(57)【要約】【課題】【解決手段】  変異抗原の免疫原性を試験する新規の方法を提供する。特に、トランスジェニック動物の使用に基づく方法を提供し、このトランスジェニック動物は、特定の抗原に対して耐性化され、この抗原の変異体に曝露されて、免疫反応を決定する。一の実施例では、このトランスジェニック動物は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子について遺伝子組み換えされているマウスであり、変異型抗原のライブラリの免疫原性を試験する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳類の抗原から取り出した、当該ほ乳類ＭＨＣクラスＩＩ分子用の非ヒトほ乳類遺伝子の変異型抗原の免疫原性の試験方法であって、前記非ヒトほ乳類が前記ほ乳類抗原の源ではない方法において、前記方法が：
（ａ）前記ほ乳類抗原との接触によって、前記トランスジェニックほ乳類に前記ほ乳類抗原に対する耐性を与えるステップと；
（ｂ）前記トランスジェニックほ乳類を前記変異型抗原と接触させるステップと；
（ｃ）前記トランスジェニックほ乳類中の前記変異型抗原の免疫原性を測定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ほ乳類抗原との接触が、前記ほ乳類抗原をコードする一又はそれ以上の導入遺伝子を前記トランスジェニックほ乳類に導入することによって達成され、前記一又はそれ以上の導入遺伝子の発現が、前記ほ乳類の抗原との更なる接触に対して前記トランスジェニックほ乳類に耐性を付けることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記抗原が可溶性タンパク質であり、前記トランスジェニックほ乳類が、前記タンパク質と接触して耐性を誘発し、次いで、一又はそれ以上の前記タンパク質の変異株の免疫性を試験することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記抗原がモノクノーナル抗体であり、前記トランスジェニックほ乳類が、可溶性単量体抗原と接触して耐性を誘発し、次いで、一又はそれ以上のモノクローナル抗体の変異株の免疫性を試験することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、前記抗原がほ乳類ポリクローナル抗原配合物であり、前記トランスジェニックほ乳類が、前記可溶性ポリクローナル抗原と接触して耐性を誘発し、次いで、一又はそれ以上のモノクローナル抗体の免疫性を試験することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか１項に記載の方法において、前記タンパク質が、アジュバント中にあるか、不溶性又は固定型のどちらかであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２に記載の方法において、前記抗原が非タンパク質分子であり、前記トランスジェニックほ乳類が、前期非タンパク質分子と接触して耐性を誘発し、次いで、一又はそれ以上の前記非タンパク質分子の変異株の免疫性を試験することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記変異型非タンパク質分子が、アジュバント内にあるか、不溶性又は固定型のどちらかであることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の方法において、前記非ヒトほ乳類が齧歯類であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記齧歯類がマウスであり、ほ乳類ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ヒト、例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記抗原に対して耐性を誘発するために、前記トランスジェニックマウスが、生後６週まで、好ましくは生後３２時間以内に、前記抗原と接触した新生仔マウスであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法において、前記ほ乳類抗原がヒト抗原であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法において、前記ほ乳類抗原が非ヒト抗原であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスを修飾して、前記抗原又は前記抗原の変異型を発現するマウスの遺伝子を欠失させる、又は不活化することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスを修飾して、マウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を欠失させ、又は不活化し、次いで、試験モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の免疫原性の免疫性を試験し、測定する前に、前記マウスに、ヒト免疫グロブリンに対する耐性を与えることを特徴とすることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスを修飾してマウスタンパク質遺伝子を欠失させ、又は不活化し、次いで、一又はそれ以上の変異型非マウスタンパク質の免疫原性の免疫性を試験し、又は測定する前に、前記マウスに、非マウスタンパク質に対する耐性を与えることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスがヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードし、前記トランスジェニックマウスが、一又はそれ以上の試験モノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体と実質的に接触することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスが一又はそれ以上のヒトタンパク質をコードし、前記トランスジェニックマウスが、一又はそれ以上の変異型ヒトタンパク質と実質的に接触することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法において、前記トランスジェニックマウスが一又はそれ以上のヒトタンパク質をコードし、前記トランスジェニックマウスが、一又はそれ以上の変異型ヒトタンパク質と実質的に接触することを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１０から１７のいずれか１項に記載の方法において、前記トランスジェニックほ乳類由来の血清を用いて免疫原性を測定し、前記試験モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又は試験タンパク質に対する抗原の誘発について試験することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１０から１７のいずれか１項に記載の方法において、マウスＴ細胞の源としてマウスの血液又は組織サンプルを用いて、Ｔ細胞増殖又はＴ細胞活性化アッセイで免疫原性を測定することを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１０から１７のいずれか１項に記載の方法において、例えば、特異ペプチド−ＭＨＣ複合体の結合による等して、タンパク質反応性Ｔ細胞の産生について試験、サイトカイン産生物、増殖、細胞表面マーカ発現、Ｃａ２＋フラックス、ＰＣＲ又はＤＮＡフィンガープリントの測定によるＴ又はＢ細胞の試験、又は特異的免疫反応性Ｂ又はＴ細胞の発生についての試験によって、ヒト免疫原性を測定することを特徴とする方法。
