(57)【要約】  【課題】本発明は生物流体中のサブ集団の細胞を捕獲するためのマイクロ流体デバイス及びその使用に関する。前記デバイスは流体を循環するためのチャンバー（１）を含有し、その内壁（５）は組織化自己集合シラン層の形態で共有結合固定化表面を備えており、そこに該集団の細胞の特異的同定のための生物分子層を固定する。
2008505630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団に特異的な認識生物分子の層で固定されたシランの組織化自己集合層によりその内壁（５）がグラフトされている、流体の循環のためのチャンバー（１）を備えた細胞集団を捕獲するためのマイクロ流体デバイスであって、シランの組織化自己集合層が、式（Ｉ）：
【化１】
2008505630.tif 000014
（ここで、
−ｎは、１５と３５の間、好ましくは２０と２５の間であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ６アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Ａは、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｋ−（ＣＨ２）ｉ−基を表し（ここでｋは０と１００の間、好ましくは０と５の間の整数を表し）、そしてｉは０以上、好ましくは０または１と等しい整数を表し、
−Ｂは、−ＯＣＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ、−Ｒ−、−ＣＯＲ、−ＮＲ１Ｒ２、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、ＣＯＯＲ、−ＳＲまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−Ｒ、Ｒ１及びＲ２は：水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖（これは１以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、１〜２４炭素原子を含む）、あるいは、１以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される（Ｒ＝ＨまたはＲ＝アルカリのとき、Ｂ≠−Ｒと理解される））
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含むことを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
生物分子層が、カップリング剤層を介してシランの組織化自己集合層と結合することを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
特異的なグラフトを備えた流体の循環のためのチャンバー（１）の内壁（５）が、ガラスまたはシリコンスライド、あるいは表面に−ＯＨ官能基を備えた任意の固体金属表面であり得る固体支持体（５）から構成されることを特徴とする、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
流体の循環のためのチャンバー（１）の寸法が、それが層流チャンバーであるように選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５】
流体の循環のためのチャンバー（１）が、キャビティの二つの端に配置される２つのオリフィス（３、４）を備えた平行六面体（parallelepipedal）タイプのキャビティ（２）を備え、流体が第一オリフィス（３）を介して注入され、そして第二オリフィス（４）を介して収集されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項６】
流体の循環のためのチャンバー（１）が、３０μｌ以下、さらに好ましくはまた１２μｌ以下の容量を有するキャビティ（２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項７】
流体の循環のためのチャンバー（１）に試料流体を注入することを可能にするポンプ（１０）を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項８】
特異的なグラフトを備えた壁（５）が、流体の循環のためのチャンバー（１）を通過する流れと平行であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項９】
加水分解可能な基が：ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ’）２基及び−ＯＲ’基から選択され、Ｒ’が飽和、直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１０】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が塩素原子を表すことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１１】
ｎが２２以上であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１２】
該カップリング剤が：
−ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート；
−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−シクロへキサンカルボキシレート
−プロテインA
−プロテインＧ
−Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート
−κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−ヒドラジド
から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のデバイス。
【請求項１３】
該認識生物分子がタンパク質であり、そのリシンの側鎖ＮＨ２官能基がチオール（ＳＨ）基に変換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１４】
該認識生物分子が：
−  モノクローナル抗体１７−１Ａ、ＭＯＣ３１、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＨＡ−１２５（これらは細胞間接着分子Ｅｐ−ＣＡＭを認識する）
−  抗−ＨＥＲ−２（抗−ヒトＥｒＢ２）抗体
−  抗−ＭＵＣ１（ＣＴ２  Ｍａｂ）抗体
から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１５】
キャビティ（２）ならびに細胞及び流体の循環のためのインレット（３）とアウトレット（４）オリフィスを備えた層流チャンバー（１）、化学的に官能化され且つ該キャビティ（２）に固定されたチャンバーの床を構成する除去可能なガラスまたは結晶性Ｓｉスライド（５）、該開口部（３、４）を介する流体の導入及び排出を制御する蠕動ポンプ（１０）、生物試料（１１）が配置される少なくとも一つのレセプタクル（１２）、レセプタクル（１２）を該開口部（３）に接続する少なくとも一つの循環チューブ（１３）、ならびに該開口部（４）に接続された少なくとも一つのアウトレットチューブ（１８）を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１６】
レセプタクル（１２）が、層流チャンバー（１）に導入するためのチューブ（１７）を介して開口部（３）に接続されていることを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
試薬（１４ａ、１４ｂ）を備える少なくとも一つのレセプタクル（１４）、チューブ（１７）を介してレセプタクル（１４）を開口部（３）に接続する循環チューブ（１５）、該チューブ（１５）及び（１３）及び（１７）間の接続を調節するための該循環チューブ（１５）、（１３）及び（１７）の交差部分のバルブ（１６）を備えることを特徴とする、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
キャビティ（２）と接続した排出チューブ（２０）及び再循環チューブ（２１）ならびに該チューブ（１８）、（２０）及び（２１）間の流体を方向付けるためのバルブ（１９）を備えることを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１９】
請求項１〜１９のいずれか一つに記載のデバイスの流体の循環のためのチャンバー（１）に生物試料を通過させる工程を含むことを特徴とする、生物試料中の細胞捕獲プロセス。
