(57)【要約】  神経変性、自己免疫脱髄、および自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）を含む中枢神経系の疾患、および糖尿病）のウイルス病因についての非ヒト動物モデル系が提供される。このような非ヒト動物モデル系は、ＭＳおよび糖尿病などの疾患の研究のために、そしてそのような疾患の処置のための候補治療化合物および候補組成物の同定ならびに特徴付けのために、適切に使用することができる。治療剤ナタリズマブによって本明細書に例示されるように、１種以上の治療剤による処置の後に、自己免疫疾患に感受性の高い患者において、中枢神経系の自己免疫疾患（例えば、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ））を検出するためのマーカーおよび方法もまた、本明細書において提供される。例示的な動物モデル系は、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂなどのヘルペスウイルスに感染したマーモセット、トランスジェニックマウス、およびゼブラフィッシュの動物モデル系（この系において導入遺伝子はＣＤ４６をコードする）、ならびにＭＳ、糖尿病および抗接着分子（例えば、ナタリズマブ）で処置される他の自己免疫疾患を有する患者のリスクをモニタリングするための方法を包含する。
2008523785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多発性硬化症（ＭＳ）のための非ヒト動物モデル系であって、該非ヒト動物モデル系はサルおよびヘルペスウイルスを包含し、該サルが該ヘルペスウイルスに感染される、非ヒト動物モデル系。
【請求項２】
前記サルが、マーモセット、新世界ザルおよび旧世界ザルからなる群より選択され、該サルは、前記ヘルペスウイルスによる感染に対して感受性が高い、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項３】
前記マーモセットがC.jacchusである、請求項２に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項４】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択される、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項５】
前記サルの前記ヘルペスウイルスに対する単回曝露が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項６】
前記サルの前記ヘルペスウイルスに対する２回以上の曝露が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項７】
前記中枢神経系の炎症性疾患が、多発性硬化症である、請求項５または６に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項８】
前記サルの前記ヘルペスウイルス、他のヘルペスウイルスまたは他のウイルスに対する１回以上の曝露が、新生物随伴症候群および小脳変性、辺縁系脳炎、眼球クローヌス−ミオクローヌス、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、ＰＭＬおよび他の広範性または病巣性の白質萎縮症（早発型および遅発型）、急性および慢性の多発性ニューロパシーおよび急性および慢性の多発神経根障害、急性播種性脳脊髄炎、ミオパシー、重症筋無力症、ギヤン−バレー症候群、ミラー−フィッシャー症候群、イートン−ランバート症候群、ＣＮＳ脈管炎、サルコイドーシスおよび神経サルコイドーシス、ラスムッセン病、新生物随伴性感覚性ニューロパシー、ＣＮＳリンパ腫、高悪性度および低悪性度の希突起神経膠腫および高悪性度および低悪性度のグリア芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫、視神経膠腫および髄膜腫、脳室上衣細胞腫および髄芽細胞腫からなる群より選択される、中枢神経系もしくは末梢神経系および神経筋接合部の他の炎症性疾患または悪性疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項９】
前記サルの前記ヘルペスウイルスまたは別のウイルスに対する１回以上の曝露が、炎症性要素を含む未知の原因の他の神経学的疾患の重症度を生じ、誘発および／または増大させ、該神経学的疾患が、睡眠発作、慢性疲労症候群、スティッフマン症候および小児の自閉症からなる群より選択される、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項１０】
前記サルの前記ヘルペスウイルスに対する１回以上の曝露が、糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎もしくは間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性疾患および／または自己免疫疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項１１】
前記動物モデル系が、希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞および脳細胞からなる群より選択される細胞型に対する前記ヘルペスウイルスの直接毒性を媒介する因子を同定するのに適切である、請求項１に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項１２】
ＣＤ４６をコードする導入遺伝子とヘルペスウイルスとを包含するトランスジェニックマウスモデル系であって、該マウスが、該ヘルペスウイルスにより感染される、トランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１３】
前記ヘルペスウイルスが、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択される、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１４】
前記ＣＤ４６をコードする導入遺伝子が、インビボで遍在的に発現される、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１５】
前記ＣＤ４６をコードする導入遺伝子が、脳、脊髄および末梢神経からなる群より選択される組織においてインビボで発現される、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１６】
前記トランスジェニックマウスの前記ヘルペスウイルスに対する単回曝露が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１７】
前記トランスジェニックマウスの前記ヘルペスウイルスに対する２回以上の曝露が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１８】
前記中枢神経系の炎症性疾患が、多発性硬化症である、請求項１６または１７に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項１９】
前記マウスの前記ヘルペスウイルスに対する１回以上の曝露が、糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎もしくは間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性疾患および／または自己免疫疾患の重症度を誘発および／または増大させる、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項２０】
前記モデル系が、希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞および脳細胞からなる群より選択される細胞型に対する前記ヘルペスウイルスの直接毒性を媒介する因子を同定するのに適切である、請求項１２に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項２１】
前記因子が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項２０に記載のトランスジェニックマウスモデル系。
【請求項２２】
脳萎縮または脊髄萎縮ならびに脳幹神経節および灰白質に影響する疾患における変性を研究するための非ヒト動物モデル系であって、該疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィー小体病、ラフォラ病、舞踏病およびアテトーシス、ハンティングトン病、および筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病）からなる群より選択される、非ヒト動物モデル系。
【請求項２３】
ウイルスと霊長動物免疫系との間の相互作用を研究するための非ヒト動物モデル系であって、該霊長動物は、ヒトおよび非ヒトからなる群より選択される、非ヒト動物モデル系。
【請求項２４】
ウイルスのペアの間の相互作用を研究するための非ヒト動物モデル系であって、該ウイルスのペアは、（ａ）ＨＨＶ６−ＡとＨＨＶ６−Ｂ；（ｂ）ＨＨＶ６−ＡとＣＭＶ；（ｃ）ＨＨＶ６−ＡとＥＢＶ；（ｄ）ＨＨＶ６−ＡとＶＺＶ；（ｅ）ＨＨＶ６−ＡとＨＨＶ８；（ｆ）ＨＨＶ６−ＡとＨＩＶ；（ｇ）ＨＨＶ６−ＡとＨＴＬＶ；ならびに（ｈ）ＨＨＶ６−Ａ、ＨＨＶ６−Ｂ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＶＺＶおよびＨＨＶ８のうちのいずれか１つとＨＩＶ、からなる群より選択される、非ヒト動物モデル系。
【請求項２５】
疾患の重症度を低減するための候補化合物の能力を研究するための実験系であって、該実験系は、ヘルペスウイルスに感染した非ヒト動物を包含し、
該疾患は、脱髄疾患、神経変性疾患、および多発性硬化症からなる群より選択され、そして
該疾患の重症度の低減が、ウイルスの複製および／または転写の阻害を測定することによって決定される、実験系。
【請求項２６】
サル、野生型マウス、ＥＡＥマウス、およびＣＤ４６トランスジェニックマウスからなる群より選択される哺乳動物を包含する実験系であって、該実験系は、可溶性ＣＤ４６（補体レセプター）を治療剤として試験することを可能にする、実験系。
【請求項２７】
（ａ）可溶性ＣＤ４６、（ｂ）ＣＤ４６に結合する細胞、および（ｃ）ＣＤ４６に結合する人工送達系からなる群より選択されるＣＤ４６を含有する組成物であって、
該組成物は、多発性硬化症および／または脳もしくは他の標的器官の他の自己免疫媒介性炎症疾患および免疫媒介性炎症疾患からなる群より選択される疾患の重症度を低減するのに有効であり；
該可溶性ＣＤ４６は、全長ポリペプチドまたは切断型改変体として、組換え形態で生成され；そして
該人工送達系は、リポソームまたは小胞のいずれかである、組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、神経変性疾患および／または腫瘍の処置に有効である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
疾患の重症度を低減するワクチン治療の能力を研究するための実験系であって、該実験系は、ヘルペスウイルスに感染した動物を含み、該疾患は、自己免疫疾患および／または神経変性疾患である、実験系。
【請求項３０】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項２９に記載の実験系。
【請求項３１】
前記ヘルペスウイルスがＨＨＶ６である、請求項２９に記載の実験系。
【請求項３２】
患者において検出可能な疾患が発症する前に、自己免疫疾患および／または神経変性疾患を早期に検出するための非ヒト動物モデル系。
【請求項３３】
前記患者が、小児またはティーンエージャーである、請求項３２に記載の非ヒト動物モデル系。
【請求項３４】
蛍光細胞分取分析または他の方法によって血清中のウイルス、例えば、これに限定されないがＨＨＶ６（すなわち、立体構造的であってタンパク質抗原に限定されない）に対する特定の抗体を検出するための１種以上の方法であって、検出タグが、細胞表面上の標的抗原または該抗原の天然のコンホメーションに似た他の提示における標的抗原に結合する抗体の存在を明らかにするために使用される、方法。
【請求項３５】
ＨＨＶ６の複製および活性と関連または同時に起こる活性な破壊プロセスが進行している被験体を同定する能力を上記のように評価する方法であって、該方法は、これらの被験体において早期処置を開始し、そしてＭＳ、慢性疲労症候群および他の障害のような疾患の完全な発症を妨げるためのものである、方法。
【請求項３６】
患者においてウイルス感染を検出するためのフローサイトメトリー方法であって、ウイルス特異的免疫グロブリン反応を検出する工程を包含し、該ウイルスは、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＪＣ、ＢＫおよびＳＶ４０からなる群より選択される、方法。
【請求項３７】
抗体またはインビトロの細胞反応の測定が、多発性硬化症の発症についての個体のリスクを予測するためのバイオマーカーとして使用される、請求項３４〜３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体の存在が、ＣＮＳ障害を発症するリスクの予測である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体の存在が、糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎または間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される自己免疫疾患を発症するリスクの予測である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ヘルペスウイルスへの曝露の後の自己免疫疾患および／または神経変性疾患の発症の原因となる遺伝子を同定するための実験系であって、該実験系は、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する、実験系。
【請求項４１】
ヘルペスウイルスへの曝露の後に自己免疫疾患および／または神経変性疾患を引き起こし得る有害な自己抗体反応の発生の原因となる遺伝子を同定するための実験系であって、該実験系は、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する、実験系。
【請求項４２】
ヘルペスウイルスへの曝露の後に自己免疫疾患および／または神経変性疾患の発症を予防し得る有益な自己抗体反応（ウイルスに対する中和抗体）の発生の原因となる遺伝子を同定するための実験系であって、該実験系は、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する、実験系。
【請求項４３】
請求項１または１２に記載のモデル系においてヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度を低減するのに有効な化合物を同定するための方法であって、
（ａ）該モデル系に候補化合物を投与する工程、および
（ｂ）該ヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度が低減したかどうかを決定する工程
を包含する方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の有害な自己抗体の発生をアンタゴナイズする化合物または他の介入の治療価値を評価するための方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の有益な自己抗体の発生を援助する化合物または他の介入の治療価値を評価するための方法。
【請求項４６】
有害な自己抗体をアンタゴナイズするか、または有益な抗体を援助するかのいずれかの方法で、細胞応答を介して免疫系を変更する化合物または介入の治療価値を評価するための、方法およびモデル系。
【請求項４７】
前記ヘルペスウイルス媒介性毒性が、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、および小脳変性からなる群より選択される神経変性疾患と相関的である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
患者サンプルにおいてＨＨＶ−６媒介性細胞毒性を検出するための方法であって、該方法は、細胞死をアッセイする工程を包含し、該患者のサンプルは、ＣＮＳサンプル、血液サンプル、およびＣＳＦサンプルからなる群より選択される、方法。
【請求項４９】
免疫治療処置レジメンの後に、提示ウイルス関連性の発癌性合併症を発症する患者のリスクを評価するためのフローサイトメトリー方法であって、該方法は、
ＣＤ３+ＣＤ８+細胞の絶対数、ＣＤ１９+の絶対数、ＣＤ１９+細胞の相対的比率、およびＣＤ１９+／ＣＤ３+比を測定する工程、
を包含し、ＣＤ３+ＣＤ８+細胞の数の減少、ＣＤ１９+の絶対数の増加、ＣＤ１９+細胞の相対的比率の増加、およびＣＤ１９+／ＣＤ３+比の増加は、患者が、ウイルス関連性の発癌性合併症を示すことのリスクの増加を示す、方法。
【請求項５０】
前記免疫治療処置レジメンが、ナタリズマブ、muromonab-CD3、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、エファリズマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブからなる群より選択される抗体治療剤を前記患者に投与する工程を包含する、請求項４９に記載のフローサイトメトリー方法。
【請求項５１】
糖尿病のための非ヒト動物モデル系であって、該非ヒト動物モデル系はサルおよびヘルペスウイルスを包含し、該サルが該ヘルペスウイルスにより感染される、非ヒト動物モデル系。
【請求項５２】
前記サルが、約２００ｍｇ／ｄｌと２，０００ｍｇ／ｄｌとの間の血液グルコースレベルを示す、請求項５１に記載の非ヒト動物モデル系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許法（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．）セクション１１９（ｅ）のもと、米国仮特許出願第６０／６１８，２７７号（２００４年１０月１２日出願）および同時継続の米国仮特許出願第６０／７２０，６７６号（２００５年９月２６日出願）（これらの各々は本明細書においてその全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（政府の支援）
以下に開示される発明の特定の局面は、米国多発性硬化症協会（National Multiple Sclerosis Society）助成金番号ＰＰ０９１６からの支援によって展開された。政府は、これらの発明の一部の局面に対して特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は、一般的に、ウイルス病原および自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）および糖尿病を含む中枢神経系の疾患）に関する。より具体的には、本明細書において、神経変性および自己免疫脱髄のウイルス病原に対する非ヒト動物モデル系が提供される。このような動物モデル系は、ＭＳの研究のため、そしてＭＳを処置するための候補治療化合物および候補治療組成物の同定ならびに特徴付けのために、適切に使用され得る。本明細書においてはまた、自己免疫疾患に感受性が高い患者において、本明細書において例示される治療剤ナタリズマブによるような１種以上の治療剤での処理の後に、中枢神経系の自己免疫疾患（例えば、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ））を検出するためのマーカーおよび方法も提供される。
【０００４】
（関連分野の説明）
多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の異質性の免疫媒介性慢性脱髄障害の群を示し、３５０,０００人の米国人および世界中で１００万人を超える人々に影響している。ＭＳは、男性の２倍頻度で女性に影響する。従ってＭＳはまた、重大な女性の健康問題である。病理学的には、ＭＳは、単核細胞およびマクロファージからなる脈管周囲の浸潤の斑によって特徴付けられ、ミエリン鞘の集中的な破壊（脱髄）、希突起神経膠細胞の死滅、神経膠星状細胞の増殖、および軸策損傷を伴う。Lassmann, Multiple Sclerosis 4:93-98 (1998); Raine, Multiple Sclerosis and Chronic Relapsing EAE: Comparative Ultrastructural Neuropathology, in Multiple Sclerosis: Pathology, Diagnosis and Management 413-460 (Hallpike et al. eds., 1983);およびTrapp et al., The New England Journal of Medicine 338:278-285 (1998)。
【０００５】
ＭＳの病因は未知であるが、しかし、強力な状況的証拠から、ＭＳは、環境的な誘因の存在下で遺伝的に感受性の高い宿主に生じる自己免疫疾患であることが示唆されている。Hohlfeld, Brain 120:865-916 (1997)および Oksenberg et al., Pathogenesis of Multiple Sclerosis: Relationship to Therapeutic Strategies, in Multiple Sclerosis: Advances in Clinical Trial Design, Treatment and Future Perspectives 14-46 (Goodkin et al. eds., 1996)。大体において、ＭＳ病変の病原に関係し得る因子に関する本発明者らの現在の知識は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ＣＮＳミエリンの抗原による感作によって実験動物で生じた自己免疫疾患の観察に基づいている。Martin et al., Ann. Rev. Immunol. 10:153-187 (1992); Miller et al., Immunol. Today 15:356-361 (1994);およびWekerle et al., Ann Neurol 36:S47-S53 (1994)。
【０００６】
ＥＡＥの多くのモデルで出くわすしばしばステレオタイプ化された疾病とは対照的に、ヒトＭＳの臨床的表現型は、良性であることもあるし、種々の経過（再発形態、緩和形態、または進行形態を含み）を伴って速やかに無力化されることもある。臨床的な提示が均質でないことは、環境因子および／または受け継いだ遺伝的因子の複雑な影響を反映する可能性が最も高く、種々の割合の炎症、脱髄、ならびに希突起神経膠細胞および軸策の病理学を有する特異的な病変パターンを示す生検材料および剖検材料の最近の分析によって示唆されるように、別個の神経病理学的サブタイプに相関する可能性がある。Lassmann, Multiple Sclerosis 4:93-98 (1998); Lucchinetti et al., Ann. Neurol. 47:707-717(2000);およびStorch et al., Ann Neurol 43:465-471 (1998)。ＣＮＳ自己免疫における組織損傷のエフェクター機構は、浸潤Ｔ細胞の直接毒性、炎症性サイトカインの分泌、抗体媒介性毒性、ならびに補体およびマクロファージの活性化を含む（Brosnan et al., Brain Pathol 6:243-257 (1996)において概説される）。
【０００７】
