(57)【要約】  本発明は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解した（５）−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる、改良されたホスホルアミダイト活性化剤を提供する。さらに提供されるのは、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解した（５）−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなるホスホルアミダイト活性化剤を用いる、ヌクレオシド間結合を調製するための、改良されたオリゴヌクレオチド合成方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解させた５−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる、ホスホルアミダイト活性化剤。
【請求項２】
少なくとも約０．５重量％のＮ−アルキルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
少なくとも約１．０重量％のＮ−アルキルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項４】
少なくとも約１．５重量％のＮ−アルキルイミダゾールを含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項５】
Ｎ−アルキルイミダゾールがＮ−メチルイミダゾールである、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項６】
少なくとも約０．２５Ｍのベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項７】
約０．３０Ｍ以上のベンジルメルカプトテトラゾールの溶液を含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項８】
少なくとも約０．３５Ｍのベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項９】
約０．４０Ｍ以上のベンジルメルカプトテトラゾールの溶液を含んでなる、請求項１に記載の活性化剤。
【請求項１０】
ホスホルアミダイトを活性化する方法であって、
（ａ）  ホスホルアミダイトを提供する工程と；
（ｂ）  工程（ａ）のホスホルアミダイトを請求項１に記載のホスホルアミダイト活性化剤と反応させて、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’−Ｏ部位と反応可能な中間生成物を生成する工程と；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１１】
前記ホスホルアミダイトが、化学式：
【化１】
2008530092.tif 000011
［式中、Ｐｇは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３からなる群より選択される亜リン酸保護基であり；
Ｒ１は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドであり；そして、
Ｒ２は、モルホリノ、ジアルキルアミノ、または−Ｎ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する４〜７員環のへテロシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルケニルである］
を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドを調製する方法であって、
（ａ）  ３’−ヌクレオシドホスホルアミダイトまたは３’−オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトを提供する工程と；
（ｂ）  前記３’−ヌクレオシドホスホルアミダイトまたは３’−オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトを、ホスホルアミダイト活性化剤の存在下でヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシルと反応させる工程と；
ここで、前記ホスホルアミダイト活性化剤は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解した５−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなり、前記溶液は、約０．２５Ｍよりも高い５−ベンジルメルカプトテトラゾール濃度を有する；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１３】
前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドが、固体担体に結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
糖間共有結合を調製するための方法であって、
（ａ）  ホスホルアミダイトを提供する工程と；
（ｂ）  前記ホスホルアミダイトを、ホスホルアミダイト活性化剤の存在下で、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドの糖部分のヒドロキシル基と反応させて、化学式：
【化２】
2008530092.tif 000012
［式中、Ｐｇは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３からなる群より選択される亜リン酸保護基であり；
Ｒ１は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドであり；そして、
Ｒ４は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドである］
