラスＡ因子に適用可能である。炭疽は、毒素媒介性疾患であり、そしてＡｂがこの因子に関して保護的であることを、示している（Ｌｉｔｔｌｅら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５１７１−５１７５；Ｂｅｅｄｈａｍら、（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：４４０９−４４１６）。ワクシニア免疫グロブリンは、痘瘡または免疫無防備状態の宿主のワクチン接種から生じる合併症を、予防または処置するために使用され得る（Ｆｅｅｒｙ、（１９７６）Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．３１：６８−７６）。Ａｂはまた、出血熱ウイルスによって引き起こされる悪疫および疾患に対して有用であり得る（Ｈｉｌｌら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．ｉｍｍｕｎ．６５：４４７６−４４８２；Ｗｉｌｓｏｎら、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１６６４−１６６６）。本発明者らのデータは、ＢｏＮＴならびに細菌戦および生物テロリズムの他の因子に対抗するためのオリゴクローナルＡｂの迅速な開発および評価を支援する。
【０２４３】
（実施例３）
（免疫性ヒトファージライブラリーおよび非免疫性ヒトファージライブラリー由来の抗ボツリヌスＡ型抗体の遺伝的比較ならびに免疫学的比較）
ボツリヌス中毒における抗体応答を理解することは、ワクチン設計および受動的予防のために重要である。この活性を調査するために、本発明者らは、ファージディスプレイを使用して、分子レベルでＢｏＮＴ／Ａ（ボツリヌス神経毒素血清型Ａ）結合ドメイン（ＨＣ）に対する免疫応答を研究した。上記ｓｃＦｖ抗体を、（ａ）五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア、ならびに（ｂ）非免疫のヒト末梢血リンパ球およびヒト脾臓細胞から調製したＶ遺伝子レパートリーから単離した。ボツリヌス結合ｓｃＦｖを発現する血清型特異的ファージの大きなパネルを、両方のライブラリーから選択し得る。ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する免疫ｓｃＦｖバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）のエピトープマッピングは、驚くべきことに、２つの異なる群（クラスターＩおよびクラスターＩＩ）に対応した立体構造的なエピトープを認識する限定された数のｓｃＦｖを示した。クラスターＩ由来のｓｃＦｖのみが、マウス片側横隔膜アッセイにおいて中和活性を示した。非免疫性ライブラリーに由来する抗ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣクローンは、便宜的に、クラスターＩＩＩ〜ＸＩにグループ分けされ得、そして重複するエピトープを、クラスターＩまたはクラスターＩＩと共有しないようであった。さらに、それらは、生物学的に顕著な濃度で毒素を中和しないことを示した。したがって、本発明者らは、五価ボツリヌストキソイドに基づくワクチンが結合ドメインＨＣ上に露出した限定された数の免疫優勢なエピトープに対する体液性免疫応答を導くことを、示唆する。
【０２４４】
（導入）
ボツリヌス毒素は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属に属する多くの細菌種によって産生される７種の異なる血清型（Ａ〜Ｇ）として存在する麻痺性神経毒素である（Ｈａｔｈｅｗａｙ、（１９８９）Ｐｐ．３−２４、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＬＬ、編集者、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。それらは、単鎖タンパク質（Ｍｒ：１５０，０００）として産生され、そしてジスルフィド結合および非共有結合によって１つに保たれる２つの鎖（重鎖（Ｍｒ：１００，０００）および軽鎖（Ｍｒ：５０，０００））の形成をもたらす限定的なタンパク質分解によって完全に活性化される（Ｎｉｅｍａｎｎ、（１９９１）Ｐｐ．３０３−３４８、Ａｌｏｕｆ  ＪＥ、Ｆｒｅｅｒ  ＪＨ、編集者、Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｉｍｐｓｏｎ、（１９９０）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：１４３−１５１）。中毒は、クロストリジウム属に汚染された食物の摂取（食物媒介性ボツリヌス中毒）、乳児の腸管感染（乳児ボツリヌス中毒）、および創傷の深部皮下の感染（創傷ボツリヌス中毒）によって生じる。ヒトボツリヌス中毒は、Ａ型、Ｂ型、およびＥ型によって最も頻繁に引き起こされ、そして稀にＦによって引き起こされる（Ｄｏｗｅｌｌ、（１９８４）Ｒｅｖ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、６（第１補遺）：２０２−２０７；Ｂｏｔｕｌｉｓｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｏｒｋｅｒｓ．Ａｔｌａｎｔａ、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、１９８０）。ＢｏＮＴ（ボツリヌス神経毒素血清型）は、コリン作動性神経終末に対して優先的に作用して、アセチルコリンの放出をブロックする（Ｈａｂｅｒｍａｎｎら、（１９８６）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２９：９３−１７９；Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏら、（１９９４）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３：１−８）。ＢｏＮＴの作用は、３つの工程を包含する（Ｓｉｍｐｓｏｎ、（１９８６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、２６：４２７−４５３）：（１）重鎖のＣ末端ＨＣを介したシナプス前膜上のレセプターに対する結合；（２）重鎖のＮ末端ＨＮを介した、軽鎖のサイトゾル中へのトランスロケーション；および（３）軽鎖の亜鉛プロテアーゼ活性による、シナプス小胞のドッキングおよび融合タンパク質複合体における１つ以上の重要な成分の切断（Ｍｏｎｔｅｃｕｃｃｏら、（１９９４）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３：１−８；Ｓｃｈｉａｖｏ、（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２６７：２３４７９−２３４８３；Ｓｃｈｉａｖｏら、（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎ．１９５：２５７−２７５）。受動免疫療法は、ヒトの病原体およびそれらの毒素に対する有益な予防的アプローチならびに治療的アプローチとして確立されている（概説については、Ｇｒｏｎｓｋｉら、（１９９０）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ��２８：１３２１−１３３２およびＣｒｏｓｓ（１９９７）Ｐ．９７、Ｃｒｙｚ  ＳＪ、編集者、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔを参照のこと）。ボツリヌス中毒の場合において、ＢｏＮＴ重鎖のＣ末端ドメイン（ＨＣ）を認識する抗体調製物は、その細胞レセプターに対するその毒素の結合を妨げる得ると考えられる。組換えＨＣによるマウスの免疫化は、１，０００，０００マウスｉ．ｐ．ＬＤ５０までのチャレンジ用量に対して、インビボでの良好な保護を提供した（Ｃｌａｙｔｏｎら、（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６３：２７３８−２７４２；Ｂｙｒｎｅら、（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６６：１０）。ウマ血漿由来のポリクローナル抗ボツリヌス抗体調製物（ウマＨＩＧ）は、過去において、８０％より多い成人ボツリヌス中毒患者に投与されてきた（ＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋおよびＢｒｏｗｎ、（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎ．、１９５：８９−１２２；Ｔａｃｋｅｔら、（１９８４）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．、７６：７９４−７９８；Ｍｏｒｒｉｓ（１９８１）Ｐ．１５  Ｉｎ：Ｌｅｗｉｓ  ＧＥ  ｊｒ、編集者、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｓｍ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。ポリクローナル抗体調製物によって認識される多数の異なるエピトープは、通常、保護的な抗体の存在を確実にし、その存在は、通常、全抗体の小さい亜集団である。予防に関して、ウマ抗体は、曝露前に投与された場合に最も有効であるが、曝露後２４時間まで、疾患を予防し得る（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎ．、１９５：８９−１２２）。しかし、ウマ抗毒素の投与は、症例のうちの９％において血清病およびアナフィラキシーなどの有害作用を引き起こし得る（ＢｌａｃｋおよびＧｕｎｎ、（１９８０）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．６９：５６７−５７０）。最近の努力は、免疫化したボランティアドナーの血清から調製したヒト免疫グロブリン（ヒトＢＩＧ）の産生に集中している（Ａｒｎｏｎ、（１９９３）Ｐｐ．４７７−４８２、ＤａｓＧｕｐｔａ  ＢＲ、編集者、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ，ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）。中和モノクローナル抗体（特に、ヒト起源のものである場合）は、抗体の無制限の供給源を提供し、そしてヒトまたはウマからの抗体の調製を置換する。
【０２４５】
本発明者らは、ＢｏＮＴを中和し得るモノクローナル抗体を産生するために、抗体ファージディスプレイを使用した（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３−４１３７；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４；ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８−１０４１）。免疫化したマウスから構築したファージ抗体ライブラリーを使用して、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ上の２つの重複しない中和エピトープを結合するモノクローナルの２種のセットを同定した（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：３７４３−３７５２）。本発明の例において、本発明者らは、五価ボツリヌストキソイド（Ａ〜Ｅ）によって免疫化したヒトボランティアから構築したファージ抗体ライブラリーから選択したモノクローナル抗体の特徴付けを記載する。これらのモノクローナル抗体の親和性、およびこれらのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを、非免疫性ヒトファージライブラリーから選択したモノクローナル抗体の親和性および非免疫性ヒトファージライブラリーから選択したモノクローナル抗体によって認識されるエピトープと比較した。その結果は、さらなる中和エピトープを同定し、そしてボツリヌス中毒の予防および処置のために完全ヒト抗体を産生する経路を提供する。
【０２４６】
（材料および方法）
（免疫性Ｖ遺伝子抗体ライブラリーおよび非免疫性Ｖ遺伝子抗体ライブラリー）