疫学的研究(Kurtzke, Clin. Microbiol Rev. 6:382-427 (1993); Kurtzke et al., Neurology 36:307-328 (1986))、および神経向性ウイルスによる感染との関連で生じるＣＮＳ脱髄疾患の状況的証拠(Gilden et al., Multiple Sclerosis 2:179-183 (1996) ; Stohlman et al., Brain Pathol 11:92-106 (2001); Raine, in Textbook of Neuropathology 627- 714 (Davis et al., eds. 1997a))に基づいて、ＭＳに対して長い間ウイルス病因が疑われている。有力な仮説は、感染が、分子模倣、つまり、ミエリンのペプチドの擬態（mimic）であるウイルスペプチドを、免疫系のＴ細胞が認識することによる現象を誘発し得る（直接模倣）というものである。ウイルス感染後のＴ細胞によるＣＮＳ浸潤はまた、模倣に起因しても急性感染の除去に起因してもいずれにせよ、ウイルスを内部に持つ細胞に対する直接的な細胞毒性か、あるいはCNS内の毒性環境およびマクロファージまたは小神経膠細胞の活性化を引き起こす炎症誘発生成物の産生（巻き添え損傷）のいずれかを通じて、ミエリンおよび／またはニューロンを損傷し得る。このことから、次いで、曝露されたＣＮＳ抗原に対して二次免疫攻撃が誘発され得る(Stohlman et al., Brain Pathol 11:92-106 (2001))。
【０００８】
特定のウイルス感染またはワクチン接種（例えば、麻疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ワクシニアウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ＨＴＬＶ−Ｉ）と、急性の播種性脳脊髄炎、脳炎、または脊髄炎の原因との間の関連は、十分に認識されている。ウイルス感染がＭＳ症状発現を誘発し得ることもまた、広く認められている。コントロールと比較して、ＭＳ血清または脳脊髄液（ＣＳＦ）について、神経向性ウイルスに対してより抗体力価が高いことが報告されている(Johnson et al., N Engl J Med 310: 137-141 (1984);およびJohnson, Ann Neurol 36:S54-S60 (1994))。ＭＳおよびＣＮＳの感染において抗原が駆動するＣＮＳ限定免疫反応が存在することは、患者のＣＳＦ中で特定のオリゴクローナルバンドを見出したことによって（Tourtelotte et al., Neurology 30:240-244 (1980)）、そして特定のＢ細胞免疫グロブリン遺伝子再配置のクローン性増殖がより最近になって実証されたことによって(Baranzini et al., J. Immunol. 163:5133-44 (1999); Owens et al., An. Neurol. 43:236-243 (1998); Colombo et al., J. Immunol. 164:2782-2789 (2000);およびQin et al., J. Clin. Invest. 102:1045-1050 (1998))、支持されている。ＣＮＳ感染において、ウイルス抗原指向性であるオリゴクローナルバンドとは対照的に(Gilden et al.., Multiple Sclerosis 2:179-183 (1996))、ＭＳにおけるオリゴクローナルバンドの特異性は確立されていない。しかし、最近、これらがエプスタイン−バーウイルスの一部の成分と反応し得ることが示唆されている（Cepok et al., J Clin Invest 115 :1352-60 (2005)）。ＭＳ病因において原因とみなされているウイルスの数は絶えず増加しており、実際、インターフェロン（ＩＦＮ）−βが、その抗ウイルス活性からＭＳに対する処置として最初に試された。
【０００９】
ウイルス曝露とＭＳとの間の直接的な関係の確立において１つ困難なことは、そのような関係を確認するための適切なインビボ実験系がないことである。急性または慢性の脱髄疾患を誘導し得るウイルスの例としては、イヌジステンパーウイルス、マウス肝炎ウイルスのＪＨＭ株、マウスセムリキ森林ウイルス、ヒツジビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、マカクザルのＳＶ４０、タイレルマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）(Johnson, Ann Neurol 36:S54-S60 (1994))、およびリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）(Evans et al., Journal of Experimental Medicine 184:2371-84 (1996))が挙げられる。感染に対して動物に感受性を与えるウイルスタンパク質は、トランスジェニックマウスのＣＮＳにおいても発現させることが可能である（Evans et al., Journal of Experimental Medicine 184:2371-84 (1996)）。疾患の病因は、これらのモデルの間で異なり、ウイルスの持続性に関連する成分（単相疾患）、またはウイルス感染に関連しない二次的なＣＮＳの炎症および破壊を含み得る。ＴＭＥＶによるマウスの感染は、胃腸炎を引き起こすが、これは急速に除去される。続いて、近交系の感受性の高い系統のみが、和らぐことのない重篤な進行性の脱髄疾患を発症する。これは、ミエリンに対する巻き添え損傷によるものだと考えられている。Stohlman et al., Brain Pathol 11: 92- 106 (2001)およびDal Canto et al., Microscopy Research and Technique 32:215-29 (1995)。ＬＣＭＶによるマウスの感染は、ＣＮＳ細胞標的を直接的に破壊する細胞傷害性のＣＤ８＋媒介性反応を引き起こす。これらのモデルが自己免疫ＣＮＳ脱髄とウイルス感染との間の関係に第一の（かつ唯一存在する）洞察を提供しているとはいえ、有害な結果を伴わずにヒトに遍在的に感染するいずれかのウイルスとＭＳとの直接的関係を提供するには、まだ不十分であることを理解することは重要である。ＴＭＥＶ感染のＣＮＳ合併症は、遺伝的影響という限定的コントロールのもとにあり、非近交系のヒト集団に対してこれらの機構を当てはめるのは困難である。これらの疾患モデルの多くは、ウイルスを新生児動物に頭蓋内注入することを必要とし、ＥＡＥと類似する人工的な状況は、病原体に対するヒトの自然曝露をまねてはいない。
【００１０】
Callithrix jacchus(C. jacchus)マーモセットを、アジュバント中のヒト白質全体およびミエリン／希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）で免疫すると、ヒトＭＳの典型的形態と似た軽度から中程度の臨床的重症度の慢性的な再発寛解型（relapsing-remitting）疾患を引き起こす。急性のC. jacchus ＥＡＥの神経病理は、広い同一中心状の領域の一次脱髄（primary demyelination）、マクロファージ浸潤、アストログリオーシス（astrogliosis）、および希突起神経膠細胞の死滅からなる。Massacesi et al., Ann. Neurol 37:519-530 (1995); Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001);およびBrok et al., Immunol Rev 183:173-185 (2001)。ミエリン分解の超微細構造特性は、マーモセットＥＡＥとヒトＭＳとにおいて類似しており、このことはミエリン破壊の共通機構を示唆する。Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001)およびRaine et al., Ann Neurol 46:144-160 (1999)。慢性ＥＡＥにおいては、再髄鞘形成が起こる。
【００１１】
C. jacchusマーモセットは、小さな動物である（３５０〜４００ｇｍ）が、連続的な臨床補助的（paraclinical）な研究および実験室研究（例えば、ミエリン抗原に対する末梢血液の反応性、ＣＳＦサンプリング、およびインビボ磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））を得ることができる。Genain et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3601-3605 (1995); Genain et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology 10:420-434 (1996); Jordan et al., AJNR Am. J. Neuroradiol. 20:965-976 (1999);およびHart et al., Am. J. Pathol. 153 :649-663 (1998)。非近交種と同様に、マーモセットは、ミエリン抗原に対してヒトと類似した非常に広範な免疫学的レパートリーを示す。ミエリン全体およびＭＯＧに加えて、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＭＢＰ由来ペプチド、およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）への感受性が実証されている。Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001)。多様なエピトープ認識およびＴ細胞レセプターβ鎖の利用は、ミエリンタンパク質に対する脳炎誘発性レパートリーでみられる。Genain et al., J. Clin. Invest. 94:1339-1345 (1994); Uccelli et al., Eur. J. Immunol 31:474-479 (2001); Villoslada et al., Eur. J. Immunol. 31 :2942-2950 (2001);およびMesleh et al., Neurobiol Dis 9:160-172 (2002)。C. jacchusは、自己免疫の研究のためのユニークな霊長動物である。なぜならば、これらのサルは、自然発生的な骨髄キメラとして誕生するからである。同胞ペアまたはトリプレットが遺伝的に異なる一方、C. jacchusは、Ｔ細胞クローンの養子移植を可能にする互いの骨髄由来の細胞集団を共有し、そしてこれらに対して寛容である。Genain et al., J. Clin. Invest. 94:1339-1345 (1994); Villoslada et al., Eur. J. Immunol 31:2942-2950 (2001);およびWatkins et al., Journal of Immunology 144:3726-3735 (1990)。
【００１２】
C. jacchusのＭＳ様病変は、ミエリンに対する細胞応答と体液性応答との間の複雑な相互作用によって媒介される。ＭＯＧは、脱髄抗体に対する標的であることが示されている。Genain et al., J. Clin. Invest. 96:2966-2974 (1995)。重要なことに、ＭＯＧ特異的自己抗体の病原性は、ヒトＭＳの選択された症例においても実証されている。Genain et al., Nat Med 5:170-175 (1999)。C. jacchusは、ミエリンおよび免疫系の遺伝子について、ヒトと非常に高い程度の相同性を共有している。ＭＯＧ特異的なマーモセット免疫グロブリン遺伝子の最近のクローニングから、遺伝子使用およびエピトープ認識に関するマーモセットとヒトとの間の類似性が明らかにされている。von Budingen et al., Immunogenetics 53:557- 563 (2001) およびvon Budingen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:8207-8212 (2002)。
【００１３】
ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）６は、多発性硬化症（ＭＳ）の病因に関係している。このことは、ＭＳの斑および血清においてＨＨＶ６  ＤＮＡが検出されること、ＭＳ罹患個体において抗ＨＨＶ６反応性が存在すること、そしてこのウイルスに関連する脳炎および脳脊髄炎が報告されていることに基づいている。実際、疫学的研究から、ウイルスもしくは他の環境因子がＭＳを誘発し得るか、またはその経過に影響し得ることが示唆される。しかし、他のウイルスについてと同様に、ＨＨＶ６−Ａと疾患病因との間の因果律の直接的な関連についての証拠は得られていない。
【００１４】
２種のＨＨＶ６改変体（ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂ）は、広範なヒト宿主細胞および霊長動物宿主細胞に感染する能力を示す。ＨＨＶ６−Ｂは、ほとんどが小児期の良性熱性疾患である、突発性発疹を引き起こす。ＨＨＶ６に対する細胞レセプターは、膜補因子タンパク質（ＣＤ４６）として認識されている。ＣＤ４６は、他の微生物およびヘルペスウイルス（麻疹を含む）に対して無差別な遍在的レセプターであり、補体レセプタータンパク質のファミリーに属する。ＭＳの初期段階において高いレベルの可溶性ＣＤ４６が観察される。この知見もまた、再発の際のＨＨＶ６感染の役割についての証拠と解釈される。
【００１５】
ＨＨＶ６は、全てのヘルペスウイルス科に共通する７つの遺伝子ブロックを含む１５９ｋｂｐ〜１７０ｋｂｐ長ゲノム、β−ヘルペスウイルスにのみ見出される遺伝子群（ＯＲＦ  Ｕ２〜Ｕ１４）、およびRoseolavirus属に特異的な遺伝子（ＯＲＦ  Ｕ１５〜Ｕ２５）を有するヘルペスウイルスである。３つの遺伝子、Ｕ２２、Ｕ８３およびＵ９４は、ＨＨＶ６に特異的である（ＨＨＶ７ではない）。ＨＨＶ６−Ａの１１０個のＯＲＦと比較して、ＨＨＶ６−Ｂは１１９個のＯＲＦを含む。Dockrell, J Med Microbiol 52:5-18 (2003)。この２種のＨＨＶ６改変体は非常に似ているにもかかわらず、非常に異なる細胞親和性および疾患の症状発現を有し、このことがこれらが異なるヘルペスウイルスであるという考えを支持する。
【００１６】
ＨＨＶ６−Ｂは、小児期において突発性発疹を引き起こすか、または最初の曝露は無症候性である場合がある。実際には、全ての個体が２歳前に感染する（Caserta et al., J Pediatr 145:478-84 (2004)およびZerr et al., N Engl J Med 352:768-76 (2005)）。ＨＨＶ６−Ｂは、種々の組織（リンパ系器官、脳、血清および唾液腺が挙げられる）において見出される。Ablashi et al., J Virol Methods 21:29-48. (1988); Levy et al., Lancet 335 :1047-1050 (1990); Levy et al., Virology 178:113-121 (1990)およびLusso et al., Baillieres Clin Haematol 8:201-23 (1995))。
【００１７】
ＨＨＶ６−Ａは、ＣＮＳおよび皮膚に対して特定の指向性を有する。この改変体は、今までのところ、最初にＨＨＶ６に感染した小児においてほとんど単離も検出もされておらず、健康な集団におけるいずれの感染性疾患とも明確には関連していない。ＨＨＶ６は、生涯を通じて潜伏状態または複製状態で消えずに残り、唾液腺で活発に複製する（改変体Ｂ）。ＨＨＶ６による二次感染は、免疫易感染性の患者を除いて、通常症状は無い。Dockrell, J Med Microbiol 52:5-18 (2003)およびCampadelli-Fiume et al., Emerg Infect Dis 5:353-366 (1999)。ＨＨＶ６−Ａに対する抗体は、一般集団の大部分において見出され、生涯を通じて安定的に存続し、その後、高齢被験体において減退する。Levy, Lancet 349:558-563 (1997)。
【００１８】
ＣＤ４６細胞ＨＨＶ６レセプター（Santoro et al., Cell 99:817-827 (1999)）は、ＣＮＳを含め遍在的に発現するが、ヒトならびに特定の高等哺乳動物および霊長動物においてのみ発現し、このことから、このウイルスによって感染され得る種の範囲が狭いことが説明される。ＣＤ４６は、Ｃ３ｂタンパク質およびＣ４ｂタンパク質に結合し、補体系を不活化する。従って、ＣＤ４６の推定される機能の１つは、補体による自己溶解から細胞を保護することである。ＨＨＶ６は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞およびγδ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、上皮細胞、ならびに種々のリンパ系由来細胞系またはＣＮＳ由来細胞系に感染し得る。Dockrell, J Med Microbiol 52:5-18 (2003); Campadelli-Fiume et al., Emerg Infect Dis 5:353-366 (1999);およびLevy, Lancet 349:558-563 (1997)。両方の改変体とも初代の胎児神経膠星状細胞に感染するが、ＨＨＶ６−Ａは、インビボでより大きな神経向性を有するようである。Hall et al., Clin Infect Dis 26:132-137 (1998)。ＨＨＶ６によるインビトロ感染は単相性（monophasic）であり、その後、一般的に、細胞増殖の低下および／または細胞死が起こる。Grivel et al., J Virol 77:8280-9 (2003); Opsahl et al., Brain 128:516-27 (2005);およびSmith, et al., J Virol 79:2807-13 (2005)。インビボにおいて、ＨＨＶ６は、ヒト胎児の胸腺および肝臓を移植されたＳＣＩＤマウスモデルにおいて示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞枯渇を誘導し（Gobbi et al., J Exp Med 189:1953-1960 (1999)）、ＨＩＶが関連する免疫抑制の一因となり得る。記載されている増強効果または抑制効果のいずれかについて、ＨＨＶ６感染が、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む他のウイルスに干渉することもまた明らかである。Levy, Lancet 349:558-563 (1997)。
【００１９】
上記ＣＤ４６レセプターは、麻疹ウイルスを含む多くの病原体によって共用され、この分子を通じたシグナル伝達は、Ｔ細胞の刺激および活性化の最も強力な機構の１つである。細胞質ドメインが異なるＣＤ４６のいくつかのアイソフォームがヒトで発現されており、ＣＤ４６レセプターのこれら２クラスの関与は、Ｔｈ１表現型またはＴｈ２表現型に対する免疫応答の分極に関して反対の結果を有するようである（Marie et al., Nat Immunol 3:659-66 (2002); Russell, Tissue Antigens, 64:111-8 (2004);および Riley-Vargas et al., Trends Immunol 25:496-503 (2004)）。
【００２０】
インビボにおいて、ＨＨＶ６は、ヒト胎児の胸腺および肝臓を移植されたＳＣＩＤマウスモデルにおいて示されるように、ＣＤ４＋ Ｔ細胞枯渇を誘導し（Gobbi et al., J Exp Med 189:1953-1960 (1999)および Gobbi et al.., J Virol 74:8726-31 (2000)）、ＨＩＶが関連する免疫抑制の一因となり得る（Lusso et al.., Immunol Today 16:67-71 (1995b)）。記載されている増強効果または抑制効果のいずれかについて、ＨＨＶ６感染が、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含む他のウイルスに干渉することもまた明らかである（Levy, Lancet 349:558-63 (1997)およびAblashi et al., J Virol Methods 21:29-48 (1988)）。霊長動物（マカクおよびチンパンジー）においてＨＨＶ６による感染のモデルを作製するために多くの試みがなされており、ＳＣＩＤマウスモデルにおいてと同様に、ＨＨＶ６−Ａが、サル後天性免疫不全症候群において補助因子として作用するという考えを主に支持する（Lusso et al., J Virol 64:2751-8 (1990)およびLusso et al., AIDS Res Hum Retroviruses 10:181-7 (1994)）。
【００２１】
一般集団の９５％よりも多くが新生児期の間に上記ウイルスに曝露されているので、病原体というさらなる因子の非存在下において、ＭＳ有病率（合衆国の白色人種（Caucasion）について、およそ１:１,０００）の単一の原因としてＨＨＶ６感染を想定するのは困難である。ＭＳとウイルス曝露との関係を説明するために提唱されている１つの可能性のあるシナリオは、一次感染が中枢神経系（ＣＮＳ）に対して無症候性の免疫攻撃を誘発し、これが長い間の後に、ＣＮＳ指向性自己免疫の発症につながるというものである。この仮説に賛成すると、ＭＳを発症するリスクは生涯の早いうちに獲得するようであり、個体が小児の間に移住する場合、低／高有病率の地理的領域への、および該領域からの移動パターンにしたがう。ＭＳの流行は、以前に単離された島集団が外来環境因子に新たに曝露された後にも観察されている。しかし、任意のウイルス曝露とＭＳの一般的形態との間の関連の直接的な証拠はまだ存在しない。
【００２２】
ＭＳに対する特定の関連性の中で、両方のＨＨＶ６改変体がＴｈ１（炎症誘発性）表現型に対してＴ細胞の炎症反応を調節する能力を示すという最近の観察がある。Mayne et al., J Virol 75:11641-11650 (2001)。さらに、ＨＨＶ６−Ａによる内皮細胞感染の結果、脈管内皮の浸透性が上昇するようである。Caruso et al., J Med Virol 67:528-533 (2002)。従って、ＭＳの病態生理学において異質性の考えを維持すると、まだ同定されていない特定の臨床的サブタイプまたは神経病理学的サブタイプに関して、ＭＳとＨＨＶ６との間に関係性が存在するという可能性はある。しかし、このことが、このウイルスが、一般的に、全身性の自己免疫調節異常（dysregulation）、ウイルスＤＮＡの検出、抗体反応性を伴う疾患とみなされているＭＳを引き起こすことの十分な証拠であると結論付けるのは時期尚早であるか、あるいはウイルス感染による関連でさえ、実際は、この疾患の原因ではなく疾患の結果を表す可能性もある。
【００２３】
ＨＨＶ６−ＡとＭＳとの間の関連は、最近、ＭＳ斑内の罹患した希突起神経膠細胞においてＨＨＶ６−Ｂ  ＤＮＡ配列が見出されたことによって示唆された（Challoner et al., Proc. Natl. Acad. Sci 92:7440-7444 (1995); Opsahl et al., Brain 128:516-27 (2005)）。しかしながら、これらの観察は、その後の試みによっては確認されておらず（Coates et al., Nat Med 4:537-8 (1998)）、免疫組織化学によって形式的に確認されることができなかった。ＨＨＶ６  ＤＮＡはまた、正常被験体の脳およびアルツハイマー病においても見出されている（Luppi et al., J Med Virol 47:105-11 (1995); Lin et al., J Pathol 197:395-402 (2002)）。従って、ＣＮＳでのウイルス配列の検出は、病原性を証明するためには十分ではない。血清的な研究から、コントロールと比較して、再発寛解型ＭＳの患者において抗ＨＨＶ６抗体の力価が上昇していることが報告されている（Ablashi et al., Mult Scler 4:490-6 (1998); Sola et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 56:917-9(1993); Soldan et al., Nature Medicine 3:1394-7 (1997)）。しかし、血清および／またはＣＳＦ中のＩｇＧ／ＩｇＭ反応性、血清、ＣＳＦおよび脳におけるＨＨＶ６  ＤＮＡまたはウイルス転写物の存在、ＨＨＶ６に応答する末梢Ｔ細胞増殖、または培養物中のウイルス回収を試験する数多くのその後の研究は、これらの結果を明白には確認していない。以下の概説は、実施されている多くのＨＨＶ６関連研究の詳細な考察を提供する（Ablashi et al., J Virol Methods 21:29-48 (1988); Ablashi et al., Mult Scler 4:490-6 (1998); Krueger et al., Pathol Res Pract 185:915-29 (1989); Enbom, Apmis 109:401-11 (2001); Moore et al., Acta Neurol Scand 106:63-83 (2002); Krueger et al., Intervirology 46:257-69 (2003); DeRanieri et al., J Sch Nurs 20:69-75 (2004); Dewhurst, Herpes 11 Suppl 2:105A-111A (2004); Fotheringham et al., Herpes 12:4-9 (2005)）。
