(57)【要約】本発明は細菌学の分野に関する。特に、本発明は、病原性微生物の集団の増殖およびビルレンス(virulence)を変化させる(例えば、阻害する)ための新規組成物ならびに方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織をドナー細胞に曝露する段階を含む、組織の処置方法であって、
該ドナー細胞が、
i)殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え伝達性プラスミドと、
ii)該殺菌性タンパク質を阻害するように構成された免疫タンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドとを含み、
該ドナー細胞が、該組換え伝達性プラスミドをレシピエント細胞へ接合的に伝達するように構成され、かつ該組換え伝達性プラスミドが、該レシピエント細胞において殺菌性タンパク質をコードする該遺伝子を発現するように構成される、
方法。
【請求項２】
殺菌性タンパク質をコードする遺伝子の発現がレシピエント細胞に対して致死性である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
殺菌性タンパク質がコリシンである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
コリシンがcolE3である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
殺菌性タンパク質が、colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9、およびリゾチームからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
免疫タンパク質が殺菌性タンパク質に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
免疫タンパク質がimmE3である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
免疫タンパク質が、コリシンA、コリシンB、コリシンD、コリシンIa、コリシンIb、コリシンK、コリシンN、コリシンE1、コリシンE2、コリシンE4、コリシンE5、コリシンE6、コリシンE7、コリシンE8、およびコリシンE9免疫タンパク質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
組織の処置が、組織における創傷の処置を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
創傷が熱傷創を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
組織をドナー細胞に曝露する以前に、組織はレシピエント細胞と接触している、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
組織をドナー細胞に曝露する以前に、組織はレシピエント細胞と接触していない、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
組織が皮膚である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
組換え伝達性プラスミドが自己伝達性である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
組換え伝達性プラスミドが、pCON15-56A、pCON19-79からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
ヘルパープラスミドが、pON1-93およびpCON1-94からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
レシピエント細胞が細菌細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
細菌細胞が病原性細菌細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
細菌細胞が、サルモネラ属(Salmonella)、シゲラ属(Shigella)、エシェリヒア属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)、プロテウス属(Proteus)、エルシニア属(Yersinia)、シトロバクター属(Citrobacter)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、プロビデンシア属(Providencia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ハフニア属(Hafnia)、エウィンゲラ属(Ewingella)、クライベラ属(Kluyvera)、モルガネラ属(Morganella)、プラノコッカス属(Planococcus)、ストマトコッカス属(Stomatococcus)、ミクロコッカス属(Micrococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ビブリオ属(Vibrio)、アエロモナス属(Aeromonas)、プレシオモナス属(Plessiomonas)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、パスツレラ属(Pasteurella)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、ウレアプラズマ属(Ureaplasma)、リケッチア属(Rickettsia)、コクシエラ属(Coxiella)、ロシャリメア属(Rochalimaea)、エールリヒア属(Ehrlichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アエロコッカス属(Aerococcus)、双子菌属(Gemella)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ペディコッカス属(Pedicoccus)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、アルカノバクテリウム属(Arcanobacterium)、アクチノミセス属(Actinomyces)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、リステリア属(Listeria)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ガードネレラ属(Gardnerella)、ナイセリア属(Neisseria)、カンピロバクター属(Campylobacter)、アルコバクター属(Arcobacter)、ウォリネラ属(Wolinella)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、アクロモバクター属(Achromobacter)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、クリセオモナス属(Chryseomonas)、コマモナス属(Comamonas)、エイケネラ属(Eikenella)、フラビモナス属(Flavimonas)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、モラクセラ属(Moraxella)、オリゲラ属(Oligella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、シュワネラ属(Shewanella)、ウィークセラ属(Weeksella)、ザントモナス属(Xanthomonas)、ボルデテラ属(Bordetella)、フランシセラ属(Franciesella)、ブルセラ属(Brucella)、レジオネラ属(Legionella)、アフィピア属(Afipia)、バルトネラ属(Bartonella)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、カルジオバクテリウム属(Cardiobacterium)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、スピリルム属(Spirillum)、ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、ペプトコッカス属(Peptococcus)、サルシナ属(Sarcinia)、コプロコッカス属(Coprococcus)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、モビルンカス属(Mobiluncus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ロチア属(Rothia)、クロストリジウム属(Clostridium)、バクテロイデス属(Bacteroides)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、プレボテラ属(Prevotella)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、バイロフィラ属(Bilophila)、レプトトリキア属(Leptotrichia)、ウォリネラ属(Wolinella)、アシダミノコッカス属(Acidaminococcus)、メガスフェラ属(Megasphaera)、ベイヨネラ属(Veilonella)、ノカルジア属(Norcardia)、アクチノマヅラ属(Actinomadura)、ノカルジオプシス属(Norcardiopsis)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ミクロポリスポラ属(Micropolysporas)、テルモアクチノミセス属(Thermoactinomycetes)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、トレポネーマ属(Treponema)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、またはクラミジア属(Chlamydiae)からなる群より選択される属のものである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ドナー細胞を含む組成物であって、
該ドナー細胞が、
i)殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え伝達性プラスミドと、
ii)該殺菌性タンパク質を阻害するように構成された免疫タンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドとを含み、
該ドナー細胞が、該組換え伝達性プラスミドをレシピエント細胞へ接合的に伝達するように構成され、該組換え伝達性プラスミドが、該レシピエント細胞において殺菌性タンパク質をコードする該遺伝子を発現するように構成される、
組成物。
【請求項２１】
殺菌性タンパク質がコリシンである、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
コリシンがcolE3である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
殺菌性タンパク質が、colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9、およびリゾチームからなる群より選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項２４】
免疫タンパク質が殺菌性タンパク質に結合する、請求項20記載の組成物。
【請求項２５】
免疫タンパク質がimmE3である、請求項22記載の組成物。
【請求項２６】
免疫タンパク質が、コリシンA、コリシンB、コリシンD、コリシンIa、コリシンIb、コリシンK、コリシンN、コリシンE1、コリシンE2、コリシンE4、コリシンE5、コリシンE6、コリシンE7、コリシンE8、およびコリシンE9免疫タンパク質からなる群より選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項２７】
伝達性プラスミドがRSF1010のoriTおよびoriVを含み、かつColE3をコードする遺伝子がlacプロモーター/オペレーターの制御下にある、請求項20記載の組成物。
【請求項２８】
免疫タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターの制御下にあり、該プロモーターが構成的に活性である、請求項20記載の組成物。
【請求項２９】
プロモーターがPneoである、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
免疫タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターの制御下にあり、該プロモーターが誘導性である、請求項20記載の組成物。
【請求項３１】
伝達性プラスミドがpCON15-56AまたはpCON19-79である、請求項20記載の組成物。
【請求項３２】
ヘルパープラスミドがpCON1-93またはpCON1-94である、請求項20記載の組成物。
【請求項３３】
ドナー細胞を含む組成物を表面に供給する段階を含む、表面の処置方法であって、
該ドナー細胞が、
i)殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え伝達性プラスミドと、
ii)該殺菌性タンパク質を阻害するように構成された免疫タンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドとを含み、
該ドナー細胞が、該組換え伝達性プラスミドをレシピエント細胞へ接合的に伝達するように構成され、該組換え伝達性プラスミドが、該レシピエント細胞において殺菌性タンパク質をコードする該遺伝子を発現するように構成される、
方法。
【請求項３４】
表面が、医療デバイス、創傷治療デバイス、体腔デバイス、ヒト身体、動物身体、個人用保護デバイス、受胎調節デバイス、および薬物送達デバイスの1つまたは複数に存在する、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
表面が、シリコン、プラスチック、ガラス、ポリマー、セラミック、フォトレジスト、皮膚、組織、ニトロセルロース、ヒドロゲル、紙、ポリプロピレン、布、綿、ウール、木、れんが、皮革、ビニール、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、光ファイバー、天然繊維、ナイロン、金属、ゴム、またはそれらの複合物を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
処置が、表面上のレシピエント細胞の増殖を阻害する、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
処置が、表面と接触するレシピエント細胞を殺傷する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
プラスミドが自己伝達性である、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
a)pCON15-56A、pCON19-79、pCON1-93、およびpCON1-94からなる群より選択される1つまたは複数のプラスミドを含むドナー細胞を含む組成物を供給する段階；ならびに
b)該組成物を表面に曝露する段階
を含む、表面の処置方法。
【請求項４０】
ドナー細胞が、ビルレンスの低い(low virulence)細菌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４１】
ビルレンスの低い細菌細胞が大腸菌(E. coli)83972細胞である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
組織が膀胱組織である、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
ドナー細胞が、ビルレンスの低い細菌細胞である、請求項20記載の組成物。
【請求項４４】
ビルレンスの低い細菌細胞が大腸菌83972細胞である、請求項20記載の組成物。
【請求項４５】
ドナー細胞が、ビルレンスの低い細菌細胞である、請求項33記載の方法。
【請求項４６】
ビルレンスの低い細菌細胞が大腸菌83972細胞である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
表面が膀胱組織である、請求項34記載の方法。
【請求項４８】
表面がカテーテルの表面を含む、請求項34記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は細菌学の分野に関する。特に、本発明は、組織(例えば、皮膚および他の軟組織の病変)を処置するための新規組成物(例えば、抗菌剤)およびそれらを用いる方法に関する。いくつかの態様において、本発明は、微生物の集団を殺傷する、または微生物の集団の増殖およびビルレンス(virulence)を変化させる(例えば、阻害する)段階を含む。
【０００２】
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる2005年5月26日に出願された米国特許出願第11/137,950号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)およびマクロライド耐性化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ならびに多剤耐性緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)は、皮膚および軟組織感染の処置をますます困難にさせている(Fung et al., Drugs 63:1459-80 (2003)(非特許文献1))。
【０００４】
例えば、熱傷創治療の根強い問題の一つは、微生物感染の発生である。人間は、無菌環境においてではなく、細菌および他の微生物との共生関係において生きている。無傷皮膚および粘膜表面は、我々の組織と細菌集団の間の繊細なバランスを維持するように働く。皮膚または粘膜バリアにおけるいかなる裂け目もこのバランスを変化させ、それに従って、細菌が下層組織に接近するのを可能にすることにより感染を開始し、臨界数に達する可能性を有する。熱傷外科医の主な処置目標の一つは、感染を防ぐことであり、汚染が起きている場合には、目標は、感染を開始し、広げるために必要とされる臨界数より下に微生物汚染を低減することである。抗生物質の発見によって、熱傷創感染は制御下にあるように思われた。しかしながら、細菌は、耐性の発生を通して抗生物質に打ち勝つことができ、実際、打ち勝っていることが発見されている。細菌の耐性株の出現は、多くの病院に基づいた感染の主な供給源になっており、熱傷外科医へ重大な臨床上のジレンマをもたらしている。
