(57)【要約】  本発明は、対象における前立腺癌の存在を判定する方法を提供する。この方法は、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、前記１つ又は複数のマーカーは、ＥＭ、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における前立腺癌の存在を判定する方法であって、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項２】
対象における前立腺癌のステージを判定する方法であって、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項３】
前立腺肥大症と悪性の前立腺癌とを識別するための、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
局所浸潤性前立腺癌と転移性前立腺癌とを識別するための、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前立腺癌治療に対する対象の反応をモニターする方法であって、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む方法。
【請求項６】
対象体内の前立腺癌の侵襲性を判定する方法であって、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルをモニターするステップを含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む。
【請求項７】
前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３，ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又は複数のマーカーが、ＲＥＣＫ及びクラスタリン、ＲＥＣＫ及びＭＴＳＰ−１、クラスタリン及びＭＴＳＰ−１、又はＲＥＣＫ、クラスタリン、及びＭＴＳＰ−１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数のマーカーが、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＨＩＦ−１α、Ｅ２Ｆ３、ＭＭＰ９、ｅ−ｃａｄ、及びＥ２Ｆ４のうちの少なくとも１つを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数のマーカーが、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＨＩＦ−１α、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＭＭＰ９、ＰＩＭ−１、及びＭＴＳＰ−１のうちの少なくとも１つを含む、請求項２又は４に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数のマーカーが、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、及びＥ２Ｆ３のうちの少なくとも１つを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３及びＣＡＩＸのうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーのうちの１つ又は複数の発現レベルを、相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記相対的定量化が、対照ＰＣＲ産物の量に対するマーカーＰＣＲ産物の量の比率として計算される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象から得た血液試料における、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＡ、及びＦＡＳのうちの１つ又は複数の発現レベルを測定するステップをさらに含む、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又は複数のマーカーの１つ又は複数の選択的スプライシング変種の存在又は不在を判定するステップをさらに含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ又は複数の選択的スプライシング変種が、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、及びＣＡＩＸのスプライシング変種から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＡＸＩＩの選択的スプライシング変種の存在又は不在を判定する、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
１つ又は複数のスプライシング変種の存在又は不在を、ＲＴ−ＰＣＲによって判定する、請求項１６から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象が、肥大した前立腺を有する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
対象における前立腺癌の存在を判定する方法で使用するのに適した検査キットであって、対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定する手段を含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む。
【請求項２２】
対象から得た血液試料中のＡＭＡＣＲ、ＰＳＡ、及びＦＡＳのうちの１つ又は複数の発現レベルを測定する手段をさらに含む、請求項２１に記載の検査キット。
【請求項２３】
内部対照と、内部対照の発現レベルを測定する手段とをさらに含む、請求項２１又は２２に記載の検査キット。
【請求項２４】
内部対照がＧＡＰＤＨ、α−アクチン、β−アクチン、又は解糖経路の他の酵素をコードする遺伝子である、請求項２３に記載の検査キット。
【請求項２５】
対象の前立腺癌の治療に使用するための医薬品の製造における薬剤の使用であって、請求項１から２０までのいずれか一項の方法に従って、前記対象が前立腺癌を有すると同定されている使用。
【請求項２６】
対象における前立腺癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法の使用によって、対象が前立腺癌を有するかどうか判定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で前立腺癌を有すると同定された対象に、前立腺癌の治療で使用される薬剤を治療有効量投与するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の診断に関し、より詳細には、前立腺癌の早期診断及びステージ判定に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌（ＣａＰ）は重大な健康問題であるという認識が高まっている。ＣａＰは、最も一般的に診断される固形癌であり、また、男性では最も一般的な癌関連の死亡原因である。
【０００３】
ＣａＰの診断は、グリーソンスコア及び血清ＰＳＡという２つの古典的な判定規準の使用によって促進された。しかし、これらの判定規準は、予後判定に有用であるにもかかわらず、ある種の限界を有する。生検を用いたＣａＰ診断は困難であり、高レベルの血清ＰＳＡは、前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び前立腺炎などの非悪性の状態でも存在することが実証されているので、必ずしもＣａＰを示すものではない。したがって、前立腺癌マーカーとしてのＰＳＡの特異性には、疑問の余地があり、現在進行中の議論の対象である。さらに、ＣａＰ患者が、進行速度の異なる、異なる種類の腫瘍を有するという事実によって、前立腺での発癌に関与する遺伝子に関する知識は未だ極めて限定的である。
【０００４】
血清ＰＳＡ測定は、それに代わる唯一の前立腺癌診断技法である前立腺生検の必要性を判定するのに有用であり得る。通常の麻酔薬の下で行われ、正しい領域から採取された生検は、癌の存在及び腫瘍グレードに関する情報、したがって、さらに、その癌がどのように発達し、最終的に転移するかに関する情報を与える有益なものであり得る。しかし、この検査は侵襲的な、苦痛を伴うものであり、腫瘍の正しい領域を標的にしない限り、１００％満足できるものでない可能性がある。
【０００５】
腫瘍塊の存在を診断するのに、超音波及びＭＲＩスキャンが使用されてきた。しかし、これらの技法では、腫瘍又は癌が達しているであろうステージの同定ができず、また、肥大した前立腺良性腫瘍、又は悪性腫瘍を識別することができない。これらの診断方法に基づいて、男性に、不要な手術を行うように勧められることがしばしばあった。不要な手術は、それ自体で副作用を有し、且つ生活の質を低下させるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣａＰの早期診断、ＣａＰの発達ステージの正確な診断、及び治療又は手術に対する反応のモニタリングのための、新規の非侵襲性で高感度な分子診断ＣａＰ検査及び予後ＣａＰ検査の開発の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、循環している前立腺癌（ＣａＰ）細胞でのマーカー遺伝子発現を検出するのに、相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用し、この発現が、ＣａＰの発達及び進行の診断及びモニタリングに使用できることを示した。ＲＴ−ＰＣＲは、前立腺から循環流内に脱落した細胞を検出するのに、本発明に従って利用される強力な方法である。ＲＴ−ＰＣＲは、患者の血液試料から抽出されたｍＲＮＡにおいて行われる。この方法は、極めて感度が高いので、１億の血球中にある１つの前立腺細胞を検出することができる。
【０００８】
詳細には、本発明者らの結果は、すべての患者群で、Ｅ２Ｆ３遺伝子発現レベルの顕著な相違が存在することを示しており（ｐ＜０．００１）、局所及び転移性ＣａＰ群では、それぞれ、前立腺肥大症（ＢＰＨ）群と比較して平均３９倍及び１４倍の増大が見出された。前立腺全摘除術（ＲＰ）群は、局所癌群のものに類似したＥ２Ｆ３発現レベルを示した。これは、末梢循環中に腫瘍細胞が存在している可能を示し、検出されていない微小転移巣の存在を示唆する。正常な雄性対照試料ではＥ２Ｆ３の発現が検出されなかった。循環しているＣａＰ細胞におけるＥ２Ｆ３発現レベルを疾患の発達及び進行と相関させることは、診断上及び臨床上の意義を有し、個々の遺伝子発現プロフィールに基づいた特定の治療法を示唆する。
【０００９】
本発明者らは、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、循環しているＣａＰ細胞におけるＨＩＦ−１α遺伝子発現を検出し、ＣａＰの発達及び進行を診断及びモニターする際の正確なマーカーとして、この発現が使用できることを示した。
【００１０】
詳細には、本発明者らは、局所ＣａＰ（ＬｏｃＣａＰ）を有する患者と他の患者群との間に、相対的ＨＩＦ−１α発現レベルに有意な相違を見出した（ｐ＜０．０００１）。
【００１１】
加えて、本発明者らは、循環しているＣａＰ細胞におけるＣＡＸＩＩ遺伝子発現を検出するのにｑＲＴ−ＰＣＲを用い、この発現がＣａＰの診断、並びにＣａＰ発達及び進行のモニタリングで使用できることを示した。詳細には、ＣＡＸＩＩ発現は、前立腺肥大症群と比較して、局所ＣａＰ群で上方制御されており、また、局所ＣａＰ群と比較して、転移性ＣａＰ群で下方制御されている。
【００１２】
本発明者らは、循環しているＣａＰ細胞で検出され得る、前立腺癌の他のマーカーも同定し、血液中を循環している細胞など、体液中に存在している細胞におけるマーカー発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を用いた前立腺癌の診断及び／又はステージ判定を行う方法で、単独で、若しくは他の前立腺癌マーカーと組み合わせて使用した。これらの追加のマーカーには、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＩＸ、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲが含まれる。本発明が提供する高感度非侵襲性のｑＲＴ−ＰＣＲ技法では、上述したマーカーのうちのいずれか１つ又は複数を利用できる。
【００１３】
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＴを用いて、さらに、ＣａＰが、Ｅ２Ｆ３、ｅ−ｃａｄ、及びＣＡＩＸを含めた特定のマーカーの選択的スプライシング変種と関連していることも実証した。
【００１４】
したがって、本発明は、
−対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、対象における前立腺癌の存在を判定する方法；
−対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、対象における前立腺癌のステージを判定する方法；
−対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定するステップを含む、前立腺癌治療に対する対象の反応をモニターする方法；及び、
−対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルをモニターするステップを含む、対象における前立腺癌の侵襲性を判定する方法
を提供する。
【００１５】
上記方法のそれぞれで、上記マーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。上記方法はそれぞれ、１つ又は複数のマーカーの１つ又は複数の選択的スプライシング変種の存在又は不在を判定するステップをさらに含み得る。