【００２４】
ＨＨＶ６−Ａと特定の形態のＣＮＳ脱髄との間の関連（ＭＳ提示の範囲の極値（extreme）を表す可能性がある）についてより有力なもの（compelling）は、脳脊髄炎の多くの症例報告、および感染とＣＮＳ疾患との間の明確な関係が強く示唆された急性および慢性の脊髄炎である（Carrigan et al., Neurology 47:145-148 (1996); Mackenzie et al., Neurology 45.:2015-7 (1995); McCullers et al., Clin Infect Dis 21:571-6 (1995); Novoa et al., J Med Virol 52:301-8 (1997); Portolani et al., J Med Virol 65:133-7 (2001); Portolani et al., Minerva Pediatr 54:459-64 (2002); Singh et al., Transplantation, 69:2474-9 (2000); Moore et al., Acta Neurol Scand 106:63-83 (2002); Dockrell, J Med Microbiol 52:5-18 (2003); Campadelli-Fiume et al., Emerg Infect Dis 5:353- 66 (1999); Gilden et al., Multiple Sclerosis 2:179-183 (1996); Kleinschmidt-DeMasters et al., Brain Pathol 11:440-51 (2001); Ward, Curr Opin Infect Dis 18:247-52 (2005)）。
【００２５】
ＭＳおよび脳脊髄炎に加えて、ＨＨＶ６曝露およびＨＨＶ６反応性との関連が、慢性疲労症候群および睡眠発作（narcoplepsy）についても主張されている。慢性疲労症候群（ＣＦＳ）は、全ての年齢の成人の無力化疾患（incapacitating disease）であり、ＭＳと特定の臨床的特徴（疲労）を共有し、また免疫媒介性である可能性が高い。ＭＳと同様に、抗体反応性の研究は、ＣＦＳとＨＨＶ６との間の関係性の提供において矛盾している（Enbom, Apmis 109:401-11 (2001); Ablashi et al., J Clin Virol 16:179-91 (2000); Wallace et al., Clin Diagn Lab Immunol 6:216-23 (1999); Nicolson et al., Apmis 111:557-66 (2003)）。
【００２６】
ＨＨＶ６感染とヒトＭＳを模倣するＣＮＳ炎症状態の発現との間の原因となる関係を理解するための実験系が必要とされている。このようなモデルの唯一の有用性は、感染とＣＮＳ疾患との間の原因となる時間依存的な関係を制御された様式で研究することを可能にする。従って、自己免疫ＣＮＳ脱髄におけるこのウイルスの役割を特徴付けるために、ＨＨＶ６曝露の後に長期的研究を可能にする実験系、ならびにこの自己免疫疾患の重症度を改善または低下させるのに有効な効果的な治療および処置レジメンを同定し、特徴付けることに適切な動物モデル系に対する必要性が、当該分野で依然として存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要旨）
本発明は、特に、神経変性、自己免疫脱髄、および糖尿病のウイルス病因のための非ヒト動物モデル系を提供することによって、これらの必要性および他の関連する必要性に対処する。このような動物モデル系は、多発性硬化症（ＭＳ）の研究のため、そしてＭＳを処置するための候補の治療化合物および治療組成物の同定ならびに特徴付けのために、適切に使用することができる。
【００２８】
本発明による動物モデル系は、ヒトのＭＳ疾患と相関的であり、従って、広範な利用性を見出す。このような動物モデル系は、例えば、（１）ＨＨＶ６に曝露した後にＣＮＳ自己免疫の病因を制御する因子を同定するための機会を提供する；（２）ＭＳ疾患を処置するために効果的な可能性のある治療剤の同定および特徴付けのための適切な系を提供する；（３）さらなるもしくは代替的な、神経変性および自己免疫、免疫媒介性ヒト状態または感染性および感染後のヒト状態について、同様の調査および治療試験を実施するための適切な系を提供する；（４）ＭＳの検出のためのバイオマーカーを新たに見出すことを可能にする；そして（５）ＨＨＶ６誘導型ＣＮＳ病理を治療するためのストラテジーおよび／または処置レジメンを開発する。
【００２９】
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は非ヒト霊長動物であって、この霊長動物は、ヘルペスウイルスによって感染される。典型的には、本発明に従ってヘルペスウイルスに適切に感染された非ヒト霊長動物としてはサルが挙げられ、マーモセット、新世界ザルおよび旧世界ザルからなる群より選択される。ここで、上記霊長動物は、上記ヘルペスウイルスによる感染に対して感受性が高い。
【００３０】
マーモセット（C. jacchus）がヘルペスウイルスにより感染される非ヒト霊長動物モデル系が、本明細書において例示される。より具体的には、ＨＨＶ６による非ヒト動物のインビボ感染に基づいたＭＳ疾患の非ヒト動物モデル系が、本明細書において提示される。ＨＨＶ６誘導型ＣＮＳ脱髄の例示的な動物モデルは、コモンマーモセットC jacchus、新世界非ヒト霊長動物において作製されており、この動物は、自然発生的な自己免疫を発症し、そしてまた実験的アレルギー性脳脊髄炎の研究においても使用される。
【００３１】
捕獲マーモセットは、ＨＨＶ６に対してナイーブであり、ヒトＣＤ４６に相同的であるＣＤ４６を発現し、このことから、本明細書において提示されるように、最初の曝露と次の曝露とに続く事象をモデル化し、感染の結果を研究するための機会を提供する。ＣＮＳ自己免疫脱髄は、ＨＨＶ６−Ａに対する成体マーモセットの反復曝露に関連するようである。
【００３２】
従って、特定の実施形態において、１種以上のＨＨＶ６改変体により例示されたヘルペスウイルスに感染させたC. jacchusマーモセットが提供される。ＨＨＶ６による感染は単相的であり、インビトロにおいて細胞を速やかに死に至らしめる（ＨＨＶ６は、ＣＮＳグリア細胞においてアポトーシスを誘導し得る）一方、本明細書において、ＣＮＳ脱髄疾患が、ＨＨＶ６−Ａによるナイーブな成体マーモセットの感染の後に起こることが実証される。いくつかの例において、特定の動物が、灰白質（特に、脳幹神経節）の病変、および著しい脳萎縮を進行させることがさらに実証される。いずれの特定の作用様式にも束縛されることを望まずに、このＣＮＳ疾患は、ミエリン抗原に対してＴ細胞の反応性が生じることに関連すると考えられる。
【００３３】
本明細書で開示される非ヒト霊長動物モデル系において、多種多様なヘルペスウイルスを適切に使用することができる。ＣＤ４６レセプターに特異的に結合し得るヘルペスウイルスが特に適切である。ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択されるヘルペスウイルスに感染される非ヒト霊長動物モデル系が、本明細書において例示される。
【００３４】
企図される正確な適用に依存して、単一のヘルペスウイルス改変体に対する単回曝露によって、非ヒト霊長動物を感染させることができ、これにより、ヘルペスウイルスによる非ヒト霊長動物の感染が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる。代替的には、単一のヘルペスウイルス改変体に対する２回以上の曝露によって、非ヒト霊長動物を感染させ、上記ヘルペスウイルスへの非ヒト霊長動物の２回以上の曝露が、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発（trigger）および／または増大させるような他の適用が必要とされ得る。霊長動物が、２種以上のヘルペスウイルス改変体への１回以上の曝露により感染される非ヒト霊長動物モデル系が、さらに提供される。本明細書において提示される非ヒト霊長動物モデル系に特に適切なのは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択されるヘルペスウイルス改変体である。
【００３５】
本発明の非ヒト霊長動物モデル系は、疾患の機構を研究するため、そして中枢神経系の多くの疾患（特に、中枢神経系の炎症性疾患および脱髄疾患）のための候補治療剤を同定および特徴付けするために、適切に使用される。多発性硬化症の非ヒト霊長動物モデル系が、本明細書において例示される。関連する局面において、１種以上のヘルペスウイルス改変体に非ヒト霊長動物を曝露すると、中枢神経系もしくは末梢神経系および神経筋接合部の他の炎症性疾患または悪性疾患の重症度を、さらに誘発および／または増大させ得る。
【００３６】
例えば、非ヒト霊長動物を１種以上のヘルペスウイルスに曝露すると、新生物随伴症候群および小脳変性、辺縁系脳炎、眼球クローヌス−ミオクローヌス、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）および他の広範性または病巣性の白質萎縮症（早発型および遅発型）、急性および慢性の多発性ニューロパシー（polyneurpathy）ならびに急性および慢性の多発神経根障害、急性播種性脳脊髄炎、ミオパシー、重症筋無力症、ギヤン−バレー症候群（Guillan Barre）、ミラー−フィッシャー症候群、イートン−ランバート症候群、ＣＮＳ脈管炎、サルコイドーシスおよび神経サルコイドーシス、ラスムッセン病、新生物随伴性感覚性ニューロパシー、ＣＮＳリンパ腫、高悪性度および低悪性度の希突起神経膠腫ならびに高悪性度および低悪性度のグリア芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫（glioblastoma multiformis）、視神経膠腫および髄膜腫、脳室上衣細胞腫および髄芽細胞腫からなる群より選択される疾患の重要度を誘発および／または増大させ得る。
【００３７】
本発明の代替的な局面は、１種以上のヘルペスウイルスへの非ヒト霊長動物の曝露が、睡眠発作、慢性疲労症候群、スティッフマン症候および小児の自閉症からなる群より選択される炎症性要素を含む神経学的疾患の重症度を誘発および／または増大させる局面を提供する。
【００３８】
本発明のなおさらなる局面は、１種以上のヘルペスウイルスへの非ヒト霊長動物の曝露が、糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎または間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性疾患および／または自己免疫疾患の重症度を誘発および／または増大させ得る局面を提供する。
【００３９】
本発明のさらに他の局面は、１種以上のヘルペスウイルスの直接毒性を媒介する因子の同定に適切な非ヒト霊長動物モデル系と、希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、および脳細胞からなる群より選択される細胞型とを提供する。
【００４０】
本明細書において開示される発明の他の実施形態は、脳萎縮または脊髄萎縮ならびに脳幹神経節および灰白質に影響する疾患における変性を研究するための非ヒト動物モデル系を提供し、ここで上記疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レヴィー小体病、ラフォラ病、舞踏病およびアテトーシス、ハンティングトン病、および筋萎縮性側索硬化症（Lou Gherig's disease）からなる群より選択される。
【００４１】
さらなる実施形態は、ウイルスと霊長動物免疫系との間の相互作用を研究するための非ヒト動物モデル系を提供し、上記霊長動物は、マーモセット、新世界ザル、および旧世界ザルからなる群より選択される。このような実施形態の特定の局面は、ウイルスのペアの間の相互作用を研究するための非ヒト動物モデル系を提供し、上記ウイルスのペアは、以下：（ａ）ＨＨＶ６−ＡとＨＨＶ６−Ｂ；（ｂ）ＨＨＶ６とＣＭＶ；（ｃ）ＨＨＶ６とＥＢＶ；（ｄ）ＨＨＶ６とＶＺＶ；（ｅ）ＨＨＶ６とＨＨＶ８；（ｆ）ＨＨＶ６とＨＩＶ；および（ｇ）ＨＨＶ６とＨＴＬＶからなる群より選択される。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、疾患の重症度を低減するための候補化合物の能力を研究するための実験系を提供し、上記実験系は、ヘルペスウイルスに感染した非ヒト動物を包含し、上記疾患は、脱髄疾患、神経変性疾患、および多発性硬化症からなる群より選択され、そして上記疾患の重症度の低減は、ウイルスの複製および／または転写の阻害を測定することによって決定される。本明細書において提供されるこの実験系の特定の局面は、サル、野生型マウス、ＥＡＥマウス、およびＣＤ４６トランスジェニックマウスからなる群より選択される哺乳動物を包含し、上記実験系は、可溶性ＣＤ４６（補体レセプター）を治療剤として試験することを可能にする。
【００４３】
本発明の関連する局面は、疾患の重症度を低減するための可能性のあるワクチン治療を研究するための実験的な非ヒト動物モデル系を提供し、上記疾患は、多発性硬化症のような自己免疫疾患および／または神経変性疾患からなる群より選択される。このような実験系は、典型的には、ヘルペスウイルスに感染された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物または非ヒト霊長動物）を含む。例えば、このヘルペスウイルスがＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂである実験的な非ヒト動物モデル系が、本明細書において例示される。
【００４４】
なおさらなる関連する局面は、ヘルペスウイルスへの曝露の後に自己免疫疾患および／または神経変性疾患の発症の原因となる遺伝子を同定するための実験系を含み、この実験系は、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する。
【００４５】
さらに他の関連する局面は、ヘルペスウイルスへの曝露の後に自己免疫疾患および／または神経変性疾患を引き起こし得る有害な自己抗体反応の発生の原因となる遺伝子を同定するための実験系を含み、この実験系は、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する。
【００４６】
他の関連する局面は、有益な自己抗体反応（例えば、ヘルペスウイルスに対する中和抗体反応）の発生の原因となる遺伝子を同定するための実験系を含み、この有益な自己抗体反応は、ヘルペスウイルスへの曝露の後に自己免疫疾患および／または神経変性疾患の発症を予防するか、あるいはこの発症を実質的に低下させる。このような実験系は、典型的には、遺伝子発現アレイ、プロテオミクス、メタボノミクス、およびメタボロニクスからなる群より選択される技術を使用する。
【００４７】
本発明の他の実施形態において、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子とヘルペスウイルスとを含むトランスジェニック動物モデル系（例えば、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ）および線虫動物モデル系が提供される。ＣＤ４６をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス動物モデル系が本明細書において例示され、このトランスジェニックマウスは、ヘルペスウイルスに感染されており、このヘルペスウイルスは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より典型的には選択される。これらの実施形態の特定の局面において、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子は、インビボで遍在的に発現する。代替的な局面において、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子は、脳、脊髄、および末梢神経からなる群より選択される組織においてインビボで発現する。
【００４８】
本明細書において提示されるトランスジェニックマウス動物モデル系は、ＣＤ４６トランスジェニックマウスをヘルペスウイルスへ単回曝露することによって達成し得、このようなウイルス曝露は、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる。代替的な局面において、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させるために、トランスジェニックマウスをヘルペスウイルスに２回以上曝露することが必要とされる。本発明のなおさらなる局面において、上記ＣＤ４６トランスジェニックマウスは、例えば、（ａ）ＨＨＶ６−ＡとＨＨＶ６−Ｂ；（ｂ）ＨＨＶ６とＣＭＶ；（ｃ）ＨＨＶ６とＥＢＶ；（ｄ）ＨＨＶ６とＶＺＶ；（ｅ）ＨＨＶ６とＨＨＶ８；（ｆ）ＨＨＶ６とＨＩＶ；および（ｇ）ＨＨＶ６とＨＴＬＶのような２種以上のウイルスの組み合わせに曝露される。
【００４９】
本明細書において開示されるトランスジェニックマウス動物モデル系は、中枢神経系または末梢神経系の疾患（例えば、神経系の炎症性疾患）の重症度を低下させるための候補化合物の能力を研究するために適切に使用される。典型的には、本明細書に記載のように、ＣＤ４６トランスジェニックマウスを１種以上のヘルペスウイルスに曝露すると、多発性硬化症、糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎もしくは間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性疾患および／または自己免疫疾患の重症度を誘発および／または増大させる。このようなヘルペスウイルスに感染させたＣＤ４６トランスジェニック動物モデル系は、例えば、希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、および脳細胞からなる群より選択される細胞型に対するヘルペスウイルスの直接毒性を媒介する因子を同定するのに適切である。例示的な因子としては、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のような免疫系の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、（ａ）可溶性ＣＤ４６、（ｂ）ＣＤ４６に結合する細胞、および（ｃ）ＣＤ４６に結合する人工送達系からなる群より選択されるＣＤ４６改変体を含有する組成物を提供する。ここでこの組成物は、多発性硬化症および／または脳もしくは他の標的器官の他の自己免疫疾患ならびに免疫媒介性炎症疾患からなる群より選択される疾患の重症度を低減するのに有効であり、上記ＣＤ４６は、全長ポリペプチドまたは切断型改変体として組換え形態で生成され、そして上記人工送達系は、リポソームまたは小胞のいずれかである。特定の局面において、このような組成物は、神経変性疾患および／または腫瘍の処置に有効である。
【００５１】
本発明のなおさらなる実施形態は、例えば、多発性硬化症および／または脳もしくは他の標的器官の他の自己免疫疾患および免疫媒介性炎症疾患のような疾患を発症するリスクを有する患者を検出するための方法を提供する。特定の局面において、このような方法は、以下の（１）〜（４）の工程を包含する：（１）ヒトＣＤ４６に特異的に結合する抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルを患者から単離する工程；（２）ヒトＣＤ４６に特異的に結合する抗体とヒトＣＤ４６を発現する細胞とを含む第一の複合体を得るために必要とされる時間の間、そのような条件下において、ヒトＣＤ４６またはその改変体を発現する細胞と上記生物学的サンプルを接触させる工程；（３）二次抗ヒト抗体と上記複合体を接触させる工程であって、この二次抗体は、上記第一の複合体に特異的に結合する二次抗ヒト抗体を含む第二の複合体を得るために必要とされる時間の間、そのような条件下において検出可能なタグを含む、工程；ならびに（４）上記結合された二次抗体上の検出可能なタグを検出する工程。典型的には、蛍光細胞分取（fluorescence activated cell sorting）の分析または検出タグを使用して二次抗体の存在を明らかにする他の方法によって、二次抗体上の検出可能なタグが検出される。検出可能なタグは、蛍光タグであってもよいし放射性同位元素であってもよい。特定の局面において、これらの実施形態に従う方法は、ヘルペスウイルスの複製（ＨＨＶ６の複製を含む）に関連するか、またはこれに付随する活動的な破壊プロセスを有し、活性が継続している患者を同定するために適切に使用することができる。このような方法によって、患者で早期処置レジメンを開始することが可能であり、これによって多発性硬化症、慢性疲労症候群および他の関連疾患のような疾患の完全な発症が予防される。
【００５２】
本発明の関連する実施形態は、患者（例えば、ヒト患者）において、ヘルペスウイルス媒介性感染（例えば、ＨＨＶ６媒介性感染）の中和をもたらす抗体または細胞反応の存在を評価するための方法を提供する。早発型もしくは遅発型の器官特異的自己免疫（多発性硬化症および糖尿病を含む）をもたらす抗体および／またはＴ細胞反応を生じない患者を評価することを可能にする、同様の方法が提供される。これらの方法によって、抗体（例えば、中和抗体）または細胞反応が検出され、中枢神経系の疾患（例えば、多発性硬化症）を発症する患者のリスクならびに／あるいは糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎または間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される自己免疫疾患を発症する患者のリスクと相互に関連付けされる。
【００５３】
これらの実施形態の代替的な関連局面は、患者サンプル内の細胞においてヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度を低下するのに有効な化合物を同定するための方法を含み、このような方法は、（ａ）本明細書に記載の非ヒト動物モデル系に候補化合物を投与する工程、および（ｂ）ヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度が低下したかどうかを決定する工程を包含する。典型的には、このようなヘルペスウイルス媒介性毒性は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、および小脳変性からなる群より選択される神経変性疾患と相関する。患者サンプル内の例示的な細胞としては、患者の血清、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）の中のニューロンおよび細胞、ならびに／または他の患者サンプルが挙げられる。細胞毒性の測定は、毒性、溶解効果、サイトカイン媒介性死滅、アポトーシスを含む。
【００５４】
有害な自己抗体の発生をアンタゴナイズする化合物または他の介入の治療価値を評価するための方法もまた提供され、抗体の産生は、例えば、ＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂのようなヘルペスウイルスに曝露されることによって誘導される。有益な自己抗体の発生を援助する化合物または他の介入の治療価値を評価するための関連方法が提供される。有害な自己抗体をアンタゴナイズするか、もしくは有益な抗体をアゴナイズするような細胞反応を介して免疫系を変更する化合物または介入の治療価値を評価するためのさらなる方法が提供される。
【００５５】
