(57)【要約】  アルコキシアミンで官能化されたPEG分子の調製方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの化合物の調製方法であって、
R1-R2-O-NH2 (I)
［ここで、R1は、式
【化１】
2008530289.tif 000017
の一価アシルラジカルであり、ここでXは、結合、アリーレン、(CH2)1-10、NH、O、S、またはこれらの組合せを表し、Yは、平均分子量100 Da〜80 kDaの分枝または非分枝のPEG由来のラジカルを表し；
R2は、式
【化２】
2008530289.tif 000018
のジラジカルであり、ここでAは、アリーレン、アルキレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、部分的または完全に飽和のヘテロアリーレン、またはこれらの組合せを表し、これらの各々は、低級アルキルで必要に応じて置換される］
以下の工程を含む方法：
(i) 式IIの化合物
R1-LG (II)
[ここでLGは、求核置換のための離脱基を表す]
を、適切な溶媒または溶媒混合液中で、過剰の式IIIの化合物
H-R2-O-NH-Pg (III)
[ここでPgは、保護基を表す]
により処理する工程；
(ii) 式(IV)の化合物
R1-R2-O-NHPg (IV)
を単離する工程；および
(iii) 保護基を除去して、式Iの化合物を得る工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、R1が、
【化３】
2008530289.tif 000019
を表し、R2が、
【化４】
2008530289.tif 000020
を表し、ここでArは、アリーレンまたはヘテロアリーレン表し、これらの各々は、カルボキシ、ヒドロキシル、ニトロ、またはシアノから選択される一または複数の置換基で必要に応じて置換される、方法。
【請求項３】
請求項１および２の何れか１項に記載の方法であって、R1が、
【化５】
2008530289.tif 000021
であり、R2が、
【化６】
2008530289.tif 000022
である方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、R1が、
【化７】
2008530289.tif 000023
であり、R2が、
【化８】
2008530289.tif 000024
である方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、単離工程(ii)が、(i)の反応混合液に多量の第一の沈殿溶媒を添加する沈殿工程を含み、式IVの化合物はこの沈殿溶媒に実質的に不溶であり、反応溶媒と一般式IIIの化合物はこの沈殿溶媒に可溶である、方法。
【請求項６】
濾過して、式IVの化合物を含む沈殿物を単離する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
単離された沈殿物に、式IVの化合物を溶解可能な溶媒を添加することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
適切な溶媒中で酸性イオン交換樹脂の懸濁液を添加し、得られた混合液を所定時間撹拌し、その後濾過し、イオン交換樹脂を洗い流し、合体させた濾液を回収し、必要に応じて濃縮することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
必要に応じて第二の沈殿溶媒を添加し、式IVの化合物を沈殿させることを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
式(III)の化合物のPgが、Bocである、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程(i)の溶媒が、ジクロロメタンである、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
過剰の式(III)の化合物が、1.5〜300倍である、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第一の沈殿溶媒が、ジエチルエーテルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
所定の時間が、1分〜10時間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
式Iの化合物の調製方法であって、
R1-R2-O-NH2 (I)
［ここで、R1は、
【化９】
2008530289.tif 000025
を表し；R2は、
【化１０】
2008530289.tif 000026
を表し、ここでArは、アリーレンまたはヘテロアリーレン表し、これらの両方が、カルボキシ、ヒドロキシル、ニトロ、またはシアノから選択される一または複数の置換基で必要に応じて置換され得る］
以下の工程を含む方法：
(a) 式IIの化合物
