(57)【要約】  本発明は２−メチレン−１９−ノル−１７−エンビタミンＤアナログに関し、特に２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールおよびその医薬用途に関する。本化合物は未分化細胞の増殖を抑制し、それらの単球への分化を誘発する著しい活性を示し、これにより抗癌剤としての使用と、乾癬ならびに小じわ、たるんだ皮膚、乾燥皮膚および皮脂分泌の不足などの皮膚の状態などの皮膚疾患の治療のための使用の証拠を示している。本化合物はまた、あるとしてもほんの少ししかカルシウム作用を示さず、従ってヒトにおける自己免疫疾患および炎症性疾患ばかりでなく腎性骨異栄養症の治療にも使用できる。本化合物はまた、肥満の治療にも使用できる。【選択図】図１
2008520705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008520705.tif 000007
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物。
【請求項２】
Ｘ２が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が水素である、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１およびＸ２が共にｔ−ブチルジメチルシリルである、請求項１記載の化合物
【請求項５】
薬学的に許容される賦形剤と共に、請求項１記載の少なくとも１つの化合物の有効量を含有する医薬組成物。
【請求項６】
前記有効量が組成物１ｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記有効量が組成物１ｇ当たり約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
式：
【化２】
2008520705.tif 000008
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロール。
【請求項９】
薬学的に許容される賦形剤と共に２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールの有効量を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
前記有効量が組成物１ｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０００μｇを含む、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記有効量が組成物１ｇ当たり約０．１μｇ〜約５００μｇを含む、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式：
【化３】
2008520705.tif 000009
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を乾癬患者に投与することを含む乾癬の治療方法。
【請求項１３】
化合物が経口投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
化合物が非経口投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
化合物が経皮投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
化合物が局所投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
化合物が直腸投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
化合物が経鼻投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
化合物が舌下投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、式：
【化４】
2008520705.tif 000010
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
式：
【化５】
2008520705.tif 000011
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を、白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌または前立腺癌からなる群から選択される疾患の患者に投与することを含む前記疾患の治療方法。
【請求項２３】
化合物が経口投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
化合物が非経口投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
化合物が経皮投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
化合物が直腸投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
化合物が経鼻投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
化合物が舌下投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
化合物が式：
【化６】
2008520705.tif 000012
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
式：
【化７】
2008520705.tif 000013
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を、多発性硬化症、狼瘡、糖尿病、移植片対宿主拒絶反応、および臓器移植拒絶反応からなる群から選択される自己免疫疾患の患者に投与することを含む、前記疾患の治療方法。
【請求項３２】
化合物が経口投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
化合物が非経口投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
化合物が経皮投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
化合物が直腸投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
化合物が経鼻投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
化合物が舌下投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
化合物が式：
【化８】
2008520705.tif 000014
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
式：
【化９】
2008520705.tif 000015
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を、リウマチ様関節炎、喘息、および炎症性腸疾患からなる群から選択される炎症性疾患の患者に投与することを含む、前記疾患の治療方法。
【請求項４１】
化合物が経口投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
化合物が非経口投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
化合物が経皮投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
化合物が直腸投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
化合物が経鼻投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
化合物が舌下投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４７】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４８】
化合物が式：
【化１０】
2008520705.tif 000016
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４０記載の方法。
【請求項４９】
式：
【化１１】
2008520705.tif 000017
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を、小じわ、適切な肌の張りの不足、適切な皮膚の水分量の不足および皮脂分泌の不足からなる群から選択される皮膚の状態の患者に投与することを含む、前記皮膚の状態の治療方法。
