(57)【要約】  第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチド配列を含むRAGE融合タンパク質を開示する。前記RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むRAGEポリペプチド・ドメイン、及び免疫グロブリンCH2ドメインに直接連結されたドメイン間リンカーを利用できる。そのような融合タンパク質は、RAGEリガンドに対する特異的で、高い親和性結合を提供しうる。また、RAGE媒介性病理の治療法としてのRAGE融合タンパク質の使用も開示しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥポリペプチドを含んで成る融合タンパク質であって、当該ＲＡＧＥポリペプチドがＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成る融合タンパク質。
【請求項２】
ＲＡＧＥポリペプチドが免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインの一部を含んで成るポリペプチドと連結している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
免疫グロブリンドメインを含んで成る前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＣH２又はＣH３ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含んで成る、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＲＡＧＥリガンド結合部位が配列番号９又はそれと９０％同一の配列、あるいは配列番号１０又はそれと９０％同一の配列を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸２４−１１６に相当する配列番号８のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸２４−１２３に相当する配列番号１４のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸２４−２２６に相当する配列番号１８のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥ又はｓＲＡＧＥのアミノ酸２４−３３９に相当する配列番号５のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥポリペプチドであって、リガンド結合部位を含んで成るＲＡＧＥポリペプチドをコードする単離した核酸配列。
【請求項１０】
ＲＡＧＥポリペプチドが免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインの一部を含んで成るポリペプチドと連結している、請求項９に記載の単離した核酸配列。
【請求項１１】
免疫グロブリンドメインを含んで成る前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＣH２又はＣH３ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含んで成る、請求項１０に記載の単離した核酸配列。
【請求項１２】
ＲＡＧＥリガンド結合部位が配列番号９又はそれと９０％同一の配列、あるいは配列番号１０又はそれと９０％同一の配列を含んで成る、請求項９に記載の単離した核酸配列。
【請求項１３】
配列番号２５又はそのフラグメントを含んで成る、請求項９に記載の単離した核酸配列。
【請求項１４】
配列番号２６又はそのフラグメントを含んで成る、請求項９に記載の単離した核酸配列。
【請求項１５】
配列番号２８又はそのフラグメントを含んで成る、請求項９に記載の単離した核酸配列。
【請求項１６】
治療上有効量のＲＡＧＥ融合タンパク質を医薬として許容される担体中に含んで成る組成物であって、ＲＡＧＥ融合タンパク質が、第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥポリペプチドを含んで成り、当該ＲＡＧＥポリペプチドがＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成る、組成物。
【請求項１７】
ＲＡＧＥポリペプチドが免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインの一部を含んで成るポリペプチドと連結している、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
免疫グロブリンドメインを含んで成る前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＣH２又はＣH３ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含んで成る、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＲＡＧＥリガンド結合部位が配列番号９又はそれと９０％同一の配列、あるいは配列番号１０又はそれと９０％同一の配列を含んで成る、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸２４−１１６に相当する配列番号８のアミノ酸配列を含んで成る、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
ＲＡＧＥ融合タンパク質が注射剤として調製されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
ＲＡＧＥ融合タンパク質が無菌凍結乾燥散剤として調製されている、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥポリペプチドであって、ＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成るＲＡＧＥポリペプチドを共有結合させるステップを含んで成る、ＲＡＧＥ融合タンパク質の製造方法。
【請求項２４】
ＲＡＧＥポリペプチドと第二の非ＲＡＧＥポリペプチドが組換えＤＮＡコンストラクトでコードされている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡコンストラクトを発現ベクターに組み込むステップを更に含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現ベクターを宿主細胞に挿入するステップを更に含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＡＧＥモジュレーターの検出方法であって：（ａ）第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成るＲＡＧＥポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を準備し；（ｂ）注目の化合物と、ＲＡＧＥに対して既知の結合親和性を有するリガンドを、前記融合タンパク質と混合し；（ｃ）既知のＲＡＧＥリガンドと、ＲＡＧＥ融合タンパク質との、注目の化合物の存在下での結合を測定すること、を含んで成る方法。
【請求項２８】
ＲＡＧＥモジュレーターの検出のためのキットであって：（ａ）ポジティブコントロールとしての、ＲＡＧＥに対して既知の結合親和性を有する化合物；（ｂ）第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成るＲＡＧＥポリペプチドを含んで成るＲＡＧＥ融合タンパク質；及び（ｃ）使用説明書、を含んで成るキット。
【請求項２９】
対象のＲＡＧＥ媒介型障害を処置する方法であって、対象に対し、第二の非ＲＡＧＥポリペプチドと連結したＲＡＧＥリガンド結合部位を含んで成るＲＡＧＥポリペプチドを含んで成るポリペプチドを投与することを含んで成る方法。
【請求項３０】
ＲＡＧＥポリペプチドが免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインの一部を含んで成るポリペプチドと連結している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫グロブリンドメインを含んで成る前記ポリペプチドがヒトＩｇＧのＣH２又はＣH３ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含んで成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＡＧＥリガンド結合部位が配列番号９又はそれと９０％同一の配列、あるいは配列番号１０又はそれと９０％同一の配列を含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＡＧＥポリペプチドが、ヒトＲＡＧＥのアミノ酸２４−１１６に相当する配列番号８のアミノ酸配列を含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
対象に対するＲＡＧＥ融合タンパク質の静脈内投与を含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
対象に対するＲＡＧＥ融合タンパク質の腹腔内投与を含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
対象に対するＲＡＧＥ融合タンパク質の皮下投与を含んで成る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質を、糖尿病の症候、又は糖尿病の後期合併症の症候を処置するために使用する、請２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖尿病、又は糖尿病の後期合併症の症候が糖尿病性腎症を含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖尿病、又は糖尿病の後期合併症の症候が糖尿病性網膜症を含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖尿病、又は糖尿病の後期合併症の症候が足の糖尿病性壊疽を含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖尿病、又は糖尿病の後期合併症の症候が心血管系の合併症を含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記糖尿病、又は糖尿病の後期合併症の症候が糖尿病性神経障害を含んで成る、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記融合タンパク質を、アミロイドーシスを処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記融合タンパク質を、アルツハイマー病を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記融合タンパク質を、癌を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４６】
前記融合タンパク質を、自己免疫に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
前記融合タンパク質を、炎症性腸疾患に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
前記融合タンパク質を、関節リウマチに関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記融合タンパク質を、乾癬に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記融合タンパク質を、多発性硬化症に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５１】
前記融合タンパク質を、低酸素血症に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記融合タンパク質を、脳卒中に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記融合タンパク質を、心臓発作に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５４】
前記融合タンパク質を、出血性ショックに関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５５】
前記融合タンパク質を、敗血症に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５６】
前記融合タンパク質を、臓器移植に関連する炎症を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５７】
前記融合タンパク質を、臓器移植に関連する創傷治癒障害を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【請求項５８】
前記融合タンパク質を、腎不全に関連する創傷治癒障害を処置するために使用する、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
当該出願は、2004年8月3日付で出願された米国特許仮出願番号第60/598,362号に基づいて合衆国法典第35巻第119条（e）の下に優先権を主張する。米国特許仮出願番号第60/598,362号の開示の全体を本明細書で援用する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は終末糖化産物受容体（RAGE）の調節に関する。特に、本発明は、RAGEポリペプチドを含む融合タンパク質、そのような融合タンパク質の作製方法、及びRAGEベースの障害の処置のためのそのようなタンパク質の使用について説明する。
【背景技術】
【０００３】
背景
アルドース糖とタンパク質又は脂質のインキュベーションは、タンパク質のアミノ基の非酵素的な糖化及び酸化を引き起こして、アマドリ付加化合物を形成する。時間が経つにつれて、その付加物は、さらなる転位、脱水、及び他のタンパク質との架橋を受けて、最終糖化反応物（AGE）として知られる複合体を形成する。AGEの形成を促進する要因として、（例えば、アミロイドーシスなどの場合の）遅れたタンパク質の代謝回転、高いリジン含量を有する高分子の蓄積、及び（例えば、糖尿病などの場合の）高い血糖値がある（Hori ら、J. Biol. Chem. 270；25752-761ページ（1995年））。AGEは、糖尿病及び正常な老化に関連する合併症を含めた様々な障害に関係している。
【０００４】
AGEは、単球、マクロファージ、微小血管系の内皮細胞、平滑筋細胞、メサンギウム細胞、及びニューロンの細胞表面受容体への特異的、且つ、飽和結合を見せる。終末糖化産物受容体（RAGE）は、免疫グロブリン超遺伝子ファミリー分子のメンバーである。RAGEの細胞外（N末端）ドメインは、3つの免疫グロブリン型領域：1つのV（可変）型領域と、それに続く2つのC型（定常）ドメインを含む（Neeperら、J. Biol. Chem. 267：14998-15004ページ（1992年）；Schmidtら、Circ.（付録）96#194（1997年））。1つの膜貫通ドメイン、及び短い、高電荷のサイトゾル側末端が、細胞外ドメインに続く。N末端の細胞外ドメインは、RAGEのタンパク質分解、又はV及びCドメインを含む可溶性RAGE（sRAGE）を作り出すための分子生物学的アプローチによって単離することができる。
【０００５】
RAGEは、白血球、ニューロン、ミクログリア細胞、及び血管内皮細胞を含めた多様な細胞型で発現される（例えば、Horiら、J. Biol. Chem. 270：25752-761ページ（1995年））。高いRAGEレベルは、老化した組織（Schleicherら、J. Clin, Invest.、99（3）：457-468ページ（1997年））、並びに糖尿病の網膜、血管系、及び腎臓（Schmidtら、Nature Med. 1：1002-1004ページ（1995年））においてもまた見られる。
【０００６】
AGEに加えて、他の化合物が、RAGEに結合し、そして調節することができる。RAGEには、アミロイド-β（Aβ）、血清アミロイドA（SAA）、最終糖化産物（AGE）、S100（カルグラヌリン・ファミリーの炎症誘発性メンバー）、カルボキシメチルリジン（CML）、アンホテリン、及びCD11b/CD18を含めた多数の機能的、及び構造的に多様なリガンドが結合する（Bucciarelliら、Cell Mol. Life Sci. 59：1117-128ページ（2002年）；Chavakisら、Microbes Infect. 6：1219-1225ページ（2004年）；Kokkolaら、Scand. J. Immunol. 61：1-9ページ（2005年）；Schmidtら、J. Clin. Invest. 108：949-955ページ（2001年）；Rockenら、Am. J. Pathol. 162：1213-1220ページ（2003年））。
【０００７】
例えば、AGE、S100/カルグラヌリン、β-アミロイド、CML（Nε-カルボキシメチルリジン）、アンホテリンといったリガンドのRAGEへの結合は、様々な遺伝子の発現を修飾することがわかっている。これらの相互作用は、次に、p38の活性化、p21ras、MAPキナーゼ、Erk1-2リン酸化、及び炎症性シグナル伝達の転写メディエーターであるNF-κBの活性化を含めたシグナル伝達機序を開始することができる（Yehら、Diabetes 50：1495-1504ページ（2001年））。例えば、多くの細胞型において、RAGEとそのリガンドの間の相互作用が酸化ストレスを発生させることができ、それによって、フリーラジカル感受性転写因子であるNF-κBの活性化を引き起こし、そしてNP-κBの活性化が、例えばサイトカインIL-10及びTNF-αといった遺伝子を調節する。さらに、RAGE発現はNF-κBを介して上方制御され、そして、炎症又は酸化ストレス部位にて高められた発現を見せた。（Tanakaら、J. Biol. Chem. 275：25781-25790ページ（2000年））。よって、上方スパイラル、しばしば有害なスパイラルがリガンドの結合によって開始された正のフィードバック・ループによって増幅される。
【０００８】
異なる組織及び臓器におけるRAGEの活性化は、多くの病態生理学的因果関係につながる可能性がある。RAGEは、以下の：急性及び慢性炎症（Hofmannら、Cell 97：889-901ページ（1999年））、例えば高い血管透過といった糖尿病の後期合併症の発生（Wautierら、J. Clin. Invest. 97：238-243ページ（1995年））、腎障害（Teilletら、J. Am. Soc. Nephrol. 11：1488-1497ページ（2000年））、動脈硬化（Vlassaraら、The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med. 28：419-426ページ（1996年））、及び網膜障害（Harainesら、Diabetologia 42：603-607ページ（1999年））を含めた様々な病態にかかわる。RAGEは、アルツハイマー病（Yanら、Nature 382：685-691ページ（1996年））、並びに腫瘍侵襲及び転移（Taguchiら、Nature 405：354-357ページ（2000年））にもかかわる。
【０００９】
RAGEの広範囲の発現、及び多数の様々な病態モデルにおけるそのいかにも多面的な役割にもかかわらず、RAGEは正常な発生に不可欠であるように見えない。例えば、RAGEノックアウト・マウスには目立った異常な表現型はなく、慢性的に刺激された場合にRAGEは疾患病理学における役割を果たす可能性がある一方で、RAGEの阻害はいずれかの望ましくない急性表現型の原因となるとは考えられないことを示唆している（Liliensiekら、J. Clin. Invest. 113：1641-50ページ（2004年））。
【００１０】
RAGEへの生理的リガンドの拮抗性結合は、過剰濃度のAGE及び他のRAGEリガンドによって引き起こされた病態生理学的変化を下方制御することができる。内因性リガンドのRAGEへの結合を減少させることによって、RAGE媒介性障害に関連している症候を軽減できる。可溶性RAGE（sRAGE）は、効果的に、RAGEのRAGEリガンドへの結合に拮抗することができる。しかしながら、sRAGEは、インビボに投与された場合に、１又は複数の障害に処置的有効であるには短すぎるかもしれない半減期を有する可能性がある。よって、AGE及び他の生理的リガンドのRAGE受容体への結合に拮抗する、所望の薬理動態学特性を有する化合物を開発する必要がある。
【発明の開示】
【００１１】
概要
本発明の態様は、RAGE融合タンパク質、及びかかるタンパク質の使用方法を含む。本発明は、様々な方法で実施されてもよい。本発明の態様は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を含むことがある。1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含む。融合タンパク質は、免疫グロブリンのCH2ドメイン、又はCH2ドメインの一部を含むポリペプチドに直接連結したRAGEポリペプチドをさらに含むことができる。
【００１２】
本発明は、RAGE融合タンパク質を作製する方法も含む。1つの態様において、前記方法は、RAGEポリペプチドを第二の非RAGEポリペプチドに連結することを含む。1つの態様において、前記RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合部位を含む。前記方法は、RAGEポリペプチドを免疫グロブリンのCH2ドメイン又はCH2ドメインの一部を含むポリペプチドに直接連結することを含んでもよい。
【００１３】
他の態様において、本発明は、対象のRAGE媒介性障害を処置するための方法及び組成物を含んでもよい。前記方法は、本発明の融合タンパク質を対象に投与することを含んでもよい。その組成物は、医薬として許容される担体中に本発明のRAGE融合タンパク質を含んでもよい。
【００１４】
本発明の特定の態様に関連する様々な利点がある。1つの態様において、本発明の融合タンパク質は、対象に投与された場合に、代謝的に安定でありうる。また、本発明の融合タンパク質は、RAGEリガンドに対して高親和性結合を示すことができる。ある態様において、本発明の融合タンパク質は、高ナノモル〜低マイクロモルの範囲内の親和性でRAGEリガンドが結合する。生理学的RAGEリガンドに高親和性で結合することによって、本発明の融合タンパク質は、RAGEへの内因性リガンドの結合を抑制し、それによって、RAGE媒介性疾患を改善する手段を提供するために使用することができる。
【００１５】
また、本発明の融合タンパク質を、タンパク質又は核酸の形態で提供することができる。ある例示的な態様において、融合タンパク質は、全身に投与され、そしてRAGEによって一部が介在される血管疾患を潜在的に処置するために血管系内に残ってもよい。別の例示的な態様において、融合タンパク質は、RAGEリガンドが疾患の病変の原因となる所に、疾患を処置するために局所的に投与することができる。あるいは、融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトは、一過性の局所的発現がRAGEリガンドと受容体との相互作用を抑制することができる部位に、例えばウイルス又は裸のDNAといった適切な担体の使用によって提供されてもよい。よって、投与は、一過性であるか（例えば、融合タンパク質が投与される場合）、又は、実際は永久的であってもよい（例えば、融合タンパク質が組換えDNAとして投与される場合）。
【００１６】
本発明の追加の特徴を以下説明する。本願発明が以下の請求項、説明、及び図面に説明される詳細に限定されないことは理解されるべきである。本発明は、他の態様が可能であり、そして様々な方法で実践又は実施することができる。
【００１７】
詳細な説明
本願明細書のために、別段の指示のない限り、本明細書中に使用される成分、反応条件などの数量を表現する全ての数字が、全ての場合に、用語「約」によって修飾されることは理解されるべきである。従って、それとは反対に指示のない限り、以下の明細書中で説明される数的パラメータは、本発明によって得られるべき所望の特性に依存して変化する可能性がある概算値である。少なくとも、そして特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、それぞれの数的パラメータは、報告する有効数字の数の観点から、そして普通の丸めの技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
【００１８】
本発明の幅広い範囲を説明する数値域及びパラメータは概算値であるにもかかわらず、特定の態様において説明される数値はできるだけ的確に報告する。しかしながら、どんな数値もそれらのそれぞれの試験計測において見られる標準偏差から生じるいくらかの誤差を本来必ず含む。そのうえ、本明細書中に開示された全ての範囲が、その中に包含されるあらゆる部分的な範囲を取り込むことが理解される。例えば、「1〜10」の規定された範囲は、最小値の1と最大値の10の間の（及びそれを含めて）あらゆる部分的な範囲；すなわち、1以上の最小値、例えば、1〜6.1に始まって、そして10以下、例えば、5.5〜10の最大値で終わる全ての部分的な範囲を含むことが理解されるべきである。さらに、「本明細書で援用する」といわれるあらゆる参考文献は、その全体が援用されると理解されるべきである。
【００１９】
本願明細書に使用される、単数形（「a」、「an」、及び「the」）が、特別に、且つ、はっきりと1つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象物を含むことが、さらに留意される。用語「又は」は、他のものを明確に指示する言葉のない限り、用語「及び／又は」と互換性を持って使用される。
【００２０】
また、用語「部分」及び「フラグメント」は、ポリペプチド、核酸、又は他の分子コンストラクトの一部を表すために互換性を持って使用される。
【００２１】
