(57)【要約】  本発明は、ＨＩＦ−１αの過剰発現に関連する病気又は疾患（例えば、腫瘍、呼吸器系疾患）の治療、予防及び／又は管理のために、アデノシン受容体アンタゴニスト、好ましくはＡ３受容体アンタゴニストを、単独で又は他の薬剤との組み合わせによる使用に関する。本発明の方法及び化合物は、特に、本発明のＡ３受容体アンタゴニストを使用して、腫瘍、低酸素誘導因子-1α（ＨＩＦ−１α）が関与する疾患又は疾病に伴う症状の治療、予防又は緩和に有用である。本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍、そしてさらに特に低酸素状態腫瘍の増殖を阻害するための方法を提供する。【選択図】図１
2008520746.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を投与することからなる、それを必要とする対象におけるＨＩＦ−１αを発現している癌の治療方法。
【請求項２】
癌が、子宮頸癌、肺癌、乳癌、希突起膠腫、中咽頭扁平上皮腫瘍、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、ヒト肺癌、ヒト結腸癌、膵臓癌、前立腺癌及び胃の消化管間質腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌が更にＡ３受容体を発現している癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に一つ又はそれ以上の付加的な癌の治療法を施すことからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記付加的治療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法及び外科手術からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
更に一つ又はそれ以上の抗癌薬を投与することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗癌薬が、化学療法薬、血管新生阻害薬、細胞毒性薬及び癌治療抗体からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ａ３受容体アンタゴニストが、次の一般式
【化００１】
2008520746.tif 000046
（式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾールであり、
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり、
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を１つ又はそれ以上含む５〜６員の複素環を形成し、
Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり、
Ｒ３は、置換ヘテロアリール環に関して本明細書で記載されているような置換基の１つ又はそれ以上で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり、そして
ｂは、１又は２である）
で表される化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩であるか、
又は、
Ａ３受容体アンタゴニストが、次の一般式
【化００２】
2008520746.tif 000047
（式中、
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−ＳＯｂＳＲ１又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり、
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、低級アルケニル、低級アルカノイルであるか又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５−６員の複素環形成し、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、好ましくはクロロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり、
Ｒ３は、置換ヘテロアリール環に関して本明細書に記載されているような置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり、そして
ｂは、１又は２である）
で表される化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
当該Ａ３受容体アンタゴニストが、一般式ＩＩＡ：
（式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾールであり、
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり、
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、低級アルケニル、低級アルカノイルであるか、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５−６員の複素環を形成し、
Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり、
Ｒ３は、置換ヘテロアリール環に関して本明細書に記載されているような置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり、そして
ｂは、１又は２である）
で表される化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａ３受容体アンタゴニストが、
Ａが、ピラゾールであり、
Ｒが、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり、
Ｒ１が、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、低級アルケニル、低級アルカノイルであるか、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５−６員の複素環を形成し、
Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり、
Ｒ３が、フランであり、
Ｘが、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり、そして
ｂが、１又は２、である、
化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ａ３受容体アンタゴニストが、
Ａが、ピラゾールであり、
Ｒが、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり、
Ｒ１が、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５〜６員の複素環であり、
Ｒ２が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり、そして
Ｒ３がフランである、
化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ａ３受容体アンタゴニストが、一般式ＩＩＥ：
【化００３】
2008520746.tif 000048
（式中、
Ｒ２はアルキルであり、そして
Ｒ６はアリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールである）
で表される化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ａ３受容体アンタゴニストが、以下の構造式：
【化００４】
2008520746.tif 000049
の一つを有する化合物又は薬学的に許容されるその化合物の塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を投与することからなる、対象における固形低酸素腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項１５】
固形低酸素腫瘍の増殖が少なくとも１０％低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固形低酸素腫瘍の増殖が少なくとも３０％低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
固形低酸素腫瘍の増殖が少なくとも６０％低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を投与することからなる、対象におけるＨＩＦ−１が介在する疾患の治療方法。
【請求項１９】
アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、ＨＩＦ−１αの発現レベルを低減する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＩＦ−１αの発現レベルが少なくとも１０％低減する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＩＦ−１が介在する疾患が、癌、慢性閉塞性肺疾患及び喘息からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
更に（ａ）対象から組織サンプルを取り出し、（ｂ）ＨＩＦ−１αレベルをＨＩＦ−１αブローブを用いて測定する、工程からなる、請求項１、１４又は１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＩＦ−１αブローブが、抗体、抗原、核酸、タンパク質及び小分子からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が免疫特異的にＨＩＦ−１α又はその断片又は誘導体に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＨＩＦ−１αレベルを測定する工程が、少なくとも１つのアリコートをテストすることからなり、当該テストする工程が、
（ａ）アリコートを、ＨＩＦ−１αに対して免疫特異的である抗体と接触させ、そして
（ｂ）抗体と少なくとも１つのアリコートとの間に結合が起こったか否か検出する、ことからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ＨＩＦ−１αレベルを測定する工程が、少なくとも１つのアリコートをテストすることからなり、当該テストする工程が、
（ａ）アリコートを、ＨＩＦ−１αをコードする核酸とハイブリダイズする分離した核酸と接触させること、及び
（ｂ）核酸ブローブと少なくとも１つのアリコートとの間でハイブリダイゼーションが起こるかどうか検出する、ことからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
対象に、Ａ３受容体アンタゴニストの有効量を予防的に投与することにより、ＨＩＦ−１αの過剰発現を特徴とする癌の進行を阻害するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年１１月２２日に出願された、米国仮出願番号第６０／６３０，５５７号の優先権を主張するものであり、その開示は、その全てを参照として本明細書に取り込む。
【０００２】
本発明は、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増大するＨＩＦ−１α活性に関連する病気又は疾患（例えば、癌、呼吸器系疾患）の治療、予防及び／又は管理のために、アデノシン受容体アンタゴニスト、好ましくはＡ３受容体アンタゴニストを、単独か又は他の薬剤との組み合わせによる使用に関する。本発明の方法及び組成物は、特に、本発明のＡ３受容体アンタゴニストを使用して、癌、低酸素誘導因子 1α（ＨＩＦ−１α）が関与する疾患又は疾病に伴う症状の治療、予防又は緩和に有用である。本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍、そして更に特に低酸素状態腫瘍の増殖を阻害するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
（３．１  アデノシン）
アデノシンは、最近は「根源的情報伝達分子（primordial signalling molecule)」と呼ばれ（Linden 2001, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, Unital 41: 775-87）、発達に影響をもたらす可能性を持ち、あらゆる哺乳類の組織中に存在し、あらゆる哺乳類組織の生理的応答を調節している。アデノシンの作用は、酸素要求性が高く、酸素分圧が低い組織中、すなわち血管形成の速度よりも細胞増殖が高いような固形腫瘍の内側で、最も顕著である（Sitkovsky, 2004 Annu. Rev. Immunol. 22, 657-82; Fredholm, 2001, Pharmacol. Rev. 53,527-552）。結果として、腫瘍は低酸素状態の局所領域を持ち、アデノシンは、高レベルに蓄積する（Hockel, 2001, J. Natl. Cancer Inst. 93, 266-76）。特に、アデノシンの顕著なレベルは、固形腫瘍の細胞外液に存在すると認識されており（Blay, 1997, Cancer Res., 57, 3602-5）、このことからこのヌクレオシドが腫瘍の増殖に果たす役割が示唆されている。
【０００４】
アデノシンは、腫瘍の発達と関連する。上昇したアデノシン濃度は、腫瘍の塊の内側で報告されてきた。インビボで筋肉組織における腫瘍増殖を妨げ、インビトロで悪性腫瘍細胞の増殖や生存を低下させることは、抗腫瘍剤であることを示すと推測されてきた。しかしながら、アデノシンは、脳及び心臓において虚血性障害中に細胞保護剤として働くものとして知られている。アデノシンは、低酸素状態で放出されることが知られている。多くの検討が、アデノシンが虚血性障害から心臓の細胞を保護することを示している。
【０００５】
アデノシンは、たくさんの動物モデル及びヒトにおいて保護的役割をもつことが示されてきた（Am. J. Cardiol. 79(12A):44-48 (1997)）。例えば、心臓において、Ａ１及びＡ３両受容体は、虚血に対する防御を表す（Am. J. Physiol., 273(42)H501-505 (1997)）。しかしながら、虚血に対して持続的な防御を表すのはＡ３受容体である（PNAS 95:6995-6999 (1998)）。アデノシンが低酸素状態から腫瘍細胞を防御する能力があることは、本発明に先立って他者によって認識されたことはなかった。
【０００６】
アデノシンは、Ｇタンパク質ファミリーの異なる部位に連結した糖タンパク質である細胞表面受容体と相互作用する。今まで、４つのアデノシン受容体：Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３がクローン化され、性状解析されてきた。Ａ３受容体に選択的なアンタゴニストを、脳における抗炎症及び抗虚血剤として使用することが提案されてきた。最近、Ａ３アンタゴニストは、抗喘息薬、抗うつ薬、抗不整脈薬、腎臓保護剤、抗パーキンソン病薬、及び認知促進剤として開発中である。例えば、Ｍａｒｌｅｎｅ  Ｊａｃｏｂｓｏｎらの米国特許第５，６４６，１５６号には、選択的Ａ３アンタゴニストを使用して、好酸球の活性化を阻害することが記載されている。
【０００７】
筋細胞を用いた最近の検討は、アデノシンＡ３受容体が、虚血に対する長期的な防御に役割を果たすことを示してきた（Liang and Jacobson, PNAS, 1998, 95:6995-6999）。本発明者らは、筋細胞に加え、腫瘍細胞を含む他の細胞種においても、アデノシンが保護作用を示すという仮説を立てているけれども、腫瘍細胞に対するアデノシンの保護効果を限定する努力はなされたことがない。
【０００８】
（３．２  ＨＩＦ−１の生物学）
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１は、酸素恒常性の主たる制御因子として機能する転写因子である（Semenza, 2001, Trends Mol. Med. 7, 345-350.）。
【０００９】
ＨＩＦ−１は、誘導されて発現するＨＩＦ−１αサブユニットと定常的に発現するＨＩＦ−１βサブユニットからなるヘテロ二量体である（Epstein, 2001, Cell, 107, 43-54）。ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１βのｍＲＮＡは、正常酸素分圧及び低酸素条件下では、一定して発現される（Wiener, 1996 Biochem. Biophys. Res. Commun. 225,485-488）。ＨＩＦ−１の独特の特徴は、ＨＩＦ−１α発現の調節である：細胞内酸素濃度が低下するほど、発現が増大する（Cramer, 2003, Cell, 112, 645-657, Pugh, 2003, Nat. Med. 9, 677-84）。正常酸素分圧の間、ＨＩＦ−１αは、ユビキチンプロテアソーム系によってすばやく分解されるが、低酸素状況への曝露は、その分解を妨げる（Minchenko, 2002 J. Biol. Chem., 277, 6183-6187; Semenza, 2000, J. Appl. Physiol., 88, 1474-1480）。
【００１０】
ＨＩＦ−１が腫瘍の進展及び転移に貢献することを示す証拠の例数が増大している（Hopfl, 2004, Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 286, R608-23; Welsh, 2003, Curr. Cancer Drug Targets. 3, 391-405）。免疫組織化学的解析は、ＨＩＦ−１αが、正常組織よりヒト腫瘍において高いレベルで存在することを示してきた（Zhong, 2000, Cancer Res. 60, 1541-5）。腫瘍の進展は、低酸素状態に対する適応に関係しており、腫瘍の酸素化と臨床転帰の間には逆相関がある（Pugh, 2003, Ann. Med. 35, 380-90; Semenza, 2000 J. Appl. Physiol., 88, 1474-1480）。特に、細胞内ＨＩＦ−１活性レベルは、ヌードマウスにおける腫瘍形成性及び血管新生と相関がある（Chen, 2003, Am. J. Pathol. 162,1283-91）。ＨＩＦ−１の発現を欠いている腫瘍細胞は、その増殖と血管形成において、顕著に機能低下している（Carmeliet, 1998, Nature 394, 485-90; Jiang, 1997, Cancer Res., 57, 5328-5335; Maxwell, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 8104-8109; Ryan, 1998 EMBO J. 17, 3005-3015）。それゆえ、ＨＩＦ−１αの発現及び活性は、腫瘍増殖及び進展に対し中心的役割をもつため、ＨＩＦ−１阻害は適切な抗腫瘍標的になる（Kung, 2000, Nat. Med. 6, 1335-40）。
【００１１】
（３．３  関連疾患）
（３．３．１  癌）
新生物又は腫瘍は、良性又は悪性であり得る、制御されない細胞異常増殖に起因する腫瘍性塊である。良性腫瘍は一般的に、局部的に残る。悪性腫瘍を集団的に癌と称する。「悪性」とは、一般的に癌が、隣接する身体構造を侵害し破壊し、遠位部位に広がり、死にいたらしめ得る、という意味である(参考として、Robbins and Angell,1976,Basic pathology, 2nd Ed, W.B.SAunders Co.,Philadelphia,pp.68-122を参照のこと)。癌は、身体のあらゆる部位に発生して、その起源により異なる振る舞いをし得る。癌性細胞は、発生源である身体部位を破壊し、更に、新増殖を始めてさらなる破壊を引き起こす身体の他の部位に広がる。
【００１２】
毎年１２０万人以上のアメリカ人が癌を発病している。癌はアメリカ合衆国における死因の第２位であり、現在の傾向が続けば、２０１０年までには癌が合衆国における死因の第一位になると懸念されている。肺癌と前立腺癌が合衆国における男性の癌の死因のトップである。肺癌と乳癌が合衆国における女性の癌の死因のトップである。合衆国における男性の２人に１人が生存中に何度か癌であると診断されるであろう。合衆国における女性の３人に１人が生存中に何度か癌であると診断されるであろう。
【００１３】
癌の治療法は未だ発見されていない。外科手術、化学療法及び放射線療法のような、現在の治療法の選択肢においては、しばしば、効果的でないか深刻な副作用を示す。
【００１４】
現在、癌治療法には、外科手術、化学療法、ホルモン療法及び/又は患者における新生細胞を照射する放射線療法が含まれうる（例えば、Stockdale,1998,"Princeples of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman eds., Capter 12,S ection IVを参照のこと）。近年、癌治療法として、生物療法又は免疫療法も含まれるようになった。これら全ての取り組みは、患者に対して深刻な障害をもたらしている。外科手術は、例えば、患者の健康状態により禁忌であり得、又はその患者には施行不能である。加えて、外科手術は、新生組織を完全に取り除くことはできない。放射線療法は、新生組織が通常組織よりも放射線に対して高い感度を示す場合のみ、効果的であり、更に、放射線療法はしばしば深刻な副作用を伴う。ホルモン療法は、単一剤としてはまれにしか施行されず、効果的であるにもかかわらず、しばしば、他の療法により癌細胞の大部分を取り除いた後に、癌の再発を予防又は遅延するために用いられる。生物療法/免疫療法は、数的に制限され、発疹又は腫れ、熱、悪寒及び倦怠感、消化管障害、又はアレルギー反応を含む、インフルエンザ様の症状のような副作用を生じ得る。
【００１５】
化学療法に関して、癌の治療に使用できる多種の化学療法薬がある。癌化学療法の重要な部分は、ＤＮＡ破壊と付随の細胞分裂を防止するために、直接的か又は間接的に、デオキシリボヌクレオチドの三リン酸塩先駆体の生合成を阻害することにより、ＤＮＡ合成を阻害する作用である（例えば、Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamom Press, New York, 2001, 10th ed.)を参照のこと)。ニトロソウレアのようなアルキル化剤、メトトレキサート及びヒドロキシウレアのような代謝産物、及びエトポシド、カンパテシン、ブレオマイシン、ドキソルビシンダ、ウノルビシン等の他の薬剤を含む、これらの薬剤は、必ずしも細胞周期特効薬ではないが、ＤＮＡ複製におけるそれらの効能により、Ｓ期細胞を殺生する。他の薬剤は、特に、コルヒチン及びビンブラスチンやビンクリスチンのようなビンカアルカロイドは、核分裂停止をもたらす微小管重合に干渉する。化学療法手順には、治療効果を高めるために、一般的に化学療法薬の組合せ投与を含む。
【００１６】
多種の化学療法薬の可用性にもかかわらず、化学療法には多くの障害がある（例えば、Stockdale,1998,"Princeples Of Cancer Patient Management" in Scientific American Medicine, vol.3, Rubenstein and Federman, eds., ch. 12, sect. 10 を参照のこと）。ほとんど全ての化学療法薬は毒性であり、化学療法は、激しい嘔吐、骨髄抑制、免疫抑制等を含む、顕著な、しばしば危険な副作用を引き起こす。更に、化学療法薬を組合せて投与する場合でさえも、多くの癌細胞が、化学療法薬に対して耐性がある又は耐性を持つようになる。実際、治療手順に用いられる特定の化学療法薬に対して耐性のあるこれらの細胞は、しばしば、他の薬剤に対して、特定の治療に用いられる薬剤の活性機構とは異なる機構により作用する薬剤に対してでさえ、耐性があることが判明していて、この事象を多面的薬又は多剤耐性と称する。それゆえ、薬剤耐性が要因で、多くの癌が標準的化学療法手順に対して難治性であることが判明している。
【００１７】
代替の癌治療法、特に外科手術、放射線療法、化学療法及びホルモン療法のような標準的癌治療法に対して難治性であると判明している癌に対する治療法が、顕著に必要とされている。期待されている代替法は、免疫療法であり、ここで癌細胞は、癌抗原−特異抗体の特異的な標的である。主要作用は、免疫応答の特異性を利用するも、例えば、ハイブリドーマ技術が、癌選択的モノクローナル抗体の開発を可能にしてきた（Green M.C. et al., 2000 Cancer Treat Rev., 26:269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl.14):43-51を参照のこと）、更にここ数年の間に、連邦食品医薬品局は、癌治療に関する最初のＭＡｂｓを承認した。しかし、癌治療に対する必要性が満たされたわけではない。
【００１８】
現在のヒト癌の化学療法において、化学療法薬に関連する副作用がしばしば深刻である。パクリタキセルあるいはドセタキセル（両者ともタキセン系薬剤である）の腫瘍性疾患の治療における使用は、多くの患者で経験された急性の超過敏性応答により制限される。例えば、１００ｍｇ／ｍ２で投与されたドセタキセルは、１３％の患者において急性の超過敏性応答を引き起こし、１．２％において深刻な超過敏性応答を引き起こした。これらの反応により、患者は通常、経口コルチステロイドを前投与される。
【００１９】
同様に、ビンカアルカロイドの使用に伴う副作用もしばしば有用な投薬量を制限する。例えば、ビンクリスチンは神経毒性により投与量が制限されることが報告されている。神経保護効果を提供する増強薬がそれゆえに好ましい。化学療法薬はまた、製造及び患者に提供するうえで費用がかかる。もし薬が低減された用量で使用できるのであれば、経費及び好ましくない副作用の範囲を同様に減じることができるだろう。他の化学療法においてしばしば出くわす難関は、癌の成長あるいは多剤耐性（ＭＤＲ）を生み出している細胞による、効果の制限である。ほとんどの癌細胞は遺伝子的に不安定であるので、それらは薬剤耐性細胞を生成しやすいよう変異する傾向がある。
【００２０】
多剤耐性は、疾病が単数もしくは複数の薬剤に応答しない際に、その環境に対して与えられる名称である。ＭＤＲは内在性、すなわちその薬剤に疾病が決して応答しないもの、あるいは獲得できるもの、すなわち以前は応答していた薬剤に対して疾病が応答しなくなったもののいずれかでありえる。ＭＤＲは１つ以上の機能的に及び／又は構造的に関連のない薬剤に対する疾病の交差抵抗性により特徴付けられる。癌の領域におけるＭＤＲは、Ｋｕｓｍｉｃｈ及びＴｅｗによる「Detoxification Mechanism and Tumor Cell resistance to Anticancer Drugs」、特にセクションVII「The Multidrug-Resistant Phenotype（ＭＤＲ）」、「Medical Research Reviews, Vol.11, No.2, 185-217」 (Section VIIは208-213頁)(1991)、及び、Ｇｅｏｒｇｅｓ、Ｓｈａｒｏｍ及びＬｉｎｇによる「Multidrug Resistance and Chemosensitization: Therapeutic Implications for Cancer Chemotherapy」、「Advances in Pharmacology, Vol.12, 185-220 (1990)」においてより詳細に議論されている。
【００２１】
異なるＭＤＲ機構が報告されている。多剤耐性（ＭＤＲ）の一つの形態は、多面的な糖蛋白質として表される膜結合性１７０−１８０ｋＤのエネルギー依存性流出ポンプあるいはＭＤＲ−１遺伝子によりコードされるP―グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）により介在される（Endicott JA, Annu Rev Biochem 1989）。P―グリコプロテンはヒト腫瘍の多くにおいて、内在性の及び獲得された抵抗性において重要な役割を果たすことが示されている。基質として作用し、その結果としてＰ−ｇｐにより効力を弱められる薬剤には、ビンカアルイカロイド（ビンクリスティン及びビンブラスティン）、アントラサイクリン（アドリアマイシン）およびエピポドフィロトキシン（エトポサイド）が含まれる。
【００２２】
最近、ＭＤＲ−１遺伝子が進行した卵巣癌における追加的な危険因子として同定されている。Ｄ．Ｓ．Ａｌｂｅｒｔｓらによる検討において、フェーズＩＩＩの卵巣癌患者がＭＤＲ−１でスクリーニングされた。高レベルのＭＤＲ−１を有する卵巣癌患者は、平均９．８ヶ月生存した。低レベルのＭＤＲ−１を有する、もしくはＭＤＲ−１を発現しない患者は平均３０ヶ月あるいはそれ以上生存した。
【００２３】
ＭＤＲに関連したＰ−ｇｐが化学療法試薬に対する腫瘍細胞抵抗性において主要な因子である一方、ＭＤＲ現象は多機能性で多くの異なる機構を含んでいる。アントラサイクリンに対する抵抗性の他の経路一つは、Ｐ−ｇｐではない１９０ｋＤ蛋白質（ｐ１９０）の出現を含んでいる。Ｔ．  ＭｃＧｒａｔｈらの「Biochemical Pharmacology, 38:3611 (1989)」を参照されたい。蛋白質ｐ１９０は血漿膜において排他的に見出されるものではなく、むしろ小胞体に顕著に局在化しているようである。例えば、「Marquardt、1992. Cancer Research, 52:3157」を参照されたい。
【００２４】
コール（Cole）及びディーレイ（Deeley）の業績により多剤耐性蛋白質（ＭＲＰ)に指定されている１５３１個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）が単離された。ファン（Fan）らにより報告されているように、ＭＲＰ蛋白質は上記の１９０ｋＤ蛋白質と同様のものと考えられる。ＭＲＰは乳癌（breast cancer）、ヒト白血病、小細胞肺癌、ヒト大細胞肺癌、繊維肉腫、腺癌、甲状腺癌及び子宮頸癌において観察されている。チェン（Chen）は、ＭＲＰはカプトテシン及びそのアナログに対する多剤耐性に関連していることを報告している。
【００２５】
Ｐ−ｇｐにもＭＲＰにも関連していない他のＭＤＲが報告されている(Kellen編、「Alternative Mechanism of Multidrug Resistance in Cancer, Birkhauser, 1995)」）。本発明者らにより得られた結果は、Ｐ−ｇｐあるいはＭＲＰ多剤耐性に対抗するが、他の型のＭＤＲに対抗しないアデノシンＡ３アンタゴニストの使用と矛盾しない。
【００２６】
α−［３−［［２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチ］ルメチルアミノ］プロピル］−３，４−ジメトキシ−α−（１−メチルエチル）ベンゼンアセトニトリル（ベラパミル）は、ＭＤＲに関連したＰ−ｇｐの効果に対抗するための薬剤として使用されている。ベラパミルはＬタイプのカルシウムチャンネルを遮断し、冠動脈と末梢血管の強力な血管拡張に使用され、心筋の酸素消費を減少させる。ベラパミルの生理学的な効果により、ベラパミルのＭＤＲ使用は、低血圧、うっ血性心不全、洞房（ＳＡ）あるいは房室（ＡＶ）結節伝導障害、ジギタリス毒性、ウルフパーキンソンホワイト症候群及び更にβブロッカーあるいはキニジンで治療されていない患者に対して制限されなければならない。
【００２７】
Ｐ−ｇｐはまたアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）依存性であることを認識すると、ＭＤＲと対抗するほかの提唱される方法は、癌細胞においてＡＴＰの生成を阻害することである。Carsonらの米国特許第６２１０９１７号は、ＭＤＲと対抗するためにＬ−アデノシン及び他のアデノシンキナーゼ阻害剤を使用することを開示している。加えて米国特許第６３９１８８４号は、２−デオキシグルコース、シアニン、オリゴマイシン、バリノマイシン及びアジド、更にそれらの塩及び誘導体を含むＡＴＰ除去剤を同定している。ＭＤＲへの対抗におけるＡＴＰの除去及び阻害に依存するアプローチは、臨床的な成功には至っていない。
【００２８】
その結果、癌治療において単独あるいはＡＴＰ除去剤とともにＭＤＲを阻害あるいはＭＤＲに対抗し、ベラパミルにより課されている制限がない、化学治療薬エンハンサーあるいは化合物が必要であると思われる。
【００２９】
治療薬を組み合わせて使用することは、腫瘍疾患の治療において一般的である。例えば、パクリタキセル（Taxol（登録商標））は、卵巣癌の治療においてシスプラチンとともに使用されることが、米国ＦＤＡにより承認されている。Bisseryらの米国特許第５９０８８３５号は、ダウノルビシンあるいはドキソルビシンのようなアントラサイクリン抗生物質と共に、パクリタキセルあるいはドセタキセルを使用することによる相乗性をクレームしている。同様に、Bisserらの米国特許第５７２８６８７号は、アルキル化薬、エピドフィロトキシン、アンチメタボライト、あるいはビンカアルカロイドと共にパクリタキセルあるいはドセタキセルを使用することによる相乗性をクレームしている。しかしながら、このような組み合わせは従来、アデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニストの使用は含んでいない。
【００３０】
それ故、本発明の目的は、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用により、細胞上のアデノシンの防御的な効果を最少化あるいは減じることにより、腫瘍細胞の処置を増強する化合物及び方法を提供する。更に本発明の目的は、Ｐ−ｇｐ及び／又はＭＲＰ関連多剤耐性に対抗するために適した組成物及び方法を提供することである。本発明の更なる目的は、現在用いられている抗癌剤及び／又は抗癌治療の副作用、特にタキサン誘導性超過敏反応、を減じる組成物及び方法を提供することである。
（発明の要約）
【００３１】
本発明は部分的に、固形腫瘍の低酸素領域内に存在するプリン・ヌクレオシドである、アデノシンが、低酸素応答因子−１（ＨＩＦ−１）の発現を調節する、という本発明者の驚くべき発見に基づいている。ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βサブユニットからなるヘテロ二量体性の転写因子である、ＨＩＦ−１は、腫瘍増殖と血管形成に関連している（概説については例えば、Semenza 2000, Nature, 3:721-32 を参照のこと）。本発明者らは、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株において、アデノシンが、低酸素状態に応答して用量及び経時依存的にＨＩＦ−１αタンパク質の発現を上方調整することを、見出した。アデノシンに対する応答は、Ａ１、Ａ２Ａ又はＡ２Ｂ受容体アンタゴニストには阻害されないが、Ａ３受容体アンタゴニストにより阻止された。本発明者らは、Ａ３受容体と高い親和性で結合しているアデノシン類縁体である、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡが、低酸素状態の細胞中にアデノシン効果を再現する、ことを見出した。更に、Ａ３受容体アンタゴニストは、Ａ３受容体刺激に応答して、ＨＩＦ−１αタンパク質蓄積を阻止する。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、アデノシンに対する応答は細胞表面に、Ａ３受容体発現の阻害後、低分子干渉ＲＮＡを用いることにより、ヌクレオシド効果を阻止した。低酸素状態においてＡ３受容体刺激に維持される主要細胞内シグナル伝達経路には、ｐ４４／ｐ４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）とｐ３８ＭＡＰＫ活性を含む。ゆえに、本発明者らは、アデノシンが低酸素状態におけるＨＩＦ−１α調整において重要な役割を果たす、ことを最初に見出した。
【００３２】
本発明者らは、アデノシン受容体アンタゴニスト、好ましくはＡ３受容体である化合物が、増殖腫瘍細胞において、そのような細胞が酸素を渇望する時(即ち、適正な脈管構造が生成される前)に、又は抗血管形成剤が投与される時に、アデノシン保護効果を阻害することを見出した。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、本発明のアンタゴニストは、アデノシンと同じ位置に結合できる、又はアロステリックアンタゴニストになれる(即ち、アデノシンが結合する位置とは異なる位置に結合するが、その位置に結合するアデノシンの能力に悪影響を及ぼす又は増殖腫瘍細胞を保護するためにいったんアデノシン受容体、特にＡ３受容体に結合したアデノシンの能力に悪影響を及ぼす)。
【００３３】
従って、本発明は、アデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニスト単独か、又はＡ１、Ａ２Ａ又はＡ２Ｂ受容体アンタゴニストと組合せて用いることにより、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び/又は増大するＨＩＦ−１α活性に関連する疾患や疾病（例えば、癌、喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療、予防及び/又は管理の方法に関する。Ａ１、Ａ２Ａ又はＡ２Ｂ受容体アンタゴニストは、Ａ３受容体アンタゴニストとは異なる経路を通して作用し得るが、これらのアンタゴニストとＡ３受容体アンタゴニストとの組合せは、疾患や疾病、例えば癌の治療、予防及び/又は管理に有益になる。
【００３４】
最も好ましい態様において、本発明の方法は、アデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニスト単独で用いることにより、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び/又は増大するＨＩＦ−１α活性に関連する疾患や疾病の治療、予防及び/又は管理に関する。特定の作用機構に縛られることなく、アデノシン受容体に対するアンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニストの投与は、低酸素状態に対する保護効果を拮抗して、低酸素状態による破壊に対するそのような細胞の感受性を提供する。アデノシン受容体、特にＡ３受容体が、虚血に対する細胞の持続的保護に関与しているように、アデノシン受容体に対するアンタゴニスト、特にＡ３受容体は、抗癌剤の活性促進に特に効果的である。
【００３５】
Ａ３受容体アンタゴニストを含む本発明の方法と組成物は、当業者に知られ本明細書に開示される方法を用いて決定されるような、ＨＩＦ−１αの発現及び／又は活性のレベルが、標準的レベル又はバックグラウンドレベル以上に上昇しているときに、特に有用である。本明細書で用いられる、ＨＩＦ−１αの測定されたレベルの標準的レベルへの「上昇」とは、当該技術分野で公知又は将来開発されるＨＩＦ−１αを測定するための方法の何れかで検出される標準と比較して、サンプル又は対象のＨＩＦ−１α量又は濃度が高いこと、を意味する。例えば、標準レベルと比べた測定レベルの上昇は、あらゆる統計的に有意な検出可能な上昇であり得る。ＨＩＦ−１α発現及び／又は活性そのような上昇は、標準の約１０％、約２０％、約４０％、約８０％、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２〜２０倍、２〜５０倍、２〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜１００倍に上昇することを含みうるが、それらに限定されるものではない。本明細書で用いられる「約」という用語は、標準的数値のその数値のプラスマイナス１０％の変動レベルを意味する。
【００３６】
本発明の治療法は、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増加したＨＩＦ−１α活性に関連する疾病又は疾患（例えば、癌、喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療効果を、その治療の慣用的な方法と比較して、改善するために、治療有効量の本発明のＡ３受容体アンタゴニストを、投与することを含む。好ましくは、本発明の方法は、治療計画開始の少なくとも一日、一週間、一ヶ月、二ヶ月以内にＨＩＦ−１αレベルをバックグラウンドレベルに減少させる。最も好ましい態様では、本発明の方法は、ＨＩＦ−１αレベルの標準的レベルまでの減少をもたらす。本発明は、ＨＩＦ−１αレベルのバックグラウンドレベルの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％；バックグランドレベルの約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２〜２０倍、２〜５０倍、２〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜１００倍以内であるレベルへの減少を包含する。好ましくは、本発明の方法がいったんＨＩＦ−１αレベルを特定レベルまで減少させると、治療計画中は、そのレベルが維持され、維持されるＨＩＦ−１αレベルは疾病、例えば癌の退化をもたらすのに十分及び効果的である。
【００３７】
好ましい特定の態様では、本発明は、本明細書に開示される治療的及び／又は予防的有効量のＡ３アンタゴニスト化合物を単独か又は他の治療又は予防薬と組合せて投与することを含む、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増大したＨＩＦ−１α活性に関連する疾病又は疾患（例えば、癌、喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療、予防及び／又は管理のための方法を包含する。
【００３８】
本発明はまた、対象におけるＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増大したＨＩＦ−１α活性に関連する疾病又は疾患の予後を決定するための方法を包含する。好ましくは、対象はヒトである。他の態様においては、対象は以前に治療計画で処置されている。本発明は、対象が本発明の治療的及び／又は予防的方法の必要性があるかどうかを決定するために、対象のＨＩＦ−１αレベルを測定することを包含する。本発明は、対象から得られたサンプル中のＨＩＦ−１αレベルを測定し、測定されたレベルと標準的なレベルと比較することを包含する、ここで標準的なレベルと比較して少なくとも１つのＨＩＦ−１αの測定されたレベルの上昇は、対象が病気又は疾患、例えば癌の転移の増大した危険性を有していることを意味する。ＨＩＦ−１αレベルは、当該技術分野で公知なもの及び本明細書に例示されているもののような、少なくとも１つのＨＩＦ−１α測定及び検出の方法を用いて測定できる。
【００３９】
本発明は、本発明の方法において使用されるＡ３又はＡ１受容体アンタゴニストである化合物を包含する。このような化合物の例は、米国特許第６，３２６，３９０号；同第６，４０７，２３６号；同第６，４４８，２５３号；同第６，３５８，９６４号及び米国特許出願公開第２００３／０１４４２６６号公報及び同第２００４／００６７９３２号公報に開示されており；これらの全ては、その全てを参照して本明細書に取り込む。更には、そのような化合物の付加的な例は表１の参考文献一覧に開示され、これらの開示は、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【００４０】
表１  Ａ３受容体アンタゴニスト
【表１】
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【００４１】
本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、例えば、単一薬剤療法として又は他の形態の癌治療法と組み合わせて、癌の予防、治療及び/又は管理に、特に有用である。好ましい態様において、本発明は、ヒト白血病、メラノーマ、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、悪性メラノーマ、組織球性リンパ腫及びある種の星状細胞腫を含む、がこれらに限定されるものではない、Ａ３受容体発現癌である癌の予防、治療又は管理の方法を包含する。他の好ましい態様において、本発明は、子宮頚癌（早期）、肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌（リンパ節転移陽性乳癌及びリンパ節転移陰性乳癌を含む）、希突起グリオーマ、口腔咽頭のへん平上皮細胞癌、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、胃の消化管間質腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない、高レベルのＨＩＦ−１α発現を伴う癌の予防、治療又は管理方法を包含する。本発明の方法は、特に、生物学的効果が腫瘍性低酸素細胞に観察されるような、ここで高アデノシン濃度が増加したＨＩＦ−１α蓄積をもたらすような、組織選択性をもたらす、癌治療に特に有用である。
【００４２】
Ａ３受容体アンタゴニスト(又はＡ１受容体アンタゴニスト又はそれらの組合せ）を含む本発明の方法及び組成物は、特に、固形腫瘍の治療、阻害又は退化に有用である。ここで用いる、「固形腫瘍」とは、喉頭腫瘍、脳腫瘍、及び他の頭頸部癌；結腸、直腸及び前立腺腫瘍；乳及び胸部固形腫瘍；卵巣及び子宮腫瘍；食道、胃、膵臓及び肝臓の癌；膀胱及び胆嚢癌；メラノーマのような皮膚腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない、細胞の大部分が腫瘍細胞又は腫瘍関連細胞である、腫瘍細胞の所在を意味する。
【００４３】
本発明は、ヒトを含む哺乳類における腫瘍の増殖を阻害する本発明のＡ３又はＡ１受容体アンタゴニスト化合物の使用を包含する。本発明は、腫瘍細胞を保護するアデノシンの作用力を阻止するのに十分な、アデノシンＡ３又はＡ１アンタゴニスト、好ましくはＡ３アンタゴニストの有効量を投与することによる方法を包含する。
【００４４】
他の態様において、本発明は、他の治療的及び/又は予防的薬剤、例えば細胞毒性薬と組合せて使用するＡ３及び/又はＡ１受容体アンタゴニストを含む、本発明の化合物を投与することからなる、癌を治療、予防及び/又は管理する方法を包含する。
本発明者らは驚異的にも、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、相乗的に細胞毒性療法を促進させ、いくらか形態の多剤耐性に対抗する、ことを見出した。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、本発明の組合せ治療は、腫瘍細胞を直接攻撃して、腫瘍細胞の周りの新生血管の増殖を阻止して、アデノシンＡ３アンタゴニストの効力により、新生血管が増殖すること無しに細胞の存続力を阻止するであろう。本発明者らは、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、アデノシンＡ３受容体を発現する癌の多くの化学療法の促進剤として有用であることを見出した。驚異的にも、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、Ｐ−糖タンパク質(Ｐ−ｇｐ）放出ポンプ多剤耐性（ＭＤＲ）にもまた拮抗する。最終的に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、細胞毒性薬の副作用、特にタキサン誘導性過敏症を軽減又は緩和するのに有用である。例えば、本発明のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストと組合せて用いると、低用量のタキサンを使用することができる。
【００４５】
他の態様において、本発明は、アデノシンＡ３受容体を発現している癌の化学療法を促進するために、及びＰ−糖タンパク質又はＭＲＰを発現している癌における多剤耐性に拮抗するための、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用を包含する。
好ましい態様において、タキサン系、ビンカ・アルカロイド、カンプトテシン又は複合抗生物質の投与前に又は投与中に、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを投与する。好ましい高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、本明細書中に記載の一般式ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ及びＩＩＤを含む、以下参照のこと。
【００４６】
本発明は、低酸素誘導因子 1α（ＨＩＦ−１α）に関連する癌、疾病又は疾患に関わる症状を予防、治療又は緩和するために、一つ又はそれ以上の本発明の化合物を、動物に、好ましくは哺乳類に、最も好ましくはヒトに投与することを含む治療方法を包含する。
【００４７】
本発明は更に、治療的又は予防的に有効な量の、Ａ１又はＡ３受容体に特異的に結合する本発明化合物、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬製剤は、アデノシンＡ３アンタゴニスト及び一つ又はそれ以上の添加物を含む。製剤は、ＺＭ２４１３８５及びＳＣＨ５８６１のようなアデノシンＡ２Ａアンタゴニスト、ＭＲＥ−２０２９０−Ｆ２０及びＡＳ−１６のようなアデノシンＡ２Ｂアンタゴニスト、及びヒト化及びキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体を含む、細胞毒性薬及び他の抗血管新生剤を含む、他の抗腫瘍剤を含みうる。好ましい態様において、化合物は、腫瘍増殖を阻止するために有効な量の、アデノシンＡ３受容体アンタゴニスト、細胞毒性薬及び抗血管新生剤を含む。
【００４８】
（４．１    定義）  
本明細書で用いられるように、化合物は、アゴニストによる作用を阻止可能である場合及び競合結合アッセイにおいて[１２５Ｉ]-ＡＢ-ＭＥＣＡに置き換え可能である場合、「アデノシンＡ３受容体のアンタゴニスト」である。
【００４９】
本明細書用いられるように、Ａ３受容体に対する親和性が、Ａ１、Ａ２Ａ、及びＡ２Ｂ受容体に対する親和性より大きいならば、化合物はＡ３受容体に選択的である。好ましくは、Ａ１／Ａ３及びＡ２／Ａ３活性の比率は、約５０より大きい、好ましくは５０と１００の間、より好ましくは、約１００より大きい。Ａ３受容体の薬理は、種によって、特にげっ歯類のＡ３とヒトのＡ３受容体の間で、異なるので、ヒトアデノシン受容体においてＡ３化合物の選択性を決定することが重要である。それらが選択的であるかどうかに関して、同じことが、アデノシンＡ１とＡ２Ａ受容体に対してもあてはまる。
【００５０】
本明細書用いられる、「アデノシンＡ１アンタゴニスト」は通常の公知の意味で用いる。アデノシンＡ１アンタゴニストは、当該分野において公知である。いくらかのより公知な化合物には、ＣＰＸ、ＣＶＴ１２４、ＦＫ３５２、及びＩＬＦ１１７が含まれ、その構造もよく知られている。
【００５１】
本明細書用いられる、「アデノシンＡ３アンタゴニスト」は通常の公知の意味で用いる。アデノシンＡ３アンタゴニストは、当該分野において公知である。いくらかのより公知な化合物には、ＭＲＳ１０９７、ＭＲＳ１１９１及びＭＲＳ１２２０が含まれる（Research Biochemicals International, Natick, Mass. より入手可能）。他の適切なアンタゴニストは、Jacobson et al., Neuropharmacology, 36:1157-1165(1997); Yao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 232:317-322(1997); Kim et al., J. Med. Chem., 39(21):4142-4148(1996); van Rhee et al., Drug Devel. Res., 37:131(1996); van Rhee et al., J. Med. Chem., 39:2980-2989(1996); Siquidi et al., Nucleosides, Nucleotides 15:693-718(1996); van Rhee et al., J. Med. Chem., 39:398-406(1996); Jacobson et al., Drugs of the Future, 20:689-699(1995); Jacobson et al., J. Med. Chem., 38:1720-1735(1995); Karton et al., J. Med. Chem., 39:2293-2301(1996); Kohno et al., Blood, 88:3569-3574(1996); Jiang et al., J. Med. Chem., 39:4667-4675(1996); Yao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:317-322(1997); 及び Jiang et al., J. Med. Chem. 40:2596-2608(1996)に開示のものを含み、その内容は全てを参照として本明細書に取り込む。加えて、他の好ましいアデノシンＡ３アンタゴニストは表１に記載の文献に開示され、その開示はその全てを参照して本明細書に取り込む。  
