(57)【要約】ＣＣＩ−７７９の合成代謝産物を作製する方法が提供される。５つの新規のＣＣＩ−７７９誘導体が記載され、試料中のＣＣＩ−７７９代謝産物の検出のためにこれらの誘導体を使用する方法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物２７−ヒドロキシセコ−ＣＣＩ−７７９（Ｍ７）。
【請求項２】
下記構造を特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【化１】
2008517874.tif 000006
【請求項３】
化合物３６−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ８）。
【請求項４】
下記構造を特徴とする、請求項３に記載の化合物。
【化２】
2008517874.tif 000007
【請求項５】
化合物３５−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ９）。
【請求項６】
下記構造を特徴とする、請求項５に記載の化合物。
【化３】
2008517874.tif 000008
【請求項７】
化合物１１−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ１０）。
【請求項８】
下記構造を特徴とする、請求項７に記載の化合物。
【化４】
2008517874.tif 000009
【請求項９】
化合物Ｎ−オキシドＣＣＩ−７７９（Ｍ１２）。
【請求項１０】
下記構造を特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【化５】
2008517874.tif 000010
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を使用して作製された抗体。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物を標準として含む、ＣＣＩ−７７９による治療をモニタリングするためのキット。
【請求項１３】
請求項１１に記載の抗体を含む、ＣＣＩ−７７９による治療をモニタリングするためのキット。
【請求項１４】
試料を請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物と比較することを含む、ＣＣＩ−７７９の代謝産物を検出するための方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の抗体との結合を検出することを含む、ＣＣＩ−７７９の代謝産物を検出するための方法。
【請求項１６】
還元剤の存在下でＣＹＰ３Ａ４アイソザイム及びＣＣＩ−７７９をインキュベートすることを含む、ＣＣＩ−７７９の合成代謝産物を生成させる方法。
【請求項１７】
前記還元剤がＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
デヒドロゲナーゼの存在下でＣＹＰ３Ａ４アイソザイム及びＣＣＩ−７７９をインキュベートすることを含む、ＣＣＩ−７７９の誘導体を生成させる方法。
【請求項１９】
前記デヒドロゲナーゼがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、独特の酵素過程を使用して形成されたＣＣＩ−７７９の新規の誘導体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸とのラパマイシン４２−エステル（ＣＣＩ−７７９）は、インビトロ及びインビボ両方のモデルにおいて腫瘍増殖に対する有意な阻害効果を示したラパマイシンのエステル誘導体である。
【０００３】
ＣＣＩ−７７９は、細胞障害剤というよりむしろ代表的な細胞分裂停止剤であり、腫瘍の進行までの時間又は腫瘍再発までの時間を遅延させ得る。ＣＣＩ−７７９は、シロリムスのものに類似した作用機序を有すると考えられている。ＣＣＩ−７７９は、細胞質タンパク質ＦＫＢＰと結合し、それと共に複合体を形成し、それが、酵素ｍＴＯＲ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン関連タンパク質［ＦＲＡＰ］としても既知の哺乳動物ラパマイシン標的）を阻害する。ｍＴＯＲのキナーゼ活性の阻害は、サイトカインにより刺激される細胞増殖、細胞周期のＧ１期を制御するいくつかの重要タンパク質のｍＲＮＡの翻訳、及びＩＬ−２により誘導される転写を含む、多様なシグナル伝達経路を阻害し、Ｇ1からＳへの細胞周期の進行の阻害に至る。Ｇ1−Ｓ期遮断をもたらすＣＣＩ−７７９の作用機序は、抗癌薬では新規である。
【０００４】
インビトロで、ＣＣＩ−７７９は、多数の組織学的に多様な腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている。ＣＣＩ−７７９に対して最も感受性のものには、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、白血病（Ｔ細胞）、乳癌、前立腺癌、及び黒色腫系が含まれていた。上記化合物は、細胞周期のＧ1期で細胞を阻止した。
【０００５】
