(57)【要約】  反応混合物、特に所定の化学量論及び/又は所定の時点での増幅反応混合物に、第一及び第二機能性核酸配列を加える方法であって、以下のステップ：  スペーサー配列により分断された第一及び第二機能性核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを反応混合物に加え、当該スペーサー配列は、二重鎖であるときに、開裂可能部位を含む部位を含み；  当該オリゴヌクレオチドのスペーサー部位内に開裂可能な二重鎖部位を形成し；並びに  当該オリゴヌクレオチド内の当該二重鎖部位を開裂すること、を含む、前記方法。本方法において使用するための、そして、スペーサー部位により分断された第一及び第二機能性核酸配列、例えば増幅反応で使用されるプライマー又はプローブ、を含むオリゴヌクレオチドも提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の化学量論及び/又は所定の時点での反応混合物に、第一及び第二機能性核酸配列を加える方法であって、以下のステップ：
スペーサー配列により分断された第一及び第二機能性核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを反応混合物に加え、ここで、当該スペーサー配列は、二重鎖であるときに、開裂可能部位を含む部位を含み；
当該オリゴヌクレオチドのスペーサー部位内に開裂可能な二重鎖部位を形成し；並びに
当該オリゴヌクレオチド内の当該二重鎖部位を開裂すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記のオリゴヌクレオチドの二重鎖開裂可能部位が、酵素を用いて開裂される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドがDNA配列であり、かつ前記酵素が制限エンドヌクレアーゼである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列の二重鎖部位が、RNA鎖及びDNA鎖を含み、そして、前記酵素がRNアーゼH又はRNアーゼH活性を有する酵素である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記機能性核酸配列の１つが、5'-3'配列方向に向き、他の機能性核酸配列がオリゴヌクレオチド内で3'-5'方向に向き、これらの核酸配列が、オリゴヌクレオチドの両末端が5'末端であるように配置されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列が、互いにハイブリダイズして二重鎖開裂可能部位を形成することができる、２つの相補性部位を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列の２つの相補性部位が、互いに離れている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
第三の機能性核酸配列が、前記オリゴヌクレオチドの２つの相補性部位の間に含まれ、当該第三の機能性配列が、スペーサー配列の開裂の際に放出される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第三の機能性核酸が、第一機能性核酸と第二機能性核酸との間に提供され、そして、前記スペーサー配列が二重鎖であるときに、スペーサー配列が、開裂可能部位を含む十分な部位を含み、全ての機能性配列をそこに放出させるために十分な時間オリゴヌクレオチドを開裂させる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
１以上の機能性核酸配列が標識を有する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
増幅反応を行う方法であって、以下のステップ：
(i) 標的核酸配列を含む又は含むと予想される試料、及びスペーサー配列により分断された第一及び第二機能性核酸配列を含むオリゴヌクレオチドを含む増幅反応混合物を形成し、ここで、当該スペーサー配列は、二重鎖であるとき、開裂可能部位を含む部位を含み、当該第一及び第二核酸配列の各々は、プライマー又はプローブ配列である；
(ii) 開裂可能な二重鎖部位が当該オリゴヌクレオチドのスペーサー内に形成される条件下に、当該混合物を供し；
(iii) 当該部位を開裂し; 並びに
(iv) 得られた混合物を増幅すること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
ステップ（iii）が、前記２つの相補性部位により形成された二重鎖核酸を開裂することができる酵素を、前記反応混合物に加え、そして、オリゴヌクレオチドの開裂を起こさせるために十分な時間及び十分な温度で、前記混合物をインキュベートすること、によって達成される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがDNA配列であり、かつ前記酵素が制限エンドヌクレアーゼである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列の二重鎖部位が、RNA鎖及びDNA鎖を含み、そして前記酵素がRNアーゼH又はRNアーゼH活性を有する酵素である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記機能性核酸配列の１つがオリゴヌクレオチド内で5'-3'配列方向に向き、他の機能性核酸配列がオリゴヌクレオチド内で3'-5'方向に向き、これらの核酸配列が、オリゴヌクレオチドの両末端が5'末端であるように配置されている、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列が、互いにハイブリダイズして、二重鎖の開裂可能部位を形成することができる、２つの相補性部位を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記のオリゴヌクレオチドのスペーサー配列の２つの相補性部位が、互いに離れている、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第三の機能性核酸配列が、前記オリゴヌクレオチドの２つの相補性部位の間に含まれ、当該第三の機能性配列が、スペーサー配列の開裂の際に放出される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