を有する化合物を生成する工程と；
ここで、前記ホスホルアミダイト活性化剤は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解した０．２５Ｍ以上の５−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる；
を含んでなる、上記方法。
【請求項１５】
前記ホスホルアミダイトが、化学式：
【化３】
2008530092.tif 000013
［式中、Ｐｇは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３からなる群より選択される亜リン酸保護基であり；
Ｒ１は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドであり；そして、
Ｒ２は、モルホリノ、ジアルキルアミノ、または−Ｎ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する４〜７員環のへテロシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルケニルである］
を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返し行って、予め選択されたヌクレオチド塩基配列にしたがったオリゴヌクレオチドを生成する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、オリゴヌクレオチドを合成するための改良された組成物に関する。より具体的には、本発明は、改良されたホスホルアミダイト活性化剤に関し、そして、これをオリゴヌクレオチド合成に用いる方法に関する。
【０００２】
背景
オリゴヌクレオチド合成は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）複製のためのプライマーを作製するのに極めて有用であることが見いだされている。具体的には、オリゴヌクレオチドを、相補的ＤＮＡの特定領域に結合するよう調整することが可能であり、それによってＤＮＡの特定断片を増幅することが可能となる。オリゴヌクレオチドのこの側面は、治療的及び診断的な応用における、そして具体的には、遺伝子及びタンパク質の機能の配列特異的な修飾に用いるための、オリゴヌクレオチドの使用への関心を集めている。これら及び他の応用に向けて、オリゴヌクレオチドを大量に生産しなければならず、かつ、それは高純度でなければならない。
【０００３】
ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は、複数のヌクレオシドの連続した結合を伴う。この過程は、一般には、（１）第一のヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド上の５’−ヒドロキシル基のデブロッキング；（２）ホスホルアミダイトモノマーの塩基の活性化；（３）ホスファイト結合を介した、第一の活性化ヌクレオシドと活性化ホスホルアミダイトとの結合；及び、（４）ホスファイト結合の酸化による、より安定なホスファートの形成；の工程を必要とする。これらの４工程は、所望のオリゴヌクレオチドを生成するまで繰り返すことが可能である。
【０００４】
したがって、ホスホルアミダイトは、オリゴヌクレオチドの合成において、ビルディングブロックとして重要である。様々なヌクレオシドに対するホスホルアミダイトが、様々なサプライヤーから市販されている。３’−Ｏ−ホスホルアミダイトが最も広く使用されているアミダイトであるが、しかし、オリゴヌクレオチドの合成は、５’−Ｏ及び２’−Ｏが保護されたホスホルアミダイトによることも可能である（Wagnerら、Nucleosides & Nucleotides、1997年、17,1657-1660；Bhanら、Nucleosides & Nucleotides、1997年、17,1195-1199）。さらに、ヌクレオシドでない利用可能なホスホルアミダイトも多数ある（Cruachem Inc.、ダレス、バージニア州；クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）。
【０００５】
上記に示すように、オリゴヌクレオチド合成は、典型的には、３’−Ｏ−ホスホルアミダイトとヌクレオシド、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ基とのカップリングを伴う。この合成過程における工程の一つは、ホスホルアミダイトの活性化であり、これは、亜リン酸結合を保護する基の一つを切り離すことにより達せられる。次いで、得られた活性化亜リン酸を、ヌクレオシド塩基の活性５’−ヒドロキシル基と結合させることが可能である。この反応の例を、ホスホルアミダイト（Ｉ）が、ホスホルアミダイト活性化剤存在下で、プライマー担体に結合させたオリゴヌクレオシド（ＩＩ）と反応して、ヌクレオシド間結合（ＩＩＩ）を形成する、以下のスキームに示す。
【０００６】
【化１】
2008530092.tif 000002
【０００７】
この例において、Ｒは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチル）−ジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピル−シリル）オキシ］メチル（ＴＯＭ）、オリゴヌクレオチド及びそのアナログ等などの部分であり；Ｐｇは、アルキル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３等などの亜リン酸保護基であり；Ｘ及びＸ’は、独立して、水素、フルオロ、アルコキシ、−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＯＴＢＤＭＳ）、−Ｏ−メトキシメチル（ＯＭＯＭ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）等であり；そして、Ｂ及びＢ’は、独立して、アデニン、シトシン、グアニン、チミジンまたはウラシルに由来する部分である。
