(57)【要約】植物におけるオレオシン発現レベルをモジュレートする方法が提供される。特に、種子に貯蔵される集積物(seed storage reserves)の組成、とりわけ種子の脂質およびタンパク質の含有量が改変された種子から、種子由来生成物を調製する方法を提供する。特に、本発明は、オレオシン遺伝子発現のモジュレーション、およびより具体的にはオレオシン遺伝子発現の抑制により、種子の集積物が改変された種子から、種子由来生成物を調製する方法を提供する。2008515406.tif 000012
2008515406.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法：
a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入する工程；
c）形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【請求項２】
核酸配列（ii）がSEQ ID NO：85または86を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
キメラ核酸構築物が、（iii）オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列をさらに含み、該核酸配列が（ii）において提供された核酸配列に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列（iii）が、SEQ ID NO：87または88を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
核酸配列（ii）および核酸配列（iii）が同一の長さである、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
キメラ核酸構築物がヘアピン構造を形成する、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
キメラ核酸構築物がポリヌクレオチドループ構造をさらに含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ポリヌクレオチドループ構造がオレオシン遺伝子イントロンを含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドループ構造がSEQ ID NO：89、90、または91を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
修飾されたオレオシンプロファイルを有する種子が、非形質転換種子と比較して、全タンパク質含有量の増加および脂質含有量の減少を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
植物種子が単子葉植物の種子である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
植物種子が双子葉植物の種子である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
植物種子が、ナタネ（ブラッシカ（Brassica）spp.）、アマニ／アマ（リヌム ウシタチッシマム（Linum usitatissimum））、ベニバナ（カルタムス ティンクトリウス（Carthamus tinctorius））、ヒマワリ（ヘリアンタス アヌウス（Helianthus annuus））、トウモロコシ（ジー メイズ（Zea mays））、ダイズ（グリシネ マックス（Glycine max））、マスタード（ブラッシカ（Brassica）spp.およびシナピス アルバ（Sinapis alba））、ハマナ、（クランベ アビッシニカ（Crambe abyssinica））、エルカ（eruca）（エルカ サチバ（Eruca sativa））、アブラヤシ（エラエイス グイニイス（Elaeis guineeis））、メンジツ（ゴッシピウム（Gossypium）spp.）、ラッカセイ（アラキス ヒポゲア（Arachis hypogaea））、ココナツ（コカス ヌシフェラ（Cocus nucifera））、トウゴマ（リキヌス コミュニス（Ricinus communis））、コリアンダー（コリアンドラム サチバム（Coriandrum sativum））、カボチャ、（ククルビタ マキシマ（Cucurbita maxima））、ブラジルナッツ（ベルトレチア エクセルサ（Bertholletia excelsa））、およびホホバ（シモンドシア チネンシス（Simmondsia chinensis））からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
植物種子由来生成物が、食品または飼料製品である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
植物種子由来生成物が、修飾されたオレオシンプロファイルを含むオイルボディである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
修飾されたオレオシンプロファイルを含むオイルボディが、パーソナルケア製品へと製剤化される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
キメラ核酸構築物が核ゲノム組み込み条件下で植物細胞に導入される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
以下のものを含む、植物細胞において発現され得るキメラ核酸配列：
（a）植物細胞における転写を調節し得る核酸配列；
（b）オレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（c）植物細胞において機能性の終結領域をコードする核酸配列。
【請求項１９】
キメラ核酸構築物がオレオシンまたはその断片をコードする核酸配列をさらに含み、該核酸配列が（b）において提供された核酸配列に相補的である、請求項18記載のキメラ核酸配列。
【請求項２０】
オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列が、SEQ ID NO：87または88を含む、請求項19記載のキメラ核酸配列。
【請求項２１】
核酸配列（b）およびオレオシンまたはその断片をコードする核酸配列が、同一の長さである、請求項18または19記載のキメラ核酸配列。
【請求項２２】
キメラ核酸構築物がヘアピン構造を形成する、請求項18〜21のいずれか一項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項２３】
キメラ核酸構築物がポリヌクレオチドループ構造をさらに含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載のキメラ核酸配列。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドループ構造がオレオシン遺伝子イントロンを含む、請求項23記載のキメラ核酸配列。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドループ構造がSEQ ID NO：89、90、または91を含む、請求項24記載のキメラ核酸配列。
【請求項２６】
請求項17〜25記載のキメラ核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２７】
請求項17〜25記載のキメラ核酸配列により形質転換された植物。
【請求項２８】
単子葉植物である、請求項27記載の植物。
【請求項２９】
双子葉植物である、請求項27記載の植物。
【請求項３０】
ナタネ（ブラッシカspp.）、アマニ／アマ（リヌム ウシタチッシマム）、ベニバナ（カルタムス ティンクトリウス）、ヒマワリ（ヘリアンタス アヌウス）、トウモロコシ（ジー メイズ）、ダイズ（グリシネ マックス）、マスタード（ブラッシカspp.およびシナピス アルバ）、ハマナ、（クランベ アビッシニカ）、エルカ（エルカ サチバ）、アブラヤシ（エラエイス グイニイス）、メンジツ（ゴッシピウムspp.）、ラッカセイ（アラキス ヒポゲア）、ココナツ（コカス ヌシフェラ）、トウゴマ（リキヌス コミュニス）、コリアンダー（コリアンドラム サチバム）、カボチャ、（ククルビタ マキシマ）、ブラジルナッツ（ベルトレチア エクセルサ）、およびホホバ（シモンドシア チネンシス）からなる群より選択される、請求項27記載の植物。
【請求項３１】
修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子から単離されたオイルボディを含む組成物であって、該オイルボディが野生型オイルボディより少なくとも2倍大きい、組成物。
【請求項３２】
以下の工程を含むプロセスにより調製される、請求項31記載の組成物：
a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写により生成する核酸；
b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入する工程；
c）形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；ならびに
d）該種子を採取し、修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子からオイルボディを単離する工程。
【請求項３３】
核酸配列（ii）がSEQ ID NO：85または86を含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３４】
修飾されたオレオシンプロファイルを有する種子が、非形質転換種子と比較して、全タンパク質含有量の増加および脂質含有量の減少を有する、請求項31〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
キメラ核酸構築物が（iii）オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列をさらに含み、該核酸配列が（ii）において提供された核酸配列に相補的である、請求項31〜34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
オレオシンまたはその断片をコードし得る核酸配列（iii）が、SEQ ID NO：87または88である、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
核酸配列（ii）および核酸配列（iii）が同一の長さである、請求項35または36記載の組成物。
【請求項３８】
キメラ核酸構築物がヘアピン構造を形成する、請求項35〜37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
キメラ核酸構築物がポリヌクレオチドループ構造をさらに含む、請求項35〜38のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
ポリヌクレオチドループ構造がオレオシン遺伝子イントロンからなる、請求項39記載の修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディを含む組成物。
【請求項４１】
ポリヌクレオチドループ構造がSEQ ID NO：89、90、または91である、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
植物種子が単子葉植物の種子である、請求項31〜41のいずれか一項に記載の修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディを含む組成物。
【請求項４３】
植物種子が双子葉植物の種子である、請求項31〜41のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
植物種子が、ナタネ（ブラッシカspp.）、アマニ／アマ（リヌム ウシタチッシマム）、ベニバナ（カルタムス ティンクトリウス）、ヒマワリ（ヘリアンタス アヌウス）、トウモロコシ（ジー メイズ）、ダイズ（グリシネ マックス）、マスタード（ブラッシカspp.およびシナピス アルバ）、ハマナ、（クランベ アビッシニカ）、エルカ（エルカ サチバ）、アブラヤシ（エラエイス グイニイス）、メンジツ（ゴッシピウムspp.）、ラッカセイ（アラキス ヒポゲア）、ココナツ（コカス ヌシフェラ）、トウゴマ（リキヌス コミュニス）、コリアンダー（コリアンドラム サチバム）、カボチャ、（ククルビタ マキシマ）、ブラジルナッツ（ベルトレチア エクセルサ）、およびホホバ（シモンドシア チネンシス）の種を含む群より選択される、請求項31〜41のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物遺伝子工学の方法に関する。より具体的には、本発明は、植物におけるオレオシンタンパク質の発現レベルをモジュレートする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物種子は、ヒトおよび動物両方が使用するための栄養素の重要な供給源となっている。例えば、植物種子タンパク質は、動物飼料の主成分となっており、植物種子油は、ヒトの消費のために広範に使用されている植物油の作製のために使用される。
【０００３】
種子には、0.5〜2.0マイクロメートルの範囲の直径を有する（Tzen,1993 Plant Physiol.101：267-276）、オイルボディ（oil bodies）、オレオソーム（oleosomes）、リピドボディ（lipid bodies）、またはスフェロソーム（spherosomes）として当技術分野において様々に知られている不連続の細胞内構造に、非水溶性の油画分が保管されている（Huang,1992 Ann.Rev.Plant Mol. Biol.43：177-200）。化学的には脂肪酸のグリセロールエステルとして定義される油（トリアシルグリセリド）の混合物に加え、オイルボディは、リン脂質および集合的にオイルボディタンパク質と呼ばれる多数の関連タンパク質を含む。構造的な視点からは、オイルボディは、オイルボディタンパク質が埋め込まれたリン脂質の単層により被包されたトリアシルグリセリドマトリックスであると考えられる（Huang,1992 Ann.Rev.Plant Mol.Biol.43：177-200）。植物種のオイルボディ画分に存在する種子油は、様々なトリアシルグリセリドの混合物であり、その正確な組成は、油が由来する植物種に依る。
【０００４】
植物種子の脂質要素およびタンパク質要素、従って、植物種子の栄養価のモジュレーションのための方法論は、周知である。そのような方法論には、伝統的な品種改良が含まれ、遺伝子工学に基づく方法論も含まれる。しかしながら、そのような方法論の利用可能性にも関わらず、種子におけるオイルボディタンパク質、特に、例えばブラッシカにおいて全種子タンパク質の最大8〜20％を構成し得るオレオシンタンパク質（Huang(1992)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 43:177-200およびMurphy and Cummins(1989)J.Plant Physiol 135:63-69.）のレベルのモジュレーションを明白にもたらす方法は、限られている。
【０００５】
先行技術は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）T-DNA挿入変異体に基づく方法論を使用して作成されたアラビドプシス タリアナ（Arabidopsis thaliana）植物系を提供している。この方法論を使用して、225,000を超える独立したゲノム挿入イベントが作出された（Alsonso et al.(2003)Science 301:653-657）。現在までに、この植物系の集団内で、二つのアラビドプシス オレオシン変異体が同定されている。SM_3-29875は、Atol1の第二エキソンにDNA挿入を含有しており（Tissier A.F.et al.,Plant Cell 11:1841-1852）、SALK_072403は、Atol2に単一の挿入を含有している（Alonso J.M.et al.,Science 301:653-657）。これらのアラビドプシス変異体は、オレオシン遺伝子の発現の消失を示すが、これらの植物系を作成するために使用された方法論は、ランダムであり、特異的な遺伝子の特異的な抑制を可能にしないし、特定のオレオシン遺伝子の発現レベルの様々な範囲を有する植物系の作成も可能にしない。また、より大きなゲノムサイズを有する収穫植物が使用される場合には、T-DNAアグロバクテリウム挿入変異誘発方法論は、ますます実用的でなくなる。
【０００６】
Chaudhary S.（2002,Ph.D.Thesis.University of Calgary.Molecular biology of flax(Linum usitatissimum L)seed oleosin genes.）は、内因的に存在するオレオシンタンパク質のレベルを抑制するために、アンチセンス遺伝子ノックアウト戦略が利用され得ることを推測しているが、如何にして、この方法論を使用して、そのようなオレオシン遺伝子抑制が達成され得るのか、または実際オレオシン抑制が達成され得るのか否かについての詳細は、立証されていない。
【０００７】
従って、先行技術の欠点を考慮すると、T-DNAアグロバクテリウム挿入方法論を使用する以外に、植物におけるオレオシン遺伝子発現が如何にして抑制され得るのかは、現在未知である。さらに、オレオシン遺伝子発現の抑制が、植物種子において種子の脂質要素およびタンパク質要素をモジュレートするために使用され得るか否か、そして如何にして使用され得るかも、未知である。植物におけるオレオシンの抑制方法を改良する必要が当技術分野には存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、種子に貯蔵される集積物(seed storage reserves)の組成、とりわけ種子の脂質およびタンパク質の含有量が改変された種子から、種子由来生成物を調製する方法に関する。特に、本発明は、オレオシン遺伝子発現のモジュレーション、より具体的にはオレオシン遺伝子発現の抑制により、種子の集積物が改変された種子から、種子由来生成物を調製する方法を提供する。