【００５２】
本明細書で用いられる、ＨＩＦ−１α又はＡ３受容体の測定されたレベルの標準的なレベルと比べた「上昇」は、サンプルや対象におけるＨＩＦ−１α又はＡ３受容体の量又は濃度が、現在当業界で知られる、又は将来開発されるＨＩＦ−１α又はＡ３受容体を測定するためのいかなる方法で検出される標準レベルに比べて十分に高いことを意味する。例えば、測定されたレベルの標準的なレベルと比べた上昇は、あらゆる検出可能で統計的に有意な上昇であり得る。ＨＩＦ−１αの発現及び／又は活性におけるそのような上昇は、標準レベルに比べて、約１０％、約２０％、約４０％、約８０％、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２〜２０倍、２〜５０倍、２〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜１００倍に上昇することを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いられる「約」という用語は、標準的数値プラスマイナス１０％の上昇レベルであることを意味する。
【００５３】
本明細書で用いられる、「標準的なレベル」又は「バックグラウンドレベル」という用語は、一人又はそれ以上の正常対象者、すなわち既往歴がなく、現在病気、疾患又は癌に罹患していない対象において決定されるような、ＨＩＦ−１αレベルのベースラインの量を意味する。例えば、ベースラインは少なくとも一人の対象、及び好ましくは対象の平均（例えば、ｎ＝２〜１００又はそれ以上）から得られる。ここで対象又は対象者たちは、病気、疾患又は癌の履歴がなく、特にＨＩＦ−１αの発現及び／又は活性の異常レベルに関わる病気の履歴はない。本発明においては、ＨＩＦ−１αレベルの測定は、ＨＩＦ−１αプローブ又はＨＩＦ−１α活性試験を用いて実行されうる（セクション６参照）。
【００５４】
本明細書で用いられる、「増強」とは以下に定義される増強した因子を測定することで決定されるような、相乗的な効果である。一般に、一以上の増強された因子が相乗的であると考えられる。例えば、もし化合物の一つに個々の化学治療効果がほとんどない場合には、一よりも大きい増強された因子が、相乗的な効果が生じていることを示す。
【００５５】
本明細書で用いられる、「癌」とは、細胞の異常な管理されない増殖に起因する新生物又は腫瘍を意味する。ここで用いられる、癌は明白に白血病とリンパ腫を含む。「癌」という用語は、末梢部位にまで転移して、非癌細胞とは異なる表現形質、例えば、軟寒天のような３次元基質におけるコロニー形成、又は３次元基底膜又は細胞外マトリクス製剤における管状ネットワーク又はクモの巣状マトリクスの形成、を示す潜在性を有する細胞を含む疾病を意味する。非癌細胞は、軟寒天内にコロニー形成を行わず、３次元基底膜又は細胞外マトリクス製剤においては明確に球状構造をしている。癌細胞は、その進行中に、多種機構にもかかわらず、機能の特異性集合を獲得する。そのような機能は、アポトーシスの回避、成長シグナルの自給、抗成長シグナルに対する無感性、組織侵害／転移、無限の複製潜在力、及び持続的血管形成を含む。「癌細胞」という用語は、プレ悪性と悪性の両方の癌細胞を含むことを意味する。ある特定な態様において、癌は、局所にとどまっている良性腫瘍を意味する。他の態様において、癌は、隣接する身体構造を侵害し破壊して、遠位部位に広がる悪性腫瘍を意味する。更に他の態様において、癌は、特異的癌抗原に関連する。
【００５６】
本明細書で用いられる、「Ａ３を発現する癌」とは、アデノシンＡ３受容体を発現するあるいは、そうでなければアデノシン受容体の上昇した濃度を含むヒトの癌である。濃度の上昇は、類似した細胞型の正常、非癌性組織と比較することにより決定される。Ａ３を発現する癌の例には、ヒト白血病、メラノーマ、すい臓癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、悪性メラノーマ、組織球性リンパ腫、及び星状細胞腫のいくつかの形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本明細書で用いられる、ＨＩＦ−１αを発現する癌とは、ＨＩＦ−１αを発現するあるいは、そうでなければＨＩＦ−１αの上昇した濃度を含むヒトの癌である。濃度の上昇は、類似した細胞型の正常、非癌性組織と比較することにより決定される。ＨＩＦ−１αを
発現する癌の例には、子宮頚癌（早期）、メラノーマ、肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌（リンパ節転移陽性乳癌及びリンパ節転移陰性乳癌を含む）、希突起グリオーマ、口腔咽頭のへん平上皮細胞癌、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、胃の消化管間質腫瘍を含むが、これらに制限されるものではない。
【００５８】
本明細書で用いられる、「低酸素」又は「虚血」は、組織の生理機能が危険に曝される及び／又は一つ又はそれ以上の組織における血液供給が危険に曝される、あらゆる状況を意味する。これら二つの用語は、同義的に用いられてもよい。その状況はまた、一つ又はそれ以上の組織における酸素の分圧の減少を包含する。「低酸素」又は「虚血」という用語は、細胞、組織、又は臓器が、酸素欠乏又は減少した血流を経験するあらゆる状況を包含する。
【００５９】
本明細書で用いられる、「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、一つ又はそれ以上の治療薬の投与によりもたらされる、原発性の、局所性の又は転移性の癌組織の根絶、除去、調節、又は制御を意味する。ある特定の態様では、そのような用語は、一つ又はそれ以上の治療薬をそのような疾患をもつ対象に投与することによってもたらされる疾患を最小化すること、又は疾患の進行を遅くすることを意味する。
この用語はまた、ＨＩＦ−１αレベル及び／又は活性の異常レベルに関連する症状又は疾患の根絶、低減もしくは改善を意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる、「治療的有効量」とは、癌の拡大を遅らせる又は最小化するために十分な治療薬の量を意味する。治療有効量はまた、病気又は疾患の治療又は管理において、治療の有益性を提供する治療薬の量を意味する。更には、本発明の治療薬に関する治療有効量は、治療薬単独、又は、疾患の治療又は管理に治療的な有益性を提供する他の治療法との組み合わせにおける量を意味する。本発明の化合物の量と関連して使用される場合には、本用語は、治療全体を改善し、好ましくない効果を減弱又は避け、若しくは他の治療薬との相互作用による治療的な有効性を増強する量を包含しうる。
【００６１】
本明細書で用いられる、「予防薬」及び「複数の予防薬」という用語は、疾患の予防、又は病気の再発若しくは拡大の防止において用いられうるあらゆる薬剤を意味する。予防的に有効な量は、疾患、特に癌の再発若しくは拡大、又はこれに限定されないが過剰増殖性疾患に罹りやすいヒト、例えば遺伝的に癌にかかりやすい又は過去に発癌性物質にさらされたようなヒト、を含む、このような患者の発生、を予防するのに十分な予防薬の量を意味する。予防的に有効な量はまた、疾患を防ぐ際に、予防効果を提供する予防薬の量を意味する。更には、本発明の予防薬に関する予防的に有効な量は、疾患の阻止に予防効果を提供する予防薬単独、又は他の薬剤との組み合わせにおける予防薬の量を意味する。本発明の化合物の量と関連して使用される場合には、本用語は、予防全体を改善し、又は、その予防的な有効性、又はこれに限定されるものではないが治療的な抗体のような他の予防薬との相互作用を増強する量を包含することができる。
【００６２】
本明細書で用いられる、「管理する」、「管理すること」及び「管理」という用語は、予防薬又は治療薬の投与から対象が受ける有益な効果であって、疾患もしくは病気の治療につながらないものを意味する。ある特定の態様では、対象は、疾患の進展又は悪化を防ぐために疾患を「管理する」一つ又はそれ以上の予防薬又は治療薬を投与される。
【００６３】
本明細書で用いられるように、「予防する」、「予防している」及び「予防」という用語は、予防薬の投与により対象にもたらされる、病気もしくは疾患の予防又は回避、又は疾患の一つ又はそれ以上の症状の再発若しくは発症を遅らせることを意味する。
【００６４】
本明細書で用いられる、「組み合わせて」という用語は、一つ以上の予防薬及び／又は治療薬の使用を意味する。「組み合わせて」という用語の使用は、予防薬及び／又は治療薬が疾患、例えば過剰増殖性細胞異常、特に癌、に罹患した患者に投与される順番を制限しない。最初の予防薬又は治療薬は、２番目の予防薬又は治療薬の投与に前もって（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間前）、同時に、又は後に続いて（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間又は１２週間後）、疾患に罹患した、罹患している、又は疾患に罹患しうる対象に投与されうる。予防薬又は治療薬は、他の方法で投与された場合に比べて増大した有益性を提供するために、本発明の薬剤が他の薬剤とともに作用し得る順序及び間隔を置いて対象に投与される。あらゆる付加的な予防薬又は治療薬は、他の付加的な予防薬又は治療薬とともにあらゆる順番で投与されうる。
【００６５】
本明細書で用いられる、「アルキル」という用語は、好ましくは１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１０の炭素原子を（「低級アルキル」）、及び最も好ましくは１〜６の炭素原子を有する、一価の直鎖、分枝鎖又は環状飽和炭化水素基を意味する。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｎ−へキシル等のような基によって例示される。
「アルキレン」及び「低級アルキレン」という用語は、対応するアルカンの二価のラジカルを意味する。
更に、本明細書で用いられる、アルコキシル、アルカノイル、アルケニル、シクロアルケニル等のような、アルカンに由来する名を有する他の残基が、「低級」で修飾されるとき、これらは１０個又はそれ以下の炭素原子の炭素鎖を有する。
最小炭素数が１より大きいような場合、例えばアルケニル（最小２炭素）及びシクロアルキル（最小３炭素）、「低級」とは、少なくとも最小の炭素数を意味する、と理解される。
【００６６】
本明細書で用いられる、「置換アルキル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシロキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシロキシ、オキシアシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及びモノ−及びジ−アルキルアミノ、モノ−及びジ−（置換アルキル）アミノ、モノ−及びジ−アリールアミノ、モノ−及びジ−ヘテロアリールアミノ、モノ−及びジ−複素環アミノ、及び、アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、及び置換複素環から選択される異なる置換基を有する非対称二置換アミン、からなる群より選択される１〜５個の置換基、好ましくは１〜ら３個の置換基を有し、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する（「置換低級アルキル」、アルキル基を意味する。本明細書で用いられる、接頭辞「置換」を有する他の残基は、一つ又はそれ以上の上記の置換基を含むことを意味する。
【００６７】
本明細書で用いられる、「アラリキル」は、アリール置換基を持つアルキル基を意味する。アルキル基を介して結合されている。「アルカリール」は、アルキル置換基を持つアリール基を意味し、アリール基を介して結合されている。
【００６８】
本明細書で用いられる、「アルコキシ」という用語は、「アルキル−Ｏ−」基を意味し、アルキルは上記定義の通りである。好ましいアルコキシ基は、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等を含む。
【００６９】
本明細書で用いられる、「アルケニル」という用語は、好ましくは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素原子を有し、そして少なくとも１個そして好ましくは１〜２の二重結合を有する、不飽和の直鎖又は分枝鎖炭化水素基を意味する。好ましいアルケニル基は、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、ｎ−プロペニル（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、ｉｓｏ−プロペニル（−Ｃ(ＣＨ３)＝ＣＨ２）等を含む。
【００７０】
本明細書で用いられる、「アルキニル」という用語は、好ましくは、２〜１０個の炭素原子、より好ましくは２〜６個の炭素分子を有し、そして少なくとも１個そして好ましくは１〜２個のの三重結合を有する、不飽和の直鎖、又は分枝鎖炭化水素基を意味する。
【００７１】
本明細書で用いられる、「アシル」は、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、及び複素環−Ｃ（Ｏ）−基を意味し、ここでは、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は本明細書に定義の通りである。
【００７２】
本明細書で用いられる、「アミノアシル」という用語は、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ３３Ｒ３３基を意味し、ここで各Ｒ３３は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール又は複素環であり、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール及び複素環は本明細書に定義の通りである。
【００７３】
本明細書で用いられる、「アシルアミノ」という用語は、Ｒ３４−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ３３）−基を意味し、ここで各Ｒ３４は、独立して、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール又は複素環であり、ここで、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は本明細書に定義の通りである。
【００７４】
本明細書で用いられる、「アシルオキシ」という用語は、Ｒ３４−Ｃ（Ｏ）−基を意味し、ここで各Ｒ３４は、独立して、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は複素環であり、ここで、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及び複素環は本明細書に定義の通りである。
【００７５】
本明細書で用いられる、「アミノ酸」という用語は、自然にタンパク質中に生成し、特異的立体化学特性を問わないようなアミノ酸から選択される、αアミノ酸を意味する。
「保護されたアミノ酸」という用語は、αアミノ基を反応性の低い残基に転換し、しかしその残基は比較的容易にアミノ基に変換し直すことができるような、アミノ酸を意味する。
「アミノ酸残渣」と「アミノ酸部分」という用語は、本発明では同意語として用いる。
【００７６】
本明細書で用いる、「アリール」という用語は、単環(例えばフェニル)、又は融合(縮合)多環(例えばナフチル又はアントリル)を有する、６〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を意味する。好ましいアリールは、フェニル、ナフチル等を含む。アリール置換基に関する定義に特に他の制約がなければ、そのようなアリールは、ヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルカリール、アラルキル、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、アルキルチオ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、トリハロメチルよりなる群から選択される１〜５個の置換基、好ましくは１〜３個の置換基で、置換されうる。好ましい置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、トリハロメチル、及びチオアルコキシを含む。
【００７７】
本明細書で用いる、「シクロアルキル」という用語は、単環又は多縮合環を有する、３〜１２個の炭素原子の環状アルキル基を意味する。そのようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等のような単環構造を含む。
【００７８】
本明細書で用いる、「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素、好ましくはフッ素又は塩素のいずれかを意味する。
【００７９】
本明細書で用いる、「ヘテロアリール」という用語は、１から１５個の炭素原子及び少なくとも１つの環内（環が１つ以上の場合)に酸素、窒素及び硫黄よりなる基から選択される１〜４個のヘテロ原子からなる、芳香族炭素環基を意味する。
【００８０】
ヘテロアリール置換基に関する定義に特に他の制約がなければ、そのようなヘテロアリール基は、ヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルカリール、アラルキル、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及びトリハロメチルよりなる群から選択される、１〜５個の置換基、好ましくは１〜３個の置換基で置換されうる。好ましい置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、トリハロメチル、及びチオアルコキシを含む。そのようなヘテロアリール基は、単環(例えばピリジル又はフリル)又は縮合多環（例えばインドリジニル又はベンゾチエニル）を有することができる。
【００８１】
「複素環」又は「複素環の」は、１から１５個の炭素原子及び環内に窒素、硫黄及び酸素からなる基からから選ばれる１〜４個のヘテロ原子の、単環又は縮合多環を有する、一価の飽和又は不飽和炭素環基を意味する。
【００８２】
複素環置換基に関する定義に特に他の制約がなければ、そのような複素環基は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、トリハロメチル等よりなる基から選択される、１〜５個の置換基で置換されうる。そのような複素環基は、単環又は縮合多環を含み得る。
【００８３】
一つ又はそれ以上の置換基を含む上記の基に関して、そのような基には、当然、立体的に非実際的な及び／又は合成的に実現不可能な、いかなる置換基又は置換基形態も含めない、ということは理解される。
【００８４】
本明細書で用いる、「カルボン酸誘導体」及び「スルホン酸誘導体」は、−Ｃ（Ｘ）Ｒ３１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ３１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ３１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ３１、−ＳＯｂＲ３１、−ＳＯｂＯＲ３１、−ＳＯｂＳＲ３１又は−ＳＯｂＮ(Ｒ３１)２を意味し、ここでＸは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ３１、であり、Ｒ３１は、水素、アルキル、置換アルキル、又は、アリール、及び、無水物、エステル及び塩素、臭素及びヨウ素のようなハロゲン化物のような、活性化されたその誘導体である。
【００８５】
「薬学的に許容される塩」は、式ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ及びＩＩＤの化合物の薬学的に許容される塩であり、それらの塩は、当該技術分野で公知の種々の有機及び無機対イオンから得られる塩であり、単なる一例にすぎないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等を含む。分子が塩基官能性を含む場合は、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシレート、アセテート、マレイン酸塩、シュウ酸塩等のような、有機又は無機酸の塩が、薬学的に許容される塩として用いられ得る。
【００８６】
（５．発明の詳細な説明）
本発明は部分的に、固形腫瘍の低酸素領域内に存在するプリンヌクレオシドであるアデノシンが、低酸素応答因子−１（ＨＩＦ−１）の発現を調節する、という本発明者の驚くべき発見に基づいている。ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βサブユニットからなるヘテロ二量体性の転写因子である、ＨＩＦ−１は、腫瘍増殖と血管形成に関連している。本発明者らは、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株アデノシンが、低酸素状態に応答して用量及び経時依存態様でＨＩＦ−１αタンパク質の発現を上方調整することを、見出した。アデノシンに対する応答は、Ａ１、Ａ２Ａ又はＡ２Ｂ受容体アンタゴニストには阻害されないが、Ａ３受容体アンタゴニストにより阻止される。本発明者らは、Ａ３受容体と高親和性に結合しているアデノシンアナログであるＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡが、低酸素状態の細胞中にアデノシン効果を再現する、ことを見出した。更に、Ａ３受容体アンタゴニストは、Ａ３受容体刺激に応答して、ＨＩＦ−１αタンパク質蓄積を阻止する。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、アデノシンに対する応答は細胞表面に、Ａ３受容体発現の阻害後、小低分子干渉ＲＮＡを用いることにより、ヌクレオシド効果を阻止した。低酸素状態においてＡ３受容体刺激に維持される主要細胞内シグナル伝達経路には、ｐ４４／ｐ４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）とｐ３８ＭＡＰＫ活性を含む。ゆえに、本発明者らは、アデノシンが低酸素状態におけるＨＩＦ−１α調整において重要な役割を果たす、ことを最初に見出した。
【００８７】
本発明者らは、アデノシン受容体のアンタゴニスト、好ましくはＡ３受容体である化合物が、増殖腫瘍細胞において、そのような細胞が酸素を渇望する時（即ち、適正な脈管構造が生成される前)に、又は抗血管形成剤が投与される時に、アデノシン保護効果を阻害することを見出した。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、本発明のアンタゴニストは、アデノシンと同じ位置に結合できる、又はアロステリックアンタゴニストになれる（即ち、アデノシンが結合する位置とは異なる位置に結合するが、その位置に結合するアデノシンの能力に悪影響を及ぼす又は増殖腫瘍細胞を保護するために一旦アデノシン受容体、特にＡ３受容体に結合したアデノシンの能力に悪影響を及ぼす)。
【００８８】
従って、本発明は、アデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニスト単独か又はＡ１受容体アンタゴニストと組合せて用いることにより、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び/又は増大するＨＩＦ−１α活性に関連する疾患や疾病の治療、予防及び/又は管理の方法に関する（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）。特定の作用機構に縛られることを意図するものではなく、アデノシン受容体に対するアンタゴニストの投与は、低酸素状態に対する保護効果を拮抗して、低酸素状態による破壊に対するそのような細胞の感受性を提供する。アデノシン受容体、特にＡ３受容体が、虚血に対する細胞の持続的保護に関与しているように、アデノシン受容体に対するアンタゴニスト、特にＡ３受容体は、抗腫瘍剤の活性促進に特に効果的である。
【００８９】
Ａ３受容体アンタゴニストを含む本発明の方法と組成物は、当業者に知られ本明細書に開示される方法を用いて決定されるような、ＨＩＦ−１αの発現及び／又は活性のレベルが、標準的レベル又はバックグラウンドレベル以上に上昇しているときに、特に有用である。本明細書で用いられる、ＨＩＦ−１αの測定されたレベルの標準レベルの「上昇」とは、当該技術分野で公知又は将来開発されるＨＩＦ−１αを測定するための方法の何れかで検出される標準と比較して、サンプル又は対象のＨＩＦ−１α量又は濃度が高いこと、を意味する。例えば、標準レベルと比べた測定レベルの上昇は、あらゆる統計的に有意義な検出可能な上昇であり得る。そのような上昇は、ＨＩＦ−１α発現及び／又は活性が、標準の約１０％、約２０％、約４０％、約８０％、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２〜２０倍、２〜５０倍、２〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜１００倍に上昇することを含みうるが、それらに限定されるものではない。本明細書で用いられる「約」という用語は、標準的数値のその数値のプラスマイナス１０％の変動レベルを意味する。
【００９０】
本明細書で用いられる「標準レベル」又は「バックグラウンドレベル」という用語は、一つ又はそれ以上の正常対象、すなわち過去又は現行に病気又は疾患の既往歴がない対象者において決定されるようなＨＩＦ−１αレベルのベースライン量を意味する。例えば、ベースラインは、少なくとも一人の対象者から得られ、好ましくは対象の平均（例えば、ｎ＝２〜１００又はそれ以上）の平均値から得られうる、ここで対象者とは、病気又は疾患の既往歴のない、特にＨＩＦ−１αの発現及び／又は活性の異常なレベルに関連する疾患の既往歴のない対象者である。
【００９１】
本発明において、ＨＩＦ−１αレベルの測定は、ＨＩＦ−１αプローブ又はＨＩＦ−１α活性測定法（セクション５．３．４を参照されたい）を用いて実施される。本明細書で用いられる、本発明の方法におけるＨＩＦ−１αのレベル測定の参考は、ＨＩＦ−１αレベルのあらゆる代用物に関する。例えば、そのようなレベルは、これらに限定されるものではないが、対象由来のサンプル中のＨＩＦ−１α核酸又はアミノ酸配列の量を含んでもよい。ＨＩＦ−１αレベルは、ＨＩＦ−１αの全長タンパク質の量に対応してもよい。あるいは、ＨＩＦ−１αのレベルは、ＨＩＦ−１αタンパク質の断片、類似物、又は誘導体の量に対応してもよい。ＨＩＦ−１αレベルは、ＨＩＦ−１αの全長又は断片に対応する核酸（又はそれに相補的な配列）の量を測定することにより決定される。より好ましい態様では、ＨＩＦ−１αをコードするｍＲＮＡの量が測定される。
【００９２】
本明細書で用いられる、ＨＩＦ−１αの量又は濃度を決定できるプローブは、これらに限定されないが、抗体、抗原、核酸、タンパク質又は小分子を含む。特定の態様では、プローブはＨＩＦ−１αタンパク質又はその断片である。別の態様では、プローブは、例えばモノクローナル抗体又はその結合断片のような、免疫学的に特異的にＨＩＦ−１αに結合する抗体である。
【００９３】
特定の態様では、ＨＩＦ−１αのレベルを測定することは、（a）アリコートに、ＨＩＦ−１αに対し免疫学的に特異的である抗体又はその断片を接触させること、及び（b）抗体又はその断片とアリコート中のＨＩＦ−１αの少なくとも一種との間で結合が起こるかどうか、及びどの程度起こるかを検出すること、からなる上記の試験段階である、サンプルの少なくとも１つのアリコートを試験することを含む。別の特定の態様では、ＨＩＦ−１αのレベルを測定することは、（a）アリコートに、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸プローブと接触させること、及び（b）核酸プローブとアリコート中のＨＩＦ−１αｍＲＮＡの少なくとも一種との間でハイブリダイゼーションが起こるかどうか、及びどの程度起こるかを検出すること、からなる試験段階を含む、少なくとも１つのアリコートを試験することを含む。両方の態様では、ＨＩＦ−１αのレベルを測定することは、複合体形成量を定量することを含む。例えば、抗体又はその断片とアリコート中のＨＩＦ−１αの少なくとも一種の間の複合体形成量は、サンプルのアリコート中のＨＩＦ−１αの少なくとも一種の量と相関するであろう。
【００９４】
更なる特定の態様では、抗体又は他のプローブは、検出可能なマーカーで標識される。別の特定の態様では、検出可能なマーカーは、化学発光、酵素、蛍光、又は放射性の標識である。
【００９５】
本発明の治療方法は、伝統的な治療法に比べて、ＨＩＦ−１αの発現及び／又は増加するＨＩＦ−１α活性に関連する病気又は疾患（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療効果を改善するために、本発明の治療に有効な量のＡ３受容体アゴニストを投与することを含む。好ましくは、本発明の方法は、治療計画の開始から１日、１週間、１ヶ月又は２ヶ月以内に、ＨＩＦ−１αレベルをバックグラウンドレベルに減少させる。好ましくは、本発明の方法が一旦ＨＩＦ−１αレベルを特定レベルまで減少させると、治療計画中は、そのレベルが維持され、維持されるＨＩＦ−１αレベルは疾病、例えば癌の退化をもたらすのに十分及び効果的なものである。
【００９６】
最も好ましい態様では、本発明の方法は、ＨＩＦ−１αレベルをバックグラウンドレベルまで減少させる。本発明は、ＨＩＦ−１αレベルをバックグラウンドレベルの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％以内のレベルまで減少させることを包含する。
【００９７】
好ましい特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されるＡ３アンタゴニスト化合物の治療的及び／又は予防的有効量を、投与することを含む、ＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増大したＨＩＦ−１α活性に関連する疾病又は疾患（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療、予防及び／又は管理のための方法を包含する。
【００９８】
本発明は、対象におけるＨＩＦ−１αの過剰発現及び／又は増大したＨＩＦ−１α活性に関連する疾病又は疾患の予後を決定するための方法を包含する。好ましくは、対象はヒトである。他の態様においては、対象は以前に治療計画を処置されている。本発明は、対象が本発明の治療的及び／又は予防的方法の必要性があるかどうかを決定するために、対象の少なくともＨＩＦ−１αレベルを測定することを包含する。本発明は、対象から得たサンプル中のＨＩＦ−１αレベルを測定し、測定されたレベルと標準的なレベルを比較することを包含する、本明細書で標準的なレベルと比較して少なくとも１つのＨＩＦ−１αの測定されたレベルの上昇は、対象が疾病又は疾患、例えば癌の転移の増大した危険性を有していることを意味する。
【００９９】
本発明は、本発明の方法において使用されるアデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３アンタゴニストである化合物を包含する。そのような化合物の例は、米国特許第６，３２６，３９０号；同第６，４０７，２３６号；同第６，４４８，２５３号；同第６，３５８，９６４号及び米国特許出願公開第２００３／０１４４２６６号公報及び同第２００４／００６７９３２号公報であり；これらの全ては、その全てを参照して本明細書に取り込む。更に、他の好適なアデノシンＡ３アンタゴニストは表１に記載の参考文献に開示され、この開示を参照して本明細書に取り込む。
【０１００】
本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、例えば、単一薬剤療法として又は他の形態の癌治療法と組み合わせて、癌の予防、治療及び/又は管理に、特に有用である。好ましい態様において、本発明は、これらに限定されないが、ヒト白血病、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、悪性メラノーマ、組織球性リンパ腫及びある種の星状細胞腫を含み、Ａ３受容体発現癌である癌の予防、治療又は管理方法を包含する。他の好ましい態様において、本発明は、これらに限定されないが、子宮頚癌（早期）、肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌（リンパ節転移陽性乳癌及びリンパ節転移陰性乳癌を含む）、希突起グリオーマ、口腔咽頭のへん平上皮細胞癌、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、胃の消化管間質腫瘍を含み、高レベルのＨＩＦ−１α発現を伴う癌の予防、治療又は管理の方法を包含する。本発明の方法は、特に、生物学的効果が腫瘍性低酸素細胞に観察されるような、ここで高アデノシン濃度が増加したＨＩＦ−１α蓄積をもたらすような、組織に選択性を提供する癌治療に特に有用である。
【０１０１】
Ａ３受容体アンタゴニスト(又はＡ１受容体アンタゴニスト又はそれらの組合せ）を含む本発明の方法及び化合物は、特に、固形腫瘍の治療、阻害又は退化に有用である。本明細書で用いる「固形腫瘍」とは、これらに限定されないが、喉頭腫瘍、脳腫瘍、及び他の頭頸部癌；結腸、直腸及び前立腺腫瘍；乳及び胸部固形腫瘍；卵巣及び子宮腫瘍；食道、胃、膵臓及び肝臓癌；膀胱及び胆嚢癌；メラノーマのような皮膚腫瘍を含み、細胞の大部分が腫瘍細胞又は腫瘍関連細胞である所の、腫瘍細胞の所在を意味する。更に、本発明に包含される腫瘍は、原発性癌、又は身体内の他の場所の癌細胞が胸部に転移することに起因する二次の腫瘍のどちらかでもあり得る。
【０１０２】
本発明は、ヒトを含む哺乳類における腫瘍の増殖を阻害する本発明のアデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニストの使用を包含する。本発明は、腫瘍細胞を保護するアデノシンの作用力を阻止するのに、アデノシン受容体アンタゴニスト、好ましくはＡ３受容体アンタゴニストの有効量を投与する方法を包含する。
【０１０３】
他の態様において、本発明は、他の治療的及び/又は予防的薬剤、例えば、細胞毒性薬剤と組合せて使用するアデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニストを投与することを包含する、癌の治療、予防及び/又は管理に関する方法を包含する。本発明者らは驚異的に、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、相乗的に細胞毒性療法を増強させ、幾つかの形態の多剤耐性に対抗する、ことを見出した。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、本発明の組合せ治療は、腫瘍細胞を直接攻撃して、腫瘍細胞の周りの新生血管の増殖を阻止して、アデノシンＡ３アンタゴニストの効力により、新生血管が増殖すること無しに細胞の残存する能力を阻止するであろう。本発明者らは、高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、アデノシンＡ３受容体発現の癌の多くの化学療法の促進剤として有用であることを見出した。驚異的にも、高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、Ｐ−糖タンパク質(Ｐ−ｇｐ）放出ポンプ多剤耐性（ＭＤＲ）にもまた対抗する。最終的に、高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、細胞毒性薬、例えばタキサンの副作用を軽減又は緩和するのに有用である。
【０１０４】
他の態様において、本発明は、アデノシンＡ３受容体発現の癌の化学療法を促進するために、及びＰ−糖タンパク質又はＭＲＰを発現する癌における多剤耐性に対抗するための、高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用を包含する。好ましい態様において、タキサン系、ビンカアルカロイド、カンプトテシン又は抗生物質の投与前又は投与中に、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを投与する。好ましい高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、本明細書の以下に記載の一般式ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ及びＩＩＤの化合物を含む。
【０１０５】
本発明は、低酸素誘導因子−1α（ＨＩＦ−１α）に関連する癌、疾病又は疾患に関わる症状を予防、治療又は緩和するために、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を、動物に、好ましくは哺乳類に、最も好ましくはヒトに投与することを含む治療方法を包含する。
【０１０６】
本発明は更に、Ａ１又はＡ３受容体に特別に結合する、治療的又は予防的に有効な量の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、好ましくは、Ａ３受容体アンタゴニスト及び１つ又はそれ以上の賦形剤を含む。製剤は、ＺＭ２４１３８５及びＳＣＨ５８６１のようなアデノシンＡ２Ａアンタゴニスト、ＭＲＥ−２０２９０−Ｆ２０及びＡＳ−１６のようなアデノシンＡ２Ａアンタゴニスト、及びヒト化及びキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体を含む、細胞毒性薬及び他の抗血管新生剤を含む、更に他の抗腫瘍剤を含みうる。好ましい態様において、組成物は、腫瘍増殖を阻止するために有効な量のアデノシンＡ３受容体アンタゴニスト、細胞毒性薬及び抗血管新生剤を包含する。
【０１０７】
（６．１  本発明の化合物）
（６．１．１  一般式ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＣの化合物）
具体的態様において、本発明は、以下の一般式ＩＩＡ及びＩＩＢを含む化合物、又は薬学的に許容可能なその化合物の塩の有効量を、必要とする患者に投与することからなる、ＨＩＦ−１αに関連する疾病又は疾患の患者における治療方法を提供する。
【０１０８】
【化００５】
2008520746.tif 000019
2008520746.tif 000020
【０１０９】
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール、又はトリアゾールであり；
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１、又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり；
【０１１０】
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環、置換複素環、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は、窒素原子に結合している場合には、窒素原子とともにアゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５−６員の複素環を形成し；
Ｒ２は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり；
Ｒ３は、置換ヘテロアリール環に関して本明細書に記すような置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェンであり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり；
ｂは、１又は２、である。
【０１１１】
好ましいＲ１は、水素；Ｃ１〜Ｃ８のアルキル；Ｃ２〜Ｃ７のアルケニル、Ｃ２〜Ｃ７のアルキニル；Ｃ３〜Ｃ７のシクロアルキル；一つ又はそれ以上のハロゲン原子、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７のシクロアルキル又は式−ＮＲ３２Ｒ３２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３２Ｒ３２の基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル；アリール、Ｃ１〜Ｃ４のアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４のハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ４のハロアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミドよりなる群から選択された置換基で置換されたアリール；アリール部分が上記のアリール基における置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、Ｃ７〜Ｃ１０のアラリキル；Ｈｅｔが、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択されたヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む、５〜６員の芳香族又は非芳香族の複素環であり、ｍが０〜５の整数、ある特定の態様においては１〜５である、式−（ＣＨ２）ｍ−Ｈｅｔの基；である。
【０１１２】
好ましいＣ１〜Ｃ８のアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びイソペンチルである。Ｃ３〜Ｃ７のシクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロペンチル及びシクロへキシルを含む。Ｃ３〜Ｃ７のシクロアルキル基で置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基の例は、シクロへキシルメチル、シクロペンチルメチル、及び２−シクロペンチルエチルを含む。置換されたＣ１〜Ｃ５のアルキル基の例は、２−ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、３−アミノプロピル、２−（４−メチル−１−ピペラジン）エチル、２−（４−モルホリニル）エチル、２−アミノカルボニルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−ジメチルアミノプロピルを含む。アリールは、好ましくはフェニルであり、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメトキシ基で置換されていてもよい。Ｎ、Ｏ及び／又はＳを含む５〜６員の複素環の基の例は、ピペラジニル、モルホリニル、チアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、トリアゾリル、テトラゾリルを含む。Ｃ７〜Ｃ１０のアラリキル基の例は、Ｃｌ、Ｆ、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル、及びジフルオロメトキシから選択された置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、ベンジル又はフェネチルを含む。
【０１１３】
好ましくは、Ｒ１は、置換されていてもよい、好ましくはハロゲン原子で置換されていてもよい、水素、Ｃ１〜Ｃ８のアルキル、アリール又はＣ７〜Ｃ１０のアラリキルである。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ２はＣ２−Ｃ３アルキル又は置換アルキルであり、そしてＲ３はフランである。
【０１１４】
具体的態様において、Ｒ２がアルキルである。
【０１１５】
特に好ましい化合物は、Ｒが、塩素、フッ素原子、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル及びジフルオロメトキシ基からなる群より選択された置換基の一つ又はそれ以上でフェニル環が置換されている、フェネチル基であるようなものである。
【０１１６】
Ａの最善の意味は、以下の構造式で示される。
【０１１７】
【化００６】
2008520746.tif 000021
【０１１８】
具体的な態様において、本発明は、一般式ＩＩＡを有する化合物、又は薬学的に許容されるその化合物の塩の有効量を、その必要のある患者に投与することからなる、患者におけるＨＩＦ−１αに関連する疾病又は疾患を治療する方法を提供する。
式ＩＩＡにおいて、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール、又はトリアゾールであり；
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｎＲ１、−ＳＯｎＳＲ１、又は−ＳＯｎＮ(Ｒ１)２であり；
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、複素環、低級アルケニル、低級アルカノイルであるか、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５〜６員の複素環を形成し；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール又はアリールであり；
Ｒ３は、ヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシロキシ、アシルアミノ、アルカリール、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換アルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール、及びトリハロメチルからなる群より選択される１つ又はそれ以上で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、ベンジピロール、ベンゾチオフェンであり；      
Ｘは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ１であり；そして
ｎは、１又は２である。
【０１１９】
本発明の具体的な態様においては、前記方法がＲ２が、水素、アルキル、アルケニル及びアリールからなる群から選択される、一般式ＩＩＡの化合物を用いて施行される。
【０１２０】
他の本発明の具体的な態様においては、前記方法がＡがトリアゾロ環である、一般式ＩＩＡの化合物を用いて施行される。
【０１２１】
その他の本発明の具体的な態様においては、前記方法がＡがピラゾロ環である、一般式ＩＩＡの化合物を用いて施行される。
【０１２２】
本発明の具体的な態様において、前記方法が高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストとして、一般式ＩＩＣで示される「フェニル−カルバモイル−アミノ」化合物及びその薬学的塩を用いる。
【０１２３】
【化００７】
2008520746.tif 000022
【０１２４】
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール、又はトリアゾールであり；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アラルキル、置換アラルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール又はアリールであり；
Ｒ３は、フランであり；そして
Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環又は置換複素環である。
【０１２５】
一般式ＩＩＡ及びＩＩＣの化合物の例は、これに限定されないが、以下の表２及び表３に記載される化合物を含む。
【０１２６】
【表２】
2008520746.tif 000023
2008520746.tif 000024
【０１２７】
【表３】
2008520746.tif 000025
【０１２８】
（６．１．２  一般式ＩＩＤの化合物）  
他の具体的態様において、本発明は、以下の一般式ＩＩＤを有する化合物、又はその薬学的に許容される化合物の塩の有効量を、その必要のある患者に投与することからなる、患者におけるＨＩＦ−１αに関連する疾病又は疾患を治療する方法を提供する。
【０１２９】
【化００８】
2008520746.tif 000026
【０１３０】
式中の、
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｂＲ１、−ＳＯｂＯＲ１、−ＳＯｂＳＲ１、又は−ＳＯｂＮ（Ｒ１）２であり；
Ｒ１は、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、低級アルケニル、低級アルカノイルであるか、又は、窒素原子と結合していれば窒素原子とともに、アゼチジン環又はＮ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む５〜６員の複素環を形成し；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、好ましくはクロロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、アラリキル、置換アラリキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、又は置換ヘテロアリールであり；
Ｒ３は、置換ヘテロアリール環に関して本明細書に記載されているような置換基の一つ又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェンであり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１であり；そして
ｂは、１又は２、である。
【０１３１】
ある特定の態様において、化合物は、Ｒが−Ｃ(Ｘ)Ｒのときは、Ｒ２はハロゲンではないという条件の、上記の式ＩＩＤの化合物である。好ましいＲ基は、ＸがＯである、−Ｃ(Ｘ)-Ｎ(Ｒ１)２である。
【０１３２】
一般式ＩＩＤに関して、好ましくは、Ｒ１が、水素；Ｃ１−８アルキル；Ｃ２−７アルケニル、Ｃ２−７アルキニル；Ｃ３−７シクロアルキル；一つ又はそれ以上のハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ３−７シクロアルキル又は式−ＮＲ３２、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ３２の基で置換されたＣ１−５アルキル；アリール、置換アリール（ここで、置換基はＣ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキル、ニトロ、アミノ、シアノ、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−４ハロアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミドよりなる群から選択される）；アリール部分が上記のアリール基について示されている置換基の一つ又はそれ以上で置換されていてもよい、Ｃ７−１０アラリキル；Ｈｅｔが、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群より選択されるヘテロ原子を一つ又はそれ以上含む、５〜６員の芳香族又は非芳香族の複素環であり、ｍが１から５の整数である、式-(ＣＨ２)ｍ-Ｈｅｔの基である。
【０１３３】
