(57)【要約】【課題】パーキンソン症候群(Parkinsonism)または卒中に起因するとされるような神経障害によって惹起される損傷の修復には、満足できる方法がない。ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から生じる神経学的欠損の治療が求められている。【解決手段】本発明は、ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損の治療法において、ドーパミン作動性表現型に分化する能力を有する細胞群を実際に当該ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量で、ヒト組換えGDF5をヒトの線条体または黒質緻密部に投与することによる神経学的欠損の治療法、および、この治療法での使用に適した神経栄養組成物およびマトリックスに向けられたものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損を治療する方法において、
ドーパミン作動性表現型に分化する能力を含む細胞群を実際に前記ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量で、GDF5-HRを前記ヒトの前記線条体または前記黒質緻密部に投与する段階、
を含む、方法。
【請求項２】
ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損の治療に適した神経栄養組成物において、
ドーパミン作動性表現型に分化する能力を含む細胞群を実際に前記ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量のGDF5-HRと、
ソニックヘッジホッグと、
FGF8と、
生理的に受容可能なキャリアと、
を含む、神経栄養組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の神経栄養組成物において、
前記GDF5-HRが、MP52、BMP-14、およびCDMP-1から成る群から選択される、
組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、
前記GDF5-HRが、MP52を含む、
組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物において、
前記神経栄養組成物が、約0.5〜約1,000ナノグラムの前記MP52を含む、
組成物。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物において、
ソニックヘッジホッグ、およびFGF8、
をさらに含む、組成物。
【請求項７】
請求項２に記載の組成物において、
ソニックヘッジホッグ、およびFGF8、
をさらに含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損を、ヒト組換えGDF5の線条体または黒質緻密部への投与により治療する方法、また、当該治療法での使用のためのヒト組換えGDF5を含有する組成物およびマトリックスに向けられる。
【０００２】
〔発明の背景〕
パーキンソン病（パーキンソン症候群(Parkinsonism)）、または卒中に起因するとされるような神経障害（neuropathies）によって惹起される損傷の修復には、満足できる方法がない。パーキンソン病は、振顫（tremor）、硬直、運動緩慢、運動低下などの神経障害、および、平衡および姿勢における他の障害から成る症候群である。パーキンソン病は、神経系の老化に伴うことがしばしばである。同様に、卒中が、運動系を冒し、患者は片側不全麻痺または麻痺の徴候を呈する場合がある。
【０００３】
黒質は、パーキンソン病の主たる病変部位である。黒質の色素性ニューロンは、尾状核-被殻(線条体)に広範囲に瀰漫的に突出しており、ドーパミンの合成および放出を専門に行う。ドーパミン作動性神経支配の75〜80％が破壊されると、パーキンソン症候群の徴候が現れる。パーキンソン病患者は、ドーパミン置換療法（dopamine replacement therapy）に反応する。不運なことに、ドーパミン置換療法の効果は、黒質線条体ドーパミン作動性経路の持続的変性とともに、漸進的に低下する。
【０００４】
幹細胞の特定が、再生医学に対する特異的細胞型の選択的発生を目標とする研究を促した。パーキンソン病治療用ドーパミン作動性(DA)ニューロン、ALS治療用運動ニューロン、および、MS治療用オリゴデンドロサイトなど、治療関連細胞型への幹細胞の方向付け分化に関してプロトコルが作成されているが、幹細胞からのかなりの数のこれらの細胞型の効率的な発生は、まだ報告されていない。中脳DAニューロンマーカーの完全補体（full complement）を発現する無限の数のDAニューロンを発生する能力は、パーキンソン病治癒を提供するための重要な役割である。よって、幹細胞のDA系への分化の刺激に利用されることができる作用物質は、パーキンソン病、ならびに、中大脳動脈(MCA)およびその支流を冒す卒中に対して、外因性幹細胞、内因性幹細胞双方を利用し、分化させる可能性、を提供する。
【０００５】
他の場合、脳および/または脊髄の急性または神経変性の病巣の作用に対抗する試みは、主に、喪失または欠損した神経機能を代償しようとして胚ニューロンの移植を含んだ。しかし、ヒト胎児細胞移植の研究は、厳しく制限されている。神経成長因子およびインスリン-様増殖因子などの神経栄養因子の投与も、中枢神経系(CNS)内でニューロン増殖を刺激することが示唆されている。例えば、ルンドボーグ（Lundborg）,「アクタ・オーソピーディカ・スカンディナヴィカ（Acta Orthop. Scand.）」 58: 145〜169 (1987); 米国特許第5,093,317号を参照されたい。神経栄養因子のCNSへの投与は、血液脳関門の迂回を必要とする。当該関門は、直接注入によって、あるいは、化学修飾または共役、または、分子切断によるなど、分子を修飾して、当該分子の当該関門を越える運搬を増強することによって、克服されることができる。TGF-β超科[キングスレー（Kingsley）,「ジーン・アンド・ディベロプメント（Genes & Development）」 8 133〜146 (1994)]、および、それに引用された文献からの多くの増殖因子が、特に、創傷治癒および組織再生に関する広範囲な内科的治療法および適用に適している。