(57)【要約】転移したガン、たとえば転移した腫瘍を治療する方法は、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を被験体に投与する工程を含む。化合物、化合物の互変異性体、化合物の塩、互変異性体の塩、またはそれらの混合物を使用して転移性ガンの医薬を製造できる可能性がある。変数Ａは本明細書で定義された値を持つ。一つの実施態様において、本発明は、ヒトガン患者などの被験体において、転移性のガンを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガンは乳ガン、肝ガン、肺ガン、または前立腺ガンである。2008528617.tif 000034
2008528617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移した腫瘍を持つ被験体を治療する方法であって、該方法は、構造式Ｉ
【化１】
2008528617.tif 000028
の化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を被験体に投与する工程を包含し、式中、Ａは次の構造
【化２】
2008528617.tif 000029
の一つを有する基であり、ここで、
Ｒ１は、１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、
さらに、該転移した腫瘍の増殖が、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を該被験体に投与したあとで、阻害される、
方法。
【請求項２】
Ｒ１がメチル基であり、構造Ｉの化合物が構造ＩＡ
【化３】
2008528617.tif 000030
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物を全身投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、第二の物質を前記被験体に投与する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
構造Ｉの化合物の乳酸塩またはその互変異性体を被験体に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍が多発性骨髄腫であり、前記被験体がｔ（４；１４）染色体の転座を持つ多発性骨髄腫患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍が多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該多発性骨髄腫が線維芽細胞増殖因子レセプター３を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍が多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該多発性骨髄腫が該患者の骨に転移している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の物質が骨粗鬆症の治療を対象としている、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が急性骨髄性白血病であり、前記被験体が急性骨髄性白血病患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が血液学的な腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が充実性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が前記被験体の骨に転移している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が乳ガン、前立腺ガン、肝臓ガンまたは肺ガンに罹っていて、そして／または前記腫瘍が乳ガン、前立腺ガン、肝臓ガンまたは肺ガンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガン患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガンの患者であり、そして該前立腺ガンが該患者の骨に転移している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二の物質がビスホスホネートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガンの患者であり、そして該患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の物質が抗ガン剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
構造Ｉの化合物が経口投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
構造式Ｉ
【化４】
2008528617.tif 000031
の化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物の、被験体の転移したガンを治療するための医薬の製造における使用であって、式中、
Ａは次の構造
【化５】
2008528617.tif 000032
の一つを有する基であり、ここで、
Ｒ１は、１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、
さらに、該患者の転移した腫瘍の増殖が、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を該被験体に投与したあとで、阻害される、
使用。
【請求項２４】
Ｒ１がメチル基であり、構造Ｉの化合物が構造式ＩＡ
【化６】
2008528617.tif 000033
を有する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記医薬がさらに第二の物質を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
構造Ｉの化合物の乳酸塩またはその互変異性体が前記医薬の製造に使用される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
前記ガンが多発性骨髄腫であり、前記被験体がｔ（４；１４）染色体が転座した多発性骨髄腫患者である、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２８】
前記ガンが多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該多発性骨髄腫が線維芽細胞増殖因子レセプター３を発現する、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２９】
前記ガンが多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該多発性骨髄腫が該患者の骨に転移している、請求項２３〜２６に記載の使用。
【請求項３０】
前記ガンが多発性骨髄腫であり、前記被験体が多発性骨髄腫患者であり、そして該患者がヒトである、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３１】
前記ガンが急性骨髄性白血病であり、前記被験体が急性骨髄性白血病患者である、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３２】
前記ガンが血液学的な腫瘍である、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３３】
前記ガンが充実性腫瘍である、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３４】
前記ガンが前記被験体の骨に転移している、請求項２３に記載の使用。
【請求項３５】
前記被験体が乳ガン、前立腺ガン、肝臓ガンまたは肺ガンを罹っており、そして／または前記ガンが乳ガン、前立腺ガン、肝臓ガンまたは肺ガンから選択される、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３６】
前記ガンが前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガン患者である、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３７】
前記ガンが前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガンの患者であり、そして該前立腺ガンが該患者の骨に転移している、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３８】
前記ガンが前立腺ガンであり、前記被験体が前立腺ガンの患者であり、そして該患者がヒトである、請求項２３〜２６のいずれか一つに記載の使用。
【請求項３９】
前記第二の物質が骨粗鬆症の治療を対象としている、請求項２５に記載の使用。
【請求項４０】
前記第二の物質がビスホスホネートである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記第二の物質が抗ガン剤である、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広く被験体の転移した腫瘍を治療するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、転移した腫瘍を処理し、そして転移した腫瘍を治療するための医薬を製造することに化合物、たとえば４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オンおよびその互変異性体、塩およびそれらの混合物を使用することを提供する。
【背景技術】
【０００２】
毛細血管は、人体のほぼすべての組織中に入り込んでおり、酸素および栄養分を組織に供給するとともに、老廃物の排泄が促進される。典型的な条件下では、毛細血管の内壁を被覆する内皮細胞は細胞分裂しないため、成人では通常その数も大きさも増加しない。しかし、ある正常な条件下、たとえば組織が損傷を受けた時や、月経周期のある一定の時期には、毛細血管が急激に増殖を始める。すでに存在する血管から新しい毛細血管が形成される過程は血管形成あるいは血管新生という言葉で知られている。非特許文献１を参照。傷が治癒する間に見られる血管形成は成人期における病態生理学的血管新生の一つの例である。傷が治癒する間、追加された毛細血管によって酸素および栄養分が供給され、肉芽組織が増進され老廃物の排泄が促進される。治癒過程が終了すると、通常毛細血管は退行する。Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ，Ａ．“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ａｄｕｌｔ，ａｎｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｈａａｒｔｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，（１９９９）。
【０００３】
血管形成は、ガン細胞の増殖にも重要な役割を演じる。ガン細胞病変が、ひとたびある大きさ、大ざっぱに言って１〜２ｍｍに達すると、拡散だけでは、ガン細胞に十分な酸素と栄養分を供給することが困難になるため、腫瘍がさらに成長するためには、ガン細胞が血液の供給を増やさなければならないことが知られている。したがって、血管の形成を阻害すればガン細胞の増殖を止めることができるものと予想される。
【０００４】
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は細胞の成長と分化、および成体組織の再形成や再生を調節するトランスメンブラン（膜貫通）ポリペプチドである。非特許文献２；非特許文献３。増殖因子として知られるポリペプチドリガンドまたはサイトカインは、ＲＴＫを活性化することが知られている。シグナリングＲＴＫは、リガンドの結合、およびレセプターの外部ドメインにおける立体配置の変化とそれによるレセプターの二量化を含む。Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ，Ａ．“Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ａｄｕｌｔ，ａｎｄ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｔｈｏｌｏｇｙ，  Ｈａａｒｔｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，（１９９９）；  Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ほか、Ｃｅｌｌ  ６１，２０３〜２１２（１９９０）。リガンドがＲＴＫに結合すると特定のチロシン残基でレセプターのトランスホスホリル化が起き、そのあとに、細胞質基質をリン酸化するための触媒ドメインの活性化がつづく。同上文献。
【０００５】
ＲＴＫの２つのサブファミリーは血管内皮に対して特異的である。これらのサブファミリーには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）サブファミリーとＴｉｅレセプターサブファミリーとが含まれる。クラスＶ  ＲＴＫにはＶＥＧＦＲ１（ＦＬＴ−１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ（ヒト）、Ｆｌｋ−１（マウス））、およびＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ−４）が含まれる。Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．ほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５，５１９〜５２５（１９９０）；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．ほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６，１６７７〜１６８３（１９９１）；  Ａｐｒｅｌｉｋｏｖａ，Ｏ．ほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，７４６〜７４８（１９９２）。
【０００６】
ガンは、腫瘍細胞の増殖を推進する多重の遺伝子欠陥を含む病気である。それゆえ、複数個の細胞シグナル伝達経路を同時に阻害する戦略が、より好ましい治療成績をもたらす可能性がある。腫瘍細胞には、しばしば、ＲＴＫの過剰発現および／または活性化をもたらす変異が存在し、腫瘍の増殖に関係している。Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ，ＰおよびＨｕｎｔｅｒ，Ｔ．，“Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ，４１１，ｐｐ３５５〜６５（２００１）；  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，２５５，ｐｐ５３８〜６１（２００４）。ほとんどのＲＴＫは、細胞外ドメインを持ち、リガンドの結合および自己リン酸化を仲介し、シグナル伝達イベントのカスケードの引き金を引く下流シグナル伝達分子の動員を仲介する細胞内キナーゼドメインと関連している。ガンに関係するＲＴＫは３０を超え、その例を挙げれば、たとえばタイプＩＩＩ（ＰＤＦＧＲ、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＬＴ３およびｃ−ＫＩＴ）、タイプＩＶ（ＦＧＦＲ１−４）およびタイプＶ（ＶＥＧＦＲ１−３）ＲＴＫなどがある。
【０００７】
悪性Ｂ細胞の疾患である多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄（ＢＭ）にクローン形質細胞が蓄積することと、溶骨障害とに特徴がある。自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）と支援的ケアの進歩とが、この病気と長期生存とにめざましい効果をもたらしている。Ａｔｔａｌ，Ｍ．ほか、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９６；３３５：９１〜９７；およびＢａｒｌｏｇｉｅ，Ｂ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１９９７；８９：７８９〜７９３。しかし、患者は常に病気をぶりかえすため、ＭＭは、普遍的な死の病である。ＭＭにおけるランダムでない染色体の転座を同定することで、強力な予後ツールを手にすることができ、新規分子標的の同定が可能となった。ＭＭの患者の半数近くがガン遺伝子と推定されている遺伝子を過剰発現し、５つの再発性免疫グロブリン重（ＩｇＨ）転座：１１ｑ１３（サイクリンＤ１）、６ｐ２１（サイクリンＤ３）、４ｐ１６（ＦＧＦＲ３およびＭＭＳＥＴ）、１６ｑ２３（ｃ−ｍａｆ）および２０ｑ１１（ｍａｆＢ）のうちの一つによって調節不全に陥る。Ｋｕｅｈｌ，Ｗ．Ｍ．ほか、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２；２：１７５〜１８７；およびＡｖｅｔ−Ｌｏｉｓｅａｕ，Ｈ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００２；９９：２１８５〜２１９１。これらの転座はＭＭが進行する過程の早期のおそらく生殖の（ｓｅｍｉｎａｌ）イベントを表している可能性が高い。比較的最近、これらの特異的ＩｇＨ転座が予後に関連することが明確になってきた。特に、患者のおよそ１５％に現れるｔ（４；１４）は、ＭＭに対して、ＡＳＣＴの目に見えるような治療効果が上がらず、特にはかばかしくない予後の原因になっているように見える。Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００３；１０１：４５６９〜４５７５；  Ｋｅａｔｓ，Ｊ．Ｊ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００３；１０１：１５２０〜１５２９；  Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００２；１００：１５７９〜１５８３；およびＣｈａｎｇ，Ｈ．ほか、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００４；１２５：６４〜６８。新規治療法がこれらの患者にとって必要であることは言うまでもない。
【０００８】
ｔ（４；１４）転座は、２つのガン遺伝子、すなわちｄｅｒ（４）上のＭＭＳＥＴと、ｄｅｒ（１４）上のＦＧＦＲ３とが調節不全であると思われる点で異常である。Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．ほか、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９７；１６：２６０〜２６５；およびＣｈｅｓｉ，Ｍ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１９９８；９２：３０２５〜３０３４。これらの遺伝子のいずれか一方、または両方の調節不全が、ＭＭの病態発現にとって重大な意味を持つか否かはわかっていないが、いくつかの証拠は、腫瘍の開始と進行にＦＧＦＲ３が果たす役割を裏付けている。ＲＴＫの一つ、ＷＴ  ＦＧＦＲ３の活性化が、骨髄腫細胞の増殖と生存を促進しており、造血マウスモデルにわずかに転換しつつある。Ｐｌｏｗｒｉｇｈｔ，Ｅ．Ｅ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２０００；１００：３８１９〜３８２１。つづいて起きる一部ＭＭにおけるＦＧＦＲ３の変異活性化の獲得は、後期骨髄腫への進行と関連していて、いくつかの実験モデルにいちじるしく転換しつつある。Ｃｈｅｓｉ，Ｍ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２０００；９７：７２９〜７３６；およびＬｉ，Ｚ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００１；９７：２４１３〜２４１９。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究は、ＦＧＦＲ３が、化学抵抗性を付与する可能性を示唆している。その観察は通常の化学療法に対する応答が悪いことおよびｔ（４；１４）ＭＭ患者の生存期間中央値が短いことを示す臨床データによって支持される。Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００３；１０１：４５６９〜４５７６；Ｋｅａｔｓ，Ｊ．Ｊ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００３；１０１：１５２０〜１５２９；Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００２；１００：１５７９〜１５８３；およびＣｈａｎｇ，Ｈ．ほか、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００４；１２５：６４〜６８。これらの知見はＦＧＦＲ３の異所発現が、骨髄腫の腫瘍形成に重要な、しかし珍しくはない役割を演じる可能性を示唆しており、そのことがこのＲＴＫを分子療法の標的にする動機をなしている。
【０００９】
ｔ（４；１４）ＭＭ細胞株におけるＦＧＦＲ３の阻害は細胞毒応答を誘起する。そのことは、末期患者から取り出したこれらの細胞の遺伝子的変化が複雑であるにもかかわらず、これらの細胞は、ＦＧＦＲ３のシグナル伝達に依存しつづけることを示している。Ｔｒｕｄｅｌ，Ｓ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００４；１０３：３５２１〜３５２８；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．ほか、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００４；１２４：５９５〜６０３；およびＧｒａｎｄ，Ｅ．Ｋ．ほか、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００４；１８：９６２〜９６６。これらの観察はヒトの悪性度の範囲でレセプターチロシンの不活性化の結果と一致しており、そこでは臨床的な成功の記録が保存されており、その成功は、予後が良くないこれらの患者を治療するためのＦＧＦＲ３インヒビターの臨床的開発を促している。Ｄｒｕｋｅｒ，Ｂ．Ｊ．ほか、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１；３４４：１０３１〜１０３７；  Ｄｅｍｅｔｒｉ，Ｇ．Ｄ．ほか、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２；３４７：４７２〜４８０；  Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ほか、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１；３４４：７８３〜７９２；およびＳｍｉｔｈ，Ｂ．Ｄ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００４；１０３：３６６９〜３６７６。