一般式ＩＩＤの化合物に関して、好ましいＣ１−８アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びイソペンチルである。Ｃ３−７シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロペンチル及びシクロへキシルを含む。Ｃ３−７シクロアルキルで置換されたＣ１−５アルキル基の例は、シクロへキシルメチル、シクロペンチルメチル、及び２−シクロペンチルエチルを含む。置換されたＣ１−５アルキル基の例は、２−ヒドロキシエチル、２−メトキシエチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、３−アミノプロピル、２−（４−メチル−１−ピペラジン）エチル、２−（４−モルホリニル）エチル、２−アミノカルボニルエチル、２−ジメチルアミノエチル、３−ジメチルアミノプロピルを含む。アリールは、好ましくはフェニルであり、Ｃｌ、Ｆ、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメトキシ基で置換されていてもよい。Ｎ、Ｏ及び／又はＳを含む５〜６員の複素環基の例は、ピペラジニル、モルホリニル、チアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、フリル、チエニル、ピロリル、トリアゾリル、テトラゾリルを含む。Ｃ７−１０アラリキル基の例は、Ｃｌ、Ｆ、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル、及びジフルオロメトキシから選択される一つ又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい、ベンジル又はフェネチルを含む。好ましくは、Ｒ１は、水素、Ｃ１−８アルキル、アリール、又は、置換されていてもよい、好ましくはハロゲン原子で置換されていてもよい、水素、Ｃ１−８アルキル、アリール又は、Ｃ７−１０アラリキルである。好ましくは、ＸはＯであり、Ｒ２は、クロロ、Ｃ２−３アルキル又は置換アルキルであり、そしてＲ３はフランである。             
【０１３４】
特に好ましい化合物は、Ｒが、フェニル環が塩素、フッ素原子、メトキシ、ニトロ、シアノ、メチル、トリフルオロメチル及びジフルオロメトキシ基からなる群より選択さる一つ又はそれ以上の置換基で置換されている、フェネチル基であるようなものである。    
【０１３５】
式ＩＩＤの化合物の例は、これに限定されないが、以下の表に記載される化合物を含む。
【０１３６】
【表４】
2008520746.tif 000027
【０１３７】
（６．２  本発明の化合物の製造方法）
一般式：ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＣの化合物は、例えば、米国特許第６４０７２３６号；同第６４４８２５３号及び米国特許出願第１０／１３４２１９号公報（２００２年４月２６日出願）に記載のように製造でき、これら全体を参照することによりこれらの開示は本明細書に含まれる。一般式：ＩＩＤの化合物は、例えば、米国特許番号第６３５８９６４号に記載のように製造でき、これ全体を参照することによりこの開示は本明細書に含まれる。
【０１３８】
必要とするところの、 本明細書に使用する化合物の製造に用いるある特定の合成中間体は、反応部分を含んでいてもよい。それら有機化学分野における技術が、反応性の及び不安定な機能基を、特別な反応又は一連の反応に先駆けて、しばしば保護しなければならない、更に最終反応が完了した後にそれらの原形に戻すことで、評価されるであろう。通常、基は相対的に安定な誘導体に変換することにより、保護される。例えば、水酸基はエーテル基に、そしてアミノ基は、アミド又はカルバメートに変換されてもよい。保護及び脱保護方法は、「ブロック」及び「脱ブロック」としても知られるように、当該技術分野において公知であり広く実施されている、例えば、「T.Greeen,Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, New York(1981)」又は「Protective Groups in Organic Chemistry, Ed.J.F.W. McOmie, Plenum Press, London (1973)」を参照されたい。
【０１３９】
（６．３  予防及び治療方法）
本発明は、Ａ３受容体アンタゴニスト単独又はＡ１受容体アンタゴニストと組み合わせて用いることによる、ＨＩＦ−１αの発現及び／又はＨＩＦ−１α活性の増大に関連する疾患及び疾病（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸系疾患）の治療、予防及び管理のための方法に関する。
【０１４０】
本明細書に記載する方法を用いて測定した、当業者に公知の及び本明細書に開示の方法を用いて測定される、ＨＩＦ−１α発現及び／又は活性のレベルが標準又はバックグラウンドレベルを越えて上昇した時に、特に有用である。例えば、標準レベルと比べた測定レベルの上昇とは、あらゆる統計的に有意な検出可能な上昇であってもよい。そのようなＨＩＦ−１α発現及び／又は活性の上昇は、標準と比べて、約１０％、約２０％、約４０％、約８０％、約２倍、約４倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、約１００倍、約２倍〜２０倍、約２倍〜５０倍、約２倍〜１００倍、約２０倍〜５０倍、約２０倍〜１００倍の上昇を含んでいてよく、しかしこれらに限定されるものではない。本明細書に使用される「約」という用語は、標準数値のプラス又はマイナス１０％の上昇レベルを意味する。
【０１４１】
本発明のＡ３受容体アンタゴニストの治療有効量を投与することからなる本発明の治療方法は、従来のそのような治療の方法と比べて、ＨＩＦ−１αの発現及び／又はＨＩＦ−１α活性の増大に関連する疾患及び疾病（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療における治療的効果を改善する。好ましい本発明の方法は、治療的投薬計画の開始の、１日、１週間、１ヶ月、少なくとも２ヶ月以内に、バックグラウンドレベルのＨＩＦ−１αレベルに減少させる。最も好ましい態様において、本発明の方法は、バックグラウンドレベルのＨＩＦ−１αレベルに減少となることである。本発明は、バックグラウンドレベルの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％以内のレベルのＨＩＦ−１αレベルへの減少をもたらす。
【０１４２】
好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載のＡ３受容体アンタゴニスト化合物の治療的及び／又は予防的有効量を投与することからなる、ＨＩＦ−１αの発現及び／又はＨＩＦ−１α活性の増大に関連する疾患及び疾病（例えば、癌、並びに喘息及び閉塞性肺疾患のような呼吸器系疾患）の治療、予防及び／又は管理のための方法をもたらす。
【０１４３】
疾患又は疾病の予防及び／又は治療剤として機能する本発明の化合物は、疾患又は疾病に関連する症状の１つ又はそれ以上を治療、予防又は改善するために、動物、好ましくは哺乳類、及び最も好ましくはヒトに投与できる。対象は、好ましくは、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ネズミ等）及び、霊長類（例えば、カニクイザルのようなサル及びヒト）のような哺乳動物である。好ましい態様において、対象はヒトである。本発明の化合物は、ＨＩＦ−１αの介在する疾病の治療、予防又は管理に有用な、他の予防及び／又は治療剤と組み合わせて投与することができ、ＨＩＦ−１発現又は活性を調整することによりそれらは改善又は緩和される。
【０１４４】
効果的所望のために要求される（アデノシンＡ１及び／又はＡ３アンタゴニストを含む）本発明の化合物の量は、治療される哺乳動物の個体により当然異なり、最終的には医学又は獣医学の専門家の決定による。考慮すべき要因としては、治療対象の症状、投与経路、製剤の性質、哺乳動物の体重、体表面積、年齢及び一般的状況、及び投与される特定の化合物が含まれる。しかしながら、好ましい効果的な投与量は、患者の体重に対して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇの範囲である。
【０１４５】
１日あたりの合計投与量は、単一投与、複数投与として、例えば１日に２〜６回でもよく、又は選択期間に経静脈注入により投与されてもよい。上記範囲の投与量の以上又は以下は、本発明の範囲内であり、所望及び必要であれば、患者個体に投与されてもよい。
【０１４６】
本発明の方法及び組成物は、疾患又は疾病を患っている又は患うと予想される対象／患者に、本発明の化合物の１つ又はそれ以上を投与することからなる。
【０１４７】
（６．３．１  組合せ治療）
本発明は、治療又は予防される特定の病気又は疾患の治療及び／又は予防のために慣用的に使用される１つ又はそれ以上の他の治療法と組み合わせて、本発明の１つ又はそれ以上の化合物を投与する組み合わせ療法を包含する。例えば癌の場合、本発明のＡ３及び／又はＡ１受容体アンタゴニストは、これらに限定されないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は生物学的療法／免疫療法のような、癌療法の１つ又はそれ以上と組合せて投与されてもよい。
【０１４８】
本発明の方法及び組成物に使用され得る予防的及び治療的化合物は、これらに限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（これらに限定されないが、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体などを含む）を含むタンパク質性の分子；小分子（１０００ダルトン未満）、無機又は有機化合物；これらに限定されないが、二重鎖若しくは一重鎖のＤＮＡ、二重鎖又は一重鎖ＲＮＡ、更に三重らせんの核酸分子を含む核酸分子を含むが、これらに限定されるものではない。予防的及び治療的化合物は、あらゆる既知の生物（これらに限定されないが、動物、植物、バクテリア、カビ、及び原生生物又はウィルスを含む）、又は合成分子ライブラリーに由来しうる。ある態様では、本発明の１つ又はそれ以上の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトに、疾患の治療に有用な１つ又はそれ以上の他の治療薬と同時に投与される。「同時に」という用語は、予防薬又は治療薬と全く同時に投与することに限定されるものではなく、むしろ本発明の化合物及び他の薬剤は、連続して、及び他の方法で投与された場合に比べて増大した利益を提供するために、本発明の化合物が他の薬剤とともに作用しうるような時間間隔内に対象に投与される。例えば、各々の予防薬又は治療薬は、同時に又は異なる時点でいかなる順に連続して投与されてもよい；しかしながら、もし同時に投与されなければ、望ましい治療効果又は予防効果を提供するために十分に近い時間で投与されるべきである。各々の治療薬は、適当な形態の何れかで、適切な経路の何れかで、別々に投与されうる。
【０１４９】
様々な態様では、予防薬又は治療薬は、1時間以内の間隔で、約1時間間隔で、約1時間〜約2時間間隔で、約２時間〜約３時間間隔で、約３時間〜約４時間間隔で、約４時間〜約５時間間隔で、約５時間〜約６時間間隔で、約６時間〜約７時間間隔で、約７時間〜約８時間間隔で、約８時間〜約９時間間隔で、約９時間〜約１０時間間隔で、約１０時間〜約１１時間間隔で、約１１時間〜約１２時間間隔で、２４時間以内の間隔で、又は４８時間以内の間隔で、投与される。好ましい態様では、２つ又はそれ以上の組成物は、同一の患者診察時に投与される。
【０１５０】
本明細書に提供される投与量及び投与頻度は、治療効果及び予防効果という用語に包含される。用量及び頻度はさらに、投与された特異的な治療薬又は予防薬、疾患の重篤度及び型、投与経路、更に年齢、体重、応答、及び患者の過去の医学的履歴、に依存した各々の患者に特異的な要因に従って一般的に変わるであろう。適切な計画は、そのような要因を考慮することにより、例えば、文献に報告された及びＰｈｙｓｉｃｉａｎ‘ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５８版、２００４）において推奨された用量に従って、当業者により選択されることができる。
【０１５１】
（５．３．２  アンタゴニストベースの治療／予防）
（５．３．２．１  癌）
本発明の化合物、特にＡ１及びＡ３受容体アンタゴニストは、単独か、又は他の抗癌剤、例えば当該技術分野で公知の治療抗体と組み合わせて、原発腫瘍の増殖又は癌細胞の転移を予防、阻害又は減少するために使用できる。特定の態様において、本発明の化合物は、単独か又はある抗癌剤と組み合わせて投与されるとき、前記化合物が存在しない場合の原発腫瘍の増殖又は癌細胞の転移と比較して、少なくとも９９％まで、少なくとも９５％まで、少なくとも９０％まで、少なくとも８５％まで、少なくとも８０％まで、少なくとも７５％まで、少なくとも７０％まで、少なくとも６０％まで、少なくとも５０％まで、少なくとも４５％まで、少なくとも４０％まで、少なくとも４５％まで、少なくとも３５％まで、少なくとも３０％まで、少なくとも２５％まで、少なくとも２０％まで、又は少なくとも１０％まで、原発腫瘍の増殖又は癌細胞の転移を阻害又は減少させる。より好ましい態様において、本発明の化合物、特に抗癌剤と組み合わせたＡ１及びＡ３受容体アンタゴニストは、前記化合物が存在しない場合の増殖又は転移と比較して、少なくとも９９％まで、少なくとも９５％まで、少なくとも９０％まで、少なくとも８５％まで、少なくとも８０％まで、少なくとも７５％まで、少なくとも７０％まで、少なくとも６０％まで、少なくとも５０％まで、少なくとも４５％まで、少なくとも４０％まで、少なくとも４５％まで、少なくとも３５％まで、少なくとも３０％まで、少なくとも２５％まで、少なくとも２０％まで、又は少なくとも１０％まで、原発腫瘍の増殖又は癌細胞の転移を阻害又は減少させる。本発明の方法は、固形腫瘍、低酸素腫瘍、Ａ３発現腫瘍及びＨＩＦ−１α発現腫瘍の治療に特に有用である。
【０１５２】
本発明の化合物、特にＡ１及びＡ３受容体アンタゴニストは、固形腫瘍の治療に用いられ得る。本発明の方法に従い治療され得る固形腫瘍には、これらに限定されないが、進行性骨化性線維形成異常症、前立腺癌、良性前立腺過形成、劣性栄養障害型表皮水疱症（ＲＤＥＢ）、ルイス肺癌、乳癌及び脳腫瘍を含む。
【０１５３】
本明細書に用いる「Ａ３発現癌」とは、アデノシンＡ３受容体が発現する又はさもなければ上昇したアデノシンＡ３受容体濃度を含む、ヒト癌を意味する。上昇した濃度とは、類似細胞型の正常、非癌組織と比較して確定される。Ａ３発現癌の具体例には、これらに限定されないが、ヒト白血病、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、肺悪性メラノーマ、組織球性リンパ腫及びある種の星状細胞腫を含む。
【０１５４】
本明細書に用いる「ＨＩＦ−１α発現癌」とは、ＨＩＦ−１αが発現する又はさもなければ上昇したＨＩＦ−１α濃度を含む、ヒト癌を意味する。上昇した濃度とは、類似細胞型の正常、非癌組織と比較して確定される。ＨＩＦ−１α発現癌の具体例には、これらに限定されないが、子宮頚癌（早期）、肺癌（非小細胞肺癌）、乳癌（リンパ節転移陽性乳癌及びリンパ節転移陰性乳癌を含む）、希突起グリオーマ、口腔咽頭へん平上皮細胞癌、卵巣癌、食道癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、胃の消化管間質腫瘍を含む。
【０１５５】
特定の態様において、本発明の方法及び化合物は、本発明のＡ３受容体アンタゴニスト（単独か又は他の抗癌剤と組み合わせて）の１つ又はそれ以上を、癌を患っている又は患うことが予想される、例えば、特定の種類の癌に対する遺伝性素因を有する、発癌性物質にさらされたことがある、又はある特定の癌の鎮静状態であるといった、対象／患者に投与することを含む。本発明の方法及び化合物は、１次又は２次癌治療に用いることができる。他の癌治療を受けている患者に対する治療もまた本発明に含まれ、これらの他の癌治療におけるあらゆる副作用やアレルギーが生じる前に、本発明の方法及び化合物を用いることができる。更に本発明は、難治性の患者における症状を治療又は改善するために、本発明のＡ３受容体アンタゴニスト化合物の１つ又はそれ以上を投与する方法を含む。特定の態様において、癌が治療法に対して難治性であるとは、少なくとも、いくらかの癌細胞のかなりの部分が死滅しない、又はそれらの細胞分裂が阻止されない、ことを意味する。癌細胞が難治性であるか否かの判断は、インビボ又はインビトロのいずれかで、癌細胞における治療効果を評価するための当該技術分野に公知のあらゆる方法により、そのような状況において、技術的に容認可能な意味の「難治性」をふまえて実施される。多種の実施形態において、癌細胞の数が顕著には減少しない、又は増大する場合、癌は難治性である。本発明はまた、癌にかかりやすい患者における癌の発現又は再発を阻止するために、本発明のＡ３受容体アンタゴニスト化合物の１つ又はそれ以上を投与する方法も含む。
【０１５６】
特定の態様において、ある特定のホルモン、放射線及び化学療法剤に対する癌細胞の抵抗力を反転させ又は感度を減少させ、それによりそれら薬剤の１つ又はそれ以上に癌細胞を再感作させるように、本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、投与され、ひいては、転移を阻止することを含め癌を治療又は管理するために投与（又は継続投与）され得る。
【０１５７】
代替の態様において、本発明は、あらゆる他の治療法と組み合わせて、又は他の治療について難治性であるとの実績があり、しかもその治療を行っていない患者に対して、本発明のＡ３受容体アンタゴニストの１つ又はそれ以上を投与することによる、対象における癌の治療のための方法を提供する。ある態様において、本発明の方法による治療を受けている患者は、すでに化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物学的療法／免疫療法の治療中の患者である。これらの患者は、難治性の患者であり、従来の癌治療を受けたにもかかわらず未だ癌を患っている患者である。他の実施例において、すでに治療を受けていて、もはや疾患活動性を有しない患者が、本発明のＡ３受容体アンタゴニスト化合物の１つ又はそれ以上を、癌の転移を阻止するために投与される。
【０１５８】
更に、本発明は、治療中の対象に対して、毒性等があると認められた又はその可能性があり、例えば、結果として副作用を許容できないか又は耐えられないところの、化学療法、放射線療法、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法の代替法として、癌の治療方法を提供する。本発明の方法による治療を受けている対象は、どの治療が許容できないか又は耐えられないかに応じて、任意的に、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物学的療法のような他の癌治療をともに受けることができる。  
他の態様において、本発明は、そのような治療にとって難治性であると認められたところの癌治療に対して、他のいかなる癌治療法なしに、本発明のＡ３受容体アンタゴニスト化合物の１つ又はそれ以上の投与することを提供する。特定の態様において、他の癌治療法に対して難治性である患者は、その癌治療法なしに、Ａ３受容体アンタゴニスト化合物の１つ又はそれ以上を投与される。
【０１５９】
Ａ３発現癌の治療時の好ましい態様において、高親和性のＡ３受容体アンタゴニストストと化学療法抗癌剤が患者に投与される。組合せ治療は、化学療法抗癌剤の効果を増強させ、多剤耐性が進行するのを防ぐ。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、本発明に対して望ましい応答を示す化学療法抗癌剤は、これに限定されないが、タキサン化合物、ヒンカアルカロイド、カンプトセシン及び化学療法剤として有用な抗生剤を含む、進行性Ｐ−ｇｐ又はＭＲＰ類多剤耐性で知られる薬剤が具体的である。
本発明は、すでに多剤耐性の進行が認められる癌の治療に対する組合せ治療法をもたらす。この場合、高親和性のＡ３受容体アンタゴニストは、更に化学療法抗癌剤の効果を増強する一方で、現存のＭＤＲに対抗する。具体的作用を例示するが、本発明は全ての型のＭＤＲ癌に対して効果的であるわけではない。本発明に対して望ましい応答を示すＭＤＲ癌は、Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰ類である。
【０１６０】
化学療法抗癌剤がタキサン群の化合物である場合、高親和性のＡ３受容体アンタゴニストストは、タキサン化合物の投与前又は投与中の何れにおいても、好ましく投与される。特定の作用機構に縛られることを意図するものではないが、これは、タキサン剤に対する超過敏症の発生を減少させる結果をもたらす。商業的に市販されているタキサン系の化合物には、パクリタキセル（商標名ＴＡＸＯＬとしてブリストル・マイヤーズ・スクイーブ社（プリンストン、ニューヨーク）から及びジュネリック薬としてイバックス社（マイアミ、ＦＬ）から市販）及び、ドセタキセル（商標名ＴＡＸＯＴＥＲＥとしてアベンティス・ファーマシュティカルズ（カレッジビル、ＰＡ）から市販）があり、本発明に包含される。更なるタキサン系化学療法抗癌剤は、現在開発及び試験段階にあり、本発明に包含されることを、特記する。
現存する腫瘍の治療における他の好ましい態様において、組成物は、腫瘍の増殖を阻害するために、アデノシンＡ３受容体アンタゴニスト及びタキサン群化合物である化学療法抗癌剤、例えば、パクリタキセル又はドセタキセルの有効量を含む。パクリタキセルは、商標名ＴＡＸＯＬとしてブリストル・マイヤーズ・スクイーブ社（プリンストン、ニューヨーク）から及びジュネリック薬としてイバックス社（マイアミ、ＦＬ）から市販されている。ドセタキセルは、商標名ＴＡＸＯＴＥＲＥとしてアベンティス・ファーマシュティカルズ（カレッジビル、ＰＡ）から市販されている。この態様において、Ａ３アンタゴニストストは、癌細胞の増殖率を低減させ、低酸素状態に対するアデノシン保護効果を妨げ、タキソンの化学療法効果を増強させ、患者における超過敏性反応を低減させ、及び多剤耐性の進行に対抗することができる。
【０１６１】
本発明のＡ１及び／又はＡ３受容体アンタゴニストからなる方法及び化合物による治療又は予防可能な癌及び関連する疾病は、これらに限定されないが、以下のものを含む。
急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、骨髄球細胞性、骨髄単球性、単球性、赤白血性白血病及び骨髄異形成症候群のような急性骨髄性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病のような、しかしこれに限定されない、慢性白血病を含む、しかしこれらに限定されない、白血病；
真性赤血球増加症；
ホジキン病、非ホジキン病のような、しかしこれらに限定されない、リンパ腫；
くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、孤立性形質細胞腫及び髄外性形質細胞腫のような、しかしこれらに限定されない、多発性骨髄腫；
ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；
意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症；
良性単クローン性高ガンマグロブリン血症；
重鎖病；
ホネ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性骨巨細胞腫、ホネの線維肉腫、脊索腫、骨膜腫、軟部組織の肉腫、脈管腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫のような、しかしこれらに限定されない、ホネ及び結合組織の肉腫；
【０１６２】
神経膠腫、星状細胞腫、脳幹部腫瘍、上衣細胞腫、乏突起膠腫、ノングリア腫瘍（nonglial tumor）、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳腫瘍を含むがこれらに限定されない脳腫瘍；
腺癌、小葉（小細胞）癌、腺管内癌、髄様乳癌、粘液性乳癌、管状乳腺癌、乳頭癌、パジェット病、及び炎症性乳癌を含むがこれらに限定されない乳癌；
褐色細胞腫及び副腎皮質癌を含むがこれらに限定されない副腎癌；
甲状腺乳頭癌又は濾胞状甲状腺癌、甲状腺髄様癌及び未分化甲状腺癌のような、しかしこれらに限定されない甲状腺癌；  
インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン産生腫瘍及びカルチノイド腫瘍又は島細胞腫を含むがこれらに限定されない膵臓癌；
クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症及び尿崩症を含むがこれらに限定されない下垂体癌；
虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ及び毛様体メラノーマのような眼メラノーマ、及び網膜芽細胞腫を含むがこれらに限定されない眼癌；
へん平上皮癌、腺癌及びメラノーマを含むがこれらに限定されない膣癌；
扁平上皮癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫及びパジェット病を含むがこれらに限定されない外陰癌；
【０１６３】
扁平上皮癌及び腺癌を含むがこれらに限定されない子宮頚癌；
子宮内膜癌及び子宮肉腫を含むがこれらに限定されない子宮癌；
上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質腫瘍を含むがこれらに限定されない卵巣癌；
へん平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘液性類表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、骨髄腫、疣状癌及び燕麦細胞（小細胞）癌を含むがこれらに限定されない食道癌；
腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、広範拡散型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫を含むがこれらに限定されない胃癌；
結腸癌；
直腸癌；
肝細胞腫瘍及び肝芽腫を含むがこれらに限定されない肝臓癌；
腺癌を含むがこれらに限定されない胆嚢癌；
乳頭、結節性及び広汎性を含むがこれらに限定されない胆管癌；
非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌及び小細胞肺癌を含むがこれらに限定されない肺癌；
胚芽腫瘍、精上皮腫、退形成癌、典型的（標準的）、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫腫瘍、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、腺癌を含むがこれらに限定されない前立腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫を含むがこれらに限定されない睾丸癌；
【０１６４】
ペナル（penal）癌;
扁平上皮癌を含むがこれらに限定されない口腔癌;
バサル(basal)癌;
腺癌、粘液性類表皮癌及び腺様嚢胞癌を含むがこれらに限定されない唾液腺癌；
扁平上皮癌及び疣状癌を含むがこれらに限定されない咽頭癌；
基底細胞腫、扁平上皮癌及びメラノーマ、表在拡大型メラノーマ、結節型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマを含むがこれらに限定されない皮膚癌；
腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盂及び／又は尿管）を含むがこれらに限定されない腎臓癌；
ウィルムス腫瘍；
移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫を含むがこれらに限定されない膀胱癌。
さらに、癌は、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮腫、リンパ管内皮腫、中皮腫、骨膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性肺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌及び乳頭腺癌（このような疾病の総説については、Fishman et al.,1985, Medicine,2d Ed.,J.B.Lippincott Co., Phladelphia and Murphy et al.,1997,Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment, and Recovery,Viking Penguin, Penguin Books U.S.A.,Inc.,United States of Americaを参照のこと。）
【０１６５】
従って、本発明の方法及び化合物は、以下を含む（しかしこれらに限定されない）、多様な癌又は他の増殖性異常疾病の治療又は予防にもまた有用である：
膀胱、乳、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮、甲状腺及び皮膚の癌腫を含む癌腫；
へん平上皮癌；
白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ベルケッツ（Ｂｅｒｋｅｔｔｓ）リンパ腫を含むリンパ系列の造血器腫瘍；
急性及び慢性骨髄性白血病及び骨髄球白血病を含む骨髄細胞系列の造血器腫瘍；
線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉性由来の腫瘍；
メラノーマ、精上皮腫、奇形癌腫（tetratocarcinoma）、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；
星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；
線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉性由来の腫瘍；
及びメラノーマ、乾皮症(xenoderma)、色素性乾皮症（pegmentosum）、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌及び奇形癌腫（tetratocarcinoma）を含む他の腫瘍。アポトーシスの異常に起因する腫瘍もまた、本発明の方法及び化合物により治療することができる。そのような腫瘍には、これに限定されないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を伴う腫瘍、乳房、前立腺、卵巣のホルモン依存性腫瘍、及び、遺伝性大腸腺腫様ポリポーシス及び骨髄異形成症候群のような前癌性病変を含む。特定の態様において、卵巣、膀胱、乳、大腸、肺、皮膚、膵臓又は子宮における、悪性又は異常増殖性の変化（化生及び異形成のような）、又は過剰増殖性疾患は、本発明の方法及び化合物により治療される。他の特定の態様において、肉腫、メラノーマ又は白血病が、本発明の方法及び化合物により治療又は予防される。
【０１６６】
癌抗原に関連する癌は、癌抗原を拘束して細胞毒性である抗体と組み合わせて、本発明のＡ３受容体アンタゴニストを投与することにより、治療又は予防することができる。一つの特定の態様において、本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、特定の癌抗原に向けられた抗体の細胞毒活性に介在される抗体を増強する。例えば、しかしこれに限定されるものではないが、以下の癌抗原に関連する癌は、本発明の方法及び化合物により治療又は予防される。ＫＳ１／４汎腫瘍抗原（Perezand Walker,1990,J.Immunol.142:32-37; Bumal,1988,Hybridoma 7(4):407-415)、卵巣腫瘍抗原（ＣＡ１２５）（Yu et al.,1991,Cancer Res.18(1):4928）、前立腺酸性フォスファターゼ（Tailor et al.,1990,Nucl.Acids Res.18(1):4928)、前立腺特定抗原（Henttu and Vihko, 1989, BIochem.Biophys.Res.Comm.10(2):903-910;Israeli et al.,1993,Cancer Res.53:227-230）、メラノーマ関連抗原ｐ９７（Estin et al.,1989,j.Natl.Cancer Instit.81(6):445-44）、メラノーマ抗原ｇｐ７５（Vijayasardahl et al.,1989,J.Exp.Med.171(4):1375-1380）、高分子量メラノーマ抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（Natali et al.,1987,Cancer 59:55-3; MIttelman et al., 1990,J.Clin.Invest.86:2136-2144)）、前立腺特定膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２（Yokata et al.,1992,Cancer Res.52:3402-3408）、ＣＯ１７−１Ａ（Ragnhammar et al.,1993,Int.J.Cancer53:751-758）;
【０１６７】
ＧＩＣＡ１９−９（Herlyn et al.,1982,J.Clin.Immunol.2:135）、ＣＴＡ−１とＬＥＡ、バーカイトのリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＤ１９（Ghetie et al., 1994,Blood 83:435-445）、ヒトＢ−リンパ腫抗原−ＣＤ２０(Reff et al.,1994,Blood 83:435-445)、ＣＤ３３（Sgours et al.,1993,J.Nucl.Med.34:422-430）、ガングリオシドＧＤ２のようなメラノーマ特定抗原（Saleh et al.,1993,J,Immunol,151,3390-3398）、ガングリオシドＧＤ３（Shitara et al.,1993,Cancer Immunol.Immunother.36:373-380）、ガングリオシドＧＭ２（Livingston et al.,1994,J.Clin.Oncol.12:1036-1044）、ガングリオシドＧＭ３（Hoon et al.,1993,Cancer Res.53:5244-5250）、Ｔ−抗原ＤＮＡ腫瘍ウイルス及びＲＮＡ腫瘍ウイルスの外膜抗原を含むウイルス誘発性腫瘍抗原のような細胞表面の腫瘍特定移植型抗原（ＴＳＴＡ）、大腸のＣＥＡのような腫瘍胎児抗原αフェトプロテイン、膀胱腫瘍胎児抗原（Hellstrom et al.,1985,Cancer.Res.45:2210-2188）、ヒト肺癌抗原Ｌ６、Ｌ２０のような分化抗原（Hellstrom et al.,1986,Cancer.Res.46:3917-3923）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７（Bhattacharya-Chatterjee et al.,1988,J.of Immun.141:1398-1403）、ネオ糖タンパク質、スフィンゴ脂質、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）のような乳癌抗原、ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）、多形上皮性ムチン（ＰＥＭ）（Hilkens et al.,1992,trends in Bio.Chem.Sci.17:359）、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１（Bernhard et al.,1989,Science 245:301-304）、分化抗原（Feizi,1985,Nature 314:53-57）、胎児赤血球や初期内胚に見られるＩ抗原、胃腺癌に見られるＩ（Ｍ）、乳房上皮に見られるＭ１８及びＭ３９、骨髄性細胞に見られるＳＳＥＡ−１、結腸癌に見られるＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ-Ｄ５及びＤ1５６-２２、結腸腺癌に見られるＴＲＡ-１-８５（血液型Ｈ）,Ｃ１４、肺腺癌に見られるＦ３、胃癌に見られるＨ６、Ｙハプテン、胎生期癌細胞に見られるＬｅｙ、ＴＬ５（血液型Ａ）,Ａ４３１細胞に見られるＥＧＦ受容体、膵臓癌に見られるＥ1系（血液型Ｂ）、胚性癌腫細胞に見られるＦＣ１０．２、胃腺癌、腺癌に見られるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）、腺癌に見られるＮＳ−１０、結腸腺癌に見られるＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）、Ｇ４９、ＥＧＦ受容体（血液型ＡＬｅｂ  ／Ｌｅｙ）、結腸癌,胃癌ムチンに見られる１９．９、骨髄性細胞に見られるＴ５Ａ７、メラノーマに見られるＲ２４、胚性癌腫細胞に見られる４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、Ｍ１：２２：２５：８、及び４〜８細胞分裂時の胎児に見られるＳＳＥＡ−３，ＳＳＥＡ−４。他の態様において、抗原は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体誘導ペプチドである（Edelson,1998,The Cancer Journal 4:62参照のこと）。   
【０１６８】
（６．３．２．１．１．他の薬剤）
本発明の高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、単独か又は他の治療及び／又は予防剤と組合せて投与することができる。
本発明の方法は、一つ又はそれ以上の化学療法抗癌剤の投与を包含する。化学療法抗癌剤とは、癌細胞を攻撃及び殺生する薬剤と定義される。本発明の方法に使用され得る化学療法剤は、タキサン化合物及びその誘導体、パクリタキセル及びその誘導体又はドセタキセル及びその誘導体を含む。さらなるタキサン誘導体及び合成方法は、米国特許第６，１９１，２８７号（Holton et al.）、米国特許第５，７０５，５０８号（Ojima et al.）、米国特許第５，６８８，９７７号及び同第５，７５０，７３７号（Sisti et al.）、米国特許第５，２４８，７９６号（Chen et al.）、米国特許第６，０２０，５０７号（Gibson et al.）、米国特許第５，９０８，８３５号（Bissery）に開示されており、これら全てを参照して本明細書に取り込む。
【０１６９】
本発明の方法に用いられ得る他の化学療法抗癌剤は、分裂抑制剤（ビンカ・アルカロイド）を含む。これには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びＮａｖｅｌｂｉｎｅ(登録商標)（酒石酸ビノレルビン、５−ノルアンハイドロブラスチン）を含む。更に他の態様において、化学療法抗癌剤は、カンプトテシン化合物のようなトポイソメラーゼＩ阻害剤を含む。 本明細書における使用において、「カンプトテシン化合物」は、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標)（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ(登録商標)（トポテカンＨＣＬ）及びカンプトテシン及びそのアナログから誘導される他の化合物を含む。本発明の方法及び化合物に用いられ得る化学療法抗癌剤の他のカテゴリーは、エトポシド、テニポシド及びミトポドジドのようなポドフィロトキシン誘導体である。本発明は更に、アルキル化剤として公知であり、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化する、他の化学療法抗癌剤を含有する。これらには、シスプラチン、シクロフォスファミド、ナイトロジェン・マスタード、トリメチレン・チオフォスフォラミド、カルムスチン、ブスルファン 、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシル・マスタード、クロルナファジン及びダカルバジンを含むが、これらに限定されるものではない。本発明は、化学療法剤として代謝拮抗物質を包含する。このタイプの薬剤の具体例は、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリム及びプロカルバジンを含む。本発明の方法及び化合物に用いられ得る化学療法抗癌剤のさらなるカテゴリーは、抗生物質を含む。具体例には、これらに限定されるものではないが、ドキソルビシン、ブレオミシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、ミトマイシン、マイトマイシンＣ及びダウノマイシンを含む。これらの化合物については、数多くの市販のリポソーム製剤がある。本発明は更に、これらに限定されるものではないが、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イフォスファミド及びミトキサントロンを含む、他の化学療法抗癌剤を包含する。
【０１７０】
Ａ３アンタゴニストは、単独か又は、細胞毒性／抗腫瘍剤及び血管新生阻害剤を含む、他の抗腫瘍剤と組合せて投与され得る。細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞を攻撃及び殺生する薬剤と定義される。いくつかの細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤であり、具体的には、シスプラチン、シクロフォスファミド、ナイトロジェン・マスタード、トリメチレン・チオフォスフォラミド、カルムスチン、ブスルファン 、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシル・マスタード、クロルナファジン及びダカルバジンである。他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に対する代謝拮抗物質であり、具体的には、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリム及びプロカルバジンである。他の細胞毒性／抗腫瘍剤は血管新生阻害剤であり、具体的には、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、ミトマイシン、マイトマイシンＣ及びダウノマイシンである。これらの化合物については、多数の市販のリポソーム製剤がある。更に他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、分裂抑制剤（ビンカ・アルカロイド）である。多種の細胞毒性／抗腫瘍剤は、タキソール及びその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファレン、ＶＭ−２６、イフォスファミド、ミトキサントロン及びビンデシンを含む。
【０１７１】
血管新生阻害剤は当該技術分野において公知である。本発明の方法及び化合物に用いる好ましい血管新生阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体を含み、ヒト化及びキメラ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む。他の公知の血管新生阻害剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インタールーキン１（αとβを含む）、インタールーキン１２、レチノイン酸及びメタロプロテイナーゼ組織阻害剤−１と−２（ＴＩＭＰ−１と−２）を含む。ラゾキサン、一種の血管新生阻害活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤のような、トポイソメラーゼを含む小分子も又使用することができる。
【０１７２】
一つの態様において、血管新生阻害剤はアデノシンＡ２aアンタゴニストである。Ａ２aアンタゴニストは当該技術分野において公知である。この化合物の具体例には、シェーリング・プラウ社のＳＣＨ５８２６１、ＺＭ２４１３８５（Palmer et al.,Mol.Pharmacol.,48:970-974(1995))、三環形非キサンチンアンタゴニスト及びＣＰ６６７１３を含むトリアゾロキナゾリン（Nikodijevic et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,259:286-294(1991)に開示）、更にvon Lubitz et al.,Eur.J.Pharmacol.,287:295-302(1995)に開示の化合物、を含む。上記文献の内容を全て参照して本明細書に取り込む。
【０１７３】
本発明の多種の態様において、薬学的組成物及び投薬形態及び用具一式を含む、本発明のＡ３受容体アンタゴニストと組合せて使用され得る抗癌剤は、これらに限定されるものではないが、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスルキン、アルトレタミン、アムボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アンスラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィド・ジメシラート、ビゼレシン、スルフォン酸ブレオマイシン、ブレキナル・ナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチオマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチメル、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴル、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトル・メシラート、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニン・メシラート、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキシアート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾル、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム 、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、
【０１７４】
塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フルオキスリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、フォストリエシン・ナトリウム、ジェムシタビン、塩酸ジェムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イラルビシン、イフォスファミド、イルモフォシン、インタールーキンＩＩ（組み換えインタールーキンＩＩ又はｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎ１、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸レウプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソール・ナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキシアート、メトトレキシアート・ナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギルリン、ミトマルシン、ミトマイシン、ミトスペール、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、スルフォン酸ペプロマイシン、ペルフォスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィメル・ナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセート・ナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガラン・ナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、
【０１７５】
トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシル・マスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、スルフォン酸ビンブラスチン、スルフォン酸ビンクリスチン、ビンデシン、スルフォン酸ビンデシン、スルフォン酸ビネピジン、 スルフォン酸ビングリシナート、スルフォン酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビン、スルフォン酸ビンロシジン、スルフォン酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンを含む。他の抗癌剤は、これらに制限されないが、20-epi-1,25ジヒドロキシビタミンＤ３、５−エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスルーキン、ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アムバムスチン、アミドクス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリデ、アナストロゾール、アンドログラフォリド、アンジオジェネシス阻害薬、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗ドルサリジン形成タンパク質−１、抗アントロゲン・前立腺癌、抗エストロゲン、抗ネオプラストン、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子モジュレータ、アポトーシス・レギュレータ、アプリン酸、ara-CDP-DL-PTBA、アラジニン・デアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール、バチマスタル、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロポリン、βラクタム誘導体、β−アレシン、ベタクラマイシンＢ、
【０１７６】
ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害薬、ビカルタミド、ビサントレン、ビサジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフラット、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニン・スルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリポクスＩＬ−２、カペシタビン、カルボキシアミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔＭ３、ＣＡＲＮ７００、軟骨由来阻害薬、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害薬（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリクス、Chlorlns、クロロキノキサリン・スルホンアミド、シカプロスト、ｃｉｓ−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン・アナログ、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン・アナログ、コナゲニン、クラムベスシジン８１６、クリスナトル、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、クラシンＡ、シクロペンタンスラキノネス、シクロプラタン、シペマイシン、シタラビン・オクホスファート、細胞溶解因子、シトスタチン、ダクリズマブ、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ、デスロレリン、デキサメタソン、デキシホスファミド、デキスラゾクサン、デキスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドクス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジヒドロタキソール、９−オキサマイシン、ジフェニル・スピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノル、デュオカルマイシンＳＡ、