第三の機能性核酸が、第一機能性核酸と第二機能性核酸との間に提供され、前記スペーサー配列が二重鎖であるときに、スペーサー配列が、開裂可能部位を含む十分な部位を含み、全ての機能性配列をそこに放出させるために十分な時間オリゴヌクレオチドを開裂させる、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記第三機能性核酸配列が、プローブ配列である、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
１以上の機能性核酸配列が標識を有する、請求項１１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記第一オリゴヌクレオチドよりも短く、及び前記第一オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、第二オリゴヌクレオチドを、前記反応混合物に加えて前記二重鎖開裂可能部位をつくる、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記第一及び第二機能性核酸配列が、プライマー配列である、請求項１１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記反応混合物が、１以上の標識されたプローブを含み、そして、反応が増幅により監視される、請求項１１〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素が、高温で実質的に活性である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ピロリン酸塩が、プライマー伸張が起こるのを抑制するために、ステップ（i）で形成された増幅反応混合物に加えられ、その後、ステップ（iv）の前に、当該ピロリン酸塩がピロホスファターゼ酵素を用いて消化される、請求項１１〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドが、スペーサー配列により分断された第一及び第二機能性核酸配列を含み、スペーサー配列が、二重鎖であるときに、開裂可能部位を含む部位を含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法において使用するためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記スペーサー配列が、互いにハイブリダイズして、二重鎖開裂可能部位を形成することができる、２つの相補性部位を含む、請求項２７記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記第一及び第二機能性核酸配列が、プライマー配列である、請求項２７又は２８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記二重鎖開裂可能部位が、酵素を用いて開裂され得る、請求項２７〜２９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
DNA配列であり、かつ前記酵素が制限エンドヌクレアーゼである、請求項３０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
前記のスペーサー配列の二重鎖部位が、RNA鎖及びDNA鎖を含み、かつ前記酵素がRNアーゼH又はRNアーゼH活性を有する酵素である、請求項３０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
前記機能性核酸配列の１つがオリゴヌクレオチド内で5'-3'配列方向に向き、他の機能性核酸配列がオリゴヌクレオチド内で3'-5'方向に向き、これらの核酸配列が、オリゴヌクレオチドの両末端が5'末端であるように配置されている、請求項２７〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記のスペーサー配列の２つの相補性部位が、互いに離れている、請求項２８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
第三機能性核酸配列が、前記２つの相補性部位の間に含まれる、請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
第三機能性核酸が、第一機能性核酸と第二機能性核酸との間に提供され、そして前記スペーサー配列が二重鎖であるときに、スペーサー配列が、開裂可能部位を含む十分な部位を含み、全ての機能性配列をそこに放出させるために十分な時間オリゴヌクレオチドを開裂させる、請求項２７〜３２のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記第三機能性核酸配列が、プローブ配列である、請求項３５又は３６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
１以上の機能性核酸配列が標識を有する、請求項２７〜３７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
前記標識された機能性核酸配列が、プローブ又はプライマーである、請求項３８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