【０００８】
上記のスキームによって形成されるオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知であり、例えば、Rudiger Welz及びSabine Muller、「5-Benzylmercapto-1H-tetrazole as activator for 2'0-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis」、Tetrahedron Letters 43、2002年、795-97頁を参照されたい。これらのオリゴヌクレオチドへの高まる需要を供給するためには、商業規模でオリゴヌクレオチドの合成を改良することが望ましい（Noe、Kaufhold、『New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry』、Wiley-VCh Weinheim、2000年、261）。この目的のために、大きな努力が、ホスホルアミダイト活性化剤の開発に費やされている。
【０００９】
ホスホルアミダイト反応に関して記載された最初の活性化剤は、１Ｈ−テトラゾールであった。続いて、５−メチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、５−ニトロフェニル−１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール及び４，５−ジシアノイミダゾールを始めとする、より強力な活性化剤が開発された。つい最近では、５−ベンジルメルカプトテトラゾール（ＢＭＴ）（ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）またはベンジル−１Ｈ−テトラゾールとしても公知である）が、ＴＯＭ保護及びＴＢＤＭＳ保護ＲＮＡホスホルアミダイトの活性化などの特定のＲＮＡ合成技術のための理想的な活性化剤として、導入された。例えば、X.Wu及びS.Pitsch、Nucleic Acids Research、1998年、26,4315-23）；S.Pitschら、Helv.Chim.Acta、2001年、84,3773-3795；及び、R.Welz及びS.Muller、「5-Benzylmercapto-1H-tetrazole as activator for 2'O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis」、Tetrahedron Letters 43、2002年、795-97頁を参照されたい。
【００１０】
ＢＭＴは、１Ｈ−テトラゾールを用いる過程により必要とされるものと比較して５０％ほど少ないＴＢＤＭＳもしくはＴＯＭモノマーを用いて、効率的なＲＮＡ合成を可能にする。加えて、ＢＭＴは、１Ｈ−テトラゾールよりもより低温でより高い溶解度を有し、そして、ＢＭＴは結晶化しないか、または１９Ｅ  Ｃ以下でラインを詰まらせない。しかしながら、アセトニトリル中でのＢＭＴの最大溶解度は、約０．３３Ｍ（http://www.eurogentec.be/ code/EN/what.asppk_id_what=85を参照されたい）であり、そして、ＢＭＴの親水的性質は、アセトニトリルに溶解した場合の商用利用を、０．２５Ｍ以下の溶液に制限している。上記のその濃度では、アセトニトリル中におけるＢＭＴは不安定となり、そして、商用運転の際に試薬ラインを詰まらせる傾向がある。結果として、アセトニトリルに溶解した場合のＢＭＴの商用利用は、０．３Ｍを超える溶液がより効率的かつ迅速な活性化、及びより少ないホスホルアミダイトの消費をもたらすにもかかわらず、０．２５Ｍ以下の溶液に制限されている。加えて、アセトニトリルに溶解したＢＭＴが０．３Ｍ超であると、爆発性でなくより安全なため、大量に製造し、そして、２００Ｌステンレススチール圧分配装置などの金属容器にて保管及び輸送することが可能である。
【００１１】
出願人は、本発明により、先行技術のこういった欠点および他の欠点を克服した。
発明の説明及び好ましい実施態様：
本発明は、オリゴヌクレオチド合成のための改良されたホスホルアミダイト活性化剤溶液について記載する。具体的には、出願人は、５−ベンジルメルカプトテトラゾール（ＢＭＴ）（ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）またはベンジル−１Ｈ−テトラゾールとしても公知である）のアセトニトリル中濃度を、Ｎ−アルキルイミダゾール（alklimidazole）、テトラヒドロフラン及びジオキサンなどの特定の極性共溶媒の添加により増加させることが可能であることを発見した。本発明において利用してもよい共溶媒は、ホスホルアミダイトを溶解可能でなければならず、かつ、その官能基が従来のＤＮＡ及びＲＮＡ合成技術を妨げてはならない。好ましい共溶媒は、Ｎ−アルキルイミダゾール（alklimidazole）である。アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾール（alklimidazole）に溶解したＢＭＴ溶液は、０．２５Ｍを超える濃度で安定であることが見いだされている。ホスホルアミダイト活性化剤として用いる場合、０．２５Ｍを超えるＢＭＴ溶液は、ホスホルアミダイトの活性化を増加させ、それにより、より効率的かつ迅速なオリゴヌクレオチド合成を、より少ないホスホルアミダイトの消費にてもたらす。
【００１２】
本発明によるホスホルアミダイトは、化学式Ｉ：
【００１３】
【化２】
2008530092.tif 000003
【００１４】
［式中、Ｐｇは、アルキル、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３などの亜リン酸保護基であり；
Ｒ１は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドであり；そして、