【請求項２３】
ヒトＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウス中の、ヒト抗原由来の変異型抗原の前記免疫原性の試験方法において、前記方法が：
（ａ）前記ヒト抗原との接触によって、前記トランスジェニックマウスに前記ヒト抗原に対する耐性を与えるステップと；
（ｂ）前記トランスジェニックマウスを前記変異型抗原と接触させるステップと；
（ｃ）前記トランスジェニックマウスの前記変異型抗原の免疫原性を測定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２４】
ヒトＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウス中の、非ヒト抗原由来の変異型抗原の前記免疫原性の試験方法において、前記方法が：
（ａ）前記非ヒト抗原との接触によって、前記トランスジェニックマウスに前記非ヒト抗原に対する耐性を与えるステップと；
（ｂ）前記トランスジェニックマウスを前記変異型非ヒト抗原と接触させるステップと；
（ｃ）前記トランスジェニックマウスの前記変異型非ヒト抗原の免疫原性を測定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
変異型抗原のライブラリの前記免疫原性の試験における請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項２６】
請求項２５に記載の使用において、前記変異型抗原がヒト抗原であることを特徴とする使用。
【請求項２７】
請求項２６に記載の使用において、前記ヒト抗原がタンパク質であることを特徴とする使用。
【請求項２８】
請求項２５に記載の使用において、前記変異型抗原が非ヒト抗原であることを特徴とする使用。
【請求項２９】
請求項２８に記載の使用において、前記非ヒト抗原がタンパク質であることを特徴とする使用。
【請求項３０】
請求項２７に記載の使用において、前記タンパク質が抗体のライブラリ、又は抗体のフラグメントであることを特徴とする使用。
【請求項３１】
ヒトＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスの、ヒト抗原由来の一又はそれ以上の変異型抗原の選択方法において、前記方法が：
（ａ）前記ヒト抗原との接触によって、前記トランスジェニックマウスに前記ヒト抗原に対する耐性を与えるステップと；
（ｂ）前記トランスジェニックマウスを二又はそれ以上の変異型ヒト抗原の混合物と接触させるステップと；
（ｃ）前記トランスジェニックマウスの異なるレベルの免疫原性に基づいて、前記混合物から、個々の変異型ヒト抗原を直接選択するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の使用において、前記注入した変異型ヒト抗原混合物に発現する抗体を試験して個々の変異型ヒト抗原に発現する前記抗体を決定するステップによって、又は前記変異型ヒト抗原混合物を前記混合物に誘発された抗体と前吸収するステップによって、変異型ヒト抗原を直接選択することを特徴とする使用。
【請求項３３】
請求項３１に記載の使用において、前記注入された変異型ヒト抗原を粒子に付着させ、この粒子を用いて個々の変異株を同定することを特徴とする使用。
【請求項３４】
請求項３１に記載の使用において、前記注入された変異型ヒト抗原を生細胞に付着させて、この生細胞を用いて、個々の変異株を同定することを特徴とする使用。
【請求項３５】
請求項３１から３４のいずれか１項に記載の使用において、一又はそれ以上の変異型抗原が非ヒト抗原由来であることを特徴とする使用。
【請求項３６】
請求項３１から３４のいずれか１項に記載の使用において、一又はそれ以上の変異型抗原が抗体由来であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク変異体の免疫原性を試験するためのインビボ系に関する。具体的には、本発明は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子用遺伝子導入マウスを用いる方法であって、このようなマウスが、特定のタンパク質に対する耐性を作り、次いで、免疫原性導入用の特定のタンパク質の変異体で試験する方法に関する。加えて、本発明は、低減免疫原性用タンパク質変異体のライブラリからタンパク質を選択するためのインビボ系であって、耐性ヒトＭＨＣトランスジェニックマウスに、様々な変異型タンパク質に関連するセルライン又は粒子のライブラリを注入し、そのライブラリの他のタンパク質よりも免疫原性が低い変異型タンパク質に関連する特定のセルライン又は粒子がインビボで選択されるインビボ系に関する。
【０００２】
非ヒト種は、ヒト由来の様々なＭＨＣ（主要組織適合遺伝子抗原）分子を有し、従って、試験動物に注入したタンパク質に対する免疫応答は、ヒトの持つ同じタンパク質に対する予測される免疫応答を反映しないので、ヒトの潜在的免疫原性についての薬学的タンパク質候補を試験するための現在の方法は本来的に限定されている。従って、ヒト細胞又はヒトＭＨＣを有する細胞のどちらかを用いて免疫原性用のタンパク質を試験することが重要である。特に価値のあるアプローチは、ヒトの血液サンプルを用いてＴ細胞増殖アッセイのタンパク質を試験することである。しかしながら、このアプローチは、インビトロ試験タンパク質に対するＴ細胞反応を測定するものであり、今のところ、インビボで生じるような抗体の産生を生じさせるインビトロ免疫原性法は立証されていない。代替のアプローチは、ヒトＴ及びＢ細胞で再構成したマウスか、レジデントマウスＭＨＣ、及び、いくつかの場合では、Ｔ細胞レセプタ分子をこれらのヒトの相当部分と入れ替えたトランスジェニックマウスを用いることができる。しかしながら、これらのアプローチは、耐性、特に正常なヒトタンパク質に対するヒト免疫系の耐性を考慮していないので、ヒトの免疫原性を正確に予測できない。例えば、ヒトＭＨＣ遺伝子導入マウスは、注入したヒトタンパク質と反対の免疫反応を起こすことが予測される。というのも、マウスはこのようなヒトタンパク質に対して耐性を持っていないからである。従って、この種におけるタンパク質に対する標準的耐性を考慮して、タンパク質及びタンパク質変異体のインビボ免疫原性試験を容易にする改良した方法が求められている。
【０００３】
従って、第１の態様において、本発明は、前記ほ乳類のＭＨＣクラスＩＩ分子用の非ヒトほ乳類中のほ乳類抗原から取り出した変異型抗原の免疫原性を試験するための方法であって、この非ヒトほ乳類が、ほ乳類抗原の源ではない方法において、当該方法が：
（ａ）前記ほ乳類抗原との接触によって、前記トランスジェニックほ乳類に前記ほ乳類抗原に対する耐性を与えるステップと；
（ｂ）前記トランスジェニックほ乳類を前記変異型抗原と接触させるステップと；
（ｃ）前記トランスジェニックほ乳類の前記変異型抗原の免疫原性を測定するステップと；
を具える。
【０００４】