前記標識された機能性核酸配列が、プローブである、請求項３９記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項２７記載の第一オリゴヌクレオチドと、第一オリゴヌクレオチドよりも短く、かつ第一オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖開裂可能部位をつくることができる、第二オリゴヌクレオチドとの組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学試薬、特にオリゴヌクレオチド及びその使用、特に、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、非-特異的プライマー-テンプレートにより生じる偽アーチファクト（spurious artefacts）及びプライマー-プライマー相互作用が問題となる、ことがよく知られている。後者は、検出限界を著しく低下させることがあり、かかる産物は反応終了に向かって迅速に使い果たされる反応成分と競合する。第一変性ステップの前のフォワードプライマーとリバースプライマーとの相互作用は、これだけには限らないが、問題の主要な要因である。
【０００３】
この問題を解決するために様々な方法が採られており、これらは、「ホットスタート」手段として知られている。一般的に、これらは、所望の反応点、特に反応容器中で特定の温度に到達するまでにポリメラーゼ酵素の活性を制御することに焦点を合わせている。
【０００４】
例えば、酵素活性は、物理的分離（ワックス）、例えば抗-Taq抗体のようなポリメラーゼに結合する抗体のために使用する金属イオン封鎖、又は化学修飾（TaqGold用アチトネート（acitonate））により、より低温で阻害することができる。好適なピロホスファターゼ酵素を用いて除去可能である、ピロリン酸塩の阻害量の添加による酵素阻害が報告されている（WO02/088387）。
【０００５】
別の方法は、ホットスタートポリメラーゼ酵素を含み、それらの最も有効なものは、かなりの時間、熱活性化を必要とする。しかしながら、活性化に必要とされる時間よりも短い時間内に全PCRプロセスを実行することができる高速機械ほど好ましくない。
【０００６】
オリゴヌクレオチドプライマーの自動合成は、現在ではルーチンである。フォワード及びリバースプライマーは、別個の操作で合成される。それらは、一般的に、反応中同一の濃度であることが必要とされる。一般的には、規定どおりにオリゴヌクレオチド収量を決定するための迅速で、正確かつ明確な方法は存在しないため、各プライマーについての正確な反応化学量論を得ることは、バッチ間の実験的決定を必要とする。
【発明の開示】
【０００７】
本出願人は、これらの問題に対する新規な方法を開発した。
【０００８】
本発明によれば、第一及び第二機能性核酸配列を反応混合物に加える方法であって、以下：反応混合物に上記のオリゴヌクレオチドを加え；上記のオリゴヌクレオチドのスペーサー部位内の開裂可能な二重鎖部位を形成し；及び上記オリゴヌクレオチド内の二重鎖部位を開裂すること、を含む、前記方法を提供する。
【０００９】
この種のオリゴヌクレオチドを用いて、本方法は、所定の化学量論及び/又は所定の時点で、第一及び第二機能性核酸配列を反応混合物に加えることができる。化学量論は、第一機能性核酸の単一コピー及び第二機能性核酸の単一コピーを含むオリゴヌクレオチドにおいて、第一機能性核酸対第二機能性核酸の量比が１：１になるように、オリゴヌクレオチドに含まれる配列の割合により決定される。
【００１０】
更に、個々の機能性核酸を利用できる時点は、開裂反応が起こる時点に制御することができる。このことは、例えば、機能性核酸配列の放出が必要とされる特定の時点での開裂剤、例えば制限酵素を添加又は活性化することにより制御することができる。オリゴヌクレオチド、特に、本明細書に記載の方法を実行するために好適なものは、本発明の更なる局面を形成する。
【００１１】
本発明の更なる局面によれば、スペーサー配列により分断された第一及び第二機能性核酸配列を含むオリゴヌクレオチドであって、当該スペーサー配列が二重鎖であるときに、当該スペーサー配列が開裂可能部位を含む部位を含む、前記オリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、好適には、本明細書に記載の方法に好適であるように設計される。
【００１２】
二重鎖部位は、様々な方法、例えば、スペーサー配列の前記部位とハイブリダイズすることができる小DNA又はRNAオリゴヌクレオチドの添加により形成することができる。従って、このように形成された二重鎖部位は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ又はRNアーゼHもしくはRNアーゼH活性を有する酵素、例えば、二重鎖部位を開裂又は消化する逆転写酵素（RT）酵素を用いて、開裂可能である。上記の第一オリゴヌクレオチドと、当該第一オリゴヌクレオチドより短くかつ当該第一オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして二重鎖開裂可能部位をつくることができる第二オリゴヌクレオチドとの組み合わせは、本発明の更なる局面を形成する。
【００１３】
しかしながら、好ましくは、オリゴヌクレオチドのスペーサー配列は、互いにハイブリダイズして二重鎖開裂な部位を形成することができる、２つの相補的部位を含む。
【００１４】
「機能性核酸配列」は、核酸配列が独立した機能を有することを意味する。例えば、生物活性を有し、又はより一般的には、例えば増幅プライマーもしくはプローブとして働くことにより、アッセイ又は反応において有用であり得る。かかるオリゴヌクレオチドは、本来、多機能性であり、そして、アッセイ等の使用のための化学量論的量で別個の機能性配列を提供するために使用することができる点で、有用である。
【００１５】
プライマー混合物の化学量論に関する問題は、効率的に解決されるので、かかるオリゴヌクレオチドは、増幅反応、例えばPCR反応の文脈では特に有用である。
