(57)【要約】開示されるのは細菌性微生物シュワネラ・ジャポニカ(Shewanella japonica)およびシュワネラ・オレヤナ(Shewanella olleyana)由来の完全な多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系、ならびに生物学的に活性なその断片および相同体である。より詳細には、本発明は、そのようなPUFA PKS系をコードする核酸に関し、そのようなPUFA PKS系を含むそのタンパク質およびドメインに関し、そのようなPUFA PKS系を含む遺伝的に改変された生物(植物および微生物)に関し、ならびに本明細書において開示されるPUFA PKS系を作出するおよび使用する方法に関する。本発明は同様に、PUFAポリケチドシンターゼ(PKS)系の操作によって種々の多価不飽和脂肪酸(PUFA)およびその他の生物活性分子に富む脂質を効率的に産生するための遺伝的に改変された植物および微生物ならびに方法に関する。2008515461.tif 000013
2008515461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される核酸配列を含む、単離核酸分子：
a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片をコードする核酸配列;
c) SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:8に少なくとも約65%同一であるならびにKS活性、MAT活性、KR活性、ACP活性、および非FabA様デヒドラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
d) SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:9に少なくとも約60%同一であるおよびAT生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
e) SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:10に少なくとも約70%同一であるならびにKS活性、CLF活性およびDH活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
f) SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:12に少なくとも約60%同一であるおよびPPTase生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
g) SEQ ID NO:11に少なくとも約85%同一であるまたはSEQ ID NO:5に少なくとも約95%同一であるおよびER生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項２】
核酸配列が以下からなる群より選択される、請求項1記載の単離核酸分子:
a) SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:8に少なくとも約75%同一であるならびにKS活性、MAT活性、KR活性、ACP活性、および非FabA様デヒドラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b) SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:9に少なくとも約70%同一であるおよびAT生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
c) SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:10に少なくとも約80%同一であるならびにKS活性、CLF活性およびDH活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
d) SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:12に少なくとも約70%同一であるおよびPPTase生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
e) SEQ ID NO:11に少なくとも約95%同一であるまたはSEQ ID NO:5に少なくとも約96%同一であるおよびER生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項３】
核酸配列が以下からなる群より選択される、請求項1記載の単離核酸分子:
a) SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:8に少なくとも約85%同一であるならびにKS活性、MAT活性、KR活性、ACP活性、および非FabA様デヒドラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b) SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:9に少なくとも約80%同一であるおよびAT生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
c) SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:10に少なくとも約90%同一であるならびにKS活性、CLF活性およびDH活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
d) SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:12に少なくとも約80%同一であるおよびPPTase生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
e) SEQ ID NO:11に少なくとも約96%同一であるまたはSEQ ID NO:5に少なくとも約97%同一であるおよびER生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項４】
核酸配列が以下からなる群より選択される、請求項1記載の単離核酸分子:
a) SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:8に少なくとも約95%同一であるならびにKS活性、MAT活性、KR活性、ACP活性、および非FabA様デヒドラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
b) SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:9に少なくとも約90%同一であるおよびAT生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
c) SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:10に少なくとも約95%同一であるならびにKS活性、CLF活性およびDH活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
d) SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:12に少なくとも約90%同一であるおよびPPTase生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列;
e) SEQ ID NO:11に少なくとも約97%同一であるまたはSEQ ID NO:5に少なくとも約98%同一であるおよびER生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【請求項５】
核酸配列が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の単離核酸分子:
a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項６】
(b)に記載の断片が以下からなる群より選択される、請求項1記載の単離核酸分子:
a) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約29位から約513位までのSEQ ID NO:2の断片;
b) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約625位から約943位までのSEQ ID NO:2の断片;
c) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約1264位から約1889位までのSEQ ID NO:2の断片、およびそのサブドメイン;
d) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2264位から約2398位までのSEQ ID NO:2の断片;
e) 非FabA様デヒドラーゼ生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2504位から約2516位までを含むSEQ ID NO:2の断片;
f) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:3の約378位から約684位までのSEQ ID NO:3の断片;
g) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約5位から約483位までのSEQ ID NO:4の断片;
h) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約489位から約771位までのSEQ ID NO:4の断片;
i) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1428位から約1570位までのSEQ ID NO:4の断片;
j) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1881位から約2019位までのSEQ ID NO:4の断片;
k) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:5の約84位から約497位までのSEQ ID NO:5の断片;
l) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:6の約40位から約186位までのSEQ ID NO:6の断片;
m) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約29位から約513位までのSEQ ID NO:8の断片;
n) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約625位から約943位までのSEQ ID NO:8の断片;
o) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約1275位から約1872位までのSEQ ID NO:8の断片、およびそのサブドメイン;
p) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2240位から約2374位までのSEQ ID NO:8の断片;
q) 非FabA様デヒドラーゼ活性を有する、SEQ ID NO:8の約2480〜2492位までを含むSEQ ID NO:8の断片;
r) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:9の約366位から約703位までのSEQ ID NO:9の断片;
s) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約10位から約488位までのSEQ ID NO:10の断片;
t) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約502位から約750位までのSEQ ID NO:10の断片;
u) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1431位から約1573位までのSEQ ID NO:10の断片;
v) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1882位から約2020位までのSEQ ID NO:10の断片;
w) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:11の約84位から約497位までのSEQ ID NO:11の断片; ならびに
x) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:12の約29位から約177位までのSEQ ID NO:12の断片。
【請求項７】
核酸配列がSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項８】
請求項1記載の核酸分子に完全に相補的である核酸配列から本質的になる単離核酸分子。
【請求項９】
少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された、請求項1記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
【請求項１０】
請求項9記載の組換え核酸分子をトランスフェクトされた組換え細胞。
【請求項１１】
請求項1記載の核酸分子によってコードされる、多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なタンパク質またはそのドメインを含むPKS系を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１２】
以下からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分:
a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１４】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１５】
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１６】
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１７】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分:
a) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約29位から約513位までのSEQ ID NO:2の断片;
b) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約625位から約943位までのSEQ ID NO:2の断片;
c) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約1264位から約1889位までのSEQ ID NO:2の断片、およびそのサブドメイン;
d) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2264位から約2398位までのSEQ ID NO:2の断片;
e) 非FabA様デヒドラーゼ生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2504位から約2516位までを含むSEQ ID NO:2の断片;
f) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:3の約378位から約684位までのSEQ ID NO:3の断片;
g) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約5位から約483位までのSEQ ID NO:4の断片;
h) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約489位から約771位までのSEQ ID NO:4の断片;
i) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1428位から約1570位までのSEQ ID NO:4の断片;
j) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1881位から約2019位までのSEQ ID NO:4の断片;
k) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:5の約84位から約497位までのSEQ ID NO:5の断片;
l) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:6の約40位から約186位までのSEQ ID NO:6の断片;
m) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約29位から約513位までのSEQ ID NO:8の断片;
n) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約625位から約943位までのSEQ ID NO:8の断片;
o) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約1275位から約1872位までのSEQ ID NO:8の断片、およびそのサブドメイン;
p) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2240位から約2374位までのSEQ ID NO:8の断片;
q) 非FabA様デヒドラーゼ生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2480〜2492位までを含むSEQ ID NO:8の断片;
r) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:9の約366位から約703位までのSEQ ID NO:9の断片;
s) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約10位から約488位までのSEQ ID NO:10の断片;
t) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約502位から約750位までのSEQ ID NO:10の断片;
u) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1431位から約1573位までのSEQ ID NO:10の断片;
v) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1882位から約2020位までのSEQ ID NO:10の断片;
w) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:11の約84位から約497位までのSEQ ID NO:11の断片; ならびに
x) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:12の約29位から約177位までのSEQ ID NO:12の断片。
【請求項１８】
スラウストキトリド(Thraustochytrid)由来の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なタンパク質またはドメインを発現するようさらに遺伝的に改変されている、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項１９】
スラウストキトリドがシゾキトリウム(Schizochytrium)およびスラウストキトリウム(Thraustochytrium)からなる群より選択される、請求項18記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２０】
タンパク質またはドメインが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分:
a) SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、およびSEQ ID NO:18; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項２１】
タンパク質またはドメインが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項18記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分:
a) SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:24; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項２２】
遺伝的改変の結果として、DHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、ω-3))、ARA (エイコサテトラエン酸もしくはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、ω-6もしくはω-3))、およびEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3)からなる群より選択される1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２３】
遺伝的改変の結果として、DHAを産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２４】
遺伝的改変の結果として、EPAを産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２５】
遺伝的改変の結果として、EPAおよびDHAを産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２６】
遺伝的改変の結果として、ARAおよびDHAを産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２７】
遺伝的改変の結果として、ARAおよびEPAを産生する、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２８】
穀物植物である、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項２９】
双子葉植物である、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項３０】
単子葉植物である、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項３１】
キャノーラ、大豆、菜種、亜麻仁、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコからなる群より選択される、請求項11記載の遺伝的に改変された植物または植物の一部分。
【請求項３２】
請求項1記載の単離核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、遺伝的に改変された微生物。
【請求項３３】
以下からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物:
a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項３４】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３５】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３６】
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３７】
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項３８】
以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物:
a) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約32位から約513位までのSEQ ID NO:2の断片;
b) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約625位から約943位までのSEQ ID NO:2の断片;
c) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約1264位から約1889位までのSEQ ID NO:2の断片、およびそのサブドメイン;
d) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2264位から約2398位までのSEQ ID NO:2の断片;
e) 非FabA様デヒドラーゼ活性を有する、SEQ ID NO:2の約2504位から約2516位までを含むSEQ ID NO:2の断片;
f) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:3の約378位から約684位までのSEQ ID NO:3の断片;
g) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約5位から約483位までのSEQ ID NO:4の断片;
h) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約489位から約771位までのSEQ ID NO:4の断片;
i) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1428位から約1570位までのSEQ ID NO:4の断片;
j) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1881位から約2019位までのSEQ ID NO:4の断片;
k) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:5の約84位から約497位までのSEQ ID NO:5の断片;
l) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:6の約40位から約186位までのSEQ ID NO:6の断片;
m) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約29位から約513位までのSEQ ID NO:8の断片;
n) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約625位から約943位までのSEQ ID NO:8の断片;
o) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約1275位から約1872位までのSEQ ID NO:8の断片、およびそのサブドメイン;
p) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2240位から約2374位までのSEQ ID NO:8の断片;
q) 非FabA様デヒドラーゼ活性を有する、SEQ ID NO:8の約2480〜2492位までを含むSEQ ID NO:8の断片;
r) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:9の約366位から約703位までのSEQ ID NO:9の断片;
s) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約10位から約488位までのSEQ ID NO:10の断片;
t) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約502位から約750位までのSEQ ID NO:10の断片;
u) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1431位から約1573位までのSEQ ID NO:10の断片;
v) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1882位から約2020位までのSEQ ID NO:10の断片;
w) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:11の約84位から約497位までのSEQ ID NO:11の断片; ならびに
x) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:12の約29位から約177位までのSEQ ID NO:12の断片。
【請求項３９】
スラウストキトリド由来の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なタンパク質またはドメインを発現するようさらに遺伝的に改変されている、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４０】
スラウストキトリドがシゾキトリウムおよびスラウストキトリウムからなる群より選択される、請求項39記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４１】
タンパク質またはドメインが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の遺伝的に改変された微生物:
a) SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、およびSEQ ID NO:18; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項４２】
タンパク質またはドメインが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項39記載の遺伝的に改変された微生物:
a) SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:24; ならびに
b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【請求項４３】
遺伝的改変の結果として、DHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、ω-3))、ARA (エイコサテトラエン酸もしくはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、ω-6もしくはω-3))、およびEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3)からなる群より選択される多価不飽和脂肪酸を産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４４】
遺伝的改変の結果として、DHAを産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４５】
遺伝的改変の結果として、EPAを産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４６】
遺伝的改変の結果として、EPAおよびDHAを産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４７】
遺伝的改変の結果として、ARAおよびDHAを産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４８】
遺伝的改変の結果として、ARAおよびEPAを産生する、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項４９】
内因性PUFA PKS系を含む、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５０】
内因性PUFA PKS系が、内因性PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインをコードする核酸配列に対しての異なるPKS系の少なくとも1つのドメインをコードする別の単離核酸分子の置換により改変されている、請求項49記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５１】
異なるPKS系が非細菌性PUFA PKS系、細菌性PUFA PKS系、I型モジュールPKS系、I型反復PKS系、II型PKS系、およびIII型PKS系からなる群より選択される、請求項50記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５２】
内因性PUFA PKS系が、内因性PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインをコードする核酸配列に対しての請求項1記載の単離核酸分子の置換により遺伝的に改変されている、請求項49記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５３】
C20単位の合成を指令する、鎖伸長因子、または鎖伸長因子に加えてβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメインをコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている、請求項49記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５４】
内因性PUFA PKS系が、FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインをコードするドメインおよびβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)をコードするドメインからなる群より選択される1つのドメインまたは複数のドメインで改変されており、改変によって、改変のない場合に比べPUFA PKS系によって産生される長鎖脂肪酸の比率が変えられる、請求項49記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５５】
改変が、内因性PUFA PKS系のFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)に対しての異性化活性を保有しないDHドメインの置換を含む、請求項54記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５６】
改変がドメインの全部または一部の欠失、ドメインに対しての異なる生物由来の相同ドメインの置換、およびドメインの突然変異からなる群より選択される、請求項54記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５７】
内因性PUFA PKS系が、エノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメインで改変されており、改変によって、改変のない場合に比べ異なる化合物の産生がもたらされる、請求項49記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５８】
改変がERドメインの全部または一部の欠失、ERドメインに対しての異なる生物由来のERドメインの置換、およびERドメインの突然変異からなる群より選択される、請求項57記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項５９】
微生物がスラウストキトリドである、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項６０】
スラウストキトリドがシゾキトリウムおよびスラウストキトリウムからなる群より選択される属由来である、請求項59記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項６１】
微生物が細菌である、請求項32記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項６２】
生物活性分子を産生させるのに効果的な条件の下で、請求項12記載の遺伝的に改変された植物を増殖させる段階を含む、ポリケチドシンターゼ系によって産生される生物活性分子を産生させる方法。
【請求項６３】
生物活性分子を産生させるのに効果的な条件の下で、請求項29記載の遺伝的に改変された微生物を培養する段階を含む、ポリケチドシンターゼ系によって産生される生物活性分子を産生させる方法。
【請求項６４】
遺伝的改変が野生型生物に比べて、内因性PKS系によって産生される少なくとも1つの産物を変化させる、請求項63記載の方法。
【請求項６５】
