(57)【要約】  本発明は、等温ＤＮＡ増幅のための方法に関し、本方法は、ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ非標準塩基を含む第１のプライマーと、ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、かつ非標準塩基を含む第２のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、鎖置換が可能な酵素と、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基においてもしくはその付近でニックを生じるか、もしくは塩基を切除する酵素とを含む増幅混合物を増幅されるＤＮＡに提供する工程；およびそのＤＮＡを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第１のプライマーと、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、該非標準塩基においてもしくはその付近で、ニックを生じるか、または塩基を切除する酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
該ＤＮＡを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、前記増幅混合物を加える前、加えている間、または加えた後に変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプライマーが、ＤＮＡの第１の鎖のある領域に少なくとも部分的に相補的であり、前記第２のプライマーが、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチドまたはＩＮＡ／オリゴヌクレオチドなどのキメラ性のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、デオキシオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーが、２つ以上の非標準塩基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーがＤＮＡに結合するとき、該プライマーが、前記酵素によって認識される部位を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記非標準塩基が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格内に挿入され得る化学物質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記非標準塩基が、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、リボヌクレオチド、５−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記鎖置換酵素が、ヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、および任意の鎖置換が可能な酵素のうちのミスマッチ修復酵素からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換能力も有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識することができる前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧ１、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＭｃｒＢＣおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ増幅に必要な添加物をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記添加物が、ヌクレオチド、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの緩衝液または希釈剤、補助因子、およびＴ４ｇｐ３２などの一本鎖結合タンパク質を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
増幅が、前記酵素が所望の活性を有する任意の適した温度で行われる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記温度が、約２０℃〜約７５℃である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記温度が、約４２℃である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡが、一本鎖改変ＤＮＡを形成するための条件下で、シトシン塩基を改変するが、５’−メチル−シトシン塩基を改変しない改変剤で前処理される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変剤が、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択され、処理が、実質的なＤＮＡ断片化を生じない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変剤が、亜硫酸水素ナトリウムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
等温ＤＮＡ増幅のためのキットであって、
ＤＮＡポリメラーゼ；
鎖置換が可能な酵素；および
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、該非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素
を備える、キット。
【請求項２５】
ＤＮＡ増幅に必要な添加物をさらに備える、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットを使用するための指示書をさらに備える、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記ＤＮＡポリメラーゼと鎖置換が可能な酵素が、同じ酵素である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
少なくとも１つの内部非標準塩基を含み、ＤＮＡのある領域に結合したとき、一方のＤＮＡ鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じることができるかまたは塩基を切除することができる酵素によって認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマー。
【請求項２９】
前記非標準塩基が、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格中に挿入され得る化学物質である、請求項２８に記載のプライマー。
【請求項３０】
前記非標準塩基が、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、リボヌクレオチド、５−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項２９に記載のプライマー。
【請求項３１】
前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項３０に記載のプライマー。
【請求項３２】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載のキットの使用。
【請求項３３】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のプライマーの使用。
【請求項３４】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項３５】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じるかまたは塩基を切除する酵素の使用。
【請求項３６】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じるかまたは塩基を切除する酵素、および鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、温度サイクル無しで核酸分子を増幅するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
核酸配列の集団から特定の配列を増幅するために最も広く使用されている方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による方法である（ディーフェンバハ  Ｃ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  Ｃ）およびドベクスラー  Ｇ（Ｄｖｅｋｓｌｅｒ  Ｇ）編。ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク州）。この増幅方法では、オリゴヌクレオチド（一般に、増幅される領域のどちらかの末端における相補鎖上の１５〜３０ヌクレオチド長）を使用して、変性された一本鎖ＤＮＡ鋳型上でＤＮＡ合成を開始する。変性とプライマーハイブリダイゼーションと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡ鎖合成との連続サイクルによって、プライマー間の配列を指数関数的に増幅することが可能となる。ＲＮＡ配列は、初めに逆転写酵素を使用して複製することによって増幅することができ、その結果、ｃＤＮＡコピーが生成される。増幅されたＤＮＡフラグメントは、種々の手段によって検出することができる。その手段としては、ゲル電気泳動、標識プローブとのハイブリダイゼーション、その後の同定を可能にする（例えば、酵素結合アッセイによって）タグ付きプライマーの使用、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション時にシグナルを生じる蛍光タグ化プライマーの使用（例えば、ＢｅａｃｏｎおよびＴａｑＭａｎシステム）が挙げられる。
