(57)【要約】【課題】本発明は、抗ＣＤモノクローナル抗体（ＣＬ１−Ｒ２  ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４）及びその保存的均等物に関する。【解決手段】更に、特にＥＣ血管新生、ＮＫ、及びＴサイトカイン生成の分野におけるこれらの抗ＣＤ１６０化合物の適用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗血管新生薬剤の製造のための抗ＣＤ１６０化合物の使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０への結合について抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託されているハイブリドーマから得られる）と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなく、ＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異的であることを特徴とする使用方法。
【請求項２】
請求項１記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、更に、ＣＤ８５ｊに結合しないことを特徴とする薬剤。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗血管新生薬剤は、腫瘍の予防又は治療を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項４】
請求項１又は２のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗血管新生薬剤は、子癇前症若しくは子癇の予防又は治療を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項５】
請求項１又は２のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗血管新生薬剤は、糖尿病、及び／又は虚血性眼疾患、及び／又は関節リュウマチの予防又は治療を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、前記抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ−１−Ｒ２であることを特徴とする使用方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗ＣＤ化合物は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を保持する前記ｍＡｂＣＬ−１−Ｒ２の保存的フラグメントであり、ＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異性を保持していることを特徴とする使用方法。
【請求項８】
請求項７記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ−１−Ｒ２の保存的フラグメントは、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントであることを特徴とする使用方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であり、該保存的誘導体は少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを含み、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合でき、また少なくともＣＤ８αβに結合することなく、ＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異性を保持していることを特徴とする使用方法。
【請求項１０】
請求項９記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ペプチドリンカー（Ｌ）を介して、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＬ領域にリンクされる少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＨ領域を含む少なくとも１つのｓｃＦｖ化合物を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の使用方法であって、
前記保存的誘導体は、一価ｓｃＦｖであることを特徴とする使用方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の使用方法であって、
前記保存的誘導体は、多価ｓｃＦｖであることを特徴とする使用方法。
【請求項１３】
請求項９記載の使用方法であって、
前記保存的誘導体は、Ｆｃフラグメントに連結された、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２から誘導されたｓｃＦｖ多量体を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項１４】
請求項９記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ヒトＦｃに連結したＣＲ１−Ｒ２の少なくとも１つのＦｖフラグメントを含む化合物であることを特徴とする使用方法。
【請求項１５】
請求項９記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、前記ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂから誘導された１つ以上のＦａｂを、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂの各Ｈ鎖のＣ末端に付加することによって得られるものであることを特徴とする使用方法。
【請求項１６】
請求項９記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂを一緒に共有結合させて凝集Ａｂ形態を形成することによって得られるものであることを特徴とする使用方法。
【請求項１７】
請求項９記載の使用方法であって、
前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、２つ以上のＦａｂを頭部対尾部で結合させることによって得られるものであることを特徴とする使用方法。
【請求項１８】
抗血管新生化合物の特定及び／又は単離のための、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託されているハイブリドーマから得られる）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体のインビトロでの使用方法であって、
前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異であり、
前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項１９】
抗血管新生化合物を特定するためのインビトロでの方法であって、以下のことを含むことを特徴とし、
候補化合物を提供し、
前記候補化合物が以下のものであるかどうかを判断し、
ＣＤ１６０に対する結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を有する、及び
ＣＤ８αβに結合しない、
前記候補化合物が、前記ＣＤ１６０結合の親和性と特異性を実際に有するならば、それを抗血管新生の特異性化合物であると特定する。
【請求項２０】
ＥＣ発現ＣＤ１６０によって仲介される、抗血管新生シグナル伝達に関与する分子を特定するための、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体の、インビトロでの使用方法であって、
前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異であり、
前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項２１】
内皮細胞によって発現したときのＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達経路に関与する脂質ＲＡＦＴ付随膜分子を特定するためのインビトロでの方法であって、次のことを含むことを特徴とし、
ＣＬ１−Ｒ２を用いて又はその保存的フラグメントもしくは誘導体を用いて、
前記細胞の脂質ＲＡＦＴのドメイン画分を回収するように前記細胞を溶解し、少なくとも１つの脂質ＲＡＦＴドメインを含む前記溶解物の画分を回収し、
前記ＲＡＦＴ画分の中で、ＣＤ１６０特異性を表す少なくとも１つの化合物を、以下のようにして特定し、
同様な条件下で得られる対照化合物を比較することにより、但し、前記ＣＬ１−Ｒ２又は保存的フラグメントもしくは誘導体の代わりに、非反応性アイソタイプ一致の対照Ａｂを使用方法することにより、及び
同様な条件下で得られる対照化合物を比較することにより、但し、ＣＤ１６０には結合しないが別なＥＣ発現受容体には結合する化合物を用いて、
場合により、こうして特定された前記少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物を回収し、
場合により、この（これらの）化合物を配列決定又は小配列決定し、
それにより、こうして特定された前記少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物が、ＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達経路に関与する脂質ＲＡＦＴ関連の膜分子であるとする。
【請求項２２】
内皮細胞によって発現されたときのＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達経路に関与する二次メッセンジャーを特定する方法であって、以下のことを含むことを特徴とし、
ＥＣ上に発現したＣＤ１６０をＣＬ１−Ｒ２を用いて活性化し、
ＣＤ１６０上に形成された推定複合体を基本的に保存するように、穏やかな条件下で前記細胞を溶解し、
場合により、その溶解物を予備洗浄し、
ＣＬ１−Ｒ２及びそれらに結合し得る化合物を回収し、
インビトロのキナーゼアッセイを行い、
前記インビトロのキナーゼアッセイの結果として、少なくとも１つのリン化合物を取り込んだ少なくとも１つの化合物を特定し、
それにより、前記少なくとも１つの特定された化合物は、ＣＤ１６０シグナル伝達経路に関与する二次メッセンジャーであり、
場合により、前記少なくとも１つの特定された化合物を回収し、
前記少なくとも１つの特定された化合物が、タンパク質又はポリペプチド成分を含むとき、
場合により、前記少なくとも１つの回収された化合物のトリプシン消化を行い、
場合により、前記少なくとも１つの回収された化合物を配列決定又は小配列決定し、
そのようにして前記タンパク質又はポリペプチド成分の配列を得る。
【請求項２３】
ある個体のサイトカイン生成を誘導又は阻害する、及び／又は上方又は下方制御することを目的とする薬剤の製造のための抗ＣＤ１６０化合物の使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０への結合について抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異であることを特徴とする使用方法。
【請求項２４】
請求項２３記載の使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、更にＣＤ８５ｊ及び／又はＣＤ４に結合しないことを特徴とする使用方法。
【請求項２５】
請求項２３又は２４のいずれかに記載の使用方法であって、
前記サイトカインは、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα及び／又はＩＬ−６であることを特徴とする使用方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記薬剤は前記個体の適応できる免疫可能性を誘導又は阻害する、及び／又は上方又は下方制御することを目的とするものであることを特徴とする使用方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の使用方法であって、
前記薬剤は、感染の治療又は予防を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項２８】
請求項２６又は２７記載の使用方法であって、
前記薬剤は、ワクチン組成物に含まれるか又はワクチンの助剤として用いられることを特徴とする使用方法。
【請求項２９】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記薬剤は、前記個体における血球新生を誘導又は阻害する、及び／又は上方又は下方制御することを目的とするものであることを特徴とする使用方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の使用方法であって、前記薬剤は、放射能にさらされた個体の治療及び／又は骨髄形成不全の治療又は予防を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項３１】
請求項２３〜２５のいずれかに記載の使用方法であって、
前記薬剤は、前記個体における炎症反応を誘導又は阻害する、及び／又は上方又は下方制御することを目的とするものであることを特徴とする使用方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の使用方法であって、
前記薬剤は、前記個体におけるアレルギーの治療又は予防を目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項３３】
請求項３１記載の使用方法であって、
前記薬剤は、血管拡張作用を誘導することを目的とすることを特徴とする使用方法。
【請求項３４】
請求項２３〜２５、２６、２９、３１、３２のいずれかに記載の、ある個体のサイトカイン生成を阻害及び／又は下方制御することを目的とする前記薬剤の製造のための使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、少なくとも１つのＣＤ１６０結合部位、及び少なくとも１つのＣＤ１５８ｂ結合部位を含むことを特徴とする使用方法。
【請求項３５】
請求項２３〜２５、２６、２９、３１、３２のいずれかに記載の、ある個体のサイトカイン生成を阻害及び／又は下方制御することを目的とする前記薬剤の製造のための使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、可溶性化合物であることを特徴とする使用方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の使用方法であって、
前記可溶性抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４ハイブリドーマから得られる抗ＣＤ１６０ｍＡｂであることを特徴とする使用方法。
【請求項３７】
請求項３５記載の使用方法であって、
前記可溶性抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合できる能力を保持し、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異性を保持しているＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメントであることを特徴とする使用方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の使用方法であって、
前記ＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメントは、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントであることを特徴とする使用方法。
【請求項３９】
請求項３５記載の使用方法であって、
前記可溶性化合物は、ＣＬ１−Ｒ２の一価又は二価の保存的誘導体であり、即ち、ＣＬ１−Ｒ２誘導体は：
ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合できる能力を保持し、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異性を保持しており、
前記誘導体は、少なくとも１つの前記ＣＬ１−Ｒ２のフラグメントを含み、
前記誘導体は、１つ又は２つの、しかし２つ以下のＣＤ１６０結合部位を有する、
ことを特徴とする使用方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の使用方法であって、
前記ＣＬ１−Ｒ２の一価又は二価の保存的誘導体は、：
ＣＬ１−Ｒ２のヒト型のＡｂの形態、又は
ＣＬ１−Ｒ２のキメラＡｂの形態、又は
ＣＬ１−Ｒ２から誘導され、場合によりＦｃフラグメントに連結した一価又は二価のｓｃＦｖ、又は
Ｆｃフラグメントに結合したＣＬ１−Ｒ２フラグメント、又は
その各Ｈ鎖に１つの付加的ＣＬ１−Ｒ２Ｆａｂを含むフルレングスＣＬ１−Ｒ２Ａｂ、
であることを特徴とする使用方法。
【請求項４１】
請求項２３〜３１、３３に記載の、ある個体のサイトカイン生成を誘導及び／又は上方制御することを目的とする前記薬剤の製造のための使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、凝集化合物であることを特徴とする使用方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の使用方法であって、
前記凝集化合物は、請求項３５〜３９のいずれかに定義された可溶性の凝集形態であることを特徴とする使用方法。
【請求項４３】
請求項４１又は４２記載の使用方法であって、
前記凝集化合物は、少なくとも３つのＣＤ１６０結合部位を含み、ＣＤ１５８結合部位を含まないことを特徴とする使用方法。
【請求項４４】
ＮＫ細胞及び／又はＴ  ＣＤ８＋細胞及び／又はＴ  ＣＤ４＋細胞のサイトカイン生成を誘導又は阻害、及び／又は上方又は下方制御する能力を有する化合物の特定及び／又は単離のための、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託されているハイブリドーマから得られる）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体のインビトロでの使用方法であって、
前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異的であり、
前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを含むことを特徴とする使用方法。
【請求項４５】
ＮＫ細胞及び／又はＴ  ＣＤ８＋細胞及び／又はＴ  ＣＤ４＋細胞のサイトカイン生成を誘導又は阻害、及び／又は上方又は下方制御する能力を有する化合物の特定するためのインビトロでの方法であって、以下のことを含むことを特徴とし、
候補化合物を提供し、
前記候補化合物を以下について判断し、
ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を有する、及び
少なくともＣＤ８αβに結合しない、
それが実際に前記ＣＤ１６０結合親和性と特異性を有するならば、ＮＫ細胞及び／又はＴＣ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞の化合物のサイトカイン生成を誘発又は抑制、及び／又は上方もしくは下方制御する能力を有するとして前記候補化合物を特定する。
【請求項４６】
抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体の、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与する分子を特定するためのＣＤ１６０リガンドとしての使用方法であって、
前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合に対してＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、少なくともＣＤ８αβに結合せずにＣＤ１６０に結合するのに十分なＣＤ１６０特異性を有し、
前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを有する。
【請求項４７】
ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与し、前記細胞によって脂質ＲＡＦＴ付随の膜分子として発現する分子を特定するインビトロでの方法であって、以下のことを含むことを特徴とし、
ＣＬ１−Ｒ２又はその保存的フラグメント又は誘導体を用いて、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞によって発現するＣＤ１６０を活性化し、
前記細胞の脂質ＲＡＦＴドメイン画分を回収するために前記細胞を溶解し、例えば、膜複合体を解離するように前記細胞を溶解し、そして少なくとも１つの脂質ＲＡＦＴドメインを含む前記可溶化液の画分を回収し、
ＣＤ１６０特異性を現す少なくとも１つの化合物を前記ＲＡＦＴ画分の中で特定し、即ち、
同様な条件下で得られるが、前記ＣＬ１−Ｒ２又は保存的フラグメントもしくは誘導体の代わりに、非反応性アイソタイプ一致の対照Ａｂを用いた対照化合物との比較によって、
同様な条件下で得られるが、ＣＤ１６０に結合しないが前記細胞によって発現する別な受容体には結合する化合物を用いた対照化合物との比較によって、
場合により、このようにして特定された少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物を回収し、
場合により、この（これらの）化合物を配列決定又は小配列決定し、
それにより、このようにして特定された前記少なくとも１つのＣＤ１６０特異性化合物が、前記細胞のＣＤ１６０仲介のサイトカイン生成に関与し、前記細胞によって脂質ＲＡＦＴ付随の膜分子として発現する分子であるとする。
【請求項４８】
ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与する二次メッセンジャーを特定するインビトロでの方法であって、以下のことを含むことを特徴とし、
ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞の上に発現したＣＤ１６０を、ＣＬ１−Ｒ２を用いて活性化し、
ＣＤ１６０の上に形成されたと推定される複合体を基本的に保存するように、前記細胞を穏やかな条件下で溶解し、
場合により、可溶化液を予備洗浄し、
ＣＬ１−Ｒ２及びそれに結合し得る化合物を回収し、
インビトロのキナーゼアッセイを行い、
前記インビトロのキナーゼアッセイの結果として、少なくとも１つのリン化合物が取り込まれた少なくとも１つの化合物を特定し、
それによって、前記少なくとも１つの特定された化合物は、前記細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与する二次メッセンジャーであるとし、
場合により、前記少なくとも１つの特定した化合物を回収し、及び
前記少なくとも１つの特定した化合物がタンパク質又はポリペプチド成分を含むとき、
場合により、前記少なくとも１つの回収化合物のトリプシン消化を行い、
場合により、前記少なくとも１つの回収化合物を配列決定又は小配列決定し、
それにより、前記タンパク質又はポリペプチド成分の配列を得る。
【請求項４９】
ＣＤ１６０受容体の源として、又はプロバイダーとしてのＴ  ＣＤ４＋細胞のインビトロでの使用方法。
【請求項５０】
ＣＤ４補助受容体としてのＣＤ１６０のインビトロでの使用方法。
【請求項５１】
ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞によるサイトカイン生成を引き起こす又は刺激する受容体としてのＣＤ１６０のインビトロでの使用方法。
【請求項５２】
ＩＬ−６生産株としてのＮＫ細胞のインビトロでの使用方法。
【請求項５３】
ＣＴＬ分化を引き起こすための抗ＣＤ１６０化合物のインビトロでの使用方法であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０への結合について抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）と競合でき、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０への結合について十分にＣＤ１６０特異であることを特徴とする使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＤ１６０特異的ｍＡｂ（ハイブリドーマ寄託番号ＣＮＣＭＩ−３２０４で取得できるＣＬ１−Ｒ２）、それに由来する抗ＣＤ１６０特異的化合物、及びこうした抗ＣＤ１６０化合物とｍＡｂの生物学的・医学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、より詳しくは、内皮細胞（ＥＣ）の血管新生、及び免疫システムの制御に対するＮＫ細胞とＴ細胞の寄与、を特異的にコントロールし制御するための手段に関する。
【０００３】
本発明の様々な局面は、本発明の抗ＣＤ１６０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、即ち、本発明者によりＣＬ１−Ｒ２と称されるｍＡｂ（ハイブリドーマのブタペスト条約寄託ＣＮＣＭＩ−３２０４）又はその保存的等価物を提供又は必要とする共通の特徴を共有する。
【０００４】
本発明は、実際に、細胞傷害性のＮＫとＴサブセット（ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔＣＤ３−ＮＫ、ＴＣＤ８＋、ＴＣＲγδ）によって表されることが知られる受容体ＣＤ１６０（以前はＢＹ５５とも称された）が、血管新生と免疫システムの双方の制御に関与することを実証する。ＣＤ１６０の構造は、先行技術文献に広範囲に記載されており、例えば、名称ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ  ＣＡＮＣＥＲ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥのＷＯ９８／２１２４０を参照されたい。
【０００５】
内皮細胞と血管新生
既存の血管から新しい毛細血管が生成する血管新生は、胎児の血管の発育と分化、傷の治癒、及び器官再生の重大な要素である。しかしながら、これはまた、腫瘍成長、糖尿病、虚血性眼疾患、及び関節リュウマチなどの新血管新生に依存する病状の進行にも寄与する（Ｒｉｓａｕ，  ９９７；  Ｆｅｒｒａｒａ，  １９９７）。血管新生の最も重要なメディエータ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、及び繊維芽細胞成長因子ファミリーは、十分に明確であるが、血管新生は、様々な細胞タイプによって発現される遺伝子産物が関与する複雑なプロセスとして位置しており、全ての遺伝子産物は統合された一連の事象に関与する。
【０００６】
名称ＡＢＴＥＣＨのＷＯ０３／０１８０４８は、血管新生を抑制する又は血管新生箇所を検出するための２つの可溶性ＨＬＡクラスＩ分子、即ち、ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｂ７の使用に関する。この抗血管新生作用の支持は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が内皮細胞（ＥＣ）の増殖と遊走を抑制するという実証である。また、ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｂ７は、ヌードマウスにヒト前立腺癌細胞を移植することによって誘発された腫瘍の進行を抑制できることが示されている。
【０００７】
また、ＷＯ０３／０１８０４８は、ＣＬ１−Ｒ２と称される抗ＣＤ１６０抗体が、ｓＨＬＡ−Ｇによって発揮されるＥＣ遊走への作用を抑制すると述べている。そのことから、ＢＹ５５が、ｓＨＬＡ−Ｇの内皮受容体であり得ると推定される（公開ＷＯ０３／０１８０４８の第２３頁３〜８行参照）。
【０００８】
しかしながら、当業者は、ＷＯ０３／０１８０４８が、記載のＣＬ１−Ｒ２抗体の公に入手可能な源を何ら与えないと気付くであろう。
一方、ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｂ７のような可溶性ＨＬＡは、多くの受容体にとって天然リガンドである。
【０００９】
したがって、含まれるメカニズムの解明を可能にする血管新生のシグナル伝達経路に十分特異的な手段に対して、従来技術においてニーズが存在している。また、必ずしもシグナル伝達経路を邪魔することなく、血管新生の特異的コントロールを発揮することができる医学上有用な化合物を提供する特異性もまた必要とされている。
【００１０】
ＮＫとＴ細胞と免疫システム
ＮＫ細胞は、ウイルス感染又は腫瘍細胞に対して導かれる先天性免疫において役割を果たすリンパ球のサブセットを構成する。それらのエフェクター機能は、標的細胞の死滅とサイトカイン生成である。ＮＫ細胞は、標的細胞の死滅を仲介するために細胞表面で発現する抑制性でアクティブな受容体と、特異的リガンドとの相互作用時のサイトカイン放出のコンビネーションを利用する。標的細胞上に存在するこれらのリガンドと特定の会合をすると、それらは、標的細胞のアポトーシスに寄与するパーフォリンとグランザイムを含む細胞溶解性の顆粒を放出する。感受性の標的細胞と接触すると、それらはまた、Ｔ細胞機能を制御することにより、適応性免疫を調節する先天性免疫反応の早期に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＧＭ−ＣＳＦなどの多数のサイトカインを生成する。炎症性組織と二次リンパ器官の双方におけるＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの放出は、樹状細胞が惹起した適応性免疫反応に影響する。また、子宮ＮＫ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、妊娠中の胎盤の発達と血管新生をコントロールすることができる。
【００１１】
さらに、僅かだけのヒト活性化ＮＫ細胞受容体が、特定の会合後にサイトカイン生成を引き起こすことが示されている。ＫＩＲ２ＤＬ４（ＣＤ１５８ｄ）は、休止又は活性化ＮＫ細胞において、ＩＦＮ−γ生成を引き起こす。ＣＤ１６は、Ａｂ依存性の細胞障害活性（ＡＤＣＣ）に応答できる低親和性のＦｃγＲＩＩＩ受容体である。ＣＤ１６を経由したシグナル伝達は、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びいくつかのケモカインなどのサイトカインの生成の引金を引く。抗ＮＫｐ３０又は抗ＮＫｐ４６ｍＡｂを用いた活性化ＮＫ細胞のインキュベーションは、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ生成をもたらした。ストレス誘発性のＭＩＣＡとＭＩＣＢ分子及び分子のＵＬＢＰファミリーを認識してＮＫ細胞仲介細胞傷害性の主要な役割を果たすヒトＮＫＧ２Ｄ活性化受容体は、恐らく、特異性ｍＡｂによって引金を引かれた後はサイトカインを生成することができない。
【００１２】
ＣＤ８＋などのＴ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞もまたサイトカインを生成する。ＴｈＩ細胞はＩＬ−２とＩＦＮγを生成し、一方で、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４を生成する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能は、部分的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のそれと重なる。ナイーブＴ細胞は、明確なサイトカインパターンを有する少なくとも２つのサブセットに分化することができ、Ｔ細胞障害性１細胞は、Ｔｈ１のようなサイトカインパターンを分泌し、一方で、Ｔ細胞障害性２細胞は、Ｔｈ２サイトカインを分泌する。現状では、ＩＦＮ−γを典型的なタイプ１サイトカインを表わすと考えるのが習慣であり、一方で、タイプ２応答のサインサイトカインはＩＬ−４である。
【００１３】
サイトカインは、抗体生成Ｂ細胞クローンの分化と刺激及び細胞傷害性Ｔ細胞の細胞編成作用に介入する。同様に、サイトカインの分泌は、ＮＫ細胞の細胞破壊能力、及びいろいろな歯垢成分を食菌するマクロファージの能力に影響する。
【００１４】
本発明は、サイトカイン生成の上方又は下方制御を特異的にコントロールする手段を提供する。その手段は、ＣＤ１６０シグナル伝達経路に特異的に作用する。
【００１５】
これまでに報告されているいろいろな活性化ＮＫ細胞受容体の中で、ＣＤ１６０は、唯一の、大部分の循環性ＮＫ細胞上に非クローン的に発現した受容体である。ＣＤ１６０＋細胞は、非増殖型の高度に細胞溶解性のＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫサブセットに対応する。ＨＬＡ−Ｃ分子によるＣＤ１６０の活性化は、細胞傷害性機能を仲介する。
【００１６】
ＣＤ１６０は、循環性ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔＣＤ３−ＮＫによって発現し、これは大部分のＰＢ−ＮＫ細胞を構成する。
ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞のサブセットは、より自然に細胞傷害性であり、単球による活性化に続いて、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔサブセットよりも少ない量のサイトカインを生成する。ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞サブセットもまた、ケモカイン受容体と接着分子の特異的パターンを発現する。こうした表現型は、最終分化したエフェクター細胞の特徴である。ＣＤ１６０＋ＮＫ細胞は、高い細胞傷害活性の可能性を有し、ＩＬ−２により増殖せず、ＨＬＡ−Ｃと相互作用すると細胞溶解を仲介する。
【００１７】
これまでに報告された別なヒトＮＫ細胞受容体と異なり、ＣＤ１６０受容体は、次の理由により独特と思われる。それは、ヒト染色体１に位置する遺伝子によってコード化され、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカリング分子であり、その細胞面発現は、ＩＬ−２とＩＬ−１５などのサイトカインによって仲介されるＮＫ細胞活性により下方調節される。キラー細胞Ｉｇ状の抑制性受容体について報告されたように、ＣＤ１６０は、γδＴ細胞、及びαβＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットによってもまた発現される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、抗ＣＤ１６０モノクローナル抗体（ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３２０４の下で取得できるハイブリドーマＴＭ６０より入手可能なｍＡｂＣＬ１−Ｒ２）、及びその保存的抗ＣＤ１６０等価物に関する。より詳しくは、ＥＣ血管新生の分野におけるこれらの抗ＣＤ１６０化合物の用途、及びＮＫとＴサイトカイン生成に関する。
【００１９】
本発明は、実際に、ＣＤ１６０が内皮細胞（ＥＣ）によって発現し、本発明の抗ＣＤ１６０化合物がＣＤ１６０活性化リガンドとして作用し得ることを実証する。本発明の抗ＣＤ１６０化合物によるＣＤ１６０シグナル伝達経路の刺激は、抗血管新生効果を引き起こす。
【００２０】
また、本発明はまた、ＣＤ１６０が、細胞傷害性ＮＫとＴサブセットのみならず、ＩＬ−１５（細胞傷害活性を発現）とともに培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞によっても発現し、本発明の凝集した抗ＣＤ１６０化合物によるＣＤ１６０刺激がサイトカイン生成をもたらすことを実証する。このようにして得られるサイトカインの特性は、別のＮＫ発現受容体の刺激によって得られるものに比較して独特である。またそれは、天然リガンド（膜結合性ＨＬＡ）によるＣＤ１６０刺激によって誘導されるサイトカインの特性に非常によく類似するという意味において独特である。これらのサイトカインは、特に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６を含む。天然リガンドではないが、ＮＫ細胞からＩＬ−６生成を誘導し得る化合物を初めて提供するものである。細胞膜ＨＬＡ分子によって誘導されるサイトカイン生成は、可溶形態の本発明の抗ＣＤ１６０化合物、又はＣＤ１６０結合部位に加えて少なくとも１つのＣＤ１５８ｂ結合部位を有する本発明の抗ＣＤ１６０化合物のいずれかを用いて抑制することができる。
【００２１】
本発明は、したがって、ハイブリドーマＴＭ６０、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、本発明の抗ＣＤ１６０化合物、それらを含む全ての組成物又はキット、及びそれらの少なくとも１つを含有する全ての薬剤を包含する。本発明はまた、ＣＤ１６０リガンド、ＣＤ１６０膜付随分子、及びＣＤ１６０の細胞質セカンドメッセンジャーの特定を可能にする手段に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、本発明者によりＣＬ１−Ｒ２と称される抗ＣＤ１６０特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の公に入手可能な源を与える。ＣＬ１−Ｒ２生成ハイブリドーマは、２００４年４月２８日のブタペスト条約の規約にしたがい、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒに寄託されている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ２５，  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５  Ｆｒａｎｃｅ）。寄託されたハイブリドーマは、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３２０４を有する。本発明は、したがって、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３２０４の下で利用可能なハイブリドーマＴＭ６０と同時に、それから得られる抗ＣＤ１６０ｍＡｂ（ＣＬ１−Ｒ２）に関する。
【００２３】
本発明はまた、前記ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂから得られる抗ＣＤ１６０化合物、例えば、ＣＬ１−Ｒ２フラグメント又は誘導体を提供する。さらに、本発明者は、内皮細胞（ＥＣ）と血管新生に関する実証、ＮＫ細胞とＴ細胞及びサイトカイン生成に関する実証を提供する。これらの実証は、前記ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ又はそれから得られる保存的抗ＣＤ１６０化合物を実施するという共通の特徴を共有する。
【００２４】
〔ＥＣと血管新生〕
本発明は、これまで、ＮＫ細胞の細胞傷害性サブセット及びＣＤ８＋とＴＣＲγδＴ細胞とによって発現することが知られていた受容体であるＣＤ１６０が、膜受容体としての内皮細胞（ＥＣ）によっても発現すること、及びＣＤ１６０がＨＬＡ抗血管新生シグナル伝達を仲介することの実証を提供する。
また、本発明は、ＷＯ０３／０１８０４８で、ＥＣにおいてＨＬＡ−Ｇ作用を阻害すると言われた抗ＣＤ１６０ｍＡｂが、実際はそれを阻害するのではなく、ＨＬＡ−Ｇ作用に類似しているということを実証する。
【００２５】
さらに、本発明は、適切な抗ＣＤ１６０化合物によるＣＤ１６０の結合、好ましくは架橋が、ＥＣにおけるのＶＥＧＦ又はＦＧＦ２のようなプロ血管新生因子によって引き起こされる血管の生成と成長を抑制することを実証する。このように、本発明は、新しい毛細血管の形成が実際に制御されコントロールされることができるという最初の直接的な実証を提供し、また、その工業的に有効な手段を提供する。したがって、本発明は、現実的な医薬・医療上の適用を提供する。
【００２６】
こうした適用は、特に、新血管新生の活性化によって引き起こされるそれらの病状又は状態の予防、症状の緩和又は治療を含む。これらの状況下で、新血管新生は、前病理的要素として作用する。新血管新生の活性は、そこで、不都合な活性を呈するもの、又は過剰レベルにあるものと見なされる。
こうした新血管新生が与える病状又は状態は、特に、腫瘍成長（例えば、腫瘍類の成長）、糖尿病、虚血性目疾病、及び関節リュウマチを含む。また、それらは子癇前症又は子癇を含み、これらは、胎児と胎盤の境界における不十分な血液供給によって特徴づけられる（母体らせん動脈の不十分又は不適切な血管内栄養膜浸入）。
【００２７】
本発明の有益な局面によると、適切な手段は、ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合するのに十分高いＣＤ１６０への結合親和性を有する抗ＣＤ１６０化合物を含む。
【００２８】
上記のように、ＣＬ１−Ｒ２は、ＣＮＣＭ寄託番号Ｉ−３２０４の下で到達可能なハイブリドーマによって生成される抗ＣＤ１６０ｍＡｂである。それがＥＣ発現ＣＤ１６０に関係するとき、ＣＬ１−Ｒ２は、可溶形態と同時に凝集形態で使用することができる。両方の形態とも、ＣＤ１６０に結合するとシグナル伝達を引き起こす（即ち、血管新生抑制のシグナルの伝達）。凝集形態は、可溶形態よりも、ＣＤ１６０に対する結合についてより高い親和性を有する。
【００２９】
抗ＣＤ１６０ｍＡｂは、ＨＬＡリガンドが有しない特異性を有するといった特別な技術的利点を有する。ＨＬＡリガンドは、それらがヒトのような生体組織に投与されると、ＣＤ１６０と同時に多くの別な受容体に結合し、それにより、その生体における完全にコントロール不良の連鎖反応を引き起こす。治療上の観点において、ＨＬＡリガンドは、このため工業的有用性が証明されていない。
【００３０】
ＣＬ１−Ｒ２のような抗ＣＤ１６０ｍＡｂは、ＣＤ１６０に特異的であり、即ち、それらは、少なくとも生体のような条件下で、基本的にＣＤ１６０にのみ結合するのに十分なＣＤ１６０親和性を有する。このため、ＨＬＡリガンドとは異なり、抗ＣＤ１６０ｍＡｂは、治療上の薬剤として工業的利用性を有する。
本発明は、それゆえ、活性化リガンドとしてＣＤ１６０に作用することができ、ＣＤ１６０活性化処理を必要とする生物体に投与されるべき薬剤としても有用な薬剤を最初に提供する。要するに、本発明は、最初の治療的上協力的なＣＤ１６０活性化剤を提供する。
【００３１】
こうした適切な抗ＣＤ１６０の候補リガンドには、当然、ＣＬ１−Ｒ２そのもの、並びにその保存的フラグメント及び誘導体が含まれる。
【００３２】
また、本発明の１つの局面は、ＣＤ１６０が腫瘍細胞（ルイス肺癌細胞）によって発現するのではなく、腫瘍を囲む又は侵入するＥＣが実際にＣＤ１６０を発現するという実証を新たに提供することにある。
【００３３】
本発明の抗ＣＤ１６０ｍＡｂ並びに保存的フラグメント及び誘導体は、それらの細胞膜でＣＤ１６０分子を発現したＢ細胞の慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）のような悪性細胞に対する治療薬として使用することができる。
【００３４】
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、このため、腫瘍発達の症状を防止、治療、又は軽減するのに非常に有用な手段である。
【００３５】
また、本発明は、ＣＤ１６０に対する結合をスクリーニングすることによる、及び／又はＣＤ１６０−特異的膜−結合又は細胞質のエフェクターをスクリーニングすることによる、薬剤的に有用な化合物を特定する手段を提供する。こうしたエフェクターは、抗血管新生治療に対する有用な標的を提示する。
【００３６】
ＣＤ１６０は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＣＤ１６０についての記述的情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｗ／ｇｕｉｄｅ／ｌ６６０５９０４５８＿ｇ．ｈｔｍに見ることができる。ヒトＣＤ１６０のｃＤＮＡ配列はＷＯ９８／２１２４０（ＤＡＮＡ−ＦＡＲＢＥＲ  ＣＡＮＣＥＲ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ）にＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１（１３６１ｂｐ）として記載されている。
【００３７】
ヒトＣＤ１６０のｍＲＮＡ配列は、受入番号ＡＦ０６０９８１の下でジェンバンクから入手可能であり、マウスＣＤ１６０のｍＲＮＡ配列は、ＡＦ０６０９８２ジェンバンク受入番号を有する。
ヒトＣＤ１６０のタンパク質配列は、前記ＷＯ９８／２１２４０にＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２として記載され、また、ＡＡＣ７２３０２受入番号（１８１ａａ）の下でジェンバンクから入手可能である。
【００３８】
ＣＤ１６０核酸は、当業者に用いられ得る任意の常套手順にしたがい、ＣＤ１６０発現細胞から単離することができる（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｅｄｓ．  Ａｕｆｕｂｅｌ，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｍｏｒｅ，  Ｆｅｉｄｍａｎ，  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｔｕｈｌ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  Ｎ．Ｙ．  １９９２」に開示の手順参照）。
【００３９】
天然由来のＣＤ１６０発現細胞は、特に、細胞溶解性ＮＫ細胞とＴ細胞の中に（Ｄ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞、並びに、ＴＣＲγδ及びＴＣＲαβ＋ＣＤ８ｂｒｉｇｈｔＣＤ９５＋ＣＤ５６＋ＣＤ２８−ＣＤ２７−細胞など）、並びに本発明によれば、外皮細胞と細胞障害性ＣＤ＋Ｔ細胞の中に見出すことができる。
【００４０】
単離したＣＤ１６０タンパク質とポリペプチドは、ＣＤ１６０発現細胞からの分離による、又は組換え生成によるなどの、当業者に用いられ得る任意の常套手順にしたがって入手することができる（上記文献のマニュアルＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）。
【００４１】
ＣＤ１６０タンパク質は、ＣＤ１６０タンパク質へのアクセスがＣＤ１６０を発現している細胞の供給を通して得られるので、当然、非単離形態で利用することもできる。したがって、膜受容体としてＣＤ１６０を発現している細胞は、非単離形態のＣＤ１６０へのアクセスもまた提供する。
【００４２】
結合実験及び／又は生物活性分析のため、膜受容体としてＣＤ１６０を発現している細胞は、ＣＤ１６０材料の好ましい源である。こうした細胞の例には、特に、ヒトから採取した細胞溶解活性を有するＮＫ細胞及びＴ細胞又はＥＣ細胞又は細胞障害性ＣＤ４＋Ｔ細胞、並びに、ＮＫ９２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０７）、ＨＵＶＥＣ、又はヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような細胞株が含まれる。
【００４３】
また、ＣＤ１６０タンパク質又はポリペプチドは、密集した形態で提供することもできる。ＣＤ１６０タンパク質又はポリペプチドは、例えば、固体支持体、好ましくは、ＣＤ１６０でコーティングしたビーズのような生物的に不活性な固体支持体に結合させることができる。
【００４４】
このように、本発明は、抗ＣＤ１６０化合物、及びその医療的及び／又は生物的適用に関する。
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＬ１−Ｒ２よりも実質的に同じエピトープ上のＣＤ１６０に結合し、好ましくは、ＣＤ１６０に対する結合について、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託したハイブリドーマから入手可能）と競合することができる。
好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０は、例えば、ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合することなく、ＣＤ１６０に対する結合について、十分にＣＤ１６０特異的である。
【００４５】
さらに、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１６０化合物を含む医薬組成物に関し、ここで前記組成物は、抗血管新生治療における使用を目的とし、特に、抗血管新生薬剤に関する。
また、本発明は、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１６０化合物を含む医薬組成物に関し、ここで前記組成物は、抗血管新生箇所の検出、及び／又は血管新生を伴う疾病又は状態の治療及び／又は予測を目的とする。
【００４６】
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２そのものを含む。
ＣＬ１−Ｒ２は、ＣＤ１６０に結合したときに抗血管新生作用を引き起こすのに非常に有効であることが証明されているが、これに対し、従来技術は、抗ＣＤ１６０ｍＡｂは効果が無いと証明している。このため、ＣＤ１６０上の正しいＣＤ１６０エピトープを標的にすること、即ち、ＣＬ１−Ｒ２が結合するものに本質的に類似するエピトープを標的にすることは、所望の効果を得るために重要であると考えられる。このため、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、好ましくは、ＣＬ１−Ｒ２が結合するものに本質的に類似するエピトロープを有するＣＤ１６０に結合する。好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ヒトＣＤ１６０に結合する。
【００４７】
不特定の結合が、抗ＣＤ１６０化合物を受け入れる生物体に不都合な副作用を引き起こすことがある。より詳しくは、ｓＨＬＡ−ＧのようなｓＨＬＡが、抗血管新生効果を必要とする患者（例えば、腫瘍を有する患者）に投与された場合、前記ｓＨＬＡは、ＣＤ１６０に結合し、ＥＣにおいて望ましい抗血管新生効果を引き起こすであろうが、前記患者中の様々な細胞によって発現する多くの別な受容体にも結合するであろう。ｓＨＬＡ−ＧのようなｓＨＬＡは、特に、Ｔ細胞によって発現するＣＤ８αβに結合し、これらのＴ細胞のアポトーシスを誘発するであろう。こうした抗Ｔ効果は、癌のような疾病を患う患者にとって非常に不都合である。
本発明は、十分なＣＤ１６０特異性を有する抗ＣＤ１６０化合物が、例えば、Ｔ細胞のアポトーシスのような不都合でコントロールできない副作用を引き起こすことなく、ＥＣにおいて抗血管新生を引き起こすことを最初に提供する。それゆえ、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ヒトＣＤ８αβに結合しないことが好ましい。
【００４８】
このｍＡｂから、以下の常套手段にしたがい、当業者により、保存的フラグメントと誘導体を容易に製造することができる。
こうした保存的フラグメントと誘導体は、所望の結合親和性と特異性を有し、即ち、それらはＣＬ１−Ｒ２と実質的に同じエピトープに依然として結合し、及び／又はＣＤ１６０に対する結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合できるため、「保存的」と見なされ、十分なＣＤ１６０特異性、例えば、ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合しない十分なＣＤ１６０特異性を保有する。
【００４９】
本発明の有益な特徴によると、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、Ｔ−、ＮＫ−発現受容体ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ−２とも称される）に結合しない。好ましくは、それらは、ヒトＣＤ８５ｊに結合しない。好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０以外のあらゆるＥＣ受容体と交差反応しない。
【００５０】
最も好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、アリル又はブロード特異性のいずれのあらゆる古典的及び非古典的ＨＬＡ分子とは交差反応しないといった意味で完全にＣＤ１６０特異性である。これらの受容体には、ＮＫＧ２ファミリー遺伝子生成物（第１２番染色体に位置）の各々に関連するＣＤ８αβ、ＣＤ９４、及びＫＩＲとＩＬＴ／ＬＩＲファミリーを含む第１９染色体に位置する遺伝子の全ての生成物が含まれる。
【００５１】
受容体に対する本発明の抗ＣＤ１６０化合物の結合又は非結合は、生理的条件下、又はインビボ条件を模倣したインビトロ条件下で観察される結合又は非結合を意味する。当業者が前記結合アッセイを行うのに適切と見出した任意の手段及び／又は手順は、化合物がＣＤ１６０に結合するか、何らかの別なＥＣ受容体に結合しないか、ＣＤ８αβに結合しないか、及びＣＤ８５ｊに結合しないかを判断するのに適切である。
【００５２】
例示の条件は、ＥＣ（ＣＤ１６０と他のＥＣ受容体を発現）又はＣＤ８＋Ｔ（ＣＤ１６０とＣＤ８αβを発現）、又は下記に示すようなＣＤ４＋Ｔ細胞（本発明によって実証されるようなＣＤ１６０を発現）のような所望の標的を発現する細胞を提供すること、及び前記ＣＤ１６０発現細胞を、その天然リガンドによる細胞発現標的への結合を可能にする化合物濃度、接触時間、ｐＨ、及び温度の条件下で、その化合物に接触させることを含む。
【００５３】
ある化合物が、ＣＤ１６０には結合するが、特にＣＤ８αβのような少なくとも１つの別なＨＬＡ受容体には結合しないかどうかを評価するための例示の技術には、次のものが含まれる。
・ＨＬＡ分子（ＣＤ１６０、ＣＤ８αβ等）に結合可能な遺伝子生成物のそれぞれを発現する形質移入細胞を用いたフローサイトメトリー分析、及び／又は
・Ｂｉａｃｏｒｅ（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた、ＣＤ１６０、ＣＤ８αβ等のような可溶性の組換え型ＨＬＡリガンドによってコーティング可能なセンサーチップ（例えば、センサーチップＢＲ−１０００−１４，  ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  スウェーデン）
【００５４】
ＣＤ１６０発現細胞の源には、健常人から収集したＥＣ、又はＮＫ９２（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−２４０７）、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）のような細胞株からのＥＣが含まれる。
ＣＤ８αβ発現細胞の源には、健常人から収集したＣＤ８＋Ｔ細胞のようなＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１５８２）のような細胞株からのＣＤ８＋Ｔが含まれる。
ＣＤ８５ｊ発現細胞の源には、健常人から収集したＣＤ８５ｊ＋Ｔ細胞又は単球のようなＣＤ８５ｊ＋Ｔ細胞、又はＮＡＭＡＬＷＡ（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１４３２）のような細胞株からのＣＤ８５ｊ＋Ｔ細胞が含まれる。
好ましい源は、標的受容体のヒト形態を発現するものである。
【００５５】
人間のＣＤ１６０の配列は、受入番号ＮＭ＿００７０５３（核酸）とＣＡＧ４６６８６（タンパク質）の下でＮＣＢＩデータバンクから入手可能である。人間のＣＤ８αの配列は、受入番号Ｍ２７１６１（核酸）とＡＡＡ５９６７４（タンパク質）の下でＮＣＢＩデータバンクから入手可能である。人間のＣＤ８βの配列は、受入番号Ｍ３６７１２（核酸）とＡＡＡ３５６６４（タンパク質）の下でＮＣＢＩデータバンクから入手可能である。人間のＣＤ８５ｊの配列は、受入番号ＢＣ０１５７３１とＮＭ＿００６６６９Ｍ３６７１２（核酸）、及びＡＡＨ１５７３１とＮＰ＿００６６６０．１（タンパク質）の下でＮＣＢＩデータバンクから入手可能である。
【００５６】
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、抗血管新生剤であり、したがって、癌腫又は白血病（例えば、Ｂ細胞の慢性リンパ性白血病）のような腫瘍の予防又は治療に有用である。
また、それらは、子癇前症又は子癇の予防又は治療、及び／又は糖尿病、虚血性眼疾患、及び関節リュウマチの予防又は治療に有用である。
【００５７】
本発明の例示の抗ＣＤ１６０化合物には、前記ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂが含まれる。このｍＡｂの保存的フラグメントから、以下の常套手順にしたがい、当業者によって誘導体を製造することができる。こうした保存的フラグメントと誘導体は、前記ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂの機能上均等物である。
【００５８】
「抗体フラグメント」は、重鎖、軽鎖、ＶＨ、ＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２等のような抗体の一部、並びに、高度可変領域（ＣＤＲｌＨ、ＣＤＲ２Ｈ、ＣＤＲ３Ｈ、ＣＤＲｌＬ、ＣＤＲ２Ｌ、ＣＤＲ３Ｌ）に類似するアミノ酸残基からなる各々の最小認識単位である。こうしたフラグメントは、タンパク分解のような常套手順によって入手可能である（例えば、Ｆ（ａｂ’）を発生するペプシン消化、Ｆａｂを発生するパパイン消化）。
【００５９】
本発明の好ましいフラグメントは、保存的であるもの、即ち、前記の望ましいＣＤ１６０の結合親和性と特異性を保持したＣＬ１−Ｒ２フラグメントである（即ち、ＣＬ１−Ｒ２と実質的に同じエピトープでＣＤ１６０に結合し、ＣＤ１６０に対する結合について、ＣＬ１−Ｒ２と競合することができる特徴、及び、例えば、ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合することなくＣＤ１６０に結合する特徴を保持する）。ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の好ましい保存的フラグメントには、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントが含まれる。
【００６０】
こうした保存的フラグメントは、そのようなものとして、生物学的及び／又は医学的用途に用いることができる。
しかしながら、単離した形態におけるＣＬ１−Ｒ２ＣＤＲのような非保存的フラグメントも、それらが一緒に結合してＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体を形成し得るため、本発明の目的物である。
【００６１】
また、本発明の抗ＣＤ１６０化合物には、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体、即ち、下記の任意の抗ＣＤ１６０化合物が含まれる。
・少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメント（好ましくはＣＬ１−Ｒ２の少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくはＣＬ１−Ｒ２の少なくとも１つのＣＤＲ３）を含むといった意味でＣＬ１−Ｒ２誘導体であるもの、及び
・得られる誘導体がＣＤ１６０に対する結合の親和性を保持し、前記ＣＤ１６０結合特異性もまた保持するという意味で保存的でもあるもの（即ち、ＣＬ１−Ｒ２と実質的に同じエピトープでＣＤ１６０に結合し、ＣＤ１６０に対する結合について、ＣＬ１−Ｒ２と競合することができる特徴、及び、例えば、ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合することなく、ＣＤ１６０に結合する特徴を保持する）。
【００６２】
ＣＬ１−Ｒ２から、合成及び／又は遺伝子操作を通して、当業者により保存的誘導体が実際に得られる。例示の保存的誘導体は、当業者により我々の常套手順にしたがって得られる。
本発明の保存的誘導体は、一価（１つのＣＤ１６０結合部位）又は多価（少なくとも２つのＣＤ１６０結合部位）であってもよい。好ましい多価の保存的誘導体には、四価の保存的誘導体が含まれる。
【００６３】
それらには、例えば、別な抗体に由来するＦｃフラグメントにＣ１−Ｒ２の少なくとも１つのＦｖフラグメントを移植することによって得られるキメラ抗体である誘導体が含まれる。Ｆｃフラグメントは、好ましくは、前記薬剤が投与される生物体にとって出来るだけ免疫反応性が少ないように選択される。例えば、その薬剤が人間に投与される目的のとき、前記Ｆｃフラグメントは、好ましくはヒトＦｃフラグメントである。また、本発明の保存的誘導体には、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２ＣＤＲをヒト抗体フレーム領域（ｈＦＲ）に移植することによって得られるヒト化抗体もまた含まれる。ここで、この目的はまた、前記薬剤が投与されるべき生物体に、引き起こす不都合な免疫原性が出来るだけ少ない化合物を提供することである。また、本発明の保存的誘導体には、少なくとも１つのＣＲ１−Ｒ２ＶＨ領域を、所望によりペプチドリンカーのようなリンカー（Ｌ）を介して、少なくとも１つのＶＬ領域に移植することよって得られる誘導体が含まれる。こうした分子は、当業者にｓｃＦｖとして知られている。それらは、単量体的又は多量体的であることができる。適切なリンカーは、ＶＨとＶＬドメインを全抗体の原構造に非常に似た三次元構造を有する単ポリペプチド鎖の中に組み入れることを可能にするものであり、このようにして、結合特異性を維持する。こうした適切なリンカーは、当業者に知られている。こうしたリンカーを生成する例示の方法は、ＧＥＮＥＸ社のＷＯ８８／０１６４９に記載されている（米国特許第４９４６７７８号、米国特許第５２６０２０３号）。ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の前記保存的誘導体は、一価又は多価であることができる。
【００６４】
例示されたｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ペプチドリンカー（Ｌ）を介して、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＬ領域にリンクされる少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＨ領域を含む少なくとも１つのｓｃＦｖ化合物を含む。
ｓｃＦｖは、ＶＬ−Ｌ−ＶＨの方向性（例えば、ＧＥＮＥＸ社のＷＯ８８／０１６４９、米国特許第４９４６７７８号、米国特許第５２６０２０３号参照）を有してもよく、又はＶＨ−Ｌ−ＶＬの方向性（例えば、ＣＲＥＡＴＩＶＥ  ＢＩＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ社のＷＯ８８／００９３４４、米国特許第５１３２４０５号、米国特許第５０９１５１３号、米国特許第５２５８４９８号、米国特許第５４７６７８６号、米国特許第５４８２８５８号、米国特許第６２０７８０４号Ｂ１−参照）を有してもよい。
ｓｃＦｖは、一価又は多価（いくつかのｓｃＦｖの集合体）であってもよい。
【００６５】
例示の保存的誘導体には、特に、Ｆｃフラグメントに連結された、前記ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂから誘導されたｓｃＦｖ多量体が含まれる。
もう１つの例示のｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ヒトＦｃに連結したＣＲ１−Ｒ２の少なくとも１つのＦｖフラグメントを含む化合物である。
もう１つの例示のｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、前記ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂから誘導された１つ以上のＦａｂを、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂの各Ｈ鎖のＣ末端に付加することによって得られる。
【００６６】
もう１つの例示のｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂを一緒に共有結合させてＡｂの集合形態を形成することによって得られる。
もう１つの例示のｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、２つ以上のＦａｂを頭部対尾部で結合させることによって得られる。
【００６７】
本発明による多価ｓｃＦｖは、少なくとも２つのｓｃＦｖを多量体に結合させることによって得られる。結合は、共有的又は非共有的に達成することができる。例示の多価ｓｃＦｖは四量体ｓｃＦｖである。多価ｓｃＦｖは１より多い結合部位を有する。それゆえ、いくつかのＣＤ１６０結合部位を有する多量体ｓｃＦｖを生成させ、ＣＤ１６０に対する高い結合活性を有する抗ＣＤ１６０化合物を提供することができる。こうした多量体ｓｃＦｖは、本発明において特に有益である。
多量体ｓｃＦｖは、単一特異性であってもよく、即ち、それらの全結合部位がＣＤ１６０を標的にすることができる。あるいは、多量体ｓｃＦｖは、１つ以上のＣＤ１６０結合部位を有すると同時に、ＣＤ１６０とは異なる標的に結合する１つ以上の別な結合部位を有することができる。こうした別な結合部位は、ＥＣへの化合物の作用をより効率的に導くように、例えば、ＣＤ１６０とは異なるが依然としてＥＣによって発現される化合物を標的にすることができる。こうした別な標的の例には、ＶＥＧＦ受容体、及びそれらの生理的リガンドとの連結によってＥＣ成長を引き起こす全ての受容体が含まれる。
【００６８】
二重特異的又は多特異的多量体ｓｃＦｖは、特に有益な治療手段である。多量体ｓｃＦｖを製造する方法は、当業者に知られており、例えば、ダウケミカル社のＷＯ９４／１３８０６（米国特許第５８７７２９１号、米国特許第５８９２０２０号）、ＥＮＺＯＮ社のＷＯ９３／１１１６１（米国特許第６５１５１１０号Ｂ１、米国特許第６１２１４２４号、米国特許第６０２７７２５号、米国特許第５８６９６２０号）を参照されたい。
【００６９】
この他の保存的多価誘導体は次のようにして得ることができ、即ち、
・ｓｃＦｖ多量体をＦｃフラグメントに連結させる、又は
・全長ＣＬ１−Ｒ２ＩｇＧの各Ｈ鎖のＣ末端に１つ以上のＦａｂを付加する、又は
・全長ＣＬ１−Ｒ２を共有的に連結し、多価Ａｂを生成する、又は