本明細書中では、用語「上流」は、その分子がタンパク質である場合、第2の残基に対してN末端側にある残基を表し、又はその分子が核酸である場合、第2の残基に対して5’側にある残基を表す。同様に、本明細書中では、用語「下流」は、その分子がタンパク質である場合、第2の残基に対してC末端側にある残基を表し、又はその分子が核酸である場合、第2の残基に対して3'側にある残基を表す。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中では、全てが技術的及び科学的な用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持っている。専門家は、当業界の定義及び用語について、特に分子生物学の最新のプロトコール（例えば、Ausubel, P.M.ら、Short Protocols in Molecular Biology、第4版、第2章、John Wiley & Sons、N.Y.を参照のこと）を対象にする。アミノ酸残基に関する略語は、20個の一般的なL-アミノ酸の1つを表すのに当業界で使用される標準的な3文字、及び／又は1文字コードである。
【００２３】
「核酸」は、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）といったポリヌクレオチドである。前記用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸、並びにヌクレオチド又はヌクレオシド類似体から作られるRNA及びDNAを含むのに使用される。
【００２４】
用語「ベクター」は、細胞内に第2の核酸分子を輸送するのに使用できる核酸分子を表す。1つの態様において、ベクターは、ベクター内に挿入されたDNA配列の複製を可能にする。ベクターは、少なくともいくつかの宿主細胞において核酸分子の発現を促進するためにプロモーターを含むことができる。ベクターは、自律的に（染色体外）複製できるか、又は宿主細胞染色体内に統合されることができる。1つの態様において、前記ベクターは、ベクター内に挿入された核酸配列の少なくとも一部に由来するタンパク質を産生することができる発現ベクターを含むことができる。
【００２５】
当業界で知られているように、互いに核酸配列をハイブリダイズするための条件は、低いストリンジェンシー〜高いストリンジェンシーにわたるものとして説明できる。一般に、高ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は、高熱にて低塩バッファー中でハイブリッド物を洗浄することを表す。ハイブリダイゼーションは、65℃にて、当業界で標準的なハイブリダイゼーション溶液、例えば0.5MのNaHPO4、7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を使用し、そしてプローブの長さに依存して室温〜68℃の温度で0.25MのNaHPO4、3.5%のSDS中で洗浄し、続いて0.1×SSC/0.1%のSDSで洗浄することによって結合したDNAを選別することであろう（Ausubelら）。例えば、高ストリンジェンシーな洗浄は、14塩基のオリゴヌクレオチドプローブに対して37℃にて、17塩基のオリゴヌクレオチドプローブに対して48℃にて、20塩基のオリゴヌクレオチドプローブに対して55℃にて、25塩基のオリゴヌクレオチドプローブに対して60℃にて、又は約250ヌクレオチドの長さのヌクレオチドプローブに対して65℃にて6×SSC/0.05%のピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを含む。核酸プローブは、例えば、［γ-32P］ATPでの末端標識、又はランダムプライマー標識による放射性標識ヌクレオチド、例えば［α-32P］dCTPの取り込みによって放射性ヌクレオチドで標識されることができる。あるいは、プローブは、ビオチン化又はフルオレセイン標識ヌクレオチドの取り込みによって標識されることができ、そしてそのプローブスは、ストレプトアビジン又は抗フルオレセイン抗体を使用して検出される。
【００２６】
本明細書中では、「小有機分子」は、少なくとも1つの炭素原子を含む2,000ダルトン未満の分子量の分子である。
【００２７】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、部分的又は完全長のいずれかのタンパク質を含むことができるタンパク質分子を説明するために互換性を持って本明細書中に使用される。
【００２８】
用語「融合タンパク質」は、2つ以上タンパク質由来のアミノ酸配列を持つタンパク質又はポリペプチドを表す。融合タンパク質は、また、別々のタンパク質に由来するアミノ酸部分の間にアミノ酸の連結領域を含むこともできる。
【００２９】
本明細書中では、「非RAGEポリペプチド」は、RAGE又はそのフラグメントに由来しないあらゆるポリペプチドである。そのような非RAGEポリペプチドは、免疫グロブリン・ペプチド、二量化ポリペプチド、安定化ポリペプチド、両親媒性ペプチド、あるいはタンパク質のターゲティング又は精製のための「タグ」を提供するアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドを含む。
【００３０】
本明細書中では、「免疫グロブリン・ペプチド」は、免疫グロブリン重鎖又はその一部を含むかもしれない。1つの態様において、重鎖の一部は、Fcフラグメント又はその一部でありうる。本明細書中では、Fcフラグメントは、単量体型又は二量体型のいずれかの、重鎖のヒンジ・ポリペプチド、並びに免疫グロブリンの重鎖のCH2及びCH3ドメインを含む。または、CH1及びFcフラグメントを、免疫グロブリン・ポリペプチドとして使用できる。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれかから得ることができる。さらに、重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、あるいは生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ又はサブタイプの変異群のいずれか1つから得ることができる。変更されうる生物学的活性の例は、例えばヒンジ領域の修飾による、いくつかのFc受容体に結合するアイソタイプの能力の低下を含む。
【００３１】
用語「同一性」又は「パーセント同一の」は、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の間の配列同一性を表す。パーセント同一性は、2つの配列をアラインすることによって測定できて、そして比較された配列によって共有された位置における同じ残基（すなわち、アミノ酸又はヌクレオチド）の数を表す。配列のアラインメント及び比較は、当業界において標準的なアルゴリズムを使用して（例えば、Smith and Waterman、1981年、Adv. Appl Math. 2：482ページ；Needleman and Wunsch、1970年、J. Mol. Bid. 48：443ページ；Pearson and Lipman、1988年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85：2444ページ）又はBLAST及びFASTAとして公的に利用可能なこれらのアルゴリズムのコンピュータ化したバージョン（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、Genetics Computer Group、575 Science Drive, Madison, WI）によって行われることができる。また、National Institutes of Health、Bethesda, MDを通じて利用可能なENTREZが、配列比較に使用できる。1つの態様において、2つの配列のパーセントの同一性は、各アミノ酸のギャップを2つの配列の間の1つのアミノ酸のミスマッチであるかのように加重するように1のギャップ加重を有するGCGを使用して決定されることができる。
【００３２】
本明細書中では、用語「保存残基」は、同じ構造、及び／又は機能を有する多くのタンパク質の中で同じであるアミノ酸を表す。保存残基の領域は、タンパク質の構造又は機能に重要である可能性がある。よって、3次元タンパク質において特定される近接する保存残基は、タンパク質の構造又は機能に重要である可能性がある。保存残基又は三次元構造の保存領域を見つけるために、異なる種から又は同じ種の個体からの同じか又は類似したタンパク質の配列の比較が、行われるかもしれない。
【００３３】
本明細書中では、用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列と一定の相同性を有するポリペプチドを意味する。相同性比較は、目で見て、又は、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つ以上の配列の間の相同性パーセントについて計算できる（例えば、Wilbur, W. J. and Lipman, D. J.、1983年、Proc. Nail Acad. Sci. USA, 80：726-730ページ）。例えば、相同性配列を、別の態様において、互いに、少なくとも75%同一、85%同一、95%同一、又は98%同一であるアミノ酸が含まれるようにすることができる。
【００３４】
本明細書中では、ポリペプチド又はタンパク質の「ドメイン」は、独自の単位を含むポリペプチド又はタンパク質に沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列、及び／又は生物学的活性の面から規定されることができる。1つの態様において、ポリペプチド・ドメインは、タンパク質の残りの部分から実質的に独立した様式で折り畳まれたタンパク質の領域を含むことができる。ドメインは、例えば、これだけに制限されることなく、PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISREC、PROFILES、SAMRT、及びPROCLASSといったドメイン・データベースを使用して同定できる。
【００３５】
本明細書中では、「免疫グロブリン・ドメイン」は、免疫グロブリンのドメインと構造的に相同であるか、又は同一であるアミノ酸配列である。免疫グロブリン・ドメインのアミノ酸配列の長さは、どんな長さであってもよい。1つの態様において、免疫グロブリン・ドメインは、250アミノ酸未満でありうる。1つの例において、免疫グロブリン・ドメインは、約80〜150アミノ酸の長さでありうる。例えば、IgGの可変領域、並びにCH1、CH2、及びCH3領域は、それぞれ免疫グロブリン・ドメインである。他の例において、IgMの可変、CH1、CH2、CH3、及びCH4領域は、それぞれ免疫グロブリン・ドメインである。
【００３６】
本明細書中では、「RAGE免疫グロブリン・ドメイン」は、免疫グロブリンのドメインと構造的に相同であるか、又は同一であるRAGEタンパク質からアミノ酸配列である。例えば、RAGE免疫グロブリン・ドメインは、RAGEのV-ドメイン、RAGEのIg様C2タイプ1ドメイン（「C1ドメイン」）、又はRAGEのIg様C2タイプ2ドメイン（「C2ドメイン」）を含むことができる。
【００３７】
本明細書中では、「ドメイン間リンカー」は、2つのドメインを連結させるポリペプチドを含む。Fcヒンジ領域は、IgGのドメイン間リンカーの例である。
【００３８】
本明細書中では、「直接連結された」は、連結される2つの基の間にいかなる介在原子も持たない2つの異なる基（例えば、核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチド・ドメイン）の間の共有結合とみなす。
【００３９】
本明細書中では、「リガンド結合ドメイン」は、リガンドが結合する原因となるタンパク質のドメインを表す。用語、リガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメイン又はその一部に関する相同体を含む。この関連で、リガンド結合ドメインの結合特異性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、又は親水性における類似性に基づいてリガンド結合部位において、計画的なアミノ酸置換を行うことができる。
【００４０】
本明細書中では、「リガンド結合部位」は、リガンドと直接相互作用するタンパク質内の残基、又はリガンドと直接相互作用する残基に極めて接近したリガンドの位置決めに関与する残基を含む。リガンド結合部位内の残基の相互作用は、モデル又は構造におけるリガンドに対する残基の空間的近接によって規定することができる。用語、リガンド結合部位は、リガンド結合部位の相同体又はその一部を含んでいる。これに関連して、計画的なアミノ酸置換が、リガンド結合部位の結合特異性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水度、又は親水性の類似性に基づいてリガンド結合部位内で行われてもよい。リガンド結合部位は、タンパク質又はポリペプチドの１又は複数のリガンド結合ドメイン内に存在することができる。
【００４１】
本明細書中では、用語「相互作用」は、リガンド又は化合物、あるいはその一部若しくはフラグメントと、注目の第2の分子の一部との間の近接条件を表す。相互作用は、非共有結合、例えば水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電気、又は疎水性相互作用の結果であるかもしれず、あるいはそれは共有結合でありうる。
【００４２】
本明細書中では、「リガンド」は、リガンド結合部位と相互作用する分子、化合物、あるいは、基質若しくはアナログ又はその一部を含めた物体を表す。本明細書中に記載のとおり、用語「リガンド」は、注目のタンパク質に結合する化合物を表すことができる。リガンドは、アゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターであってもよい。又は、リガンドは生物学的効果を有することができない。又は、リガンドは他のリガンドの結合を妨げ、それによって、生物学的効果を抑制することができる。リガンドは、これだけに制限されることなく、低分子阻害剤を含むことができる。これらの小分子は、ペプチド、ペプチドミメティックス、有機化合物等を含むことができる。リガンドは、また、ポリペプチド、及び／又はタンパク質を含むことができる。
【００４３】
本明細書中では、「モジュレーター化合物」は、注目の分子の生物学的活性を変化させるか、又は部分的に変更する分子を表す。モジュレーター化合物は、注目の分子の活性を高めるか又は下げるか、あるいは、物理的若しくは化学的特性、又は機能的若しくは免疫的性質を変化させることができる。RAGEに関して、モジュレーター化合物は、RAGE又はその一部の活性を高めるか若しくは下げるか、あるいは特性、又は機能的若しくは免疫的性質を変化させることができる。モジュレーター化合物は、天然の、及び／又は化学的に合成された、又は人工のペプチド、修飾したペプチド（例えば、リンペプチド）、抗体、炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、糖脂質、複素環式化合物、ヌクレオシド、若しくはヌクレオチド、又はその部分、あるいは小さな有機又は無機分子を含むことができる。モジュレーター化合物は、内因性の生理学的化合物であるか、あるいはそれは天然の又は合成の化合物でありうる。又は、モジュレーター化合物は、小有機分子でありうる。用語「モジュレーター化合物」は、また、化学的に修飾したリガンド又は化合物をも含むので、異性体及びラセミ体を含む。
【００４４】
「アゴニスト」は、受容体に結合して、関連する受容体に特異的な薬理学的応答を引き出す複合体を形成する化合物を含む。
【００４５】
「アンタゴニスト」は、アゴニストに、又は受容体に結合して、実質的な薬理学的応答をもたらすことなくアゴニストによって誘発される生物学的応答を抑制することができる複合体を形成する化合物を含む。
【００４６】
RAGEアゴニストは、このため、RAGEに結合し、RAGE媒介性細胞過程を刺激することができ、且つ、RAGEアンタゴニストは、RAGE媒介性過程がRAGEアゴニストによって刺激されるのを抑制することができる。例えば、ある態様において、RAGEアゴニストによって刺激された細胞過程は、TNF-α遺伝子転写の活性化を含む。
【００４７】
用語「ペプチドミメティックス」は、分子間の相互作用においてペプチドの代用の役目を果たすコンストラクトを表す（Morganら、1989年、Ann. Reports Med. Chem., 24：243-252ページ）。ペプチドミメティックスは、アミノ酸、及び／又はペプチド結合を含むことができるが、ペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストの構造的及び機能的特徴を保持する合成のコンストラクトを含むことができる。ペプチドミメティックスは、また、ペプトイド、オリゴペプトイド（Simonら、1972年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：9367ページ）、及び本発明のペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストに対応するアミノ酸のあらゆる可能性のある配列に相当する設計された長さのペプチドを含めたペプチド・ライブラリをも含んでいる。
【００４８】
用語「処置すること」又は「処置する」は、疾患又は障害の症候を改善することを表し、且つ、障害を治すか、障害の発症を実質的に防ぐか、又は対象の病状を改善することを含むことができる。本明細書中では、用語「処置」は、対象が罹患している所定の障害に関する処置の全領域を表し、その障害から生じる1つの症候又は大部分の症候の緩和、特定の障害の治癒、又は障害の発症の予防を含んでいる。
【００４９】
本明細書中では、用語「EC50」は、計測された生物学的効果の50%をもたらすアゴニストの濃度と規定される。例えば、計測可能な生物学的効果を有する処置薬のEC50は、アゴニストが生物学的効果の50%を見せる値を含むことができる。
【００５０】
本明細書中では、用語「IC50」は、測定した効果の50%の阻害をもたらすアゴニストの濃度と規定される。例えば、RAGE結合のアンタゴニストのIC50は、アンタゴニストがRAGEのリガンド結合部位へのリガンドの結合を50%まで減少させる値を含むことができる。
【００５１】
本明細書中では、「有効量」は、対象における所望の効果を発生さるのに有効であるアゴニストの量を意味する。用語「治療上有効量」は、求められている動物又はヒトの処置応答を引き出す薬物又は医薬的なアゴニストの量を意味する。有効量を含む実際の用量は、投与経路、対象の体格と健康状態、処置される障害等に依存するかもしれない。
【００５２】
用語「医薬として許容される担体」は、本明細書中では、例えばRAGE媒介性障害又は疾患の処置のために投与される処置組成物に関してヒト又は動物の対象における使用に好適な化合物及び組成物を表すことができる。
【００５３】
用語「医薬組成物」は、本明細書中では、従来の無毒の担体、希釈剤、アジュバント、溶媒等を含む単位投与量製剤として、例えば、経口的に、非経口的に、局所的に、吸入スプレーによって、鼻腔内的に、又は経直腸的に哺乳動物宿主に投与することができる組成物を意味する。
【００５４】
用語「非経口」は、本明細書中では、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射、又は注入技術を含んでいる。
【００５５】
RAGE融合タンパク質
本発明の態様は、RAGE融合タンパク質、そのような融合タンパク質の作製方法、及びそのような融合タンパク質の使用方法を含む。本発明は、様々な方法で実施することができる。
【００５６】
例えば、本発明の態様は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。1つの態様において、融合タンパク質はRAGEリガンド結合部位を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【００５７】
ある態様において、RAGEポリペプチドは、免疫グロブリン・ドメイン又は免疫グロブリン・ドメインの一部（例えば、そのフラグメント）を含むポリペプチドに連結されてもよい。1つの態様において、免疫グロブリン・ドメインを含むポリペプチドは、少なくとも1つのヒトIgGのCH2又はCH3ドメインの少なくとも一部を含む。
【００５８】
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、完全長のヒトRAGEタンパク質（例えば、配列番号1）、又はヒトRAGEのフラグメントを含むことができる。本明細書中では、RAGEポリペプチドのフラグメントは、少なくとも5アミノ酸の長さであり、30アミノ酸より長い長さでありうるが、完全なアミノ酸配列未満である。本発明のタンパク質、方法、及び組成物に関する別の態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEと70%、80%、又は85%、あるいは90%同一である配列、又はそのフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら（1992）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列を取り除いた完全長のRAGE（例えば、配列番号2又は配列番号3）（図1A及び1B）、あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。
【００５９】
本発明の融合タンパク質は、また、sRAGE（例えば、配列番号4）、sRAGEと90%同一のポリペプチド、又はsRAGEのフラグメントを含むことができる。本明細書中では、sRAGEは、膜貫通領域又は細胞質側末端を含まないRAGEタンパク質である（Parkら、Nature Med. 4：1025-1031ページ（1998年））。例えば、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトsRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら（1992年）を参照のこと）。又は、RAGEポリペプチドは、シグナル配列が取り除かれたヒトsRAGE（配列番号5若しくは配列番号6）（図１Ｃ）、又はそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。
【００６０】
他の態様において、RAGEタンパク質は、RAGEのVドメインを含むことができる（例えば、図1Dの中の配列番号7若しくは配列番号8（Neeperら（1992年）；Schmidtら（1997年）））。又は、RAGEのVドメインに少なくとも90%同一の配列又はそのフラグメントを使用できる。
【００６１】
又は、RAGEタンパク質は、RAGEのVドメインのフラグメントを含むことができる（例えば、図1Dの中の配列番号9若しくは配列番号10）。1つの態様において、RAGEタンパク質は、リガンド結合部位を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、配列番号10又はそれと90%同一の配列を含むことができる。さらに他の態様において、RAGEフラグメントは合成ペプチドである。
【００６２】
よって、本発明の融合タンパク質に使用されるRAGEポリペプチドは、完全長RAGEのフラグメントを含むことができる。当業界で知られているように、RAGEは、それぞれがドメイン間リンカーによって互いに連結された、Vドメイン、並びにC1及びC2ドメインの3つの免疫グロブリン様ポリペプチド・ドメインを含む。完全長のRAGEは、また、C2ドメインの下流側、且つ、C2ドメインに連結された膜貫通ポリペプチド及び細胞質側末端（C末端）も含んでいる。
【００６３】
ある態様において、RAGEポリペプチドは、シグナル配列残基を全く含んでいない。RAGEのシグナル配列は、完全長RAGEの第1〜22残基又は第1〜23残基のいずれかを含むことができる。
【００６４】
例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメインに相当する、ヒトRAGEの23〜116アミノ酸（配列番号7）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜116アミノ酸（配列番号8）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのC1ドメインに相当する、ヒトRAGEの124〜221アミノ酸（配列番号11）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。他の態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEのC2ドメインに相当する、ヒトRAGEの227〜317アミノ酸（配列番号12）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜123アミノ酸（配列番号13）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜123アミノ酸（配列番号14）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、及びこれら2つのドメインを連結するドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜226アミノ酸（配列番号17）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜226アミノ酸（配列番号18）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、sRAGEに相当する（すなわち、V、C1、C2ドメイン、及びドメイン間リンカーをコードする）、ヒトRAGEの23〜339アミノ酸（配列番号5）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜339アミノ酸（配列番号6）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、これらの配列のそれぞれのフラグメントを使用できる。
【００６５】