これらの多機能タンパクの一部は、多くの細胞型における増殖および分化の調節などの機能に加えて、ニューロンに対する生存促進作用も有する[ロバーツおよびスポーン（Roberts and Sporn）,「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・ファーマコロジー（Handbook of Experimental Pharmacology）」 95 419〜472, スポーンおよびロバーツ（Sporn and Roberts）編集(1990); サクライ他（Sakurai et al.）, 「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」, 269 14118〜14122 (1994)]。よって、例えば、胚の運動ニューロンおよび感覚ニューロンへの栄養効果が、生体外でTGF-βについて実証された[マーティノウ他（Martinou et al.）, 「ディベロプメンタル・ブレイン・リサーチ（Devl. Brain Res.）, 52 175〜181 (1990); シャラゾニティス他（Chalazonitis et al.）, 「ディベロプメンタル・バイオロジー（Dev. Biol.）」, 152 121〜132 (1992)]。さらに、中脳のドーパミン作動性ニューロンに対する生存促進作用が、タンパクTGF-β-1、-2、-3、アクチビンAおよびGDNF(グリア細胞系由来神経栄養因子)、TGF-β超科構成物への構造類似性を有するタンパクについて認められたが、これらの作用は、アストロサイトによって介在されなかった[クリーグルスタイン他（Krieglstein et al.）, 「ＥＭＢＯジャーナル（EMBO J.）」, 14, 736〜742 (1995)]。各種の組織および発達段階でのTGF-β超科タンパクの発生は、当該タンパクの正確な機能に関する差、ならびに、標的部位、寿命、補助因子の必要性、必要な細胞の生理的環境および/または変性への耐性と対応する。
【０００６】
GDF5は、新生ラットの中脳に発現され、GDF5がドーパミン作動性ニューロンの発達に役割を果たすことが示唆されている[クリーグルスタイン他（Krieglstein et al.）, 「ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（J. Neurosci. Res.）」, 42 724〜32 (1995)]。生体外での研究は、MP52が、ラット胎仔ドーパミン作動性ニューロンに対する生存促進作用を有し、毒素1-メチル-4-ピリジニウム(MPP+)から当該ニューロンを保護することを実証した。さらに、生体内での研究は、GDF5の実質内注射が、成熟ラットの黒質線条体ドーパミン作動系を内側前脳束の6-ヒドロキシドーパミン(6OHDA)病変により誘発される死滅から保護することを実証した[サリバン他（Sullivan et al.）, 「ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Eur. J. Neurosci.）」, 233 73〜6 (1997)]。しかし、当該研究は、GDF5が、ドーパミン作動性大脳辺縁系の発達と保護に重要な役割を果たすようであると指摘している一方で、当該研究は、神経再生能、あるいは内因性または外因性細胞群分化能に対するGDF5の関連性を提起もしくは明らかにしていない。
【０００７】
従って、ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から生じる神経学的欠損の治療が求められている。本発明は、このように生じた欠損の治療または防止を可能にするように、ヒト組換えGDF5を利用することを追求する。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から生じる神経学的欠損の治療法において、ドーパミン作動性表現型に分化する能力を有する細胞群を誘導し、実際に当該ドーパミン作動性表現型に細胞を分化させるのに有効な量でヒト組換えGDF5をヒトの線条体または黒質緻密部に投与する段階を含む前記神経欠損の治療法、および、前記欠損の治療に適したヒト組換えGDF5を含む組成物およびマトリックスに向けられたものである。
【０００９】
〔発明の詳細な説明〕
神経発生は、成人の海馬、脳室下帯、黒質および嗅球で実証されている。よって、これらの細胞を動員し、および/または、DA特異的ニューロンに分化させる作用物質は、パーキンソン病の原因とされるヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から生じる神経学的欠損の治療における細胞置換の提供に不可欠である。本発明の治療法および組成物では、内因性、外因性にかかわらず、幹細胞群または前駆細胞群を分化させるための分化前（pre-differentiation）の薬剤または分化剤（differentiation agent）として、ヒト組換えGDF5が用いられる。本発明は、少なくとも一部は、ヒト組換えGDF5が、成熟神経海馬前駆細胞を選択的に誘導し、ドーパミン作動性表現型に分化させる神経栄養因子であるという発見に基づく。本明細書に記述されるデータは、ヒト組換えGDF5が神経幹細胞分化の強力な誘導物質であることを実証している。よって、これらの結果は、神経保護機能に加えて、神経再生機能を提供するためのヒト組換えGDF5の相乗的有用性を実証するものである。
【００１０】
GDF5は、増殖因子および分化因子として機能するタンパクである。当該タンパクは、哺乳動物において自然状態で認められることができる。自然界に産するヒトGDF5は、本明細書で詳細に説明されるように、また、当業者が理解するように、修飾、精製され、または、別途、処理され、ヒト組換えGDF5を形成することができる。「ヒト組換えGDF5」は、本明細書では、GDF5-HRと総称されることとする。既知のGDF5-HRタンパクは、BMP-14、CDMP-1およびMP52を含む。
【００１１】
MP52は、ドイツのハイデルベルグに事業所を有するドイツ企業バイオファームＧｍｂＨ（Biopharm GmbH）から入手でき、1994年にTGF-β遺伝子超科に属する骨形成因子として、そのcDNAが初めて単離された。MP52は、N-末端がアラニンのアミノ酸残基120個を有するタンパクで、そのアミノ酸配列は、WO93/16099およびWO95/04819に報告されている。MP52が他の骨形成因子と同様の骨形成に関与することは、各種動物実験から明らかである。
【００１２】
