(57)【要約】  ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体を含む医薬組成物が、血管性疾患を他の条件の中でも治療、予防または抑制することを開示する。本医薬組成物にはまた、ＡＣＥ阻害剤またはそれ以外の薬剤も含めることができる。また、ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体の有効量を必要とする哺乳類動物に投与することによって、ＰＡＩ−１発現を減少させる方法も開示する。さらに、ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体の有効量を哺乳類動物に投与することを含む、このような予防、抑制または治療を必要とする哺乳類動物の血栓症を予防、抑制または治療する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＤＲＡまたはビタミンＤ類似体の治療有効量；場合によってアンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシン（ＩＩ）受容体（Ｉ）遮断薬、およびアルドステロン遮断薬からなる群の少なくとも一つのメンバーの治療有効量を含む、心血管性疾患、脳血管性疾患、および末梢性血管疾患、特に心不全、心筋症、アテローム動脈硬化、心筋梗塞、および脳血管障害の予防、治療、および進行遅延のための持続放出性医薬組成物。
【請求項２】
前記ＶＤＲＡまたはビタミンＤ類似体がパリカルシトール、カルシトリオール、およびドキセルカルシフェロールからなる群から選択される、請求項１に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物が経皮パッチ剤型である、請求項１に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物が経口剤型である、請求項１に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物が皮下剤型である、請求項１に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物が注射剤型である、請求項１に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項７】
前記注射剤型が皮下剤型およびデポー剤型からなる群の一つのメンバーである、請求項６に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物がインプラント可能な剤型である、請求項５に記載の持続放出性医薬組成物。
【請求項９】
ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体の治療有効量：場合によってアンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシン（ＩＩ）受容体（Ｉ）遮断薬、およびアルドステロン遮断薬からなる群の少なくとも一つのメンバーの治療有効量を含む、哺乳類動物における血管性疾患の治療、予防または進行遅延のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記心血管疾患が心不全、心筋症、アテローム動脈硬化、心筋梗塞、脳血管障害、および末梢性血管疾患からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体がパリカルシトール、カルシトリオール、およびドキセルカルシフェロールからなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が経皮パッチ剤型である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が経口剤型である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が皮下剤型である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記組成物が注射剤型である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記注射剤型が皮下剤型およびデポー剤型からなる群から選択される一つのメンバーである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記組成物がインプラント可能な剤型である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳類動物における血管性疾患の予防、治療、および進行遅延の方法であって、請求項９に記載の医薬組成物を前記哺乳類動物に投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
前記投与段階が連続的である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与段階が経皮パッチを用いて行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与段階が経口剤型を用いて行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与段階が注射剤型を用いて行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与段階が皮下剤型を用いて行なわれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
哺乳類動物の血管性疾患を、前記哺乳類動物のＰＡＩ−１発現を減少させることによって治療、抑制、または予防する方法であって、ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体の有効量を前記哺乳類動物に投与する段階を含む方法。
【請求項２５】
前記ビタミンＤ受容体活性化物質がパリカルシトールまたはカルシトリオールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ビタミンＤ類似体がドキセルカルシフェロールまたはアルファカルシドールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療、抑制、または予防を必要とする哺乳類動物の血栓症を、治療、抑制または予防する方法であって、ビタミンＤ受容体活性化物質またはビタミンＤ類似体の有効量を前記哺乳類動物に投与する段階を含む方法。
【請求項２８】
前記ビタミンＤ受容体活性化物質がパリカルシトールまたはカルシトリオールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミンＤ類似体がドキセルカルシフェロールまたはアルファカルシドールである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳血管性疾患および末梢性血管疾患を含む心血管疾患、特に心不全、心筋症、アテローム動脈硬化、心筋梗塞および脳血管障害を治療および予防するためのビタミンＤ受容体活性化物質（ＶＤＲＡ）、好ましくはパリカルシトール、またはビタミンＤ類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム動脈硬化および心筋症による心血管疾患（ＣＶＤ）の合併症は、欧米社会で最も一般的な死因である。具体的には、高血圧および高脂血症が、主要な心臓の危険因子である。高血圧症（例えば、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩｓ））、および異常脂質レベルを治療する幾つかの薬物類が、血液透析患者のような高リスク集団の心血管死亡率を有意に減少させることが証明されてきた。しかし、有害な副作用を含む、幾つかの因子のために、心血管疾患の進行予防のための既存の薬物類の有用性は制限され、またその他の点では、特に高リスク集団にとって重大であるＣＶＤの治療に、これらの薬物類が適さないものとなっている。