【請求項２０】
流体の循環のためのチャンバー（１）に生物試料を通過させる少なくとも２工程を含むことを特徴とする、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
さらに、細胞を脱着する工程を含むことを特徴とする、請求項１９または請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２３】
１０ｐＮ〜１ｎＮ、有利には２０ｐN〜５００ｐＮ、好ましくは３０〜３００ｐＮ、さらに好ましくは５０〜１５０ｐＮの範囲の強さで、細胞がその受容体と相互作用を有する特異的表面マーカーの、生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
血液試料からの循環している腫瘍細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２５】
乳ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、結腸ガンまたは肺ガンから選択される病状の進行の診断及びモニタリングにおける、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
母体由来の血液試料からの胎児細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２７】
骨髄中の循環している腫瘍細胞の検出における、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、新規のマイクロ流体デバイス及び生物学的流体中の細胞のサブ集団（subpopulation）の捕獲におけるその使用である。
【０００２】
より詳細には、本発明は流体の循環（circulation）のためのチャンバーを備えたデバイスに関し、この一つの壁は、このチャンバーで循環される生物学的試料中の細胞のサブ集団の捕獲を可能にするグラフト（grafting）を備える。このデバイスは、この生物学的試料に非常に少量で存在する細胞の捕獲を可能にする。本発明の他の主題は、生物学的試料中の細胞を捕獲するためのプロセスであり、このプロセスは、該生物学的試料をこのようなデバイスを通過させる工程を含むことを特徴とする。
【０００３】
本発明のデバイスは、患者の血液試料からの循環している（circulating）腫瘍細胞の精製及び特徴付けのために、または、母親から得た血液試料からの胎児細胞の精製及び特徴付けのために使用され得る。
【背景技術】
【０００４】
乳ガンは、欧州及び米国の女性の最も一般的な悪性腫瘍である。転移（metastatic dissemination）のモニタリングは病状の予後において重要なファクターである。循環している腫瘍細胞（ＣＴＣ）の精製及び分子の特徴付けは、初期段階の微小転移性病態を評価するためのパラメーターとしても、また後期段階の表現型（phenotypic）及び遺伝子型（genotypic）ツールとしても、患者のモニタリングにおいて重要な挑戦（challenge）を表す。
【０００５】
循環している腫瘍細胞の精製及び特徴付けの可能性は、乳ガンだけでなく前立腺、腎臓、膀胱、肝臓、結腸または肺ガンのような他のタイプのガンの進行の診断及びモニタリングに主に関心が向けられる。
【０００６】
ＣＴＣを精製するための現在の手順は、CELLection kitを使用し、これは特異的な抗上皮抗体がグラフトされた磁気ビーズ（Dynal（登録商標）RAM IgGI CELLection TM Kit）で捕獲されることによる細胞分離の原理に従って行う。この方法は、幾つかの非常にやっかいな遠心処理段階を併用する。これは実質的に１日半の操作を必要とする。収率は非常に低い。ＣＴＣの損失は非常に高く、これは主に該磁気ビーズへのそれらの付着に起因する。これが、この技術をルーチンに臨床的な応用において使用することが困難であることの理由である。
【０００７】
細胞の捕獲を可能にする層流チャンバーを備えたデバイスは当該技術分野で知られている。
【０００８】
文献WO 03/091730は、白血球の移動をモニターすることを目的とするデバイスを開示しており、このデバイスは、チャネルを介して互いに接続された２つのチャンバーを備える。目的は、白血球の血管壁への結合メカニズムを研究することである。内皮細胞を構成する白血球の移動のモジュレータである化合物は該チャネル内に配置され得る。試験化合物もまたこのデバイスに配置され得る。
【０００９】
文献US 2003/0044766は２つのタイプの細胞間の相互作用を検出するための方法及びデバイスを開示しており、一つは、第二のタイプの細胞を含む分散物の層流にさらされる通路に固定される。
【００１０】
このデバイスは、白血球集団と内皮細胞の間の相互作用を研究することを目的とする。
【００１１】
文献A. Pierres et al., Faraday Discuss., 1998, 111, 321-330は、ストレプトアビジンで被覆された球体（spheres）とビオチンによりグラフトされたチャンバー壁との結合の形成を研究するための層流チャンバーの使用を開示している。
【００１２】
文献M.R. Wattenberger et al., Biophys. J., vol. 57, April 1990, 765-777は、リガンドで被覆された表面と受容体を備えた細胞との間の相互作用を支配するパラメーターを詳細に研究している。リポソームに取り込まれた受容体は細胞モデルとして使用された。試験は層流チャンバー内で行われた。
【００１３】
剪断力、リガンド−受容体結合力及び表面の受容体密度は重要なパラメーターである。
【００１４】
文献WO 00/23802は生物学的試料中の細胞の結合能を測定することを可能にする診断方法を開示しており、これはこの試料を、細胞に結合しているサブストレート（substrate）で被覆された表面上を通過させることからなる。
【００１５】
この文献はより詳細には、血小板異常及び血栓症の診断に向けられる。適用される剪断条件は、これらの細胞がin vivoの血管中で経験する条件を真似ることを目的とする。
【００１６】
しかし、先行技術文献は本質的には、血小板粘着または受容体を備えている細胞モデル（リポソーム球体）を研究するために、２つの細胞集団：白血球及び内皮細胞の間の相互作用を研究することを目的とするデバイス及びプロセスに関する。
【００１７】
これらの文献はいずれも、循環している腫瘍細胞または胎児細胞の捕獲及び研究に関するものではない。
【００１８】
先行技術文献は、扱う試料中に高濃度で存在し、そして、それらの表面に非常に高密度で存在している受容体で被覆された細胞の集団の挙動の研究に関する。
【００１９】
本発明がより詳細に関心を持つ細胞は、試験される生物学的試料において、それらより数で非常に勝る他の細胞集団中で、非常に低濃度で存在するという明確な特徴を有する。これらの細胞の特異的な受容体は、それらの表面に低密度で発現される。これが、これらを捕獲すること、及びこれらを生物学的試料から識別することを特に難しくしているこれらの２つの明確な特徴である。
【００２０】
先行技術の層流デバイス（この一つの壁はＣＴＣｓのためのリガンドにより従来法でグラフトされる）を使用しても血液試料中のＣＴＣｓを捕獲することはできない（後者は非常に少量しか存在せず、そしてこの捕獲に関する抗原抗体相互作用は５０〜１５０ピコニュートンオーダーであり、これは２つの細胞集団間の接着のための分子の相互作用と比較して非常に低い）。本発明はより詳細には細胞集団の捕獲に関し、それらの特異的な表面マーカーはそれらの受容体と１０ｐN〜１ｎＮ、有利には２０ｐN〜５００ｐＮ、好ましくは３０〜３００ｐＮ、さらに好ましくは５０〜１５０ｐＮの範囲の強さの相互作用を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明が解決しようと試みる問題は、少量の生物試料を使用し、そしてできるだけ高い捕獲効率を有する、生物学的試料中の少数のＣＴＣタイプの細胞集団の捕獲である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この問題は、流体の循環のためのチャンバーを含むデバイスによって解決され得、この一つの内壁には特定のグラフトを備える。
【００２３】
本発明のデバイスが備えるグラフトは、捕獲することが望ましい細胞のサブ集団に特異的なリガンド集団をグラフトし得る均質で一様な表面（homogeneous uniform surface）を提示するという明確な特徴を有する。該表面の均質性は、他の装置の条件下で、この捕獲を実施することができない弱力の（low-strength）リガンド−受容体または抗原−抗体相互作用に有利である。
【００２４】