本発明は、例えば、タンパク質及びタンパク質変異体の免疫原性を試験するための新規なインビボシステムを提供する。本明細書に記載されているように、この変異型抗原は、ほ乳類抗原から取り出される。変異型抗原は、付加、欠失、又は置換を有するか、又は化学的手段によって派生したタンパク質又はポリペプチド配列を含むことができる。この抗原は、本方法で用いられる非ヒトトランスジェニックほ乳類からのものではない。
【０００５】
特に、本発明は、ヒトＴ細胞エピトープの表示を可能にするヒトＭＨＣクラスＩＩ分子用遺伝子導入マウスを用いて、マウスバックグラウンド中のヒトタンパク質及びタンパク質変異体に対する潜在的免疫原性を試験する方法に関する。
【０００６】
本発明の一の実施例では、低濃度（例えば、ヒト血清及び／又はその他の組織に見られる生理学的量に相当する）のタンパク質を注入することによって、生殖細胞系列ヒトＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ｔｇ）遺伝子を発現する新生仔マウスにヒトタンパク質に対する耐性が誘発される。タンパク質は、好ましくは単量体であり、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の免疫不活性緩衝液中で静脈内に投与される。このような系では、耐性を誘発する投与頻度は、耐性が誘発されるタンパク質に依存して変化する。例えば、通常血清濃度が高い状態で存在するタンパク質は、通常生理学的濃度が低い状態で見られるタンパク質よりも、より高い頻度で投与して耐性を誘発することが必要である。
【０００７】
好ましくは、Ｔ細胞の発生中に、耐性タンパク質が確実に存在し、これによって中枢性耐性を誘発するために、未成熟マウス（例えば、新生仔マウス）を用いる。
【０００８】
一般的に、胸腺由来の成熟ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が減少している（通常の成人期）生後６週までのマウスに繰り返し投与する。試験タンパク質又はこの試験タンパク質の変異型に対する耐性を確立し、次いで、耐性マウスに、試験タンパク質又はタンパク質変異体を注入し、次いで、試験タンパク質又はタンパク質変異体に対する免疫原性を試験する。非修飾免疫グロブリン遺伝子を有するマウスでは、試験タンパク質又はタンパク質変異体に対する抗体の産生によって、免疫原性を測定することができる。代替的に、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウス由来の末梢血、脾臓、又はパイエル板を用いた試験タンパク質−特異Ｔ又はＢ細胞反応を測定するアッセイのような免疫原性に関するその他のアッセイを行うことができる。
【０００９】
本発明の別の実施例では、ヒトＨＬＡ−ｔｇマウスを、対象のタンパク質に対してヒトトランス遺伝子を発現するマウスに戻し交配することによって、マウスに耐性を誘発する。例えば、ヒトＩｇＧに耐性を有するヒトＩｇＧを発現するヒトＨＬＡ−ｔｇマウスを産生することができる。クラススイッチによって定常（Ｃ）領域において可変（Ｖ）領域が体細胞変異、転座又は再配列、又は変化を可能にするような方法でヒトＩｇＧを発現しない場合、これらのマウスは、発現した特異的ヒトＩｇＧ配列には耐性を有するが、クラススイッチによってＣ領域において、あるヒトＶ領域体の細胞変異、転座又は再配列又は変化には耐性を有さない。Ｖ領域が体細胞変異、転座又は再配列、或いはＣ領域がクラススイッチすることを可能にするような方法でヒトＩｇＧを発現する場合、これらのマウスは、特異的生殖細胞Ｖ及びＣ領域配列を含む特異的ヒトＩｇＧに対してだけでなく、親和性変異が生じ、あらゆる抗原に対して特異的であるヒトＩｇＧに対しても耐性を有する。
【００１０】
これらの条件下で、ヒトＭＨＣクラスＩＩのコンテキストにおいて中枢性耐性を達成することができる内因性ヒトＭＨＣクラスＩＩ及びヒトタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを産生することができる。マウスのゲノムに組み込まれた（対象のヒトタンパク質をコードする）ヒトトランス遺伝子のコピー数、又はトランス遺伝子の発現効率（転写及び転座効率、及びマウスのゲノム内のトランス遺伝子の局在化等の様々な因子によって決定する）が、発現するタンパク質の量を決定し、「生理学的量」のトランス遺伝子を発現するマウスのみをＨＬＡ−ｔｇマウスに戻し交配するために選択するように、ヒトトランス遺伝子についての様々な発現レベルでマウスを発生させるように変化する。
【００１１】
注入かトランス遺伝子のいずれかのアプローチによって、ＨＬＡ−ｔｇマウスのヒトタンパク質に対する耐性を誘発し、単一ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を発現するマウスを用いることが好ましい。従って、上記のプロセスを用いて、単一ＭＨＣクラスＩＩアロタイプをそれぞれが発現するマウスパネルに耐性を誘発する。ヒトＭＨＣクラスＩＩアロタイプに要求されるのと同じくらい大きい収集カバレージを達成するように、多ＨＬＡ−ｔｇマウスを選択する。本発明の範囲内で、その他の方法を用いて、特異的タンパク質に耐性を有する特異的白血球を誘発する方法と、特異的タンパク質に反応する特異的白血球を除去する方法と、耐性を誘発するように、特異的タンパク質又は変異体への曝露中に、免疫系を調節する方法とを含む対象の特異的タンパク質又はタンパク質変異体に耐性を有するＨＬＡ−ｔｇマウスを提供することができることが理解されよう。また、可能であるならば、特異的試験タンパク質又はタンパク質変異体に相当するマウスを発現しないマウスを本発明で用いて、試験タンパク質又はタンパク質変異体に対するこれらのマウスのあらゆる先天的耐性を避けることが好ましいことも理解されよう。
【００１２】
特異的タンパク質又はタンパク質変異体の免疫原性を試験する、或いは、免疫原性用のタンパク質変異体セットをランク付けするための種々の方法で、本発明の上記の実施例から得た耐性ＨＬＡ−ｔｇマウスを用いることができることが理解されよう。特異的タンパク質に耐性を有するマウスで、タンパク質内でアミノ酸が変化した変異体と、脱アミド又はグリコシル化、調整の差異、物理的差異（例えば、凝集の差）、又は免疫原性を引き起こすあらゆるその他の差異等のアミノ酸修飾における差異を有する変異体を含むタンパク質の変異体に対して、免疫原性を試験することができる。特に、耐性マウスに対する高濃度の対象のタンパク質の投与によって、非常に長期に注入した結果を決定することができる。また、投与の経路に関連する免疫原性を調査することができ、耐性マウスと、結果としての評価された免疫原性中の異なる位置にタンパク質を投与することができる。耐性マウスの免疫原性の分析は、抗体（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＰＡ、ＦＡＣＳ及び表面プラズモン共鳴等）についての試験タンパク質又はタンパク質変異体の注入後の、マウスからの血液サンプル試験、又はその他の組織サンプル（パイエル板、脾臓等）の試験、Ｔ細胞増殖又は活性化試験、例えば、特異的ペプチドＭＨＣ複合体の結合によるタンパク質反応性Ｔ細胞試験、サイトカイン産生、増殖、細胞表面マーカ発現、Ｃａ２＋フラックス、ＰＣＲ、又はＤＮＡフィンガープリントの測定によるＴ又はＢ細胞試験、特異的免疫反応性Ｂ又はＴ細胞出現試験を含む種々の方法によって、又は免疫原性を試験するあらゆるその他の手段によって行われることが理解されよう。非修飾機能免疫グロブリン遺伝子を有する耐性マウスの免疫原性の分析は、単一の試験タンパク質の注入、及び、例えば、注入した試験タンパク質に結合する抗体の形成を測定することによる抗体の産生を介した免疫原性の測定によって、又は代替的に、例えば、試験タンパク質とタンパク質変異体の混合物内で特異的タンパク質又はタンパク質変異体に結合するために注入した混合物に反応して形成した抗体を試験する（例えば、個別の試験タンパク質又はタンパク質変異体のアレイ上にイムノブロットするステップによって；又は注入したマウスから抗体又は抗体配列を単離して、個別の試験タンパク質又はタンパク質変異体に結合するこれらの抗体の結合の特異性を決定することによって；）ことによる試験タンパク質とタンパク質の混合物を注入することによって、行われることが理解されよう。