【請求項５０】
化合物が経口投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
化合物が非経口投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
化合物が経皮投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
化合物が局所投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
化合物が直腸投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５５】
化合物が経鼻投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５６】
化合物が舌下投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５７】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５８】
化合物が式：
【化１２】
2008520705.tif 000018
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項４９記載の方法。
【請求項５９】
式：
【化１３】
2008520705.tif 000019
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量を腎性骨異栄養症患者に投与することを含む、腎性骨異栄養症の治療方法。
【請求項６０】
化合物が経口投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
化合物が非経口投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
化合物が経皮投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
化合物が直腸投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
化合物が経鼻投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６５】
化合物が舌下投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６６】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項５９記載の方法。
【請求項６７】
化合物が式：
【化１４】
2008520705.tif 000020
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項５９記載の方法。
【請求項６８】
式：
【化１５】
2008520705.tif 000021
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）を有する化合物の有効量をその必要性のある動物に投与することを含む、動物における肥満の治療または予防、脂肪細胞分化の抑制、ＳＣＤ−１遺伝子の転写の抑制および／または体脂肪の抑制をする方法。
【請求項６９】
化合物が経口投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
化合物が非経口投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
化合物が経皮投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
化合物が直腸投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
化合物が経鼻投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
化合物が舌下投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７５】
化合物が約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日の投与量で投与される、請求項６８記載の方法。
【請求項７６】
化合物が式：
【化１６】
2008520705.tif 000022
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである、請求項６８記載の方法。
【請求項７７】
動物がヒトである、請求項６８記載の方法。
【請求項７８】
動物が家畜である、請求項６８記載の方法。
【請求項７９】
動物が農業動物である、請求項６８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明はビタミンＤ化合物に関し、より具体的には２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールおよびその医薬用途に関する。
【０００２】
天然のホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３とそのエルゴステロール系列のアナログである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２は、動物およびヒトにおける極めて強力なカルシウムホメオスタシス調節剤であることが知られ、それらの細胞分化における活性もまた立証されている（Ostrem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2610 (1987))。１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、種々の側鎖のビタミン同族体およびフッ素化アナログを含む、これらの代謝物の多くの構造アナログが製造され試験されてきた。これらの化合物の一部は、細胞分化とカルシウム調節における興味ある活性の分離を示す。この活性の相違は、腎性骨異栄養症、ビタミンＤ抵抗性くる病、骨粗鬆症、乾癬、および特定の悪性腫瘍などの種々の疾患の治療に有用でありうる。
【０００３】
ビタミンＤアナログの他の種類、すなわちいわゆる１９−ノル−ビタミンＤ化合物は、ビタミンＤ系の典型であるＡ環の環外メチレン基（炭素１９）が２つの水素原子で置換されていることにより特徴付けられる。このような１９−ノル−アナログ（例えば、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３）の生物学的試験により、細胞分化の誘導における高い有効性と、大変低いカルシウム動員活性を有する選択活性プロフィールが明らかになった。従って、これらの化合物は、悪性腫瘍の治療または種々の皮膚障害の治療のための治療剤として有用な可能性がある。このような１９−ノル−ビタミンＤアナログの２つの異なる合成方法が記載されている(Perlman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991), and DeLuca et al., 米国特許第５，０８６，１９１号)。
【０００４】
米国特許第４，６６６，６３４号において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の２β−ヒドロキシおよびアルコキシ（例えば、ＥＤ−７１）アナログが、骨粗鬆症薬候補として、そして抗癌剤としてChugaiグループにより記載され試験されている。Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989) もまた参照のこと。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の他の２位置換（ヒドロキシアルキル（例えば、ＥＤ−１２０）およびフルオロアルキル基による）Ａ環アナログもまた製造され試験されている(Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. 1, 190 (1993); Posner et al., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), and J. Org. Chem. 60, 4617 (1995))。
【０００５】
１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３の２位置換アナログ、すなわちヒドロキシまたはアルコキシ基(DeLuca et al., 米国特許第5,536,713号)、２−アルキル基(DeLuca et al 米国特許第５，９４５，４１０号)、および２−アルキリデン基(DeLuca et al 米国特許第５，８４３，９２８号）で２位を置換された化合物もまた合成され、それらは興味ある選択活性プロフィールを示している。これらの研究は全て、ビタミンＤ受容体の結合部位が、合成ビタミンＤアナログのＣ−２における異なる置換基に適合できることを示している。