免疫性ファージ抗体ライブラリーの構築のために、ヒトボランティアは、五価ボツリヌストキソイドＡ型〜五価ボツリヌストキソイドＥ型（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）による免疫化を受容した。上記ボランティアを、０週間目、２週間目および１２週間目において、０．５ｍｌの五価トキソイドによって免疫化し、そして１年後に０．５ｍｌのトキソイドによって追加免疫した。ＢｏＮＴ／Ａに対する中和の力価を、マウス血清中和バイオアッセイを使用して測定した（Ｈａｔｈｅｗａｙら、（１９８４）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、１５０：４０７−４１２）。ＰＢＬを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７における遠心分離によって単離し、そしてＲＮＡを、改変したＣａｔｈａｌａらの方法（Ｃａｔｈａｌａら、（１９８３）ＤＮＡ、２：３２９−３３５）を使用して調製した。第１のｃＤＮＡ鎖を、重鎖についてのＩｇＧ定常領域プライマー、または軽鎖についてのκ定常領域プライマーおよびλ定常領域プライマーを使用して、１．０×１０８個のＢ細胞から調製したＲＮＡから作製した［２６］。ＶＨ遺伝子、Ｖκ遺伝子およびＶλ遺伝子を、記載（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７）される通りに、第１のｃＤＮＡ鎖から増幅した。ＰＣＲ産物を、ゲルで精製し、そのゲルからの抽出後にエタノール沈殿し、そして先に記載される通りに、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを構築するために使用した（Ｉｄ．）。そのｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを、ゲルで精製し、次いで付与した制限酵素部位を含むフランキングオリゴヌクレオチドによって再度増幅するために、テンプレートとして使用した（Ｉｄ．）。ｓｃＦｖ遺伝子レパートリー（ＶＨ−Ｖκ、ＶＨ−Ｖλ）を、ゲルで精製し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、そしてＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いて消化したベクターｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）にライゲーションした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９９１）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。そのライゲーション混合物を、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、エタノール沈殿し、そして５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞中にエレクトロポレーションした（Ｇｉｂｓｏｎ、（１９８４）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ）。細胞を、１００＿ｇ／ｍｌのアンピシリンと１％（ｗ／ｖ）グルコースとを含むＴＹＥプレート上にプレーティングした。コロニーを、−７０℃にて保存するために、そのプレートから、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと、１％（ｗ／ｖ）グルコースと１５％（ｖ／ｖ）グリセロールとを含む２ｍｌの２×ＴＹ中にこすり落とした。４種の形質転換体由来の産物は、７．７×１０５個の個別の組換え体からなるライブラリーをもたらした。非免疫性ライブラリーに関して、６．７×１０９個のメンバーを含む先に報告されたファージ上に提示されたヒト単鎖抗体ライブラリーを、利用した（Ｓｈｅｅｔｓら、（１９９７）���ｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：６１５７−６１６２）。
【０２４７】
（ファージの調製および選択）
両方のライブラリー由来のプラスミド粒子を、先に記載される通り、ＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたレスキューによって調製した（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７）。ファージ粒子を、精製し、そして２回のＰＥＧ沈殿によって濃縮し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９９１）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、２ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁し、そして０．４５μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過して、約１０１３形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を達成した。
【０２４８】
ライブラリーを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の、２ｍｌのＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥ（各５０μｇ／ｍｌ）、またはＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ（５０μｇ／ｍｌ）によって４℃にて一晩コーティングした７５ｍｍ×１２ｍｍイムノチューブ（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を使用して選択した（Ｅｍａｎｕｅｌら、（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．、１９３：１８９−９７）。チューブを、ＰＢＳ中の２％脱脂粉乳によってＲＴにて１時間ブロックし、次いで選択手順、洗浄手順および溶出手順を、先に記載される通り、５．０×１０１２ＴＵ／ｍｌの濃度にてファージを使用して行った（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７）。５００μｌのその溶出したファージを使用して、２×ＴＹ−ＡＭＰ−Ｇｌｕプレート上にプレーティングした１０ｍｌの対数増殖するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させた。ファージを、レスキューし、上に記載したように濃縮し、そして次の選択ラウンドのために使用した。レスキュー−選択−プレーティングの周期を、代表的に、４ラウンド繰り返した。
【０２４９】
（ＥＬＩＳＡスクリーニングおよびフィンガープリント）
選択の各ラウンド後、単一のアンピシリン耐性コロニーを使用して、１５０μｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−０．１％グルコースを含むマイクロタイタープレートウェルに接種した。その細菌を、約０．９のＡ６００を与えるように増殖させ、そしてｓｃＦｖ発現を、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度まで添加することによって誘導した（Ｄｅ  ＢｅｌｌｉｓおよびＳｃｈｗａｒｔｚ、（１９９０）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１３１１）。細菌を、２５℃にて振盪しながら一晩増殖させ、その細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして可溶性のｓｃＦｖを含む上清を、回収した。ＢｏＮＴおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する結合についてのｓｃＦｖのスクリーニングを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０μｇ／ｍｌの抗原を用いてコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３９１２）において行なった。非免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖを、記載（ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＭａｌｍｑｖｉｓｔ、（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４）通りに、その後にペルオキシダーゼ結合体化抗マウスＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を伴うＣ末端ｍｙｃタグ（ＭｕｎｒｏおよびＰｅｌｈａｍ、（１９８６）Ｃｅｌｌ、４６：２９１−３００））を認識するマウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（１μｇ／ｍｌ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）を使用して検出した。免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖを、ペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗体抗Ｅ（２．５μｇ／ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して検出した。その反応を、３０分後にＮａＦ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を用いて停止させ、そしてＡ４０５ｎｍを、測定した。固有のクローンの数を、ＰＣＲ−フィンガープリント（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）を行い、次いで各フィンガープリントパターンからの少なくとも２つのクローンのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のＤＮＡ配列決定を行なうことによって決定した。抗体の特異性を、１０μｇ／ｍｌのＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣおよび血清型Ａの組換えトランスロケーションドメイン（ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮ）を用いてコーティングしたウェルを使用して、上記の通りに行ったＥＬＩＳＡによって決定した。クローンを、それらがバックグラウンドよりも少なくとも５倍高いシグナルを与えた場合、選択した抗原に対して特異的であるものとして同定した。
【０２５０】
（ｓｃＦｖのサブクローニング、発現および精製）
ＥＬＩＳＡによって決定したところのＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣを結合するｓｃＦｖ抗体を、そのｓｃＦｖのＣ末端にてヘキサヒスチジンタグの融合を生じる発現ベクターｐＵＣ１１９  Ｓｆｉ−ＮｏｔｍｙｃＨｉｓ中にサブクローニングした（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．、１：７３−８１）。そのｓｃＦｖを、発現させ、そして先に記載される通りに固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製し（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２５５：２８−４３）、そして精製したモノマーのｓｃＦｖの濃度を、１．０のＡ２８０ｎｍが０．７ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ濃度に相関すると仮定して分光測光法によって決定した。
【０２５１】
（エピトープマッピングおよび親和性の決定）
エピトープマッピング研究および動態研究を、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）における表面プラズモン共鳴を使用して行なった。ＢＩＡｃｏｒｅフローセルにおいて、約６００共鳴単位（ＲＵ）のＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ（１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の１５μｇ／ｍｌ）を、ＮＨＳ−ＥＤＣ化学（Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８：２６８−２７７）を使用して、ＣＭ５センサーチップにカップリングさせた。カップリングしたＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣのこの量は、１００〜１７５ＲＵのｓｃＦｖ  ＲＵｍａｘをもたらした。その表面を、ｓｃＦｖの結合後に４Ｍ  ＭｇＣｌ２を使用して再生した。エピトープマッピング研究のために、対の各メンバーに結合されたｓｃＦｖの量（ＲＵ）を決定し、次いでその２種のｓｃＦｖを、個々のｓｃＦｖの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：３７４３−３７５２）。ｓｃＦｖのＫｄを、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて決定した会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）から算出した（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。会合を、５０〜１０００ｎＭのｓｃＦｖの濃度範囲を使用して、５μｌ／分の連続的な流れにおいて測定した。そのｋｏｎを、ｌｎ（ｄＲ／ｄｔ）／ｔ対濃度のプロットから決定した（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．、１４５：２２９−２４０）。そのｋｏｆｆを、再結合を防止するために３０μｌ／分の流速を使用することによって、分析したｓｃＦｖの最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。
【０２５２】
（インビトロバイオアッセイ）
インビトロ中和研究を、先に記載される通り、マウス片側横隔膜調製物を使用して行なった（Ｄｅｓｐｈａｎｄｅ、（１９９５）Ｔｏｘｉｃｏｎ、３３：５５１−５５７）。横隔神経−片側横隔膜調製物を、雄ＣＤ／１マウス（２５〜３３ｇ）から切除し、そして１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４、１５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１１ｍＭ  グルコースに懸濁した。インキュベーションバスを、９５％  Ｏ２、５％  ＣＯを用いて泡立て、そして３６℃に維持した。横隔神経を、０．２ｍｓ持続時間の四角波で０．０５Ｈｚにて刺激した。等尺性単収縮張力を、チャートレコーダーに接続した力変位変換器（Ｍｏｄｅｌ  ＦＴ０３、Ｇｒａｓｓ）を用いて測定した。精製したｓｃＦｖ抗体を、ＢｏＮＴ／Ａと一緒にＲＴにて３０分間インキュベートし、次いで組織のバスに添加し、２．０×１０−８ＭのｓｃＦｖ最終濃度および２．０×１０−１１ＭのＢｏＮＴ／Ａ最終濃度をもたらした。毒素誘導性の麻痺を、最初の筋肉単収縮の５０％の減少として規定した。延長の比を、上記抗体による５０％の減少をＢｏＮＴ／Ａの５０％の減少で除算した値から算出した。３Ｄ１２とＣ２５との組み合わせを、各２．０×１０−８Ｍの最終濃度において研究した。５０％の単収縮減少までの時間の間の差を、有意である０．０５未満のＰ値を用いて両側ｔ検定を使用して決定した。
【０２５３】
（ボツリヌス毒素およびボツリヌス毒素ドメインの調製）