流体の循環のためのチャンバーはキャビティの２つの端に配置される２つのオリフィスを含むキャビティ、好ましくは平行六面体（parallelepipedal）タイプのキャビティを備え、該流体は第一オリフィスを介して注入され、そして第二オリフィスを介して収集される。
【００２５】
流体の循環のためのチャンバーの寸法は、それが層流チャンバーであるように有利に選択される。それはまた、文献US 6 408 878に開示されるようなマイクロ流体デバイスのキャビティでもあり得る。有利には、流体の循環のためのチャンバーの内部キャビティは３０μｌ以下、さらに好ましくはまた１２μｌ以下の容量を有し、これは少量の生物学的試料を処理することを可能にする。
【００２６】
有利には、該デバイスは試料流体を流体の循環のためのチャンバーに注入することを可能にするポンプを備える。さらに有利には、該デバイスは、処理される試料が収集される前に流体の循環のためのチャンバーを１回より多く通過するように、ポンプに接続したループ中で流体を循環するための回路（circuit）を備える。
【００２７】
本発明に従うと、流体の循環のためのチャンバーの少なくとも一つの壁は特異的なグラフトを備える。好ましくは、それは、流体の循環のためのチャンバーを通過する流れと平行な壁である。好ましくは流体の循環のためのチャンバーは、平行六面体であり、そしてその内面の一つは特異的なグラフトを含む。
【００２８】
特異的なグラフトを備える流体の循環のためのチャンバー壁は、ガラスまたはシリコンスライド、あるいは該表面に−ＯＨ官能基を含む任意の固体金属表面であり得、かつ、流体の循環のためのチャンバー内に配置される、固体支持体で構成される。
【００２９】
該固体支持体（ガラス、Ｓｉまたは他のスライド）の表面は、均質なクロロシラン鎖の自己組織化単分子層により官能化される。
【００３０】
標的細胞の、特に循環している腫瘍細胞集団を認識するためのタンパク質エンティティ（entity）（抗体またはタンパク質リガンド）は、直接または好適なカップリング剤を介してクロロシラン層にグラフトされる。認識生物分子の選択性は、標的細胞集団の捕獲のために測定される。調製される固体支持体（スライド）はその後、流体の循環のためのデバイスに置かれる。
【００３１】
細胞捕獲のための固体支持体は、３工程：クロロシランのガラススライドへのグラフト、カップリング剤のグラフト（これは化学的カップリング剤、あるいはプロテインAまたはＧタイプの薬剤であり得る）、及び、最後にタンパク質認識エンティティのグラフト（細胞の膜受容体のための抗体またはリガンド）、において官能化される。図１は抗体によりグラフトされたこのタイプのガラススライドの説明であり：該固体支持体は、カップリング剤の層（リンカー）に共有結合を介して固定化されるシランの組織化自己集合層によりグラフトされる。標的細胞集団を特異的に認識するための生物分子の層は、共有結合でまたは非共有結合でカップリング剤に固定化される。カップリング剤の層の存在は任意であり：本発明の一つの別の形態に従うと、シランの組織化自己集合層に直接固定される認識生物分子を備えることができる。
【００３２】
無機表面に有機分子を共有結合で固定するためには、この表面に、無機支持体への有機分子の固定を確実にするカップリング分子をグラフトすることが最初に必要である。
【００３３】
有機ケイ素カップリング分子は、L.A. Chrisey et al. (Nucleic Acids Research, 1996, 24, 15, 3031-3039)、及びU. Maskos et al. (Nucleic Acids Research, 1992, 20, 7, 1679-1684)により、この目的のために提供されている。しかしながら、使用される分子、すなわち３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン及び様々なアミノシランは、該表面にランダムかつ再現性なく堆積するという欠点を示す。これらは、それらの上に不均質な膜を形成し、その厚みは制御できない；さらに、該膜はのちの化学処理に関してあまり丈夫ではなく、該膜の不均質性は特にシロキサン結合の保護を乏しくすることを示す。このように、このような分子の再現性の良好なグラフトを得ることは非常に困難である。該支持体へ、または支持体上に、オリゴヌクレオチドを固定または合成する前に、表面における立体障害を減じるために（例えばL.A. Chrisey et al.により記載された二官能性複素環式分子）、該表面をさらに親水性にするために(U. Maskos et al.は、エチレングリコール、ペンタエチレングリコール、またはヘキサエチレングリコールのグラフトを記載している)、及び／または、該表面官能基の低反応性を克服するために、さらなる表面反応が必要であり、さらなる操作はそれ自身制御されない。
【００３４】
UlmanはChem. Rev., 1996, 96, 1533-1554に、官能化アルキルトリクロロシランタイプの有機ケイ素化合物を使用することによる固体支持体上での組織化自己集合単層の形成を記載している。生物分子の固定のためのこれらの使用が提案されており、該方法は、この文脈では、チオール官能基による生物分子の修飾とヘテロ二官能性分子による表面の修飾がおそらく必要である。
【００３５】
有機ケイ素化合物は、この欠点を解決するための文献WO 01/53303に記載されている。これらの化合物は、組織化自己集合単層を固体支持体の表面に堆積するためのカップリング分子として使用され得る。このような分子は特に、核酸のような生物分子の固定のために使用されている。
【００３６】
先行技術の生物分子をグラフィティングする方法とは対照的に、WO 01/53303に開示される方法は、組織化自己集合単層上に固定化された生物分子によりグラフトされた固体支持体を得ることを可能にしている。この特徴は、この表面上に循環している生物学的試料中の低密度の特異的なセンサーを有する少数の細胞集団の捕獲に好ましい生物分子の均質な表面を提示することに反映される。
【００３７】
これは先行技術のグラフトが満足できる表面の均質性を得ることができないためであり、そして、この欠点の結果が、生物学的試料中の少数の標的細胞の捕獲レベルの低さである。
【００３８】
本発明のデバイスにおいて、固体支持体は、式（Ｉ）：
【００３９】
【化１】
2008505630.tif 000003
【００４０】
（ここで、
−ｎは、１５と３５の間、好ましくは２０と２５の間であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Ａは、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｋ−（ＣＨ２）ｉ−基を表し、ここでｋは０と１００の間、好ましくは０と５の間の整数を表し、そしてｉは０以上、好ましくは０または１と等しい整数を表し、
−Ｂは、−ＯＣＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ、−Ｒ−、−ＣＯＲ、−ＮＲ１Ｒ２、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、ＣＯＯＲ、−ＳＲまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−Ｒ、Ｒ１及びＲ２は：水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖（これは１以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、１〜２４炭素原子、好ましくは１〜６炭素原子を含む）、あるいは、１以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される）
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含有する組織化自己集合単層により修飾される。
【００４１】
用語「芳香族（aromatic）」は、１以上のアリール環、例えばフェニル基を有する任意の基、を意味すると理解される。
【００４２】
用語「組織化自己集合単層（organized self-assembled monolayer）」は分子の集合を意味すると理解され、ここで該分子は組織化されており、この組織化は該分子の鎖間における相互作用かつ強い結束作用のためであり、これは安定かつ規則正しい異方性膜を生じる(A. Ulman, Chem. Rev., 1996, 96, 1533-1554)。
【００４３】
固体支持体上に形成される組織化自己集合単層は、化学的及び構造的のいずれにおいても明確なパラメーターを有する緻密かつ均質な有機表面を得ることを可能にする。明確なｎ、ｍ、ｋ及びｉ値の式（Ｉ）の化合物の自己組織化特性によって得られるこの単層の形成は、各有機ケイ素化合物に関する再現性が非常に良い。さらに、非常に緻密な組織化自己集合単層の形成は、化学処理（酸または塩基処理）に対してシロキサン結合を保護し、これはこの表面上で様々な化学反応を行うことを可能にする。