融合タンパク質は、RAGE又はそのフラグメントに由来しない数タイプのペプチドを含むことができる。融合タンパク質の第二のポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。1つの態様において、免疫グロブリン・ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖、又はその一部（すなわち、フラグメント）を含むことができる。例えば、重鎖フラグメントは免疫グロブリンのFcフラグメントに由来するポリペプチドを含むことができるが、ここで、Fcフラグメントは、モノマーとして重鎖ヒンジ・ポリペプチド、及び免疫グロブリン重鎖のCH2とCH3ドメインを含む。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれか1つから得ることができる。さらに、重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、又は生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ又はサブタイプの突然変異体のいずれか1つから得ることができる。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、あるいはこれらのドメインのいずれか、又は両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。
【００６６】
免疫グロブリン鎖のFc部分は、in vivoにおいて炎症誘発性でありうる。よって、1つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来するドメイン間ヒンジ・ポリペプチドよりむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含む。
【００６７】
よって、1つの態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド、又は免疫グロブリンのCH2ドメインのフラグメント若しくは一部に直接連結されたRAGEポリペプチドを含むことができる。1つの態様において、CH2ドメイン又はそのフラグメントは、配列番号42を含むことができる。1つの態様において、RAGEポリペプチドは、リガンド結合部位を含むことができる。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【００６８】
本発明の融合タンパク質に使用するRAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。追加的に又は択一的に、RAGEのフラグメントは、ドメイン間リンカーを含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、上流（すなわち、N末端により近い）又は下流（すなわち、C末端により近い）のドメイン間リンカーに連結されたRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。さらに他の態様において、RAGEポリペプチドは、それぞれがドメイン間リンカーによって互いに連結された2つの（又はそれより多い）RAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。RAGEポリペプチドは、１又は複数のドメイン間リンカーによって互いに連結された複数のRAGE免疫グロブリン・ドメインを更に含むことができ、そしてN末端のRAGE免疫グロブリン・ドメイン、及び／又はC末端の免疫グロブリン・ドメインに結合させた端末ドメイン間リンカーを有する。RAGE免疫グロブリン・ドメインとドメイン間リンカーの更なる組み合わせが、本発明の範囲内にある。
【００６９】
1つの態様において、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、且つ、RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が免疫グロブリンのCH2ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結したRAGEドメイン間リンカーを含む。免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインのいずれか若しくはその両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は 配列番号40を含むことができる。
【００７０】
先に説明したように、本発明の融合タンパク質は、RAGE由来の単独の又は複数のドメインを含むことができる。また、RAGEポリペプチド・ドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長RAGEタンパク質のフラグメントを含むことができる。例えば、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEの23〜136アミノ酸（配列番号15）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜136アミノ酸（配列番号16）又はそれと90%同一の配列融合タンパク質を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これら2つのドメインを連結するドメイン間リンカー、及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜251アミノ酸（配列番号19）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜251アミノ酸（配列番号20）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。
【００７１】
例えば、1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。融合タンパク質は、第一のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第一のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、そして第二のRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がCH2免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸に直接連結されるように、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第1のRAGEドメイン間リンカーを含むことができる。1つの態様において、4ドメインRAGE融合タンパク質は、配列番号32を含むことができる。別の態様において、4ドメインRAGE融合タンパク質は、配列番号33又は配列番号34を含む。
【００７２】
あるいは、3ドメイン融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、CH2免疫グロブリン・ドメイン又はCH2免疫グロブリン・ドメインの一部のN末端アミノ酸に、RAGEドメイン間リンカーを介して連結された1つのRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。1つの態様において、3ドメインRAGE融合タンパク質は、配列番号35を含むことができる。別の態様において、3ドメインRAGE融合タンパク質は、配列番号36又は配列番号37を含むことができる。
【００７３】
RAGEドメイン間リンカーフラグメントは、天然においてRAGE免疫グロブリン・ドメインの下流に存在し、それ故にそこに連結できるペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGEのVドメインに関しては、ドメイン間リンカーは、天然においてVドメインから下流に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第117〜123アミノ酸に相当する配列番号21を含むことができる。又はリンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号21の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（例えば、1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むドメイン間リンカーが使用できる。よって、1つの態様において、ドメイン間リンカーは、完全長のRAGEの第117〜136アミノ酸を含む配列番号23を含むことができる。又はリンカーのいずれかの末端から、例えば1、2、又は3個のアミノ酸が欠失している配列番号21のフラグメントが使用できる。別の態様において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23と70%同一、80%同一、85%同一、又は90%同一である配列を含むことができる。
【００７４】
RAGEのC1ドメインに関して、リンカーは、天然においてC1ドメインの下流に存在するペプチド配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第222〜251アミノ酸に相当する配列番号22を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を有するペプチドを含むことができる。例えば、配列番号22の上流及び下流のいくつかのアミノ酸（1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むリンカーが使用できる。又は、配列番号22のフラグメントが使用でき、リンカーのいずれかの末端から、例えば1〜3、1〜5、若しくは1〜10、又は1〜15のアミノ酸を取り除くことができる。例えば、1つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、第222〜226アミノ酸に相当する配列番号24を含むことができる。又は、ドメイン間リンカーは、RAGEの第318〜342アミノ酸に相当する配列番号44を含むことができる。
【００７５】
RAGE融合タンパク質の製造方法
本発明は、また、RAGE融合タンパク質を作製する方法を含む。よって、1つの態様において、本発明は、第二の非RAGEポリペプチドと連結した、RAGEリガンド結合部位を含むRAGEポリペプチドを共有結合するステップを含むRAGE融合タンパク質を作製する方法を含む。例えば、連結されたRAGEポリペプチドと第二の非RAGEポリペプチドは、組換えDNAコンストラクトによってコードされていてもよい。その方法は、さらに、DNAコンストラクトを発現ベクターに組み込むステップを含むことができる。また、その方法は、宿主細胞の中に発現ベクターを挿入するステップを含むことができる。
【００７６】
例えば、本発明の態様は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、RAGE融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【００７７】
ある態様において、RAGEポリペプチドは、免疫グロブリン・ドメイン又は免疫グロブリン・ドメインの一部（例えば、そのフラグメント）を含むポリペプチドに連結してもよい。1つの態様において、免疫グロブリン・ドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgGのCH2又はCH3ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含む。
【００７８】
前記融合タンパク質は、組み換えDNA技術によって設計できる。例えば、1つの態様において、本発明は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドをコードする単離した核酸配列を含んで成ることがある。ある態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。
【００７９】
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、完全長のヒトRAGE（例えば、配列番号1）又はヒトRAGEのフラグメントを含むことができる。ある態様において、RAGEポリペプチドは、シグナル配列残基を全く含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長のRAGE（配列番号1）の第1〜22残基又は第1〜23残基のいずれかを含むことができる。別の態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEと70%、又は80%、あるいは90%同一である配列、あるいはそのフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、ヒトRAGEは、シグナル配列を取り除いた完全長のRAGE（例えば、配列番号2又は配列番号3）（図1A及び1B）あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。また、本発明のRAGE融合タンパク質は、また、sRAGE（例えば、配列番号4）、sRAGEと90%同一のポリペプチド、又はsRAGEのフラグメントを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトsRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列が取り除かれたsRAGE（配列番号5若しくは配列番号6）（図１Ｃ）、あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。他の態様において、RAGEタンパク質は、Vドメイン（例えば、図1Dの中の配列番号7若しくは配列番号8）を含むことができる。又は、Vドメインと90%同一の配列、又はそのフラグメントを使用できる。又はRAGEタンパク質は、Vドメインの一部を含むRAGEのフラグメント（例えば図1Dの中の配列番号9若しくは配列番号10）を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含むことができる。さらに他の態様において、RAGEフラグメントは合成ペプチドである。
【００８０】
ある態様において、核酸配列は、ヒトRAGEの1〜118アミノ酸又はそのフラグメントをコードする配列番号25を含む。例えば、配列番号25の第1〜348ヌクレオチドを含む配列が、ヒトRAGEの1〜116アミノ酸をコードするのに使用できる。又は、核酸は、ヒトRAGEの1〜123アミノ酸をコードする配列番号26を含むことができる。又は、核酸は、ヒトRAGEの1〜136アミノ酸をコードする配列番号27を含むことができる。又は、核酸は、ヒトRAGEの1〜230アミノ酸をコードする配列番号28を含むことができる。又は、核酸は、ヒトRAGEの1〜251アミノ酸をコードする配列番号29を含むことができる。又は、これらの核酸配列が、RAGEポリペプチドフラグメントをコードするのに使用できる。
【００８１】
融合タンパク質は、RAGE又はそのフラグメントに由来しない数タイプのペプチドを含むことができる。融合タンパク質の第二のポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれか1つから得ることができる。さらに、重鎖（その一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、又は生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ若しくはサブタイプの変異体のいずれか1つから得ることができる。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインのいずれか、若しくは両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。免疫グロブリン・ペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によってコードされることができる。
【００８２】
免疫グロブリン鎖のFc部分は、in vivoにおいて炎症誘発性でありうる。よって、本発明のRAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来するドメイン間ヒンジ・ポリペプチドよりむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、1つの態様において、融合タンパク質は、組換えDNAコンストラクトによってコードされることができる。また、その方法は、DNAコンストラクトを発現ベクター内に組み込むステップを含むことができる。また、その方法は、宿主細胞内に発現ベクターをトランスフェクションすることを含むことができる。
【００８３】
よって、1つの態様において、本発明は、免疫グロブリンのCH2ドメイン又は免疫グロブリンのCH2ドメインの一部を含むポリペプチドにRAGEポリペプチドを連結する共有結合ステップを含むRAGE融合タンパク質の作製方法を含む。1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【００８４】
例えば、1つの態様において、本発明は、免疫グロブリンのCH2ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドをコードする核酸を含む。1つの態様において、CH2ドメイン又はそのフラグメントは、配列番号42を含む。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。免疫グロブリン・ペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によってコードされることができる。
【００８５】
1つの態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、且つ、RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が免疫グロブリンのCH2ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含むことができる。免疫グロブリンのCH2ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインの両方、若しくはいずれかの一部を含むポリペプチドを含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。
【００８６】
本発明の融合タンパク質は、RAGE由来の1つの又は複数のドメインを含むことができる。また、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長のRAGEタンパク質のフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。融合タンパク質は、第一のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第一のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、そして第二のRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第一のドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これらの2つのドメインに連結されたドメイン間リンカー、及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜251アミノ酸（配列番号19）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜251アミノ酸（配列番号20）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。1つの態様において、配列番号30又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、4ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる。
【００８７】
あるいは、3ドメイン融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に連結された1つのRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜136アミノ酸（配列番号15）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜136アミノ酸（配列番号16）又はそれと90%同一の配列融合タンパク質を含むことができる。1つの態様において、配列番号31又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、3ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる。
【００８８】
RAGEドメイン間リンカーフラグメントは、天然においてRAGE免疫グロブリン・ドメインの下流に存在し、よって、そこに連結されるペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGEのVドメインに関して、ドメイン間リンカーは、天然においてVドメインから下流に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第117〜123アミノ酸に相当する配列番号21を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号21の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（例えば、1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むドメイン間リンカーを使用できる。よって、1つの態様において、ドメイン間リンカーは、完全長のRAGEの第117〜136アミノ酸を含む配列番号23を含む。又は、リンカーのいずれかの末端から1、2、又は3個のアミノ酸を取り除いた配列番号21のフラグメントを使用できる。別の態様において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23と70%同一、又は80%同一、あるいは90%同一である配列を含むことができる。
【００８９】
RAGEのC1ドメインに関して、リンカーは、天然においてC1ドメインの下流に存在するペプチド配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第222〜251アミノ酸に相当する配列番号22を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号22の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むリンカーを使用できる。又は、リンカーのいずれかの末端から、例えば1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸を取り除いた配列番号22のフラグメントを使用できる。例えば、1つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、第222〜226アミノ酸に相当する配列番号24を含むことができる。又は、ドメイン間リンカーは、RAGEの第318〜342アミノ酸に相当する配列番号44を含むことができる。
【００９０】
前記方法は、さらに、DNAコンストラクトを発現ベクター内に組み込むステップを含むことができる。よって、ある態様において、本発明は、免疫グロブリンのCH2ドメイン又は免疫グロブリンのCH2ドメインの一部を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質をコードする発現ベクターを含む。ある態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が免疫グロブリンのCH2ドメイン又はその一部を含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを持ったコンストラクト、例えば、本明細書に記載のものを含む。例えば、細胞をトランスフェクションするのに使用する発現ベクターは、配列番号30又はそのフラグメント、あるいは配列番号31又はそのフラグメントの核酸配列を含むことができる。
【００９１】
前記方法は、さらに、本発明の発現ベクターで細胞をトランスフェクションするステップを含むことができる。よって、ある態様において、本発明は、その上記細胞が、免疫グロブリンのCH2ドメイン又は免疫グロブリンのCH2ドメインの一部を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を発現するように、本発明のRAGE融合タンパク質が発現される発現ベクターでトランスフェクションされた細胞を含む。ある態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が免疫グロブリンのCH2ドメイン又はその一部を含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結させたRAGEドメイン間リンカーを持ったコンストラクト、例えば本明細書中に説明したものを含む。例えば、発現ベクターは、配列番号30又はそのフラグメント、あるいは配列番号31又はそのフラグメントの核酸配列を含むことができる。
【００９２】
例えば、プラスミドは、異なる長さのヒトRAGEの5’側のcDNA配列を、ヒトIgG1 Fc（γ1）の3’側のcDNA配列と融合することによってRAGE-IgG Fc融合タンパク質を発現するように構築されることができる。発現カセット配列は、標準的な組換え技術を使用して、例えばpcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen, CA）といった発現ベクター内に挿入されることができる。
【００９３】
また、前記方法は、宿主細胞内に本発明の発現ベクターをトランスフェクションすることを含むことができる。1つの態様において、組換え発現ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）内にトランスフェクションされ、そして発現が最適化されることができる。別の態様において、前記細胞は、0.1〜20グラム／リットル、0.5〜10グラム／リットル、又は約1〜2グラム／リットルを産生できる。
【００９４】
