(57)【要約】分光法ならびに、それと関連したエネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し解析するための装置およびコンピュータ・プログラムに関する。本方法は、以下のステップ：ａ）励起パルスを用いて蛍光分子内に遷移状態を生成するステップで、該ステップにおいては、蛍光分子内における、基底、通例において一重項（Ｓｏ）、状態および、励起、通例において一重項（Ｓからの遷移で生じるＳＯ状態）、状態と、遷移状態との間に、反復的パルス励起−発光サイクルが誘起されるステップと；ｂ）励起パルスの直後より始まる期間において基底状態への遷移により遷移状態のポピュレーションを緩和させるステップと；ｃ）蛍光を記録することで遷移状態のポピュレーションを求めるステップとを有する。本発明は、あるパルス・シークエンスと、その次との間で、パルスの特性を変更することにより、検出の時間分解能にかかる必要性を回避する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し分析する分光法であって、
ａ）励起パルスを用いて蛍光分子内に遷移状態を生成するステップであって、前記蛍光分子内において、一重項（Ｓ０）状態を含む基底状態と、一重項（Ｓ１）、状態を含む励起状態との間での、Ｓ１から前記遷移状態への遷移を含む遷移を伴った、パルスの反復的な励起−発光サイクルを誘起させる、ステップと、
ｂ）前記励起パルスの後の期間において、Ｓ０へ戻る遷移により、前記遷移状態のポピュレーションを緩和させるステップと、
ｃ）前記蛍光を記録することにより、前記遷移状態のポピュレーションを求めるステップと、を有し、
検出における時間分解の必要性の排除を目的として、パルスのシークエンスとその次のパルスのシークエンスとの間でパルスの特性を変化させるステップを有する、方法。
【請求項２】
パルスの特性は、パルス持続時間、パルス間の時間間隔、時空間におけるパルス形状、偏光極性、波長、および、前記パルスにおける励起強度、のうちのいずれか１つであり、前記蛍光分子内における遷移状態の累積の程度および反応速度を変化させることができる特性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パルスの各シークエンスにおける少なくとも１波長の期間に含まれる時間にわたる平均蛍光輝度を記録することにより、占有および非占有のポピュレーションおよび速さを含む前記遷移状態の特性を求める、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生成される遷移状態は、三重項状態Ｔと、光異性化状態もしくは光イオン化状態を含む光誘起性の非蛍光性状態もしくは弱蛍光性状態を含む、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記生成される遷移状態は、さらに、前記励起パルスが開始される時点において前記蛍光分子が発する蛍光が含まれる波長レンジとは別の波長レンジに含まれる蛍光を発することが可能な状態を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記三重項状態を含む前記遷移状態は、Ｓ１からＳ０への緩和との比較において、励起−発光サイクルが生成される確率が低く、初期の基底状態へ緩和される速さが遅い、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
励起パルス間の間隔が累積する遷移状態が定常状態に達する時間よりも長い時間間隔であり、かつ、前記励起パルスの持続時間が微少量の遷移状態の累積のみが生じる時間よりも短い持続時間である範囲において、前記励起パルスの長さを変化させる、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記励起パルスの長さが、モニタリングされた前記三重項状態の緩和時間との比較において、短いか、または、モニタリングされた前記遷移状態の緩和時間との比較において、長い、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記励起パルス間の時間間隔として、前記遷移状態が緩和される長さよりも長い時間が選択、または、パルスのシークエンスに含まれるパルスの数を増大させるにつれて前記遷移状態のポピュレーションの累積的な増加を誘起する長さよりも短い時間が選択される、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記励起パルス間の時間間隔は、モニタリングされた前記三重項状態の緩和時間の倍数よりも短いか、または、前記遷移時間の緩和時間の倍数よりも長い、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
項間交差の率、および／または、Ｔ−Ｓ０緩和の率、を増大させる誘導剤／消光剤を添加し、励起の後に生じる蛍光を操作する、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記消光剤を選択することによって、項間交差あるいはＴ−Ｓ０緩和のいずれが優先的に増大されるかが相違する、相異なる蛍光分子種からの蛍光を操作する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
衝突相互作用および粘性の変化、前記蛍光分子の周囲の媒質の極性および導電性に作用し、三重項状態以外の遷移状態へ、あるいは、三重項状態以外の遷移状態から、の遷移率に影響を及ぼす別の化合物を添加する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記消光剤からの影響を受ける前記蛍光分子は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）システムの一部を構成し、
非占有率は、ドナー蛍光分子における遷移状態の形成率よりも大きく、アクセプタ蛍光分子における遷移状態の形成率よりも小さい、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記遷移状態は、三重項状態であり、
前記形成率および前記非占有率は、それぞれ、前記三重項状態の緩和時間への項間交差およびＴ−Ｓ０緩和である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遷移状態へ、および、前記遷移状態から、の遷移の実効的な率に対し、光誘起性の変更を行い、
前記光誘起性の変更は、より高い三重項状態およびより高い一重項状態への励起を含んでいる、請求項１ないし１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記遷移の率に対する前記光誘起性の変更は、少なくとも１回の付加的照射場によって行われ、前記付加的照射場は、前記励起エネルギー・パルスとの関係において、空間的にオーバーラップし、かつ、時間的にずらされ、波長が異なる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記付加的照射場は、
時間的なパルスのシークエンスを有し、
パルスの特性を変化させることができ、
前記励起および照射場に対するパルス列の時間的遅延を変化させることができ、
励起のための波長を変化させることができる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記パルスのシークエンスに含まれる前記パルスに関し、少なくとも１つの付加的レベルの変調が行われ、
前記励起場および前記付加的照射場に含まれる前記パルスのシークエンスに含まれる前記パルスは、重畳的な変調を受け、
前記パルス内において、高周波付加的パルス列が生成され、
前記付加的パルス列に含まれるパルスもまた変調され、
当該付加的パルス列のパルス内において第２の付加的レベルのパルス列が生成される、請求項１６ないし１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
全ての、相異なる励起場および照射場における重ね合わせられた付加的パルス列間において、パルス特性および時間的遅延を変化させることができる、請求項１６ないし１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
フィードバック制御を適用して前記励起場のパルス特性を適合化し、さらに、少なくとも１つの付加的照射場のパルス特性を適合化し、
前記遷移状態の特性に基づいて、前記励起場および前記少なくとも１つの付加的照射場のパルスのシークエンスの間に時間的遅延を与え、
前記蛍光分子の周囲の微環境の変化あるいは生じる分子間相互作用に起因した遷移状態の率のパラメータにおける変化に対する遷移状態特性の応答性を最大化する、請求項１ないし２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記フィードバック制御を用いて、確定され固定された遷移状態パラメータを維持し、
前記パルス列のパルス特性を定める１つまたは複数のパラメータに対して必要な適合化を、読み出しとして用いる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光コードが付された高分子ビーズを分析するステップを有し、
前記ビーズは、蛍光分子の含有量および発光波長ならびに三重項状態消光剤／誘導剤が添加されたビーズの量に関し、区別可能である、請求項１ないし２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
蛍光コードが付された粒子を分析するステップを有し、
前記粒子は、ビーズ、セル、および、脂質小胞を含み、
前記粒子は、その表面に、少なくとも蛍光分子を備え、
前記蛍光分子の１つもしくは複数の蛍光特性は、前記表面において生じる相互作用に起因して変化することができる、請求項１ないし２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記励起エネルギー・パルスおよび用いることができる付加的照射場は、少なくとも１つの合焦されたレーザ光線によって生成され、
前記パルスの励起強度およびエネルギーは、小領域あるいは小容量に集中され、