精製したボツリヌス毒素血清型Ａ、Ｂ、ＣおよびＥ（１５０ｋＤａ）を、ＵＳＡＭＲＩＩＤから得た。ボツリヌス毒素Ａ型の結合ドメイン（ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ）を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＣ末端の（Ｈｉｓ６）タグを利用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（Ｏｐｈｉｄｉａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）によって精製した。ボツリヌス毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン（ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮ）は、Ｄｒ．Ｒ．Ｓｔｅｖｅｎｓ（ＵＣ−Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）からの贈呈であった。
【０２５４】
（表１０．免疫性ファージディスプレイライブラリーおよび非免疫性ファージディスプレイライブラリーから選択したＢｏＮＴ結合ｓｃＦｖの特異性）
【０２５５】
【表１０】
2008528060.tif 000013
（結果）
（免疫性ファージディスプレイライブラリーの合成のためのストラテジー）
五価ボツリヌストキソイドによって免疫化したヒトボランティア由来のＰＢＬを、ｓｃＦｖファージ抗体ライブラリーを産生するために使用した。上記ドナーのポリクローナル血清は、マウス中和バイオアッセイ（Ｈａｔｈｅｗａｙら、（１９８４）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、１５０：４０７−４１２）において、２．５６ＩＵ（国際単位）の力価でＢｏＮＴ／Ａに対して保護的であった。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、ＲＮＡから増幅し、スプライシングしてｓｃＦｖ遺伝子レパートリーを作製し、そしてそれを、ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ中にクローニングして７．７×１０５個の形質転換体のファージ抗体ライブラリーを作製した。１５個のランダムに選択したクローンのＰＣＲスクリーニングは、全てが、生殖系列遺伝子特異的な軽鎖プライマーによって決定したところ、完全長の挿入物（６６％がＶκ軽鎖を有し、そして３４％がＶλ軽鎖を有する）を保有することを示した（データ示さず）。
【０２５６】
（ファージ抗体ライブラリーの選択およびＥＬＩＳＡスクリーニング）
免疫性ライブラリーおよび大きな非免疫性ヒトファージ抗体ライブラリーの両方（Ｓｈｅｅｔｓら、（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：６１５７−６１６２）を、ＢｏＮＴ血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対して選択した。ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する３ラウンドの選択後、上記免疫性ライブラリー由来のＥＬＩＳＡポジティブクローンの頻度は、それぞれ、７９％および１００％であった。ＥＬＩＳＡ陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。ＢｏＮＴ／ＡまたはＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する３ラウンドの選択後、上記非免疫性ライブラリー由来のＥＬＩＳＡポジティブクローンの頻度は、それぞれ、２８％および９４％であった。ＥＬＩＳＡ陽性の同様の頻度が、他の血清型について観察された。固有のｓｃＦｖの数を、ＤＮＡフィンガープリントを行ない、次いでＤＮＡ配列決定を行なうことによって決定し、そして各ｓｃＦｖの特異性を、ＥＬＩＳＡによって決定した。各選択からの１００個のクローンのスクリーニングにおいて、４８種の固有の抗体（２３種のＢｏＮＴ／Ａ、１６種のＢｏＮＴ／Ｂ、６種のＢｏＮＴ／Ｃおよび３  ＢｏＮＴ／Ｅ）を、上記免疫性ライブラリーから同定し、そして２７種の固有の抗体（１４種のＢｏＮＴ／Ａ、５種のＢｏＮＴ／Ｂ、５種のＢｏＮＴ／Ｃおよび３種のＢｏＮＴ／Ｅ）を、上記非免疫性ライブラリーから同定した（表１０）。
【０２５７】
各ＢｏＮＴ／Ａ  ｓｃＦｖの詳しい特異性を、組換えＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣドメインおよび組換えＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮドメインに対するＥＬＩＳＡによって決定した（図８）。毒素に対する選択後に単離された２３種の免疫性ＢｏＮＴ／Ａ抗体のうち、６種（３Ａ６、３Ｄ１２、２Ａ１、３Ｂ８、３Ｆ１０、２Ｂ１１）が、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合し、４種（３Ｄ４、３Ａ１１、４Ａ４、３Ｇ４）が、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮに結合し（図８Ａ）、そして残りの１３種の抗体は、おそらく、上記軽鎖（Ｃｈｅｎら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６５：１６２６−１６３０）結合した。これらの知見は、ボツリヌストキソイドによる免疫化が、ＨＣドメインまたはＨＮドメインに対する数種の抗体によって上記軽鎖に対する免疫応答を導くことを示唆する。
【０２５８】
ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する上記ライブラリーの選択は、単一の固有の抗体（２Ａ１）のみをもたらし、この抗体は、毒素で選択したクローン３Ｄ１２および３Ｄ６とクローン的に関連した（表１１）。６個の抗ＨＣクローンのＶＬ遺伝子使用を分析した場合、全てが、Ｖκ１遺伝子ファミリーを使用することを見出した（表１１）が、上記ライブラリーは、２／３のＶκ軽鎖遺伝子および１／３のＶλ軽鎖遺伝子を含んだ。ＢｏＮＴ／Ａホロ毒素に対する非免疫性ライブラリーの選択は、４種の抗体をもたらしたが、これらは、いずれもＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣを結合しなかった。ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する上記ライブラリーの選択は、１０種の固有のｓｃＦｖをもたらし、それらは、Ｖκ軽鎖遺伝子またはＶλ軽鎖遺伝子の両方を使用した（表１１）。全体として、これらのｓｃＦｖのうちの５０％のみが、ホロ毒素を結合し、ＨＣ表面のかなりの部分が上記ホロ毒素に埋もれるという観察（Ｌａｃｙら、（１９９８）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．、５：８９８−９０２）と一致した。全てのｓｃＦｖ抗体は、血清型特異的かつドメイン特異的であり、ＥＬＩＳＡによって決定したところ、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣドメインおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮドメインに結合した非免疫性ライブラリー由来の２Ｂ１１を除いて、交差反応性は、観察されなかった（図８Ｂ）。
【０２５９】
（表１１．ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対して選択した免疫性ライブラリーならびに非免疫性ライブラリーから単離されたヒトｓｃＦｖ抗体についてのＣＤＲ  ３−配列および親和性ａ）
【０２６０】
【表１１−１】
2008528060.tif 000014
【０２６１】
【表１１−２】
2008528060.tif 000015
ａヒト生殖系列のＶＨセグメント、ＶκセグメントおよびＶλセグメントは、Ｖ−ＢＡＳＥデータベース（ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）において詳述されるように割り当てられている。列挙したクローン（同一のＶＨ  ＣＤＲ  ３領域またはＶＬ  ＣＤＲ  ３領域を有する）は、生殖系列遺伝子とのそれらの相違によって示されるように、異なるＣＤＲ  １領域、ＣＤＲ  ２領域およびフレームワーク領域を示した；アクセッションは、番号ＡＦ０９０４０５〜ＡＦ０９０４２０を伴ってＧｅｎＢａｎｋによって行われ得る。
ｂＢｏＮＴ／Ａに対して選択したライブラリー。
ｃＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対して選択したライブラリー。
【０２６２】
（ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ特異的抗体フラグメントのエピトープマッピング）
ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ結合ｓｃＦｖを、認識された重複しないエピトープの数を決定するためにエピトープマッピングした。エピトープマッピングを、チップ表面のほぼ完全な飽和および少なくとも１００ＲＵの結合されたｓｃＦｖを生じる濃度にて、ｓｃＦｖの対を研究するＢＩＡｃｏｒｅＴＭにおける表面プラズモン共鳴を使用して行なった。結合されたｓｃＦｖの量を、対の各メンバーについて決定し、次いでその２種のｓｃＦｖを、個々のｓｃＦｖの測定のために使用した濃度と等しい最終濃度を与えるように一緒に混合した。同一のエピトープを認識する抗体は、一緒に注入した場合に、結合されたＲＵの最小限の増大を示し（図９Ａ）、一方で、異なるエピトープを認識するｓｃＦｖは、ＲＵの相加的な増大を示した（図９Ｂ）。表２および表３に示したように、クラスターＩと称されるｓｃＦｖ  ３Ａ６、ｓｃＦｖ  ３Ｄ１２およびｓｃＦｖ  ２Ａ１は、ＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメント（それぞれ、ＤＰ  ５０およびＬ１２）の高い相同性を共有し、そして重複するエピトープを認識する。それらは、体細胞変異によって導入される重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子における変異によってのみ、配列において異なる。クラスターＩＩと称されるｓｃＦｖ  ３Ｂ８およびｓｃＦｖ  ３Ｆ１０は、クラスターＩと比較して、異なるエピトープに結合する抗体の第２のセットを形成する。可能な固有のエピトープを示すクローン２Ｂ１１は、乏しい発現レベルに起因して分析できなかった。上記非免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖ抗体を分析したとき、本発明者らは、全てが、表３に示したような、クラスターＩＩＩ〜クラスターＸＩと称される固有のエピトープに結合したことを見出した。上記非免疫性ライブラリーのメンバー（クラスターＩＩＩ〜クラスターＸＩ）は、上記免疫性ライブラリーのメンバー（クラスターＩおよびクラスターＩＩ）と重複しない結合を示した。上記免疫性ｓｃＦｖおよび非免疫性ｓｃＦｖの両方によって認識されるエピトープは、２種の先に報告されたマウスｓｃＦｖ（Ｃ２５およびＳ２５）（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：３７４３−３７５２）によって結合されるエピトープと重複しない。
【０２６３】
（反応速度測定および中和アッセイ）
ｋｏｎおよびｋｏｆｆを、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを、平衡解離定数を算出するために使用した。上記免疫性ライブラリーから選択したｓｃＦｖは、３．６９×１０−８Ｍおよび７．８×１０−９ＭのＫｄを有し、ハイブリドーマから産生されたモノクローナルＩｇＧについて報告されたもの（ＦｏｏｔｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：５３０−５３２）に匹敵する値であった（表１２）。非免疫性ｓｃＦｖは、４．６×１０−７Ｍ〜２．６１×１０−８Ｍの範囲の、より低いＫｄを有した。毒素誘導性の神経麻痺を中和するｓｃＦｖの能力を決定するために、インビトロ研究を、横隔神経−片側横隔膜調製物を使用して、各エピトープクラスター由来の１つの代表的なメンバーについて行なった。値を、ＢｏＮＴ／Ａ単独および２．０×１０−８ＭのｓｃＦｖの存在下における５０％の単収縮減少までの時間で報告した。表１２ならびに図１０Ａおよび図１０Ｂに示した通り、異なる抗ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ  ｓｃＦｖの中和における有意な差が、使用したライブラリーに依存して見出された。上記免疫性ライブラリーから、３Ｄ１２（クラスターＩ）が、神経麻痺までの時間を有意に１．５倍延長したのに対して、３Ｆ１０（クラスターＩＩ）は、毒素中和に対する効果を示さなかった。上記非免疫性ライブラリーのうちの代表的なもの（クラスターＩＩＩ〜クラスターＸＩ）は、１．８×１０−７Ｍの最終濃度におけるクラスターＩＩＩ〜クラスターＸＩの全てのメンバーの組み合わせの後でさえも、上記片側横隔膜アッセイにおいて保護的効果を示さなかった。３Ｄ１２（クラスターＩ）と先に単離されたマウスｓｃＦｖ（Ｃ２５）（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：３７４３−３７５２）との組み合わせを使用する場合、麻痺までの時間は、３．２倍まで有意に増大し、このことは、毒素中和に対する相乗効果を示した。本発明者らは、マウスｓｃＦｖ  Ｓ２５とマウスｓｃＦｖ  ３Ｄ１２とによる同様の相乗作用を観察した（データ示さず）。
【０２６４】
（表１２．ファージ抗体ライブラリーから選択したｓｃＦｖの、親和性、結合動態、およびインビトロ毒素中和の結果）
【０２６５】
【表１２】
2008528060.tif 000016
ａ変動するｋｏｎおよびｋｏｆｆを、表面プラズモン共鳴によって測定し、そしてＫｄを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
ｂ２０ｎＭ  ｓｃＦｖ＋２０ｐＭ  ＢｏＮＴ／Ａを使用したマウス片側横隔膜アッセイにおける５０％の単収縮減少までの時間（分）を、ＢｏＮＴ／Ａ単独についての時間と比較した。各値は、少なくとも３回の観察の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
ｃＢｏＮＴ／Ａに対して選択したライブラリー。