【０００５】
抗生物質耐性の問題は、限定されるわけではないが、皮膚および軟組織の感染を含む、あらゆる種類の細菌感染に影響を及ぼす。病原性生物体における抗生物質耐性のはびこる根源には多くの例がある。コーパスクリスティ(Corpus Christi)、テキサス(Texas)の一つの病院において、地域感染型のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)が、皮膚および軟組織感染に最もよく見られるのだが、1990年の3%から1999年の10%までゆっくり増加し、その後、2003年における62%まで4年間に渡って急速に増加した(Goodman, J Clin Invest 114, 1181 (2004)(非特許文献2))。マイアミ(Miami)病院において、下腿潰瘍におけるキノロンに対する緑膿菌耐性は、1992年の19%から2001年の56%まで増加した(Valencia et al., J Am Acad Dermatol 50, 845-9 (2004)(非特許文献3))。その分野において討論はなく、新しい処置がこれらの感染を制御するために必要とされている。
【０００６】
硝酸銀、スルファジアジン銀(シルベルデン(Silverdene)、テルマジン(Thermazine)、フラマジン(Flamazine))、および酢酸マフェニド(スルファミロン(Sulfamylon))のような抗細菌剤の予防的使用は、熱傷創のような創傷において細菌コロニー形成を低減するための治療の標準になっている。しかしながら、これらの作用物質には限界がある。例えば、シルベルデンは、創傷治癒を遅らせることが示されており、サルファ剤に対してアレルギー性である患者に用いることができない。スルファミロンの代謝産物は、炭酸脱水酵素の強力なインヒビターであり、それゆえに、代謝性アシドーシスを引き起こしうる。この化合物の使用は、気道傷害を有する患者および敗血症を発症した患者には特に禁忌である。
【０００７】
細菌コロニー形成を予防または低減するために用いられる他の抗菌剤は、硫酸ゲンタマイシン、バシトラシン、ニトロフラントインである。残念なことに、これらの抗菌剤の常時使用は、結果として、原因菌の耐性株の出現を生じる。
【０００８】
熱傷患者の処置における治療の標準としてのこれらの抗菌ストラテジーの承認にもかかわらず、薬剤耐性細菌感染(例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、緑膿菌、およびアシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii))の発生は、長期入院中の患者(例えば、重症の熱傷患者または慢性潰瘍を有する糖尿病患者)において重大な臨床的問題を課し続けている。
【０００９】
従って、抗菌処置の代わりとなるストラテジーを開発する大きな必要性が存在する。特に、薬剤耐性微生物に向けて、効果的に殺傷するまたは減弱させることができる処置が必要とされる。
【００１０】
【非特許文献１】Fung et al., Drugs 63:1459-80 (2003)
【非特許文献２】Goodman, J Clin Invest 114, 1181 (2004)
【非特許文献３】Valencia et al., J Am Acad Dermatol 50, 845-9 (2004)
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は細菌学の分野に関する。特に、本発明は、組織(例えば、皮膚および他の軟組織の病変)を処置するための新規組成物(例えば、抗菌剤)、ならびに微生物の集団を殺傷する、または微生物の集団の増殖およびビルレンスを変化させる(例えば、阻害する)段階を含むそれらを用いる方法に関する。いくつかの態様において、新規組成物の作用は、組織に該組成物でコロニーを形成すること、例えば、創傷、腸管、または尿路の1つもしくは複数の構成要素にコロニーを形成することを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明の方法は、組織をドナー細胞に曝露することにより組織を処置する段階を含み、該ドナー細胞は、殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え伝達性プラスミド、および免疫タンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドを含み、該免疫タンパク質は、該殺菌性タンパク質を阻害するように構成される。そのような態様において、ドナー細胞は、組換え伝達性プラスミドがレシピエント細胞において殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を発現するように、組換え伝達性プラスミドをレシピエント細胞へ接合的に伝達するように構成される。好ましい態様において、殺菌性タンパク質をコードする遺伝子の発現は、レシピエント細胞に対して致死性である。いくつかの態様において、殺菌性タンパク質はコリシンである。いくつかの好ましい態様において、コリシンはcolE3であり、一方、他の好ましい態様において、殺菌性タンパク質は、限定されるわけではないが、colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9、またはリゾチームを含む。
【００１３】
本発明の方法は、殺菌性タンパク質の効果を阻害するように構成された免疫タンパク質の使用を企図する。好ましい態様において、免疫タンパク質は殺菌性タンパク質に結合する。例えば、免疫タンパク質immE3は、殺菌性タンパク質colE3に結合して、阻害する(例えば、不活性化する)。殺菌性タンパク質および対応する免疫タンパク質の多数のペアは、当技術分野において公知である。本発明において、上で列挙された殺菌性タンパク質は、それぞれ、対応するコリシンA、コリシンB、コリシンD、コリシンIa、コリシンIb、コリシンK、コリシンN、コリシンE1、コリシンE2、コリシンE4、コリシンE5、コリシンE6、コリシンE7、コリシンE8、およびコリシンE9免疫タンパク質により阻害される。
【００１４】
本発明は、限定されるわけではないが、皮膚、粘膜組織、肺組織、膀胱組織などを含む組織を処置するための組成物および方法を提供する。いくつかの態様において、非損傷組織が処置され、一方、いくつかの態様において、組織は創傷を含む。いくつかの好ましい態様において、創傷は熱傷創を含む。いくつかの態様において、処置は、該組織に、例えば、本発明の組成物で、コロニーを形成する段階を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物での処置は、感染組織または汚染表面に適用されうる。そのような態様において、処置される組織または表面は、感染組織または汚染表面を本発明の組成物(例えば、ドナー細胞、処置された表面)に曝露する以前に、レシピエント細胞(例えば、病原体細胞)と接触している。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物での処置は、予防的または防止的でありうる。そのような態様において、処置される組織または表面は、組織または表面を本発明の組成物(例えば、ドナー細胞、処置された表面)に曝露する以前に、レシピエント細胞(例えば、病原体細胞)と接触していない。
【００１７】
本発明の方法および組成物は多数の異なる組換え伝達性プラスミドを用いうることが、企図される。いくつかの態様において、組換え伝達性プラスミドは自己伝達性であり、一方、他の態様において、組換え伝達性プラスミドは自己伝達性ではない。いくつかの好ましい態様において、組換え伝達性プラスミドは、pCON15-56A、pCON19-79からなる群より選択される。ヘルパープラスミドは、限定されるわけではないが、pCON1-93およびpCON1-94を含む。
【００１８】
本発明の方法および組成物により標的とされるレシピエント細胞は、限定されるわけではないが、細菌細胞を含む。好ましい態様において、レシピエント細胞は病原性細菌細胞である。特に好ましい態様において、レシピエント細菌細胞は、サルモネラ属(Salmonella)、シゲラ属(Shigella)、エシェリヒア属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、セラチア属(Serratia)、プロテウス属(Proteus)、エルシニア属(Yersinia)、シトロバクター属(Citrobacter)、エドワードシエラ属(Edwardsiella)、プロビデンシア属(Providencia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、ハフニア属(Hafnia)、エウィンゲラ属(Ewingella)、クライベラ属(Kluyvera)、モルガネラ属(Morganella)、プラノコッカス属(Planococcus)、ストマトコッカス属(Stomatococcus)、ミクロコッカス属(Micrococcus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ビブリオ属(Vibrio)、アエロモナス属(Aeromonas)、プレシオモナス属(Plessiomonas)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、アクチノバチルス属(Actinobacillus)、パスツレラ属(Pasteurella)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、ウレアプラズマ属(Ureaplasma)、リケッチア属(Rickettsia)、コクシエラ属(Coxiella)、ロシャリメア属(Rochalimaea)、エールリヒア属(Ehrlichia)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アエロコッカス属(Aerococcus)、双子菌属(Gemella)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ロイコノストック属(Leuconostoc)、ペディコッカス属(Pedicoccus)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、アルカノバクテリウム属(Arcanobacterium)、アクチノミセス属(Actinomyces)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、リステリア属(Listeria)、エリジペロスリックス属(Erysipelothrix)、ガードネレラ属(Gardnerella)、ナイセリア属(Neisseria)、カンピロバクター属(Campylobacter)、アルコバクター属(Arcobacter)、ウォリネラ属(Wolinella)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、アクロモバクター属(Achromobacter)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、クリセオモナス属(Chryseomonas)、コマモナス属(Comamonas)、エイケネラ属(Eikenella)、フラビモナス属(Flavimonas)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、モラクセラ属(Moraxella)、オリゲラ属(Oligella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、シュワネラ属(Shewanella)、ウィークセラ属(Weeksella)、ザントモナス属(Xanthomonas)、ボルデテラ属(Bordetella)、フランシセラ属(Franciesella)、ブルセラ属(Brucella)、レジオネラ属(Legionella)、アフィピア属(Afipia)、バルトネラ属(Bartonella)、カリマトバクテリウム属(Calymmatobacterium)、カルジオバクテリウム属(Cardiobacterium)、ストレプトバチルス属(Streptobacillus)、スピリルム属(Spirillum)、ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、ペプトコッカス属(Peptococcus)、サルシナ属(Sarcinia)、コプロコッカス属(Coprococcus)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、モビルンカス属(Mobiluncus)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ロチア属(Rothia)、クロストリジウム属(Clostridium)、バクテロイデス属(Bacteroides)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、プレボテラ属(Prevotella)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、バイロフィラ属(Bilophila)、レプトトリキア属(Leptotrichia)、ウォリネラ属(Wolinella)、アシダミノコッカス属(Acidaminococcus)、メガスフェラ属(Megasphaera)、ベイヨネラ属(Veilonella)��ノカルジア属(Norcardia)、アクチノマヅラ属(Actinomadura)、ノカルジオプシス属(Norcardiopsis)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ミクロポリスポラス属(Micropolysporas)、テルモアクチノミセス属(Thermoactinomycetes)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、トレポネーマ属(Treponema)、ボレリア属(Borrelia)、レプトスピラ属(Leptospira)、またはクラミジア属(Chlamydiae)からなる群より選択される属のものである。
【００１９】
本発明は、ドナー細胞を含む組成物を提供し、該ドナー細胞は、殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を含む組換え伝達性プラスミド、および免疫タンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドを含み、該免疫タンパク質は該殺菌性タンパク質を阻害するように構成される。そのような態様において、ドナー細胞は、組換え伝達性プラスミドがレシピエント細胞において殺菌性タンパク質をコードする遺伝子を発現するように、組換え伝達性プラスミドをレシピエント細胞へ接合的に伝達するように構成される。好ましい態様において、殺菌性タンパク質をコードする遺伝子の発現は、レシピエント細胞に対して致死性である。いくつかの態様において、殺菌性タンパク質はコリシンである。いくつかの好ましい態様において、コリシンはcolE3であり、一方、他の好ましい態様において、殺菌性タンパク質は、限定されるわけではないが、colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9、またはリゾチームを含む。本発明のいくつかの態様において、伝達性プラスミドはRSF1010のoriTおよびoriVを含み、ColE3をコードする該遺伝子は、lacプロモーター/オペレーターの制御下にある。いくつかの好ましい態様において、伝達性プラスミドはpCON15-56AまたはpCON19-79である。
【００２０】
いくつかの態様において、ドナー細胞は、ビルレンスの低い(low-virulence)細菌株由来である。いくつかの態様において、このビルレンスの低い株は大腸菌(E. coli)株である。いくつかの好ましい態様において、ビルレンスの低い株は大腸菌83972である。
【００２１】
本発明の組成物は、殺菌性タンパク質の効果を阻害するように構成された免疫タンパク質の使用を企図する。好ましい態様において、免疫タンパク質は、殺菌性タンパク質に結合する。例えば、免疫タンパク質immE3は、殺菌性タンパク質colE3に結合して、阻害する(例えば、不活性化する)。殺菌性タンパク質および対応する免疫タンパク質の多数のペアは、当技術分野において公知である。本発明において、上で列挙された殺菌性タンパク質は、それぞれ、対応するコリシンA、コリシンB、コリシンD、コリシンIa、コリシンIb、コリシンK、コリシンN、コリシンE1、コリシンE2、コリシンE4、コリシンE5、コリシンE6、コリシンE7、コリシンE8、およびコリシンE9免疫タンパク質により阻害される。いくつかの態様において、免疫タンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターは構成的に活性である。いくつかの態様において、プロモーターはPneoである。他の態様において、免疫タンパク質をコードする遺伝子は、誘導性であるプロモーターの制御下にある。いくつかの態様において、ヘルパープラスミドは、pCON1-93またはpCON1-94である。
【００２２】
本発明の組成物は表面を処置するために用いられうることが企図される。本発明の方法および組成物により処置されうる表面は、限定されるわけではないが、医療デバイス、創傷治療デバイス、体腔デバイス、ヒト身体、動物身体、個人用保護デバイス、受胎調節デバイス、および薬物送達デバイスの表面を含む。いくつかの好ましい態様において、デバイスは尿路カテーテルを含む。表面は、限定されるわけではないが、シリコン、プラスチック、ガラス、ポリマー、セラミック、フォトレジスト、皮膚、組織、ニトロセルロース、ヒドロゲル、紙、ポリプロピレン、布、綿、ウール、木、れんが、皮革、ビニール、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、光ファイバー、天然繊維、ナイロン、金属、ゴム、およびそれらの複合物を含む。いくつかの態様において、処置は、表面上においてレシピエント細胞の増殖を阻害し、一方、他の態様において、処置は、表面と接触するレシピエント細胞を殺傷する、または減弱させる。いくつかの態様において、処置は該表面にコロニーを形成する。
【００２３】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００２４】
本明細書に用いられる場合、「被験体」という用語は、本発明の方法または組成物により処置されるべき個体(例えば、ヒト、動物、または他の生物体)を指す。被験体は、限定されるわけではないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど)を含み、最も好ましくは、ヒトを含む。本発明との関連において、「被験体」という用語は、一般的に、病原性細菌の存在により特徴付けられる状態について、または病原性細菌への可能性のある曝露を予測して、処置(例えば、ドナー細胞、および任意で1つまたは複数の他の作用物質、の投与)を受けるであろう、または処置を受けている個体を指す。
