(57)【要約】  １態様において本発明は、ミクロＲＮＡ分子を増幅してＤＮＡ分子を製造する方法を提供する。その各方法には、（ａ）プライマー伸長を用いて、標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子を作る段階；および（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＤＮＡ分子を増幅することで増幅ＤＮＡ分子を製造する段階がある。その方法の一部の実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む。
2008528003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロＲＮＡ分子を増幅してＤＮＡ分子を製造する方法であり、
（ａ）プライマー伸長を用いて、標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的である第１のＤＮＡ分子を製造する段階；ならびに
（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて前記第１のＤＮＡ分子を増幅して、増幅ＤＮＡ分子を製造する段階
を有する方法。
【請求項２】
ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック（ｌｏｃｋｅｄ）核酸分子を含む請求項１の方法。
【請求項３】
プライマー伸長が、１０ないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する伸長プライマーを用いる請求項１の方法。
【請求項４】
プライマー伸長が、２０ないし３５ヌクレオチドの範囲の長さを有する伸長プライマーを用いる請求項１の方法。
【請求項５】
伸長プライマーが、ミクロＲＮＡ分子の一部にハイブリダイズする第１の部分を有する請求項１の方法。
【請求項６】
第１の部分が３ないし２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項５の方法。
【請求項７】
伸長プライマーが第２の部分を有する請求項５の方法。
【請求項８】
第２の部分が１８ないし２５ヌクレオチドの長さを有する請求項７の方法。
【請求項９】
第２の部分が、配列番号１の核酸配列を含む核酸配列を有する請求項７の方法。
【請求項１０】
ユニバーサルフォワードプライマーが、１６ヌクレオチドないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項１の方法。
【請求項１１】
ユニバーサルフォワードプライマーが、配列番号１３に示した核酸配列からなる請求項１の方法。
【請求項１２】
ユニバーサルフォワードプライマーが、伸長プライマーの第２の部分の相補体にハイブリダイズする請求項７の方法。
【請求項１３】
ユニバーサルフォワードプライマーが少なくとも１個のロック核酸分子を有する請求項２の方法。
【請求項１４】
ユニバーサルフォワードプライマーが、１ないし２５個のロック核酸分子を含む請求項１３の方法。
【請求項１５】
リバースプライマーが、１０ヌクレオチドないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項１の方法。
【請求項１６】
リバースプライマーが少なくとも１個のロック核酸分子を含む請求項２の方法。
【請求項１７】
リバースプライマーが１ないし２５個のロック核酸分子を含む請求項１６の方法。
【請求項１８】
リバースプライマーが、所定のハイブリダイゼーション条件下で特定のミクロＲＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズするよう選択される請求項１の方法。
【請求項１９】
増幅ＤＮＡ分子の量を測定する段階をさらに有する請求項１の方法。
【請求項２０】
複数の連続するＰＣＲ反応によって増幅を行う請求項１の方法。
【請求項２１】
生体からのサンプル中の標的ミクロＲＮＡの量を測定する方法であり、生体内の多数の異なる細胞種中の標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する段階を含み、前記標的ミクロＲＮＡ分子の量を、
（１）プライマー伸長を用いて、サンプル中の標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的である第１のＤＮＡ分子を製造する段階；
（２）ユニバーサルフォワードおよびリバースプライマーを用いて、前記第１のＤＮＡ分子を増幅して増幅ＤＮＡ分子を製造する段階；および
（３）増幅ＤＮＡ分子の量を測定する段階
を有する方法によって測定する方法。
【請求項２２】
ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む請求項２１の方法。
【請求項２３】
増幅ＤＮＡ分子の量を、蛍光に基づく定量ＰＣＲを用いて測定する請求項２１の方法。
【請求項２４】
増幅ＤＮＡ分子の量を、ＳＹＢＲグリーン色素を用いて測定する請求項２１の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットであり、標的ミクロＲＮＡの検出に特異的な少なくとも一つのプライマーセットを含み、前記プライマーセットが、
（１）標的ミクロＲＮＡにハイブリダイズする第１の部分およびユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー用のハイブリダイゼーション配列を有する第２の部分を含む、標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を製造するための伸長プライマー；
（２）前記伸長プライマー上のハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズするよう選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー；および
（３）前記ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするよう選択された配列を含む、前記ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマー
を含むキット。
【請求項２６】
ユニバーサルフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
伸長プライマーが１０ないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
伸長プライマーの第１の部分が、３ないし２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
伸長プライマーの第２の部分が、１８ないし２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
伸長プライマーの第２の部分が、配列番号１の核酸配列を含む核酸配列を有する請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーが１６ないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
ユニバーサルフォワードプライマーが、配列番号１３に示した核酸配列からなる請求項２５に記載のキット。
【請求項３３】
リバースＰＣＲプライマーが、１０ないし１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する請求項２５に記載のキット。
【請求項３４】
リバースＰＣＲプライマーが１ないし２５個のロック核酸分子を含む請求項２５に記載のキット。
【請求項３５】
少なくとも一つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡがヒトミクロＲＮＡである請求項２５に記載のキット。
【請求項３６】
少なくとも一つの標的ミクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０２ａ＊、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０２ｂ＊、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３＊、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４５０、ｍｉＲ−４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ、ｌｅｔ７ｉ、ｍｉＲ−３７６ａおよびｍｉＲ−３７７からなる群から選択される請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
少なくとも一つの標的ミクロＲＮＡが、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇおよびｌｅｔ７ｉからなる群から選択される請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
少なくとも一つの標的ミクロＲＮＡがマウスミクロＲＮＡである請求項２５に記載のキット。
【請求項３９】
配列番号２から配列番号４９９よりなる群から選択される少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む少なくとも一つの哺乳動物ミクロＲＮＡを検出するためのキット。
【請求項４０】