【０１７７】
エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニシン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン・アナログ、エストラゲン・アゴニスト、エストラゲン・アンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシデ、エグゼメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウム・テキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリクス、ゲラチナーゼ阻害薬、ゲムシタビン、グルタチオン阻害薬、ヘプスルファン、ヘレグリン、ヘキサメチレン・ビスアセタミド、ハイペリシン、イバンドロン酸 、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドネス、イミキモド、インムノスチムラント・ペプチド、インスリン様増殖因子−1受容体阻害薬、インターフェロン・アゴニスト、インターフェロン、インタールーキン、イオベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール  ４−、イロプラクト、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメルラリン−Ｎ・トリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスタチン、スルフォン酸レンチナン、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球αインターフェロン、ロイプロリド＋エストラゲン＋プロゲステロン、ロイプロレリン、ルバミソール、リアロゾール、線形ポリアミン・アナログ、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、
【０１７８】
ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、lurtotecan、ルテチウム・テキサフィリン、細胞溶解性ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリルシン阻害薬、マトリクス・メタロプロテイナーゼ阻害薬、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオオニナーセ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害薬、ミフェプリストン、ミルテホシン、二重鎖の塩基対応を意図的に変化させたＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、ミトマイシン・アナログ、メトナフィド、ミトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチン、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリル脂質Ａ+ミオバクテリア細胞壁SK、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害薬、多発性腫瘍抑制剤１−基礎治療、マスタード抗癌剤、マイカペロキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、マイリアポロン、Ｎ−アセチルジナリン、Ｎ-置換ベンザミド、ナファレリン、nagrestip、ナロキソン+ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチン、ネダプラチン、ネダプラチン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素モジュレータ、一酸化窒素抗酸化剤、ニトルルリン、
【０１７９】
Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘発剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル・アナログ、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、palmitoylrhizoxin、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼルリプチン、ペグアスパラガーゼ、ペルデシン、ペントサン多硫化ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリルリル・アルコール、フェナジノマイシン、フェニルアセテート、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、ピリトレキシン、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノゲン活性化阻害薬、白金錯体、白金化合物、白金−トリアミン錯体、ポルフィメール・ナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニソン、プロピル−ビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害薬、プロテインＡ−基礎免疫モジュレータ、プロテイン・キナーゼＣ阻害薬、プロテイン・キナーゼＣ阻害薬・微細藻類、リン酸プロテインチロシン阻害薬、プリン・ヌクレオチド・ホヅホリラーゼ阻害薬、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化されたヘモグロビン・ポリオキシエチレン共役、ラフ・アンタゴニスト、ラルチトレキシ化、ラモセトロン、ラス・ファルネシル・プロテイン・トランスフェラーゼ阻害薬、ラス阻害薬、ラス−ＧＡＰ阻害薬、レテルリプチンジメチレート化、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボジーム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツキン、ロキニメクス、ルビジノンＢ１、ルボキシル、サフィンゴール、サイントピン、
【０１８０】
ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトルＡ、サルグロモスチン、Ｓｄｉ１ミメティック、セムスチン、老化誘発阻害薬１、センス・オリゴヌクレオチド、シグナル変換阻害薬、シグナル変換モジュレータ、シグナルチェーン抗原結合プロテイン、シゾフィラン、ソブゾキサン、ボロカプトナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム 、ソルベロール、ソマトメジン結合プロテイン、ソネルミン、スパルホス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンギスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害薬、幹細胞分裂阻害薬、スチピアミド、ストロメリシン阻害薬、スルフィノシン、超活性血管作動性ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、合成グリコサミノグリカン、タルリムスチン、タモキシフェン・メチオジド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルルラフィリリウム、テロメラーゼ阻害薬、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポジド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラススチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣薬、チマルファシン、チモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、チロイド刺激ホルモン、エチル・エチオプルプリンすず、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、転移阻害薬、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキシアート 、トリプトレリン、トロピセトロン、テュロステライド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、泌尿生殖器サイナス派生増殖阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系・赤血球遺伝子療法、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、及びジノスタチン・スチマラマーを含む。好ましい付加的な抗癌剤は、５−フルオロウラシル及びルコボリンである。
【０１８１】
本発明の方法に用いられ得る治療抗体の具体例は、これらに限定されるものではないが、転移性乳癌を患う患者の治療のためのヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Trastuzumab）(ジェネテック社、CA)；
血栓形成を予防するための血小板上の抗グリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体であるＲＥＯＰＲＯ（登録商標）（abciximab）(セントコール社);
急性腎臓同種移植拒絶反応の予防のための免疫抑制性のヒト化抗ＣＤ２５モノクロナール抗体であるＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標）（dacrizumab）(ロッシュ・ファーマシュティカルズ社、スイス）
マウス抗−１７−ＬＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体であるＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標）（グラクソ・ウェルコム社／セントコール社）；
マウス抗イディオタイプ （ＧＤ3エピトープ）ＩｇＧ抗体であるＢＥＣ２（イムクローン・システム社）；
キメラ抗ＥＧＦＲＩｇＧ抗体であるＩＭＣ−Ｃ２２５（イムクローン・システム社）；
ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体であるＶＩＴＡＸＩＮ(登録商標)(アプライド・モレキュラー・エボリューション社/MedImmune社)；
ヒト化抗ＣＤ５２ＩｇＧ１抗体であるＣａｍｐａｔｈ  １Ｈ／ＬＤＰ-０３(Leukosite社）；
ヒト化抗ＣＤ３３ＩｇＧ抗体であるＳｍａｒｔＭ１９５（プロテイン・デザイン・ラボ社／鐘紡（株））；
キメラ抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（アイデック・ファーマ社／ジェネテック社、ロッシュ社／Ｚｅｔｔａｙａｋｕ社）；
ヒト化抗ＣＤ２２ＩｇＧ抗体であるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）（イムノメディックス社）；
【０１８２】
ＩＣＭ３はヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体である（アイコス・ファーマ社）；
ＩＤＥＣ−１１４は霊長類化抗ＣＤ８０抗体である（アイデック・ファーアマ社／三菱社）；  
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）は放射性標識マウス抗ＣＤ２０抗体である（アイデック社／シャーリングＡＧ社）；
ＩＤＥＣ−１３１はヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体である（アイデック社／エーザイ（株））；
ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４抗体である（アイデック社）；
ＩＤＥＣ−１５２は霊長類化抗ＣＤ２３抗体である（アイデック社／生化学工業（株））；
ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３はヒト化抗ＣＤ３ＩｇＧである（プロテイン・デザイン・ラボ社）；
５Ｇ１．１はヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体である（アレクシオン・ファーマ社）；
Ｄ２Ｅ７はヒト化抗ＴＮＦ−α抗体である（ＣＡＴ社／ＢＡＳＦ社）；
ＣＤＰ８７０はヒト化抗ＴＮＦ−αＦａｂフラグメントである（セルテック社）；
ＩＤＥＣ−１５１は霊長類化抗ＣＤ４ＩｇＧ１抗体である（アイデック・ファーマ社／スミスクライン・ビーチャム 社）；
ＭＤＸ−ＣＤ４はヒト化抗ＣＤ４ＩｇＧ１抗体である（メダレックス社／エーザイ（株）／ゲンマブ社）；
ＣＤＰ５７１はヒト化抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体である（セルテック社）；
ＬＤＰ−０２はヒト化抗α４β７抗体である（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ社／ジェネテック社）；
ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅＯＫＴ４Ａはヒト化抗ＣＤ４ＩｇＧ抗体である（オルト・バイオテク社）；
ＡＮＴＯＶＡ（登録商標）は ヒト化抗ＣＤ４０ＬＩｇＧ抗体である（バイオゲン社）；
ＡＮＴＥＧＲＥＮ（登録商標）は ヒト化抗ＶＬＡ−４ＩｇＧ抗体である（エラン社）；
及びＣＡＴ−１５２はヒト化抗ＴＧＦ−β２抗体である（カンブリッジＡＧテク社）を含む。
本発明のＡ３受容体アンタゴニストと組合せて用いられ得る治療抗体の他の具体例を、以下の表５に示す。
【０１８３】
表５．本発明のＡ３受容体アンタゴニストと組合せて用いられ得る癌治療のためのモノクローン抗体
【表５】
2008520746.tif 000028
2008520746.tif 000029
【０１８４】
本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、本明細書に開示される疾患及び疾病、即ち癌の処置の治療効果を向上するためにＡＴＰ除去剤と組合せて使用することができる。代替的に、本発明のＡ３受容体アンタゴニストは、本明細書において論じる疾患及び疾病、即ち癌の処置における従来方法の治療効果を向上するためにベラパミルとともに使用することができる。
【０１８５】
（６．３．２．２    呼吸器系疾患）
本発明の化合物、特にＡ１及びＡ３受容体アンタゴニストは、単独か、又は他の抗癌剤及び／又は予防剤と組み合わせて、喘息及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような呼吸器系疾患の予防、治療又は管理のためにも使用できる。
【０１８６】
本発明のＡ１及び／又はＡ３受容体アンタゴニストからなる方法及び化合物は、喘息の治療、予防及び／又は管理に効果的である。喘息に対する本発明の治療的及び予防的方法は、喘息の治療、予防及び／又は管理に関する当該技術分野における公知の他の方法、これらに限定されないが、吸入β２アゴニスト、吸入コルチコステロイド、レチノイン酸、抗Ｉｇ−Ｅ抗体、ホスホジエステラーゼ阻害薬、ロイコトリエンアンタゴニスト、抗ＩＬ−９抗体、及び／又は抗ムチン療法（例えば、Ｌｏｍｕｃｉｎ（登録商標）のような抗ｈＣＬＣＡ１療法）、βアドレナリン作用性薬（例えば、エピネフリン及びイソプロテレノール）、テオフィリン、抗コリン薬（例えば、アトロピン及び臭化イプラトロピウム）、及びコルチコステロイド、アドレナリン刺激薬（例えば、カテコラミン（例えば、エピネフリン、イソプロテレノール、及びイソエタリン））、レゾルシノール（例えば、メタプロテレノール、テルブタリン及びフェノテロール）、及びサリゲニン（例えば、サルブタモール）、他のステロイド、免疫抑制剤（例えば、メトトレキサレート及び金塩）、肥満細胞モジュレータ（例えば、クロモリンナトリウム（ＩＮＴＡＬ（登録商標）及びネドクロミルナトリウム（ＴＩＬＡＤＥ（登録商標））、及び粘液溶解薬（例えば、アセチルシステイン）を含み、組合せて使用できる。
【０１８７】
本発明のＡ１及び／又はＡ３受容体アンタゴニストからなる方法及び化合物は、不可逆性気道疾患、慢性気管支炎及び気腫を含む、ＣＯＰＤの治療、予防及び／又は管理に効果的である。
本発明の治療的及び予防的方法は、ＣＯＰＤの治療、予防及び／又は管理に関する当該技術分野における公知の他の治療方法、これらに限定されないが、チオトロピウム及び／又はイプラトロピウムを含み、組合せて使用できる。
本発明の方法及び化合物を用いて治療、予防又は管理され得る他の呼吸器系疾患は、肺線維症、気管支過敏性を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１８８】
（５．４  投与の組成物及び方法）
本発明は、本発明の化合物を含む方法及び薬学的組成物を提供する。本発明はまた、対象に本発明の有効量の化合物を投与することにより、疾患に関連する１つ又はそれ以上の症状、疾患又は病気の治療、予防及び改善する方法を提供する。特定の態様では、対象は、動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）及び霊長類（例えば、カニクイザルのようなサルやヒト）のような哺乳動物である。好ましい態様では、対象はヒトである。
【０１８９】
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造において有用なバルク薬剤組成（例えば、不純な又は未滅菌の組成物）、及び、単位用量型の調製に用いられうる薬学的組成物（すなわち、対象又は患者に投与するために適切な組成物）を含む。そのような組成物は、本明細書に開示される予防又は治療に有効な量の予防薬及び／又は治療薬、又はそれら薬剤と薬学的に許容可能な担体の組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防又は治療に有効な量の本発明の化合物及び薬学的に許容可能な担体を含む。
特定の態様では、薬学的組成物は、治療又は予防に有効な量のＡ３又はＡ１受容体アゴニスト及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の特定の態様では、前記薬学的組成物は、更に１つ又はそれ以上の抗癌剤を含む。
【０１９０】
特定の態様では、「薬学的に許容可能」という用語は、連邦又は州政府の規制当局により承認された、又は米国でリスト化された薬局方、又は他の一般的に認識されている、動物、より特定的にヒトに利用されるための薬局方を意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び非完全））、添加物、又は治療薬が投与される際の賦形剤、を意味する。そのような薬学的担体は、水及びピーナッツオイル、大豆油、ミネラルオイル、セサミオイルなどのような、石油、動物、野菜又は合成起源のものを含む油のような、滅菌された液体でありうる。水は、薬学的な組成物が経静脈的に投与される際に、好ましい担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液はまた、液体担体、特に注入可能な溶液として用いることができる。適切な薬学的添加物は、でんぷん、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物はまた、所望により、少量の湿っている若しくは乳化された薬剤、又はｐＨ緩衝液剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続的な放出剤などの形態を取ることができる。
【０１９１】
一般的に、本発明の組成物の成分は、例えば、アンプル、活性薬の量を示す小袋のような密封された容器中に凍結乾燥された粉末又は無水濃縮物として、別々に又は単位用量の形態に一緒に混ぜて、供給される。組成物が注入により投与される場合には、滅菌された薬学的グレードの水又は生理食塩水を含む注入瓶で投薬できる。組成物が注射により投与される場合では、注射のための滅菌水又は生理食塩水のアンプルが、投与前に成分が混合されるように、提供される。
本発明の組成物は、中性又は塩の形で製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、塩酸、リン酸、酢酸、しゅう酸、酒石酸などに由来するような陰イオンで形成されるものと、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののような陽イオンで形成されるものを含むが、これらに限定されるものではない。い。
【０１９２】
上記の化合物は、好ましくは、投与方法のための許容可能な担体とともに、活性化合物すなわちアデノシンＡ１及び／又はＡ３受容体アゴニストを含む剤形で投与される。適切な薬学的に許容可能な担体は、当業者に知られている。組成物は、任意に、抗血管新生薬剤及び抗癌剤を含む、その他の治療に有効な薬剤を含みうる。他の任意の成分は、抗ウィルス薬、抗菌薬、抗炎症薬、鎮痛薬及び免疫抑制薬を含む。担体は、剤形の他の成分と適合するという意味において、薬学的に許容可能であり、その受容者に対して有害でないものでなければならない。
本発明の化合物、例えば、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連の糖溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、又はヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール、又はポリエチレングリコール）、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル１，３−ジオキサン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレングリコール）４００）、油、脂肪酸、脂肪酸エステル又はグリセリド、又は薬学的に許容可能な界面活性剤（例えば、石鹸又は洗剤）の添加された又はされていないアセチル化脂肪酸グリセリド、懸濁剤（ペクチン、カーボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースのような）又は乳化剤、並びにその他の薬学的な添加物及びアジュバントを含む、滅菌された液体又は液体の混合物のような、薬学的担体又は生理学的に許容可能な希釈液中で投薬することができる。
【０１９３】
剤形は、経口、直腸、局所又は非経口（皮下、筋肉内、及び経静脈を含む）投与に適した担体を含むことができる。好ましい担体は、経口又は非経口投与に適したものである。
非経口投与に適した剤形は、好ましくはレシピエントの血液と等張である、活性化合物の滅菌された水性調合剤を便宜的に含む。こうしてそのような剤形は、便宜的に、蒸留水、蒸留水又は生理食塩水の５％デキストロース溶液を含む。有益な剤形はまた、適当な溶液で希釈されたときに上記の非経口投与に適した溶液を与える化合物を含む濃縮された溶液又は固体を含む。
非経口投与に適した剤形は、水性又は非水性の溶液、等張の滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び対象のレシピエントの血液と等張の剤形を提供する溶質を含む）、及び水性又は非水性の滅菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、濃化剤、安定化剤及び防腐剤を含んでもよい）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１９４】
非経口投与の剤形は、一般的には、溶液中の有効成分の重さで、約０．５％〜約２５％まで含むであろう。適切な防腐剤及び緩衝液は、そのような剤形で用いられる。注入部位の刺激を最小化又は除外するために、そのような組成物は、約１２〜約１７までの親水−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、１つ又はそれ以上の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。このような剤形の海面活性剤の量は、約５〜約１５％重量の範囲である。適当な界面活性剤は、モノオレイン酸ソルビタン及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合により形成される疎水性塩基とエチレンオキシドとの高分子量付加物のような、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。非経口の剤形は、アンプルやバイアルのような、単位用量又は多用量の密封された容器に存在させ、注入のために、使用の直前に、例えば、水のような、滅菌された液体担体の添加だけを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥された）状況で、貯蔵することができる。一時的な注入溶液及び懸濁液は、すでに開示されている種類の、滅菌された粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
【０１９５】
本発明の化合物、例えば、高親和性のアデノシンＡ３受容体アゴニストは、注入可能な剤形に作られうる。注入可能な組成物のための効果的な薬学的担体の必要条件は、当業者によく知られている。「Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)」及び「ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)」を参照されたい；その全てを参照してこの明細書に取り込む。
腸内投与のために、化合物は、カプセル、薬包、錠剤又は薬用キャンデー（トローチ剤）のような個々の単位で、不活性な担体に挿入することができ、それぞれがあらかじめ決定された量の活性化合物を、粉末又は顆粒として；又は、例えば、シロップ、エリクシール、乳液又は吸入のような、水性の液体又は非水性の液体での懸濁液又は溶液として含んでいる。適切な担体は、でんぷん又は糖であり、潤滑剤、香味、結合剤及び他の同質の物質を含んでもよい。
【０１９６】
経口投与のために適した剤形は、（a）水、生理食塩水又はオレンジジュースのような、希釈剤に有効量の化合物を溶かしたような液体の溶液；（b）カプセル、薬包、錠剤、薬用キャンデー及びトローチであって、各々は固体又は顆粒として、あらかじめ決められた量の有効成分を含む；（c）粉末；（d）適当な液体中の懸濁液；及び（e）適切な乳化剤、からなる。液体の剤形は、水、及び例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールなどのアルコールのような、希釈剤を含んでもよく、追加の薬学的に許容の界面活性剤、懸濁剤又は乳化剤を添加しても添加しなくてもよい。カプセル型は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、及びラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、及びコーンスターチのような、不活性な充填剤などを含む、通常の硬い又はやわらかいからで覆われたゼラチンタイプでありうる。
【０１９７】
錠剤型は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、じゃがいもでんぷん、アルギン酸、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアールガム、コロイド状の二酸化シリコン、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の添加物、着色剤、希釈剤、緩衝液剤、崩壊剤、加湿剤、防腐剤、香料及び薬学的に適合する担体のうち、１つ又はそれ以上を含むことができる。薬用キャンデー（トローチ剤）が、当該技術分野で公知の担体に加えて、香料の有効成分、通常サクロース及びアカシア又はトラガカント、更にゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアのような不活性な基材中の有効成分を含むトローチ、乳液、ゲル及び同類の含有物、を包含することができる。
【０１９８】
錠剤は、任意に１つ又はそれ以上の補助的な成分と共に、圧縮又は鋳型法により製造される。圧縮された錠剤は、例えば、粉末又は顆粒などの自由流動の型の中に活性な化合物を、任意に、例えば結合剤、潤滑油、不活性な希釈剤、界面活性剤又は分散剤、などの補助的な成分と混合して、適切な機械の中で圧縮することにより調製することができる。鋳型法の錠剤は、適切な担体の何れかと共に、粉末状の活性化合物の混合物を適切な機械の中で鋳型に入れ、製造することができる。
【０１９９】
シロップ又は懸濁液は、糖の濃縮された水性溶液（例えば、スクロースに補助的な成分の何れかが加えられてもよい）に活性化合物を添加することにより製造される。このような補助的な成分は、香料、糖の結晶化を遅らせる薬剤、又は、例えばグリセロール又はソルビトールなどの多価アルコールのような、その他の成分の何れかの溶解性を高める薬剤を含んでいてもよい。
【０２００】
化合物はまた、調剤技術分野において公知の慣用的な方法により調製される、溶液、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、又はポリマー素材（例えば、プルロニックＴＭ、ＢＡＳＦ）の局所的な適用により、局部に投与することができる。溶液、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、又はポリマー基材及び有効成分に加えて、そのような局所投与の剤形はまた、防腐剤、香料、及び更なる活性な薬剤を含んでもよい。高親和性のアデノシンＡ３受容体アゴニストのための局所投与の剤形は、調剤技術分野において公知の慣用的な方法により調製される軟膏、クリーム、ゲル、及びローションを含む。そのような局所投与の剤形は又、さらに防腐剤、香料、及び更なる活性な薬剤を含んでもよい。好ましい追加の薬剤は、Ａ３受容体アンタゴニスト（例えば、ＭＤＲの阻害によって）によって癌治療が顕著に向上する又は利点がある、癌治療のための化学療法剤を含む。好ましい局所製剤の例として、高親和性のアデノシンＡ３及びタキサン系化合物が含まれる。
【０２０１】
非経口の剤形に用いられうる油は、石油、動物、野菜及び合成の油を含む。油の特別な例は、ピーナッツ、大豆、セサミ、綿実、コーン、オリーブ、石油及び鉱物を含む。非経口の剤形に用いられる適切な脂肪酸は、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。非経口の剤形に用いられる適切なセッケンは、脂肪族アルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩を含み、適切な界面活性剤は、（a）例えば、ハロゲン化ジメチルジアルキルアンモニウム及びハロゲン化アルキルピリジニウムのような、陽イオン性界面活性剤、（b）例えば、アルキル、アリル及びオレフィン硫酸エステル、アルキル、オレフィン、エーテル及び硫酸モノグリセリド、及びスルホコハク酸、のような陰イオン性界面活性剤、（c）例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン・コポリマーのような、非イオン性界面活性剤、（d）例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸及び２−アルキルイミダゾリン４級アンモニウム塩のような、両性界面活性剤、及び（e）それらの混合物を含む。
【０２０２】
さらに、例えば、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストなどの、本発明の化合物は、乳化基材又は水溶性基材のような、様々な基材と混合することにより、座薬を製造することができる。膣内投与に適した剤形は、有効成分に加えて、当該技術分野で公知の適当な担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、又はスプレーの剤形として提示されてもよい。
【０２０３】
直腸投与のための剤形は、例えば、ココアバター又はＷｉｔｅｐｓｏｌ Ｓ５５（登録商標）（Dynamite Nobel Chemical, Germany）のような、座薬の基材のための慣用的な担体を有する座薬として提示されてもよい。
【０２０４】
剤形は、便宜的に単位用量の形で提示され、調剤技術分野で公知の方法の何れかにより調製されてもよい。全ての方法は、１つ又はそれ以上の補助的な成分を構成する担体と活性化合物を組み合わせる工程を含む。一般的に、剤形は、液体の担体又は微細の固形の担体と活性化合物を均一に親密に組み合わせることにより、その後、必要であれば、その生成物を所望の単位用量形態に形成することにより調製される。
【０２０５】
前述の成分に加えて、本発明の剤形は、更に１つ又はそれ以上の細胞障害性薬剤、そして例えば、希釈剤、緩衝液、香料、結合剤、界面活性剤、濃化剤、潤滑剤、懸濁剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）などの薬剤の技術分野で用いられる、１つ又はそれ以上の任意の補助的な成分を更に含んでいてもよい。
【０２０６】
様々な送達システム、例えば、リポソーム、ミクロ粒子、マイクロカプセルへの封入などのシステムが、本発明の化合物を含む組成物を投与するために用いられる。
【０２０７】
幾つかの態様では、本発明の化合物は、本発明の化合物を標的へ送達するためにリポソーム内に製剤化される。リポソームは、水相を内封する同心円状に並べられたリン脂質二重層を含む小胞である。リポソームは一般的に、様々な型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む。リポソームの構成成分は、生物学的な膜の脂質の整列と同様に、二重層構造に整列される。リポソームは特に、部分的に、生物適合性、低い免疫原性及び低い毒性のために好ましい送達小胞である。リポソームの調製法は、当該技術分野で公知であり、本発明内に包含される。例えば、「Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688；Hwang et al., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4」；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号を参照されたい。それらの全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２０８】
本発明はまた、長期の血清半減期、すなわち米国特許第５，０１３，５５６号に開示されるように、促進された循環時間、を有するリポソームの調製方法を包含する。本発明の方法で用いられる好ましいリポソームは、循環からすぐには消失しない、すなわち単核食細胞系（ＭＰＳ）に取り込まれない。本発明は、当業者に知られている一般的な方法を用いて調製される、無菌的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機構に限定することを意図するものではないが、無菌的に安定化されたリポソームは、リポソームと血清タンパク質との望ましくない反応を減弱させ、血清成分とのオプソニン化を減弱させ、そしてＭＰＳによる認識を低下させる、嵩高く、高度に柔軟性がある親水性領域をもつ脂質成分を含む。無菌滅菌的に安定化されたリポソームは、好ましくは、ポリエチレングリコールを用いて調製される。リポソーム及び無菌的に安定化されたリポソームの調製のために、例えば、「Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224」；「Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6」；「Klibanov et al., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7」；「Blum et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7」；「Torchilin .et al., 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116」；「Litzinger et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107」；「Maruyama et al., 1991, Chem. Pharm. Bull., 39: 1620-2」；「Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8；Allen et al., 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309」を参照されたい；それらの全てを参照して本明細書に取り込む。本発明はまた、標的化される特異的な臓器に応用されるリポソームを包含する。例えば、米国特許第４，５４４，５４５号を参照されたい。特に本発明の組成物及び方法に用いられる有用なリポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導化フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発乾燥法により生成される。リポソームは、望ましい径を有するリポソームを産生するために、決められた孔の大きさをもつフィルターを通して押し出される。いくつかの態様では、本発明の抗体の断片、例えばＦ(ａｂ’)は、すでに開示されている方法を用いてリポソームに結合させることができる。例えば、「Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288」を参照されたい。それらの全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２０９】
患者に投与するためのリポソームやミクロスフィアを調製する方法は、当業者によく知られている。米国特許第４，７８９，７３４号は、その内容は全てを参照して本明細書に取り込むが、生物学的な物質をリポソーム内に封入するための方法を記述している。この方法では、特に素材は水性溶液に溶かされ、適当なリン脂質及び脂質を、必要なら界面活性剤と共に加えて、その素材は必要に応じて透析し、超音波処理する。公知の方法の総説は、「G. Gregoriadis, Chapter 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979)」により提供され、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２１０】
ポリマーやタンパク質から形成されるミクロスフィアは当業者によく知られ、胃腸管を介して血流に直接通過するために適合化させることができる。あるいは、化合物はミクロスフィア又はミクロスフィアの混合物に取り込まれ、数日から数ヶ月の範囲の期間を超える徐放のために埋め込むことができる。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、第４，９２５，６７３号及び第３，６２５，２１４号を参照されたい、そして、それらの全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２１１】
好ましい微粒子は、ポリグリコライド、ポリラクチド及びそれらのコポリマーのような生分解性のポリマーから調製されたものである。当業者は、薬剤の望ましい放出速度及び望ましい用量を含む様々な要因に従って、適切な担体システムを容易に決定することができる。
【０２１２】
別の態様では、組成物は小胞内、特にリポソーム内に送達されうる（「Langer, Science 249:1527-1533 (1990)」；「Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)」；「Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327」を参照されたい、一般に同書を参照されたい）。
【０２１３】
別の態様では、組成物は、制御された放出又は徐放システムで送達することができる。当業者に公知の技術の何れかが、１つ又はそれ以上の本発明のＡ３受容体アンタゴニストを含む徐放性製剤を生成るために用いることができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ国際公開第９１／０５５４８号公報；ＰＣＴ国際公開第９６／２０６９８号公報；「Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189」、「Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397」；「Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854」；及び「Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760」を参照されたい。それらの各々を、その全てを参照して本明細書に取り込む。一態様では、ポンプが制御放出系に用いることができる（「Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed Eng. 14:20」；「Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507」；及び「Saudek et al., 1989, N. Engl. 
J. Med 321:574」を参照されたい）。別の態様では、ポリマー素材が、Ａ３受容体アンタゴニストの制御された放出を達成するために用いられる（例えば、「Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida. (1974)」；「Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)」；「Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61」；「Levy et al., 1985, Science 228:190」；「During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105」；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８．３２６号；ＰＣＴ国際公開第９９／１５１５４号公報;ＰＣＴ国際公開第９９／２０２５３号公報も参照されたい）。持続的な放出の製剤に用いられるポリマーの例は、これらに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコライド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルを含む。更なる別の態様では、制御された放出系は治療標的（例えば肺）の近傍に置かれ、これによって、全身投与量の一部しか必要としない（例えば、「Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)」を参照されたい）。別の態様では、制御された放出埋め込み体として有用なポリマー構成成分は、Ｄｕｎｎら（米国特許第５，９４５，１５５号を参照されたい）に従って用いられる。この特定の方法は、ポリマー系から生物活性物質のｉｎ  ｓｉｔｕ制御された放出の治療効果に基づいている。埋め込みは、一般に、治療的な処置が必要な患者の体内のどこにでも存在させることができる。別の態様では、薬物送達システムとして用いられる患者体内の非ポリマーの埋め込みによって、非ポリマーの持続的な送達システムが用いられる。体内に埋め込まれるとき、埋め込みの有機溶剤は、組成物から周囲の組織液へ消散し、分散し、又は浸出するであろう。そして非ポリマー物質は、徐々に凝固又は沈殿して、固体の微小孔のあるマトリクスを形成するであろう（米国特許第５，８８８，５３３号を参照されたい）。
制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる総説において議論されている（1990, Science 249:1527-1533）。当業者で公知の技術の何れかは、本発明の１つ又はそれ以上の治療薬を含む、持続的な放出製剤を生産するために使用される。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号公報及び第９６／２０６９８号公報；「Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189」；「Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397」；「Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854」；及び「Lam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760」を参照されたい。それらの各々は、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２１４】
本発明の化合物を投与する方法は、これらに限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外及び粘膜投与（例えば、鼻内及び口腔経路）を含む。特定の態様では、本発明の化合物は、筋肉内、静脈内又は皮下に投与される。組成物は、便宜的な経路の何れか、例えば、注射又は一度の注入により、上皮又は皮膚と粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸管粘膜など）を通した吸収により、投与され、そしてその他の生物学的に活性な薬剤と共に投与されてもよい。投与は、全身的又は局所的でありうる。加えて、肺投与はまた、例えば、吸入器又は噴霧器の使用により、及びエアロゾル化試薬を用いた製剤化により、用いることができる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，２０号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号及び同第４，８８０，０７８号；及びＰＣＴ国際公開第９２／１９２４４号公報；同第９７／３２５７２号公報；同第９７／４４０１３号公報；同第９８／３１３４６号公報；及び同第９９／６６９０３号公報を参照されたい。それらの各々を、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２１５】
一態様では、粒子が経静脈的に送達されて、生長している腫瘍の周りの毛細血管床にトラップされるような大きさをもつ、リポソーム又は微粒子内に存在させ、化合物を経静脈的に投与する。この態様における適切な粒子サイズは、例えば、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標)という名称で市販されているリポソームで現在用いられているようなものであり、その径は約２００〜５００μｍと考えられている。その後、化合物は、腫瘍の部位で局所的に、時間をかけて放出される。
このことは、細胞毒性薬の投与の全身性の副作用を効率的に制限することができ、そしてアデノシンアンタゴニスト及びその他の抗アレルギー薬剤を、血管増殖が阻害される部位に直接標的として投与される。
【０２１６】
別の態様では、腫瘍が外科的に取り除かれる部位に適用される組織被覆、好ましくはポリマーの組織被覆、より好ましくは生分解性の組織被覆内に存在させ、化合物は投与される。適切なポリマー素材は、例えば、Ｈｕｂｂｅｌｌらの米国特許第５，４１０，０１６号に開示され、その内容は、参照して本明細書に取り込む。
【０２１７】
アデノシンＡ３アンタゴニストと組み合わせたポリマーのバリアは、更にその他の血管新生剤及び／又は細胞毒性薬と組み合わせてもよく、物理的バリアー、更に腫瘍増殖及び腫瘍周辺の脈管構造に対する化学的バリアーを提供する。
【０２１８】
上記の２つの態様は、著しい全身性副作用を伴う細胞毒性薬を使用する場合に、特に有用である。本発明の化合物を特異的部位を標的として投与して、局所的に本発明の化合物を供給することにより、全身性副作用を軽減できる。
【０２１９】
更に他の態様において、抗ＶＥＧＦ抗体は、本発明の化合物を含む微粒子又はリポソームと共有結合できる。その抗体を、当該化合物の標的供給のみならず、血管形成阻止による腫瘍増殖の阻害を支援するために用いることができる。
【０２２０】
疾患に関連する１つ又はそれ以上の症状の治療、予防又は改善において効果的であろう本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定されうる。製剤に用いられる正確な投与量はまた、投与経路及び状況の重篤度に依存するであろう、また開業医及び各々の患者の状況を判断して決められるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から外挿されうる。
【０２２１】
特定の態様では、本発明の薬学的組成物を処置が必要な領域に局所的に投与することが望ましい；これは、これらに限定されないが、例えば、局所的な注射により、注入により、又は埋め込み方法により、達成することができ、この埋め込みは、シアラスチック（sialastic）膜のような膜又は線維を含む、孔の開いた、孔の開いていない、又はゼラチン素材からなる。
【０２２２】
対象を治療及び予防に有効な量の本発明の化合物で処置することは、単回処置を含み、好ましくは連続的な処置を含む。好ましい実施例において、対象は、本発明の化合物を、患者の体重当たり約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｇ／ｋｇで、週に１回投与で、約１〜１０週間、好ましくは約２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、及び更により好ましくは、約４，５又は６週間の範囲で処置される。その他の態様では、本発明の薬学的組成物は、１日に一度、１日に二度、又は１日に三度、投与される。その他の態様では、薬学的組成物は、週に一度、週に二度、二週間に一度、月に一度、六週間に一度、二ヶ月に一度、年に二度又は年に一度で、投与される。処置に用いられる化合物の有効な投与量は、特定の処置の工程で、増加させたり、減少させたりすることも、評価されるであろう。アデノシンＡ３受容体のアゴニストとして効果的であることが要求される化合物の量は、もちろん、選択された活性部位、処置される個々の哺乳動物、で異なり、最終的には、医学又は獣医学の開業医の裁量にゆだねられる。考慮されるべき要因は、活性物質の結合親和性、投与経路、製剤の性質、哺乳動物の体重、表面積、年齢及び一般的状況、及び投与される特定の化合物を含む。
【０２２３】
毎日の投与の総量は、単回投与量、多数回投与量、例えば１日に２〜６回、又は選択された期間の静脈内注射として与えられる。上記範囲より高い又はより低い投与量は、本発明の範囲内であり、所望され必要なら、個々の患者に投与されうる。例えば、７５ｋｇの哺乳動物では、用量範囲は、１日当たり約７５μｇ〜約５０ｍｇであり、そして一般的な用量は、１日当たり約５０ｍｇであろう。もし個別の多数用量を示すならば、処置は一般的に、日に３回で本発明の化合物の５０ｍｇであろう。
【０２２４】
本発明はまた、本発明の化合物が、アンプルや、抗体の量を示唆する小包のような密封された容器にパックされることを提供する。一態様では、本発明の化合物は、密封してシールした容器に、乾燥滅菌された凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、供給され、例えば、対象に投与する適切な濃度に水又は生理食塩水で再構成される。好ましくは、本発明の化合物は、密封してシールした容器内に、乾燥滅菌された凍結乾燥粉末として、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、又は少なくとも７５ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも５００ｍｇ又は少なくとも１ｇの単位用量で、供給される。本発明の凍結乾燥化合物は、もとの容器で、２から８℃の間で貯蔵されるべきで、化合物は、再構成された後、１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内に投与されるべきである。別の態様では、本発明の化合物は、化合物の量と濃度を示している密封してシールした容器内に、液体の形で供給される。好ましくは、化合物の液体の形態は、密封してシールした容器内に少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの化合物で供給される。
【０２２５】
