(57)【要約】  本発明は、自己分泌Wnt古典的シグナル伝達経路が活性化されている癌を治療するための化合物および方法に関する。特に、Wntシグナル伝達を改変する化合物にこのような腫瘍細胞を接触させることによる、腫瘍細胞の増殖を抑制するためまたは癌細胞を治療に感受性にするための方法が提供される。Wntシグナル伝達を改変する化合物は、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Wntシグナル伝達を改変する化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、前記化合物が、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む方法。
【請求項２】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物がポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、アンチセンスRNAまたはsiRNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、Wntアンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記Wntアンタゴニストが、分泌性Frizzled(フリズルド)関連タンパク質またはケルベロス(cerberus)である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、Wnt受容体アンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記Wnt受容体アンタゴニストがDickkopf-1(DKK1)である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記Wnt受容体アンタゴニストが低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)5またはLRP6に特異的なsiRNAである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、アポトーシスを誘導または亢進させる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞が卵巣癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が大腸癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞を化学療法剤に接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞を放射線に接触させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変されたWntシグナル伝達が、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの低下として検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
5'-CCGCATGGTGATTGATGAA-3'(配列番号:8)のヌクレオチド配列を有する、単離されたLRP6 siRNA。
【請求項１７】
発現制御配列に作動可能に結合された、請求項16に記載の相補的核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
前記発現制御配列が、腫瘍細胞における発現を実現する、請求項17に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項1から8に記載の前記化合物のうちいずれか1種または複数種、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
Wntシグナル伝達を改変する化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含む、腫瘍を治療に感受性にする方法であって、前記化合物が、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む方法。
【請求項２１】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物がポリペプチドである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、アンチセンスRNAまたはsiRNAである、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、Wntアンタゴニストである、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記Wntアンタゴニストが、分泌性Frizzled関連タンパク質またはケルベロスである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、Wnt受容体アンタゴニストである、請求項20に記載の方法。
【請求項２６】
Wnt受容体アンタゴニストがDickkopf-1(DKK1)である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
Wnt受容体アンタゴニストが低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)5またはLRP6に特異的なsiRNAである、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
Wntシグナル伝達を改変する前記化合物が、アポトーシスを誘導または亢進させる、請求項20から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍細胞が卵巣癌細胞である、請求項20に記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍細胞が大腸癌細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍細胞を化学療法剤に接触させるステップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍細胞を放射線に接触させるステップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変されたWntシグナル伝達が、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの低下として検出される、請求項20に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物が、Wntシグナル伝達を改変する化合物、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物として製剤化される、請求項1または請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2004年11月15日に出願された米国特許仮出願第60/627977号からの優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、一般に、過剰増殖性疾患を治療または予防すること、およびより具体的には、Wntシグナル伝達の増大している悪性新生物を、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せを用いてそのようなシグナル伝達を改変することによって、治療または予防するための化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Wntシグナル伝達は、細胞運命の決定および組織の発達において重要な役割を果たしている(Nusse, R. およびVarmus, H.E. (1992年) Cell 69、1073〜1087頁; Cadigan, K. M.およびNusse, R. (1997年) Genes Dev 11、3286〜3305頁)。分泌性糖タンパク質のこのファミリーのいくつかのメンバーは、補助受容体frizzledおよびLRP5/6と相互に作用して、Dishevelled(Dsh)、APC、およびAxinを含む大型の細胞質内複合体内部のセリントレオニンキナーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-β(GSK-3β)によるβ-カテニンリン酸化の阻害をもたらす(Giles, R. H.、van Es, J. H.、およびClevers, H.(2003年) Biochim Biophys Acta 1653、1〜24頁)。β-カテニンリン酸化の阻害により、ユビキチン/プロテアソーム経路によるその分解は減少し、その結果、細胞質ゾルの複合体を形成していない分子が蓄積する。次いで、複合体を形成していないβ-カテニンは、TCF/LEFと相互に作用する場所である核に移行し、かつ標的遺伝子を活性化する(Giles, R. H.、van Es, J. H.、およびClevers, H.(2003年) Biochim Biophys Acta 1653、1〜24頁)。蓄積しつつある証拠により、Wnt古典的経路を介したシグナル伝達は、結腸の上皮(van de Wetering, M.、de Lau, W.、およびClevers, H.(2002年) Cell 109 補遺、13〜19頁)および皮膚(Alonso, L.、およびFuchs, E.(2003年) Genes Dev 17、1189〜1200頁)、ならびに、筋肉(Polesskaya, A.、Seale, P.、およびRudnicki,M. A.(2003年) Cell 113、841〜852頁) および造血細胞(Reya, T.、Duncan, A. W.、Ailles, L.、Domen, J., Scherer, D. C.、Willert, K.、Hintz, L.、Nusse, R.、およびWeissman, I. L.(2003年) Nature 423、409〜414頁)における、成体幹細胞の分化を調節することが示唆されている。構成的に活性化されたWntシグナル伝達は、癌に因果的に関与していることも示された(Polakis, P.(2000年) Genes Dev 14、1837〜1851頁)。
【０００４】
Wnt活性の空間的パターンおよび時間的パターンを微調整する機能を果たし、かつ、細胞表面で作用して、受容体を介したWntシグナル伝達を阻害する細胞外阻害因子が、最近発見された(Kawano, Y.およびKypta, R.(2003年) J Cell Sci 116、2627〜2634頁)。Wntアンタゴニストの1つのグループは、分泌性Frizzled(フリズルド)関連タンパク質(FRP)であり、これらは、Frizzled受容体CRD(システインリッチドメイン)との配列類似性を共有しているが、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは欠いている(Leyns, L.、Bouwmeester, T.、Kim, S. H.、Piccolo, S.、およびDe Robertis, E. M.(1997年) Cell 88、747〜756頁; Wang, S.、Krinks, M.、Lin, K.、Luyten, F. P.、およびMoos, M., Jr.(1997年) Cell 88、757〜766頁; Finch, P. W.、 He, X.、Kelley, M. J.、Uren, A.、Schaudies, R. P.、Popescu, N. C.、Rudikoff, S.、Aaronson, S. A.、Varmus, H. E.、およびRubin, J. S.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、6770〜6775頁)。CRDを介して、FRPは、Wntに結合する能力を提示し、2量体を形成し、かつfrizzledとヘテロダイマーを形成する(Leyns, L.、Bouwmeester, T.、Kim, S. H.、Piccolo, S.、およびDe Robertis, E. M.(1997年) Cell 88、747〜756頁; Wang, S.、Krinks, M.、Lin, K.、Luyten, F. P.、およびMoos, M., Jr.(1997年) Cell 88、757〜766頁; Rattner, A.、Hsieh, J. C.、Smallwood, P. M.、Gilbert, D. J.、Copeland, N. G.、Jenkins, N. A.、およびNathans, J.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、2859〜2863頁; Lin, K.、Wang, S.、Julius, M. A.、Kitajewski, J.、Moos, M., Jr.、およびLuyten, F. P.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、11196〜11200頁;Bafico, A.、Gazit, A.、Pramila, T.、Finch, P. W.、Yaniv, A.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274、16180〜16187頁)。したがって、FRPは、Wntを捕捉する役割を果たし得るだけでなく、frizzled受容体との非機能的な複合体の形成を介してWntシグナル伝達を阻害する役割も果たし得る。別のWntアンタゴニストは、Dickkopf-1(DKK1)と呼ばれており、WntにもFrizzledにも構造的に無関係な分泌性タンパク質ファミリーの原型である(Glinka, A.、Wu, W.、Delius, H.、Monaghan, A. P.、Blumenstock, C.、およびNiehrs, C.(1998年) Nature 391、357〜362頁; Fedi, P.、Bafico, A.、Nieto Soria, A.、Burgess, W. H.、Miki, T.、Bottaro, D. P.、Kraus, M. H.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274、19465〜19472頁)。DKK1は、Wnt補助受容体LRP6に結合し、かつ膜貫通型タンパク質Kremenとの三元複合体の形成を介して、エンドサイトーシスを引き起こす(Mao, B.、Wu, W.、Li, Y.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Glinka, A.、およびNiehrs, C.(2001年) Nature 411、321〜325頁; Bafico, A.、Liu, G.、Yaniv, A.、Gazit, A.、およびAaronson, S. A.(2001年) Nat Cell Biol 3、683〜686頁; Semenov, M. V.、Tamai, K.、Brott, B. K.、Kuhl, M.、Sokol, S.、およびHe, X.(2001年) Curr Biol 11、951〜961頁; Mao, B.、Wu, W.、Davidson, G.、Marhold, J.、Li, M.、Mechler, B. M.、Delius, H.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Walter, C.ら、(2002年) Nature 417、664〜667頁)。
【０００５】
Wntは、乳癌形成を開始する、マウス乳癌ウイルスプロモーターの挿入による転写活性化の結果として最初に同定された(Nusse, R.、およびVarmus, H. E.(1992年). Cell 69、1073〜1087頁)。その後の研究により、APCおよびβ-カテニンを壊し(afflicting)、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの上昇をもたらす遺伝的改変が、ヒトの結腸癌および他の癌において極めて一般的に存在することが確かめられた(Polakis, P.(2000年) Genes Dev 14、1837〜1851頁; Giles, R. H.、van Es, J. H.、およびClevers, H.(2003年) Biochim Biophys Acta 1653、1〜24頁)。マウスモデルにおけるWnt自己分泌形質転換機序の最初の発見が20年超前であるにもかかわらず、ヒト癌におけるこの機序の証拠は不足している。
【特許文献１】米国特許仮出願第60/627977号
【特許文献２】WO 89/12690
【特許文献３】米国特許第5476786号
【特許文献４】米国特許第5132405号
【特許文献５】米国特許第4946778号
【特許文献６】米国特許第5385839号
【特許文献７】米国特許第5168062号
【特許文献８】米国特許第5814500号
【特許文献９】米国特許第5811234号
【特許文献１０】米国特許第5780607号
【特許文献１１】米国特許第5677437号
【特許文献１２】米国特許第5792844号
【特許文献１３】米国特許第5783682号
【特許文献１４】米国特許第5637684号
【特許文献１５】米国特許第5034506号
【特許文献１６】WO 95/28494
【特許文献１７】WO 95/18863
【特許文献１８】WO 96/17823
【特許文献１９】米国特許第5459127号
【特許文献２０】WO 95/21931
【特許文献２１】WO 96/25508
【特許文献２２】カナダ特許出願第2012311号
【特許文献２３】米国特許第5580859号
【特許文献２４】米国特許第5589466号
【特許文献２５】WO 99/01157
【特許文献２６】WO 99/01158
【特許文献２７】WO 99/01175
【非特許文献１】Nusse, R. およびVarmus, H.E. (1992年) Cell 69、1073〜1087頁
【非特許文献２】Cadigan, K. M.およびNusse, R. (1997年) Genes Dev 11、3286〜3305頁
【非特許文献３】Giles, R. H.、van Es, J. H.、およびClevers, H.(2003年) Biochim Biophys Acta 1653、1〜24頁
【非特許文献４】van de Wetering, M.、de Lau, W.、およびClevers, H.(2002年) Cell 109 補遺、13〜19頁
【非特許文献５】Alonso, L.、およびFuchs, E.(2003年) Genes Dev 17、1189〜1200頁
【非特許文献６】Polesskaya, A.、Seale, P.、およびRudnicki,M. A.(2003年) Cell 113、841〜852頁
【非特許文献７】Reya, T.、Duncan, A. W.、Ailles, L.、Domen, J., Scherer, D. C.、Willert, K.、Hintz, L.、Nusse, R.、およびWeissman, I. L.(2003年) Nature 423、409〜414頁
【非特許文献８】Polakis, P.(2000年) Genes Dev 14、1837〜1851頁
【非特許文献９】Kawano, Y.およびKypta, R.(2003年) J Cell Sci 116、2627〜2634頁
【非特許文献１０】Leyns, L.、Bouwmeester, T.、Kim, S. H.、Piccolo, S.、およびDe Robertis, E. M.(1997年) Cell 88、747〜756頁
【非特許文献１１】Wang, S.、Krinks, M.、Lin, K.、Luyten, F. P.、およびMoos, M., Jr.(1997年) Cell 88、757〜766頁
【非特許文献１２】Finch, P. W.、 He, X.、Kelley, M. J.、Uren, A.、Schaudies, R. P.、Popescu, N. C.、Rudikoff, S.、Aaronson, S. A.、Varmus, H. E.、およびRubin, J. S.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、6770〜6775頁
【非特許文献１３】Rattner, A.、Hsieh, J. C.、Smallwood, P. M.、Gilbert, D. J.、Copeland, N. G.、Jenkins, N. A.、およびNathans, J.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、2859〜2863頁
【非特許文献１４】Lin, K.、Wang, S.、Julius, M. A.、Kitajewski, J.、Moos, M., Jr.、およびLuyten, F. P.(1997年) Proc Natl Acad Sci U S A 94、11196〜11200頁