ｄＢｏＮＴ／Ａと比較してＰ＜０．０１。
ｅ有意ではない。
ｆＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対して選択したライブラリー。
ｇＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣと比較してＰ＜０．０１。
【０２６６】
（考察）
本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣの組換え結合ドメインを用いたマウスの免疫化が、免疫応答を、シナプス前毒素レセプターに対するＨＣ結合に関与するエピトープを結合する抗体の産生に導くことを、先に示した（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６５：３７４３−３７５２）。これらの実験は、ｓｃＦｖによる毒素の中和が、レセプター結合部位に関して上記ホロ毒素と競合するｓｃＦｖの親和性および能力の両方に相関し得ることを示した。ここで、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａに対するヒト体液性免疫応答および非免疫応答をマッピングするために、免疫性ファージディスプレイライブラリーおよび非免疫性ファージディスプレイライブラリーを使用することによって、より系統的なアプローチを実施した。上記２種の抗体ライブラリーのための抗体遺伝子の供給源は、（ａ）五価トキソイド（Ａ〜Ｅ）によって免疫化したヒトボランティアのＰＢＬ、ならびに（ｂ）非免疫性の末梢血リンパ球および脾臓細胞であった。このアプローチの１つの制限は、これらの研究のために用いる１人のヒトドナーが、ボツリヌス中毒に対する曝露の際にもたらされる広範な遺伝的多様性を示す程度である。マウスおよびヒトにおける体液性免疫応答がむしろ限定された数の保護的エピトープをもたらしたという事実は、保護を与える抗原性エピトープの顕著な保存を示唆する。選択手順は、４種の固定化されたボツリヌス神経毒素（血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥ）に対して両方のコンビナトリアルライブラリーをパニングすることを包含する。３回〜４回のパニング周期の後、この順序（ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／ＣおよびＢｏＮＴ／Ｅ）で漸減する頻度で、各血清型に対する抗体を両方のライブラリーから得た。バインダーの同様の頻度はまた、ＢｏＮＴ／Ｂを除いて、非免疫性ライブラリーについて観察された。これらの結果は、Ｓｉｅｇｅｌ（Ｓｉｅｇｅｌ、（１９８９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２６：２３５１−２３５６）の知見と相関し、Ｓｉｅｇｅｌは、ボツリヌス五価トキソイドの２５人のヒトレシピエントからの血清標本を研究した。種々の血清型の免疫原性を、マウス血清中和バイオアッセイによって決定した−−血清型Ａは、５．７ＩＵ／ｍｌと５１．６ＩＵ／ｍｌとの間の範囲であり、次いで血清型Ｂは、０．７８ＩＵ／ｍｌ〜１８ＩＵ／ｍｌであり、そして血清型Ｅは、０．６１ＩＵ／ｍｌ〜１０ＩＵ／ｍｌであった。
【０２６７】
トキソイドを用いたヒトの免疫化は、ＨＣを結合するより少ない抗体と共に、概して上記毒素軽鎖に対する抗体の産生をもたらした。同様の結果が、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣを用いてマウスを免疫化し、次いでホロ毒素によって追加免疫した後に観察された。抗体の中和活性は、概して、ＨＣによる細胞レセプター結合をブロックすることによって生じるので、これらの分析は、ＨＣワクチンが毒素ベースのワクチンよりも保護的である（より多くのＨＣ抗体が、産生されるからである）ことを示す。ヒト免疫性ＨＣ  ｓｃＦｖは、少なくとも２種の重複しないエピトープを認識した。これらのエピトープ（クラスターＩ）のうちの１種を結合するｓｃＦｖは、インビトロで毒素を中和し得た。毒素中和の効力は、クラスターＩを結合するｓｃＦｖを、２種の重複しないＨＣエピトープのうちのいずれか１種を結合する免疫性マウスｓｃＦｖと組み合わせた場合、増大した。この結果は、ＨＣが、複数の細胞レセプターのいずれかとドッキングすること、またはドッキングが、広範な表面領域にわたって起きることを示唆する（Ｍｕｌｌａｎｅｙら、（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、６９：６５１１−６５１４）。
【０２６８】
ＨＣを認識するヒトｓｃＦｖのレパートリーを、ＢｏＮＴ／Ａに対する大きな非免疫性ライブラリーを選択することによって他のエピトープ（クラスターＩＩＩ〜クラスターＸＩ）の範囲に拡大した。興味深いことに、この結果は、一次免疫レパートリーは、溶媒が接近可能な抗原の領域の多くを認識し得る抗体を含むが、免疫化は、限定された数の免疫優勢なエピトープに対するこの認識を導くという概念と一致する。しかし、非免疫性ライブラリーから得られた抗体の全ては、非中和エピトープを指向した（または少なくとも、毒素をインビトロで中和しなかった）。中和の不全に関する１つの説明は、そのレセプターに対する上記毒素の高親和性（０．３〜２．３ｎＭ（Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄ、（１９９９）Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｔｏｘｉｎ  Ｒｅｖ．、１８：３５−４４））での相互作用と比較して、上記ＨＣドメインに対する抗体（例えば、２Ｂ１０、２Ｅ６、２Ｂ１、３Ｄ１）の低い親和性（１０７〜４６０ｎＭの範囲である）に起因し得た。
【０２６９】
結論として、本発明者らは、ここで、ボツリヌス神経毒素およびそれらのサブドメインに対して特異的なヒト抗体の、免疫性ヒトドナーおよび非免疫性ヒトドナーから調製したコンビナトリアルライブラリーを使用した首尾よい単離を報告する。感染症または病原体を有する任意の者の抗体レパートリーをスクリーニングするためのファージディスプレイの使用は、治療的潜在性および調査における潜在性を有するヒトモノクローナル抗体の非常に大きなプールの利用を可能にする。
【０２７０】
（実施例４）
（より高い親和性に関して進化した中和抗体）
ボツリヌス中毒の検出および処置を改良するために、分子進化および酵母ディスプレイを、ＢｏＮＴ血清型Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）を結合する２種の中和単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（ＨｕＣ２５および３Ｄ１２）の親和性を増大させるために使用した。
【０２７１】
（ｍＡｂ  ＨｕＣ２５の親和性の成熟）
ＢｏＮＴ／Ａに対するＨｕＣ２５の親和性を、一連の変異酵母ディスプレイライブラリーを使用して連続的に増大させた（図２０）。第１に、ＨｕＣ２５遺伝子を、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして酵母ディスプレイベクターｐＹＤ２中にサブクローニングした。上記ｓｃＦｖ遺伝子は、酵母表面上に首尾よく提示され、そして提示されたｓｃＦｖの純粋なＢｏＮＴ／Ａに対するＫＤを、フローサイトメトリーによって決定し、そのＫＤは、８．４４×１０−１０Ｍであった（図２１）。これは、ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＳＰＲを使用して先に測定したような、組換えＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに対する精製したＨｕＣ２５  ｓｃＦｖの結合について測定したＫＤ（１．４×１０−９Ｍ）に匹敵する。次いでＨｕＣ２５  ｓｃＦｖ遺伝子を、誤りを起こしやすい条件を使用したＰＣＲによってランダムに変異させ、そして得られた遺伝子レパートリーをギャップ修復を使用してｐＹＤ２中にクローニングして、２．０×１０５個の形質転換体のライブラリーを作製した（図２０）。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでｓｃＦｖディスプレイの頻度（２７％）および抗原結合の頻度（３．６５％）についてフローサイトメトリーによって分析した。
【０２７２】
次いで上記ライブラリーを、漸減濃度の純粋なＢｏＮＴ／Ａを使用して４ラウンドの選択に供した。上記ｓｃＦｖ遺伝子を、選別の最終ラウンド後に得られた６種の個々のクローンからＰＣＲで増幅し、それは、１種の固有の配列（ＡＲ１）の存在を示した（図１８）。ｓｃＦｖディスプレイに含まれるＡＲ１クローンを、増殖させ、そしてＢｏＮＴ／Ａに対する提示されたｓｃＦｖのＫＤを、測定し、そのＫＤは、１．６９×１０−１０Ｍ（ＨｕＣ２５からの５倍の改良）であった（図２１）。
【０２７３】
親和性をさらに増大させるために、２つの変異酵母ディスプレイライブラリーを、ＡＲ１の配列に基づいて構築した。一方のライブラリーについて、ＡＲ１  ｓｃＦｖ遺伝子を、誤りがちのＰＣＲを使用することにってランダムに変異させた；第２のライブラリーについて、位置指定突然変異誘発を、Ｌ３における４アミノ酸（ＳＮＥＤ）を多様化するために使用した。このループを、突然変異誘発のために選択した。なぜならば、これは、ここで変異が親和性を増大させ得ることがＡＲ１の選択から示され、そして誤りを起こしやすい方法がこのループにおいて完全にサンプリングされた変異を有さなかった可能性があったからである。４ラウンドの選択を、各ライブラリーに対して行い、最終ラウンドの解離速度選択（ｏｆ  ｏｆｆ  ｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、精製したＢｏＮＴ／Ａを用いて標識化し、次いで再結合を防止するためにＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン（ＨＣ）の存在下において１２時間の解離を行なうことによって実施した。次いでＢｏＮＴ／Ａ標識化酵母を、その毒素の触媒ドメインを結合するｍＡｂ（７Ｃ１）を使用して選別した。選別の最終ラウンド由来の個々のクローンのスクリーニングは、その位置指定型ライブラリーに対して野生型ＡＲ１配列のみを示し、これは、Ｌ３が既に最適化されたことを示唆した。上記誤りを起こしやすいライブラリーから、単一の固有のクローンを、単離し（ＡＲ２、図１８）、酵母が提示したｓｃＦｖとしてのそのＫＤを、決定し、そのＫＤは、６．１４×１０−１１Ｍ（親ＡＲ１からの２．８倍の増大）であった（図２１）。
【０２７４】
さらなる酵母ディスプレイライブラリーを、ＡＲ２の親和性をさらに増大させるために作製した。これらは、ランダム変異をＡＲ２遺伝子に導入し、かつ２つの位置指定型ライブラリーがＨ１における５アミノ酸またはＬ２における４アミノ酸のいずれかを多様化したＡＲ２の配列に基づくライブラリーを含んだ。ライブラリーを、ＡＲ１の選択について記載したストラテジーを使用して純粋なＢｏＮＴ／Ａに対して選択し、個々のコロニーを、配列決定し、そして酵母が提示した固有のｓｃＦｖの親和性を、測定した。より高い親和性のクローンは、誤りを起こしやすいライブラリーまたはＬ２変異体のライブラリーから同定されなかった。より高い親和性の２種のクローン（ＡＲ３およびＡＲ４（１．９×１０−１１ＭのＫＤおよび２．３×１０−１１ＭのＫＤ（ＡＲ２からの親和性の約３倍の増大）、図２１））を、Ｈ１ライブラリーから同定した（図１８）。
【０２７５】
（ｍＡｂ  ３Ｄ１２の親和性の成熟）
親和性の成熟のために、３Ｄ１２  ｓｃＦｖ遺伝子を、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅから、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントとして酵母ディスプレイベクターｐＹＤ２中にクローニングした。次いでランダム変異を、誤りを起こしやすい条件下でＰＣＲを使用して３Ｄ１２  ｓｃＦｖ遺伝子に導入し、そして得られた遺伝子レパートリーを、ギャップ修復を使用してｐＹＤ２中にクローニングして、２．１×１０６個の形質転換体のライブラリーを作製した。上記ライブラリーを、増殖させ、インキュベーションし、次いでｓｃＦｖディスプレイの頻度（２７％）および抗原結合の頻度（３．６５％）についてフローサイトメトリーによって分析した。次いで上記ライブラリーを、漸減濃度の純粋なＢｏＮＴ／Ａを使用して５ラウンドの選択に供した。次いで最終ラウンドの解離速度選択を、精製したＢｏＮＴ／Ａを用いて標識化し、次いで再結合を防止するためにＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン（ＨＣ）の存在下において１５時間の解離を行なうことによって実施した。次いでＢｏＮＴ／Ａ標識化酵母を、その毒素の触媒ドメインを結合するｍＡｂ（７Ｃ１）を使用して選別した。上記ｓｃＦｖ遺伝子を、選別の最終ラウンド後に得られた６種の個々のコロニーからＰＣＲで増幅し、これは、３種の固有の配列の存在（表１３、クローン３−１（ＲＡＺ１としても公知である、図１９Ａ）、クローン３−８、およびクローン３−１０）を示した。固有の各クローンを、増殖させ、ｓｃＦｖディスプレイを、誘導し、そしてＢｏＮＴ／Ａに対する提示されたｓｃＦｖのＫＤを、野生型３Ｄ１２  ｓｃＦｖと一緒に、フローサイトメトリーを使用して測定した、全３種の変異ｓｃＦｖは、野生型３Ｄ１２  ｓｃＦｖよりも高い親和性を有した。最も高い親和性のｓｃＦｖ（ＲＡＺ１、図２１におけるＫＤ）に関して、変異は、そのＶＬ内でＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３中に全体的に位置した（図１９Ａ）。
【０２７６】
（表１３．成熟した親和性の抗体および／または改変した抗体についてのアミノ酸配列）
【０２７７】
【表１３−１】
2008528060.tif 000017
【０２７８】
【表１３−２】
2008528060.tif 000018
【０２７９】
【表１３−３】
2008528060.tif 000019
＊完全な重鎖についての配列は、重鎖フレームワーク１＋重鎖ＣＤＲ１＋重鎖フレームワーク２＋重鎖ＣＤＲ２＋重鎖フレームワーク３＋重鎖ＣＤＲ３＋重鎖フレームワーク４である。
完全な軽鎖についての配列は、軽鎖フレームワーク１＋軽鎖ＣＤＲ１＋軽鎖フレームワーク２＋軽鎖ＣＤＲ２＋軽鎖フレームワーク３＋軽鎖ＣＤＲ３＋軽鎖フレームワーク４である。
【０２８０】