【００２５】
本明細書に用いられる場合の「診断された」という用語は、疾患の徴候および症状(例えば、通常の治療に対する抵抗性)、または遺伝学的分析、病理学的分析、組織学的分析などによる、疾患(例えば、病原性細菌の存在により引き起こされた疾患)の識別を指す。
【００２６】
本明細書に用いられる場合、「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的環境内で生じる過程または反応を指す。インビトロ環境は、限定されるわけではないが、試験管および細胞培養物を含む。「インビボ」という用語は、天然の環境、および天然の環境内で生じる過程または反応を指す。
【００２７】
本明細書に用いられる場合、「細胞培養物」という用語は、任意の細胞のインビトロ培養物を指す。この用語には、連続継代細胞系統(例えば、不死の表現型を有する)、初代細胞培養物、有限細胞系統(例えば、非形質転換細胞)、ならびに、卵母細胞および胚を含むインビトロで維持された任意の他の細胞集団が含まれる。
【００２８】
本明細書に用いられる場合、「接合」という用語は、一つの細胞からもう一つへのDNA伝達の過程を指す。接合は主として細菌細胞間で観察されるが、この過程は、細菌細胞から高等および下等真核細胞へと起こる(Waters, Nat Genet. 29:375-376 (2001); Nishikawa et al., Jpn J Genet. 65:323-334 (1990))。接合は、複雑な細胞性機構により媒介され、必須タンパク質成分は、しばしば、プラスミドにおける一連の遺伝子(例えば、プラスミドRK2についてのtra遺伝子)としてコードされる。これらの遺伝子産物の一部は、集合して、直接的な細胞-細胞相互作用(例えば、交配対形成)を促進し、それらの一部は、DNAおよび付随タンパク質分子を伝達する役割、ならびにDNA分子を複製する役割を果たす(例えば、DNA伝達/複製)。oriTは、DNA分子の伝達が接合の過程においてそこから開始するところのDNA配列である。
【００２９】
本明細書に用いられる場合、「接合ドナー」および「ドナー細胞」という用語は、プラスミドを有する細胞（例えば、細菌細胞）を指すために交換可能に用いられ、該プラスミドは、接合を通してもう一つの細胞へ伝達されうる。ドナー細胞の例は、限定されるわけではないが、自己伝達性プラスミドまたは非自己伝達性プラスミドを含む大腸菌株を含む。ドナー細胞由来のプラスミドまたは他の細胞物質を接合伝達を介して受ける細胞は、「レシピエント細胞」と呼ばれる。本明細書に用いられる場合、「伝達性プラスミド」という用語は、ドナー細胞からレシピエント細胞へ接合を介して伝達されうるプラスミドを指す。
【００３０】
本明細書に用いられる場合、「自己伝達性プラスミド」という用語は、接合を媒介するのに必要とされるすべての遺伝子をコードするプラスミドを指す。自己伝達性プラスミドのレシピエントは、自己伝達性プラスミドをもう一つのレシピエント細胞へさらに伝達しうる熟達したドナーになる。
【００３１】
本明細書に用いられる場合、「非自己伝達性プラスミド」または「可動性プラスミド」という用語は、接合を媒介するのに必要とされる遺伝子の一部を欠くプラスミドを指す。非自己伝達性プラスミドを有する細胞は、欠けている遺伝子が同じ細胞内でトランスに供給されない限り、接合を通してDNAを伝達しない。それゆえに、欠けている遺伝子を欠損するレシピエント細胞は、それが非自己伝達性プラスミドを受ける場合、熟達した接合ドナーにならない。
【００３２】
本明細書に用いられる場合、「伝達開始点」または「oriT」という用語は、DNA伝達に必要とされるシス作用性部位を指し、oriT配列の非伝達性プラスミドへの組込みは、それを可動性プラスミドへ変換する(Lanka and Wilins, Annu Rev Biochem, 64:141-169 (1995))。
【００３３】
いくつかの態様において、ドナー細胞は細菌細胞(例えば、グラム陽性またはグラム陰性細菌)である。ドナー細胞の例は、限定されるわけではないが、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属、エルシニア属、シトロバクター属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、クレブシエラ属、ハフニア属、エウィンゲラ属、クライベラ属、モルガネラ属、プラノコッカス属、ストマトコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、アエロモナス属、プレシオモナス属、ヘモフィルス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、リケッチア属、コクシエラ属、ロシャリメア属、エールリヒア属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、アエロコッカス属、双子菌属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディコッカス属、バチルス属、コリネバクテリウム属、アルカノバクテリウム属、アクチノミセス属、ロドコッカス属、リステリア属、エリジペロスリックス属、ガードネレラ属、ナイセリア属、カンピロバクター属、アルコバクター属、ウォリネラ属、ヘリコバクター属、アクロモバクター属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、クリセオモナス属、コマモナス属、エイケネラ属、フラビモナス属、フラボバクテリウム属、モラクセラ属、オリゲラ属、シュードモナス属、シュワネラ属、ウィークセラ属、ザントモナス属、ボルデテラ属、フランシセラ属、ブルセラ属、レジオネラ属、アフィピア属、バルトネラ属、カリマトバクテリウム属、カルジオバクテリウム属、ストレプトバチルス属、スピリルム属、ペプトストレプトコッカス属、ペプトコッカス属、サルシナ属、コプロコッカス属、ルミノコッカス属、プロピオニバクテリウム属、モビルンカス属、ビフィドバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ラクトバチルス属、ロチア属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フソバクテリウム属、バイロフィラ属、レプトトリキア属、ウォリネラ属、アシダミノコッカス属、メガスフェラ属、ベイヨネラ属、ノカルジア属、アクチノマヅラ属、ノカルジオプシス属、ストレプトミセス属、ミクロポリスポラス属、テルモアクチノミセス属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、レプトスピラ属、およびクラミジア属を含む群より選択される細菌属の細菌細胞を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、ドナー細胞は、限定されるわけではないが、細菌ミニ細胞、マキシ細胞、または非分裂細胞を含む生育不能細胞である。
【００３５】
本明細書に用いられる場合、「マキシ細胞」という用語は、例えば、UV照射および延長されたインキュベーションにより、染色体分解を最大にするように処置されている細胞を指す。マキシ細胞は、たいてい、プラスミドDNAを含み、マキシ細胞内でのタンパク質の合成は、本質的には、もっぱら細胞におけるプラスミドDNAから起きる。
【００３６】
本明細書に用いられる場合、「非分裂細胞」または「ND細胞」という用語は、細胞の染色体DNAを優先的に損傷するように選択される様式で(例えば、UVまたは他の照射により)処置されている細胞を指し、該細胞は、染色体分解を最小にするために、例えば、DNA損傷処置後の急速冷却などによりさらに処置される。「ND細胞」はまた、ドナー細菌内での殺菌性タンパク質(例えば、ColE3)の一時的発現のような過程において得られうる。従って、いくつかの態様において、タンパク質(例えば、ColE3)の誘導は、細胞におけるタンパク質合成を破壊し、ColE3合成前に合成された接合器および染色体DNAを無傷のままにしておくと同時に、細胞死へと導く。ND細胞は、染色体DNAおよびプラスミドDNAの両方を含むが、細胞の機能は、例えば、UV照射により、十分変化しており、該ND細胞は分裂する能力が有るか無しかである。
【００３７】
「標的細胞」、「標的」、「レシピエント細胞」、および「レシピエント」という用語は、本明細書で交換可能に用いられる。好ましい態様において、本発明の組成物および方法についての標的細胞は、限定されるわけではないが、接合伝達を介してドナー細胞から物質を受けることができる病原性生物体(例えば、病原性細菌)のような微生物を含む。病原性細菌は、限定されるわけではないが、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属、エルシニア属、シトロバクター属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、クレブシエラ属、ハフニア属、エウィンゲラ属、クライベラ属、モルガネラ属、プラノコッカス属、ストマトコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、アエロモナス属、プレシオモナス属、ヘモフィルス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、リケッチア属、コクシエラ属、ロシャリメア属、エールリヒア属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、アエロコッカス属、双子菌属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディコッカス属、バチルス属、コリネバクテリウム属、アルカノバクテリウム属、アクチノミセス属、ロドコッカス属、リステリア属、エリジペロスリックス属、ガードネレラ属、ナイセリア属、カンピロバクター属、アルコバクター属、ウォリネラ属、ヘリコバクター属、アクロモバクター属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、クリセオモナス属、コマモナス属、エイケネラ属、フラビモナス属、フラボバクテリウム属、モラクセラ属、オリゲラ属、シュードモナス属、シュワネラ属、ウィークセラ属、ザントモナス属、ボルデテラ属、フランシセラ属、ブルセラ属、レジオネラ属、アフィピア属、バルトネラ属、カリマトバクテリウム属、カルジオバクテリウム属、ストレプトバチルス属、スピリルム属、ペプトストレプトコッカス属、ペプトコッカス属、サルシナ属、コプロコッカス属、ルミノコッカス属、プロピオニバクテリウム属、モビルンカス属、ビフィドバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ラクトバチルス属、ロチア属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フソバクテリウム属、バイロフィラ属、レプトトリキア属、ウォリネラ属、アシダミノコッカス属、メガスフェラ属、ベイヨネラ属、ノカルジア属、アクチノマヅラ属、ノカルジオプシス属、ストレプトミセス属、ミクロポリスポラス属、テルモアクチノミセス属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、レプトスピラ属、およびクラミジア属を含む。いくつかの態様において、標的細胞は、継代培養された細胞である。いくつかの態様において、標的細胞は、それらの天然の環境に(例えば、創傷または感染の部位に)存在する、または患者組織から得られた(例えば、生検によって)、培養されていない細胞である。好ましい態様において、標的細胞は、病的成長または増殖を示す。
【００３８】
本明細書に用いられる場合、「ビルレンス」という用語は、例えば、生じた疾患の重症度、または被験体の組織に侵入するそれの能力により示されるような、微生物の病原性の程度を指す。それは一般的に、半致死量(LD50)または半感染量(ID50)により実験的に測定される。この用語はまた、病理学的効果を生じる任意の感染物質の能力を指すために用いられる場合がある。
【００３９】
「キラー遺伝子」という用語は、感受性細胞における発現によって、細胞を殺傷する産物を産生する遺伝子を指す。
【００４０】
「キラープラスミド」という用語は、キラー遺伝子を含むプラスミドを指す。
【００４１】
本明細書に用いられる場合、例えば、レシピエント細胞または標的細胞の特徴に関して本明細書に用いられる時の「減弱させる」および「減弱」という用語は、その特徴を低下させること、もしくは弱めること、またはその特徴の効果を低下させることを指す。例えば、病原体または標的細胞の病原性に関して用いられる場合、減弱は、一般的に、病原体のビルレンスにおける低下を指す。病原体の減弱は、ビルレンスの低下のいずれの特定の機構にも限定されない。いくつかの態様において、ビルレンスの低下は、例えば、分泌性経路の破壊により、達成されうる。他の態様において、ビルレンスの低下は、薬物、例えば、病原体のビルレンスを減弱させる、もしくは病原体を殺傷する薬物に対する反応性または感受性を増加させるように細胞代謝を変化させることにより達成されうる。いくつかの態様において、減弱は、特徴、例えば細胞の集団のビルレンスを意味する。例えば、本発明のいくつかの態様において、病原体細胞の集団は、細胞の集団がビルレンスを減少するように、例えば、本発明の方法および組成物により処置される。例えば、同時係属中の2005年5月26日に出願された特許出願第11/137,948号、およびExpress Mail Label No. EV 850782307 USの下で2006年5月26日に出願されたPCT出願を参照されたい。各出願は、あらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００４２】
本明細書に用いられる場合、「ビルレンス」という用語は、例えば、生じた疾患の重症度、または被験体の組織に侵入するそれの能力により示されるような、微生物の病原性の程度を指す。それは一般的に、半致死量(LD50)または半感染量(ID50)により実験的に測定される。その用語はまた、病理学的効果を生じる任意の感染物質の能力を指すために用いられる場合がある。
【００４３】
本明細書に用いられる場合、「有効量」という用語は、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な組成物(例えば、ドナー細胞)の量を指す。有効量は、1回もしくは複数回の投与、適用、または用量で投与され、特定の剤形または投与経路に限定されるとは意図されない。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、「投与」という用語は、薬物、プロドラッグ、もしくは他の作用物質、または治療的処置(例えば、本発明の組成物)を生理学系(例えば、被験体、またはインビボ、インビトロ、もしくはエクスビボの細胞、組織、および器官)に与えるという行動を指す。ヒト身体への投与の例示的な経路は、眼(眼の)、口(経口の)、皮膚(経皮的な)、鼻(鼻の)、肺(吸入する)、口腔粘膜(頬の)、耳を通して、注射による(例えば、静脈内に、皮下に、腫瘍内に、腹腔内になど)、膀胱への導入によるなどでありうる。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、「表面を処置すること」という用語は、本発明の1つまたは複数の組成物へ表面を曝露するという行動を指す。表面を処置する方法は、限定されるわけではないが、スプレーすること、霧吹きすること、浸すこと、およびコーティングすることを含む。
【００４６】
本明細書に用いられる場合、「同時投与」という用語は、少なくとも2つの作用物質(例えば、それぞれが異なるプラスミドを含む、2つの別々のドナー細菌)または治療の被験体への投与を指す。いくつかの態様において、2つ以上の作用物質または治療の同時投与は、同時である。他の態様において、第一作用物質/治療は、第二作用物質/治療の前に投与される。当業者は、用いられる様々な作用物質もしくは治療の剤形および/または投与経路が変わりうることを理解している。同時投与についての適切な用量は、当業者により容易に決定されうる。いくつかの態様において、作用物質または治療が同時投与される場合、それぞれの作用物質または治療は、それらの単独での投与について適切であるものより低い用量で投与される。従って、同時投与は、作用物質または治療の同時投与が、潜在的に有害な(例えば、有毒な)作用物質の必要用量を低下させる態様において、特に望ましい。
【００４７】
本明細書に用いられる場合、「有毒な」という用語は、毒物の投与前の同じ細胞または組織と比較した、被験体、細胞、または組織への任意の不利益なまたは有害な効果を指す。
【００４８】
本明細書に用いられる場合、「薬学的組成物」という用語は、組成物をインビトロ、インビボ、もしくはエクスビボでの診断的または治療的使用に特に適しているように作製した、不活性または活性の担体と活性作用物質(例えば、ドナー細菌細胞)との組み合わせを指す。
【００４９】
本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は、被験体に投与される場合、実質的に、有害反応、例えば、有毒な、アレルギー性の、または免疫学的な反応を生じない組成物を指す。
【００５０】
本明細書に用いられる場合、「局所に」という用語は、本発明の組成物の、皮膚および粘膜の細胞ならびに組織(例えば、歯槽の、頬の、舌の、咀嚼器官の、または鼻の粘膜、ならびに中空器官または体腔、例えば、膀胱の内側を覆う他の組織および細胞)の表面への適用を指す。
【００５１】
本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳濁液(例えば、水中油滴形または油中水滴形乳濁液のような)、および様々な型の湿潤剤、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、ラウリル硫酸ナトリウム、等張性吸収遅延剤、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)などを含む標準的な薬学的担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含みうる。担体、安定剤、および補助剤の例について。(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975)を参照)。さらに、特定の態様において、本発明の組成物は、園芸または農業利用のために製剤化されうる。そのような剤形は、浸漬液、スプレー、種子粉衣、茎部注入、スプレー、および噴霧を含む。
【００５２】