【００１６】
従って、好ましい実施態様では、第一及び第二核酸配列は、第一及び第二プライマー配列を含む。しかしながら、他の配列を提供することができる。例えば、第一及び第二配列の一方又は両方は、場合により、アッセイで使用され、及びインサイチュで生成し得る標識されたプローブ配列を含むことがある。
【００１７】
任意のプライマーの5'末端は、例えあるにしてもほとんどプライミング事象に特異性を与えない。事実、非-特異的配列の長テイルは、一般的に、クローニング及び一般的プローブ法において利用される。よって、オリゴヌクレオチドが所望の第一及び第二プライマー配列の5'末端で正確に開裂されることは必須でない。スペーサー部位の中には、形成された第一及び第二プライマーの5'末端に融合することができるものがあるという事実は、増幅反応におけるプライマーの有用性に影響を与えないだろう。
【００１８】
加えて、オリゴヌクレオチドは、特定の条件下、例えば高温で開裂するように設計することができる。これは「ホットスタート」PCRの形態を実行するために使用することができる可能性を与える。必要であれば、オリゴヌクレオチドの十分な量が開裂される、例えばオリゴヌクレオチドの開裂がほとんど終了することを確実にするために十分な時間、予備的な高温インキュベーションステップが実行される。事実上、増幅反応において使用されるプライマーは、反応が開始するまで覆われている（clocked）。
【００１９】
多くのミス-プライミング事象は、試料及び反応混合物が最初に加熱されるときに起こる。高緊縮性は、高温でのみ達成される。そのため、初期の溶融期に温度が典型的に0℃〜95℃に増加する初期加熱期では、存在しているプライマーは、互いに又はテンプレートに非-特異的にアニールする可能性がある。
【００２０】
しかしながら、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、プライマーの一方又は両方が、このようなアニーリング温度まで遊離状態で存在せず、そのためミス-プライミングの可能性は実質的に減少する、ことを確実にするだろう。
【００２１】
理想的には、遊離のプライマー配列の形成を導く開裂反応は、核酸の変性温度で又はその温度の近くで起こる。このことは、第二プライマーが、特に、（以下でより詳細に議論する）3'-5'方向のオリゴヌクレオチドに存在する場合に、テンプレートと著しく相互作用し、プライマー伸張を受けることができるよりも高い温度ではじめて形成することができる、ことを意味する。
【００２２】
特定の実施態様では、二重鎖開裂可能部位は酵素を用いて開裂することができる。
【００２３】
制限酵素、例えばヘパリン構造から形成されたDNAを含むdsDNAを効果的に切断することができる制限エンドヌクレアーゼは、よく知られている。切断頻度は変動し、切断頻度の中には珍しい標的配列、例えば、約７〜８塩基対長を有する配列を有し、長いテンプレートDNAが研究される場合には特に当該配列を有用にさせる。しかしながら、反応を危うくしないように、開裂される配列が、増幅において使用されるべきテンプレートの標的部位のネイティブ配列ではないことを確実にする必要がある。
【００２４】
高温開裂を促進することができる、熱活性で好ましくは熱安定性制限酵素も、利用することができる。
【００２５】
かかる酵素の具体的な例は、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のBsm 1、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ET由来のBstEII、珍しい配列を認識するノカルジア・オチジスカビアラム（Nocardia otidiscaviarum）由来のNot 1、及び熱安定性であるサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のTaq 1を含む。しかしながら、特定の所望の性質を有する酵素は、つくり出すことができ又は好適な起源から単離することができる。例えば、高温又は高められた温度、例えば、増幅反応例えばPCR、の変性段階中に遭遇する温度でのみ実質的に活性である制限酵素は、好熱性生物、例えば好熱性アーキア、特に超好熱性アーキアから単離することができる。好適な制限酵素の起源である好熱性生物の（及び、例えば、増幅反応例えばPCRにおいて利用することができる他の例）例は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス属NH、サーマス・ブロッキアヌス（Thermus brockianus）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、スルホルブス・アシジカルダリウス（Sulfolbus acidicaldarius）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、又はアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）を含む。
【００２６】
しかしながら、特に、制限酵素が、高温で耐える又は活性であることが期待されない方法で使用される場合には、多くの他の制限酵素を使用することができる。例えば、多くの場合には、反応の開始直前に反応混合物に制限酵素を加え、オリゴヌクレオチドを開裂して機能性核酸配列を放出させることが好適であろう。この場合には、機能性核酸配列がその後に放出されるので、加熱の結果としての制限酵素の失活は、処理の成功に影響を与えないだろう。
【００２７】
かかる酵素を使用するためには、酵素により認識された配列をつくり出し、オリゴヌクレオチドのスペーサー部位に挿入することが唯一必要である。これらの特定の配列及びこれらを開裂する酵素の例は、以下の表に記載されている。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