【００１３】
本発明は、様々なヒト（又はヒト化）モノクローナル抗体又はこれらのフラグメントの免疫原性試験に特に適している。これによって、ＨＬＡ−ｔｇマウスは、ヒトモノクローナル抗体配列に耐性を有し、このようなマウスは、可変領域に体細胞変異（又は、その他の非生殖細胞系突然変異、転座、又は再配列）を有するヒト抗体に関連した可変領域変異に反応することができる。これらの場合、欠失又は非発現内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を有するマウスが好ましい。このように、本発明は、免疫原性が全くないか、又は低レベルの免疫原性を有するこれらの抗体を同定するための、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体のパネル又はライブラリの比較免疫原性試験に特に適している。特に、同じマウスに注入した様々なヒト（又はヒト化）モノクローナル抗体又はこれらのフラグメントの混合物を試験し、例えば、イムノブロットによって、この混合物中の個別の抗体の免疫原性を決定するための本発明の機能は、抗体の大きなライブラリの迅速分析に特に適している。バクテリオファージ、細胞、又はその他の粒子等の粒子に表示される抗体用に、本発明は、マウスが注入した粒子に耐性を有する場合、表示粒子上に抗体ライブラリの直接注入を含むことが好ましい（必須ではない）。
【００１４】
本発明の延長として、特異的ＨＬＡバックグラウンド、例えば、ヒトＨＬＡに対して発生した耐性を有するタンパク質変異体の発生に、対象のタンパク質又はタンパク質変異体に対して付加的な遺伝子組み換えをしたＨＬＡ−ｔｇマウスを用いることができる。例えば、生殖細胞ヒトＩｇＧが、連続的なＶ領域体細胞変異、転座、又は再配列、或いは、Ｃ領域クラススイッチを可能にするような方法で発現するとき、ヒトＨＬＡのバックグラウンド上の抗原の注入に続いて、ヒトモノクローナル抗体を産生することができる。次いで、親和性変異が生じ、あらゆる抗原に対して特異的であるヒトＩｇＧに対して、これらのマウスで発現したヒトＨＬＡのコンテキストで、マウスが耐性を有する。これは、このようなヒトＨＬＡ−ｔｇマウス内で発生したヒト抗体が、ヒトに非免疫原性である可能性を減らすことができる。
【００１５】
対象のタンパク質又はタンパク質変異体に耐性があるか、遺伝子組み換えを行ったＨＬＡ−ｔｇマウスは、発生に関する用途を選別し、ヒト用薬剤を試験する種々の免疫原性に用いることができる。例えば、タンパク質変異体の免疫原性を測定するステップに加えて、このようなＨＬＡ−ｔｇマウスを用いて、対象のタンパク質又はタンパク質変異体内で免疫原性領域又は免疫原性配列をマッピングすることができる。特に、血清又は組織の単離からのＴ細胞増殖の測定による等して、ＨＬＡ−ｔｇマウス内への直接注入と、続く免疫原性の測定によって、対象のタンパク質又はタンパク質変異体のペプチド全域部分又は全配列を試験することができる。この方法で、このようなＨＬＡ−ｔｇマウスは、タンパク質又はタンパク質変異体の配列中のＴ細胞エピトープのマッピングに特に有用である。ヒト用の潜在的な医薬としてタンパク質又はタンパク質変異体を使用する前に、タンパク質又はタンパク質変異体内で、このようなＴ細胞エピトープ配列を変性させて、エピトープを除去することができる。
【００１６】
対象のタンパク質又はタンパク質変異体に耐性を有する、又は遺伝子組み換えを行ったＨＬＡ−ｔｇマウスは、感染性疾患薬、種々のその他の細胞、その他の医薬、化学的／環境的要因等のＨＬＡ−ｔｇマウス内に同時注入されるか存在する種々の要因の存在下で、及び、免疫不全、又は種々の発作、負傷、又は疾患に罹っているＨＬＡ−ｔｇマウスにおける製造バッチを含む種々の調整バッチから、種々の調整における投与時、種々の時点で、及び繰り返して投与した後に、対象のタンパク質又はタンパク質変異体の免疫原性を試験する種々の方法で用いることができる。
【００１７】
本発明の更なる延長として、対象のタンパク質に耐性を有するＨＬＡ−ｔｇマウスを用いて、変異型タンパク質のライブラリからライブラリの他の員と比較して、低免疫原性を有するこれらのタンパク質を直接選択する。このような選択において、特異的タンパク質又はタンパク質変異体に対するＨＬＡ−ｔｇマウスの免疫原性反応は、低免疫原性を有するその他のタンパク質を強化される、又は同定されるようにタンパク質又はタンパク質変異体に対する選択を直接導く。例えば、免疫原性タンパク質又はタンパク質変異体によって誘発される抗体は、この変異体に対する選択の基礎として、免疫原性タンパク質又はタンパク質変異体に直接結合する。いくつかの方法を用いて、このような選択を達成することができる。例えば、変異型タンパク質のライブラリが注入されるＨＬＡ−ｔｇマウス由来の血清免疫グロブリンを用いて、タンパク質分子レベル（例えば、質量分析ベースのシークエンシング又はフィンガープリンティングによって）で、或いは、変異体、例えばペプチド配列タグ、又はライブラリ中の特異的タンパク質変異体を同定するために用いられる核酸シークエンス、又はその他の分子コードに関連した粒子によって、同定することができる低免疫原性又は非免疫原性を残すライブラリ由来の免疫原性タンパク質変異体を前吸収（例えば、免疫沈降、又は免疫クロマトグラフィによって）することができる。その他のインビトロ方法を用いて、このような変異体を、マウス抗体が存在せず、タンパク質変異体上の特異的捕獲サイトを妨げない固相のみで捕獲される方法等の低免疫原性を有する変異体を同定することができる。例えば、ヒトＩｇＧｓのライブラリの場合では、固相抗原調合を用いて、マウス免疫グロブリンがヒトＩｇＧ上の抗原結合サイトに結合していない抗体を捕獲することができた。
【００１８】
低免疫原性を有するライブラリ由来のタンパク質変異体を選択選択するインビトロ方法の代替として、低免疫原性又は非免疫原性変異体をインビボで選択するインビボ選択方法を用いることができる。インビボ選択は、この循環又はマウス内の注入した区画から特異的変異体に結合するか、或いは、このような変異体、又は、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒素）又はＣＤＣ（補体依存性細胞毒素）による表面ＩｇＧ又は生バクテリオファージによって、生骨髄腫細胞、又は抗体依存性飲作用によって特異的変異体に結合した不活性粒子に結合したこのような変異体又は粒子を発現する生細胞を直接殺す、又は取り込むことによって、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウスで生じる抗体によって行われる。基本的方法では、ＨＬＡ−ｔｇマウスにタンパク質変異体のライブラリを注入し（例えば、静脈内に）、選択した時点で、タンパク質変異体が、宿主免疫グロブリンによって、依然として不透明に残っているとの分析が為される。例えば、この分析はインビボ選択の後に選択された時点で、タンパク質変異体のライブラリの員を精製し、ライブラリで強化された変異体を同定することによって実施することができる。代替的に、タンパク質変異体が核酸に関連している場合（例えば、骨髄腫又はバクテリオファージ等の生細胞内で）、選択によって強化されたフィンガープリントのバンドを同定するための選択前、及び後に、強化タンパク質変異体又はＤＮＡフィンガープリントに関連する遺伝子の直接的な増幅及びＤＮＡシークエンシングによって、この分析をすることができる。このようなバンドは、続いて強化タンパク質変異体を同定するのに提供される。タンパク質変異体が生細胞又は粒子上で選択され、このような細胞又は粒子自身が免疫原性を誘発する場合は、ＨＬＡ−ｔｇマウスは、例えば、注入、又は遺伝子組み換えバックグラウンドへの更なる追加、或いは、タンパク質変異体の選択プロセスにおけるこのような細胞及び粒子の干渉を避けるために用いられるその他の手段によって、このような細胞又は粒子に対して耐性を有することができる。