【００１６】
本発明は、
−対象から得た血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを測定する手段を含み、前記１つ又は複数のマーカーが、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む、対象における前立腺癌の存在を判定する方法で使用するのに適した検査キット；
−本発明の方法に従って前立腺癌を有すると同定された対象の前立腺癌の治療に使用するための医薬品の製造での薬剤の使用；並びに、
−（ａ）本発明による方法の使用によって対象が前立腺癌を有するかどうか判定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で前立腺癌を有すると同定された対象に、前立腺癌の治療で使用される薬剤を治療有効量投与するステップと
を含む、対象における前立腺癌を治療する方法
も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明によれば、体内にＣａＰが存在している対象を同定する方法が提供される。本発明は、悪性所見なし（ＮＥＯＭ）、局所前立腺癌（ＬｏｃＣａＰ）、及び／又は転移性前立腺癌（ＭｅｔＣａＰ）の患者を識別する方法、ＣａＰの侵襲性を判定する方法、並びにＣａＰをモニターする方法も提供する。
【００１８】
本発明が提供する診断検査は、患者の血液試料を使用する。この方法は、血液又は他の体液中における候補マーカーの発現レベルの定量分析を用いて、循環している正常な前立腺細胞、癌細胞、及び前立腺癌細胞を検出する。上記マーカーは、組織分析、又は蛋白質チップを用いたＳＥＬＤＩ−ＴｏＦ分析などのいかなる適した技法によって同定してもよい。ＣａＰで又はＣａＰの異なるステージで上方制御又は下方制御されるいかなるマーカーも、本発明の非侵襲性分子技法を用いてモニターできる。上記検査では、単一のマーカーの分析を行うものでもよいが、２つ以上のマーカーを組み合わせた分析が好ましい。
【００１９】
本発明の方法は、Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ−１α、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＥＺＨ２、ＰＩＭ−１、ｃ−ｍｅｔ、ｅ−ｃａｄ、Ｊａｇｇｅｄ、ヘプシン、ｐＲＢ、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、Ｅ２Ｆ４、ＩＧＦＢＰ−３、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうちの少なくとも１つの発現レベルのモニタリングを含み得る。
【００２０】
上記方法は、体内のＣａＰが非常に初期のステージにある対象を同定するのに用いることができる。加えて、上記方法は、ＣａＰの異なるステージの相互識別、すなわちＣａＰのステージ判定に使用できる。上記方法は、ＣａＰ治療の有効性をモニターするのにも使用できる（治療が行われているとき、又は治療が停止した後）。したがって、上記方法は、すべての癌組織が手術によって表面上切除されたときに、微小転移巣を患っている対象を同定するのに使用できる。
【００２１】
対象は、本発明の方法を実施する際に、ＣａＰに関して無症状であってもよい。上記対象は、前立腺の問題によるものである可能性のある１つ又は複数の症状を示しているものであることが好ましい。上記対象は、哺乳動物、例えばヒトであることが好ましい。
【００２２】
（試料）
本発明の方法は、生検を必要とせずに実施できる非侵襲性の方法である。この方法は、全血などの体液中に存在する前立腺細胞表面での前立腺癌マーカーの発現を検出する。本発明の方法で使用される体液は通常、血液である。使用できる他の体液には、尿及び脳脊髄液が含まれる。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともできるが、対象から得られた試料においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで上記方法を行う方が、通常好都合である。
【００２３】
上記方法を実施する目的で、試料に処理を加えることができる。例えば、核酸抽出を行うことができる。詳細には、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡなどのＲＮＡを単離することができる。試料から抽出されたＲＮＡを、次に、ｃＤＮＡに変換することができる。試料中のポリヌクレオチドを、例えば、ＰＣＲベースの技法を用いることによって、コピー（又は増幅）することができる。
【００２４】
試料は、本発明の検査で、患者から取得した直後に処理することができる。別法では、試料を、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を安定した状態に保つ条件下に保存することができる。例えば、試料は、氷上に置いても、冷凍しても、或いは血液チューブ（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｘ社）若しくはｍＲＮＡを常温（すなわち約２０℃）で安定に保つ他の容器の中に保存してもよい。
【００２５】
（マーカー発現の測定）
マーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定は、例えばＲＮＡ、特にｍＲＮＡの存在又は不在を判定することによって、ＲＮＡレベルで行うことも、例えばマーカー遺伝子産物の存在又は不在を判定することによって、タンパク質レベルで行うこともできる。例えば、マーカー遺伝子の発現が存在しているか、又は不在であるかの判定は、ヌクレオチドレベル、例えば、ＲＮＡブロッティング又は逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＲＮＡレベルで、且つ／或いは抗体の使用によるタンパク質（ポリペプチド）レベルで行うことができる
【００２６】
マーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定は、対象におけるマーカー遺伝子の発現量の測定を行うものであり得る。すなわち、対象の体液中のマーカー遺伝子の発現レベルを測定するものであり得る。これはＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルで実施できる。マーカー遺伝子の発現レベルの測定は、そのような遺伝子の発現レベルが、癌細胞内と非癌細胞内とで多かれ少なかれ一定に、例えば実質的に一定に保たれているので、絶対的なものでも、或いは相対的なもの、例えば選択された内部対照に対するものでもよい。したがって、対象におけるマーカー遺伝子発現の分析は、定量的でも、定性的でもよい。
【００２７】
好ましい一実施形態では、マーカーの発現レベルを測定するのに、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析を用いる。ｑＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現レベルを測定するための非常に高感度な技法であり、したがって、末梢循環における腫瘍細胞表面のマーカー発現を検出するのに使用できる。
【００２８】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、同一のＲＴ−ＰＣＲ反応物中で、遺伝子特異的（すなわちマーカー遺伝子特異的）プライマーと共に多重化されている内部対照用のプライマーを用いる。内部対照及び遺伝子特異的プライマーは相互に適合したものでなければならない。すなわちそれらは、追加のバンドを生成してはいけないし、相互にハイブリッド形成してもいけない。内部対照の発現は、分析される試料全体にわたって一定であるべきである。次に、変動的なＲＮＡ品質若しくはＲＴ効率、又は不正確な定量化若しくはピペット操作によって引き起こされる管相互の相違を考慮して、試料データを正規化するのに、内部対照からのシグナルを用いることができる。
【００２９】
本発明での使用に適した内部対照には、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、α−アクチン、β−アクチンなど、解糖経路の酵素をコードする遺伝子が含まれる。ｑＲＴ−ＰＣＲでは、通常、内部対照及びマーカー遺伝子産物の両方からの産物が検出可能であり、且つ指数期の範囲内で増幅されているときに、ＰＣＲ反応を終了させる。内部対照ＲＮＡは、通常、構成的に発現されている存在量の多いハウスキーピング遺伝子なので、それらの増幅は、ごく少数のＰＣＲサイクルで指数期を越える。いくつかの方法、すなわち、１）産物検出の感度を増強することによって、２）ＲＴ反応又はＰＣＲ反応で入力される鋳型の量を減少させることによって、且つ／又は３）ＰＣＲサイクル数を低減することによって、豊富なメッセージの存在下で、指数期の範囲内にありながら、希少なメッセージの検出を実現することができる。
【００３０】
本発明の一実施形態では、マーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定は、１つ又は複数のマーカーの１つ又は複数の選択的スプライシング変種の存在又は不在の判定を行うものであり得る。この実施形態では、選択的スプライシング変種の存在又は不在は、通常、選択的スプライシングが起こる１つ又は複数の領域に隣接したヌクレオチド配列に特異的に結合するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって検出する。選択的スプライシング変種の存在は、タンパク質レベルでも検出できる。
【００３１】
マーカー遺伝子及び内部対照の増幅に本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下に置かれた場合、合成の開始点として作用できる。上記条件には、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質が適した温度及びｐＨであることが含まれ得る。
【００３２】
オリゴヌクレオチドプライマーの感度及び特異性は、鋳型ＤＮＡの所与の試料におけるプライマーの長さ及び配列の特有性によって決定される。短過ぎるプライマー（例えば約１０量体未満）は、ゲノムＤＮＡ中の広範な配列への非特異的結合を示す可能性があり、本発明での使用には好ましくない。
【００３３】
したがって、本発明で使用されるプライマーは、重合用の薬剤の存在下で伸長産物合成のプライミングをするのに十分長く、通常、約１０から約５０個までのヌクレオチドを含有しているであろう。より短いプライマー分子は、通常、十分安定したハイブリッド複合体を鋳型と形成するのに、より低い温度を必要とする。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマーは、長さが約１５ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドまで、例えば長さが約１８ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまであり得る。本発明で使用されるプライマーの融解温度（Ｔｍ）は、通常、約５０℃から約７０℃までであろう。これらのプライマーは、同じ長さである必要も、同じ融解温度を有する必要もない。
【００３４】
本発明の方法での使用に適したプライマーは、天然に存在するもの、例えば精製された制限消化産物中に存在するものでも、或いは合成又は組換えによって産生されたものでもよい。合成又は組換え体オリゴヌクレオチドを調製する方法は、当業者には周知である。合成オリゴヌクレオチドを調製するのに適した方法には、トリエステル法かホスホラミダイト化学を用いた調製が含まれる。組換え体オリゴヌクレオチドの調製に適した方法には、ＤＮＡ又はＲＮＡの鋳型の酵素依存的複製による調製が含まれる。
【００３５】
本発明での使用に適したプライマーは化学的に修飾されているものでもよい。例えば、ホスホロチオエートプライマーを用いることができる。他のデオキシヌクレオチド類似体には、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオ酸、Ｎ３’Ｐ５’−ホスホラミデート、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオエート及びそれらの２’−Ｏ−アルキル類似体、並びに２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれる。
【００３６】
別法では、混成バックボーンプライマー（ＭＢＯ）を用いることができる。ＭＢＯは、ホスホチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの区域と、適切に配置された修飾オリゴデオキシヌクレオチド若しくはオリゴリボヌクレオチドの区域とを含有する。ＭＢＯは、ホスホロチオエート結合の区域と、メチルホスホネートなどの他の修飾オリゴヌクレオチドの他の区域を有する。メチルホスホネートは、非イオン性であり、ヌクレアーゼ又は２’−Ｏ−アルキルオリゴデオキシヌクレオチドに対して極めて強い耐性を有する。
【００３７】
通常、適したＰＣＲプライマーは、増幅される対応配列に完全に相補的な配列を含むであろう。しかし、必要な場合には、好都合な制限酵素部位を導入するために、１つ又は複数、例えば最大約３つまで、最大約５つまで、若しくは最大約８つまでのミスマッチを、例えば、そのようなミスマッチは、プライマーが標的配列にハイブリッド形成する能力に過度に影響を与えないという条件で導入することができる。適したプライマーは、検出を容易にする１つ又は複数の標識を保持していてもよい。
【００３８】