【０００３】
ＰＣＲの欠点の１つは、ＤＮＡを変性するために増幅混合物を加熱および冷却するサーモサイクラーを必要とする点である。このため、増幅を原始的な場所で行うことはできず、研究室外の環境では容易に操作することができない。
【０００４】
ＰＣＲと同様に、種々の他の技術が、特定配列を検出および増幅するために開発されてきた。１つの例は、リガーゼ連鎖反応である（バーラーニ  Ｆ（Ｂａｒａｎｙ  Ｆ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｌｏｎｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｌｉｇａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３頁（１９９１年））。
【０００５】
増幅反応の間の熱による標的の変性に依存するＤＮＡ増幅の従来法に加えて、増幅反応の間に鋳型変性を必要としない多くの方法が報告されており、それらは、等温増幅技術と呼ばれている。
【０００６】
等温増幅は、１９９２年に初めて報告され（ウォーカー  ＧＴ（Ｗａｌｋｅｒ  ＧＴ）、リトル  ＭＣ（Ｌｉｔｔｌｅ  ＭＣ）、ナドー  ＪＧ（Ｎａｄｅａｕ  ＪＧ）およびシャンク  Ｄ（Ｓｈａｎｋ  Ｄ）。Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．ＰＮＡＳ  ８９：３９２−３９６頁（１９９２年））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）と呼ばれた。それ以来、多くの他の等温増幅技術が報告され、対応するゲノムＤＮＡではなくＲＮＡ配列を複製するＲＮＡポリメラーゼを使用する転写媒介性増幅（ＴＭＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などが挙げられる（グアテッリ  ＪＣ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ＪＣ）、ホイットフィールド  ＫＭ（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ  ＫＭ）、コウ  ＤＹ（Ｋｗｏｈ  ＤＹ）、バリンジャー  ＫＪ（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ＫＪ）、リッチマン  ＤＤ（Ｒｉｃｈｍａｎｎ  ＤＤ）およびジンジェラス  ＴＲ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ＴＲ）。Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ  ８７：１８７４−１８７８頁（１９９０年）：キービッツ  Ｔ（Ｋｉｅｖｉｔｓ  Ｔ）、ヴァンゲーメン  Ｂ（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎ  Ｂ）、ヴァンシュトリップ  Ｄ（ｖａｎ  Ｓｔｒｉｊｐ  Ｄ）、シュッキンク  Ｒ（Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ  Ｒ）、ダークス  Ｍ（Ｄｉｒｃｋｓ  Ｍ）、アドリアーンセ  Ｈ（Ａｄｒｉａａｎｓｅ  Ｈ）、マレック  Ｌ（Ｍａｌｅｋ  Ｌ）、スークナナン  Ｒ（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ  Ｒ）、レンズ  Ｐ（Ｌｅｎｓ  Ｐ）。ＮＡＳＢＡ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９１年１２月；３５（３）：２７３−８６頁）。
【０００７】
他のＤＮＡベースの等温技術としては、ＤＮＡポリメラーゼが環状鋳型を対象としたプライマーを伸長するローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（ファイア  Ａ（Ｆｉｒｅ  Ａ）およびジョ  ＳＱ（Ｘｕ  ＳＱ）。Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｃｉｒｃｌｅｓ．ＰＮＡＳ  ９２：４６４１−４６４５頁（１９９５年））、標的検出用の環状プローブを使用する分枝増幅（Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＡＭ）（チャン  Ｗ（Ｚｈａｎｇ  Ｗ）、コーエンフォード  Ｍ（Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄ  Ｍ）、レントリシア  Ｂ（Ｌｅｎｔｒｉｃｈｉａ  Ｂ）、アイセンベルク  ＨＤ（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ  ＨＤ）、シムソン  Ｅ（Ｓｉｍｓｏｎ  Ｅ）、リ  Ｈ（Ｌｉ  Ｈ）、イ  Ｊ（Ｙｉ  Ｊ）、チャン  ＤＹ（Ｚｈａｎｇ  ＤＹ）。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｂｙ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：ａ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２年１月；４０（１）：１２８−３２頁）、および最近のものとしては、ＤＮＡ鎖をほどくために熱の代わりにヘリカーゼ酵素を用いるヘリカーゼ依存性等温ＤＮＡ増幅（ＨＤＡ）（ヴィンセント  Ｍ（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ）、ジョ  Ｙ（Ｘｕ  Ｙ）、コン  Ｈ（Ｋｏｎｇ  Ｈ）。Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００４年８月；５（８）：７９５−８００頁）が挙げられる。
【０００８】
近年、ＤＮＡ増幅の等温方法が報告されている（ウォーカー  ＧＴ（Ｗａｌｋｅｒ  ＧＴ）、リトル  ＭＣ（Ｌｉｔｔｌｅ  ＭＣ）、ナドー  ＪＧ（Ｎａｄｅａｕ  ＪＧ）およびシャンク  Ｄ（Ｓｈａｎｋ  Ｄ）。Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．ＰＮＡＳ  ８９：３９２−３９６頁（１９９２年））。従来の増幅技術は、増幅反応の各サイクルにおいて標的分子の変性および再生のサイクルを連続して行うことに依存している。ＤＮＡの熱処理により、ある一定の程度でＤＮＡ分子の剪断が生じるので、例えば、発生途中の胚盤胞由来の少数の細胞からＤＮＡを単離するとき、または特に、ＤＮＡが既に断片化された形態（組織切片、パラフィンブロックおよび古代のＤＮＡサンプルなど）であるときなどのようにＤＮＡが限られている場合、この加熱−冷却サイクルは、さらにＤＮＡに損傷を与えることになり、増幅シグナルの損失につながる。等温法は、さらなる増幅の鋳型として働く一本鎖分子を生成するために鋳型ＤＮＡの連続変性に依存しないが、一定温度において特定の制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ分子の酵素的ニッキングに依存する。
【０００９】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）と呼ばれる技術は、半改変（ｈｅｍｉ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＤＮＡの非改変鎖にニックを生じる特定の制限酵素の能力および下流の鎖を伸長して置換する５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの能力に依存する。そして、指数関数的な増幅がセンス反応とアンチセンス反応を組み合わせることによって達成され、センス反応からの鎖置換は、アンチセンス反応の鋳型として働く（ウォーカー  ＧＴ（Ｗａｌｋｅｒ  ＧＴ）、リトル  ＭＣ（Ｌｉｔｔｌｅ  ＭＣ）、ナドー  ＪＧ（Ｎａｄｅａｕ  ＪＧ）およびシャンク  Ｄ（Ｓｈａｎｋ  Ｄ）。Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．ＰＮＡＳ  ８９：３９２−３９６頁（１９９２年））。このような技術を使用することにより、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（ウォーカー  ＧＴ（Ｗａｌｋｅｒ  ＧＴ）、リトル  ＭＣ（Ｌｉｔｔｌｅ  ＭＣ）、ナドー  ＪＧ（Ｎａｄｅａｕ  ＪＧ）およびシャンク  Ｄ（Ｓｈａｎｋ  Ｄ）。Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ．ＰＮＡＳ  ８９：３９２−３９６頁（１９９２年））、ＨＩＶ−１、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＨＰＶ−１６（ヌォーヴォ  Ｇ．Ｊ．（Ｎｕｏｖｏ  Ｇ．Ｊ．）、２０００年）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（スピアーズ  ＰＡ（Ｓｐｅａｒｓ  ＰＡ）、リン  Ｐ（Ｌｉｎｎ  Ｐ）、ウッダード  ＤＬ（Ｗｏｏｄａｒｄ  ＤＬ）およびウォーカー  ＧＴ（Ｗａｌｋｅｒ  ＧＴ）。Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｅｍ．２４７：１３０−１３７頁（１９９７年））の増幅に成功した。
【００１０】