当業界で知られているとおり、そのような核酸コンストラクトは、例えば、注目の突然変異を含むプライマーを用いた核酸鋳型のPCR増幅のように、突然変異によって修飾できる。このようにして、RAGEリガンドに対する親和性を変えることを含むポリペプチドを、設計することができる。1つの態様において、突然変異配列は、開始DNAと90%以上同一でありうる。そのようなものとして、変異体は、ストリンジェント条件下（すなわち、1モルの塩中でのDNA二本鎖の融解温度（TM）より約20〜27℃低い温度に相当）でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９５】
コード配列は、適切な宿主内に発現ベクターをトランスフェクションすることによって発現することができる。例えば、組換えベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞内に安定してトランスフェクションすることができ、そして融合タンパク質を発現する細胞を選択し、そしてクローニングすることができる。ある態様において、組換えコンストラクトを発現する細胞は、抗生物質G418を適用することによって、プラスミドにコードされたネオマイシン耐性について選択される。個々のクローンを選択でき、そして、細胞上清のウェスタンブロット分析によって検出される高レベルの組換えタンパク質を発現するクローンを高めることができ、そして、その遺伝子産物を、プロテインAカラムを使用した親和性クロマトグラフィーで精製することができる。
【００９６】
本発明のRAGE融合タンパク質をコードする組換え核酸の態様のサンプルが、図2〜5に示されている。例えば、先に説明したように、組換えDNAコンストラクトによって作り出された融合タンパク質は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含むかもしれない。融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つのドメイン、及び免疫グロブリンに由来する2つのドメインを含むことができる。このタイプの構造を有する融合タンパク質TTP-4000（TT4）をコードする核酸コンストラクトの例が、図2（配列番号30）に示されている。図2に示されているように、（ボールド体で強調された）コード配列1〜753がRAGEのN末端タンパク質配列をコードする一方で、754〜1386はIgG Fcタンパク質配列をコードする。
【００９７】
配列番号30、あるいはそれらと90%同一の配列に由来する場合、RAGE融合タンパク質は、配列番号32の4ドメイン・アミノ酸配列、又はシグナル配列が取り除かれたポリペプチドを含むことができる（例えば、配列番号33若しくは配列番号34）（図４）。図4において、RAGEアミノ酸配列は、ボールド体で強調されている。免疫グロブリン配列は、IgGのCH2及びCH3免疫グロブリン・ドメインである。図6Bに示されるように、完全長のTTP-4000 RAGE融合タンパク質の初めの251個のアミノ酸は、RAGEポリペプチド配列として、第1〜22/23アミノ酸を含むシグナル配列、第23/24〜116アミノ酸を含む（リガンド結合部位を含めた）V免疫グロブリン・ドメイン、第117〜123アミノ酸を含むドメイン間リンカー、第124〜221アミノ酸を含む第二の免疫グロブリン・ドメイン（C1）、及び第222〜251アミノ酸を含む下流ドメイン間リンカーを含む。
【００９８】
ある態様において、融合タンパク質は、必ずしも、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができるわけではない。例えば、融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。このタイプの融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトの例が、図3（配列番号31）に示されている。図3に示されているように、（ボールド体で強調された）第1〜408ヌクレオチドのコード配列がRAGEのN末端タンパク質配列をコードする一方で、409〜1041の配列はIgG1 Fc（γ1）タンパク質配列をコードする。
【００９９】
配列番号31、あるいはそれと90%同一の配列に由来する場合、融合タンパク質は、配列番号35の3ドメイン・アミノ酸配列、又はシグナル配列が取り除かれたポリペプチドを含むことができる（例えば、図5の中の配列番号36若しくは配列番号37）。図5及び図20において、RAGEアミノ酸配列は、ボールド体で強調されている。図6Bに示されるように、完全長のTTP-3000 RAGE融合タンパク質の初めの136個のアミノ酸は、RAGEポリペプチドとして、第1〜22/23アミノ酸を含むシグナル配列、第23/24〜116アミノ酸を含む（リガンド結合部位を含めた）V免疫グロブリン・ドメイン、及び第117〜136アミノ酸を含むドメイン間リンカーを含む。137〜346の配列は、IgGのCH2及びCH3免疫グロブリン・ドメインを含む。
【０１００】
本発明の融合タンパク質は、第二のポリペプチドを含まないRAGEポリペプチドを上回る改善されたインビボにおける安定性を含むことができる。融合タンパク質は、安定性、有効性、作用強度、及び生物学的利用能を高めるためにさらに修飾されてもよい。よって、本発明の融合タンパク質は、翻訳後過程又は化学修飾によって修飾されることができる。例えば、融合タンパク質は、L-、D-又は天然にないアミノ酸、α-二基置換アミノ酸、又はN-アルキル・アミノ酸を含むように合成的に調製されてもよい。さらに、タンパク質は、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、例えばホスファチジルイノシトールといった脂質の付着、ジスルフィド結合の形成によって修飾されてもよい。さらに、ポリエチレングリコールが、融合タンパク質の生物学的安定性を高めるために加えられることができる。
【０１０１】
RAGE融合タンパク質へのRAGEアンタゴニストの結合
本発明の融合タンパク質は、多くの用途を含むことができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、例えばRAGEアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターといったRAGEリガンドを同定するための結合アッセイに使用されることができる。
【０１０２】
例えば、1つの態様において、本発明は以下の：（a）第二の非RAGEポリペプチドに連結しており、リガンド結合部位を含むRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を準備し；（b）注目の化合物及びRAGEに対して既知の結合親和性を有するリガンドを、融合タンパク質と混合し；そして（c）注目の化合物の存在下、RAGE融合タンパク質への既知のRAGEリガンドの結合を測定すること、を含むRAGEモジュレーターの検出方法を提供する。ある態様において、リガンド結合部位は、融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。
【０１０３】
RAGE融合タンパク質は、また、RAGEモジュレーターの検出のためのキットを提供することができる。例えば、1つの態様において、本発明のキットは、（a）ポジティブコントロールとしてRAGEに対して既知の結合親和力を有する化合物；（b）第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質であって、上記RAGEポリペプチドがRAGEリガンド結合部位を含むもの；及び（c）使用説明書、を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。
【０１０４】
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、完全長のヒトRAGE（例えば、配列番号1）又はヒトRAGEのフラグメントを含むことができる。ある態様において、RAGEポリペプチドは、いかなるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長のRAGE（配列番号1）の第1〜22残基又は第1〜23残基のいずれかを含むことができる。別の態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEと70%、80%、又は90%同一である配列、あるいはそのフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、ヒトRAGEは、シグナル配列を取り除いた完全長のRAGE（例えば、配列番号2又は配列番号3）（図1A及び1B）あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。また、本発明のRAGE融合タンパク質は、また、sRAGE（例えば、配列番号4）、sRAGEと90%同一のポリペプチド、又はsRAGEのフラグメントを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトsRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列が取り除かれたsRAGE（配列番号5若しくは配列番号6）（図１Ｃ）、あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。他の態様において、RAGEタンパク質は、Vドメイン（例えば、図1Dの中の配列番号7若しくは配列番号8）を含むことができる。又は、Vドメインと90%同一の配列、又はそのフラグメントを使用できる。又はRAGEタンパク質は、Vドメインの一部を含むRAGEのフラグメント（例えば図1Dの中の配列番号9若しくは配列番号10）を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含むことができる。さらに他の態様において、RAGEフラグメントは合成ペプチドである。
【０１０５】
融合タンパク質は、RAGE又はそのフラグメントに由来しない数タイプのペプチドを含むことができる。融合タンパク質の第2のポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれか1つから得ることができる。さらに、重鎖（その一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、又は生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ若しくはサブタイプの変異体のいずれか1つから得ることができる。第2のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインのいずれか、若しくは両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。免疫グロブリン・ペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によってコードされることがある。
【０１０６】
免疫グロブリン鎖のFc部分は、in vivoにおいて炎症誘発性でありうる。よって、本発明のRAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来するドメイン間ヒンジ・ポリペプチドよりむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含むことができる。ある態様において、前記融合タンパク質は、CH2免疫グロブリンドメイン又はそのフラグメントを含んで成るポリペプチドに連結したRAGE免疫グロブリンドメインを含んで成ることがある。1つの態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、且つ、RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が免疫グロブリンのCH2ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含むことができる。免疫グロブリンのCH2ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。
【０１０７】
本発明の融合タンパク質は、RAGE由来の1つの又は複数のドメインを含むことができる。また、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長のRAGEタンパク質のフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。RAGE融合タンパク質は、第1のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第1のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸が第1のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸に連結され、第2のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、そして第2のRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第2のRAGEドメイン間リンカーに連結された第1のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第1のドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これらの2つのドメインに連結されたドメイン間リンカー、及びC1の下流の第2のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜251アミノ酸（配列番号19）又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGEの第24〜251アミノ酸（配列番号20）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。1つの態様において、配列番号30又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、4ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる
【０１０８】
あるいは、3ドメイン融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に連結された1つのRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜136アミノ酸（配列番号15）又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGEの第24〜136アミノ酸（配列番号16）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。1つの態様において、配列番号31又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、3ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる。
【０１０９】
本明細書に記載のように、RAGEドメイン間リンカーフラグメントは、天然においてRAGE免疫グロブリン・ドメインの下流に存在し、よって、そこに連結されるペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGEのVドメインに関して、ドメイン間リンカーは、天然においてVドメインから下流に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第117〜123アミノ酸に相当する配列番号21を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号21の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（例えば、1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むドメイン間リンカーを使用できる。よって、1つの態様において、ドメイン間リンカーは、完全長のRAGEの第117〜136アミノ酸を含む配列番号23を含む。又は、リンカーのいずれかの末端から1、2、又は3個のアミノ酸を取り除いた配列番号21のフラグメントを使用できる。別の態様において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23と70%同一、又は80%同一、あるいは90%同一である配列を含むことができる。
【０１１０】
RAGEのC1ドメインに関して、リンカーは、天然においてC1ドメインの下流に存在するペプチド配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第222〜251アミノ酸に相当する配列番号22を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号22の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むリンカーを使用できる。又は、リンカーのいずれかの末端から、例えば1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸を取り除いた配列番号22のフラグメントを使用できる。例えば、1つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、第222〜226アミノ酸に相当する配列番号24を含むことができる。又は、ドメイン間リンカーは、RAGEの第318〜342アミノ酸に相当する配列番号44を含むことができる。
【０１１１】
例えば、RAGE融合タンパク質は、強力なRAGEリガンドを同定するための結合アッセイで使用できる。そのような結合アッセイの態様の一例において、既知のRAGEリガンドは、各ウェルが約100マイクロリットル（μL）の総容積を収容できる場合に、1ウェルあたり約5マイクログラムの濃度で固体基板（例えば、Maxisorbプレート）上にコートすることができる。プレートは、4℃で一晩インキューベートされ、リガンドを吸着させる。あるいは、より高い温度（例えば、室温）でのより短いインキュベーション時間を使用することができる。リガンドを前記基板に結合させる時間の後に、アッセイ・ウェルは吸引され、そして非特異的結合をブロックするために、ブロッキング・バッファー（例えば、50mMのイミダゾール・バッファー中、1%のBSA、pH7.2）を加えることができる。例えば、ブロッキング・バッファーは、室温で1時間、プレートに加えておくことができる。プレートは、次に、吸引される、及び／又は洗浄バッファーで洗浄されることができる。1つの態様において、20mMのイミダゾール、150mMのNaCl、0.05%のTween-20、5mMのCaCl2、及び5mMのMgCl2、pH7.2を含むバッファーが、洗浄バッファーとして使用できる。融合タンパク質は、次に、漸増する希釈度でアッセイ・ウェルに加えられることができる。RAGE融合タンパク質は、次に、結合が平衡に達するように、アッセイ・ウェル中で固定化リガンドと一緒にインキューベートしてもよい。1つの態様において、RAGE融合タンパク質は、37℃で約1時間、固定化リガンドと一緒にインキューベートしてもよい。別の態様において、より低温でより長いインキュベーション時間を使用することができる。融合タンパク質と固定化リガンドがインキューベートされた後に、あらゆる非結合融合タンパク質を取り除くために、前記プレートは洗浄されることができる。固定化リガンドに結合した融合タンパク質は、様々な方法で検出されることができる。1つの態様において、検出にはELISAを用いる。よって、1つの態様において、モノクローナル・マウス抗ヒトIgG1、ビオチン化ヤギ抗マウスIgG、及びアビジン連結アルカリホスファターゼを含む免疫検出複合体は、アッセイ・ウェルに固定された融合タンパク質に加えられることができる。融合タンパク質と免疫検出複合体の間の結合が平衡に達するように、免疫検出複合体を固定された融合タンパク質と結合させることができる。例えば、前記複合体を、融合タンパク質と室温で1時間結合させることができる。その時点で、洗浄バッファーでアッセイ・ウェルを洗浄することによって、あらゆる非結合複合体が取り除かれることができる。結合複合体は、アルカリホスファターゼ基質であるパラ-ニトロフェニルリン酸（PNPP）を加え、そして405nmの吸光度の増大としてPNPPのパラニトロフェノール（PNP）への転換を測定することによって検出できる。
【０１１２】
ある態様において、RAGEリガンドは、ナノモル（nM）又はマイクロモル（μM）の親和性でRAGE融合タンパク質に結合する。本発明のRAGE融合タンパク質へのRAGEリガンドの結合を説明する実験が、図7に示されている。それぞれ、1.082mg/mL及び370mg/mLの初期濃度を有するTTP-3000（TT3）及びTTP-4000（TT4）の溶液が、調製された。図7に示されるとおり、様々な希釈度にて、RAGE融合タンパク質TTP-3000及びTTP-4000は、固定されたRAGEリガンドであるアミロイドβ（Abeta）（Biosource製のアミロイドβ（1〜40））、S100b（S100）、及びアンホテリン（Ampho）に結合することができ、吸光度の増大をもたらす。リガンドの不存在（すなわち、BSAのみでコートする）において、吸光度の増大は全くなかった。
【０１１３】
本発明の結合アッセイは、RAGEへのリガンド結合を定量化するために使用できる。別の態様において、RAGEリガンドは、0.1〜1000ナノモル（nM）、又は1〜500nM、又は10〜80nMの範囲にわたる結合親和性で本発明のRAGE融合タンパク質に結合することができる。
【０１１４】
本発明の融合タンパク質は、また、RAGEに結合する能力を持っている化合物を同定するためにも使用できる。それぞれ図8及び9に示されているように、RAGEリガンドは、TTP-4000（TT4）又はTTP-3000（TT3）RAGE融合タンパク質に結合する固定されたアミロイドβと競争するその能力をアッセイされることができる。よって、10μMの最終アッセイ濃度（FAC）のRAGEリガンドが、最初のTTP-4000溶液（図8）又はTTP-3000（図9）の1：3、1：10、1：30、及び1：100の濃度にてRAGE融合タンパク質のアミロイド-βへの結合に置き換わり得ることが分かった。
【０１１５】
細胞エフェクターの調節
本発明の融合タンパク質の態様が、RAGEによって媒介される生物学的反応を調節するために使用できる。例えば、融合タンパク質は、RAGE誘導性の遺伝子発現増大を調節するように設計できる。よって、ある態様において、本発明の融合タンパク質は、生体酵素の機能を調節するために使用できる。例えば、RAGEとそのリガンドの間の相互作用は、酸化ストレス、そしてNF-κBの活性化、及び、例えばサイトカインであるIL-1β、TNF-α等のNF-κB制御遺伝子を作り出すことができる。さらに、例えばp21ras、MAPキナーゼ、ERK1、及びERK2に関与するものなどの他のいくつかの調節経路が、AGE及びRAGEに対する他のリガンドの結合によって活性化されることが示されている。
【０１１６】
細胞エフェクターであるTNF-αの発現を調節するための本発明の融合タンパク質の使用は、図10に示されている。THP-1骨髄細胞は、10%のウシ胎児血清を補ったRPMI-1640培地中で培養され、そしてS100bによるRAGEの刺激によってTNF-αを分泌するように誘導されてもよい。RAGE融合タンパク質の存在下でそのような刺激が生じた場合に、RAGEにS100bが結合することによるTNF-αの誘導は抑制されるかもしれない。よって、図10に示されているように、10μgのTTP-3000（TT3）又はTTP-4000（TT4）RAGE融合タンパク質の添加は、約50%〜75%までTNF-αのS100b誘導を減少させる。融合タンパク質TTP-4000は、sRAGEのように、TNF-αのS100b誘導の遮断に少なくとも同じくらい有効でありうる（図10）。TTP-4000及びTTP-3000のRAGE配列に対する阻害の特異性は、IgGのみがS100b刺激細胞に加えられた実験によって示される。アッセイへのIgG及びS100bの添加は、S100b単独と同じのTNF-αレベルを示している。
【０１１７】
RAGE融合タンパク質の生理学的特徴
sRAGEがRAGE媒介性疾患の調節において治療効果を有することができるとはいえ、ヒトsRAGEは、血漿中におけるsRAGEの比較的短い半減期に基づく独立した治療法として限界があるかもしれない。例えば、齧歯動物sRAGEは、正常なラット及び糖尿病ラットにおいて約20時間の半減期を持っているのに対して、sRAGEの免疫反応性の保持によって評価した場合に、ヒトsRAGEは2時間未満の半減期しかなかった（Renardら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、290：1458-1466ページ（1999年））。
【０１１８】
sRAGEと類似した結合特性を有するが、より安定した薬理動態学的特性を有するRAGE治療法を作り出すために、１又は複数のヒト免疫グロブリン・ドメインに連結されたRAGEリガンド結合部位を含むRAGE融合タンパク質が使用できる。当業界で知られているように、免疫グロブリン・ドメインは、免疫グロブリン重鎖のFc部分を含むことができる。
【０１１９】
免疫グロブリンのFc部分は、融合タンパク質にいくつかの特質を与えることができる。例えば、Fc融合タンパク質は、多くの場合、何時間〜数日、上記融合タンパク質の血中半減期を拡張することができる。薬理動態学的の安定性の増大は、一般に、FcRn受容体と、FcフラグメントのCH2とCH3領域間のリンカーとの相互作用の結果である（Winesら、J. Immunol. 164：5313-5318ページ（2000年））。
【０１２０】
免疫グロブリンFcポリペプチドを含む融合タンパク質は安定性が高いという利点をもたらすが、免疫グロブリン融合タンパク質は、宿主内に導入された場合に、炎症反応を引き起こす可能性がある。炎症反応は、主に、融合タンパク質の免疫グロブリンのFc部分に起因するかもしれない。排除される必要がある罹患した細胞型（例えば、癌細胞、自己免疫疾患を引き起こすリンパ球の集団）で標的が発現される場合、炎症誘発性反応が望ましい特性でありうる。ほとんどの可溶タンパク質が免疫グロブリンを活性化しないので、標的が可溶タンパク質である場合には、炎症誘発性反応は中立の特性でありうる。しかしながら、その破壊が有害な副作用をもたらす細胞型にて標的が発現される場合には、炎症誘発性反応は負の特性でありうる。また、炎症の多くのメディエーターが周辺組織に対して有害であり、及び／又は全身作用を引き起こす可能性があるので、炎症カスケードが組織標的に結合する融合タンパク質の場所にて構築される場合には、炎症誘発性反応は負の特性でありうる。