通常は、他の遺伝子と実質的な相同性を共有しない領域が使用されるが、上記マーカー遺伝子それぞれのいかなる部分も、ＰＣＲプライマーの標的として使用できる。使用されるＰＣＲプライマーは、上記マーカーｍＲＮＡそれぞれの全体又は一部が増幅されるように設計することができる。内部対照ｍＲＮＡを増幅するためのプライマーの設計にも、同じ原則があてはまる。
【００３９】
ｑＲＴ−ＰＣＲに適したプライマーの例を表３に示す。選択的スプライシング変種を検出するのに適したプライマーの例を表９に示す。
【００４０】
使用される各マーカー遺伝子及び内部対照遺伝子の相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲは、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを、製造業者のプロトコルに従って用いて実施できる。
【００４１】
マーカーｍＲＮＡ及び内部対照ｍＲＮＡのレベルは、それぞれ精製されたマーカーＰＣＲ産物及び内部対照プラスミドを用いた校正曲線の作成を用いて計算することができる。相対的定量化は、内部対照の量で割った、標的分子マーカー遺伝子の量の比率、例えば、マーカー／内部対照として計算できる。相対的定量化の正確な計算を可能にするために、マーカー遺伝子及び内部対照の検量線からの点を各対象の測定に含めることができる。
【００４２】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性を確認するため、さらに、特異的及び非特異的マーカー産物と、プライマーダイマーとを識別するために、定量化の後に融解曲線分析を行うことができる。加えて、融解曲線分析の結果を確認するために、マーカーｑＲＴ−ＰＣＲ産物を、例えば１％アガロースゲルの電気泳動で分析することができる。
【００４３】
（ＣａＰの診断）
対象におけるＣａＰの存在を判定する方法は、通常、対象から得た体液試料、典型的には血液試料中の１つ又は複数のマーカーの発現レベルを、典型的にはＲＴ−ＰＣＲによって測定するステップを含む。
【００４４】
本発明の方法は、Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ−１α、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＥＺＨ２、ＰＩＭ−１、ｃ−ｍｅｔ、ｅ−ｃａｄ、Ｊａｇｇｅｄ、ヘプシン、ｐＲＢ、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、Ｅ２Ｆ４、ＩＧＦＢＰ−３、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうちの少なくとも１つの発現のレベルをモニターするステップを含み得る。
【００４５】
一実施形態では、上記方法は、Ｅ２Ｆ３遺伝子発現の存在又は不在、好ましくはレベルを測定するステップを含む。Ｅ２Ｆ３遺伝子は、転写因子Ｅ２Ｆファミリーのメンバーである。
【００４６】
上記に特定したマーカーのうちの１つ、或いは複数、例えば、それらのうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はすべてを併せて用いることができる。患者のＣａＰを診断するため、或いは患者がＣａＰを有していないかどうか判定するための好ましいマーカーには、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ−１α、ＭＴＳＰ１、及びｅ−ｃａｄが含まれる。ＣａＰを診断するため、或いは患者がＣａＰを有していないかどうか判定するための好ましい組合せは、ＲＥＣＫ及びクラスタリン；クラスタリン及びＭＴＳＰ１；ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＭＴＳＰ１；並びにＲＥＣＫ及びＭＴＳＰ１である。
【００４７】
Ｅ２Ｆ３、ＨＩＦ−１α、及び／又はＣＡＸＩＩ遺伝子発現などの、上述したマーカーの発現の存在又は不在、好ましくは発現のレベルに加えて、対象の血液試料中でのさらに別のマーカーの発現の存在又は不在、好ましくは発現のレベルを測定してもよい。例えば、１、２、３、４、５個、又はそれ以上の遺伝子から、最大約１０、約２０、約５０、約１００、若しくは約５００又はそれ以上までの遺伝子の発現の存在又は不在を判定することができる。したがって、そのうちの少なくとも１つが、Ｅ２Ｆ３遺伝子、ＨＩＦ−１α遺伝子、及び／又はＣＡＸＩＩ遺伝子など、本明細書で特定したマーカーの１つである１パネルの遺伝子のそれぞれの発現の存在又は不在を判定することができる。各マーカー遺伝子の発現レベルを測定してもよい。これは、対象におけるＣａＰのステージに関して、より正確な指標を与え得る。加えて、その後、対象の特定の発現プロフィールに合わせて治療を行うこともできる。
【００４８】
本発明の方法においてその発現の存在若しくは不在、又はその発現のレベルが測定できる追加の遺伝子には、体液試料中のＡＭＡＣＲ、ＰＳＡ、及びＦＡＳのうちの１つ又は複数が含まれ、診断、ステージ判定検査、再発モニタリング検査、又は侵襲性検査をさらに容易にするために、それらを測定することができる。通常は、使用される遺伝子それぞれの発現レベルが測定されるであろう。
【００４９】
使用されるマーカー遺伝子それぞれの発現レベルは、同時に、例えばマルチプレックスｑＰＣＲ反応で測定しても、或いは個々のｑＰＣＲ反応で別々に測定してもよい。
【００５０】
本明細書で言及されているマーカー遺伝子のヌクレオチド配列は、下記の表に示すアクセッション番号の下でＧｅｎＢａｎｋに記載されている。
【表１】
2008520228.tif 000002
【００５１】
（ＣａＰのステージのモニタリング）
本明細書に記載されているＣａＰマーカーそれぞれの発現レベルを用いて、上記疾患を有していることが既知である患者におけるＣａＰ発達ステージをモニターすることができる。この診断方法は、以前には診断されなかった患者の疾患ステージに関する指標も与え得る。例えば、上記診断は、患者が局所ＣａＰなどの初期ステージのＣａＰを有することも示し得る。異なるマーカー遺伝子は、腫瘍発達の異なるステージで、異なる上方制御及び／又は下方制御を受ける。したがって、１つのマーカーのレベルの増大に別のマーカーのレベルの減少が伴うことがある。
【００５２】
様々なマーカーの発現レベルが、ＣａＰの様々なステージの間で徐々に上方制御されており、したがって、ステージ相互の間には明確な区分点が存在しない。ＣａＰの初期ステージで機能するマーカーは、それより後のステージに関与しているものとは異なっている可能性がある。例えば、この疾患の初期ステージにおける癌形成に伴う低酸素は、ＨＩＦ−１α及び炭酸脱水酵素などの低酸素誘導マーカーの上方制御をもたらす。ＨＩＦ−１αは、細胞生存及びアポトーシスに関連した遺伝子の活性化を媒介する。これらの正常な細胞反応も、腫瘍細胞に生存上の優位を与える。しかし、ひとたび腫瘍が確立されれば、腫瘍発達中に他のメカニズムが引き継ぎを行う。このステージには、カベオリン又はＭＭＰ９などの他の遺伝子及びマーカーの発現が誘導又は上方制御されている可能性がある。
【００５３】
したがって、前立腺癌発達のすべてのステージを識別できる診断検査は、通常、それぞれのマーカーが特異的に調節されており、ＣａＰの異なるステージに対して感受性であるいくつかのマーカーを用いる。いずれか１つのステージの診断精度を増大させるマーカーの組合せを用いることができる。例えば、感度の低い特異的マーカーを、特異性の低い高感度なマーカーと併せることができる。
【００５４】
本発明の一実施形態では、患者が、悪性所見なし（ＮＥＯＭ）であるか、局所ＣａＰ（ＬｏｃＣａＰ）を有するかを判定するのに、血液又は他の体液中の１つ又は複数のＣａＰマーカーの発現レベルを用いることができる。ＮＥＯＭとＬｏｃＣａＰとを識別するのに好ましいマーカーには、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＨＩＦ−１α、Ｅ２Ｆ３、ＭＭＰ９、及びＥ２Ｆ４が含まれる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、ＭｅｔＣａＰとＬｏｃＣａＰとを識別するのに、血液又は他の体液中の１つ又は複数のＣａＰマーカーの発現レベルを用いることができる。ＬｏｃＣａＰとＭｅｔＣａＰとを識別するのに好ましいマーカーには、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＨＩＦ−１α、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ３、カベオリン、ＭＭＰ９、ＰＩＭ−１、及びＭＴＳＰ１が含まれる。
【００５６】
例えば、対象の体液中のＥ２Ｆ３遺伝子発現の量は、ＣａＰの発達における異なるステージを識別するのに用いることができる。すなわち、低レベルのＥ２Ｆ３遺伝子発現は、良性の過形成（ＢＰＨ又はＮＥＯＭ）を示すものであり得、一方、高レベルのＥ２Ｆ３遺伝子発現は悪性のＣａＰ（ＭｅｔＣａＰ）を示すものであり得る。したがって、Ｅ２Ｆ３遺伝子発現のレベルは、良性ＣａＰを患っている対象と、悪性ＣａＰを患っている対象とを識別するのに用いることができる。
【００５７】
また、試料中のＥ２Ｆ３遺伝子発現の量を、局所浸潤ＣａＰと転移性ＣａＰとを識別するのに用いてもよい。これらの２つのタイプの癌の相互識別は、Ｅ２Ｆ３遺伝子発現のレベルを他のマーカーの発現、並びに／又はＣａＰの他の診断指標、例えばグリーソンスコア及び／若しくは血清ＰＳＡのレベルと共に考慮した場合に、さらに改善できる。
【００５８】
本発明の一実施形態では、対象から得た体液試料中のＣＡＸＩＩ遺伝子発現のレベルを、対象がＣａＰを有することが既知である場合に、或いはＣａＰ診断検査の一部として、対象におけるＣａＰの発達ステージを判定するのに用いることができる。詳細には、高レベルのＣＡＸＩＩ遺伝子発現は局所ＣａＰ（ＬｏｃＣａＰ）を示すものであり得、一方、低レベルのＣＡＸＩＩ遺伝子発現は、悪性ＣａＰ（ＭｅｔＣａＰ）又は前立腺肥大症（ＢＰＨ）を示すものであり得る。この場合も、これらのタイプの癌の相互識別は、ＣＡＸＩＩ遺伝子発現のレベルを他のマーカーの発現、並びに／又はグリーソンスコア及び／若しくは血清ＰＳＡのレベルＣａＰなどの他の診断指標と共に考慮した場合に、さらに改善できる。詳細には、ＣＡＸＩＩレベルを他のマーカーの検出と併せて考慮することは、転移性ＣａＰと前立腺肥大症とを識別するのに有用であり得る。
【００５９】
さらに別の実施形態では、ＣａＰ発達における異なるステージを識別するために、体液中のＨＩＦ−１α発現レベルを検出することができる。詳細には、高レベルのＨＩＦ−１αは局所ＣａＰを示すものであり得、一方、低レベルのＨＩＦ−１αは、患者が前立腺肥大症を有すること、又は上記癌が転移性になっていることを示すものであり得る。この場合も、ＨＩＦ−１αを他の１つ又は複数のマーカーと併せてマーカーとして使用することが、ＣａＰの異なるステージ、例えば前立腺肥大症と転移性ＣａＰとを識別するのに有用であり得る。
【００６０】
（予後判定におけるマーカーの有用性）
Ｅ２Ｆ３及びＣＡＩＸなどのマーカーの一部は、それらの発現レベルの変化に加えて、疾患発達の侵襲性を判定する予後判定における有用性を有する。１つ又は複数のそのようなマーカーを、本発明の診断検査で使用されるマーカーのパネルに含めることは、疾患のステージの正確な診断に寄与するのみではなく、潜在的な疾患進行の速度も示すことができるであろう。疾患進行速度の予測が可能となることによって、治療の適切な選択を行うことが可能となろう。
【００６１】
Ｅ２Ｆ３は、侵襲性の高い形態の前立腺癌と関連していると以前に報告されているので、可能性の高いＣａＰの侵襲性を判定するための適当なマーカーである（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４年、２３（３５）：５８７１−５８７９）。
【００６２】
患者のＣａＰの侵襲性を予測するのに、ＣＡＩＸを用いてもよい。ＣＡＩＸは、低酸素によって誘導され、ＣａＰ発達の初期に上方制御される。アンドロゲン非依存性骨細胞系（ＰＣ３）は治療に対して非反応性であり、この細胞系では別の潜在的なスプライシング形態が発現されるが、このスプライシング形態はアンドロゲン依存性リンパ節細胞系（ＬｎＣａＰ）では発現されない。この選択的スプライシング形態は、すべての患者試料にも存在している。これは、攻撃的な腫瘍においてＣＡＩＸが上方制御されていること、及び上記選択的スプライシング形態が、攻撃的な腫瘍の初期診断及び予後判定のツールとなることを示唆している。
【００６３】
（転移ステージでの検査の適用）
転移ステージのＣａＰを診断する現在の方法には、血清ＰＳＡレベルの測定が含まれ、＞１０μｇ／ｌのレベルが転移癌を示す。しかし、局所癌を有する患者及び悪性所見のない患者の一部も、より高いレベルを有することがあり、また、転移癌を有する患者の一部は、より低いレベルを有することがある。したがって、正確な診断には、この方法を単独で用いることはできない。
【００６４】
組織学では、腫瘍が転移性になっているかどうか、それとも局所性のままでいるかどうかを示さないので、腫瘍生検も、転移ステージのＣａＰを正確に診断するのに用いることはできない。いかなる二次腫瘍を同定するのにも、骨スキャンを用いることができる。しかし、それらの可視化は、その腫瘍が検出されるのに十分に大きく、且つ十分に確立されているかどうかに依存する。したがって、初期ステージの転移性疾患は同定されない可能性がある。この発達初期ステージにある転移ＣａＰの同定は、適切且つ有効な治療を探求するのに不可欠である。
【００６５】
本発明のｑＲＴ−ＰＣＲ診断検査は、末梢血中を循環している細胞を検出する。患者が転移ＣａＰを有するかどうかを判定するモニタリングを行うのに、転移ステージで特異的に上方制御されているマーカーを選択することができる。例えば、ＭＭＰ９は、ＢＰＨ／ＮＥＯＭと比較してＬｏｃＣａＰで上方制御されており、また、ＭｅｔＣａＰで有意にさらに上方制御されており、転移の明確な指標を与えるものである。したがって、ＭＭＰ９レベル又はＭｅｔＣａＰで上方制御若しくは下方制御されている他のマーカーのレベルのいかなる増大も、転移の危険性を示すであろう。本発明の検査は、上記マーカーの発現レベルのいかなる増大の検出も、循環している細胞の数のいかなる増大の検出も可能にする。治療の有効性を判定するために、同じマーカーの発現変化のモニタリングを行ってもよい。有効な治療は、細胞数の減少と、マーカー発現の低下とをもたらすであろう。