【０００９】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【００１０】
本発明は、以下の工程を含む、植物種子におけるタンパク質含有量を増加させる方法も提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程（該種子におけるタンパク質含有量は、非形質転換植物と比較して増加している）。
【００１１】
本発明は、以下の工程を含む、植物種子における脂質含有量を減少させる方法も提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程（該種子における脂質含有量は、非形質転換植物と比較して減少している）。
【００１２】
本発明に従って調製されたこれらの植物から入手された種子は、多様な植物種子由来生成物の調製のための起源として使用され得る。
【００１３】
さらに、本発明は、以下の工程を含む、植物におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においてはオレオシンタンパク質の発現が抑制されている）。
【００１４】
本発明の好ましい態様において、オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列は、オレオシンをコードする核酸配列と連結される。従って、本発明は、以下の工程を含む、植物におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においてはオレオシンタンパク質の発現が抑制されている）。
【００１５】
本発明の好ましい態様において、植物細胞における発現を制御し得る核酸配列は、植物種子細胞における発現を許容し、形質転換植物は、種子を生じ得る植物である。さらに好ましい態様において、プロモーターは、種子にとって好ましいプロモーターである。
【００１６】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物の種子におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生させる工程；ならびに
（d）形質転換植物を、種子を生じ得る成熟植物へと生長させる工程（種子においてはオレオシン発現レベルが抑制されている）。
【００１７】
好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、植物の種子におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生させる工程；ならびに
（d）形質転換植物を、種子を生じ得る成熟植物へと生長させる工程（種子においてはオレオシン発現レベルが抑制されている）。
【００１８】
さらにもう一つの好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入する工程；
（c）形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【００１９】
さらに好ましい態様において、キメラ核酸構築物は、核ゲノム組み込み条件下で植物細胞に導入される。そのような条件の下では、キメラ核酸配列は、植物のゲノムに安定的に組み込まれる。
【００２０】
本発明のその他の特色および利点は、以下の詳細な説明より容易に明らかになると考えられる。しかしながら、本発明の精神および範囲に含まれる様々な変化および修正が、この詳細な説明より、当業者には容易に明らかになるため、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい態様を示しており、例示のためにのみ与えられていることを理解されたい。
【００２１】
発明の詳細な説明
I. 用語および定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有するものとする。許容される場合には、開示において言及された特許、出願、公開された出願、ならびにジェンバンク（GenBank）、スイスプロ（SwissPro）、およびその他のデータベースからの核酸およびポリペプチドの配列を含むその他の刊行物は、全て、参照により完全に組み込まれる。
【００２２】
本明細書において使用されるような「核酸構築物」および「核酸配列」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるモノマーからなるポリヌクレオシドまたはポリヌクレオチドを指す。その用語には、天然には存在しないモノマーまたはそれらの一部を含む、修飾または置換された配列も含まれる。本発明の核酸構築物は、デオキシリボ核酸構築物（DNA）またはリボ核酸構築物（例えば、RNA、mRNA）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む天然に存在する塩基を含み得る。構築物は、修飾された塩基を含有していてもよい。そのような修飾された塩基の例には、アザ型およびデアザ型のアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが含まれる。
【００２３】
核酸配列に関して本明細書において使用されるような「キメラ」という用語は、天然には連結されていない少なくとも二つの連結された核酸配列を指す。例えば、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なmRNAをコードする核酸配列に連結された、植物プロモーターを構成する核酸配列は、キメラ核酸配列である。
【００２４】
「相補的な」という用語は、二つの核酸配列が、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズして、核酸二重鎖を形成し得ることを意味する。「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、溶液中の二つの相補的な核酸分子の間の選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は、典型的には、少なくとも15（例えば、20、25、30、40、または50）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液においてはナトリウムイオン濃度および温度の関数である、Tm(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(%(G+C)-600/l)または類似の式）により決定されることを認識するであろう。従って、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似しているが同一ではない分子を同定するためには、1％のミスマッチが、Tmの約1℃の減少をもたらすと仮定することができ、例えば、＞95％の同一性を有する核酸分子が求められる場合には、最終洗浄温度が約5℃低下させられるであろう。これらの考慮に基づき、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択し得るであろう。好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例えば、以下の条件が、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために利用され得る：上記の式に基づくTm−5℃における、5×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）／5×デンハルト溶液／1.0％SDSにおけるハイブリダイゼーション、続いて、60℃で、0.2×SSC／0.1％SDSの洗浄。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、42℃における3×SSCにおける洗浄工程が含まれる。しかしながら、等価なストリンジェンシーが、別の緩衝液、塩、および温度を使用しても達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる案内は、以下に見出され得る：Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.,1989,6.3.1.-6.3.6およびSambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Vol.3。
【００２５】
本明細書において使用されるような「mRNA」または「メッセンジャーRNA」という用語は、DNA配列の転写の産物であり、ポリペプチドへと翻訳され得るポリヌクレオチドを指す。
【００２６】
本明細書において使用されるような「オイルボディ（oil body）」または「オイルボディ（oil bodies）」という用語は、（例えば、Huang(1992)Ann.Rev.Plant Mol.Biol.43:177-200に記載された）植物細胞の油または脂肪の保管オルガネラを指す。
【００２７】
本明細書において交換可能に使用され得るような「オレオシン」および「オレオシンポリペプチド」という用語は、表1に挙げられたオレオシンポリペプチド（SEQ ID NO：1〜84）を含み、同義コドンの使用を別にすれば、（i）本明細書に示されたオレオシンポリペプチドを構成するアミノ酸配列と実質的に同一であるか、または（ii）少なくとも中程度にストリンジェントな条件でオレオシンをコードする核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列によりコードされるポリペプチド分子も含む、全ての任意のオレオシンポリペプチドを指す。オレオシンポリペプチドは、好ましくは、植物起源に由来する。
【００２８】
「実質的に同一の」という用語は、二つのポリペプチド配列が、好ましくは少なくとも75％同一、より好ましくは少なくとも85％同一、最も好ましくは少なくとも95％同一、例えば、96％、97％、98％、または99％同一であることを意味する。二つのポリペプチド配列間の同一率を決定するためには、一方の配列の全長の少なくとも50％がアラインメントに含まれるよう、二つの配列間の最も高いマッチが得られるよう、好ましくは、BLOSUM 62スコアリング マトリックス（Henikoff S.and Henikoff J.G.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919）並びに10のギャップ開始ペナルティおよび0.1のギャップ伸張ペナルティと共に、Clustal Wアルゴリズム（Thompson,JD,Higgins DG,Gibson TJ,1994,Nucleic Acids Res.22(22):4673-4680を使用して、そのような二つの配列のアミノ酸配列が整列化される。配列を整列化するために使用され得るその他の方法は、最も高いマッチが二つの配列間で入手され、二つの配列間の同一アミノ酸の数が決定されるよう、SmithおよびWaterman（Adv.Appl.Math.,1981,2:482）により改訂された、NeedlemanおよびWunsch（J.Mol.Biol.,1970,48:443）の整列化法である。二つのアミノ酸配列間の同一率を計算するためのその他の方法は、一般に当技術分野において認識されており、例えば、CarilloおよびLipton（SIAM J.Applied Math.,1988,48:1073）により記載されたもの、ならびにComputational Molecular Biology,Lesk,e.d.Oxford University Press,New York,1988,Biocomputing:Informatics and Genomics Projectsに記載されたものが含まれる。一般に、コンピュータプログラムが、そのような計算のために利用されるであろう。これに関して使用され得るコンピュータプログラムには、GCG（Devereux et al.,Nucleic Acids Res.,1984,12：387）BLASTP、BLASTN、およびFASTA（Altschul et al.,J.Molec.Biol.,1990：215：403）が含まれるが、これらに制限はされない。
【００２９】
本明細書において使用されるような「ヘアピン」または「ヘアピン構造」という用語は、mRNAポリヌクレオチドの第一の部分が、mRNAポリヌクレオチドの第二の部分のすぐ5'側に位置している、mRNAポリヌクレオチドの第一および第二の部分のハイブリダイゼーションにより形成されるRNA二重鎖構造を指す（参照：図1b）。「ヘアピン」は、二本鎖ステムセグメントから伸びる3'および／または5'の一本鎖領域をさらに含み得る。
【００３０】
本明細書において使用されるような「ポリヌクレオチドループ」または「ループ」という用語は、オレオシンをコードし得る核酸配列から、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドをコードする核酸配列を隔離している一つまたは複数のmRNAヌクレオチドを指す（参照：図1c）。ポリヌクレオチドループは、任意の介在配列であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドループは、二次構造を有しない。
【００３１】
「修飾されたオレオシンプロファイル」という語句は、植物が、非形質転換植物と比較して低下した定常状態オレオシンレベルを有することを意味する。好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する種子は、非形質転換種子と比較して、全タンパク質含有量の増加および脂質含有量の減少も有する。
【００３２】
「修飾されたオレオシンプロファイル」は、好ましくは、非形質転換植物に由来する同一タンパク質と比較した、特異的なオレオシンタンパク質の定常状態レベルの低下である。本願の目的のため、この低下は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。定常状態タンパク質レベルは、未改変のタンパク質レベルと比較して、約10％〜約90％のレベルに低下する。より好ましくは、定常状態タンパク質レベルは、未改変のタンパク質レベルと比較して、50％〜90％のレベルに低下し、最も好ましくは、定常状態タンパク質レベルは、本発明のキメラ核酸配列を含まない植物体に存在する未改変のタンパク質レベルと比較して、80％〜90％低下する。定常状態タンパク質レベルを決定するための技術には、濃度測定、定量的ウェスタンブロット分析、またはELISAの使用が含まれる。プロトコルの例は、Coligan et al.Current Protocols in Protein Science,vol3に見出され得る。
【００３３】
II. 植物細胞におけるオレオシン遺伝子発現を抑制し得るキメラ核酸配列、およびそのようなキメラ核酸配列を含む組換え発現ベクターの調製
前記のように、本発明は、植物における内因的に存在するオレオシンポリペプチドの発現を抑制する方法を提供する。本明細書に記載された方法は、オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸配列を使用して、オレオシンの生合成による産生を抑制することを目的とした、植物ゲノムの修飾に基づく。
【００３４】
特に、本発明は、種子に貯蔵される集積物の組成、とりわけ種子の脂質およびタンパク質の含有量が改変された種子からの種子由来生成物の調製に関する。特に、本発明は、オレオシン遺伝子発現のモジュレーション、より具体的にはオレオシン遺伝子発現の抑制により、種子の集積物が改変された種子から、種子由来生成物を調製する方法を提供する。
【００３５】
本発明者らは、オレオシンmRNAに相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列の導入が、内因性植物オレオシンの発現レベルの抑制をもたらすことを見出した。このオレオシンの発現レベルの低下は、植物種子内に存在する植物オイルボディサイズの驚くべきモジュレーションをもたらし、そして重要なこととして、種子組成の実質的な改変をもたらす。特に、本発明の方法論を用いて、種子の脂質およびタンパク質の含有量がモジュレートされ得る。本明細書に記載された方法論は、内因性オレオシンポリペプチドの発現レベルの特異的なモジュレーションを許容するという点でさらに有利である。
【００３６】
本発明に従って入手された種子は、食品および飼料の製品の製剤化を含む、ヒトおよび動物が使用するための広範囲の製品を調製するために使用され得る。
【００３７】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【００３８】
本発明において提供される方法に従い使用され得る、オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列は、オレオシンmRNAまたは対応するオレオシンcDNAをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する任意の核酸配列であり得る。この配列は、本明細書において「アンチセンス配列」と呼ばれ得る。オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的なアンチセンス配列は、都合よく、オレオシンをコードするDNA配列を選択し、そのような選択されたDNA配列を使用して、それに相補的な核酸配列を調製することにより、調製され得る。オレオシンをコードするDNA配列は、当技術分野において周知であり、多数の起源から一般に入手可能である。本発明によると、オレオシンをコードするDNA配列は、好ましくは、植物起源より選択される。これに関して選択され得る例示的なDNA配列には、アラビドプシス（Van Rooijen et al(1991)Plant Mol.Bio.18:1177-1179）；トウモロコシ（Qu and Huang(1990)J.Biol.Chem.Vol.265 4:2238-2243）；ナタネ（Lee and Huang(1991)Plant Physiol.96:1395-1397）；およびニンジン（Hatzopoulos et al(1990)Plant Cell Vol.2,457-467.）から入手可能なオレオシン配列が含まれる。これに従い使用され得るオレオシン配列には、SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：84として示されたものが含まれる。オレオシンポリペプチドをコードする対応する核酸配列は、表1に提供されるスイス プロテイン（Swiss Protein）名（identifier）番号を介して容易に同定され得る。これらの核酸配列を使用すれば、付加的な新規のオレオシンコーディング核酸配列が、当業者に周知の技術を使用して容易に同定され得る。例えば、発現ライブラリーのようなライブラリーがスクリーニングされ得、配列情報を含有しているデータベースが類似配列に関してスクリーニングされ得る。これに従い、オレオシンをコードする核酸配列を同定するためのその他の方法が使用され得、新規の配列が発見され使用され得る。