【０００６】
薬理学的に重要なビタミンＤ化合物の１９−ノルクラスを探求するための継続的な努力の中で、炭素２（Ｃ−２）におけるメチレン置換基、炭素１（Ｃ−１）におけるヒドロキシル基および炭素２０（Ｃ−２０）に結合した短くした側鎖の存在により特徴付けられるアナログもまた合成され、試験されている。１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−プレグナカルシフェロールは米国特許第６，５６６，３５２号に記載され、１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，５７９，８６１号に記載され、１α−ヒドロキシ−２−メチレン−１９−ノル−ビスホモプレグナカルシフェロールは米国特許第６，６２７，６２２号に記載されている。これらの化合物は３つとも全て、ビタミンＤ受容体に対する比較的高い結合活性と比較的高い細胞分化活性を示すが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較してカルシウム作用をほとんど示さない。’３５２、’８６１および’６２２の特許に記載されているように、その生物活性により、これらの化合物は種々の医薬用途に対して優れた候補と考えられる。
発明の概要
本発明は２−メチレン−１９−ノル−１７−エン−ビタミンＤアナログに関し、より具体的には２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロール、それらの生物活性、およびこれらの化合物の種々の医薬用途に関する。
【０００７】
これらの２−メチレン−１９−ノル−１７−エン−ビタミンＤアナログの構造は、下記の一般式Ｉ：
【０００８】
【化１】
2008520705.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｘ１およびＸ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水素またはヒドロキシ保護基から選択される）で特徴付けられる。好ましいアナログは、下記の式Ｉａ：
【００１０】
【化２】
2008520705.tif 000004
【００１１】
を有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールである。
【００１２】
上記の化合物Ｉ、特に化合物Ｉａは、望ましく、かつ大変に好都合な生物活性のパターンを示す。これらの化合物は、ビタミンＤ受容体への比較的強い結合と、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に比べて大変低い腸管カルシウム輸送活性とで特徴付けられ、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較して、骨からのカルシウム動員活性は大変低い。従って、これらの化合物はカルシウム作用をほとんど示さないことで特徴付けられる。プレプロ副甲状腺ホルモン遺伝子(Darwish & DeLuca, Arch. Biochem. Biophys. 365, 123-130, 1999) および副甲状腺増殖を抑制するとき、血清カルシウムを超生理学的レベルに上昇させるのは望ましくない。分化に対して強い作用を示す一方でカルシウム作用をほとんどあるいは全く示さないこれらのアナログは、腎性骨異栄養症の二次性副甲状腺機能亢進症の抑制のための治療剤として有用であると期待される。
【００１３】
本発明の化合物Ｉ、特に化合物Ｉａは、例えば多発性硬化症、狼瘡、糖尿病、移植片対宿主拒絶反応、および臓器移植拒絶反応を含む自己免疫疾患における免疫系の不均衡により特徴付けられるヒト障害の治療と予防にとりわけ適し、さらにリウマチ様関節炎、喘息、および炎症性腸疾患（セリアック病、潰瘍性大腸炎、およびクローン病など）などの炎症性疾患の治療にとりわけ適していることもまた見いだされている。本発明の化合物で治療できる他の状態にはアクネ、脱毛症および高血圧がある。
【００１４】
上記の化合物Ｉ、特に化合物Ｉａは、比較的高い細胞分化活性によっても特徴付けられる。従って、これらの化合物はまた、乾癬治療用の治療剤または特に白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対する抗癌剤としての治療剤を提供する。さらに、その比較的高い細胞分化活性により、これらの化合物は、小じわ、適切な皮膚の水分量の不足（すなわち乾燥皮膚）、適切な肌の張りの不足（すなわちたるんだ皮膚）、および皮脂分泌の不足を含む種々の皮膚の状態を治療するための治療剤を提供する。従って、これらの化合物の使用により皮膚に潤いを与えられるばかりでなく、皮膚のバリア機能もまた改善される。
【００１５】
本発明の式Ｉの化合物、特に式Ｉａの化合物は、動物被験体における、肥満の予防または治療、脂肪細胞分化の抑制、ＳＣＤ−１遺伝子の転写抑制、および／または体脂肪の抑制にも有用である。従って、一部の実施形態において、動物被験体における肥満の予防または治療、脂肪細胞分化の抑制、ＳＣＤ−１遺伝子の転写抑制、および／または体脂肪の抑制方法は、式Ｉの化合物の１以上またはそれを含む医薬組成物の有効量を動物被験体に投与することを含む。動物被験体に本化合物の１以上または本医薬組成物を投与することにより、動物被験体において脂肪細胞分化は抑制され、遺伝子の転写は抑制され、かつ／または体脂肪は抑制される。
【００１６】
上記の疾病・疾患を治療するために、本化合物の１以上を、約０．０１μｇ／ｇｍ組成物〜約１０００μｇ／ｇｍ組成物、好ましくは約０．１μｇ／ｇｍ組成物〜約５００μｇ／ｇｍ組成物の量で組成物中に含有させ、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の投与量で局所、経皮、経口または非経口投与することができる。
【００１７】
図１〜６に、天然のホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（以後、「１，２５（ＯＨ）２Ｄ３」と呼ぶ）と比較した２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロール（以後、「ＶＩＴ−Ｉ」と呼ぶ）の種々の生物活性を示す。
発明の詳細な説明
２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロール（本明細書ではＶＩＴ−Ｉと呼ぶ）を合成し、試験した。この１９−ノルアナログの構造は前記の一般式Ｉａで特徴付けられ、そのプロドラッグ（保護ヒドロキシ形）は式Ｉで特徴付けられる。
【００１８】
構造Ｉａを有する２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールならびにアナログＩの製造は、通常の一般法、すなわち二環式Windaus-Grundmann型ケトンＩＩをアリルホスフィンオキシドＩＩＩと縮合させて対応する２−メチレン−１９−ノル−１７−エン−ビタミンＤアナログＩＶを得、ついでＣ−１およびＣ−３で脱保護することによりＩａを得ることにより達成できる。
【００１９】
【化３】
2008520705.tif 000005
【００２０】
構造ＩＩＩおよびＩＶにおいて、基Ｘ１およびＸ２はヒドロキシ保護基（好ましくはｔ−ブチルジメチルシリル）であるが、反応する可能性のある任意の官能基、あるいは縮合反応を妨げる官能基は当該技術分野で知られているようにして適切に保護される必要があることもまた理解されなければならない。上記のプロセスは、ビタミンＤ化合物の製造に有効に用いられてきた収束的合成の概念の適用を表している。［例えば、Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 449 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem. 51, 1269 (1986); DeLuca et al., 米国特許第５，０８６，１９１号; DeLuca et al., 米国特許第５，５３６，７１３号］。
【００２１】
一般構造ＩＩのヒドリンダノンは公知ではない。これは本明細書のスキームに示した方法で製造できる（化合物ＶＩＴ−Iの製造を参照のこと）。
【００２２】
所望される、一般構造ＩＩＩのホスフィンオキシドの製造のために、Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) および DeLuca et al., 米国特許第５，０８６，１９１号に記載されているように、市販の（１Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−（−）−キナ酸から容易に得られるキナ酸メチル誘導体から出発する合成経路が開発されている。