【００６６】
ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＨＩＦ−１α、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＰＩＭ−１、及びＭＴＳＰ１が、ＣａＰが転移性であるかどうかを判定するのに使用できる他の好ましいマーカーである。
【００６７】
（手術後の潜在的再発のモニタリング／ＣａＰ治療の有効性）
本発明の別の実施形態では、ＣａＰの治療を受けている患者又はＣａＰの治療を受けた患者をモニターするのに、対象からの体液試料中における、本明細書に記述したマーカーの発現レベルを用いることができる。
【００６８】
例えば、手術後のＣａＰ患者、典型的には前立腺全摘除術（ＲＰ）を受けた患者では、可能性の高いＣａＰの再発をモニターするのに血液中のマーカー発現の分析を用いることができる。手術後に、マーカーレベルが上昇を続ける場合、又は低下の徴候を示さない場合には、これは疾患の残存又は以前に検出されなかった転移の存在のいずれかを示すものであり得る。これはＨＩＦ−１αを参照して明示され得る。前立腺全摘除術（ＲＰ）を受けた患者から手術後に得られた血液試料中で、疾患の残存を示す陽性切除縁を有する患者は、疾患残存の徴候を示さない陰性切除縁の患者より有意に高い血中ＨＩＦ−１αレベルを有する。したがって、疾患の再発をモニターするために、単独で、若しくは他の１つ又は複数のマーカーと併せてＨＩＦ−１αを用いることができる。
【００６９】
ＬｏｃＣａＰのホルモン療法又は放射線療法を受けている患者では、一部のマーカーの発現レベルの増大又は他のマーカーの発現レベルの低下によって、癌が転移ステージに発達する継続的な危険性が示される。それによって、代替治療又はより攻撃的な治療が指示されるであろう。逆に、治療が成功している場合には、マーカー発現レベルが、ＢＰＨ／ＮＥＯＭの典型的なレベルに類似したものとなるであろう。
【００７０】
この実施形態では、ＭＴＳＰ１及びＥ２Ｆ３マーカーが好ましく、ＲＥＣＫ、クラスタリン、及びＭＭＰ９がさらに好ましい。これらのマーカーは皆、ＮＥＯＭ／ＢＰＨ患者群とＭｅｔＣａＰの患者群との間で極めて顕著な相違を示す。
【００７１】
（発現レベルの分析）
マーカーと内部対照とのいかなる特定の組合せにも、統計分析を行うことができ、それによって、所与のレベルのマーカー遺伝子発現（ｑＰＣＲによって測定されたもの）に関して、特定のステージの前立腺癌、例えば、良性対悪性又は局所浸潤性対転移性を示す確率を生成させることができる。
【００７２】
例えば、異なる患者群からの結果を、患者群相互の相対的マーカー発現レベルの全一対比較に関するＡＮＯＶＡ及び多重比較を用いて分析できる。また、代替のノンパラメトリック法（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ順位和検定）も、患者群相互の相対的なマーカー発現の相違を決定するのに使用できる。加えて、多項式モデルを用いて、データをさらに分析してもよい。
【００７３】
データは、判別分析、要因分析、クラスター分析、ロジスティック回帰分析、ＡＮＯＶＡ、又は主成分分析などの、２つ以上変数を同時に分析する統計的手法（多変量解析）を用いて分析できる。
【００７４】
判別分析は、例えば、１セットの観察を事前に定義されたクラスに分類する技法である。目的は、予測変数又は入力変数と呼ばれる１セットの変数に基づいて、観察のクラスを決定することである。モデルは、クラスが既知である１セットの観察に基づいて構築される。例えば、前立腺癌の診断、及びこの疾患の異なるステージの鑑別診断のための検査において、癌患者及び非癌患者など、２つ以上の群に１セットの観察を分割する根拠となる特性を同定するのに判別分析を用いることができる。個々の症例に関する情報は多くの変数から得られる。個体が属する群を定義及び／又は予測するのに、これらの変数を使用できるかどうか尋ねるのは妥当なことである。判別分析は、元の変数の組合せである新規の変数を生成することによって働く。これは、事前に定義された群相互の相違が最大となるような方法で行う。
【００７５】
受信者動作特性／曲線下面積（ＲＯＣ／ＡＵＣ）分析は、本発明の検査を用いて得られるデータを分析するのに使用できる別の技法である（Ｍｅｔｚ，Ｃ．Ｅ．（１９７８年）、「ＲＯＣ分析の基本原理（Ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＲＯＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．８（４）：２８３−９８）。ＲＯＣ／ＡＵＣ分析は、診断検査の診断「精度」、「感度」、及び「特異性」の測定を可能にする。これらの測定値、並びに関連した指標である「真陽性率」及び「擬陽性率」は、判定閾値の任意の選択に依存する。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、この判定閾値作用の単純ではあるが完全な実証的記述であり、様々な種類の正しい判定及び誤った判定の相対頻度のすべての可能な組合せを示すことが示されている。
【００７６】
検査の精度は、その検査が検査される群をいかに良く、例えば、ＣａＰを有するものと、そうでないものとに分離するかに依存している。精度は、ＲＯＣ曲線の下の面積（ＡＵＣ）によって測定される。面積１．０は、検査が最大の識別力を有することを示し、面積０．５は、全く識別しないことを表す。診断検査の精度を分類する大まかな指針は以下の通りである。
【表２】
2008520228.tif 000003
【００７７】
ＣａＰマーカーのレベルがＣａＰを示すものであるか、それとも癌でないことを示すものであるかを決定する方法、ＣａＰマーカーのレベルが、ＬｏｃＣａｐ若しくはＭｅｔＣａｐなどの特定のステージのＣａＰを示すものであるかどうかを決定する方法、又は患者のＣａＰの侵襲性を予測する方法は、コンピューターを用いて実施してもよい。上記コンピューターは、発現データを得るのに使用される測定器、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）と物理的に離れていても、或いは一体となっていてもよい。
【００７８】
ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた発現データを用いて、非癌、ＣａＰ、並びに／又はＣａＰの様々なステージ及び／若しくは侵襲性を識別するのに、教師付き機械学習クラス分類法を使用することもできる。最初に、機械学習クラス分類器の訓練を、状態が既知の患者から得られたトレーニング用発現データと、対照とする対象からのトレーニング用対照データとを用いて行う。
【００７９】
機械学習クラス分類器として適したものには、単層パーセプトロン（ＳＬＰ）、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、決定木、及びサポートベクトルマシンが含まれる。上記クラス分類器は、ガウシアンカーネルサポートベクトルマシンなどのサポートベクトルマシンが好ましい。純粋生物統計学アルゴリズム（ｐｕｒｅｌｙ  ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、遺伝子クラスターアルゴリズム、及び決定木−クラス決定木などの他の適当な生命情報工学モデルを用いてもよい。
【００８０】
（ＣａＰの症状及び診断）
ＣａＰのマーカーは、局所癌を有する患者で上方制御（ＮＥＯＭ又はＢＰＨとの比較）されていることも、転移性疾患を有する患者でさらに上方制御されていることもある（下表のマーカー１を参照）。そのようなマーカーの例には、カベオリン及びＭＭＰ９が含まれる。１つ又は複数のそのようなマーカーの発現レベルを測定することによって、疾患の発達におけるすべてのステージの正確な診断が可能となる。
【００８１】
ＣａＰの他のマーカーは、局所癌を有する患者では上方制御されているが、その後、転移性疾患を有する患者では下方制御される（下表のマーカー２を参照）。そのようなマーカーの一例はｅ−ｃａｄである。一部の場合では、悪性所見のない患者、及び転移性疾患を有する患者のマーカー発現レベルがかなり近似していることがある。そのような場合、この疾患の２つの形態を識別するのに、他の因子を考慮に入れることができる。例えば、ＮＥＯＭ患者とＭｅｔＣａＰ患者との間で顕著に異なる症状及び血清ＰＳＡレベルを、循環しているＣａＰ細胞におけるＣａＰマーカーに加えて、モニターすることができる。
【００８２】
【表３】
2008520228.tif 000004
【００８３】
伝統的には、血清ＰＳＡレベル４未満は、ＮＥＯＭを示し、４を超えるレベルは局所癌を示すと考えられている。しかし、オーバラップ領域が存在するため、血清ＰＳＡレベルによって、良性と局所癌とを正確に識別することはできない。局所癌患者における、本研究に含まれているマーカーの顕著な上方制御を用いて、これらの疾患ステージの正確な鑑別診断を行うことができる。しかし、転移段階におけるこれらのマーカーの下方制御には、血清ＰＳＡの著しい上昇が伴っている（１０を超えるレベルが転移性疾患を示す）。したがって、一部のマーカーの発現がかなり近似したものであり得るという事実にもかかわらず、悪性所見のない患者（血清ＰＳＡ＜４）を、転移性疾患を有する患者（＞１０）と区別して正確に診断することが可能である。
【００８４】
ＣａＰのマーカーの一部は、他のタイプの癌のマーカーとしても働く。したがって、ＣａＰの診断は、通常、患者がＣａＰに特徴的な肉体的症状を示す場合になされる。したがって、ＣａＰを他の癌から識別するのに、或いはＣａＰの異なるステージの識別を補助するのに症状が使用される場合がある。
【００８５】
ＢＰＨ／ＮＥＯＭの患者は、排尿回数の増加（夜間多尿）、排尿開始時の遅延若しくは困難、尿滴下、膀胱内残尿感、及び尿流量低下を現す。閉塞性症状は、未処置の場合、水腎症病変になることも、腎不全になることさえある。これらの症状の発達は通常長期化し、典型的には何ヶ月も、或いは何年もかかる。
【００８６】
転移性疾患を有する患者では、症状の開始がさらに速いことが多く、通常は数ヶ月以内である。上記の症状に加えて、患者は血尿を示すことがあり、これには失血による貧血が伴う可能性がある。これは、癌性悪液質と共に、倦怠及び嗜眠を引き起こし得る。転移は、主として骨内に形成され、臀部、骨盤、背骨（腰部及び胸部）、及び胸郭が最も一般的な部位である。これは、休息によって解消されない疼痛をもたらし、この疼痛は通常の鎮痛剤に反応しない。骨内の転移は、特発性骨折を引き起こす可能性があり、それによって神経障害が起こり得る。腰椎骨折は、下肢における感覚運動障害を引き起こす可能性があり、また、失禁も引き起こし得る。これらのすべての症状は、ＢＰＨ又はＮＥＯＭを示す患者には存在していないであろう。
【００８７】
診断をさらに明確にし得る追加検査には、
−転移の存在を同定するための骨スキャン；
−転移癌患者におけるクレアチニンレベルの急増を実証するための尿電解質分析；
−高レベルだと骨転移の存在を示す、血液試料中のアルカリホスファターゼレベルのモニター；及び、
−ＢＰＨにおけるなめらかな前立腺であるか、悪性の場合の硬く不均整な前立腺であるかを明らかにする直腸検査
が含まれる。
【００８８】
他の共変量の包含に関する最適な結果を得るために、ＡＩＣ評価基準を考慮に入れることができる。ＡＩＣスコアへのグリーソンスコア及び年齢の影響を判定するため、したがって、モデル適合性へのそれらの影響を判定するために、それらを追加又は代替の共変量として含めてもよい。
【００８９】
例えば、非癌性の対象から得られた試料、又はＣａＰを有することが既知である対象から得られた試料を用いて、対照アッセイを行うこともできる。
【００９０】
（検査キット）
本発明は、本発明の方法で使用するための検査キットも提供する。上記検査キットは、ＣａＰを診断するためのものでも、ＣａＰのステージを判定するためのものでも、ＣａＰの侵襲性を判定するためのものでも、手術後の患者における潜在的な再発をモニタリングするためのものでも、或いは患者における治療の有効性をモニタリングするためのものでもよい。したがって、本発明の検査キットは、対象から得た体液試料における、１つ又は複数のマーカーの存在若しくは不在、又は発現レベルを測定する手段を含み、前記１つ又は複数のマーカーは、Ｅ２Ｆ３、ｃ−ｍｅｔ、ｐＲＢ、ＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ、ＣＡＸＩＩ、ＣＡＩＸ、ＨＩＦ−１α、Ｊａｇｇｅｄ、ＰＩＭ−１、ヘプシン、ＲＥＣＫ、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＴＳＰ−１、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ１５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、Ｅ２Ｆ４、カベオリン、ＥＦ−１Ａ、カリクレイン２、カリクレイン３、及びＰＳＧＲのうち少なくとも１つを含む。上記検査キットは、上記対象から得た体液試料における、ＡＭＡＣＲ、ＰＳＡ、及びＦＡＳのうちの１つ又は複数の発現レベルを測定する手段をさらに含み得る。
【００９１】
対象の体液においてマーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定のための手段は、例えば、対象の体液中のマーカー遺伝子の発現レベルを測定するための手段、詳細には、相対的定量的ＰＣＲを用いた、対象の体液中のマーカー遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含み得る。マーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定のための手段は、１つ又は複数のマーカーの選択的スプライシング型の存在又は不在を測定する手段を含み得る。
