(57)【要約】本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶形および薬剤として許容されるその溶媒和物を提供する。その結晶形は、遊離塩基、または二リン酸塩、一硫酸塩もしくは二シュウ酸塩などの塩であってよい。本発明は、これらの結晶性化合物を含むかまたはこれらの化合物を用いて調製される医薬品組成物、その結晶性化合物を調製するための方法および中間体、ならびに肺障害を治療するためのこれらの化合物の使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶形または薬剤として許容されるその溶媒和物。
【請求項２】
前記結晶形が二リン酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
６．４±０．２、７．６±０．２、８．６±０．２、１３．７±０．２、１５．０±０．２、１９．４±０．２、２１．６±０．２、２２．１±０．２、２２．９±０．２および２３．７±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、１５．０±０．２、１９．４±０．２、２１．６±０．２および２３．７±０．２の２θ値での回折ピークを含む請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
そのピーク位置が、図１に示すパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項６】
約１５４．５℃で最大吸熱熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項７】
図２に示す示差走査熱量測定トレースと実質的に一致するトレースを特徴とする、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
前記結晶形が一硫酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
７．７±０．２、８．４±０．２、８．８±０．２、１２．６±０．２、１３．７±０．２、１４．１±０．２、１５．３±０．２、１６．０±０．２、１９．７±０．２、２０．６±０．２、２３．０±０．２および２４．４±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、１２．６±０．２、１９．７±０．２、２３．０±０．２および２４．４±０．２の２θ値での回折ピークを含む、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
そのピーク位置が、図８に示すパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
約７６．５℃で最大吸熱熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
図１０に示す示差走査熱量測定トレースと実質的に一致するトレースを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
前記結晶形が二シュウ酸塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
７．７±０．２、８．７±０．２、１３．５±０．２、１４．０±０．２、１４．８±０．２、１５．４±０．２、１５．８±０．２、１９．４±０．２、２２．９±０．２、２３．３±０．２および２４．６±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、８．７±０．２、１４．０±０．２、１９．４±０．２および２２．９±０．２の２θ値での回折ピークを含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
そのピーク位置が、図１３に示すパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
約７３．７℃で最大吸熱熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
図１５に示す示差走査熱量測定トレースと実質的に一致するトレースを特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２０】
前記結晶形が遊離塩基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
４．７±０．２、９．６±０．２、１２．７±０．２、１３．７±０．２、１６．７±０．２、１７．４±０．２、１８．５±０．２、１９．４±０．２、２０．８±０．２、２１．４±０．２、２４．２±０．２および２５．６±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、４．７±０．２、１８．５±０．２、２０．８±０．２および２５．６±０．２の２θ値での回折ピークを含む、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
そのピーク位置が、図１８に示すパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２４】
約１０２．７℃で最大吸熱熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２５】
図１９に示す示差走査熱量測定トレースと実質的に一致するトレースを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２６】
４．６±０．２、９．３±０．２、１２．９±０．２、１３．６±０．２、１４．０±０．２、１４．６±０．２、１６．５±０．２、１８．６±０．２、１９．１±０．２、２０．９±０．２、２２．１±０．２、２２．７±０．２および２５．７±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２７】
前記粉末Ｘ線回折パターンが、４．６±０．２、１８．６±０．２、２２．１±０．２および２２．７±０．２の２θ値での回折ピークを含む、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
そのピーク位置が、図２３に示すパターンのピーク位置と実質的に一致する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２９】
約９８．６℃で最大吸熱熱流を示す示差走査熱量測定トレースを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項３０】
図２４に示す示差走査熱量測定トレースと実質的に一致するトレースを特徴とする、請求項２０に記載の化合物。
【請求項３１】
薬剤として許容される担体と請求項１から３０のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬品組成物。
【請求項３２】
β２アドレナリン作動性受容体作用薬、ステロイド系抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ−４阻害剤およびその組合せから選択される治療有効量の薬剤をさらに含み、前記化合物と前記薬剤を一緒または別個に配合する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
治療有効量のβ２アドレナリン作動性受容体作用薬およびステロイド系抗炎症剤を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記β２アドレナリン作動性受容体作用薬がＮ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミンの一塩酸塩である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ステロイド系抗炎症剤が６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記化合物と前記薬剤を一緒に配合する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記化合物と前記薬剤を別個に配合する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組成物を吸入で投与するために配合する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記担体が約４〜約６のｐＨ範囲を有する水性の等張性生理食塩水である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項４０】
クエン酸塩緩衝剤を含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項３１に記載の組成物を含む乾燥粉末吸入器を備える薬物送達装置。
【請求項４２】
微粒化した形態の請求項１から３０のいずれか一項に記載の化合物の結晶形。
【請求項４３】
薬剤として許容される担体および請求項４２に記載の化合物を含む医薬品組成物。
【請求項４４】
前記担体がラクトースである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをリン酸と接触させることを含む、請求項２に記載の化合物の調製方法。
【請求項４６】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを硫酸と接触させることを含む、請求項８に記載の化合物の調製方法。
【請求項４７】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをシュウ酸と接触させて、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二シュウ酸塩の種晶を形成させるステップと、
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをシュウ酸と接触させて、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの二シュウ酸塩を形成させ、前記塩を不活性希釈剤中に溶解して溶液を形成するステップと、
前記種晶を前記溶液に加えるステップと
を含む、請求項１４に記載の化合物の調製方法。
【請求項４８】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを不活性希釈剤と接触させて、結晶性遊離塩基の種晶を形成させるステップと、
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを不活性希釈剤と接触させて、結晶性遊離塩基を形成させ、得られた結晶性エステルを溶解させて溶液を形成するステップと、
前記種晶を前記溶液に加えるステップと
を含む、請求項２０に記載の化合物の調製方法。
【請求項４９】
請求項４５から４８のいずれか一項に記載の方法によって調製された生成物。
【請求項５０】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性塩または結晶性遊離塩基を形成させることを含む、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを精製するための方法における請求項１から３０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５１】
治療において、または医薬品として用いるための請求項１から３０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５２】
医薬品の製造のための請求項１から３０のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５３】
前記医薬品が哺乳動物におけるムスカリン性受容体に拮抗させるためのものである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記医薬品が肺障害を治療するためのものである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
前記医薬品が気管支拡張をもたらすためのものである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５６】
前記医薬品が慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療するためのものである、請求項５２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、肺障害の治療に有用であると期待されるビフェニル化合物の新規な結晶形およびその溶媒和物に関する。本発明は、結晶性化合物を含むかまたはそうした化合物から調製される医薬品組成物、その結晶性化合物を調製するための方法および中間体、ならびに肺障害を治療するためのその化合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
本発明の譲受人に譲渡されたＭａｍｍｅｎらの特許文献１は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息などの肺障害を治療するのに有用であると期待されている新規なビフェニル化合物を開示している。特に、化合物ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルが、ムスカリン性受容体拮抗薬または抗コリン作用を有していることを本出願で具体的に述べられている。
【０００３】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの化学構造は式Ｉで表される。
【０００４】
【化１】
2008533036.tif 000002
式Ｉの化合物は市販されているＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて称されている。
【０００５】
肺障害または呼吸器障害の治療に有用な治療剤は、吸入によって直接気道中に投与することが有利である。この関連で、吸入によって治療剤を投与するために、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、計量式吸入器（ＭＤＩ）および噴霧型吸入器を含むいくつかの種類の薬剤用吸入装置が開発されている。そうした装置のための医薬品組成物および配合物を調製する場合、吸湿性でも潮解性でもなく、かつ比較的高い融点（一般に約１５０℃を超える）を有し、それによってそれほど分解を伴うことなくその物質を微粒化することができる治療剤の結晶形を有することが特に望まれる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２０３１３３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
式Ｉの化合物の結晶形はこれまで報告されていない。許容できる程度の吸湿性と比較的高い融点を有する安定した非潮解性の式Ｉの化合物の結晶形が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉ）の結晶形を提供する。結晶形は遊離塩基、二リン酸塩、一硫酸塩もしくは二シュウ酸塩などの薬剤として許容される塩、またはそうした塩の薬剤として許容される溶媒和物であってよい。
【０００８】
驚くべきことに、本発明の結晶形は、大気中の湿気に曝しても潮解性でないことが分かった。さらに、本発明の結晶形は、許容できる程度の吸湿性と約７０ｏＣを超える許容できる融点を有する。例えば、二リン酸塩は約１５０ｏＣの融点を有する。
【０００９】
様々な用途の中で、とりわけ、式Ｉの化合物の結晶形は、肺障害を治療するのに有用性が期待される医薬品組成物を調製するのに有用である。したがって、本発明の一態様は、薬剤として許容される担体と、治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形を含む医薬品組成物に関する。
【００１０】
本発明のさらに他の態様は、式Ｉの化合物の結晶形を１種または複数の他の治療剤と合わせて含む組成物に関する。したがって、一実施形態では、本発明は、（ａ）薬剤として許容される担体および治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形と、（ｂ）コルチコステロイド；β２アドレナリン作動性受容体作用薬；ホスホジエステラーゼ−４阻害剤；またはその組合せなどのステロイド系抗炎症剤から選択される治療有効量の薬剤とを含む組成物であって、その結晶形と薬剤が一緒かまたは別個に配合される組成物を対象とする。その薬剤を別個に配合する場合、薬剤として許容される担体を含めることができる。
【００１１】
本発明の他の態様は、式Ｉの化合物の結晶形を含む水性の等張性生理食塩水を含む医薬品組成物であって、上記食塩水が約４〜６の範囲のｐＨを有する組成物に関する。特定の実施形態では、水性の噴霧型配合物を、クエン酸塩緩衝剤で約５のｐＨに緩衝させる。他の特定の実施形態では、水性の噴霧型配合物は、約０．５ｍｇ／ｍｌのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの遊離塩基相当物を含む。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、薬剤として許容される担体と式Ｉの化合物の結晶形を含む医薬品組成物を含む乾燥粉末吸入器を備えた薬物送達装置を提供する。
【００１３】
式Ｉの化合物はムスカリン性受容体拮抗活性を有する。したがって、式Ｉの化合物の結晶形は喘息および慢性閉塞性肺疾患などの肺障害を治療するのに有用である。したがって、本発明の他の態様は、患者に治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形を投与することを含む肺障害を治療するための方法に関する。本発明のさらに他の態様は、気管支拡張をもたらす量の式Ｉの化合物の結晶形を患者に投与することを含む患者の気管支拡張をもたらす方法に関する。一実施形態では、化合物を吸入により投与する。本発明は、患者に治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形を投与することを含む慢性閉塞性肺疾患または喘息の治療方法を提供する。本発明の他の態様は、哺乳動物に治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形を投与することを含む哺乳動物のムスカリン性受容体を拮抗させるための方法を対象とする。
【００１４】
本発明は、式Ｉの化合物の結晶形を調製するための方法も対象とする。本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性塩または結晶性遊離塩基を形成させることを含む式Ｉの化合物を精製するための方法を提供する。本発明は、本明細書で述べる方法によって調製される生成物をさらに対象とする。
【００１５】
本発明は、微粒化した形態の式Ｉの化合物の結晶形、ならびに薬剤として許容される担体と微粒化した結晶形の式Ｉの化合物を含む医薬品組成物も対象とする。
【００１６】
本発明は、治療で用いるためまたは医薬品としての式Ｉの化合物の結晶形も対象とする。さらに、本発明は、医薬品の製造のため、特に哺乳動物の肺障害を治療するかまたはムスカリン性受容体に拮抗させる医薬品の製造のための式Ｉの化合物の結晶形の使用に関する。
【００１７】
本発明の様々な態様を、添付の図面を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶形を提供する。結晶形は、遊離塩基、二リン酸塩、一硫酸塩または二シュウ酸塩などの薬剤として許容される塩、あるいはそうした塩の薬剤として許容される溶媒和物であってよい。特定の実施形態では、結晶形は二リン酸塩である。
定義
本発明の化合物、組成物、方法およびプロセスを説明する場合、別段の指定のない限り、以下の用語は以下の意味を有する。
【００１９】
「溶媒和物」という用語は、溶質すなわち、式Ｉの結晶性化合物の１個または複数の分子と、溶媒の１個または複数の分子によって形成される複合体または凝集物を意味する。そうした溶媒和物は一般に実質的に一定の溶質と溶媒のモル比を有する。この用語は、水との包接化合物を含む包接化合物も意味する。代表的な溶媒には、例として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが含まれる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。
