(57)【要約】  本発明は、単離された変異体ａｔｐＥタンパク質、および前記変異体ａｔｐＥタンパク質から出発してＡＴＰアーゼ結合ドメインの同定を提供する。本発明はまた、関連する核酸、ベクター、宿主細胞、製薬学的組成物および製品も提供する。本発明はさらに、試験化合物がａｔｐＥタンパク質、すなわち本発明のＡＴＰアーゼ結合ドメインと相互作用するかどうかの決定方法、ならびに、とりわけ抗菌薬、より具体的には抗ミコバクテリウム薬として、なおより具体的には被験体における結核を処置するための前記試験化合物を含んでなる製薬学的組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｔｐＥタンパク質の耐性を賦与する突然変異部位を含んでなることを特徴とする、ＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位。
【請求項２】
耐性を賦与する突然変異部位が、Ｍｔｂ＿Ｓ（配列番号１）若しくはＭｔｂ＿Ｒ（配列番号２）の番号付けを参照として採用して、ａｔｐＥタンパク質のアミノ酸１４ないし３４およびアミノ酸５３ないし６９を指す、請求項１に記載の結合部位。
【請求項３】
１個のＣサブユニットの少なくともアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４およびＰｈｅ６５、ならびに１個のＡサブユニットのアミノ酸Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５、Ａｒｇ１８６を含んでなる、請求項１に記載の結合部位。
【請求項４】
アミノ酸が、表３、４若しくは５のいずれかの原子座標、または約１．５Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を有する、請求項４に記載の結合部位。
【請求項５】
ＡＴＰアーゼのＦ０部分と相互作用する化合物、および抗菌化合物としてのそれらの潜在能力の同定方法における、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の結合部位の使用。
【請求項６】
ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法であって、前記方法が；
−請求項１ないし４のいずれかに記載の結合部位の三次元構造を生成させるための分子モデル化技術；
−コンピュータによる手段を使用して試験化合物と該結合部位の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること；および
−前記フィッティング操作の結果を解析して、試験化合物の該結合部位の三次元構造との会合を定量化すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項７】
三次元構造が、表３、４若しくは５のいずれかの原子座標、または約１．５Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を使用して、１個のＣサブユニットの少なくともアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４およびＰｈｅ６５、ならびに１個のＡサブユニットのアミノ酸Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６を伴い生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
三次元構造が、表３、４若しくは５のいずれかのＡ鎖のアミノ酸Ａｌａ２１、Ｇｌｙ２５；表３、４若しくは５のいずれかのＫ鎖のアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｐｈｅ５４、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５：表３、４若しくは５のいずれかのＬ鎖のアミノ酸Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｇｌｙ２０、Ａｌａ２１、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｙ２３、Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２５、Ｉｌｅ２６、Ｇｌｙ２７、Ａｓｐ２８、Ｇｌｙ２９、Ａｌａ３１、Ｐｈｅ５３、Ｔｈｒ５６、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｌｅｕ５９、Ｖａｌ６０、Ｇｌｕ６１、Ａｌａ６２、Ａｌａ６３／Ｐｒｏ６３、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；ならびに表３、４若しくは５のいずれかのＭ鎖のアミノ酸Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６の原子座標を使用して生成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
耐性を賦与する突然変異部位でａｔｐＥタンパク質と相互作用する化合物を被験体に投
与することを含んでなる、微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法。
【請求項１０】
耐性を賦与する突然変異部位が、Ｍｔｂ＿Ｓ（配列番号１）若しくはＭｔｂ＿Ｒ（配列番号２）の番号付けを参照として採用して、ａｔｐＥタンパク質のアミノ酸１４ないし３４およびアミノ酸５３ないし６９を指す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか１つに記載の結合部位と相互作用する化合物を被験体に投与することを含んでなる、微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法。
【請求項１２】
微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法における、前述のスクリーニング方法のいずれかを使用して同定される化合物の使用。
【請求項１３】
グラム陽性細菌、より具体的にはミコバクテリウムにより引き起こされる感染症、ならびに最も具体的にはＭ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ結核菌−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、カメ結核菌（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、Ｍ．フォルツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒｅａ）、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）およびＭ．ラネ（Ｍ．ｒａｎａｅ）により引き起こされる感染症に対し処置するための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
中枢神経系の感染症、外耳感染症、急性中耳炎のような中耳の感染症、硬膜静脈洞の感染症、眼の感染症、歯、歯肉および粘膜の感染症のような口腔の感染症、上気道感染症、下気道感染症、泌尿生殖器感染症、胃腸感染症、産婦人科感染症、敗血症、骨および関節の感染症、皮膚および皮膚構造の感染症、細菌性心内膜炎、火傷、手術の抗菌的予防、ならびに癌化学療法を受領している患者若しくは臓器移植患者のような免疫抑制患者における抗菌的予防を処置するための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
細菌感染症（但し、前記感染症がミコバクテリウム感染症以外である）を処置するための医薬品の製造におけるＤＡＲＱ  Ｊの使用。
【請求項１６】
突然変異が、図２の配列アライメントに示されるところのアミノ酸２０ないし４０、とりわけ３０ないし４０、若しくはアミノ酸６０ないし７５、とりわけ６２ないし７３のいずれか１つに位置する最低１個の点突然変異よりなる、単離された変異体ａｔｐＥタンパク質。
【請求項１７】
突然変異が、図２の配列アライメントに示されるところのアミノ酸３４若しくはアミノ酸６９の最低１個の点突然変異よりなる、請求項１６に記載の単離された変異体ａｔｐＥタンパク質。
【請求項１８】
Ｍｔｂ＿Ｒ（配列番号２）、Ｍｓｍ＿Ｒ０９（配列番号４）、Ｍｓｍ＿Ｒ１０（配列番号５）、およびＭｔｂ＿Ｒ、Ｍｓｍ＿Ｒ０９若しくはＭｓｍ＿Ｒ１０に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択される、請求項１７に記載の単離された変異体ａｔｐＥタンパク質。
【請求項１９】
請求項１６ないし１８のいずれか１つに記載の単離された変異体ａｔｐＥタンパク質をコードする単離された核酸配列。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸配列を含んでなるベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを運搬する宿主細胞。
【請求項２２】
抗菌化合物の同定方法であって、前記方法が、
ａ）ａｔｐＥタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させること、および
ｂ）該試験化合物がａｔｐＥタンパク質と相互作用するかどうかを決定すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項２３】
ａｔｐＥタンパク質が；
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１０５９８、またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１０５９８に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９８％の配列同一性を有するタンパク質；および
請求項１ないし３のいずれか１つに記載の変異体ａｔｐＥタンパク質
よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
単離されたａｔｐＥタンパク質に試験化合物が結合するかどうかの同定方法であって、前記方法が；
ａ）ａｔｐＥタンパク質を発現する細胞（こうした細胞は前記ａｔｐＥタンパク質を通常は発現しない）を、ａｔｐＥタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存在下で試験化合物と接触させること、
ｂ）ａｔｐＥタンパク質に結合することが既知の化合物を参照として使用して、ａｔｐＥタンパク質への該試験化合物の結合を測定すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項２５】
ａｔｐＥタンパク質が；
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１０５９８、またはＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１０５９８に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９８％の配列同一性を有するタンパク質；および
請求項１６ないし１８のいずれか１つに記載の変異体ａｔｐＥタンパク質
よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ａｔｐＥタンパク質に結合することが既知の化合物が検出可能に標識されかつ（Ｊ）よりなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
段階ａ）が、ａｔｐＥタンパク質を含んでなる細胞組成物を、ａｔｐＥタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存在下で試験化合物と接触させることよりなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
細胞組成物が、請求項２１に記載の細胞から得られる膜調製物よりなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法であって、前記方法が；
ａ）分子モデル化技術を使用してａｔｐＥタンパク質の三次元構造を明確に表すこと、
ｂ）コンピュータによる手段を使用して、試験化合物とａｔｐＥタンパク質の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること、および
ｃ）前記フィッティング操作の結果を解析して、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造との試
験化合物の会合を定量化すること
を含んでなる、上記方法。
【請求項３０】
ａｔｐＥタンパク質の三次元構造が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（タンパク質データベース１Ｑ０１）のＩｌｅ２８、Ｇｌｕ６１およびＩｌｅ６３の原子座標＋／−１０Åを超えない前記アミノ酸のバックボーン原子の二乗平均偏差を使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａｔｐＥタンパク質の三次元構造が、表６若しくは７の原子座標＋／−１．５Åを超えない前記アミノ酸のバックボーン原子の二乗平均偏差を使用して生成される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離された変異体ａｔｐＥタンパク質、および前記変異体ａｔｐＥタンパク質から出発してＡＴＰアーゼ結合ドメインの同定を提供する。本発明はまた、関連する核酸、ベクター、宿主細胞、製薬学的組成物および製品も提供する。本発明はさらに、試験化合物がａｔｐＥタンパク質と、すなわち本発明のＡＴＰアーゼ結合ドメインと相互作用するかどうかの決定方法、ならびに、とりわけ抗菌薬としての、より具体的には抗ミコバクテリウム薬としての、なおより具体的には被験体における結核を処置するための前記試験化合物を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ後、結核（ＴＢ）は世界の成人の死亡の第一位の原因（年あたり２〜３百万の死亡）であり、そして世界的な貧困および被害の軽減に対する決定的な障害である（非特許文献１）。該疾患の復活に寄与する因子は、多くの国における抗ＴＢプログラムの実行における困難、免疫抑制個体の数の劇的な増加（主としてＨＩＶ感染による）、およびＴＢが固有である地域を通過しかつそこからの人々の動きを包含する。ＴＢおよびＨＩＶの異常発生は、共感染した人々（現在１，１００万人の成人）において相互に刺激し、罹患率および死亡率双方を増大させる（非特許文献２、３）。加えて、ＴＢはＨＩＶに感染した人々における死亡の第一位の原因である（非特許文献４）。
【０００３】
第一列の抗ＴＢ薬物レジメンは９０％以上の有効率を達成し得るとは言え、それらの複雑さは、十分な医学的支援およびＴＢ処置プログラムが利用可能でない場合に乏しいコンプライアンス、そして順に耐性の発生につながり得る（非特許文献５）。ＴＢの多剤耐性（ＭＤＲ）株は処置を大きく複雑にする（非特許文献６）。結核治療薬開発のための世界同盟（Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｆｏｒ  ＴＢ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、いかなる新たな処置も、既存の治療法を上回る以下の３つの利点、すなわち、ＴＢの効果的処置を短縮若しくは単純化すること；ＭＤＲ−ＴＢに対する有効性を増大させること；および潜伏型のＴＢ感染の処置を改良することの最低１つを提供すべきであると勧告した。こうした新薬は患者コンプライアンスを大きく改善して、それにより世界保健機関（ＷＨＯ）の直接監視下短期化学療法（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  Ｏｂｓｅｒｖｅｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｓｈｏｒｔ−ｃｏｕｒｓｅ）（ＤＯＴＳ）戦略のようなＴＢ処置プログラムの費用を低減させるとみられる（非特許文献７）。