本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、標的被験体(例えば、哺乳動物被験体、および/またはインビボもしくはエクスビボの細胞、組織、もしくは器官)において生理学的に許容される本発明の化合物の任意の塩(例えば、酸または塩基との反応により得られる)を指す。本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から導かれうる。酸の例は、限定されるわけではないが、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、スルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを含む。蓚酸のような他の酸は、それ自体では薬学的に許容されていないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として、有用な塩の調製に用いられうる。
【００５３】
塩基の例は、限定されるわけではないが、アルカリ金属(例えば、ナトリウム)水酸化物、アルカリ土類金属(例えば、マグネシウム)水酸化物、アンモニア、および式NW4+(WがC1-4アルキルである)の化合物などを含む。
【００５４】
塩の例は、限定されるわけではないが、以下を含む：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、カンフォレート(camphorate)、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、蓚酸塩、パルモエート(palmoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩など。塩の他の例は、Na+、NH4+、およびNW4+(WがC1-4アルキル基である)のような適した陽イオンと化合した本発明の化合物の陰イオンなどを含む。治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるように企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において、使用を見出しうる。
【００５５】
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されるように企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において、使用を見出しうる。
【００５６】
本明細書に用いられる場合、「医療デバイス」という用語は、例えば、医学的処置(例えば、疾患または傷害について)の過程において、被験体の、もしくは患者の身体の上で、中で、または通して用いられる、任意の材料またはデバイスを含む。医療デバイスは、限定されるわけではないが、医療インプラント、創傷治療デバイス、薬物送達デバイス、ならびに体腔および個人用保護デバイスのような品目を含む。医療インプラントは、限定されるわけではないが、尿路カテーテル、血管内カテーテル、透析用シャント、創傷排液チューブ、皮膚縫合、血管移植片、埋め込み型メッシュ、眼内デバイス、心臓弁などを含む。創傷治療デバイスは、限定されるわけではないが、一般的な創傷包帯、生物学的移植片材料、テープクロージャーおよび包帯、ならびに手術切開用無菌布を含む。薬物送達デバイスは、限定されるわけではないが、針、薬物送達皮膚パッチ、薬物送達粘膜パッチ、および医療用スポンジを含む。体腔および個人用保護デバイスは、限定されるわけではないが、タンポン、スポンジ、手術用および検査用手袋、ならびに歯ブラシを含む。受胎調節デバイスは、限定されるわけではないが、子宮内器具(IUD)、ペッサリー、およびコンドームを含む。
【００５７】
本明細書に用いられる場合、「治療剤」という用語は、病原性微生物に接触した被験体において感染性、罹患率、もしくは死亡の発生を減少させる、または病原性微生物に接触した宿主において感染性、罹患率、もしくは死亡の発生を防ぐ組成物を指す。本明細書に用いられる場合、治療剤は、例えば、病原体の非存在下において、病原体への可能性のある将来の曝露を考慮して、予防的に用いられる作用物質を含む。そのような作用物質は、追加として、薬学的に許容される化合物(例えば、補助剤、賦形剤、安定剤、希釈剤など)を含む。いくつかの態様において、本発明の治療剤は、局所用組成物、注射可能組成物、摂取可能組成物などの形をとって投与される。経路が局所である場合、形は、例えば、溶液、クリーム、軟膏、膏薬、またはスプレーでありうる。
【００５８】
本明細書に用いられる場合、「病原体」という用語は、宿主において疾患状態(例えば、感染、癌など)を引き起こす生物学的作用物質を指す。「病原体」は、限定されるわけではないが、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオン、および寄生生物を含む。
【００５９】
「細菌(bacteria)」および「細菌(bacterium)」は、原核生物界における門の全部の中のものを含むすべての原核生物を指す。その用語は、マイコプラズマ属、クラミジア属、アクチノミセス属、ストレプトミセス属、およびリケッチア属を含む細菌であると考えられるすべての微生物を含むことが意図される。球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含むあらゆる型の細菌が、この定義内に含まれる。この用語内にはまた、グラム陰性またはグラム陽性である原生生物も含まれる。「グラム陰性」および「グラム陽性」は、当技術分野において周知であるグラム染色方法での染色パターンを指す。(例えば、Finegold and Martin, Diagnostic Microbiology, 6th Ed., CV Mosby St. Louis, pp. 13-15 (1982)参照)。「グラム陽性細菌」は、グラム染色に用いられる一次染料を保持する細菌であり、グラム染色により、染色された細胞は一般的に、顕微鏡下で紺青色〜紫色に見える。「グラム陰性細菌」は、グラム染色で用いられる一次染料を保持しないが、対比染色により染色される。従って、グラム陰性細菌は一般的に、赤色に見える。
【００６０】
本明細書に用いられる場合、「微生物」という用語は、限定されるわけではないが、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、および寄生生物を含む任意の種または型の微生物を指す。本発明は、それに含まれるいくつかの微生物がまた、被験体に対して病原性であることを企図する。
【００６１】
本明細書に用いられる場合、「真菌」という用語は、二形性真菌を含むカビおよび酵母のような真核生物に関して用いられる。
【００６２】
本明細書に用いられる場合、「非ヒト動物」という用語は、限定されるわけではないが、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ綱などのような脊椎動物を含むすべての非ヒト動物を指す。
【００６３】
本明細書に用いられる場合、「核酸分子」という用語は、限定されるわけではないが、DNAまたはRNAを含む、任意の核酸含有分子を指す。その用語は、限定されるわけではないが、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシル-メチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、および2,6-ジアミノプリンを含む、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を含む。
【００６４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体、またはRNA(例えば、rRNA、tRNA)の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA)配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列により、または完全長もしくは断片の所望の活性もしくは機能的性質(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など)が保持される限りコード配列の任意の部分により、コードされうる。その用語はまた、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するように、構造遺伝子のコード領域、ならびに5'末端および3'末端の両方においてコード領域に隣接して、どちらの末端にも約1kbまたはそれ以上の距離の間に位置する配列を含む。コード領域の5'側に位置し、かつmRNAに存在する配列は、5'非翻訳配列、または5'フランキング配列と呼ばれる。コード領域の3'側または下流に位置し、かつmRNAに存在する配列は、3'非翻訳配列または3'フランキング配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNA型およびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」もしくは「介在配列」と名付けられた非コード配列で中断されるコード領域を含む。イントロンは、プレmRNAへ転写される遺伝子のセグメントである；イントロンはエンハンサーのような制御エレメントを含みうる。イントロンは、一般的に、一次(プレmRNA)転写産物から除去される、または「スプライスされて出される」；イントロンは、それゆえに、一般的に、メッセンジャーRNA(mRNA)転写産物に存在しない。mRNAは、翻訳中、新生ポリペプチドにおいてアミノ酸の配列または順番を特定するように機能する。
【００６５】
本明細書に用いられる場合、「異種性遺伝子」および「異種性核酸」という用語は、その天然の環境で存在しない遺伝子または核酸を指す。例えば、異種性遺伝子または核酸は、別の種へ導入された一つの種由来の遺伝子または核酸を含む。異種性遺伝子または核酸はまた、どこか(例えば、突然変異した、複数コピーで付加された、非天然制御配列に連結された、など)変化している生物体原産の遺伝子または核酸を含む。異種性遺伝子または核酸は、異種性遺伝子または核酸配列が、典型的には、染色体においてその遺伝子もしくは核酸配列と結合しては天然では見出されないDNA配列に連結されている点、または天然で見出されない染色体の部分と結合している(例えば、その遺伝子が通常には発現しない座において発現する遺伝子)点において、内因性遺伝子または核酸と区別される。
【００６６】
本明細書に用いられる場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子においてコードされた遺伝的情報を遺伝子の「転写」を通して(すなわち、RNAポリメラーゼの酵素作用によって)RNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA)へ、およびタンパク質をコードする遺伝子については、mRNAの「翻訳」を通してタンパク質へ、変換する過程を指す。遺伝子発現は、過程における多くの段階で制御されうる。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物の産生を増加させる制御を指し、一方、「下方制御」または「抑圧」は、産生を減少させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子(例えば、転写因子)は、しばしば、それぞれ、「アクチベーター」および「リプレッサー」と呼ばれる。
【００６７】
「野生型」という用語は、天然の源から単離される形をとる遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団において最も頻繁に観察されるものであり、従って、適宜、遺伝子の「正常」形または「野生型」形と名付けられる。対照的に、「改変型」または「突然変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合、配列および/または機能的性質における改変(すなわち、変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の突然変異体が単離されうることに留意されたい；これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合、それらが変化した特徴(変化した核酸配列を含む)をもつという事実により同定される。
【００６８】
本明細書に用いられる場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、および「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順番を決定する。DNAにおけるヌクレオチドの配列は、従って、対応するポリペプチドにおけるアミノ酸の配列をコードする。
【００６９】
本明細書に用いられる場合、「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、または言い換えれば、遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNAの形で存在しうる。DNAの形で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖(すなわち、センス鎖)または二本鎖でありうる。エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどのような適した調節エレメントは、転写の適切な開始および/または一次RNA転写産物の正しいプロセシングを可能にするために必要とされる場合には、遺伝子のコード領域に近接して配置されうる。または、本発明の発現ベクターに利用されるコード領域は、内因性エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性調節エレメントの両方の組み合わせを含みうる。
【００７０】
本明細書に用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖ポリヌクレオチド鎖の短い長さを指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、200残基未満の長さ(例えば、15と100の間)であるが、本明細書に用いられる場合、その用語はまた、より長いポリヌクレオチド鎖を含むことが意図される。オリゴヌクレオチドは、しばしば、それらの長さによって呼ばれる。例えば、24残基オリゴヌクレオチドは、「24-mer」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズすることにより、または他のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、二次および三次構造を形成することができる。そのような構造は、限定されるわけではないが、二重鎖、ヘアピン、十字形、屈曲、および三重鎖を含みうる。
【００７１】
本明細書に用いられる場合、「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対形成ルールにより関係づけられたポリヌクレオチドに関して(すなわち、オリゴヌクレオチドのようなヌクレオチドまたは標的核酸の配列)用いられる。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は配列「3'-T-C-A-5'」と相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成ルールに従ってマッチしている。または、核酸間に「完全な」または「全部の」相補性がありうる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さへ有意な効果を生じる。これは、核酸間の結合に依存する増幅反応および検出方法において特に重要である。どちらの用語もまた、個々のヌクレオチドに関して、特にポリヌクレオチドという文脈において、用いられうる。例えば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、もう一つの核酸鎖内のヌクレオチドに対するそれの相補性またはその欠如について、オリゴヌクレオチドの残りと核酸鎖の間の相補性と対比または比較して、言及されうる。
【００７２】
「相同性」という用語は、核酸分子のような分子間の類似性の程度を指す。部分的相同性または完全な相同性(すなわち、同一性)がありうる。完全に相補的な核酸分子が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する核酸分子の部分的に相補的な配列は、「実質的に相同的」である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションアッセイ(サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて調べられうる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で完全に相同的な核酸分子の標的への結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)において競合し、かつ阻害する。これは、低ストリンジェンシーの条件が、非特異的結合が許されるほどのものであると言うべきではない；低ストリンジェンシー条件は、2つの配列のお互いへの結合が特異的な(すなわち、選択的な)相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、実質的に非相補的である(例えば、約30%未満の同一性)第二標的の使用により試験されうる；非特異的結合の非存在下において、プローブは第二の非相補的標的にハイブリダイズしない。
【００７３】
cDNAまたはゲノムクローンのような二本鎖核酸配列に関して用いられる場合、「実質的に相同的な」という用語は、上記のように、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができる任意の核酸を指す。一本鎖核酸配列に関して用いられる場合、「実質的に相同的な」という用語は、上記のように、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列の相補体にハイブリダイズすることができる(すなわち、それは相補体である)任意の核酸を指す。
【００７４】
遺伝子は、一次RNA転写産物のディファレンシャルスプライシングにより生成される複数のRNA種を産生しうる。同じ遺伝子のスプライスバリアントであるcDNAは、配列同一性または完全な相同性の領域(両方のcDNAにおける同じエクソン、または同じエクソンの部分の存在を表す)、および完全な非同一性の領域(例えば、cDNA2が代わりにエクソン「B」を含む、cDNA1におけるエクソン「A」の存在を表す)を含む。2つのcDNAは配列同一性の領域を含むため、それらは、両方のcDNAに見出される配列を含む全遺伝子または遺伝子の部分から導かれたプローブに両方ともハイブリダイズする；2つのスプライスバリアントは、それゆえに、そのようなプローブと、およびお互いと、実質的に相同である。
【００７５】
本明細書に用いられる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ(すなわち、核酸間の会合の強さ)は、核酸間の相補性の程度、含まれる条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比のような因子により影響される。その構造内に相補的な核酸の対形成を含む単一分子は、「自己ハイブリダイズ」していると言われる。