剤形は、便宜的に単位用量形態で表され、薬局の技術分野で公知の方法の何れかで調製される。全ての方法は、１つ又はそれ以上の補助的な成分を構成する担体と活性化合物を組み合わせる工程を含む。一般的に、剤形は、液体の担体又は微細の固形の担体と活性化合物を均一に親密に組み合わせることにより、その後、必要であれば、その生成物を所望の単位用量形態に形成することにより調製される。
【０２２６】
前述の成分に加えて、剤形はさらに、１つ又はそれ以上の任意の薬剤の技術分野で用いられる補助的な成分、例えば、希釈剤、緩衝液、香料、結合剤、界面活性化試薬、濃化剤、潤滑剤、懸濁剤、防腐剤（抗酸化剤を含む）などを含むことができる。
【０２２７】
剤形は、経口、直腸、局所，又は非経口（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）投与に適切な剤形を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、経口又は非経口に適した剤形である。
【０２２８】
本明細書に記載される薬学的に許容可能な担体は、例えば、媒体、アジュバント、賦形剤又は希釈剤であり、当業者によく知られており、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、活性化合物に対し化学的に不活性であり、使用する条件において、有害な副作用又は毒性を有しないものであることがより好まれる。
【０２２９】
担体の選択は、特定の活性な薬剤により、更に組成物を投与するために用いられる特定の方法により、一部決定されるであろう。従って、本発明の薬学的組成物の様々な適切な製剤がある。経口、エアロゾル、非経口、皮下、経静脈、経動脈、筋肉内、腹腔内、髄腔内、直腸、及び膣内投与のための以下の製剤は、単なる例示であり、限定されるものではない。
【０２３０】
本発明の化合物、例えば、高親和性アデノシンA３受容体アンタゴニストは、単独か又は他の適切な組成物との組み合わせで、吸入により投与されるエアロゾル製剤に製造される。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、加圧可能な加圧ガス中に置かれる。それらはまた、噴霧器又は霧吹きのような、非圧縮的調製のための調剤として製剤化することができる。
【０２３１】
（６．５  治療的／予防的利用の特徴及び実証）
薬学的組成物のいくつかの態様では、本発明の予防薬又は治療薬は、ヒトに使用する前に所望の治療活性のために、好ましくは、インビトロ、例えば、細胞培養系で、そしてその後インビボ、例えば、げっ歯類の動物モデル系のような動物モデル生物において、試験される。予防薬及び／又は治療薬の組み合わせは、ヒトに用いる前に、適切な動物モデル系で試験される。このような動物モデル系は、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどを含むが、これらに限定されるものではない。当該技術分野でよく知られる動物系の何れかが、使用される。例えば、特異的な薬学的組成物の投与を指示するかどうか決定するために用いられるアッセイは、細胞培養アッセイを含み、本明細書で、患者の組織サンプルは培養内で成長して、薬学的組成物に曝す又はさもなければ接触させて、組織サンプルにおけるそのような組成物の有効性が観察される、例えば、軟寒天、又は三次元基底膜若しくは細胞外マトリクス製剤中の管状ネットワーク形成での、増殖及び／又はコロニー形成を阻害又は減少が観察される。組織サンプルは患者からの生検により入手できる。この検査で、各患者個体に関する治療的に最適な予防的又は治療的分子の同定ができる。あるいは、患者からの細胞培養の代わりに、治療薬及び方法を、腫瘍細胞又は悪性細胞株を用いて選別することもできる。種々の特異的態様において、インビトロアッセイは、自己免疫又は炎症性疾患（例えば、Ｔ細胞）を含む細胞型の代表的な細胞を用いて、本発明の薬学的組成物がそのような細胞型上で所望の効果を有するかどうか判定するために、実施できる。当該分野の多くのアッセイ標準を、そのような生存及び／又は成長を評価するために用いることができる；例えば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取込の測定により、直接細胞計数により、ガン原遺伝子（例えば、foｓ、myc）のような公知の遺伝子の転写活性又は細胞周期マーカーの変化を検出することにより検定でき、細胞存続は、トリパンブルー染色により評価でき、分化は、軟寒天、又は三次元基底膜若しくは細胞外マトリクス製剤中の管状ネットワーク形成での、増殖及び／又はコロニー形成を減少させる形態の変化に基づき、視覚的に検定できる。
【０２３２】
予防薬及び／又は治療薬の組み合わせは、ヒトに用いる前に、適切な動物モデル系で試験されうる。そのような動物モデル系は、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、などを含むが、これらに限定されるものではない。当業界によく知られるいかなる動物系も、使用することができる。本発明の特定の態様では、予防薬及び／又は治療薬の組み合わせは、マウスモデル系において試験される。そのようなモデル系は、当業者には公知であり、広く使用されている。予防薬及び／又は治療薬は、繰り返し投与することができる。手順のいくつかの局面では、予防薬及び／又は治療薬の投与の一時的な計画のように変化してもよく、そのような薬剤が別々に又は混合剤として投与される。
【０２３３】
本発明の予防薬及び／又は治療薬が動物モデルで試験されると、それらの効力を確立するために臨床治験において試験されうる。臨床治験を確立することは、当業者に知られる一般的な方法論に従って実施され、本発明の組成物の毒性プロフィールと同様に最適な投与量と投与経路が通常行われる実験によって確立される。
【０２３４】
本発明の予防的及び／又は治療的手順の毒性及び有効性は、例えば、ＬＤ５０値（集団の５０％が死亡する用量）やＥＤ５０値（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比率は、治療指数及びＬＤ５０値／ＥＤ５０値比として表現される。大きな治療指数を表す予防薬及び／又は治療薬は、より好ましい。毒性副作用を示す予防薬及び／又は治療薬が用いられうる場合、非感染細胞への可能性ある障害を最小化し、それにより副作用を減弱するために、そのような薬剤で疾患に冒された組織の部位を標的とする送達系をデザインすることに注意が払われなければならない。
【０２３５】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための予防薬及び／又は治療薬の投与量の範囲で製剤化することに用いられる。そのような薬剤の投与量は、好ましくは、毒性が殆どなく又は全くなく、ＥＤ５０値を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる用量形態及び使用される投与経路に依存して、この範囲内で変わりうる。本発明の方法に用いられるいかなる薬剤にとっての治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから評価される。投与量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０値（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環する血漿中濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて製剤化される。そのような情報は、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定するために用いられる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定される。
【０２３６】
本発明に従って用いられる治療の抗癌活性はまた、ＳＣＩＤネズミモデル又はヒト異種移植片を有する遺伝子導入マウス又はヌードマウスのような、癌検討のための種々の実験動物モデルを用いて測定することができる。また、ハムスター、ウサギ等のような動物モデルは、当該技術分野で公知であり、「抗癌剤開発に関する腫瘍モデルの関与性（1999,eds.Fiebig and Burger)」、「腫瘍学へ貢献(1999, Karger)」、「腫瘍学研究におけるヌードマウス（1991, eds.Boven and Winograd）」及び「抗癌剤開発ガイド（1997 ed.Teicher）」に記載され、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０２３７】
本発明の手順及び組成物は、ヒトに用いられる前に、所望の治療的又は予防的活性のために、好ましくは、インビトロで、その後インビボで、試験される。治療薬及び方法は、腫瘍細胞又は悪性腫瘍細胞株を用いて選択することができる。当該技術分野の多くのアッセイ標準を、そのような生存及び／又は成長を評価するために用いることができる；例えば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジン取込の測定により、直接細胞計数により、ガン原遺伝子（例えば、foｓ、myc）のような公知の遺伝子の転写活性又は細胞周期マーカーの変化を検出することにより検定でき、細胞存続は、トリパンブルー染色により評価でき、分化は、軟寒天、又は三次元基底膜若しくは細胞外マトリクス製剤中の管状ネットワーク形成での、増殖及び／又はコロニー形成を減少させる形態の変化に基づき、視覚的に検定できる。
【０２３８】
治療に用いられる化合物は、ヒトに試験される前に、これらに限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなど、例えば、上記の動物モデルを含む適切な動物モデル系において試験されうる。化合物はその後、適切な臨床治験に用いられうる。
【０２３９】
（６．５．１  抗増殖アッセイ）
本発明の化合物の抗増殖活性は、細胞成長阻害アッセイを使用する慣用的な実験により、容易に測定することができる。そのようなアッセイのための細胞株の選択は、所望される将来の薬学的使用に基づく。多くの細胞株がアメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection, Manassas、VA）から検討のために入手可能である。アッセイに適した細胞株には、ＨＬ−６０ヒト白血病、Ａ３７５ヒトメラノーマ、ＳＫＭＥＳヒト肺癌、ＨＴ２９ヒト大腸癌及びＰａｎｃ−１ヒトすい臓癌細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞株は、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（フンギゾン）、２ｍＭのグルタミン、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０％の熱不活性化胎児ウシ血清が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で保持されることができる。そのように保持された細胞は、Ｔ２５ファルコン組織培養フラスコ内で３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内で培養されることができる。例えば、そのように保持された細胞は、Ａ３７５ヒト白血病では約２２時間、ＳＫＭＥＳヒト肺癌では４６時間、ＨＴ２９ヒト大腸癌では４８時間、Ｐａｎｃ−１ヒトすい臓癌では６０時間が各々の倍増時間で、週に２回の継代培養ができる。
【０２４０】
成長阻害アッセイのひとつはＭＴＴアッセイである。細胞（１０００〜１５００細胞／ウエル）が総容量１００μｌ／ウエルで９６ウエルマイクロ培養プレートに植え付けられる。３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内で一晩培養された後、様々な濃度の培地で希釈された化学治療薬を、各々のウエルに１００μｌ添加する。プレートは、３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内に７〜１０日置かれる。それからプレートは簡単に遠心され、１００μｌの増殖培地が除去される。細胞培養物は、５０μｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム・ブロマイド］試薬（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水内で１ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４時間培養される。結果として生じる紫ホルマザン沈殿物が２００μｌのイソプロパノール中の０．０４Ｎの塩酸で溶解される。吸光度が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０マイクロプレートリーダーを用いて、５９５ｎｍの波長と、参照となる６５５ｎｍの波長で測定される。好ましくは、全ての試験は個々の投薬量レベルにおいて２回実行される。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製マイクロプレートリーダーは、適切に設置されている場合には、試験結果をＥＺＥＤ５０プログラムのようなコンピュータプログラムを介してパーソナルコンピュータへ送信する。ＥＺＥＤ５０コンピュータプログラムは、対照細胞と比較して５０％細胞成長を阻害する試薬の濃度を見積もる。これはＩＣ５０値と呼ばれるもので、以下の４つの対数の式を用いる曲線フィッティングテストデータにより決定される。
【０２４１】
Ｙ＝（Ａｍａｘ−Ａｍｉｎ）／｛１＋（Ｘ／ＩＣ５０）ｎ｝＋Ａｍｉｎ
ここでＡｍａｘは対照細胞の吸光度、Ａｍｉｎは最も高い濃度で試薬が存在する際の細胞の吸光度、Ｙは測定された吸光度、Ｘは試薬の濃度、ＩＣ５０は対照細胞に比較して細胞成長を５０％阻害する試薬の濃度、ｎは曲線の傾きである。
【０２４２】
もし試験濃度が適切に選択されれば（すなわち、低濃度では全く又はほとんど成長が阻害されず、高濃度では完全に阻害される）、ＥＺＥＤ５０プログラムはデータを非常によくフィットさせ、ＩＣ５０値を正確に見積もる。もし試験薬があまりに強力で、全ての試験された濃度において５０％以上細胞成長を阻害する場合には、ＥＺＥＤ５０プログラムではＩＣ５０値を正確に見積もることができない（誤ってフィットされたＡｍａｘ値により表されたものとして）。これらの例では、データはＡｍａｘ値を修正することにより、再分析されることができるだろう。
【０２４３】
一方、仮に試験される化合物が最も高い試薬濃度において不完全にしか阻害しない場合には、ＥＺＥＤ５０は試験試薬の能力を過大評価するだろう（フィットされたＩＣ５０値は実際のＩＣ５０値より低い）。この場合、ＩＣ５０値はＡｍａｘとＡｍｉｎ値の両方が決定された場合には、より正確に評価されるだろう。Ａｍａｘ及び／又はＡｍａｘとＡｍｉｎを、実験を繰り返すことなく決定することによりＩＣ５０値を見積もることは便利かもしれないが、ＩＣ５０値を正確に決定するのに最もよい方法は、試験試薬の濃度を減少又は増加させて試験を繰り返すことである。
【０２４４】
阻害アッセイ試験はまた、Ａ３受容体アンタゴニストを他の腫瘍阻害薬と組み合わせることにより増大した治療効果を決定するために使用される。細胞成長阻害アッセイは、Ａ３受容体アンタゴニストを選択された濃度で含有する又は含有しないで、実施される。腫瘍阻害薬のＩＣ５０値が、Ａ３受容体アンタゴニストの共存下でより低い場合には、増大した治療効果が存在する。
【０２４５】
定量的には、増強係数（ＥＦ）は、腫瘍抑制薬のＩＣ５０値を同じ細胞株のＡ３受容体アンタゴニストとともに腫瘍阻害薬を用いた場合のＩＣ５０値で割ることで算出される。
増強係数（ＥＦ）＝抗腫瘍薬のＩＣ５０値／（抗腫瘍薬とＡ３受容体アンタゴニストのＩＣ５０値）
【０２４６】
ＥＦの解釈は、試験されるＡ３受容体アンタゴニストの濃度に依存する。例えば、Ａ３受容体アンタゴニストを非常に低い濃度で使用する場合には、もしＡ３受容体アンタゴニストの濃度が細胞成長阻害の閾値よりも下の場合には、１．０より大きいＥＦ値は、相乗作用を示す。
【０２４７】
（６．５．２  アデノシン受容体に基づくアッセイ）
アデノシンＡ３アゴニストとしての本発明の化合物の活性及び選択性は、本明細書に開示される又は当業者に公知のあらゆるアッセイを用いて、通常の実験を越えることなく、容易に決定される。Ａ１及びＡ２Ａ受容体は、ヒトとげっ歯類で同様の薬理学効果を示すので、ラット由来の内因性受容体は、Ａ１及びＡ２Ａ結合アッセイのために用いられる。
【０２４８】
典型的なラットＡ１及びＡ２Ａアデノシン受容体結合アッセイは、次の工程を含む。膜の調製：雄性Ｗｉｓｔｅｒラット（２００〜２５０ｇ）は断首され、全脳（ｍｉｎｕｇ脳幹、線条体及び小脳）は氷上で解剖された。脳組織は、２０倍容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で、ポリトロン（セッティング５）で粉砕することができる。ホモジネートは、その後、４８，０００ｇで１０分間遠心分離され、生成したペレットは、２ＩＵ／ｍｌの４型アデノシンデアミナーゼ（Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA）を含むＴｒｉｓ・ＨＣｌ中に再縣濁される。３７℃で３０分間のインキュベーション後、膜は遠心分離され、ペレットは−７０℃で貯蔵される。線条体組織は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む２５倍容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ポリトロンでホモジナイズされる。その後、ホモジネートは、４℃で４８，０００ｇで１０分間遠心分離され、２ＩＵ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼを含むＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液中に再縣濁される。３７℃で３０分間のインキュベーション後、膜は遠心分離され、ペレットは−７０℃で貯蔵された。放射性リガンド結合アッセイは、以下の工程を含む：［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ（１，３−ジプロピル−８−シクロペンチルキサンチン）のラット脳の膜に対する結合は、本質的にＢｒｕｎｓらによって以前記載された方法（「1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 5547-5551」；その全てを参照して、本明細書に取り込む）に従って実施される。置換実験は、１ｎＭの［３Ｈ］−ＤＰＣＰＸ、１００μｌのラット脳希釈膜（アッセイ当たり１００μｇタンパク質）及び少なくとも６〜８ケースの異なる濃度の検討化合物を含む、０．２５ｍｌの緩衝液中で実施される。非特異的結合は、１０μＭのＣＨＡ（Ｎ６シクロヘキシルアデノシン）の存在下に測定され、これは常に全結合の１０％以下である。インキュベーション時間は、一般的には２５℃で１２０分である。
【０２４９】
放射性リガンドの結合アッセイは、以下の工程を含む：［３Ｈ］−ＳＣＨ５８２６１（５−アミノ−７−（２−フェニルエチル）−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン）のラット線条体膜（アッセイ当たり１００μｇタンパク質）への結合は、Ｚｏｃｃｈｉらの記載の方法（「1996, J. Pharm. and Exper. Ther. 276:398-404」；その全てを参照して、本明細書に取り込む）に従って実施される。競合実験において、少なくとも６〜８ケースの異なる濃度の検討化合物が用いられるべきである。非特異的結合は、５０μＭのＮＥＣＡ（５‘−（Ｎ−エチルカルボキサミド）アデノシン）の存在下に測定される。インキュベーション時間は、一般的に２５℃で６０分である。結合及びフリーの放射活性は、ブランデル社製セルハーベスター（Gaithersburg, Md., USA）を用い、ワットマンＧＦ／Ｂのグラスファイバーろ紙を通して、アッセイ混合物をろ過することにより分離される。インキュベーション混合物は、３ｍｌの氷冷培養緩衝液で希釈され、すばやく真空ろ過され、そしてろ紙は３ｍｌのインキュベーション緩衝液で３回洗浄される。放射活性を結合したろ紙は、例えば、液体シンチレーションスペクトロメトリーにより、測定される。タンパク質濃度は、例えば、バイオラド（Bao-Rad）の方法（「Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248」；その全てを参照して、本明細書に取り込む）に従って、ウシアルブミンを参照標準として用いることで、測定される。
【０２５０】
ヒトクローン化Ａ３アデノシン受容体結合アッセイの一般的なアッセイは、以下の工程を含む：結合アッセイは、サルバトールらの記載された方法（「1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10365-10369」；その全てを参照して、本明細書に取り込む）に従って実行される。飽和検討において、ヒト組み換えＡ３アデノシン受容体（Research Biochemical International, Natick, Mass., USA）でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞由来の膜（８ｍｇタンパク質／ｍｌ）のアリコートは、０．１〜５ｎＭの範囲の１０〜１２ケースの異なる濃度の［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡとインキュベーションさせる。競合実験は、試験管に、０．３ｎＭ［１２５Ｉ］ＡＢ−ＭＥＣＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４、２０μｌの希釈された膜（１２．４ｍｇタンパク質／ｍｌ）及び少なくとも６〜８ケースの異なる濃度の検討リガンドを含む最終容量１００μｌ中で、２つ組で実施される。インキュベーション時間は、以前の時間経過実験の結果に従って、３７℃で６０分であった。結合及びフリーの放射活性は、ブランデル社製セルハーベスターを用い、ワットマンＧＦ／Ｂのグラスファイバーろ紙を通して、アッセイ混合物をろ過することにより、分離される。非特異的結合は、５０μＭのＲ−ＰＩＡの存在下での結合として決定され、全結合の約３０％であった。インキュベーション混合物は、３ｍｌの氷冷培養緩衝液で希釈され、すばやく真空ろ過され、そしてろ紙は３ｍｌの培養緩衝液で３回洗浄された。放射活性を結合したろ紙は、ベックマンガンマ５５００Ｂのガンマカウンターで計数された。タンパク質濃度は、バイオラドの方法に従い、ウシアルブミンを参照標準として測定される。
【０２５１】
データ解析は、次のように実施される：結合阻害定数、Ｋｉの値は、ＩＣ５０の値からＣｈｅｎｇ＆Ｐｒｕｓｏｆｆの式（Cheng and Prusoff, 1973, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108）、Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋[Ｃ＊]Ｉ／ＫＤ＊）、ここで[Ｃ＊]は、放射性リガンドの濃度であり、ＫＤはその解離定数である、に従って計算される。重み付けされた非線形最小二乗法曲線外挿プログラムＬＩＧＡＮＤ（Munson and Rodbard, 1990, Anal. Biochem. 107:220-239）は、飽和や阻害実験のコンピュータ解析に用いられる。データは、一般的には、幾何平均で表され、９５％又は９９％信頼区間をカッコ内に付記する。
【０２５２】
いくつかの態様において、本発明の化合物の有効性を動物モデルにおいて試験することができる。例えば、アデノシンＡ３受容体アンタゴニスト単独か、又は細胞毒性薬／抗新生物薬及び抗血管形成薬のような従来の抗腫瘍剤との組合せの有効性を従来薬単独の場合と比較することができる。一般的に、所定の大きさの腫瘍を、ネズミ又はマウスに存在させる。マウスを薬剤で処理して、腫瘍の大きさを繰り返し測定する。動物の生存期間の平均も測定できる。使用するアデノシンＡ３アンタゴニストは、試験する動物内のアデノシンＡ３受容体と活性的に結合していなければならない。異種移植片を特異的細胞毒性化合物としての能力を試験するために動物中に移植することができる。しかし、抗血管形成療法の効果は、抗血管形成化合物が特異的動物の脈管の阻害にいかによく作用するかに依存している。
【０２５３】
腫瘍増殖を抑制するエンドスタチンとアンジオスタチンの有効性が実証するアッセイ方法を、Ａ１、Ａ２Ａ及びＡ３受容体アンタゴニストに実施できる。例えば、ルイス肺癌、Ｔ２４１線維肉腫又はＢ１６Ｆ１０メラノーマは、マウスに移植できる（Boehm et al.,1977,Nature,390:404-407；本明細書でその全てを参照して、本明細書に取り込む）。ＰＣ−３ヒト前立腺腫、ＣＣＬ１８８ヒト結腸腫及びＵＢＣ膀胱癌のような、他の腫瘍は血管形成剤を放出している（Chen et al.,1996, Cancer Res., 55:4230-4322；本明細書でその全てを参照して、本明細書に取り込む）。これらの腫瘍もまた、アデノシンアンタゴニストの抗腫瘍活性を促進するためにマウスに移植することができる。アデノシンアンタゴニストは、本明細書に記載の方法によりマウスに投与することができる。この治療法は、単独か、又は抗血管形成療法又は従来の化学療法と組合わせて用いることができる。
【０２５４】
（６．５．３  ＨＩＦ−１αレベルを測定し及び決定するための方法）
本発明は、ＨＩＦ−１α発現の定量的及び定性的局面を評価するための方法を包含する。一つの具体例において、増加したＨＩＦ−１α発現の遺伝子又は遺伝子産生物は、癌又はＨＩＦ−１α発現の増加に関連する疾病又は疾患の進行に対する素因を示している。あるいは、ＨＩＦ−１α発現レベルが増大した遺伝子又は遺伝子産生物は、対象における癌の存在又は当該対象における該癌の転移の危険性を示しうる。当該技術分野で公知の手法、例えば、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ若しくはノーザンブロットは、ＨＩＦ−１αの発現レベルを測定するために用いられる。ＨＩＦ−１α遺伝子又は遺伝子産生物発現の定性的及び定量的の両局面を記載する方法は、以下の実施例に詳細に述べる。ＨＩＦ−１α遺伝子発現レベルの測定は、自然に起こるＨＩＦ−１α転写物及びその変異体、更に非自然的に起こるその変異体を測定することを含むことができる。しかしながら、対象における病気又は疾患の診断及び／又は予後のためには、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物は、好ましくは、自然に起こるＨＩＦ−１α遺伝子産生物又はその変異体である。こうして、本発明は対象におけるＨＩＦ−１α遺伝子の発現を測定する方法に関する。
【０２５５】
ＨＩＦ−１αレベルを検出及び／又は定量化するための当該技術分野で知られる方法の何れかは、本発明の方法及びキットで使用することができる。その多くは本明細書に例示される。特に好ましいのは、ＨＩＦ−１α活性又はＨＩＦ−１α関連の活性を検出及び／又は定量化するための当該技術分野で公知の、例えば、ＨＩＦ−１α経路において下流のエフェクター分子のリン酸化する方法である。いくつかの態様では、本発明は、ＨＩＦ−１α活性、又はこれに限定されないが、ＨＩＦ−１αシグナル伝達カスケードの１つ又はそれ以上の下流のエフェクターの活性を測定することを含む、ＨＩＦ−１α関連活性を測定すること、を包含する。ＨＩＦ−１α活性又はＨＩＦ−１α関連の活性を測定することは、本明細書に開示される方法の何れか、又は当業者に知られる標準的な方法の何れかを用いて行われる。
【０２５６】
その他の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法の何れか、又は当業者に知られる標準的な方法の何れかを用いて行われる、対象から得られたサンプル中のＨＩＦ−１αをコードする核酸の定量を包含する。
【０２５７】
更に他の態様では、本発明は、病気又は疾患（例えば、癌）を有する対象由来のサンプルにおいて、ＨＩＦ−１αタンパク質の定量化を包含する。ＨＩＦ−１αタンパク質の検出及び定量のための当該技術分野で公知の方法が、本発明の中に包含されている。
【０２５８】
（６．５．３．１    核酸分子の検出）
本発明の方法及びキットは、対象から得られたサンプルにおけるＨＩＦ−１αをコードする核酸配列の検出及び／又は定量を包含する。ある態様では、本発明は、癌に罹患した対象から得られたサンプルにおいて、特異的なＨＩＦ−１αの核酸配列を増幅する方法、そしてそれを検出及び／又は定量するための方法を提供する。ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、当該技術分野でよく知られている。例えば、「Wang et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 5510-4」；及び国際公開第９６／３９４２６号公報を参照されたい。それらの全ては、その全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２５９】
本発明の方法及びキットは、米国特許第５，５２５，４６２号；第６，５２８，６３２号；第６，３４４，３１７号；第６，１１４，１１７号；第６，１２７，１２０号；第６，４４８，００１号に記載されるような当業者に知られる核酸増幅又は検出方法の何れかを使用してもよい。これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２６０】
いくつかの態様では、ＨＩＦ−１αをコードする核酸は、当業者に知られる方法を用いて、ＰＣＲ増幅により、増幅される。しかしながら、当業者は、癌に罹患した対象から得られたサンプルにおける標的配列（すなわち、ＨＩＦ−１αをコードする核酸配列）の増幅は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＰ−レプリカーゼ増幅、転写増幅、及び自立した配列複製のような、それぞれが十分な増幅をもたらす、公知の手法の何れかによって達成することができる。ＰＣＲプロセスは、当該技術分野でよく知られており、よって本明細書には詳細に記載しない。ＰＣＲ法及びプロトコールの総説として、例えば、「Innis et al., eds., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1990」を参照されたい。これの全てを参照して、本明細書に取り込む。また、米国特許第４，６８３，２０２号も参照されたい；これの全てを参照して、本明細書に取り込む。ＰＣＲ試薬及び手順は、ロシュモレキュラーシステムズ（Rosche Molecular Systems）のような市販業者からも入手可能である。
【０２６１】
本発明は、ＨＩＦ−１α発現の定量的及び／又は定性的レベルを測定するための方法を包含する。ＨＩＦ−１αの発現を測定するための当該技術分野で知られるいかなる技術も本発明の範囲に属するものであり、それらは定量的及び／又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット解析を含むものであるが、これらに限定されるものではない。
【０２６２】
いくつかの態様では、本発明は、本発明の方法に従って癌に罹患した対象から得られたサンプル、好ましくは組織サンプルにおいて、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いたＨＩＦ−１α核酸の検出及び／又は定量を包含する。ＦＩＳＨは特に、腫瘍細胞において特異的な染色体異常を検出する際に、例えば、診断及び腫瘍病期分類を補助するために、当該技術分野で用いられる一般的な手法である。本発明の方法において適用されるように、ＨＩＦ−１α核酸の検出及び／又は定量方法としても使用されうる。ＦＩＳＨ方法論の総説として、例えば、「Weier et al., 2002, Expert Rev. Mol. Diagn. 2(2): 109-119；Trask et al., 1991, Trends Genet. 7(5): 149-154」；及び「Tkachuk et al., 1991, Genet. Anal. Tech. Appl. 8: 676-74」を参照されたい。これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２６３】
本発明は、自然に生じるＨＩＦ−１α転写産生物及びその変異体、更に非自然に存在する変異体を測定することを包含する。本発明の方法を用いる対象における癌の予後診断の為には、ＨＩＦ−１α転写物は、自然に存在するＨＩＦ−１α転写物であることが好ましい。
【０２６４】
いくつかの態様では、本発明は、対象におけるＨＩＦ−１α転写物の発現を測定することにより、対象における疾病の予後（診断）の方法に関するものである。例えば、標準（例えば、非癌サンプル）と比べて低下したＨＩＦ−１αをコードするｍＲＮＡのレベルは、その対象において、癌が進行する増大した危険性を示すであろう。別な態様において、
標準と比べて増加したＨＩＦ−１αをコードするｍＲＮＡのレベルは、その対象における癌の転移の危険性又はその対象における予後不良の見通しを示すだろう。
【０２６５】
一態様では、本発明は、癌に罹患した対象から得られたサンプルからＲＮＡを単離し、ＨＩＦ−１αのレベルを測定するための上述したようなハイブリダイゼーションやＰＣＲ技術を利用してＲＮＡを試験する方法を包含する。別の態様では、本発明は、逆転写により単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを包含する。生じたｃＤＮＡの全部又は一部は、それからＰＣＲ等のような核酸増幅反応のための鋳型として使用される。本方法の逆転写及び核酸増幅工程において、合成開始試薬（例えば、プライマー）として使用される核酸試薬は、以下に記載されるＨＩＦ−１α核酸分子試薬の中から選択される。そのような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。増幅された産生物の検出のために、核酸増幅が、放射性又は非放射性標識のヌクレオチドを使用して実施される。あるいは、標準的なエチジウムブロマイド染色により、又は他の適した核酸染色方法の何れかの利用により可視化できるように、十分な増幅された産生物が生成されるであろう。
【０２６６】
代わりとなる態様では、癌に罹患した対象から得られたサンプルにおいて、当業者に知られる標準的なノーザン解析技術が実施されうる。ノーザン解析において用いるプローブの好ましい長さは、９〜５０ヌクレオチドである。そのような技術を利用して、ＨＩＦ−１α転写物の定量的検出、更に転写物間のサイズに関連する違いも検出できるであろう。
【０２６７】
代わりとなる態様では、本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕ、すなわち、核酸の精製が不要な、生検や再切片から得られた患者の組織の組織切片(固定された及び／又は凍結された)上での直接の遺伝子発現アッセイを包含する。以下に記載されるような核酸試薬が、このようなｉｎ  ｓｉｔｕ手法での、プローブ及び／又はプライマーとして使用されるであろう（例えば、「Nuovo, G. J., 1992, PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications, Raven Press, NY」を参照されたい；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）。
【０２６８】
本発明の標的ＨＩＦ−１α核酸はまた、当業者によく知られたその他の標準的な技術を使用して検出可能である。一般的には、増幅工程は検出工程より先に行われるが、増幅は本発明の方法において、必ずしも必要ではない。例えば、ＨＩＦ−１αの核酸は、サイズ分画（例えば、ゲル電気泳動）により、同定可能である。対照と比較して、サンプルの異なる又は追加的なバンドが存在することは、本発明の標的核酸分子の存在を示唆している。あるいは標的ＨＩＦ−１α核酸は、よく知られた手法に従って、配列により同定可能である。代わりとなる態様では、標的ＨＩＦ−１α核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、特異的な断片の存在を検出するために使用できる。
【０２６９】
配列特異的なプローブハイブリダイゼーションは、生物学的液体又は組織サンプルを含むサンプルにおいて、所望の核酸を検出する公知の方法であり、本発明の範囲に含まれる。つまり、十分に厳しいハイブリダイゼーション条件下で、プローブは実質的に相補的な配列にのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の厳しさは、異なる量の配列のミスマッチを許容するために、緩められるだろう。標的がはじめに増幅される場合、正しく増幅された標的のみの検出を確実にするために、この配列特異的なハイブリダイゼーションが、増幅された産生物の検出に利用され、これにより関連する生物や他の夾雑配列由来の相同配列の存在によって生じる擬陽性の機会を減少させる。
【０２７０】
これらに限定されないが、溶液相、固相、混合相又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを含む、当該技術分野で周知の多くのハイブリダイゼーションフォーマットは、本発明の核酸分子検出方法に包含される。溶液(又は液体)相ハイブリダイゼーションにおいては、標的核酸とプローブ又はプライマーの両者が、反応混合溶液内で自由に相互作用する、固相ハイブリダイゼーションアッセイでは、標的又はプローブのどちらかが、溶液内の相補的核酸とハイブリダイゼーションできる固体支持体に結合している。固相フォーマットの例には、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット等を含む。以下の文献は、様々なハイブリダイゼーションアッセイフォーマットの概観を提供するものであり、これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。文献は、「Singer et al., 1986 Biotechniques 4: 230; Haase et al., 1984, Methods in Virology, Vol. VII, pp. 189-226」；「Wilkinson, In Situ Hybridization, D. G. Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford」；及び「Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B. D. and Higgins, S. J., eds., IRL Press (1987)」である。
【０２７１】
本発明は、本発明の方法に従って、ＨＩＦ−１α核酸配列の検出及び／又は定量のために、同種間に基づくハイブリダイゼーションアッセイ、更に異種間に基づくアッセイを包含する。異種間に基づくアッセイは、ハイブリダイズしない核酸分子からハイブリダイズしたものを分離する能力に依存するものである。そのようなアッセイは、液相に残るハイブリダイズしていない核酸分子が、ハイブリダイゼーション反応の完了後に容易に分離できるように、個体支持体に標的又はプローブを固定化することを含むものである（例えば、「Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-517」を参照されたい；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）。これに対して、同種間アッセイは、ハイブリダイズした核酸とハイブリダイズしていない核酸を他の手段により区別するものである。同種間アッセイは分離工程を必要としていないため、一般的により望ましいアッセイと考えられている。そのような同種間アッセイの１つは、標的がプローブにハイブリダイズする際に、シグナルを生成できるだけのプローブ核酸につけられた標識の使用によるものである（例えば、「Nelson, et al., 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, New York, N.Y., pages 274-310」を参照されたい；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）。
【０２７２】
本発明は、サイクリックプローブ技術（Bakkaoui et al., 1996, BioTechniques 20: 240-8；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）の使用及び分岐プローブ（Urdea et al., 1993, Clin. Chem. 39: 725-6；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）の使用を含むが、これらに限定されるものではなく、そのようなアッセイにおいて、検出可能なシグナルの感度を増加させるための当該技術分野で知られるいかなる方法も包含する。
【０２７３】
ハイブリダイゼーション複合体は、当該技術分野でよく知られた方法に従って検出される。標的に対して特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブは、ハイブリダイズした核酸分子の存在を検出するために一般的に使用されるいくつかの方法のいずれか１つにより標識される。検出の一般的な方法の１つは、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ等で標識されたプローブを使用する、オートラジオグラフィの使用である。放射性同位体の選択は、選択された同位体の合成の容易さ、安定性及び半減期による研究選択に依存する。その他の標識は、蛍光団、化学発光試薬、又は酵素で標識された抗リガンド又は抗体に結合する化合物(例えば、ビオチンやジゴキシゲニン)を含む。あるいはプローブは、蛍光団、化学発光試薬、又は酵素のような標識に直接結合しうる。標識の選択は、要求される感度、プローブとの結合の容易さ、安定性の要求、及び利用可能な装置に依存する。
【０２７４】
本発明のプローブ及びプライマーは、当業者に知られた技術を使用して、合成及び標識される。プローブ又はプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、「Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H., 1981, Tetrahedron Lett. 22(20): 1859-1862」に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、「Needham-VanDevanter, D. R., et al. 1984, Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168」に記載されるように自動合成装置を用いて、化学的に合成されるであろう。オリゴヌクレオチドの精製は、「Pearson, J. D. and Regnier, F. E., 1983, J. Chrom. 255:137-149」に記載のように、非変性アクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオン交換ＨＰＬＣのどちらかにより可能である。上記に引用された参考文献の全ては、これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２７５】
（６．５．４  タンパク質の検出）
本発明の方法及びキットは、対象から得られたサンプルにおけるＨＩＦ−１αの検出及び／又は定量を包含する。ＨＩＦ−１αタンパク質の検出及び定量のための当業者に公知の方法の何れも本発明に包含される。本発明の方法及びキットで使用可能なＨＩＦ−１αタンパク質配列は、当該技術分野でよく知られている。例えば、「Wang et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 5510-4」；「Merighi et al., HIF-1α Expression in Cancer cells in up-regulated by adeerrozine A3 receptor，paper submitted to nature, 2004」及び国際公開第９６／３９４２６号公報を参照されたい；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２７６】
ＨＩＦ−１αタンパク質、抗ＨＩＦ−１α抗体及びその免疫特異的断片が、本発明のアッセイにおいて、適切である。ＨＩＦ−１α遺伝子産生物の検出及び定量は、本明細書に例示されるタンパク質の検出を包含するものである。本発明の方法で対象から得られたサンプルにおいて、増加したＨＩＦ−１α遺伝子産生物のレベルの検出とは、一般的に標準サンプルと比較するものである。
【０２７７】
いくつかの態様では、自然に存在するＨＩＦ−１αタンパク質に対する抗体が、本発明の方法において使用されうる。本発明は、これらに限定されないが、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳを含み、当業者に知られる標準イムノアッセイ法の何れかの使用を包含するものである。
【０２７８】
一態様では、本発明は、サンプル内のＨＩＦ−１α受容体に免疫特異的な結合が生じうる条件下で、対象由来のサンプルと抗ＨＩＦ−１α抗体又はその免疫特異的断片を接触させ、それによって、免疫複合体を形成し、形成される複合体の量を検出及び／又は測定することを含む、イムノアッセイの使用を包含する。特定の態様では、サンプルにおいて、ＨＩＦ−１αの存在をアッセイするためにＨＩＦ−１αに対する抗体が使用され、そこでは標準サンプルと比較してＨＩＦ−１αの増加したレベルが検出される。
【０２７９】
いくつかの態様では、生物学的サンプルは、ニトロセルロース、又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化できる他の固体支持体のような、固相支持体又は担体に接触させられて、固定化される。支持体は、適切な緩衝液で洗浄され、続いて、ＨＩＦ−１αタンパク質に選択的に又は特異的に結合する抗体により処理される。固相支持体は、それに結合していない抗体を除去するために、緩衝液で洗浄される。その後、固相支持体に結合した抗体の量が、一般的な方法により検出されるであろう。
【０２８０】
本明細書で使用される「固相支持体又は担体」とは、抗原又は抗体に結合可能なあらゆる支持体をいう。よく知られた支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ（gabbros）及びマグネタイトが含まれる。本発明の目的のためには、担体の性質は、いくらか可溶性であっても、不溶性であってもよい。支持体物質は、結合した分子が抗原又は抗体に結合できる限り、視覚的にいかなる可能な構造配置であっても良い。こうして、支持体の構造は、ビーズのように球形でも、試験管の内側又は竿の外側表面のように、円筒型であってもよい。あるいは、表面は、シート、試験紙等のように平らでも良い。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。抗体又は抗原を結合するための他の多くの適した担体は当該技術分野で公知であり、通常の実験の使用により、それらを確認できるであろう。
【０２８１】
いくつかの態様では、抗ＨＩＦ−１α抗体又はその免疫特異性断片は、それらを酵素に結合して、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD.；Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31:507-520；Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73:482；Maggio, E. ed., 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL.；Ishikawa, E. et al., eds., 1981, Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo；これらの全てを参照して、本明細書に取り込む）において、標識された抗体を使用することにより、検出可能に標識される。抗体に結合する酵素は、例えば、分光分析、蛍光分析、又は可視化の方法により検出できる化学的部分を生成するように、適切な基質、好ましくは好色素性基質と反応するであろう。抗体を検出可能なように標識するために使用可能な酵素には、数ある中でも、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロフォスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。検出は、酵素に対する好色素性基質を用いる色素的手法により達成されうる。検出はまた、同様に調製される標準と比較して、基質の酵素的反応の程度を視覚的に比較することによっても、達成されるであろう。
【０２８２】
検出はまた、当業者に公知のその他の方法の何れかを用いても達成されうる。例えば、抗体又は抗体断片の放射性標識により、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（例えば、「Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986」を参照されたい）の使用によるＨＩＦ−１αタンパク質の検出が可能である。放射性同位元素は、ガンマカウンター又はシンチレーションカウンターのような手段により、又はオートラジオグラフィにより検出可能であろう。
【０２８３】
その他の態様では、本発明は、蛍光化合物で標識された抗体を包含する。蛍光標識された抗体が、適切な波長の光に曝されると、蛍光によってその存在が検出できる。最も一般に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（phthaldehyde）及びフルオレサミンである。さらにその他の態様では、抗体はまた、１５２Ｅｕやランタナイド系列の他の元素のような蛍光発光金属を使用して、検出可能に標識しうる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて抗体に結合可能である。
【０２８４】
本発明はさらに、化学発光化合物に抗体を結合させることで、検出可能に標識することを包含する。化学発光標識された抗体の存在は、化学反応工程の間に上昇する発光の存在を検出することにより、決定される。特に、有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体を標識するために使用可能である。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物学的システムにおいて見出される化学発光のタイプである。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより、決定される。標識を目的とする生物発光化合物は、例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを含む。
【０２８５】
本発明はまた、間接的なＨＩＦ−１αの検出方法を包含する。特定の態様では、本発明は、癌に罹患した対象由来のサンプルを、抗ＨＩＦ−１α抗体(一次抗体)又はその免疫特異的断片に、サンプル内のＨＩＦ−１αタンパク質に免疫特異的結合が生じるような条件下で接触させ、これにより免疫複合体を形成させて、一次抗体への免疫特異的な結合が起こるような条件下で、二次抗体を添加して、間接的に形成された複合体の量を検出すること及び／又は定量することを含んでなる、イムノアッセイの使用を包含する。
【０２８６】
抗ＨＩＦ−１α抗体又は免疫特異的なその断片は、サンプル内のＨＩＦ−１αを定量的又は定性的に検出するために使用されうる。いくつかの態様では、サンプルが組織の場合には、抗ＨＩＦ−１α抗体又は免疫特異的なその断片は、ＨＩＦ−１α受容体のｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために、当業者に知られている一般的な技術を用いて、例えば、免疫蛍光又は顕微鏡の検討を、組織学的に用いることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、対象から組織学的標本、例えば胸部組織などのパラフィン包埋された組織切片を調製し、それに本発明の標識された抗体を適用することにより達成される。抗体(断片)は、好ましくは標識抗体（又は断片）を生物学的サンプルに重ねることにより、適用される。そのような手順を用いることにより、ＨＩＦ−１αタンパク質の存在だけでなく、検討された組織におけるその分布も評価できるであろう。本発明の方法を用いることで、通常の当該分野の技術をもつものは、様々な組織学的方法（染色手順のような）の何れかを、そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出を達成するために変更できるであろう。