【０１２１】
免疫グロブリンFcフラグメントの一次炎症誘発性部位は、CH1とCH2の間のヒンジ部に存在する。このヒンジ領域は、様々な白血球上のFcR1〜3と相互作用し、そしてこれらの細胞が標的を侵襲する誘因となる（Winesら、J. Immunol. 164：5313-5318ページ（2000年））。
【０１２２】
RAGE媒介性疾患のための治療法として、RAGE融合タンパク質は炎症反応の発生を必要とされないかもしれない。よって、本発明のRAGE融合タンパク質の態様は、免疫グロブリン・ドメインに連結されたRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を含むことができるが、ここで、上記免疫グロブリンのFcヒンジ領域は取り除かれ、そしてRAGEポリペプチドで置き換えられている。このように、炎症細胞上でのRAGE融合タンパク質とFc受容体との相互作用を最小限にすることができる。しかしながら、融合タンパク質の様々な免疫グロブリン・ドメイン間の適切な積重ね、及び他の3次元構造の相互作用を維持することは、重要であるかもしれない。よって、本発明の融合タンパク質の態様は、免疫グロブリン重鎖の正常なヒンジ領域の代わりに、RAGEのVとC1ドメインを分離する生物学的に不活性な、しかし、構造的に類似したRAGEドメイン間リンカー、又はRAGEのC1とC2ドメインを分離するリンカーを置換できる。よって、融合タンパク質のRAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインの下流で天然に見られて、RAGEの免疫グロブリン・ドメイン／リンカーフラグメントを形成するドメイン間リンカー配列を含むことができる。このように、RAGE又は免疫グロブリンのいずれかによって導かれた免疫グロブリン・ドメイン間の3次元相互作用を維持することができる。
【０１２３】
ある態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、sRAGEと比べて、薬理動態学的安定性のかなりの増大を含むことができる。例えば、図11は、RAGE融合タンパク質TTP-4000はいったんリガンドの飽和状態にすると、それが300時間より長い半減期を保持できることを示している。これは、ヒト血漿中のほんの数時間のsRAGEの半減期とは対照的である。
【０１２４】
よって、ある態様において、本発明のRAGE融合タンパク質が、許容できない量の炎症を引き起こすことなくRAGE媒介性疾患を処置する手段としてRAGEに対する生理的リガンドの結合に拮抗するように使用されてもよい。本発明の融合タンパク質は、IgGと比べて、炎症誘発性反応の発生のかなりの減少を示すことができる。例えば、図12に示されるとおり、RAGE融合タンパク質TTP-4000は、TNF-α放出のヒトIgG刺激が検出される条件下、細胞からのTNF-α放出を刺激しない。
【０１２５】
RAGE融合タンパク質を用いた疾患の処置
本発明は、また、ヒト対象におけるRAGE媒介性障害の処置のための方法を含むこともできる。ある態様において、前記方法は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEリガンド結合部位を含むRAGEポリペプチドを含む融合タンパク質を対象に投与することを含むことができる。1つの態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、RAGE融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【０１２６】
ある態様において、RAGEポリペプチドは、免疫グロブリン・ドメイン又は免疫グロブリン・ドメインの一部（例えば、そのフラグメント）を含むポリペプチドに連結できる。1つの態様において、免疫グロブリン・ドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgGのCH2又はCH3ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含む。
【０１２７】
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、完全長のヒトRAGE（例えば、配列番号1）又はヒトRAGEのフラグメントを含むことができる。ある態様において、RAGEポリペプチドは、いかなるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長のRAGE（配列番号1）の第1〜22残基又は第1〜23残基のいずれかを含むことができる。別の態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEと70%、80%、又は90%同一である配列、あるいはそのフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、ヒトRAGEは、シグナル配列を取り除いた完全長のRAGE（例えば、配列番号2又は配列番号3）（図1A及び1B）あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。また、本発明のRAGE融合タンパク質は、また、sRAGE（例えば、配列番号4）、sRAGEと90%同一のポリペプチド、又はsRAGEのフラグメントを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ最初の残基としてグリシンを有するヒトsRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列が取り除かれたsRAGE（配列番号5若しくは配列番号6）（図１Ｃ）、あるいはそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。他の態様において、RAGEタンパク質は、Vドメイン（例えば、図1Dの中の配列番号7若しくは配列番号8）を含むことができる。又は、Vドメインと90%同一の配列、又はそのフラグメントを使用できる。又はRAGEタンパク質は、Vドメインの一部を含むRAGEのフラグメント（例えば図1Dの中の配列番号9若しくは配列番号10）を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含むことができる。さらに他の態様において、RAGEフラグメントは合成ペプチドである。
【０１２８】
融合タンパク質は、RAGE又はそのフラグメントに由来しない数タイプのペプチドを含むことができる。融合タンパク質の第2のポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれか1つから得ることができる。さらに、重鎖（その一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、又は生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ若しくはサブタイプの変異体のいずれか1つから得ることができる。第2のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインのいずれか、若しくは両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。免疫グロブリン・ペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によってコードされることがある。
【０１２９】
例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメインに相当する、ヒトRAGEの第23〜116アミノ酸（配列番号7）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの第24〜116アミノ酸（配列番号8）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのC1ドメインに相当する、ヒトRAGEの第124〜221アミノ酸（配列番号11）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。他の態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEのC2ドメインに相当する、ヒトRAGEの第227〜317アミノ酸（配列番号12）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜123アミノ酸（配列番号13）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの第24〜123アミノ酸（配列番号14）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、及びこれら2つのドメインを連結するドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜226アミノ酸（配列番号17）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの第24〜226アミノ酸（配列番号18）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、sRAGEに相当する（すなわち、V、C1、C2ドメイン、及びドメイン間リンカーをコードする）、ヒトRAGEの第23〜339アミノ酸（配列番号5）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの第24〜339アミノ酸（配列番号6）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、これらの配列のそれぞれのフラグメントを使用できる。
【０１３０】
免疫グロブリン鎖のFc部分は、インビボにおいて炎症誘発性でありうる。よって、1つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来するドメイン間ヒンジ・ポリペプチドよりむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含む。
【０１３１】
よって、1つの態様において、RAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はそのフラグメントに直接連結されたRAGEポリペプチドをさらに含むことができる。1つの態様において、CH2ドメイン又はそのフラグメントは、配列番号42を含む。
【０１３２】
1つの態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が、免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はそのフラグメントのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結したRAGEドメイン間リンカーを含む。免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はその一部は、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、あるいはこれらのドメインの両方又はいずれかの一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチド、又はその一部は、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。
【０１３３】
本発明の融合タンパク質は、RAGE由来の1つの又は複数のドメインを含むことができる。また、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長のRAGEタンパク質のフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。RAGE融合タンパク質は、第1のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第1のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸が第1のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸に連結され、第2のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、そして第2のRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に直接連結されるように、第2のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第2のRAGEドメイン間リンカーに連結された第1のRAGE免疫グロブリン・ドメインと第1のドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これらの2つのドメインに連結されたドメイン間リンカー、及びC1の下流の第2のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜251アミノ酸（配列番号19）又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGEの第24〜251アミノ酸（配列番号20）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。１つの態様において、配列番号３０又はそのフラグメントを含んで成る核酸コンストラクトは、４ドメインＲＡＧＥ融合タンパク質をコードしてもよい。
【０１３４】
あるいは、3ドメイン融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に連結された1つのRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの第23〜136アミノ酸（配列番号15）又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGEの第24〜136アミノ酸（配列番号16）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。1つの態様において、配列番号31又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、3ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる。
【０１３５】
RAGEドメイン間リンカーフラグメントは、天然においてRAGE免疫グロブリン・ドメインの下流に存在し、よって、そこに連結されるペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGEのVドメインに関して、ドメイン間リンカーは、天然においてVドメインから下流に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第117〜123アミノ酸に相当する配列番号21を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号21の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（例えば、1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むドメイン間リンカーを使用できる。よって、1つの態様において、ドメイン間リンカーは、完全長のRAGEの第117〜136アミノ酸を含む配列番号23を含む。又は、リンカーのいずれかの末端から1、2、又は3個のアミノ酸を取り除いた配列番号21のフラグメントを使用できる。別の態様において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23と70%同一、又は80%同一、あるいは90%同一である配列を含むことができる。
【０１３６】
RAGEのC1ドメインに関して、リンカーは、天然においてC1ドメインの下流に存在するペプチド配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第222〜251アミノ酸に相当する配列番号22を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を持ったペプチドを含むことができる。例えば、配列番号22の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むリンカーを使用できる。又は、リンカーのいずれかの末端から、例えば1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸を取り除いた配列番号22のフラグメントを使用できる。例えば、1つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、第222〜226アミノ酸に相当する配列番号24を含むことができる。又は、ドメイン間リンカーは、RAGEの第318〜342アミノ酸に相当する配列番号44を含むことができる。
【０１３７】
ある態様において、本発明の融合タンパク質は、様々な経路で投与されることができる。本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、腹腔内（IP）注射を用いることができる。あるいは、RAGE融合タンパク質は、経口的に、鼻腔内に、又はエアゾール剤として投与されることができる。他の態様において、投与は静脈注射（IV）である。RAGE融合タンパク質は、また、皮下注射されることもできる。他の態様において、融合タンパク質の投与は、動脈注射である。他の態様において、投与は舌下である。また、投与は、時限放出性カプセル剤が用いられることもできる。さらに他の態様において、投与は、座剤などによるように経直腸でありうる。例えば、皮下投与は、自己投与が望まれる場合の慢性障害を処置するために有用でありうる。
【０１３８】
様々な動物モデルが、治療法としてRAGEを調節する化合物の使用の正当性を確認するのに使用された。これらのモデルの例は、以下の通りである：
a）sRAGEは、RAGEを介した内皮、平滑筋、及びマクロファージ活性化を抑制することによって糖尿病ラット及び正常ラットの両方における動脈傷害後のラット再狭窄モデルでの新生内膜形成を阻害した（Zhouら、Circulation 107：2238-2243ページ（2003年））；
b）sRAGE又は抗RAGE抗体のいずれかを使用したRAGE/リガンド相互作用の阻害は、マウス全身性アミロイドーシス・モデルにおけるアミロイド斑形成を減少させた（Yanら、Nat. Med. 6：643-651ページ（2000年））。アミロイド斑の減少に伴って起こることは、炎症性サイトカインであるインターロイキン-6（IL-6）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の減少であり、並びに処置された動物においてNF-κBの活性化を低下させた；
c）RAGEトランスジェニック・マウス（RAGE過剰発現及びRAGEドミナントネガティブ）は、マウスADモデルにおけるプラーク形成及び認知機能障害を示す（Arancioら、EMBO J. 23：4096-4105ページ（2004年））；
d）sRAGEでの糖尿病ラットの処置が、血管の透過性を低下させた（Bonnardel-Phuら、Diabetes 48：2052-2058ページ（1999年））；
e）sRAGEでの処置が、糖尿病アポリポタンパク質E-ヌル・マウスにおけるアテローム性動脈硬化症を減少させ、そしてdb/dbマウスにおける糖尿病性腎症の機能的及び形態学的な症候を予防した（Hudsonら、Arch. Biochem. Biophys. 419：80-88ページ（2003年））；そして
f）sRAGEは、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル（Hofmannら、Genes Immunol. 3：123-135ページ（2002年））、マウス実験的アレルギー性脳脊髄炎モデル（Yanら、Nat. Med. 9：28-293ページ（2003年））、及びマウス炎症性腸疾患モデル（Hofmannら、Cell, 97：889-901ページ（1999年））における炎症の重症度を軽減させた。
【０１３９】
よって、ある態様において、本発明の融合タンパク質は、RAGEによって媒介される糖尿病から生じる糖尿病、及び／又は合併症の症状を処置するのに使用できる。別の態様において、糖尿病又は糖尿病の後期合併症の症状は、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、足の糖尿病性壊疽、糖尿病の心血管系合併症、又は糖尿病性神経障害を含むことができる。
【０１４０】
その発現が糖尿病の病理に関連する分子の受容体として最初に同定されたRAGE自体は、糖尿病性合併症の病理生理学に不可欠である。インビボにおいて、そのリガンドとのRAGE相互作用の阻害が、糖尿病性合併症及び炎症の複数のモデルにおける治療に使用可能であることが示された（Hudsonら、Arch. Biochem, Biophys. 419：80-88ページ（2003年））。例えば、抗RAGE抗体での2カ月の処置は、糖尿病マウスにおける腎臓機能を正常化し、かつ、異常な腎臓組織病理を減少させた（Flyvbjergら、Diabetes 53：166-172ページ（2004年））。さらに、RAGEリガンドに結合し、且つ、RAGE/リガンド相互作用を阻害する可溶性型のRAGE（sRAGE）での処置は、糖尿病アポリポタンパク質E-ヌル・マウスにおけるアテローム性動脈硬化症を軽減し、及びdb/dbマウスにおける糖尿病性腎障害の機能的及び形態学的な病理を弱めた（Bucciarelliら、Circulation 106：2827-2835ページ（2002年））。
【０１４１】
また、最終糖化反応物（AGE）の形成を最終的にもたらす高分子の非酵素的糖酸化が、高血糖及び全身的又は局所的な酸化ストレスに関連する他の症状の存在下、腎不全症が炎症部位にて増強されることが示された（Dyerら、J. Clin. Invest. 91：2463-2469ページ（1993年）；Reddyら、Biochem. 34：10872-10878ページ（1995年）；Dyerら、J. Biol. Chem. 266：11654-11660ページ（1991年）；Degenhardtら、Cell Mol. Biol. 44：1139-1145ページ（1998年））。血管系におけるAGEの蓄積は、透析関連アミロイド症の対象に見られるか（Miyataら、J. Clin. Invest. 92；1243-1252ページ（1993年）；Miyataら、J. Clin. Invest. 98：1088-1094ページ（1996年））、又は、通常、糖尿病の対象の血管系及び組織によって典型的に示されるような（Schmidt ら、Nature Med. 1：1002-1004ページ（1995年））AGE-β2-ミクログロブリンから成る関節アミロイドのように局所的に起こる可能性がある。糖尿病対象における長期にわたるAGEの進行性の蓄積は、内因性クリアランス機構がAGE堆積部位にて有効に機能できないことを示唆している。そのような蓄積されたAGEは、多くの作用機序によって細胞特性を変更させる能力を有する。RAGEは正常組織及び血管系において低レベルで発現されるが、受容体のリガンドが蓄積する環境において、RAGEが上方制御されることが示された（Liら、J. Biol. Chem. 272：16498-16506ページ（1997年）；Liら、J. Biol. Chem. 273：30870-30878ページ（1998年）；Tanakaら、J. Biol. Chem. 275：25781-25790ページ（2000年））。RAGE発現は、糖尿病の血管系内の内皮、平滑筋細胞、及び浸潤性単核食細胞において増強される。また、細胞培養における研究は、そのAGE-RAGE相互作用が血管の恒常性に重要な細胞特性の変化を引き起こすことを実証した。
【０１４２】
糖尿病に関連する病理の処置におけるRAGE融合タンパク質の使用が、図13に説明されている。RAGE融合タンパク質TTP-4000は、血管障害後の平滑筋増殖及び内膜膨張を測定することを伴うラット糖尿病モデルの再狭窄で評価された。図13で説明されるように、減少させる、TTP-4000処置は、用量反応様式での糖尿病に関連した再狭窄における内膜／中膜（I/M）比を有意に減少させることができる（図13A；表1）。また、TTP-4000処置は、用量反応様式で再狭窄に関連する血管平滑筋細胞の増殖を有意に減少させることができる。
【０１４３】
【表１】
2008508882.tif 000002
【０１４４】
他の態様において、本発明の融合タンパク質は、また、アミロイドーシス及びアルツハイマー病を処置するか、又は回復に向かわせるのに使用することもできる。RAGEは、アミロイド-β（Aβ）、並びにSAA及びアミリンを含めた他のアミロイド形成タンパク質の受容体である（Yanら、Nature 382：685-691ページ（1996年）；Yanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：5296-5301ページ（1997年）；Yanら、Nat. Med. 6：643-651ページ（2000年）；Sousaら、Lab. Invest. 80：1101-1110ページ（2000年））。また、AGE、S100b、及びAβタンパク質を含めたRAGEリガンドは、ヒトの老人斑を取り囲む組織に見られる（Luthら、Cereb. Cortex 15：211-220ページ（2005年）；Petzoldら、Neurosci. Lett. 336：167-170ページ（2003年）；Sasakiら、Brain Res. 12：256-262ページ（2001年）；Yanら、Restor. Neural Neruosci. 12：167-173ページ（1998年））。RAGEが、サブユニット（アミロイド-βペプチド、アミリン、血清アミロイドA、プリオン誘導ペプチド）の組成にかかわらずβ-シート線維性物質に結合することが示された（Yanら、Nature 382：685-691ページ（1996年）；Yanら、Nat. Med. 6：643-651ページ（2000年））。さらに、アミロイドの堆積は、RAGEの発現増強をもたらすことが示された。例えば、アルツハイマー病（AD）の対象の脳において、RAGE発現はニューロン及びグリアで増強される（Yanら、Nature 382：685-691ページ（1996年））。RAGEリガンドの発現と同時に、RAGEは、ADの個体の海馬内の星状細胞及びミクログリア細胞において上方制御されるが、しかしADでない個体においては上方制御されていない（Lueら、Exp. Neural. 171：29-45ページ（2001年））。これらの調査結果は、RAGEを発現する細胞が、老人斑周辺のRAGE/RAGEリガンド相互作用によって活性化されることを示唆している。また、インビトロにおいて、Aβ媒介性ミクログリア細胞活性化は、RAGEのリガンド結合部位に対する抗体で妨げることができる（Yanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：5296-5301ページ（1997年））。RAGEが原線維集合の中心として機能できることもまた証明した（Deaneら、Nat. Mad. 9：907-913ページ（2003年））。