【００１０】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は攻撃的なガンであり、全成人急性白血病の９０％を占め、発生率は１００，０００人当たり３．９人で、毎年新たに１０，５００症例の発生が推定されている。Ｒｅｄａｅｌｌｉ，Ａ．ほか、Ｅｘｐｅｒ．Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．，３，６９５〜７１０（２００３）。細胞毒物質（Ａｒａｃ＋アントラサイクリン）はＡＭＬ患者の最大７０％に寛解を誘発する可能性を持つ。しかし、大部分は再発してしまい、もっと効果的な療法の必要性を映し出している。Ｗｅｉｃｋ，Ｊ．Ｋ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，８８：２８４１〜２８５１（１９９６）；  Ｖｏｇｌｅｒ，Ｗ．Ｒ．ほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０：１１０３〜１１１１（１９９２）。腫瘍細胞の遺伝子型は、ＡＭＬ芽細胞の２５〜３５％がｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｆｌｔ３／Ｆｌｋ２／Ｓｔｋ−２）の変異を持っているのに対して、大部分（＞７０％）は野生型ＦＬＴ３を発現することを示している。Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｄ．Ｇ．ほか、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，９：２７４〜２８１（２００２）；  Ｎａｋａｏ，Ｍ．ほか、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１０：１９１１−１９１８（１９９６）；  Ｙｏｋｏｔａ，Ｓ．ほか、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１１：１６０５〜１６０９（１９９７）。ＦＬＴ３レセプターは、ＣＳＦ−１Ｒ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＤＣＦＲを包含するクラスＩＩＩレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のメンバーで、造血細胞、樹枝状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および始原Ｂ細胞の増殖、分化および生存に重要な役割を演じていることは、機能的に知られている。ＭｃＫｅｎｎａ，Ｈ．Ｊ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９５：３４８０〜３４９７（２０００）；  Ｍａｃｋａｅｈｔｃｊｉａｎ，ｋ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３／１４７〜１６１（１９９５）。ＦＬＴ３は他のＲＴＫと同様、５つのＩＧ様細胞外ドメインに特徴があり、親水的なキナーゼ挿入ドメインを含んでいる。Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ，Ｐ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ，４１１：３５５〜３６５（２００１）。ＦＬＴ３の連結につづくシグナル伝達は、ＳＴＡＴ５（転写５のシグナルトランスデューサおよびアクチベーター）、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）およびＰＩ３Ｋを含む複数の下流経路を変調する。Ｈａｙａｋａｗａ，Ｆ．ほか、Ｏｎｃｏｒｏｇｅｎｅ，１９：６２４〜６３１（２０００）；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１６：８５〜９２（２００４）；  Ｚｈａｎｇ，Ｓ．ほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２：７１９〜７２８（２０００）；  Ｒｏｓｎｅｔ，Ｏ．ほか、Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９５：２１８２２３（１９９６）。変異体ＦＬＴ３を持つ細胞では、発ガンシグナルの伝達が、調節不全キナーゼの活性化および／または自己抑制ドメインの機能喪失から生じる（ＦＬＴ３ライゲーション不在下の）構成キナーゼの活性化と関連づけられる。Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ，Ｄ．Ｌ．ほか、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３：６５０〜６６５（２００３）；  Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．ほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０：７０７〜７２１（２００４）。これらＦＬＴ３変異の分子レベルにおける特性評価から、ＦＬＴ３のメンブラン近傍（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）領域における遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）かキナーゼ領域（ＡＳＰ８３５／８３６）の点変異が明らかにされており、１７〜３４％がＦＬＴ３  ＩＴＤであり、約７％が点変異である。Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９７：２４３４〜２４３９（２００１）；  Ｔｈｉｅｄｅ，Ｃ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９９：４３２６〜４３３５（２００２）；  Ａｂｕ−Ｄｕｈｉｅｒ，Ｆ．Ｍ．ほか、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１１３：９８３〜９８８（２００１）。さらに、ＡＭＬにおける好ましくない予後としてＦＬＴ３  ＩＴＤ変異が関係していることを裏づけるかなりの証拠があり、病気の再発の増加および全体的な生存の減少と相関づけている。Ｔｈｉｅｄｅ，Ｃ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９９：４３２６〜４３３５（２００２）；  Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ，Ｓ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１００：５９〜６６（２００２）。ＡＭＬにおけるＦＬＴ３変異の関連性を考慮に入れると、ＦＬＴ３に対する小分子キナーゼインヒビター／抗体を使用する多くの標的化アプローチは、医薬品開発の臨床前または初期のフェーズで研究が進められている最中である。Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．ほか、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４０：７０７〜７２１（２００４）；  Ｏ‘Ｆａｒｒｅｌｌ，Ａ．Ｍ．ほか、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，９：５４６４〜５４７６（２００３）；  Ｗｅｉｓｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．ほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１；４３３〜４４３（２００２）；  Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｄ．ほか、Ｂｌｏｏｄ（２００４）；  Ｋｅｌｌｙ，Ｌ．Ｍ．ほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１：４２１〜４３２（２００２）。
【００１１】
前立腺腫瘍の場合、ＶＥＧＦＲおよび、血管形成におけるＰＤＧＦＲの役割以外に、いくつかの線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびそれらの受容体（ＦＧＦＲ）が、ヒトの前立腺の発達とホメオスタシスにおいて、カギとなる間質−表皮間の連絡を促進する。Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ，Ａ．Ｗ．およびＭｏｌｅｍａ，Ｇ．，“Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５２，ｐｐ２３７〜６８（２０００）；  Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，“ＶＥＧＦ：ａｎ  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｓｐｅｃｔｓ，”  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，ｐｐ６１７〜２４（２０００）；  Ｋｗａｂｉ−Ａｄｄｏ，Ｂ．，Ｏｚｅｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｉｔｔｍａｎｎ，Ｍ．，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｃｅｒ，”Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ，１１，ｐｐ７０９〜２４（２００４）；およびＧｏｗａｒｄｈａｎ，Ｂ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｄ．Ａ．，Ｍａｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．ほか、“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９２，ｐｐ．３２０〜７（２００５）。前立腺ガンの病理発生に線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の変化が関係しているのではないかと言われている。Ｏｚｅｎ，Ｍ．Ｇｉｒｉ，Ｄ．Ｒｏｐｉｑｕｅｔ，Ｆ．，Ｍａｎｓｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｉｔｔｍａｎｎ．Ｍ．“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，”Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９３，ｐｐ．１７８３〜９０（２００１）。前立腺ガンは、多くの症例で骨に転移する傾向があるため、患者が骨格の合併症および／または骨折を起こすリスクが高く、その高いリスクが、前立腺ガン患者の罹病率と死亡率の主要原因をなしている。このように、前立腺ガン治療法および前立腺ガン患者における前立腺ガンの骨への転移を防止する方法が必要とされている。
【００１２】
近年、各種インドリル置換化合物が特許文献１、特許文献２および特許文献３に開示され、やはり近年、各種ベンズイミダゾリル化合物が特許文献４に開示されている。開示内容によれば、これらの化合物は、レセプタータイプおよび非レセプターチロシンキナーゼのシグナル伝達を阻害、変調、および／または調節できるという。開示された化合物のいくつかは、インドリル基またはベンズイミダゾリル基に結合したキノロンフラグメントを含んでいる。
【００１３】
４−ヒドロキシキノロン誘導体および４−ヒドロキシキノリン誘導体の合成は、多くの文献に開示されており、これらの文書は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる。例を挙げれば、Ｕｋｒａｉｎｅｔｓらは、３−（ベンズイミダゾール−２−イル）−４−ヒドロキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリンの合成を開示している。Ｕｒａｉｎｅｔｓ，Ｉほか、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．４２，７７４７〜７７４８（１９９５）；  Ｕｒａｉｎｅｔｓ，Ｉほか、Ｋｈｉｍｉｙａ  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ  Ｓｏｅｄｉｎｉｉ，２，２３９〜２４１（１９９２）。Ｕｋａｒａｉｎｅｔｓは、別の４−ヒドロキシキノロンおよびそれらのアナローグ、たとえば１Ｈ−２−オキソ−３−（２−ベンズイミダゾリル）−４−ヒドロキシキノリンの合成、抗痙攣活性および抗甲状腺活性も開示している。Ｕｒａｉｎｅｔｓ，Ｉほか、Ｋｈｉｍｉｙａ  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ  Ｓｏｅｄｉｎｉｉ，１，１０５〜１０８（１９９３）；  Ｕｒａｉｎｅｔｓ，Ｉほか、Ｋｈｉｍｉｙａ  Ｇｅｔｅｒｏｔｓｉｋｌｉｃｈｅｓｋｉｋｈ  Ｓｏｅｄｉｎｉｉ，８，１１０５〜１０８（１９９３）；  Ｕｒａｉｎｅｔｓ，Ｉほか、Ｃｈｅｍ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐ．，３３，６００〜６０４（１９９７）。
【００１４】
各種キノリン誘導体の合成が特許文献５に開示されている。これらの化合物は、核ホルモンレセプターに対する結合能力を有するとして、また骨芽細胞の増殖および骨の成長を刺激するために有用であるとして開示されている。これらの化合物は、核ホルモンレセプターファミリーが関係する病気の治療または防止にも有用であるとして開示されている。
【００１５】
キノロンのベンゼン環が硫黄基で置換された各種キノリン誘導体が特許文献６に開示されている。これらの化合物は医薬製剤に有用であるとして、また医薬として開示されている。
【００１６】
キノロンおよびクマリン誘導体が、医薬および医薬製剤と関係のないさまざまな用途に有用であるとして開示されている。光重合可能な組成物への使用および発光する性質に対する使用に向けられるキノロン誘導体の生成について記載する文献として、Ｏｋａｍｏｔｏらに授与された特許文献７；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２および特許文献１３を挙げることができ、これらの文書は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【００１７】
血管形成および血管内皮増殖因子レセプターチロシンキナーゼの阻害に、また別のチロシンキナーゼおよびセリン／スレオニンキナーゼの阻害に有用な、たとえば４−アミノ−５−フルオロ−３−［５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オンまたはその互変異性体のような各種キノリノンベンズイミダゾール化合物が、次に挙げる文書、つまり特許文献１４；特許文献１５；米国特許出願第１０／１１６，１１７号（特許文献１６として２００３年０２月０６日公告）；米国特許出願第１０／６４４，０５５号（特許文献１７として２００４年０５月１３日公告）；米国特許出願第１０／９８３，１７４号；米国特許出願第１０／７０６，３２８号（特許文献１８として２００４年１１月０４日公告）；米国特許出願第１０／９８２，７５７号；米国特許出願第１０／９８２，５４３号に開示されており、これらの文書は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【特許文献１】国際公報第０１／２９０２５号パンフレット
【特許文献２】国際公報第０１／６２２５１号パンフレット
【特許文献３】国際公報第０１／６２２５２号パンフレット
【特許文献４】国際公報第０１／２８９９３号パンフレット
【特許文献５】国際公報第９７／４８６９４号パンフレット
【特許文献６】国際公報第９２／１８４８３号パンフレット
【特許文献７】米国特許第５，８０１，２１２号明細書
【特許文献８】特開平８−２９９７３号公報
【特許文献９】特開平７−４３８９６号公報
【特許文献１０】特開平６−９９５２号公報
【特許文献１１】特開昭６３−２５８９０３号公報
【特許文献１２】欧州特許第７９７３７６号明細書
【特許文献１３】独国特許発明第２３  ６３  ４５９号明細書
【特許文献１４】米国特許第６，６０５，６１７号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，７５６，３８３号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００３／００２８０１８号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００４／００９２５３５号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００４／０２２０１９６号明細書
【非特許文献１】Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９６）２７５，１５０〜１５４
【非特許文献２】Ｍｕｓｔｏｎｅｎ，Ｔほか、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）１２９，８９５〜８９８
【非特許文献３】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ，Ｐ．ほか、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４）１０，２５１〜３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
近年、腫瘍およびガンの治療方法が進歩したにもかかわらず、新しいガン治療法に対する要求、特に、転移した腫瘍のような転移性のガンの治療に対する新しい方法および組成物に対する要求は、依然として重要である。多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病および前立腺ガンに対する治療方法は、なお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は転移性のガンおよび特に転移した腫瘍の治療方法を提供する。また、本発明は転移性のガンを治療するための医薬製剤および医薬の使用において、化合物、その互変異性体、その塩およびそれらの混合物の使用を供する。
【００２０】
一つの実施態様において、本発明は、ヒトガン患者などの被験体において、転移性のガンを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガンは乳ガン、肝ガン、肺ガン、または前立腺ガンである。別の実施形態において、転移した腫瘍を治療する方法が提供される。別の実施形態において、転移した腫瘍を持つ被験体を治療する方法が提供される。追加的な実施形態は血液学的腫瘍を治療する方法を提供する。別の実施形態は充実性腫瘍を治療する方法を提供する。これらの方法は、有効量の構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を被験体に投与する工程を含む。構造式Ｉは次式で表される：
【００２１】
【化７】
2008528617.tif 000003
（式中、
Ａは次の構造の一つを有する基である：
【００２２】
【化８】
2008528617.tif 000004
（式中、
Ｒ１は、Ｈまたは、１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基から選択される）。
【００２３】
本発明の方法のさまざまな実施形態において、投与したあとで（被験体の）ガンまたは転移した腫瘍の増殖を阻害される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、Ｒ１はメチル基であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＡを有する。
【００２５】
【化９】
2008528617.tif 000005
いくつかの実施形態において、Ｒ１は水素であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＢを有する。
【００２６】
【化１０】
2008528617.tif 000006
いくつかの実施形態において、Ｒ１はメチル基であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＣを有する。
【００２７】
【化１１】
2008528617.tif 000007
別の実施形態は、転移した腫瘍を持つ被験体を治療する方法を提供し、その方法は、転移した腫瘍に構造ＩＡ、ＩＢまたはＩＣを接触させることを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、化合物は全身投与される。特に構造Ｉの化合物が経口投与または静脈内投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、第二の物質が被験体に投与される。特に、第二の物質は骨粗鬆症を治療するための物質であり、たとえばビスホスホネートである。別の実施形態において、第二の物質は抗ガン剤である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、化合物は構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣの化合物であり、化合物の乳酸塩または互変異性体が被験体に投与される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体はｔ（４；１４）染色体が転座した多発性骨髄腫患者である。特に、腫瘍は血液学的腫瘍である。
【００３２】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、多発性骨髄腫は線維芽細胞増殖因子レセプター３を発現する。
【００３３】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、多発性骨髄腫は患者の骨、たとえば骨髄に転移している。
【００３４】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、患者はヒトである。
【００３５】
いくつかの実施形態において、腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり、被験体は急性骨髄性白血病の患者である。いくつかのそのような実施形態において、被験体は哺乳動物であり、いくつかの実施形態においてそれはヒトであり、別の実施形態においてそれはイヌまたはネコである。
【００３６】
いくつかの実施形態において、腫瘍またはガンは肝ガン、肺ガン、または乳ガンから選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、腫瘍は前立腺ガンであり、被験体は前立腺ガンの患者であり、前立腺ガンは患者の骨に転移している。
【００３８】
いくつかの実施形態において、腫瘍は前立腺ガンであり、被験体は前立腺ガンの患者であり、患者はヒトである。
【００３９】
一つの実施態様において、本発明は、本発明の方法の、いずれかの実施形態の、いずれかに使用するための医薬または医薬製剤の製造における、構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、および／またはＩＣの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物の使用を提供する。
【００４０】
別の一つの実施態様において、本発明は、構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、および／またはＩＣの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を入れた容器を含むキットを提供する。そのキットは転移したガンまたは腫瘍の治療に使用するための別の一つの化合物を含んでもよい。キットは、さらに、本発明の方法のいずれかを実施するための指示が書かれた使用説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態において、書かれた使用説明書は、キットの容器とは別個の紙の文書として含まれてもよく、それに対して、別の実施形態において、書かれた文書は、キットの容器に貼り付けられるラベルに書かれてもよい。
【００４１】
本発明のさらなる目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明は転移したガン、特に、転移した腫瘍、たとえば転移した多発性骨髄腫および転移した前立腺ガンなどの治療方法を提供する。さらに本発明は、化合物、互変異性体、塩およびそれらの混合物を、転移したガン、特に充実性腫瘍または血液学的な腫瘍を治療するための医薬または医薬製剤の製造に使用することを提供する。
【００４３】
本出願明細書には全体にわたって次の略字および定義が使用される：
“ＡＭＬ”は急性骨髄性白血病を表す略字である。
【００４４】
“ＡＬＳ”は筋萎縮性側索硬化症を表す略字である。
【００４５】
“ＡＤ”  はアルツハイマー病を表す略字である。
【００４６】
“ＡＰＰ”  はアミロイド前駆体タンパク質を表す略字である。
【００４７】
“ＡＳＣＴ”  は自己幹細胞移植を表す略字である。
【００４８】
“ＢＭ”  は骨髄を表す略字である。
【００４９】
“ｂＦＧＦ”  はベーシック線維芽細胞増殖因子を表す略字である。
【００５０】
“ＦＧＦＲ１”  は、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦと相互作用するチロシンキナーゼを表す略字であり、ｂＦＧＦＲとも呼ばれる。
【００５１】
“Ｃｄｃ２”  は細胞分裂サイクル２を表す略字である。
【００５２】
“Ｃｄｋ２”  はサイクリン依存性キナーゼ２を表す略字である。
【００５３】
“Ｃｄｋ４”  はサイクリン依存性キナーゼ４を表す略字である。
【００５４】
“Ｃｈｋ１”  はチェックポイントキナーゼ１を表す略字である。
【００５５】
“ＣＫ１ε”  はカゼインキナーゼ１（エプシロン）を表す略字である。
【００５６】
“ｃＡＢＬ”  は最初、アベルソン白血病ウイルスから分離された腫瘍発生産生物を表すチロシンキナーゼの略字である。
【００５７】
“Ｃ−Ｋｉｔ”  は幹細胞因子レセプターまたはマスト細胞増殖因子レセプターとしても知られる。
【００５８】
“ＦＧＦ”  はＦＧＦＲ１と相互作用する線維芽細胞増殖因子を表す略字である。
【００５９】
