(57)【要約】  本発明は、治療的に有用な島の供与源としての膵臓を評価する方法に関する。５つの評価基準がリストされる採点システムが記載される。３つの評価基準が肯定的であれば、その膵臓は治療的に有用な島の適切な供与源である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された膵臓が治療的に有用な島の供給源であるか否かを決定する方法であって、
（ｉ）前記単離された膵臓の温虚血（warm ischemia）時間を決定する工程、及び、以下の工程のうち、少なくとも２つの工程を有する、
（ｉｉ）前記単離された膵臓の色を決定する工程、
（ｉｉｉ）前記単離された膵臓の脂肪含有率を決定する工程、
（ｉｖ）前記膵臓中の島の境界区分（demarcation）を決定する工程、及び、
（ｖ）前記単離された膵臓から単離された島の平均サイズを決定する工程、
ここで、
（ａ）（ｉ）の工程において、約１５分未満の温虚血時間には＋１の得点が与えられ、約１５分以上のものには−１の得点が与えられる、
（ｂ）約６０以上の前記色の反射率には＋１の得点が与えられ、約６０未満のものには−１の得点が与えられる、
（ｃ）約２５％未満の脂肪含有率には＋１の得点が与えられ、約２５％以上のものには−１の得点が与えられる、
（ｄ）約５０％以上の境界区分には＋１の得点が与えられ、約５０％未満のものには−１の得点が与えられる、そして
（ｅ）種の平均値以上の島の平均直径には＋１の得点が与えられ、前記種の前記平均値未満のものには−１の得点が与えられ、これにより、
最終の正の得点は、前記膵臓が治療的に有用な島の供給源であることを示す、方法。
【請求項２】
前記（ｉ）の工程、及び前記（ｉｉ）〜（ｖ）の工程の少なくとも３つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｉ）〜（ｖ）の工程のすべてを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ｉ）、及び（ｉｉｉ）〜（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここにその全体を参考文献として合体させる、２００４年１１月１８日出願の出願番号６０／６２９，２２７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、島の収率（yield）の質と量を改善するための方法に関する。島は、動物の膵臓中に見出され、本発明は、膵臓が島の良好な収率を提供するか否かを決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
今日、島補充療法（islet replacement therapy）は、種々の疾患を有する患者の治療のための有効なアプローチであるということが認められている。これらは、上腹部内臓除去を受けているがん患者（ツァキス（Tzakis）他著、Lancet、336：402〜405（1990））；膵臓炎（クレイトン（Clayton）他著、Transplantation、76：92〜98（2003）；ファーニー（Farney）他著、Surgery、110：427〜437（1991）；フォンテス（Fontes）他著、Transplant Proc.、24：2809（1992）；オーベンホルツァー（Obenholzer）他著、Transplantation、69：1115〜1123（2000）；ロバートソン（Robertson）他著、Diabetes、50：47〜50（2001））、そして島移植が１つの治療的選択肢であるインスリン依存患者（ゴス（Goss）他著、Transplantation、74：1761〜1766（2002）；リコルディ（Ricordi）他著、Transplantation、75：1524〜1527（2003）；リャン（Ryan）他著、Diabetes、50：710〜719（2001）；シャピロ（Shapiro）他著、N. Engl. J. Med.、343：230〜238（2000））、を含む。
【０００４】