【０００３】
ＶＤＲＡ類の生物学的効果は、核ホルモン受容体スーパーファミリーの１メンバーである、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）によって媒介される。ＶＤＲが生物学的効果を仲介すると考えられている一つの機構は、ビタミンＤ応答遺伝子の特異的ＤＮＡ配列に結合する転写因子の活性化および、究極的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを介した転写の速度への影響である。ＶＤＲ類は、殆どのタイプのヒト細胞、特に心血管系および免疫系に存在している。
【０００４】
図１に示すように、ビタミンＤが心血管の生理機能の調節に重要な役割を果たしているという考えを支持する幾つかの証拠がある。ビタミンＤは、炎症経路を負に調節し、血管石灰化阻害剤の正常な発現を回復する免疫系に影響を及ぼすことによって、アテローム動脈硬化および血管石灰化を防ぐ可能性がある。ビタミンＤは細胞増殖にも影響を及ぼす。低ビタミンＤレベルは、うっ血性心不全と関連した。ビタミンＤには、エンドセリン−１によって誘発される心筋細胞の肥大化に拮抗する直接的な効果がある。最終的に、ＶＤＲＡ類は、レニン生合成を阻害することによって、ＲＡＡＳを負に調節している。従って、ＶＤＲＡ類／ビタミンＤ類似体での処置は、図１の中の一つ、または全ての経路に影響を与えることによって、心血管疾患を予防または治療し得る。
【０００５】
しかし、インビトロデータ、および動物のデータによると、ＶＤＲＡ類および／またはビタミンＤ類似体は、例えば、血管石灰化、心筋梗塞、心不全、心筋症および脳血管障害を引き起こすことよって、尿毒症患者の心臓を傷害しうることが示唆されている。従って、医学界では心血管疾患に対する治療として、これらの化合物の使用を推奨しておらず、それらの使用を制限するよう勧告している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心血管疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患、特に心不全、心筋症、アテローム動脈硬化症、心筋梗塞および脳血管障害を含む、血管性疾患の予防、治療、および進行遅延のための方法、およびこのために有用な医薬組成物を対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施形態によると、本発明は血管性疾患の予防、治療、および進行遅延のための、ＶＤＲＡ類またはビタミンＤ類似体（本明細書では“ＶＤＲＡ類／ビタミンＤ類似体”と呼ばれる）を含む組成物に関する。本発明の幾つかの態様によると、ビタミンＤ受容体活性化物質（ＶＤＲＡ）化合物が使用できる。ＶＤＲＡ類には、パリカルシトール、カルシトリオール、２２−オキサ−１−アルファ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、ＭＣ−９０３（カルシポトリオール）、１６−エン−２３−イン−１アルファ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、および２４−ジフルオロー２６，２７−ジメチル−１６−エン−１アルファ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（参考として本明細書中に援用されている、ＰＮＡＳ，２００４，ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．１８，ｐ６９００−６９０４，にＤｅＬｕｃａらによって、より詳細に記載されている）、参考として本明細書中に援用されている、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９８，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．４，ｐ１１９３−１２３１，の表１にリストされた化合物、およびいわゆるＧｅｍｉｎｉ化合物（参考として本明細書中に援用されている、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏｌ．８９−９０，２００４，３５−３８，Ｍａｅｈｒらによって、より詳しく記載されている）、ＥＢ−１０８９（ＬＥＯ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ化合物）、およびＥＤ−７１（Ｒｏｃｈｅ化合物）を含む。パリカルシトールは、選択的ＶＤＲＡのため、特に好ましい。パリカルシトールは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから（Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，商標名ＺＥＭＰＬＡＲで）市販されている。
【０００８】
本発明の他の態様によれば、ビタミンＤ類似体はドキセルカルシフェロールまたはアルファカルシドールであり得る。
【０００９】
幾つかの実施形態によると、本発明の特に好ましい組成物には、次の１以上の薬剤も含まれる：アンギオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）またはアンギオテンシンＩＩ受容体１（ＡＴ１）遮断薬またはアルドステロン遮断薬（ＡＲＢ）。本発明による組成物にはまた、アスピリンを含め、ベータ遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗脂血症薬、血圧降下薬および抗炎症剤のような、心血管疾患を治療または予防するのに使用される他の薬剤も含めることができる。
【００１０】
本発明の幾つかの態様によれば、医薬組成物は持続的（または連続的）デリバリーシステムによって、投与することが可能である。本発明はまた経口、注射および経皮投与を含むが、これらに限定されない他の投与様式も意図している。
【００１１】
本発明はまた、そのような治療、阻害または予防を必要とする哺乳類動物の血栓症を治療、阻害または予防する方法をも含んでおり、その方法はビタミンＤ受容体活性化物質、またはビタミンＤ類似体の有効量を哺乳類動物に投与する段階を含む。ビタミンＤ受容体活性化物質は、例えば、パリカルシトールまたはカルシトリオールでよく、ビタミンＤ類似体は、例えば、ドキセルカルシフェロールまたはアルファカルシドールでよい。
【００１２】
本明細書で言及される、全ての特許および出版物は参考として本明細書中に援用されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は一般に、心筋症疾患、冠状動脈性疾患、脳血管性疾患および末梢血管性疾患を含む、心血管疾患（ＣＶＤ）を治療または予防するための、ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体を含む組成物を対象とする。本発明はまた、ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の治療有効量を含む、持続放出製剤であり得る医薬組成物を患者に投与することによってＣＶＤを治療する方法に関する。
【００１４】
ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の治療有効量を含む組成物を投与することによる、ＣＶＤ患者の治療は、心臓組織におけるＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の治療的作用を直接的に介して、レニン発現の効果的な減少、炎症抑制、および、心機能改善に有利であると期待される。 対照的に、ＡＣＥＩ投与にもとづく従来の治療では（即ち、ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体を用いずに）、例えば、アンギオテンシン（ＩＩ）を減少させるのみで、レニン濃度を減少させることはなく、または心臓系、血管系、および免疫系自体のビタミンＤ受容体に作用することはない。ＡＣＥＩ投与は、有害な転帰ゆえに魅力的な長期治療とはなりえない。
【００１５】
本発明の幾つかの態様によれば、本発明の組成物はＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体、および以下の薬剤：レニンの産生を阻害、またはレニンーアンギオテンシンーアルドステロン系の活性化を阻害する治療有効量のＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン（ＩＩ）受容体遮断薬（ＡＲＢ）、およびアルドステロン遮断薬の少なくとも１つを含む。好ましい組成物は、これらのパリカルシトール以外の薬剤の少なくとも一つと共にパリカルシトールを含む。このような組み合わせは、続いて起こるアンギオテンシン（ＩＩ）産生、およびアルドステロン産生の増加と共に、ＡＣＥ阻害逸脱、およびアルドステロン逸脱を回避することができる。
【００１６】
好適なＡＣＥ阻害剤、ＡＲＢ遮断薬、およびアルドステロン遮断薬は市販されている。好適なＡＣＥ阻害剤は以下を含むが、これに限らない：カプトプリル（Ｍｙｌａｎから商標名ＣＡＰＯＴＥＮで市販されている）、エナラプリル（Ｍｅｒｃｋから商標名ＶＡＳＯＴＥＣで市販されている）、フォシナプリル（ｆｏｓｉｎａｐｒｉｌ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂから商標名ＭＯＮＯＰＲＩＬで市販されている）、ベンザプリル（ｂｅｎｚａｐｒｉｌ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから商標名ＬＯＴＥＮＳＩＮで市販されている）、モエキシプリル（Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｐｈａｒｍａから商標名ＵＮＩＶＡＳＣで市販されている）、ペリンドプリル（Ｓｏｌｖａｙから商標名ＡＣＥＯＮで市販されている）、キナプリル（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓから商標名ＡＣＣＵＰＲＩＬで市販されている）、ラミプリル（Ｍｏｎａｒｃｈから商標名ＡＬＴＡＣＥで市販されている）、トランドラプリル（Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商標名ＭＡＶＩＫで市販されている）、リシノプリル（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａから商標名ＰＲＩＮＩＶＩＬおよびＺＥＳＴＲＩＬで市販されている）。
【００１７】
好適なアンギオテンシン受容体遮断作用薬は以下を含むが、これに限らない：ロサルタン（ＭｅｒｃｋからＣＯＺＡＡＲとして市販されている）、イルベサルタン（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂおよびＳａｎｏｆｉからＡＶＡＰＲＯとして市販されている）、カンデサルタン（Ａｓｔｒａ  ＺｅｎｅｃａからＡＴＡＣＡＮＤとして市販されている）、エプロサルタン（Ｂｉｏｖａｉｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣａｎａｄａからＴＥＶＥＴＥＮとして市販されている）、テルミサルタン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＩｎｇｅｌｈｅｉｍからＭＩＣＡＲＤＩＳとして市販されている）およびバルサルタン（ＮｏｖａｒｔｉｓからＤＩＯＶＡＮとして市販されている）。
【００１８】
好適なアルドステロン遮断薬は以下を含むが、これに限らない：エプレレノン（Ｐｈａｒｍａｃｉａから商標名ＩＮＳＰＲＡで市販されている）、スピロノラクトン（Ａｌｄａｃｔｏｎｅ，Ａｄｕｌｔｍｉｎ，Ａｌｄｏｐｕｒ，Ａｌｄｏｓｐｉｒｏｎｅ，Ａｌｍａｔｏｌ，Ｂｅｒｌａｃｔｏｎｅ，Ｄｉａｔｅｎｓｅｃ，Ｄｉｒａｍ，Ｅｓｅｋｏｎ，Ｈｙｐａｚｏｎ，Ｉｄｒｏｌａｔｔｏｎｅ，Ｍｅｒａｂｉｓ，Ｎｏｖｏｓｐｉｒｏｔｏｎ，Ｏｓｉｒｅｎ，Ｏｓｙｒｏｌ，Ｐｉｒｏｌａｃｔｏｎ，Ｒｅｓａｃｔｏｎ，Ｓｉｎｃｏｍｅｎ，Ｓｐｉｒａｃｔｉｎ，Ｓｐｉｒｏｃｔａｎ，Ｓｐｉｒｏｌａｃｔｏｎ，Ｓｐｉｒｏｌａｎｇ，Ｓｐｉｒｏｎｅｘ，Ｓｐｉｒｏｔｏｎｅ，Ｔｅｖａｓｐｉｒｏｎｅ，Ｖｅｒｏｓｐｉｒｏｎ，Ｘｅｎａｌｏｎ  Ｌａｃｔａｂｓ，Ｙｏｕｌａｃｔｏｎｅの商標名で市販されている）。
【００１９】
別の成分、例えば生理的に許容できる担体、溶媒、結合剤、酸化防止剤、着色料、および基質は、必要または所望ならば使用可能である。
【００２０】
本発明による、ＣＶＤ患者にとって好ましい治療または予防レジメは、持続デリバリーまたは連続デリバリーを実効するのに十分な期間、本発明による治療有効量のＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体を含む組成物を投与することである。本明細書では“治療有効用量”は、感受性患者においてＣＶＤ進行を防ぐのに十分な用量、またはＣＶＤ退行を起こすのに十分な用量、またはＣＶＤによって引き起こされる症状を軽減することができる用量である。
【００２１】
典型的な投与レジメでは、１日あたり約０．５マイクログラム当量のカルシトリオール、または少なくとも約１マイクログラムのカルシトリオールを、週３回の注射によって提供することになる。パリカルシトールについては、適した投与レジメでは、1日あたり約２マイクログラム当量のパリカルシトール、または週３回のボラースとして投与された少なくとも約４マイクログラムのパリカルシトールを提供することになる。他のＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体、例えばドキセルカルシフェロールに適した投与レジメは、投与されるＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の治療有効性にもとづき、当業者によって直接決定されうる。
【００２２】
ＡＣＥI、ＡＲＢおよびアルドステロン阻害剤は異なる効能を有し、ビタミンＤとは異なる経路を介して身体に影響を及ぼすので、本発明による組成物は、当業者に周知で、直ちに利用できる従来の投与レジメに従って投与されるＡＣＥＩ、ＡＲＢ、またはアルドステロン阻害剤を組み入れることができる。
【００２３】
本発明はまた、選択的ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体、およびＡＣＥIおよび／またはＡＲＢおよび／またはアルドステロン遮断薬を含む、連続、または持続薬物デリバリー剤型をも意図している。適したデリバリー剤型は、経口投与用の錠剤またはカプセル、注射、局所的投与用の経皮パッチ（例えば、支持体または例えばエチルセルロースのような裏打ち基質に接着または吸着されたポリマーマトリックスにデリバリーされる薬剤が混合される）、デポー剤型（例えば、所望の生理活性化合物を含む注射可能なミクロスフェア）およびインプラントを含むが、これに限定されない。これら薬物デリバリー剤型を製造する技術は、当業者に周知である。