本発明はまた、他の実施形態において、免疫抑制、移植、ＡＩＤＳ、および／または他の免疫不全に対して感受性が高い患者において、多発性硬化症および／または別の自己免疫疾患のような疾患状態での遍在的なウイルスによる感染のリスクを検出するための方法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、中枢神経系の自己免疫疾患は、免疫系がウイルス複製を抑制および制御することができなくなることの結果として生じるという、マーモセットおよびヒトにおいての観察に基づいている。本明細書において開示された観察に基づいて、本発明は、自己免疫脱髄疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））についての非ヒト動物モデル系を提供し、この動物モデル系は、神経変性疾患の治療的処置の様式の同定および特徴付けする際に利用を見出す。本発明の他の関連する実施形態において、ヒトの自己免疫脱髄に相関的なマーカーを検出するための方法論が提供される。本発明の種々の実施形態の各々は、本明細書の以下において詳細に説明され、本明細書で引用される文献と併せて最もよく理解される。これらの文献は、これから以下で記載されるものであっても上で既に記載されたものであっても、それらは全て、それらの文献があたかも個々に本明細書によって援用されるように、その全体が本明細書において参考として援用される。
【００５７】
（中枢神経系の炎症状態および神経変性状態のマーモセット動物モデル系）
第一の実施形態において、ＨＨＶ６感染とＣＮＳ炎症状態または神経変性状態の発生との間の原因に関する時間依存的関係を特徴付けるために有用な非ヒト実験動物モデル系が開示される。このような非ヒト動物モデル系は、制御された様式でヒトの多発性硬化症（ＭＳ）および糖尿病を模倣する霊長動物のモデル系によって例示される。
【００５８】
上記で示されたように、本発明は、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）（非ヒト霊長動物の新世界ザル）は、自然発生的な自己免疫を発症し、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）による感染に対して感受性が高く、そしてミエリン抗原での免疫化に対して非常に感受性が高いという観察に部分的に基づいている。このコモンマーモセットは、ＭＳの治療および処置レジメンを同定および特徴付けするために適切に使用され得る実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のＭＳ様形態を発生させる。
【００５９】
従って、特定の実施形態において、中枢神経系の炎症状態および／または神経変性状態（ＭＳがよい例であるが、これに限定されない）についての非ヒト動物モデル系を提供する。このモデル系では、C. jacchusマーモセットは、例えば、１種以上のＨＨＶ６改変体（例えば、ＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂ）のようなヘルペスウイルスに感染される。本発明で開示される実施例において記載するように、ＨＨＶ６での感染は単相的であり、インビトロにおいて細胞を速やかに死に至らしめるが、ＨＨＶ６−Ａによるナイーブな成体マーモセットのインビトロでの感染の結果としてはＣＮＳ脱髄疾患が起こる。いかなる特定の作用様式にも束縛されることを望むことなく、このＣＮＳ疾患および関連するＣＮＳ疾患は、ミエリン抗原に対するＴ細胞反応性を受けたアポトーシス性の細胞死に関連しているようにみえ、この細胞死は、臨床的な疾患に続いて発生するようであると考えられる。アポトーシスは、インビトロ実験によって実証されるとおり、神経膠細胞（オリゴ細胞、神経膠星状細胞）およびニューロンにも影響を与え得る。
【００６０】
本発明による非ヒト実験モデル系は、ヒトの自己免疫神経変性疾患に相関的であり、従って、（１）ＨＨＶ６−Ａへの曝露後にＣＮＳ自己免疫の病因を制御する因子を同定するための機会を提供し、そして（２）中枢神経系の自己免疫疾患の処置に有効な可能性のある治療剤を同定および特徴付けるための適切な系を提供する。
【００６１】
C. jacchusマーモセットがヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６の改変体）への曝露の後に炎症性脱髄を発症するという本発明で開示される知見は、機能的なＨＨＶ６細胞レセプター（すなわち、ＣＤ４６）を遍在的に発現し、かつヒトに近い系統発生を有する霊長動物種においてＣＮＳ脱髄のウイルス病因を理解するための独自の機会を提供する。ＨＨＶ６に感染したC. jacchusマーモセット動物モデル系は、非近交系種においてＣＮＳ自己免疫脱髄の間の原因となる関連を制御する因子を明らかにするためのさらなる研究において利用を見出す。この非近交種は、異なる感受性およびＨＨＶ６（成人ヒト集団の大部分において病原性であるとはみなされていない遍在的なウイルス）への自然形態の曝露（例えば、血行性）を示し得る。
【００６２】
C. jacchusマーモセットは、リンパ球の養子移植を可能にする自然発生的な骨髄キメラを有し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩの多形性が限定されており、そしてウイルス感染（特に、ヘルペスウイルス）への高い程度の感受性についての基礎となるＭＨＣクラスＩ領域が広く欠けているので、これらの動物は、本発明の動物モデル系において適切に使用され得る。
【００６３】
本明細書において提示される非ヒト動物モデル系は、神経変性、自己免疫脱髄、および糖尿病に関連する疾患（例えば、ＭＳ）の基礎となる感染原因を診断するために適切なバイオマーカーの同定および確認において有用性を見出す。例えば、このような動物モデル系は、ヒトでのこのような疾患のために適切に使用することができ、前臨床段階を含め若年成人の疾患リスクを予測する。
【００６４】
本明細書において開示される非ヒト動物モデルは、ＭＳの場合だけでなく、他の疾患の場合においても、他の遍在的ヒトウイルスと、複合的な因子（agent）への曝露と、自己免疫または免疫不全の状態をもたす全ての生物との間の相互作用のモデル化において有用性を見出す。この点に関して、例えば、マーモセット動物モデルから得たデータは、バイオインフォマティクスによってこれらの相互作用をモデル化する能力を高めることが可能である。Krueger et al., (2004)。本明細書において開示される非ヒト動物モデル系はまた、ＨＨＶ６感染によって駆動される神経変性、自己免疫脱髄、および糖尿病に関連する疾患（例えば、ＭＳ）の治療的介入および予防的介入のための治療標的ならびに治療剤の同定においても有用性を見出す。
【００６５】
（実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）についてのコモンマーモセット動物モデル系）
コモンマーモセット（シロミミマーモセット（white ear-tuffed marmoset）、Callithrix jacchus jacchus）は、飼育下繁殖が容易であり、サイズが小さい（成体齢において、〜４００ｇｍ）ことに起因して、パーキンソン症候群および加齢の動物モデルとして使用されている非ヒト霊長動物の新世界ザルである。Abbott et al., Comp Med 53:339-50 (2003); Mansfield, Comp Med 53:383-92 (2003); Zuhlke et al., Toxicol Pathol 31 Suppl: 123-7 (2003); Brack et al., Vet Pathol 18:45-54 (1981)およびGore et al., J Med Primatol 30:179-84 (2001)。マーモセットは、タマリンおよびヒトを含む他の霊長動物と密接に関連しており、多くの自己免疫疾患に対する異なる感受性ならびに大腸炎、甲状腺炎、および不明な病態生理からの腎不全による消耗症候群の自然発症を共にする。Levy et al., J Comp Pathol 82:99-103 (1972)およびClapp et al., in Carcinoma of the Large Bowel and Its Precursors: Progress In Clinical and Biological Research 247-61 (Ingalls et al. eds., 1985)。
【００６６】
マーモセットは、多形性のＭＨＣクラスＩＩ構成を有するが、進化的に大きく欠失したことに起因する非常に限定されたクラスＩを有し(Watkins et al., Journal of Immunology 144:3726-3735 (1990); Antunes et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:11745-11750 (1998)およびCadavid et al., J. Immunol. 157:2403-2409 (1996))、このことが多くのウイルスに対して感受性が高いことを説明する可能性が高い。さらに、マーモセットの系統発生はヒトと近く、多くの免疫系遺伝子および神経系遺伝子が、高い程度で保存されている。Uccelli et al., J. Immunol. 158:1201-1207 (1997); Uccelli et al., Eur. J. Immunol. 31:474-479 (2001); von Budingen et al., Immunogenetics 53:557-563 (2001); von Budingen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:8207-8212 (2002);およびMesleh et al., Neurobiol Dis 9:160-72 (2002)。
【００６７】
C. jacchusマーモセットは、最近の１０年においてＥＡＥの強度な研究の被験体となっている。これは、C. jacchusマーモセットが、ＭＳの臨床的な特徴および病理の証明を再現するＣＮＳ炎症性脱髄疾患を発症する性質によるものである。この種において、アジュバント中のヒトの白質全体、またはミエリン／希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＧＯ）による活動的な免疫化によって、ヒトＭＳの典型的な形態を思い起こさせる軽度から中程度の臨床的重症度を有する、慢性の再発寛解型疾患が生じる。急性のC. jacchusＥＡＥの神経病理は、広範な同心状領域の一次脱髄、マクロファージ浸潤、アストログリオーシス（astrogliosis）、および希突起神経膠細胞の死滅からなる。Massacesi et al., Ann. Neurol. 37:519-530 (1995); Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001);およびBrok et al., Immunol Rev 183:173-85 (2001)。
【００６８】
ミエリン分解の超微細構造特徴（ultrastructural feature）は、マーモセットＥＡＥとヒトＭＳとで類似しており、このことからミエリン破壊の共通の機構が示唆される（Raine et al., Ann. Neurol. 46:144-160 (1999)および Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001)）。マーモセットのＭＳ様ＥＡＥ病変の基礎となる原因機構は解明されており、それは、ミエリン指向性自己攻撃反応および病原性自己抗体反応の複雑な相互作用である。同上。
【００６９】
（ＨＨＶ６感染に関連する疾患のマーモセットモデル）
コモンマーモセットは、ヘルペスウイルスによる感染に対して感受性が高い（Provost et al., J Virol 61:2951-5 (1987); Jenson et al., J Gen Virol 83:1621-33 (2002); Ramer et al., Comp Med 50:59-68 (2000); Farrell et al., J Gen Virol 78 (Pt 6): 1417-24 (1997); Cox et al., J Gen Virol 77 (Pt 6): 1173-80 (1996); Wedderburn et al., J Infect Dis 150:878-82 (1984); Johnson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 78:6391-5 (1981); de-The et al., Intervirology 14:284-91 (1980); Ablashi et al., Biomedicine 29:7-10 (1978) ;およびFalk et al., Int J Cancer 17:785-8 (1976)。マーモセットは、ヒトＣＤ４６に相同性が高いＣＤ４６分子を発現し、ＨＨＶ６の種々の株（ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂが挙げられるが、これらに限定されない）による感染によって例示されるとおり、ヘルペスウイルス感染についての標的である。
【００７０】
ＨＨＶ６に感染したヒトＴ細胞株とのトランスウェル共培養（trans-well co-culture）を使用して、マーモセットリンパ球（ＰＢＭＣ）がＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂの両方にインビトロで感染され得るということが、本発明の一部として実証された。インビトロ共培養および感染についての方法論は、当該分野において周知であり、植物性血球凝集素でＰＢＭＣを刺激することによって容易にすることができる。このような例示的条件下において、ＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂに対して感染ヒト不死化Ｔ細胞株を曝露した後、５日〜１０日以内に感染が起こる。
【００７１】
マーモセットのインビボ感染は、種々のプロトコルを使用して、ＨＨＶ６改変体を用いて達成することができる。これらのプロトコルは、本明細書の以下において詳述され、表３に要約され、そして以下に例示する：（１）ＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂにインビトロで感染させた（免疫蛍光（ＩＦＡ）およびポリメーラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような周知の技術によって実証する）動物自身のＰＢＭＣを静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、６〜７週間後に生ＨＨＶ６−Ａウイルス改変体および／またはＨＨＶ６−Ｂウイルス改変体を含む細胞溶解物を静脈内注射する（動物＃１９０−９４およびＵ０３１−００について本明細書において開示した感染プロトコルを参照のこと）；（２）ＨＨＶ６−Ｂ感染細胞（例えば、ＭＯＬＴ３細胞）由来の溶解物を、５週間隔で２回ｉ．ｖ．注射する；（３）ＨＨＶ６−Ａに感染した細胞（例えば、ＨＳＢ２細胞）を接種してＨＨＶ６−Ａ＋細胞を作製し（例えば、ＨＨＶ６−Ａ＋ＨＳＢ２細胞）、約３ヶ月後、ＨＨＶ６−Ａ感染細胞を注射するか（例えば、ＨＨＶ６−Ａ＋ＨＳＢ２細胞；動物＃５５０−９９について本明細書において開示した感染プロトコルを参照のこと）、または約３ヶ月後に非感染ＨＳＢ２細胞を注射する（動物＃３６７−９４について本明細書において開示した感染プロトコルを参照のこと）。細胞の選択は、ＭＯＬＴ３細胞またはＨＳＢ２細胞の使用によって本明細書において例示されているが、代替的には、広範な範囲のＣＤ４６＋造血性の株を含み得ることが理解され、これらとしては、Ｋ５６２細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＫＧ−１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＯＬＴ４細胞、およびＳｕｐ  Ｔ１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞の各々は、American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA)から容易に入手可能である。
【００７２】
C. jacchusマーモセットは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂに対してナイーブであり、これらのウイルスに容易に感染させることができる。ＨＨＶ６−Ａによる成体動物の反復感染により、病理学的にＭＳと類似した脈管周囲の炎症性脱髄を伴う軽度の慢性再発型ＣＮＳ疾患を生じる。従って、本明細書に提示される動物モデル系は、遍在的ヒトウイルスとＭＳを模倣する慢性障害との間の原因となる関連を提供し、非近交系種においてこのような微生物と複雑な神経免疫反応との間の相互作用を特徴付けるためのモデルを与える。
【００７３】
ヒトにおいてと同様にマーモセットにおいて持続および複製し得る改変体Ａおよび改変体Ｂの両方によるＨＨＶ６感染は、一過性の免疫抑制を引き起こし得る。しかしながら、ＨＨＶ６−Ａ感染のみが、ＭＳ様ＣＮＳ炎症性脱髄を生じると考えられている。いかなる特異的な機構的論理にも限定されることなく、可能性のある説明として、この改変体に対する好ましいＣＮＳ向性および／または神経膠細胞に対する溶解効果もしくはアポトーシス効果が挙げられる。ミエリン抗原による模倣は、この動物モデル系における炎症性ＣＮＳ損傷についての主な機構でも原因となる機構でもないようにみえるが、遅発型のＴ細胞自己反応性は、慢性疾患の有害な効果（perpetration）において役割を果たす可能性がある。
【００７４】
非近交系霊長動物種の個体において、ＨＨＶ６への特定の時期の曝露の後に、新たにＣＮＳ脱髄が発症するという本発明の実証は、ヒト状態に非常に近い本明細書に開示された感染プロトコルのために、ＨＨＶ６感染と神経変性および脱髄に関連する中枢神経系の疾患（例えば、多発性硬化症）との間の一過性の機構的関係を研究するために重要である。
【００７５】
選択される投与の経路に依存して、最初の感染は、無症候性であってもほとんど無症候性であってもよい。しかし、典型的には、生のＨＨＶ６ウイルス（例えば、ＨＨＶ６−Ａウイルス）の第二の接種に対して動物を再び曝露すると、すぐに体重が減少して感覚欠損を伴う低緊張性麻痺を起こす。例えば、動物１９０−９４およびＵ０７６−０３について本明細書において提示されるデータを参照のこと。
【００７６】
神経病理学および／または脳脊髄液（ＣＳＦ）を分析すると、一般的に、複製するＨＨＶ６−Ａの反復接種を受けた動物において、中枢神経系（ＣＮＳ）の血液脳関門の機能停止および炎症が証明される。マーモセットの実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）でみられる脱髄と識別できない脱髄は、第２の接種の後に明らかになり得（例えば、動物＃１９０−９４を参照のこと）、この動物はまた、対応するＭＲＩ可視（磁気共鳴画像化）を提示し、Ｔ２強調した（T2-weighted）非常に強度の高い脳幹病変は以前に記載されたウイルス性ＣＮＳ感染に関連する病理を思い起こさせる（Raine et at, J Neuropathol Exp Neurol 32:19-33 (1973); Raine, in Textbook of Neuropathology 627-714 (Davis et al. eds., 1997);およびMatsumoto et al., Acta Neurochir 141:439-40 (1999)）。ＨＨＶ６のウイルスの存在は、炎症性浸潤の近接において免疫組織化学によって実証することができる。対照的に、ＨＨＶ６−Ａは、組織学的に正常なＣＮＳ組織、脾臓、リンパ節、または他の末梢組織においては、ＰＣＲもしくは免疫組織化学のいずれによっても典型的には検出されない。ＨＨＶ６ウイルスに感染したＣＮＳの細胞は、プログラム化細胞死（すなわち、アポトーシス）のプロセスをさらに受け得る。
【００７７】
（ＨＨＶ６誘導性炎症および炎症性ＣＮＳ脱髄をモニタリングするための方法）
本発明のさらなる局面において、マーモセット動物モデル系において、ウイルス抗原に対する免疫反応（Ｔ細胞および抗体の反応を含む）をモニタリングするための方法が提供される。例えば、ウイルス抽出物を抗原として使用する標準的な増殖アッセイを使用して、Ｔ細胞反応性（例えば、ＰＢＭＣまたはリンパ系器官における反応性）を検出することができる。
【００７８】
本発明は、ウイルス特異的免疫グロブリン反応（特に、ＩｇＧおよびＩｇＭの反応）の検出に基づいたウイルス感染を検出するためのフローサイトメトリー方法をさらに提供する。本発明のこの局面は、広範なウイルス感染（特に、体液性免疫応答を誘発するウイルス感染）を検出する際に有用性を見出す。従って、例えば、本明細書において開示されるフローサイトメトリー方法は、ウイルス抗原（agent）がＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＪＣ、ＢＫ、およびＳＶ４０からなる群より選択されるウイルス感染の検出に有用である。他のウイルス感染もまた、本明細書において開示される方法によって検出することができる。
【００７９】
本明細書において開示されるフローサイトメトリー方法は、当該分野で利用可能な既存のＥＬＩＳＡベースの方法およびＰＣＲベースの方法を越える実質的な改良であり、検出されるべき特定のウイルス抗原（agent）に対して特異性が高い。これらの方法は、ウイルス抗原に対するウイルス抗原に特異的に結合する抗ウイルス抗体は、感染細胞の表面上に独特な非天然型の転写後改変およびコンホメーションをとるという観察に基づいている。このような独特なウイルス抗原種は、ＥＬＩＳＡおよびＰＣＲの技術によって検出されないままである。
【００８０】
特定の実施形態において、ＩｇＧ抗体反応性は、例えば、１：５０〜１：１００の血清希釈、および蛍光標識（例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ））された抗サルＩｇＧ二次抗体を使用して、それぞれＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂに感染した細胞株に対する血清のフローサイトメトリーによって評価することができる。このような方法は、典型的には、最初のウイルス曝露後に抗体反応性を検出し、この抗体は、二回目の接種、またはその後の接種の後に抗体力価が上昇する。動物における抗体（ＩｇＧ）反応性は、典型的には、感染しているウイルス改変体に特異的であり、他のＨＨＶ６改変体または感染していない細胞株に対して反応性はない。
【００８１】
ＨＨＶ６  ＤＮＡの存在はまた、ウイルスゲノムの種々のエレメントに対するオリゴヌクレオチドを使用するネステッドＰＣＲ（nested PCR）反応によって連続的にモニタリングすることもできる。ＨＨＶ６改変体（ＨＨＶ６−Ａではなく、ＨＨＶ６−Ｂ）の公知の指向性と一致することを、感染動物の血液中で検出することができる。血液（ＨＨＶ６−Ｂ）およびＣＮＳ（ＩＨＣによって検出されるＨＨＶ６−Ａ）と対称的に、ウイルスの持続性またはウイルス複製は、典型的には、他の器官において検出されない。
【００８２】
ウイルス感染は、宿主の免疫系がミエリンタンパク質ペプチドと似たウイルスペプチドを認識し、それによって免疫攻撃を誘発する現象である分子模倣をもたらし得る。例えば、Fujinami et al., Science 230:1043-1045 (1985)およびOldstone, Faseb Journal 12:1255-1265 (1998)を参照のこと。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の免疫優勢なペプチドに対するこのような相同性は、ＨＨＶ６ Ｕ２４タンパク質において最近記載された。Tejada-Simon et al., Ann Neurol 53:189-97 (2003)およびCirone et al., J Med Virol 68:268-72 (2002)。分子模倣は、他のウイルスで実証されているようにＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンの交差的な活性化（cross-activation）を導き得、ＭＳ攻撃または有害な影響を伴う（perpetrating）疾患を誘発する可能性のある機構を強調し得る。Wucherpfennig et al., Cell 80:695-705 (1995); Talbot et al., Curr Top Microbiol Immunol 253:247-71 (2001)およびLang et al., Nat Immunol 3:940-3 (2002)。
【００８３】