【００９２】
本発明の試験キットには、対象の体液におけるマーカー遺伝子の発現が存在しているか、或いは不在であるかの判定をするためのいかなる適切な手段も含まれ得る。通常、上記手段は、マーカーを増幅するのに使用できる２つのオリゴヌクレオチド（プライマー）を含むであろう。通常、対象とする各マーカーにつき、１対のプライマー対が含まれるであろう。本発明の検査キットは、適した緩衝剤、例えばＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼを含めた酵素及び／又は対照ポリヌクレオチドを任意選択で含み得る。本発明のキットは、対象における脳卒中の起こしやすさを判定する方法で使用するのに適した容器及び説明書も含み得る。本発明の検査キットは、ＣａＰの治療で使用される薬剤も含み得る。
【００９３】
上記キットは、試料、好ましくは血液、又は試料から抽出されたＲＮＡなど、処理を受けた形態の試料の貯蔵用及び／若しくは輸送用の容器を含み得る。上記容器は、ｍＲＮＡを常温（すなわち約２０℃）で約１から約１０日間、好ましくは少なくとも約４日間、安定に保持できるものであり得る。例えば、上記容器は血液チューブ（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｘ社）でよい。そのような容器を用いる利点は、病院などの検査地に患者が移動する必要がないであろうことである。
【００９４】
（ＣａＰ治療）
本発明は、癌発達の極めて初期段階にあるＣａＰを有する対象の同定を可能にする。したがって、ＣａＰを、その発達初期段階に治療することができる。ＣａＰを患っていると同定された患者に、ＣａＰの治療を施すことができる。ＣａＰの治療として知られているいかなる適切な治療又は療法も使用できる。
【００９５】
監視待機が適切な場合もある。これは、症状が出現又は変化するまで、いかなる治療も与えずに患者の状態を注意深くモニタリングするものである。これは通常、他の医学上の問題を有するか、或いは疾患が早期にある年配の男性に用いる。
【００９６】
７０歳未満の健康状態が良好な患者には、通常、ＣａＰの治療として手術が薦められる。本発明に従って同定された患者を治療するのに、以下のタイプの手術が行われる。
−骨盤リンパ節切除：これは、骨盤中のリンパ節を除去する手術である。病理学者が、顕微鏡下で組織を見て癌細胞を探す。そのリンパ節が癌を含んでいる場合、医師は、前立腺を除去せずに、他の治療を推奨するであろう。
−前立腺全摘除術：これは、前立腺、その周囲の組織、及び近傍リンパ節を除去する手術である。前立腺全摘除術には２つのタイプがある。腹壁の切り込み（切開部）を介して前立腺を除去する手術である恥骨後式前立腺全摘除術、及び会陰（陰嚢と肛門との間の領域）に入れた切り込み（切開部）を介して前立腺を除去する手術である会陰式前立腺全摘除術である。近傍リンパ節の除去は、どちらのタイプの前立腺全摘除術とも同時に行うことができる。
−尿道を通して挿入された膀胱鏡（薄い照光チューブ）を用いて、前立腺から組織を除去する手術である経尿道的前立腺摘除術術（ＴＵＲＰ）。この手順は、他の癌治療を施す前に腫瘍によって引き起こされた症状を軽減させるのに時に用いられる。経尿道的前立腺摘除術術は、年齢又は病気のために前立腺全摘除術を施すことができない男性にも施すことができる。
【００９７】
手術を受けた男性では、性交不能症、及び膀胱からの尿の漏出、若しくは直腸からの糞便の漏出が起こり得る。場合によっては、神経保存術として知られている技法を用いてもよい。このタイプの手術では、勃起を調節する神経を残し得る。しかし、大きな腫瘍又は神経の直近にある腫瘍を有する男性には、この手術を施すことができない可能性がある。
【００９８】
高エネルギーエックス線又は他のタイプの放射線照射が用いられる放射線療法が使用できる。放射線療法は、外部放射線療法でも、内部放射線療法でもよい。内部放射線療法は、癌の中又は近傍に直接配置された針、種子、ワイヤー、又はカテーテル中に封入された放射性物質を用いる。放射線療法が施される方法は、治療される癌のタイプ及びステージに依存するであろう。
【００９９】
ホルモン療法には、以下のもの、すなわち、ロイプロリド、ゴセレリン、及びブセレリンなどの黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；フルタミド及びビカルタミドなどの抗男性ホルモン；並びに、ケトコナゾール及びアミノグルテチミドを含めた、副腎がアンドロゲンを産生するのを阻止できる医薬品が含まれ得る。睾丸摘出術も、ホルモン産生を低下させるために用いることができる。
【０１００】
ＣａＰ細胞を凍らせて、それによって破壊する低温外科手術を用いることもできる。
【０１０１】
転移性前立腺癌（ＭｅｔＣａＰ）の治療では、前立腺の局所療法及び二次腫瘍の治療を施す。
【０１０２】
前立腺の局所療法では、通常、第１線としてホルモン療法を施す。例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト及び／又は抗男性ホルモン治療（ビカルタミド又は酢酸シプロテロン）を用いることができる。ホルモン療法がうまくいかなかった患者では、コルチコステロイド、ミトキサントロン、ドセタキセル、スラミン（Ｓｕｒａｍｎｉｎ）、及び／又はエストラムスチンなど、様々な様式の化学療法を含めた治療へと進める。持続的な血尿、又は腎不全を引き起こす水腎症（腎臓／尿管の肥大）などの副次作用がある場合、局所癌中の前立腺に放射線療法を施すことがある。
【０１０３】
２次病変は通常、骨内に存在する。２次病変の治療では、通常、局所放射線療法又ストロンチウム−８９などの放射性医薬品を用いる。患者の疼痛又は神経損傷を治療することができる。治療関連骨粗鬆症を治療し、骨関連イベントの発生を低下させるのに、ビスホスホネートを用いることができる。
【０１０４】
他の支持処置には、貧血及び出血の治療、播種性血管内凝固症状群の管理（発症した場合）、疼痛管理用のオピオイド、並びに尿管障害を治療するのに用いる尿管ステント術又は尿路変更術が含まれる。
【０１０５】
本発明の方法に従って、ＣａＰを患っていると同定された対象は、化学療法を用いて治療することができる。化学療法は、全身性のものでも、局所的なものでもよい。
【０１０６】
生物療法若しくは免疫療法も適切であり得る。
【０１０７】
本発明の方法を用いて同定された対象の治療を、上述した治療のいずれに従っても行うことができる。したがって、そのような対象を治療するのに、ＣａＰ治療用であることが知られているいかなる適当な薬剤も使用できる。
【０１０８】
本発明の方法に従って同定された対象を治療する方法で使用に供する医薬品の製造において、ＣａＰの治療に用いられる薬剤を用いることができる。したがって、ＣａＰの治療で用いられる薬剤の投与によって、ＣａＰを有するものとして同定された対象の状態を改善させることができる。本発明の方法に従って同定された患者に、ＣａＰの治療に用いられる薬剤を治療有効量投与できる。
【０１０９】
ＣａＰの治療に用いられる薬剤は、様々な剤形で投与することができる。したがって、それらは、例えば、錠剤、トローチ、口中錠、水性若しくは油性懸濁液、分散性の粉末若しくは顆粒として経口投与できる。ＣａＰを治療するのに用いられる薬剤は、非経口的に、皮下、静脈、筋肉内、胸骨内、若しくは経皮的に、或いは注入技法によって投与することもできる。そのような薬剤は、座薬としても投与できる。医師は、特定の患者それぞれに必要な投与の経路を決定できるであろう。
【０１１０】
ＣａＰの治療で用いられる薬剤の処方は、正確な薬剤の性質、意図されている使用が医薬用のものか獣医学的なものかなどの因子に依存するであろう。ＣａＰを治療するのに用いられる薬剤は、同時に、別々に、或いは逐次に使用するように処方できる。
【０１１１】
対象の体液における１つ又は複数のマーカー遺伝子の発現の不在若しくは存在、又はレベルを測定するための手段と、治療によってヒト又は動物の体を治療する方法で、同時に、別々に、若しくは逐次に使用するための混合調製物としてＣａＰの治療で使用する薬剤とを含有する製品も本発明によって提供する。そのような製品は、治療のための手段と、診断のための手段との両方を含み得る。
【０１１２】
ＣａＰの治療に用いられる薬剤は、通常、本発明における投与用に、薬学的に許容される担体又は希釈剤と共に処方される。上記薬学的担体又は希釈剤は、例えば等張液であり得る。例えば、経口用固体製剤は、活性化合物と共に、希釈剤、例えば、ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、又はジャガイモデンプン；潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニールピロリドン；脱凝集剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、又はデンプングリコール酸ナトリウム；飽和剤；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリルスルホン酸などの湿潤剤；並びに、製剤に使用される非毒性且つ薬理学的に不活性な物質一般を含有し得る。そのような製剤は、既知な方法で、例えば、混合、造粒、錠剤化、糖コーティング又はフィルムコーティング工程によって製造できる。
【０１１３】
経口投与用の液体分散媒は、シロップ、エマルジョン又は懸濁液でよい。シロップは、担体として例えば、ショ糖、或いはグリセリン及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールとショ糖とを含有し得る。
【０１１４】
懸濁液及びエマルジョンは、担体として例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含有し得る。筋肉注射用の懸濁液又は溶液は、活性化合物と共に、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、及びグリコール、例えばプロピレングリコールと、望ましい場合には適切な量の塩酸リドカインを含有し得る。
【０１１５】
静脈内投与用又は注入用の溶液は、担体として、例えば滅菌水を含有するか、或いは好ましくは、それらは無菌且つ水性の等張食塩水の形態のものであり得る。
【０１１６】
ＣａＰの治療に用いられる薬剤を、患者に治療有効量投与する。ＣａＰの治療に用いられる薬剤の用量は、様々なパラメータに応じて、なかでも、使用される物質；治療を受ける患者の年齢、体重、及び状態；投与経路；及び必要とされる処方計画に応じて決定することができる。この場合も、いかなる特定の患者に関しても、医師が必要な投与経路及び用量を決定できよう。典型的な日用量は、特異的阻害剤の活性、治療される対象の年齢、体重、及び状態、変性のタイプ及び重度、並びに投与の頻度及び経路に応じて、体重１ｋｇあたり約０．１から５０ｍｇまでである。１日用量レベルは５ｍｇから２ｇまであることが好ましい。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１１８】
（諸言）
セントジョージ病院（Ｓｔ．Ｇｅｏｒｇｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）泌尿器腫瘍科外来診療所に来診した患者から血液試料を採集した。それらを、以下に示す臨床的な詳細と、病理組織学的学的分析の結果とに基づいた診断に従って分類した。
【０１１９】
ＮＥＯＭ群（悪性所見なし）は、生検結果が悪性所見を示さなかった患者から成る。この群には、ＢＰＨ（前立腺肥大症）と診断された患者も含まれる。ＢＰＨ患者は、そう診断された結果として、チャネルＴＵＲＰ（経尿道的前立腺摘除術）を受けた。この群の年齢の中央値は６０である。試料採取時における血清ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）の中央値は５．３５ｎｇ／ｍｌである。組織学検査時におけるＰＳＡの中央値は６．２ｎｇ／ｍｌである。組織学検査と試料採取との間隔の中央値は１４５日間である。
【０１２０】
ＬｏｃＣａｐ群（局所癌）には、生検で立証された前立腺腺症を有するが、転移性疾患のいかなる臨床的及び／又は放射線学的証拠もない患者が含まれる。この群の年齢の中央値は７２である。試料採取時における血清ＰＳＡの中央値は７．３５ｎｇ／ｍｌである。組織学的診断時の血清ＰＳＡの中央値は１２．８５ｎｇ／ｍｌである。組織学的診断と試料採集との間隔の中央値は２１２日間である。この群は、監視を受けている患者と、治療を受けている患者とを含有する。治療タイプに関する正確なデータは得ることができない。
【０１２１】
ＭｅｔＣａｐ（転移癌）群は、広範な疾患の証拠を示した患者から成る。これらの患者の大部分は、骨スキャンで陽性であった。２名は、骨盤のＣＴ／ＭＲＩ（コンピューター断層撮影法／磁気共鳴映像法）で、転移性疾患を有すると診断された。この群の年齢の中央値は７１である。試料採取時における血清ＰＳＡの中央値は２７．６ｎｇ／ｍｌである。組織学的診断時の血清ＰＳＡの中央値は２４４ｎｇ／ｍｌである。組織学検査と試料採取との間隔の中央値は４８３日間である。この群の患者はすべて、何らかの形態の積極的治療を受けている。治療のタイプに関するデータは得ることができない。
【０１２２】
ＲＰ群（前立腺全摘除術）は、前立腺全摘除術を受けた患者から成る。これらの試料はすべて、手術後に採取された（手術後８１から１５８４日までの範囲）。手術前及び手術後の両方で試料採取された患者はいない。手術日と試料採取との間の期間の中央値は４４９日間である。手術前における血清ＰＳＡの中央値は７．６ｎｇ／ｍｌである。試料採取時における血清ＰＳＡの中央値は、０．１ｎｇ／ｍｌであり、平均は０．４ｎｇ／ｍｌである。手術標本の組織学は、１０／１８の症例で陽性の範囲を示した。試料採取の時点で、生化学的に再発を示した患者が４人いる。２００４年１２月までの血清ＰＳＡデータを考慮に入れた場合、この数字は９にまで増大する。これらのうち、３人は手術標本では陰性の範囲にあった。