【００３９】
オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的な核酸配列は、好ましくは、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および植物の再生により、相補的なRNAポリヌクレオチドへと転写されるDNA配列である。オレオシンをコードするDNA配列から出発して、相補的なDNA配列は、mRNAの逆転写を使用したcDNA配列の作成を含む多様な方式で調製され得る。逆転写酵素PCR（RT-PCR）のプロトコルは、Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Vol.3に見出され得る。好ましくは、cDNA配列は、二次構造を含有していない。より好ましくは、cDNA配列は、増強された安定性のためポリAテールも含有する。
【００４０】
オレオシン配列をコードする核酸配列に相補的なDNA配列の長さは、変動し得るが、但し、再生した植物におけるキメラ核酸配列の発現により、内因的に存在する植物オレオシンのレベルの低下をもたらす配列が使用される。本明細書において使用されるような「抑制」という用語は、特異的なタンパク質の定常状態レベルの低下を説明する。本願の目的のため、この低下は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。定常状態タンパク質レベルは、未改変のタンパク質レベルと比較して、約10％〜約90％のレベルに低下する。より好ましくは、定常状態タンパク質レベルは、未改変のタンパク質レベルと比較して、50％〜90％のレベルに低下し、最も好ましくは、定常状態タンパク質レベルは、本発明のキメラ核酸配列を含まない植物に存在する未改変のタンパク質レベルと比較して、80％〜90％低下する。定常状態タンパク質レベルを決定するための技術には、濃度測定、定量的ウェスタンブロット分析、またはELISAの使用が含まれる。プロトコルの例は、Coligan et al.Current Protocols in Protein Science,vol 3に見出され得る。上に挙げられた技術は、全種子抽出物またはオイルボディ画分のいずれかに対して実施され得る。
【００４１】
好ましくは、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なDNA配列は、オレオシンをコードするDNA配列と同一の長さであり（図2aを参照）、オレオシンをコードする配列に相補的なDNA配列に対する配列同一率は100％であるが、オレオシンをコードする配列の一部のみに相補的な、より短い断片が使用されてもよく、同一率は、より低く、例えば、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、または90％であってもよい。より短い断片が使用される場合、そのような断片は、例えば、全オレオシンヌクレオチド配列の長さの95％、90％、85％、80％、または75％であり得る。好ましい実施形態において、オレオシンmRNAをコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドをコードする核酸配列は、SEQ ID NO：85および86より選択される。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態において、キメラ核酸配列は、オレオシンをコードし得る核酸配列をさらに含む。オレオシンをコードする核酸は、本明細書において定義されるようなオレオシンまたはオレオシンポリペプチドをコードする任意の核酸配列であり得る。この核酸配列は、本明細書において「センス配列」とも呼ばれ得る。
【００４３】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においてはオレオシンタンパク質の発現が抑制されている）。
【００４４】
もう一つの好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入する工程；
（c）形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【００４５】
これに従い、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列に連結された、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成するキメラ核酸配列により形質転換された植物細胞においては、転写時に一本鎖mRNAが合成され、そのようなmRNAは、合成により核酸配列（ii）および（iii）の相補性のため二重鎖構造を形成するであろうことが予想される。好ましい態様において、ヘアピンとして知られる二重鎖構造が形成される。「ヘアピン」という用語は、既に本明細書において定義されており、図1bに概略的に示される。
【００４６】
好ましい態様において、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列は、全長オレオシンヌクレオチド配列に相補的であり、オレオシンまたはその断片をコードし得る核酸配列は、全長オレオシンをコードし得る（参照：図2cおよび2d）。
【００４７】
その他の態様において、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列は、全長オレオシンヌクレオチド配列に相補的であるが、オレオシンをコードする核酸配列の断片のみが使用される。好ましくは、ヘアピンを形成し得る断片が選択される。さらに他の態様において、オレオシンをコードする核酸配列は、全長オレオシンをコードし得、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドは、全長オレオシンヌクレオチド配列の断片のみに相補的である。特に好ましい態様において、使用される断片は、ヘアピンを形成し得る。そのような断片の長さは、変動し得るが、一般に、23、24、25、26、27、28、29、30ヌクレオチド長またはそれ以上と考えられる（Thomas et al.,(2001)Plant J.25(4):417-425）。好ましい態様において、オレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドをコードする核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：87および88より選択される。
【００４８】
前述のように、ヘアピン構造は、オレオシンをコードする核酸配列に連結された、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチドをコードする核酸配列の間で形成され得る。しかしながら、本発明の別の態様において、オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列（アンチセンス配列）を転写時に生成する核酸配列は、一つまたは複数のヌクレオチドにより、オレオシンをコードし得る核酸配列（センス配列）から隔離される。これらの隔離ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドループを形成するが、二重鎖構造の形成には一般に参加しない。「ポリヌクレオチドループ」または「ループ」という用語は、既に本明細書において定義されており、図1cに概略的に示される。
【００４９】
好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、1〜150ヌクレオチド長である。さらに好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、50〜100ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、該ループは、70〜80ヌクレオチド長である。好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、ポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖である。好ましい態様において、該ポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖は、2〜150ヌクレオチド長である。さらに好ましい態様において、該ポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖は、10〜150ヌクレオチド長である。さらに好ましい態様において、該ポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖は、50〜100ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、該ポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖は、20〜80ヌクレオチド長である。
【００５０】
さらに好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、または40個の連続するA、U、C、またはGヌクレオチド残基を含むポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖を少なくとも一つ含む。さらに好ましい態様において、該ループは、該ポリヌクレオチドループの全長の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％を含むポリA、ポリU、ポリC、またはポリGヌクレオチド鎖を少なくとも一つ含む。
【００５１】
さらに好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、少なくとも1、2、5、10、15、20、25、30、35、または40個の連続する（AC）、（AU）、（AG）、（UC）、（UG）、（UA）、（CU）、（CG）、（CA）、（GU）、（GA）、または（GC）ヌクレオチド残基を含む（AC）、（AU）、（AG）、（UC）、（UG）、（UA）、（CU）、（CG）、（CA）、（GU）、（GA）、または（GC）ヌクレオチド鎖を少なくとも一つ含む。さらに好ましい態様において、該ポリヌクレオチドループは、該ポリヌクレオチドループの全長の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％を含む（AC）、（AU）、（AG）、（UC）、（UG）、（UA）、（CU）、（CG）、（CA）、（GU）、（GA）、または（GC）ヌクレオチド鎖を少なくとも一つ含む。
【００５２】
好ましい態様において、ポリヌクレオチドループはイントロンであり、さらに好ましい態様において、イントロンは植物イントロンである。植物イントロンの長さは広範に変動し得るが、全ての植物イントロンのおよそ2/3は、150ヌクレオチドより短く、イントロンの大半が、80〜139ヌクレオチド長の範囲に入る（Simpson GG and Filipowicz W.(1996)Plant Mol Biol 32:1-41.）。イントロンの最小の機能的な長さは、高等植物においてはおよそ70ヌクレオチドであることが決定されている（Goodall GJ and Filipowics W.(1990)Plant Mol Biol 14:727-733.）。さらに好ましい態様において、イントロンは、5'および3'両方のスプライス部位配列からなる古典的なスプライス部位を含有している。植物において、高等植物におけるより広い5'スプライス部位コンセンサスは、AG/GUAAGUである。最低でも、5'スプライス部位は、/GUジヌクレオチドを含む。稀な場合において、5'スプライス部位は、/GCジヌクレオチドを含む。植物において、植物におけるより広い3'スプライス部位コンセンサスは、UGYAG/GUである。最低でも、3'スプライス部位はジヌクレオチドAG/を含む。（Simpson GG and Filipowicz W.(1996)Plant Mol Biol 32:1-41.）。好ましい態様において、ポリヌクレオチドループは、オレオシンをコードするヌクレオチド配列から入手可能なイントロンである。最も好ましい態様において、ポリヌクレオチドループの配列は、SEQ ID NO：89〜91より選択される。
【００５３】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（iii）ポリヌクレオチドループをコードする核酸配列；および
（iv）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；ならびに
（c）該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においてはオレオシンタンパク質の発現が抑制されている）。
【００５４】
好ましい態様において、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（iii）ポリヌクレオチドループをコードする核酸配列；および
（iv）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入する工程；
（c）形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から植物種子由来生成物を調製する工程。
【００５５】
本発明に従って、キメラ核酸配列は組換え発現ベクターに組み込まれる。従って、本発明は、転写の5’から3’方向に以下のものを含むキメラ核酸配列を含む、植物細胞における発現のために適している組換え発現ベクターを提供する：
（a）以下のものと機能的に連結された植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（b）オレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列。
【００５６】
「選択された細胞における発現のために適している」という用語は、組換え発現ベクターが、選択された細胞における発現を保証するのに必要な全ての核酸配列を含有していることを意味する。従って、組換え発現ベクターは、修飾されたオレオシンをコードする核酸配列に機能的に連結された、発現のために使用される細胞に基づき選択された、転写の開始および終結を保証する調節核酸配列をさらに含有している。発現を制御し得る核酸配列には、プロモーター、エンハンサー、サイレンシングエレメント、リボソーム結合部位、シャイン-ダルガーノ配列、イントロン、およびその他の発現エレメントが含まれる。「機能的に連結された」とは、細胞におけるアンチセンス オレオシン発現をコードする核酸配列に連結された調節領域を含む核酸配列を意味するものである。典型的な核酸構築物は、5’から3’方向に、発現を指図し得るプロモーター領域、修飾されたオレオシンポリペプチドを含むコーディング領域、および選択された細胞において機能性の終結領域を含む。調節配列の選択は、修飾されたオレオシンが発現される植物および細胞の型に依り、mRNAの発現レベルに影響を及ぼし得る。調節配列は、一般に当技術分野において認識されており、細胞における修飾されたオレオシンの発現を指図するために選択される。
【００５７】
本発明において使用され得る植物細胞において機能性のプロモーターには、35S CaMVプロモーター（Rothstein et al.,1987 Gene 53:153-161）、アクチンプロモーター（McElroy et al.,1990 Plant Cell 2:163-171）、およびユビキチンプロモーター（欧州特許出願0 342 926）のような構成性プロモーターが含まれる。その他のプロモーターは、ある種の組織もしくは器官（例えば、根、葉、花、もしくは種子）または細胞型（例えば、葉上皮細胞、葉肉細胞、もしくは根皮層細胞）、または植物発達のある段階に特異的である。発現のタイミングは、誘導可能プロモーター、例えば、米国特許第5,614,395号に記載されたPR-aプロモーターを選択することにより制御され得る。従って、プロモーターの選択は、所望のポリペプチドの蓄積の所望の位置およびタイミングに依る。
【００５８】
特定の好ましい態様において、種子細胞において発現されるオレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNAポリヌクレオチド、および種子特異的プロモーターが利用される。本発明において使用され得る種子特異的プロモーターには、例えば、ファセオリンプロモーター（Sengupta-Gopalan et al.,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA:82 3320-3324）およびアラビドプシス18kDaオレオシンプロモーター（van Rooijen et al.,1992 Plant.Mol.Biol.18:1177-1179）が含まれる。様々な植物細胞型において有用な新たなプロモーターは、絶えず発見されている。植物プロモーターの多数の例は、Ohamuroら（Biochem of Pl.,1989 15:1-82）に見出され得る。好ましい態様において、プロモーターは構成性プロモーターである。構成性プロモーターの例には、35S CaMVプロモーター（Rothstein et al.,1987 Gene 53:153-161）、アクチンプロモーター（McElroy et al.,1990 Plant Cell 2:163-171）、およびユビキチンプロモーター（欧州特許出願0 342 926）が含まれるが、これらに制限はされない。さらに好ましい態様において、プロモーターは、抑制すべきオレオシン遺伝子の正確なタイミングおよび組織特異性を有する。最も好ましい態様において、抑制すべきオレオシン遺伝子に由来するプロモーターが使用される。