治療に於ける島の有用性により、上述したように、それらを単離する方法の開発が着目されている。自動化された方法を使用した島の単離に関して多く報告が存在するが（ブランドホースト（Brandhorst）他著、Exp. Clin. Endocrinol Diabetes、103 Suppl. 2：3〜14（1995）；クイ（Cui）他著、Cell Transplant、6：48〜54（2001）；マルチェッティ（Marchetti）他著、Transplantation、52：209〜213（1991）；ミヤモト（Miyamoto）他著、Cell Tranplant、7：397〜402 （1998）；ニールセン（Nielsen）他著, Comp. Med.、52：127〜135（2002）；スワンソン（Swanson）他著、Hum. Immunol.、62：739〜749（2001）；トゥーミー（Toomey）他著、Brit. J. Surg.、80：240〜243（1993）；トソ（Toso）他著、Cell Transplant、9：297〜305（2000）；ウェンバーグ（Wennberg）他著、Transplant Proc.、33：2537（2001））、島の単離がいまだ困難であることは有名である。例えば、ボスタ（Bosta）他著、J. Investig. Med.、43：555〜566（1995）；クリックハーン（Krickhahn）他著、Cell Transplant、11：827〜838（2002）；クリックハーン（Krickhahn）他著, Ann. Transplant、6：48〜54（2001）、オニール（O’Neil）他著、Cell Transplant、10：235〜246（2001）及びホワイト（White）他著、Horm. Metab. Res.、31：579〜524（1999）、これらはすべてこれに関する問題について記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、島の収率の好結果の可能性を最大化するための方法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下の開示内容に記載される本発明は、島の収率の好結果の可能性を最大化するための方法に関する。ここに記載される評価システムを使用することにより、所与の膵臓島単離から、島の良好な収率を獲得する機会を最大化することができることが判った。
【０００７】
本発明は、単離された膵臓が治療的に有用な島の供給源であるか否かを決定する方法であって、
（ｉ）前記単離された膵臓の温虚血（warm ischemia）時間を決定する工程、及び、以下の少なくとも２つの工程を有する、
（ｉｉ）前記単離された膵臓の色を決定する工程、
（ｉｉｉ）前記単離された膵臓の脂肪含有率を決定する工程、
（ｉｖ）前記膵臓中の島の境界区分（demarcation）を決定する工程、及び、
（ｖ）前記単離された膵臓から単離された島の平均サイズを決定する工程、
ここで、
（ａ）（ｉ）の工程において、約１５分未満（less than about 15 minutes）の温虚血時間には＋１の得点が与えられ、約１５分以上（greater than about 15 minutes）のものには−１の得点が与えられる、
（ｂ）約６０以上（above about 60）の前記色の反射率には＋１の得点が与えられ、約６０未満（below about 60）のものには−１の得点が与えられる、
（ｃ）約２５％未満（below about 25%）の脂肪含有率には＋１の得点が与えられ、約２５％以上（above about 25%）のものには−１の得点が与えられる、
（ｄ）約５０％以上（above about 50%）の境界区分には＋１の得点が与えられ、約５０％未満（below about 50%）のものには−１の得点が与えられる、そして
（ｅ）種の平均値以上の島の平均直径には＋１の得点が与えられ、前記種の前記平均値未満のものには−１の得点が与えられ、これにより、
最終の正の得点は、前記少なくとも１つの膵臓が治療的に有用な島の供給源であることを示す、方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
これがいかに達成されるか、以下の開示から理解されるであろう。
【０００９】
以下の例は、それから得られる島が治療的に有用なものであるか否かを決定するために膵臓を評価する方法である本発明の特徴を記載したものである。この方法は、５つの特定の評価基準の内の少なくとも３つを評価し、各評価基準に対して得点を与えるものである。前記値の選択肢は、上述したように、＋１又は−１である。もしも、前記３つの評価の後に、その臓器が＋３の得点を有しているならば、テストを終わらせることができる。というのは、最後の２つの評価基準が−１の得点となったとしても、その臓器が＋１未満（less than +1）の総得点を得ることは不可能であるからである。
【００１０】
もしも、前記５つの評価基準の内の３つの決定後に、その臓器が＋１の得点であったならば、たとえ３種類の決定後で＋１の得点であったとしてもそれによって最終の得点が＋１以上（+1 or greater）になるという保証は無いので、第４のテストが行われることになる。そして、臓器の第４の評価基準が＋１の得点となったならば、その場合には、ここでも、その臓器が４つのテスト後に＋２の得点を有しているのであれば、その臓器がもはや＋１未満の得点になることは不可能であるため、テストは完了したものと見なしてよい。