MP52が神経幹細胞分化の強力な誘導物質であることが発見されて以来、MP52は、神経変性疾患、特にパーキンソン病、または、中大脳動脈(MCA)およびその支流を冒す卒中に惹起される損傷、に起因するとされるヒトの線条体または黒質緻密部の神経学的欠損の治療に有用であろうということが確定している。我々は、MP52単独で、海馬から単離された成熟神経前駆細胞のドーパミン作動性表現型への分化を刺激できることを認めたが、MP52は、作用薬と配合され、神経幹細胞での、または、ドーパミン作動性表現型への分化能を有する他の細胞での増大されたドーパミン作動性分化を誘導することができる。例えば、MP52は、ソニックヘッジホッグ(SHH)または線維芽細胞増殖因子8(FGF8)と併用して利用することができ、神経幹細胞と、表現型がドーパミン作動性になる本明細書記述の他の細胞の、有意に増強された誘導法を提供する。SHHは、Wnt シグナリング経路（Wnt signaling pathway）の必須部分である。この発達経路で重要な他の因子は、GDF5-HRと併用することでニューロン形成に重要であると考えられる。
【００１３】
GDF5-HRは、海馬前駆細胞または海馬幹細胞、または、ドーパミン作動性表現型に分化させる能力を有する他の細胞など、種々の成熟神経前駆細胞以外の幹細胞形態を分化させるのにも使用されることができる。これらの他形態の細胞は、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚幹細胞(ESC)、胚幹細胞由来前駆細胞、分娩後由来（postpartum-derived）幹細胞または前駆細胞、臍帯または胎盤組織由来細胞、筋肉由来幹細胞または前駆細胞、膵臓由来幹細胞または前駆細胞、辺縁由来（limbal-derived）幹細胞または前駆細胞、網膜由来幹細胞または前駆細胞、および、肝臓由来幹細胞または前駆細胞を含むが、それらに制約されない。
【００１４】
GDF5-HRは、ヒトの線条体または黒質緻密部の神経学的欠損の治療において細胞群を誘導し、分化させる神経栄養因子として単独で使用されることができる。神経栄養（neurotrophic）という用語は、本明細書で使用される場合、細胞を回復させ、再生し、および分化させる可能性を含むと定義される。また、タンパクが、神経栄養組成物に取り込まれ、あるいは、送達または支持系として作用する適切なマトリックスと合わせて使用されることができる。当該神経栄養組成物は、有効量のGDF5-HRを含むことになる。有効量とは、ドーパミン作動性表現型に分化する能力を含む細胞群を実際に前記ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量を意味する。本発明の神経栄養組成物は、約0.5〜約1,000ナノグラムのMP52、または、約0.5〜約200ナノグラムのMP52を含むことができる。
【００１５】
神経栄養組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性溶媒にGDF5-HRを固定、混合、溶解または懸濁することによって入手されることができる。例えば、キャリアまたは水性溶媒の適切な例は、臨床級の滅菌水（clinical grade sterile water）、滅菌食塩水、滅菌リン酸緩衝食塩水、滅菌水中デキストロース、滅菌液体培地または他の生理的に受容可能な等張液を含むが、それらに制約されない。さらに、本発明の神経栄養組成物は、安定化剤、防腐剤、増粘剤、可溶化剤など、多様な薬理学的に受容可能な添加剤を含有でき、これらは、前記キャリアまたは水性溶媒と配合されることができる。
【００１６】
GDF5-HRは、送達または支持系として作用する適切なマトリックスと合わせて使用されることができる。成果が得られるGDF５-HR用マトリックスは、望ましくは、数種の重要な機能を発揮する。当該マトリックスは、望ましくは、GDF5-HRを結合し、緩徐なまたは持続的な放出送達系として作用し、分化中、細胞応答の各段階を調節する。当該マトリックスは、送達部位からのGDF5-HRの拡散を防止し、よって、送達細胞へのGDF5-HRの作用を局在化させると思われる。さらに、選択されるマトリックス材料は、生体内で生体適合性があり、多孔性で、好ましくは生分解性であることが必要である。生分解性という用語は、本明細書で使用される場合、生体内の生理的条件下で、分解または破壊され(化学的に、もしくは、物理的に)、それによって、分解産物が生体によって排出可能または吸収可能である材料を含むと定義される。生分解速度は、いったん線条体または黒質緻密部に埋め込まれると、所望の放出速度に従って変動することができる。当該マトリックスは、望ましくは、新たに成長した神経組織によって置換されるまで、仮の足場としても作用する。そのため、ある実施態様では、当該マトリックスは、神経栄養因子成分の持続放出を、当該因子を必要とする患者に提供し、また、当該患者における発達組織の増殖のための構造を提供できる。当該マトリックスは、微粒子形態(直径10ミクロン以上の大粒子または直径10ミクロン未満の微粒子)であることができ、あるいは、構造的に安定な、三次元インプラント(例、足場)の形態であることができる。当該インプラントは、例えば、立方体、円柱、管、ブロック、フィルム、シート、または、適当な解剖学的形態であることができる。
【００１７】
生体内生分解性ポリマーの機械的性能に影響する因子は、ポリマー科学者に周知であり、モノマーの選択、初期プロセス条件および添加剤の存在を含む。生分解は、主鎖中に不安定な結合、または、生体内で安全に酸化もしくは加水分解されることができる結合を有するポリマーを合成することによって達成された。この特性を有する最も一般的な化学官能基は、エーテル、エステル、無水物、オルトエステルおよびアミドである。そのため、本発明のある実施態様では、GDF5-HRは、生分解性ポリマーマトリックスから、生分解性ポリマー中の化学結合の加水分解によってGDF5-HRが必要とされる部位へ制御可能に放出される。生分解性ポリマーマトリックスは、好ましくは、粉末、微粒子、微小球、細長小片、原位置で重合可能なゲル（in situ polymerizable gel）などのゲル、ウェブまたはスポンジの形態である。
【００１８】
前記生体適合性マトリックスは、天然、修飾天然または合成生分解性ポリマーから構成されることができ、これらポリマーは、ホモポリマー、コポリマーおよびブロックポリマー、ならびに、それらの組合せを含む。ポリマーは、当該ポリマーが一般に合成されるモノマーに基づいて名付けられる点が注目される。
【００１９】