“ＦＧＦＲ３”  は骨髄腫タイプのガンにしばしば発現されるチロシンキナーゼ線維芽細胞増殖因子レセプター３を表す略字である。
【００６０】
“Ｆｌｋ−１”  は胎児肝臓チロシンキナーゼ１を表す略字であり、キナーゼ挿入ドメインチロシンキナーゼあるいはＫＤＲ（ヒト）でも知られ、さらに血管内皮増殖因子レセプター２またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ（ヒト）、Ｆｌｋ―１（マウス））の名称でも知られている。
【００６１】
“ＦＬＴ−１”  はｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１を表す略字であり、血管内皮増殖因子レセプター１またはＶＥＧＦＲ１の名称でも知られている。
【００６２】
“ＦＬＴ−３”  はｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３を表す略字であり、幹細胞チロシンキナーゼ１（ＳＴＫ１）の名称でも知られている。
【００６３】
“ＦＬＴ−４”  はｆｍｓ様チロシンキナーゼ−４を表す略字であり、ＶＥＧＦＲ３でも知られている。
【００６４】
“Ｆｙｎ”  はＳＲＣ、ＦＧＲ、ＹＥＳと関連するＦＹＮ腫瘍遺伝子キナーゼを表す略字である。
【００６５】
“ＧＳＫ−３”  はグリコーゲン合成酵素キナーゼ３を表す略字である。
【００６６】
“ＰＡＲ−１”  は乱れた会合キナーゼとしても知られるキナーゼを表す略字で、ＨＤＡＫとも呼ばれる。
【００６７】
“Ｌｃｋ”  はリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼを表す略字である。
【００６８】
“ＭＥＫ１”  はＲａｔ−ＭＥＫ１−ＥＲＫの、形成されたモジュールのＭＡＰＫ（分裂促進因子によって活性化されるタンパク質キナーゼ）シグナル伝達経路におけるセリンスレオニンキナーゼを表す略字である。ＭＥＫ１はＥＲＫ（細胞外調節キナーゼ）をリン酸化する。
【００６９】
“ＭＭ”  は多発性骨髄腫を表す略字である。
【００７０】
“ＮＥＫ−２”  はＮＩＭ−Ａ関連キナーゼを表す略字である。
【００７１】
“ＮＩＭ−Ａ”  は有糸分裂をしないことを表す略字である。
【００７２】
“ＰＤＧＦ”  は血小板由来増殖因子を表す略字である。ＰＤＧＦはチロシンキナーゼＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβと相互作用する。
【００７３】
“Ｒｓｋ２”  はリボソームＳ６キナーゼ２を表す略字である。
【００７４】
“Ｒａｆ”はＭＡＰＫシグナル伝達経路におけるセリン／スレオニンキナーゼである。
【００７５】
“ＲＴＫ”はレセプターチロシンキナーゼを表す略字である。
【００７６】
“Ｔｉｅ−２”  はＩｇおよびＥＧＦ相同ドメインを持つチロシンキナーゼを表す略字である。
【００７７】
“ＶＥＧＦ”  は血管内皮増殖因子を表す略字である。
【００７８】
“ＶＥＧＦ−ＲＴＫ”  は血管内皮増殖因子レセプターチロシンキナーゼを表す略字である。
【００７９】
「転移」という用語は、腫瘍部位から身体の別の部位へガン細胞が広がることを指す。ガン細胞は、一般にリンパ系または血流を介して全身に広がる。
【００８０】
転移した腫瘍の増殖阻害とは、腫瘍の増殖を直接的に阻害すること、および／または腫瘍に由来するガン細胞を全身的に阻害することを指す。
【００８１】
一般に、ある元素、たとえば水素またはＨについて言及した場合、それはその元素のすべての同位体を包含することを意味する。たとえば、構造Ｉの化合物のある一つの基が削除される場合、あるいはＨで表される場合、それは水素またはＨ、デュートリウムおよびトリチウムを含むものと定義される。
【００８２】
「１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基」という表現は、ヘテロ原子を含まず、かつ１ないし６個の炭素原子を含むアルキル基を意味する。それゆえ、この表現にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖アルキル基が包含される。さらに、この表現には直鎖アルキル基の分枝鎖異性体も含まれ、例として次のような基を挙げることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない：  −ＣＨ（ＣＨ２）２、−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２など。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基を包含する。別の実施形態において、アルキル基は１ないし４個の炭素原子を有する。さらに別の実施形態において、アルキル基は、１ないし２個の炭素原子を有する直鎖アルキル基（メチル基またはエチル基）である。さらに別の実施形態において、アルキル基はただ１個の炭素原子を有していて、メチル基（−ＣＨ３）である。
【００８３】
「医薬的に許容される塩」という表現は、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸、塩基性アミノ酸、または酸性アミノ酸との塩を含む。無機塩基の塩の例として、本発明は、たとえばアルカリ金属、たとえばナトリウムまたはカリウム、アルカリ土類金属、たとえばカルシウムおよびマグネシウムまたはアルミニウム、およびアンモニアを含む。有機塩基の塩として、本発明は、たとえばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンを含む。無機酸として、本発明は、たとえば塩酸、ヒドロホウ酸（ｈｙｄｒｏｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、硝酸、硫酸、およびリン酸を含む。有機酸として、本発明は、たとえばギ散、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸を含む。塩基性アミノ酸として、本発明は、たとえばアルギニン、リシンおよびオルニチンを含む。酸性アミノ酸として、本発明は、たとえばアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００８４】
一つの実施態様において、本発明は被験体、たとえばヒトガン患者の転移したガンを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ガンは乳ガン、肝ガン、肺ガンまたは前立腺ガンである。別の実施形態において、転移した腫瘍を治療する方法が提供される。別の実施形態において、転移した腫瘍を持つ被験体を治療する方法が提供される。追加的な実施形態は、血液学的腫瘍を治療する方法を提供する。別の実施形態は、充実性腫瘍を治療する方法を提供する。これらの方法は、有効量の構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を、投与する必要がある被験体に投与する工程を含む。構造Ｉは次式を有する：
【００８５】
【化１２】
2008528617.tif 000008
式中、
Ａは、次の構造の一つを有する：
【００８６】
【化１３】
2008528617.tif 000009
式中、
Ｒ１は、Ｈまたは１ないし６個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基から選択され、そして
さまざまな実施形態において、ガンまたは転移した腫瘍の増殖が、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を投与したあとで阻害される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ１はメチル基であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＡを有する。
【００８８】
【化１４】
2008528617.tif 000010
いくつかの実施形態において、Ｒ１は水素であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＢを有する。  
【００８９】
【化１５】
2008528617.tif 000011
いくつかの実施形態において、Ｒ１はメチル基であり、構造Ｉの化合物は構造ＩＣを有する。
【００９０】
【化１６】
2008528617.tif 000012
別の実施形態は、転移した腫瘍を持つ被験体を治療する方法を提供し、その方法は、転移した腫瘍に構造ＩＡ、ＩＢまたはＩＣを接触させることを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、化合物は全身投与される。特に構造Ｉの化合物が経口投与または静脈内投与される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第二の物質が被験体に投与される。特に、第二の物質は骨粗鬆症を治療するための物質であり、たとえばビスホスホネートである。別の実施形態において、第二の物質は抗ガン剤である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、化合物は構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、またはＩＣの化合物であり、化合物の乳酸塩または互変異性体が被験体に投与される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、被験体の生存率が、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を投与したあとで、引き延ばされる。
【００９５】
本発明によれば、転移したさまざまな腫瘍を治療することが可能である。血液学的な腫瘍およびガンの例として、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫などが挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は、ｔ（４；１４）染色体が転座した多発性骨髄腫の患者である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、そして多発性骨髄腫は線維芽細胞増殖因子レセプター３を発現する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、そして多発性骨髄腫は患者の骨、たとえば骨髄に転移している。本発明の化合物は骨に集中するため、転移した血液学的腫瘍の治療に特に有用であり、かつ有効である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、腫瘍は充実性腫瘍である。別の実施形態において、患者は乳ガン、肝ガン、肺ガンまたは前立腺ガンに罹っている。それゆえ、いくつかの実施形態において、ガンまたは腫瘍は乳ガンである。別の実施形態において、ガンまたは腫瘍は肝ガンである。さらに別の実施形態において、ガンまたは腫瘍は肺ガンである。さらに別の実施形態において、ガンまたは腫瘍は前立腺ガンである。別の実施形態において、患者は胃ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、副腎ガン、非小細胞肺ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、卵巣ガン、腹膜ガン、前立腺ガン、頭部および頸部ガン、膀胱ガン、結腸直腸ガン、またはグリア芽細胞腫に罹っている。本明細書に記載する方法はこのような任意のガンの治療にも有用である。特に、これらの方法は骨に転移したガン、たとえば患者の骨に転移した前立腺ガンの治療などに有用である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明は骨に転移したガン患者の治療方法を提供する。このようなガンは血液学的腫瘍か、あるいは充実性腫瘍でもよい。いくつかの実施形態において、ガンは多発性骨髄腫であり、別の実施形態において、前立腺ガンである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、腫瘍は多発性骨髄腫であり、被験体は多発性骨髄腫の患者であり、そして患者はヒトである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、腫瘍は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であり、被験体は急性骨髄性白血病の患者である。いくつかの実施形態において、被験体は哺乳動物であり、いくつかの実施形態において、その哺乳動物はヒトであり、別の実施形態において、その哺乳動物はイヌまたはネコである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、腫瘍は前立腺ガンであり、被験体は前立腺ガン患者であり、そして前立腺ガンは患者の骨に転移している。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、腫瘍は前立腺ガンであり、被験体は前立腺ガン患者であり、そして患者はヒトである。
【０１０４】
一つの実施態様において、本発明は、構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、および／またはＩＣの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を、本発明の方法のいずれかの、実施形態のいずれかに使用するための医薬または医薬製剤の製造に使用することを提供する。
【０１０５】
別の一つの実施態様において、本発明は構造Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、および／またはＩＣの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を入れた容器を含むキットを提供する。そのキットは転移したガンまたは腫瘍の治療に使用するための、別の一つの化合物を含んでもよい。キットは、さらに、本発明の方法のいずれかを実施するための指示が書かれた使用説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態において、書かれた使用説明書は、キットの容器とは別個の紙の文書として含まれてもよく、それに対して、別の実施形態において、書かれた文書は、キットの容器に貼り付けられるラベルに書かれてもよい。
【０１０６】
構造Ｉの化合物は、下記「実施例」の章に記載する手順および下記の文書に開示された手順を使って容易に合成される。次に挙げる文書は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる：  米国特許第６，６０５，６１７号，米国特許出願第２００４／００９２５３５号として公告；  米国特許出願第１０／９８３，１７４号，米国特許出願第２００４／０２２０１９６号として公告；  米国特許出願第１０／９８２，７５７号；および米国特許出願第１０／９８２、５４３号。
【０１０７】
本明細書に記載する目的のために使用することが可能であり、そして本明細書に記載するさまざまな生物学的状態を治療するために使用することが可能な医薬を製造するために、構造Ｉの化合物、該化合物の互変異性体、該化合物の医薬的に許容される塩、該互変異性体の医薬的に許容される塩、またはそれらの混合物を使用することができる。
【０１０８】
医薬製剤は、上記実施形態のいずれかに記載する化合物、互変異性体、または塩のいずれかを、本明細書に記載するような医薬的に許容される担体と組み合わせた形で、含むことができる。  
【０１０９】
さらに、本発明は、本発明の一つ以上の化合物、またはその医薬的に許容される塩、互変異性体、またはそれらの混合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤、バインダー、希釈剤などとを混合することにより製造可能な、転移した腫瘍に関係する障害を治療または改善するための組成物も提供する。本発明の組成物は、本明細書に記載する転移した腫瘍を治療するために使用される製剤の製造に使用できる。このような製剤は、たとえば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐薬、注射液、乳剤、エリキシル剤、懸濁液または溶液の形が可能である。本組成物はさまざまな投与経路、たとえば、経口投与、鼻腔内投与、直腸投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、または腹腔内注射などに合わせて製剤化することができる。下記の剤型を例に挙げて説明するが、もちろんこれによって本発明が制限されるものではない。
【０１１０】
口腔、頬部および舌下への投与には、粉末、懸濁液、顆粒、錠剤、ピル、カプセル、ゲルキャップ、およびキャップレットが、固体剤型として許容される。これらの剤型はたとえば、一つ以上の本発明の化合物、医薬的に許容される塩、互変異性体、またはそれらの混合物を、少なくとも一つの添加物、たとえばデンプンなどと混合して作ることができる。好適な添加物はショ糖、乳糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギネート、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成ポリマーまたは半合成ポリマーまたはグリセリドである。経口剤型には、投与しやすくするため、たとえば不活性希釈剤や、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、パラベンやソルビン酸などの保存剤、アスコルビン酸、トコフェロール、システインなどの酸化剤のほか、さらに崩壊剤、バインダー、増粘剤、緩衝剤、甘味料、風味料、あるいは香料など、上記以外の成分を任意選択的に含めることができる。錠剤およびピルは、さらに、適当な既存の被覆物質で処理することができる。
【０１１１】
経口投与のための液体剤型は、医薬的に許容されるエマルション、シロップ、エリキシル剤、懸濁液、および溶液の形が可能であり、これらの液剤には水などの不活性希釈剤を含めることができる。医薬製剤および医薬は、滅菌液を使って液体懸濁液や溶液の形で製造することができ、その場合、滅菌液にはたとえば油、水、アルコールおよびこれらの組み合わせを使用できるが、これらに限定されるものではない。経口または非経口投与には、医薬的に好適な界面活性剤、懸濁剤、乳化剤を加えることができる。
【０１１２】
上で触れたたように懸濁液には油を加えることができる。そのような油として、たとえば落花生油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。懸濁製剤には脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドなどを含めることができる。懸濁液製剤は、アルコール、たとえば、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールを含むことができるが、これらに限定されるものではない。懸濁製剤には、限定されるものではないがポリ（エチレングリコール）のようなエーテル、そして鉱油およびワセリンなどの石油系炭化水素および水も使用できる。
【０１１３】
鼻腔投与の場合、医薬製剤および医薬は、適当な溶媒および、任意選択的にその他の化合物、たとえば、限定されるものではないが安定剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ改善剤、およびそれらの組み合わせを含むスプレーまたはエアロゾルが可能である。エアロゾル製剤用噴射剤としては、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または炭化水素系低沸点溶媒が使用可能である。
【０１１４】
注射液剤型には、一般に、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使って調製可能な水性懸濁液または油性懸濁液が含まれる。注射液剤型は、溶媒または希釈剤を使って調製される溶液相か懸濁液の形が可能である。許容される溶媒または媒質は、滅菌水、リンゲル液または生理食塩水などである。あるいは、溶媒または懸濁剤として滅菌油も使用できる。使用される油または脂肪酸は、好ましくは不揮発性天然油または合成油、脂肪酸、モノ、ジまたはトリグリセリドである。
【０１１５】
注射用医薬製剤および／または医薬は、上に記載した適当な溶液で再溶解するのに適した粉末とすることも可能である。このような例を挙げれば、凍結乾燥粉末、回転式蒸発器でえられた乾燥粉末またはスプレイドライ粉末、非結晶粉末、顆粒、沈殿物または粒子などであるが、これらに限定されるものではない。注射用製剤は、任意選択的に安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ改善剤およびこれらの組み合わせを含んでもよい。
【０１１６】
直腸投与用の医薬製剤および医薬は、腸、Ｓ状結腸曲および／または結腸で化合物を放出する坐薬、軟膏、浣腸剤、錠剤またはクリームの形が可能である。直腸に投与する坐薬は、一つ以上の本発明の化合物、または化合物の医薬的に許容される塩もしくは互変異性体を、許容される賦形剤、たとえば普通の保存温度では固相で存在し、体内、たとえば直腸で薬物を放出するに適する温度では液相で存在するココアバターまたはポリエチレングリコールと混合することによって製造することができる。油も軟質ゼラチンタイプの製剤および坐薬の製造に使用できる。懸濁製剤の製造には水、食塩水、デキストロース水溶液とその関連糖液およびグリセロールが使用でき、懸濁製剤は、懸濁剤、たとえばペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースのほか、緩衝剤および保存剤も含むことができる。
【０１１７】
上に記載した代表的な剤型以外に、医薬的に許容される賦形剤および担体は当業者に広く知られており、それゆえ本発明に包含される。このような賦形剤および担体は、たとえば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されている。この文献は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【０１１８】
本発明の製剤は、以下で述べるように、短時間作用、迅速放出、長時間作用および持続的放出するように設計することが可能である。すなわち、医薬製剤を、放出を制御したり、ゆっくり放出されるように製剤化することもできる。
【０１１９】
本組成物は、たとえばミセル、リポソーム、あるいは何か別のカプセル化した剤型を包含することもできるし、あるいは長時間貯蔵および／または送達効果を賦与するため、長時間にわたって放出する形で投与する工程もできる。それゆえ、医薬製剤および医薬はペレットまたは円柱状に加圧成型し、デポ注射剤として、あるいはステントのようなインプラントとして筋肉内または皮下に埋め込むこともできる。このようなインプラントは、既知の不活性材料、たとえばシリコーンポリマーや生分解性ポリマーを使用できる。
【０１２０】
比投与量は、被験体の病気の状態、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、およびダイエット、投与の間隔、投与経路、排出速度、および使用薬物の組み合わせによって調節可能である。有効量を含む上記剤型は、いずれもルーチン実験の範囲内に入るため、本発明の範囲内にある。
【０１２１】
治療的に効果的な用量は投与経路および剤型によって変化する可能性がある。本発明の好ましい化合物は高い治療指数を示す製剤である。治療指数というのは毒性効果と治療効果の間の用量比であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の間の比で表すことができる。ＬＤ５０は集合の５０％が死亡する量を意味し、ＥＤ５０は集合の５０％に対して治療的に有効な量を指す。ＬＤ５０とＥＤ５０は、標準的薬物学的手順に従い、動物細胞培地または実験動物を使って決定される。
【０１２２】
本発明で言う「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という表現は、障害または病気に付随する症状を緩和すること、またはそれらの症状がさらに進行または悪化するのを阻止すること、または病気または障害を防止または予防することを意味する。たとえば、患者の転移した腫瘍を治療するという文脈の範囲内で、成功した治療（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）とは、腫瘍または病気組織に栄養補給をする毛細血管の増殖の低下、ガンの増殖または腫瘍、毛細血管または病気組織の増殖に関連する症状の緩和、毛細血管の増殖の阻止、またはガンなどの病気の進行、またはガン細胞の増殖の阻止を含む。治療は本発明の医薬製剤の投与と他の治療法の組み合わせも含むことができる。たとえば、本発明の化合物および医薬製剤は、外科手術および／または放射線治療の前に、これらの治療法と並行して、あるいはこれらの治療のあとに投与する工程ができる。本発明の化合物は、アンチセンスおよび遺伝子治療法で使用されるものを含む別の抗ガン剤と組み合わせて投与する工程も可能である。適当な組み合わせは、腫瘍学およびガン医薬分野の当業者によって決定可能である。
【０１２３】