R1-LG (II)
[ここでLGは、求核置換のための離脱基を表す]
を、適切な溶媒または溶媒混合液中で、過剰の式IIIの化合物
H-R2-O-NH-Pg (III)
[ここでPgは、保護基を表す]
により処理する工程、その後
(b) 保護基を有する式Iの化合物、すなわち
R1-R2-O-NHPg (IV)
である式(IV)の化合物は、実質的に不溶であり、反応溶媒と一般式(III)の化合物は可溶である、多量の適切な溶媒を添加することにより、(a)で得られた生成物を沈殿させる工程、その後
(c) 式(IV)の化合物を濾過により単離する工程、その後
(d) 工程(c)で単離された生成物に、式(IV)の化合物を溶解可能な適切な溶媒を添加する工程、その後
(e) 必要に応じて、(b)および(c)の沈殿、濾過および可溶化の工程を繰り返す工程、その後
(f) 適切な溶媒中で酸性イオン交換樹脂の懸濁液を添加し、得られた混合液を撹拌し、その後濾過し、イオン交換樹脂を洗い流し、合体させた濾液を回収し、必要に応じて濃縮する工程、その後
(g) 必要に応じて、適切な溶媒を添加して、式(IV)の化合物を沈殿させ、その後、工程(b)および(c)に記載される濾過および可溶化を行う工程、その後
(h) 適切な試薬を用いて保護基を除去して、式Iの化合物を得、必要に応じて溶媒と未反応の試薬を除去する工程。
【請求項１６】
式(III)の化合物の保護基が、Bocである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程(a)の溶媒が、ジクロロメタンである、請求項１５および１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
過剰の式(III)の化合物が、1.5〜300倍である、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程(b)の溶媒が、ジエチルエーテルである、請求項１５〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
得られた混合液を、1分〜10時間撹拌する、請求項１５〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
イオン交換クロマトグラフィーの工程を更に含む、請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
化合物を、イソプロパノールから再結晶化させる工程を更に含む、請求項１５〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
透析の工程を更に含む、請求項１５〜２２の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アルコキシアミンで官能化された（alkoxyamine functionalised）ポリエチレングリコールの調製方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
たとえば薬理学的特性を改良するための周知のペプチドのコンジュゲーション方法は、アルコキシアミンで官能化されたポリエチレングリコール(PEG)を、ペプチド由来のアルデヒドまたはケトンと反応させて、オキシム結合を介してPEGに共有結合したペプチドを提供する工程を含む。総説については、Roberts, M.J. et. al, Adv. Drug Deliv. Rev. 2002, 54, 459-476、Kinstler, O. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2002, 54, 477-485が参照される。
【０００３】
アルコキシアミンで官能化されたPEGは、Boc-(アミノキシ)アセチル誘導体をPEG由来のアミンで処理し、その後、酸を介してBoc基を除去することにより通常調製され、これは、Gaertner and Offord, Bioconjugate Chem.,7, 38-44, 1996に記載される。多くの市販のPEG誘導体は、アシル化剤、すなわちカルボン酸誘導体であり、PEG由来のアルコキシアミン誘導体の調製には、ジアミン−スペーサーの使用、並びにこれによる幾つかの合成工程および中間体の精製が必要であり、これは、下記スキームに示されるとおりである。かかる複数工程の手順は、冗長で時間がかかり、最終生成物の収率を低下させる。ジアミンのモノアシル化は、かかる反応が副生成物としてジアシル化ジアミンを通常生成するため、最終生成物の収率を著しく低下させる（Jacobson et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 2592）。
【化１１】
2008530289.tif 000002
【０００４】