【００７６】
本明細書に用いられる場合、ヌクレオチド配列に関する時の「部分」という用語(「所定のヌクレオチド配列の部分」においてのような)は、その配列の断片を指す。断片は、サイズが4ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列マイナス1ヌクレオチドまでの範囲でありうる(10ヌクレオチド、20、30、40、50、100、200など)。
【００７７】
本明細書に用いられる場合、「機能的な組み合わせで」、「機能的な順番で」、および「機能的に連結される」という用語は、所定の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指揮する能力がある核酸分子が産生されるような様式での核酸配列の連結を指す。その用語はまた、機能性タンパク質が産生されるような様式でのアミノ酸配列の連結を指す。
【００７８】
「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」においてのような核酸に関して用いられる時の「単離された」という用語は、同定され、かつそれが、その天然の源において通常、付随している少なくとも1つの成分または夾雑物から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、それが天然で見出されるのとは異なるように、ある形または設定で存在する。対照的に、単離されていない核酸は、それらが天然で存在する状態で見出されるDNAおよびRNAのような核酸である。例えば、所定のDNA配列(例えば、遺伝子)は、宿主細胞染色体上で隣接遺伝子の近くに見出される；特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列のようなRNA配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として細胞内に見出される。しかしながら、所定のタンパク質をコードする単離された核酸は、例として、核酸が天然の細胞のとは異なる染色体位置にある、またはそうでなければ、天然で見出されるものとは異なる核酸配列に隣接している、所定のタンパク質を普通に発現する細胞におけるそのような核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形で存在しうる。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、センス鎖またはコード鎖を最小限に含むが(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖でありうる)、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含みうる(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖でありうる)。
【００７９】
本明細書に用いられる場合、「精製された」または「精製すること」という用語は、試料からの成分(例えば、夾雑物)の除去を指す。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去により精製される；それらはまた、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去により精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去および/または標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去は、結果として、試料において標的反応性免疫グロブリンの割合(%)における増加をもたらす。もう一つの例において、組換えポリペプチドは、細菌宿主細胞において発現し、ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質の除去により精製される；組換えポリペプチドの割合(%)は、それにより、試料において増加する。さらにもう一つの例において、試料における核酸は、試料から1つもしくは複数の成分を除去するまたは低減させることにより精製される。精製において低減または除去されるべき成分は、他の核酸、損傷核酸、タンパク質、塩などを含む。
【００８０】
「アミノ酸配列」、および「ポリペプチド」または「タンパク質」のような用語は、列挙されたタンパク質分子に関連した完全な天然のアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定するとは意図されない。
【００８１】
本明細書に用いられる場合、「天然タンパク質」という用語は、タンパク質がベクター配列によりコードされたアミノ酸残基を含まないことを示す；すなわち、天然タンパク質は、それが天然で存在しているとおり、タンパク質に見出されるそれらのアミノ酸のみを含む。天然タンパク質は、組換え手段により産生されうる、または天然源から単離されうる。
【００８２】
本明細書に用いられる場合、タンパク質に関する時の「部分」という用語(「所定のタンパク質の部分」においてのような)は、そのタンパク質の断片を指す。断片は、サイズが4アミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸までの範囲でありうる。
【００８３】
本明細書に用いられる場合、「細胞培養物」という用語は、任意の細胞のインビトロ培養物を指す。この用語内には、連続継代細胞系統(例えば、不死の表現型を有する)、初代細胞培養物、形質転換細胞系統、有限細胞系統(例えば、非形質転換細胞)、ならびにインビトロで維持された任意の他の細胞集団が含まれる。
【００８４】
用いられる場合、「真核生物」という用語は、「原核生物」と識別可能な生物体を指す。その用語は、内に染色体が存在する、核膜により境界を示された真核の存在、膜結合性オルガネラの存在、真核生物に共通して観察される他の特徴のような、真核生物の通常の特徴を示す細胞を有するすべての生物体を含むことが意図される。従って、その用語は、限定されるわけではないが、真菌、原生動物、および動物(例えば、ヒト)のような生物体を含む。
【００８５】
本明細書に用いられる場合、「トランスドミナントネガティブ突然変異体遺伝子」という用語は、変異していない(すなわち、野生型配列を有する)同じ遺伝子または遺伝子産物の他のコピーを適切に機能できないように妨げる(例えば、野生型タンパク質機能を阻害することにより)タンパク質産物をコードする遺伝子を指す。トランスドミナントネガティブ突然変異体遺伝子の産物は、本明細書では「ドミナントネガティブ」または「DN」(例えば、ドミナントネガティブタンパク質、またはDNタンパク質)と呼ばれる。
【００８６】
本明細書に用いられる場合、「キット」という用語は、材料を送達する任意の送達システムを指す。ドナー細胞のような反応材料の関連において、そのような送達システムは、一つの場所から別の場所への反応試薬(例えば、適切な容器における細胞、緩衝液、選択試薬など)および/もしくは補助材料(例えば、培地、材料を用いて実施するための書面の使用説明書など)の貯蔵、輸送、または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連した反応試薬および/または補助材料を含む1つまたは複数の封入物(例えば、箱)を含む。本明細書に用いられる場合、「細分化キット」という用語は、それぞれが全キット構成要素のサブ部分(subportion)を含む2つ以上の別々の容器を含む送達システムを指す。容器は、いっしょにまたは別々に、所定のレシピエントへ送達されうる。例えば、第一容器は特定の使用のための細胞を含み、第二容器は選択培地を含む。「細分化キット」という用語は、Federal Food, Drug and Cosmetic Actのセクション520(e)下で規制された分析物特異試薬(Analyte specific reagents)(ASR's)を含むキットを含むことが意図される。実際、それぞれが全キット構成要素のサブ部分を含む2つ以上の別々の容器を含む任意の送達システムは、「細分化キット」という用語に含まれる。対照的に、「混合型(combined)キット」は、特定の使用に必要とされる反応材料の構成要素の全部を単一の容器に(例えば、求められる構成要素のそれぞれを収納する単一の箱に)含む送達システムを指す。「キット」という用語は、細分化キットおよび混合型キットの両方を含む。
【００８７】
本明細書に用いられる場合、「細胞代謝機能」という用語は、ゲノム複製以外の、細胞により行われる任意またはすべての過程(例えば、細胞機能に関連した酵素的または化学的過程)を指す。
【００８８】
発明の詳細な説明
皮膚病変について処置中の多くの型の患者は、長期入院、複数回の手術、医学的介入、および輸血を必要とする(例えば、熱傷被害者、または慢性潰瘍を有する糖尿病患者)。いくつかの研究は、外傷および外科の重症度とこれらの患者の敗血症を発症しうる素因の間の因果関係を示している(例えば、Angele and Faist, Crit Care 6, 298 (2002); Roumen et al., Ann Surg 218, 769 (1993)参照)。
【００８９】
未解決の敗血症は、多臓器不全および最終的に死へと導く。臓器不全は、外傷および外科患者における死亡の主な原因である。過剰炎症反応および細胞性免疫の抑制は、これらの患者を感染合併症に罹りやすくする(例えば、Angele and Faist, Crit Care 6, 298 (2002); Faist, Curr Top Microbiol Immunol 216, 259 (1996);およびSchinkel et al., J Trauma 44, 743 (1998)参照)。
【００９０】
毎年、尿路カテーテルは、救急病院および拡張看護施設において5百万人より多い患者に挿入されている(Maki, D.G. and P.A. Tambyah, Emerg Infect Dis 7(2):342-7 (2001))。尿排液のためのカテーテルの使用は、尿路閉塞をもつ患者にとって、正確な出力モニタリングが必要とされる状況にとって、ならびに周術期における選択された泌尿器科的および婦人科的手順にとって、不可欠である(Nicolle, L.E. Drugs Aging 22(8):627-39 (2005))。たまに、長期留置カテーテルが褥瘡の治癒を助けるために用いられる；それらはまた、時々、失禁または尿貯留の管理のために用いられる。尿路カテーテルの最も頻繁にある合併症はUTIであり、カテーテル関連UTI(CAUTI)は、総施設内感染の40%より多くを含む、病院および老人ホームにおいて最もよくある院内感染である。
【００９１】
近年は、いくつかの多抗生物質耐性細菌株の出現が、重傷を負った患者における院内感染の処置を極めて難しくさせている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ならびに緑膿菌およびアシネトバクター・バウマニ(A. バウマニ)の多剤耐性株は、重傷を負った患者において管理し、絶滅させるのが最も困難な感染のいくつかの中である。A. バウマニは、しばしば、汎薬剤耐性かまたは極めて有毒の抗生物質コリスチンに対してのみ感受性があるかのいずれかである。A. バウマニの発生は、より一般的にかつより広範囲になりつつある。これらの汎耐性感染と戦うための効率的かつ強力な治療用兵器庫を提供する新規ストラテジーが必要とされる。
【００９２】
従って、いくつかの態様において、本発明は、1つまたは複数のプラスミド(例えば、自己伝達性または非自己伝達性プラスミド)を含むドナー細胞(例えば、病原性または非病原性細菌、非分裂細胞)を含む治療的処置を提供し、プラスミドはドナー細胞から標的/レシピエント細胞(例えば、病原性微生物)へ伝達することができ(例えば、接合を通して)、結果として、標的においてその遺伝物質を発現するプラスミドが生じる。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明は、伝達性プラスミドを含むドナー細胞を提供し、レシピエント細胞の細胞機能、例えば、ビルレンス因子を変化させるために、プラスミドをドナー細胞からレシピエント細胞(例えば、病原性微生物)へ伝達することができ(例えば、接合を通して)、結果として、レシピエント細胞においてその遺伝物質を発現するプラスミドが生じる。好ましい態様において、伝達性プラスミドは組換え伝達性プラスミドである。ドナー細胞から標的レシピエント細胞へ遺伝物質を伝達するための接合は、様々な目的に対して記載されている。例えば、PCT公開WO 02/18605、米国特許出願第20040137002号、および米国特許出願第10/884,257号を参照のこと。各出願は、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる。本発明は、レシピエント細胞の細胞機能を変化させるために、例えば、標的細胞を殺傷するまたは障害するために、接合伝達を用いる。
【００９４】
本発明によるレシピエント細胞の改変はまた、そのようなレシピエント細胞の薬物、例えば、抗生物質に対する応答を変化させるためにそのような細胞を変化させる段階を含むことが企図される。レシピエント細胞が薬物に対して感受性を有する、または薬物に対する感受性もしくは応答の増加を有するように、そのレシピエント細胞の代謝を変化させうるレシピエント細胞への任意の改変は、本発明の方法、組成物、および系により達成されることが企図される。いくつかの態様において、本発明の伝達性プラスミドは、抗生物質のような薬物を破壊または不活性化する病原体の能力を阻害することができる因子をコードする。例えば、伝達性プラスミドの発現産物は、抗生物質を破壊または不活性化することができる病原体酵素の能力を乱しうる。他の態様において、伝達性プラスミドの発現産物は、病原体細胞の上もしくは中に抗生物質についての受容体を提供しうる、または病原体細胞の上もしくは中に抗生物質についての欠陥受容体を回復させうる。さらに他の態様において、伝達性プラスミドの発現産物は、抗生物質の病原体細胞への侵入を促進しうる、または抗生物質を病原体細胞から外へ輸送する病原体細胞の能力を阻害しうる。
【００９５】
いくつかの態様において、伝達性プラスミドの発現産物は、プロドラッグのような不活性薬物を活性型、例えば、レシピエント細胞が応答性である型へ代謝する働きをしうる。活性薬物を形成するように代謝されるプロドラッグの使用は、薬物耐性機構を迂回する際に、および選択的処置、例えば、適切な伝達性プラスミドを受けている細胞の標的化を提供する際に、特に有益でありうる。
【００９６】
伝達性プラスミド
RK2接合系は、グラム陰性細菌宿主(例えば、大腸菌)からのDNA伝達の非常に熟達した過程であり、RK2プラスミドは界を通してまでも接合できる(例えば、Bates et al., J Bacteriol 180, 6538-6543 (1998); Waters, Nat Genet 29, 375-376 (Dec, 2001)参照)。RK2は、動物または酵母細胞において安定に複製する能力がないが、DNA伝達は起こる。従って、機能的RK2接合機構は、多数のグラム陰性細菌宿主からプラスミドDNAを動員する(mobilize)ことができる。適切な増殖性(vegetative)複製開始点が導入される限り、プラスミドはこれらのドナー(大腸菌および他のグラム陰性ドナー)から他のグラム陰性標的株へ、およびさらにはグラム陽性標的株へと動員することができ(例えば、Giebelhaus et al., J Bacteriol 178, 6378-6381 (1996)参照)、接合完了体が生じることが示されている。接合性プラスミドの大多数は強い類似性を共有するため、本発明の接合系はRK2に限定されず、任意の他の系が送達系として働くことができる。
【００９７】
例えば、限定されるわけではないが、RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600を含む複数の他の接合系は、本発明においての使用に適していることが企図される。いくつかの態様において、2つ以上の接合系が同時に用いられる。すでに記載されたものに加えて、本発明において使用を見出す例示的なプラスミドは、限定されるわけではないが、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第20040137002号、第20040224340号、および第10/884,257号のプラスミドを含む。
【００９８】
キラープラスミド
機構の理解は本発明を実施するために必要ではないし、かつ本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されないが、いくつかの態様において、ドナー細胞は、標的へ接合的に伝達される伝達性プラスミドを含み、プラスミドによりコードされる1つまたは複数の産物が発現し(例えば、mRNAまたはタンパク質を生成するように)、結果として、標的細胞の殺傷またはそれらの増殖の阻害を生じることが企図される(例えば、実施例6および7参照)。いくつかの態様において、ドナー細胞はさらに、ヘルパープラスミドを含む。いくつかの態様において、伝達性プラスミドは、自己伝達性プラスミドである。
【００９９】
いくつかの態様において、ドナー細胞は、殺菌性であるポリアミノ酸(例えば、ポリペプチドまたはタンパク質)をコードする核酸を含む非自己伝達性プラスミド(例えば、pCON15-56A)を含む。好ましい態様において、ドナー細胞はさらに、ドナー細胞内で非自己伝達性プラスミドのポリアミノ酸の殺菌性質を中和する能力があるポリアミノ酸をコードする核酸を含む(例えば、免疫タンパク質；例えば、実施例2および4参照)。好ましい態様において、中和ポリアミノ酸をコードする遺伝子は、限定されるわけではないが、pCON1-93またはpCON1-94を含むヘルパープラスミド上にある。いくつかの態様において、殺菌性ポリアミノ酸を中和する能力があるポリアミノ酸は、構成的プロモーターの制御下である。いくつかの態様において、殺菌性ポリアミノ酸を中和する能力があるポリアミノ酸は、誘導性プロモーターの制御下である。機構の理解は本発明を実施するために必要ではないし、かつ本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されないが、いくつかの態様において、殺菌性ポリアミノ酸を中和する能力があるポリアミノ酸および殺菌性ポリアミノ酸は、ドナー細菌内で無毒性複合体を形成し、複合体はドナー細菌の外側へ分泌され、複合体または成分部分は標的細胞上の受容体に結合し、標的細胞へ転位置され、標的細胞死が結果として起こることが企図される。
【０１００】
いくつかの態様において、殺菌性ポリアミノ酸は、colE3遺伝子によりコードされる。本発明は、用いられる殺菌性遺伝子の型によって限定されない。実際、限定されるわけではないが、colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9、およびリゾチームをコードする遺伝子を含む様々な殺菌性遺伝子が企図される。いくつかの態様において、自己伝達性または非自己伝達性プラスミドは、殺菌性ポリアミノ酸の発現を作動するプロモーター(例えば、lacプロモーター/オペレーター)を含む。いくつかの態様において、ヘルパープラスミドは、殺菌性遺伝子の発現を阻害する能力があるリプレッサータンパク質(例えば、lacI)をコードする。いくつかの態様において、リプレッサータンパク質は、構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの態様において、リプレッサータンパク質は、誘導性プロモーターの制御下にある。