【００２３】
化合物Ｉ、Ｉａ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの合成の全体のプロセスは、「２−アルキリデン−１９−ノル−ビタミンＤ化合物」という発明の名称の米国特許第５，８４３，９２８号に例示され、さらに詳しく説明されている（その明細書を本願に引用して援用する）。
【００２４】
明細書および特許請求の範囲で用いられているように、「ヒドロキシ保護基」という用語は、アルコキシカルボニル、アシル、アルキルシリルもしくはアルキルアリールシリル基（以後単に「シリル」基と呼ぶ）およびアルコキシアルキル基などの、ヒドロキシ官能基の一時的な保護のために一般的に用いられる任意の基を意味する。アルコキシカルボニル保護基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはアリルオキシカルボニルなどのアルキル−Ｏ−ＣＯ−基である。「アシル」という用語は、１〜６炭素のアルカノイル基（その異性体の全てを含む）、またはオキサリル、マロニル、スクシニル、グルタリル基などの１〜６炭素のカルボキシアルカノイル基、またはベンゾイル、またはハロ、ニトロもしくはアルキル置換ベンゾイル基などの芳香族アシル基を意味する。「アルキル」という用語は、明細書または特許請求の範囲で用いられているように、１〜１０炭素の直鎖または分枝鎖アルキル基（その異性体の全てを含む）を意味する。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエトキシメチル、またはテトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニルなどの基である。好ましいシリル保護基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ジブチルメチルシリル、ジフェニルメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ジフェニル−ｔ−ブチルシリルおよび類似のアルキルシリル基である。「アリール」という用語は、フェニル−またはアルキル−、ニトロ−もしくはハロ−置換フェニル基のことを言う。
【００２５】
「保護ヒドロキシ」基は、上記で定義した、例えばシリル、アルコキシアルキル、アシルまたはアルコキシカルボニル基などの、ヒドロキシ官能基の一時的または永続的な保護のために一般的に用いられる上記の基のいずれかにより誘導体化または保護されたヒドロキシ基である。「ヒドロキシアルキル」、「重水素化アルキル」および「フルオロアルキル」という用語は、それぞれ１以上のヒドロキシ、重水素またはフルオロ基で置換されたアルキル基を指す。
【００２６】
さらに具体的には、化合物ＶＩＴ−Ｉの製造の詳細な例示のための以下の実施例および説明のみならず、スキーム１も参照されたい。
【００２７】
【化４】
2008520705.tif 000006
【００２８】
デス−Ａ，Ｂ−２３，２４−ジノルコラン−８β，２２−ジオール（２）。炎で乾燥した１０００ｍＬの二口フラスコにエルゴカルシフェロール１（５ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）、ピリジン（５ｍＬ）、および無水ＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を入れた。溶液をアルゴン雰囲気下で−７８℃に冷却した。溶液が深緑色になり、それが持続するまで（約１ｈ）、溶液にＯ３をバブリングした。青色が消えるまで（１５分）、溶液をＯ２で処理した。ついでＮａＢＨ４（１．５ｇ，３９．７ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、２回目のＮａＢＨ４（１．５ｇ，３９．７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温に戻した。ついで３回目のＮａＢＨ４（１．５ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を終夜放置した。水（５０ｍＬ）を滴下して反応物をクエンチした。減圧下でメタノールを留去し、残渣を酢酸エチルに溶解した。有機層を１Ｎ ＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、２．１８ｇ（１０．３ｍｍｏｌ，８１％）のジオール２を白色固体で得た。Ｍｐ：１１０〜１１１℃；1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.09 (1H, m), 3.64 (1H, dd, J= 10.5および 3.2 Hz), 3.38 (1H, dd, J= 10.5および6.7 Hz), 1.03 (3H, d, J= 6.6 Hz), 0.96 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 69.2, 67.8, 52.9, 52.4, 41.8, 40.2, 38.2, 33.6, 26.6, 22.6, 17.4, 16.6, 13.6; ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：２１２（Ｍ＋，２），１９４（１５），１７９（１８），１２５（４３），１１１（１００）；Ｃ１３Ｈ２２Ｏ（［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋）の精密質量計算値：１９４．１６７１；実測値：１９４．１６６５。
【００２９】
デス−Ａ，Ｂ−２２−（ｐ−トルエンスルホニルオキシ）−２３，２４−ジノルコラン−８β−オール（３）。ジオール２（１ｇ，４．７１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（１２ｍＬ）溶液を−２５℃に冷却し、予冷した塩化トシル（１．０８ｇ，５．６６ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（２ｍＬ）溶液を滴下した。その温度で反応混合物を４時間撹拌し、０℃まで戻し、その温度でさらに２０時間撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＣｕＳＯ４溶液（３０ｍＬ）、１Ｎ ＨＣｌ（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（ＮａＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して１．７ｇ（４．６４ｍｍｏｌ，９８％）のヒドロキシルトシレート３を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.78 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.35 (2H, d, J= 8.2 Hz), 4.06 (1H, m), 3.95 (1H, dd, J= 9.2および3.0 Hz), 3.8 (1H, dd, J = 9.2および6.2 Hz), 2.45 (3H, s), 0.96 (3H, d, J = 6.6 Hz), 0.89 (3H, s); 13C NMR (1OOMHz, CDCl3) δ: 144.7, 133.0, 129.8, 127.9, 75.6, 69.0, 60.4, 52.2, 41.9, 40.1, 35.7, 33.5, 26.4, 22.4, 21.6, 17.3, 16.7, 13.4;ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：３６６（Ｍ＋，６），１９４（１４），１７９（１６），１２５（３０），１１１（１００）。
【００３０】
