(57)【要約】  還元剤を有する低伝導率緩衝液を、該デバイスに供することによる、電極デバイス上の核酸の輸送およびハイブリダイゼーションの方法。また、該低伝導率緩衝液は、双性イオンを含有してもよい。電流および電圧は、該デバイスの位置に適用されて、該位置に向かって該核酸の電気泳動輸送を実施する。次いで、該核酸は、該位置にある核酸プローブにハイブリダイズされる。また、該低伝導率緩衝液中の該還元剤は、カオトロピック剤として作用し得る。
2008514928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤を含む低伝導率の双性イオン緩衝液を、アクティブな電子システムに供し；
電流および電圧を電極に適用して、電極に向かう核酸の電気泳動輸送を実行する工程を含む、電極部位へ核酸を輸送する方法。
【請求項２】
さらに、該核酸を、該電極に位置するプローブとハイブリダイズさせ、それにより、該電極の上方の局所pHが、その等電点にて、該緩衝液の該pHを下回ることとなる工程を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項１記載の方法。
【請求項４】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項１記載の方法。
【請求項５】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項１記載の方法。
【請求項６】
該還元剤の濃度が約25-500 mMである請求項１記載の方法。
【請求項７】
該還元剤の濃度が約25 mMである請求項１記載の方法。
【請求項８】
該還元剤の濃度が約125 mMである請求項１記載の方法。
【請求項９】
該還元剤の濃度が約150 mMである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該還元剤の濃度が約250 mMである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該還元剤の濃度が約500 mMである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がヒスチジンである請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該低伝導率の双性イオン緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がL-ヒスチジンを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がD-ヒスチジンを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１６】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がシステインを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がアラニンを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がリジンを含有する請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がグルタミン酸を含有する請求項１記載の方法。
【請求項２０】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がγ-アミノ酪酸を含有する請求項１記載の方法。
【請求項２１】
還元剤を含有する第１の緩衝液を電極デバイスに供し、
ここに、該デバイスは、ある位置に結合した核酸プローブを有する複数の位置を含み；
該第１の緩衝液において該核酸を該デバイスに供し；
該位置に電流および電位を適用し；
該核酸を該位置に輸送し；
該緩衝液を、低伝導率の双性イオンの第２の緩衝液に変化させ；次いで
該位置にて、該核酸を該核酸プローブにハイブリダイズさせる工程を含む、電極デバイス上にて核酸を効果的に輸送し、およびハイブリダイズさせる方法。
【請求項２２】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
該還元剤の濃度が約25-500 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
該還元剤の濃度が約125 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
該還元剤の濃度が約25 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
該還元剤の濃度が約150 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
該還元剤の濃度が約250 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
該還元剤の濃度が約500 mMである請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がヒスチジンを含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３２】
該低伝導率の双性イオン緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がシステインを含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がアラニンを含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がリジンを含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３６】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がグルタミン酸を含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３７】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がγ-アミノ酪酸を含有する請求項２１記載の方法。
【請求項３８】
還元剤を含有する低伝導率の双性イオン緩衝液を、電子ハイブリダイゼーションデバイスに適用し、ここに該デバイスは核酸プローブを有する位置を含み；
標的核酸を該デバイスに供し；
電流および電位を該デバイスに適用することによって、該標的核酸を該位置に濃縮し；次いで
該標的核酸を該核酸プローブとハイブリダイズさせる工程を含む、電子ハイブリダイゼーションデバイス上にて核酸を輸送し、およびハイブリダイズさせる方法。
【請求項３９】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
該還元剤の濃度が約25-500 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
該還元剤の濃度が約25 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