【０１０１】
上記のように、好ましい態様において、本発明のドナー細胞は、伝達性プラスミドにより発現した殺菌性タンパク質を阻害または中和する免疫タンパク質を含む。殺菌性タンパク質および対応する免疫タンパク質の多数のペアは当技術分野において公知である。本発明において、上で列挙された殺菌性タンパク質は、それぞれ、対応するコリシンA、コリシンB、コリシンD、コリシンIa、コリシンIb、コリシンK、コリシンN、コリシンE1、コリシンE2、コリシンE4、コリシンE5、コリシンE6、コリシンE7、コリシンE8、およびコリシンE9免疫タンパク質により阻害される。殺菌性タンパク質(例えば、バクテリオシン)および中和免疫タンパク質のさらに他の組み合わせは、当技術分野において公知である(例えば、ワールドワイドウェブサイトus.expasy.org/cgi-bin/get-entries?KW=Bacteriocin%20immunity、Swiss Institute of Bioinformatics(SIB)のExPASy(Expert Protein Analysis System)プロテオミクスサーバー上におけるバクテリオシン免疫タンパク質の例示的な表を参照)。いくつかの態様において、免疫タンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターは構成的に活性である。いくつかの態様において、プロモーターはPneoである。他の態様において、免疫タンパク質をコードする遺伝子は、誘導性であるプロモーターの制御下にある。いくつかの態様において、ヘルパープラスミドは、pCON1-93またはpCON1-94である。
【０１０２】
様々な自己伝達性プラスミドおよび非自己伝達性プラスミドが本発明において企図される。例えば、いくつかの態様において、本発明は、プラスミドRSF1010をプラスミドの構築のためのバックボーンとして利用する。いくつかの態様において、プラスミドは、pACYC177の誘導体である。本発明のプラスミドを含む組成物は研究および治療の適用において使用を見出すことが企図される。
【０１０３】
ドナー細胞
ドナー細菌
任意の型の細菌(例えば、グラム陽性およびグラム陰性細菌)が本発明においてドナー細胞として用いられうることが企図される(例えば、実施例1参照)。いくつかのアプローチは、ドナー細菌の伝播(例えば、増殖)を防ぐために採用されうる。ドナーとして非分裂細胞を用いること(例えば、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる、2004年7月2日に出願された米国特許出願第10/884,257号を参照)に加えて、いくつかの他のアプローチは、限定されるわけではないが、温度感受性突然変異(例えば、アミノアシル-tRNAシンセターゼおよびRNアーゼP突然変異)、栄養要求性突然変異体(例えば、dapAおよびaroA)、セリン突然変異、および/またはアミノ酸合成における他の突然変異もしくは欠損を有するドナーを用いることを含む。これらの例は、本発明の範囲を限定するとは意図されない。当業者は、ドナー細菌を減弱させるために用いられうる代替アプローチがあることをすぐに理解するものと思われる。これらの突然変異は、分析されており、当技術分野において周知であり、これらの突然変異の新しく得られた細菌ドナーへの導入は、十分、当業者が対応できる範囲にある。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明のドナー細菌細胞は、温度感受性突然変異を含む。温度感受性突然変異体は、その同質遺伝子的な野生型細菌と比較して温度のある特定の範囲内で異常に増殖する。突然変異体において、RNAまたはタンパク質における突然変異は、突然変異体が実験室においてそれらの許容温度で増殖できるように、温度に対して感受性がある効果、例えば、立体構造における変化、をもたらす；しかしながら、それらは、非許容(例えば、より高い)温度で(例えば、体温で)ひどい増殖欠陥をもつ。
【０１０５】
これらの突然変異の例は、アミノアシル-tRNAシンセターゼ(例えば、Sakamoto et al., J Bacteriol 186, 5899-5905 (2004); Martin et al., J Bacteriol 179, 3691-3696 (1997)参照)およびRNアーゼP(Li, RNA 9, 518-532 (2003); Li and Altman, Proc Natl Acad Sci USA 100, 13213-13218 (2003))を含む。アミノアシル-tRNAシンセターゼは、特定のアミノ酸の、対応するtRNAの3'末端アデノシンへのエステル化を触媒し、RNアーゼPは、すべての生物体においてtRNAの成熟5'末端を生じるために非常に重要なリボヌクレアーゼである(Gopalan et al., J Biol Chem 277, 6759-6762 (2002))。これらの酵素機能における欠陥は、細胞におけるタンパク質合成を妨げる。
【０１０６】
いくつかの態様において(例えば、グラム陽性細菌が標的である場合)、グラム陽性ドナーが用いられる。グラム陽性ドナー細菌は、限定されるわけではないが、バチルス属の種、スタフィロコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、ストレプトコッカス属の種、ラクトバチルス属の種、およびラクトコッカス属の種を含む。これらの株のうち、ラクトバチルスおよびラクトコッカスは、これらの種が食品産業で用いられており、Code of Federal Regulations(CFR)のTitle 21におけるGRAS(Generally Recongized As Safe)として分類されているため、特に有用である。これらのグラム陽性宿主について、数あるプラスミドの中でも、最もよく研究されているグラム陽性接合性プラスミドのうちの2つである、接合性プラスミドpAD1および/またはpCF10を用いることが可能である(例えば、Hirt et al., J Bacteriol 187, 1044-1054 (2005); Francia et al., Plasmid 46, 117-127 (2001)参照)。これらのプラスミドの接合機構は、RK2と有意なレベルの類似性を共有する。文献に基づいて、本発明における使用のためにこれらのプラスミドが改変されうること(例えば、実施例2参照)が企図される。これらの改変は、とりわけ、可動性プラスミドの作製、殺菌性遺伝子の組込み、ならびに制限酵素切断部位の付加および減算を含む。
【０１０７】
本発明の好ましい態様において、環境においてDNAまたは遺伝子改変の生物体の使用に関連した可能性のあるリスクを最小限にするために、特定の特徴が、本発明のプラスミドおよびドナー細胞に用いられる。例えば、環境に敏感な状況において、非自己伝達性プラスミドを利用することが好ましい可能性がある。従って、いくつかの態様において、プラスミドは、接合機構によって移動可能であるが、自己伝達性ではない。本明細書に考察されているように、これは、いくつかの態様において、その産物が接合機構の構築のために必要であるすべてのtra遺伝子を宿主染色体へ組込むことにより達成されうる。そのような態様において、プラスミドは、伝達開始点(oriT)のみを有するように構成される。この特徴は、レシピエントが、それが死ぬ前または死んだ後さえも、そのプラスミドをさらに伝達できないようにする。
【０１０８】
もう一つのバイオセーフティの特徴は、あらかじめ決められた宿主域との接合系を利用することを含む。上で考察されているように、ある特定のエレメントはほんの少数の関係のある細菌においてのみ機能することが知られており(狭い宿主域)、他のものは多数の関係のない細菌において機能することが知られている(広い宿主域または乱交雑)(del Solar et al., Mol. Microbiol. 32:661-666, (1996); Zatyka and Thomas, FEMS Microbiol. Rev. 21:291 319, (1998))。また、それらの接合系の多くは、グラム陽性細菌かまたはグラム陰性細菌のいずれかで機能することができるが、一般的には、両方においては機能しない(del Solar, 1996, 前記; Zatyka and Thomas, 1998, 前記)。
【０１０９】
いくつかの態様において、本発明のドナー細菌細胞は、栄養要求性突然変異体を含む。当技術分野において公知の多数の栄養要求性突然変異体がある。そのような表現型をもたらす遺伝子の例は、dapAおよびaroAである。dapAは、植物および細菌におけるリシン生合成のための鍵酵素である、酵素ジヒドロピコリン酸シンターゼをコードし(例えば、Ledwidge and Blanchard, Biochemistry 38, 3019-3024 (1999)参照)、aroAは、芳香族アミノ酸の合成における重要段階を触媒する酵素である、5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸シンターゼをコードする(例えば、Rogers et al., Appl Environ Microbiol 46, 37-43 (1983)参照)。これらの突然変異体は、これらの細菌についての欠損しているアミノ酸の補充によって実験室条件下で増殖することができる。しかしながら、適用時、これらの突然変異体は、重要な栄養因子が欠けているため、十分増殖することができない。これらは、ほんの2つの例だけであり、当業者に利用可能であることが知られた多くの類似した栄養要求性突然変異がある。
【０１１０】
抗生物質耐性の不注意による増殖は、本発明において、抗生物質耐性マーカーの使用を避けることにより最小限にされる。好ましい代替のアプローチにおいて、アミノ酸(例えば、セリン)の合成に関与する遺伝子を突然変異させることができ、ドナーではこのアミノ酸の要求性が生じる。そのような突然変異体細菌は、セリンを欠く培地において、それらが、増殖に必要とされる産物を生じるser遺伝子を有するプラスミドを含むといった条件で、増殖する。同様に、ハウスキーピング機能のいくつについてでも関与する遺伝子は、細胞が、それらが突然変異したハウスキーピング遺伝子の機能バージョンを供給するプラスミドを含まない限り、生存しないように、突然変異されうる。
【０１１１】
従って、本発明は、Ser遺伝子もしくは多くの他の栄養性遺伝子マーカーの1つ、または1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子を含むプラスミドの有利な使用を企図する。これらのマーカーは、ドナー細胞におけるプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０１１２】
もう一つのアプローチは、プラスミドの宿主域を調節するための制限-修飾系の使用を含む。接合およびプラスミド確立は、プラスミドが制限系を回避し、複製できる分類学的に関連した種間でより頻繁に起きることが予想される。II型制限エンドヌクレアーゼは、二重鎖DNAの特異的な認識配列内または近くで二本鎖切断を生じる。同族の修飾酵素は、同じ配列をメチル化し、切断からそれを保護できる。制限-修飾系(RM)は、細菌および古細菌において遍在性であるが、真核生物においては存在していない。RM系の一部は、プラスミドにコードされているが、他は細菌染色体上にある(Roberts and Macelis, Nucl. Acids Res. 24:223-235, (1998))。制限酵素は、ウイルスDNAまたはプラスミドDNAのような外来DNAを、このDNAが適切な修飾酵素により修飾されていない場合、切断する。このように、細胞は、外来DNAの侵入から保護されている。従って、1つまたは複数のメチラーゼを産生するドナー株を用いることにより、1つまたは複数の制限酵素による切断は回避されうる。部位特異的突然変異誘発は、特定の制限部位に欠けているか、または新しい部位を含むかのいずれかであるプラスミドDNAを作製するために用いられ、エンドヌクレアーゼに対してそれぞれ、プラスミドDNAを保護する、またはプラスミドDNAを攻撃されやすくする。いくつかの態様において、単に、典型的には狭い宿主域プラスミドに存在する制限切断部位の多くを有しないことによるだけで制限系を回避する広い宿主域プラスミドが用いられる(Wilkins et al., J. Mol. Biol. 258, 447-456 (1996))。
【０１１３】
いくつかの態様において、本発明は、ドナーとして環境的に安全な細菌を利用する。安全な細菌は当技術分野において公知である。例えば、弱毒化細胞内グラム陽性およびグラム陰性細菌によるDNAワクチンの送達が報告されている(Dietrich et al., 2001 Vaccine 19, 2506-2512; Grillot-Courvalin et al., 1999 Current Opinion in Biotech. 10, 477-481)。加えて、ドナー株は、身体の非殺菌部分(例えば、皮膚、胃腸、泌尿生殖器、口、鼻腔、咽喉、および上気道系)にコロニーを形成する何千という無害細菌の1つでありうる。いくつかの好ましい態様において、ビルレンスの低い株が用いられる。例えば、大腸菌83972は、腎機能において症候も低下も示さなかった3年間、コロニーが形成されたスウェーデンの少女の尿路から得られた野生株である。大腸菌83972は、ヒトでの研究において、膀胱の一過性無症候性コロニー形成の能力があることが確認された。
【０１１４】
ヒトにおける大腸菌83972の最初の研究は、1991年に報告された(Darouiche, R.O. and R.A. Hull, J Spinal Cord Med 23(2):136-412000 (2000))。通常の抗生物質治療では効果がない再発症候性UTIの病歴をもつ8人の女性が、合計15個のコロニー形成の試みを受けた。大腸菌83972は、平均88日間(範囲：1〜226日間)、尿に存続した。たった1人の被験体はより低いUTI症候を記述し、彼女は、抗生物質で成功裡に処置された；大腸菌83972は、彼女の尿から培養された唯一の生物体であった。残りの7人の患者は、一過性(<48時間)膿尿症および尿中インターロイキンIL-6およびIL-8の排出を示し、発熱、血液白血球数、排尿困難、血清IL-6、血清IL-8、または赤血球沈降速度の上昇を含む全身徴候および症候をもたなかった(Anderson, P., I. Engberg, et al., Infect Immun 59(9):2915-21 (1991); Agace, et al., J Clin Invest 92(2):780-5 (1983))。従って、大腸菌83972は、インビボで最小限の炎症応答を誘発するように思われた。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,719,991号を参照のこと。
【０１１５】
生育不能ドナー細胞
もう一つのストラテジーにおいて、生育不能ドナーが、生細胞の代わりに利用される。例えば、ミニ細胞およびマキシ細胞は、代謝活性であるが生育不能細菌細胞のよく研究されたモデル系である。ミニ細胞は、染色体DNAを欠き、DNA複製なしに細胞分裂を起こす特殊な突然変異体細胞により作製される。細胞が多コピープラスミドを含む場合には、ミニ細胞の多くは、プラスミドを含む。ミニ細胞は分裂も成長もしない。しかしながら、接合性プラスミドを有するミニ細胞は、接合複製、およびプラスミドDNAの生きているレシピエント細胞への伝達の能力がある。(例えば、米国特許第4,968,619号参照)。
【０１１６】
マキシ細胞は、それらが含むプラスミドの機能を保持すると同時に、それらの染色体DNAを破壊するために処置された細胞である。マキシ細胞は、重要なDNA修復経路における(recA、uvrA、およびphr)突然変異を有する大腸菌の株から得られうる。マキシ細胞はそのように多いDNA修復機能を欠くため、それらは低線量のUVへの曝露で死滅する。重要なことには、UV照射を受けないプラスミド分子(例えば、pBR322)は複製し続ける。転写および翻訳(プラスミド指示性)は、そのような条件下で効率的に起こることができ(Sancar et al., J Bacteriol. 137:692-693 (1979))、照射前に生成されたタンパク質は接合を維持するのに十分であるはずである。これは以下の2つの観察により支持される：i)ストレプトマイシンで殺傷された細胞は活性ドナーのままであること、およびii)接合性プラスミドの伝達は新たな遺伝子発現を妨げる抗生物質の存在において起こりうること(例えば、Heineman and Ankenbauer, J. Bacteriol. 175, 583-588 (1993); Cooper and Heineman, Plasmid 43, 171-175 (2000)参照)。従って、UV処置されたマキシ細胞は、プラスミドDNAを生きているレシピエントへ伝達する能力がある。細菌間でのrecAおよびuvrA遺伝子の保存は、得られうる大腸菌以外のドナー株のマキシ細胞を可能にするはずであることもまた留意されるべきである。
【０１１７】
いくつかの態様において、本発明は、ドナー細胞として非分裂細胞(例えば、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる、2004年7月2日に出願された米国特許出願第10/884,257号に記載された)を利用する。非分裂細胞は、一般的に、分裂および成長する能力が除去されるが、接合効率は保存されるように処置されている。好ましい態様において、非分裂細胞は、染色体DNAは損傷されるが、それがマキシ細胞の作製においてのと同じ程度までは破壊されないように処置されている。
【０１１８】
いくつかの態様において、必須の細胞機能(例えば、米国特許第4,968,619号に記載されているような、細胞壁、タンパク質合成、RNA合成)をコードする遺伝子における温度感受性突然変異を含むために機能することができない改変微生物が用いられる。
【０１１９】