高強度励起手段を用いることなしに、前記蛍光分子内に遷移状態励起率が生じる、請求項１ないし２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
前記蛍光分子が前記励起場に滞留する時間をモニタリングするステップを有し、
前記励起場は、合焦レーザ光線を含み、
前記滞留する時間内に前記蛍光分子が受ける励起パルスの数の結果として前記遷移状態のポピュレーションに現れる影響から、前記滞留する時間のモニタリングを行い、
前記現れる影響は、前記遷移状態のポピュレーションの累積的増加量である、請求項１ないし２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
励起場のパターンを用いて前記励起エネルギー・パルスおよび付加的照射場を生成するステップを有し、
前記の励起場のパターンを用いる生成ステップは、２つ以上の励起場相互間の干渉の利用、または、照明場内のパターン状マスクの利用、を含み、
前記２つ以上の励起場相互間の干渉の利用、および、前記照明場内のパターン状マスクの利用は、ともに、時空間において変調可能である、請求項１ないし２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
検出した前記蛍光の時空間における拍動振動数を形成して分析するステップを有し、
前記拍動振動数は、前記励起場および少なくとも１つの付加的照射場によって生成され、かつ、形成される遷移状態および動力学に影響を受ける、請求項１ないし２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記励起場の空間的なおよび時間的な周波数、および、前記１つあるいは複数の付加的照射場の空間的なおよび時間的な周波数を、モニタリングされた遷移状態の動力学の変化が、より大きな前記拍動振動数の相対的ずれを生じさせるように、調査対象の蛍光サンプルの遷移状態の動力学に関して調整するステップを有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
自由に拡散する蛍光分子に関す、前記少なくとも励起場を通過するための通過時間をより短くすることにより、光退色の程度を最小化する、ステップを有する、請求項２５ないし２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記励起場の少なくとも１つは、レーザ光線を含んでいる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記蛍光分子を、前記励起場に対して並進させることにより、光退色の程度を最小化する、ステップを有する、請求項２５ないし３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
蛍光分子を、一重項状態以外の発光状態と、非発光あるいは前記発光状態よりも弱い発光の遷移状態と、の間で交替させるステップを有する、請求項１ないし３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
蛍光分子を、別の物体と交換するステップを有し、
前記別の物体は、量子ドット、蛍光ナノ粒子、を含み、
前記別の物体は、発光状態と、非発光あるいは前記発光状態よりも弱い発光の遷移状態と、の間を交替される、請求項１ないし３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記の記録ステップと、同時的に、蛍光分子あるいは調査対象の物体から付加的発光パラメータを記録するステップと、を組み合わせてするステップを有し、
前記付加的発光パラメータは、蛍光寿命、偏光極性、および、波長、ならびに、遅れた蛍光あるいは燐光から抽出された強度およびパラメータと同じパラメータ、を含み、
前記遅れた蛍光および燐光は、励起一重項状態の再占有、および、三重項状態の非活性化による蛍光および燐光である、請求項１ないし３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
励起後の蛍光分子の輝度を測定し分析する分光装置であって、
励起パルスを用いて蛍光分子内に遷移状態を生成する手段であって、前記蛍光分子内において、一重項（Ｓ０）状態を含む基底状態と、一重項（Ｓ１）、状態を含む励起状態との間での、前記励起状態から、長寿命の非蛍光性あるいは弱蛍光性の遷移状態への遷移を含む遷移を伴った、少なくとも１回のパルスの励起−発光サイクルを誘起させる、手段と、
前記蛍光を記録することにより、前記遷移状態のポピュレーションを求める記録手段と、を有し、
検出における時間分解の必要性の排除を目的として、パルスのシークエンスとその次のパルスのシークエンスとの間でパルスの特性を変化させる手段を有する、装置。
【請求項３７】
前記記録手段は、検出器を備える、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
少なくとも１回の付加的照射場を加える手段を備え、前記付加的照射場は、前記励起エネルギー・パルスとの関係において、空間的にオーバーラップし、かつ、時間的にずらされ、波長が異なる、請求項３６または３７に記載の装置。
【請求項３９】
並列的な状態のモニタリングを含む並列的手法で請求項１ないし３５のいずれか１つに記載の方法を実行することができるように適合化されている、請求項３６ないし３８のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４０】
励起領域のマトリックスをサンプル領域／容量に適用し、広範囲検出によってモニタリングする、請求項３６ないし３９のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４１】
少なくとも、蛍光顕微鏡、蛍光プレート・リーダ、および、蛍光活性化細胞分別機、のいずれか１つを有する、請求項３６ないし４０のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４２】
励起の後で発光した蛍光は、像面内における１つまたは複数のピンホール、あるいは、時空間内において変化可能なマスクにより空間的フィルタリングを受け、
前記マスクは、ニプコー・ディスクを含む、請求項３６ないし４１のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４３】
サンプル領域は、マイクロ・ウェル、または、固体支持核酸、ペプチド、もしくは、蛋白質、または、細胞もしくは生物学的組織の表面、である、請求項３６ないし４２のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４４】
前記励起場を偏向させることで空間的変化を生じさせ、および／または、前記励起場の位置に関し前記サンプルを並進させ、もって、励起期間ｔｅｘｃを有する周期的励起を行うための手段を有する、請求項３６ないし４３のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４５】
前記励起場にかかる空間的な、および／または、時間的な変化は、２つ以上の励起場相互間の干渉によって実現され、
前記励起場は、音響光学的原理に基づく変調器／偏向器を含む、レーザ光線または光線の変調器／偏向器によって生成されるか、または、マスクを利用して生成されるか、または、空間的フィルタリング手段を用いて生成され、
前記励起場は、時間的に、および／または、空間的に、変調可能である、請求項３６ないし４４のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４６】
検出、および／または、トランスレーション、のサイクルの速さを変化させるための手段を備え、前記変化させるための手段が、ｔｅｘｃおよび／またはｔｄａｒｋを変化させる、請求項４４または４５に記載の装置。
【請求項４７】
１つの同一の領域／容量に対して連続的パルス列を照射する、周期的励起を行うための手段を備え、
前記周期的励起を複数の領域／容量に対して、並列的に行うことができ、
１つの領域／容量におけるパルス特性が、パルス列とその次のパルス列との間で変化される、請求項３６ないし４６のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの、サンプルの面内における励起場は、二光子励起、または、内部全反射の後のエバネセント場により、実現される、請求項３６ないし４７のいずれか１つに記載の装置。
【請求項４９】
減衰フィルタを用いて励起強度（Ｉｅｘｃ）の空間的勾配を、前記少なくとも１つの励起場内に形成する、請求項３６ないし４８のいずれか１つに記載の装置。
【請求項５０】
複数の半透過ミラーを用いて励起に用いる光線を分割するか、または、グレーティング、回折光学素子、または、空間的光変調器を使用することで、複数の励起アレイを形成する、請求項３６ないし４９のいずれか１つに記載の装置。
【請求項５１】
蛍光の読み出しを、別の蛍光パラメータの読み出しを同時的に行うための計測手段に統合し、
前記別の蛍光パラメータは、調査対象の蛍光分子あるいは物体から抽出可能な、少なくとも、寿命、偏光極性、および、波長、のいずれかを含む、請求項３６ないし５０のいずれか１つに記載の装置。
【請求項５２】
コンピュータが読み取り可能なコードを有する、エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し分析するコンピュータ・プログラムであって、
前記コンピュータ・プログラムは、前記コンピュータにおいて実行されることにより、前記コンピュータに、請求項１ないし３５のいずれか１つに記載の方法を実行させる、コンピュータ・プログラム。
【請求項５３】
エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し分析するコンピュータ・プログラム製品であって、
コンピュータ読み取り可能な記録媒体、および、
コンピュータが読み取り可能なコードを有する、エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し分析するコンピュータ・プログラムであって、前記コンピュータにおいて実行されることにより、前記コンピュータに、請求項１ないし３５のいずれか１つに記載の方法を実行させる、コンピュータ・プログラム、とを有し、