【００２０】
「形態Ｉ」という用語は、不活性希釈剤としての溶媒混合物の一部として水を用いる方法で調製される結晶性遊離塩基を指す。「形態ＩＩ」という用語は、不活性希釈剤として有機溶媒混合物を用いる、すなわち水を用いない方法で調製される結晶性遊離塩基を指す。
【００２１】
「治療有効量」という用語は、治療を必要とする患者に投与したときに効果的に治療するのに十分な量を意味する。例えば、ムスカリン性受容体に拮抗させるための治療有効量は所望の拮抗効果を実現するその量である。同様に、肺障害を治療するための治療有効量は所望の治療結果を実現するその量であり、それは以下で述べるような疾患の防止、改善、抑制または緩和であってよい。
【００２２】
本明細書で用いる「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、
（ａ）疾患または病状の発症を防止する、すなわち、そうした疾患または病状にかかっているかまたはかかる恐れがあると考えられる患者に予防的治療をすること、
（ｂ）疾患または病状を改善する、すなわち、そうした疾患または病状を有する患者の疾患または病状を排除するかその後退をもたらすこと、
（ｃ）疾患または病状を抑制する、すなわち、そうした疾患または病状を有する患者の疾患または病状の進行を遅くするかまたは止めること、または、
（ｄ）そうした疾患または病状を有する患者の疾患または病状の症状を緩和することを含む、哺乳動物（特にヒト）などの患者における疾患または病状（ＣＯＰＤなど）を治療することすなわち治療を意味する。
【００２３】
「薬剤として許容される」という用語は、生物学的にであってもなくても望ましくなくはない材料を指す。例えば、「薬剤として許容される担体」という用語は、組成物中に混ぜ込み、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、また組成物中の他の成分と有害な形で相互作用することなく患者に投与することができる材料を指す。そうした薬剤として許容される材料は、一般に毒物学的試験および製造上の試験の必要な基準に適合しており、米国食品医薬品局によって適切な非活性成分として認定されている材料を含む。
【００２４】
「単位剤形」という用語は、患者に投薬するのに適している物理的に離散した単位を指す。すなわち、各単位が単独で、または１つまたは複数の追加的単位と併用して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の本発明の化合物を含むことを指す。例えば、そうした単位剤形はカプセル剤、錠剤、丸剤などであってよい。
合成
本発明の結晶性化合物は、容易に入手できる出発材料から、以下および実施例に記載のようにして合成することができる。具体的なプロセス条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧力等）を示すが、別段の指定のない限り、他のプロセス条件も用いることができることを理解されたい。一般に、反応は適切な不活性希釈剤中で実施する。その希釈剤の例には、これらに限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、メチルｔ−ブチルエーテルなど、および一般に水を含むその混合物が含まれる。上記反応のいずれかが完了したら、結晶性化合物は、沈殿、濃縮、遠心分離などの通常の任意の手段で反応混合物から単離することができる。
【００２５】
本発明で用いるビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルは、実施例に記載の手順を用いるか、またはＭａｍｍｅｎらの米国特許出願第２００５／０２０３１３３号に記載の手順を用いて市販の出発材料および試薬から容易に調製することができる。
【００２６】
本発明の方法で述べるモル比は、当業者が利用できる様々な方法で容易に決定できる。例えば、そうしたモル比は、１Ｈ  ＮＭＲによって容易に決定できる。あるいは、モル比を元素分析法およびＨＰＬＣ法を用いて決定できる。
二リン酸塩結晶
本発明の二リン酸塩は一般に、式Ｉの化合物のモル当量当たり約１．９〜２．１モル当量のリン酸を含む、式Ｉの化合物のモル当量当たり約１．８〜２．２モル当量のリン酸を含む。
【００２７】
一般に、式Ｉの化合物の結晶性二リン酸塩または薬剤として許容されるその溶媒和物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをリン酸と接触させて調製することができる。例えば、エステルを希釈リン酸水溶液と接触させて無定形二リン酸塩を形成させ、次いでこれを不活性希釈剤と接触させることができる。
【００２８】
無定形二リン酸塩を調製するために、通常エステルをリン酸水溶液中に溶解させ、水で希釈し、凍結乾燥により単離する。一般に、この反応は約２４℃などの約０〜３０℃の温度範囲で実施する。エステルのｍｇと１Ｍリン酸のｍｌとの比は約１：３．５を含む約１：３〜約１：４である。次いで得られた無定形二リン酸塩を一般に約１５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤と接触させる。一般に、この反応は約６０℃などの約５０〜７０℃の温度範囲で実施する。
【００２９】
特定の実施形態では、５００ｍｇのエステルを５ｍｌの水および１．５ｍｌの１Ｍリン酸にとる。１Ｍリン酸を加えて（２．１モル当量に等しくする）、ｐＨを約ｐＨ５．３に調節する。透明溶液をろ過し、凍結させ、凍結乾燥で乾燥させて無定形二リン酸塩を得る。得られた無定形二リン酸塩をイソプロパノール：アセトニトリル（１：１）溶液に加え、続いて水を加える。この反応では、無定形の二リン酸塩のｍｇとイソプロパノール：アセトニトリルのｍｌの比は、約２：１を含む約２：０．９〜約２：２である。
【００３０】
あるいは、結晶性二リン酸塩は、エステルを約２．０〜約２．１モル当量のリン酸と接触させて調製することができる。一般に、この反応は、不活性希釈剤中で、約５０℃などの約４０〜６０℃の温度範囲で実施する。特定の実施形態では、エステルをイソプロパノール：アセトニトリル（１：１）溶液に加え、続いて水を加える。加熱後、リン酸を加える。この反応では、エステルのｍｇとリン酸のｍｌの比は、約５：１６を含む約５：１４〜約５：１８である。
【００３１】
結晶性二リン酸塩を調製するための上記方法はどちらも、より不安定な離散した二リン酸塩結晶形態の生成をもたらすことができる。図６および図７は、このより不安定な形態のＰＸＲＤパターンおよびＤＳＣトレースをそれぞれ示す。より安定である二リン酸塩結晶が一般的な形態であるが、より不安定な二リン酸塩形態物が存在する場合、溶媒混合物中の水分含量を増大させ、その懸濁液を約５０℃〜約７０℃、典型的には約６０℃で約２〜約６時間、典型的には約２時間予備加熱し、続いて緩やかに撹拌しながら室温に冷却することによって、その二リン酸塩形態物をより安定な結晶に容易に転換させることができる。
一硫酸塩結晶
本発明の一硫酸塩は、一般に、式Ｉの化合物のモル当量当たり約０．９〜１．１モル当量の硫酸を含む、式Ｉの化合物のモル当量当たり約０．８〜１．２モル当量の硫酸を含む。
【００３２】
式Ｉの化合物の結晶性一硫酸塩または薬剤として許容されるその溶媒和物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを硫酸と接触させて調製することができる。例えば、エステルは、１Ｎ硫酸水溶液と接触させて一硫酸塩を形成させ、次いでそれを不活性希釈剤と接触させることができる。
【００３３】
一硫酸塩を調製するために、通常エステルを１：１アセトニトリル：水に溶解させ、硫酸水溶液で希釈し、水で希釈し、凍結乾燥により単離する。一般に、この反応は約２４℃などの約０〜３０℃の温度範囲で実施する。エステルのｍｇと水の中の１Ｎ硫酸ｍｌとの比は、約３０５ｍｇ／ｍｌを含む約３２５ｍｇ／ｍｌ〜約２８５ｍｇ／ｍｌである。一つの特定の実施形態では、４４２ｍｇのエステルを５ｍｌの１：１アセトニトリル：水にとり、ｐＨを監視しながら１．４５ｍｌの１Ｎ硫酸を徐々に加える。次いで、ｐＨを約ｐＨ３．３に調節する。透明溶液をろ過し、凍結させ、凍結乾燥で乾燥させて一硫酸塩を得る。次いで、得られた一硫酸塩を一般に約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤と接触させる。一実施形態では、この反応を第１の温度で実施し、次いでより低い第２の温度で実施する。その両方の温度は、６０℃〜７０℃などの約５０〜８０℃の範囲の温度である。特定の実施形態では、一硫酸塩をイソプロパノール：アセトニトリル（１０：１）溶液に加える。この反応では、一硫酸塩のｍｇとイソプロパノール：アセトニトリルのｍｌの比は、約１５：１を含む約１５：３〜約１５：０．８である。
【００３４】
他の実施形態では、この反応を第１の温度で実施し、次いでより低い２つの温度サイクルで実施する。第１の温度範囲は、約７０℃などを含む約５０〜８０℃である。第１のより低い温度サイクルは約６０℃〜３０℃の範囲である。第２のより低い温度サイクルは約４０℃〜３０℃である。特定の実施形態では、一硫酸塩をイソプロパノール：アセトニトリル（１０：１）溶液に加える。この反応では、一水和物塩のｍｇとイソプロパノール：アセトニトリルのｍｌの比は、約１６１：９を含む約１６１：７〜約１６１：１１である。
二シュウ酸塩結晶
本発明の二シュウ酸塩は一般に、式Ｉの化合物のモル当量当たり約１．９〜２．１モル当量のシュウ酸を含む、式Ｉの化合物のモル当量当たりの約１．８〜２．２モル当量のシュウ酸を含む。
【００３５】
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二シュウ酸塩または薬剤として許容されるその溶媒和物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをシュウ酸と接触させて調製することができる。例えば、エステルを、１Ｍシュウ酸水溶液と接触させて二シュウ酸塩を形成させ、次いでこれを不活性希釈剤と接触させることができる。
【００３６】
二シュウ酸塩を調製するために、通常エステルを１：１アセトニトリル：水に溶解させ、シュウ酸水溶液で希釈し、水で希釈し、凍結乾燥により単離する。一般に、この反応は約２４℃などの約０〜３０℃の温度範囲で実施する。エステルのｍｇと１Ｍシュウ酸水溶液のｍｌの比は、約３００ｍｇ／ｍｌを含む約３２０ｍｇ／ｍｌ〜約２８０ｍｇ／ｍｌである。一つの特定の実施形態では、５１０ｍｇのエステルを５ｍｌの１：１アセトニトリル：水にとり、ｐＨを監視しながら、１．７ｍｌの１Ｍシュウ酸水溶液を徐々に加える。ｐＨを約ｐＨ３．０に調節する。透明溶液をろ過し、凍結させ、凍結乾燥で乾燥させて二シュウ酸塩を得る。
【００３７】
一実施形態では、次いで得られた二シュウ酸塩を一般に約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤に接触させる。一般に、この反応は約６０℃などの約５０〜７０℃の温度範囲で実施する。特定の実施形態では、二シュウ酸塩をイソプロパノール：水（９４：６）溶液に加える。この反応では、二シュウ酸塩のｍｇとイソプロパノール：水のｍｌの比は、約１０：１を含む約１０：０．８〜約１０：３である。
【００３８】
結晶性二シュウ酸塩は、エステルの結晶性二シュウ酸塩（上記のようにして合成）の種晶を形成し、エステルをシュウ酸と接触させることによってエステルの二シュウ酸塩を形成し、その塩を不活性希釈剤中に溶解させて溶液を形成させ、その種晶を溶液に加えることによって調製することもできる。
【００３９】
一実施形態では、二シュウ酸塩は一般に約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤と接触させる。一般に、この反応は約６０℃などの約５０〜７０℃の第１の温度範囲で実施する。次いでその混合物を約４℃などの約３〜１０℃の第２の温度範囲まで冷却する。次いでエステルの結晶性二シュウ酸塩の種晶を加える。特定の実施形態では、二シュウ酸塩をイソプロパノール：水（９４：６）溶液に加える。この反応では、二シュウ酸塩のｍｇとイソプロパノール：水のｍｌの比は、約１５０：１３を含む約１５０：１０〜約１５０：１６である。
遊離塩基結晶
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性遊離塩基または薬剤として許容されるその溶媒和物は、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルを不活性希釈剤と接触させることによって調製することができる。
【００４０】
結晶性遊離塩基の１つの形態物（形態Ｉ）を調製するために、エステルを一般に約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤と接触させる。一般に、この反応は約２５℃などの約２０〜３０℃の温度範囲で実施する。特定の実施形態では、エステルを水：アセトニトリル（１：１）溶液に加える。この反応では、エステルのｍｇと水：アセトニトリルのｍｌの比は、約１００：０．５を含む約１００：０．３〜約１００：１である。あるいは、反応を、約２５℃などの約２０〜３０℃の範囲の第１の温度で実施し、次いで約４℃などの約３〜１０℃の範囲の第２の温度に冷却することができる。
【００４１】
結晶性遊離塩基は、結晶性遊離塩基（上記のようにして合成）の種晶を形成し、エステルを不活性希釈剤と接触させることによって結晶性遊離塩基を形成し、得られた結晶性エステル中に溶解させて溶液を形成させ、その種晶を溶液に加えることによって調製することもできる。
【００４２】
一実施形態では、エステルは一般に約５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤と接触させる。一般に、この反応は約６０℃などの約５０〜７０℃の第１の温度範囲で実施する。次いでその混合物を約４℃などの約３〜１０℃の第２の温度範囲まで冷却する。次いでエステルの結晶性遊離塩基の種晶を加え、続いて加熱と冷却のサイクルを数回繰り返す。第１の加熱サイクルを、例えば約３０〜４０℃、次いで約５０℃にし、続いて室温に冷却して行う。第２、第３および第４の加熱サイクルは、試料を約６０℃などの約５０〜７０℃の温度範囲に加熱し、続いて室温に冷却して行う。特定の実施形態では、エステルを水：アセトニトリル（１：１）溶液に加え、続いて水を加え、さらにアセトニトリルを加える。この反応では、エステルのｍｇとアセトニトリルおよび水のｍｌの比は、約２３０：０．２を含む約２３０：０．１〜約２３０：０．５である。
【００４３】
結晶性遊離塩基の他の形態物（形態ＩＩ）を調製するために、エステルを一般に約２００ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌの不活性希釈剤に接触させる。一般に、この反応は約２５℃などの約２０〜３０℃の温度範囲で実施する。特に適切な不活性希釈剤はアセトニトリルとメチルｔ−ブチルエーテルの組合せである。特定の実施形態では、ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルをアセトニトリルに加え、続いて、メチルｔ−ブチルエーテルを加え、さらにアセトニトリルを加える。この反応では、エステルのｍｇとアセトニトリル：メチルｔ−ブチルエーテル（１：２溶液）のｍｌの比は、約７０：０．４５を含む約２００ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌである。
結晶特性
様々な利点のなかでとりわけ、式Ｉの結晶性化合物を形成させると、式Ｉの化合物を精製するのに有用であることが分かった。例えば、結晶性二リン酸塩は９６％超、典型的には９８％超の純度を有する。
【００４４】
粉末ｘ線回折（ＰＸＲＤ）の分野でよく知られているように、ＰＸＲＤスペクトルの相対的ピーク高さは、試料調製や装置の形状に関連する多くの要因に依存するが、ピーク位置は実験上の細部の影響を比較的受けない。したがって、一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、特定のピーク位置を有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００４５】
一実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性二リン酸塩は、６．４±０．２、７．６±０．２、８．６±０．２、１３．７±０．２、１５．０±０．２、１９．４±０．２、２１．６±０．２、２２．１±０．２、２２．９±０．２および２３．７±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。一つの特定の実施形態では、この結晶形は、１５．０±０．２、１９．４±０．２、２１．６±０．２および２３．７±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。他の実施形態では、結晶性二リン酸塩はそのピーク位置が図１に示すものと実質的に一致するＰＸＲＤパターンを特徴とする。図１のＰＸＲＤパターンと、図６に示すようなより不安定な二リン酸塩についてのＰＸＲＤパターンの間の差に注目されたい。
【００４６】
一実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性一硫酸塩は、７．７±０．２、８．４±０．２、８．８±０．２、１２．６±０．２、１３．７±０．２、１４．１±０．２、１５．３±０．２、１６．０±０．２、１９．７±０．２、２０．６±０．２、２３．０±０．２および２４．４±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。一つの特定の実施形態では、この結晶形は、１２．６±０．２、１９．７±０．２、２３．０±０．２および２４．４±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。他の実施形態では、結晶性一硫酸塩はそのピーク位置が図８に示すものと実質的に一致するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００４７】
一実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性二シュウ酸塩は、７．７±０．２、８．７±０．２、１３．５±０．２、１４．０±０．２、１４．８±０．２、１５．４±０．２、１５．８±０．２、１９．４±０．２、２２．９±０．２、２３．３±０．２および２４．６±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。一つの特定の実施形態では、この結晶形は、８．７±０．２、１４．０±０．２、１９．４±０．２および２２．９±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。他の実施形態では、結晶性二シュウ酸塩はそのピーク位置が図１３に示すものと実質的に一致するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００４８】
一実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）は４．７±０．２、９．６±０．２、１２．７±０．２、１３．７±０．２、１６．７±０．２、１７．４±０．２、１８．５±０．２、１９．４±０．２、２０．８±０．２、２１．４±０．２、２４．２±０．２および２５．６±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。一つの特定の実施形態では、この結晶形は、４．７±０．２、１８．５±０．２、２０．８±０．２および２５．６±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。他の実施形態では、結晶性遊離塩基（形態Ｉ）はそのピーク位置が図１８に示すものと実質的に一致するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００４９】