本発明による医薬製剤および医薬は、構造Ｉの化合物またはその互変異性体、それらの塩またはそれらの混合物を医薬的に許容される担体と組み合わせた形で包含する。かくして、本発明の化合物は医薬および医薬製剤の製造に使用でき、このようにして製造された医薬および医薬製剤は本明細書に記載する治療方法に使用できる。
【０１２４】
本発明の医薬製剤および医薬は、カンプトテシン、ドキソルビシン、シスプラチン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩおよびＩＩインヒビター、および放射線治療などの抗ガン剤と併用すると、相乗効果を示すことが明らかにされており、特に、併用療法の使用に適している。それゆえ、本発明は、抗ガン剤と併用する形で、構造Ｉの化合物および互変異性体、それらの塩および／またはそれらの混合物を含む医薬製剤を提供する。さらに本発明は、このような製剤および医薬の創出に化合物、互変異性体、塩、および／または混合物の使用を提供する。
【０１２５】
別の一つの実施態様において、本発明は、本発明の化合物と抗ガン剤とを併用投与して転移したガンを治療する方法を提供する。その方法は、それを必要とする被験体に、メシル酸イマチニブ（グリベック）、ＢＡＹ  ４３−９００６、ブロスタリシン、レナリドマイド（レブリミド）、サリドマイド（サロミド）、ドセタキセル（タキソテール）、エルロチニブ（タルセバ）、バタリニブ（ＰＴＫ−７８７）、ＶＥＧＦ−トラップ、ｆｅｎｒｅｔｉｄｉｎｅ、ボルテゾミブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ペルツズマブ、および／またはリツキシマブから選択された抗ガン剤および本発明の化合物、化合物の互変異性体、化合物の塩、互変異性体の塩、それらの混合物、または、化合物、互変異性体、化合物の塩、互変異性体の塩、または混合物を含む医薬製剤を投与する工程を含む。
【０１２６】
本発明の化合物はさまざまな被験体の治療に使用できる。好適な被験体には哺乳動物およびヒトが含まれる。好適な哺乳動物には、キツネザル、類人猿、およびサルなどの霊長類；ラット、マウスおよびモルモットなどの齧歯類；家ウサギ、野ウサギ；ウシ；ウマ；ブタ；ヤギ；ヒツジ；有袋類；およびネコ科、イヌ科およびクマ科などの肉食動物が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、被験体または患者はヒトである。別の実施形態において、被験体または患者はマウスまたはラットなどの齧歯類である。いくつかの実施形態において、被験体または患者はヒト以外の動物であり、いくつかの実施形態において、被験体または患者はヒト以外の哺乳動物である。
【０１２７】
本発明に使用される化合物が互変異性現象を示すことを理解しなければならない。本明細書の中で言及される化学構造は、可能な互変異性体の一つしか表すことができないため、本発明は、描かれた構造のいかなる互変異性体をも包含していることを理解しなければならない。たとえば、構造ＩＡは以下に一つの互変異性体、すなわち互変異性体１ａで示されている：
【０１２８】
【化１７】
2008528617.tif 000013
構造ＩＡの別の互変異性体、すなわち互変異性体Ｉｂおよび互変異性体Ｉｃは以下に示されている。
【０１２９】
【化１８】
2008528617.tif 000014
このように包括的に記述された本発明は、図解によって示される以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解できよう。そしてこれらの実施例は、本発明の理解を助けるためのものであって、これによって本発明が制限されるものではない。
【実施例】
【０１３０】
本明細書で一貫して使用される化学用語に関する略字は以下のとおりである：
ＡＴＰ：        アデノシントリホスフェート
Ｂｏｃ：        Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＢＳＡ：        ウシ血漿アルブミン
ＤＭＳＯ：      ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ：        ＤＬ−ジチオスレイトール
ＥＤ５０：        集団の５０％に対して治療的に有効な用量
ＥＤＴＡ：      エチレンジアミン四酢酸
ＥｔＯＨ：      エタノール
ＨＰＬＣ：      高速液体クロマトグラフィ
ＩＣ５０値：      測定された活性を５０％低下させるインヒビター濃度
ＫＨＭＤＳ：    カリウム＝ビス（トリメチルシリル）アミド
ＬＣ／ＭＳ：    液体クロマトグラフィ／質量分析
ＴＨＦ：        テトラヒドロフラン。
【０１３１】
（化合物の精製および確認）
本発明の化合物は２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅを装着したＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍクロマトグラフィシステム（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，Ｍａｓａｃｈｕｓｅｔｓ）を使った高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって確認した。分析カラムにはＡｌｌｔｅｃｈ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手したＡｌｌｔｉｍａ  Ｃ−１８逆相カラム、４．６×２５０  ｍｍを使用した。溶離にはグラジエント溶離法を使用した。使用した代表的な溶離は、プログラムによって、５％アセトニトリル／９５％水から１００％アセトニトリルまで４０分間で変化させた。すべての溶媒にはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を０．１％含量となるように添加した。化合物は、２２０ｎｍまたは２５４ｎｍにおける紫外線（ＵＶ）の吸収により検出した。ＨＰＬＣ用溶媒はＢｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ社（Ｍｕｓｋｅｇａｎ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）またはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手した。いくつかの例において、純度は、たとえばＢａｋｅｒ−Ｆｌｅｘ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  １Ｂ２−Ｆフレキシブルシートのような、シリカゲルガラスプレートまたはプラスチックシートを使った薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって検定した。ＴＬＣの結果は、紫外線を照射するか、あるいはよく知られたヨウ素蒸気およびその他の各種発色方法によって、容易に肉眼で検出された。
【０１３２】
質量分光分析は２種類のＬＣＭＳ装置のうちの一つで行った：Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ  ＨＰＬＣ＋Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ質量分析装置；    カラム：Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８，２１×５０ｍｍ；  溶媒系：０．０５％ＴＦＡ添加５〜９５％アセトニトリル／水；流速０．８ｍＬ／分；  分子量範囲１５０〜８５０；  コーン電圧２０Ｖ；  カラム温度４０℃）またはＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｒｉｅｓ  １１００  ＨＰＬＣ：  カラム：Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８，２．１×５０ｍｍ；  溶媒系：０．０５％ＴＦＡ添加１〜９５％アセトニトリル／水；  流速０．４ｍＬ／分；  分子量範囲１５０〜８５０；  コーン電圧５０Ｖ；カラム温度３０℃）。すべての質量はプロトン化した親イオンとして報告する。
【０１３３】
ＧＣＭＳ分析はＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ分析装置（ＨＰ６８９０  Ｓｅｒｉｅｓガスクロマトグラフ＋Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ５９７３；        注入量：１μＬ；  初期カラム温度：５０℃；  最終カラム温度：２５０℃；  ランプ時間：２０分；  ガス流量：１ｍＬ／分；  カラム：５％フェニルメチルシロキサン＃ＨＰ  １９０９１５−４４３，カラムサイズ：３０．０ｍ×２５μｍ×０．２５μｍ）で行った。
【０１３４】
分取スケールの分離は、Ｆｌａｓｈ  ４０クロマトグラフィシステム＋ＫＰ−Ｓｉｌ，６０Ａ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）か、Ｃ−１８逆相カラムを使ったＨＰＬＣの、どちらかで行った。Ｆｌａｓｈ  ４０  Ｂｉｏｔａｇｅシステムには、主な溶媒としてジクロロメタン、メタノール、酢酸エチル、ヘキサンおよびトリエチルアミンを使用した。逆相クロマトグラフィには、濃度を変化させたアセトニトリル−水にトリフルオロ酢酸を０．１％添加したものを使用した。
【０１３５】
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペリジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの合成
【０１３６】
【化１９】
2008528617.tif 000015
Ａ．５−（４−メチルピペリジン−１−イル）−２−ニトロアニリンの合成
方法Ａ
【０１３７】
【化２０】
2008528617.tif 000016
冷却器を備えた２０００ｍＬフラスコに、５−クロロ−２−ニトロアニリン（５００ｇ，２．８９８ｍｏｌ）および１−メチルピペラジン（８７１ｇ，８．６９３ｍｏｌ）を入れ、窒素ガスでフラスコ内部を置換した。１００℃に加熱した油浴にフラスコを入れ、ＨＰＬＣで確認しながら５−ニトロ−２−ニトロアニリンが完全に反応するまで（通常一晩）加熱した。５−ニトロ−２−ニトロアニリンが完全に消えたことをＨＰＬＣで確認したのち、機械的に攪拌しながら、反応混合物を直接（まだ温かい間に）室温の水２５００ｍＬに注入した。室温になるまで生成した混合物を攪拌し、それから濾過した。得られた黄色固体を１０００ｍＬの水に加えて３０分間攪拌した。生成した混合物を濾過し、得られた固体をＴＢＭＥ（５００ｍＬ，２回）で洗浄し、それから固体をゴム製ダムを使って１時間真空乾燥した。得られた固体を乾燥トレイに移し、重さが変わらなくなるまで、真空乾燥器内で、５０℃で乾燥し、標題化合物６７０ｇ（９７．８％）の黄色粉末を得た。
【０１３８】
方法Ｂ
オーバーヘッド（電動）攪拌機、冷却器、ガス導入管、滴下漏斗および温度プローブを備えた５００ｍＬ４つ口丸底フラスコに、５−クロロ−２−ニトロアニリン（３０８．２ｇ，１．７９ｍｏｌ）を加えた。フラスコ内に窒素ガスを導入したのち、攪拌しながら１−メチルピペラジン（７５８．１ｇ、８４０ｍＬ、７．５７ｍｏｌ）および２００ｐｒｏｏｆエタノール（５０６ｍＬ）を反応フラスコに加えた。再びフラスコを窒素ガスで置換し、反応を窒素下に維持した。フラスコを内部の温度が９７℃（±５℃）になるまで加熱マントルで加熱し、反応が終了したことをＨＰＬＣで確認するまで（通常約４０時間）この温度に維持した。反応が終了したら加熱をやめ、内部の温度が約２０〜２５℃に下がるまで攪拌しながら反応物を冷却し、それから反応物を２〜３時間攪拌した。この間に沈殿が生じなかった場合は、５−（４−メチルピペリジン−１−イル）−２−ニトロアニリンの種結晶（０．２０ｇ，０．８５ｍｏｌ）を反応混合物に添加した。攪拌しながら約１時間かけて水（２，４５０ｍｍＬ）を反応混合物に加えた。この間、内部の温度は約２０〜３０℃の温度範囲に維持した。水を添加したのち、生成した混合物を２０〜３０℃の温度で１時間攪拌した。次に、生成した混合物を濾過し、フラスコと濾過ケーキを水（３×２．５６Ｌ）で洗浄した。黄金色固体生成物を真空乾燥器中、約５０℃で、重さが変化しなくなるまで真空乾燥した（４１６ｇ，９８．６％）。
【０１３９】
方法Ｃ
オーバーヘッド攪拌機、冷却器、ガス導入管、滴下漏斗および温度プローブを備えた１２Ｌ４つ口丸底フラスコに、５−クロロ−２−ニトロアニリン（４０１ｇ，２．３２ｍｏｌ）を加えた。フラスコ内に窒素ガスを導入したのち、攪拌しながら１−メチルピペラジン（９７７ｇ、１．０８Ｌ、９．７５ｍｏｌ）および１００％エタノール（６５０ｍＬ）を反応フラスコに加えた。再びフラスコを窒素ガスで置換し、反応物を窒素下に維持した。フラスコを内部の温度が９７℃（±５℃）になるまで加熱マントルで加熱し、反応が終わったことをＨＰＬＣで確認するまで（通常約４０時間）この温度に維持した。反応が終了したら加熱をやめ、内温が約８０℃に下がるまで、攪拌しながら反応物を冷却し、内部温度を８２℃（±３℃）に維持しながら、滴下漏斗から水（３．１５Ｌ）を、混合物に１時間かけて添加した。水の添加が終了したら、加熱をやめ、反応混合物の内部温度が２０〜２５℃に達するまで、４時間以上の時間をかけて放冷した。反応混合物を、内部温度２０〜３０℃でさらに１時間攪拌した。生成した混合物を濾過し、フラスコと濾過ケーキを水（１×１Ｌ）、５０％エタノール（１×１Ｌ）および９５％エタノール（１×１Ｌ）で洗浄した。黄金の固体生成物を乾燥皿に入れ、真空乾燥器中、約５０℃で、重さが変化しなくなるまで真空乾燥した（５４６ｇ，収率９９％）。
【０１４０】
Ｂ．［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステルの合成
方法Ａ
【０１４１】
【化２１】
2008528617.tif 000017
５０００ｍＬ４つ口フラスコに攪拌機、温度計、冷却器およびガス導入管／排出管を取り付けた。そのフラスコに５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリン２６５．７ｇ（１．１２ｍｏｌ、１．０ｅｑ）および２００ｐｒｏｏｆエタノール２１２５ｍＬを入れた。生成した溶液に１５分間窒素ガスを導入した。次に、５％Ｐｄ／Ｃ（５０％Ｈ２Ｏ  ｗ／ｗ）２０．０ｇを加えた。水素ガスを導入しながら、反応混合物を４０〜５０℃（内部温度）で激しく攪拌した。１時間ごとにＨＰＬＣで反応をモニターし、５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリンの消失を追跡した。典型的な反応時間は６時間であった。
【０１４２】
５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリンが反応物から完全に消えたのち、溶液に窒素ガスを１５分間導入した。次に、３−エトキシ−３−イミノプロパン酸エチル塩酸塩４４０．０ｇ（２．２５ｍｏｌ）を固体として加えた。反応が終了するまで、４０〜５０℃（内部の温度）で反応物を攪拌した。ＨＰＬＣでジアミノ化合物の消失を追跡することにより、反応をモニターした。典型的な反応時間は１〜２時間であった。反応が終了したら、反応物を室温まで冷却し、Ｃｅｌｉｔｅ濾過助材の層を通して濾過した。無水エタノール（２×２５０ｍＬ）でＣｅｌｉｔｅ濾過助材を洗浄し、濾液を減圧濃縮して粘稠な褐色／橙色油状物を得た。得られた油状物を０．３７％ＨＣＬ溶液８５０ｍＬに溶解した。次に、固体ＮａＯＨ（２５ｇ）を一度に加えると、沈殿が生成した。生成した混合物を１時間攪拌したのち、濾過した。固体を水（２×４００ｍＬ）で洗ったのち、真空乾燥機中、５０℃で乾燥すると、［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル２５１．７ｇ（７４．１％）が、淡黄色の粉末として得られた。
【０１４３】
方法Ｂ
５０００ｍｍＬのジャケット付き４つ口フラスコに機械式攪拌機、冷却器、温度プローブ、ガス導入管およびオイルバブラーを取り付けた。そのフラスコに５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリン３００ｇ（１．２７ｍｏｌ）および２００ｐｒｏｏｆエタノール２４００ｍＬ（反応は９５％エタノール中で行うことができるかもしれないし実際に行われた。したがって、この反応に２００ｐｒｏｏｆエタノールを使用する必要はない）を入れた。生成した溶液を攪拌し、１５分間窒素ガスを導入した。次に、５％Ｐｄ／Ｃ（５０％Ｈ２Ｏ  ｗ／ｗ）２２．７ｇを反応フラスコに加えた。反応器に窒素ガスを１５分間導入した。窒素ガスを導入したのち、反応フラスコに水素ガスをゆっくり、しかし一定の速度で導入して置換した。ＨＰＬＣ分析によって５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリンが完全に消費されたことが確認されるまで、４５〜５５℃（内部の温度）で、水素を導入しながら反応物を攪拌した。典型的な反応時間は６時間であった。
【０１４４】
反応物からすべての５−（４−メチルピペラジン−１−イル）−２−ニトロアニリンが消えたのち、溶液に窒素ガスを１５分間導入した。ジアミン中間体は空気に鋭敏なため、空気にさらされないように注意した。３−エトキシ−３−イミノプロパン酸エチル塩酸塩５００ｇ（２．５６ｍｏｌ）を反応混合物に約３０分かけて添加した。ＨＰＬＣ分析によってジアミンが完全に消費されたことが確認されるまで、反応物を、窒素下、４５〜５５℃（内部の温度）で攪拌した。典型的な反応時間は約２時間であった。反応が終了したら、暖かい間にＣｅｌｉｔｅの層を通して反応物を濾過した。反応フラスコおよびＣｅｌｉｔｅを２００ｐｒｏｏｆエタノール（３×２８５ｍｌ）で洗浄した。濾液を５０００ｍＬフラスコに入れて一つにし、真空蒸発させてエタノール約３３００ｍＬを除去すると、橙色油状物が得られた。得られた油状物に水（５３０ｍＬ）、つづいて１Ｍ  ＨＣｌ（３５０ｍＬ）を加え、得られた混合物を攪拌した。生成した溶液を激しく攪拌しながら、これに３０％ＮａＯＨ（２００ｍＬ）を、内部の温度を約２５〜３０℃に保ちながら、約２０分間で添加し、ｐＨを９〜１０にした。内部の温度を約２０〜２５℃に維持しながら、生成した懸濁液を約４時間攪拌した。得られた混合物を濾過し、濾過ケーキを水（３×３００ｍＬ）で洗浄した。集めた固体を、重さが一定になるまで真空乾燥器中、５０℃で真空乾燥し、［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル３４５．９ｇ（９０．１％）を淡黄色の粉末として得た。もう一つの分離操作法では、濾液を一つに合わせたのち、エタノールを真空下に蒸発させ、少なくとも約９０％のエタノールを除去した。得られた油状物に中性のｐＨで水を加え、それから溶液を約０℃まで冷却した。次に、高速で攪拌しながら２０％ＮａＯＨ水溶液をゆっくり加えて、（ｐＨメーターで見ながら）ｐＨを９．２にした。生成した混合物を濾過し、上記と同様に乾燥した。この分離操作法により淡黄褐色ないし淡黄色生成物が９７％の高収率で得られた。
【０１４５】
［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステルの水分含量を減らす方法
上の操作で得られ、約８〜９％の水分含量まで乾燥した［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル（１２０．７ｇ）を２０００ｍＬ丸底フラスコに入れ、無水エタノール（５００ｍＬ）に溶解した。コハク色の溶液を回転式蒸発器で加熱しながら濃縮して溶媒を完全に除去し、粘稠な油状物を得た。この操作をさらに２回くり返した。このようにして得られた粘稠油状物がフラスコに残った状態でそのまま真空乾燥器に入れ、５０℃で一晩加熱した。カールフィッシャー水分測定の結果、水含量は５．２５％であることがわかった。この方法による低水分含量は、次の実施例において収率の向上をもたらした。この乾燥法に対して、エタノールの代わりにトルエンやＴＨＦなどの別の溶媒を使用することができる。
【０１４６】
Ｃ．４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの合成
方法Ａ
【０１４７】
【化２２】
2008528617.tif 000018
冷却器、機械式攪拌機、温度プローブを取り付けた５０００ｍＬフラスコ中、ＴＨＦ（３８００ｍＬ）に［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル（２５０ｇ，８２０ｍｍｏｌ）（エタノールとともに上記のように乾燥）を溶解し、アルゴンを導入した。２−アミノ−６−フルオロベンゾニトリル（９５．３ｇ，７００ｍｍｏｌ）を溶液に加え、内部の温度を４０℃まで昇温した。すべての固体が溶解し、溶液の温度が４０℃に達したら、固体ＫＨＭＤＳ（３７６．２ｇ，１８９０ｍｍｏｌ）を５分間かけて加えた。カリウム塩基を加え終わったとき、不均一な黄色溶液が得られ、内部の温度は６２℃まで上昇していた。６０分すると内部の温度は４０℃まで下がり、ＨＰＬＣ分析によれば反応は終了していることがわかった（出発物質または非環化中間生成物は存在しなかった）。稠密な反応混合物を水（６０００ｍＬ）中に注加し、生成した混合物が室温に下がるまで攪拌してクエンチした。つづいて混合物を濾過し、濾過層を水（１０００ｍＬ、２×）で洗浄した。鮮やかな黄色固体を乾燥トレイに入れ、真空乾燥器中、５０℃で一晩乾燥し、１５５．３ｇ（４７．９％）の目的物質、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンを得た。
【０１４８】
方法Ｂ
５０００ｍｍＬのジャケット付き４つ口フラスコに蒸留装置、温度プローブ、窒素ガス導入管、滴下漏斗および機械式攪拌機を取り付けた。［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル（１７３．０ｇ，５７０ｍｍｏｌ）を反応器に入れ、窒素ガスを１５分間導入した。つづいて、攪拌しながら乾燥ＴＨＦ（２６００ｍＬ）フラスコに加えた。すべての固体が溶解したのち、必要に応じて加熱しながら溶媒を留去した（真空下または大気圧下（温度を上げればそれだけ水の除去が容易になる））。溶媒１０００ｍＬを除去したのち蒸留をやめ、反応系に窒素ガスを導入した。つづいて乾燥ＴＨＦ１０００ｍＬを反応器に加え、すべての固体が溶解したら、再度溶媒１０００ｍＬを除去し終わるまで、蒸留（真空下または大気圧下）を行った。ＴＨＦを加えて溶媒を留去するこの操作を少なくとも４回くり返した（最初の３回の蒸留では溶媒の４０％を留去するのに対して４回目の蒸留では６０％を留去する）。それから試料１ｍＬを採取し、カールフィッシャー分析にかけて水分含量を決定した。分析の結果、試料の水分含量が０．２０％未満であることがわかったときは、反応を次の段落に記載したとおり続けた。しかし分析の結果、水分含量が０．２０％より多いことがわかったときは、０．２０％未満になるまで、上記の乾燥操作をくり返した。
【０１４９】
前の段落に記載した方法で水分含量が０．２０％未満になったのち、蒸留装置を還流冷却に取り替え、反応器に２−アミノ−６−フルオロベンゾニトリル（６６．２ｇ，４７０ｍｍｏｌ）（何回かの反応では０．９５当量使用した）を入れた。反応物を加熱し内部の温度を３８〜４２℃とした。内部温度が３８〜４２℃に達したとき、滴下漏斗からＫＨＭＤＳ溶液（１３１３ｇ，１．３２ｍｏｌ，ＴＨＦに溶かした２０％ＫＨＭＤＳ）を、内部温度を約３８〜５０℃に保ちながら５分間かけて反応物に添加した。カリウム塩基を加え終わったら、内部温度を３８〜４２℃に維持しながら、反応物を３．５〜４．５時間攪拌した（一部の実施例では３０〜６０分間攪拌したが、この時間以内に反応が終了している可能性がある）。ここで反応試料を採取し、ＨＰＬＣ分析した。反応が終了していないときは、ＫＨＭＤＳ溶液を５分間かけてさらに追加し、３８〜４２℃で４５〜６０分間攪拌した（ＫＨＭＤＳ溶液の量は次のようにして決定した：  ＩＰＣ比が３．５０＜０のときは１２５ｍＬ、１０．０≧ＩＰＣ比≧３．５０のときは５６ｍＬ、そして２０．０≧ＩＰＣ比≧１０のときは３０ｍＬ加えた）。ＩＰＣ比は、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンに対応する面積と非環化中間物質に対応する面積との比に等しい）。反応が終了（ＩＰＣ比＞２０）していれば反応器を内部温度が２５〜３０℃になるまで冷却し、内部温度を２５〜３５℃に保ちながら、反応器に水（３５０ｍＬ）を１５分間かけて加えた（別の一つの操作では反応を４０℃で行い、水を５分未満の時間で添加した。速くクエンチするほど時間とともに形成される不純物の量が減少する）。次に、還流冷却器を蒸留装置と付け替え、必要に応じて加熱しながら溶媒を留去（真空蒸留または常圧蒸留）した。溶媒１５００ｍＬを除去したのち、蒸留をやめ、反応器内に窒素を導入した。内部温度を２０〜３０℃の保ちながら、反応フラスコに水（１６６０ｍＬ）を添加した。つづいて、反応混合物を内部温度２０〜３０℃で３０分攪拌し、それから反応混合物を５〜１０℃まで冷却し、１時間攪拌した。生成した懸濁液を濾過し、反応フラスコと濾過ケーキを水（×３６５０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を真空乾燥器中、５０℃で重さが一定になるまで乾燥し、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの淡黄色粉末１０３．９ｇ（収率４２．６％）を得た。