適切な生分解性ポリマーまたはポリマー種（polymer classes）の例は、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、再形成基底膜マトリックス、デンプン、デキストラン、アルギニン酸塩、ヒアルロン、キチン、キトサン、アガロース、多糖類、ヒアルロン酸、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリエチレングリコール、脱細胞化組織（decellularized tissue）、自己組織化ペプチド（self-assembling peptides）、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、それらの誘導体およびそれらの混合物を含む。グリコール酸、乳酸の両方の場合、典型的には、中間環式二量体が調製され、重合前に精製される。これらの中間二量体は、それぞれグリコリドおよびラクチドと呼ばれる。他の有用な生分解性ポリマーまたはポリマー種は、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリオキサレート、ポリ(α-エステル)、ポリアンヒドリド、ポリアセテート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル)、ポリアミノ酸、ポリアミドおよびそれらの混合物およびコポリマーを含むが、それらに制約されない。さらなる有用な生分解性ポリマーは、L-乳酸およびD-乳酸のステレオポリマー、ビス(パラ-カルボキシフェノキシ)プロパン酸とセバシン酸のコポリマー、セバシン酸コポリマー、カプロラクトンのコポリマー、ポリ(乳酸)/ポリ(グリコール酸)/ポリエチレングリコールコポリマー、ポリウレタンとポリ(乳酸)のコポリマー、ポリウレタンとポリ(乳酸)のコポリマー、α-アミノ酸のコポリマー、α-アミノ酸とカプロン酸のコポリマー、α-ベンジルグルタメートとポリエチレングリコールのコポリマー、コハク酸塩とポリ(グリコール)のコポリマー、ポリフォスファゼン、ポリヒドロキシ-アルカノエートおよびそれらの混合物を含むが、それらに制約されない。二成分系および三成分系も考慮される。
【００２０】
一般に、前記マトリックスとしての使用に適した生分解性ポリマーは、望ましくは、当該ポリマーが意図する適用に適した機械的性状を有し、組織が内部増殖し、治癒するまで十分に無傷のままであり、炎症反応または有毒反応を引き起こさず、目的達成後に体内で代謝され、形成されるべき所望の最終製品への加工が容易であり、受容可能な貯蔵寿命を示し、滅菌が容易であるように構成される。
【００２１】
本発明のある態様では、前記マトリックスの形成に使用される前記生体適合性ポリマーは、ハイドロゲルの形態である。一般に、ハイドロゲルは、架橋ポリマー材であり、明らかな三次元構造を維持しながら、水中で重量の20％余りを吸収できる。この定義は、水性環境で膨潤する乾燥架橋ポリマー、ならびに、水膨潤材料を含む。親水性ポリマーのホストは、当該ポリマーが生物由来であっても、半合成品であっても、完全合成品であっても、架橋され、ハイドロゲルを生成することができる。当該ハイドロゲルは、合成ポリマー材料から生成されることができる。当該合成ポリマーは、一連の特性および予測可能なロット間一様性になるように調整され、一般に免疫原性の懸念のない信頼できる材料源であることができる。当該マトリックスは、米国特許第5,670,483号および第5,955,343号、米国特許出願第2002/0160471号、 PCT出願WO02/062969で論じられているもののように、自己組織化ペプチドから形成されるハイドロゲルを含む。
【００２２】
薬剤送達の適用においてハイドロゲルを価値あるものにする特性は、平衡膨潤度、吸着速度論、溶質透過性、および、それらの生体内での性能特性を含む。GDF5−HRを含めた化合物への透過性は、一部には、膨潤度または水分量および生分解速度に左右される。ゲルの機械的強度は、膨潤度に正比例して減少するので、複合系（composite system）が機械的強度を高めるように、ハイドロゲルが基質に付着されることができる点も、十分に本発明実施の範囲内である。別の実施態様では、当該ハイドロゲルは、GDF5-HRに対する当該ハイドロゲルの有用な送達性とともに、多孔性基質内に浸含され、それによって、当該基質の機械的強度を高めることができる。ある実施態様では、黒質緻密部または線条体へのGDF5-HR、または、GDF5-HRを含む神経栄養組成物、または、GDF5-HRを含むマトリックスの直接実質内注射は、前駆細胞または幹細胞の残留プールの分化を促進し、当該神経前駆細胞または幹細胞の局所的なニッシェをドーパミン作動系に分化させるのに有効であることができる。
【００２３】
別法として、GDF5-HR神経栄養組成物および/またはGDF5-HRを含むマトリックスは、直接の埋め込み、マイクロカテーテル、カテーテル内挿入(intracatheterization)、または、ミニポンプによって部位に送達されることができる。当該GDF5-HR組成物および/またはマトリックスは、クモ膜下内送達によって、または、脳室内、あるいは、経鼻投与によって、黒質緻密部または線条体に間接的に送達することもできる。ビヒクル、賦形剤またはキャリアは、患者、特に、細胞分化が誘導されるべき部位への局所的な投与に対して薬学的に受容可能であることが周知のいずれかの物質であることができる。例は、液体培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、滅菌食塩水、滅菌リン酸緩衝食塩水、リーボビッツ培地（Leibovitz's medium）(L15、インビトロジェン社（Invitrogen）, カリフォルニア州カールズバッド)、滅菌水中デキストロース、および、いずれかの他の生理的に受容可能な液体を含む。黒質緻密部への好ましい送達法は、例えば、F.バリスおよびD.ポプラック（F. Balis & D. Poplack）, 「アメリカン・ジャーナル・オブ・ぺディアトリック・ヘマトロジカル・オンコロジー（Am. J. Pediatric. Hematol. Oncol.）」 1 l(l):74〜86. (1989)で説明されているものなど、周知の技術に従ったオマヤレザバーによるクモ膜下内または脳室内投与である。はるかに好ましい黒質緻密部への送達法は、マイクロカテーテルを介した直接実質内注射による。
【００２４】
別の実施態様では、GDF5-HRは、埋め込み前の成熟幹細胞または前駆細胞の前処置に使用され、あるいは、埋め込み前に装置中で、当該細胞と組み合わせて添加され、脳内の細胞群中のこれらの転写物の生体内での上方調節を誘導する、または、別法として、脳内での神経幹細胞または前駆細胞プールの分化を強制的に行わせることができる。よって、これらの条件が利用され、線条体または黒質で、埋め込み前に、神経幹細胞もしくは前駆細胞、または他の幹細胞もしくは前駆細胞、または本明細書に記述される他の細胞を含めて、細胞プールを前処理することができる。例えば、海馬神経幹細胞は、GDF5-HRを有する適切なマトリックス/足場上で分化され、その分化した形態で線条体または黒質緻密部に直接移植されることができる。