一実施形態では、式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）は、４．６±０．２、９．３±０．２、１２．９±０．２、１３．６±０．２、１４．０±０．２、１４．６±０．２、１６．５±０．２、１８．６±０．２、１９．１±０．２、２０．９±０．２、２２．１±０．２、２２．７±０．２および２５．７±０．２から選択される２θ値で２つ以上の回折ピークを有するＰＸＲＤパターンを特徴とする。一つの特定の実施形態では、この結晶形は、４．６±０．２、１８．６±０．２、２２．１±０．２および２２．７±０．２の２θ値での回折ピークを含むＰＸＲＤパターンを特徴とする。他の実施形態では、結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）はそのピーク位置が図２３に示すものと実質的に一致するＰＸＲＤパターンを特徴とする。
【００５０】
さらに他の実施形態では、式Ｉの結晶性化合物はその示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）トレースを特徴とする。したがって、式Ｉの化合物の結晶性二リン酸塩は、図２で示すように、約１５４．５℃で最大の吸熱熱流を示すそのＤＳＣトレースを特徴とする。図２のＤＳＣトレースと、図７のより不安定な二リン酸塩のＤＳＣトレースの間の差に注目されたい。安定な結晶性二リン酸塩（図２）のＤＳＣトレースは典型的な低い温度遷移を示し、続いて約１５４．５℃での比較的シャープなピークを示す。他方、不安定な結晶性二リン酸塩（図７）のＤＳＣトレースは、約１５０．３℃でのより小さい融解転移の前にはっきりした肩を示す。
【００５１】
同様に、式Ｉの化合物の結晶性一硫酸塩は、図１０で示すように、約７６．５℃で最大の吸熱熱流を示すそのＤＳＣトレースを特徴とし、結晶性二シュウ酸塩は、図１５で示すように、約７３．７℃で最大の吸熱熱流を示すそのＤＳＣトレースを特徴とし、結晶性遊離塩基（形態Ｉ）は、図１９で示すように、約１０２．７℃で最大の吸熱熱流を示すそのＤＳＣトレースを特徴とし、結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）は、図２４で示すように、約９８．６℃で最大の吸熱熱流を示すそのＤＳＣトレースを特徴とする。
【００５２】
本発明の結晶性化合物は許容される適度なレベルの吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示す。すなわち、最大で９０％の相対湿度に曝した場合、式Ｉの化合物の結晶性二リン酸塩は２％未満の増量を示し；最大で９０％の相対湿度に曝した場合、結晶性一硫酸塩は４％未満の増量を示し；最大で９０％の相対湿度に曝した場合、結晶性二シュウ酸塩は３％未満の増量を示し；最大で９０％の相対湿度に曝した場合、結晶性遊離塩基（形態Ｉ）は６％未満の増量を示し；最大で９０％の相対湿度に曝した場合、結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）は４％未満の増量を示すことが実証された。
【００５３】
さらに、本発明の結晶性化合物は、高い温度と湿度に曝しても安定であることが分かった。例えば、４０℃、７５％相対湿度で１か月間保存した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析して、本発明の結晶性化合物について、検出可能な化学的分解は見られなかった（すなわち、０．５％未満の分解）。
【００５４】
本発明の結晶性化合物のこれらの特性を以下の実施例でさらに説明する。
医薬品組成物および配合物
式Ｉの結晶性化合物は一般に医薬品組成物または配合物の形態で患者に投与する。そうした医薬品組成物は、これらに限定されないが、吸入、経口、経鼻、局所（経皮を含む）および非経口方式の投与を含む可能な任意の投与経路で患者に投与することができる。しかし、当業者は、本発明の結晶性塩が配合されると、それはもはや結晶形ではない、すなわちその塩を適切な担体中に溶解させることができることを理解されよう。
【００５５】
したがって、一実施形態では、本発明は、薬剤として許容される担体もしくは賦形剤、および結晶性のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルまたは薬剤として許容されるその溶媒和物を含む医薬品組成物を対象とする。医薬品組成物は、必要に応じて、他の治療薬および／または配合剤を含むことができる。
【００５６】
本発明の医薬品組成物は一般に、活性剤として、治療有効量の結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルまたは薬剤として許容されるその溶媒和物を含む。通常、そうした医薬品組成物は約０．０１〜約３０重量％、例えば約０．０１〜約１０重量％の活性剤を含む約０．０１〜約９５重量％の活性剤を含む。
【００５７】
従来の任意の担体または賦形剤を、本発明の医薬品組成物に用いることができる。担体もしくは賦形剤、または担体もしくは賦形剤の組合せの具体的な選択は、具体的な患者を治療するのに用いる投与の方式、または病状または疾患の状態のタイプに応じて変わることになる。この関連では、特定の投与方式のための適切な医薬品組成物の調製は、十分に薬剤業界の技術者の範囲内である。さらに、そうした組成物のための成分は、例えばＳｉｇｍａ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８から市販されている。従来の配合技術のさらなる説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（２０００年）；およびＨ．Ｃ．ＡｎｓｅｌらのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｈｉｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９９年）に記載されている。
【００５８】
薬剤として許容される担体として作用することができる材料の代表的な例には、これらに限定されないが、以下のもの、すなわち：ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；非発熱性水；等張性生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；クロロフルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンなどの圧縮噴射ガス；ならびに医薬品組成物で用いられる他の非毒性の適合物質が含まれる。
【００５９】
本発明の医薬品組成物は、一般に、発明の化合物を薬剤として許容される担体および１種または複数の任意選択の成分と、完全にかつ密に混合または配合することによって調製する。必要であるかまたはそれを望む場合、次いで得られた均一に配合した混合物を、従来の手順および装置を用いて錠剤、カプセル剤、丸剤、小型容器、カートリッジ、分注器などに成形するかまたはそれに詰め込むことができる。
【００６０】
一実施形態では、本発明の医薬品組成物は吸入投与に適している。吸入投与のための適切な医薬品組成物は典型的にはエアロゾルまたは粉末の形態である。そうした組成物は通常、噴霧型吸入器、計量式吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）または同様の送達装置などのよく知られた送達装置を用いて投与される。
【００６１】
本発明の特定の実施形態では、活性剤を含む医薬品組成物を、噴霧型吸入器を用いて吸入で投与する。そうした噴霧装置は一般に、活性剤を含む医薬品組成物を、患者の気道中に送られる霧状物として、噴霧状にする高速の空気の流れを発生させる。したがって、噴霧型吸入器での使用のために配合する場合、活性剤を適切な担体中に溶解させて溶液を形成させる。適切な噴霧装置は例えばＰＡＲＩ  ＧｍｂＨ（Ｓｔａｒｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎ）から市販されている。他の噴霧装置には、Ｒｅｓｐｉｍａｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）や、例えばＬｌｏｙｄらの米国特許第６，１２３，０６８号およびＷＯ９７／１２６８７（Ｅｉｃｈｅｒら）に記載されているものが含まれる。その開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００６２】
噴霧型吸入器で用いるための代表的な医薬品組成物は、約０．０５μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍｌの式Ｉの結晶性化合物または薬剤として許容されるその溶媒和物を含む水溶液を含む。一実施形態では、水性配合物は等張性である。一実施形態では、水性配合物は約４〜６の範囲のｐＨである。特定の実施形態では、水性配合物はクエン酸塩緩衝剤で緩衝させて約５のｐＨにしたものである。他の特定の実施形態では、水性配合物は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの遊離塩基相当物を含む。
【００６３】
本発明の他の特定の実施形態では、活性剤を含む医薬品組成物を、ＤＰＩを用いた吸入によって投与する。そうしたＤＰＩは一般に活性剤を、吸気の際に患者の気流中に分散される自由流動性粉末として投与する。自由流動性の粉末を得るために、活性剤は一般にラクトースまたはデンプンなどの適切な賦形剤を用いて配合する。微粒化は、結晶サイズを肺送達に適したサイズに小さくする一般的な方法である。通常、活性剤を微粒化し、適切な担体と混合して吸入できるサイズの微粒化粒子の懸濁液を形成させる。ここで、「微粒化した粒子」または「微粒化した形態」とは、粒子の少なくとも約９０％が約１０μｍ未満の直径を有することを意味する。所望の粒子サイズが得られる限り、微細ミリング、裁断、破砕、粉砕、ミリング、篩別、摩砕、粉状化などの粒子サイズを小さくする他の方法も用いることができる。
【００６４】
ＤＰＩで用いるための代表的な医薬品組成物は、約１μｍ〜約１００μｍの粒子サイズを有する乾燥ラクトースと、Ｉの結晶性化合物または薬剤として許容されるその溶媒和物の微粒化した粒子を含む。そうした乾燥粉末配合は、例えば、ラクトースを活性剤と混合し、次いでその成分をドライブレンドすることによって作製することができる。あるいは、望むなら、活性剤を賦形剤なしで配合することができる。次いで医薬品組成物は一般に、乾燥粉末送達装置で用いるために、乾燥粉末分注器中か、または吸入カートリッジもしくはカプセル剤に詰め込むことができる。
【００６５】
ＤＰＩ送達装置の例には、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ；例えば、Ｎｅｗｅｌｌらの米国特許第５，０３５，２３７号参照）；Ｄｉｓｋｕｓ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、Ｄａｖｉｅｓらの米国特許第６，３７８，５１９号参照）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ；例えば、Ｗｅｔｔｅｒｌｉｎの米国特許第４，５２４，７６９号参照）；Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；例えば、Ｈａｌｌｗｏｒｔｈらの米国特許第４，３５３，３６５号参照）およびＨａｎｄｉｈａｌｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が含まれる。適切なＤＰＩ装置の他の例は、Ｃａｓｐｅｒらの米国特許第５，４１５，１６２号、Ｅｖａｎｓらの米国特許第５，２３９，９９３号ならびにＡｒｍｓｔｒｏｎｇらの米国特許第５，７１５，８１０号およびその中の引用文献に記載されている。上記特許の開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００６６】
本発明のさらに他の具体的な実施形態では、活性剤を含む医薬品組成物を、ＭＤＩを用いて吸入により投与する。ＭＤＩは一般に、圧縮噴射ガスを用いて、一定量の活性剤あるいは薬剤として許容されるその塩もしくは溶媒和物または立体異性体を放出する。したがって、ＭＤＩを用いて投与される医薬品組成物は一般に、活性剤の液化噴射剤中の溶液または懸濁液を含む。ＣＣｌ３Ｆなどのクロロフルオロカーボンや、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ２２７）などのヒドロフルオロアルカン（ＨＦＡ）を含む適切な任意の液化噴射剤を用いることができる。オゾン層への影響を及ぼすクロロフルオロカーボンに対する懸念があるため、ＨＦＡを含む配合物が一般に好ましい。ＨＦＡ配合物の他の任意選択の成分には、エタノールまたはペンタンなどの共溶媒や、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチンおよびグリセリンなどの界面活性剤が含まれる。例えば、Ｐｕｒｅｗａｌらの米国特許第５，２２５，１８３号、欧州特許第０７１７９８７Ａ２号（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびＷＯ９２／２２２８６（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。その開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００６７】
計量式吸入器で用いるための代表的な医薬品組成物は約０．０１〜５重量％の式Ｉの結晶性化合物または薬剤として許容されるその溶媒和物；約０〜２０重量％のエタノール；および約０〜５重量％の界面活性剤を含み、その残りはＨＦＡ噴射剤である。
【００６８】
そうした組成物は一般に、冷却または圧縮したヒドロフルオロアルカンを、活性剤、エタノール（存在する場合）および界面活性剤（存在する場合）を含む適切な容器に加えて調製する。懸濁液を調製するためには、活性剤を微粒化し、次いで噴射剤と一緒にする。次いで配合物を計量式吸入器装置の一部をなすエアロゾル小型容器に詰め込む。ＨＦＡ噴射剤を用いて使用するために特に開発された計量式吸入器装置の例は、Ｍａｒｅｃｋｉの米国特許第６，００６，７４５号およびＡｓｈｕｒｓｔらの同第６，１４３，２７７号に記載されている。あるいは、懸濁液配合物は、活性剤の微粒化粒子上への界面活性剤のコーティング物を噴霧乾燥することによって調製することができる。例えばＷＯ９９／５３９０１（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）およびＷＯ００／６１１０８（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）を参照されたい。上記特許および出願の開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００６９】
吸入投薬に適した呼吸用の粒子の調製方法、および配合物ならびに装置の他の例については、Ｇａｏらの米国特許第６，２６８，５３３号、Ｔｒｏｆａｓｔの米国特許第５，９８３，９５６号；Ｂｒｉｇｇｎｅｒらの米国特許第５，８７４，０６３号；およびＪａｋｕｐｏｖｉｃらの米国特許第６，２２１，３９８号；ならびにＷＯ９９／５５３１９（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）およびＷＯ００／３０６１４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  ＡＢ）を参照されたい。その開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００７０】
他の実施形態では、本発明の医薬品組成物は経口投与に適している。経口投与のために適した医薬品組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カシェ剤、糖衣錠、粉末、顆粒剤の形態；または、水性もしくは非水性液体中の液剤または懸濁剤として；または、水注油型もしくは油中水型乳剤として；または、エリキシル剤もしくはシロップ剤などとしてであってよい。それぞれ、活性成分として所定量の本発明の塩を含む。医薬品組成物は単位剤形で包装することができる。
【００７１】
固体剤形（すなわち、カプセル剤、錠剤、丸剤などとして）で経口投与しようとする場合、本発明の医薬品組成物は一般に、活性成分としての本発明の結晶性化合物と、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどの１種または複数の薬剤として許容される担体を含む。そうした固体剤形は、任意選択的または代替的に、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸などの充てん剤すなわち増量剤；カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解遅延剤；四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セチルアルコールおよび／またはグリセロールモノステアレートなどの湿潤剤；カオリンおよび／またはベントナイト粘土などの吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよび／またはその混合物などの滑剤；着色剤ならびに緩衝剤を含むこともできる。
【００７２】
離型剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味剤および芳香剤、保存剤ならびに抗酸化剤が本発明の医薬品組成物中に存在してもよい。薬剤として許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属−キレート剤が含まれる。錠剤、カプセル剤、丸剤などのためのコーティング剤には、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸エステルコポリマー、セルロースアセテートトリメリレート（ＣＡＴ）、カルボキシメチルエチルセルロース（ＣＭＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）などの腸溶コーティングに用いるものが含まれる。
【００７３】
望むなら、本発明の医薬品組成物は、例えば、様々な特性のヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、活性成分の持続放出または制御放出をもたらすように配合することもできる。
【００７４】
さらに、本発明の医薬品組成物は任意選択で乳白剤を含むことができ、胃腸管の特定の部位において遅延した形で、活性成分だけかまたはそれを優先的に放出するように配合することができる。用いることができる埋め込み型組成物の例には、ポリマー系物質やワックスが含まれる。適切な場合、１種または複数の上記賦形剤を用いて、活性成分をマイクロカプセル化した形態にすることもできる。
【００７５】
経口投与用の適切な液状剤形には、例えば薬剤として許容される乳剤、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。そうした液状剤形は一般に、活性成分、不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤、ならび乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジ、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油類（特に綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物などを含む。懸濁剤は、活性成分に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物などの懸濁化剤を含むことができる。
【００７６】
本発明の結晶性化合物は、既知の経皮送達系および賦形剤を用いて経皮的に投与することもできる。例えば、本発明の化合物を、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールモノラウレート、アザシクロアルカン−２−オンなどの浸透促進剤と混合し、パッチまたは類似の送達系に組み込むことができる。望むなら、そうした経皮組成物中に、ゲル化剤、乳化剤および緩衝剤を含む他の賦形剤も用いることができる。
【００７７】