（酵母が提示したｓｃＦｖのＩｇＧへの変換の、親和性に対する影響）
多くの免疫学的アッセイ、およびインビボ中和研究のために、ＩｇＧを利用する必要がある。したがって、本発明者らは、二重ＣＭＶプロモーターによって駆動する哺乳動物発現ベクター中にＶＨ遺伝子およびＶｋ遺伝子を連続的にクローニングすることによって、ＨｕＣ２５、ＡＲ１、ＡＲ２、ＡＲ３、ＡＲ４、３Ｄ１２、およびＲＡＺ１を、ヒトγ１定常領域およびヒトκ定常領域からなる完全長ＩｇＧに変換した。安定なＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株を、７種の抗体の各々について確立し、そしてＩｇＧを、上記７種の抗体のうちの６種について５〜２０ｍｇ／Ｌの収量で細胞培養上清から精製した。本発明者らは、顕著な量のＡＲ３  ＩｇＧを、全く発現させることができなかった。
【０２８１】
各ＩｇＧの親和性を、反応速度排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｋｉｎｅｘａ）によって測定した。ＨｕＣ２５ファミリーの変異体の親和性およびＲＡＺ１の親和性は、酵母が提示したｓｃＦｖよりも、ＩｇＧとして顕著に高かったが、そのＩｇＧの親和性の相対的増大は、酵母が提示したｓｃＦｖに対して決定した相対的親和性と一致した（表１４）。例えば、ＡＲ４  ｓｃＦｖは、酵母ディスプレイによるＨｕＣ２５  ｓｃＦｖよりも３７倍高い親和性を有し、そしてＡＲ４  ＩｇＧは、Ｋｉｎｅｘａによって測定したところ、ＨｕＣ２５  ＩｇＧよりも３４倍高い親和性を有した。ＲＡＺ１  ｓｃＦｖは、酵母ディスプレイによる３Ｄ１２  ｓｃＦｖよりも４５倍高い親和性を有し、そしてＲＡＺ１  ＩｇＧは、Ｋｉｎｅｘａによって測定したところ、３Ｄ１２  ＩｇＧよりも３５倍高い親和性を有した。
【０２８２】
（表１４．Ａ１毒素およびＡ２毒素に対する抗体の親和性）
【０２８３】
【表１４】
2008528060.tif 000020
（フローサイトメトリーによるＢｏＮＴ／Ａの検出における親和性の影響）
酵母上に提示されたより高い親和性のｓｃＦｖは、酵母が提示したより低い親和性のｓｃＦｖと比較して、顕著により低い濃度のＢｏＮＴ／Ａを検出できた（図２２）。最も高い親和性のｓｃＦｖ（ＡＲ４）は、０．１ｐＭ（他の増幅されないＢｏＮＴ検出システムについて報告されたものよりも低い値）程度に低いＢｏＮＴ／Ａを検出できた。したがって、その結果は、検出感度を増加させるための漸増する抗体親和性の有用性を立証する。
【０２８４】
（ＢｏＮＴ／Ａの中和に対する親和性の影響）
野生型抗体およびより高い親和性の抗体を、インビボマウス中和アッセイにおいて研究した。単一の抗体に関して、より高い親和性は、腹腔内にＢｏＮＴ／Ａをチャレンジしたマウスの保護の小さい増大（約２倍）をもたらし（図２３）、最も高い親和性のＡＲ抗体は、１００マウスＬＤ５０の毒素に対する完全な保護を提供したが、２００  ＬＤ５０に対しては完全な保護を提供しなかった。２種の抗体を組み合わせた場合、保護は、顕著に増大し、ＡＲ４＋３Ｄ１２の組み合わせは、保護の約２倍（２５００  ＬＤ５０から５０００  ＬＤ５０）までの増加を提供した。ＲＡＺ１を、その抗体の対において３Ｄ１２に対して置換した場合、保護は、ＡＲ４とＲＡＺ１との組み合わせについて、１０，０００マウスＬＤ５０を超えて見られた。したがって、そのデータは、抗体の組み合わせにおいてより高い親和性の抗体を使用することがより強力な毒素中和を生じることを示す。これは、３種の抗体の組み合わせについて、よりさらに明確である（表１５）。
【０２８５】
（表１５．抗体の組み合わせの中和の効力）
【０２８６】
【表１５】
2008528060.tif 000021
ここで、ＨｕＣ２５／Ｂ４／３Ｄ１２またはＲＡＺ１の組み合わせにおける、より高い親和性のＲＡＺ１による３Ｄ１２の置換は、１０，０００  ＬＤ５０チャレンジ用量の毒素における完全な保護を提供する。上記組み合わせにおける野生型３Ｄ１２に関して、１０，０００  ＬＤ５０にてチャレンジしたマウスは、生存しない。より高い親和性のＩＮＧ１によるＢ４の置換、およびより高い親和性のＣＲ１によるＨｕＣ２５の置換は、１０，０００  ＬＤ５０チャレンジ用量の毒素における８０％の生存を依然として伴いつつ、抗体用量の５０ｕｇから１ｕｇまでの減少を可能にする。したがって、抗体の組み合わせにおいて使用される単一の抗体の親和性を増大させることは、効力を増大させ、かつ抗体用量の減少を可能にする。
【０２８７】
（実施例５）
（ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーションは、抗体結合および中和に影響する）
（材料および方法）
（毒素遺伝子配列）
ＮＣＢＩデータベースおよびＭｅｄｌｉｎｅを、ボツリヌス神経毒素遺伝子またはボツリヌス神経毒素タンパク質の公開された配列あるいは記録された配列を同定するために検索した。クロストリジウム属の株ＦＲＩ−Ａ２Ｈの神経毒素遺伝子を、この研究のために配列決定した（調製における書き写し）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ株の神経毒素遺伝子配列は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｐｅｃｋからの贈呈であった。遺伝子配列を、ベクターＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に入れ、翻訳させ、血清型によって分類し、そして整列した。系統樹を、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して構築した。
【０２８８】
（毒素および抗体）
精製した純粋でありかつ複合体形成したボツリヌス神経毒素Ａ１（Ｈａｌｌ  ｈｙｐｅｒ）およびＡ２（ＦＲＩ−Ａ２Ｈ）を、Ｍｅｔａｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。抗体Ｓ２５およびＣ２５を、免疫化されたマウス（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３７４３−３７５２；Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９９：１１３４６−５０）のＶ遺伝子から構築した単鎖Ｆｖファージディスプレイライブラリーから得た。抗体３Ｄ１２を、免疫化されたヒトボランティアドナー（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１６４０−１６４８；Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒら、（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：３７４３−３７５２）のＶ遺伝子から構築した単鎖Ｆｖファージディスプレイライブラリーから得た。抗体Ｂ４を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の免疫化されたトランスジェニックマウス（Ｘｅｎｏマウス）（Ｉ．ＧｅｒｅｎおよびＪ．Ｄ．Ｍａｒｋｓが考案した）のＶ遺伝子から構築した単鎖Ｆｖファージディスプレイライブラリーから得た。これら４種の抗体の各々のＶ遺伝子を、先に記載される通りに、ヒトＩｇＧ１定常領域およびヒトκ定常領域を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９９：１１３４６−５０）。安定なＣＨＯ  ＤＧ４４細胞株を確立し、そしてＩｇＧを、先に記載される通りに、プロテインＧを使用して精製した（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９９：１１３４６−５０）。抗体の純度および濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。抗体９Ｄ８（マウスＩｇＧ１／κ）および７Ｃ１（マウスＩｇＧ１／κ）を、ｒＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣによって免疫化し、そしてＢｏＮＴ／Ａ毒素によって追加免疫したマウスから産生したハイブリドーマから得た。ＩｇＧを、プロテインＧを使用してハイブリドーマ上清から精製し、そして純度および濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）によって決定した。次なる研究のために、ＩｇＧ抗体を、約１〜３ｍｇ／ｍｌにてＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に保存した。
【０２８９】
（毒素捕捉ＥＬＩＳＡ）
毒素捕捉ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を、２μｇ／ｍｌの抗体を用いて４℃にて一晩コーティングした。５％脱脂乳−ＰＢＳにおいて３０分間ブロックした後、毒素を、１００ｎＭから１ｐＭまで、二連で３．２倍希釈（ｈａｌｆ−ｌｏｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）に適用し、そして３７℃にて９０分間インキュベートした。プレートを、洗浄し、そしてウマ抗ＢｏＮＴ抗体（ＰｅｒＩｍｍｕｎｅ）と一緒にインキュベートし、０．２ＩＵ／ｍｌまで希釈し（６０分間）、次いで洗浄し、そして１：１０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）に結合体化したヤギ抗ウマ抗体と一緒に６０分間インキュベートした。プレートを、ＡＢＴＳ（ＫＰＬ）によって発色させた。バックグラウンドコントロールの減算後の４０５ｎｍにおける平均吸光度を、毒素濃度に対してプロットした。
【０２９０】
（毒素に対する抗体親和性の測定）
精製したＢｏＮＴ／Ａ１毒素または精製したＢｏＮＴ／Ａ２毒素についてのＩｇＧ会合速度定数およびＩｇＧ解離速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ  １０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）における表面プラズモン共鳴を使用して測定し、そしてそれらを使用して、先に記載される通りにＫＤを算出した（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９９：１１３４６−１１３５０）。簡潔には、約１００〜４００ＲＵの精製したＩｇＧ（１０ｍＭアセテート（ｐＨ３．５〜４．５）中の１０〜２０ｕｇ／ｍｌ）を、ＮＨＳ−ＥＤＣ化学を使用してＣＭ５センサーチップにカップリングさせた。精製したＢｏＮＴ／Ａ１神経毒素または精製したＢｏＮＴ／Ａ２神経毒素についての会合速度定数を、５０〜８００ｎＭの範囲の毒素濃度を使用して、１５μｌ／分の連続的な流れにおいて測定した。その会合速度定数（ｋｏｎ）を、（ｌｎ（ｄＲ／ｄｔ））／ｔ対濃度のプロットから決定した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、再結合を防止するために３０μｌ／分の流速を使用して、分析した毒素の最も高い濃度におけるセンサーグラムの解離部分から決定した。ＫＤを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。
【０２９１】
（インビボ毒素中和の測定）
５０μｇの適切なＩｇＧを、０．５ｍｌ（総容量）のゼラチンリン酸緩衝液中のＢｏＮＴ／Ａ１神経毒素複合体（Ｈａｌｌ株）の示された数のマウスＬＤ５０またはＢｏＮＴ／Ａ２神経毒素複合体（ＦＲＩ−Ａ２Ｈ株）の示された数のマウスＬＤ５０に添加し、そしてＲＴにて３０分間インキュベートした。ｍＡｂの対に関して、２５μｇの各ｍＡｂを添加し、そして３種のｍＡｂの組み合わせに関して、１６．７μｇの各ｍＡｂを添加した。次いでその混合物を、雌ＣＤ−１マウス（受領時に１６〜２２ｇ）に対して腹腔内に注射した。マウスを、１０の群において研究し、そして少なくとも毎日観察した。死亡の最終集計を、注射の５日後に決定した。マウスを使用した研究を、動物保護法および他の連邦法令ならびに動物および動物に関する実験に関する規制に従って行い、そしてこの研究は、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ、１９９６に記述される原則を遵守する。この調査が行われた施設は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって完全に認定される。
【０２９２】
（結果）
（ボツリヌス神経毒素血清型内の配列バリエーション）
毒素血清型内の配列変異性の程度を決定するために、６０種の公開された神経毒素配列を示す文献を、検索した。このデータは、４９種の完全な毒素遺伝子配列および１１種の部分的な毒素遺伝子配列を含んだ（表１６）。上記４９種の完全な配列を、血清型によって分類し、整列し、そして配列同一性の程度を決定した（表１７および図１１）。分析した４９種の配列のうち、７種のＢｏＮＴ／Ａ、９種のＢｏＮＴ／Ｂ、６種のＢｏＮＴ／Ｃ、５種のＢｏＮＴ／Ｄ、１７種のＢｏＮＴ／Ｅ、４種のＢｏＮＴ／Ｆ、および１種のＢｏＮＴ／Ｇが存在した。血清型内で、２つの型の毒素遺伝子配列が、観察された；互いに実質的に同一である配列（下記参照）およびアミノ酸レベルで少なくとも２．６％異なる配列。このような配列変異性は、１種より多い毒素遺伝子が配列決定されている全６種の血清型（ＢｏＮＴ  Ａ、ＢｏＮＴ  Ｂ、ＢｏＮＴ  Ｃ、ＢｏＮＴ  Ｄ、ＢｏＮＴ  Ｅ、およびＢｏＮＴ  Ｆ）内で観察された。血清型内で、変異性は、高くてＢｏＮＴ／Ｆについての３２％〜低くてＢｏＮＴ／Ｅについての２．６％の範囲であった（表１７）。３種のＢｏＮＴ  Ｃ／Ｄモザイク株および２種のＢｏＮＴ  Ｄ／Ｃモザイク株を、配列決定した。これらの株は、代表的に、それらの親血清型に対応した軽鎖およびＮ末端の重鎖を含み、その神経毒素配列の末端の３分の１は、そのモザイク株の代わりの血清型との強力であるが、絶対的ではない同一性を有する（表１６）。
【０２９３】
（表１６．配列分析において使用したクロストリジウム属の株：アクセッション番号は、ＮＣＩヌクレオチドデータデースからのものである）
【０２９４】
【表１６−１】
2008528060.tif 000022
【０２９５】
【表１６−２】
2008528060.tif 000023
【０２９６】
【化１】
2008528060.tif 000024