【００２４】
さらに血液透析を受けているＣＫＤ患者が、しばしば血液透析（ＨＤ）のため動静脈（Ａ−Ｖ）フィステル形成を必要とすることも注意すべきである。自己Ａ−ＶフィステルがＨＤのため最も耐久性のあるアクセスであることは、長く証明されてきた。血管アクセスの主たる失敗は、主として血栓症に関係がある。狭窄形成の根底にある病態生理は、血小板および内皮細胞を活性化する、血流の乱流である。血栓症を起こす最終的な引き金は、フィステル血流の決定的な減少である。これに関連して、特別な役割が血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に関して仮定されている。
【００２５】
下記の実施例５に示すデータにもとづき、ゼンプラー治療との統計的に有意な関連とより少ない血管アクセス変化とがあると結論できる。従って、ゼンプラーは血栓症の原因である、内皮細胞、血小板、およびＰＤＧＦにおける作用を介して有益な効果を有するかもしれない。将来の研究では、提唱されている効果の機序を解明し、ＡＶフィステルを超え、移植片、投与時間依存性、およびＣａｘＰ産物との関連にまで及ぶかどうかを解明すべきである。
【００２６】
（実施例）
本発明は、以下の非限定的実施例によって例示することができる。
【実施例１】
【００２７】
ビタミンＤ治療に関連して減少する罹患率および死亡率
長期血液透析を受けている患者の罹患率および死亡率の主な原因は、心血管疾患と関連した。血液透析治療を開始した患者の少なくとも７５％に、ＣＶＤ罹患を見ることができる。
【００２８】
パリカルシトールと共にビタミンＤ治療を開始した血液透析患者を調査する、監視コホート研究では、カルシトリオール治療の患者と比べ、心疾患発症および非感染性炎症に関連した入院数がより少なかった。（Ｐａｒｉｃａｌｃｉｔｏｌ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｗｏｒｌｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ，  Ｄ．Ｇ．Ｄｏｂｒｅｚら，Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２００４  １９：１１７４）
【００２９】
この研究は、ビタミンＤ受容体活性化物質による治療を受けていない患者にまで拡大され［“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｒｉｃａｌｃｉｔｏｌ．”Ｊ．Ｍｅｌｎｉｃｋら，Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙからの要約本，Ｊｕｎｅ８−１２，２００３，Ｂｅｒｌｉｎ．Ｐａｇｅ１４８］、いかなるビタミンＤ治療も受けなかった患者と比べ、パリカルシトールまたはカルシトールで治療された血液透析（ＨＤ）患者では、パリカルシトール治療が入院数が改善された結果と関連することを明らかにした。
【００３０】
図２に示すように、入院終了時の評価によって、ＶＤＲＡ治療を受けている患者（パリカルシトール（“Ｐａｒ”）、またはカルシトリオールを受けている患者（“Ｃａｌ”）の１年間の入院回数の中央値は、ビタミンＤ治療を受けなかった患者（“Ｎｏ  Ｄ”）よりも低いことが判明した。注目すべきことに、パリカルシトールで治療された患者（１．５）では、カルシトリオールで治療された患者（２．２）よりも入院が明らかに少なかった。さらに、病院に滞在した日数の中央値は、ビタミンＤ治療を受けなかった患者（２．６）と比べて、ＶＤＲＡ治療（特にパリカルシトール）を受けた患者では、より低かった。在院日数はカルシトリオール（１０．６）、および非ビタミンＤ（１４．７）と比べて、パリカルシトールでは再び最も低かった（５．２）。
【００３１】
図３は年あたりの入院数、および在院日数の多変量の結果を示している。このデータの回帰分析によって、入院回数に統計的差がないとしても、非ビタミンＤ群に比べ、カルシトール治療を受けることが、７．７少ない在院日数と関連があることが明らかになった。しかし、パリカルシトールを用いた治療は、非ビタミンＤ群と比較して、１．２少ない入院回数および１７．５少ない在院日数と関連した。
【実施例２】
【００３２】
レニン発現を抑制するパリカルシトールの活性
最近、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが、レニン生合成の負の調節因子として機能することが、インビトロおよびインビボの研究において発見された。カルシトリオールもレニン遺伝子発現を阻害することができ、このことがレニンーアンギオテンシンーアルドステロン系（ＲＡＡＳ）を調節する新しいレニン阻害剤として、ビタミンＤ、およびビタミンＤ類似体の使用を探索する分子的根拠となっている。
【００３３】
インビトロの細胞培養系を用いて、レニン遺伝子発現を抑制するパリカルシトールの活性を、既に公表された技術を使って調べた（１，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｉｓ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｊｕｌｙ  ２００２）。図４に示すように、ノザンブロット解析によって、Ａｓ４．１−ｈＶＤＲ細胞をパリカルシトール処理すると、用量依存的にレニンｍＲＮＡの発現を阻害する。事実、そのレニン阻害活性は、カルシトリオールよりも少し強力であるように見える（図．４Ａ、およびＢ）。この阻害効果は、レニン遺伝子転写を抑えるパリカルシトール活性を調べるレニンプロモーター・ルシフェラーゼレポーターアッセイによって確認されている。これらのアッセイでは、レニン遺伝子プロモーター活性の抑制において、パリカルシトールはカルシトリオールと少なくとも同程度の効力があるように見える（図．６）。
【００３４】
このデータは、レニンーアンギオテンシンーアルドステロン系およびＣＶＤ発症におけるその臨界性および心血管疾患の進行遅延を調節するのに、ＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体が有用であることを支持している。
【実施例３】
【００３５】
ＰＡＩ−１に対するＶＤＲ活性化物質の効果
ヒト冠動脈平滑筋細胞の一次培養中のＰＡＩ−１に対するパリカルシトールおよびカルシトリオールの効果を検討した（図６参照）。ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性阻害物質タイプ−１）は、冠動脈心疾患のリスクマーカーの一つであり、動脈硬化プラークにおいて増強され、マクロファージと局所で共存する。
【００３６】
ヒト冠動脈平滑筋細胞を、示された濃度のパリカルシトールまたはカルシトリオールと共に、２４時間３７℃でインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーにサンプルを溶解し、各サンプル中のタンパク質含量をＢｉｏ−Ｒａｄ  ｄｙｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙによって測定した。サンプルを４−１２％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解像し、タンパク質を電気泳動的にウエスタンブロッティング用ＰＶＤＦメンブレンへ転写した。メンブレンをＰＢＳ−Ｔの中で５％脱脂粉乳と共に１時間２５℃でブロットし、ついでＰＢＳ−Ｔの中でマウス抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体と共に一晩４℃でインキュベートした。メンブレンをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼーでラベルした抗ウサギ抗体と共に１時間２５℃でインキュベートした。ついで、メンブレンを検出試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＰｉｃｏ）とともにインキュベートした。Ｋｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘフィルムに用紙を露光させ、特異的なバンドを可視化した。