本発明の結晶性化合物は他の治療剤と併用投与することもできる。この併用療法は、一緒に配合する（例えば、単一の配合物中に一緒に包装する）かまたは別個に配合して（例えば、別個の単位剤形として包装する）、これらの第２の薬剤の１つまたは複数と一緒に本発明の化合物を用いることを含む。複数の薬剤を同一の配合物中に一緒にするか、または別個の単位剤形にする方法は当業界で周知である。
【００７８】
他の治療剤は、他の気管支拡張薬（例えば、ＰＤＥ３阻害剤、アデノシン２ｂ修飾因子およびβ２アドレナリン作動性受容体作用薬）；抗炎症剤（例えば、コルチコステロイドなどのステロイド系抗炎症剤；非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）およびＰＤＥ４阻害剤）；他のムスカリン性受容体拮抗薬（すなわち、抗コリン剤（ａｎｔｉｃｈｌｏｌｉｎｅｒｉｃ  ａｇｅｎｔ））；抗炎症薬（例えば、グラム陽性およびグラム陰性抗生物質または抗ウイルス剤）；抗ヒスタミン剤；プロテアーゼ阻害剤ならびに求心性遮断薬（例えば、Ｄ２作用薬およびニューロキニン修飾因子）から選択することができる。
【００７９】
本発明の１つの特定の実施形態は、（ａ）薬剤として許容される担体および治療有効量の式Ｉの化合物の結晶形と、（ｂ）薬剤として許容される担体、およびコルチコステロイド；β２アドレナリン作動性受容体作用薬；ホスホジエステラーゼ−４阻害剤；またはその組合せなどのステロイド系抗炎症剤から選択される治療有効量の薬剤とを含む組成物であって、その式Ｉの化合物と上記薬剤を一緒かまたは別個に配合する組成物を対象とする。他の実施形態では、（ｂ）は薬剤として許容される担体と、治療有効量のβ２アドレナリン作動性受容体作用薬およびステロイド系抗炎症剤である。第２の薬剤は、薬剤として許容される塩または溶媒和物の形態で、適切な場合、光学的に純粋な立体異性体として用いることができる。
【００８０】
本発明の結晶性化合物と併用できる代表的なβ２アドレナリン作動性受容体作用薬には、これらに限定されないが、サルメテロール、サルブタモール、フォルモテロール、サルメテロール、フェノテロール、テルブタリン、アルブテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ビトルテロール、ピルブテロール、レバルブテロール等、または薬剤として許容されるその塩が含まれる。用いることができる他のβ２アドレナリン作動性受容体作用薬には、これらに限定されないが、３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−フェニル］エチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミドおよび３−（−３−｛［７−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝−アミノ）ヘプチル］オキシ｝−プロピル）ベンゼンスルホンアミドおよびＷＯ０２／０６６４２２に記載の関連化合物（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）；３−［３−（４−｛［６−（［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−フェニル］イミダゾリジン−２，４−ジオンおよびＷＯ０２／０７０４９０（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）に記載の関連化合物；３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、３−（４−｛［６−（｛（２Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ／Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ／Ｓ）−２−［３−（ホルミルアミノ）−４−ヒドロキシフェニル］−２−ヒドロキシエチル｝アミノ）−ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミドおよびＷＯ０２／０７６９３３に記載の関連化合物（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）；４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛２−［（２，６−ジクロロベンジル）オキシ］エトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノールおよびＷＯ０３／０２４４３９に記載の関連化合物（Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）；Ｎ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェ���ル）エチルアミンおよびＭｏｒａｎらの米国特許第６，５７６，７９３号に記載の関連化合物；Ｎ−｛２−［４−（３−フェニル−４−メトキシフェニル）アミノフェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノリン−５−イル）エチルアミンおよびＭｏｒａｎらの米国特許第６，６５３，３２３号に記載の関連化合物；ならびに薬剤として許容されるその塩が含まれる。特定の実施形態では、β２−アドレナリン受容体作用薬は、Ｎ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミンの結晶性モノ塩酸塩である。用いる場合、β２−アドレナリン受容体作用薬は医薬品組成物中に治療有効量で存在する。一般に、β２−アドレナリン受容体作用薬は、用量当たり約０．０５μｇ〜５００μｇを提供するのに十分な量で存在する。上記特許および出願の開示全体を参照により本明細書に組み込む。
【００８１】
本発明の結晶性化合物と併用できる代表的なステロイド系抗炎症剤には、これらに限定されないが、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロフラン−３Ｓ−イル）エステル、ベクロメタゾンエステル（例えば、１７−プロピオン酸エステルまたは１７，２１−二プロピオン酸エステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（例えば、フロ酸エステル）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド、ブチクソコートプロピオネート（ｂｕｔｉｘｏｃｏｒｔ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＲＰＲ−１０６５４１、ＳＴ−１２６などまたは薬剤として許容されるその塩である。用いる場合、ステロイド系抗炎症剤は組成物中に治療有効量で存在する。一般に、ステロイド系抗炎症剤は、用量当たり約０．０５μｇ〜５００μｇを提供するのに十分な量で存在する。
【００８２】
組合せの例は、β２アドレナリン作動性受容体作用薬としてのサルメテロール、およびステロイド系抗炎症剤としてのプロピオン酸フルチカゾンと同時投与される式Ｉの化合物の結晶形またはその溶媒和物である。他の組合せの例は、β２−アドレナリン受容体作用薬としてのＮ−｛２−［４−（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−フェニルエチルアミノ）フェニル］エチル｝−（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−（３−ホルムアミド−４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン、およびステロイド系抗炎症剤としての６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソアンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルの結晶性モノ塩酸塩と同時投与される式Ｉの化合物の結晶形またはその溶媒和物である。上記のようにこれらの薬剤は一緒にも別個にも配合することができる。
【００８３】
他の適切な組合せには、例えば、他の抗炎症剤、例えばＮＳＡＩＤ（例えば、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ならびにテオフィリンなどのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤および混合ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤）；ロイコトリエン拮抗薬（例えば、モンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｅｕｋａｓｔ））；ロイコトリエン合成の阻害剤；ｉＮＯＳ阻害剤；トリプターゼおよびエラスターゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤；β−２インテグリン拮抗薬およびアデノシン受容体作用薬または拮抗薬（例えば、アデノシン２ａ作用薬）；サイトカイン拮抗薬（例えば、インターロイキン抗体（αＩＬ抗体）、特に、αＩＬ−４治療薬、αＩＬ−１３治療薬またはその組合せなどのケモカイン拮抗薬）；あるいはサイトカイン合成の阻害剤が含まれる。
【００８４】
本発明の結晶性化合物と併用できる代表的なホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）阻害剤または混合ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害剤は、これらに限定されないが、シス４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オン；シス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシフェニル）シクロヘキサン−１−オル］；シス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロヘキサン−１−カルボン酸など、または薬剤として許容されるその塩が含まれる。他の代表的なＰＤＥ４または混合ＰＤＥ４／ＰＤＥ３阻害剤には、ＡＷＤ−１２−２８１（ｅｌｂｉｏｎ）；ＮＣＳ−６１３（ＩＮＳＥＲＭ）；Ｄ−４４１８（Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）；ＣＩ−１０１８またはＰＤ−１６８７８７（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＷＯ９９／１６７６６に記載のベンゾジオキソール化合物（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）；Ｋ−３４（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ）；Ｖ−１１２９４Ａ（Ｎａｐｐ）；ロフルミラスト（ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ）（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）；ＷＯ９９／４７５０５に記載のフタラジノン化合物（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）；プマフェントリン（Ｐｕｍａｆｅｎｔｒｉｎｅ）（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ、現在Ａｌｔａｎａである）；アロフィリン（ａｒｏｆｙｌｌｉｎｅ）（Ａｌｍｉｒａｌｌ−Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａ）；ＶＭ５５４／ＵＭ５６５（Ｖｅｒｎａｌｉｓ）；Ｔ−４４０（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ）；およびＴ２５８５（Ｔａｎａｂｅ  Ｓｅｉｙａｋｕ）が含まれる。
【００８５】
本発明の結晶性化合物と併用できる代表的なムスカリン性拮抗薬（すなわち、抗コリン剤）には、これらに限定されないが、アトロピン、硫酸アトロピン、酸化アトロピン、硝酸メチルアトロピン、臭化水素酸ホマトロピン、臭化水素酸ヒヨスチアミン（ｄ、ｌ）、臭化水素酸スコポラミン、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、臭化チオトロピウム、メタンテリン、臭化プロパンテリン、臭化メチルアニソトロピン、臭化クリジニウム、コピロレート（ｃｏｐｙｒｒｏｌａｔｅ）（Ｒｏｂｉｎｕｌ）、ヨウ化イソプロパミド、臭化メペンゾラート、塩化トリジヘキセチル（Ｐａｔｈｉｌｏｎｅ）、メチル硫酸ヘキソシクリウム、塩酸シクロペントレート、トロピカミド、塩酸トリヘキシフェニジル、ピレンゼピン、テレンゼピン、ＡＦ−ＤＸ１１６およびメトクトラミンなど、または薬剤として許容されるその塩；あるいは、塩として挙げた化合物についての、代替の薬剤として許容されるその塩が含まれる。
【００８６】
代表的な抗ヒスタミン剤（すなわち、Ｈ１−受容体拮抗薬）には、これらに限定されないが、マレイン酸カルビノキサミン、フマル酸クレマスチン、塩酸ジフェニルヒドラミンおよびジメンヒドリナートなどのエタノールアミン；マレイン酸ピリラミン、塩酸トリペレナミンおよびクエン酸トリペレナミンなどのエチレンジアミン；クロルフェニラミンおよびアクリバスチンなどのアルキルアミン；塩酸ヒドロキシジン、パモ酸ヒドロキシジン、塩酸シクリジン、乳酸シクリジン、塩酸メクリジンおよび塩酸セチリジンなどのピペラジン；アステミゾール、塩酸レボカバスチン、ロラタジンまたはそのデスカルボエトキシ類似体、テルフェナジンおよび塩酸フェキソフェナジンなどのピペリジン；塩酸アゼラスチン；などまたは薬剤として許容されるその塩；あるいは、塩として挙げた化合物についての、代替の薬剤として許容されるその塩が含まれる。
【００８７】
別段の指定のない限り、本発明の結晶性化合物と併用投与される他の治療剤の適切な用量の例は、約０．０５μｇ／日〜１００ｍｇ／日の範囲である。
【００８８】
以下の配合は、本発明の代表的な医薬品組成物、ならびに調製方法の例を示す。１種または複数の第２の薬剤を、本発明の結晶性化合物（第１活性剤）と任意選択で配合することができる。あるいは、第２の薬剤を別個に配合し、同時にかまたは逐次的に第１活性剤と共投与することができる。例えば、一実施形態では、単一の乾燥粉末配合物を、本発明の結晶性化合物と１種または複数の第２の薬剤の両方を含むように作製することができる。他の実施形態では、１つの配合物を、本発明の結晶性化合物を含むように作製し、別の配合物を、第２の薬剤を含むように作製する。次いでそうした乾燥粉末配合物を、分離されたブリスターパックに包装し、単一のＤＰＩ装置で投与することができる。
吸入による投与のための乾燥粉末配合物の例
０．２ｍｇの本発明の結晶性化合物を微粒化し、次いで２５ｍｇのラクトースと配合する。次いで配合混合物をゼラチン吸入カートリッジに詰め込む。カートリッジの内容物を、粉末吸入器を用いて投与する。
乾燥粉末吸入器による投与のための乾燥粉末配合物の例
乾燥粉末を、本発明の微粒化結晶性化合物（活性剤）とラクトースのバルク配合物比が１：２００を有するように調製する。その粉末を、用量当たり約１０μｇ〜１００μｇの活性剤を送達できる乾燥粉末吸入装置に充てんする。
計量式吸入器による投与のための配合物の例
２００ｍｌの脱塩水中に溶解した０．２ｇのレシチンから生成した溶液中に、１０ｇの活性剤を１０μｍ未満の平均サイズを有する微粒化粒子として分散させて、５重量％の本発明の結晶性化合物（活性剤）と０．１重量％のレシチンを含む懸濁液を調製する。懸濁液を噴霧乾燥し、得られた材料を１．５μｍ未満の平均径を有する粒子に微粒化する。粒子を、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンを用いてカートリッジに充てんする。
【００８９】
あるいは、５ｇの活性剤を、１００ｍｌの脱塩水中に溶解した０．５ｇのトレハロースと０．５ｇのレシチンから形成させたコロイド状溶液中に、１０μｍ未満の平均サイズを有する微粒化粒子として分散させて、５重量％の活性剤、０．５重量％のレシチンおよび０．５重量％のトレハロースを含む懸濁液を調製する。懸濁液を噴霧乾燥し、得られた材料を、１．５μｍ未満の平均径を有する粒子に微粒化する。粒子を、加圧された１，１，１，２−テトラフルオロエタンを用いて小型容器に充てんする。
噴霧器による投与のための水性エアロゾル配合物の例
医薬品組成物を、０．５ｍｇの本発明の結晶性化合物（活性剤）をクエン酸で酸性化させた１ｍｌの０．９％塩化ナトリウム溶液中に溶解させて調製する。混合液を撹拌し、活性剤が溶解するまで超音波にかける。ＮａＯＨを徐々に加えて、溶液のｐＨを３〜８（典型的には約５）の範囲の値に調節する。
経口投与のための硬質ゼラチンカプセル配合物の例
以下の成分、すなわち、２５０ｍｇの本発明の結晶性化合物、２００ｍｇのラクトース（噴霧乾燥品）および１０ｍｇのステアリン酸マグネシウムを十分に配合し、次いで硬質ゼラチンカプセル中に充てんする。カプセル当たり合計４６０ｍｇの組成物である。
経口投与のための懸濁配合物の例
以下の成分を混合して、懸濁液１０ｍＬ当たり１００ｍｇの活性成分を含む懸濁剤を形成させる。
【００９０】
【表１】
2008533036.tif 000003
注入可能な配合物の例
以下の成分を配合し、０．５Ｎ  ＨＣｌまたは０．５Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨを４±０．５に調節する。
【００９１】
【表２】
2008533036.tif 000004
有用性
式Ｉの化合物はムスカリン性受容体拮抗活性を有しており、したがって式Ｉの化合物の結晶形は、ムスカリン性受容体によって媒介される病状、すなわちムスカリン性受容体拮抗薬を用いた治療によって改善される病状を治療するのに有用であると期待される。そうした病状には、例えば、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性および喘息様の気管支炎、および肺気腫）、喘息、肺線維症、アレルギー性鼻炎、鼻漏などの可逆性気道閉塞に付随するものを含む肺障害または疾患が含まれる。ムスカリン性受容体拮抗薬で治療できる他の病状は、過活動膀胱または排尿筋過反射およびその症状などの泌尿生殖器障害；過敏性腸症候群、憩室疾患、アカラシア、胃腸管運動過剰障害および下痢などの胃腸管障害；洞性徐脈などの心不整脈；パーキンソン病；アルツハイマー病などの認識障害；月経困難症（ｄｉｓｍｅｎｏｒｒｈｅａ）などである。
【００９２】
したがって、一実施形態では、本発明は、肺障害を治療する方法であって、治療有効量の結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルまたは薬剤として許容されるその溶媒和物を患者に投与することを含む方法を対象とする。肺障害を治療するのに用いる場合、本発明の結晶性化合物は一般に１日当たり複数用量、単一の日量または単一の週量で吸入により投与する。一般に、肺障害を治療するための用量は約１０μｇ／日〜２００μｇ／日である。
【００９３】
吸入により投与する場合、本発明の結晶性化合物は一般に気管支拡張をもたらす効果を有している。したがって、他の実施形態では、本発明は、患者に気管支拡張をもたらすための方法であって、気管支拡張をもたらす量の結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルまたは薬剤として許容されるその溶媒和物を患者に投与することを含む方法を対象とする。一般に、気管支拡張をもたらすための治療有効用量は約１０μｇ／日〜２００μｇ／日の範囲である。
【００９４】
一実施形態では、本発明は、慢性閉塞性肺疾患または喘息を治療するための方法であって、治療有効量の結晶性ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルまたは薬剤として許容されるその溶媒和物を患者に投与することを含む方法を対象とする。ＣＯＰＤまたは喘息を治療するのに用いる場合、本発明の塩は一般に１日当たり複数用量または単一の日量で吸入により投与する。一般に、ＣＯＰＤまたは喘息を治療するための用量は約１０μｇ／日〜２００μｇ／日の範囲である。本明細書で用いるＣＯＰＤは、慢性の閉塞性気管支炎および肺気腫を含む（例えば、Ｂａｒｎｅｓ，ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：２６９〜７８頁（２０００年）を参照されたい）。