Ｒ２は、モルホリノ、ジアルキルアミノ（dialklamino）、または−Ｎ（Ｒ３）２［式中、Ｒ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または、窒素、硫黄及び酸素からなる群より選択される３個までのヘテロ原子を有する４〜７員環のへテロシクロアルキルもしくはヘテロシクロアルケニルである］
の化合物である。
【００１５】
本発明によるヌクレオシド化合物としては、モノマーの、及び連結した、ＤＮＡもしくはＲＮＡヌクレオシドが挙げられる。「ヌクレオシド」の語は、自然界に存在するヌクレオシドまたは自然界に存在しないヌクレオシド、ならびに、連結核酸（ＬＮＡ）誘導体、及び、例えばハロゲン置換基などのさらなる基により置換されたヌクレオシドを始めとする、核酸塩基が修飾され、かつ／または糖部分が修飾されたヌクレオシド、ビオチンもしくはフルオレセインが連結した化合物を始めとする、検出剤含有ヌクレオシド；アンチセンス作用を増強するリガンドを有するエフェクター含有化合物；ならびに、これらのうち２またはそれより多くに由来するオリゴマー構造を含むことが、意図される。適切なＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドとしては、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン及びデオキシグアノシンの５’−Ｏ保護ヌクレオシドを始めとする、５’−Ｏ保護ヌクレオシド（ベンゾイル、イソブチリル、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル「ＴＡＣ」等による保護などの、さらなるＮ保護を伴うか、または伴わない）などの、保護ヌクレオチド；アデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンの５’−Ｏ保護２’保護ヌクレオシド（ここで、好ましい２’保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、メトキシエチル（ＭＯＥ）基、及びメトキシ基などのアルコキシ基を含む）を始めとする、５’−Ｏ保護２’保護ヌクレオシド（さらなるＮ保護を伴うか、または伴わない）、ならびに、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン及びデオキシグアノシンの３’−Ｏ保護ヌクレオシド（さらなるＮ保護を伴うか、または伴わない）、ならびにそれらに由来するオリゴマー構造が、挙げられる。連結したヌクレオシド間におけるヌクレオシド間結合は、天然のホスホジエステル結合、ならびに、ホスホロ−チオエート結合などの修飾された結合を、含んでなる。当該技術分野において公知のような他のヌクレオシド間結合もまた、本発明に従っている。
【００１６】
糖修飾は、先行技術分野において公知であり、そして、例えば、Ｆなどの２’置換基、ならびに、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、エーテル類及びポリエーテル類などの２’−Ｏ−置換基（ここで、置換は、１または複数のアミノ、イミダゾール、ハロゲン、シアノ、カルボキシ、ヒドロキシ、ニトロ及びメルカプト残基から選択される）が、含まれる。好ましいポリエーテル類は、クラウンエーテル及びOuchiら、「Drug Design and Discovery」、1992年、9,93；Ravasioら、J.Org.Chem. 1991年、56,4329；及びDelgardoら、「Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems」、1992年、9,249らにより開示されているものなどの、直線状及び環状ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、ならびに（ＰＥＧ）含有群である。該文献のそれぞれは、参照により本明細書に記載されているものとする。糖修飾は、上記のCook, P.D.文献においてさらに開示されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル及びアルキルアミノによる置換は、「Oligomeric Compounds having Pyrimidine Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions」と題する、1995年3月6日に出願された米国特許出願第08/398,901に記載されている。該出願は、参照により本明細書に記載されているものとする。
【００１７】
リボシル環上にＯ−置換を有する糖類もまた、本発明に従っている。環のＯに対する代表的な置換としては、Ｓ，ＣＨ２、ＣＨＦ及びＣＦ２が挙げられ、例えば、Secristら、「Abstract 21, Program & Abstracts」（Tenth International Roundtable, Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications、パークシティ、ユタ州、1992年9月16〜20日）を参照されたい。該文献は、参照により本明細書に記載されているものとする。
【００１８】
本明細書では、「アルキル」の語は、これに限定されないが、直鎖、分鎖及び脂環式の炭化水素基を含む。本発明のアルキル基は、置換されていてもよい。代表的なアルキル置換基は、米国特許第5,212,295の12列41〜50行に開示されている。該出願は、参照により本明細書に記載されているものとする。
【００１９】
「アリール」基は、これに限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル及びキシリルを始めとする、芳香族環状化合物である。
一般に、「ヘテロ」の語は、炭素以外の原子、好ましくは、これに限らないがＮ、ＯまたはＳを示す。したがって、「ヘテロシクロアルキル」の語は、１またはそれより多くのヘテロ原子（すなわち、非炭素原子）を有するアルキル環系を示す。好ましいヘテロシクロアルキル基としては、例えば、モルホリノ基が挙げられる。本明細書では、「ヘテロシクロアルケニル」の語は、１またはそれより多くの二重結合及び１またはそれより多くのヘテロ原子を有する環系を示す。好ましいヘテロシクロアルケニル基としては、例えば、ピロリジノ基が挙げられる。