【０１４５】
また、sRAGE又は抗RAGE抗体のいずれかを使用するインビボにおけるRAGE/リガンド相互作用の阻害は、マウス全身性アミロイドーシス・モデルにおけるアミロイド斑の形成を減少させることもできる（Yanら、Nat. Med. 6：643-651ページ（2000年））。ニューロン内でヒトRAGE、並びにスウェーデン型及びロンドン型突然変異を持つヒト・アミロイド前駆タンパク質（APP）を過剰発現する二重トランスジェニック・マウス（突然変異hAPP）は、それらの単独突然変異hAPPトランスジェニック対応物より早く学習欠陥及び神経病理学的異常性を発症する。対照的に、同じ突然変異hAPPの背景においてRAGEのドミナントネガティブ形態を発現するニューロンに起因して減少したAβシグナル伝達能力を有する二重トランスジェニック・マウスは、それらの単独のAPPトランスジェニック対応物と比べて神経病理学的及び学習の異常の遅い発現を示す（Arancioら、EMBO J. 23：4096-4105ページ（2004年））。
【０１４６】
さらに、RAGEアミロイド相互作用の阻害が、細胞のRAGE及び細胞ストレス・マーカーの発現（並びにNF-κB活性化）を減少させ、且つ、（初期段階においてでさえ）アミロイドが富化された環境における、並びにアミロイド蓄積による細胞特性の混乱の両方に果たすRAGEアミロイド相互作用の役割を示唆するアミロイド沈着を減少させることが示された（Yanら、Nat. Med. 6：643-651ページ（2000年））。
【０１４７】
よって、本発明のRAGE融合タンパク質は、また、アミロイドーシスを減少させるため、並びにアルツハイマー病（AD）に関連するアミロイド斑及び認知機能障害を減少させるために使用できる。先に説明したように、sRAGEは、ADの動物モデルにおいて脳のアミロイド斑形成、そして炎症性マーカーのその後の増大の両方を減少させることが分かった。図14A及び14Bは、ADであって、TTP-4000又はマウスsRAGEのいずれかで3カ月間、処置されたマウスは、溶媒又はヒトIgGのネガティブコントロール（IgG1）を受けた動物に比べてより少ないアミロイド-β（Aβ）斑及びより低い認識障害を示した。sRAGEのように、TTP-4000は、また、ADに関連している炎症性サイトカインIL-1及びTNF-α（データ未掲載）を減少させることもできる。
【０１４８】
また、本発明の融合タンパク質は、アテローム性動脈硬化及び他の心臓血管疾患を処置するのにも使用できる。よって、虚血性心疾患は、糖尿病の対象において特に深刻であることが示された（Robertsonら、Lab Invest. 18：538-551ページ（1968年）；Kannelら、J. Am. Med. Assoc. 241：2035-2038ページ（1979年）；Kannelら、Diab. Care 2：120-126ページ（1979年））。さらに、研究は、糖尿病の対象のアテローム性動脈硬化が糖尿病に罹患していない対象よりも加速され、且つ、広範囲に及ぶことを示した（例えば、Wallerら、Am. J. Med. 69：498-506ページ（1980年）；Crallら、Am. J. Med. 64：221-230ページ（1978年）；Hambyら、Chest 2：251-257ページ（1976年）；及びPyoralaら、Diab. Metab. Rev. 3：463-524ページ（1978年）を参照のこと）。糖尿病に伴う促進化アテローム性動脈硬化の理由は多いが、AGEの減少がプラーク形成を減少させることができることが示された。
【０１４９】
例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、また、脳卒中を処置するために使用できる。脳卒中の疾患関連動物モデルにおいてTTP-4000をsRAGEと比べた場合に、TTP-4000が梗塞部容積の非常に大きな減少を提供することがわかった。このモデルにおいて、マウスの中頚動脈が結紮され、そして脳卒中を形成するように再潅流される。脳卒中を処置又は予防するRAGE融合タンパク質の有効性を評価するために、再潅流直前にマウスをsRAGE、TTP-4000、又はコントロール免疫グロブリンによって処置した。表2に見ることができるように、これらの動物における梗塞部面積に限っては、TTP-4000がsRAGEよりも有効であり、その優れた血漿中の半減期のためTTP-4000がsRAGEより大きな保護を維持できたことを示唆した。
【０１５０】
【表２】
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【０１５１】
他の態様において、本発明の融合タンパク質は、癌の処置のために使用されることができる。1つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置される癌は、RAGEを発現する癌細胞を含む。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質で処置されることができる癌は、一部の肺癌、一部のグリオーマ、一部の乳頭腫等を含む。アンホテリンは、RAGEと相互作用することが示された高移動度群Iの非ヒストン染色体DNA結合タンパク質である（Rauvalaら、J. Biol. Chem. 262：16625-16635ページ（1987年）；Parkikinenら、J. Biol. Chem. 268：19726-19738ページ（1993年））。アンホテリンが、神経突起伸長を促進し、並びに線溶系の（また、細胞移動性に寄与することも知られている）プロテアーゼ複合体の集合のための表面としての役割を担うことが示されている。さらに、RAGEを遮断することの局所的な腫瘍増殖抑制効果が、原発腫瘍モデル（C6グリオーマ）、Lewis肺転移モデル（Taguchiら、Nature 405：354-360ページ（2000年））、及びv-Ha-ras導入遺伝子を発現するマウスにおける自然発生的な乳頭腫（Lederら、Proc. Natl. Acad. Sci. 87：9178-9182ページ（1990年））において観測された。
【０１５２】
さらに他の態様において、本発明の融合タンパク質は、炎症を処置するために使用されることができる。例えば、別の態様において、本発明の融合タンパク質は、自己免疫に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、関節リウマチに関連する炎症、乾癬に関連する炎症、多発性硬化症に関連する炎症、低酸素血症に関連する炎症、脳卒中に関連する炎症、心臓発作に関連する炎症、出血性ショックに関連する炎症、敗血症に関連する炎症、臓器移植に関連する炎症、又は創傷治癒不良に関連する炎症を処置するために使用されることができる。
【０１５３】
例えば、血栓溶解の処置に続いて、例えば顆粒球といった炎症細胞は、虚血組織に浸潤して、低酸素血症によって死滅したよりも多くの細胞を破壊できる酸素ラジカルを産生する。抗体又は他のタンパク質アンタゴニストと共に組織に浸潤することもできる好中球に関与する好中球上の受容体を阻害することで、反応を改善することが示された。RAGEはこの好中球受容体のリガンドであるので、RAGEフラグメントを含む融合タンパク質は、おとりとして作用し、好中球が再潅流部位に往来するのを防いで、それによって更なる組織破壊を防ぐことができる。炎症の予防におけるRAGEの役割は、sRAGEが、恐らく、内皮細胞、平滑筋細胞の増殖、及びRAGEによるマクロファージ活性化を抑制することによって、糖尿病及び正常ラットの両方における動脈傷害後のラット再狭窄モデルでの新生内膜の拡張を抑制したことを示す研究によって示すことができる（Zhouら、Circulation 107：2238-2243ページ（2003年））。さらに、sRAGEは、遅延型過敏症、実験的自己免疫性脳炎、及び炎症性腸疾患を含めた炎症モデルを抑制した（Hofinanら、Cell 97：889-901ページ（1999年））。
【０１５４】
ある態様において、本発明の融合タンパク質は、自己免疫による障害を処置するため使用されることができる、例えば、ある態様において、本発明の融合タンパク質は、腎不全を処置するために使用されることができる。よって、本発明のRAGE融合タンパク質は、全身性ループス腎炎又は炎症性ループス腎炎を処置するために使用されることができる。例えば、S100/カルグラヌリンは、結合ペプチドによって連結された2つのEF-ハンド領域を特徴とする密接に関連したカルシウム結合性ポリペプチドのファミリーを含むことが示された（Schaferら、TIBS 21：134-140ページ（1996年）；Zimmerら、Brain Res. Bull. 37：417-429ページ（1995年）；Rammesら、J. Biol. Chem. 272：9496-9502ページ（1997年）；Lugeringら、Eur. J. Clin. Invest. 25：659-664ページ（1995年））。それらはシグナル・ペプチドを欠いているが、嚢胞性繊維症及び関節リウマチのように、特に慢性の免疫／炎症反応の部位にて、S100/カルグラヌリンが細胞外空間との接触を得ることが長い間知られていた。RAGEは、S100/カルグラヌリン・ファミリーの多くのメンバーの受容体であり、例えばリンパ球及び単核食細胞といった細胞に対するそれらの炎症誘発性効果を媒介する。また、遅延型過敏症応答、IL-10ヌル・マウスにおける大腸炎、コラーゲン誘導性関節炎、及び実験的自己免疫性脳炎モデルについての研究は、RAGEリガンド相互作用（おそらく、S100/カルグラヌリンとの相互作用）が炎症カスケードにおいて基部に近い役割を担っていることが示唆された。
【０１５５】
よって、種々の選択された態様において、本発明は、治療上有効量の本発明の融合タンパク質を対象に投与することによって対象のRAGEとAGEの相互作用を抑制するための方法を提供できる。本発明のRAGE融合タンパク質を使用して処置される対象は、動物でありうる。ある態様において、その対象はヒトである。対象は、AGE関連疾患、例えば糖尿病、糖尿病性合併症、例えば腎障害、神経障害、網膜障害、足の壊死、アミロイドーシス、又は腎不全、及び炎症に罹患しているかもしれない。又は、対象はアルツハイマー病の個体でありうる。別の態様において、対象は癌の個体でありうる。さらに他の態様において、対象は、全身性ループス腎炎又は炎症性ループス腎炎に罹患しているかもしれない。他の疾患が、RAGEによって媒介されている可能性があるので、そのため、本発明の融合タンパク質を使用して処置することができる。よって、本発明の追加的な別の態様において、融合タンパク質は、ヒト又は動物の対象におけるクローン病、関節炎、脈管炎、腎障害、網膜障害、及び神経障害の処置に使用されることができる。
【０１５６】
治療上有効量は、対象のAGE又は他のタイプの内因性RAGEリガンドと、RAGEとの相互作用を妨げることができる量を含むことができる。従って、その量は、処置される対象により異なる。化合物の投与は、時間毎、日毎、月毎、年毎であるか、又は単回事象でありうる。様々な別の態様において、融合タンパク質の有効量は、約1ng/kg体重〜約100mg/kg体重、又は約10μg/kg体重〜約50mg/kg体重、又は約100μg/kg体重〜約10mg/kg体重の範囲にわたることができる。実際の有効量は、当業界において標準的な方法を使用した用量／応答アッセイによって確立されることができる（Johnsonら、Diabetes. 42：1179ページ（1993年））。よって、当業者に知られているとおり、有効量は、化合物の生物学的利用能、生理活性、及び生物分解能に依存するかもしれない。
【０１５７】
組成物
本発明は、医薬として許容される担体と混合した本発明の融合タンパク質を含む組成物を含むことができる。融合タンパク質は、第二の非RAGEポリペプチドと連結したRAGEポリペプチドを含むことができる。1つの態様において、融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。ある態様において、リガンド結合部位は、融合タンパク質のN末端ドメインの大部分を含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン又はその一部を含むことができる。ある態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、あるいは配列番号10又はそれと90%同一の配列を含む。
【０１５８】
ある態様において、RAGEポリペプチドは、免疫グロブリン・ドメイン又は免疫グロブリン・ドメインの一部（例えば、そのフラグメント）を含むポリペプチドに連結できる。1つの態様において、免疫グロブリン・ドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgGのCH2又はCH3ドメインの少なくとも一方の少なくとも一部を含む。
【０１５９】
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、完全長のヒトRAGE（例えば、配列番号1）、又はヒトRAGEのフラグメントを含むことができる。ある態様において、RAGEポリペプチドは、あらゆるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長RAGE（配列番号1）の第1〜22残基又は第1〜23残基のいずれかを含むことができる。別の態様において、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEと70%、80%、又は90%同一の配列、又はそのフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ第1の残基としてグリシンを有するヒトRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列が取り除かれた完全長のRAGE（例えば、配列番号2又は配列番号3）（図1A及び1B）又はそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。また、本発明のRAGE融合タンパク質は、sRAGE（例えば、配列番号4）、sRAGEと90%同一のポリペプチド、又はsRAGEのフラグメントを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりむしろ第1の残基としてグリシンを有するヒトsRAGE又はそのフラグメントを含むことができる（例えば、Neeperら、（1992年）を参照のこと）。又は、ヒトRAGEは、シグナル配列が取り除かれたsRAGE（配列番号5若しくは配列番号6）（図１Ｃ）又はそのアミノ酸配列の一部を含むことができる。他の態様において、RAGEタンパク質は、Vドメインを含むことができる（例えば、図1Dの中の配列番号7若しくは配列番号8）。又は、Vドメインと90%同一の配列、又はそのフラグメントを使用できる。又は、RAGEタンパク質は、Vドメインの一部を含むRAGEのフラグメントを含むことができる（例えば、図1Dの中の配列番号9若しくは配列番号10）。ある態様において、リガンド結合部位は、配列番号9又はそれと90%同一の配列、配列番号10又はそれと90%同一の配列を含むことができる。さらに他の態様において、RAGEフラグメントは合成ペプチドである。
【０１６０】
例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメインに相当する、ヒトRAGE（配列番号7）の第23〜116アミノ酸又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGE（配列番号8）の第24〜116アミノ酸又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのC1ドメインに相当する、ヒトRAGEの124〜221アミノ酸（配列番号11）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。他の態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEのC2ドメインに相当する、ヒトRAGEの227〜317アミノ酸（配列番号12）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜123アミノ酸（配列番号13）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜123アミノ酸（配列番号14）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、及びこれらの2つのドメインを連結するドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜226アミノ酸（配列番号17）又はそれと90%同一の配列、又はヒトRAGEの24〜226アミノ酸（配列番号18）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、RAGEポリペプチドは、sRAGE（すなわち、V、C1、及びC2ドメイン、並びにドメイン間リンカーをコードするもの）に相当する、ヒトRAGEの23〜339アミノ酸（配列番号5）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜339アミノ酸（配列番号6）又はそれと90%同一の配列を含むことができる。又は、これらの配列のそれぞれのフラグメントを使用できる。
【０１６１】
融合タンパク質は、RAGE又はそのフラグメントに由来しないいくつかのタイプのペプチドを含むことができる。RAGE融合タンパク質の第二のポリペプチドは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、又はIgA（α）のいずれか1つから得ることができる。さらに、重鎖（又はその一部）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ3）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、又は生体活性を変化させるするこれらのアイソタイプ又はサブタイプの変異体のいずれか1つから得ることができる。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、あるいはこれらのドメインのいずれか又は両方の一部を含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はその一部を含むポリペプチドは、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。免疫グロブリン・ペプチドは、配列番号39又は配列番号41の核酸配列によってコードされることができる。
【０１６２】
免疫グロブリン鎖のFc部分は、インビボにおいて炎症誘発性でありうる。よって、1つの態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、免疫グロブリンに由来するドメイン間ヒンジ・ポリペプチドよりむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含む。
【０１６３】
よって、1つの態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はそのフラグメントに直接連結されたRAGEポリペプチドをさらに含むことができる。1つの態様において、CH2ドメイン又はそのフラグメントは、配列番号42を含む。
【０１６４】
1つの態様において、RAGEポリペプチドは、RAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸が、免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はそのフラグメントのN末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結したRAGEドメイン間リンカーを含む。免疫グロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチド又はその一部は、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むことができる。ある例示的な態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチド、又はその一部は、配列番号38又は配列番号40を含むことができる。
【０１６５】
本発明の融合タンパク質は、RAGE由来の単独の又は複数のドメインを含むことができる。また、RAGE免疫グロブリン・ドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長のRAGEタンパク質のフラグメントを含むことができる。例えば、1つの態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。RAGE融合タンパク質は、第一のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第一のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのN末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN末端アミノ酸が第二のRAGE免疫グロブリン・ドメインのC末端アミノ酸に連結され、そして第二のRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がCH2免疫グロブリン・ドメインを含むポリペプチド又はそのフラグメントのN末端アミノ酸に直接連結されるように、第一のRAGE免疫グロブリン・ドメイン、並びに第二のRAGE免疫グロブリン・ドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これらの2つのドメインを連結するドメイン間リンカー、及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜251アミノ酸（配列番号19）又はそれと90%同一の配列、ヒトRAGEの24〜251アミノ酸（配列番号20）又はそれと90%同一の配列、あるいはQ24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEの24〜251アミノ酸又はそれと90%同一の配列（配列番号51）を含むことができる。1つの態様において、配列番号30又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、4ドメインRAGE融合タンパク質をコードできる。
【０１６６】
あるいは、3ドメイン融合タンパク質は、RAGEに由来する1つの免疫グロブリン・ドメイン、及びヒトFcポリペプチドに由来する2つの免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2免疫グロブリン・ドメイン又はそのフラグメントを含むポリペプチドのN末端アミノ酸に連結された単独のRAGE免疫グロブリン・ドメインを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEの23〜136アミノ酸（配列番号15）又はそれと90%同一の配列、あるいはヒトRAGEの24〜136アミノ酸（配列番号16）又はそれと90%同一の配列融合タンパク質を含むことができる。1つの態様において、配列番号31又はそのフラグメントを含む核酸コンストラクトは、3ドメインRAGE融合タンパク質をコードすることができる。
【０１６７】
RAGEドメイン間リンカーフラグメントは、天然においてRAGE免疫グロブリン・ドメインの下流に存在し、それによりそこに連結されるペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGEのVドメインについて、ドメイン間リンカーは、天然においてVドメインから下流側に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長RAGEの第117〜123アミノ酸に相当する配列番号21を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を有するペプチドを含むことができる。例えば、配列番号21の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（例えば、1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むドメイン間リンカーが使用できる。よって、1つの態様において、ドメイン間リンカーは、完全長RAGEの第117〜136アミノ酸を含む配列番号23を含む。又は、リンカーのいずれかの末端から、例えば1、2、又は3個のアミノ酸を取り除いた配列番号21のフラグメントを使用できる。別の態様において、リンカーは、配列番号21又は配列番号23と70%同一であるか、80%同一であるか、又は90%同一である配列を含むことができる。
【０１６８】
RAGEのC1ドメインについて、リンカーは、天然においてC1ドメインの下流に存在するペプチド配列を含むことができる。ある態様において、リンカーは、完全長のRAGEの第222〜251アミノ酸に相当する配列番号22を含むことができる。又は、リンカーは、天然のRAGE配列の追加部分を有するペプチドを含むことができる。例えば、配列番号22の上流及び下流にいくつかのアミノ酸（1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸）を含むリンカーが使用できる。又は、リンカーのいずれかの末端から、例えば1〜3、1〜5、1〜10、又は1〜15個のアミノ酸を取り除いた配列番号22のフラグメントを使用できる。例えば、1つの態様において、RAGEドメイン間リンカーは、第222〜226アミノ酸に相当する配列番号24を含むことができる。又は、ドメイン間リンカーは、RAGEの第318〜342アミノ酸に相当する配列番号44を含むことができる。