今までのＳＤＡの使用は、酵素切断に抵抗性である改変鎖上の半ホスホルチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）ＤＮＡ二重鎖を生成するために、改変ホスホルチオエートヌクレオチドに依存しており、置換反応を進める消化の代わりに酵素的ニッキングを生じる。しかしながら、近年、いくつかの「ニッカーゼ」酵素が設計されてきた。これらの酵素は、従来の様式でＤＮＡを切断しないが、一方のＤＮＡ鎖にニックを生じる。「ニッカーゼ」酵素としては、Ｎ．Ａｌｗ１（ジョ  Ｙ（Ｘｕ  Ｙ）、ルネン  ＫＤ（Ｌｕｎｎｅｎ  ＫＤ）およびコン  Ｈ（Ｋｏｎｇ  Ｈ）。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎ．Ａｌｗ１  ｂｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ．ＰＮＡＳ  ９８：１２９９０−１２９９５頁（２００１年））、Ｎ．ＢｓｔＮＢ１（モーガン  ＲＤ（Ｍｏｒｇａｎ  ＲＤ）、カルベ  Ｃ（Ｃａｌｖｅｔ  Ｃ）、デメートル  Ｍ（Ｄｅｍｅｔｅｒ  Ｍ）、アグラ  Ｒ（Ａｇｒａ  Ｒ）、コン  Ｈ（Ｋｏｎｇ  Ｈ）。Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００年１１月；３８１（１１）：１１２３−５頁）およびＭｌｙ１（ベスニア  ＣＥ（Ｂｅｓｎｉｅｒ  ＣＥ）、コン  Ｈ（Ｋｏｎｇ  Ｈ）。Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｍｌｙｌ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｔｏ  ａ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｉｔｓ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００１年９月；２（９）：７８２−６頁。電子版２００１年８月２３日）が挙げられる。このような酵素の使用は、ＳＤＡ手順を単純化する。
【００１１】
さらに、ＳＤＡは、耐熱性制限酵素（Ａｖａ１）および耐熱性エキソポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）を組み合わせて使用することにより改善されてきた。この組み合わせは、１０８倍増幅〜１０１０倍増幅に反応の増幅効率を高めることが示されており、この技術を使用して固有の単一コピー分子を増幅することが可能である。耐熱性ポリメラーゼ／酵素の組み合わせを使用して、結果として生じる増幅率は、１０９の規模である（ミラ  Ｍ．Ａ．（Ｍｉｌｌａ  Ｍ．Ａ．）、スピアーズ  Ｐ．Ａ．（Ｓｐｅａｒｓ  Ｐ．Ａ．）、ピアソン  Ｒ．Ｅ．（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｒ．Ｅ．）およびウォーカー  Ｇ．Ｔ．（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．）Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｖａ１  ａｎｄ  Ｅｘｏ−Ｂｓｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９７年  ２４：３９２−３９６頁）。
【００１２】
これまでのすべての等温ＤＮＡ増幅技術は、増幅を開始する前に、最初に二本鎖鋳型ＤＮＡ分子を変性する必要がある。さらに、その最初の変性からは、増幅が１回開始されるだけである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、酵素およびプライマーを使用し、温度サイクルの繰り返しを必要としない新規の増幅方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の開示
第１の態様において、本発明は、等温ＤＮＡ増幅のための方法を提供し、本方法は、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第１のプライマーと、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第２のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基においてもしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
上記ＤＮＡを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程
を含む。
【００１５】
必要に応じて、上記ＤＮＡは、増幅混合物を加える前、加えている間または加えた後に変性され得る。
【００１６】
好ましくは、第１のプライマーは、ＤＮＡの第１の鎖のある領域に少なくとも部分的に相補的であり、第２のプライマーは、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的である。
【００１７】
第１のプライマーおよび第２のプライマーは、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチドまたはＩＮＡ／オリゴヌクレオチドなどのキメラ性のオリゴヌクレオチドであり得る。好ましくは、上記プライマーは、デオキシオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチド類似体は、挿入核酸（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＩＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＡＮ）、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、核酸ベースの結合体、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リキソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、２’−ＯＲ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡおよびβ−Ｄ−ＲＮＡならびにそれらの混合物およびそれらの複合型、ならびにそれらの亜リン酸原子改変物（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステルおよびホスホボラノエートが挙げられるがこれらに限定されない）から選択される。さらに非亜リン酸含有化合物は、ヌクレオチド（例えば、メチルイミノメチル、ホルムアセテート、チオホルムアセテートおよびアミドを含む連結基が挙げられるがこれらに限定されない）に連結するために使用され得る。特に核酸および核酸類似体は、１つ以上のインターカレーター偽ヌクレオチドを含みうる。
【００１９】
ＩＮＡとは、本明細書中に参照により援用される国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレットおよび国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄに譲渡）の教示に従って、挿入核酸を意味する。ＩＮＡは、オリゴヌクレオチド、または１つ以上のインターカレーター偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含むオリゴヌクレオチド類似体である。
【００２０】
非標準塩基を有するプライマーがＤＮＡに結合するとき、その非標準塩基は、酵素によって認識される部位を形成する。
【００２１】
非標準塩基（すなわち非標準ＤＮＡ塩基）は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格に挿入され得る化学物質と本明細書中において定義される。非標準塩基の例としては、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、５ヒドロキシウリジン、Ｃを有する５ブロモ−ｄＵイノシン、リボヌクレオチドおよびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、非標準塩基は、デオキシイノシンである。
【００２２】
しかしながら、非標準塩基は、必ずしもヌクレオチドの構造を有する必要はないことが理解されるだろう。
【００２３】
プライマーは、１つ以上の非標準塩基を有することができる。いくつかの状況において、２つ以上の非標準塩基が、増幅プロセスを改善することができる。非標準塩基は、少なくとも数個の標準塩基の近くまたはそれらから間隔をあけて位置しうる。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼは、任意の適当なポリメラーゼ、例えば、ＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ、Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＫｌｅｎＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼターボ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔエキソ−ポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーミネーター（Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、エキスパンド（Ｅｘｐａｎｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  フラグメント、ＤＮＡポリメラーゼ１、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  Ｂポリメラーゼ、ｐｈｉ−２９ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼβであり得る。
【００２５】
鎖置換酵素は、任意の適当な酵素、例えば、ヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、鎖置換が可能なミスマッチ修復酵素または遺伝的に（または別の方法で）改変された鎖置換が可能な酵素であり得る。