【００１１】
もしも、４つのテストの後に、臓器の得点が０であるならば、解決的結果（dispositive result）を得るために第５のテストを行うべきである。
【００１２】
反対に、もしも３つのテスト後に臓器の得点が−３であれば、それ以上進める必要は無く、４つのテスト後に−２の得点であれは最後のテストの必要性な無くなる（尚、本発明によれば、３つのテスト後に可能な得点は＋３，＋１、−１，又は−３のみであり、４つのテスト後に可能な得点は＋４，＋２，０，−２又は−４のみであるが、＋４と−４との得点の場合は更にテストする必要性が無くなる。従って、そうすることは望ましいかもしれないが、それは必要ではない）。
【００１３】
最初に行う３つのテストの選択は当業者次第であるが、温虚血時間は調査員の制御下にあるので、これは最初の３つのテストの内の１つとして好適である。最初の３つのテストのその他は当業者の選択に任される。
【００１４】
ここに記載した方法は、非限定的に、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、霊長類、ヒト、魚類（piscine）その他の種を含む、全ての種の膵臓に使用することができる。
【００１５】
本発明によって選択される膵臓から得られる島は、前記例によって示されるように、「そのまま」使用することもできるし、或いは、共にここに参考文献として合体させる米国特許第５，６４３，５６９号及びＲｅ  ３８，０２７号に記載されているようにカプセル化又はマクロビーズ形態で使用してもよい。
【００１６】
本発明のその他の態様は当業者に明らかであろう、従って詳述する必要はない。
【００１７】
ここに使用した用語及び表現は記載のためのものであって限定的なものではなく、これらの用語及び表現を使用するにあたって、図示、記載した特徴構成又はそれらの一部のいかなる均等物も除外する意図はなく、種々の改変構造も本発明の範囲内において可能であると理解される。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１Ａは、本発明の方法を使用して、＋３の得点を有し、従って、有用な膵臓としての資格認定される膵臓の顕微鏡図であり、図１Ｂは−１の得点を有し、資格認定されない膵臓の顕微鏡図である。
【実施例】
【００１９】
好適実施例の詳細な説明
【００２０】
例１
以下の例に使用された動物は産歴の異なる（with multiple parities）２歳以上の雌ブタであった。これらの動物は電気気絶され、失血された。次に、膵臓切開解剖のために内蔵を取り出した。電気気絶から冷ハンクス平衡塩類溶液（“ＨＢＳＳ”）中への膵臓の載置までの時間は、ほぼ１０〜１５分間であった。冷虚血（cold ischemia）の時間は１５〜２０分間であった。
【００２１】
この手順について詳述すると、全膵臓を回収し、次に、約２〜５ｍｍの厚みの生検組織の切片を提供するために、門脈回りの環状輪（annular ring）を、左右の葉の間の接続部で横位切断した。
【００２２】
前記生検組織切片を、リコルディ（Ricordi）他：リコルディ（Ricordi）他著、ed. Pancreatic Islet Cell Transplantation（Austin：R.G. Landes Company, 1992）132〜142：に従って、半分に切断し、ＨＢＳＳ中又はジチゾン溶液（“ＤＴＺ”）中のいずれかに載置した。
【００２３】
次に、前記膵臓を、予め２％の熱不活性化ブタ血清（“ＰＳ”）を添加しておいたＨＢＳＳ中に載置し、その後、島単離のために実験室に搬送した。
【００２４】
次に、膵臓生検組織を、それらが島単離のために適切であるかを決定するべく評価した。５つの変量（variable）を評価した。後述するように、各ケースにおいて、その変量に対して、＋１か−１のいずれかの得点を与えた。
【００２５】
先ず、温虚血（warm ischemia）時間を測定した。これは、失血の開始から膵臓の冷保存溶液中への載置までの時間として定義される。もしもこれが１５分以内（15 minutes, or less）に達成された場合は、＋１の評価を与えた。もしも１５分以上（more than 15 minutes）経過した場合は、−１の評価を与えた。２０分間まで（up to 20 minutes）の温虚血時間によって島の良好な収率が提供されることもあるが、１５分間の温虚血以後は、好結果の可能性が低下する。
【００２６】