本発明の一部として、Ｔ細胞の模倣がＨＨＶ６を接種した動物において生じ得ることがここで開示される。動物は、例えば、ミエリン希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、他のＨＨＶ６抗原、および／またはそれらのペプチドに対して反応性を示し得る。連続的な血液サンプルを動物から得て、レクチン（ＰＨＡ）に対する末梢Ｔ細胞免疫反応性（ＰＢＭＣ）をモニタリングすることができる。典型的には、二度目のＨＨＶ６接種に続いて、一過性状態の免疫抑制（ＰＨＡに対する反応性が低下することによって証明される）が起こり得、さらに後にウイルス抗原（例えば、ＭＯＧおよび／またはＭＢＰ）に対する反応性が生じ得る。
【００８４】
希突起神経膠細胞およびニューロンのアポトーシスまたは死滅は、ＭＳおよびＥＡＥの病変の病因に関連することが示唆されている。Raine, J Neuroimmunol 77:135-52 (1997b); およびLucchinetti et al., Ann. Neurol. 47: 707- 717 (2000)。ＨＨＶ６改変体はまた、ＣＮＳ中の神経膠星状細胞のような神経膠細胞に対しても毒性であり得るが、保護効果についての可能性も報告されている。Kong et al., J Neurovirol 9:539-50 (2003); De Bolle et al., Clin Microbiol Rev 18:217-45 (2005);およびDonati et al., J Virol 79:9439-48 (2005)。ＨＨＶ６に感染し、炎症性浸潤によって特徴付けられた動物（例えば、マーモセット）を、ＨＨＶ６感染動物由来の脳の切片上でのＴＵＮＥＬ反応および／またはカスパーゼ３に対する染色によってさらに分析することができる。これらのアッセイ系は、病変の近くでアポトーシス細胞（例えば、神経膠細胞および／またはニューロン細胞）が存在することを実証する際に有用である。
【００８５】
アポトーシスまたはプログラム化細胞死は、細胞容量の喪失、ゼイオーシス（zeiosis）、クロマチンの凝集、およびアポトーシス小体への核の断片化を含む一連の特徴によって特徴付けられる。フローサイトメトリーによってアポトーシスを定量化するために使用され得る当該分野で公知のいくつかの方法が存在する。最も一般的な方法の１つは、ヨウ化プロピジウムを使用してＤＮＡを染色し、細胞周期プロフィールからサブ二倍体（sub-diploid）の細胞集団を探す方法である。ＤＮＡ含有量／細胞周期分析のために最も一般的に使用される色素は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）である。ＰＩは、二重鎖ＤＮＡの主溝に入り込み、４８８ｎｍで励起して６００ｎｍ付近を中心として広く放射し得る蛍光性が高い付加物を生成する。ＰＩは二重鎖ＲＮＡにも結合し得るので、最適なＤＮＡ分解のために、典型的には、細胞をＲＮａｓｅで処理する。他の周知のフローサイトメトリーベースの方法としては、ＤＮＡ鎖の分解を測定するＴＵＮＥＬアッセイ、および細胞内表面から細胞外表面への膜ホスファチジルセリンの再配置を検出するアネキシンＶ結合が挙げられる。さらに、システインプロテアーゼであるカスパーゼ（典型的には、カスパーゼ−３）の活性を、アポトーシスの尺度としてアッセイすることができる。カスパーゼは、蛍光基質（Pharmingen）を使用して検出することができる。顕微鏡調査およびゲル電気泳動によるＤＮＡラダー形成の検出を使用して、フローサイトメトリーの結果を確認してもよい。
【００８６】
ネクローシスのプロセスにある細胞および細胞集団を同定するためのアッセイ系もまた記載されており、当該分野で周知である。例えば、Dive et al., "Analysis and Discrimination of Necrosis and Apoptosis (Programmed Cell Death) by Multiparameter Flow Cytometry," Bioch Biophysica Acta 1133:275-285 (1992)を参照のこと。
【００８７】
本発明の一部として、アポトーシスおよびネクローシスが、希突起神経膠細胞（ＴＣ６２０）、ならびにＣＲＴ（神経膠星状細胞）およびニューロン（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）において、ＨＨＶ６−Ａによって誘導されることが観察された。これらのデータは、表１に要約する。
【００８８】
（表１）
（ＨＨＶ６−Ａ感染細胞株における３日目でのアポトーシスおよびネクローシス）
【表１】
2008523785.tif 000003
【００８９】
従って、本発明はＨＨＶ６−Ａ媒介性の細胞死を検出するための方法をさらに提供し、この細胞死には、血液、脳脊髄液および／または尿のような患者サンプル中のプログラム化細胞死（アポトーシス）、ネクローシス、サイトカイン媒介性細胞死、細胞溶解ならびに毒性が含まれる。この実施形態に従う方法は、上記で考察した希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、およびニューロン、ならびに本明細書において例示した広範な範囲の細胞に適用された場合の細胞死を評価する工程を包含する。広範な範囲の組織サンプルおよび細胞型にこれらの方法を適用することが可能であり、表２に示すような種々のウイルスが誘導する疾患状態の検出において有用性を見出す。
【００９０】
（表２）
（ＨＨＶ６−Ａ媒介性細胞死による疾患病因についてアッセイされ得る自己免疫疾患および対応する罹患した組織／細胞型）
【表２】
2008523785.tif 000004
【００９１】
（糖尿病のための非ヒト動物のＨＨＶ６−Ｂ感染モデル系）
本発明の別の実施形態において、糖尿病についての非ヒト動物モデル系が提供される。本発明のこの局面は、ＨＨＶ６−Ｂヘルペスウイルス改変体が、一連の２回のこのウイルスの接種の後に、感染マーモセットにおいて体重減少および血糖値の上昇を誘導し得るという観察に基づく（図２２を参照のこと；動物＃５０−０１）。本明細書において開示される動物モデル系は、尿および／または血液の糖含有量を実質的に上昇させ、急激に体重が減少する。
【００９２】
従って、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択されるヘルペスウイルス改変体によるマーモセットの感染によって作製される糖尿病のマーモセット動物モデル系が、本明細書において提供される。この動物モデルは、約１００ｍｇ／ｄｌと約５，０００ｍｇ／ｄｌとの間、より典型的には約１００ｍｇ／ｄｌと約１，０００ｍｇ／ｄｌとの間、さらにより典型的には約１５０ｍｇ／ｄｌと約５００ｍｇ／ｄｌとの間の尿および／または血液の糖含有量と、２１０日目において約１５〜５０％の間、より典型的には約２０％と約３０％との間の体重減少とによって特徴付けられる。具体的には、糖尿病のマーモセット動物モデル系が本明細書において例示され、この動物は、ＨＨＶ６−Ｂに曝露され、ＨＨＶ６−Ｂによる最初の接種の後、約１，０００ｍｇ／ｄｌの尿の糖含有量と、約２１０日で最初の体重からの〜２７％の体重減少を示した。ＨＨＶ６−Ａヘルペスウイルス改変体を接種した動物とは対称的に、ＨＨＶ６−Ｂに感染した動物は、実質的な神経学的欠損または中枢神経系病理を生じない。
【００９３】
本発明の非ヒト動物モデル系は、糖尿病の発症に関連し得る広範な種々のウイルスに対して適切に拡張され得ることがさらに企図される。上記ウイルスとしては、１種以上のコロナウイルス、レオウイルス（rheovirus）、アデノウイルス、パラミクソウイルスおよび／またはコクサッキーウイルス（coksackie virus）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
（多発性硬化症および他の自己免疫疾患のためのトランスジェニック動物モデル系）
本発明の他の実施形態において、多発性骨髄腫および脱髄によって特徴付けられる中枢神経系の他の関連する自己免疫疾患のための非ヒトトランスジェニック動物モデル系が提供される。多種多様な動物種が、本発明のこれらの実施形態に関連して企図される。例えば、非ヒトトランスジェニックのマウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、および線虫の動物モデル系が本明細書において提供され、この系において動物は、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子を含み、ヘルペスウイルスに感染されるか、そして／またはヘルペスウイルスに曝露される。
【００９５】
本発明によるトランスジェニックマウス動物モデル系は、当該分野で容易に利用可能な方法論を参照することによって作製することができる。例えば、以下に記載される方法論を参照のこと（これらの各々は、その全体が本明細書において参考として援用される）：Hogan et al., "Manipulation the mouse embryo: A laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986); Palmiter et al., Nature 300:611-15 (1982); Ebert et al., MoI. Endocrin. 2:277-83 (1988); Sutrave et al., Gene Dev. 4:1462-72 (1990); Pursel et al., Theriogenology 45:348 (1996);米国特許第6,323,390号、同第6,218,597号、同第6,137,029号、同第6,156,727号、同第6,127,598号、同第6,111,166号、同第6,107,541号および同第6,077, 990号。
【００９６】
ヒトＣＤ４６導入遺伝子を含み、かつヒトＣＤ４６導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスは、麻疹ウイルス感染の研究に関して記載されている。Rall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94:4659-4663 (1997)は、ＣＤ４６遺伝子がニューロン特異的プロモーターによって転写調節される脳の麻疹ウイルス感染についてのトランスジェニックマウスモデルを記載する。ＣＤ４６を発現すると、一次ニューロンがＭＶ−Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎに感染するようになる。Horvat et al. (J. Virol, 70(10): 6673-6681 (1996))は、ヒトＣＤ４６を遍在的に発現するトランスジェニックマウスを記載する。これらの著者は、遍在的に発現するヒドロキシメチル−グルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧＣＲ）の遺伝子プロモーターの制御のもとに、ＣＤ４５のＣ−ＣＹＴ２アイソフォーム（エキソン１〜６、９〜１２、および１４を含む）を配置した。この構築物は、Ｂ６ＤＢＡマウス卵母細胞の前核にマイクロインジェクトされ、標準的方法によってトランスジェニックマウスが作製された。Evlashev et al. (J. Virol. 74:1373-1382 (2000)およびJ. Gen. Virol. 82:2125-2129 (2001))は、ＭＶが誘導する病理のトランスジェニックマウスモデルを記載し、このモデルにおいて、トランスジェニックマウスのいくつかの系統は、脳においてＣｙｔ１またはＣｙｔ２の細胞質テールのいずれかとともにヒトＣＤ４６を遍在的に発現するように作製された。Hahm et al. (J. Virol. 77:3505-3515 (2003))は、ｌｃｋプロモーターの制御下でヒトシグナル伝達リンパ球性活性化分子（ｈＳＬＡＭ）を発現するトランスジェニックマウスを記載する。ｈＳＬＡＭは、血液および脾臓においてＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞で発現し、ＣＤ４＋胸腺細胞、ＣＤ８＋胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞、およびＣＤ４−ＣＤ８−胸腺細胞で発現した。これら文献の各々は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【００９７】
ＣＤ４６をコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスの動物モデル系が本明細書において例示され、この系において、上記トランスジェニックマウスはヘルペスウイルスに感染され、このヘルペスウイルスは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂからなる群より選択される。これらの実施形態の特定の局面において、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子は、インビボで遍在的に発現される。代替的な局面において、ＣＤ４６をコードする導入遺伝子は、脳、脊髄および末梢神経からなる群より選択される組織においてインビボで発現される。このようなトランスジェニックマウス動物モデルは、多発性硬化症の機構的研究においての利用を見出し、多発性硬化症の処置のための治療および処置レジメン（例えば、本明細書の上記に詳細に記載したマーモセットＭＳモデル系によって同定されたもの）を含む候補の治療をさらに特徴付けるために使用される。
【００９８】
本明細書において提示されたトランスジェニックマウス動物モデル系は、ＣＤ４６トランスジェニックマウスをヘルペスウイルスに単回曝露することによって達成することができ、このモデル系において、このようなウイルス曝露は、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させる。代替的な局面において、トランスジェニックマウスをヘルペスウイルスに２回以上曝露することが、中枢神経系の炎症性疾患の重症度を誘発および／または増大させるために必要とされる。本発明のなおさらなる局面において、上記ＣＤ４６トランスジェニックマウスは、例えば以下のような２種以上のウイルスの組み合わせに曝露される：（ａ）ＨＨＶ６−ＡとＨＨＶ６−Ｂ；（ｂ）ＨＨＶ６とＣＭＶ；（ｃ）ＨＨＶ６とＥＢＶ；（ｄ）ＨＨＶ６とＶＺＶ；（ｅ）ＨＨＶ６とＨＨＶ８；（ｆ）ＨＨＶ６とＨＩＶ；および（ｇ）ＨＨＶ６とＨＴＬＶ。
【００９９】
ウイルス感染は、本質的には、ヘルペスウイルス感染のマーモセット動物モデル系について本明細書において記載されたように達成することができる。例えば、適切な組織サンプルを動物から取り出し、従来の組織培養技術に供し、１種以上のヘルペスウイルス改変体および／または上に示したようなウイルスの組み合わせにエキソビボで曝露し、その感染細胞を動物に再導入する。このような感染され得る自己由来技術に適切な細胞としては、細胞表面ＣＤ４６を発現する細胞（例えば、ＰＢＭＣ、脾臓細胞、およびリンパ節細胞）が挙げられる。他の細胞型もまた、ヘルペスウイルス感染のために使用することができる。エキソビボウイルス感染の程度は、プラーク形成アッセイまたは単離物中のウイルス粒子のカウントに基づいた用量応答曲線を用いて、モニタリングおよび評価することができる。
【０１００】
典型的には、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射を介して、細胞を動物に再導入する。他の投与経路も適切であり得、企図される特定の細胞型および適用を考慮して当業者によって決定される。本明細書において注記されたように、動物のウイルス感染は、単回のエキソビボのウイルス曝露および再導入によって首尾よく達成することができるか、あるいは典型的には約３週〜約８週の間隔で、一連のエキソビボウイルス曝露および再導入をその後一回以上行うことを必要とする場合がある。適切に使用することができる多くの感染レジメンが、本明細書において例示される。
【０１０１】
本明細書において開示されるトランスジェニックマウス動物モデル系は、中枢神経系または末梢神経系の疾患（例えば、神経系炎症性疾患）の重症度を低減させるための候補化合物の能力を研究するために適切に使用される。典型的には、本明細書において記載するように、１種以上のヘルペスウイルスにＣＤ４６トランスジェニックマウスを曝露すると、多発性硬化症、糖尿病、関節炎、貧血、狼痘、天然痘、甲状腺炎、糸球体腎炎もしくは間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される炎症性疾患および／または自己免疫疾患の重症度を誘発および／または増大させる。このようなヘルペスウイルスに感染されたＣＤ４６トランスジェニック動物モデル系は、細胞型（例えば、希突起神経膠細胞、神経膠星状細胞、および脳細胞からなる群より選択される細胞型）に対するヘルペスウイルスの直接毒性を媒介する因子の同定に適切である。毒性は、当該分野で周知の方法論によって本明細書に記載のように評価することができ、これらの方法論は、例えば、組織学的試験、アポトーシスおよび／もしくはネクローシスの評価、サイトカインおよび他の因子の測定、ならびに／または、末梢血／リンパ器官におけるＴ細胞および抗体の反応性であるが、これらに限定されない。例示的な因子としては、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞のような免疫系の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
（多発性硬化症および他の自己免疫疾患についてのトランスジェニックゼブラフィッシュモデル系）
ヒトＣＤ４６を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、トランスジェニック構築物をゼブラフィッシュの細胞（典型的には、胎性細胞）に導入するか、またはMeng et al. Methods Cell Biol. 60:133-48 (1999)および米国特許出願公開番号2005/0120392（これらの各々は、その全体が本明細書において参考として援用される）に記載のように一個の胚に導入することによって作製することができる。例えば、トランスジェニック構築物は、ヒトＣＤ４６を発現するために米国特許出願公開番号2004/0117866およびChou et al., Transgenic Research 10:303-315 (2001)に記載のように、市販のプラスミド系（例えば、ｐＤｓＲｅｄ２−１（Clontech）およびｐ−αＥＧＦＰＩＴＲを改変することによって作製することができる。このような構築物は、ゼブラフィッシュのゲノムに組み込まれ得るか、または人工染色体として構築され得る。トランスジェニック構築物は、当該分野で公知の技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、および粒子銃の衝撃）を使用して胎性細胞に導入することができる。１つまたは２つの細胞段階において胚をマイクロインジェクトすることができるか、または後で増殖する胚に組み込まれ得る胎性幹細胞に構築物を組み込むことができる。
【０１０３】
Rubenstein et al.、米国特許出願公開番号2005/0120392、2002/0187921および2004/0143865、ならびにTsai、米国特許出願公開番号2004/0117866に記載のように胚または胎性細胞を得ることができる。ＣＤ４６導入遺伝子を含むゼブラフィッシュは、多数の方法（例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングによって導入遺伝子構築物の存在についてゼブラフィッシュのゲノムを調べる方法）によって同定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して、導入遺伝子の存在を検出することもできる。
【０１０４】
レポータータンパク質の発現は、当該分野で公知の方法によっても検出することができる。例えば、ＲＮＡは、多数の核酸検出技術のうちのいずれを用いても検出することができる。代替的には、抗体を使用して発現産物を検出することができるか、または当業者は、ＧＦＰのような蛍光レポータータンパク質の発現を可視化および定量することができる。本明細書において使用される場合、レポータータンパク質とは、発現されたときに特異的に検出され得る任意のタンパク質である。レポータータンパク質は、発現配列からの発現を検出または定量するのに有用である。例えば、組織特異的な発現配列に作動可能に連結したレポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、直系の発生を研究することを可能にする。このような研究において、レポータータンパク質は、発生プロセスをモニタリングするためのマーカーとして役立つ。
【０１０５】
多くのレポータータンパク質が当該分野で周知である。これらとしては、特異的な検出可能な産物を生成するβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ、）サンゴ蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のような蛍光レポータータンパク質もまた使用することができる。例えば、ＧＦＰまたはＲＣＦＰを利用することによって、基質を添加することなく、紫外光、水銀、キセノン、アルゴン、またはクリプトンのアーク光に曝露された際に蛍光が観察される。
【０１０６】
ＧＦＰのようなレポータータンパク質を使用すると、ゼブラフィッシュの発生の間に遺伝子発現を検出または評価するために好ましくあり得る外因性因子を添加することを必要とせずに、直接的に検出可能である。レポータータンパク質および組織特異的発現配列をコードする構築物を保有するＣＤ４６トランスジェニックゼブラフィッシュ胚は、空間的および時間的な発現パターンを分析するための、迅速なリアルタイムのインビボ系を提供する。
【０１０７】
（ＣＤ４６ベースの組成物）
本発明の他の実施形態は、（ａ）可溶性ＣＤ４６、（ｂ）ＣＤ４６に結合する細胞、および（ｃ）ＣＤ４６に結合する人工送達系からなる群より選択されるＣＤ４６改変体を含む組成物を提供し、この組成物は、多発性硬化症および／または脳もしくは他の標的器官の他の自己免疫疾患および免疫媒介性炎症疾患からなる群より選択される疾患の重症度を低減させるのに有効であり、上記可溶性ＣＤ４６は、全長ポリペプチドとしてか、もしくは切断型改変体として組換え形態で産生され、そして上記人工送達系は、リポソームまたは小胞のいずれかである。特定の局面において、このような組成物は、神経変性疾患および／または腫瘍の処置に有効である。
【０１０８】
（ＣＮＳ炎症状態および／または神経変性状態の非ヒト動物モデル系を使用する方法）
種々の実施形態において、本発明は、以下（１）〜（５）をさらに提供する：（１）疾患を発症するリスクを有する患者を検出するための方法；（２）ヘルペスウイルス媒介性感染（例えば、ＨＨＶ６媒介性感染）の中和をもたらす抗体または細胞反応の存在を、患者（例えば、ヒト患者）において評価するための方法；（３）患者サンプル内の細胞中でヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度を低減させるのに有効な化合物を同定するための方法；（４）有害な自己抗体の発生をアンタゴナイズする候補化合物または他の介入の治療的能力を評価するための方法；ならびに（５）多発性硬化症および／または別の自己免疫疾患のような疾患状態において遍在的ウイルスによる感染のリスクを、患者において検出するための方法。これらの方法の各々は、本明細書および実施例においてさらに詳細に記載される。
【０１０９】
１つの実施形態において、本発明は、例えば、多発性硬化症および／または脳もしくは他の標的器官の他の自己免疫疾患および免疫媒介性炎症疾患のような疾患を発症するリスクを有する患者を検出するための方法を提供する。特定の局面において、このような方法は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を包含する：（ａ）ヒトＣＤ４６に特異的に結合する抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルを患者から単離する工程；（ｂ）ヒトＣＤ４６に特異的に結合する抗体およびヒトＣＤ４６を発現する細胞を含む第一の複合体を達成するのに必要とされる時間の間、そのような条件のもと、上記生物学的サンプルをヒトＣＤ４６またはその改変体（例えば、固体マトリックスまたはＣＤ４６発現細胞に吸着されるＣＤ４６）と接触させる工程；（ｃ）上記複合体を二次抗ヒト抗体と接触させる工程であって、この二次抗体は、第一の複合体に特異的に結合する二次抗ヒト抗体を含む第二の複合体を達成するのに必要とされる時間の間、そのような条件のもとで検出可能なタグを含む、工程；ならびに（ｄ）結合した二次抗体上の検出可能なタグを検出する工程。
【０１１０】
