(57)【要約】  本発明は、プラスミド及びペプチド又はその類似体を含む免疫原性組成物をそれを必要とする被療者に提供することにより、癌のような細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。本発明の実施形態では、癌腫抗原のＭＨＣクラスＩ拘束エピトープに対する免疫応答を誘導、同調及び／又は増幅して、有効な抗癌免疫応答を生じさせるための方法及び組成物が提供される。
2008543869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の核酸組成物及び１つ又は複数のペプチド組成物を含む複数の組成物を含む免疫原性生成物であって、前記１つ又は複数の核酸組成物が、ＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される、１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができ；前記１つ又は複数のペプチド組成物が、ＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される前記１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体から本質的になり；そして前記１つ又は複数のペプチドが選択された前記核酸により発現される前記エピトープに対応する免疫原性生成物。
【請求項２】
前記１つ又は複数の核酸組成物がｐＳＥＭ、ｐＢＰＬ及びｐＲＰ１２からなる群から選択されるプラスミドを含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項３】
前記１つ又は複数のペプチド組成物が、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）、その類似体ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）；ＮＹ−ＥＳＯ−１157-I65（配列番号２）、その類似体ＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号６）；ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、その類似体Ｓ（Ｎｖａ）ＬＱＨＬＩＧ（Ｎｌｅ）（配列番号７）；ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、その類似体ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号８）；メランＡ26-35（配列番号９）、その類似体ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１１）；チロシナーゼ369-377（配列番号１０）、及びその類似体ＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号１２）からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項４】
前記複数の組成物が以下の：
ａ）ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｂ）ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｃ）ＰＲＡＭＥクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｄ）ＰＳＭＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｅ）本質的に前記ＳＳＸ−２エピトープ又はその類似体からなるペプチド；
ｆ）本質的に前記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ又はその類似体からなるペプチド；
ｇ）本質的に前記ＰＲＡＭＥエピトープ又はその類似体からなるペプチド；及び
ｈ）本質的に前記ＰＳＭＡエピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項５】
前記ａ）及びｂ）の核酸分子が同一組成物の一部である、請求項４に記載の生成物。
【請求項６】
前記核酸分子が同一物である、請求項５に記載の生成物。
【請求項７】
前記核酸分子がｐＢＰＬの遊離配列をコードする配列（配列番号１３）を含む、請求項６に記載の生成物。
【請求項８】
前記核酸がｐＢＰＬの免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１６）を含む、請求項７に記載の生成物。
【請求項９】
前記核酸分子がｐＢＰＬ（配列番号２０）である、請求項８に記載の生成物。
【請求項１０】
前記ｃ）及びｄ）の核酸分子が同一組成物の一部である、請求項４に記載の生成物。
【請求項１１】
前記核酸分子が同一である、請求項１０に記載の生成物。
【請求項１２】
前記核酸分子がｐＲＰ１２の遊離配列をコードする配列（配列番号１４）を含む、請求項１０に記載の生成物。
【請求項１３】
前記核酸がｐＲＰ１２の免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１７）を含む、請求項１２に記載の生成物。
【請求項１４】
前記核酸分子がｐＲＰ１２（配列番号２１）である、請求項１２に記載の生成物。
【請求項１５】
前記ＳＳＸ−２エピトープがＳＳＸ−２41-49（配列番号１）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項１６】
前記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープがＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項１７】
前記ＰＲＡＭＥエピトープがＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項１８】
前記ＰＳＭＡエピトープがＰＳＭＡ288-297（配列番号４）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項１９】
前記ｅ)におけるＳＳＸ−２類似体がＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項２０】
前記ｆ)におけるＮＹ−ＥＳＯ−１類似体がＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号６）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項２１】
前記ｇ)におけるＰＲＡＭＥ類似体がＳ（Ｎｖａ）ＬＱＨＬＩＧ（Ｎｌｅ）（配列番号７）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項２２】
前記ｈ)におけるＰＳＭＡ類似体がＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号８）である、請求項１に記載の生成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の生成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項２４】
前記癌が乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、脳腫瘍、リンパ癌、皮膚癌、骨肉腫、腎臓癌、直腸癌、黒色腫、膠芽細胞腫又は肉腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
複数の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌腫の治療方法であって、該複数の組成物が：
ｉ）ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現する
ことができる核酸分子；及び
ｉｉｉ）ＰＲＡＭＥクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｖｉ）ＰＳＭＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子
を含む、癌腫の治療方法。
【請求項２６】
本質的にＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡからなるエピトープ又は類似体の群から選択される１つ又は複数のペプチドを投与する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の組成物が以下の：
ｉ）メラン−ＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉ）チロシナーゼクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉｉ）本質的に前記メラン−Ａエピトープ又はその類似体からなるペプチド；及び
ｖｉ）本質的に前記チロシナーゼエピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項２８】
前記ｉ）及びｉｉ）の核酸分子が同一組成物の一部である、請求項２７に記載の生成物。
【請求項２９】
前記核酸分子が同一である、請求項２８に記載の生成物。
【請求項３０】
前記核酸分子がｐＳＥＭの遊離配列をコードする配列（配列番号１５）を含む、請求項２９に記載の生成物。
【請求項３１】
前記核酸がｐＳＥＭの免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１８）を含む、請求項３０に記載の生成物。
【請求項３２】
前記核酸分子がｐＳＥＭである、請求項３１に記載の生成物。
【請求項３３】
前記メラン−Ａエピトープがメラン−Ａ26-35（配列番号９）である、請求項２７に記載の生成物。
【請求項３４】
前記チロシナーゼエピトープがチロシナーゼ369-377（配列番号１０）である、請求項２７に記載の生成物。
【請求項３５】
ｉ）ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；及び
ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
をさらに含む、請求項２７に記載の生成物。
【請求項３６】
本質的にＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープからなるペプチドをさらに含む、請求項３５に記載の生成物。
【請求項３７】
本質的にＳＳＸ−２エピトープからなるペプチドをさらに含む、請求項３５又は３６に記載の免疫原性生成物。
【請求項３８】
複数の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌の治療方法であって、該複数の組成物が：
ｉ）メラン−ＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉ）チロシナーゼクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉｉ）本質的に前記メラン−Ａエピトープ又はその類似体からなるペプチド；及び
ｉｖ）本質的に前記チロシナーゼエピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む方法。
【請求項３９】
前記癌が膠芽細胞腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が黒色腫である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ｉ）ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉ）ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｉｉｉ）本質的に前記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ又はその類似体からなるペプチド；及び
ｖｉ）本質的に前記ＳＳＸ−２エピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む組成物をそれを必要とする患者に投与する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記複数の組成物が以下の：
ａ）ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｂ）ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｃ）本質的に前記ＳＳＸ−２エピトープ又はその類似体からなるペプチド；
ｄ）本質的に前記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項４３】
前記複数の組成物が以下の：
ａ）ＰＲＡＭＥクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｂ）ＰＳＭＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；
ｃ）本質的に前記ＰＲＡＭＥエピトープ又はその類似体からなるペプチド；及び
ｄ）本質的に前記ＰＳＭＡエピトープ又はその類似体からなるペプチド
を含む、請求項１に記載の免疫原性生成物。
【請求項４４】
被療者のリンパ系への投与に適した医薬の製造における、請求項１に記載の免疫原性生成物の使用。
【請求項４５】
被療者における抗癌免疫応答を誘導するのに適した医薬の製造における、請求項１に記載の免疫原性生成物の使用。
【請求項４６】
被療者におけるＴ細胞応答を同調及び増幅する医薬の製造における、請求項１に記載の
免疫原性生成物の使用。
【請求項４７】
被療者における癌腫を治療するための医薬の製造における、請求項１に記載の免疫原性生成物の使用。
【請求項４８】
被療者における抗癌免疫応答を誘導するのに適した医薬の製造における、１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる１つ又は複数の核酸組成物及び前記クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体に対応する１つ又は複数のペプチド組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で開示される本発明は、ＭＨＣクラスＩ制限免疫応答を誘導し、応答、特に多価応答の性質及び大きさを制御し、そして病原性プロセスにおける有効な免疫学的介入を促進するための方法及び組成物に関する。本明細書中には、病原性プロセスにおける有効な免疫学的介入を促進し得る腫瘍関連抗原の種々の組合せに対する免疫応答を誘導するための方法及び組成物が開示される。
【０００２】
本出願は、米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）の出願日の利益を主張する（参照によりその全文が放棄されずに本明細書中で援用される）。
【背景技術】
【０００３】
［関連技術の記載］
米国癌学会は、毎年、百万を超える人々が癌にかかり、米国人男性の約２人に１人及び米国人女性の約３人に１人が、生涯の或る時点で何らかの種類の癌を有するであろうと推定している。
【０００４】
正常な体細胞は、規則的な様式で成長し、分裂し、死滅する。癌のような細胞増殖の異常では、細胞が死滅する代わりに制御不能に成長及び分裂し続ける。様々な種類の癌があるが、これらは通常、異常細胞の制御不能な成長のために起きる。
【０００５】
癌に対する通常の治療の選択肢としては、手術、放射線療法及び化学療法が挙げられる。免疫療法と呼ばれる、第４の治療の選択肢が近年確立されてきている。免疫療法は、免疫系が癌細胞を認識することを助け、そして／又は癌を破壊させるために癌細胞に対する応答を強めるように考えられたものである。免疫療法には、能動免疫療法及び受動免疫療法が含まれる。能動免疫療法は、体自体の免疫系を刺激して病気と戦わせるように試みる。受動免疫療法は、通常、患者の免疫系によって病気を攻撃するものではなく、代わりに、患者の体の外で作られた免疫系構成成分（抗原等）を用いる。
【０００６】
免疫系は、２つの別個のエフェクター部門、即ち先天免疫及び適応免疫に分類することができる。先天免疫は、直ちに、しかし一般的には外来刺激に応答する多数の細胞構成成分と可溶性因子を包含する。適応免疫は、外来作用因子からの明確なエピトープに特異的に応答するようカスタマイズされる。適応免疫応答は、体液性及び細胞性免疫系として既知の２つのエフェクター部門にさらに分けられる。体液性部門はＢリンパ球による抗体の産生を中心とし、一方、細胞性部門は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞溶解活性に係わる。
【０００７】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、標的化抗原それ自体の上のエピトープを認識しない。そうではなく、ＣＴＬは、細胞の表面に表示される抗原の断片を検出する。その結果、抗原は、それらが細胞によりプロセシングされ、細胞の表面に提示された後にだけ、ＣＴＬに認識される。細胞の抗原プロセシング及び提示システムは、十分に確立されている。ＣＴＬは、クラスＩ主要組織適合複合分子（ＭＨＣ）と非共有的に会合して表面に表示される短いペプチド抗原を認識する。これらのクラスＩペプチドは、順次、細胞質タンパク質の分解により生じる。
【０００８】
様々な癌治療法の存在にも拘わらず、付加的で、そしてさらに有効な代替治療に対する必要性が依然として存在する。このような代替治療の１つは、免疫付与により免疫応答を開始し、刺激し、及び／又は増強する能力を要するか又はそれから利益を得る医学的処置
の方法を想定したものである。これらの方法としては、所望の抗原性ポリペプチドに対する免疫応答の発生に依るもの、そして先天免疫応答の開始又は調節に依るものが挙げられる。したがって癌の治療における一つの手法は、治療的な抗癌ワクチンの使用による免疫系の操作である。
【０００９】
ワクチン又は他の免疫原性組成物を生成するために、免疫応答が高められ得る抗原又はエピトープが被療者に導入される。腫瘍癌細胞は正常細胞に由来し、したがって遺伝子レベルで正常細胞と本質的に同一であるが、多数の腫瘍細胞は腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）を提示することが既知である。これらの抗原は、被療者の免疫系により用いられて、腫瘍細胞を異物として認識し、攻撃することができる。残念ながら、腫瘍細胞は一般的に、宿主の免疫系により無視されると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
腫瘍細胞に対する活性を有するワクチンを生成する試みにおいて、多数の異なる戦略が当該技術分野で開発されてきたが、有効且つ顕著な生成物は生じていない。したがって本発明は、当該技術分野における欠陥を克服するのに貢献し、そして癌又は腫瘍細胞を標的化するために本明細書中に開示されるような複数の免疫原性組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、癌腫抗原のＭＨＣクラスＩ拘束エピトープに対する免疫応答を誘導、同調及び／又は増幅して、有効な抗癌免疫応答を生じるための方法及び組成物に関する。
【００１２】
開示される本発明の実施の形態は、種々の型の癌を有する患者の免疫療法のための腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）の組合せの使用を対象とする。好ましい実施の形態では、ＴｕＡＡは、癌細胞それ自体により発現される抗原である。このようなＴｕＡＡの例は、メラン−Ａ（Ｍｅｌａｎ−Ａ）、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＰＲＡＭＥである。代替的な実施の形態では、ＴｕＡＡは、腫瘍関連新血管系又は他の間質のような腫瘍の非癌性構成成分と関連する抗原である。このような抗原の一例はＰＳＭＡであるが、前立腺癌では、ＰＳＭＡは癌性細胞により発現される。特に好ましい実施の形態では、両方の型の抗原が標的になる。本発明の異なる態様は、免疫原性組成物、特定の生成物中へのそれらの収集、及びそれらの使用方法を含む。
【００１３】