【０１２３】
患者の血液試料からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに転写し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた定性的増幅及び定量的増幅にすぐに使用できるようにした。これらのアッセイはすべて、四つ組で行った。
【０１２４】
本発明者らの研究は、１９９５年に立ち上げた、プロスペクティブな病理学（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）に基づいた前立腺疾患のデータベースセットに依拠するものである。このデータベースセットは、セントジョージ病院で行われたか、外部の独立した病院から送られてきた生検すべての症例に関するものである。これらのデータには、ＰＳＡ値と併せて、利用可能な場合、診断の方法、並びに、いかなるものであれ、存在している腫瘍のグレード及びステージに関する情報が含まれている。上記データベースは、上記分析でその血液が使用されている各患者の診断及び臨床上の詳細の正確性を確実なものとし、それによって、本発明者らの結果を臨床診断と相関させることを可能にする。
【０１２５】
前立腺特異的マーカー及び前立腺癌特異的マーカーの発現を測定した。これらのマーカーの特徴と、それらを診断試験で使用する可能性に従って、それらの優先順位をつけた。
【０１２６】
本発明者らは、まず、ＲＴ−ＰＣＲの確立及び最適化を行い、それに続いて、Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲの確立及び最適化を行った。相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、循環している前立腺細胞の存在だけでなく、血中にある前立腺（癌）細胞の実際のレベルも測定する。このことは、それによって疾患の発達及び治療に対する反応のモニタリングが可能となるので重要である。結果は、既存の病理組織学的診断データと相関され、それによって、ＲＴ−ＲＣＲ検査におけるＣａＰマーカーの感受性の測定が可能となる。本発明者らは、検査された各マーカーを用いて得られた結果を、疾患発達のステージが既知なものと相関させた。
【０１２７】
（（実施例１）ＣａＰマーカーとしてのＥ２Ｆ３）
（材料及び方法）
（患者募集）
セントジョージ病院（英国ロンドン）の泌尿路腫瘍科クリニックに来診した患者を、前立腺生検による診断及び経尿道的前立腺摘除術（ＴＵＲＰ）に基づいて採用した。完全なインフォームドコンセントの後に、血液試料を得た。試験は、世界医師会のヘルシンキ宣言（２０００）に従って実施した。この試験に対する倫理的承認は、Ｗａｎｄｓｗｏｒｔｈ  Ｌｏｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。
【０１２８】
臨床診断及び病理組織学的情報並びに放射線医学的情報（骨スキャン及びＣＴ／ＭＲＩスキャン）に基づいて、患者を別個の群に分類した。各患者ごとのグリーソンスコアが利用可能であった。最も一般的に使用されるＣａＰ分類システムであるグリーソンスコアでは、正常な前立腺細胞が腺を形成する方法を、どのくらいの癌細胞の配置が模倣しているかに基づいて、癌性前立腺組織に対して１から５までの数字を割り当てる。細胞が出現する最も一般的なパターンに対して２つの数字が割り当てられ、次いでこれらを組み合わせて、グリーソンスコアを決定する（１から１０に及ぶ）。
【０１２９】
（ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成）
ＲＮＡｚｏｌ（商標）（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を使用し、製造業者のプロトコルに従って、血液（患者１００名及び健常男性対照１０名）から４連で全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ  ２μｇを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）及びオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡにした。
【０１３０】
（ＲＴ−ＰＣＲによるＥ２Ｆ３発現の分析）
Ｅ２Ｆ３の癌特異性を、ＲＴ−ＰＣＲと、ＬｎＣａｔ（アンドロゲン感受性）及びＰＣ３（アンドロゲン非感受性）細胞系及び１０名の健常男性の試料から抽出したｍＲＮＡとを使用して検証した。Ｅ２Ｆ３に対する遺伝子特異的プライマーは、公開されたｍＲＮＡ配列（アクセッション番号：ＮＭ＿００１９４９）に基づいて設計された［５’−ａａｔａｔｇｇｃｇｔａｇｔａｔｃｔｃｃｇ−３’（順方向）及び５’−ｃｔｔｃｃａａａｃａｔａｃａｃｃｃａｃ−３’（逆方向）］。第１鎖合成、Ｅ２Ｆ３に従う。
【０１３１】
ｃＤＮＡを、９５℃で１５分間変性させ、次いで９５℃／１分、５５℃／１分、及び７２℃／１分のサイクルを４０回使用して増幅した。この後、７２℃で６分間の最終伸長ステップを実施した。ＰＣ３及びＬｎＣａＰ  ＲＴ−ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動させ、配列決定して、増幅された産物の正確な同一性を確認した。同様にＲＴ−ＰＣＲは、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ（順方向：５’−ｔｇｃａｃｃａｃｃａａｃｔｇｃｔｔａ−３’、及び逆方向：５’−ｇｇａｔｇｃａｇｇｇａｔｇａｔｇｔｔｃ−３’）に関するプライマーを使用して実施し、それによってＲＮＡの質を決定した。
【０１３２】
（定量ＲＴ−ＰＣＲ）
相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用し、製造業者のプロトコルに従って、Ｅ２Ｆ３及びＧＡＰＤＨ遺伝子（前述のようなプライマー）に関して実施した。Ｅ２Ｆ３  ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのレベルは、精製されたＥ２Ｆ３  ＰＣＲ産物及びＧＡＰＤＨプラスミドをそれぞれ使用して、較正曲線を構成することにより計算した。相対的定量化は、標的分子の量をＧＡＰＤＨの量で割った比（Ｅ２Ｆ３／ＧＡＰＤＨ）として計算した。Ｅ２Ｆ３及びＧＡＰＤＨの標準曲線からの点は、各患者のサンプルランに含まれており、それによって、相対的定量化の正確な計算が可能になった。
【０１３３】
融解曲線分析を定量の後に実施して、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性を確認し、特異的及び非特異的Ｅ２Ｆ３産物とプライマーダイマーとを区別した。Ｅ２Ｆ３  ｑＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で電気泳動させて、融解曲線分析の結果を確認した。
【０１３４】
（統計分析）
統計分析を、Ｓ−ｐｌｕｓ（Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐ、シアトル、２００３）及びＳＰＳＳ  １１．５（ＳＰＳＳ、シカゴ、２００２）を使用して実施した。種々の患者群から得られた結果について、患者群相互での相対的Ｅ２Ｆ３発現のすべての対のある比較に関するＡＮＯＶＡ及び多重比較を使用して分析した［Ｓ−ｐｌｕｓ  ６．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｖｏｌｓ．Ｉ、ＩＩ（２００１）Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ］。代替のノンパラメトリック法（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位和検定）も使用して、患者群相互での相対的Ｅ２Ｆ３発現の差を決定した。さらに、多項式モデルを使用して、データをさらに分析した。その他の共変量の包含に関して最適な結果を実現するために、ＡＩＣ基準を考慮に入れた。グリーソンスコア、年齢、及び血清ＰＳＡを共変量として含め、それによって、これらがＡＩＣスコアに及ぼす影響、したがってモデルの適切性に及ぼす影響を決定した。
【０１３５】
（結果）
（ＣａＰ細胞系及び健常男性個体におけるＥ２Ｆ３発現の評価）
Ｅ２Ｆ３遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＣａＰ細胞系、ＬｎＣａＰ、及びＰＣ３で検出可能であった。健常男性個体ではＥ２Ｆ３産物が見られず、したがって、その癌特異性が確認された。ＧＡＰＤＨ発現は、両方の細胞系及び健常男性個体で陽性であり、したがってｍＲＮＡの完全性が検証された。
【０１３６】
（良性及び悪性の前立腺標本における定量Ｅ２Ｆ３発現プロファイリング）
相対的な定量Ｅ２Ｆ３遺伝子発現レベルを、前立腺肥大症（ＢＰＨ、ｎ＝８）、局所ＣａＰ（ＬｏｃＣａＰ、ｎ＝５１）、転移性ＣａＰ（ＭｅｔＣａｐ、ｎ＝２３）に罹り、また根治的前立腺摘除術（ＲＰ、ｎ＝１８）が施された患者から採取した血液ＲＮＡ試料に関して計算した。試料を、４連で分析した。
【０１３７】
４つの癌患者群すべての融解曲線分析は、Ｅ２Ｆ３  ｑＲＴ−ＰＣＲ産物の場合に８４℃の融解温度を示し、正確な同一性が確認された。ｑＲＴ−ＰＣＲを、負のＲＴ−ＰＣＲにもかかわらず男性対照試料に対しても実施して、Ｅ２Ｆ３が発現するか否か、又は発現が検出レベルよりも低いか否かをＲＴ−ＰＣＲを使用して決定した。しかし融解曲線分析は、いかなるＰＣＲ産物も示さず、健常男性対照試料ではＥ２Ｆ３発現がなかったことが確認された。
【０１３８】
Ｅ２Ｆ３  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、Ｅ２Ｆ３発現レベルがＢＰＨ患者群で極めて低いので（平均値０．１２、中央値０．０５５）、感受性が高かった。Ｅ２Ｆ３発現は、ＬｏｃＣａＰ患者群で大量に上方制御されることがわかった（平均値４．６７、中央値１．５４）。ＭｅｔＣａＰ患者群でのＥ２Ｆ３レベル（平均値１．８９、中央値０．６８）は、ＬｏｃＣａＰ群の場合よりも低いがＢＰＨ群の場合よりも著しく高かった（図１）。これらの結果は、より高いレベルのＥ２Ｆ３発現が、少なくとも良性疾患から局所的侵襲性ＣａＰへの移行の場合においてより侵襲的な疾患段階に関連していることを示している。根治的前立腺摘除術が施された患者は、ＬｏｃＣａＰ群で得られた場合と同様の、高レベルの平均Ｅ２Ｆ３発現を示した。個々のＲＰ患者それぞれに関する、本発明者等の術後臨床病理データのさらなる分析を実施した。正確な病理組織学的情報が利用可能である１４名のＲＰ患者のうち、９名の患者は陽性縁を示し、これは高レベルのＥ２Ｆ３発現であること説明することになる。陰性縁を示す残り５名のＲＰ患者のうち、２名は、ＢＰＨ群で得られた場合と同様の非常に低いＥ２Ｆ３発現レベルを示した。残り３名のＲＰ患者のうち、１名は高いＥ２Ｆ３発現を示したが、術後血清ＰＳＡレベルは極めて高く、疾患の再発を示していた。陰性切除縁を示すが高いＥ２Ｆ３レベルを示すこれら２つのケースは、一部の患者がその手術時に見掛け上すべての癌を切除したにもかかわらず再発を示すように、最終的には、経過観察中に転移性疾患に罹ることがわかる。それらの経過は観察されている。
【０１３９】
多重比較法のためには、正規性に関する検定仮定を満足させるように、対数変換が必要であった。多重比較検定を使用した統計分析［Ｓ−ｐｌｕｓ  ６．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｖｏｌｓ．Ｉ、ＩＩ（２００１）Ｉｎｓｉｇｈｔｆｕｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、シアトル］は、ＬｏｃＣａＰ患者群とＲＰ患者群の間を除き、異なる患者群間（ｐ値＜０．００１）でＥ２Ｆ３発現に、非常に有意な差があることを示した。同様の結果が、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの順位和検定を使用して得られた（ｐ値＜０．００１）。
【０１４０】
患者が、それらのＥ２Ｆ３値に従って３つの患者群のそれぞれに属することが予測される確率を示すプロットを構成する際に、Ｓｐｌｕｓでの多項式分析から得られた予測値を使用した（図２）。Ｅ２Ｆ３レベルが２よりも高いと、ＬｏｃＣａＰの診断とその他の２つの患者群（ＢＰＨ及びＭｅｔＣａＰ）の診断との確率分布はより明らかになり、ＬｏｃＣａＰ群が優位になる。したがって、Ｅ２Ｆ３値が２よりも高い場合、診断からＬｏｃＣａＰに関するものである確率は、一貫して０．５９よりも高く、場合によっては１）に近いレベルに到達する。一方、ＢＰＨ又はＭｅｔＣａＰの診断確率は、Ｅ２Ｆ３の閾値レベルが２の後に、著しく低下する。
【０１４１】
非常に低いＥ２Ｆ３発現レベル（０から１）では、３つの群における診断確率を分離することができない。ＬｏｃＣａＰに関する高確率レベルが、このプロットの上方領域を占め、したがって必然的に、ＭｅｔＣａＰ患者の場合に若干の誤分類をもたらす可能性があることに留意する価値がある（診断精度のセクションも参照）。
【０１４２】
グリーソンスコアを含むことによって、多項式モデルに関するＡＩＣスコアが著しく低下し（適合度と過剰パラメータ表示とのバランスをとる指標）、ＡＩＣの値が小さい場合は、より節約的なモデルを指し示しており［Ｂｕｒｎｈａｍ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（２００２）Ｍｏｄａｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ニューヨーク］、これらが正確な診断に寄与することを示している（図３）。多項式モデルのために、ＢＰＨ群の患者は、０に等しいグリーソンスコアを有すると見なす。侵襲性がより低い形の癌の場合（グリーソン＝２）、ＬｏｃＣａＰ患者群は、それらの相対的Ｅ２Ｆ３値に関して、ＭｅｔＣａＰ患者群から明瞭に分離することができる。しかし、より侵襲性の高い形の癌では（グリーソン＝７及び１０）、ＭｅｔＣａＰ患者群が、より大きい間隔のＥ２Ｆ３／ＧＡＰＤＨ値に関して、その可能性ある占有率を増大させる。最も侵襲的な癌では（グリーソン＝１０）、ＭｅｔＣａＰの診断は、０から８の間の相対的Ｅ２Ｆ３に対してより高い確率を有する。