【００２０】
本発明の一部の好ましい実施態様において、アミノ基に、アルキル基または、例えば２’−アルコキシ基（例えば、Ｒ１がアルコキシであるもの）などの他の基が付加している。このようなアミノ基も、通常は、自然界に存在する核酸塩基及び自然界に存在しない核酸塩基中に存在する。一般には、これらのアミノ基は、本発明のオリゴマー化合物の合成中において、保護された形態にある。これらの目的に適した代表的なアミノ保護基は、Greene及びWuts、『Protective Groups in Organic Synthesis』、第7章、第2版、John Wiley & Sons、ニューヨーク州、1991年において論じられている。一般には、本明細書では、「核酸塩基」などの分子部分に関連して用いられる場合の「保護される」の語は、分子部分が、保護基によって保護される１またはそれより多くの官能基を含有することを、示す。
【００２１】
本出願では、「核酸塩基」の語は、例えばアデニン、グアニン、シトシン、ウリン及びチミジンなどの自然界に存在する核酸塩基、ならびに、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他の６−アルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他の２−アルキル誘導体、５−ハロウラシル及び５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６−アザチミジン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニンなどの修飾されている核酸塩基を含むことが、意図される。さらなるプリン及びピリミジンとしては、米国特許第3,687,808に開示されるもの、コンサイス百科事典Polymer Science And Engineering,（858〜859頁、Kroschwitz,J.I.編集、John Wiley & Sons、1990年）に開示されるもの、及び、Englischら、「Angewandte Chemie」（国際版、1991年、30,613）、Limbach,A.ら、「Nucleic Acids Research」（1994年、22,2183-2196）に開示されるものが挙げられる。「ヌクレオシド塩基」の語は、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基でないが、しかしヌクレオシド塩基として働く、特定の「ユニバーサル塩基」を初めとする、ヌクレオシド塩基のように働くことが可能な複素環化合物をさらに含むことが、意図される。ユニバーサル塩基として特に挙げられるのは、３−ニトロピロールである。
【００２２】
修飾されたヌクレオシド間結合は、先行技術分野において公知であり、そして、例えば、メチルホスホナート、モノチオホスファート、ジチオホスファート、ホスホルアミダート、リン酸エステル、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロチオアート、架橋メチレンホスホナート、ならびに、シロキサン架橋、カルボナート架橋、カルボキシメチルエステル架橋、アセトアミド架橋、カルバマート架橋、チオエステル架橋、スルホキシ架橋、スルホノ架橋、種々の「塑性」ＤＮＡ、Ａ−アノマー架橋及びボラン誘導体を伴う脱リン酸ヌクレオチド間アナログが挙げられる。
【００２３】
ホスホルアミダイト活性化の効率は、オリゴヌクレオチド合成中の最終生成物の収率と直接的に相関する。この効率を、ＢＭＴがより高濃度のホスホルアミダイト活性剤溶液を供することによって、改良することが可能である。出願人は、アセトニトリル中でのＢＭＴの溶解度を、共溶媒としてＮ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）を加えることにより増加させることが可能であることを、発見した。したがって、本発明の一側面は、アセトニトリル及び約０．１％〜約１０％Ｎ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）に溶解したＢＭＴを含んでなるホスホルアミダイト活性化剤組成物を、提供する。好ましい実施態様において、本発明の活性化剤組成物は、約０．１％〜約１．５％Ｎ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）、より好ましくは約０．５％〜約１．５％Ｎ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）、そしてよりいっそう好ましくは約１．０％〜約１．５％Ｎ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）を含んでなる。１０％を超えるＮ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）の濃度は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ合成過程を妨げる可能性がある。好ましくは、Ｎ−アルキルイミダゾール（alkyimidazole）は、Ｎ−メチルイミダゾールである。
【００２４】
別の好ましい実施態様において、ホスホルアミダイト活性化剤組成物は、合成グレードのアセトニトリル中に溶解した約０．２５〜約１．０モル濃度のＢＭＴを有する溶液を、含んでなる。より好ましくは、該組成物は、約０．３０〜約０．４０モル濃度のＢＭＴ溶液を含んでなるが、よりいっそう好ましいのは、約０．３５〜約０．４０モル濃度のＢＭＴ溶液の組成物である。好ましくは、該組成物を、約−１Ｅ  Ｃを超える温度に、そしてより好ましくは約４Ｅ  Ｃを超える温度に維持する。−４Ｅ  Ｃ以下の温度に該組成物を長期間曝露すると、沈殿が生じて、商業的なオリゴヌクレオチド合成過程に悪影響を与える可能性がある。
【００２５】