【０００４】
現在前臨床および臨床開発中のより新たな抗ＴＢの候補は、既存の薬物群（モキシフロキサシンのような）、若しくはＭＪＨ−９８−１−８１（イソニアジドから）、オキサゾリジノンおよびリファペンチン（リファンピンの近接アナログ）のような第一列の薬物のアナログのいずれかからである傾向がある（非特許文献８）。これらの新薬は強力でありうるとは言え、アナログ化合物は耐性に対する一時的な解決策のみを提供する（非特許文献９）。それらは既存の薬物群と同一の作用機序に頼るからである。
【０００５】
抗生物質は、一般に、通常、細菌の代謝を特定の機序により阻害することにより細菌の複製を阻害する。例えば、イソニアジドはミコール酸（細胞壁の必要な成分）を合成する酵素機構を妨害する一方、リファンピシンはＤＮＡからＲＮＡを転写するための細菌の機構を妨害する。従って、既知の剤に比較して、細胞の増殖および複製の異なったミコバクテリウム特異的局面を標的とする抗ＴＢ化合物の新規同定方法を探索することが興味深い。
【非特許文献１】Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｆｏｒ  ＴＢ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  ｆａｓｔｅｒ  ＴＢ  ｃｕｒｅ（２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｂａｌｌｉａｎｃｅ．ｏｒｇ）
【非特許文献２】Ｅ．Ｌ．Ｃｏｒｂｅｔｔら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｖｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６３、１００９（２００３）
【非特許文献３】ＵＮＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｕｐｄａｔｅ  ２００３（２００３；ｗｗｗ．ｕｎａｉｄｓ．ｏｒｇ／Ｕｎａｉｄｓ／ＥＮ／Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）。
【非特許文献４】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｈｅａｌｔｈ＿ｔｏｐｉｃｓ／ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ／ｅｎ／）。
【非特許文献５】Ｒ．Ｊ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｐ．Ｐ．Ｎｕｎｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６３、１０５５（２００１）。
【非特許文献６】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ  １０４（２００４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１０４／ｅｎ／）。
【非特許文献７】Ａ．Ｊ．Ｃｌａｘｔｏｎ、Ｊ．Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ．Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２３、１２９６（２００１）。
【非特許文献８】Ｎ．Ｌｏｕｎｉｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５、３４８２（２００１）。
【非特許文献９】Ａ．Ｓ．Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、Ｊ．Ｈ．Ｇｒｏｓｓｅｔ、Ｗ．Ｒ．Ｂｉｓｈａｉ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３、４３２（２００３）。
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、とりわけ（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）および（配列番号５）から選択されるアミノ酸配列によりコードされる単離された変異体ａｔｐＥタンパク質、とりわけ（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９）および（配列番号１０）よりなる群から選択される前記変異体ａｔｐＥタンパク質をコードする単離された核酸、ならびに本核酸を含んでなるベクターを提供する。特定の一態様において、変異体ａｔｐＥタンパク質は配列番号２によりコードされ、また、前記タンパク質をコードする単離された核酸配列は配列番号７よりなる。
【０００７】
本発明はさらに、本発現ベクターをその中に有する宿主細胞を含んでなる宿主−ベクター系を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、変異体ａｔｐＥタンパク質が該細胞中で抗菌耐性を誘導する、前記タンパク質を含んでなる単離された細胞を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、抗菌化合物の同定方法を提供し、前記方法は、
ａ）ａｔｐＥタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させる段階、および
ｂ）該試験化合物がａｔｐＥタンパク質と相互作用するかどうかを決定する段階
を含んでなる。
【００１０】
本発明はさらに、ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法を提供し、前記方法は；
（ａ）分子モデル化技術を使用して、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造を生成させること；
（ｂ）コンピュータによる手段を使用して、試験化合物と、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること；および
（ｃ）前記フィッティング操作の結果を解析して、試験化合物のａｔｐＥタンパク質の三次元構造との会合を定量化すること
を含んでなる。
【００１１】
１個のＣサブユニットの少なくともアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４およびＰｈｅ６５；１個のＡサブユニットのアミノ酸Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８３、Ｓｅｒ１８４、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６を含んでなり、かつ、前記アミノ酸は表３、４若しくは５のいずれかの原子座標を有する、ＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位を提供することもまた、本発明の一目的である。
【００１２】
さらなる一目的において、本発明は、ＡＴＰアーゼのＦ０部分と相互作用する化合物の同定方法、および、抗菌化合物としてのそれらの潜在能力、とりわけ抗ミコバクテリウム化合物の同定方法における、前述の結合ドメインの使用を提供する。
【００１３】
従って、ＡＴＰアーゼのＦ０部分と、とりわけ耐性を賦与する突然変異部位でａｔｐＥタンパク質と、若しくは本発明の結合部位と相互作用する化合物を被験体に投与することを含んでなる、微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法を提供することが、本発明の一目的である。本発明はさらに、前述のスクリーニング方法のいずれかを使用してａｔｐＥタンパク質と相互作用する剤を被験体に投与することを含んでなる、結核に苦しめられる被験体の処置方法を提供する。ＡＴＰアーゼのＦ０部分、とりわけａｔｐＥタンパク質と相互作用する化合物の使用を含んでなる処置方法において、ＡＴＰアーゼのＦ０部分、およびとりわけａｔｐＥタンパク質と相互作用することが以前に知られている化合物は除外されるべきである。より具体的には、開示された処置方法のいずれかにおける（１１）に記述されるＤＡＲＱ  Ｊ化合物の使用が除外されるべきである。
【００１４】
本発明はさらに、細胞中でａｔｐＥタンパク質と相互作用する剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。最後に、本発明は、（ａ）製薬学的剤が細胞中でａｔｐＥタンパク質と相互作用し、かつ（ｂ）包装が被験体における細菌感染症を処置するための該剤の使用を示すラベルを含んでなる、包装および製薬学的剤を含んでなる製品を提供する。特定の一態様において、本発明は抗菌医薬品の製造におけるＤＡＲＱ  Ｊの使用を提供する。
【００１５】
本発明のこれおよびさらなる局面は下でより詳細に論考されるであろう。
【００１６】
［図面の簡単な説明］
表１  多様なミコバクテリウム種の増殖を９０％阻害した、リードＤＡＲＱ化合物（Ｊ）の最小阻害濃度（ＭＩＣ）。試験した株の数は別の方法で示されない限りｎ＝１であった。
【００１７】
表２  ＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位の周囲のアミノ酸。
【００１８】
表３  野性型およびＤＡＲＱ  Ｊ変異体ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株双方由来のＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位の周囲のアミノ酸の原子座標。
【００１９】
表４  野性型ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位の原子座標。
【００２０】
表５  ＤＡＲＱ  Ｊ変異体ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株のＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位の原子座標。
【００２１】
表６  ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の変異体ａｔｐＥタンパク質（配列番号２）の原子座標。
【００２２】
表７  ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の野性型ａｔｐＥタンパク質（配列番号１）の原子座標。
【００２３】
図１  下でＪ若しくはＤＡＲＱ  Ｊともまた称されるＲ２０７９１０の絶対配置。
【００２４】
図２  ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）変異体のａｔｐＥタンパク質配列アライメント。Ｍｔｂ＿Ｓ：薬物感受性株ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲｖのａｔｐＥ（１−８１）。受託番号：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ１０５９８（配列番号１）。Ｍｔｂ＿Ｒ：薬物耐性株ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＢＫ１２のａｔｐＥ（１−８１）（配列番号２）。Ｍｓｍ＿Ｓ：薬物感受性株スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ（１−８６）。ゲノム研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により得られた配列（配列番号３）。Ｍｓｍ＿Ｒ０９（配列番号４）およびＲ１０（配列番号５）：薬物耐性株スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ（１−８６）。社内で得られた配列。Ｈｕｍａｎ：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＡＴＰ５Ｇ３（６６−１４２）。受託番号：Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＰ０００００２８４７２７。上の番号付け：ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ。下の番号付け：ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＡＴＰ５Ｇ３（６６−１４２）陰影はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用するアミノ酸類似性を示す（黒＝高、灰色＝中）。矢印は耐性株で観察される点突然変異の位置を示す。
【００２５】
図３  ＤＡＲＱ  Ｊ、イソニアジドおよびＤＣＣＤの存在下でのヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の全細胞ＡＴＰ測定。野性型ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＤＡＲＱ  Ｊ変異体ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）双方で５２６ｎｍで測定したオキシルシフェリンの相対発光単位。
【００２６】
図４  一緒になってＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位を形成する３個のＣサブユニット（Ａ鎖、Ｋ鎖およびＬ鎖）ならびにＡサブユニット（Ｍ鎖）のリボン表示。
【００２７】
［発明の詳細な記述］
定義
別の方法で本明細書に明らかに提供されるところを除き、本出願で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、下に示される意味するところを有する。
【００２８】
「ａｔｐＥタンパク質」は、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）についてＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリＱ１０５９８により表されるところのＡＴＰアーゼ複合体のＦ０サブユニットのＣ鎖、または前記ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）配列に対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９９％の配列同一性を有するタンパク質を意味している。
【００２９】
ＡＴＰアーゼ、ＡＴＰ合成酵素若しくはＦ０Ｆ１ＡＴＰアーゼともまた称される「Ｆ１Ｆ０ＡＴＰアーゼ」は、ＡＴＰの合成若しくは加水分解を触媒する大型の多サブユニット複合体を意味している。Ｆ０Ｆ１ＡＴＰアーゼは２ドメイン、すなわち、膜に対し外部でありかつ触媒部位を含有するＦ１部位、および二層におよびかつプロトン孔を含有するＦ０部分より構成される。ＡＴＰアーゼは、細菌の形質膜、葉緑体のチラコイド膜、およびミトコンドリアの内膜で見出され、そこでそれらはプロトンの電子化学的勾配のエネルギーを使用してＡＴＰ合成を駆動する。
【００３０】