【００９５】
肺障害を治療するのに用いる場合、本発明の結晶性化合物を、任意選択で他の治療剤と併用して投与する。したがって、特定の実施形態では、本発明の医薬品組成物および方法は、治療有効量のβ２−アドレナリン受容体作用薬、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症剤またはその組合せをさらに含む。
【００９６】
他の実施形態では、本発明の結晶性化合物は、生体系、およびマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトなどの哺乳動物において、ムスカリン性受容体に拮抗させるために用いる。この実施形態では、治療有効量の式Ｉの結晶性化合物を哺乳動物に投与する。望むなら、次いでムスカリン性受容体を拮抗させる効果を、従来の手順および装置を用いて測定することができる。
【００９７】
本発明の結晶性化合物の特性および有用性は、当業者によく知られているインビトロおよびインビボでの様々なアッセイを用いて実証することができる。例えば、代表的なアッセイを以下の実施例でさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００９８】
本発明の具体的な実施形態を説明するために以下の調製方法および実施例を示す。しかし、別段の指定のない限り、これらの具体的な実施形態は本発明の範囲を限定するものではない。別段の指定のない限り、以下の略語は以下の意味を有しており、本明細書で用いられ、かつ定義されていない他のどの略語もその標準的な意味を有するものとする。
【００９９】
ＡＣ          アデニリルシクラーゼ
ＡＣｈ        アセチルコリン
ＡＣＮ        アセトニトリル
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ      ３’−５’一リン酸環状アデノシン
ＣＨＯ        チャイニーズハムスター卵巣由来
ｃＭ５        クローンチンパンジーＭ５受容体
ＤＣＭ        ジクロロメタン（すなわち、塩化メチレン）
ＤＩＰＥＡ    Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ｄＰＢＳ      ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＤＭＳＯ      ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ        １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ        ウシ胎仔血清
ＦＬＩＰＲ    蛍光イメージングプレートリーダー
ＨＢＳＳ      ハンクス緩衝塩溶液
ＨＥＰＥＳ    ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ｈＭ１        クローン化ヒトＭ１受容体
ｈＭ２        クローン化ヒトＭ２受容体
ｈＭ３        クローン化ヒトＭ３受容体
ｈＭ４        クローン化ヒトＭ４受容体
ｈＭ５        クローン化ヒトＭ５受容体
ＨＯＢＴ      Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ      高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ        イソプロパノール
ＭＣｈ        メチルコリン
ＭＴＢＥ      メチルｔ−ブチルエーテル
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
本明細書で用いる定義されていない他のどの略語も、標準的な一般に受け入れられている意味を有する。別段の言及のない限り、試薬、出発材料および溶媒は供給業者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｆｌｕｋａなど）から購入したものであり、さらに精製することなくそれらを用いた。
【０１００】
別段の指定のない限り、ＨＰＬＣ分析は３．５ミクロンの粒子サイズを有するＺｏｒｂａｘＢｏｎｕｓ  ＲＰ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｓｅｒｉｅｓ１１００装置を用いて実施した。吸収は２１４ｎｍでのＵＶ吸収によった。用いた移動相は以下のものである（容積で）：ＡはＡＣＮ（２％）、水（９８％）およびＴＦＡ（０．１％）であり、Ｂはアセトニトリル（９０％）、水（１０％）およびＴＦＡ（０．１％）である。ＨＰＬＣ１０−７０データは、６分間にわたる勾配で０．５ｍＬ／分の流速の１０〜７０％Ｂ（残りはＡ）を用いて得た。同様に、ＨＰＬＣ５−３５データおよびＨＰＬＣ１０−９０データは５分間にわたる勾配で５〜３５％Ｂ；または１０〜９０％Ｂを用いて得た。
【０１０１】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）データはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）Ｍｏｄｅｌ  ＡＰＩ−１５０ＥＸ装置を用いて得た。
【０１０２】
ＬＣＭＳ１０−９０データは５分間にわたる勾配で１０〜９０％移動相Ｂを用いて得た。
【０１０３】
（調製１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル
ビフェニル−２−イソシアネート（９７．５ｇ、５２１ミリモル）と４−ヒドロキシ−Ｎ−ベンジルピペリジン（１０５ｇ、５４９ミリモル）を７０℃で１２時間一緒に加熱した。次いで反応混合物を５０℃に冷却し、エタノール（１Ｌ）を加え、次いで６Ｍ  ＨＣｌ（１９１ｍＬ）を徐々に加えた。次いで得られた混合物を周囲温度に冷却し、ギ酸アンモニウム（９８．５ｇ、１．５６モル）を加え、溶液を通して窒素ガスを２０分間強力にバブリングさせた。次いで活性炭担持パラジウム（２０ｇ、１０重量％乾燥ベース）を加え、反応混合物を４０℃で１２時間加熱し、次いでセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）充填物を通してろ過した。次いで溶媒を減圧下で除去し、１Ｍ  ＨＣｌ（４０ｍＬ）を粗製残留物に加えた。次いで、１０Ｎ  ＮａＯＨで混合物のｐＨをｐＨ１２に調節した。水層を酢酸エチル（２×１５０ｍＬ）で抽出し、有機層を脱水し（硫酸マグネシウム）、ろ過し、溶媒を減圧下で除去して１５５ｇの標記中間体（１００％収率）を得た。ＨＰＬＣ（１０−７０）Ｒｔ＝２．５２；ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］  Ｃ１８Ｈ２０Ｎ２Ｏ２について計算して  ２９７．１５；結果２９７．３。
【０１０４】
（調製２）
Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノアセトアルデヒド
３ッ口の２Ｌフラスコに、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（３０．５ｇ、０．１８２モル）、ＤＣＭ（０．５Ｌ）、ＤＩＰＥＡ（９５ｍＬ、０．５４６モル）およびＤＭＳＯ（４１ｍＬ、０．７２８モル）を加えた。氷浴を用いて、混合物を約−１０℃に冷却し、三酸化硫黄ピリジン錯体（８７ｇ、０．５４６モル）を４分割して５分間隔で加えた。反応液を−１０℃で２時間撹拌した。氷浴を取り外す前に、水（０．５Ｌ）を加えて反応をクエンチした。水層を分離し、有機層を水（０．５Ｌ）とブライン（０．５Ｌ）で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過して標記化合物を得た。さらに精製することなくこれを使用した。
【０１０５】
（調製３）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（ベンジルメチルアミノ）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
ＤＣＭ（０．５Ｌ）中に調製２の生成物を含む２Ｌフラスコに、調製１の生成物（３０ｇ、０．１０１モル）を加え、続いてナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（４５ｇ、０．２０２モル）を加えた。反応混合物を終夜撹拌し、次いで、激しく撹拌しながら１Ｎ塩酸（０．５Ｌ）を加えてクエンチした。３つの層が認められ、水層を除去した。１Ｎ  ＮａＯＨ（０．５Ｌ）で洗浄した後、均一な有機層を得た。次いでこれをＮａＣｌの飽和水溶液（０．５Ｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を最少量のイソプロパノールに溶解して精製し、この溶液を０℃に冷却して固体が生成した。これを集め、冷イソプロパノールで洗浄して４２．６ｇの標記化合物（９５％収率）を得た。ＭＳｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］  Ｃ２８Ｈ３３Ｎ３Ｏ２について計算して  ４４４．３；結果４４４．６．Ｒｆ＝３．５１分（１０−７０ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、逆相ＨＰＬＣ）。
【０１０６】
（調製３Ａ）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−［２−（ベンジルメチルアミノ）エチル］ピペリジン−４−イルエステル
標記化合物を、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンをメシル化し、次いでこれをアルキル化反応でビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステルと反応させて調製した。
【０１０７】
５００ｍＬフラスコ（反応器フラスコ）に、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（２４．５ｍＬ）、ＤＣＭ（１２０ｍＬ）、ＮａＯＨ（８０ｍＬ；３０ｗｔ％）およびテトラブチルアンモニウムクロライドを入れた。反応を通して低速で混合しながら、混合物を−１０℃（冷却浴）に冷却し、添加漏斗でＤＣＭ（３０ｍＬ）および塩化メシル（１５．８５ｍＬ）を入れた。これを、一定速度で３０分間かけて滴下した。添加は発熱的であった。撹拌を１５分間続行し、その間温度は−１０℃に戻って平衡に達した。反応を少なくとも１０分間保持して、過剰の塩化メシルを確実にかつ完全に加水分解させた。
【０１０８】
２５０ｍＬフラスコに、ビフェニル−２−イルカルバミン酸ピペリジン−４−イルエステル（２６ｇ；調製１に記載のようにして調製した）とＤＣＭ（１２５ｍＬ）を入れ、室温で１５分間撹拌し、混合物を短時間冷却して１０℃にするとスラリーが生成した。次いで、スラリーを添加漏斗で反応器フラスコに入れた。冷却浴を取り外し、反応混合物を５℃に加温した。混合物を分液漏斗に移し、各層を静置し、水層を除去した。有機層を反応器フラスコに戻し、撹拌を再開し、混合物を室温に保持し、反応をＨＰＬＣで合計３．５時間監視した。
【０１０９】
反応器フラスコにＮａＯＨ（１Ｍ溶液；１００ｍＬ）を入れ、撹拌し、各層を静置した。有機層を分離し、洗浄し（ＮａＣｌ飽和溶液）、真空下で容積を一部減らし、ＩＰＡによる反復洗浄にかけた。固形分を集め、空気乾燥させた（２５．８５ｇ、９８％純度）。母液をさらに処理して追加の固形分を得た（容積削減、ＩＰＡ、冷却）。
【０１１０】
（調製４）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−メチルアミノエチル）ピペリジン−４−イルエステル
Ｐａｒｒ型水素化フラスコに、調製３の生成物（４０ｇ、０．０９モル）とエタノール（０．５Ｌ）を加えた。フラスコを窒素ガスでフラッシュし、酢酸（２０ｍＬ）と一緒に活性炭担持パラジウム（１５ｇ、１０重量％（乾燥ベース）、３７％重量／重量）を加えた。混合物を、水素雰囲気（約５０ｐｓｉ）下で３時間Ｐａｒｒ型水素化器に保持した。次いで、混合物をろ過し、エタノールで洗浄した。ろ液を濃縮し、残留物を最少量のＤＣＭに溶解した。酢酸イソプロピル（１０容積）を徐々に加えて固形物を形成させ、これを集めて２２．０ｇの標記化合物（７０％収率）を得た。ＭＳｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］  Ｃ２１Ｈ２７Ｎ３Ｏ２について計算して  ３５４．２；結果３５４．３．Ｒｆ＝２．９６分（１０−７０ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、逆相ＨＰＬＣ）。
【０１１１】
（調製５）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−｛２−［（４−ホルミルベンゾイル）メチルアミノ］エチル｝ピペリジン−４−イルエステル
３ッ口の１Ｌフラスコに、４−カルボキシベンズアルデヒド（４．７７ｇ、３１．８ミリモル）、ＥＤＣ（６．６４ｇ、３４．７ミリモル）、ＨＯＢＴ（１．９１ｇ、３１．８ミリモル）およびＤＣＭ（２００ｍＬ）を加えた。混合物が均一である場合、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の調製４の生成物（１０ｇ、３１．８ミリモル）の溶液を徐々に加えた。反応混合物を室温で約１６時間撹拌し、次いで水（１×１００ｍＬ）、１Ｎ  ＨＣｌ（５×６０ｍＬ）、１Ｎ  ＮａＯＨ（１×１００ｍＬ）ブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、濃縮して１２．６ｇの標記化合物（９２％収率；ＨＰＬＣにより８５％純度）を得た。ＭＳｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］  Ｃ２９Ｈ３１Ｎ３Ｏ４について計算して  ４８６．２；結果４８６．４．Ｒｆ＝３．１２分（１０−７０ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、逆相ＨＰＬＣ）。
【０１１２】
（実施例１）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル
【０１１３】
【化２】
2008533036.tif 000005
３ッ口の２Ｌフラスコに、イソニペコタミド（５．９９ｇ、４０．０ミリモル）、酢酸（２．５７ｍＬ）、硫酸ナトリウム（６．４４ｇ）およびイソプロパノール（４００ｍＬ）を加えた。反応混合物を氷浴で０〜１０℃に冷却し、イソプロパノール（３００ｍＬ）中のビフェニル−２−イルカルバミン酸１−｛２−［（４−ホルミルベンゾイル）メチルアミノ］エチル｝ピペリジン−４−イルエステル（１１ｇ、２２．７ミリモル；調製５に記載のようにして調製した）の溶液を徐々に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで０〜１０℃に冷却した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１５．１６ｇ、６８．５ミリモル）を分割して加え、この混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで反応混合物を減圧下で約５０ｍＬの容積まで濃縮し、この混合物を１Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）で酸性化してｐＨ３にした。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、次いでＤＣＭ（３×２５０ｍＬ）で抽出した。次いで水相を氷浴で０〜５℃に冷却し、５０％ＮａＯＨ水溶液を加えて混合物のｐＨを１０に調節した。次いでこの混合物を酢酸イソプロピル（３×３００ｍＬ）で抽出し、一緒にした有機層を水（１００ｍＬ）、ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過し、濃縮して１０．８ｇの標記化合物（８０％収率を得た。ＭＳｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］  Ｃ３５Ｈ４３Ｎ５Ｏ４について計算して  ５９８．３；結果５９８．６．Ｒｆ＝２．３２分（１０−７０ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、逆相ＨＰＬＣ）。
【０１１４】
（実施例２）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二リン酸塩
５００ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（０．８２６ミリモルの９６％純度の材料；実施例１に記載のようにして調製した）を５ｍｌの水および１．５ｍｌの１Ｍリン酸にとった。０．２５ｍｌの１Ｍリン酸（２．１モル当量に等しい）を追加してｐＨを約ｐＨ５．３に調節した。０．２ミクロンフィルターで透明溶液をろ過し、凍結させて、凍結乾燥して無定形の二リン酸塩を得た。
【０１１５】
２０ｍｇの無定形の二リン酸塩を２ｍｌのＩＰＡ：ＡＣＮ（１：１）中に溶解した。０．１ｍｌの水を加え、混合物を撹拌下で６０℃に加熱した。固体のほとんどすべてが溶解した。この懸濁液を、撹拌しながら終夜置いて周囲温度にした。得られた結晶をろ取し、２０分間空気乾燥して標記化合物（１８．５ｍｇ、９３％収率）を白色結晶性固体として得た。偏光を用いて顕微鏡で検査して、結晶はいくらかの複屈折性を示した。
【０１１６】
（実施例３）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二リン酸塩
５．０ｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（遊離塩基；実施例１に記載のようにして調製した）を８０ｍｌのＩＰＡ：ＡＣＮ（１：１）と混合した。４．０ｍｌの水を加え、混合物を撹拌下で５０℃に加熱して透明溶液が形成された。これに、５０℃で１６ｍｌ  １Ｍリン酸を滴下した。得られた濁った溶液を５０℃で５時間撹拌し、次いで終夜緩やかに撹拌しながら周囲温度にした。得られた結晶をろ過し、１時間空気乾燥し、次いで真空下で１８時間乾燥して標記化合物（５．８ｇ、７５％収率）を白色結晶性固体（ＨＰＬＣにより９８．３％純度）として得た。
【０１１７】
（実施例４）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性一硫酸塩
４４２ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（０．７３９ミリモルの９６％純粋な材料；実施例１に記載のようにして調製した）を５ｍｌのＨ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）にとり、ｐＨを監視しながら、１．４５ｍｌの１Ｎ硫酸を徐々に加えた。ｐＨを約ｐＨ３．３に調節した。透明溶液を０．２ミクロンフィルターでろ過し、凍結し、凍結乾燥して一硫酸塩を得た。
【０１１８】
３０．３ｍｇの一硫酸塩を１．６５ｍｌのＩＰＡ：ＡＣＮ（１０：１）に溶解させた。懸濁液を、バイアルを予め加熱した６０℃の水浴中に３０分間置いて加熱した。粘性材料が形成された。３０分間加熱して７０℃に昇温した。材料が粘性のまま保持されたので、加熱を６０℃に低下させ、混合物を１時間さらに加熱した。加熱を停止し、混合物を室温に冷却した。４日後、その材料は固体状になり、試料をさらに９日間置いた。次いでこの固体をろ過し、真空ポンプを用いて１時間乾燥して標記化合物（２３ｍｇ、７６％収率）を得た。
【０１１９】
（実施例５）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性一硫酸塩
１６１ｇの一硫酸塩（実施例４に記載のようにして調製した）を８．７７ｍｌのＩＰＡ：ＡＣＮ（１０：１）に溶解させた。懸濁液を、バイアルを予め加熱した７０℃の水浴中に１．５時間置いて加熱した。５分以内に油滴が形成された。加熱を６０℃に低下させ、続いて、５０℃で４０分間、４０℃で４０分間、次いで３０℃で４５分間加熱した。加熱を停止し、混合物を室温に徐々に冷却した。翌日、顕微鏡下で材料を観察し、それは針状や平板状の形態であった。次いで材料を４０℃で２時間、３５℃で３０分間、次いで３０℃で３０分間に加熱した。加熱を停止し、混合物を室温に徐々に冷却した。次いでこの固体をろ過し、真空ポンプを用いて１時間乾燥して標記化合物（１１７ｍｇ、７３％収率）を得た。