他の酵素は、核酸ハイブリッドを切断するかもしれない。例えば、RNアーゼHは、RNA-DNAデュプレックスのRNA部分を開裂するだろう。従って、かかる酵素は、DNA-RNAコポリマーを含み、そして、スペーサー配列が、加えられた小オリゴヌクレオチド又はスペーサー配列内に見出される相補性部位のいずれかを有するRNA/DNAデュプレックスを形成する、上記のオリゴヌクレオチドを開裂するために使用することができる。
【００３０】
追加的に、自己-開裂核酸配列、例えばリボザイム、及び自己-開裂のように見える不安定DNAヌクレオチド構造についての報告がある（K. K. Singh et al., Ribozymes and siRNA protocols, Second Edition, March 2004, pps. 033-048, ISBN: 1-59259-746-7, Series: Methods in Molecular Biology, Volume #: 252, and Carmi N, et al.: Chem Biol. 1996 Dec; 3 (12): 1039-46）。これらは、特に、ヘパリン構造を形成することができる相補性部位を含むオリゴヌクレオチドにおいて使用してもよい。
【００３１】
オリゴヌクレオチドの合成は、通常、3'から5'に行われる。しかしながら、第一塩基が3'塩基であることを条件に、特定のホスホロアミデートモノマーを用いる5'から3'への合成を行うこともできる。合成の間に方向を切り替えることもできる。かかる化学をもって、オリゴヌクレオチドの両末端が効果的に5'末端であるように連続合成を行うことができる。単一3'塩基、次いで例えば、20〜30塩基の5'-3'塩基伸張は、プライマー配列として働く配列能力を邪魔しないだろう。
【００３２】
従って、特定の実施態様では、単一オリゴヌクレオチド内で、配列の１つは5'-3'配列の方向に向き、他の配列は3'-5'の方向に向く。これらは、オリゴヌクレオチドの両末端が5'末端であるように配置される。このことは、これらの配列が第一及び第二プライマー配列である場合に、開裂前に「遊離」の3'末端が存在しないので、プライマー配列が時期尚早のプライミング事象を生じない、ことを確実にする利点を有する。
【００３３】
更なる具体的な実施態様では、オリゴヌクレオチド内にスペーサー配列の２つの相補性部位が存在し、これらは互いに離れている。このことは、構造により柔軟性を与え、その結果、相補性部位が、通常の方法で容易に互いにハイブリダイズして、「ヘパリン」型構造を形成することを確実にする。
【００３４】
更に、２つの相補性部位の間のスペースは、第三又は別の機能性核酸配列を含むことができる。これは、特定のアッセイにおいて有用なことがある。
【００３５】
しかしながら、相補的部位を含まないオリゴヌクレオチド中に別の機能性配列を含むこともできる。この場合、スペーサー部位は、全ての機能性配列をそこに放出するために十分な時間、オリゴヌクレオチドを開裂させる相補的部位を形成することができる十分な部位を含むことを条件とする。
【００３６】
同様に、更なる配列を別個に使用することを意図している場合に、それらはオリゴヌクレオチド内の他の部位に相補的である部位により分かれており、任意の形成されたハイブリッドが上記のように開裂することができることを条件に、必要ならば、更なる配列を、２つの相補的部位の間のスペース内に「有する（carried）」ことができる。
【００３７】
かかる追加の機能性配列の具体例は、例えばプローブ配列を含む。これらは、オリゴヌクレオチドの開裂が一対のプライマー及びプローブを生じることになるので、第一及び第二配列が第一及び第二プライマー配列であるときに特に有用であり得る。当該一対のプライマー及びプローブは、多くの増幅アッセイ、特に増幅をリアルタイムで監視することができるアッセイ、例えば周知の「TaqMan（商標）」法、及び例えばWO 99/28500に記載の方法、の基本的成分である。
【００３８】
しかしながら、試薬のこのような組み合わせは、第一及び第二配列が第一プライマー及びプローブを含む場合に、そして前記第三配列が第二プライマーである場合に形成されてもよい。
【００３９】
第一及び第二配列から第三配列（及び任意の更なる配列）を放出するためには、開裂可能部位及び/又は開裂を達成するために使用される手段が、デュプレックスの両鎖を切断するために好適であることを確実にする必要がある。従って、例えば、RNアーゼHが開裂手段として使用される場合には、オリゴヌクレオチドは、好適な数の別個のRNA部位を含むRNA/DNAコポリマーであることを確実して、完全な開裂が行われることを確実にする必要があるだろう。例えば、オリゴヌクレオチドの相補的部位の間のスペースにのみ、第三配列が存在する場合には、オリゴヌクレオチド内に２つのRNA部位が存在し、その内の１つは、オリゴヌクレオチドから第一配列を放出するように配置し、１つは、第二配列を放出するように配置することを確実にする必要があるだろう。
【００４０】
代替的に、機能性配列間のスペーサーは、特に相補的部位間に存在する場合には、好適な時間で第一及び第二配列を開裂するために有効であろう、リボザイムのような「自己-開裂」機能性を含むことがある。
【００４１】
第一、第二又は第三機能性核酸配列の内の任意は、必要ならば１以上の標識を有することがある。特に、それらがプライマー又はプローブ配列である場合には、それらは、検出可能に標識することができ、好ましくは、同種の方法、特に「リアルタイム」で増幅産物を検出する可能性を生じるような方法で標識することができる。特に、オリゴヌクレオチド内の任意のプローブ配列を検出可能に標識することが有利であろう。
【００４２】
かかる標識は、可視的標識、特に蛍光標識を含む。特に１以上の蛍光標識は、アッセイ中に、光エネルギー移動法（FET）、特に蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）を受けるように配置することができ、よってこれらの標識は、上記のオリゴヌクレオチド内に含まれ得る。