「投与すること」は、当業者に既知の多様な方法および送達系のいずれかを使用して遂げられ若しくは実施されるある様式で送達することを意味している。投与することは、例えば、局所で、静脈内に、心膜に、経口で、植込物を介して、経粘膜で、経皮で、筋肉内に、皮下に、腹腔内に、クモ膜下腔内に、リンパ内に（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ）、病変内に、若しくは硬膜外に実施し得る。投与することはまた、例えば１回、複数回、および／または１つ若しくはそれ以上の延長された期間にわたっても実施し得る。
【００３１】
「宿主細胞」は、限定されるものでないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を挙げることができる。細菌細胞は、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法および微小注入法のような当該技術分野で公知の方法によりトランスフェクトし得る。
【００３２】
ａｔｐＥタンパク質に関して「単離された」は、ａｔｐＥがその天然の機能を保持しかつその天然の環境中の他のタンパク質の数種若しくは全部を含まない、ａｔｐＥタンパク質を含有する膜断片調製物若しくは他の適する調製物を意味している。それは、Ｆ０Ｆ１ＡＴＰアーゼのＦ０部分、とりわけ本発明の変異体ａｔｐＥタンパク質を含んでなるＦ０部分を含んでなる膜調製物を包含することを意味している。
【００３３】
「細菌細胞」はいかなる細菌細胞も意味している。細菌細胞は、正常、異常および形質転換され、かつ、ミコバクテリウム、とりわけヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、コリネバクテリウム、ノカルジア類、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌および腸球菌のようなグラム陽性細菌、若しくは例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のようなグラム陰性細菌により例示される細胞を制限なしに包含する。
【００３４】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は本明細書で互換性に使用され、そしてそれぞれデオキシリボヌクレオチドおよび／若しくはリボヌクレオチドのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは天然に存在し得るか、若しくはその合成のアナログであり得る。
【００３５】
「生理学的条件」という用語は、所定の細胞に関して、該細胞の生化学的環境を通常構成しうる条件を意味している。細胞の生化学的環境は、該細胞が通常曝露される数種若しくは全部のプロテアーゼを制限なしに包含する。こうした条件は、限定されるものでないがｉｎ  ｖｉｖｏ状態を挙げることができる。
【００３６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は本明細書で互換性に使用され、そしてそれぞれアミノ酸残基のポリマーを意味している。アミノ酸残基は天然に存在し得るか、若しくはそれらの化学的アナログであり得る。ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質はまた、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、水酸化およびＡＤＰ−リボシル化のような修飾も包含し得る。
【００３７】
「被験体」は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットのようなげっ歯類、シチメンチョウ、ニワトリおよび霊長類を制限なしに包含する哺乳動物若しくは鳥類のようないかなる動物も意味している。好ましい態様において、被験体はヒトである。
【００３８】
「処置すること」は、被験体における疾患を除外すること、その経過を反転すること、その進行を遅らせること、その症状を低下させること、若しくは別の方法で改善することを制限なしに包含する。
【００３９】
「ベクター」は当該技術分野で既知のいかなる核酸ベクターも意味している。こうしたベクターは、限定されるものでないが、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクターを挙げることができる。
【００４０】
「候補物質」および「試験化合物」という用語は互換性に使用され、そして、生物学的応答修飾因子として別の部分すなわちａｔｐＥタンパク質と相互作用すると考えられている物質を指す。例えば、代表的な候補物質は、ａｔｐＥタンパク質と相互作用すると考えられ、また、ＡＴＰアーゼ活性を改変すると考えられている。本発明の方法を使用して検討され得る例示的候補物質は、限定されるものでないが、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、糖、オリゴヌクレオチド、化合物小分子およびモノクローナル抗体を挙げることができる。
【００４１】
「調節する」は、野性型若しくは変異体ａｔｐＥタンパク質のいずれかの若しくは全部の化学的および生物学的活性若しくは特性の増大、減少若しくは他の変化を意味している。
【００４２】
「相互作用する」は、分子間の「結合」相互作用を包含する分子間の検出可能な相互作用を意味している。相互作用は、例えば、性質がタンパク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸であり得る。こうした相互作用は技術既知の手順、例えば酵母２ハイブリッドアッセイ、免疫沈降、ＳＰＡアッセイ若しくはフィルター結合アッセイを使用して検出し得る。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「原子座標」若しくは「構造座標」という用語は、各原子についてＸ、Ｙ、ＺおよびＢを包含するタンパク質データバンク（ＰＤＢ）フォーマットで原子の位置を記述する数学的座標を指す。当業者は、Ｘ線結晶学により決定される一組の構造座標が標準誤差を伴わなくはないことを理解している。本発明の目的上、表３、４、５、６若しくは７の対応する原子座標の水素以外の原子位置に重ね合わせられる場合に１．５Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を有するいかなる供給源からのＡＰＴ合成酵素の構造座標のいずれの組も、実質的に同一若しくは相同と考えられる。より好ましい一態様において、表３、４、５、６若しくは７の対応する原子座標の水素以外の原子位置に重ね合わせられる場合に０．７５Å未満の水素以外の原子の二乗平均偏差を有するいかなる供給源からのＡＰＴ合成酵素の構造座標のいずれの組も、実質的に同一と考えられる。
【００４４】
本発明の態様
変異体ａｔｐＥタンパク質
本発明は、単離された変異体ａｔｐＥタンパク質、とりわけ細菌のａｔｐＥタンパク質、より具体的にはミコバクテリウムのａｔｐＥタンパク質、なおより具体的にはヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）若しくはスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥタンパク質を提供する。突然変異は単一の点突然変異、挿入若しくは欠失から選択される。本発明の一態様において、突然変異は、図２の配列アライメントに示されるところのアミノ酸２０ないし４０、とりわけ３０ないし４０のいずれか１つ、好ましいアミノ酸３４の、若しくはアミノ酸６０ないし７５の、とりわけ６２ないし７３のいずれか１つ、好ましくはアミノ酸６９に位置する最低１個の点突然変異よりなる。さらなる一態様において、単離された変異体ａｔｐＥタンパク質は、図２に示されるところのＭｔｂ＿Ｒ（配列番号２）、Ｍｓｍ＿Ｒ０９（配列番号４）およびＭｓｍ＿Ｒ１０（配列番号５）、または前述のアミノ酸配列のいずれかに対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列のから選択される。
【００４５】
本発明はさらに、前記変異体ａｔｐＥタンパク質をコードする単離された核酸を提供する。一態様において、前記核酸配列は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、Ｖｏｌ．２６９（１０）、ｐ．７２８５−７２８９に記述されるようなＦ０部分をコードする全部の遺伝子よりなり、ここで前記遺伝子は単一のプロモーターから転写され、そして本発明の変異体ａｔｐＥタンパク質をコードする核酸配列を含んでなる。核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡ、および好ましくはＤＮＡであり得、そして、さらなる一態様において、Ｍｔｂ＿Ｒ（配列番号７）Ｍｓｍ＿Ｒ０９（配列番号９）、Ｍｓｍ＿Ｒ１０（配列番号１０）をコードする核酸配列、または前述の核酸配列のいずれかに対する最低７０、８０、９０、９５、９７若しくは９８％の配列同一性を有する核酸配列から選択される。
【００４６】
核酸およびポリペプチド配列の同一性パーセントは、参照配列をクエリ配列と比較する商業的に入手可能なアルゴリズムを使用して計算し得る。以下のプログラム（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供される）、すなわち、ＢＬＡＳＴ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して相同性／同一性を決定することができ、これらはデフォルトのパラメータとともに使用しうる。
【００４７】
アルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン州マディソン）は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用して、一致の数を最大にしかつギャップの数を最少にする２種の完全な配列を整列させる。一般に、ギャップ創製ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝４を伴うデフォルトのパラメータを使用する。
【００４８】
核酸配列若しくはその一部分とクエリ配列の間の最良の全体的一致の別の決定方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．、６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムの使用である。該プログラムは包括的配列アライメントを提供する。前記包括的配列アライメントの結果は同一性パーセントにある。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ検索で使用される適するパラメータは：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝４、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、結合ペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝３０、無作為化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ）＝１、ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５およびウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ）＝５００若しくはヌクレオチド塩基中のクエリ配列長さのいずれか短い方、である。アミノ酸アライメントの同一性および類似性パーセントを計算するための適するパラメータは：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、結合ペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、無作為化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ）＝１、ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５およびウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ）＝５００若しくはヌクレオチド塩基中のクエリ配列長さのいずれか短い方、である。
【００４９】
本発明はさらに、本核酸を含んでなるベクターを提供する。一態様において、ベクター
はプラスミドベクターである。
【００５０】
本発明はさらに、本プラスミドベクターをその中に有する宿主細胞を含んでなる宿主−ベクター系を提供する。該細胞は原核生物若しくは真核生物であり得、一態様において、宿主細胞は細菌細胞、とりわけ例えばヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）若しくはスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のようなミコバクテリウム細胞である。
【００５１】
本発明はさらに、変異体ａｔｐＥタンパク質（このタンパク質は細胞中で抗菌耐性を誘導する）を含んでなる単離された細胞を提供する。一態様において、単離された細胞は、変異体のミコバクテリウムａｔｐＥタンパク質で形質転換された、とりわけ、突然変異が図２の配列アライメントに示されるところのアミノ酸２０ないし４０、より具体的には３０ないし４０のいずれか１つ、好ましいアミノ酸３４に、若しくはアミノ酸６０ないし７５、とりわけ６２ないし７３のいずれか１つ、好ましくはアミノ酸６９に位置する最低１個の点突然変異よりなる変異体のミコバクテリウムａｔｐＥタンパク質で形質転換されたスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）細胞よりなる。
【００５２】
スクリーニング方法
本発明はさらに、抗菌化合物の同定方法を提供し、前記方法は
（ａ）ａｔｐＥタンパク質を発現する細胞を、生理学的条件下で試験化合物と接触させる段階；
（ｂ）該試験化合物がａｔｐＥタンパク質と相互作用するかどうかを決定する段階
を含んでなる。
【００５３】
一態様において、前述の方法で使用されるａｔｐＥタンパク質は、細菌のａｔｐＥタンパク質、とりわけミコバクテリウムのタンパク質よりなり、かつ、野性型ａｔｐＥタンパク質ならびに上述されたところの変異体ａｔｐＥタンパク質の双方を包含することを意味している。本発明のさらなる一態様において、前述の方法で使用されるミコバクテリウムのａｔｐＥタンパク質は、本発明の変異体のミコバクテリウムａｔｐＥタンパク質よりなる。前述のアッセイの特定の一態様において、本発明の変異体ａｔｐＥタンパク質で形質転換した細胞を使用し、そして、試験化合物の前記ａｔｐＥタンパク質との相互作用を、前記変異体ａｔｐＥタンパク質を含んでなるＦ１Ｆ０−ＡＴＰアーゼの酵素活性の可能な阻害を測定することにより評価する。Ｆ１Ｆ０−ＡＴＰアーゼ活性の阻害は、例えば、ＡＤＰの産生をピルビン酸キナーゼおよび乳酸脱水素酵素の反応を介するＮＡＤＨの酸化に結びつけることによる酵素活性の検出を用いる、Ｆ１Ｆ０−ＡＴＰアーゼおよび基質としてのＡＴＰを含んでなる系への物質の添加によるような技術既知の手順を使用して測定する。
【００５４】
アッセイの一態様において、ａｔｐＥタンパク質を結合アッセイで使用しうる。結合アッセイは競合的でも若しくは非競合的でもよい。こうしたアッセイは、どの化合物（あれば）がポリペプチドに結合することが可能であるかを決定するための多数の化合物の迅速スクリーニングを提供し得る。
【００５５】
この情況内で、本発明は、試験化合物が本発明の単離されたａｔｐＥタンパク質に結合するかどうか、そして従って潜在的抗菌化合物であるかどうかの同定方法を提供し、前記方法は；
ａ）ａｔｐＥタンパク質を発現する細胞（こうした細胞は前記ａｔｐＥタンパク質を通常は発現しない）を、ａｔｐＥタンパク質を結合することが既知の化合物の存在および非存在下に試験化合物と接触させること、
ｂ）ａｔｐＥタンパク質に結合することが既知の化合物を参照として使用してａｔｐＥタンパク質への試験化合物の結合を測定すること
を含んでなる。
【００５６】