いくつかの特定の実施の形態は、１つ又は複数の核酸組成物及び１つ又は複数のペプチド組成物を含む複数の組成物を含む免疫原性生成物であって、１つ又は複数の核酸組成物が、ＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができ；１つ又は複数のペプチド組成物が、本質的にＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される上記１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体からなる；そして１つ又は複数のペプチドが選択された核酸により発現されるエピトープに対応する免疫原性生成物に関する。
【００１４】
免疫原性生成物のいくつかの実施の形態では、１つ又は複数の核酸組成物がｐＳＥＭ、ｐＢＰＬ及びｐＲＰ１２からなる群から選択されるプラスミドを含む。いくつかの実施の形態では、１つ又は複数のペプチド組成物が、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）、その類似体ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）；ＮＹ−ＥＳＯ−１157-I65（配列番号２）、その類似体ＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号６）；ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、その類似体Ｓ（Ｎｖａ）ＬＱＨＬＩＧ（Ｎｌｅ）（配列番号７）；ＰＳＭＡ288-297（配
列番号４）、その類似体ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号８）；メラン−Ａ26-35（配列番号９）、その類似体ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１１）；チロシナーゼ369-377（配列番号１０）、及びその類似体ｙＭｄｇｔｍｓｑＮｖａ（配列番号１２）からなる群から選択されるペプチドを含む。いくつかの実施の形態では、複数の組成物が以下の：ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＰＲＡＭＥクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＰＳＭＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；本質的に上記ＳＳＸ−２エピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的に上記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的に上記ＰＲＡＭＥエピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的にＰＳＭＡエピトープ又はその類似体からなるペプチドを含む。
【００１５】
免疫原性生成物のいくつかの実施の形態では、含まれる核酸分子が同一組成物の一部である。いくつかの実施の形態では、核酸分子が同一である。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＢＰＬの遊離配列（liberation sequence）をコードする配列（配列番号１３）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸がｐＢＰＬの免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１６）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＢＰＬ（配列番号２０）である。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＲＰ１２の遊離配列をコードする配列（配列番号１４）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸がｐＲＰ１２の免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１７）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＲＰ１２（配列番号２１）である。いくつかの実施の形態では、ＳＳＸ−２エピトープがＳＳＸ−２41-49（配列番号１）である。いくつかの実施の形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープがＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）である。いくつかの実施の形態では、ＰＲＡＭＥエピトープがＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）である。いくつかの実施の形態では、ＰＳＭＡエピトープがＰＳＭＡ288-297（配列番号４）である。いくつかの実施の形態では、ＳＳＸ−２類似体がＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）である。いくつかの実施の形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１類似体がＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号６）である。いくつかの実施の形態では、ＰＲＡＭＥ類似体がＳ（Ｎｖａ）ＬＱＨＬＩＧ（Ｎｌｅ）（配列番号７）である。いくつかの実施の形態では、ＰＳＭＡ類似体がＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号８）である。
【００１６】
免疫原性生成物のいくつかの実施形態において、複数の組成物は：メラン−ＡクラスＩ
ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；チロシナーゼクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；本質的に上記メラン−Ａエピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的に上記チロシナーゼエピトープ又はその類似体からなるペプチドを含む。いくつかの実施の形態では、核酸分子が同一組成物の一部である。いくつかの実施の形態では、核酸分子が同一である。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＳＥＭの遊離配列をコードする配列（配列番号１５）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸がｐＳＥＭの免疫原性ポリペプチドをコードする配列（配列番号１８）を含む。いくつかの実施の形態では、核酸分子がｐＳＥＭ（配列番号１９）である。いくつかの実施の形態では、メラン−Ａエピトープがメラン−Ａ26-35（配列番号９）である。いくつかの実施の形態では、チロシナーゼエピトープがチロシナーゼ369-377（配列番号１０）である。いくつかの実施の形態では、免疫原性生成物は、以下の：ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子をさらに含む。いくつかの実施の形態では、免疫原性生成物は、本質的にＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープからなるペプチドをも含む。いくつかの実施の形態では、免疫原性生成物は、本質的にＳＳＸ−２エピトープからなるペプチドをも含む。
【００１７】
本発明の実施の形態は、Ｔ細胞応答を同調及び増幅するための組成物及び方法に関する。このような方法は、免疫原をコードする核酸を含む組成物が動物に送達される、同調する工程を包含する。組成物は、動物における種々の位置に送達することができるが、好ましくは組成物はリンパ系（例えばリンパ節）に送達される。同調する工程は、例えば或る期間にわたって分散して又は或る期間にわたって連続して、その組成物の１回又は複数回の送達を含み得る。本方法はさらに、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、メラン−Ａ26-35（配列番号９）、チロシナーゼ369-377（配列番号１０）、及び核酸組成物によりコードされる対応するＴｕＡＡエピトープと実質的類似性を有するその類似体のような（配列番号５、６、７、８、１１及び１２により表される）ペプチド免疫原を含む組成物を投与することを含む、増幅工程を含む。増幅工程は、１回又は複数回、例えば或る期間にわたる間隔で、１回大量投与で、又は或る期間にわたって連続的に実施され得る。すべての実施の形態に必要とされるわけではないが、いくつかの実施の形態は、免疫増強剤又はアジュバントを含む組成物の使用を含み得る。
【００１８】
さらなる実施の形態は、開示されるプラスミドが独立して又は任意の組合せで用いられるものを含む。これらのエピトープに対応するペプチド組成物並びに免疫付与戦略の増幅された部分の一部は、本質的にネイティブ配列又はネイティブエピトープ配列と類似しているペプチド類似体であり得る。ペプチドは、独立して、又は２、３、４若しくはそれより多い免疫原の組合せで、増幅プロトコルに組入れられ得る。
【００１９】
さらに他の実施の形態は、ｐＳＥＭ（配列番号１９）、ｐＢＰＬ（配列番号２０）及びｐＲＰ１２（配列番号２１）プラスミド中で発現されるエピトープと同様の組合せで置換される代替的エピトープ（米国特許出願第１０／１１７，９３７号（表題「エピトープ配列（Epitope Sequences）」、２００２年４月４日出願）（公開番号２００３０２２０２３９  Ａ１）（参照により本明細書に明示的に援用される）に記載されているもの等）、並びに免疫戦略の増幅部分として投与される対応するペプチド免疫原を含み得る。
【００２０】
本発明の実施の形態は、例えば両免疫原を発現する１つの二価プラスミドの代わりに単一免疫原を発現する２つの一価プラスミド；１つの二価及び１つの一価プラスミドの代わりに３つの免疫原を発現する三価プラスミド；四価プラスミドの代わりに１つの三価プラスミド及び１つの一価プラスミド；又は四価プラスミドの代わりの２つの二価プラスミドを含み得る。実施の形態は、同調・増幅免疫付与戦略の同調工程の一部としての種々のプラスミドの組合せの使用も包含し得る。
【００２１】
本発明の実施の形態は、リンパ中で個々のペプチドに切断され得るポリペプチド又は接合ペプチド、並びに同調・増幅免疫付与戦略の増幅工程におけるその使用を含み得る。
【００２２】
本発明の実施の形態は、哺乳類のリンパ系中に直接的に一連の免疫原用量を投与することを含む免疫付与方法であって、当該一連の免疫原用量が少なくとも１回の同調用量及び少なくとも１回の増幅用量を含むことができ、そして同調用量が免疫原をコードする核酸を含むことができ、増幅用量が任意のウイルス、ウイルスベクター又は複製可能なベクターを含み得ない方法に関する。該方法は、抗原特異的免疫応答を得ることをさらに含み得る。当該方法は、非限定的な例において、１〜２回の同調用量を含み得る。当該方法は、複数の同調用量を投与することを含むことができ、上記用量は１〜約７日にわたって投与される。同調用量、増幅用量、又は同調及び増幅用量は、複数対の注射で送達され、一対の第一メンバー（a first member of a pair：同調用量）は、その対の第二メンバー（a second member of the pair：増幅用量）の約４日以内に投与することができ、そして異なる対の第一メンバー間の間隔は少なくとも約１４日であり得る。最後の同調用量と第一
の増幅用量との間の間隔は、例えば約７〜約１００日であり得るが、このように限定されるわけではない。
【００２３】
他の実施の形態は、ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＰＲＡＭＥクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；及びＰＳＭＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子を含む複数の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌腫の治療方法に関する。別の実施の形態は、本質的にＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡからなるエピトープ又は類似体の群から選択される１つ又は複数のペプチドを投与する工程をさらに含む、上記方法に関する。
【００２４】
１つ又は複数の核酸組成物及び１つ又は複数のペプチド組成物を含む複数の組成物を含む免疫原性生成物を投与することを包含する癌の治療方法であって、１つ又は複数の核酸組成物がＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができ；１つ又は複数のペプチド組成物が、ＳＳＸ−１エピトープ、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ、ＰＲＡＭＥエピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、チロシナーゼエピトープ及びメラン−Ａエピトープからなる群から選択される上記の１つ又は複数のクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体から本質的になり；そして１つ又は複数のペプチドが選択された核酸により発現されるエピトープに対応する、癌の治療方法。いくつかの実施の形態は、癌が乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、脳腫瘍、リンパ癌、皮膚癌、骨肉腫、腎臓癌、直腸癌、黒色腫、膠芽細胞腫又は肉腫である上記の方法の使用に関する。
【００２５】
さらに他の実施の形態は、複数の組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌の治療方法であって、当該複数の組成物が以下の：メラン−ＡクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；チロシナーゼクラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；本質的に上記メラン−Ａエピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的に上記チロシナーゼエピトープ又はその類似体からなるペプチドを含む、癌の治療方法に関する。他の実施の形態は、治療される癌が膠芽細胞腫又は黒色腫である当該方法の使用に関する。さらに他の実施の形態は、組成物であって、以下の：ＳＳＸ−２クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる核酸分子；本質的に上記ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ又はその類似体からなるペプチド；本質的に上記ＳＳＸ−２エピトープ又はその類似体からなるペプチドを含む組成物をそれを必要とする患者に投与するさらなる工程を含む。
【００２６】
他の実施の形態は、限定されるわけではないが、１〜６回の同調用量及び少なくとも１回の増幅用量を含む、哺乳類における免疫応答の誘導のための免疫原性組成物のセットに関する。このような実施の形態では、同調用量は、免疫原をコードする核酸を含むことができ、増幅用量はペプチドエピトープを含むことができ、そしてエピトープは核酸を発現するｐＡＰＣにより提示され得る。一用量はさらに、アジュバント、例えばＲＮＡを含み得る。同調及び増幅用量は、リンパ系（例えばリンパ節等）への直接投与に適した担体中に存在し得る。核酸は、プラスミドであり得る。エピトープは、クラスＩ  ＨＬＡエピトープであり得る。免疫原はエピトープアレイを含むことができ、このアレイは、遊離配列を含み得る。免疫原は、本質的に標的関連抗原から成ることができる。標的関連抗原は腫
瘍関連抗原であり得るが、これに限定されない。免疫原は、エピトープクラスターを含み得る標的関連抗原の断片を含み得る。
【００２７】
さらなる実施の形態は、黒色腫を含む癌腫の治療における、同調・増幅治療用組成物、四価、二価及び／又は一価プラスミド並びに対応するペプチド免疫原の使用方法であって、最適化された免疫付与スケジュールに従って、リンパ節注射（即ち、免疫応答が開始され、増幅される器官中に直接的に）による投与を包含する方法に関する。
【００２８】
またさらなる実施の形態は、本発明の組成物を含む医薬の製造に関する。一実施の形態は、被療者のリンパ系への投与に適した医薬の製造に関する。別の実施の形態は、被療者における抗癌免疫応答を誘導するのに適した医薬の製造に関する。別の実施の形態は、被療者におけるＴ細胞応答を同調及び増幅する医薬の製造に関する。別の実施の形態は、被療者における癌腫を治療するための医薬の製造に関する。別の実施の形態は、被療者における抗癌免疫応答を誘導するのに適した医薬の製造における１つ又は複数のクラスI  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体を発現することができる１つ又は複数の核酸組成物及び上記クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ又はその類似体に対応する１つ又は複数のペプチド組成物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施形態は、癌細胞及び潜在的な新血管系により発現される複数の分子に対して好ましくは同時標的化される能動免疫（治療的ワクチン接種）の誘導に基づいている。この手法は、好ましくはリンパ節に直接的に組換えＤＮＡ（プラスミド）及び合成ペプチドを標的化送達し、それにより原発病変及び転移病変内の腫瘍細胞の生存及び／又は成育可能性を最終的に妨害する潜在能力を有する強力な細胞媒介性免疫応答を誘発することを包含する。
【００３０】
本発明の方法は、好ましくは最適化された免疫付与スケジュールに従ってリンパ節注射による初回刺激（prime）（プラスミド）／追加免疫（boost）（ペプチド）手法を用いて投与される組換えＤＮＡプラスミド及び合成ペプチドの組合せの使用を含む。好ましい実施形態では、リンパ節注射は、免疫応答が開始され、増幅される生物体に直接的に行われる。本発明の実施形態は、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ*０２０１を発現する腫瘍組織を有する患者に投与され得る。プラスミドが免疫応答を開始し得るだけではないこの免疫付与プロトコルを用いることにより、調節性能とは対照的にエフェクターに対する応答及びその後の増幅に偏らせることが観察されている。この先行する核酸ベースの免疫付与を行わずに、ペプチドを反復投与することは、調節性Ｔ細胞による応答をさらに優勢にする。エフェクター応答に向かう長続きする偏向は、同調と呼ばれる。
【００３１】
癌腫及び黒色腫のための治療法を同調・増幅することに関する開示される実施形態を用いて、多価攻撃を達成して、攻撃に対する腫瘍の感受性を増大するという利点を提供することができる。腫瘍細胞上の２つ以上の抗原が標的化される場合、それに従って抗腫瘍薬の有効濃度が増大する。腫瘍に関連する間質、例えば血管系に及ぼす攻撃も、それらを標的化する作用因子の腫瘍細胞への接触可能性を増大し得る。したがって、多価攻撃において標的化されるべき他の抗原もその組織によって発現されない場合、何らかの正常組織上で発現される抗原でも、標的抗原としてより深く考察され得る。
【００３２】
異種形態の免疫原を包含するこのような免疫付与プロトコルの実施は、少なくとも２つの異なる組成物の使用を必要とし、特に、２つ以上の標的抗原が存在する場合、共に及び／又は異なる時点で投与されるべきいくつかの組成物を含み得る。したがって、本発明の実施形態は、免疫原性組成物のセット及びサブセット、並びにその個々の用量を含む。多価性は、多価免疫原、一価免疫原の組合せを含む組成物、１つ若しくは複数の一価免疫原