配列番号４７、４８、４９、５０、５５、５６、８１、８２、８３、８４、９１、９２、１０３、１０４、１２３、１２４、１４５、１４６、１９３、１９４、１９７、１９８、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３９、２４０、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２７７、２７８、２８５、２８６、２８７、２８８、２９３、２９４、３０１、３０２、３０９、３１０、３１１、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３５９、３６０、３６９、３７０、３８９、３９０、３９３、３９４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１５、４１６、４１９、４２０、４２１、４２２、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４６１および４６２からなる群から選択される少なくとも１以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
配列番号２から配列番号４９９よりなる群から選択されるヒトミクロＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４２】
プライマーが、配列番号４７、４８、４９、５０、５５、５６、８１、８２、８３、８４、９１、９２、１０３、１０４、１２３、１２４、１４５、１４６、１９３、１９４、１９７、１９８、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３９、２４０、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２７７、２７８、２８５、２８６、２８７、２８８、２９３、２９４、３０１、３０２、３０９、３１０、３１１、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３５９、３６０、３６９、３７０、３８９、３９０、３９３、３９４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１５、４１６、４１９、４２０、４２１、４２２、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４６１および４６２からなる群から選択される請求項４１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小ＲＮＡ分子の増幅および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を阻害する機能を有する進化的に保存されるプロセスである（Bernstein et al. (2001), Nature 409:363-6；Dykxhoorn et al. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4:457-61）。ＲＮＡｉの現象は最初にシノラブディス・エレガンスで報告され、その場合に、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の注入によって、ＲＮＡに対して相補的であるｍＲＮＡの効率的な配列特異的遺伝子サイレンシングが生じた（Fire et al. (1998) Nature 397:806-11）。ＲＮＡｉは、ウィルス防御機序として用いられると考えられる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と称される現象として植物でも報告されている（Jorgensen (1990) Trends Biotechnol. 8:340-4; Brigneti et al. (1998) EMBO J. 17:6739-46; Hamilton & Baulcombe (1999) Science 286:950-2）。
【０００３】
ＰＴＧＳを調節する分子が相対的に長いｄｓＲＮＡからプロセシングされた短いＲＮＡであることが当初示されたのは、植物における相対的に長いｄｓＲＮＡ由来の短い２１〜２２ヌクレオチドｄｓＲＮＡの同定によるものであった（Hamilton & Baulcombe (1999) Science 286:950-2）。この所見は、ショウジョウバエ胚抽出物で繰り返され、その場合にはＲＮａｓｅＩＩＩ型酵素であるＤｉｃｅｒによって、長いｄｓＲＮＡがプロセシングされて２１〜２５ヌクレオチドの短いＲＮＡとなっていることが認められた（Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8；Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20: 6877-88；Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 75: 188-200）。これらの所見により、エルバシル（Elbashir）らは、合成２１〜２５ヌクレオチド合成ｄｓＲＮＡがショウジョウバエ胚溶解物および哺乳動物細胞培養物での遺伝子発現を特異的に阻害する機能を有するか否かを調べるようになった（Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-8；Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20:6877-88；Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 75:188-200）。彼らは、小干渉ＲＮＡ （ｓｉＲＮＡ）が、インターフェロン応答を誘発することなく、哺乳動物細胞培養物での遺伝子発現を特異的に阻害する能力を有することを示している。
【０００４】
これらの所見から、 ヘアピン型ｓｉＲＮＡを生じるプラスミド系などの哺乳動物細胞培養物での特異的遺伝子発現を低減または消失させる技術が開発された（Brummelkamp et al. (2002) Science 296:550-3；Paddison et al. (2002) Genes Dev. 75:948-58；Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 1443-8；Paul et al. 2002) Nat. Biotechnol. 20:404-8）。ｓｉＲＮＡ分子は、イン・ビボで細胞に導入して、特異的タンパク質の発現を阻害することもできる（例えば、Soutschek, J., et al, Nature 432 (7014):173-178 (2004)も参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｓｉＲＮＡ分子は、特異的タンパク質の発現を阻害する治療薬、ならびに疾患状態に関与するタンパク質の発現を調節する機能を有するｓｉＲＮＡ分子の活性に影響を与える薬剤の標的の両方として有望である。そのような治療剤開発における第１段階は、生物内の異なる細胞種における特異的ｓｉＲＮＡ分子の量を測定することで、身体内でのｓｉＲＮＡ発現の「地図」を構築することである。さらに、所定の刺激に対する応答または疾患状態での特定細胞種における特異的ｓｉＲＮＡ分子の量の変化を測定することが有用であろう。
【０００６】
短いＲＮＡ分子は定量が困難である。例えば、小ＲＮＡ分子の増幅および測定のためのＰＣＲ使用に関して、ほとんどのＰＣＲプライマーがその小ＲＮＡ分子より長いために、小ＲＮＡ分子とかなりの重なりを有し、プライマー伸長およびＰＣＲ増幅反応に用いられる温度で小ＲＮＡ分子に選択的にハイブリダイズするプライマーを設計することは困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１態様において、本発明は、ミクロＲＮＡ分子を増幅してｃＤＮＡ分子を製造する方法を提供する。その方法には、（ａ）プライマー伸長を用いて、標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的である第１のＤＮＡ分子を製造する段階；ならびに（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて第１のＤＮＡ分子を増幅して、増幅ＤＮＡ分子を製造する段階がある。その方法の一部の実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を有する。本発明の実施において、代表的には多く（例えば、数百万）の個々のミクロＲＮＡ分子がサンプル（例：生存細胞から単離されるＲＮＡ分子の溶液）中で増幅されることは明らかであろう。
【０００８】
別の態様では本発明は、生体からのサンプル中の標的ミクロＲＮＡの量を測定する方法を提供する。本発明のこの態様の方法には、生体内の非常に多数の異なる細胞種における標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する段階があり、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）プライマー伸長を用いて、サンプル中の標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的である第１のＤＮＡ分子を製造する段階；（２）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、第１のＤＮＡ分子を増幅して、増幅ＤＮＡ分子を製造する段階；ならびに（３）増幅ＤＮＡ分子の量を測定する段階を有する方法によって測定される。この方法の一部の実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を有する。