【０１５０】
方法Ｃ
【０１５１】
【化２３】
2008528617.tif 000019
冷却器、機械式攪拌機、ガス導入管、および温度プローブを取り付けた１２Ｌの４つ口フラスコに［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル］酢酸エチルエステル（乾燥品）（６０８ｇ，２．０１ｍｏｌ）および２−アミノ−６−フルオロベンゾニトリル（２７４ｇ，２．０１ｍｏｌ）を入れ、加熱マントルにセットした。反応器に窒素を導入し、攪拌しながらトルエン（７．７Ｌ）を反応混合物に加えた。反応器に再度窒素を導入し、窒素雰囲気下に維持した。混合物の内部温度を６３℃（±３℃）まで昇温した。混合物の内部温度を６３℃（±３℃）に保ちながらトルエン約２．６Ｌをフラスコから減圧留去した（３８０±１０ｔｏｒｒ、蒸留ヘッドの温度ｔ＝４０℃（±１０℃））（カールフィッシャー分析を行って混合物の水分含量をチェックした。水分含量が０．０３％より多いときは、トルエンをさらに２．６Ｌ加えて、蒸留をくり返した。水分含量が０．０３％より少なくなるまでこの操作をくり返した）。水分含量が０．０３％より少なくなったら、加熱を止め、窒素下で反応物を内部温度１７〜１９℃まで冷却した。次に、反応物の内部温度を２０℃より低い温度に保ちながら、窒素下、反応物にカリウムｔ−ブトキシドＴＨＦ溶液（ＴＨＦに溶かした２０％溶液；３．３９ｋｇ、６．０４ｍｏｌｅｓのカリウムｔ−ブトキシド）を加えた。カリウムｔ−ブトキシドを加え終わったら、２０℃より低い内部温度で反応物を３０分間攪拌した。つづいて温度を２５℃まで上げ、反応物を少なくとも１時間攪拌した。それから温度を３０℃まで上げ、反応物を少なくとも３０分間攪拌した。つづいて、出発物質が消費され、反応が終了したかチェックするため、ＨＰＬＣを使って反応をモニターした（典型的には、２〜３時間で両出発物質が消費された（ＨＰＬＣにおける面積％が０．５％未満））。２時間後になっても反応が終了していないときは、さらに一回に０．０５当量のカリウムｔ−ブトキシドを加え、ＨＰＬＣで反応が終了したことが証明されるまで、この操作を行った。反応が終了したら、反応混合物を攪拌しながら水６５０ｍＬを加えた。つづいて、反応物を内部温度５０℃まで加熱し、減圧下に反応混合物からＴＨＦを留去した（約３Ｌ）。次に、滴下漏斗を使って反応混合物に水（２．６Ｌ）を滴下した。つづいて、混合物を室温まで冷却して少なくとも１時間攪拌した。混合物を濾過し、濾過ケーキを水（１．２Ｌ）、７０％エタノール（１．２Ｌ）および９５％エタノール（１．２Ｌ）で洗浄した。鮮やかな黄色固体を乾燥トレイに移し、真空乾燥器中、５０℃で重さが一定になるまで乾燥して、目的とする４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン６７４ｇ（収率８５．４％）を得た。
【０１５２】
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの精製
冷却器、温度プローブ、窒素ガス導入管、および機械式攪拌機を取り付けた３０００ｍｍＬ４つ口フラスコを加熱マントルにセットした。フラスコに４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（１０１．０ｇ，０．２６ｍｏｌ）を入れ、黄色固体を９５％エタノール（１０００ｍｍＬ）に懸濁させて攪拌した。いくつかの例では８：１の溶媒比を使用した。次に、懸濁液を攪拌しながら約１時間穏やかに加熱還流させた（温度約７６℃）。次に、反応物を還流させながら４５〜７５分間攪拌した。この時点で加熱をやめ、懸濁液を２５〜３０℃まで放冷した。験濁液を濾過し濾過層を水（２×５００ｍＬ）で洗浄した。次に、黄色固体を乾燥トレイに移し、真空乾燥器中、５０℃で重さが一定になるまで（典型的には１６時間）乾燥し、精製した生成物９７．２ｇ（収率９６．２％）の淡黄色粉末を得た。
【０１５３】
Ｄ．４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの乳酸塩の調製
【０１５４】
【化２４】
2008528617.tif 000020
３０００ｍＬ４つ口フラスコに冷却器、温度プローブ、窒素ガス導入管、および機械式攪拌機を取り付けた。反応器に窒素を少なくとも１５分間導入し、それから４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（４８４ｇ、１．２３ｍｏｌ）を入れた。Ｄ，Ｌ−乳酸（２４３．３ｇ，モノマー１．７２ｍｏｌ−次の段落を参照）、水（３３９ｍＬ）およびエタノール（１２１１ｍＬ）の溶液を調製して反応フラスコに入れた。中程度の速度で攪拌を開始し、反応物を内部温度６８〜７２℃まで加熱した。反応内部温度を６８〜７２℃に１５〜４５分間保ち、それから加熱をやめた。１０〜２０ミクロンのガラス製濾過板を通して生成混合物を濾過し、濾液を１２Ｌフラスコに集めた。１２Ｌフラスコに内部温度プローブ、還流冷却器、滴下漏斗、ガス導入管および排出管、およびオーバーヘッド攪拌機を取り付けた。次に、濾液を中程度の速度で攪拌しながら加熱還流させた（内部の温度約７８℃）。穏やかに還流させながら、約２０分かけてエタノール（３，５９６ｍＬ）をフラスコに加えた。次に、１５〜２５分間に反応フラスコの内部温度を約６４〜７０℃まで冷却し、この温度に約３０分間保った。反応器内の結晶の状態を検査した。結晶が見られない場合は、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン乳酸塩の結晶（４８４ｍｇ，０．１ｍｏｌｅ％）をフラスコに加え、反応物を６４〜７０℃で３０分間攪拌し、それから再度フラスコの結晶を検査した。結晶が存在していれば、攪拌速度を遅くして、反応物を６４〜７０℃でさらに９０分間攪拌した。つづいて、反応物を約２時間かけて約０℃まで冷却し、生成する混合物を２５〜５０ミクロングラスフィルターを使って濾過した。反応器をエタノール（４８４ｍＬ）で洗浄し、内部温度が約０℃になるまで攪拌した。冷エタノールを使って濾過ケーキを洗浄し、この操作をさらに２回くり返した。集めた固体を真空乾燥器中、５０℃で重さが変化しなくなるまで真空乾燥し、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン乳酸塩の黄色結晶５１０．７ｇ（８５．７％）を得た。濾過操作には、典型的にはゴム製ダムまたは不活性条件を使用した。乾燥した固体は非常に吸湿性が強いようには見えないが、湿った濾過ケーキは吸湿してべとつきが見られる。したがって、湿った濾過ケーキはなるべく長時間大気に曝さないように注意した。
【０１５５】
市販の乳酸は一般に水分を８〜１２％ｗ／ｗ含んでいるほか、さらに単量体の乳酸に加えて、二量体および三量体の乳酸も含んでいる。二量体乳酸対単量体乳酸比は一般におよそ１．０：４．７である。市販の乳酸は、好ましくは反応混合物からモノラクテート塩が析出する、前の段落に記載した方法に使用できる。
【０１５６】
代謝産物の同定
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（化合物１）の２種類の代謝産物が同定されており、本明細書に組み込まれた引用文献に記載されている２週間の毒物試験から、プールされたラットの血漿で諸特性が決定されている。同定された２種類の代謝産物は、下記構造のピペラジンＮ−オキシド（化合物２）とＮ−脱メチル化合物（化合物３）であった。
【０１５７】
【化２５】
2008528617.tif 000021
化合物１〜３のＩＣ５０
化合物１〜３について、若干数のタンパク質チロシンキナーゼのキナーゼ活性を、下記手順によって測定し、次表に示すＩＣ５０値を得た。
【０１５８】
【化２６】
2008528617.tif 000022
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチル−４−オキシドピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物２）および４−アミノ−５−フルオロ−３−（６−ピペラジン−１−イル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物３）の合成
化合物１の同定された代謝産物の構造を確認するため、代謝産物を独立に合成した。
【０１５９】
化合物２、すなわち化合物１のＮ−オキシド代謝産物は、下記スキームに従って合成した。化合物１を、エタノール、ジメチルアセトアミドおよび過酸化水素の混合物中で加熱した。反応が終了したのち、濾過して化合物２を分離し、エタノールで洗浄した。生成物は、必要に応じてカラムクロマトグラフィにかけ、さらに精製することができた。
【０１６０】
【化２７】
2008528617.tif 000023
化合物３、すなわち化合物１のＮ−脱メチル代謝産物は、下記スキームに従って合成した。５−クロロ−２−ニトロアニリンをピペラジンと処理して４を合成し、つづいて４をブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護して５を得た。ニトロ基を還元し、つづいて３−エトキシ−３−イミノプロピオン酸エチルエステルと縮合して６を合成した。さらに、カリウム＝ヘキサメチルジシラジドを塩基として、６と６−フルオロアントラニロニトリルとを縮合して７を得た。粗製の７を塩酸水溶液で処理すると、目的とする代謝産物が、精製後、黄色／褐色固体として得られた。
【０１６１】
【化２８】
2008528617.tif 000024
アッセイ方法
セリン／スレオニンキナーゼ
ＡＴＰと、リン酸化を受けるセリンまたはスレオニンアミノ酸残基を含む適当なペプチドまたはタンパク質とを準備して、セリンまたはスレオニン残基へのリン酸基の転移を検定することにより、各種タンパク質セリン／スレオニンキナーゼのキナーゼ活性を測定した。バキュロウイルス発現系（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってＳｆ９昆虫細胞にＧＳＫ−３、ＲＳＫ−２、ＰＡＲ−１、ＮＥＫ−２、およびＣＨＫ−１酵素のキナーゼドメインを含む組み換えタンパク質を発現させ、Ｇｌｕ抗体相互作用（Ｇｌｕエピトープタグが付けられた構造体に対して）あるいは金属イオンクロマトグラフィ（Ｈｉｓ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）タグが付けられた構造体に対して）によって精製した。Ｃｄｃ２（ＧＳＴ融合構造体）およびサイクリンＢは、バキュロウイルス発現系を使ってＳｆ９昆虫細胞に共発現させた。組み換え体活性Ｃｄｋ２／サイクリンＡは市販されており、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。アッセイに使用した精製Ｃｄｃ２酵素は市販品を使用した。Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入できるかもしれない。各アッセイを行うには、試験化合物をそれぞれＤＭＳＯ中で系列希釈したのち、適当なキナーゼ反応緩衝液＋５〜１０ｎＭ  ３３Ｐガンマ標識ＡＴＰと混合した。キナーゼタンパク質および該当するビオチニル化ペプチド基質を加えて最終体積を１５０μＬとした。反応物を室温で３〜４時間インキュベートし、それから、反応停止緩衝液１００μＬを含むストレプトアビジンコーティング白色マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）に移し、反応を停止させた。反応停止緩衝液は５０ｍＭ  非標識ＡＴＰと３０ｍＭ  ＥＤＴＡとからなる。１時間インキュベートしたのち、ストレプトアビジンプレートをＰＢＳで洗い、各槽に２００μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０シンチレーション液を添加した。プレートをシールしてＴｏｐＣｏｕｎｔでカウントした。ＸＬ  Ｆｉｔデータ解析ソフトウェアを使用し、非線形回帰法によって各化合物の５０％阻止濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１６２】
反応緩衝液は、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  βグリセロホスフェート、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．５μＭ  ペプチド基質、および１μＭ  非標識ＡＴＰを含んでいた。ＧＳＫ−３酵素は２７ｎＭで、ＣＨＫ１は５ｎＭで、Ｃｄｃ２は１ｎＭで、Ｃｄｋ２は５ｎＭで、そしてＲｓｋ２は０．０４４単位／ｍＬの各濃度で使用した。ＧＳＫ−３のアッセイにはビオチン−ＣＲＥＢペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＧＳＧＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰ（ｐＳ）ＹＲ−ＮＨ２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を使用した。ＣＨＫ１のアッセイにはビオチン−Ｃｄｃ２５ｃペプチド（ビオチン−［ＡＨＸ］ＳＧＳＧＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ［ＣＯＮＨ２］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５））を使用した。Ｃｄｃ２およびＣｄｋ２のアッセイには、ビオチン−ヒストンＨ１ペプチド（［ＩｃＢｉｏｔｉｎ］ＧＧＧＧＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬ［ＣＯＮＨ２］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６））を使用した。Ｒｓｋ２のアッセイには、ビオチン−ｐ７０ペプチド、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．７μＭ  ＰＫＣインヒビターペプチド、および２．７μＭ  ＰＫＡインヒビターペプチドを使用した。
【０１６３】
チロシンキナーゼ
ＡＴＰと、リン酸化を受けるチロシンアミノ酸残基を含む適当なペプチドまたはタンパク質とを準備して、チロシン残基へのリン酸基の転移を検定することにより、いくつかのタンパク質チロシンキナーゼのキナーゼ活性を測定した。バキュロウイルス発現系（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってＳｆ９昆虫細胞にＦＬＴ−１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｔｉｅ−２、ＰＦＧＦＲα、ＰＦＧＦＲβ、およびＦＧＦＲ１レセプターの細胞質ドメインに対応する組み換えタンパク質を発現させ、Ｇｌｕ抗体相互作用（Ｇｌｕエピトープタグが付けられた構造体に対して）あるいは金属イオンクロマトグラフィ（Ｈｉｓ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）タグが付けられた構造体に対して）によって精製できるかもしれない。各アッセイを行うには、試験化合物をそれぞれＤＭＳＯ中で系列希釈したのち、適当なキナーゼ反応緩衝液＋ＡＴＰと混合した。キナーゼタンパク質および該当するビオチニル化ペプチド基質を加えて最終体積を５０〜１００μＬとした。反応物を室温で１〜３時間インキュベートし、それから、４５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を２５〜５０μＬ加えて反応を停止させた。停止させた反応混合物（７５μＬ）をストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に移し、１時間インキュベートした。リン酸化されたペプチド生成物は、ＤＥＬＦＩＡ時間分解蛍光システム（ＷａｌｌａｃまたはＰＥ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。この測定にはユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体ＰＴ６６を使用し、抗体の希釈には１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えたＤＥＬＦＩＡ分析用緩衝液を使用した。Ｗａｌｌａｃ  １２３２  ＤＥＬＦＩＡ蛍光計またはＰＥ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ多重信号読みとり装置を使って時間分解蛍光強度を読みとった。ＸＬ  Ｆｉｔデータ解析ソフトウェアを使用し、非線形回帰法によって各化合物の５０％阻止濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１６４】
ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＦＧＦＲ３、Ｔｉｅ−２、およびＦＧＦＲ１キナーゼのアッセイは、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、２μＭ  ＡＴＰ、および０．２０〜０．５０μＭの対応するビオチン化ペプチド基質の中で行った。ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｔｉｅ−２、およびＦＧＦＲ１キナーゼは、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、または０．１μｇ／ｍＬ濃度で、それぞれ加えた。ＰＤＧＦＲキナーゼのアッセイには、ＡＴＰおよびペプチド基質の濃度を１．４μＭ  ＡＴＰおよび０．２５μＭ  ビオチン−ＧＧＬＦＤＤＰＳＹＶＮＶＱＮＬ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）ペプチド基質に変更した点を除き、上記と同じ緩衝液条件で１２０μｇ／ｍＬの酵素を使用した。
【０１６５】
組み換え体および活性チロシンキナーゼＦｙｎおよびＬｃｋは市販品を使用でき、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。各アッセイに対して、試験化合物をＤＭＳＯ中で系列希釈したのち、適当なキナーゼ反応緩衝液＋１０ｎＭ  ３３Ｐガンマ標識ＡＴＰと混合した。キナーゼタンパク質および該当するビオチニル化ペプチド基質を加えて最終体積を１５０μＬとした。反応物を室温で３〜４時間インキュベートし、つづいて、１００ｍＭ  ＥＤＴＡと５０μＭ  非標識ＡＴＰとからなる１００μＬの反応停止緩衝液を含むストレプトアビジンコーティング白色マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）に移して反応を停止させた。１時間インキュベートしたのち、ストレプトアビジンプレートをＰＢＳで洗い、各槽に２００μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０シンチレーション液を添加した。プレートをシールしてＴｏｐＣｏｕｎｔでカウントした。ＸＬ  Ｆｉｔデータ解析ソフトウェアを使用し、非線形回帰法によって各化合物の５０％阻止濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１６６】
Ｆｌｙ、Ｌｃｋおよびｃ−ＡＢＬに対するキナーゼ反応緩衝液には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  β−グリセロールホスフェート、０．０１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、０．５μＭ濃度の適当なペプチド基質（ビオチニル化Ｓｒｃペプチド基質：ＦｙｎおよびＬｃｋに対しビオチン−ＧＧＧＧＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））、１μＭ  非標識ＡＴＰおよび１ｎＭ  キナーゼが含まれた。
【０１６７】
ｃ−ＫＩＴおよびＦＬＴ−３のキナーゼ活性は、ＡＴＰと、リン酸化を受けるチロシンアミノ残基を含むペプチドまたはタンパク質とを準備して、チロシン残基へのリン酸基の転移を検定することにより測定した。ｃ−ＫｉｔおよびＦＬＴ−３レセプターの細胞質ドメインに対応する組み換え体タンパク質は購入した（Ｐｒｏｑｕｉｎａｓｅ）。試験を行うには、例として取り上げる化合物、たとえば４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンをＤＭＳＯで希釈したのち、下記のキナーゼ反応緩衝液＋ＡＴＰと混合する。キナーゼタンパク質（ｃ−ＫｉｔまたはＦＬＴ−３）およびビオチニル化ペプチド基質（ビオチン−ＧＧＬＦＤＤＰＳＹＶＮＶＱＮＬ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））を加えて最終体積を１００μＬとした。これらの反応物を室温で２時間インキュベートし、それから、４５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５を５０μＬ加えて反応を停止させた。停止させた反応混合物（７５μＬ）をストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に移し、１時間インキュベートした。リン酸化されたペプチド生成物は、ＤＥＬＦＩＡ時間分解蛍光システム（ＷａｌｌａｃまたはＰＥ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）により、ユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体ＰＴ６６を使用し、抗体の希釈には１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えたＤＥＬＦＩＡ分析用緩衝液を使うという変更を行って測定した。Ｗａｌｌａｃ  １２３２  ＤＥＬＦＩＡ蛍光計またはＰＥ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ多重信号読みとり装置を使って時間分解蛍光強度を決定した。ＸＬ  Ｆｉｔデータ解析ソフトウェアを使用し、非線形回帰法によって各化合物の５０％阻止濃度（ＩＣ５０）を計算した。
【０１６８】
ＦＬＴ−３およびｃ−Ｋｉｔキナーゼは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、８μＭ  ＡＴＰおよび１μＭ濃度の対応するビオチニル化ペプチド基質（ビオチン−ＧＧＬＦＤＤＰＳＹＶＮＶＱＮＬ−ＮＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２））の中でアッセイした。ＦＬＴ−３およびｃ−Ｋｉｔキナーゼ濃度のアッセイは２ｎＭで行った。
【０１６９】
臨床前多発性骨髄腫モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの有効性についてのリアルタイムによる画像評価と包括的画像評価
多発性骨髄腫（ＭＭ）、すなわち造血性骨髄における形質細胞のクローン拡大によって特徴づけられるＢ細胞新生物は、通常の高用量化学療法を導入しても、生来の薬物抵抗性に加えて後天的薬物抵抗性が形成されるため、今なお致命的な血液学的悪性腫瘍でありつづけている。好ましくはＭＭ細胞のホームであり、増殖する場所でもある骨髄の微小環境が、ＭＭに対する従来の治療法および新規の治療法にとってきわめて重要な役割を演じることはすでに証明されている。したがって、ＭＭ細胞だけでなくＭＭ細胞と骨髄微小環境との相互作用をも標的とする分子的に標的化された薬剤は、ＭＭを治療するための有望な機会を与える。近年、ＭＭの分子病理学の理解が進んだことで、この病気を治療するための新しい治療目標が立てられるようになった。異所発現し、かつ調節を受けないＦＧＦＲ−３は、ｔ（４；１４）染色体転座によって起きるＭＭの患者の１５％に発生し、臨床での予後が特に悪いため、ＭＭに対する魅力的な治療ターゲットになっている。
【０１７０】