を含む組成物の協調使用、又はその種々の組合せを用いて達成され得る。このような方法に従って特定の治療レジメン又はプロトコルに用いるために製造される複数の組成物は、免疫療法生成物と定義されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、当該生成物の組成物のすべて又はサブセットは、キット中に共に包装される。いくつかの実施形態では、単一のエピトープ又はエピトープのセットを標的化する誘導及び増幅組成物が、共に包装され得る。他の例では、複数の誘導組成物は一キット中に集められ、そして対応する増幅組成物は別のキット中に集められ得る。代替的には、組成物は、指示される免疫付与プロトコルの有益な結果を達成するためにそれらが共に用いられ得る方法を記載している、印刷形態の又は機械読取可能媒体上の使用説明書と共に個別に包装され、販売され得る。さらなる変形形態が当業者に明らかになるであろう。特定のプロトコル又はレジメンに用いられ得る組成物の全部未満を含む種々の包装方式の使用は、例えば腫瘍抗原発現に、或いは免疫治療薬又はその種々の構成成分に対する観察された応答に基づいた治療の個別化を促す（米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号（２００４年６月１７日出願）；米国特許出願第１１／１５５，２８８号（公開番号２００６０００８４６８）（２００５年６月１７日出願）及び米国特許出願第１１／３２３，９６４号（２００５年１２月２９日出願）（すべて表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）；並びに米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号及び米国特許出願第１１／１５５，９２８号（公開番号２００５０２８７０６８）（共に表題「IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS」）に記載）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００３４】
本発明の実施形態は、個別に、又は２、３、４若しくはそれより多い免疫原と組合せて、増幅プロトコルに組入れられるペプチドを包含する。全部より少ないのペプチドエピトープを用いる理由としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：１）抗原のいずれかの最適以下発現；２）患者は対応する抗原を発現しないか、又はもはや発現しない；３）あまり強くない応答が或るエピトープ又は別のエピトープに対して生じており、この場合、このようなペプチドは、より均衡の取れた応答を得るために、他のものの非存在下で投与され得る；そして４）何らかの種類の免疫毒性を生じている場合、ペプチドは中断され得る。
【００３５】
Ｉ．  本発明の治療用ペプチド及びプラスミド
Ａ．  治療用ペプチド及びその類似体
本発明は、癌の治療における治療薬として、癌細胞及び新血管系によって発現される複数の分子の使用を意図するものである。このような分子としては、癌細胞自体によって発現されるか、又は腫瘍の非癌性成分、例えば腫瘍関連新血管系若しくは他の間質に関する抗原である腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）が挙げられる。ＴｕＡＡは、適切な免疫治療薬又はレジメンに患者の癌の病状又は型を適合させるのに役立つ。本発明で意図されるＴｕＡＡの非限定的な例としては、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（前立腺に特異的な膜抗原）、メラン−Ａ及びチロシナーゼが挙げられる。したがって、本発明の特定の実施形態では、癌治療薬として、ペプチド、ペプチド類似体、又はＴｕＡＡのエピトープ（表１）が提供される。本発明の代替的な実施形態では、ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡのネイティブ配列又は類似体を含むことができ、例えば、米国特許仮出願第６０／５８１，００１号、同第６０／５８０，９６２号、及び同第６０／６９１，８８９号、並びにこれらに対応する米国特許出願第１１／１５６，２５３号（公開番号第２００６００６３９１３）、同第１１／１５５，９２９号（公開番号２００６００９４６６１）、同第１１／１５６，３６９号（公開番号２００６００５７６７３）、同第    ／    号（本出願と同一日付で出願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ）、同第    ／    号（本出願と同一日付で出
願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ２）及び同第    ／    号（本出願と同一日付で出願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ３）；並びに米国特許出願第１１／１５６，３６９号（公開番号２００６００５７６７３）及び同第１１／１５６，２５３号（公開番号２００６００６３９１３）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されているものとすることができる。
【００３６】
メラニン生合成酵素であるチロシナーゼはメラノサイト中で主に発現され、黒色腫においてしばしば高レベルで観察される。したがってチロシナーゼは、メラノサイト分化の最も特異的なマーカーの１つとみなされる。それは、メラノサイトと同様に、神経外胚葉から発達する神経膠細胞中でも発現される。したがってチロシナーゼは、多形成膠芽細胞腫を含む膠芽細胞腫のための有用なＴｕＡＡでもある。ＴｕＡＡとしてのチロシナーゼのさらなる詳細は、米国特許第５，７４７，２７１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。本発明の特定の実施形態では、本明細書中で配列番号１０により表されるチロシナーゼ369-377エピトープが提供される（表１）。
【００３７】
本発明で用いられる別のＴｕＡＡは、ＭＡＲＴ−１（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）としても既知のメラン−Ａである。メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１も黒色腫中で高レベルで発現されるメラニン生合成タンパク質である。メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１は、米国特許第５，９９４，５２３号、同第５，８７４，５６０号及び同第５，６２０，８８６号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）でＴｕＡＡとして開示されている。本発明の好ましい実施形態では、本明細書中で配列番号９により表されるメラン−Ａ  ＴｕＡＡ、メラン−Ａ26-35が提供される（表１）。
【００３８】
Ｈｏｍ−Ｍｅｌ−４０としても既知のＳＳＸ−２は、高度に保存された癌−精巣（ＣＴ）抗原の一ファミリーの一メンバーである（Gure, A.O. et al., Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997、参照によりその全体が本明細書に援用される）。癌−精巣抗原は種々の腫瘍中に見出されるが、一般に、精巣以外の正常成人組織には存在しない。ＳＳＸファミリーの異なるメンバーの発現は、種々の腫瘍細胞株中に見出されている。ＴｕＡＡとしてのＳＳＸ−２は、米国特許第６，０２５，１９１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。本発明の特定の実施形態では、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びその類似体、即ちＳＳＸ−２類似体（配列番号５）が提供される（表１）。
【００３９】
ＣＴＡＧ−１（癌−精巣抗原−１）及びＣＡＧ−３（癌抗原−３）としても既知のＮＹ−ＥＳＯ−１は、広範な種類の腫瘍中に見出される癌−精巣抗原である。ＴｕＡＡとしてのＮＹ−ＥＳＯ−１は、米国特許第５，８０４，３８１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。好ましい実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号２及び配列番号６により表されるＮＹ−ＥＳＯ−１のエピトープ及びその類似体を提供する（表１）。
【００４０】
本発明において意図される別のＴｕＡＡは、ＭＡＰＥ、ＤＡＧＥ及びＯＩＰ４としても既知のＰＲＡＭＥである。ＰＲＡＭＥは、癌−精巣（ＣＴ）抗原として当該技術分野で既知である。しかしながら多数のＣＴ抗原、例えばＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＢＡＧＥとは異なり、それは急性骨髄性白血病において発現される。ＴｕＡＡとしてのＰＲＡＭＥは、米国特許第５，８３０，７５３号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。好ましい実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号３及び配列番号７により表されるＰＲＡＭＥのエピトープ及びその類似体を提供する（表１）。
【００４１】
本発明で用いられるさらに別のＴｕＡＡは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。ＰＳＭＡは、前立腺癌細胞中で高度に発現されることが判明している。しかしながら、ＰＳＭＡ発現は、正常前立腺上皮において、及び非前立腺腫瘍の新血管系においても認めら
れる。抗新血管系調製物としてのＰＳＭＡは、米国特許仮出願第６０／２７４，０６３号及び米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４）及び同第１１／０７３，３４７号（公開番号２００５０２６０２３４）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。ＴｕＡＡとしてのＰＳＭＡは、米国特許第５，５３８，８６６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。好ましい実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４及び配列番号８により表されるようなＰＳＭＡのエピトープ及びその類似体を提供する（表１）。
【００４２】
【表１】
2008543869.tif 000003
【００４３】
上記のような本発明の抗原は、癌（但しこれに限定されない）のような疾患を治療するに際して種々の治療レジメンに用いられ得る。
【００４４】
Ｂ．  ペプチドと組合せたプラスミドを含む免疫原性組成物
上記のように、本発明は、合成ペプチドと組合せて用いられるプラスミドを含む癌の治療のための免疫原性組成物を提供する。このような免疫原性プロトコルは、強力な細胞媒介性免疫応答を引き出して特定の癌を標的化し、それにより被療者における癌を排除、根絶、又は改善する。本発明で用いられる好ましいプラスミドは、ｐＲＰ１２プラスミド（配列番号２１）（米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号及び対応する米国特許出願第
号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５３Ａ（本出願と同一日付けで出願））、共に表題「METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA」）、ｐＢＰＬプラスミド（配列番号２０）及びｐＳＥＭ（配列番号１９）（それぞれ米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号及び米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４）に開示）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）である（それらの文献において、ｐＳＥＭはｐＭＡ２Ｍと呼ばれることに留意）。用いられ得る付加的プラスミドは、これらの参考文献中に、また米国特許出願第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３０１３８８０８）に開示されている。
【００４５】
したがって種々の実施形態では、免疫療法生成物は、免疫原性組成物の集合物（assemblages）を含む。このような集合物は、１、２又は３つのプラスミドを個々の組成物の一セットとして含むことができるか、又は単一の組成物が２つ以上のプラスミドを含むことができる。このような集合物は、プラスミドにより発現されるエピトープに対応する複数のペプチドも含み得る。同様に、それらは、個々の又は複数のペプチドを含む組成物として提供され得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の同調プラスミドは、対応する増幅ペプチドと共に販売される。他の実施形態では、複数のプラスミドが、共に、しかし対応するペプチドを伴わずに販売される。さらに他の実施形態では、対応するペプチドのセットは、例えば同調化応答の後の増幅のために、プラスミドを伴わずに共に販売される。
【００４６】
したがって、本発明の１つの特定の実施形態において、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）エピトープを発現するｐＢＰＬプラスミド（米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４）（表題「EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS
FOR THEIR DESIGN」）（参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される）に詳細に記載さている）と、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）及びＰＳＭＡ288-297（配列番号４）エピトープを発現するｐＲＰ１２プラスミド（米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号、米国特許出願第          号（本出願と同一日付で出願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５３Ａ）（共に表題「METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA」）（参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される）とを含む集合物が提供される。ｐＢＰＬプラスミド及びｐＲＰ１２プラスミドの遊離配列は本明細書中でそれぞれ、配列番号１３及び配列番号１４として表され、また、米国特許出願第１０／２１２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４）（参照により本明細書に援用される）に開示されている。プラスミドは、ｐＡＰＣによりエピトープを発現及び提示されるようにエピトープをコードする。
【００４７】
本発明の別の特定の実施形態では、メラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）エピトープを発現するｐＳＥＭプラスミド（米国特許出願第１０
／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４）（参照により本明細書に援用される）に詳細に記載され、ｐＭＡ２Ｍと呼ばれる）を含む集合物が提供される。ペプチド類似体メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）及びチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）は、米国特許出願第１１／１５６，３６９号及び米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（共に表題「EPITOPE ANALOGS」）（それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。このプラスミドの遊離配列は本明細書中で、配列番号１５として表され、また、米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号（２００５年６月１７日出願）及び米国特許出願第    ／    号（本出願と同一日付で出願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５３Ａ）（共に表題「METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES， EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA」）に開示されている。ｐＳＥＭプラスミドは、ｐＡＰＣによる発現及び提示を可能にするようにメラン−Ａ及びチロシナーゼエピトープをコードする。
【００４８】
本発明のさらなる特定の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）エピトープを発現するｐＢＰＬプラスミド（上記）と、メラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）エピトープを発現するｐＳＥＭプラスミド（上記）（配列番号１９）とを含む集合物が提供される。ペプチド類似体メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）、チロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）、ＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（配列番号６）は、米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号、米国特許出願第１１／１５５，９２９号、米国特許仮出願第６０／５８１，００１号、米国特許出願第１１／１５６，２５３号、米国特許出願第１１／１５６，３６９号及び米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（それぞれ参照によりその全体が本明細書に完全に援用される）に記載されている。プラスミド、即ちｐＳＥＭ（配列番号１９）及びｐＢＰＬ（配列番号２０）は、ｐＡＰＣによりエピトープが発現及び提示されるように、それぞれのエピトープ（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２）をコードする。
【００４９】
本発明の別の特定の実施形態は、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）及びＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）エピトープを発現するｐＲＰ１２プラスミド（上記）と、メラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）エピトープを発現するｐＳＥＭプラスミド（上記）とを含む集合物に関する。ペプチド類似体メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）、チロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）、ＰＲＡＭＥ425-433L４２６Ｎｖａ、I４３３Ｎｌｅ（配列番号７）、及びＰＳＭＡ288-297Ｉ２９７Ｖ（配列番号８）は、米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号、米国特許出願第１１／１５５，９２９号、米国特許仮出願第６０／５８１，００１号、米国特許出願第１１／１５６，２５３号、米国特許出願第１１／１５６，３６９号及び米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（それぞれ参照によりその全体が本明細書に完全に援用される）に記載されている。プラスミドは共に、ｐＡＰＣによりエピトープが発現及び提示されるように、それぞれのエピトープ（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）をコードする。
【００５０】