【０００９】
別の態様において本発明は、表１、表２、表６および表７に示した配列番号１〜配列番号４９９からなる核酸プライマー分子を提供する。本発明のプライマー分子は、本明細書に記載の本発明の方法を用いて、哺乳動物ミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして用いることができる。
【００１０】
別の態様において本発明は、少なくとも一つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するためのキットであって、標的ミクロＲＮＡの検出に特異的な１以上のプライマーセットを含み、各プライマーセットが（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を製造するための伸長プライマー、（２）ｃＤＮＡ分子を増幅するためのユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーおよび（３）ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含むキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリダイズする第１の部分およびユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー用のハイブリダイゼーション配列を含む第２の部分を有する。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするよう選択された配列を含む。キットの一部の実施形態において、ユニバーサルフォワードおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む。本発明のキットは、本発明の方法の各種実施形態を実行するのに用いることができる。
【００１１】
本発明は、例えば生体における各種細胞内の特異的ミクロＲＮＡ分子を定量するか、例えば刺激に応答した（例：薬剤投与に応答）生存細胞での特異的ミクロＲＮＡの量における変化を測定する上で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の上記の態様および付随する利点の多くは、下記の詳細な説明を添付の図面と併用して参照することで理解が深まるにつれて、より容易に評価されることになろう。
【００１３】
上記によれば、１態様において本発明は、ミクロＲＮＡ分子を増幅してｃＤＮＡ分子を製造する方法を提供する。その方法には、（ａ）プライマー伸長を用いて標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子を作る段階；および（ｂ）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＤＮＡ分子を増幅して、増幅ＤＮＡ分子を製造する段階がある。その方法の一部の実施形態では、ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも一つのロック核酸分子を含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ロック核酸分子」（ＬＮＡ分子と略する）という用語は、２′−Ｏ，４′−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分を含む核酸分子を指す。２′−Ｏ，４′−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシル部分の例ならびにそのような部分を含むＬＮＡの例は、例えばピーターセンの報告（Petersen, M. and Wengel, J., Trends in Biotechnology 21(2): 74-81 (2003)）（この刊行物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「ミクロＲＮＡ」という用語は、２１ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの範囲の長さを有するＲＮＡ分子を指す。一部のミクロＲＮＡ分子（例：ｓｉＲＮＡ分子）は、生体細胞において遺伝子発現を調節する機能を有する。
【００１６】
本発明の代表的な方法
図１には、本発明の代表的な方法のフローチャートを示してある。図１に示した方法では、ミクロＲＮＡは相補的な第１のＤＮＡ分子合成のための鋳型である。第１のＤＮＡ分子の合成は伸長プライマーによって準備されることから、第１のＤＮＡ分子には、伸長プライマーおよび新たに合成されたＤＮＡ（図１において点線で表示）がある。そのＤＮＡ合成は、逆転写酵素によって触媒される。
【００１７】
伸長プライマーには、第１の部分（図１ではＦＰと略している）およびa第２の部分（図１ではＳＰと略している）がある。第１の部分はミクロＲＮＡ標的鋳型にハイブリダイズし、第２の部分には下記に記載のように、ユニバーサルフォワードプライマーとハイブリダイズする核酸配列がある。
【００１８】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、第１のＤＮＡ分子に対して相補的な第２のＤＮＡ分子を作る。第２のＤＮＡ分子の合成は、標的第１のＤＮＡ分子の一部に特異的にハイブリダイズするよう選択された配列を有するリバースプライマーによって準備される。従って、リバースプライマーは、第１のＤＮＡ分子以外の核酸分子にハイブリダイズしない。リバースプライマーは、伸長プライマーと重ならないリバースプライマーの部分内にある少なくとも一つのＬＮＡ分子を含んでいても良い。図１では、ＬＮＡ分子は影付き楕円形によって表される。ユニバーサルフォワードプライマーは第２のＤＮＡ分子の３′末端にハイブリダイズし、第３のＤＮＡ分子の合成を準備する。図１には単一のミクロＲＮＡ分子、単一の第１のＤＮＡ分子、単一の第２のＤＮＡ分子、単一の第３のＤＮＡ分子および単一の伸長、フォワードおよびリバースプライマーが示してあるが、代表的には本発明の実施においては、核酸分子それぞれの多くのコピー（例：数百万個のコピー）を含む反応混合物が用いられることは明らかであろう。
【００１９】
本発明の方法の各段階について、より詳細に検討する。
【００２０】
鋳型として有用なミクロＲＮＡ分子の製造
本発明の方法で鋳型として有用なミクロＲＮＡ分子は、生体（例：哺乳動物などの真核生物）または臓器、組織および／または個々の細胞（培養細胞を含む）等のそれの一部から単離することができる。総細胞ＲＮＡなどのミクロＲＮＡを含む好適なＲＮＡ調製物を用いることができる。ＲＮＡは、細胞の溶解およびそれに含まれるタンパク質の変性が関与する手順によって細胞から単離することができる。対象となる細胞には、野生型細胞、薬剤曝露した野生型細胞、修飾細胞および薬剤曝露された修飾細胞などがある。
【００２１】
別の段階を用いて、ＤＮＡの一部または全てを除去することができる。細胞溶解は、ノニオン系洗剤と、それに続くマイクロ遠心による核除去、従って細胞ＤＮＡの大部分の除去によって行うことができる。１実施形態では、ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジニウム溶解とそれに続くＣｓＣｌ遠心によるＤＮＡからのＲＮＡの分離を用いて対象とする各種細胞から抽出する（Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299参照）。ＤＮＡからのＲＮＡの分離は、例えば熱フェノールまたはフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いた有機抽出によって行うこともできる。
【００２２】
所望に応じて、ＲＮａｓｅ阻害薬を溶解緩衝液に加えることができる。同様に、ある種の細胞種では、タンパク質変性／消化段階をプロトコールに加えることが望ましい場合がある。
【００２３】
ＲＮＡのサンプルは、非常に多くの異なるミクロＲＮＡ分子を含むことができ、異なるミクロＲＮＡ分子はそれぞれ異なるヌクレオチド配列を有する。ある具体的な実施形態では、ＲＮＡサンプル中のミクロＲＮＡ分子は少なくとも１００の異なるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、ＲＮＡサンプルのミクロＲＮＡ分子は、少なくとも５００、１０００、５０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００または１０００００の異なるヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
本発明の方法を用いて、ミクロＲＮＡの存在を検出することができる。例えば、本発明の方法を用いて、グリフィス−ジョーンズらの報告（Griffith-Jones et al. (2004), Nucleic Acids Research 32:D109-D111およびGriffith-Jones et al. (2006), Nucleic Acids Research 34: D140-D144）に記載され、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/のウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）のウェブサイトでワールドワイドウェブ上で公的にアクセス可能な「ｍｉＲ塩基配列データベース」などのデータベースに記載のミクロＲＮＡ標的のうちの１以上を検出することができる。ミクロＲＮＡ標的の例のリストが、ラゴス−キンタナらの参考文献（Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12(9):735-9 (2002)）にも記載されている。
