(57)【要約】  本発明は、例えば抗菌薬若しくは飼料添加物としてさえ使用される、ブレビバシラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズからの新規ペプチド、ならびに、２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を有する単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを包含するそれに関するペプチドの、組成物ならびに特徴付けおよび使用方法を包含する。
2008508851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを含んでなる、飼料添加物。
【請求項２】
Ｃ末端のバリンのカルボキシ末端の−ＣＯＯＨ基が−ＣＨ２ＯＨに還元されている、請求項１に記載の添加物。
【請求項３】
Ｃ末端のバリンのカルボキシ末端の−ＣＯＯＨ基が−ＣＨ２ＯＨに還元され、そして該ペプチドにプロテアーゼ抵抗性を賦与する、請求項１に記載の添加物。
【請求項４】
ペプチドが１．０のｐＨで安定で、ｐＨ１３．０でプロテアーゼに抵抗性であるか、若しくはそれらの組合せの請求項１に記載の添加物。
【請求項５】
ペプチドが配列番号１ないし２０の１種若しくはそれ以上から選択される、請求項１に記載の添加物。
【請求項６】
ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物若しくはそれらの組合せを殺す、請求項１に記載の添加物。
【請求項７】
ペプチドが、ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）から単離される、請求項１に記載の添加物。
【請求項８】
ペプチドが約０．５ｐｐｍと約１００ｐｐｍとの間で添加される、請求項１に記載の添加物。
【請求項９】
ペプチドが約６ｐｐｍと約１２ｐｐｍとの間で添加される、請求項１に記載の添加物。
【請求項１０】
ペプチドが、家禽、家畜、養殖魚、カニ、エビおよび淡水カメの１種若しくはそれ以上による使用に適合された飼料に添加される、請求項１に記載の添加物。
【請求項１１】
オオムギ、ダイズ、コムギ、ライコムギ、ライムギおよびトウモロコシから選択される少なくとも１種の穀類；ならびに、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを含んでなる、穀類に基づく動物飼料。
【請求項１２】
約１ｐｐｍと１０００ｐｐｍとの間の、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを含んでなる、ペプチドに基づく飼料添加物。
【請求項１３】
カルボキシ末端が還元されｐＨおよび熱安定性のブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる、抗菌性ペプチド。
【請求項１４】
カルボキシ末端が還元された熱安定性のアミノ末端がメチル化されたペプチドでありかつ２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる抗菌性ペプチドを産生する、微生物ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ
）（寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４）の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離かつ精製された微生物を含んでなる飼料添加物。
【請求項１６】
添加物が、代用乳、育成飼料、仕上げ飼料、離乳前飼料および離乳飼料よりなる群から選択される家畜のための飼料と混合される、請求項１５に記載の飼料添加物。
【請求項１７】
請求項１に記載の組成物を動物飼料と混合することを含んでなる、動物における体重増加効率および飼料効率の増大方法。
【請求項１８】
動物飼料が、畜牛、ブタ、ニワトリ、ウマ、シチメンチョウ、ヒツジ、ヤギ、養殖魚、カニ、エビおよびカメよりなる群から選択される家畜に給餌するために適合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
動物飼料が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、コーニッシュヘンおよびハトよりなる群から選択される鳥に給餌するために適合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記飼料が、穀類、ダイズミール、単離されたダイズタンパク質、単離されたダイズ油、単離されたダイズ脂肪、脱脂粉乳、魚粉、肉粉、骨粉、血液粉、血漿タンパク質、ホエイ、米ぬか、ふすま、甘味料、ミネラル、ビタミン、塩および牧草よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドの１日用量が、動物の体重１ｋｇあたり約１ミリグラムから約１０グラムまでの範囲にわたる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
カルボキシ末端が還元されたｐＨおよび熱安定性のブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを含んでなる、局所使用のための広域スペクトルの抗菌性化合物。
【請求項２３】
ペプチドが、配列Ｍｅ２Ｂｍｔ−Ｌ−ｄＯ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−ｄＫ−Ｖ−ｄＬ−Ｋ−ｄＹ−Ｌ−Ｖ−ＣＨ２ＯＨ（配列番号１）を含んでなる、請求項２２に記載の抗菌性化合物。
【請求項２４】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを生じるタンパク質を発現するＢＴオペロン（配列番号２１）若しくはその部分の配列を有する単離かつ精製された核酸。
【請求項２５】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを作成するのに使用される１種若しくはそれ以上の酵素を含んでなるＢＴオペロンタンパク質の１種若しくはそれ以上のポリペプチド配列（配列番号２２ないし２８）をコードする、単離かつ精製された核酸。
【請求項２６】
配列番号２１に対する少なくとも７５％の相同性を有する単離された核酸。
【請求項２７】
核酸が、熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを作成するのに使用される酵素であるペプチド合成オペロンタンパク質の１種若しくはそれ以上のポリペプチド配列（配列番号２２ないし２８）をコードする、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンポリペプチドが配列番号２１から発現され、かつ、熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを作成するのに使用される１種若しくはそれ以上の酵素を含んでなる、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）Ｅ５８の単離された細菌株を含んでなる単離された細菌サンプル。
【請求項３０】
ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、シネドロシプティス（Ｓｙｎｅｄｒｏｃｙｐｔｉｓ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の増殖を阻害する、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された、単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチド。
【請求項３１】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸で形質転換された細菌。
【請求項３２】
該核酸から発現されるタンパク質が１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質を含んでなる、請求項３１に記載の細菌。
【請求項３３】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸を含んでなるベクター。
【請求項３４】
該核酸から発現されるタンパク質が１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質を含んでなる、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
配列番号１〜２０に対する７５％より大の配列の相同性を有する単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを含んでなる飼料添加物。
【請求項３６】
製薬学的に有効な量の、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを、治療の必要な動物に提供することを含んでなる、大腸菌症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般として、新規単離かつ精製されたペプチドの分野に、ならびに、より具体的には、新たに発見された生物体ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）からの新規一群のペプチドの同定、特徴付けおよび使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００４年１月３０日出願の米国仮出願第６０／５４０，５６９号（適切な部分が引用することにより本明細書に組込まれる）に対する優先権を主張する。本発明の範囲を制限することなく、その背景を抗生物質および飼料添加物に関連して記述する。
【０００３】
抗生物質の濫用は広範な細菌の薬物耐性に至った。伝統的抗生物質に抵抗性の細菌により引き起こされる感染症を防除するために新規抗生物質が必要とされている。微生物が、競合する微生物に対する化学的闘争を遂行するために極めて多様な抗生物質を産生することが公知である。
【０００４】
微生物起源の多くのペプチド抗生物質は非リボソームペプチド合成（ＮＲＰＳ）により合成され、そしてそれらは異常なアミノ酸を含有する。ＮＲＰＳ酵素は通常、共直線的モジュール構造を有する（非特許文献１）。Ｎ末端からＣ末端の順序および個々のモジュールの特異性は、ペプチド産物中のアミノ酸残基の連続的順序および同一性に対応する。各ＮＲＰＳモジュールは特定の１アミノ酸を認識し、そして段階的縮合を触媒して成長するペプチド鎖を形成する。特定の１モジュールにより認識されるアミノ酸の同一性は、既知の特異性の他のモジュールとの比較により予測し得る（非特許文献２）。こうした厳格な相関は、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノム中のミコバクチン生合成オペロンの同定（非特許文献３）により示されるとおり、既知の構造をもつ多数の細菌の非リボソームペプチドのＮＲＰＳ酵素をコードする遺伝子を同定することを可能にした。にもかかわらず、当該技術は、新規抗菌剤を単離、同定および特徴付けすることの引き続き存在する必要性を認識している。
【０００５】
飼料添加物の例は当該技術分野で公知である。例えば、Ｒｅｇｉｓｔｅｒに交付された特許文献１は、１種のこうした家禽および家畜の飼料添加物を開示する。簡潔には、この特許は、それらの食餌の電解質バランスを増大させるように３６重量％の電解質、食用ぬかおよび鉱物油を含有する家禽および家畜の飼料添加物組成物を教示する。電解質添加物組成物の添加は、卵産生、体重、および低下された熱ストレスからの死亡率に関して育種用雌鳥の成績を向上させる。この食餌を与えたブロイラーは、増大された処理収量、飼料効率および体重をもたらす。家禽および家畜のためのこの食餌電解質飼料の製造方法もまた記述される。
【０００６】
飼料添加物のなお別の例は、以下の３成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）、すなわち（ａ）松葉、サンザシ果実、オオバナオケラ（Ｂｉｇｈｅａｄ  Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ）地下茎、レンゲソウ（Ｍｉｌｋｖｅｔｃｈ）根、タツナミソウ根、タンジェリン果実およびハッカ篩いかすから選択される最低１種の薬草；（ｂ）酵母細胞壁、ならびにアシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）および／若しくはエンテロコッカス  フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）を含有する生細菌調製物より構成される生細菌混合物；ならびに（ｃ）有機酸よりなる群から選択される最低２成分を包含する動物飼料添加物を教示する特許文献２においてＮａｇａｉらにより教示される。