【００３７】
図６は抗ＰＡＩ−１抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。これらの研究において二つの観察が注目できる：（１）どの被験化合物の１μＭでも、増殖の１００％阻害は達成されなかった。これらの薬剤は細胞質から核へのＶＤＲ移行を誘発するのに強力であるが、共焦点顕微鏡試験によって、２時間の露出の後でさえ、全ての細胞がＶＤＲＡ類に反応しないことが確認され、これは＜１００％阻害が説明し得る。（２）パリカルシトールはカルシトリオールよりも臨床試験で強力でないことが知られているが、このアッセイではカルシトリオールと同様の効力を示している。２４（ＯＨ）ａｓｅの発現に対する薬剤の効果を調べることによって、パリカルシトールが２４（ＯＨ）ａｓｅ発現の刺激にカルシトリオールと比べて効力が少ないことが見いだされ、これはこのアッセイにおけるパリカルシトールのより高い効力を一部説明し得る。これらの結果は、パリカルシトールおよびカルシトリオールがヒト冠動脈平滑筋細胞のＰＡＩレベルを減少することに同等の効力があることを示している。パリカルシトールは通常、臨床の場面ではカルシトリオールよりも約４倍高い用量で使用され、このことは平滑筋細胞の機能を調節する４倍高い効力を説明し得る。
【実施例４】
【００３８】
心筋または血管平滑筋培養細胞を用いたインビトロモデルでのパリカルシトールの効果
実験的に誘発されたビタミンＤ欠乏は、その他の点では正常な成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、心臓の肥大化および高血圧と関連がある（Ｗｅｉｓｈａａｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０  Ｊａｎ；２５８（１  Ｐｔ  １）：Ｅ１３４−４２）。心臓の肥大化はまたＶＤＲ−／−マウスでも見られ（Ｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００２  Ｊｕｌ；１１０（２）：２２９−３８）、これは収縮期の血圧における１０−１５mmHg上昇設定で起こり、肥大化が、少なくとも一部、増加する心室の過負荷を反映し得ることを暗示している。ビタミンＤは新生仔ラット心筋培養細胞のエンドセリン（ＥＴ）−誘導性の肥大化を阻害することが示されている（Ｗｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６  Ａｐｒ  １；９７（７）：１５７７−８８、およびＬｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｆｅｂ  １８；２６９（７）：４９３４−９）。これはＡＮＰ、ＢＮＰ、およびα骨格アクチン遺伝子の発現、およびヒトＡＮＰおよびＢＮＰ遺伝子プロモーターの抑制における減少と関連がある（Ｗｕら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９５  Ｊｕｎ；２６８（６  Ｐｔ  １）：Ｅ１１０８−１３）。
【００３９】
本研究では、心筋または血管平滑筋培養細胞を用い、幾つかのインビトロモデルにおいて、パリカルシトールが（天然ホルモンに対し）同様の効果を持っているかどうかに関して、試験がなされた。
【００４０】
ＮＰＲ−Ａ遺伝子プロモーター活性に対するＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の効果
新生仔ＲＡＳＭ細胞に−１５７５  ＮＰＲ−Ａ  ＬＵＣ（０．５μg）を電気穿孔法によってトランスフェクトした。トランスフェクト効率における差を調節するために、細胞に構造上活性なＣＭＶ−ウミシイタケ・ルシフェラーゼ・レポーター（０．２５μg）を同時トランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後、示されているように、細胞をビタミンＤ類似体または溶媒で処理した。４８時間インキュベートを続け、この時点で細胞を回収して溶解産物を作成し、ルシフェラーゼ（ホタル、およびウミシイタケ）測定を行なった。
【００４１】
ＮＰＲ−Ａ活性に対するＶＤＲＡ／ビタミンＤ類似体の効果
１，２５ジヒドロキシビタミンＤ（ＶＤ）、パリカルシトール、ＨＥＣＴＥＲＯＬ（登録商標）（カルシトリオール）またはＨＥＣＴＥＲＯＬ（カルシトリオール）の活性化型の中で、細胞を４８時間予備インキュベートした。この時点で、培地を交換し、非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（１０−４Ｍ）を加え、１０分間３７℃でインキュベートを続けた。ついでＡＮＰ（１０−７Ｍ）を各培地に加え、インキュベートをさらに１０分間延長した。ついで培地を吸引し、細胞をＴＣＡで溶解し、可溶性抽出液のエーテル抽出、中和、およびｃＧＭＰ濃度に対する放射性免疫測定を行った。ここで示された全てのｃＧＭＰ濃度は、抽出液に存在する可溶性タンパク質μgに関して標準化された。結果を図７、８、および９に示す。
【００４２】
ｈＢＮＰ遺伝子プロモーター活性に対するビタミンＤ類似体の効果
既に記されたように、新生仔ラット心室性筋細胞に−１５９５  ｈＢＮＰ  ＬＵＣ（０．２５μg）を電気穿孔法によってトランスフェクトした。上記のように、同時トランスフェクトされたＣＭＶウミシイタケ・ルシフェラーゼ（０．２５μg）はトランスフェクト効率の差に対してサンプルを標準化するため使用された。選択的ケースでは、ヒトビタミンＤ受容体（ｈＶＤＲ）（０．３μg）、およびヒトレチノイドＸ受容体（ｈＲＸＲ）（０．３μg）の発現ベクターをＢＮＰルシフェラーゼ・レポーターと同時にトランスフェクトした。ここで示されたサンプルをエンドセリン（１０−７Ｍ）、またはビタミンＤ類似体の一つで処理した。結果を図１０および１１に示す。
【００４３】
Ｃｄｋ２活性の測定
細胞を示された間隔で、ビヒクルまたはビタミンＤ類似体で処理した。細胞を溶解バッファーで溶解し、上澄みタンパク質１００μgを抗Ｃｄｋ２抗体１μg、およびタンパクＧ−セファロース１０μと共に、１−２時間４℃でインキュベートした。免疫複合体キナーゼアッセイは、キナーゼバッファー中のヒストン１の２μg、およびγ−３２Ｐ−ＡＴＰと共に上記にて産生された免疫沈降物を用いて、上記のように行なった。反応物を変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離、乾燥し、Ｘ線フィルムに露光させた。結果を図１２に示す。
【００４４】