【００２５】
ミクロＲＮＡ分子を鋳型として用いるＤＮＡ分子の合成
本発明の方法の実施において、ミクロＲＮＡ標的分子に対して相補的であり、伸長プライマーおよび新たに合成されたＤＮＡからなる（伸長プライマーが、その新たに合成されたＤＮＡの合成を準備する）第１のＤＮＡ分子を合成する。個々の第１のＤＮＡ分子は、全ミクロＲＮＡ標的分子に対して、またはそれの部分に対して相補的であることができる。ただし、代表的には、個々の第１のＤＮＡ分子は全ミクロＲＮＡ標的分子に対して相補的である。従って、本発明の方法の実施において、それぞれが標的ミクロＲＮＡ分子の全体または一部に対して相補的な個々のＤＮＡ分子を含む第１のＤＮＡ分子群が合成される。
【００２６】
第１のＤＮＡ分子の合成は、逆転写酵素によって触媒される。逆転写酵素分子を用いて、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ−ＲＴ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−ＲＴ）由来のものなどの第１のＤＮＡ分子を合成することができる。この段階で合成される二本鎖ｃＤＮＡの量を低減するには、ＲＮａｓｅＨ活性を持たない逆転写酵素（例：インビトロゲン（Invitrogen, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008）が販売しているスーパースクリプト（SUPERSCRIPT）ＩＩＩ（商標名））が好ましい。逆転写酵素分子は好ましくは、熱安定性であることで、プライマーのミクロＲＮＡ標的分子へのハイブリダイゼーションがなおも可能としながら、できるだけ高い温度でＤＮＡ合成反応を行うことができるものでなければならない。
【００２７】
第１のＤＮＡ分子の合成の準備
第１のＤＮＡ分子の合成は、伸長プライマーを用いて準備される。代表的には、伸長プライマーの長さは、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、例えば２０〜３５ヌクレオチドの範囲である。伸長プライマーの核酸配列を、各合成ＤＮＡ分子の配列に組み込む。伸長プライマーには、ミクロＲＮＡ分子の一部にハイブリダイズする第１の部分がある。代表的には、伸長プライマーの第１の部分には伸長プライマーの３′末端が含まれる。伸長プライマーの第１の部分は代表的には、６ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、例えば１０ヌクレオチド〜１２ヌクレオチドの範囲の長さを有する。一部の実施形態では、伸長プライマーの第１の部分は、３ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００２８】
伸長プライマーには、代表的には１８〜２５ヌクレオチドの長さを有する第２の部分も含まれる。例えば、伸長プライマーの第２の部分は、２０ヌクレオチドの長さであることができる。伸長プライマーの第２の部分は、伸長プライマーの第１の部分に対して５′にある。伸長プライマーの第２の部分には、ユニバーサルフォワードプライマー用のハイブリダイゼーション部位の少なくとも一部が含まれる。例えば、伸長プライマーの第２の部分は、ユニバーサルフォワードプライマー用のハイブリダイゼーション部位の全てを含んでいることができるか、例えばユニバーサルフォワードプライマー用のハイブリダイゼーション部位のわずか１個のヌクレオチドを含むことができる（フォワードプライマー用のハイブリダイゼーション部位の残りの部分は、例えば伸長プライマーの第１の部分にあっても良い）。伸長プライマーの第２の部分の核酸配列の１例は、５′ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ３′（配列番号１）である。
【００２９】
ＤＮＡ分子の増幅
本発明の方法の実施において、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、第１のＤＮＡ分子を酵素的に増幅する。ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を準備する。リバースプライマーには、第１のＤＮＡ分子の一部に特異的にハイブリダイズするよう選択される核酸配列が含まれる。
【００３０】
リバースプライマーは代表的には、１０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。一部の実施形態では、リバースプライマーは１２ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。所定のハイブリダイゼーション条件下で特定の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、リバースプライマーのヌクレオチド配列を選択する。リバースプライマーおよび伸長プライマーはいずれも、ＰＣＲ反応混合物中に存在することから、リバースプライマーは溶融温度（Ｔｍ）が少なくとも５０℃となるほど長いものでなければならないが、「プライマー二量体」の形成を引き起こし得る伸長プライマーとの広範囲の重なりが生じるほど長いものであってはならない。「プライマー二量体」は、リバースプライマーが伸長プライマーにハイブリダイズする時に形成され、ＤＮＡ合成用基質として伸長プライマーを用いるものであり、伸長プライマーはリバースプライマーにハイブリダイズし、リバースプライマーをＤＮＡ合成の基質として使用する。「プライマー二量体」の形成を回避するためには、代表的にはリバースプライマーおよび伸長プライマーを、それらが６個を超えてヌクレオチドが互いに重ならないように設計する。Ｔｍが少なくとも５０℃であるリバースプライマーを作ることができず、リバースプライマーおよび伸長プライマーが６個を超えるヌクレオチドの重なりを持たない場合、リバースプライマーを延長し（通常、オリゴヌクレオチドが長くなるに連れてＴｍは上昇することから）、伸長プライマーを短くすることが好ましい。
【００３１】
リバースプライマーは、第１のＤＮＡ分子に対して相補的な第２のＤＮＡ分子の合成を準備する。ユニバーサルフォワードプライマーは、全ての第１のＤＮＡ分子中に取り込まれる伸長プライマーの第２の部分に対して相補的な第２のＤＮＡ分子の部分にハイブリダイズする。ユニバーサルフォワードプライマーは、第３のＤＮＡ分子の合成を準備する。ユニバーサルフォワードプライマーは代表的には、１６ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの範囲の長さを有する。一部の実施形態では、ユニバーサルフォワードプライマーは１６ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ユニバーサルフォワードプライマーは、少なくとも１個のロック核酸分子を含むことができる。一部の実施形態において、ユニバーサルフォワードプライマーは１〜２５子のロック核酸分子を含む。ユニバーサルフォワードプライマーの１例の核酸配列を配列番号１３に示している。
【００３２】
概して、ポリメラーゼ連鎖反応中の増幅サイクル数が大きいほど、得られる増幅ＤＮＡの量が大きくなる。他方、増幅サイクルが多すぎると（例えば、３５を超える増幅サイクル数）、非標的二本鎖ＤＮＡの擬似的で意図しない増幅が生じる可能性がある。従って、一部の実施形態では、増幅サイクルの所望数は１〜４５増幅サイクルであり、例えば１〜２５増幅サイクル、または５〜１５増幅サイクル、または１０増幅サイクルである。
【００３３】
ＬＮＡ分子の使用およびプライマーハイブリダイゼーション条件の選択
基質分子上の相補配列に対するプライマー分子の特異的ハイブリダイゼーションを促進するハイブリダイゼーション条件を選択する。伸長プライマーの１２ヌクレオチドの第１の部分のミクロＲＮＡへのハイブリダイゼーションに関して、特異的ハイブリダイゼーションは５０℃の温度で起こることが認められている。同様に、２０ヌクレオチドユニバーサルフォワードプライマーの相補ＤＮＡ分子へのハイブリダイゼーションならびに相補ＤＮＡ分子へのリバースプライマー（１２〜２０ヌクレオチド、例えば１４〜１６ヌクレオチドの範囲の長さを有する）のハイブリダイゼーションが５０℃の温度で起こることが認められている。例を挙げると、それぞれが５０℃〜６０℃の範囲のハイブリダイゼーション温度を有する伸長、リバースおよびユニバーサルフォワードプライマーを設計することが望ましい場合が多い。
【００３４】
一部の実施形態において、ＬＮＡ分子を伸長プライマー、リバースプライマーおよびユニバーサルフォワードプライマーのうちの少なくとも一つに組み込むことで、プライマーのうちの１以上のＴｍを少なくとも５０℃まで上昇させることができる。標的第１のＤＮＡ分子にハイブリダイズするが伸長プライマーにはハイブリダイズしないリバースプライマーの部分へのＬＮＡ分子の組み込みは、リバースプライマーのこの部分が代表的には長さが１０以下のヌクレオチドであることから有用であると考えられる。例えば、標的の第１のＤＮＡ分子にハイブリダイズするが伸長プライマーにはハイブリダイズしないリバースプライマーの部分は、少なくとも１個のロック核酸分子（例：１〜２５個のロック核酸分子）を有することができる。一部の実施形態では、２個もしくは３個のロック核酸分子が、リバースプライマーの最初の８個のヌクレオチドから５′末端の範囲内に含まれる。
【００３５】
特異的プライマーに組み込んでＴｍを所望の温度まで上昇させなければならないＬＮＡ残基数は、主としてプライマーの長さおよびプライマーのヌクレオチド組成によって決まる。プライマーにおける１以上のＬＮＡのＴｍに対する効果を測定する手段は、エキシコン社（Exiqon, Bygstubben 9, DK-2950 Vedbaek, Denmark）のインターネットウェブサイトで入手可能である。