試験化合物、若しくは下で参照化合物ともまた称されるａｔｐＥタンパク質に結合することが既知の化合物の結合を、タンパク質−リガンド相互作用の技術既知の試験方法を使用して評価する。例えば、こうした結合は標識した物質若しくは参照化合物を使用することにより測定し得る。試験化合物若しくは参照化合物、とりわけ化合物Ｊ（図１）を、当該技術分野で既知のいずれかの便宜的様式、例えば放射活性で、蛍光で若しくは酵素的に標識し得る。前述の方法の特定の一態様において、参照化合物としてもまた知られるａｔｐＥタンパク質に結合することが既知の化合物を、検出可能に標識し、そして。前記標識を使用して、試験化合物のａｔｐＥタンパク質への結合を測定する。前記参照化合物は、放射標識、蛍光標識若しくは酵素標識、より好ましくは放射標識を使用して標識する。
【００５７】
本発明の代替の一態様において、前述の結合アッセイは、細胞組成物、すなわち上で定義されたところのａｔｐＥタンパク質を含んでなる細胞抽出物、細胞画分若しくは細胞小器官（ｏｒｇａｎｅｌ）上で実施される。より具体的には、前述の結合アッセイは、細胞組成物、すなわち上で定義されたところのａｔｐＥタンパク質を含んでなる膜調節物上で実施され、前記細胞組成物すなわち膜調製物は、変異体のミコバクテリウムａｔｐＥタンパク質で形質転換された、とりわけ、突然変異が図２の配列アライメントに示されるところのアミノ酸２０ないし４０、とりわけ３０ないし４０のいずれか１つ、好ましいアミノ酸３４に、またはアミノ酸６０ないし７５、とりわけ６２ないし７３のいずれか１つ、好ましくはアミノ酸６９に位置する最低１個の点突然変異よりなる変異体のミコバクテリウムａｔｐＥタンパク質で形質転換されたスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）細胞から得られる。Ｍｔｂ＿Ｓ（配列番号１）若しくはＭｔｂ＿Ｒ（配列番号２）の番号付けを参照として採用すれば、前述の領域は、アミノ酸１４ないし３４、とりわけ２４ないし３４、好ましくはアミノ酸２８中に、若しくはアミノ酸５４ないし６９、とりわけ５６ないし６７、好ましくはアミノ酸６３に対応する。
【００５８】
一態様において、結合アッセイは膜調製物を使用して実施される。これらの膜調製物は、放射標識ａｔｐＥリガンド（３Ｈ標識ＤＡＲＱを包含する）の結合およびこうした放射リガンドの結合部位についての競合体による置換を検出するために、慣習的フィルター結合アッセイ（例えばＢｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を使用して）若しくはハイスループットシンチレーション近接型結合アッセイ（ＳＰＡおよびＣｙｔｏｓｔａｒ−Ｔフラッシュプレート技術；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で使用し得る。放射活性は、９６、３８４、１５３６マイクロタイタープレート形式から迅速測定を行うことが可能なＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ若しくは類似の装置で測定し得る。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術はハイスループットスクリーニングにとりわけ従いやすく、そして、従って、この技術は標準的リガンドを置換することが可能な化合物についてのスクリーニングとして使用するのに適する。
【００５９】
天然の状況に近づける環境でのａｔｐＥタンパク質へのリガンドの結合を研究するための別のアプローチは、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｂｉａｃｏｒｅ）により活用される表面プラスモン共鳴効果を利用する。膜調製物若しくは全細胞中のａｔｐＥタンパク質をＢｉａｃｏｒｅのバイオセンサーチップに結合し得、そして、リガンドの結合を化合物の存在および非存在下で検査して、結合部位の競合体を同定し得る。
【００６０】
分子モデル化
本発明はさらに、ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法を提供し、前記方法は；
（ａ）分子モデル化技術を使用してａｔｐＥタンパク質の三次元構造を明確に表すこと；（ｂ）コンピュータによる手段を使用して、試験化合物とａｔｐＥタンパク質の三次元構
造との間のフィッティング操作を実施すること；および
（ｃ）前記フィッティング操作の結果を解析して、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造との試験化合物の会合を定量化すること
を含んでなる。
【００６１】
受容体および酵素のコンホメーションのモデルを創製かつ利用するのに適切なハードウェアおよびソフトウェア双方を包含する分子モデル化技術は当該技術分野で既知である。
【００６２】
多数のコンピュータプログラムが、本明細書に記述される方法で潜在的なａｔｐＥと相互作用する化合物をコンピュータモデル化し、モデル構築しかつコンピュータにより同定、選択および評価する方法に利用可能でありかつ適する。これらは、例えば、ＧＲＩＤ（英国オックスフォード大学から入手可能）、ＭＣＳＳ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能）、ＦＬＥＸ  Ｘ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）、ＤＯＣＫ（カリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能）、ＣＡＶＥＡＴ（カリフォルニア大学、バークレーから入手可能）、ＨＯＯＫ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ならびにＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンリアンドロから入手可能）、ＵＮＩＴＹ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）およびＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）のような３Ｄデータベースシステムを包含する。潜在的候補物質はまた、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）、ＬＥＧＥＮＤ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）およびＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）のようなソフトウェアパッケージを使用してコンピュータで「新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）」設計されうる。化合物の変形エネルギーおよび静電反発力は、ＧＡＵＳＳＩＡＮ  ９２、ＡＭＢＥＲ、ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭおよびＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ／ＤＩＳＣＯＶＥＲのようなプログラムを使用して解析しうる。これらのコンピュータ評価およびモデル化技術は、例えばＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓおよび他者から入手可能なワークステーションを包含するいずれの適するハードウェアでも実施しうる。これらのモデル化技術、方法、ハードウェアおよびソフトウェアパッケージは代表的なものであり、かつ、包括的列挙であることを意図していない。当該技術分野で既知の他のモデル化技術もまた本発明で使用しうる。例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい。
【００６３】
本発明の一態様において、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（タンパク質データベース１Ｑ０１）のＩｌｅ２８、Ｇｌｕ６１およびＩｌｅ６３の原子座標＋／−１０Åを超えない、好ましくは５Åを超えない前記アミノ酸のバックボーン原子の二乗平均偏差を使用して生成される。
【００６４】
下の実施例で提供されるとおり、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造を提供することが本発明の一目的であった。表６および７は、配列番号２および配列番号１を伴う変異体および野性型のａｔｐＥタンパク質の原子座標を提供する。従って、一態様において、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造は表６若しくは７の原子座標を使用して生成される。特定の一態様において、ａｔｐＥタンパク質の三次元構造は表７の原子座標を使用して生成される。ＤＡＲＱ  Ｊ化合物は、その脱プロトン化された形態のＡサブユニットのＡｒｇ１８６のＣサブユニットのＧｌｕ６１との相互作用を阻害する。従って、ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法における表６若しくは７の原子座標の使用を提供することが、本発明の一目的である。
【００６５】
結合部位
別の態様において、本発明は、ＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位の特徴を提供する。ＤＡＲＱ  Ｊ化合物を結合することが可能であると同定されたこの結合部位は、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥタンパク質中の耐性を賦与する突然変異部位として上で同定された領域と一致することが見出された（１７）。これゆえに、本発明は、それがａｔｐＥタンパク質の耐性を賦与する突然変異部位を含んでなることを特徴とするＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位を提供する。本明細書で使用されるところの耐性を賦与する突然変異部位は、Ｍｔｂ＿Ｓ（配列番号１）若しくはＭｔｂ＿Ｒ（配列番号２）の番号付けを参照として採用して、ａｔｐＥタンパク質のアミノ酸１４ないし３４、とりわけ２４ないし３４、およびアミノ酸５３ないし６９、とりわけ５６ないし６７を指す。
【００６６】
さらなる一態様において、該結合部位は、少なくとも、１個のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４およびＰｈｅ６５、ならびに１個のＡサブユニットのアミノ酸Ｓｅｒ１８２、Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６（Ａサブユニットについて表３、４および５のコードＳｅｒ２０６−Ｌｅｕ２０７−Ｌｅｕ２０９およびＡｒｇ２１０を有する）を含んでなり、前記アミノ酸は、表３、４若しくは５のいずれかの原子座標、または、表３、４若しくは５の対応する原子座標の水素以外の原子位置に重ね合わせられる場合に約１．５Å未満の、好ましくは０．７５Åを超えない水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を有する。特定の一態様において、結合部位は、第一のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２１、Ｇｌｙ２５；第二のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｐｈｅ５４、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；第三のＣサブユニットのアミノ酸Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｇｌｙ２０、Ａｌａ２１、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｙ２３、Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２５、Ｉｌｅ２６、Ｇｌｙ２７、Ａｓｐ２８、Ｇｌｙ２９、Ａｌａ３１、Ｐｈｅ５３、Ｔｈｒ５６、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｌｅｕ５９、Ｖａｌ６０、Ｇｌｕ６１、Ａｌａ６２、Ａｌａ６３／Ｐｒｏ６３、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５、ならびにＡサブユニットのアミノ酸Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６を含んでなり；前記アミノ酸は、表３、４若しくは５のいずれかの原子座標、または、表３、４若しくは５の対応する原子座標の水素以外の原子位置に重ね合わせられる場合に約１．５Å未満の、好ましくは０．７５Åを超えない水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を有する。なおより具体的な一態様において、結合部位は、第一のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２１、Ｇｌｙ２５；第二のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｐｈｅ５４、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；第三のＣサブユニットのアミノ酸Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｇｌｙ２０、Ａｌａ２１、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｙ２３、Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２５、Ｉｌｅ２６、Ｇｌｙ２７、Ａｓｐ２８、Ｇｌｙ２９、Ａｌａ３１、Ｐｈｅ５３、Ｔｈｒ５６、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｌｅｕ５９、Ｖａｌ６０、Ｇｌｕ６１、Ａｌａ６２、Ａｌａ６３／Ｐｒｏ６３、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５、ならびにＡサブユニットのアミノ酸Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６よりなり；前記アミノ酸は表３、４若しくは５のいずれかの原子座標を有する。最も具体的な一態様において、結合部位は、第一のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２１、Ｇｌｙ２５；第二のＣサブユニットのアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｐｈｅ５４、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；第三のＣサブユニットのアミノ酸Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｇｌｙ２０、Ａｌａ２１、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｙ２３、Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２５、Ｉｌｅ２６、Ｇｌｙ２７、Ａｓｐ２８、Ｇｌｙ２９、Ａｌａ３１、Ｐｈｅ５３、Ｔｈｒ５６、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｌｅｕ５９、Ｖａｌ６０、Ｇｌｕ６１、Ａｌａ６２、Ａｌａ６３／Ｐｒｏ６３、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５、ならびにＡサブユニットのアミノ酸Ｌｅｕ１８３、Ｌｅｕ１８５およびＡｒｇ１８６よりなり；前記アミノ酸は表３の原子座標を有する。