該還元剤の濃度が約125 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
該還元剤の濃度が約150 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４６】
該還元剤の濃度が約250 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４７】
該還元剤の濃度が約500 mMである請求項３８記載の方法。
【請求項４８】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がヒスチジンを含有する請求項３８記載の方法。
【請求項４９】
該低伝導率の双性イオン緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がシステインを含有する請求項３８記載の方法。
【請求項５１】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がアラニンを含有する請求項３８記載の方法。
【請求項５２】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がリジンを含有する請求項３８記載の方法。
【請求項５３】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がグルタミン酸を含有する請求項３８記載の方法。
【請求項５４】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がγ-アミノ酪酸を含有する請求項３８記載の方法。
【請求項５５】
還元剤および低伝導率、双性イオン分子を含有する緩衝液を該デバイスに適用し；
該位置にて電場を生成するのに十分な量で、該電子デバイス上の該位置に電流を適用し、ここに該位置は、DNA分析物に対して正にバイアスされており；
該DNA分析物を該位置に輸送し；
該DNA分析物を、一本鎖捕獲DNAにハイブリダイズさせ、ここに、該位置にて正に荷電した緩衝液分子は、該DNA分析物および第一本鎖捕獲DNAの間のハイブリダイゼーションを安定させる工程を含む、電子デバイス上で正にバイアスされた位置にて、電場において、DNA分析物の一本鎖捕獲DNAへのハイブリダイゼーションを電子的に強化する方法。
【請求項５６】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がヒスチジンである請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
該低伝導率の双性イオン緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がシステインである請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がアラニンである請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がリジンである請求項５５記載の方法。
【請求項６４】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がグルタミン酸である請求項５５記載の方法。
【請求項６５】
該低伝導率の双性イオン緩衝液分子がγ-アミノ酪酸である請求項５５記載の方法。
【請求項６６】
二本鎖核酸を、還元剤を有する低伝導率の双性イオン緩衝液に添加し、ここに、該緩衝液は該二本鎖核酸を、第１および第２の鎖へと変性させ；
該第１および第２の鎖を含有する緩衝液を電極デバイスに供し；
捕獲配列を有する該電極デバイスの電極を供し、ここに、該捕獲配列は該第１の鎖に相補的であり；
約30℃未満の温度にて、電流および電圧を該電極に適用して、該電極に向けての該第１の鎖の電気泳動輸送を実行し；次いで
該二本鎖核酸の第１の鎖を、該電極にて、該捕獲配列にハイブリダイズさせる工程を含む、電極デバイスにおいて核酸を輸送する方法。
【請求項６７】
該電流および電圧が、約25℃未満の温度にて、該電極に適用される請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
該電流および電圧が、約20℃未満の温度にて、該電極に適用される請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
該還元剤の濃度が約25-500 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７３】
該還元剤の濃度が約25 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７４】
該還元剤の濃度が約125 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７５】
該還元剤の濃度が約150 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７６】
該還元剤の濃度が約250 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７７】
該還元剤の濃度が約500 mMである請求項６６記載の方法。
【請求項７８】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がヒスチジンである請求項６６記載の方法。
【請求項７９】
該低伝導率の双性イオン緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がL-ヒスチジンを含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８１】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がD-ヒスチジンを含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８２】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がシステインを含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８３】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がアラニンを含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８４】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がリジンを含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８５】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がグルタミン酸を含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８６】