【００２６】
好ましい形態において、ＤＮＡポリメラーゼもまた鎖置換能力を有する。そのＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能力を有する任意の適当なポリメラーゼであり得る。例としては、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）カタログ番号Ｍ０２１２Ｓ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２７５Ｓ）、Ｖｅｎｔエキソ−（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５７Ｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔエキソ−（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５９Ｓ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５３Ｓ）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６０Ｓ）およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６９Ｓ）ＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Ｐｒｏｋａｒｉａ  ｅｈｆ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−である。
【００２７】
好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ欠損である。
【００２８】
酵素は、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識することができ、その非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除することができる任意の適当な酵素であり得る。例としては、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ）、Ｆｐｇ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４０Ｓ）、ｈＯＧＧ１（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４１Ｓ）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２９７Ｓ）、ＡＰＥ１（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８２Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０４Ｓ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２９９Ｓ）、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０２Ｓ）、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）、ＭｃｒＢＣ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２７２Ｓ）およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、この酵素は、エンドヌクレアーゼＶである。
【００２９】
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、そして本発明に記載の方法においてニッキングまたは塩基の除去に必要とされるように作用する他の適当な酵素を、作製することができるか、または入手することができることが理解されるだろう。
【００３０】
ＤＮＡ増幅に必要な添加物としては、ヌクレオチド、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの緩衝液または希釈剤、当該分野で公知の補助因子などが挙げられる。
【００３１】
増幅混合物はまた、ヌクレオチド、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの緩衝液または希釈剤、補助因子およびＴ４ｇｐ３２またはＲｅｃＡなどの一本鎖結合タンパク質などの適当な添加物を含むことができる。
【００３２】
増幅は、酵素が所望の活性を有する任意の適当な温度で行うことができる。典型的には、その温度は、約２０℃〜約７５℃、約２５℃〜６０℃または約３０℃〜４５℃であり得る。本研究において使用される酵素については、約４２℃が特に適当であることが見出されている。それよりも高いかまたは低い他の温度が使用され得、それには外界温度または室温が含まれ得ることが理解されるだろう。重要なこととして、本発明は、核酸を増幅するために温度サイクルを必要としない。
【００３３】
１つの好ましい形態において、ＤＮＡは、一本鎖改変ＤＮＡを形成する条件下でシトシン塩基を改変するが、５’−メチル−シトシン塩基を改変しない改変剤で前処理される。好ましくは、その改変剤は、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択され、処理は、実質的なＤＮＡ断片化を生じない。より好ましくは、その薬剤は、亜硫酸水素ナトリウムであり、これは、水の存在下でシトシンをウラシルに改変する試薬である。
【００３４】
亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応することにより、脱アミノ化しやすく、水の存在下でウラシル亜硫酸塩を生じる、スルホン化されたシトシン反応中間体を形成する。必要であれば、この亜硫酸基を、穏やかなアルカリ性条件下で除去し、ウラシルを形成することができる。このようにして、潜在的にすべてのシトシンは、ウラシルに変換される。しかしながら、任意のメチル化されたシトシンは、メチル化による保護のために改変試薬で変換され得ない。
【００３５】
核酸を亜硫酸水素塩で処理するための好ましい方法は、本明細書中で参照により援用されるＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（オーストラリア）の国際公開第２００４／０９６８２５号パンフレットに見出すことができる。
【００３６】
処理されたＤＮＡの両方の鎖が、同じ増幅反応において増幅される必要がない場合、４種類のプライマー（すなわち、ＤＮＡの各改変鎖につき２種類のプライマー）を使用することができる。
【００３７】
第２の態様において、本発明は、等温ＤＮＡ増幅のためのキットを提供し、本キットは、
ＤＮＡポリメラーゼ；
鎖置換が可能な酵素；および
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素
を備える。
【００３８】
好ましくは、本キットは、さらにＤＮＡ増幅に必要な添加物を備える。
【００３９】
好ましくは、本キットは、さらに本キットを使用するための指示書を備える。
【００４０】
好ましい形態において、ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換が可能な酵素は、同じ酵素である。
【００４１】
第３の態様において、本発明は、少なくとも１つの内部非標準塩基を含む等温ＤＮＡ増幅のための、およびＤＮＡのある領域に結合したときに、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じることができるか、または塩基を切除することができる酵素によって認識される部位を形成するプライマーを提供する。
【００４２】
好ましくは、上記非標準塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格中に挿入され得る化学物質である。より好ましくは、上記非標準塩基は、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、５−メチルシトシン、ヒドロキシウラシル、リボヌクレオチドおよびウラシルからなる群から選択される。より好ましくは、上記非標準塩基はデオキシイノシンである。
【００４３】
第４の態様において、本発明は、実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、本発明の第２の態様に記載のキットの使用を提供する。
【００４４】
第５の態様において、本発明は、実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、本発明の第４の態様に記載のプライマーの使用を提供する
【００４５】
第６の態様において、本発明は、実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用を提供する。
【００４６】
第７の態様において、本発明は、実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素の使用を提供する。
【００４７】
第８の態様において、本発明は、実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、鎖置換能力を有するＤＮＡポリメラーゼの使用、および二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除する酵素の使用を提供する。
【００４８】