典型的には、二次抗体上の検出可能なタグは、蛍光細胞分取の分析または検出タグを使用して二次抗体上の検出可能なタグの存在を明らかにするような他の方法によって検出される。例えば、検出可能なタグは、蛍光タグであっても放射性同位元素であってもよい。特定の局面において、これらの実施形態に従う方法は、活性な破壊プロセスが、ヘルペスウイルスの複製（ＨＨＶ６複製を含む）と関連するか、またはこれに付随して起こり、そして活性が継続している患者を同定するために適切に使用され得る。このような方法によって、早期処置レジメンを患者で開始することもできる。これによって、多発性硬化症、慢性疲労症症候群および他の関連障害の疾患が完全に発症するのを妨げる。
【０１１１】
本発明の関連する実施形態は、ヘルペスウイルス媒介性感染（例えば、ＨＨＶ６媒介性感染）の中和をもたらす抗体または細胞反応の存在を、患者（例えば、ヒト患者）において評価するための方法を提供する。早発型または遅発型の器官特異的自己免疫（多発性硬化症および糖尿病を含む）をもたらす抗体および／またはＴ細胞反応を生じない患者を評価することを可能にする同様の方法が提供される。これらの方法によって、抗体（例えば、中和抗体）または細胞反応が検出され、中枢神経系の疾患（例えば、多発性硬化症）を発症する患者のリスクおよび／または糖尿病、関節炎、貧血、狼瘡、天疱瘡、甲状腺炎、糸球体腎炎もしくは間質性腎炎、心筋症、筋炎、皮膚筋炎、肝炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される自己免疫障害を発症する患者のリスクと相互に関連する。
【０１１２】
本発明の方法の他の実施形態は、患者サンプル内の細胞においてヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度を低減するのに有効な化合物を同定するための方法を包含し、ここでこのような方法は、（ａ）本明細書に記載の非ヒト動物モデル系に候補化合物を投与する工程、および（ｂ）患者サンプル内の細胞において、ヘルペスウイルス媒介性毒性の重症度が低下したかどうかを決定する工程、を包含する。典型的には、このようなヘルペスウイルス媒介性毒性は、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、および小脳変性からなる群より選択される神経変性疾患と互いに関連する。患者サンプル内の例示的な細胞としては、患者の血清、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）および／または他の患者サンプル内のニューロンならびに細胞が挙げられる。細胞毒性の測定は、溶解効果、サイトカイン媒介性細胞死、およびアポトーシスを含むがこれらに限定されない。
【０１１３】
例えば、ＨＨＶ６−Ａおよび／またはＨＨＶ６−Ｂのようなヘルペスウイルスへの曝露によって産生が誘導される有害な自己抗体の発生をアンタゴナイズする化合物または他の介入の治療価値を評価するための方法もまた、提供される。有益な自己抗体の発生を援助する化合物または他の介入の治療価値を評価するための関連方法が提供される。有害な自己抗体がアンタゴナイズされるか、または有益な自己抗体がアゴナイズされるような細胞反応を介して免疫系を変更する化合物または介入の治療効果を評価するためのさらなる方法が、提供される。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明はまた、多発性硬化症および／または別の自己免疫疾患のような疾患状態において、偏在性ウイルスによる感染のリスクを患者で検出するための方法を提供し、この方法において、上記患者は、免疫抑制、移植、ＡＩＤＳ、および／または他の免疫不全に対して感受性が高い。
【０１１５】
（中枢神経系の自己免疫疾患を検出するためのマーカーおよび方法）
以下の実施例で考察するように、再発寛解型多発性硬化症（ＭＳ）およびクローン病のような疾患に関して、ナタリズマブをインターフェロンベータ１−ａ（ＩＦＮ−β）と組み合わせて受けた患者は、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）（ＨＩＶとＪＣウイルスとによる感染と関連している病因を有する疾患）を示すことが報告されている。例えば、Bossolasco et al., "Prognostic Significance of JC Virus DNA Levels in Cerebrospinal Fluid of Patients with HIV- Associated Progressive Multifocal Leukoencephalopathy" Clinical Infectious Diseases 40(5):738-744 (2005)を参照のこと。それと共に、ＰＭＬは、他の一般的なヒト病原体による日和見感染のような免疫抑制された個体（例えば、ＡＤＤＳ、移植患者）において、通常観察される。Ｂ細胞は、腎臓から脳にウイルスが移動することによって、ＰＭＬの病因に関連し得る。この疾患は、希突起神経膠細胞中でのＪＣウイルスの複製を通して媒介されると考えられる。
【０１１６】
ヒト患者でのこれらの観察に基づいて、本発明は、１種以上の治療適用による処置の後でＰＭＬを発症した患者において、リンパ球サブセットの免疫学的特性を評価するためのマーカーおよび方法をさらに提供する。従って、本明細書に記載される実施形態は、Muromonab-CD3（Johnson & Johnson）、アブシキシマブ（Centocor）、リツキシマブ（Biogen IDEC）、ダクリズマブ（daclizumab）（Protein Design Labs）、バシリキシマブ（Novartis）、パリビズマブ（Palivizumab）（MedImmune）、インフリキシマブ（Centocor）、トラスツズマブ（Genentech）、ゲムツズマブ（Wyeth）、アレムツズマブ（Millennium/ILEX）、イブリツモマブ（Biogen IDEC）、アダリムマブ（Abbott）、オマリズマブ（Genentech）、トシツモマブ−Ｉ１３１（Corixa）、エファリズマブ（Genentech）、セツキシマブ（Imclone Systems）、およびベバシズマブ（Genentech）または例えば、多発性硬化症などの広範なウイルス関連免疫疾患のために現在使用されている他の強力な免疫抑制の生物学的製剤のような処置のもとにある場合に、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）または他の脳炎などの合併症に感受性が高い患者（ヒト患者を含む）の同定のためのマーカーおよび方法を提供する。
【０１１７】
従って、例えば、本発明は、自己免疫疾患における遍在的ウイルスによる感染のリスクを検出するためのフローサイトメトリー方法を提供する。この疾患としては、多発性硬化症、免疫抑制を用いて処置された疾患、移植、ＡＩＤＳ、および免疫不全の他の状態、他の神経変性病理または器官特異的病理を含む。このような方法は、患者サンプル（例えば、末梢血液）中で、ＣＤ１９およびＣＤ３のレベルおよび／またはＣＤ１９とＣＤ３との比、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団、調節Ｔ細胞のレベル、および／またはＣＤ８のレベルを測定する工程、ならびに、これらのレベルおよび／または比を、その患者がウイルス関連性の合併症および発癌性合併症を提示するリスクと相関付ける工程を包含する。多くのウイルス関連性の合併症は、その病因がウイルス（例えば、ＪＣ、ＨＨＶ６、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＣＭＶ、ＨＳＶ  ＩおよびＨＳＶ  ＩＩ）に関連している合併症であることが現在企図されている。
【０１１８】
ヘパリン化血液および凝固血清が、治療レジメンを受けた患者から回収され得、１種以上の蛍光タグされた一次抗体（例えば、ＣＤ３−ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＰｅｒＣｐ：ＳＰ３４、ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＰＥ：Ｌ２００（BD Pharmingen）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ：ＳＦＣＩ２１Ｔｈｙ２Ｄ３（Beckman Coulter）、ＣＤ１９−ＰＥ：４Ｇ７、およびＣＤ２５−ＦＩＴＣ：２Ａ３（Becton-Dickinson））を使用して製造業者の指示に従って、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために染色され得る。
【０１１９】
典型的には、白血球（ＷＢＣ）数、リンパ球数、ならびにＣＤ３+ＣＤ４+細胞、ＣＤ３+ＣＤ８+細胞、およびＣＤ１９+細胞の絶対数は、本発明の方法によって測定されるウイルス関連性の合併症において影響を受けない。しかし、対照的に、ＣＤ３+ＣＤ８+細胞数の減少、ＣＤ１９+細胞の絶対数の増加、ＣＤ１９+細胞（成熟Ｂ細胞）の相対的割合の増加、およびＣＤ１９／ＣＤ３比の増加は、患者がウイルス関連性の合併症および発癌性合併症を示すというリスクの増加を示す。
さらに、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、調節活性を有するＴ細胞（Ｔｒｅｇ）を含み、このＴ細胞は、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の絶対数によって証明されるように、ＰＭＬを発症する患者おいて低下するか、または上記患者に実質的に存在しない。全リンパ球およびＣＤ４+Ｔ細胞が比較的保存されているにもかかわらず、Ｔｒｅｇ集団の抑制が起き、そしてこれらの患者のＢ細胞集団、特にＣＤ８＋（サプレッサー）細胞の割合が増加する傾向があると考えられている。いかなる特定の機構的論理にも限定されることなく、Ｔ調節活性の喪失は、これらの患者においてＢ細胞の活性および輸送（trafficking）の制御が不十分であること、そして潜伏していて通常は良性のウイルス（例えば、ＪＣウイルス）の複製を妨げることができないことの原因であり得ると考えられる。Ｔ調節活性の喪失から生じ得る「機能的に免疫不全」の状態はまた、例えば、ＰＭＬの場合において、他の遍在的な病原体が再活性化する能力にも影響し得る。
【０１２０】
Ｔ細胞サブセットのような免疫学的マーカー（特に、ＣＤ１９+およびＣＤ４+ＣＤ２５+）の測定は、治療的に誘導される合併症の発症についてのリスクを有する患者を検出することに対して有用性を見出す。特に、本明細書において提示されるデータは、ＭＳおよび治療の適用（例えば、ナタリズマブ）で処置された他の自己免疫疾患を有する患者のリスクをモニタリングするためのマーカーとして、ＣＤ１９／ＣＤ３比、ＣＤ４+ＣＤ２５+集団、ＣＤ８+細胞数およびＣＤ３+細胞数の評価ならびに使用を支持する。
【０１２１】
本明細書に引用される全ての文献は、以下に記載のものも上記に記載のものも、その全体が本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、説明のために提供され、限定のために提供されるものではない。
【０１２３】
（実施例１  インビトロでのマーモセット細胞の感染）
本実施例は、ＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂによるインビトロでの感染に対するマーモセットリンパ球（ＰＢＭＣ）の感受性を実証する。
コモンマーモセットは、ヘルペスウイルスによる感染に対して感受性であり（Provost et al., J Virol 61:2951-2955 (1987); Jenson et al., J Gen Virol 83:1621-1633 (2002); Ramer et al., Comp Med 50:59-68 (2000); Farrell et al., J Gen Virol 78(6): 1417-1424 (1997); Cox et al., J Gen Virol 77(6): 1173-1180 (1996); Wedderburn et al., J Infect Dis 150:878-882 (1984); Johnson et al., Proc Natl Acad Sd U S A 78:6391-6395 (1981); de-The et al., Intervirology 14:284-291 (1980); Ablashi et al., Biomedicine 29:7-10 (1978); Falk et al., Int J Cancer 17:785-788 (1976)）、ヒトＨＨＶ６レセプターに対して相同性が高いＣＤ４６分子を発現する。Murakami et al., Biochem J 330:1351-1359 (1998)。ＨＨＶ６感染ヒトＴ細胞株とのトランスウェル共培養を使用して、マーモセットリンパ球（ＰＢＭＣ）がＨＨＶ６の改変体Ａと改変体Ｂとの両方にインビトロで感染され得ることを実証した。
【０１２４】
（実施例２  インビボでのマーモセットの感染）
本実施例は、ＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂによるインビボ感染に対するC. jacchusマーモセットの感受性を実証する。
種々のプロトコルを使用して、７匹の成体マーモセットをＨＨＶ６にインビボで感染させた（以下の表３に要約した）：（１）ＨＨＶ６−ＡまたはＨＨＶ６−Ｂによりエキソビボで感染させた（ＩＦＡおよびＰＣＲにより証明した）動物自身のＰＢＭＣを静脈内接種し、６〜８週間後に同一の生ウイルス改変体を含む細胞溶解物を静脈内注射する；（２）５週間の間隔で、ＭＯＬＴ３  ＨＨＶ６−Ｂ感染培養物に由来するウイルス溶解物を２回静脈内注射する；そして（３）ＨＨＶ６−Ａに感染させたＨＳＢ２細胞（ＨＨＶ６−Ａ+ＨＳＢ２）を１回接種し、３ヶ月後に感染細胞または非感染細胞のいずれかを注射する。
【０１２５】
（表３）
（ＨＨＶ６改変体によるコモンマーモセットの感染）
【表３】
2008523785.tif 000005
【０１２６】
これらの動物の各々について、最初の感染ではほとんど症状はなかった。しかし、動物を生ＨＨＶ６−Ａに再び曝露すると、２回目の接種の後に、急速に体重が減少して感覚欠損を伴う低緊張性麻痺を起こした。図４の動物番号１９０−９４および５５０−９９を参照のこと。
【０１２７】
接種の前と後との種々の時間において、一部の動物においてＭＲＩ画像化を実施した。陽性結果は以下を含んだ：脳幹神経節中の広範囲のＴ２強調された低信号の（hypointensity）領域およびＴ１強調された低信号の領域（１９０−９４、図５）；顕著な局所性、そして広範性脳萎縮の程度がより低い。萎縮は、側脳質および軟膜下空間を含む脳脊髄容積の増大から明白であり、脳の左側の海馬の灰白質、側頭葉および後頭葉の周辺の領域で広くみられた（Ｕ０３１−００、図６）。これらの結果の両方とも、ウイルスＣＮＳ感染の後遺症（sequellae）および特徴に対応しているようであった。著しい萎縮および脳室容積の増大（図６）が、２回のウイルス接種後に安楽死させた動物において観察され（Ｕ０３１−００、１６３日目）、顕著な急性脱髄病変を示すが、認識できる萎縮は示さないより早い時点で安楽死させた動物においては観察されない（１９０−９４、６８日目）ことは、注目すべきである。動物Ｕ０３１−００における結果は、重度の身体的障害または認知障害を伴うＭＳの特徴である「エキソバキュオ（ex vacuo）」脳萎縮を思い起こさせる程度が高く、最初の提示にかかわらず（遅発寛解型、二次進行型（secondary progressive）および一次進行型（primary progressive））、この疾患の自然の過程での一般的な結果である。ヒトＭＳでの広範性脳萎縮または局所性脳萎縮のこのＭＲＩパターンは、新規の限局性ＭＲＩ病変の出現にかかわらずに観察され、疾患の経過の早期に現れても後期に現れても、脳室周囲の白質および／または灰白質の破壊ならびに喪失を反映すると考えられる。脳萎縮は多くの場合、可逆性の神経炎症の後のＭＳの発症の段階（ここで、ニューロンまたは希突起神経膠細胞に対して不可逆的な損傷が起こる）を表す臨床補助的なマーカーとみなされる。
【０１２８】
上記の結果から、ヒトのＨＨＶ６感染が、この疾患の異質な範囲内において神経学者に周知であるより「良性」な形態とは対照的に、白質および／または灰白質の破壊に関連する傾向のＭＳの特定のサブタイプを生じさせ得ることが示唆される。Pittock et al., Ann Neurol 56:303-306 (2004)を参照のこと。さらに（または、あるいは）、動物１９０−９４の脳幹神経節構造と動物Ｕ０３１−００の局所的な萎縮との関連から、現在のマーモセットモデルもまた、ヒトでの一般的なウイルスに対する曝露と、神経変性または他の疾患（例えば、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、睡眠発作、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、または痴呆の他の形態、進行性核上性麻痺、舞踏病アテトーシス（choreoathatosis）、亜急性硬化性全脳炎、クロイツフェルト−ヤーコブ病（Jacob- Creutzfeld）、進行性多病巣性白質脳障害（progressive multifocal leukiencephalopathy）、焦点てんかんまたは全身てんかんの後期発症型の特定の形態、ラスムッセン脳炎、小脳萎縮、複合型脊髄硬化症、ＭＥＬＡＳおよびカダシル（Cadasil）病）の表現型の重症度との間の原因となる関係を研究するために価値があることも示唆される。
【０１２９】
複製するＨＨＶ６−Ａの繰り返し注入を受けた動物において軽度の炎症の脈管周囲または軟膜下の浸潤を示す神経病理が、全ての動物について得られた。炎症は、脈管周囲の分布で最も顕著であり、二回目の接種のすぐ後に屠殺した一匹の動物（１９０−９４）において明らかに認識できる脱髄と関係していた。これらの病変は慣用的な染色ではマーモセットＥＡＥの病変と区別できず、ＭＲＩによってインビボで検出することもできる（図５）。ＨＨＶ６ウイルスの存在を、動物１９０−９４の炎症性浸潤の近辺において、免疫組織化学によって実証した。図７Ａ〜７Ｂを参照のこと。対照的に、組織学的に正常なＣＮＳ組織においても、脾臓、リンパ節、および試験したいくつかの末梢組織においても、ＰＣＲまたは免疫組織化学のいずれでもＨＨＶ６を検出できなかった。これらのデータから、完全に進行したＭＳ様の炎症性脱髄病変を有するＣＮＳ病理の出現は、ウイルスの持続性および／または複製を必要とし得ることが示唆される。ＨＨＶ６−Ｂ溶解物もしくはＨＨＶ６−Ａ+細胞の単回注射を使用した重大な臨床疾患または神経病理の誘発は、このプロトコルに供された動物（すなわち、番号１２５および３６７−９４）においてこれまでのところ検出されなかった。
【０１３０】
（実施例３  ウイルス抗原に対する免疫反応性）
本実施例は、ＨＨＶ６抗原に対するＴ細胞および抗体の反応をモニタリングするための方法論を開示する。
ウイルス抗原に対するＴ細胞および抗体の反応を連続的にモニタリングするための方法を開発した。コロニー中のマーモセットはＨＨＶ６に対してナイーブであり、接種の後に抗体反応性が生じることが予備的な証拠から示された（図８を参照のこと）。ＰＢＭＣまたはリンパ器官で、顕著なＴ細胞反応性は検出されなかった。ＨＨＶ６  ＤＮＡの存在を、ネステッドＰＣＲ方法論によって連続的にモニタリングした。ＨＨＶ６改変体の公知の指向性と矛盾なく、感染動物の血液中でＨＨＶ６−ＡではなくＨＨＶ６−Ｂを検出した（図９を参照のこと）。
【０１３１】
重要なことに、ＨＨＶ６感染細胞に対するはっきりとした血清（ＩｇＧ抗体）反応性は、接種の後の週の間に明らかになることを観察し、ＦＡＣＳ分析を使用して容易に検出した一方、製造業者の指示に従って使用した固体支持体Strain Z-29（Applied Biosciences, Foster City, California）上にコーティングした精製ウイルス溶解物を利用した標準的なＥＬＩＳＡ法、およびウイルス抽出物でコーティングしたプレートを使用した本発明者らの実験室からのデータから、これらの血清のいずれにおいてもＩｇＧ反応性は全く検出されなかった（表４）。
【０１３２】
（表４）
（感染後安楽死させるまでのベースラインおよび種々の時間において、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂに感染した動物はＨＨＶ６に対する血清ＩｇＧ反応性がない（精製ウイルス抽出物でコーティングしたＥＬＩＳＡウェルを使用））
【表４】
2008523785.tif 000006
【０１３３】
動物番号（一次抗体として血清を添加）および静脈切開のデータ。ブランク、血清なし；ポジティブ、ＥＬＩＳＡキットで提供されるポジティブコントロール；ネガティブ、ネガティブコントロール；ＰＰ１０９５、非常に強いＨＨＶ６反応性を示す原発性進行性（ＰＰ）ＭＳを有する患者由来の血清。バックグラウンドを超える陽性サンプルは、灰色の色調でマークしている（左パネル）。ＥＬＩＳＡプレートから光学密度（ＯＤ）を読み取る。血清の希釈は、１：２０である（右パネル）。
【０１３４】
本明細書において研究される４動物の各々について、安楽死の日のサンプルは、太字でマークしている。図８での結果（ＨＨＶ６に感染させたＨＳＢ２細胞に対して反応性のＩｇＧについてのポジティブＦＡＣＳ染色）と動物１９０−９４由来のデータ（ＩｇＧについてＥＬＩＳＡで読み取ったネガティブＯＤ）を比較した。
【０１３５】
ＩｇＧに加えて、血清ＩｇＭの反応性を全ての動物で研究した。ＩｇＭ反応性は、初期の一次免疫反応を反映していると考えられ、可溶性ＩｇＭは、病原性である可能性もあるが、成熟した超変異高親和性ＩｇＧ抗体の産生を導く記憶Ｂ細胞反応の発生の前にまず現れる一過性の低親和性抗体とみなされる。実に驚くべきことに、本発明者らは、一部の動物が、ＥＬＩＳＡによって検出することができる激しいＩｇＭ反応を起こすことを見出した。これらの動物はＨＨＶ６Ｂに感染させた動物およびＨＨＶ６Ａ感染サルの一部を含む（５５０−９９および３６７−９４）。際立って対照的なことには、最も重度の炎症性脱髄の神経病理学的な病変を示した動物１９０−９４は、ＥＬＩＳＡによって検出されるＩｇＭ反応を起こさなかった（データは示さず）。
【０１３６】
これらの結果は、特定の個体のマーモセット（１９０−９４、全ての動物と同様にこのウイルスに対してナイーブ）をＨＨＶ６に新たに曝露すると、１種以上のウイルス抗原（タンパク質、糖タンパク質または脂質）上のコンフォメーションエピトープのみを認識する特定のＩｇＧサブクラス（アイソタイプ）の抗体が産生され、従って、ＥＬＩＳＡではなくＦＡＣＳによってのみ検出することができることを示唆する。他のエピトープに対してＥＬＩＳＡで検出可能なＩｇＭ反応がない場合に、これらのＩｇＧ抗体が生じる。従って、このパターンの抗体反応性は、動物１９０−９４の神経病理学的知見によって示されるように、炎症性脱髄の発生と関連しているようである（図７〜８）。他方、より軽度のＣＮＳ疾患を有する全ての動物またはＣＮＳ疾患ではない全ての動物は、ＨＨＶ６の改変体Ａまたは改変体Ｂに感染していても感染していなくても、ＥＬＩＳＡによって検出することができるＨＨＶ６抗原に対して、顕著で、かつ非常に持続性の高いＩｇＭ免疫反応を示す。
【０１３７】
ＦＡＣＳ分析によって検出可能なＩｇＭ反応性と、エピトープ認識およびアイソタイプスイッチングに関する種々の抗体の全体の特徴付けとはまだ調査中である一方、これらの知見は、個体被験体におけるＨＨＶ６に対する抗体反応の性質および動的特徴は、より高度な霊長動物の種においてこのウイルスへの曝露の結果と重要性に大きく影響し得るか、またはこれを制御さえし得るということを実際に示唆する。具体的には、ゲノム、ポストゲノム、転写後および／もしくは環境の影響または適切な制御反応（例えば、特異的な抗体中和）を起こさない任意のこれらの組み合わせのもとで、ＣＮＳにおいてウイルス持続性に関連する疾患および／または他の器官の疾患は、他の動物においては抑制される一方で感受性の高い動物において発症が許容されるという仮説を立てることができる。ＣＤ４６ウイルスレセプターのオリゴマー化（Christiansen et al., J Virol 74:4672-4678 (2000)）またはそのアイソフォーム（ＣＤ４６−ｃｙｔ１およびＣＤ４６ ｃｙｔ２）の差次的発現が、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型と（Evlashev et al., J Gen Virol 82:2125-2129 (2001); Marie et al., Nat Immunol 3:659-666 (2002); Kemper et al., Nature 421 :388-92 (2003)）、調節細胞と、ＮＫ細胞活性と（Grossman et al., Blood:Epub (2004)）を制御することによって後天免疫の反応を調節するという最近の観察に従って、抗体アイソタイプスイッチングが、インビボでのＨＨＶ６の感染および複製の重要な調節機構であるということは、たとえ有望でなくとも極めて可能性が高い。狼瘡において、自己抗体由来のペプチド配列が、サイトカインの産生および免疫反応のＴｈ表現型に影響し得ることが最近報告されている。Kalsi et al., Lupus 13:490-500 (2004)を参照のこと。さらに、そして本出願において特許請求されるものに対して重要なことには、ＨＨＶ６または他のウイルスに対する宿主反応のインビトロ研究が、インビボでのウイルス感染の結果（例えば、クリアランスまたは持続性、および免疫系に対する影響）を予測する助けとなり得ることを想定することができる。Ning et al., J Med Virol 69:306-312 (2003)を参照のこと。従って、インビトロで観察される細胞反応および／もしくは抗体反応、またはインビボで既に存在するＨＨＶ６に対する抗体反応の特徴付けは、小児期の後半または成人期に入る前に個々の被験体がＭＳまたは他の自己免疫疾患を発症する傾向およびリスクを予測することに関して、価値のあるバイオマーカーとなり得る。