【非特許文献１５】Bafico, A.、Gazit, A.、Pramila, T.、Finch, P. W.、Yaniv, A.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274、16180〜16187頁
【非特許文献１６】Glinka, A.、Wu, W.、Delius, H.、Monaghan, A. P.、Blumenstock, C.、およびNiehrs, C.(1998年) Nature 391、357〜362頁
【非特許文献１７】Fedi, P.、Bafico, A.、Nieto Soria, A.、Burgess, W. H.、Miki, T.、Bottaro, D. P.、Kraus, M. H.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274、19465〜19472頁
【非特許文献１８】Mao, B.、Wu, W.、Li, Y.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Glinka, A.、およびNiehrs, C.(2001年) Nature 411、321〜325頁
【非特許文献１９】Bafico, A.、Liu, G.、Yaniv, A.、Gazit, A.、およびAaronson, S. A.(2001年) Nat Cell Biol 3、683〜686頁
【非特許文献２０】Semenov, M. V.、Tamai, K.、Brott, B. K.、Kuhl, M.、Sokol, S.、およびHe, X.(2001年) Curr Biol 11、951〜961頁
【非特許文献２１】Mao, B.、Wu, W.、Davidson, G.、Marhold, J.、Li, M.、Mechler, B. M.、Delius, H.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Walter, C.ら、(2002年) Nature 417、664〜667頁
【非特許文献２２】Wang, Y.、Macke, J.P.、Abella, B.S.、Andreasson, P.W.、Gilbert, D.J.、Copeland, N.G.、Jenkins, N.A.、およびNathans, J.(1996年) J. Biol. Chem. 271、4468〜4476頁
【非特許文献２３】Bhanot, P.、Brink, M.、Samos, C.H.、Hsieh, J.C.、Wang, Y.、Macke, J.P.、Andrew, D.、Nathans, J. 、およびNusse, R.(1996年) Nature 382、225〜230頁
【非特許文献２４】Tamai, K.、Semenov, M.、Kato, Y.、Spokony, R.、Liu, C.、Katsuyama, Y.、Hess, F.、Saint-Jeannet, J.P.、およびHe, X.(2000年) Nature 407、530〜535頁
【非特許文献２５】Niehrs, C.(1999年) Trends Genet.15、314〜319頁
【非特許文献２６】Piccolo, S.、Agius, E.、Leyns, L.、Bhattacharyya, S.、Grunz, H.、Bouwmeester, T.、およびDe Robertis, E.M.(1999年) Nature 397、707〜710頁
【非特許文献２７】Willert, K. およびNusse, R.(1998年) Curr. Opin. Genet. Dev. 8、95〜102頁
【非特許文献２８】Tada, M.およびSmith, J.C.(2000年) Development 127、2227〜2238頁
【非特許文献２９】Wallingford, J.B.、Rowning, B.A.、Vogeli, K.M.、Rothbacher, U.、Fraser, S.E.、およびHarland, R.M.(2000年) Nature 405、81〜85頁
【非特許文献３０】Winklbauer, R.、Medina, A.、Swain, R.K.、およびSteinbeisser, H.(2001年) Nature 413、856〜860頁
【非特許文献３１】Noordermeer, J.、Klingensmith, J.、Perrimon, N.、およびNusse, R.(1994年) Nature 367、80〜83頁
【非特許文献３２】Siegfried, E.、Wilder, E.L.、およびPerrimon, N.(1994年) Nature 367、76〜80頁
【非特許文献３３】van Leeuwen, F.、Samos, C.H.、およびNusse, R.(1994年) Nature 368、342〜344頁
【非特許文献３４】van de Wetering, M.、Cavallo, R.、Dooijes, D、van Beest, M.、van Es, J.、Loureiro, J.、Ypma, A.、Hursh, D.、Jones, T.、およびBejsovec, A.(1997年) Cell 88、789〜799頁
【非特許文献３５】KohlerおよびMilstein(1975年) Nature 256、495〜497頁
【非特許文献３６】Kozborら、(1983年) Immunology Today 4、72頁
【非特許文献３７】Coteら、(1983年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 80、2026〜2030頁
【非特許文献３８】Coleら、(1985年) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁
【非特許文献３９】Morrisonら、(1984年) J. Bacteriol. 159、870頁
【非特許文献４０】Neubergerら、(1984年) Nature 312、604〜608頁
【非特許文献４１】Takedaら、(1985年) Nature 314、452〜454頁
【非特許文献４２】Huseら、(1989年) Science 246、1275〜1281頁
【非特許文献４３】Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989年) Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク
【非特許文献４４】DNA Cloning: A Practical Approach、第I巻およびII巻(D.N. Glover編 1985年)
【非特許文献４５】Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編1984年)
【非特許文献４６】Nucleic Acid Hybridization [B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1985年)]
【非特許文献４７】Transcription And Translation [B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1984年)]
【非特許文献４８】Animal Cell Culture [R.I. Freshney編(1986年)]
【非特許文献４９】Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press、(1986年)]
【非特許文献５０】B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984年)
【非特許文献５１】F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(1994年)
【非特許文献５２】BenoistおよびChambon(1981年) Nature、290、304〜310頁
【非特許文献５３】Yamamotoら、(1980年) Cell 22、787〜797頁
【非特許文献５４】Wagnerら、(1981年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78、1441〜1445頁
【非特許文献５５】Brinsterら、(1982年) Nature 296、39〜42頁
【非特許文献５６】Villa-Komaroffら、(1978年) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 75、3727〜3731頁
【非特許文献５７】DeBoerら、(1983年) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 80、21〜25頁
【非特許文献５８】「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American(1980年) 242:74〜94頁
【非特許文献５９】Magramら、(1985年) Nature 315、338〜340頁
【非特許文献６０】Kolliasら、(1986年) Cell 46、89〜94頁
【非特許文献６１】Maoucheら、(1991年) Blood 78、2557〜2563頁
【非特許文献６２】Reeckら、(1987年) Cell 50、667頁
【非特許文献６３】Nielsen, P.E.、Egholm, M.、Berg, R.H.、およびBuchardt, O.(1991年) Science 254、1497〜1500頁
【非特許文献６４】Felgnerら、(1987年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84、7413〜7417頁
【非特許文献６５】FelgnerおよびRingold(1989年) Science 337、387〜388頁
【非特許文献６６】Mackeyら、(1988年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85、8027〜8031頁
【非特許文献６７】Ulmerら、(1993年) Science 259、1745〜1748頁
【非特許文献６８】Wuら、(1992年) J. Biol. Chem. 267、963〜967頁
【非特許文献６９】WuおよびWu(1988年) J. Biol. Chem. 263、14621〜14624頁
【非特許文献７０】Williamsら、(1991年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88、2726〜2730頁
【非特許文献７１】Curielら、(1992年) Hum. Gene Ther. 3、147〜154頁
【非特許文献７２】WuおよびWu(1987年) J. Biol. Chem. 262、4429〜4432頁
【非特許文献７３】Mirら、(1998年) C.P. Acad. Sci. 321、893頁
【非特許文献７４】米国薬局方
【非特許文献７５】E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」
【非特許文献７６】医薬品の製造管理および品質管理に関する基準(GMP)
【非特許文献７７】Hudziak, R. M.、Lewis, G. D.、Winget, M.、Fendly, B. M.、Shepard, H. M.、およびUllrich, A.(1989年) Mol Cell Biol 9、1165〜1172頁
【非特許文献７８】Myers, C.、Cooper, M.、Stein, C.、LaRocca, R.、Walther, M. M.、Weiss, G.、Choyke, P.、Dawson, N.、Steinberg, S.、Uhrich, M. M.ら、(1992年) J Clin Oncol 10、881〜889頁
【非特許文献７９】Slamon, D. J., Leyland-Jones、B., Shak, S.、Fuchs, H.、Paton, V.、Bajamonde, A.、Fleming, T.、Eiermann, W.、Wolter, J.、Pegram, M.ら、(2001年) N Engl J Med 344、783〜792頁
【非特許文献８０】MorgensternおよびLand、(1990年) Nucleic Acids Res.18:3587〜96頁
【非特許文献８１】Hulskenら、(1994年) J. Cell Biol. 127:2061〜2069頁
【非特許文献８２】Sugrueら、(1997年) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 94:9648〜9653頁
【非特許文献８３】Liuら、(2003年) Mol. Cell Biol. 23:5825〜5835頁
【非特許文献８４】StampferおよびBartley(1985年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 82:2394〜2398頁
【非特許文献８５】Sekine, S.、Shibata, T.、Sakamoto, M.、およびHirohashi, S.(2002年) Oncogene 21、5906〜5911頁
【非特許文献８６】Baficoら、(1998年) Oncogene 16:2819〜2825頁
【非特許文献８７】van Noortら、(2002年) J.Biol. Chem. 277:17901〜17905頁
【非特許文献８８】Staalら、(2002年) EMBO Rep. 3:63〜68頁
【非特許文献８９】BienzおよびClevers(2000年) Cell 103:311〜320頁
【非特許文献９０】Morinら、(1997年) Science 275:1787〜1790頁
【非特許文献９１】Pinsonら、(2000年) Nature 407:535〜538頁
【非特許文献９２】Wehrliら、(2000年) Nature 407:527〜530頁
【非特許文献９３】Brummelkampら、(2002年) Science 296:550〜553頁
【非特許文献９４】Blasband, A.、Schryver, B.、およびPapkoff, J.(1992年) Oncogene 7、153〜161頁
【非特許文献９５】Wong, G. T.、Gavin, B. J.、およびMcMahon, A. P.(1994年) Mol Cell Biol 14、6278〜6286頁
【非特許文献９６】Shimizu, H.、Julius, M. A.、Giarre, M.、Zheng, Z.、Brown, A. M.、およびKitajewski, J.(1997年) Cell Growth Differ 8、1349〜1358頁
【非特許文献９７】Orford, K.、Orford, C. C.、およびByers, S. W.(1999年) J Cell Biol 146、855〜868頁
【非特許文献９８】Chen, S.、Guttridge, D.C.、You, Z.、Zhang, Z.、Fribley, A.、Mayo, M. W.、Kitajewski, J.、およびWang, C. Y.(2001年) J Cell Biol 152, 87〜96頁
【非特許文献９９】You, Z.、Saims, D.、Chen, S.、Zhang, Z.、Guttridge, D. C.、Guan, K. L.、MacDougald, O. A.、Brown, A. M.、Evan, G.、Kitajewski, J.、およびWang, C. Y.(2002年) J Cell Biol 157、429〜440頁
【非特許文献１００】Longo, K. A.、Kennell, J. A.、Ochocinska, M. J.、Ross, S. E.、Wright, W. S.、およびMacDougald、O. A.(2002年) J Biol Chem 277、38239〜38244頁
【非特許文献１０１】Macipら、(2003年) Mol. Cell Biol. 23:8576〜8585頁
【非特許文献１０２】Baficoら、(2004年) Cancer Cell 6(5):497〜506頁
【非特許文献１０３】Heら、(1998年) Science 281:1509〜1512頁
【非特許文献１０４】Filaliら、(2002年) J. Biol. Chem. 277:33398〜33410頁
【非特許文献１０５】Rockmanら、(2001年) J. Biol. Chem. 276:45113〜45119頁
【非特許文献１０６】TetsuおよびMcCormick(1999年) Nature 398、422〜426頁
【非特許文献１０７】Shtutmanら、(1999年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96、5522〜5527頁
【非特許文献１０８】Yuら、(2001年) Nature 411:1017〜1021頁
【非特許文献１０９】Rowlandsら、(2003年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100:11400〜11405頁
【非特許文献１１０】van de Weteringら、(2002年) Cell 111:241〜250頁
【非特許文献１１１】Liら、(2003年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100:15853〜15858頁
【非特許文献１１２】Liuら、(2004年) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 101:4158〜4163頁
【非特許文献１１３】Stinglら、(2001年) Breast Cancer Res. Treat. 67:93〜109頁
【非特許文献１１４】Going(2003年) J. Pathol. 199:1〜3頁
【非特許文献１１５】Pinto, D.、Gregorieff, A.、Begthel, H.およびClevers, H.(2003年) Genes Dev 17、1709〜1713頁
【非特許文献１１６】Kuhnert, F.、Davis, C. R.、Wang, H. T.、Chu, P.、Lee, M.、Yuan, J.、Nusse, R.、およびKuo, C. J.(2004年) Proc Natl Acad Sci U S A 101、266〜271頁
【非特許文献１１７】Suzuki, H.、Gabrielson, E.、Chen, W.、Anbazhagan, R.、van Engeland, M.、Weijenberg, M. P.、Herman, J. G.、およびBaylin, S. B.(2002年) Nat Genet 31、141〜149頁
【非特許文献１１８】Caldwell, G. M.、Jones, C.、Gensberg, K.、Jan, S.、Hardy, R. G.、Byrd, P.、Chughtai, S.、Wallis, Y.、Matthews, G. M.、およびMorton, D. G.(2004年) Cancer Res 64、883〜888頁
【非特許文献１１９】Chan、T.A., Wang, Z.、Dang, L.H.、Vogelstein, B.、およびKinzler, K.W.(2002年) Proc Natl Acad SCi U S A 99: 8265〜8270頁
【非特許文献１２０】Pierceら、(1991年) Oncogene 6:1189〜1194頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌を治療もしくは予防するのに、または公知の癌治療法と組み合わせて使用するのに有用な化学療法剤の開発が、引き続き必要とされている。本発明はこのような必要を満たし、かつ関連する他の利点をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本開示は、Wntシグナル伝達を改変する化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含む、腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、前記化合物が、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む方法を提供する。特定の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、ポリペプチド、アンチセンスRNA、またはsiRNAである。他の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、分泌性Frizzled関連タンパク質やケルベロス(cerberus)などのWntアンタゴニストである。関連した実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、Dickkopf-1(DKK1)のような、ポリペプチドでもその断片でもよいWnt受容体アンタゴニスト、または、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)5もしくはLRP6に特異的なもののようなsiRNAである。本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、アポトーシスを誘導または亢進し得る。特定の実施形態では、この方法は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、非小細胞肺癌、または大腸癌細胞など特定の腫瘍細胞を治療するのに使用される。特定の実施形態では、これらの方法は、化学療法剤または放射線に腫瘍細胞を接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変されたWntシグナル伝達は、複合体を形成していないβ-カテニンレベルを測定することによって検出される。前述した化合物または化合物の組合せのいずれも、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物としてさらに製剤化される。
