(57)【要約】  本発明は、全般に、結晶が1種又は複数の生体活性分子を含む表面コーティングを有する、1種又は複数の水溶性結晶を含有するミクロン又はサブミクロンの粒子、更にはそのような粒子を生成する効率的方法、及びそのような粒子の形成に好ましい条件をスクリーニングする迅速な方法に関する。これらの粒子は、医薬製剤に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体活性分子でコートされた微結晶を形成する連続法であって：
(a)共沈剤分子を含有する第一の水溶液を提供する工程；
(b)生体活性分子を含有する第二の水溶液を提供する工程；
(c)水混和性溶媒を含有する第三の溶液を提供する工程；
(d)該第一の水溶液、該第二の水溶液及び該第三の溶液を、実質的に同時に混合するか；又は、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合し、その後第一及び第二の水溶液のいずれかの残りと混合し；その結果、共沈剤及び生体活性分子の共沈が始まり、該微結晶の形成につながる工程；並びに
(e)微結晶の懸濁液を収集する工程；を含む、方法。
【請求項２】
水混和性溶媒が、メタノール；エタノール；プロパン-1-オール；プロパン-2-オールなどの短鎖アルコール；アセトンなどのアルデヒド又はケトン、乳酸エチルなどのエステル、テトラヒドロフランなどのエーテル、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、1,5-ペンタンジオール、及び様々なサイズのポリエチレングリコール(PEGS)及びポリオールなどのジオール；又は、それらの任意の組合せもしくは混合物である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第一のポンプが、共沈剤分子を含有する第一の水溶液を連続して送達し、第二のポンプが、生体活性分子を含有する第二の水溶液を連続して送達し、及び第三のポンプが、水混和性溶媒を含有する第三の溶液を連続して送達する、請求項1又は2のいずれか1項記載の方法。
【請求項４】
第一のポンプが、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第二のポンプにより連続して送達される第三の溶液へ連続して送達し、その後第三のポンプが、第一及び第二の水溶液のいずれかの残りを連続して送達する、請求項1又は2のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
水溶液が、流量約0.2ml/分〜約1000ml/分で送達される、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
1種又は複数の微結晶を含む粒子を含有する医薬製剤であって、ここで微結晶が：
(a)共沈剤分子から形成された実質的に非-吸湿性の内部結晶コア；及び
(b)1種又は複数の生体活性分子を含有する外側コーティング；を含み、
ここで、コートされた微結晶は、共沈剤分子を含有する第一の水溶液、生体活性分子を有する第二の溶液、及び水混和性溶媒を含有する第三の溶液を実質的に混合するか；又は、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合し、その後第一及び第二の水溶液のいずれかの残りと混合することにより、単独の連続プロセスにおいて形成される、医薬製剤。
【請求項７】
外側コーティングの厚さが、約0.01〜1000μm、約1〜100μm、約5〜50μm又は約10〜20μmの範囲である、請求項6記載の医薬製剤。
【請求項８】
粒子が、最大断面寸法約80μm未満、直径で約50μm未満、又は約20μm未満を有する、請求項6又は7のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項９】
結晶コアを作製する分子が、分子量約2kDa未満を有する、請求項6〜8のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１０】
結晶コアを作製する分子が、アミノ酸、両性イオン、ペプチド、糖質、緩衝成分、水溶性薬物、有機塩及び無機塩、強力に水素結合した格子を形成する化合物、又はそれらの誘導体もしくはいずれかの組合せのいずれかから選択される、請求項6〜9のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１１】
抗炎症薬；抗癌薬；抗精神病薬；抗菌薬；抗真菌薬；天然又は非天然のペプチド；タンパク質、例えば、インスリン、α1-アンチトリプシン、α-キモトリプシン、アルブミン；インターフェロン；抗体；Fc-融合タンパク質などの融合タンパク質；タンパク質-薬物複合体；天然の供給源又は合成のオリゴヌクレオチド及びアンチセンスヌクレオチドに由来した、遺伝子の断片、DNA、RNA又はRNAiなどの核酸；単糖、二糖又は多糖などの糖質；プラスミド；並びに、タンパク質/ペプチド-薬物複合体などの薬物を含有する、請求項6〜10のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１２】
粒子が、D,L-バリンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-グリシンの結晶コア及びアンチトリプシンのコーティング、グルタミン酸ナトリウムの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-メチオニンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-アラニンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-バリンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-ヒスチジンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-グリシンの結晶コア及びα-アンチトリプシンのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びアルブミンのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びオリゴヌクレオチドDQA-HEXのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びα1-アンチトリプシンのコーティング、更にN-アセチルシステインの抗酸化剤外側コーティング；D,L-バリンの結晶コア及びオボアルブミンのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びオボアルブミンのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及び破傷風トキソイドのコーティング；D,L-バリンの結晶コア並びにジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドの混合物のコーティング；L-グルタミンの結晶コア並びにジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドの混合物のコーティングを伴うものを含む、請求項6〜11のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれか1項に従い形成された微結晶を含有する、肺送達のための医薬製剤。
【請求項１４】
肺用医薬製剤の形成のための生体活性分子が、治療用タンパク質、例えばインスリン、α1-アンチトリプシン、インターフェロンなど；抗体並びに抗体の断片及び誘導体；治療用ペプチド及びホルモン；DNAベースの医薬品を含む、合成及び天然のDNA；酵素；ワクチン成分；抗生物質；鎮痛薬；水溶性薬物；感水性薬物；脂質及び界面活性剤；多糖；又は、それらの任意の組合せもしくは誘導体からなる群より選択される、請求項13記載の医薬製剤。
【請求項１５】
肺用製剤が、約10μm未満又は約5μm未満の空気動力学的中央粒子径を伴う粒子を含有する、請求項13又は14のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１６】
肺用製剤が、バリン、ヒスチジン、イソロイシン、グリシン又はグルタミンなどのアミノ酸で構成される結晶コアを有し、これは例えば、バリンの結晶コア及びインスリンのような治療用タンパク質のコーティング；ヒスチジンの結晶コア及び酵素のコーティング；バリンの結晶コア及びα-アンチトリプシンのような酵素阻害剤のコーティング；バリンの結晶コア及びDNAのコーティング；バリンの結晶コア及びワクチンコーティング；グルタミンの結晶コア及びワクチンコーティング；グルタミンの結晶コア及びアルブミンのコーティングを有する、請求項13〜15のいずれか1項記載の医薬製剤。
【請求項１７】
請求項1〜5のいずれか1項に従い形成された微結晶又は微結晶の懸濁液を含有する、非経口製剤。
【請求項１８】
請求項1〜5のいずれか1項に従い形成された微結晶又は微結晶の懸濁液を含有する、持続放出型又は放出制御型の医薬製剤(又はデポ剤)。
【請求項１９】
請求項1〜5のいずれか1項に従い形成された微結晶を含む、吸入のための薬物送達装置。
【請求項２０】
生体活性分子でコートされた微結晶を作製する最適条件を決定する方法であって：
可変パラメータの第一のセットに従い生体活性分子でコートされた微結晶の第一のバッチを調製し、及び該生体活性分子でコートされた微結晶の少なくとも1種の特性を定量する工程；
少なくとも1種の可変パラメータを変更することにより、生体活性分子でコートされた微結晶の第二のバッチを調製し、並びに該少なくとも1種の変化が、少なくとも1種の特性に対し有益又は有害な作用を有するかどうかを確定することができるように、該少なくとも1種の特性を定量する工程を含む、方法。
【請求項２１】
請求項1〜5のいずれか1項に従い形成された生体活性分子でコートされた微結晶を形成する要請を受け取る方法であって：
(a)顧客が、生体活性、用量、負荷、サイズ、形状及び共沈剤を含む、生体活性分子でコートされた微結晶に関する必要要件を規定すること；
(b)パート(a)において規定された微結晶を得るために、共沈条件を調整すること；
(c)適当な必要要件を伴う微結晶を得るために、共沈条件を洗練すること；並びに
(d)必要とされる微結晶を形成するための適当な条件を確定することを含む、方法。
【請求項２２】
請求項1〜5のいずれか1項に従う生体活性分子でコートされた微結晶を形成する方法に関連したサービスを提供する方法であって：
顧客からの、サイズ及び生体活性を含む特定の必要要件を伴う、生体活性分子でコートされた微結晶を形成する要請を受け取ること；
該生体活性分子でコートされた微結晶の形成法を決定すること；並びに
該生体活性分子でコートされた微結晶の形成法のサービスを顧客へ提供することの報酬を受け取ることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は一般に、1種又は複数の水溶性結晶を含有するミクロン又はサブミクロンの粒子であり、ここで結晶は1種又は複数の生体活性分子を含有する表面コーティングを有する粒子に関し、更にはそのような粒子を形成する効果的方法及びそのような粒子を形成するのに好ましい条件をスクリーニングする迅速な方法に関する。これらの粒子は、医薬製剤に適している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
国際公開公報第00/69887号は、本発明者らによるタンパク質でコートされた微結晶(PCMC)に関係する先行する出願であり、これは本願明細書に参照として組入れられている。国際公開公報第00/69887号に開示されたコートされた結晶は、一般に、水混和性溶媒へ添加することにより、共沈剤及び生体分子の飽和した溶液を含む水性混合物から共沈される。しかし、飽和を下回る溶液を使用する利点に関する開示はない。
【０００３】
国際公開公報第00/69887号において、共沈剤及び生体活性分子の飽和した水溶液の過剰な溶媒への添加によるPCMCの生成が、説明されている。効率的な混合を得る国際公開公報第00/69887号における好ましい方法は、この水溶液の、激しく混合している過剰な有機混和性溶媒への滴下であった。しかしこのバッチ式プロセスは、以下の多くの欠点を有する：
a)溶媒の含水量は全体を通じて増加するので、沈殿条件は、連続して変動する。様々な最初の含水量は、結晶の異なるサイズ及び形状、並びに生体活性の変動につながることはわかっている；
b)沈殿は、懸濁液中に既に増大する量の結晶を含有する懸濁液へ実行される。このことは、発生期の結晶が既に形成された結晶の上に融合する可能性を増大するであろう；
【０００４】
c)大規模バッチが必要な場合には、過剰な剪断力を伴わない攪拌されたバッチ反応器で、高効率の攪拌を得ることは困難である。高効率の攪拌は一般に、より小さい結晶を作製し、及び結晶の凝集塊への「セメント化(cementing)」を防止するために必要である。しかし高い剪断力は、タンパク質変性又は核酸の「ニック形成」のように、生体活性分子を損傷し始めることがある。非常に小さい液滴を提供するための水性流入の霧状化(nebulising)のような、迅速混合の別法も、剪断力及び界面変性プロセスから生じる問題点がある可能性がある；
d)生体活性分子及び共沈剤は、溶媒への添加時まで、混合物として調製され及び貯蔵されることが必要である。このことは、例えば生体分子がその混合物中で不安定であるか、又はそうでなければこれが、例えば凝集、沈殿もしくは化学的修飾を防止するために、添加剤もしくは安定剤の存在を必要とする場合に、問題を引き起こし得る。これらが閾値濃度を上回って存在することを必要とする場合、これらは、共沈プロセスに影響を及ぼすことがある；
【０００５】
e)所望の物理特性及び最適生体活性を伴う生体活性でコートされた微結晶が生成されるような共沈プロセスを実行する最適条件を決定するための、自動化されたスクリーニング手法を導入することは困難である。このことは、一旦共沈剤及び生体活性分子が一緒に混合されると、共沈プロセスに作用する多くのパラメータが、固定された値に維持され、及び互いに対し変動することができないことから生じる。例えば、水-溶媒比、使用される共沈剤の濃度及び粒子中の生体活性分子の負荷は、最初に更なる水性混合物を調製すること以外に、互いに相対的に変動することはできない。このことは時間がかかり、非効率であり、誤りをもたらすことがある。更に生体活性分子が、少ない量でのみ入手可能であり及び／又は作製するのは高価である場合、多くの異なる水溶液の調製は、不可能となるか又はそうでなくとも不経済である。スクリーニングされることが必要である関連のある物理特性は、サイズ、形状、結晶化度、ゼータ電位、空気動力学的特性、溶解度及び流れ性を含む。生体活性に影響を及ぼす因子は、生体活性分子の微結晶上への収量及び負荷、含水量及び生体活性分子構造の変化、組成及び凝集状態を含む。非常に多数の可変パラメータは、最適生体活性と共に所望の物理特性を有する粒子を作製するための最良の条件のスクリーニングを可能にする新規の効率的方法の明確な必要性が存在することを意味する。例えばこのことは、医薬製剤がより迅速に最適化されることを可能にする。
【０００６】
超臨界流体を使用する乾燥タンパク質粉末を製造する連続法が明らかにされているが、これらの方法は、タンパク質でコートされた微結晶を提供せず、及びこれらは特別な高圧ポンピングシステムの使用を必要とするという欠点がある。加えて、超臨界二酸化炭素及び水は狭い範囲で単に混和するのみであるので、第三の溶媒を使用し、並びに超臨界流体の低い粘度及び高い拡散性を利用することができる精巧な混合装置を使用することが必要である。ひとつの更に深刻な問題点は、水の存在下で、超臨界二酸化炭素は酸性となり、このことはこの方法を、低pHに感受性がある多くの生体活性分子の加工処理に余り適さないものとすることである。