【００２５】
本発明のいくつかの態様をさらに詳細に説明するために、以下のサンプルが提供されるが、このサンプルは、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００２６】
〔実施例１〕
成熟ゲッ歯類海馬神経前駆細胞の、ドーパミン作動性表現型へのMP-52誘導分化
これまでに発表されている方法[スヴェンソン他（Svendson et al.）, 「ネイチャー・リビューズ・ジェネティクス（Nat Rev Genet.）」, 5(2) 136〜44 (2004)]に従って、成熟ラットの脳から成熟ゲッ歯類海馬神経前駆細胞が単離された。単離細胞は、ラミニン被覆24ウェル組織培養プレート(ベクトン・ディクソン社（Becton Dickson）,マサチューセッツ州ベッドフォード)に細胞1,000個/cm2で接種された。
【００２７】
接種細胞は、初めに補充神経基礎培地（supplemented neuralbasal medium）(NBM)中で増殖された。当該NBMは、B27補助剤(インビトロジェン社（Invitrogen）, カリフォルニア州カールズバッド)、およびL-グルタミン(4ミリモル) (シグマ社（Sigma）,ミズーリ州セントルイス)を含むニューロベーサルA（Neurobasal-A）培地(インビトロジェン社（Invitrogen）,カリフォルニア州カールズバッド)であった。補充NBMは、20ナノグラム/ミリリットルの表皮増殖因子(EGF)(シグマ社（Sigma）,ミズーリ州セントルイス)、20ナノグラム/ミリリットルの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(ペプロテック社（Peprotech）,ニュージャージー州ロッキーヒル)も含有する。
【００２８】
セット1の細胞は、補充NBM中で17日間培養された。セット2の細胞は、初めに補充NBM中で4日間培養された。次に、当該補充NBMが培養プレートから除去され、細胞は、20ナノグラム/ミリリットルのMP52(バイオファームＧｍｂＨ（Biopharm GmbH）,ドイツハイデルベルグ)含有NBM中で13日間培養された。セット3の細胞は、初めに、補充NBM中で10日間培養された。次に、補充NBMが培養プレートから除去され、細胞は、200ナノグラム/ミリリットルのソニックヘッジホッグ(SHH)(シグマ社（Sigma）,ミズーリ州セントルイス)、および100ナノグラム/ミリリットルの線維芽細胞増殖因子8(FGF8) (ペプロテック社（Peprotech）, ニュージャージー州ロッキーヒル)を含有するNMBで培養された。セット4の細胞は、初めに補充NBM中で10日間培養された。次に、補充NBMが培養プレートから除去され、細胞は、20ナノグラム/ミリリットルのMP52、200ナノグラム/ミリリットルのSHH、および100ナノグラム/ミリリットルのFGF8を含有するNBM中で培養された。
【００２９】
17日間の実験期間の終了時、全培養物は、4％パラホルムアルデヒド(シグマ社（Sigma）, ミズーリ州セントルイス)で固定され、免疫細胞化学染色が実施され、ベータチューブリンIII(TuJ1)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)の発現が評価された。手短に言えば、固定培養物は、リン酸緩衝食塩水(PBS)(インビトロジェン社（Invitrogen）,カリフォルニア州カールズバッド)で洗浄され、タンパクブロッキング溶液に30分間曝露された。当該タンパクブロッキング溶液は、4％ヤギ血清(ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)、および0.3％トリトン（Triton）(トリトンＸ−１００（Triton X-100）,シグマ社（Sigma）)を含むPBSであった。その後、一次抗体溶液は、ブロッキング溶液プラス1：500希釈のTuJ1抗体(シグマ社（Sigma）,ミズーリ州セントルイス)、1：1,000希釈のGFAP抗体(ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)、および1：2,000希釈のTH(ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)を含有するサンプルに室温で1時間適用された。
【００３０】
前記一次抗体溶液は除去され、サンプルは、PBSで洗浄された。次に、二次抗体溶液が室温で1時間適用された。当該二次抗体溶液は、1：250希釈のヤギ抗-マウスＩｇＧ−テキサスレッド（IgG-Texas Red）(ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)、および、1：250希釈のヤギ抗-ウサギＩｇＧ−アレクサ４８８（IgG-Alexa 488）(ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)を有するタンパクブロッキング溶液であった。その後、サンプルが洗浄され、10マイクロモルの4'-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール-2HCl(DAPI)(モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）,オレゴン州ユージーン)とともに10分間インキュベートされ、細胞核が可視化された。
【００３１】
免疫細胞化学染色後、蛍光が、オリンパス倒立エピ蛍光顕微鏡（Olympus inverted epifluorescent microscope）を使って可視化され、画像が、デジタルカメラおよびイメージプロ（ImagePro）ソフトウェア(メディアサイバネティクス（Media Cybernetics）,メリーランド州シルバースプリング)で入手された。反応をさらに定量化するために、視野の中の細胞（fields of cells）が、200xの拡大率でカウントされ、各マーカーに対する陽性細胞のパーセンテージが検討され、NBM単独中で増殖された対照サンプルと比較された。1つの条件あたり最低1,000個の細胞がカウントされ、あるいは、1,000個に満たない場合、その条件で観察された全細胞数がカウントされた。
【００３２】
既定のマーカーに対して陽性の細胞のパーセンテージは、特定のマーカーに対する陽性細胞数を、DAPI染色で決定された全有核細胞数で除して決定された。表1は、TuJ1、THおよびGFAPに対して陽性染色された細胞のパーセンテージを示す。
【表１】
2008514633.tif 000002
【００３３】