【０００８】
別の態様では、本開示は、5'-CCGCATGGTGATTGATGAA-3'(配列番号:1)のヌクレオチド配列を有する、単離されたLRP6 siRNAを提供する。特定の実施形態では、LRP siRNAの相補的コピーが発現ベクター中に含まれ、かつ発現制御配列に作動可能に結合している。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、腫瘍細胞における発現を可能にする発現制御配列を有する。
【０００９】
さらに別の態様では、本開示は、Wntシグナル伝達を改変する化合物に腫瘍細胞を接触させるステップを含む、腫瘍を治療に感受性にするための方法であって、前記化合物が、Wntアンタゴニスト、Wnt受容体アンタゴニスト、またはそれらの組合せを含む方法を提供する。特定の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、ポリペプチド、アンチセンスRNA、またはsiRNAである。他の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、分泌性Frizzled関連タンパク質やケルベロスなどのWntアンタゴニストである。関連した実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、Wnt受容体アンタゴニストであるか、あるいは、Dickkopf-1(DKK1)のようなタンパク質、または、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)5もしくはLRP6に特異的なもののようなsiRNAである。本明細書において提供される方法のいくつかの実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、アポトーシスを誘導または亢進し得る。特定の実施形態では、この方法は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、非小細胞肺癌、または大腸癌細胞など特定の腫瘍細胞を治療するのに使用される。特定の実施形態では、これらの方法は、化学療法剤または放射線に腫瘍細胞を接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、改変されたWntシグナル伝達は、複合体を形成していないβ-カテニンレベルを測定することによって検出される。前述した化合物または化合物の組合せのいずれも、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物としてさらに製剤化される。
【００１０】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面を参照すると、明らかになると考えられる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に説明する様々な参考文献が本明細書において示され、したがって、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、腫瘍細胞の増殖を抑制するための手法、および特に、自己分泌Wnt古典的シグナル伝達経路が活性である腫瘍細胞を治療するための手法を提供する。特に、腫瘍細胞増殖を抑制し、腫瘍原性(tumorgenicity)を抑制し、腫瘍細胞をアポトーシスに対して感受性にし、かつ放射線療法または化学療法の抗腫瘍活性を向上させるか、もしくはそれらの抗腫瘍活性に対して腫瘍細胞を感受性にするためにWntシグナル伝達を改変するための組成物および方法が提供される。より具体的には、WntアンタゴニストおよびWnt受容体アンタゴニストが提供される。したがって、本発明は、有利には、(卵巣癌や乳癌などの)過剰増殖性疾患に罹患している哺乳動物を治療するための方法を提供し、その際、過剰増殖性疾患の細胞は、活性なWntシグナル伝達を有する。
【００１２】
背景として、理論に拘泥するものではないが、frizzled(Fz)受容体は、細胞内部にシグナルを中継するためのWntシグナル伝達カスケードにおいて必要とされている(Wang, Y.、Macke, J.P.、Abella, B.S.、Andreasson, P.W.、Gilbert, D.J.、Copeland, N.G.、Jenkins, N.A.、およびNathans, J.(1996年) J. Biol. Chem. 271、4468〜4476頁)。frizzled受容体は、7回膜貫通ドメインおよびシステインリッチドメイン(CRD)を有し、Wnt結合およびシグナル伝達に関与している(Bhanot, P.、Brink, M.、Samos, C.H.、Hsieh, J.C.、Wang, Y.、Macke, J.P.、Andrew, D.、Nathans, J. 、およびNusse, R.(1996年) Nature 382、225〜230頁)。実際には、Wntはヘテロ受容体複合体を有し、その中で、LRP5/6(低密度リポタンパク質、LDL受容体関連タンパク質5および6)が補助受容体の役割を果たしている(Tamai, K.、Semenov, M.、Kato, Y.、Spokony, R.、Liu, C.、Katsuyama, Y.、Hess, F.、Saint-Jeannet, J.P.、およびHe, X.(2000年) Nature 407、530〜535頁)。Wntシグナル伝達は、同様にCRDドメインを有する分泌性frizzled様タンパク質(sFRP)によって(Rattner, A.、Hsieh, J.C.、Smallwood, P.M.、Gilbert, D.J.、Copeland, N.G.、Jenkins, N.A.、およびNathans, J.(1997年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A.、94、2859〜2863頁)、Dickkopf(Dkk)(Niehrs, C.(1999年) Trends Genet.15、314〜319頁)またはケルベロス(Piccolo, S.、Agius, E.、Leyns, L.、Bhattacharyya, S.、Grunz, H.、Bouwmeester, T.、およびDe Robertis, E.M.(1999年) Nature 397、707〜710頁)によって、阻害され得る。細胞分化において、以下の少なくとも3つの経路がWntシグナル伝達に対して存在する:背腹軸の確立に寄与する古典的Wntまたはdisheveled依存性β-カテニン経路(Willert, K. およびNusse, R.(1998年) Curr. Opin. Genet. Dev. 8、95〜102頁)、細胞極性化に不可欠である、平面内細胞極性経路(Tada, M.およびSmith, J.C.(2000年) Development 127、2227〜2238頁; Wallingford, J.B.、Rowning, B.A.、Vogeli, K.M.、Rothbacher, U.、Fraser, S.E.、およびHarland, R.M.(2000年) Nature 405、81〜85頁)、ならびに、中胚葉における細胞選別挙動を制御する、disheveled非依存性タンパク質キナーゼC経路(Fz/PKC)(Winklbauer, R.、Medina, A.、Swain, R.K.、およびSteinbeisser, H.(2001年) Nature 413、856〜860頁)。
【００１３】
古典的Wnt経路において、シグナル伝達カスケードは、frizzled受容体とWntタンパク質の間の相互作用によって細胞膜で開始される。次いで、シグナルは細胞内部でdisheveled(Dsh)に伝達され(Noordermeer, J.、Klingensmith, J.、Perrimon, N.、およびNusse, R.(1994年) Nature 367、80〜83頁)、Dshは活性化される。この活性化に続いて、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β(GSK-3β)が不活性化されて(Siegfried, E.、Wilder, E.L.、およびPerrimon, N.(1994年) Nature 367、76〜80頁)、細胞質中にβ-カテニンが蓄積する(van Leeuwen, F.、 Samos, C.H.、およびNusse, R.(1994年) Nature 368、342〜344頁)。β-カテニンは核に移行し、TCF(T細胞因子)と共に遺伝子発現を調節する(van de Wetering, M.、Cavallo, R.、Dooijes, D、van Beest, M.、van Es, J.、Loureiro, J.、Ypma, A.、Hursh, D.、Jones, T.、およびBejsovec, A.(1997年) Cell 88、789〜799頁)。
【００１４】
本明細書において列挙する任意の濃度、配列、量、比率、または他の数値範囲は、別段の定めが無い限り、その範囲内の任意の整数およびある整数の10分の1や100分の1などその分数を含むと理解されるべきである。上記および本明細書の別の場所で使用する「a」や「an」などの不定用語は、列挙された構成要素の「1つまたは複数」を指すこと、ならびに、「or」のような選択肢の使用は、各要素を個別に、集合的に、もしくは任意の組合せで指すことが理解されるべきである。本明細書において使用される場合、「約」という用語は、示された値の±15%を意味する。
【００１５】
本発明は、Wntタンパク質またはWnt受容体に拮抗するポリペプチドまたはペプチドの使用、Wntタンパク質またはWnt受容体に拮抗するポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸配列の使用、およびWntタンパク質またはWnt受容体の発現に影響を及ぼすRNA干渉(siRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を含む、Wntシグナル伝達を改変するための様々な戦略を提供する。特定の態様では、これらの手法のうちのいずれかを単独で、その任意の組合せで、または他の治療物質(例えば、アポトーシスの誘導物質)と組み合わせて、治療的に使用することができる。ポリペプチドまたはペプチドに基づく手法は、Wntタンパク質もしくはWnt受容体のポリペプチドもしくはペプチドアンタゴニストを送達するステップ、または抗Wntタンパク質抗体もしくは抗Wnt受容体抗体の細胞への送達を含み、それぞれWntシグナル伝達を改変し得る。ベクターに基づく手法は、Wntタンパク質もしくはWnt受容体のアンタゴニスト、Wntタンパク質抗体もしくは抗Wnt受容体抗体の抗アンタゴニスト、またはWntタンパク質もしくはWnt受容体のsiRNAもしくはアンチセンス核酸配列など、Wntシグナル伝達を改変する化合物をコードしている遺伝子を含むベクターを送達するステップを含む。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「Wntシグナル伝達を改変する化合物」という語句は、Wntシグナル伝達に拮抗する任意のポリペプチドまたはペプチドおよびその断片または誘導体を意味する。このような化合物は、Wntタンパク質と直接結合することができても、Wnt受容体または他の関連したタンパク質もしくは分子を介してWntタンパク質と間接的に結合することができてもよい。特定の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、(例えば、FRPのCRDを含むペプチド断片のような)その機能的な断片および誘導体もしくは類似体を含めて、FRPやDKK1などのWntアンタゴニスト、またはWntアンタゴニストの過剰発現を含む。他の実施形態では、Wntシグナル伝達を改変する化合物は、例えば、Wnt受容体へのWntタンパク質の結合を競合的に阻害するWntタンパク質ドメインを含む。さらに別の実施形態では、frizzled、LRP5、またはLRP6など1種または複数種のWnt受容体に特異的なsiRNAが提供される。
【００１７】
「Wntシグナル伝達の改変」(およびその文法的変形のすべて)は、β-カテニンによって媒介されるWnt依存性の転写の阻害を含む。特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の改変は、Wntタンパク質のWnt受容体との結合の阻害、およびWnt依存性転写の阻害、(未処置の腫瘍細胞に比べた)腫瘍細胞増殖の抑制、自発的または誘導性アポトーシスの亢進、UV照射や化学療法薬による治療などの治療法に対する腫瘍細胞の感受性の上昇(特にヒト卵巣癌細胞、乳癌細胞、および非小細胞肺癌細胞)などを含む。特定の実施形態では、Wntシグナル伝達の阻害により、腫瘍細胞の増殖が抑制され、この方法は、Id2、サイクリンD1、およびMycなどのWnt依存性遺伝子の転写活性を抑制するステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、Wnt活性の抑制は、腫瘍細胞を、化学療法薬もしくは放射線を用いた治療またはアポトーシスに感受性にするステップを含み、この方法は、Wnt依存性遺伝子の転写活性を抑制するステップもさらに含む。本明細書において使用される場合、「感受性化」または「腫瘍細胞を感受性にする」とは、例えば、化学療法、放射線による治療、または、自発的(基本的な)アポトーシスもしくは誘導されたアポトーシスを含めて、プログラム細胞死(アポトーシス)経路に移行することに対する細胞の敏感性を増大させることを意味する。特定の実施形態では、新生物治療またはアポトーシスに感受性にされた腫瘍細胞は、このような治療またはシグナルに耐性である。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「腫瘍」という用語は、制御不可能に増殖し(すなわち、過剰増殖性疾患である)、かつ活性なWntシグナル伝達を有する形質転換細胞を含む悪性組織を意味する。腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、プラズマ細胞腫など、および固形腫瘍が含まれ得る。本発明に従って治療することができる固形腫瘍の例には、以下のような肉腫および癌腫が含まれる:黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、頭頸部癌、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【００１９】
Wntタンパク質、Wnt受容体、またはそれらの断片、類似体、もしくは誘導体を対象とするモノクローナル抗体を使用し得る。このような抗体を得る方法には、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技術((1975年) Nature 256、495〜497頁)、ならびにトリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、(1983年) Immunology Today 4、72頁; Coteら、(1983年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 80、2026〜2030頁)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら、(1985年) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁)が含まれる。本発明のさらなる実施形態では、無菌動物においてモノクローナル抗体を作製することができる。(PCT公報WO 89/12690)。実際には、本発明に従って、WntポリペプチドまたはWnt受容体ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子に由来する遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子に由来する遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術(Morrisonら、(1984年) J. Bacteriol. 159、870頁; Neubergerら、(1984年) Nature 312、604〜608頁;およびTakedaら、(1985年) Nature 314、452〜454頁)を使用することができる。このような抗体は、本発明の範囲内である。ヒト抗体またはヒト化抗体は、それら自体による免疫応答、特にアレルギー応答を誘発する可能性が異種抗体よりずっと低いため、このようなヒト抗体またはヒト化キメラ抗体は、(本明細書において説明する)ヒトの疾患または障害の治療法において使用するのに好ましい。
【００２０】
本開示によれば、単鎖抗体の作製に関して説明された技術(Hustonの米国特許第5476786号および5132405号;米国特許第4946778号)を、WntポリペプチドまたはWnt受容体に特異的な単鎖抗体を作製するために適合させることができる。実際、in vivo発現のためにこれらの遺伝子を送達することができる。本発明のさらなる実施形態では、Fab発現ライブラリーの構築に関して説明された技術(Huseら、(1989年) Science 246、1275〜1281頁)を利用して、WntもしくはWnt受容体ポリペプチド、またはその誘導体もしくは類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定を可能にする。(大半の細胞内抗体技術の基礎である)単鎖抗体、特に、ペプチド移行配列を発現するように人工的に設計されたものが好ましい。
【００２１】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は、公知の技術によって作製することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、それだけには限らないが、以下のものが挙げられる:抗体分子のペプシン消化によって作製することができるF(ab')2断片;F(ab')2断片のジスルフィド架橋を減少させることによって作製することができるFab'断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製することができるFab断片。
【００２２】
本発明によれば、当技術分野の技術や知識の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術が使用され得る。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(1989年) Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(本明細書においては「Sambrookら、1989年」); DNA Cloning: A Practical Approach、第I巻およびII巻(D.N. Glover編 1985年); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編1984年); Nucleic Acid Hybridization [B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1985年)]; Transcription And Translation [B.D. HamesおよびS.J. Higgins編(1984年)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney編(1986年)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press、(1986年)]; B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984年); F.M. Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.(1994年)を参照されたい。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、DNAやRNAなどの核酸中の一続きのヌクレオチド塩基(「ヌクレオチド」とも呼ばれる)であり、2つ以上のヌクレオチドからなる任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を作る細胞機構によって使用される情報を含めて、遺伝的情報を保有している。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムDNAおよびcDNA、RNA、任意の合成ポリヌクレオチドおよび遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドの双方(ただし、本明細書においてはセンス鎖のみを示す)を含む。これは、一本鎖および二本鎖の分子、すなわち、DNA-DNA、DNA-RNA、およびRNA-RNAハイブリッド、ならびにアミノ酸主鎖に塩基を結合させることによって形成される「タンパク質核酸」(PNA)を含む。これはまた、修飾された塩基、例えば、チオウラシル、チオグアニン、およびフルオロウラシルを含む核酸も含む。