現在の研究はＶＤＲＡ類が、天然ホルモン１，２５ジヒドロキシビタミンＤに関して以前示されたのと定性的かつ定量的に類似する、心血管系における機能活性を有していることを示している。特に、この研究の主要な発見は、具体的にＶＤＲＡ類が以下であることを示している：１）新生仔ラット大動脈平滑筋細胞において、タイプＡナトリウム利尿ペプチド受容体（ＮＰＲ−Ａ）の活性を増加させ、２）ビタミンＤ応答要素を介して、同じ細胞におけるＮＰＲ−Ａ遺伝子プロモーター活性を増加させ、３）新生仔ラット心室筋培養細胞においてＢＮＰ遺伝子プロモーターのＥＴ−依存性刺激を抑制し、４）ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みのエンドセリン依存性刺激、および成体ラット大動脈筋細胞におけるＣｄｋ２活性を阻害する。まとめると、これらのデータは、パリカルシトールが１，２５ジヒドロキシビタミンＤのように、心筋細胞壁において心筋細胞の肥大化を調節する心臓防御的効果、および再構築血管壁における細胞増殖を制限すると共に脈管構造における抗増殖性、血管弛緩性ナトリウム利尿ペプチド／ＮＰＲ系の発現／活性を上昇させる血管防御的効果を有し得ることを示唆する。
【実施例５】
【００４５】
ゼンプラー処理された被験者における血管アクセスの変化
方法：初期の一次血管アクセスとしてＡＶフィステルを有する、ＨＤ新規の２１１２成人患者の病歴コホート集団を３５ヶ月の期間に渡って、透析医療提供者データベースを用いて追跡した（１９９９年１月から２００１年１１月）。患者はゼンプラーまたは非ビタミン治療で治療された；ゼンプラー治療を受けている患者は少なくとも１０用量を受け、同じ治療を続けた。ベースラインの特徴、および一年あたりの治療様式間の血管アクセス変化総数を要約するために記述概要統計学を用いた。さらに、ゼンプラーまたは非ビタミンＤ治療と一年あたりの血管アクセス変化総数との間の関連を評価するために、回帰モデルを用いた。結果：データセットは、ゼンプラー治療された５７７の患者、および非ビタミンＤ治療を受けた１５３５の患者を含めた。血管アクセス変化総数は、平均するとゼンプラー患者では一年あたり０．６の変化、および非Ｄ患者では一年あたり０．９の変化であった（ｐ＝０．００３４）。ベースライン共変量に対して調節するために、負二項回帰が行なわれた；これは、非Ｄ群がゼンプラー患者よりも２８％以上血管アクセス変化と関連があることを明らかにした（ｐ＝０．０３８）。
【実施例６】
【００４６】
ＣＹＰ２７Ｂ１（１−α−ヒドロキシラーゼ）ノックアウトマウスにおける血圧、および心血管表現型に対する遺伝的１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３J欠損の効果
１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３（カルシトリオール）は、レニン−アンギオテンシン系の負の調節因子であることが示されてきた。従って、ビタミンＤ３（１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）の活性化型の合成における重要な酵素である、ＣＹＰ２７Ｂ１（１−アルファヒドロキシラーゼ）を欠くマウスは恐らく、野生型（ＷＴ）同腹仔に比べ、血圧を上昇させたであろうと考えられた。
【００４７】
ノックアウト（ＫＯ）マウスおよびＷＴマウスに遠隔測定伝達物質を装着した；ベースラインの血圧、および心拍数を連続的に記録し、７日間２４時間平均値として報告した。動物のある亜群（ｎ＝４／群）において、心臓および腎臓がビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２４Ａ１）、レニン、およびナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ（ＮＰＰＡ）のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量のために単離された。遠隔測定記録の７日間を通して平均動脈圧（ＭＡＰ）はＷＴ同腹仔（１０６±２、および１０８±２mmHgの間；ｎ＝１０）に比べ、ＫＯマウスで有意に上昇していた（１１２±２、および１１６±４mmHgの間の２４時間群平均値；ｎ＝７）。さらに、ＫＯマウス（６０１±６、および６１０±７拍動／分の間の２４時間群平均値）は、ＷＴ対照（５４４±６、および５６６±４拍動／分の間）と比べ同じ期間を通して頻脈であった。心臓対体重、およびＬＶ対体重の割合もまたＫＯ対ＷＴマウスで増加傾向にあり、心筋にかかる負荷の増加を反映している。ＫＯマウスにおける血圧の増加にともない、ＶＤＲｍＲＮＡ発現が低下した一方で、腎臓のレニンｍＲＮＡ発現はＷＴ同腹仔に比べ増加傾向にあった（ｎ＝４）。ＫＯ動物の心臓においてＮＰＰＡは中程度に上昇しており、高血圧および肥大化に反応した代償的効果を反映しているようである。
【００４８】
以上の結果は、ＣＹＰ２７Ｂ１遺伝子産物の破壊は効果的な１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３欠損を引き起こすが、１−アルファ−ヒドロキシラーゼが十分にある動物と比べ、血圧および心拍数の持続した上昇を起こすことを示している。これらの結果はまたＭＡＰの増加が、レニンーアンギオテンシン系の調節解除に仲介されている可能性も示唆している。
【実施例７】
【００４９】
尿毒性ラットの血管石灰化に対するビタミンＤ類似体の異なる効果
ビタミンＤ受容体活性化物質（ＶＤＲＡ類）は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）と関連する二次性副甲状腺機能亢進症に対処するため一般に使用されている。最近の臨床データはＶＤＲＡ類はステージ５のＣＫＤに対して生存利益を与えることを示している。ＣＫＤ患者では、血管石灰化がしばしば予後不良につながる。この研究では、尿毒性ラットから単離された大動脈におけるカルシウムおよびリン含有量を測定した。培養大動脈リングへの４５Ｃａ取り込みも調べられた。
【００５０】
５／６腎摘出ラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ.（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手した。腎摘出２週間後、ラットに０．９％リン、および０．６％カルシウムを含む食餌を４週間与え、引き続き溶媒（５％エタノール＋９５％プロピレングリコール、０．４ml／ｋg）、０．６７μg／kgのパリカルシトールまたはドキセルカルシフェロールを腹腔内注射で３回／週、２週間処理した。最後の投与２４時間後に、ケタミン麻酔下で（５０mg／kg）尾静脈を通して血液を採取し、石灰化調査のため大動脈が回収した。５／６腎摘出および高リン食餌の組み合わせで、低カルシウム血症（血清カルシウム：１．０６に対し野生動物では１．２８mmol／Ｌ）、高リン酸塩血症（１１．６  対  ７．５mg／dL）および血清ＰＴＨ（１７．３倍）、クレアチン（２．９倍）およびＢＵＮ（３．８倍）の上昇という結果になった。大動脈をラットから無菌的方法で取り除き、外膜を静かに除去し、各動脈を培養液で３回洗浄した。各動脈の分節をカルシウムとリン測定のため加工処理した。各動脈の分岐部分を剥皮し、２−３mmリングに切断し、０．２μCi／ml  ４５Ｃａを含むＤＭＥＭ中に３７℃３日間置いた。その後、大動脈リングを洗浄、乾燥、計量し、次いで、放射能を測定するため溶解した。結果は以下のことを示している：（１）大動脈におけるカルシウムおよびリン含有量および４５Ｃａ取り込みの間には直線的相関があった、（２）Ｃａ含有量の中程度の増加（１．６倍）があったが、パリカルシトール処理群では４５Ｃａ取り込みまたはリン含有量には溶媒に比べ有意差がなかった、（３）４５Ｃａ取り込みは４０倍高く、Ｃａ含有量は１０倍高く、リン含有量はドキセルカルシフェロール処理群ではビヒクル群と比べ１７倍高かった。０．６７μg／kgのパリカルシトールおよびドキセルカルシフェロールはともに、ｉＣａを上昇させ（〜２５％）ＰＴＨを抑制した（＞９０％）。これらの結果は、ドキセルカルシフェロールおよびパリカルシトールが尿毒性ラットでは大動脈石灰化に異なる効果を表すことを示唆している。