【０１３８】
これらの観察は、臨床的神経学およびＭＳまたは慢性疲労症候群に関して完全に新規であり、特に特徴的である。なぜならば、現在までの全ての研究は、ＥＬＩＳＡ方法のみを利用して、ヒトにおいてＨＨＶ６に対するＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体のいずれかを検出するからである。
【０１３９】
（実施例５  インビボでのＣＮＳミエリン抗原に対する反応性）
本実施例は、ＨＨＶ６によるインビボ感染が内因性ミエリンペプチドと相同であるウイルスペプチドの免疫系による認識を誘導することを開示する。
ＨＨＶ６によるウイルス感染は、分子模倣をもたらす。分子模倣とは、宿主免疫系によって、免疫攻撃を誘発するミエリンタンパク質ペプチドに似ているウイルスペプチドが認識される現象である（Fujinami et al., Science 230:1043-1045 (1985);およびOldstone, Faseb Journal 12:1255-1265 (1998)）。ＭＢＰの免疫優勢ペプチドに対するこのような相同性は、最近、ＨＨＶ６  Ｕ２４タンパク質において記載された。Tejada-Simon et al., Ann Neurol 53:189-197 (2003)。
【０１４０】
これらのデータから、ＨＨＶ６−Ａを接種した動物でＴ細胞模倣が起こり、臨床的徴候および神経病理を示した動物は、ＭＯＧ（細胞外ドメイン、ａａ１〜１２５）、ＭＧＯ由来ペプチド（重複する２０個のアミノ酸ペプチドの混合物）に対する顕著なＴ細胞反応を起こし、そしてＭＢＰに対する弱いＴ細胞反応を起こすことが示唆される。図１０Ａおよび図１０Ｂを参照のこと。マーモセットＥＡＥで生じる典型的な体液反応とは対照的に、ミエリンタンパク質に対する顕著な抗体（ＩｇＧ）反応は検出されなかった。ミエリンタンパク質とは対照的に、ウイルス溶解物に対する顕著なＴ細胞反応性は、ＰＢＭＣとリンパ器官のいずれにおいても検出されなかった。
【０１４１】
ひとまとめにして考えると、これらのデータは以下を実証する：（１）飼育繁殖された成体C. jacchusマーモセットは、ＨＨＶ６−Ａに対してナイーブであり、血行性経路を介してこのウイルスに感染し得た。ＨＨＶ６に対する抗体反応は、感染の後に起こる；（２）ＨＨＶ６−Ａによる反復感染は、ＭＳと似た神経学的欠損および病理を有する炎症性ＣＮＳ脱髄の形態を生じた；そして（３）ＭＳは、ミエリン抗原に対するＴ細胞反応性の新規の出現と関連し、ＣＮＳ病変でのウイルスの持続性が必要とされた。
【０１４２】
（実施例６  ＥＡＥに対するウイルス感染の効果）
ヒト自己免疫における病原体曝露の周知の効果と同様に、ＥＡＥを発症する傾向にある実験動物の感染は、疾患を悪化させる。Eralinna et al., J Neuroimmunol 55:81-90 (1994); Lieber et al., J Neuroimmunol 46:217-223 (1993); Massanari, Clin Immunol Immunopathol 19:457-462 (1981);およびMokhtarian et al., J Immunol 138:3264-3268 (1987)。ミエリンの脳炎誘発性エピトープに対する感受性を与えるＴＣＲ導入遺伝子を発現するマウスは、病原体がない環境下で飼育した場合、自発的疾患または重症疾患を発症しない。Goverman et al., Cell. 72:551-560 (1993)。従って、模倣を誘発し疾患を引き起こす際のＨＨＶ６の役割に加えて、これらのウイルスは、ＭＳの疾患の表現型発現を調節する可能性を有する。同様に、さらなる実験証拠から、成体野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスを麻疹ウイルスまたはそのタンパク質のいずれかに曝露すると、ＭＯＧａａ３５〜５５（げっ歯動物のＭＯＧの免疫優勢エピトープ）で誘導したＥＡＥの症状がさらに悪化することが示された（表５および図１１）。
【０１４３】
（表５）
【表５】
2008523785.tif 000007
【０１４４】
（実施例７  ＨＨＶ６への曝露によるC. jacchusマーモセットでのＭＳ様疾病の生成）
本実施例は、以下を決定するための方法論を開示する：（１）ＨＨＶ６への単回曝露または反復曝露が疾患発現のために必要かどうか；（２）どのＨＨＶ６改変体がＣＮＳ自己免疫脱髄を生成するか；そして（３）何が関連疾患の過程か。
【０１４５】
各々８匹の動物からなる２つの群に、それら自身の同種の感染ＰＢＭＣを静脈内注射することによって、最初にＨＨＶ６−ＡまたはＨＨＶ６−Ｂのいずいれかで感染させる。新たに単離したＰＢＭＣを２．５μｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で刺激し、図３に記載されるトランスウェル系において、それぞれの感染性細胞株の存在下で共培養する。各改変体に由来する主要なカプシドタンパク質遺伝子ＤＮＡおよび共通の核抗原ｐ４１を検出する免疫蛍光（ＩＦＡ）を増幅するための特異的なプライマーを使用するネステッドＰＣＲによって、３〜７日後に、感染の成功を評価する。Soldan et al., Nature Medicine 3:1394-1397 (1997)およびSecchiero et al., J Clin Microbiol 33:2124-2130 (1995)。
【０１４６】
完全に洗浄した後、５〜１０×１０6個の感染ＰＢＭＣを各ドナーの静脈内に再注射し、疾患の臨床マーカーおよび臨床補助マーカーについて、１２０日間動物をモニタリングする。この期間の終わりに明らかな疾患が観察されない場合、次に動物に、適切なウイルス溶解物の二回目の注射をし、６０日間までモニタリングする。ウイルス複製が誘導する細胞毒性ではなく純粋な分子模倣がＣＮＳ病理の一因となるのかどうかを調査するために、６匹の動物からなる第３の群に、同様に、ウイルスのＵＶ不活化の後に同種のＨＨＶ６−Ａ感染ＰＢＭＣの二回の接種をする。
【０１４７】
動物がウイルスタンパク質に対する免疫反応性の証拠を示す時期に依存して、後半の実験は、不活化ウイルスの３回以上の接種に広げることができる。非特異的な因子を制御するために、さらに６匹の動物に同種のＣＭＶ感染ＰＢＭＣまたはＥＢＶ感染ＰＢＭＣを注射する。Ablashi et al., Biomedicine 29:7-10 (1978)。この方法論は、ＣＮＳ脱髄疾患を生成するための曝露条件を規定し、２種のＨＨＶ６改変体にそれぞれ関連する異なる疾患表現型（例えば、急性型、慢性再発型および進行型）を同定する。この方法論は、疾患の発生および経過の初期の観察の結果に依存して調整することができる（例えば、複数接種）。
【０１４８】
感染プロトコルについて目隠しされた観察者によって、疾患の臨床的徴候について、動物を毎日モニタリングする。ＣＮＳ炎症（ＣＳＦ細胞増加症）の検出（Genain et al., J. Clin. Invest. 94:1339-1345 (1994)）およびインビトロ調査のために、２週間ごとに血液とＣＳＦとを収集する。明らかな臨床的徴候がはっきりしない事象において、C. jacchusでの連続的なＭＲＩ画像化を使用することができる。
【０１４９】
動物のうちの半分を疾患の急性段階（すなわち、発症から７日以内）で犠牲にし、これらのプロトコルが慢性疾患を誘導し得るか否かを確認するために、各群の残りの動物をさらに６０日間観察する。深いペントバルビタール麻酔のもとで、この期間の終わりに全ての動物を全採血によって犠牲にし、その後すぐにＰＢＳで心臓内灌流を行い、次いで下行大動脈をクランピングしながら固定する。このことによって免疫学的機能の細胞アッセイのために処理され得る脊髄の胸部分および腰部分、ならびにより低位置の身体のリンパ節および脾臓を保存する。
【０１５０】
視神経を含む脳脊髄軸全体を収集して複数の標本を得、固定して保存するか、または２ｍｍ切片に凍結する。慣用的な組織学、ならびに薄いエポキシ包埋切片、電子顕微鏡、および免疫組織化学によるさらなる分析のために、サンプルを処理する。
【０１５１】
（実施例８  ＨＨＶ６に感染したC. jacchusマーモセットモデル系におけるＣＮＳ自己免疫の発症についてのインビボ機構の同定および特徴付け）
本明細書において提示されるデータ（前出）は、以下を実証した：（１）ミエリン成分に対する反応性の模倣型は、疾患の臨床的徴候および／または神経病理学的徴候を有する動物において発症した；（２）急性感染から時間を隔てたウイルス複製は、ＣＮＳ破壊が起こるために必要とされた；そして（３）この病理を生じるためには２段階の感染が必要とされる可能性がある。
【０１５２】
連続的なＰＢＭＣサンプル、ならびに安楽死させたときの脾臓細胞およびリンパ節細胞におけるミエリン抗原（ＭＢＰ、ＭＯＧ、ＰＬＰ、および２０マーペプチド）およびウイルス溶解物に対して、Ｔ細胞増殖反応を検出することができる。ＦＡＣＳ分析およびＨＨＶ６感染細胞株のＩＦＡによって、血清およびＣＳＦの抗体反応性（ＩｇＧおよびＩｇＭ）をまた試験することもできる。存在する場合には、これらの反応（例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２）の性質は、マーモセットサイトカインのＲＴ／ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって分析することができる。Genain et al., Immunol. Reviews 183:159-172 (2001)およびGenain et al., Science 274:2054-2057 (1996)を参照のこと。
【０１５３】
Ｔ細胞反応性の原因となる細胞型の同定は、ブロッキング抗体（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）を用いて行うことができる。ブロッキング抗体の存在下および非存在下で増殖反応を測定し、その反応がＭＨＣクラスＩＩ分子およびクラスＩ分子によって制限されるかどうかを確認する。
【０１５４】
本明細書の上記に記載のように、安楽死の後にＰＣＲおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、ＰＢＭＣ、血清およびＣＦＳの連続的なサンプル、ならびにＣＮＳおよびコントロール組織において、ウイルス複製を試験することができる。Soldan et al., Nature Medicine 3:1394-1397 (1997)およびSecchiero et al., J Clin Microbiol 33:2124-2130 (1995)。実験室においてＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂを増殖させるために使用する未感染のＨＳＢ２株およびＭＯＬＴ３株と器官抽出物とを共培養することによって、ウイルス回収のアッセイが考えられる。
【０１５５】
病変の特徴付けを、形態学的研究および免疫組織化学（ＩＨＣ）によって行う。炎症性浸潤の細胞の性質（Ｔ細胞［ＣＤ３＋細胞］、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞［ＣＤ２０］；形質細胞（plasmocyte）［ＣＤ３８］；マクロファージ［ＨＡＭ５６、ＣＤ６８］、神経膠星状細胞［ＧＦＡＰ］）、およびサイトカインを、ＲＴ／ＰＣＲおよびＩＨＣによって試験した（Ｔｈ１：ＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γ；Ｔｈ２：ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）。ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＡＧおよびＭＯＧに対する抗体、抗リン酸化神経フィラメント抗体ならびにアポトーシスのマーカーを使用して、希突起神経膠細胞および軸策の病理を評価する。Lucchinetti et al., Ann. Neurol. 47:707- 717 (2000)およびTrapp et al., J. Neuroimmunol. 98:49-56 (1999)。希突起神経膠細胞またはニューロンが死滅する証拠が存在する場合、初代培養物の感染動物由来のリンパ球、およびミエリンタンパク質でトランスフェクトしたか、またはＨＨＶ６に感染したかのいずれかの細胞株の細胞毒性を試験するためのプロトコルを開発する。
【０１５６】
感染動物のＣＮＳおよび他の器官のＣＤ４６発現レベル、ならびにこれらのそれぞれのコントロールをモニタリングする。循環する可溶性ＣＤ４６のレベルは、ＭＳの攻撃と相関する。Soldan et al., Ann Neurol 50:486-493 (2001)。マーモセットＣＤ４６、組換えヒトＣＤ４６、およびＣＤ４６をトランスフェクトした細胞株を認識するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のパネルとコントロールとを使用して、この分子を疾患活性のマーカーとして使用することができるかどうかを調査する。
【０１５７】
ＣＮＳ病理を発症するＨＨＶ６−感染動物は、ウイルスに対して強力なＴ細胞反応を起こさず、このことから、これらの動物は、ウイルス感染を除くことができないことが示唆される。ＭＳにおける免疫調節不全は、正常個体の自己免疫を抑制する調節機構の欠陥と主に関連し得（Antel et al., J Neuroimmunol 100:181-189 (1999)）、ＨＨＶ６クリアランスがＭＳにおいて不完全である可能性がある。Tejada-Simon et al., J Virol 76:6147-6154 (2002)。Ｔ細胞反応に加えて、標準的なウイルス中和アッセイを使用してこの可能性を試験し、感染動物の血清およびＣＳＦにおいてＨＨＶ６中和抗体を検出する。
【０１５８】
これらの分析の時間依存性を、臨床疾患の出現に関してモニタリングする。例えば、ＨＨＶ６感染の後に、急性の単相が起こるかどうか、あるいは慢性疾患（再発型または進行型）を決定できるかどうか、そしてミエリン特異的免疫反応もしくはＨＨＶ６特異的免疫反応とこれらの事象との相関、および／またはウイルス複製を測定できるかどうか。従って、分子内エピトープおよび分子間エピトープの伸び（spreading）（ＭＳの再発に関する機構として提案されているげっ歯動物ＥＡＥにおいて観察される現象）を検出することができる。Miller et al., Immunol. Today 15:356-361 (1994)およびTuohy et al., Immunological Reviews 164:93-100 (1998)。
【０１５９】
（実施例９  複製する生ＨＨＶ６ウイルスへの曝露は、マーモセットにおいてＥＡＥの経過および重症度に影響する）
ＣＤ４６トランスジェニックＣ５７／Ｂ１６マウスのＭＯＧａａ３５〜５５が誘導するＥＡＥ感染の悪化を測定することができる。致死量以下の麻疹ウイルスでの感染は、成体野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスでＥＡＥの重症度を悪化させる。ウイルスタンパク質による感作は、生麻疹ウイルスと同程度に有効であり得、このことから模倣機構の可能性が示唆される。成体ｃｙｔ１およびｃｙｔ２のＣＤ４６トランスジェニックマウスのアジュバント中のＭＯＧａａ３５〜５５による免疫に対する感受性を決定することができる。免疫の前の末梢注射を介して、麻疹ウイルスまたは複製するＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂのいずれかで、これらの動物を感染させることができる。ＥＢＶまたはＵＶ不活化ＨＨＶ６を使用して、コントロール実験を行うことができる。実験は、３０〜４５日間の期間で実施することができ、ウイルスをその後に注射することによって動物を再感染させる試みを含むことも可能である。
【０１６０】
臨床的エンドポイントおよび神経病理学的エンドポイントをマウス実験で使用することができる。マーモセットについて記載されるものと同様の分析は、ＣＮＳ疾患の発生と観察される種々の表現型に依存して調整することが可能である。マウスの実験から、細胞毒性株および細胞毒性クローンを養子移植（adoptive transfer）することによって同種のレシピエントに病原性が与えられるかどうかを確認することができる。
これらのモデルは、マイクロアレイを使用したＣＮＳ遺伝子の発現プロファイリングのために使用され得る。この技術は、マウスの分野で容易に利用可能であり、マーモセット組織についてAgilent and Affymetrix human DNA microchipsで確認されている。
【０１６１】
（実施例１０  ヒトＣＤ４６トランスジェニックマウスにおけるＨＨＶ６感染によって生成される疾患表現型を測定するためのアッセイ系）
マウスにおけるＨＨＶ６感染のさらなるモデルを使用して、疾患機構の総合的な理解および処置ストラテジーのスクリーニングのための総合的な理解が提供される。ＣＤ４６の発現は、げっ歯動物種において制限されている。Miwa et al., Immunogenetics 48:363-371 (1998)。ヒトＣＤ４６導入遺伝子を発現するマウスが作製され、麻疹ウイルスに感染可能であることが示された。Kemper et al., Clin Exp Immunol 124:180-189 (2001); Evlashev et al., J Virol 74:1373-1382 (2000);およびOldstone et al., Cell 98:629-640 (1999)。ヒトＣＤ４６の二種のアイソフォームを発現するいくつかのマウス系統が作製された。これら２種のアイソフォームは、ＭＯＧペプチドａａ３５〜５５によって誘導されるＥＡＥに感受性が高いＣ５７／Ｂ１６バックグラウンドに対して、細胞質テールの配列が異なる（ｃｙｔ１およびｃｙｔ２）。Lyons et al., European Journal of Immunology 29:3432-3439 (1999)。これら２種のアイソタイプによるシグナル伝達は、Ｔｈ１またはＴｈ２の選択に関して反対の様式で、先天免疫および後天免疫を区別して影響を及ぼす。Marie et al., Nat Immunol 3:659-666 (2002)およびLudford-Menting et al., J. Biol Chem 277:4477-4484 (2002)。ＨＨＶ６改変体による増殖感染によってこれらの動物において誘導され得るＣＮＳ脱髄病理をアッセイすることができる。
【０１６２】
ｃｙｔ１およびｃｙｔ２のＣＤ４６トランスジェニックマウスの両方において、各々１０〜１５匹の動物の研究群について研究を行う：（１）新生仔授乳期マウス（２〜３日齢）に、３０μｌのＨＨＶ６−Ａ、ＨＨＶ６−Ｂおよび麻疹ウイルス（コントロールとして）を直接頭蓋内注射することによって感染させる。麻疹ウイルスの公知の致死量に基づく力価実験もまた行う。
【０１６３】
感染ＰＢＭＣを用いた成体動物での持続感染を頭蓋内注射によって比較する。ＨＨＶ６−Ａの効果を別々に分析し、マーモセットと同様に二回以上の接種に対する単回接種の効果を４５〜６０日の期間にわたって試験する。コントロール実験には、ＥＢＶおよびＵＶ不活化ＨＨＶ６ウイルスを使用する。
【０１６４】
（実施例１１  多発性硬化症患者および非感染個体におけるＨＨＶ６に対する免疫反応）
多発性硬化症における免疫調節不全は、正常個体で自己免疫を抑制する調節機構における欠陥と主に関連する。Antel et al., J Neuroimmunol. 100:181-189 (1999)。ＭＳにおけるＨＨＶ６クリアランスの不足分を標準的なウイルス中和アッセイを使用してアッセイし、最初のエピソードからなる症候群（clinically isolated syndrome）（ＣＩＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）および二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）と共に提示される、患者の血清およびＣＳＦの中のＨＨＶ６中和抗体を検出する。Tejada-Simon et al., J Virol 76:6147-6154 (2002)。ＨＨＶ６曝露の後に、感受性の高い被験体がＭＳまたは他の状態を発症しないことを、Ｔサプレッサー（Ｔｓ）細胞およびＴ調節（Ｔｒｅｇ）細胞の不足を特徴付けることによってさらに調査した。これらの細胞の一部は、細胞伝達経路からＣＤ４６のｃｙｔ１およびｃｙｔ２を介して助長される。
【０１６５】
（実施例１２  ＨＨＶ６によって誘導される神経膠細胞アポトーシスおよび慢性再発性中枢神経系自己免疫脱髄）
本実施例は、自己免疫に対する傾向および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する感受性について周知であるC. jacchusマーモセットが、ＨＨＶ６−Ａへの曝露の後に炎症性脱髄を発症することを示す。
コモンマーモセットは、ヒトレセプターと相同性の高いＣＤ４６分子を発現する。ＨＨＶ６感染ヒトＴ細胞株（ＨＳＢ２およびＭＯＬＴ３）とのトランスウェル培養を用いて、マーモセットの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インビトロでＨＨＶ６の改変体Ａおよび改変体Ｂの両方に感染させ得ることが見出された。
【０１６６】
種々のプロトコルを使用して、９匹の成体マーモセットをインビボでＨＨＶ６に感染させた。このプロトコルとしては、以下が挙げられる：１）インビトロでＨＨＶ６−ＡまたはＨＨＶ−６Ｂに感染させた（ＩＦＡおよびＰＣＲで確認した）その動物自身のＰＢＭＣを静脈内注射し、６〜８週間後に同じ生ウイルスを含む細胞溶解物を静脈内注射する；２）ＭＯＬＴ３のＨＨＶ６−Ｂ感染培養物に由来するウイルス溶解物を、８週間隔で２回静脈内注射する；そして３）ＨＨＶ６−Ａに感染させたＨＳＢ２細胞を１回接種し、８〜１２週間後に感染細胞または非感染細胞のいずれかを注射する。
【０１６７】
マーモセットの最初の感染は、ほとんど症候がないことが見出された。生ＨＨＶ６−Ａウイルスに繰り返し曝露したマーモセット（１９０−９４、５５０−９９、Ｕ０３１−００、およびＵ０７６−０１）において、体重低下と感覚欠損を伴う低緊張性麻痺が観察された。これらのマーモセットは、雄と雌のどちらも含み、成体齢（１歳〜９歳）であった。
【０１６８】
生ＨＨＶ６−Ａウイルスを２回受けたマーモセットにおいて、炎症および脱髄を伴う脈管周囲の浸潤に対応する非常に強度の高いＴ２強調病変（Hyper-intense T2-weighted lesion）が観察された。図１２は、各段階での特徴的な神経病理学的特徴を有する再発型マーモセットＥＡＥの例を示す。これらの病変は、図１３Ａおよび図１３Ｂに示すように、慣用的な組織学的染色ではマーモセットＥＡＥの病変と区別できなかった。図１３Ａは、第４脳室に隣接するマーモセットの脳幹での非常に強度の高いＴ２病変を示す。図１３Ｂは、同じ動物での脱髄性炎症性浸潤を示す（ＬＦＢ／ＰＡＳ）。
【０１６９】
ＨＨＶ６の存在は、図７Ａおよび図７Ｂにおいて示すように、炎症性浸潤における免疫組織化学によって実証することができる。早期核抗原（early nuclear antigen）ｐ４１／ｐ３８についての染色は、希突起神経膠細胞の形態を有する細胞において、病変内でのウイルスの持続性／複製を実証する。従って、ＣＮＳ病理の出現は、ウイルスの持続性および／または複製に必要とされ得る。図１３Ｂに示すように、ＨＨＶ６−Ａ感染動物の病変内で多数のアポトーシス細胞を観察した（ＴＵＮＥＬ）。
【０１７０】