第２の評価基準に関して、膵臓の色を観察した。膵臓間の色のバリエーションは、複数の要因の結果かもしれない。例えば、もしも膵臓が例えば動物の感電死や、ストレス応答の結果、静脈性うっ血を示している場合、膵臓は、島ドナーとしてそれを望ましいものとする性質を示さない。これら両方の条件によって、膵臓内での血液の貯留、ヘモグロビンの放出、及び、それの細胞外空間への拡散がもたらされる可能性がある。そして、これによって、臓器の色の変化、通常は、茶色又は紫色、が生じる。
【００２７】
膵臓の色は主観的に観察することができ、当業者であれば暗色の膵臓（これは望ましいものではなく、ａ−１の得点になる）、明色のもの（これは望ましく、ａ＋１の得点になる）を見分けることができるが、より客観的なテストは、入射光に対する反射光の比率、即ち、反射率、に基づいて色を検出する比色計を使用する。もしもこれが約６０未満（less than about 60）であれば、−１の得点が与えられ、約６０を超えれば（above about 60）、＋１の得点が与えられる。
【００２８】
臓器に使用される第３の評価基準は脂肪含有率であった。これを測定するために、約２×２×．５ｃｍの厚みの生検サンプルをＤＴＺ中に約５分間、浸漬した。染色後、組織を、１０×の倍率で手術用顕微鏡観察した。島は赤く見え、脂質組織は緑色に見える。視野を選択し、緑色に見える総面積の比率を推定した。もしも総脂肪含有率が約２５％を超える（above about 25%）場合、その臓器に−１の得点を与え、約２５％未満（less than about 25%）の脂肪含有率は＋１の得点とした。
【００２９】
勿論、臓器の脂肪含有率を測定するためにその他の方法を利用することが可能であり、それら全てをここで使用可能である、と理解される。
【００３０】
使用した第４の評価基準は島境界（demarcation）であった。このパラメータに対して、同じ染色法と観察方法を使用した。直径が５０μｍ以上（greater than 50 μm）である島を境界のために評価した。詳述すると、２つ以上（2 or more）のグループのＤＴＺ染色島細胞が、通常、滑らかで鋭く境界区分された外側島境界／平面であるものを超えて、島の中心から径方向に突出した場合、それによって測定結果は境界不良とされた。もしも５０％以上（more than 50%）の島が良好に境界区分されているならば、この評価基準には、＋１の得点が与えられ、５０％未満（less than 50%）であれば−１とされた。
【００３１】
最後の評価基準は島のサイズであり、これは、考慮対象動物の種の島の平均直径に対する直径として測定された。評価目的のために決定的であることは、考慮対象の臓器の島の平均直径が平均よりも大きい（greater than average）か、否かである。多くの種の場合、島の平均直径は、約１００ミクロンである。これは、ネズミ、ブタ及びヒトの島、その他多くの種の島に当てはまる。上述した検査された島の多くが直径１００μｍ以上（more than 100 μm）であれば、＋１の得点を与え、そうでない場合は、−１の得点を与えた。他方、島の平均直径がブタのそれと異なる場合は、その種の平均直径を参照として使用することになる。例えば、魚の種、ティラピアは、平均で約５ｍｍの直径である非常に大きな島を有することが良く知られている。ティラピアの膵臓が評価対象であれば、カットオフ点は５ｍｍになり、その島の平均直径が５ｍｍ以上（greater than 5 mm）である場合に正の得点が与えられることになるであろう。
【００３２】
これら５つの評価基準の評価を、調べた各膵臓について表にした。もしも総得点が＋１以上（+1 or higher）であれば、その臓器は適当な島ドナーであるとみなされた。
【００３３】
総得点が＋１以上であった１０個の臓器に関する結果例を次の表に示す。
【００３４】
【表１】
2008520240.tif 000002
【００３５】
図１Ａと１Ｂの写真において、比較の目的のために、＋３の得点の膵臓（図１Ａ）と、−１の得点の膵臓（図１Ｂ）との顕微鏡写真が示されている。図１Ａにおいて、大きな島（＞１００μｍ）が明瞭であり、それらの良好な境界区分も明瞭に示されている。これに対して、図１Ｂに図示されている膵臓は小さく、境界が不明瞭な島を示している。
【００３６】
ここに記載のプロトコルの基準では、図１Ｂの膵臓はそれ以上処理されることはないが、以下の例に記載されるように、それは比較の目的のために処理された。
【００３７】
例２
例１に記載した評価に従い、＋１以上の得点の膵臓と、更に、−１の得点の比較用の膵臓とを更に処理した。腺を、脂肪と結合組織のトリミングをし、主膵管に、１６ｇ、ステンレス鋼製の鈍端ニードルをカニュレーションした。コラゲナーゼＰを１．５〜２．０ｇ／ｌの濃度で含有するＨＢＳＳの溶液を、３０℃で５０ｍｌ／ｍｍの速度で灌流し、膵臓重量１ｇあたり２ｍｌの溶液を提供した。