さらなる実施形態では、上記の集合物のそれぞれは、それらのプラスミドにより発現されるエピトープに対応するペプチド（応答を増幅することが可能である）を包含する。他の特定の実施形態は、個々のプラスミド並びに一方又は両方の対応するペプチドを含む（本明細書中で言及される特定のプラスミドは二価として記載されるが、それらは一価様式でも増幅され得る）。
【００５１】
本明細書中で言及されるように、ＰＰ治療レジメンは、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ抗原を
標的にする。同様にＭＴレジメンはメラン−Ａ／チロシナーゼ抗原を標的化するためにプラスミド及びペプチドを投与する。そしてＮＳ治療レジメンはＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２抗原を標的にする。
【００５２】
ＩＩ．  細胞増殖性疾患及びスクリーニング方法
プラスミド及び１つ又は複数のペプチド又はその類似体を含む本発明の免疫原性組成物は、被療者における癌のような細胞増殖性疾患の治療に際して投与され得る。本発明の免疫原性組成物を用いて治療され得る癌としては、例えば黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む肺癌、肝細胞癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽細胞腫、白血病、神経芽細胞腫、頭部及び頚部癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、骨肉腫、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頚部癌、胃腸癌、リンパ腫、結腸癌、膀胱癌、及び／又は血液、脳、皮膚、眼、舌、歯肉の癌が挙げられる。本発明の免疫原性組成物は、癌以外の細胞増殖性疾患を治療するために用いられ得るとも予測され得る。本発明において意図される他の細胞増殖性疾患としては、例えば異形成、前腫瘍性病変（例えば腺腫様過形成、前立腺上皮内腫瘍、子宮頚部異形成、結腸ポリープ症）、或いはｉｎ  ｓｉｔｕでの癌腫が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５３】
癌素因があるか又は癌を有する患者から得られた細胞又は組織は、患者に投与するための適切な免疫療法レジメンをより的確に決定するために、スクリーニングされ得る。このようなスクリーニングは、腫瘍の抗原プロファイルを示すために抗原の予備選択パネル中の２つ以上の発現された腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）に関して患者の腫瘍組織を検定する工程を含み得る。次に得られた抗原プロファイルに基づいて、免疫療法レジメンが選択され得る。選択されたレジメンは、２、３、４又はそれより多くの発現された抗原を標的化する少なくとも１つの免疫治療薬を投与することを含み得る。免疫治療薬は、腫瘍により発現される２つ以上の抗原のそれぞれに関して患者のクラスＩ  ＭＨＣ型により制限されるエピトープを含むか又はコードし得る。抗原の発現は、腫瘍細胞若しくは腫瘍関連間質細胞又はその両方の上で検出され得る。
【００５４】
本発明において提供される免疫療法レジメンは、以下を含む：標的抗原がＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡであるＰＰレジメン；このレジメンは、血管系及び癌精巣抗原を同時標的化する。本発明により提供される別のレジメンは、標的抗原がメラン−Ａ及びチロシナーゼであるＭＴレジメンである；このレジメンは、黒色腫及び膠芽細胞腫と関連する組織特異的抗原を標的にする。本発明のＮＳレジメンは、広範囲の癌において種々の頻度で見出される癌精巣抗原である標的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２に関する。本発明の他の特定の実施形態では、レジメン：ＰＰＮＳ（ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＮＹＥＳＯ−１、ＳＳＸ２を同時標的化）、ＮＳＭＴ（ＮＹＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、メランＡ及びチロシナーゼを同時標的化）又はＰＰＭＴ（ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、メランＡ、チロシナーゼを同時標的化）が提供される。
【００５５】
本発明に用いられるスクリーニング方法は、以下の工程を含む：患者の腫瘍組織を検定して、予備選択パネル中の１つ又は複数の発現ポリペプチドを検出する工程であって、パネルが２、３、４又はそれより多いＴｕＡＡ及び少なくとも１つの系統特異的マーカーを含む工程；及び検定に基づいて癌診断を確認する工程。パネルは、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１及びＳＳＸタンパク質からなる群から選択される少なくとも２、３、４又はそれより多くのＴｕＡＡを含み得る。いくつかの例では、系統特異的マーカーはＴｕＡＡであり得る；代替的には、系統特異的マーカーはＴｕＡＡでない。例えば黒色腫及び／又は膠芽細胞腫の場合、系統特異的マーカーはチロシナーゼ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１又はｇｐ１００であり得る；前立腺癌の場合、系統特異的マーカーはＰＳＡ又はＰＳＭＡであり得る。
【００５６】
腫瘍抗原発現は不均質である傾向があるので、任意の特定の生検試料は発現されたすべての抗原を完全に提示しないと思われる。したがって患者のプロファイルが治療のための抗原すべてを含有する必要はない。本発明に用いられるスクリーニング方法は、抗原の予備選択パネルの発現のための対応する仮定の腫瘍組織の検定を含み得る。いくつかの場合、一つの腫瘍型に関して集合されたＴｕＡＡのパネルを用いて、同一抗原のうちの少なくともいくつかと、示された発現プロファイルを発現し得る他の腫瘍型をスクリーニングし得る。
【００５７】
本発明の免疫原性組成物は、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ*０２０１を発現する腫瘍組織を有する患者に投与され得る。
【００５８】
抗原又は抗原の組合せが特定の癌を治療するのに有用であるか否かを決定するために用いられ得る特定の腫瘍の抗原発現のプロファイルを得るための例示的方法は、米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号（２００４年６月１７日出願）；米国特許出願第１１／１５５，２８８号（公開番号２００６０００８４６８）（２００５年６月１７日出願）及び米国特許出願第１１／３２３，９６４号（これも２００５年６月１７日出願）（すべて表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に見出され得る。特定の癌に対する免疫応答を指示するのに特に利益を有する特異的な抗原の組合せは、米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号（２００３年６月１７日出願）、米国特許出願第１０／８７１，７０８号（公開番号２００５０１１８１８６）（２００４年６月１７日出願）（共に表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」）に記載）及びＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／１１２８２５（２００４年６月１７日出願）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【００５９】
ＩＩＩ．  投与のための同調・増幅治療
好ましい実施形態では、本発明は、初回刺激（プラスミド）／追加免疫（ペプチド）手法を用いて投与される組換えＤＮＡプラスミド及び合成ペプチドの組合せ使用を含む組成物を提供する。このような組成物は、最適化された免疫付与スケジュールに従って、リンパ節注射により送達され得る。本発明の実施形態は、ＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ*０２０１を発現する腫瘍組織を有する患者に投与され得る。したがってプラスミド及び１つ又は複数のペプチド又はその類似体を含む免疫原性組成物は、被療者における癌を治療する際に投与され得る。本発明の開示される実施形態は、多価攻撃を達成するために用いられて、攻撃に対する腫瘍の感受性を増大する利点を提供し得る癌腫、例えば黒色腫のための同調・増幅治療薬に関する。
【００６０】
したがって特定の実施形態では、本発明は、癌の治療のための多価同調・増幅治療薬を提供する。このような多価治療薬は、腫瘍細胞上の２つ以上の抗原を標的にし得る。腫瘍細胞上の２つ以上の抗原が標的になる場合、抗腫瘍治療薬の有効濃度はそれに従って増大される。血管系のような腫瘍に関連した間質に及ぼす攻撃は、それらを標的化する作用因子への腫瘍細胞の接触可能性を増大し得る。したがって何らかの正常組織上でも発現される抗原でも、多価攻撃において標的となるべき他の抗原がその組織により発現されない場合、標的抗原としてより深く考察され得る。
【００６１】
Ａ．  二価同調・増幅治療
本発明の一実施形態は、黒色腫のための二価同調・増幅治療薬に関する。したがって本発明においては、黒色腫に対するＭＴレジメンとして投与されるメラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）に対応するｐＳＥＭプラスミド及びペプチドを含む集合物が提供される。好ましい実施形態では、ペプチド類似体メラン−Ａ
26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）及び／又はチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）を増幅する工程に利用する。本発明に用いられる同調・増幅プロトコルは、上記に開示されている。
【００６２】
ｐＳＥＭプラスミド集合物は、黒色腫のための四価同調・増幅治療薬に関して上記されたものと同様の方法で送達され得る。黒色腫患者は、本明細書中で開示される方法、並びに腫瘍抗原プロファイルがメラン−Ａ及び／又はチロシナーゼを含む患者に関して利用されるＭＴレジメンに従ってスクリーニングされ得る。ペプチド追加免疫の投与は、プラスミドにより発現される抗原の一方又は両方を含み得る。
【００６３】
同様に、ＰＰ及びＮＳレジメンは、それぞれ、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）及びＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）エピトープに対応するｐＲＰ１２及びペプチド並びにＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）に対応するｐＢＰＬ及びペプチドを含む集合物を用いる二価療法のために用いられ得る。これらの二価レジメンは組合されて、より高い結合価の治療を生じ、その選択される実施形態は以下に記載され、そして免疫原性組成物の種々のセットがそれらを支持するために集合され得る。
【００６４】
Ｂ．  四価同調・増幅治療
本発明の一実施形態は、癌腫のための四価同調・増幅治療薬に関する。したがって本発明の特定の一実施形態では、免疫付与戦略の同調免疫原としてそれぞれ投与されるＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）エピトープを発現するｐＢＰＬプラスミド、並びにＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）及びＰＳＭＡ288-297（配列番号４）エピトープを発現するｐＲＰ１２プラスミドを含む集合物が提供される（本明細書中ではＰＰレジメンと呼ばれる）。本発明において意図される「同調」免疫原は、多数の実施形態において、Ｔ細胞の誘導系統の免疫プロファイルに特定の安定性を付与する誘導を含む。
【００６５】
さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡエピトープに対応する４つのペプチド組成物は、同調免疫原のものと同一の免疫付与戦略の増幅部分として投与される。好ましい一実施形態では、ペプチド類似体ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（配列番号６）；ＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）；ＰＳＭＡ288-297Ｉ２９７Ｖ（配列番号８）；及び／又はＰＲＡＭＥ425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ（配列番号７）が増幅する工程で利用される。本発明において意図されるように、「増幅すること又は増幅（amplifying or amplification）」という用語は、Ｔ細胞応答の場合のように、多数の実施形態において、特定の応答に関与するＴ細胞の細胞数、活性化細胞数、活性レベル、増殖速度、又は類似のパラメーターを増大するためのプロセスを含む。
【００６６】
本発明に用いられる同調・増幅プロトコルは、米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号、米国特許出願第１０／８７１，７０７号（公開番号２００５００７９１５２）及び米国特許出願第１１／３２３，５７２号（それぞれ、表題「METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES」）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、プラスミドは、鼠径部リンパ節への同調免疫原として、節内（一方は左側、一方は右側）に投与される。その後、ペプチドは、増幅免疫原として節内に、２つは左節に別個の日に、他の２つは右節に別個の日に順次投与される。対応するエピトープをコードするプラスミドを受容する同一リンパ節にペプチドが投与される
ことが好ましいが、必要というわけではない。
【００６８】
癌腫患者、特に卵巣、結腸直腸、膵臓又は腎細胞癌腫を有する患者は、本明細書中に開示される方法に従ってスクリーニングされ、そして、その腫瘍プロファイルがＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及び／又はＳＳＸ−２を含む患者にＰＰ及び／又はＮＳ治療レジメンが投与される。ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープはＬＡＧＥ  １ａ／ｓ中にも見出され、プロファイルの中のこの抗原の存在は腫瘍プロファイルにおいても考察され得ることに留意されたい。腫瘍抗原発現は不均質である傾向があるので、任意の特定の生検試料は発現される抗原すべてを完全に示さないと思われる。したがって患者のプロファイルが、本発明の治療薬による治療のための候補であるその患者に関する４つの抗原すべてを含有する必要はない。しかしながら該プロファイルは抗原のうちの２、３又は４つを含有するのが好ましい。
【００６９】
Ｃ．  黒色腫のための四価同調・増幅治療薬
本発明の一実施形態は、プラスミドｐＳＥＭ及びｐＢＰＬ並びに対応するペプチドを含む黒色腫のための四価同調・増幅治療薬に関する。ｐＳＥＭプラスミドは、メラン−Ａ26-35（配列番号９）エピトープ及びネイティブチロシナーゼ（チロシナーゼ369-377（配列番号１０））エピトープ配列のＡ２７Ｌ類似体をコードする（本明細書中ではＭＴレジメンと呼ばれる）。ｐＢＰＬプラスミドはＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）ネイティブ配列をコードする。プラスミドを含む集合物は、黒色腫に対する免疫付与戦略の同調部分として投与される。さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、メラン−Ａ及びチロシナーゼエピトープに対応する４つのペプチド組成物は、同一免疫付与戦略の増幅部分として投与される。好ましい一実施形態では、ペプチド類似体メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）、チロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）、ＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（配列番号６）が増幅する工程で利用される。
【００７０】
黒色腫のような癌の治療のために、プラスミドは、同調免疫原として鼠径部リンパ節に節内投与される。その後、ペプチドは、増幅免疫原として任意の特定の日に、好ましくは一方は左節に、他方は右節に、節内投与される。黒色腫患者は、本明細書中に開示される方法に従ってスクリーニングされ、そして、適切なレジメンがその抗原プロファイルがメラン−Ａ及び／又はチロシナーゼを含む患者に投与される。ペプチド追加免疫の投与は、プラスミドにより発現される抗原のうちの２、３又は４つを含み得る。
【００７１】
Ｄ．  膠芽細胞腫のための四価同調・増幅治療薬
本発明のさらなる特定の一実施形態では、膠芽細胞腫のようなその他の癌に適用される、黒色腫に適用可能な四価同調・増幅治療薬が提供される。このような一実施形態は、免疫付与戦略の同調部分として投与されるＰＳＭＡ288-297（配列番号４）及びＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）エピトープを発現する混合ｐＲＰ１２プラスミド（上記）並びにメラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）エピトープを発現するｐＳＥＭ（上記）プラスミドに関する。さらに、ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、メラン−Ａ及びチロシナーゼエピトープに対応する４つのペプチド組成物は、同一免疫付与戦略の増幅部分として投与される。好ましい一実施形態では、ペプチド類似体メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）、チロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）、ＰＲＡＭＥ425-433Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｉ４３３Ｎｌｅ（配列番号７）及びＰＳＭＡ288-297Ｉ２９７Ｖ（配列番号８）が増幅する工程で利用される。
【００７２】
癌患者は、本明細書中に開示される方法に従ってスクリーニングされ、そして、ＰＰ及び／又はＭＴレジメンがその腫瘍抗原プロファイルがＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、メラン−Ａ及び／又はチロシナーゼを含む患者に投与される。ペプチド追加免疫の投与は、プラスミ
ドにより発現される抗原のうちの２つ、３つ又は４つを含み得る。
【００７３】
ＩＶ．  本発明の組成物の送達方法
本発明において、初回刺激としての組換えＤＮＡプラスミドをそして追加免疫としての合成ペプチドを含む免疫原性組成物の好ましい投与は、リンパ節注射による。プラスミド（初回刺激）は、ペプチド（追加免疫）と別個に投与され得る。本発明の実施形態は、両免疫原を発現する１つの二価プラスミドの代わりに単一免疫原を発現する２つの一価プラスミドを含み得る。他の実施形態では、１つの二価及び１つの一価プラスミドの代わりに３つの免疫原を発現する三価プラスミドが用いられ得る。いくつかの場合、四価プラスミドの代わりに１つの三価プラスミド及び１つの一価プラスミドが；又は四価プラスミドの代わりに２つの二価プラスミドが用いられ得る。本発明のどの組成物の組合せが用いられるとしても、最適化された免疫付与スケジュールに従って免疫応答が開始され増幅される器官中への直接的送達を可能にするので、リンパ節注射が好ましい。
【００７４】