・２つ以上のＦａｂを頭部対尾部で結合させる（例えば、「Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  “Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １７０：４８５４−４８６１」参照）。
【００７０】
本発明は、診断及び／又は予後及び／又は治療に使用される、本発明の抗ＣＤ１６０化合物を活性成分として含む薬剤組成物を提供する。
前記組成物は、限定されるものではないが、溶液、サスペンジョン、凍結乾燥粉末、カプセル、及び錠剤などの、患者に対する投与について適切な任意の薬剤形態であってもよい。本発明の薬剤組成物は、さらに、医薬的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、又は助剤を含むことができる。
本発明の薬剤組成物は、注入、例えば、局所注射、経粘膜的投与、吸入、経口投与用に製剤することができ、より一般的には、当業者が所望の予後及び／又は診断及び／又は治療を達成するのに適切と見出す任意の製剤にすることができる。
【００７１】
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、意図する目的を達成するのに有効な量で、かつ選択された投与ルートに適する用量で、前記薬剤組成物の中に含められる。より詳しくは、治療的に有効な用量は、治療される被検者の疾病又は状態の症状を予防、軽減又は改善する、又は前記疾病又は状態を抑止するのに有効な化合物の量を意味する。
【００７２】
意図する用途に応じ、ＣＬ１−Ｒ２フラグメントであれＣＬ１−Ｒ２誘導体であれ、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、付加的成分をさらに含むことができる。
例えば、本発明の抗ＣＤ１６０化合物が予後又は診断を目的とするときには、蛍光色素のような検出可能なラベル、又は酵素活性もしくは放射能を有するもの、そしてより一般的には、前記化合物の検出を可能にする任意のものをさらに含むことができる。
【００７３】
その化合物が、それを必要とする生物体への治療的投与を目的とするとき、それはさらに免疫毒素及び／又は放射性元素を含むことができる。
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、あるいは、当然ながら、抗血管新生箇所の検出のために使用することができる。それゆえ、本発明はまた、抗血管新生箇所の検出を目的とした、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１６０化合物を含む治療組成物又はキットに関する。
【００７４】
本発明はまた、抗血管新生化合物の特定のための本発明の抗ＣＤ１６０化合物の使用に関する。
本発明は実際に、ＣＤ１６０が内皮細胞（ＥＣ）によって発現し、本発明の抗ＣＤ１６０化合物がＥＣ発現ＣＤ１６０に結合し、その結果、前記ＥＣで抗血管新生効果を引き起こすといった実証を提供する。
本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０の活性化細胞外リガンドとして作用する有益な能力を有する。
【００７５】
それゆえ、均等化合物は、ＣＤ１６０への結合に対する同等な親和性と特異性を示し、即ち、ＣＤ１６０への結合に対する本発明の抗ＣＤ１６０化合物（ＣＬ１−Ｒ２自身など）と競合する能力を有し、ＣＤ１６０に対する結合について十分にＣＤ１６０特異的であってＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合しない化合物の単離及び／又は同定によって見出すことができる。
【００７６】
こうした同定及び／又は単離は、例えば、ハイスループットスクリーニングのようなスクリーニング方法によって達成することができる。
本発明はまた、それゆえ、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１６０化合物を含む薬剤組成物又はキットに関し、前記薬剤組成物又はキットは、抗血管新生化合物の同定及び／又は単離を目的とする。
【００７７】
したがって、本発明はまた、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体の、抗血管新生化合物の同定及び／又は単離のための使用、より詳しくは、インビトロでの使用に関し、ここで、前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合に対してＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、ＣＤ１６０に対する結合について十分にＣＤ１６０特異的であって、ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合せず、ここで、前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを有する。
【００７８】
より詳しくは、本発明は、抗血管新生化合物を特定する方法を包含し、以下のことを含むことを特徴とする。即ち、
・候補化合物を提供し、
・前記候補化合物が以下のものであるかどうかを判断し、
‐ＣＤ１６０に対する結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を有する、及び
‐ＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合しない、
・前記候補化合物が、前記ＣＤ１６０結合の親和性と特異性を実際に有するならば、それを抗血管新生の特異性化合物であると特定する。
【００７９】
当業者が適切と見出す任意の候補化合物を、本発明の方法の実施に提供することができる。例示の候補化合物は、例えば、ウイルスペプチド又は病原体に由来するペプチド（例えば、サイトメガロウイルスペプチド）のような化学的又は生物学的収集によって見出すことができる。
本発明の方法の実施に使用されるＣＤ１６０標的は、当業者が適切と見出す任意の形態で提供することができる。それは、例えば、機能性膜受容体としてＣＤ１６０を発現する細胞の形態で提供することができる。例示の細胞には、特に、ＥＣが含まれる。ＥＣは、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＫ９２のような細胞株から入手することができる（例えば、下記の実施例２参照）。ＥＣはまた、健常人から収集・単離によって得ることもできる。ＣＤ１６０標的はまた、可溶性の組換え型ＣＤ１６０タンパク質（Ｆｌａｇ−ＣＤ１６０又はＧＳＴ−ＣＤ１６０）の形態で提供することもできる。
【００８０】
本発明はまた、ＣＤ１６０分子エフェクター又はトランスデューサーを特定するためのＣＤ１６０活性化リガンドとしての本発明の抗ＣＤ１６０化合物の使用、より詳しくはインビトロでの使用、即ち、ＥＣ発現ＣＤ１６０によって仲介される、抗血管新生シグナル伝達に関与する分子を特定するためのＣＤ１６０リガンドとしての本発明の抗ＣＤ１６０化合物の使用に関する。
こうしたエフェクター又はトランスデューサーは、抗腫瘍薬のような抗血管新生薬剤にとって好ましい細胞内標的である。
【００８１】
それゆえ、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ１６０化合物を含む医薬組成物又はキットに関し、前記医薬組成物又はキットは、ＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達に関与する膜分子に関連する脂質ＲＡＦＴ、及び／又はＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達に関与するセカンドメッセンジャーの特定及び／又は単離を目的とする。
【００８２】
本発明はまた、内皮細胞によって発現したときのＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達経路に関与する脂質ＲＡＦＴ付随膜分子を特定するための方法に関し、次のことを含むことを特徴とし、即ち、
・ＣＬ１−Ｒ２を用いて又はその保存的フラグメントもしくは誘導体を用いて、例えば、ＣＤ１６０発現性ＥＣを提供し、ＣＤ１６０を会合させるために、ＣＤ１６０発現性ＥＣを、ＣＬ１−Ｒ２又はその保存的フラグメント又はその誘導体と接触させることにより、ＥＣ上に発現したＣＤ１６０を活性化し、
・前記細胞の脂質ＲＡＦＴのドメイン画分を回収するように前記細胞を溶解し、例えば、膜複合体を解離するように前記細胞を溶解し（例えば、ＮＰ４０のような強い界面活性剤を使用）、少なくとも１つの脂質ＲＡＦＴドメインを含む前記溶解物の画分を回収し、）
・前記ＲＡＦＴ画分の中で、ＣＤ１６０特異性を表す少なくとも１つの化合物を、以下のようにして特定し、
‐同様な条件下で得られる対照化合物を比較することにより、但し、前記ＣＬ１−Ｒ２又は保存的フラグメントもしくは誘導体の代わりに、非反応性アイソタイプ一致の対照Ａｂを使用することにより、及び
‐同様な条件下で得られる対照化合物を比較することにより、但し、ＣＤ１６０には結合しないが別なＥＣ発現受容体には結合する化合物を用いて、
・場合により、こうして特定された前記少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物を回収し、
・場合により、この（これらの）化合物を配列決定又は小配列決定し、
それにより、こうして特定された前記少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物が、ＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達経路に関与する脂質ＲＡＦＴ関連の膜分子であるとする。
【００８３】
前記対照との必要な比較を行うため、当業者がタンパク質パターンを比較するために適切と見出す任意の手段及び／又は方法を用いることができる。
例えば、前記ＲＡＦＴ画分を、例えば、二次元ゲル（ｐＨ／ＰＭ）中に泳動のために配置され、そしてタンパク質スポットは硝酸銀によって表される。
前記非反応性でアイソタイプが同一の対照Ａｂは、ＣＬ１−Ｒ２と同じアイソタイプを有する非関連性Ａｂであるが、ＣＤ１６０と結合せず、また、前記ＥＣ中又はＥＣ上に見出されることがある何らかの化合物にも結合しない。前記非反応性アイソタイプ一致の対照Ａｂは、例えば、非関連性のマウスＩｇであることができる。
ＣＤ１６０に結合しないが別なＥＣ発現受容体に結合する前記化合物は、例えば、ＥＣが使用されるときの抗ＶＥＧＦ受容体のような、ＣＤ１６０以外のＥＣ受容体に向けられるＡｂであることができる。
【００８４】
任意のＣＤ１６０発現ＥＣを用いることができる。例示の細胞には、特に、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ、ＮＫ９２（下記の実施例２参照）のような細胞株から、又は健常人から収集・単離によって得られるＥＣが含まれる。
【００８５】
本発明はまた、内皮細胞によって発現されたときのＣＤ１６０抗血管新生シグナル伝達に関与するセカンドメッセンジャーを特定する方法に関し、以下のことを含むことを特徴とし、即ち、
・ＥＣ上に発現したＣＤ１６０をＣＬ１−Ｒ２を用いて活性化し、例えば、ＣＤ１６０発現性ＥＣを提供し、ＣＤ１６０を会合させるために、それをＣＬ１−Ｒ２と接触させ、
・ＣＤ１６０上に形成された想定される複合体を基本的に保存するように、穏やかな条件下で前記細胞を溶解し（例えば、ＢＲＩＪ５８（登録商標）又はＢＲＩＪ９８（登録商標）−ＳＩＧＭＡ−のような穏やかな界面活性剤を用いて）、
・場合により、その溶解物を予備洗浄し、
・ＣＬ１−Ｒ２及びそれらに結合し得る化合物を、例えば、ヤギ抗マウスＡｂを用いた免疫沈降によって回収し、
・インビトロのキナーゼアッセイを行い、
前記インビトロのキナーゼアッセイの結果として、少なくとも１つのリン化合物を取り込んだ少なくとも１つの化合物を特定し、
それにより、前記少なくとも１つの特定された化合物は、ＣＤ１６０（抗血管新生）シグナル伝達に関与するセカンドメッセンジャーであり、
・場合により、前記少なくとも１つの特定された化合物を回収し、
・前記少なくとも１つの特定された化合物が、タンパク質又はポリペプチド成分を含むとき、
‐場合により、前記少なくとも１つの回収された化合物のトリプシン消化を行い、
‐場合により、前記少なくとも１つの回収された化合物を配列決定又は小配列決定し、このようにして得られたペプチド配列を、タンパク質データバンクから入手可能なものと比較し、又は、「Ｂｒｕｙｎｓ  Ｅ，  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ  Ａ，  Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ  Ｈ，  Ｓａｇｏｌｌａ  Ｋ，  Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ，  Ｍａｎｎ  Ｍ，  Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ  Ｆ，  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ａ，  Ｍｅｕｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒａｖｅｎ  Ｂ．  《Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＴＲＩＭ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｍｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＴＣＲ−ＣＤ３−ｚｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ》  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９８  Ａｕｇ  ３；１８８（３）：５６１−７５．」に記載されたような質量分析法にしたがい、
そのようにして前記タンパク質又はポリペプチド成分の配列を得る。
【００８６】
インビトロのキナーゼアッセイは、当業者に周知である。検出可能なリン化合物（例えば、Ｐ３２−ＡＴＰによって提供される放射能リン、蛍光性又は発光性リン化合物）が、通常、こうしたインビトロのキナーゼアッセイに使用される。例示の実験手順が「Ｂｒｕｙｎｓ  Ｅ，  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ  Ａ，  Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ  Ｈ，  Ｓａｇｏｌｌａ  Ｋ，  Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ，  Ｍａｎｎ  Ｍ，  Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ  Ｆ，  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ａ，  Ｍｅｕｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒａｖｅｎ  Ｂ．  《Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＴＲＩＭ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｍｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＴＣＲ−ＣＤ３−ｚｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ》  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９８  Ａｕｇ  ３；１８８（３）：５６１−７５」に記載されている。
【００８７】
少なくとも１つのリン化合物を取り込んだ前記少なくとも１つの化合物を特定するため、当業者が適切と見出す任意の手段及び／又は手順を用いることができる。それは、例えば、前記ＣＬ１−Ｒ２複合体画分のポリアクリルアミドゲルへの遊走、場合により抗リン酸化Ｔｙｒ及び／又は抗リン酸化Ｓｅｒ及び／又はホスホＴｈｒを用いたウエスターンブロット、及び取り込まれたリン酸化反応の検出（Ｐ３２が使用された場合は放射能シンチレーションカウンターを用いる）、対応するバンドの回収（例えば、溶出による）によって進行することができる。
【００８８】
例示の実験手順は、当業者によって見出すこともでき、「Ｎｉｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  （“ＢＹ５５／ＣＤ１６０  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＣＤ２８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．５，  ｐ．４４５−４５１）」に見ることもできる。
【００８９】
ＣＤ１６０（抗血管新生）シグナル伝達に関与する例示のセカンドメッセンジャーは、本発明者によって特定されている。それらは、特に、ｐｉ−３−キナーゼとＬｃｋ（ｐ５６）を含む。
【００９０】
膜付随分子及び／又は細胞質のセカンドメッセンジャーへの阻害剤は、治療への利用性を有することができる。それらは、好都合にも、それらの送達の特異性を高める化合物に結合させことができる。
【００９１】
〔ＮＫ及びＴ細胞並びに免疫系〕
本発明は、ＮＫ細胞とＴ細胞によるサイトカイン生成が、ＮＫ細胞とＴ細胞のＣＤ１６０シグナル伝達経路を使用し、それは、上方制御については凝集した抗ＣＤ１６０化合物によって、又は下方制御については可溶性の抗ＣＤ１６０化合物又はＣＤ１６０−ＣＤ１５８ｂ架橋剤によってコントロールされ得るという実証を提供する。
本発明は、ＣＤ１６０に対してこれらのコントロールを特に及ぼすことができる抗ＣＤ１６０特異的化合物を提供する。
【００９２】
本発明はまた、ＣＤ１６０のＣＤ１５８ｂとの架橋結合が、ＣＤ１６０活性化の阻害を引き起こし、それによりサイトカイン生成の阻害をもたらすことを実証する。
【００９３】
ＣＤ１６０の刺激によって引き起こされるサイトカインの概略は、ＣＤ１６又はＮＫＧ２Ｄのような別のＮＫ発現受容体の刺激によって得られるものに比べて独特である。また、ＣＤ１６０が引き金となるサイトカインの概略は、天然ＣＤ１６０リガンド（ｓＨＬＡ）を用いた刺激によって得られるものと非常によく似ているという意味で独特である。
【００９４】
ＣＤ１６０の刺激は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−６の生成と分泌を引き起こす。天然リガンドｓＨＬＡを除き、ＮＫ細胞からＩＬ−６の生成を引き起こすリガンドを提供するものとしては最初である。
【００９５】
本発明によって提供されるＣＤ１６０リガンドは、抗ＣＤ１６０特異的化合物である。それらは、特に、本発明者によってＣＬ１−Ｒ２と称される抗ＣＤ１６０モノクローナル抗体を含む。ＣＬ１−Ｒ２生成ハイブリドーマは、ブタペスト条約にしたがい、ＣＮＣＭ寄託受入番号Ｉ−３２０４の下でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されている（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ２５，  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ−７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５  Ｆｒａｎｃｅ）。
【００９６】
本発明はまた、ＣＤ１６０がＣＤ＋４Ｔ細胞によって発現することを記載する。こうしたＣＤ１６０の検出は、本発明が公に入手可能な抗ＣＤ１６０特異的化合物を提供することによって可能となったし、可能である。ＣＤ１６０＋ＣＤ４＋細胞は、特に、アトピー性皮膚炎を患うヒト患者からの皮膚サンプルの中に特定されている。
【００９７】
ＮＫ細胞とＴ細胞のサイトカイン生成を制御するのに有用な本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＥＣと血管新生について上述したものと同じであり、即ち、それらには、本発明のｍＡｂＣＬ１−Ｒ２並びにその保存的フラグメント及び誘導体が含まれる。それゆえ、ＥＣ血管新生の文脈の中で本発明の抗ＣＤ１６０化合物について記載したその構造的記載、親和性、及び特異性は、必要な変更を加えて、ＮＫ細胞とＴ細胞のサイトカイン生成の制御の文脈の中で、本発明の抗ＣＤ１６０化合物にあてはまる。
【００９８】
また、ＥＣ血管新生制御の文脈の中で詳細に説明したのと同様に、非特異的結合、又は不都合な標的への結合、即ち、ＣＤ８αβ及び／又はＣＤ８５ｊ及び／又はＣＤ４のようなＣＤ１６０以外のＨＬＡ受容体に対する結合は、有益ではない。こうした化合物は、投与されるであろう生物体にコントロール不良の連鎖反応を引き起こすためである。それらが抗ＣＤ８リガンドを含んでいた場合、それらは、特に、Ｔ細胞アポトーシスを引き起こすであろう。
【００９９】
しかしながら、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞上で免疫受容体として発現したＣＤ１６０のリガンドとして使用されたときの本発明の抗ＣＤ１６０化合物と、内皮細胞受容体として発現したＣＤ１６０のリガンドとして使用されたときの本発明の抗ＣＤ１６０化合物と、の間には、機能的な相違が存在する。
ＮＫ細胞とＴ細胞及びサイトカイン生成に関係する場合、可溶性の抗ＣＤ１６０化合物と凝集した抗ＣＤ１６０化合物との間は、事実上、機能的に区別されるはずである。本発明の可溶性の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０シグナル伝達経路の阻害を引き起こし（即ち、サイトカイン生成の抑制）、その一方で、本発明の凝集した形態の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０刺激を引き起こす（即ち、サイトカイン生成の誘導又は刺激）。
【０１００】
それゆえ、本発明はまた、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）を含む抗ＣＤ１６０化合物、及びＣＤ１６０に対する結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、好ましくはＣＤ８αβのようなＣＤ１６０以外の少なくとも１つのＨＬＡ受容体に結合せずに、ＣＤ１６０に対する結合について十分にＣＤ１６０特異性の任意の化合物に関する。
好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、さらに、ＣＤ８５ｊ及び／又はＣＤ４に結合しない。
最も好ましくは、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０以外の全てのＨＬＡ受容体に結合しない。
本発明はまた、本発明の抗ＣＤ１６０化合物を含む薬剤のような、医薬組成物に関する。
【０１０１】
こうした薬剤は、ある個体のサイトカイン生成を誘導又は抑制及び／又は下方もしくは上方制御するのに有用である。前記サイトカインには、特に、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦα及び／又はＩＬ−６が含まれる。こうした薬剤は、過剰又は不十分なサイトカイン生成を伴う疾病又は状態の（治癒及び／又は予防及び／又は対症）の治療に有用である。
【０１０２】
このように、こうした薬剤は、前記個体の適応できる免疫可能性を誘導又は抑制及び／又は下方もしくは上方制御するのに有用であることができる。したがって、それは、Ｔｈ１応答の制御を可能にする。前記薬剤はまた、感染の治療又は防止を目的することができる。前記薬剤はまた、特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を引き起こす及び／又は増幅するためのワクチン法において、助剤のような付加的な製品を目的とすることができる。また、こうした薬剤は、ある個体の血球新生の誘導又は抑制及び／又は下方もしくは上方制御、放射線にさらされた個体の治療（治癒又は対症又は予防）、及び／又は骨髄形成不全の治療もしくは予防、を目的することができる。こうした薬剤は、その結果、移植前治療において又は抗癌治療として放射線治療を受けた患者に非常に有用であることができ、即ち、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、実際に、それらの血液細胞集団を回復するのを助長することができる。
【０１０３】
前記薬剤はまた、前記個人の炎症反応の誘導又は抑制及び／又は下方もしくは上方制御、及び／又は前記個体のアトピー性皮膚炎のようなアレルギーの治療もしくは防止を目的とすることができる。前記薬剤はまた、血管拡張を引き起こすことを目的とすることができる。
【０１０４】
ある個体のサイトカイン生成の抑制及び／又は下方制御を意図する場合、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、そのＣＤ１６０結合部位に加え、少なくとも１つのＣＤ１５８ｂ結合部位を有していてもよい。ＣＤ１６０とＣＤ１５８ｂの架橋結合は、実際に、ＣＤ１６０シグナル伝達経路の阻害を引き起こす。
【０１０５】
あるいは、本発明の抗ＣＤ１６０は、可溶形態で提供することもできる。可溶形態で提供された場合、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、実際に、ＣＤ１６０シグナル伝達経路を阻害する。「可溶」形態は、本願において、免疫系の受容体とリガンドの相互作用の分野における当業者によって意味される「可溶」形態を意味する。より詳しくは、リガンドが可溶形態であることは、前記リガンドが、活性化標的に対して、即ち、ＣＤ１６０の存在において、１つ又は２つであって２つを超えない結合部位を有することを示唆する。
逆に、リガンドが凝集形態であることは、前記リガンドが、活性化標的に対して、即ち、ＣＤ１６０の存在において、少なくとも２つの結合部位を有することを示唆する。
【０１０６】
可溶形態における本発明の抗ＣＤ１６０化合物には、ハイブリドーマＣＮＣＭＩ−３２０４（ＩｇＧ）から得られる抗ＣＤ１６０ｍＡｂが含まれる。
また、それらには、ＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメント、即ち、ＣＤ１６０に対する結合親和性、より詳しくは、ＣＤ１６０に対する結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を保持し、少なくともＣＤ８αβに結合せずにＣＤ１６０に結合するのに十分なＣＤ１６０特異性を保持したＣＬ１−Ｒ２フラグメントが含まれる。こうした保存的フラグメントには、特に、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントが含まれる。
【０１０７】
可溶形態における本発明の抗ＣＤ１６０化合物には、ＣＬ１−Ｒ２の一価又は二価の保存的誘導体もまた挙げることができ、即ち、以下の化合物であり、
・前記ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂの少なくとも１つのフラグメントを有し、及び
・ＣＤ１６０への結合に対してＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を保持し、少なくともＣＤ８αβに結合せずにＣＤ１６０に結合するのに十分なＣＤ１６０特異性を保持し、
・ここで、前記誘導体は、１つ又は２つのＣＤ１６０結合部位を有する。
例示のＣＬ１−Ｒ２の一価又は二価の保存的誘導体には、以下のものが挙げられ、即ち、
・ＣＬ１−Ｒ２の任意のヒト型のＡｂの形態、又は
・ＣＬ１−Ｒ２の任意のキメラＡｂの形態、又は
・ＣＬ１−Ｒ２から誘導され、場合によりＦｃフラグメントに連結した任意の一価又は二価のｓｃＦｖ、又は
・Ｆｃフラグメントに結合したＣＬ１−Ｒ２フラグメント、又は
・その各Ｈ鎖に１つの付加的ＣＬ１−Ｒ２Ｆａｂを含む全長ＣＬ１−Ｒ２Ａｂ。
【０１０８】
ある個体のサイトカイン生成の誘発及び／又は上方制御が目的とされるとき、本発明の抗ＣＤ１６０化合物を、凝集形態、即ち、少なくとも３つのＣＤ１６０結合部位を有してＣＤ１５８ｂ結合部位を有しない化合物として提供することができる。
本発明の抗ＣＤ１６０化合物のこうした凝集形態は、本発明の抗ＣＤ１６０化合物の可溶形態の凝集によって得ることができる。凝集形態は、遺伝子操作によって又はリンカーを用いて化学的に得ることができる。
【０１０９】
本発明はまた、ＮＫ細胞及び／又はＴＣ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のサイトカイン生成を誘発又は抑制、及び／又は上方もしくは下方制御する能力を有する化合物の同定及び／又は単離のための、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されたハイブリドーマＴＭ６０から入手可能）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体の使用に関し、ここで、前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合に対してＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、少なくともＣＤ８αβに結合せずにＣＤ１６０に結合するのに十分にＣＤ１６０特異的であり、ここで、前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを有する。
【０１１０】
より詳しくは、本発明は、ＮＫ細胞及び／又はＴＣ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のサイトカイン生成を誘発又は抑制、及び／又は上方もしくは下方制御する能力を有する化合物を同定する方法を包含し、以下を含むことを特徴とし、即ち、
・候補化合物を提供し、
・前記候補化合物を以下について判断し、
‐ＣＤ１６０への結合についてＣＬ１−Ｒ２と競合する能力を有する、及び
‐少なくともＣＤ８αβに結合しない、
・それが実際に前記ＣＤ１６０結合親和性と特異性を有するならば、ＮＫ細胞及び／又はＴＣ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞の化合物のサイトカイン生成を誘発又は抑制、及び／又は上方もしくは下方制御する能力を有するとして前記候補化合物を特定する。
【０１１１】
本発明はまた、抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２（ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４として寄託されたハイブリドーマから入手可能）、又はその保存的フラグメント、又はその保存的誘導体の、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与する分子を特定するためのＣＤ１６０リガンドとしての使用を包含し、ここで、前記フラグメント又は誘導体は、ＣＤ１６０への結合に対してＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、少なくともＣＤ８αβに結合せずにＣＤ１６０に結合するのに十分なＣＤ１６０特異性を有し、ここで、前記誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを有する。
【０１１２】
より詳しくは、本発明は、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与し、前記細胞によって脂質ＲＡＦＴ付随の膜分子として発現する分子を特定する方法に関し、以下のことを含むことを特徴とし、即ち、
・ＣＬ１−Ｒ２又はその保存的フラグメント又は誘導体を用いて、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞によって発現するＣＤ１６０を活性化し、例えば、ＣＤ１６０発現ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞を提供し、ＣＤ１６０を会合させるために、それをＣＬ１−Ｒ２又はその保存的フラグメント又は誘導体と接触させ、
・前記細胞の脂質ＲＡＦＴドメイン画分を回収するために前記細胞を溶解し、例えば、膜複合体を解離するように前記細胞を溶解し（例えば、ＮＰ４０のような強い界面活性剤を用いて）、そして少なくとも１つの脂質ＲＡＦＴドメインを含む前記可溶化液の画分を回収し、
・ＣＤ１６０特異性を現す少なくとも１つの化合物を前記ＲＡＦＴ画分の中で特定し、即ち、
‐同様な条件下で得られるが、前記ＣＬ１−Ｒ２又は保存的フラグメントもしくは誘導体の代わりに、非反応性アイソタイプ一致の対照Ａｂを用いた対照化合物との比較によって、
‐同様な条件下で得られるが、ＣＤ１６０に結合しないが前記細胞によって発現する別な受容体（ＮＫ細胞を用いたときは抗ＣＤ１６又は抗ＣＤ２抗体、ＴＣＤ８＋細胞を用いたときは抗ＣＤ８抗体、ＴＣＤ４＋細胞を用いたときは抗ＣＤ４抗体）には結合する化合物を用いた対照化合物との比較によって、
・場合により、このようにして特定された少なくとも１つのＣＤ１６０特異的化合物を回収し、
・場合により、この（これらの）化合物を配列決定又は小配列決定し、
それにより、このようにして特定された少なくとも１つのＣＤ１６０特異性化合物が、前記細胞のＣＤ１６０仲介のサイトカイン生成に関与し、前記細胞によって脂質ＲＡＦＴ付随の膜分子として発現する分子であるとする。
【０１１３】
また、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、ＮＫ細胞のサイトリック区画に発現し、そしてＣＤ１６０シグナル伝達に関与することによって前記ＮＫ細胞のサイトカイン生成の上方又は下方制御を仲介する分子の特定を可能にする。
