(57)【要約】  アレルギー性炎症状態の治療における使用のためのリン脂質及び製薬組成物、並びにアレルギー性炎症状態の治療方法。前記リン脂質は、特にプマクタントとして既知のリン脂質の混合物である。
2008542248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルギー性炎症状態の治療における使用のための、ジアシル置換ホスファチジル基を含むリン脂質。
【請求項２】
式（Ｉ）：
【化１】
2008542248.tif 000006
[式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々個別に１３乃至２１の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表し、好ましくはＲ１及びＲ２は、各々個別に１５乃至１９の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表し；
Ｒ３は、水素原子またはコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、もしくはイノシトール基を表し、好ましくはＲ３はコリンまたはグリセロールを表す]
に示される、請求項１に記載のリン脂質。
【請求項３】
式（II）：
【化２】
2008542248.tif 000007
[式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、個別に請求項２に定義される通りである]
に示される、請求項２に記載のリン脂質。
【請求項４】
Ｒ３がグリセロールを表し、且つＲ１及びＲ２が各々個別に下記：
【化３】
2008542248.tif 000008
を表す、請求項２または３に記載のリン脂質。
【請求項５】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及び／またはホスファチジン酸である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項６】
ジパルミトイルホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールとの、１：９乃至９：１、好ましくは６：４乃至８：２、更に好ましくは約７：３の重量比での混合物である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項７】
合成リン脂質である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項８】
炎症１平方センチメートル当たり１、好ましくは１０、更に好ましくは５０乃至１０００、好ましくは上限８００、更に好ましくは上限３００μｇの割合で使用される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項９】
乾燥粉末の形態である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項１０】
前記治療がリンパ球分泌の阻害を含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載のリン脂質。
【請求項１１】
ジアシル置換ホスファチジル基を含むリン脂質を、製薬品として許容される賦形剤と共に含む、アレルギー性炎症状態の治療における使用のための製薬組成物。
【請求項１２】
前記リン脂質が請求項２乃至１０のいずれか一項に記載のものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記治療がリンパ球分泌の阻害を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記賦形剤が、界面活性剤、タンパク質、及び／または液体担体である、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のリン脂質、または請求項１１乃至１４のいずれか一項に記載の製薬組成物の、アレルギー性炎症状態の治療における使用のための薬剤の製造における使用。
【請求項１６】
前記治療がリンパ球分泌の阻害を含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
アレルギー性炎症状態の治療方法であって、ジアシル置換ホスファチジル基を含むリン脂質の治療上の有効量を、こうした治療を要するヒトもしくは動物の患者に適用する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記リン脂質が、請求項２乃至１０のいずれか一項に記載のものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リン脂質が、請求項１１乃至１４のいずれか一項に記載の製薬組成物の形態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記リン脂質が、リンパ球分泌を阻害する、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性炎症状態の治療における使用のためのリン脂質及び製薬組成物、並びにアレルギー性炎症状態の治療方法を提供する。この組成物は、リン脂質、特にプマクタント（pumactant）として知られるリン脂質の混合物を含む。
【背景技術】
【０００２】