【００６７】
従って、コンピュータによるスクリーニングプログラムにおいて、上で概説されたところの原子座標を使用してａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力を評価することが、本発明の一目的である。一態様において、本発明は、ａｔｐＥタンパク質と相互作用する試験化合物の潜在能力の評価方法を提供し、前記方法は；−ＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位の三次元構造を生成させるための分子モデル化技術；−コンピュータによる手段を使用して、試験化合物と結合部位の三次元構造の間のフィッティング操作を実施すること；および−前記フィッティング操作の結果を解析して結合部位の三次元構造との試験化合物の会合を定量化することを含んでなる。本発明のさらなる一態様において、結合部位の三次元構造は、表３、４若しくは５の原子座標、または、表３、４若しくは５の対応する原子座標の水素以外の原子位置に重ね合わせられる場合に約１．５Å未満の、好ましくは０．７５Åを超えない水素以外の原子の二乗平均偏差を含んでなる相同な構造座標を使用して生成される。特定の一態様において、三次元構造は、表３、４若しくは５のいずれかのＡ鎖のアミノ酸Ａｌａ２１、Ｇｌｙ２５；表３、４若しくは５のいずれかのＫ鎖のアミノ酸Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ５３、Ｐｈｅ５４、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｕ６１、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；表３、４若しくは５のいずれかのＬ鎖のアミノ酸Ｍｅｔ１７、Ｇｌｙ１９、Ｇｌｙ２０、Ａｌａ２１、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｙ２３、Ａｌａ２４、Ｇｌｙ２５、Ｉｌｅ２６、Ｇｌｙ２７、Ａｓｐ２８、Ｇｌｙ２９、Ａｌａ３１、Ｐｈｅ５３、Ｔｈｒ５６、Ｖａｌ５７、Ｇｌｙ５８、Ｌｅｕ５９、Ｖａｌ６０、Ｇｌｕ６１、Ａｌａ６２、Ａｌａ６３／Ｐｒｏ６３、Ｔｙｒ６４、Ｐｈｅ６５；ならびに表３、４若しくは５のいずれかのＭ鎖のアミノ酸Ｓｅｒ２０６、Ｌｅｕ２０７、Ｌｅｕ２０７およびＡｒｇ２１０の原子座標を使用して生成される。
【００６８】
このスクリーニングにおいて、こうした化合物の結合部位へのフィッティングの質は、形状の相補性若しくは推定される相互作用エネルギーのいずれかにより判断しうる（Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｏｍａ．Ｃｈｅｍ  １３：５０５−５２４（１９９２））。
【００６９】
結合部位の使用
本発明のａｔｐＥに結合するか、その機能的活性を促進するか若しくは阻害する化合物の設計は、一般に、２種の因子の考慮を必要とする。第一に、該化合物はａｔｐＥと物理的かつ構造的に会合することが可能でなければならない。ａｔｐＥの化合物との会合において重要な非共有分子相互作用は、水素結合形成、ファンデルワールスおよび疎水性相互作用を包含する。第二に、化合物は、それがａｔｐＥと会合することを可能にするコンホメーションをとることが可能でなければならない。化合物のある部分がａｔｐＥとの会合に直接参画しなくてもよいとは言え、それらの部分はなお、該分子の全体的コンホメーションに影響しうる。これは、順に、結合親和性、治療的有効性、薬物様の質および効力に対する大きな影響を有しうる。こうしたコンホメーションの要件は、ａｔｐＥの活性部位若しくは他の領域の全部若しくは一部分に関しての化学的実体若しくは化合物の全体的な三次元構造および幾何学的配置、またはａｔｐＥと直接相互作用する数種の化学的実体を含んでなる化合物の官能基間の間隔を包含する。
【００７０】
ａｔｐＥに対するリガンド若しくは他の化合物の潜在的な予測される阻害性のアゴニスト、アンタゴニスト若しくは結合の効果は、コンピュータモデル化技術の使用により、その実際の合成および試験の前に解析しうる。所定の化合物の理論的構造がそれとａｔｐＥの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合は、該化合物の合成および試験を未然に防ぎうる。しかしながら、コンピュータモデル化が強い相互作用を示す場合には、該分子を合成しかつａｔｐＥと相互作用するその能力について試験しうる。この様式で、無効の化合物の合成を回避しうる。いくつかの場合には、モデル化で予測される不活性化合物
を合成しかつその後試験してａｔｐＥの特定の領域と相互作用する化合物のＳＡＲ（構造活性相関）を作成する。当業者は、いくつかの方法の１つを使用して、化学的実体のフラグメント、化合物若しくは剤をａｔｐＥおよびより具体的にはａｔｐＥの個々の結合ポケットすなわち活性部位と会合するそれらの能力についてスクリーニングしうる。この方法は、例えば、ａｔｐＥ若しくはリガンドと複合体形成したａｔｐＥの原子座標に基づくコンピュータスクリーニングでの活性部位の目視検査により開始しうる。選択された化学的実体、化合物若しくは剤をその後、多様な幾何学的配置に配置しうるか、若しくはａｔｐＥの個々の結合ポケット内にドッキングしうる。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェア、次いでＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的分子の力学上の力場（ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄ）を用いるエネルギー最小化および分子動力学を使用して達成しうる。
【００７１】
特化されたコンピュータプログラムもまた化学的実体の選択の方法で補助しうる。これらは、限定されるものでないが：ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．、“Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５）、オックスフォード大学、英国オックスフォードから入手可能）；ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．とＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２９−３４（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．とＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｅｅａｌｉｎｇ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：１９５−２０２（１９９０）、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能）；およびＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら、“Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ．−Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８（１９８２）、カリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能）を挙げることができる。
【００７２】
多様な官能基の特徴をもつプローブと巨大分子表面の間のありそうな相互作用部位を決定するプログラムであるＧＲＩＤのようなソフトウェアの使用は、表面部位を分析して類似の阻害するタンパク質若しくは化合物の構造を決定するのに使用される。プローブとしての分子上の適する阻害する基（例えばプロトン化された一級アミン）を用いるＧＲＩＤ計算を使用して、適するエネルギー等高線（ｃｏｎｔｏｕｒ）の水準の到達可能な位置の周囲の潜在的ホットスポットを同定する。ＤＯＣＫプログラムを使用して、活性部位若しくはリガンド結合部位を解析しかつ相補的立体構造特性をもつリガンドを示唆しうる。
【００７３】
適する化学的実体、化合物若しくは剤が一旦選択されれば、それらを単一のリガンド若しくは化合物若しくは阻害剤若しくは活性化物質に集成し得る。集成は、三次元像での相互に対するフラグメントの関係の目視検査により進行しうる。これに次いで、Ｑｕａｎｔａ若しくはＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを使用して人的にモデルを構築しうる。
【００７４】
個々の化学的実体、化合物若しくは剤の結合において補助するための有用なプログラムは、限定されるものでないが：ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．ら、“ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．、Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．中、７８、ｐｐ．８２−１９６（１９８９））；ＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンリアンドロ、およびＭａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．、“３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４（１９９２）のような３Ｄデータベースシステム；ならびにＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能）を挙げることができる。
【００７５】
ファルマコフォア仮説を検定しかつスクリーニングのための化合物を選択するために三次元データベースを検索するためのいくつかの方法論が利用可能である。これらはＣＡＶＥＡＴプログラム（Ｂａｃｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５：８４９−８５８（１９９２））を包含する。例えば、ＣＡＶＥＡＴは、活性部位に既に配置されているいずれかの数の化学的断片を結合するための「スペーサー」として作用し得る環状化合物のデータベースを使用する。これは、当業者が、密接な結合に必要であることが既に知られているか若しくは疑われる断片を結合するための何百もの可能な方法を迅速に生成することを可能にする。上述されたとおり一度に１種の化学的実体を段階的様式でａｔｐＥの阻害剤活性化物質、アゴニスト若しくはアンタゴニストを構築するように進行する代わりに、こうした化合物は、空の結合部位を使用すること、または既知分子のいくつかの部分（１個若しくは複数）を場合によっては包含することのいずれかを使用して、全体としてすなわち「新規に」設計しうる。これらの方法は：ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．−Ｊ．、“Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｎｉｔｏｒｓ”，Ｊ．ＣｏｍＲ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ、６、ｐｐ．６１−７８（１９９２）、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴから入手可能）；ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．とＡ．Ｉｔａｉ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能）；およびＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、ミズーリ州セントルイスから入手可能）を包含する。例えば、ＬＵＤＩプログラムは、水素結合形成および疎水性フラグメントの双方が位置するべき相互作用部位の一覧を決定し得る。ＬＵＤＩはその後、リンカーのライブラリーを使用して、４個までの異なる相互作用部位を断片に結合する。その後、――ＣＨ２−および――ＣＯＯ――のようなより小さい「結合」基を使用してこれらの断片を結合する。例えば、酵素ＤＨＦＲについて、公知の阻害剤メトトレキセート中の重要な官能基の配置がＬＵＤＩにより再現された。ＲｏｔｓｔｅｉｎとＭｕｒｃｋｏ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００−１７１０（１９９２）もまた参照されたい。
【００７６】
他の分子モデル化技術もまた本発明で使用しうる。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４（１９９０）を参照されたい。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．とＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２、ｐｐ．２０２−２１０（１９９２）もまた参照されたい。
【００７７】
化合物が上の方法により一旦設計若しくは選択されれば、その化合物がａｔｐＥを結合若しくはそれと会合する親和性を、コンピュータによる評価および／若しくは該化合物を合成した後に生物学的活性を試験することにより試験かつ最適化しうる。阻害剤若しくは
化合物は、全体的な結合エネルギーが類似である１種以上のコンホメーションでａｔｐＥと相互作用しうる。それらの場合に、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと、該化合物がａｔｐＥに結合する場合に観察されるコンホメーションの平均エネルギーの間の差違であると解釈される。
【００７８】
ａｔｐＥと結合若しくは会合するとして設計若しくは選択される化合物は、その結合された状態でそれが好ましくはａｔｐＥとの反発性静電相互作用を欠くであろうようにさらにコンピュータにより最適化しうる。こうした非相補的（例えば静電的）相互作用は、反発性の電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を包含する。とりわけ、阻害剤が結合されている場合の阻害剤とａｔｐＥの間の全部の静電的相互作用の総和は、好ましくは、結合のエンタルピーへの中立の若しくは好ましい貢献をなす。弱い結合化合物もまた、ＳＡＲを決定するようにこれらの方法により設計することができる。例えば、米国特許出願第６０／２７５，６２９号；同第６０／３３１，２３５号；同第６０／３７９，６１７号；および同第１０／０９７，２４９号明細書を参照されたい。
【００７９】
特定のコンピュータソフトウェアが、化合物の変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するのに当該技術分野で使用可能である。こうした用途のため設計されたプログラムの例は：Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９２、ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ピッツバーグ、ＣＯＰＹＲＧＴ １９９２）；ＡＭＢＥＲ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ、カリフォルニア大学サンフランシスコ校、ＧＯＰＹＲＧＴ  １９９４）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州バーリントン、ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９４）；およびＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ、ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９４）を包含する。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは当業者に既知であろう。