【０００７】
従って、a)より幅広い生体活性分子に適用することができ；b)通常の溶媒に適用することができ；c)操作がより容易で余り高価でなく；並びに、d)タンパク質でコートされた微結晶の生成に使用することができる；タンパク質粉末を調製するための別の連続プロセスを開発する必要性が存在することは明らかである。
前述の欠点の少なくともひとつ又は複数を取り除くか又は軽減することはことは、本発明の少なくともひとつの局面の目的である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の第一の局面に従い、下記工程を含む、生体活性分子でコートされた微結晶を形成する連続法が提供される：
(a)共沈剤分子を含有する第一の水溶液を提供する工程；
(b)生体活性分子を含有する第二の水溶液を提供する工程；
(c)水混和性溶媒を含有する第三の溶液を提供する工程；
(d)該第一の水溶液、該第二の水溶液及び該第三の溶液を、実質的に同時に混合するか；又は、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合し、その後第一及び第二の水溶液のいずれかの残りと混合し；その結果、共沈剤及び生体活性分子の共沈が始まり、該微結晶の形成につながる工程；並びに
(e)微結晶の懸濁液を収集する工程。
【０００９】
驚くべきことに、共沈剤分子を含有する第一の水溶液、生体活性分子を含有する第二の水溶液及び水混和性溶媒を含有する第三の溶液について、個別の溶液を提供することは非常に有利であることがわかった。例えば、2種の個別の溶液として共沈剤分子及び生体活性分子を提供することは、有利なことに、これらの成分が異なる添加剤及び／又はpHを含む溶液から共沈プロセスへと貯蔵及び導入されること、並びにこれらの溶液が異なる温度及び圧力に維持されることを可能にする。
本願明細書における連続プロセスは、調製された溶液が一定して混合されるプロセスを意味する。これらの溶液は、例えば、個別の溶液の単独又は複数の混合装置へのポンプ送りにより、一定して混合することができる。少なくとも3種の個別の溶液を、ひとつの装置内で実質的に同時に一緒に混合することができる。
【００１０】
あるいは、第一の工程において共沈剤分子を含有する第一の水溶液が、水混和性溶媒を含有する第三の溶液へ添加され、その後第二の工程において生体活性分子を含有する第二の水溶液が添加される逐次プロセスを行うことができる。別の例においては、第一の工程において生体活性分子を含有する第二の水溶液が、水混和性溶媒を含有する第三の溶液へ添加され、その後第二の工程において共沈剤分子を含有する第一の水溶液が添加される。
これらの一緒にした混合物は、十分量の微結晶が形成されるまで、混合装置(複数)の外へ同時にポンプ送りされてよい。
【００１１】
1種又は複数の生体活性分子を含有する表面コーティングを伴う微結晶の製剤の製造のための大規模プロセスにおいて、担体結晶へ結合した生体活性分子の収量を最大化することが望ましいことがある。これは、例えば治療用タンパク質の製造及び精製には非常に経費がかかることがあるからである。従って、担体結晶上への固定時に喪失される生体活性分子の量を最小化することが望ましいことがある。この喪失は、サブミクロン粒子の形で混和性溶媒中に残存する未結合の生体活性分子から、又はそうでなければ結合した生体活性分子の生体活性の喪失から生じることがある。結合プロセスの効率は、一定期間共沈プロセスを試行し、その結果生体活性分子の既知量が導入され、その後形成された微結晶が沈殿溶媒から濾過により単離され、形成された微結晶に結合している導入された生体活性分子の割合が測定されることにより試験することができる。典型的には、生体活性分子の担体結晶への結合効率は、約20％より大きい、約50％より大きい、約80％より大きいか、より好ましくは約90％より大きいことができる。
【００１２】
驚くべきことに、共沈時のタンパク質などの生体活性分子の結合効率は、特に水溶液のpH及び導入される塩又は緩衝液の濃度に感受性があることがわかった。0.1M未満又は好ましくは0.01M未満のような低い塩濃度で、共沈に使用される水溶液のpHを、タンパク質などの生体活性分子のpI近くに変更することができるならば、結合効率は一般に改善することがわかる。理論に結びつけられることを欲するものではないが、低下した全体の電荷を伴う生体活性分子は、ナノ粒子にクラスター化することがより可能であり、及びその後これらは担体結晶の表面をコートするように互いにより良く密集することもできる。
pHは、例えばIgGのような抗体とうまく再構成することができる結合した生体活性分子の量に作用することも発見された。このような場合、共沈pHを最適化することも望ましいことがある。
【００１３】
残念なことに、先に明らかにされた国際公開公報第00/69887号に開示された2-系統連続プロセスを使用し共沈プロセスを実行する場合、水溶液pHの変化は、例えばアミノ酸のように、使用される共沈剤が緩衝能を有する場合には特に困難である。このような場合は、濃厚な共沈剤溶液のpHを、生体活性モジュール(module)のpI近くへ移動するために、著しい量のpH調節剤、例えば酸、塩基又は緩衝液などを導入することが必要である。これらの調節剤の高濃度での存在は、沈殿プロセスと干渉し、担体材料の沈殿量の減少につながり得る。最終的固形製剤中の大量の調節剤の存在も、望ましくないことが多い。例えば、再構成時に許容可能な調節限界を上回る望ましくない等張性、好ましくない浸透力又はイオン強度を有する溶液が得られ、結果的に非経口投与に適さない。従って、pHの変化はこの状況を改善することができるが、国際公開公報第00/69887号に開示された2-系統プロセスは、高効率で1種又は複数の生体活性分子を含有する表面コーティングを伴う微結晶を調製するための商業的必要要件に適した経路を提供しないことは明らかである。これは選択された共沈剤のpIから離れたpIを伴う生体活性分子に特に当てはまるであろう。
【００１４】
驚くべきことに、効率的な製造プロセスを得ることに関連した困難は、異なるpHの共沈剤溶液及び生体活性分子溶液が、個別の流れとして連続混合装置へ導入され、並びに水混和性溶媒と迅速に一緒にされる場合に克服することができることがわかった。3-系統プロセスと称されることがあるこのプロセスは、異なるpHの共沈剤及び生体活性分子の水溶液で操作され、このことはタンパク質結合のような生体活性分子結合の効率を、緩衝せずに操作される2-系統プロセスを使用する場合と比べて、著しく改善する。このプロセスは、共沈剤溶液を緩衝することを必要とせずに、より高いレベルの例えば可溶性抗体を得るために使用することもできる。3-流れの混合は、実質的に同時に実行されるか、又はそうでなく一方もしくは他方の水性流れを、最初に混和性溶媒と一緒にし、次にこの混合物を迅速に他方の水性流れと一緒にすることができる。2水性流れ中の成分の間のプロトン交換は、混合時に非常に迅速であり、その結果これらの流れ間の最初の差異は迅速に解消されることが予想されるので、観察された改善された結合は驚くべきことである。
【００１５】
本発明において、共沈剤分子を含有する第一の水溶液は、生体活性分子を含有する第二の水溶液よりもより高速で混合プロセスへ導入され、水混和性溶媒を含有する第三の溶液は更により高速で導入される。添加の相対速度は、形成された微結晶の懸濁液内の特定の最終組成及び含水量を提供するために、必要に応じ変更することができる。
【００１６】
共沈剤分子を含有する第一の水溶液のpHは、良好に形成された共沈剤微結晶の迅速な沈殿を提供するように選択されてよい。両性イオン性化合物の場合、pH最適値は、通常溶液中に全部の中性分子が存在するpH近傍であってよい。アミノ酸に関して、適切なpHは都合が良いことに、ほぼ飽和濃度の濃厚な溶液を作製するために、純粋な化合物の固形結晶の水への溶解により実現することができる。
【００１７】
生体活性分子を含有する第二の水溶液は、例えば、生理的に許容できる緩衝液を使用し、共沈剤分子を含有する第一の水溶液とは異なってよい生体活性分子のpIに近いpHへ緩衝することができる。この緩衝液濃度は、約0.1M未満、約0.05M未満、好ましくは約0.02M未満のいずれかから選択することができる。このpHは、沈殿前の保持時間にわたり生体活性分子が、水溶液中に可溶性であり続け、その生体活性分子の生体活性を維持するように選択されることが好ましい。結合効率を最大化するために、生体活性分子を含有する第二の水溶液に使用されるpHは、一般にそのpIの4.5pH単位以内、好ましくはそのpIの3pH単位以内、最も好ましくはそのpIの2pH単位以内である。生体活性分子の濃度は上昇されるので、これは生体活性分子の沈殿又は凝集を防止するためにpIから更に移動することが必要であることがある。例えば治療用タンパク質溶液を特定のpHに維持するために必要な緩衝成分の量は、大量の濃厚な共沈剤溶液の緩衝に必要な量よりもはるかに少ないことは、当業者には明らかであろう。これは、例えばアミノ酸のような、イオン化可能な共沈剤にとって特に利点であろう。
【００１８】
従って本発明は、共沈プロセスの効率を増大しつつ、最終的に形成された微結晶へ導入される緩衝化合物の割合を最小化する方法を提供する。同様に共沈剤溶液から生体活性分子溶液を分離することも、微結晶へ導入される他の添加剤、例えば塩、界面活性剤、安定剤及び抗酸化剤などの量を、国際公開公報第00/69887号に開示された2-系統プロセスの量と比べ、減少することができる。
【００１９】
沈殿後コーティング、混合共沈剤システム又は架橋のようなある種の用途においては、共沈装置の前又は後に連続して配置された追加の流入口を介するか又は他の混合装置を介し、更なる溶液を調製し、ポンプ送出し及び混合することが必要であることがある。同様にスクリーニング用途のために、有利なことに共沈剤及び生体活性分子の初期濃度又は最終濃度を系統だった様式で変動させるために、追加の水性メイクアップ(make-up)流れを使用することができる。主な用途は、3-流れ混合プロセスと称されるが、3よりも多いあらゆる数も、本出願の範囲内であることを意味することも理解されなければならない。例えば4-流れ、5-流れ、6-流れ、7-流れ、8-流れ、9-流れ又は10-流れプロセスを使用してもよい。
【００２０】
説明された連続プロセスの好ましい特徴は、混合装置を通じて一緒にされた流量は高く、その結果混合装置内の一緒にされた溶液の滞留時間は非常に短いことである。各装置内で実質的に完全な混合が生じることを確実にすることも好ましい。滞留時間は、装置を通り単位時間当たりにポンプ送出された溶液の総容積で除算された混合チャンバーの容積として計算することができる。典型的滞留時間は、約5秒未満、好ましくは約1秒未満、最も好ましくは約0.2秒未満であろう。その結果溶液は、混合チャンバー内に最短期間存在しながら、迅速かつ完全に混合されるような連続プロセスのこの特徴は、微結晶形成の開始がそのプロセスを通じて同じ環境で生じることを保証する。一定の開始条件又は核形成条件は、微粒子がより均一なサイズ及び形状を持つことにつながり、並びに互いの微結晶の融合を最小化することを助ける。サイズ及び形状の比較的狭い分布を伴う粒子は、一般に加工処理がより容易であり、これは単位剤形を調製することがより容易であるので、例えば医薬製剤の作製により適している。
【００２１】
本発明者らは驚くべきことに、共沈プロセスに高流量3-流れ連続ミキサーを使用し、濃厚な共沈剤水溶液及び生体活性分子溶液の、個別の連続流れによる混合装置への導入が可能であることを発見した。混合流動装置内で、これらの個別の水溶液の投入は、水混和性溶媒の第三のより大きい投入と混合され、共沈が始まる。混合物は、混合装置から流出し、得られる粒子懸濁液は、保持容器中に収集されるか、又は更に例えば濃縮、濾過又は遠心、それに続く乾燥により、直ぐに加工処理される。
【００２２】
水性タンパク質溶液及び個別の濃厚な共沈剤溶液の、急速に混合している過剰な溶媒の入った容器への同時滴下は、タンパク質でコートされた微結晶につながらないことが先に示されたので、3流れプロセスの適用の成功は驚くべきことであった。むしろこれは、2種の個別の成分、すなわち、タンパク質凝集塊及びコートされない共沈剤結晶の沈殿を生じた。従ってタンパク質及び共沈剤の2成分は、水混和性溶媒への添加前に密に混合されることが必要であると考えられた。理論に結びつけられることを欲するものではないが、高い流量の沈降分離装置中で実現することができる3投入流動の効率的な混合は、ほぼ定常状態条件につながり、その結果生体活性分子による共沈剤結晶の核形成は、自己-核形成と競合し始め、予想された相分離よりもむしろコートされた結晶の形成につながるように見える。
【００２３】
驚くべきことに、この3流れプロセスは、そのような共沈プロセスにより予想されるような投入チューブの閉塞を伴わずに、長期間操作することができる。有利なことにこのプロセスにより形成された粒子は、全操作サイクルにわたりサイズ、形状及び収量が高度に一貫していることがわかり、これは共沈条件が一定に維持されることを示している。更なる利点は、この流動システムは、無人で何時間も試行することができ、そのような運転は大量の粒子を生産することである。
【００２４】
予め形成された水性混合物が導入されることを必要とする2-流れ装置と比べ、3-流れミキサー装置において水溶液はミキサーへ個別に導入することができるので、大きい利点が生じる。いくつかのこれらの利点は、各溶液は、異なる条件下で保持し、及び異なる組成を有することができるという事実に関連している。例えば生体活性分子溶液は、10℃未満のような低温で保持され、界面活性剤又は他の添加剤のような安定剤を、これらの溶液が一緒にされる場合に可能な濃度よりもより高い濃度で含むことができる。これは微結晶上のタンパク質の質量％負荷が低いことが必要である場合に特に当てはまる。3-流れプロセスに関してこの場合、共沈剤溶液よりもはるかに少ない生体活性分子溶液がミキサーへ導入されることが必要であり、そのため共沈時及び最終粒子中に存在する添加剤及び安定剤の総量は減少されるであろう。
【００２５】
第一及び第二の水溶液の分離も、より効率的に好ましい形態の粒子の形成について最良の条件についてスクリーニングを行い、及び必要な生体活性分子の量を最小化するという利点がある。例えば、生体活性分子の共沈剤に対する比及び水-溶媒比は互いに独立して変動することが可能である。この3系統システムを用い、粒子製造システムを最適化するために必要とされる個別の実験数及び溶液の数を最小化する非常に効率的な要因実験デザインプロトコールを提供することも発見された。従って一部実施要因を使用し、特定の適用のためにあつらえられた特性を有するコートされた微結晶について効率的にスクリーニングすることが可能である。加えて3-流れ法で、生体活性分子溶液を、直接供給された形、例えば供給プロセス又は下流精製プロセスとして使用しても良い。このことは、粒子の共沈及び生成前に操作する溶液の量を最小化するという利点を有する。操作することは、例えば、凝集又は容器もしくはフィルターへの吸着により、生体活性分子の一部を喪失するリスクを増大する。
全体のシステムは、密封され及び滅菌されてもよく、並びに3流れの各々は独立して滅菌フィルターで濾過することができるので、全プロセスは、医薬製剤製造に必要なように無菌で行うこともできる。
【００２６】
典型的には、共沈剤を含有する第一の水溶液は、調製された温度での平衡飽和濃度の30〜250％である、実質的に飽和した又はより高く濃厚な水溶液として調製されてもよい。必要ならば、第一の水溶液は、様々な温度又はpHで貯蔵することができ、及び生体活性分子を含有する第二の水溶液とは異なる添加剤、例えば溶媒を含有することができる。約30℃〜約95℃のような比較的高い温度を使用し、水溶液に溶解した共沈剤の濃度を増加することができ、並びに溶媒の添加を、必要に応じ溶解度を低下又は上昇のいずれかのために使用することができる。共沈剤の最初の濃度は、他の溶液との混合により実現される過飽和度に影響を及ぼし、並びにこれは、得られる微結晶のサイズに影響を及ぼす。例えば肺用製剤により良く適することができる、比較的小さい微結晶に関して、比較的高い初期濃度が一般に必要である。室温飽和限界の約150％である濃度の使用は、20％を上回る粒子サイズの低下につながり得る。これは、細かい粒子画分のような、改善された空気動力学的特性につながる。好ましくはこの共沈剤は、水混和性溶媒を含有する第三の溶液中で、その水溶液よりも実質的により低い溶解度を示すように選択されなければならない。