【０００７】
飼料添加物はまた、真菌および／若しくは細菌の発酵副生成物を含有する反芻動物のための飼料添加物についてＪｕｌｉｅｎに交付された特許文献３により教示されるもののような、発酵および他の過程の副生成物も包含しうる。反芻動物のための飼料添加物は、グルタミン酸発酵可溶物、乾燥トウモロコシ発酵可溶物、若しくは乾燥グルタミン酸発酵可溶物および乾燥トウモロコシ発酵可溶物の混合物を提供する、乾燥真菌および／若しくは細菌発酵副生成物を包含し、ここで、該乾燥可溶物は、約８０°Ｆより低くなくかつ約９００°Ｆを超えない温度で３０重量％未満の総水分含量まで乾燥されている。
【特許文献１】米国特許第６，６８２，７６２号
【特許文献２】米国特許第６，５０３，５４４号
【特許文献３】米国特許第５，８６３，５７４号
【非特許文献１】Ｍｏｏｔｚら、２００２
【非特許文献２】Ｃｈａｌｌｉｓら、２０００
【非特許文献３】Ｑｕａｄｒｉら、１９９８
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
一態様において、本発明は、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを包含する飼料添加物である。該ペプチドのＣ末端のバリンのカルボキシ末端の−ＣＯＯＨ基は−ＣＨ２ＯＨに還元されていることができ、そして該ペプチドにプロテアーゼ抵抗性を賦与しうる。該ペプチド飼料添加物は、１．０のｐＨで安定で、ｐＨ１３．０でプロテアーゼに抵抗性でありうるか、若しくはそれらの組合せでありうる。該ペプチドの例は、配列番号１ないし２０（集合的にＢＴペプチドと呼ばれる）の１種若しくはそれ以上から選択されうる。該ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物若しくはそれらの組合せを殺すことが見出された。該ペプチドはブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４）から単離されることができ、そして約０．５と約１００ｐｐｍとの間で飼料に添加しうる。一使用において、該ペプチドが約６と約１２ｐｐｍとの間で添加され、そして統計学的に有意の成長促進を示した。
【０００９】
該添加物ペプチドは、家禽、家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、養殖魚、カニ、エビおよび淡水カメの１種若しくはそれ以上による使用に適合された飼料に添加しうる。例えば、該ペプチドは、穀物に基づく動物飼料、例えば、オオムギ、ダイズ、コムギ、ライコムギ、ライムギおよびトウモロコシから選択される最低１種の穀類；ならびに、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドに包含されうる。該ペプチドに基づく飼料添加物は、約１と１０００ｐｐｍとの間の、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を有する単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドで包含されうる。事実、本発明は多様な飼料のいずれとも使用しうる。
【００１０】
本発明はまた、カルボキシ末端が還元されたｐＨおよび熱安定性のブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を有する抗菌性ペプチドも包含する。例えば、本発明は、カルボキシ末端が還元された熱安定性のアミノ末端がメチル化されたペプチドでありかつ２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を包含しうる抗菌性ペプチドを産生する、微生物ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）寄託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４）の生物学的に純粋な培養物を包含する。該飼料添加物はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４の単離かつ精製された微生物でさえありうる。該添加物は、代用乳、育成飼料、仕上げ飼料、離乳前飼料および離乳飼料よりなる群から選択される家畜のための飼料と混合しうる。
【００１１】
本発明はまた、動物飼料中に成長を増大させるのに十分な有効な量のＢＴペプチドの１種若しくはそれ以上を提供することによる、動物における体重増加効率および飼料効率の増大方法も包含する。該動物飼料は、例えば畜牛、ブタ、ニワトリ、ウマ、シチメンチョウ、ヒツジ、ヤギ、養殖魚、カニ、エビおよびカメよりなる群から選択される家畜に給餌するために適合される。飼料の例はまた、例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、コーニッシュヘンおよびハトよりなる群から選択される鳥に給餌するためのものも包含する。であるから、該飼料は、例えば、穀類、ダイズミール、単離されたダイズタンパク質、単離されたダイズ油、単離されたダイズ脂肪、脱脂粉乳、魚粉、肉粉、骨粉、血液粉、血漿タンパク質、ホエイ、米ぬか、ふすま、甘味料、ミネラル、ビタミン、塩および牧草よりなる群から選択されうる。該ペプチドの１日用量は、動物の体重１ｋｇあたり約０．０１から約１０グラムまでの範囲にわたる。
【００１２】
なお別の態様において、本発明は、カルボキシ末端が還元されたｐＨおよび熱安定性のブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を有するペプチドを含んでなる、局所使用のための広域スペクトルの抗菌性化合物である。例えば、該ペプチドは、配列Ｍｅ２Ｂｍｔ−Ｌ−ｄＯ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−ｄＫ−Ｖ−ｄＬ−Ｋ−ｄＹ−Ｌ−Ｖ−ＣＨ２ＯＨ（配列番号１）、若しくは配列番号１〜２０のいずれか１種を有しうる。
【００１３】
なお別の態様は、２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸である。２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを作成するのに使用される１種若しくはそれ以上の酵素を包含するＢＴオペロンタンパク質の１種若しくはそれ以上のポリペプチド配列（配列番号２２ないし２８）をコードする、単離かつ精製された核酸。本発明はまた、配列番号２１に対する最低７５％の相同性を有する単離された核酸も包含する。より具体的には、該核酸は、２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを作成するのに使用される酵素であるペプチド合成オペロンタンパク質の１種若しくはそれ以上のポリペプチド配列（配列番号２２ないし２８）をコードしうる。１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンポリペプチドが配列番号２１から発現され、かつ、２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを作成するのに使用される１種若しくはそれ以上の酵素を含んでなる。
【００１４】
本発明での使用のための単離された細菌サンプルは、ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）Ｅ５８の単離された細菌株を包含しうる。別の態様は、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、シネドロシプティス（Ｓｙｎｅｄｒｏｃｙｐｔｉｓ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりなる群から選択される最低１種の細菌の増殖を阻害する、ブレビバシラス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）スピーシーズから単離された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を有する単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドである。細菌は、２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸で形質転換されうる。該核酸から発現されるタンパク質は、１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質またはそれらに関係するものを包含しうる。２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなる熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸を包含するベクターを改変若しくは単離しうる。１種若しくはそれ以上のタンパク質が、１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質をコードする核酸から発現されうる。該飼料添加物は、配列番号１〜２０に対する７５％より大の配列の相同性を有する単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元されたペプチドもまた包含しうる。
【００１５】
本発明はまた、ペプチド、ならびに異常なアミノ酸および他の型の修飾を含有するこれらのペプチドを合成する非リボソームペプチド合成酵素にも関する。本発明はまた、該ペプチドの製造方法、ならびに、多様な微生物感染症および原生動物感染症、ならびにこうした感染症と関係する障害；腫瘍細胞の増殖、成長および広がりの処置および予防において；若しくは免疫調節剤としての該ペプチドの単独で若しくは伝統的抗生物質と相乗的に使用する方法も包含する。
【００１６】
［発明の詳細な記述］
本発明の多様な態様の作成および使用を下に詳細に論考する一方、本発明は多様な特定の情況で例示され得る多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるはずである。本明細書で論考される特定の態様は、単に、本発明を作成かつ使用するための特定の方法を具体的に説明し、そして本発明の範囲を定めない。
【００１７】
本発明の理解を容易にするために、多数の用語を下で定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関する分野の当業者により一般に理解されるところの意味するところを有する。「１つの（ａ）」、「ａｎ」および「該（ｔｈｅ）」のような用語は単一の実体のみを指すことを意図しておらず、しかし、特定の一例が具体的説明に使用されうるその一般的分類を包含する。本明細書の専門用語は本発明の特定の態様を記述するために使用されるが、しかし、それらの使用は、請求の範囲に概説されるとおりを除き、本発明を制限しない。
【００１８】
本明細書で使用されるところの「家畜」（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ）という用語は、例えばブタ、畜牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ、シカ、イヌ、ネコおよび多数の有用なげっ歯類のいずれも記述する。本明細書で使用されるところの「家禽」という用語は、例えばニワトリ、メンドリ、ウズラ、シチメンチョウ、ホロホロチョウなどを包含する。ここで使用される「養殖魚」という用語は、例えばコイ、ナマズ、ニジマス、アユ（ａｙｕ）（アユ（ｓｗｅｅｔ  ｆｉｓｈ））、ウナギ、テラピア、アナゴ、サケ、マス、マダイ、カンパチ、ヒラメ（カレイ）、フグなどを包含する。多数の他の動物、例えばエビおよびクルマエビもまた有用であることを企図している。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「添加物」および「飼料添加物」という用語は、家畜、家禽および魚の健康状態の改善ならびに低下された若しくは低い体重による経済的損失の低下をもたらしかつ／または既存の健康な動物の成長の速度（例えば重量）を増大させる、飼料添加物として動物飼料とともに使用しうる細菌からの組成物を記述するのに使用する。例えば、本発明の飼料添加物は、細菌単離物から、部分的に若しくは完全に分解された細菌、単離された、細菌から単離かつ精製された、および／または完全に若しくは部分的に合成的に合成されたを使用しうる。家畜、家禽および魚類のための添加物若しくは飼料添加物は粉末、粒状若しくは液体の形態のものであってよく、そして、給餌条件ならびに飼育場の設備および標的動物に従って使用することができる。