ヌードマウスにおけるインビボ研究は、ＣＣＩ−７７９が、多様な組織学的な型のヒト腫瘍異種移植片に対する活性を有することを証明している。神経膠腫は、特にＣＣＩ−７７９に対して感受性であり、その化合物はヌードマウスにおける同所性の神経膠腫モデルにおいて活性であった。インビトロのヒト神経膠芽腫細胞系の増殖因子（血小板由来）により誘導される刺激は、ＣＣＩ−７７９により著しく抑制された。ヌードマウスにおけるいくつかのヒト膵臓腫瘍、そしてインビボで研究された２つの乳癌系のうちの１つの増殖も、ＣＣＩ−７７９により阻害された。
【０００６】
構造活性を探究するための、その新たな誘導体の調製に、多大の努力がなされてきた。しかしながら、複数の官能基の存在のため、ラパマイシンは、酸性及び塩基性の反応条件に対して極めて感受性である。従って、選択的な構造改変は困難である。ラパマイシンの改変は、エーテル生成物及びエステル生成物（例えば：ＣＣＩ−７７９）としての４２−ヒドロキシ位、並びに７位誘導体に主として焦点が置かれてきた。７位及び４２位の改変以外の生成物は、ほとんど報告されていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＣＹＰ３Ａ４アイソザイム系を使用してＣＣＩ−７７９還元ヒドロキシル化誘導体を選択的に作製する方法を提供する。この系を使用して、ＣＣＩ−７７９の選択的なＣ27−ケトン還元、３６−ヒドロキシル化、３５−ヒドロキシル化、１１−ヒドロキシル化、及びＮ酸化にそれぞれ起因する５つの新規のＣＣＩ−７７９誘導体が、同定された。本発明のこれらの方法及び組成物のための様々な使用が提供される。
【０００８】
本発明のその他の態様及び利点は、以下の発明の詳細な説明から明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明のＣＣＩ−７７９化合物は、被験体、哺乳動物、霊長類（非ヒトもしくはヒト）、又はヒト患者によるＣＣＩ−７７９のプロセシングによって形成される「代謝産物」に対する合成等価体であると考えられる。従って、本発明の化合物は、被験体におけるＣＣＩ−７７９又はそのプロドラッグの投与の後に、被験体においてＣＣＩ−７７９治療をモニタリングする際に使用される標準として有用である。
【００１０】
本発明は、ヒトシトクロムＰ４５０−３Ａ４アイソザイムを発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の膜と共にＣＣＩ−７７９をインキュベートすることにより、ＣＣＩ−７７９の特異的な誘導体を作製する方法を提供する。
【００１１】
ＣＣＩ−７７９を含むラパマイシンのヒドロキシエステルの調製及び使用は、本明細書において参考として援用される米国特許第５，３６２，７１８号に記載されている。ＣＣＩ−７７９の位置特異的な合成は、本明細書において参考として援用される米国特許第６，２７７，９８３号に記載されている。ＣＣＩ−７７９の位置選択的な合成は、本明細書において参考として援用される米国特許公開ＵＳ２００５／００３３０４６  Ａ１（米国特許出願第１０／９０３，０６２号）に記載されている。ＣＣＩ−７７９は、商業的な供給源からも入手可能である。本発明は、ＣＣＩ−７７９の供給源により制限されない。
【００１２】
ＣＣＩ−７７９は、以下の構造を有する。
【化６】
2008517874.tif 000002
【００１３】
ヒトシトクロムＰ４５０−３Ａ４としても既知のＣＹＰ３Ａ４酵素（ヒトシトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、メンバー４）は、商業的に入手され得る［例えば、BD Biosciences,6 Henshaw St.,Woburn,MA 01801 USA）］。又は、その酵素は、組換えにより産生され得る。１つの実施形態において、酵素は大腸菌細胞において産生される。しかしながら、酵素の発現のためのその他の適切な宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であり得る。酵素をコードする核酸分子によりこれらの宿主細胞をトランスフェクト（又は形質転換）するための適切な方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）及びその他の実験教科書に見出され得る。
【００１４】
例えば、ヒトＣＹＰ３Ａ４ヌクレオチド配列の発現を指図する核酸ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞は、ポリペプチドの発現が起こることを可能にする適当な条件の下で培養され得る。適切な核酸配列は、公開されている配列を使用して作製され得る。例えば、Strausberg et al, Proc Natl Acad Sci USA, 99(26):16899-903(Dec 24, 2002)、及びＧｅｎＢａｎｋ、例えば、登録番号ＢＣ０６９４１８を参照のこと。細胞培養のための適切な培地は、当技術分野において周知である。ＣＹＰ３Ａ４酵素は、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外ろ過、電気泳動、及びそのようなポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野において既知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、又はその両方から単離され得る。膜結合型タンパク質の場合、これらは、膜会合タンパク質が、もはや膜画分に完全には埋め込まれておらず、少なくとも膜画分からクロマトグラフィにより単離され得る程度に可溶化されている可溶化複合体を形成するよう、膜会合タンパク質画分を界面活性剤と接触させることにより、宿主細胞から単離され得る。最終精製工程において使用され得るクロマトグラフィ技術は、当技術分野において既知であり、疎水的相互作用、レクチン親和性、イオン交換、色素親和性、及び免疫親和性が挙げられる。