【００５９】
ポリペプチドの発現を増強し得る遺伝子エレメントが、発現ベクターに含まれ得る。植物細胞において、これらには、例えば、AMVリーダー配列（Jobling and Gehrke,1987 Nature 325:622-625）のようなウイルスに由来する非翻訳リーダー配列およびトウモロコシユビキチンプロモーターに関連したイントロン（参照：米国特許第5,504,200号）が含まれる。
【００６０】
転写ターミネーターは、一般に当技術分野において認識されており、転写終結のシグナルとして機能する他に、mRNAの半減期を延長するよう機能する防御エレメントとしても機能する（Guarneros et al.,1982 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:238-242）。植物細胞における発現のための核酸配列において、転写ターミネーターは、典型的には、約200ヌクレオチド〜約1000ヌクレオチド長である。本発明において使用され得るターミネーター配列には、例えば、ノパリンシンターゼ終結領域（Bevan et al.,1983 Nucl.Acid.Res.11:369-385）、ファセオリンターミネーター（van der Geest et al.,1994 Plant J.6:413-423）、アグロバクテリウム ツメファシエンス（tumefaciens）のオクトピンシンターゼ遺伝子のためのターミネーター、またはその他の同様に機能するエレメントが含まれる。転写ターミネーターは、An(1987)Methods in Enzym.153:292により記載されたようにして入手され得る。転写ターミネーターの選択は、転写の速度に対する効果を有し得る。
【００６１】
組換え発現ベクターは、さらに、マーカー遺伝子を含有し得る。本発明に従って使用され得るマーカー遺伝子には、全ての選択可能かつスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む、非形質転換細胞からの形質転換細胞の区別を可能にする全ての遺伝子が含まれる。マーカーは、化学的な手段による形質の選択を可能にする、例えば、カナマイシン、アンピシリン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールに対する抗生物質耐性マーカーのような耐性マーカー、または例えば通常植物毒性の糖マンノースのような化学的薬剤に対する耐性マーカーであり得る（Negrotto et al.,2000 Plant Cell Rep.19:798-803）。植物組換え発現ベクターにおいては、除草剤耐性マーカー、例えば、グリフォセート（米国特許第4,940,935号および第5,188,642号）またはフォスフィノスリシン（White et al.,1990 Nucl.Acids Res.18:1062；Spencer et al.,1990 Theor.Appl.Genet.79:625-631）に対する耐性を付与するマーカーが、便利に使用され得る。オレオシンタンパク質に近接して連結された場合、除草剤に対する耐性マーカーは、関心対象のタンパク質を失っていない植物のための、植物細胞または植物の集団に対する選択圧を維持するために使用され得る。視覚的な観察を通して形質転換体を同定するために利用され得るスクリーニング可能なマーカーには、ベータ-グルクロニダーゼ（GUS）（米国特許第5,268,463号および第5,599,670号を参照）ならびに緑色蛍光タンパク質（GFP）（Niedz et al.,1995 Plant Cell Rep.14:403）が含まれる。
【００６２】
植物細胞における核酸配列の導入のために適している組換え発現ベクターには、TiおよびRiプラスミドのようなアグロバクテリウムおよびリゾビウム（Rhizobium）に基づくベクターが含まれる。アグロバクテリウムに基づくベクターは、典型的には、少なくとも一つのT-DNAボーダー配列を保持し、pBIN19（Bevan,1984 Nucl Acids Res.Vol.12,22:8711-8721）およびその他のバイナリーベクター系（例えば：米国特許第4,940,838号）のようなベクターを含む。
【００６３】
前述のように、本発明の好ましい態様において、植物細胞における発現を制御し得る核酸配列は、植物種子細胞における発現を許容し、形質転換植物は、種子を生じ得る植物である。さらに好ましい態様において、プロモーターは、種子にとって好ましいプロモーターである。従って、本発明は、以下の工程を含む、植物の種子におけるオレオシンタンパク質の発現を抑制する方法を提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生させる工程；ならびに
（d）形質転換植物を、種子を生じ得る成熟植物体へと生長させる工程（種子においてはオレオシン発現レベルが抑制されている）。
【００６４】
本発明の組換え発現ベクターおよびキメラ核酸配列は、分子生物学の分野の当業者に周知の方法論に従って調製され得る。そのような調製は、典型的には、中間クローニング宿主として細菌種大腸菌（Escherichia coli）を含むであろう。大腸菌ベクターおよび植物形質転換ベクターの調製は、制限消化、ライゲーション、ゲル電気泳動、DNA配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、およびその他の方法論のような一般的に公知の技術を使用して達成され得る。組換え発現ベクターを調製するために必要とされる必要な工程を実施するために、多様なクローニングベクターが利用可能である。大腸菌において機能性の複製系を有するベクターには、pBR322、pUC系列のベクター、M13mp系列のベクター、pBluescript等のようなベクターがある。典型的には、これらのクローニングベクターは、形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含有している。核酸配列はこれらのベクターに導入され得、ベクターは適切な培地において培養された大腸菌に導入され得る。組換え発現ベクターは、細胞の採集および溶解により、細胞から容易に回収され得る。さらに、組換えベクターの調製に関する一般的な案内は、例えば、以下に見出され得る：Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Vol.3。
【００６５】
III. 内因性オレオシンレベルが抑制された植物の調製
本発明に従って、組換え発現ベクターを選択された細胞へ導入し、選択された細胞を、子孫細胞において修飾されたオレオシンタンパク質を作製するために増殖させる。
【００６６】
本明細書において「形質転換」とも呼ばれる、組換え発現ベクターを細胞へ導入する方法論は、当技術分野において周知であり、選択された細胞型に依って変動する。組換え発現ベクターを細胞へ移入するための一般的な技術には、電気穿孔；化学的に媒介される技術、例えば、CaCl2により媒介される核酸取り込み；パーティクルガン（particle bombardment）（微粒子銃（biolistics））；天然に感染性の核酸配列、例えばウイルス由来核酸配列、または植物細胞が使用される場合にはアグロバクテリウムもしくはリゾビウムに由来する核酸配列の使用；PEGにより媒介される核酸取り込み、微量注入、および炭化ケイ素ウィスカ（whiskers）の使用（Kaeppler et al.,1990 Plant Cell Rep.9:415-418）が含まれ、これらは全て本発明において使用され得る。
【００６７】
組換え発現ベクターの細胞への導入は、染色体DNAまたはプラスチドゲノムを含む宿主細胞ゲノムへの完全または部分的な取り込みの組み込みをもたらし得る。好ましい態様において、キメラ核酸構築物は、核ゲノム組み込み条件下で植物細胞へ導入される。そのような条件の下では、キメラ核酸配列は、植物のゲノムに安定的に組み込まれる。または、組換え発現ベクターは、ゲノムに組み込まれず、宿主細胞のゲノムDNAから独立して複製してもよい。核酸配列のゲノム組み込みは、その後の世代の細胞による導入された核酸配列の安定的な遺伝、および作出、植物系を可能にするため、典型的に使用される。
【００６８】
特定の態様は、植物細胞の使用を含む。本発明において使用される特定の植物細胞には、アラビドプシス タリアナ、ブラジルナッツ（ベルトレチア エクセルサ）；トウゴマ（リキヌス コミュニス）；ココナツ（コカス ヌシフェラ）；コリアンダー（コリアンドラム サチバム）；ワタ（ゴッシピウムspp.）；ラッカセイ（アラキス ヒポゲア）；ホホバ（シモンドシア チネンシス）；アマニ／アマ（リヌム ウシタチッシマム）；トウモロコシ（ジー メイズ）；マスタード（ブラッシカspp.およびシナピス アルバ）；アブラヤシ（エラエイス グイニイス）；オリーブ（オレア ユーロペア（Olea europaea））；ベニバナ（カルタムス ティンクトリウス）；ダイズ（グリシネ マックス）；カボチャ（ククルビタ マキシマ）；オオムギ（ホルデウム ブルガレ（Hordeum vulgare））；コムギ（トレチカム エスチバム（Traeticum aestivum））、およびヒマワリ（ヘリアンタス アヌウス）から入手可能な細胞が含まれる。
【００６９】
双子葉（dicotelydenous）植物種の形質転換方法論は、周知である。一般に、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換が、その高い効率、および全てではないにしても多くの双子葉植物種による一般的な感受性のため、利用されている。アグロバクテリウム形質転換は、一般に、例えば、組換えバイナリーベクターを保持する大腸菌株、および標的アグロバクテリウム株へのバイナリーベクターの動員が可能なヘルパープラスミドを保持する大腸菌株とのトリペアレンタルメイティング（tri-parental mating）、またはアグロバクテリウム株のDNA形質転換による、関心対象のDNAを含むバイナリーベクター（例えば、pBIN19）の、適切なアグロバクテリウム株（例えば、CIB542）への移入を含む（Hofgen et al.Nucl.Acids.Res.,1988 16:9877。双子葉植物種を形質転換するために使用され得るその他の形質転換方法論には、遺伝子銃（Sanford,1988 Trends in Biotechn.6:299-302）；電気穿孔（Fromm et al.,1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824-5828）；PEGにより媒介されるDNA取り込み（Potrykus et al.,1985 Mol.Gen.Genetics 199:169-177）；微量注入（Reich et al.,1986 Bio/Techn.4:1001-1004）、および炭化ケイ素ウィスカ（Kaeppler et al.,1990 Plant Cell Rep.9:415-418）が含まれる。正確な形質転換方法論は、典型的には、使用される植物種に依って多少変動する。
【００７０】
特定の態様において、アラビドプシス、ベニバナ、またはアマの植物細胞が使用される。ベニバナ形質転換は、BakerおよびDyer（1996 Plant Cell Rep.16:106-110.）により記載されている。アマ形質転換は、Dong J.およびMcHughen A.（Plant Cell Reports(1991)10:555-560）、Dong J.およびMcHughen A.（Plant Sciences(1993)88:61-71）、ならびにMlynarovaら（Plant Cell Reports(1994)13:282-285）により記載されている。付加的な植物種特異的な形質転換プロトコルは、Biotechnology in Agriculture and Forestry 46:Transgenic Crops I(Y.P.S.Bajaj ed.),Springer-Verlag,New York(1999)およびBiotechnology in Agriculture and Forestry 47:Transgenic Crops II(Y.P.S.Bajaj ed.),Springer-Verlag,New York(2001)に見出され得る。
【００７１】
単子葉（Monocotelydenous）植物種は、パーティクルガン（Christou et al.,1991 Biotechn.9:957-962；Weeks et al.,1993 Plant Physiol.102:1077-1084；Gordon-Kamm et al.,1990 Plant Cell 2:603-618）PEGにより媒介されるDNA取り込み（EP 0 292 435；0 392 225）、またはアグロバクテリウムにより媒介される形質転換（Goto-Fumiyuki et al.,1999 Nature-Biotech.17(3):282-286）を含む多様な方法論を使用して形質転換され得る。
【００７２】
プラスチド形質転換は、米国特許第5,451,513号；第5,545,817号、および第5,545,818号；ならびにPCT特許出願第95/16783号；第98/11235号、および第00/39313号に記載されている。基本的な葉緑体形質転換は、例えば、遺伝子銃またはプロトプラスト形質転換を使用して、選択可能マーカーに隣接するクローニングされたプラスチドDNAを、関心対象の核酸配列と共に、適当な標的組織へ導入することを含む。使用され得る選択マーカーには、例えば、細菌aadA遺伝子（Svab et al.,1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913-917）が含まれる。使用され得るプラスチドプロモーターには、例えば、タバコclpP遺伝子プロモーターが含まれる（PCT特許出願97/06250）。
【００７３】
もう一つの態様において、本発明において提供される本発明のキメラ核酸構築物（contructs）は、直接、プラスチドゲノムへと形質転換される。プラスチド形質転換技術は、米国特許第5,451,513号、第5,545,817号、第5,545,818号、および第5,576,198号；PCT出願WO95/16783およびWO97/32977；並びにMcBride et.al.,1994 Proc Natl Acad Sci USA 91:7301-7305（これら全ての全開示が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。一つの態様において、プラスチド形質転換は、遺伝子銃を介して達成され、まず単細胞緑藻クラミドモナス レインハルドチー（Chlamydomonas reinhardtii）（Boynton et al.,1988 Science 240:1534-1537）において実施され、次いでニコチアナ タバカム（Nicotiana tabacum）（Svab et al.,1990 Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530）に拡張され、シス作用性抗生物質耐性遺伝子座（スペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する耐性）の選択または非光合成変異表現型の補完と組み合わせられる。
【００７４】
もう一つの態様において、タバコプラスチド形質転換は、選択可能抗生物質耐性マーカーに隣接するクローニングされたプラスチドDNAを使用した、葉もしくはカルス組織のパーティクルガン、またはポリエチレングリコール（PEG）により媒介されるプロトプラストによるプラスミドDNAの取り込みにより実施される。例えば、ターゲティング配列と呼ばれる1〜1.5kbの隣接領域が、プラスチドゲノムとの相同的組み換えを容易にし、156kbのタバコプラスチドゲノムの特異的な領域の置換または修飾を可能にする。一つの態様において、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに対する耐性を付与するプラスチド16S rDNAおよびrps12遺伝子の点変異が、標的葉の打ち込み100回につきおよそ1回の頻度で安定的なホモプラスミック形質転換体をもたらす形質転換のための選択マーカーとして利用され得る（Svab et al.,1990 Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530；Staub et al.,1992 Plant Cell 4:39-45（これらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲティングベクターの作出を可能にする（Staub et al.,1993 EMBO J 12：601-606（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。もう一つの態様において、劣性のrRNAまたはr-タンパク質抗生物質耐性遺伝子の優性選択可能マーカー、スペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌aadA遺伝子への置換により、形質転換頻度の実質的な増加が入手され得る（Svab et al.,1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:913-917（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。このマーカーは、緑藻クラミドモナス レインハルドチーのプラスチドゲノムの高頻度形質転換のためにも良好に使用されている（Goldschmidt-Clermont,M.,1991 Nucl Acids Res 19,4083-4089（これの全開示は参照により本明細書に組み入れられる））。その他の態様において、タバコおよびコケ、フィスコミトレラ（Physcomitrella）からのプロトプラストのプラスチド形質転換は、PEGにより媒介されるDNA取り込みを使用して達成され得る（O'Neill et al.,1993 Plant J 3:729-738；Koop et al.,1996 Planta 199:193-201（これらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。