デス−Ａ，Ｂ−８β−（トリエチルシリルオキシ）−２２−（ｐ−トルエンスルホニルオキシ）−２３，２４−ジノルコラン（４）。−５０℃に冷却したヒドロキシルトシレート３（１．７ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液に、２，６−ルチジン（０．６４ｍＬ，５．５７ｍｍｏｌ）を加え、ついでＴＥＳＯＴｆ（１．２６ｍＬ，１．４７ｇ，５．５７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を０℃で１５分間撹拌し、水（１０ｍＬ）を加えた。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３ｘ４０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａＯＨ（４０ｍＬ）の１Ｎ水溶液で洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、１．８７ｇ（３．８９ｍｍｏｌ，８４％）のＯ−シリル化トシレート４を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 7.77 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.33 (2H, d, J = 8.2 Hz), 4.01(1H, m), 3.95(1H, dd, J= 9.2および3.0 Hz), 3.78 (1H, dd, J = 9.2および6.4 Hz), 2.43 (3H, s), 0.94 (3H, d, J= 7.0Hz), 0.93 (9H, t, J= 7.9 Hz), 0.85 (3H, s), 0.53 (6H, q, J= 7.9 Hz); 13C NMR (lOOMHz, CDCl3) δ: 144.5, 133.1, 129.7, 127.9, 75.7, 69.1, 52.7, 52.4, 42.1, 40.4, 35.7, 34.5, 26.5, 22.9, 21.6, 17.5, 16.7, 13.4, 6.9, 4.9;ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：４８０（Ｍ＋，３０），４３７（５０），２７９（４９），２５７（４９），２５７（８４），１７７（１００）；Ｃ２６Ｈ４４Ｏ４ＳＳｉ（Ｍ＋）の精密質量計算値：４８０．２７３０；実測値：４８０．２７４１。
【００３１】
デス−Ａ，Ｂ−８β−（トリエチルシリルオキシ）−２３，２４−ジノルコラン−２２−アール（５）。Ｏ−シリル化トシレート４（１．８ｇ，３．７５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（５ｍＬ）溶液にＮａＨＣＯ３（１．４２ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２０ｍＬ）懸濁液を室温で加えた。混合物をアルゴン雰囲気下で１５０℃に１５分間加熱し、室温に冷却した。水（５０ｍＬ）を加え、ついで酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて水層を酢酸エチル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、０．９２ｇ（２．８３ｍｍｏｌ，７６％）のＯシリル化アルデヒド５を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 9.58 (1H, d, J= 3.2Hz), 4.06 (1H, m), 2.35 (1H, m), 1.09 (3H, d, J= 6.8Hz), 0.96 (3H, s), 0.95 (9H, t, J= 8.1Hz), 0.55 (6H, q, J= 8.1Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 205.5, 69.0, 52.3, 51.7, 49.2, 42.6, 40.5, 34.5, 26.2, 23.3, 17.6, 13.9, 13.3, 6.9, 4.9; ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：Ｍ＋（観測されず），２９５（Ｍ＋−Ｃ２Ｈ５，４１），１６３（１００），１３５（３５），１０３（７２）；Ｃ１７Ｈ３１Ｏ２Ｓｉ（［Ｍ−Ｃ２Ｈ５］＋）の精密質量計算値：２９５．２０９３；実測値：２９５．２０９５。
【００３２】
デス−Ａ，Ｂ−８β−（トリエチルシリルオキシ）−プレグナン−２０−オン（６）。炎で乾燥したフラスコにＫＯ−ｔ−Ｂｕ（１．５５ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）および無水ｔ−ＢｕＯＨ（３０ｍＬ）を入れた。溶液にＯ２を１５分間バブリングした。反応混合物にＯ−シリル化アルデヒド５（０．９ｇ，２．７８ｍｍｏｌ）の無水ｔ−ＢｕＯＨ（１５ｍＬ）溶液を加え、溶液にＯ２をさらに１０分間バブリングした。溶液を水（１５ｍｌ）でクエンチし、エーテル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（３％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、０．５３ｇ（１．７ｍｍｏｌ，６２％）のＯ−シリル化２０−ケトン６を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.07 (1H, m), 2.46 (1H, t, J= 9.0 Hz), 2.09 (3H, s), 0.94 (9H, t, J= 8.0Hz), 0.85 (3H, 3), 0.55 (6H, q, J = 8.0 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 209.6, 68.9, 64.5, 53.2, 43.7, 39.9, 34.4, 31.5, 23.1, 21.8, 17.6, 15.3, 6.9, 4.9;ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：３１０（Ｍ＋，１２），２８１（１００），２６７（５９），１０３（９８）；Ｃ１８Ｈ３４Ｏ２Ｓｉ（Ｍ＋）の精密質量計算値：３１０．２３２８；実測値：３１０．２３２５。
【００３３】
デス−Ａ，Ｂ−２０−メチル−８β−（トリエチルシリルオキシ）−プレグナン−２０−オール（７）。ケトン６（０．５ｇ，１．６１ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に０℃、アルゴン雰囲気下で、臭化メチルマグネシウムの３Ｍジエチルエーテル（１．３ｍＬ，０．４８ｇ，４．０３ｍｍｏｌ）溶液を加えた。反応物を室温に戻し、その温度で２時間撹拌した。ついでこれを飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチした。混合物を酢酸エチル（３ｘ２ＯｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（３０ｍＬ）およびブライン溶液（３０ｍＬ）で洗浄した。これを乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、０．４２ｇ（１．２９ｍｍｏｌ，８０％）の第三級アルコール７を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.05 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.29 (3H, s), 1.17 (3H, s), 1.10 (3H, s), 0.95 (9H, t, J= 7.9 Hz), 0.55 (6H, q, J= 7.9 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 73.1, 69.0, 60.1, 52.6, 42.5, 40.7, 34.1, 30.5, 29.5, 22.3, 21.7, 17.2, 14.9, 6.5, 4.5;ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：３２６（Ｍ＋，２），３１１（４），２９７（３１），２７９（１００）；Ｃ１７Ｈ３３Ｏ２Ｓｉの精密質量計算値（［Ｍ−Ｃ２Ｈ５］＋）：２９７．２２５０；実測値：２９７．２２４６。
【００３４】
デス−Ａ，Ｂ−２０−メチル−プレグナン−１７（２０）−エン−８β−オール（８）。化合物７（０．１５０ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、２Ｍ塩酸（５ｍＬ）およびＴＨＦ（５ｍＬ）の混合物を７０℃で１時間還流した。減圧下でＴＨＦを留去し、水層を２．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を用いて塩基性化した。水層を酢酸エチル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（５０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し濾過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１２％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、ついでヘキサン：ＩＰＡ（９５．５：０．５）溶媒系を用いるＨＰＬＣ（９．４ｍｍｘ２５ｃｍ ｚｏｒｂａｘ−ｓｉｌカラム，４ｍｌ／分）で精製した。０．０４１ｇ（０．２１ｍｍｏｌ，４６％）の純粋なアルコール８がＲｖ＝５６ｍＬで溶出した。1H NMR(5OO MHz, CDCl3) δ: 4.16 (1H, m), 2.28 (2H, m), 2.18 (1H5 m), 1.70 (3H, s), 1.55 (3H, s), 1.10 (3H, s).