前記表は、NBMプラスFGF8およびSHHのみによって、これらの神経前駆細胞の９％が、ドーパミン作動性表現型に分化した(TH陽性染色で実証されたとおり)ことを示している。MP52がFGF8およびSHHと併用されると、ドーパミン作動性分化は、有意に増強された(26％TH陽性)。さらに、MP52は、免疫細胞化学で実証されたとおり、中間径フィラメントタンパクGFAPの発現増加によって明らかなように、これらの神経前駆細胞のアストロサイト表現型への分化も誘導した。ニューロン(TuJ1陽性細胞)総数は、MP52がSHHおよびFGF8と併用して添加されても、有意に変化しなかったが、成熟し、ドーパミン作動性TH陽性表現型になったこれらの細胞のパーセンテージは、MP52の存在下で有意に増加した。
【００３４】
〔実施例２〕
分娩後細胞におけるMP52-誘導Nurr1発現
分娩後細胞は、米国特許出願第10/887,012号および第10/877,446号に記述されているように、臍帯および胎盤消化物から単離された。手短に言えば、ヒト臍帯および胎盤細胞は、分娩後組織の外植片から単離された。当該組織は、分娩または正常な外科的分娩時に妊婦から入手された。以下の細胞単離プロトコルが、層流フード中、無菌条件下で実施された。
【００３５】
分娩後組織は、抗真菌剤および抗生物質(AA)(1ミリリットル/100ミリリットル(10,000単位/ミリリットル)の存在下、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で洗浄された(PBS-AA)。洗浄段階は、温和な攪拌下でのPBS-AAによる当該組織のゆすぎから成り立った。このプロセスは、数回実施され、血液および残渣が除去された。次に、洗浄された組織は、DMEM-低グルコース(DMEM:Lg)またはDMEM高グルコース(DMEM:Hg)培地50ミリリットルの存在下、150 cm組織培養プレート中で機械的に分離された。
【００３６】
いったん前記組織が細断されると、細断組織は、50-ミリリットルの円錐管に、当該管1本当たり組織5gとして移された。その後、当該組織は、DMEM中に溶解したコラゲナーゼ：ジスパーゼ(C：D)、またはDMEM中に溶解したコラゲナーゼ：ジスパーゼ：ヒアルロニダーゼ(C：D：H)10ミリリットルで、AA含有DMEM:LgまたはDMEM:Hg40ミリリットルで消化された。C：Dは、DMEM50ミリリットルに希釈された、II型コラゲナーゼ750ミリグラム(＞125単位/ミリグラム(0.5-3 FALGA単位/ミリグラム))、ジスパーゼ(0.4単位/ミリグラム)500ミリグラムであった。よって、C：D：Hは、DMEM50ミリリットルに希釈された、II型コラゲナーゼ750ミリグラム(＞125単位/ミリグラム(0.5-3 FALGA単位/ミリグラム))、ジスパーゼ500ミリグラム(0.4単位/ミリグラム)、ヒアルロニダーゼ200ミリグラム(300単位/mg)であった。別法として、このプロトコルでは、IV型コラゲナーゼ(＞125単位/ミリグラム(0.5-3 FALGA単位/ミリグラム)で750ミリグラム)も用いられた。前記組織、培地および消化酵素を含有する円錐管は、37℃で、オービタルシェーカー（培地振盪) 中で24時間未満の間インキュベートされた。
【００３７】
消化後、前記組織は、40-マイクロメートルナイロン細胞ストレーナーで濾過された。次に、濾過された細胞浮遊液は、1000 Xgで10分間遠心分離された。上清が吸引され、細胞ペレットが新鮮培地50ミリリットルに再浮遊された。このプロセスは、2回実施され、細胞群から残留酵素活性が除去された。次に、上清が除去され、細胞ペレットが増殖培地(expansion medium)2ミリリットル(DMEM:LgまたはDMEM:Hg；15％FBS(ハイクローン社定義の（Hyclone Defined）ウシ血清No.AND18475)；2-メルカプトエタノール(1マイクロリットル/100ミリリットル)；抗生物質/抗真菌剤(1ミリリットル/100ミリリットル(10,000単位/ミリリットル))に再浮遊された。単離された細胞数当たりの細胞生存度が、トリパンブルー排除法の手集計によって決定された。
【００３８】
単離された臍帯細胞および胎盤細胞は、ラミニン被覆24ウェル組織培養プレート(ニューヨーク州コーニング)に細胞1,000個/cm2で接種された。細胞は、初めに、証明されていない通し番号（nonprov serial no）に記述されているように、維持培地(対照)に接種された。維持培地中で4日後、細胞は、4群に分けられた。セット1の細胞は、EGF(20ナノグラム/ミリリットル)、およびbFGF(20ナノグラム/ミリリットル)を補充されたNBMに切替えられ、13日間増殖された。セット2〜4は、EGF(20ナノグラム/ミリリットル)、およびbFGF(20ナノグラム/ミリリットル)を補充されたNBMに切替えられ、6日間増殖された。次に、EGFおよびFGF8補充NBMが除去され、細胞は、MP52プラスSHHプラスFGF8(セット2）；MP52プラスSHHプラスFGF8プラスレチノイン酸(RA)(セット3)；または、MP52プラスRA(セット4) を含有するNBM中でさらに7日間培養された。
【００３９】
17日間の実験期間終了時、RNAがＲｎイージー（Rneasy）キット(ＲＮイージー・ミニ・キット（RNeasy Mini kit）,キアゲン社（Qiagen）,カリフォルニア州バレンシア)を使って誘導細胞群から単離された。細胞は、製造会社の説明書(ＲＮイージー・ミニ・キット（RNeasy Mini kit）,キアゲン社（Qiagen）,カリフォルニア州バレンシア)に従って、β-メルカプトエタノール(シグマ社（Sigma）、ミズーリ州セントルイス)含有緩衝液RLT 350マイクロリットルで溶解され、−80℃で保存された。細胞溶解物は、融解され、製造会社の説明書に従ってサンプル1個当たり2.7単位のＤＮアーゼ処理(シグマ社（Sigma）、ミズーリ州セントルイス)でRNAが抽出された。RNAは、DEPC処理水50マイクロリットル(0.1％ジエチルピロカーボネート、シグマ社（Sigma）、ミズーリ州セントルイス)で溶出され、−80℃で保存された。RNAは、タックマン（TaqMan）逆転写試薬(アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）,カリフォルニア州フォスターシティ)によってランダムヘキサマーを使って、25℃で10分間、37℃で60分間、および、95℃で10分間逆転写された。サンプルは、−20℃で保存された。
【００４０】