【００１５】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌(archebacteria)、真菌（特に、酵母）、並びに植物及び動物の細胞（特に、哺乳動物細胞）が含まれる。特に重要であるのは、Ｃ．アルビカンス(albicans)、大腸菌、Ｂ．ズブチリス(Subtilis)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、シゾサッカロミセス・ポンビ(Schizosaccharomyces pombi)、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ(Neurospora)、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、並びに不死化された哺乳動物の骨髄細胞系及びリンパ細胞系である。好ましい複製系には、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス等が含まれる。多数の転写の開始及び終結の制御領域が、単離され、様々な宿主における異種タンパク質の転写及び翻訳において有効であることが示されている。これらの領域の例、単離の方法、操作の様式等は、当技術分野において既知である。適当な発現条件の下で、宿主細胞は、組換えにより産生される酵素の供給源として使用され得る。
【００１６】
ヒトＣＹＰ４５０ファミリーのメンバーであるＣＹＰ３Ａ４（BD Biosciences, Woburn, MA 01801のように、商業的にも入手可能）は、ＣＣＩ−７７９誘導体を特異的に作製する、この酵素ファミリーの唯一のメンバーである。２Ａ６、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１９、及び２Ｅ１を含む、その他のいくつかの試験されたＣＹＰ４５０は、これらの誘導体を作製することができない。
【００１７】
本発明の特異的なヒドロキシル化誘導体を作製するため、ＣＣＩ−７７９及びＣＹＰ３Ａ４は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのような還元剤の存在下でインキュベートされ得る。適切には、ＣＣＩ−７７９及び酵素は、３００：１〜５００：１、望ましくは約３３０：１のＣＣＩ−７７９対酵素の比率で存在し得る。下記の例において、これらの成分は、０．１ｍＭ  ＣＣＩ−７７９、３００ｎＭ  ３Ａ４酵素、及び２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ再生系という最終濃度で混合される。しかしながら、その他の濃度も、容易に使用され得る。
【００１８】
１つの実施形態において、上記還元剤はＮＡＤＰＨである。場合により、ＮＡＤＰＨ発生系、即ち、ＮＡＤＰ、リン酸供給源、デヒドロゲナーゼ、及び適切な緩衝溶液が存在する。この系において使用するための適切なデヒドロゲナーゼは、既知のデヒドロゲナーゼの中から容易に選択され得、例えば、特に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであり得る。
【００１９】
ＮＡＤＰＨ再生系は、通常、ＮＡＤＰ塩、Ｄ−グルコース−６−リン酸、及びインキュベーション時間中にＮＡＤＰをＮＡＤＰＨへと還元するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含み、従って、インキュベーション溶液は、以下の反応に必要な量のＮＡＤＰＨを確実に維持することができる。ヒドロキシル化は、一般的な反応：ＲＨ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｏ2−−＞ＲＯＨ＋ＮＡＤＰ+＋Ｈ2Ｏ（ここで、ＲＨは基質、即ち、ＣＣＩ−７７９である）を介して起こる。
【００２０】
得られた混合溶液がインキュベートされ、粗生成物が適切な溶媒による抽出により入手される。場合により、インキュベーション（即ち、酵素反応）は、３０℃〜約４０℃の範囲の温度で実施される。適切には、ｐＨは、約６〜約８、約７〜約８、又は約７．２〜約７．６の範囲内に維持される。代表的には、反応時間は、３０分〜９０分である。しかしながら、より低い温度及びより長いインキュベーション時間も使用され得る。同様に、より高い温度及びより短いインキュベーション時間も、ＣＣＩ−７７９誘導体が作製される前に酵素活性が破壊されないよう注意して、使用され得る。１つの実施形態において、混合物は、約３７℃で１時間インキュベートされる。適切には、ｐＨは、約６〜約９、約７〜約８の範囲内、又は７．４に維持される。
【００２１】