本発明の増幅方法は、ＰＣＲまたは他の公知のＤＮＡ増幅プロセスに置き換わるものとして、使用することができる。用途としては、疾患の検出、所望の遺伝子またはＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメントの増幅、ＳＮＰ検出、リアルタイム増幅手順、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅、全ゲノム増幅方法、クローニング法の補助、細胞学的検体におけるＤＮＡのインサイチュ増幅（例えば、切片または標本における微生物の検出、食品中の微生物混入の検出、様々な癌におけるＢＣＲ−ＡＢＬ転座などの染色体のブレークポイントの増幅、発癌性であり得、疾患進行を予測し得る、染色体に挿入された配列（ＨＰＶフラグメント挿入など）の増幅、正常細胞対癌性細胞におけるメチル化配列対非メチル化配列の検出、および胚盤胞発生の正常性についてのＩＶＦ試験におけるメチル化変化についてのインサイチュ試験が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明の独特の利点は、二本鎖ＤＮＡにおいて直接行うことができるという点である。本発明はまた、等温増幅の前にＲＮＡの逆転写を行うことによってＲＮＡに対して使用することもできる。さらに、本発明は、増幅のために加熱または冷却を必要としない。本発明に記載の方法は、高度な研究室の設備を必要とせずに、「野外で」、すなわち室温または外界温度で行うことができることが企図される。
【００５０】
本明細書を通して、文脈が他に求めない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、他の任意のエレメント、整数もしくは工程、またはエレメント、整数もしくは工程の群を含むのではなく、述べられたエレメント、整数もしくは工程、またはエレメント、整数もしくは工程の群を含むことを示すと理解される。
【００５１】
本明細書中に含まれる文書、行為、材料、デバイス、論文などの記述のいずれもが、単に本発明の状況を提供するだけの目的である。これらの事項の任意のものまたはすべてが、従来技術の基礎の部分を形成すること、または、それらがあたかも本発明の開発の前に存在したように本発明の関連分野における通常の一般的な知識であったということの承認とみなされるべきでない。
【００５２】
本発明をより明確に理解するために、以下の図面および実施例を参照して好ましい実施形態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
発明を実施するための態様
材料および方法
非標準塩基
非標準塩基は、本明細書中で、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格中に挿入され得る化学物質と定義される。非標準塩基の例としては、デオキシイノシン、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、Ｃを有する５ブロモ−ｄＵイノシン、リボヌクレオチド、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
非標準塩基であるデオキシイノシンは、本発明によって有用であると見出された。
【００５５】
この非標準塩基は、本発明において機能するために必ずしもヌクレオチドの構造を有する必要がないことに注意するべきである。
【００５６】
プライマー
プライマーは、任意の市販のＤＮＡ合成サービスまたは社内（研究室内）のＤＮＡ合成装置を使用して合成することができる。標準的なホスホアミダイト合成技術を使用して、非標準塩基を任意の位置でプライマーに組み込むことができる。
【００５７】
酵素
いくつかの様式が、本発明を実施するために利用することができる。
Ｉ．酵素エンドヌクレアーゼＶによって認識される非標準塩基であるデオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチド
ＩＩ．酵素Ｆｐｇによって認識される非標準塩基である、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
ＩＩＩ．酵素ｈＯＧＧ１によって認識される非標準塩基である、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
ＩＶ．酵素ＲＮａｓｅ  Ｈによって認識される非標準塩基であるリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
Ｖ．酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたはＵＳＥＲ酵素によって認識される非標準塩基であるウラシルを含むオリゴヌクレオチド
ＶＩ．酵素ＭｃｒＢＣによって認識される非標準塩基である５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド
【００５８】
鎖置換が可能な酵素としては、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、Ｖｅｎｔエキソ−、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔエキソ−、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼおよびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００５９】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換能力を有する、任意の適当なポリメラーゼであり得る。例としては、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）カタログ番号Ｍ０２１２Ｓ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２７５Ｓ）、Ｖｅｎｔエキソ−（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５７Ｓ）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔエキソ−（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５９Ｓ）、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２５３Ｓ）、９°ＮｍＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６０Ｓ）およびＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６９Ｓ）ＴｈｅｒｍｏＰｈｉ（商標）（Ｐｒｏｋａｒｉａ  ｅｈｆ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−である。
【００６０】
増幅混合物
プライマー中の非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【００６１】
鎖置換が可能なＤＮＡポリメラーゼは、エンドヌクレアーゼＶとした。
【００６２】
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識する酵素は、Ｋｌｅｎｏｗエキソ−とした。
【００６３】
反応容器中、
５０ｎｇのプライマー
５００μＭ  ｄＮＴＰ、
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）。
【００６４】
増幅
本発明による増幅は、以下の様式で起こる（図１を参照のこと）。
第１のプライマーが、ＤＮＡの一方の鎖に結合し（Ａ）、
ＤＮＡポリメラーゼが第１のプライマーを伸長して、非標準塩基を含む第１の新しく合成された鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｂ）、
ニッキング酵素が、伸長したＤＮＡの非標準塩基においてまたはその付近でニックまたは塩基切除を生じ（Ｃ）、
鎖置換酵素または鎖置換が可能なＤＮＡポリメラーゼが、第１の新しく合成された鎖を置換し（Ｄ）、
第２のプライマーが、置換された第１の新たに合成された鎖に結合し（Ｅ）、
ＤＮＡポリメラーゼが、第２のプライマーを伸長して、非標準塩基を含む第２の新たに合成された鎖を有する二本鎖分子を形成し（Ｆ）、
ニッキング酵素が、伸長したＤＮＡの非標準塩基においてまたはその付近でニックまたは塩基切除を生じ（Ｇ）、
鎖置換酵素または鎖置換が可能なＤＮＡポリメラーゼが、第２の新しく合成された鎖を置換し（Ｈ）、
第１のプライマーが、置換された第２の新しく合成された鎖に結合し（Ｉ）、そして
このプロセスが、繰り返されることにより、ＤＮＡ鎖の新たな合成が続いていく（Ｊ）。
【００６５】
ポリメラーゼは、５’−３’方向で第１のプライマーを複製するはずである。なぜなら、これが起きなければ、ニックの部位が失われてさらなる増幅が妨害されるので、この反応は、増幅の第３サイクルの後に停止してしまう。そして、上記の反応は、ニッキング、伸長および置換を繰り返すことによってサイクルが続く。プライマーは、通常、連続回の増幅を可能にするポリメラーゼによって再生される。
【００６６】
結果
等温増幅の特異性
本発明の特異性を証明するために、増幅反応を２つの人工ＤＮＡ分子（標的および非標的）において行った。
【００６７】
標的
【化１】
2008541705.tif 000002
【００６８】
非標的
【化２】
2008541705.tif 000003
【００６９】
この２つのオリゴヌクレオチドの差は、非標的オリゴヌクレオチドのすべてのＣｐＧ対をＴｐＧ対で置換したという点であった。
【００７０】
標的ＤＮＡ配列の検出用の以下のプライマーセットを使用して、等温増幅を行った。
【化３】
2008541705.tif 000004
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【００７１】
プライマーを、標準的なホスホアミダイト化学を使用して合成した。
【００７２】
増幅は、以下の条件下で行った。
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【００７３】
８ピコモルの標的オリゴヌクレオチドと非標的オリゴヌクレオチドの両方を１０２〜１０−４に希釈した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で２時間インキュベーションした。