【００２７】
生体活性分子を含有する第二の水溶液は、水溶液中に溶解される、例えば粉末のような、固形調製物から開始し、調製することができる。あるいは、生体活性分子又は分子の混合物が、溶液又は懸濁液として提供されてもよい。この溶液は、水溶液中の生体活性分子の安定化に適している賦形剤を含有しても良い。このような賦形剤は、当該技術分野において周知であり、並びに界面活性剤、緩衝液、抗酸化剤及び安定剤を含んでよい。第二の水溶液のpHは、第一の水溶液とは異なって良い。このpHは、例えば第一の溶液中よりも、生体活性分子のpIにより近いように選択されて良い。この溶液は調製後、添加前に長期間にわたり、生体活性又は完全性の喪失を最小化する条件下で貯蔵されて良い。このことは、例えば10℃未満又は約4℃でなど、その他の溶液について使用されるものとは異なる温度でのその溶液の貯蔵を必要とすることができる。この溶液は、化学分解を防ぐために、アルゴン、窒素、ネオン及びヘリウムなどの不活性(sterile)大気下で貯蔵することもできる。
【００２８】
共沈剤分子を含有する第一の水溶液及び生体活性分子を含有する第二の水溶液は、例えば実質的に水混和性有機溶媒又は溶媒の水混和性混合物を含有する第三の溶液と混合することができ、ここでこの溶媒又は溶媒混合物は共沈剤溶液と実質的に完全に混和性であるものが好ましい。典型的には、これらの水溶液は、過剰な水混和性有機溶媒に添加される。過剰な完全に水混和性の有機溶媒は、溶媒/水溶液の最終含水量が、一般に約30容量％未満であり、典型的には約10〜20容量％であり、通常は約8容量％未満であるものである。この様式で、有機溶媒は、最初に約0.5〜5容量％未満の水を含むか、又は実質的に無水であることが好ましいが、必ずしも完全に無水ではなくてよい。
【００２９】
生体活性分子に有害に作用しないあらゆる水混和性溶媒を、共沈に使用することができる。典型的水混和性有機溶媒は、例えば、メタノール；エタノール；プロパン-1-オール；プロパン-2-オールなどの短鎖アルコール；アセトンなどのアルデヒド又はケトン、乳酸エチルなどのエステル、テトラヒドロフランなどのエーテル、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、1,5-ペンタンジオール、及び様々なサイズのポリエチレングリコール(PEGS)及びポリオールなどのジオール；又は、それらの任意の組合せもしくは混合物であることができる。一般に医薬製剤の調製に関して、溶媒は無毒であり、クラス3溶媒のように一般に安全と認められ(GRAS)なければならないが、他の用途に関して、アセトニトリルのような溶媒が使用されても良い。
【００３０】
ある状況において、水溶液の添加時の2成分の互いの沈殿を確実にするために、有機溶媒は、生体活性分子で予め-飽和されるか、及び／又は共沈されてよい。このことは、溶媒への材料の喪失を低下し、及び粒子当たりに負荷する生体活性分子の制御をもたらし、その結果用法(dosage)がより容易になる。溶媒の選択は、異なるサイズ又は形状の微結晶につながり得る。これは、結晶へのタンパク質の結合効率にも作用することができる。
コーティングは、アジュバント、もしくはベクターとして、又は生体活性分子の生体利用性を変更するために、ナノ粒子を含むこともできる。ナノ粒子又はそれらの前駆体は、有利なことに第一の水溶液及び／又は第三の溶媒中に含まれ、共沈前にはそれらを生体活性分子から分離することができる。ポリマー、生体分子並びに有機及び無機物質から作製された適当なナノ粒子が、当該技術分野において公知である。
【００３１】
用語「混合された」は、水混和性有機溶媒及び水溶液が、非常に迅速に一緒にされるか又は互いに攪拌されるプロセス工程を意味することは理解されなければならない。これは、著しい微結晶成長が生じる前に混合チャンバーから駆出されるほぼ均質な混合物を提供することが好ましい。従って極めて迅速に結晶化する共沈剤は、3-流れ連続流混合装置における使用に適さず、その理由はこの混合チャンバー内では、結晶成長が著しいことがあるからである。これは、共沈剤及び生体活性分子の粒子融合及び／又は個別沈殿が好ましい。迅速に結晶化する共沈剤は、例えばイオン塩であることができる。
【００３２】
典型的には、共沈剤分子を含有する第一の水溶液及び生体活性分子を含有する第二の水溶液の混合は、生体活性分子及び共沈剤の連続水性流れが、はるかに多い容量の水混和性有機溶媒を含有する第三の溶液と一緒に混合されるプロセスにおいて生じることができる。混合装置から流出する一緒にされた混合物は、典型的には約75容量％よりも多い溶媒、好ましくは約85容量％よりも多い溶媒、最も好ましくは約90〜約99.5容量％の溶媒を含む。水混和性溶媒流れは、水約5容量％未満を含み、及び／又は共沈を補助するために、共沈剤で実質的に飽和される。
有利なことに、これらの微結晶は、大気圧を含む様々な圧力で維持された保持容器を用い、溶媒中の懸濁液として収集される。
【００３３】
周囲に近い条件下での連続プロセスの試行は、噴霧乾燥又は超臨界流体プロセッシングなどの医薬用途のための粒子形成の従来の方法と比べ、低い資本コスト及び操作経費につながることができる。例えば大量の生体活性分子でコートされた粒子は、産業規模でのこの方法で作製され得ることが想定される。
【００３４】
連続共沈法において、第一のポンプは、共沈剤分子を含有する第一の水溶液を連続して送達し、第二のポンプは、生体活性分子を含有する第二の水溶液を連続して送達し、及び第三のポンプは、水混和性溶媒を含有する第三の溶液を連続して送達することができる。更にポンプは、コーティング化合物又は架橋化合物又はポリマーなどの追加成分が導入されることが必要である場合に使用することができる。微結晶の形成が妨害されないように、そのような複数の溶液を、第一のものに連続して連結された第二の混合装置を介して導入することが必要なことがある。チューブの長さは、微結晶形成が完了又は妨害されたことを確実にするために変更することができる。コーティング又は架橋を使用し、微結晶により示される溶解度、生体活性及び生体利用性を変更することができる。あるいは、生体活性分子溶液は、第一の混合装置中で過剰な溶媒と混合され、その後この混合物は、第二の混合装置へポンプ送達され、共沈剤と混合されるか、又はそうでなければ共沈剤溶液が、第一の混合装置中の過剰な溶媒と混合され、その後この混合物は、第二の混合装置へポンプ送りされ、生体活性分子溶液と混合されてよい。これらの交互の混合様式を用い、粒子のサイズ及び／又は形成された微結晶への生体活性分子の結合効率を制御することができる。これらのポンプは、いずれか適当な型であってよいが、溶液を規定された流量で精密かつ正確に送達しなければならず、並びに使用される生体活性分子と適合性がなければならない。都合の良いことに、HPLCポンプなどは、流量の範囲を上回る水溶液及び水混和性溶媒の送達について最適化されるので、これらを使用することができる。2種の水溶液の相対流量は負荷に影響を及ぼすので、これが定数を維持することを確実にするために、これらのポンプは、パルス-レスに近い(near)運転を示すことが好ましい。あるいは、蠕動型又は遠心型ポンプも、同じく水性流れ及び溶媒流れを正確に送達するために使用することができ、並びに清掃コストが低く及び清掃が容易であるので、これらを使用することができる。流量、清掃及び溶媒相溶性の差のために、異なる入り口の流れを送達するために異なる型のポンプを使用することは有利であることがある。
【００３５】
典型的にはこれらの水溶液は、流量約0.1ml/分〜約1000ml/分で送達することができる。スクリーニング用途のためには、水溶液は、流量約0.2ml/分〜約20ml/分で送達されることが好ましく、並びに水溶液製造のためには、典型的には約2ml/分〜約1000ml/分、好ましくは約5ml/分〜約1000ml/分で送達される。水性ポンプのヘッド及びラインは、生体活性分子による汚れに抵抗性がある材料で製造されて良い。水混和性溶媒は、一般に水溶液よりも約4〜100倍速く送達され、及び必要な正確さはより少なく、そのため遠心型ポンプなどのより強力で/効率的なポンプが必要である。典型的には溶媒は、ほぼ約2ml/分〜約20,000ml/分で送達され、スクリーニング用途のためには、好ましくは約2ml/分〜約200ml/分で送達される。製造のためには、溶媒は、好ましくは約20ml/分〜約20,000ml/分で、より好ましくは約500ml/分〜約20,000ml/分で送達される。
【００３６】
混合装置は、沈殿がほぼ即時に生じ始めるよう、第一及び第二の水溶液の2連続水性流れの、水混和性溶媒流れを含有する第三の溶液の連続流との、迅速かつ密な混合のための方法を提供してよい。
この混合装置は、これら3種の溶液の急速混合を実現するいずれかの装置であってよい。従ってこれは、例えば、同軸、T-型、Y-型又はより複雑な幾何学的配置による、入ってくる液体流動パターンの造形/組合せ又は衝突により操作する静電装置、又はそうでなければ3種の液体流れを一緒にもしくはそうでなければ組合せて勢いよく攪拌する動的装置であることができる。動的装置において、3種流れの攪拌は、攪拌、音波処理、振盪などの様々な手段の使用により実現することができる。攪拌法は、パドル攪拌機、スクリュー及び磁気攪拌機を含む。磁気攪拌が使用される場合、例えば単純な棒状又はマルタ十字架のような様々な外観を伴う様々な撹拌子を使用することができる。混合装置の内側の裏当ての材料は、生体活性分子又は粒子のその上への著しい結合を防止するように選択されることが好ましい。適当な材料は、医療用ステンレス鋼、チタン、ガラス、シリコーン及びテ流れン(登録商標)を含むことができる。
【００３７】
あるいは、この混合装置は、第一又は第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合させ、その後第一又は第二の水溶液のいずれかの残りを添加することができる。
混合装置は、必要とされる生産規模に応じ、異なるサイズ及び幾何学的配置で作製することができる。必要とされる混合チャンバーのサイズは、溶媒流れの流量の関数である。水溶液の約0.025〜10ml/分及び溶媒の約2.5〜200ml/分の流量については、約0.2mlの混合チャンバーを使用することは都合がよい。より高い流量に関して、約1.0〜10.0mlのような、それに比例してより大きい混合チャンバー又は装置が好ましい。
【００３８】
典型的には、連続プロセスにおいて、生体活性分子溶液及び共沈剤溶液が、過剰な水混和性有機溶媒へ添加される。これは、比較的小さい容積の水溶液が、比較的大きい容積の過剰な有機溶媒へ添加されることを必然的に伴い、その結果生体活性分子/共沈剤溶液から、有機溶媒への水の急激な希釈が生じ、これは生体活性分子の急激な脱水及び微結晶の形成を伴う。
沈殿を実行することができる温度は、変動することができる。例えば水溶液及び溶媒は、加熱されるか又は冷却されるかのいずれかであってよい。生体活性分子溶液及び有機溶媒の冷却は、生体活性分子が脆弱である場合に有用である。あるいは、溶媒及び水性混合物は全て異なる温度であってよい。例えば、溶媒を室温で及び生体活性分子を低温、例えば約10℃未満で維持しながら、高い共沈剤濃度を実現するために、共沈剤溶液を加熱することが好ましいことがある。必要ならば溶媒は、水性混合物の氷点以下の温度で維持されてよい。更に圧力も変動することができ、例えば比較的高い圧力が、溶媒の揮発を低下するために有用であることがある。
【００３９】
生体活性分子/共沈剤溶液の過剰な水混和性有機溶媒への混合時に、生体活性及び共沈剤の共沈は迅速に生じる。典型的には約1〜5分間くらいのプライミング期間(priming period)の後、ミキサーを出る混合物は、3種の流れが一緒になった後約30秒未満で、最も典型的には約10秒未満で、微結晶の存在のためにわずかに不透明となり始める。必要ならば、結晶種法を使用し、混合装置をプライミングすることができる。例えば、これらの流動は一時的に停止され、その後再開される。
【００４０】
沈殿した粒子は、必要ならば、無水であるか又は少量の水を含んでよい新鮮な有機溶媒ですすぐことにより、更に脱水される。好ましくは含水量0.5〜8％の溶媒が使用される。この範囲内で、生体活性分子は、有利なことにより高い生体活性を保持することが多い。すすぎは、共沈剤中で飽和した残存する溶媒を除去するためにも有用である。この残留物の乾燥時に、共沈剤は、そうでなければ、凝集塊の形成につながる粒子を互いにセメント化するために利用される。乾燥又は貯蔵前の賦形剤溶液によるすすぎが、他の賦形剤を粒子上に導入するためにも使用される。
【００４１】
有利なことに、沈殿された微結晶は、有機溶媒中に貯蔵することができること、及び生体活性分子は長期間にわたり極めて良好な活性の保持及び安定性を示すことがわかった。更に有機溶媒中に貯蔵された沈殿された生体活性分子は、典型的には細菌による攻撃に抵抗性があり、従ってそれらの貯蔵寿命が延長される。
共沈物が沈降する時には、過剰な溶媒をデカントすることにより、微結晶の濃厚な懸濁液の容易な回収が可能である。しかし沈殿した粒子をより迅速に回収するために、共沈物に、例えば遠心及び／又は濾過が供されても良い。風乾、真空乾燥又は流動床乾燥のような、当該技術分野において公知の従来の乾燥手法を使用し、残存する溶媒を蒸発させ、溶媒非含有微結晶を残すことができる。
【００４２】
あるいは溶媒は、HFA-134aのようなヒドロフルオロカーボンなどの圧縮ガス又は超臨界CO2のような超臨界流体を使用する乾燥法において、微結晶から除去されてもよい。典型的には3流れ連続プロセスにおいて調製された溶媒中の微結晶は、圧縮ガス又はCO2のような超臨界流体と共に高圧チャンバーへ負荷され、溶媒(又はできる限り多量の)が除去されるまで、この懸濁液を貫流することができる。HFA-134a又はHFA-227のようなヒドロフルオロカーボンの圧縮ガスは、共沈物溶媒(coprecipitant solvent)を溶解し、及びその濃度が必要なレベルに達するまで貫流することができる。その後圧力は解放され、乾燥粉末又はそうでなければ懸濁液としてのHFA中に残存する粒子を提供する。ヒドロフルオロカーボン中の生体活性にコートされた(bioactive coated)微結晶の懸濁液は、反復投与用吸入装置(MDI)に適している。この技術は、事実上全ての残留溶媒を微結晶から除去する。残留溶媒は予想外の生理的作用につながることがあるので、このことは特に医薬製剤にとって恩典がある。懸濁液の圧縮ガス又は超臨界流体の乾燥の更なる利点は、これは他の単離技術により得られるものよりも、はるかに低いバルク密度を有する粉末及び医薬製剤を製造するために使用することができることである。典型的には約0.1g/mlよりも低いバルク密度を得ることができる。低バルク密度製剤は、一般により少ない強力に結合した凝集塊を含むので、これらは、生体活性分子の肺送達に特に有用である。臨界点乾燥又は圧縮ガス抽出は、当該技術分野において公知の多くの様々な方法で実行することができる。
【００４３】
従って、第一の局面に従い微結晶及び事実上他の型の粒子を形成し、その後圧縮ガス又は超臨界CO2のような超臨界流体を使用しこれらの粒子を乾燥するために、連続共沈システムを設定することが可能である。
医薬用途に関して、乾燥沈殿した粒子(すなわち微結晶)は、典型的には使用前に無菌条件下で、無菌の送達装置又はバイアルへ導入されてよい。あるいはこれらの粒子は、無菌条件下で、溶媒中の懸濁液として無菌の送達装置又はバイアルへ移されてよい。これらはその後、任意に例えばHFA又は超臨界CO2乾燥を用い、現場で乾燥されてよい。