９０％より多くのヒトボツリヌス中毒を引き起こす２種の毒素血清型（ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂ（Ｃｏｎｔｒｏｌ、（１９９８）Ｂｏｔｕｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ、１８９９−１９９８．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，ａｎｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｏｒｋｅｒｓ．Ａｔｌａｎｔａ、Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ：ｄｏｗｎｌｏａｄａｂｌｅ  ａｔ  ｗｗｗ．ｂｔ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｇｅｎｔ／ｂｏｔｕｌｉｓｍ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐにてダウンロード可能である））を、より詳細に分析した。７種の公開されたＢｏＮＴ／Ａ毒素配列のうち、５種（６２Ａ、ＮＣＴＣ  ２９１６、ＡＴＣＣ  ３５０２、およびＨａｌｌ  ｈｙｐｅｒ（Ｈａｌｌ  Ａｌｌｅｒｇａｎ））は、実質的に同一（９９．９〜１００％の同一性）であり、そしてそれらは、サブタイプＡ１として分類されている（図１２Ａ）。他の２種のＢｏＮＴ／Ａ配列（Ｋｙｏｔｏ−ＦおよびＦＲＩ−Ａ２Ｈ）は、１００％同一であり、そしてサブタイプＡ２として分類されている（図１２Ａ）。Ａ１毒素は、Ａ２毒素と１０．１％異なり、これは、レセプター結合ドメイン（Ｃ末端重鎖、ＨＣ）中の配列における最も大きな相違である（表１８）。数かより多いことに加えて、ＨＣアミノ酸の相違は、毒素表面上に露出した溶媒が接近可能なアミノ酸に存在する傾向にあった（図１２Ｂ）。多くのこれらの相違は、推定上のガングリオシド結合部位の周りに集まっていた（図１２Ｂ）。触媒ドメイン（軽鎖）の配列は、より保存されており（表１８）、１は、より埋められるようである相違を有する（図１２Ｂ）。
【０２９７】
（表１７．クロストリジウム属のボツリヌス神経毒素遺伝子配列の分類：サブタイプを、アミノ酸レベルにて少なくとも２．６％異なるものとして規定した）
【０２９８】
【表１７】
2008528060.tif 000025
（表１８．ＢｏＮＴ  Ａ１株とＢｏＮＴ  Ａ２株との間の％アミノ酸同一性）
【０２９９】
【表１８】
2008528060.tif 000026
９種の公開されたＢｏＮＴ／Ｂ配列は、ＤＮＡの相同性およびタンパクの質相同性に基づいて４種のサブタイプにグループ分けされ得た（図１３）。これらの群は、二価ＢｏＮＴ／Ｂ（ＢｏＮＴ  Ａｂ  １４３６、ＢｏＮＴ  Ａｂ  ５８８、ＢｏＮＴ  Ａｂ  ５９３、およびＢｏＮＴ  Ｂｆ  ３２８１）、ＢｏＮＴ／Ｂ１（ＢｏＮＴ／Ｂ  Ｄａｎｉｓｈ）、ＢｏＮＴ／Ｂ２（ＢｏＮＴ／Ｂ株１１１）、および非タンパク質分解性ＢｏＮＴ／Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ  Ｅｋｌｕｎｄ）を含んだ。これらの毒素は、その軽鎖と比較して、その重鎖においてより大きい相違を伴って、アミノ酸レベルにて互いと３．６％〜７．７％異なる（表１９）。
【０３００】
（表１９．ＢｏＮＴ  Ｂ株の間の％アミノ酸同一性）
【０３０１】
【表１９】
2008528060.tif 000027
（ＢｏＮＴ／Ａ毒素配列バリエーションおよび抗体結合の影響）
免疫の認識に対するＢｏＮＴ／Ａ毒素配列変異性の影響を決定するために、本発明者らは、捕捉ＥＬＩＳＡによって、ＢｏＮＴ／Ａ１に対して惹起された６種のモノクローナル抗体のＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に結合する能力を測定した。純粋な神経毒素および神経毒素複合体の両方に対する結合を、決定した。４種のｍＡｂ（３Ｄ１２、Ｃ２５、Ｂ４、およびＳ２５）は、組換えＨＣに対するＥＬＩＳＡによって決定したところ、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣ上の重複しないエピトープを結合した。３Ｄ１２およびＳ２５は、先に、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣのＣ末端サブドメインに対してエピトープマッピングされており、一方で、Ｃ２５は、２つのＨＣサブドメインによって形成された複合体エピトープを認識する（Ｍｕｌｌａｎｅｙら、（２００１）Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．、６９：６５１１−６５１４）。１種のｍＡｂ（９Ｄ８）は、組換えＨＮに対するＥＬＩＳＡによって決定したところ、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメイン（ＨＮ）を結合した（データ示さず）。１種のｍＡｂ（７Ｃ１）は、組換え軽鎖に対するＥＬＩＳＡによって決定したところ、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖を結合した。
【０３０２】
ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣを結合した４種の抗体のうちの３種は、ＢｏＮＴ／Ａ２毒素と比較して、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素に対する結合において著しい減少を示した（図１４）。対照的に、非ＨＣ結合ｍＡｂは、かなりのＥＬＩＳＡシグナルを、Ａ１毒素およびＡ２毒素の両方において示した（図１５）。Ａ１毒素およびＡ２毒素に対する結合における差を定量するために、平衡解離定数および結合速度動態を、精製したＡ１毒素および精製したＡ２毒素に対する各ｍＡｂの結合について測定した（表１７）。全てのｍＡｂは、Ａ１毒素を高親和性（６ｎＭと０．１７ｎＭとの間の範囲のＫＤ）で結合した。Ａ２毒素に対する減少した結合を示した（捕捉ＥＬＩＳＡによる）３種のｍＡｂ（Ｃ２５、Ｓ２５、およびＢ４）は、Ａ１毒素と比較して、Ａ２毒素に対する親和性の５５３倍〜１２００より大きい減少を示した。ＢｏＮＴ／Ａ２に対するＢ４  ｍＡｂ結合についてのＫＤすることは、非常に低い親和性結合に起因して不可能であった。親和性の減少の大部分は、会合速度定数の大きな減少に起因した（表２０）。対照的に、３種のｍＡｂ（３Ｄ１２、９Ｄ８および７Ｃ１）は、Ａ１毒素およびＡ２毒素の両方に対するかなりの高親和性を示した。
【０３０３】
（表２０．ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対するＢｏＮＴ／Ａ  ＩｇＧ結合についての、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）ならびに平衡解離定数（Ｋｄ）：会合速度定数および解離速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴によって決定しそしてＫＤを、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した）
【０３０４】
【表２０】
2008528060.tif 000028
ＮＭ＝測定不能
（Ａ１神経毒素およびＡ２神経毒素の中和に対する抗体結合の影響）
本発明者らは、先に、本明細書で記載した３種のｍＡｂ（３Ｄ１２、Ｓ２５、およびＣ２５）のＢｏＮＴ／Ａ１毒素に対するインビボ中和能を研究した。ＢｏＮＴ／Ａ１の顕著なインビトロ中和を示すにもかかわらず、これら３種のｍＡｂは、５０ｕｇの抗体を受容し、かつ２０マウスＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ１によってチャレンジしたマウスの顕著なインビボ保護を示さなかった（１０〜２０％のみの生存（Ｎｏｗａｋｏｗｓｋｉら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９９：１１３４６−１１３５０））。同様に、本明細書で報告した残りの３種のｍＡｂは、マウスを２０マウスＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ１によってチャレンジした場合に、顕著なインビボ保護を示さなかった（１０〜２０％のみの生存、データ示さず）。本発明者らは、ｍＡｂを組み合わせた場合のインビボ保護における顕著な相乗作用を先に報告したので、本発明者らは、ｍＡｂの対およびトリプレットのインビボで毒素を中和する能力を研究した。先に観察した通り、抗体の対は、単一のｍＡｂよりも顕著に大きいＢｏＮＴ／Ａ１中和を示し、さらに大きい効力が、３種のｍＡｂの組み合わせについて観察された（図１６および１７Ａ）。相乗効果は、１種のみの結合ドメイン抗体を含んだｍＡｂ対（Ｃ２５＋９Ｄ８）または非結合ドメイン抗体を含んだｍＡｂ対（９Ｄ８＋７Ｃ１）（図１６）、または１種のみの結合ドメイン抗体を含んだ３種のｍＡｂの組み合わせ（Ｃ２５＋９Ｄ８＋７Ｃ１）（図１７Ａ）について観察された。ＢｏＮＴ／Ａ２毒素の中和に関して、ＢｏＮＴ／Ａ２を高親和性で結合したｍＡｂを含むｍＡｂの対またはトリプレットのみが、中和について顕著な相乗作用を示した（図１７Ｂ）。最も強力なｍＡｂのトリプレット（３Ｄ１２＋９Ｄ８＋７Ｃ１）は、１０，０００マウスＬＤ５０のＡ１毒素またはＡ２毒素のチャレンジからマウスを完全に保護できた。この組み合わせ（３Ｄ１２＋９Ｄ８＋７Ｃ１）は、Ａ１毒素の中和について３種の結合ドメインｍＡｂの組み合わせ（Ｃ２５＋３Ｄ１２＋Ｂ４）ほど強力ではなく、一方で、１種のみの結合ドメインｍＡｂは、Ａ２毒素を任意の親和性で結合し、そして結果として、Ｃ２５＋３Ｄ１２＋Ｂ４のトリプレットは、２００マウスＬＤ５０未満のＡ２毒素を中和した。
【０３０５】
（考察）
４９種の公開された完全なボツリヌス神経毒素配列の分析は、毒素遺伝子配列が、血清型内で、実質的に同一であるかまたはアミノ酸レベルで互いと少なくとも３．６％異なるかのいずれかであったことを示した。本発明者らは、この最小限の相違（３．６％）を有するそれらの毒素を、所与の血清型のサブタイプであると称している。このような分析は、１種より多くの毒素遺伝子が配列決定されている６種の血清型について、平均で２．８個のサブタイプを示した（１種の血清型あたり２個〜４個の範囲のサブタイプ）。この分析は、おそらく、最も頻繁な毒素サブタイプを示す一方で、さらなる毒素サブタイプが、同定され続ける（比較的少数の配列決定された毒素遺伝子が与えられる（１種の血清型あたり平均で８種の毒素遺伝子））ようである。
【０３０６】
毒素サブタイプの重要性は、診断的検査および毒素の治療の開発に対するそれらの影響である。明確には、ヌクレオチド多型性のこのレベルは、ＤＮＡプローブベースのアッセイ（例えば、ＰＣＲ）に影響し得る。重要なことに、アミノ酸置換の程度は、ＥＬＩＳＡおよび他の免疫学ベースの診断的試験に使用されるモノクローナル抗体の結合に影響し得る。本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプとＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプとの間の１０％のアミノ酸の相違が、分析した６種のモノクローナル抗体のうちの３種の結合親和性およびＥＬＩＳＡシグナルに対して劇的な影響を有することを明確に示した。興味深いことに、ｍＡｂ親和性の減少についての動態の基礎は、概して、解離速度定数の増加よりもむしろ会合速度定数の減少に起因する。毒素アミノ酸配列における相違のポリクローナル抗体の結合に対する影響は、未知である。明確には、免疫学的認識に基づく毒素アッセイは、異なる毒素サブタイプを使用して検証される必要がある。
【０３０７】
結合親和性の差は、インビボ毒素中和の効力の顕著な差へと変化する。本発明者らは、単一のｍＡｂによる強力なインビボ毒素中和を観察しなかったので、本発明者らは、ｍＡｂの組み合わせの効力に対する毒素配列のバリエーションの影響を研究した。結合研究と同様に、Ａ１サブタイプおよびＡ２サブタイプの両方に強固に結合するｍＡｂの組み合わせのみが、インビボで強力に毒素を中和した。したがって、効力に対するサブタイプ変異性の影響は、抗体ベースの毒素治療の開発において、このような治療がオリゴクローナル性であるかポリクローナル性であるかにかかわらず評価されなくてはならない。同様に、単一のサブタイプに基づく毒素ワクチンは、関連するサブタイプから保護するそれらの能力について評価される必要があり得る。
【０３０８】
これらの研究における予想外の発見は、ＢｏＮＴのトランスロケーションドメインおよび／または触媒ドメインに対するｍＡｂ結合が、互いと組み合わせたか、またはＢｏＮＴレセプター結合ドメイン（ＨＣ）を認識するｍＡｂと組み合わせたかのいずれかの場合に、中和活性を有したことであった。中和活性はまた、破傷風毒素の触媒ドメイン（Ｋｏｚａｋｉら、（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３９：７６７−７７４）を結合するｍＡｂおよびリシン（Ｌａｎｇら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４６６−４７２）を結合するｍＡｂについて報告されている。ＢｏＮＴレセプター結合ドメインに結合しないｍＡｂは、細胞レセプターに対するＢｏＮＴ結合ドメインエピトープの相互作用、およびその後のＢｏＮＴのエンドサイトーシスを厳密にブロックできないので、それらが中和に寄与する機構は、未知のままである。可能性としては、複数のｍＡｂの結合の際の循環からのＢｏＮＴのクリアランスの上昇（Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｊｕｌｉａｎら、（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：９１７−９２４）、立体化学的な効果によるレセプター結合の妨害、必要とされる細胞内の毒素プロセス（エンドソーム脱出または触媒活性）の妨害（ＫｏｒｉａｚｏｖａおよびＭｏｎｔａｌ、（２００３）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１０：１３−１８）、および／またはＢｏＮＴ細胞内輸送の変化が挙げられる。上記機構にかかわらず、非結合ドメインｍＡｂの毒素を中和する能力は、中和ｍＡｂの産生に利用可能なエピトープの数を顕著に増加させ、全てのＢｏＮＴサブタイプを結合および中和するｍＡｂの発見の尤度を増加させる。