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（化合物１）は、ＶＥＧＦＲ−２およびＰＤＧＦＲ（キナーゼアッセイでＩＣ５０は〜２０ｎＭ）およびＦＧＦＲ−３（キナーゼアッセイでＩＣ５０は〜５ｎＭ）を含む多重レセプターチロシンキナーゼを標的とする小分子インヒビターである。４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＧＦＲ−３の自己リン酸化を阻害し、ＦＧＦＲ−３変異体ＭＭ細胞における細胞増殖を阻害することは証明されている（Ｓ．Ｔｒｕｄｅｌほか、Ｂｌｏｏｄ；印刷中）。４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの抗骨髄腫有効性を評価するため、ルシフェラーゼ構造体を安定的に移入した変異体ＦＧＦＲ−３（Ｙ３７３Ｃ）を発現するヒトＫＭＳ−１１−ｌｕｃ細胞を尾部血管に静脈注射すると、そのあとに多臓器ＭＭ病変が現れるｉｎ  ｖｉｖｏ臨床前ＭＭモデルを考案した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＫＭＳ−１１−ｌｕｃＭＭ腫瘍の増殖と転移を非侵襲的にモニターするには、生体発光画像化（ＢＬＩ）法を使用した。このモデルを使ったＢＬＩ法によって、転移病変の増殖を早期に発見し、かつ逐次的包括的にモニターすることに成功した。ＫＭＳ−１１−ｌｕｃＭＭ腫瘍細胞を注射されたほとんどすべての実験動物で、２６日目という早期にＭＭ病変を発現することが見いだされた。これらの病変は、主として背骨、頭蓋骨および骨盤に局在し、このモデルにしばしば麻痺をもたらした。ｉｎ  ｖｉｖｏで静脈内注射されたこのＫＭＳ−１１−ｌｕｃＭＭモデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの抗骨髄腫有効性を調べた結果、ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ腫瘍においてＥＲＫのリン酸化をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することが証明された用量である２０ｍｇ／ｋｇの４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンを毎日経口投与すると、ＫＭＳ−１１腫瘍の増殖が有意に阻害されることが、逐次ＢＬＩ法によって見いだされた。加えて、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの抗腫瘍増殖活性は、賦形剤による治療と比較して、試験動物の生存率の有意な改善となって現れた。これらの試験は、今後、ＭＭ患者に４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンを臨床試験するための臨床前基礎を与えると同時に、このＫＭＳ−１１−ｌｕｃ  ｉｎ  ｖｉｖｏモデルで従来の医薬、あるいは他の分子標的化させた医薬との併用療法における４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ���ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの成績評価の実施を確実なものにする。
【０１７１】
方法
免疫欠損ＳＣＩＤベージュマウスのメス１８匹（約１８週齢）からなるコホートは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手し、ｂａｒｒｉｅｒ  ｆａｃｉｌｉｔｙ内の、１２時間サイクルで明暗をくり返す滅菌フィルター付きケージで飼育した。すべての実験は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌが認定した施設で、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅのすべてのガイドラインおよびＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）に従って実施した。ＦＧＦＲ−３変異体（Ｙ７３７Ｃ）を内包するＫＭＳ−１１−ｌｕｃＭＭ細胞は、Ｉｓｃｏｖｅ培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｌ−グルタミンで培養し、２回／週、１：２ないし１：４の範囲で継代した。細胞は、各マウスに１００μＬ  ＨＢＳＳ当たり、１０×１０６個の細胞を尾部静脈に静脈内注射して移植した。マウスには細胞移植の日に３ＧＹで照射した（３．２分間）。動物は、ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ細胞を注射してから４８時間後に開始し、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンまたは賦形剤２０ｍｇ／ｋｇの経口投与による治療を毎日受けた（各群ｎ＝９）。生物蛍光画像（ＢＬＩ）は、遮光カメラボックスに取り付ける形で冷却高感度ＣＣＤカメラを搭載したＩＶＩＳ（登録商標）画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって得られた。フォトン／秒によって量子化された画像および生物蛍光シグナルの測定は、ルシフェラーゼ基質を注射後、８日目、そしてその後は毎週１回に取得した。動物の体重は１週間に２回モニターし、臨床所見は毎日記録した。動物の保護に関する法律とガイドラインに従い、マウスに麻痺が起きた場合および生存の質の観点からやむを得ない場合は、ＣＯ２を吸入させて安楽死させた。
【０１７２】
結果
ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤベージュマウスに静脈内注射してから８日目には、全身画像から細胞増殖の進行および、主として肺、肝臓および脾臓を含む骨格外部位に局在化したＭＭと思われる病変の進行が明らかになった。（ＢＬＩ画像に見られるように）４１日目から４８日目の間に、ほとんどのマウスにうしろ足の麻痺を伴う典型的な瀰漫性多発性骨格障害、たとえば頭蓋骨、骨盤および背骨を含む骨格の障害が、はっきり観察された。マウスは、プロトコルに従って安楽死させた。
【０１７３】
このｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用し、ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ細胞における４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの抗骨髄腫有効性を試験した。マウスの経口治療は、ＫＭＳ−１１−ｌｕｃ細胞を注射してから４８時間後に開始し、化合物１を毎日２０ｍｇ／ｋｇ経口投与した（ｎ＝マウス９匹／群）。１週間ベースのスケジュールに従って、包括的逐次的に各試験動物のフォトンカウント数をモニターした。図１に示すように賦形剤投与群に比べて、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンによる治療群に、フォトン平均カウント数の有意な減少が見られた。このことは、ＫＭＳ−１１を注射したのち、賦形剤で治療したマウスと４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンで治療したマウスの全身ＢＬＩ画像を比較するとただちにわかる。興味深いことに、化合物１で治療したマウスのＫＭＳ−１１多発性骨髄腫細胞パターンの広がりも顕著に少なかった。転移は腹部と背部に限られ、頭蓋骨、脊椎またはうしろ足に大きな広がりは見られなかった。
【０１７４】
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンで治療したマウスのフォトンカウント数の減少は、賦形剤で治療を受けたマウスより生存期間が有意に延びたことによく表れた。４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンで治療したマウスは、９匹のうち５匹が、９１日目でも全体的に健康な状態で生存をつづけた。それに対して、賦形剤治療群のほとんどのマウスは、５０日目前後に安楽死させた。また、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンで治療したマウスは、この長い試験期間中この治療によく耐えた。４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンで治療したマウスの生存期間が明白に改善されたため、実際的な見地から、この試験は９１日目で終了した。
【０１７５】
キナーゼの阻害全般、ＦＧＦＲ−３の阻害、および多発性骨髄腫を含め各種ガンの４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンによる治療に関するさらなる研究は、公告米国特許出願第２００４／００９２５３５号、および米国特許出願第１０／９８３，１７４号、米国特許出願第２００４／０２２０１９６号、および米国特許出願第６，６０５，６１７号に記載されている。したがって、これによって、これらの文献は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のためにすべてここに組み込まれる。
【０１７６】
ヒトＡＭＬの腫瘍異種移植実験モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの活性
４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（化合物１）は、内皮細胞および腫瘍細胞の増殖に関係するＦＬＴ３キナーゼおよびクラスＩＩＩ、ＩＶおよびＶに属するＲＴＫに強い阻害活性を示す、新規の経口活性な複数標的化された小分子である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）におけるＦＬＴ３変異の関与を考慮して、ＦＬＴ３の変異状態が異なる（ＭＶ４；１１  ＦＬＴ３  ＩＴＤ対ＲＳ−４１１  ＦＬＴ３  ＩＴＤ）２種類のヒト白血病細胞株に対する化合物１の試験を行った。その結果、ＭＶ４；１１に対する化合物１の抗増殖活性はＲＳ４；１１と比較して〜２４倍高く、構成的に活性化されたＦＬＴ３に対する阻害がより強力であることを示した。ＭＶ４；１１細胞におけるレセプターのリン酸化および下流シグナル伝達（ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ／ＭＡＰＫ）の化合物１による用量依存性の変調は、分子レベルでの作用機構を裏づけた。化合物１の生物活性用量でＭＶ４；１１腫瘍におけるｐＦＬＴ３、ｐＥＲＫの標的変調が見られた。皮下および骨髄（ＢＭ）生植白血病異種移植モデルで腫瘍が退行したことおよびＡＭＬ細胞がＢＭから根絶されたことが示された。腫瘍の反応は、細胞増殖の減少と、アポトーシスによる細胞死を示唆する活性カスパーゼ３および切断ＰＡＲＰのポジティブな免疫組織化学的染色とによって確認された。以上のデータは化合物１のＡＭＬにおける臨床的評価を支持している。
【０１７７】
細胞株
ヒトＭＶ４；１１（ＦＬＴ３  ＩＴＤ）およびＲＳ４；１１（ＦＬＴ３  ＷＴ）白血病細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）２４―２６から入手した。ＭＶ４；１１細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を加えた、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５ｎｇ／ｍｌ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＢＭ）で培養した。ＲＳ４；１１細胞は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を含むＲＰＭＩ−１６４０で培養した。細胞は、懸濁培地で培養し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。
【０１７８】
キナーゼのアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦＬＴ−３キナーゼのアッセイは、８μＭ  ＡＴＰおよび系列希釈した化合物１の存在下に、２ｎＭ  ＦＬＴ３酵素（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｒｌｏｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）で行った。最終濃度１μＭのリン酸化ペプチド基質は、ユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体（ＰＴ６６）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）と一緒にインキュベートした。ユーロピウムは時間分割蛍光分析によって検出した。ＩＣ５０は非線形回帰法によって計算した。
【０１７９】
増殖のアッセイ
細胞を９６槽マイクロタイタープレートに入れ（細胞１０，０００個／槽）、系列希釈した化合物１を加えた。ＲＳ４；１１細胞をＦＬＴ３リガンドで刺激した（１００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。インキュベート終了時（３７℃で７２時間）にＭＴＳのアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を行って細胞生存率を測定した。ＥＣ５０値は、非線形回帰法によって計算し、治療しなかった対照に対して、治療した細胞の吸光度が５０％低下するのに必要な濃度と定義した。
【０１８０】
免疫沈降分析およびウェスタンブロット分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験を行うため、ＭＶ４；１１細胞およびＲＳ；１１細胞を化合物１で３時間処理した。すなわち、化合物１とインキュベートしたのち、ＲＳ４；１１細胞をＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍＬ）で１５分間刺激した。薬物と一緒にインキュベートしたのち、細胞を集め、氷冷したＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびホスファターゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１×リン酸塩緩衝食塩水に溶かした０．１％硫酸ドデシルナトリウム，ｐＨ７．２）で溶解した。ｉｎ  ｖｉｖｏで標的変調の分析を行うため、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ（Ｒｏｃｈｅ）、および完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）で溶解するまえに、切除した腫瘍をフラッシュ凍結し、粉砕して−７０℃で貯蔵した。溶解物に含まれるタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって決定した。ｐＥＲＫ（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に対するマウス抗体について、ｐＥＲＫのウェスタンブロット分析を行い、４℃で一晩インキュベートした。全ＥＲＫに対する抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で再プローブして全ＥＲＫレベルを評価した。つづいて、膜を１：５０００ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と室温で１時間インキュベートした。免疫沈降によってＦＬＴ３を検出するため、等量のタンパク質（ＳＴＡＴ５の場合５００μｇ；ＦＬＴ３の場合１０００μｇ）をヒトＦＬＴ３またはＳＴＡＴ５に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と４℃で一晩、そしてタンパク質Ａ−アガロースと４℃で２時間インキュベートした。ＦＬＴ３またはＳＴＡＴ５のリン酸化を、抗ホスホチロシン抗体（抗ｐＦＬＴ３抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手し、抗ｐＳＴＡＴ５抗体はＵｐｓｔａｔｅから入手した）でプロービングすることにより測定した。タンパク質は増強化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）を利用して検出し、コダックのフィルムに露光して可視化した。バンド強度の定量は、走査式デンシトメトリーによって行った。ローディング量をそろえるため、ブロットから取り出し、抗ＦＬＴ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または抗ＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で再プローブして、それぞれ全ＦＬＴ３またはＳＴＡＴ５タンパク質量を測定した。ｐＦＬＴ５、ｐＥＲＫまたはｐＳＴＡＴ５の量を全ＦＬＴ３、ＥＲＫまたはＳＴＡＴ５タンパク質レベルに規格化して、賦形剤投与群、すなわち治���しなかった対照群と比較した。
【０１８１】
フローサイトメトリーによるアッセイ
ＭＶ４；１１細胞を、血漿欠乏条件で化合物１と３時間処理した（ＯｐｔｉＭＥＭ培地で一晩）。ｐＳＴＡＴ５を検出するため、細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、９０％氷冷メタノールで透過性を上げた。透過性が増した細胞（０．５〜１×１０６）を抗ｐＳＴＡＴ５抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と３０分間インキュベートした。同じ濃度の精製したウサギＩｇＧ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）をアイソタイプの対照として使用した。二次抗体はＰＥ結合ヤギＦ（ａｂ‘）２抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とした。試料は、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析するまで４℃で暗所保存した。ｐＳＴＡＴ５の染色に対して平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って決定し、対照のアイソタイプ抗体のＭＦＩとの差を比ＭＦＩとした。
【０１８２】
マウスＭＶ４；１１生着モデル由来の骨髄（ＢＭ）を処理するため、大腿骨を冷食塩水で洗浄し、赤血球をＦＡＣＳ溶解緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に溶解した。マウスの骨髄に対するヒト白血病細胞の生着率は、抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色することにより決定した（アイソタイプに適合する抗体−ＦＩＴＣを対照とする）。
【０１８３】
ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ
ＭＶ４；１１は、濃度を様々に変えて（０〜１μＭ）化合物１を加えた１０％ＦＢＳ含有培地で４８時間培養した。遠心分離にかけたのち上清液を集め、ＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって測定した。タンパク質の濃度はＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使って決定し、得られた結果はタンパク質濃度に対して規格化した。
【０１８４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
メスのＳＣＩＤ−ＮＯＤマウス（４〜６週齢，１８〜２２ｇ）はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、試験を始める前に、病原体を排除した囲いの中で１週間訓化した。試験動物は無菌の齧歯類用食餌と水が随時与えられ、１２時間周期で明暗がくり返される無菌フィルター付きケージに収容した。すべての実験は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのガイドラインに従って実施した。
【０１８５】
皮下モデル
ＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１細胞は、ＳＣＩＤ−ＮＤＯマウスの皮下の腫瘍から継代された。細胞（細胞５×１０６個／マウス）は５０％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で再構成して、ＳＣＩＤ−ＮＤＯマウスの右脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）に移植した。具体的な試験デザインの項に記述したように、治療は腫瘍が２００〜１０００ｍｍ３になったときに開始した。マウスをコホートに割り付けるときは無作為に行った（典型的には、有効性試験の場合１０匹／群、薬物動態（ＰＤ）研究の場合３〜５匹／群）。化合物１は、溶液の形で経口給餌によって投与した。腫瘍の体積と体重は毎週２〜３回測定した。腫瘍をカリパスで測定した結果は、１／２（長さ×［幅］２）の関係式によって平均腫瘍体積に変換した。腫瘍の増殖阻害率（ＴＧＩ）を賦形剤で治療したマウスと比較した。応答率は、治療開始時の腫瘍体積と比較して、完全応答（ＣＲ）（触診されない）か部分応答（ＰＲ）（５０〜９９％収縮）かの形で定義した。
【０１８６】
静脈内骨髄（ＢＭ）生植モデル
１×１０７  ＭＶ４；１１細胞を含む０．２ｍｌ食塩液を尾部静脈に注射するまえに、ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに照射した（３Ｇｙ）。化合物１または賦形剤による治療は、細胞接種から３週間後に開始した。マウスは毎日モニターし、瀕死の状態か、早期にうしろ足の麻痺の徴候が見られたときは安楽死させた。治療を受けたマウスの寿命の伸び（ＩＬＳ）は、賦形剤で治療した対照マウスに対する生存期間中央値（ＭＳＴ）増加百分率として計算した。
【０１８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的の変調
ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウス（ｎ＝３匹／群）におけるＭＶ４；１１皮下腫瘍は３００ｍｍ３で病期分類し、治療は、賦形剤か化合物１のどちらかを、５日間１０ｍｇ／ｋｇ経口投与する工程で行った。化合物１のＰＤの特徴を明らかにするため、化合物１投与後、時間を変えて腫瘍サンプルを採取した（Ｎ＝３匹／サンプリング時点）。
【０１８８】
免疫化学
切除した腫瘍を緩衝化した１０％中性ホルマリン液に入れて一晩室温に放置し、それから７０％エタノールに移し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ  組織プロセッサー（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、パラフィンに包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）した。骨（大腿骨）のサンプルは脱石灰化した（ＰｒｏｔｏｃｏｌＴＭ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＶＡ）。パラフィンブロックを４μｍの厚さに切り出して、正に荷電したスライドグラス上にのせた。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ自動スライド機（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使って組織を染色した。スライドを加圧スチーマー中、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）で処理し、Ｋｉ−６７，ｐＫＥＲＫおよびＰＡＲＰの染色に対して抗原を検索し、カスパーゼ３はＶｅｎｔａｎａ試薬ＣＣ１によって検索した。一次抗体にはＫｉ−６７（１：７５０希釈，ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＫ）、ｐＥＲＫ（１：１００希釈，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、抗ヒトミトコンドリア（１：２００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、切断カスパーゼ３（１：２００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および切断ＰＡＲＰ（１：１００，Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を使用した。二次抗体にはヒツジ抗ウサギＦ（ａｂ‘）２ビオチニル化抗体，１：１００希釈（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、染色したスライドにカバースリップをかぶせた。ヘマトキシリン染色およびエオシン染色によって全体的な組織の形態も評価した。
【０１８９】
統計的分析
線形回帰分析を行うにはマイクロソフトのＥｘｃｅｌ（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を使った。２つの治療群間における統計的な有意性を測定するにはスチューデントのｔ検定を使用した。多重比較を行うには一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、異なる治療手段を比較するｐｏｓｔ−ｔｅｓｔを行うにはＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌの検定法を使用した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）。生存率の検討にはログランク検定（Ｐｒｉｓｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使って各種治療法と賦形剤による治療群との間の、生存率曲線の有意性を決定した。試験終了時に正常な健康状態にあって安楽死させたマウスは長期生存したとし、この統計では削除した。ｐ＜０．０５における差は統計的に有意であると見なした。
【０１９０】
結果
化合物１はＦＬＴ３キナーゼ活性を強力に阻害する