本発明の別の側面によると、新規なホスホルアミダイト活性化法が提供される。いずれの特定の理論によって拘束されることはないが、ＢＭＴがホスホルアミダイトを活性化するメカニズムは、まず、ホスホルアミダイトの三価リンのプロトン付加、そして、中間生成物を形成するためのモルホリノ、ジアルカミノもしくはアミン離脱基の付加を伴うと考えられている。続いて、離脱基を置換して、亜リン酸をヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの利用可能な５’−Ｏ部位に結合させ、それによってオリゴヌクレオチド内に糖間共有結合を作り出す。この反応メカニズムの例を以下のスキームに示す。
【００２６】
【化３】
2008530092.tif 000004
【００２７】
ホスホルアミダイト活性化剤の存在下でのホスホルアミダイトとヒドロキシル基の反応を、アセトニトリルなどの溶媒の存在下で行うことが可能である。
このように、一部の好ましい実施態様において、本発明は、化学式ＩＩ：
【００２８】
【化４】
2008530092.tif 000005
【００２９】
［式中、Ｐｇ及びＲ１は、上記のように定義され；そして、
Ｒ４は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドである］
を有する化合物により示されるものを始めとする、糖間共有結合を調製するための方法であって、
（ａ）  化学式Ｉのホスホルアミダイトを提供する工程；および、
（ｂ）  ホスホルアミダイト活性化剤の存在下で、前記ホスホルアミダイトを、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドの糖部分のヒドロキシル基と反応させる工程、ここで、前記ホスホルアミダイト活性化剤は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾール（alklimidazole）に溶解した０．２５Ｍよりも高濃度のＢＭＴ溶液を含んでなる；
を含んでなる上記方法に関する。
【００３０】
特定の好ましい実施態様において、Ｒ４は、例えば、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成レジメンにおけるように、固体担体が好ましい。本発明による固体担体としては、例えば、徐放性多孔性ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル−徐放性多孔性ガラス（例えば、Alulら、Nucleic Acids Research、1991年、19,1527を参照されたい。該文献は、その全体が本明細書に記載されているものとする。）、TentaGel担体、アミノポリエチレングリコール誘導体化担体（例えば、Wrightら、Tetrahedron Letters、1993年、34,3373を参照されたい。該文献は、その全体が本明細書に記載されているものとする。）及びポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体であるＰｏｒｏｓを始めとする、固相方法論における使用に適することが当該技術分野において一般的に公知のものが、挙げられる。
【００３１】
さらに、本発明に従い提供されるのは、
（ａ）  ３’−モノヌクレオシドホスホルアミダイトまたは３’−オリゴヌクレオシドホスホルアミダイトを提供する工程；および、
（ｂ）  前記３’−モノヌクレオシドホスホルアミダイトまたは３’−オリゴヌクレオシドホスホルアミダイトを、ホスホルアミダイト活性化剤の存在下で、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルと反応させる工程、ここで、前記ホスホルアミダイト活性化剤は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾール（alklimidazole）に溶解した０．２５Ｍよりも高濃度のＢＭＴ溶液を含んでなる；
を含んでなる、オリゴヌクレオチドの調製方法である。
【００３２】
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」の語は、自然界に存在するオリゴヌクレオチドと自然界に存在しない（すなわち、「合成」）オリゴヌクレオチドの双方を含むことが、意図される。自然界に存在するオリゴヌクレオチドとは、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル核酸塩基を有するリボース及びデオキシリボースホスホジエステルオリゴヌクレオチドなどの、自然界に存在するものである。本明細書では、自然界に存在しないオリゴヌクレオチドとは、修飾糖、ヌクレオシド間結合及び／または核酸塩基部分を含有するオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドアナログは、典型的には、自然界に存在するオリゴヌクレオチドまたは合成の野生型オリゴヌクレオチドとは構造的に区別可能であるにもかかわらず、これらと機能的に代替可能である。このように、自然界に存在しないオリゴヌクレオチドは、例えば標的をハイブリダイズすることによって、所望のＲＮＡもしくはＤＮＡ鎖の構造及び／または機能を模倣する働きを効果的に行う、すべてのこのような構造を含む。
【００３３】
一部の好ましい実施態様では、３’−モノヌクレオシドホスホルアミダイトまたは３’−オリゴヌクレオシドホスホルアミダイトを、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを結合させた固体担体の５’ヒドロキシルと反応させる。
【００３４】
さらに好ましい実施態様では、前述の方法のそれぞれを繰り返し行って、予め選択されたヌクレオチド塩基配列を有するオリゴヌクレオチドまたはそのアナログを生成させる。
一般には、「Ｐｇ」と表される亜リン酸保護基は、合成レジメンの最後、好ましくは、完成したオリゴヌクレオチドまたはアナログを固体担体から切り離すときに、除去される。
【００３５】