【００７４】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そしてそのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカーは、Ｅ−ゲル低分子用（ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ）定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ゲルをＵＶ照射下で可視化した。
【００７５】
図２は、合成の亜硫酸水素塩メチル化標的配列および合成の亜硫酸水素塩非メチル化非標的配列を使用して、４２℃で２時間インキュベーションした後に生成された増幅産物の４％アガロースゲル解析を示す。これらの結果は、等温増幅反応の特異性を証明する。２種類の合成１１０ｂｐオリゴヌクレオチドが合成された（以下を参照のこと）。標的の合成亜硫酸水素塩メチル化ＤＮＡ配列の増幅に特異的であるように設計された単一の内部イノシン（Ｉ）塩基を含むオリゴヌクレオチドを使用して、等温増幅を行った。見ることができるように、この反応は、標的ＤＮＡ分子の増幅に特異的であった。過剰量の非標的ＤＮＡが存在する場合でさえも、非標的由来のバンドは認められなかった。この反応は、メチル化配列の検出に特異的であり、鋳型が大量に存在する場合でさえも非メチル化配列を増幅しなかった。このように、比較的低温（４２℃）であっても、比較的似ている２つの配列を区別することができた。
【００７６】
等温増幅の効率
増幅の効率を測定するために、本発明に記載の方法によって連続希釈した標的ＤＮＡを増幅した。
【００７７】
図３は、４２℃で４時間インキュベーションした後に生成された増幅産物の４％アガロースゲル解析を示す。矢印は、正しい増幅産物を示している。図３Ａにおける対は、インタクトなプライマー配列を含む全長増幅産物の結果および５’にイノシンが挿入されたプライマー配列を含む鎖置換産物の結果である。
【００７８】
セットＡは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでいた。
【化４】
2008541705.tif 000005
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【００７９】
セットＢは、同じプライマーを含んでいたが、反応物に１ｍＭ  ＤＴＴを補充した。
【化５】
2008541705.tif 000006
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【００８０】
プライマーは、標準的なホスホアミダイト化学を使用して合成した。
【００８１】
増幅は、以下の条件下で行った。
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【００８２】
標的ＤＮＡは、合成１１０ｂｐオリゴヌクレオチドとした。
【化６】
2008541705.tif 000007
【００８３】
８ピコモルの標的ＤＮＡを１０−３〜１０−７に連続希釈した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。
【００８４】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカーは、Ｅ−ゲル低分子量用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用してＵＶ照射下でゲルを可視化した。
【００８５】
図３に見られるように、この方法は、鋳型ＤＮＡの１０５希釈を使用して標的ＤＮＡ配列からＤＮＡ増幅することができた。さらに、図３Ｂに見られるように、最終濃度１ｍＭのＤＴＴを加えることによって、図３Ａと比較して増幅が改善された。これは、従来のＰＣＲとは異なり、たった１つのコピーを正確な開始事象の各々から生成することができる場合に、正確にハイブリダイズされた同じオリゴヌクレオチドに由来する複数の置換事象を有することが可能であったことを意味する。これは、理論上、本発明に記載の等温技術が、多コピーの標的を各々の正確な開始事象から生成できる場合に、ＤＮＡ配列を増幅する際にＰＣＲよりもさらに高い感度であり得るということを意味する。
【００８６】
ＰＣＲ増幅比較
市販の増幅標準と本発明の効率を比較するために、同じプライマーおよび標的ＤＮＡを使用してＰＣＲを行った。
【００８７】
ＰＣＲは、以下のプライマーを使用して行った。
【化７】
2008541705.tif 000008
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【００８８】
ＰＣＲ反応混合物を、全反応容積２５μｌにおいて×１Ｐｒｏｍｅｇａマスター混合物中の１００ｎｇの上記各プライマーを使用して調製した。ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーマルサイクラーにおいて、以下の条件下、９５℃３０秒間、５０℃４５秒間、６８℃４５秒間を２５サイクルの増幅で、ＰＣＲ産物のサンプルを増幅した。
【００８９】
標的ＤＮＡは、合成１１０ｂｐオリゴヌクレオチドとした。
【化８】
2008541705.tif 000009
【００９０】
８ピコモルの標的ＤＮＡを１０−２〜１０−８に連続希釈した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加えた。
【００９１】
１０μｌのＰＣＲ由来産物を１０μｌの水と混合し、ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ６０００−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカーは、Ｅ−ゲル低分子用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。
【００９２】
図４は、ＤＮＡ増幅の等温方法と従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）との直接比較を示す。ＰＣＲを使用した場合は、鋳型ＤＮＡの１０６希釈を使用した増幅されたバンドを見ることができるだけであった。２５サイクルの増幅の使用は、通常、１２ＳリボソームＤＮＡ配列などの多コピーの標的の増幅を成功させるのに十分である。
【００９３】
これらの結果から、ＤＮＡ増幅の等温方法が、迅速であり、感度が高く、また、ＤＮＡ増幅に特異的な方法であることが分かる。この方法は、高価なサイクル装置を必要としないので、任意の通常の研究室または医師の診療室においてでさえも行うことができるであろう。
【００９４】
二本鎖ＤＮＡの直接増幅
図５は、ヒトゲノムＤＮＡ由来の１２Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の増幅を示す。増幅は、以下の条件下で行った。
９μｌの×０．５Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、
５０ｎｇの各オリゴヌクレオチドプライマー
【化９】
2008541705.tif 000010
５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２ならびに１５０ｎｇ、１５ｎｇ、１．５ｎｇおよび０．１５ｎｇの濃度の１μｌのヒトゲノムのゲノム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃Ｇ１４７Ａ）。反応混合物を９５℃で２分間加熱し、そして氷上で急冷した。次に、反応混合物に、１０μｌの×０．５Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−および１ｍＭのＤＴＴを補充した。
【００９５】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカーは、Ｅ−ゲル低分子用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。
【００９６】
ウイルスＤＮＡ増幅
全長ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のウイルスゲノムＨＰＶ１ａ（４５０２１）、ＨＰＶ１６（４５１１３Ｄ）およびＨＰＶ１８（４５１５２Ｄ）を含むプラスミドをＡＴＣＣから入手した。供給者の推奨によって指摘されているようにプラスミド調製物を調製した。Ｑｉａｇｅｎプラスミド中型キット（Ｃａｔ＃１２１４３）を使用してプラスミドを精製した後、ＨＰＶ−１ａおよびＨＰＶ−１６についてはＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ  Ｃａｔ＃Ｒ０１０４Ｓ）で、またはＣｌａＩ（ＮＥＢ  Ｃａｔ＃Ｒ０１９７Ｓ）で、製造者の指示に従ってプラスミドを線状にした。等温増幅のための鋳型となるようにプラスミドの１０倍連続希釈物を滅菌水に調製した。
【００９７】
標的ＨＰＶ  ＤＮＡ配列の検出用の以下のプライマーセットを使用して、等温増幅を行った。
ＨＰＶ−１ａプライマー
【化１０】
2008541705.tif 000011
【００９８】
ＨＰＶ−１６
【化１１】
2008541705.tif 000012
【００９９】
ＨＰＶ−１８
【化１２】
2008541705.tif 000013
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【０１００】
プライマーを標準的なホスホアミダイト化学を使用して合成した。
【０１０１】
増幅を以下の条件下で行った。
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【０１０２】
１００ｎｇ／μｌ〜１００ｆｇ／μｌの範囲で、精製プラスミドＤＮＡの１０倍連続希釈物を調製した。プラスミド希釈物を９５℃で２分間加熱し、そして、必要になるまで氷上で急冷した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。