【００３８】
次に、膵臓を、３０℃で、２００ｍｌのコラゲナーゼ溶液と共に、５００ｍｌのＨＢＳＳと２％ＰＳによってカバーした。３９℃でゆっくりと水を外側に循環させることによって臓器を３７℃まであたため、３６〜３７℃の消化温度に維持した。臓器が解離したように見え、手からの圧力（manual pressure）に対してほとんど抵抗を与えなくなった時（総時間約１０〜２０分間後、及び３７℃に達した後、５〜１０分間）、消化を停止した。
【００３９】
次に、収集された消化物（digestate）を遠心分離にかけ、上清を吸引し、得られたペレットを１０％  ＰＳと臓器保存溶液中に懸濁させた。次に、島を、５０ｍｌの試験管中で、１．１０５、１．０９５、１．０８５及び１．０５ｇ／ｃｍ３の濃度勾配、ＨＢＳＳプラス２％  ＰＳ、不連続フィコールで精製した。試験管を４℃にて、６５０ｇで遠心分離にかけ、島を含む層を収集し、ＨＢＳＳプラス１０％ＰＳ中で３回洗浄し、その後、手術用顕微鏡を使用して、マニュアルで、それらから島以外の組織を精製した。島を再懸濁し、２つの０．５ｍｌのサンプルを、島収率を計数するために使用した。
【００４０】
図１Ａと図１Ｂとに図示の膵臓の場合、例えば、ａ＋３の値の膵臓の収率は、９８．８％の純度で、約１０５，０００ＥＩＮ（前述のリコルディ（Ricordi）他によって定義されている等価島数（Equivalent Islet Number））であった。これに対して、図１Ｂの臓器からの収率は、４４，０００ＥＩＮであった。
【００４１】
表１の１０の膵臓の平均収率は、実際に、１３０，０００ＥＩＮであり、その消化された組織１ｇあたりの平均は、１，１０１ＥＩＮであった。純度は、全てのケースにおいて、９０％以上（over 90%）であった。前記臓器のうち９つにおいて、島生存率は８９％以上（greater than 89%）であった。これらの測定の方法については後述する。
【００４２】
例３
島の単離後、上述した、純度、生存率、を含む種々のパラメータを測定した。
【００４３】
約５００ＥＩＮを１０分間、ＤＴＺで染色することによって純度を評価し、次に、手術用顕微鏡とデジタルカメラとを使用して標準的な画像分析を行った。
【００４４】
サンプルをフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）とエチジウムブロミド（ＥＢ）とによって染色することによって生存率を測定した。詳述すると、約５００ＥＩＮを１ｍｌ  ＲＰＭＩ、１０％  ＰＳ及び１％ 抗生物質／抗真菌剤（“Ａ／Ａ”）に添加した。次に、１０ｍｇのＦＤＡと１ｍｌのアセトンとによって作成しておいた２０μｌのＦＤＡ染色剤と、３０μｌのＥＢと１ｍｌのＰＢＳとで作成しておいた２００μｌのＥＢとを添加した。島を、暗所で７分間染色し、その後、１０〜５０の島のランダムサンプルを、蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影し、標準画像分析を使用して生存率を測定した。
【００４５】
約５００ＥＩＮを酸性アルコール抽出液（７．２ｍｌの１Ｎ  ＨＣＬ、４００ｍｌの１００％変性エタノール）中に入れることによって前記島のインスリン含有率も測定した。サンプルを−２０℃で保存し、インスリンＲＩＡを行った。
【００４６】
【表２】
2008520240.tif 000003
【００４７】
例４
この例と、以下の例とは、記載したようにして有用であると認められ単離された島がマクロビーズに使用することが可能であるか否かという問題に関する。
【００４８】
精製された島を、２０００ＥＩＮ／ｍｌの量に対して、ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＰＳ＋１％  Ａ／Ａ中に再懸濁した。これらの島を、試験管中において均等に分布させ、各試験管が２０００ＥＩＮの懸濁液を１ｍｌ含むようにした。
【００４９】
重力による沈殿後、上清を除去し、各サンプルに対して、最小必須培地プラス２．５％  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に調製した、５０℃にて１．５％アガロース０．５ｍｌを添加し、均等に混合した。次に、懸濁液を、滅菌ミネラルオイル下で排出（expelled）し、平滑な表面で均等な島分布を有する４つのビーズを作成した。
【００５０】