【００１９】
本発明の例は、生細胞によって産生した抗体変異体のインビボ選択であり、これによって、抗体Ｖ領域を表示するヒトＩｇＧｓ又はバクテリオファージ細胞を発現するマウス骨髄腫（例えば、ハイブリドーマ）細胞ライブラリ等の生細胞の集団が、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウス内に注入される。これらのマウスは、注入した骨髄腫細胞又はバクテリオファージによって産生したあらゆる免疫原性ヒトＩｇＧｓに対する抗体を産生し、これらの抗体は、表面ＩｇＧに結合し、従って、細胞の増殖／ファージの感染力を阻害する、又はこれらの細胞又はファージを（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又はエンドサイトーシスによって）破壊する。このようにして、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウスは、免疫原性抗体を産生する骨髄腫細胞又はバクテリオファージに対して選択し、低免疫原性又は免疫原性が全くない抗体を産生する細胞／ファージが、注入した集団から富化される。次いで、例えば、富化骨髄腫細胞を回収及び培養することによって、抗体産生細胞を区別するための抗Ｉｇ染色を用いた細胞選別の使用によって、又はバクテリアの循環感染によって選択したファージを増幅することによって、このような低免疫原性又は免疫原性が全くない所望の抗体を産生する細胞／ファージを再生することができる。代替的に、Ｂ細胞等の非不死化ほ乳類細胞については、ＥＢＶ形質転換又は細胞融合又はクローニング前の不死化する他の手段等の標準的な不死化及びクローニング手順を用いるか、ＰＣＲ等の核酸増幅方法を用いて、選択した抗体からＶ領域遺伝子を単離することができる。加えて、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウスの選択前及び後の、Ｂ細胞集団の比較分析を、例えば、比較ＰＣＲ、比較ＤＮＡフィンガープリント又はＬＣ−ＭＳ等の比較質量分析法によって、強化Ｂ細胞系統、又は特異的抗体の強化の同定に用いることができる。
【００２０】
タンパク質及びタンパク質変異体の免疫原性を試験する本発明の方法の多くの変形例があるが、これらは、バックグラウンドとして特異的タンパク質又はタンパク質変異体に耐性を有するＨＬＡ−ｔｇマウスを用いて、タンパク質の免疫原性を測定する、又は、低免疫原性或いは免疫原性がないタンパク質を選択する、或いは、免疫原性に基づく様々なタンパク質を比較して順位付けする本発明の範囲内であると考えられるべきであることは、当業者によって理解されるであろう。特異的タンパク質に耐性を有するＨＬＡ−ｔｇマウスは、特に、新規な、ヒトＨＬＡトランス遺伝子に加えて、一又はそれ以上のヒトタンパク質トランス遺伝子を有するトランスジェニックマウスであることが理解されよう。特に、好ましくは、可能な限り多くのヒト重鎖及び軽鎖可変領域免疫グロブリン座をコードする追加ヒトＩｇＧトランス遺伝子を有するヒトＨＬＡ−ｔｇマウスが新規であり、治療上のモノクローナル抗体の免疫原性試験、又は変異体の選択から治療上の抗体のインビボ選択に特に有用である。また、本発明は、医薬として、又はヒト用インビボ診断薬として使用するタンパク質の発生に特に適用され、これによって、ヒトＨＬＡ−ｔｇマウスを用いて、低免疫原性又は免疫原性がないタンパク質を、ヒトに存在するのと同じＨＬＡバックグラウンドを用いて、（もしあるならば）ヒトに期待される同様のレベルの耐性を用いて選択することが理解されよう。当然のことながら、本発明では、マウス以外の生体を用いることができる場合は、遺伝子組み換えによって、或いは、ヒト抗原提示細胞の注入等の手段によって、ヒトＨＬＡ分子を提供することができる。また、当然のことながら、ヒトの医薬以外の目的（例えば、動物医薬）で、ヒト以外のＨＬＡバックグラウンドも、使用される種のタンパク質に生じる耐性と共に用いることができる。当然のことながら、耐性ＨＬＡ−ｔｇ動物も本発明の範囲内で用いることができ、いくつかの方法を用いて、ワクチン接種用の高免疫原性を有するタンパク質又はタンパク質変異体を選択する。
【００２１】
また、広範囲に渡るインビトロ又はインビボ試験又は単離方法によって低免疫原性に対するタンパク質又はタンパク質変異体を選択する本発明の方法には多くの変形例があるが、これらは、このような選択についてのバックグラウンドとして、特異的タンパク質又はタンパク質変異体に耐性を有するＨＬＡ−ｔｇマウスを用いる本発明の範囲内であると考えるべきであることが、当業者によって理解されよう。また、耐性ＨＬＡ−ｔｇマウスによるタンパク質又はタンパク質変異体の分析又は選択は、通常、異なるアロタイプＨＬＡ遺伝子型を有するトランスジェニックマウスパネルを介して、バックグラウンドＨＬＡアロタイプの範囲での平行分析又は選択が必要である。ヒト用のタンパク質又はタンパク質変異体の選択について、少なくとも５０％のヒト集団で表されるＭＨＣアロタイプの範囲は、一度タンパク質を分析又は選択に用いられるマウスに存在しない他のアロタイプを有するヒトに注入すると、免疫原性を導くことができるあまりにも少ないアロタイプ上のタンパク質を選択することを避けるために望ましい。
【００２２】
また、本発明をトランスジェニックマウスの使用に限定すべきではないだけでなく、ヒトＭＨＣクラスＩＩに遺伝子組み換えを提供し、タンパク質変異体の免疫原性を測定する、或いは、低免疫原性を有するタンパク質変異体を選択するのに同様に用いることができるその他の動物が含まれることは、当業者によって理解されよう。また、本発明は、タンパク質に限定されるべきではなく、非タンパク質変異体の免疫原性の測定に、或いは有機化学物質、無機化学物質、アレルゲン、化粧品、環境汚染物質、病原体及び食料品等の低免疫原性を有する非タンパク質変異体の選択に適用できることが理解されよう。また、本発明を、例えばヒトワクチン用に有効なＴ細胞エピトープの決定、有効なサブユニット又はＤＮＡワクチンのスクリーニング、ヒトにおける予測できる効果のための様々なワクチン処方及び投与経路の試験、感染病、癌、及び炎症等の治療薬に対する予防又は免疫反応の誘発用の潜在的ワクチンの試験において、ヒト用ワクチンの開発及び試験に用いて、これによって、潜在的なワクチンを試験する前に、このような疾患をマウス（又はその他の動物）に導入又は誘発することが理解されよう。また、ヒトＭＨＣクラスＩＩに加えて、本発明のＨＬＡ−ｔｇ動物は、ヒト免疫に関する様々な分子現象の範囲を模倣することに対して、ヒト免疫系の追加の成分を導入する各場合に、Ｔ細胞レセプタ、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ４、ＣＤ８及びその他のサイトカイン又はレセプタといった免疫系のその他のヒト分子の個々の成分又はこれらの組み合わせに対して遺伝子が導入されることが理解されよう。同様に、試験タンパク質又は非タンパク質に対するヒト免疫反応を促進するために、ヒト免疫系の一又はそれ以上の細胞を、本発明の動物に移植することができる。