前記コンピュータ・プログラムは、前記コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されている、コンピュータ・プログラム製品。
【請求項５４】
請求項１ないし５３のいずれか１つに記載の発明により、エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を測定し分析するコンピュータ読み取り可能な媒体であって、
前記コンピュータ読み取り可能な媒体は、伝搬される信号であり、前記伝搬される信号は、搬送波である、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エネルギー・パルスにより励起された蛍光分子の輝度を計測し分析するための装置、分光法、および、それに関連するコンピュータ・プログラムに関する。より具体的には、本発明は、励起パルスによって蛍光物質内に遷移状態を生成すること、および、励起させることなしにある期間内に基底状態へ緩和させること、に関する。遷移状態の特性は、蛍光輝度の励起を伴う持続時間および励起を伴わない持続時間に対する依存性より求める。
【背景技術】
【０００２】
蛍光分子の特性および様々な遷移状態の特性を測定し取得する方法として、様々な方法が知られている。その１つとして、蛍光相関分光法（ＦＣＳ(fluorescence correlation spectroscopy)）がある（ジェイ・ヴィデングレン、および、ウェ．メッツ、「シングル・モレキュル・ディテクション・イン・ソリューション−メソッズ・アンド・アプリケーションズ」、頁６９−１１９、ＶＣＨ−ワイリー・フェアラーク、ベルリン、２００２年(J. Widengren and Ue. Mets p. 69-119 in "Single Molecule Detection in Solution - methods and applications" VCH-Wiley Verlag, Berlin, 2002)を参照。）。ここ１０年で、学界やバイオテクノロジー関連および製薬関連企業において分子間相互作用を研究する上で、ＦＣＳやそれに関連する方法を用いることが急激に増加している（エム．オーラー、ドラッグ・ディスク・トゥデイ、１９９８、３：４５７、シー・エッゲリング、エル・ブランド、ディー・ウルマン、および、エス・イェーガー、ドラッグ・ディスク・トゥデイ、１９９８、２００３  ８（１４）：６３２(M. Auer, Drug Disc. Today, 1998, 3:457, C Eggeling, L Brand, D Ullumann and S Jaeger, Drug Disc. Today, 1998, 2003 8(14):632)を参照。）。ＦＣＳは、合焦レーザ光線により励起された蛍光分子の強度の揺らぎに関する分析に基づく。原理上、この手法は、蛍光輝度の変化として現れるナノ秒以上のレンジにおける分子の動力学的過程に関する情報を提供することができる。蛍光の揺らぎは、検出される蛍光輝度の自己共分散として解析され、二乗蛍光輝度時間平均で正規化される。
【数１】
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【０００３】
並進拡散に関し、蛍光揺らぎの持続時間は、分子の通過速度（passage time）を反映する。一方、揺らぎの相対振幅は、検出容量内における平均分子数、Ｎ、に逆比例する（図１を参照。）。相関曲線は、ある分子からの光子が時刻ゼロにおいて検出されたと仮定した場合における、その分子からの蛍光光子の検出の、時間に対する確率を反映する。つまり、ＦＣＳ曲線の時間減衰、τＤ、は、通過速度を反映する。振幅は、相対蛍光揺らぎおよび１／Ｎに比例する。
【０００４】
蛍光分子、つまり、フルオロフォアにおいて、一般に、蛍光光子の放出は、基底状態（Ｓ０）から第１の励起一重項状態（Ｓ１）への励起に続いて起こる緩和において生じる。Ｓ１からＳ０（ｋ２１）への緩和の速さ（rate）は、一般に、１０９ｓ−１のオーダである。加えて、さらに長寿命の、非−あるいは弱い、蛍光遷移状態が乗じることもある。以降、これらを遷移状態と称する。また、これらの状態のうちから、我々は、最も低い三重項状態を例に用いて本発明の背景および原理を説明する。特に、光誘起の、電荷移動あるいは異性化は、このような遷移状態のカテゴリーに属する。これらも、ＦＣＳを用いれば、同様の原理で、三重項状態としてモニタリング可能である（ヴィデングレン・ジェイ、ダプリッチ・ジェイ、および、リグラー・アール、ケム・フィジクス、２１６、４１７−４２６、１９９７、ならびに、ヴィデングレン・ジェイ、シュヴァイル・ピー、ジェイ・フィス・ケム・エイ、１０４（２７）：６４１６−６４２８、２０００（Widengren J, Dapprich J, and Rigler R. Chem Physics, 216, 417-426, 1997 and WidengrenJ, Schwille P, J phys Chem A, 104(27):6416-6428, 2000）を参照。）。
【０００５】
最も低い三重項状態（Ｔ）に関し、Ｓ１からの項間交差によりポピュレーションが発生する。一般にその速さ（ｋＩＳＣ）は、１０６ｓ−１のオーダである（図３を参照。）。三重項状態は、完全に非蛍光性であると考えることができる。速度定数の比、ｋＩＳＣ／ｋ２１、より、およし、１０００の励起−発光サイクルにつき１つの割合で生じることがわかる。しかし、ひとたび占有（populated）されると、三重項状態は、極めて長寿命である（マイクロ秒−ミリ秒）。三重項の減衰率、ｋＴ、は、１０３から１０６ｓ−１のオーダである。そのため、連続的励起率が高いと、つまり、ｋｅｘｅがｋ２１と同程度であってＳ１が著しく占有されるような場合だと、三重項フルオロフォアの定常状態ポピュレーションは、堅調に蓄積する。三重項への、および、三重項状態からの遷移は、蛍光に揺らぎを生じさせる。ここで、フルオロフォアは、一重項として実在する（Ｓ０およびＳ１）限りにおいては蛍光性を有し、三重項状態、Ｔ、にある場合においては非蛍光性である。
【０００６】
ＦＣＳにおいては、これらの揺らぎは、検出容量への、および、検出容量からの蛍光分子の並進拡散によるものに重ね合わされる（図１参照）。そして、相関曲線において第２の緩和過程が生成される。相関曲線においては、この第２の緩和過程の相対的振幅は、検出容量におけるフルオロフォアの平均三重項状態ポピュレーション、
【数２】
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に対応する。緩和時間、τＴ、は、一重項−三重項遷移の緩和時間に対応する（図４参照。）（ジェイ・ヴィデングレン、ウェ・メッツ、アール・リグラー、ジェイ・フィス・ケム、１９９５、９９、頁１３３６８（J Widengren, Ue Mets, R Rigler, J Phys Chem 1995, 99, p. 13368）を参照。）。図３より、これらのパラメータは、励起率、ｋ１２に従属する。
【数３】
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【数４】
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【０００７】
異なる励起強度におけるＦＣＳ曲線を作成し、
【数５】
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、および、τＴを求めることで、一重項−三重項遷移に含まれる、全ての速さ（rate）にかかるパラメータを求めることができる。ＦＣＳは、三重項状態の調査のための閃光光分解法や過渡吸収法に対する、いくつかの重要な有利性をもたらす。これら手法とは対照的に、ＦＣＳは、摂動の形で外部同期を導入する必要なしで、内在する熱力学的揺らぎを巧みに利用して動力学的過程をフォローする。ＦＣＳから導出される三重項のパラメータはまた、再現性がよい。対照的に、過渡吸収法で得た三重項状態の率（速さ（rate））のパラメータは、報告毎にかなりの違いがある。
【０００８】
とはいえ、ＦＣＳを用いるうえでの困難性や不利点も存在する。この方法は比較的シンプルかつパワフルだが、ＦＣＳによる三重項状態のモニタリングは、ある制限に悩まされる。それら制限の１つは、必要な、自然発生的な揺らぎを観察するためには、低い分子数を記録する必要があることである。従い、低いサンプル濃度（＜１００ｎＭ）しかモニタリングできない。第２には、ノイズ・レベルが低くかつ非常にセンシティブな検出器が必要であり、かつ、三重項の揺らぎの時間スケールが、高い時間分解能を備えた蛍光データの検出および処理を要求する。検出に関し、そのような要求を満たすのは、点検出器（point detectors）しかない。
【０００９】
三重項状態の特性を探査することで、分子に関する、有益な情報を入手できる。用途の１つとしては、三重項状態の誘起もしくは消光性の量（extent）を探査することがある。蛍光の消光に関しては、これらの効果は、そもそも、フルオロフォア、および、フルオロフォアの異なる状態間の遷移率を向上させることができる分子間における衝突相互作用に基づくものである。蛍光の消光においては、Ｓ１からＳ０へ至る、別の蛍光緩和経路が誘起され、もって、蛍光性が低減される。蛍光性の減少（あるいは、フルオロフォアの蛍光寿命の低減）は、衝突相互作用の程度を測定するのに用いることができる。これは、例えば、ラベリングにかかるサイトのアクセシビリティに関する情報や、周囲ソルベントからどれくらいよくシールドされているかといった情報を供することができる。このアクセシビリティは、立体配座の変化あるいは分子間相互作用により変化することがあり、これらをモニタリングすることに用いることができる。他方、三重項状態は、Ｓ１（ナノ秒）と比較して、相対的に長寿命（ミリ秒−マイクロ秒）である。従って、三重項状態の失活率、ｋＴ、に影響を及ぼすことができる周囲分子は、三重項状態と衝突相互作用する時間が、少なくとも１０００倍長い。また、これらは、Ｔに対する項間交差の率を増大させることができる。三重項状態の反応速度論を用いてモニタリングされる三重項状態の消光／誘起は、このように、フルオロフォアの直近の環境に関する非常に繊細な情報を供することができる。そのような情報は、例えば、分子間相互作用や蛋白質構造の変化を反映している。
【００１０】