マクロビーズ取り出し、２回洗浄（ＲＰＭＩ＋５％  ＰＳ＋１％  Ａ／Ａ）した。これらのマクロビーズを、加湿５％  ＣＯ２雰囲気中で５〜７日間、同じ溶液中で培養し、その後、それらを、ＲＰＭＩ＋１％  Ａ／Ａ中で３回洗浄し、その後、第２のアガロースのコーティングを行った。このために、６０℃にて、ＭＥＭ、プラスＨＥＰＥＳ緩衝液中の、０．５ｍｌの５ ％アガロースをピペットによって殺菌プラスチックスプーンに移し、各マクロビーズを３〜５回ローリングして、均一な第２のアガロースコーティングを形成した。平滑な表面を形成するために殺菌ミネラルオイルに移し変えた後、前記マクロビーズを取り出し、ＲＰＭＩ＋２．５％  ＰＳ＋１％  Ａ／Ａ中で２回洗浄し、加湿５％  ＣＯ２プラス空気中で、３７℃にてインキュベートした。
【００５１】
カプセル封入された島を含む前記マクロビーズを、６ヶ月間以上に亘って生存しつづけるかを測定したが、その期間の間、ラジオイムノアッセイによって、それらは良好なレベルのインスリンを産生しつづけていることが示された。
【００５２】
例５
この例は、上述したようにして単離された島がイン・ヴィヴォで作用するか否かという問題に関する実験について記載する。
【００５３】
オスの非肥満性糖尿病ＣＢ１７−ＰｒＫｄｃ＜ｓｃｉｄ＞／Ｊ  ｍｉｃｅ、７〜９週齢、を使用した。一週間の馴化後、動物に、糖尿病を誘発する２７５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを与えた。９日後、それらの血中グルコースレベルが４８０ｍｇ／ｄｌ以上で平均化したとき、それらのインスリン療法を開始した。
【００５４】
ストレプトゾトシン投与後の３４〜３５日目、動物に約１０００ＥＩＮのブタ島を与えた。それらは、ここに参考文献として合体させるボーウェン（Bowen）他著、Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.,、58：441〜447（1980）に従って、血塊（blood clot）中に移植された。簡単に説明すると、島を懸濁液からペレット化し、培地を吸引した。次に、約５〜１０μｌの血液を動物から取り出し、島に添加し、凝塊させた。前記レシピエント動物を、等量のケタミン（１６７ｍｇ／ｄｌ）と、キシラジン（３３ｍｇ／ｍｌ）と生理食塩水とで麻酔した。前記混合物を０．５ｍｌ／１００ｇの投与量で皮下投与した。左側腹部に小さな切開を形成して腎臓を露出させ、手術用顕微鏡を使用して腎臓の被嚢（capsule）に小さな切開を形成した。次に、カプセルを腎臓から分離し、島／血塊を被嚢の下に置き、切開部を閉じて動物を回復させた。
【００５５】
前記移植の３８〜３９日後に前記動物に対して腎摘出を行った。簡単に説明すると、麻酔後、移植片を担持する腎臓を露出させ、腎血管を結さつし、各動物の腎臓を除去した。５日後、動物を犠牲にし、完全な島ベータ細胞破壊を組織学的に確認するために膵臓を回収した。
【００５６】
組織サンプルを１０％中性緩衝組成物中に２４時間載置し、その後、７０％エチルアルコールに移した。
【００５７】
この後、前記組織をパラフィンに封埋し、５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。膵臓と移植腎臓切片とを、標準方法を使用してインスリン、及びグルカゴン含有細胞に対して染色し、次に、それらを調べた。
【００５８】
全てのマウスは、島移植後に、正常血糖になった。腎摘出後、全てのマウスは４日間以内に過血糖になった。
【００５９】
以上の例は、それから得られる島が治療的に有用なものであるか否かを決定するために膵臓を評価する方法である本発明の特徴を記載したものである。この方法は、５つの特定の評価基準の内の少なくとも３つを評価し、各評価基準に対して得点を与えるものである。前記値の選択肢は、上述したように、＋１又は−１である。もしも、前記３つの評価の後に、その臓器が＋３の得点を有しているならば、テストを終わらせることができる。というのは、最後の２つの評価基準が−１の得点となったとしても、その臓器が＋１未満（less than +1）の総得点を得ることは不可能であるからである。
【００６０】
もしも、前記５つの評価基準の内の３つの決定後に、その臓器が＋１の得点であったならば、たとえ３種類の決定後に＋１の得点であったとしてもそれによって最終の得点が＋１以上（+1 or greater）になるという保証は無いので、第４のテストが行われることになる。そして、臓器の第４の評価基準が＋１の得点となったならば、その場合には、ここでも、その臓器が４つのテスト後に＋２の得点を有しているのであれば、その臓器がもはや＋１未満の得点になることは不可能であるため、テストは完了したものと見なしてよい。
【００６１】
もしも、４つのテストの後に、臓器の得点が０であるならば、解決的結果（dispositive result）を得るために第５のテストを行うべきである。
【００６２】