多くのアプローチについて、条件付きで複製するプラスミドが用いられうる。そのようなプラスミドは、ドナーにおいて複製することができるが、レシピエント細菌において複製できないのだが、単に、それらの同族複製開始タンパク質(例えば、Rep)が前者の細胞において産生されるが、後者の細胞においては産生されないという理由だけである。いくつかの態様において、変種プラスミドは、rep遺伝子に温度感受性突然変異を含むので、それは37度より下の温度でのみ複製できる。このゆえに、その複製は、皮膚上に適用される細菌においては起きるが、そのような細菌が身体のコアへ侵入した場合には起こらない。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明は、任意の細菌細胞を殺傷することができる組成物および方法を提供する。本発明は、標的とされる細胞の型によって限定されない。例えば、標的細胞は、限定されるわけではないが、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属、エルシニア属、シトロバクター属、エドワードシエラ属、プロビデンシア属、クレブシエラ属、ハフニア属、エウィンゲラ属、クライベラ属、モルガネラ属、プラノコッカス属、ストマトコッカス属、ミクロコッカス属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、アエロモナス属、プレシオモナス属、ヘモフィルス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、リケッチア属、コクシエラ属、ロシャリメア属、エールリヒア属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、アエロコッカス属、双子菌属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディコッカス属、バチルス属、コリネバクテリウム属、アルカノバクテリウム属、アクチノミセス属、ロドコッカス属、リステリア属、エリジペロスリックス属、ガードネレラ属、ナイセリア属、カンピロバクター属、アルコバクター属、ウォリネラ属、ヘリコバクター属、アクロモバクター属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、クリセオモナス属、コマモナス属、エイケネラ属、フラビモナス属、フラボバクテリウム属、モラクセラ属、オリゲラ属、シュードモナス属、シュワネラ属、ウィークセラ属、ザントモナス属、ボルデテラ属、フランシセラ属、ブルセラ属、レジオネラ属、アフィピア属、バルトネラ属、カリマトバクテリウム属、カルジオバクテリウム属、ストレプトバチルス属、スピリルム属、ペプトストレプトコッカス属、ペプトコッカス属、サルシナ属、コプロコッカス属、ルミノコッカス属、プロピオニバクテリウム属、モビルンカス属、ビフィドバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ラクトバチルス属、ロチア属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、フソバクテリウム属、バイロフィラ属、レプトトリキア属、ウォリネラ属、アシダミノコッカス属、メガスフェラ属、ベイヨネラ属、ノカルジア属、アクチノマヅラ属、ノカルジオプシス属、ストレプトミセス属、ミクロポリスポラス属、テルモアクチノミセス属、マイコバクテリウム属、トレポネーマ属、ボレリア属、レプトスピラ属、およびクラミジア属からなる群より選択されるものを含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、タンパク質(例えば、殺菌性タンパク質)をコードする核酸配列は、伝達性または非伝達性プラスミド(例えば、RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600、またはPCON4-78)上にコードされ、タンパク質の発現のためにプラスミドをレシピエント細胞(例えば、病原性または非病原性の細菌の属)へ接合的に伝達する能力を有するドナー細胞(例えば、病原性または非病原性の細菌の属)へ配置される。好ましい態様において、接合的に伝達されるプラスミド上にコードされた核酸配列の発現は、レシピエント/標的細胞の殺傷へと導く。本明細書に記載されたものに加えて、本発明に使用を見出す例示的なドナー細胞は、限定されるわけではないが、すべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20040137002号、第20040224340号、および第10/884,257号のものを含む。
【０１２２】
治療
本発明の組成物および方法は、ヒトの処置のために、ならびに様々な獣医学、作物学、園芸学、および食品加工の適用において、有用性を見出す。
【０１２３】
ヒトおよび獣医学的使用について、かつ保護のために(例えば、病原性標的細胞の殺傷による)標的とされる細胞集団または組織に依存して、本発明の組成物(例えば、伝達性プラスミドを含むドナー細菌細胞)の投与の以下の様式が企図される：局所、経口、鼻、肺/気管支(例えば、吸入器による)、眼、直腸、尿生殖器、皮下、腹腔内、および静脈内。細菌は好ましくは、処置される患者について選択される投与様式に適した送達媒体における薬学的調製物として供給される。
【０１２４】
例えば、ドナー細菌細胞を胃腸管または鼻腔へ送達するために、好ましい投与様式は、経口摂取もしくは鼻エアゾールによる、または摂食(単独での、または被験体の飼料もしくは食物へ組み入れられた)による。この点において、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)のようなプロバイオティック細菌が細菌細胞の凍結乾燥混合物およびマンニトールのような固体担体を含むゲルカプセルとして販売されていることは注目されるべきである。ゲルカプセルが液体と共に摂取される場合、凍結乾燥細胞は、再水和され、生存可能なコロニー形成性細菌になる。従って、類似した様式において、本発明のドナー細菌細胞は、ゲルカプセルにおける、または食品もしくは飲料へ振りかけるためのバルクでの粉末凍結乾燥調製物として供給されうる。再水和された生存可能な細菌細胞は、その後、上部および下部消化管系に渡って、住みつくおよび/またはコロニーを形成し、その後、標的病原性細菌と接触する。
【０１２５】
局所適用について、細菌は、冒された皮膚表面上に広げられうる軟膏またはクリームとして製剤化されうる。軟膏またはクリーム製剤はまた、坐剤のような他の標準製剤と共に、直腸または膣送達に適している。局所、膣、または直腸投与のための適切な製剤は医化学者にとって周知である。
【０１２６】
本発明は、様々な細菌感染症または細菌関連の望ましくない状態を処置するための局所または粘膜投与として特に有用性がある。これらの使用のいくつかの代表的な例は、限定されるわけではないが、(1)ヘモフィルス属の種により引き起こされる結膜炎および緑膿菌により引き起こされる角膜潰瘍；(2)緑膿菌により引き起こされる外耳炎；(3)多くのグラム陽性球菌およびグラム陰性桿菌により引き起こされる慢性静脈洞炎、ならびに気管支の全般的な汚染除去のための；(4)緑膿菌に関連した嚢胞性線維症；(5)ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)(潰瘍)、大腸菌、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、カンピロバクターおよびシゲラ属の種により引き起こされる腸炎；(6)ガードネレラ・バジナリス(Gardnerella vaginalis)および他の嫌気菌に関連した公開WO 02/18605 PCT/US01/27028；ならびに(12)様々な生物体により引き起こされる歯肉炎および/または齲歯の処置を含む。
【０１２７】
本発明のドナー細胞は、治療薬として皮膚(例えば、熱傷した、または感染した皮膚)に適用されうる、または細菌感染を防ぐための予防薬として適用されうる。ドナー細胞はいくつかの送達機構を介して皮膚表面へ適用されうることが企図される。
【０１２８】
例えば、本発明の組成物(例えば、キラープラスミドを含むドナー細胞)は、限定されるわけではないが、以下を含む多数の方法により適用されうる(例えば、皮膚熱傷または創傷表面へ)：溶液に懸濁され(例えば、コロイド溶液)、表面へ適用されること；溶液に懸濁され、スプレー塗布器を用いて表面上へスプレーすること；フィブリン接着剤と混合され、表面(例えば、皮膚熱傷または創傷)上へ適用される(例えば、スプレーされる)こと；創傷包帯もしくは絆創膏上へ含浸され、絆創膏を表面(例えば、感染症または創傷)へ適用すること；徐放性機構により適用されること；後で表面(例えば、皮膚熱傷または創傷)上に置かれ、それにより創傷界面および移植片界面の両方で保護することができる、無細胞性生物学的マトリックスの片側もしくは両側に含浸されること；リポソームとして適用されること；体腔へ注入される(例えば、カテーテルを介して膀胱へ注入される)、もしくは体腔への開口部へ適用される(尿道口への適用)こと；またはポリマー上に適用されること。
【０１２９】
機構の理解は本発明を実施するために必要ではないし、かつ本発明はいかなる特定の作用機構にも限定されないが、いくつかの態様において、いったん皮膚または創傷表面上にあると、ドナー細菌が標的病原性細菌と接触し、接合過程を介して抗菌遺伝子を標的病原体へ移行させ、病原体を殺傷することが企図される。
【０１３０】
ドナー細菌は、任意のグラム陰性またはグラム陽性細菌を含む細菌の任意の株でありうる。例えば、いくつかの態様において、本発明は、ドナー細菌として、大腸菌、シュードモナス属の種、クレブシエラ属の種、エンテロバクター属の種、アシネトバクター属の種、ラクトバチルス属の種、ラクトコッカス属の種、スタフィロコッカス属の種、ストレプトコッカス属の種、エンテロコッカス属の種、またはバクテロイデス属の種を提供する。いくつかの好ましい態様において、ドナー細菌は大腸菌83972である。例えば、Hull, et al., Infect Immun. Jan;67(1):429-32 (1999)を参照のこと。
【０１３１】
他の態様において、本発明の組成物および方法は、好ましくない細菌(例えば、病原体)の減弱または増殖阻害のための表面の処置において適用を見出す。例えば、手術、カテーテル法などのような侵襲的処置に用いられうる表面が、表面上の細菌汚染による被験体の感染を防ぐために処置されうる。本発明の方法および組成物は、多数の表面、物体、物質など(例えば、医療または応急処置用品、育児および台所用品、ならびに表面)をその上における細菌汚染を制御するように処置するために用いられうることが企図される。
【０１３２】
他の態様において、組成物は、組成物を微生物感染の予防のための部位へ送達するために、縫合糸、絆創膏、およびガーゼのような吸収性材料へ含浸されうる、または外科用ステープル、ジッパー、およびカテーテルのような固相材料の表面上にコーティングされうる。この型の他の送達系は、当業者にとって容易に明らかであると思われる。
【０１３３】
ドナー細菌を含む薬学的調製物は、投与の容易さおよび用量の均一性のために用量単位で製剤化される。本明細書に用いられる場合、用量単位形は、処置を受ける患者に適切な薬学的調製物の物理的に別々の単位を指す。各用量は、選択された薬学的担体と関連して所望の抗菌(例えば、病原性の減弱)効果を生じるように計算されたドナー細菌細胞の量を含むべきである。適切な用量単位を決定するための手順は、当業者に周知である。
【０１３４】
用量単位は、患者の体重に基づき、比例して増加または減少しうる。標的細胞集団または組織において病原性細菌の根絶を達成するための適切な濃度は、当技術分野において公知のように、用量濃度曲線計算により決定されうる。
【０１３５】
本発明のドナー細胞についての他の使用もまた企図される。これらは、様々な農業、園芸、環境、および食品加工の適用を含む。例えば、農業および園芸において、様々な植物病原性細菌は、植物の病気を最小限にするために標的とされうる。標的に適した植物病原体の一つの例は、熱傷病の原因因子となるエルウィニア・アミロボラ(Erwinia amylovora)である。
【０１３６】
類似したストラテジーは、切り花のしおれを低減または防止するために利用されうる。獣医学または動物農業において、本発明の組成物(例えば、プラスミド系)は、バイオバーデンを低減するために、または特定の病原性生物体(例えば、サルモネラ)を減弱させるために、動物飼料(ニワトリ、ウシ)へ組み入れられうる。他の態様において、本発明は、病原性細菌(例えば、肉における大腸菌01 57:H7)を減弱または中和するために肉または他の食品へ利用されうる。
【０１３７】
環境的利用は、例えば、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)およびその接合性プラスミドの1つを、殺虫性物質を送達し、条件付きで発現するように操作することを含む(例えば、マラリアまたはウエストナイルウイルスを広める蚊の制御のために)。そのような適用、加えて上記の農業および園芸の適用において、溶液、エアゾール、またはゲルカプセルとしてのプラスミドおよびドナー細菌の製剤化が企図される。
【０１３８】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を実証し、かつさらに例証するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１３９】
後に続く実験開示において、以下の略語が適用される：℃(摂氏温度)；cm(センチメートル)；g(グラム)；lまたはL(リットル)；μg(マイクログラム)；μl(マイクロリットル)；μm(マイクロメートル)；μM(マイクロモル濃度)；μmol(マイクロモル)；mg(ミリグラム)；ml(ミリリットル)；mm(ミリメートル)；mM(ミリモル濃度)；mmol(ミリモル)；M(モル濃度)；mol(モル)；ng(ナノグラム)；nm(ナノメートル)；nmol(ナノモル)；N(規定)；pmol(ピコモル)；bp(塩基対)；cfu(コロニー形成単位)；Invitrogen(Invitrogen, Carlsbad, CA)；lacOP(大腸菌lacオペレーター/プロモーターをコードする領域)；Kan(カナマイシン耐性についての決定因子)；Cm(クロラムフェニコール耐性についての決定因子)；Tra1(接合伝達に関与する遺伝子をコードする領域)；Control(調節領域をコードする領域)；oriV(増殖性複製開始点をコードする領域)；oriT(接合伝達開始点をコードする領域)；tetR(tetAのリプレッサーをコードする遺伝子)；tetA(テトラサイクリンに対する耐性をコードする遺伝子)；Rep(複製に関与する遺伝子をコードする領域)；Primase(複製に関与する遺伝子をコードする領域)；Tra2(交配対形成に関与する遺伝子をコードする領域)；colE3(コリシンE3をコードする遺伝子)；repA、repB、およびrepC(RSF1010の増殖性複製に必須のタンパク質をコードする)；mobA、mobB、およびmobC(RSF1010の可動化に関与するタンパク質をコードする)；イテロン、ssiA、およびssiBをコードする領域(増殖性複製開始点)。
【０１４０】
実施例1
インビトロおよびインビボ試験に用いられるドナー
接合を通して、プラスミドは、自己伝達性様式かまたは非自己伝達性様式かのいずれかで動員されうる。接合伝達産物を惹起するために、tra遺伝子およびoriT(伝達開始点)DNA配列が必要とされる。tra遺伝子産物は、oriT配列を認識し、配列内の1つの鎖へのニッキングを開始し、この一本鎖プラスミドDNAをレシピエント細胞へ動員する。すべての必須tra遺伝子およびoriT配列が単一プラスミド上に位置している場合、このプラスミドは、このプラスミドのレシピエント細菌が熟達した接合ドナーになるため、自己伝達性と呼ばれる。対照的に、非自己伝達性プラスミドは、oriT配列を有し、tra遺伝子のセット全体を有しない。このプラスミドは、tra遺伝子産物が、染色体上かまたは他のプラスミド上かのいずれかにコードされた遺伝子から、同じドナー細胞においてトランスに供給される場合のみ、レシピエント細胞へ動員されうる。大腸菌の誘導体(例えば、K12、S17、例えば、Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1985)参照)が、本発明の開発中に用いられた。これらの株は、ミニRK2またはIncQプラスミド(例えば、RSF1010)のような可動性プラスミドの複製および接合伝達に必須のすべてのtra遺伝子産物を供給する、組み込まれたRK2プラスミドを有する。従って、いくつかの態様において、本発明は自己伝達性プラスミドを用いる。
【０１４１】
組み込まれたtra遺伝子に加えて、S17-1はまた、recA欠損であり、細胞において相同組換えの大部分を妨げる。recAマイナス大腸菌は、その親株より有意にゆっくりと増殖し、その乏しい増殖は、このドナーの伝播を防ぐための一つの重要な因子である。本発明の組成物および方法に用いるためのこの株のさらなる改変は下に記載されている。
【０１４２】
リポ多糖(LPS)は、感染で動物宿主に炎症を引き起こす主要な成分の一つであり、S17-1もまたLPSを有する。LPSは細菌生存のための必須成分である；それゆえに、この分子の除去は、妥当と思われるアプローチではない。しかしながら、LPSへの特定の改変は、細胞増殖を可能にするが、炎症応答を有意に低下させる。例えば、msbB遺伝子はLPSへミリストイル基を付着させることに関与する酵素をコードする。LPSからのこのアシル基の除去は、結果として、炎症応答の10分の1〜100分の1の低下を生じる(例えば、Low et al., Nat Biotechnol 17, 37-41 (1999)参照)。従って、いくつかの態様において、本発明は、msbB遺伝子が除去された(例えば、遺伝子置換を通して)S17-1を提供する。本発明者らは、一般的な分子遺伝学的技術、遺伝子置換を用いてS17-1においてmsbBを除去した(例えば、Court et al., Annu Rev Genet 36, 361-388 (2002);およびGong et al., Genome Res 12, 1992-1998 (2002)参照)。この方法に従って設計された、新しく作製された大腸菌ドナー株は、CON4-11cと名付けられた。
【０１４３】
このmsbB欠損株の接合効率は調べられ、対照と比較してその接合効率において検出可能な違いは観察されなかった。それゆえに、これは、それが接合効率を損なうことなくより少ない炎症を引き起こすため、治療的適用にとって非常に有用な株である。この株は、本発明の組成物および方法の有用性および幅広い範囲の適用を実証するためにインビトロおよびインビボの両方の実験に用いられた。
【０１４４】
実施例2
非自己伝達性キラープラスミドの構築
RK2は広い宿主域プラスミドであり、ほとんどすべてのグラム陰性細菌において複製することができる。しかしながら、その接合効率は異なるレシピエント株に依存して変化し、緑膿菌は、これらの相対的に乏しい接合のレシピエントの一つである。対照的に、IncQ群(例えば、RSF1010)のプラスミドは可動性プラスミドであり、RK2により供給されたtra遺伝子産物を利用する(例えば、Lessl et al., J Bacteriol 174, 2493-2500 (1992); Tietze, Microbiol. Mol Biol Rev 65, 481-496 (2001)参照)。RSF1010およびRK2の接合効率は、レシピエントとして緑膿菌を用いて比較された。結果は、RSF1010がこの細菌とRK2より約100倍良く接合することを示した。従って、RSF1010は、キラープラスミドの構築のためのバックボーンとして用いられた。作製された一つのそのようなプラスミドの例はpCON15-56Aである(例えば、図5参照)。
【０１４５】