【００４４】
本願明細書に説明された方法は、水溶液中に存在する有機可溶性成分を、生体活性分子から分離させることもできる。除去されることが必要である典型的成分は、緩衝剤、界面活性剤、疎水性生体分子、例えば脂質もしくはリポタンパク質及び変性剤を含む。例えばその遊離塩基型でエタノールのような有機溶媒中に溶解するTrisのような緩衝液は、沈殿時に生体活性分子から分離することができる。しかし、水溶液又は有機溶媒への別の有機可溶性塩基の添加により、この緩衝剤を遊離塩基に転換することは必要である。従って本発明は、望ましくない成分を、生体活性分子から除去し、その結果望ましくない成分は、生体活性分子と共沈せず、そのため有機相に溶解し続けるような効率的な連続法も明らかにしている。これは、非-吸湿性のコートされた粒子の生体活性分子沈殿前の、水性溶媒又は有機溶媒中の酸、塩基、イオン-対形成剤及びキレート剤などの添加剤の包含により実現することができる。従ってこの生体活性分子は、高純度型でコートすることができる。
【００４５】
本発明において説明された製剤は、典型的には多くの用量強度で作製することができる。この用量は都合がよいことに、粒子あたりの生体活性分子の質量パーセントを約0.1質量％未満から最大約50質量％まで変えることにより、変動することができる。3-流れ連続流沈降分離装置を使用することの特有の利点は、生体活性分子の負荷を容易に変動することが可能であることである。これは特に、通常の緩衝された水溶液中で高い溶解度を有するが、共沈剤の存在下ではやや溶けにくい生体活性分子についてあてはまる。例えば混合による出発よりもより高い負荷が達成可能であるように、共沈剤の濃厚な溶液を、ミキサーへ、生体活性分子のそれよりも遅い速度で導入することは可能である。この担体溶解度は、約50質量％から約1質量％未満又は約＜0.1質量％未満さえもの負荷で、生体活性分子を含有する粒子を生成する可能性を提供することができ、その結果都合がよいことにその医薬製剤の用量強度は変動することができる。水溶液中の室温での担体溶解度は、約2〜200mg/mlの範囲であり、より好ましくは約10〜150mg/mlの範囲であることができる。
【００４６】
高負荷生体活性分子コートされた微結晶は、生体活性分子を濃縮する簡便な方法を提供する。従って低溶解度の共沈剤により作製された微結晶は、共沈剤の溶解度限界を著しく上回るようなレベルで、水溶液中に高濃度で懸濁することができる。表面上の生体活性分子は、水へ連続して溶解することができ、濃厚な溶液を生成し、これは、残りのコア微結晶から容易に分離することができる。グルタミンは、水溶液中のその低い溶解度のために、このプロセスの好ましい共沈剤である。例えば約20質量％負荷のグルタミンの微結晶は、5mg/ml生体活性分子溶液を用いて調製され、その後水溶液中のこれらの結晶の約125mg懸濁液が、飽和グルタミン溶液中のおよそ25mg/mlの生体活性分子を作成し、これは約5倍の濃縮工程に対応している。この種のプロセスを使用し、生体活性分子濃度の約2〜20倍の増加を得ることが可能である。これは、限外濾過又は凍結乾燥などの他の濃縮技術に勝る、経費及び時間の利点を提供することができる。
【００４７】
高流量ミキサーにより、約160mg/ml未満又は好ましくは80mg/ml未満の共沈剤濃度は、自由流動粒子を含有する医薬製剤を作製するために有利に使用することができる。これらの粒子は典型的には、狭いサイズ分布を有し、平均粒子サイズは約50μm未満である。より高い濃度は、より高い温度で使用することができる。狭いサイズ分布のコートされた結晶を含有する製剤は、改善された送達再現性を提供し、その結果より良い臨床成績を提供する。
【００４８】
説明された医薬製剤は都合のよいことに、それらを含んだ無菌環境中で混合する前に、水溶液及び有機溶液を約0.2ミクロンフィルターを通し予備-濾過することにより、無菌型で製造することができる。医薬製剤は、有害な残存溶媒を実質的に非含有でなければならず、及び本発明は典型的には、従来の乾燥手法に従い、約0.5質量％未満のクラス3溶媒を含有する散剤を提供する。実質的により低い溶媒レベルは、真空乾燥又は風乾により、並びに無水の水混和性及びCO2混和性溶媒中の微結晶の懸濁液を通る圧縮ガス又はCO2などの超臨界流体の流れにより、得ることができる。
【００４９】
本方法は、典型的生体活性巨大分子よりもはるかに小さい水溶性生体活性化合物を使用し、医薬製剤に適した生体活性分子でコートされた微結晶を作製するために使用することもできる。これらの製剤は、バッチプロセス又は連続プロセスのいずれかにより作製することができ、並びに有利なことに非-吸湿性担体、例えばD,L-バリンを使用することができる。硫酸トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン及びカナマイシンなどのアミノ配糖体をベースにした抗生物質、又はノビスピリン(novispirin)及びプレクタシンなどの抗菌ペプチドを含有する水溶性生体活性薬物を使用しても良い。好ましくは、この生体活性分子は、極性があり、及び共沈に使用されるpHでイオン化することができる1個又は複数の官能基を含むことができる。この生体活性分子は、結晶時にコア材料により形成された単位セルよりも大きい最大寸法を有することも好ましい。これは、生体活性分子でコートされた微結晶の形成に好ましく、及び結晶格子内に生体活性分子が包接(inclusion)される可能性を最小化する。
【００５０】
コートされた微結晶の物理特性並びに更には生体活性分子の生体活性及び生体利用性も潜在的に変更する多くの異なるパラメータを変更することができることは、先の説明から明らかである。
本発明の第二の局面に従い、1種又は複数の微結晶を含む粒子を含有する医薬製剤が提供され、ここで微結晶は：
(a)共沈剤分子から形成される実質的に非-吸湿性の内部結晶コア；及び
(b)1種又は複数の生体活性分子を含有する外側コーティング；を含み、
ここで、コートされた微結晶は、共沈剤分子を含有する第一の水溶液、生体活性分子を有する第二の溶液、及び水混和性溶媒を含有する第三の溶液を実質的に同時に混合するか；又は、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合し、その後第一及び第二の水溶液のいずれかの残りと混合する；ことによる、単独の連続プロセスにおいて形成される。
【００５１】
本願明細書において実質的に非-吸湿性とは、結晶コアは、容易に溶解されず、湿潤であり続けることを意味する。典型的には、これらの粒子は、凝集しないばかりか、このコアは、室温で相対湿度約50％以上及び好ましくは相対湿度約80％以上に曝された場合に形態又は結晶化度に著しい変化も受けないであろう。
【００５２】
結晶コアは、構成分子又はイオンが、粉末X線回折により同定することができる反復する対称の固体(solid)の3-次元結晶格子へ組織化されることを意味する。典型的には良く定義された融解吸熱(すなわちガラス転移ではない)を、示差走査熱量計(DSC)において、粒子の加熱時に認めることができる。これは、結晶化度を示す周知の特性であり、同じく結晶コアは一般に室温及び周囲湿度で熱力学的に安定している実質的に固体状態相で構成されることも示す。
【００５３】
連続プロセスは、結晶コアを提供する分子及び外側コーティングを提供する生体活性分子が、コートされた粒子の形で一緒に直接溶液から沈殿することを意味する。これは、予め形成された結晶が処理され、その後コーティング材料に曝される鋳型法とは明らかに異なる。この単独工程プロセスは、分離コーティング又は摩砕工程の必要性がないことを意味する。粒子形成には、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥を生じるような、いかなる蒸発プロセスも必要ないことも理解されるべきである。実質的に類似した密度の完全に混和性の通常の溶媒の混合物内で粒子形成が生じる超臨界流体も必要ではない。
【００５４】
これらの粒子は、例えば疾患の存在を検出するキット型のような、治療的又は診断的方法のような医療用途で使用することができる。これらの粒子が肺へ送達され、及び肺の能力(capacity)/有効性が試験される場合には、肺癌、肺炎、気管支炎などの肺疾患を含む疾患、又は疾患の原因物質が、同定される。これらの粒子は、獣医学的用途で使用されてもよい。
【００５５】
典型的には生体活性分子のコーティングは、実質的に連続してよい。あるいは、生体活性分子で実質的に不連続コーティングされた粒子を含む医薬製剤を有することが有利であることがある。このコーティングは、厚さも変動することができ、これは約0.01〜1000μm、約1〜100μm、約5〜50μm又は約10〜20μmの範囲であることができる。生体活性分子のコーティングは、連続又は不連続であってよい。
医薬製剤は、狭いサイズ分布を有する粒子を含むことが望ましい。従って典型的にはこの医薬製剤は、著しい数の粒子が、全般に同じ又は同様のサイズを有する実質的に均質な系を含むことができる。
【００５６】
連続プロセスにより生成された微結晶及び生体活性分子でコートされた微結晶は、スパン(Span)が2未満、好ましくは1.8未満及びより好ましくは1.5未満の動的レーザー光散乱により評価された場合に、典型的には狭いサイズ分布を示す。共沈により生成された生体活性分子でコートされた微結晶は、典型的には有利なことに純粋な担体材料の沈殿により生成された微結晶よりもより小さい。これは、微結晶表面上の生体活性分子のコーティングと矛盾しない。スパン値は、以下のように計算される。
d(0.1)(μm)＝粒子の10％は、この粒子サイズを下回る。
d(0.5)(μm)＝粒子の50％は、この粒子サイズを上回る及び下回る。
d(0.9)(μm)＝粒子の90％は、この粒子サイズを下回る。
スパン＝d(0.9)−d(0.1)／d(0.5)。
これらの粒子は、最大断面寸法約80μm未満、このましくは直径で(across)約50μm未満、又はより好ましくは約20μm未満を有する。最大断面寸法は、正反対の位置の間で測定可能な最大距離を意味する。
【００５７】
結晶コアを作製する分子は、典型的には各々分子量約2kDa未満を有する。好ましくは、結晶コアを作製する分子は、各々分子量約1kDa未満を有する。より好ましくは、結晶コアを作製する分子は、各々分子量約500Da未満を有する。好ましい分子は、迅速に核形成され、沈殿しながら結晶を形成することができるものである。従って実質的に非晶質凝集塊又はガラスからなる粒子を提供する分子は、コア材料として一般に適していない。
【００５８】
典型的には、結晶コアを形成する分子は、周囲温度で水への溶解度約150mg/ml未満、及び好ましくは約80mg/ml未満を有する。驚くべきことに、本発明者らは、これらの値未満の溶解度の分子は、改善された流動特性を伴う結晶を生成する傾向があることを発見した。自由流動粒子は、例えば正確な用量のカプセル充填を促進し、及びコーティングのような更なる操作に都合良く使用することができるので、これらは一般に、多くの製薬法について好ましい。自由流動粒子は一般に一定のサイズ及び寸法であり、低い静電荷を有する。高いアスペクト比の針状結晶は、例えば一般に自由流動ではなく、従ってある種の製剤においては好ましくない。
【００５９】
結晶コアを作製する分子は、例えば、アミノ酸、両性イオン、ペプチド、糖質、緩衝成分、水溶性薬物、有機塩及び無機塩、強力に水素結合した格子を形成する化合物、又はそれらの誘導体もしくはいずれかの組合せであってよい。典型的には、これらの分子は、レシピエントへの投与後の有害な生理的反応を最小化するように選択される。
【００６０】
結晶コアの形成に適したアミノ酸は、天然又は非天然、及び純粋なエナンチオマー又はラセミ体の形であってよい。例は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、D-バリン、L-バリン、D,L-バリン混合物、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びセリン、タウリン又はそれらのいずれかの組合せを含む。特にL-グルタミン、L-ヒスチジン、L-セリン、L-メチオニン、L-イソロイシン、タウリン、L-バリンまたはD,L-バリンが、好ましい。共沈条件下で実質的にイオン化する側鎖を有するアミノ酸について、低溶解度の結晶塩を生成し及び非-吸湿性である対イオンを使用することが好ましい。結晶コアを形成するその他の分子及び塩の例は、α-乳糖、β-乳糖、マンニトール、炭酸水素アンモニウム、グルタミン酸ナトリウム、リン酸アルギニン及びベタインを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
典型的には、結晶コアを形成する分子は、水中で低溶解度、例えば約25℃で約12〜150mg/ml及び好ましくは約20〜80mg/mlを有する。水中で約150mg/mlを上回る溶解度の分子は、これらが飽和以下の水溶液から共沈するという条件で、自由流動粒子を得るために使用することもできる。好ましくはこれらは、濃度約150mg/ml又はそれ未満で、より好ましくは約80mg/ml又はそれ未満で共沈される。25℃で水溶解度の高い分子について、約10℃又は約4℃のようなより低い共沈温度を使用することも利点であり、その結果それらは濃度150mg/ml又はそれ未満で飽和により近くなる。同様により高い温度、例えば35℃又は50℃を、25℃でやや溶けにくいコア形成分子の共沈に使用することができる。
【００６２】
結晶コアを形成する分子は、約90℃よりも高い、例えば約120℃を上回る、好ましくは約150℃を上回る融点を有する。高融点を有することは、形成された結晶が、高い格子エネルギーを有することを意味する。高い格子エネルギーは、形成された粒子が表面上にコートされた生体活性分子を伴う結晶コアを有する可能性を増大し、粒子の非晶質含量を最小化する傾向があるであろう。非晶質物質を含む粒子は、高湿又は高温に曝された場合に物理特性の望ましくない変化を受け、このことは医薬製剤には望ましくない生体活性及び溶解度の変化につながり得る。従って高融点の粒子を生じる共沈剤は、より安定した医薬製剤を形成する傾向があるので、これらを使用することは利点である。高融点の共沈剤は一般に、低下した水への溶解度も有し、そのことは好ましい濃度範囲内の共沈に一層適している。
例えば硫酸カリウムなどの無機塩のように、極めて迅速に結晶化する共沈剤は、3系統プロセスにおける使用に適してはいない。
【００６３】
都合の良いことに、結晶コア上のコーティングを形成する生体活性分子は、例えば医薬原体(API)のような治療作用又は診断作用を生じることが可能ないずれかの分子から選択されても良い。治療作用は、ヒト又は動物の体の何らかの障害又は機能不全に罹患している症状を治癒、緩和、除去もしくは軽減するか、又は罹患を予防もしくはその可能性を低下するかのいずれかの作用を意味し、従って予防作用を包含している。
生体活性分子のコーティングは、医薬製剤において通常使用される賦形剤、例えば安定剤、界面活性剤、等張剤及びpH/緩衝剤なども含むことができる。ワクチンの場合、生体活性分子コーティングは、水への溶解度を低下し及び免疫応答を増強するために存在する、架橋剤分子及びアジュバントも含むことができる。
生体活性分子は、例えば薬物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、糖質、ワクチン成分、又はそれらのいずれかの誘導体もしくは複合体、又は治療作用を生じる任意の組合せであることができる。
【００６４】
生体活性分子の例は、抗炎症薬、抗癌薬、抗精神病薬、抗菌薬、抗真菌薬；天然又は非天然のペプチド；タンパク質、例えばインスリン、α1-アンチトリプシン、α-キモトリプシン、アルブミン、インターフェロン、抗体、Fc-融合タンパク質などの融合タンパク質、タンパク質-薬物複合体；天然の給源又は合成のオリゴヌクレオチド及びアンチセンスヌクレオチドに由来した、遺伝子断片、プラスミド、DNA、RNA又はRNAiなどの核酸；単糖、二糖又は多糖などの糖質；プラスミド；並びに、タンパク質/ペプチド-薬物複合体、例えば抗体断片(Fc断片-薬物複合体など)などの薬物を含むが、これらに限定されるものではない。適当な薬物は、例えばカプレオミシン(capreomcin)のような結核に対する活性物質であることができる。