１つの実施形態において、インキュベーションは、収率を最大限にするために酸素雰囲気下で実施される。インキュベーションの後、反応溶液が冷却され、粗ＣＣＩ−７７９誘導体を回収するために抽出される。適切な抽出溶媒には、例えば、酢酸エチル及びジクロロメタンが含まれる。その他の抽出溶媒も、当業者によって選択され得る。代表的には、抽出物は合わせられ、粗生成物を得るために真空下で蒸発される。
【００２２】
従来の技術が、インキュベーション混合物から生成物を回収するために使用され得る。例えば、反応試薬から未反応のＣＣＩ−７７９及びその他の材料を除去するために、粗抽出物をシリカゲルカラムに通過させ、溶媒の勾配により溶出させることができる。勾配において使用するための適切な溶媒は、当業者によって容易に選択され得る。本明細書の実施例においては、ヘキサン／アセトン及びアセトン／メタノールを、連続的に溶媒として使用した。ＣＣＩ−７７９誘導体を含有している画分を合わせ、ＣＣＩ−７７９誘導体混合物を提供するために溶媒を蒸発させた。
【００２３】
個々の誘導体を単離するため、精製された混合物は、クロマトグラフィ技術を使用したさらなる分離に供され得る。例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が使用され得る。分離のための適切なカラム及び条件は、本発明の開示があれば、当業者には容易に明白になるであろう。
【００２４】
理論により拘束されることは望まないが、本発明の誘導体は、ＣＣＩ−７７９の投与後に被験体によって生成される代謝産物に対する生物学的等価物（ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）であると考えられる独特の合成代謝産物である。従って、本発明の誘導体は、ＣＣＩ−７７９治療をモニタリングするためのキットにおける標準として、そしてＣＣＩ−７７９代謝産物に特異的な抗体を作製するために有用である。そのような抗体は、ＣＣＩ−７７９治療の効果のモニタリング及び研究のために有用である。
【００２５】
本発明の誘導体は、１つ以上の不斉中心を含有していてもよく、従って、光学異性体及びジアステレオ異性体を生じ得る。以下には原子の空間的配置を顧慮せずに示したが、本発明には、そのような光学異性体及びジアステレオ異性体が含まれ；ラセミ化合物及び分離されたエナンチオマー的(enantiomerically)に純粋なＲ立体異性体及びＳ立体異性体も含まれ；その他のＲ立体異性体及びＳ立体異性体の混合物、並びにそれらの薬学的に許容される塩も含まれる。本発明の５つの誘導体は、以下のように示される。
【化７】
2008517874.tif 000003
【００２６】
１つの実施形態において、これらの化合物は、以下の原子の空間的配置を有する。
【化８】
2008517874.tif 000004
【００２７】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のＣＣＩ−７７９誘導体を含有している組成物をさらに提供する。そのような組成物は、試料中のＣＣＩ−７７９代謝産物の存在を検出するために使用されるキットのための標準として使用され得る。
【００２８】
「試料」とは、本明細書において使用される場合、例えば、個体、即ち、インビボから単離された組織もしくは液体（血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、尿、唾液、及び組織切片が挙げられるがこれらに限定されない）、又はインビトロ細胞培養物構成要素から単離された組織もしくは液体、並びに環境からの試料をさす。
【００２９】
本発明のキットは、適当に標識されたトレーサー、標準、及び使用説明書を含有し得る。トレーサーのための標識は、任意の適切な標識、例えば、放射標識、蛍光標識、又は比色標識であり得る。便利である場合には、キットの成分は、凍結乾燥形態であってもよい。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のＣＣＩ−７７９誘導体に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナルの抗体を提供する。１つの実施形態において、そのような抗体は、本発明のＣＣＩ−７７９誘導体に選択的に結合し、ＣＣＩ−７７９及びその他の代謝産物から区別する。
【００３１】
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ＣＣＩ−７７９及び／又はその代謝産物と特異的に反応性であるそれらの断片が含まれることが意図される。
【００３２】
本発明のＣＣＩ−７７９誘導体（例えば、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、又はＭ１１）に特異的な抗体は、本発明の誘導体を抗原として標準的な技術を使用して調製される。例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと。
【００３３】