【００８０】
ａｔｐＥと会合する化合物が上述されたとおり一旦最適に選択若しくは設計されれば、その後、その結合特性を改良若しくは改変するために、その原子若しくは側基のいくつかで置換を行いうる。一般に、初期置換は保存的であり、すなわち、置換基は元の基とほぼ同一の大きさ、形状、疎水性および電荷を有することができる。もちろん、コンホメーションを変えることが当該技術分野で既知の化合物は回避されうることが理解されるべきである。こうした置換された化合物をその後、詳細に上述された同一のコンピュータ法によりａｔｐＥへのフィッティングの効率について解析しうる。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書に記述される配列および／若しくは構造座標を含有するシステム、とりわけコンピュータに基づくシステムを提供する。こうした系は、ａｔｐＥ若しくはＡＴＰアーゼのＦ０部分の結合部位の構造決定および理論的ドラッグデザインを行うよう設計される。コンピュータに基づくシステムは、詳細に上述されたコンピュータ法のいずれかで本発明の配列および／若しくは構造座標を解析するのに使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータに基づくシステムの最小ハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含んでなる。当業者は、現在利用可能なコンピュータに基づくシステムのどれが本発明での使用に適するかを容易に認識し得る。
【００８２】
従って、本明細書に記述される構造座標を含有するコンピュータで読み取り可能なデータ記憶媒体を提供することが、本発明の一目的である。本明細書で使用されるところの「コンピュータで読み取り可能なデータ記憶媒体」は、コンピュータにより直接読み取り若しくはアクセスし得るいかなる媒体も指す。こうした培体は、限定されるものでないが：フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープのような磁気記憶媒体；光ディスク若しくはＣＤ−ＲＯＭのような光学式記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気的記憶媒体；ならびに磁気／光学式記憶媒体のようなこれらの範疇のハイブリッドを挙げることができる。
【００８３】
処置方法
上で既に挙げられたとおり、微生物に基づく感染症を伴う被験体の処置方法において、前述のスクリーニング方法のいずれかを使用して同定される化合物の使用を提供することもまた、本発明の一目的である。一般に、細菌性病原体はグラム陽性若しくはグラム陰性いずれかの病原体に分類しうる。グラム陽性およびグラム陰性双方の病原体に対する活性をもつ抗菌化合物は、一般に広範囲の活性を有するとみなされる。本発明の化合物は、グラム陽性および／若しくはグラム陰性の細菌性病原体に対し活性とみなされる。とりわけ、本化合物は、最低１種のグラム陽性細菌、好ましくは数種のグラム陽性細菌、より好ましくは１種若しくはそれ以上のグラム陽性細菌および／または１種若しくはそれ以上のグラム陰性細菌に対し活性である。
【００８４】
グラム陽性およびグラム陰性の好気性および嫌気性細菌の例は、ブドウ球菌、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；腸球菌、例えばＥ．フェーカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；連鎖球菌、例えば肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｅｎａｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｓ）；バチルス属の細菌、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、例えばリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、例えばインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）；モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、例えばＭ．カタラリス（Ｍ．ｃｈａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；およびエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する。グラム陽性病原体、例えば、ブドウ球菌、腸球菌および連鎖球菌は、処置することが困難かつ一旦確立すれば例えば病院環境から根絶することが困難の双方である耐性株の発生によりとりわけ重要である。こうした株の例は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、メチシリン耐性凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＭＲＣＮＳ）、ペニシリン耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）および多剤耐性エンテロコッカス  ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕ  ｆａｅｃｉｕｍ）である。
【００８５】
本発明の化合物は耐性細菌株に対する活性もまた示す。
【００８６】
本発明の化合物は、生存率がＦ１Ｆ０ＡＴＰ合成酵素の適正な機能に依存する細菌に対しとりわけ活性である。いずれかの論理により束縛されずに、本化合物の活性がＦ１Ｆ０ＡＴＰ合成酵素の阻害、とりわけＦ１Ｆ０ＡＴＰ合成酵素のＦ０複合体の阻害、より具体的にはＦ１Ｆ０ＡＴＰ合成酵素のＦ０複合体のＡサブユニットのＡｒｇ１８６からＣサブユニットのＧｌｕ６１へのプロトンの移動の阻害に存し、細菌の細胞ＡＴＰ濃度の枯渇により該細菌の死滅に至ることが教示される。前述のスクリーニング方法のいずれかを使用して同定される化合物は、グラム陽性細菌、より具体的にはミコバクテリウム、および最も具体的にはＭ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、ウシ結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ウシ結核菌−ＢＣＧ（Ｍ．ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧ）、カメ結核菌（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、Ｍ．フォルツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、Ｍ．スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒｅａ）、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）およびＭ．ラネ（Ｍ．ｒａｎａｅ）により引き起こされる感染症に対しとりわけ活性である。
【００８７】
上記若しくは下記で使用される場合はいつも、該化合物が細菌感染症を処置し得ることは、該化合物が１種若しくはそれ以上の細菌株への感染を処置し得ることを意味している。抗菌化合物としてのＤＡＲＱ  Ｊの使用に関してしかしながら使用される場合、抗菌薬は、１種若しくはそれ以上の細菌株への感染を処置し得る化合物であることを意味しているが、但し前記細菌株はミコバクテリウム以外である。
【００８８】
本化合物により処置されうる細菌感染症は、例えば、中枢神経系の感染症、外耳感染症、急性中耳炎のような中耳の感染症、硬膜静脈洞の感染症、眼の感染症、歯、歯肉および粘膜の感染症のような口腔の感染症、上気道感染症、下気道感染症、泌尿生殖器感染症、胃腸感染症、産婦人科感染症、敗血症、骨および関節の感染症、皮膚および皮膚構造の感染症、細菌性心内膜炎、火傷、手術の抗菌的予防、ならびに癌化学療法を受領している患者若しくは臓器移植患者のような免疫抑制患者における抗菌的予防を包含する。
【００８９】
本発明はさらに、ａｔｐＥタンパク質と相互作用する剤を被験体に投与することを含んでなる、結核に苦しめられる被験体の処置方法を提供する。
【００９０】
製薬学的組成物
本発明はさらに、細胞中でａｔｐＥタンパク質と相互作用する剤および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。こうした剤は、製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と一緒になって剤を含んでなる組成物に処方しうる。剤は、エステル若しくは塩のような、酸付加塩若しくは塩基金属塩、またはＮ若しくはＳオキシドのような生理学的に機能的な誘導体の形態にあることができる。組成物はいかなる適する投与経路および手段のためにも処方しうる。製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤は、経口、直腸、鼻、吸入可能、局所（頬側および舌下を包含する）、膣若しくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、クモ膜下腔内および硬膜外を包含する）投与に適する製剤で使用されるものを包含する。担体若しくは希釈剤の選択はもちろん、剤およびその治療目的に依存しうる提案される投与経路に依存することができる。製剤は、便宜的には単位投薬形態物で提示されることができ、また、製薬学の技術分野で公知の方法のいずれによっても製造しうる。こうした方法は、有効成分を１種若しくはそれ以上の付属成分を構成する担体との連合にもたらす段階を包含する。一般に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微粉化した固体担体または双方との連合に均一かつ緊密にもたらすこと、およびその後必要な場合は生成物を造形することにより製造する。
【００９１】
固体の組成物について、慣習的な非毒性の固体担体は、例えば、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを包含するものを使用しうる。上記で定義されるところの有効成分を、例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを担体として使用して坐剤として処方しうる。液体の製薬学的に投与可能な組成物は、例えば、例えば水、生理的食塩水、水性Ｄ−ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどのような担体中に、上で定義されたところの有効成分および任意の製薬学的補助物質を溶解、分散などしてそれにより溶液若しくは懸濁液を形成することにより製造し得る。所望の場合は、投与されるべき製薬学的組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、酢酸トリエタノールアミンナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどのような非毒性の補助物質もまた含有しうる。こうした投薬形態物の実際の製造方法は当業者に既知であるか若しくは明らかであろう；例えば、Ｇｅｎｎａｒｏら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン、第１８版、１９９０を参照されたい。
【００９２】
組成物若しくは製剤は、いずれにしても、処置されている被験体の症状を緩和するのに有効な量の、ある量の有効成分（１種若しくは複数）を含有することができる。
【００９３】
本化合物の正確な投薬量および投与の頻度は、当業者に公知であるとおり、使用される特定の化合物、処置されている特定の状態、処置されている状態の重症度、特定の患者の齢、重量、性、食餌、投与時間および全身の健康状態、投与様式、ならびに該個体が服用しうる他の医薬品に依存する。さらに、有効１日量は、処置される被験体の応答に依存して、かつ／若しくは本発明の化合物を処方する内科医の評価に依存して減少若しくは増大させうる。
【００９４】
非毒性の担体から構成されるバランス（ｂａｌａｎｃｅ）を伴う０．２５ないし９５％の範囲の有効成分を含有する投薬形態物若しくは組成物を製造しうる。投与様式に依存して、製薬学的組成物は、好ましくは、０．０５から９９重量％まで、より好ましくは０．１から７０重量％までの有効成分、および１から９９．９５重量％まで、より好ましくは３０から９９．９重量％までの製薬学的に許容できる担体を含むことができ、全部のパーセンテージは全組成物に基づく。
【００９５】
経口投与のため、製薬学的に許容できる非毒性の組成物は、例えば製薬学的等級のマンニトール、乳糖、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、ブドウ糖、ショ糖、マグネシウム、炭酸塩などのような通常使用される賦形剤のいずれかの組み込みにより形成される。こうした組成物は溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、除放製剤などの形態を取る。こうした組成物は１％〜９５％の有効成分、より好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％を含有しうる。
【００９６】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内若しくは静脈内いずれかでの注入を特徴とする。注入可能物は、慣習的形態で、液体の溶液若しくは懸濁液、注入前の液体中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態、または乳剤のいずれかとして製造し得る。適する賦形剤は、例えば水、生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどである。加えて、所望の場合は、投与されるべき製薬学的組成物は、少量の例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、酢酸トリエタノールアミンナトリウムなどのような、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などのような非毒性の補助物質もまた含有しうる。
【００９７】
こうした非経口組成物中に含有される有効成分のパーセンテージは、その特定の性質、ならびに化合物の活性および被験体の必要性に高度に依存する。しかしながら、溶液中０．１％ないし１０％という有効成分のパーセンテージが使用可能であり、そして、該組成物が上のパーセンテージに後に希釈されることができる固体である場合はより高いことができる。好ましくは、組成物は溶液中に０．２〜２％の有効成分を含むことができる。
【００９８】
最後に、本発明は、（ａ）製薬学的剤が細胞中でａｔｐＥタンパク質と相互作用し、かつ（ｂ）包装が被験体における細菌感染症を処置するための該剤の使用を示すラベルを含んでなる、包装および製薬学的剤を含んでなる、とりわけ、抗ミコバクテリウム医薬品としての製品を提供する。
【００９９】
本記述を通じ、「標準的方法」、「標準的プロトコル」および「標準的手順」という用語は、分子生物学技術の文脈で使用される場合に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｔｙ、編者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９のような通常の実験室手引書に見出されるプロトコルおよび手順として理解されるべきである。
【０１００】