【００３６】
本発明の実施において用いられるプライマーには１以上のＬＮＡが含まれ得るが、ＬＮＡが伸長プライマーに組み込まれている場合、ｃＤＮＡ合成の効率は低いことが認められている。理論に拘束されるものではないが、ＬＮＡが逆転写酵素の活性を阻害する可能性がある。
【００３７】
増幅ＤＮＡ分子の検出および量測定
増幅ＤＮＡ分子は、蛍光分子などの検出可能なマーカー分子の存在によって検出および定量することができる。例えば、増幅ＤＮＡ分子は、本発明の方法のＰＣＲ増幅段階中に二本鎖ＤＮＡに優先的または排他的に結合する色素（例：ＳＹＢＲグリーン）の存在によって検出および定量することができる。例えば、モレキュラー・プローブス社（Molecular Probes, Inc., 29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402）は、ＳＹＢＲ緑色色素を含む定量的ＰＣＲ反応混合物を販売している。別の例を挙げると、リアルタイムＰＣＲ中に産生される二本鎖ＤＮＡを標識するのに用いることができる別の色素（「ＢＥＢＯ」と称する）が、ベングトソン（Bengtsson, M., et al., Nucleic Acids Research 37(8):e45 (April 15, 2003）；この刊行物は参照によって本明細書に組み込まれる）によって報告されている。やはり例を挙げると、フルオロフォアおよび消光剤を含むフォワードおよび／またはリバースプライマーを用いて、本発明の方法のＰＣＲ増幅段階を準備することができる。ＰＣＲ中の標識プライマーの伸長後に起こるフルオロフォアおよび消光剤の物理的分離によって、フルオロフォアの蛍光発光が可能となり、その蛍光を用いて、ＰＣＲ増幅産物の量を測定することができる。フルオロフォアおよび消光剤を含む市販のプライマーの例には、いずれもモレキュラープローブス社が販売しているスコーピオン（Scorpion）プライマーおよびユニプライマー類（Uniprimer）などがある。
【００３８】
本発明の代表的な使用
本発明は、ミクロＲＮＡ標的分子からのｃＤＮＡ分子製造において有用である。原料中の標的ミクロＲＮＡ分子の量測定値を与えるＤＮＡ分子の量を測定することができる。例えば、本発明の方法を用いて、生体細胞中の特異的ミクロＲＮＡ分子（例：特異的ｓｉＲＮＡ分子）の量を測定することができる。やはり例を挙げると、本発明を用いて、生体中の異なる細胞種における特異的ミクロＲＮＡ分子（例：特異的ｓｉＲＮＡ分子）の量を測定することで、身体内の特異的ミクロＲＮＡ分子の分布の「地図」を作ることができる。やはり例を挙げると、本発明を用いて、刺激に応答した、例えば薬剤による生体細胞群の治療に応答した特異的ミクロＲＮＡ分子（例：特異的ｓｉＲＮＡ分子）の量における変化を測定することができる。
【００３９】
従って、別の態様において本発明は、生体内の非常に多数の異なる細胞種における標的ミクロＲＮＡ量を測定する方法（例えば、生物のミクロＲＮＡ「地図」を作成するため）を提供する。本発明のこの態様の各方法には、生体内の非常に多数の異なる細胞種における標的ミクロＲＮＡ分子の量を測定する段階があり、標的ミクロＲＮＡ分子の量は、（１）プライマー伸長を用いて、生体のある細胞種から単離された標的ミクロＲＮＡ分子に対して相補的なＤＮＡ分子を作る段階；（２）ユニバーサルフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてＤＮＡ分子を増幅することで、増幅ＤＮＡ分子を製造する段階、ならびに（３）増幅ＤＮＡ分子の量を測定する段階を有する方法によって測定される。方法の一部の実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む。増幅ＤＮＡ分子の測定量は、例えばコンピュータ読み取り可能媒体（例：フロッピーディスク）などの電子形態での問い合わせ可能データベースに保存することができる。
【００４０】
別の態様において本発明は、表１、表２、表６および表７に示した配列番号１〜配列番号４９９からなる核酸プライマー分子を提供する。本明細書に記載の本発明の方法を用いて、本発明のプライマー分子を、哺乳動物ミクロＲＮＡ標的分子を検出するためのプライマーとして用いることができる。
【００４１】
別の態様において本発明は、少なくとも一つの哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するキットであって、キットが標的ミクロＲＮＡの検出に特異的な１以上のプライマーセットを含み、各プライマーセットが（１）標的ミクロＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡ分子を製造するための伸長プライマー、（２）ユニバーサルフォワードＰＣＲプライマーおよび（３）ｃＤＮＡ分子を増幅するためのリバースＰＣＲプライマーを含むキットを提供する。伸長プライマーは、標的ミクロＲＮＡ分子にハイブリダイズする第１の部分ならびにユニバーサルフォワードＰＣＲプライマー用のハイブリダイゼーション配列を含む第２の部分を含む。リバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡ分子の一部にハイブリダイズするよう選択された配列を含む。キットの一部の実施形態において、ユニバーサルフォワードおよびリバースプライマーの少なくとも一方が、少なくとも１個のロック核酸分子を含む。
【００４２】
キットに含める伸長プライマー、ユニバーサルフォワードおよびリバースプライマーは、本明細書の方法に従って哺乳動物標的ミクロＲＮＡを検出するよう設計することができる。ヒト標的ミクロＲＮＡ標的分子の例（それに限定されるものではない）ならびに標的特異的伸長プライマーおよびリバースプライマーの例を、下記の表１、表２および表６に挙げてある。マウス標的ミクロＲＮＡ標的分子の例（それに限定されるものではない）ならびに標的特異的伸長プライマーおよびリバースプライマーの例を、下記の表７に挙げてある。ユニバーサルフォワードプライマーの例（それに限定されるものではない）を、配列番号１３として示してある。
【００４３】
ある種の実施形態において、キットは、それぞれが５０℃〜６０℃の範囲のハイブリダイゼーション温度を有する特定の標的ミクロＲＮＡ分子用の伸長プライマー、リバースおよびユニバーサルフォワードプライマーを含むプライマーのセットを含む。
【００４４】
ある種の実施形態においてキットは、例えば２個のミクロＲＮＡ標的から数百個までのミクロＲＮＡ標的のような複数の哺乳動物ミクロＲＮＡ標的を検出するのに用いることができる複数のプライマーセットを含む。
【００４５】
ある種の実施形態においてキットは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９＊、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ａ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２＊、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１８９、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１９９ａ＊、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０２ａ＊、ｍｉＲ−３０２ａ、ｍｉＲ−３０２ｂ＊、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３０２ｄ、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６３、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３＊、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８１、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４１２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４３１、ｍｉＲ−４４８、ｍｉＲ−４４９、ｍｉＲ−４５０、ｍｉＲ−４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇ、ｌｅｔ７ｉ、ｍｉＲ−３７６ａおよびｍｉＲ−３７７という少なくとも１以上のヒトミクロＲＮＡ標的鋳型を検出することができる１以上のプライマーセットを含む。上記ミクロＲＮＡ標的の配列は、グリフィス−ジョーンズらの報告（Griffith-Jones et al. (2004), Nucleic Acids Research 32:D109-D111およびGriffith-Jones et al. (2006), Nucleic Acids Research 34: D140-D144）に記載され、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/のウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）のウェブサイトでワールドワイドウェブ上で公的にアクセス可能な「ｍｉＲ塩基配列データベース」に提供されている。
【００４６】
キットのこの実施形態に従って使用されるプライマーの例を、下記の表１、表２および表６に示してある。
【００４７】