ＣＣＩ−７７９代謝産物の特異的な部位に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、イムノアッセイ又はＴＤＭ（治療薬物モニタリング）キットの開発のために使用され得る。そのようなアッセイには、直接型、阻害型、競合型、もしくはサンドイッチ型のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡもしくはその他のアッセイ系）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、固相型もしくは液相型のアッセイ、又は自動化されたアッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
競合型アッセイが使用される場合、抗体のための競合剤は、アッセイプレートに結合した本発明のＣＣＩ−７７９誘導体、又は標識された誘導体、例えば、蛍光標識された誘導体、放射標識された誘導体、もしくはトリチウム標識された誘導体であり得る。
【００３５】
本発明のアッセイ手順は、正確かつ再現性のある結果を与えるために、標準的な生物学的分析(bioanalytical)装置を使用して迅速かつ単純に実施され得るという利点を有する。また、全血が、抽出の必要なしに使用され得る。
【００３６】
本発明は、血中のＣＣＩ−７７９代謝産物から医薬品(pharmaceutical)を置換する結合競合剤；及びその医薬品と結合し、結合競合剤とは有意に結合しない抗体を含む、血中のＣＣＩ−７７９代謝産物の量を検出するのに適したアッセイキットも提供する。
（実施例）
【００３７】
以下の実施例は、本発明の誘導体を作製するための方法を例示するものである。
【実施例１】
【００３８】
（ＣＣＩ−７７９誘導体の調製）
ＣＣＩ−７７９  ５１４ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、ＭｇＣｌ2（０．４Ｍ×５ｍＬ）、ＮＡＤＰＨ発生系（ＮＡＤＰナトリウム塩：７５ｍｇ×１００ｍＬ、Ｄ−グルコース−６−リン酸：６０ｍｇ／ｍＬ×１００ｍＬ；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ：２５単位／ｍＬ×１００ｍＬ）、及び大腸菌において発現されたＣＹＰ−３Ａ４膜（１５００ｎｍｏｌ）を含有している５Ｌのリアクターに、５Ｌになるまでリン酸カリウム緩衝溶液を添加した。その混合溶液を、１時間、１２５ｒｐｍで撹拌しながら、酸素雰囲気（０．３Ｌ／分でＯ2を噴霧）下で３７℃でインキュベートした。１時間の反応の後、反応溶液を氷浴上で２５℃にまで冷却し、等しい容量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル抽出物を合わせ、真空下で蒸発し、粗インキュベーション抽出物を得た（およそ５００ｍｇ）。
【実施例２】
【００３９】
（粗抽出物の単離及び精製）
反応試薬から未反応のＣＣＩ−７７９及びその他の材料を取り除くために、粗抽出物をフラッシュシリカゲルカラムに通過させた。ヘキサン／アセトン及びアセトン／メタノールの勾配を、溶媒として使用した。ＣＣＩ−７７９誘導体を含有していた画分を合わせた。溶媒を蒸発させた後、ＣＣＩ−７７９誘導体混合物を入手し、分取用（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによるさらなる分離に供した。分取用ＨＰＬＣは、ＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌTMＬＣ−１８カラムで達成し、５ｍＭ酢酸アンモニウム／メタノールを含有している水の勾配（２ｍＬ／分の流速で９０分で４：６から２：８まで）を、移動相として使用した。それぞれ２２０ｎｍ及び２８０ｎｍにＵＶ検出器を設定することにより、単離をモニタリングした。各ＣＣＩ−７７９誘導体ピークを、氷浴上の容器に収集した。溶媒を真空下で蒸発させた後、１３の純粋な誘導体を入手した。
【実施例３】
【００４０】
（単離した誘導体の構造同定）
精製したＣＣＩ−７７９誘導体の構造を、ＣＣＩ−７７９のものと比較して、ＬＣ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、及びＭＳ／ＭＳ／ＭＳスペクトル分析により決定し、それを、高分解能の正確な質量測定及び1Ｈ−ＮＭＲ分析によりさらに確認した。それらの中から、２７−ヒドロキシセコ−ＣＣＩ−７７９（Ｍ７）、３６−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ８）、３５−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ９）、１１−ヒドロキシＣＣＩ−７７９（Ｍ１０）、及びＮ−オキシドＣＣＩ−７７９（Ｍ１２）としてそれぞれ割り当てた５つの新規の化合物を同定した。それらの構造式は以下の通りであり、ここで、点線で囲まれた部分は、ＣＣＩ−７７９に対する改変の位置を示す。
【化９】
2008517874.tif 000005
【００４１】
この明細書において言及された特許、特許公開、及びその他の刊行物は、全て、本明細書において参考として援用される。本発明は特定の実施形態に関して記載されたが、本発明の精神から逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識されるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【国際調査報告】
2008517874.tif 000011
2008517874.tif 000012
2008517874.tif 000013