本発明は、後に続く実験の詳細を参照してより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらは下に続く請求の範囲により完全に記述されるところの本発明を具体的に説明するのみであることを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じ多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示は、本発明が関する従来技術をより完全に記述するために、本出願に引用することによりここに組み込まれる。
【０１０１】
実験
スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を代理物として使用して、われわれは、数種のミコバクテリウムに対する強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性をもつ一連のＤＡＲＱを発見した（１１）。今日まで、ＤＡＲＱ系列の２０種の分子がヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒｖに対し０．５μｇ／ｍｌより下の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を有し、また、これらの３種について、抗ミコバクテリウム活性がｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルで確認された。
【０１０２】
構造的におよび機構的に、ＤＡＲＱは、フルオロキノロン（メトキシキノロンを包含する）、ならびにメフロキンならびにそのアナログ４−メチルキノリンおよび４−キノリルヒドラゾンを包含する他のキノロン分類の双方と非常に異なる（１２−１６）。ＤＡＲＱと他のキノロン若しくはキノリン分類の間の主要な構造上の差違の１つは、ＤＡＲＱ分類により担持される官能性化された側（３’）鎖の特異性である。加えて、既存の化学分類とのミコバクテリウムの交差耐性の欠如が異なる作用機序を指摘する。
【０１０３】
下でＪ若しくはＤＡＲＱ  Ｊと称されるＤＡＲＱのリード化合物（図１）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで独特の範囲の強力かつ選択的な抗ミコバクテリウム活性を有することが見出された（表１）。実験室株Ｈ３７Ｒｖおよび６種の完全に感受性の単離物について得られたＭＩＣの中央値は、リファンピンについて１．００μｇ／ｍｌに対し０．０６０μｇ／ｍｌであった。Ｊは、第一列のＴＢ薬リファンピン、ストレプトマイシン、エタンブトールおよびピラジナミド；ならびに第二列のＴＢ薬モキシフロキサシンに対し耐性のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）臨床単離物に対する類似のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性を示した。イソニアジドに対し耐性の８種の臨床単離物について、ＭＩＣの中央値は０．０１０μｇ／ｍｌであった。現在使用されている抗ＴＢ薬との交差耐性の欠如は、ＪがＭＤＲ−ＴＢ株に対する活性を保持しうることを示唆した。事実、ＢＡＣＴＥＣＴＭ培養系を使用して、細菌の増殖の明瞭な濃度依存性の阻害が、ＭＤＲ−ＴＢ株を固定濃度のＪに曝露した場合に見られた。ＭＤＲ−ＴＢの３０種の単離物のうち、１３種（４３％）が０．１００μｇ／ｍｌのＪに対し感受性であることが見出され、また、１７種（５７％）が０．０１０μｇ／ｍｌのＪに対し感受性であった。類似の高い程度の感受性（０．０１０μｇ／ｍｌより下のＭＩＣ）は、ＢＡＣＴＥＣＴＭ系を使用して試験した場合に１０種の付加的な完全に薬物感受性の株の１種のみについて見られた一方、全部の株が０．１００μｇ／ｍｌのＪに対し感受性であった。
【０１０４】
強力な活性は、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）およびミコバクテリウム  カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）を包含する他のミコバクテリウム種、ならびに、トリ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉ
ｕｍ）群（ＭＡＣ）、カメ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｃｅｓｓｕｓ）、ミコバクテリウム  フォルツイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）およびミコバクテリウム  マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）のような、多くの他の抗ＴＢ薬に対し天然に耐性かつ日和見感染症に関与する種に対してもまた示された（表１）。
【０１０５】
驚くべきことに、Ｊの活性はミコバクテリウムに特異的であるようであった。Ｊは、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＭＩＣ  ４．００μｇ／ｍｌ）およびノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）（ＭＩＣ＞４．００μｇ／ｍｌ）のようなミコバクテリウムに近い種に対しほとんど活性でなく、また、グラム陽性の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（メシチリン耐性株（ＭＩＣ＞３２μｇ／ｍｌ）を包含する）およびエンテロコッカス  フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、若しくはグラム陰性の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）を包含する他の生物体に対し活性でなかった。対数期増殖にあるヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１００×ＭＩＣのＪの濃度への曝露は、１２日後に細菌数の１０３対数の減少をもたらし、Ｊがｉｎ  ｖｉｔｒｏで殺菌活性を有することを示した。静止期の結核桿菌に対するＪの影響は未だ研究されていない。
【０１０６】
変異体の単離、交差耐性および想定される薬物標的
ミコバクテリウム耐性を検討することにより、われわれは分子薬物標的を同定しかつ作用機序を提案することを目的とした。ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の耐性変異体を、
−ミコバクテリウム中の耐性変異体の比率を定量化する（対照としてリファンピンを用いて）
−耐性変異体の耐性パターン（キノロンに対する交差／非交差耐性を包含する）を評価する
−作用機序を検討する
ため、阻害濃度のＪでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択により導き出した。
【０１０７】
選択実験から、Ｊに対する低下された感受性を伴う変異体の比率は、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）についてそれぞれＭＩＣ×４で５×１０−７および２×１０−８、ならびにＭＩＣ×８で５×１０−８および１×１０−８であった（サポーティングオンラインテキスト）。ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の場合、これらの比率はリファンピンに対し耐性の変異体のもの（１０−７ないし１０−８）に匹敵し、そして、Ｊに対する天然に存在する耐性がまれであることを示す。加えて、Ｊに対し耐性のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株の感受性は、抗ＴＢ薬イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、アミカシン、エタンブトールおよびモキシフロキサシンに対し不変のままであった。Ｊに対する低下された感受性を伴うヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）変異体のさらなる分析は、キノロン耐性が典型的に発生する配列すなわちＤＮＡジャイレース領域のｇｙｒＡおよびｇｙｒＢに突然変異が存在しなかったことを示した。これは、Ｊの分子標的がフルオロキノロンのものと異なることを確認する。
【０１０８】
Ｊの分子標的を決定しかつ作用機序を推察することへの１アプローチは、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の感受性および耐性株で耐性を賦与する突然変異を同定かつ比較することである。耐性のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株ＢＫ１２ならびに２種の耐性のスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）株Ｒ０９およびＲ１０、ならびに親スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のゲノムを完了近くまで配列決定した。われわれは、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の感受性および耐性株のゲノム配列の比較分析により、耐性を賦与する突然変異を同定した（図２）。われわれは、対応する親野性型に対し全３種の独立の変異体中で影響を及ぼされた唯一の遺伝子がａｔｐＥ（ＡＴＰ合成酵素のＦ０サブユニットの一部）をコードすることを示した。これは、ａｔｐＥが変異体株でのＪに対する耐性の原因であることを示唆し、Ｊが新たなヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の標的すなわちＡＴＰ合成酵素のプロトンポンプを阻害することを示す。
【０１０９】
変異体ａｔｐＥ遺伝子がＪに対する耐性の原因であること、および直接推測によりａｔｐＥ遺伝子産物がミコバクテリウムでのＪの標的であることを示すため、補完的研究を実施した。ＡＴＰ合成酵素のオペロンの全遺伝子が協調された方法で発現されなければならない、すなわち、Ｆ０部分をコードする全遺伝子が同一の場所から発現されなければならないことが既知であるという事実を考え、われわれは、該オペロンのＦ０部分を耐性のスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）株（Ｄ３２Ｖ）から増幅し、そしてＰＣＲ過程により付加的な突然変異を獲得しなかったクローンを選択した。野性型スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を、かように選択した変異体Ｆ０フラグメントを含有するプラスミドで形質転換した。これは、細胞を、耐性株のスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）Ｒ０９（Ｄ３２Ｖ）のものと実際上同一のＭＩＣを伴い、Ｊに対し耐性にした。加えて、該プラスミドをこれらの形質転換体から再単離しかつａｔｐＥ遺伝子を配列決定した場合に、それが変異体アレル（Ｄ３２Ｖ）を残存していたことが示された。
【０１１０】
ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）でのＡＴＰ産生に対するＤＡＲＱ  Ｊの実際の影響を、ＲｏｃｈｅのＡＴＰ生物発光ルシフェラーゼアッセイキットＨＳ  ＩＩを使用してミコバクテリウム中に存在する全細胞ＡＴＰに対するＪの影響を測定することにより、さらに示した。このアッセイは、５２６ｎｍで測定し得るＤ−ルシフェリンのオキシルシフェリンへのＡＴＰに駆動される変換に基づく。
【０１１１】
【化１】
2008515395.tif 000002
【０１１２】
簡潔には、全ＡＴＰに対するＤＡＲＱ  Ｊの影響を野性型ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）および変異体株双方で試験した。ＡＴＰ合成酵素の公知の阻害剤であるＤＣＣＤを陽性対照として使用し、また、ある種の細胞壁成分の生合成の阻害剤であるがしかしＡＴＰ産生に対し影響を有しないイソニアジドを陰性対照として使用した。
【０１１３】
図３に見ることができるとおり、ＤＡＲＱ  Ｊでの野性型ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の処理は、これらの細菌中でのＡＴＰ産生の用量依存性の減少に至る。対照的に、イソニアジドはＡＴＰ産生に対する影響を有しない。既に上述されたとおり、これらの細菌を高濃度のＤＡＲＱ  Ｊに曝露することは、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のジアリールキノリン耐性変異体を生じさせた。これらの耐性ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をＤＡＲＱ  Ｊで処理した場合、これらの細菌は、この化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）の１００倍ででさえＡＴＰ産生のいかなる減少も示さなかった。対照的に、ＤＣＣＤはこれらの桿菌中でのＡＴＰ産生を阻害することが可能で
あり、ＤＡＲＱ  ＪおよびＤＣＣＤがＡＴＰ合成において異なる結合ポケットを有することを示唆した。
【０１１４】
ＤＡＲＱ  Ｊ結合領域のコンピュータモデル化および同定
ＤＣＣＤおよびＤＡＲＱ  Ｊの異なる作用様式をさらに検討するため、野性型およびＤＡＲＱ  Ｊ変異体双方のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＡＴＰ合成酵素のコンピュータ生成される３Ｄモデルを生成した。表４および５に提供される原子座標は、公表されたアミノ酸配列Ｐ６３６９１およびＡＪ８６５３７７の３Ｄ構造のモデルを作成することにより計算した。実際のＤＡＲＱ  Ｊ結合部位は、ＡおよびＣサブユニットの接触領域、より具体的には、表３、４若しくは５で称されるところのＡサブユニットのアミノ酸「Ａｒｇ２１０」およびＣサブユニットの「Ｇｌｕ６１」周辺に位置することが見出された。これは、上述されたヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）の感受性および耐性株での耐性を賦与する突然変異のスクリーニングについて見られた結果とよく一致する。
【０１１５】
該モデルは、ＡＴＰアーゼ構造のＡおよびＣヘリックスの相対配置の最適化、ならびに最小のコンピュータ化した内部株（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔｒａｉｎ）に対するアミノ酸バックボーンおよび側鎖の幾何学的配置に基づく。該配置は、異なる生物体［Ｅ−Ｃｏｌｉ  ＰＤＢエントリコード１Ｃ１７−Ｖ．Ｋ．ＲａｓｔｏｇｉとＭ．Ｅ．Ｇｉｒｖｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４０２、２６３−２６８（１９９９）］の以前に公表された全般的らせん配置から出発する多数の分子動力学シミュレーション周期および分子力学の緩和によって得た。分子動力学および配置緩和は双方ともＭＭＦＦ９４に基づく力場のパラメータ化［Ｈａｌｇｒｅｎ，Ｔ．Ａ．（１９９６）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１７、４９０−５１９］を用いて実施したが、しかし、いずれかの従来技術の分子動力学ソフトウェア［Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．Ｃ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｐｏｅｌ，Ｄ．とｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ，Ｒ．、Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍ．９１（１９９５）、４３−５６；Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｅ．、Ｈｅｓｓ，Ｂ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｐｏｅｌ，Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄ．７（２００１）３０６−３１７．］、次いで適する配置最適化［Ｊ．Ｗ．ＰｏｎｄｅｒとＦ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、８、１０１６−１０２４（１９８７）］を使用し得た。