広範な状態に関連する炎症の治療を改善する方法の探求が、一般的に求められている。
【０００３】
本発明によれば、アレルギー性炎症状態の治療における使用のための、ジアセチル置換ホスファチジル基を含むリン脂質が提供される。
【特許文献１】米国特許６１３３２４９
【非特許文献１】Baer&Bachrea, Can. J. of Biochem. Physiol 1959, 37, page 953
【非特許文献２】Comfurions et al, Biochem. Biophys Acta 1977, 488, pages 36 to 42
【非特許文献３】Dawson, Biochem J. 1967, 102, pages 205 to 210
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
リン脂質は、体内、特に肺の表面などの界面で天然に産生され、ここで刺激物が肺内のレセプターを刺激することを防ぐ、天然の保護バリアを提供する。喘息患者においてはこの天然のバリアが不足することが提唱されている。プマクタント等のリン脂質が、天然のバリアを回復させ、よって刺激物に暴露されるレセプターの数を低減することに基づいて喘息の治療向けに開示されている。しかしながら、プマクタント等のリン脂質が、これを適用した組織に影響を及ぼすことは何ら示唆されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、ここに、プマクタント等のリン脂質が、その適用された組織と確かに相互作用し、抗炎症反応を阻害することが判明した。この相互作用の性質は知られていないが、その結果は本願実施例１に明白に見ることができる。この実施例から、リン脂質がＴ細胞増殖、特にＴ細胞によるリンパ球分泌を阻害することが見て取れる。実施例１中のデータは、オボアルブミンペプチドで刺激されたＴ細胞におけるＴ細胞増殖の阻害を示す。オボアルブミンは、アレルギー性結膜炎及びアレルギー性気道疾患等のアレルギー性状態、関節炎等の自己免疫状態、並びに肺炎症などの炎症を模倣するために通常使用される抗原である。したがって、こうした状態の治療にリン脂質が有用であることは明かである。
【０００６】
本発明によれば、ジアシル置換ホスファチジル基を含むリン脂質を、製薬品として許容される賦形剤もしくは担体と共に含む、アレルギー性炎症状態の治療における使用のための製薬組成物が更に提供される。
【０００７】
本発明によれば、ジアシル置換ホスファチジル基を含むリン脂質、あるいはアレルギー性炎症状態の治療における使用のための薬剤の製造における本発明による製薬組成物の使用もまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
好ましくは、本発明によって使用されるリン脂質は、式（Ｉ）：
【化１】
2008542248.tif 000003
[式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々個別に１３乃至２１の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表し；
Ｒ３は、水素原子またはコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、もしくはイノシトール基を表し、好ましくはＲ３はコリンまたはグリセロールを表す]
に示されるリン脂質である。
【０００９】
更に好ましくは、本発明において使用されるリン脂質は、式（II）：
【化２】
2008542248.tif 000004
[式中、
Ｒ１及びＲ２は、各々個別に１３乃至２１の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表し、；
Ｒ３は、水素原子またはコリン、グリセロール、エタノールアミン、セリン、もしくはイノシトール基を表し、好ましくはＲ３はコリンまたはグリセロールを表す]
に示されるリン脂質である。
【００１０】
本発明における使用のためのリン脂質は、2つのアシル基によって置換されたホスファチジル基を有する。好ましくは、本発明における使用のためのリン脂質は、2つのアシル基によって置換されたホスファチジル基を含む。アシル基は、各々が一般的に１４乃至２２の炭素原子を含み（Ｒ１及びＲ２が、各々個別に１３乃至２１の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表し）、好ましくは１６乃至２０の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアシル基を含んで（Ｒ１及びＲ２は、各々個別に１５乃至１９の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基を表して）良い。
好ましくは、前記リン脂質は、アシル基として、飽和のパルミトイル基Ｃ１６：０（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１５の炭素原子を有する飽和アルキル基を表すもの）及びステアロイル基Ｃ１８：０（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１７の炭素原子を有する飽和アルキル基を表すもの）、及び／または不飽和のオレオイル基Ｃ１８：１（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１７の炭素原子を有するモノ不飽和アルキル基を表すもの）及びＣ１８：２（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１７の炭素原子を有する二不飽和アルキル基を表すもの）を含んで良い。前記リン脂質は、とりわけ２つ同一の飽和もしくは不飽和のアシル基を含み（Ｒ１及びＲ２が好ましくは同一のアルキル基を表して同一であり）、特にジパルミトイル及びジステアロイル、またはこうした基が主であるリン脂質の混合物、特にジパルミトイルが主要なジアセチル成分となる混合物を含む。