【０１１４】
本発明はまた、それゆえ、ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与するセカンドメッセンジャーを特定する方法に関し、以下のことを含むことを特徴とし、即ち、
・ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞の上に発現したＣＤ１６０を、ＣＬ１−Ｒ２を用いて、例えば、ＣＤ１６０発現性ＮＫ（即ち、細胞傷害性ＮＫ及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞）を提供することによって、活性化し、ＣＤ１６０を凝集させるために、それをＣＬ１−Ｒ２と接触させて、
・ＣＤ１６０の上に形成されたと推定される複合体を基本的に保存するように、前記細胞を穏やかな条件下で溶解し（例えば、ＢＲＩＪ５８（登録商標）、ＢＲＩＪ９８（登録商標）、−ＳＩＧＭＡ−のようなマイルドな界面活性剤を用いて）、
・場合により、可溶化液を予備洗浄し、
・ＣＬ１−Ｒ２及びそれに結合し得る化合物を、例えば、ヤギの抗マウスＡｂを用いて免疫沈降によって回収し、
・インビトロのキナーゼアッセイを行い、
・前記インビトロのキナーゼアッセイの結果として、少なくとも１つのリン化合物が取り込まれた少なくとも１つの化合物を特定し、
それによって、前記少なくとも１つの特定された化合物は、前記細胞のＣＤ１６０仲介サイトカイン生成に関与するセカンドメッセンジャーであるとし、
・場合により、前記少なくとも１つの特定した化合物を回収し、及び
・前記少なくとも１つの特定した化合物がタンパク質又はポリペプチド成分を含むとき、
‐場合により、前記少なくとも１つの回収化合物のトリプシン消化を行い、
‐場合により、前記少なくとも１つの回収化合物を配列決定又は小配列決定し、このようにして得られたペプチド配列を、タンパク質データバンクで入手できるものと比較し、又は「Ｂｒｕｙｎｓ  Ｅ，  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ  Ａ，  Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ  Ｈ，  Ｓａｇｏｌｌａ  Ｋ，  Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ，  Ｍａｎｎ  Ｍ，  Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ  Ｆ，  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ａ，  Ｍｅｕｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒａｖｅｎ  Ｂ．  《Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＴＲＩＭ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｕｌｆｌｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＴＣＲ−ＣＤ  ３−ｚｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ》  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９８  Ａｕｇ  ３；１８８（３）：５６１−７５．」に記載されたような質量分析法を踏襲し、
それにより、前記タンパク質又はポリペプチド成分の配列を得る。
【０１１５】
上述したように、インビトロのキナーゼアッセイは、当業者に周知である。検出可能なリン化合物（例えば、Ｐ３２−ＡＴＰによって提供される放射性リン、蛍光性又は発光性リン化合物）が、通常、こうしたインビトロのキナーゼアッセイに使用される。
例示の実験手順が「Ｂｒｕｙｎｓ  Ｅ，  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ  Ａ，  Ｋｉｒｃｈｇｅｓｓｎｅｒ  Ｈ，  Ｓａｇｏｌｌａ  Ｋ，  Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  Ａ，  Ｍａｎｎ  Ｍ，  Ａｕｔｓｃｈｂａｃｈ  Ｆ，  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ  Ａ，  Ｍｅｕｅｒ  Ｓ，  Ｓｃｈｒａｖｅｎ  Ｂ．  《Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＴＣＲ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  （ＴＲＩＭ），  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｄｉｍｍｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＴＣＲ−ＣＤ３−ｚｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ》  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９８  Ａｕｇ  ３；１８８（３）：５６１−７５」に記載されている。
例示の実験手順は、「Ｎｉｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２  （“ＢＹ５５／ＣＤ１６０  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＣＤ２８  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１４，  Ｎｏ．５，  ｐ．４４５−４５１）」に見ることもできる。
【０１１６】
ＣＤ１６０（抗血管新生）シグナル伝達に関与する実例のセカンドメッセンジャーは、本発明者によって特定されている。それらは特に、ｐｉ−３−キナーゼとＬｃｋ（ｐ５６）を含む。
【０１１７】
本発明はまた、以下のものに関し、即ち、
・ＣＤ１６０受容体の源又はプロバイダーとしてのＴＣＤ４＋細胞の使用
・ＣＤ４補助受容体としてのＣＤ１６０の使用
・ＮＫ細胞及び／又はＴＣＤ８＋細胞及び／又はＴＣＤ４＋細胞によるサイトカイン生成を引き起こす又は刺激する受容体としてのＣＤ１６０の使用
・ＩＬ−６生産株としてのＮＫ細胞の使用。
本発明はまた、ＣＴＬ分化を引き起こすための本発明の抗ＣＤ１６０化合物の使用を包含する。
【実施例１】
【０１１８】
〔そのＨＬＡ−Ｃ生理的リガンドによるＣＤ１６０の関与が、細胞傷害性抹消血のＮＫ細胞サブセットにおけるユニークなサイトカインプロフィール分泌の引金を引く〕
〔材料と方法〕
〔細胞〕
エフェクター細胞は、ＩＬ−２を用いて数日間にわたって培養したヒトＣＤ１６０＋ＮＫ９２株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２４０７）と、正常ドナーから得られ、免疫磁気ＮＫ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって精製した新鮮なヒト抹消血（ＰＢ）−ＮＫ細胞とした。ＰＢ−ＮＫ純度は、フローサイトメトリーによると、ＣＤ３−ＣＤ５６＋が９０％を上回り、精製されたＰＢ−ＮＫの９０％超がＣＤ１６０＋であった。
ヒトＫ５６２赤白血病細胞の２つの変種を標的細胞として用い、１つの変種（Ｋ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋）は、ＩＦＮ−γ（参照１４の文献、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）を用いて培養したときＨＬＡ−Ｃを発現したのに対し、他方（ＩＦＮ−γを用いて培養したＫ５６２、ＡＴＴＣ  ＣＣＬ−２４３）はしなかった。Ｋ５６２−ＨＬＡ−Ｃｗ５形質移入体（Ｋ５６２−Ｃｗ５）を、Ｋ５６２ＭＨＣのクラスＩ陰性親細胞の中のＨＬＡ−Ｃｗ５ｃＤＮＡの形質移入によって得た。
【０１１９】
〔抗体とフローサイメトリー分析〕
使用したｍＡｂｓは次のものを含んだ。
・ＣＬ１−Ｒ２（抗ＣＤ１６０ＩｇＧｌ、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．寄託番号Ｉ−３２０４の下でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ２５，  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  ＣＥＤＥＸ  １５  ＦＲＡＮＣＥより入手可能なハイブリドーマＴＭ６０）
・ＢＹ５５（抗ＣＤ１６０ＩｇＭ、ベックマン・コールター社製）
・Ｗ６／３２抗ＨＬＡ（ＩｇＧ２ａ、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９５）、本願では抗ＨＬＡ−Ｃと称す
・ＰＥ共役３Ｇ８抗ＣＤ１６（ＩｇＧ１、ベックマン・コールター社製）
・ＧＬ１８３抗ＣＤ１５８ｂ（ＩｇＧ１、ベックマン・コールター社製）
・抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ベックマン・コールター社製）
・抗ＣＤ５６（ベックマン・コールター社製）、及び
・抗ＮＫＧ２Ｄクローン１４９８１０（ＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄシステムズ社製）
【０１２０】
単一染色のフローサイトメトリー分析のため、細胞を、ＰＥ−Ｃｙ５−共役ＢＹ５５抗ＣＤ１６０ｍＡｂ又は他のＰＥ共役ｍＡｂを用いてインキュベートした。ＮＫＧ２Ｄ染色のため、細胞を、抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂと続いてＰＥ−共役Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ１Ａｂ（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅ社製）によってインキュベートした。二重染色のため、細胞を、ＰＥ−Ｃｙ５−共役ＢＹ５５と続いてＰＥ共役抗ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１５８ｍＡｂｓによって、又は抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂと続いてＰＥ−共役Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ１Ａｂによってインキュベートした。ＰＥ−Ｃｙ５−ＩｇＭ、又はＰＥ−ＩｇＧ（ベックマン・コールター社製）をアイソタイプ対照として用いた。サンプルを、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ４Ｃフローサイトメトリー（ベックマン・コールター社製）で分析した。
【０１２１】
〔受容体特異性ｍＡｂ仲介の架橋結合〕
ＰＢ−ＮＫ細胞上のＣＤ１６０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、又はＣＤ１５８ｂ受容体の架橋結合を、５％ＣＯ２中の３７℃で１６時間のインキュベーションの間に１〜１０μｇ／ｍｌの最終濃度で行った。ＩｇＧ１アイソタイプ対照もまた同じ条件で使用した。１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２をインキュベーション期間の中で添加した。上清を収集し、次の分析まで−８０℃で保管した。
【０１２２】
〔ＮＫ細胞とＣＤ１６０リガンド発現細胞の共培養〕
ＮＫ９２又はＰＢ−ＮＫ細胞を、Ｋ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋、Ｋ５６２又はＫ５６２−Ｃｗ５のいずれかを１０：１の比で用い、Ｗ６／３２又はＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂｓ又はＩｇアイソタイプ対照の阻止濃度（２５〜５０μｇ／ｍｌ）の存在又は不存在下で、４時間（ＮＫ９２）又は１６時間（ＰＢ−ＮＫ）にわたって、単独で又は共にインキュベートした。インキュベーション期間の中で１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した。
【０１２３】
〔細胞内のＴＮＦ−αの検出〕
上記のようにして処理したＮＫ９２細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒドに固定し、０．１％サポニンで１０分間にわたって透過処理し、ＰＥ−共役抗ＴＮＦ−αｍＡｂ又はマウスＩｇＧ１−ＰＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）で染色し、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ４Ｃフローサイトメーター（コールター社製）で分析した。
【０１２４】
〔Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙによるサイトカイン測定〕
メーカーの説明書にしたがい、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γの同時測定のためにＴｈ１／Ｔｈ２のＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ社製）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた（Ｃｏｏｋ，  Ｅ．Ｂ．，  Ｊ．Ｌ．  Ｓｔａｈｌ，  Ｌ．Ｌｏｗｅ，  Ｒ．Ｃｈｅｎ，  Ｅ．Ｍｏｒｇａｎ，  Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｒ．Ｖａｒｒｏ，  Ａ．Ｃｈａｎ，  Ｆ．Ｍ．Ｇｒａｚｉａｎｏ，  ａｎｄ  Ｎ．Ｐ．Ｂａｒｎｅｙ．  ２００１．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅａｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  ａｌｌｅｒｇｉｅｓ  ｖｓ．  ｎｏｎ−ａｌｌｅｒｇｉｅｓ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ２５４：１０９−１１８．）。要するに、ＣＢＡは、不連続の蛍光強度（ＦＬ３）を有する一連の均一サイズのビーズを用いる。ビーズの各シリーズは、１つのサイトカインに対してｍＡｂでコーティングされる（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α又はＩＦＮ−γ、及びビーズの混合物が、１つのサンプル中の６つのサイトカインを検出する）。所定量の全ての６つのサイトカインの混合物を含むサイトカイン標準を、標準曲線を作成するために用いた。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γに特異的な各捕獲ビーズの１０μｌアリコートを、分析すべき各アッセイチューブに混合した。次いで、このようにして混合した捕獲ビーズの５０μｌ、ヒトＴｈ１／Ｔｈ２−ＰＥ検出試薬の５０μｌ、及び適切なテストサンプルの５０μｌ（異なる処理をしたＰＢ−ＮＫ細胞からの冷凍した上清、分析前に解凍・遠心分離）を各アッセイチューブに添加した。チューブを室温で３時間にわたってインキュベートし、洗浄し、３００μｌの洗浄バッファーの中で再構成した。最後に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γのサイトカイン結合の細胞数測定ビーズをＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用い、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で分析した。平均の蛍光を、標準曲線と添付のＣＢＡソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて計算したサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）とで比較した。ＩＬ−２測定は、いろいろなアッセイの間にＮＫ細胞をインキュベートした培地が常にＩＬ−２を含んでいたため、分析から除外した。
【０１２５】
両側のスチューデントＴテスト又はスチューデントペアーＴテストを用い、ｐ＜０．０５を有意と規定して、統計解析を行った。
【０１２６】
〔結果と議論〕
〔ＨＬＡ−Ｃ発現性Ｋ５６２標的細胞株がＰＢ−ＮＫ細胞によるサイトカイン生成の引金を引く〕
我々は、ＴＮＦ−α生成が、多量のＣＤ１６０を発現するＮＫ９２細胞株の中で得ることができるかどうかを検討した。このサイトカインの細胞内発現は、Ｋ５６２（Ｋ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋）標的細胞を発現するＨＬＡ−Ｃと共培養したＮＫ９２において、フローサイトメトリーによって評価した。我々は、ＮＫ９２のみの培養によりこのサイトカインを中程度に分泌することに比較し、こうした共培養がＴＮＦ−α生成を刺激することを見出した（図１Ａ）。Ｋ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋のみによってＴＮＦ−α生成がないことは、ＴＮＦ−α放出が、もっぱらＮＫ９２によって生じたことを示す。また、ｍＡｂ培地の中に、標的細胞にマスキングしたＷ６／３２仲介ＨＬＡ−Ｃを添加することは、ＮＫ９２によるＴＮＦ−α生成の減少をもたらした（図１Ａ）。これらの結果は、ＨＣＬ−Ａは、ＮＫ９２がＴＮＦ−αを分泌することの引金を引くことが出来ることを示す。
【０１２７】
次に、我々は、特異的ＨＬＡ−Ｃ仲介誘導の後に、細胞傷害性ＰＢ−ＮＫがＴＮＦ−αもまた生成し得るかどうかを検討した。いずれもそれらの細胞表面にＨＬＡ−Ｃ分子を発現するＫ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋とＫ５６２−Ｃｗ５形質移入体、又は完全にＭＨＣクラスＩ陰性のＫ５６２を用い、ＰＢ−ＮＫを１６時間にわたって共培養した（図１Ｂ）。ＣＢＡキットとフローサイトメトリーを用い、ＴＮＦ−αと４つの他のＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインを無細胞の上清流体の中で測定した（１つの例示の実験について図１Ｃ、及び５つの独立した実験について表１）。
【０１２８】
【表１】
2008517873.tif 000002
【０１２９】
異なるドナーからのＰＢ−ＮＫをＫ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋又はＫ５６２−Ｃｗ５と共培養したとき、多量のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−６を検出したが、ＩＬ−４とＩＬ−１０は検出しなかった。比較すると、クラスＩの陰性Ｋ５６２と共培養したＰＫ−ＮＫは、非常に少量のＩＦＮ−γと限界量のみのＴＮＦ−αとＩＬ−６を生成したが、ＰＢ−ＮＫ細胞を単独で培養したときに観察されたものと有意に相違しなかった（図１Ｃと表Ｉ）。自発性のサイトカイン放出は、Ｋ５６２又はＫ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋を単独で培養したときに絶対的に生成しなかった。しかしながら、我々は、いくつかのドナーにおいて、Ｋ５６２と共培養したときに、ＰＢ−ＮＫがサイトカインを生成したと言わなければならない。このことは、ＭＨＣクラスＩ独立活性化受容体もまた含まれ得ることを示唆した。全体として、これらのデータは、細胞障害性ＰＢ−ＮＫ細胞サブセットによるＨＬＡ−Ｃの生理的リガンド認識が、特異的サイトカイン分泌の引金を引くことができたことを示す。
【０１３０】
〔その生理的リガンドＨＬＡ−ＣによるＣＤ１６０の特異的関与は、ＰＢ−ＮＫによるＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の生成をもたらす〕
我々は、ＣＤ１６０受容体が、ＨＬＡ−Ｃとの関与の後、ＰＢ−ＮＫによる特異的サイトカイン分泌の引金を引くかどうかを検討した。ＰＢ−ＮＫを、ＣＤ１６０もしくはＨＬＡ−Ｃに対するｍＡｂ、又はＩｇアイソタイプ対照の阻止濃度の存在中で、Ｋ５６２ｃｌａｓｓ  Ｉ＋と共培養した（表２）。
【０１３１】
【表２】
2008517873.tif 000003
【０１３２】
それらの特異的ｍＡｂによるＨＬＡ−Ｃリガンド又はＣＤ１６０受容体のマスキングは、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の生成を大きく減少させた。これらの結果は、このＰＢ−ＮＫサイトカイン生成が、主に、ＣＤ１６０とＨＬＡ−Ｃの相互作用に起因することを示す。しかしながら、未知の理由のため、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ−ＣｍＡｂの使用は、有意にＩＬ−６の分泌を阻害しなかった。
【０１３３】
〔細胞障害性ＰＢ−ＮＫによって発現するＣＤ１６０の抗体架橋結合は、ＣＤ１６又はＮＫＧ２Ｄの関与後に得られるものと異なる独特なサイトカイン生成プロフィルの引金を引く〕
我々は、次に、ＣＤ１６０誘導によって生成したサイトカインを、その発現が細胞傷害性ＮＫ細胞サブセットにもまた制約されるＣＤ１６活性化受容体と比較した。活性化ナチュラル細胞障害性受容体（ＮＣＲ）と２Ｂ４／ＣＤ２４４共受容体は、それらが細胞障害性と非細胞障害性のＰＢ−ＮＫリンパ球の双方の上に同等に分布するため、この比較から除外した（Ｆｅｒｌａｚｚｏ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍｕｎｚ．  ２００４．  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：１３３３−１３３９．）。ＮＫＧ２Ｄ活性化受容体の誘導は、ヒトＮＫ細胞におけるそのものによるサイトカイン生成を仲介するその無能についての陰性対照として用いた（「Ａｎｄｒｅ，  Ｐ．，  Ｒ．  Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，  Ｍ．  Ｅｓｐｅｌｉ，  Ｎ．  Ａｎｆｏｓｓｉ，  Ｔ．  Ｊｕａｒｅｚ，  Ｓ．  Ｈｕｅ，  Ｈ．  Ｃｏｎｗａｙ，  Ｆ．  Ｒｏｍａｇｎｅ，  Ａ．  Ｄｏｎｄｅｒｏ，  Ｍ．  Ｎａｎｎｉ，  Ｓ．  Ｃａｉｌｌａｔ−Ｚｕｃｍａｎ，  Ｄ．Ｈ．  Ｒａｕｌｅｔ，  Ｃ．  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｅ．  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ａ．  Ｍｏｒｅｔｔａ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｐａｕｌ．  ２００４．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＮＫＧ２Ｄ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４：９６１−９７１．」、「ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４：９６１−９７１．」、「Ｒａｕｌｅｔ，  Ｄ．Ｈ．  ２００３．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＫＧ２Ｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：７８１−７９０．」）。結果は、ＣＤ１６０−ｍＡｂ架橋結合は、ＰＢ−ＮＫがサイトカイン放出の同じパターン生成、即ち、ＨＬＡ−Ｃ生理的リガンドの誘導よりも、高いレベルのＩＦＮ−γ、低い量のＴＮＦ−αとＩＬ−６をもたらし、但し、ＩＬ−４とＩＬ−１０は生成しないことを示す（表１）。アイソタイプ一致の対照Ｉｇの使用は、こうした分泌をもたらさなかった。次に、我々は、ＣＤ１６受容体と特異性３Ｇ８ｍＡｂとの架橋結合の後、サイトカイン生成を分析した。これは、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの生成の双方の引金を引いたが、ＩＬ−６の引金は引かなかった（図２）。重要なことに、ＴＮＦ−αの量は、ＣＤ１６０又はＣＤ１６の関与後は同程度であったが、ＣＤ１６架橋結合によって仲介されるＩＦＮ−γの生成は、ＣＤ１６０の関与後に得られる分泌の約３０倍少なかった。予想通り、ＮＫＧ２ＤのＡｂ架橋結合は、有意なサイトカイン生成の引金を引かなかった。これらのデータは、細胞障害性ＰＢ−ＮＫ細胞上のＣＤ１６０受容体のＡｂ架橋結合が、ＨＬＡ−Ｃ生理的リガンドとの相互作用の後に観察されるものと類似の独特なサイトカインプロファイルをもたらすことをさらに実証する。活性化受容体の誘導後の細胞障害性ＮＫ細胞サブセットによるＩＬ−６生成は、未だ報告されていないことに留���すべきである。ＩＬ−６は、免疫系で作用する多機能サイトカインであり、最近の報告は、いくつかの腫瘍浸潤性リンパ球が、高濃度のＩＬ−６、腫瘍細胞ＴＧＦ−β１の抗ＬＡＫ活性の阻害を生じることを示した（Ｈｓｉａｏ，  Ｙ．Ｗ．，  Ｋ．Ｗ．  Ｌｉａｏ，  Ｓ．Ｗ．  Ｈｕｎｇ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．  Ｃｈｕ．  ２００４．  Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６  Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  Ｔｕｍｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：１５０８−１５１４）。
【０１３４】
〔ＣＤ１５８ｂ抑制性受容体によるＣＤ１６０仲介ＮＫ細胞サイトカイン生成の抑制〕
ＮＫ細胞の活性化は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ又は−Ｃ分子の異なる対立形質グループを認識するキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの抑制性受容体によって通常は機能的に静められる活性化受容体に依存する。我々は、先に、ＣＤ１６０関与によって引金を引いた細胞障害性活性は、ＣＤ１５８ｂ抑制性受容体の再関与によって抑制されると報告した（Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，  Ｐ．，  Ａ．  Ｂａｒａｋｏｎｙｉ，  Ｊ．  Ｇｉｕｓｔｉｎｉａｎｉ，  Ｆ．  Ｌｅｎｆａｎｔ，  Ａ．  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ，  Ｍ．  Ａｇｕｅｒｒｅ−Ｇｉｒｒ，  Ｍ．  Ｒａｂｏｔ，  Ｉ．  Ｈｉｌｇｅｒｔ，  Ｆ．  Ｍａｍｉ−Ｃｈｏｕａｉｂ，  Ｊ．  Ｔａｂｉａｓｃｏ，  Ｌ．  Ｂｏｕｍｓｅｌｌ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ．  ２００２．  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ１６０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ｃ  ｉｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１６９６３−１６９６８．）。我々は、このように、抑制性受容体はまたＣＤ１６０仲介のサイトカイン生成をコントロールするかどうかを検討した。我々は、ＣＤ１５８ｂ抑制性受容体を有する種々の割合の細胞集団を発現するドナーからのＰＢ−ＮＫを使用した。我々は、新たに分離した精製ＰＢ−ＮＫ上のフローサイトメトリーによって、ＣＤ１６０、並びに、ＣＤ１５８ｂ、ＮＫＧ２Ｄ、及び他のＮＫ細胞マーカーの細胞表面発現を分析した。図３Ａは、一人の代表的なドナーにおいて得られた結果を示す。ＰＢ−ＮＫの主なサブセットは、ＣＤ１６０を発現し、ここで、それらの全ては、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−、及びＣＤ１６＋である（図３Ａ、上側パネル）。全体のＰＢ−ＮＫ集団はＮＫＧ２Ｄ＋であるが、あるサブセットのみがＣＤ１５８ｂ抑制性受容体を発現する。二重染色が、ＣＤ１６０＋ＰＢ−ＮＫがＣＤ３−であり、殆どがＣＤ５６ｄｉｍとＣＤ１６＋であったと確認する（図３Ａ、下側パネル）。また、我々は、ＣＤ１６０＋細胞の唯一の亜集団もまたＣＤ１５８ｂ又はＮＫＧ２Ｄを発現することを見出した（図３Ａ、下側パネル）。予想通り、我々は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のではなくＣＤ１６０のｍＡｂ媒介の架橋結合が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の生成をもたらし、ＣＤ１５８抑制性受容体とＣＤ１６０の双方の架橋結合が、サイトカイン生成を有意に減少させることを見出した（図３Ｂ）。こうした減少は、アイソタイプ一致の対照ＡｂがＣＤ１５８ｂｍＡｂを置換したときは生じない。同様な結果が、精製したＰＢ−ＮＫ細胞の中でＣＤ１５８ｂ＋ＮＫサブセットのいろいろな割合（約８〜３０％）を含む５つの異なるＰＢ−ＮＫドナーについて得られた。ＰＢ−ＮＫの亜集団のみがＣＤ１５８ｂを発現したため、我々の実験においてサイトカイン分泌の下方調節が部分的に過ぎないことの理由を説明することができる。異なるＨＬＡ対立遺伝子と相互作用する別のＫＩＲが、ＣＤ１６０の引き起こすサイトカイン生成のこうしたコントロールにもまた寄与し、したがって通常の生理的状況の中でのＮＫ細胞耐性に寄与すると推測することができる。我々はまた、ＮＫＧ２Ｄ共関与が、ＣＤ１６０と協力し、増大した刺激性シグナルを生成し得るかどうかを調べた。我々は、そのレベルがＩＬ−２活性化に続いて上方制御されるＮＫＧ２ＤとＣＤ１６０活性化受容体との同時架橋結合が、ＣＤ１６０受容体のみを通した刺激と比較し、累積の正のシグナルを引き起こさないことを見出した（図３）。このことは、特異的ｍＡｂ架橋結合によるヒトＮＫＧ２Ｄ誘導がサイトカイン分泌の活性化を引き起こさないことを示す先の結果を確認する（Ａｎｄｒｅ，  Ｐ．，  Ｒ．  Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，  Ｍ．  Ｅｓｐｅｌｉ，  Ｎ．  Ａｎｆｏｓｓｉ，  Ｔ．  Ｊｕａｒｅｚ，  Ｓ．  Ｈｕｅ，  Ｈ．  Ｃｏｎｗａｙ，  Ｆ．  Ｒｏｍａｇｎｅ，  Ａ．  Ｄｏｎｄｅｒｏ，  Ｍ．  Ｎａｎｎｉ，  Ｓ．  Ｃａｉｌｌａｔ−Ｚｕｃｍａｎ，  Ｄ．Ｈ．  Ｒａｕｌｅｔ，  Ｃ．  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｅ．  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ａ．  Ｍｏｒｅｔｔａ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｐａｕｌ．  ２００４．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＮＫＧ２Ｄ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ｈｎｍｕｎｏｌ．  ３４：９６１−９７１．）。しかしながら、プラスチック結合組換え型ＭＩＣＡ又はＵＬＢＰの生理的リガンドを用いたポリクローナル活性化ＮＫ細胞の刺激は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮ−γ生成の引金を引くことができた（Ａｎｄｒｅ，  Ｐ．，  Ｒ．  Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，  Ｍ．  Ｅｓｐｅｌｉ，  Ｎ．  Ａｎｆｏｓｓｉ，  Ｔ．  Ｊｕａｒｅｚ，  Ｓ．  Ｈｕｅ，  Ｈ．  Ｃｏｎｗａｙ，  Ｆ．  Ｒｏｍａｇｎｅ，  Ａ．  Ｄｏｎｄｅｒｏ，  Ｍ．  Ｎａｎｎｉ，  Ｓ．  Ｃａｉｌｌａｔ−Ｚｕｃｍａｎ，  Ｄ．Ｈ．  Ｒａｕｌｅｔ，  Ｃ．  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｅ．  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ａ．  Ｍｏｒｅｔｔａ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｐａｕｌ．  ２００４．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＮＫＧ２Ｄ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３４：９６１−９７１．）。
【０１３５】