【００２３】
次の例は、本発明を例示するために提供されており、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではない。
【００２４】
例１．免疫原性／非免疫原性試験抗体の発生
【００２５】
調査用に選択された免疫原性試験抗体は、マウスｃＡ２抗体から取り出された変形可能な領域を有するＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６２７７９６９号）として知られているキメラ抗ＴＮＦα抗体であった（以下、「Ｒｅｍｉｃａｄｅ」という）。用いられた更なる試験抗体は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ  ８９（１９９２）ｐ４２８５，米国特許第５８２１３３７号）として知られているヒト化抗ＨＥＲ２抗体であった（以下、「Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ」という）。用いられた非免疫原性対照抗体は、ヒト生殖細胞Ｖｈ３−５３及びＶκＯ１２配列を組み込んだＨｅｒｃｅｐｔｉｎの誘導体（以下、「ＧＬＨ」＝生殖細胞Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））であった。
【００２６】
公知の方法と、これらの方法で用いられている酵素及び抗体用の供給者指示を用いて、組み換えＤＮＡ及び抗体技術を実施した。一般的な方法の源は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌｓ１−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓと；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓと；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒと；を含んでいた。各鎖について、完全なヒトＶＨ及びＶＬ配列をコードする３０〜６０アミノ酸長の、８つの合成オリゴヌクレオチドを用いて、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）及びＧＬＨ抗体Ｖ領域に相当する配列を作った。分離ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチドを、まず、リン酸化し、等しいモル分率で混合し、熱循環装置で５分間９４℃に加熱し、次いで、６５℃に冷却し、６５℃で２分間インキュベートした。次いで、４５℃で２分間、３５℃で２分間、２５℃で２分間、及び４℃で３０分間でインキュベートを継続した。次いで、１４℃で１８時間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（英国ペーズリー所在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、オリゴヌクレオチドを結紮した。
【００２７】
ＶＨ及びＶＬオリゴヌクレオチド混合物と、Ｋｏｚａｋ配列、リーダーシグナルペプチド配列及びリーダーイントロンを含む５’フランキング配列をコードする追加のオリゴヌクレオチドと、スプライスサイト及びイントロン配列を含む３’フランキング配列のそれぞれに対して上記の追加を行い、アニールした。産生したＶＨ及びＶＬ発現カセットを、ＢａｍＨＩフラグメントに対して、プラスミドベクタｐＵＣ１９内にＨｉｎｄＩＩＩとしてクローニングし、完全ＤＮＡ配列を確認した。これらを、ヒトＩｇＧ１又はヒトκ定常領域それぞれと、ほ乳類細胞の選択用マーカを含む発現ベクタｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１９８９）３８３３−３８３７）に転写した。
【００２８】
抗体発現用主宿セルラインは、英国ポートン所在のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ社（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ８５１１０５０３）から得たＮＳ０、すなわち、マウス骨髄腫を産生する非免疫グロブリンであった。重鎖及び軽鎖発現ベクタを、エレクトロポレーションによってＮＳ０細胞内に同時形質移入を行った。ｇｐｔ遺伝子を発現するコロニーを、１０％ウシ胎仔血清、０．８μｇ／ｍｌミコフェノール酸、及び２５０μｇ／ｍｌキサンチンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で選択した。形質移入された細胞クローンを、ヒトＩｇＧ用ＥＬＩＳＡによって、ヒト抗体の産生物をスクリーニングした。Ｐｒｏｓｅｐ（登録商標）−Ａ（英国ワトフォード所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて抗体を精製し、ヒトＩｇＧκ（英国セントアルバンス所在のＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）用ＥＬＩＳＡによって、濃度を決定した。精製したＲｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びＧＬＨ抗体を、２つのアッセイにおける結合について試験した。１つは標準ＥＬＩＳＡにおいて固定化ヒトＴＮＦαを用いて（ＷＯ０３／０４２２４７Ａ２に記載されている）、もう１つは、４Ｄ５（Ｈｕｄｚｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（Ｍａｒｃｈ  １９８９）ｐ１１６５−１１７２）によって記載されているような、ＨＥＲ２＋ヒト乳房腫瘍セルラインＳＫ−ＢＲ−３の増殖の阻害を用いた。Ｒｅｍｉｃａｄｅ抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ中でヒトＴＮＦαに期待される結合を示したが、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の阻害はなかった。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ヒトＴＮＦαに結合しなかったが、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖の阻害を示した。ＧＬＨ抗体は、ヒトＴＮＦαに対する結合も、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の阻害も示さなかった。
【００２９】
例２．マウス免疫グロブリン発現欠失ヒトＨＬＡトランスジェニックマウス
【００３０】