当業者によって認識されるであろうように、オリゴヌクレオチドを、バッチ及び／または連続過程を介してのみならず、例えばアプライド・バイオシステムズ社ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置モデル392及び394のユーザーマニュアル；第6節、Chemistry for Automated DNA/RNA Synthesis（1994年3月）、及びM.JGait、「Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach」（オックスフォード大学プレス内IRLプレス、1984年、ISBN 0-904147-74-6）に記載されるようなオリゴヌクレオチド自動合成法も用いて、本方法に従い合成してもよい。該文献は、参照により本明細書に記載されているものとする。このような実施態様では、ヌクレオシド及び／またはオリゴヌクレオチドのヒドロキシル含有化合物を固体担体上に固定し、そして、自動ＤＮＡ合成装置内で、ヌクレオシドホスフィチル化剤及びホスフィチル化活性化剤の存在下で反応させて、オリゴヌクレオチドを形成する。特定数及び特定配列のホスフィチル化反応を行って、異なる長さ及び配列のヌクレオシドを含んでなるオリゴヌクレオチドを、本発明に従い生成させてもよい。
【００３６】
いずれの適切な固体担体材料も、本発明における使用に適し得る。適切な固体担体材料の例としては、徐放性多孔性ガラス（「ＣＰＧ」）、ポリスチレン、シリカ、セルロース紙、及びその２種またはそれより多くの組み合わせが、挙げられる。好ましい分類の固体担体材料としては、徐放性多孔性ガラス、ポリスチレン及びその組み合わせが挙げられる。
【００３７】
本方法における使用のための固体担体は、任意の適切なサイズの孔を有してもよい。当業者に認識されるであろうように、孔サイズの選択は、少なくとも部分的には、生成されるオリゴマーのサイズ及び用いるヌクレオチド合成過程によって決まる。本明細書における教示を踏まえて、当業者は、幅広く多様な応用における使用に向けて、適切な孔サイズの固体担体材料を容易に選択することが可能であろう。
【００３８】
多様な固体担体に固定されたヌクレオシドが、市販されている。例えば、ＣＰＧ上に固定された多数のｎ保護デオキシヌクレオシド（１０００オングストロームＣＰＧの０．２μＭのベンゾイル保護デオキシヌクレオシドを含む）は、アプライド・バイオシステムズ社（ＡＢＩ）より入手可能である。
【００３９】
広範囲の自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置のいずれも、本発明における使用に適している可能性がある。適切なＤＮＡ合成装置の例としては、アプライド・バイオシステムズ社のモデル3900、3948、3400、380、380B、392及び394、Expedite 8800、8905、8909；アマシャム社／ＧＥヘルスケア社から入手可能なGene Assembler、OligoPilot II, AKTAoligopilot 10及びAKTAoligopilot 100；ならびに、Beckmann Oligo 1000及び100OM、MWG Biotech Oligo 2000、PolyPlex GeneMachine、Illumina Oligator、MerMadeI、ＩＩ及びＶ、Intelligent BioInstruments Primer Station 960、Proligo Polygen、Syntower等が挙げられる。好ましい分類の合成装置としては、モデルABA-394等が挙げられる。
【００４０】
本発明のさらなる特徴を、以下の実施例において提供する。該実施例は、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１〜１２）
以下の実施例は、共溶媒Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）を添加した場合にアセトニトリル中でのＢＭＴ溶解度が増加することを示す。
【００４２】
【表１】
2008530092.tif 000006
【００４３】
上記の実施例に示されるように、アセトニトリル中のＢＭＴ濃度を、共溶媒ＮＭＩの添加により増加させることが可能である。
（実施例１３〜３７）
以下の実施例は、異なるホスホルアミダイト活性化剤を利用したＲＮＡ合成のカップリング収率及び完全長生成物の比較を示す。各実施例に対する平均値は、ｒＵ２０配列またはＲＮＡ  ２１ｍｅｒ配列を用いた合計３実験を平均することによって算出した。
【００４４】
実施例１３の実験方法は、以下のとおりである：
ｒ−ＤＭＴ−Ｕ及びＱ−リンカーを用いて誘導体化したＬＣＡＡ−ＣＰＧ担体（１５．４ｍｇ）を含有する合成カラムを、ABI 394ＤＮＡ合成装置に設置した。該合成装置を、０．１Ｍ  ２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル保護ＲＮＡホスホルアミダイト溶液（トランスジェノミック社）、ならびに通常用いられるデブロック、キャッピング及び酸化溶液を用いて、構成した。用いた活性化溶液は、０．３Ｍ  ＢＭＴ＋２．５％ＮＭＩであった。標準的な０．２μｍｏｌ規模でのＲＮＡ合成サイクル（３００秒のカップリング時間）を行った（Tr-off／手動で終了）。合成後、粗生成物は、担体に付着したままにした。合成カラムを開け、そして、ＣＰＧの一部（５．２ｍｇ）を取り出し、そして、水酸化アンモニウム中に入れた（４８時間、ＲＴ）。溶液の上清を捨て、ＮＨ４ＯＨを蒸発により除去し、そして、残留物を水に溶解した。２６０ｎｍでのＵＶ定量により、２７．３Ａ２６０単位（または、１０ｍｇのＣＰＧにつき５２．５Ａ２６０単位の回収率が示された。２’−Ｏ−シリル化粗材料（５Ａ２６０単位）のアリコットを取り出し、３：１のＤＭＳＯ／ＴＥＡ−３ＨＦ（１０μｌ）に溶解し、そして加熱して（６５℃にて３時間）、２’−ＯＨ基を脱保護した。ｎ−ブタノール（１．５ｍｌ）を加えて、完全に脱保護した生成物を沈殿させた。遠心分離後、ペレットを収集し、次いで、ＲＮＡ分解酵素の混入を避けるために手袋及び無菌ＤＥＰＣ水を用いることを除けば上述のように、キャピラリーゲル電気泳動により分析した。