上に記載したように、精製酵素によるＡＴＰ競争結合アッセイを使って、様々なＲＴＫに対する化合物１の特異性を検査した。その結果、化合物１は、ｃ−ＫＩＴ（２ｎＭ）；ＶＥＧＦＲ１／２／３（１０ｎＭ）；ＦＧＦＲ１／３（８ｎＭ）；ＰＤＧＦＲβ（２７ｎＭ）；ＣＳＦ−１Ｒ（３６ｎＭ）に比べてＦＬＴ３（１ｎＭ）に対してナノモルで活性を示し、きわめて強力であることがわかった（次表を参照）。クラスＩＩＩ、ＩＶおよびＶのＲＴＫに対する選択性を確認するため、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ（Ｋ）経路の他のキナーゼに対する化合物１の活性を調べた結果、活性は無視できるほど小さい（ＩＣ５０＞１０μＭ）ことがわかった（次表を参照）。
【０１９１】
（表  各種ＲＴＫに対する４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンの活性）
【０１９２】
【化２９】
2008528617.tif 000025
上の表の作成に使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＴＫアッセイは、上で述べたように、精製した酵素およびＡＴＰの存在下に、化合物１の希釈率をさまざまに変えて行った。リン酸化されたペプチド基質（１μＭ）をユーロピウムで標識した抗ホスホ特異的抗体と一緒にインキュベートしたのち、ユーロピウムを時間分解蛍光によって検出した。
【０１９３】
ＭＶ４；１１（ＦＬＴ３  ＩＴＤ）細胞に対する化合物１の強力な抗増殖効果
ＦＬＴ３の阻害がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖阻害に変換するか否かを明らかにするため、ＭＴＳアッセイを使ってＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１に対する化合物１の活性を調べた。ＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１を系列希釈した化合物１と一緒に（ＦＬＴ３リガンドの存在で）インキュベートした。７２時間インキュベートしたのち、ＭＴＳ検定を行って細胞生存率を決定した。非線形回帰法によりＥＣ５０値を計算し、治療した細胞の吸光度が、治療しなかった対照の細胞と比べて、５０％減少するために必要な濃度として定義した。化合物１は、用量依存的にＭＶ４；１１細胞の増殖を強力に阻害し、ＥＣ５０＝１３ｎＭであった。ＲＳ４；１１でも増殖に対して類似の濃度依存効果が観察されたが、化合物に対する感度は約２４分の１であった（ＥＣ５０＝３１５ｎＭ）。ＭＬＶ４；１１で見られた濃度と類似のＥＣ５０濃度（ＥＣ５０〜６ｎＭ）を持つＦＬＴ３  ＩＴＤ変異体細胞、ＭＯＬＭ１３およびＭＯＬＭ１４に対する化合物１の抗増殖効果も検査した。これらのデータは、化合物１がＦＬＴ３  ＩＴＤとＷＴ白血病細胞の両者に対して活性であり、構成的に活性なレセプターは阻害に対してより鋭敏であることを示唆している。
【０１９４】
白血病細胞のＦＬＴ３媒介シグナル伝達に対する化合物１のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効果
ＦＬＴ３変異状態（ＲＴ―ＰＣＲによって確認）を対比させながら、２つのヒト白血病細胞株、ＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１に対する化合物１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞活性を調べた。これらの実験において、細胞を溶解する前に、血漿を含まないＭＶ４；１１（ＩＴＤ）またはＲＳ４；１１（ＷＴ）細胞を、濃度を高くした化合物１と３時間インキュベートした。ＲＳ４；１１細胞はＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。細胞溶解物全量を抗ヒトＦＬＴ３抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。免疫ブロットを抗ホスホチロシン抗体でプローブした。ＦＬＴ３のローディングが等量であることを証明するため、膜を除去し、抗ヒトＦＬＴ３で再プローブした。デンシトメーターを使って、ｐＦＬＴ３の変化は、ベースライン（無処理）に対する百分率で表示される。ＭＶ４；１１細胞は、ＦＬＴ３レセプターに内部縦列重複変異（ＩＴＤ）を持ち、構成的に活性化されたＦＬＴ３を形成する。Ｌｅｖｉｓ  Ｍ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９：３８８５〜３８９１（２００２）；Ｏ‘Ｆｅｒｒｅｌｌ  Ａ．Ｍ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０１：３５９７〜３６０５（２００３）。外因性リガンドによる刺激がない場合、この活性化によってＦＬＴ３の自己リン酸化が起きる。血漿欠乏ＭＶ４；１１細胞を化合物１で３時間処理し、ＦＬＴ３レセプターの活性化に対する直接効果を、リン酸化状態を分析することで決定した。化合物１の濃度を高くしてＭＶ４；１１細胞をこれにさらすと、用量依存的にｐＦＬＴ３を強力に阻害し、ＥＣ５０濃度は１〜１０ｎＭであった。
【０１９５】
ＦＬＴ３  ＩＴＤは、ＡＭＬ患者の芽細胞の約２０％に認められるのに対して、ほとんどの急性白血病がＷＴ  ＦＬＴ３を発現する。ＦＬＴ３レセプターのリン酸化を活性化する外因性ＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ，１５分）につづいて、白血病ＲＳ４；１１細胞に対する化合物１の効果も調べた（ＦＬＴ３  ＷＴ）。ＲＳ４；１１  ＦＬＴ３  ＷＴ細胞は、ＦＬＴ３リガンド刺激がなければ低いベースレベルのｐＦＬＴ３を持つ。化合物１で処理すると、ＲＳ４；１１細胞のｐＦＬＴ３レベルは低下した。しかし、ＩＴＤに比べてＷＴ  ＦＬＴ３の変調には比較的高い濃度が必要であった。＞０．５μＭの濃度で完全な阻害が実現された。
【０１９６】
化合物１はＦＬＴ３を阻害するための下流の標的、ＥＲＫおよびＳＴＡＴ５を変調する
ＦＬＴ３の阻害に関する化合物１の効果の特徴をさらに明らかにするため、ＦＬＴ３を阻害するための下流の標的、すなわち細胞の生存と増殖のカギを握るタンパク質であるＥＲＫおよびＳＴＡＴ５の変調について調べた。化合物１の濃度を高くして、ＭＶ４；１１細胞を３時間処理したのち、ｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ５を検出するため、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットにかけた。ｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ５の変化は、ベースライン（無処理）百分率の形で表示される。ＭＶ４；１１細胞の場合、ＦＬＴ３のシグナル伝達が活性なため、細胞のｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ５ベースレベルは高い。化合物１は、用量依存的にＥＲＫおよびＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害した。＞０．１μＭの濃度（フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット）で、ｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ５の実質的な阻害（＞５０％）が観察された。ｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ５に対する化合物１の阻害効果は、ＦＬＴ３リガンドによって刺激されるＲＳ４；１１細胞よりもＭＶ４；１１の方が強力であった。
【０１９７】
化合物１はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＶ４；１１における自己分泌ＶＥＧＦの産生を阻害する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶＥＧＦの産生に対する化合物１の効果に的を絞るため、ＭＶ４；１１培地の上清に対してＥＬＩＳＡを行った。これらの実験では、化合物１の濃度を高くして（０〜１μＭ）、ＭＶ４；１１細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地で４８時間培養した。薬物による治療を行わなかった場合、ＭＶ４；１１細胞はかなりの量（１８０ｐｇ／ｍｌ）のＶＥＧＦを分泌するのに対して、化合物１はＶＥＧＦの産生を用量依存的に阻害し、ＥＣ５０値は０．００１〜０．０１μＭ、そして完全阻害濃度は＞０．５μＭであった。
【０１９８】
化合物１はｉｎ  ｖｉｖｏでＦＬＴ３のシグナル伝達を変調する
ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的の変調を試験するため、ＭＶ４；１１の腫瘍を持つマウス（３００〜５００ｍｍ３の病期にある）に化合物１（１０ｍｇ／ｋｇ／日）または賦形剤を５日間投与した。５日目の投与後４、８、２４および４８時間目に腫瘍を切除し、粉砕し、直ちにフラッシュ凍結した（−７０℃）。決められた時点で採取した腫瘍をホモジナイズし、ＩＰ／ウェスタンブロットにかけてｐＦＬＴ３およびｐＳＴＡＴ５を分析した。ｐＦＬＴ３およびｐＳＴＡＴ５の変調を調べるため、腫瘍溶解物を抗ヒトＦＬＴ３または抗ＳＴＡＴ５抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。免疫ブロットを適当な抗ホスホチロシン抗体でプローブした。ローディングの対照として、全ＦＬＴ３またはＳＴＡＴ５タンパク質を定量するため、膜を取り去り、抗ＦＬＴ３か抗ＳＴＡＴ５で再プローブした。ｐＦＬＴ３およびｐＳＴＡＴ５レベルの有意な減少は、化合物１を単回または複数回投与後早くも４時間で観察され、他方、全ＦＬＴ３またはＳＴＡＴ５タンパク質に対する影響は見られなかった。ＦＬＴ３およびＳＴＡＴ５両者のリン酸化は、ベースラインに対して減少し、投与後８時間で最大値の〜９０％阻害に到達し、２４時間抑制（〜８５％阻害）はつづいた。ホスホＦＬＴ３はベースラインレベル近くまで戻ったのに対して、ｐ−ＳＴＡＴ５は、投与後４８時間が経過しても阻害（〜６０％阻害）がつづいた。ｐＥＲＫレベルの減少も観察された。このことは下流ＦＬＴ３シグナル伝達の封鎖を示している。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験
ＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１の腫瘍に対する化合物１の
ｉｎ  ｖｉｖｏ用量応答効果  
化合物１のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果が、腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖阻害と相関性があるかを確かめるため、ＳＣＩＤ−ＮＤＯマウスにおけるＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１腫瘍の異種移植に対する化合物１の有効性を試験した。マウスに腫瘍細胞を皮下移植し、腫瘍が２００〜３００ｍｍ３になったときに、化合物１による治療を開始した。用量−応答有効性試験において、ＭＶ４；１１の腫瘍に対しては、化合物１を１〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲で、またＲＳ４；１１の腫瘍に対しては、１０〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲で経口投与した。
【０２００】
化合物１はＭＶ４；１１の腫瘍に対してきわめて有効であり、良好な用量−応答効果を示し、＞５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で有意な腫瘍増殖阻害を示した（図２）。３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、部分応答者と完全応答者からなる（１ＣＲ，８ＰＲ）腫瘍の退行が誘起された（９／１０の腫瘍応答）。１ｍｇ／ｋｇ／日の投与でも、２週間後には、わずかではあるが腫瘍増殖阻害が観察され（２３％）、このモデルにおける統計的最小有効用量であると確認された（ｐ＜０．０１対賦形剤）。ＲＳ４；１１腫瘍を有するマウスにおいて、化合物１による治療は腫瘍の増殖を阻害したが、退行は観察されなかった（図３）。化合物１の阻害効果は、各モデルにおけるそれぞれの最小有効用量によって定義されるところによれば、ＲＳ４；１１腫瘍に対してより、ＭＶ４；１１腫瘍に対して強力であった（８日目：ＲＳ４；１１腫瘍に対して１００ｍｇ／ｋｇ／日；４８％ＴＧＩ、ｐ＜０．０１対ＭＶ４；１１腫瘍に対して１ｍｇ／ｋｇ／日；２３％ＴＧＩ、ｐ＜０．０１）。
【０２０１】
化合物１の別の投与スケジュールも等しく有効である
ＭＶ４；１１異種移植腫瘍に対する化合物１の断続的投与と周期的投与の効果も調べた（図４）。化合物１を３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、毎日、一日おきに（ｑ．ｏ．ｄ）、または７日間つづけて投与し、７日間中断するサイクルで２サイクルほど、経口投与した（図４）。毎日投与した場合と同様、断続的に投与した場合も薬物治療の期間の間に有意な腫瘍の退行をもたらした（＞９４％ＴＧＩ）。３種類の投与方式すべてが等価な抗腫瘍活性をもたらし（２９日目、ｐ＞０．０５）、ｑ．ｏ．ｄ．（６ＰＲ）の場合および７日間投与をつづけて７日間投与を中断した場合（９ＰＲ）の応答数は、毎日投与した場合（１ＣＲ，９ＰＲ）の応答数と類似の成績であった。
【０２０２】
化合物１は大きなＭＶ４；１１腫瘍に対して有効である
大きさの異なる３００、５００または１０００ｍｍ３の大きなＭＶ４；１１腫瘍に対する化合物１の効果も調べた。化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療すると、治療開始時の腫瘍の初期サイズに関係なく、すべてのＭＶ４；１１腫瘍に対して、有意な退行が誘起された（図５）。腫瘍の退行は薬物治療を開始して３〜５日以内に現れた。すべての治療された腫瘍が応答し（ｎ＝２７）、完全応答が１５％、部分応答が７０％であった。残る１５％は応答が弱いか安定したままであった。５０日後には投与を中止した。５０日間治療している間に再増殖した症例はなかった。このことは化合物１に対する抵抗性が現れなかったことを示唆している。治療中断後の応答の持続性も検討した。一つのＣＲとＰＲのほぼ５０％が、化合物１の投与を中止してから４０日間持続した。再増殖（６００〜２０００ｍｍ３まで）した１０の腫瘍を、試験９０日目（投与中止後４０日目）に３０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で再治療を開始し、６０日間つづけた。すべての腫瘍が化合物１の第二サイクルに応答した（２ＣＲ、８ＣＲ）。明らかにこのことは、化合物１に対する腫瘍の抵抗性がないことを示している。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物活性の組織学的評価
腫瘍の体積および標的の変調エンドポイントに加えて、免疫組織学化学的読みとり値を薬物活性の指標として使用した。われわれは３０ｍｇ／ｋｇの４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オン（化合物１）で治療したＳＣＩＤ−ＮＤＯマウスのＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１腫瘍における、腫瘍のアポトーシス／ネクローシスおよび細胞増殖の阻害を、組織学および免疫組織化学分析によって評価した。この研究では、皮下にＭＶ４；１１腫瘍を持つＳＣＩＤ−ＮＤＯマウス（ｎ＝３〜５／群）を、賦形剤または３０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１で５日間治療した。２〜５日で腫瘍を切除した。パラフィンに包埋した腫瘍をヘマトキシリンおよびエオシンで染色するか、Ｋｉ６７（増殖マーカー）、ｐＥＲＫ（機構的薬力学マーカー）、切断カスパーゼ３（アポトーシス用）またはＰＡＲＰ（アポトーシス用）（ヘマトキシリンで対比染色）で免疫染色した。ＭＶ４；１１腫瘍において、化合物１を１回ないし５回投与した後の、投与による一時的な効果を調べた。Ｈ＆Ｅ染色による形態学的評価の結果、賦形剤で治療した腫瘍は、骨髄の過形成を示唆する著しい細胞過多（ｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）を備えたＭＶ４；１１腫瘍細胞からなることが明らかになった。賦形剤治療群の腫瘍細胞がＫｉ６７で強く染色されたことは、この腫瘍が増殖性の強い細胞で構成されていることを示している。投与から２４時間までに化合物１で治療した腫瘍は細胞充填密度の低下を示し、アポトーシス細胞／ネクローシス細胞のまばらの領域からなった（１日目）。５回投与後、アポトーシス細胞／ネクローシス領域はさらに顕著となり、Ｋｉ６７による染色が弱まったのと時を同じくして、非生存腫瘍領域がかなりの部分を占めた。ｐＥＲＫの免疫組織化学的染色から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける標的の変調が確認された。化合物１で治療した腫瘍中のホスホＥＲＫは５日間の投与で著しく低下し、そのことは腫瘍中のｐＥＲＫのウェスタン分析によって確認された。化合物１によってアポトーシスが誘発されたことは、賦形剤で治療した対照に比べて、５日目に腫瘍中の活性化カスパーゼ３が増加したことおよび切断ＰＡＲＰの染色がより濃厚であったことから明白である。さらにわれわれは、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１で治療したあとのＲＳ４；１１腫瘍を免疫組織化学的に調べた。ＲＳ４；１１腫瘍（ｎ＝３〜５／群）を賦形剤または化合物３０ｍｇ／ｋｇで治療した。９日目に腫瘍を切除した。パラフィンで包埋した腫瘍は、ヘマトキシリンまたはエオシンで染色するか、Ｋｉ６７またはｐＥＲＫで免疫染色した（上記参照）。化合物１（３０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療したＲＳ４；１１腫瘍でも、細胞性と増殖が低下し、ｐＥＲＫが減少するという類似の効果がはっきり認められた。
【０２０４】
さらに、われわれは、部分応答（＞５０％の腫瘍阻害）と完全応答（触診できる腫瘍の塊を認めない）とを定義して、腫瘍を組織学的に評価した。これらの研究では、ＭＶ４；１１腫瘍を皮下に持つＳＣＩＤ−ＮＯＤマウス（ｎ＝３〜５匹／群）を賦形剤または化合物１  ３０ｍｇ／ｋｇ／日で治療した。賦形剤で治療した腫瘍は１５日目に切除し、化合物１で治療した腫瘍は８９日目に切除した（化合物１を毎日１回投与で５０回投与し＋治療しないで３９日）。パラフィンで包埋した腫瘍は、ヘマトキシリンまたはエオシンで染色するか、Ｋｉ６７で免疫染色した（ヘマトキシリンで対比染色）。完全応答者にはＭＶ４；１１腫瘍細胞が全く存在せず、ネクローシスおよび／または傷跡のわずかな痕跡が見られるだけであった。部分応答者には腫瘍周辺部にＫｉ６７陽性増殖腫瘍のポケットが観察された。
【０２０５】
化合物１は播種性ヒト白血病細胞を持つマウスの生存期間を延長する
照射ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスの尾部静脈に細胞を接種したＭＶ４；１１白血病モデルで化合物１の有効性を調べた（図６）。このモデルでＭＶ４；１１細胞は骨髄（ＢＭ）に散在し、ヒト白血病に似た疾患パターンを病理学的に模した。１日目にマウスにＭＶ４；１１を注射し、ＭＶ４；１１細胞がＢＭに生植してから２３日目に化合物１による治療（２０ｍｇ／ｋｇを毎日投与、または７日間投与をつづけて、７日間投与を中断、ｎ＝１０〜１２／群）を開始した。対照（賦形剤で治療する）マウスは、典型的には、腫瘍細胞がＢＭに浸潤した結果としてうしろ足に麻痺を発症し、生存期間の中央値（ＭＳＴ）は５１日であった（図６）。生存試験で、化合物１による治療を毎日行う（２３日目〜１００日目）と、賦形剤で治療を行った対照と比較して（ＭＳＴ＝５１日）、病気が進行する時間を有意に遅らせた（ＭＳＴ＝１３４日）（ｐ＜０．０００１）。このことは生存期間（ＩＬＳ）が１６３％に延びたことを意味する（図６）。印象的なのは、化合物１で毎日治療したマウスの４匹が長期生存したという点である（ＭＳＴ＞１６０日）。ＢＭ中のＭＶ４；１１細胞の生殖率（％）を定量するのに組織学的分析およびフローサイトメトリー分析を使用した。フローサイトメトリー分析でヒトＭＨＣｌのエピトープに結合する抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体で、マウスＢＭ中にヒトＭＶ４；１１細胞を同定した。賦形剤で治療したマウスでは、分離された全ＢＭ細胞の約２〜１９％は、生植ＭＶ４；１１細胞からなった（５１日目）。このことは、マウスのＢＭマトリックス中にヒト細胞を同定するＭＶ４；１１細胞を染色するヒトミトコンドリアに対する抗体の免疫組織化学によって確証される。毎日（２０ｍｇ／ｋｇ）２５日間にわたって投与した化合物１は、賦形剤に比して、白血病の負荷を有意に軽減した（ＢＭ中にＭＶ４；１１細胞＜１％）。興味深いことに、化合物１による治療後に生存しているマウスは、ＢＭ中に腫瘍細胞の免疫組織化学的な形跡を見せず（１６７日目には、抗ヒトミトコンドリア陽性細胞は存在しないものと見られた）、「治癒したものと」定義された。化合物１を周期的に投与（７日間投与して、７日間投与を中止するサイクルを５回）した場合も、生存期間が有意に延長（ＭＳＴ＝１１８日、賦形剤に対して１３１％ＩＬＳ、ｐ＝０．０００１）されたが、毎日投与した場合ほど有効ではなかった（ｐ＝０．００７、図６）。
【０２０６】
前立腺ガンの細胞株を治療するときの化合物１の有効性
化合物１は、ケースＩＩＩ、ＩＶおよびＶ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対して複数標的化されたキナーゼ選択性を持つため、前立腺ガンの転移モデルで、化合物１の活性を調べた。化合物１によって阻害される重要なＲＴＳであるＶＥＧＦＲおよびＦＧＦＲを発現するＰＣ−３Ｍ腫瘍を使って、化合物１の抗腫瘍有効性を評価した。ＰＣ−３Ｍ細胞は骨に転移することが明らかにされているため、ヌードマウスにおけるヒト前立腺ガンの転移性異種移植実験モデルで化合物１の活性を調べるのにこのモデルを使用した。
【０２０７】
細胞株  ｎｕｌｌ  ｐ５３、ｄｅｌ  ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦＲ、ＦＧＦＲを発現し、ルシフェラーゼ構造体を確実に移入される転移性ヒト前立腺細胞株ＰＣ−３ＭをＸｅｎｏｇｅｎ社とのライセンス契約によって入手した。
【０２０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験  オスのヌードマウス（４〜６週齢、１８〜２２ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手して、試験開始前に病原を排除した囲いの中で１週間訓化した。試験動物は無菌の齧歯類用食餌と水が随時与えられ、１２時間周期で明暗がくり返される無菌フィルター付きケージに収容した。すべての実験は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのガイドラインに従って行われた。
【０２０９】
ＰＣ−３Ｍ  ｌｕｃ骨転移モデル  ルシフェラーゼ構造体を確実に移入されるヒト前立腺ガン細胞株ＰＣ−３Ｍ  ｌｕｃ細胞（１．５×１０６個の細胞）を心臓内に注射した。細胞接種後のＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖および転移を非侵襲的にモニターするには生物発光画像化法（Ｘｅｎｏｇｅｎ社ＩＶＩＳ（登録商標）画像化システム）を使用した。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ腫瘍細胞を注射されたほとんどすべての試験動物が前立腺病変を発症し、それらの病変は主として大腿骨および下顎骨に局在した。細胞を接種して４週間後（試験０日目）に化合物１、タキソールまたは賦形剤による治療を開始した（ｎ＝７／群）。毎日マウスをモニターし、瀕死状態のマウスは安楽死させた。
【０２１０】
試験群に関する情報
細胞を接種して４週間後に投与を開始（試験０日目）
１．賦形剤（ｎ＝８）  
２．化合物１、５０ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、毎日投与（ｎ＝７）
３．タキソール、１５ｍｇ／ｋｇ、１週間にｉ．ｐ．３回投与（ｎ＝７）
エンドポイント  有効性（Ｘｅｎｏｇｅｎ社のＩＶＩＳ（登録商標）画像化システムを使って腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏでリアルタイムに画像化）。
【０２１１】
免疫組織化学  骨（大腿骨、下顎骨）のサンプルは脱石灰化した（ＰｒｏｔｏｃｏｌＴＭ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＶＡ）。パラフィンブロックを４ｍｍの厚さに切り出して、正に荷電したスライドグラス上にのせた。全般的な組織の形態を確認し、骨のＰＣ−３Ｍ細胞を同定するため、組織をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０２１２】