定量的PCR (Q-PCR)は、cDNAサンプルについて、アッセイズ‐オン‐デマンド（Assays-on-Demand）(登録商標)遺伝子発現産物Nurr I(Hs00428691)、チロシンヒドロキシラーゼ(Hs00428691)、およびGAPDH(アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）,カリフォルニア州フォスターシティ)、およびタックマン・ユニバーサルＰＣＲマスター・ミックス（TaqMan Universal PCR master mix）を使い、ＡＢＩプリズム７０００ＳＤＳ（ABI prism 7000 SDS）ソフトウェアによる7000配列検出システムを使って、製造会社の説明書に従って実施された。熱サイクル条件は、初めに50℃で2分間、および、95℃で10分間、続いて、95℃で15秒間と60℃で1分間のサイクルが40回であった。
【００４１】
分娩後細胞分化後のNurr1、およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)mRNA発現が、表2に示される。当該表は、MP52が分娩後細胞においてNurr1およびTH発現を誘導したことを示す。対照(NBMプラスEGFプラスFGF8)と比較すると、Nurr1発現は、SHHプラス FGF8プラス MP52、または、SHH プラスFGF8 プラスMP52プラスレチノイン酸とのインキュベーション後、分娩後細胞培養物中で誘導された。分娩後細胞がレチノイン酸のみと併用したMP52とともにインキュベートされると、対照に比較して、Nurr1誘導はさらに増加した。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)発現は、対照(神経基礎培地プラスB27補助剤プラスEGF/FGF)と比較して、SHHプラスFGF8プラスMP52、SHHプラスFGF8プラスMP52プラスレチノイン酸、またはMP52プラスレチノイン酸とのインキュベーション後、臍帯細胞培養物において誘導された。
【表２】
2008514633.tif 000003
【００４２】
〔実施例３〕
成熟ゲッ歯類海馬神経前駆細胞のオリゴデンドロサイトおよびアストロサイトへのMP52-誘導分化
MP52含有微小球コアは、二重エマルジョン技術によって調製された。手短に言えば、固有粘度0.4 dl/gの、ポリ(D,L-乳酸-コ-グリコール酸）（poly(D,L-lactic-co-glycolic) acid）の90：10コポリマー(メディソーブ（MEDISORB）の商品名で販売、アルカームズ・インコーポレイティッド（Alkermes, Inc.）,オハイオ州ウィルミントン)50 mgが、塩化メチレン1.5 mL、およびアセトン0.5 mLに溶解された。25マイクログラムのMP52は、0.1％(w/v)ヒト血清アルブミン(HSA)(シグマ社（Sigma）、ミズーリ州セントルイス)含有16mＭクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)0.15 mLに溶解された。MP52は、前記微小球への取り込み前に、タンパクを安定化させるために、賦形剤で再構成された。ポリマー/MP52水溶液は、ブランソン・ソニファイアー４５０（Branson Sonifier 450）(ブランソン・ウルトラソニックス社（Branson Ultrasonics）,コネチカット州ダンベリー)を使って、10秒間振動させることによる連続的に超音波を当てて分解され、単一エマルジョンを生じた。当該単一エマルジョンは、5％(w/v)ポリビニルアルコール(MW 31,000-50,000、87〜89％加水分解；アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（Aldrich Chemical Company）,ウィスコンシン州ミルウォーキー)、および5％(w/w) NaClを含有する水溶液30 mLに添加された。生じた溶液は、1分間電磁攪拌され、二重エマルジョンを生成した。
【００４３】
前記二重エマルジョン(水/油/水)は、10％(w/w)NaCl含有脱イオン水(400 ミリリットル)に添加され、25分間電磁攪拌された。次に、微小球コアは、40-ミクロンナイロン細胞ストレーナー(ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickinson）,ニュージャージー州)で濾過され、脱イオン水(400 mL)で洗浄された。次に、当該コアは、−80℃で2時間凍結された。その後、微小球は、ヴァーティス・フリーズモバイル（Virtis Freezemobile）(ヴァーティス・カンパニー（Virtis Company）,ニューヨーク市ガーディニア（Gardinier, NYC）)を使った凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥された。微小球は、−40℃の周囲温度を保ちながら凍結乾燥され、その後の使用まで滅菌ミクロバイアル中、4℃で保存された。
【００４４】
凍結乾燥微小球は、ニューロベーサル‐Ａ（Neurobasal-A）培養培地で数回洗浄され、残渣が除去された。洗浄済み微小球は、20 マイクログラム/ミリリットルのラミニン(シグマ社（Sigma）,ミズーリ州セントルイス)で被覆された。ラミニン被覆微小球20〜50個は、1ミリリットルのニューロベーサル‐Ａ（Neurobasal A）培地で、１０〜３０分間、滅菌エッペンドルフ（eppendorf）(アンビオン社（Ambion）,テキサス州オースティン)中で、実施例1に記載された方法に従って調製された成熟ゲッ歯類神経前駆細胞500,000個と混合された。このコア/細胞浮遊液は、24ウェル超低クラスター組織培養プレート(コーニング・インコーポレイティッド（Corning Inc.）,ニューヨーク州コーニング)の2個のウェル（ウェル１個当たり５００マイクロリットル）に接種された。各ウェルに新鮮培地100マイクロリットルが、さらに5日間補充された。
【００４５】
実験期間終了時、前記微小球に付着された細胞は、4％パラホルムアルデヒドで固定され、免疫細胞化学が実施され、GFAP(GFAP, 1:1000, ダコ・サイトメーション社（DakoCytomation）,カリフォルニア州カーピンテリア)、およびミエリン塩基性タンパク(MBP, 1：500, ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)の発現が評価された。適切な染色用サンプル調製のために、固定された細胞被覆微小球は、15mL円錐試験管中、100 x gで3分間遠心分離された。次に、ペレットが少量の滅菌PBSに再浮遊された。混合物は、マイクロピペットでウェイボートディッシュ(weigh boat dish)の中央に静置された。OCT封埋化合物(ティシュー‐テックＯＣＴ化合物（Tissue- Tek OCT Compound）,サクラ社（Sakura）,カリフォルニア州トーランス)が、小ペレット周囲に、当該ウェイボートを満たすまで添加された。次に、当該ウェイボートは、エタノールおよびドライアイスの凍結槽最上部に静置され、当該OCTの温度を急速低下させ、それによって、細胞被覆微小球を硬質ブロックに封埋した。