pCON15-56Aを作製するために、RSF1010のPstI-NotI断片を、RK2由来のtetAを有するPstI-NotI断片およびcolE3と置換し、pCON15-56Aを生成した。colE3は、lacプロモーター/オペレーター、lacPOの制御下にあり、培地におけるlacリプレッサーLacIおよびグルコースの存在下で厳重に抑制される。lacPOの直前に、転写ターミネーターを、lacPOの直前で開始されるリードスルー転写によるcolE3の漏出性発現を防ぐためにクローニングした。RSF1010はまた、ストレプトマイシンおよびスルホンアミド耐性決定因子を有するが、それらはpCON15-56Aを構築する過程で除去された。ベクターの図は下に示されている。
【０１４６】
いくつかの態様において、colE3は殺菌性遺伝子として用いられた。colE3は、グルコースが培地に添加される限り、プラスミド上において厳重に抑制される(例えば、Anthony, J Microbiol Methods 58, 243-250 (2004)参照)。この非常に強力な毒素は、16SリボソームRNAの3'末端で保存ヌクレオチド配列を特異的に切断するリボヌクレアーゼである(例えば、Bowman et al., Proc Natl Acad Sci USA 68, 964-8 (1971)参照)。しかしながら、漏出性発現は、このプラスミドを有するドナーが大量のグルコースなしの環境(例えば、創傷の部位において)に曝露される場合、観察される。これが起こる時(すなわち、細菌がcolE3を発現し始めるやいなや)、ドナー細胞はこの毒素の発現のために殺傷される。これを避けるために、ヘルパープラスミドを同じ宿主細菌へ導入した。このヘルパープラスミド、pCON1-94は、毒素についての免疫タンパク質をコードするimmE3(例えば、Jakes and Zinder, Proc Natl Acad Sci USA 71, 3380-3384 (1974)参照)、およびlacPOのリプレッサー、lacIを有する。
【０１４７】
pCON1-94プラスミドのバックボーンはpACYC177由来である。immE3は、構成的プロモーターPneo(Tn5由来のネオマイシン耐性決定因子を発現しうるプロモーター)を用いて発現する。lacIは、lacIQ由来のそれ自身のプロモーター下で発現する。このプラスミドは、カナマイシン耐性決定因子、KmRを有する。プラスミド、pCON15-56AおよびpCON1-94は適合性があり、適切な選択圧、カナマイシンおよびテトラサイクリンの存在下で大腸菌宿主において安定に維持される。pCON1-94の構造は図6に描かれている。
【０１４８】
実施例3
接合のモニタリング
接合の効率をモニターするために、通常のフィルター接合が用いられた。この方法は当技術分野において十分、確立されている(Merryweather et al., J Bacteriol 167, 12-17 (1986))。過程は図1に描かれている。両方のプレート上のコロニーを数えた後、接合の効率は、以下の方程式を用いて計算された。
2008542302.tif 000002
【０１４９】
簡単には、ドナー細胞および標的細胞を、適切な抗生物質を含むLuria Bertani(LB)培地で一晩、増殖させ、ドナー細胞およびレシピエント/標的細胞の同量をフィルター接合に用いた。接合後、細胞を段階希釈し、コロニー形成単位(cfu)を測定するためにLB-抗生物質プレート上にスポットした。接合完了体を、混合された細胞懸濁液においてドナー細菌および標的細菌の増殖を妨げる2つの選択マーカー(RifR、TetR)により選択した。Rifを含むLBプレートは、レシピエント細胞の総数を計算するために用いられた(例えば、図1A参照)。次に、接合性プラスミド、pCON4-45を用いる接合効率を試験した。pCON4-45は、RK2上にIS21およびPar/Mrs領域を含む6kb NsiI-AsiSI断片の欠失をもつRK2の誘導体である。この欠失した領域は、このプラスミドの接合に必須ではない。従って、pCON4-45は自己伝達性プラスミドである。フィルター接合後、細胞を、RifおよびRif/Tetプレート上に蒔くために段階希釈した(例えば、図1B参照)。コロニーを、両方のプレート上で数え、接合の効率を計算した。
【０１５０】
実施例4
pCON15-56Aの接合および殺傷効率
非自己伝達性キラープラスミドpCON15-56A(図5参照)を、実施例2に記載されているように構築した。プラスミドの接合および殺傷効率を、レシピエント/標的として大腸菌を用いてモニターした。接合の効率をモニターするために通常のフィルター接合を用いた(実施例3および図1B参照)。接合効率をモニターするために、レシピエントが殺傷されるのを防ぐように入ってくる毒素遺伝子を中和するためにimmE3遺伝子を有する大腸菌株を用いた。
【０１５１】
pCON15-56AおよびpCON1-94の両方を有するドナー細菌は、活性ColE3毒素を培地へ分泌し、隣のColE3感受性細菌を殺傷することができる。ColE3およびその免疫タンパク質ImmE3は複合体を形成し、ドナー細菌の外側へ分泌する。この複合体は大腸菌表面受容体に結合し(James et al., Microbiology 142 1569-1580 (1996))、毒素は細胞へ転位置し、細胞死が結果として起こる。フィルター接合の過程において、ドナー細胞およびレシピエント/標的細胞の両方を混合し、コリシン感受性レシピエント/標的は、接合非依存性様式でドナー細胞の周囲の分泌毒素で殺傷されうる。しかしながら、この受容体に突然変異が起こった場合、そのような突然変異を有する大腸菌株は、毒素が細胞へ転位置できないため、もはやColE3により殺傷されない。これのような突然変異体(例えば、ColE3受容体に突然変異を含む大腸菌)は、接合依存性殺傷と接合非依存性殺傷を区別するためにレシピエントとして用いられた。この突然変異体大腸菌株は、RL315-E3Rと名付けられ、K12の誘導体でもある。
【０１５２】
キラープラスミドの接合および殺傷効率はその後、試験された。フィルター接合方法(実施例3に記載されているような)は接合を媒介するために用いられた。接合後、ドナー細胞およびレシピエント細胞の混合物を収集し、段階希釈した。段階希釈された細胞懸濁液を、接合完了体を選択的に増殖させるためにリファンピシン/テトラサイクリンを含むLBプレートのセット上にスポットした。具体的には、ドナー細胞(con4-11c/pCON15-56A/pCON1-94)は2つの異なる大腸菌株へ接合された：一つは、キラープラスミドに対して感受性があり(RL315-E3R)、他方のものは耐性である(RL315-E3R/pCON1-94)。耐性株はimmE3を含むヘルパープラスミドを有するので、キラープラスミド上のcolE3から保護される。フィルター接合後、ドナー細胞およびレシピエント細胞の混合物を段階希釈し、接合完了体のみが増殖できるRif/Tetプレート上にスポットした。列「a」は、レシピエントとしてのColE3感受性株に関する結果を示し、列「b」はレシピエントとしてのColE3耐性株に関する結果を示す。
【０１５３】
耐性株の生存は、キラープラスミドが成功裡にレシピエント株へ伝達されていることを示す。従って、感受性株の増殖の欠如は、これらの細胞が、選択増殖培地によるというよりむしろ、伝達されたColE3遺伝子からの発現により殺傷されたことを示す(図2参照。最上部から最下部まで、希釈は以下のとおりであった：×1、×10-2、×10-4、および×10-6)。
【０１５４】
キラープラスミドまたは非キラープラスミド処置されたレシピエントから、それぞれ、約55個および6×106個のコロニーが数えられた(例えば、図2参照)。これらの2つの数の比較は、キラープラスミドで処置された接合完了体の生存が約0.001%であったことを実証している。従って、本明細書に記載された組成物を用いて、本発明は、標的細菌細胞を終焉させる非常に効率的かつ効果的な方法を提供する。
【０１５５】
実施例5
インビボ有効性試験
実施例4に記載されたドナー/プラスミドペアを用いて、インビボ有効性試験は、マウス熱傷/敗血症モデルを用いて試験された。簡単には、実験動物は、9秒間の100℃水での浸漬により第三度全層(総表面積15%)背側熱湯熱傷を受けた。緑膿菌PA14を、その後、熱傷創へ局所的に塗布した。この株は、植物、虫、および動物を含むいくつかの宿主にとってビルレントであることが示されている(Rahme et al., Science 268, 1899-1902 (1995))。病原体の量は、そのOD600により計算された2×104cfuに調整された。プラスミドを含むドナー細胞の異なる量をその後すぐに塗布し、動物の生存をモニターした。
【０１５６】
PA14のみに曝露されたほとんどすべてのマウスは、3日後、死亡し、5日目までにすべてが死んだ(例えば、図3参照)。しかしながら、PA14、およびキラープラスミドを含むドナー細菌細胞に曝露されたマウスは、有意に死亡率を低下させた。10日目において、生存動物のパーセンテージが処置間で比較され、P値が計算された。すべてのP値は0.000001未満であり、未処置のマウス(すなわち、熱傷プラス病原体のみ)と処置されたマウス(すなわち、熱傷プラス病原体プラス全用量のドナー細菌細胞)の間の差が高度に有意であることを示した。
【０１５７】
実施例6
新しいキラープラスミドの構築
RSF1010はIncQ群に属する可動性プラスミドである。この群におけるプラスミドは、RK2を含むいくつかの接合系を用いて接合的に動員されうる(Lessl et al., J Bacteriol 174, 2493-2500 (1992))。RK2およびRSF1010が単一の細菌に共存する場合、RK2により提供された接合機構がRSF1010を非常に効率的に動員する。複製についての宿主細菌因子へのより少ない依存性のせいで、このプラスミドは緑膿菌と非常に効率的に接合し、実施例3に記載されたフィルター接合アッセイにおいてしばしば、100%効率に近づく。RSF1010およびRK2の両方は、組み合わされて、緑膿菌を効率的に接合しうる自己伝達性プラスミドを生じた。
【０１５８】
具体的には、RK2由来tra遺伝子をRSF1010のバックボーンと組み合わせて、pCON19-79を生じた。RK2由来のoriT配列は、この領域からのプラスミドの伝達を防ぐために突然変異を誘発された。RK2のプラスミド複製機能は、RK2由来複製開始点oriVの欠失によって消失した。その代わりとして、pCON19-79は、プラスミドの可動化および複製のために、それぞれ、RSF1010由来oriTおよびoriVを利用する。colE3はlacPOプロモーターの制御下にあり、その漏出性発現は、このプラスミドの直前に転写ターミネーターを直列に置くことによりさらに抑制される(例えば、Anthony et al., J Microbiol Methods 58, 243-250 (2004)参照)。
【０１５９】
RK2上のtra遺伝子の発現は、それ自身のプラスミド上にコードされた1セットのリプレッサータンパク質により細かく調整される(Bingle et al., Mol Microbiol 49, 1095-1108 (2003))。これらのリプレッサー無しに、プラスミド由来のtra遺伝子の構成的発現は、おそらく細菌細胞エンベロープにおける細孔の形成のせいで、宿主細胞にとって致死的となる(Grahn et al., J Bacteriol 182, 1564-74 (2000))。本発明者らは、高レベルの構成的tra発現を導くこのリプレッサー無し接合性プラスミドの特徴をCDC(Constitutively Derepressed Conjugation(構成的抑制解除性接合))と呼ぶ。このプラスミドの構造は図7に描かれている。
【０１６０】
pCON1-93(図8参照)は、キラー遺伝子および頑強なプラスミド伝達の組み合わせを用いてレシピエント/標的殺傷を最大限にするように設計された。このプラスミドは、ヘルパープラスミドpCON1-93と共に大腸菌ドナー(例えば、con4-11c、実施例I参照)に維持されうる。ヘルパープラスミドは、コリシンE3についての免疫タンパク質をコードするimmE3を有し、このプラスミドの構造は図8に示されている。pCON1-93のバックボーンはpUC19由来であり、immE3はPCRにより増幅され、プラスミドへクローニングされた。immE3は、構成的プロモーターPneo(ネオマイシン耐性決定因子についてのプロモーター)の制御下にある。
【０１６１】
これらの2つのプラスミド、pCON19-79およびpCON1-93は、大腸菌ドナー、CON4-11cに維持され、インビトロ殺傷実験に用いられた。
【０１６２】
実施例7
新しいプラスミドでの改善されたインビトロ殺傷の実証
本発明の一部として開発された新しいキラープラスミド(例えば、実施例6参照)は、殺傷能力について試験された。本明細書に考察された新しいプラスミドに加えて、新しいアッセイが、本発明のプラスミド(例えば、実施例6のプラスミドpCON19-79およびpCON1-93)の改善された殺傷能力を実証するために設計された。この実施例において、2つの異なる緑膿菌株、および1つのアシネトバクター・バウマニ株が用いられた。両方の緑膿菌株は、臨床的に単離された株であった。それらの一つは、創傷患者からの単離物であり、多数の抗生物質に対して耐性である(PanR：Poly-Antibiotic Resistance(多抗生物質耐性))ことが示された。A. バウマニは、熱傷および/または創傷に関連しており、しばしば、多くの臨床的に有用な抗生物質に対して耐性であることが見出され、それゆえに、重大な健康への脅威になりつつある。両方の緑膿菌株は、リファンピシン耐性であったが、A. バウマニ株は耐性ではなかった。実施例2に記載されているように、適切な選択マーカーが接合効率をモニターするために必要とされ、リファンピシン耐性が、レシピエント株を選択的に増殖させるために用いられた。リファンピシン耐性突然変異体は、染色体DNA上での自然突然変異により得られた。簡単には、一晩増殖したA. バウマニ培養物を、リファンピシンを含むLBプレート上に広げ、これらのプレート上で増殖した突然変異体を以下の実験のために単離した。一晩増殖した標的株の細菌培養物を、リファンピシンを含むLBプレートの表面上にオーバーレイした。
【０１６３】
キラープラスミド(例えば、実施例6のプラスミド)を有するドナー細菌を、一晩増殖させ、段階希釈し、標的細菌の菌叢の上にスポットした。レシピエント/標的細菌および接合完了体のみが、リファンピシンを含むLBプレート上で選択的に増殖することができる。キラープラスミドが動員され、レシピエント細胞を効率的に殺傷する場合には、ドナーがスポットされた領域は透明のままであり、増殖阻害ゾーンを残す。この実験のストラテジーは図4Aに示されている。
【０１６４】
簡単には、ドナー細菌の細胞懸濁液を、リファンピシンを含むLBプレートに渡って均一に広げられた標的細菌の表面上にスポットした。リファンピシンの存在下において、標的細菌のみが増殖できる。標的細胞がドナー細菌により殺傷された場合、細胞懸濁液がスポットされた領域は、ドナー細菌および標的細菌の両方の増殖が阻止されたため、透明のままであった。ドナーが標的細菌に効果を生じない場合には(例えば、ドナーがレシピエント/標的細菌の増殖を絶たない、または減弱しない場合には)、スポットされた領域は、増殖中の標的細胞により覆われるようになる。従って、このアッセイを用いて、新しく構築されたドナー/プラスミドペアの3つの病原体への有効性が試験されうる(例えば、図4B参照)。
【０１６５】
各病原体を、非キラープラスミド(処置「a」)およびキラープラスミド(処置「b」)の両方で処置した。図4Bに見られるように、キラープラスミド(すなわち、実施例6で作製されたpCON19-79)は病原体の菌叢に渡って増殖阻害ゾーンを形成し(図4Bにおいて暗いスポットとして目に見える)、標的細菌を殺傷するプラスミドの能力を証明した。ドナー細菌は少量のコリシンE3を培地へ分泌することは留意されたい。しかしながら、この実験で試験された病原体のそれぞれは、おそらく細胞表面上のこの毒素についての受容体のそれらの欠損のせいで、培地における毒素に対して感受性がない。
【０１６６】
実施例8
pCON19-79でのインビボ有効性試験
実施例5で行われたものと類似した実験を、実施例6で作製されたプラスミドpCON19-79で行った。簡単には、実験動物は、9秒間の85℃水での浸漬により第三度12%TBSA(総表面積)背側熱湯熱傷を受けた。緑膿菌PA14をその後、熱傷創へ局所的に塗布した。PA14の塗布後すぐに、pCON19-79を有するドナー細胞を、様々な用量で熱傷表面へ塗布した。マウスの生存を10日間、モニターした。pCON19-79を含むドナー細胞の塗布なしで緑膿菌PAを2×104cfuで受けた52匹の対照マウスのうち42匹が、緑膿菌PA14の熱傷への塗布から6日以内に死んだ(下の表1参照)。しかしながら、2×104cfuでの緑膿菌PA14プラスpCON19-79プラスミドを含むドナー細胞の様々な用量を受けたマウスは、対照と比較して著しく改善された生存率を示した(例えば、図9参照)。例えば、2×104cfuでの緑膿菌PA14および1.3×1010cfuのドナー細胞を受けた52匹のマウスのうち、塗布後とても長くも10日間、いずれも死ななかった。死亡率における有意な改善はまた、より少ない用量のドナー細胞が用いられた場合にも観察された(例えば、図9参照)。
【０１６７】
上の明細書に挙げたすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の記載された組成物および方法の様々な改変および変更は、本発明の範囲および真意から逸脱することなく、当業者にとって明らかであると思われる。本発明は特定の好ましい態様に関連して記載されているが、主張されているような特許はそのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことは理解されているはずである。実際、関連分野の業者にとって明らかである本発明を行うための記載された様式の様々な改変は、本発明の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】接合効率をモニターする方法を描く。図1Aは、例示的な接合アッセイの概略図を示す。図1Bは、接合効率を計算するための希釈アッセイの例を提供する。
【図２】キラープラスミドの接合および殺傷効率をモニターするための培地上にスポットされた細菌の画像を示す。
【図３】本発明のプラスミドを含むドナー細胞を用いるインビボ有効性の結果を示すグラフを示す。
【図４】図4Aは、本発明に従った、ドナー細胞による細菌阻害を試験するための例示的な方法の概略図を提供する。図4Bは、示された標的細胞の菌叢(列「a」における)、および接合依存性増殖阻害からの病原体細胞の菌叢における透明にされた領域(列「b」における)の画像を示す。
【図５】プラスミドRSF1010 pCON15-56Aの概略図を示す。
【図６】プラスミドpCON1-94の概略図を示す。
【図７】pCON19-79の概略図を示す。
【図８】pCON1-93の概略図を示す。
【図９】pCON19-79プラスミドを含むドナー細胞を用いるインビボ有効性試験の結果を示すグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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