【００４４】
本発明で使用する式（Ｉ）の有機ケイ素化合物は、Ａ基の性質及び使用され得るＢ末端基の多様性の点で、非常に多様な官能基及び高い反応性を有利に示し、当然に、これは、これらのＢ基を、当業者によく知られた有機化学反応に従い望ましく修飾及び官能化することが可能である。
【００４５】
上述した化合物は、支持体上に形成される組織化自己集合単層の均質性及び安定性の点で、該支持体上に確実かつ再現性良く生物分子を固定化することを特に有利に、また選択された式（Ｉ）の有機ケイ素化合物のために、可能にする。該生物分子は、修飾された支持体上に強力な共有結合を介して、有機ケイ素化合物と該固体支持体との間に生じるシロキサン結合を弱めることなく固定される。
【００４６】
好適な固体支持体は、一般的に水和された表面を有するもので、及び／またはヒドロキシル基を示す表面を有するものである。好ましくは、前記支持体は、ガラス、セラミック（例えば酸化物型の）、金属（例えばアルミニウムまたは金）及び半金属（例えばシリコン）からなる群から選択される。
【００４７】
本発明の意味において、用語「加水分解可能な（hydrolyzable）」は、化合物Ｘ１Ｈ、Ｘ２ＨまたはＸ３Ｈ（Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は式（Ｉ）で定義される通りである）を与えるために、水性メディウムにおいて酸と反応できる任意の基を意味すると理解される。
【００４８】
有利な実施形態に従うと、前記加水分解可能な基は、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ’）２基及び−ＯＲ’基からなる群から選択され、Ｒ’は飽和、直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ６アルキル基である。
【００４９】
Ｂ基及び加水分解可能な基に関して、好適なハロゲン原子は塩素、臭素またはヨウ素と十分に等しくフッ素である。
【００５０】
もう１つの有利な実施形態に従うと、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は塩素原子を表す。
【００５１】
有利には、ｎは２２以上である。
【００５２】
本発明に従う修飾された固体支持体の使用は、生物学的試料内のサブ集団を表す細胞を選択的に固定できるタンパク質エンティティ（抗体、細胞受容体のためのリガンド、タンパク質など）を共有結合で固定する支持体の製造に特に有利である。
【００５３】
本発明に従うグラフトされた固体支持体の製造は、以下の工程を含む：
ａ）上述の式（Ｉ）に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含む組織化自己集合単層により修飾された固体支持体の製造（ここで前記有機ケイ素化合物は、それらの末端で、保護されたカルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基を示す）；
ｂ）カルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基の必要に応じた脱保護；
ｃ）修飾された該固体支持体へのカップリング剤の必要に応じたグラフト；
ｄ）タンパク質エンティティのグラフト。
【００５４】
工程ａ）は、有利には以下の工程を経て行われる：
ｉ）該固体支持体からの汚染物質の除去、ならびにその表面の水和及び／または水酸化、
ｊ）不活化雰囲気下での、少なくとも一つの非極性炭化水素溶媒を含有する少なくとも２つの溶媒混合物への、上述の式（Ｉ）の有機ケイ素化合物（該化合物は、一端が、保護されたカルボン酸、ヒドロキシルまたはアミン官能基を示す）の導入、
ｋ）工程ｊ）で調製した溶液に浸漬することによる、工程ｉ）で得られた支持体のシラン化、
ｌ）自己組織化単層を保有する、５０と１２０℃の間の温度で、５分から一晩の期間の、工程ｋ）で得られたシラン化支持体の必要に応じたアニーリング、及び
ｍ）溶媒、好ましくは極性溶媒の酸による、工程ｋ）またはｌ）で得られた修飾された支持体のリンス。
【００５５】
シラン層で官能化された固体支持体の製造は、文献WO 01/53303において詳細に説明されている。
【００５６】
該固体支持体の用語「汚染物質（contaminants）」は、支持体自身の化学構造の部分を形成しない支持体表面に存在する油、ちり及び他のもののような任意の化合物を意味すると理解される。
【００５７】
該固体支持体の性質に従うと、工程ｉ）は、１以上の溶媒及び／または酸化剤及び／またはヒドロキシル化剤（例えばクロム酸／硫酸混合物）、洗浄液（例えばHellmanex（登録商標））、オゾンまたは任意の他の好適な処理を伴う光化学処理を使用して実施され得る。
【００５８】
工程ｊ）は、有利には、少なくとも１つの非極性炭化水素溶媒と少なくとも１つの極性溶媒の混合物中で実施される。この場合、非極性溶媒と極性溶媒の量比は好ましくは７０／３０と９５／５の間である。
【００５９】
実施例によると、制限を示唆するものではないが、工程ｊ）において、使用され得る非極性炭化水素溶媒はシクロヘキサンであり、また使用され得る極性溶媒はクロロホルムである。
【００６０】
工程ｊ）において、溶媒混合物中の有機ケイ素化合物の濃度は、好ましくは１×１０−５と１×１０−２モル／リッターの間である。
【００６１】
該支持体のシラン化の工程ｋ）は、使用する溶媒に応じて、１分と３日の間の時間で、及び−１０℃と１２０℃の間の温度で実施され得る。
【００６２】
カップリング剤をグラフトする工程ｃ）は、式（Ｉ）の基の末端官能基の性質に応じて様々な方法で実施され得る。
（ｉ）−ＮＨ２末端を有する鎖の場合：
ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のカップリング剤が選択され得る。タンパク質と反応することを目的とされる官能基は、スルホスクシンイミジル（ＢＳ３）の有するカルボニル基か、またはスルホ−ＮＨＳエステル（スルホ−ＳＭＣＣ）のいずれか一方である。以下が含まれ得る：
−ＢＳ３：ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（Staros JV (1982). N-hydroxysulfosuccinimide active esters: Bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linker. Biochemistry, 21, 3950）。これはスキーム１に従い実施される：
【００６３】
【化２】
2008505630.tif 000004
【００６４】
−スルホ−ＳＭＣＣ：スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−シクロへキサンカルボキシレート（Samoszuk MK et al. (1989). Antibody, Immunoconjugates. Radiopharm., 2, 37）、これはスキーム２に従い実施される：
【００６５】
【化３】
2008505630.tif 000005
【００６６】
−化学カップリング剤の代わりに、プロテインA（ＰＡ）またはプロテインＧ（ＰＧ）がカップリング剤として作用し得る（Eliasson M, Olsson A, Palmcrantz E et al. (1988), Chimeric-binding receptors engineered from Staphylococcal protein A and Streptococcal protein G. J. Biol. Chem., 263, 4323）。この場合、ＰＡまたはＰＧは、ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド］の存在下でＮＨ２−末端クロロシラン鎖に直接カップリングされ得る（Grabarek Z and Gergely J (1990). Zero-length cross-linking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem., 185, 131）。この別の形態はスキーム３で説明される：
【００６７】
【化４】
2008505630.tif 000006
【００６８】
（ｉｉ）ＯＨ−末端鎖の場合：
ヘテロ二官能性カップリング剤は：
−ＰＭＰＩ：Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート（Annunziato ME at al. (1993). p-Maleimidophenyl isocyanate: a novel heterobifunctional linker for hydroxyl to thiol coupling. Bioconjug. Chem., 4, 212）。これはスキーム４で説明されるように使用される：