その発現が、エフェクター細胞障害性ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔＰＢ−ＮＫ細胞サブセットに制約されるＣＤ１６０受容体は、特異的なリガンドの結合の後、サイトカイン分泌を促進可能な独特なＭＨＣクラスＩ依存性活性化受容体として現れる。第１に、ＣＤ１６０のＨＬＡ−Ｃ主要リガンドは、構成的に発現し、これは、細胞障害性と非細胞障害性のＮＫリンパ球サブセットの双方の上に発現する別なＮＫ誘導受容体の誘導性自己リガンド又は病原体誘導型リガンドとは相違する。ヒトＮＫＧ２Ｄリガンドは、主に上皮由来又は病原体コード化ＵＬＢＰの細胞によって発現するストレス誘発性のＭＩＣＡとＭＩＣＢの分子である（Ｒａｕｌｅｔ，  Ｄ．Ｈ．２００３．  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＫＧ２Ｄ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：７８１−７９０．）。また、ＮＫＧ２Ｄは、ヒトにおいてそれ自身でＩＦＮ−γ生成の引金を引くことができない（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｙｏｋｏｙａｍａ．  ２００４．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：２６−３３．）。最近記載されたポリオウイルス受容体（ＣＤ１５５）と、ＤＮＡＭ−１共活性化受容体のネクチン−２（ＣＤ１１２）リガンドもまた、殆どは、ストレスのある組織において発現する（Ｍｏｒｅｔｔａ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｍｏｒｅｔｔａ．  ２００４．  Ｕｎｒａｖｅｌｌｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ２３：２５５−２５９．）。ＮＣＲリガンドは、ＮＫｐ４４とＮＫｐ４６についてのＳＶヘマグルチニン−ノイラミノダーゼなどの非ＭＨＣ分子である（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗ．  Ｙｏｋｏｙａｍａ．  ２００４．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６：２６−３３．）。上記の受容体とは異なり、ＣＤ１６は、エフェクター細胞障害性ＰＢ−ＮＫリンパ球サブセットの上にのみ存在し、そのリガンドは、ＩｇＧのＦｃ部分である。第２に、細胞障害性ＰＢ−ＮＫリンパ球のサブセットによってのみ発現する刺激性のＫＩＲｓとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ活性化受容体は、前者についてのＨＬＡ−Ｃなどの構成的ＨＬＡクラスＩ分子と相互作用もまた行い、公知のシグナル伝達モチーフのない短い細胞質ドメインを有する（Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｌａｎｉｅｒ．  ２００１．  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：４１−４９．）。また、これらの活性化受容体は、アダプター分子に付随し、シグナル伝達を開始し（Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．  ２００３．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕ��ｏｌ．  １５：３０８−３１４．）、これは、ＣＤ１６０のＧＰＩアンカリング細胞表面分子とは相違する（Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，  Ｐ．，  Ａ．  Ｂａｒａｋｏｎｙｉ，  Ｊ．  Ｇｉｕｓｔｉｎｉａｎｉ，  Ｆ．  Ｌｅｎｆａｎｔ，  Ａ．  Ｍａｒｉｅ−Ｃａｒｄｉｎｅ，  Ｍ．  Ａｇｕｅｒｒｅ−Ｇｉｒｒ，  Ｍ．  Ｒａｂｏｔ，  Ｉ．  Ｈｉｌｇｅｒｔ，  Ｆ．  Ｍａｍｉ−Ｃｈｏｕａｉｂ，  Ｊ．  Ｔａｂｉａｓｃｏ，  Ｌ．  Ｂｏｕｍｓｅｌｌ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ．  ２００２．）。ＨＬＡ−ＣによるＣＤ１６０受容体の関与は、細胞障害性を仲介するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を循環することによって使用される誘導メカニズムである（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１６９６３−１６９６８．）。２Ｂ４／ＣＤ２４４は、共刺激性シグナルを、ＮＣＲ又はＮＧＫ２Ｄなどの他の活性化受容体に与えるＮＫ細胞受容体である（Ｍｏｒｅｔｔａ，  Ｌ．，  Ｍ．  Ｍｉｎｇａｒｉ，  Ｃ．  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｄ．  Ｐｅｎｄｅ，  Ｒ．  Ｂｉａｓｓｏｎｉ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｍｏｒｅｔｔａ．  ２００３．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８８：８９−９３．）。
【０１３６】
この研究からのデータは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６０受容体の刺激が、先天性免疫（特定の細胞の死滅を通して）及び適応性免疫（サイトカイン分泌を通して）の双方の向上をもたらし得ることを示す。際立ったことに、ＣＤ１６０のＨＬＡ−Ｃリガンドは、それぞれ、ＵＳ２又はＵＳ１１のＣＭＶ誘導タンパク質（Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，  Ｄ．，  Ｂ．  Ｇｅｗｕｒｚ，  Ｍ．  Ｆｕｒｍａｎ，  Ｄ．  Ｓｃｈｕｓｔ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｐｌｏｅｇｈ．  ２０００．  Ｖｉｒａｌ  ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８：８６１−９２６．）又はＮｅｆＨＩＶ−１タンパク質（Ｃｏｈｅｎ，  Ｇ．，  Ｒ．  Ｇａｎｄｈｉ，  Ｄ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｏ．  Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，  Ｂ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．  １９９９．  Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＨＩＶ−Ｉ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：６６１−６７１．）によって仲介される分解又はエンドサイトーシスから保護されることが示されている。このことは、ＣＤ１６０が、ウイルス感染の直後でも依然として機能し得ることを示唆する。
【０１３７】
循環休止ＮＫ細胞を生体内の活性化サイトカイン分泌細胞に形質転換するシグナルは十分には理解されていない。これは、主として、活性化・抑制性受容体から生じるシグナルの、それらの特異的リガンドによる関与後の結果によって決まる。ＣＤ１５８ａ／ＣＤ１５８ｂ抑制性受容体が、標的細胞上のＨＣＡ−Ｃ分子に関与することを知り、我々は、ＨＬＡ−Ｃの発現レベルが、ＫＩＲ又はＣＤ１６０受容体のいずれかの引金を引く重要な要因であるとの仮説を立てる。ＨＬＡ−Ｃのレベルが通常のとき、ＫＩＲ抑制性受容体の関与はＣＤ１６０をコントロールするであろう。これに対し、ＨＬＡ−Ｃの発現レベルが下方調節されると、ＫＩＲ受容体はもはや効果的に関与することなく、ＣＤ１６０受容体の活性化機能が起きることを許容する。
【０１３８】
まとめると、この研究は、ＨＬＡ−Ｃ生理的リガンドによるＣＤ１６０のＮＫ細胞受容体の機能的活性化が、最適な受容体の誘導の後、細胞傷害性とサイトカイン生成の双方を開始することを実証する。本結果は、ＣＤ１６０がウイルス血症及び腫瘍量又は病原体感染細胞を制限する独特なシグナル伝達経路を介して活性化エフェクター機能を仲介することを、強く示唆する。
【実施例２】
【０１３９】
〔最先端：可溶性ＨＬＡ−Ｇ１が、内皮細胞によって発現するＣＤ１６０受容体への結合を介して血管形成を抑制する〕
〔材料と方法〕
〔細胞と試薬〕
ＨＵＶＥＣとヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）［ＨＵＶＥＣ  ＣＣ−２５１７，  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ＨＭＶＥＣ−Ｃ（ＣＣ−２５０５）；  Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｕ．Ｓ．Ａ；  ｃｆ．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｍｂｒｅｘ．ｃｏｍ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＣａｔＮａｖ．ｏｉｄ．４３５］を、５％ＦＣＳと１ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＩＬ）を１日おきに補充したＥＢＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）の中に維持した。
【０１４０】
ヒトのＪｕｒｋａｔＴ細胞は、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ１５２より入手可能である。ＣＤ１６０で形質移入したＪｕｒｋａｔ細胞（ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０）を「Ａｎｕｍａｎｔｈａ，  Ａ．，  Ａ．  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，  Ｌ．  Ｂｏｕｍｓｅｌｌ，  Ａ．  Ｃｈｒｉｓｔ，  Ｒ．  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｖｏｓｓ，  Ａ．  Ｐａｔｅｌ，  Ｍ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎａｄｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  １９９８」に報告されているように、Ｊｕｒｋａｔ細胞の中にＣＤ１６０を形質移入することによって作成した（“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＢＹ５５，  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ，  ＣＴＬ，  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６１：２７８０．）。  ＮＫ９２は、ＣＤ１６０を発現するヒトＮＫ細胞株である（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２４０７）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ分離システムを用いてＰＢＭＣから精製した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）。ｓＨＬＡ−Ｇ１−β２ｍ融合単鎖遺伝子を、ＨＬＡ−Ｇのα３ドメインの最終残基を、１５残基スペーサーを介して、ヒトβ２ｍ配列の第１コドンに接続することによって操作した（Ｆｏｕｒｎｅｌ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ａｇｕｅｒｒｅ−Ｇｉｒｒ，  Ａ．  Ｃａｍｐａｎ，  Ｌ．  Ｓａｌａｕｚｅ，  Ａ．  Ｂｅｒｒｅｂｉ，  Ｙ．  Ｌｏｎｅ，  Ｆ．  Ｌｅｎｆａｎｔ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ．  １９９９．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇ：  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＥＬＩＳＡ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２：２２．）。ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｇｌｍｏｎｏを、先に記載されたようにして免疫親和性カラムを用い、真核細胞の培養上清から精製した（Ｆｏｕｒｎｅｌ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ａｇｕｅｒｒｅ−Ｇｉｒｒ，  Ａ．  Ｃａｍｐａｎ，  Ｌ．  Ｓａｌａｕｚｅ，  Ａ．  Ｂｅｒｒｅｂｉ，  Ｙ．  Ｌｏｎｅ，  Ｆ．  Ｌｅｎｆａｎｔ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ．  １９９９．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇ：  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＥＬＩＳＡ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２：２２．）。記載のように、バキュロウイルス系でＶＥＧＦ１６５を発現した（Ｐｌｏｕｅｔ，  Ｊ．，  Ｆ．  Ｍｏｒｏ，  Ｓ．  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ，  Ｎ．  Ｃｏｌｄｅｂｏｅｕｆ，  Ｈ．  Ｍａｚａｒｇｕｉｌ，  Ｓ．  Ｃｌａｍｅｎｓ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｂａｙａｒｄ．  １９９７．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８９−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｂｙ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ��  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１３３９０．）。
【０１４１】
使用したｍＡｂｓは次のものを含んだ。
・ＣＬ１−Ｒ２（抗ＣＤ１６０ＩｇＧ１、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ寄託番号Ｉ−３２０４の下でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ２５，  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  ＣＥＤＥＸ１５  ＦＲＡＮＣＥから入手可能なハイブリドーマＴＭ６０）
・抗ＣＤ８（Ｂ９．ｌｌ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）
・抗ＣＤ８５ｊ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，  ＵＳＡ）
・抗ＣＤ１６０（ＩＧ１１  Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）
・透析したマウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）
【０１４２】
合成自己ペプチドＲＩＩＰＲＨＬＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を用い、ストレプトアビジン‐ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の添加後、基本的に先に記載されたようにして（Ａｌｌａｎ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｍ．  Ｃｏｌｏｎｎａ，  Ｌ．Ｌ．  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｔ．Ｄ．  Ｃｈｕｒａｋｏｖａ，  Ｊ．Ｓ．  Ａｂｒａｍｓ，  Ｓ．Ａ．  Ｅｌｌｉｓ，  Ａ．Ｊ．  ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，  ａｎｄ  Ｖ．Ｍ．  Ｂｒａｕｄ．  １９９９．  Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＨＬＡ）−Ｇ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：１１４９．）ＨＬＡ−Ｇ四量体を作成した（Ｌｅｅ，  Ｎ．，  Ａ．Ｒ．  Ｍａｌａｃｋｏ，  Ａ．  Ｉｓｈｉｔａｎｉ，  Ｍ．Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｂａｊｏｒａｔｈ，  Ｈ．  Ｍａｒｑｕａｒｄｔ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．  Ｇｅｒａｇｈｔｙ．  １９９５．  Ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｂｉｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｕｔ  ｄｉｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ＴＡＰ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：５９１）。ＰＥ共役ＨＬＡ−Ｇ四量体によるＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＪｕｒｋａｔＣＤ１６０の標識化を３７℃で１時間にわたって行った。ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０とＪｕｒｋａｔについて、四量体は、抗クラスＨＬＡクラスＩのＷ６／３２ｍＡｂと架橋結合した。
【０１４３】
ルイス肺癌細胞は、ＥＣＡＣＣから入手可能である［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ；  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ；  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ；  ＳＰ４  ＯＪＧ  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＵＫ］（ヒトのコーカサス肺癌細胞株ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ、寄託番号ＥＣＡＣＣ９６０４２３３９）。
【０１４４】
〔細胞の増殖と遊走のアッセイ〕
増殖の分析のため、ＨＵＶＥＣ（８×１０３）を０．３％ゼラチンをコーティングした１２ウェルのプレートに接種した。種々の濃度のｓＨＬＡ−Ｇ１又はｓＨＬＡ−Ｇｌｍｏｎｏの存在・不在において、生理食塩水又はＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて細胞をインキュベートした。７日後、細胞をトリプシン処理し、コールターカウンターＺＭ（Ｍａｒｇｅｎｃｙ，  Ｆｒａｎｃｅ）でカウントした。遊走アッセイを、成長停止集密的ＨＵＶＥＣ又はＢＡＥＣの上で行った。細胞の単層をラバーポリスマンを用いて傷つけた。無血清媒体を用いてディッシュを洗浄し、各ウェルを倍率１００倍で写真撮影した。次いで、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在又は不在の中で、ｓＨＬＡ−Ｇ１又はｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地の中でディッシュを１６時間にわたってインキュベートした。各ウェルの第２の写真を撮り、２枚の写真を重ね合わせることによって遊走した細胞をカウントした。
【０１４５】
〔ＶＥＧＦとｓＨＬＡ−Ｇ１の細胞結合〕
それぞれ２４００００と１１００００ｃｐｍ／ｎｇの比放射能とし、ヨードゲン法を用いてＶＥＧＦとｓＨＬＡ−Ｇ１をヨウ素化した（Ｐｌｏｕｅｔ，  Ｊ．，  Ｆ．  Ｍｏｒｏ，  Ｓ．  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ，  Ｎ．  Ｃｏｌｄｅｂｏｅｕｆ，  Ｈ．  Ｍａｚａｒｇｕｉｌ，  Ｓ．  Ｃｌａｍｅｎｓ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｂａｙａｒｄ．  １９９７．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８９−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｂｙ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１３３９０．）。２×１０５の血清不足ＨＵＶＥＣを含むウェルは、３７℃において種々の時間間隔（０．１〜２４時間）で５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦもしくはｓＨＬＡ−Ｇ１を用いて前処理するか又は結合アッセイのために直ちに処理した。要するに、ディッシュを０．２％ゼラチンと２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）を添加した非放射性ＤＭＥＭでリンスし、非標識リガンドの不在又は存在する中で、２ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ＶＥＧＥ又はｓＨＬＡ−Ｇ１を用い、４℃で２時間にわたってインキュベートした。次いで、同じ培地で細胞をリンスし、ＲＩＰＡ緩衝液に溶かし、放射能をパッカードγカウンターで計数した。
【０１４６】
〔インビトロの毛細管作成〕
増殖因子減少マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコラーゲンで希釈し（体積比１／６）、氷上に保持した。この溶液の１６０μｌを、タイプＩのラット尾部コラーゲンでプレコートした８ウェル培養スライドの各ウェルに添加し、３７℃で１時間放置した。ゲル生成の後、対照、ＦＧＦ−２、ｓＨＬＡ−Ｇ１、又はｍＡｂＣＤ１６０と混合した又はしないＨＵＶＥＣサスペンジョンを、湿り５％ＣＯ２インキュベータの中で、３７℃で２４時間にわたり、マトリゲル／コラーゲンのゲルの上に接種した。先に記載されたようにして血管新生を定量した（Ｒｕｇｇｅｒｉ  Ｂ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｊ，  Ｇｉｎｇｒｉｃｈ  Ｄ，  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｔ，  Ａｌｂｏｍ  Ｍ，  Ｙａｎｇ  Ｓ，  Ｃｈａｎｇ  Ｈ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｃ，  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｋ５  Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉ  Ｐ，  Ｊｏｎｅｓ−Ｂｏｌｉｎ  Ｓ，  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ  Ｓ，  Ａｉｍｏｎｅ  Ｌ，  Ｋｌｅｉｎ−Ｓｚａｎｔｏ  Ａ，  Ｈｅｒｂｅｒｔ  ＪＭ，  Ｂｏｎｏ  Ｆ，  Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ｐ，  Ｃａｓｅｌｌａｓ  Ｐ，  Ｂｏｕｒｉｅ  Ｂ，  ＰｉＩｉ  Ｒ，  Ｉｓａａｃｓ  Ｊ，  Ａｔｏｒ  Ｍ，  Ｈｕｄｋｉｎｓ  Ｒ，  Ｖａｕｇｈｔ  Ｊ，  Ｍａｌｌａｍｏ  Ｊ，  Ｄｉｏｎｎｅ  Ｃ．  “ＣＥＰ−７０５５：  ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ｓｅｐ  １５；６３（１８）：５９７８−９１；  Ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ：  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ｎｏｖ  ｌ；６３（２１）：７５４３．）。
要するに、培地を除去し、細胞をＰＢＳを用いて２回リンスし、４％ＰＦＡ溶液に室温で３０分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳを用いて２回リンスし、マッソントリクローム染色で染色した。微細毛管の網状組織の広がりを、自動化コンピューター利用イメージ解析装置（Ｉｍａｇｅｎｉａ，  Ｂｉｏｃｏｍ，  Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）で測定し、各ウェルにおける毛管の全長を測定した。平均の微細毛管の網状組織の長さ（μｍ）を、各実験の条件について計算した。実験は、３通り行って３回繰り返した。
【０１４７】
〔フローサイトメトリー分析〕
正常酸素又は低酸素（５％Ｏ２雰囲気の３７℃で２４時間インキュベート）における亜集密ＨＭＶＥＣ又はＨＵＶＥＣ（Ｂｉｏｗｉｔｔｈａｋｅｒ）を、ＰＢＳ−ＢＳＡに掻爬し、４℃で１００ｎｇ／ｍｌのｓＨＬＡ−Ｇ１を用いてインキュベートする又はしなかった。２時間後、ＣＤ８、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ（Ｐｌｏｕｅｔ，  Ｊ．，  Ｆ．  Ｍｏｒｏ，  Ｓ．  Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ，  Ｎ．  Ｃｏｌｄｅｂｏｅｕｆ，  Ｈ．  Ｍａｚａｒｇｕｉｌ，  Ｓ．  Ｃｌａｍｅｎｓ，  ａｎｄ  Ｆ．  Ｂａｙａｒｄ．  １９９７．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８９−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｂｙ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１３３９０．１）、ＣＤ１０６（ＢＤ）、ＣＬ１−Ｒ２ＢＹ５５（Ｆｏｕｒｎｅｌ，  Ｓ．，  Ｍ．  Ａｇｕｅｒｒｅ−Ｇｉｒｒ，  Ａ．  Ｃａｍｐａｎ，  Ｌ．  Ｓａｌａｕｚｅ，  Ａ．  Ｂｅｒｒｅｂｉ，  Ｙ．  Ｌｏｎｅ，  Ｆ．  Ｌｅｎｆａｎｔ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ．  １９９９．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇ：  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＥＬＩＳＡ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２：２２．）、特異的ｍＡｂｓ、又はアイソタイプ対照Ａｂｓ２０μｇ／ｍｌを用い、続いてＦ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧを用い、細胞をインキュベートした。ヨウ化プロピジウムの使用によって非生存可能な細胞を排除した。Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｅｐｉｃｓ  ＥＬＩＴＥフローサイトメーターによって細胞を分析した。
【０１４８】
〔ＲＴ−ＰＣＲ及びｃＤＮＡ配列決定〕
ＣＤ１６０の転写産物を、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより検出した：５’−３’（ｓｅｎｓｅ）ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）及び３’−５’（ｒｅｖｅｒｓｅ）ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。ｃＤＮＡの品質は、以下のプライマーを用いてβアクチンの増幅によって確認した：５’−３’ＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及び３’−５’ＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）。ＣＤ１６０及びβアクチンの増幅条件は、９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分で、３５サイクル行った。ＣＤ１６０の配列決定のために、Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＰＣＲ生成物を精製し（ｑｉａｅｘ  ＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ）、以下のプライマーを用いて分析した：ＢＹ０ｌ（５’−３’  ｓｅｎｓｅ）（ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＢＹ０３（３’−５’  ｒｅｖｅｒｓｅ）（ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；ＢＹ０２（５’−３’  ｓｅｎｓｅ）ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＢＹ０４（３’−５’  ｒｅｖｅｒｓｅ）（ＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【０１４９】
〔組織学的研究についての同質遺伝的腫瘍〕
密集成長直前のルイス肺癌細胞をトリプシン処理し、２回洗浄し、ＰＢＳ中で再懸濁した。２．１０５細胞を、麻酔した（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ，  ＩＰ）雌Ｃ５７Ｂ１６マウス（ＩＦＦＡ  ＣＲＥＤＯ，  Ｆｒａｎｃｅ）の右後部側腹部の皮下に接種した。細胞注射の２１日後、ペントバルビタールの過剰投与でマウスを殺し、腫瘍を取り出し、１０％中性緩衝化ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）に４℃で一晩固定し、パラフィン包埋した後（Ｅｍｂｅｄｄｅｒ  Ｌｅｉｃａ）、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ）で薄切りにした（５μｍ）。再水和（トルエン／エタノール／ＰＢＳ）の後、ｐＨ６．１のクエン酸塩緩衝液の中でスライドを２０分間加熱した。切片を、ＤＡＫＯ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに入れ、ＴＮＢ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇバファー（ＴＳＡ  Ｋｉｔ，  ＮＥＮ）、ペルオキシダーゼ遮断薬（Ｄａｋｏ）、及びＭｏｕｓｅ  ｏｎ  Ｍｏｕｓｅ免疫グロブリン遮断薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベートした。腫瘍血管を、室温で３０分間にわたって、１０μｇ／ｍｌ（希釈１／５００の溶液）の最終濃度のモノクローナル抗体ＣＬ１−Ｒ２で染色した。切片を、ビオチン標識のヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて１０分間インキュベートし、続いてＡｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて３０分間インキュベートした。次いで、切片をＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。免疫染色組織を、ニコン顕微鏡（Ｅ−８００）で観察し、４０倍対物のＤＭＸ１２００カメラ（ニコン）を用いてデジタル化した。
【０１５０】
〔結果〕
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ２誘発の内皮細胞の増殖、遊走、及び毛細血管状の管生成を阻害する〕
ＶＥＧＦは、血管性ＥＣのより強力な分裂促進的・遊走促進的因子である。したがって、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１がインビトロでＥＣのＶＥＧＦ機能を妨害し得るかどうかを調べた。我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導増殖を阻害するのに対し、これらの細胞の基本的増殖に影響を及ぼさないことを見出した（図４Ａ）。これに対し、ｓＨＬＡ−Ｇ１がβ２ｍに融合したとき、単鎖タンパク質が、ＶＥＧＦに誘導されるＥＣの増殖に影響を及ぼさず、したがって、分子の折りたたみがその生物的活性にとって重要であることを示唆する。さらに、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、大動脈又は副腎の微細血管に由来するウシＥＣのＶＥＧＦ誘導増殖を阻害し、ＥＣの起源の種及び組織の中で保存されるメカニズムを示唆する。
【０１５１】
