(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的タンパク質の分離・精製方法、目的タンパク質の製造方法及び全体細胞酵素または部分精製された酵素を用いた生物変換方法に関する。  本発明によれば、目的タンパク質の製造のための培養工程及び分離・精製工程にｓＨＳＰｓを添加する場合、プロテアーゼによるタンパク質損失を防止することにより、高収率の目的タンパク質を得ることができる。また、全体細胞酵素または部分精製された酵素を用いる反応工程にｓＨＳＰｓを添加する場合、プロテアーゼによる酵素の損失を防止することにより、酵素を用いた生物変換の収率を高めることができる。
2008541718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質が発現された細胞またはその培養液から目的タンパク質を分離・精製する方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために分離・精製過程に有効量のスモール熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰｓ）を添加することを特徴とする、目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項２】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp. ）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項３】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項４】
細胞培養による目的タンパク質の製造方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために培養過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
【請求項５】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp. ）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項６】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項７】
細胞培養による目的タンパク質の製造方法において、培養過程でプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するためにｓＨＳＰｓの遺伝子で組換えられた細胞を用いることを特徴とする、目的タンパク質の製造方法。
【請求項８】
前記ｓＨＳＰｓの遺伝子で組換えられた細胞は、染色体にｓＨＳＰｓの遺伝子が挿入された細胞、又はｓＨＳＰｓの遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項９】
前記ｓＨＳＰｓの遺伝子で組換えられた細胞は、ｓＨＳＰｓの遺伝子と目的タンパク質の遺伝子が融合タンパク質（fusion protein）の形として発現されるように組換えられた細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp.）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項７に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
目的タンパク質が発現された細胞またはその培養液からクロマトグラフィーを用いて目的タンパク質を分離・精製する方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するためにそのレジン（resin）又はビーズ（bead）に有効量のｓＨＳＰｓが固定されているクロマトグラフィーを用いることを特徴とする、目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項１３】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp.）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項１４】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の目的タンパク質の分離・精製方法。
【請求項１５】
全体細胞酵素又は部分精製された酵素を用いた反応によって基質から目的物質を製造する方法において、プロテアーゼによる前記酵素の分解を防止するために酵素反応過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする、目的物質の製造方法。
【請求項１６】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp. ）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の目的物質の製造方法。
【請求項１７】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１６に記載の目的物質の製造方法。
【請求項１８】
プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために前記目的タンパク質の処理過程にｓＨＳＰｓを用いる方法。
【請求項１９】
前記ｓＨＳＰｓはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pi sum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandleri）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp. ）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ）Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｓＨＳＰｓは大腸菌由来のＩｂｐＡ、大腸菌由来のＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２よりなる群から選ばれた、少なくとも一つ以上であることを特徴とする、請求項１９に記載の目的物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために有効量のスモール熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰｓ）を添加することを特徴とする目的タンパク質の分離・精製方法、目的タンパク質の製造方法及び全体細胞（whole cell）酵素または部分精製された酵素を用いた生物変換（bioconversion）方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術の眩しい発展のお陰で、自然状態では微量のみが得られていた医薬用・産業用有用タンパク質を大腸菌、酵母、かび、動・植物及び昆虫細胞から大量に生産することが可能になった。