構造形成あるいは三重項状態蛍光分子の減少に影響を及ぼす分子の添加とは別に、三重項状態への、または、三重項状態からの遷移は、Ｓ１および／またはＴをより高い一重項または三重項状態へ励起することで変化する。これらの、より高い状態に関し、フルオロフォアの一重項および三重項のものの間の遷移率は、Ｓ１／Ｓ０およびＴの間における率とは異なる。よって、三重項状態にあるフルオロフォアの割合も異なる。Ｓ０をＳ１へ移す、ｋ１２（ｋ１２−励起）と同時に、（後の照射場（radiation field）によって）より高い励起状態へ励起させることができ、最適励起波長は、一般に、ｋ１２−励起の波長よりも僅かに赤方へ偏位する。ＦＣＳ実験において生成されモニタリングされた、付加的励起場を用いた光誘起三重項消光／変容（modification）に関しては、ジェイ．ヴィデングレン、シー．ザイデル、フィス・ケム・ケム・フィス、２０００、２：頁３４３５−３４４１（J. Widengren, C. Seidel, Phys Chem Chem Phys, 2000, 2:p. 3435-3441）を参照されたい。
【００１１】
後の照射場は、ｋ１２−励起に対して幾分時間的に遅れて実施可能である。さらには、照射場は、後のより高い励起状態の生成に加えて、励起状態からより低い状態への誘導放出を誘起することに用いることができる。ｋ１２−励起と後の放射場との間の上記時間的遅延（以降、ｔｄｅｌａｙと称する。）を調節することで、後の照射場によって、様々な、ｋ１２−励起の後の緩和の段階を、操作したり調べたりすることができる。ｋ１２−励起の後、緩和が生じる。緩和は、（一般にピコ秒のレンジの）電子状態Ｓ１における振動緩和、（一般にナノ秒のレンジの）Ｓ１のＳ０への電子緩和、および、（一般にマイクロ秒以上のレンジの）より長寿命な遷移状態への緩和による。ｋ１２−励起の後、後の照射場が適用された時点における（ｔｄｅｌａｙにおける）振動緩和の程度は、Ｓ１とその近傍の状態間のエネルギー差に影響を及ぼし、もって、後の放射場によるＳ１からの励起もしくは誘導放出の発生にかかるスペクトル依存性にも影響を及ぼす。より長い時間スケール（一般にナノ秒）に関し、ｔｄｅｌａｙにおける電子緩和の量は、なおＳ１に留まり、より高い励起状態へ励起可能な、あるいは、より低い状態へ誘導放出されることが可能な蛍光分子の割合を決定する。同様、さらに長い時間スケールにおいては、ｔｄｅｌａｙにおいて生じている長寿命な遷移状態への緩和の量が、後の放射場によって可能な遷移を決定し、励起放射場開始後のある時刻ｔｄｅｌａｙにおいて存在している状態の分布から単純に、後の放射場の影響下で可能な遷移に対する、可能な「開始点」が決定される。
【００１２】
蛍光消光実験は、通常、フルオロフォア−消光剤間相互作用の結果である励起状態のデポピュレーション（depopulation）の量を測定する。蛍光寿命は、一般に、ナノ秒の時間レンジに含まれるので、三重項状態のような長寿命な状態と較べれば、相互作用に用いることが可能な時間は、１０００倍程度に短い。実際、三重項状態消光測定の手順は既に実施されている。しかしながら、そこでの問題点は、三重項状態のポピュレーションのモニタリングである。通常、これは、三重項状態の吸収、あるいは、三重項状態が基底一重項状態へ減衰することで生じる燐光を用いてモニタリングされるが、通例、これは、技術的に複雑であり、鋭敏性を欠く。
【００１３】
三重項状態のモニタリングのためのＦＣＳ法は、蛍光分子に対する強い励起に依っており、よって、励起強度（あるいは放射、Ｗ／ｃｍ２）に対する分子毎の蛍光強度の応答性は、用いる励起強度の範囲においてはもはや線形でない、つまり、励起一重項状態Ｓ１の占有（populating）の平均確率は、もはや、励起強度に比例しない。ＦＣＳ測定においては、顕微鏡対物の下での、調査対象の分子が存在する位置における励起レーザ光線の強い合焦（フォーカシング）により、十分に高い励起強度を容易に達成することができる。実際、回折限界あるいは回折限界近傍でレーザ光線を合焦させ、光線のウェストをおよそ０．３マイクロメートル程度とすれば、レーザ光線の合焦容量内におけるフルオロフォアにおいて、優れた三重項状態のポピュレーションを得るのに、１ミリＷ未満の励起パワーで十分である。さらには、焦点が小さいことで、自由に移動している分子は、大抵、光退色を生じさせないのに十分な程度に短い時間内に、レーザ光線合焦容量を通過する。あるいは、励起のためにレーザの焦点を用いる場合においては、（光線を静止させた状態で）サンプルを走査（スキャン（scan））あるいは流すこと、あるいは、（サンプルを静止させた状態で）光線を走査させることで、分子の通過時間、つまり、励起レーザに対する曝露時間を、短くすることが可能である。
【００１４】
（前文にて概説した）三重項状態の消光／誘起を用いた分子のモニタリングとは別に、いわゆる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer））（Foerster）により、三重項状態のパラメータを、分子内距離および分子間距離の読み出しに用いることができる。ＦＲＥＴは、光物理過程であって、１０−１００オングストロームのレンジにおける分子の距離に関する情報を導くための、よく確立されたツールである（ティー・フェルスター、アン・フィス、１９４８、２：頁５５、エル・シュトライヤ、アールピー・ホーランド、プロック・ナトル・アカド・サイ、１９６７、５８：頁７１９（T Foerster, Ann. Phys. 1948, 2: p. 55; L Stryer, RP Haugland, Proc. Natl. Acad. Sci. 1967, 58: p. 719）を参照。）。ＦＲＥＴを介し、エネルギーは、ドナー分子から、誘起された双極子誘起双極子相互作用により、アクセプタ分子へ、非−放射的に、移動する。励起エネルギーの移動が生じる、その効率、Ｅ、は、複数のパラメータに従属する。そのようなパラメータは、例えば、フルオロフォアの双極子モーメントの相互間の方向性、スペクトルのオーバーラップ、等、である。
【００１５】
しかしながら、ＦＲＥＴの有用性は、主として、Ｅがドナーおよびアクセプタ色素分子間の距離、ＲＤＡ、の６乗の逆数に従属する、という事実に依拠している。しかして、ＦＲＥＴは、「分子定規（molecular ruler）」と称される。従来の蛍光分光学において、ＦＲＥＴ効率Ｅは、複数のパラメータを介してモニタリング可能であった。その中でも最もよく使われたのは、ドナーおよびアクセプタ・フルオロフォアの輝度（Ｅが高くなると、ドナーの蛍光は低減しかつアクセプタの蛍光は増大する。）、あるいは、ドナーの寿命（Ｅが高くなると、ドナーの蛍光の寿命が短くなる。）、である。ＦＲＥＴは、生物医学分野において幅広い利用用途を有する。顕微鏡法的技術の導入により、多くの相異なる微環境に対しＦＲＥＴを適用することが可能となり、研究対象の系にかかる干渉が全く、あるいは、殆ど、生じなくなった。また、ＦＲＥＴは、分子結合アッセイの基礎として、広範な利用用途を有する。ＦＲＥＴによって生成される蛍光信号に関する光物理学的構造が、分子の配座（conformation）、結合（association）、および、脱離（separation）に鋭敏であることは、文献、イー・エー・ヤレス−エルドマン、および、ティー・エム・ジョビン、ネイチャー・バイオテクノロジー、巻２１、号１１、２００３年１１月（E. A. Jares-Erdman and T. M. Jovin, Nature Biotechnology, Vol. 21, No. 11, Nov. 2003）に示されている通りである。
【００１６】
どのようなパラメータを介してＦＲＥＴ効率を導出するかに関係なく、この手法には、ある欠点がある。ドナー・フルオロフォアともアクセプタ・フルオロフォアともラベル付けされていない分子をかなりの割合で含む分子団に基づいてＥを計算する場合のように、不完全な分子のラベリングを勘案する場合に特に問題が生じやすい。また、ディテクタがドナーの蛍光の一部分をアクセプタの蛍光として検出したり、その逆であったり、といった蛍光のクロス・トークの問題も生じている。
【００１７】
示した方法による三重項状態の特性の探査は、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）にも有用である。ＨＴＳにおいては、分子間相互作用を、高度に並列化した高速な手法で調査する。時には、極微量しか利用することができない生物活性分子を、大量の化合物と区別したり、相互作用の観点で調べたりする必要がある。（単分子検出の）高度な鋭敏性（センシティビティ（sensitivity））、高速な読み出し、および、（多くのパラメータを用いることが可能な）高度な特定性（スペシフィシティ（specificity））により、蛍光分光法は、創薬および診断法に関するバイオテクノロジーにおけるキー・テクノロジとなった。商業的重要性を示すものとして、全世界の製薬会社が新薬候補のハイスループット・スクリーニングに超高感度蛍光法の使用に非常に強い興味を示している点を指摘することができる。開発されたＨＴＳアッセイの多くは、ＦＲＥＴ（および内在する欠点）を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従来技術による方法、および、それと関連する装置は全て、それぞれ、不利点を有する。上述した不利点に加え、上述の周知の方法および技術はいずれも、フルオロフォアの光誘起性の遷移状態の占有や非占有にかかる準位（level）や率（rate）に関する情報とともに、三重項状態の並列的な読み出しにかかる情報を取得するための、正確かつ信頼できる方法および技術ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記を鑑み、本発明は、時間分解された情報を取得するための新しい方法を提供するとともに、上述の欠点および問題に対する解決策を提供する。本発明は、１つあるいは限定的な数の小さな励起スポット／ボリューム（容量）からの読み出しに限定されない。これらは、独立請求項に記載の方法あるいは装置により実現される。
【００２０】
本発明の別の有利な実施の形態は、添付の特許請求の範囲に記載される。
【００２１】
提案にかかる解決策においては、光誘起性の長寿命な遷移状態を、高い鋭敏性で、高度に並列化されハイスループットなやり方で調べることができる。これら状態が長寿命であることに起因したこれら状態の分子間相互作用に対する鋭敏性と相まって、本発明は、上述のような方法でこれら状態の反応速度論的パラメータ（kinetic parameters）を、蛍光を記録するうえで遭遇する固有の多くのアーチファクトを排除しつつ記録可能であるため、非常に高精度かつ正確なものとなる。