【０１１６】
表３、４および５のコンピュータ化した座標は、提案された阻害様式、および生物学的アッセイにおける点突然変異を誘導する耐性の発生に基づき、これらの酵素中のＭＴＢ  ＡＴＰアーゼ活性の阻害に関連すると考えられる領域の予測された構造の一部（３０オングストロームの半径量を伴う）を含んでなる。
【０１１７】
考察
ＤＡＲＱ  Ｊは、参照化合物のＭＩＣに等しいか若しくはそれより小さいＭＩＣをもつ、抗ＴＢ薬の新たな化学的分類の１メンバーである。そのスペクトルは、ヒトで重要な異型の種；ＭＡＣ、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）ならびに迅速増殖体Ｍ．フォルツイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）およびカメ結核菌（Ｍ．ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）を包含するミコバクテリウムに対するその特異性において独特である。この抗ミコバクテリウム特異的スペクトルは、ＭＡＣに対する活性を有しないイソニアジドのものと異なる。Ｊの臨床使用はＴＢおよびミコバクテリウム感染症の処置に高度に標的を定めることができる。ミコバクテリウム以外を阻害するＪの不能は、より広範なスペクトルをもつ抗生物質と比較した場合に、他の細菌種で発生するより小さい選択圧および耐性のより低いリスクになるはずである（９）。
【０１１８】
Ｊの標的および作用機序は他の抗ＴＢ薬のものと異なる。多様な細菌のＡＴＰ合成酵素および真核生物のＡＴＰ合成酵素、ならびにとりわけＡＴＰアーゼ複合体のＦ０サブユニ
ットのＣ鎖の配列の比較は、野性型および変異体のヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＡＴＰ合成酵素の３Ｄモデル化と一緒になって、抗菌スペクトルの特異性、およびより少ない程度まで安全性プロファイルに理論的根拠を提供する。
【０１１９】
構築されたミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＡＴＰアーゼモデルで実施される動力学的研究は、これらの構造中で空洞（表３の原子座標による結合部位）がＡおよびＣサブユニットの接触領域（Ａサブユニットのアミノ酸「Ａｒｇ２１０」およびＣサブユニットの「Ｇｌｕ６１」周辺）に存在することを示す。表４および５は、この部位を取り囲む原子の２種の研究されたバリアントの座標、およびそれらの平均位置を提供する。ＤＡＲＱ  Ｊ阻害剤は、これら２アミノ酸が相互作用することを禁止することにより、これら２アミノ酸を伴う通常のプロトン移動段階を妨害することが可能である。ＤＡＲＱ  Ｊの立体特異性は予測された結合部位の非対称性から理解され得；活性のキラル鏡像異性体がこの空洞を最適に提供し、該化合物の他の形態およびＡＴＰアーゼのバリアントがより少なく良好に一致する。
【０１２０】
われわれがここで導き出した結合部位は、ＡＴＰアーゼ系のＤＣＣＤと完全に異なる部分にある（ＤＡＲＱは酵素の膜部分にあり、ＤＣＣＤ結合は細胞の内側からおよそ９０オングストローム離れて発生する；Ｃ．Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｍ．Ｇ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、Ａ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｓｌｉｅ、Ｊ．Ｅ．Ｗａｌｋｅｒ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７、１０５５（２０００）に公表されたウシＡＴＰアーゼ結晶「１Ｅ７９」のＰＤＢ構造に基づく）。従って、ＭＴＢ  ＡＴＰアーゼのＤＣＣＤ型の阻害と潜在的に関与し得る原子は、結合部位（酵素の膜部分にのみちょうどわたる）の座標の表に列挙される領域中になく、そして、相互に、ＤＡＲＱ  Ｊの阻害様式に関与する酵素のこの部分は、公表された「１Ｅ７９」構造（細胞内部分のみ示す）に存在しない。結合部位のこの差違は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＴＰ産生アッセイで観察されたヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の異なる応答を説明しうる。
【０１２１】
上にもかかわらず、ミトコンドリアのＡＴＰアーゼでＤＣＣＤを用いるより古い研究は、例えばＳｅｂａｌｄ  Ｗ、Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ  Ｗ、Ｗａｃｈｔｅｒ  Ｅ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８０年２月；７７（２）：７８５−７８９により、該酵素のＦ０領域の親油性環境の１酸性アミノ酸の周囲に位置する別の結合部位を示唆している。ミトコンドリアのＡＴＰアーゼのこの結合位置は、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種についてここで記述されるものに類似とみなし得る。
【０１２２】
同時に、新たな機構を標的とすることは、利用可能な処置に対する耐性突然変異を伴う現在循環しているＴＢ株がＪに対し交差耐性でないことを確実にする。Ｊが、ＭＤＲ−ＴＢ単離物に対し、なお、広範な４種の薬物耐性をもつものに対して、ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の通常の野性型汎感受性株に対すると少なくとも同じくらい高い抗菌効果を有することが、われわれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から明らかである。この観察結果は、既存の抗ＴＢ薬物との交差耐性が存在しないことをそれが明瞭に示すために、重要である。ＡＴＰアーゼの膜部分の結合ポケットのさらなる同定を考えれば、本研究の結果は、新たな抗菌化合物、とりわけこれらの生物体中でのＡＴＰ合成を標的とする抗ミコバクテリウム化合物のさらなる開発を可能にするであろう。
【０１２３】
【表１】
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【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
【表１０】
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【０１３３】
【表１１】
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【０１３４】
【表１２】
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【０１３５】
【表１３】
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【０１３６】
【表１４】
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【０１３７】
【表１５】
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【０１３８】
【表１６】
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【０１３９】
【表１７】
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【０１４０】
【表１８】
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【０１４１】
【表１９】
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【０１４２】
【表２０】
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【０１４３】
【表２１】
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【０１４４】
【表２２】
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【０１４５】
【表２３】
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【０１４６】
【表２４】
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【０１４７】
【表２５】
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【０１４８】
【表２６】
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【０１４９】
【表２７】
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【０１５０】
【表２８】
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【０１５１】
【表２９】
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【０１５２】
【表３０】
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【０１５３】
【表３１】
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【０１５４】
【表３２】
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【０１５５】
【表３３】
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【０１５６】
【表３４】
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【０１５７】
【表３５】
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【０１５８】
【表３６】
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【０１５９】
【表３７】
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【０１６０】
【表３８】
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【０１６１】
【表３９】
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【０１６２】
【表４０】
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【０１６３】
【表４１】
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【０１６４】
【表４２】
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【０１６５】
【表４３】
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【０１６６】
【表４４】
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【０１６７】
【表４５】
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【０１６８】
【表４６】
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【０１６９】
【表４７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】下でＪ若しくはＤＡＲＱ  Ｊともまた称されるＲ２０７９１０の絶対配置。
【図２】ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）変異体のａｔｐＥタンパク質配列アライメント。Ｍｔｂ＿Ｓ：薬物感受性株ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲｖのａｔｐＥ（１−８１）。受託番号：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｑ１０５９８（配列番号１）。Ｍｔｂ＿Ｒ：薬物耐性株ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＢＫ１２のａｔｐＥ（１−８１）（配列番号２）。Ｍｓｍ＿Ｓ：薬物感受性株スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ（１−８６）。ゲノム研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により得られた配列（配列番号３）。Ｍｓｍ＿Ｒ０９（配列番号４）およびＲ１０（配列番号５）：薬物耐性株スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ（１−８６）。社内で得られた配列。Ｈｕｍａｎ：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ＡＴＰ５Ｇ３（６６−１４２）。受託番号：Ｅｎｓｅｍｂｌ  ＥＮＳＰ０００００２８４７２７。上の番号付け：ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のａｔｐＥ。下の番号付け：ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＡＴＰ５Ｇ３（６６−１４２）陰影はＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用するアミノ酸類似性を示す（黒＝高、灰色＝中）。矢印は耐性株で観察される点突然変異の位置を示す。
【図３】ＤＡＲＱ  Ｊ、イソニアジドおよびＤＣＣＤの存在下でのヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の全細胞ＡＴＰ測定。野性型ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＤＡＲＱ  Ｊ変異体ヒト結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）双方で５２６ｎｍで測定したオキシルシフェリンの相対発光単位。
【図４】一緒になってＤＡＲＱ  Ｊ化合物の結合部位を形成する３個のＣサブユニット（Ａ鎖、Ｋ鎖およびＬ鎖）ならびにＡサブユニット（Ｍ鎖）のリボン表示。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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