例えば、インターフェロン（interferon）、インターロイキン２（interleukin２）、コロニー刺激因子（colony-stimulating factors）、成長ホルモン（growth hormone）、インスリン様成長因子（insulin-like growth factors）、ヒト血清アルブミン（human serum albumin）のようなタンパク質が組換え大腸菌を用いて成功的に生産されてきた（Lee，SY，Trends Biotechnol.,１４:９８、１９９６）。特に、大腸菌の高密度細胞培養（high cell-density culture）技術が確立されており、これにより目的タンパク質を高い生産性で量産することができて、目的タンパク質の生産コストを削減することができる。しかし、効率的な発現ベクターシステムによって有用なタンパク質を大量生産するとしても、タンパク質の分離及び精製システムが確立できなければ、最終的に得られるタンパク質の収率（yields）が急激に減少してしまう。このような分離及び精製段階は、タンパク質の合成が困難で手間がかかる場合や生産量自体が少ない場合こそ一層重要である。
【０００３】
タンパク質の分離及び精製段階は、一般に次のような過程を経る。（１）細胞分画：細胞や組職をガラスホモジナイザー（glass homogenizer）、ミキサー（mixer）、ポリトロン（polytron）、ソニケーター（sonicator）などを用いて破砕し、遠心分離法により分離する。（２）可溶化：不溶性タンパク質を分離・精製する場合、先ずそれを可溶化しなければならない。生体膜タンパク質の可溶化剤として各種界面活性剤（ＳＤＳ，Triton Ｘ−１００，NonidetＰ−４０，ＣＨＡＰＳなど）が用いられる。（３）タンパク質の分離、濃縮及び透析：タンパク質試料の本格的な精製に先立って、タンパク質溶解度による硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）沈殿法、タンパク質分子量の差による分画分子量（molecular weight cut off）法、多孔性セルロース膜（porous cellulose membrane）による透析法（dialysis）などを用いる。（４）最終タンパク質の精製：タンパク質の精製方法は、表１に示すように多様であるので、各実験の目的と材料の種類によってこれらの方法を組み合わせて行う必要がある。通常、初期段階では、分離能力（separation activity）が多少低くても高い処理能力（process capacity）を有する方法を選択し、最終段階に行くほど高い分離能力を有する方法を用いる。
【０００４】
【表１】
2008541718.tif 000003
【０００５】
プロテアーゼ（protease）によるタンパク質の分解を防止するため、プロテアーゼ抑制剤（protease inhibitor）を混合して用いることができるが、中性セリン・プロテアーゼ（serine protease）に対しては０．４〜４．０ｍＭのペファブロックＳＣ（Pefabloc SC）、０．１〜１．０ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ：phenylmethyl-sulfonyl fluoride）、５〜５０ｍＭのロイペプチン（Leupeptin）などを用い、中性メタロプロテアーゼ（metalloprotease）に対しては０．５〜５ｍＭ ＥＤＴＡを用い、システイン・プロテアーゼ（cysteine protease）に対しては０．１〜３０ｍＭ Ｅ−６４を、アスパラギン酸プロテアーゼ（aspartic acid protease）に対しては１ｍＭのペプスタチン（Pepstatin）を用いる。また、各種抑制剤（inhibitor）を混合したカクテル（cocktail）も汎用されている。
【０００６】
しかし、プロテアーゼ抑制剤を用いるとしても目的タンパク質の分解（proteolysis）を完全に抑制させることはできない。特に、プロテアーゼが多く存在する植物抽出物、または動物の膵臓（pancreas）、胃（stomach）、肝臓（liver）、脾臓（spleen）などで目的タンパク質が分離及び精製されるか、あるいは目的タンパク質自体がプロテアーゼによって攻撃され易くなった場合には、タンパク質損失が一層大きくなる。
【０００７】
一方、スモール熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰｓ）は、小分子量（１２−４３ｋＤａ）を有する熱ショックタンパク質（heat shock proteins：ＨＳＰｓ）であって、熱ショックや特定タンパク質の過剰生産のようなストレスによって誘導される。ｓＨＳＰｓは、真核生物（eukaryotes）から原核生物（prokaryotes）に至るまで全ての生物に１つ以上ずつ存在し、今まで明かにされているｓＨＳＰｓは下記表２に示す通りである。 
【０００８】
ＡＴＰ非依存性ｓＨＳＰｓは、熱ストレス（heat stress）下で変性されたタンパク質と結合して、不可逆的にタンパク質の凝集（aggregation）を防ぐ機能を行い、ＡＴＰ依存性熱ショックタンパク質（heat shock proteins）と協力して、変性されたタンパク質を正確にリフォールディング（refolding）することにより、変性されたタンパク質を元の状態に戻す。例えば、大腸菌由来のＩｂｐＡとＩｂｐＢは熱や酸化剤（oxidant）によるクエン酸シンターゼ（citrate synthase）の不活性化を防止すると報告されており（Kitagawa et al., Eur. J. Biochem., 269:2907, 2002）、豆（pea）由来のＨＳＰ１８．１は熱ストレス下でリンゴ酸脱水素酵素（malate dehydrogenase：ＭＤＨ）、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehydes-３-phosphate dehydrogenase）などのようなタンパク質の凝集を防止する役目を果たすと報告されている（Lee et al., EMBO J., 16:659, 1997）。