該低伝導率の双性イオン緩衝液がγ-アミノ酪酸を含有する請求項６６記載の方法。
【請求項８７】
還元剤を含む低伝導率緩衝液をアクティブ電子システムに供し；
電流および電圧を電極に適用して、該電極に向けての該核酸の電気泳動輸送を実行する工程を含む、核酸を電極部位に輸送する方法。
【請求項８８】
さらに、該核酸を該電極に位置するプローブとハイブリダイズさせ、それにより、該電極の上方の局所pHがその等電点での該緩衝液のpHを下回ることとなる工程を含む請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
該還元剤がα−チオグリセロールである請求項８７記載の方法。
【請求項９０】
該還元剤がジチオスレイトールである請求項８７記載の方法。
【請求項９１】
該還元剤がβ−メルカプトエタノールである請求項８７記載の方法。
【請求項９２】
該還元剤の濃度が約25-500 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９３】
該還元剤の濃度が約25 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９４】
該還元剤の濃度が約125 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９５】
該還元剤の濃度が約150 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９６】
該還元剤の濃度が約250 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９７】
該還元剤の濃度が約500 mMである請求項８７記載の方法。
【請求項９８】
該緩衝液が、さらに、双性イオンを含む請求項８７記載の方法。
【請求項９９】
該双性イオンがヒスチジンである請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
該低伝導率緩衝液が、さらに、さらなる双性イオンを含む請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
該双性イオンがL-ヒスチジンである請求項９９記載の方法。
【請求項１０２】
該双性イオンがD-ヒスチジンである請求項９９記載の方法。
【請求項１０３】
該双性イオンがシステインである請求項９９記載の方法。
【請求項１０４】
該双性イオンがアラニンである請求項９９記載の方法。
【請求項１０５】
該双性イオンがリジンである請求項９９記載の方法。
【請求項１０６】
該双性イオンがグルタミン酸である請求項９９記載の方法。
【請求項１０７】
該双性イオンがγ-アミノ酪酸である請求項９９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、その全てが本明細書中にその全文において引用によって援用される、2004年9月23日に出願された、仮米国出願60/613,148の利益を主張する2005年9月22日に出願された米国出願11/234,054に基づく国際出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、緩衝液および電解質、ならびに医療診断、生物学、および他のマイクロ流体適用に適合された電子デバイスでそれらを用いる方法に関する。より具体的には、本発明は、緩衝液、電解質、およびマイクロ電子診断デバイス上で実施されるDNA輸送および引き続いてのハイブリダイゼーション分析でそれらを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最近、エレクトロニクスおよび分子メカニズムを組み合わせるデバイスにおける関心が増加している。これらのシステムは、核酸ハイブリダイゼーション、抗体/抗原反応、臨床診断、および生体高分子合成のような分子生物学反応において有利に使用される広範囲の機能を実行することが可能である。これらのシステムはいずれかの電極デバイスを含む。該システムは、単一の電極または複数の電極を有し得る。１つのそのようなシステムは、その全文において引用によって本明細書中に明白に組み込まれる、現在、米国特許5,605,662として発行された、1993年11月1日に出願された“ACTIVE PROGRAMMABLE ELECTRONIC DEVICES FOR MOLECULAR BIOLOGICAL ANALYSIS AND DIAGNOSTICS,” Serial No. 08/146,504に開示される。
【０００４】
電極デバイスは、それらの操作のために緩衝液および電解質を利用する。緩衝液は、酸またはアルカリの添加の際に、pHの変化に耐性のある化学溶液と定義されている。例えば、Dictionary of Biotechnology, Second Edition, James Coombs, Stockton Press参照。そこで述べられるように、「無機塩 (リン酸塩、炭酸塩)および有機酸塩 (酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、グリシン、マレイン酸塩、バルビツール酸塩等)に基づく緩衝液が、生物学的実験において使用された」。
【０００５】
輸送、ハイブリダイゼーション、反応、診断、および／または合成を実施する分子電子デバイスにおいて有利に使用される緩衝液および電解質を発見することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
以下の発明は、種々のパラメーター、電解質 (緩衝液)、および荷電生体分子 (例えば、DNA、RNA等)の輸送の速度、ハイブリダイゼーション反応の効率、およびマイクロ電子チップおよびデバイスにおける全体的なハイブリダイゼーション特異性を改善するまたは最適化する他の条件に関する我々の発見に関する。特に、本発明は、還元剤を含有する低伝導率の双性イオン緩衝液が、高速DNA輸送および効率的なハイブリダイゼーション反応の両方に対する最適条件を提供するという発見に関する。
【０００７】
本発明の方法は、電極デバイスにおいて核酸を輸送しハイブリダイズさせることに関する。還元剤を含有する低伝導率の双性イオン緩衝液は、該電極デバイスに供される。次いで、該核酸は、該位置にて、該電極に、電流および電圧を適用することによって、該電極デバイスの位置に、電気泳動的に輸送される。次いで、該核酸は、該電極に位置するプローブにハイブリダイズされ得、それにより、該マイクロ位置の上方の局所pHは、その等電点にて、該緩衝液のpHを下回る。別法として、該核酸は、該位置にて、該電極と関連した浸透層に結合され得る。
【０００８】
本発明のもう１つの具体例において、該方法は、電極デバイス上での核酸の輸送およびハイブリダイゼーションに関し、ここに該デバイスは、核酸プローブを有する位置を有する。還元剤を含有する低伝導率の双性イオン緩衝液は、該電極デバイスに適用される。次いで、標的核酸は該デバイスに適用される。次いで、該標的核酸は、電流および電位を該デバイスに適用することによって、該位置に濃縮される。一旦該位置に来ると、該標的核酸は該核酸プローブとハイブリダイズする。
【０００９】