内皮細胞モデルとしてＨＵＶＥＣを用いた遊走アッセイにおいて、ｓＨＬＡ−Ｇ１又はｓＨＬＡ−ＧｌｍｏｎｏをＶＥＧＦの存在しない中で添加するか否かによらず、遊走は生じなかった（図４Ｂ）。これに対し、ＶＥＧＦの添加後、遊走細胞の数に有意な増加が検出された。これらの条件において、ｓＨＬＡ−Ｇ１の添加は遊走を阻害したのに対し、ｓＨＬＡ−Ｇｌｍｏｎｏは有意な効果を有しなかった（図４Ｂ）。プロ血管新生因子による刺激後に、ｓＨＬＡ−Ｇ１が管生成を阻止できるかどうかを評価するため、ＨＵＶＥＣをマトリゲルモデルのＦＧＦ−２に供した。この目的のため、培養の３日後に一般に生じる自発的血管新生を制限するため、マトリゲルをコラーゲンで希釈した。マトリゲル中の細胞の形態を図４Ｃに示し、合計の細管の長さの定量を図４Ｄに示す。結果は、ＦＧＦ−２が有力な血管新生応答を引き起こし、ＦＧＦ−２へのｓＨＬＡ−Ｇ１の添加が、管生成を有意に阻害することを示す。全体として、これらの結果は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、プロ血管新生の因子誘導のＥＣ増殖、遊走、及びインビトロの血管形成を阻害できることを実証している。
【０１５２】
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１はＶＥＧＦ受容体を妨害しない〕
この研究において、１２５Ｉ−ＶＥＧＦと１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１の双方をリガンドとして使用した。４℃でのＨＵＶＥＣ細胞に対する放射標識リガンドのトータルの結合は、時間依存性であり、実験の開始から４５分後に平衡に達する。６０分後、未標識リガンドを用いたインキュベーションは、内皮細胞から１２５Ｉ−ＶＥＧＦ又は１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１の結合をほぼ全体的に分離した。即ち、平衡結合実験を、６０分のインキュベーション時間を設定することによって行った。使用した放射性リガンドによらず、高濃度の未標識リガンドの存在下で測定した全結合は、用量依存で非特異性の結合であり、放射性リガンドの濃度に線形であった。非特異性結合は、全結合の２０％を超えなかった。１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１をリガンドとして用いた競合実験において、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ナノモル範囲のＩＣ５０値でＨＵＶＥＣに対する結合を急速に移動したが、細胞でプレインンキュベートした又はしないＶＥＧＦは、この結合に影響を及ぼさなかった（図２Ａ）。次に１２５Ｉ−ＶＥＧＦをリガンドとして用いた競合実験において、ＶＥＧＦは、ナノモル範囲のＩＣ５０値で１２５Ｉ−ＶＥＧＦのＨＵＶＥＣに対する結合を急速に移動したが、細胞でプレインンキュベートした又はしないｓＨＬＡ−Ｇ１は、この結合に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が特に内皮細胞に結合することができ、この結合がＶＥＧＦによって調節されないことを実証する。さらに、我々は、内皮細胞上のＶＥＧＦ受容体をｓＨＬＡ−Ｇ１が妨害しないことを明確に実証する。
【０１５３】
〔ＣＤ１６０受容体が内皮細胞によって発現する〕
特異的ｍＡｂｓとフローサイトメトリー分析を用い、我々は、ＨＵＶＥＣがＣＤ８とＣＤ８５ｊを発現しないことを見出した。これに対し、これらの細胞は、ＨＭＶＥＣのような抗ＣＤ１６０ｍＡｂによって強く染色される（図６Ａ）。ＣＤ１６０がＨＵＶＥＣによって発現するさらなる証拠を提供するため、我々は、ＣＤ１６０特異的プライマーを用い、ＣＤ１６０＋（ＮＫ９２）とＣＤ１６０−（ＣＤ４＋Ｔ）対照細胞に対する比較によるこれらの細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＮＫ９２と同様に、ＣＤ１６０ｍＲＮＡをＨＵＶＥＣ内に検出し、これに対し、ＣＤ１６０＋は陰性であった（図６Ｂ）。次いで、ＨＵＶＥＣとＮＫ９２ｃＤＮＡを分離し、配列決定した。ＨＵＶＥＣとＮＫ９２ＣＤ１６０タンパク質の予測されたアミノ酸配列アライメントは、それらの双方が、既に記載されたＣＤ１６０配列に類似することを示した（Ａｎｕｍａｎｔｈａ，  Ａ．，  Ａ．  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，  Ｌ．  Ｂｏｕｍｓｅｌｌ，  Ａ．  Ｃｈｒｉｓｔ，  Ｒ．  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｖｏｓｓ，  Ａ．  Ｐａｔｅｌ，  Ｍ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｌ．  Ｎａｄｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｆｒｅｅｍａｎ．  １９９８．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＢＹ５５，  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ，  ＣＴＬ，  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６１：２７８０．）（図６Ｃ）。全体として、これらの結果は、ＣＤ１６０がＥＣによって発現することを実証する。
【０１５４】
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＨＵＶＥＣの細胞表面に発現したＣＤ１６０と相互作用する〕
ＣＤ１６０がＥＣ上に存在したことを示し、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が有望なリガンドであり得るかどうかを調べた。ＨＵＶＥＣ上のｓＨＬＡ−Ｇ１とのＣＤ１６０の直接相互作用は、ＨＬＡ−Ｇ１四量体を用いることによって実証された。我々は、これらの四量体が、非形質移入Ｊｕｒｋａｔではなく、ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０に特異的に結合することを最初に示し（図７Ａ）、ｓＨＬＡ−Ｇ１リガンドに対するＣＤ１６０の特異性を最初に実証した。ＨＵＶＥＣがＨＬＡ−Ｇ１四量体とともにインキュベートされると、明確な染色が検出され、この細胞によって発現したＣＤ１６０にｓＨＬＡ−Ｇ１が結合したことを示唆する（図７Ａ）。ＣＤ１６０とｓＨＬＡ−Ｇ１の相互作用は、ｓＨＬＡ−Ｇ１とともにプレインキュベートした又はしないＨＵＶＥＣ上のフローサイメトリーによってさらに評価した。我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１を用いたＨＵＶＥＣのプレインキュベーションが、ＣＤ１６０細胞の表面発現を下方調節することを見出した（図７Ｂ）。このことは、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、ＨＵＶＥＣの細胞表面でＣＤ１６０と直接相互作用をすることを実証する。
【０１５５】
〔内皮細胞によって発現したＣＤ１６０のｍＡｂ架橋結合が、毛細管状の管形成の抑制の引金を引く〕
次に、我々は、ＣＤ１６０−ｍＡｂの架橋結合が、ｓＨＬＡ−Ｇ１の抗血管新生活性を模倣できるかどうかを調べた。インビトロのマトリゲルアッセイを用い、我々は、ＣＤ１６０−ｍＡｂの架橋結合が、ＦＧＦ２Ｃ仲介の細管成長の抑制をもたらすことを見出した（図８）。これらのデータは、ＥＣによって発現したＣＤ１６０が、抗血管新生の細胞応答の引金を引くことができる機能的受容体であることをさらに実証した。
【０１５６】
〔低酸素は、内皮細胞上のＣＤ１６０の発現増加を誘発した〕
細胞遊走又は内皮管形成のような血管新生における個々の表現型プロセスの多くは、低酸素培地条件によって誘発できるが、我々は、低酸素条件下で培養したＨＭＶＥＣにおけるＣＤ１６０の発現を測定した（Ｌｕｔｔｕｎ，  Ａ．，  Ｍ．  Ａｕｔｉｅｒｏ，  Ｍ．  Ｔｊｗａ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ．  ２００４．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｒｅ  ＰｌＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦＲ−Ｉ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｓ？  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６５４：７９．）。特異的ＣＤ１６０ｍＡｂとフローサイトメトリー分析を用い、我々は、低酸素が内皮細胞上のＣＤ１６０発現を強力に増加させることを見出した（図９）。
【０１５７】
〔ＬＬＣ腫瘍の免疫組織化学的染色は、ＥＣのみが腫瘍中でＣＤ１６０を発現することを実証する〕
最終的に、我々は、ＬＬＣ腫瘍中のＥＣ上のＣＤ１６０に強い染色を観察したが（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ）、これに対し、非特異的ＩｇＧには染色は観察されなかった。腫瘍細胞はＣＤ１６０を発現しなかったが、腫瘍周囲のリンパ管又は腫瘍内部の微細血管のＥＣは、高レベルのＣＤ１６０を発現する。
【０１５８】
この研究において、我々は、内皮細胞において抗血管新生反応の引き金を引くことのできる新たな受容体、ＣＤ１６０を特定した。我々は、初めて、このＭＨＣクラスＩ依存受容体が、ＥＣによって発現されることを実証した。
ＣＤ１６０は、その生理的リガンド、ｓＨＬＡ−Ｇ１、又は以下の特異的ｍＡｂ架橋結合（ＣＬ１−Ｒ２）の関与によってＣＤ１６０−ＶＥＧＦ又はＦＧＦが引き起こすインビトロでの血管新生の阻害の引き金を引く。
ＣＤ１６０は、従来記述されているＣＤ３６、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ−１）によって結合されている膜貫通型糖タンパク、有力な阻害剤（Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｓ．Ｆ．Ｐｅａｒｃｅ，Ｒ．Ｚｈｏｎｇ，Ｒ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ａ．Ｆｒａｚｉｅｒ，ａｎｄ  Ｎ．Ｐ．Ｂｏｕｃｋ．１９９７．ＣＤ３６  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３８：７０７．）とは異なる。ＣＤ３６と対照的に、ＣＤ１６０は、膜貫通型ドメインや細胞質側の尾部領域を有さないＧＰＩ固定分子である（Ａｎｕｍａｎｔｈａ，Ａ．，Ａ．Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，Ｌ．Ｂｏｕｍｓｅｌｌ，Ａ．Ｃｈｒｉｓｔ，Ｒ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｓ．Ｖｏｓｓ，Ａ．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｌ．Ｎａｄｌｅｒ，ａｎｄ  Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ．１９９８．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＢＹ５５，ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ，ＣＴＬ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６１：２７８０．）。
【０１５９】
我々は更に、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＥＣ  ＣＤ１６０リガンドであったことを発見した。様々なＨＬＡクラスＩ分子は、ＣＤ１６０に結合するかもしれないし、他の可溶性ＭＨＣクラスＩ分子も抗血管新生機能を発揮するこの受容体の引き金を引くかもしれない。我々は、実際に、組換え型の可溶性ＨＬＡ−Ｂ７が、ＨＵＶＥＣ増殖の抑制もまた可能であることを観察した。これらの観察は、ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｂ７の抗血管新生機能が、全ての可溶性ＨＬＡに普遍化し得ることを示唆する。
【０１６０】
ここで報告されたｓＨＬＡ−Ｇ１の抗血管新生活性は、今までに記載された最初の非免疫機能である。母体と胎児の境界における血管新生の空間的・時間的制御は、成長する胎児に栄養を与えるための適切な血液供給を確保するのに重要な役割を果たし、血管成長を制御する局所的活動因子が存在することを示唆する（Ｏｎｇ，  Ｓ．，  Ｇ．  Ｌａｓｈ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｎ．  Ｂａｋｅｒ．  ２０００．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  １４：９６９．）。ｓＨＬＡ−Ｇ１は、母親のラセン状動脈のＥＣを置き換える血管内栄養膜などの絨毛外栄養膜細胞によって分泌され（Ｍｏｒａｌｅｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｊ．  Ｌ．  Ｐａｃｅ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｐｌａｔｔ，  Ｔ．  Ａ．  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｋ．  Ｍｏｒｇａｎ，  Ａ．  Ｔ．  Ｆａｚｌｅａｂａｓ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓ．  Ｈｕｎｔ．  ２００３．  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ２  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：６２１５．）、それによって、これらの血管の直径を数倍増加させる（Ｌｏｋｅ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｋｉｎｇ．  ２０００．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  １４：８２７．）。我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１の抗血管新生効果が、こうした置き換えに寄与すると仮説を立てる。浅い細胞栄養芽層浸入と母親血液の胎盤胎児ユニットへの低下した流れを特徴とする子癇胎盤におけるＨＬＡ−Ｇ発現の不足は（Ｌｉｍ，  Ｋ．  Ｈ．，  Ｙ．  Ｚｈｏｕ，  Ｍ．  Ｊａｎａｔｐｏｕｒ，  Ｍ．  ＭｃＭａｓｔｅｒ，  Ｋ．  Ｂａｓｓ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｃｈｕｎ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｊ．  Ｆｉｓｈｅｒ．  １９９７．  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ／ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｉｎ  ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５１：１８０９．）、こうした仮説に賛成する。
【０１６１】
低酸素は、ＣＤ５４、ＣＤ１０５又はｔｉｅ−２受容体として、複数の血管新生内皮マーカーの発現を制御することが示されている。ｔｉｅ−２の過剰発現は、それが低酸素に対する陽性の血管新生応答に関与することを示唆する。低酸素によるＣＤ１６０の上方制御は、血管新生の負の制御を発生することができ、新生血管の生成を防ぐことができる。さらに、ＣＤ１６０抗体を用いたマウス腫瘍上の免疫組織化学は、この受容体が、腫瘍細胞自身によって発現するのではなく、腫瘍性脈管構造のＥＣによって発現することを示す。これらの結果はいずれも、低酸素によって上方制御されたＣＤ１６０が、血管新生の抑制性シグナル伝達受容体であり、その活性化が、腫瘍性細胞成長を妨げる実験的抗血管新生治療に有用であり得ることを実証する。
【実施例３】
【０１６２】
〔ＣＤ１６０は、細胞傷害性ＴとＮＫサブセットに限定されず、ＣＤ４＋Ｔ細胞によっても発現する〕
新たに分離した抹消血（ＰＢ）−ＣＤ４＋細胞を、免疫磁気ＣＤ４細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、健常人のリンパ球から得た。ＰＢ−ＣＤ４＋の純度は、フローサイトメトリーにより９８％超のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−であることが示された。高濃度のＩＬ−１５でサプリメントした１０％の加熱不活性化ヒトＡＢ血清を含む標準的培地の中で、ＰＢ−ＣＤ４＋をさらに数日間（３〜６日）培養した。以下のプライマーを用い、ＣＤ１６０転写物をＲＴ−ＰＣＲによって検出した。
５’−３’（センス）：ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：８）
３’−５’（リバース）：ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣ（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：９）
代表的な結果を図１１に示す。
【実施例４】
【０１６３】
〔アネキシン−ＶとＰＩの二重染色フローサイトメトリーによるアポトーシスの評価〕
〔材料と方法〕
０．２×１０６の細胞を６ウェル／プレートに接種し、２４時間にわたって血清飢餓条件にした後、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在中で５０時間にわたってｓＨＬＡ−Ｇ１（１μｇ／ｍｌ）、ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂＣＤ１６０（１０μｇ／ｍｌ）、又は対照Ｉｇ−Ｇ１（１０μｇ／ｍｌ）を用いて処理した。処理の最後に、遠心分離によって浮遊細胞を収集し、一方で、付着細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液によって収穫し、単細懸濁液を作成した。次いで、細胞を遠心分離によってペレットにし、ＰＢＳで２回洗浄した。メーカー説明書にしたがってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＤＡＫＯ）を用い、アポトーシス細胞死を、組換え型ＦＩＴＣ（蛍光色素イソチオシアネート）共役アネキシン−ＶとＰＩ（ヨウ化プロピジウム）による二重染色によって特定した。ＦＩＴＣ抱合体については蛍光１（ＦＬ１）シグナル検出器を、ＰＩについてはＦＬ３シグナル検出器を用い、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のフローサイトメトリーによって細胞を分析した。各サンプルについて一万数千のイベントを記録した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いてデータを解析した。
【０１６４】
〔結果〕
図１８ａは、ＣＤ１６０受容体が、初代培養のヒト線維芽細胞又は平滑筋細胞ではなく、ＨＵＶＥＣとＨＭＶＥＣの細胞表面に発現することを実証する。図１８ｂは、ＣＬ１−Ｒ２が、線維芽細胞ではなく、ＨＵＶＥＣの特異性アポトーシスの引金を引くことを実証する。
図１８ｃは、ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０モノクロナール抗体が、ＣＤ１６０の可溶性ＨＬＡ−Ｇ１天然リガンドの抗血管新生効果を模倣することを示す。可溶性ＨＬＡ−Ｇ１及び抗ＣＤ６０モノクローナル抗体の双方は、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）特異性アポトーシスを仲介し、ＩｇＧ１アイソタイプ対照には効果がない。したがって、アネキシンＶ結合実験は、この効果の特異性を確立し、即ち、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体は、ＣＤ１６０陰性初期線維芽細胞のではなく、ＣＤ１６０発現ＨＵＶＥＣのアポトーシスを引き起こす。
【実施例５】
【０１６５】
〔可溶性ＨＬＡ−Ｇ１は、アポトーシス経路を通して、かつ内皮細胞によって発現するＣＤ１６０受容体への直接結合によって血管新生を抑制する〕
〔要約〕
ＨＬＡ−Ｇは、その構成的組織分布が、妊娠の間に母体と胎児の境界における栄養膜細胞に主に制約される主要組織適合性の複合体クラスＩｂ分子である。この研究において、我々は、可溶性ＨＬＡ−Ｇ１（ｓＨＬＡ−Ｇ１）アイソフォームが血管内皮増殖因子誘発の内皮細胞の増殖と遊走を抑制し、線維芽細胞成長因子−２−誘発の毛細状管形成を低下させる能力を実証する。我々は、このことが起きる可能なメカニズムを確認し、即ち、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、内皮細胞によって発現するグリコシルホスファチジルイノシトール固定の受容体であるＣＤ１６０に結合することによって、アポトーシスを誘発する。さらに、我々は、特異性ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０モニクロナール抗体が、内皮細胞管形成とアポトーシス誘発のｓＨＬＡ−Ｇ１仲介抑制を模倣することを示す。このように、内皮細胞におけるＣＤ１６０の関与は、血管新生抑制にとって基本的であり得る。ｓＨＬＡ−Ｇ１／ＣＤ１６０仲介の抗血管新生特性は、妊娠中の母体ラセン動脈の血管再構築に関与し、我々がネズミ腫瘍の脈管構造中にＣＤ１６０が強力に発現することを見出したように、病的新血管形成を防ぐための誘引性の治療目標を提供する。
【０１６６】
〔緒言〕
ＨＬＡ−Ｇは、ユニークなプロモーター領域、限られた多形性、制約された構造的組織分布、及び膜結合又は可溶性のタンパク質１のいずれかをコード化するいくつかのスプライスした転写物の発生によって特徴づけられるヒトの主な組織適合性クラスＩｂ遺伝子である。活発に分泌された可溶性ＨＬＡ−Ｇ１（ｓＨＬＡ−Ｇ１）アイソフォームは、ｍＲＮＡ保持イントロン４２から出現し、これは、膜貫通型ドメインの翻訳を妨げる終止コドンを含む。この３７ｋＤａイントロン保持ｓＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、β２−マイクログロブリン（β２ｍ）に付随する２。多形のＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−ＢのクラスＩａ分子が発現したときの胎座におけるｓＨＬＡ−Ｇ１の有力な発現は、妊娠中の重要な免疫機能と一貫性がある３。ｓＨＬＡ−Ｇ１は、活性化したＣＤ＋８ＴとＮＫ細胞のアポトーシスを誘発し４，５、ＣＤ４＋Ｔ細胞のアロ増殖応答を下方制御する６。いくつかの抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が胎盤内皮細胞に結合したという観察は７，８、ＨＬＡ−Ｇもまた胎盤血管形成と子宮血管再構築の調節に関与し得る７という我々の仮説に帰結する。いくつかのさらなる観察は、ＨＬＡ−Ｇのこうした新規な機能と一致しており、即ち、第１に、絨毛外栄養膜細胞におけるＨＬＡ−Ｇ発現の欠陥は、母体のラセン動脈のＨＬＡ−Ｇ＋血管内栄養膜浸入が抑止され、母体境界への血流を損なう９妊娠の一般的合併症である子癇前症に付随し９，１０、第２に、ＨＬＡ−Ｇは、ＮＫ細胞の経皮内遊走１１と内皮細胞上の活性化ＮＫ細胞の回転付着を抑制することが示されている１２。今までに、血管新生の調節におけるｓＨＬＡ−Ｇ１の起こり得る役割には取り組まれていなかった。
【０１６７】
既存の血管から新しい毛管が生成する血管新生は、胎児の血管の発達と分化、傷の回復、及び組織再生の重大な要素であるが、さらに、腫瘍成長、糖尿病、虚血性眼疾患、及び関節リュウマチなどの新血管形成によって決まる病状の進行にも寄与する１３−１５。血管新生、内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の系統群の最も重要なメディエーターは十分に画定されるが１６、血管新生は、いずれもが事象の統合順序に寄与するいろいろな細胞種類によって発現する多様な遺伝子生成物を伴う複雑なプロセスとして存在する１７。
【０１６８】
ｓＨＬＡ−Ｇ１が内皮細胞活性の制御因子であるという我々の仮説をテストするため、我々はそのインビトロ効果を調べた。この研究は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、ＶＥＧＦとＦＧＦの誘発する血管新生を抑制し、内皮細胞上に発現したグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定のＣＤ１６０受容体１８，１９との相互作用によって内皮細胞のアポトーシスを誘発することを実証する。興味深いことに、我々は、生体外で行った免疫組織化学的染色により、ＣＤ１６０がマウス腫瘍モデルの血管レベルで発現することを示す。
【０１６９】
〔結果〕
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ２仲介の内皮細胞の増殖、遊走、及び毛細血管形成を抑制する〕
ＶＥＧＦは、内皮細胞の最も強力な分裂促進的・遊走促進的因子である１６。したがって、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１がインビトロでＶＥＧＦ機能を妨害し得るかどうかを調べた。精製組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＨＵＶＥＣに外因的に添加したとき、用量依存性の状態で、ＶＥＧＦへの増殖反応を抑制した（図１２ａ）。これに対し、β２ｍ（ｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏ）に融合した単鎖タンパク質ｓＨＬＡ−Ｇ１は、効果を有さず、ｓＨＬＡ−Ｇ１の折りたたみがその生物的活性にとって重要であることを示唆する。さらにまた、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、大動脈又は副腎微小血管に由来するウシ内皮細胞のＶＥＧＦ仲介増殖を抑制し（データは示さない）、異なる組織から発する種と内皮細胞の中から保存されるメカニズムを示唆する。
【０１７０】
次いで、我々は、遊走アッセイを用い、内皮細胞遊走に及ぼすｓＨＬＡ−Ｇ１の効果を検討した。ＨＵＶＥＣをＶＥＧＦの不在下でインキュベートしたとき、ｓＨＬＡ−Ｇ１を添加したか否かによらず、僅かな自発的遊走が生じた（図１２ｂ、未処理）。これに対し、ＶＥＧＦの添加後、遊走した細胞の数の有意な増加が検出された。これらの条件下で、ｓＨＬＡ−Ｇ１の添加はそれらの遊走を抑制した（図１２ｂ、ＶＥＧＦ処理）。遊走の抑制はｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏでは観察されなかった。
我々は、次に、マトリゲル上で培養した内皮細胞による毛細血管形成を抑制するｓＨＬＡ−Ｇ１の能力を評価した。ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＦＧＦ−２誘発の管状形成を有意に抑制した（図１２ｃ、形態、図１２ｄ、定量化）。総じて、これらの発見は、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、インビトロのプロ血管新生因子仲介の内皮細胞の増殖、遊走、及び毛細血管形成を抑制することを示す。
【０１７１】
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１は内皮細胞のアポトーシスを誘発する〕
これらのｓＨＬＡ−Ｇ１誘発の抑制効果に関与するメカニズムを割り出す目的で、我々は、経時的顕微鏡検査法を用い、アポトーシスの形態変化がｓＨＬＡ−Ｇ１処理の後に内皮細胞で生じたかどうかを検討した。ＨＵＶＥＣに由来する内皮細胞を用い、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１を含む条件培地を用いたこれらの細胞のインキュベーションが、経時的デジタルイメージ顕微鏡検査法による測定で（図１３ａ、ｂ）、明確にアポトーシスを誘発したことを見出した。実験結果からのイメージ（図１３ｂ）とビデオデータは、ｓＨＬＡ−Ｇ１処理細胞の形態が、細胞質と核の収縮及び相の明るい外観への変化、並びに膜のブレブ／ブリスターの形成によって特徴づけられることを示す。比較として、対照の条件培地におけるこれらの細胞のインキュベーションは、効果を有しなかった。組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いた実験は、同様なアポトーシス効果を示した（図１３ｃ、ｄ）。広域スペクトルのカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋの使用は、組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１仲介のアポトーシスを防いだ（図１３ｃ、ｄ）。ｓＨＬＡ−Ｇ１によるアポトーシスの誘発は、さらに、ウエスタンブロット解析による分割ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の検出によって実証された（図１３ｅ）。
【０１７２】
〔ｓＨＬＡ−Ｇ１はＣＤ１６０受容体に直接結合する〕
次に、内皮細胞に及ぼすｓＨＬＡ−Ｇ１仲介の抑制効果に関与する受容体の特定が重要であった。我々は、先ず、種々の濃度の非放射性競合者の存在下で、１２５Ｉ−ＶＥＧＦ又は１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１を用い、２時間（平衡時間）にわたってインキュベートしたＨＵＶＥＣ上の４℃における放射性受容体アッセイ結合実験を行うことにより、ｓＨＬＡ−Ｇ１がＶＥＧＦ受容体によって干渉されるかどうかをテストした。我々は、最初に、ＨＵＶＥＣに対する１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１の結合を分析し、低温ＶＥＧＦ又はＦＧＦ−２競合者が効果を有さず、一方で、未標識ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ナノモル範囲におけるＩＣ５０値の濃度の関数としてこの結合を抑制することを見出した（図１４ａ）。リガンドとして１２５Ｉ−ＶＥＧＦを用いた競合実験において、我々は、低温ＶＥＧＦが、ナノモル範囲にＩＣ５０値を有するＨＵＶＥＣにその結合を迅速に置き換え、一方で、ｓＨＬＡ−Ｇ１は効果を有しないことを見出した（図１４ｂ）。さらに、我々は、低温ｓＨＬＡ−Ｇ１競合者が、ＰＡＥＣ−ＶＥＧＦ−Ｒ２又はＰＡＥＣ−ＮＰＬｌ形質移入体に対する１２５Ｉ−ＶＥＧＦの結合を抑制しないことを見出した（データは示さず）。しかしながら、ドーパミンのようなＶＥＧＦ依存性の増殖と遊走の別な抑制剤は、ＶＥＧＦ細胞結合と競合せずに、ＶＥＧＦ受容体の内部移行を通して作用することができる。３７℃でのＶＥＧＦを用いたＨＵＶＥＣのプレインキュベーションは、１時間以内に１２５Ｉ−ＶＥＧＦの結合をほぼ全体的に消滅させたのに対し、ｓＨＬＡ−Ｇ１のそれは２４時間までその結合に効果を有さず（データは示さず）、このため、ＶＥＧＦ受容体の内部移行又は発現を調節しないことを実証している。これらの結果は、ｓＨＬＡ−Ｇ１結合が、ＶＥＧＦ受容体に干渉することなく、内皮細胞に特異的に結合することを実証する。
【０１７３】
次いで、我々は、ＣＤ８４４、ＣＤ８５ｄ２１、ＣＤ８５ｊ２１、及びＣＤ１６０２２などのいくつかの今までに記載されたＨＬＡ−Ｇ受容体を、ＨＵＶＥＣが発現したかどうかを調べた。フローサイトメトリー分析は、一定レベルではないものの、ＨＵＶＥＣが、抗ＣＤ１６０ｍＡｂによって染色されるけれど、抗ＣＤ８、ＣＤ８５ｄ、又はＣＤ８５ＪｍＡｂによっては染色されないことを示した（図１５ａ）。同様に、ＨＭＶＥＣはまた、ウシ内皮細胞のように（データは示さず）抗ＣＤ１６０ｍＡｂに結合し（図１５ａ）、ｍＡｂによって認識されるＣＤ１６０エピトープが種の中で保存されたことを示唆する。ＣＤ１６９がＨＵＶＥＣによって発現することをさらに実証するため、我々は、ＣＤ１６０特異性プライマーを用い、ＣＤ１６０＋（ＮＫ細胞株ＮＫ９２）とＣＤ１６０−（ＣＤ４＋Ｔ）対照細胞との比較により、これらの細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＮＫ９２と同様に、ＣＤ１６０ｍＲＮＡがＨＵＶＥＣ中に検出されたのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞は陰性であった（図１５ｂ）。次いで、ＨＵＶＥＣとＮＫ９２ｃＤＮＡｓを分離し、配列決定した。ＨＵＶＥＣとＮＫ９２ＣＤ１６０のタンパク質の予測されたアミノ酸配列アラインメントは、２つの置換残基があり得る対立形質形態を示すことを除き、それらはいずれも、既に記載１９されたＣＤ１６０配列に類似であることを示した（図１５ｃ）。
【０１７４】
ＣＤ１６０もまたインビボの内皮細胞上に発現し、その発現が培地条件に起因しないことを実証するため、我々は、移植されたルイス肺癌のマウス腫瘍の特定の免疫組織化学的染色を行った。我々は、抗ＣＤ１６０ｍＡｂが、腫瘍の周囲（図１６ａ，ｂ）と内側（図１６ｃ、ｄ）で微細血管の内皮細胞を強力に染色したのに対し、ＩｇＧアイソタイプ対照では染色が検出されない（データは示さず）ことを見出した。これに対し、腫瘍細胞は未染色のままであった。こうしたＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂの反応性は、ヒトとマウスの双方のＣＤ１６０コード化ｃＤＮＡの先の同定と配列決定が、２つの種の間で強い相同性を示したことから、驚くことではない。
【０１７５】