マウスＭＨＣクラスＩＩ欠失ヒトＨＬＡ−ＤＲ１トランスジェニックマウス（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１（１９９５）８６７−８７５）を英国ロンドン所在のＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ社から入手した。これらを、英国ケンブリッジ所在のＢａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から入手した免疫グロブリン重鎖（ＣΔ−／−）を欠失しているマウスと交配し（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，欧州特許第０４３８４７４Ｂ１号）、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１＋／＋、マウスＭＨＣクラスＩＩ−／−、及びマウスＩｇＣΔ−／−の所望の遺伝型を有するマウスを得た（以下、「ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−」マウス）。次いで、これらのｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−マウスを免疫グロブリン軽鎖（λ／κ−／−，Ｂａｂｒａｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）を欠失しているマウスと更に交配させ、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１＋／＋、マウスＭＨＣクラスＩＩ−／−、マウスＩｇＣΔ−／−、及びマウスλ／κ−／−の所望の遺伝型を有するマウスを得た（以下、「ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−λκ−」マウスという）。
【００３１】
例３．新生仔耐性の誘発
【００３２】
Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＧＬＨ抗体を透析して、ＰＢＳの５００μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で１５分間、２０，０００ｇで遠心分離した。耐性用量の５０μｌの個別の抗体を、生後３０時間以内に（＝０日）、新生仔ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−マウスの腹腔内に注入した。対照のマウスに、５０μｌＰＢＳを注入した。次いで、１０日、１６日、及び２４日に、５μｇ用量のＲｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びＧＬＨ抗体を、５μｇＫＬＨ対照と共に、トータルで２００ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョン（ＲＡＳ−Ｒｉｂｉ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｄｅ  Ｒ−７００，米国モンタナ州ハミルトン所在のＣｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ社）を皮下に注入した。３２日に、Ｔ細胞増殖アッセイのために、マウスを犠牲にした。赤血球除去Ｆｉｃｏｌｌ精製脾細胞を調製して、Ｌｏｉｒａｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（２０００）４７４８−４７５５に記載されているように抗体又はＫＬＨ−パルスガンマ線放射ＬＰＳ−ブラスト（ＫＬＨ−ｐｕｌｓｅｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ＬＰＳ−ｂｌａｓｔｓ）で、Ｔ２５フラスコ内の５×１０６細胞で培養した。培養７日後に、抗体又はＫＬＨ−パルス放射ＬＰＳ−ブラストで、平底の９６ウエルマイクロプレート内で、１ウエル当たり５×１０５で細胞を培養し、更に７２時間、ＲＰＭＩ＋３％ＦＣＳで完全にインキュベートした。１ウエル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンで、最終１６時間細胞をパルスし、ＴＯＭＴＥＣコレクタ（英国ウォリントン所在のＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてフィルタメイト上にハーベストした。マイクロビートカウンタ（ｍｉｃｒｏ−ｂｅａｔ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で放射能を測定した。放射能は、抗体又はＫＬＨ処置物対ＰＢＳ対照物についての刺激インデックスのｃｐｍとして表される。
【００３３】
これらの結果は、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、及びＧＬＨ抗体に耐性を有する動物について有意なＳＩ＞２を示さず、アジュバントの同じ個々の抗体で免疫性を試験した。しかし、精製ポリクローナルヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）に耐性を有する動物の１０匹のマウス中５匹のマウスで、Ｔ細胞応答（ＳＩ＞２）が観察され、次いで、Ｒｅｍｉｃａｄｅ抗体で免疫性を試験した。対照的に、ＧＬＨで免疫性を試験した後は、１０匹のｈｕＩｇＧ耐性マウス中１匹だけに反応（ＳＩ＞２）が検出されたが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎに耐性を有する動物については、ＧＬＨで免疫性を試験した後に、反応（ＳＩ＞２）が検出されなかった。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、ｈｕＩｇＧ又はＧＬＨそれぞれに耐性を有する１０匹のマウス中３又は１匹に反応が誘発された。全てのマウスは、アジュバントのＫＬＨに対して強く反応し、９０％のマウスに強いＫＬＨ特異的反応をもたらした。これらの結果は、同じ抗体を用いた免疫性の試験が失敗してＴ細胞増殖反応を誘発するような個々のＲｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、及びＧＬＨ抗体に対して、ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−マウスに新生仔耐性が良好に誘発されることを示した。
【００３４】
これらの結果は、ｈｕＩｇＧに対して耐性を有するマウスの免疫原性Ｒｅｍｉｃａｄｅ抗体に対する重要なＴ細胞反応の誘発を示している。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（５０％反応率）よりも低い免疫原性（３０％反応率）であるように思われるが、ＧＬＨは、ｈｕＩｇＧ又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性マウスに反応を誘発しなかった。この例は、ヒトＨＬＡ−ＤＲに耐性を有し、ヒト免疫グロブリンに対するヒトの耐性と同等である特異的免疫グロブリンに対して耐性を有するマウスの使用における本発明の主要部分を示す。次いで、このようなトランスジェニックマウスを用いて、ヒトのこのような抗体を試験するための代替物として、特異的免疫グロブリンマウスに耐性を有するトランスジェニックヒトＨＬＡ−ＤＲマウスの免疫原性の誘発について種々のモノクローナル抗体を試験することができる。この例は、ヒトの重要な免疫原性であるＲｅｍｉｃａｄｅ抗体が、このようなトランスジェニック耐性ヒトＨＬＡ−ＤＲマウスの重要な免疫原性を誘発することを示している。以後の追加の実験では、ヒトグロブリンの調製を用いて、例３に示すように、ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−マウスを耐性化し、これらのマウスをＲｅｍｉｃａｄｅ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、及びＧＬＨ抗体を用いて免疫性の試験をした。結果は、個別の抗体に耐性を有するので、Ｒｅｍｉｃａｄｅ注入は、３０％のマウスでＳｉ＞２をもたらすことを示したが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びＧＬＨは、あらゆる動物でＳＩ＞２を示さなかった。