【００２４】
本明細書における核酸は、天然の調節(発現制御)配列に隣接していてもよく、または、プロモーター、配列内リボソーム進入部位および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、5'-および3'非コード領域などを含めて、異種配列と結合していてもよい。これらの核酸はまた、当技術分野において公知の多くの手段によって改変してもよい。このような改変の非限定的な例としては、メチル化、「キャップ」、類似体による、天然のヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ならびに、例えば、無電荷結合を有するもの(例えば、メチルホスホナート、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど)、および電荷結合を有するもの(例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど)などのヌクレオチド間改変が挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リシンなど)、インターカレーター(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など)、およびアルキル化剤など1種または複数種の付加的な共有結合された部分を含み得る。これらのポリヌクレオチドは、メチルもしくはエチルリン酸トリエステルまたはアルキルホスホロアミダート結合の形成によって誘導体化され得る。さらに、本明細書におけるポリヌクレオチドはまた、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾してもよい。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光性分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００２５】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、細胞中でRNAポリメラーゼを結合し、かつ下流の(3'方向)コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明を明確にするために、プロモーター配列は、その3'末端に転写開始部位が結合しており、かつ、上流(5'方向)に伸びて、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内部には、転写開始部位(簡便のため定義する)、ならびにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が存在すると考えられる。プロモーターは、エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含めて、他の発現制御配列と作動可能に結合され得る。
【００２６】
遺伝子発現を制御するのに使用され得るプロモーターとしては、それだけには限らないが、ポリオーマウイルスに由来する伸長因子プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(米国特許第5385839号および第5168062号)、SV40初期プロモーター領域(BenoistおよびChambon(1981年) Nature、290、304〜310頁)、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamotoら、(1980年) Cell 22、787〜797頁)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター (Wagnerら、(1981年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78、1441〜1445頁)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら、(1982年) Nature 296、39〜42頁);β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Komaroffら、(1978年) Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 75、3727〜3731頁)やtacプロモーター(DeBoerら、(1983年) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 80、21〜25頁)などの原核生物発現ベクター;「Useful proteins from recombinant bacteria」、Scientific American(1980年) 242:74〜94頁も参照されたい;Gal 4プロモーターのような酵母またはその他の菌類に由来するプロモーターエレメント、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター;および造血組織特異性を示す転写制御領域、特に、骨髄細胞において活性であるβ-グロビン遺伝子制御領域(Magramら、(1985年) Nature 315、338〜340頁; Kolliasら、(1986年) Cell 46、89〜94頁)、造血幹細胞分化因子プロモーター、エリスロポエチン受容体プロモーター(Maoucheら、(1991年) Blood 78、2557〜2563頁)などが挙げられる。tet、RU486、ならびにエクジソン(echdysone)誘導系およびtet抑制系などの誘導性/抑制性プロモーター系もまた使用することができる。
【００２７】
「コード配列」、またはRNA、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素などの発現産物を「コードしている」配列は、発現された場合に、そのRNA、ポリペプチド、タンパク質、または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列である。すなわち、このヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素のアミノ酸配列をコードしている。あるタンパク質に対するコード配列は、開始コドン(通常ATG)および停止コドンを含み得る。
【００２８】
「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、1種もしくは複数種のタンパク質もしくは酵素のすべてもしくは一部分を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか、またはそれに対応し、かつ、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列のような調節DNA配列を含んでも含まなくてもよい、DNA配列を意味する。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、DNAからRNAに転写され得るが、アミノ酸配列に翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはDNA転写の調節因子として機能し得る。
【００２９】
RNAポリメラーゼが、コード配列をRNA、特にmRNA(次いで、(イントロンを含む場合には)トランスRNAスプライシングされ、かつそのコード配列によってコードされているタンパク質に翻訳される)に転写する際、コード配列は、細胞中で「制御下」にあるか、または転写および翻訳制御配列に「作動可能もしくは作動的に結合している」。
【００３０】
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という用語は、それを用いてDNAまたはRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞中に導入して、宿主を形質転換し、かつ導入された配列の発現(例えば、転写および翻訳)を促進することができる運搬体を意味する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる;これらを以下により詳細に考察する。
【００３１】
ベクターは、典型的には、外来DNAをその中に挿入する伝達性病原体のDNAを含む。DNAの1つのセグメントをDNAの別のセグメント中に挿入するための一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特異的部位(ヌクレオチドの特異的グループ)でDNAを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を伴う。「カセット」とは、ベクターの所定の制限部位に挿入され得る、DNAコード配列または発現産物をコードできるDNAのセグメントを指す。カセット制限部位は、適切なリーディングフレームにおけるカセットの挿入を確実にするように設計される。通常、外来DNAは、ベクターDNAの1つまたは複数の制限部位に挿入され、次いで、ベクターによって、伝達性ベクターDNAと共に宿主細胞中へ運ばれる。発現ベクターのような、挿入されたDNAまたは追加されたDNAを有するDNAのセグメントまたは配列は、「DNA構築物」と呼ぶこともできる。一般的なタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは一般に、追加の(外来の)DNAを容易に受け取ることができ、かつ適切な宿主細胞中へ容易に導入されることができる、通常は細菌起源の二本鎖DNAの自立型(self-contained)分子である。プラスミドベクターは、コーディングDNAおよびプロモーターDNAをしばしば含み、かつ、外来DNAを挿入するのに適した1つまたは複数の制限部位を有する。コーディングDNAは、特定のタンパク質または酵素に対する特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列である。プロモーターDNAは、コーディングDNAの発現を開始、調節、またはそうでなければ媒介もしくは制御するDNA配列である。プロモーターDNAおよびコーディングDNAは、同じ遺伝子に由来しても、異なる遺伝子に由来してもよく、かつ、同じ生物に由来しても異なる生物に由来してもよい。プラスミドおよび菌類ベクターを含めて、多数のベクターが、様々な真核生物宿主および原核生物宿主における複製および/または発現に関して説明されている。非限定的な例としては、pKKプラスミド(Clonetech社)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen, Inc.社、マディソン、ウィスコンシン州)、pRSETプラスミドもしくはpREPプラスミド(Invitrogen社、サンディエゴ、カリフォルニア州)、pQEプラスミド(Qiagen社、チャッツワース、カリフォルニア州)、またはpMALプラスミド(New England Biolabs社、ビバリー、マサチューセッツ州)、および、本明細書において開示もしくは引用するか、またはそうでなければ当業者には公知の方法を使用する、多くの適切な宿主細胞が挙げられる。組換型クローニングベクターは、クローニングまたは発現のための1つもしくは複数の複製系、宿主における選択のための1つもしくは複数の選択マーカー、例えば抗生物質耐性、1つもしくは複数のタグもしくは融合配列(6×ヒスチジンタグ、HAタグ、もしくはFLAGエピトープなど)、または1つもしくは複数の発現カセットをしばしば含む。
【００３２】
「発現する」および「発現」という用語は、遺伝子またはDNA配列中の情報が顕在化するのを可能にすること、または顕在化を引き起こすこと、例えば、対応する遺伝子またはDNA配列の転写および翻訳に関与している細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。DNA配列は、細胞中で、または細胞によって発現されて、タンパク質のような「発現産物」を形成する。発現産物それ自体、例えば、結果として生じるタンパク質が、細胞によって「発現される」と言ってもよい。発現産物は、細胞内、細胞外、または分泌性として特徴付けることができる。「細胞内」という用語は、細胞内部にある何かを意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外側にある何かを意味する。物質が細胞の外側に有意な量で現れる場合、細胞上または細胞内部のどこかから、細胞によって「分泌され」ている。
【００３３】
「トランスフェクション」という用語は、細胞中への外来核酸の導入を意味する。「形質転換」という用語は、導入された遺伝子または配列を宿主細胞が発現して、所望の物質、典型的には、その導入された遺伝子または配列によってコードされているタンパク質または酵素を産生するように、「外来の」(すなわち外因性もしくは細胞外の)遺伝子、DNA、またはRNA配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入された遺伝子または配列は、「クローン化された」または「外来の」遺伝子または配列と呼んでもよく、開始配列、停止配列、プロモーター配列、シグナル配列、分泌配列、もしくは細胞の遺伝的機構によって使用される他の配列などの調節配列または制御配列を含んでもよい。遺伝子または配列は、非機能的配列または公知の機能を持たない配列を含んでもよい。導入されたDNAまたはRNAを受け取り、かつ発現する宿主細胞は「形質転換」されており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるDNAまたはRNAは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含めて、任意の供給源に由来してよい。
【００３４】
「宿主細胞」という用語は、細胞によるある物質の産生、例えば、細胞による、遺伝子、DNAもしくはRNA配列、タンパク質、または酵素の発現のために、任意の方法で選択、改変、形質転換、増殖されるか、または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、以下に説明するように、スクリーニングまたは他のアッセイ法のためにさらに使用することもできる。
【００３５】
「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来DNAによってコードされているタンパク質を発現するための、適切な条件下の宿主細胞および適合性のあるベクターを意味する。一般的な発現系としては、大腸菌(E.coli)宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。特定の実施形態では、対象のタンパク質はCOS-1またはC2C12細胞において発現される。他の適切な細胞としては、CHO細胞、HeLa細胞、293T(ヒト腎臓細胞)、マウス初代筋芽細胞、およびNIH3T3細胞が挙げられる。
【００３６】
「異種」という用語は、非天然の要素の組合せを意味する。例えば、異種DNAとは、細胞の細胞中、または染色体部位中に天然には位置していないDNAを指す。好ましくは、異種DNAは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、自然界で作動的に結合している遺伝子とは異なる遺伝子に作動的に結合しているようなエレメントである。本発明において、対象のタンパク質をコードしている遺伝子は、クローニングまたは発現のためにそれが挿入されるベクターDNAに対して異種であり、かつ、それが発現される場である、そのようなベクターを含む宿主細胞、例えばCHO細胞に対して異種である。
【００３７】
「変異体(mutant)」および「変異」という用語は、遺伝物質、例えばDNAの任意の検出可能な変化、またはそのような変化の任意のプロセス、機序、もしくは結果を意味する。これには、遺伝子の構造(例えばDNA配列)が改変される遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはDNA、および変更された遺伝子またはDNA配列によって発現される任意の発現産物(例えば、タンパク質もしくは酵素)が含まれる。「変種(variant)」という用語もまた、変更または改変された遺伝子、DNA配列、酵素、細胞など、すなわち任意の種類の変異体を示すために使用され得る。
【００３８】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存的変種」は、所与のコドン位置における1つまたは複数のヌクレオチドの変化によって、その位置でコードされているアミノ酸の変更がもたらされないものである。
【００３９】
「機能保存的変種」は、あるアミノ酸を同様の諸特性(例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など)を有するもので置換することを含めて、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全般的な立体配置および機能を改変することなく変更されているものである。同様の諸特性を有するアミノ酸は、当技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンは、親水性塩基性アミノ酸であり、互いに交換できる。同様に、イソロイシンは疎水性アミノ酸であり、ロイシン、メチオニン、またはバリンで置き換えられ得る。このような変化は、そのタンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量もしくは等電点にほとんど影響を与えないか、またはまったく影響を与えないと予想される。タンパク質または酵素中の、保存されているとして示されるもの以外のアミノ酸は、異なってよく、したがって、同様の機能を有する任意の2種のタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列類似性のパーセントは変動し得、例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づいているCluster Methodによるもののようなアライメントスキームに従って決定されるように、70%〜99%であり得る。「機能保存的変種」には、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって決定されるように、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、かつ、比較される対象の天然もしくは親のタンパク質もしくは酵素と同じもしくは実質的に同様の諸特性もしくは機能を有する、ポリペプチドまたは酵素も含まれる。
【００４０】
本明細書において使用される場合、すべての文法的形態およびスペルの変形の「同種」という用語は、スーパーファミリー(例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー)に由来するタンパク質および異なる種に由来する同種のタンパク質(例えば、ミオシン軽鎖など)を含めて、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係を指す(Reeckら、(1987年) Cell 50、667頁)。このようなタンパク質(およびそれらをコードしている遺伝子)は、類似率の見地からであれ、保存されている位置の特定の残基またはモチーフの存在の見地からであれ、それらの配列類似性によって示されるように、配列相同性を有する。
【００４１】
したがって、すべての文法的形態の「配列類似性」という用語は、共通の進化的起源を共有することもあれば共有しないこともあるタンパク質の核酸またはアミノ酸配列間の同一性または一致の程度を指す(Reeckら、(1987年) Cell 50、667頁を参照されたい)。しかし、一般的な用法および本出願においては、「高度に」のような副詞で修飾された場合、「同種」という用語は、配列類似性を指すことができ、かつ共通の進化的起源に関係してもしなくてもよい。
【００４２】