我々は、次いで、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、内皮細胞によって発現したＣＤ１６０受容体に効果的に結合することを実証した。我々は、先ず、ＨＬＡ−Ｇ１四量体が、ＣＤ１６０形質移入Ｊｕｒｋａｔと同様に、ＨＵＶＥＣに特異的に結合することを見出した（図１７ａ）。ｓＨＬＡ−Ｇ１とＣＤ１６０のＨＵＶＥＣ上の直接の相互作用は、組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１を用いたＨＵＶＥＣのプレインキュベーションは、抗ＣＤ１６０ｍＡｂの結合を特異的に阻止するのに対し（図１７ｂ）、ＶＥＧＦを用いたプレインキュベーションは阻止しない（データは示さず）ことを示すことによってさらに実証された。
【０１７６】
ｓＨＬＡ−Ｇ１機能がＣＤ１６０との相互作用を通して仲介されるということをさらに実証するため、我々は、可溶性抗ＣＤ１６０ｍＡｂが、インビトロのマトリゲルアッセイとプロアポトーシス効果におけるｓＨＬＡ−Ｇ１抗血管新生活性を模倣し得るかどうかをテストした。結果は、精製ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂの１〜１０μｇ／ｍｌの添加が、ＦＧＦ−２仲介の血管成長の抑制（図１７ｃ）と内皮アポトーシスの誘発（図１７ｄ）をもたらしたことを明らかに示した。これらのデータは、内皮細胞によって発現したＣＤ１６０が、抗血管新生細胞応答の引金を引くことができる機能的受容体であることをさらに実証する。
【０１７７】
〔議論〕
この研究において、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１分子が非免疫機能、即ち、血管新生抑制を及ぼし得ることを実証した。母体と胎児の境界における脈管構造の空間的・時間的制御は、発育する胎児に栄養を与える適切な血液供給を確保するのに重要な役割を果たし、血管細胞を制御する局所的に作用する因子が存在することを示唆する２３。ｓＨＬＡ−Ｇ１は、内皮細胞を置き換えて母親のラセン状動脈を再構築する血管内栄養膜などの絨毛外栄養膜細胞によって分泌され３、それによって、これらの血管の直径を数倍増加させる２４。我々は、内皮細胞へのｓＨＬＡ−Ｇ１効果がこうした置き換えに寄与するとの仮説を立てる。浅い細胞栄養芽層浸入と母親血液の胎盤胎児ユニット９，１０への低下した流れを特徴とする子癇胎盤における可溶性ＨＬＡ−Ｇの減少などのＨＬＡ−Ｇ発現の不足は、こうした仮説に賛成する。
【０１７８】
内皮細胞アポトーシスの誘発２５、マトリックスのメタロプロテアーゼ活性の抑制２６、又は内皮細胞の化学的反発２７などの血管新生阻害剤の活性を説明するため、いろいろなメカニズムが報告されている。本報告において、我々は、内皮細胞の遊走、増殖、及び血管形成の有意な遮断などの、ｓＨＬＡ−Ｇ１の新規な抑制作用を実証する。また、我々は、ｓＨＬＡ−Ｇ１処理の内皮細胞が次第にアポトーシス形態を示したことから、これらの効果が内皮細胞アポトーシスの誘発を伴い得ることを示唆する。ＣＤ８＋Ｔ細胞４におけるように、このアポトーシスが内皮ＦａｓＬ発現によって仲介されるかどうかは、実証されるべきままである。妊娠中の子宮動脈の再構築におけるアポトーシスとＦａｓ／ＦａｓＬ相互作用についての役割が最近になって実証された２８ことは興味深い。
【０１７９】
血管形成に及ぼすｓＨＬＡ−Ｇ１の直接の抑制効果は、ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂがマトリゲルで培養された内皮細胞によるＦＧＦ−２誘発の毛細血管形成の抑制と内皮アポトーシスの誘発を模倣することから、多分、機能的ＣＤ１６０受容体を通して仲介される。ニューロピン受容体２７に結合するＶＥＧＦの競合者であるセマフォリン３Ｆのような別の血管新生阻害剤と異なり、ｓＨＬＡ−Ｇ１はＣＤ１６０受容体に直接作用する。種々のＨＬＡクラスＩ分子がＣＤ１６０に結合し得る２９ことを知ると、別の可溶性ＭＨＣクラスＩ分子もまたこの受容体が抗血管新生機能を発揮する引金を引き得ることを排除することができない。総じて、これらの発見は、ｓＨＬＡ−Ｇ１の抗血管新生作用についての重要な力学的洞察を提供する。ＣＤ１６０関与に続いて内皮細胞とＮＫ細胞によって使用され、前者についてはアポトーシスをもたらし、後者についえはサイトカイン生成３０と後者については細胞障害性２９をもたらすシグナル伝達経路を割り出すため、さらなる検討が必要とされる。
【０１８０】
胎盤／子宮の環境における明らかな重要性に加え、血管新生についての抑制的シグナル伝達受容体としてのＣＤ１６０の特定は、腫瘍細胞の成長を防ぐ実験的抗血管新生治療にとって有用であり得る。マウス移植腫瘍の我々の免疫組織化学的分析は、この種３１において保存される遺伝子によってコード化されるＣＤ１６０が、腫瘍性脈管構造の内皮細胞には存在するが、腫瘍細胞によっては発現しないことを示した。将来的目標は、したがって、いろいろな腫瘍における起こり得るＣＤ１６０／ｓＨＬＡ−Ｇ１仲介の抗血管新生効果を割り出し、病的新血管形成の制御におけるＣＤ１６０のあり得る治療的使用を探求することである。
【０１８１】
〔方法〕
〔細胞と試薬〕
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を、１日おきに５％ＦＣＳと１ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＩＬ）で添加したＥＢＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）の中に維持した。ＳＧＨＥＣ−７細胞は、先に記載された３２ようにして培養したＨＵＶＥＣ由来の細胞株である。ブタの大動脈内皮細胞（ＰＡＥＣ）−ＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ）、ＰＡＥＣ−ＮＰＬｌ形質移入体、ヒトのＪｕｒｋａｔＴ細胞、及びＣＤ１６０で形質移入したＪｕｒｋａｔ（ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０）２９を局所的に製造した。ＮＫ９２は、ＣＤ１６０を発現するヒトＮＫ細胞株である２９。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を用いてＰＢＭＣから精製した。イントロン４保持ｓＨＬＡ−Ｇ１ｃＤＮＡを含むＰＣＤＮＡベクトルで形質移入した前立腺癌ＰＣ３細胞と空ベクトル（ＰＣ３−ネオ）３３で形質移入したＰＣ３細胞を、４日間にわたって集密に成長させ、条件培地を収集した。培地を除去し、遠心分離して細胞片を除去し、−２０℃で貯蔵した。ｓＨＬＡ−Ｇ１−β２ｍ融合単鎖遺伝子を、ＨＬＡ−Ｇのα３ドメインの先端残基をヒトβ２ｍ配列の第１コドンに、１５残基スペーサー３４を介して接続することによって操作した。ｓＨＬＡ−Ｇ１とｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏは、先に記載されたようにして３４、免疫親和性カラムを用い、真核細胞の培養上清から精製した。ＶＥＧＦ１６５は、記載されたように３５、バキュロウイルス系の中で発現した。使用したｍＡｂには、我々の研究室の１つで製造したＣＬ１−Ｒ２（ＩｇＧ１）抗ＢＹ５５／ＣＤ１６０２９、抗ＣＤ８（ＯＫＴ８，  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、抗ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ（Ｍ．  Ｃｏｌｏｎｎａの贈答）、抗ＩＬＴ２／ＣＤ８５Ｊ、抗ＣＤ１０６（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、及び透析マウスＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＤＡＫＯ又はＳｉｇｍａ）が含まれた。ＨＬＡ−Ｇ１四量体を基本的に先に記載された３６ようにして、合成自己ペプチドＲＩＩＰＲＨＬＱＬ３７を用い、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の添加の後、製造した。ＰＥ共役ＨＬＡ−Ｇ四量体によるＨＵＶＥＣ、Ｊｕｒｋａｔ、及びＪｕｒｋａｔＣＤ１６０の標識化は、３７℃で１時間にわたって行った。ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０とＪｕｒｋａｔについて、四量体は、先に記載されたようにして２２、抗ＨＬＡクラスＩ  Ｗ６／３２ｍＡｂを用いて架橋結合した。
【０１８２】
〔内皮細胞の増殖と遊走のアッセイ〕
増殖分析のため、ＰＢＳ中の０．３％ゼラチンをコーティングした１２ウェルのプレート（８０００細胞／ウェル）にＨＵＶＥＣを接種した。細胞を、種々の濃度のｓＨＬＡ−Ｇ１又はｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏの存在又は不在下で、生理食塩水又はＶＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を用いてインキュベートした。数日後、細胞をトリプシン処理し、コールターカウンターＺＭを用いてカウントした。遊走アッセイを、成長抑止集密ＨＵＶＥＣ又はＢＡＥＣの上で行った。細胞の単層を、ラバーポリスマンを用いて傷つけ、無血清培地で洗浄し、各ウェルを１００倍の倍率で写真撮影した。次いで、ディッシュを、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在又は不在下で、ｓＨＬＡ−Ｇ１又はｓＨＬＡ−Ｇ１ｍｏｎｏ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地中で１６時間にわたってインキュベートした。各ウェルの第２の写真を撮り、２枚の写真を重ねることによって遊走した細胞をカウントした。
【０１８３】
〔ＶＥＧＦとｓＨＬＡ−Ｇ１の細胞結合〕
精製組換え型ＶＥＧＦとｓＨＬＡ−Ｇ１をそれぞれ３５、２．４×１０４と１．１×１０５ｃｐｍ／ｎｇの比放射能にＮａ１２５Ｉを用いて放射標識した。２×１０５の血清不足ＨＵＶＥＣを含むウェルを、種々の時間間隔（０．１〜２４時間）にわたって３７℃にて５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ又はｓＨＬＡ−Ｇ１を用いて前処理するか、あるいは結合アッセイについて直ぐに処理した。要するに、０．２％ゼラチンと２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）でサプリメントした低温ＤＭＥＭの中でディッシュをリンスし、指示濃度の低温競合者の不在又は存在下で、２ｎｇ／ｍｌの１２５Ｉ−ＶＥＧＦ又は１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１を用い、４℃で２時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞を同じ培地中でリンスし、ＲＩＰＡバッファーに溶かし、γカウンターで放射能をカウントした。
【０１８４】
〔インビトロの毛細管形成〕
増殖因子減少マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコラーゲンで希釈し（体積比１／６）、氷上に保持した。この溶液の１６０μｌを、タイプＩのラット尾部コラーゲンでプレコートした８ウェル培養スライドの各ウェルに添加し、３７℃にて１時間放置した。対照、ＦＧＦ−２、ｓＨＬＡ−Ｇ１、又はｍＡｂＣＤ１６０と混合した又はしないＨＵＶＥＣ懸濁液を３７℃で２４時間にわたってマトリゲル／コラーゲンのゲルの中に接種した。微細管を先に記載のようにして３８顕微鏡法によって定量した。要するに、培地を除去し、細胞をＰＢＳを用いて２回リンスし、４％ＰＦＡ溶液に室温で３０分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、マッソントリクロームで染色した。微細毛管の網状組織の範囲を、自動化コンピューター利用イメージ解析装置（Ｉｍａｇｅｎｉａ，  Ｂｉｏｃｏｍ）で測定し、各ウェルにおける毛管の全長を測定した。平均の微細毛管の網状組織の長さ（μｍ）を、各実験条件について計算した。実験は、３通り行って３回繰り返した。
【０１８５】
〔フローサイトメトリー分析〕
亜集密ＨＵＶＥＣ又はＨＶＭＥＣをＰＢＳ−ＥＤＴＡに掻爬し、１００ｎｇ／ｍｌのｓＨＬＡ−Ｇ１の存在又は不在下で、４℃においてインキュベートした。２時間後、抗ＣＤ８、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ１０６もしくはＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０特異性ｍＡｂ、又はＩｇアイソタイプ対照（２０μｇ／ｍｌ）を用いて、続いてＦ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣ又はＰＥ共役ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて、細胞をインキュベートした。ヨウ化プロピジウムの使用によって非生存可能な細胞を排除した。Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｅｐｉｃｓ  ＥＬＩＴＥフローサイトメーターによってサンプルを分析した。
【０１８６】
〔ＲＴ―ＰＣＲ及びｃＤＮＡ配列決定〕
ＣＤ１６０の転写産物を、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより検出した：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び３’−ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）。ｃＤＮＡの品質は、前記適切なプライマーを用いてβアクチンの増幅によって確認した。ＣＤ１６０及びβアクチンの増幅コンディションは、９５℃４５秒、６０℃３０秒、７２℃１分で行った。ＣＤ１６０の配列決定のために、Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＰＣＲ生成物を精製し（ｑｉａｅｘ  ＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ）、以下のプライマーを用いて分析した：ＢＹ０ｌ（５’−ＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＣＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＢＹ０３（３’  −ＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣ−５’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；ＢＹ０２（５’−ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＴＣ−３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＢＹ０４（３’−ＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧ−５’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【０１８７】
〔免疫組織化学〕
亜集密ルイス肺癌細胞をトリプシン処理し、２回洗浄し、ＰＢＳに懸濁させた。２×１０５の細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（ＩＦＦＡ  Ｃｒｅｄｏ，  Ｆｒａｎｃｅ）の背側中央領域の中に皮下注入した。腫瘍を２１日に採取し、４℃で終夜にわたって１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）に固定し、パラフィン（Ｅｍｂｅｄｅｒ  Ｌｅｉｃａ）に包埋した。５μｍの切片をＤａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒに入れ、ＴＮＢ阻害緩衝液（ＴＳＡキット、ＮＥＮ）、ペルオキシダーゼ阻害剤（ＤＡＫＯ）、及びマウス免疫グロブリン阻害剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベートした。切片を、ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、続いてビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧとアビジン−ビオチン複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベートした。それらをＤＡＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色し、ヘマトキシリンで対比染色し、ニコン顕微鏡（Ｅ−８００）で観察し、４０倍対物のＤＭＸ１２００カメラ（ニコン）を用いてデジタル化した。
【０１８８】
〔経時的顕微鏡検査法〕
ＳＧＨＥＣ−７細胞を、通常の培地で、６ウェルプレート（２．５×１０５細胞／ウェルに接種した。１５時間後、ＰＣ３−ｓＧ１又はＰＣ３−ネオ細胞からの条件培地、組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂ（１〜１０μｇ／ｍｌ）、ＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）又はｚＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μモル／ｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をウェルに添加した。プレートを、モーター付きステージと冷却ＣＣＤカメラを備えたオリンパスＬＸ７０倒立蛍光顕微鏡に移し、３７℃の空気中５％ＣＯ２の加熱加湿チャンバーに入れた。１５分ごとに３６〜５０時間にわたって写真を撮り、ＩｍａｇｅＰｒｏ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いてタイムラプス配列を解析した。各々の視野において、４０細胞をランダムに選択した。実験は少なくとも４回繰り返した。明確なアポトーシス形態が最初に観察されたときの時間にしたがってアポトーシス細胞を記録した３９。
【０１８９】
〔切断ＰＡＲＰ発現のウエスタンブロット分析〕
ＳＧＨＥＣ−７内皮細胞を培地に接種した。１６時間後、細胞を組換え型ｓＨＬＡ−Ｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて６０時間にわたって刺激した。細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、３０μｌ／ｍｌのアプロチニン、１ミリモル／ｌのオルトバナジン酸ナトリウムを含むＲＩＰＡ緩衝液に４℃で３０分間溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、ニトロセルロース膜に移した。阻止緩衝液中で室温にて１時間インキュベートした後、ウサギのポリクローナル抗ヒト分割ＰＡＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて膜を１時間インキュベートした。抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ（Ａ６１５４，  Ｓｉｇｍａ）を１時間にわたって添加した。膜結合抗体の検出は、化学発光によって行った（ＥＣＬＰｌｕｓ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ）。
【０１９０】
〔統計的解析〕
結果は、ｎの独立した実験の平均±ＳＥＭ又はＳＤとして表し、必要に応じてマンホイットニーＵ検定又はＡＮＯＶＡテスト、及びＰ＜０．０５を統計的に有意と考えるＥｖｅｒｓｔａｔ又はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて評価した。
【０１９１】
１．  Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，  Ｐ．  ＆  Ｂｌａｓｃｈｉｔｚ，  Ａ．  Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｉｓ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １６７，  ２３３−２４４  （１９９９）．  
２．  Ｉｓｈｉｔａｎｉ，  Ａ．  ＆  Ｇｅｒａｇｈｔｙ，  Ｄ．Ｅ．  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９，  ３９４７−３９５１  （１９９２）．  
３．  Ｍｏｒａｌｅｓ，  ＰＪ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ２  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１，  ６２１５−６２２４  （２００３）．  
４．  Ｆｏｕｒｎｅｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｅｄｇｅ：  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇｌ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ＣＤ９５／ＣＤ９５  ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ８＋  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＤ８．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４，  ６１００−６１０４  （２０００）．  
５．  Ｃｏｎｔｉｎｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ａ５−Ｂ５−Ｃ  ａｎｄ  −Ｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｔ  ａｎｄ  ＮＫ  ＣＤ８＋  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＣＤ８  ｌｉｇａｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３，  １２５−１３４  （２００３）．  
６．  ＬｉＩａ，  Ｎ．，  Ｒｏｕａｓ−Ｆｒｅｉｓｓ，  Ｎ．，  Ｄａｕｓｓｅｔ，  Ｊ．，  Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，  Ａ．  ＆  Ｃａｒｏｓｅｌｌａ，  Ｅ．Ｄ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａｌｌｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｌｌｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：  Ａ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８，  １２１５０−１２１５５  （２００１）．  
７．  Ｂｌａｓｃｈｉｔｚ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｆｅｔａｌ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｏｆ  ｆｉｒｓｔ  ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＨＬＡ−Ｇ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７，  ３３８０−３３８８  （１９９７）．  
８．  Ｄｙｅ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｒｍ  Ｐｌａｃｅｎｔａ．  Ｐｌａｃｅｎｔａ  ２２，  ３２−４３  （２００１）．  
９．  Ｌｉｍ，  Ｋ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ／ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｉｎ  ｐｒｅ−  ｅｃｌａｍｐｓｉａ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １５１，  １８０９−１８１８  （１９９７）．  
１０．  Ｙｉｅ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｌｉ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｙ．Ｍ．  ＆  Ｌｉｂｒａｃｈ，  Ｃ．  ＨＬＡ−Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １９１，  ５２５−５２９  （２００４）．  
１１．  Ｄｏｒｌｉｎｇ，  Ａ．，  Ｍｏｎｋ，  Ｎ．  ＆  Ｌｅｃｈｌｅｒ，  Ｒ．  ＨＬＡ−Ｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０，  ５８６−５９３  （２０００）．  
１２．  Ｆｏｒｔｅ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  ＨＬＡ−Ｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７，  ６００２−６００８  （２００１）．  
１３．  Ｒｉｓａｕ，  Ｗ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，  ６７１−６７４  （１９９７）．  
１４．  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，  Ｐ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９，  ６５３−６６０  （２００３）．  
１５．  Ｆｏｌｋｍａｎ，  Ｊ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ，  ｖａｓｃｕｌａｒ，  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １，  ２７−３１  （１９９５）．  
１６．  Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．，  Ｇｅｒｂｅｒ，  Ｈ．Ｐ．  ＆  ＬｅＣｏｕｔｅｒ，  Ｊ．  Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９，  ６６９−７６．  （２００３）．  
１７．  Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５５，  １５−３５；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３５−３６  （２０００）．  
１８．  Ｍａｉｚａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ８０−ｋＤ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８，  １１２１−１１２６  （１９９３）．  
１９．  Ａｎｕｍａｎｔｈａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＢＹ５５，  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ，  ＣＴＬ，  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１，  ２７８０−２７９０  （１９９８）．  
２０．  Ｂａｓｕ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｄｏｐａｍｉｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ／ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７，  ５６９−５７４  （２００１）．  
２１．  Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ２  （ＩＬＴ２）  ａｎｄ  ＩＬＴ４  ｃｏｍｐｅｔｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ８  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｔｏ  ＨＬＡ−Ｇ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００，  ８８５６−８８６１  （２００３）．  
２２．  Ａｇｒａｗａｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２，  １２２３−１２２６  （１９９９）．  
２３．  Ｏｎｇ，  Ｓ．，  Ｌａｓｈ，  Ｇ．  ＆  Ｂａｋｅｒ，  Ｐ．Ｎ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｂｓｔ．  Ｇｙｎａｅｃｏｌ．  １４，  ９６９−９８０  （２０００）．  
２４．  Ｌｏｋｅ，  Ｙ．  ＆  Ｋｉｎｇ，  Ａ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｏｂｓｔ．  Ｇｙｎａｅｃｏｌ．  １４，  ８２７−８３７  （２０００）．  
２５．  Ｆｏｌｋｍａｎ，  Ｊ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｓｅｍ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  １３，  １５９−１６７  （２００３）．  
２６．  Ｋｉｍ，  Ｙ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０，  ５４１０−５４５３  （２０００）．  
２７．  Ｂｉｅｌｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｆ，  ａ  ｃｈｅｍｏｒｅｐｕｌｓａｎｔ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｐｏｏｒｌｙ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ，  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ，  ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１４，  １２６０−１２７１  （２００４）．  
２８．  Ａｓｈｔｏｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｐｉｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｆａｓ／ＦａｓＬ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｖａｓｅ．  Ｂｉｏｌ．  ２５，  １０２−１０８  （２００５）．  
２９．  Ｌｅ  Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤｌ  ６０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ｃ  ｉｓ  ａ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９，  １６９６３−１６９６８  （２００２）．  
３０．  Ｂａｒａｋｏｎｙｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｅｄｇｅ：  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ  １６０  ｂｙ  ｉｔｓ  ＨＬＡ−Ｃ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３，  ５３４９−５３５４  （２００４）．  
３１．  Ｂｅｎｓｕｓｓａｎ，  Ａ．  ＢＹ５５  （ＣＤ１６０）．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｗｅｂ  １，  ７２−７３  （２０００）．  
３２．  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｗｈｉｔｌｅｙ，  Ｇ．Ｓ．  ＆  Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，  Ａ．Ｐ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ２１７，  ３２９−３３５  （１９９５）．  
３３．  Ｓｏｌｉｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｎ  ４−ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇｌ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｌｌｏｕｓ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２，  ３５７６−３５８６  （２００２）．  