【００４６】
次に、10-ミクロン切片が、標準クリオスタット(ライカ社（Leica）)を使って切断され、染色用ガラススライド上に静置された。疎水性ペンを使って、染色用切片周囲に疎水面を作った。実施例1同様に免疫染色が実施されたが、今回は、前述の濃度のGFAPおよびMBP (1：500, ミエリン塩基性タンパク, ケミコン社（Chemicon）,カリフォルニア州テメキュラ)に対する抗体を用いた。
【００４７】
免疫組織化学は、MP52-負荷微小球（MP52-loaded microspheres）上に接種された成熟ゲッ歯類海馬神経前駆細胞の分化を実証した。MP52-負荷微小球は、有意な数の成熟ゲッ歯類海馬神経前駆細胞のGFAP陽性アストロサイトおよびミエリン塩基性タンパク陽性オリゴデンドロサイトへの分化を誘導した。この作用は、MP52を負荷されない対照粒子では認められなかった。
【００４８】
本明細書では、我々は、MP52を使って内因性または外因性(移植された)幹細胞または前駆細胞様細胞（progenitor-like cells）、または他の利用可能な細胞の、ドーパミン作動性表現型への分化によるヒトのパーキンソン症候群の欠損の治療薬としてのMP52の利用の証拠を提供する。この手法は、黒質緻密部から線条体に突出するドーパミン作動性ニューロンの損失から起こる成人の当該欠損の改善に使用されることができる。特に海馬神経前駆細胞に関連するこの適用におけるMP52の頑健な分化能は、パーキンソン病治療のため多数のドーパミン作動性細胞を発生させるための治療手段を提供する。
【００４９】
〔実施の態様〕
（１）  ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損を治療する方法において、
ドーパミン作動性表現型に分化する能力を含む細胞群を実際に前記ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量で、GDF5-HRを前記ヒトの前記線条体または前記黒質緻密部に投与する段階、
を含む、方法。
（２）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、単回量で投与される、
方法。
（３）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、徐放量で投与される、
方法。
（４）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、生理的に受容可能なキャリアを含む神経栄養組成物として投与される、
方法。
（５）  実施態様4に記載の方法において、
前記キャリアが、臨床級滅菌水、滅菌食塩水、滅菌リン酸緩衝食塩水、滅菌水中デキストロース、滅菌液体培地、および生理的に受容可能な等張液から成る群から選択される、
方法。
【００５０】
（６）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、マトリックス中で投与される、
方法。
（７）  実施態様6に記載の方法において、
前記マトリックスが、粒子、足場、立方体、円柱、管、ブロック、フィルム、ハイドロゲル、またはシートから成る群から選択される形態である、
方法。
（８）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、マイクロカテーテル、カテーテル内挿入、クモ膜下送達を経る注射（injection）、あるいは、ミニポンプから脳室内への、または、クモ膜下内への、または、鼻内への注射によって頭蓋内に投与される、
方法。
（９）  実施態様1に記載の方法において、
前記細胞群が、幹細胞、または、成熟神経前駆細胞である前駆細胞、海馬前駆細胞、海馬幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚幹細胞、胚幹細胞由来前駆細胞、分娩後由来細胞、臍帯幹細胞、臍帯前駆細胞、胎盤幹細胞、胎盤前駆細胞、筋肉幹細胞、肝臓幹細胞、膵臓幹細胞、辺縁幹細胞、網膜幹細胞、筋肉前駆細胞、膵臓前駆細胞、辺縁前駆細胞、網膜前駆細胞、および肝臓前駆細胞から成る群から選択される細胞を含む、
方法。
（１０）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、MP52、BMP-14、およびCDMP-1から成る群から選択される、
方法。
【００５１】
（１１）  実施態様1に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、MP52を含む、
方法。
（１２）  実施態様4に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、MP52を含む、
方法。
（１３）  実施態様12に記載の方法において、
前記神経栄養組成物が、約0.5〜約1,000ナノグラムの前記MP52を含む、
方法。  
（１４）  実施態様12に記載の方法において、
前記神経栄養組成物が、ソニックヘッジホッグ、およびFGF8をさらに含む、
方法。
（１５）  ヒトの線条体または黒質緻密部への損傷または疾患から起こる神経学的欠損の治療に適した神経栄養組成物において、
ドーパミン作動性表現型に分化する能力を含む細胞群を実際に前記ドーパミン作動性表現型に分化させるのに有効な量のGDF5-HRと、
ソニックヘッジホッグと、
FGF8と、
生理的に受容可能なキャリアと、
を含む、神経栄養組成物。
【００５２】
（１６）  実施態様１５に記載の神経栄養組成物において、
前記GDF5-HRが、MP52、BMP-14、およびCDMP-1から成る群から選択される、
神経栄養組成物。
（１７）  実施態様15に記載の方法において、
前記GDF5-HRが、MP52を含む、
方法。
（１８）  実施態様17に記載の方法において、
前記神経栄養組成物が、約0.5〜約1,000ナノグラムの前記MP52を含む、
方法。  
（１９）  実施態様17に記載の組成物において、
ソニックヘッジホッグ、およびFGF8、
をさらに含む、組成物。
（２０）  実施態様15に記載の組成物において、
ソニックヘッジホッグ、およびFGF8、
をさらに含む、組成物。
【国際調査報告】
2008514633.tif 000004