特定の実施形態では、2つのDNA配列は、BLAST、FASTA、DNA Striderなどの配列比較アルゴリズムによって決定した際に、少なくとも約80%、および最も好ましくは少なくとも約90%または95%のヌクレオチドが、所定の長さのDNA配列に渡って一致している場合、「実質的に同種」または「実質的に類似」である。このような配列の例は、本発明の特定の遺伝子の対立遺伝子または変種である。実質的に同種である配列は、配列データバンクで利用可能な標準ソフトウェアを用いて、または、例えば、その個々の系に対して定められるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、それらの配列を比較することによって同定することができる。
【００４３】
同様に、ある特定の実施形態では、2つのアミノ酸配列は、アミノ酸の80%超が同一である場合、または約90%超が類似(機能的に同一)である場合、「実質的に同種」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または同種の配列は、例えば、GCG(Genetics Computer Group、GCGパッケージ、バージョン7用のプログラムマニュアル、マディソン、ウィスコンシン州)パイルアッププログラム、または上述のプログラム(BLAST、FASTAなど)のうちのいずれかを使用するアライメントによって同定される。
【００４４】
核酸分子の一本鎖型が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールすることができる場合、核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である(Sambrookら、前掲を参照されたい)。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。同種の核酸の予備スクリーニングのために、Tm(融点)55℃に対応する、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用することができる(例えば、5×SSC、0.1%SDS、0.25%乳、ホルムアミド無し;または30%ホルムアミド、5×SSC、0.5%SDS)。適度なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いTmに相当し、例えば、5×SCCまたは6×SCCを含む40%ホルムアミドである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いTmに相当し、例えば、50%ホルムアミド、5×SCCまたは6×SCCである。SCCは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸Naである。ハイブリダイゼーションは、2つの核酸が相補的な配列を含むことを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズするのに適するストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変動要素である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、そのような配列を有する核酸のハイブリッド用のTmの値はより大きい。核酸ハイブリダイゼーションの(より高いTmに対応する)相対的安定性は、以下の順序で減少する:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。長さが100超のヌクレオチドのハイブリッドに関しては、Tmを算出するための式が導かれた(Sambrookら、前掲、9.50〜9.51を参照されたい)。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置はより重要となり、かつ、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する(Sambrookら、前掲、11.7〜11.8を参照されたい)。ハイブリダイズ可能な核酸の最低限の長さは、少なくとも約10ヌクレオチド;好ましくは少なくとも約15ヌクレオ
チドであり;およびより好ましくは、長さは少なくとも約20ヌクレオチドである。
【００４５】
特定の実施形態では、「標準のハイブリダイゼーション条件」という用語は、55℃のTmを指し、かつ上述の条件を利用する。好ましい実施形態では、Tmは60℃であり;より好ましい実施形態では、Tmは65℃である。特定の実施形態では、「高ストリンジェンシー」とは、68℃で0.2×SSC中、42℃で50%ホルムアミド、4×SSC中の条件、またはこれら2種の条件のいずれかのもとで観察されるレベルと同等のハイブリダイゼーションレベルを与える条件下での、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄を指す。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、通常、少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、およびより好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、好ましくは100個以下のヌクレオチドからなり、対象の遺伝子、mRNA、cDNA、もしくは他の核酸をコードしているゲノムDNA分子、cDNA分子、またはmRNA分子にハイブリダイズ可能である核酸を意味する。オリゴヌクレオチドは、例えば、32P-ヌクレオチド、またはビオチンのような標識を共有結合されたヌクレオチドを用いて標識することができる。一実施形態では、標識オリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド(うち一方または両方が標識され得る)をPCRプライマーとして使用して、その遺伝子の完全長または断片をクローニングするか、またはタンパク質をコードしている核酸の存在を検出することができる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、DNA分子と三重らせんを形成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドは、合成的に、好ましくは核酸合成機で調製される。したがって、オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合などのような非天然のリン酸エステル類似結合を用いて調製することができる。
【００４７】
本発明は、本発明の目的タンパク質の発現を阻害するのに使用され得るアンチセンス核酸(リボザイムを含む)を提供する。「アンチセンス核酸」は、RNAまたはDNA分子中の相補的塩基と細胞質内の条件下でハイブリダイズした際に、後者の役割を阻害する、一本鎖核酸分子である。RNAがメッセンジャーRNA転写物である場合、アンチセンス核酸は、逆方向転写物(countertranscript)またはmRNAに干渉する相補的核酸である。本明細書において使用される場合、「アンチセンス」は、RNA-RNA相互作用、RNA-DNA相互作用、リボザイム、およびRNase-Hの媒介による停止を広く含む。アンチセンス核酸分子は、細胞中での発現用の組換え遺伝子によってコードすることができ(例えば、米国特許第5814500号;米国特許第5811234号)、あるいは、合成的にこれらを調製することもできる(例えば、米国特許第5780607号)。
【００４８】
本発明向けに想定される合成オリゴヌクレオチドの具体的な非限定的例としては、ホスホロチオアート、リン酸トリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖へテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。(リン酸ジエステルがO-PO2-O-CH2である場合)、CH2-NH-O-CH2、CH2-N(CH3)-O-CH2、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2、およびO-N(CH3)-CH2-CH2主鎖を有するものが最も好ましい。米国特許第5677437号では、ヘテロ芳香族オリゴヌクレオシド結合を説明している。窒素リンカーまたは窒素を含む基もまた、オリゴヌクレオチド模倣物を調製するために使用することができる(米国特許第5792844号および第5783682号)。米国特許第5637684号では、ホスホロアミダートおよびホスホロチオアミダートオリゴマー化合物を説明している。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドもまた、想定される(米国特許第5034506号)。ペプチド-核酸(PNA)主鎖のような他の実施形態では、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖は、ポリアミド主鎖で置き換えられてよく、塩基は、ポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接的にまたは間接的に結合されている(Nielsen, P.E.、Egholm, M.、Berg, R.H.、およびBuchardt, O.(1991年) Science 254、1497〜1500頁)。他の合成オリゴヌクレオチドは、2'位に以下のもののうちの1つを含む置換された糖部分を含み得る:OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2、もしくはO(CH2)CH3(nは1〜約10である);C1〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル;CI;Br;CN;CF3;OCF3;O-;S-、またはN-アルキル;O-、S-、またはN-アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;ヘテロシクロアルキル;ヘテロシクロアルカリル;アミノアルキルアミノ;ポリアルキルアミノ;置換シリル;フルオレセイン部分;RNA切断基;レポーター基;インターカレーター;オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基;またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルや他の炭素環などの糖ミメティックを有してもよい。イノシンのような、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、およびウリジン以外のヌクレオシドを有するヌクレオチド単位が、オリゴヌクレオチド分子において使用され得る。
【００４９】
in vitro、in vivo、およびex vivoで好ましいベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および望ましい細胞向性を有する他の組換えウイルスなどのウイルスベクターである。したがって、機能的タンパク質もしくは変異タンパク質またはそのポリペプチドドメイン断片をコードする遺伝子を、ウイルスベクターを用いて、またはDNAの直接導入によって、in vitro、in vivo、またはex vivoで導入することができる。標的とされた組織における発現は、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドを用いて、もしくは組織特異的プロモーターを用いることによって、またはその両方によってなど、特定の細胞にトランスジェニックベクターを標的化することによって実施することができる。標的化された遺伝子送達は、PCT公報WO 95/28494において説明されている。
【００５０】
決してそれだけには限らないが、Avigen社(アラメダ、カリフォルニア州;AAVベクター)、Cell Genesys社(フォスター市、カリフォルニア州;レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびレンチウイルスベクター)、Clontech社(レトロウイルスベクターおよびバキュロウイルスベクター)、Genova社(シャロンヒル、ペンシルバニア州;アデノウイルスベクターおよびAAVベクター)、Genvec社(アデノウイルスベクター)、Intro Gene社(レイデン、オランダ;アデノウイルスベクター)、Molecular Medicine社(レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、およびヘルペスウイルスベクター)、Norgen社(アデノウイルスベクター)、Oxford BioMedica社(オックスフォード、イギリス;レンチウイルスベクター)、ならびにTransgene社(ストラスブール、フランス;アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクター)を含めて、様々な会社が、商業的にウイルスベクターを製造している。
【００５１】
別の実施形態では、ベクターは非ウイルス性であり得る。このようなベクターは、「裸」DNAおよびトランスフェクション促進剤(ペプチド、ポリマーなど)を含む。合成カチオン性脂質は、コード遺伝子のトランスフェクション用のリポソームを調製するために使用することができる(Felgnerら、(1987年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 84、7413〜7417頁; FelgnerおよびRingold(1989年) Science 337、387〜388頁; Mackeyら、(1988年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85、8027〜8031頁; Ulmerら、(1993年) Science 259、1745〜1748頁を参照されたい)。核酸の導入に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公報WO 95/18863およびWO 96/17823、ならびに米国特許第5459127号において説明されている。脂質は、ターゲティングのために別の分子と化学的に結合させてよい(Mackeyら、(1988年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85、8027〜8031頁を参照されたい)。標的とされるペプチド、例えば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合され得る。陽イオン性オリゴペプチド(例えば、国際特許公報WO 95/21931)、DNA結合タンパク質に由来するペプチド(例えば、国際特許公報WO 96/25508)、または陽イオン性ポリマー(例えば、国際特許公報WO 95/21931)など他の分子もまた、in vivoでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。
【００５２】
裸DNAプラスミドとしてベクターを導入することも可能である。遺伝子療法用の裸DNAベクターは、当技術分野において公知の方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降、遺伝子銃の使用、またはDNAベクター輸送体の使用によって、所望の宿主細胞中に導入することができる(例えば、Wuら、(1992年) J. Biol. Chem. 267、963〜967頁; WuおよびWu(1988年) J. Biol. Chem. 263、14621〜14624頁; Hartmutら、1990年3月15日に出願されたカナダ特許出願第2012311号;ならびにWilliamsら、(1991年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88、2726〜2730頁を参照されたい)。受容体を介したDNA送達手法もまた、使用することができる(Curielら、(1992年) Hum. Gene Ther. 3、147〜154頁;ならびにWuおよびWu(1987年) J. Biol. Chem. 262、4429〜4432頁)。米国特許第5580859号および第5589466号では、トランスフェクション促進剤を用いない、哺乳動物における外因性DNA配列の送達を開示している。最近、エレクトロトランスファーと呼ばれる、比較的低電圧で高効率のin vivoのDNA導入技術が説明された(Mirら、(1998年) C.P. Acad. Sci. 321、893頁; WO 99/01157; WO 99/01158; および WO 99/01175)。
【００５３】
本明細書において説明する、Wntシグナル伝達を改変するポリペプチドまたはペプチド化合物は、患者に投与するための医薬組成物に配合することができる。本明細書において使用される場合、「医薬組成物」は、活性な作用物質、すなわち、ペプチド、融合タンパク質またはベクター、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された際に、生理学的に容認することができ、かつ、急性胃蠕動やめまいなどのアレルギー性または類似した有害反応を通常はもたらさない分子単位および組成物を意味する。好ましくは、本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、あるいは、米国薬局方、または動物、より具体的にはヒトで使用するための他の一般的に知られている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、化合物がそれと共に投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような薬剤用担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、植物、または合成由来のものを含めて、水や油など滅菌した液体でよい。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水溶液、ならびに水性デキストロース溶液およびグリセロール溶液が、担体として、特に注射用溶液として使用される。適切な薬剤用担体は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に説明されている。
【００５４】
ヒト治療法の場合、活性な作用物質のそれぞれを含めて、医薬組成物は、食品医薬品局(FDA)によって定められている医薬品の製造管理および品質管理に関する基準(GMP)に従って調製される。品質保証(QA)および品質管理(QC)の基準は、ポリペプチドの場合は純度および機能;ベクターの場合は同質性および機能;ならびにウイルスベクターの場合は複製能を有するウイルスの存在(ウイルスベクターが不完全である場合);ならびに他の標準的な基準について試験することを含むと考えられる。
【００５５】
腫瘍細胞を治療するために、医薬組成物は、腫瘍細胞への活性作用物質の送達を可能にすると考えられる任意の経路によって投与される。特定の実施形態では、投与は非経口であり、例えば、静脈注射によるか、または細動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、および頭蓋内投与など他の経路による。他の実施形態では、WntアンタゴニストやWnt受容体アンタゴニストなどWntシグナル伝達を改変する化合物、またはその組成物の送達は、腫瘍に局所的に送達され、これは、局所的でもよく、または腫瘍塊中への注射によってもよい。
【００５６】
本発明の治療的処置において、内科医は、治療有効量の医薬組成物を投与する。本明細書において使用される場合、「治療有効量」という用語は、宿主の活性、機能、および応答の臨床的に有意な欠陥を、少なくとも約15パーセント、好ましくは少なくとも50パーセント、より好ましくは少なくとも90パーセント減少させ、かつ、最も好ましくはそれを防止するのに十分な量を意味する。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に有意な状態の改善を引き起こすのに十分である。具体的には、治療有効量は以下のうちの1つまたは複数を引き起こすと考えられる:腫瘍細胞のアポトーシス;腫瘍細胞のネクローシス;腫瘍転移の消失または防止;腫瘍増殖速度の低下;腫瘍サイズの減少または腫瘍収縮;腫瘍の消失;癌の寛解;癌の再発までの時間の延長;および患者の生存期間の延長。治療法の頻度および投与量は、標準の用量-応答技術を用いて、通常の内科医が調整することができる。
【００５７】
以下の要約は、以下の実施例において発見された結果を考察しており、本発明の範囲を制限するべきではない。
【００５８】