【実施例８】
【００５１】
ヒト血管平滑筋細胞における石灰化に対するビタミンＤ類似体の効果
慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者は心血管疾患による高い死亡率を経験する。パリカルシトール、ドキセルカルシフェロールおよびカルシトリオールのようなビタミンＤ受容体活性化物質（ＶＤＲＡ類）は一般に、ＣＫＤと関連する二次性副甲状腺機能亢進症に対処するために使用される。最近の臨床データはＶＤＲＡ類がステージ５のＣＫＤ患者に生存利益を与えることを示している。ＣＫＤ患者において、血管石灰化はしばしば予後不良につながる。以前の研究は、１０−７から１０−９Ｍの１，２５（ＯＨ）２Ｄ３（カルシトリオール）がウシ血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）インビトロ石灰化の用量依存性増加を引き起こすことを示してきた（Ｊｏｎｏら、２０００）。この研究では、ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）の一次培養への４５Ｃａ取り込みに対するビタミンＤ類似体の効果を調べた。
【００５２】
一次培養ヒトＣＡＳＭＣを＞８０％密集まで増殖させ、５継代以内に使用した。細胞を好適な培地中で５日間、薬剤処理し、ついで０．２μCi／ml４５Ｃａを含む基本培地[ＮＩ：ＤＭＥＭ（１．８mM  Ｃａ＋２、および０．９mM  ＰＯ−４  を含む）]に２４時間戻した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗い、液体シンチレーションで放射能を測定した。Ｎ１培地で培養した細胞では最小の４５Ｃａ取り込みを示した（９８±１４，ｎ＝５）。誘導培地[（Ｐ１−高リン：ＤＭＥＭ（１．８mM  Ｃａ＋２，３．８mM  ＰＯ−４、および７．５Ｕ／ml  アルカリホスファターゼを含む）]で処理した細胞は４５Ｃａ取り込みの著しい増加を示した。誘導培地の効果は用量依存性であった；９０％  Ｎ１／１０％  Ｐ１または６０％  Ｎ１／４０％  Ｐ１の混合物は、それぞれ４５Ｃａ取り込みを７．４、および３４．４倍増加させた。１００nMのパリカルシトールは、Ｎ１培地またはＰ１培地の異なる用量（２０−６０％）で処理した細胞における４５Ｃａ取り込みに、有意な効果を示さなかった。対照として、パリカルシトールはＣＹＰ２４Ａ１を刺激し、ＰＡＩ−１  ｍＲＮＡ発現を用量依存的な様式で抑制した。Ｎ１または６０％  Ｎ１／４０％  Ｐ１培地において細胞をパリカルシトール、カルシトリオールまたは活性化ドキセルカルシフェロール（１−１００nM）の濃度を増加させて処理した場合、薬剤からの４５Ｃａ取り込みにおける有意な効果は見られなかった。これらの結果は、高リン＋アルカリホスファターゼを含む培地で培養されたヒトＣＡＳＭＣはカルシウム取り込みの増大を示し、ビタミンＤ類似体は有意な効果がないことを示唆している。
【実施例９】
【００５３】
確立された二次性副甲状腺機能亢進症を有する尿毒性ラットにおける、血清ＰＴＨ、およびイオン化カルシウムに対するパリカルシトールおよびドキセルカルシフェロールの異なる効果
高カルシウム血症に関係なく、確立された二次性副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）を有するＥＳＲＤ患者において、上昇する血清ＰＴＨ量を抑えることは臨床的に重要である。さらに、５／６尿毒性ラットモデルはＰＴＨおよび高カルシウム血症に関して、ビタミンＤ類似体の臨床的プロファイルを効果的に予想してきた。従って、ＳＨＰＴを確立するために４週間、高リン食餌（０．９％  リン，０．６％  Ｃａ）を受け、５／６腎摘出（外科的切断）を受けたオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける、パリカルシトール（ＰＡＲＩ）およびドキセルカルシフェロール（ＤＯＸ）の直接的比較を行なった。０日目に、ラットをビヒクル（ＶＥＨ；５％エタノール、９５％プロピレングリコール；０．４ml／kg；ＩＰ）または薬物（０．０８３，０．１７，０．３３，０．６６  mcg／kg；ｎ＝７−１０／群）を３回／週で１２日間、処理した。血液サンプルを投与後２４時間で採取した（１３日目）。以下の０日目の値（平均値±ＳＥＭ）：クレアチン（ＶＥＨ  対  偽物）は１．０２±０．０５  対  ０．４８±０．０１mg／dLであった；ＰＴＨ、１３２０±１８５  対  １７８±１１pg／ml；血液カルシウムイオン（ｉＣａ；１．２６±０．０１  対  １．３０±０．０１mmol／Ｌ）；リン（８．７０±０．３４  対  ７．３６±０．０９mg／dL）。ＶＥＨでは、１３日目／０日目  ｉＣａ値の割合は偽物で０．９３±０．０２  対  １．０２±０．０１に減少した；ＰＴＨ、およびリンは増加する傾向があった。対照的に、ＤＯＸ用量依存的に１３日目／０日目Ｃａ＋＋の比率は、０．３３、および０．６６mcg／kg  用量で、１．０９±０．０３＊、および１．１７±０．０４＊に増加した。ＰＡＲIはｉＣａ比率が、ＤＯＸのそれより少なく、０．６６mcg／kgで１．０５±０．０２＊＃まで中程度に増加した一方で、０．３３mcg／kgではｉＣａに影響がなかった。ＰＡＲIはＰＴＨ比率を０．３７±０．０７＊，０．３３±０．０６＊，０．１３±０．０２＊まで低下させた一方で、ＤＯＸでは１３日目／０日目のＰＴＨ比率が、０．１８，０．３３，０．６６mcg／kgに反応して、それぞれ、０．４３±０．１２，０．２６±０．０６＊，および０．２２±０．１１＊まで低下した。血清リンはどの処理群でも影響しなかった。ＤＯＸは生体外の十二指腸で活性カルシウム輸送における用量依存的な増加を引き起こした；ＰＡＲIは効果がなかった。従って、確立されたＳＨＰＴを有する尿毒性ラットにおいて、ＤＯＸは、ＰＡＲIの相当する用量で引き起こされるよりも、さらに多くのカルシウムイオンの用量依存的な上昇を伴い、血清ＰＴＨ量を抑制した。これらの用量では、ＰＡＲIは用量依存的な血中イオン化カルシウムの変化を誘発することなく効果的にＰＴＨを減少させる。
＊＝ｐ＜０．０５  対  ＶＥＨ  ＡＮＯＶＡ；＃ｐ＜０．０５  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  検定  ＤＯＸ  対  ＰＡＲI
【実施例１０】
【００５４】
ビタミンＤ類似体パリカルシトールによるレニン生合成の阻害
レニンーアンギオテンシン系（ＲＡＳ）は、電解質および容積恒常性の調節において必須な役割を果たしている。ＲＡＳの過剰活性化は、高血圧ならびに心臓肥大および糖尿病性腎疾患のような他の心血管疾患および腎障害と関連がある。レニンはレニンーアンギオテンシンカスケードの最初の律速酵素であり、従って重要な治療のターゲットを代表している；しかし、レニン阻害剤は現在は利用できない。ビタミンＤのホルモン型である、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５（ＯＨ）２Ｄ３］は、レニン生合成の内分泌抑制因子であり、ＲＡＳを調節するレニン阻害剤としてのビタミンＤ類似体の能力を探索するための分子的基盤を与える。
【００５５】