本発明のもう１つの具体例において、該方法は、電極デバイス上の正にバイアスされた位置の電場における位置にて、一本鎖捕獲DNAへのDNA分析物のハイブリダイゼーションを電子的に強化することに関する。還元剤および低伝導率の双性イオン分子を含有する緩衝液が該デバイスに適用される。次いで、電流が、該位置にて電場を生成するのに十分な量で、該位置に適用され、ここに該位置は、該DNA分析物に対して正にバイアスされる。結果として、該DNA分析物は、該位置に輸送される。一旦該位置にあると、該DNA分析物は、該一本鎖捕獲DNAにハイブリダイズされ、ここに、該位置の正電気を帯びた緩衝液分子は、該ハイブリダイゼーションを安定させる。
【００１０】
本発明のもう１つの具体例において、該方法は、電極デバイスにおいて核酸を輸送することに関する。第１および第２の鎖を有する二本鎖核酸は、還元剤を有する低伝導率の双性イオン緩衝液に添加される。次いで、該二本鎖核酸は、還元剤を含有する該低伝導率の双性イオン緩衝液によって、該第１および第２の一本鎖へと変性させる。次いで、該核酸は、還元剤を含有する該低伝導率の双性イオン緩衝液において該デバイス上に装填される。また、該電極デバイスの電極には、捕獲配列が供され、ここに該捕獲配列は、該二本鎖核酸の該第１の鎖に相補的である。次いで、電流および電圧は、該電極に向けての該第１の鎖の電気泳動輸送を実施するために、約30℃未満の温度で、該電極に適用される。続いて、該核酸の第１の鎖は、該電極と関連した該捕獲配列とハイブリダイズする。代替の具体例において、該電流および電圧は、約28℃未満、別法として約25℃未満、別法として約23℃未満、別法として約20℃未満、別法として約18℃未満、別法として約15℃未満、別法として約10℃未満の温度で、該電極に適用される。
【００１１】
本発明のもう１つの具体例において、本発明の方法は、電極デバイスにおいて核酸を輸送およびハイブリダイズすることに関する。還元剤を含有する低伝導率緩衝液は、該電極デバイスに供される。次いで、該核酸は、該電極デバイスの位置に、電流および電圧を該位置にて該電極に適用することによって、電気泳動的に輸送される。次いで、該核酸は、該電極に位置するプローブにハイブリダイズすることができる。別法として、該核酸は、該位置にて、該電極と関連した浸透層に結合し得る。
【００１２】
上記の全ての種々の方法において、該還元剤は、α−チオグリセロール、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、システイン、またはその組合せであってよい。該還元剤の濃度は、該DNAのハイブリダイゼーションと干渉しないように、該電極での泡立ちを減少するのに十分であるべきである。該還元剤の濃度は、約25-700 mM、別法として約25-500 mM、別法として約25 mM、別法として約50 mM、別法として約100mM、別法として約125 mM、別法として約150 mM、別法として約250 mM、別法として約500 mMであってよい。
【００１３】
上記の全ての種々の方法において、低伝導性の双性イオン緩衝液は、ヒスチジン (D-またはL-ヒスチジンのいずれか)、γ-アミノ酪酸 (GABA)、アラニン、リジン、グルタミン酸、いずれかの他の天然に生じるまたは合成双性イオン、またはそのいずれかの組合せを含有し得る。
【００１４】
発明の詳細な記載
本発明のデバイスおよび関連した方法論によって、分子生物学および診断反応を「完全な電子制御」下で実施することができる。本発明において言及される「電子制御」の意味は、該用語の慣用的な意味を超える。最も慣用的な電子デバイス、器具、および検出器システムは、常に、電子制御下で何らかのレベルにある。本発明の電子デバイスは、慣用的な電子制御下のみだけでなく、より重要なことに、それらは、分子生物学的および診断反応を実施する物理的態様にわたりさらなる直接的電子制御を提供する。本発明は、電極を有する電子デバイスを提供する。該電子デバイスは、単一の電極または複数の電極を有し得る。例えば、該電子デバイスは、1、4、8、6、16、25、36、100、400、1000、または10,000 電極を有し得る。
【００１５】
１つのそのようなデバイスは、該APEXシステムである。該APEXデバイスの詳細は、上記で引用され援用によって組み込まれた米国特許5,605,662として発行された米国出願08/146,504にある。簡潔には、図１は、マイクロリソグラフィー技術を用いて作られた自己アドレス指定マイクロロケーションの基本的設計を示す。該３つのマイクロロケーション (10) (ML-1、ML-2、ML-3)は、絶縁層/基材上に蒸着されている金属部位 (12)の表面上で形成される。該金属部位(12)は、下にあるマイクロ電極構造 (10)として働く。絶縁体材料は、該金属部位(12)を相互から分離する。絶縁体材料は、二酸化ケイ素、ガラス、抵抗、ゴム、プラスチック、またはセラミック材料を含むが、これらに制限されるものではない。
【００１６】
図２は、マイクロリソグラフィーにより生成された金属部位(12)上に形成された個々のマイクロロケーション(10)の基本的な特徴を示す。該アドレス可能なマイクロロケーションは、該電極/金属部位(12)上で形成され、浸透層(22)を組み込む。該電極/金属部位は、白金、ケイ化白金、炭素、および当業者に知られるいずれかの他の適当な材料を含み得る。該浸透層は、該金属表面および該プローブまたは特異的な結合体の間に間隔を提供し、溶媒分子、小対イオン、およびガスを、該電極の表面を自由に通過させる。プローブまたは特異的な結合体は、該浸透層において付着部位に結合し得る。種々の浸透層の詳細は、2001年12月10日に出願された米国出願10/014,895；1999年12月15日に出願され、現在では米国特許6,303,082として発行された09/464,670；および2001年8月3日に出願された09/922/349において見出すことができ、それらの全ては、それらの全文において、本明細書中に引用によって明白に援用される。
【００１７】
基本的なマイクロエレクトロニクス構造の最初の製造後、該デバイスは、特異的な結合体または捕獲プローブによる各特異的なマイクロロケーションのアドレス指定を自己指令することが可能である。従って、本発明のデバイスおよび方法は、いずれかのDNAまたはRNAプローブ、またはいずれかの他のリガンドによるAPEXチップデバイスのアドレス指定を可能にする装置システムに組み合わせることができる。そのようなシステムは、「自分で自分のチップを作る」製品および適用を可能にする。そのような製品および適用は、臨床診断、分子生物学、機能ゲノムおよび薬物発見適用のための多くの研究者および最終ユーザーに有用であろう。該自己アドレス指定デバイスは、そのマイクロロケーションのいずれかにて個々の複数の工程およびコンビナトーリアル反応をアクティブに実行することが可能である。該デバイスは、各反応が真に独立したテスト部位の相当物にて生じるという重要な利点をもって、多重化反応を実施することが可能である。該デバイスは、検体および反応物質の迅速な動きおよび濃度を、そのマイクロロケーションのいずれかへまたはそれから電子的に方向付けおよび制御することが可能である。該デバイスの種々の反応の動的態様を電子的に制御する能力は、多くの新たなメカニズムおよび重要な利点および改善を提供する。