このため、アルコキシアミンで官能化されたPEGの簡便で迅速で効率的な調製方法、理想的には一または二段階の合成工程の調製方法を提供することが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、アルコキシアミンで官能化されたPEGが、保護されたアルコキシアミン官能基を含有する過剰のアミンと容易に入手可能なPEG由来のアシル化剤とを反応させ、その後、酸性イオン交換樹脂により未反応のアミンを除去することにより調製され得ることを驚くべきことに見出した。
【０００６】
このため、本発明は、式Iの化合物の調製方法であって、
R1-R2-O-NH2 (I)
［ここで、R1は、式
【化１２】
2008530289.tif 000003
【０００７】
の一価アシルラジカルであり、ここでXは、結合、アリーレン、(CH2)1-10、NH、O、S、またはこれらの組合せを表し、Yは、平均分子量100 Da〜80 kDaの分枝または非分枝のPEG由来のラジカルを表し；
R2は、式
【化１３】
2008530289.tif 000004
【０００８】
のジラジカルであり、ここでAは、アリーレン、アルキレン、シクロアルキレン、ヘテロアリーレン、部分的または完全に飽和のヘテロアリーレン、またはこれらの組合せを表し、これらの各々は、低級アルキルで必要に応じて置換される］
以下の工程を含む方法を提供する：
(i) 式IIの化合物
R1-LG (II)
[ここでLGは、求核置換のための離脱基を表す]
を、適切な溶媒または溶媒混合液中で、過剰の式IIIの化合物
H-R2-O-NH-Pg (III)
[ここでPgは、保護基を表す]
により処理する工程；
(ii) 式(IV)の化合物
R1-R2-O-NHPg (IV)
を単離する工程；および
(iii) 保護基を除去して、式Iの化合物を得る工程。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、式Iの化合物の調製方法であって、
R1-R2-O-NH2 (I)
［ここで、R1は、
【化１４】
2008530289.tif 000005
【００１０】
を表し、R2は、
【化１５】
2008530289.tif 000006
【００１１】
を表し、ここでArは、アリーレンまたはヘテロアリーレン表し、これらの両方が、カルボキシ、ヒドロキシル、ニトロ、またはシアノから選択される一または複数の置換基で必要に応じて置換され得る］
以下の工程を含む方法に関する：
(a) 式IIの化合物
R1-LG (II)
[ここでLGは、求核置換のための離脱基を表す]
を、適切な溶媒または溶媒混合液中で、過剰の式IIIの化合物
H-R2-O-NH-Pg (III)
[ここでPgは、保護基を表す]
により処理する工程、その後
(b) 保護基を有する式Iの化合物、すなわち
R1-R2-O-NHPg (IV)
である式(IV)の化合物は、実質的に不溶であり、反応溶媒と一般式(III)の化合物は可溶である、多量の適切な溶媒を添加することにより、(a)で得られた生成物を沈殿させる工程、その後
(c) 式(IV)の化合物を濾過により単離する工程、その後
(d) 工程(c)で単離された生成物に、式(IV)の化合物を溶解可能な適切な溶媒を添加する工程、その後
(e) 必要に応じて、(b)および(c)の沈殿、濾過および可溶化の工程を繰り返す工程、その後
(f) 適切な溶媒中で酸性イオン交換樹脂の懸濁液を添加し、得られた混合液を撹拌し、その後濾過し、イオン交換樹脂を洗い流し、合体させた濾液を回収し、必要に応じて濃縮する工程、その後
(g) 必要に応じて、適切な溶媒を添加して、式(IV)の化合物を沈殿させ、その後、工程(b)および(c)に記載される濾過および可溶化を行う工程、その後
(h) 適切な試薬を用いて保護基を除去して、式Iの化合物を得、必要に応じて溶媒と未反応の試薬を除去する工程。
【定義】
【００１２】
「アルカン」の用語は、飽和の、直鎖、分枝および/または環状炭化水素を指すことを意図する。この用語は、炭素原子の数で規定されない場合、１〜30（１も30も含む）の炭素原子、たとえば１〜20（１も20も含む）、たとえば１〜10（１も10も含む）、たとえば１〜５（１も５も含む）の炭素原子の炭化水素を指すことを意図する。アルキルおよびアルキレンの用語は、それぞれ、対応するラジカルおよびビラジカルを指す。
【００１３】
本明細書で使用される「アリール」の用語は、一または複数の環を含む炭素環式芳香族環系、たとえば、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インデニル、ペンタレニル、およびアズレニルなどを指すことを意図する。またアリールは、少なくとも一つの環が芳香族である、上述の複数環炭素環系の部分的に水素化された誘導体を含むことも意図する。かかる部分的に水素化された誘導体の例には、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、および1,4-ジヒドロナフチルが含まれる。「アリーレン」の用語は、対応するビラジカルを指すことを意図し、その例には、1,2-フェニレン、1,3-フェニレン、1,4-フェニレン、1,2-ナフチレン、1,4-ナフチレン、4,4'-ビフェニレン、4,4''-テルフェニレン、および4,4'''-クアテルフェニレンが含まれる。