本開示は、ヒト腫瘍細胞におけるβ-カテニンの構成的上方調節が、Wnt自己分泌シグナル伝達を含む新規な機序によって発生し得ることを示す。この機序は、MMTVプロモーター挿入がWnt発現を発癌的に活性化するマウス乳癌モデルにおいて最初に発見された(Nusse, R.およびVarmus, H.E.(1992年) Cell 69、1073〜1087頁)が、MMTVはヒト細胞に感染せず、かつWnt自己分泌シグナル伝達がヒト細胞中で存在するかどうかが不明であったため、20年を超える期間、一度も追跡調査されなかった。より最近の研究により、ヒト結腸癌および他の様々な腫瘍におけるWntシグナル伝達経路の上方調節をもたらす、Wntシグナル伝達経路の下流構成要素の変異が同定された(Polakis, P.(2000年) Genes Dev 14、1837〜1851頁; Giles, R.H.、van Es, J. H.、およびClevers, H.(2003年) Biochim Biophys Acta 1653、1〜24頁)。本開示は、Wntリガンド発現、および複合体を形成していない非リン酸化β-カテニンの転写活性型のレベルの上昇を示すことが判明していたいくつかのヒト乳房腫瘍細胞株およびヒト卵巣腫瘍細胞株が、驚くべきことに、一般に関係があるとされている下流のシグナル伝達構成要素であるAPCまたはβ-カテニンの検出可能な障害(lesion)を有していなかったことを示す。リガンド/受容体相互作用のレベルでのWntシグナル伝達の2種の例示的なアンタゴニストであるFRP1およびDKK1(Leyns, L.、Bouwmeester, T.、Kim, S. H.、Piccolo, S.、およびDe Robertis, E. M.(1997年) Cell 88、747〜756頁; Wang, S.、Krinks, M.、Lin, K.、Luyten, F. P.、およびMoos, M.、Jr.(1997年) Cell 88, 757〜766頁; Mao, B.、Wu, W.、Li, Y.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Glinka, A.、およびNiehrs, C.(2001年) Nature 411、321〜325頁; Bafico, A.、Liu, G.、Yaniv, A.、Gazit, A.、およびAaronson, S. A.(2001年) Nat Cell Biol 3、683〜686頁; Mao, B.、Wu, W.、Davidson, G.、Marhold,J.、Li, M.、Mechler, B. M.、Delius, H.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Walter, C.ら、(2002年) Nature 417、664〜667頁)は、腫瘍細胞中の複合体を形成していないβ-カテニンの下方調節を引き起こし、かつ、自己分泌Wntループおよび腫瘍の増殖を抑制する方法または腫瘍の感受性化を増大させる方法に強く結び付いていることが、本開示において示された。
【００５９】
別の例示的な実施形態では、Wnt受容体LRP5およびLRP6を対象とするsiRNAを使用して、自己分泌Wntシグナル伝達を改変した。本開示は、LRP6が、卵巣癌細胞におけるWnt自己分泌シグナルの伝達を特異的に担っていたことを教示する。ヒト乳房腫瘍細胞を用いたさらなる機能研究により、Wntアンタゴニストが、Wnt標的遺伝子発現だけでなく、Wntに誘導される公知の生物学的効果も阻害することが明らかにされた。本開示は、WntアンタゴニストであるFRP1および/またはDKK1が、活性化されたβ-カテニンの下方調節を引き起こす能力によって明示されるように、自己分泌Wntシグナル伝達が、分析されたヒト乳癌細胞株およびヒト卵巣癌細胞株の約25%において予想外に同定されて、このような腫瘍のかなりの割合におけるこの機序を示唆したことを示す。これらの研究結果はすべて、自己分泌Wntシグナル伝達が、卵巣癌や乳癌のようなヒト腫瘍の病因学においてある役割を果たし得ることを示す。
【００６０】
代表的なWnt自己分泌腫瘍細胞において、可溶性のDKK1が、Wnt形質転換マウス細胞を用いて観察された効果に類似して、複合体を形成していない上方調節されたβ-カテニンを本質的に検出不可能なレベルまで著しく減少させたことが実証されている。細胞表面のリガンドまたは受容体を成功裡に標的とした癌薬剤の数が増えつつある(Hudziak, R. M.、Lewis, G. D.、Winget, M.、Fendly, B. M.、Shepard, H. M.、およびUllrich, A.(1989年) Mol Cell Biol 9、1165〜1172頁; Myers, C.、Cooper, M.、Stein, C.、LaRocca, R.、Walther, M. M.、Weiss, G.、Choyke, P.、Dawson, N.、Steinberg, S.、Uhrich, M. M.ら、(1992年) J Clin Oncol 10、881〜889頁; Slamon, D. J., Leyland-Jones、B., Shak, S.、Fuchs, H.、Paton, V.、Bajamonde, A.; Fleming, T.、Eiermann, W.、Wolter, J.、Pegram, M.ら、(2001年) N Engl J Med 344、783〜792頁)。したがって、本開示の驚くべき結果は、自己分泌Wntシグナル伝達が、WntアンタゴニストもしくはWnt受容体アンタゴニスト、またはWntおよびそれらの受容体を含む細胞表面の相互作用に干渉することを狙いとした他の様式を用いた治療的介入のための標的とすることができるということである。
【００６１】
本発明は、例証のために提供され、限定のために提供されるのではない以下の実施例を参照することにより、より良く理解されると考えられる。
【００６２】
(実施例)
(実施例1)
DNA構築物
ヒトFRP1(Baficoら、(1999年) J. Biol. Chem. 274:16180〜16187頁)およびDKK1(Baficoら、(2001年) Nat. Cell Biol. 3:683〜686頁) cDNAを、カルボキシ末端HAタグを含む、pBabeに由来するレトロウイルスベクター(MorgensternおよびLand、(1990年) Nucleic Acids Res.18:3587〜96頁)中にサブクローニングし、pCL-amphoパッケージングプラスミド(Imgenex社、ソレントバレイ、カリフォルニア州)と共に293T細胞(ATCC番号CRL-11268)中にコトランスフェクトした。72時間目に培養液を回収し、NIH3T3細胞(ATCC番号CRL-1658)上に添加(titrated)した。Dr. W. Birchmeierによって寛大に提供されたβ-カテニンcDNA(Hulskenら、(1994年) J. Cell Biol. 127:2061〜2069頁)を、本発明者らが以前に報告した系(Sugrueら、(1997年) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 94:9648〜9653頁)を用いて、Tet調節可能なプロモーターの制御下で発現させた。pCMV-LRP6-Flagは、以前に説明されている(Liuら、(2003年) Mol. Cell Biol. 23:5825〜5835頁)。Dr. Matthew Warman(ケース・ウエスタン・リザーブ大学(Case Western Reserve University))によって寛大に提供されたヒトLRP5を、pcDNA3.1(Invitrogen社)中にサブクローニングした。
【００６３】
(実施例2)
細胞培養および遺伝子形質導入
乳房(MDA-MB-157(ATCC番号 HTB-24)、BC3(ATCC番号 CRL-2277)、MCF7(ATCC番号 HTB-22)、MDA-MB-231(ATCC番号 HTB-26)、MDAMB134(ATCC番号 HTB-23)、MDAMB175(ATCC番号 HTB-25)、MDAMB435(ATCC番号 HTB-129)、MDAMB453(ATCC番号 HTB-131)、MDAMB361(ATCC番号 HTB-27)、MDAMB415(ATCC番号 HTB-128)、MDAMB468(ATCC番号 HTB-132))、卵巣(A1847、A2780、PAI、SKOV3(ATCC番号 HTB-77)、OVCAR3(ATCC番号 HTB-161)、44S、53S(ATCC番号 HB-8182)、26S、OV90(ATCC番号 CRL-11732))、および結腸HCT116(ATCC番号 CCL-247)を含めて、ヒト腫瘍細胞株を、10%ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で維持した。不死化させた乳房上皮細胞株であるAB589(StampferおよびBartley(1985年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 82:2394〜2398頁)を、1μMデキサメタゾン(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)を添加した同じ培地中で培養した。相同組換えによって人工的に設計したHCT116対立遺伝子を標的としたクローンは説明されており(Sekine, S.、Shibata, T.、Sakamoto, M.、およびHirohashi, S.(2002年) Oncogene 21、5906〜5911頁)、これらを、2μg/mlピューロマイシン(Calbiochem社、サンディエゴ、カルフォルニア州)を含むDMEM中で維持した。10%子ウシ血清を添加したDMEM培地中でNIH3T3細胞を維持した。レトロウイルスを介した遺伝子形質導入のために、2μg/mlポリブレン(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)を含有する増殖培地中に、60mmプレート当たり5×105個の細胞濃度で培養物を播種した。24時間後、ピューロマイシンまたはジェネテシンマーカーのいずれかを有する対照のベクター、FRP1、またはDKK1に細胞を感染させた。ピューロマイシン(0.5〜2μg/ml)またはジェネテシン(750μg/ml)(Invitrogen社、カールズバッド、カリフォルニア州)を増殖培地に添加することによって、細胞を2週間選択した。一部の場合では、FuGene(登録商標)(Roche社、インディアナポリス、インディアナ州)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、サブコンフルエントな培養物をトランスフェクトした。
【００６４】
(実施例3)
GST-E-カドヘリン結合アッセイおよびイムノブロット解析
以前に説明されているGST-E-カドヘリン結合アッセイ(Baficoら、(1998年) Oncogene 16:2819〜2825頁)を用いて、β-カテニンレベルを評価した。手短に言えば、細菌によって発現させたGST-E-カドヘリンをグルタチオン-セファロースビーズを用いて精製し、かつ各細胞溶解物1mgと共にインキュベートした。ビーズに結合されたGST-E-カドヘリンβ-カテニン複合体を遠心分離によって回収し、かつ、SDS-PAGEとそれに続くイムノブロッティングによって解析した。β-カテニンに対するモノクローナル抗体(Transduction Laboratories社)を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンを検出した。27〜37番残基で脱リン酸されたβ-カテニンに特異的なモノクローナル抗体(Alexis社、ラウフェルフフィンゲン(Laufelfingen)、スイス)を用いて、非リン酸化β-カテニンを検出した。抗HAモノクローナル抗体(Hybridoma Center、マウントサイナイ医科大学(Mount Sinai School of Medicine)、ニューヨーク)を用いて、FRP1-HAおよびDKK1-HAを検出した。
【００６５】
(実施例4)
構成的なWNT経路活性化を有するヒト乳房腫瘍細胞株およびヒト卵巣腫瘍細胞株の同定
ヒト腫瘍における自己分泌Wntシグナル伝達の証拠を探すために、本発明者らは、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルの上昇に関して、ヒト乳房腫瘍細胞株およびヒト卵巣腫瘍細胞株のパネルを最初に調べた。ヒト乳房腫瘍細胞株およびヒト卵巣腫瘍細胞株を実施例2で説明したようにして培養した。以前に説明されているGST-E-カドヘリン結合アッセイ(Baficoら、(1998年) Oncogene 16:2819〜2825頁)を用いて、β-カテニンレベルを評価した(実施例3を参照されたい)。手短に言えば、細菌によって発現させたGST-E-カドヘリンをグルタチオン-セファロースビーズを用いて精製し、かつ各細胞溶解物1mgと共にインキュベートした。ビーズに結合されたGST-E-カドヘリンβ-カテニン複合体を遠心分離によって回収し、かつ、SDS-PAGEとそれに続くイムノブロッティングによって解析した。β-カテニンに対するモノクローナル抗体(Transduction Laboratories社、レキシントン、ケンタッキー州)を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンを検出した。27〜37番残基で脱リン酸されたβ-カテニンに特異的なモノクローナル抗体(Alexis社)を用いて、非リン酸化β-カテニンを検出した。
【００６６】
いくつかのヒト乳房腫瘍細胞株およびヒト卵巣腫瘍細胞株が、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルが上昇しているものとして同定された(図1Aおよび表1)。Wntシグナル伝達を活性化すると、タンパク質の転写活性型に相当する、N末端がリン酸化されていないβ-カテニンのレベルが特異的に上昇する(van Noortら、(2002年) J.Biol. Chem. 277:17901〜17905頁; Staalら、(2002年) EMBO Rep. 3:63〜68頁)。非リン酸化型を特異的に認識する抗体を用いた、複合体を形成していないβ-カテニンプールの解析により、各場合におけるこのプールが、転写活性型を含むことが明らかになった(図1A)。β-カテニンまたはAPC、すなわちこの経路において最も頻繁に改変される癌遺伝子(Polakis(2000年) Genes Dev.14:1837〜1851頁; BienzおよびClevers(2000年) Cell 103:311〜320頁)のいずれかにおける検出可能な発癌性障害は、β-カテニンが上方調節されたこれらの腫瘍株のいずれにおいてもまったく見出されず(データは示さない)、新規な機序が示唆された。
【００６７】
Wnt自己分泌シグナル伝達を結び付けるために、本発明者らは、それぞれに特異的なプライマーを使用するRT-PCRによって、代表的なWntの発現を解析した。トリアゾール(Invitrogen社)を用いて全RNAを抽出し、かつ、Superscript II Reverse Trancriptase(Invitrogen社)を用いて逆転写させた。cDNA反応物100μlのうち10μlを、各Wntに特異的な以下のプライマーを用いた増幅用の鋳型として利用した。ヒトWnt-2の場合、フォワード:5'-TGGCTCCCTCTGCTCTTGACC-3'(配列番号:2)、およびリバース:5'-AGTCAATGTTATCACTGCAGC-3'(配列番号:3);ヒトWnt-3の場合、フォワード:5'-GAAGGCTGGAAGTGGGGCGGCT-3'(配列番号:4)およびリバース:5'-GTCTCCACCCAGCCTCGGGACTCA-3'(配列番号:5);ヒトWnt-3aの場合、フォワード:5'-GGATACTTCTTACTCCTCTGCAG-3'(配列番号:6)およびリバース:5'-AATGGCGTGGACAAAGGCCGACT-3'(配列番号:7)。ヒトWNT遺伝子ファミリー多重遺伝子-12RT-PCRプロファイリングキット(SuperArray社)を利用して、他のWntファミリーのメンバーの発現を解析した。エチジウムブロマイド染色によってRT-PCR産物を可視化した。図1Bは、解析したWntリガンドが様々なパターンの発現を示したこと、および上方調節されたβ-カテニンを含む腫瘍細胞株が、これらのWntのうちの1種または複数種を発現したことを示す。
【００６８】
【表１】
2008520583.tif 000002
【００６９】
検出可能なAPCまたはβ-カテニン変異を伴わないヒト腫瘍細胞株を、本明細書において説明する複合体を形成していないβ-カテニンの発現に関して解析した。同時に解析した様々な株の比較に基づいて、相対的レベルを概算した(図1を参照されたい)。少なくとも3回の独立した実験の結果に基づき、FRPおよび/またはDKKによる阻害を、陽性と記録した(ND=未決定)。本明細書において説明するように、すべての細胞株は、本発明者らまたは公共の供託所のいずれかから入手可能である。
【００７０】
(実施例5)
WNTアンタゴニストは、ヒト腫瘍細胞における自己分泌Wntシグナル伝達を特定する
これらの細胞中に自己分泌シグナル伝達ループが存在する可能性を直接検討するために、本発明者らは、リガンド/受容体相互作用のレベルでWntシグナル伝達を阻害する、FRP1およびDKK1アンタゴニストを活用した(Leyns, L.、Bouwmeester, T.、Kim, S.H.、Piccolo, S.、およびDe Robertis, E. M.(1997年) Cell 88、747〜756頁; Wang, S.、Krinks, M.、Lin, K.、Luyten, F. P.、およびMoos, M., Jr.(1997年) Cell 88、757〜766頁; Bafico, A.、Gazit, A.、Pramila, T.、Finch, P. W.、Yaniv, A.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274、16180〜16187頁; Bafico, A.、Liu, G.、Yaniv, A.、Gazit, A.、およびAaronson, S. A.(2001年) Nat Cell Biol 3、683〜686頁; Mao, B.、Wu, W.、Li, Y.、Hoppe, D.、Stannek, P.、Glinka, A.、およびNiehrs, C.(2001年) Nature 411、321〜325頁; Semenov, M. V.、Tamai, K.、Brott, B. K.、Kuhl, M.、Sokol, S.、およびHe, X.(2001年) Curr Biol 11、951〜961頁)。Tet誘導性プロモーターの制御下でβ-カテニンを発現するNIH3T3細胞を、様々な量のテトラサイクリン(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)の存在下で増殖させた:レーン1および2:1μg/ml;レーン3および4:7.5ng/ml;レーン5および6:5ng/ml(図2Aを参照されたい)。Wnt-3を発現するNIH3T3細胞(レーン7および8)を精製したDKK1(10nM)と共にインキュベートした。前述のNIH3T3細胞を(実施例3で説明した)GST-E-カドヘリン結合アッセイ、続いてSDSPAGE、および抗β-カテニン抗体(Transduction Laboratories社)を用いたイムノブロット解析に供した。
【００７１】
図2Aに示したように、Wnt-3aを安定に発現するNIH3T3細胞にDKK1を添加すると、上方調節されたβ-カテニンレベルが著しく抑制された。一方、同じ阻害物質は、tetで調節可能なプロモーターの制御下で発現された外因性β-カテニンによって誘導される複合体を形成していないβ-カテニンにはまったく影響を示さなかった。したがって、Wnt自己分泌ループがヒト腫瘍細胞において機能的であった場合には、FRP1またはDKK1アンタゴニストは、上方調節されたβ-カテニンレベルの特異的な抑制を引き起こすはずである。
【００７２】
濃度を段階的に上げた精製DKK1にMDAMB157細胞培養物を曝露させ、次いで可溶化し、かつ実施例3で説明したように、イムノブロット解析および抗β-カテニン抗体を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンについて解析した。図2Bに示したように、濃度を段階的に上げた(0.5〜10nM)精製DKK1(Bafico, A.、Liu, G.、Yaniv, A.、Gazit, A.、およびAaronson、S.A.(2001年) Nat Cell Biol 3, 683〜686頁)にMDAMB157乳房腫瘍細胞を曝露させると、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルの用量依存的な著しい低下が起こった(図2B)。
【００７３】
MDAMB157細胞を、ベクターのみ、(実施例1で説明した)FRP1-HAレトロウイルス、または(実施例1で説明した)DKK1-HAレトロウイルスに感染させ、かつマーカー選択した。実施例3で説明したように抗β-カテニン抗体を用いたイムノブロット解析を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンタンパク質レベルを解析した。抗HAモノクローナル抗体(Hybridoma Center、マウントサイナイ医科大学、ニューヨーク)を用いた溶解物のイムノブロット解析によって、FRP1-HAまたはDKK1-HAの発現を評価した。図2Cに例示したように、MDAMB157細胞における、レトロウイルスを介した遺伝子形質導入によるFRP1またはDKK1の安定な発現は、同様に、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの劇的な低下をもたらした。