デス−Ａ，Ｂ−２０−メチル−プレグナン−１７（２０）−エン−８−オン（９）。アルコール８（０．０２０ｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液に、室温でＰＤＣ（０．０５４ｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン雰囲気下で反応物を３時間撹拌した後、溶液を酢酸エチルを用いセライトパッドに通過させた。濾液を濃縮し、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジに添着し、酢酸エチル／ヘキサン（６％）で溶出してケトンを無色オイルで得た。４％酢酸エチル／ヘキサン溶媒系を用いるＨＰＬＣ（６．２ｍｍｘ２５ｃｍ ｚｏｒｂａｘ−ｓｉｌカラム，４ｍｌ／分）でケトンを精製した。１５．４ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ，７８％）の純粋なケトン９がＲｖ＝４２ｍＬに無色オイルとして溶出した。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 2.57 (1H, m), 1.74 (3H, s), 1.59 (3H, m), .083 (3H, s), MS m/z (相対強度): 192 (M+, 98), 177 (88), 159 (100), 149 (91), 107 (89); Ｃ１３Ｈ２０Ｏ（Ｍ＋）の精密質量計算値：１９２．１５１４；実測値：１９２．１５２１。
【００３５】
ｌα−ヒドロキシ−２０−メチル−２−メチレン−１７（２０）−エン−１９−ノル−プレグナカルシフェロール（１２）。ホスフィンオキシド１０（０．０３０ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５００μＬ）溶液に、−２５℃、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらＰｈＬｉ（３４μＬ，５ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。溶液は濃橙色に変化した。その温度で混合物を２０分間撹拌し、−７８℃に冷却した。予冷したケトン９（０．００４ｇ，０．０２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１００μＬ）溶液（−７８℃）をゆっくり加えた。−７８℃、アルゴン雰囲気下で混合物を３時間撹拌し、０℃で１８時間撹拌した。酢酸エチルを加え、有機層をブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、留去した。残渣をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジに添着し、１％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して１９−ノル保護ビタミン誘導体を得た（１ｍｇの未反応ケトンが回収された）。ヘキサン／酢酸エチル（９９．０５：０．０５）溶媒系を用いるＨＰＬＣ（６．２ｍｍｘ２５ｃｍ ｚｏｒｂａｘ−ｓｉｌカラム，４ｍｌ／ｍｉｎ）でビタミンをさらに精製した。３．６ｍｇ（０．００６７ｍｍｏｌ，４１％）の純粋な化合物１１が無色オイルとしてＲｖ＝２８ｍＬに溶出した。ＵＶ（ヘキサン溶液）：λｍａｘ ２４４，２５２，２６２ｎｍ； 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 6.21 and 5.87 (1H and 1H, each d, J= 11.4 Hz), 4.97 and 4.92 (2H, each s), 4.43 (2H, m), 2.80 (1H, m), 2.53 (1H, dd, J = 13.8 and 5.6Hz）, 2.452 (1H, dd, J = 8.2 and 5.6Hz), 1.71 (3H. s), 1.58 (3H, s), 0.90, 0.84 (9H and 9H, each s), 0.74 (3H, s), 0.027, 0.050, 0.068, 0.081 (each 3H, each s)。保護ビタミン１１（０．００３６ｇ，０．００６７ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（５００μＬ）に溶解し、ＴＢＡＦ（６６μＬ，１８ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）で処理し、室温、暗所で終夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジに添着し、３０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出して脱保護ビタミンを得た。ヘキサン／ＩＰＡ（９０／１０）を溶媒系として用いるＨＰＬＣ（６．２ｍｍｘ２５ｃｍ ｚｏｒｂａｘ−ｓｉｌカラム，４ｍｌ／ｍｉｎ）によりビタミンを精製した。１．３ｍｇ（０．００３６ｍｍｏｌ，６１％）の純粋なビタミン１２がＲｖ＝２６ｍＬに溶出された。ＵＶ（エタノール溶液）：λｍａｘ ２４３，２５１，２６１ｎｍ; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 6.35 and 5.92 (1H and 1H, each d, J = 11.3 Hz), 5.10 and 5.13 (1H and 1H, each s), 4.48 (2H, m), 2.88 (1H, dd, J = 13.3 and 4.5Hz), 2.78 (1H, dd, J = 12.6 and 3.6 Hz), 2.58 (1H, dd, J = 12.7 and 3.6 Hz), 2.13 (1H, m), 1.71 (3H, s), 1.61 (3H, s), 0.739 (3H, s); ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：３２８（Ｍ＋，１００），３１３（２３），３１０（１５），２９５（１１），２７７（８），２４３（３５），２２９（４１），１４９（８３）；Ｃ２２Ｈ３２Ｏ２Ｎａ（［ＭＮａ］＋）の精密質量計算値３５１．２３００；実測値：３５１．２３０４。
２−メチレン−１９−ノル−１α−ヒドロキシ−１７−エン−ホモプレグナカルシフェロールの生物活性
１α−ヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３の２位へのメチレン基の導入、１７位および２０位間への二重結合の導入、および側鎖における炭素２３、２４、２５、２６および２７の除去は、完全長組み換えラットビタミンＤ受容体への結合に関して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と比較してほとんど影響を示さなかった。化合物ＶＩＴ−Ｉは、標準の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３と比較して受容体に同程度に結合した（図１）。これらの結果からは、化合物ＶＩＴ−Ｉは同等の生物活性を有すると予想される。しかしながら、驚いたことに、化合物ＶＩＴ−Ｉは特有の生物活性を有する高選択的アナログである。
【００３６】
図６は、腸管カルシウム輸送の刺激において、天然のホルモンである１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）の活性と比較してＶＩＴ−Ｉはほとんど活性を示さないことを明らかにしている。
【００３７】
図４および５は、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と比較してＶＩＴ−Ｉはほとんど骨カルシウム動員活性を示さないことを立証している。
【００３８】
このように図４〜６は、ＶＩＴ−Ｉが、あるとしてもほんの少ししかカルシウム作用を示さないことで特徴付けられることを明らかにしている。
【００３９】
図２は、ＶＩＴ−ＩはＨＬ−６０細胞分化に関して、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とほぼ同等の強度を示し、それにより乾癬および癌、特に白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対する治療のための優れた候補に挙げられることを明らかにしている。さらに、その比較的高い細胞分化活性により、この化合物は、小じわ、適切な皮膚の水分量の不足（すなわち乾燥皮膚）、適切な肌の張りの不足（すなわちたるんだ皮膚）および皮脂分泌の不足を含む種々の皮膚の状態を治療するための治療剤を提供する。従って、この化合物の使用により、皮膚の保湿がもたらされるばかりでなく、皮膚のバリア機能も改善される。
【００４０】