【００１４】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」の用語は、窒素、酸素および硫黄から選択される一または複数のヘテロ原子を含有するヘテロ環芳香族環系のラジカルを指すことを意図し、たとえばフリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、1,2,3-トリアジニル、1,2,4-トリアジニル、1,3,5-トリアジニル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、プリニル、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、アクリジニルなどである。またこの用語は、ヘテロ原子を含む少なくとも一つの環が芳香族であるという条件で、上述の複数環ヘテロ環系の部分的に水素化された誘導体を含むことも意図する。かかる部分的に水素化された誘導体の例には、2,3-ジヒドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、およびオキサアゼピニル(oxazepinyl)が含まれる。「ヘテロアリーレン」の用語は、対応するビラジカルを指すことを意図し、その例には、1,2,4-ピラゾール-2,5-ジイル、イミダゾール-1,2-ジイル、チアゾール-2,4-ジイル、(4-フェニルイミダゾール)-4,1’-ジイル、および(3,5-ジフェニル-1,2,4-オキサジアゾール)-4,4’’-ジイルが含まれる。
【００１５】
「PEG」の用語は、約100〜約1,000,000 Daの間の分子量のポリエチレングリコールを指すことを意図し、その類似体も包含され、たとえば、末端OH基が、メトキシ基、エトキシ基またはプロポキシ基などのアルコキシ基により置換された類似体も包含される。とりわけ、末端OH基がメトキシにより置換されたPEGは、mPEGと称される。
【００１６】
「mPEG」（またはより適切には「mPEGyl」）の用語は、以下の構造の多分散または単分散ラジカルを意味する：
【化１６】
2008530289.tif 000007
【００１７】
ここでｍは、１より大きい整数である。このため、ｍが90であるmPEGは、3991 Da、すなわち約4 kDaの分子量を有する。同様に、平均分子量が20 kDaのmPEGは、ｍの平均が454である。これら分子量は、mPEGを作成する方法に起因して、しばしば分子量分布を示す。この分布は、多分散性インデックスにより表される。
【００１８】
本明細書で使用される「多分散性インデックス」の用語は、高分子化学の分野で公知のとおり、重量平均分子量と数平均分子量の間の比を意味する（たとえば、“Polymer Synthesis and Characterization”, J.A. Nairn, University of Utah, 2003を参照）。多分散性インデックスは、一以上の数であり、ゲル透過クロマトグラフィーのデータから推定され得る。多分散性インデックスが１である場合、その生成物は単分散であり、単一の分子量の化合物から構成される。多分散性インデックスが１より大きい場合、これは、そのポリマーの多分散性の指標であり、すなわち、異なる分子量のポリマーの分布が如何に広いかの指標である。
【００１９】
式、化合物名または分子構造において、たとえば「mPEG20000」の使用は、mPEGが多分散であり約20 kDaの分子量を有するmPEG残基を示す。
【００２０】
多分散性インデックスは、典型的には、PEGまたはmPEGの分子量とともに増大する。5 kDa PEG、とりわけ5 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。10 kDa PEG、とりわけ10 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。15 kDa PEG、とりわけ15 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。20 kDa PEG、とりわけ20 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。30 kDa PEG、とりわけ30 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。40 kDa PEG、とりわけ40 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。60 kDa PEG、とりわけ60 kDa mPEGを例に挙げると、これは、1.06以下、たとえば1.05以下、たとえば1.04以下、たとえば1.03以下、たとえば1.02〜1.03の多分散性インデックスの化合物（または実際には化合物の混合物）を指すことが意図される。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明の方法の全反応は、以下の反応シークエンスにより記載することができる。