【００２０】
適する動物飼料は、例えば青刈飼料、貯蔵牧草、乾燥青刈飼料、根、根茎、新鮮果実、穀粒および種子、ビール醸造かす、搾りかす、醸造用酵母、蒸留酒に使用した穀類、微粉砕の副生成物、糖、デンプンの製造および油回収の副生成物、ならびに多様な食物廃棄物を包含する。本発明の飼料添加物は、単独で、または、抗酸化剤若しくは強化のためこうした飼料に添加し得る多様な物質の混合物（ミネラル混合物、ビタミン混合物）のような他の公知の飼料添加物とともに使用しうる。特定の飼料を、齢および発育の段階に依存してある動物種にもまた適合させうる。
【００２１】
本発明のペプチドとともにの使用に適する基礎飼料は、飼料の製造の当業者に公知であるとおり製造することができ、例えば、それらは、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４版、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．２８８−３００、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９９３（適切な部分が引用することにより本明細書に組込まれる）に記述されるものを使用しうる。例えば、基礎飼料は以下の成分、すなわち、トウモロコシ、ソーガム（ｓｏｒｇｈｕｍ）、オオムギ、コムギ、ダイズ、ラッカセイ、キャノーラ、魚粉、乳製品、脂肪および油、ビタミンならびにミネラルの１種若しくはそれ以上を包含しうる。
【００２２】
本発明者は、ＮＲＰＳオペロンがペプチド産物のある構造の詳細を学習することを可能にする情報の供給源でありうることを認識した。ＢＴのＮＲＰＳオペロンの同定はＢＴ  １５８３ペプチドの構造の決定的な絞り込みをもたらす。新規抗生物質を産生する株について土壌微生物をスクリーニングした。バシラス  スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｅ５８（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８５４）を、免疫が無防備状態の患者で生命を脅かす院内感染を引き起こす黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ）に対する抗生物質ＢＴを産生するその能力のため単離した。該株は、ブレビバシラス  ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）へのその関連性に基づき、ブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）と命名した。
【００２３】
ＮＲＰＳのモジュールは、ペプチド産物を形成するためのアミノ酸前駆体の認識、活性化、修飾若しくは結合において特定の役割をそれぞれ実施するより小さい単位すなわち「ドメイン」から構成される。１つの型のドメイン、アデニル化（Ａ−）ドメインは、ＮＲＰＳの特定の１モジュールにより取り込まれるはずであるアミノ酸の選択的認識および活性化を司る。他のＡ−ドメインとの配列比較とともにのグラミシジンＳのＮＲＰＳのＰｈｅＡサブユニットのＡ−ドメインの基質結合ポケットの分析により、Ａ−ドメインに対する基質特異性の主決定因子である１０残基を規定することが可能であった（Ｃｏｎｔｉら、１９９７；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、１９９９）。該１０残基はＮＲＰＳ「コドン」とみなされる。ＮＲＰＳコドンの集合体は、新たなＮＲＰＳコドンが発見され続けているためになお増大しつつある。本発明は、バリン、ロイシン、オルニチンおよびチロシンの新規ＮＲＰＳコドンの一群の単離かつ精製された核酸およびそれによりコードされるタンパク質を包含する。
【００２４】
アミノ酸活性化段階はＡＴＰ依存性であり、そしてアミノアシルアデニル酸の一時的な形成を必要とする。活性化されたアミノ酸は、一般にＡ−ドメインに隣接して位置する別の型のドメイン、チオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）（Ｔ−）ドメインによりペプチド合成酵素に共有結合される。Ｔ−ドメインは、保存されたセリン残基へのホスホパンテテイニル（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）補綴（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）アー
ムの共有結合により翻訳後に修飾される。該活性化されたアミノ酸基質は、それぞれのＴ−ドメインのホスホパンテテイニル補綴アームへのチオエステル結合を介してＮＲＰＳに結合される。ＮＲＰＳの連続単位に結合されたアミノ酸はその後、別の型のドメイン、縮合（Ｃ−）ドメインにより触媒されるアミド結合の形成により一緒に共有結合される。ＮＲＰＳモジュールはまた、ときに、補助反応を実施する付加的な機能的ドメインもまた含有し得、最も一般的なものはアミノ酸基質のＬ−体からＤ−体へのエピマー化である。この反応は、一般に所定のＮＲＰＳモジュールのＴ−ドメインに隣接して位置するエピマー化（Ｅ−）ドメインと称されるドメインにより触媒される。従って、典型的なＮＲＰＳモジュールは以下のドメイン構成、すなわちＣ−Ａ−Ｔ−（Ｅ）を有する。
【００２５】
ＮＲＰＳによる生成物の集成は、３個の別個の相、すなわち鎖開始、鎖伸長および鎖終止を伴う（ＫｅａｔｉｎｇとＷａｌｓｈ、１９９９）。ペプチド鎖開始はＡ−ドメインおよびＴ−ドメインを含んでなる「開始体モジュール」と命名される特化したモジュールにより実施される。伸長モジュールは、加えて、Ａ−ドメインの上流に位置するＣ−ドメインを有する。こうした伸長ドメインはＣ−ドメインによる妨害によりペプチド結合形成を開始し得ないことが実験的に示されている（ＬｉｎｎｅとＭａｒａｈｉｅｌ、２０００）。全部の成長するペプチド中間体は、伸長する一連のアシル−Ｓ−酵素中間体として、転位の間にＮＲＰＳに共有結合される。ＮＲＰＳから成熟ペプチド産物を遊離させるためには、末端のアシル−Ｓ−酵素結合が破壊されなければならない。この過程が鎖終止段階であり、そして通常はＣ末端チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインにより触媒される。ＮＲＰＳ酵素からの成熟ペプチドのチオエステラーゼ媒介性の遊離は、アシル−Ｏ−ＴＥ中間体の一過性の形成を含み、この中間体はその後、加水分解若しくは加水分解および同時に環化されて成熟ペプチドを遊離する（Ｋｅａｔｉｎｇら、２００１）。代替の一終止スキームは、最後のＮＲＰＳモジュールに存する還元酵素（Ｒ−）ドメインによる結合されたＣ末端残基の還元を含み、アルコール性のＣ末端残基をもつペプチドの遊離をもたらす（Ｇａｉｔａｔｚｉｓら、２００１；Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）。こうした還元酵素媒介性の終止／Ｃ末端修飾がＢＴ生合成において起こり、そしてＢＴペプチドの超プロテアーゼ抵抗性に寄与する。
【００２６】
ＮＲＰＳオペロンの同定および単離はペプチド抗生物質の研究に有用であったが、しかしながら、特定のＮＲＰＳオペロンの同定は手強い責務であり続ける。ＮＲＰＳオペロンの同定は、伝統的に、既知のＮＲＰＳ遺伝子からのＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、若しくは縮重プライマーを使用するゲノムＤＮＡのＰＣＲにより増幅された遺伝子フラグメントによる、ゲノムＢＡＣ若しくはコスミドライブラリー中のクローンの同定で開始する。ＮＲＰＳドメインのアミノ酸配列は通常極めて類似しているため、こうしたアプローチは成功裏であり得るが、しかしながら、プローブ若しくはプライマーはしばしば不完全であるため、若干のＮＲＰＳオペロンが見逃され得る。さらに、微生物はしばしば複数のＮＲＰＳオペロンを含有し、その結果、プローブ若しくはプライマーは数種のＮＲＰＳオペロンを示しうるが、しかし探求されているものを示さないことがある。これはしばしば、不正確な遺伝子に集中される不運な努力をもたらす（Ｈｏｐｗｏｏｄ、１９９７）。新規ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアプローチ（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃａ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を、ＮＲＰＳオペロンの迅速かつ正確な同定を可能にするために、本明細書に記述されるとおり使用した。
【００２７】
材料および方法。ＢＴの部分的精製。Ｅ５８  Ｂ．テクサスポルス（Ｂ．ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）細胞を１リットルのＬＢ中で３７℃の空気振とう器中３日間増殖させた。培養物を臨床遠心機で３０００ｒｐｍで１５分間回転した。上清を収集し、そして５００グラムの硫酸アンモニウムを添加しかつ溶解した。サンプルを臨床遠心機で３０００ｒｐｍで１５分間回転した。ペレットを２００ｍｌの蒸留水に溶解した。溶液をその後１５分間沸騰させ、そしてその後氷上で冷却した。サンプルを０．２ミクロンのフィルター（Ｎａｌ
ｇｅｎ）で濾過した。濾液を０．２リットルのクロロホルムと攪拌子を用いて室温で２０分間混合した。混合物を、臨床遠心機で３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により二層に分離した。有機層を収集しかつ真空エバポレーターで乾燥した。
【００２８】
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ。乾燥したクロロホルム抽出物を２ｍｌの滅菌蒸留水に溶解した。溶液を、３０％Ｂから５５％溶液Ｂ（溶液Ｂはアセトニトリル中０．０７５％ＴＦＡであり、溶液Ａは水中０．１％ＴＦＡである）までの勾配で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムで分画した。結果として生じる画分を乾燥しかつ滅菌蒸留水に溶解し、そしてプレート透明領域アッセイで抗黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）活性について分析した。ピーク画分（画分３３）を、アミノ酸組成、質量分析、タンデム質量分析およびキラリティー分析にかけた。
【００２９】
アミノ酸組成。アミノ酸分析はテキサス州カレッジステーションのテキサスＡ＆Ｍ大学（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のタンパク質化学研究室（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により実施した。サンプルを内部標準と混合し、ガラス管中で真空濃縮器で乾燥し、そして、フェノールの存在下にアルゴン雰囲気下１１０℃で２４時間の６Ｎ  ＨＣｌによる気相加水分解にかけた。サンプルをその後ホウ酸緩衝液中で再構成し、そして自動誘導体化および負荷のためのＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ＡｍｉｎｏＱｕａｎｔＩＩ装置に移した。ＡｍｉｎｏＱｕａｎｔは、加水分解されたサンプルのｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）およびクロロギ酸９−フルオロメチル（ＦＭＯＣ）でのカラム前（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）誘導体化によりペプチドおよびタンパク質を分析する。誘導体化されたアミノ酸を逆相ＨＰＬＣにより分離し、そしてダイオードアレイ検出器でのＵＶ吸光度若しくはインライン蛍光検出器を使用する蛍光により検出する。
【００３０】
質量分析およびタンデム質量分析。Ｄ−体アミノ酸残基の検出。ＢＴ中のアミノ酸残基のキラル分析を、バージニア州リッチモンドのＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により実施した。ＢＴを６Ｎ  ＣＨｌ中で真空中１１０℃で１８時間の加水分解にかけた。アミノ酸をＦＭＯＣアミノ酸に誘導体化し、そしてＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分離した。各アミノ酸の溶出プロファイルをその後キラルなカラムで決定した。双方の型のクロマトグラフィーカラムについて、ピークは適切な標準との比較により同定した。
【００３１】
ゲノムＤＮＡ調製。対数期のＥ５８細胞をＬＢ培養物から収集し、そして溶解緩衝液［１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ］で溶解した。ＲＮアーゼＡを添加して汚染するＲＮＡを消化した。ゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてその後エタノールで沈殿させた。乾燥したＤＮＡをＴＥに再懸濁し、そしてアリコートを品質管理のため０．５％アガロースゲル中で泳動した。