ヒト（human）由来のαクリスタリン（α-crystallin）は、変性された目的タンパク質の透析（dialysis）過程におけるタンパク質の凝集を防止して、目的タンパク質の正確なリフォールディング（correct refolding）を助けると報告されている（Horwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10449, 1992）。ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のｓＨＳＰは、熱によるクエン酸シンターゼ（citrate synthase）の凝集を防止すると報告されている（Studer and Narberhaus, J. Biol. Chem., 275:37212, 2000）。熱に安定な有機体（organism）で精製したＰｆｕ−ｓＨＳＰは、熱ストレス（heat stress）下で細胞のタンパク質を保護するから、ＰＣＲの遂行時に高温でTaq polymerase及び他の酵素を安定化させると報告されている（ＷＯ／０１／７９２５０Ａ１）。また、マウス（Murine）由来のｓＨＳＰ２５は、診断分析（diagnostic assay）において不安定なタンパク質やペプチドを安定化させると報告されている（Ehrnsperger et al., Anal. Biochem., 259:218. 1998）。
【０００９】
このようなｓＨＳＰｓタンパク質は、進化過程で保存された区域（conserved region）を有するため、ほとんど類似の機能を行っている。本発明者らは、ｓＨＳＰｓを含むタンパク質の分解防止用組成物及びこれを用いた２次元ゲル電気泳動法に対する特許を出願したことがある（ＰＣＴ／ＫＲ０３／０２５３９）。しかし、目的タンパク質を製造する培養工程、目的タンパク質の分離・精製及び全体細胞酵素または部分精製された酵素を用いた反応工程における、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を効率的に防止することについてはまだ報告の例がない。
【００１０】
【表２】
2008541718.tif 000004
【００１１】
したがって、本発明者らは、目的タンパク質を製造する培養工程と分離・精製工程、及び目的タンパク質を生体触媒（biocatalyst）として用いる酵素反応において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するための方法を開発するために鋭意努力した結果 、ｓＨＳＰｓを用いると、プロテアーゼによる目的タンパク質の損失を防止することができるということを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
本発明の主な目的は、プロテアーゼによって目的タンパク質の分解が発生する分離・精製過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的タンパク質の分離・精製方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、プロテアーゼによって目的タンパク質の分解が発生する培養過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的タンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１４】
更に、本発明の他の目的は、ｓＨＳＰｓの遺伝子を含む組換え微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１５】
更に、本発明の他の目的は、有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする全体細胞（whole cell）酵素または部分精製された酵素を用いた生物変換方法を提供することにある。
【技術的解決方法】
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は、目的タンパク質が発現された細胞またはその培養液から目的タンパク質を分離・精製する方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために分離・精製過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的タンパク質の分離・精製方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、細胞培養による目的タンパク質の製造方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために培養過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的タンパク質の製造方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、細胞培養による目的タンパク質の製造方法において、培養過程でプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するためにｓＨＳＰｓの遺伝子で組換えられた細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明において、前記ｓＨＳＰｓの遺伝子で組換えられた細胞は、染色体にｓＨＳＰｓの遺伝子が挿入されるか、ｓＨＳＰｓの遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された細胞であることを特徴とし、また、ｓＨＳＰｓの遺伝子と目的タンパク質の遺伝子が融合タンパク質（fusion protein）の形として発現されるように組換えられた細胞であることを特徴とすることができる。
【００２０】
また、本発明は、目的タンパク質が発現された細胞またはその培養液からクロマトグラフィーを用いて目的タンパク質を分離・精製する方法において、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するためにそのレジン（resin）やビーズ（bead）に有効量のｓＨＳＰｓが固定されているクロマトグラフィーを用いることを特徴とする目的タンパク質の分離・精製方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、全体細胞酵素又は部分精製された酵素を用いた反応によって基質から目的物質を製造する方法において、プロテアーゼによる前記酵素の分解を防止するために酵素反応過程に有効量のｓＨＳＰｓを添加することを特徴とする目的物質の製造方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するために目的タンパク質の処理過程にｓＨＳＰｓを用いる方法を提供する。
【００２３】