【００６５】
本発明の生体活性分子は、薬物又は他の適当な活性生体分子が、タンパク質/ペプチドに、例えばタンパク質/ペプチド及び薬物上の反応基を介して、共有結合のような適当な結合により複合されている、タンパク質-ペプチド-薬物複合体の形であることもできる。当業者は、そのような複合体を合成する当該技術分野において公知の技術を周知している。そのような複合体のタンパク質/ペプチド成分は、例えば当該技術分野において公知のTAT又はCharriotなど、細胞への侵入を促進するようにデザインされてもよい。細胞への侵入を促進するその他のペプチドは、例えば国際公開公報第01/41811号、米国特許第5,807,746号及び国際公開公報第99/05302号に開示されており、これらは本願明細書に参照として組入れられている。肺の中心領域への能動取り込みを促進するために特に好ましいペプチドは、抗体分子、特にIgGのFc断片、又は他の抗体断片を基にすることができ、これらは肺中心へ能動的に輸送されることが示されている。同様に、ナノ粒子へ複合された生体活性分子を、同様の方法で使用することができる。
【００６６】
核酸は、例えば一旦レシピエントへ導入されると、発現されることが可能である。従って核酸は、核酸の発現を制御するための適当な調節制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど)を含むことができる。この生体活性分子は、例えばPEG-タンパク質のように、天然又は合成の治療的物質の化学的に修飾された誘導体であることもできる。
この核酸は、プラスミド、ファージミド又はウイルスベクターのようなベクター内に含まれてもよい。当業者に公知のいずれか適当なベクターを使用することができる。
【００６７】
ワクチンコーティング成分は、例えば病因物質の抗原性成分、例えばジフテリアトキソイド及び／又は破傷風トキソイドのような細菌又はウイルスを含んでよい。そのようなワクチン製剤に特有の利点は、それらは概して、高温に曝された場合に、従来の液体調製物と比べて安定性の大きい増強を示すことである。本発明に従い調製されたそのような製剤は、例えば、45℃よりも高い温度に48時間曝すことができ、in vivo試験した場合に、免疫応答を誘起するそれらの能力を維持するのに対し、標準の液体試料は、概して完全に失活することが認められる。高温安定性を示すワクチンは、冷蔵する必要がなく、従って貯蔵に関するかなりの経費削減を提供し、特に開発途上国における配布を容易にする。ワクチンは、ウイルス、真菌、原虫、アメーバ及び細菌による感染などを含む、病原性微生物により引き起こされる感染症の予防及び／又は治療に有用である。本発明に従い調製することができるワクチン製剤の例は、ジフテリア、破傷風、ペスト、炭疽菌ポリオ、百日咳並びにA型、B型及びC型肝炎、HIV、狂犬病及びインフルエンザを含むが、これらに限定されるものではない、サブ-ユニット、弱毒化された又は不活化された生体ワクチンである。
【００６８】
ジフテリアトキソイドでコートされたD,L-バリン又はL-グルタミン結晶のような、ワクチンでコートされた微結晶の製剤は、広範な異なる条件下で貯蔵することができ、引き続きの再構成及び接種は、強力な一次及び二次免疫応答を誘起することが認められる。あるいはワクチンでコートされた結晶は、非経口、肺及び鼻腔投与を含む、多くのその他の経路による、レシピエントへの送達のための乾燥散剤として製剤することができる。肺送達は、非常に幼い小児にとって特に効果的である。
【００６９】
本発明の粒子は、HiB(インフルエンザ菌(haemopholis influenza)B)及び肺炎球菌のワクチンのようなタンパク質に連結した多糖、並びにムンプス、はしか及び狂犬病などの生ウイルスワクチンの投与にも適用することができる。本発明の粒子は、現代の流感(modern flu)のワクチン成分、例えばMV Aベクター化されたインフルエンザワクチンなどと共に調製することもできる。
【００７０】
加えて、ワクチン成分でコートされた微結晶は、癌、特にメラノーマ；皮膚癌；肺癌；乳癌；結腸癌及び他の癌を含む、ヒト癌のために開発されたワクチンの製剤に有用であることができる。本願明細書に説明された肺用製剤は、肺癌の治療に特に適している。タンパク質ベースのワクチン(すなわち内側の実質的に非-吸湿性結晶コア上にコートされたタンパク質/ペプチド成分)に加え、核酸ベースのワクチン製剤も、本発明に従い調製することができ、ここで核酸分子は、内側の実質的に非-吸湿性結晶コア上にコートされていることは注目されなければならない。
【００７１】
有利な特性を有することがわかっている非-吸湿性のコートされた粒子の例は、粒子が、D,L-バリンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-グリシンの結晶コア及びアンチトリプシンのコーティング、グルタミン酸ナトリウムの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-メチオニンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-アラニンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-バリンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-ヒスチジンの結晶コア及びインスリンのコーティング；L-グリシンの結晶コア及びα-アンチトリプシンのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びアルブミンのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びオリゴヌクレオチドDQA-HEXのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びα1-アンチトリプシンのコーティング、更にN-アセチルシステインの抗酸化剤外側コーティング；D,L-バリンの結晶コア及びオボアルブミンのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びオボアルブミンのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；D,L-バリンの結晶コア及びジフテリアトキソイドのコーティング；L-グルタミンの結晶コア及び破傷風トキソイドのコーティング；D,L-バリンの結晶コア並びにジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドの混合物のコーティング；L-グルタミンの結晶コア並びにジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイドの混合物のコーティングを伴うものを含む。
【００７２】
典型的には、よく管理された条件下で形成された粒子のバッチは、全てが実質的に同じ形態又は結晶形を示し、並びに狭いサイズ分布を有するような、個々の微結晶で構成される。これは都合がよいことに、SEM画像で観察し、粒子サイズ測定により検証することができる。本発明の微結晶は、典型的には最大断面寸法及び最大寸法約80μm未満を有する。好ましくはこれらは、最大断面寸法約40μm未満を、より好ましくは20μm未満を有する。約0.5〜約20μmの最大断面寸法を持つ粒子が、最も好ましい。あるいは同様のサイズの微結晶の球形凝集塊の自由流動散剤が、最大断面寸法約50μm未満及び好ましくは約20μm未満で形成されてもよい。好ましい共沈剤と共に形成された粒子の注目すべき局面は、それらのサイズ及び形態は、最大約80％RHなどの高い湿度に曝された際に、実質的に一定であり続けることである。加えてそれらの自由流動特性及び空気動力学的特性は、再乾燥時に維持することができる。
【００７３】
核粒子上にコートされた生体活性分子の量は都合が良いことに、共沈前の最初の水溶液中の生体活性分子のコア分子に対する比の変化により、変動することができる。典型的にはこの生体活性分子は、各々のコートされた微結晶の約0.1質量％〜約50質量％を形成するであろう。より好ましくは、粒子中の生体活性分子の負荷は、約1質量％〜約40質量％であろう。
【００７４】
典型的には、生体活性分子の少なくとも一部は、例え高い湿度に曝された後であっても、高いレベルの活性を維持する。
典型的には非-吸湿性のコートされた粒子は、高温に曝された際に安定しており(すなわち、実質的にそれらの生体活性を維持する)、最高約60℃で1週間よりも長く安定であることができる。このことは、貯蔵を助け、及び非-吸湿性のコートされた粒子から形成された医薬製剤は、例え冷蔵条件下でなくとも、長期の貯蔵寿命を有すると予想することができる。
典型的には非-吸湿性のコートされた粒子のコア材料は、最大約80％の相対湿度で、水を約5質量％未満及び好ましくは約0.5質量％未満吸収するであろう。生体分子を含有する粒子は、典型的には、負荷に応じてより高い質量％の水を吸収するであろう。
【００７５】
典型的には、結晶コア上にコートされた生体活性分子は、未変性の又はほぼ未変性の立体配置を維持する、すなわち生体活性分子は、製造プロセス期間中には不可逆的に変性されない。有利なことに結晶コア上の生体活性分子のコーティングは、周囲温度又は高温での粒子の貯蔵時の安定性の増強につながることもわかっている。例えば典型的にはこの生体活性分子は、水性媒体中で再構成された場合に、その生体活性のほとんどを維持することができる。好ましくは、生体活性分子は、25℃で6ヶ月間貯蔵した後に、その最初の生体活性を約50％よりも多く維持するであろう。より好ましくは、生体活性分子は、その生体活性の約80％よりも多く、最も好ましくは約95％よりも多い生体活性を維持するであろう。
【００７６】
説明された細かい自由流動粒子又は懸濁液は、典型的にはガラスバイアルの壁には接着しない。これらの粒子は典型的には、水、水溶液(再構成に通常使用されるもののような、緩衝液及び塩を含む)又は他の生理的溶液中に、迅速かつ完全に再溶解する。乾燥散剤又は懸濁液の完全な再溶解は、一般に約2分以内に、好ましくは約60秒以内に、及び最も好ましくは約30秒以内に生じるであろう。水性緩衝液中に再構成された製剤は、典型的には、約15FNUよりも良い、及び好ましくは約6FNUよりも良い透明度を有する、低い濁度の、無色の溶液である(FNU＝フォルマジン濁度)。あるいは、本共沈剤の飽和水溶液中の微結晶の懸濁液は、解離速度を遅延するために使用することができる。
【００７７】
一般に生体活性分子は、緩衝化合物、塩、糖質、界面活性剤、抗凝集剤及び抗酸化剤などの、水溶液中に溶解した場合に、賦形剤又は安定剤が存在することを必要とする。これらは、出発水溶液中に含まれ、及び共沈プロセス時に粒子へ組み込まれてよい。その後これらは、例えば医薬製剤としての粒子の再構成時に存在するであろう。典型的には、全ての成分の共沈後、賦形剤は、粒子の外側表面上に濃縮され、及び生体活性分子のコーティングへ浸透するであろう。典型的抗酸化剤は、例えばN-アセチルシステインの形などのシステインであり、他方で典型的界面活性剤はTweenであることができる。共沈の期間中に、賦形剤の生体活性分子に対する相対比は、溶媒への溶解のために変化することが可能である。これは、乾燥時に望ましい比が粒子において得られるよう、選択された賦形剤を、最初の水溶液、共沈溶媒又は洗浄溶媒のいずれかへの予備添加することにより制御することができる。従って例えば、増強された貯蔵安定性を提供するために、有機可溶性糖質又はポリマーを、洗浄溶媒中に含有することにより、タンパク質でコートされた粒子の表面上にコートすることができる。あるいは塩又はナノ粒子のような添加剤を、共沈溶媒又は洗浄溶媒中に含有し、洗浄することにより、粒子の生理的特性又は治療特性を改善するために、粒子の外側表面上にコートすることができる。例えば、乾燥前に形成された微結晶を2-プロパノール中のイソロイシン溶液で洗浄することにより、イソロイシンでコートされたインスリン-グリシン粒子を提供することは、有利であることがわかっている。これらの粒子は、コートされないものと比べ、増強された流動特性及び空気動力学的特性を有する。
【００７８】
本発明の第三の局面に従い、第一の局面に従い形成された微結晶を含む、肺送達のための医薬製剤が提供される。
薬物分子の血流への投与のために吸入を使用するためには、この薬物は、適用に応じ主気道又はそうでなければ肺深部へ送達されることが可能な製剤に製造されなければならない。肺深部において、この生体活性分子は、血流へ受動的に輸送することができ、及びその効率はより大きい分子についてより低くなる傾向があるであろう。例えば受容体媒介型輸送により能動輸送が生じることができる肺領域において、より大きい生体活性分子の血流へのより効率的な送達が可能であろう。この能動輸送経路は、約50kDaよりも大きい分子質量の生体活性分子にとって好ましく、約100kDaよりも大きい分子質量の分子にとってより好ましい。例えばIgGのようなFc-領域又はFc-融合タンパク質もしくはFc-薬物のようなFc-複合体を伴う抗体を含む生体活性分子でコートされた微結晶を、主気道への送達に使用しても良い。これは、FcRn媒介型輸送によるか、又は例えばアルブミンのような他の分子を特異的に輸送する他の受容体によることができる。肺深部へ送達するための乾燥散剤の場合は、これは一般に、約1〜5μmの範囲の寸法中央値(mass median dimention)を持つ粒子を必要とするが、特別な空気動力学的特性を伴うより大きい粒子を使用することができることが明らかにされている。主気道への送達については、空気動力学的中央粒子径が約3〜30μmであるより大きい粒子が好ましい。これらは有利なことに、以下に説明される「実験計画」法を使用し、共沈条件を調整することにより、3系統共沈プロセスにおいて作製することができる。明らかにされた粒子は一般に非-球形であるので、空気動力学的中央粒子径は、幾何学的中央粒子径よりも小さいことが認められる。ある本発明の粒子の製剤は、吸入による送達に良く適した細かい自由流動粒子の作製に使用することができるので、これらは肺用製剤の形成に適しているであろう。生体活性分子がこれらの非-吸湿性のコートされた粒子の表面上にあるならば、これらの粒子は一般に、予想外に低い静電荷を示し、並びに乾燥散剤としての送達装置中での操作及び使用が容易になる。あるいは、例えばこれらは、ネブライザー内の懸濁液として使用することができる。
【００７９】
特に、肺用医薬製剤の形成に適している生体活性分子は、治療用タンパク質、例えばインスリン、α1-アンチトリプシン、インターフェロンなど；抗体及び抗体断片及び誘導体；治療用ペプチド及びホルモン；DNAベースの医薬品を含む、合成及び天然のDNA；酵素；ワクチン成分；抗生物質；鎮痛薬；水溶性薬物；感水性薬物；脂質及び界面活性剤；多糖；又は、それらの任意の組合せもしくは誘導体のいずれかを含むが、これらに限定されるものではない。粒子を含有する肺用製剤は、高い噴射量(emitted dose)及び高度に細かい粒子画分を提供するために、吸入装置中で直接使用されてもよい。従ってMSLI(ステージ1-5)で測定された噴射量は、典型的には、約70％よりも大きく、好ましくは90％よりも大きい。MSLI(ステージ3-5)で測定された細かい粒子画分は、典型的には約20％よりも大きく、好ましくは約40％よりも大きく、より好ましくは約55％よりも大きい。細かい粒子画分は通常、マルチ-ステージ液体インピンジャー(MSLI)のより低いステージで収集された画分として定義され、及び吸入による肺深部への投与に適した空気動力学的特性を伴う粒子、すなわち約3.3μm未満に相当している。主気道を標的とする肺用製剤を調製することもできる。これらは、同様に高い噴射量を有するが、低いFPFで、MLSIのステージ1-2で収集される傾向があるであろう。これらは有利なことに、規制機関の承認した賦形剤、例えば乳糖と共に作製することができる。肺用製剤は、例えば乳糖などのより大きい担体粒子と共に、更なる製剤を伴わずに、乾燥散剤送達装置内で使用することができる。