【００７５】
パーティクルガンおよびプロトプラスト形質転換の両方が、本発明において使用するために企図される。脂肪種子植物のプラスチド形質転換は、アラビドプシス属およびブラッシカ属において良好に実施されている（Sikdar et al.,1998 Plant Cell Rep 18:20-24；PCT出願WO00/39313（これらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。
【００７６】
キメラ核酸配列構築物は、植物プラスチドにおいて構築物を発現し得るプロモーターを含むプラスチド発現カセットへ挿入される。植物プラスチドにおける発現が可能な特定のプロモーターは、例えば、同一種に由来してもよいし、または異なる種に由来してもよく、その天然産物が、典型的には、非緑色組織に存在するものを含むプラスチド型の大半に見出され得る、プラスチド遺伝子のコーディング領域の上流の5'隣接領域から単離されたプロモーターである。プラスチドにおける遺伝子発現は、核遺伝子発現とは異なり、原核生物における遺伝子発現と関係がある（Stern et al.,1997 Trends in Plant Sci 2:308-315（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））。
【００７７】
プラスチドプロモーターは、一般に、原核生物プロモーターに典型的な-35および-10エレメントを含有しており、PEP（プラスチドにコードされたRNAポリメラーゼ）プロモーターと呼ばれるいくつかのプラスチドプロモーターは、プラスチドゲノムに主にコードされた大腸菌様RNAポリメラーゼにより認識され、NEPプロモーターと呼ばれるその他のプラスチドプロモーターは、核にコードされたRNAポリメラーゼにより認識される。いずれの型のプラスチドプロモーターも、本発明において使用するのに適している。プラスチドプロモーターの例には、タバコclpP遺伝子プロモーター（WO97/06250（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））およびアラビドプシスclpP遺伝子プロモーター（米国出願第09/038,878号（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる））のようなclpP遺伝子のプロモーターが含まれる。植物プラスチドにおけるキメラ核酸構築物の発現を駆動し得るもう一つのプロモーターは、プラスチド16SリボソームRNAオペロンの調節領域に由来する（Harris et al.,1994 Microbiol Rev 58:700-754；Shinozaki et al.,1986 EMBO J 5:2043-2049（これら両方の全開示が参照により本明細書に組み入れられる）。植物プラスチドにおける核酸構築物の発現を駆動し得るプロモーターのその他の例には、psbAプロモーターまたはam rbcLプロモーターが含まれる。プラスチド発現カセットは、好ましくは、本発明のキメラ核酸構築物に機能的に連結されたプラスチド遺伝子3'非翻訳配列（3'UTR）をさらに含む。非翻訳配列の役割は、好ましくは、転写の終結ではなく、転写されたRNAの3'プロセシングを指図することである。例示的な3'UTRは、プラスチドrps16遺伝子3'非翻訳配列またはアラビドプシスプラスチドpsbA遺伝子3'非翻訳配列である。さらなる態様において、プラスチド発現カセットは、3'非翻訳配列の代わりにポリGトラクトを含む。プラスチド発現カセットは、好ましくは、さらに、本発明において提供されたキメラ核酸構築物に機能的に連結された、植物プラスチドにおいて機能性の5'非翻訳配列（5'UTR）も含む。
【００７８】
プラスチド発現カセットは、好ましくは、相同的組み換えによるプラスチドゲノムへの組み込みのための隣接領域をさらに含むプラスチド形質転換ベクターに含有されている。プラスチド形質転換ベクターは、任意で、少なくとも一つのプラスチド複製開始点を含み得る。本発明には、そのようなプラスチド形質転換ベクターにより形質転換された植物プラスチドも包含される（この場合、キメラ核酸構築物は植物プラスチドにおいて発現可能である）。また、この植物プラスチドを含む、子孫を含む植物または植物細胞も、本発明に包含される。特定の態様において、子孫を含む植物または植物細胞は、トランスジェニックプラスチドに関してホモプラスミックである。
【００７９】
植物プラスチドにおけるキメラ核酸構築物の発現を駆動し得るその他のプロモーターには、好ましくは、植物または発現が達成される植物細胞の細胞内オルガネラもしくは構成要素に対して異種の、トランス活性化因子により制御されるプロモーターが含まれる。これらのケースにおいて、トランス活性化因子をコードするDNA分子は、植物核DNAに形質転換される適切な核発現カセットへ挿入される。トランス活性化因子は、プラスチド移行ペプチドを使用して、プラスチドへとターゲティングされる。トランス活性化因子およびトランス活性化因子により駆動されるDNA分子は、選択されたプラスチド形質転換系を、プラスチドターゲティング配列が補足され、核プロモーターに機能的に連結されたトランス活性化因子をコードするDNA分子を含有しているトランスジェニック系と交雑すること、または核プロモーターに機能的に連結されたプラスチドターゲティング配列が補足されたトランス活性化因子をコードするキメラ核酸構築物を含有しているトランスジェニック系に、所望のDNA分子を含有しているプラスチド形質転換ベクターを直接形質転換することにより、合わせられる。核プロモーターが誘導可能プロモーター、特に、化学的に誘導可能な態様である場合、植物のプラスチドにおけるキメラ核酸構築物の発現は、化学的誘導因子の葉面適用により活性化される。そのような誘導可能なトランス活性化因子により媒介されるプラスチド発現系は、好ましくは、誘導前には検出可能な発現がなく、誘導後に例外的に高いタンパク質の発現および蓄積がある、厳密に制御可能なものである。
【００８０】
特定のトランス活性化因子は、例えば、ウイルスRNAポリメラーゼである。この型の特定のプロモーターは、バクテリオファージT7 DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるT7遺伝子10プロモーターのような、単一サブユニットRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。T7ポリメラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、核ゲノムに形質転換され、T7ポリメラーゼは、プラスチド移行ペプチドを使用してプラスチドにターゲティングされる。遺伝子、例えば、T7ポリメラーゼのようなウイルスRNAポリメラーゼをコードする遺伝子の核発現のために適しているプロモーターは、本願において既に他の箇所に記載されている。プラスチドにおけるキメラ核酸構築物の発現は、構成性であってもよいし、または誘導可能であってもよく、そのようなプラスチド発現は、器官または組織に特異的であってもよい。様々な発現系の例は、WO98/11235（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる）に詳細に記載されている。従って、一つの局面において、本発明は、例えば、米国特許第5,614,395号（これの全開示が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたようなT7遺伝子10プロモーター／ターミネーター配列により調節される葉緑体レポータートランスジーンと機能的に連結された、化学的に誘導可能なPR-1aプロモーター、例えば、タバコのPR-1プロモーターの制御下での、葉緑体にターゲティングされたファージT7 RNAポリメラーゼの核ゲノムにおける共役発現を利用する。もう一つの態様において、母性遺伝したTRまたはNTR遺伝子に関してホモプラスミックのプラスチド形質転換体が、核にT7ポリメラーゼを発現する系により授粉される場合、プラスチドにおける大量の酵素的に活性なタンパク質の合成が、PR-1a誘導化合物ベンゾ（1,2,3）チアゾール-7-カルボチオ酸S-メチルエステル（BTH）の葉面適用によって誘発されるまで、それらを発現しない両方のトランスジーン構築物を保持するF1植物が入手される。
【００８１】
形質転換の後、細胞は、典型的には、形質転換体の同定を可能にする選択培地において増殖させられる。細胞は、当技術分野において公知の方法論に従って採集され得る。これらの方法論は、一般に、細胞型依存性であり、熟練した当業者に公知である。植物が利用される場合、それらは、熟練した当業者に一般に公知の植物組織培養技術を使用して、成熟植物へと再生させられてもよい。種子は、成熟形質転換植物から採取され、植物系を繁殖させるために使用され得る。植物は交雑されてもよく、このように、遺伝的背景の異なる細胞系およびトランスジェニック植物の育種が、本発明において企図され得る。
【００８２】
植物ゲノムは、典型的には各々多少核酸配列が異なる、一つまたは複数のオレオシンをコードするヌクレオチド配列を含み得ることに注意すべきである。複数のオレオシンの発現を同時に抑制することが、望ましいかもしれない。従って、各々異なるオレオシンヌクレオチド配列の発現を抑制するために設計された複数のキメラ配列が調製され得る。これに従い、そのようなキメラ核酸配列を含む別々のベクターは、植物細胞へ同時に導入され得る。または、各キメラ配列が、（i）植物細胞における転写を指図し得る核酸配列；（ii）オレオシンをコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列、および（iii）オレオシンをコードする核酸配列を含む、複数のキメラ核酸配列を含む単一のベクターが、植物細胞へ導入されてもよいい（図2b、g、h、iを参照）。または、複数のオレオシンの抑制を達成するため、これに従い一つのキメラ核酸配列を使用して植物を調製した後、そのような植物を、各々異なる内因性植物オレオシンを標的とする一つまたは複数の付加的なキメラ核酸配列により形質転換してもよい。
【００８３】
一つの局面において、本発明は、転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含む、オレオシン遺伝子発現が抑制されている植物および植物種子も提供する：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNAまたはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写により生成する核酸。
【００８４】
さらなる局面において、本発明は、本発明の修飾されたオレオシンプロファイルを含むオイルボディも含む。
【００８５】
IV. 抑制されたオレオシンのレベルを含む植物種子の使用
前述のように、本発明に従って入手された種子は、種子由来生成物を調製するために使用され得る。本発明に従って調製され得る種子由来生成物には、食品および飼料製品ならびにパーソナルケア製品を含む、ヒトおよび動物が使用するための生成物が含まれる。
【００８６】
当業者であれば、生成物の性質に依るであろう、植物種子由来生成物の調製法を容易に決定することができよう。例えば、植物種子由来生成物は、種子のための任意の標準的な商業的加工実務を使用して調製され得る。完全な種子または破砕された種子が、種子由来生成物、例えば、食品を調製するために使用され得る。または、種子画分が調製され、次いで、それが種子由来生成物を調製するために使用されてもよい。これに従い使用され得る好ましい方法には、ヘキサンによる抽出のような溶媒抽出、および機械的な力の適用、例えば、圧搾、粉砕、または磨砕が含まれる。典型的には、これらのプロセスは、ミール画分とも呼ばれるタンパク質画分からの種子油画分の分離をもたらす。単離されたミール画分および油画分は、両方とも、食品もしくは飼料の生成物またはパーソナルケア製品におけるさらなる加工のために使用され得る。
【００８７】
本発明に従って調製され得るヒト消費用の種子由来生成物には、健康上の恩典を付与し得る任意の健康食品を含む任意の食品が含まれる。本発明に従って調製された種子生成物から調製され得る飲料には、乾燥粉末状または液状の任意の飲料、例えば、任意の果汁、新鮮凍結または缶詰めの濃縮物、風味付けされた飲料が含まれ、大人用および乳幼児用の調製乳も含まれる。さらなる製品には、豆乳のような非乳製品乳から調製された製品が含まれる。これらの製品には、全乳、スキムミルク、アイスクリーム、ヨーグルト等が含まれる。
【００８８】
本発明に従って調製された種子を使用して調製され得る動物飼料製品には、ウシ、家禽、ブタ等に供給するための製品が含まれる。さらに、魚および小エビの養殖において使用するための製品を含む養殖飼料製品、ならびにイヌ、ネコ、トリ、爬虫類、げっ歯類等に供給するためのペットフード製品が含まれる。
【００８９】
本発明に従って調製された種子由来生成物を使用して調製され得るパーソナルケア製品には、セッケン、スキンクリーム、フェイシャルクリーム、フェースマスク、スキンクレンザー、練り歯磨き、リップスティック、香水、化粧品、ファンデーション、頬紅、マスカラ、アイシャドー、日焼け止めローション、ヘアコンディショナー、およびヘアカラーを含む、ヒトが使用するための任意の化粧用製品が含まれる。
【００９０】
利用される正確な種子加工条件および植物種子由来生成物調製方法論は、植物種に依って、そして種子が加工される所望の植物種子由来生成物に依って変動するであろう。利用される正確な種子の加工条件または種子由来の調製技術は、本発明にとっては重要でないと考えられる。
【００９１】
種子の栄養価をモジュレートすること
前述のように、本発明は、植物、とりわけ植物種子の組成を改変する方法を提供する。特に、野生型植物種子から入手された種子と比べて、脂質含有量が低下しており、種子内のタンパク質含有量が増加している種子が、本発明に従って調製され得る。
【００９２】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物種子におけるタンパク質含有量を増加させる方法も提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；ならびに
（d）非形質転換植物と比較して種子の全タンパク質含有量の増加を有している種子を入手する工程。
【００９３】
従って、本発明は、以下の工程を含む、植物種子における脂質含有量を減少させる方法も提供する：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；ならびに
（d）非形質転換植物と比較して種子の全脂質含有量の減少を有している種子を入手する工程。
【００９４】
このようにして入手された種子は、植物種子由来生成物を調製するために使用され得る。
【００９５】
種子内の修飾されたオレオシンタンパク質プロファイルを有する植物種子は、該植物種子の全タンパク質含有量の増加を有する。本願の目的のため、このタンパク質の増加は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の全タンパク質含有量の増加は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子の全タンパク質含有量と比べて約5％〜約30％のレベルに増加する。より好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の全タンパク質含有量は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子の全タンパク質含有量と比べて15％〜30％のレベルに増加し、最も好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の全タンパク質含有量は、本発明のキメラ核酸配列を含まない野生型植物に由来する植物種子の全タンパク質含有量と比較して20％〜30％のレベルに増加する。植物種子の全タンパク質含有量を決定するための技術は、BCAタンパク質アッセイ試薬（Pierce,Rockford,IL）の使用を含み、本願の実施例5にさらに記載される。上に挙げられた技術は、全種子抽出物またはオイルボディ画分のいずれかに対して実施され得る。
【００９６】
種子内の修飾されたオレオシンタンパク質プロファイルを有する植物種子は、該植物種子内の脂質含有量の減少を有する。本願の目的のため、この脂質含有量の減少は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の脂質含有量の減少は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子の脂質含有量と比べて約1％〜約20％のレベルに減少する。より好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の脂質含有量は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子の脂質含有量と比べて10％〜20％のレベル減少し、最も好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子の脂質含有量は、本発明のキメラ核酸配列を含まない野生型植物に由来する植物種子の脂質含有量と比較して15％〜20％のレベルに増加する。植物種子の脂質含有量を決定するための技術は、BlighおよびDyer（1959.Can.J.Med.Sci.37:911-917）に記載されており、本願の実施例5にさらに記載される。
【００９７】
オイルボディに基づく生成物
種子由来生成物を調製するために本発明に従って入手され得る一つの種子画分は、オイルボディ画分である。従って、本発明のもう一つの局面において、オイルボディ画分が、例えばPCT98/53698に開示されるような方法を使用して入手され得、オイルボディ画分が、食品、飼料、またはパーソナルケア製品を調製するために使用され得る。