生物が、遺伝的改変のない天然に存在する生物とは異なる多価不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルをもたらす、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
生物活性分子が抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ（Helicobactor pylori）薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤からなる群より選択される、請求項63記載の方法。
【請求項６７】
生物活性分子が抗生物質である、請求項63記載の方法。
【請求項６８】
生物活性分子が多価不飽和脂肪酸(PUFA)である、請求項63記載の方法。
【請求項６９】
生物活性分子がシス配置に炭素-炭素二重結合を含む分子である、請求項63記載の方法。
【請求項７０】
生物活性分子が3個毎の炭素に二重結合を含む分子である、請求項63記載の方法。
【請求項７１】
請求項9記載の少なくとも1つの組換え核酸分子を含むPKS系を発現するよう植物の細胞を遺伝的に改変する段階を含む、天然に存在する植物とは異なる多価不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルを有する植物を作出する方法。
【請求項７２】
請求項9記載の少なくとも1つの組換え核酸分子を発現するよう微生物細胞を遺伝的に改変する段階を含む、組換え微生物を作出する方法。
【請求項７３】
請求項9記載の少なくとも1つの組換え核酸分子を発現する組換え宿主細胞により産生された油分を最終産物に添加する段階を含む、少なくとも1つの脂肪酸を含むよう最終産物を改変する方法。
【請求項７４】
最終産物が栄養補助食品、食品、薬剤、ヒト化畜乳、および調合乳からなる群より選択される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
請求項9記載の少なくとも1つの組換え核酸分子を用いて泌乳動物の泌乳細胞を遺伝的に改変する段階を含む、ヒト化畜乳を産生する方法。
【請求項７６】
PUFA PKSが反復および非反復の両酵素反応を触媒し、PUFA PKS系が
a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン;
c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン;
h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および
i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含み、ならびに
PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生する、
組換え細菌の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系を発現するよう改変されている組換え宿主細胞。
【請求項７７】
PUFA PKS系が以下を含む、請求項76記載の組換え宿主細胞:
a) 1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b) 6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン;
c) 2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d) 1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e) 1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f) 2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g) 1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン;
h) 1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および
i) 1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメイン。
【請求項７８】
PUFA PKS系がシュワネラ・ジャポニカ(Shewanella japonica)およびシュワネラ・オレヤナ(Shewanella olleyana)からなる群より選択される海洋細菌由来のPUFA PKS系である、請求項76記載の組換え宿主細胞。
【請求項７９】
細菌性PUFA PKS系が反復および非反復の両酵素反応を触媒し、細菌性PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生し、かつ細菌性PUFA PKS系が
a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン;
c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン;
h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および
i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含み、ならびに
遺伝的改変がPUFA PKS系の活性に影響を及ぼす、
細菌の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つのタンパク質またはドメインを含む遺伝的に改変された生物。
【請求項８０】
細菌性PUFA PKS系の少なくとも1つのタンパク質またはドメインで組換えによって発現するよう改変されている、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８１】
細菌性PUFA PKS系を組換えによって発現するよう改変されている、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８２】
植物である、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８３】
微生物である、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８４】
細菌性PUFA PKS系が、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナからなる群より選択される海洋細菌由来のPUFA PKS系である、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８５】
生物が、第二の異なるPKS系由来の少なくとも1つのさらなるタンパク質またはドメインを発現する、請求項79記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項８６】
細菌性PUFA PKS系が反復および非反復の両酵素反応を触媒し、細菌性PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生し、かつ細菌性PUFA PKS系が
a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン;
b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン;
c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン;
d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン;
e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン;
f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン;
g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン;
h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および
i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含む、