【００１１】
リン脂質は、任意に動物由来であるかまたは合成リン脂質であり、これは好ましくは合成リン脂質である。
【００１２】
動物由来のリン脂質は、ほ乳類の肺、例えばブタの肺またはウシの肺の細分化または洗浄による通常の方法で得られる。使用しうる動物由来のリン脂質の例には、細分化したブタの肺から製造され、９９％のリン脂質及び１％の界面活性タンパク質からなるCurosurf(Chiesi Farmaceutici)；ウシの肺洗浄液から得られる化合物であり、９０％のリン脂質、約１％のタンパク質、３％のコレステロール、０．５％の遊離脂肪酸、及びトリグリセリドを含む別の成分を含むAlveofact（Dr. Karl Thomae, Ltd., Germany）；細分化したウシの肺の脂質抽出により調製され、約８４％のリン脂質、１％のタンパク質、及び６％の遊離脂肪酸を含むSurvanta(Abbott, Ltd., Germany)；ウシの肺洗浄液により製造されるBLES（BLES Biochemicals, Canada）；または仔ウシの肺洗浄により製造され、２６ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリン（ＰＣ）、２６ｍｇ／ｍｌのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、０．６５ｍｇ／ｍｌのタンパク質、及び０．２６ｍｇ／ｍｌの疎水性ペプチドである、３５ｍｇ／ｍｌのリン脂質を含み、カーファクタント（calfactant）としても知られるInfasurf(Forest Labs)が含まれる。
【００１３】
合成リン脂質は、好ましくはジアシルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、例えばＤＰＰＣ、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、またはジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ＰＣ、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及び／またはホスファチジン酸である。
【００１４】
リン脂質は、好ましくはジアシルホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールとの混合物である。ホスファチジルグリセロールは、有利にはジアシルホスファチジルグリセロールである。ホスファチジルグリセロールのアシル基は、同一であるかまたは相違して良く、有利には各々が１４乃至２２の炭素原子を有して良い脂肪酸アシル基である。実際には、ホスファチジルグリセロール成分は、様々なアシル基を含むホスファチジルグリセロールの混合物であってよい。ホスファチジルグリセロールの脂肪酸アシル基の少なくとも一部分が、不飽和脂肪酸残基、例えばモノまたはジ-不飽和Ｃ１８（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１７の炭素原子を有するモノもしくはジ-不飽和アルキル基を表す）またはＣ２０脂肪酸残基（Ｒ１及びＲ２が好ましくは各々個別に１９の炭素原子を有するモノもしくはジ-不飽和アルキル基を表す）であることが好ましい。
【００１５】
ホスファチジルグリセロール成分中の好ましいアシル置換基は、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル、及びアラキドノイルである。然るに、式（Ｉ）または（II）の化合物中で、Ｒ３がグリセロールを表す場合、Ｒ１及びＲ２は、各々個別に：
【化３】
2008542248.tif 000005
を表す。リン脂質は、好ましくはジパルミトイルホスファチジルコリン及びホスファチジルグリセロールを含む。
【００１６】
リン脂質は、好ましくはＤＰＰＣとＰＧとの混合物である。いっそう好ましくは、リン脂質はＤＰＰＣとＰＧとの、１：９乃至９：１、好ましくは６：４乃至８：２、更に好ましくは約７：３の重量比での混合物である。ＤＰＰＣは、Baer&Bachrea, Can. J. of Biochem. Physiol 1959, 37, page 953の方法を利用してグリセリルホスホリルコリンのアシル化によって合成的に調製することができ、またSigma (London)Ltd.より市販品を入手可能である。ＰＧはComfurions et al, Biochem. Biophys Acta 1977, 488, pages 36 to 42;及びDawson, Biochem J. 1967, 102, pages 205 to 210の方法により卵ホスファチジルコリンから、あるいは別のホスファチジルコリン、例えば大豆レシチンから調製して良い。
【００１７】