【００２２】
本発明は、三重項状態の消光鋭敏性を、読出手段として用いる蛍光に起因する鋭敏性および特定性と組み合わせた手法を用いる。蛍光消光実験に基づく周知の方法との比較においては、本発明は、その有利点を併せ持ち、かつ、一重項状態消光あるいは三重項状態消光のいずれかを別々に用いることの不利点を回避する。このことは、ＦＣＳ法にも当て嵌まる。同様にして、同じ主要な有利点は、非蛍光性あるいは弱い蛍光性の長寿命な光誘起性の遷移状態にかかる別カテゴリーの消光／誘起をモニタリングする場合にも活用することができる。ＦＣＳは、光誘起電荷移動により生じる遷移状態のポピュレーションの変化（ヴィデングレン・ジェイ、ダプリッチ・ジェイ、および、リグラー・アール、ケム・フィジクス、２１６、４１７−４２６、１９９７（Widengren J, Dapprich J and Rigler R. Chem Physics, 216, 417-426, 1997）を参照。）、あるいは、問題としている特定の状態へ、もしくは、該状態からの変化率（transfer rate）を向上させるかあるいは抑制させる化合物の添加による、異性化（ヴィデングレン・ジェイ、シュヴァイル・ピー、ジェイ・フィス・ケム・エイ、１０４（２７）：６４１６−６４２８、２０００（Widengren J, Dapprich J, and Rigler R. Chem Physics, 216, 417-426, 1997 and WidengrenJ, Schwille P, J phys Chem A, 104(27):6416-6428, 2000）を参照。）をよくモニタリングすることは既に示されている。添加された化合物の影響は、衝突相互作用を用いて、あるいは、蛍光分子もしくはプローブの直近の環境における粘性および極性の変化を用いて、導入することができる。しかしながら、遷移状態モニタリングに関してＦＣＳ法とは対照的に、本発明は、遷移状態消光／誘起実験を、ハイスループット・スクリーニング用途にも適用可能な大規模な並列的スケールで実行することができる。また、モニタリングにかかる分子濃度は、およそ１μＭ未満に限定されない。
【００２３】
消光／誘起にかかる遷移状態は、１つあるいは複数の後の放射場を用いて導入することも可能である。励起放射場の開始から後、あるいは、励起場パルスの停止の後、のある時刻ｔｄｅｌａｙにおいて存在する状態の分布は、後の放射場による影響を被ることになる、可能な遷移に関する可能な「開始点」を決定する。このようにして、図３に示すような三状態反応機構（three-state kinetic scheme）は、ｋ１２−励起によって制御された状態ポピュレーションを備え、また、別の状態で拡張することが可能であり、ここで、状態間遷移の１つまたは複数が光の影響を受けることが可能であり、もって、１つまたは複数の付加的な放射場の特性、特にその強度、持続時間、および、可能なｔｄｅｌａｙ、のみならず、時空間における偏光極性（polarization）および形状により、ポピュレーションの動力学は決定され、場合によっては、変調されることも可能である。
【００２４】
同様に、結果生じる蛍光が、励起場と、１つあるいは複数の付加的放射場の積（プロダクト（product））であるなら、拍動パターン（beating pattern）を形成することも可能である。これらの場を空間的あるいは時間的に変調することで、空間的および時間的拍動パターンが現れる。その振動数は、励起場および付加的放射場の差から定まるが、加えて、遷移状態の動力学による影響も受ける。遷移状態動力学における変化は、拍動の振動数においても、大きな、相対的変化を生じさせることがある。もって、このことは、遷移状態パラメータの読み出しに用いることができる。
【００２５】
同様、ＦＣＳも、そのような状況下において、付加的放射場を用い、後者のカテゴリーにかかる状態モデルを用いることで、遷移状態の動力学（反応速度論）のモニタリングが可能である。しかしながら、本発明にかかる遷移状態モニタリングの方法論においては、さらに少ない分子濃度にかかる制約の下で、並列的モニタリングが可能である。
【００２６】
少なくとも１つの後の放射場による、遷移状態の反応速度の、光誘起による変更（modification）は、フィードバックの導入という拡張が可能である。そのような場合においては、遷移状態パラメータの応答を用いて、パルス特性の適合化を誘導することができる。その目的の１つは、パルス特性の適合化を促進し、（分子間相互作用あるいは蛍光分子周囲の微環境の変化による）遷移状態パラメータの軽微な変化によって、モニタリングされる遷移状態パラメータへ及ぶ影響を最大化することである。特定の（固定された（clamped））遷移状態パラメータのセットを生成するのに必要な、パルス特性適合化の程度および様式（特に、励起強度、パルス持続時間、時空間における形状、ｔｄｅｌａｙ、偏光極性）は、読み出し（read-out）としても用いることができる。読み出し（リード・アウト）のコントラストを改善させるための、動的フィードバックの原理、および、読み出しとしてパラメータ自身を固定させるために必要なフィードバックの使用は、例えば、原子間力顕微鏡法において実践されているやり方と類似する。例えば、力固定タッピングモードＡＦＭ（ヤリリ、および、ラクスミナラヤナ、メカトロニクス、１４（２０００）、頁９０７−９４５（Jalili and Laxminarayana, Mechatronics 14 (2000) p. 907-945））、および、所謂アクティブ−Ｑ・フィードバック（ヘルバー、および、マイルズ、サイエンス、（２００３）、頁１００２−１００５（Hoerber and Miles, Science (2003), p. 1002-1005））。
【００２７】
このように、本発明は、分子間相互作用のモニタリングが可能である。ここで、分子間相互作用は、三重項状態といった光誘起性遷移状態や、光誘起性異性化によって導入された状態や、電子移動や、ＦＲＥＴにおける変化として反映される。以下に２、３の例を示す。
【００２８】
・ＤＮＡ配列および蛋白質配列の読み出し手法としての使用。ハイブリダイゼーション／分子間相互作用を、個体支持アレイや溶液で満たしたウェルのアレイの両方を用いて高度に並列化したやり方でモニタリング可能である。このようなセッティングにおいては、提案する本手法は、ＨＴＳ用途に関し、新しく、パワフルで、未だ利用されていない、鋭敏で顕著な蛍光ベースのパラメータを使用可能にする。
【００２９】
・本発明は、「従来の」蛍光パラメータ（輝度、励起および発光の波長、蛍光寿命、ならびに、偏光極性）に加え、新しい遷移状態パラメータを提供する。非従属的（独立）なパラメータの数が増えることによって、例えば、サンプルのアレイに含まれる、疾患特異的な分子、あるいは、分子間相互作用の存在を確認したり証明したりできる可能性を向上させることができる。
【００３０】
・環境因子（environmental factors）の画像化の分野においては、自由なあるいは他の分子と共役したフルオロフォアは、その三重項状態（あるいは、電荷移動状態）を介し、消光剤の、例えば、酸素分子の、濃度を反映する。同様、シス・トランス異性化特性は、（例えば、微環境あるいは分子間相互作用による影響として、）局所的な粘性および力を探ることができる。したがって、提案する本手法は、例えば、細胞の表面および内部、ならびに、（マイクロ・アレイ内、あるいは、固体支持体上の）サンプルのアレイの微環境の画像化に関する新しい方法論を提示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の、上述および別の特徴、有利点、便益は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明より明らかである。図面においては、参照用文字、および、数字は、全図において同じ部位を指す。
【００３２】
以下、本発明を実施するための最良の形態であると現在考えられる形態について説明する。本説明は、限定的に解釈されるべきものではない。本説明は、本発明の一般原理を説明することを目的としている。したがって、ここでは、本発明がモニタリング可能な遷移状態の一例として、蛍光分子の最も低い三重項状態を取りあげる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照し定めるべきである。
【００３３】
本発明にかかる第１の実施形態においては、相異なるパルス持続時間および励起強度を備えた周期的励起により、
【数６】
2008542748.tif 000008
をモニタリング、および、操作、制御する形態を説明する。上述のとおり、ＦＣＳ曲線は、相関時間、τ＝０、において分子から蛍光光子が放出される場合において調査対象の分子から蛍光光子が検出される確率を、反映している。図４を参照すれば、フルオロフォアは、τ＝０において、一重項の状態にある（なぜなら、ちょうどそのときに、フルオロフォアは、光子を放出するから。）。ＦＣＳ曲線における第１の緩和過程は、フルオロフォアの、一重項粒子の状態（Ｓ０あるいはＳ１）から定常状態への遷移を反映している。ここでは、
【数７】
2008542748.tif 000009
なる確率で、三重項状態にある（よって、低いほうの振幅＝光子を放出する確率、である。）換言するなら、τ＝０において、（蛍光発光可能な、）一重項状態にあるフルオロフォアを見出す確率は、Ｓ０＋Ｓ１＝１００％であり、したがって、フルオロフォアは、完全に蛍光性である。τ＞＞τＴにおいて、フルオロフォアは、
【数８】
2008542748.tif 000010
で定常状態へ緩和され、それに対応した平均蛍光輝度の減少を伴う。（τＤにおいては、フルオロフォアは、一般的には、検出容量から抜け出ようとする。そして、そのフルオロフォアからの蛍光光子が検出される確率は、ゼロに漸近する。）
【００３４】
ＦＣＳ曲線は、まるで、蛍光分子が、時刻ｔ＝０から開始される同じ一定の励起強度に曝されるかのように、同じ初期条件（Ｓ０＋Ｓ１＝１００％）で、同じ確率関数を反映する。だから、図２に関して言えば、励起パルスの開始の後の時間に関する関数、Ｔ（ｔ）、である三重項のポピュレーションは、ｔ＝０においてはゼロである。ｔ＜＜τＴにおいては、Ｔ（ｔ）は、無視することができ、ｔが大きくなるにつれて徐々に増加し、最終的に、ｔ＞τＴに関して定常状態のポピュレーション、