別の実施形態においてキットは、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５４＊、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９９、ｍｉＲ−３０２ｃ＊、ｍｉＲ−３０２ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ３６３、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ３７９、ｍｉＲ４１０、ｍｉＲ４１２、ｍｉＲ４２４、ｍｉＲ４２９、ｍｉＲ４３１、ｍｉＲ４４９、ｍｉＲ４５１、ｌｅｔ７ａ、ｌｅｔ７ｂ、ｌｅｔ７ｃ、ｌｅｔ７ｄ、ｌｅｔ７ｅ、ｌｅｔ７ｆ、ｌｅｔ７ｇおよびｌｅｔ７ｉという少なくとも１以上のヒトミクロＲＮＡ標的鋳型を検出することができる１以上のプライマーセットを含む。キットのこの実施形態に従って使用されるプライマーの例を、下記の表１、表２および表６に示してある。
【００４８】
別の実施形態においてキットは、表１、表２、表６および表７に示した、配列番号２〜配列番号４９３からなる群から選択される少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００４９】
別の実施形態においてキットは、表６に示した配列番号４７、４８、４９、５０、５５、５６、８１、８２、８３、８４、９１、９２、１０３、１０４、１２３、１２４、１４５、１４６、１９３、１９４、１９７、１９８、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３９、２４０、２４７、２４８、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２７７、２７８、２８５、２８６、２８７、２８８、２９３、２９４、３０１、３０２、３０９、３１０、３１１、３１２、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３５９、３６０、３６９、３７０、３８９、３９０、３９３、３９４、４０５、４０６、４０７、４０８、４１５、４１６、４１９、４２０、４２１、４２２、４２５、４２６、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４６１および４６２からなる群から選択される少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００５０】
本発明のキットは、プライマー伸長および増幅反応用の試薬を提供することもできる。例えば一部の実施形態において、キットはさらに、逆転写酵素酵素、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、Ｔｒｉｓ緩衝液、カリウム塩（例：塩化カリウム）、マグネシウム塩（例：塩化マグネシウム）、還元剤（例：ジチオトレイトール）およびデオキシヌクレオシド・３リン酸（ｄＮＴＰ）という成分の１以上を含むことができる。
【００５１】
各種実施形態においてキットは、ＰＣＲ増幅段階中に二本鎖ＤＮＡに優先的または排他的に結合するＳＹＢＲ緑色色素またはＢＥＢＯ色素などの検出試薬を含むことができる。他の実施形態においてキットは、フルオロフォアおよび消光剤を含んでＰＣＲ増幅産物の量を測定するフォワードおよび／またはリバースプライマーを含むことができる。そのキットには、１以上の哺乳動物ミクロＲＮＡ標的の検出および定量におけるキットの使用説明書が入っていても良い。そのキットは、好ましくは高スループットでロボットによる取り扱いを行う上で有用である好適な筐体に入れて提供されても良い。
【００５２】
下記の実施例は、単に本発明を実施する上で現在想到される最良の形態を示すものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【００５３】
本実施例は、ミクロＲＮＡ標的分子からＤＮＡ分子を製造する本発明の代表的な方法について説明するものである。
【００５４】
プライマー伸長を下記のように実施した（インビトロゲンのスーパースクリプトＩＩＩ（登録商標）逆転写酵素を用い、その酵素に添付の指針に従った。）。下記の反応混合物を氷上で調製した。
【００５５】
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １μＬ
２μＭ伸長プライマー  １μＬ
標的鋳型  １〜５μＬ
「５倍ｃＤＮＡ緩衝液」  ４μＬ
０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μＬ
ＲＮＡａｓｅＯＵＴ  １μＬ
スーパースクリプトＩＩＩ（登録商標）酵素  １μＬ
水  ２０μＬとなるまで。
【００５６】
混合物を５℃で３０分間、次に８５℃で５分間インキュベートし、冷却して室温とし、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００５７】
ＰＣＲサイクル数の関数としての二本鎖ＰＣＲ単位複製配列のＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光をモニタリングすることで、ＡＢＩ７９００ＨＴＳ検出システム（Applied Biosystems, Foster City, California, U. S. A.）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。代表的な１０μＬ  ＰＣＲ反応混合物は下記のものを含んでいた。
【００５８】
２倍ＳＹＢＲ（登録商標）緑色原液混合物（ＡＢＩ）  ５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー  ０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー  ０．８μＬ
水  １．４μＬ
標的鋳型（１０倍希釈ＲＴ反応）  ２．０μＬ。
【００５９】
標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃−１５秒、６０℃−６０秒）４０サイクルによって反応をモニタリングし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定した。
【００６０】
総ＲＮＡのサンプル中に存在する内因性ミクロＲＮＡを定量するための１１のプライマー伸長ＰＣＲアッセイで、下記の方法を用いて奏功した。これら１１のアッセイで用いた伸長プライマーのＤＮＡ配列、ユニバーサルフォワードプライマー配列およびＬＮＡ置換リバースプライマーを表１に示してある。
【００６１】
【表１】
2008528003.tif 000003
2008528003.tif 000004
【００６２】
このアッセイは、２ｎＭ〜２０ｆＭの濃度範囲でミクロＲＮＡを検出することができた。これらのアッセイは、少なくとも合成ミクロＲＮＡ濃度２ｎＭ（＞１００００００コピー／細胞）まで直線的であった。
【実施例２】
【００６３】
本実施例は、１２〜３塩基対の長さ範囲である遺伝子特異的領域を有するミクロＲＮＡアッセイ用の一連の伸長プライマーを用いる効率的なプライマー伸長介在ｃＤＮＡ合成の最小配列要件の評価について説明するものである。
【００６４】
プライマー伸長反応
標的分子ｍｉＲ−１９５およびｍｉＲ−２１５を用い、下記のようにプライマー伸長を行った。標的鋳型ｍｉＲ−１９５およびｍｉＲ−２１５をＴＥゼロ＋１００ｎｇ／μｇ総酵母ＲＮＡで希釈して、１ｎＭ  ＲＮＡ（１０００００コピー／細胞）とした。ＴＥゼロ＋１００ｎｇ／μｇ総酵母ＲＮＡで、無鋳型対照（ＮＴＣ）を得た。逆転写酵素反応を、ｍｉＲ−１９５用の一連の伸長プライマー（配列番号２５〜３４）およびｍｉＲ−２１５用の一連の伸長プライマー（配列番号３５〜４４）（それらの配列は下記の表２に示してある）を用いて下記のように行った（インビトロゲンのスーパースクリプト（登録商標）逆転写酵素を用い、その酵素に添付のガイドラインに従った）。反応混合物を氷上で調製した。
【００６５】
セット１：無鋳型対照
水  ３７．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １２．５μＬ
０．１ｍＭ  ＤＴＴ  １２．５μＬ
「５倍ｃＤＮＡ緩衝液」  ５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ  １２．５μＬ
スーパースクリプト（ＩＩＩ）（登録商標）逆転写酵素  １２．５μＬ
１μｇ／μＬヒーラ細胞総ＲＮＡ（Ambion）  １２．５μＬ
２μＭ伸長プライマー  ＋５０μＬ
ＴＥゼロ＋酵母ＲＮＡ  ＋５０μＬ。
【００６６】
セット２：無鋳型対照
水  ３７．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  １２．５μＬ
０．１ｍＭ  ＤＴＴ  １２．５μＬ
「５倍ｃＤＮＡ緩衝液」  ５０μＬ
ＲＮＡｓｅＯＵＴ  １２．５μＬ
スーパースクリプト（ＩＩＩ）（登録商標）逆転写酵素（インビトロゲン）  １２．５μＬ
１μｇ／μＬヒーラ細胞総ＲＮＡ（Ambion）  １２．５μＬ
２μＭ伸長プライマー  ＋５０μＬ
１０倍刻みで連続希釈した１ｎＭ  ＲＮＡ標的鋳型（ｍｉＲ−１９５またはｍｉＲ−２１５）。
【００６７】
反応液を５０℃で３０分間、次に８５℃で５分間インキュベートし、冷却して４℃とし、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１０倍希釈した。
【００６８】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応