【００９８】
好ましい態様において、本発明は、植物種子から単離された修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディを含む組成物を提供する。従って、本発明は、植物種子から単離された修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディを含む組成物を提供する。修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディは、好ましくは、以下の工程を含むプロセスにより調製される：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；および
（iii）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞へ導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においては、オレオシンタンパク質の発現が抑制されている）；ならびに
（d）種子を採取し、修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディを該種子から単離する工程。
【００９９】
本発明のさらに好ましい態様において、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子から単離されたオイルボディを含む組成物は、以下の工程を含むプロセスにより調製される：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物種子細胞における発現を制御し得る核酸配列；
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（iii）ポリヌクレオチドループをコードする核酸配列；および
（iv）（ii）において提供された核酸配列に相補的な、オレオシンまたはその断片をコードする核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から形質転換植物を再生させる工程（該形質転換植物においては、オレオシンタンパク質の発現が抑制されている）；ならびに
（d）種子を採取し、修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子からオイルボディを単離する工程。
【０１００】
植物種子からそのようなオイルボディを調製するためには、植物を生長させ、一般的な農業実務に従って種子を生じさせる。種子を採取し、必要であれば、石または種皮のような大きな不溶性材料を、例えば、篩過または濯ぎにより除去した後、種子からのオイルボディの単離のために適している任意のプロセスが、本発明において使用され得る。典型的なプロセスは、種子粉砕の後の水性抽出過程を含む。
【０１０１】
種子粉砕は、種子細胞に存在するオイルボディの構造的な完全性を損なうことなく、種子細胞膜および細胞壁の実質的な破壊をもたらす任意の細分化プロセスにより達成され得る。これに関して適当な粉砕プロセスには、種子の機械的な圧搾および磨砕が含まれる。ワタ（Lawhon et al.,1977 J.Am.Oil Chem.Soc.63:533-534）およびダイズ（米国特許第3,971,856号；Carter et al.,1974 J.Am.Oil Chem.Soc.51:137-141）に関して記載されたような湿式磨砕プロセスは、特に、これに関して有用である。産業的規模の種子磨砕が可能な適当な磨砕装置には、コロイドミル、ディスクミル、ピンミル、回転式ミル、IKAミル、および産業的規模のホモジナイザーが含まれる。磨砕装置の選択は、選択された種子に依り、処理能力要件にも依るであろう。
【０１０２】
種皮、繊維性材料、未溶解の炭水化物、タンパク質、およびその他の不溶性汚染物質のような固体汚染物質は、続いて、好ましくは、ろ過のようなサイズ排除に基づく方法論、または遠心分離に基づく分離プロセスのような重力に基づく方法を使用して、粉砕された種子画分から除去される。遠心分離は、例えば、HASCO 200 2-フェーズ デカンテーション（phase decantation）遠心分離機またはNX310B（Alpha Laval）のようなデカンテーション遠心分離機を使用して達成され得る。作動条件は、不溶性汚染物質および沈積物の実質的な部分が可溶性画分から分離され得るよう選択される。
【０１０３】
不溶性物質の除去の後、オイルボディ画分は、水性画分から分離され得る。重力に基づく方法およびサイズ排除に基づく技術が、使用され得る。使用され得る重力に基づく方法には、例えば、Sharples AS-16もしくはAS-46（Alpha Laval）のような円筒型（tubular bowl）遠心分離機、分離板型（disc stack）遠心分離機、もしくはハイドロサイクロン（hydrocyclone）を使用した遠心分離、または天然重力下での相の分離が含まれる。使用され得るサイズ排除方法論には、膜限外濾過およびクロスフローマイクロフィルトレーション（crossflow microfiltration）が含まれる。
【０１０４】
固体の分離および水相からのオイルボディ相の分離は、重力に基づく分離法またはサイズ排除に基づく方法を使用して同時に実施されてもよい。
【０１０５】
プロセス中のこの段階で入手されたオイルボディ調製物は、一般に、比較的粗であり、オイルボディの適用に依っては、さらなる汚染物質を除去することが望ましいかもしれない。さらなる種子汚染物質を除去し得る任意のプロセスが、これに関して使用され得る。都合のよいことには、オイルボディ調製物からのこれらの汚染物質の除去は、水相にオイルボディ調製物を再懸濁させ、再懸濁画分を再遠心分離することにより達成され得る。選択される再懸濁条件は、オイルボディ画分の所望の純度に依って変動し得る。オイルボディは、所望の純度に依って1回または複数回再懸濁されてもよく、イオン強度、pH、および温度が全て変動され得る。分析技術が、汚染物質の除去をモニタリングするために使用され得る。例えば、SDSゲル電気泳動が、種子タンパク質の除去をモニタリングするために利用され得る。
【０１０６】
オイルボディ単離プロセス全体は、バッチ式または連続流通式で実施され得る。特定の態様において、産業的規模の連続流通式のプロセスが利用される。
【０１０７】
これらおよび類似した技術の適用を通して、熟練した当業者は、オイルボディを含む任意の細胞からオイルボディを入手し得る。熟練した当業者であれば、一般に、プロセスが、選択された細胞型に依って多少変動するであろうことを認識するであろう。しかしながら、そのような変動は、本発明の範囲および本旨を逸脱することなくなされ得る。
【０１０８】
修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物から単離されたオイルボディは、野生型植物に見出されるオイルボディより大きい。本願の目的のため、このサイズの増加は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディのサイズは、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来するオイルボディと比較して、約1、2、3、4、5、6、7、8、9〜約10倍のレベルに増加する。好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディのサイズは、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来するオイルボディと比較して、2倍、より好ましくは5〜10倍のレベルに増加する。最も好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有するオイルボディのサイズは、本発明のキメラ核酸配列を含まない野生型植物に由来するオイルボディと比較して、8〜10倍のレベルに増加する。インビボでオイルボディのサイズを決定するための技術には、共焦点顕微鏡検が含まれる。この技術は、ホールマウント、胚切片の調査を可能にし、アラビドプシス系間のより正確なサイズ比較を提供する。成熟種子から胚を単離することができ、中性脂質をナイルレッド（Nile Red）で染色した。大部分の脂肪種子において、トリアシルグリセロールが中性脂質の大半を占めており、従って、オイルボディは、ナイルレッドで選択的に染色される。プロトコルの例は、Paddock et al.Methods in Molecular Biology,vol 122."Confocal Microscopy-Methods and Protocols"に見出され得る。インビトロでオイルボディのサイズを決定するための技術には、一般的な明視野顕微鏡検の使用が含まれる。プロトコルの例は、Bright-field,phase and dark-field microscopy.,Spencer,M.,Fundamentals of Light Microscopy,Cambridge University Press,New York,32-39(1982)に見出され得る。
【０１０９】
種子内の修飾されたオレオシンタンパク質プロファイルを有する植物種子は、該植物種子中のリン脂質蓄積の減少を有する。本願の目的のため、このリン脂質蓄積の減少は、キメラ核酸配列の植物細胞への導入および成熟植物の再生の後に得られる。修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子のリン脂質蓄積の減少は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子のリン脂質蓄積と比べて約5％〜約40％のレベルに減少する。より好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子のリン脂質蓄積は、未改変のタンパク質レベルを有する野生型植物に由来する植物種子のリン脂質蓄積と比べて約20％〜約40％のレベルに減少し、最も好ましくは、修飾されたオレオシンプロファイルを有する植物種子のリン脂質蓄積は、本発明のキメラ核酸配列を含まない野生型植物に由来する植物種子のリン脂質蓄積と比較して約30％〜約40％のレベルに増加する。植物種子のリン脂質蓄積を決定するための技術は、Vance and Russel,1990（J.Lipid Res 31:1491-1501.）に記載されており、本願の実施例6にさらに記載される。
【０１１０】
オレオシン要素のモジュレーション
本発明は、さらに、植物種子中のオレオシン構成要素をモジュレートする方法を提供する。ある場合においては、特定の植物のオレオシン要素を改変することが望ましいかもしれない。これによる植物の形質転換および再生により、オレオシンをコードする核酸配列が、そのような植物系に導入され得る。そのようなオレオシンをコードする核酸配列は、異なる植物種から入手され得る。
【０１１１】
オイルボディ上の組換えタンパク質の量の増加
本発明は、さらに、オイルボディの表面における組換えタンパク質の蓄積を増加させる方法を記載する。その方法は、同時に組換えオレオシンを発現させながら、内因性オレオシンを抑制することに基づく。修飾されたオイルボディは、より多量の組換えオレオシンを含有しているかもしれない。さらに好ましい態様において、該組換えオレオシンは、WO93/21320および関連出願（これらは参照により完全に組み込まれる）に開示されるようにして、キメラタンパク質を形成するため、第二の組換えタンパク質に共有結合的に連結される。担体またはターゲティング手段としての組換えオレオシンタンパク質の使用は、タンパク質を回収するための単純なメカニズムを提供する。オイルボディに関連したキメラタンパク質は、例えば、遠心分離サイズ排除または浮選を使用したオイルボディ画分の単離により、一工程で細胞構成要素の大部分から分離され得る。本発明は、組換えオレオシンと融合し、オイルボディと会合した、酵素、治療用タンパク質、診断用タンパク質等を含む異種タンパク質の使用を企図する。タンパク質のオイルボディとの会合は、単純な手段（遠心分離および浮選）によるタンパク質のその後の回収を可能にする。従って、本発明は、以下の工程を含む、植物種子から植物種子由来生成物を調製する方法をさらに含む：
（a）転写の5’から3’方向に、機能的に連結された構成要素として、以下のものを含むキメラ核酸構築物を提供する工程：
（i）植物細胞における発現を制御し得る核酸配列；および
（ii）オレオシンmRNA配列またはその断片をコードする核酸配列に相補的なRNA核酸配列を転写時に生成する核酸配列；
（b）キメラ核酸構築物を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を入手する工程；
（c）該形質転換植物細胞から、種子を生じ得る形質転換植物を再生させる工程；
（d）修飾されたオレオシンプロファイルを有する該種子を採取する工程；ならびに
（e）該種子から、精製されたタンパク質である植物種子由来生成物を調製する工程。
【０１１２】
組換えオレオシンの同時発現と共に、内因性オレオシンの抑制されたレベルを有するオイルボディは、内因性オレオシンが抑制されていない野生型植物における組換えオレオシンの発現レベルと比較して、該オイルボディの表面上の組換えオレオシンの増加した密度または発現レベルを有する。好ましい態様において、内因性オレオシンの抑制されたレベルを有する植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルは、内因性オレオシンが抑制されていない植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルと比較して、約1％〜約20％のレベルに増加する。より好ましくは、内因性オレオシンの抑制されたレベルを有する植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルは、内因性オレオシンが抑制されていない植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルと比較して、約10％〜約20％のレベルに増加し、最も好ましくは、内因性オレオシンの抑制されたレベルを有する植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルは、内因性オレオシンが抑制されていない植物に由来するオイルボディ上の組換えオレオシンの発現レベルと比較して、約15％〜約20％のレベルに増加する。組換えオレオシンタンパク質レベルを決定するための技術には、濃度測定、定量的ウェスタンブロット分析、またはELISAの使用が含まれる。プロトコルの例は、Coligan et al.Current Protocols in Protein Science,vol 3に見出され得る。
【０１１３】
オイルボディの表面上の組換え融合タンパク質の量の増加を有するオイルボディのアフィニティマトリックスとしての使用
本発明は、さらに、オイルボディの表面上の第二の組換えタンパク質に共有結合的に連結された組換えオレオシンの増加した蓄積を有するオイルボディの使用を記載する。好ましい態様において、オイルボディの表面における組換え融合タンパク質の増加した蓄積を有するオイルボディは、アフィニティマトリックスとして使用され得る（WO98/27115および関連出願（これらは全て参照により本明細書に組み入れられる）を参照）。WO98/27115に記載されるように、オイルボディおよびそれらの関連タンパク質は、試料からのタンパク質、炭水化物、脂質、有機分子、核酸、金属、細胞、および細胞画分のような多様な標的分子の分離のためのアフィニティマトリックスとして使用され得ることが見出された。本発明により、以下の工程を含む、標的分子の試料からの分離の方法が提供される：1）（i）組換えオレオシンに共有結合的に接着したリガンドまたは第二の組換えタンパク質を通して標的分子と会合し得るオイルボディを、（ii）標的分子を含有している試料と接触させる工程；および2）標的分子と会合したオイルボディを試料から分離する工程。オイルボディおよび標的分子を含有している試料は、オイルボディが標的と会合することを可能にするために十分な様式で接触させられる。好ましくは、オイルボディは標的と混合される。所望により、標的分子は、オイルボディからさらに分離され得る。一例において、オイルボディタンパク質と融合したリガンドは、ヒルジンであり得、トロンビンを精製するために使用され得る。もう一つの例において、オイルボディタンパク質と融合したリガンドは、メタロチオネインであり得、試料からカドミウムを分離するために使用され得る。さらなる例において、オイルボディタンパク質と融合したリガンドは、プロテインAであり得、免疫グロブリンを分離するために使用され得る。もう一つの例において、オイルボディタンパク質と融合したリガンドは、セルロース結合タンパク質であり得、試料からセルロースを分離するために使用され得る。
【０１１４】
オイルボディの表面上の組換え融合タンパク質の量の増加を有するオイルボディの免疫原性製剤としての使用
本発明は、さらに、オイルボディの表面上の第二の組換えタンパク質に共有結合的に連結された組換えオレオシンの増加した蓄積を有するオイルボディの使用を記載する。好ましい態様において、低い内因性オレオシンバックグラウンドは、オイルボディの表面上の抗原性ポリペプチドの提示を可能にし、免疫原性製剤もしくはワクチンの中のアジュバントとして、または免疫原性製剤としてのそれらの使用を改良し得る（WO01/95934および関連出願、ならびに米国特許第6,761,914号および関連の特許および特許出願（これらは全て参照により本明細書に組み入れられる）を参照）。好ましい態様において、組換えオレオシンは、ワクチンまたは免疫原性製剤においてオイルボディと物理的に会合し得る（WO93/21320および関連出願（これらは参照により完全に組み入れられる）に開示されたような）抗原または第二の組換えタンパク質に共有結合的に連結される。本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、経皮または経粘膜を含む任意の投与経路を使用して、任意の抗原に対する免疫応答を誘発するために使用され得る。
【０１１５】
実施例
実施例1
オレオシン抑制カセットの構築
アンチセンスカセット