【００３２】
ライブラリー構築およびゲノム配列決定。Ｅ５８ゲノムライブラリー構築、ショットガン配列決定および集成は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチューセッツ州ビバリー）により実施した。簡潔には、全ゲノムライブラリーを、約５ｋｂの平均挿入物長さを伴い構築した。１０，０００個のこうしたクローンを、挿入物の両端から自動化ＤＮＡ配列決定にかけた。１６，９０１個の成功裏に配列決定された読み出し（ｒｅａｄ）を収集かつ集成した。
【００３３】
ヌクレオチド配列およびデータ解析。Ｅ５８ゲノムに対する全部のＢＬＡＳＴ解析は、ローカルコンピュータにインストールしたＷＵ  ＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージ（バージョン２０）（Ｇｉｓｈ，Ｗ．１９９６−２００３。ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）の使用により実施した。アミノ酸配列の相同性の検索は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（メリーランド州ベセスダ）のＢＬＡＳＴサーバ、およびデフォルトのパラメータ値を用いる非冗長タンパク質配列データベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）の使用により実施した。アミノ酸配列のアライメントは、タンパク質生物学・化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（フランス・リヨン）のＮＰＳ＠ウェブサーバで稼働しているＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）の使用により実施した。
【００３４】
ＢＴのＮＲＰＳオペロン。ＢＴのＮＲＰＳオペロン（超連結断片（ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｇ）３）は最低４６ｋｂの領域にわたる１１個の連結断片を含有した。配列未決定の領域、１回のみ配列決定された領域、および不良の配列決定の質を伴う領域が存在した。また、１３番目のモジュールのカルボキシル領域は超連結断片３により包括されなかった。３回のプライマー伸長配列決定および１回のゲノム歩行を実施して、ＮＲＰＳオペロンの仕上げを達成した。超連結断片３中の全部の元の配列決定の読み出しを抽出し、そしてＳｅｑＭａｎ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）を使用して再集成した。デフォルトのパラメータを再集成に使用した。ＳｅｑＭａｎにより採用されたより高い緊縮性は、再集成された超連結断片３を、１６個の配列未決定のギャップを伴う１７個の連結断片に分割させた。全連結断片を、単一の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）および不良の質の領域について手動で（ｍａｎｕａｌｌｙ）さらに検査した。プライマーは、ギャップに配列決定しならびに単一適用範囲および低い質の領域の付加的な読み出しを得るように設計した。新たな配列決定の読み出しを元の読み出しと結合して新たな超連結断片を創製した。新たな超連結断片を、ギャップ、単一適用範囲および低い質の領域について再度確認した。３回のこうしたプライマー伸長および再集成の後に、推定のＢＴのＮＲＰＳオペロンが長さ４８，９９７ｂｐの単一連結断片に集成された。集成された配列を確認するため、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重消化を、全領域に集合的にわたる２０クローンを用いて実施した。結果として生じる消化パターンは連結断片により予測される制限地図と完全に一致した（データは示されない）。連結断片の下流の領域を配列決定するため、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットを使用してＥ５８ゲノムＤＮＡでゲノム歩行を成功裏に実施した。該努力は、推定のＢＴのＮＲＰＳオペロンを包括する５０，６７４ｂｐのＤＮＡ配列をもたらした（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号＿＿＿＿＿＿＿）。
【００３５】
Ｈｉｓ１０標識したＢＴのＡ−ドメインタンパク質のクローニング、過剰発現および精製。ＢＴのＮＲＰＳのモジュール８、５、７、４および２のＡ−ドメインをコードするＤＮＡフラグメント（Ｂｔ８Ａ、Ｂｔ５Ａ、Ｂｔ７Ａ、Ｂｔ４ＡおよびＢｔ２Ａ）をＰＣＲ増幅し、そして、ＰＣＲ産物をＨｉｓ１０標識組換えタンパク質発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。Ａ−ドメインの境界は（Ｋｏｎｚら、１９９９）により定義されたとおり決定した。発現構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＡＩ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をＬ−ブロス中３７℃で０．６のＡ６００まで増殖させ、そしてその後１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および０．２％Ｌ−アラビノースで誘導した。細胞を、収集する前に３０℃で追加の２時間増殖させた。Ｈｉｓ１０標識組換えタンパク質の精製は、改変を伴うマニュアルで推奨されている条件下でのＴＡＬＯＮ金属アフィニティー樹脂（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して達成した。簡潔には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を超音波処理により破壊した。細胞ライセートを２５，０００×ｇで１時間の遠心分離により澄明にした。Ｈｉｓ標識した組換えタンパク質をその後ＴＡＬＯＮ樹脂とともにインキュベートし、洗浄し、そして５００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出したタンパク質を緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対し透析し、そしてその後ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色で分析した。組換えタンパク質は、算出された分子量に匹敵する見かけの分子量を表し、そしてそれらは均一まで精製されたようであった。精製されたタンパク質の濃度を、Ａ２８０について計算されたモル減衰係数を使用することにより決定した。
【００３６】
ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイ。ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイを実施して、Ａ−ドメインの基質特異性を決定した。ＡＴＰ−ＰＰｉ交換は、小さな改変を伴い以前に記述された（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、１９９８）とおりアッセイした。アッセイ混合物は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭアミノ酸、０．０５ｍＭ  ＰＰｉ、０．１５μＣｉ［３２Ｐ］ピロリン酸四ナトリウムを含有した。精製した組換えＡ−ドメインタンパク質の０．１ｍｌの総容量までの添加により交換を開始した。タンパク質濃度は、モジュール４およびモジュール５のＡ−ドメインについて０．２μＭであった一方、モジュール７およびモジュール８のＡ−ドメインについて２μＭであった。３７℃で１５分間のインキュベーション後に、０．５ｍｌの停止混合物（１００ｍＭピロリン酸四ナトリウム、３．５％ＨＣｌＯ４および１．６％［ｗ／ｖ］活性炭）の添加により反応を停止した。炭を遠心分離によりペレットにし、最初に４０ｍＭピロリン酸および１．４％過塩素酸、およびその後水で洗浄し、そして０．５ｍｌの水に再懸濁した。炭／水懸濁液を５．０ｍｌのシンチレーション液体を含有するシンチレーションバイアルに添加し、そして結合された放射活性を液体シンチレーション計数により測定した。見かけのＫｍ値を、０．１から１０ｍＭまでの範囲にわたる基質濃度で決定した。
【００３７】
ＭＩＣ決定アッセイ。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ）をＬＢ中３７℃で対数中期まで増殖させ、そして新鮮なＬＢで５００倍希釈しかつ９６ウェルマイクロタイタープレートに分注した。多様な濃度のペプチドを添加し、そしてマイクロタイタープレートを振とうしながら３７℃でインキュベートした。最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、透明なウェルを生じた最低のペプチド濃度として決定した。全部の実験は三重で実施し、そして高度に一致するＭＩＣが得られた。
【００３８】
ＢＴペプチドの同定。細菌株Ｅ５８を、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する新規抗生物質を産生する土壌微生物を同定しようとして土壌から単離した。Ｅ５８は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の相同性（９８．５％の同一性）に基づき、ブレビバシラス  ラテロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）に緊密に関係することが見出された。Ｅ５８をブレビバシラス  テクサスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｘａｓｐｏｒｕｓ）と命名し、そしてＡＴＣＣに寄託した（カタログ番号ＰＴＡ−５８５４）。Ｅ５８により産生される抗生物質をＢＴと命名し、そしてその活性は液体Ｅ５８  ＬＢ培養物の上清中で検出し得た。細胞を含まない培養上清が、従ってＢＴ精製の出発原料であった。抗生物質活性は硫酸アンモニウムにより沈殿され、該抗生物質がタンパク質若しくはペプチドであることを示唆した（データは示されない）。該活性はクロロホルムにさらに抽出され、ＢＴが小分子から構成されることを示した。抗生物質のクロロホルム抽出液を真空エバポレーターで蒸発させ、水に溶解し、そしてその後ＳＤＳトリシンゲル上で泳動した。各半分に同一のレーンをもつゲルの２個の半分を、タンパク質／ペプチドについて染色したか、若しくは抗生物質活性について試験するためにＢＴ感受性細菌バシラス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）を埋め込んだ寒天で覆ったかのいずれかした（図１Ａ）。３種、すなわちゲル負荷緩衝液から発するブロモフェノールブルー色素、１．４ｋＤ未満の質量を伴う未知のペプチド、および抗生物質活性をもつ第三の種が染色後に見えた。この第三の種は低濃度で約１．５ｋＤのバンドとして泳動し（元のゲル上で明瞭に見える）、そして後に、関係するペプチドの一群から構成されると示された（下を参照されたい）。それらの見かけの質量は濃縮とともに増大し、該ペプチドがより高濃度で凝集することを示唆している。抗生物質活性はより高濃度のペプチドと関連して見られ、そしてわれわれは従って、該ペプチドがＢＴの抗生物質活性を賦与することがありそうであることを結論づけた。該ペプチドをＢＴペプチドと称した。ＢＴペプチドは見かけ上、本アッセイでより低濃度でＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）に対し毒性でなかった。最小の検出可能なＢＴのバンドが約１．５ｋＤで泳動したため、従って、ＢＴペプチドはおよそ１３残基を含有した。
【００３９】
クロロホルム抽出したＢＴを質量分析アッセイにかけた。一群のペプチドが１５５０と１６５０ダルトンとの間の範囲で検出された（図１Ｂ）。主な種は１５８３の分子量を示し、そしてそれをＢＴ１５８３と命名した。他のペプチドは後にＢＴ１５８３の異性体であることが示された（表５および６）。
【００４０】