【００６９】
【化５】
2008505630.tif 000007
【００７０】
（ｉｉｉ）ＣＯＯＨ−末端鎖の場合：
ヘテロ二官能性カップリング剤は：
−ＫＭＵＨ：κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−ヒドラジド（Trail PA et al. (1993). Science, 261, 212）。これはスキーム５で説明されるように使用される：
【００７１】
【化６】
2008505630.tif 000008
【００７２】
−  −ＣＯＯＨ末端を含む鎖の場合、上述のプロテインAまたはプロテインＧを使用することもまた可能である。
【００７３】
工程ｄ）において、タンパク質エンティティはデバイスの望ましい使用に従い選択される：
捕獲することが望ましいサブ集団の細胞の性質は、このタンパク質エンティティの選択を決定している。後者は、標的のサブ集団に特異的な親和性を示す必要がある。
【００７４】
ＣＴＣｓの捕獲戦略は細胞表面の分子の認識特性に基づく。これらの分子は細胞接着分子または膜受容体である。細胞捕獲は、その受容体と特異的なリガンドの、あるいは接着分子または受容体のエピトープに対して指向性を有する抗体の、相互作用により媒介される。
【００７５】
細胞捕獲に使用されるタンパク質エンティティ（リガンドまたは抗体）がどのようなものであっても、認識タンパク質のリシンの側鎖のＮＨ２官能基を修飾すること、及びこれらをチオール（ＳＨ）基に変えることが必要である。
【００７６】
抗体の場合、抗原−抗体認識のために、Ｆｃ部分上に位置するリシンの側鎖ＮＨ２の修飾は、Ｆａｂフラグメント上の結合部位をフリーのままにすることを可能にするため非常に重要であり、これらの部位は細胞抗原の認識のために必要である。
【００７７】
タンパク質認識エンティティを固定するための戦略は、スキーム６及び７に説明されるように、２工程を含むプロセスによる反応剤ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート）（Duncan RJS, Weston PD et al.(1983). A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassays. Anal. Biochem., 132, 68）、あるいはスキーム８に説明されるようにトラウト試薬（２−イミノチオラン・ＨＣｌ）（Ghosh SS, Kao PM, McCue AW et al. (1990). Use of maleimide thiol coupling chemistry for efficient syntheses of oligonucleotide-enzyme conjugate hybridization probes. Bioconjug. Chem., 1, 71）の使用からなり得る：
Ａ．ＮＨ２基とＳＡＴＡの反応（工程Ｉ）
【００７８】
【化７】
2008505630.tif 000009
【００７９】
Ｂ．ヒドロキシルアミンによるＳＨ基の脱保護（工程ＩＩ）
【００８０】
【化８】
2008505630.tif 000010
【００８１】
Ｃ．トラウト試薬によるＮＨ２基の修飾
【００８２】
【化９】
2008505630.tif 000011
【００８３】
分子表面を認識し、かつ本発明のデバイスにグラフトされることを意図する抗体の幾つかの例示：
ａ）細胞間接着分子Ｅｐ−ＣＡＭの過剰発現
上皮組織由来の乳房の固形腫瘍は、Ｅｐ−ＣＡＭ、細胞間接着分子を過剰発現する（Gastl G, Spizzo G, Obrist P et al. (2000). Ep-CAM overexpression in breast cancer as a predictor of survival. The Lancet, 356, 1981）。Ｅｐ−ＣＡＭはまた、名前：１７−１Ａ、ＥＳＡ、ＥＧＰ４０でも表される。これは、ＧＡ７３３−２遺伝子によりコードされる４０ｋＤａ膜貫通上皮糖蛋白である（Linnenbach AJ, Woicierowski J, Wu S et al. (1989). Sequence investigation for the major gastrointestinal tumor-associated antigen family, GA733. Proc. Natl. Acad. USA, 86, 27; Gottlinger HG, Funke I, Johnson JP et al. (1986). The epithelial cell surface antigen, a target for antibody-mediated tumor therapy: its biochemical nature, tissue distribution and recognition by different monoclonal antibodies. Int. J. Cancer, 38, 47）。これは、癌腫の大部分で過剰発現する腫瘍抗原として認識され、また転移プロセスに関与する（Litvinov SV, Velders MP, Bakker HA et al. (1994). Ep-CAM: a human antigen is a homophilic cell-cell adhesion molecule. J. Cell Biol., 125, 437）。Ｅｐ−ＣＡＭは特に免疫療法において治療標的として提案されている。様々なモノクローナル抗体、１７−１Ａ、ＭＯＣ３１、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＨＡ−１２５が、この分子の様々なエピトープに対して指向性を有する。モノクローナル抗体Ｂｅｒ−ＥＰ４は、Ｅｐ−ＣＡＭの２つの３４及び３９ｋＤａのエピトープを認識する（Latza U, Niedobitek G, Schawarting R et al. (1990). Ber-EP4: a new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from mesothelia. J. Clin. Pathol., 43, 213）。
【００８４】
Ｂｅｒ−ＥＰ４またはＭＯＣ３１またはＨＡ−１２５は、プロテインAまたはプロテインＧに直接か、あるいは好適なカップリング剤を介してＮＨ２、ＯＨまたはＣＯＯＨ末端を含むクロロシラン鎖に結合され得る。
ｂ）ＨＥＲ−２の過剰発現
ヒト増殖因子２レセプター（ＨＥＲ−２）／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ−２）の遺伝子は、１７ｑクロモソーム上に局在し、そして上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲｓ）のファミリーまたはＨＥＲｓのファミリーのチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質レセプターをコードする。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の増幅またはＨＥＲ−２（ｐ１８５ＨＥＲ２）タンパク質の過剰発現は、乳ガン及び様々な癌腫の予後診断因子である（Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et al. (1987). Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the Her-2/neu oncogene. Science, 235, 177）。抗−ＨＥＲ−２抗体（トラスツズマブ（Trastuzumab））が抗腫瘍治療に使用される。
【００８５】
抗−ＨＥＲ−２（抗−ヒトＥｒＢ２）抗体は、乳ガンのＣＴＣｓを捕獲するための特異的マーカーとして使用される。Ｂｅｒ−ＥＰ４による検出に関して、これはＣＴＣｓの潜在的なマーカーとして作用する。
【００８６】
抗−ＨＥＲ−２抗体のグラフトは、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体のそれと同じ方法で実施され得る。
ｃ）ＭＵＣ１の過剰発現
ムチンは、呼吸器系の空気／水界面のようなラフな環境状況（rough environmental context）、胃の酸性環境、肝臓、膵臓、胆嚢、腎臓、唾液腺、涙腺及び眼のような分化した器官の分泌性上皮表面と腸との複合環境にある様々なタイプの正常上皮細胞により発現される。ムチンのファミリーは少なくとも１７の分泌または非分泌分子を含み、またホメオスタシスを維持する主要な役割を果たす（Hollingsworth MA and Swanson JB (2004). Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Reviews Cancer, 4, 45）。