【０２８７】
（６．６  ＨＩＦ−１αをコードする核酸）
本発明の方法は、ＨＩＦ−１αレベルを決定するための代用物として、ＨＩＦ−１αをコード化する核酸、その類縁体、断片、又は誘導体を使用しても良い。核酸は、当業者に知られる技術を使って製造される、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子(例えば、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、ｍＲＮＡ)及びＤＮＡ又はＲＮＡの類縁体(例えばペプチド核酸)を包含することを意図する。ＨＩＦ−１αレベルに対する代用物として測定される核酸は、一本鎖又は二本鎖でありうる。
【０２８８】
例えば、しかしながら限定されるものではないが、本発明の方法及びキットにおいて用いられるヌクレオチド配列は、米国特許第６，４５５，６７４号（Ｅｉｎａｔらに発行）；同第６，６５２，７９９号（Ｓｅｍｅｎｚａに発行）；同第６，２２２，０１８号（Ｓｅｍｅｎｚａに発行）；「Wang et al., 1995 PNAS USA, 92: 5510-4」；及び国際公開第９６／３９４２６号公報において開示されるヌクレオチド配列の全て又は一部を含むことができる。本発明は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ＿００１５３０及び同ＮＭ＿１８１０５４を有する、ヒトＨＩＦ−１αのヌクレオチド配列の全部又は一部を包含する。上記に参照された全てのヌクレオチド配列は、これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２８９】
一般的に、当該技術分野で公知のＨＩＦ−１α核酸の何れかは、本発明の方法及びキットにおいて、有用であろう。そのような核酸は、一般的にＨＩＦ−１αの少なくとも一部をコード化するか、又は本明細書に記載されるハイブリダイズ条件下で、ＨＩＦ−１αをコードする核酸に、ハイブリダイズする配列を有している。
【０２９０】
一態様では、本発明の方法は、ＨＩＦ−１αをコードする核酸の、コード配列、５’若しくは３‘非翻訳領域又はそれらの断片をプローブとして使用でき、それらは自然に存在する及び非自然に存在する変異体を含むものである。非自然に存在する変異体は、ヒトにより設計されるものである（例えば、ペプチド核酸プローブ）。本発明の方法で、対象のサンプルにおけるＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−１αをコードするｍＲＮＡが検出又は測定される場合には、野生型遺伝子産生物、更に変異体、対立遺伝子の変異体、スプライシングバリアント、多型変異体等を含むが、これらに限定されるものではない、自然に存在する遺伝子産生物が検出される。一般的に、変異体は、ＨＩＦ−１αをコードする野生型遺伝子産生物と、例えば少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性（当該技術分野で知られる標準的なアルゴリズムにより決定される、例えば、「Altschul, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268」；「Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877」；「Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403-410」を参照されたい）であるような、高度に相同性があるであろう。
【０２９１】
プローブとして使用されるＨＩＦ−１α変異体は、厳しい条件下でＨＩＦ−１αをコードする核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされるものであって良い。核酸ハイブリダイゼーション方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、「Sambrook et al., 2001 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York」；「Ausubel et al., eds., 1994-1997, in the Current Protocols in Molecular Biology」：「Series of laboratory technique manuals, John Wiley and Sons, Inc.」；「Shilo and Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-92」；「Dyson, 1991 Essential Molecular Biology: A Practical Approach, vol. 2, T. A. Brown, ed., 111-156, Press at Oxford University Press, Oxford, UK」を参照されたい）。「厳しい条件」という用語は、第一のポリヌクレオチド分子が、ハイブリダイズし、６５℃での０．５MのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で第二のポリヌクレオチド分子との結合を保持し、引き続く４２℃での０．２xＳＳＣ／０．１％のＳＤＳで洗浄することでの、第一のポリヌクレオチド分子の能力を意味する（「Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3」を参照されたい）。特定の態様では、検出又は測定される変異体は、野生型配列に比べて１，２，３，４，５，１０，１５又は２０以下の点変異（置換）を包含するものである（又は、核酸の場合ならば、それをコードするものである）。
【０２９２】
ＨＩＦ−１α又はその一部をコードする単離された核酸プローブは、当該技術分野で公知の方法の何れかにより、例えば、寄託されたプラスミドから、配列の３‘及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅、及び／又は標準的なスクリーニング技術を用いるｃＤＮＡ若しくはゲノムライブラリーからのクローニング、又はポリヌクレオチド合成により得ることができる。特定の配列の検出及び定量のためのそのようなプローブの使用は、当該技術分野でよく知られている（「Erlich, e.d., 1989, PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification, Macmillan Publishers Ltd., England」；「Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001」を参照されたい）。
【０２９３】
いくつかの態様では、本発明の方法は、遺伝子コード配列、例えば、ｃＤＮＡ、ＨＩＦ−１αの遺伝子コード配列を用いることができ、この場合の配列は、上記のような厳しい条件下で、ＨＩＦ−１αのタンパク質の検出に有用である、ＨＩＦ−１αタンパク質の遺伝子コード配列の少なくとも約６個、好ましくは約１２個、最も好ましくは約１８個又はそれ以上の連続したヌクレオチドをハイブリダイズすることが好ましい。
【０２９４】
ハイブリダイゼーションプローブとして、本明細書に例示されるもののような、ＨＩＦ−１αタンパク質をコードする核酸配列の全部又は一部を使用して、ＨＩＦ−１αタンパク質をコードする全長核酸分子が、本発明の方法における使用のための、すなわちＨＩＦ−１αレベルの代用物として、標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.sup.rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001、参照）により定量可能である。
【０２９５】
本発明の方法において用いられるＨＩＦ−１α配列は、好ましくはヒトの配列である。しかしながら、その他の動物から単離されたヒトＨＩＦ−１αの相同体は、特に、対象が非ヒト動物の場合に、ＨＩＦ−１αレベルの代用物として本発明の方法に使用できる。このように本発明はまた、本発明の方法において、非ヒト霊長類、ラット、マウス、これらに限定されないが、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどを含む農場動物、これらに限定されないが、ネコ、イヌを含む家庭用ペット等のような非ヒト動物から同定される、ＨＩＦ−１αの相同体の使用を含む。
【０２９６】
本発明の方法はまた、本発明の方法の何れかにおいて、本明細書に開示される核酸の何れかの断片を使用しても良い。断片は、本明細書に開示される配列の少なくとも１０，２０，５０，１００又は２００個の連続するヌクレオチドを含むのが好ましい。
【０２９７】
本発明の方法及びキットにおける使用のために、当該技術分野で知られる標準的な組み換えＤＮＡ技術が、ＨＩＦ−１αタンパク質又はＨＩＦ−１αタンパク質をコードする核酸、又はそれらの断片を提供するために使用することができる。いくつかの態様では、標準としてＨＩＦ−１αや核酸を提供するために、目的とするＨＩＦ−１αタンパク質をコードする対応するヌクレオチド配列がクローニングされうる。本発明に従って、使用されるＰＣＲ技術とクローニング手法の総説として、例えば、「PCR Primer, 1995, Dieffenbach et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al., 2001」を参照されたい。そして、これらは、全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０２９８】
（６．７  ＨＩＦ−１αタンパク質）
本発明は、本発明の方法のために抗体を産生する目的で、ＨＩＦ−１αタンパク質又はその断片を使用することを提供する。ＨＩＦ−１αのポリペプチドと断片はまた、本発明の方法において、タンパク質の量又は活性の標準として使用されうる。
【０２９９】
例えば、本発明は、これらに限定されないが、米国特許第６，４５５，６７４号（Ｅｉｎａｔらに発行）；米国特許第６，６５２，７９９号（Ｓｅｍｅｎｚａに発行）；米国特許第６，２２２，０１８号（Ｓｅｍｅｎｚａに発行）；「Wang et al., 1995 PNAS USA, 92: 5510-4」；米国特許第６，４３６，６５４号（Ｂｅｒｋｅｎｓｔａｍに発行）；国際公開第９６／３９４２６号公報に開示されるＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を包含する。上記文献に参照されるアミノ酸配列は、その全てを参照して、本明細書に全て取り込む。本発明は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿００１５２１及びＮＰ＿８５１３９７を有する、ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸配列を包含し、それらの各々は、その全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０３００】
いくつかの態様では、ＨＩＦ−１αタンパク質は、当該技術分野で公知のＨＩＦ−１αタンパク質の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列類似性を示すアミノ酸配列を含む。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントを決定するためのアルゴリズムは、当該技術分野でよく知られている。例えば、「Altschul, 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264-2268」；「Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5877」；「Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215: 403-410」を参照されたい。それらの各々は、それらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０３０１】
特定の態様では、タンパク質は少なくとも１０個の連続したアミノ酸からなるＨＩＦ−１αタンパク質断片からなるもの、又はそれを含むものである。別の態様では、断片は、使用、例えば、抗体を産生するために、ＨＩＦ−１αタンパク質由来の少なくとも２０，３０，４０又は５０の連続したアミノ酸からなる又はそれを包含するものである。そのような断片はまた、例えば、本発明の方法やキットにおける標準や対照として有用である。
【０３０２】
本発明の方法における使用のために、ＨＩＦ−１αタンパク質や断片を発現するために、様々な宿主発現ベクターシステムが使用することができる。そのような宿主発現システムは、公知であり、目的のタンパク質を産生し、続いて精製する必要な手段を提供する。本発明に従って、使用可能な宿主発現ベクターシステムの例は：ＨＩＦ−１α核酸をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたバクテリア細胞（例えば、大腸菌、バシラス・サブチリス）；ＨＩＦ−１αをコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞（例えば、サッカロミセス、ピキア）；ＨＩＦ−１α核酸をコードする配列を含む組み換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）で感染された昆虫細胞；組み換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染された、又はＨＩＦ−１α核酸をコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞；又は哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウィルス（例えば、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィルス７．５Kプロモーター）由来のプロモーターを含む、組み換え発現コンストラクトを保持している（harboring）、哺乳動物の細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）である。
【０３０３】
バクテリアシステムでは、ＨＩＦ−１αを発現することを意図した使用に合わせて、多くの発現ベクターが利点を考えて選択されうる。例えば、抗体を産生するためにそのようなタンパク質が大量に産生されるようにする場合には、容易に精製されるタンパク質生成物が、高レベルに発現できるベクターが望ましいだろう。そのようなベクターは、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃＺコード領域を有するベクターインフレームに、ＨＩＦ−１αコード配列が連結する、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503）；などが含まれるが、これらに限定されるものではない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させるために使用可能である。一般に、そのような融合たんぱく質は可溶性で、グルタチオンアガロースビーズからなるカラムに吸着及び結合させ、続いて遊離グルタチオン存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製可能である。ｐＧＥＸベクターは、クローンの標的遺伝子産生物がＧＳＴ部分から解離できるように、例えばトロンビンやＸａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされている。
【０３０４】
昆虫システムでは、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファ・カ. リフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウィルス (ＡｃＮＰＶ)が使用できる。ウィルスは、ヨトウガ（スポドプテラ・フルギペルダ：Spodoptera frugiperda）細胞内で成長する。ＨＩＦ−１αをコードする配列は、ウィルスの個々の非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)にクローンを作り、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリへドロンプロモーター）の制御下に配置されうる。ＨＩＦ−１αコード配列の成功した挿入は、ポリへドロン遺伝子の不活性化と塞がれていない組み換えウィルス（すなわち、ポリへドロン遺伝子により、コードするタンパク質性の被覆を欠如しているウィルス）の産生をもたらすだろう。これらの組み換えウィルスは、挿入された遺伝子が発現するヨトウガ（スポドプテラ・フルギペルダ）細胞を感染するのに使用されうる（例えば、「Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584」；Ｓｍｉｔｈの米国特許第４，２１５，０５１号を参照されたい）。
【０３０５】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウィルス性発現システムを使用することができる。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のＨＩＦ−１αをコードする配列は、例えば、後期プロモーター及び３部からなるリーダー配列等、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体に連結されうる。このキメラ遺伝子は、次にインビトロ又はインビボでの組み換えでアデノウィルスゲノムに挿入されうる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、E１又はE３領域）への挿入は、感染宿主において生存して、ＨＩＦ−１αを発現可能な組み換えウィルスを生じるであろう（例えば、「Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655」を参照されたい）。特定の開始シグナルがまた、挿入されたＨＩＦ−１αコード配列の効率的な翻訳に必要であろう。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び近接の配列を含む。それ自身の開始コドンと近接した配列を含む完全ＨＩＦ−１α遺伝子が、適切な発現ベクターに挿入される場合には、追加的な翻訳制御配列は、不要であろう。しかしながら、ＨＩＦ−１αコード配列の一部のみが挿入された場合には、必要があれば、ＡＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルが提供されなければならない。これらの外来翻訳制御シグナル及び開始コドンは、様々な起源のもので、自然に存在するもの及び合成されるものでありうる。更に、開始コドンは、挿入物全体が正確に翻訳されることを確実にするために、所望のコード配列の読み込みフレームと一致していなければならない。発現効率は、適切な転写のエンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を包含させることにより、増大されるであろう（「Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516」を参照されたい）。
【０３０６】
加えて、挿入配列の発現を調節する、又は所望される特別な方法で遺伝子産生物を修飾又はプロセシングする宿主細胞株が、選ばれるであろう。そのようなタンパク質産生物の修飾(例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要であろう。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産生物の翻訳後プロセシング及び修飾において、特徴的で特異的な機構を有している。適切な細胞株又は宿主システムが、発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択されうる。この目的を達成するために、一次転写物の正しいプロセシング、遺伝子産生物のグリコシル化及びリン酸化のための、細胞性機構を有する真核宿主細胞が使用されうる。そのような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、並びに特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２６、ＢＴ２０及びＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、そして例えば、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常乳腺細胞株を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３０７】
組み換えタンパク質の長期の高産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、ＨＩＦ−１αの遺伝子産生物を安定に発現する細胞株が設計されうる。宿主細胞は、ウィルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル部位等)によって制御されるＤＮＡ、及び選択マーカーで形質転換されうる。
【０３０８】
外来ＤＮＡの挿入に続いて、設計された細胞は、１〜２日間強化培地中で成長させた後、選択培地に変えることができる。選択培地に対する抵抗性を与えることのできる、プラスミドのような組み換え構築物における選択マーカーは、細胞が染色体内へプラスミドを安定に一体化させ、そして順番に、クローンを作り、細胞株へ拡大される、フォーカスを形成するように成長する。本方法は、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物を安定に発現する細胞株を設計するために、有利に使用されうる。そのような設計された細胞株は、特にＨＩＦ−１α遺伝子産生物の内在性活性に影響を与える化合物のスクリーニング及び評価において有用である。
【０３０９】
これらに限定されないが、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（Wigler et al., 1977, Cell 11: 223）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., 1980, Cell 22: 817）遺伝子を含む多くの選択系が、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−の細胞のそれぞれに用いることができる。また、抗代謝物抵抗性は、以下の遺伝子のための選択法として用いられうる：メトトレキサートに対する抵抗性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al., 1980, Proc Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を与えるｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を与えるｎｅｏ（Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1）；及びハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre et al., 1984, Gene 30: 147）。
【０３１０】
（６．８  ＨＩＦ−１αに対する抗体）
本発明の方法及びキットは、ＨＩＦ−１αタンパク質の１つ又はそれ以上のエピトープを特異的に認識する抗ＨＩＦ−１α抗体又はその断片の使用を包含する。従って、免疫特異的にＨＩＦ−１αタンパク質に結合する抗体を産生する免疫源として、あらゆるＨＩＦ−１αタンパク質、誘導体又は断片が使用可能である。そのような抗体及び断片は、本明細書に開示されるような本発明の方法の何れかを遂行するために、サンプル内のＨＩＦ−１αの検出及び定量において使用できる。
【０３１１】
そのような抗体は、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ａｂ‘)２断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記の何れかのエピトープ結合断片を含むことができる。特定の態様では、ヒトＨＩＦ−１αタンパク質に対する抗体が使用される。
【０３１２】
抗体又はその免疫特異性断片の一般的な産生方法が、本明細書に開示される。そのような抗体や断片の何れかは、適切な宿主生物において、標準的な免疫的手法、又は抗体若しくはその免疫性断片をコードする核酸分子を発現する組み換え体により産生されうる。
【０３１３】
ＨＩＦ−１αに対する抗体の産生のために、様々な宿主動物が、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物又はその一部を注入して免疫され得る。そのような宿主動物には、ウサギ、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されるものではない。宿主種に依存する免疫応答性を増加させるために、これらに限定されないが、フロインドのもの（完全又は非完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、又はＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）及びコリネバクテリウム・パルバムのような可能性のある有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントが使用されうる。
【０３１４】
抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体が、本発明の方法及びキットにおける使用に好ましい。モノクローナル抗体は、連続的な細胞株により、インキュベーションで抗体分子を産生するために提供される技術により得られる。これらは、これらに限定されないが、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（「1975, Nature 256: 495」；及び米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（「Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72」；「Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026」）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77）を含む。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びそれらのサブクラスを含むあらゆるイムノグロブリンクラスでありうる。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボでインキュベーションされうる。
【０３１５】
適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生理学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライスすることにより、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312, 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314, 452-454）は、本発明において有用な抗体を調製するために使用されうる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を有するというような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号；及びＢｏｓｓらの米国特許第５，８１６，３９７号を参照されたい）。本発明は、このように、ＨＩＦ−１αタンパク質に特異的で、選択的なキメラ抗体を考慮する。しばしば治療のために設計されるが、そのようなキメラ抗体は、本発明の方法に従って、ＨＩＦ−１αレベルを定量するのに有用でありうる。
【０３１６】
更に、ヒト化抗体が本発明の方法及びキットにおいて使用されうる。つまり、ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の１つ又はそれ以上の超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。フレームワーク領域及びＣａｒｓの範囲は、詳細に決定されている（「"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983)」を参照されたい）。ヒト化抗体を産生するために開発されている技術の例は、当該技術分野で知られており、本発明の範囲内で有用である（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５８５，０８９号及びＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい）。ヒト化抗体は一般的には、治療薬として開発されている。しかしながら、そのような抗体は本発明においてＨＩＦ−１αレベルを定量するために使用できるように、本発明の方法及びキットにおいて用いられる。
【０３１７】
ファージ提示法技術が、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物に対する抗体の親和性を増加させるために使用されうる。この技術は、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物に対するより高い親和性抗体を得るために有用であり、そのような抗体は、本発明に従って病気や疾患に罹患した対象の診断及び予後のために用いられる。親和性成熟と称される技術は、変異又はＣＤＲウォーキングを使用し、最初の又は親抗体と比較して、抗原に対してより高い親和性で結合する抗体を同定するために、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物抗原を用いて再選択するものである（例えば、「Glaser et al., 1992, J. Immunology 149:3903」を参照されたい）。単一ヌクレオチドよりもコドン全体を突然変異させると、アミノ酸変異のセミランダムなレパートリーを生じる。ライブラリーは、各々のクローンが、単一ＣＤＲにおいて１アミノ酸変性により異なるものである様々なクローンの集団（pool）から構築され、各々のＣＤＲ残基にそれぞれ可能なアミノ酸置換を示す変異体を含むものである。抗原に対して増加した結合親和性を有する変異体は、固定化された変異体を標識された抗原と接触させることでスクリーニングできる。当該技術分野で知られるスクリーニング方法の何れも、抗原に対する増加した親和力を有する変異抗体を同定するために使用可能である（例えば、ＥＬＩＳＡ）（「Wu et al., 1998, Proc Natl. Acad. Sci. USA 95:6037」；「Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994」を参照されたい）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングもまた有用であろう（「Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551」を参照されたい）。
【０３１８】
あるいは、一本鎖抗体の産生に関し記述される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；「Bird, 1988, Science 242:423」；「Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879」；及び「Ward et al., 1989, Nature 334: 544」）がＨＩＦ−１α遺伝子産生物に対する一本鎖抗体を産生するために、適用される。一本鎖抗体は、アミノ酸ブリッジを介して、Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖を結合することによって形成され、一本鎖のポリペプチドを生じる。大腸菌において機能的なＦｖ断片を集積するための技術がまた、使用されうる（Skerra et al., 1988, Science 242:1038）。
【０３１９】
特異的なエピトープを認識する抗体断片が、既知の方法により産生されうる。そのような断片は、当該技術分野で知られる利用可能な方法の何れかに従って、ＨＩＦ−１α遺伝子産生物を定量するために使用可能である。例えば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化により生成できるＦ(ａｂ‘)２断片；Ｆ(ａｂ’)２断片のジスルフィド結合を還元することで生成できるＦａｂ断片；抗体分子をパパインと還元試薬で処理することにより生成できるＦａｂ断片；及びＦｖ断片を含むが、これらに限定されるものではない。あるいはＦａｂ発現ライブラリーが、所望の特異性を有するヒトモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ容易に同定できるように構築されうる（Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281）。
【０３２０】
目的の抗原に対する抗体の分子クローンは、当業者に知られる技術により、調製可能である。組み換えＤＮＡ手法（例えば、「Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York」を参照されたい）が、モノクローナル抗体分子又はその免疫特異性断片をコードする核酸配列を構築するために使用可能である。
【０３２１】
抗体分子は、例えば、免疫吸着や免疫親和性クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）のようなクロマトグラフ手法、及びそれらの組み合わせの、よく知られた技術で、精製可能である。
【０３２２】
抗体の生成において、所望の抗体のスクリーニングが、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）などの当該技術分野で知られる技術により、達成されうる。例えば、ＨＩＦ−１αの特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、産生されたハイブリドーマは、そのようなドメインを含むＨＩＦ−１α断片に結合する産生物を分析するのが可能である。
【０３２３】
前述の抗体は、本発現の方法及びキットにおいて、例えば適切なサンプル中のレベルを測定する等のＨＩＦ−１αタンパク質の定量に使用されうる。
【０３２４】
本明細書で用いられる抗体産生手法は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅにより記載されるものを含み（Harlow, E. and Lane, D., 1988, and later editions, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）、これらの全てを参照して、本明細書に取り込む。
【０３２５】
ＨＩＦ−１αの１つ又はそれ以上のエピトープに対するいかなる抗体も、本発明の方法及びキットにおいて使用可能である。例えば、「Novus Biologicals, Inc. (Littleton, Colo.)」；「Affinity BioReagents,(Golden, Colo.)」から入手可能な、ＨＩＦ−１α抗体が本発明において使用されうる。
【０３２６】
（６．９  キット）
本発明は、本発明の化合物で満たされる１つ又はそれ以上の容器を含む薬学的なパックやキットを提供する。加えて、疾患の処置に有用な１つ又はそれ以上の他の予防薬又は治療薬もまたその薬学的パックやキットに包含されうる。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ又はそれ以上の成分で満たす、１つ又はそれ以上の容器を含む薬学的パック又はキットを提供する。そのような容器は、薬学的又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により指示された形態における通知を伴っていてもよく、その通知は、ヒトに対する製造、使用及び販売が政府により認められたことを反映するものである。
【０３２７】
本発明は、上述の方法において使用可能なキットを提供する。ある態様では、キットは本発明の１つ又はそれ以上の化合物を含む。別の態様では、キットは更に、１つ又はそれ以上の容器の中に、虚血の処置に有用な１つ又はそれ以上の予防薬及び治療薬を含む。別の態様では、キットは、癌と関連する１つ又はそれ以上の癌抗原と結合する１つ又はそれ以上の抗癌剤を更に包含する。別な態様では、予防的又は治療的薬剤は、生物学的療法又はホルモン療法である。
【０３２８】
（７．  実施例）
以下の実施例は、本発明の態様を例示するものであり、これらに限定されるものではない。これらの実施例に用いられる記号や慣習は、例えば、米国化学会雑誌（J. Am. Chem. Soc.）及びテトラヘドロン（Tetrahedron）のような現代の、国際的な化学文献で用いられるものと一致することが意図されている。
【０３２９】
物質と方法−試薬と試料 
ヒトＡ３７５、ＳＫＭＥＳ、ＨＴ２９、Ｐａｎｃ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｅＬ０２３及びＮＣＴＣ２５４４細胞は、アメリカ組織培養保存機関（American Tissue Culture Collection：ＡＴＣＣ）から入手した。組織培養媒地及び増殖補助剤はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒから入手した。特に明記されない限り、他の全ての試料はＳｉｇｍａより購入した。ＭＲＥ３０４６Ｆ２０、５−Ｎ−（４−メチルフェニル−カルバモイル）アミノ−８−メチル−２（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジン；ＩＬ−１０塩、５−Ｎ−（４−ジエチルアミノ−フェニル−カルバモイル）アミノ−８−メチル−（２（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジン；ＭＲＥ３００８Ｆ２０、５−Ｎ−（４−メトキシフェニル−カルバモイル）アミノ−８−プロピル−２（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジン；ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、５−Ｎ−（４−フェニルカルバモイル）アミノ−８−プロピル−２（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５ｃ］−ピリミジン及びＭＲＥ３０６２Ｆ２０、５−Ｎ−（４−フェニル−カルバモイル）アミノ−８−ブチル−２（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジンは、Ｆｅｒｒａｒａ大学（イタリア）のＰｒｏｆ．Ｐ．Ｇ．Ｂａｒａｌｄｉにより合成された。ＣＧＳ１５９４３、５−アミノ−９−クロロ−２−（フリル）１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−キナゾリン及びＺＭ２４１３８５、４−（２［７−アミノ−２−（２−フリル）−［１，２，４］−トリアゾロ［２，３−α］［１，３，５］トリアジン−５イルアミノ］エチル)フェノールは、ＲＢＩ（ゼネカ・ファーマシュティカルズ社（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ））より入手した。ＰＤ９８０５９、２−アミノ−３−メトキシフラボン、（ＭＡＰキナーゼ（ＭＥＫ）の選択的阻害剤）及びローダミン１２３は、カルバイオケム社から入手した。Ｕ０１２６（ＭＥＫ−１およびＭＥＫ−２の阻害剤）及びＳＢ２０３５８０（ｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤）はプロメガ社から入手し、ＲＮＡｓｅは、ベーリンガー社から購入した。
【０３３０】
細胞培養
化学療法の促進試験のために、ヒトメラノーマＡ３７５、ヒト肺癌ＳＫＭＥＳ、結腸癌ＨＴ２９及び腎臓癌Ｐａｎｃ−１細胞株は、最初にＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関：American Type Culture Collection）から購入して、ＰＲＣで保持した。細胞株は、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に保持して、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（fungizone）、２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＲＳ、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補給する。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気で加湿培養器中のＴ２５ファルコン組織培養フラスコ内で培養する。細胞は週２回継代培養を行う。Ａ３７５、ＳＫＭＥＳ、ＨＴ２９及びＰａｎｃ−１の倍増時間は、各々約２２、４５、４８及び６０時間である。
【０３３１】
多剤耐性試験のために、Ａ３７５及びＮＣＴＣ２５４４細胞の各々を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含み、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気で、ＤＭＥＭ及びＥＭＥＭ培地中に付着して成長させ、保持する。ＨｅＬ０２３及びＪｕｒｋａｔを、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含み、３７℃で、５％ＣＯ２／９５％空気でＲＰＭＩ−１６４０培地中に成長させる。細胞は、週に２又は３回、１：５と１:１０の間の比率で継代培養する。リンパ球を、Ｆｅｒｒａｒａ大学病院の血液バンクより提供された軟膜から丁寧に分離する。研究の状況をよく説明して相手の同意を得た後に、健康なボランティアから献血した血液を入手した。リンパ球を、密度勾配遠心分離法（Ｆｉｃｏｌｌ／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １．０７７ｇ／ｍｌ）により単離する。細胞を、精製したフィトヘモアグルチニン（１μｇ／ｍｌ）で刺激して、インターロイキン２（２０ユニット／ｍｌ）及び１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ培地中に広げた。
【０３３２】
コロニー形成アッセイ
指数的に成長したＡ３７５細胞を、２ｍｌの新鮮な培地の６-ウェルプレートにおいて、３００細胞／ウェルで植え付け、ＤＭＳＯ溶液に溶解したパクリタキセル、ビンデシン、及びアデノシン受容体アゴニスト及びアンタゴニストで処理する。対照プレートに同量のＤＭＳＯのみを入れた。３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿環境で７日成長させた後、細胞を遊離メタノールに５分間固定して、１／１０Ｇｉｅｍｓａ／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）染色液で１０分間染色する。染色液を除去して、３０細胞以上のコロニーを残渣として得た。各処理において、６つの個別ウェルを得た。
【０３３３】
フローサイトメトリー解析
Ａ３７５接着細胞は、トリプシン処理され、浮遊細胞と混合され、ＰＢＳで洗浄され、そして７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール／ＰＢＳ溶液中で、４℃少なくとも２４時間の間、透過性を高められた。細胞は、ＰＢＳで洗浄され、ＤＮＡは２０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムと１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅを含むＰＢＳ溶液中で、室温下30分染色された。細胞は、ＥＰＩＣＳ ＸＬフローサイトメーター（Beckman Coulter, Miami, FL）で分析し、ＤＮＡ含量は、Ｃｅｌｌ−ＬＩＳＹＳプログラム（Becton-Dickinson）により評価した。細胞周期位相間の細胞の分配及びアポトーシス細胞の百分率は、すでに開示されている（Merighi 2002）ように評価された。つまり、細胞周期の分配は、ヨウ化プロピジウム染色で判定される２ｎ（Ｇ０／Ｇ１位相）、４ｎ（Ｇ２及びＭ位相）、４ｎ＞ｘ＞２ｎのＤＮＡ量（Ｓ位相）を含む細胞の百分率として示される。アポトーシス集団は、２ｎより少ないＤＮＡ含量を有する細胞の百分率である。
【０３３４】
ローダミン１２３流出アッセイ
各々のサブライン由来の５ｘ１０５細胞に、５０ｎｇ／ｍｌのローダミン１２３が３０分間３７℃で負荷された。細胞は洗浄され、ローダミン１２３を流出させるために３７℃で３時間染色試薬のない培地に再懸濁された。細胞は次いで２回洗浄され、細胞内のローダミン１２３の蛍光がフローサイトメーター（残存の蛍光ＦＲＥＳ）で分析された。蛍光度は、薬剤の放出を抑制するために４℃で保持された、負荷された細胞と比較された（最大蛍光ＦＭＡＸ）。細胞は、アデノシン受容体がＰ−ｇｐ薬剤流出活性を防ぐ能力を評価するために、アデノシン受容体アンタゴニストで処理された。ローダミン１２３に曝されていない各々のサブライン由来の細胞は、陰性の対照として使用された。
【０３３５】
代謝阻害剤
細胞は、アデノシン受容体アゴニスト及びパクリタキセル又はビンデシンで試験する前に、代謝阻害剤又は薬物賦形剤（ＤＭＳＯ）で３０分処理した。２４時間後、細胞を、フローサイトメトリー分析のために収集した。ＰＤ９８０５９を、ＭＥＫ−１活性化を抑制するために、ＭＥＫの阻害剤として、２０ｕＭで用いた。Ｕ０１２６を、細胞外シグナル調節キナーゼＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２の活性化を抑制するために、ＭＥＫ−１及びＭＥＫ−２の阻害剤として、１０ｕＭで用いた。ＳＢ２０３５８０を、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）の阻害剤として、１ｕＭで用いた。
【０３３６】
統計解析
図や文章中の全ての値は、ｎ個の観察結果（ｎは３以上）の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表現される。データセットは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットテスト（Dunnet's test）（必要であれば）により検討された。０．０５より小さなＰ値は、統計的に有意であると考えられた。ＦＡＣスキャン（FACscan）による代表的な画像は、少なくとも３つの異なる実験で得られた同様な結果と共に報告した。
【０３３７】
本発明者らは、非癌性腫瘍（non-cancerous tumors)又は正常組織と比較して、癌性腫瘍において増加している、ヒト癌細胞におけるアデノシンＡ３受容体の濃度を検証した。表８及び図１は、本発明者らによって、ヒトＡ３７５（ヒトメラノーマ）、Ｐａｎｃ−１（ヒトすい臓癌）、ＭＸ−１（ヒト胸癌）、ＰＣ−１（ヒト前立腺癌）、ＨＴ２９（ヒト大腸癌）、ＳＫＭＥＳ（ヒト肺癌）及びＡ２７８０ＡＤ１０（ヒト卵巣癌）において見出されるアデノシンＡ３受容体の増加したレベルを示す。
【０３３８】
３つのＡ３受容体アンタゴニストは、成長阻害活性度及び公知の抗腫瘍薬の阻害性成長機能の強化に関して試験を行っている。表６に、３つのＡ３受容体アンタゴニスト化合物の受容体結合アッセイを示す。３つの化合物の構造は以下の通りである。
【０３３９】
【化００９】
2008520746.tif 000030
ＭＲＥ３００８Ｆ２０：５−［［（４−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル］アミノ−８−プロピル−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジン
【０３４０】
【化０１０】
2008520746.tif 000031
ＩＬ−１０：Ｎ−１−（４−ジエチルアミノ−フェニル）−Ｎ’−Ｓ−［８−メチル−２−（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］−ピリミジン］−ウレア
【０３４１】
【化０１１】
2008520746.tif 000032
ＩＬ−１１：Ｎ−１−（４−ジエチルアミノ−フェニル）−Ｎ’−５−［８−メチル−２−（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３−ｅ］−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン］−ウレア
【０３４２】
ＩＬ−１１：Ｎ−１−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−Ｎ’−５−［８−メチル−２−（２−フリル）−ピラゾロ−［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン］−ウレア
【０３４３】
表６：ｒＡ１、ｒＡ２及びｈＡ３アデノシン受容体の結合親和性
【表６】
2008520746.tif 000033
【０３４４】
表６は、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１が、ヒトアデノシンＡ３受容体に関して効果的、選択的アンタゴニストであることを示す。
これら３つの化合物の結合親和性の検討に加えて、成長阻害性の検討もまた行った。他の化合物と組合わせない、化合物の成長検討の結果を、表７に示す。表７もまた、一般の抗腫瘍剤の成長阻害活性を示している。
【０３４５】
表７：別々に用いたＡ３アンタゴニスト及び抗腫瘍薬の成長阻害活性
【表７】
2008520746.tif 000034
【０３４６】
化合物ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１は、キング・ファーマシュティカル社から入手した。イリノテカンＨＣＬ（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）；２０ｍｇ／ｍｌ）は、ファーマシア・アンド・アップジョン社から入手した。パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標）；６ｍｇ／ｍｌ）は、ブリストル・マイヤー・スクイーブ社から入手した。ドセタクセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））は、ローヌ・プーロン・ロレール社から入手した。硫酸ビンブラスチン塩は、シグマ・ケミカル社から入手した（Ｖ１３７７）。イリノテカンは、培地で希釈した。他の薬剤は全て、適切な濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。ＤＭＳＯ原液を、成長培地で１００倍に希釈して、最終ＤＭＳＯ濃度を１％にした。本発明者らは以前に、ＤＭＳＯが１％以上の濃度において、培養細胞の成長に効果がないことを示している。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロマイド)は、シグマ・ケミカル社から入手した。ＲＰＭＩ−１６４０培地、抗真菌抗生物質１００Ｘ（１０，０００ユニット／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１０，０００μｇ／ｍｌのスルフォン酸ストレプトマイシン、 ２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（fungizone）、グルタミン（２００ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）、ゲンタミシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（７．５％）を含む）及びウシ胎仔血清は、ＧｉｂｃｏＢＲＬから入手した。ウシ胎仔血清中の相補体を、５６℃で３０分間非活性化した。 
【０３４７】