逆転写後、ＰＣＲサイクル数の関数としての二本鎖ＰＣＲ単位複製配列のＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光をモニタリングすることで、ＡＢＩ７９００ＨＴＳ検出システム（Applied Biosystems, Foster City, California, U. S. A.）を用いる定量的リアルタイム（ｑＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの４連測定を行った。下記の反応混合物を調製した。
【００６９】
２倍ＳＹＢＲ（登録商標）緑色原液混合物（ＡＢＩ）  ５μＬ
１０μＭユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）  ０．８μＬ
１０μＭリバースプライマー（ｍｉＲ−１９５ＲＰ：配列番号４５またはｍｉＲ２１５ＲＰ：配列番号４６）  ０．８μＬ
水  １．４μＬ
標的鋳型（１０倍希釈ｍｉＲ−１９５またはｍｉＲ−２１５ＲＴ反応）  ２．０μＬ。
【００７０】
製造者が推薦する条件を用い、各サンプルについて４連で定量的リアルタイムＰＣＲを実施した。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃−１５秒、６０℃−６０秒）４０サイクルによって反応をモニタリングし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を得た。ｍｉＲ−１９５およびｍｉＲ−２１５アッセイで用いた伸長プライマーのＤＮＡ配列、ユニバーサルフォワードプライマー配列およびＬＮＡ置換リバースプライマーを表２に示してある。ｍｉＲ−１９５についてのアッセイ結果を下記の表３に示してあり、ｍｉＲ−２１５についてのアッセイ結果を下記の表４に示してある。
【００７１】
【表２】
2008528003.tif 000005
2008528003.tif 000006
【００７２】
結果
ミクロＲＮＡ標的鋳型を含むアッセイで蛍光が検出されたサイクル数と定義されるサイクル閾値（Ｃｔ）によって、各アッセイの感度を測定した。このＣｔ値が低いほど（例えばサイクル数が少ないほど）、アッセイの感度が高かった。ミクロＲＮＡサンプルに関しては、鋳型を含むサンプルおよび無鋳型対照のいずれも最終的に検出閾値を通過するが、鋳型を有するサンプルはそれよりかなり低いサイクル数でもそうであることが認められた。ΔＣｔ値は、鋳型含有サンプルと無鋳型対照の間のサイクル数（Ｃｔ）の差であり、アッセイのダイナミックレンジの尺度として役立つ。高いダイナミックレンジを有するアッセイでは、非常に低いミクロＲＮＡコピー数の測定が可能となる。従って、ミクロＲＮＡ検出アッセイの所望の特性には、高感度（低Ｃｔ値）ならびに標的鋳型を含むサンプルと無鋳型バックグラウンド対照サンプルのシグナル間での広いダイナミックレンジ（ΔＣｔ≧１２）などがある。
【００７３】
大きさが１２ヌクレオチド〜３ヌクレオチドの範囲にある遺伝子特異的部分を有する伸長プライマーを用いるｍｉＲ１９５およびｍｉＲ２１５アッセイの結果を、それぞれ下記の表３および表４に示してある。これらの実験の結果から予想外に、３ヌクレオチドという短い遺伝子特異的準備配列が鋳型特異的プリミングを示すことが明らかである。ｍｉＲ−１９５アッセイセット（表３に示したもの）およびｍｉＲ−２１５アッセイセット（表４に示したもの）の両方に関して、両方のアッセイセットについてのダイナミックレンジ（ΔＣｔ）が、長さが８ヌクレオチド以上である遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーにおいてかなり一定であることが結果からわかる。アッセイのダイナミックレンジ（ΔＣｔ）は、８ヌクレオチド以下の遺伝子特異的領域を有する伸長プライマーにおいては低下し始め、ｍｉＲ−１９５アッセイでは７ヌクレオチド以下、ｍｉＲ−２１５アッセイでは６ヌクレオチド以下のアッセイ特異性の低下がある。ｍｉＲ−２１５サンプルの融点分析で、３ヌクレオチドであっても、プラス鋳型サンプルに存在する特異的ＰＣＲ産物があることがわかった（データは示していない）。総合すると、これらのデータは、伸長プライマーの遺伝子特異的領域が理想的には≧８ヌクレオチドであるが、長さが３ヌクレオチドと短いものであっても良いことを示している。
【００７４】
【表３】
2008528003.tif 000007
2008528003.tif 000008
【００７５】
【表４】
2008528003.tif 000009
【実施例３】
【００７６】
本実施例は、ヒトミクロＲＮＡ発現パターンの定量的分析用に設計されたアッセイおよびプライマーセットについて記載するものである。
【００７７】
プライマー設計
ミクロＲＮＡ標的鋳型
本明細書に記載の標的鋳型の配列は、グリフィス−ジョーンズらの報告（Griffith-Jones et al. (2004), Nucleic Acids Research 32:D109-D111およびGriffith-Jones et al. (2006), Nucleic Acids Research 34: D140-D144）に記載された「ｍｉＲ塩基配列データベース」で、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）のウェブサイトでワールドワイドウェブ上で公的にアクセス可能である。
【００７８】
伸長プライマー
ミクロＲＮＡのプライマー伸長によるｃＤＮＡ形成とそれに続く定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅のための遺伝子特異的プライマーを、（１）ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換し；（２）ｃＤＮＡ分子の一方の末端に「ユニバーサル」ＰＣＲ結合部位（配列番号１）を導入し；（３）ｃＤＮＡの長さを延長して、ｑＰＣＲによるその後のモニタリングを容易にするように設計した。
【００７９】
リバースプライマー
一般的なユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１３）と組み合わせて、未修飾リバースプライマーおよびリバースプライマー（ＲＰ）を含むロック核酸（ＬＮＡ）を設計して、プライマー伸長した全長ｃＤＮＡを定量するようにした。リバースプライマーを含有するロック核酸に関しては、表６に提供しているリバースプライマー配列の例で下記に示したように、リバースプライマーオリゴヌクレオチドの５′末端からの最初の８ヌクレオチド内で、２個もしくは３個のＬＮＡ修飾塩基を置換した。ＬＮＡ塩基置換を選択して、最高量によるプライマーの予想Ｔｍを上昇させ、選択されたプライマーの最終予想Ｔｍを、好ましくは５０℃以下となるように指定した。
【００８０】
ｍｉＲ−９５およびｍｉＲ−４２４の検出におけるプライマーセットの１例を用いるアッセイについて説明する例について、下記に記載している。
【００８１】
プライマー伸長反応
下記のように、ｍｉＲ−９５およびｍｉＲ−４２４に相当するＤＮＡ鋳型を用いてプライマー伸長を実施した。ＤＮＡ鋳型を、ＴＥゼロ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）＋１００ｎｇ／μＬ酵母総ＲＮＡ（Ambion, Austin TX）で、０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ希釈まで希釈した。逆転写酵素反応は、下記のプライマーを用いて実施した。
【００８２】
【化１】
2008528003.tif 000010
2008528003.tif 000011
【００８３】
逆転写（反応液当たり）
水  ２μＬ
「５倍ｃＤＮＡ緩衝液」（InVitrogen, Carlsbad, CA）  ０．５μＬ
０．１ｍＭ  ＤＴＴ（InVitrogen, Carlsbad, CA）  ０．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（InVitrogen, Carlsbad, CA）  ０．５μＬ
スーパースクリプトＩＩＩ（登録商標）逆転写酵素（InVitrogen, Carlsbad, CA）  ０．５μＬ
伸長プライマー２μＬ＋鋳型希釈液２μＬ。
【００８４】
反応液を混合し、５０℃で３０分間、次に８５℃で５分間インキュベートし、冷却して４℃とし、ＴＥゼロで１０倍希釈した。
【００８５】
定量的リアルタイムＰＣＲ反応（反応当たり）
２倍ＳＹＢＲ混合物（Applied Biosystems, Foster City, CA）  ５μＬ
水  １．４μＬ
ユニバーサルプライマー（ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡ（配列番号１３））  ０．８μＬ
上記からの希釈逆転写（ＲＴ）産物  ２．０μＬ。
【００８６】
製造者の推奨条件を用い、各サンプルについて４連で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。標準的な「２サイクル」ＰＣＲ（９５℃−１５秒、６０℃−６０秒）４０サイクルによって反応をモニタリングし、ＰＣＲ産物の蛍光を測定し、解離曲線を得た。代表的なｍｉＲ−９５およびｍｉＲ−４２４アッセイで用いた伸長プライマーのＤＮＡ配列、ユニバーサルフォワードプライマー配列およびＬＮＡ置換リバースプライマー、ならびに２１２種類の異なるヒトミクロＲＮＡ鋳型についてのプライマーセットを下記の表６に示してある。高ダイナミックレンジを有する高感度アッセイを行うために広範囲の試験および設計変更を行う必要があるアッセイ用のプライマーセットを表６に示してあり、プライマー名の後に記号＃を付してある。
【００８７】
結果
表５には、ｍｉＲ−９５およびｍｉＲ−４２４アッセイからのＣｔ値（４つのサンプルからの平均）を示してあり、それは図２に示したグラフでプロットされている。これらアッセイの結果は、勾配（第６列）、切片（第７列）およびバックグラウンド（第８列）と称される表６に示したアッセイパラメータの有意性を説明するための代表的な例として提供されているものである。