図３は、化合物ＶＩＴ−Ｉが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３よりも低くはあるが、骨細胞において転写活性を示すことを明らかにしている。この結果は、図２の細胞分化活性と合わせて考えれば、ＶＩＴ−Ｉが、細胞分化、遺伝子の転写を引き起こし、細胞増殖を抑制する直接の細胞活性を有するので、乾癬に大変に有効であることを示唆している。これらのデータはまた、ＶＩＴ−Ｉは、特に白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対する抗癌剤として顕著な活性を有することを示している。
【００４１】
ＶＩＴ−ＩのＨＬ−６０分化およびインビトロ転写に対する強い活性は、副甲状腺の増殖抑制およびプレプロ甲状腺遺伝子の抑制に活性を示すことを示唆している。
実験方法
ビタミンＤ受容体結合
試験材料
タンパク質源
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ Ｐｌｕｓ ＲＩＬ細胞内で完全長組み換えラット受容体を発現し、２つの異なるカラムクロマトグラフィー系を用いて均一になるまで精製した。第１の系は、このタンパク質上のＣ末端ヒスチジンタグを利用するニッケルアフィニティ樹脂であった。この樹脂から溶出したタンパク質をイオン交換クロマトグラフィー（Ｓ−セファロースファーストフロー）を用いてさらに精製した。精製タンパク質のアリコートを液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。結合アッセイに使用するために、０．１％の界面活性剤Ｃｈａｐｓを含有するＴＥＤＫ５０（５０ｍＭトリス，１．５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４，５ｍＭ ＤＴＴ，１５０ｍＭ ＫＣｌ）でタンパク質を希釈した。添加した放射性標識リガンドの２０％以下が受容体に結合するように、受容体タンパク質およびリガンド濃度を最適化した。
試験薬
非標識リガンドをエタノールに溶解し、紫外分光光度計を用いて濃度を測定した（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３：モル吸光係数＝１８，２００、λｍａｘ＝２６５ｎｍ；アナログ：モル吸光係数＝４２，０００、λｍａｘ＝２５２ｎｍ）。放射性標識リガンド（３Ｈ−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、〜１５９Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を１ｎＭの最終濃度になるようにエタノールに加えた。
アッセイ条件
放射性標識および非標識リガンドを≦１０％の最終エタノール濃度になるように、１００ｍｃｌの希釈タンパク質に加え、氷上で混合し、結合平衡に達するまで終夜インキュベートした。翌日、１００ｍｃｌのヒドロキシルアパタイトスラリー（５０％）を各チューブに加え、１０分間隔で３０分間混合した。ヒドロキシルアパタイトを遠心分離で回収し、ついで０．５％Ｔｉｔｒｏｎ Ｘ−１００を含有するトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス，１．５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、４ｍｌのＢｉｏｓａｆｅ ＩＩシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルにペレットを移し、混合し、シンチレーションカウンターにセットした。放射性標識リガンドのみを含有するチューブから全結合を測定した。
ＨＬ−６０分化
試験材料
試験薬
試験薬をエタノールに溶解し、濃度を紫外分光光度計を用いて測定した。薬物濃度の範囲が細胞培養物中に存在するエタノール（≦０．２％）の最終濃度を変えないで測定できるように連続希釈液を調製した。
細胞
１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中でヒト前骨髄球性白血病（ＨＬ６０）細胞を培養した。５％ＣＯ２の存在下、３７°Ｃで細胞をインキュベートした。
アッセイ条件
ＨＬ６０細胞を１．２ｘ１０５細胞／ｍｌでプレーティングした。プレーティングの１８時間後、薬物を用いて細胞を２連で処理した。４日後、細胞を採取し、ニトロブルーテトラゾリウム還元アッセイを行った(Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974)。全部で２００の細胞を計数し、細胞内黒青色ホルマザン沈着物の数を記録することにより分化細胞の百分率を決定した。食作用を測定することにより、単球細胞への分化の確認を行った（データは示さず）。
インビトロ転写アッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流の２４−ヒドロキシラーゼ（２４Ｏｈａｓｅ）遺伝子プロモーターで安定的にトランスフェクトしたＲＯＳ１７／２．８（骨）細胞中で転写活性を測定した(Arbour et al., 1998)。一連の投与量を細胞に与えた。投与１６時間後、細胞を採取し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
ＲＬＵ＝相対ルシフェラーゼ単位
腸管カルシウム輸送および骨カルシウム動員
雄の離乳スプラーグ・ドーリー・ラットにＤｉｅｔ１１（０．４７％Ｃａ）＋ＡＥＫの食餌を１週間与え、ついでＤｉｅｔ１１（０．０２％Ｃａ）＋ＡＥＫの食餌を３週間与えた。ついでこれらのラットに０．４７％Ｃａを含有する同じ食餌に変えて与え、ついで０．０２％Ｃａを含有する同じ食餌を２週間与えた。０．０２％カルシウム食餌を与える最後の週に投与を開始した。おおよそ２４時間離して４回連続して腹腔内投与を行った。最後の投与から２４時間後、切断された頸部から血液を採取し、骨カルシウム動員の指標として原子吸光分光法で血清カルシウム濃度を測定した。腸管反転法を用いた腸管カルシウム輸送分析を行うために、腸の最初の１０ｃｍもまた採取した。
データの解釈
ＶＤＲ結合、ＨＬ６０細胞の分化、および転写活性
完全長組み換えラットビタミンＤ受容体への結合を［３Ｈ］−１，２５（ＯＨ）２Ｄ３と競合する能力において、ＶＩＴ−Ｉ（Ｋｉ＝１．９ｘ１０−１０Ｍ）は天然のホルモンである１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｋｉ＝７．８ｘ１０−１１Ｍ）とほぼ同等である（図１）。ＨＬ６０の分化を促進する能力（効力または有効性）において、ＶＩＴ−Ｉ（ＥＣ５０＝１．３ｘ１０−８Ｍ）と１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝６．２ｘ１０−９Ｍ）との差異もまたほとんどなかった（図２参照）。化合物ＶＩＴ−Ｉ（ＥＣ５０＝６．０ｘ１０−９Ｍ）は骨細胞において転写活性を示すが、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＥＣ５０＝２．２ｘ１０−１０Ｍ）よりも著しく低かった（図３参照）。ＶＩＴ−Ｉは細胞分化の促進および細胞増殖の抑制において細胞に直接の効果を有するため、これらの結果はＶＩＴ−Ｉが乾癬に大変有効であることを示唆している。これらの結果はまた、ＶＩＴ−Ｉが特に白血病、結腸癌、乳癌、皮膚癌および前立腺癌に対して抗癌剤として顕著な活性を有するばかりでなく、乾燥皮膚（皮膚の水分量の不足）、過度の皮膚のたるみ（不十分な皮膚のはり）、皮脂分泌の不足およびじわなどの皮膚の状態に対しても顕著な活性を有することを示している。二次性副甲状腺機能亢進症の抑制に大変有効であることもまた期待される。
【００４２】
ビタミンＤ欠乏動物における骨からのカルシウム動員および腸管のカルシウム吸収。低カルシウム食餌（０．０２％）を与えたビタミンＤ欠乏ラットを用いて、腸および骨におけるＶＩＴ−Ｉおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の活性を試験した。予想されたように、天然のホルモン（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）は全ての投与量において血清カルシウムレベルを増加させた（図４）。ＶＩＴ−Ｉは骨からのカルシウム動員活性をあるとしてもほんの少ししか示さないことを図４および図５は示している。４日間連続でＶＩＴ−Ｉを７８０ｐｍｏｌ／日投与しても、骨カルシウムの動員は起こらず、ＶＩＴ−Ｉの量を２３４０ｐｍｏｌ／日まで増やし、ついで７０２０ｐｍｏｌ／日まで増やしても、特に実質的な効果はなかった。
【００４３】
腸管反転法（図６）を用いて、動物の同一群における腸管カルシウム輸送を評価した。化合物ＶＩＴ−Iは７８０ｐｍｏｌ／日、２３４０ｐｍｏｌ／日または７０２０ｐｍｏｌ／日で投与するとき腸管カルシウム輸送を促進しないが、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は７８０ｐｍｏｌ／日の投与で顕著な促進を示すことをこれらの結果は示している。従って、ＶＩＴ−Ｉは、試験した投与量では本質的に腸管カルシウム輸送活性を有さないことが結論できる。