【０１２０】
（実施例６）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二シュウ酸塩
５１０ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（０．８５３ミリモルの９６％純粋な材料；実施例１に記載のようにして調製した）を５ｍｌのＨ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）にとり、ｐＨを監視しながら、１．７ｍｌの１Ｍシュウ酸水溶液を徐々に加えた。ｐＨを約ｐＨ３．０に調節した。透明溶液を０．２ミクロンフィルターでろ過し、凍結し、凍結乾燥凍結乾燥して二シュウ酸塩を得た。
【０１２１】
３１．５ｍｇの二シュウ酸塩を２．７６ｍｌの９４％ＩＰＡ／６％Ｈ２０に溶解させた。混合物を、予め加熱した６０℃の水浴中で２．５時間撹拌した。２５分間後、試料のすべてが溶解していた。加熱を停止し、混合物を室温に冷却した。翌日、少量の粘性材料が見られた。バイアルを４℃で冷蔵した。４日後、その粘性材料が依然として見られた。次いでバイアルを室温に置き、１か月後に観察した。この材料は固体状の見掛けをしており、顕微鏡下で結晶性であることが観察された。次いで固形物をろ過し、真空ポンプで１時間乾燥して結晶性の標記化合物（２０ｍｇ、６３．５％収率）を得た。
【０１２２】
（実施例７）
ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステルの結晶性二シュウ酸塩
１５０ｍｇの二シュウ酸塩（実施例６に記載のようにして調製した）を１３．１ｍｌの９４％ＩＰＡ／６％Ｈ２０に溶解させた。混合物を、予め加熱した６０℃の水浴中で２．５時間撹拌した。加熱を停止し、混合物を室温に冷却した。バイアルを４℃で冷蔵した。６日後、油状の材料が観察され、バイアルの側部に結晶が認められた。次いでバイアルを室温に冷却し、その時点で種晶（実施例６からの結晶性材料）を加え１６日間置いた。その間、溶液からのより多くの結晶の析出が観察された。次いで固体をろ過し、真空ポンプを用いて１４時間乾燥して標記化合物（１０５ｍｇ、７０％収率）を得た。
【０１２３】
（実施例８）
結晶性遊離塩基  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（形態Ｉ）
１０９ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（実施例１に記載のようにして調製した）を０．５６ｍｌのＨ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）に溶解させた。懸濁液をバイアル（キャップはその頂部に緩めに置いた）中に保持して、より時間をかけて蒸発させた。バイアルを窒素気流雰囲気下に置いた。しかし、窒素はその雰囲気下に置くためだけであって、蒸発させるために用いたものではない。１日以内に沈殿物が認められた。顕微鏡下でこれは結晶性であると認められた。次いでこの固体を高真空系にかけ、すべての溶媒を除去して標記化合物を得た。ＨＰＬＣにより定量的回収の９７．８％純度であった。
【０１２４】
代替の手順では、Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）（約３５０ｍｇ／ｍＬ）中に溶解後、バイアルを５℃で保存し、２日間で沈殿物が認められた。固体をろ過し、水で濯ぎ、高真空で終夜乾燥した。回収率は５５％であった。固体は９８．２％の純度を有しており、液体は９２．８％の純度を有していた。
【０１２５】
（実施例９）
結晶性遊離塩基  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（形態Ｉ）
５０．４ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（実施例１に記載のようにして調製した）を０．１４４ｍｌのＨ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）に溶解させた。懸濁液をバイアル（キャップはその頂部に緩めに置いた）中に保持して、より時間をかけて蒸発させた。バイアルを４℃で６日間冷蔵した。２日後に沈殿物が認められた。固体をろ過し、これを高真空系にかけ、すべての溶媒を除去して標記化合物を白色固体（２７．８ｍｇ、５５．２％収率）として得た。
【０１２６】
（実施例１０）
結晶性遊離塩基  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（形態Ｉ）
２３０ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（実施例１に記載のようにして調製した）を若干加熱して０．２ｍｌのＨ２Ｏ：ＡＣＮ（１：１）に溶解させた。次いで混合物を７０℃の水浴で２時間加熱した。加熱を停止し、混合物を室温に冷却し、次いで４℃で１時間冷蔵した。次いで５０μｌの水を加え（オイルを排除し（ｏｉｌｅｄ  ｏｕｔ））、続いて４０μｌのＡＣＮを加えて、試料を再び溶液に戻した。室温で徐々に撹拌しながら種晶（実施例８からの結晶性材料）を加えた。結晶が形成され始め、緩やかに撹拌しながら、混合物を終夜置いた。翌日、加熱冷却サイクル（３０℃で１０分間、４０℃で１０分間、次いで５０℃で２０分間）を施した。加熱を停止し、緩やかに撹拌しながら混合物を終夜冷却した。翌日、第２の加熱／冷却サイクル（６０℃で１時間、７０℃で溶解が観察された）を施した。加熱を停止し、緩やかに撹拌しながら混合物を終夜冷却した。翌日、結晶が認められ、第３の加熱冷却サイクル（６０℃で３時間）を施した。加熱を停止し、緩やかに撹拌しながら混合物を終夜冷却した。翌日、加熱冷却サイクル（６０℃で３時間、緩やかな冷却、次いで６０℃で３時間）を施した。加熱を停止し、緩やかに撹拌しながら混合物を終夜冷却した。３日後、固体をろ過し、高真空系にかけ、すべての溶媒を除去して標記化合物を得た。
【０１２７】
（実施例１１）
結晶性遊離塩基  ビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（形態ＩＩ）
７０ｍｇのビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（実施例１に記載のようにして調製した）を０．１ｍＬ  ＡＣＮに溶解させた。０．３ｍｌ  ＭＴＢＥを加えた後、溶液は濁っていた。５０μｌのＡＣＮをさらに加えると、溶液は透明になった（１５５ｍｇ／ｍｌ  ＡＣＮ：ＭＴＢＥ＝１：２）。混合物をバイアル中に入れふたをかぶせた。翌日までには結晶が認められた。次いで固体をろ過し、これを高真空系にかけ、すべての溶媒を除去して標記化合物を得た。
【０１２８】
（実施例１２）
粉末Ｘ線回折
粉末Ｘ線回折パターンを、Ｃｕ  Ｋα（３０．０ｋＶ、１５．０ｍＡ）放射線を用いてＲｉｇａｋｕ回折計で得た。分析は、ゴニオメーターを用いて、２〜４５°の範囲にわたって０．０３°の刻み幅で、１分間当たり３°の連続的スキャニング方式で稼働して実験した。試料を、石英製の試料ホルダー上に粉末材料の薄層として作製した。装置は金属ケイ素標準物を用いて校正した。
【０１２９】
実施例２の二リン酸塩の試料のＰＸＲＤパターンは、材料が結晶性であることを示した。実施例３の結晶性二リン酸塩の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図１に示す。実施例４の一硫酸塩の試料のＰＸＲＤパターンは、材料が結晶性であることを示した。実施例５の結晶性一硫酸塩の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図８に示す。実施例６の二シュウ酸塩の試料のＰＸＲＤパターンは、材料が結晶性であることを示した。実施例７の結晶性二シュウ酸塩の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図１３に示す。実施例８および９の遊離塩基（形態Ｉ）の試料のＰＸＲＤパターンは、材料が結晶性であることを示した。実施例１０の遊離塩基（形態Ｉ）の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図１８に示す。実施例１１の遊離塩基（形態ＩＩ）の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図２３に示す。
【０１３０】
（実施例１３）
熱分析
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）はＴｈｅｒｍａｌ  Ａｎａｌｙｓｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを備えたＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−１０モジュールを用いて実施した。ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを取り、分析した。約１〜４ｍｇの試料を、アルミ製の蓋付きの皿の中に正確に計り込んだ。試料は、周囲温度から約３００℃まで、１０℃／分の線形加熱傾斜で評価した。使用の間、ＤＳＣセルを乾燥窒素でパージした。
【０１３１】
図２に示すように、実施例３の結晶性二リン酸塩の試料の代表的なＤＳＣトレースは約６３．８℃と１５４．３℃で２つの転移を示した。このＤＳＣトレースは、この結晶性二リン酸塩が、約１５４．５℃で溶融ピークを有し、かつ１５０℃より低い温度で熱分解することなく満足できる良好な熱安定性を有していることを実証している。ＤＳＣトレースは、約１３５℃での吸熱的熱流の開始も示している。
【０１３２】
実施例４の一硫酸塩の試料の代表的なＤＳＣトレースは、約５７℃と７３．２℃で２つの転移を示した。図１０に示すように、実施例５の結晶性一硫酸塩の試料の代表的なＤＳＣトレースは７６℃で転移を示した。これは、この結晶性一硫酸塩が約７６．５℃で溶融ピークを有していることを実証している。
【０１３３】
実施例６の結晶性二シュウ酸塩の試料の代表的なＤＳＣトレースは、６９．２℃と１２２．８℃で２つの転移を示した。図１５に示すように、実施例７の結晶性二シュウ酸塩の試料の代表的なＤＳＣトレースは７３℃で転移を示した。このＤＳＣトレースは、この結晶性二シュウ酸塩が約７３．７℃で溶融ピークを有していることを実証している。
【０１３４】
実施例８の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料の代表的なＤＳＣトレースは、９０．４℃で転移を示した。実施例９の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料のＤＳＣトレースは、８６．１℃と１０３．６℃で２つの転移を示した。図１９に示すように、実施例１０（形態Ｉ）の結晶性遊離塩基の試料の代表的なＤＳＣトレースは、閉じた皿の中では２つの転移を示したが（８３．９℃と１０２．１℃）、開放した皿の中では１０２．５℃で転移を示した（早期のピークは水および／または溶媒によるものである）。このＤＳＣトレースは、この結晶性遊離塩基が約１０２．７℃で溶融ピークを有し、かつ８０℃より低い温度で熱分解することなく良好な熱安定性を有していることを実証している。ＤＳＣトレースは、約９０℃での吸熱的熱流の開始も示している。
【０１３５】
図２４に示すように、実施例１１の結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）の試料のＡ代表的なＤＳＣトレースは９８．６℃で転移を示した。これは、この結晶性遊離塩基が約９８．６℃で溶融ピークを有し、かつ７５℃より低い温度で熱分解することなく良好な熱安定性を有していることを実証している。ＤＳＣトレースは、７５℃での吸熱的熱流の開始も示している。
【０１３６】
熱重量分析（ＴＧＡ）を、高分解能を有するＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｑ−５０モジュールを用いて実施した。ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてデータを取り、分析した。約１０ｍｇの重量の試料を白金皿上の置き、高分解能−加熱速度で、周囲温度から３００℃までスキャンした。使用の間、天秤と炉室を窒素気流でパージした。
【０１３７】
図３に示すように、実施例３の結晶性二リン酸塩の試料の代表的なＴＧＡトレースは１５５℃未満の温度で溶媒および／または水（８．２％）の減量を示した。
【０１３８】
実施例４の結晶性一硫酸塩の試料のＴＧＡトレースは、１１６℃未満の温度で溶媒および／または水（１２．６％）の減量を示した。図９に示すように、実施例５の結晶性一硫酸塩の試料の代表的なＴＧＡトレースは１５０℃未満の温度で溶媒および／または水（１３．７％）の減量を示した。
【０１３９】
実施例６の結晶性二シュウ酸塩の試料のＴＧＡトレースは、１２５℃未満の温度で溶媒および／または水（１５．４％）の減量を示した。図１４に示すように、実施例７の結晶性二シュウ酸塩の試料の代表的なＴＧＡトレースは１２５℃未満の温度で溶媒および／または水（１２．７％）の減量を示した。
【０１４０】
実施例８の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料のＴＧＡトレースは、７５℃より低い温度で溶媒および／または水（７．３％）の減量を示した。実施例９の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料のＴＧＡトレースは、７０℃より低い温度で溶媒および／または水（５．２％）の減量を示した。図２０に示すように、実施例１０の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料の代表的なＴＧＡトレースは９８℃より低い温度で溶媒および／または水（３．８％）の減量を示した。
【０１４１】
図２５に示すように、実施例１１の結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）の試料の代表的なＴＧＡトレースは９８℃より低い温度で溶媒および／または水（３．０％）の減量を示した。
【０１４２】
これらのＴＧＡトレースは、本発明の結晶性化合物が、室温からある程度高い高温（例えば、７５〜１５０℃）で若干重量を減少することを示している。その量は、残留する水分または溶媒の減量と一致する。
【０１４３】
（実施例１４）
動的水分収着評価
動的水分収着（ＤＭＳ）の評価（水分収着−脱着プロファイルとしても知られている）を、ＶＴＩ大気圧微量天秤（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）、ＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ  ３３０１６）を用いて実施した。約１０ｍｇの試料サイズを用い、湿度は分析開始時点の周囲値に設定した。典型的なＤＭＳ分析は３つのスキャンからなる。すなわち、５％ＲＨ／ステップのスキャン速度で、周囲値から２％の相対湿度（ＲＨ）へ、２％ＲＨから９０％ＲＨへ、９０％ＲＨから５％ＲＨである。２分毎に質量を計り、５連続点について０．０１％以内で試料の質量が安定したら、ＲＨを次の値（＋／−５％ＲＨ）へ変化させた。
【０１４４】
図４に示すように、実施例３の結晶性二リン酸塩の試料の代表的なＤＭＳトレースは、２〜９０％のＲＨに曝して３．３％の増量で、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で０．６％の増量という低い吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示した。
【０１４５】
図１１に示すように、実施例５の結晶性一硫酸塩の試料の代表的なＤＭＳトレースは、２〜９０％のＲＨに曝して１０％の増量で、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で１．８％の増量という低い吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示した。
【０１４６】
図１６に示すように、実施例７の結晶性二シュウ酸塩の試料の代表的なＤＭＳトレースは、２〜９０％のＲＨに曝して５．３％の増量で、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で１．１％の増量という低い吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示した。
【０１４７】
図２１に示すように、実施例１０の結晶性遊離塩基（形態Ｉ）の試料の代表的なＤＭＳトレースは、２〜９０％のＲＨに曝して１０％の増量で、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で１．２％の増量という低い吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示した。
【０１４８】
図２６に示すように、実施例１１の結晶性遊離塩基（形態ＩＩ）の試料の代表的なＤＭＳトレースは、２〜９０％のＲＨに曝して９％の増量で、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で１．３％の増量という低い吸湿性を有する可逆的吸着／脱着プロファイルを示した。
【０１４９】
これらのＤＭＳトレースは、本発明の結晶性化合物が、低い吸湿性の可逆的吸着／脱着プロファイルを有することを実証している。広い湿度範囲に曝しても、結晶性化合物の増量は許容されるものである。可逆的水分吸着／脱着プロファイルは、本発明の結晶性化合物が、許容される吸湿性を有しており、潮解性でないことを実証している。
【０１５０】
（実施例１５）
固体状態の安定性評価
実施例３の結晶性二リン酸塩の試料約１〜２ｍｇをそれぞれ、−２０ｏＣ（密封容器）および４０℃／７５％ＲＨ（開放容器および密封容器）で複数の３ｍＬホウケイ酸塩バイアル中に保存した。特定の間隔で、代表的なバイアルの全内容物を以下のＨＰＬＣ法で分析した。
【０１５１】
カラム：Ｘｔｅｒｒａ  Ｍｓ  Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（Ｐａｒｔ  ＮＯ．１８６０００４９４）；移動相Ａ：０．１Ｍ  ＮＨ４ＡＣ、ｐＨ７．０；移動相Ｂ：１００％ＡＣＮ；流速：１ｍＬ／分；注入容積：１０μＬ；検出器：２４０ｎｍ；勾配−時間［分で］（％移動相Ｂ）：０．０（８）；５．００（２８）；２２．００（４２）；３０．００（１００）；３５．００（１００）；３５．１０（８）；および４５．００（８）。試料を、ｐＨ５の１０ｍＭクエン酸塩緩衝剤生理食塩水中の０．５ｍｇ／ｍＬストック溶液として調製した。
【０１５２】
実施例３の結晶性二リン酸塩について、試料の初期純度は、ＨＰＬＣで測定して９８．３面積％であった。６週間保存後、どの条件下に保持した試料も、化学的純度に検出可能な変化はなく、材料の見掛けに目に見える変化はなく、またＤＳＣおよびＴＧＡによる分析でも検出可能な差は示されなかった。
【０１５３】
（実施例１６）
元素分析
Ｆｌａｓｈ  ＥＡ１１１２元素分析計（ＣＥ  Ｅｌａｎｔｅｃｈ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）を用いた燃焼分析によって、本発明の結晶性化合物の試料について、以下の元素割合が測定された。
【０１５４】
実施例５の結晶性一硫酸塩では：５２．８８％炭素、７．１０％水素、８．８１％窒素、２７．１７％酸素および４．０３％イオウ（予測）であり、５２．１１％炭素、６．９０％水素、８．４２％窒素、２４．９４％酸素および４．０６％イオウ（結果）であった。
【０１５５】
実施例７の結晶性二シュウ酸塩では：５４．５４％炭素、６．５７％水素、８．１５％窒素、および３０．７４％酸素（予測）であり、５６．３３％炭素、６．９０％水素、８．２２％窒素および２６．３２％酸素（結果）であった。
（実施例１７）
微粒化
実施例３の結晶性二リン酸塩の１３ｇの試料をジェットミルで微粒化して、顕微鏡検査による観察で複屈折性を有する８．７ｇの自由流動性の白色粉末を得た（回収率６７％）。予備微粒化では、結晶性二リン酸塩はＨＰＬＣで測定して９８．１面積％の初期純度を有していた。微粒化した材料の純度は同じであった。予備微粒化した材料の水分含量は６．５４重量％であり、微粒化した材料の水分含量は６．２３重量％であった。