【００８８】
表５に示したように、各種濃度での各鋳型についてのＣｔ値が提供されている。図２に示したように、Ｃｔ値（ｘ軸）を鋳型濃度（ｙ軸）の関数としてプロットして、各アッセイについて標準曲線を得ている。勾配および切片は、各ミクロＲＮＡについての細胞当たりコピー数の推定を可能とするアッセイ測定の特徴を規定するものである。例えば、ｍｉＲ−９５アッセイにおける５０μｇ総ＲＮＡ投入量に関するＣｔ値をプロットすると、勾配および切片がそれぞれ−．０３５６９および９．６５５である標準曲線が得られる。これらの標準曲線パラメータを未知サンプル（ｘ）のＣｔに当てはめると、それらによってｌｏｇ１０（コピー／２０ｐｇ総ＲＮＡ）（ｙ）が得られる。平均的細胞が総ＲＮＡ２０ｐｇを生じることから、これらの測定値は細胞当たりのミクロＲＮＡのコピー数に等しくなる。バックグラウンドは、サンプル中で測定できる最低コピー数の推定値を提供し、無鋳型対照（ＮＴＣ）値をこの等式に入れることによって計算される。本実施例では、表６に示したように、ｍｉＲ−９５はＲＮＡ投入量５０μｇでコピー数１．６８／２０ｐｇのバックグラウンドを与える。
【００８９】
表６でさらに示したように、ＬＮＡを含まないリバースプライマーも、本発明の方法に従って用いることができる。例えば配列番号４９４〜４９９を参照する。非ＬＮＡ含有リバースプライマー配列番号４９４〜４９９を用いるアッセイの感度およびダイナミックレンジによって、ＬＮＡ含有リバースプライマーを用いる相当するアッセイと同様の結果が得られた。
【００９０】
【表５】
2008528003.tif 000012
2008528003.tif 000013
【００９１】
【表６】
2008528003.tif 000014
2008528003.tif 000015
2008528003.tif 000016
2008528003.tif 000017
2008528003.tif 000018
2008528003.tif 000019
2008528003.tif 000020
2008528003.tif 000021
2008528003.tif 000022
2008528003.tif 000023
2008528003.tif 000024
2008528003.tif 000025
2008528003.tif 000026
2008528003.tif 000027
2008528003.tif 000028
2008528003.tif 000029
2008528003.tif 000030
2008528003.tif 000031
2008528003.tif 000032
【実施例４】
【００９２】
本実施例は、マウスｍｉＮＲＡ発現パターンの定量的分析のために設計されたアッセイおよびプライマーについて説明するものである。
【００９３】
方法
表７に記載されている代表的なマウスミクロＲＮＡ標的鋳型は、グリフィス−ジョーンズらの報告（Griffith-Jones et al. (2004), Nucleic Acids Research 32:D109-D111およびGriffith-Jones et al. (2006), Nucleic Acids Research 34: D140-D144）に記載されている「ｍｉＲ塩基配列データベース」で、ウェルカム・トラスト・サンガー研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）のウェブサイトでワールドワイドウェブ上で公的にアクセス可能である。下記の表７に示したように、マウスミクロＲＮＡ鋳型は、相当するヒトミクロＲＮＡ鋳型と全く同一であるか、重なる配列において同一であって末端が異なっているか、ヒトミクロＲＮＡ配列と比較して１以上の塩基対変化を有するものである。相当するヒト鋳型と同一であるか同一の重複配列を有するマウスミクロＲＮＡ鋳型は、表７に示したようにヒトミクロＲＮＡ鋳型用に設計された同じプライマーセットを用いてアッセイすることができる。相当するヒト鋳型と比較して１以上の塩基対変化を有するマウスミクロＲＮＡ鋳型に関して、特にマウスミクロＲＮＡの検出用に、プライマーセットが設計されており、これらのプライマーが表７に示してある。マウスミクロＲＮＡ鋳型の検出用の伸長プライマー反応および定量的ＰＣＲ反応は、実施例３の方法に従って行うことができる。
【００９４】
【表７】
2008528003.tif 000033
2008528003.tif 000034
2008528003.tif 000035
2008528003.tif 000036
2008528003.tif 000037
2008528003.tif 000038
2008528003.tif 000039
2008528003.tif 000040
2008528003.tif 000041
2008528003.tif 000042
2008528003.tif 000043
2008528003.tif 000044
2008528003.tif 000045
【実施例５】
【００９５】
本実施例は、本発明の１実施形態による方法を用いて、１２種類の異なる組織から単離された総ＲＮＡ中の３つのミクロＲＮＡに関する発現プロファイルの検出および分析について説明するものである。
【００９６】
方法
脳、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ、卵巣、骨格筋、脾臓、胸腺および子宮という組織から単離されたプライマー伸長反応液１０μＬ当たりについて、ファーストチョイス（First Choice）総ＲＮＡ（Ambion, Inc.）０．５μｇを用いてｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−１５０ミクロＲＮＡ鋳型の定量分析を行った。下記のＰＣＲプライマーを用いて、プライマー伸長酵素および定量的ＰＣＲ反応を、実施例３で前述した方法に従って実施した。
【００９７】
【化２】
2008528003.tif 000046
【００９８】
【化３】
2008528003.tif 000047
【００９９】
【化４】
2008528003.tif 000048
【０１００】
結果
ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２４およびｍｉＲ−１５０についての発現プロファイルを、それぞれ図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに示した。図３Ａ〜３Ｃにおけるデータは、総ＲＮＡ（ｙ軸）１０ｐｇ当たりのミクロＲＮＡコピー数の単位で表してある。これらの単位は、ヒト細胞系が代表的には細胞当たり≦総ＲＮＡ１０ｐｇを与えたために選択したものである。従って、示したデータは細胞当たりのミクロＲＮＡコピーの推定値である。ｘ軸上の数字は、（１）脳、（２）心臓、（３）腸、（４）腎臓、（５）肝臓、（６）肺、（７）リンパ、（８）卵巣、（９）骨格筋、（１０）脾臓、（１１）胸腺および（１２）子宮という組織に相当するものである。
【０１０１】
既報の報告と一致して、ｍｉＲ−１において非常に高レベルの横紋筋特異的発現が認められ（図３Ａに示したように）、ｍｉＲ−１２４において高レベルの脳発現が認められた（図３Ｂに示したように）（Lagos-Quintana et al., RNA 9: 175-179, 2003参照）。定量分析から、これらミクロＲＮＡが細胞当たり数十〜数十万個のコピーで存在することがわかる。これらのデータは、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１２４レベルの定量的ノーザンブロット推定値と一致している（Lim et al., Nature 433:769-773, 2005）。図３Ｃに示したように、ｍｉＲ−１５０は、免疫関連のリンパ節、胸腺および脾臓サンプルで高度に発現されることが認められ、それは既報の所見とも一致する（Baskerville et al., RNA 77:241-247, 2005参照）。
【０１０２】
以上、本発明の好ましい実施形態について例示および説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて、本発明において各種の変更を行うことが可能であることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】本発明の代表的方法のフローチャートである。
【図２】実施例３に記載のミクロＲＮＡ標的ｍｉＲ−９５およびｍｉＲ−４２４の検出に特異的なアッセイに関する標準曲線をグラフ表示した図である。
【図３Ａ】実施例５に記載の１２の組織から単離された総ＲＮＡパネルにわたるｍｉＲ−１の発現プロファイルを示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｂ】実施例５に記載の１２の組織から単離された総ＲＮＡパネルにわたるｍｉＲ−１２４の発現プロファイルを示すヒストグラムプロットである。
【図３Ｃ】実施例５に記載の１２の組織から単離された総ＲＮＡパネルにわたるｍｉＲ−１５０の発現プロファイルを示すヒストグラムプロットである。
【図１】
2008528003.tif 000049
【図２】
2008528003.tif 000050
【図３Ａ】
2008528003.tif 000051
【図３Ｂ】
2008528003.tif 000052
【図３Ｃ】
2008528003.tif 000053
【配列表】
2008528003000001.app
【国際調査報告】
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