部分的ＢＴ配列決定。クロロホルム抽出したＢＴをＣ１８逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した（詳細については材料および方法を参照されたい）。ＢＴ１５８３はＣ１８  ＨＰＬＣの画分３３に均一まで精製された（図１Ｃ）。ＢＴ１５８３（画分３３）のアミノ酸組成分析は、ＢＴ１５８３がＴｙｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＯｒｎの残基を含有したことを示した。ＢＴ１５８３はＮ末端配列決定に対し無反応性であり、また、アミノペプチダーゼＭによる分解に対し抵抗性であり、標準的でないＮ末端残基であることを示唆した。ＢＴ１５８３はまたカルボキシペプチダーゼＹによる切断に対しても抵抗性であり、標準的でないＣ末端アミノ酸であることを示唆した。カルボキシル末端配列決定は、従って試みなかった。
【００４１】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）をその後、ＢＴ１５８３ペプチドを配列決定するために選んだ。ＭＳ／ＭＳデータをＢＴ１５８３について得、そしてそれらを図２Ａおよび表２に示す。該ＭＳ／ＭＳデータは、ＢＴ１５８３がアミノ酸組成と良好に相関した１３アミノ酸残基を含有したことを示した。期待されたとおり、残基１および１３の質量はいかなる標準的アミノ酸とも対応しなかった。最後の残基は１０３ダルトンの質量を示し、これはそのＣ末端をカルボン酸からアルコールに還元させたバリンと矛盾しないようであった。Ｃ末端のアルコール性バリンの存在は、ＢＴのＮＲＰＳの１３番目のバリン特異的モジュール中の還元酵素ドメインの存在によりさらに確認された（下を参照されたい）。Ｎ末端残基の同一性は決定するのがより困難であった。にもかかわらず、１９８の質量をもつＮ末端残基は、Ｎ，Ｎ−メチル化された形態のＢｍｔ｛４−メチル−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４，Ｎ−メチル−トレオニン｝と矛盾しないと思われた（Ｏｆｆｅｎｚｅｌｌｅｒら、１９９６；Ｏｆｆｅｎｚｅｌｌｅｒら、１９９３）。
【００４２】
ＢＴ１５８３中のオルニチンの存在は、ＢＴ１５８３がリボソームにより合成され得ないことを示す。Ｄ−アミノ酸の存在はこの見解を強化するとみられる。われわれは、ＢＴ１５８３中の最も豊富な残基の２種すなわちＶａｌおよびＬｅｕのキラルな特性を評価することを選んだ。キラル分析は、均一なＬ−Ｖａｌ残基、しかし２：１の比のＬ−およびＤ−双方のＬｅｕ残基を示した。
【００４３】
上の生化学的および構造的分析は、部分的なＢＴ１５８３ペプチド配列をわれわれに提供することが可能であった（表２および図２Ｂ）。ＮおよびＣ末端残基の構造は完全に決定されなかった。イソロイシンおよびロイシンは識別し得なかった。Ｄ−体のＬｅｕの位置は指定されなかった。該ペプチド中の他の残基のキラル特性は決定されなかった。
【００４４】
Ｅ５８ゲノムのショットガン配列決定。ＢＴ１５８３ペプチドの構造および生合成をより良好に理解するために、われわれは、ＢＴの生合成を司る遺伝子若しくはオペロンを同定することを決定した。ペプチド中のタンパク新生性でないオルニチンおよびＤ−体アミノ酸の存在は、ＢＴ１５８３がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＲＰＳにより合成されたと考えることにわれわれを導いた（Ｍａｒａｈｉｅｌ、１９９７）。ＮＲＰＳ遺伝子の大部分は、ＮＲ
ＰＳモジュールとペプチド産物中のアミノ酸残基間の厳密な相関を反映して共直線的である。ＢＴのＮＲＰＳオペロンが共直線的である場合、それはＢＴ１５８３ペプチド中の１３アミノ酸残基に対応する１３モジュールをコードするはずである。平均して各モジュールが平均３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントによりコードされることを想定すれば、４６ｋｂ長のＤＮＡフラグメントがＢＴのＮＲＰＳオペロンを収容するのに必要であるとみられる。前に挙げられたとおり、ＮＲＰＳオペロンの伝統的な同定方法は、包括的プローブでコスミドライブラリーをプロービングすることを含む。不完全な包括的プローブは標的遺伝子を見逃すことがあり、また、通常、細菌ゲノム中に複数のＮＲＰＳオペロンが存在するため、こうした方法は頻繁に研究者に誤ったＮＲＰＳオペロンを追跡させる。こうした落とし穴を回避するために、われわれは、ＮＲＰＳオペロンの直接の比較および従って道理的な候補オペロンの選択を可能にする、ゲノム中の全ＮＲＰＳオペロンの偏りのないｉｎ  ｓｉｌｉｃａの概観を提供するゲノムアプローチを開発した。この新規アプローチはＢＴのＮＲＰＳオペロンの迅速かつ正確な同定をもたらした。
【００４５】
Ｅ５８ゲノムは５Ｍｂであることが推定された。Ｅ５８ゲノムライブラリーを５ｋｂの平均挿入物の大きさを伴い構築した。全ゲノムを２倍の適用範囲について配列決定した。配列集成後に、Ｅ５８ゲノムは、７００ｂｐから２２．６ｋｂまでの範囲にわたる大きさおよび９３２のｓｉｎｇｌｅｔを伴う１９１９個の連結断片により表された。こうした適用範囲は、ゲノムの９９．９９５％がクローンにより表されることを可能にするとみられる。また、２個の隣接する連結断片間のギャップの平均長さは、超連結断片が構築され得るように約２５０ｂｐであるとみられる（下を参照されたい）。さらに、こうした分解度（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）の超連結断片は、正確なｉｎ  ｓｉｌｉｃａのＮＲＰＳオペロン同定を可能にするのに十分な情報を含有するとみられる。
【００４６】
ＢＴのＮＲＰＳオペロンのｉｎ  ｓｉｌｉｃａ同定。三段階の手順を使用して、候補のＢＴのＮＲＰＳオペロンを選択した。最初に、全連結断片およびｓｉｎｇｌｅｔを、ＮＲＰＳのモジュールをコードする配列について検索した。Ｅ５８は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に関係するため、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からの推定のペプチド合成酵素ＰＰＳ１を、全部の集成されたＥ５８連結断片を含有するデータベースに対するＢＬＡＳＴ解析のクエリ配列として選んだ。１２８個の連結断片がＰＰＳ１に対する翻訳されたアミノ酸配列の類似性を示し、Ｐ値は０から１までの範囲にわたった。
【００４７】
第二に、超連結断片を１２８個の連結断片から構築した。同一の挿入物の端からの２個の配列決定読み出しが配列対合（ｍａｔｅ  ｐａｉｒ）を形成する。超連結断片は、異なる連結断片中に存する連結断片が結合された配列対合の集合物である。配列対合の同定は、隣接する連結断片が順序付けされかつ正しい方向に置かれて超連結断片を形成することを可能にした（図３Ａ）。３１個の超連結断片を、Ｅ５８のＮＲＰＳオペロンのラインアップ全体を表すように成功裏に構築した。
【００４８】
候補のＢＴのＮＲＰＳオペロンをＥ５８のＮＲＰＳオペロンのラインアップから選択した。３１個の超連結断片をＢＴのＮＲＰＳオペロンをもつ可能性について検査し、そして、超連結断片３（完成した配列に基づくその遺伝子の特徴を図３Ｂおよび３Ｃに示す）を、以下の分析に基づき、候補として選んだ。
【００４９】
超連結断片３は、１３個のＮＲＰＳモジュールをコードするＤＮＡ配列を潜在的に含有した。超連結断片３のＡ−ドメインの基質特異性に関する入手可能な情報は、部分的なＢＴ１５８３配列との適合性を示した。基質特異性を賦与するアミノ酸残基の完全な組を１１種のモジュール（不完全なＤＮＡ配列によりモジュール２および１３を除く）について同定し得た。全部の特異性の予測をなし得なかったとは言え、予測されたＮＲＰＳアミノ酸基質と部分的なＢＴ１５８３配列との間で良好な相関が確立された。とりわけ、モジュール４はＩｌｅを組み込むことが予測され、また、モジュール９および１２はＬｅｕを組み込むことが予測された（表３、詳細については下を参照されたい）。部分的なＢＴ１５８３配列は位置４、９および１２にＬｅｕ若しくはＩｌｅを有した。該１１モジュールの基質を賦与するアミノ酸の系統発生的解析は、同一若しくは高度に類似のアミノ酸を組み込むことが期待されるモジュールが一緒にグループを作ることを示した（図３Ｄ）。例えば、全部Ｖａｌを組み込むことが予測されたモジュール５、６および８は１クラスターを形成した。類似の陽イオン性アミノ酸（それぞれＬｙｓおよびＯｒｎ）を組み込むことが予測されたモジュール７、１０および３は別のクラスターを形成した。
【００５０】
超連結断片３によりコードされるＮＲＰＳ中のＥ−ドメイン位置は、部分的なＢＴ１５８３ペプチド構造との適合性を示した。４個のＥ−ドメインがモジュール３、７、９および１１に見出された（図３Ｃ）。それらの位置は、全部Ｌ−体のＶａｌ残基および２：１のＬ−対Ｄ−体のＬｅｕ残基の比の前述のＢＴ１５９３のキラル特性と一致した。
【００５１】
超連結断片３を、従って、ＢＴのＮＲＰＳオペロンの候補遺伝子座と同定した。プライマー伸長およびゲノム歩行を実施して、該遺伝子座の高品質の配列を得た。該努力は、推定のＢＴのＮＲＰＳオペロンを包括する５１，８２１ｂｐの１連結断片（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号）をもたらした。図３Ｆを参照されたい。
【００５２】
推定のＢＴのＮＲＰＳサブユニット。１０個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、翻訳分析およびｂｌａｓｔ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）により、配列決定した領域中で同定された（図３Ｂ）。中央の６個のＯＲＦ（ｂｔＡからｂｔＦと命名された）がＢＴのＮＲＰＳの６サブユニット（ＢｔＡからＢｔＦ）をコードすることが予測され、そしてそれらの組合せ（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を表４に列挙する。推定のサブユニットの配列分析は、典型的な共直線的ＮＲＰＳのモジュール構造を確認した（図３Ｃ）。それぞれＡ−ドメインおよびＴ−ドメインを含有する該モジュールはＣ−ドメインにより結合される。負荷モジュールＢｔＡはＡ−ドメイン、次いでＴ−ドメインを有する。推定のＢＴのＮＲＰＳサブユニットについて２個の顕著な全体的特徴が存在する。第一に、６サブユニットのうち４種が２モジュール構造を表す。第二に、全部の補助的なＥ−ドメインは推定のＮＲＰＳサブユニットの中央によりもむしろ端に存在する。保存されたドメインの配列のアライメントを図４に示す。
【００５３】
モジュール１３中の還元酵素ドメイン。約５００アミノ酸の１ドメインがＢｔＦのＣ末端又はモジュール１３で同定された。ＢＬＡＳＴ解析は、それが他のＮＲＰＳからの数種のＮＡＤＰＨ依存性の還元酵素およびポリケチド合成酵素との高い類似性を有することを示した。Ｓ．アウランティアカ（Ｓ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）のＭｘｃＧおよびビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）のＬｙｓ２からの還元酵素ドメインとのそのアライメントを図４Ｅに示す。類似の還元酵素ドメインがグラミシジンＡのＮＲＰＳ中でもまた同定された（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）。全３種の還元酵素は、ＮＡＤＰＨ依存性の反応において、それらの基質を対応するアルデヒドに還元することが実験的に示されている（Ｇａｉｔａｔｚｉｓら、２００１；Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４；ＳａｇｉｓａｋａとＳｈｉｍｕｒａ、１９５９）。ミクソケリンＡおよびグラミシジンＡについて、アルデヒドはさらにアルコールに還元される。第二の還元段階の正確な機構は同定されていない。それらの還元酵素それら自身若しくは別のタンパク質が第二の還元段階を実施するか、または第二の還元段階は自発的であるかのいずれかである。ＭＳ／ＭＳ実験は、ＢＴ１５８３のＣ末端残基がアルコールの形態のバリンでありうることを示唆した（図２Ｂ）。最後の推定のＢＴのＮＲＰＳモジュールのＡ−ドメインの特異性の予測、および該モジュール中の還元酵素ドメインの存在が、この提案を確認した。
【００５４】
ｂｔＧはＡＢＣ輸送体をコードする。ｂｔＧはｂｔＦのすぐ下流であるＯＲＦであり、
そしてそれは他のｂｔのＯＲＦが転写されると同一の方向に転写される。開始コドンＡＴＧはｂｔＦの終止コドンの６１ｂｐ下流に位置する。翻訳されたアミノ酸配列は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーのメンバーとの高い類似性を示した（データは示されない）。ＡＢＣ輸送体のＯＲＦは典型的なＮＲＰＳオペロン中に見出される。それらの役割は、細胞からペプチドを汲み出す（ｐｕｍｐ）ことによりペプチド抗生物質産物に対する抵抗性を宿主に提供することと提案されている。推定のＢｔＧ  ＡＢＣ輸送体の正確な役割は確立されることを必要とする。
【００５５】