Atol1 cDNA（SEQ ID NO：94）を鋳型として使用して、HindIIIIおよびNcoI制限部位（下線）を含有している順方向プライマーNTD
2008515406.tif 000003
ならびにSpeI制限部位（下線）を含有している逆方向プライマーCTR
2008515406.tif 000004
を使用して、Atol1 cDNAを増幅した。そのPCR産物を精製し、ファセオリンプロモーター／ターミネーター（Slightom et al.,1983 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1897-1901.）の調節下でベクターpSBS2090に挿入した。このベクターは、予め制限酵素SwaIで消化された（図3b）。酵素SwaIは平滑末端を生じるため、PCR産物は順方向または逆方向で挿入され得る。逆方向にAtol1 cDNAを含有しているプラスミドを、酵素Ncolによりスクリーニングした。NcoIで消化された逆方向にAtol1 cDNAを含有しているベクターは、551bpを有するDNA断片を放出する（図3c）。
【０１１６】
ヘアピンカセット
ヘアピンカセットを、アンチセンスに関して記載されたのと同一のスキームに従って構築した。唯一の違いは、Atol1 cDNAの二つの逆方向リピートのpSBS2090への挿入を可能にするため、ライゲーション反応において、PCR産物の量を増加させた点であった。挿入されたAtol1のコピー数を、XbaおよびHindIIIによる消化を通して分析した。Atol1の各コピーは555bp長であり、二量体は1110bpを有するであろう。二つのコピーの方向をチェックするために、NcoIによる消化を実施した。ベクターがAtol1 cDNAの逆方向リピートを含有しているのであれば、NcoIによる消化は、1054bpを有する断片を放出するであろう（図3d）。
【０１１７】
ヘアピンおよびイントロンカセット
イントロンをヘアピンカセットに挿入することにより、ヘアピン＋イントロンカセットを構築した。Atol1ゲノムクローンを鋳型として使用して、SpeI制限部位（下線）を含有している順方向プライマーIntronD
2008515406.tif 000005
およびSpeI制限部位（下線）を含有している逆方向プライマーIntronR
2008515406.tif 000006
を使用して、Atol1の特有のイントロンを増幅した。そのPCR産物を精製し、SpeIで消化した（図4d）。ヘアピン＋イントロンカセットを、KpnおよびBamHIの制限部位において、プラスミドpUC19（New England Biolabs Inc.）にサブクローニングした（図4c）。得られたベクターを、Atol1 cDNAの逆方向リピートの間でSpeI制限酵素で消化した。Atol1イントロンを、リピートの間に挿入した（図4e）。挿入の方向を、PCRを通して確証した。
【０１１８】
アンチセンスカセット（SEQ ID NO：97）、ヘアピンカセット（SEQ ID NO：98）、およびヘアピン＋イントロンカセット（SEQ ID NO：99）を、部位KpnIおよびBamHIにおいてバイナリーベクターpSBS3000に挿入し（図5）、ベクターpSBS3000-antisense、pSBS3000-hairpin、およびpSBS3000-hairpin+intronを作出する。
【０１１９】
実施例2
アグロバクテリウムおよびアラビドプシスの形質転換
バイナリーベクターpSBS3000-antisense、pSBS3000-hairpin、およびpSBS3000-hairpin+intronを、電気穿孔法により、アグロバクテリウムEHA101（Hood,E.E. et al.1986.Journal of Bacteriology 168:1291-1301）に個々に挿入した。バイナリーベクターを含有している形質転換アグロバクテリウム系を、スペクチノマイシン耐性（図5e中の「SpecR」）を使用して選択した。各構築物について一つのアグロバクテリウム系を選択した。
【０１２０】
アラビドプシス タリアナ生態型C24を、形質転換のために使用した。5個の種子を、4インチポット内の土壌混合物（pH＝6.7を有するレディアース（Redi-earth）3分の2およびパーライト3分の1）の表面に蒔いた。実生を、およそ2.5cmの直径にまで、6〜8枚のロゼット段階にまで生長させた。メッシュに直径1cmの孔5個（各角に1個ずつ、中央に1個）が切り込まれた窓網戸材料で覆われた、上記の土壌混合物を含有している4インチポットへ、これらの実生を移植した。そのポットを、冷処理のため4日間4℃のドーム内に置き、続いて、約150μEの一定の光および50％の相対湿度を有する24℃の生長室に移動させた。植物に2〜3日間隔で灌水し、1％のピーターズ（Peters）20-20-20を毎週施肥した。茎が高さ約2cmに達した時点で、二次および三次のボルト（bolts）の生長を助長するため、一次ボルトを切断した。一次ボルトの切断から4〜5日後、植物にアグロバクテリウムを感染させる準備が整った。
【０１２１】
アグロバクテリウム系をLB培地500mlに個々に接種し、600nmにおける光学濃度が0.8に達するまで生長させた。培養物を、細菌を沈殿させるために遠心分離し、続いて、それを5％のショ糖および0.05％の界面活性剤Silwet L-77（Lehle Seeds）を含有している溶液に懸濁させた。
【０１２２】
アラビドプシス植物を有するポットを、20秒間、溶液中に逆さまにした。続いて、より高い湿度を維持するため、24時間、ポットを透明プラスティックドームで覆った。植物を、成熟するまで生長させ、種子（非形質転換および形質転換）を採取した。
【０１２３】
トランスジェニック系の選択のため、70％エタノールの迅速な洗浄および15分間の20％市販漂白剤における処理により、推定形質転換種子を滅菌した。水で種子を4時間濯ぐことにより、漂白剤溶液を除去した。約1000個の滅菌された種子を、0.6％トップアガーと混合し、1％ショ糖および80μM除草剤フォスフィノスリシン（PPT）DLを含有しているハーフレングス（half strength）MSプレート（Murashige and Skoog 1962.Physiologia Plantarum 15:473-497）に均一に播いた。次いで、プレートを、暗8時間および明16時間という光計画で24℃の生長室に置いた。7〜10日後、推定上トランスジェニック実生は、緑色で生長中であったが、非形質転換実生は枯れていた。根が確立された後、推定トランスジェニック実生を、個々に、ポットに移した（個々の植物は、3日間隔で灌水され、5日間隔で1％ピーターズ20-20-20を施肥され、成熟するまで生長させられた）。感受性の高い実生を保護するため、3日間、透明プラスティックドームによりポットを覆った。7日後、散乱による種子損失を防止するために、Lehle Seedsからのシードコレクター（seed collector）で実生を覆った。これらのトランスジェニック植物に由来する種子は、個々に採取され、分析の準備が整っている。
【０１２４】
実施例3
オイルボディの単離
選択された植物から回収された種子におけるAtol1の蓄積を、オイルボディ画分のSDS-PAGEにより分析した。これらの種子に由来するオイルボディを、以下の修飾を含む、van Rooijen & Moloney,(1995)Biotechnology(N.Y.)13,72-77により報告された方法を使用して入手した。簡単に説明すると、10〜20mgの乾燥成熟種子を、オイルボディ抽出緩衝液（0.4Mショ糖および0.5M NaClを含む50mMトリス-HCl pH7.5）0.4mlを有する1.7ml微量遠心管内で粉砕した。その抽出物を、室温（RT）で10,000gで15分間遠心分離した。遠心分離の後、オイルボディを含有している脂肪パッドを、水相から除去し、もう一つの微量遠心管に移した。オイルボディを、高ストリンジェンシー尿素緩衝液（8M尿素を含む100mM炭酸Na緩衝液pH8.0）0.4mlに再懸濁させた。その試料を、4℃で10,000gで15分間遠心分離し、下層（undernatant）を除去した。オイルボディを、最終的に水0.1mlに懸濁させた。オイルボディ画分におけるAtol1の存在は、SDS-PAGE 15％にオイルボディ画分20μlを負荷し、クーマシーブルーで染色することにより検出された（図6）。野生型オイルボディ画分と比較して、Atol1のレベルの減少が、全てのカセットのオイルボディ画分において観察され、ヘアピン-ループカセットにおいては抑制のレベルがより高かった（アンチセンス−レーン3、ヘアピン−レーン2、およびヘアピン-ループ−レーン1）。
【０１２５】
実施例4
オイルボディの顕微鏡検分析
オイルボディの形態学的分析は、インビボで暗視野共焦点顕微鏡検を使用して、またはインビトロで一般的な明視野顕微鏡検を使用して実施され得る。成熟胚を、PerryおよびWang（2003 Biotechniques 35:278-281）により確立された方法に従い単離した。共焦点顕微鏡検（暗視野顕微鏡検）のため、中性脂質染色（Greenspan et al.,1985.J.Cell Biol.100:965-973）のため、10μg/mlナイルレッド（Molecular Probes）の水性溶液により、単離された胚を浸潤させた。488nmおよび543nmのレーザー（それぞれ20％および100％に設定）によるAOTF制御された励起により、ラインシーケンシャル シングルトラッキング（line-sequential single-tracking）モードを使用して、Zewass LSM 510レーザー走査型共焦点顕微鏡により、染色された胚を調査した。Plan-Appochromat 40×/1.4 Oil DIC対物レンズを、スキャンズームにより使用した。ピンホールは約100μmのため最適化された。得られた顕微鏡写真は、図7に示される。野生型胚において、オイルボディは、約1μmを有する小単位として細胞の境界に存在する（図7A）。pSBS3000-antisense、pSBS3000-hairpin、およびpSBS3000-hairpin+intronにより形質転換されたトランスジェニック植物から入手された胚において、オイルボディは相当に大きく、直径は最大6μmであった（それぞれ、図7B、7C、および7D）。pSBS3000-antisenseにより形質転換されたトランスジェニック植物に由来するオイルボディはサイズが比較的均一のままであったが、ヘアピンおよびヘアピン＋イントロンにより形質転換された植物に由来するオイルボディは、サイズが極めて不均質であった。これらのオイルボディのサイズは、野生型に類似したものから数倍大きいものまであった。
【０１２６】
明視野顕微鏡検のため、単離された胚を、直ちに、2.5％グルタルアルデヒドおよび1.6％パラホルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）で4時間固定した。同緩衝液で数回濯いだ後、胚を、さらに4時間、2％四酸化オスミウム溶液により後固定した。四酸化オスミウム溶液は、標本における脂質固定のために使用された。アセトンシリーズを使用した脱水の後、胚を浸潤させ、続いて、Ladd LX-112エポキシ樹脂に埋め込んだ。やや薄い（Semi-thin）切片を、Sorval MT-1ウルトラミクロトームを使用して入手する。切片を、過ヨウ素酸-シッフ反応を使用して染色し、アルカリトルイジンブルーO溶液により対比染色した（Yeung,1990.Stain Technol.65:45-47.）。得られた顕微鏡写真は、プロテインボディ（protein bodies）が紫色に染色され、オイルボディが中空構造として存在する胚細胞構造を示す（図8）。野生型胚において、オイルボディは小単位（1μm）として存在した（図8A）。共焦点顕微鏡検について証明されたように、pSBS3000-hairpin+intronおよびpSBS3000-hairpinにより形質転換されたトランスジェニック植物から入手されたオイルボディは、サイズが相当に不均一であり、野生型のものに類似したサイズから大きなもの（最大6μm）まであり、プロテインボディは極めて不規則であった（図8B）。やはり、pSBS3000-antisenseにより形質転換されたトランスジェニック植物に由来するオイルボディは、大きかったが、均一であった。さらに、pSBS3000-hairpin+intronカセットを欠く野生型様（ヌル）アラビドプシス系が、pSBS3000-hairpin+intron形質転換親系から繁殖した。このヌル系に由来するオイルボディは、親トランスジェニック植物のものより、野生型のものに、より類似した表現型を提示した（図8C）。
【０１２７】
実施例5
脂質、タンパク質、ショ糖、およびデンプンの含有量の測定
ヘアピン＋イントロンカセットにより形質転換された植物における種子脂質蓄積を、修飾を含む、BlighおよびDyer（1959.Can.J.Med.Sci.37:911-917）により記載された方法に従って分析した。種子50ミリグラムを液体窒素中でホモジナイズし、イソプロパノール5mlと共に70℃で10分間インキュベートした。イソプロパノールを蒸発させ、脂質を、クロロホルム、メタノール、および水二相溶液（MeOH：CHCl3：H2O）の3回の抽出により抽出した。最初の抽出は、MeOH：CHCl3：H2O（2：2：1.8[v/v]）5.8mlにより実施し、第二および第三の抽出は、MeOH：CHCl3：H2O（1：2：0.8[v/v]）2.0mlにより実施する。脂質画分を収集し、溶媒を窒素環境下で蒸発させた。全脂質を、重量分析により定量化した。
【０１２８】
ヘアピン＋イントロンカセットにより形質転換された植物における種子タンパク質蓄積を、BCAタンパク質アッセイ試薬（Pierce,Rockford,IL）を使用して分析した。タンパク質抽出緩衝液（2％SDS、5mM EDTA、50mMトリス-HCl、pH6.8）1.5ml中でホモジナイズされた種子50mgから、全種子タンパク質を抽出した。ホモジネートを5分間沸騰水中に置き、10分間最大スピードで遠心分離した。上相を除去し、細片を抽出緩衝液0.5mlで2回洗浄した。画分をプールし、タンパク質の量をBCAタンパク質アッセイ試薬により測定した。
【０１２９】
ヘアピン＋イントロンカセットにより形質転換された植物における炭水化物の分析は、いくつかの修飾を含むFocks and Benning(1998)Plant Phys.118：91-101.）により記載されたようにして、実施された。種子5ミリグラムを、80％（v/v）エタノール0.5ml中でホモジナイズし、70℃で90分間インキュベートした。ホモジネートを、5分間最大スピードで遠心分離し、上清を新たな試験管に移した。ペレットを80％エタノール0.5mlで3回洗浄し、合わせた上清の溶媒を真空下で室温で蒸発させた。可溶性炭水化物画分に相当する残さを水0.1mlに溶解させ、ショ糖定量化のために使用した。エタノール抽出からの不溶性画分を、0.2M KOH 0.2ml中に懸濁させ、95℃で1時間インキュベートした。その溶液を1M酢酸35mlにより中和し、5分間最大スピードで遠心分離した。その上清を、デンプン定量化のために使用した。ショ糖およびデンプンを、Sigma-Aldrich（Oakville,ON）からのキットを使用して決定した。
【０１３０】
オレオシンのAtol1アイソフォームの抑制は、タンパク質含有量の増加を伴う、脂質蓄積の減少をもたらした。脂質およびタンパク質の含有量の比率は変化したが、タンパク質および油の全重量は一定のままであった。ショ糖およびデンプンの含有量の分析は、これらの炭水化物の蓄積の有意差を示さなかった（表2）。
【０１３１】
実施例6
オイルボディ組成に対する効果
野生型植物およびヘアピン＋イントロンカセットにより形質転換された植物のオイルボディにおける脂質およびタンパク質の蓄積を分析した。オイルボディを種子から単離し、水中に懸濁させた。全脂質を、Bligh and Dyer(1959)により記載された方法を通して、メタノールおよびクロロホルムにより一定分量のオイルボディ懸濁物から抽出した。3回の抽出を実施し、溶媒を窒素環境下で蒸発させた。全脂質を重量測定を通して定量化した。タンパク質の量を測定するため、オイルボディ懸濁物を、2％のSDSの存在下で沸騰させ、遠心分離した。オイルボディタンパク質を含有している下層を収集し、BCAタンパク質アッセイにおいて使用した。脂質およびタンパク質の百分率を、両方の質量の合計をオイルボディの全質量と見なして、計算した。pSBS3000-hairpin+intronカセットにより形質転換されたトランスジェニック植物に由来するオイルボディは、野生型植物に由来するものより、少ないタンパク質、または低いオレオシン-TAG比を含有していた。
【０１３２】
オイルボディ画分中の脂質の組成を、薄層クロマトグラフィを通して評価した。オイルボディから抽出された全脂質を、類似した量、シリカ-ゲルプレートに負荷した。プレートを、リン脂質を分離するため、混合物クロロホルム-メタノール-酢酸-ギ酸-水（70：30：12：4：2[v/v]）により半分展開し、中性脂質の分離を可能にするため、混合物ヘキサン-ジエチルエーテル-酢酸（65：35：2[v/v]）により完全に展開した（Vance and Russel,1990）。脂質を、硫酸第二銅の存在下でのチャーリング（charring）を通して可視化した。脂質の大半が、少量のコレステロールエステルおよびその他の中性脂質と共に、TAGから構成されていた。リン脂質について、最も多量に存在したのは、ホスファチジルコリン（PC）であり、続いて、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルセリン（PE）、およびホスファチジルイノシトール（PI）であった。pSBS3000-hairpin+loop形質転換植物に由来するオイルボディは、野生型植物に由来するオイルボディと比較して、リン脂質含有量、特に、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトールのわずかな低下を示した（図9）。
【０１３３】
実施例7
野生型表現型への復帰
オレオシンの量を増加させることにより表現型を回復する可能性を探求するため、組換えオレオシンをコードする遺伝子を、ヘアピン-ループ系に導入した。PTGSを通した相互抑制を回避するため、トウモロコシ由来のオレオシン（MaizeOle1、アクセッション番号U13701）が、Atol1から系統発生的に遠く離れているため（Huang,1996；Lee et al.,1994）、機能を回復するために選択された。