【００４３】
２つの一般的に使用されるFET又はFRET型プローブがあり、これらは、核酸プローブの加水分解を用いてアクセプターからドナーを分離し、ハイブリダイゼーションを用いてドナー分子とアクセプター分子との空間的関係を変更する。
【００４４】
加水分解プローブは、TaqMan（商標）プローブとして商業的に利用することができる。これらは、ドナー分子及びアクセプター分子で標識されたDNAオリゴヌクレオチドからなる。プローブは、PCR産物の１つの鎖上の特異的部位に結合するように設計される。この鎖へのPCRプライマーのアニーリングに続いて、Taq酵素は、5'から3'ヘのポリメラーゼ活性を有するDNAを伸張する。Taq酵素はまた、5'から3'ヘのエキソヌクレアーゼ活性を示す。TaqMan（商標）プローブは、リン酸化により3'末端を保護して、Taq伸張をプライミングしないようにしている。TaqMan（商標）プローブが産物の鎖にハイブリダイズする場合には、伸張するTaq分子は、プローブを加水分解してもよく、検出の基準としてアクセプターからドナーを遊離する。この例でのシグナルは、累積的であり、遊離のドナー及びアクセプター分子の濃度は、増幅反応の各サイクルに従って増加する。
【００４５】
ハイブリダイゼーションプローブは、多数の形態で入手できる。分子ビーコンは、オリゴヌクレオチドがヘパリンループを形成するような相補的5'及び3'配列を有するオリゴヌクレオチドである。ヘパリン構造が形成されるときに、末端蛍光標識は、FRETを生じるくらいに近接している。分子ビーコンの相補配列へのハイブリダイゼーションに続いて、蛍光標識はFRETを起こさないように分離され、これは検出の基準を形成する。しかしながら、例えばプローブが本発明のオリゴヌクレオチドに取り込まれる場合には、プローブの開裂可能部位を開裂するために使用される手段は、プローブ内に存在する二重構造を開裂しない、ことを確実にするために留意しなければならない。このことは、例えば、プローブのこの部位に影響を与えなかった酵素を選択することにより、可能になるだろう。例えば、それが酵素により認識される配列を含まなかったため、又はそれはRNアーゼHであったが、プローブ配列はDNAのみの構造を含んだためである。
【００４６】
標識されたオリゴヌクレオチドの対もアッセイで使用することができる。これらは、PCR産物-を有するドナー及びアクセプター分子上で近接してハイブリダイズし、FRETを起こすことができる。増加したFRETは、検出の基準である。この種の変異形は、単一の隣接プローブによって標識された増幅プライマーを用いることを含む。プローブ又はプライマー及び隣接プローブのこれらの対は、例えば、上記のオリゴヌクレオチド内に第一、第二、第三又は追加の配列を含むことがある。
【００４７】
増幅反応が起こっているときにその増幅反応を検出する他の方法が知られているが、これらのいずれでも使用することができる。かかる方法の具体的な例は、例えば、WO 99/28500、イギリス特許第2,338,301号、WO 99/28501及びWO 99/42611に記載されている。
【００４８】
WO 99/28500は、試料中の標的核酸配列の存在を検出するための極めて成功的アッセイを記載する。この方法では、DNA二重結合剤及び標的配列に特異的なプローブを試料に加える。プローブは、DNA二重結合剤から蛍光を吸収することができる、又は当該結合剤に蛍光エネルギーを提供することができる、反応性分子を含む。この混合物は、次いで、標的核酸が増幅される増幅反応に供され、プローブが標的配列にハイブリダイズする増幅プロセス中又は後のいずれかに、条件が発生する。試料からの蛍光を監視する。
【００４９】
プローブ上の蛍光標識から蛍光エネルギーを吸収することができるDNA二重結合剤を利用することができるが可視光を放出しない、このアッセイの代替的な形態は、同時係属のイギリス特許出願第2235638に記載されている。
【００５０】
これらのアッセイで使用されるこれらのプライマー及びプローブはいずれも、アッセイにおいて正確な化学量論的量でこれらの要素がインサイチュで効果的に生じることができるようにするために、本発明のオリゴヌクレオチドに取り込むことができる。
【００５１】
１以上の機能性核酸配列が１対１以外の化学量論で加える必要がある場合には、オリゴヌクレオチドにおいて提供される核酸配列のコピー数は、それ相当に調整することができ、機能性核酸配列の各々は、上記の開裂可能なスペーサー部位により分断される。
【００５２】
また上述したように、スペーサー部位又は各々のスペーサー部位内で開裂可能な二重鎖部位を形成するステップを行うことができる。例えば、短い相補配列を加え、そしてこのように形成された混合物を、相補配列がスペーサー部位にアニールする条件に供することにより、達成することができる。代替的に、スペーサー部位が相補性部位を含む場合には、オリゴヌクレオチドが「ヘパリン」構造を達成するように相補配列が互いにアニールすることを確実にするように、反応混合物の温度を好適なレベルに調整又は維持さえすればよい。先に述べたように、このことは、特に、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、の文脈では特に有用である。
【００５３】
従って、具体的な実施態様では、本発明は、増幅反応を実行するための方法を提供する。この反応は、以下：
（i）上記のように、標的核酸配列及びオリゴヌクレオチドを含む又は含むと予想される試料を含む増幅反応混合物を形成し、ここで第一及び第二核酸配列の各々はプライマー又はプローブ配列であり；
(ii) 開裂可能な二重鎖部位が当該オリゴヌクレオチドのスペーサー内に形成される条件に混合物を供し；
(iii) 当該部位を開裂し；並びに
(iv) 得られた混合物を増幅すること、
を含む。
【００５４】