【００４４】
これらの結果は、ＶＩＴ−Ｉが本明細書記載の多くのヒト療法に対する優れた候補であり、腎性骨異栄養症の二次性副甲状腺機能亢進症、自己免疫疾患、癌、および乾癬の抑制などの多くの状況に特に有用であることができることを例示している。（１）ＶＩＴ−Ｉは顕著なＶＤＲ結合、転写活性および細胞分化活性を示す；（２）ＶＩＴ−Ｉは１，２５（ＯＨ）２Ｄ３とは異なり、高カルシウム血症になりやすさを欠いている；そして（３）ＶＩＴ−Ｉは容易に合成できる；という理由により、ＶＩＴ−Ｉは乾癬治療の優れた候補である。ＶＩＴ−Ｉは顕著なビタミンＤ受容体への結合活性、細胞分化活性、および遺伝子の転写活性を示すが、血清カルシウムを上昇させる能力をほとんど有さないので、ＶＩＴ−Ｉはまた腎性骨異栄養症の二次性副甲状腺機能亢進症の治療に特に有用でありうる。
【００４５】
これらのデータはまた、本発明の化合物ＶＩＴ−Ｉは、免疫系、例えば多発性硬化症、狼瘡、糖尿病、移植片対宿主拒絶反応、および臓器移植拒絶反応を含む自己免疫疾患における不均衡により特徴付けられるヒト障害の治療と予防に特に適し、さらにリウマチ様関節炎、喘息、ならびにセリアック病、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患などの炎症性疾患の治療に特に適していることを示している。アクネ、脱毛症および高血圧は、本発明の化合物ＶＩＴ−Ｉで治療できる他の状態である。
【００４６】
式Ｉ、および特に式Ｉａの本発明の化合物はまた、動物被験体における肥満の予防または治療、脂肪細胞分化の抑制、ＳＣＤ−１遺伝子の転写抑制、および／または体脂肪の抑制に有用である。従って、一部の実施形態において、動物被験体における肥満の予防または治療方法、脂肪細胞分化の抑制方法、ＳＣＤ−１遺伝子の転写抑制方法、および／または体脂肪の抑制方法は、式Ｉの化合物の１以上を含む化合物または医薬組成物の１以上の有効量を動物被験体に投与することを含む。本化合物または医薬組成物を被験体に投与することにより、動物被験体における脂肪細胞分化、遺伝子の転写、および／または体脂肪が抑制される。動物は、ヒト、イヌもしくはネコなどの家畜、または特にニワトリ、七面鳥、キジまたはウズラなどの家禽のみならずウシ、羊、ヤギ、またはブタなどのヒトの食用のための食肉を提供する農業動物であることができる。
【００４７】
予防および／または治療目的のために、式Ｉで定義される本発明の化合物は当該技術分野で公知の慣用法に従って、無害の溶媒中の溶液として、適切な溶媒または担体中のエマルジョン、サスペンジョンもしくは分散剤として、または固体担体と共にピル、錠剤またはカプセルとして薬学的応用のために製剤化することができる。このような製剤はいずれも、安定化剤、抗酸化薬、結合剤、着色剤、乳化剤または味覚修飾剤などの他の薬学的に許容される無毒の賦形剤を含むことができる。
【００４８】
式Ｉの化合物、および特にＶＩＴ−Ｉは、経口、局所、非経口、直腸内、経鼻、舌下または経皮で投与できる。本化合物は、好都合には、適切な滅菌溶液の注射もしくは静脈内注入で、消化管を介する液体もしくは固体の形で、またはクリーム剤、軟膏、パッチ、もしくは経皮投与に適した同様なビヒクルの形で投与できる。化合物Ｉ、特にＶＩＴ−Ｉの０．０１μｇ〜１０００μｇ／日、好ましくは約０．１μｇ〜約５００μｇ／日の投与が予防および／または治療目的に適しているが、当該技術分野で公知のように、このような投与量は治療される疾患、その重篤度および被験体の反応に従って調整される。本化合物は作用が特異的であるため、それぞれは単独で、あるいは異なる程度の骨ミネラル動員およびカルシウム輸送刺激が利点を有すると知られている場合、他の活性ビタミンＤ化合物（例えば１α−ヒドロキシビタミンＤ２もしくはＤ３、または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）の段階投与と共に適切に投与できる。
【００４９】
前記の治療に使用する組成物は、活性成分として上記式ＩおよびＩａにより定義される化合物Ｉ、特にＶＩＴ−Ｉの有効量、ならびに適切な担体を含む。本発明記載の使用のためのこのような化合物の有効量は、組成物１ｇ当たり約０．０１μｇ〜約１０００μｇ、好ましくは組成物１ｇ当たり約０．１μｇ〜約５００μｇであり、約０．０１μｇ／日〜約１０００μｇ／日、好ましくは約０．１μｇ／日〜約５００μｇ／日の投与量で、局所、経皮、経口、直腸内、経鼻、舌下または非経口で投与できる。
【００５０】
化合物Ｉ、特にＶＩＴ−Ｉは、クリーム剤、ローション、軟膏、局所パッチ、ピル、カプセルもしくは錠剤、座剤、エアゾールとして、または薬学的に無害で許容される溶媒もしくはオイル中の溶液、エマルジョン、分散剤、もしくはサスペンジョンとして液体形で製剤化でき、このような製剤はさらに安定化剤、抗酸化剤、乳化剤、着色剤、結合剤または味覚修飾剤などの他の薬学的に無害または有益な成分を含むことができる。
【００５１】
化合物Ｉ、特にＶＩＴ−Ｉは好都合には、前骨髄球から通常のマクロファージへの分化をもたらすのに十分な量で投与できる。前述の投与量は適切であるが、当該技術分野で公知のように、投与量は疾患の重篤度、ならびに被験体の状態および反応に従って調整されなければならないことが理解されるべきである。
【００５２】
従って、本発明の製剤は、薬学的に許容される担体および所望により他の治療成分を加えた活性成分を含む。製剤の他の成分と混合しても化学反応を起こさず、レシピエント自身に有害でないという意味で、担体は「許容される」ものでなければならない。
【００５３】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが活性成分の所定量を含有するカプセル、サシェ、錠剤またはロゼンジとして分離した単位の形で；粉末または顆粒の形で；水性液または非水性液体中の溶液またはサスペンジョンの形で；あるいは水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンの形であることができる。
【００５４】
直腸投与のための製剤は、活性成分とカカオバターなどの担体を混合した座剤の形、あるいは浣腸剤の形であることができる。
【００５５】
非経口投与に適した製剤は、好都合には、好ましくはレシピエントの血液と等張である活性成分の滅菌油性または水性製剤を含む。
【００５６】
局所投与に適した製剤は、リニメント剤、ローション、塗布剤、水中油型または油中水型オイルエマルジョン（クリーム剤、軟膏またはペーストなど）などの液体または半液体製剤；滴剤などの溶液またはサスペンジョン；またはスプレーなどを含む。
【００５７】
自動推進式またはスプレー製剤の粉末吸入などの、スプレー容器で投薬する経鼻投与のために、ネブライザーまたは噴霧器を使用できる。本製剤は、投薬されるとき、好ましくは１０〜１００μの範囲の粒子径を有する。
【００５８】
本製剤は、好都合には、投与単位形で提供でき、製薬業界に公知の任意の方法で製造できる。「投与単位」という用語は、活性成分自体あるいは固体または液体の医薬希釈剤または担体と活性成分の混合物のいずれかを含む物理的および化学的に安定な投薬単位として患者に投与できる単位投与すなわち単回投与を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】［３Ｈ］−１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３の完全長組み換えラットビタミンＤ受容体への結合に競合する、ＶＩＴ−Ｉと１，２５（ＯＨ）２Ｄ３との相対活性を示すグラフである。
【図２】ＶＩＴ−Ｉおよび１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度の関数として表した、ＨＬ−６０細胞分化の％を示すグラフである。
【図３】ＶＩＴ−Ｉと比較した１，２５（ＯＨ）２Ｄ３のインビトロ転写活性を示すグラフである。
【図４】ＶＩＴ−Ｉと比較した１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。
【図５】ＶＩＴ−Ｉと比較した１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の骨カルシウム動員活性を示す棒グラフである。図４および図５のグラフはビタミンＤ欠乏動物の異なるバッチを表す。図５に示した結果にはビヒクル対照をおいていないが、投与前および投与後に動物から採血しているので、各動物がその対照の役割をしている。
【図６】ＶＩＴ−Ｉと比較した１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の腸管カルシウム輸送活性を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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