【化１７】
2008530289.tif 000008
【００２２】
一つの態様において、本発明の方法は、以下の反応シークエンスにより記載することができる。
【化１８】
2008530289.tif 000009
【００２３】
式(II)の化合物においてLGは、求核置換のための離脱基を表す。LGの例には、ハロゲン化物、アジド、N-スクシンイミジルオキシ、1-イミダゾリル、1-トリアゾリル、1-テトラゾリル、N-ベンゾトリアゾリルオキシ、N-フタルイミジルオキシ、フェニルオキシ、および4-ニトロフェニルオキシが含まれる。
【００２４】
特定の態様において、本発明の方法は、以下の反応シークエンスにより記載することができる。
【化１９】
2008530289.tif 000010
【００２５】
式(III)の化合物は、アシル化反応（反応１）を妥当な時間で完了させるために、式IIの化合物に対して過剰量で添加する。典型的には、過剰量は、1.5〜300倍、たとえば2〜10倍である。
【００２６】
式(III)および(IV)の化合物は、反応の間アミン官能基を保護するために、保護基Pgを含む。当該技術分野で公知の保護基の典型例には、Boc、Fmoc、Cbz、Bpoc、Mpc、Ddz、Adpoc、Azoc、Alloc、およびTrocが含まれる。温和な条件下で最終的な脱保護が可能であり、反応の最終生成物に悪影響を与えず、更に、脱保護の間に揮発性の副生成物のみを産生し、たとえば減圧下で除去し易い、保護基Pgを使用することが好ましい。かかるPgの例には、Boc、Cbz、およびAllocが含まれる。
【００２７】
アシル化反応は、適切な溶媒中で、たとえばジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロカーボン、二硫化炭素、ニトロベンゼン、アセトニトリル、酢酸エチル、プロピオニトリル、クロロベンゼン、トルエン、または溶媒混合液中で、必要に応じて反応を促進させるための触媒または塩基の存在下で、たとえばDIPEA、DMAP、トリエチルアミン、またはピリジンの存在下で行うことができる。とりわけジクロロメタンが挙げられる。
【００２８】
（式(III)の）過剰のアミンは、脱保護の際にアルコキシルアミンを産生し、これが、ペプチド由来のアルデヒドまたはケトンとの縮合反応において式(I)の化合物と競合し、所望の縮合生成物の収率を低下させるため、保護基Pgを除去する前に（式(III)の）過剰のアミンを除去することは極めて重要である。本発明は、アミン(III)を除去するための実用的な方法を提供する。この方法は、純度の高い一般式(I)の生成物を産生し、文献で報告される長くて冗長な手法と比較して有意な改良を示す。ペプチド由来のアルデヒドまたはケトンとの縮合生成物を高い収率で作成したい場合、一般式(I)の生成物の純度は不可欠である。
【００２９】
式(IV)の化合物からの過剰の化合物(III)の除去は、適切な溶媒中で、たとえばジクロロメタン、クロロホルムまたは水中で、充分な量の酸性イオン交換樹脂、たとえばAmberlyst 15、Amberlyst 36、Amberjet 1200(H)、Amberlite IR-120、Amberlite IRC-50、Amberlite IRP、Dowex 50WX、Dowex HCRW2、Dowex 650C、Dowex DR-2030、またはDowex HCR-Sを用いて、1分〜数時間、たとえば1、2、3、4、5、または10時間、粗生成物(IV)の溶液を処理することにより行うことができる。溶媒として、とりわけジクロロメタンが挙げられる。濾過し、イオン交換樹脂を洗い流し、合体させた濾液を濃縮または凍結乾燥して、試薬(III)または他の塩基性副生成物または触媒の存在しない、生成物(IV)を得る。
【００３０】
酸性イオン交換樹脂を用いた処理による試薬(III)の除去に加えて、中間体(IV)は、ジエチルエーテルからの沈殿、イソプロパノールからの再結晶化、イオン交換クロマトグラフィー、透析、または当業者に周知のPEG誘導体の精製に適用可能な他の方法により、精製することができる。各中間体について、これら精製方法の何れかを使用することができる。精製された中間体(IV)は、その後、保護基Pgの除去に必要な状況に置かれ、必要に応じて精製した後、ペプチド由来のアルデヒドまたはケトンの誘導体化のために使用することができる。
【００３１】
保護基の除去は、当該技術分野で周知である。一例として、TFAでの処理により、Bocなどの酸に不安定な保護基は除去される。
【００３２】
式Iの化合物の特定の例には、以下のものが含まれる。
【化２０】
2008530289.tif 000011
【実施例】
【００３３】
以下の略語を使用する
Boc: tert-ブチルオキシカルボニル
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
Cbz: ベンジルオキシカルボニル
Bpoc: 1-(4-ビフェニルイル)-1-メチルエトキシカルボニル