【０１４３】
血清ＰＳＡレベル及び診断年齢を共変量として含めることによって、ＡＩＣが増大し、診断確率を定めるのに何の影響も及ぼさなかった（結果は図示せず）。
【０１４４】
（診断精度）
上述と同じ統計モデルに基づけば、Ｅ２Ｆ３遺伝子の値を基にした予後精度は、予測するのに用いられる患者群のタイプに左右されることが明らかである。図４は、標的がＢＰＨ群とその他２つの癌の群（左手側のプロット）とを区別するものである場合、正確な結果を実現できることを示す。しかし、様々な癌の群とｌｏｃＣａＰからＭｅｔＣａＰまでとを区別することが、徐々により困難になる。本発明者等は、これが、臨床的に侵襲性のＣａＰからＭｅｔＣａＰへの疾患の進行に関連したその他のメカニズムに起因する可能性があるという自らの見解を、繰り返し主張する。
【０１４５】
先に述べたように、高確率レベルのＬｏｃＣａＰはプロットの上方領域を占め、したがって、ＭｅｔＣａＰ患者の場合には、若干の誤分類を必然的にもたらす可能性がある。これは、図４に見ることができる。図４は、相対的Ｅ２Ｆ３レベルに従って３つの患者群のそれぞれに分類される予測確率分布が、真の診断に従って分けられることを示す。Ｅ２Ｆ３発現レベルは、ＢＰＨと悪性疾患とを明瞭に区別するが（図４ａ）、ＬｏｃＣａＰとＭｅｔＣａＰとを正確に区別することは、それほどうまくできない（図４ｂ及び４ｃ）。
【０１４６】
（考察）
本発明者等の知見は、ｑＲＴ−ＰＣＲの感受性ある非侵襲的技法を使用したＣａＰの早期診断及び正確なステージ判定のための非常に特異的なマーカーとしてＥ２Ｆ３を使用することができることを実証している。
【０１４７】
Ｅ２Ｆ３は、ＬｎＣａＰ及びＰＣ３細胞系の両方で多量に発現し、これはＥ２Ｆ３が、ＣａＰの最終産物ではなくて前立腺癌形成及び進行に関わるいくつかのメカニズムの１つであることを示している。転移性ＣａＰに罹っている患者のＥ２Ｆ３発現レベルは、局所ＣａＰ患者群の場合よりも低かったがＢＰＨ患者群でのレベルよりも著しく高く、これは疾患が臨床的に局在するＣａＰからアンドロゲン依存性の転移性ＣａＰへと進行するにつれて、Ｅ２Ｆ３とアンドロゲン受容体（ＡＲ）の作用との間に相乗作用が生ずる可能性があることを示している。しかし、この仮説は、さらに調べる必要がある（例えば、種々のレベルのＡＲを発現するＣａＰ細胞系での、Ｅ２Ｆ３発現の研究）。さらに、ＡＲに対する感受性／抵抗性に基づいた転移性患者群のさらなる細分化は、上記仮説をさらに評価するのに役立てることができる。
【０１４８】
ＬｏｃＣａＰ群で得られた場合と同様の、ＲＰ群での高レベルの平均Ｅ２Ｆ３発現は、前に検出されていない微小転移巣の存在を示す可能性がある。手術後であっても腫瘍細胞が依然として血液循環内に存在し、これはしばしば、疾患の再発及び／又は転移の可能性ある理由である（例えば、最小限の量の循環腫瘍細胞の存在は、結腸直腸癌患者の悪い予後と相関している）ことが十分に証明されている［Ｓｃｈｏｔｔ他（１９９８）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２７、３７２〜３７９］。
【０１４９】
多項式回帰モデルと一緒に、Ｅ２Ｆ３に関して定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用することにより、相対的Ｅ２Ｆ３発現レベルが２よりも高い場合、患者は臨床的に侵襲性あるＣａＰに罹っていると診断される確率がより高くなることが実証された。本発明者等のモデルは、治療がより効果的である疾患発症の初期段階で、ＣａＰと診断することができることを実証している。しかし、確率プロットを使用すると、正確な診断が不可能なＥ２Ｆ３発現レベルが依然としてある。これは、全く異なる生化学的経路を表すいくつかの分子メカニズム及び異なる組の遺伝子が疾患の発症及び進行に関与していることが文書で十分立証されているので、意外なことではない。これらの結果はさらに、ＣａＰの早期診断及び正確なステージ判定に関して、一組の診断遺伝子マーカーを開発する重要性を強調している。さらにＥ２Ｆ３は、前立腺癌形成の基礎をなすメカニズムを表すことができる、制御軸（ｐＲＢ−Ｅ２Ｆ３−ＥＺＨ２）の部分である。Ｅ２Ｆ３は、局所的な侵襲性ＣａＰで過発現し、ＭｅｔＣａＰ患者ではその発現レベルが低下することが示されているが、ＬｏｃＣａＰで同様に過発現したＥＺＨ２は、ＭｅｔＣａＰ患者でさらに上方制御される。したがって、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＥＺＨ２遺伝子発現レベルの評価、及び本発明者等のＥ２Ｆ３確率モデルにその結果を包めることは、良性疾患と局所的な侵襲性癌との正確な区別だけでなく、臨床上局在化したＣａＰと転移性ＣａＰとの正確な区別を行う際にも、さらなる助けとなる。
【０１５０】
ＣａＰ患者の血液中のＥ２Ｆ３発現の分析におけるｑＲＴ−ＰＣＲの使用は、疾患の発症及び進行を診断しモニターするのに、正確で感受性ある非侵襲的な技法であり、個々の遺伝子発現プロファイルに基づいて、より時宜に適った効果的な療法が可能になることが判明した。
【０１５１】
（（実施例２）ＣａＰのマーカーとしてのＨＩＦ−１α）
（方法）
セントジョージ病院（英国ロンドン）の泌尿器腫瘍科クリニックに来院した患者を前立腺生検による診断に基づいて採用した。
【０１５２】
患者１６４名及び対照の健常男性１０名から採取した血液から４連で全ＲＮＡを抽出し（ＲＮＡｚｏｌ法−Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ前増幅システムをオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用してそれを逆転写して第１鎖ｃＤＮＡにした。
【０１５３】
臨床診断及び病理組織学的情報並びに放射線医学的情報（骨スキャン及びＣＴ／ＭＲＩスキャン）に基づいて、患者を以下の４つ別々の群に分類した：ＢＰＨと診断された患者も含めた悪性所見なし（ＮＥＯＭ、Ｎ＝３６）の群；局所ＣａＰ（ＬｏｃＣａＰ、Ｎ＝６７）の群；転移性ＣａＰ（ＭｅｔＣａＰ；Ｎ＝２７）の群、及び前立腺全摘除術を受けた患者から手術後に得られた血液試料の群（ＲＰ、Ｎ＝３４）。
【０１５４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用するｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＣａＰ患者の血液試料中でのＨＩＦ−１α遺伝子発現を分析した。
【０１５５】
ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ２）を使用してデータを正規化して４群間で一定のレベルを維持した。結果は、ＨＩＦ−１α／ＧＡＰＤＨ２として表した。
【０１５６】
（結果）
（ＨＩＦ−１α発現の検証実験）
（１．増幅効率及び標準曲線）
ＨＩＦ−１αの反応は、再現性も高く（図５Ａ）、感度も高かった（対数値９の大きさ−図５Ｂ）。標準曲線は相関係数（Ｒ２）が０．９９８５、勾配が−３．５３である直線的な反応を示し（図５Ｂ）、それによって、指数関数的増幅効率が１．９９５であり、反応効率が９２％である（効率＝１０［−１／勾配］−１）ことが実証された。
【０１５７】
（２．融解曲線分析）
融解曲線分析から、別々の狭域ピークを伴う単一産物の増幅が実証され（図５Ｃ）、このことから高度に特異的な反応が示唆される。アガロースゲル電気泳動（図５Ｄ）及び単位複製配列の配列決定によってさらなる反応特異性を確認した。
【０１５８】
（３．統計分析）
ＲＰ群を、疾患の残存を示す手術後陽性切除縁を有する患者（ＲＰ＋）、及び陰性縁の患者（ＲＰ−）にさらに分割して、疾患の再発をモニターする際におけるＨＩＦ−１αの予後判定上の意味を決定した。その結果を図３に示す。
【０１５９】
ＭｅｔＣａＰとＮＥＯＭの間、ＮＥＯＭとＲＰ−（陰性縁）の間、ＭｅｔＣａＰとＲＰ−の間を除いて、異なる患者群間で相対的ＨＩＦ−１α発現レベル（ＨＩＦ−１α／ＧＡＰＤＨ２）において有意差が認められた（ｐ＜０．０００１）。
【表４】
2008520228.tif 000005
【０１６０】
（考察）
ＨＩＦ−１αは、ＬｏｃＣａＰ患者の５９／６３名で過剰発現している（ＮＥＯＭのベースライン集団と比較して遺伝子発現レベルの平均の上昇が２０倍；ｐ＜０．０００１）ことがわかり、このことから、ＨＩＦ−１αの上方制御によって生じる低酸素がＣａＰ形成の初期事象であることが示唆される。
【０１６１】
ＭｅｔＣａＰ患者群でのＨＩＦ−１αの下方制御（ＬｏｃＣａＰとＭｅｔＣａＰの間でｐ＜０．０００１）から、新生脈管構造の形成及び新生血管の構築後は腫瘍組織が低酸素環境でなく、腫瘍細胞が血流中に侵入し、二次的な転移部位を形成するには代替のメカニズムが必要であることが示唆される。ＲＰ患者群において高レベルのＨＩＦ−１α発現が認められた。そのうち高い割合の患者が陽性縁を有することが判明し、このことから残存疾患の存在が示唆され、モニタリングを継続し、考えられるさらなる療法を行う必要性が明らかとなる。
【０１６２】
ＣａＰ患者の血液中でのＨＩＦ−１α発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、疾患の発達の初期ステージを診断しモニターする高感度な非侵襲性の技法である。これらの結果から、ＨＩＦ−１αが、その発現の阻害により血管新生及び腫瘍増殖を阻害する新たな作用物質の開発を通じてＣａＰ療法の潜在的な標的となる可能性があることがさらに示唆される。
（実施例３）
【０１６３】
（ＣａＰのマーカーとしてのＣＡＸＩＩ）
（ｑＲＴ−ＰＣＲの結果）
患者試料すべてがＣＡＸＩＩ発現陽性であった。シグナル強度の差異から、患者間での現実の酵素レベルの差が示唆された。定量的ＲＴ−ＰＣＲから、
−ＣＡＸＩＩ発現が、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）群と比較して局所癌群（ＬＣａＰ）で上方制御され（６倍）、
−ＬＣａＰ群と比較して、ＭＣａＰ（転移癌）群（大多数はホルモン不応性であった）で下方制御される（１８分の１）
ことが判明した。
【表５】
2008520228.tif 000006
【０１６４】
（結論）
ＣＡＸＩＩは低酸素によって（ＨＩＦ−１を介して）誘導されるので、この結果から低酸素がＣａＰの発達に関与するメカニズムであることが示唆される。しかし、ＭＣａＰ患者でのＣＡＸＩＩの下方制御から、ホルモン不応性の末期ＣａＰで低酸素誘導メカニズムに優先する可能な代替経路が示唆される。これらのＣＡＸＩＩの特徴付けから、それが、腫瘍の環境を変化させることにより前立腺癌の初期の発達に現実に関与する可能性があることが示唆される。
【０１６５】
ＣＡＸＩＩは、ＣａＰの日常的な臨床診断及び予後判定において潜在的に優秀な分子マーカーである。
【０１６６】
（（実施例４）複数マーカーの分析）
表３に示すプライマーを使用して、上記に記載のｑＲＴ−ＰＣＲにより、患者血液試料から抽出したＲＮＡ中での以下のマーカーの発現を測定した：ｅ−ｃａｄ、ＲＥＣＫ、カベオリン、ＭＴＳＰ−１、ＨＩＦ−１α、Ｅ２Ｆ３、クラスタリン、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ２４、ＰＩＭ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３及びＥ２Ｆ４。様々な統計技法により発現データを分析し、その結果の概要を表４〜８に示す。
【０１６７】
表４に、悪性所見なし（ＮＭ）、局所ＣａＰ（ＬＣ）及び転移癌（ＭＣ）の患者におけるマーカー発現レベルの記述的分析の結果を示す。各患者群における各マーカーの発現レベルの平均値及び中央値を、標準偏差／四分値間範囲（ＳＤ／ＩＱＲ）及び信頼限界（９５％Ｃｌ）と一緒に示す。一方向ＡＮＯＶＡ試験の結果も、マーカーが上方制御されるか或いは下方制御されるかを示す表示と一緒に示す。×印は、示した群間でのマーカー発現レベルに有意差が認められなかったことを示す。
【０１６８】
表５に、前立腺癌（癌）患者と非癌（良性）患者を識別する各マーカーの能力を判定するＲＯＣ／ＡＵＣ分析の結果を示す。前記に記載の通りに（Ｍｅｔｚら、１９７８年）分析を実施した。この表は、各マーカーを分析した各群の患者数、曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼限界（９５％Ｃｌ）、癌患者と良性患者を識別する各マーカーの能力（分類）及びｐ値を示す。識別力を有するマーカーについては、この表は、各マーカーの陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）、効率、感度及び特異性も示す。
【０１６９】
表６及び７に、悪性所見なし（ＮＭ）の患者と局所ＣａＰ（ＬＣ）、ＮＭと転移癌（ＭＣ）、及びＬＣとＭＣを識別する各マーカーの能力を判定するＲＯＣ／ＡＵＣ分析の結果を示す。前記に記載の通りに（Ｍｅｔｚら、１９７８年）分析を実施した。表６は、曲線下面積（ＡＵＣ）、信頼限界（９５％Ｃｌ）及びｐ値を示す。表７はさらに、各マーカーを分析した各群の患者数（ｎ）、並びに各マーカーの陽性的中率（ＰＰＶ）、陰性的中率（ＮＰＶ）、効率、感度及び特異性を示す。
【０１７０】