【０１５６】
微粒化の過程で特に問題はなかった。粒径分布は以下の通りであった。
【０１５７】
【表３】
2008533036.tif 000006
微粒化していない材料と比べて、微粒化した材料は、粉末Ｘ線回折パターン、ＴＧＡ、ＤＳＣ、ＤＭＳ、化学的純度、キラル純度および水分含量に有意の変化は認められなかった。例えば、実施例１４で示したように、実施例３の結晶性二リン酸塩の試料の代表的なＤＭＳトレースは、４０〜７５％ＲＨの湿度範囲で０．６％の増量を示し、微粒化した材料はこの湿度範囲で０．７％の増量を示した。
【０１５８】
（実施例１８）
吸入用溶液の安定性
ｐＨ５の１０ｍＭクエン酸塩緩衝生理食塩水中に０．５ｍｇ／ｍＬ遊離塩基相当物（実施例３に記載のようにして調製した結晶性二リン酸塩を用いて）の溶液を調製した。結晶性塩の溶解度は、緩衝剤中に４０ｍｇ／ｍＬ超の遊離塩基相当物より大きかった。４０℃／７５％ＲＨで１か月保存して、０．５％未満の分解が観察された。
【０１５９】
（アッセイ１）
放射性リガンド結合アッセイ
ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３およびｈＭ４ムスカリン性受容体サブタイプを発現する細胞からの膜調製
クローン化したヒトｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３およびｈＭ４ムスカリン性受容体サブタイプを安定的に発現するＣＨＯ細胞系をそれぞれ、１０％ＦＢＳおよび２５０μｇ／ｍＬジェネティシンで補足したＨＡＭ’ｓ  Ｆ−１２からなる培地中でコンフルエンシー近傍まで増殖させた。細胞をインキュベーター中で、５％ＣＯ２下、３７℃で増殖させ、ｄＰＢＳ中の２ｍＭ  ＥＤＴＡでリフトした。細胞を６５０×ｇで遠心分離に５分間かけて収集し、細胞ペレットを−８０℃で凍結保存するか、または直ちに膜を作製した。膜の作製のために、細胞ペレットを溶解緩衝液中に再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破砕機（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ；２０秒間×２バースト）で再びホモジナイズした。粗製膜を４０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離機にかけた。次いで、膜ペレットを再懸濁緩衝液で再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破砕機でホモジナイズした。膜懸濁液のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．らのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９３：２６５（１９５１年）に記載されされている方法で測定した。すべての膜を一定分量−８０℃で凍結保存するか、または直ちに使用した。一定分量の調製ずみｈＭ５受容体膜はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから直接購入し、使用するまで−８０℃で保存した。
ムスカリン性受容体サブタイプｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４およびｈＭ５についての放射性リガンド結合アッセイ
放射性リガンド結合アッセイを、合計１００μＬのアッセイ容積で９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて実施した。ｈＭ１、ｈＭ２、ｈＭ３、ｈＭ４またはｈＭ５ムスカリン性サブタイプのいずれかを安定的に発現するＣＨＯ細胞膜を、アッセイ緩衝剤中で、以下の特定の標的タンパク質濃度（μｇ／ウェル）、すなわち、ｈＭ１については１０μｇ、ｈＭ２については１０〜１５μｇ、ｈＭ３については１０〜２０μｇ、ｈＭ４については１０〜２０μｇ、ｈＭ５については１０〜１２μｇに希釈した。アッセイプレートへ加える前に、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織破砕機（１０秒間）を用いて膜を簡単にホモジナイズした。放射性リガンドのＫＤ値を決定するための飽和結合の検討を、Ｌ−［Ｎ−メチル−３Ｈ］スコポラミンメチルクロリド（［３Ｈ］−ＮＭＳ）（ＴＲＫ６６６，８４．０Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を０．００１ｎＭ〜２０ｎＭの範囲で用いて実施した。試験化合物のＫｉ値を決定するための置換アッセイを、１ｎＭの［３Ｈ］−ＮＭＳを用いて、１１の異なる試験化合物濃度で実施した。最初に、試験化合物を、希釈緩衝液中に４００μＭの濃度に希釈し、次いで希釈緩衝液で連続的に５×希釈し１０ｐＭ〜１００μＭの範囲の最終濃度にした。アッセイプレートへの希釈順と容積は以下の通りである：２５μＬ放射性リガンド、２５μＬ希釈された試験化合物および５０μＬ膜である。アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。１％ＢＳＡで事前処置したＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタープレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて急速ろ過して、結合反応を終了させた。フィルタープレートを洗浄用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で３回濯いで未結合の放射性物質を除去した。次いでプレートを空気乾燥し、各ウェルに５０μＬ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０液体用シンチレーション流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を加えた。次いでプレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）でカウントした。結合データを、ワンサイト競合モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）での非線形回帰分析により分析した。試験化合物のＫｉ値を、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ；Ｐｒｕｓｏｆｆ  Ｗ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２２（２３）：３０９９〜１０８頁（１９７３年））を用いて、観測ＩＣ５０値および放射性リガンドのＫＤ値から計算した。幾何平均および９５％信頼区間を得るためにＫｉ値をｐＫｉ値に変換した。次いでこれらの要約統計量（ｓｕｍｍａｒｙ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を、データ処理のためＫｉ値に変換して戻した。
【０１６０】
このアッセイでは、より小さいＫｉ値は、試験した受容体について、試験化合物がより高い結合親和力を有することを示している。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物はＭ３ムスカリン性受容体サブタイプについて、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有することが分かった。
【０１６１】
（アッセイ２）
ムスカリン性受容体の機能的能力アッセイ
ｃＡＭＰ蓄積の作用薬媒介阻害の遮断
このアッセイでは、試験化合物の機能的能力を、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、試験化合物がホルスコリン仲介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害を遮断する能力を測定することによって決定した。
【０１６２】
ｃＡＭＰアッセイは、１２５Ｉ−ｃＡＭＰを用いたフラッシュプレートアデニリルシクラーゼ活性化アッセイシステム（ＮＥＮ  ＳＭＰ００４Ｂ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によるラジオイムノアッセイ法で、メーカーの説明書にしたがって実施した。
【０１６３】
細胞をｄＰＢＳで１回濯ぎ、上記の細胞培養および膜の作製の部で説明したようにして、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ）でリフトした。脱離した細胞を、５０ｍＬ  ｄＰＢＳ中で、６５０×ｇで５分間遠心分離にかけて２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを１０ｍＬ  ｄＰＢＳ中に再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ１デュアル式粒子カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で細胞をカウントした。細胞を６５０×ｇで５分間、再度遠心分離にかけ、刺激緩衝液中に再懸濁して１．６×１０６〜２．８×１０６細胞／ｍＬのアッセイ濃度にした。試験化合物を最初に希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（０．１％）で補充されたｄＰＢＳ）中に４００μＭの濃度で希釈し、次いで希釈緩衝液で連続的に希釈して１００μＭ〜０．１ｎＭの範囲の最終モル濃度にした。同じような仕方でオキソトレモリンを希釈した。
【０１６４】
ＡＣ活性のオキソトレモリン阻害を測定するために、２５μＬホルスコリン（ｄＰＢＳ中に希釈して２５μＭの最終濃度）、２５μＬ希釈オキソトレモリンおよび５０μＬ細胞を作用薬アッセイウェルに加えた。試験化合物がオキソトレモリン阻害ＡＣ活性を遮断する能力を測定するために、２５μＬのホルスコリンおよびオキソトレモリン（ｄＰＢＳ中に希釈して、それぞれ２５μＭおよび５μＭの最終濃度）、２５μＬ希釈試験化合物ならびに５０μＬ細胞を残るアッセイウェルに加えた。
【０１６５】
反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、１００μＬの氷冷検出用緩衝液を加えて反応を停止させた。プレートを密封し、室温で終夜インキュベートし、翌朝、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ液体シンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）でカウントした。産生したｃＡＭＰの量（ｐモル／ウェル）を、メーカーのユーザーマニュアルに記載のようにして、試料およびｃＡＭＰ標準品について測定されたカウント数をもとに計算した。データを非線形回帰、ワンサイト競合式を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による非線形回帰分析によって分析した。Ｋｉを計算するためにＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いた。ここで、オキソトレモリン濃度−応答曲線のＥＣ５０と、それぞれＫＤおよび［Ｌ］としてのオキソトレモリン濃度を用いた。幾何平均および９５％信頼区間を得るためにＫｉ値をｐＫｉ値に変換した。次いでこれらの要約統計量を、データ処理のためＫｉ値に変換し戻した。
【０１６６】
このアッセイでは、より小さいＫｉ値は、試験した受容体で試験化合物がより高い機能活性を有していることを示している。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、ホルスコリン仲介性ｃＡＭＰ蓄積のオキソトレモリン阻害の遮断について、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有していることが分かった。
作用薬媒介［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断
第２の機能アッセイでは、試験化合物の機能的能力は、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、化合物がオキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を遮断する能力を測定して決定することができる。
【０１６７】
使用の時点で、凍結した膜を解凍し、次いでウェル当たり５〜１０μｇタンパク質の最終目的の組織濃度でアッセイ緩衝液中に希釈した。膜を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ−２１００組織破砕機で簡単にホモジナイズし、次いでアッセイプレートに加えた。作用薬オキソトレモリンによる［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の刺激についてのＥＣ９０値（９０％最大反応のための有効濃度）を各実験で測定した。
【０１６８】
試験化合物がオキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を阻害する能力を測定するために９６ウェルプレートの各ウェルに以下のもの、すなわち、２５μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．４ｎＭ）を有するアッセイ緩衝液、２５μＬのオキソトレモリン（ＥＣ９０）およびＧＤＰ（３μＭ）、２５μＬの希釈試験化合物ならびに２５μＬのｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ細胞膜を加えた。次いで、アッセイプレートを３７℃で６０分間インキュベートした。アッセイプレートを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６ウェル収穫器を用いて１％ＢＳＡ−事前処理ＧＦ／Ｂフィルターにかけてろ過した。プレートを、氷冷洗浄緩衝液で３×３秒間濯ぎ、次いで空気乾燥または真空乾燥した。Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０シンチレーション液（５０μＬ）を各ウェルに加え、各プレートを密封し、トップカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で放射能を計った。データを非線形回帰、ワンサイト競合式を用いたＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による非線形回帰分析によって分析した。Ｋｉを計算するためにＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いた。ここで、試験化合物についての濃度−応答曲線のＩＣ５０と、それぞれＫＤおよび［Ｌ］、リガンド濃度としてのアッセイにおけるオキソトレモリン濃度を用いた。
【０１６９】
このアッセイでは、より小さいＫｉ値は、試験した受容体で試験化合物がより高い機能活性を有していることを示している。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は、ｈＭ２受容体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、オキソトレモリン刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の遮断について、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有していることが分かった。
ＦＬＩＰＲアッセイによる作用薬媒介カルシウム放出の遮断
Ｇｑタンパク質と共役するムスカリン性受容体サブタイプ（Ｍ１、Ｍ３およびＭ５受容体）は、受容体との作用薬結合によってホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路を活性化する。その結果、活性化されたＰＬＣは、ホスファチルイノシトール二リン酸塩（ＰＩＰ２）を加水分解して、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）とホスファチジル−１，４，５−三リン酸塩（ＩＰ３）にし、次いでこれは細胞内貯蔵、すなわち小胞体および筋小胞体からのカルシウムの放出をもたらす。ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）アッセイは、遊離カルシウムと結合して蛍光を発するカルシウム感受性染料（Ｆｌｕｏ−４ＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、細胞内カルシウムのこの増加を利用する。この発光現象は、ヒトＭ１およびＭ３ならびにチンパンジーＭ５受容体でクローン化した細胞の単層からの発光の変化を検出するＦＬＩＰＲを用いてリアルタイムで測定される。拮抗薬効能は、拮抗薬が作用薬媒介による細胞内のカルシウムの増大を阻害する能力で判定することができる。
【０１７０】
ＦＬＩＰＲカルシウム刺激アッセイのために、アッセイを行う前の晩に、ｈＭ１、ｈＭ３およびｃＭ５受容体を安定的に発現するＣＨＯ細胞を９６ウェルＦＬＩＰＲプレートに播種する。播種した細胞を、ＦＬＩＰＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭ塩化カルシウム、カルシウムおよびマグネシウムを有していないＨＢＳＳ中の２．５ｍＭプロベネシド）を用いてＣｅｌｌｗａｓｈ（ＭＴＸ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で２回洗浄して培養基を除去し、５０μＬ／ウェルのＦＬＩＰＲ緩衝液が残る。次いで細胞を、５０μＬ／ウェルの４μＭ  ＦＬＵＯ−４ＡＭ（２Ｘ溶液を作製）で、３７℃、５％二酸化炭素のもとで４０分間インキュベートする。染料インキュベーション期間に続いて、細胞をＦＬＩＰＲ緩衝剤で２回洗浄して５０μＬ／ウェルの最終容積を得た。
【０１７１】
拮抗薬効能を測定するために、拮抗薬効能を後で、ＥＣ９０濃度でのオキソトレモリン刺激に対して測定することができるように、オキソトレモリンについての細胞内のＣａ２＋放出の用量依存刺激をまず測定する。細胞をまず、化合物希釈緩衝液を用いて２０分間インキュベートし、続いて作用薬を加える。これはＦＬＩＰＲを用いて実施する。オキソトレモリンについてのＥＣ９０値は、式ＥＣＦ＝（（Ｆ／１００−Ｆ）＾１／Ｈ）＊ＥＣ５０とあわせて、ＦＬＩＰＲ測定および以下のデータ換算の部で詳細に示す方法によって得る。刺激プレートにおいて３×ＥＣＦのオキソトレモリン濃度を調製し、ＥＣ９０濃度のオキソトレモリンを拮抗薬阻害アッセイプレート中の各ウェルに加える。
【０１７２】
ＦＬＩＰＲに用いたパラメータは：０．４秒の曝露時間、０．５ワットのレーザー強度、４８８ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの発光波長である。ベースラインは、作用薬を加える前に、蛍光の変化を１０秒間測定して決定する。作用薬刺激に続いて、ＦＬＩＰＲにより蛍光の変化を０．５〜１秒毎に１．５分間連続的に測定して最大の蛍光変化を捕える。
【０１７３】
蛍光の変化は、各ウェルについて最大の蛍光からベースライン蛍光を減じたものとして表わされる。生データを、シグモイド用量応答のための組込みモデルを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で非線形回帰により薬物濃度の対数に対して分析する。拮抗薬Ｋｉ値は、ＫＤとしてのオキソトレモリンＥＣ５０値、およびＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｃｈｅｎｇ  ＆  Ｐｒｕｓｏｆｆ，１９７３年）によるリガンド濃度についてのオキソトレモリンＥＣ９０を用いてＰｒｉｓｍにより測定する。
【０１７４】
このアッセイでは、より小さいＫｉ値は、試験した受容体で試験化合物がより高い機能活性を有していることを示している。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は、ｈＭ３受容体を安定的に発現するＣＨＯ細胞において、作用薬媒介カルシウム放出の遮断について、約５ｎＭ未満のＫｉ値を有していることが分かった。
（アッセイ３）
モルモットモデルでのアセチルコリ誘発気管支収縮の気管支保護期間の測定