Mpc: 1-(4-メチルフェニル)-1-メチルエトキシカルボニル
Ddz: 1-(3,5-ジメトキシフェニル)-1-メチルエトキシカルボニル
Adpoc: 1-(1-アダマンチル)-1-メチルエトキシカルボニル
Alloc: アリルオキシカルボニル
Troc: 2,2,2-トリクロロエチルオキシカルボニル
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: 4-ジメチルアミノピリジン
TFA: トリフルオロ酢酸。
【００３４】
容易に入手可能な出発材料から始まる本発明の模範的な方法を、以下の反応スキームに示す。
【化２１】
2008530289.tif 000012
【００３５】
例１：
O-(4-(4-(1,3-ビス(mPEG(20K)オキシ)-2-プロピルオキシ)ブチリルアミノ)ブチル)ヒドロキシルアミン
(a) N-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル)フタルイミド
【化２２】
2008530289.tif 000013
【００３６】
N-(4-ブロモブチル)フタルイミド (18.9 g, 67.0 mmol)、MeCN (14 ml)、およびN-Boc-ヒドロキシルアミン (12.7 g, 95.4 mmol) の撹拌された混合物に、DBU (15.0 ml, 101 mmol) を一部ずつ添加した。得られた混合物を50℃で24時間撹拌した。水 (300 ml) および12 M HCl (10 ml) を添加し、生成物をAcOEtで3回抽出した。合体させた抽出物を、塩水で洗浄し、乾燥させ (MgSO4)、減圧下で濃縮した。得られた油状物 (28 g) をクロマトグラフィーにより精製した (140 g SiO2, ヘプタン/AcOEtで勾配溶出)。17.9 g (80%) の標題化合物を油状物として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.36 (s, 9H), 1.50 (m, 2H), 1.67 (m, 2H), 3.58 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.68 (t, J = 7 Hz, 2H), 7.85 (m, 4H), 9.90 (s, 1H)。
【００３７】
(b) 4-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシ)ブチルアミン
【化２３】
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【００３８】
(a)で得たN-(tert-ブチルオキシカルボニルアミノキシブチル)フタルイミド (8.35 g, 25.0 mmol) のEtOH (10 ml) 溶液に、ヒドラジン水化物 (20 ml) を添加し、その混合物を80℃で38時間撹拌した。その混合物を濃縮し、残渣を、EtOHおよびPhMeを用いて同時蒸着させた（coevaporate）。その残渣にEtOH (50 ml) を添加し、沈殿したフタルヒドラジドを濾過し、EtOH (50 ml) で洗浄した。合体させた濾液を濃縮して、5.08 gの油状物を得た。この油状物を、K2CO3 (10 g) の水 (20 ml) 溶液と混合し、生成物をCH2Cl2で抽出した。乾燥させ (MgSO4)、濃縮して、2.28 g (45%) の標題化合物を油状物として得、これを更に精製することなく使用した。1H NMR (DMSO-d6) δ 1.38 (m, 2H), 1.39 (s, 9H), 1.51 (m, 2H), 2.51 (t, J = 7 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 7 Hz, 2H)。
【００３９】
(c) N-Boc-O-(4-(4-(1,3-ビス(mPEG(20K)オキシ)-2-プロピルオキシ)ブチリルアミノ)ブチル)ヒドロキシルアミン
【化２４】
2008530289.tif 000015
【００４０】
(mPeg-NH-CO-O-CH2)2CH-O-(CH2)3-CO-OSu (Nektar, 2Z3Y0T01, 2.0 g, 50μmol) を、4-(Boc-アミノキシ)ブチルアミン (187 mg, 915μmol) のDCM (12 ml) 溶液と混合した。室温で43時間撹拌した後、その混合物を、撹拌されたEt2O (200 ml) に滴下した。濾過し、Et2Oで洗浄した。生成物をDCM (10 ml) 中に再度溶解し、Et2O (200 ml) からもう１回沈殿させた。この沈殿析出は、3回繰り返した。その後、生成物をDCM (100 ml) 中に溶解し、Amberlyst 15 (11 g; DCMで洗浄) で5分間処理した。濾過し、濃縮した後、生成物を、上述のとおりEt2Oから沈殿させた。濾過し、減圧下で乾燥させて、1.98 gの標題化合物を固形物として得た。
【００４１】