表８に、段階的判別分析を使用して、癌患者と非癌患者を区別する、組み合わせて使用したときの選択したマーカーの診断強度を調べた結果を示す。以前に記載されている通りに（Ａｂｒａｍｏｗｉｔｚ及びＳｔｅｇｕｎ（編）、「公式、グラフ及び数表付き数学関数ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｆｏｒｍｕｌａｓ，Ｇｒａｐｈｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｔａｂｌｅｓ）」、第９刷、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｄｏｖｅｒ、９２７−９２８、１９７２年；Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ、「多変数分析（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、コネチカット州Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ：Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；Ｇｏｕｌｄ、「人間の測り間違い（Ｔｈｅ  Ｍｉｓｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｎ）」、ｒｅｖ．ｅｘｐ．版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｗ．Ｎｏｒｔｏｎ、１９９６年；Ｈａｉｒ、「多変量データ分析と解釈（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｄｉｎｇｓ）」、第４版、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ：Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、１９９５年；Ｓｃｈａｆｅｒ、「不完全な多変量データの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｄａｔａ）」、フロリダ州Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年；並びにＳｈａｒｍａ、「応用多変量技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ、１９９６年）分析を実施した。
【表６−１】
2008520228.tif 000007
【表６−２】
2008520228.tif 000008
【表７−１】
2008520228.tif 000009
【表７−２】
2008520228.tif 000010
【表８】
2008520228.tif 000011
【表９】
2008520228.tif 000012
【表１０】
2008520228.tif 000013
【表１１】
2008520228.tif 000014
【０１７１】
表５に示すマーカーの診断強度を判定するＲＯＣ／ＡＵＣ分析の結果を参照すると、ＲＥＣＫ及びクラスタリンは癌／非癌の診断を導く感度及び特異性の極めて高い組合せである優秀なマーカーであり、ＭＭＰ９、Ｅ２Ｆ３、ＭＴＳＰ−１、ＨＩＦ−１α及びｅ−ｃａｄは良好〜可のマーカーである。
【０１７２】
順方向の段階的判別分析の結果を示す表８を参照すると、組み合わせて使用したときに癌と非癌の区別をつけて診断するための最も強力なマーカーの組合せは、ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＭＴＳＰ１を含む。これらのマーカーの組合せは、癌と非癌の優秀な百分率での正確な診断（すなわち、癌と非癌のどちらについても１００％正確な診断）をもたらす。
【０１７３】
表６は、受信者動作特性／曲線下面積（ＲＯＣ／ＡＵＣ）分析を使用して判定した、疾患の発達の異なるステージでのマーカーの診断力の強度を示すものである。その結果は、
−ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＨＩＦ−１αを使用して、ＬｏｃＣａｐとＭｅｔＣａｐを区別することができ、同様にＮＥＯＭとＬｏｃＣａｐを区別することもできること；
−ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＨＩＦ−１αに加えて、Ｅ２Ｆ３及びＭＭＰ９がＮＥＯＭと局所疾患を区別する良好なマーカーであり、このステージでの診断にｅ−ｃａｄ及びＥ２Ｆ４を使用することもできること；並びに
−ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＨＩＦ−１αに加えて、局所癌と転移性癌を区別する良好なマーカーには、ＩＧＦＢＰ−３及びＥ２Ｆ４があり、この目的でカベオリン、ＭＭＰ９、ＰＩＭ−１及びＭＴＳＰ１を使用することもできること
を示すものである。
【０１７４】
マーカーの強度は、その使用を組み合わせることによりさらに増大させることができる。
【０１７５】
ＭｅｔＣａｐとＢＰＨ／ＮＥＯＭの正確な識別により、手術（前立腺全摘除術（ＲＰ））後の考えられる再発、及び／又はＣａＰ療法の有効性のモニタリングを容易にすることができる。局所癌患者は、ホルモン治療、放射線療法及び／又は手術（ＲＰ）を受けることになる。マーカーの発現レベルがホルモン治療及び／又は放射線療法の間に上昇していることが判明した場合、このことから、癌が危険な転移ステージに発達するリスクが継続していることが示唆され、それによって代替の又はより攻撃的な療法が指示される。反対に、療法が成功している場合、マーカー発現のレベルは、ＢＰＨ／ＮＥＯＭ患者試料により得られるものと同様となるはずである。同様に、ＲＰ後、マーカー発現レベルが上昇し続け、又は低下する徴候が示されない場合、このことから、残存疾患又は以前に検出されなかった転移（初期の転移性疾患には骨微小転移の形成があり、それは骨スキャンによって検出することができない）が示唆され得る。
【０１７６】
表６でのＮＥＯＭとＭｅｔＣａｐの間の判別分析を参照すると、ＲＥＣＫ、クラスタリン及びＭＭＰ９は療法に対する応答のモニタリングにおける潜在的な使用についての優秀なマーカーであり、ＭＴＳＰ１及びＥ２Ｆ３は良好なマーカーである。すべてのマーカーは、ＮＥＯＭ／ＢＰＨ患者群とＭｅｔＣａｐ患者群の間で高度な有意差を示した。
【０１７７】
（（実施例５）選択的スプライシング）
選択的スプライシングは、十分に裏付けられた現象であり、しばしば悪性形質転換と関連付けられる（Ｒｏｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５年  ３３（１６）：５０２６−３３、Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５年  ３３４（１）：２３−９、Ｓｃｈｗｅｒｋ  Ｃら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００５年  １９（１）：１−１３）。その根底にあるメカニズムには、認識部位を破壊するイントロン／エキソン境界での、或いはその後のスプライシングのための別の認識部位を生じさせるエキソン又はイントロン内での突然変異（置換、欠失又は挿入）が関与する。このようにして、別の物質がスプライシングを受けてｍＲＮＡに入ることもでき、或いは物質がスプライシングを受けてｍＲＮＡから外に出ることもでき、その結果、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）上で予想又は計算されるものより大きな又は小さな産物が生じる。
【０１７８】
ｍＲＮＡ及びその結果翻訳されるタンパク質のこれらの変化は、腫瘍形成の前駆現象となり得る。したがって、ｍＲＮＡスプライシングの変化をモニターすることは、腫瘍の発達のリスクを診断する潜在性を有する（Ａｔａｎｅｌｏｖら、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００５年  ４０  Ｓｕｐｐｌ  １６：１４−２０、Ｋｉｒｓｃｈｂａｕｍ−Ｓｌａｇｅｒ  Ｎら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００５年  ２１（３）：４２３−３２）。いくつかのマーカーが、前立腺癌における選択的スプライシング形態を示すものとして報告されている（Ｍｕｂｉｒｕ  ＪＮら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００５年  ６５（２）：１１７−２３、Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｕ  Ｐら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ．２００５年  ３５７（２）：１９０−５）。
【０１７９】
これらの腫瘍前駆突然変異及び選択的スプライシングの有無を判定する技法では、血液試料から抽出されたｍＲＮＡ、及びスプライシング突然変異を有する領域に隣接するヌクレオチド配列に特異的に設計されたプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを行う。アガロースゲルを使用して反応産物を電気泳動し、産物のサイズを分析する。別の産物が容易に示される。疾患の初期ステージ（ＢＰＨ）にある個人における別のスプライシング産物の判定は、その後の腫瘍の発達を示すものである。
【０１８０】
選択的スプライシングの証拠を示す癌特異的、前立腺特異的、又は前立腺癌特異的なマーカーのＥＺＨ２、ｅ−ｃａｄ及びＣＡＩＸをさらに調べた。使用したプライマーの配列及びその結果を表９に示す。
【表１２】
2008520228.tif 000015
ＲＴ−ＰＣＲ後、健常男性試料は正確な（予想／計算された）サイズの産物を示すが、細胞系試料（ＬｎＣａＰ及びＰＣ３）及び患者試料（ＮＥＯＭ、ＢＰＨ、ＬｏｃＣａＰ及びＭｅｔＣａＰ）では選択的スプライシングが明らかである。
【０１８１】
ＥＺＨ２は、細胞増殖経路を調節する転写抑制因子である。ＥＺＨ２の過剰発現によって癌の発達が生じる。正常なＥＺＨ２の産物は３２７ｂｐであり、ＣａＰで認められる選択的スプライシング産物は３９０ｂｐである。ＥＺＨ２のどちらの形態（正常な産物及び別の産物）も、すべての患者群及び細胞系で認められる。大きなスプライシング形態が示されたことから、イントロン内に別のスプライシング部位が生じ、その結果別の物質が包含される突然変異が示唆される。
【０１８２】
ｅ−ｃａｄは、ＣａＰで、特に高グリーソンスコアの腫瘍並びに局所進行性及び転移性腫瘍で下方制御される。正常なｅ−ｃａｄの産物は６１６ｂｐであり、選択的スプライシング産物はわずか３００ｂｐである。このＲＴ−ＰＣＲに使用するプライマーはどちらもエキソン１６に位置するものである。このことから、別のスプライシング認識部位が生じ、エキソン配列がスプライシングを受けて外に出る、エキソン内での塩基突然変異の可能性が示唆される。選択的スプライシング形態は、試験したどちらの細胞系でも認められた。患者試料は試験しなかった。
【０１８３】
ＣＡＩＸはＨＩＦ−１αによって制御され、ＣＡＩＸは低酸素の間に誘導され、癌の初期の確立及び発達に役割を果たす。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＣＡＩＸがＬｏｃＣａＰで上方制御され、ＭｅｔＣａＰで下方制御されていることを示すものである。正常なＣＡＩＸの産物は２５５ｂｐであり、選択的スプライシング産物は長さが９００ｂｐである。選択的スプライシング形態の検出に使用するプライマーはエキソン８〜１１にまたがるものである。別の産物は、イントロン９〜１０及び１０〜１１の一部を含む。別の産物が（ＬｎＣａＰ細胞系でなく）ＰＣ３細胞系及びすべての患者試料で示された。ＬｎＣａＰはリンパ節細胞系であるが、ＰＣ３は骨細胞系であり、したがってアンドロゲン依存性である。このことから、ＣＡＩＸが攻撃的な腫瘍で上方制御されていることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】４つの患者群における相対的な定量的Ｅ２Ｆ３発現レベルを示すグラフである。Ｅ２Ｆ３の発現はＬｏｃＣａＰ患者群で著しく上方制御されていた。これは、ＣａＰの早期診断及び正確なステージ判定を行うための診断上及び予後判定上の意味を有する可能性を示している。
【図２】患者の相対的なＥ２Ｆ３発現レベルに対する、患者が各群に属すると予測される確率を示すグラフである（説明変数としてＥ２Ｆ３／ＧＡＰＤＨ比を含む多項式回帰モデルに基づいて予測された）。
【図３】患者の相対的なＥ２Ｆ３発現レベルに対する、患者が各群に属すると予測される確率を示すグラフである（説明変数としてＥ２Ｆ３／ＧＡＰＤＨ比及びグリーソンスコアを含む多項式回帰モデルに基づいて予測された）。
【図４】（ａ）ＢＨＰ、（ｂ）ＬｏｃＣａＰ及び（ｃ）ＭｅｔＣａＰと分類された、予測された確率の識別能を、試験に参加した８２人の患者の真の診断に従って分割して示したグラフである（説明変数としてＥ２Ｆ３／ＧＡＰＤＨ比を含む多項式回帰に基づいた予測）。
【図５】ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いた、ＨＩＦ−１αＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果に示す図である。増幅中の蛍光シグナルのプロット。精製されたＨＩＦ−１αＰＣＲ産物の連続希釈を調製し、データを規準化するための外部標準（Ａ）として使用し、交差点（Ｃｐ−サイクル数）をコピー数（濃度）の対数に対してプロットしたグラフを作成して、検量線（較正曲線）（Ｂ）を得た。融解曲線分析は、８２℃で形成される幅の狭いピークの存在を明らかにし（Ｃ）、１％アガロースゲル電気泳動は、予測されたサイズである４１８ｂｐの単一バンドを示した（Ｄ）。
【図６】様々な患者群における相対的な定量的ＨＩＦ−１α発現レベルの対数プロット（Ａ）、及びＡＮＯＶＡを用いたＨＩＦ−１α発現の一対比較（Ｂ）を示す図である。
【図１】
2008520228.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008520228.tif 000020
【図６】
2008520228.tif 000021
【配列表】
2008520228000001.app
【国際調査報告】
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