【００１８】
種々のタイプの電解質/緩衝液溶液において、DNAおよび他の荷電した検体の電気泳動輸送に関連した種々の物理的パラメーターが存在する。例えば、上記で言及されたシリアル番号08/146,504に記載のようなAPEXデバイスといった特定のデバイスは、主にDC (直流) 電子デバイスである。荷電された分子の電気泳動輸送は、該デバイス表面上の反対に (+/-) バイアスされたマイクロロケーションの間で生じる。
【００１９】
APEX型デバイスは、電圧が適用されると、「電気泳動法のサイン」として認識される有意な正味の直流(DC)を生成する。電気泳動法において、イオンおよび荷電粒子の移動は、該電場グラジエントの方向に沿った電気力によって生成され、電流および電圧の関係は、この技術に重要である。該電気泳動は、それ自体を、肉眼的に、適用された電圧の影響下での溶液における電流の伝導として示し、オームの法則に従う。
V=RxI
Vは電位である
Rは該電解質の電気抵抗である [VxA-1=R(Ω)]
Iは電流 [A]である。
【００２０】
該溶液の抵抗は、コンダクタンスの逆数であり、これは電気伝導度計によって測定できる。該コンダクタンスは、主に、該緩衝液/電解質のイオン種およびそれらの濃度によって決まり；従って、これらのパラメーターは、電場関連分子生物学技術に非常に重要である。該基本的な電流／電圧関係は、APEX技術に対して、いずれかの他の電気泳動システムに対してと本質的に同じであるが、生成された電場は、真に微視的環境にある。
【００２１】
電流および電圧を調達する種々の方法、およびどのように該電流および電圧シナリオが、我々のシステムの性能を改善すると分かったかに関する該APEXシステムの独特な特徴が存在する。特に、種々のDCパルス手順 (直線的および対数グラジエント)は、改善されたハイブリダイゼーションストリンジェンシーを提供するようである。
【００２２】
複雑性低減デバイスの詳細は、本明細書中にその全文において引用によって援用される、現在米国特許6,129,828として発行された米国出願08/709,358にある。
【００２３】
電気泳動輸送対イオン強度
電気泳動法の分野において、荷電分析物種 (蛋白質、DNA等)の移動度において対数的減少が存在することは既に確立されており、これは該電解質溶液のイオン強度の平方根に反比例する(“Capillary Electrophoresis:  Principles and Practice”, R. Kuhn and S. Hoffstetter, Springer-Verlag, 1993のページ83および図3.16参照)。いずれかの所与の一定の電場強度にて、検体種(蛋白質、DNA等)に相対的に該電解質濃度が減少すると、該検体は、より早い速度で輸送されるであろう。ダンシル化アミノ酸に対してこの効果を示す同様の結果が、J.J. Issaq et. al., Chromatographia Vol. 32, #3/4, August 1991, ページ155ないし161 (特にページ157の図3を参照)によって示されている。異なる電解質溶液中のDNAに対するこの効果を示す結果は、P.D. Ross and R.L. Scruggs, Biopolymers Vol. 2, ページ231ないし236, 1964に示されている (特に図1, ページ232参照)。
【００２４】
イオン強度／コンダクタンス関係
溶液中で完全に解離するアニオンおよびカチオン種(Na+ ⇔ Cl-、K+ ⇔ Cl-等)を含む非緩衝電解質 (塩化ナトリウム、塩化カリウム等)について、該イオン強度およびコンダクタンスは同等であり、つまり該コンダクタンスは、通常、該イオン強度に比例するであろう。解離状態(例:  2 Na+ ⇔ PO4-2)にある緩衝電解質 (リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等)について、該イオン強度およびコンダクタンスは、通常、同等であり、つまり、コンダクタンスは、該イオン強度に比例する。双性イオン種(pIにて正味荷電なし)を有し得る緩衝電解質(適した緩衝液- MOPS、HEPES、TAPS、トリシン、Bicine、アミノ酸緩衝液、両性電解質等)について、該コンダクタンスは、該等電点(pI)および該(pKa)の間の各pH単位差につき、約10倍減少するであろう。例えば、その双性イオン状態(-OOC-CH(R)-NH3+)のアミノ酸は、該「アミノ酸部位」が完全な正味の正電荷 (HOOC-CH(R)-NH2+ X-)、または完全な負電荷 (Y+ - OOC-CH(R)-NH2)を有する時より約1000倍低いコンダクタンス値を有するであろう。従って、見掛けの負または正電荷は、それがそのpIから遠ざかると、該アミノ酸部位上で発生し、該コンダクタンスおよびイオン強度は相関し始めるであろう。しかしながら、該pIまたはその近くにある時、該コンダクタンスは、該所与のイオン強度または濃度に対して予測されるよりずっと低いであろう。pIにてまたはその近くで使用される時、電気泳動テキストは、「高イオン強度または濃度での低コンダクタンス」 (Capillary Electrophoresis:  Principles and Practice”, R. Kuhn and S. Hoffstetter, Springer - Verlag, 1993のページ88参照)を有するとして、Good緩衝液およびアミノ酸緩衝液を指す。一般的に使用される電気泳動緩衝液 「トリスホウ酸塩」は、実際には、そのイオン強度または濃度から予測されるであろう有意により低いコンダクタンスを有する。これは、溶液中で、比較的安定した双性イオン複合体を形成する「トリスカチオン」および「ホウ酸塩アニオン」によるものであり得る。100 mMのトリスホウ酸塩溶液のコンダクタンスを、そのイオン強度から予測されるであろうより約20倍低く、5 mMのリン酸ナトリウムまたは塩化ナトリウム溶液に大体同等である、694 μS/cmと決定した。表1は、多くの輸送緩衝液のコンダクタンス測定を示す。
【００２５】
【表１】
2008514928.tif 000003
【００２６】
双性イオン緩衝液／コンダクタンス／輸送速度
特定の利点は、pIにてまたはその近くで、双性イオン緩衝液 (Good緩衝液、アミノ酸緩衝液)、または該トリスホウ酸塩緩衝液を用いる時、DNAの電気泳動輸送の割合または速度に関して存在する。これらの利点は：1) 双性イオン緩衝液が比較的高濃度で使用されて、緩衝能を増加し得る；2) 双性イオン緩衝液のコンダクタンスが、該同一濃度での他のタイプの緩衝液より有意に低い、および3) 双性イオン緩衝液が、該関心のある検体(例えば、DNA、RNA)に対して、より高い電気泳動輸送速度を有することを含む。
【００２７】
該等電点 (pI)での双性イオン緩衝能