本明細書で用いる「増幅反応混合物」は、増幅反応を行うために必要な成分のうちの少なくともいくつかを有する混合物を含む。これらは、当該分野でよく理解されるような試薬、例えばポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩等を含むことができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドが、増幅又は産物の検出に用いられる例えばプライマーを含む場合には、これらはステップ（ii）においてインサイチュで生じるので、初期増幅反応混合物に加える必要はないだろう。
【００５５】
上で議論したように、標識オリゴヌクレオチドは、単一オリゴヌクレオチドに含まれて、１以上のプローブ分子及びプライマーを提供することができる。代替的に、当該分野で理解されているように、これらは、実行するアッセイの性質、及びリアルタイムで監視するか否か等の因子に依って、最初に又は終了時のいずれかにおいて反応混合物に加えることができる。
【００５６】
ステップ（ii）は、オリゴヌクレオチドの配列及び性質に依り様々な方法で行われる。例えば、オリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズしてヘパリン構造を形成する相補性部位を含む場合には、ステップ（ii）は、これらの部位間のハイブリダイゼーションが起こり得る条件に混合物を供することのみにより行うことができる。
【００５７】
しかしながら、代替的には、反応混合物に短いオリゴヌクレオチドを加え、そしてこれが当該部位とアニールする条件に混合物を供することにより、達成することができる。
【００５８】
ステップ（iii）を行う方法も、上記の開裂方法のいずれも好適である場合には、使用されるオリゴヌクレオチドの性質にかなりの程度で依拠するだろう。しかしながら、一般的には、ステップ（iii）は、当該２つの相補性部位により形成される二重鎖核酸を開裂することができる酵素を反応混合物に加え、そしてオリゴヌクレオチドの開裂、好ましくは実質的な終了を進行させるために十分な時間及び十分な温度で、混合物をインキュベートすることにより達成されるだろう。好ましくは、酵素は、高い温度、例えば50℃を超える温度のみで実質的に活性である酵素である。これは、上記の増幅中に可能なアーチファクトを減少させるだろう。特に、これらの酵素は、50℃未満の温度で、その潜在的活性の50%未満、好適には活性の20%未満、最も好ましくは10%未満を示すだろう。
【００５９】
例えば、オリゴヌクレオチドを開裂するために使用される酵素が制限酵素、例えばTaq 1である場合、70℃のインキュベーション温度を使用することができる。
【００６０】
このことは、初期高温インキュベーションで行うことができる。これは、増幅反応の最初の変性サイクルとして効果的に使用することができ、ステップ（iv）で行うことができる。
【００６１】
次いで、増幅は通常の方法で行われる。第一及び第二核酸配列が、各々、標識されていない第一及び第二プライマー配列であり、プローブが全く反応混合物に加えられていない場合には、増幅産物は、慣用的方法、例えばゲル電気泳動、次いで色素による視覚化を用いて検出することができる。
【００６２】
しかしながら、１以上の標識されたプローブが反応中に含まれる場合には、TAQMAN（商標）法のような他の検出法及び上記の他の方法が、終了中又は終了後のいずれかの増幅を検出するために使用することができる。
【００６３】
この増幅を行う方法は、他の「ホットスタート」法により有用に捕捉することができる。特に例えば、本明細書に参考文献として全体が援用されているWO02/088387の方法は、本明細書に記載の方法と組み合わせて適用することができる。その場合には、増幅反応混合物に存在するポリメラーゼ酵素の活性は、無機ピロリン酸塩、例えばピロリン酸四ナトリウム（Na2P2O7）の阻害量の意図的な添加により阻害される。
【００６４】
ピロホスファターゼ酵素、特にWO02/088387に記載の高温でのみ実質的に活性であるもの、例えば、スルホルブス・アシジカルダリウス（Sulfolbus acidicaldarius）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）、又は特にアエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）から入手可能な熱安定性PPアーゼ（PPase）の更なる添加は、阻害するピロホスファターゼの消化を引き起こすだろうが、これは、増幅反応混合物が準備でき、高温で好適である場合にのみ消化を引き起こすだろう。当該方法は、ポリメラーゼ活性を阻害することにより働く。しかしながら、プライマー又はプローブアーチファクト、例えばプライマー-ダイマーの形成は、増幅反応を邪魔することがあり、増幅の前に反応混合物中でなお形成され得る。
【００６５】
この技術は、そのため、本明細書に記載の方法と有効に組み合わせることができる。プラマー及びプローブを単一オリゴヌクレオチドと組み合わせることにより、これらの間の非-特異的結合の可能性は減少する。具体的な実施態様では、個々のプライマー及びプローブは、スペーサー部位の開裂においてのみ放出され、上述のように、例えば、必要な時点で制限エンドヌクレアーゼを加えることにより、又はある高い温度に近づいたときにのみ実質的に活性である制限エンドヌクレアーゼを利用することにより、増幅反応が開始寸前であるときのみにこれらが利用できるように、このことは制御することができる。
【００６６】
特に、増幅反応混合物は、増幅プライマー及び/又はプローブ配列を含む本明細書に記載の単一オリゴヌクレオチドを用いて形成することができる。加えて、ピロリン酸塩及びピロホスファターゼ酵素は、所望の温度になるまで増幅反応を阻害するように、WO02/088387に記載のようにして加えられる。これらの２つの方法を組み合わせることにより、ミス-プライミング事象及び所望のポリメラーゼ活性により起こるアーチファクトはいずれも減少し、よって、増幅反応効果的に進行することができる。
【００６７】
本発明を、以下の添付図を参照して例示しながら具体的に記載する。
【００６８】