【００８０】
肺深部に標的化された肺用製剤について、空気動力学的中央粒子径約10μm未満及びより好ましくは約5μm未満を有する粒子が、好ましい。主気道への送達に関して、空気動力学的中央粒子径約4〜20μm及びより好ましくは約5〜10μmの範囲を有する粒子が、好ましい。これらは典型的には、それらの空気動力学的中央粒子径に類似した中央粒子径を有する。典型的には、肺深部については最大断面直径約1〜5μm又は主気道については5〜10μmの範囲を伴う、自由流動の非-吸湿性の低静電荷の粒子が、好ましい。これらは、結晶コアを形成するために、アミノ酸、例えばL-グルタミンなどを用いて得ることができる。しかし本発明者らは驚くべきことに、高いアスペクト比のフレークの形をとる生体活性分子でコートされた微結晶は、有利なことにそれらの最大断面直径よりもより小さい(smaller then)空気動力学的中央粒子径を有することを発見した。適当な形状は、例えば葉状又はタイル状であることができる。そのような粒子により、肺深部に関する最大断面直径の好ましい範囲は、約1〜5μmよりも大きく、及び例えば約1〜10μmであってよい。同様に最大断面直径が約5〜10μmより大きい、例えば約5〜30μmである粒子は、主気道への送達に使用することができる。典型的には生体活性分子でコートされた結晶粒子を形成する共沈剤は、ヒスチジン、及びD,L-バリンを含む。従って乾燥散剤肺用製剤に関して、高いアスペクト比のフレークのを生じる共沈剤で作製された粒子も、好ましい。
【００８１】
特に吸入可能な又は肺用製剤は、バリン、ヒスチジン、イソロイシン、グリシン又はグルタミンなどのアミノ酸で構成される結晶コアを有し、これは例えば、バリンの結晶コア及びインスリンのような治療用タンパク質のコーティング；ヒスチジンの結晶コア及び酵素のコーティング；バリンの結晶コア及びα-アンチトリプシンのような酵素阻害剤のコーティング；バリンの結晶コア及びDNAのコーティング；バリンの結晶コア及びワクチンコーティング；グルタミンの結晶コア及びワクチンコーティング；グルタミンの結晶コア及びアルブミンのコーティングを有するするように選択されることが好ましい。製剤のための粒子が形成される場合には、高湿度に曝された際に凝集せず離散した粒子を生じる共沈剤が使用されることが好ましい。加えて共沈剤は、投与後患者の口中に不快な味を残さないことが好ましい。従ってグルタミンは、高い湿度に曝すことができ、及び淡泊な味を有するので、これは非常に好ましい。
【００８２】
本発明の第四の局面に従い、第一の局面に従い形成された微結晶又は微結晶の懸濁液を含有する、非経口製剤が提供される。
このような製剤は、静脈内、皮下又は筋肉内注射を含む、様々な方法により送達することができるか、又はそうでなければ持続放出型製剤又は放出制御型製剤において使用することができる。これらの微結晶は有利なことに、費用対効果の良いプロセスで作製され、周囲温度で長期の貯蔵寿命を示す無菌の非経口製剤を提供する。散剤又は懸濁液の形の製剤は、好ましくは水溶液中に60秒以内で再構成され、注射に適した濁度の低い溶液を提供する。懸濁液の再構成は、生体活性分子が、特に毒性又は効能がある場合、従って乾燥散剤として製造又は取り扱うことが困難である場合に好ましい。あるいは、例えばエタノール又はヒドロフルオロカーボンなどの溶媒中の微結晶の濃厚な懸濁液を、再構成することなく直接の非経口投与に使用してもよい。これは、治療効果を提供するために非常に高用量の形で送達される必要性がある生体活性分子にとって、利点を提供することができる。このような生体活性分子は、治療用抗体及びそれらの誘導体を含むことができる。これらは、再構成時に凝集するか、又はそうでなければ投与が困難である高粘度の溶液を形成することがある。従って高用量の生体活性分子を含有する粒子の濃厚な懸濁液を使用し、代わりのより簡便かつ治療効果のあるそのような分子の送達法を提供することができる。この懸濁液は、溶媒中であるか、又はそうでなければ微結晶の調製に使用された共沈剤の飽和水溶液中に調製される。グルタミンは、その飽和濃度は低いので、この適用のための好ましい共沈剤である。生体活性分子でコートされた粒子は、希釈時にこれらは非常に迅速に再構成し、及び生体活性分子の最小の凝集を示すので、特にこの適用に適している。凝集塊の投与は、有害な免疫応答の開始につながることがあるので、これは望ましくない。
【００８３】
非経口送達による投与に適した生体活性分子は、本発明の第三の局面に説明されたものを含む。加えて非経口投与を使用し、貧弱な全身の生体利用性のために肺を経由した対象の血流への投与に適さないワクチン又は抗体のような、巨大な生体分子を送達することができる。好ましい結晶コア材料は、マンニトール及びショ糖のような非経口製剤において通常使用される賦形剤を含む。迅速に再構成し、例え高温であっても安定であり、かつ処理及び取り扱いが容易であるような粒子を形成するために使用することができるL-グルタミンのような天然のアミノ酸も好ましい。同じくL-グルタミンは、患者へ高用量で有害な副作用を伴わずに投与されるので、好ましい。
【００８４】
本発明の第五の局面では、第一の局面に従う微結晶又は微結晶の懸濁液を含有する、持続放出型又は放出制御型の医薬製剤(又はデポ剤)が提供される。
ある適用に関しては、投与時に、持続された又は延長された治療作用を提供する非経口もしくは肺用製剤又は他の製剤を作製することが好ましい。これは、例えば、対象の血流内で達成される生体活性分子の最高濃度を制限するために使用されるか、又はそうでなければ反復投与の間に必要とされる期間を延長するために使用される。あるいは、生体利用性を改善するか又は免疫原性を増加もしくは低下するために、微結晶の表面特性又は溶解度を変化することが必要であることもある。生体活性分子でコートされた微結晶は都合がよいことに、持続型又は放出制御型の製剤を作製するために使用することができる。これは、微結晶のコーティング、又はゲルもしくはポリマーのような別のマトリックス材料の混入によるか、又はそれらの送達装置内の固定により実現される。
【００８５】
例えば、各微結晶は、当該技術分野において公知の技術を使用し、微結晶の成分の放出又は送達を変更する物質により、均等にコートされ得る。
微結晶のコーティングに使用することができる物質は、例えば、水にやや溶けにくい生分解性ポリマー、例えばポリラクチド又はポリグリコリド及びそれらのコポリマー；ポリアミノ酸；ヒドロゲル；及び、生理的条件への曝露に反応してそれらの溶解度又は架橋度を変更することが当該技術分野において公知の他の物質などであってよい。コーティングは、例えば粒子懸濁液を、コーティング材料の溶液と接触し、その後得られる粒子を乾燥することにより適用することができる。必要ならば、このプロセスは、放出プロファイルを延長するために繰り返すことができる。コートされた微結晶は、実質的に一定速度の生体活性分子の溶液への放出を提供することがわかっている。あるいは例えば結合剤により、複数の粒子を例えば単独の錠剤形へ組合せることができる。錠剤を互いに保持する結合剤は、次第に溶解するので、粒子が連続して溶液へ放出される時には、結合剤は溶液中に溶解してよい。
【００８６】
当業者は、前述の内容の組合せを用い、他の医薬製剤、例えば鼻腔用製剤、経口製剤及び外用製剤などを提供することが可能であることを認めるであろう。鼻腔用製剤及び経口製剤は、例えば粘膜への接着を提供する別の物質による粒子のコーティングが必要であることがある。
本発明の第六の局面に従い、第一の局面に従い形成された微結晶を含む吸入用の薬物送達装置が提供される。
吸入は、肺又は鼻腔であってよい。
肺への薬物送達装置は、例えば液体ネブライザー、エアロゾル-ベースの測定量吸入装置又は乾燥散剤分布装置であってよい。
【００８７】
本発明の第七の局面に従い、以下の工程を含む、生体活性分子でコートされた微結晶を作製する最適条件を決定する方法が提供される：
可変パラメータの第一のセットに従い生体活性分子でコートされた微結晶の第一のバッチを調製し、及び該生体活性分子でコートされた微結晶の少なくとも1種の特性を定量する工程；
少なくとも1種の可変パラメータを変更することにより、生体活性分子でコートされた微結晶の第二のバッチを調製し、並びに該少なくとも1種の変化が、該少なくとも1種の特性に対し有益又は有害な作用を有するかどうかを確定することができるために、該少なくとも1種の特性を定量する工程。
【００８８】
任意に、この方法は、最適特性を示す微結晶を得ることを求めるために、必要ならば、何回も繰り返すことができる。
この方法は都合がよいことに、生体活性分子でコートされた微結晶の製造のための最適条件を見つけるために、バッチ又は連続プロセスのいずれかでのスクリーニングに使用することができる。3-流れの連続流沈降分離装置は、そのようなスクリーニングプロセスを実行する上で特に簡便かつ効率的な方法を提供することがわかっている。このスクリーニングの目的は一般に、特定の適用について最も魅力的な物理特性を伴うと同時に、最大生体活性を保持するような粒子を提供することであるが、他のスクリーニングも可能である。
【００８９】
本スクリーニングプロセスは、本質的に下記の工程からなる：
a)生体活性分子でコートされた微結晶のどの特性が、特定の適用について最も望ましいかを確定し、及びこれらの特性がいくつかの種類の測定により正確に定量することができることを確実にする工程；
b)最適化されることが必要である特性に最も作用することが予想されたこれらのパラメータを確定する工程；
c)確定されたパラメータののどの範囲が変動するか、及びどの制約がこれを実際に実現する際に存在するかを決定する工程；
d)選択されたパラメータの所望の特性に対する作用を効率的にスクリーニングする実験のマトリックスを確定する工程；
e)実験計画法により確定された共沈を実行し、及び生成されたコートされた微結晶により示される特性の測定を行う工程；
f)得られた結果を解析し、必要ならば、最適条件を見つけるために更なる実験を計画する工程；
g)任意に微結晶を作製するプロセスが確定された目的に適合するまで、工程a)-f)を繰り返す工程。
【００９０】
スクリーニングすることができる物理特性の例は、平均サイズ、平均形状、サイズ分布、結晶化度、溶解時間、平均空気動力学的粒子径、総噴射量、細粒分画及び他の測定可能な医薬製剤に関係し得るパラメータを含む。生体活性の保持に関係する特性の例は、結晶上に保持された生体活性分子の収量、生体活性分子の負荷又は用量、濁度、凝集度、in vitro生体活性、分解産物(cleavage product)の非存在、in vitro生体利用性、不純物レベル、構造の保持及び他の治療適用に関連し得るパラメータを含む。望ましい物理特性又は生体活性に関係する測定は、生体活性でコートされた微結晶の調製直後に行われるか、又はそうでなければ試料を例えば高温又は湿度に曝すことにより故意にストレスをかけた貯蔵期間の後に行われて良い。
【００９１】
驚くべきことに、スクリーニングプロセスは一般に、3-系統連続流沈降分離装置により、最も効率的に実行することができることがわかる。
特定の共沈剤/溶媒組合せを使用する連続プロセスにおける生体活性分子でコートされた微結晶の共沈の成功は、いくつかのプロセスパラメータに応じて左右されることがわかり、ほとんどの場合において、これらの因子をスクリーニングしかつ最適化することが必要である。優先的にスクリーニング及び最適化されなければならない少なくとも3種の主要なパラメータが存在し、これは以下である：
・タンパク質負荷(質量％)
・最終含水量(容量％)
・共沈剤濃度(mg/ml)。
【００９２】
タンパク質負荷及び最終含水量は、粒子サイズ及び保持された生体活性レベルに影響を及ぼすことがわかっている。最初の共沈剤濃度は、実現可能な過飽和及び核形成プロファイルに影響することがわかり、これは次に粒子のサイズ及び形状並びに粒子凝集に影響することがわかっている。従って生体活性分子でコートされた微結晶が、特定の適用に必要である場合、これら3種のパラメータのスクリーニングは、最初の製剤に達する迅速な経路を提供することができることがわかる。
【００９３】
同じく生体活性及び／又は粒子特性に影響を及ぼすことがわかっている他のパラメータは、以下を含む：
・pH
・温度(試薬溶液；混合セル；生成物溶液)
・添加剤/安定剤
・混合効率。
【００９４】
これらのパラメータを使用する最適化は、例えば第二ラウンドのスクリーニングプロセス時に実行されてよい。このパラメータリストは、網羅しているものではないが、研究される可能性のあるいくつかの追加のパラメータを例証するために役立つ。
これらのパラメータの作用の研究は、少なくとも2種の方法で取り組むことができる。第一に、他のパラメータは全て一定に維持しつつ、各パラメータを個別にスクリーニングする単純な方法がある。この反復法は、許容できるが、資源に関して非効率的であり、概して非常に時間がかかることが多い。更に長期にわたる研究は、系統誤差及びランダム誤差を受けやすいことがある。
【００９５】
第二の手法は、より効率的な統計的手法を利用するものであり、これにより大部分のパラメータは、最初にスクリーニングされ、引き続き最も影響力の大きいパラメータが慎重に最適化される。この方法は通常「実験計画法(DoE)」と称され、著しい利点を提供することがわかっている。典型的試験において、5種のパラメータを確定することができる。例えば、標的生体活性分子/共沈剤/溶媒の組合せを使用し、特定の特徴を有する粒子が必要である場合、第一工程は、例えばタンパク質負荷、最終含水量及び共沈剤濃度のような、先に確定された3種の基本因子についてスクリーニングすることができる。加えて先行する知識は、その生体活性分子(例えばタンパク質)は、おそらくpH及び温度に対し感受性があることを指摘している。従って最初のスクリーニングにおいて、5種のパラメータを調べることができる。
【００９６】
各パラメータに関して、感知し得る実験範囲を確定することができる。これは、先行する同様の研究から得られた知識に頼ることが多いが、現実的な到達できるレベルの推定が必要であることがある。典型的には、例えば製剤を試験するための妥当なタンパク質負荷範囲は、約0.25〜10質量％であることができる。同様に典型的最終含水量範囲は、約0.5〜10容量％であることができ、及び典型的賦形剤濃度範囲は、飽和濃度の約75〜90％であることができる。例えばDL-バリンが特定温度で約66mg/mlの飽和濃度を有する場合、75％は50mg/mlと等しく；90％は60mg/mlと等しい。同様に妥当なpH及び温度範囲を選択することができる。反応において感知可能な変化をもたらす範囲を試み及び予想することは好ましい。これは最初に、数桁に広がる範囲のような、極めて広い範囲で開始することが必要であることが多い。再度先行する知識が、この選択プロセスを補助するであろう。更にこれらの選択されたパラメータ範囲は、引き続きの試料分析において測定可能な反応を生じる必要がある。従って分析技術が非常に敏感であり、試料間のごくわずかな変化の報告が可能である場合、狭いパラメータ範囲を選択することが受け入れられる。他方で、分析技術が若干鈍感であるか又は高レベルのノイズにより損なわれる場合は、広範なパラメータ範囲を選択することが賢明であろう。
【００９７】
パラメータ及び適当な範囲の選択後、選択された因子をDoEソフトウェアへ入力することが必要であることがある。最近、利用可能なDoEソフトウェアの量が大きく増加しており、その多くは試用目的でオンラインで入手可能である。本発明者らは、少数の例を検証し、簡単なパラメータ調査のためには、全て受入れ可能であると結論づけた。全てのソフトウェアパッケージは、類似したDoE入力基準を有し、実験後統計解析のみが多彩である。