【０１６９】
医薬として許容される担体は、当業界で知られる標準的な医薬として許容されるあらゆる担体を含むことができる。1つの態様において、医薬担体は液体であり、そして、融合タンパク質又は核酸コンストラクトは溶液の形態でありうる。他の態様において、医薬として許容される担体は、散剤、凍結乾燥散剤、又は錠剤の形態の固体でありうる。又は、医薬担体は、ゲル剤、坐剤、又はクリーム剤状でありうる。別の態様において、担体は、リポソーム、マイクロカプセル、ポリマー・カプセル化細胞、又はウイルスを含むことができる。よって、用語、医薬として許容される担体は、これだけに制限されることなく、あらゆる標準的な医薬として許容される担体、例えば、水、アルコール、リン酸緩衝生理的食塩溶液、糖（例えば、ショ糖又はマンニトール）、オイル又はエマルジョン、例えばオイル／水エマルション又はトリグリセリド・エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、コートした錠剤、及びカプセル剤を含む。
【０１７０】
本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、様々な経路を用いることができる。よって、本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、腹腔内（IP）注射を用いることができる。あるいは、RAGE融合タンパク質は、経口的に、鼻腔内に、又はエアゾール剤として投与できる。他の態様において、投与は静脈注射（IV）である。RAGE融合タンパク質は、また、皮下に注入されてもよい。他の態様において、融合タンパク質の投与は動脈内へのものである。他の態様において、投与は舌下へのものである。また、投与は、時限放出カプセル剤を利用することができる。例えば、自己投与が望ましい場合に、皮下投与が慢性障害を処置するために有用でありうる。
【０１７１】
医薬組成物は、無毒の非経口的に許容される溶剤又は溶媒中の無菌注射液の形態でありうる。利用できる、許容される溶媒及び溶剤の中には、水、リンゲル液、3-ブタンジオール、等張食塩溶液、又は、例えば、生理的に許容されるクエン酸、酢酸、グリシン、ヒスチジン、リン酸、トリス、又はコハク酸バッファーのような水性緩衝液が存在するかもしれない。注射液は、化学的分解及び凝集体の形成に対して保護する安定化剤を含むことができる。安定化剤は、抗酸化剤、例えばブチル化ヒドロキシ・アニソール（BHA）及びブチル化ヒドロキシ・トルエン（BHT）、バッファー（クエン酸、グリシン、ヒスチジン）、又は界面活性剤（ポリソルベート80、ポロクサマー）を含むことができる。溶液は、また、例えば、ベンジルアルコール及びパラベンといった抗菌性防腐剤を含むことができる。溶液は、また、凝集を減少させるための界面活性剤、例えばポリソルベート80、ポロクサマー、又は当業界で知られている他の界面活性剤を含むこともできる。溶液は、また、ヒト血液と同様になるように組成物の浸透圧を調整するために、例えば糖又は生理食塩水といった他の添加物を含むこともできる。
【０１７２】
医薬組成物は、希釈剤を用いた再構成後の注射のための無菌の凍結乾燥散剤の形態でありうる。希釈剤は、注射用の水、注射用の静菌性水、又は無菌の生理食塩水でありうる。凍結乾燥散剤は、融合タンパク質の溶液を凍結乾燥させて、乾燥形態のタンパク質を作り出すことによって製造することができる。当業界で知られているとおり、凍結乾燥タンパク質は、通常、タンパク質の液体溶液に比べて高い安定性と長い貯蔵寿命を有する。凍結乾燥散剤（ひと塊（cake））は、多くが、pHを調整するためのバッファー、例えば、生理的に許容されるクエン酸、酢酸、グリシン、ヒスチジン、リン酸、トリス、又はコハク酸バッファーを含む。凍結乾燥散剤は、また、その物理的及び化学的な安定性を維持するためのリオプロテクタント（lyoprotectants）を含むことができる。一般的に使用されるリオプロテクタントは、例えばショ糖、マンニトール、又はトレハロースといった非還元糖及び二糖である。凍結乾燥散剤は、化学的分解及び凝集体の形成に対して保護するために安定化剤を含むことができる。安定化剤は、これだけに制限されることなく、抗酸化剤（BHA、BHT）、バッファー（クエン酸、グリシン、ヒスチジン）、又は界面活性剤（ポリソルベート80、ポロクサマー）を含むことができる。凍結乾燥散剤は、また、例えばベンジルアルコール又はパラベンといった抗菌性防腐剤も含むことができる。凍結乾燥散剤は、また、凝集を減らすために界面活性剤、例えばポリソルベート80及びポロクサマーも含むことができる。凍結乾燥散剤は、また、散剤の再構成のときにヒト血液と同じようになるように浸透圧を調整する添加物（例えば、糖又は生理食塩水）も含むことができる。凍結乾燥散剤は、また、増量剤、例えば糖又は二糖も含むことができる。
【０１７３】
また、注射用の医薬組成物は、油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、先に記載した好適な分散又は湿潤剤、及び懸濁化剤を使用して既知の方法に従って処方されることができる。さらに、無菌の、不揮発性油が、溶剤又は懸濁化剤として便利に利用される。このために、合成のモノ又はジグリセリドを使用したあらゆる無菌性の不揮発性油もまた用いることができる。また、油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、又はココナッツ油の中に、あるいは鉱油、例えば流動パラフィンの中に、有効成分を懸濁させることによって処方できる。例えば、注射剤の調製において、脂肪酸、例えばオレイン酸が使われる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含むことができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸の添加によって保存されることができる。
【０１７４】
本発明の医薬組成物は、また、水中油型エマルジョン又は水性懸濁液の形態であってもよい。油性相は、植物油、例えばオリーブ油、若しくはラッカセイ油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、あるいはその混合物でありうる。好適な乳化剤は、天然ゴム、例えばアラビアゴムゴム若しくはトラガントゴム、天然のリン脂質、例えば大豆、レシチン、脂肪酸に由来するエステル又は部分エステル、並びにヘキシトール無水物、例えば、ソルビタン・モノオレエート、及びエチレンオキサイドを有する上記部分エステル縮合物、例えばポリオキシエチレン・ソルビタンでありうる。
【０１７５】
水性懸濁液は、また、賦形剤との混合物中に活性物質を含むことができる。そのような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロース・ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニールピロリドン、トラガントゴム、及びアラビアゴム；分散又は湿潤剤、例えば天然のホスファチド、例えばレシチン、又は脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は、長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキサイドの縮合物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又は、脂肪酸とヘキシトールに由来する部分エステルと、エチレンオキサイドの縮合物、例えばポリオキシエチレン・ソルビトール・モノオレエート、又は脂肪酸とヘキシトール無水物、例えば、ポリエチレン・ソルビタン・モノオレエートに由来する部分エステルと、エチレンオキサイドの縮合物を含むことができる。
【０１７６】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性の散剤及び顆粒剤は、分散剤、懸濁化剤、及び１又は複数の防腐剤の混合物の状態で活性物質を提供できる。好適な防腐剤、分散剤、及び懸濁化剤については先に説明されている。
【０１７７】
組成物は、また、本発明の化合物の直腸投与用の坐剤の形態であってもよい。これらの組成物は、常温で固体であるが直腸温度で液体であるため、直腸内で融解して薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤と、薬物を混合することによって調製されることができる。そのような材料は、例えばココアバター及びポリエチレングリコールを含んでいる。
【０１７８】
局所使用のために、本発明の化合物を含むクリーム剤、軟膏剤、ゼリー剤、溶液又は懸濁液が使用できる。局所適用は、また、洗口剤及びうがい薬も含むことができる。好適な防腐剤、抗酸化剤、例えばBHA及びBHT、分散剤、界面活性剤、又はバッファーを使用できる。
【０１７９】
本発明の化合物は、また、リポソーム・デリバリー・システム、例えば小単層小胞（small unilamellar vesicles）、大単層小胞、及び多層小胞の形態で投与できる。リポソームは、様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン、又はホスファチジルコリンから形成されることができる。
【０１８０】
態様によっては、本発明の化合物は、代謝酵素による循環からのクリアランスをさらに遅らせるために修飾されてもよい。1つの態様において、化合物は、水溶性高分子、例えばポリエチレングリコール（PEG）、PEGの共重合体、及びポリプロピレングリコール、ポリビニールピロリドン又はポリプロリン、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニールアルコール等の共有結合によって修飾されることができる。そのような修飾は、また、水溶液中への化合物の溶解性を高めることもできる。重合体、例えばポリエチレングリコールは、１又は複数の活性アミノ残基、スルフィドリル残基、又はカルボキシル残基に共有結合させることができる。カルボン酸又は炭酸誘導体の活性エステルを含めたPEGの多数の活性型、特に脱離基がアミノ基との反応のためのN-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェノール、イミダゾール、又は1-ヒドロキシ-2-ニトロベンゼン-3-スルフォン、スルフィドリル基との反応のための多重モード又はハロ・アセチル誘導体、及び炭水化物基との反応のためのアミノヒドラジン又はヒドラジド誘導体であるものについて説明されている。
【０１８１】
本発明の融合タンパク質と一緒に使用できるタンパク質製剤のさらなる調製方法は、米国特許番号第6,267,958号及び同第5,567,677号に記載されている。
【０１８２】
本発明の更なる側面において、本発明のRAGE融合タンパク質は、他の既知の処置薬を用いたアジュバント療法処置、又は併用療法処置において利用されることができる。以下のものは、本発明のRAGE融合タンパク質モジュレーターと組み合わせて利用されることができるアジュバント及び追加的な処置剤の不完全な一覧表である：
【０１８３】
抗癌剤の薬理学的分類：
1．アルキル化剤：シクロホスファミド、ニトロソ尿素、カルボプラチン、シスプラチン、プロカルバジン
2．抗生物質：ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン
3．代謝拮抗剤：メトトレキサート、シタラビン、フルオロウラシル、アザチオプリン、6-メルカプトプリン、及び細胞損害性癌の化学療法薬
4．植物アルカロイド：ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、パクリタクセル
5．ホルモン：タモキシフェン、酢酸オクトレオチド、フィナステリド、フルタミド
6．生物学的反応修飾物質：インターフェロン、インターロイキン
【０１８４】
関節リウマチに対する処置の薬理学的分類
1．鎮痛剤：アスピリン
2．NSAID（非ステロイド系抗炎症薬）：イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク
3．DMARD（疾患修飾抗リウマチ薬）：メトトレキサート、金剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン
4．生物学的反応修飾物質、DMARD：エタネルセプト、インフリキシマブ、グルココルチコイド、例えばベクロメタゾン、メチルプレドニソロン、ベタメサゾン、プレドニゾン、デキサメサゾン、及びヒドロコルチゾン
【０１８５】
糖尿病に対する処置の薬理学的分類
1．スルホニル尿素類：トルブタミド、トラザミド、グリブリド、グリピジド
2．ビグアニド：メトホルミン
3．種々の経口剤：アカルボース、トログリタゾン
4．インスリン：
【０１８６】
アルツハイマー病に対する処置の薬理学的分類
1．コリンエステラーゼ阻害剤：タクリン、ドネペジル
2．抗精神病薬：ハロペリドール、チオリダジン
3．抗うつ薬：デシプラミン、フルオキセチン、トラゾドン、パロキセチン
4．抗けいれん剤：カルバマゼピン、バルプロ酸
【０１８７】
1つの態様において、本発明は、それ故に、RAGE媒介性疾患を処置する方法を提供できるが、上記方法は、以下の：アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾物質、鎮痛剤、NSAID、DMARD、グルココルチコイド、スルホニル尿素、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、及び抗けいれん剤から成る群から選択される処置薬と組み合わせて、処置として有効量のRAGE融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することを含む。更なる態様において、本発明は、以下の：アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾物質、鎮痛剤、NSAID、DMARD、グルココルチコイド、スルホニル尿素、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、及び抗けいれん薬から成る群から選択される処置薬の1種類以上を更に含む、先に説明した本発明の医薬組成物を提供する。
【実施例】
【０１８８】
本発明によって包含される本発明の概念の特徴及び利点を、以下に続く実施例において更に説明する。
実施例1A：RAGE IgG Fc融合タンパク質の製造
2つのプラスミドを構築して、RAGE-IgG Fc融合タンパク質を発現させた。両方のプラスミドを、ヒトRAGE由来の異なる長さの5’側のcDNA配列と、ヒトIgG Fc（γ1）からの同じ3’側のcDNA配列とを連結することによって構築した。これらの発現配列（すなわち、連結産物）を、次に、pcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen, CA）内に挿入した。融合タンパク質コード領域をコードする核酸配列を、図2及び3に示す。TTP-4000RAGE融合タンパク質について、第1〜753の核酸配列（ボールド体で強調した）が、RAGEのN末端タンパク質配列をコードするのに対して、第754〜1386の核酸配列は、IgG-Fcタンパク質配列をコードする（図2）。TTP-3000について、第1〜408の核酸配列（ボールド体で強調した）が、RAGEのN末端タンパク質配列をコードするのに対して、第409〜1041の核酸配列はIgG-Fcタンパク質配列（図3）をコードする。
【０１８９】
RAGE融合タンパク質を作り出すために、配列番号30又は配列番号31のいずれかの核酸配列を含む発現ベクターを、CHO細胞内に安定的にトランスフェクションした。ポジティブな形質転換体を、プラスミドによって与えられるネオマイシン耐性について選択し、そしてクローン化した。上清のウェスタンブロット分析によって検出される高生産クローンを増やし、そして、その遺伝子産物を、プロテインAカラムを使用したアフィニティ・クロマトグラフィーによって精製した。細胞が1リットルあたり約1.3グラムのレベルで組換え型のTTP-4000を産生するように、発現を最適化した。
【０１９０】
２つの融合タンパク質をコードする発現ポリペプチドを図４−６に示す。ＴＴＰ−４０００の４ドメイン構造については、 最初の２５１アミノ酸（図４中ボールド体で示している）は、ヒトＲＡＧＥタンパク質の、シグナル配列（１−２２／２３）、Ｖ免疫グロブリン（及びリガンド結合）ドメイン（２３／２４−１１６）、第二のドメイン間リンカー（１１７−２２３）、第二の免疫グロブリン（ＣH１）（１２４−２２１）、及び第二のリンカー（２２２−２５１）を含んでいる（図５、６Ｂ）。２５２−４６１の配列には、ＩｇＧのＣH２及びＣH３の免疫グロブリンドメインが含まれる。
【０１９１】
ＴＴＰ−３０００の４ドメイン構造の場合、最初の１３６アミノ酸（ボールドで示した）は、ヒトＲＡＧＥタンパク質の、シグナル配列（１−２２／２３）、Ｖ免疫グロブリン（及びリガンド結合）ドメイン（２３／２４−１１６）及びドメイン間リンカー配列（１１７−１３６）を含んでいる（図５、６Ｂ）。
【０１９２】
実施例2：RAGE-IgG1融合タンパク質の活性を試験する方法
A．インビトロにおけるリガンド結合
既知のRAGEリガンドを、1ウェルあたり5マイクログラムの濃度でMaxisorbプレート表面上にコートした。プレートを4℃で一晩インキューベートした。リガンド・インキュベーションに続いて、プレートを吸引し、そして、50mMのイミダゾール・バッファー（pH7.2）中、1%のBSAから成るブロッキング・バッファーをプレートに加えた（室温で1時間）。プレートを、次に、吸引し、及び／又は洗浄バッファー（20mMのイミダゾール、150mMのNaCl、0.05%のTween-20、5mMのCaCl2、及び5mMのMgCl2、pH7.2）で洗浄した。1.082mg/mLの初期濃度にてTTP-3000の溶液（TT3）、及び370μg/mLの初期濃度にてTTP-4000の溶液（TT4）を調製した。RAGE融合タンパク質を、初期サンプルを漸増する希釈度にて加えた。RAGE融合タンパク質を、固定化リガンドと一緒に37℃で1時間インキューベートし、その後、そのプレートを洗浄し、そして融合タンパク質の結合についてアッセイした。結合を、21ng/100μLの最終アッセイ濃度（FAC）まで1：11,000に希釈したモノクローナル・マウス抗ヒトのIgG1、500ng/μLのFACまで1：500に希釈したビオチン化ヤギ抗マウスIgG、及びアビジン連結アルカリホスファターゼを含む免疫検出複合体の添加によって検出した。複合体を、固定化融合タンパク質と一緒に室温で1時間インキューベートし、その後、プレートを洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ基質・パラニトロフェニルホスファート（PNPP）を加えた。固定化融合タンパク質への複合体の結合を、405nmにて分光光度測定で計測されるPNPPのパラ-ニトロフェノール（PNP）への転換を測定することによって定量化した。
【０１９３】
図7で説明されるように、融合タンパク質TTP-4000（TT4）及びTTP-3000（TT3）は、既知のRAGEリガンドであるアミロイド-β（Aβ）、S100b（S100）、及びアンホテリン（Ampho）と特異的に相互作用する。リガンドの不存在下、すなわち、BSAコートのみ（BSA又はBSA＋洗浄）において、免疫検出複合体の非特異的結合に起因するレベルを超える吸光度の増大はなかった。アミロイド-βが標識リガンドとして使用される場合には、アッセイ前にアミロイド-βをプレインキュベートする必要があるかもしれない。アミロイド-βがプリーツシート形態でRAGEに選択的に結合することができるので、プレインキュベーションはアミロイド-βのプリーツシート形態への自己集合を可能にすることができる。
【０１９４】
RAGE融合タンパク質TTP4000及びTTP-3000とRAGEリガンドの間の特異的な相互作用の更なる証拠は、RAGEリガンドがRAGE融合タンパク質に結合するために既知のRAGEリガンドと効果的に競合できることを示す研究において例示される。これらの研究において、先に説明したように、アミロイド-β（A-β）をMaxisorbプレート上に固定し、そしてRAGE融合タンパク質を加えた。さらに、RAGEリガンドを、RAGE融合タンパク質と同時にいくつかのウェルに加えた。
【０１９５】
TTP-4000が123μg/mL（1：3希釈、図8）で存在していた場合に、RAGEリガンドが、TTP-4000（TT4）の結合を約25%〜30%まで妨げることができるのがわかった。TTP-4000の初期溶液を10又は30倍に希釈した場合（1：10又は1：30）、固定化リガンドへの融合タンパク質の結合はRAGEリガンドによって完全に抑制された。同様に、TTP-3000が360μg/mL（1：3希釈、図9）で存在する場合に、RAGEリガンドは、TTP-3000（TT3）の結合を約50%まで妨げた。TTP-3000の初期溶液を10倍に希釈した場合（1：10）、固定化リガンドへのRAGE融合タンパク質の結合はRAGEリガンドによって完全に抑制された。よって、RAGEリガンドへのRAGE融合タンパク質の結合の特異性は用量依存性であった。また、図8及び9に示されているように、RAGE融合タンパク質の不存在、すなわち、免疫検出複合体のみを使用した（「複合体のみ」）の場合、本質的に結合は検出されなかった。
【０１９６】
B．細胞ベースのアッセイにおけるRAGE融合タンパク質の効果
これまでの研究によると、骨髄性THP-1細胞がRAGEリガンドに応答してTNF-αを分泌する可能性があることが示されている。このアッセイでは、THP-1細胞を、ATCCによって提供されたプロトコールを使用して10%のFBSを補ったRPMI-1640培地中で培養した。その細胞を、RAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）又はTTP-4000（TT4）（10μg）、sRAGE（10μg）、ヒトIgG（10μg）（すなわち、ネガティブコントロールとして）の不存在下、及び存在下の両方で、0.1mg/mlのS100bを伴ったRAGEの刺激によってTNF-αを分泌するように誘導した。THP-1細胞によって分泌されたTNF-αの量を、細胞培養へのタンパク質添加の24時間後に、TNF-αのための市販のELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を使用することで計測した。図10の結果は、RAGE融合タンパク質が、これらの細胞におけるTNF-αのS100b/RAGEに誘発された産生を抑制するということを実証している。図10に示されているとおり、10μgのRAGE融合タンパク質TTP-3000又はTTP-4000の添加で、S100b（0.1mg/ml FAC）によるTNF-αの誘導はそれぞれ約45%〜70%まで減少した。TNF-αのS100b誘導を妨げることにおいて、融合タンパク質TTP-4000は、少なくともsRAGEと同じくらい有効でありうる（図10）。TTP-4000及びTTP-3000のRAGE配列に対する阻害の特異性は、S100b刺激細胞にIgG単独で加えられた実験によって示されている。アッセイへのIgG及びS100bの添加は、S100b単独の場合と同じレベルのTNF-αを示している。融合タンパク質のRAGE配列に対するTTP-4000及びTTP-3000によるTNF-α誘導の阻害の特異性は、S100b刺激細胞にIgGのみを加えた実験によって示される。アッセイへのIgG、すなわち、RAGE配列を持たないヒトIgG（SigmaヒトIgGを10μg/ウェルで加えた）及びS100bの添加が、S100b単独の場合と同じレベルのTNF-αを示すことがわかった。
【０１９７】
実施例3：TTP-4000の薬物動態額的特性
ヒトsRAGEと比べてTTP-4000が優れた薬理動態学特性を有するか否かを判定するために、ラット及び非ヒト霊長類をTTP-4000の静脈内（IV）注射（5mg/kg）に供し、次に、TTP-4000の存在について血漿を評価した。これらの実験では、2匹の未処置雄サルに、末梢静脈中へのTTP-4000の単回IV大量投与（5mg/ml/kg）と、それに続く約1.0ミリリットル（mL）の生理食塩水洗浄液を与えた。血液サンプル（約1.0mL）を、投薬前（すなわち、TTP-4000注射の前）、又は投薬後0.083、0.25、0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、120、168、240、288、及び336時間に、（リチウム・ヘパリン）を含む試験管内に採取した。採取に続いて、その試験管を、冷却（2〜8℃）下、1500×gで15分間の遠心分離にかけるまで湿った氷上に（最大30分）に置いた。それぞれの得られた血漿サンプルを、次に、実施例6に記載されるように、注射に続いて様々な時点でELISAを使用してRAGEポリペプチドについてアッセイするまで冷凍（−70℃±10℃）で保存した。
【０１９８】
図11に示される動力学的特性は、2匹の動物におけるアルファ相のかなり急な勾配によって証明されるように、TTP-4000がそのリガンドをいったん飽和すると、300時間を越える末端半減期を維持することを明らかにする。この半減期は、血漿中のヒトsRAGEの半減期（一般に約2時間）よりも有意に長いので、急性及び準慢性適応症のための単回注射の機会を与える。図11において、各曲線は同じ実験条件下の異なる動物を表す。
【０１９９】
実施例4：TTP-4000のFc活性化
ヒトIgGと比べた場合のRAGE融合タンパク質TTP-4000によるFc受容体の活性化を測定するために実験を実施した。Fc受容体の活性化を、Fc受容体を発現するTHP-1細胞からのTNF-α分泌を測定することによって計測した。これらの実験では、96ウェル・プレートを10μg/ウェルのTTP-4000又はヒトIgGでコートした。Fc刺激がTNF-α分泌をもたらした。TNF-αの量を、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって計測した。
【０２００】