【０３０９】
本発明者らは、抗体結合および単一の血清型（ＢｏＮＴ／Ａ）についての中和に対する配列変異性の影響のみを研究したが、３種の血清型（ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、およびＢｏＮＴ／Ｆ）は、ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／Ａ２との間の１０％より大きい相違（１０．７％〜３１．６％）で互いと異なるサブタイプを有する。これらの３種の血清型に関して、免疫の認識に対する配列変異性の影響は、ＢｏＮＴ／Ａの影響より大きいようである。２種の血清型（ＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／Ｅ）について、配列変異性は、ＢｏＮＴ／Ａについて観察されるものより低い（２．６％〜７．６％）。このレベルの配列変異性の影響は、評価される必要があるが、それは、ＢｏＮＴ／Ｂ毒素に結合するｍＡｂの以前の評価（Ｇｉｂｓｏｎら、（１９８８）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、６４：２８５−２９１；Ｋｏｚａｋｉら、（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６６：４８１１−４８１６）およびＢｏＮＴ  Ｅに結合するｍＡｂの以前の評価（Ｋｏｚａｋｉら、（１９８６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５２：７８６−７９１）において示される通り、明確に、ｍＡｂ結合に影響し得る範囲にある。
【０３１０】
結論として、本発明者らは、７種のボツリヌス神経毒素血清型のうちの６種内でかなりの配列変異性が存在することを報告し、そしてこのレベルの変異性が抗体結合および中和に著しく影響し得ることを示す。このような毒素の多様性の完全な範囲を決定することは、ボツリヌス毒素の免疫学的なアッセイ、治療およびワクチンの開発において重要な工程である。一旦配列変異性が規定されると、いくつかのこれらの毒素改変体は、検出アッセイ、治療、およびワクチンの確認のために生産される必要があるようである。
【０３１１】
（実施例６）
（ＢｏＮＴ／ＡサブタイプＡ１、Ａ２、およびＡ３の交差中和（ｃｒｏｓｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために選択され、そして進化させた中和抗体）
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａが挙げられる）の異なるサブタイプの発見は、診断的抗体および治療的抗体の開発に対する挑戦をもたらす。理想的には、ｍＡｂまたはｍＡｂの混合物は、異なるＢｏＮＴサブタイプの大部分または全てに結合し、そしてそれらを検出／中和する。これは、いくつかのサブタイプの検出に失敗しなかった検出システムをもたらす。治療的抗体について、交差反応性は、その抗体が上記サブタイプの１種以上を中和し損なわないことを確実にする。
【０３１２】
（ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に結合する抗体の選択）
ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を結合し得るモノクローナル抗体を産生するために、免疫性ファージｓｃＦｖ抗体ライブラリーまたは免疫性酵母ｓｃＦｖ抗体ライブラリーを、最初はＢｏＮＴ／Ａ１に対し、次いでＢｏＮＴ／Ａ２に対して連続的に選択した。複数のラウンドの選択後、ファージ抗体または酵母抗体を、両方のＢｏＮＴサブタイプに対する結合についてスクリーニングした。２種のｓｃＦｖ抗体を、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の両方を匹敵する親和性で結合した抗体を同定した（ＩＮＧ１、ｓｃＦｖ  ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ１＝１．１７×１０−９Ｍ；ｓｃＦｖ  ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ２＝１．１８×１０−９Ｍ：およびＩＮＧ２、ｓｃＦｖ  ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ１＝４．１７×１０−１０Ｍ；ｓｃＦｖ  ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ２＝４．５×１０−１０Ｍ。ＩＮＧ１およびＩＮＧ２の配列については、表１３を参照のこと。インビボ研究のために、これら２種のｓｃＦｖを、ＩｇＧに変換した。そのＩｇＧは、Ａ１  ＢｏＮＴおよびＡ２  ＢｏＮＴの両方に対して、高親和性の結合を維持した（表２１）。
【０３１３】
（表２１．ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の両方を高親和性で結合する交差反応性であるＩｇＧの親和性：親和性および結合動態を、フロー蛍光定量法によって決定した）
【０３１４】
【表２１】
2008528060.tif 000029
（ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２の両方を高親和性で結合し得るＨｕＣ２５改変体の産生）
ＨｕＣ２５もそのより高い親和性の誘導体も、ＢｏＮＴ／Ａ２を高親和性で結合する（ｂｏＮｔ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対するＡＲ２の親和性については、表２２を参照のこと）。ＢｏＮＴ／Ａ２に対する親和性を増大させるために、本発明者らは、より高い親和性の改変体ＡＲ２を用いて開始した。ＩｇＧとしてのこの抗体は、１０，０００より多い、ＢｏＮＴ／Ａ１よりも低い親和性をＢｏＮＴ／Ａ２に対して有し、そしてＢｏＮＴ／Ａ２に対する２．０×１０−７Ｍの非常に低い親和性を有する（表２２）。
【０３１５】
（表２２．ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対するＡＲ２  ＩｇＧならびに酵母が提示したｓｃＦｖの親和性および結合動態）
【０３１６】
【表２２】
2008528060.tif 000030
ＡＲ２変異体のライブラリーを、スパイクオリゴヌクレオチド（ｓｐｉｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または誤りがちのＰＣＲを使用して産生し、そしてその変異体は、ｓｃＦｖとして酵母の表面上に提示された。ライブラリーを、最初はＢｏＮＴ／Ａ１に対し、そしてＢｏＮＴ／Ａ２に対して連続的に選択し、変異体ＷＲ１（Ｔ）（ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ２＝３．７ｎＭ）、ＷＲ１（Ｖ）（ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ２＝９．０ｎＭ）およびＣＲ１（ＫＤ  ＢｏＮＴ／Ａ２＝８５０ｐＭ）を産生した（配列については表２０）。最も高い親和性のｓｃＦｖであるＣＲ１を、ＩｇＧに変換し、そのＩｇＧは、親ＡＲ２  ＩｇＧと比較して、約８０倍の、より高い親和性をＢｏＮＴ／Ａ２毒素に対して有し、一方でＢｏＮＴ／Ａ１に対するその親和性もまた約１０倍増大した（表２３）。ＢｏＮＴ／Ａ２に対する親和性をさらに増大させるために、ＣＲ１  ｓｃＦｖ遺伝子を、ランダムに変異させ、酵母上に提示させ、そしてより高い親和性のｓｃＦｖを、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対して連続的に選択し、変異体ＣＲ２をもたらした（配列については、配列表または表１３を参照のこと）。ＩｇＧへの変換後、ＣＲ２は、ＣＲ１よりも約６倍高い親和性をＢｏＮＴ／Ａ２に対して有し、そしてＢｏＮＴ／Ａ１に対して高親和性の結合を維持した（表２３）。
【０３１７】
（表２３．フロー蛍光定量法によって決定した場合の、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対するＡＲ２  ＩｇＧ、ＣＲ１  ＩｇＧ、ならびにＣＲ２  ＩｇＧの親和性および結合動態）
【０３１８】
【表２３】
2008528060.tif 000031
（ＢｏＮＴ／Ａ２に対するより高い親和性を有する抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ２を高い効力で中和する）
実施例５において、抗体ＨｕＣ２５と、Ｂ４と、３Ｄ１２との組み合わせの５０ｕｇが４０，０００マウスＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ１（しかし、２００ＬＤ５０未満のＢｏＮＴ／Ａ２）を中和し得ることを示した。Ｂ４もＨｕＣ２５も、ＢｏＮＴ／Ａ２を高親和性で結合した。したがって、本発明者らは、ＨｕＣ２５に由来するがＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２に対して高親和性を有するＣＲ１抗体（ＲＡＺ１、およびＩＮＧ１またはＩＮＧ２のいずれかと組み合わせた）の、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２を中和する能力を研究した。５０ｕｇ（全抗体）の抗体用量を使用して、ＣＲ１＋ＲＡＺ１＋ＩＮＧ１またはＩＮＧ２のいずれかの組み合わせは、４０，０００マウスＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ１によってチャレンジしたマウスを完全に保護した。同用量の抗体は、ＢｏＮＴ／Ａ２によってチャレンジしたマウスの顕著な保護を示し、組み合わせＣＲ１＋ＲＡＺ１＋ＩＮＧ１が、最も強力であり、それは、４０，０００マウスＬＤ５０のＢｏＮＴ／Ａ２によってチャレンジしたマウスを完全に保護した（図２５）。したがって、本発明者らは、複数のＢｏＮＴサブタイプ（この場合において、ＢｏＮＴ／Ａ１およびＢｏＮＴ／Ａ２）を高親和性で結合し得る抗体を産生し、そして進化させることが可能であること、およびこれが、抗体が組み合わせられる場合に強力な中和をもたらすことを示した。
【０３１９】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は例示をのみを目的としていること、ならびにそれらを考慮した種々の改変および変更は当業者に対して示唆され、かつ本願の精神および全範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが、理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が本明細書に参考として援用される。
【０３２０】
【化２】
2008528060.tif 000032
【０３２１】
【化３】
2008528060.tif 000033
【０３２２】
【化４】
2008528060.tif 000034
【０３２３】
【化５】
2008528060.tif 000035
【０３２４】
【化６】
2008528060.tif 000036
【０３２５】
【化７】
2008528060.tif 000037
【０３２６】
【化８】
2008528060.tif 000038
【０３２７】
【化９】
2008528060.tif 000039
【０３２８】
【化１０】
2008528060.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０３２９】
【図１】図１は、ファージライブラリーを使用したインビトロ抗体産生のためのストラテジーを示す。ｍＲＮＡは、脾臓細胞から調製され、第１のｃＤＮＡ鎖が、調製され、そして抗体ＶＨ遺伝子および抗体ＶＬ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅される。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、ｓｃＦｖ遺伝子のレパートリーを作製するためにＰＣＲを使用して１つにランダムにスプライシングされる。上記ｓｃＦｖ遺伝子レパートリーは、ファージミドベクター中にファージミドマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）をコードする遺伝子（ｇＩＩＩ）と一緒にインフレームでクローニングされる。得られたファージ抗体ライブラリー中の各ファージは、その表面上にｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現し、そしてｓｃＦｖをコードする遺伝子を内部に含む。特異的抗原を結合するファージ抗体は、固定化された抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって結合しないファージ抗体から分離され得る。単一のラウンドの選択は、その抗体の親和性に依存して、２０〜１０，０００の範囲の因数によって抗原結合ファージ抗体の数を増加させる。溶出したファージ抗体は、Ｅ．ｃｏｌｉに感染させる為に使用され、そのＥ．ｃｏｌｉは、次いで、次のラウンドの選択のためのさらなるファージ抗体を産生する。ラウンドを繰り返した選択は、本来１０億分の１未満の頻度で存在した抗原結合ファージ抗体の単離を可能にする。
【図２】図２のパネルＡおよびパネルＢは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合するｓｃＦｖをエピトープマッピングするために使用される技術を例示するセンサーグラムを示す。エピトープマッピングは、対において研究されるｓｃＦｖを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を使用することによって行なわれた。各ｓｃＦｖは、上記ＢＩＡｃｏｒｅに注入され、そして飽和が達成されるまで、センサーチップ表面にカップリングされたＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合し得る。各ｓｃＦｖ単独についての結合された量（ＲＵ）は、上記２種のｓｃＦｖが、混合され、そして一緒に注入された場合に結合された量と比較された。点ａは、その後に注入の始まりが続くベースラインを示す。点ｂ１および点ｂ２は、最初の会合相を示す。点ｃ１および点ｃ２は、解離の始まりを示す。点ａと点ｃとの間のＲＵの差は、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合されたｓｃＦｖの量に等しい。パネルＡは、異なるエピトープを認識する２種のｓｃＦｖ（Ｃ２５およびＣ９）を示す。一緒に注入された２種のｓｃＦｖの結合された量（Ｃ９／Ｃ２５、点ｃ２）は、単独で注入されたその２種のｓｃＦｖ（ｃ１）の合計である。パネルＢは、エピトープを認識する２種のｓｃＦｖ  （Ｃ３９およびＣ２５）を示す。一緒に注入された２種のｓｃＦｖの結合された量（Ｃ２５／Ｃ３９；点ｃ）は、単独で注入されたその２種のｓｃＦｖ（ｃ）と同じである。点ｂ１と点ｃ１との間、点ｂ２と点ｃ２との間、および点ｂ１と点ｃとの間のＲＵの大きな差は、ｓｃＦｖと泳動緩衝液との間の屈折率の差に起因する。