【００９８】
本出願の範囲においては、Umetricsから供給されるDoEパッケージMODDE 6を試用した。このパッケージは、基本仕様が非常にシンプルである点が魅力的である。実験者には、選択された実験パラメータ(このソフトウェアではファクターと称される)、及び測定された統計的測定値(このソフトウェアではレスポンスと称される)の入力が指示される。その後実験者には、問題の試験がスクリーニング試験か又は最適化試験かが問われる。決定された選択に従い、可能な統計学的試験の選択が示唆され、科学者には、最も適当なものを選択することが指示される。最後に、実験及び解析のマトリックスが作製され、作業の系統的スキームが提供される。
実験者はこの時点で、ランダム化様式は最終的統計解析においてランダム誤差の作用を最小化するので、好ましくはランダム化様式で、実験を行う準備が整っている。
【００９９】
本発明の第八の局面に従い、下記の工程を含む、肺の特定領域へ送達するための、生体活性でコートされた微結晶を形成する調整可能な方法が提供される：
a)共沈剤分子を含有する第一の水溶液を提供する工程；
b)生体活性分子を含有する第二の水溶液を提供する工程；
c)水混和性溶媒を含有する第三の溶液を提供する工程；
d)該第一の水溶液、該第二の水溶液及び該第三の溶液を、実質的に同時に混合するか；又は、第一及び第二の水溶液のいずれかを、第三の溶液と混合し、その後第一及び第二の水溶液のいずれかの残りと混合し；その結果、共沈剤及び生体活性分子の共沈が始まり、該微結晶の形成につながる工程；
e)該微結晶の懸濁液を収集する工程；並びに
f)微結晶の平均サイズを検出し、及びそのような微結晶は、肺の特定の領域への送達に適しているかどうかを決定し、微結晶の平均粒子サイズが適していない事象(event)においては、この調整可能な方法の可変パラメータを変更する工程。
【０１００】
形成される粒子のサイズに影響を及ぼし得るパラメータは、共沈剤の濃度、pH、溶媒、含水量、生体活性分子の負荷、温度、添加剤濃度及び混合効率を含む。第一及び第二の水溶液の溶媒への逐次添加が使用される場合、溶液が第一のミキサーから第二のミキサーへと移動する時間は、変動してもよい。一部のシステムにおいては、これらの値の1又は複数は固定されることが必要であるが、DoEを使用し、残りの可変パラメータの効率的スクリーニングを実行することができる。これは、サイズ及びそれらの間のあらゆる相互作用に最も影響を及ぼすこれらのパラメータを確定するために使用することができる。その後この情報を使用し、標的範囲内の粒子サイズを作製すると同時に、生体活性及び結合効率も最適化するために、反応のサーフェスモデリング(surface modeling)を介しパラメータを更に洗練することができる。
【０１０１】
本発明の第九の局面に従い、前述の局面のいずれかに従い生体活性分子でコートされた微結晶を形成する要請を受け取る方法が提供され、これは：
(a)顧客が、生体活性、用量、負荷、サイズ、形状及び共沈剤を含む、生体活性分子でコートされた微結晶に関する必要要件を規定すること；
(b)パート(a)において規定された微結晶を得るために、共沈条件を調整すること；
(c)適当な必要要件を伴う微結晶を得るために、共沈条件を洗練すること；並びに
(d)必要とされる微結晶を形成するための適当な条件を確定すること；を含む。
【０１０２】
典型的には、変更することができる共沈条件は、溶媒、pH、温度、混合速度及び濃度のいずれかから選択することができる。
洗練プロセス時に、微結晶の生体活性及び完全性に関する安定性試験を行うこともできる。
得られた微結晶が適さない事象において、工程(b)及び(c)は繰り返すことができる。
【０１０３】
本発明の第十の局面に従い、前述の局面のいずれかに従う生体活性分子でコートされた微結晶を形成する方法に関連したサービスを提供する方法が提供され、これは：
顧客からの、サイズ及び生体活性を含む特定の必要要件を伴う、生体活性分子でコートされた微結晶を形成する要請を受け取ること；
該生体活性分子でコートされた微結晶の形成法を決定すること；並びに
該生体活性分子でコートされた微結晶の形成法のサービスを顧客へ提供することの報酬を受け取ること；を含む。
【実施例】
【０１０４】
実験結果
実施例1
3-系統連続流共沈分離装置(CFCP)を使用するタンパク質でコートされた微結晶(PCMC)の共沈
概略
本願明細書に参照として組入れられているPCT/GB2004/000044において、タンパク質及び賦形剤の水溶液が、混和性溶媒と連続配合される、2-系統システムを使用するPCMCの連続流共沈が使用される。本出願において、PCMCは、PCMCの3成分、すなわちタンパク質、共沈剤及び混和性溶媒が、各々独立して送達される、3-系統システムにより作製される。ポンプAはタンパク質の緩衝された水溶液を送達し、ポンプBは共沈剤水溶液を送達し、及びポンプCは、混和性溶媒を送達する。
【０１０５】
実験手法及び得られた結果は、以下に詳述する。本実験は、JV714と表示した。
本実験の目的は、第一に2-系統システムで及び第二に3系統システムにより作製された理論的に同一のPCMCを比較することであった。
2-系統システムに関して、CFCPは、PCT/GB2004/000044に先に報告されたように使用した。全てのポンプは、使用前にキャリブレーションした。3-系統システムに関して、CFCPは、追加の流入口を通って混合セルに垂直とされた(plumbed)別のポンプを含むように改変した。流量は、下記に報告されたように調節したが、他の全てのパラメータは一定に維持した。
【０１０６】
先の試験から、トリプシン-DL-バリンPCMCをモデルシステムとして使用することを決定した。トリプシンのDL-バリンへの理論的2.5質量％負荷を調製した。PCMC懸濁液の含水量は、4.0容量％に固定した。総流量は、100ml/分に固定した。トリプシン(ロット番号81K7653)及びDL-バリン(ロット番号55H1252)は、Sigma Aldrich Co.(英国)から入手した。プロパン-2-オール(ロット番号K32707146347)及び塩化カルシウム(ロット番号9930948 389)は、BDH, Poole(英国)から入手した。塩化カルシウムは、PCMC結晶の表面上のトリプシン保持を改善することがわかっているので、本実験に含んだ。これは、水性又は有機溶媒により導入することができるが、本実験においては、水性共沈剤混合物中に含んだ。
下記表は、使用した各ポンプにより送達される流量、タンパク質及び／又は共沈剤濃度を記している。
【０１０７】
【表１】
2008508246.tif 000002
【０１０８】
単位時間当たり、正確に同量のPCMC成分が混合セルに侵入されることを保証することが必要であった。
2-系統及び3-系統の両実験について、単独バッチの混和性溶媒を、以下のように調製した。過剰なDL-バリンを、プロパン-2-オール約2Lへ添加し、この溶液を、室温で約2時間攪拌した。その後この溶液を、0.45μmメンブレンフィルターを通して直ぐに濾過した。この溶液は、溶液4と称する。
【０１０９】
2-系統実験に関して、トリプシン-DL-バリン溶液を、以下のように調製した。脱イオン水中のCaCl2 2.19mg/mlのストック液を調製した。このストック液を使用し、DL-バリン60mg/mlを含有する溶液を調製した。最終的に、トリプシンを添加し、濃度1.538mg/mlを得た。この溶液は、溶液1と称する。
3系統実験に関して、2種の溶液を調製した。脱イオン水中のCaCl2 2.5mg/mlのストック液を調製した。このストック液を使用し、DL-バリン68.571mg/mlを含有する溶液を調製した。この溶液は、溶液2と称する。
同じく濃度12.304mg/mlの脱イオン水中のトリプシンの溶液も調製した。この溶液は、溶液3と称する。
【０１１０】
2-系統PCMCは、下記のように調製した。溶液1を、各々流量4及び96ml/分で溶液4と配合した。PCMC 25mlを収集した。共沈の約5〜10分後、PCMCを、0.45μmメンブレンフィルターを通して直ぐに濾過し、30℃のインキュベーター内で約1時間放置し乾燥した。
3-系統PCMCは、下記のように調製した。溶液2、3を、各々流量0.5、3.5及び96ml/分で溶液4と配合した。PCMC 25mlを収集した。共沈の約5〜10分後、PCMCを、0.45μmメンブレンフィルターを通して直ぐに濾過し、30℃のインキュベーター内で約1時間放置し乾燥した。
【０１１１】
分析
これらの調製した試料を、3種の分析技法を用いて分析した。第一に、DL-バリン上のトリプシンのタンパク質負荷を、ビシンコニン酸(BCA)比色アッセイを用いて測定した。第二に、トリプシン-DLバリンPCMCの活性を、周知のトリプシンアッセイであるN-p-トシル-L-アルギニンメチルエステル(TAME)塩酸塩の加水分解アッセイを用いて確認した。第三に、PCMC粒子集団のサイズ及びスパンを、動的光散乱(DLS)分析装置、すなわちMalvern Mastersizerを用いて測定した。
【０１１２】
BCAアッセイ
乾燥材料約5mgを、25mlバイアルに正確に秤量した。理論的にタンパク質負荷は、2.5質量％でなければならず、従って、2.5質量％を積算した質量を秤量した。得られた値は、PCMC試料中のトリプシン理論量を表した。この値を、0.015mg/ml(アッセイ濃度)で除算し、必要な希釈を得た。PCMCを、アッセイ緩衝液(0.046M Tris；0.0115M CaCl2 25℃でpH8.1)に溶解した。その後各溶液を、以下のように分析した。タンパク質標準0.5mlを、1.5mlのEppendorfへ添加した。BCA作業緩衝液0.5mlを、各Eppendorfへ添加した。(沈殿が形成されてよい)。12,000rpmで2分間遠心した。60℃のヒートブロックに正確に15分間配置した。12,000rpmで2分間遠心した。
0.75mlを、マイクロキュベットにピペットで移し、直ぐに562nmで測定した。
【０１１３】
TAMEアッセイ
乾燥材料約5mgを、25mlバイアルに正確に秤量した。理論的にタンパク質負荷は、2.5質量％でなければならず、従って、2.5質量％を積算した質量を秤量した。得られた値は、PCMC試料中のトリプシン理論量を表した。この値を、0.015mg/ml(アッセイ濃度)で除算し、必要な希釈を得た。PCMCを、水に溶解した。各溶液を、以下のように分析した。透明なUV石英キュベットへ、アッセイ緩衝液1.3ml及び0.01M TAME溶液150μlを添加した。25℃で5〜10分間インキュベーションした。PCMC 希釈液50μlを添加し、攪拌し、247nmで10分間アッセイした。
【０１１４】
動的光散乱分析(DLS)
試料を、PCMC懸濁液として及びDL-バリン飽和した貧溶媒中で再構成される乾燥散剤として分析した。機器は最初に、貧溶媒でブランクを取った。その後PCMC懸濁液約500μlを添加し、約12％のレーザー障害を得た。各試料について5つ組の測定を行った。
【０１１５】
BCAアッセイ
図1は、供給業者から受け取った新鮮なトリプシン；各々、2-系統CFCP及び3-系統CFCPにより作製されたトリプシンPCMCに関するBCAアッセイの結果を表すグラフである。
図1のBCA結果は、実験誤差内で、2系統方法及び3系統方法には、有意差がないことを示している。
図2は、供給業者から受け取った新鮮なトリプシン；各々、2-系統CFCP及び3-系統CFCPにより作製されたトリプシンPCMCに関するTAMEアッセイの結果を示すグラフである。
【０１１６】
先のBCAアッセイ同様に、TAMEの結果も、実験誤差内で、2系統方法及び3系統方法は、有意差がないことを示している。図3は、PCMCの活性(TAMEアッセイにより決定される)の、PCMCのタンパク質負荷(BCAアッセイにより決定される)による補正の作用を示している。
動的光散乱(DLS)
図4は、3-系統システムにより作製された微結晶は、サイズ及びスパンが測定上より小さいことを示す動的光散乱(DLS)の結果を示している。
【０１１７】
結論
トリプシン-DL-バリンを、2-系統及び3-系統共沈法により作製した。他の全てのパラメータは一定に保った。PCMCのタンパク質負荷、活性、サイズ及びスパンを測定した。得られた生体活性の結果からは、2-系統及び3-系統システムは、著しく異ならなかったが、得られた粒子はより小さいことがわかった。これは、医薬製剤にとって利点である。
【０１１８】
実施例2
本実施例において、3系統を使用し、異なる温度で維持される共沈剤溶液を使用し、トリプシン/DL-バリンPCMCを共沈した。理論的タンパク質負荷は2.5質量％であり；含水量は4.0容量％であり；総流量は100ml/分であった。ひとつの実験[JV790]においては、DL-バリン水溶液を加熱し、その濃度は90mg/mlであり、別の実験[JV675]においては、DL-バリン溶液は室温で維持し、その濃度は68.571mg/mlであった。塩化カルシウムは、これらの実験においては含まれなかった。90mg/ml DL-バリンを脱イオン水に溶解するために、溶液温度を〜90℃に加熱し及び維持することが必要である。溶液は、Techne Dri-Block DB-3ヒートブロックを用いて加熱した。このユニットは、サーモスタットで制御され、かつ一定温度を維持した。
【０１１９】
理論的タンパク質負荷は、2.5質量％であり、賦形剤濃度は90mg/mlであった。全ての系統が室温で維持される比較実験において、理論的タンパク質負荷は2.5質量％であったが、賦形剤濃度は60mg/mlであった。この結果として、下記表2に示したような、溶液濃度の調節が必要であった：
【０１２０】
【表２】
2008508246.tif 000003
【０１２１】
表2は、3系統システムを用いてトリプシン/DL-バリンPCMCを作製するために必要な、トリプシン及び賦形剤の濃度を詳述している。
*これらの数値は、非混合溶液中の共沈剤濃度を意味する。3溶液が混合される場合、有効水溶液濃度又は[共沈剤]水性は、相対流量により左右される。溶液2及び3の構成成分流動は、各々3.5及び0.5ml/分である。溶液2及び3の総水性流動は、4.0ml/分であった。結果的に混合時点で、下記の計算により、[共沈剤]水性を得た；
[共沈剤]水性＝(混合前濃度(mg/ml) x 混合前流量(ml/分))／4.0(ml/分)
従って、JV675において、D,L-バリンの有効水溶液濃度、[共沈剤]水性は、60mg/mlであり、及びJV790においてこれは78.75mg/mlである。
【０１２２】
従ってまとめると、この追加実験は、有効DL-バリン濃度の60mg/mlから78.75mg/mlまでの増加の作用を調べている。全ての他のパラメータは一定に維持し、全ての試料は、先に説明されたように、タンパク質負荷(BCA)、酵素活性(TAME)及び粒子サイズ(DLS)について分析した。
【０１２３】
試料は、先の3系統試料と同様の様式で調製したが、賦形剤溶液は、サーモスタットで90℃に制御されたので、これは本質的に、混合時点までこの温度を維持するよう試みた。できればセルを90℃の脱イオン水でフラッシュする前に、金属ピストンの伝導度による、この温度の降下は最小化されることを保証した。ポンプ閉塞の問題は、本実験期間中は経験しなかった。
【０１２４】
試料は共沈し、懸濁液約10〜15mlを、Millipore Duraporeフィルター上で濾過した。濾過直後に、試料をインキュベーター内で16時間以上乾燥した。調製しかつ分析したこれらの試料を、表3に示す。
【０１２５】
【表３】
2008508246.tif 000004
【０１２６】
図5は、供給業者から受け取った新鮮なトリプシンを含む、JV790/2、JV790/4に関するBCAタンパク質負荷分析の結果を示すグラフである。塩化カルシウムが存在しない場合に、予想されたように共沈プロセス時に若干のトリプシンの喪失が明らかに存在している。
図6は、供給業者から受け取った新鮮なトリプシンを含む、JV790/2及びJV790/4の酵素活性を示すグラフである。JV790/4の保持された生体活性の喪失は、主にタンパク質喪失に起因している。