反対に、もしも３つのテスト後に臓器の得点が−３であれば、それ以上進める必要は無く、４つのテスト後に−２の得点であれは最後のテストの必要性な無くなる（尚、本発明によれば、３つのテスト後に可能な得点は＋３，＋１、−１，又は−３のみであり、４つのテスト後に可能な得点は＋４，＋２，０，−２又は−４のみであるが、＋４と−４との得点の場合は更にテストする必要性が無くなる。従って、そうすることは望ましいかもしれないが、それは必要ではない）。
【００６３】
最初に行う３つのテストの選択は当業者次第であるが、温虚血時間は調査員の制御下にあるので、これは最初の３つのテストの内の１つとして好適である。最初の３つのテストのその他は当業者の選択に任される。
【００６４】
ここに記載した方法は、非限定的に、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、霊長類、ヒト、魚類（piscine）その他の種を含む、全ての種の膵臓に使用することができる。
【００６５】
本発明によって選択される膵臓から得られる島は、前記例によって示されるように、「そのまま」使用することもできるし、或いは、共にここに参考文献として合体させる米国特許第５，６４３，５６９号及びＲｅ  ３８，０２７号に記載されているようにカプセル化又はマクロビーズ形態で使用してもよい。
【００６６】
本発明のその他の態様は当業者に明らかであろう、従って詳述する必要はない。
【００６７】
ここに使用した用語及び表現は記載のためのものであって限定的なものではなく、これらの用語及び表現を使用するにあたって、図示、記載した特徴構成又はそれらの一部のいかなる均等物も除外する意図はなく、種々の改変構造も本発明の範囲内において可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】本発明の方法を使用して、＋３の得点を有し、従って、有用な少なくとも１つの膵臓としての資格認定される膵臓の顕微鏡図
【図１Ｂ】本発明の方法を使用して、−１の得点を有し、従って、資格認定されない膵臓の顕微鏡図
【図１】
2008520240.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月20日(2007.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された膵臓が治療的に有用な島の供給源であるか否かを決定する方法であって、
（ｉ）前記単離された膵臓の温虚血（warm ischemia）時間を決定する工程、及び、以下の工程のうち、少なくとも２つの工程を有する、
（ｉｉ）前記単離された膵臓の色を決定する工程、
（ｉｉｉ）前記単離された膵臓の脂肪含有率を決定する工程、
（ｉｖ）前記膵臓中の島の境界区分（demarcation）を決定する工程、及び、
（ｖ）前記単離された膵臓から単離された島の平均サイズを決定する工程、
ここで、
（ａ）（ｉ）の工程において、約１５分未満の温虚血時間には＋１の得点が与えられ、約１５分以上のものには−１の得点が与えられる、
（ｂ）約６０以上の前記色の反射率には＋１の得点が与えられ、約６０未満のものには−１の得点が与えられる、
（ｃ）約２５％未満の脂肪含有率には＋１の得点が与えられ、約２５％以上のものには−１の得点が与えられる、
（ｄ）約５０％以上の境界区分には＋１の得点が与えられ、約５０％未満のものには−１の得点が与えられる、そして
（ｅ）種の平均値以上の島の平均直径には＋１の得点が与えられ、前記種の前記平均値未満のものには−１の得点が与えられる
ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程のうち、３つの工程の実施の後、＋１、又は−１の得点が得られた場合には、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程の４番目の工程を実施し、そして、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程の４番目の工程の実施後、０の得点が得られたら、５番目の工程を実行する、方法。
【請求項２】
前記（ｉ）の工程、及び前記（ｉｉ）〜（ｖ）の工程の少なくとも３つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｉ）〜（ｖ）の工程のすべてを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）、及び（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ｉ）、及び（ｉｉｉ）〜（ｖ）の工程を含む請求項２に記載の方法。
【国際調査報告】
2008520240.tif 000005