ＢＴ１５８３ペプチド配列の絞り込み。基質特異性を賦与する残基（Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、１９９９）を全１３種のＡ−ドメインから抽出し、そして公的なＮＲＰＳコドンデータベース（ｒａｙｍａｎ．ｃｈｍ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／〜ｎｒｐｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）（Ｃｈａｌｌｉｓら、２０００）中のアミノ酸結合ポケットの構成要素の集合物と比較した。基質特異性の予測を配列のアライメントに基づいて行い、そしてそれらを表３に列挙する。第一のモジュールのアミノ酸結合ポケットの構成要素はトレオニン／デヒドロトレオニンのＮＲＰＳコドンとの完全な一致を示し、また、モジュール１がトレオニン誘導体を組み込むことが予測された。Ｎ，Ｎ−メチル化されたＢｍｔは、ＭＳ／ＭＳデータによりＮ末端アミノ酸残基であることが提案された（図２Ｂおよび表２）。該２つの提案は相互に１００％一致しないとは言え、双方はＮ末端アミノ酸残基としてトレオニン誘導体を要求する。
【００５６】
前に挙げられたとおり、３種の明白な特異性の割り当ては、ＮＲＰＳコドンデータベースに従ってモジュール４（Ｉｌｅ）、モジュール９（Ｌｅｕ）およびモジュール１２（Ｌｅｕ）について行い得た。これらの割り当ては部分的なＢＴ１５８３配列と矛盾せず、そして、従って、ＢＴ１５８３ペプチドの位置４、９および１２はそれぞれＩｌｅ、ＬｅｕおよびＬｅｕに絞り込まれた。ＢＴ１５８３ペプチドの唯一のＩｌｅが位置４に割り当てられたため、残りのＬｅｕはＢＴ１５８３ペプチドの位置２に割り当てられた。モジュール２のＡ−ドメインの特異性は従ってＬｅｕであると推定された。Ｅ−ドメインの位置情報とともにのこれらの割り当ては、われわれがＢＴ１５８３ペプチド配列を（ＣＨ３）２−Ｂｍｔ−Ｌｅｕ−ｄＯｒｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ｄＬｙｓ−Ｖａｌ−ｄＬｅｕ−Ｌｙｓ−ｄＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＣＨ２ＯＨに絞り込むことを可能にした。
【００５７】
ＢＴ生合成における新規ＮＲＰＳコドン。モジュール５、６および８のアミノ酸結合ポケットの構成要素は同一である。それらは１残基のみモジュール１３のものと異なる。ＮＲＰＳコドンデータベース中には、アミノ酸結合ポケットの構成要素のこれらの組について良好な一致が見出されなかった。しかしながら、それらは、データベース中のあるＩｌｅ、Ｌｅｕ若しくはＶａｌのＮＲＰＳコドンに対する類似性を示した。部分的なＢＴ１５８３ペプチド配列は位置５、６、８および１３にＶａｌ残基を有したため、モジュール５、６、８および１３はＶａｌを組み込むことが推定された。モジュール５、６、８および１３のアミノ酸結合ポケットの構成要素は、Ｖａｌの潜在的に新規のＮＲＰＳコドンを表す。
【００５８】
モジュール７および１０のアミノ酸結合ポケットの構成要素は同一であり、そしてそれらは１残基のみモジュール３のものと異なる。ＮＲＰＳコドンデータベース中には、アミノ酸結合ポケットの構成要素のこれらの組について一致が見出されなかった。部分的なＢＴ１５８３ペプチド配列は位置７および１０にＬｙｓ残基を有したため、これらのモジュールの特異性はＬｙｓであることが推定された。同様に、部分的なＢＴ１５８３ペプチド配列は位置３にＯｒｎ残基（構造がＬｙｓに高度に類似している）を有し、そして、モジュール３の特異性は従ってＯｒｎであることが推定された。モジュール７および１０のアミノ酸結合ポケットの構成要素はＬｙｓの第一のＮＲＰＳコドンを潜在的に表す一方、モジュール３のものはＯｒｎの潜在的な新規ＮＲＰＳコドンを表す。
【００５９】
モジュール１１の特異性の予測はＮＲＰＳコドンデータベースによりきわめて曖昧であった。ＮＲＰＳコドンデータベース中には、アミノ酸結合ポケットの構成要素のこれらの組について良好な一致が見出されなかった。しかしながら、それはデータベース中のあるＰｈｅ、Ｔｒｐ若しくはＴｙｒのＮＲＰＳコドンに対する類似性を示した（データは示されない）。部分的なＢＴ１５８３ペプチド配列が位置１１にＴｙｒ残基を有したため、モジュール１１のＡ−ドメインの特異性は、従ってＴｙｒであることが推定された。モジュール１１のアミノ酸結合ポケットの構成要素はＴｙｒの潜在的な新規ＮＲＰＳコドンを表す。
【００６０】
ＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性の確認。ＢＴの生合成は新規ＮＲＰＳコドンを含むため、新規コドン（とりわけ新規バリンおよびリシンコドン）の実験的確立が、ＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性の確認に決定的に重要である。加えて、ＢＴ１５８３中の位置４のＩｌｅの配置は３個のＬｅｕ残基の配置に影響を及ぼすため、モジュール４のコドンもまた試験されることを必要とした。
【００６１】
ＮＲＰＳモジュールの精製された組換えＡ−ドメインは、ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイにおいてＮＲＰＳモジュールの同族のアミノ酸基質を選択的かつ効率的に活性化し得る（Ｋｏｎｚら、１９９９；ＭｏｏｔｚとＭａｒａｈｉｅｌ、１９９７）ため、ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイを使用して、ＮＲＰＳモジュールの特異性および新規ＮＲＰＳコドンを実験的に確立した。ＢＴのＮＲＰＳのモジュール８、５、７、４および２の組換えＡ−ドメインを、材料および方法に記述されるとおり産生させかつ精製した。ほぼ完全に可溶性の組換えＡ−ドメインタンパク質が得られた。Ａ−ドメインの特異性をＡＴＰ−ＰＰｉ交換およびａａ  Ｋｍアッセイ（ａａ  Ｋｍ  ａｓｓａｙ）で測定し（材料および方法を参照されたい）、そして結果を図５に示す。全２０種のタンパク新生性アミノ酸およびＬ−Ｏｒｎを各Ａ−ドメインタンパク質について試験し、そして実験のバックグラウンドノイズは通常１％より下であった。
【００６２】
モジュール８のＡ−ドメインタンパク質は、Ｌ−Ｌｙｓ（１０％）およびＬ−Ｉｌｅ（４％）の小さな活性化を伴いＬ−Ｖａｌ（１００％）を活性化することが示された。見かけのＫｍはＬ−Ｖａｌについて２．７５ｍＭであることが決定された。これらの結果は新規のバリンのＮＲＰＳコドンを確認した。同様に、モジュール５のＡ−ドメインタンパク質が、Ｌ−Ｖａｌ（１００％）、Ｌ−Ｉｌｅ（２３％）およびＬ−Ｌｅｕ（１７％）を活性化することが見出された。見かけのＫｍはＬ−Ｖａｌについて１．１１ｍＭおよびＬ−Ｉｌｅについて２．７８ｍＭであることが決定され、Ｌ−Ｖａｌがモジュール５の好ましい基質であることをはっきりと示す。
【００６３】
Ｌ−Ｌｙｓはモジュール７のＡ−ドメインタンパク質により活性化した唯一のアミノ酸であった。見かけのＫｍ値は１．１２ｍＭであることが決定された。これらの結果は第一のＬｙｓのＮＲＰＳコドンを確立した。
【００６４】
モジュール４のＡ−ドメインタンパク質は、Ｌ−Ｖａｌ（９％）およびＬ−Ｌｅｕ（７％）の小さな活性化を伴いＬ−Ｉｌｅ（１００％）を選択的に活性化することが示された。Ｌ−Ｉｌｅの見かけのＫｍ値は０．５ｍＭで測定された。
【００６５】
モジュール２のＡ−ドメインタンパク質は極めてあいまいであることが見出された。それはＬ−Ｖａｌ（６７％）のかなりの活性化、ならびにＬ−Ｉｌｅ（１９％）およびＬ−Ｐｈｅ（３．５％）の小さな活性化を伴い、ほぼ等しい効率でＬ−Ｌｅｕ（９８％）およびＬ−Ｍｅｔ（１００％）を活性化した。
【００６６】
一般に、全部の精製されたＡ−ドメインタンパク質は、ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイにおいて、予測されたアミノ酸基質を選択的に活性化することが見出された。これらの結果はＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性を実験的に確認した。
【００６７】
合成ペプチド。ＢＴペプチド配列ならびにＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性をさらに確認するために、合成ペプチドＰ８１（図６）を（Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州コンコードにより）作成し、そしてその特性について試験した。Ｂｍｔは商業的に入手可能でないため、われわれは絞り込まれたＢＴ１５８３配列に従ってペプチドを合成することが可能でなく、そして、われわれは、オクタン酸で修飾したトレオニンを使用してＢＴ１５８３を模倣するようにリポペプチドＰ８１を合成した。Ｐ８１はＢＴ１５８３のような完全な抗生物質活性およびプロナーゼ抵抗性を示した。これらの結果は、絞り込まれたＢＴ１５８３ペプチド配列およびＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性に裏付けを与える。
【００６８】
Ｃ末端のアルコール性の修飾の意義を検討するために、アミドの形態のＰ８１（Ｐ５９）を合成した。Ｐ５９は抗生物質活性を表したが、しかしプロナーゼ抵抗性を表さなかった。これらの結果は、Ｃ末端のアルコール性の修飾が、Ｐ８１およびおそらく同様にＢＴ１５８３へのプロテアーゼ抵抗性の賦与において重要な役割を演じていることを示した。
【００６９】
第一のＢＴのＮＲＰＳモジュールのコドンは既知のＴｈｒのＮＲＰＳコドンと完全に一致するため、位置１の未修飾のＴｈｒをもつ活性のＢＴ異性体の可能性が検討されることが必要であった。アミドの形態のＰ８１（Ｐ５８）を従って合成し、そしてＰ５８は乏しい抗生物質活性を表した。この結果は、（未修飾のＴｈｒよりもむしろ）Ｔｈｒ誘導体が抗生物質活性を賦与するために位置１にあることが必要であることを確認した。
【００７０】
Ｌ−およびＤ−体の残基は、位置５（Ｖａｌ）を除きＢＴ１５８３の中央で交互に置かれる。交代するキラリティーはペプチド抗生物質グラミシジンＡの重要な構造上の特徴であるため、われわれは、われわれがモジュール５のＥ−ドメインのコーディング配列を見逃したかどうかを検討することを決定した。Ｐ５９のＤ／Ｌが交互するバージョン（Ｐ８０）を合成した。Ｐ８０は抗生物質活性を表さなかった。上の結果は、ＢＴ１５８３ペプチド構造（Ｎ末端残基を除く）のみならずしかしまたＢＴのＮＲＰＳオペロンの同一性も確認した。
【００７１】
ＢＴ１５８３ペプチドの構造、ＢＴのＮＲＰＳオペロンおよびＢＴのＮＲＰＳは、われわれがＢＴ１５８３の異性体の縮重式を提案することを可能にする（表５）。各モジュールの相対的基質選択性に基づき、Ｅ５８によりかなりの量で産生されることがありそうなＢＴ異性体を予測し、そして表６に列挙した。予測されるＢＴ異性体の大部分はＭＳ／ＭＳにより実験的に確認された（データは示されない）。
【００７２】
ＢＴペプチドの構造および生合成を、生化学、生物物理学およびゲノム学の統合されたアプローチを使用して決定した。精製したＢＴ１５８３（主なＢＴ異性体）を用いるアミノ酸組成およびタンデム質量分析実験は部分的なペプチド構造を生じた。該部分的構造中のオルニチンおよびＤ−体残基の存在は、該ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで非リボソームペプチド合成酵素により合成されたことを示した。ＢＴのＮＲＰＳオペロンは新規のｉｎ  ｓｉｌｉｃａ遺伝子ハンティングスキームを介して迅速かつ正確に同定された。ＢＴのＮＲＰＳオペロンの配列分析は、それが共直線的モジュールのＮＲＰＳをコードすることを示した。ＢＴのＮＲＰＳの共直線的な性質は、われわれがＢＴオペロンのゲノム情報を使用しそしてＢＴ１５８３ペプチドの配列を（ＣＨ３）２−Ｂｍｔ−Ｌ−ｄＯ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−ｄＫ−Ｖ−ｄＬ−Ｋ−ｄＹ−Ｌ−Ｖ−ＯＨに絞り込むことを可能にした。さらに、バリン、リシン、オルニチンおよびチロシンの新たなＮＲＰＳコドンが発見され、そして本明
細書に報告される。
【００７３】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃａのＮＲＰＳオペロンの同定。伝統的なＮＲＰＳ遺伝子同定は、包括的プローブでゲノムのコスミドライブラリーをプロービングすることを含む。こうしたアプローチは、研究者に複数のＮＲＰＳオペロンをもつゲノム中の誤った遺伝子を追跡させるという固有の欠点を有する。本明細書に示されるとおり、ＮＲＰＳ遺伝子の同定は、最良の適合を見出すために同時に比較される場合にゲノム中の全ＮＲＰＳオペロンについて改良される。こうした比較はドラフトゲノムを必要とする。幸運なことに、配列決定の費用は、微生物のゲノムの慣例の配列決定を可能にするように大きく低下された。２倍の適用範囲が、正確なＮＲＰＳオペロンの同定に十分であった。実際のＢＴのＮＲＰＳオペロンの選択において、以下の２組の情報、すなわち、基質結合ポケットの構成要素の類似性によるＮＲＰＳモジュールのクラスター形成パターン；およびＤ−体の残基の位置のような位置情報が生成され、そして最良の候補を見出すために比較される。モジュールクラスター形成技術は、新規ＮＲＰＳコドンを伴うオペロンの立候補の確立において（すなわち、ＢＴのＮＲＰＳオペロンのモジュール５、６および８の場合に）とりわけ強力である。本ｉｎ  ｓｉｌｉｃａ戦略は、ゲノム中に多数のＮＲＰＳオペロンを有する（Ｅ５８のような）株におけるＮＲＰＳオペロンの同定にとりわけ有用である。