ヒトメラノーマＡ３７５、ヒト肺癌ＳＫＭＥＳ、結腸癌ＨＴ２９及び腎臓癌Ｐａｎｃ−１細胞株は、最初にＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関：American Type Culture Collection）から購入して、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に保持し、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍｌのスルフォン酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（fungizone）、２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＲＳ、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補給する。
【０３４８】
薬剤のほとんどが、広域スペクトル、及びこれら４つの組織学的に明確なヒト腫瘍細胞株（Ａ３７５メラノーマ、ＨＴ２９結腸癌、Ｐａｎｃ−１腎臓癌及びＳＫＭＥＳ肺癌）に対する同等の効果的成長阻害活性を示した。ＩＣ５０値は、４つの細胞株に対してほぼ同じ値であった。興味深いことに、ＨＴ２９は、ドキソルビシン（ＩＣ５０値は０．２１１対０．００６４μｇ／ｍｌ）及びミトキサントロン（ＩＣ５０値は０．１対０．００３２μｇ／ｍｌ）の各々に対して、Ａ３７５よりも約３０倍以上の難治性であった。ＨＴ２９細胞株は、トポイソメラーゼＩＩの別の形態を有し、それゆえ、トポイソメラーゼＩＩ、ＤＮＡ及び三重複合体の薬剤を捕捉することにより、それらの成長阻害活性を介在しているドキソルビシン及びミトキサントロンに対してより難治性である、ことがあり得る。
【０３４９】
（７．１  ヒト固形腫瘍及びメラノーマにおける数々のＡ３受容体）
本発明者らは、非癌性腫瘍又は正常組織と比べて、癌性腫瘍において上昇する、ヒト癌細胞におけるアデノシンＡ３受容体の濃度を検証した。表８及び図１に、本発明者らが、Ａ３７５（ヒトメラノーマ）、Ｐａｎｃ−１（ヒト腎臓癌）、ＭＸ−１（ヒト乳癌）、ＰＣ−１（ヒト前立腺癌）、ＨＴ２９（ヒト結腸腫瘍）及びＳＫＭＥＳ（ヒト肺腫瘍）において見出した、アデノシンＡ３受容体の増加を示す。
【０３５０】
表８  ヒト固形腫瘍及びメラノーマにおける数々のＡ３受容体
示されたデータは、腫瘍組織に発現するヒトＡ３アデノシン受容体に対する飽和実験に基づく[３Ｈ]ＭＲＥ３００８Ｆ２０に関する、解離定数ＫＤ（ｎＭ）及びＢＭＡＸ（ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質）として表される４℃での平衡結合パラメータである。
【０３５１】
表８  ヒト固体個体及びメラノーマでの豊富なＡ３受容体
【表８】
2008520746.tif 000035
【０３５２】
（７．２  ヒトメラノーマＡ３７５）
ヒトメラノーマＡ３７５細胞株に対するパクリタキセルの成長阻害活性は、１０μｇ／ｍｌのＭＲＥ３００８Ｆ２０又は各々５μｇ／ｍｌのＩＬ−１０及びＩＬ−１１の存在又は非存在下で測定した（表９）。これらの副細胞毒性濃度において、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１（Ａ３アンタゴニスト単独の存在における約３０〜４５％の成長阻害）は、パクリタキセルの成長阻害活性を８〜１２倍増加させ、ＩＣ５０値は、０．００４６μｇ／ｍｌ（パクリタキセル単独）から、０．０００４〜０．０００５μｇ／ｍｌ（ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１にパクリタキセルを加えて）に減少した。
【０３５３】
表９  Ａ３７５細胞でのＡ３アンタゴニスト及び併用の抗腫瘍薬の成長阻害活性
【表９】
2008520746.tif 000036
【０３５４】
ＩＬ−１０及びＩＬ−１１は、濃度依存的に、パクリタキセルの成長阻害活性を増加させることも確認された。タキサン系化合物での増強効果のさらなる試験の結果を表１０に示す。一般のタキサン化合物は、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ（登録商標））及びドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））の両方を含む。
【０３５５】
表１０に、ＭＲＥ３００８Ｆ２０の１、３及び１０μｇ／ｍｌの濃度での、及び化合物ＩＬ−１０及びＩＬ−１１の０．５、１．５及び５μｇ／ｍｌの濃度での、濃度依存性を示す。ＭＲＥ３００８Ｆ２０は、パクリタキセルの成長阻害活性を、濃度依存的に増大させた（３種濃度全てにおいて、増大因子＝６．４〜７．１）。一方、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１は、パクリタキセルの成長阻害活性を、濃度依存的に増大させた。この試験はまた、化合物のＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０及びＩＬ−１１が、相乗効果を示すドセタキセルと一緒になって増大因子を有することをも示唆した。
【０３５６】
表１０  Ａ３７５細胞でのアンタゴニスト及び併用のタキサン化合物の成長阻害活性
【表１０】
2008520746.tif 000037
2008520746.tif 000038
【０３５７】
（７．３  ヒト肺腫瘍 ＳＫＭＥＳ）
ヒト肺癌ＳＫＭＥＳにおいて、３種のＡ３アンタゴニスト全てが、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン及びビンデシンの成長阻害活性を増大させる（表１１）。
【０３５８】
表１１  ＳＫＭＥＳ細胞でのＡ３アンタゴニスト及び併用の抗腫瘍薬の成長阻害活性
【表１１】
2008520746.tif 000039
【０３５９】
Ａ３７５ヒトメラノーマに関し得られた結果を示した表１０と比べて、ＳＫＭＥＳ細胞におけるタキサン化合物に関する増大量は、Ａ３７５ヒトメラノーマのそれよりも小さい。これらの相乗作用における絶対量の差異は、採用した試験条件下、異なる腫瘍におけるＰ−ｇｐ活性に関連していると思われる。しかしながら、Ａ３アンタゴニスト及びタキサン化合物間の増大効果は、常に観察された。ＳＫＭＥＳ細胞での増大もまた、ビンブラスチンの場合の阻害Ｐ−ｇｐの機構、及びイリノテカンＨＣＬの場合の阻害ＭＲＰの機構と一致する。
【０３６０】
（７．４  ヒト結腸腫瘍 ＨＴ２９）
ヒト結腸腫瘍ＨＴ２９細胞株に対するパクリタキセル及びドセタキセルの成長阻害活性は、１μｇ／ｍｌのＭＲＥ３００８Ｆ２０又は各々０．５μｇ／ｍｌのＩＬ−１０及びＩＬ−１１の存在又は非存在下で測定した（表１２）。 Ａ３アンタゴニストが、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン及びイリノテカンの成長阻害活性を増進することを見出した。
【０３６１】
表１２  ＨＴ２９細胞でのＡ３アンタゴニスト及び併用のタキサン化合物の成長阻害活性
【表１２】
2008520746.tif 000040
【０３６２】
（７．５  ヒト腎臓癌Ｐａｎｃ−１）
ヒト腎臓癌Ｐａｎｃ−１において、Ａ３アンタゴニストが、タキサン系化合物のパクリタキセル及びドセタキセルの成長阻害活性を増大させた。（表１３）。しかし、観察された増大作用は、Ａ３７５メラノーマにおいて観察されたそれに比して小さい。
【０３６３】
表１３  Ｐａｎｃ−１細胞でのＡ３アンタゴニスト及び併用のタキサン化合物の成長阻害活性
【表１３】
2008520746.tif 000041
【０３６４】
上記のデータ及び表から、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、化学療法抗癌剤と併用して、多くの薬剤に対する顕著な増大効果をもたらす、ことがわかる。
【０３６５】
（７．６  ＭＤＲ癌細胞処理）
化学療法抗癌剤は、それら薬剤の関連するＭＤＲの形態からＡ３アンタゴニストの増大を選択できることを特記したが、本発明者らは更に、高親和性のアデノシンＡ３受容体アンタゴニストが、多剤耐性に関連するＰ−ｇｐ及びＭＲＰに対抗するように用いられることを立証した。
【０３６６】
第一に、本発明者らは、Ａ３アデノシン受容体が、従来の化学療法剤の毒性効果から細胞を保護できるかどうかを評価した。コロニー形成アッセイ実験を、パクリタキセルの濃度を高めながら（０．２５〜７５μｇ／ｍｌ）処理したＡ３７５メラノーマ細胞において実施した。Ａ３刺激は、選択的アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡにて実施し、一方、Ａ３阻害は、選択的アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０に実施した。パクリタキセル単独又はＭＲＥ３００８Ｆ２０単独で適用した場合は、コロニー形成が部分的に減少したにすぎないのに反して、パクリタキセル（０．７５μｇ／ｍｌ）及びＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μｇ／ｍｌ）の両方を適用した場合は、Ａ３７５細胞のコロニー形成が阻止された（図２）。
【０３６７】
アデノシンＡ３アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０μｇ）を適用した場合、Ａ３７５細胞のコロニー形成は、約３０％増加した。これは、図２の棒グラフ「Ｃ」が、ＤＭＳＯの対照棒グラフ「Ｄ」の１３０％を示し、更に、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡがタキサン系化合物パクリタキセル（０．７５μｇ／ｍｌ）と組合せた場合、増大したコロニー形成が生じていることを示した。パクリタキセルを単独で加えた場合、コロニー形成は対照の６４％である（図２の棒グラフ「Ｔ」）。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡと組合せた場合、コロニー形成は、単独に比べて３２％、つまり対照の８５％に増加させる（図２の棒グラフ「ＴＣ」）。
【０３６８】
アデノシンＡ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μｇ／ｍｌ）単独の使用は、コロニー形成を対照の５９％に減少させる（図２の棒グラフ「Ｍ」）。アデノシンＡ３アンタゴニストをタキサン化合物と組合せた場合、驚くことにほとんど全てのコロニー形成が阻止される（図２の棒グラフ「ＴＭ」）。これは、明確にＡ３アンタゴニストと化学療法剤の組合せの相乗効果を立証するものである。０．２％のコロニー形成という驚異的な結果に比べて、幾何学的組合せでは、３８％の結果が予見される。
【０３６９】
これらの結果に関する一つの解釈は、Ａ３受容体は、促進性生存シグナルを誘発し、タキサンのパクリタキセルと共に処理されたＡ３７５細胞のコロニー形成能力を修復することはできず、一方Ａ３の閉塞は悪影響を介在するパクリタキセルを増大させる（ｐ＜０．０１、図２の棒グラフ「ＴＭ」対「Ｔ」）。
【０３７０】
コロニー形成の実験後に、本発明者らはまた、タキソン系化合物のパクリタキセル及びビンカアルカロイドのビンデシンでＡ３７５細胞を急性処置を実施することによって、化学療法効果を増大させるために、Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストの能力を分析した。細胞増殖とアポトーシスは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）ＤＮＡ染色の後に、フローサイトメトリー分析により定量化する。２４時間の露光後、パクリタキセル及びビンデシンは、Ｇ２／Ｍ細胞周期位相に用量依存性の細胞蓄積及びＧ１集団の並列減少を誘発した。
【０３７１】
パクリタキセルとビンデシンが細胞増殖を変化させる効果の定量化のために、本発明者らは、５０％のＧ２／Ｍの蓄積（ＥＣ５０値）を発揮させる濃度を測定した。増加する濃度の化学療法剤に曝すとき、ＥＣ５０値は、パクリタキセルとビンデシンに関して各々１６．６０±２．００ｎｇ／ｍｌと１．９０±０．２０ｎＭである（４回の実験の平均）。更なる解析の結果、パクリタキセルとビンデシンがＧ１集団を減少させるＥＣ５０値は、Ｇ２／Ｍ抑止のＥＣ５０値と比べて、有意な変化は見られなかった。代表的なＤＮＡを複製する、Ｓ期集団には目立つ変化は見られない。
【０３７２】
付加的実験で、代表的な細胞がアポトーシスを受ける、ｓｕｂ−Ｇ１集団を定量化した。Ａ３７５細胞において、アポトーシス細胞のパーセントは、パクリタキセルの濃度と共に増加し、５ｎｇ／ｍｌで最高値に達する（異なる実験において３５％から５３％の範囲）。パクリタキセルの濃度の増加は、ｓｕｂ−Ｇ１におけるＡ３７５細胞の減少をもたらす。最大アポトーシス（ＥＣＭＡＸ）をもたらす濃度は、６．００±０．６３ｎｇ／ｍｌ（４回の実験の平均）である。同様に、ビンデシンで行った実験では、３．５４±０．４２ｎＭのＥＣＭＡＸ値を得た（４回の実験の平均）。
【０３７３】
Ａ３アデノシン受容体であるＡ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０の存在又は非存在下でパクリタキセル又はビンデシンで処理したＡ３７５細胞は、増大することを示した。図３Ａ及び図３Ｃに、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）が、ビンデシンとパクリタキセルの細胞増殖を変化させる能力を向上させるを示す。ＭＲＥ３００８Ｆ２０は、パクリタキセル及びビンデシンのＥＣ５０を各々１．９及び４．０倍に減少させた。同様の結果が、Ｇ１集団に関して算出したＥＣ５０値の解析からも得られた。
【０３７４】
更に、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）は、パクリタキセルとビンデシンに関するＥＣＭＡＸ値を、各々２．０及び２．１倍に減少させた（図３Ｂ及び３Ｄ）。
【０３７５】
Ａ３７５細胞（Ａｐｏ（ｓｕｂ  ｄｉｐｌｏｉｄ細胞）、Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期）でのＤＮＡ内容の代表的なフローサイトメトリーグラフを、図４に示す。ビンデシン処理細胞単独の場合（図４Ｂ）と比べて、図４Ｃは、両方の処理（Ａ３アンタゴニストのＭＲＥ３００８Ｆ２０とビンカアルカロイドのビンデシン）では、細胞がＧ１期からＧ２／Ｍ期まで進行しており、ビンデシンの応答が増加していることを示している。同様の結果が、タキソン系化合物のパクリタキセルを用いた場合にも得られた（図４Ｅ〜Ｆ）。
【０３７６】
この増大活性が、ＭＲＥ３００８Ｆ２０溶液中の毒性汚染物質の存在に関連するものではなく、Ａ３アデノシン受容体の特異的妨害によるものであるかどうか確認するために、本発明者らは、ビンデシンとパクリタキセルに対するＡ３７５細胞の応答を増大させるための他のアデノシン受容体アンタゴニストの能力を定量化した。
【０３７７】
Ａ３７５細胞は、アデノシン受容体アンタゴニスト（ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、ＭＲＥ３０４６Ｆ２０、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０、ＣＧＳ１５９４３、ＺＭ２４１３８５）の濃度を増やしながら、ビンデシンと処理した。図５Ａに示すように、アデノシンアンタゴニストのビンデシン効果を高める効力の順番は、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０（最高）＞ＭＲＥ３０６２Ｆ２０＞ＭＲＥ３０４６Ｆ２０＞ＭＲＥ３００８Ｆ２０＞ＩＬ−１０＞ＣＧＳ１５９４３＞ＺＭ２４１３８５（最低）であった。５０％の増大活性をもたらす濃度（ＳＥＣ５０値）を、４回の実験の平均値として、表１４に報告する。ＳＥＣ５０値は、アデノシンＡ３受容体に関する結合実験において観察された阻害平衡結合係数（Ｋｉ）とよく一致している（図５Ｂ）。
【０３７８】
表１４  Ａ３７５細胞におけるアデノシン受容体アンタゴニストのビンデシンに対する活性を増大させる係数及びアデノシンＡ３受容体の結合親和力
【表１４】
2008520746.tif 000042
【０３７９】
ＳＥＣ５０値は、Ｇ２／Ｍ蓄積用量応答曲線において算出した、ビンデシン（１ｎＭ）に対する５０％増大の活性をもたらすアデノシン受容体アンタゴニストの用量を示す。Ｋｉ値は、ヒトＡ３アデノシン受容体における結合親和力の平衡係数を示す。データは４回の独立した実験の平均を示す。
【０３８０】
細胞増殖とアポトーシスにおける変化に介在するパクリタキセルとビンダシンにおけるＡ３受容体アンタゴニストの役割を確認するために、試験を追加の細胞株を用いて実施した。細胞株は、Ａ３７５細胞に類似のアデノシン受容体発現表面の形態を選択した、即ち、ＨｅＬ０２３、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＣＴＣ２５４４及びＰＢＭＣブラストを選択した。実験条件は、Ａ３７５細胞試験の場合と同様である。Ａ３受容体アンタゴニストのＭＲＥ３００８Ｆ２０を用いて処理して、細胞周期分布変化（Ｇ２／Ｍ蓄積）を介在する、ビンデシン及びパクリタキセルのＥＣ５０値としての効果を、表１５に示す。ＥＣ５０値に反映されているアポトーシスのレベル変化も示す。
【０３８１】
表１５において、ＨｅＬ０２３細胞株は、パクリタキセル及びビンデシン単独に対して、最低の感度を示す。興味深いことに、ＨｅＬ０２３細胞は、ＭＲＥ３００８Ｆ２０との併用処理によって、最大の増大を示す。
【０３８２】
表１５  Ａ３受容体アンタゴニストのＭＲＥ３００８Ｆ２０処理有り又は無しの場合のパクリタキセル及びビンデシンによる異なる細胞のＧ２／Ｍ蓄積及びアポトーシスの誘発 
【表１５】
2008520746.tif 000043
データは、４回の独立した実験の平均±標準誤差を示す。ＭＲＥ３００８Ｆ２０は、１０μＭである。
【０３８３】
ＥＣ５０値は、Ｇ２／Ｍ蓄積用量応答曲線の解析により得た。ＥＣＭＡＸ値は、ｓｕｂ−Ｇ１蓄積用量応答曲線の解析により得た。パクリタキセル値の単位は、ｎｇ／ｍｌである。ビンダシン値の単位は、ｎＭである。ｎｄは、「ｎｏｔ  ｄｏｎｅ」で実施していないことを意味する。ＤＭＳＯに対して、＊Ｐ＜０．０１であり、分析は、ダネット検定に従い、ＡＮＯＶＡによる。
【０３８４】
ＨｅＬ０２３細胞株におけるより大きな相対的増強は、他の細胞株にはない因子によるものか、又はＰ−グリコプロテイン薬剤排出活性により調整された細胞内の活性濃度に関連する可能性がある。
【０３８５】
ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）保持力、Ｐ−ｇｐ機能アッセイは、全ての細胞株において検討された。このアッセイは、Ｒｈ１２３とともに細胞株を培養し、その蛍光発光を測定することによるＲｈ１２３蓄積を割り出して実施した。Ｒｈ１２３の最大充填（ＦＭＡＸ）は、いかなる活性Ｒｈ１２３の流出をも防ぐための、細胞を取り出し４℃で貯蔵するという処理の最後に定量化した。Ｐ−ｇｐ薬剤流出は、Ｒｈ１２３充填細胞を、Ｒｈ１２３のない未使用の新しい培地で、３７℃で３時間培養することにした。この培養後、残留蛍光発光（ＦＲＥＳ）を測定して、ＦＭＡＸと比較した。
【０３８６】
Ａ３７５細胞におけるＲｈ１２３保持力の結果を、図６Ａと図６Ｂに示す。図６Ａは、アデノシンＡ３アンタゴニストの存在しない場合の、Ａ３７５細胞によるＲｈ１２３保持に関するフロー・クロマトグラムを示す。２つの細胞集団が検出され、ＦＭＡＸより低い平均蛍光発光強度を有するＦＲＥＳに特徴づけられる。総細胞の２６±５％を占め、最も低い蛍光発光を持つ集団は、機能的Ｐ−ｇｐに発現して、Ｒｈ１２３の低い細胞内レベルを持つ細胞を示す。
【０３８７】
対照的に、図６Ｂは、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）存在下の、Ａ３７５細胞のＲｈ１２３蓄積を示す。高親和性Ａ３アンタゴニストの存在により、ＦＭＡＸと比較可能なＦＲＥＳクロマトグラムもたらした反応は、Ｒｈ１２３転送を介在するＰ−ｇｐの完全な阻止と一致する。
【０３８８】
ヒトＨｅｒｉｔｈｒｏ−白血病ＨｅＬ０２３細胞におけるＲｈ１２３保持力の試験結果を、図６Ｃと図６Ｄに示す。図６Ｃは、ＨｅＬ０２３細胞が、Ａ３７５細胞よりも高いＰ−ｇｐ活性を有することを示す。ＦＲＥＳ（黒い影部分）は、Ｒｈ１２３（蛍光発光）で処理していない細胞から得られたクロマトグラムと類似している。これは、高レベルの機能的なＰ−ｇｐを発現する殆ど全ての細胞（１００±１％）に一致している。
【０３８９】
Ａ３アンタゴニストのＭＲＥ３００８Ｆ２０を付加したＨｅＬ０２３細胞は、Ｐ−ｇｐ阻害作用を示す（図６Ｄ）。ＭＲＥ３００８Ｆ２０存在下のＦＲＥＳ値は、ＦＭＡＸ値に類似している。これは、ほぼ完全なＰ−ｇｐ阻害を示すものである。
【０３９０】
Ｊｕｒｋａｔ及びＮＣＴＣ２５４４細胞の検討においては、３７℃での３時間の培養後（ＦＲＥＳ値はＦＭＡＸ値に類似している）に、Ｒｈ１２３蛍光発光における有意な変化が見られず、これは、これらの細胞においてＰ−ｇｐ薬剤ポンピング活性は存在しないか又は検出不能である点で一致している。
【０３９１】
Ａ３アンタゴニストの抗Ｐ−ｇｐ活性が、ＭＲＥ３００８Ｆ２０溶液中の毒性汚濁物質
の存在に関連していないことを立証するために、薬剤流出に介在するＰ−ｇｐを妨害する、他のアデノシン受容体アンタゴニストの能力を定量化した。ＨｅＬ０２３細胞は、アデノシン受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１０、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、ＭＲＥ３０４６Ｆ２０、ＣＧＳ１５９４３及びＺＭ２４１３８５）で処理した。結果を表６に示す。
【０３９２】
表１６は、アデノシン受容体アンタゴニストの存在下の、細胞発現Ｐ−ｇｐ活性の％（Ｒｈ１２３陰性細胞の％）を示している。高親和性のアデノシンＡ３アンタゴニストのＩＬ−１０、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、ＭＲＥ３０６２Ｆ２０及びＭＲＥ３０４６Ｆ２０は、Ｐ−ｇｐ活性の強力な阻害活性物質である。それに対して、低親和性のアンタゴニストのＣＧＳ１５９４３とＺＭ２４１３８５は、Ｐ−ｇｐ活性において非常に小さい効果しか持たない。これは、より高いＡ３親和性によるものか、又は、アデノシン受容体アンタゴニストに介在されるＰ−ｇｐ薬剤排除活性の阻害に対する構造活性関係の存在によるものであり得る。
【０３９３】
【表１６】
2008520746.tif 000044
2008520746.tif 000045
【０３９４】
表１６のデータは、独立した４回の実験の平均を示す。
【０３９５】
ビンデシン及びパクリタキセルの抗増殖効果に対する応答に介在するＡ３アンタゴニストを持続している分子メカニズムを明確に示すために、シグナル伝達検討を行った。
【０３９６】
先行研究は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）系の活性化に対するパクリタキセルとビンカアルカロイド誘導体の致死性に関連したものであった（Lieu in Sequence-dependent potentiation mol. Pharmacol. 2001）。これまでは、３つのＭＡＰＫ系メンバーである、ＥＲＫＳ（又はｐ４２／４４ＭＡＰＫ）、ＪＮＫ（又はＳＡＰＫ）及びｐ３８ＭＡＰＫの特性が示されている。シグナル伝達検討においては、ビンデシンとパクリタキセルの機能強化に介在するＭＲＥ３００８Ｆ２０における、ＥＲＫＳとｐ３８ＭＡＰＫの効果を調査している。ＪＮＫ経路については、市販のＪＮＫ阻害剤が無いために検討されていない。図７Ａと図７Ｂに結果を示す。
【０３９７】
ＭＥＫ経路の阻害のために、ＭＥＫ１／２の選択性阻害剤（dudley dt, PNAS 92:7686, 1995）のＰＤ９８０５９を使用した。ＥＲＫ活性化の阻害剤として、ＰＤ９８０５９より約１００倍効果的な薬剤のＵ０１２６を使用した。ＳＢ２０３５８０が、ｐ３８ＭＡＰＫ活性を選択的に阻害する（Young PR JBC 272:12116 1997）。Ａ３７５細胞は、ＰＤ９８０５９（２０μＭ）、Ｕ０１２６（３０μＭ）、ＳＢ２０３５８０（１μＭ）又はＤＭＳＯ（対照として）で前処理した後、ビンデシン（１ｎＭ）又はパクリタキセル（１５ｎｇ／ｍｌ）で処理した。２４時間の後処理で、細胞を採取して、アポトーシスと細胞周期を分析した。
【０３９８】
ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６及びＳＢ２０３５８０に、パクリタキセル又はビンデシンを組合せても、パクリタキセル又はビンダシン単独の場合と比べて、Ｇ２／Ｍの蓄積率は、改良されなかった。ＰＤ９８０５９及びＳＢ２０３５８０は、ビンデシンとパクリタキセルに対するＡ３７５細胞の感受性を向上させるＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）を阻害しなかった。ＰＤ９８０５９とパクリテタキセルとの組合せの結果は、図７Ａの棒グラフ「ＴＰ」に、ビンデシンとの組合せは、棒グラフ「ＶＰ」に示す。ＳＢ２０３５８０とパクリテタキセルとの組合せの結果は、図７Ａの棒グラフ「ＴＳ」に、ビンデシンとの組合せは、棒グラフ「ＶＳ」に示す。
【０３９９】
Ｕ０１２６は、Ｇ２／ＭにおけるＭＲＥ３００８Ｆ２０誘発型蓄積を、パクリタキセルの存在下で２３±５％（図７Ａの棒グラフ「ＴＵ」）、ビンデシンの存在下で４８±５％（図７Ａの棒グラフ「ＶＵ」）までそれぞれ阻害した。これは、増進活性の分子メディエータがＥＲＫであることを推論させる。
【０４００】
経路の選択的阻害効果をね図７Ｂに示す。特記すべきは、２５ｎｇ／ｍｌのパクリタキセルに誘発されて、アポトーシスの顕著な減少が、ＰＤ９８０５９で処理された細胞（３５±６％、図７Ｂ  レーン５）及びＵ０１２６で処理された細胞（７３±１０％、図７Ｂ  レーン３）において見られる一方、ＳＢ２０３５８０はいかなる効果も発揮しなかった（図７Ｂ  レーン７）ことである。しかし、Ｕ０１２６の存在下で観察されている（図７Ｂ  レーン４）ように、ＰＤ９８０５９とＳＢ２０３５８０においては、パクリタキセルにより誘発されるアポトーシスにおいて、ＭＲＥ３００８Ｆ２０による保護効果は向上していない（各々、図７Ｂ  レーン６及びレーン８）。
【０４０１】
これらの結果から、ＭＲＥ３００８Ｆ２０誘発性のパクリタキセルにおけるアポト−シスの減少は、ＥＲＫ活性によるものであることが立証される。Ｈｅｌ０２３、ＮＣＴＣ２５４４及びＪｕｒｋａｔ細胞株において、付加的に同様な試験を行った（データは表示しない）。
【０４０２】
更なる試験により、Ｐ−ｇｐの妨害とＥＲＫの関与は互いに独立して起こりうることが示された。Ａ３７５細胞は、Ｕ０１２６（３０μＭ）による３０分間の初期処理を施し、続いてＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）と共にインキュベートした。Ｐ−ｇｐ活性を、ＭＲＥ３００８Ｆ２０単独で処理した細胞と比較した（例えば、図６Ｂの細胞）。Ｕ０１２６は、Ｐ−ｇｐのＭＲＥ３００８Ｆ２０妨害を阻止しなかった。これは、Ｐ−ｇｐの妨害とＥＲＫの関与は互いに独立して起こりうることを立証している。
【０４０３】
考察
これまでの結果から、いくつかのアデノシン受容体アンタゴニストは、化学療法剤に対して増進活性をもたらすことが示される。注目すべきは、この増進活性がＡ３アデノシン受容体依存であることである。この薬理学的特異性は、生理学的効果をもたらす用量（Ｇ２／Ｍ蓄積を定量化したＳＥＣ５０値）と異なるアデノシン受容体アンタゴニストのＡ３アデノシン受容体に対する結合能力（Ｋｉ値）との間の厳密なＳｐｅｒｍｅａｎ’ｓ順位相関により確定した（ｒ＝０．９６、図５Ｂ）。この増強の仕組みについては、未だ公知で明確な解釈はされていない。しかしながら、Ｇ２／Ｍ蓄積におけるＳＥＣ５０値と受容体親和値との間の、高度に統計的に有意なＳｐｅｒｍｅａｎ’ｓ順位相関係数は、高度に有意な正相関を示した。
【０４０４】
結果は、Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストは、化学療法剤の抗増殖及びアポトーシス効果を増強することを示す。Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストは、化学療法剤のＥＣ５０用量を減少させ（Ｇ２／Ｍ蓄積率の分析により定量化実施）、ＨｅＬ０２３、Ａ３７５及びＪｕｒｋａｔ細胞株で処理した場合、それぞれパクリタキセルに関して１２．３、１．９、１．２倍まで、ビンダシンに関して３６．３、４．０、２．５倍まで減少させた。アポトーシス度合いを評価した場合、化学療法剤のＥＣＭＡＸ用量をパクリタキセルに関して、ＨｅＬ０２３、Ａ３７５及びＪｕｒｋａｔ細胞株において、それぞれ１０．５、２．０、１．５倍まで、ビンダシンに関して、ＨｅＬ０２３及びＡ３７５細胞において、それぞれ３１．５、２．０倍まで減少させて、この増大した活性が立証された。
【０４０５】
異なる細胞型で様々なレベルのＥＣ５０値が観察されたことは、薬剤誘発の増強が細胞型特異性で関与していることを示唆する。注目すべきは、薬剤活性の必須条件は、標的部位へのその供給である。しかしながら、薬剤性能は、発現耐性、即ち、投与する薬剤に対する細胞感度の欠如により制限される。多剤耐性（ＭＤＲ）表現型を有する腫瘍細胞は、耐性を示す化合物の細胞内蓄積を低減することで特性化される。
【０４０６】
更に、ＭＤＲ表現型を有する細胞株の殆どが、エネルギー依存の流出ポンプとして作用する、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）に関連する１７０ＫＤａ細胞膜の過発現を示す。このタンパク質が、有毒内生代謝物の輸送において重要な役割を担うことはすでに証明されており、更に、耐性細胞内で観察される細胞内薬剤蓄積の減少の要因であると思われる（Fojo A, Canser Res45:3002-7,1985）。先行検討において、メラノーマ及びＨｅｌ造血細胞株が機能的なＰ−ｇｐを発現すると報告している。
【０４０７】
一方、ＭＲＰ及び非Ｐ−ｇｐ輸送体が、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞（Ｔリンパ球細胞株）に発現する。これは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるローダミン１２３流出は低い一方で、ＨｅＬ０２３及びＡ３７５細胞がＰ−ｇｐ流出活性を生み出すという結果と一致する。このことは、アデノシンＡ３アンタゴニストがＰ−ｇｐ発現及びＭＲＰ発現細胞株の両方における増強に有用であることを示すものである。
【０４０８】
Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰ阻害に対して、ＣＧＳ１５９４３及びＺＭ２４１３８５が極めて低い能力であることは、これらの化合物のアデノシンＡ３親和性の非常に低いことと関連する。試験した高親和性のＡ３アンタゴニスト化合物は、Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰ薬剤耐性の増強と阻害の両方に極めて高い有効性を有している。このことは、これら化合物のより高い親和性又は分子構造によるものである可能性がある。例えば、試験した高親和性化合物は、２−フリルピラゾール−トリアゾロ−ピリミジン構造のＮ５位に、フェニル−カルバルノイル−アミノ誘導体を有する。ＣＧＳ１５９４３及びＺＭ２４１３８５は、Ａ３親和性が非常に低いことに加えて、非常に異なる分子構造を有している。
【実施例】
【０４０９】
（７．７  製剤例）
以下の実施例は、本発明の概要を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。これらの実施例において使用される記号と仕様は、現代の国際的な化学文献、例えば、「the Journal of the American Chemical Society」及び「Tetrahedron」などで使用されているものと同様である。
【０４１０】
製剤処方 
（Ａ）経皮系の製剤（１０００パッチに対して）
成分                                              量          
活性化合物                                       １００ｇ
シリコーン油                                     ４５０ｇ
コロイド性のシリコンの二酸化物                       ２ｇ
【０４１１】
活性化合物とシリコン液を共に混合して、コロイド状のシリコンの二酸化物を加えて粘性を増加させる。この物質を、続いて、ポリエステルの放出の裏地、シリコン又はアクリルポリマーから成る皮膚接触接着剤、ポリオレフィンである制御薄膜及びポリエステルの多層のラミネート製の不浸透性バッキング薄膜を含んでなる、重合体のラミネートに混ぜ、引き続きヒートシールされる。得られたラミネートされたシートを、１０ｃｍ２のパッチに切り分ける。
【０４１２】
（Ｂ）経口投与錠剤（１０００錠に対して）
成分                                              量          
活性化合物                                       ５０ｇ
デンプン                                         ５０ｇ
ステアリン酸マグネシウム                           ５ｇ
【０４１３】
活性化合物とデンプンを水で顆粒にして、乾燥させる。ステアリン酸マグネシウムを乾燥した顆粒に加え、その混合物を十分に混ぜる。混ぜ合わせた混合物を打錠して錠剤にする。
【０４１４】
（Ｃ）注射剤（１ｍＬのアンプルの１０００本に対して）
成分                                       量                  
活性化合物                             １０ｇ
緩衝化剤                               ｑ．ｓ．（十分な量）
プロピレングリコール               ４００ｍｇ
注射用水                          １０００ｍＬまで
【０４１５】
活性化合物と緩衝化剤を、約５０℃のプロピレングリコールに溶解する。その後、撹拌しながら注射用の水を加え、得られた溶液を濾過して、アンプルに充填し、シールし、そしてオートクレーブで殺菌する。
【０４１６】
（Ｄ）点滴液（１０００ｍＬに対して）
成分 量                
活性化合物                                   １０ｇ
緩衝化剤                                     ｑ．ｓ．（十分な量）
注射用水                                  １０００ｍＬまで
【０４１７】
活性化合物と緩衝化剤を、約５０℃の水に溶解する。得られた溶液を濾過し、適切な投与容器に充填し、シールし、殺菌する。
【０４１８】
（Ｅ）局部軟膏（１ｇパックの１０００個に対して）
成分                                              量      
活性化合物                                   １０ｇ
ホワイトペトロリアムベース            ｑ．ｓ．９９０ｇ
【０４１９】
活性化合物を、無菌状態でホワイトペトロリアムベース中に混合して、１ｇパックに充填する。
【０４２０】
本発明は、具体的な態様について記載されているが、物質や条件において種々の代用ができることは、当業者にとって明らかであろう。例えば、他の賦形剤が製剤処方にあたり用いられ得る。加えて、多くの活性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、一つ又はそれ以上の非対称性中心を含んでいて、それゆえ、光学異性体及びジアステレオマー、更にそれらのラセミ体含み、そして光学異性的に純粋な形態、又はジアステレオ異性的に純粋な形態に分離されているもの、そして薬学的に許容されるそれらの塩を含む。アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、細胞有毒剤と同時に投与されることはしばしば望ましいことである。この場合、本発明の利用者は、Ａ３受容体アンタゴニストと細胞毒素の組合せを単一投薬形態にすることに、有益を見出すことができる。これら及びその他の応用は、当業者には自明であり、本明細書に含まれるものである。本発明の範囲は以下の請求項によってのみ限定されるものである。
【０４２１】
（７．８  アデノシンによるＨＩＦ−１αの調整）
試薬と試料 
Ａ３７５メラノーマ、ＮＣＴＣ２５４４ケラチン生成細胞、Ｕ２ＯＳ骨肉腫、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽細胞種ヒト細胞は、アメリカ組織培養保存機関（American Tissue Culture Collection：ＡＴＣＣ）から入手した。組織培養媒体及び増殖補助剤は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒから入手した。ＧａｓＰａｋＰｏｕｃｈ（登録商標）システムは、ベクトン・ディッキンソン社から入手した。特に断りのない限り、他の全ての試料は、シグマ社より購入した。抗ＨＩＦ−１α及び抗ＨＩＦ−１β抗体（ｍＡｂ）はトランスダクション・ラボラトリ社（ＢＤ、ミラノ、イタリア）から入手した。Ｕ０１２６（ＭＥＫ−１及びＭＥＫ−２の阻害剤）、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害剤）、抗ＡＣＴＩＶＥ（登録商標）ＭＡＰＫ及び抗ＥＲＫ１／２（ｐＡｂ）はプロメガ社から入手した。ホスホ−ｐ３８及びｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体セル・シグナリング・テクノロジ社から入手した。抗アデノシンＡ３受容体（ｐｏｌｙＡｂ）はアビバ・アンチボディ・コーポレーションから入手した。
【０４２２】
細胞培養及び低酸素症治療
細胞は、ＤＭＥＭ（Ａ３７５）、ＥＭＥＭ（ＮＣＴＣ２５４４）又はＲＰＭＩ１６４０（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２ＯＳ）培地（１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含み）で、３７℃にて５％ＣＯ２／９５％空気に保持した。細胞は、週に２又は３回、１：５〜１０の比で培養した。酸素濃度を２％以下に減少させた低酸素状態に曝して、３５℃にて２時間以内のインキュベーションをＢＢＬ（登録商標）ＧａｓＰａｋＰｏｕｃｈ（登録商標）システム（ベクトン・ディッキンソン社）中で実施した。
【０４２３】
［３Ｈ］−チミジンの取り込み、細胞増殖試験
細胞を、未使用の培地に、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含むＤＭＥＭ中で、１ｕＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−チミジンとともに、播種した。２４時間標識した後、細胞をトリプシン化し、９６ウェル・プレートの４ウェルに分注し、Ｍｉｃｒｏ−Ｍａｔｅ１９６細胞ハーベスタ（パッカード・インストロメント・カンパニー）を用いてワットマンＧＦ／Ｃグラスファイバーフィルターを通しろ過した。放射性活性に結合するフィルターを、Ｍｉｃｒｏ−Ｓｃｉｎｔ２０を用いて、トップ・カウント・マイクロプレート・シンチレーション・カウンタ（効率５７％）で計数を行った。
【０４２４】
フロー・サイトメトリー解析
Ａ３７５付着細胞を、トリプシン化し、遊離細胞と混合し、ＰＢＳで洗浄し、そして７０％（容積/容積）エタノール／ＰＢＳ溶液に４℃で少なくとも２４時間浸透化させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡを２０ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムと１００ｕｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼを含むＰＢＳ溶液で室温で３０分間染色した。細胞を、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフロー・サイトメータ（ベックマン・コールター、マイアミ、ＦＬ）を用いて分析して、ＤＮＡの内容をＣｅｌｌ−ＬＩＳＹＳプログラム（ベクトン−ディキンソン）を用いて評価した。細胞周期位相中の細胞分布とアポトーシスの細胞の割合を、前記（Merighi 2002）のように評価した。つまり、細胞周期分布を、ヨウ化プロピジウム染色による判断で、２ｎ（Ｇ０／Ｇ１期）、４ｎ（Ｇ２及びＭ期）、４ｎ＞ｘ＞２ｎＤＮＡ量（Ｓ期）を含む細胞の割合として示す。アポトーシスの集団は、２ｎより低いＤＮＡ含有量の細胞の割合である。
【０４２５】
低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ）の設計
Ａ３受容体ｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＡ３）を標的とする低分子干渉ＲＮＡを引き起こすために、３'末端に２'-デオキシリボヌクレオシドの存在を除いた、リボヌクレオシドから成る８つのオリゴヌクレオチドを、Ｅｌｂａｓｈｉｒ（ｒｅｆ）の推奨、製造元の取り扱い説明書（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｉＲＮＡコンストラクション・キット、Ａｍｂｉｏｎ）に従い、そして前記（Ｍｉｒａｎｄｏｌａ，２００４）のように、合成して、アニール化を行った。ｏｌｉｇｏ−１に対して、センス配列：５’−ＧＣＵＵＡＣＣＧＵＣＡＧＡＵＡＣＡＡＧＵＵ−３’（配列番号１）及びアンチセンス５'−ＣＵＵＧＵＡＵＣＵＧＡＣＧＧＵＡＡＧＣＵＵ−３’（配列番号２）。ｏｌｉｇｏ−２に対して、センス配列：５’−ＧＡＣＧＧＣＵＡＡＧＵＣＣＵＵＧＵＵＵＵＵ−３’（配列番号３）及びアンチセンス５'−ＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＵＵＡＧＣＣＧＵＣＵＵ−３’（配列番号４）。ｏｌｉｇｏ−３に対して、センス配列：５’−ＡＣＡＣＵＵＧＡＧＧＧＣＣＵＧＵＡＵＧＵＵ−３’（配列番号５）及びアンチセンス５'−ＣＡＵＡＣＡＧＧＣＣＣＵＣＡＡＧＵＧＵＵＵ−３’（配列番号６）。ｏｌｉｇｏ−４に対して、センス配列：５’−ＣＣＵＧＣＵＣＵＣＧＧＡＧＧＡＵＧＣＣＵＵ−３’（配列番号７）及びアンチセンス５'−ＧＧＣＡＵＣＣＵＣＣＧＡＧＡＧＣＡＧＧＵＵ−３’（配列番号８）。標的配列は、他の遺伝子との顕著な相同無しに配列を保証するために、ＢＬＡＳＴ検索においてヒトゲノムデータベースに配列した。ｏｌｉｇｏ−１、ｏｌｉｇｏ−２、ｏｌｉｇｏ−３及びｏｌｉｇｏ−４に対する標的配列は、Ａ３受容体ｍＲＮＡ配列（Ｌ２０４６３）の開始コドンの下流、３３７、６７９、１００９及び１３５６番目のベース（bases）にそれぞれ位置する。
【０４２６】
ｓｉＲＮＡによる細胞の処置
Ａ３７５細胞は、６ウェルプレートに播種して、トランスフェクションを行う前に、５０〜７０％密集度まで成長させた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ＲＮＡｉＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション・キット（キアゲン社）を用いて、１００ｎＭ濃度で実施した。細胞を、完成培地でインキュベーションして、２４、４８、７２時間目に全ＲＮＡを単離して、Ａ３受容体ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析及びＡ３受容体タンパク質のウェスタンブロット分析を行った。トランスフェクションから４８時間後に、Ａ３７５細胞を、更に２４時間血清饑餓状態にして、更に４時間低酸素状態で、Ａ３アデノシン受容体アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡの濃度を増加させた。その後、全タンパク質を収集して、ウェスタンブロット分析を行った。対照として、細胞をＲＮＡｉＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬にｓｉＲＮＡＡ３無しで曝した。ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ標識（キアゲン社）を使用して、細胞のトランスフェクション効率を定量化した。トランスフェクションから２４時間後、細胞をトリプシン化し、ＰＢＳに再懸濁して、フロー・サイトメトリー解析を行った。ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞から得た蛍光発光を、非トランスフェクションの対照で発生した自家蛍光と比較した。
【０４２７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験
全細胞質ＲＮＡ、酸性グアニジンチオシアン酸フェノール法（Chomczynski & Sacchi、1987）で抽出した。ＨＩＦ−１α及びＡ３受容体ｍＲＮＡ転写物の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ（樋口、１９９３）を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム(Applied Biosystems、Warrington Cheshire、ＵＫ）の遺伝子特異的二重蛍光標識ＴａｑＭａｎＭＧＢプローブ（マイナー溝結合体）を用いて行った。以下のプライマー及びプローブ配列をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに用いた。Ａ３フォワードプライマ：５’−ＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号９）；Ａ３リバースプライマ：５’−ＡＣＡＡＴＣＣＡＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴ−３’（配列番号１０）；Ａ３ＭＧＢプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号１１）；ＨＩＦ−１α遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに関し、ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−ｄｅｍａｎｄ（登録商標）遺伝子発現産生物登録Ｎｏ．ＮＭ０１９０５８を用いた（Applied Biosystems, Monza, Italy）。蛍光レポーターＦＡＭと消光剤ＴＡＭＲＡは、各々６−カルボキシフルオレセインと６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミンである。対照遺伝子のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲには、内因性対照ヒトβアクチンキットを用い、ＶＩＣ（登録商標）(Applied Biosystems, Monza, Italy）を用いてプローブの蛍光標識を行った。
【０４２８】
ウェスタンブロッティング
Ａ３７５、ＮＣＴＣ２５４４、Ｕ２ＯＳ及びＵ８７ＭＧ細胞は、アデノシン又はアデノシンアナログで処理して、正常酸素分圧及び低酸素状態に異なる時間（２〜２４時間）曝した。細胞を収集して、１ｍＭのオルトバナジウムナトリウム、１０４ｍＭのＡＥＢＳＦ、０．０８ｍＭのアプロチニン、２ｍＭのロイペプチン、４ｍＭのベスタチン、１．５ｍＭのペプスタチンＡ、１．４ｍＭのＥ−６４を含む、氷冷したＰＢＳで洗浄した。その後、細胞をトリトン溶解緩衝液みに溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。等量のタンパク質（３５μｇ)に、７．５％のドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル中で電気泳動を施した。その後、ゲルをニトロセルロース薄膜上に電気的に転写された。膜を、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％の無脂肪乾燥ミルクでブロックし、そして０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％の無脂肪乾燥ミルク中で、ＨＩＦ−１α（１対２５０希釈）及びＨＩＦ−１β（１対１０００希釈）に対する抗体とともに４℃で一晩インキュベートされた。全タンパク質サンプルのアリコート（５０μｇ）を、リン酸化（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）又は全ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫ（１：５０００希釈）、リン酸化（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）又は全ｐ３８ＭＡＰＫ（１：１０００希釈）に対して、及びＡ３受容体（１μｇ／ｍｌ希釈）に対して特異的な抗体を用いて分析した。フィルターを洗浄して、１時間室温で、マウスとウサギＩｇＧに対するペルオキシダーゼ共役２次抗体（１：２０００希釈）と共にインキュベーションした。特異的反応を、促進化学発光ウェスタンブロッティング検出試薬（Amersham Corp., Arlington Heights, Ill）で明らかにした。その後、膜を剥離して、等量のタンパク質が装填されていることを確認するためにチューブリン（１対２５０）で再プローブした。
【０４２９】
代謝阻害剤
細胞を、アデノシン又はアデノシンアナログで処理する前に、３０分間代謝阻害剤又は薬物賦形剤（ＤＭＳＯ）で処理した。Ｕ０１２６を、ｐ４４及びｐ４２のＭＡＰＫ活性化を防ぐため、ＭＥＫ−１及びＭＥＫ−２の阻害剤として、１０及び３０ｕＭで用いた。ＳＢ２０２１９０を、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤として、１及び１０μＭで用いた。
【０４３０】
デンシトメトリー解析
イムノブロットアッセイにおける各々のバンド強度は、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（Bio-Rad）を用いて定量化した。独立した実験から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、対照の細胞の結果に対して標準化された。データは、平均値±標準誤差で表現され、ステューデントのテストにより解析した。
【０４３１】
統計的分析
図や文章中の全ての値は、ｎ個の観察結果（ｎは３以上）の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表現される。データセットは、分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットテスト（Dunnet's test）（必要であれば）により検討した。０．０５より小さなＰ値は、統計的に有意であると考えられる。
【０４３２】
結果
アデノシンは、低酸素状態におけるＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を誘導する。本発明者らは、ヒトＡ３７５メラノーマ細胞株において長期間の酸素除去により産み出される生物学的効果を評価した。低酸素状態に２４時間曝露されたＡ３７５細胞の生存率及び増殖は、アポトーシス細胞の百分率及び細胞周期の異なる位相間の分配を分析することにより評価された。本発明者らは、アポトーシス、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期の状態の細胞を区別するために、ヨウ化プロピジウムによるＤＮＡ染色とフローサイトメトリーを実施した。その結果は、低酸素状態は、メラノーマ細胞をＧ０／Ｇ１及びＳ期に拘束し、Ｇ２／Ｍ期にいる細胞の数を減少させ、増殖を阻害したが、有意な細胞死を促進しなかった（図８）。これらのデータは、トリパンブルー除外試験、細胞計数及び［３Ｈ−チミジン］取り込み試験を用いることで確認された（データは示されていない）。
【０４３３】
Ａ３７５細胞を低酸素状態に曝露すると、ＨＩＦ−１αタンパク質発現が誘導された（図９）。低酸素状態によるＨＩＦ−１αの誘導は速く、増大は、低酸素状態でのインキュベーション後の最初の２〜３時間にみられた。最大の刺激は、酸素除去条件におけるインキュベーションの４〜８時間に得られたが、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは、長期の低酸素状態では幾分低くなった。逆に、ＨＩＦ−１βのレベルは、変化しなかった。
【０４３４】