本研究では、ＦＤＡ承認された低い血漿カルシウム上昇性のビタミンＤ類似体、パリカルシトールのインビトロ、およびインビボのレニン生合成を阻害する活性について調査した。この目標のために、ヒトＶＤＲを安定にトランスフェクトしたＪＧ細胞様の細胞株である、Ａｓ４．１−ｈＶＤＲ細胞を、パリカルシトールまたは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を１０−１０から１０−７Ｍまでの範囲の用量で２４時間処理し、そのレニン阻害活性をノザンブロット分析によって評価した；細胞はまたレニン遺伝子プロモーター・ルシフェラーゼ・レポーター・プラスミドをトランスフェクトされ、ルシフェラーゼ活性をパリカルシトールまたは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の有無により測定した。これらのインビトロの研究は、パリカルシトールがレニンｍＲＮＡ発現、およびレニン遺伝子転写を用量依存的様式で、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のレニン発現に匹敵する効力で、抑制していることを示した。
【００５６】
この化合物のインビトロ活性を評価するために、ＣＤ−１オスマウス（ｎ＝７）をパリカルシトリオール１．５、および３．０μg／kg体重の用量で、週３回３週間、腹腔内注射によって処理し、体重の変化、血中カルシウムイオン、腎臓レニンｍＲＮＡ、および血漿レニン活性（ＰＲＡ）を処理終了時に評価した。データはこれら２つの用量のパリカルシトールは体重への影響がなく、血中カルシウムイオンのレベルをわずかに上げるだけであることを示した；しかし、これら２つの用量のパリカルシトールは、処理マウスにおいて腎臓のレニンｍＲＮＡ（２３％から４５％）、およびＰＲＡ（２０％から７０％）のレベルを共に有意に下げた。これらのデータは、原理的には、パリカルシトールがレニン生合成を実際に阻害することができることを証明しており、パリカルシトールがレニン産生を調節するために潜在的に使用されうる可能性を示唆している。
【実施例１１】
【００５７】
ビタミンＤ欠損ラットにおけるレニンｍＲＮＡ発現に対するパリカルシトールの効果
慢性腎疾患（ＣＫＤ）患者は、一般人よりも非常に高い心血管疾患のリスクに遭遇する。パリカルシトールを含む、幾つかのビタミンＤ受容体活性化物質は、ＣＫＤに付随する副甲状腺機能亢進症の処置のために、現在使われている。最近の臨床データはパリカルシトールがＣＫＤ患者に生存利益を与えることを示している。以前、ビタミンＤ受容体活性化物質がＡＳ４．１細胞でレニン発現を抑制することが示されてきた。非カルシウム血症用量で、パリカルシトールがインビトロでレニンを調節するかどうかを調べるため、パリカルシトールで処理したビタミンＤ欠損ラットの腎臓における、レニンｍＲＮＡ発現を調べた。
【００５８】
ＵＶ光のない環境で飼われた離乳Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラットに０．４％Ｃａ、０．３％Ｐ、ビタミンＤ欠乏食餌を５週間与え、ついで０．０２％Ｃａ、０．５％Ｐ、ビタミンＤ欠乏食餌に２１日間交換した。ラットに０．００３、０．０１、０．０３、および０．３μg／kgのパリカルシトールを最後の２週間に週３回、腹腔内注射で投与した。動物の対照群にはビヒクルのみを与え（５％エタノール／９５％プロピレングリコール）、通常の食餌で（０．５％Ｃａ、０．４％Ｐ）無処理、同年齢の動物を正常同年齢対照として扱った。最終投与の２４時間後、ラットをケタミン（１００mg／kg）で麻酔し、心臓の血液を抜いて、二酸化炭素で殺し、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のために組織を回収し、カルシウム、リン、およびＰＴＨの測定のために血清を採取した。食餌による処理は低カルシウム血症（カルシウムイオン０．７０±０．０２に対し、正常同年齢対照では１．３４±０．０１mmol／Ｌ）、血清ＰＴＨ（２９倍）、およびリン（９．３±０．３  対  ８．１±０．２mg／dl）の上昇、および腎臓のレニンｍＲＮＡの増大（＋２０％）という結果になった。試験した用量のパリカルシトールではカルシウムの有意な変化はなかったが、用量依存的な血清ＰＴＨの減少という結果になった。パリカルシトール処理は腎臓のｍＲＮＡ発現を正常で、ビタミンＤが十分な動物で見られるレベルにまで正常化した。
【００５９】
以上のデータは、上昇したＰＴＨおよび低カルシウム血症を有するビタミンＤ欠損ラットにおいて、血清カルシウムに影響を与えない用量のパリカルシトールが腎臓のレニンｍＲＮＡ発現を有意に抑制していることを示している。レニン発現の抑制に対するパリカルシトールの効果は、パリカルシトール処理されたＣＫＤ患者の死亡率、および罹患率リスクの減少に寄与する因子であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】アテローム動脈硬化と関連する種々の炎症因子の調節解除におけるビタミンＤの役割およびその心筋細胞のリモデリングとの関連を模式的に示す図である。
【図２】パリカルシトール、カルシトリオール、および非Ｄ治療に関する、年あたりの平均入院数、および年あたり在院日数を比較した棒グラフを示す図である。
【図３】パリカルシトールでの治療が非Ｄと比べて年あたり、より少ない入院数、および在院日数と関連があることを示す回帰分析の結果を比較した棒グラフを示す図である。
【図４Ａ】Ａｓ４．１−ｈＶＤＲ細胞のパリカルシトール処理が用量依存的にレニンｍＲＮＡ発現を阻害することを実証するノザンブロットを示す図である。
【図４Ｂ】Ａｓ４．１−ｈＶＤＲ細胞のパリカルシトール処理が用量依存的にレニンｍＲＮＡ発現を阻害することを実証するノザンブロットを示す図である。
【図５】レニン遺伝子の転写を抑制するパリカルシトールの活性を調べるために使われたレニン・プロモーター・ルシフェラーゼ分析の結果を示す図である。
【図６Ａ】ヒト冠状動脈平滑筋細胞の一次培養において、ＰＡI−１に対するパリカルシトール、およびカルシトリオールの効果を示す図である。
【図６Ｂ】ヒト冠状動脈平滑筋細胞の一次培養において、ＰＡI−１に対するパリカルシトール、およびカルシトリオールの効果を示す図である。
【図７】ＮＰＲ−Ａ遺伝子プロモーター発現に対するビタミンＤ類似体の効果を示す図である。ＶＤ３は１，２５ジヒドロキシビタミンＤを意味する（全ての結果は、同時トランスフェクトされたＣＭＶウミシイタケ・ルシフェラーゼの発現に関して標準化される）。
【図８】ＡＮＰ刺激サイクリックＧＭＰ蓄積に対するビタミンＤ類似体の効果を示す図であり、ここではＡＮＰ依存性ｃＧＭＰ産生がＡＮＰ活性の代わりとして使われた。
【図９】新生仔ラット大動脈平滑筋細胞における、変異体（ＶＤＲＥ欠失）ＮＰＲ−Ａ遺伝子プロモーターに対するビタミンＤ類似体の効果を示す図である；結果はウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現に関して標準化される。結果は、全ての試験化合物がビタミンＤ応答エレメントを介してＡＮＰを誘導することを示唆している。
【図１０】無血清培地で培養されトランスフェクトれた心筋細胞を用いて、基礎  対  エンドセリン（１０−７Ｍ）刺激による、ｈＢＮＰ遺伝子プロモーター活性に対するビタミンＤ類似体の効果を示す図である。
【図１１】０．２％ウシ胎児血清で培養されトランスフェクトされた心筋細胞を用いて、基礎およびエンドセリン（１０−７Ｍ）刺激による、ｈＢＮＰ遺伝子プロモーター活性に対するビタミンＤ類似体の効果を示す図である。全ての細胞はｈＶＤＲ、およびｈＲＸＲの発現を指令する発現ベクターで同時トランスフェクトされた。
【図１２】新生仔ラット大動脈平滑筋細胞における、基礎およびエンドセリン（１０−７Ｍ）刺激による、Ｃｄｋ２活性に対するビタミンＤ類似体の効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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