図１（ａ）の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、その5’末端にリバースプライマー配列（濃いグレー）を含み、そして、3’末端にフォワードプライマー配列（黒）を含む。これらは、開裂成分として働くことができるスペーサー部位（薄いグレー）として一緒に結合する（図１（ａ）（Ａ））。これは、その相補鎖にハイブリダイズするときに、制限エンドヌクレアーゼにより認識される配列を形成することにより、開裂成分を形成することができる。そのような場合には、相補鎖を含む短いオリゴヌクレオチドの添加は、開裂成分を完成するだろう。しかしながら、好ましくは、スペーサー部位は、オリゴヌクレオチドに、二次的構造を選択させることができる２つの相補的部位を含む。そこでは、これらの部位は、「ヘパリン」構造が形成されるように、一緒にハイブリダイズする（図１（ａ）（Ｂ））。
【００６９】
相補性部位により形成されるデュプレックスは、例えば特定の制限エンドヌクレアーゼにより認識される。開列部位又は構造を提供する（図１（ａ）（Ｃ）の斜線部分）。そのため、この制限エンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドのインキュベーションは、オリゴヌクレオチドの開裂を生じて、ファワードプライマー及びリバースプライマー、並びにスペーサー部位から残りのフラグメントを形成する。ある量のスペーサー部位は、この場合には、フォワードプライマーの5’末端に結合したままであるが、これは、PCR等の増幅反応におけるプライマーとして働くプライマーの能力に影響を与えないだろう。
【００７０】
図１（ｂ）の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、その5’末端にリバースプライマー配列（濃いグレー）を含み、3’末端にフォワードプライマー配列（黒）を含む。しかしながら、この例では、フォワードプライマー配列は逆方向にあり、オリゴヌクレオチドの両末端が5’末端であることを意味する。２つのプライマー配列は、再度、開裂成分として働くことができるスペーサー部位（薄いグレー）として一緒に結合することができるが（図１（ｂ）（Ａ））、この場合には、２つの末端に3’結合させるリンカーを更に含む。黒のドットで示すスペーサー部位は、標識を更に含む。
【００７１】
既に述べたように、スペーサー部位が２つの相補性部位を含むとき、オリゴヌクレオチドは、「ヘパリン」構造が形成されるように、これらの部位が一緒にハイブリダイズする二次構造を選択する傾向がある（図１（ｂ）（Ｂ））。再度、相補性部位により形成されるデュプレックスは、例えば、特定の制限エンドヌクレアーゼにより認識される、開裂部位又は構造を提供する（図１（ｂ）（ｃ））の斜線部分）。そのため、この制限エンドヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドのインキュベーションは、オリゴヌクレオチドの開裂を生じて、フォワード及びリバースプライマー、並びにスペーサー部位からの残りの標識フラグメントを形成する（図１（ｂ）（ｂ））。この場合には、標識フラグメントが標的テンプレートDNAにハイブリダイズする部位を含むので、標識フラグメントは、次のアッセイにおいてプローブとして働くことができる。
【００７２】
図２は、PCR反応において図１（ａ）で得られた産物の使用を示す。フォワード及びリバースプライマーは、テンプレートDNAの相補鎖にアニーリングすることにより、通常の方式で働き、典型的な第一ラウンド産物を形成するように伸張される。
【００７３】
しかしながら、オリゴヌクレオチドの開裂が完全でない事象では、オリゴヌクレオチド自体は、フォワードプライマーとして働くことができる。この場合には、第一ラウンド産物は、5'-末端にオリゴヌクレオチド全体を有するテンプレート配列を含むだろう。次のサイクルにおいて、この伸張産物の相補鎖がつくられ、反対の方向を有する２つの潜在的開裂部位を生じる。制限エンドヌクレアーゼの作用は、必要ならば、このアーチファクトを切断し、アーチファクトを正確な産物に変換する効果を有するだろう。
【００７４】
最後に、図３は、産生され得る様々な開裂構造を図解的に示す。オリゴヌクレオチドがDNA分子である場合には（図３Ａ）、例えば、当該分野で理解される1型、2型又は3型で制限酵素を用いて開裂することができる慣用的なヘアピン構造を形成することができる。オリゴヌクレオチドに含まれる配列が、使用される特定の酵素により認識され、標的テンプレートDNA中に存在しないことを、確実にさえすればよい。
【００７５】
このことが難しい場合には、オリゴヌクレオチドはRNAが開裂成分の要素を形成するDNA/RNAコポリマーを含むことができる（図３Ｂ）。RNアーゼによる開裂の際には、RNA部分は、DNAとミスペアして一対のプライマーを生じるため、完全に消化するだろう。
【００７６】
最後に、図３Ｃは、自己―開裂オリゴヌクレオチドを示す。そこでは、スペーサー部位が、オリゴヌクレオチドの相補性部位により形成されるデュプレックスを開裂することができるリボザイムを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１ａ】図１（ａ）は、5'-3'二重プライマーを含む、本発明の実施態様のオリゴヌクレオチドの構造及び開裂を示す。
【図１ｂ】図１（ｂ）は、「連続」プライマー（5'-3'...3'-5'構造）を含む、本発明の代替的オリゴヌクレオチドの構造及び開裂を示す。
【図２】図２は、本発明の実施態様を形成するオリゴヌクレオチドを用いて得られる、可能な特異的プライマー伸張産物を示す。
【図３】図３は、本発明のいくつかの実施態様のオリゴヌクレオチドにおいて利用することができる様々な開裂メカニズムを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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