【数９】
2008542748.tif 000011
へ漸近する。よって、励起期間の持続時間、ｔｅｘｃ、を異なれば、該励起期間における平均三重項ポピュレーション、
【数１０】
2008542748.tif 000012
も異なる。故に、平均検出蛍光輝度は、
【数１１】
2008542748.tif 000013
である。これを用いて
【数１２】
2008542748.tif 000014
を求めることができる。
【００３５】
周期的励起（ｔｅｘｃの間、励起強度一定Ｉｅｘｃであり、その後に非励起時間ｔｄａｒｋが続き、周期の総時間Ｐｔ＝ｔｅｘｃ＋ｔｄａｒｋ。図９参照。）を用い、異なるパルス・シークエンスでは、Ｉｅｘｃおよびｔｅｘｃを変化させることで、検出サイドにおいて時間分解することなしで、Ｔ（ｔ）および三重項状態の率（rate）のパラメータｋＴおよびｋＩＳＣを求めることができる。手順は、以下の通りである。周期的励起における、時間に関するトータルの蛍光、
【数１３】
2008542748.tif 000015
を、記録ごとに励起の持続期間ｔｅｘｃを次々に変えながら、記録する。用いる周期時間Ｐｔは、ｔｄａｒｋの間に三重項状態が緩和される程度に、十分に長い。異なるｔｅｘｃ、ｔｄａｒｋ、および、ＩｅｘｃにおいてＦｔｏｔを記録することで、三重項状態の特性は、完全に明らかにすることができる。ＦＣＳに関するなら、点検出、低濃度、あるいは、高い時間分解能および感度に関する制約がない。この手法に従って、より一般的には、励起パルスの特性を変化させながらＦｔｏｔにおける差違を求めることができる。励起パルスの特性には、ｔｅｘｃ、ｔｄａｒｋ、および、Ｉｅｘｃに加え、時空間内におけるパルス形状の変動、偏光極性、が含まれる。そして、この差違は、後で様々な光誘起性の遷移状態をモニタリングするときに用いることができる。
【００３６】
同様、付加的照射場に関して上述と同様のパルス特性を変化させたり、付加的照射場の波長、位相、および、変調周波数のずれ（シフト）を、励起場に対して変化させたりすることにより、少なくとも１回の付加的照射パルス場を適用することで、遷移状態のポピュレーションの反応速度論（動力学）に対し付加的な操作および変調をすることができる。励起場および付加的照射場のパルス・シークエンスは、パルス列に、少なくとも１つの、より高速な（短い）時間スケールの付加的ヒエラルキーをオリジナルのパルス列に重ね合わせることができる。パルス列の各ヒエラルキーは、それぞれ特定のパルス特性を有し、それらパルス特性はそれぞれ、励起場のパルス列における対応するヒエラルキーのパルス、あるいは、別の付加的照射場の同一のヒエラルキー・レベルのパルスに対し、特定のｔｄｅｌａｙだけ時間的にずらす（シフトさせる）ことができる。このようにして、ｋ１２−励起の後の緩和に関する複数の相異なる段階を、各ヒエラルキー・レベルの
【数１４】
2008542748.tif 000016
を、ひいては、記録したＦｔｏｔを用い、具体的にかつ同時的に、操作および調査することができる。
【００３７】
付加的照射場を適用可能なことから、分子事象あるいは分子間相互作用に対する反応として、遷移段階の動力学を操作／変調することが可能となり、そして、遷移状態の動力学のふるまいのコントラストの強調も可能となる。遷移状態の動力学のふるまいから励起場のパルス特性、さらには、後の照射場のパルス特性へのフィードバック制御を追加することで、上述のコントラストの強調の最適化の手段を実現することができる。さらに、動的フィードバックにより遷移状態の動力学をクランプ（固定化）させるような使用法を用いれば、フィードバックの程度（エクステント）や様式（モーダリティ）を実際の読み出しとして用いることが可能である。
【００３８】
三重項状態は、Ｓ１よりもずっと長寿命であるため（、それ故にフルオロフォアの直近の環境との衝突やその他の相互作用の影響を受ける時間がずっと長いため）、Ｓ１消光よりもずっと鋭敏な読み出しを提供可能である。先述の三重項状態モニタリングにかかる問題点、これら問題点は第１の実施形態による解決策によって克服することが可能である、を別にしても、三重項状態消光／誘起を使用することにはなお困難性がある。なぜなら、フルオロフォアとその周囲との間に、三重項状態に影響を及ぼす、特定されない相互作用があるためである。
【００３９】
本発明にかかる第２の実施形態において、三重項状態消光の量の探査の信頼性をさらに高める方策を提案する（図１０を参照。）。消光剤の付加により、三重項状態のポピュレーションを著しく増大させることができる。これは、いわゆる重原子効果が、項間交差速度（率）、ｋＩＳＣを増大させるためである。このことは、ＦＣＳ測定においては、三重項のポピュレーションの突出した増大として、明瞭に見て取ることができる。しかしながら、我々は、幾つかのフルオロフォア／消光剤の組み合わせについては、三重項減衰率、ｋＴ、が、項間交差よりもさらに強められることを、観察している。もし、励起強度が、定常状態の三重項のポピュレーションを最初の段階で生成するのに十分なほどに強ければ、ｋＩＳＣあるいはｋＴのいずれが最も増大するか、に依って、三重項のポピュレーションは、消光剤の付加によって、顕著に増大、あるいは、減少する（図１０を参照。）。このことは、今後、特異的消光（ディファレンシャル・クエンチング（differential quenching））と称することとする。よって、相異なる波長領域の放出しかつ三重項状態消光剤／誘導剤の付加に対して相異なる反応をする２つの異なるフルオロフォアを用いれば、その影響を、一方のフルオロフォアについては蛍光輝度の増大および三重項状態のポピュレーションの減少として、また他方のフルオロフォアについては蛍光輝度／三重項状態のポピュレーションの同時的／連動的減少として、高度に明瞭な形で、モニタリングすることができる。
【００４０】
本発明にかかる第３の実施形態により、特異的消光の利用と組み合わせたＦＲＥＴを提案する。上記式２および式３から解るように、
【数１５】
2008542748.tif 000017
およびτＴは、励起率ｋ１２に従属する。この従属関係は、励起の様式を問わず存在する。よって、もし、ＦＲＥＴを通じて励起が生じれば、アクセプタの三重項状態のパラメータを用いてＦＲＥＴ介在のドナーからの励起（FRET-mediated excitation from the donor）を求めることができる。そして、ＦＲＥＴ効率Ｅを求めることができる。アクセプタの三重項状態のポピュレーションは、選択的に突出し、Ｅにおける小さな変化も明瞭に認めることができ、ドナーの三重項状態のポピュレーションは低く、アクセプタへの励起エネルギーの移動における干渉は最小化される。ここで提案している方策は、特異的消光を用いる手法である。ここでは、ドナーの三重項状態のポピュレーションは減少し、他方、アクセプタの三重項状態のポピュレーションは増大する。
【００４１】
ＦＲＥＴと特異的消光とを組み合わせて用いることによる優位性として、以下が期待できる。
【００４２】
・ドナーの蛍光のクロス・トークおよびバックグラウンド（背景）からの影響が非常に小さい。（ドナーの蛍光のクロス・トーク、あるいは、アクセプタのチャンネル中へ漏れるバックグラウンドは幾分存在するが、それらは、三重項に影響された（triplet-influenced）アクセプタの蛍光にかかる特徴的な緩和時間を示さない。）
【００４３】
・ラベリングが不完全であることによる影響が最小化される。（ＦＲＥＴ効率は、アクセプタの蛍光から読み取られるので、実際には、ドナー・およびアクセプタ・フルオロフォアの両方のラベルが付された分子のみが信号に現れる。）
【００４４】
・濃度のキャリブレーション、絶対的蛍光、あるいは、検出量子収量（収率）（detection quantum yields）は、もはや必要でない。（三重項パラメータは、アクセプタの蛍光それ自体に関係するパラメータのみから抽出される。三重項パラメータ自身のキャリブレーションは、周知の励起郷土を用いたアクセプタに対する直接的な励起を行うことで可能である。つまり、付加的分子は、キャリブレーションには不要である。）
【００４５】
本発明にかかる第４の実施形態は、
【数１６】
2008542748.tif 000018
およびτＴを反映する
【数１７】
2008542748.tif 000019
の読み出しに用いられる。そして、並列的に第１の実施形態を使用することにより、次に誘起／消光およびＦＲＥＴを（上述の第２および第３の実施形態により）反映させ、より正確、高精度、かつ、ハイスループット化される。
【００４６】
ハイスループットな分析に関し、三重項状態のモニタリングを並列化可能であることは、非常に興味深いことである。ハイスループットな用途目的においては、大規模な並列的スケール上で、ＦＣＳによる三重項状態モニタリングを実行することは、非常に難しくかつ費用がかかる。それは、対応するレーザの焦点に関して個別的にかつ正確に位置あわせされたディテクタ（検出器）のマトリックスを構成し、焦点からの蛍光を記録する必要がある。
【００４７】
対照的に、レーザの焦点のマトリックスあるいは別種のパターン化されたかもしくは均一な広範囲励起を使用し、および、１つの（およそ１０００×１０００ドットで検出する）ＣＣＤカメラによるマトリックスの検出することにより、第１の実施形態は、ＨＴＳに対しても、高度に並列化された方法で、空間的な光フィルタリング／セクショニング（切片化）と組み合わせることができる検出および／もしくは励起、を実現することができる。検出サイドにおける空間的光フィルタリング／セクショニングの目的は、蛍光検出を空間的に、励起の状態がよく定まった蛍光検出領域／容量に限定することである。これは、像面内においてピンホール・アレイを有する手段、あるいは、像面内において空間的および／または時間的に変化可能な、ニプコー・ディスク（Nipkow disc）といったマスクで実現可能である。ただし、これは、それらに限定されない。フィルタリング／セクショニングは、励起サイドにおいて実現することもできる。その場合、二光子励起、内部全反射によるエバネセント場励起、または、空間的におよび／もしくは時間的に励起場をパターニング／マスキングする各種方法を使用すればよい。励起領域は、その、パルス持続時間ｔｅｘｃ、励起パルス間の暗時間間隔ｔｄａｒｋ、および、パルスの励起強度Ｉｅｘｃについて、時空間におけるパルスの偏光極性および形状を用いて、検出の空間的規模全域にわたって変化させることもできる。各励起領域アレイは、消光剤の濃度の違い、プリズム、グレーティング、もしくは、ミラーによる蛍光発光のスペクトル分離、または、サンプルのアレイ、に基づいて、アレイの付加的ヒエラルキーにおける位置を構成する。