【０１２７】
図7は、BCAアッセイを用いて測定した実際のタンパク質負荷について補正されているJV790において得られた生体活性のグラフである。これは、存在するトリプシンは、高い保持された活性を有することを認めることができる。
図8は、Malvern Mastersizer分析の結果を示すグラフである。JV675及びJV790両実験に関して、トリプシンと共に調製された試料は、トリプシンを伴わない試料よりもはるかに小さいことを認めることができる。JV675及びJV790の結果を比較し、JV790における増加した共沈濃度は、粒子サイズの減少につながる。これは、存在する生体活性分子、トリプシンで調製された試料について最も明らかに認められる。より高い濃度の共沈剤で調製された試料(JV790)は、より低い濃度で調製されたもの(JV675)よりも、25％小さい。これらの結果は、共沈剤水溶液を生体活性分子溶液から分離することの利点を明らかにしている。この場合、D,L-バリン溶液は、トリプシン変性のリスクを冒すことなく、90℃で加熱することができる。
【０１２８】
結論
一般に、温度90℃で賦形剤濃度90mg/mlを用いて作製されたトリプシン/DL-バリンPCMCは、同等の室温条件を用いて得られたものと比べて、タンパク質負荷及び酵素活性の特徴を変更しなかった。これは、図7に示されている。この実験仮説は、高共沈剤濃度は、より高い過飽和、その結果のより小さいPCMCを誘導することを提唱した。これは、タンパク質が存在した場合に認められ、加熱したより高濃度の共沈剤溶液を用いると、粒子サイズの25％サイズ減少が認められた。
【０１２９】
実施例3
イソプロパノールへのトリプシン/K2S04の共沈のための2系統又は3系統CFCPシステムの比較[Expt JV818]
本実施例は、3系統混合プロセスの先に説明した利点を、非常に迅速に共沈することがわかっている共沈剤で同じく得ることができるかどうかを決定するためにデザインした。
K2SO4は、無機塩であり、これはプロパン-2-オールのような適当な貧溶媒への添加時に、濃厚な水溶液から迅速に沈殿する。文献において、無機塩は迅速に沈殿し、多くの場合沈殿は非常に迅速であるので、そのプロセスを測定することは困難でさえあることは周知である。先に本発明者らは、生体活性分子でコートされた微結晶は、バッチシステム又は2系統連続プロセスのいずれかを使用し、硫酸カリウムで作製することができることを明らかにした。更に、この共沈プロセスは、タンパク質非存在下での沈殿時に得られたものよりも小さい結晶の形成につながることが一貫して認められた(K2SO4及び多くの他の物質と共に)。従って粒子サイズは、その生体活性分子が共沈時に結晶の形成に影響を及ぼすかどうかを決定するための都合の良い判定道具を提供する。
【０１３０】
実施例1において、2系統又は3系統プロセスのいずれかによりトリプシンと共沈されたDL-バリンについて、純粋なDL-バリンの沈殿と比べて、粒子サイズが有意に低下したことが示された。本実施例において、3系統混合システムを、生体活性分子トリプシンの硫酸カリウム(K2SO4)との共沈に適用し、及び使用される結晶サイズを変更し、その生成物が2-系統システムで得られるものと異なるかどうかを決定した。
【０１３１】
実験手法
下記の一連の試料を、表4に示したように調製した。
【０１３２】
【表４】
2008508246.tif 000005
【０１３３】
この実験のためには、表5に示したように、必要な流量及び必要な試薬を計算することが必要であった。
【０１３４】
【表５】
2008508246.tif 000006
【０１３５】
理論的タンパク質負荷2.5質量％を選択した。PCMC懸濁液の含水量は、4.0容量％で固定した。総流量は、100ml/分で固定した。トリプシン(ロット番号121K7692)及びK2S04(ロット番号121K0043)は、Sigma Aldrich Co.(英国)から入手した。プロパン-2-オール(ロット番号K32883646)は、BDH, Poole(英国)から入手した。
【０１３６】
先の実験のように、単位時間当たり同量の材料がフローセルに侵入することを確実にするために、3-系統システムについてはトリプシン及びK2S04のより濃厚な溶液を調製することが必要であった。含水量を4容量％で固定するために、流量も変更した。撹拌機の速度は、1500rpmで固定した。
CFCPシステムは、共沈を行う前に、キャリブレーションした。各ポンプは、個別にキャリブレーションし、これらのポンプは満足できる精度であることを認めた。
試料1-4は共沈し、直ぐに貯蔵のために冷蔵庫へ移した。
【０１３７】
結果
共沈のほぼ直後に、2-及び3-系統システムの間に観測可能な差異があることが明らかになった。試料2及び4を比較し、沈降速度は劇的に異なるので、試料2の粒子は、試料4の粒子よりも有意に小さいことが観測された。実際試料4は、トリプシンを含有しない試料1及び3と本質的に類似していた。図9は、共沈後約10分間の沈降の程度を示している。
【０１３８】
明らかに、試料3は、他のものとは著しく異なり、このことは試料2においてのみ、トリプシンがK2S04と相互作用し、PCMCを生成したことを示唆している。
共沈のほぼ4時間後、全ての懸濁液試料を、レーザー回折技術を使用するMalvern Mastersizerを用いて分析し、生成された粒子のサイズ及びスパンを確認した。結果を表6に示す。
【０１３９】
【表６】
2008508246.tif 000007
【０１４０】
本質的に試料1、3及び4は、実験誤差内で同じである。しかし試料2は大部分は、有意により小さい粒子を作製し、この試料は沈降により長時間を要するという知見と一致する。図10及び11は、各々試料2及び4のMastersizer結果を示している。
図10は、ミクロン以下の寸法を持つ生体活性分子でコートされた微結晶は、適当な混合様式が適用されるならば、アクセス可能であることを明らかにしている。図11は、3系統システムにおいてその混合は、最初の沈殿時にタンパク質の相互作用を提供するには余りにも遅いにもかかわらず、これらの粒子はそれでもなお全て同様のサイズであることを示している。恐らく、pIが9であるトリプシンは、負のゼータ電位を有する沈殿したK2S04結晶と静電気結合するであろう。このことは、徐放製剤の製造への適用に有益であることが認められる狭いサイズ分布を有するより大きいコートされた粒子への経路を提供する。
【０１４１】
結論
これらの結果は、K2S04と共沈したトリプシンについて、3系統システムで得られた粒子は、純粋なK2S04の沈殿により得られた粒子とサイズが同一であることを明確に示している。他方で、2系統システムにおいて、はるかに小さい粒子が、このタンパク質存在下で得られた。ここで得られた結果及びDL-バリンにより得られた結果の間の差異は、沈殿の相対速度に関して互いに関連付けることができる。3系統システムにおいては、沈殿開始前にバリンとのほぼ完全な混合が実現され得る。このことは、この生体活性分子の粒子核形成プロセスへの介入を可能にする。この場合、3系統システムにおいて調製された粒子は、2系統システムにおいて得られた粒子よりも測定できる程小さく、タンパク質非存在で得られる粒子よりも有意に小さかった。
【０１４２】
K2S04により、沈殿は非常に迅速であり、そのため2水性流れが個別に流入される場合、粒子形成は完全な混合が生じる前に生じ、及びタンパク質の添加は作用を有さない。このことは、生体活性分子の重要な能動的役割は、粒子サイズの制御であることを明らかにしている。これは同じく、分離された2水性成分を維持することができる点で3系統システムの利点を得るためには、良好な混合を実現するために必要とされるものよりもより遅い時間スケールで共沈するアミノ酸又は糖質のような共沈剤を選択することが必要であることも明らかにしている。
【０１４３】
実施例4
2系統及び3系統プロセスによる抗体でコートされた微結晶の調製
ウシIgG-コートされたバリン微結晶を、実施例1に説明された装置及び表7で説明された条件を用い、2系統及び3系統プロセスにより調製した。ウシIgG(ロット番号052742366)は、0.01Mリン酸ナトリウム、0.15M NaCl(PBS)、pH7.4(保存剤0.1％アジ化ナトリウム)中に10mg/mlで、Lampire Biologicals(PO Box 270, Pipersville, PA 18947)から供給された。2系統及び3系統の両実験について、沈殿時に製剤中の同じ理論的タンパク質負荷7.5質量％、懸濁液中の最終含水量4容量％、及び同じバリンの過飽和を生じるように、条件をデザインした。これら2種の実験の間の重要な差異は、3系統実験においてはタンパク質はPBS緩衝液(pH7.4)中で共沈に導入されるのに対し、2系統実験においてはこれはバリン共沈剤と混合され及びpH約6.2であることである。
【０１４４】
【表７】
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【０１４５】
表8は、乾燥散剤として室温で1日から6日間貯蔵した後、これらの製剤から回収することができる可溶性タンパク質の量の差異を示している。3系統プロセスは、タンパク質完全性の保持に関して著しい利点を提供することは明らかである−処理後に、検出可能なタンパク質凝集は存在せず、及びこの製剤は室温での貯蔵により安定している。
【０１４６】
【表８】
2008508246.tif 000009
【０１４７】
図12は、3系統システムにより調製されたウシIgGでコートされた微結晶のSEM像を示している。観察されたフレークは、直径5〜15μmを有した。この種のフレークは、乾燥散剤吸入器による送達に適し、及び幾何学的直径未満の空気動力学的中央粒子径を示すことがこれまでにわかっている(組成特許)。従ってこれらの製剤は、抗体及びFc-融合タンパク質及びFc-薬物複合体(congugate)を、能動輸送による全身送達のために主気道へ送達するのに良く適していることが予想される。
【０１４８】
実施例5
トリプシンでコートしたグルタミン微結晶を、実施例1に説明された装置及び供給業者並びに表xで説明された条件を用い、2系統プロセス及び3系統プロセスにより調製した(トリプシン(Sigmaカタログ番号T1426、ロット番号104K7575)、L-グルタミン(Sigmaカタログ番号G8540、ロット番号072K03651))。
従ってタンパク質を含有する水溶液は、2系統システムにおいてグルタミンによりpH6.3に設定するか、又はそうでなければ3系統システムにおいてリン酸緩衝液によりpH9.2に設定するかのいずれかであった。pH9.2は、トリプシンのpIに近い。3系統システムにおいても、グルタミン溶液のpHはpH6.3であった。生成された結晶を収集し、溶媒で洗浄し、乾燥し、実施例1に説明された加水分解アッセイを用い、トリプシン生体活性についてアッセイした。
結果を、表9に示す。
【０１４９】
【表９】
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【０１５０】
保持された生体活性の割合を、全てのタンパク質が固定された場合に予想される最大値に対して計算した。
表10に示したように、3系統システムにより調製した試料(トリプシンpIに近いタンパク質のpHを持つ)は、2系統システムにおけるよりも、有意に高い生体活性トリプシンの保持につながる。RP-HPLCは、この差異は、微結晶に結合したタンパク質量の変化に相関していることを確認した。従って3系統システムは、生成物へのより少ない量の緩衝液の導入を伴う結合の改善された効率を得る方法を提供する。
【０１５１】
【表１０】
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【０１５２】
実施例6
図13は、領域1〜6を伴う肺の異なる部分を示す画像である。
領域5及び6は、肺の肺胞腔として知られている。粒子サイズ約1μmの微結晶を、肺用装置により領域6へ送達することもできる。粒子サイズ約1〜5μmの微結晶を、肺用装置により領域5へ送達することができる。
【０１５３】
領域3及び4は、肺の大きい有毛大気道腔(large ciliated airways space)として知られている。粒子サイズ約5〜10μmの微結晶を、肺用装置により領域3及び4へ送達することができる。
領域1及び2は、上気道として知られており、ほとんどの状況において、取り込まないので、この領域に微結晶を提供することには適していない。
生体活性分子でコートされた微結晶の製造法を適合することにより、これらの微結晶は、図13に示されたように、領域1〜6のいずれか又はそれらの組合せに優先的に結合するように適合させることができる。
【０１５４】
粒子のサイズに影響を及ぼし得るパラメータは、共沈剤濃度、pH、溶媒、含水量、生体活性分子負荷、温度、添加剤濃度及び混合効率を含む。第一及び第二の水溶液の溶媒への逐次添加が使用される場合、第一のミキサーから第二のミキサーへ溶液が流れる時間を変動することもできる。一部のシステムにおいて、1又は複数のこれらの値は、固定されることが必要であるが、DoEを使用し、残りの可変パラメータの効率的なスクリーニングを実行することができる。これは、サイズ及びそれらの間の何らかの相互作用に最も影響を及ぼすものを同定するために使用することができる。次にこの情報を使用し、パラメータを、反応サーフェスモデリングにより更に洗練し、標的範囲内の粒子サイズを生成すると同時に、生体活性及び結合効率を最適化することもできる。
本発明の態様をここで、添付図面を参照し、単なる例証として説明する：
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図1は、供給業者から受け取った新鮮なトリプシン、並びに2-系統連続流共沈分離装置及び3-系統連続流共沈分離装置により作製されたトリプシンPCMCに関する、ビシンコニン酸(BCA)アッセイの結果を表すグラフである。
【図２】図2は、新鮮なトリプシン、並びに2-系統連続流共沈分離装置及び3-系統連続流共-沈分離装置により作製されたトリプシンPCMCのN-p-トシル-L-アルギニンメチルエステル(TAME)アッセイの結果を示すグラフである。
【図３】図3は、新鮮なトリプシン、並びに2-系統連続流共沈分離装置及び3-系統連続流共沈分離装置により作製されたPCMCに関する、BCA/TAME補正した活性データのグラフである。
【図４】図4は、2-系統連続流共沈分離装置及び3-系統連続流共沈分離装置により作製されたトリプシンでコートされた及びコートされないバリン微結晶の動的光散乱(DLS)から得られた粒子サイズを示す。
【図５】図5は、一連のPCMC及び新鮮なトリプシンのビシンコニン酸(BCA)タンパク質負荷分析の結果を示すグラフである。
【図６】図6は、新鮮なトリプシンに対するトリプシン/DL-バリンPCMCの保持された酵素活性に関するTAME結果を示すグラフである。
【図７】図7は、トリプシン/D,L-バリン微結晶に関するBCA補正された保持された活性を示すグラフである。
【図８】図8は、様々な共沈剤濃度を使用して得られたトリプシンコートされた及びコートされないバリン微結晶の動的光散乱(DLS)で得られた粒子サイズを示す。
【図９】図9は、2-系統連続流共沈分離装置及び3-系統連続流共沈分離装置により形成されたPCMCの異なる沈降速度を示す表示である。
【図１０】図10は、2-系統連続流共沈分離装置により形成されたPCMCの粒子サイズ範囲を示す。
【図１１】図11は、3-系統連続流共沈分離装置により形成されたPCMCに関する粒子サイズ範囲を示す。
【図１２】図12は、本発明に従い形成されたウシIgGでコートされた微結晶のSEM像である。
【図１３】図13は、肺の異なる部分を示す画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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