【０１３４】
ヘアピン-ループ アラビドプシス植物（図10A）を、リニン種子特異的プロモーターの制御下でMaizeOle1を発現するアラビドプシス系MaizO1と手動で交雑した（図10B）。MaizeOle1は、アラビドプシス オレオシンと比較して、別個の分子量（15.8kDa）を有する。本発明者らは、交雑された系の子孫を分析するためにこの特性を使用した。トウモロコシオレオシンの存在およびAtol1の抑制を示す系を選択し、さらに2世代にわたって繁殖させた。ホモ接合性の系を入手し、種子を共焦点顕微鏡で分析した（図10C）。この系におけるオイルボディは、ヘアピン-ループ系で見出された表現型を提示しなかった。そのようなオイルボディは、アンチセンス系で見出されたものと同様に、サイズが野生型のものよりさらに大きかったが、均一であった。この結果は、オイルボディのサイズが、オレオシンタンパク質のレベルにより制御されることを示している。
【０１３５】
実施例8
発芽および実生発達中のオイルボディの運命に対する効果
顕微鏡検分析は、オレオシンの抑制が、オイルボディ生成の改変をもたらし、タンパク質保管オルガネラの組織化に影響を与えることを明白に示した。TAGおよび保管タンパク質の両方が実生発達のために使用されるため、実生生長中のこの異常な細胞内形態学の効果を調査した。発芽試験を、炭水化物利用可能性および露光の異なる条件で実施したところ、野生型種子と比較した、SupAtol1-Loop（ヘアピン-ループ）の発芽の遅延が認められた（図11）。最も顕著な差は、湿った紙の上で発芽した種子について、2日目および3日目に見出された（図11A）。ショ糖が補足され、露光下で発芽した種子については、有意差は見出さなかった（図11B）。
【０１３６】
ヘアピン-ループ系が、3日間層積（stratified）され、続いて明所で発芽した場合、上で観察された発芽の遅延は遮蔽された（図11B）。しかしながら、ヘアピン-ループ系が、3日間層積され、続いて暗所で発芽した場合、発芽の遅延は、層積しなかった場合と、層積して明所で発芽させた場合との間の中間であった。
【０１３７】
種子が、暗所で維持され、ショ糖を含む、もしくは含まないMS培地で発芽した場合（図11Eおよび11F）、または露光され、ショ糖を含まない培地で発芽した場合（図11C）。種子が、ショ糖を含む培地に播種され、露光された場合（図11D）、または種子が、湿った紙の上に播種され、3日間層積に供された場合（図11B）、種子発芽の遅延は復帰し得る。
【０１３８】
発芽の後、オレオシンが抑制された実生の発達は、野生型と比較可能であった（図12FおよびG）。通常、オイルボディは、吸水の後、最初の日の間に消費される。本発明者らの実験は、吸水から2日後に、オイルボディが、小単位として細胞の境界にまだ存在することを証明した。4日後、それらはほとんど見出されず、5日目に完全に消失した（図12Aおよび12B）。オレオシンが抑制された植物において、オイルボディは、異なる挙動を呈する。発芽から2日後、それらは、約10μmを有する大きな構造として細胞質に見出される。吸水から4日後、オイルボディの数およびサイズは減少するが、まだ大きな構造がいくつかの細胞に存在する。発芽から6日後、まだいくつかのオイルボディが大きな構造として見出され得るが、その後、それらは完全に消失する（図12C〜12E）。TAGのより遅い動員は、発芽後の生長には影響を与えないようである（図12Fおよび12G）。ヘアピン-ループ系においては、いくつかの実生が比較的小さいようであるが、これは、発芽の遅延のためである可能性が最も高い。
【０１３９】
従って、本発明は、本明細書に記載された特定の態様に制限されるものと見られるべきでなく、本発明はタンパク質発現一般に関する広い適用可能性を有することが理解されるべきである。当業者には修正が明白になるであろうため、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ制限されるものとする。
【０１４０】
配列の概要
SEQ ID NO：1〜84は、表1に記載される既知のオレオシン配列を示す。
【０１４１】
SEQ ID NO：85および86は、アンチセンス配列の核酸配列を示す。
【０１４２】
SEQ ID NO：87および88は、センス配列の核酸配列を示す。
【０１４３】
SEQ ID NO：89〜91は、ループ配列の核酸配列を示す。
【０１４４】
SEQ ID NO：92は、Atol1 cDNAクローンの5'領域に相補的であり、その後のライゲーションを容易にするため、5'領域にHindIIIIおよびNcoI制限部位部位を追加するために設計されている順方向プライマーNTDのヌクレオチド配列を示す。
【０１４５】
SEQ ID NO：93は、Atol1 cDNAのC末端ドメインの3'領域に相補的であり、その後のライゲーションを容易にするため、3'領域にSpeI部位を追加するために設計されている逆方向プライマーCTRのヌクレオチド配列を示す。
【０１４６】
SEQ ID NO：94は、Atol1 cDNA配列のヌクレオチド配列を示す。
【０１４７】
SEQ ID NO：95は、（エキソン1の3'領域を含む）Atol1のイントロンの5'境界の5'領域に相補的であり、その後のライゲーションを容易にするため、5'領域にSpeI制限部位部位を追加するために設計されている順方向プライマーIntron Dのヌクレオチド配列を示す。
【０１４８】
SEQ ID NO：96は、（エキソン2の5'領域を含む）Atol1のイントロンの3'境界の3'領域に相補的であり、その後のライゲーションを容易にするため、3'領域にSpeI制限部位部位を追加するために設計されている逆方向プライマーIntron Rのヌクレオチド配列を示す。
【０１４９】
SEQ ID NO：97は、実施例1に記載されたようなアンチセンスカセットのヌクレオチド配列を示す。
【０１５０】
SEQ ID NO：98は、実施例1に記載されたようなヘアピン構築物のヌクレオチド配列を示す。
【０１５１】
SEQ ID NO：99は、実施例1に記載されたようなヘアピンおよびイントロンカセットのヌクレオチド配列を示す。
【０１５２】
（表1）既知のオレオシン配列の例
2008515406.tif 000007
2008515406.tif 000008
2008515406.tif 000009
【０１５３】
（表2）野生型種子およびヘアピン-ループ種子における脂質、タンパク質、および炭水化物の含有量
2008515406.tif 000010
【０１５４】
（表3）野生型オイルボディおよびヘアピン-ループオイルボディにおける脂質およびタンパク質の含有量
2008515406.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
以下、本発明を図面に関して説明する。
【０１５６】
【図１】転写後遺伝子サイレンシングを誘発するRNA分子の構造。（a）標的mRNAに相補的なRNA鎖の模式図。（b）ヘアピンRNA構造の模式図。この分子は、標的mRNAと同一の部分（センス部分）および標的mRNAに相補的な同一のもう一つの部分（アンチセンス部分）により構成された自己相補的領域を含有している。ヘアピンRNAは、3'末にセンス部分を含有し、5'末にアンチセンス部分を含有していてもよいし（左パネル）、または3'末にアンチセンス部分を含有し、5'末にセンス部分を含有していてもよい（右パネル）。（c）ヘアピン-ループRNA構造の模式図。この分子は、標的mRNAと同一の部分（センス部分）、標的mRNAと同一または相補的でない領域（ループ）、および標的mRNAに相補的なもう一つの部分（アンチセンス部分）により構成された自己相補的領域を含有している。ヘアピン-ループRNAは、3'末にセンス部分、続いてループ部分、続いて5'末にアンチセンス部分を含有していてもよいし（左パネル）、または3'末にアンチセンス部分、続いてループ部分、続いて5'末にセンス部分を含有していてもよい（右パネル）。
【図２】一つまたは複数のオレオシン遺伝子を抑制するために使用されるカセットの異なる配置。（a）単一のオレオシン遺伝子を抑制するためのアンチセンスカセット：プロモーター断片が、逆方向のオレオシンコーディング領域と融合しており、続いてターミネーター断片が融合している。（b）二つのオレオシン遺伝子を抑制するためのアンチセンスカセット：プロモーター断片が、いずれも逆方向の二つのオレオシンコーディング領域と融合しており、続いてターミネーター断片が融合している。（c）単一のオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピンカセット：プロモーター断片が、オレオシンコーディング領域と融合しており、続いて逆方向の同コーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（d）ヘアピンカセットのもう一つの配置：プロモーター断片が、逆方向のオレオシンコーディング領域と融合しており、続いて正方向の同コーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（e）単一のオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピン-ループカセット：プロモーター断片がオレオシンコーディング領域と融合しており、続いてコーディング領域と無関係のDNA断片（例えば、イントロン）が融合し、続いて逆方向の同コーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（f）単一のオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピン-ループカセット：プロモーター断片が逆方向のオレオシンコーディング領域と融合しており、続いて無関係のDNA断片が融合し、続いて正方向の同コーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（g）三つの異なるオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピン-ループカセット：プロモーター断片が、タンデムの三つのオレオシンコーディング領域と融合しており、続いて無関係のDNA断片が融合し、続いて逆方向の同じ順序の同じ三つのコーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（h）三つの異なるオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピン-ループカセット：プロモーター断片がタンデムの逆方向の三つのオレオシンコーディング領域と融合しており、続いて無関係のDNA断片が融合し、続いて正方向の同じ順序の同一の三つのコーディング領域が融合し、続いてターミネーター断片が融合している。（i）三つの異なるオレオシン遺伝子を抑制するためのヘアピン-ループカセット：プロモーター断片が、正方向の第一のオレオシンコーディング領域と融合しており、続いて逆方向の第二のオレオシンコーディング領域が融合し、続いて正方向の第三のオレオシンコーディング領域が融合し、続いて無関係のDNA断片が融合し、続いて逆方向の第三のコーディング領域が融合し、続いて正方向の第二のコーディング領域が融合し、続いて逆方向の第一のコーディング領域Iが融合し、続いてターミネーター断片が融合している。
【図３】アンチセンスカセットおよびヘアピンカセットの構築に関する模式図。アラビドプシス タリアナの18kDaオレオシンをコードするcDNA（Atol1）（a）を、プライマーNTDおよびCTRを用いたPCR反応により入手し、ファセオリンプロモーターとターミネーターとの間で酵素SwaIにより予め消化されたプラスミドpSBS2090（b）に挿入した。その挿入は、NcoIおよびHindIII/SalIにより入手されたプロファイルに従って選択されたプラスミドpAntisense（c）およびpHairpin（d）を与えた。
【図４】ヘアピン-ループカセットの構築に関する模式図。プラスミドpHairpin（b）を、酵素KpnIおよびBamHIにより消化した。ヘアピンカセットを、ベクターpUC19（a）へサブクローニングし、プラスミドpUC-Hairpin（c）を作成した。Atol1遺伝子のイントロンに相応する断片を、プライマーIntronDおよびIntronRを使用して増幅した（d）。これらのプライマーは、各末にSpeIの制限部位を作出した。その断片を精製し、SpeIにより消化し、プラスミドpUC-Hairpinに挿入した。得られたプラスミドは、pHairpin-intron（e）と呼ばれる。
【図５】抑制カセットを保持するバイナリーベクターの構築に関する模式図。プラスミドpAntisense、pHairpin、およびpHairpin+intron（a）を、BamHIおよびKpnIにより消化した。カセットを、バイナリーベクターpSBS3000（b）に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれ、pSBS3000 Antisense、pSBS3000 Hairpin、およびpSBS3000 Hairpin+intron（c）と名付けた。
【図６】トランスジェニック アラビドプシス系に由来する種子におけるAtol1オレオシンの抑制。抑制カセット（レーン3）アンチセンス、（レーン2）ヘアピン（harpin）（レーン1）ヘアピン（harpin）＋イントロンを含有しているアラビドプシス系の種子からオイルボディが抽出される。オイルボディ関連タンパク質が、SDS-PAGE 15％に負荷され、クーマシー（Comassie）ブルーR250により染色される。
【図７】アラビドプシス系のオイルボディサイズのインビボ比較。パネル「a」は、野生型（非形質転換）アラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。パネル「b」は、アンチセンス抑制カセットを含有しているアラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。パネル「c」は、ヘアピン抑制カセットを含有しているアラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。パネル「d」は、ヘアピン＋イントロン抑制カセットを含有しているアラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。赤色の円が、オイルボディに相当する。白色のバーは、「μm」で参照距離を示す。
【図８】アラビドプシス系のオイルボディサイズのインビトロ比較。パネル「A」は、野生型（非形質転換）アラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。パネル「B」は、抑制カセット ヘアピン＋イントロンを含有しているアラビドプシス種子に由来するオイルボディを示す。青色で染色された材料は、主としてプロテインボディに相当する。オープンの円が、オイルボディに相当する。パネル「C」は、抑制カセットヘアピン＋イントロンを含有している植物から分離した野生型様（ヌル）アラビドプシス系に由来するオイルボディを示す。
【図９】オイルボディ-脂質の薄層クロマトグラフィ。オイルボディが異なる植物から単離され、これらのオルガネラから全脂質が抽出された。脂質がシリカゲル60 F254プレートに適用され、Vance and Russell（1990）に従って、クロロホルム-メタノール-酢酸-ギ酸-水（70：30：12：4：2[v/v]）により半分展開され、ヘキサン-ジエチルエーテル-酢酸（65：35：2[v/v]）により完全に展開された。脂質は、酢酸第二銅（3％）およびリン酸（8％）を含有している溶液に浸漬した後、プレートを加熱することにより可視化された。略号は、PC、ホスファチジルコリン；PE、ホスファチジルエタノールアミン；PS、ホスファチジルセリン；PI、ホスファチジルイノシトール（PI）、およびTAG、トリアシルグリセロールである。
【図１０】表現型を救出するための組換えオレオシンの導入が左パネルに示され、共焦点切片が右パネルに示される。（A）SupAtol1-Loop（ヘアピン-ループ）植物：左パネル：オイルボディ関連タンパク質のSDS-PAGEプロファイル。Atol1ポリペプチドが、黒矢印により示される。右パネル：成熟胚の共焦点切片。白矢印が、大きなオイルボディを示す。（B）MaizO1植物：左パネル：オイルボディ関連タンパク質のSDS-PAGEプロファイル。Atol1およびトウモロコシ由来の組換えオレオシンが、黒矢印により示される。右パネル：成熟胚の共焦点切片。（C）SupAtol1-Loop（ヘアピン-ループ）植物とMaizO1植物との交雑からの子孫：左パネル：オイルボディ関連タンパク質のSDS-PAGEプロファイル。Atol1およびトウモロコシ由来の組換えオレオシンが、黒矢印により示される。右パネル：成熟胚の共焦点切片。（A）および（C）中のバー＝5μm；（B）中のバー＝8μm。
【図１１】異なる条件における野生型植物およびSupAtol1-Loop植物の発芽の比較。各バッチの発芽率が、24時間毎に幼根発生の可視化によりスコア化された。（A）湿ったろ紙；明；（B）湿ったろ紙；層積された種子；明（C）ハーフ ストレングスMS培地−ショ糖；明；（D）ハーフ ストレングスMS培地＋ショ糖；明；（E）ハーフ ストレングスMS培地−ショ糖；暗；（F）ハーフ ストレングスMS培地＋ショ糖；暗。
【図１２】発芽および実生発達の後のオイルボディの運命。（A）および（B）それぞれ、吸水から2および4日後の野生型アラビドプシス実生の共焦点切片。オイルボディはナイルレッドにより染色された。（C）、（D）、および（E）それぞれ、吸水から2、4、および6日後のオレオシン抑制アラビドプシス実生の共焦点切片。オイルボディは、ナイルレッドにより染色された。（F）および（G）それぞれ、ショ糖が補足されていないハーフ ストレングスMS培地において発芽した5日齢の野生型およびSupAtol1-Loopの実生。（A）および（B）中のバー＝10μm；（C）〜（E）中のバー＝20μm。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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