【００４８】
このようにして、本方法は、高い正確性および精度を、高い鋭敏性、−ＣＣＤカメラによる検出量子収量はアバランシェ・フォトダイオードと同程度に高い−、およびハイスループットとを、結びつけている。分子および単一分子レベルで生じる分子間相互作用を、高濃度（ミリＭ−Ｍ）まで、モニタリングすることができる。ｔｅｘｃ、ｔｄａｒｋ、Ｉｅｘｃ、および、その他のパルス特性がサンプル内の空間スケールにわたって変化している励起領域アレイに代えて、相異なるパルス特性を備えた一連のパルス列を適用することにより、それに対応するパルス特性の変化を、１つの同一のサンプル位置において実現してもよい。
【００４９】
本方法を、一重項−三重項遷移以外の、相異なる状態に関するポピュレーションの初期条件（三重項の例におけるＳ１＋Ｓ０＝１に対応。）が、励起パルスの開始の時点において定まった光誘起性の過程に拡張することができる。ＦＣＳにより、我々は別種の光誘起性の過程を分析する。そのような過程は、三重項状態遷移に類似の緩和の動力学を示し、同様の類の初期条件（τ＝０において、光誘起性の状態のポピュレーションは、ゼロ、もしくは、ｔｅｘｃ＝０。）を課す。シアニン型（cyanine-type）のフルオロフォアの光誘起の電子移動およびシス−トランス異性化は、、そのような過程に属する。
【００５０】
光誘起性の電子移動は、ある種のヌクレオチド、特に、ｄＧＴＰと相互作用する、複数の染料について、ＦＣＳによって観察されている。三重項状態の緩和の過程に先立って、突出した緩和過程が見られる。手法Ｉを、三重項状態の動力学について、同様のやり方で適用することができる。相異なるヌクレオチド間での激しいばらつきや、相互作用の強い距離依存性によって、フルオロフォアでラベリングされたプライマーの、関心のある標的ＤＮＡに対する配列特異的なハイブリダイゼーションを、ＤＮＡアレイのように追跡調査することが可能である。
【００５１】
三重項状態のモニタリングに関し、手法Ｉを異性化特性分析について適用可能である。シアニン・フルオロフォアにおけるシス−トランス異性化は、フルオロフォアの２つの頭部基と繋がった炭化水素鎖の、光誘起性のねじれ（ツイスティング）である。このねじれは、立体障害が無く低粘性である場合に高速である。異性化の動力学もまた、分子力あるいはフルオロフォアに作用する歪みによる影響を受けることがある。このように、分子間相互作用は、これらのパラメータに影響を及ぼしやすく、また、異性化の動力学における変化に反映され、また、異性化の動力学における変化を介してモニタリングすることができる。
【００５２】
マイクロ・アレイの代わりに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（fluorescence-activated cell sorting））と組み合わせたビーズ・ベースのアッセイ（bead-based assay）が開発され、多重化分子アッセイに用いられている。第２の実施形態と組み合わせた第１の実施形態は、そのようなアッセイに用いることができる。
【００５３】
多重化ビーズ・ベース・アッセイ・システムにおいては、捕捉分子は、一般に直径５−６マイクロｍの、特定の符合（特定コード）が付されたポリスチレン（polystyrene）ミクロスフェアと結びつく。個々のミクロスフェアは、相異なるドーピング濃度において、明確に区別されるフルオロフォア混合物で色分けされ（カラー・コード化）、相異なる発光スペクトルを備える。
【００５４】
分析分子（analyte molecules）の各捕捉分子との結合は、第２のエピトープとの蛍光抗体結合を伴い、付加的な別のスペクトルにおける発光が生じ、サンドイッチ・アッセイにおいてモニタリング可能である（図１２参照。）。個々のビーズの信号強度は、ＦＡＣＳ装置により測定される。ビーズの蛍光コード（符合）（所謂、蛍光バー・コード）から、分析物がいずれの分子と結合したのかを特定することができ（図１２Ｂ参照。）、第２の抗体の蛍光から、結合の程度を定量化することができる（図１２Ｃ参照。）図１２Ｂにおいては、ビーズは、４種の明確に相異なる濃度で２つのフルオロフォアとともに導入され、１６の相異なる蛍光コードを示している。カラー・コード化ミクロスフェアを用いれば、１００種までの相異なるアッセイ・タイプを同時的に実行することができる（ＬａｂＭＡＰシステム（LabMAP system）、ｗｗｗ．ｌｕｍｉｎｅｘｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
【００５５】
同時的に使用可能な相異なるコードを備えたビーズの数に関する制限は、ビーズに導入された相異なるフルオロフォア間における発光スペクトルのオーバーラップにより定まる（図１２においては、２つの相異なるフルオロフォアのみである。）。
【００５６】
第１の実施形態を用い、それらがＦＡＣＳ装置内を流れる際に少なくとも２つの相異なるモード（様式）でビーズを励起し、パルス列の特性パラメータ（ｔｅｘｃ、ｔｄａｒｋ、Ｉｅｘｃ、偏光極性、および、時空間におけるパルス形状）の少なくとも１つが当該様式間において相異なる場合、三重項のポピュレーションの量を、当該相異なる様式において生じた傾向輝度の差違より求めることができる（図９参照。）。ビーズ内の所与のフルオロフォアに関し、ｋＩＳＣまたはｋＴを増進させる消光剤を備えたビーズをドーピングすることにより、三重項状態のポピュレーションを操作することができる（図３参照。）ビーズを、複数の明確に異なるレベルの消光剤濃度でドーピングすることで、励起の様式がある様式から別の様式へ移行する際、蛍光に違いが生じる。このように、ビーズ内の消光剤濃度は、ＦＡＣＳによる蛍光の読み出しを用いて、ビーズを特徴付け、ビーズを特定できる、付加的なパラメータ／ディメンジョン（特質）を提供することができる。このような方法論に沿ってうまく手法Ｉを実現すれば、同時的アッセイの数を、（１０進数の）一桁だけ増大させることが可能となる。
【００５７】
後者の蛍光ビーズ・ベースの手法に代えて、粒子（例えば、ポリスチレン・ビーズ、セル（細胞）、脂質小胞）の表面上にラベリングを施すことで蛍光バー・コードの手法を実現することもできる。（例えば、結合事象といった）過程に起因して、異なるフルオロフォアでラベリングが施された、１つもしくは複数の分子に対する作用や、それら分子間の相互作用に対する影響が生じ、１つもしくは複数の表面上の蛍光分子の三重項状態（もしくは、その他の光誘起性の遷移状態）の特性における変化が生じることがある。後者の蛍光ビーズ・ベースの手法と同様の励起手順を用いれば、ビーズがＦＡＣＳ装置内を流れる際に少なくとも２つの相異なる様式においてビーズが励起され、当該様式間において少なくとも１つのパルスの特性パラメータ（ｔｅｘｃ、ｔｄａｒｋ、Ｉｅｘｃ、偏光極性、および、時空間におけるパルス形状）が異なるならば、三重項状態（もしくは、その他の光誘起性の遷移状態）の特性（ポピュレーションおよび緩和時間）を、当該相異なる様式において生じた蛍光輝度における差違から求めることができる。この手法を用いれば、調査される粒子の同定性（同一性）を維持しつつ、同時に、蛍光でマークされた、１つもしくは複数の分子に影響を及ぼす、相互作用、または、それらの内部相互作用、を検出することができる。同一の励起手順を並列的方法論で用い、例えば、マイクロ・ウェル・プレートのウェルに存在する、ビーズのマトリックスを同時的に励起させることができる。
【００５８】
本発明の実施形態の例を概略化したデータを図１４に示す。上で使用したＦＣＳ機器の構成と類似した、共焦点の、落射照明ＦＣＳ機器（図１４Ａ）において（ヴィデングレンら、ジェイ・フィス・ケム（１９９５）、９９、頁１３３６８（Widengren et al, J Phys. Chem. (1995), 99, P. 13368））、付加的音響光学モジュレータ（変調器）を用いてレーザ励起の強度を時間的に変調し、矩形パルス列を用いて、異なる量のヨウ化カリウム（ＫＩ）を含んだ水溶性溶液中のローダミン６Ｇフルオロフォア分子を励起した。パルス列に関し、ｔｅｃｘ、ｔｄａｒｋ、および、Ｉｅｘｃを、１つのパルス列と、その次のパルス列とで変化させた。各パルス列に関し、励起期間中の共焦点検出容量からの平均蛍光輝度を検出して算出し、同一の励起強度、
【数１８】
2008542748.tif 000020
、を有する連続的励起下での同一の容量からの平均輝度で正規化した。図１４Ｂにおいて、４ミリＭのＫＩを含んだ溶液中のＲｈ６Ｇについて、（励起パルス内において）１２０マイクロＷのレーザ励起に曝した場合における、ｔｅｘｃおよび周期時間（ｔｅｘｃ＋ｔｄａｒｋ）に対する
【数１９】
2008542748.tif 000021
の変動を示す。Ｒｈ６Ｇに対する三状態モデル（図３）に基づき、かつ、検出容量内における励起強度がガウス−ローレンツ分布をすると仮定して計算された
【数２０】
2008542748.tif 000022
の計算値で、ｋＩＳＣおよびｋＴを変化させ、
【数２１】
2008542748.tif 000023
の実験値をフィット（近似）させる。この、非線形最小二乗化法をベースにしたフィティング（リーフェンベルク・マルカート法（Levenberg Marquart））において、導出したパラメータ値（ｋＩＳＣ＝１１×１０６ｓ−１、ｋＴ＝０．６×１０６ｓ−１）は、ＦＣＳ（同一のセット・アップで、ＣＷ励起。）で抽出したものとよく一致する。この変調的手法で求めたｋＩＳＣパラメータは、ＫＩ濃度の増大ともに、線形的に増大することが見出された。このように、記録した平均蛍光輝度から、変調した励起を用い、かつ、検出を時間分解することなしに、信頼性のある三重項状態のパラメータを抽出することができた。本手順は、原則的には、本例において用いたアバランシェ・ダイオードによる検出を、例えば、ＣＣＤカメラに置き換えることで、並列的なスケール上で実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＦＣＳにおける検出容量の概略図である。これは、蛍光分子を励起するレーザ光線の焦点の大きさ、および、顕微鏡の収集効率関数より定まる。