(d) O-(4-(4-(1,3-ビス(mPEG(20K)オキシ)-2-プロピルオキシ)ブチリルアミノ)ブチル)ヒドロキシルアミン
【化２５】
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【００４２】
先の反応から得た生成物 (1.98 g) をDCM中に溶解し、Amberlyst 15 (7.5 g; DCMで洗浄) を添加した。5分間撹拌した後、その混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣に、DCM (40 ml) およびTFA (40 ml) を添加した。室温に0.5時間置いた後、その混合物を濃縮し、残渣を、DCMおよびトルエンの混合物を用いて2回同時蒸着させ（coevaporate）、減圧下で一晩乾燥させた。残渣を水 (33 ml) 中に溶解し、2-メチルピリジン (1.5 ml) の添加によりpH 5-6に中和した。この溶液を、タンパク質由来のアルデヒドのオキシム化のために直接使用した。
【００４３】
本明細書で引用される出版物、特許出願および特許を含むすべての参照文献は、これらの各々が、個別かつ具体的に参照により組み込まれていることが表示され、かつ本明細書にその全体が記載されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
すべての見出しおよび小見出しは、便宜の目的のためだけに本明細書で使用され、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００４５】
あらゆる可能なバリエーションでの上記構成要件の任意の組合せが、本明細書にそうでないことが記載されていたり、あるいは文脈により明らかに否定されていたりしない限り、本発明に包含される。
【００４６】
本発明を説明する文脈で使用される用語“a”および“an”および“the”および類似の指示語は、本明細書にそうでないことが記載されていたり、あるいは文脈により明らかに否定されていたりしない限り、単数および複数の両方をカバーするものと解釈すべきである。
【００４７】
本明細書において値の範囲の記載は、本明細書にそうでないことが記載されていない限り、その範囲内に含まれる別個の各値を個々に言及する簡略方法として機能することを単に意図し、別個の各値は、本明細書に個々に列挙されているように本明細書に組み込まれる。そうでないことが記載されない限り、本明細書で提供される正確な値のすべては、対応する近似値の代表値である（たとえば、特定の因子または測定に関して提供される正確な例示的な値のすべては、適切な場合には、「約」により修飾される、対応する近似の測定値も提供すると考えることができる）。
【００４８】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書にそうでないことが記載されていたり、あるいは文脈により明らかに否定されていたりしない限り、任意の適切な順序で実施することができる。
【００４９】
本明細書で提供されるあらゆる例または例示的な言語（たとえば、“たとえば（such as）”）の使用は、本発明に対して説明の光明を投ずることを単に意図し、そうでないことが記載されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確に記載されていない限り、本明細書におけるいずれの言語も、任意の構成要件が本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈すべきではない。
【００５０】
本明細書において特許文献の引用および組込みは、便宜の目的のためだけに為され、かかる特許文献の有効性、特許性および/または法的強制力の見解を反映するものではない。
【００５１】
一または複数の構成要件に関して“含む（comprising）”、“有する（having）”、“包含する（including）”または“含有する（containing）”などの用語を使用する、本発明の任意の側面または態様の本明細書における記載は、そうでないことが記載されていたり、あるいは文脈により明らかに否定されていたりしない限り、その特定の構成要件“からなる（consists of）”、その特定の構成要件“から本質的になる（consists essentially of）”、またはその特定の構成要件“を実質的に含む（substantially comprises）”本発明の類似の側面または態様に対するサポートを提供することを意図する（たとえば、特定の構成要件を含むものとして本明細書に記載される組成物は、そうでないことが記載されていたり、あるいは文脈により明らかに否定されていたりしない限り、その構成要件からなる組成物を記載するものとも理解すべきである）。
【００５２】
本発明は、本明細書で示される側面または特許請求の範囲に記載の主題のあらゆる改変および均等物を、適用法で許容される最大限の範囲まで包含する。
【国際調査報告】
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