【００７４】
【表１】
2008508851.tif 000003
【００７５】
【表２】
2008508851.tif 000004
【００７６】
【表３】
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【００７７】
【表４】
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【００７８】
【表５】
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【００７９】
【表６】
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【００８０】
ＢＴペプチドの構造ならびにその生物学的および生化学的特性に基づき、本研究者は、飼料添加物としてのその使用を試験するのに十分な材料を製造した。要するに、使用されたペプチドの特性は、後に続くとおり、すなわち多数の潜在的な天然のバリアント若しくは異性体（＞８）および誘導体（＞３０）を伴う１３アミノ酸残基であった。生物学的に、ＢＴペプチドがグラム陽性細菌により産生される天然の産物であったことが見出された。ＢＴペプチドファミリーは非リボソームペプチド合成（ＮＲＰＳ）により合成され、クローニングおよび特徴付けが本明細書に開示される。１種のこうしたペプチド、ＢＴ１５８３すなわちＭｅ２Ｂｍｔ−Ｌ−ｄＯ−Ｉ−Ｖ−Ｖ−ｄＫ−Ｖ−ｄＬ−Ｋ−ｄＹ−Ｌ−Ｖ−ＣＨ２ＯＨ（配列番号１）を、それが陽イオン性かつおそらく両親媒性であるために、さらなる研究に選択した。それは異常なアミノ酸残基を含有しかつ／若しくは複数の修飾を包含する。
【００８１】
ＢＴ１５８３はまた、その高レベルの安定性によっても選択された。このペプチドについて観察された高い安定性は、以下の特徴、すなわち（１）いずれの既知の酵素もそれを消化し得ない；（２）それはマウス若しくはニワトリの胃腸路で消化されない；（３）それはオートクレーブし得る；（４）それは飼料のペレット化工程を切り抜けた；（５）それは極端なｐＨ（ｐＨ１．０およびｐＨ１３．０）を耐え得る；および（６）それの唯一の既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ不活性化方法はｐＨ１．０および１００℃一夜である、の１個若しくはそれ以上を包含した。
【００８２】
ＢＴ１５８３の顕著な安定性に加え、それはｉｎ  ｖｉｔｒｏでグラム陽性細菌に対し抗菌性、例えば、大部分のグラム陽性について：ＭＩＣ＝１マイクログラム／ｍｌを示された。グラム陰性について、以下が観察された抗菌活性であった。すなわち、大腸菌（Ｅ
．ｃｏｌｉ）：ＭＩＣ＞２０マイクログラム／ｍｌ；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）：ＭＩＣ＞１００マイクログラム／ｍｌ。ＢＴ１５８３はまた抗真菌性も示した。例えば、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：ＭＩＣ＝５０マイクログラム／ｍｌ。抗原生動物活性もまた、ＢＴ１５８３について、テトラヒメナ：ＭＩＣ＝２５マイクログラム／ｍｌに対して観察された。
【００８３】
ＢＴ１５８３を産生させるためのＥ５８株は、それが迅速に増殖しかつ高ペプチド産生体株であったために選択した。さらに、迅速なペプチド生合成に加え、該株はまた、安価な培地中で、例えば約０．４セント／Ｌの培地費用、および例えば０．５ｇ／Ｌの収量でも増殖する。増殖は一般に空気振とう器中で実施するが、しかしまた発酵させてもよい。さらに、該ペプチドおよび該株は、容易な一段階精製方法への公知の手順の高価な改作を伴わずに使用しうる。
【００８４】
以下の表および実施例は、例えば２１日バタリー試験（ｂａｔｔｅｒｙ  ｔｅｓｔ）でのブロイラーにおけるＢＴ１５８３ペプチドの成長促進能力および特徴を示す。
【００８５】
【表７】
2008508851.tif 000009
【００８６】
簡潔には、ペプチドを半精製された形態で使用して、バタリーケージ中での２０日齢の連続飼育した（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｒｕｎ）ブロイラーの成長および飼料効率を試験した（試験２−１および２−２）。２種の量を、飼料対照、６ｐｐｍのペプチドおよび１２ｐｐｍのペプチドに対して試験し、檻あたり４羽の鳥を用いる１処置あたり１２回の反復を実施した。該試験で使用した食餌は後に続くとおりであった。
【００８７】
【表８】
2008508851.tif 000010
【００８８】
【表９】
2008508851.tif 000011
【００８９】
【表１０】
2008508851.tif 000012
【００９０】
【表１１】
2008508851.tif 000013
【００９１】
【表１２】
2008508851.tif 000014
【００９２】
【表１３】
2008508851.tif 000015
【００９３】
【表１４】
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【００９４】
【表１５】
2008508851.tif 000017
【００９５】
【表１６】
2008508851.tif 000018
【００９６】
業界型（ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ｔｙｐｅ）のペレット状の離乳飼料を給餌した３週齢の連続飼育ブロイラーの成長および飼料効率でＴＡＭＵＳ  ＢＴ１５８３を評価するために（バタリーケージ中、試験３−１および３−２）。簡潔には、以下の６種の処置レジメン、すなわち、対照、９０ｐｐｍのモネシン、５０ｐｐｍのＢＭＤ  ５０、１２ｐｐｍのＢＴ１５８３、モネシン＋ＢＭＤ  ５０、モネシン＋および１２ｐｐｍのＢＴ１５８３を検査した。再度檻あたり４羽の鳥で処置あたり８回の試験の反復を使用した。
【００９７】
【表１７】
2008508851.tif 000019
【００９８】
【表１８】
2008508851.tif 000020
【００９９】
【表１９】
2008508851.tif 000021
【０１００】
【表２０】
2008508851.tif 000022
【０１０１】
【表２１】
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【０１０２】
【表２２】
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【０１０３】
【表２３】
2008508851.tif 000025
【０１０４】
【表２４】
2008508851.tif 000026
【０１０５】
【表２５】
2008508851.tif 000027
【０１０６】
床檻（ｆｌｏｏｒ  ｐｅｎ）中の４２日齢の連続飼育ブロイラーの成長および飼料効率でＴＡＭＵＳ  ＢＴ１５８３を評価するためのより完全な試験は、後に続くとおりでありうる。すなわち、６群の処置すなわち対照、９０ｐｐｍのモネシン、１２ｐｐｍのＢＴ１５８３、Ｍｏｎｅｓｉｎおよび５０ｐｐｍのＢＭＤ、モネシンおよび１２ｐｐｍのＢＴ１５８３、ならびに５０ｐｐｍのＢＭＤ。処置あたり１０回の試験の反復を使用して、今回は檻あたり４０羽の鳥を用いて、飼料添加物としてＢＴ１５８３ペプチドを使用することの効果を評価した。
【０１０７】
食物生産動物の成長を促進するために使用される場合、ＢＴ１５８３ペプチドが飼料効率の約１０ポイントおよび余分の体重増加を提供したことが見出された。本発明の明確な一利点は、ニワトリ胃腸路による全く若しくは非常にわずかの吸収で、それによりそれを広範な使用に有用にすることである。さらに、伝統的抗生物質と異なり、本発明は細菌膜を標的とすることができ、そして、現在、薬物耐性の発生を可能にするように１若しくは２個の突然変異を伴い変えられ得る薬物標的が存在しない。さらに、可能な宿主免疫調節を介する成長促進がニワトリに固有でありかつ薬物耐性に依存しないことが見出された。あるいは、しかし本発明をいかなる方法でも制限せずに、本発明は、細菌感染のための動物使用のみの抗生物質として使用しうる。また、今日まで、該ペプチドの成長促進活性の減少は観察されていない。
【０１０８】
ＢＴ１５８３単独および広範に使用されるコクシジウム抑制薬モネシン（ＭＯＮ）との組合せとしての本プロジェクトに指定された新たな抗菌薬の成績を、単独で供給されるＭＯＮ、また広範に使用される抗菌薬バシトラシンＭＤ（ＢＭＤ）と組合せのＭＯＮ、およびＢＭＤ単独と比較するためのブロイラー床檻試験。
【０１０９】
以下のレベルの各処置を評価した：
１：  補充なし
２：  モネシン（ＭＯＮ）９９ｐｐｍ
３：  ＢＴ１５８３  １２ｐｐｍ
４：  ＢＴ１５８３  １２ｐｐｍ＋ＭＯＮ  ９９ｐｐｍ
５：  ＭＯＮ  ９９ｐｐｍ＋ＢＭＤ  ５５ｐｐｍ
６：  ＢＭＤ  ５５ｐｐｍ
【０１１０】
該試験デザインは、処置あたり１０個の檻、および孵化日に収容した檻あたり４０羽の鳥を包含した。減少するタンパク質（およそ２３ないし２０％）および増大する代謝可能なエネルギー（およそ１４００ないし１４５５ｋｃａｌ／ｌｂ）の、２種の基礎的なトウモロコシ−ダイズに基づく食餌を、それぞれ第０から２１日まで（離乳飼料）および第２２ないし４２日（育成飼料）に使用した。処置予混合物（ｐｒｅｍｉｘ）を測定し、そして必要とされるレベルで食餌に配合した。第０と２１日との間で死亡率は１％未満であり、全部の鳥は最適に成長しかつ全群にわたり高度に健康であった。
【０１１１】
試験第２２日に開始して、試験監督者は、ナイーブなブロイラーの群内で大腸菌症の大発生に対し伝導性の産業条件を模倣するように、室の温度および空気流を調節した。これは、この試験のための天然の攻撃を促進するために行った。死亡率は第４２日までにおよそ１０％の室平均（ｈｏｕｓｅ  ａｖｅｒａｇｅ）まで上昇した。これらの死亡の大多数はＢＴ１５８３若しくはＭＯＮを受領しない群で発生した。病変は大腸菌症のもの（気嚢、肺炎、肝周囲炎、心膜炎および極端な罹病率）と矛盾しなかった。全部の死亡を記録した（死亡時の体重および死後剖検）。全部の鳥および飼料を第４２日に秤量した。全部の残存する鳥を第４２日に窒息により安楽死させ、死体を提供のため提出した（ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｆｏｒ  ｒｅｎｄｅｒｉｎｇ）。
【０１１２】
全部のデータは下述されるとおり解析し、そして表２６から３０に表示する。以下の変数を試験した。すなわち、応答変数：鳥あたりの増加、増加あたりの飼料、死亡率（％）、鳥あたりの補正済み飼料。０．０５の有意差レベルを使用する第４２日の一阻害要因＝場所を用いる一方向ＡＮＯＶＡからのＦ検定。
【０１１３】
全応答変数：ＡＮＯＶＡのＦ比が有意である場合に、タイプ１の平均誤差を伴う対にした比較のためのＬＳＤ  Ｔ検定手順、０．０５の全体の有意差レベルを使用した。平均の下の線（表３０、下を参照されたい）は平均の有意でない差違を伴う群を示す。
【０１１４】
【表２６】
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【０１１５】
体重増加は、第４２日に測定された、ＢＴ１５８３を受領する２群のブロイラーについて最も重く、ＭＯＮ＋ＢＴ１５８３はＭＯＮ＋ＢＭＤおよびＭＯＮ群により提供されるものより有意により重かった（ｐ＜０．０５）。
【０１１６】
飼料／増加：表２７は、ＭＯＮ＋ＢＴ１５８３を給餌されたブロイラーが、ＢＴ１５８３単独を受領する群を除く全部の他の群より低かった（ｐ＜０．０５）飼料／増加値を有したことを示す。
【０１１７】
【表２７】
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【０１１８】
補正済飼料／増加：各檻中の死亡の総重量を最終の生存重量に加え、その値を、最初の重量を減算することおよびその後その値を消費された総飼料に除算することにより減らして（ｒｅｄｕｃｅｄ）補正済飼料／増加を計算した。
【０１１９】
表２８は、飼料／増加値に対する自然の攻撃の効果を示す。死亡率についての補正を伴ってさえ、ＭＯＮ＋ＢＴ１５８３を給餌されたブロイラーは、再度、ＢＴ１５８３単独を受領する群を除く全部の他の群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）補正済飼料／増加値を有した。