アミノ酸緩衝液は、pIにて、緩衝液特性を有する。所与のアミノ酸が、そのpIにて、その「最高緩衝能」を有し得るまたは有し得ないが、それはある程度の緩衝能を有するであろう。緩衝能は、該pIおよび該pKaの間のそれぞれのpH単位差につき、10倍減少し；３つのイオン性基を有するアミノ酸(ヒスチジン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等)は、一般的には、たった２つのイオン性基を有するアミノ酸 (グリシン、アラニン、ロイシン等)より、それらのpIでより高い緩衝能を有する。例えば、ヒスチジン (pI = 7.47)、リジン (pI=9.74)、およびグルタミン酸 (pI=3.22)、全ては、アラニンまたはグリシンに対して、それらのpIにて相対的に良好な緩衝能を有し、これは、それらのpIにて、相対的に低い緩衝能を有する(A.L. Lehninger, Biochemistry, 2ed, Worth Publishers, New York, 1975; 特に、ページ79の図4-8、およびページ80の図4-9参照)。ヒスチジンは、ゲル電気泳動法における使用のための緩衝液として提案されているが（例えば、米国特許4,936,963参照）、ハイブリダイゼーションはそのようなシステムにおいて実行されない。システインは、緩衝能に関して、より中間位置にある。システインのpIは5.02であり、該α−カルボキシル基に対するpKaは1.71であり、スルフヒドリルに対するpKaは8.33であり、αアミノ基に対するpKaは10.78である。250 mMのシステインの酸／塩基滴定曲線は、システインが、20 mMのリン酸ナトリウムより、〜 pH 5にて、より良い「緩衝能」を有することを示す。該pH 4ないし6範囲において、システインの該緩衝能は、特により高いpHにて、20 mMのリン酸ナトリウムより有意に優れている。しかしながら、これらのpH範囲において、該250 mMのシステイン溶液のコンダクタンスは、〜2.9 mS/cm (100倍大きい)の値を有する20 mMのリン酸ナトリウムと比較して、非常に低い〜23 μS/cmである。APEXデバイスに適当な低コンダクタンス双性イオン緩衝液は、1997年12月5日に出願され、現在米国特許6,051,380として発行された米国出願09/986,065；1999年11月22日に出願され、現在米国特許6,518,022として発行された09/444,539；2002年6月11日に出願された10/170,172；および1996年9月6日に出願され、現在放棄された08/708,262に開示されており、その全ては全文において、本明細書中に、引用によって明白に援用される。
【００２８】
20年以上前に開発されたいくつかの電気泳動技術は、「pIにて」双性イオン緩衝液中の蛋白質を分離する能力に基づく。これらの技術は、等電点電気泳動、等速電気泳動、および焦点電気泳動と呼ばれる(“Gel Electrophoresis of Proteins:  A Practical Approach” Edited by B.D. Hames & D. Rickwood, IRL Press 1981の第三章および第四章参照)。種々のアミノ酸緩衝液およびGood緩衝液を、全てそれらのpIにて、これらの適用に使用した（上記引用文献のページ168、表2参照）。
【００２９】
低イオン強度および低コンダクタンス緩衝液におけるDNA輸送体
一連の蛍光チェッカーボード実験を、2.5% アガロース被覆5580チップおよびByTr-RCA5蛍光プローブを用いて実施した。迅速（6秒）チェッカーボードアドレス指定を、以下のシステムの全てにおいて達成した：(1) 250 mMのHEPES (低コンダクタンス)、(2) 10 μMのコハク酸ナトリウム、(3) 10 μMのクエン酸ナトリウム、および(4)蒸留水。いくつかのタイプの低コンダクタンスまたは低イオン強度溶液は、いくらかより良い特徴を有し得、チェッカーボードアドレス指定および高速DNA輸送(80 μmパッド上の6ないし12秒DNA蓄積)を、これらのシステムの全てを用いて達成した。加えて、それ自体がポリアニオンであるDNAが、該コンダクタンスを提供する該バルク溶液中に存在する電解質であるため、蒸留水中のAPEXチップをアドレス指定するDNAが可能である。
【００３０】
電気泳動輸送およびカチオン／アニオン種の関係
該荷電された分析物種 (DNA、蛋白質等)の移動度が該電解質溶液の該イオン強度に関連しているという事実に加えて、該移動度は、該電解質溶液における該カチオンおよびアニオン種の性質によって大きく影響される(“Capillary Electrophoresis: Principles and Practice”引用文献のpp 89参照)。この特定の点は、上記で引用されたBiopolymers, Vol. 2, pp. 231-236, 1964引用文献において、DNA輸送について示される。この引用文献のページ232上の図１は、該同一イオン強度にて異なる一価アニオン(Li + > Na + > K + > TMA +)を有する電解質を用いる時に、DNA移動度の変化を示す。基本的に、異なるカチオンは、該DNAリン酸基を有する異なる結合定数を有し得、および／または輸送速度に変化を招く該DNA分子周りの水和層を変化し得る。
【００３１】
また、本発明は、電場分子生物学デバイス、特にAPEX超小型電子チップおよびデバイスにおいて、DNA輸送の速度、DNAハイブリダイゼーション反応の効率、および全体的なハイブリダイゼーション特異性を改善または最適化する種々のパラメーター、電解質 (緩衝液)、および他の条件に関する我々の発見に関する。特に、本発明は、還元剤を含有する低コンダクタンス双性イオン緩衝液溶液が、高速電気泳動DNA輸送および効率的なハイブリダイゼーション反応の両方に対して良い条件を提供するという我々の発見に関する。
【００３２】
該双性イオン緩衝液要素は、双性イオン種(そのpIで正味荷電なし)を有し得るいずれかの分子であり得る。１つの具体例において、該双性イオン種はアミノ酸である。該アミノ酸は、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、グルタミン酸、リジン、γ-アミノ酪酸 (GABA)等を含み得るが、これらに限定されるものではない。好ましい具体例において、該アミノ酸はヒスチジンである。ヒスチジンの濃度は、pI (等電点〜7.47)にてまたはその近くで、10-200 mM、別法として10-100 mM、別法として50-100 mM、別法として約50 mM、別法として約100 mMの範囲であり得る。該緩衝液中のヒスチジンの濃度は、塩組成に基づくであろうし、当業者によって決定され得る。
【００３３】
該ヒスチジン緩衝液の利点は、特に、該APEXチップ型デバイスに重要である。（該微小測定型デバイスとは対照的に）これらの特定のデバイス適用され得る電流および電圧の量に関して制限を有する。この制限は、該同一の緩衝システムを用いて、高速輸送および効率的なハイブリダイゼーションの両方を達成することを困難にする。
【００３４】
１つの具体例において、DNA輸送は、低コンダクタンス緩衝液(システインまたはアラニン)において実施され、ここに、該制限された電流/電圧は、それでも高速な輸送を生成した。これらの条件下で、該DNAは該テスト部位で蓄積したが、効率良くはハイブリダイズしなかった。これらの低コンダクタンス緩衝液における輸送の後、該溶液を、高塩濃度緩衝液(> 100 mMの塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウム)に変更し、次いで、それは、該テスト部位にて、効率的なハイブリダイゼーションを生成した。