このインビボでのアッセイは、ムスカリン性受容体拮抗活性を示す試験化合物の気管支保護効果を評価するために用いられる。２５０〜３５０ｇの体重の６匹のオスのモルモット（Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ（ＨｓｄＰｏｃ：ＤＨ）Ｈａｒｌａｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のグループを、かごのカードで個別に識別する。試験を通して、その動物が食料および水に自由にアクセスできるようにしておく。
【０１７５】
試験化合物は、全身曝露式投薬チャンバー（Ｒ＆Ｓ  Ｍｏｌｄｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）中で１０分かけて吸入投与する。投薬チャンバーは、中央マニホールドから６つの個々のチャンバーにエアロゾルが同時に送達されるよう配置する。モルモットを、試験化合物または媒体（ＷＦＩ）のエアロゾルに曝す。これらのエアロゾルは、２２ｐｓｉの圧力のガス混合物（ＣＯ２＝５％、Ｏ２＝２１％およびＮ２＝７４％）によって駆動されるＬＣ  Ｓｔａｒ式噴霧器セット（Ｍｏｄｅｌ  ２２Ｆ５１、ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＶＡ）を用いて、水溶液から発生させる。噴霧器を通るガス流量は、この動作圧力で約３Ｌ／分である。発生したエアロゾルは陽圧によってチャンバー中に押し込まれる。エアロゾル化溶液の送達の際には希釈空気は使用しない。１０分間噴霧すると、約１．８ｍＬの溶液が噴霧される。これは、充てんした噴霧器の噴霧前後の重量を比較して重量法で測定される。
【０１７６】
吸入により投与された試験化合物の気管支保護効果は、投与後１．５、２４、４８および７２時間での全身のプレチスモグラフィーを用いて評価する。
【０１７７】
肺での評価の開始４５分間前に、ケタミン（４３．７５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（３．５０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（１．０５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射して各モルモットを麻酔する。手術部位を剃り、７０％アルコールで清浄化した後、首の腹側面を２〜３ｃｍ正中切開した。次いで、頸静脈を単離し、生理食塩水を満たしたポリエチレンカテーテル（ＰＥ−５０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を用いてカニューレを挿入して、生理食塩水中のＡＣｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の静脈内注射を行った。次いで、気管を切り裂き、１４Ｇテフロン（登録商標）チューブ（＃ＮＥ−０１４、Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ，  ＦＬ）を用いてカニューレを挿入した。必要に応じて、上記麻酔薬混合物をさらに筋肉注射して麻酔を維持させる。麻酔の深さを監視し、その足をつまんでも動物が応答しないかまたは呼吸速度が１００呼吸／分より大きい場合にはそれを調節する。
【０１７８】
カニューレ挿入が完了したら、動物をプレチスモグラフ（＃ＰＬＹ３１１４、Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｈａｒｏｎ，ＣＴ）中に入れ、食道圧力式カニューレ（ＰＥ−１６０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を挿入して肺駆動圧（圧力）を測定する。テフロン（登録商標）製気管チューブをプレチスモグラフの開口部に取り付けて、モルモットがチャンバー外部の大気を吸えるようにする。次いでチャンバーを密封する。体温を維持させるために加熱灯を用い、１０ｍＬの較正シリンジ（＃５５２０シリーズ、Ｈａｎｓ  Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を用いて、モルモットの肺を４ｍＬの空気で３回膨らませて、確実に、より低位の気道がつぶれず、かつ動物が過呼吸に苦しまないようにする。
【０１７９】
ベースライン値が、コンプライアンスについて０．３〜０．９ｍＬ／ｃｍＨ２Ｏの範囲内であり、抵抗について１秒当たり０．１〜０．１９９ｃｍＨ２Ｏ／ｍＬであると判断されたら肺の評価を開始する。Ｂｕｘｃｏ肺測定コンピュータプログラムによって肺の値の収集と導出が可能になる。
【０１８０】
このプログラムを開始すると、実験手順とデータ収集が開始される。各呼吸によりプレチスモグラフ内で発生する容積の経時的変化をＢｕｘｃｏ圧力変換器で測定する。この信号を時間で積分し、各呼吸について流量を計算する。Ｓｅｎｓｙｍ圧力変換器（＃ＴＲＤ４１００）を用いて収集した肺駆動圧力変化と合わせて、この信号を、Ｂｕｘｃｏ（ＭＡＸ２２７０）前置増幅器を介してデータ収集インターフェース（＃’ｓ  ＳＦＴ３４００およびＳＦＴ３８１３）に接続する。他のすべての肺パラメータはこの２つの入力によって得られる。
【０１８１】
ベースライン値を５分間集め、その後、モルモットにＡｃｈを投与する。ＡＣｈ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を、以下の実験開始からの規定時間および用量、すなわち：５分で１．９μｇ／分、１０分で３．８μｇ／分、１５分で７．５μｇ／分、２０分で１５．０μｇ／分、２５分で３０μｇ／分、および３０分で６０μｇ／分でシリンジ型ポンプ（ｓｐ２１０ｉｗ、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  装置ｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）から１分間静脈内に注入する。各ＡＣｈ投与の後、３分間で抵抗またはコンプライアンスがベースライン値がに戻らない場合は、モルモットの肺を、１０ｍＬの較正シリンジからの４ｍＬの空気で３回膨らませる。記録される肺のパラメータは、呼吸数（呼吸／分）、コンプライアンス（ｍＬ／ｃｍＨ２Ｏ）および肺抵抗（１秒当たりｃｍ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ）を含む。この手順の３５分時点で肺機能の測定が完了したら、モルモットをプレチスモグラフから取り出し、二酸化炭素で窒息させて安楽死させる。
【０１８２】
データは以下の方法の１つまたはその両方で評価する：
（ａ）肺抵抗（ＲＬ、１秒当たりｃｍ  Ｈ２Ｏ／ｍＬ）は「圧力の変化」と「流量の変化」の比から計算する。ＡＣｈ（６０（ｇ／分、ＩＨ）に対するＲＬ応答を媒体および試験化合物グループについて算出する。媒体処置した動物の各事前処置時間での平均ＡＣｈ応答を計算し、各試験化合物用量での対応する事前処置時間のＡＣｈ応答の阻害％を算出するのに用いる。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ウィンドウズ（登録商標）用バージョン３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、「ＲＬ」の阻害用量応答曲線を、４つのパラメータのロジスティック方程式で当てはめて、気管支保護のＩＤ５０（ＡＣｈ（６０（ｇ／分）気管支収縮剤応答を５０％阻害するのに要する用量）を推定する。用いた方程式は以下の通りである：
Ｙ＝最小＋（最大−最小）／（１＋１０（（ｌｏｇＩＤ５０−Ｘ）＊傾斜））
（式中、Ｘは用量の対数であり、Ｙは応答（ＲＬのＡＣｈ誘発増大の阻害％）である）
Ｙは最小でスタートし、シグモイド形で漸近的に最大に近づく。
【０１８３】
（ｂ）ベースライン肺抵抗を倍加させるのに必要なＡｃｈまたはヒスタミンの量と定義される量ＰＤ２は、ＡＣｈまたはヒスタミン投与の間にわたる流量と圧力から誘導される肺抵抗値を用いて、以下の式（これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈａｃｈｏｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ−１９９９年．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６１：３０９〜３２９頁（２０００年）に記載されているＰＣ２０°値を計算するために用いられる式から誘導される）：
【０１８４】
【数１】
2008533036.tif 000007
（式中、Ｃ１はＣ２に先行するＡｃｈまたはヒスタミンの濃度；Ｃ２は少なくとも２倍の肺抵抗（ＲＬ）の増加をもたらすＡｃｈまたはヒスタミンの濃度；Ｒ０はベースラインＲＬ値；Ｒ１はＣ１の後のＲＬ値であり、Ｒ２はＣ２の後のＲＬ値である）
から計算される。効果的な用量は、５０（ｇ／ｍＬ用量のＡｃｈへの気管支制限応答をベースライン肺抵抗（ＰＤ２（５０））の倍量に制限する用量と定義する。
【０１８５】
データの統計的分析は、両側スチューデントｔ検定を用いて実施する。Ｐ−値＜０．０５は有意であるとみなす。一般に、このアッセイで、ＡＣｈ誘発気管支収縮について投与後１．５時間で約２００μｇ／ｍＬ未満のＰＤ２（５０）を有する試験化合物が好ましい。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は、ＡＣｈ誘発気管支収縮について投与後１．５時間で約２００μｇ／ｍＬ未満のＰＤ２（５０）を有する推定される。
【０１８６】
（アッセイ４）
吸入モルモット唾液分泌アッセイ
体重２００〜３５０ｇのモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、到着後少なくとも３日間室内モルモットコロニーに順応させる。試験化合物または媒体を、パイ型をした投薬チャンバー（Ｒ＆Ｓ  Ｍｏｌｄｓ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）内で、１０分間かけて吸入（ＩＨ）により投与する。試験溶液を滅菌水中に溶解し、５．０ｍｌの投与溶液を充てんした噴霧器を用いて送達する。モルモットを３０分間吸入チャンバーに収容する。その間、モルモットを約１１０平方ｃｍの面積内に拘束する。これは、動物が自由に体を回し、体位を変え、身動きするのに十分な空間である。２０分間順応させた後、モルモットを、２２ｐｓｉの圧力の室内用空気で駆動するＬＳ  Ｓｔａｒ式噴霧器セット（Ｍｏｄｅｌ  ２２Ｆ５１、ＰＡＲＩ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＶＡ）から発生されたエアロゾルに曝す。噴霧が完了したら、モルモットを処置後、１．５、６、１２、２４、４８または７２時間で評価する。
【０１８７】
試験の１時間前に、ケタミン４３．７５ｍｇ／ｋｇ、キシラジン３．５ｍｇ／ｋｇおよびアセプロマジン１．０５ｍｇ／ｋｇの混合物を０．８８ｍＬ／ｋｇ容積で筋肉内（ＩＭ）注射してモルモットを麻酔する。動物を、加熱した（３７（Ｃ）ブランケット上に腹側を上にし、頭を２０°下方に傾けて配置する。４層の２×２インチのガーゼのパッド（Ｎｕガーゼ汎用スポンジ（Ｎｕ−Ｇａｕｚｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ−ｕｓｅ  ｓｐｏｎｇｅｓ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＴＸ）を、モルモットの口内に挿入する。５分後、ムスカリン性作用薬ピロカルピン（３．０ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ）を投与し、直ちにガーゼパッドを廃棄し、予め計量した新たなガーゼパッドに取り換える。１０分間唾液を集め、その時点でガーゼパッドを計量し、重量の差を記録して蓄積された唾液の量（ｍｇで）を決定する。媒体および各用量の試験化合物を受け入れた動物について集めた唾液の平均量を計算する。媒体グループの平均を１００％唾液分泌とする。結果の平均（ｎ＝３以上）を用いて結果を計算する。双方向ＡＮＯＶＡを用いて各時点での各用量について、信頼区間（９５％）を計算する。このモデルは、Ｒｅｃｈｔｅｒ、“Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓａｌｉｖａｔｉｏｎ”  Ａｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２４：２４３〜２５４頁（１９９６年）に記載されている手順の修正版である。
【０１８８】
各事前処置時間での媒体処置動物の唾液の平均重量を計算し、各用量の対応する事前処置時間での唾液分泌の阻害％を算出するのに用いる。阻害用量応答データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ウィンドウズ（登録商標）用バージョン３．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、４パラメータロジスティック方程式に当てはめて抗催唾薬ＩＤ５０（ピロカルピン誘発唾液分泌の５０％を阻害するのに必要な用量）を推定する。以下の式を用いる：
Ｙ＝最小＋（最大−最小）／（１＋１０（（ｌｏｇＩＤ５０−Ｘ）＊傾斜））
（式中、Ｘは用量の対数であり、Ｙは応答（唾液分泌の阻害％）である）
Ｙは最小でスタートし、シグモイド形で漸近的に最大に近づく。
【０１８９】
抗催唾薬ＩＤ５０と気管支保護のＩＤ５０の比を用いて、試験化合物の見掛けの肺選択指数を算出する。一般に、約５を超える見掛け肺選択指数を有する化合物が好ましい。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は約５を超える見掛け肺選択指数を有すると推定される。
【０１９０】
（アッセイ５）
覚醒モルモットにおけるメタコリン誘発降圧応答
この検討では、２００〜３００ｇの体重の健常なオスの成体ＳＤモルモット（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いる。イソフルラン麻酔（をもたらす）のもとで、動物に、通常の頸動脈カテーテルおよび頸静脈カテーテル（ＰＥ−５０チュービング）を取り付ける。肩甲下領域への皮下トンネルを利用して、カテーテルを体外に出す。外科的切開部はすべて、４−０  Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｓｉｌｋとヘパリン（１０００単位／ｍＬ）でロックしたカテーテルを用いて縫合する。外科処置の最後に、各動物に生理食塩水（３ｍＬ、ＳＣ）とブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）を投与する。加熱パッド上で動物を回復させ、次いで収容室へ戻す。
【０１９１】
外科処置の後、約１８〜２０時間して、動物の体重を計り、動脈圧を記録するために、各動物の頸動脈カテーテルを変換器に連結する。Ｂｉｏｐａｃ  ＭＰ−１００  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで動脈圧と心拍数を記録する。動物を２０分間順応させ安定化させる。
【０１９２】
各動物に、頸静脈系を通して与薬してＭＣｈ（０．３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）を投与し、心臓血管応答を１０分間監視する。次いで動物を、試験化合物または媒体溶液を含む噴霧器に連結されている全身用投薬チャンバーの中に置く。呼吸可能な空気と５％二酸化炭素のガス混合物を用いて３リットル／分の流速で、溶液を１０分間噴霧する。次いで、動物を全身用チャンバーから取り出し、それぞれのかごに戻す。投与後、１．５時間および２４時間で、動物に、ＭＣｈ（０．３ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）を再投与し、血行力学的応答を測定する。その後、ペントバルビタールナトリウム（１５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）で動物を安楽死させる。
【０１９３】
ＭＣｈは平均動脈圧（ＭＡＰ）の低下と心拍数（徐脈）の低下をもたらす。ＭＡＰ（降圧応答）における、ベースラインからのピークの低下を、各ＭＣｈの投与（ＩＨ投与の前後）について測定する。ＭＣｈ応答に対する処置の効果を、コントロール降圧応答の阻害％（平均＋／−ＳＥＭ）として表わす。適切なポストホック試験での双方向ＡＮＯＶＡを用いて、処置および事前処置時間の効果を試験する。媒体を吸入投与した後１．５時間および２４時間で、ＭＣｈに対する降圧応答はそれほど変わらないと推定される。
【０１９４】
試験化合物の見掛け肺選択性を算出するために、抗降圧ＩＤ５０と気管支保護ＩＤ５０の比を用いる。一般に、５を超える見掛け肺選択指数を有する化合物が好ましい。このアッセイまたは同様のアッセイで試験した場合、式Ｉの化合物は５を超える見掛け肺選択指数を有すると推定される。
【０１９５】
本発明を、特定の態様またはその実施形態を参照して説明したが、当業者は、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うかまたは等価物を置き換えることができることを理解されよう。さらに、適用できる特許法および特許に関する規則の許容する範囲で、本明細書で引用したすべての出版物、特許および特許出願の全体を、各文書が参照により本明細書に個別に組み込まれているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１はビフェニル−２−イルカルバミン酸１−（２−｛［４−（４−カルバモイルピペリジン−１−イルメチル）ベンゾイル］メチルアミノ｝エチル）ピペリジン−４−イルエステル（式Ｉの化合物）の結晶性二リン酸塩の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す。
【図２】図２は図１の結晶性塩の示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）トレースを示す。
【図３】図３は図１の結晶性塩の熱重量分析（ＴＧＡ）トレースを示す。
【図４】図４は図１の結晶性塩の動的水分収着（ＤＭＳ）トレースを示す。
【図５】図５は図１の結晶性塩の顕微鏡画像である。
【図６】図６は、より不安定な形態の結晶性二リン酸塩のＰＸＲＤパターンを示す。
【図７】図７は、より不安定な形態の結晶性二リン酸塩のＤＳＣトレースを示す。
【図８】図８は式Ｉの化合物の結晶性一硫酸塩のＰＸＲＤパターンを示す。
【図９】図８の結晶性塩はさらに、図９のＴＧＡトレースを特徴とする。
【図１０】図８の結晶性塩はさらに、図１０のＤＳＣトレースを特徴とする。
【図１１】図８の結晶性塩はさらに、図１１のＤＭＳトレースを特徴とする。
【図１２】図８の結晶性塩はさらに、図１２の顕微鏡画像を特徴とする。
【図１３】図１３は式Ｉの化合物の結晶性二シュウ酸塩のＰＸＲＤパターンを示す。
【図１４】図１３の結晶性塩はさらに、図１４のＴＧＡトレースを特徴とする。
【図１５】図１３の結晶性塩はさらに、図１５のＤＳＣトレースを特徴とする。
【図１６】図１３の結晶性塩はさらに、図１６のＤＭＳトレースを特徴とする。
【図１７】図１３の結晶性塩はさらに、図１７の顕微鏡画像を特徴とする。
【図１８】図１８は式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態ＩのＰＸＲＤパターンを示す。
【図１９】図１８の結晶性遊離塩基はさらに、図１９のＤＳＣトレースを特徴とする。
【図２０】図１８の結晶性遊離塩基はさらに、図２０のＴＧＡトレースを特徴とする。
【図２１】図１８の結晶性遊離塩基はさらに、図２１のＤＭＳトレースを特徴とする。
【図２２】図１８の結晶性遊離塩基はさらに、図２２の顕微鏡画像を特徴とする。
【図２３】図２３は式Ｉの化合物の結晶性遊離塩基の形態ＩＩのＰＸＲＤパターンを示す。
【図２４】図２３の結晶性遊離塩基はさらに、図２４のＤＳＣトレースを特徴とする。
【図２５】図２３の結晶性遊離塩基はさらに、図２５のＴＧＡトレースを特徴とする。
【図２６】図２３の結晶性遊離塩基はさらに、図２６のＤＭＳトレースを特徴とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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