【０１２０】
【表２８】
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【０１２１】
死亡率：死亡の大多数は急性および慢性大腸菌症により引き起こされた。ＢＴ１５８３若しくはモネシンを単独若しくは組合せで受領するブロイラーは、補充されない対照よりも低い死亡率を有した。
【０１２２】
【表２９】
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【０１２３】
モネシンは、家禽産業において抗原生動物剤として承認かつ使用されているポリエーテル抗生物質である。グラム陰性細菌に対するモネシンおよび他のポリエーテル抗生物質によるわずかな有効性は、多くの研究者および家禽産業の人員により報告されている。ＢＴ１５８３がグラム陰性細菌に対する有効性を有することもまた述べられている。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は健康のためおよび財政的の双方で食品産業における大きな問題である。この病原体に対し高度に有効な大部分の製品は、２１日齢より高齢のブロイラーで使用するには高価すぎるか、若しくは公衆衛生の懸念を生じるヒトの健康製品への類似性のために市場から去らされた。この試験は、ＢＴ１５８３が模擬の商業的ブロイラー条件下で育成された３ないし４週齢のナイーブなブロイラーにおいて大腸菌症に対し高度に有効であることを示した。この試験で観察された、単独および組合せで給餌されたモネシンおよびＢＭＤを上回る、ＢＴ１５８３により保持される２０超ポイントの体重増加の利点および１０超ポイントの飼料／増加の利点は、この生成物が家禽産業の将来にとって非常に有益なツールとなりうることの強力な指標である。
【０１２４】
【表３０】
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【０１２５】
本明細書に記述される特定の態様は具体的説明として示されかつ本発明の制限として示されないことが理解されるであろう。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲から離れることなく、多様な態様で使用し得る。当業者は、本明細書に記述される特定の手順に対する多数の同等物を認識するであろうか、若しくはわずかに慣例の実験を使用して確認することが可能であろう。こうした同等物は本発明の範囲内にあるとみなされ、そして請求の範囲により包括される。
【０１２６】
本明細で挙げられる全部の刊行物および特許出願は、本発明の属する技術分野の当業者の熟練の水準を示す。全部の刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に指示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
本明細書に開示かつ特許請求される組成物および／若しくは方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成かつ実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく、
該組成物および／若しくは方法に対して、ならびに本明細書に記述される方法の段階若しくは段階の順序において、変形が適用されうることが、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的双方で関係するある種の剤を、同一若しくは類似の結果を達成するとみられつつ、本明細書に記述される剤の代わりに用いうることが明らかであろう。当業者に明らかな全部のこうした類似の置換物および改変は、付属として付けられる請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想、範囲および概念内にあると考えられる。
【０１２８】
【表３１】
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【０１２９】
【表３２】
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【表３３】
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【図面の簡単な説明】
【０１３０】
本発明の特徴および利点のより完全な理解のため、今や、付随する図面と一緒に本発明の詳細な記述に参照がなされ、ここで、
【図１Ａ】ペプチドＢＴの精製を示すゲルである。ＢＴのトリシンゲル分離および関連する抗生物質活性。クロロホルム抽出したペプチドをプレキャスト１６．５％トリシンゲル（ＢｉｏＲａｄより購入した）で分離した。１個のゲルはペプチドバンドを示すためにクマシーブルーで染色した（左）。もう１個のゲル（右）は、バシラス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）を埋め込んだ寒天で覆った。細菌叢中の透明な領域は、約１５００の分子量をもつ単一のバンドに崩壊する種に対応する。分子量マーカーは後に続くとおりである。すなわち、トリオースリン酸異性化酵素２６．６ｋＤ、ミオグロビン１７．０ｋＤ、α−ラクトアルブミン１４．４ｋＤ、アプロチニン６．５ｋＤ、インスリンｂ鎖（酸化型）３．５ｋＤおよびバシトラシン１．４ｋＤ。
【図１Ｂ】クロロホルム抽出したＢＴの質量分析のグラフである。クロロホルム抽出したＢＴを塩化ナトリウムの添加によりイオン化し、そしてその後質量分析にかけた。５種のイオン化したＢＴ異性体群（ＢＴ１５５５、ＢＴ１５７１、ＢＴ１５８３、ＢＴ１５９９およびＢＴ１６１３）が検出かつ表示された（ｌａｂｅｌｅｄ）。
【図１Ｃ】精製したＢＴ１５８３の質量分析のグラフである。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣの画分３３を質量分析にかけた。プロトン化された、ナトリウムおよびカリウムでイオン化したＢＴ１５８３のみが検出された；
【図２Ａ】ＢＴ１５８３のタンデム質量分析データのグラフである。
【図２Ｂ】アミノ酸組成およびＭＳ／ＭＳ実験から推定される部分的なＢＴ１５８３配列の構造である（表１および２）（完全なモチーフおよび配列については、それぞれ図５および６を参照されたい）；
【図３Ａ−３Ｄ】ＢＴのＮＲＰＳオペロンの地図である。図３Ａは配列対合により結合された２種の連結断片からの超連結断片の構築の地図である。連結断片１および連結断片２は１クローンからの配列対合を共有する。該連結断片は、配列決定されていないギャップ領域により分離されている連結断片１および連結断片２の配列を含有する超連結断片を形成するように順序付けかつ配置されている；
【図３Ｂ】本研究で配列決定した領域および該領域中で見出される９個のＯＲＦの位置の地図である。ｂｔＡからｂｔＦの６個のＯＲＦは、ＢＴのＮＲＰＳサブユニット（ＢｔＡ、ＢｔＢ、ＢｔＣ、ＢｔＤ、ＢｔＥおよびＢｔＦ）をコードする；
【図３Ｃ】ＢＴのＮＲＰＳサブユニットのドメイン構成の地図である。各モジュールの予測されるアミノ酸基質特異性に、各Ａ−ドメイン中で印が付けられている；
【図３Ｄ】表３に記述されるところの全１３個の結合ポケットの構成要素の複数配列アライメントの系統樹である。推定の特異性を、部分的なＢＴ１５８３配列を使用して割り当てた。同一若しくは類似の基質をおそらく活性化するＡ−ドメインの結合ポケットが一緒にクラスター形成することが示される；
【図３Ｅ】ＢＴオペロンの核酸配列（配列番号２１）である；
【図３Ｆ】ＢｔＡのアミノ酸配列（配列番号２２）である；
【図３Ｇ】ＢｔＢのアミノ酸配列（配列番号２３）である；
【図３Ｈ】ＢｔＣのアミノ酸配列（配列番号２４）である；
【図３Ｉ】ＢｔＤのアミノ酸配列（配列番号２５）である；
【図３Ｊ】ＢｔＥのアミノ酸配列（配列番号２６）である；
【図３Ｋ】ＢｔＦのアミノ酸配列（配列番号２７）である；
【図３Ｌ】ＢｔＧのアミノ酸配列（配列番号２８）である；
【図４Ａ−４Ｅ】ＢＴのＮＲＰＳモジュールからのそれぞれ保存されたモチーフの配列アライメント、ならびにアデニル化、縮合、ｔｈｉｌａｔｉｏｎ、エピマー化および還元酵素ドメインのアライメントである。保存されたモチーフは（Ｍａｒａｈｉｅｌ、１９９７）に従って同定した。コンセンサス配列を各アライメントの下に配置した。残基はコンセンサスと一致するは墨かけした。全１２種のＣ−ドメインを一緒に整列し、＊記号はより少なく保存されていることが既知である開始Ｃ−ドメインを示す；
【図５Ａ−５Ｅ】それぞれモジュール８、５、７、４および２の精製したＡ−ドメインの相対的基質特異性についてのＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイであり、ＡＴＰ−ＰＰｉ交換アッセイから得られたをそれぞれＡ）ないしＤ）に列挙した。最高の活性を１００％と規定した。全２０種のタンパク新生性アミノ酸およびＬ−Ｏｒｎを各アッセイで試験し、そしてバックグラウンドは通常１％より下であった。特定のアミノ酸に対するＡ−ドメインの見かけのＫｍを下に列挙した；ならびに
【図６Ａ】合成のＢＴバリアントの概要である。
【図６Ｂ】ＢＴバリアントと、以前に記述されたところの抗生物質活性およびプロナーゼ抵抗性についてのそれらの特性との間の相関である。
【図２】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2008508851.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月25日(2008.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを含んでなる、飼料添加物。
【請求項２】
Ｃ末端のバリンのカルボキシ末端の−ＣＯＯＨ基が−ＣＨ2ＯＨに還元されている、請求項１に記載の添加物。
【請求項３】
ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、原生動物若しくはそれらの組合せを殺す、請求項１に記載の添加物。
【請求項４】
ペプチドが約６ｐｐｍと約１２ｐｐｍとの間で添加される、請求項１に記載の添加物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物を動物飼料と混合することを含んでなる、動物における体重増加効率および飼料効率の増大方法であって、動物飼料が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ウズラ、コーニッシュヘンおよびハトよりなる群から選択される鳥に給餌するために適合される、方法。
【請求項６】
核酸が、熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを作成するのに使用される酵素であるペプチド合成オペロンタンパク質の１種若しくはそれ以上のポリペプチド配列（配列番号２２ないし２８）をコードする、配列番号２１に対する少なくとも７５％の相同性を有する単離された核酸。
【請求項７】
１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンポリペプチドが配列番号２１から発現され、かつ、熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを作成するのに使用される１種若しくはそれ以上の酵素を含んでなる、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アーケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、シネドロシプティス（Ｓｙｎｅｄｒｏｃｙｐｔｉｓ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の増殖を阻害する、ブレビバシラス  スピーシーズ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から単離された、単離かつ精製された熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチド。
【請求項９】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸で形質転換された細菌であって、該核酸から発現されるタンパク質が１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質を含んでなる細菌。
【請求項１０】
熱安定性のアミノ末端がメチル化されカルボキシ末端が還元された２個若しくはそれ以上のＤ−アミノ酸を含んでなるペプチドを生じさせるＢＴオペロンの配列（配列番号２１）を有する単離かつ精製された核酸を含んでなるベクターであって、該核酸から発現されるタンパク質が１種若しくはそれ以上のＢＴオペロンタンパク質を含んでなるベクター。