患者のリンパ系に免疫原性組成物を導入するために、組成物は、好ましくはリンパ管、リンパ節、脾臓又はリンパ系の他の適切な部分に向けられる。いくつかの実施形態では、各構成成分は、ボーラス剤として投与される。他の実施形態では、１つ又は複数の構成成分は、一般的に数時間〜数日間にわたって、注入により送達される。好ましくは、リンパ節にカテーテル又は針を挿入し、そして送達中ずっとカテーテル又は針を保持することにより、組成物はリンパ節、例えば鼠径部又は腋窩リンパ節に向けられる。適切な針又はカテーテルは、金属又はプラスチック製（例えばポリウレタン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、テフロン、ポリエチレン等）で利用可能である。例えば鼠径部リンパ節中にカテーテル又は針を挿入する場合、鼠径部リンパ節は、テガダーム（商標）透明包帯（Tegaderm（商標）, St. Paul, MN, USA）を用いて固定される２４Ｇ３／４（Becton Dickinson, USA）のＶｉａｌｏｎ（商標）Ｉｎｓｙｔｅ  Ｗ（商標）カニューレ及びカテーテルを用いて、超音波診断制御下で穿刺される。この手法は一般に、経験をつんだ放射線学者により成される。鼠径部リンパ節内部のカテーテル先端の位置は、リンパ節のサイズを直ちに且つ可視的に増大する最小容積の生理食塩水の注射により確認される。後者の手法は、先端がリンパ節内部にあるという確認を可能にする。この手法は、先端がリンパ節から滑り出ず、カテーテル移植後の数日中に反復され得ることを保証するために実施され得る。先端がリンパ節内部の位置から滑り出る場合、新規のカテーテルが移植され得る。
【００７５】
本発明の治療用組成物は、当業者に既知である標準ワクチン送達プロトコルと一致する方式で患者に投与され得る。ＴｕＡＡのプラスミド及びペプチド又はペプチド類似体を含む本発明の免疫原性組成物の投与方法としては、経皮、リンパ節内、結節周囲、経口、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内及び粘膜投与、注射又は点滴又は吸入による送達が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＴＬ応答を引き出すためのワクチン送達の特に有用な方法は、オーストラリア国特許第７３９１８９号；米国特許第６，９９４，８５１号及び同第６，９７７，０７４号（共に表題「A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE」）に開示されている。
【００７６】
種々のパラメーターは、被療者に免疫原性組成物を送達するか又は投与するに際して、考慮される必要がある。さらに、投与量レジメン及び免疫付与スケジュールが用いられ得る。一般的に、治療用組成物中の構成成分の量は、患者により、抗原により、以下のような因子：応答を誘導する抗原の活性；患者の系を通過するリンパの流速；被療者の体重及び年齢；治療されている疾患及び／又は状態の型；疾患又は状態の重症度；前の又は共存する治療的介入；抗体を合成する個体の免疫系の能力；所望の防御程度；投与方式等（これらはすべて、施術者により容易に確定され得る）によって変わる。
【００７７】
概して、治療用組成物は、約１〜約５００マイクロリットル／時間又は約２４〜約１２
０００マイクロリットル／日の速度で送達され得る。抗原の濃度は、約０．１マイクログラム〜約１０，０００マイクログラムの抗原が２４時間の間に送達されるようなものである。流量は、毎分約１００〜約１０００マイクロリットルのリンパ液が成人の鼠径部リンパ節を通って流れる、という知識に基づいている。目的は、リンパ系中のワクチン処方物の局所濃度を最大にすることである。患者に関するいくつかの実験的研究は、ヒトにおける所定のワクチン調製物に関する注入の最も効果のあるレベルを確定するために必要であり得る。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、複数の逐次的用量として投与され得る。このような複数の用量は、必要とされる場合、２、３、４、５、６又はそれより多い用量投与であり得る。本発明のさらなる実施形態では、免疫原性組成物の用量は、互いに約数秒又は数分以内に右又は左鼠径部リンパ節に投与されることが意図される。例えばプラスミド（初回刺激）は、先ず右リンパ節に注射され、その後数秒又は数分以内に、第２回目のプラスミドが左鼠径部リンパ節に注射される。他の例では、１つ又は複数の免疫原を発現する１つ又は複数のプラスミドの組合せが投与され得る。リンパ節への最初の注射後のその後の注射は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分又はそれより長い分以内であるが、最初の注射の約３０、４０、５０又は６０分より長くない、というのが好ましい。同様の考察は、右及び左リンパ節への独立した２つのペプチドの投与に当てはまる。数日間隔での本発明の免疫原性組成物の複数の用量を投与することが望ましい場合があるが、この場合、その後の投与間に数日（１、２、３、４、５、６又は７日以上）が経過する。他の場合、本発明の組成物のその後の投与が、初回用量投与後、約１、２、３週間又はそれ以上の週間以内に、或いは約１、２、３ヶ月又はそれ以上の月数以内に、両側の鼠径部リンパ節注射により投与されるのが望ましい。
【００７９】
投与は、投与処方物と適合性である任意の方式であり、そして治療的に有効であるような量であり得る。本発明の免疫原性組成物の有効量又は用量は、治療されるべき被療者において望ましい応答を提供するのに必要な量である。
〔実施例〕
【００８０】
本発明の好ましい実施形態を実証するために、以下の実施例が包含される。以下の実施例に開示される方法は、本発明の実行において良好に機能するために本発明人等により発見された方法を表す、と当業者により理解されるべきであり、したがってその実行のための好ましい方式を構成すると考えられ得る。しかしながら、本発明の開示の点から見て、特定の開示される実施形態に対して多数の変更を行うことができ、さらに本発明の精神及び範囲内で同様の又は類似の結果を得ることができる、と当業者は理解する。
【実施例１】
【００８１】
実験手順
動物
ヒトＴ細胞エピトープに対する免疫応答は、免疫の固有のＭＨＣ制限のために、元の非臨床モデルで試験され得ないため、ヒトＡ*０２０１遺伝子（Pascolo et al., 1997）（これはヒト集団で頻繁に発現される）を発現する遺伝子操作マウスモデルを選択した。免疫欠損マウス（異種移植片モデルのための基礎）に対比して、Ａ*０２０１トランスジェニックモデル（ＨＨＤ）は免疫能を有し、したがって能動免疫療法戦略の評価を可能にする。
【００８２】
したがって雌Ｈ−２クラスＩ陰性（ノックアウト）ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックＨＨＤマウス（８〜１２週齢）を、これらの試験に用いた。動物を無病原体条件下で収容した。
【００８３】
方法論
腫瘍関連抗原メラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）をコードする二価ｐＳＥＭプラスミド（非複製組換えＤＮＡ）、並びに腫瘍関連抗原ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）をコードするｐＢＰＬの二価のプラスミドを、実施例２〜６におけるＴｃ１（ガンマインターフェロン産生）免疫応答を初回刺激する能力に関して評価した。メラン−Ａ26-35（Ａ２７Ｎｖａ；ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１１））ペプチド類似体、チロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ；ＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号１２））ペプチド類似体、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ；Ｓ（Ｎｖａ）ＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号６）)ペプチド類似体及びＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ；ＫＶＳＥＫＩＦＹ（配列番号５））ペプチド類似体を、その後の追加免疫のために用いた。
【００８４】
臨床緩衝液（Ｈ2Ｏ中に１２７ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、０．８８ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、０．５％のＥＴＯＨ）中で、プラスミドを処方した。メラン−Ａ26-35（Ａ２７Ｎｖａ）（配列番号１１）類似体を、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に処方した。同様に、チロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）（配列番号１２）類似体を、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に処方した。ＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）類似体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に処方し、一方、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）ペプチド類似体を、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で５％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ中に免疫付与のために調製した。サイトメトリーデータをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて収集し、そしてリンパ球集団に関してゲート制御することにより、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。
【００８５】
プラスミド及びペプチドの節内送達
試験の１、４、１５、１８、２９、３２、４９及び５３日目に、両側の鼠径部リンパ節内注射により、用量調製物を投与した。イソフランの吸入によりマウスを麻酔し、そして無菌条件下で手術を実行した。外科手術の準備後、長さ０．５〜１ｃｍの切開を鼠径部襞に作製して、鼠径部リンパ節を曝露した。０．５ｍＬインスリン注射器を用いて、最大容積２５μＬ（１ｍｇ／ｍＬ溶液中２５μｇ）のプラスミド又はペプチドを、右及び左の鼠径部リンパ節に直接注射した。滅菌した６．０ナイロン皮膚縫合糸で切り口を閉じた。
【００８６】
プラスミド（初回刺激）／ペプチド（追加免疫）免疫付与スケジュール
両側の鼠径部リンパ節に対してｐＳＥＭ／ｐＢＰＬ（１００μｇ／日）の混合物を用いて、上記のように、雌ＨＨＤ動物の３群に免疫付与した。群１（ｎ＝１０匹のマウス）には、１、４、１５、１８、２８、３２、４９及び５３日目にプラスミド注射を施した；群２及び群３（ｎ＝２５匹のマウス／群）には、表２（下記）に示すように、それぞれ、１、４、１５及び１８日目にプラスミド注射を施した。
【００８７】
群２からの動物を、２８、３２、４９及び５３日目に、チロシナーゼＶ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）（２５μｇ／日）で右リンパ節に、そしてＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖ（配列番号５）（２５μｇ／日）ペプチドで左リンパ節に追加免疫した。群３動物を、同様に表２に示すように、２８及び３２日目にチロシナーゼＶ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）（２５μｇ／日）で右リンパ節に、そしてＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖ（配列番号５）（２５μｇ／日）ペプチドで左リンパ節に追加免疫し、次にＮＹ−ＥＳＯ−１  Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（配列番号６）（１２．５μｇ／日）で右リンパ節に、そして４９及び５３日目にメラン−Ａ  Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）（２５μｇ／日）ペプチドで左リンパ節に追加免疫した。
【００８８】
【表２】
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【００８９】
テトラマー分析
ＣＤ８+抗原特異的Ｔ細胞の計数は、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の同族（cognate）認識を要する。これは、それぞれ特定のペプチドと結合され、そして蛍光タンパク質と接合される４つのＨＬＡ  ＭＨＣクラスＩ分子の複合体から成るクラスＩ  ＭＨＣテトラマーを用いて成し遂げられ得る。したがってテトラマー検定は、特定のＭＨＣ分子中に複合される所定のペプチドに特異的な総Ｔ細胞集団の定量を可能にする。フローサイトメトリーは、適切なＴ細胞受容体を有する細胞と標識化テトラマーとの結合を定量するのに用いる。さらに、結合は機能的経路によらないため、この集団は、機能的状態にかかわらず、すべての特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を包含する。
【００９０】
最終プラスミド（２５日目）及びペプチド免疫付与（３９及び６０日目）の７日後に、上記のプラスミド／ペプチド免疫付与スケジュールに記載されたように免疫付与された動物において、ＣＴＬ応答を測定した。密度遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍａｍｍａｌ， Cedarlane Labs）後に末梢血から単核球を単離し、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  ＳＳＸ−２（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１））−ＰＥ  ＭＨＣテトラマー（Beckman Coulter,
Ｔ０２００１）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  ＮＹ−ＥＳＯ（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２））−ＡＰＣ  ＭＨＣテトラマー（Beckman Coulter, Ｔ０２００１）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  メラン−Ａ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９））−ＰＥ  ＭＨＣテトラマー（Beckman Coulter, Ｔ０２００１）、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  チロシナーゼ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号１０））−ＡＰＣ  ＭＨＣテトラマー（Beckman Coulter, Ｔ０２００１）で染色した。次にこれらの細胞をＦＩＴＣ標識ラット抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モノクローナル抗体（BD Biosciences, 553031）を用いて、共染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いてデータを収集し、リンパ球集団をゲート制御し、ＣＤ８+ＣＴＬ集団内のテトラマー陽性細胞の％を算定することにより、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。
【００９１】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔ検定
細胞障害活性を測定する代わりに、ＥＬＩＳＰＯＴ検定において特定のエフェクター細胞によるＩＦＮ−γ生産を測定することによって、ＣＤ８+ＣＴＬ応答を評価することができる。この検定では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、マイクロタイターウェルのプラスチック表面上に固定され、エフェクター細胞が、様々なエフェクター（標的の比率）で添加される。抗原特異的エフェクター細胞によるＡＰＣの結合は、エフェクター細胞によるＩＦＮ−γを含むサイトカインの生産を引き起こす。細胞は染色されて、細胞内ＩＦＮ−γの存在、及び顕微鏡下でカウントされる陽性染色病巣（スポット）の数を検出することができる。
【００９２】
上記のようなプラスミド／ペプチド免疫付与スケジュールを施した動物を安楽死させて２７及び６２日目に脾臓を摘出した。密度遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍａｍｍａｌ（Cedarlane Labs， Burlington， NC））後の単核球をＨＬ−１溶媒中に再懸濁した。脾細胞（１つのウェル当たり５×１０5、又は３×1０5細胞）を、９６ウェルフィルター膜プレート（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＩＰ膜９６ウェルプレート（Millipore， Boston， MA））の三重ウェルにおいて、１０μｇのメラン−Ａ26-35（配列番号９）、チロシナーゼ369-377（配列番号）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）、又はＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）天然ペプチドでインキュベートした。試料を展開前に５％のＣＯ2及び湿度１００％で３７℃で４２時間インキュベートさせた。マウスＩＦＮ−γコーティング抗体（ＩＦＮ−γ抗体対（U-CyTech Biosciences, The Netherlands））を、脾細胞とのインキュベーション前に、コーティング試薬として用いた後、ビオチン化検出抗体と共にインキュベートした。ＧＡＢＡ結合体及びU-CyTechが独占権を有する基質をＩＦＮ−γスポット展開に用いた。ＩＦＮ−γスポット分析について較正したＥＬＩＳｐｏｔリーダー
ソフトウェアバージョン３．２．３を用いて、ＡＩＤ国際プレート読取器における、展開から２４時間後に免疫付与動物におけるＣＴＬ応答を測定した。
【００９３】
51クロム放出検定
クロム放出検定は、ＣＴＬ活性を評価するための既知の検定である。手短にいうと、それらの表面に抗原を発現する標的細胞を、クロム（51Ｃｒ）の放射性同位体で標識する。次に患者細胞を標的細胞と混合し、数時間インキュベートする。抗原発現細胞の溶解は、培地中に51Ｃｒを放出する。患者エフェクター細胞の存在下又は非存在下で、当該抗原又は対照抗原を発現する標的細胞の溶解を比較することにより、細胞特異的溶解が算定され、通常は、特異的溶解％として表す。
【実施例２】
【００９４】
ペプチド追加免疫前のプラスミドＰＳＥＭ及びＰＢＰＬによる免疫付与
この試験の目的は、プラスミドｐＳＥＭ及びｐＢＰＬによる免疫付与が４つの腫瘍関連抗原ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）、メラン−Ａ26-35（配列番号９）及びチロシナーゼ369-377（配列番号１０）に対する四価応答を誘導し得るか否かを判定することであった。
【００９５】
雌ＨＨＤ動物（Ｈ−２クラスＩ陰性（ノックアウト）ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックＨＨＤマウス（８〜１２週齢））の３群を、両側の鼠径部リンパ節にｐＳＥＭ／ｐＢＰＬ（１００μｇ／日）の混合物で免疫付与した。群１動物（ｎ＝１０匹のマウス）は、１、４、１５、１８、２８、３２、４９及び５３日目にプラスミド注射を受けた；群２及び群３（ｎ＝２５匹のマウス／群）は、それぞれ１、４、１５及び１８日目にプラスミド注射を受けた（表２；上記）。２５日目に、免疫付与動物から血液を採取し、本明細書中の別の箇所で考察されるようにテトラマー検定を用いて、ＣＤ８+Ｔ細胞分析を実施した。応答を、ナイーブ同腹子対照マウス（ｎ＝５）と比較した。
【００９６】