心臓内注射によってＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞を接種したオスのヌードマウスは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ腫瘍細胞の逐次的な全身画像化および組織学的評価による検出の結果、心臓内接種後ＰＣ−３Ｍ細胞が散在して増殖していることが確認された（図７）。ヌードマウスにＰＣ−３Ｍ細胞を接種して４週間後、全身画像化によって調べた結果、主として頭部および腹部に局在化した細胞増殖と転移病変の進展が明らかとなり、組織学的評価から、ＰＣ−３Ｍ細胞が骨（大腿骨、下顎骨）に転移することが確認された。一部のマウスでは乳房にも腫瘍細胞が検出された。これは心臓内に接種したあとも、いくらか残留した細胞ではないかと思われる。
【０２１３】
細胞を接種してから４週間後（０日目）に、腫瘍が骨に転移してから、化合物１による治療を開始した。骨に腫瘍が存在することはマウスの全身画像化によっても確認された。化合物１を５０ｍｇ／ｋｇ／日経口投与し、逐次的にマウスをスキャニングした結果、化合物１は、賦形剤による治療に比べて、ヌードマウスにおけるＰＣ−３Ｍ  ｌｕｃ腫瘍細胞の、転移性の増殖を阻害する傾向を示した。化合物１で治療したマウスが、０、８および１５／１８日目に示した平均フォトン強度（阻害）は、賦形剤で治療したマウスに比べて弱かった。化合物１によって腫瘍の増殖が阻害されることは、フォトンカウント数の中央値阻害でも評価した（図７）。化合物１による毎日治療（５０ｍｇ／ｋｇ／日）は、タキソールによる治療（１５ｍｇ／ｋｇ／日）より有効であった（図７）。タキソールによる治療と賦形剤による治療の間で、治療効率に違いは見られなかった（図７）。
【０２１４】
結果のまとめ  骨髄に転移した充実性腫瘍の治療における化合物１の有効性を試験した。このモデルでは、ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞をヌードマウスの心臓内に接種した。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞は、ルシフェラーゼを安定して移入されたヒト前立腺細胞株である。接種するとき、ＰＣ−３−ｌｕｃ細胞は骨も含めて複数臓器に散在した。散在性腫瘍細胞は、Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐから購入可能なｉｎ  ｖｉｖｏ画像化装置を使って可視化した。
【０２１５】
ヌードマウスの心臓内にＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞を１．５×１０６接種した。接種して４週間後（０日目）に、賦形剤（ｎ＝８）、化合物１  ５０ｍｇ／ｋｇを毎日経口で（ｎ＝７）、およびタキソール１５ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．（腹腔内）に週に３回（ｎ＝７）、投与を開始した。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞株はＸｅｎｏｇｅｎ社から購入し、マウスの観察にはＸｅｎｏｇｅｎ社のＩＶＩＳ（登録商標）画像化システムを使用した。
【０２１６】
化合物１で治療したマウスは、賦形剤およびタキソールで治療したマウスと比べて、フォトンカウント数の減少の傾向が見られた。マウスの頭部および脚部から発生するフォトンカウント中央値およびグラフを図７に示す。この実験から、化合物１による治療は、骨に散在しているＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞の増殖を強力に阻害することがはっきり示された。
【０２１７】
４Ｔ１ネズミの乳房腫瘍モデルにおける化合物１の有効性
以下の試験では、自発転移４Ｔ１ネズミ乳房腫瘍モデルにおける化合物１の毎日経口投与の有効性を評価した。
【０２１８】
９週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の右脇腹の皮下に２．５×１０５個の４Ｔ１細胞（転移した肝臓小結節由来の細胞）を移植した。治療は平均腫瘍体積が１４０ｍｍ３に達してから１３日後に開始した。この日を試験１日目とした。化合物１を純水に溶かして液剤とし、毎日１回強制経口投与によって１７日間投与した。
【０２１９】
治療群（ｎ＝１０／群）は：賦形剤（水）の群と、化合物の投与量が１０，３０，６０，１００および１５０ｍｇ／ｋｇの５つの群とした。
【０２２０】
腫瘍の増殖、試験動物の所見および肺および肝臓への転移数を試験のエンドポイントに含めた。スチューデント検定を使って、治療群と賦形剤の群をペアにして比較評価した。治療群間の違いを比較するには、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）と、それにつづいてペア多重比較のためのＤｕｎｎ法とを使用した。試験は、賦形剤群の腫瘍の体積を基にして１８日目で終了した。
【０２２１】
結果のまとめ  治療を開始して４日後までに１０ｍｇ／ｋｇ用量群を除いてすべての群で、一次腫瘍増殖は統計的に有意に阻害された。用量が１０、３０、６０、１００および１５０ｍｇ／ｋｇに対する最大腫瘍増殖阻害は、それぞれ３２，４５，５０，７４および８２％であった（図２５、表Ｘ）。群の間の比較から、１０．３０および６０ｍｇ／ｋｇの用量と１５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルとの間の差、および１０ｍｇ／ｋｇ群と１００ｍｇ／ｋｇ群との間の差が明らかになった（ｐ＜０．０５）。
【０２２２】
１８日目に切除した組織を肉眼で検査し、肺および肝臓への転移数を数えた。賦形剤で治療した対照マウスは、統計的な比較に影響を与えた前の試験（〜５０％ｎ減少）で観察された大きさまで肺の腫瘍を進行させなかった。賦形剤に比べて化合物１の投与によって肺への転移は減少し、特に１５０ｍｇ／ｋｇ投与群で９１％減少した。そして３０、６０および１００ｍｇ／ｋｇによる治療では肝臓腫瘍小結節の数が、賦形剤に比べて≧７７％減少した（表Ｙ）。
【０２２３】
（表Ｘ  化合物１による４Ｔ１一次腫瘍増殖阻害）
【０２２４】
【化３０】
2008528617.tif 000026
（表Ｙ  １７日間投与後の４Ｔ１自発性肝臓および肺転移に対する化合物１の有効性）
【０２２５】
【化３１】
2008528617.tif 000027
要約すると、４Ｔ１ネズミ乳房腫瘍モデルにおいて化合物を毎日経口投与する工程の有効性がこの実験で確認された。４日間の治療で有意な一次腫瘍増殖阻害が観察された。化合物１の用量を３０、６０、１００および１５０ｍｇ／ｋｇとした場合、一次腫瘍増殖阻害は、それぞれ４５％、５０％、７４％および８２％であった。化合物１による治療は、肺臓および肝臓への自発性転移を有意に阻害した。肝臓への転移の数は、１５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで完全に阻害され、３０，６０および１００ｍｇ／ｋｇの用量でも有意に減少した。肺への転移は１５０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで統計的に有意に減少した（９１％阻害）。
【０２２６】
考察
腫瘍細胞の増殖に関係する異常な細胞内キナーゼシグナル伝達経路を標的にすることで細胞過程を破壊し、腫瘍の増殖を阻害することができる。このことは、２種類の小分子標的薬、すなわちＣＭＬ（Ｂｃｒ−Ａｂｌ）および胃腸管間質腫瘍（ｖ−ＫＩＴ）におけるイマチニブ（グリベック）および進行または転移した難治性非小型細胞肺ガン（ＥＧＦＲ）におけるゲフチニブ（イレッサ）の認可によってすでに証明されている。Ｄｒｕｋｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：８５４１〜８５４６（２００２）；  Ｇｉａｃｃｏｎｅ  Ｇ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：４２３３Ｓ〜４２３７Ｓ（２００４）。両化合物は腫瘍細胞の特定の分子欠陥を標的にしており、この成功がＦＬＴ３  １５，２０−２３など、その他発ガン性のキナーゼに対する分子標的療法に関する研究を駆り立てている。ＦＬＴ３遺伝子の変異が、ＡＭＬの最も頻度の高い遺伝子の変異であり、患者の３５％近くが変異の活性化と関係がある。ＦＴ３の変異は、臨床予後が良くないことの要因であることが明らかにされており、そのためＦＬＴ３はＡＭＬにおける治療の標的になっている。Ｔｈｉｅｄｅ  Ｃ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，９９：４３２６〜４３３５（２００２）；Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ  Ｓ，ほか、Ｂｌｏｏｄ，２００２；１００：５９〜６６（２００２）。
【０２２７】
化合物１は、腫瘍増殖および血管形成に関与するクラスＩＩＩ、ＩＶおよびＶ  ＲＴＫに対してナノモル量で効力を発揮する複数標的キナーゼインヒビターである。生化学的キナーゼアッセイは、化合物１がＦＬＴ３に対して強力な活性を有する（１ｎＭのＩＣ５０）。２種類の白血病細胞株における化合物１の活性については、対照をなすＦＬＴ３の状態、ＭＶ４；１１（ＦＬＴ３  ＩＴＤ）およびＲＳ４；１１（ＦＬＴ３  ＷＴ）でその特徴が現れた。化合物１は用量依存的にＦＬＴ３のリン酸化を抑制することが示され、細胞における分子活性が確認された。化合物１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ともに細胞増殖経路の重要な調節因子であるＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ５の細胞分裂関連経路において、後に続く下流シグナル伝達分子をブロックする。細胞に対する細胞毒性／増殖アッセイで化合物１の効果が顕著であったように、ＦＬＴ３標的変調に対する活性は、ＭＶ４；１１およびＲＳ４；１１細胞において、より顕著に現れたことは興味深い。ＦＬＴ３−ＩＴＤおよび野生型ＦＬＴ３に対する同様の差別的効果はほかのＦＬＴ３インヒビターに対しても報告されている。ＦＬＴ３  ＩＴＤ  ＭＶ４；１１は、細胞の増殖を駆動する構成的に活性なグナル（Ｒａｓ，ＳＴＡＴ５）を持っており、ＦＬＴ３の活性化とは無関係に増殖を持続でき、そして／あるいは別の腫瘍原経路に依拠しているかもしれないＦＬＴ３  ＷＴ（ＲＳ４；１１）とは異なっていることが推論できる。Ｍｉｎａｍｉ  Ｙ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０２：２９６９〜２９７５（２００３）；Ｋｉｙｏｉ  Ｈ．ほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：２５５５〜２５６３（２００２）；Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ  Ｋ．ほか、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：２１４０〜２１５０（２００３）。
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験から得られた結果は、化合物１が、充実性腫瘍および白血病の播種性ＢＭモデルに対して強い活性を有することを示している。臨床前モデルにおける化合物１の分子活性に注目し、標的変調の大きさと持続期間を、ＰＤエンドポイント使って調べた。その結果、化合物１は、ＭＶ４；１１腫瘍のｐＦＬＴ３とｐＥＲＫの両者を大きくダウン調節することがわかった。４時間までに標的（ｐＦＬＴ３）の調節が観察され、その調節は、化合物１の単回または多回投与後、２４時間まで腫瘍内で持続した。腫瘍の組織病理から生物学的効果も明白であり、腫瘍におけるｐＥＲＫ、増殖およびアポトーシス応答の減少が薬物治療の１〜２日以内に観察された。ＭＶ４；１１の充実性腫瘍異種移植の場合、腫瘍の退行も薬物治療を開始して数日以内に顕著になった。ＭＶ４；１１モデルにおける化合物１の強力な阻害効果は、ＰＬＴ３の直接阻害に、他のＲＴＫの阻害が組み合わさって生まれる可能性がある。データ（ＲＴ−ＰＣＲ、この明細書には記載しなかった）は、ＭＶ４；１１が、ＶＥＧＦＲ１、ｃＫＩＴ、ＰＤＧＦＲβ、ＦＧＦＲ１、およびＣＳＦ−１Ｒ、化合物１によって強力に阻害されるすべてのＲＴＫを発現することを示している。化合物１はＶＥＧＦ１／２／３キナーゼに対して＜１０ｎＭで活性を示し、データは、化合物１がＭＶ４；１１のｉｎ  ｖｉｔｒｏの培地において自己分泌ＶＥＧＦレベルを阻害しうることを明確に示している。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、腫瘍細胞または腫瘍間質細胞（内皮細胞を含む）による分泌ＶＥＧＦまたはＦＧＦの自己分泌またはパラクリン阻害が、これらの細胞の増殖および生存を阻害している可能性がある。Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．ほか、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，９：６６９〜６７６（２００３）；  Ｃｏｍｐａｇｎｉ  Ａ．ほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０：７１６３〜７１６９（２０００）；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，９：６５３〜６６０（２００３）。充実性腫瘍における化合物１の追加的活性は、血管形成時に血管細胞周辺の補強および血管の成熟に影響を及ぼすことによって、ＰＤＧＦＲβに対する強力な効果から生まれるのかもしれない。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，９：６５３〜６６０（２００３）；Ｏｓｔｍａｎ  Ａ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，１５：２７５〜２８６（２００４）。われわれは、ＡＭＬ  ＢＭモデルで、化合物１がマウスの生存率を高め、一部のマウスでは病気を根絶したことを示す。このことは、化合物１が、直接的な抗増殖効果または骨髄血管形成の調節によって循環芽細胞およびＢＭ疾患の両方を根絶する潜在的能力を持っており、芽細胞の生存に役割を果たすかもしれないことを表わしている。Ｃａｒｏｗ  Ｃ．Ｅ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，８７：１０８９〜１０９６（１９９６）；Ｄｅｘｌｅｒ  Ｈ．Ｇ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１０：５８８〜５９９（１９９６）。
【０２２９】
化合物１の薬理学および標的阻害の点から、化合物１の断続的投与および周期的投与のスケジュールを検討した。化合物１を交互に投与するスケジュールは、化合物１を毎日投与する方式と似たような活性を示したことから、臨床では柔軟な投与方式が可能であることを示唆している。化合物１を多回投与する工程によって腫瘍の増殖を継続的に抑制することができ、治療を中断したあとで腫瘍が再発しても、薬物による再治療に対する感度（応答）は変わらないことがわかった。キナーゼインヒビターで治療した場合、ＡＭＬ患者のなかには、治療を持続していても症状がぶり返すことがあるため、このような知見は、臨床の現場に移した場合に重要である。Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｗ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，（２００４）；Ｃｏｏｌｓ  Ｊ．ほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：６３８５〜６３８９（２００４）。代謝あるいは（Ｐ−糖タンパクのような薬物輸送体の発現を経由する）細胞の流出を含む複数の機構、あるいは薬物の結合を妨害する酵素活性部位のＡＴＰ結合ドメインにおける変異が、キナーゼインヒビターと相互関連していることが明らかにされている。Ｂａｇｒｉｎｔｓｅｖａ  Ｋ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０３：２２６６〜２２７５（２００４）；Ｇｒｕｎｄｌｅｒ  Ｒ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０２：６４６〜６５１（２００３）。化合物１はＰ−ＧＰ基質ではなく、薬物治療過程を通して応答が永続的であるということは、化合物１を使うことで、抵抗性の発現が回避できるかもしれないことを暗示している。
【０２３０】
ＡＭＬに対するＦＬＴ３インヒビター（ＳＵ１１２４８  ＰＫＣ４１２、ＣＥＰ−７０１、ＭＬＮ５１８）の臨床に向けた開発はまだ初期の段階にある。Ｏ‘Ｆａｒｒｅｌｌ  Ａ．Ｍ．ほか、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：５４６５〜５４７６（２００３）；Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｗ．ほか、Ｂｌｏｏｄ（２００４）；Ｓｔｏｎｅ  Ｒ．Ｍ．ほか、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８３  Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ８９〜９０（２００４）；Ｓｍｉｔｈ  Ｂ．Ｄ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０３：３６６９〜３６７６（２００４）；ＤｅＡｎｇｅｌｏ  Ｄ．Ｊ．ほか、Ｂｌｏｏｄ，１０２：６５ａ（２００３）。単一薬剤による治療を選択することでは未だに十分な応答は得られていないし、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３インヒビターの今後の臨床的な進展もこれらの薬剤と、細胞毒薬物か、別の分子標的薬剤とを組み合わせて使用することに頼ることになるのかもしれない。ＡＭＬの病態発生に役割を演じていることがわかっているＲＴＫに対して追加的な活性を有する強力なＦＬＴ３インヒビターである化合物１について本明細書に報告したデータはその臨床的評価を保証する。
【０２３１】
構造Ｉの別の化合物、たとえば構造ＩＢおよびＩＣは上記と同様に合成した。これらの化合物を使用する試験は、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］−１Ｈ−キノリン−２−オンに対して上に記載した方法を使って実施される。これらの試験は、これらの化合物もまた、マウス、ヒトおよびその他の哺乳動物の被験体における、血液学的腫瘍を含め、転移した腫瘍の治療に有用であることを明らかにするであろう。
【０２３２】
これによって、すべての文献あるいは参照文献は、参照することにより、ここに完全に記述されたものとして、その全体があらゆる目的のために、ここに組み込まれる。
【０２３３】
本発明は図解のためにここに記述した実施形態に限定されるものではなく、本明細書の範囲に入るものとして、あらゆるそのような形態を包含することが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】ＫＭＣ−１１−ｌｕｃ細胞を注射し、４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）で治療したＳＣＩＤベージュマウスが、賦形剤で治療を受けた対照群と比較して、大幅に低いフォトン平均カウント数を示したことを示すグラフである。
【図２】ＳＩＣＤ−ＮＯＤマウスのヒトＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１白血病性腫瘍の皮下異種間移植モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物１）の抗腫瘍活性を示すグラフである。（図２）ＭＶ４；１１細胞または（図３）ＲＳ４；１１細胞をＳＩＣＤ−ＮＯＤマウス（ｎ＝１０／群）の右横腹に皮下的に移植した。ＭＶ４；１１の実験では、腫瘍が〜３００ｍｍ３になったときに、賦形剤（白抜き菱形）または化合物Ｉを１（黒塗り円）、５（黒塗り三角形）または３０（黒塗り四角形）ｍｇ／ｋｇ／日の用量で１５日間経口投与した。ＲＳ４；１１の実験では、腫瘍が〜３００ｍｍ３になったときに、賦形剤（白抜き菱形）または化合物Ｉを１０（黒塗り三角形）、３０（黒塗り四角形）、１００（黒塗り菱形）または１５０（黒塗り円）ｍｇ／ｋｇ／日の用量で８日間経口投与した。
【図３】ＳＩＣＤ−ＮＯＤマウスのヒトＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１白血病性腫瘍の皮下異種間移植モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物１）の抗腫瘍活性を示すグラフである。（図２）ＭＶ４；１１細胞または（図３）ＲＳ４；１１細胞をＳＩＣＤ−ＮＯＤマウス（ｎ＝１０／群）の右横腹に皮下的に移植した。ＭＶ４；１１の実験では、腫瘍が〜３００ｍｍ３になったときに、賦形剤（白抜き菱形）または化合物Ｉを１（黒塗り円）、５（黒塗り三角形）または３０（黒塗り四角形）ｍｇ／ｋｇ／日の用量で１５日間経口投与した。ＲＳ４；１１の実験では、腫瘍が〜３００ｍｍ３になったときに、賦形剤（白抜き菱形）または化合物Ｉを１０（黒塗り三角形）、３０（黒塗り四角形）、１００（黒塗り菱形）または１５０（黒塗り円）ｍｇ／ｋｇ／日の用量で８日間経口投与した。
【図４】ＳＩＣＤ−ＮＯＤマウスのヒトＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１白血病性腫瘍の皮下異種間移植モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物１）の抗腫瘍活性を示すグラフである。（図４）化合物Ｉを毎日、断続的および周期的に投与する方式がＭＶ４；１１腫瘍の有効性に与える効果。化合物Ｉを毎日（黒塗り四角形）、一日おきに／ｑ．ｏ．ｄ．（黒塗り円）、または周期的に７日間つづけて投与し、７日間休止する方式（×）で３０ｍｇ／ｋｇを経口投与した。
【図５】ＳＩＣＤ−ＮＯＤマウスのヒトＭＶ４；１１またはＲＳ４；１１白血病性腫瘍の皮下異種間移植モデルにおける４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物１）の抗腫瘍活性を示すグラフである。（図５）化合物Ｉは、大きくなったＭＶ４；１１腫瘍の退行を誘起する。ＭＶ４；１１の皮下腫瘍（ｎ＝マウス１０匹／群）の病期を３００（黒塗り三角形）、５００（黒塗り四角形）または１０００（黒塗り円）ｍｍ３の段階に分類した。デ―タは、腫瘍体積平均値±ＳＥ（ｎ＝マウス１０匹／群）で表わした。
【図６】４−アミノ−５−フルオロ−３−［６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル］キノリン−２（１Ｈ）−オン（化合物１）が、静脈内ＭＶ４；１１細胞を持つＳＩＣＤ−ＮＯＤマウスの生存を引き延ばすことを示すグラフである。照射したＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにＭＶ４；１１（１×１０７個の細胞、ｉ．ｖ．）をｉ．ｖ．に注入、移植した。２３日目に治療を開始し、２３日目から９８日目まで、賦形剤（黒塗り菱形）または化合物１を毎日２０ｍｇ／ｋｇ（黒塗り三角形）経口投与するか、７日間投与し、それから７日間休止する（黒塗り四角形）というスケジュールで経口投与した。早期にうしろ足の麻痺の徴候が見られる、または健康状態の悪いマウスを安楽死させた。図６は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの生存百分率を時間に対してプロットしたものである（ｎ＝マウス１０〜１２匹／群）。
【図７】ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞を封入し、それから賦形剤、タキソール、または化合物１で治療したヌードマウスの腹部、頭部および足の部位から発するフォトン（光子）の数（ログ・スケールで）をそれぞれ計測した結果を示すグラフである。グラフから、化合物１（１５４２５８）で治療するとＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃフォトンの数が抑制され、骨に広がったＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ細胞の増殖が抑制される傾向を示したことがわかる。
【図８】腫瘍の体積を治療日に対してプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月5日(2008.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008528617000001.app
【国際調査報告】
2008528617.tif 000043
2008528617.tif 000044