【００８７】
ムチンはO−グリコシド結合を介してオリゴサッカライドに接着したセリン−、トレオニン−及びプロリン−リッチ配列がタンデムにならんだ繰り返しを有する高分子量糖蛋白である。ＭＵＣ１は膜内在性タンパク質である。乳ガンにおいてＭＵＣ１は過剰発現し、そして異常にグリコシル化される（Rahn JJ, Dabbagh L, Pasdar M et al. (2001). The importance of MUC1 cellular localization in patients with breast carcinoma: an immunohistologic study of 71 patients and review of the literature. Cancer, 91, 1973）。
【００８８】
抗−ＭＵＣ１（ＣＴ２  Ｍａｂ）抗体は、乳ガンのＣＴＣｓを捕獲するための特異的マーカーとして使用される。Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体による検出に関して、それはＣＴＣｓの潜在的なマーカーとして作用する。
【００８９】
抗−ＭＵＣ１抗体のグラフトは、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体と同じ方法で実施され得る。
【００９０】
膜糖蛋白Ｅｐ−ＣＡＭ、糖蛋白ＭＵＣ１及び増殖因子レセプターＨＥＲ−２／ｎｅｕから選択される膜抗原は、ＣＴＣｓにおいて過剰発現される腫瘍マーカーである。この理由のために、腫瘍細胞は細胞表面分子の最適密度を示し得、このため特異的な細胞捕獲に有利である。末梢血中のＣＴＣの密度は全く未知のパラメーターであることに気付くべきである。このパラメーターは病状の程度に応じて変化し得、そして１０３〜２×１０４白血球あたり約１ＣＴＣである。
【００９１】
これらの分子に指向性を有する抗体は、保存、細胞の形態及び生存の点で最良の可能な条件でＣＴＣ捕獲できるよう特異的かつ十分に選択的である。
【００９２】
該表面のグラフトのために長い有機ケイ素鎖（ｎ＝２２）を使用する戦略、カップリング剤の添加、及び抗体のＦｃ部分のグラフトは、細胞捕獲を最適化する上で重要である。
【００９３】
これは、Ｘ３−Ｓｉ−（ＣＨ２）２２−カップリング剤−抗体の組合せの長さが４０と５０Åの間で変化するためであり、このため細胞抗原への抗体の有利な提示において顕著な順応性を生み出す。
【００９４】
これは、１０６の腫瘍細胞の表面全体における過剰発現したＨＥＲ−２レセプターの密度を許容しながら、迅速な評価が１０Åのサイドあたりの長さの正方形領域において８受容体を与えるためである。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）による評価に従うと、有機ケイ素鎖のグラフト密度はｎｍ２あたり３〜５分子であり、この配置（configuration）は結合剤及び得られた抗体の良好なグラフトに非常に有利である。
【００９５】
実施例
１−デバイス
層流チャンバーによる細胞捕獲を図２に説明する。
【００９６】
本細胞捕獲プロセスは、細胞及び流体の循環のためのインレット（３）とアウトレット（４）開口部を介して外部と接続している寸法２０×６×０．２ｍｍ３（ｌ×ｗ×ｈ）のキャビティ（２）を備える、Plexiglas（登録商標）により製造された層流チャンバー（１）を使用する。
【００９７】
該チャンバーの床を構成している壁（５）は、化学的に官能化された除去可能なガラスまたは結晶性Ｓｉスライドである。このスライドは、それらの防漏（leaktightness）を提供することを目的とするＯリング（７）により該チャンバー（１）のキャビティ（２）に対するくぼみ(recess)（６）に適用される。供給はＯ−リング（７）のポジショニングを好ましくするためにキャビティ（２）の端を丸くして行われ得る。該スライドは、金属プレート（９）を介してPlexiglas（登録商標）にねじで締められる（８）。Teflon（登録商標）シール（９ａ）は、ガラススライドを該金属板から離す。キャビティ内での固体支持体の固定を可能にする当業者に知られた他の方法が使用され得る。図２に説明される場合、及び本発明の好ましい別の形態に従うと、該金属プレート（９）は、その中心部において、顕微鏡（示さず）を使用してキャビティ（２）の内部を観察することを可能にする透明な領域（斜線でない）を含む。Teflon（登録商標）シール（９ａ）も同様に、透明な中心領域（斜線でない）を含む。不透明及び透明な領域の割合は変化し得る。
【００９８】
開口部（３、４）を介する流体の導入及び排出は、スループット及び流量をセットした蠕動ポンプ（１０）の制御下で行われる。
【００９９】
蠕動ポンプ（１０）は生物学的試料（１１）を、この目的のために提供され、無菌を保つために閉鎖されたレセプタクル（１２）から引き抜き、そして、それを循環チューブ（１３）に注入する。それは試薬（１４ａ、１４ｂ）を、それらが含むプロダクトの良好な保存を提供するために同じく閉鎖されたレセプタクル（１４）から引き抜き、そしてそれらを循環チューブ（１５）に注入する。循環チューブ（１５）、（１３）及び（１７）の交差部分のバルブ（１６）は、循環チューブ（１５）及び（１３）と層流チャンバー（１）に導入するためのチューブ（１７）との接続を調節することが可能である。流体は、蠕動ポンプ（１０）の制御下で層流チャンバー（１）を通過し、そして、アウトレットチューブ（１８）を介してそこから出る。バルブ（１９）は、アウトレットチューブから該流体を排出チューブ（２０）か、または該流体を再び層流チャンバー（１）を通過させることができるキャビティ（２）に接続した再循環チューブ（２１）のいずれかに向けることを可能にする。図２において、再循環チューブ（２１）は、レセプタクル（１２）を介してキャビティ（２）に接続されるが、再循環チューブ（２１）とキャビティ（２）との間の直接接続を提供することも可能である。この回路を介する生物学的試料の再循環は、標的細胞の捕獲により良い有効性を与え得る。該デバイスにおける流体の循環の方向は矢印により示される。
【０１００】
上述したデバイスは、本発明の装置の例を構成する。他の別の形態は、本発明の範囲内に包含される。必須の特徴は、層状条件下で流すことを可能にする流体の循環のためのチャンバーを通して生物学的試料を循環させることにあり、この内壁は上述の特定のグラフトを備える。流体の循環のためのチャンバーとは別に、流体の循環のための回路は、使用することが望ましいまたは望ましくない試薬に従い調整され得る。本発明の別の形態に従うと、該デバイスは、直列または並列に配置された流体の循環のための幾つかのチャンバーを含み得る。流体の循環のためのこのチャンバーは、例えば文献US6 408 878に開示されるようなマイクロ流体デバイスのような、細胞の捕獲に好適な配置を有する任意のマイクロ流体デバイスを包含し得る。
【０１０１】
選択した実験プロトコールに応じて、生物学的試料が流体の循環のためのチャンバーを１回以上通過するとき、本発明に従うグラフト化された壁に固定される細胞を回収することが、流体の循環のためのチャンバーに、これらの細胞の脱着を可能にする試薬を注入することにより可能になる。これらは続いて分析または計測されるために回収される。
【０１０２】
本発明の別の形態に従うと、図２のデバイスは、以下の方法により構築され得る：
保護されたヒドロキシル末端、保護されたアミン末端または保護された酸末端を含むクロロシラン官能基によりグラフトされた固体支持体は、キャビティ（２）を閉鎖するために上述のようにキャビティ（２）に固定化される。該デバイスの他の機械的な構成要素は図２のように配置される。末端の官能基を脱保護するための試薬は、レセプタクル（１４）のうちの一つからキャビティ（２）に注入され、そしてカップリング剤がキャビティ（２）に注入され、そして最終的には認識生物分子である。これは、図２に記載の機械的デバイスから、好適な順序での試薬の注入によりクロロシランによってグラフト化された壁（固体支持体）を官能化することを可能にし、これがリンス工程を中間工程として提供することを可能にするためである。
２−ＣＴＣｓの分離のためのプロトコール