図１は、ペプチド追加免疫前の、それぞれメラン−Ａ26-35（配列番号９）／チロシナーゼ369-377（配列番号１０）、及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）／ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）をコードするよう設計されるｐＳＥＭ及びｐＢＰＬ二価プラスミド（ｎ＝６０）の混合物の４回注射で初回刺激された動物からのテトラマーデータを示す。１００μｇの１日用量でｐＳＥＭ／ｐＢＰＬプラスミド混合物の４回注射により初回刺激された動物は、三価ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びメラン−Ａ応答を示した（群１〜３、ｎ＝合計６０）が、テトラマー検定により測定した場合、いかなるチロシナーゼ特異的ＣＴＬも生じ得なかった。さらに、メラン−Ａ及びＮＹ−ＥＳＯ−１は、図１に示すように、それぞれ二価プラスミドｐＳＥＭ及びｐＢＰＬにより発現される優勢エピトープであることが明示された。
【実施例３】
【００９７】
プラスミド初回刺激ＳＳＸ−２／チロシナーゼによる個体への免疫付与
プラスミド初回刺激後の亜優勢エピトープペプチド単独による追加免疫が、四価免疫応答を達成するのに十分であるか否かを査定した。したがって、上記の群２からの動物を、亜優勢エピトープであるチロシナーゼＶ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）及びＳＳＸ−２  Ａ４２Ｖ（配列番号５）ペプチド類似体で追加免疫し、そして免疫応答をナイーブ対照と比較した。
【００９８】
両側の鼠径部リンパ節における１、４、１５及び１８日目のｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）により動物を初回刺激し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号１）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目
に施した。３９日目、最終ペプチド注射の７日後に、免疫付与動物から血液を採取し、本明細書中の他の箇所で考察したようにテトラマー検定を用いてＣＤ８+Ｔ細胞分析を実施した。
【００９９】
図２は、テトラマーフローサイトメトリー検定を用いて選択されたナイーブ対照動物と比較した場合に３匹の代表的な免疫付与動物において生じたチロシナーゼ及びＳＳＸ−２ペプチド追加免疫後３９日目の末梢血からのテトラマー応答を示す。例えば動物２は、ＳＳＸ−２（５．８％）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（４．１％）、チロシナーゼ（８．７％）及びメラン−Ａ（１０．８％）に特異的なテトラマー応答を実証した。これらのデータは合わせて考えると、総ＣＤ８+Ｔ細胞レパートリーの２９．４％が特異的ＣＴＬ応答を示す。さらに、結果は、プラスミド初回刺激後の亜優勢エピトープペプチド単独による追加免疫は四価免疫応答を達成するのに十分であったことを示す。
【実施例４】
【０１００】
プラスミド初回刺激ＳＳＸ−２／チロシナーゼによる免疫付与
より均衡の取れた四価免疫応答を生じるために、亜優勢ペプチドエピトープチロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）（配列番号１２）及びＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）（群２及び３、ｎ＝５０）で動物を追加免疫し、免疫応答を、ｐＳＥＭ／ｐＢＰＬプラスミドの混合物（群１、ｎ＝１０）又はナイーブ対照（ｎ＝１０）で追加免疫された動物と比較した。
【０１０１】
最終ペプチド注射後７日である３９日目に、メラン−Ａ／チロシナーゼ、ＳＳＸ−２／ＮＹ−ＥＳＯ−１テトラマー分析（上記）を実施した。群１の動物（ｎ＝１０）を、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で初回刺激し、その後、２８及び３２日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で両側の鼠径部リンパ節に追加免疫した。群２及び３の動物（ｎ＝５０）を、両側の鼠径部リンパ節に、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物で初回刺激（１００μｇ／日）し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目に施した。
【０１０２】
メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１に関する平均テトラマー値を、非処置ナイーブ同腹子対照（ｎ＝５）と比較し、平均＋／−ＳＥＭを表す。図３は、群１（ｎ＝１０；プラスミド単独）と比較した場合の群２及び３（ｎ＝５０）へのチロシナーゼ及びＳＳＸ−２追加免疫の前後の免疫応答を示す。
【０１０３】
プラスミド追加免疫後、優勢な免疫応答は、図１で観察されるように、メラン−Ａ及びＮＹ−ＥＳＯ−１特異的（群１）であった。他方、プラスミド混合物で初回刺激され、亜優勢ペプチドで追加免疫された動物は、それらのチロシナーゼ応答を２倍超及びＳＳＸ−２応答を２．５倍超に追加免疫され、それにより均衡のとれた四価免疫応答を評価する（図３）。
【０１０４】
したがって、亜優勢エピトープペプチドであるチロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）（配列番号１２）及びＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）で追加免疫することにより、均衡のとれた四価免疫応答が達成された、ということをそのデータは示す。
【実施例５】
【０１０５】
第１回目のペプチド追加免疫及び第２回目のペプチド追加免疫のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析
群２から選択される動物におけるペプチド追加免疫後のインターフェロンγ生産（ＩＦ
Ｎγ）細胞の頻度を測定することによって、上記の実施例で得られるテトラマーデータが確認された。第１回目のペプチド追加免疫（図４Ａ）及び第２回目のペプチド追加免疫（図４Ｂ）の後にＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を行なった。
【０１０６】
最終ペプチド追加免疫後９日である４１日目に、代表的動物を屠殺することによって、本明細書の別の箇所に記載されるようなＥＬＩＳＰＯＴ分析を実施した。群１の動物（ｎ＝３、屠殺）を、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で初回刺激し、その後、２８及び３２日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で両側の鼠径部リンパ節に追加免疫した。群２の動物（ｎ＝６、屠殺）を、両側の鼠径部リンパ節に、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物で初回刺激（１００μｇ／日）し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８日目及び３２日目に施した。抗原特異的（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１）インターフェロン−γスポット形成細胞／脾臓を、非処理のナイーブ同腹子非処理対照（ｎ＝３）と比較した（図４Ａ）。
【０１０７】
第２回目のペプチド追加免疫後１０日目である６３日目に代表的動物を屠殺することによってＥＬＩＳＰＯＴ分析を実行し、１０日後に第２回目のペプチド追加免疫を行なった。群１の動物（ｎ＝３、屠殺）は、１、４、１５、１８、２８、３２、４９及び５３日目に両側の鼠径部リンパ節にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物の注射（１００μｇ／日）を受けた。群２の動物（ｎ＝４、屠殺）は、１、４、１５及び１８日目に両側の鼠径部リンパ節にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物の注射（１００μｇ／日）を受け、その後左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａから成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を、２８、３２、４９及び５３日目に施した。群３の動物（ｎ＝４、屠殺）は、両側の鼠径部リンパ節において１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物（１００μｇ／日）の注射を受け、その後、左リンパ節におけるＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節におけるチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８日目及び３２日目に、そして左リンパ節へのＮＹ−ＥＳＯ−１157-165Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ（配列番号６）（４９日目及び５３日目に１２．５μｇ）、及び右リンパ節へのメラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）（４９日目及び５３日目に２５μｇ）から成る第２回目のペプチド追加免疫を受けた。抗原特異的（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１）インターフェロン−γスポット形成細胞／脾臓を非処理のナイーブ同腹子対照と比較した（図４Ｂ）。
【０１０８】
図４Ａは、プラスミド混合物で初回刺激され、チロシナーゼ及びＳＳＸ−２ペプチドで追加免疫された動物（群２、ｎ＝６）がプラスミド単独処置動物（群１、ｎ＝３）より２〜８倍高いＩＦＮγ産生細胞の強い四価応答を実証していることを示す。さらに、亜優勢エピトープペプチド、ＳＳＸ−２及びチロシナーゼ（群２）又は優勢エピトープペプチド、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びメラン−Ａ（群３）のいずれかについて第２回目の追加免疫を動物に施した場合、ｐＳＥＭ及びｐＢＰＬプラスミドの組合せ単独で初回刺激され、追加免疫された動物（群１）と比較して、四価応答が保持された（図４Ｂ）。亜優勢エピトープ類似体ＳＳＸ−２及びチロシナーゼで単に追加免疫することにより、４つの抗原すべてに対するより均衡のとれた免疫応答が達成された。
【０１０９】
全体的に、上記実施例（２〜５）から得られたデータは、本発明のＮＳ及び／又はＭＴレジメンで免疫付与された動物における四価免疫応答を首尾よく生じることを示す。ナイーブ動物又はｐＳＥＭ／ｐＢＰＬプラスミドの混合物単独で追加免疫された動物（群１）における免疫応答（テトラマー及びＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析）と、亜優勢ペプチド
エピトープチロシナーゼ及びＳＳＸ−２で追加免疫された動物（群２及び３）との、２８及び３２日目における比較は、このレジメンで免疫付与された動物における四価免疫応答が首尾よく生じていることを確認した。４９及び５３日目の第２回目のペプチド追加免疫後に類似の結果を得たが、この場合、群３（ｎ＝２５）を優勢エピトープペプチドであるメラン−Ａ26-35（Ａ２７Ｎｖａ）（配列番号１１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）で追加免疫し、そして群２（ｎ＝２５）を亜優勢エピトープペプチドチロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）（配列番号１２）及びＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）で再び追加免疫した。
【実施例６】
【０１１０】
ヒト黒色腫に対する免疫応答の発生
カルボキシ−フルオレセイン二酢酸塩、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）検定は、蛍光標識細胞のための簡単且つ高感度な手段を提供する。この方法は、抗原特異的及び非特異的なＴ細胞増殖の分析を可能にする。
【０１１１】
免疫付与プロトコルの効能を評価するために、ＣＦＳＥ方法を用いた。それらのテトラマーレベルに基づいて選択された動物を、肺中のヒトＣＦＳＥ標識黒色腫腫瘍細胞を取り除くそれらの能力に関して分析した。
【０１１２】
６１日目に、各群（群１、２及び３）から２匹の動物を高テトラマーレベルに基づいて選択し、そしてＣＦＳＥ標識腫瘍細胞を静脈内注射した。さらに正確には、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ及びメラン−Ａに関する全４つの腫瘍関連抗原を発現するヒト６２４．３８培養黒色腫腫瘍細胞（１０×１０6）を、ＣＦＳＥｈｉ（ＶｙｂｒａｎｔＣＦＤＡ  ＳＥ細胞トレーサーキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）蛍光（１．０μＭ、１５分間）で染色し、群１、２又は３の免疫付与マウス（Ｎ＝２／群）中に、又はナイーブＨＨＤマウス（Ｎ＝２）中に、等比率の６２４．２８ＨＬＡ−Ａ２陰性対照細胞（ＣＦＳＥｌｏ蛍光（０．１μＭ）で染色）と共に静脈内に同時注射した。２時間後に、標的細胞の２回目の注射を動物に施した。
【０１１３】
マウスを屠殺し、肺組織を取り出し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥｈｉ対ＣＦＳＥｌｏ蛍光（ＦＬ１チャンネル）を測定することにより、標的細胞注射後約１４時間、６２日目に、ヒト標的細胞の特異的排除を測定した。本特異的溶解を算定するために用いた式を以下に示す。
【０１１４】
［（１−％ＣＦＳＥｈｉ／％ＣＦＳＥｌｏ）（免疫付与）−（１−％ＣＦＳＥｈｉ／％ＣＦＳＥｌｏ）（ナイーブ）］×１００
【０１１５】
図５は、ナイーブ対照（左上パネル）、四価免疫を有する２匹の動物（右上及び左下パネル）、並びにメラン−Ａに対する一価応答を有する動物（右下パネル）からのテトラマーレベル、ＩＦＮγ、エリスポットの結果及びＣＦＳＥヒストグラムの２つのピークを示す。予測どおり、ナイーブ対照動物は、一価免疫応答を実証する動物の場合と同様、等比率の両ヒストグラムピークの等比率の保持により実証されるように標的細胞を取り除くことができなかった。他方、全４つの抗原に対する免疫応答を示す動物は７１％及び９５％特異的溶解で、ヒト黒色腫腫瘍標的細胞を取り除く効果が非常に高かった。
【実施例７】
【０１１６】
オリジナル対拡大プロトコルによる免疫応答の発生
プラスミドＤ１（ｐＲＰ１２）及びＤ２（ｐＢＰＬ）による免疫付与が、４つの腫瘍関連抗原：ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）に対するＨＨＤ−１
マウスにおける四価応答を誘導し得るか否かを査定した。
【０１１７】
２つの異なる追加免疫戦略を、所望の免疫応答を増強するそれらの能力に関して試験した。第１の手法（「オリジナル」プロトコル）は、追加免疫手順中の各ペプチドの１回の注射を利用した。第２の手法（「拡大」プロトコル）は、各ペプチドの２回の注射を試験した。各ペプチドの３つの投与量レベル（低、中及び高）を、用量−応答関係を決定し、そして最適ペプチド濃度を決定するのを手助けするために試験した。
【０１１８】
両側の鼠径部リンパ節中に直接注射されるプラスミドＤ１及びＤ２で、１０匹の雌ＨＨＤ−１動物／群の６つの群を免疫付与した。群１〜３からの動物を「オリジナル」プロトコルを用いて追加免疫し、そして群４〜６の動物を「拡大」プロトコルを用いて追加免疫した。
【０１１９】
「オリジナルプロトコル」における動物（群１〜３、ｎ＝１０／群）に、右リンパ節にＤ１（ｐＲＰ１２（配列番号２１））プラスミド（１００μｇ／投与）の４回の注射、及び左リンパ節にＤ２（ｐＢＰＬ（配列番号２０））プラスミド（１００μｇ／投与）の４回の注射を１、４、１５及び１８日目に受けた。この後、２９日目に右リンパ節へＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）（配列番号８）、及び左リンパ節へＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）による追加免疫、並びに３２日目に右リンパ節へＰＲＡＭＥ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）（配列番号７）、及び左リンパ節へＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）で追加免疫した。
【０１２０】
「拡大プロトコル」における動物（群４〜６、ｎ＝１０／群）は、右側鼠径部リンパ節にＤ１（ｐＲＰ１２（配列番号２１））プラスミド（１００μｇ／投与）、及び左側鼠径部リンパ節にＤ２（ｐＢＰＬ（配列番号２０））プラスミド（１００μｇ／投与）の４回の注射を１、４、１５及び１８日目に受けた。この動物を続いて、右リンパ節にＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）（配列番号８）、及び左リンパ節にＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）で２９日目及び３２日目に追加免疫させ、右リンパ節にＰＲＡＭＥ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）（配列番号７）、及び左リンパ節にＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）で４３日目及び４６日目に追加免疫した。
【０１２１】
最終ペプチド追加免疫から７日目に両方のプロトコルにおいて各群から採血し、テトラマー検定を用いてＣＤ８+Ｔ細胞分析を行なった（図６）。応答を、ナイーブ同腹子対照マウス（ｎ＝５）と比較した。低、中及び高ペプチドの追加免疫から成るオリジナルプロトコル及び拡大プロトコルを比較したＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡテトラマー値を示す（図６）。
【０１２２】
Ｄ１及びＤ２プラスミドの４回の注射で初回刺激され、その後、ペプチド類似体ＰＳＭＡ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２で追加免疫された動物は、テトラマー分析により査定した場合、全４つの抗原に対する免疫応答を示した（図６）が、この場合、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡに対する免疫応答が優勢であった。さらに、この免疫付与戦略により引き出される四価免疫応答を、個々の動物において実証した（図７）。応答は、追加免疫レジメンとは無関係であることが観察された（オリジナル対拡大）。さらに、見かけの用量−応答は観察されなかったが、各治療プロトコルにおける高用量群（２５μｇペプチド）は、最高応答率を生じた。さらに、テトラマーデータは、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡが動物の免疫付与後に優勢エピトープである、ということを示した。
【実施例８】
【０１２３】
オリジナル対拡大プロトコルによる免疫応答のＩＦＮ−γエリスポット
テトラマー検定で観察された結果を確証するために、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）エリスポット検定を実行した。実施例７における各群からの動物を、最終ペプチド追加免疫後２２日目に屠殺し、脾臓をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析のために取り出した。
【０１２４】
脾臓を６８日目に安楽死動物から単離し、単核球を、密度遠心分離（Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs, Burlington, NC）後に、ＨＬ−１培地中に再懸濁した。脾臓細胞（３×１０5又は１．５×１０5細胞／ウエル）を、１０μｇのＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）又はＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）、天然ペプチドと共に、９６ウエルフィルター膜プレート（Ｍｕｌｔｉ−ｓｃｒｅｅｎ  ＩＰ膜９６ウエルプレート, Millipore, MA）の三重反復試験ウエル中でインキュベートした。試料を、５％のＣＯ2及び湿度１００％で３７℃で７２時間インキュベートした後、展開した。マウスＩＦＮ−γコーティング抗体（ＩＦＮ−γ抗体対（U-CyTech Biosciences, The Netherlands））を脾臓細胞とのインキュベーション前にコーティング試薬として用いた後、ビオチン化検出抗体とインキュベートした。ＧＡＢＡ結合体及び所有権を有する基質（U-CyTech Biosciences）を、ＩＦＮ−γスポット展開に用いた。ＩＦＮ−γスポット分析について較正されるＥＬＩＳｐｏｔリーダーソフトウエアバージョン３．２．３を用いて、ＡＩＤ国際プレートリーダー上で展開から２４時間後に免疫付与動物におけるＣＴＬ応答を測定した。