【００７４】
乳房腫瘍細胞株(MDAMB231、ATCC番号HTB-26)および卵巣A1847腫瘍細胞株を、ベクターのみ、または(実施例1で説明した)FRP1-HAレトロウイルスに感染させ、かつマーカー選択した。卵巣PAI腫瘍細胞株を、ベクターのみ、または(実施例1で説明した)DKK1-HAレトロウイルスに感染させ、かつマーカー選択した。乳房腫瘍細胞株(MDAMB231)および卵巣A1847腫瘍細胞株を、抗β-カテニン抗体(Transduction Laboratories社)または抗HA抗体(Hybridoma Center、マウントサイナイ医科大学、ニューヨーク)のいずれかを用いたイムノブロット解析によって、複合体を形成していないβ-カテニンおよびFRP1-HAに関して解析した。卵巣PAI腫瘍細胞株を、抗β-カテニン抗体(Transduction Laboratories社)または抗HA抗体(Hybridoma Center、マウントサイナイ医科大学、ニューヨーク)のいずれかを用いたイムノブロット解析によって、複合体を形成していないβ-カテニンおよびDKK1に関して解析した。図2Dに示したように、構成的に上方調節されたβ-カテニンの阻害も、MDAMB231,A1847、およびPAIを含むいくつかの他の乳房腫瘍細胞株および卵巣腫瘍細胞株におけるFRP1またはDKK1の発現と共に観察された。
【００７５】
Wntシグナル伝達は、TCF依存性の転写を活性化し、これは、TCF応答エレメントを含むレポーターによってモニターされ得る(Morinら、(1997年) Science 275:1787〜1790頁)。レポーターに作動可能に連結したTCF応答エレメント(TOP-Glow、野生型、またはFOP-Glow、変異体)を、DKK1の存在下または不在下でのPAI腫瘍細胞における転写活性に関して解析した。6ウェルプレート中にウェル当たり3×105個の濃度で播種した卵巣腫瘍PAI細胞を、FuGene(Roche社)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、TOP-glowプラスミドまたはFOP-glowプラスミド(Upstate Biotechnology社、ウォルサム、マサチューセッツ州)いずれか1μgおよびRenilla対照プラスミド(pRL-CMV)0.001μgでコトランスフェクトした。48時間後、細胞を溶解し、かつDual Luciferase Reporter Assayシステム(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)を利用して解析した。図2Eに示したように、DKK1は、代表的な卵巣腫瘍細胞株であるPAIにおける内因性TCFに依存的なシグナル伝達のレベルの著しい低下を引き起こした。これらの研究結果により、TCF依存的転写が、自己分泌Wnt機序によってこれらの腫瘍細胞において構成的に活性化されることがさらに証明された。
【００７６】
表1に要約したように、11種の乳房腫瘍細胞株のうち3種が、上方調節されたβ-カテニンを提示し、これは、各場合においてFRP1および/またはDKK1によって阻害された。8種の卵巣腫瘍細胞株のうち2種が、アンタゴニストに応答して低下する、複合体を形成していないβ-カテニンレベルを示した。高レベルの上方調節されたβ-カテニンが53S腫瘍細胞において検出されたが、阻害物質に対する検出可能な応答は示さず、これは、自己分泌ループ以外の古典的経路中の障害を暗示している。
【００７７】
(実施例6)
構成的なWNT経路活性化を有するヒト乳癌細胞株の同定
さらに、本発明者らは、約20種のさらなるヒト乳癌細胞株を、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルの上昇に関して解析した。複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析は、全細胞溶解物1mgを利用して、実施例3で説明したようにして実施した。β-カテニンに対するモノクローナル抗体(Transduction Laboratories社)をイムノブロッティングのために利用した。本発明者らは、これらの細胞株のうち6種における複合体を形成していないβ-カテニンのレベルの上昇を発見した(図3A、レーン1、3、4、データは示さない)。本発明者らは、HCC38乳癌細胞における自己分泌Wntシグナル伝達のDKK抑制も解析した。培養物を、DKK1を含む順化培地に2時間曝露させ、かつ、イムノブロッティング用のβ-カテニンに対するモノクローナル抗体(Transduction Laboratories社)を用いる、実施例3において説明したような、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析に供した。陽性細胞株のうちいくつかは、DKKに曝露された際に複合体を形成していないβ-カテニンレベルの著しい低下を示した(図3B、データは示さない)。これらの結果は、自己分泌Wntシグナル伝達が、ヒト乳癌のかなりの割合における上方調節されたβ-カテニンに対する新規な機序であるという本発明者らによる研究結果をさらに裏付け、かつ範囲を拡大する。
【００７８】
(実施例7)
構成的なWNT経路活性化を有する非小細胞肺癌細胞株の同定
本発明者らは、Wntシグナル伝達の構成的な上方調節の証拠のために、さらに別のヒト腫瘍型を調査した。非小細胞肺癌(NSCLC)に由来する多くの一連の腫瘍株において、解析した22種の株のうち8種は、複合体を形成していないβ-カテニンのレベル上昇を示した。これらの株のうち1種は、β-カテニン活性化変異を含んだが、他のものは、検出可能な活性化障害を示さなかった(データは示さない)。さらに、本発明者らは、SDS-PAGEおよび抗APCを用いたイムノブロッティング解析によるAPCタンパク質のより速い移動または検出の不足によって決定されるような、APC不活性化変異の証拠を一つも発見しなかった(データは示さない)。本発明者らは、NSCLC癌細胞株における自己分泌Wntシグナル伝達のFRP阻害を解析した。培養物を対照ベクターまたは(実施例1で説明した)FRPレトロウイルスに感染させ、かつマーカーを選択した。実施例3で説明したように、イムノブロッティング用のβ-カテニンに対するモノクローナル抗体を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析を実施した。これらの陽性細胞株の一部をFRPおよび/またはDKKに曝露すると、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルが低下し(図4、データは示さない)、これにより、乳癌および卵巣癌と同様に、かなりの割合のNSCLCが、構成的に活性化された自己分泌Wntシグナル伝達を有するという証拠が与えられた。
【００７９】
(実施例8)
LRP6を対象とするsiRNAによる自己分泌Wntシグナル伝達の阻害
自己分泌Wntシグナル伝達ループの存在を独立に確認するために、本発明者らは、LRP5およびLRP6、すなわち古典的経路に特異的なWnt補助受容体に特異的なsiRNAを作製した(Pinsonら、(2000年) Nature 407:535〜538頁)(Wehrliら、(2000年) Nature 407:527〜530頁)。ヒトLRP5およびLRP6の細胞外ドメインをコードしているRNAに対するsiRNAを293T細胞中で一過性に発現させた。以前に説明されているようにして、pSuper発現ベクター中でsiRNAを構築した(Brummelkampら、(2002年) Science 296:550〜553頁)。LRP6に対する19ヌクレオチドの標的配列は5'-CCGCATGGTGATTGATGAA-3'(配列番号:8)であり、LRP5に対する標的配列は5'-CATGATCGAGTCGTCCAAC-3'(配列番号:9)であった。Fugene(Roche社)を用いて293T細胞またはPAI細胞を一過性にトランスフェクトし、かつ72時間後に解析した。
【００８０】
抗LRP5抗体(Orbigen、サンディエゴ、カリフォルニア州)または(LRP6-FLAGに対する)抗FLAG抗体(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)を使用するイムノブロット解析によって、LRP5およびLRP6タンパク質レベルを解析した。図5Aに示したように、293T細胞中の各LRP受容体の外因性発現が、異種ではなく同種のsiRNAによって特異的に阻害された。Wnt-3a順化培地で処理した293T細胞において同じsiRNAを発現させた際、本発明者らは、LRP6 siRNAは、Wntに誘導される複合体を形成していないβ-カテニンレベルの低下を引き起こすのに対し、LRP5 siRNAは検出可能な影響を示さないことを認めた(図5B、左側のパネル)。これらの結果は、これらの細胞におけるWnt-3aに応答した古典的シグナル伝達が、内因性LRP6を必要とすることを暗示した。同じ条件下で変異β-カテニンを発現する293T細胞中の複合体を形成していないβ-カテニンレベルに対して、いずれのsiRNAも影響を示さなかった(データは示さない)。本発明者らは次に、PAI腫瘍細胞に対するこれら同じsiRNAの影響を試験し、かつ、LRP5 siRNAではなくLRP6 siRNAが、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの著しい抑制を引き起こすことを観察した(図5B、右側のパネル)。これらの結果により、Wntアンタゴニストの使用とは無関係に、構成的Wntシグナル伝達が、これらのヒト腫瘍細胞における自己分泌ループに起因したという強力な証拠が提供され、かつ、LRP6が、関与する特異的なWnt古典的受容体として関係付けられた。
【００８１】
(実施例9)
腫瘍細胞表現型に対するWnt自己分泌シグナル伝達阻害の影響
哺乳動物細胞中の古典的経路を介してシグナルを伝達するWntの外因性発現は、形質転換された表現型に関連した特性の獲得をもたらす(Blasband, A.、Schryver, B.、およびPapkoff, J.(1992年) Oncogene 7、153〜161頁; Wong, G. T.、Gavin, B. J.、およびMcMahon, A. P.(1994年) Mol Cell Biol 14、6278〜6286頁; Shimizu, H.、Julius, M. A.、Giarre, M.、Zheng, Z.、Brown, A. M.、およびKitajewski, J.(1997年) Cell Growth Differ 8、1349〜1358頁; Bafico, A.、Gazit, A.、Wu-Morgan, S. S.、Yaniv, A.、およびAaronson, S. A.(1998年) Oncogene 16、2819〜2825頁; Orford, K.、Orford, C. C.、およびByers, S. W.(1999年) J Cell Biol 146、855〜868頁)。例えば、応答性細胞において形質転換Wntが安定に発現すると、飽和密度の上昇が誘導され、これは、FRP1またはDKK1の安定な同時発現によって特異的に妨害することができる(Bafico, A.、Gazit, A.、Wu-Morgan, S. S.、Yaniv, A.、およびAaronson, S. A.(1998年) Oncogene 16、2819〜2825頁; Fedi, P.、Bafico, A.、Nieto Soria, A.、Burgess, W. H.、Miki, T.、Bottaro, D. P.、Kraus, M. H.、およびAaronson, S. A.(1999年) J Biol Chem 274, 19465〜19472頁)。Wntシグナル伝達がアポトーシスを抑制し得るという証拠もある(Chen, S.、Guttridge, D.C.、You, Z.、Zhang, Z.、Fribley, A.、Mayo, M. W.、Kitajewski, J.、およびWang, C. Y.(2001年) J Cell Biol 152, 87〜96頁; You, Z.、Saims, D.、Chen, S.、Zhang, Z.、Guttridge, D. C.、Guan, K. L.、MacDougald, O. A.、Brown, A. M.、Evan, G.、Kitajewski, J.、およびWang, C. Y.(2002年) J Cell Biol 157、429〜440頁; Longo, K. A.、Kennell, J. A.、Ochocinska, M. J.、Ross, S. E.、Wright, W. S.、およびMacDougald、O. A.(2002年) J Biol Chem 277、38239〜38244頁)。自己分泌Wntシグナル伝達を伴うヒト腫瘍細胞を同定した後、本発明者らは、これらの生物学的諸特性に対するFRP1またはDKK1の影響を分析した。
【００８２】
対照ベクター、FRP1、またはDKK1のいずれかを外因的に発現するMDAMB157細胞を、ウェル当たり1.5×105個の細胞濃度で6ウェルプレートに移した。指定された時間にデュプリケートで細胞計数を実施した。値は、2回の独立した実験の平均値に相当する。図6Aに示すように、FRP1またはDKK1を過剰発現しているMDAMB157細胞は、ベクターを形質導入された親細胞と比較すると、低い飽和密度を示した。
【００８３】
MDAMB157に対するFRP1およびDKK1の影響が、Wnt機能の阻害によるものであったことを確認するために、本発明者らは、検出不可能なレベルの複合体を形成していないβ-カテニンを提示する(図1Aを参照されたい)、不死化ヒト乳房上皮細胞株であるAB589(Stampfer, M. R.、およびBartley, J. C.(1985年) Proc Natl Acad Sci U S A 82、2394〜2398頁)を、ベクター、FRP1レトロウイルス、またはDKK1レトロウイルスのいずれかに感染させた。これらの細胞における阻害物質の発現は、飽和密度に対する検出可能な影響はもたらさなかった(データは示さない)。
【００８４】
FRP1またはDKK1によるWnt阻害が、アポトーシス性刺激に対するMDAMB157細胞の応答に与える影響を評価するために、本発明者らは、対照ベクター、FRP1、またはDKK1のいずれかを発現するAB589細胞またはMDAMB157細胞を、濃度を段階的に上げたtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBh)(Sigma社)(活性酸素種(ROS)によりDNA損傷を引き起こす、酸化ストレスの公知の誘導物質(Macipら、(2003年) Mol. Cell Biol. 23:8576〜8585頁))に曝露させ、アポトーシス応答を分析した。サブコンフルエントな培養物を、段階的に増量したtert-ブチルヒドロペルオキシド(tBh)で2時間処理した。24時間後、細胞をPBS中で洗浄し、トリプシン処理し、かつAnnexin-V-Fluos Staining kit(Roche社)を用いて、アネキシンおよびPIと共にインキュベートした。獲得および解析のために、Cell Quest 3.2ソフトウェア(Beckton Dickinson社)を使用するFACS(Beckton Dickinson FACScan)に蛍光染色した細胞を供した。
【００８５】
解析した各濃度のtBhで、MDAMB157細胞において、FRP1またはDKK1過剰発現の存在下で、アポトーシスレベルの統計学的に有意な上昇があった(図6B、左のパネル)。本発明者らはまた、WntアンタゴニストであるFRPおよびDKKの存在下または不在下での、自己分泌Wntシグナル伝達を有する肺腫瘍細胞に対するtBhの影響も試験した。MDAMB157の場合のように(Baficoら、(2004年) Cancer Cell 6(5):497〜506頁)、H1355(ATCC番号CRL-5865)非小細胞肺癌(NSCLC)細胞は、自己分泌Wntシグナル伝達が下方調節された場合に、tBhによるアポトーシスの誘発に対してより感受性であった(データは示さない)。FRP1またはDKK1を発現するAB589細胞を用いて実施した同様の実験では、ベクター感染細胞と比較してアポトーシス応答に検出可能な差異は無いことが明らかにされた(図6B、右のパネル)。これらの研究結果は、FRPやDKKなどのWntアンタゴニストが、腫瘍細胞中のWnt自己分泌シグナル伝達機序を阻害することにより、腫瘍細胞は、標準的な化学療法または放射線療法の死滅効果に対してより感受性になると考えられることを示唆する。本発明者らは、これらのアンタゴニストの発現レベルが、トランスフェクトされ、かつマーカー選択された腫瘍細胞の継代培養に伴って低下することに留意した。これにより、in vivoで、腫瘍形成に対するそれらの影響を研究することは困難になり、かつ、Wnt自己分泌腫瘍細胞中のこれらのアンタゴニストに対する、組織培養時のネガティブ選択圧が示唆された。
【００８６】
古典的Wntシグナル伝達の標的として同定されたいくつかの遺伝子の発現の変化が報告されているが、異なる細胞系におけるWnt標識遺伝子には変異性があることに留意すべきである(Gilesら、(2003年) Biochim. Biophys. Acta 1653:1〜24頁)。MDAMB157乳房腫瘍細胞における遺伝子発現に対するFRP1およびDKK1阻害の影響を調査するために、Myc(Heら、(1998年) Science 281:1509〜1512頁)、LEF-1転写因子(Filaliら、(2002年) J. Biol. Chem. 277:33398〜33410頁)、および優性ネガティブなヘリックス-ループ-ヘリックス転写調節因子、Id2(Rockmanら、(2001年) J. Biol. Chem. 276:45113〜45119頁)を含めて、代表的なWnt転写標的上でノーザンブロット解析を実施した。
【００８７】
ベクター単独、FRP1、またはDKK1を外因的に発現するMDAMB157細胞に由来する全RNAをTriazol(Invitrogen社)を用いて抽出し、アガロースゲル電気泳動(1%アガロースゲル)によって分離し、かつナイロン膜(Hybond、Pharmacia社)に移した。ランダムプライム標識(Random Prime Labelling System)法(Amersham Biosciences社)によってプローブを標識し、かつ製造業者の取扱い説明書に従ってHybrisol I溶液(Serologicals Corporation社)を利用して、ハイブリダイゼーションを一晩実施した。市販のヒトGADPH対照プローブ(BD Biosciences Clontech社)を利用して、標準化を行った。プローブはα-32P-dCTPで標識した。
【００８８】
注目すべきことに、各発現(LEF-1、ID2、およびMYC)は、FRP1またはDKK1の安定な発現によって低減された(図6C)。本発明者らは、同じ条件下で、別のWnt標的遺伝子、サイクリンD1(TetsuおよびMcCormick(1999年) Nature 398、422〜426頁; Shtutmanら、(1999年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96、5522〜5527頁)のレベルの有意な変化を観察しなかった(データは示さない)。しかし、Wntが、サイクリンD1の無い遺伝的背景においてマウスの乳房腫瘍を誘導し得、少なくともこの組織において、サイクリンD1が重要なWnt標的である見込みは少ないことを暗示することに留意すべきであり(Yuら、(2001年) Nature 411:1017〜1021頁; Rowlandsら、(2003年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100:11400〜11405頁)。
【００８９】
古典的Wntシグナル伝達は、マウス乳腺を含めて(Liら、(2003年) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100:15853〜15858頁; Liuら、(2004年) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 101:4158〜4163頁)、いくつかの組織の上皮前駆細胞を維持するのに関与しているようであるため(van de Weteringら、(2002年) Cell 111:241〜250頁; AlonsoおよびFuchs(2003年) Genes Dev. 17:1189〜1200頁; Reyaら、(2003年) Nature 423:409〜414頁; Polesskayaら、(2003年) Cell 113、841〜852頁)、本発明者らは、MDAMB157腫瘍細胞におけるWntシグナル伝達の下方調節がそれらの分化状態に影響するかどうかも調査した。分化した乳房上皮細胞によって発現されることが公知の2種のマーカーであるケラチン8およびケラチン18に対するプローブを用いた、(LEF-1、ID2、およびMYCについて前述した)RNAブロット解析により(Stinglら、(2001年) Breast Cancer Res. Treat. 67:93〜109頁; Going(2003年) J. Pathol. 199:1〜3頁; Heら、(1998年) Science 281:1509〜1512頁)、FRP1またはDKK1の安定な発現が、ケラチン8の発現の著しい増大、ならびにケラチン18レベルの上昇をもたらすことが明らかになった(図6D)。これらの研究結果はすべて、ヒト腫瘍細胞におけるWnt自己分泌形質転換機序に関する証拠を提供する。