通常の溶媒、例えばクロロホルムからＤＰＰＣと共沈させた場合、ＰＧはＤＰＰＣと共に微細な粉末を形成する。好ましくはリン脂質は、ＤＰＰＣと卵ホスファチジルコリンから誘導されるホスファチジルグリセロールとの混合物であって、これはＣ１６、Ｃ１８（飽和及び不飽和）及びＣ２０（不飽和）アシル基の混合物によって置換されたホスファチジル化合物をもたらす。こうした化合物は、式（Ｉ）または（II）（ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に１５の炭素原子を有するアルキル基、１７の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和のアルキル基、及び１９の炭素原子を有する不飽和アルキル基を表す）の化合物である。
【００１８】
市販の合成リン脂質製品の例には、２６モル部のＤＰＰＣ、８モル部のＰＯＰＧ、５モル部のＰＡ、及び１部のＫＬ−４を含むルシナクタント（lucinactant）としても既知であるSurfaxin（Discovery Labs）；組替ＳＰ−Ｃ、ＤＰＰＣ、ＰＧ、及びＰＡを含むラスパルチド（lusupultide）としても既知である肺サーファクタント因子ＬＳＦ（Altana）；ＤＰＰＣ（〜８４％）、セチルアルコール、及びチロキサポールを含むExosurf(GSK, Germany)；またはＤＰＰＣ及びＰＧの７：３の重量比での混合物を含むプマクタント（Britannia Pharmaceuticals）が含まれる。
【００１９】
リン脂質は、好ましくは体温（治療しようとするヒトまたは動物の身体の温度）とほぼ同等かまたはより低温の融点を有する、リン脂質またはリン脂質混合物である。こうしたリン脂質混合物は、好ましくは体温とほぼ同等かまたはより低温の融点を有する拡散性リン脂質、例えばＰＧ、ＰＥ、ＰＳ、またはＰＩを含む。
【００２０】
リン脂質は、炎症領域１平方センチメートルにつき１μg以上、好ましくは１０μg以上、更に好ましくは５０μg以上であって、１０００μgまで、好ましくは８００μg、更に好ましくは３００μgまでの割合で適用されることが好ましい。
【００２１】
リン脂質は、好ましくは乾燥粉末の形態で適用される。更に一般的には、粉末状リン脂質は０．５乃至１００μm、更に好適には０．５乃至２０μm、好ましくは０．５乃至１０μmの範囲の粒径を有して良い。リン脂質は、好ましくは表面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）である。
【００２２】
本発明によるリン脂質または製薬組成物は、好ましくは炎症状態の治療における使用向けである。本発明により治療しようとする好適な炎症性状態は、炎症創傷、自己免疫状態(例えば関節炎)、アレルギー状態（例えば季節性罹患喘息、慢性罹患喘息、鼻炎、花粉症）及び／またはアレルギー性反応（例えば虫刺され）である。
【００２３】
本発明により治療しようとする炎症性創傷は、好ましくは外科手術によって引き起こされたものでないヒトまたは動物の身体表面上の開口または表皮剥離である。治療しようとするヒトまたは動物の身体表面は、任意に内部または外部表面である。
【００２４】
本発明における炎症の治療は、好ましくはリンパ球分泌及び／またはＴ細胞増殖を抑制することを含む。
【００２５】
本発明による製薬組成物は、製薬品として許容される賦形剤を含む。あらゆる適合性の賦形剤を使用して良い。賦形剤は、好ましくは水を含まない。担体または希釈剤が液体である場合には、これは非水性であることが好ましい。賦形剤は、好ましくは界面活性剤を含む。界面活性剤は、体温より高い融点を有するリン脂質を当該組成物中で使用することを可能にすることから有用である。更に好ましくは、前記界面活性剤は製薬品として許容される界面活性剤または疎水性タンパク質を含む。こうした作用剤の例には、ＫＬ−４（２１アミノ酸合成ペプチド）；チロキサポール（非イオン性界面活性剤）；セチルアルコール（またはヘキサデカノール）；またはコレステリルパルミテートが含まれる。適切な別の賦形剤は、タンパク質、特にアポタンパク質Ｂ等の吸収を促進するタンパク質である。
【００２６】
該組成物が液体形態で提供される場合には、賦形剤は好ましくは担体液体を含み、前記液体中にリン酸が分散または溶解している。担体液体は、典型的には、実質的に不揮発性であるか、あるいは体温にて僅かに揮発性であるのみのものである。適当な担体には、生理学的に許容されるグリコール、特にプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び／またはグリセロールが含まれる。
【００２７】
前記組成物は、任意に液体、半液体、またはペースト形態で準備して良い。ペーストは、単に適切な担体中にリン脂質を分散させることによって、あるいは適宜加熱した担体中にリン脂質を溶解させ、好ましくはペーストを形成するように負荷をかけつつ、冷却に伴いリン脂質を沈澱させることによって調製することができる。室温にてリン脂質を分散させてペーストとしうることから、担体としてはプロピレングリコールが特に有効であるが、体温では可動溶液が生成する。さらにポリエチレングリコールも、室温ではワックス状固体、体温では液体、たとえばＰＥＧ６００として準備して良い。プロピレングリコール中のリン脂質の様々な分散物が米国特許６１３３２４９に開示されており、その全内容をここに参照のために取り込むこととする。
【００２８】
本発明によれば、炎症の治療方法が更に提供されるが、この方法は、こうした治療を必要とするヒトまたは動物に、治療上の有効量のリン脂質を適用する工程を含む。前記リン脂質は、好ましくは本発明による製薬組成物の形態をとる。