乳ガンの拡散を被った患者からの及び／またはガンでないコントロールからの３〜５ｍｌ量の末梢血を５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するHanks’ medium （In VitroGen）に慣用的に引き抜く。次いで、予め好適に与えられたチューブ（Leucosep）中のFicoll（Amersham）を含有するグラディエント上で、赤血球及び血小板から有核細胞（白血球及び腫瘍細胞）を分離する。次いで、層流チャンバーを使用して細胞を分離する前に、白血球及びＣＴＣｓを含有する細胞画分を、ｍｌあたり１×１０６cellsの割合で０．１％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含有するHanks’ medium中に希釈する。蠕動ポンプのスループットは、剪断速度１５ｓ−１と剪断応力０．１５dync／ｃｍ２に対応して、約５０μｌ／分に調整される。
【０１０３】
分離されたＣＴＣｓは、様々な方法による：ペプチド阻害剤を使用した競合による；または１０〜１００倍に流量を増加させることによる、あるいは捕獲された細胞の放出のための抗体のフラグメントのＳ＝Ｓ架橋の解離により、抗原−抗体結合の分離により、回収され得る。
【０１０４】
他の試験はマイクロ流体デバイス及び層流チャンバーにおいて実施され、これらの寸法を以下の表１及び２に示す：
【０１０５】
【表１】
2008505630.tif 000012
【０１０６】
表１：層流チャンバーの寸法
【０１０７】
【表２】
2008505630.tif 000013
【０１０８】
表２：マイクロ流体デバイスの寸法
３−腫瘍表現型の分子的特徴付け
分離されたＣＴＣｓの特徴付けのための様々なプロセスが適用され得る。
ａ）ＣＴＣｓの形態学的、免疫細胞学的及び遺伝学的特徴付け
−免疫組織化学（ＩＨＣ）による：抗体によるマーキングの検出：抗ケラチン（ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ２２）、白血球特異的抗−ＣＤ４５
−腫瘍マーカー（ＩＨＣ及びＲＴ−ＰＣＲ）：ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、ＭＵＣ−１の過剰発現
ｂ）細胞遺伝学的特徴
−ＣＧＨ（比較  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）
−ＦＩＳＨ（蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション）
４−他の適用
ａ−出生前診断
本プロセスはまた、母体血液中の胎児細胞の初期の遺伝子分析のための出生前診断において産科学においてに使用され得る（Bianchi D. (1999). Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br. J. Maematol., 105, 574; Fisk N. (1998). Maternal-fetal medicine and prenatal diagnosis. Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 10, 81）。我々のプロセスにおいて標的となる胎児細胞集団は、上皮タイプの栄養細胞を含むものであり、そして妊娠の最初３ヶ月のあいだの短い期間のものである（Shulman LP. (2003). Fetal cells in maternal blood. Current Women’s Health Reports 3, 47）。この細胞集団の密度は非常に低い：１０６母細胞あたり〜１胎児栄養芽細胞。細胞捕獲は、上皮膜抗原に指向性を有する抗体、または、ヒト胎盤ラクトゲンに指向性を有する抗体を使用して実施され得る（Latham SE, Suskin HA, Petropoulos A et al. (1996). A monoclonal antibody to human placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from maternal blood in a model system. Prenat. Diagn., 16, 813）。
【０１０９】
本プロセスは、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズのような、既存の方法に関して特定の利点を示す。
【０１１０】
分離された胎児細胞は、遺伝子異常の検出のための分子遺伝学的特徴付けに供される（ＰＣＲ、ＦＩＳＨ）。
【０１１１】
ｂ．末梢血及び骨髄におけるＣＴＣｓの検出
本プロセスの他の適用は骨髄及び末梢血におけるＣＴＣｓの検出に関する（章１５：Tumor Cell Contamination (2001). Autologous Blood and Marrow Transplantation X: Proceedings of the Tenth International Symposium, edited by Karel A. Dicke and A. Keating）。
【０１１２】
第１のケースにおいて、骨髄中の転移性ＣＴＣの存在は、治療を標的化するために予後を評価することを可能にする。
【０１１３】
第２のケースにおいて、本プロセスは、同一患者における２段階評価に関する：１）骨髄採取化学療法の前の末梢血におけるＣＴＣの存在及び割合に関する、及び２）自家移植のための造血系細胞集団を得るための処理される及びパージされる血液試料に関するＣＴＣの不在。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は抗体によりグラフトされたタイプのガラススライドを示す。
【図２】図２は層流チャンバーを使用した細胞捕獲の説明を示す。
【図１】
2008505630.tif 000015
【図２】
2008505630.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月16日(2006.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その寸法が、それが層流チャンバーであるように選択され、かつ、細胞集団に特異的な認識生物分子の層で固定されたシランの組織化自己集合層によりその内壁（５）がグラフトされている、流体の循環のためのチャンバー（１）を備えた細胞集団を捕獲するためのマイクロ流体デバイスであって、シランの組織化自己集合層が、式（Ｉ）：
【化１】
2008505630.tif 000017
（ここで、
−ｎは、１５と３５の間、好ましくは２０と２５の間であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ６アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Ａは、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｋ−（ＣＨ２）ｉ−基を表し（ここでｋは０と１００の間、好ましくは０と５の間の整数を表し）、そしてｉは０以上、好ましくは０または１と等しい整数を表し、
−Ｂは、−ＯＣＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ、−Ｒ−、−ＣＯＲ、−ＮＲ１Ｒ２、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、ＣＯＯＲ、−ＳＲまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−Ｒ、Ｒ１及びＲ２は：水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖（これは１以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、１〜２４炭素原子を含む）、あるいは、１以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される（Ｒ＝ＨまたはＲ＝アルカリのとき、Ｂ≠−Ｒと理解される））
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含むことを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
生物分子層が、カップリング剤層を介してシランの組織化自己集合層と結合することを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
特異的なグラフトを備えた流体の循環のためのチャンバー（１）の内壁（５）が、ガラスまたはシリコンスライド、あるいは表面に−ＯＨ官能基を備えた任意の固体金属表面であり得る固体支持体（５）から構成されることを特徴とする、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
流体の循環のためのチャンバー（１）が、キャビティの二つの端に配置される２つのオリフィス（３、４）を備えた平行六面体（parallelepipedal）タイプのキャビティ（２）を備え、流体が第一オリフィス（３）を介して注入され、そして第二オリフィス（４）を介して収集されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項５】