転写因子ＨＩＦ−１に及ぼすアデノシンの効果を研究するために、Ａ３７５メラノーマ細胞は低酸素条件下、増大する濃度のヌクレオシドで４時間処置された。図１０Ａにみられるように、アデノシンは低酸素状態メラノーマ細胞におけるＨＩＦ−１αタンパク質の発現を上方制御した。特に、アデノシンは、ＥＣ５０値が２．１±０．２μＭで最大上昇が１００μＭで２．６±０．２倍、用量依存的にＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を誘導した（図１０Ｂ）。本発明者らは、ＨＩＦ−１βタンパク質のいかなる修飾も観察しなかった。
【０４３５】
アデノシン受容体ファミリーは、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ及びＡ３と記される４つのサブタイプのＧタンパク質連結型受容体からなる。本発明者らは、４つ全てのアデノシン受容体がヒトメラノーマＡ３７５細胞に発現していることを、以前に証明した。低酸素条件下でのＨＩＦ−１αタンパク質発現に果たす、アデノシン受容体サブタイプの機能的な役割を評価するために、本発明者らはＤＰＣＰＸ（Ａ１受容体アンタゴニスト）、ＳＣＨ５８２６１（選択的Ａ２Ａ受容体アンタゴニスト）、ＭＲＥ２０２９Ｆ２０（選択的Ａ２Ｂ受容体アンタゴニスト）、及びＭＲＥ３００８Ｆ２０（選択的Ａ３受容体アンタゴニスト）との組合せでアデノシンの効果を検討した（Baraldi 2004; Merighi 2001; Varani 2000）。Ａ１、Ａ２Ａ及びＡ２Ｂ受容体アンタゴニストは、アデノシン誘導ＨＩＦ−１αタンパク質発現を阻害しなかったが、Ａ３受容体アンタゴニストのＭＲＥ３００８Ｆ２０は、アデノシンが誘導するＨＩＦ−１αタンパク質発現の増加を抑制した（図１０Ｃ〜Ｄ）。さらには、ＨＩＦ−１β発現は、アデノシン又は合成アデノシン受容体アンタゴニストによって影響されなかった。これらの結果は、アデノシンがＡ３受容体を介してＨＩＦ−１αタンパク質発現を増大させていることを示唆する。
【０４３６】
Ａ３アデノシン受容体は、低酸素状態におけるＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を誘導する。ＨＩＦ−１αタンパク質発現の修飾におけるＡ３受容体の関与を調べるために、本発明者らはＡ３７５細胞を選択的Ａ３受容体アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで処置した。本発明者らは、Ａ３７５細胞が１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで２−２４時間曝される経時変化実験を行った。Ａ３アデノシン受容体刺激は、正常酸素分圧下でＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を促進しなかったが、低酸素条件下でＨＩＦ−１αタンパク質発現は時間依存的に増大した（図１１）。特に、培地にＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡを添加後２時間から、ＨＩＦ−１αは増大し、最大ピークレベルは４時間後に観察された。低酸素状態下での長期間のＡ３受容体刺激は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルの修飾に小さな影響しかもたらさなかった。すでにアデノシンで観察されたように、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡはまた、正常分圧下でも低酸素状態下でもＨＩＦ−１β発現を修飾しなかった。
【０４３７】
Ａ３受容体刺激によるＨＩＦ−１α発現の誘導をより詳細に性状解析するために、Ａ３７５細胞は様々な濃度のＡ３受容体アゴニストで４時間処置された。予想されたとおり、正常酸素分圧下では、Ａ３受容体の活性化は、ＨＩＦ−１αの検出可能なレベルの誘導をしなかった。逆に、低酸素状態では、アデノシンにより産出される効果を再現するように（図１０）、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡは用量依存的にＨＩＦ−１αタンパク質の蓄積を誘導した（図１２Ａ）。ＨＩＦ−１αタンパク質の最大の発現は、１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡにより誘導され、ＥＤ５０値は、１０．６±１．２ｎＭだった（図１２Ｂ）。対照的に、Ａ３受容体刺激は、正常酸素分圧下でも、低酸素状態下でもＨＩＦ−１βタンパク質発現に影響をもたらさなかった。
【０４３８】
低酸素状態下でＨＩＦ−１αタンパク質発現を有意に増大させるＡ３受容体の能力を更に解析するために、本発明者らはＡ３選択的受容体アンタゴニスト（ＭＲＥ３００８Ｆ２０及びＭＲＥ３００５Ｆ２０）（Baraldi 2004）がこのような効果を阻害する能力を評価する一連の実験を行った。Ａ３７５細胞は増大する濃度のＭＲＥ３００８Ｆ２０及びＭＲＥ３００５Ｆ２０で３０分間、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０及び１００μＭ）の存在下又は非存在下で、処理された。ＭＲＥ３００８Ｆ２０及びＭＲＥ３００５Ｆ２０（１０及び１００μＭ）両方とも、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡのＨＩＦ−１αの修飾効果を抑制した。予想されたように、ＭＲＥ３００８Ｆ２０とＭＲＥ３００５Ｆ２０のいずれも、ＨＩＦ−１β発現に影響をもたらさなかった。図１３Ａ〜Ｂは、ＭＲＥ３００８Ｆ２０により得られた結果を示す。同様の結果は、アンタゴニストＭＲＥ３００５Ｆ２０によっても得られた（データは示されていない）。
【０４３９】
本発明者らは次に、最大近くの用量のＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡにより誘導されるＨＩＦ−１αタンパク質の増加に及ぼす、増大する濃度のＭＲＥ３００８Ｆ２０の影響を調べた。１０ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡにより誘導されたＨＩＦ−１αタンパク質の増加は、増大する濃度のＭＲＥ３００８Ｆ２０（０．３〜３０ｎＭ）により、ＩＣ５０値が０．９０±０．０８ｎＭで阻害された（図１３Ｃ−Ｄ）。
【０４４０】
最後に、アデノシンに応答してＨＩＦ−１αタンパク質が蓄積することにＡ３受容体が必要であることを、さらに証明するために、Ａ３７５細胞は、分解のためにＡ３受容体ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡＡ３）でのトランスフェクト又は偽のトランスフェクトされた。トランスフェクション効率を評価するために、Ａ３７５細胞はまた、蛍光標識された対照のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた。フローサイトメトリーによって、トランスフェクション効率は８５±５％であることが観察された（図７Ａ）。トランスフェクション後、細胞は完全培地でインキュベーションされ、Ａ３受容体ｍＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析及びＡ３受容体タンパク質のウェスタンブロッティング解析のために、２４，４８，７２時間で、全ＲＮＡが単離された。予想されたように、Ａ３受容体ｍＲＮＡレベルは、ｓｉＲＮＡＡ３をトランスフェクトされた細胞で有意に減少した（図１４Ｂ）。更に、Ａ３受容体タンパク質発現は、ｓｉＲＮＡＡ３処理細胞で大きく減少した（図１４Ｃ〜Ｄ）。偽のトランスフェクションと無関係なｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡのトランスフェクションのいずれも、Ａ３受容体ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を阻害しなかった。それゆえ、ｓｉＲＮＡＡ３トランスフェクションの７２時間後に、Ａ３７５細胞は増大する濃度のＡ３アデノシン受容体アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１〜１００ｎＭ）に低酸素状態下で４時間曝された。全タンパク質がウェスタンブロット解析のために回収された。対照として、Ａ３７５細胞は、ｓｉＲＮＡＡ３を含まないＲＮＡｉＦｅｃｔ(登録商標)トランスフェクション試薬に曝された。本発明者らは、Ａ３受容体発現の阻害が、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ誘導ＨＩＦ−１α蓄積を阻害するのに十分であることを見出した（図１４Ｅ）。
【０４４１】
ＨＩＦ−１α発現に及ぼすＡ３受容体刺激の効果が一般的な現象かどうかを決定するために、本発明者らは、Ａ３アデノシン受容体を発現している様々な細胞株においてＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡがＨＩＦ−１αレベルを誘導する能力を評価した。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ処置下で低酸素４時間後に、本発明者らは、ヒトケラチン生成細胞ＮＣＴＣ２５４４において、並びにヒト腫瘍のＵ８７ＭＧグリア芽腫及びＵ２ＯＳ骨肉腫の細胞において、ＨＩＦ−１αタンパク質発現を有意に増大させることを検出できた２ＯＳ骨肉腫細胞の両方において、ＨＩＦ−１αタンパク質発現の顕著な増加を検出した（図１５）。
【０４４２】
Ａ３受容体は、転写とは独立し、翻訳に依存した経路でＨＩＦ−１αの蓄積を仲介する。低酸素状態でのＡ３受容体刺激に応じたＨＩＦ−１α蓄積に含まれる経路を更に理解するために、本発明者らは、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡ蓄積に及ぼすＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡの効果を調べた。Ａ３７５細胞を低酸素状態下４時間処理後、ＲＮＡが抽出され、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析が実行された。メラノーマ細胞を１０ｎＭ、１００ｎＭ及び１μＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで活性化すると、対応する未処置細胞に対するＨＩＦ−１αｍＲＮＡ蓄積の増加は、それぞれ１．１３±０．１０、１．２５±０．１５及び１．１９±０．１３倍であった。このことは、Ａ３受容体刺激は、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡ転写を調節していないことを示唆している。この仮説を確認するために、Ａ３７５細胞は、デノボ（de novo）の遺伝子転写を阻害するために、１０μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ａｃｔ−Ｄ）で前処置された。その後、Ａ３７５細胞は、増大する濃度のＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１００ｎＭ）の存在下、低酸素状態で４時間、インキュベーションされた。本発明者らは、Ａ３受容体刺激がＡｃｔ−Ｄの存在下でも、ＨＩＦ−１αタンパク質発現を増加させることができることを見出した（図１６）。
【０４４３】
ＨＩＦ−１αは、正常酸素分圧下ではプロテアソーム経路を介して分解されることが示されてきた。ＨＩＦ−１αのプロリン５６４の酵素的水酸化は、ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕタンパク質との相互作用のためのタグをつけることにより、タンパク質の代謝回転を制御する（Ivan 2001; Jaakkola, 2001; Yu 2001; Maxwell 1999）。細胞が低酸素状態になると、プロリン残基は水酸化されず、ＨＩＦ−１αたんぱく質が蓄積する。プロリン５６４水酸化に及ぼす低酸素状態の効果は、コバルト、鉄キレーターのような遷移金属、及びプロリルヒドロキラーゼ酵素の阻害剤により、模倣されうる（Ivan et al., 200 l; Jaakkola et al., 2001）。
【０４４４】
本発明者らは、プロリルヒドロキラーゼ酵素の阻害剤、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）の存在下、ＨＩＦ−１αの蓄積を修飾するＡ３アデノシン受容体の能力を検討した。本発明者らは、Ａ３受容体刺激が、ＣｏＣｌ２処理細胞においても、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを増大できることを観察した（図１７Ａ）。Ａ３受容体がＨＩＦ−１α発現を翻訳依存的な経路で誘導するかどうかを判定するために、タンパク質翻訳阻害剤、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下、ＨＩＦ−１αタンパク質修飾を測定した。このために、Ａ３７５細胞は、酸素依存的なＨＩＦ−１αタンパク質分解を避けるように１００μＭのＣｏＣｌ２の存在下、正常酸素分圧下で４時間培養した後、Ａ３７５細胞は、ＣＨＸ（１μＭ）の存在下及び非存在下で１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで処理された。ＣＨＸに曝された細胞では、ＣＨＸ非存在下で観察されるように、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡは、６時間以内にＨＩＦ−１αを増大させることができなかった（図１７Ｂ）。纏めると、これらの結果は、Ａ３受容体の活性化が、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを翻訳依存的な経路で増大することを示唆している。
【０４４５】
低酸素状態のＡ３７５培養を正常酸素分圧に戻した後、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルは急激に減少し、１５分後には消失した（図１８Ａ）。それゆえ、ＨＩＦ−１αの分解に及ぼすＡ３受容体活性化の影響を検討するために、Ａ３７５細胞は、１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡの存在下及び非存在下で、低酸素状態下でインキュベーションされた。４時間後、メラノーマ細胞は、正常酸素分圧に曝され、ＨＩＦ−１α消失の経時変化を確認した。低酸素条件の除去後１５分以内に、ＨＩＦ−１αタンパク質の減少が、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ の存在下非存在下において、変わらない消失速度を有することが観察された（図１８Ｂ）。これらの結果は、正常酸素条件下では、Ａ３受容体活性化がＨＩＦ−１α分解を防ぐことはできないことを示している。
【０４４６】
主な細胞内シグナル伝達経路は、低酸素状態でのＨＩＦ−１αの蓄積時にＡ３受容体によって持続される。ＭＡＰＫがＨＩＦ−１α活性化に関与していることが証明されてきた。ＭＡＲＫ経路が、Ａ３受容体活性化により誘導されるＨＩＦ−１αタンパク質の増加に必要とされるかどうかを決定するために、Ａ３７５細胞は、ｐ４４／ｐ４２のリン酸化の上流の調節因子である（Favata 1998）ＭＥＫ１／２の有力な阻害剤であるＵ０１２６、又はｐ３８ＭＡＰＫの阻害剤であるＳＢ２０２１９０（Kramer 1996）で前処理された。その後、細胞は、１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡに低酸素状態下で４時間曝され、全細胞タンパク質抽出液が、ＨＩＦ−１α及びチューブリンタンパク質レベルのイムノブロットアッセイのために調製された。図１９Ａに示されるように、ＭＥＫ阻害剤であるＵ０１２６（１０及び３０μＭ）及びｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０２１９０（１及び１０μＭ）の両方は、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡが誘導するＨＩＦ−１αタンパク質発現の増大を阻害することができた。これらの結果は、ｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫ活性がＡ３受容体活性化により誘導されるＨＩＦ−１α発現の上昇に必要であることを示唆している。
【０４４７】
さらに、ｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫ が、Ａ３受容体活性化によって始まるシグナル伝達経路に含まれることを確認するために、本発明者らはまた、Ａ３受容体アゴニスト処理に応じた内因性のｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫの活性化レベルを調べた。Ａ３７５細胞は、増大する濃度のＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１〜１０００ｎＭ）で低酸素状態下で４時間インキュベーションされ、全細胞タンパク質抽出液が、ホスホ−ｐ４４、ホスホ−ｐ４２及びホスホ−ｐ３８のレベルを決定するために用いられた。
【０４４８】
図１９Ｂに示されるように、ｐ４４及びｐ４２のリン酸化は、ナノモル濃度のＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡに応答して誘導され、ｐ４４／ｐ４２キナーゼリン酸化状態の誘導は、１００ｎＭのＡ３受容体アゴニストの処理で最大であった（図１９Ｃ）。さらに、本発明者らは、ウェスタンブロット上のリン酸化体の検出によりＡ３受容体刺激によるｐ３８ＭＡＰＫの活性化レベルを観察した。図１９Ｄにみられるように、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化における大きな増加は、低酸素状態によるＡ３受容体刺激の４時間後に観察された。特に、Ａ３７５細胞の様々な濃度のＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡに対する曝露は、用量依存的にｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を増加した（図１９Ｅ）。ホスホ−ｐ４４、ホスホ−ｐ４２、ホスホ−ｐ３８のブロットは剥がされ、全ｐ４４、ｐ４２、及びｐ３８ＭＡＰＫを等しく認識する抗体で再ブロットされた。本発明者らは、ｐ４４、ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化レベルにおける観察された変化は、全タンパク質の発現レベルに有意な変化を伴わなかったことを見出した（図１９Ｂ〜Ｄ）。
【０４４９】
議論：  本発明者らの知る限りにおいて、本明細書が酸素感受性細胞における低酸素状態時の細胞応答の修飾に果たすアデノシンの役割を記載する最初の報告である。
【０４５０】
低酸素状態は、癌の増殖における最初の出来事の１つであり；この工程は、一方で細胞外アデノシンの蓄積を助け、もう一方で、ＨＩＦ−１αのような、低酸素誘導因子を安定化する状況を作る（Winn, 1981; Decking 1997; Ledoux 2003）。
【０４５１】
本検討の結果は、アデノシン受容体介在のシグナル伝達の本来の経路に基づいて、低酸素状態が癌成長に貢献する新しい経路を示す。はじめて、本発明者らはここで、アデノシンがＡ３７５ヒトメラノーマ細胞において用量及び時間依存的に、低酸素状態に応答してＨＩＦ−１αタンパク質発現を増大でき、ここでＨＩＦ−１βタンパク質レベルは影響されないことを証明する。
【０４５２】
本発明者らは以前に、４つのアデノシン受容体全てがヒトメラノーマＡ３７５細胞で発現していることを証明した（Merighi, 2001）。ここで本発明者らは、この細胞株においてＨＩＦ−１α調節に及ぼすアデノシンの観察された影響を、Ａ３受容体サブタイプが仲介することを報告する。
【０４５３】
ＨＩＦ−１αタンパク質蓄積に及ぼすアデノシンの効果は、Ａ１、Ａ２Ａ又はＡ２Ｂ受容体によっては仲介されない。この結論を支持するように、Ａ１、Ａ２Ａ及びＡ２Ｂ受容体にそれぞれ高度に選択的なアデノシン受容体アンタゴニストである、ＤＰＣＰＸ、ＳＣＨ５８２６１及びＭＲＥ２０２９Ｆ２０が、ＨＩＦ−１αタンパク質増加に及ぼすアデノシンの刺激効果を阻害しなかった。
【０４５４】
ＨＩＦ−１α蓄積に及ぼすアデノシンの効果が、Ａ３受容体によって仲介されるという結論は、ＨＩＦ−１αタンパク質に及ぼすこのヌクレオシドの効果が、Ａ３受容体アゴニストであるＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡによって模倣され、Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＥ３００８Ｆ２０及びＭＲＥ３００５Ｆ２０によって阻害される、という観察によって支持される。特に、これらの薬剤の能力が、アデノシンＡ３受容体への結合実験で観測された、阻害的な平衡定数（Ｋｉ）と一致している（Merighi 2001）。
【０４５５】
更に、ｍＲＮＡとタンパク質レベルでのＡ３受容体発現の阻害は、Ａ３受容体誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質蓄積を阻害するのに十分である。それゆえ、本発明者らの結果は、細胞表面Ａ３アデノシン受容体が、細胞外低酸素シグナルを細胞内へ伝達することを示している。Ａ３受容体は、メラノーマ細胞に存在し、これらの発現は低酸素の損傷とＨＩＦ−１α蓄積との間の橋渡しするように思われ、酸素感受性受容体のように、細胞の低酸素への応答を制御している。腫瘍細胞の低酸素への応答能力に、Ａ３受容体がどの程度影響を及ぼすかは、更なる研究が必要であろう。
【０４５６】
異なる細胞（ケラチン生成細胞、メラノーマ、骨肉腫、グリア芽腫）において得られた同様の結果は、低酸素状態におけるＨＩＦ−１αタンパク質発現に対するＡ３受容体の刺激効果が、正常細胞と癌細胞の区別をできなくし、それにより、全てではないが、多くの細胞型で共用される一般的なシグナル伝達経路でありうることを示している、という関心事を高めた。
【０４５７】
Ａ３アデノシン受容体刺激は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ実験で観察されたように、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡ蓄積に影響を与えなかった。従って、Ａｃｔ−Ｄ実験は、Ａ３受容体が転写依存的機構を通じて、ＨＩＦ−１αタンパク質発現を制御しているのではないことを示している。転写レベルでのＨＩＦ−１αへのアデノシン効果の欠如は、ＨＩＦ−１αの低酸素制御が主としてＨＩＦ−１αタンパク質の安定化により決定されるという事実の見地からも、驚くことではない（Huang, 1998）。加えて、本発明者らは、Ａ３アデノシン受容体が翻訳依存性経路を通じて、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを調節するが、他方、ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解に影響を与えない、という証拠が得られた。本発明者らのデータは、Ａ３アデノシン受容体が、ＨＩＦ−１αタンパク質の半減期を増加させない一方で、様々な成長因子の効果と同様に、ＨＩＦ−１αタンパク質合成速度を増加させるかもしれないことを示している（Zhong 2000；Fukuda, 2002）。しかしながら、本発明者らは、Ａ３アデノシン受容体が、ＨＩＦ−１α分解を阻害するタンパク質の翻訳を制御しているという可能性を排除することはできない。
【０４５８】
リン酸化及び脱リン酸化活性は、ＨＩＦ−１活性化を導くシグナル伝達経路において、重要であることを示唆している。いくつかの報告は、低酸素状態がＨＩＦ−１αの核への局在と転写活性の両方を増加させる、ｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫによるＨＩＦ−１αのリン酸化を、誘導することを示している（Semenza 2001 ICurrOpCB; Richard 1999BBRC；Berra 2000；Richard 1999JBC；Conrad 1999；Sodhi 2000；Mottet D, 2003；Semenza 2002）。加えて、アデノシンは、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞で、ＭＡＰＫを直接促進する（Merighi et al., 2002）が、ヒトＡ３受容体で安定に形質転換された非ヒト細胞株でも、促進される（Hammarberg 2004；Schulte 2000-2002-2003）ことが示されている。本検討において、本発明者らは、ｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫがＨＩＦ−１αレベルを増加させるのに必要だが、またこれらのキナーゼは、Ａ３受容体関与により生成される分子シグナル伝達経路に含まれることを観察した。結論として、本検討は、アデノシンがＡ３受容体を介して、ｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫ経路を通じたＨＩＦ−１αレベルを増加できることを示している。実際、低酸素状態におけるＨＩＦ−１αの減少した代謝回転、増加した寿命、及び伝達におけるｐ４４／ｐ４２及びｐ３８ＭＡＰＫの役割を評価するためには、更なる検討が必要である。
【０４５９】
ＨＩＦ−１αは、低酸素状態の結果として腫瘍内に過剰発現し、血管新生、浸潤、及び変化したエネルギー代謝のような腫瘍生物学の鍵となる局面に関わる（Ratcliffe 2000）。ＨＩＦ−１活性の阻害は、特に、腫瘍内の低酸素状態をさらに増大させ、このようなＨＩＦ阻害剤の使用のためのより大きな治療ウィンドウを提供するであろう血管形成阻害剤との組合せで、がん治療への新規な治療アプローチを示すと認識されている。最近の検討は、ＨＩＦ−１α及び特にがん細胞の生存に重要なＨＩＦにより調節される遺伝子の薬学的阻害は、ＨＩＦ遺伝子の不活性化の治療的アプローチ（Mabjeesh et al., 2003）よりも利点があることを示している。多くの正常な組織は、ＨＩＦを活性化するのに十分なｐＯ２値で機能する、そしてシステムは正常な生理的条件下で重要な機能を有している（Hopfl, 2004）。これは臨床使用のための薬学的阻害剤の開発において、考慮されることが必要であろう。
【０４６０】
アデノシンによって誘導されるＨＩＦ−１αタンパク質発現の蓄積を阻害する能力がＡ３アデノシン受容体アンタゴニストにあるとすれば、本発明者らのデータは、Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストが癌治療に有用であることを意味している。特に、本発明者らは、インビボシステムにおいて、固形腫瘍の細胞外液が、アデノシン受容体機能に役割を果たす内因性アゴニストである、増大したレベルのアデノシンを含むことに注目する。それゆえ、癌治療にA３受容体アンタゴニストを用いて、高濃度のアデノシンがＨＩＦ−１αの蓄積を増加している、腫瘍の低酸素細胞においてのみ、生物学的効果が見られるような、組織選択性を達成することが可能であろう。
【０４６１】
更なる検討が、Ａ３受容体アンタゴニストが低酸素状態の固形腫瘍の生存を阻害できるかどうかを決定することを保証する。
【図面の簡単な説明】
【０４６２】
（８．図面の簡単な説明）
【図１】図１Ａ〜Ｈは、ヒト癌におけるＡ３アデノシン受容体への［３Ｈ］−ＭＲＥ３００８-Ｆ２０の飽和を示す。ＫＤ及びＢｍａｘ値は、表８に報告されている。値は、別に実施した３回の実験の、平均値及び平均値の標準誤差である。同じデータのスキャッチャードプロットを差し込みで示した。
【図２】図２は、Ａ３７５細胞のコロニー形成アッセイを示す。細胞を異なる薬剤で処理して、コロニーを７日後に計数した。値は、４回の独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）；Ｔ＝パクリタキセル（０．７５ｎｇ／ｍｌ）；Ｍ＝ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）；Ｃ＝ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０μＭ）；ＴＭ＝パクリタキセルとＭＲＥ３００８Ｆ２０；ＴＣ＝パクリタキセルとＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、で細胞を処理した。ＴＭ対Ｔで、＊Ｐ＜０．０１であり、分析は、ダネット検定（Dunnett's test）に従い、ＡＮＯＶＡによる。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、濃度を増大させている細胞毒性薬ビンデシン（図３Ａ、図３Ｂ）及びＴａｘｏｌ（登録商標）パクリタキセル（図３Ｃ、図３Ｄ）に曝した、Ａ３７５細胞の一般の用量応答曲線を示す。△の曲線は、細胞毒性薬単独の場合を示す。▲の曲線は、１０μＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０存在下での細胞毒性薬の場合を示す。図３Ａと図３Ｃは、未処理細胞（対照）の割合として算出した、Ｇ２／Ｍ期停止を示す。図３Ｂと図３Ｄは、ｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシス）集団の蓄積（総生存細胞の割合）を示す。細胞を７０％エタノール中に固定して、ＰＩで染色して、フロー・サイトメトリーにより分析した。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、濃度を増大させている細胞毒性薬ビンデシン（図３Ａ、図３Ｂ）及びＴａｘｏｌ（登録商標）パクリタキセル（図３Ｃ、図３Ｄ）に曝した、Ａ３７５細胞の一般の用量応答曲線を示す。△の曲線は、細胞毒性薬単独の場合を示す。▲の曲線は、１０μＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０存在下での細胞毒性薬の場合を示す。図３Ａと図３Ｃは、未処理細胞（対照）の割合として算出した、Ｇ２／Ｍ期停止を示す。図３Ｂと図３Ｄは、ｓｕｂ−Ｇ１（アポトーシス）集団の蓄積（総生存細胞の割合）を示す。細胞を７０％エタノール中に固定して、ＰＩで染色して、フロー・サイトメトリーにより分析した。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、パクリタキセル又はビンデシンで処理したＡ３７５細胞の指数関数的増殖における、ＭＲＥ３００８Ｆ２０によるＧ２／Ｍ期停止の誘導を示す。Ａ３７５細胞を、２４時間、対照として薬剤−賦形剤（図４Ａ、図４Ｄ）；１ｎＭビンデシン（図４Ｂ）；２５ｎｇ／ｍｌパクリタキセルで（図４Ｅ）；１ｎＭビンデシンと１０μＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０（図４Ｃ）；２５ｎｇ／ｍｌパクリタキセルと１０μＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０（図４Ｆ）で処理した。細胞を７０％エタノール中に固定して、ＰＩで染色して、フロー・サイトメトリーにより分析した。Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期の細胞の割合を定量化した。アポトーシス細胞（Ａｐｏ）もまた検出した。
【図５】図５Ａは、１ｎＭビンデシン存在下、濃度を増大させているＡ３アデノシン受容体アンタゴニストに曝した、Ａ３７５細胞のＧ２／Ｍ期停止に対する用量応答曲線を示す。細胞を７０％エタノール中に固定して、ＰＩで染色して、フロー・サイトメトリーにより分析した。  図５Ｂは、Ａ３７５細胞におけるアデノシン受容体アンタゴニストによるビンデシンに対する増強した活性（ＳＥＣ５０値）と、Ａ３アデノシン受容体に対する結合係数（Ｋｉ値）の間の比較を示す（ｒ＝０．９６；Ｐ＜０．０１）。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、Ａ３７５細胞及びＨｅＬ０２３細胞による、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）蓄積に関するフロー・クロマトグラムを示す。図６Ａは、Ａ３７５細胞による蓄積を示す。図６Ｂは、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）存在下の、Ａ３７５細胞による蓄積を示す。図６Ｃは、ＨｅＬ０２３細胞による蓄積を示す。図６Ｄは、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）存在下の、ＨｅＬ０２３細胞による蓄積を示す。全ての場合、ＦＭＡＸ値はＲｈ１２３の最大保持を示す（灰色部分）。ＦＲＥＳ値は、３時間、Ｐ−ｇｐ介在型薬剤流出を許容した後の、残留Ｒｈ１２３蛍光発光を示す（黒い影部分）。Ｒｈ１２３非染色細胞クロマトグラムを、白抜き部分に示す。
【図７】図７Ａは、パクリタキセル(黒い棒グラフ)及びビンダシン（白い棒グラフ）に誘導された、Ｇ２／Ｍ期停止における、ＭＥＫ−(ＰＤ９８０５９)、ＥＲＫ１/２−(Ｕ０１２６)とｐ３８ＭＡＰＫ−(ＳＢ２０３５８０)−シグナル伝達の阻害剤効果を示す。残留Ｇ２／Ｍ期捕捉を、対照細胞の割合として報告する(細胞は、ＴＵ、ＴＳ、ＴＰについては、パクリタキセルとＭＲＥ３００８Ｆ２０で、又はＶＵ、ＶＳ、ＶＰについては、ビンデシンとＭＲＥ３００８Ｆ２０で処理した)。  図７Ｂは、パクリタキセルに誘導された、アポトーシスにおける、ＭＥＫ−(ＰＤ９８０５９)、ＥＲＫ１/２−(Ｕ０１２６)とｐ３８ＭＡＰＫ−(ＳＢ２０３５８０)−シグナル伝達の阻害剤効果を示す。Ｔ＝パクリタキセル（２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｖ＝ビンダシン（１μＭ）、Ｕ＝Ｕ０１２６（３０μＭ）、Ｐ＝ＰＤ９８０５９（２０μＭ）、Ｓ＝ＳＢ２０３５８０（１μＭ）、Ｍ＝ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）、Ｃ＝代謝阻害賦形剤（ＤＭＳＯ）で処理した細胞(対照)。各棒グラフは、Ａ３７５細胞において実施した独立した４回の実験の平均±ＳＥを示す。＊ＴＵ対内部制御（パクリタキセルとＭＲＥ３００８Ｆ２０）及び＃ＶＵ対内部制御（ビンデシンとＭＲＥ３００８Ｆ２０）については、Ｐ＜０．０１であり、２レーン対１レーン、４レーン対３レーン、６レーン対５レーン及び８レーン対７レーンの§は、Ｐ＜０．０５である。分析は、ダネット検定に従い、ＡＮＯＶＡによる。
【図８】図８は、正常酸素分圧又は低酸素状態で２４時間インキュベーションされたＡ３７５細胞のアポトーシス及び細胞周期解析、ヨウ化プロピジウムを用いたＤＮＡ染色による細胞周期の代表的なフローサイトメトリー解析で、正常分圧及び低酸素状態時のアポトーシス状態及びＧ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ位相にあるＡ３７５細胞のパターンを示す（Ａ）。サブ−ｄｉｐｏｉｄＤＮＡを中身にもつアポトーシス細胞（Ａｐｏ）が報告され、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ位相にある細胞のサブ２倍体の定量的解析が図の中に与えられている（Ｂ）。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、低酸素状態と比較して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図９】図９は、低酸素状態によるＨＩＦ−１発現の誘導を示す。Ａ３７５細胞は、正常酸素分圧で４時間（正常酸素分圧レーン）又は低酸素状態条件で２、３、４、８、１６及び２４時間（レーン２〜７）インキュベーションされた。全細胞蛋白抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す。
【図１０】図１０は、ＨＩＦ−１α発現のアデノシンによる誘導を示し（Ａ）、Ａ３７５細胞は、正常酸素分圧で４時間（正常酸素分圧レーン）インキュベーションされた。Ａ３７５細胞は低酸素状態下で、アデノシン無し（レーン１）又は１０ｎＭ（レーン２）、１００ｎＭ（レーン３）、１μＭ（レーン４）、１０μＭ（レーン５）、１００μＭ（レーン６）のアデノシンで４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示し、低酸素状態におけるアデノシンに曝されたＡ３７５細胞の典型的な濃度応答曲線が示されている（Ｂ）。ＨＩＦ−１αイムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。１２回の独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、アデノシン非存在下での細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝１２）であり、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ及びＡ３アデノシン受容体アンタゴニストの効果を示す（Ｃ）。Ａ３７５細胞は、低酸素状態下で、アデノシン無し（レーン１、対照）又はアデノシン１００μＭ（レーン２〜６）であり、そして１００ｎＭのＡ１受容体アンタゴニストＤＰＣＰＸ（レーン３）、１００ｎＭのＡ２Ａ受容体アンタゴニストＳＣＨ５８２６１（レーン４）、１００ｎＭのＡ２Ｂ受容体アンタゴニストMＲＥ２０２９Ｆ２０（レーン５）又は１００ｎＭのＡ３受容体アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０（レーン６）で４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す（Ｄ）、イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。５回の独立した実験（その１つはパネルＣに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、アデノシン非存在下での細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝５）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図１１】図１１は、Ａ３受容体刺激によるＨＩＦ−１発現の誘導の時間経過を示し（Ａ）、Ａ３７５細胞は、正常酸素分圧（レーン正常酸素分圧）で４時間、又は低酸素条件下でＡ３受容体アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１００ｎＭ）の存在下（＋）又は非存在下（−）で、２、４、８、１６及び２４時間インキュベーションされた。全細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示し（Ｂ）、イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。３回の独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、低酸素状態で４時間ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下での細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図１２】図１２は、Ａ３受容体刺激によるＨＩＦ−１発現の誘導の用量応答であり（Ａ）、Ａ３７５細胞は、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡなし（レーン１）、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ０．１ｎＭ（レーン２）、１ｎＭ（レーン３）、１０ｎＭ（レーン４）、１００ｎＭ（レーン５）及び１μＭ（レーン６）と共に、正常分圧下及び低酸素状態下で４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた（Ｂ）、低酸素条件下でアデノシンに曝されたＡ３７５細胞の典型的な濃度応答曲線が示されている。イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。１２回の独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、低酸素ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下での細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝１２）である。
【図１３】図１３は、Ａ３受容体アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０の効果であり（Ａ）、Ａ３７５細胞は、低酸素状態下で、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ無し（−）又はＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１０ｎＭあり（＋）で、１０ｎＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０（レーン３、４）、及び１００ｎＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０（レーン５、６）で４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた（Ｂ）、イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下での低酸素状態下細胞（対照、レーン１）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である（Ｃ）。Ａ３７５細胞は低酸素状態下で、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ無し（レーン１）又は１０ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（レーン２〜６）及び０．３ｎＭのＭＲＥ３００８Ｆ２０（レーン３）、１ｎＭ（レーン４）、３ｎＭ（レーン５）及び１０ｎＭ（レーン６）で４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられ、低酸素状態下、ＭＲＥ３００８Ｆ２０に曝されたＡ３７５細胞の典型的な濃度応答曲線が示されている（Ｄ）。イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。３回の独立した実験（その１つはパネルＣに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下での細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）である。
【図１４】図１４は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションによるＡ３受容体発現の抑制で、Ａ３７５細胞におけるｓｉＲＮＡトランスフェクション効果の解析を示し（Ａ）、ｓｉＲＮＡ−ＦＩＴＣでトランスフェクトされたＡ３７５細胞におけるｓｉＲＮＡ−ＦＩＴＣ蓄積の代表的なフロークロマトグラム。埋められていない領域は、ｓｉＲＮＡＡ３無しでＲＮＡｉＦｅｃｔ(登録商標)トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされたＡ３７５細胞を示している。トランスフェクト５時間後に、フローサイトメトリーにより蛍光が定量化された（Ｂ）、リアルタイムＰＣＲによる、βアクチンｍＲＮＡに対するＡ３受容体ｍＲＮＡの相対的定量。Ａ３７５細胞は、ＲＮＡｉＦｅｃｔ(登録商標)トランスフェクト試薬又はｓｉＲＮＡＡ３によりトランスフェクトされ、２４、４８及び７２時間正常酸素分圧でインキュベーションされた。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である（Ｃ）。ＲＮＡｉＦｅｃｔ(登録商標)トランスフェクト試薬（対照）又はｓｉＲＮＡＡ３により処理され、正常分圧下で２４、４８及び７２時間インキュベーションされたＡ３７５細胞からのタンパク質抽出液の、抗Ａ３受容体ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す（Ｄ）。Ａ３受容体ウェスタンブロットのデンシトメトリー定量化のプロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝５）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である（Ｅ）。対照ｓｉ−ＲＮＡ（−）又はｓｉＲＮＡＡ３（＋）で７２時間処理され、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１００ｎＭのあり（＋）なし（−）で低酸素状態下４時間インキュベーションされたＡ３７５細胞から得られたタンパク質抽出液の抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析で、チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す。
【図１５】図１５は、Ａ３受容体刺激は、低酸素状態下の様々なヒト細胞株でのＨＩＦ−１α蓄積の誘導を示す。ＮＣＴＣ２５４４ケラチン生成細胞、Ｕ８７ＭＧグリア芽腫、Ｕ２ＯＳ骨肉腫ヒト細胞は、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１００ｎＭのあり（＋）なし（−）で低酸素状態下４時間処理された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた。
【図１６】図１６は、転写とは独立した経路でのＨＩＦ−１αの蓄積を誘導するＡ３受容体刺激を示し（Ａ）、Ａ３７５細胞はアクチノマイシンＤ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分間前処理された後、低酸素状態に曝された。ＨＩＦ−１α蓄積は、アクチノマイシンＤの非存在下（レーン２）又は存在下（レーン４）で、Ａ３７５細胞を１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡに低酸素状態下で４時間曝露することにより誘導された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示し（Ｂ）、イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下で低酸素状態４時間後の細胞（対照＝レーン１）から得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図１７】図１７は、正常酸素分圧下でのＡ３受容体刺激によるＨＩＦ−１α蓄積の誘導を示し（Ａ）、Ａ３７５細胞は、単独（レーン１）又はＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１ｎＭ（レーン２）、１０ｎＭ（レーン３）、１００ｎＭ（レーン４）、１μＭ（レーン５）及び１０μＭ（レーン６）の存在下、正常酸素分圧の下で１００μＭのＣｏＣｌ２に４時間曝された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。その後、ブロットは剥がされ、抗ＨＩＦ−１βモノクローナル抗体を用いてＨＩＦ−１β発現を決定するために用いられた（Ｂ）。Ａ３７５細胞は、１００μＭのＣｏＣｌ２に正常酸素分圧の下、４時間曝された。ＨＩＦ−１αの蓄積は、Ａ３７５細胞を、シクロヘキシミド（１μM）の非存在下（レーン１及び２）、存在下（レーン３−６）で、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１００ｎＭ（＋）に４時間（レーン１及び４）、又は６時間（レーン５及び６）曝露することで、誘導された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す。
【図１８】図１８は、Ａ３受容体の活性化が正常酸素分圧下でのＨＩＦ−１α分解に影響を与えないことを示し（Ａ）、Ａ３７５細胞は、低酸素状態で、１００ｎＭのＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡの非存在下（レーン１〜４）又は存在下（レーン５〜８）でインキュベーションされた。４時間後、メラノーマ細胞は、正常酸素分圧に曝され、ＨＩＦ−１αの消失の経時変化が０、５、１０及び１５分で行われた。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す（Ｂ）、イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。３回の独立した実験（その１つはパネルＡに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、０時間における細胞（対照）から得られた結果に対して標準化された。残存するＨＩＦ−１αの割合が示されている。
【図１９】図１９は、Ａ３シグナル伝達におけるｐ３８、ｐ４４及びｐ４２ＭＡＰＫｓの役割を示し（Ａ）、Ａ３７５細胞は、ＳＢ２０２１９０（１及び１０μＭ）又はＵ０１２６（１０及び３０μＭ）の存在下又は非存在下で前処理された後、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ１００ｎＭ（＋）又は薬剤調製液（−）に低酸素状態下で４時間曝露された。細胞抽出液が調製され、抗ＨＩＦ−１αモノクローナル抗体を用いてイムノブロット解析された。チューブリンは、均等に装填されているタンパク質を示す（Ｂ）。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡを介したＡ３刺激は、Ａ３７５細胞において低酸素状態４時間後に、ｐ４４／ｐ４２活性化を誘導する。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ０（レーンＣ）、１０ｎＭ（レーン１）、１００ｎＭ（レーン２）、５００ｎＭ（レーン３）及び１０００ｎＭ（レーン４）がＡ３７５細胞に加えられた。４時間後、細胞が回収され、リン酸化された（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）又は全ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫｓに特異的な抗体を用いてイムノブロット解析された（Ｃ）。イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。ｐ４４及びｐ４２リン酸化アイソフォームのデンシトメトリー解析は報告されている。３回の独立した実験（その１つはパネルＢに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下における細胞（レーンＣ）か得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照（レーンＣ）と比較して、＊Ｐ＜０．０１である（Ｄ）。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡを介したＡ３刺激は、Ａ３７５細胞において低酸素状態４時間後にｐ３８活性化を誘導する。ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ０（レーンＣ）、１０ｎＭ（レーン１）、１００ｎＭ（レーン２）、５００ｎＭ（レーン３）及び１０００ｎＭ（レーン４）がＡ３７５細胞に加えられた。４時間後、細胞が回収され、リン酸化された（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）又は全ｐ３８ＭＡＰＫｓに特異的な抗体を用いてイムノブロット解析された（Ｅ）。イムノブロットシグナルは、モレキュラーアナリスト／ＰＣデンシトメトリーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）により定量化された。ｐ３８のリン酸化アイソフォームのデンシトメトリー解析は報告されている。３回の独立した実験（その１つはパネルＤに示されている）から得られた平均的なデンシトメトリーデータは、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ非存在下における細胞（レーンＣ）か得られた結果に対して標準化された。プロットは、平均値±標準誤差値（ｎ＝３）であり、対照と比較して、＊Ｐ＜０．０１である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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