【０１０３】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカー（Ｍ）は、Ｅ−ゲル低分子用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。結果を図６に示す。
【０１０４】
ＨＰＶ１８（４５１５２Ｄ）を、等温系を使用した増幅に事前の熱処理が必要であるか否かを判定するために１０倍連続希釈を行った。
【０１０５】
標的ＨＰＶ  ＤＮＡ配列の検出用の以下のプライマーセットを使用して、等温増幅を行った。
ＨＰＶ−１８
【化１３】
2008541705.tif 000014
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【０１０６】
標準的なホスホアミダイト化学を使用して、プライマーを合成した。
【０１０７】
増幅を以下の条件下で行った。
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【０１０８】
１００ｎｇ／μｌ〜１ｎｇ／μｌの範囲の精製プラスミドＤＮＡの１０倍連続希釈物を調製した。次に、事前に変性していない１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカー（Ｍ）は、Ｅ−ゲル低分子用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。結果を図７に示す。
【０１０９】
この結果は、ある一定の場合において、等温増幅の前に二本鎖ＤＮＡ鋳型の最初の変性が必要ないことを示唆する。
【０１１０】
非標準塩基の置換
以下の標的配列の検出用の以下のプライマーセットを使用して、等温増幅を行った。
【化１４】
2008541705.tif 000015
【０１１１】
野生型順方向プライマー
【化１５】
2008541705.tif 000016
【０１１２】
野生型逆方向プライマー
【化１６】
2008541705.tif 000017
非標準塩基は、Ｎ＝デオキシイノシンとした。
【０１１３】
次に、オリゴヌクレオチド中のイノシン配置の効果を判定するために、４組のプライマーを比較した。
【０１１４】
標準的なホスホアミダイト化学を使用して、プライマーを合成した。
【０１１５】
増幅を以下の条件下で行った。
９μｌの×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ＵエンドヌクレアーゼＶ、２Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【０１１６】
１０−２希釈〜１０−６の範囲で、標的ＤＮＡの１０倍連続希釈物を調製した。次に、１μｌの希釈標的ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。
【０１１７】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカー（Ｍ）は、Ｅ−ゲル低分子量定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。結果を図８に示す。増幅されたＤＮＡについての結果は、行われた反応において、イノシンが配列中のＧを置換したとき、より効率的であったことを示唆した。さらなる実験から、イノシンがＣｐＧジヌクレオチドにおけるＧを置換したとき、このＤＮＡ増幅試験についてイノシンの好ましい配置がＣＩであったことが示唆された。
【０１１８】
リボヌクレオチドを使用した増幅
以下の標的ＤＮＡ配列の検出用のプライマーセットを使用して等温増幅を行った。
【化１７】
2008541705.tif 000018
非標準塩基は、ｒ＝リボヌクレオチドとした。
【０１１９】
標準的なホスホアミダイト化学を使用して、プライマーを合成した。
【０１２０】
増幅を以下の条件下で行った。
９μｌの×１０反応緩衝液（ＮＥＢ緩衝液１、Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液またはＳｔｏｆｆｅｌ緩衝液のいずれか）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｕ  ＲＮａｓｅＨ、２．５Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【０１２１】
１０−１〜１０−３の範囲で標的ＤＮＡの１０倍連続希釈物を調製した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。
【０１２２】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカー（Ｍ）は、Ｅ−ゲル低分子量定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。結果を図９に示す。
【０１２３】
８−デオキシグアニンを使用した増幅
以下の標的ＤＮＡ配列の検出用のプライマーセットを使用して、等温増幅を行った。
【化１８】
2008541705.tif 000019
非標準塩基は、ＮＮＮＧ＝８−デオキシグアニンとした。
【０１２４】
標準的なホスホアミダイト化学を使用して、プライマーを合成した。
【０１２５】
以下の条件下で増幅を行った。
９μｌの×１０反応緩衝液×１Ｓｔｏｆｆｅｌ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、米国）中、５０ｎｇの上記各オリゴヌクレオチドプライマー、５００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１Ｕ  Ｆｐｇ、２．５Ｕ  Ｋｌｅｎｏｗエキソ−。
【０１２６】
１０−１〜１０−３の範囲で標的ＤＮＡの１０倍連続希釈物を調製した。次に、１μｌの希釈ＤＮＡを上記反応混合物に加え、４２℃で４時間インキュベーションした。
【０１２７】
１０μｌの増幅産物を１０μｌの水と混合し、その増幅産物をＥ−ゲル４８  ４％アガロース（ＨＲ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃Ｇ８０８０−０４）上で分離し、そのゲルを、Ｐｏｗｅｒｂａｓｅ（商標）を使用して電気泳動した。マーカー（Ｍ）は、Ｅ−ゲル低分子量用定量的ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１２３７３−０３１）とした。Ｋｏｄａｋ  ＵＶＩｄｏｃ  ＥＤＡＳ  ２９０システムを使用して、ＵＶ照射下でゲルを可視化した。結果を図１０に示す。
【０１２８】
広く記載してきたように、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるような本発明に対して多くの変形および／または改変がなされ得ることを当業者は理解するだろう。従って、本実施形態は、すべての点において、例示としてみなされるべきであり、限定とみなされるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、本発明に記載の核酸増幅方法の模式図である。
【図２】図２は、本発明に記載の方法を使用して標的配列を増幅した結果のアガロースゲル解析を示す。
【図３】図３は、本発明に記載の方法を使用して標的配列を増幅した結果のアガロースゲル解析を示す。
【図４】図４は、ＤＮＡ増幅の等温方法と従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とを直接比較したアガロースゲル解析を示す。
【図５】図５は、ヒトゲノムＤＮＡ由来の１２Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の増幅を示す。
【図６】図６は、様々なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡの等温増幅の結果を示す。
【図７】図７は、反応に対する変性なしの効果を試験した、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ＤＮＡの等温増幅の結果を示す。
【図８】図８は、プライマー中の非標準塩基の様々な配置を使用した等温増幅を示す。
【図９】図９は、ＲＮａｓｅ  ＨとＫｌｅｎｏｗエキソ−とを組み合わせて、リボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用した等温増幅の結果を示す。
【図１０】図１０は、ｆｐｇとＫｌｅｎｏｗエキソ−とを組み合わせて、８−デオキシグアニンを含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用した等温増幅の結果を示す。
【図１】
2008541705.tif 000020
【図２】
2008541705.tif 000021
【図３】
2008541705.tif 000022
【図４】
2008541705.tif 000023
【図５】
2008541705.tif 000024
【図６】
2008541705.tif 000025
【図７】
2008541705.tif 000026
【図８】
2008541705.tif 000027
【図９】
2008541705.tif 000028
【図１０】
2008541705.tif 000029
【配列表】
2008541705000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月20日(2007.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等温ＤＮＡ増幅のための方法であって、
増幅されるＤＮＡに、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第１のプライマーであって、リボヌクレオチドを含まない第１のプライマーと、
ＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的であり、非標準塩基を含む第２のプライマーであって、リボヌクレオチドを含まない第１のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