本発明において、sＨＳＰsは、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のＩｂｐＡ、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）由来のｓＨＳＰｓ、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrbizobium japonicum）由来のＨＳＰＢ、ＨＳＰＨ、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＦ、ブルセラ・スイス（Brucella suis）由来のＩｂｐＡ、ブルクネラ・アフィディコラ（Bruchnera aphidicola）由来のsＨＳＰs、ブルクネラ・アフィド(アシルソ・シフォン・ピサム)（Bruchnera aphid（Acyrthosiphon pisum））由来のＩｂｐＡ、シトラス・トリステザ・ウイルス（Citrus tristeza virus）由来のsＨＳＰs、大腸菌（E.coli）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）由来のＩｂｐＢ、ヒト（Human）由来のＨＳＰ２７、α,β-クリスタリン（α,β-crystallin）、メサノコッカス・ジャナシィ（Methanococcus jannaschii）由来のＨＳＰ１６.５、メタノピラス・カンドレリ（Methanopyrus kandler）由来のＩｂｐＡ、マウス（Murine）由来のＨＳＰ２５、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae）由来のsＨＳＰs、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）由来のＨＳＰ１６.３、ピレルラ種（Pirellula sp.）由来のＩｂｐＢ、ピサム・サチバム（エンドウ豆）（Pisum sativum（pea））由来のＨＳＰ１８.１、プラスモジウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）由来のｓＨＳＰｓ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ・セロバー・タイフィ（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）由来のＩｂｐＡ、、ＩｂｐＢ、シェワネラ・オンエイデンシス（Shewanella oneidensis）由来のＩｂｐＡ、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）由来のＩｂｐＡ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streotocuccus pyogenes）由来のＩｂｐＡ、ストレプトミセス・コエリコロール（Streptomyces coelicolor）由来のｓＨＳＰｓ、スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のｓＨＳＰｓ、シネココッカス・ブルカヌス（Synechococcus vulcanus）由来のＨＳＰ１６、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）由来のＩｂｐＡ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）由来のＩｂｐＡ、、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢよりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上であることを特徴とし、より好ましくは、大腸菌由来のＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＩｂｐＡＢとシュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６よりなる群から選ばれた少なくとも一つ以上であることを特徴とすることができる。
【００２４】
本発明において、プロテアーゼによるタンパク質の分解防止のために添加されるｓＨＳＰｓの量は、全体タンパク質１００重量部に対して好ましくは０．１乃至５０重量部であり、より好ましくは０．５乃至２０重量部である。０．１以下の重量部である場合、タンパク質の分解防止用として絶対量が不足し、２０以上の重量部の場合、過量のｓＨＳＰｓが目的タンパク質の分離・精製を妨げるか、ｓＨＳＰｓのコスト面で逆効果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨの遺伝子地図である。
【図２】プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨの遺伝子地図である。
【図３】プラスミドｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨの遺伝子地図である。
【図４】プラスミドｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈの遺伝子地図である。
【図５】組換えプラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨ及びｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈでそれぞれ形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅから発現されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ｐｐＩｂｐＡまたはＨＳＰ２６タンパク質を精製した電気泳動写真である。（Ａ）において、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１と２は精製されたＩｂｐＡを、レーン３と４は精製されたＩｂｐＢを、レーン５と６は精製されたｐｐＩｂｐＡをそれぞれ示す。（Ｂ）において、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１乃至３は精製されたＨＳＰ２６を示す。