【００４５】
実施例１４〜１６については、０．４５Ｍテトラゾール活性化剤を下記の組成物に置き換えたことを除き、上記方法を繰り返した。
【００４６】
【表２】
2008530092.tif 000007
【００４７】
【表３】
2008530092.tif 000008
【００４８】
上記の実施例に示されるように、０．３Ｍ  ＢＭＴのホスホルアミダイト活性化剤溶液により、特定の他の活性化剤のものと同等またはそれ以上のカップリング収率及び完全長ＲＮＡオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。しかしながら、高濃度のＮＭＩは、合成過程の効率を低下させるおそれがある。
【００４９】
（実施例３８〜４３）
以下の実施例は、異なるホスホルアミダイト活性化剤を利用したＤＮＡ合成のカップリング収率及び完全長生成物の比較を示す。各実施例に対する平均値は、示したＤＮＡ配列を用いた合計３実験を平均することによって算出した。
【００５０】
実施例３８の実験方法は、以下のとおりである：
ｄ−ＤＭＴ−Ｇ（ｉＢｕ）及びＱ−リンカーを用いて誘導体化したＬＣＡＡ−ＣＰＧ担体（１０〜１５ｍｇ）を含有する合成カラムを、ABI 394ＤＮＡ合成装置に設置した。該合成装置を、０．１Ｍのホスホルアミダイト溶液（トランスジェノミック社）、ならびに通常用いられるデブロック、キャッピング及び酸化溶液を用いて、構成した。用いた活性化溶液は、０．３Ｍ  ＢＭＴ＋０．５％ＮＭＩであった。標準的な０．２μｍｏｌ規模でのＤＮＡ合成サイクルを、行った（Tr-off／自動で終了）。合成後、粗生成物を、水酸化アンモニウムを用いて、自動的に担体から切り離した（５分間、ＲＴ）。次いで、該材料を加熱して（５５°、１６時間）、保護基を除去した。ＮＨ４ＯＨを蒸発により除去し、そして、残留物を水に溶解し、そして２６０ｎｍのＵＶにより定量した（５９Ａ２６０単位の収率）。粗材料のアリコット（０．５Ａ２６０単位）を取り出し、水（５０μｌ）に再溶解し、そしてｎ−ブタノール（１．５ｍｌ）を用いて沈殿させて、脱塩した。該試料を遠心分離し（２分間）、液体層を除去し、そして、ペレットを真空下で乾燥させた。該試料を、７：３のホルムアミド／水（１００μｌ）に再溶解し、変性させ（９５°、２分間）、氷上で冷却し（２分間）、次いで、キャピラリーゲル電気泳動により分析した。ＣＧＥは、アジレント社の条件（公開番号5988-4303EN）のとおりに、アジレント社の機器を用いて、ＰＥＧ溶液及びアジレント社ＰＶＡにより覆われたキャピラリー（１００μｍ×全長３３ｃｍ）中で行った。試料を３回分析し、そして、最も大きなピークの平均積分ピーク面積（移動度に対して補正）を、完全長生成物の全収率として用いた。
【００５１】
実施例２０及び２１については、０．５Ｍ  ＥＴＴ活性化剤を下記の組成物に置き換えたことを除き、上記方法を繰り返した。
【００５２】
【表４】
2008530092.tif 000009
【００５３】
【表５】
2008530092.tif 000010
【００５４】
上記の実施例に示されるように、０．３Ｍ  ＢＭＴのホスホルアミダイト活性化剤溶液により、他の活性化剤のものと同等のカップリング収率及び完全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドを得ることが可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月10日(2007.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトニトリルと０．５重量％以上のＮ−アルキルイミダゾールに溶解させた５−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなり、
５−ベンジルメルカプトテトラゾールが０．２５Ｍ以上の濃度で存在する、ホスホルアミダイト活性化剤。
【請求項２】
ホスホルアミダイトを活性化する方法であって、
（ａ）  ホスホルアミダイトを提供する工程と；
（ｂ）  工程（ａ）のホスホルアミダイトを請求項１に記載のホスホルアミダイト活性化剤と反応させて、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５’−Ｏ部位と反応可能な中間生成物を生成する工程と；
を含んでなる、上記方法。
【請求項３】
糖間共有結合を調製するための方法であって、
（ａ）  ホスホルアミダイトを提供する工程と；
（ｂ）  前記ホスホルアミダイトを、ホスホルアミダイト活性化剤の存在下で、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドの糖部分のヒドロキシル基と反応させて、化学式：
【化１】
2008530092.tif 000014
［式中、Ｐｇは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＮ、パラ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＣＮ、−（ＣＨ２）２−５Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（Ｃ６Ｈ５）２ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＯＣＦ３からなる群より選択される亜リン酸保護基であり；
Ｒ１は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドであり；そして、
Ｒ４は、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドである］
を有する化合物を生成する工程と；
ここで、前記ホスホルアミダイト活性化剤は、アセトニトリル及びＮ−アルキルイミダゾールに溶解させた０．２５Ｍ以上の５−ベンジルメルカプトテトラゾール溶液を含んでなる；
を含んでなる、上記方法。
【国際調査報告】
2008530092.tif 000015
2008530092.tif 000016
2008530092.tif 000017