【０１２５】
図７に示したＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ結果はテトラマーデータ（図６）と良好に相関し、そして「オリジナル」治療プロトコルにより引き出されるＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-433（配列番号４）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）に対する強い免疫応答を確認する。「拡大」プロトコルは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定した場合、「オリジナル」プロトコルを上回るいかなる見かけの利点も提供しないように思われた。
【実施例９】
【０１２６】
ＰＰ／ＮＳ治療レジメンにより発生する四価免疫応答
四価免疫応答は、亜優勢エピトープＰＳＭＡ及びＳＳＸ−２による第１回目の追加免疫、その後の優勢エピトープＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１による追加免疫によって引き出すことができるか否かを査定した。群１からの代表的動物（「オリジナルプロトコル」；高用量）に、右側鼠径部リンパ節にＤ１（ｐＲＰ１２（配列番号２１））プラスミド（１００μｇ／投与）の４回の注射、及び左側鼠径部リンパ節にＤ２（ｐＢＰＬ（配列番号２０））プラスミド（１００μｇ／投与）の４回の注射を１、４、１５及び１８日目に受けた。この後、ペプチド、例えば、２９日目に右リンパ節へのＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）（配列番号８）（２５μｇ）、及び左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）（２５μｇ）による追加免疫、並びに３２日目に右リンパ節へのＰＲＡＭＥ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）（配列番号７）（２０μｇ）、及び左リンパ節へのＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）（２５μｇ）による追加免疫を行なった。データ（図８）は、２つの別個の検定、テトラマー及びＥＬＩＳｐｏｔ分析によって測定した場合の、四価免疫反応を示す。
【実施例１０】
【０１２７】
ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ及びＳＳＸ−２に対するＣＴＬ活性を測定する51クロム放出検定
免疫付与マウスにおけるＤＮＡ初回刺激及びペプチド追加免疫並びに１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）後の51Ｃｒ細胞傷害活性検定を用いたＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）に対するＣＴＬ応答を査定した。ペプチド免疫付与レジメン完了の２２日後に免疫付与マウス（Ｎ＝６）から採取した脾臓細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ
刺激により、ＣＴＬを発生させた。
【０１２８】
手短にいうと、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。脾臓を均質化し、細胞懸濁液を濾し取って、単一細胞懸濁液を調製した。５×１０6細胞／ウエルの量を２４ウエル組織培養プレート中でプレーティングして、１．５×１０6ペプチドパルス刺激され、γ照射され、そしてＬＰＳ（リポ多糖）未分化（blasted）Ｂ細胞を各ウエルに付加した。マウス組換えＩＬ−２も、１ｎｇ／ｍｌの濃度で付加した。細胞を、ＰＲＡＭＥ群に関しては４日間、ＰＳＭＡ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１群のそれぞれに関しては６日間、インキュベートした。
【０１２９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激後、ＣＴＬをプレートから収集し、洗浄し、そして総量１００μＬ／ウエルで、１０6、３．３×１０5及び１．１×１０5細胞／ウエルの濃度で、９６ウエルＵ底マイクロタイター検定プレート中にプレーティングした。ペプチド特異的溶解を査定するために、Ｔ２細胞を51Ｃｒで標識し、そして２０μｇ／ｍＬの各ペプチド（ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ又はＰＲＡＭＥ）で３７℃で１．５時間、パルス刺激した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、再懸濁した。１０，０００個の51Ｃｒ標識及びペプチドパルスＴ２細胞を、各ウエルに付加した。次に細胞を３７℃で４時間インキュベートした。
【０１３０】
インキュベーション後、上清を収穫し、そしてガンマ計数器を用いて三重試料で細胞溶解活性を測定した。ウエルの各複製物に関して平均ｃｐｍを用いて、エフェクター細胞の各濃度に関して、補正された溶解％を算定した（図８）。以下の方程式を用いて、特異的な溶解％を算定した：放出％＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。データは、以下のように示される：ｘ軸はエフェクター対標的比を示す；ｙ軸は対応する特異的な溶解パーセンテージを示す。
【０１３１】
結果（図８）は、標的としてＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）（パネル１）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）（パネル２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）（パネル３）又はＳＳＸ−２41-49（配列番号１）（パネル４）ペプチドでパルス刺激されたＴ２細胞に対する各群からのＣＴＬに関する51クロム放出検定（ＣＲＡ）データを示す。特異的溶解値を、非パルスＴ２対照細胞と比較した。ＥＬＩＳＡ分析（データは示されていない）が、ＰＲＡＭＥ群の免疫原性が非常に強力であり、抗原誘導性細胞死を回避するためであるということを示した場合、ＰＲＡＭＥ群に関するＣＲＡを、４日ＩＶＳプロトコルの後に追跡した。他のペプチド群に関しては、６日ＩＶＳの後にＣＲＡを実行した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後に、全免疫付与群から単離されたＴ細胞は、ナイーブ動物からのものと対比して、ペプチドでパルス刺激されたＴ２細胞を特異的に殺すことが判明した。ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）に対するＣＴＬ応答は、51Ｃｒ細胞傷害性検定により査定されるように、全群において誘導された。これらのＣＴＬは、ペプチドを伴わないＴ２対照細胞に影響を及ぼさなかった。その結果は、免疫付与マウスから単離されるＣＴＬによるＴ２標的細胞溶解がペプチド特異的である、ということを実証した。「オリジナル」プロトコルと比較して、「拡大」プロトコルは溶解パーセンテージの有意の増強を提供しなかったが、これはさらに「オリジナル」プロトコルが多抗原に対する実質的な免疫応答を引き出すために十分である、ということを示唆する。さらに、ＣＲＡ検定の感受性増大のため、各群からの特異的ＮＹ−ＥＳＯ−１応答は、テトラマー及びＥＬＩＳＰＯＴ検定と比較して、より優勢であった。
【実施例１１】
【０１３２】
多治療周期の使用
プラスミドＤ１（ｐＲＰ１２（配列番号２１））及びＤ２（ｐＢＰＬ（配列番号２０）
）による免疫付与が、本発明の治療レジメンの２回以上の周期後に、４つの腫瘍関連抗原：ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）に対するＨＨＤ−１マウスにおける強い免疫応答を保持し得るか否かを査定した。
【０１３３】
雄及び雌ＨＨＤ−１マウスを、プラスミドＤ１及びプラスミドＤ２を両側の鼠径部リンパ節に直接注入することにより免疫付与した後、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＳＳＸ−２41-49（配列番号１）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）によるペプチド追加免疫を行なった。動物は、右側鼠径部リンパ節にＤ１（ｐＲＰ１２（配列番号２１））プラスミドの４回の注射、及び左側鼠径部リンパ節にＤ２（ｐＢＰＬ（配列番号２０））プラスミドの４回の注射を、１、４、１５及び１８日目に受けた。この後、２９日目に右リンパ節へＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）（配列番号８）、及び左リンパ節へＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）（配列番号５）による追加免疫、並びに３２日目に右リンパ節においてＰＲＡＭＥ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）（配列番号７）、及び左リンパ節においてＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）（配列番号６）による追加免疫を行なった。第２回目の初回刺激（プラスミド）／追加免疫（ペプチド）治療サイクルを１４日間の休止期間の後繰り返した。
【０１３４】
動物に、プラスミドビヒクル（Ｎ＝１６動物／群）、ペプチドビヒクル（Ｎ＝１６動物／群）、高用量のプラスミド（合計用量４００μｇ）（Ｎ＝１６動物／群）、高用量のペプチド（合計用量２５μｇ）（Ｎ＝１６動物／群）、高用量のプラスミド（合計用量４００μｇ）＋低用量のペプチド（合計用量５μｇ）（Ｎ＝１６動物／群）、低用量のプラスミド（合計用量１００μｇ）＋高用量のペプチド（合計用量２５μｇ）（Ｎ＝１４動物／群）、又は高用量のプラスミド（合計用量４００μｇ）＋高用量のペプチド（合計用量２５μ）（Ｎ＝１６動物／群）を注射し、ナイーブ対照群（Ｎ＝７動物／群）と比較した。
【０１３５】
各群からの動物を、最終ペプチド追加免疫の１４日後に屠殺し、脾臓をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析のために取り出した（図９）。
【０１３６】
データは、ＰＰ（ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）レジメン及びＮＳ（ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２）レジメンの２回の治療レジメン後に、強い免疫応答を発生し得る、ということを示す。
【０１３７】
全体的に、実施例７〜１１から得られるデータは、ＰＰ／ＮＳ治療的免疫付与プロトコル後に、有意のＴ細胞応答を示すが、有意の抗体応答を示さない。ペプチド特異的抗体は、１回の完全治療周期後に、ＥＬＩＳＡ検定を用いて、免疫付与マウスの血清中に検出されなかった（データは示されていない）。さらに、抗原特異的Ｔ細胞応答は、エフェクター細胞及びメモリーＴ細胞を包含し（ＩＦＮγサイトカイン産生、細胞溶解及びテトラマー結合）、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ誘導（leading）並びにＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１追跡（trailing）と匹敵する。さらに結果は、治療プロトコルの拡大はより高いＴ細胞免疫を達成し得ないが、治療周期内の優勢ペプチドに比した亜優勢ペプチドの並べ換え（reordering）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１又は任意の他の亜優勢エピトープに対する免疫を改善するために必要とされ得る、ということを示す。
【０１３８】
本出願に既に開示されたものに加えて、以下の出願は参照により本明細書にその全体が援用される。クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答、特に抗原に対するエフェクター応答及びメモリーＣＴＬ応答を誘起、同調、維持、調節及び増幅する上で、開示されている類似体を使用するのに有用な方法は、共に表題「A Method of Inducing a CTＬ Response」米国特許第６，９９４，８５１号（２００６年２月７日）及び同第６，９７７，０７４号（２
００５年１２月２０日）、表題「METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE」米国特許仮出願第６０／４７９，３９３号（２００３年６月１７日出願）、並びに共に表題「Methods to elicit， enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes， for prophylactic or therapeutic purpose」米国特許出願第１０／８７１，７０７号（公開番号２００５  ００７９１５２）及び米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号（２００４年１２月２９日出願）に記載されている。また、類似体を研究に用いて、さらなる最適な類似体を得ることができる。多くのハウスキーピングエピトープは、米国特許出願第１０／１１７，９３７号（２００２年４月４日出願）（公開番号２００３０２２０２３９  Ａ１）及び同第１０／６５７，０２２号（２００４０１８０３５４）、並びに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９  Ａ２）（２００３年９月５日出願）、並びに米国特許仮出願第６０／２８２，２１１号（２００１年４月６日出願）、同第６０／３３７，０１７号（２００１年１１月７出願）、同第６０／３６３，２１０号（２００２年３月７日出願）及び同第６０／４０９，１２３号（２００２年９月５日出願）に提示されており、これらの出願はそれぞれ、「Epitope Sequences」と題されている。類似体はさらに、これらの出願に記載されている種々の形態のいずれでも用いることができる。本発明の類似体から成るか又はこれを含み得るエピトープクラスターは、表題「EPITOPE CLUSTERS」米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）に開示及びより詳細に定義されている。本発明の類似体を使用及び送達する方法は、それぞれ表題「METHOD OF INDUCING
A CTL RESPONSE」米国特許出願第０９／３８０，５３４号及び同第６９７７０７４号（２００５年１２月２０日発行）、及び国際出願番号第ＰＣＴＵＳ９８／１４２８９号（公開番号ＷＯ９９０２１８３  Ａ２）に記載されている。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択原理は、全て表題「Epitope Synchronization in Antigen Presenting Cells」米国特許出願第０９／５６０，４６５号（２０００年４月２８日出願）、同第１０／０２６，０６６号（公開番号２００３０２１５４２５  Ａ１）（２００１年１２月７日出願）及び同第１０／００５，９０５号（２００１年１１月７日出願）；表題「Method
of Epitope Discovery」同第６，８６１，２３４号（２００５年３月１日発行、出願番号第０９／５６１，０７４号）；表題「EPITOPE CLUSTERS」同第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）；表題「Anti-Neovasculature Preparations for Cancer」同第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４  Ａ１）（２００２年３月７日出願）；共に表題「EPITOPE SEQUENCES」出願番号第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９  Ａ１）及び国際出願番号第ＰＣＴＵＳ０２／１１１０１号（公開番号ＷＯ０２０８１６４６  Ａ２）（共に２００２年４月４日出願）；並びに、共に表題「EPITOPE SEQUENCES」出願番号第１０／６５７，０２２号及び国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６号（公開番号ＷＯ０４０２２７０９  Ａ２）（共に２００３年９月５日出願）において開示されている。ワクチンプラスミドの全体的な設計の態様は、表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens」米国特許出願第０９／５６１，５７２号（２０００年４月２８日出願）、及び表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods
for their Design」同第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４  Ａ１）（２００２年１１月７日出願）；共に表題「EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS」同第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３−０１３８８０８）（２００２年８月２０日出願）、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１号（公開番号ＷＯ２００４／０１８６６６）（２００３年８月１９日出願）；並びに表題「AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION」米国特許第６，７０９，８４４号に開示されている。特定の癌に対する免疫応答を誘導する際に特定の利点を有する特定の抗原の組合せは、全て表題「Combinations
of tumor-associated antigens in vaccines for various types of cancers」米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号（２００３年６月１７日出願）及び米国特許出願第１０／８７１，７０８号（２００４年６月１７日出願）、並びに国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ
２００４／０１９５７１号（公開番号ＷＯ２００４／１１２８２５）に開示されている。腫瘍新血管系に関する抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）も、癌疾患に関して有用であり、それは、表題「Anti-Neovasculature Preparations for Cancer」米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４  Ａ１）（２００２年３月７日出願）に開示されている。生体応答改変物質の誘導投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，７２７号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。免疫応答の誘起においてＣＤ４＋細胞をバイパスする方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，８２１号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。標的組織、細胞及び疾患に関する例示的な疾患、組織及び抗原、並びにエピトープは、表題「METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE」米国特許出願第６９７７０７４号（２００５年１２月２０日発行）（２００１年２月２日出願）に記載されている。例示的な方法は、共に表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第２００６−０００８４６８  Ａ１号（２００６年１月１２日発行）に見い出されている。方法及び組成物はまた、表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF
CANCER）」米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。本発明の類似体を利用することを含む免疫方法による免疫応答を評価及びモニタリングする診断技法の統合されたものは、共に表題「Improved efficacy of active immunotherapy by integrating diagnostic with therapeutic methods」米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第２００５−０２８７０６８  Ａ１号（２００５年１２月２９日公開）により詳細に記載されている。免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、表題「Expression Vectors Encoding Epitopes of Target-Associated Antigens and Methods for their Design」米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４  Ａ１）（２００２年１１月７日出願）、及び表題「Methods and compositions to elicit multivalent immune responses against dominant and subdominant epitopes， expressed on cancer cells and tumor stroma」米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号（２００５年６月１７日出願）に開示されている。問題の方法及び組成物を含むさらなる有用な開示は、表題「Multivalent Entrain-and-Amplify Immunotherapeutics for Carcinoma」米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）に見い出されている。さらなる方法、組成物、ペプチド、及びペプチド類似体は、それぞれ表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」及び「NY-ESO PEPTIDE ANALOGS」米国特許仮出願第６０／５８１，００１号及び同第６０／５８０，９６２号（共に２００４年６月１７日出願）に開示されている。上記の段落に記述されている出願及び特許はそれぞれ、教示する全てのものに関してその全体が参照により本明細書に完全に援用される。さらなる類似体、ペプチド及び方法は、表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」米国特許出願公開番号２００６００６３９１３、及び表題「EPITOPE ANALOGS」米国特許公開番号２００６−００５７６７３  Ａ１（２００６年３月１６日公開）、表題「EPITOPE ANALOGS」及びＰＣＴ特許出願公開ＷＯ／２００６／００９９２０（全て２００５年６月１７日出願）に開示されている。さらなる方法論及び組成物は、表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」米国特許仮出願第６０／５８１，００１号（２００４年６月１７日出願）、及び表題「NY-ESO PEPTIDE ANALOGS」米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号（２００４年６月１７日出願）（これらはそれぞれ、参照により本明細書に完全に援用される）に開示されている。一例であってそれらに限定されないが、各参考文献は、クラスＩ  ＭＨＣ拘束エピトープ、類似体、類似体の設計、エピトープ及び類似体の使用、並びにエピトープを使用及び生成する方法、それらの発現に関する核酸ベクターの設計及び使用について教示しているものに関して参照により援用される。参照により本明細書に完全に援用される他の出願は、表題「SSX-2 PEPTIDE ANALOGS」米国特許出願第１１／１５６，２５３号（公開番号２００６００６３９１３）（２００５年６月１７日出願）、表題「NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS」米国特許出願第１１／１５５，９２９号（２００
５年６月１７日出願）（公開番号２００６００９４６６１）、表題「METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS」米国特許出願第１１／３２１，９６７号（２００５年１２月２９日出願）；表題「METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE REPONSES AGAINST MHC CLASS I RESTRICTED EPITOPES， FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES）」米国特許出願第１１／３２３，５７２号（２００５年１２月２９日出願）；表題「METHODS TO BYPASS CD４+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE」米国特許出願第１１／３２３，５２０号（２００５年１２月２９日出願）；表題「COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」米国特許出願第１１／３２３，０４９号（２００５年１２月２９日出願）；表題「COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS」米国特許出願第１１，３２３，９６４号（２００５年１２月２９日出願）；表題「EPITOPE ANALOGS」米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（２００５年６月１７日出願）である。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ペプチド追加免疫前のｐＳＥＭ／ｐＢＰＬ初回刺激動物のテトラマー分析。両側の鼠径部リンパ節における１、４、１５及び１８日目のｐＳＥＭ／ｐＢＰＬプラスミド混合物（１００μｇ／日）の４回注射により、群１、２及び３の動物（ｎ＝６０）を初回刺激した。最終プラスミド注射後１０日である即ち２５日目にテトラマー分析を実施し、非処置ナイーブ同腹子対照（ｎ＝５）と比較した。テトラマー値（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１）は、平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図２】３９日目に、メラン−Ａ／チロシナーゼ、ＳＳＸ−２／ＮＹ−ＥＳＯ−１テトラマー分析を実施して、個々の動物における四価免疫応答を実証した。１、４、１５及び１８日目に、両側の鼠径部リンパ節への注射によりｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で動物を初回刺激し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目に施した。群２からの代表的動物（ｎ＝３）を示し、非処置ナイーブ同腹子対照に対するテトラマー値と比較する。
【図３】ｐＳＥＭ／ｐＢＰＬ初回刺激、ＳＳＸ−２／チロシナーゼ追加免疫動物のテトラマー分析。最終ペプチド注射後７日、即ち３９日目に、メラン−Ａ／チロシナーゼ、ＳＳＸ−２／ＮＹ−ＥＳＯ−１テトラマー分析を実施した。群１の動物（ｎ＝１０）を、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で初回刺激し、その後、２８及び３２日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で追加免疫した。群２及び３の動物（ｎ＝５０）を、群１と同様にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物で初回刺激し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目に施した。平均テトラマー値（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１）を、非処置ナイーブ同腹子対照（ｎ＝５）と比較し、平均＋／−ＳＥＭを表す。
【図４】第１回目のペプチド追加免疫後のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ分析（図４Ａ）。４１日目に、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を実施した。群１の動物（ｎ＝３、屠殺）を、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で初回刺激し、その後、２８及び３２日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物（１００μｇ／日）で追加免疫した。群２及び３の動物（ｎ＝６、屠殺）を、群１と同様にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭのプラスミド混合物で初回刺激し、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目に施した。抗原特異的（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１）インターフェロン−γスポット形成細胞／脾臓を、非処置ナイーブ同腹子対照（ｎ＝３）と比較した；図４Ａ  ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を三重で実施した。値を平均＋／−標準偏差で表す。ペプチド刺激濃度は１０μｇ／ｍｌであり、４２時間インキュベートした。図４Ｂ  第２回目のペプチド追加免疫後の−ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析。６３日目に代表的動物を屠殺することにより、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を実施した。群１の動物（ｎ＝３、屠殺）は、１、４、１５、１８、２８、３２、４９及び５３日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物の注射（１００μｇ／日）を受けた。群２の動物（ｎ＝４、屠殺）は、１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物の注射（１００μｇ／日）を受け、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８、３２、４９及び５３日目に施した。群３の動物（ｎ＝７、屠殺）は、両側の鼠径部リンパ節に１、４、１５及び１８日目にｐＢＰＬ＋ｐＳＥＭの混合物（１００μｇ／日）の注射を受け、その後、左リンパ節へのＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ（配列番号５）、及び右リンパ節へのチロシナーゼ369-377Ｖ３７７Ｎｖａ（配列番号１２）から成るペプチド追加免疫（２５μｇ／日）を２８及び３２日目に、そして左リンパ節へのＮＹ−ＥＳＯ−１157-165Ｌ１５８Ｎｖａ（配列番号６）、Ｃ１６５Ｖ（１２．５μｇ、４９及び５３日目）、及び右リンパ節へのメラン−Ａ26-35Ａ２７Ｎｖａ（配列番号１１）（２５μｇ、４９及び５３日目）から成る第２回目のペプチド追加免疫を受けた。抗原特異的（メラン−Ａ、チロシナーゼ、ＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１）インターフェロン−γスポット形成細胞／脾臓を、非処置ナイーブ同腹子対照と比較した（図４Ｂ）。ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を三重反復実験で実施した。値を平均＋／−ＳＥＭで表す。ペプチド刺激濃度は１０μｇ／ｍｌであり、４２時間インキュベートした。
【図５−１】４つの腫瘍関連抗原すべてを発現するヒト黒色腫腫瘍細胞を用いて動物を試験したｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのテトラマーレベル、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びカルボキシ−フルオレセイン二酢酸塩、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ヒストグラムを示す。ナイーブ対照（左上パネル）；四価免疫を有する２匹の動物（右上パネル及び左下パネル）；及びメラン−Ａに対する一価応答を有する動物（右下パネル）。
【図５−２】４つの腫瘍関連抗原すべてを発現するヒト黒色腫腫瘍細胞を用いて動物を試験したｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのテトラマーレベル、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びカルボキシ−フルオレセイン二酢酸塩、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ヒストグラムを示す。ナイーブ対照（左上パネル）；四価免疫を有する２匹の動物（右上パネル及び左下パネル）；及びメラン−Ａに対する一価応答を有する動物（右下パネル）。
【図５−３】４つの腫瘍関連抗原すべてを発現するヒト黒色腫腫瘍細胞を用いて動物を試験したｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのテトラマーレベル、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びカルボキシ−フルオレセイン二酢酸塩、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ヒストグラムを示す。ナイーブ対照（左上パネル）；四価免疫を有する２匹の動物（右上パネル及び左下パネル）；及びメラン−Ａに対する一価応答を有する動物（右下パネル）。
【図５−４】４つの腫瘍関連抗原すべてを発現するヒト黒色腫腫瘍細胞を用いて動物を試験したｉｎ  ｖｉｖｏ試験からのテトラマーレベル、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びカルボキシ−フルオレセイン二酢酸塩、スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）ヒストグラムを示す。ナイーブ対照（左上パネル）；四価免疫を有する２匹の動物（右上パネル及び左下パネル）；及びメラン−Ａに対する一価応答を有する動物（右下パネル）。
【図６】「オリジナル」対「拡大」プロトコルのテトラマー分析。右鼠径部リンパ節にＤ１（ｐＲＰ１２）プラスミド（４ｍｇ／ｍｌ）の４回注射並びに左鼠径部リンパ節にＤ２（ｐＢＰＬ）プラスミド（４ｍｇ／ｍｌ）の４回注射で、「オリジナルプロトコル」（群１〜３）又は「拡大プロトコル」（群４〜６）に基づいて、動物に注射した。その後、ＰＳＭＡ、ＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ及びＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いて動物を追加免疫した。１、４、１５及び１８日目にＤ１（ｐＲＰ１２）プラスミド及びＤ２（ｐＢＰＬ）プラスミド（４ｍｇ／ｍｌ）で動物を初回刺激して、その後、オリジナルプロトコルに関して２９及び３１日目にＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）ペプチド（ＲＬＮ）（配列番号８）及びＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）ペプチド（ＬＬＮ）（配列番号５）で追加免疫し；そして拡大プロトコル（群４〜６）に関して４２、４５日目にＰＲＡＭＥ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）ペプチド（ＲＬＮ）（配列番号７）及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）ペプチド（ＬＬＮ）（配列番号６）で追加免疫した。値は、ペプチド追加免疫後の個々の動物からの平均＋／−ＳＥＭを表し、そして未処置ナイーブ同腹子対照（ｎ＝５）と比較する。
【図７】群１（図６）における代表的動物からの四価免疫応答。プラスミド初回刺激後、ＰＳＭＡペプチド（２５μｇ）及びＰＲＡＭＥペプチド（２０μｇ）を右リンパ節に注射した。それぞれ２５μｇのＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを左リンパ節に注射した。示したデータは、テトラマー及びＥＬＩＳｐｏｔ検定の両方により免疫応答を測定する。
【図８】「オリジナル」対「拡大」プロトコルのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析。総抗原特異的（ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）インターフェロン−γスポット形成細胞／脾臓を示して、低、中及び高ペプチド追加免疫から成る「オリジナル」及び「拡大」プロトコルを比較する。ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ分析を三重反復実験で実施した。値は、ペプチド追加免疫後の平均＋／−ＳＥＭを表す。７２時間、１０μｇ／ｍｌの濃度のペプチド（ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）を用いて、９６ウエルＥＬＩＳｐｏｔプレート中においてｅｘ  ｖｉｖｏで、脾臓細胞（３×１０5細胞／ウエル）を刺激した。値を総有核脾臓細胞から推測し、各動物からの脾臓当たりで正規化する。
【図９−１】51Ｃｒ細胞傷害活性検定。図９は、ＤＮＡ初回刺激及びペプチド追加免疫、並びに免疫付与マウスにおける１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後の、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）に対するＣＴＬ応答を示す。データは以下のように示される：ｘ軸はエフェクター対標的比を示す；ｙ軸は対応するパーセンテージ特異的溶解を示す。
【図９−２】51Ｃｒ細胞傷害活性検定。図９は、ＤＮＡ初回刺激及びペプチド追加免疫、並びに免疫付与マウスにおける１回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後の、ＰＲＡＭＥ425-433（配列番号３）、ＰＳＭＡ288-297（配列番号４）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（配列番号２）及びＳＳＸ−２41-49（配列番号１）に対するＣＴＬ応答を示す。データは以下のように示される：ｘ軸はエフェクター対標的比を示す；ｙ軸は対応するパーセンテージ特異的溶解を示す。
【図１０】ＰＲＡＭＥのペプチド優性を示すＰＰ（ＰＲＡＭＥ及びＰＳＭＡ）レジメン及びＮＳ（ＮＹ−ＥＳＯ−１及びＳＳＸ−２）レジメンの２サイクルの治療レジメンにより引き出される免疫応答。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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