【図６】ヒト血清アルブミン（human serum albumin）が添加された溶解溶液（lysis solution）におけるｓＨＳＰによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。（Ａ）は対照群としてｓＨＳＰｓが添加されない溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液をそれぞれ示す。（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）はそれぞれＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＨＳＰ２６が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．００５ug/ulｓＨＳＰｓのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０１７μｇ/μｌのトリプシンと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０１μｇ/μｌのトリプシンと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液をそれぞれ示す。（Ｅ）は様々なプロテアーゼ抑制剤（protease inhibitor）が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンと１ｍＭのＰＭＳＦが添加された溶液を、レーン６は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンと４ｍＭのペファブロックＳＣが添加された溶液を、レーン７は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンと４ｍＭのぺファブロックＳＣが添加された溶液を、レーン８は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンとカクテル抑制剤（cocktail inhibitor）（７ｍｌ／tablet）が添加された溶液を、レーン９は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μｌのトリプシンとカクテル抑制剤（７ｍｌ／tablet）が添加された溶液を、レーン１０は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０５μｇ/μｌのトリプシンと１ｍＭのＥＤＴＡが添加された溶液を、レーン１１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．０２５μｇ/μ��のトリプシンと１ｍＭ ＥＤＴＡが添加された溶液をそれぞれ示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【図７】ヒト血清アルブミンが添加された溶解溶液におけるｓＨＳＰｓによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。（Ａ）は対照群としてｓＨＳＰｓが添加されない溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０-３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫが添加された溶液をそれぞれ示す。（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）はそれぞれＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＨＳＰ２６が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと０．００５μｇ/μｌのｓＨＳＰｓが添加された溶液をそれぞれ示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。（Ｅ）は様々なプロテアーゼ抑制剤（protease inhibitor）が添加された溶解溶液であって、レーンＭはタンパク質標準分子量を示し、レーン１は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンのみが添加された溶解溶液を、レーン２は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと４ｍＭのぺファブロックＳＣが添加された溶液を、レーン３は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと４ｍＭのペファブロックＳＣが添加された溶液を、レーン４は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫとカクテル抑制剤（７ｍｌ／tablet）が添加された溶液を、レーン５は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫとカクテル抑制剤（７ｍｌ／tablet）が添加された溶液を、レーン６は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに０．５×１０−３μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと１ｍＭ ＥＤＴＡが添加された溶液を、レーン７は０．５μｇ/μｌのヒト血清アルブミンに１．５×１０−４μｇ/μｌのプロテイナーゼＫと１ｍＭ ＥＤＴＡが添加された溶液をそれぞれ示す。矢印はヒト血清アルブミンを示す。
【図８】生物分離・精製工程におけるｓＨＳＰｓによる目的タンパク質の分解防止を示す概路図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００２７】
特に、下記実施例では、ｓＨＳＰｓとして大腸菌由来のＩｂｐＡとＩｂｐＢ、シュードモナス（Pseudomonas）属由来のＩｂｐＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６を例示したが、表２に記載のｓＨＳＰｓなども限定せずに適用可能である。
【００２８】
実施例１：ｉｂｐＡ、ｉｂｐＢまたはＨＳＰ２６遺伝子を含む組換えプラスミドの製造
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０（ＡＴＣＣ４７０５４）の染色体ＤＮＡ及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体ＤＮＡを、サムブルーク（Sambrook）等の方法により分離・精製した（Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989）。
【００２９】
大腸菌Ｗ３１１０、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）を５００ｍＬのＬＢ培地（Luria-Bertani medium）で２４時間培養した。それぞれの菌株が初期の指数関数的増殖期（exponential growth phase）であるとき、遠心分離によって菌体を回収した後、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（lysozyme, Sigma Co., USA）が含まれているＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．６）５０ｍＬに懸濁した。前記菌株の懸濁液を２４時間にかけて徐々に撹拌しつつ常温において培養した。