よって、このアッセイにおいて、骨髄細胞株THP-1（ATTC番号TIB-202）を、ATCCの指示に従って10%のウシ胎仔血清を補ったRPMI-1640培地中で維持した。通常、1ウェルあたり40,000〜80,000細胞を、加熱凝集した（63℃で30分間）TTP-4000又はヒトIgG1のいずれかを10ug/ウェルでウェルをプレコートすることによるFc受容体刺激を介してTNF-αを分泌するように誘発した。THP-1細胞によって分泌されたTNF-αの量を、指示に従って市販のTNF ELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, MN # DTA00C）を使用して、処理したウェル内の24時間の細胞培養物から回収した上清において計測した。
【０２０１】
結果は、図12に示されるが、ここで、TTP-4000が2 ng/ウェル未満のTNFしか産生せず、そしてIgGは40ng/ウェルより多く産生することがわかった。
【０２０２】
実施例5：TTP-4000のインビボにおける活性
ヒト疾病のいくつかのin vivoモデルにおいて、TTP-4000の活性をsRAGEと比較した。
【０２０３】
A．再狭窄の動物モデルにおけるTTP-4000
RAGE融合タンパク質TTP-4000を、血管傷害後21日間の平滑筋増殖及び内膜拡張の計測に関与するラット糖尿病モデルの再狭窄において評価した。これらの実験では、左総頸動脈のバルーン障害を、標準的は手順を使用してザッカー糖尿病、及び非糖尿病のラットにおいて実施した。IgG、TTP-4000、又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の初回量（3mg/ラット）を、傷害の1日前に腹腔内（IP）に投与した。維持量を、傷害の7日目後まで一日おき（すなわち、傷害後1、3、5、及び7日目）に提供した。維持量は、高＝1つの群に1mg/動物、又は低＝もう1つの群に0.3mg/動物であった。
【０２０４】
血管平滑筋細胞（VSMC）増殖を測定するために、動物を、傷害の4日後と21日後に屠殺した。細胞増殖の計測のために、4日目の動物には、安楽死の18、12、及び2時間前にブロモデオキシウリジン（BrDdU）50mg/kgの腹腔内投与を与えた。屠殺後、左及び右の頚動脈の全体を採取した。標本を、包埋前の少なくとも24時間Histochoice中に保存した。VSMC増殖の評価を、マウス抗BrdUモノクローナル抗体を使用することで実施した。蛍光標識ヤギ抗マウス二次抗体を適用した。切片あたりのBrdU陽性の核の数を、処置計画を伏せられた2人の観察者によってカウントした。
【０２０５】
残ったラットを、形態測定分析のために21日目に屠殺した。形態測定分析を、ファン・ギーソン染色によって染色した頚動脈の（5mm離れた）連続切片上でコンピュータ化したデジタル顕微鏡の面積測定ソフトウェアであるImage-Pro Plusを使用して、実験群をわからないようにした観察者によって実施した。全てのデータを平均±SDとして表した。統計的分析を、SPSSソフトウェアを用いて実施した。連続的変量を、対応のないt検定を使用して比較した。P≦0.05の値を、統計的に有意であると考えた。
【０２０６】
図13A及び13Bに見られるように、TTP-4000処置は、用量応答様式で内膜/中膜の比、及び血管平滑筋細胞増殖を有意に減少させた。図13Bでは、Y軸はBrdU増殖細胞の数を表す。
【０２０７】
B．APの動物モデルにおけるTTP-4000
TTP-4000がマウスADモデルにおけるアミロイド形成と認知機能障害に影響を及ぼすかどうか評価するために、実験を実施した。実験には、PDGF-B鎖プロモーターの制御下のヒト・スウェーデン型突然変異アミロイド前駆タンパク質（APP）を発現するトランスジェニック・マウスを利用した。時間が経つにつれて、これらのマウスは、高レベルのRAGEリガンドであるアミロイド-β（Aβ）を産生した。これまでは、3カ月間のsRAGE処置が、このモデルにおける脳内のアミロイド斑形成及び炎症性マーカーの関連した増加の両方を減少させることが示された。
【０２０８】
この実験に使用されるAPPマウス（雄）を、血小板由来成長因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーターの制御下、マウス卵内への（スウェーデン型及びロンドン型の突然変異を有する）ヒトAPP遺伝子の微量注射によって設計した。そのマウスを、C57BL/6の生い立ちを持つものにおいて発生させ、そしてそれはMolecular Therapeutics Inc.によって開発された。動物に不断給餌し、そして同胞交配によって維持した。このコンストラクトから発生したマウスは、6カ月齢にて開始するアミロイド沈着を発現した。動物を、6カ月齢にし、次に90日間維持し、そしてアミロイド定量化のために屠殺した。
【０２０９】
APPトランスジェニック・マウスに、6カ月齢から開始して90日間、一日おきに［qod（i.p.）］溶媒又はTTP-4000を投与した。実験の終わりに、動物を屠殺し、脳内のAβ斑負荷について調べた（すなわち、斑の数）。6カ月のコントロールAPP群を、アミロイド沈着のベースラインを決定するのに使用した。さらに、研究の終わりに、動物を行動（モリス水迷路）分析にかけた。調査員には試験化合物が分からないようにした。サンプルを、0.25ml/マウス/一日おきでマウスに与えた。さらに、1群のマウスに200ug/日のヒトsRAGEを与えた。
【０２１０】
1．アミロイドβ堆積
組織学的検査のために、動物を、ペントバルビタール・ナトリウム（50mg/kg）の腹腔内投与（IP）で麻酔した。動物に、4℃のリン酸緩衝食塩水（PBS）と、それに続いて4%のパラホルムを経心臓的に潅流した。脳を取り出し、4%のパラホルムアルデヒド中に一晩、置いた。その脳を、パラフィン処理し、そして包埋した。脳を通した10枚の連続した30μm厚の切片を得た。トランスジェニック動物の脳内のアミロイド沈着を検出するために、切片を一次抗体（Aβペプチド抗体）に4℃で一晩、晒した（Guoら、J. Neurosci. 22：5900-5909ページ（2002年））。切片を、トリス緩衝食塩水（TBS）中で洗浄し、二次抗体を加え、そして室温で1時間インキューベートした。洗浄後に、切片を、ベクターABC Eliteキット（Vector Laboratories）に指示されるとおりにインキューベートし、そしてジアミノ安息香酸（DAB）で染色した。反応を水により止めて、キシレンでの処理後にカバースリップを乗せた。各切片内のアミロイド領域を、Quick Captureフレーム取り込みカード、オリンパス顕微鏡に備え付けられたヒタチCCDカメラ、及びカメラ・スタンドを備えたPower Macintosh（登録商標）コンピュータから成るコンピュータを利用した画像解析システムを用いて測定した。NIH画像分析ソフトウェア、v. 1.55を使用した。画像を得、そしてアミロイドの総面積を、10枚の切片にわたって測定した。処置状況を伏せられた1人のオペレーターが全ての測定を実施した。切片のアミロイド量を合計し、そして切片の総数で割ることで、アミロイド量を計算した。
【０２１１】
定量分析のために、酸素結合免疫吸着検査法（ELISA）を、APPトランスジェニック・マウス（Biosource International, Camarillo, CA）の脳内のヒト総Aβ、Aβtotal、及びAβ1-42のレベルを測定するために使用した。Aβtotal及びAβ1-42を、塩酸グアニジンによってマウスの脳から抽出し、そして製造業者による説明のとおりに定量した。このアッセイは、脳からの全Aβペプチド（可溶性と凝集性の両方）を抽出する。
【０２１２】
2．認識機能
モリス水迷路試験を以下のとおり実施した。全てのマウスを、実験の終わりにモリス水迷路試験で一度試験した。マウスを、1.2mのオープンフィールド水迷路で訓練した。プールを、30cmの深さまで水で満たし、そして25℃に維持した。エスケープ・プラットフォーム（10cm四方）を水面の1cm下に配置した。試験中、プラットフォームをプールから取り出した。手掛かり試験（cued test）を、白いカーテンで囲まれて、あらゆる余分な迷路の手掛りを隠したプールの中で行った。全ての動物に、連続した3日間、空間的な事前訓練を与えなかった（NSP）。これらの試験は、プラットフォームを見つけるための記憶の保持力を測定するための最終的な行動試験のための動物を調製するためにある。これらの試験は、記録されなかったが、訓練目的だけのためのものであった。訓練する、及び研究を学習するために、カーテンは余分な迷路の手掛りを取り除いた（これは水泳障害を伴う動物の識別を可能にする）。1日目に、マウスを、20秒間、隠したプラットフォーム上に置き（試験1）、試験2〜3のために、動物を、手掛かりのあるプラットフォーム又は隠したプラットフォーム（試験4）から10cm離れた水中に放して、プラットフォームまで泳がせた。試験の2日目に、隠したプラットフォームを、プールの中央、又はそれぞれの象限の中央の間で無作為に移動させた。動物を、無作為に壁と向き合わせてプール内に放し、そして60秒でプラットフォームに到達させた（試験3）。3番目の試験において、動物に、隠したプラットフォームによる2つと、手掛かりのあるプラットフォームによる1つの、3つの試験を与えた。NSP後の2日間、動物を、最終的な行動試験（モリス水迷路試験）にかけた。これらの試験（動物1匹あたり3つ）のために、プラットフォームをプールの1つの象限の中央に配置し、そして動物を無作為に壁に向かい合わせて放した。動物に、プラットフォームを見つけさせるか、又は60秒間、泳がせた（反応時間、プラットフォームを見つける時間）。全ての動物を、投薬の4〜6時間以内に試験し、そして試験群が分からないようにしたオペレーターによって試験するために無作為に選択させた。
【０２１３】
結果を、平均±標準偏差（SD）として表した。アミロイド及び行動研究における相違の有意性を、t-検定を使って分析した。6カ月齢のAPPコントロール群とTTP-4000処置動物、並びに9カ月齢のAPP溶媒処置群とTTP-4000処置動物の間で比較をした。0.05未満の相違を有意であると見なした。アミロイド及び行動における変化の百分率を、各群におけるデータの合計を取り、そしてコントロールで割ることによって決定した（すなわち、1、i.p./6カ月コントロール＝%変化）
【０２１４】
図14A及び14Bは、TTP-4000又はマウスsRAGEのいずれかで3カ月間処置したマウスが、溶媒及びネガティブコントロールであるヒトIgG1（IgG1）処置動物に比べてより少ないAβ斑、及びより少ない認知機能障害しか持たないことを示している。このデータは、TTP-4000がトランスジェニック・マウス・モデルにおけるAD病理の減少に有効であることを示唆している。sRAGEのように、TTP-4000が炎症性サイトカインであるIL-1及びTNF-αを下げることができることもわかった（データ未掲載）。
【０２１５】
C．脳卒中の動物モデルにおけるTTP-4000の有効性
脳卒中の疾患関連動物モデルにおいて、TTP-4000をsRAGEとも比較した。このモデルでは、マウスの中央頚動脈を1時間結紮し、続いて23時間の再潅流をして、その時点でマウスを屠殺し、そして脳内の梗塞の面積を評価した。再潅流直前に、マウスを、sRAGE、又はTTP-4000、あるいはコントロール免疫グロブリンによって処理した。
【０２１６】
これらの実験では、雄C57BL/6に、250μl/マウスにて溶媒を、又はTTP試験物質（250μl/マウスにてTTP-3000、TTP-4000）を注射した。マウスには、虚血の開始の1時間後に腹腔内に注射した。マウスを、1時間の大脳虚血、それに続く24時間の再潅流にさらした。虚血を誘発するために、各マウスを麻酔し、そして外部加温により体温を36〜37℃に維持した。左の総頚動脈（CCA）を首の正中切開により露出させた。顕微手術クリップを、内頸動脈（ICA）の起始部のそばに置いた。ECAの遠位末端を、絹糸で結紮し、そして切断した。6-0絹糸を、ECA断端のそばで軽く結んだ。ナイロン縫合糸の精密研磨された先を、ECA断端にそっと挿入した。6-0絹糸の輪を前記断端の周りで絞り、そしてナイロン縫合糸を前大脳動脈で静止するまで内頚動脈（ICA）の中に通して進め、それによって前交通動脈及び中大脳動脈を咬合する。ナイロン縫合糸を適所に据えた1時間後に、動物を再び麻酔し、直腸温度を記録し、そして縫合糸を取り除き切片部を閉じた。
【０２１７】
ペントバルビタール・ナトリウム（50mg/kg）の腹腔内投与で動物を麻痺し、次に、脳を取り出すことによって梗塞量を測定した。その脳を、次に、梗塞領域を通る4枚の2mm切片に区分し、そして2%の塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）中に30分間置いた。その後、切片を、4%のパラホルムアルデヒド中に一晩置いた。各切片の梗塞領域を、Quick Captureフレーム取り込みカード、カメラ・スタンドに据え付けられたヒタチCCDカメラを備えたPower Macintosh（登録商標）コンピュータから成るコンピュータを利用した画像解析システムを用いて測定した。NIH画像分析ソフトウェア、v. 1.55を使用した。画像を得、そして切片を通して総梗塞面積を測定した。処置状況を伏せられた1人のオペレーターが全ての測定を実施した。切片の梗塞量を合計して総梗塞量を計算した。結果を平均±標準偏差（SD）として表した。梗塞量データの相違の有意性は、t-検定を使って分析した。
【０２１８】
表2中のデータによって説明されるように、これらの動物における梗塞領域を制限することにおいて、TTP-4000はsRAGEよりも効果的であり、より優れた血漿中半減期のため、これらのマウスにおいてTTP-4000がより大きな保護を維持できたことを示唆している。
【０２１９】
実施例6：ELISAによるRAGE融合タンパク質の検出
最初に、1×PBS pH7.3中、10ug/mLの濃度にて50uLのRAGE特異的モノクローナル抗体1HB1011を、一晩のインキュベーションによってプレートにコートする。レディーフォーユースの場合、プレートを、300uLの1×イミダゾール-Tween洗浄バッファーで3回洗浄し、そして1%のBSAでブロックした。（希釈した）サンプルと、既知のTTP-4000希釈物の標準希釈物を、100uLの最終量で加える。サンプルを、室温で1時間インキューベートする。インキュベーション後に、そのプレートを3回洗浄する。1%のBSAを含む1×PBS中、ヤギ抗ヒトIgG1 1（Sigma A3312）APコンジュゲートを加え、室温で1時間インキューベートする。プレートを3回洗浄する。呈色をパラニトロフェニルホスファートではっきりさせた。
【０２２０】
実施例7：RAGE融合タンパク質へのRAGEリガンド結合の定量
図15は、種々の固定化された既知のRAGEリガンドに対するTTP-4000による飽和結合曲線を示している。リガンドを、マイクロタイタープレート上に固定し、0〜360nMの漸増する濃度のRAGE融合タンパク質の存在下でインキューベートする。RAGE融合タンパク質-リガンド相互作用を、融合キメラのIgG部分に特異的である、アルカリホスファターゼを抱合したポリクローナル抗体を使用して検出する。相対Kdsを、Graphpad Prizmソフトウェアを使用して計算し、そしてRAGE-RAGEリガンド値の立証された文献値と照合した。HMG1B＝アンホテリン、CML＝カルボキシメチルリジン、Aβ=アミロイドβ1-40。
【０２２１】
前述のものは、本発明の主要部の単なる例示とみなされる。当業者にとって、多数の修飾及び変化は容易に想到するものであるため、示すとともに説明した実際の態様に本発明を限定するものとは解されず、特許請求の範囲内の全ての適当な修飾物及び均等物が本発明の概念の範囲内にあるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１Ａ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルA、配列番号1、ヒトRAGEのアミノ酸配列；及び配列番号2、第1〜22アミノ酸から成るシグナル配列を含まないヒトRAGEのアミノ酸配列。
【図１Ｂ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルB、配列番号3、第1〜23アミノ酸から成るシグナル配列を含まないヒトRAGEのアミノ酸配列。
【図１Ｃ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルC、配列番号4、ヒトsRAGEのアミノ酸配列；配列番号5、第1〜22アミノ酸から成るシグナル配列を含まないヒトsRAGEのアミノ酸配列；及び配列番号6、第1〜23アミノ酸から成るシグナル配列を含まないヒトsRAGEのアミノ酸配列。
【図１Ｄ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルD、配列番号7、ヒトRAGEのVドメインを含むアミノ酸配列；配列番号8、ヒトRAGEのVドメインを含む代替のアミノ酸配列；配列番号9、ヒトRAGEのVドメインのN末端フラグメント；配列番号10、ヒトRAGEのVドメインの代替のN末端フラグメント；配列番号11、ヒトRAGEの124〜221アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号12、ヒトRAGEの227〜317アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号13、ヒトRAGEの23〜123アミノ酸から成るアミノ酸配列。
【図１Ｅ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルE、配列番号14、ヒトRAGEの24〜123アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号15、ヒトRAGEの23〜136アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号16、ヒトRAGEの24〜136アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号17、ヒトRAGEの23〜226アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号18、ヒトRAGEの24〜226アミノ酸から成るアミノ酸配列。
【図１Ｆ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルF、配列番号19、ヒトRAGEの23〜25 1アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号20、ヒトRAGEの24〜251アミノ酸から成るアミノ酸配列；配列番号21、RAGEドメイン間リンカー；配列番号22、第二のRAGEドメイン間リンカー；配列番号23、第3のRAGEドメイン間リンカー；配列番号24、第4のRAGEドメイン間リンカー。
【図１Ｇ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルG、配列番号25、ヒトRAGEの1〜118アミノ酸をコードするDNA；配列番号26、ヒトRAGEの1〜123アミノ酸をコードするDNA；及び配列番号27、ヒトRAGEの1〜136アミノ酸をコードするDNA。
【図１Ｈ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルH、配列番号28、ヒトRAGEの1〜230アミノ酸をコードするDNA；配列番号29、ヒトRAGEの1〜251アミノ酸をコードするDNA。
【図１Ｉ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルI、配列番号38、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインの部分アミノ酸配列；配列番号39、ヒトIgGヒトCH2及びCH3ドメインの一部をコードするDNA；配列番号40、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインのアミノ酸配列。
【図１Ｊ】本発明の別の態様による様々なRAGE配列及び免疫グロブリン配列を示す：パネルJ、配列番号41、ヒトIgGのヒトCH2及びCH3ドメインをコードするDNA；配列番号42、ヒトIgGのCH2ドメインのアミノ酸配列；配列番号43、ヒトIgGのCH3ドメインのアミノ酸配列；及び配列番号44、第5のRAGEドメイン間リンカー。
【図２】本発明の態様によるRAGE融合タンパク質（TTP-4000）コード領域のDNA配列（配列番号30）を示している。ボールド体で強調したコード配列1〜753がRAGEのN末端タンパク質配列をコードする一方で、配列754〜1386はヒトIgG Fc（γ1）タンパク質配列をコードする。
【図３】本発明の態様による別のRAGE融合タンパク質（TTP-3000）コード領域のDNA配列（配列番号31）を示している。ボールド体で強調したコード配列1〜408がRAGEのN末端タンパク質配列をコードする一方で、配列409〜1041はヒトIgG Fc（γ1）タンパク質配列をコードする。
【図４】配列番号32（TTP-4000）、配列番号33、及び配列番号34のアミノ酸配列を示しており、それぞれが本発明の別の態様による4ドメインRAGE融合タンパク質をコードするアミノ酸配列である。RAGE配列を、ボールド体のフォントで強調する。
【図５】配列番号35（TTP-3000）、配列番号36、及び配列番号37のアミノ酸配列を示しており、それぞれが本発明の別の態様による3ドメインRAGE融合タンパク質をコードするアミノ酸配列である。RAGE配列を、ボールド体のフォントで強調する。
【図６Ａ】パネルAは、本発明の別の態様によるヒトRAGEと、ヒトIgγ-1のFcタンパク質のタンパク質ドメイン、並びにTTP-3000（136位にて）、及びTTP-4000（251位にて）を作製するのに使用される開裂ポイントの比較を示している。
【図６Ｂ】パネルBは、本発明の別の態様によるTTP-3000とTTP-4000のドメイン構造を示している。
【図７】本発明の態様によるsRAGE、並びにRAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）及びTTP-3000（TT3）に関する、RAGEリガンドであるアミロイド-β（Ａ−ｂｅｔａ）、S100b（S100）、及びアンホテリン（Ampho）に対するインビトロ結合アッセイの結果を示している。
【図８】本発明の態様による、免疫検出試薬のみを含んでいるネガティブコントロール（「複合体のみ」）、及びRAGEアンタゴニスト（「RAGEリガンド」）によるそのような結合の拮抗作用と比較した場合の、RAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）（「タンパク質」）に関するアミロイド-βに対するインビトロ結合アッセイの結果を示している。
【図９】本発明の態様による、免疫検出試薬のみを含んでいるネガティブコントロール（「複合体のみ」）、及びRAGEアンタゴニスト（「RAGEリガンド」）によるそのような結合の拮抗作用と比較した場合の、RAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）（「タンパク質」）に関するアミロイド-βに対するインビトロ結合アッセイの結果を示している。
【図１０】本発明の態様による、RAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）及びTTP-4000（TT4）、並びにsRAGEによるS100b-RAGE誘発性TNF-α産生の阻害を測定する細胞ベースのアッセイの結果を示している。
【図１１】本発明の態様によるRAGE融合タンパク質TTP-4000の薬理動態学的特性を示しており、その中で、各曲線は同じ実験条件下の異なる動物を表す。
【図１２】本発明の態様による炎症反応の手段としてRAGE融合タンパク質TTP-4000による刺激、及びヒトIgGによる刺激に起因するTHP-1細胞からのTNF-α放出の相対レベルを示している。
【図１３Ａ】本発明の別の態様による糖尿病動物における再狭窄を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示しており、その中で、パネルAは、ネガティブコントロール（IgG）と比較した場合に、TTP-4000RAGE融合タンパク質が内膜／中膜の比を低下させたことを示している。
【図１３Ｂ】本発明の別の態様による糖尿病動物における再狭窄を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示しており、その中で、パネルBは、RAGE融合タンパク質TTP-4000が用量反応性の様式で血管平滑筋細胞増殖を減少させたことを示している。
【図１４Ａ】本発明の別の態様によるアルツハイマー病（AD）の動物におけるアミロイド形成と認知機能障害を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示している。その中で、パネルAは、RAGE融合タンパク質TTP-4000が脳内のアミロイド負荷を減少させたこと示している。
【図１４Ｂ】本発明の別の態様によるアルツハイマー病（AD）の動物におけるアミロイド形成と認知機能障害を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示している。その中で、パネルBは、RAGE融合タンパク質TTP-4000が認知機能障害を改善したことを示している。
【図１５】本発明の態様による種々の固定された既知のRAGEリガンドに対してTTP-4000を用いた飽和結合曲線を示している。
【図１Ａ】
2008508882.tif 000004
【図１Ｂ】
2008508882.tif 000005
【図１Ｃ】
2008508882.tif 000006
【図１Ｄ】
2008508882.tif 000007
【図１Ｅ】
2008508882.tif 000008
【図１Ｆ】
2008508882.tif 000009
【図１Ｇ】
2008508882.tif 000010
【図１Ｈ】
2008508882.tif 000011
【図１Ｉ】
2008508882.tif 000012
【図１Ｊ】
2008508882.tif 000013
【図２】
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【図３】
2008508882.tif 000015
【図４】
2008508882.tif 000016
【図５】
2008508882.tif 000017
【図６Ａ】
2008508882.tif 000018
【図６Ｂ】
2008508882.tif 000019
【図７】
2008508882.tif 000020
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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