鎖置換が可能な酵素と、
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識し、一方のＤＮＡ鎖において、該非標準塩基においてもしくはその付近で、ニックを生じるか、または塩基を切除する酵素と
を含む増幅混合物を提供する工程；および
該ＤＮＡを実質的に温度サイクル無しで増幅する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、前記増幅混合物を加える前、加えている間、または加えた後に変性される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプライマーが、ＤＮＡの第１の鎖のある領域に少なくとも部分的に相補的であり、前記第２のプライマーが、ＤＮＡの第２の鎖のＤＮＡのある領域に少なくとも部分的に相補的である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、ＰＮＡ／オリゴヌクレオチドまたはＩＮＡ／オリゴヌクレオチドなどのキメラ性のオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プライマーが、デオキシオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記プライマーが、２つ以上の非標準塩基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プライマーがＤＮＡに結合するとき、該プライマーが、前記酵素によって認識される部位を形成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記非標準塩基が、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記鎖置換酵素が、ヘリカーゼ、ＡＰエンドヌクレアーゼ、および任意の鎖置換が可能な酵素のうちのミスマッチ修復酵素からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換能力も有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識することができる前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）、Ｆｐｇ、ｈＯＧＧ１、ＭｃｒＢＣおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ増幅に必要な添加物をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記添加物が、ヌクレオチド、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンなどの緩衝液または希釈剤、補助因子、およびＴ４ｇｐ３２などの一本鎖結合タンパク質を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、２０℃〜７５℃の温度で行われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記温度が、約４２℃である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡが、一本鎖改変ＤＮＡを形成するための条件下で、シトシン塩基を改変するが、５’−メチル−シトシン塩基を改変しない改変剤で前処理される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記改変剤が、亜硫酸水素塩、酢酸塩またはクエン酸塩から選択され、処理が、実質的なＤＮＡ断片化を生じない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変剤が、亜硫酸水素ナトリウムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチルシトシンおよびウラシルからなる群から選択される少なくとも１つの内部非標準塩基を含み、ＤＮＡのある領域に結合したとき、一方のＤＮＡ鎖において、前記非標準塩基の部位でもしくはその付近で、ニックを生じることができるかまたは塩基を切除することができる酵素によって認識される部位を形成する、等温ＤＮＡ増幅のためのプライマー。
【請求項２３】
前記非標準塩基が、デオキシイノシンである、請求項２２に記載のプライマー。
【請求項２４】
実質的に温度サイクル無しでＤＮＡ増幅を行うための、請求項２２または２３に記載のプライマーの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
必要に応じて、上記ＤＮＡは、増幅混合物を加える前、加えている間または加えた後に変性され得る。
第１及び第２のプライマーはリボヌクレオチドを含まない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
非標準塩基（すなわち非標準ＤＮＡ塩基）は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格に挿入され得る化学物質と本明細書中において定義される。非標準塩基の例としては、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、ヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、５ヒドロキシウリジン、Ｃを有する５ブロモ−ｄＵイノシン、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、非標準塩基は、デオキシイノシンである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
酵素は、二本鎖ＤＮＡ中の非標準塩基を認識することができ、その非標準塩基の部位で、もしくはその付近でニックを生じるか、または塩基を切除することができる任意の適当な酵素であり得る。例としては、エンドヌクレアーゼＶ（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０５Ｓ）、Ｆｐｇ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４０Ｓ）、ｈＯＧＧ１（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２４１Ｓ）、ＡＰＥ１（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８２Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２６８Ｓ）、エンドヌクレアーゼＩＶ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０４Ｓ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２９９Ｓ）、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３０２Ｓ）、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）、ＭｃｒＢＣ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２７２Ｓ）およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＮＥＢカタログ番号Ｍ０２８０Ｓ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、この酵素は、エンドヌクレアーゼＶである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
好ましくは、上記非標準塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格中に挿入され得る化学物質である。より好ましくは、上記非標準塩基は、デオキシイノシン、８デオキシグアニン、５−メチルシトシン、ヒドロキシウラシル、およびウラシルからなる群から選択される。より好ましくは、上記非標準塩基はデオキシイノシンである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
発明を実施するための態様
材料および方法
非標準塩基
非標準塩基は、本明細書中で、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）以外の、ＤＮＡ骨格中に挿入され得る化学物質と定義される。非標準塩基の例としては、デオキシイノシン、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシル、５−メチル−ｄＣ、Ｃを有する５ブロモ−ｄＵイノシンおよびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
酵素
いくつかの様式が、本発明を実施するために利用することができる。
Ｉ．酵素エンドヌクレアーゼＶによって認識される非標準塩基であるデオキシイノシンを含むオリゴヌクレオチド
ＩＩ．酵素Ｆｐｇによって認識される非標準塩基である、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
ＩＩＩ．酵素ｈＯＧＧ１によって認識される非標準塩基である、８デオキシグアニンまたはヒドロキシウラシルを含むオリゴヌクレオチド
ＩＶ．酵素ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたはＵＳＥＲ酵素によって認識される非標準塩基であるウラシルを含むオリゴヌクレオチド
Ｖ．酵素ＭｃｒＢＣによって認識される非標準塩基である５−メチルシトシンを含むオリゴヌクレオチド
【国際調査報告】
2008541705.tif 000030
2008541705.tif 000031
2008541705.tif 000032
2008541705.tif 000033