【００３０】
菌株の破砕とタンパク質の除去のために、前記培養液に１０％のＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）溶液１６ｍＬと、２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（, Sigma Co., USA）５７０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
【００３１】
次いで、５Ｍ塩化ナトリウム溶液１４ｍＬと、０．７Ｍ塩化ナトリウム溶液に溶解されている１０％ＣＴＡＢ（cetyltrimethylammoniumbromide, Sigma Co., USA）１０．６６ｍＬを加えた後、６５℃で１０分間反応させた。その後、前記反応液と同じ体積を有するクロロホルム：イソアミルアルコール（chloroform:isoamylalcohol）＝２４:１の混合液を加え、常温で２時間にかけて注意しながら混合した。前記混合液を６,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をビーカに移し、２倍量の冷却エタノールをゆっくり加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを取り除去した後、１ｍＬのＴＥ溶液にＤＮＡを溶解させた。
【００３２】
前記ＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ（Sigma Co., USA）を最終濃度が５０μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃で１時間反応させた。反応の完了後、再び前記反応液と同じ体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（chloroform:isoamylalcohol）＝２４:１のを混合液を加え、常温で２時間かけて注意しながら混合した。
【００３３】
前記混合液を６,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清をビーカに移し、２倍量の冷却エタノールをゆっくり加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを取り除去した後、最終的に、１ｍＬのＴＥ溶液に精製された大腸菌Ｗ３１１０、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０及びサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体ＤＮＡを溶解させた。
【００３４】
ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ｐｐＩｂｐＡまたはＨＳＰ２６タンパク質の発現と精製を容易に行うために、下記のように組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨ及びｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈをそれぞれ製作した。
【００３５】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、それぞれ配列番号１と２、及び配列番号３と４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、大腸菌由来のｉｂｐＡ−６ｈｉｓ及びｉｂｐＢ−６ｈｉｓ遺伝子を得た。
【００３６】
また、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、シュードモナス由来のｐｐｉｂｐＡ−６ｈｉｓ遺伝子得た。シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０ゲノム（genome）では、ｉｂｐＢ遺伝子について、まだ明らかになっていない。
【００３７】
サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７と８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のＨＳＰ２６−６ｈｉｓ遺伝子を得た。
【００３８】
ＰＣＲにおいて、最初の変性（denaturation）は９５℃で５分間１回行い、２回目の変性は９５℃で５０秒間、アニール（annealing）は５５℃で１分間、そして伸長（extention）は７２℃で１分３０秒間行った。また、これらの過程を３０回繰り返した後、７２℃で５分間、最後の伸長を１回行った。
【００３９】
得られたｉｂｐＡ−６ｈｉｓ、ｉｂｐＢ−６ｈｉｓ、ｐｐｉｂｐＡ−６ｈｉｓ及びＨＳＰ２６−６ｈｉｓ遺伝子をそれぞれ、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによって切断された組換えプラスミドであるｐＴａｃ９９Ａに挿入し、プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨ及びｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈをそれぞれ製作した （図１、図２、図３及び図４参照）。
【００４０】
前記組換えプラスミドであるｐＴａｃ９９Ａは、ｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden）のｔｒｃプローモータがｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden）のｔａｃプローモータに値き換えられたプラスミドであって、ｐＫＫ２２３−３のｔａｃプローモータを制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで処理して得た後、ｔａｃプローモータ遺伝子の切片（gene fragment）を同じ制限酵素によって切断されたｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより製作した。
【００４１】
配列番号1: 5'-ggaattcatgcgtaactttgatttatccccg-3'
配列番号2: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttgatttcgatacggcgcgg-3'
配列番号3: 5'-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3' 
配列番号4: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggctatttaacgcgggacgttcgct-3' 
配列番号5: 5'-ggaattcatgaccatgactactgctttc-3' 
配列番号6: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttcagcgctggttttt-3'
配列番号7: 5'-ggaattcatgtcatttaacagtccatttt-3'
配列番号8: 5'-cccaagcttttaatggtgatgatggtgatggttaccccacgattcttgaga-3'
【００４２】
実施例２:ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＨＳＰ２６タンパク質の精製
前記実施例１に従い製作されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢまたはＨＳＰ２６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドである、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨ及びｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈによってそれぞれ形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene, USA）を、抗生剤であるアンピシリン（ampicillin）５０ｍｇ／Ｌの添加されたＬＢ培地（酵母抽出液５ｇ／Ｌ、トリプトファン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）で培養した。
【００４３】
ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ｐｐｂｐＡ及びＨＳＰ２６タンパク質の発現を誘導するために、分光光度計により６００ｎｍ波長で測定した光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．７であるとき、１ｍＭのＩＰＴＧ（isopropyl-b-thiogalactoside）を添加した。前記ＩＰＴＧ添加後、４時間が経過してから培養液を１ｍＬずつ取り、４℃、６,０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた沈殿物を０．５ｍＬのＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、1ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８.０）で１回洗浄した後、再び４℃、６,０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、沈殿物を得た。前記得られた沈殿物を０．２ｍＬの平衡溶液（equilibrium solution）（８Ｍ Ｕｒｅａ、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ｐＨ８.０）に懸濁させ、超音波で破砕して分画した。
【００４４】
前記懸濁溶液を４℃、１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り、予め平衡溶液によって平衡化されたＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（Qiagen, USA）に通過させた後、２,０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。６００μｌの洗浄溶液（８Ｍ Ｕｒｅａ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ｐＨ６.３）をカラムに２回通過させ、２００μｌの溶離溶液（eluant）（８Ｍ Ｕｒｅａ、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ；ｐＨ４．５）をカラムに入れて、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＨＳＰ２６タンパク質を精製した。
【００４５】
前記精製されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ及びＨＳＰ２６タンパク質を含有した溶液を２００μｌずつ取り、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル溶液（２５％のグリセロール、２％のＳＤＳ、１４．４ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１％のブロモフェノールブルー（bromophenol blue）、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５０μｌと混合し、１０分間沸騰させた後、これを１２％分離用ゲル（separating gel）でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。次いで、ゲルを染色溶液（メタノール４０％、アセト酸１０％、０．２５ｇ／ＬのクマシーブリリアントブルーＲ（Coomassie brilliant blue R））に２時間以上浸漬して染色させ、さらに脱色溶液（４０％のメタノール、７％のアセト酸）に２時間以上、ずつ２回かけて浸漬して脱色させた。
【００４６】
図５は、組換えプラスミドであるｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＨ、ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢＨ、ｐＴａｃ９９ｐｐＩｂｐＡＨ及びｐＴａｃ９９ＨＳＰ２６Ｈによってそれぞれ形質転換された組換え大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅから発現されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ｐｐｂｐＡ及びＨＳＰ２６タンパク質を精製した結果を示す電気泳動写真である。図５に示すように、精製されたＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ｐｐｂｐＡ及びＨＳＰ２６タンパク質の純度（purity）はほとんど１００％であることがわかる。
【００４７】
実施例３：トリプシンによる目的タンパク質の分解におけるｓＨＳＰｓの影響