【図２】溶液中蛍光分子の並進拡散を示すＦＣＳ曲線の記録の特性図である。相関曲線の振幅は、検出容量から検出される蛍光輝度の相対的揺らぎに対応し、１／Ｎに比例する。ここで、Ｎは、検出容量内に存在する平均蛍光分子数である。ＦＣＳ曲線の減衰時間、τＤ、は、蛍光分子の検出容量通過時間を反映する。
【図３】一重項−三重項遷移に関する、従来の三状態モデルである。Ｓ０およびＳ１はそれぞれ、基底および励起一重項状態を指す。Ｔは、最も低い三重項状態である。ｋ２１は、Ｓ１からＳ０への非活性化（失活）を意味し、ｋＩＳＣは、Ｓ１からＴへの項間交差の速さ（率（rate））を意味し、ｋＴは、Ｓ０への三重項状態非活性化の速さ（率）を意味し、ｋｅｘｃは、励起率であり、与えられる励起の強度Ｉｅｘｃに比例する。
【図４】並進拡散および一重項−三重項遷移が進行中の、水中のＲｈ６Ｇフルオロフォア分子の相関曲線である。２つの緩和過程が見られる。それらは、並進拡散による過程（緩和時間τＤ）、および、一重項−三重項遷移による過程（緩和時間τＴ）である。平均三重項状態ポピュレーションおよび三重項緩和時間は、式２および式３より与えられ、励起パワーの増大とともに増加する。Ｉ：４８．４マイクロＷ、ＩＩ：３５０マイクロＷ、ＩＩＩ：２．５５ミリＷ。
【図５】構造（コンフォメーション）の状態に関する測度としての蛍光消光を示す図である。溶剤によって消光剤からシールドされたフルオロフォアを示す図である。ここでは、蛍光性を示す。
【図６】構造（コンフォメーション）の状態に関する測度としての蛍光消光を示す図である。シールドされていないフルオロフォアを示す図である。ここでは、蛍光は（消光剤分子がフルオロフォアに到達するため）消光される。
【図７】蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ドナー（Ｄ）からアクセプタ（Ａ）フルオロフォアへの、強くフルオロフォア間距離に依存した励起エネルギーの移動、を示す図である。σＤ＝ドナーの励起断面積、Ｉｅｘｃ＝ドナーの励起強度、ｋＦＲＥＴ＝ＦＲＥＴによるアクセプタの励起率、ｋＤ１０＝ドナーの内因性の蛍光減衰率、ｋＡ１０＝アクセプタの内因性の蛍光減衰率。
【図８】蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ドナー（Ｄ）からアクセプタ（Ａ）フルオロフォアへの、強くフルオロフォア間距離に依存した励起エネルギーの移動、を示す図である。グレーのシェーディングが付された領域は、ドナーの放出とアクセプタの吸収との、スペクトルのオーバーラップ領域である。
【図９】励起パルス持続時間の、三重項状態のポピュレーションへの影響を示す図である。連続的励起Ｉｅｘｃを受けると、確率
【数２２】
2008542748.tif 000024
で、三重項状態を占有（populate）し、また、一重項−三重項緩和時間τＴ（式２および式３）を有する蛍光分子について考察している。
Ａ．励起パルス持続時間ｔｅｘｃは、三重項緩和時間τＴ（左）よりもずっと短い。フルオロフォアが励起強度に曝露される時間が余りに短いため、十分に三重項状態に遷移しない（中央）。励起期間における平均三重項状態ポピュレーション（
【数２３】
2008542748.tif 000025
）は小さく、励起パルスにおける平均蛍光強度（
【数２４】
2008542748.tif 000026
）は、相対的に、三重項状態の累積による影響を受けない（右）。
Ｂ．ｔｅｘｃは、τＴと同程度である。結果、励起パルスの際の三重項の累積は増大する（左および中央）。
【数２５】
2008542748.tif 000027
が低下し、
【数２６】
2008542748.tif 000028
が増大する（右）。
Ｃ．励起パルス持続時間は、τＴ（左）よりもずっと長い。三重項状態にある蛍光分子の割合は、連続的励起において見られるレベルに達し、
【数２７】
2008542748.tif 000029
が増大するにつれ、
【数２８】
2008542748.tif 000030
に近づく。
【数２９】
2008542748.tif 000031
は、顕著に低下する（右）。
よって、（三重項状態にはないフルオロフォアの割合を反映し、
【数３０】
2008542748.tif 000032
に比例する）
【数３１】
2008542748.tif 000033
を、相異なるパルス持続時間ｔｅｘｃ間で比較することで、励起パルス
【数３２】
2008542748.tif 000034
の間の三重項状態のポピュレーションを求めることができる。三重項状態緩和時間は、ｔｅｘｃより、ｔｅｘｃが短くなるほどに
【数３３】
2008542748.tif 000035
が増大することを用いて、求めることができる。隣接するパルスの間の期間、ｔｄａｒｋは、一般に、十分に長く、蛍光分子の三重項状態のポピュレーションの確率は、次の励起パルスの開始時点において無視することができる。しかしながら、ｔｄａｒｋを変化させて異なるｔｄａｒｋについての
【数３４】
2008542748.tif 000036
を比較し、パルス間の三重項状態緩和の量を反映させ、三重項状態に関する情報（三重項緩和時間、および、
【数３５】
2008542748.tif 000037
）を得ることもできる。
【図１０】異なる消光を示す図である。左：ＦＣＳより求めた三重項状態のポピュレーション。Ａ：消光剤なし、Ｂ：染料１（Ｄｙｅ１）＋消光剤、Ｃ：染料２（Ｄｙｅ２）＋消光剤。消光剤が無い場合において、２つの異なる染料は、飽和励起強度において、同様の三重項状態のポピュレーションを示す（Ａ）。ｋＩＳＣが最も消光剤の影響を受けるか、あるいは、ｋＴが最も消光剤の影響を受けるか、により、染料の三重項状態のポピュレーションは、増大する（Ｂ）、または、減少する（Ｃ）。
【図１１】本発明にかかる第４の実施形態において実現可能な形態を示す図である。左：励起のマトリックス。右：試薬および消光剤濃度のバリエーションを含むサンプルのアレイ。励起領域のマトリックスは、サンプルの領域に適用される。サンプルの領域は、マイクロ・ウェル・アレイ・プレート内のマイクロ・ウェル、あるいは、固体支持のＤＮＡもしくは蛋白質のスポットのアレイ内のスポットでよい。広範囲励起が用いられる。これは、スポットのアレイの形態を有することができる。偏向のサイクルにおいてスピードが変化する、励起場の周期的な偏向により、あるいは、異なる位置において時間的に変調を変化させる、別の手段を用いて、空間的バリエーションを備えた周期的励起ｔｅｘｃを導入する。Ｉｅｘｃの勾配は、空間的勾配を備えた減衰フィルタにより導入可能である。半透過ミラー、空間的光変調器（空間的光モジュレータ）、音響光学偏向器（デフレクタ）（acousto-optic defectors）、または、グレーティングその他の回折光学素子を用いてオリジナルの励起光線を分割することで、複数の励起アレイを作ることができる。
【図１２】蛍光符号化微粒子（マイクロ・ビーズ）アッセイ（fluorescence-coded microbead assays）の原理を示す図である。Ａ：ビーズおよび抗体の主要な配置を示す。ここでは、１：ポリマー・ビーズ、２：検体、３：捕捉抗体、４：ビオチン化検出抗体（biotinylated detection antibody）、５：ストレプトアビジンと結合したフルオロフォア（fluorophore coupled to streptavidin）である。Ｂ：２つの相異なる波長範囲（ＦＬ１およびＦＬ２）における蛍光輝度についてソートした、ビーズのヒストグラムの例である。ＦＬ１およびＦＬ２の絶対的レベルより、異なる抗体コーティングを有するビーズを識別可能である（Ｂ右側）。
【図１３】異なる時間領域に含まれる複数のパルス列ヒエラルキーを備えた実施の形態の例図である。照射場は時間的に変調され、あるパルス特性を備えたパルス列（ライン１）が生成される。ライン１のパルス列には、さらに高い周波数の変調を重ね合わせることができる。パルス列１のパルスは、特定のパルス特性を備えた付加的パルス列（ライン２）を含むことができる。さらに高周波な変調を導入すれば、パルス列の第３のヒエラルキーを形成することができ、以降も同様である。各パルス列ヒエラルキーに含まれるパルスのパルス特性とは別に、あるパルス列ヒエラルキーに含まれるパルスを、別の励起場あるいは照射場にかかる同一のパルス列ヒエラルキーに含まれるパルスに対して遅延させることができる。
【図１４Ａ】本発明の実施の例の簡単化された図である。本例においては、ヨウ化カリウムを含む水溶液中のローダミン６Ｇ分子からの平均蛍光輝度を、典型的なＦＣＳ機器（図１４Ａ）の落射照明共焦点検出容量要素（図１）から記録する。レーザ光線による励起は、矩形励起パルス列を生成する音響光学変調器（ＡＯＭ（acousto-optic modulator））により、時間的に変調される。
【図１４Ｂ】励起パルスにおける、変調された励起の下での平均蛍光輝度の図である。ここでは、持続時間は、ｔｅｘｃ、であり、周期時間は、ｔｅｘｃ＋ｔｄａｒｋ、であり連続的励起の下での蛍光輝度で正規化されている。ｔｅｘｃおよび周期時間に関する蛍光の変動から三重項状態パラメータを抽出可能であり、これは、同一の機器におけるＦＣＳによる時間分解検出および相関分析から抽出したものと一致する。
【符号の説明】
【００６０】
１  ・・・  ポリマー・ビーズ
２  ・・・  検体
３  ・・・  捕捉抗体
４  ・・・  ビオチン化検出抗体
５  ・・・  ストレプトアビジンと結合したフルオロフォア
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008542748.tif 000044
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2008542748.tif 000049
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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2008542748.tif 000054
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