流体の循環のためのチャンバー（１）が、３０μｌ以下、さらに好ましくはまた１２μｌ以下の容量を有するキャビティ（２）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項６】
流体の循環のためのチャンバー（１）に試料流体を注入することを可能にするポンプ（１０）を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項７】
特異的なグラフトを備えた壁（５）が、流体の循環のためのチャンバー（１）を通過する流れと平行であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項８】
加水分解可能な基が：ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ’）２基及び−ＯＲ’基から選択され、Ｒ’が飽和、直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキル基であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項９】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が塩素原子を表すことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１０】
ｎが２２以上であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１１】
該カップリング剤が：
−ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート；
−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−シクロへキサンカルボキシレート
−プロテインＡ
−プロテインＧ
−Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアナート
−κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−ヒドラジド
から選択されることを特徴とする、請求項２に記載のデバイス。
【請求項１２】
該認識生物分子がタンパク質であり、そのリシンの側鎖ＮＨ２官能基がチオール（ＳＨ）基に変換されていることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１３】
該認識生物分子が：
−  モノクローナル抗体１７−１Ａ、ＭＯＣ３１、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＨＡ−１２５（これらは細胞間接着分子Ｅｐ−ＣＡＭを認識する）
−  抗−ＨＥＲ−２（抗−ヒトＥｒＢ２）抗体
−  抗−ＭＵＣ１（ＣＴ２  Ｍａｂ）抗体
から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１４】
キャビティ（２）ならびに細胞及び流体の循環のためのインレット（３）とアウトレット（４）オリフィスを備えた層流チャンバー（１）、化学的に官能化され且つ該キャビティ（２）に固定されたチャンバーの床を構成する除去可能なガラスまたは結晶性Ｓｉスライド（５）、該開口部（３、４）を介する流体の導入及び排出を制御する蠕動ポンプ（１０）、生物試料（１１）が配置される少なくとも一つのレセプタクル（１２）、レセプタクル（１２）を該開口部（３）に接続する少なくとも一つの循環チューブ（１３）、ならびに該開口部（４）に接続された少なくとも一つのアウトレットチューブ（１８）を備えることを特徴とする、前記請求項のいずれか一つに記載のデバイス。
【請求項１５】
レセプタクル（１２）が、層流チャンバー（１）に導入するためのチューブ（１７）を介して開口部（３）に接続されていることを特徴とする、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
試薬（１４ａ、１４ｂ）を備える少なくとも一つのレセプタクル（１４）、チューブ（１７）を介してレセプタクル（１４）を開口部（３）に接続する循環チューブ（１５）、該チューブ（１５）及び（１３）及び（１７）間の接続を調節するための該循環チューブ（１５）、（１３）及び（１７）の交差部分のバルブ（１６）を備えることを特徴とする、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
キャビティ（２）と接続した排出チューブ（２０）及び再循環チューブ（２１）ならびに該チューブ（１８）、（２０）及び（２１）間の流体を方向付けるためのバルブ（１９）を備えることを特徴とする、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一つに記載のデバイスの流体の循環のためのチャンバー（１）に生物試料を通過させる工程を含むことを特徴とする、生物試料中の細胞捕獲プロセス。
【請求項１９】
流体の循環のためのチャンバー（１）に生物試料を通過させる少なくとも２工程を含むことを特徴とする、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
さらに、細胞を脱着する工程を含むことを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２２】
１０ｐＮ〜１ｎＮ、有利には２０ｐＮ〜５００ｐＮ、好ましくは３０〜３００ｐＮ、さらに好ましくは５０〜１５０ｐＮの範囲の強さで、細胞がその受容体と相互作用を有する特異的表面マーカーの、生物試料中の細胞集団の捕獲における、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
血液試料からの循環している腫瘍細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２４】
乳ガン、前立腺ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、結腸ガンまたは肺ガンから選択される病状の進行の診断及びモニタリングにおける、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
母体由来の血液試料からの胎児細胞の精製及び特徴付けにおける、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【請求項２６】
骨髄中の循環している腫瘍細胞の検出における、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のデバイスの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月7日(2007.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
（ここで、
−ｎは、１５と３５の間、好ましくは２０と２５の間であり、
−ｍは、０または１に等しく、
−Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は互いに同じでも異なってもよく、飽和の、直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキル基及び加水分解化可能な基からなる群から選択され、Ｘ１、Ｘ２またはＸ３の少なくとも一つは加水分解化可能な基を表し、
−Ａは、−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｋ−（ＣＨ２）ｉ−基を表し、ここでｋは０と１００の間、好ましくは０と５の間の整数を表し、そしてｉは０以上、好ましくは０または１と等しい整数を表し、
−Ｂは、−ＯＣＯＲ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ、−Ｒ−、−ＣＯＲ、−ＮＲ１Ｒ２、−ＣＯＮＲ１Ｒ２、ＣＯＯＲ、−ＳＲまたはハロゲン原子から選択される基を表し、
−Ｒ、Ｒ１及びＲ２は：水素原子、飽和または不飽和ならびに直鎖または分岐炭化水素鎖（これは１以上のハロゲン原子で任意に置換され、そして、１〜２４炭素原子、好ましくは１〜６炭素原子を含む）、あるいは、１以上のハロゲン原子で任意に置換された芳香族基から選択される（Ｒ＝ＨまたはＲ＝アルキルのとき、Ｂ≠−Ｒと理解される））
に対応する少なくとも一つの有機ケイ素化合物を含有する組織化自己集合単層により修飾される。
【国際調査報告】
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