【図３】図３は、マウス片側横隔膜モデルにおけるＢｏＮＴ／ＡのｓｃＦｖ中和の評価を示す。マウス片側横隔膜の電気刺激後に発生した単収縮張力は、２０のｐＭ  ＢｏＮＴ／Ａ（コントロール）、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ＋２０ｎＭのｓｃＦｖ  Ｓ２５、ｓｃＦｖ  Ｃ２５、ｓｃＦｖ  １Ｃ６、もしくはｓｃＦｖ  １Ｆ３（それぞれ、エピトープ１〜４を代表する）、または各２０ｎＭの最終濃度におけるＳ２５とＣ２５との組み合わせの添加前（−３０分〜０分）、および添加後に測定された。結果は、定常状態における単収縮張力（０分における）対時間の分数として表される。ｓｃＦｖ  １Ｃ６およびｓｃＦｖ  １Ｆ３が、５０％の単収縮減少までの時間を変化させないのに対して、ｓｃＦｖ  Ｃ２５およびｓｃＦｖ  Ｓ２５は、それを顕著に延長する。Ｓ２５とＣ２５との組み合わせは、Ｃ２５単独またはＳ２５単独と比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。
【図４】図４は、ｍＡｂによるインビトロ毒素中和、ｍＡｂの対によるインビトロ毒素中和、およびオリゴクローナルＡｂによるインビトロ毒素中和を示す。５０％の単収縮減少までの時間は、単離されたマウス片側横隔膜において測定され、そして毒素のみのコントロール、単一のｍＡｂ（Ｃ２５、Ｓ２５、または３Ｄ１２）、ｍＡｂの対（Ｃ２５＋Ｓ２５、Ｃ２５＋３Ｄ１２、または３Ｄ１２＋Ｓ２５）、およびオリゴクローナルＡｂ（Ｃ２５＋３Ｄ１２＋Ｓ２５）について繰り返された。単一のｍＡｂは、毒素のみと比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。ｍＡｂの対は、単一のｍＡｂと比較して、神経麻痺までの時間を顕著に延長した。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ｍＡｂによるインビボ毒素中和（図５Ａ）およびｍＡｂの対によるインビボ毒素中和（図５Ｂ）を示す。５０マイクログラムの全Ａｂは、２０マウスＬＤ５０の毒素または１００マウスＬＤ５０の毒素と混合され、そしてｉ．ｐ．に注入された。死亡までの時間および生存するマウスの数が、決定された。単一のｍＡｂは、２０ＬＤ５０からの顕著な保護を示さなかった。１００ＬＤ５０によってチャレンジされた全てのマウスは、ｍＡｂの任意の対を与えた場合、生存した。
【図６】図６は、ｍＡｂによるインビボ毒素中和、ｍＡｂの対によるインビボ毒素中和、およびオリゴクローナルＡｂによるインビボ毒素中和を示す。インビボ毒素中和は、漸増性の毒素チャレンジ用量におけるｍＡｂ、ｍＡｂの対、およびオリゴクローナルＡｂについて決定された。単一のｍＡｂは、顕著な保護を示さなかった。対照的に、全てのｍＡｂ対は、少なくとも１００ＬＤ５０を中和し、最も強力な対（Ｃ２５＋３Ｄ１２）に対して１，５００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジされたマウスの約５０％が、生存した。オリゴクローナルＡｂは、よりさらに強力であり、２０，０００ＬＤ５０の毒素によってチャレンジされたマウスの約５０％が、生存した。
【図７】図７は、抗体の溶液における平衡解離定数（Ｋｄ）を示す。単一のｍＡｂ  Ｃ２５およびｍＡｂ  ３Ｄ１２の溶液におけるＫｄは、漸増性のＢｏＮＴ  ＨＣ毒素の関数として存在する遊離のＡｂの量を測定することによって、フロー蛍光光度計において決定した。等モル量でＣ２５  ｍＡｂと３Ｄ１２  ｍＡｂとを組み合わせるで、Ｃ２５  Ｋｄが、１００倍より大きく減少した。第３のＡｂ（Ｓ２５）を加えることで、そのＫｄが、１８ｐＭまでさらに４倍減少した。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは、可溶性ｓｃＦｖ抗体のＥＬＩＳＡによる特徴付けを示す。アッセイは、ポリスチレンプレート上にコーティングされたそれぞれの示されたＢｏＮＴ血清型、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣおよびＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮを固定化することによって行なわれた。図８Ａ：細菌によって発現された、コーティングした抗原と反応性である免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖ抗体は、ペルオキシダーゼ結合体化ｍＡｂ抗Ｅ抗体（１：２５００）を用いて検出された。図８Ｂ：細菌によって発現された、コーティングした抗原と反応性である非免疫性ライブラリーに由来するｓｃＦｖ抗体は、９Ｅ１０抗体（１：５００）を用い、次いでペルオキシダーゼ結合体化抗マウス−Ｆｃ抗体を用いて検出された。そのアッセイの結果は、タンパク質濃度に対して正規化されていない４０５ｎｍにおける吸光度として示される。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣに結合するｓｃＦｖのエピトープマッピングのセンサーグラムを示す。点「ａ」：注入の始まり、点「ｂ」：注入の終わり、および点「ｃ」：結合されたｓｃＦｖの量。点ｂと点ｃとの間のＲＵの差は、ｓｃＦｖと泳動緩衝液との間の屈折率の差に起因する。図９Ａ：ｓｃＦｖ  ３Ａ６およびｓｃＦｖ  ３Ｄ１２は、その２種のｓｃＦｖが混合された場合に結合されたＲＵが増加しないことによって示されるように、同じエピトープを認識する。図９Ｂ：ｓｃＦｖ  ２Ａ９およびｓｃＦｖ  ２Ａ１は、その２種のｓｃＦｖが混合された場合に結合されたＲＵのほぼ相加的な増加によって示されるように、異なるエピトープを認識する。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣドメインを標的とするｓｃＦｖ抗体の個々の効果および組み合わせた効果を示す。図１０Ａ：マウス片側横隔膜の電気刺激後に発生した単収縮張力は、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ（コントロール）、２０ｐＭのＢｏＮＴ／Ａ＋２０ｎＭのクラスターＩのメンバー（３Ｄ１２）、クラスターＩＩのメンバー（３Ｆ１０）、Ｃ２５またはＳ２５の添加前（−３０分〜０分）、および添加後に測定された。ｓｃＦｖ  ３Ｆ１０が、５０％の単収縮減少までの時間を変化させなかったのに対して、ｓｃＦｖ  Ｃ２５、ｓｃＦｖ  Ｓ２５またはｓｃＦｖ  ３Ｄ１２は、５０％の単収縮減少までの時間を顕著に延長する。図１０Ｂ：Ｃ２５と、Ｓ２５または３Ｄ１２（クラスターＩ）との組み合わせは、５０％の単収縮減少までの時間を顕著に延長する。
【図１１】図１１は、公開されたボツリヌス神経毒素遺伝子の系統樹を示す。その系統樹は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアを使用して、公開されたクロストリジウム属の神経毒素遺伝子のＤＮＡ配列から構築された。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａ遺伝子配列の分析を示す。図１２Ａ：ＢｏＮＴ／Ａ遺伝子の系統樹は、２つのクラスター（Ａ１およびＡ２）を示す。図１２Ｂ：ＢｏＮＴ／Ａ１とＢｏＮＴ／Ａ２との間のアミノ酸側鎖の相違のモデル。ＢｏＮＴ／Ａ重鎖結合ドメインは、この図の上部における白色であり、青色の推定上のガングリオシド結合残基および赤色のガングリオシドを有する。重鎖トランスロケーションドメインは、橙色であり、そして軽鎖は、この図の下部における白色である。ＢｏＮＴ  Ａ１毒素とＢｏＮＴ  Ａ２毒素との間の側鎖の相違は、緑色で示される。
【図１３】図１３は、ＢｏＮＴ／Ｂ遺伝子配列の分析を示す。ＢｏＮＴ／Ｂ遺伝子の系統樹は、４つのクラスターを示す：ＢｏＮＴ／Ｂ１、ＢｏＮＴ／Ｂ２、非タンパク質分解性ＢｏＮＴ／Ｂ、および二価ＢｏＮＴ／Ｂ。クラスターの間の相違の％は、３．６％〜７．７％の範囲である。ＢｏＮＴ／Ａと同様に、最も大きい相違は、重鎖において見られる。
【図１４】図１４は、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定された場合の、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素およびＢｏＮＴ／Ａ２毒素に対するＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣモノクローナル抗体（Ｃ２５、Ｂ４、Ｓ２５、および３Ｄ１２）の結合を示す。ウェルは、示されたｍＡｂによってコーティングされ、次いで純粋かまたは複合体のＢｏＮＴ／Ａ１またはＢｏＮＴ／Ａ２の濃度の変動が行なわれた。毒素結合は、ポリクローナルウマＢｏＮＴ／Ａ抗血清を使用して検出された。Ａ１毒素は、塗りつぶした四角によって示される；Ａ２毒素は、中抜きの円によって示される。純粋な毒素は、実線であり；毒素複合体は、破線である。
【図１５】図１５は、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定された場合の、ＢｏＮＴ／Ａ１毒素およびＢｏＮＴ／Ａ２毒素に対する、ＢｏＮＴ／Ａトランスロケーションドメインおよび軽鎖モノクローナル抗体の結合を示す。方法は、図１４について記載される通りであった。
【図１６】図１６は、ｍＡｂ対のＢｏＮＴ／Ａ１毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｍＡｂトリプレットのＢｏＮＴ／Ａ１毒素またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体（図１７Ａ）またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素複合体（図１７Ｂ）は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｍＡｂトリプレットのＢｏＮＴ／Ａ１毒素またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素によってチャレンジされたマウスを保護する能力を示す。マウスＬＤ５０の範囲のＢｏＮＴ／Ａ１毒素複合体（図１７Ａ）またはＢｏＮＴ／Ａ２毒素複合体（図１７Ｂ）は、５０ｕｇの等モル比の示されたｍＡｂと混合され、そしてその混合物は、腹腔内に注射された。生存するマウスの数対チャレンジ用量が、示される。
【図１８】図１８。変異され、そして選択された抗体についての配列（ＨＵ−Ｃ２５（配列番号６）、ＡＲ１（配列番号７）、ＡＲ２（配列番号８）、ＡＲ３（配列番号９）、ＡＲ４（配列番号１０）、ＣＲ１（配列番号１１））。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂ。変異され、そして選択された抗体についての配列。図１９Ａ：３Ｄ１２（配列番号１２）、およびＲＡＺ１（配列番号１３））．図１９Ｂ：ＩＮＧ１（配列番号１４）、１Ｄ１１（配列番号１５）、２Ｇ１１（配列番号１６）、５Ｇ４（配列番号１７）、ＩＮＧ２（配列番号１８）。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂ。変異され、そして選択された抗体についての配列。図１９Ａ：３Ｄ１２（配列番号１２）、およびＲＡＺ１（配列番号１３））．図１９Ｂ：ＩＮＧ１（配列番号１４）、１Ｄ１１（配列番号１５）、２Ｇ１１（配列番号１６）、５Ｇ４（配列番号１７）、ＩＮＧ２（配列番号１８）。ダッシュは、保存された残基を示す。文字は、変異された残基を示す。
【図２０】図２０Ａおよび図２０Ｂは、ＨｕＣ２５（図２０Ａ）および３Ｄ１２（図２０Ｂ）ｓｃＦｖの酵母ディスプレイを使用した親和性の成熟のために使用されたスキームを示す。
【図２１−１】図２１Ａ〜図２１Ｄは、野生型の親和性および酵母が提示した親和性が成熟したｓｃＦｖの親和性を示す。図２１Ａ：Ｈｕ  Ｃ２５およびＡＲ１；図２１Ｂ：ＡＲ１およびＡＲ２；図２１Ｃ：ＡＲ２およびＡＲ４；図２１Ｄ：３Ｄ１２およびＲＡＺ１。
【図２１−２】図２１Ａ〜図２１Ｄは、野生型の親和性および酵母が提示した親和性が成熟したｓｃＦｖの親和性を示す。図２１Ａ：Ｈｕ  Ｃ２５およびＡＲ１；図２１Ｂ：ＡＲ１およびＡＲ２；図２１Ｃ：ＡＲ２およびＡＲ４；図２１Ｄ：３Ｄ１２およびＲＡＺ１。
【図２２】図２２は、野生型抗体および親和性が成熟した抗体を使用したフローサイトメトリーによるＢｏＮＴ／Ａの検出を示す。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、野生型および親和性が成熟した抗体によるＢｏＮＴ／Ａの中和の効力を示す。図２３Ａ：１００マウスＬＤ５０チャレンジ。図２３Ｂ：２００マウスＬＤ５０チャレンジ。
【図２４】図２４Ａ、図２４Ｂは、野生型抗体と親和性が成熟した抗体との対によるＢｏＮＴ／Ａの中和の効力を示す。図２４Ａ：５００マウスＬＤ５０チャレンジ。図２４Ｂ：５０００マウスＬＤ５０チャレンジ。
【図２５】図２５は、抗体の組み合わせによるＢｏＮＴ／Ａ２の中和を示す。
【図２６】図２６は、Ｈｕ−Ｃ２５系統の抗体（ＨＵ−Ｃ２５（配列番号１９）、ＡＲ１（配列番号２０）、ＡＲ２（配列番号２１）、ＡＲ３（配列番号２２）、ＡＲ４（配列番号２３）、ＣＲ１（配列番号２４）、およびＣＲ２（配列番号２５））のアライメントを示す。
【図１】
2008528060.tif 000041
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2008528060.tif 000056
【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月18日(2007.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008528060000001.app
【国際調査報告】
2008528060.tif 000079