【００３５】
表２は、緩衝能、pH、および伝導性のパラメーターを、該APEXチップデバイスを用いてDNA蓄積およびハイブリダイゼーション感度 (効率)と相関させる一連の実験の結果を示す。
【００３６】
【表２】
2008514928.tif 000004
【００３７】
表２は、DNA輸送 (蓄積)の低伝導率 (β-アラニン、タウリン、システイン、ヒスチジン)との相関を明白に示す。また、該表は、β-アラニン、システイン、およびヒスチジンを用いて、該ストレプトアビジン/ビオチンプローブ親和性反応に対する良い感度を示す。表２の感度データに反映されるように、ヒスチジンは、システインまたは20 mM NaPO4のような他の緩衝液のいずれかより４倍良いハイブリダイゼーション効率を提供する。システインに対する改善は、少なくとも10倍、別法として102倍、および別法として少なくとも104倍である。ヒスチジンは、良い輸送および良いDNA/DNA ハイブリダイゼーション効率の両方を提供することが分かった。
【００３８】
ヒスチジンの作用メカニズム
DNA濃度およびハイブリダイゼーションに対する輸送およびアドレス指定手順の間、該正にバイアスされた電極のすぐ上の該pHは、緩衝液依存様式において、下がることが判明している。別の実験において、それは、ヒスチジンがハイブリダイゼーションを促進し得る酸性pHにて、受動的ハイブリダイゼーションにつき観察された。電子ハイブリダイゼーションを促進するこれらのヒスチジンおよび関連した緩衝液の能力は、４つの重要な特性に関連する：(1) 相対的に変性された状態において標的DNAを維持する能力、(2) DNAの電場濃度を高める能力、(3) 該正にバイアスされたマイクロロケーションに存在する酸性条件を緩衝する能力、(4) 該二本鎖構造を安定させるDNAホスホジエステル骨格の間の反発力を遮断するまたは減少することが可能な正味の正電荷を得る能力。図３は、DNA構造のヒスチジン安定化に対する可能なメカニズムを示す。
【００３９】
基本的に、該ヒスチジン分子が、プロトン化され、該α-アミノ基およびイミダゾール環の両方の上で、正電荷によってよりジカチオン性になるため、該分子は、該二本鎖DNA構造を安定化し始め、該APEXチップ上で該正電極のハイブリダイゼーションを促進する。カチオン、ジカチオン、およびポリカチオンは、該二本鎖DNA構造上の該負に荷電されたリン酸骨格の該反発力を減少させることによって、DNA/DNAハイブリッドを安定化させることを助けることが分かっている。全く、ヒスチジンおよびds-DNAの分子構造を満たすCPK空間を検査する際、該ジカチオン性ヒスチジン種は、該DNA骨格に沿って間隔を設けられたリン酸酸素アニオンに上手く「嵌合」するようである。さらに、構造を満たすCPK空間の検査は、ジ-ヒスチジンおよび他のジ-、トリ-、およびポリペプチド構造が、ds-DNA 構造をさらに有意に安定化するであろうことを示唆する。これらのペプチド構造に加えて、大多数のペプチド誘導体および合成構造を設計して、ds-DNAを安定化させることもできると考えられる。また、該DNA/DNA/ヒスチジンが、該正電極 (過酸化水素等)で生成される他の電気化学生成物からの何らかのタイプの安定化付加化合物を形成し得ることが可能である。
【００４０】
該ヒスチジンおよび関連した緩衝液の利点は、該APEXマイクロチップ型デバイスに特に重要である。これらの特定のデバイスは、深いウェルデバイス (約10ないし100ミクロンの浸透層)およびマイクロマシンまたは巨視的デバイス (試料調製、複雑性低減、増幅、電子ドットブロット等)と反対に、より薄い浸透層 (約1ないし10 ミクロン)で覆われ、一般的には、より低い範囲の電流(約10 nAないし約5 uA)および電圧(約1.2ないし約5ボルト)で使用される。このより低い電流および電圧は、該より高いコンダクタンスの緩衝液および電解質における輸送速度およびハイブリダイゼーション効率を減少する。一般的には、これらのケースにおいて、DNA輸送は、(システインまたはアラニンのような)低コンダクタンスの緩衝液において実施され、ここに相対的により低い電流および電圧は、それでも高速DNA輸送を生成する。これらの条件下で、DNAは、該テスト部位にて高速に蓄積されるが、効率よくハイブリダイズしない。これらの低コンダクタンス緩衝液における輸送の後、該溶液は、通常、高塩濃度緩衝液 (>100 mM塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウム)へと変更され、次いで、それは、マイクロロケーションテスト部位での該濃縮された標的DNAの該DNAプローブへの非常に効率の良いハイブリダイゼーションを促進する。
【００４１】
この具体例は、ヒスチジンのような天然に生じるアミノ酸を利用するが、本発明は、良い緩衝能、低伝導率 (または双性イオン特徴)を有する他の天然または合成化合物に完全に適用可能であり、DNAハイブリダイゼーションを、電荷安定化または付加体形成によって安定化させることができる特性を有する。
【００４２】
還元剤
また、還元剤の該双性イオン緩衝液システムへの添加は、該電極へのDNA輸送を改善する。主に、O2(g)、遊離基、および過酸化物種よりなる該電極での酸化生成物は、フルオロフォア、DNA、および浸透層損傷に寄与することが分かっている。加えて、また、緩衝液要素の酸化生成物は、該浸透層上にまたはそれに堆積し、該電極の上に、該浸透層のバッググラウンドシグナルレベルを増加し得る。還元剤の存在は、有意に、該正電極での水酸化、水酸化生成物、および緩衝酸化生成物を減少する。特に、O2(g)バブルの発生の減少は、有意に、該電極のすぐ周りにある領域の乱流の量を減少し、それにより、該マイクロロケーションへの荷電粒子 (例えば、DNAまたはRNA)の蓄積の速度を増加する。加えてまたは別法として、該還元剤の存在は、該電極へのより高い電流の適用を可能にして、その結果、輸送および／またはハイブリダイゼーションを改善する。
【００４３】
該還元剤は、システイン、ジチオスレイトール(DTT)、β−メルカプトエタノール、α−チオグリセロール、他のチオール含有還元剤、およびその組合せであり得るが、これらに限定されるものではない。還元剤の該低コンダクタンス双性イオン緩衝液への添加は、低蛍光性シグナルバックグラウンド (〜75%)、DNA、RNA等に対する保護効果、および帯電物質のより早い輸送を提供するというさらなる利点を提供する。該緩衝液中の還元剤の濃度は、約25-700 mM、別法として約25-500 mM、別法として約25 mM、別法として約50 mM、別法として約100mM、別法として約125 mM、別法として約150 mM、別法として約250 mM、別法として約500 mMである。還元剤の濃度は、塩組成に依存し得、当業者によって決定され得る。
【００４４】
１つの具体例において、該還元剤は、チオール基を有する。この場合において、該還元剤は、該チオール基の該pIより下のpHにて、電荷を有さない。従って、該緩衝溶液の伝導性において、全く有意な増加（最小の増加）が存在しない。
【００４５】