【００３５】
例４．ヒトＩｇトランスジェニックマウスの産生
【００３６】
ヒトＩｇＭ／κ（ｆｏｕｒ−ｆｅａｔｕｒｅ  ｍｉｃｅ，Ｎｉｃｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３（１９９９）６８９８−６９０６）に耐性を有するマウスを、ｈｕＤＲ＋／ＩｇＣΔ−／−λκ−マウス（例２）と交配し、ヒトＩｇＭ／κ、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１＋／＋、マウスＭＨＣクラスＩＩ−／−、マウスＩｇＣΔ−／−、及びマウスλ／κ−／−の所望の遺伝型を有するマウスを選択した（以下、「ｈｕＩｇＣΔ−／−／κ」マウスという）。
【００３７】
例５．ヒトＩｇトランスジェニックマウスの免疫原性の試験
【００３８】
ｈｕＩｇＭ／κマウスで試験する免疫原性についての対照抗体を、ＶＨについてはＤ１．７／Ｊ４、及びＶκについてはＪκ４と共に生殖細胞ヒトＶＨ１−２及びＶκ４．１遺伝子を用いて発生させた（以下、「ＶＨ１−２／Ｖκ４．１」抗体という）。例１にあるようにして、組み換え型ヒトＩｇＧ１／κ抗体を発生し、例１由来のこの抗体及びＲｅｍｉｃａｄｅ抗体を、双方ともペプシン消化に曝して、注入用二重体Ｆａｂ２フラグメントを発生した。消化に曝す前に、抗体を０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０で透析し、次いで、２ｍｇ／ｍｌに調節した。２０μｇ／ｍｌペプシン（英国ドーセット州プール所在のＳｉｇｍａ社）を等量の０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０に加えて、６時間、３７℃でインキュベートした。２Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基（Ｓｉｇｍａ社）を加えてｐＨ７に調節し、ゲル電気泳動によって消化を調べた。抗体消化物をＰＢＳで夜通し透析し、次いで、２つの連結Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に適用してＦａｂ２フラグメントを単離した。
【００３９】
ＨｕＩｇＭ／κマウスを、ＣＦＡ中の５０μｇＶＨ１−２／Ｖκ４．１かＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメントで免疫化し、それぞれを４、８、及び１２週間、ＩＦＡ中の５０μｇのＦａｂ２フラグメントでブーストした。ヒトＩｇＭ／κ抗体の産生を、ＰＶＣマイクロタイタープレートを、５μｇ／ｍｌＶＨ１−２／Ｖκ４．１、Ｒｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメント、又はＰＢＳの全ＧＬＨ抗体（例１）の対照で、３７℃で一晩被覆することによって試験した。ＰＢＳで希釈した血清サンプル、５％鶏血清、及び０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を、室温で１時間、ウエルでインキュベートした。洗浄後、抗ヒトＩｇＭ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を同じ緩衝液中に１時間添加し、次いで、３０分間ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ社）を加えて、ＯＤ４１５ｎｍの測定をした。この実験は、Ｒｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２で免疫化された動物のＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメントに特異的なＩｇＭ抗体の強力価を誘発したが、ＶＨ１−２／Ｖκ４．１Ｆａｂ２で免疫化したマウスのＶＨ１−２／Ｖκ４．１に対する抗体を誘発せず、従って、ヒト免疫グロブリン／ヒトＨＬＡ−ＤＲバックグラウンドを有するマウスのＲｅｍｉｃａｄｅの免疫原性を示した。この例は、これらのマウスは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の範囲にヒトの耐性に匹敵するヒト免疫グロブリン可変領域配列の範囲に耐性を有するようなヒトＨＬＡ−ＤＲ及びヒト免疫グロブリン遺伝子に耐性を有するマウスの使用で、本発明の主要な部分を示している。このようなトランスジェニックマウスを用いて、ヒトのこのような抗体を試験する代替として、免疫原性の誘発用の種々のモノクローナル抗体を試験することができる。この例は、Ｒｅｍｉｃａｄｅ抗体が、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）に対する免疫原性を、有意な割合の免疫正常患者に誘発するヒトの発見に匹敵するこのようなトランスジェニックヒトＨＬＡ−ＤＲ／Ｉｇ＋マウスの有意な免疫原性を誘発することを示している。
【００４０】
例６．ヒトＩｇトランスジェニックマウスの抗体の選択
【００４１】
ＶＨ１−２／Ｖκ４．１と、ＰＢＳ（例５由来の）中のＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメントのサンプル１００ｍｇを、ｈｕＩｇＭ／κマウスの静脈に混注又は個別に注入した。注入開始後、１０日及び２０日後に繰り返し投与を実施した。最終投与後２時間で、ＶＨ１−２／Ｖκ４．１又はＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメントの存在又は不存在についてマウス血清を分析した。ハーベストした血清を２０，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、次いで、ＰＢＳで夜通し透析した。次いで、例５に記載されているように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５を用いて、Ｆａｂ２フラグメントを精製し、抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、例１と同様にして、ヒトＴＮＦα結合用希釈シリーズとして試験した。結果は、ＶＨ１−２／Ｖκ４．１とＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２フラグメントとを混注したマウスについて、試験した全マウス中、ＶＨ１−２／Ｖκ４．１で構成されている再生Ｆａｂ２が９５％より大きかった。これらの結果は、低免疫原性ＶＨ１−２／Ｖκ４．１と比較して、より多くの免疫原性Ｒｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２が、血液系から除去されていることを示している。この効果は、ＶＨ１−２／Ｖκ４．１よりも速いクリアランスを促進するＲｅｍｉｃａｄｅ  Ｆａｂ２を有する免疫複合体の形成によるものである可能性がある。この例は、有意な免疫原性を誘発するその他の抗体との混合物から低免疫原性を有する抗体を選択する耐性ＨＬＡ−ｔｇの能力を示している。
【国際調査報告】
2008520229.tif 000002