ヒト希突起神経膠細胞腫（oligodendrocytoma）細胞株ＴＣ６２０を使用して、ＨＨＶ６改変体の特異的なプロアポトーシス効果に関する仮説を試験した。図１４Ａおよび図１４Ｂは、非感染細胞株（バックグラウンド、Ｂ）と比較して、ＨＨＶ６−Ａ感染細胞株（Ａ）と共培養したＴＣ６２０細胞におけるアポトーシスの増加（Ｒ４）および生細胞の減少（Ｒ２）を示す。図１４Ｃは、ＨＨＶ６−Ａ感染細胞株およびＨＨＶ６−Ｂ感染細胞株と共にインキュベートした後に観察される希突起神経膠細胞アポトーシスの増加のパーセントを示す。アポトーシスはＨＨＶ６−Ａ（ＨＨＶ６−Ｂではない）の特異的な効果であることが見出された。
【０１７１】
ＨＨＶ６−Ａを接種した２匹のマーモセットおよびＨＨＶ６−Ｂを接種した１匹のマーモセット（コントロールとして）を、動物の再発経過およびミエリン抗原に対する反応性について長期間研究した。これらのマーモセットについての臨床的経過を図１５Ａに示す。連続的な血液サンプルを得て、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、ミエリン／希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する末梢Ｔ細胞免疫反応性（ＰＢＭＣ）を測定した。この結果を図１５Ｂおよび１５Ｃに示す。図１５Ｂおよび図１５Ｃに示すデータから、二回目のＨＨＶ６接種の後に、一過性の免疫抑制状態（ＰＨＡに対する反応性が低下する）が起こり、その後にＭＯＧに対する反応性が現れることが示唆される。
【０１７２】
この実験証拠は、C. jacchusマーモセットがＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂに対してナイーブであり、これらのウイルスに確実に感染し得ること、そしてＨＨＶ６−Ａによる反復感染は、病理学的にＭＳと類似した脈管周囲の炎症性脱髄を伴う軽度の慢性再発性ＣＮＳ疾患を生成することを示す。
【０１７３】
このモデルは、遍在的なヒトウイルスをＭＳを模倣する慢性疾患と原因として結びつける初めてのものであり、このような微生物と非近交種における複雑な神経−免疫反応との間のモデル相互作用を提供する。改変体Ａおよび改変体Ｂの両方によるＨＨＶ６感染は、一過性の免疫抑制の原因となり得、両方の改変体がヒトにおいてと同様にマーモセットで持続および複製し得ることが見出された。しかし、ＨＨＶ６−Ａ感染のみが、ＭＳ様ＣＮＳ炎症性脱髄を生じさせ、このことからこの改変体に対する優先的なＣＮＳ指向性の可能性および／または神経膠細胞に対するアポトーシス効果が示唆される。さらに、ミエリン抗原による模倣は、このモデルにおける炎症性ＣＮＳ損傷に対して主要なものでも原因となる機構でもないようであることが見出された。それよりも、遅発型のＴ細胞自己反応性が、慢性疾患の悪影響（perpetration）において役割を果たす可能性がある。
【０１７４】
（実施例１３  進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）の症例においてナタリズマブが誘導する免疫抑制）
進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）のいくつかの症例が、インターフェロンベータ１−ａ（ＩＦＮ−β）に加えてナタリズマブを受けた再発寛解型多発性硬化症（ＭＳ）の患者の臨床試験の文脈において最近報告された。クローン病のためにナタリズマブで処置された別の患者もまた、致死形態のＰＭＬを発症した。本実施例は、ナタリズマブおよびＩＦＮ−βで処理した後に進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）を発症した患者において、リンパ球サブセットの免疫学的特性を対象としたものである。
【０１７５】
ナタリズマブは、Ｔ細胞および単球の表面上に発現する糖タンパク質ａ４ｂ１インテグリン（極後期抗原（very late antigen）４、ＶＬＡ−４）に対するヒト化モノクローナル抗体である。実験的には、ナタリズマブの投与は、血管内皮への細胞接着および血液脳関門を通過するリンパ球の遊出を妨げ、多発性硬化症（ＭＳ）での治療的用途について合理的なものである。抗接着分子アプローチは、炎症のマウスモデルにおいて、そしてヒトＭＳの試験において有効であることが証明されており、ＭＲＩ活性および臨床的攻撃のほとんど全てをなくす。
【０１７６】
ＰＭＬは、重篤であり、多くの場合、遍在的なヒトウイルス（ＪＣウイルス）に関連付けられている急速致死性白質脳症である。ＪＣウイルスおよび関連するＢＫウイルスは、１９５０年代後半に数百万人のアメリカ人に投与されたポリオワクチンを汚染した親のサル空胞形成ウイルス（ＳＶ４０）から進化したと考えられている。第一のこれらのポリオーマウイルス（パポバウイルス科）であるマウスポリオーマウイルスは、１９５３年にGrossによって単離され、固形腫瘍の発生を促進することが示された。ＳＶ４０は、サービンの経口ポリオワクチンを製造するのに使用された腎臓細胞培養物において１９６０年にSweetおよびHilemanによって単離された。ホジキンリンパ腫によるＰＬＭの症例と、免疫抑制された腎臓移植患者の症例とから、それぞれ、ＪＣウイルスとＢＫウイルスとが１９７１年に単離された。これら２種のウイルスの単離の提供は、ヒト神経膠細胞を使用して行われ、このことは、これらのウイルスの優先的な指向性を強調するものである。ポリオーマウイルスは、小さなＤＮＡウイルスであり（およそ５ｋｂｐ）、脳に加えて腎臓細胞およびＢ細胞に特定の指向性を有する。ＳＶ４０に対するレセプターは、ＭＨＣクラスＩ抗原であるようである。ＪＣウイルスは、ＳＶ４０とこのレセプターを共有していないようであるが、クラスリン依存性レセプターに媒介されるエンドサイトーシスピットおよびセロトニンレセプター５ＨＴ２ＡＲを介して神経膠細胞および他の細胞型に侵入し得る。ヘルペスウイルス科と同様に、ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスは、ヒトにおいて感染の潜伏状態を維持するが、一生の間で時々再活性化される。約７０〜１００％の成人がＪＣウイルスおよびＢＫウイルスに対する抗体を有する。伝染の経路は知られておらず、動物貯蔵庫として知られている動物もいない。大部分の感染は無症候性であるが、一部の小児は、呼吸性症候群または膀胱炎を発症する場合がある。
【０１７７】
ＰＭＬは、通常、他の一般的なヒト病原体による日和見感染と同様に、免疫抑制された個体（例えば、ＡＩＤＳ、移植患者）において観察される。Ｂ細胞は、腎臓から脳にウイルスを輸送することによってＰＭＬの病因に関与し、この疾患は、希突起神経膠細胞中のＪＣウイルスの複製によって媒介されると考えられている。
【０１７８】
ヘパリン化血液および凝固血清を以下から収集した：１）毎月、ナタリズマブおよびＩＦＮ−βで処置されている進行性ＰＭＬを有する患者（１人）；２）同じ試験においてナタリズマブおよびＩＦＮ−βで処置されたが、ＰＭＬを発症していない患者（４人）；３）ステロイドおよび血漿交換によって処置された視神経脊髄炎（ＮＭＯ）を有する患者（３人）；４）認可された疾患改変治療（インターフェロンベータ１−ｂ、インターフェロンベータ１−ａ、またはコポリマー１）（ＭＳ−ＤＭＴ）で処置された再発寛解型ＭＳを有する患者（５人）；および５）健康なコントロール個体（１人）。
【０１７９】
ＰＭＬを罹患した患者の年齢とできるだけ近い程度に全ての被験体をマッチさせた。製造業者の指示に従って、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析のために全血を染色した。以下の抗体クローンを使用した：ＣＤ３−ＦＩＴＣ／ＰＥ／ＰｅｒＣｐ：ＳＰ３４、ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＰＥ：Ｌ２００（BD Pharmingen）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ：ＳＦＣＩ２１Ｔｈｙ２Ｄ３（Beckman Coulter）、ＣＤ１９−ＰＥ：４Ｇ７、およびＣＤ２５−ＦＩＴＣ：２Ａ３（Becton-Dickinson）。ＭＯＧ（細胞外ドメイン）に対する反応性について、血清でＥＬＩＳＡを実施した。異なる群の間で血清の抗体反応性において差はないことが見出された。
【０１８０】
表６は、フローサイトメトリー研究の結果を示す。表４に示すとおり、全体のＷＢＣ数、リンパ球数、ならびにＣＤ３+ＣＤ４+細胞、ＣＤ３+ＣＤ８+細胞、およびＣＤ１９+細胞の絶対数に差はなかった。しかし、ナタリズマブ＋ＩＮＦ−βで処置した患者では、他の群と比較してＣＤ３+ＣＤ８+細胞の数が低下したことを示す傾向であったことに注意されたい。図２０Ａ〜図２０Ｈは、ナタリズマブ＋ＩＦＮ−βで処置した患者（左）、ＮＭＯで処置した患者（中央）、および従来のＤＭＴで処置したＭＳを有する患者（右）におけるＣＤ１９+Ｂ細胞の相対的なパーセンテージおよびＣＤ１９+／ＣＤ３+数の比を示す。ＣＤ１９+の絶対数は、ＭＳ−ＤＭＴ群と比較してこれらの患者でも高く、ＣＤ１９+細胞（成熟Ｂ細胞）の相対割合は有意に増加した（ｐ＜０．０５）。結果として、表４および図２０Ａ〜図２０Ｈに示すように、ＣＤ１９+／ＣＤ３+細胞の絶対数の比を分析する場合、他のＮＭＯ患者およびＭＳ患者と比較して、この群の間に有意な差があった。
【０１８１】
（表６）
【表６】
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【０１８２】
Ｔ細胞の小さなサブセット（ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞）は、調節活性を有するＴ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むと考えられ、これを試験した。これらのＴ細胞は、図１６Ａ〜Ｃに示すよに、コントロールサンプルにおいて変動するレベルのＣＤ２５を発現する。図１６Ａ〜Ｃは、健康なコントロール（図１６Ａ）、ＩＦＮ−βのみで処置されたＭＳ患者（図１６Ｂ）およびナタリズマブ＋ＩＦＮ−βを受けたＰＭＬを発症した患者（図１６Ｃ）において、ＣＤ２５に対する不均質な染色を示す（低〜高）（ＦＩＴＣ）代表的なフローサイトメトリーのデータを示す。健康なコントロールとＤＭＴの患者とを比較すると、ナタリズマブ＋ＩＦＮ−βで処置された一部の患者は、Ｔｒｅｇ集団の著しい減少を示した。この処置の合併症として、これらの患者およびＰＭＬを発症した被験体においてＴｒｅｇ細胞は実質的に存在しなかった。図２０Ｂは、ナタリズマブ＋ＩＦＮ−β（左）およびＭＳ−ＤＭＴ（右）で処置された患者、ならびにナタリズマブ＋ＩＦＮ−βでの処置の結果としてＰＭＬを発症した被験体における、ＣＤ４+ＣＤ２５+細胞の絶対数を示す。
【０１８３】
本実施例は、ナタリズマブ＋ＩＦＮ−βでの処置が、感受性の高い被験体のサブセットにおいて著しい免疫機能異常を誘導することを実証する。全リンパ球およびＣＤ４+Ｔ細胞が比較的保存されているにもかかわらず、Ｔｒｅｇ集団の抑制が起こり、これらの患者のＢ細胞集団は、特にＣＤ８＋（サプレッサー）細胞の集団において増加する傾向があることが見出された。さらに、Ｔ調節活性が失われることは、これらの患者におけるＢ細胞の活性の不完全な制御および輸送、ならびに潜伏している通常は良性のウイルス（例えば、ＪＣウイルス）の複製を妨げることができないことの原因であり得ることが見出された。ＰＭＬの症例のみに観察されたことであるが、この「機能的免疫不全」の状態はまた、他の遍在的病原体を再活性化する能力にも影響し得る。さらに、感染Ｂ細胞の血液脳関門を通過する輸送が、ナタリズマブによって阻害され得ないという可能性もある。
【０１８４】
本研究は、ＭＳの任意の処置試験において強力かつ無差別の全身性免疫抑制という結果を理解することの重要性を強調する。ＭＲＩは、ＰＭＬのような合併症の早期の発症を検出するのに十分には感度が高くない可能性がある。なぜならば、ＭＲＩは、Ｔ２可視病変の基礎となる病理学に関する情報を提供しないからである。これらのデータは、Ｔ細胞サブセット（特に、ＣＤ１９＋およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋）のような免疫学的マーカーは、ナタリズマブが誘導する合併症を発症するリスクを有する患者を検出するために有用であることを実証する。特に、このデータは、ＣＤ１９／ＣＤ３比、ＣＤ４+ＣＤ２５+集団、ＣＤ８＋細胞数およびＣＤ３＋細胞数、ならびに他の免疫細胞（例えば、Ｔ調節細胞、記憶細胞、ＮＫ細胞が挙げられる）の数、およびそれぞれの比率を、ＭＳおよび抗接着分子（例えば、ナタリズマブ）で処置される他の自己免疫疾患を有する患者のリスクをモニタリングするためのマーカーとして評価および使用することを支持する。
【０１８５】
本発明において記載されるアプローチは、免疫不全（構成型（constitutive）または後天型）、移植患者、ならびにＡＩＤＳおよび神経系ＡＩＤＳを有する患者の集団において、あらゆる範囲のウイルス（ＣＭＶ、ＨＳＶならびにＨＨＶ６、ＨＨＶ７、およびＨＨＶ８の改変体のような他のヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）に関連するＰＭＬおよび他の日和見感染のリスクをモニタリングするための方法において広い応用性を見出すことが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、Luxolファーストブルー／過ヨウ素酸Schiff（LFB/PAS）で染色した組織切片であり、C. jacchus ＥＡＥの神経病理を示す。図１Ａは、外側脊髄および背側脊髄索における広い脈管周囲の浸潤を示す（急性ＥＡＥ）。図１Ｂは、脳室周囲の白質における脳の脈管周囲の浸潤の低倍率視野である。図１Ｃは、顕著な脱髄を伴う単核細胞およびマクロファージの浸潤を明らかにする同じ病変の高倍率の拡大図である（LFB/PAS）。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、C. jacchus ＥＡＥとヒトＭＳとを比較する組織切片である。図２Ａは、軸策（Ａｘ）、マクロファージの浸潤（核（Ｍａｃ）、右上）およびアストログリオーシス（ｇｌ）が保存された急性C. jacchus ＥＡＥの一次脱髄を示す。典型的なミエリン分解および小胞形成の形態学的変化が認識できる（＊）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、軸策（Ａｘ）の回りのミエリン小胞形成の同じ特徴的パターンを示す急性ヒトＭＳ病変（生検）を示す。マクロファージの核が右上に認識できる。
【図２Ｃ】図２Ｃは、再髄鞘形成を示す強度のグリオーシス（ｇｌ）および軸策（Ａｘ）の回りの細く密集したミエリンを説明する慢性C. jacchus ＥＡＥを示す。比較のために、正常の髄鞘を有する軸策（太いミエリン）を右上の隅に示した（＊）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは、ＨＨＶ６によるマーモセットの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロ感染を示す。図３Ａは、ネステッドＰＣＲによって増幅されたＨＨＶ６  ＤＮＡ（予測されるフラグメントサイズは２５８ｂｐ）を示すＤＮＡゲルの写真である。レーン１は、感染１０日後のＨＨＶ６−Ａに感染させたマーモセットＰＢＭＣ由来のＤＮＡである。レーン２は、未感染のＴ細胞株ＨＳＢ２由来のＤＮＡである。レーン３およびレーン８は、ＨＨＶ６−Ａに感染させたＨＳＢ２由来のＤＮＡである。レーン４は、未感染のＴ細胞株ＭＯＬＴ３由来のＤＮＡである。レーン５およびレーン９は、ＨＨＶ６−Ｂに感染させたＭＯＬＴ３由来のＤＮＡである。レーン６は、テンプレートのみである（コントロール）。レーン７は、ＨＨＶ６−Ｂに感染させたマーモセットＰＢＭＣ由来のＤＮＡである。図３Ｂ〜Ｄは、ＨＨＶ６核抗原ｐ４１に対して免疫蛍光（ＩＦＡ）染色した細胞を示す。図３Ｂは、ＨＨＶ６−Ａ感染のマーモセットＰＢＭＣを示す。図３Ｃは、ＨＨＶ６−Ａ感染のＨＳＢ２細胞を示す。図３Ｄは、未感染のマーモセットＰＢＭＣを示す。
【図４】図４は、マーモセットＥＡＥの評価尺度（grading scale）（０〜４５）を使用して研究した７匹の動物における、臨床経過（神経学的徴候）を示す。Villoslada et al., J. Exp. Med. 191:1799-1806 (2000)。
【図５】図５は、安楽死させる直前の、インビボでの動物１９０−９４（ＨＨＶ６−Ａに感染）の脳全体のＭＲＩの冠状近接断面を示す。吻側から尾側の方向で、断面を１〜１５までナンバリングする。断面３の左の線条（白矢印）、および断面１２の第４脳室に隣接する不鮮明な異常な病変（黒矢印）における、低信号のＴ２強調シグナルに注意されたい。これは、図７Ａで示す脱髄病変を表す。
【図６】図６は、安楽死させる直前の、インビボでの動物Ｕ０３１−００（ＨＨＶ６−Ａに感染）の脳全体のＭＲＩの冠状近接断面を示す。吻側から尾側に、断面を１〜１５までナンバリングする。顕著な溝および脳室（白矢印）に注意されたい。これは、側頭葉および後頭葉を含む脳の左側の脳脊髄と脳室の空間の拡大（黒矢印）に反映される著しい側性成立および非対称を伴う。局所的な萎縮（黒矢印）は、断面６、断面９および断面１０で明らかであり、これは、図５で示す相当する断面と比較することができる。
【図７】図７Ａは、動物１９０−９４の脳幹における脱髄性炎症性浸潤を示す（Luxolファーストブルー）。図７Ｂは、早期核抗原ｐ４１／ｐ３８に対する染色を示し、病変内でのウイルスの持続性／複製を実証する。
【図８】図８は、動物１９０−９４においてＨＨＶ６−Ａ+  ＨＳＢ２細胞に対する血清反応性を示すフローサイトメトリーデータのグラフである。左上のパネルは、アイソタイプコントロールに対する染色を示す。右上のパネルは、ＣＤ４６に対する染色を示す。左中段のパネルは、コントロールの抗サルＩｇＧ抗体を示す。右中段のパネルは、ナイーブ血清を示す（０日目）。左下のパネルは、一回目の接種の後の血清を示す（３５日目）。右下のパネルは、二回目の接種の後に安楽死されたときの血清を示す。白抜きの図形（open trace）は、抗サルＩｇＧ−ＦＩＴＣで得たネガティブシグナルを表す。
【図９】図９は、ＰＢＭＣ中のＨＨＶ６−Ｂ  ＤＮＡのゲル電気泳動検出を示す。レーン１は、接種から７週間後のＨＨＶ６−Ｂ感染動物由来のＤＮＡである。レーン２は、接種から７週間後のＨＨＶ６−Ａ感染動物由来のＤＮＡである。レーン３〜６は、ネガティブコントロールである。レーン７およびレーン８は、コントロールのＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂに感染した系統由来のＤＮＡである。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、動物１９０−９４および動物１２５において、ＭＢＰ、ＭＯＧ（細胞外ドメイン）、および２０マーの重複するＭＯＧペプチドの混合物に対するＴ細胞増殖反応を示す図である。データを、安楽死させたときのＰＢＭＣから得る。
【図１１】図１１は、マウスＥＡＥに対する麻疹ウイルス感作の影響を示す。
【図１２】図１２は、各段階において特徴的な神経病理学的特徴を有する再発型マーモセットＥＡＥの例を示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、生ＨＨＶ６−Ａウイルスを２回受けた動物において炎症および脱髄を伴う脈管周囲の浸潤に対応する、高信号のＴ２強調病変の存在を示す。図１３Ａは、第４脳室に隣接する動物の脳幹における高信号のＴ２病変を示す。図１３Ｂは、ＨＨＶ６−Ａ感染動物の脳切片の病変内で観察されるアポトーシス細胞を示す（ＴＵＮＥＬ）。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ヒト希突起神経膠細胞腫細胞株ＴＣ６２０に対するＨＨＶ６改変体の特異的なプロアポトーシス効果の効果を示す。図１４および図１４Ｂは、非感染細胞株（バックグラウンド、Ｂ）と比較して、ＨＨＶ６−Ａ感染細胞株（Ａ）と共インキュベートしたＴＣ６２０細胞におけるアポトーシスの増加（Ｒ４）および生細胞の減少（Ｒ２）を示す。図１４Ｃは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂの感染細胞株と共インキュベートした後に観察された希突起神経膠細胞のアポトーシスの増加のパーセントを示す。
【図１５】図１５Ａは、ＨＨＶ６−ＡおよびＨＨＶ６−Ｂを接種した動物についての臨床経過を示す。図１５Ｂおよび図１５Ｃは、その動物の連続的な血液サンプル中の植物性血球凝集素（ＰＨＡ）、ミエリン／希突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する末梢Ｔ細胞免疫反応性（ＰＢＭＣ）の測定を示す。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、健康なコントロール（図１６Ａ）、ＩＦＮ−β単独で処置されたＭＳ患者（図１６Ｂ）、およびナタリズマブ＋ＩＦＮ−βを受けるＰＭＬを発症した患者（図１６Ｃ）において、ＣＤ２５に対する不均質な染色（低〜高）（ＦＩＴＣ）を示す代表的なフローサイトメトリーデータを示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃは、動物１９０−９４と同様に生ＨＨＶ６−Ａを２回接種した動物Ｕ０７６−０３での神経病理学的結果を示す。図１７Ａは、皮質下白質の広範囲の炎症性浸潤を示す低倍率視野である。図１７Ｂは、血管の回りの単核細胞およびマクロファージによる強度の浸潤（矢じり（arrowhead））、ならびにマーモセットＥＡＥおよび急性ＭＳ病変に典型的な多数の領域でのミエリンの空胞形成および分解（矢印）を示す浸潤の詳細である（Ｈ＆Ｅ；ＧＭ：灰白質；ＷＭ：白質）。図１７Ｃは、顕著な脱髄およびマクロファージ活性を示す脈管周囲の炎症性浸潤のLuxolファーストブルー／ＰＡＳ染色である。
【図１８】図１８は、病変を欠いた脈管周囲の白質（脳梁）において、希突起神経膠細胞の染色を示す免疫組織化学染色を示す。これにより、炎症性脱髄浸潤を欠く脳の領域においてウイルス複製が起こることが実証される。
【図１９】図１９Ａは、細胞病変の部位での複製するＨＨＶ６ウイルス（ｐ４１）の染色を示し、図１９Ｂは、複製するＨＨＶ６ウイルスの位置での希突起神経膠細胞の染色（ＣＮＰａｓｅ）を示す。
【図２０−１】図２０Ａ〜図２０Ｈは、ナタリズマブ＋ＩＦＮ−βで処置された患者、ＮＭＯで処置された患者、および従来のＤＭＴで処置されたＭＳ患者において分析した全てのリンパ球サブセットを示す。丸：ナタリズマブ＋アボネックス（ＩＮＦ−β）；上向き三角：ＮＭＯ（中程度）；下向き三角：ＭＳ＋ＦＡＤによって認可された疾患改変治療（ＩＮＦ、コパクソン、まとめてＤＭＴと呼ばれる）。図２０Ａは、ＣＤ１９+／ＣＤ３+数の比を示す。図２０Ｂは、活性化Ｔ調節細胞（ＣＤ４+ＣＤ２５+）の絶対数を示す。図２０Ｃは、全白血球数を示す。図２０Ｄは、全リンパ球数を示す。
【図２０−２】図２０Ｅは、全ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３+ＣＤ４+）比を示す。図２０Ｆは、全ＣＤ８+サプレッサーＴ細胞（ＣＤ３+ＣＤ８+）を示す。図２０Ｇは、全Ｂ細胞（ＣＤ１９+）を示す。そして図２０Ｈは、全リンパ球数と比較したＣＤ１９+Ｂ細胞数のパーセンテージを示す。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃは、ナタリズマブ（Tysabri）での処置後の５人の患者、ステロイドおよび血漿交換で処置された視神経脊髄炎の３人の患者（ＮＭＯ）、および認可された疾患改変治療（インターフェロン−β  １−ｂ、インターフェロン−β  １−ａ、またはコポリマー１）で処置された再発寛解型多発性硬化症（ＭＳ）の５人の患者における、全リンパ球（図２１Ａ）、ＣＤ１９+細胞（図２１Ｂ）、およびＣＤ３+細胞を示す。
【図２２】図２２は、ＨＨＶ６−Ｂ改変体を２回接種した動物５０−０１において、体重減少と血糖値の上昇が出現する時間経過を示す。ＨＨＶ６−Ａ改変体を接種した動物とは異なり、動物５０−０１は、いかなる顕著な神経学的欠損も生じなかった。これらの動物は、また、糖尿病と診断された時点の尿サンプルにおいて１，０００ｍｇ／ｄｌを超えており、急激に体重が減少した（〜２７％初期体重、最初の接種の約２１０日後、矢印１）。＊は、現在の実験を開始する２年前からの、慣用的な健康チェックとして行った血糖測定を示す。この値および約２１０日目の値は、正常な範囲内にある（Yarbrough et al., Lab Animal Science, (1984)）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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