好ましい具体例において、該還元剤はα−チオグリセロールである。上記の全化合物は有効な還元剤であるが、α−チオグリセロール(例えば、β−メルカプトエタノールと比較して)の該長い炭素鎖は、結果的に、より低い溶液伝導性、より低い輸率、およびより低い匂いを生じる。L-システインは、より低い速度のDNA結合および残留バックグラウンド増加を有する傾向がある。DTTは、α−チオグリセロールと比較して、非常に高価である。β-メルカプトエタノールは有毒であり、独特な匂いを有する。α−チオグリセロールは無毒であり、匂いはほとんどないか全くない。
【００４６】
種々の濃度にて、少なくとも１つの両性イオン種（例えば、ヒスチジン)と併用する時、還元剤、および特にα−チオグリセロール(下記参照)は、電極デバイス上での広範な気泡を防ぐことが分かった。
【００４７】
【化１】
2008514928.tif 000005
【００４８】
特に、APEXデバイスについて、α−チオグリセロールの添加は、1 μAを超える電流にて、Ptチップ電極上での気泡を防ぐことが分かった。図4は、酸化／還元電位掃引のグラフである。100 mMのヒスチジンの溶液中のα−チオグリセロールの酸化電位は、100 mMのヒスチジンにおける水の電気分解からのO2(g)発生に必要なものより小さい。加えて、O2(g)が生成される該電位は、α−チオグリセロールの存在下で、有意に(0.25 ボルト)上昇される。従って、α−チオグリセロールの存在下では、荷電生体分子 (例えば、DNAまたはRNA)の移動性を誘導するのに発生される十分な電流が存在するが、O2(g)発生は、実質的に、α−チオグリセロールの酸化に有利に減少される。
【００４９】
加えて、該還元剤の酸化物は、該電極デバイスに対してあまり有害ではない。水およびα−チオグリセロール酸化の生成物は、図5に示される。α−チオグリセロールの酸化からの水素イオンの生成は、酸素およびそのラジカルを消費するのを助け、ポリヒスチジン付加化合物の酸化および形成を減少し、電気泳動のための電荷キャリアーとして水素イオンを提供し、該局所pHを減少して、ハイブリダイゼーションを促進する。α−チオグリセロールの酸化生成物は水溶性であり、沈殿物を残さない。該電極に結合した浸透層を有するAPEXデバイスにつき、そのような沈殿物は、該浸透層に対して有害である。図６は、電解ヒスチジン緩衝溶液のエレクトロスプレー質量分析である。m/z 154.1でのピークは、ヒスチジン (His)に対応する。m/z 309.3および463.7でのピークは、それぞれ、His付加化合物、His-HisおよびHis-His-Hisに対応する。図７は、α−チオグリセロールを含有する電解ヒスチジン緩衝溶液のエレクトロスプレー質量分析である。図６および７の比較において明白であるように、m/z 309および463での該His付加化合物は、α−チオグリセロールの存在下で、有意に減少され、α−チオグリセロールおよびα−チオグリセロールの酸化付加化合物に対応するピークは、現在存在する。加えて、該ヒスチジン/α−チオグリセロール緩衝液 (電解されていない、図8参照)の該質量スペクトルの該電解緩衝液 (図7参照)の該スペクトルとの比較は、該緩衝液成分が、電気泳動後、有意に変化しなかったことを示す。
【００５０】
DNAの輸送は、還元剤を含有する緩衝液が使用される時、適用可能なより高い電流の結果として、還元剤の存在下で、有意に速くなる。図9は、シグナルの該蓄積のグラフであり、これは、1分間、400 μAパルスを適用する後に、特定のマイクロロケーションに輸送されるDNAの量に対応する。DNA輸送体は、DTTおよびβ−メルカプトエタノールと比較して、α−チオグリセロールにおいてより速いように思われる。250 mM DTTにおいて輸送されるDNAの量は、50 mM ヒスチジンと比較して、約２倍多い。250 mM β−メルカプトエタノールにおいて輸送されるDNAの量は、50 mM ヒスチジンと比較して、約４倍多い。250 mM α−チオグリセロールにおいて輸送されるDNAの量は、50 mM ヒスチジンと比較して、４倍以上多い。
【００５１】
加えて、α−チオグリセロールは、ヒスチジン緩衝液の伝導性を有意に増加しない。作用濃度にて、α−チオグリセロールは、ヒスチジン緩衝溶液 (表3参照)の伝導性に対して、< 35%寄与する。
【００５２】
【表３】
2008514928.tif 000006
【００５３】
還元剤の添加は、該還元剤なしの緩衝液と比較して、より低いバックグラウンドシグナルを生じる。表4は、標的オリゴP1、P2、P3、FA、およびFBが、該チップ上の特異的部位に、順次にバイアスされ、ハイブリダイズして、オリゴFA、RB、RA、およびIC (内部対照)を捕獲することが可能であるシグナルを報告する。標的FAについて見られるように、ハイブリダイゼーションは、捕獲オリゴFAによって生じるだけであった。加えて、該他の標的オリゴの全てに対する該バックグラウンドシグナルは、α−チオグリセロールなしの緩衝液と比較して、α−チオグリセロールを有する緩衝液においてより低い。
【００５４】
【表４】
2008514928.tif 000007
【００５５】
熱変性
また、実験は、該還元剤、この場合はα−チオグリセロールが、カオトロピック剤として作用し得ることを示唆する。表５において見られるように、標的試料P1、P3、INF B、INF A、およびRSV Aが、熱変性工程あるなしで、α−チオグリセロールを含有する双性イオン緩衝液においてアドレス指定された時に、シグナル強度の有意な変化は存在しない。従って、熱変性に付されなかった該標的試料は、該還元剤を含有する緩衝液によって変性されたようである。
【００５６】
【表５】
2008514928.tif 000008
【００５７】
前述の発明は、明確さおよび理解の目的のために、説明および例で、いくらか詳細に記載してきたが、本発明の教示に鑑みて、特定の変更および修飾を、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、それに対してなし得ることが、当業者に直ぐに明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、３つの自己指定可能なマイクロロケーションの断面である。
【図２】図２は、マイクロロケーションの断面である。
【図３】図３は、電子ハイブリダイゼーションプロセスにおけるハイブリッドのヒスチジン安定化のグラフ表示を示す。
【図４】図４は、酸化／還元電位掃引のグラフを示す。
【図５】図５は、水およびα−チオグリセロール酸化の生成物を示す。
【図６】図６は、電解ヒスチジン緩衝液の質量スペクトルである。
【図７】図７は、α−チオグリセロールを含有する電解ヒスチジン緩衝液の質量スペクトルである。
【図８】図８は、α−チオグリセロールを含有するヒスチジン緩衝液の質量スペクトルである。
【図９】図９は、異なる緩衝液を用いた電極デバイス上のシグナル蓄積のグラフである。
【図１】
2008514928.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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