３４．  Ｆｏｕｒｎｅｌ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＬＡ−Ｇ：  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＥＬＩＳＡ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４２，  ２２−２９  （１９９９）．  
３５．  Ｐｌｏｕｅｔ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １８９−  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｆｏｒｍ  ｂｙ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １３３９０−１３３９６  （１９９７）．  
３６．  Ａｌｌａｎ，  Ｄ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＨＬＡ）−Ｇ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８９，  １１４９−  １１５６  （１９９９）．  
３７．  Ｌｅｅ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｂｉｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｕｔ  ｄｉｆｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ＴＡＰ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３，  ５９１−６００  （１９９５）．  
３８．  Ｒｕｇｇｅｒｉ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣＥＰ−７０５５：  ａ  ｎｏｖｅｌ，  ｏｒａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３，  ５９７８−５９９１  （２００３）．  
３９．  Ｄａｓｈ，  Ｐ．Ｒ．，  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｂａｋｅｒ，  Ｐ．Ｎ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｗｈｉｔｌｅｙ，  Ｇ．Ｓ．  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｔｒａｖｉｌｌｏｕｓ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ−  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ３  ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ２８７，  ３１４−３２４  （２００３）
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃは、ＨＬＡ−Ｃが引き起こすＮＫ９２細胞及びＰＢ−ＮＫ細胞によるサイトカイン生産を示す図である。〔図１Ａ〕ＮＫ９２で処理されたＩＬ−２は、Ｗ６／３２抗ＨＬＡ−ＣｍＡｂ（下のパネル）のブロッキング濃度の存在下又は不存在下で、４時間にわたってＫ５６２ｃｌａｓｓ−Ｉ＋と共にインキュベートされた。細胞は、細胞内ＴＮＦ−αの発現のために、材料と方法に記載されているように、固定、透析処理及び染色された。Ｋ５６２ｃｌａｓｓ−Ｉ＋又はＮＫ９２細胞は、単独で対照として用いられた（上のパネル）。〔図１Ｂ〕Ｋ５６２ｃｌａｓｓ−Ｉ＋、Ｋ５６２又はＫ５６２−Ｃｗ５は、Ｗ６／３２ｍＡｂを用いたＨＬＡ−Ｃの表面発現を調べるためのフローサイトメトリーによって分析され、続けてＰＥ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅによって分析された（白抜きのプロファイル）。黒ぬりのプロファイルは、Ｉｇアイソタイプの対照染色である。〔図１Ｃ〕ＰＢ−ＮＫによるＫ５６２ｃｌａｓｓ−Ｉ＋、Ｋ５６２又はＫ５６２−Ｃｗ５の存在下、単独で又は共に１６時間培養した後のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γ生産の同時測定。上清を、ＣＢＡ分析のために集めた。サンプルをデュアルレーザーフローサイトメーターを用いて得、データを２色のドットプロットとして表示した。各ビーズのサイトカイン特異的セットをＦＬ−３チャンネルによって決定される独特の蛍光強度に設定した。抗ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γ抗体によって結合され、ＰＥ−共役抗ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γｍＡｂによって検出される各サイトカインの存在は、ＦＬ−２の信号強度によって示される。データは５回行ったうちの１回の代表的な実験のものである。
【図２】ＣＤ１６０ｍＡｂ架橋結合は、ＰＢ−ＮＫ細胞によるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６サイトカイン生成の引き金を引く。１６時間のインキュベーションの間の特異的ｍＡｂによるＣＤ１６０、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫ細胞受容体の架橋結合の後、上清サンプルは、材料と方法の記載に従って、ＣＢＡによりサイトカイン生成が分析された。サンプル中のサイトカイン濃度は、各サイトカインについての標準希釈物を用いた適切な検量線と比較して計算した。結果は、異なるドナーによって遂行された９回の独立した実験の平均±ＳＥとして表される。＊Ｐ≦０．０５，＊＊Ｐ≦０．０３，＊＊＊Ｐ≦０．０１，＊＊＊＊Ｐ≦０．００３，＊＊＊＊＊Ｐ≦０．００８（スチューデントｔ検定）。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＣＤ１５８ｂ抑制受容体によるＣＤ１６０仲介ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６サイトカイン生成の阻害を表す。〔図３Ａ〕新鮮な精製されたＰＢ−ＮＫは、ＣＤ１６０、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１５８ｂ及びＮＫＧ２Ｄの表面発現を、ＰＥ−Ｃｙ５−共役ＢＹ５５抗ＣＤ１６０ｍＡｂ及び／又はＰＥ−共役―抗ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１５８ｂｍＡｂ及び／又は抗ＮＫＧ２Ｄを用いて、続いてＰＥ−共役Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ１  Ａｂを用いて、フローサイトメトリーによって直ちに分析された。上方のパネル、単染色（黒ぬりのプロファイル）；白抜きのプロファイルは、ＰＥ−Ｃｙ５−ＩｇＭ又はＰＥ−ＩｇＧアイソタイプ対照染色である。下方のパネル、２重染色：ＣＤ１６０及び他のマーカーの両方に陽性の細胞の割合。結果は５回の異なる実験を表す。〔図３Ｂ〕材料と方法に記載しているように、ＣＤ１６０、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１５８ｂＮＫ細胞受容体は、適切な濃度を使用した特異的ｍＡｂとＰＢ−ＮＫ細胞上で単独で架橋結合するか又は互いに架橋結合する。１６時間の受容体の活性化の後、上清サンプルは、材料と方法に記載しているように、ＣＢＡによって分析された。データは、異なるドナーによって遂行された５回の実験のうちの１回の代表的な実験から得た。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄは、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ２によって引き起こされたＥＣの増殖、遊走、及び毛細管様管形成におけるｓＨＬＡ−Ｇ１の効果を示す。〔図４Ａ〕ｓＨＬＡ−Ｇ１によるＶＥＧＦ仲介ＨＵＶＥＣ増殖の阻害。細胞は、ＶＥＧＦの存在下、低密度で接種され、様々な濃度のｓＨＬＡ−Ｇ１（ｓＧ１）又は対照ｓＨＬＡ−Ｇ１−β２ｍ単鎖（ｓＧ１ｍｏｎｏ）でインキュベーションされた。７日間の培養の後、細胞はトリプシン処理され、カウントされた。〔図４Ｂ〕ｓＧ１又はｓＧ１ｍｏｎｏによるＶＥＧＦ誘導ＨＵＶＥＣ遊走の阻害。成長が阻害されたＨＵＶＥＣ単層は、掻爬されｓＧ１又はｓＧ１ｍｏｎｏの存在又は非存在（−）下においてＶＥＧＦで刺激される又は刺激されなかった（−）。１８時間後細胞単層は、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色され、細胞の遊走は、材料と方法に示されたように、カウントされた。〔図４Ｃ及び図４Ｄ〕ｓＨＬＡ−Ｇ１によるインビトロでの血管新生におけるＦＧＦ−２誘導ＨＵＶＥＣの抑制。ＨＵＶＥＣは、ＦＧＦ−２及び／又はｓＧ１の存在又は非存在下、コラーゲンゲルで希釈されたマトリゲルに接種された。２４時間後、各ウェルの写真が撮られた（図４Ｃ）、そして血管新生が材料と方法に記載されているように、定量化された（図４Ｄ）。代表的なウェルの顕微写真は、ｓＨＬＡ−Ｇ１インキュベーション後のＦＧＦ−２誘導ＨＵＶＥＣ管形成が、ＦＧＦ−２単独又はＦＧＦ−２及び対照に比較して減少していることを示す。ｓＨＬＡ−Ｇ１のための対照は、免疫親和性カラムを通過し、溶出され、プールされた非形質導入細胞の培養上清である（１０）。Ａ、Ｂ及びＤの結果は３つのウェルの平均＋／−ＳＤであり、５つの独立した実験を表す。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、ｓＨＬＡ−Ｇ１はＶＥＧＦ受容体に結合しないことを示す。〔図５Ａ〕ＨＵＶＥＣは、放射性標識されていないＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２又は様々な濃度のｓＨＬＡ−Ｇ１（ｓＧ１）の存在又は非存在（−）下において１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１とインキュベーションされた。非標識ｓＨＬＡ−Ｇ１は、１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１結合を阻害したが、ＶＥＧＦとＦＧＦ−２は阻害しなかった。〔図５Ｂ〕ＨＵＶＥＣは放射性標識されていないｓＧ１、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦの存在下で、ヨード化されたＶＥＧＦとインキュベーションされた。放射性標識されていないＶＥＧＦとは異なり、放射性標識されていないｓＧ１は、ヨード化されたＶＥＧＦ結合を排除しなかった。結果は３つのウェルの平均＋／−ＳＤであり、５つの独立した実験を表す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、ＥＣによって発現されるＣＤ１６０受容体へのｓＨＬＡの結合を示す。〔図６Ａ〕ＨＵＶＥＣは、ＶＥＧＦ又はｓＧ１の存在又は非存在下において、ＣＤ８、ＩＬＴ２又はＣＬ１−Ｒ２（ＣＤ１６０）特異的ｍＡｂ（白抜きのプロファイル）又はＩｇアイソタイプ対照Ａｂ（黒ぬりのプロファイル）とインキュベーションされた後フローサイトメトリーにより分析され、次いでＦＩＴＣ標識結合体により分析された。結果は６つの独立した実験を表す。〔図６Ｂ〕ＮＫ９２、ＨＵＶＥＣ及びＰＢ−ＣＤ４＋リンパ球におけるＣＤ１６０ｍＲＮＡの発現は、ＣＤ１６０（上段）又はβ−アクチン（下段）プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって測定された。〔図６Ｃ〕ＮＫ９２（ＮＫ）及びＨＵＶＥＣにおいて発現されるＣＤ１６０の予想されるアミノ酸配列。（−）同一性を示す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ＨＬＡ−Ｇ４量体のＪｕｒｋａｔＣＤ１６０及びＨＵＶＥＣへの結合を示す。〔図７Ａ、上方〕フローサイトメトリーによって、ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２はＪｕｒｋａｔＣＤ１６０を染色したが、Ｊｕｒｋａｔを移入しなかったＣＤ１６０（白抜きのプロファイル）は染色されなかった。黒ぬりのプロファイルはＩｇアイソタイプ対照染色である。〔図７Ａ、下方〕Ｗ６／３２ｍＡｂと架橋結合され、その後ストレプトアビジン−ＰＥとインキュベーションされたＨＬＡ−Ｇ１の４量体は、ＨＵＶＥＣに結合する（白抜きのプロファイル）。黒ぬりのプロファイルは、ストレプトアビジン−ＰＥによる対照染色である。〔図７Ｂ〕ＨＵＶＥＣは、４℃でｓＨＬＡ−Ｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションされる又はされなかった。２時間後、細胞はＣＬ１−Ｒ２とインキュベーションされてＰＥ共役され、フローサイトメトリーによって分析される（白抜きのプロファイル）。黒ぬりのプロファイルは、Ｉｇアイソタイプ対照染色である。結果は、３つの独立した実験を表す。
【図８】ＣＤ１６０のｍＡｂ架橋結合は、インビトロでの血管新生の阻害の引き金を引く。ＨＵＶＥＣは、ＦＧＦ−２及びｓＨＬＡ６Ｇ１及び／又はｍＡｂＣＤ１６０又はＩｇアイソタイプ対照の存在又は非存在下、コラーゲンゲルで希釈されたマトリゲルに接種された。２４時間後、各ウェルの写真が撮られ、そして血管新生が材料と方法に記載されているように、定量化された。結果は３つのウェルの平均＋／６  ＳＤであり、５つの独立した実験を表す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、ＥＣのＣＤ１６０発現における低酸素の効果を示す。ＨＵＶＥＣは、ＰＥ標識結合体に従って、正常酸素又は低酸素（５％  Ｏ２）コンディションにおいて２４時間インキュベーションされ、ＣＬ１−Ｒ２ｍＡＢ（図９Ａ）を用いてＣＤ１６０の表面発現が、又は抗ＣＤ１０６ｍＡＢ（図９Ｂ）を用いてＶＣＭＡＭの表面発現が分析された。黒ぬりのプロファイルは、Ｉｇアイソタイプ対照染色である。結果は、３つの独立した実験を表す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、腫瘍部位におけるＣＬ１−Ｒ２ｍＡＢ免疫組織化学的染色であり、ＣＤ１６０が腫瘍細胞で発現されず、腫瘍周辺におけるリンパ管のＥＣ及び腫瘍内部の微小血管のＥＣによって高いレベルで発現されていることを示す。〔図１０Ａ及び図１０Ｂ〕腫瘍の周辺におけるリンパ微小血管のＣＤ１６０染色である。〔図１０Ｃ及び図１０Ｄ〕腫瘍内部における微小血管のＣＤ１６０染色である。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１５を有するＣＤ４＋リンパ球におけるＣＤ１６０転写産物の誘導である。
【図１２】図１２ａ、図１２ｂ、図１２ｃ及び図１２ｄは、ｓＨＬＡは、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ２が仲介する、内皮細胞の増殖、遊走及び毛細管のような管形成を阻害することを示す。（ａ）ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦに対する増殖反応である。組換えｓＨＬＡ−Ｇ１（ｓＧ１）又は対照ｓＨＬＡ−Ｇ１−  ２ｍ単鎖（ｓＧ１ｍｏｎｏ）の効果である。（ｂ）ｓＨＬＡ−Ｇ１による、ＶＥＧＦが誘導するＨＵＶＥＣの遊走の抑制である。成長が阻害されたＨＵＶＥＣ単層は、掻爬され、ｓＧ１又はｓＧ１ｍｏｎｏの存在又は非存在（−）下においてＶＥＧＦで刺激される又は刺激されなかった。１６時間後細胞単層は、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色され、細胞の遊走は、材料と方法に示されたように、カウントされた。（ｃ、ｄ）ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＦＧＦ−２−誘導血管新生を阻害する。ＨＵＶＥＣは、ＦＧＦ−２及び／又はｓＧ１の存在又は非存在下、マトリゲルに接種された。２４時間後、各ウェルの写真が撮られ（ｃ）、そして血管新生が材料と方法に記載されているように、定量化された（ｄ）。対照は、免疫親和性カラムを通過し、溶出され、プールされた非形質導入細胞の培養上清である３４。＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ検定。（ａ、ｂ及びｄ）の結果は３つのウェルの平均＋／−ＳＤであり、５つの独立した実験を表す。
【図１３】図１３ａ、図１３ｂ、図１３ｃ、図１３ｄ及び図１３ｅは、ｓＨＬＡ−Ｇ１が、内皮細胞のアポトーシスを引き起こすことを示す。（ａ）アポトーシス誘導反応速度カーブである。ＳＧＨＥＣ−７細胞は、ｓＨＬＡ−Ｇ１（Ｇ１ｓ）又は空のベクター（ｎｅｏ）で移入されたＰＣ３細胞から得た調整培地でインキュベーションされた。経時の顕微鏡観察はアポトーシスした形態の外観を評価して行われた。７つの実験からプールされたデータの平均±ＳＥＭが示されている。データは１５分毎に得られたが、明瞭に示すためにデータポイントは２時間毎にのみ示した。（ｂ）ｓＧ１又はｎｅｏ調整培地で処置された後の内皮細胞のイメージである（補足図２ビデオクリップオンライン）。（ｃ）経時顕微鏡観察によって評価されたカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在又は非存在下における組換えｓＨＬＡ−Ｇ１によるアポトーシス誘導の反応速度カーブである。４つの実験からプールされたデータの平均±ＳＥＭを示す。（ｄ）反応速度カーブから計算されたカーブの面積が（ｃ）に示されている。＊＊Ｐ＜０．００３  Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定。（ｅ）ＰＡＲＰ発現を分割されたｐ８５のウエスタンブロット分析である。ＳＧＨＥＣ−７細胞はｓＨＬＡ−Ｇ１の非存在（対照）又は存在下においてインキュベーションされた。
【図１４】図１４ａ及び図１４ｂは、ｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＶＥＧＦ受容体によって妨げられないことを示す。（ａ）ＨＵＶＥＣは、放射性標識されていないＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２又は様々な濃度のｓＨＬＡ−Ｇ１（ｓＧ１）の非存在（−）又は存在下において１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１とインキュベーションされた。非標識ｓＨＬＡ−Ｇ１は、１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１結合を阻害したが、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ−２は、１２５Ｉ−ｓＨＬＡ−Ｇ１結合を阻害しなかった。放射性標識されていないＶＥＧＦとは異なり、放射性標識されていないｓＧ１は、ヨード化されたＶＥＧＦ結合を排除しなかった。結果は３つのウェルの平均＋／−ＳＥＭであり、３つの独立した実験を表す。
【図１５】図１５ａ、図１５ｂ、図１５ｃは、ＨＵＶＥＣがＣＤ１６０受容体を発現することを示す。（ａ）ＨＵＶＥＣ及びＨＭＶＥＣは、ＦＩＴＣ標識結合体によってフォローされたＣＤ８、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｊ又はＣＬ１−Ｒ２（ＣＤ１６０）特異的ｍＡｂ（白抜きのプロファイル）又はＩｇアイソタイプ対照（黒ぬりのプロファイル）とインキュベーションされた後、フローサイトメトリーによって分析された。結果は６つの独立した実験を表す。（ｂ）ＨＵＶＥＣによるＣＤ１６０ｍＲＮＡの発現である。（ｃ）ＨＵＶＥＣ及びＮＫ９２において発現されるＣＤ１６０の予想されるアミノ酸配列である。（−）はアイデンティティーを示す。
【図１６】図１６ａ、図１６ｂ、図１６ｃ及び図１６ｄは、茶色でＣＤ１６０陽性管を示す抗ＣＤ１６０ｍＡｂでのルイス肺癌細胞部位の免疫組織化学染色である。管網染色は腫瘍の周辺に局所化された（ａ）。腫瘍周辺の血管（ｂ）及び腫瘍中心の血管（ｃ、ｄ）はまたＣＤ１６０ｍＡｂで染色された一方、腫瘍細胞は染色されなかった。拡大、４００倍。
【図１７】図１７ａ、図１７ｂ、図１７ｃ及び図１７ｄは、ｓＨＬＡ−Ｇ１が内皮細胞によって発現されたＣＤ１６０受容体に結合することを示す。（ａ、上方）抗ＣＤ１６０ｍＡｂは、ＪｕｒｋａｔＣＤ１６０を染色するが、Ｊｕｒｋａｔ非形質移入ＣＤ１６０を染色しない（黒ぬりのプロファイル、アイソタイプ対照）。  （ａ、下方）ＨＬＡ−Ｇ１  ４量体は、ＨＵＶＥＣ及びＪｕｒｋａｔＣＤ１６０調整形質移入体に結合するが、非形質移入Ｊｕｒｋａｔ細胞には結合しない（黒ぬりのプロファイル、ストレプトアビジン−ＰＥで染色した対照）。（ｂ）組換えｓＨＬＡ−Ｇ１は、ＣＤ１６０ｍＡｂのＨＵＶＥＣへの結合をブロックする（黒ぬりのプロファイル、アイソタイプ対照）。結果は、３つの独立した実験を表す。（ｃ）可溶性ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂはインビトロでの血管新生阻害の引き金を引く。ＨＵＶＥＣは、ＦＧＦ−２及びｓＨＬＡ−Ｇ１及び／又はｍＡｂＣＤ１６０（＋＋＋，１０μｇ／ｍｌ；＋，１μｇ／ｍｌ）又はＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下、マトリゲルに接種された。２４時間後、各ウェルの写真が撮られ、そして血管新生が定量化された。結果は３つのウェルの平均±ＳＤであり、５つの独立した実験を表す。ＡＮＯＶＡ検定による＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．００５、ＦＧＦ−２処理細胞との比較。（ｄ）可溶性ＣＬ１−Ｒ２抗ＣＤ１６０ｍＡｂは、内皮でのアポトーシスを引き起こす。ＳＧＨＥＣ−７細胞はＣＬ１−Ｒ２（＋，１μｇ／ｍｌ、＋＋，５μｇ／ｍｌ、＋＋＋，１０μｇ／ｍｌ）又はＩｇＧ１アイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションされ、経時顕微鏡観察がアポトーシス形態の外観を評価することによって行われた。５０時間後のアポトーシスレベルは、３つの実験からプールされたデータの平均±ＳＤで示される。ＡＮＯＶＡ検定による＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、対照との比較。
【図１８ａ】ネガティブコントロール細胞（一次培養による平滑筋細胞及びヒト繊維芽細胞）と比較したＨＵＶＥＣ及びＨＭＶＥＣにおけるＣＤ１６０の発現。ＩｇＭアイソタイプ対照と比較したＢＹ５５抗ＣＤ１６０ｍＡｂ（ＩｇＭ）を用いたフローサイトメトリー分析。細胞は、これらの抗体のいずれかとインキュベーションされ、洗浄され、抗ＩｇＭ−ＦＩＴＣ結合体とインキュベーションされた。
【図１８ｂ】ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂは、ＨＵＶＥＣのアポトーシスを引き起こすが、繊維芽細胞のアポトーシスは引き起こさない（アネクチン−Ｖ及びＰＩ二重染色フローサイトメトリーによる評価）。
【図１８ｃ】図１８ｂと同様の方法。２つの異なる実験の平均（各実験は５つの異なるウェル）。
【図１Ａ】
2008517873.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2008517873.tif 000021
【図１４】
2008517873.tif 000022
【図１５】
2008517873.tif 000023
【図１６】
2008517873.tif 000024
【図１７】
2008517873.tif 000025
【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月30日(2006.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＣＭＩ−３２０４として寄託されているハイブリドーマから得られる抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２、該ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメント、及び少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２フラグメントを含有する該ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体、を含む群から選択された抗ＣＤ１６０化合物を含有する薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、ＣＤ１６０に結合する前記抗ＣＤ１６０ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２と競合しうるものであり、少なくともＣＤ８αβに結合することなくＣＤ１６０に結合するというＣＤ１６０特異性を十分に有する薬剤。
【請求項２】
請求項１記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、更に、ＣＤ８５ｊに結合しないことを特徴とする薬剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖフラグメントからなる群から選択された１つの前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２のフラグメントであることを特徴とする薬剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であり、ペプチドリンカー（Ｌ）を介して、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＬ領域にリンクされる少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＬ１−Ｒ２ＶＨ領域を含む少なくとも１つのｓｃＦｖ化合物を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項５】
請求項４記載の薬剤であって、
前記保存的誘導体は、一価ｓｃＦｖであることを特徴とする薬剤。
【請求項６】
請求項４記載の薬剤であって、
前記保存的誘導体は、多価ｓｃＦｖであることを特徴とする薬剤。
【請求項７】
請求項１又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、Ｆｃフラグメントに連結された、前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２から誘導されたｓｃＦｖ多量体を含む前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする薬剤。
【請求項８】
請求項１又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、ヒトＦｃに連結したＣＲ１−Ｒ２の少なくとも１つのＦｖフラグメントを含む前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする薬剤。
【請求項９】
請求項１又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、前記ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂから誘導された1つ以上のＦａｂを、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂの各Ｈ鎖のＣ末端に付加することによって得られる前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする薬剤。
【請求項１０】
請求項1又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、全長ＣＲ１−Ｒ２ｍＡｂを一緒に共有結合させて凝集Ａｂ形態を形成することによって得られる前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする薬剤。
【請求項１１】
請求項1又は２記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、２つ以上のＦａｂを頭部対尾部で結合させることによって得られる前記ｍＡｂＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする薬剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、更に免疫毒素及び／又は放射性元素を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は可溶性化合物であることを特徴とする薬剤。
【請求項１４】
請求項１〜１２の何れかに記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、少なくとも１つのＣＤ結合部位及び少なくとも1つのＣＤ１５８ｂ結合部位を含む化合物であることを特徴とする薬剤。
【請求項１５】
請求項１〜１２の何れかに記載の薬剤であって、
前記抗ＣＤ１６０化合物は、凝集化合物であることを特徴とする薬剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２に記載の薬剤であって、
前記凝集化合物は、少なくとも３つのＣＤ１６０結合部位を含み、ＣＤ１５８結合部位を含まないことを特徴とする薬剤。
【請求項１７】
抗血管新生薬剤の製造のための請求項１〜１２の何れかに記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項１８】
請求項１７記載の使用であって、
前記抗血管新生薬剤は、腫瘍の予防又は治療を目的とすることを特徴とする薬剤の使用。
【請求項１９】
請求項１７記載の使用であって、
前記抗血管新生薬剤は、子癇前症若しくは子癇の予防又は治療を目的とすることを特徴とする薬剤の使用。
【請求項２０】
請求項１７記載の使用であって、
前記抗血管新生薬剤は、糖尿病、及び／又は虚血性眼疾患、及び／又は関節リュウマチの予防又は治療を目的とすることを特徴とする薬剤の使用。
【請求項２１】
ある個体の適応できる免疫可能性を誘導又は上方制御することを目的とする薬剤の製造のための、請求項１５又は１６記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２２】
請求項２１記載の使用であって、
前記薬剤は、感染の治療又は予防を目的とすることを特徴とする薬剤の使用。
【請求項２３】
請求項２１又は２２記載の使用であって、
前記薬剤は、ワクチン組成物に含まれるか又はワクチンの助剤として用いられることを特徴とする薬剤の使用。
【請求項２４】
ある個体における血球新生を誘導又は上方制御することを目的とする薬剤の製造のための請求項１５又は１６記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２５】
ある個体における炎症反応を誘導又は上方制御することを目的とする薬剤の製造のための請求項１５又は１６記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２６】
ある個体の適応できる免疫可能性を阻害又は下方制御することを目的とする薬剤の製造のための、請求項１３又は１４記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２７】
ある個体における血球新生を阻害又は下方制御することを目的とする薬剤の製造のための、請求項１３又は１４記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２８】
ある個体における炎症反応を阻害又は下方制御することを目的とする薬剤の製造のための、請求項１３又は１４記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【請求項２９】
Ｂ細胞の慢性リンパ性白血病の治療を目的とする薬剤の製造のための、請求項１〜１２記載の抗ＣＤ１６０化合物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
あるいは、本発明の抗ＣＤ１６０は、可溶形態で提供することもできる。可溶形態で提供された場合、本発明の抗ＣＤ１６０化合物は、実際に、ＣＤ１６０シグナル伝達経路を阻害する。「可溶」形態は、本願において、免疫系の受容体とリガンドの相互作用の分野における当業者によって意味される「可溶」形態を意味する。より詳しくは、リガンドが可溶形態であることは、前記リガンドが、活性化標的に対して、即ち、ＣＤ１６０の存在において、１つ又は２つであって２つを超えない結合部位を有することを示唆する。
逆に、リガンドが凝集形態であることは、前記リガンドが、活性化標的に対して、即ち、ＣＤ１６０の存在において、少なくとも３つの結合部位を有することを示唆する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
【表１】
2008517873.tif 000029
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
【表２】
2008517873.tif 000030
【国際調査報告】
2008517873.tif 000031
2008517873.tif 000032
2008517873.tif 000033
2008517873.tif 000034