目的タンパク質は細胞の溶解溶液（lysis solution）内でプロテアーゼに攻撃されやすいため、多くの損失が発生する。本実施例では、目的タンパク質としてのヒト血清アルブミンを溶解溶液で希釈し、２時間にかけて常温でプロテアーゼであるトリプシン（trypsin）を多様な濃度で共に培養した。プロテアーゼの濃度は、目的タンパク質に対して、０、１／１０、１／２０、１／３０、１／５０に変化させた。ｓＨＳＰsは、大腸菌由来のＩｂｐＡとＩｂｐＢ、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＨＳＰ２６を用いた。
【００４８】
図６は、ヒト血清アルブミンが添加された溶解溶液におけるｓＨＳＰによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。図６に示すように、ｓＨＳＰｓが添加された溶液では目的タンパク質としてのヒト血清アルブミンがほとんど分解されないのに対し、対照群ではヒト血清アルブミンがプロテアーゼの攻撃によってほとんど分解された。図６（Ａ）−図６（Ｄ）のレーン２を比較すると、特に、ヒト血清アルブミンはトリプシンによって完全に分解されるのに対し、少量のｓＨＳＰを添加した場合にはほとんど分解されなかった。また、図６（Ｂ）−図６（Ｄ）のレーン２及び３と図６（Ｅ）のレーン４乃至１１を比較すると、従来のプロテアーゼ抑制剤よりも、ｓＨＳＰｓが格段に効果的にプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するということがわかる。
【００４９】
実施例４：プロテイナーゼＫによる目的タンパク質の分解におけるｓＨＳＰｓの影響
本実施例では、他のプロテアーゼとしてのプロテイナーゼＫを用いて、上記と同じ実験を行った。目的タンパク質としてのヒト血清アルブミンを溶解溶液で希釈し、２時間にかけて常温で多様な濃度のプロテイナーゼＫと共に培養した。プロテアーゼの濃度は、目的タンパク質に対して、０、１／３００、１／１０００、１／３０００、１／１００００に変化させた。ｓＨＳＰとしては、大腸菌由来のＩｂｐＡとＩｂｐＢ、サッカロマイセス・セレヴィシエ由来のＨＳＰ２６を用いた。
【００５０】
図７は、ヒト血清アルブミンが添加された溶解溶液におけるｓＨＳＰｓによるプロテアーゼ抑制効果を示す電気泳動写真である。図７に示すように、ｓＨＳＰｓが添加された溶液では目的タンパク質としてのヒト血清アルブミンがほとんど分解されないの対し、対照群ではヒト血清アルブミンがプロテアーゼの攻撃によってほとんど分解された。図７（Ａ）−図７（Ｄ）のレーン３とレーン４をそれぞれ比較すると、特に、ヒト血清アルブミンはプロテイナーゼＫによってほとんど分解されるのに対し、少量のｓＨＳＰを添加した場合にはほとんど分解されなかった。また、図７（Ｂ）−図７（Ｄ）のレーン３と図７（Ｅ）のレーン２、レーン４及びレーン６を比較すると、ｓＨＳＰｓは、従来のプロテアーゼ抑制剤よりも、格段に効果的にプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するということがわかる。
【００５１】
間接実施例
以上の実施例では、目的タンパク質の分離・精製工程におけるｓＨＳＰｓを添加した場合、ｓＨＳＰｓがプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止するということを例示した。しかし、ほとんどの微生物培養の際、プロテアーゼが生成されることを勘案すると、目的タンパク質を製造する培養過程にｓＨＳＰｓを添加するか、目的タンパク質製造用細胞をｓＨＳＰｓの遺伝子で形質転換し、培養させて、目的タンパク質とｓＨＳＰｓを同時に発現させる場合、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止することができるということは、当業者にとって明らかなことである。
【００５２】
したがって、本発明は、生物分離・精製工程での目的タンパク質の分解を最小化するために、図８の概路図を示した。図８に示すように、精製されたｓＨＳＰｓを目的タンパク質分離・精製の各段階に添加するか、または、最初の段階から細胞内（in vivo）でｓＨＳＰｓを目的タンパク質と共に発現させる方法を含む。細胞内でｓＨＳＰｓを目的タンパク質と共に発現させるときには、ｓＨＳＰｓを、細胞の染色体に挿入するか、プラスミドの形で挿入して、発現させることができ、又は直接連結ペプチド（direct linker peptide）を用いて目的タンパク質との融合タンパク質（fusion protein）の形で製造して発現させることもできる。
【００５３】
また、全体細胞酵素または部分精製された酵素にもプロテアーゼが含まれているため、全体細胞酵素または部分精製された酵素を用いる反応工程にｓＨＳＰｓを添加する場合、プロテアーゼによる目的酵素の分解を防止することができるということも、当業者にとって明らかなことである。
【００５４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではないということは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とこれらの等価物によって定義される筈である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、目的タンパク質を製造するための培養、分離及び精製工程と、目的タンパク質を生体触媒（biocatalyst）として用いる酵素反応工程とにｓＨＳＰｓを用いることを特徴とするプロテアーゼによる目的タンパク質の分解防止方法を提供する効果がある。本発明によるＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、ＩｂｐＡＢ、ＨＳＰ２６などのｓＨＳＰｓを用いた生物分離・精製工程によれば、プロテアーゼによる目的タンパク質の損失を防止することができ、ｓＨＳＰｓは、従来の高いプロテアーゼ抑制剤を用いる場合よりも、格段に効果的にプロテアーゼによる目的タンパク質の分解を防止することができる。よって、本発明は、目的タンパク質の製造方法及び利用方法を効果的に改善するのに有用であろうと期待される。
【図１】
2008541718.tif 000005
【図２】
2008541718.tif 000006
【図３】
2008541718.tif 000007
【図４】
2008541718.tif 000008
【図８】
2008541718.tif 000009
【図５】
2008541718.tif 000010
【図６】
2008541718.tif 000011
【図７】
2008541718.tif 000012
【国際調査報告】
2008541718.tif 000013
2008541718.tif 000014
2008541718.tif 000015