【００２９】
本発明を、特許請求の範囲を制限することを企図しない、以下の図面を参照しつつ詳説する。
図1は、2時間前に様々な量のプマクタントで予備処理を施したＴ細胞の制御に対する阻害（％）を比較するグラフである。
図2は、24時間D-9  DPPC（重水素化PtdChoと呼称）でインキュベートした後のB3Zホスファチジルコリン（PtdChoと呼称）のESI-MS マススペクトグラフプロフィールである。
【００３０】
特許請求の範囲を制限することを企図しない、以下の実施例を参照しつつ、本発明をここに詳説する。
【００３１】
実施例における実験は、プマクタントとリンパ球細胞系列の免疫細胞との間の相互作用の機構を評価するためにデザインされた。これは、細胞免疫反応の50％超の阻害を引き起こす濃度においては、バルク細胞リン脂質組成には非常に限られた変化があるのみである。それにもかかわらず、プマクタントとのインキュベーションにより引き起こされる膜リン脂質組成の変化は、高度に再現性である。これらの結果は、プマクタントによる細胞免疫反応の阻害が全膜細胞リン脂質の組成に起こる変化によることはありえず、むしろ格段に特異的かつ標的とされる機構によって媒介されていることを示す。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
マウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞（B3Z細胞、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）NFAT調節レポーター構築に特異的なオボアルブミン）をプマクタント（70％ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、30％卵ホスファチジルグリセロール）と0-2時間に亘り0-3.6mMの濃度にてインキュベートした。その後、細胞を、インキュベートした濃度のプマクタントの存在下にてオボアルブミン誘導ペプチドで24時間に亘って刺激した。細胞活性化をLacZ発現によって測定し、β-ガラクトシダーゼ酵素の反応生成物の生成により比色分析的に観察した。
【００３３】
結果を図１に示す。B3Z細胞の活性化が、0.22mMプマクタントを用いたインキュベーションにより３９％阻害されたことがわかる。3.6mMでは阻害は６９％に達した。プマクタントに対するこの阻害反応の程度は、細胞刺激前の２時間に亘る予備インキュベーションによっては増大されなかった。この反応は、プマクタントへの阻害反応が迅速であり細胞膜リン脂質組成に予め変化を要しないことを示す。
【００３４】
（実施例２）
プマクタントとリンパ球との間の相互作用の機構を調査するために、107のB3Z細胞を3.6mMプマクタントの無菌エマルション（ここでは7%(w:w)のDPPCが安定な同位体重水素（メチル-d9）コリン（d9-DPPC）を含むDPPCで置き換えられている）と共に上限24時間に亘ってインキュベートした。２、６、もしくは２４時間のインキュベートの後に、クロロホルム及びメタノールを使用して全細胞脂質を抽出し、そのリン脂質組成物をエレクトロスプレイイオン化質量分析によって定量した。天然のホスファチジルコリン（PC）種がm/z184のプリカーサースキャンによって決定され、一方では（メチル-d9）標識を含むPC種がm/z193の同等のスキャンによって決定された。
【００３５】
B3Z細胞の制御においては、DPPCは非常に重要性の低い成分であった。プマクタントとの２時間に亘るインキュベーションによりDPPCの細胞含量は280%増大したが、DPPCの絶対濃度が10%の細胞PCを超えることはなかった。２４時間に亘って細胞をインキュベーション成長させた後、細胞数及び全膜リン脂質濃度はいずれも倍増した。しかしながら、これらの条件下でさえも、全細胞DPPCは２時間の時点で観察された10%を超えることはなかった。これらの結果により、プマクタントが20倍濃度過剰（実測細胞PC濃度に対する添加したプマクタントの濃度比として算出）で連続的に存在する場合でさえも、プマクタントの取込は限られており、また容易に飽和されうることが示される。
【００３６】
プマクタントのB3Z細胞への直接導入が、変性プマクタント中でのD9-DPPC成分の運命を辿ることによって示された。これらの分析の結果は、24時間経過までに免疫細胞によって取り込まれたプマクタントPCの50%超が依然DPPCとして存在しており、残部はより不飽和のPC分子に変換されていることを示した。これらの結果は図２に示される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図1は、2時間前に様々な量のプマクタントで予備処理を施したＴ細胞の制御に対する阻害（％）を比較するグラフである
【図２】図2は、24時間D-9  DPPC（重水素化PtdChoと呼称）でインキュベートした後のB3Zホスファチジルコリン（PtdChoと呼称）のESI-MS マススペクトグラフプロフィールである。
【図１】
2008542248.tif 000009
【図２】
2008542248.tif 000010
【国際調査報告】
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2008542248.tif 000012
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