【００９０】
(実施例10)
野生型または変異型のβ-カテニンのいずれかをノックアウトされたHCT116結腸癌細胞に対する、Wntアゴニストの影響
生理学的Wntシグナル伝達は、結腸上皮における陰窩前駆体表現型の維持のために必要であると思われる(Pinto, D.、Gregorieff, A.、Begthel, H.およびClevers, H.(2003年) Genes Dev 17、1709〜1713頁)(Kuhnert, F.、Davis, C. R.、Wang, H. T.、Chu, P.、Lee, M.、Yuan, J.、Nusse, R.、およびKuo, C. J.(2004年) Proc Natl Acad Sci U S A 101、266〜271頁)。FRP1が結腸癌において高い割合で変異しているか、またはメチル化されているという最近の研究結果(Suzuki, H.、Gabrielson, E.、Chen, W.、Anbazhagan, R.、van Engeland, M.、Weijenberg, M. P.、Herman, J. G.、およびBaylin, S. B.(2002年) Nat Genet 31、141〜149頁)(Caldwell, G. M.、Jones, C.、Gensberg, K.、Jan, S.、Hardy, R. G.、Byrd, P.、Chughtai, S.、Wallis, Y.、Matthews, G. M.、およびMorton, D. G.(2004年) Cancer Res 64、883〜888頁)を受けて、本発明者らは、そのような腫瘍におけるWnt自己分泌シグナル伝達の寄与が、この経路の下流の構成要素の変異によって遮断され得るかどうかを調査した。このために、本発明者らは、β-カテニン変異を含むHCT116大腸癌細胞株を利用した(Morin, P. J.、Sparks, A. B.、Korinek, V.、Barker, N.、Clevers, H.、Vogelstein, B.、およびKinzler, K. W.(1997年) Science 275、1787〜1790頁)。相同組換えによって、野生型または変異型のβ-カテニン対立遺伝子のいずれかを含むHCT116クローンが人工的に設計された(Sekine, S.、Shibata, T.、Sakamoto, M.、およびHirohashi, S.(2002年) Oncogene 21: 5906〜5911頁; Chan、T.A., Wang, Z.、Dang, L.H.、Vogelstein, B.、およびKinzler, K.W.(2002年) Proc Natl Acad SCi U S A 99: 8265〜8270頁)。
【００９１】
RT-PCRを使用して、HCT116大腸癌細胞におけるWnt-2、Wnt-3およびWnt-3aリガンドの発現を解析した。Triazol(Invitrogen社)を用いて、HCT116大腸癌細胞から全RNAを抽出し、かつ、Superscript II Reverse Trancriptase(Invitrogen社)を用いて逆転写させた。cDNA反応物100μlのうち10μlを、各Wntに特異的な以下のプライマーを用いた増幅用の鋳型として利用した。ヒトWnt-2の場合、フォワード:5'-TGGCTCCCTCTGCTCTTGACC-3'(配列番号:2)、およびリバース:5'-AGTCAATGTTATCACTGCAGC-3'(配列番号:3);ヒトWnt-3の場合、フォワード:5'-GAAGGCTGGAAGTGGGGCGGCT-3'(配列番号:4)およびリバース:5'-GTCTCCACCCAGCCTCGGGACTCA-3'(配列番号:5);ヒトWnt-3aの場合、フォワード:5'-GGATACTTCTTACTCCTCTGCAG-3'(配列番号:6)およびリバース:5'-AATGGCGTGGACAAAGGCCGACT-3'(配列番号:7)。エチジウムブロマイド染色によってRT-PCR産物を可視化した。RT-PCR解析によって、HCT116細胞において高度に形質転換するWnt-3aを含めて、古典的Wntリガンドの発現が明らかになった(図7A)。
【００９２】
HCT116親細胞および野生型または変異型のβ-カテニン対立遺伝子のいずれかを発現するクローンをFRP1-HAでトランスフェクトし、かつGST-E-カドヘリン結合アッセイ(実施例3において説明)に供して、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルに対するFRP1の影響を検査した。抗β-カテニン抗体を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンを検出した。抗HA抗体を用いて、溶解物中のFRP1レベルを検出した。野生型対立遺伝子を含むクローンは、高レベルの複合体を形成していないβ-カテニンを保持し、これは、変異型β-カテニン対立遺伝子の存在から独立したWnt経路の構成的な上方調節を示唆した(図7B)。野生型β-カテニン対立遺伝子を含む他のクローンでも、同様の結果が観察された(データは示さない)。FRP1発現が、変異型対立遺伝子のみを含むクローンにおいては、複合体を形成していないβ-カテニンレベルに対してあるとしてもほとんど影響を持たなかったのに対し、野生型β-カテニン対立遺伝子を含むクローンのβ-カテニンレベルは劇的に低下していた(図7B)。これらの研究結果により、自己分泌WntループがHCT116細胞中に存在するに違いないことが証明された。
【００９３】
本発明者らは、次に、大腸癌中のWnt/β-カテニンの公知の標的であるId2、サイクリンD1、およびMyc(Rockmanら、(2001年) J.Biol. Chem. 276:45113〜45119頁; TetsuおよびMcCormick(1999年) Nature 398:422〜426頁; Heら、(1998年) Science 281:1509〜1512頁)の発現に対するFRP1阻害の影響を評価した。RNAをHCT116親細胞から抽出し、かつ、Triazol(Invitrogen社)を用いて、対照ベクターまたはFRP1-HAのいずれかで、野生型または変異型のβ-カテニン対立遺伝子のいずれかを含むクローンをトランスフェクトした。RNAを(1%)アガロースゲル電気泳動によって分離し、かつナイロン膜(Hybond(登録商標)、Pharmacia社)に移した。ランダムプライム標識法(Amersham Biosciences社)によってプローブを標識し、かつ製造業者の取扱い説明書に従ってHybrisol I溶液(Serologicals Corporation社) を利用して、ハイブリダイゼーションを一晩実施した。市販のヒトGADPH対照プローブ(BD Biosciences Clontech社)を利用して、標準化を行った。ノーザンブロット解析により、親HCT116、ならびにβ-カテニン変異型対立遺伝子クローンにおける高レベルのId2発現が明らかになった。野生型β-カテニン対立遺伝子を含むクローンもまた、これらのクローンにおいて観察される複合体を形成していないβ-カテニンの相対的レベルと一致して、いくらか低いId2発現レベルを示した(図7Bおよび7C)。注目すべきことに、FRP1発現は、野生型β-カテニンにおいてId2転写物レベルの低下をもたらしたが、変異型対立遺伝子を含むクローンにおいてはもたらさなかった。同様に、野生型対立遺伝子を含むクローンにおけるサイクリンD1およびMycの発現は、FRP1発現によって劇的に抑制された(図7D)。
【００９４】
レポーターに作動可能に連結したTCF応答エレメント(TOP-Glow、野生型、またはFOP-Glow、変異体)を、DKK1の存在下または不在下でのPAI腫瘍細胞における転写活性に関して解析した。野生型β-カテニン対立遺伝子を含むHCT116(ATCC番号 CCL-247)細胞を6ウェルプレート中にウェル当たり3×105個の濃度で播種し、かつ、FuGene(登録商標)(Roche社)を製造業者の取扱い説明書に従って用いて、TOP-glowプラスミドまたはFOP-glowプラスミド(Upstate Biotechnology社)いずれか1μgおよびRenilla対照プラスミド(pRL-CMV)0.001μgでコトランスフェクトした。48時間後、細胞を溶解し、かつDual Luciferase Reporter Assayシステム(Promega社)を利用して解析した。図7Eに示したように、FRP1は、β-カテニン野生型対立遺伝子クローンにおけるTCF依存性レポーター活性を阻害することができた。
【００９５】
in vivoでのWnt自己分泌阻害の影響を評価するために、FRP1を発現するマーカー選択された安定な腫瘍培養物が得られる、HCT116親細胞株またはβ-カテニン野生型対立遺伝子を含むHCT116細胞株を利用して、腫瘍形成能実験を実施した。HCT116親細胞および野生型β-カテニン対立遺伝子を含むHCT116細胞に、対照ベクターまたはFRP1をトランスフェクトした。マーカー選択した各腫瘍培養物を6週齢のヌードマウスに部位当たり2.5×106個の細胞濃度で皮下注射した。以前に説明されているように、週間隔で腫瘍増殖をモニターした(Pierceら、(1991年) Oncogene 6:1189〜1194頁)。図7F中の値は、細胞株当たり4箇所の接種部位の平均値(±標準偏差)を表す。注目すべきことに、FRP1発現は、親細胞によって誘導される腫瘍増殖に対して影響を示さなかったが、β-カテニン野生型対立遺伝子を含む細胞の腫瘍形成能の著しい低下を引き起こした(図7F)。これらの研究結果はすべて、自己分泌Wntシグナル伝達が、古典的経路内部の下流の障害を有するヒト結腸癌細胞において存在し得ることを証明する。
【００９６】
(実施例11)
293T細胞およびH23非小細胞肺癌腫瘍細胞におけるβ-カテニンの位置確認
複合体を形成していない細胞質β-カテニンは、核へ移行し、かつ、転写因子のTCF/LEFファミリーのメンバーとのヘテロ二量体化を通じて転写を活性化することが公知である(Gilesら、(2003年) Biochim. Biophys. Acta 1653:1〜24頁)。本発明者らは、免疫染色とそれに続く共焦点顕微鏡観察によって、いくつかの自己分泌Wntヒト腫瘍細胞株を293T細胞と比べて解析した。293T細胞(ATCC番号CRL-11268)およびH23(ATCC番号CRL-5800)非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘍細胞のサブコンフルエントな培養物をホルムアルデヒドで固定し、かつ抗β-カテニン抗体(Transduction Laboratories社)、続いてFITC標識した二次抗体(Vector Laboratories社、バーリンゲーム、カリフォルニア州)で染色した。核はDAPI(Vector Laboratories社)で染色した。293T細胞およびH23NSCLC腫瘍細胞のβ-カテニン染色の結果から、本発明者らは、β-カテニンが、H23NSCLC腫瘍細胞の細胞質および核において検出され得ることをさらに示した(図8)。これらの研究結果は、β-カテニンが、転写因子としてそれが作用するのに必要とされる細胞下部位内に存在していることをさらに証明する。最後に、本発明者らは、TCF依存性の転写レポーター活性、ならびにFRPおよび/またはDKKが、乳房/卵巣腫瘍細胞に加えて自己分泌Wnt肺腫瘍細胞におけるこの活性を下方調節する能力を実証した(データは示さない)。これらの研究結果はすべて、構成的自己分泌Wntシグナル伝達を提示し得る腫瘍タイプの数を広げ、かつ、この機序が、ヒト乳癌、肺癌、および卵巣癌にかなりの比率で存在していることを実証する。
［参考文献］
【００９７】
本発明は、本明細書において説明する特定の実施形態によって範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書において説明したものの他の本発明の様々な修正が、前述の説明および添付図面から当業者に明らかになると考えられる。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲に収まるものとする。すべての値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】指定したヒト腫瘍乳癌細胞株および卵巣癌細胞株におけるWntシグナル伝達の上方調節を示す図である。図１Ａ：ヒト腫瘍細胞中の複合体を形成していないβ-カテニンタンパク質(上側のパネル)および非リン酸化(下側のパネル)β-カテニンタンパク質のレベルの解析を、抗β-カテニン抗体を用いて実施した。図１Ｂ；エチジウムブロマイド染色によって可視化した、指示された各WntリガンドのレベルのRT-PCR解析である。
【図２】ヒト腫瘍細胞株における自己分泌Wntシグナル伝達のFRP1およびDKK1による阻害を示す図である。図２Ａ：Tet誘導性プロモーターの制御下でβ-カテニンを発現するNIH3T3細胞(様々な量のテトラサイクリンの存在下で培養:レーン1および2:1μg/ml;レーン3および4:7.5ng/ml;レーン5および6:5ng/ml)、ならびにWnt-3aを発現するNIH3T3細胞(レーン7および8)を、精製したDKK1(10nM)と共にインキュベートし、GST-E-カドヘリン結合アッセイ、続いてSDS-PAGE、および抗β-カテニン抗体を用いるイムノブロット解析に供した。図２Ｂ：濃度を段階的に上げた精製DKK1にMDAMB157細胞培養物を曝露させ、可溶化し、かつ(A)で説明したように、複合体を形成していないβ-カテニンについて解析した。図２Ｃ：MDAMB157細胞を、ベクターのみ、FRP1-HAレトロウイルス、またはDKK1-HAレトロウイルスに感染させ、マーカー選択し(一番上のパネル)、かつFRP1(中央のパネル)およびDKK1(下側のパネル)の発現を、抗HA抗体を用いた溶解物のイムノブロット解析によって評価した。図２Ｄ：乳房腫瘍細胞株(MDAMB231)および卵巣腫瘍細胞株(A1847、PAI)を、複合体を形成していないβ-カテニン(上側のパネル)またはFRP1およびDKK1(下側のパネル)に関して、イムノブロット解析によって解析した。図２Ｅ：レポーターに作動可能に連結したTCF応答エレメント(TOP-Glow、野生型、またはFOP-Glow、変異体)を、DKK1の存在下または不在下でのPAI腫瘍細胞における転写活性に関して解析した。
【図３】ヒト腫瘍乳癌細胞株におけるWntシグナル伝達の上方調節(図3A)、およびHCC38乳癌細胞株における自己分泌Wntシグナル伝達のDKK1阻害(図3B)を示す図である。図３Ａ：1mgの全細胞溶解物を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析を実施した。β-カテニンに対するモノクローナル抗体をイムノブロッティングのために使用した。レーン1は、細胞株HCC1806の結果であり;レーン2は、細胞株HCC1428の結果であり;レーン3は、細胞株HCC1143の結果であり;レーン4は、細胞株HCC38の結果であり;かつ、レーン5は、細胞株HCC1395の結果である。図３Ｂ：HCC38乳癌細胞培養物を、DKKを含む順化培地またはDKKを含まない培地に2時間曝露させ、次いで、β-カテニンに対するモノクローナル抗体を用いる、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析に供した。
【図４】非小細胞肺癌(NSCLC)癌細胞株における自己分泌Wntシグナル伝達のFRP阻害を示す図である。NSCLC培養物を対照ベクターまたはFRPレトロウイルスに感染させ、かつマーカーを選択した。β-カテニンに対するモノクローナル抗体を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンレベルの解析を実施した。
【図５】Wntシグナル伝達に対するLRP5およびLRP6のsiRNAの影響を示す図である。図５Ａ：ヒトLRP5およびLRP6の細胞外ドメインをコードしているRNAに対抗するsiRNAを293T細胞において一過性に発現させ、かつイムノブロットによって、LRP5およびLRP6タンパク質レベルを解析した。図５Ｂ：Wnt-3aによって刺激された293T細胞または自己分泌Wnt PAIヒト腫瘍細胞に対するLRP5およびLRP6 siRNAの影響を、イムノブロットによって、複合体を形成していないβ-カテニンレベルに関して解析した。
【図６】ヒト乳房腫瘍細胞における自己分泌Wntシグナル伝達のFRP1およびDKK1による阻害の機能的影響を示す図である。図６Ａ：対照のベクター、FRP1、またはDKK1のいずれかを外因的に発現するMDAMB157細胞を、ウェル当たり1.5×105個の細胞濃度で6ウェルプレートに移した。指定された時間にデュプリケートで細胞計数を実施した。値は、2回の独立した実験の平均値に相当する。図６Ｂ：MDAMB157またはAB589のサブコンフルエントな培養物を、指定された量のtBhで処理し、かつFACS解析に供して、酸化的ストレス誘発因子に応答したアポトーシスに対するFRP1およびDKK1の影響を検査した。得られた値は、デュプリケートで実施した2回の独立した実験の平均±標準偏差(s.d.)として表す。図６Ｃ：ベクターのみ、FRP1、またはDKK1を外因的に発現しているMDAMB157細胞から抽出した全RNAを、1%アガロースゲル上で分離し、かつナイロン膜に移して、Wnt標的遺伝子および分化マーカーに対するFRP1およびDKK1の影響を検査した。図に示すように、α-32P-dCTPで標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施した。図６Ｄ：ベクターのみ、FRP1、またはDKK1を外因的に発現しているMDAMB157細胞から抽出した全RNAを、1%アガロースゲル上で分離し、かつナイロン膜に移して、Wnt標的遺伝子および分化マーカーに対するFRP1およびDKK1の影響を検査した。図に示すように、α-32P-dCTPで標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施した。
【図７】HCT116ヒト結腸癌細胞における自己分泌Wntシグナル伝達を示す図である。図７Ａ：RT-PCRを使用して、HCT116大腸癌細胞における指示された各Wntリガンドの発現を解析した。図７Ｂ：HCT116親細胞および野生型または変異型のβ-カテニン対立遺伝子のいずれかを発現するクローンをFRP1-HAでトランスフェクトし、かつGST-E-カドヘリン結合アッセイに供して、複合体を形成していないβ-カテニンのレベルに対するFRP1の影響を検査した。抗β-カテニン抗体を用いて、複合体を形成していないβ-カテニンを検出した(上側のパネル)。抗HA抗体を用いて、溶解物中のFRP1レベルを検出した(下側のパネル)。図７Ｃ：一番上:Id2のノーザンブロット解析。RNAをHCT116親細胞から抽出し、かつ、対照ベクターまたはFRP1-HAのいずれかを、野生型または変異型のβ-カテニン対立遺伝子のいずれかを含むクローンにトランスフェクトして、Id2標的遺伝子発現に対するFRP1の影響を検査した。一番下:FRP1機能の対照として、RNA抽出と同じ時点に細胞溶解物を得、(B)のようにして解析した。図７Ｄ：サイクリンD1およびMyc遺伝子発現に対するFRP1の影響を検査するために、サイクリンD1またはc-mycのいずれかの32Pα-dCTPで標識したcDNAを利用して、ハイブリダイゼーションを実施した。図７Ｅ：図2Eのように細胞をトランスフェクトおよび解析して、TCFレポーター転写活性に対するFRP1の影響を検査した。図７Ｆ：指示された細胞株を部位当たり2.5×106個の濃度でヌードマウスに皮下注射して、腫瘍形成に対するFRPの影響を検査した。腫瘍サイズを毎週モニターした。値は、細胞株当たり4箇所の接種部位の平均値(±標準偏差(SD))を表す。
【図８】293T細胞およびH23非小細胞肺癌腫瘍細胞のβ-カテニン染色を示す図である。293T細胞株およびH23 NSCLC細胞株のサブコンフルエントな培養物をホルムアルデヒドで固定し、かつ、抗β-カテニン抗体、続いてFITC標識した二次抗体で染色した。核はDAPIで染色した。
【図１】
2008520583.tif 000003
【図２】
2008520583.tif 000004
【図３Ａ】
2008520583.tif 000005
【図３Ｂ】
2008520583.tif 000006
【図４】
2008520583.tif 000007
【図５】
2008520583.tif 000008
【図６】
2008520583.tif 000009
【図７】
2008520583.tif 000010
【図８】
2008520583.tif 000011
【配列表】
2008520583000001.app
【国際調査報告】
2008520583.tif 000012
2008520583.tif 000013
2008520583.tif 000014
2008520583.tif 000015
2008520583.tif 000016