細菌の(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つのタンパク質または機能ドメインをコードする単離組換え核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌性微生物由来の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系に関する。より詳細には、本発明は、PUFA PKS系をコードする核酸に関し、PUFA PKS系を含むそのタンパク質およびドメインに関し、このようなPUFA PKS系を含む遺伝的に改変された生物に関し、ならびに本明細書において開示されるPUFA PKS系を作出するおよび使用する方法に関する。本発明は同様に、PUFAポリケチドシンターゼ(PKS)系の操作によって種々の多価不飽和脂肪酸(PUFA)に富む脂質を効率的に産生するための遺伝的に改変された植物および微生物ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリケチドシンターゼ(PKS)系は一般に、脂肪酸シンターゼ(FAS)系に関連する酵素複合体として当技術分野において公知であるが、これは高度に改変されて、通常、脂肪酸にほとんど類似性を示さない特殊な産物を産生することが多い。しかしながら、ポリケチドシンターゼ系は、アセチル-CoAおよびマロニル-CoAから多価不飽和脂肪酸(PUFA)を合成できる海洋細菌およびある種の微細藻類に存在することが明らかにされている。シュワネラ(Shewanella)および別の海洋細菌ビブリオ・マリナス(Vibrio marinus)でのPUFA合成のためのPKS経路が米国特許第6,140,486号（特許文献1）に詳細に記載されている。真核生物のスラウストキトリド(Thraustochytrid)シゾキトリウム(Schizochytrium)でのPUFA合成のためのPKS経路は米国特許第6,566,583号（特許文献2）に詳細に記載されている。シゾキトリウムでのPUFA PKS経路に関する完全な構造的記載およびスラウストキトリウム(Thraustochytrium)でのPUFA PKS経路の同定を含め、スラウストキトリアレス(Thraustochytriales)の一員などの真核生物でのPUFA合成のためのPKS経路が、これらの経路の使用に関する詳細を含めて、2002年12月19日付で公開された米国特許出願公開第20020194641号（特許文献3）(2002年4月16日付で出願された米国特許出願第10/124,800号（特許文献4）に対応する)に詳細に記載されている。2004年3月24日付で出願された米国特許出願第10/810,352号（特許文献5）は、スラウストキトリウムでのPUFA PKS経路に関する完全な構造的記載、ならびにこのような系を用いたエイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3) (EPA)およびその他のPUFAの産生に関するさらなる詳細について開示している。
【０００３】
研究者らは、I型(モジュール型または反復型)、II型、およびIII型と通常呼ばれる3つの基本型のうちの1つに分類されると、文献に従来記載されているポリケチドシンターゼ(PKS)系を使用することを試みている。明確にする目的で、I型モジュールPKS系はこれまで単純に「モジュール」PKS系とも呼ばれ、I型反復PKS系はこれまで単純に「I型」PKS系とも呼ばれていたことに留意されたい。II型系は、各々が個別の酵素反応を行う分離可能なタンパク質によって特徴付けられる。これらの酵素は協調的に働いて最終産物を産生しており、この系の各個々の酵素は、通常、最終産物の産生に何度か関与する。この型の系は、植物および細菌に見られる脂肪酸シンターゼ(FAS)系に類似した方法で作動する。I型反復PKS系は、最終産物を産生するため、酵素が反復様式で使われるという点でII型系に類似している。I型反復系は、酵素活性が分離可能なタンパク質に付随する代わり、もっと大きなタンパク質のドメインとして生じるという点でII型とは異なる。この系は、動物および真菌に見られるI型FAS系と類似している。
【０００４】
II型系とは対照的に、I型モジュールPKS系では、各酵素ドメインは最終産物の産生で1度しか使われない。これらのドメインは非常に大きなタンパク質に見られ、各反応の産物はPKSタンパク質の別のドメイン上に移される。さらに、上記のPKS系では、炭素-炭素二重結合が最終産物に組み入れられる場合、これは通常、トランス配置になる。
【０００５】
III型系は最近になって発見され、縮合酵素の植物カルコンシンターゼファミリーに属する。III型PKSはI型およびII型PKS系とは異なり、反復の縮合反応で遊離CoA基質を使用して、通常、複素環の最終産物を産生する。
【０００６】
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、ほとんどの真核生物の膜脂質にとって重要な成分であり(Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40:1(2001)（非特許文献1）; McConn et al., Plant J. 15, 521(1998)（非特許文献2）)、ある種のホルモン分子およびシグナル伝達分子の前駆体である(Heller et al., Drugs 55, 487(1998)（非特許文献3）; Creelman et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355(1997)（非特許文献4）)。わかっているPUFA合成経路は、伸長反応および好気的不飽和化反応による、脂肪酸シンターゼ(FAS)由来の、飽和16:0または18:0脂肪酸のプロセッシングに関与している(略号X:Yは、X個の炭素原子およびY個の二重結合(通常、PUFAではシス)を含むアシル基を示す; PUFAの二重結合の位置は、二重結合の系統的メチレン中断(systematic methylene interruption)を伴う、脂肪酸鎖のメチル炭素(例えば、ω3またはω6)に対して示される) (Sprecher, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2, 135(1999)（非特許文献5）; Parker-Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8284 (2000)（非特許文献6）； Shanklin et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Nol. Biol. 49, 611(1998)（非特許文献7）)。アセチル-CoAから始まるドコサヘキサエン酸(DHA)合成は、約30種の個別の酵素活性、および脂肪酸合成サイクルの4種の反復工程を含む約70種の反応を必要とする。ポリケチドシンターゼ(PKS)は、FASと同じ反応の一部を実行し(Hopwood et al., Annu. Rev. Genet. 24, 37(1990)（非特許文献8）; Bentley et al., Annu. Rev. Microbiol. 53, 411 (1999)（非特許文献9）)、成長する炭素鎖の共有結合部位と同じ小タンパク質(またはドメイン)、アシルキャリヤータンパク質(ACP)を使用する。しかしこれらの酵素系において、FASにおいて認められる還元、脱水および還元の完全なサイクルは、典型的にはトランス配置において多くのケト基およびヒドロキシ基に加え炭素-炭素二重結合を含む、高度に誘導された炭素鎖が生成されるように簡略化されることが多い。PKSの直鎖状産物は、環化され、抗生物質および多くの他の二次産物を含む複雑な生化学的物質を形成することが多い(Hopwood et al., (1990)前記（非特許文献8）; Bentley et al., (1999), 前記（非特許文献9）; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598(1999)（非特許文献10）)。
【０００７】
ドコサヘキサエン酸(DHA; 22:6ω3)およびエイコサペンタエン酸(EPA; 20:5ω3)のような非常に長鎖のPUFAは、数種類の海洋細菌から報告されており、シュワネラ種(Nichols et al., Curr. Op. Biotechnol. 10, 240(1999)（非特許文献11）; Yazawa, Lipids 31, S (1996)（非特許文献12）; DeLong et al., Appl. Environ. Microbiol. 51, 730 (1986)（非特許文献13）)を含む。シュワネラ種株SCRC2738由来のゲノム断片(プラスミドpEPAとしてクローニングした)の分析により、大腸菌(E. coli)におけるEPA生成に必要かつ十分な、合計20 Kbである、5個の読み取り枠(Orf)が同定された(Yazawa, (1996), 前記（非特許文献12）)。予想されたタンパク質ドメインのいくつかは、FAS酵素と相同であるが、他のものは、機能がわかっているタンパク質との相同性は示さなかった。5個のOrf内の少なくとも11個の領域は、推定酵素ドメインとして同定された(Metz et al., Science 293:290-293 (2001)参照（非特許文献14）)。遺伝子データベースの配列と比較する場合、これらの7個は、FASタンパク質よりも、より強力にPKSタンパク質と関連づけられた。この群は、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)、β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)、アシルトランスフェラーゼ(AT)、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ、鎖伸長因子(chain length factor) (または鎖化開始因子(chain initiation factor)) (CLF)および6個のACPドメインの高度に一般的でないクラスター(すなわち、2種よりも多いACPドメインクラスターの存在は、PKSまたはFAS配列においてこれまで報告されていない)をコードしていると推定されるドメインを含んでいた。シュワネラで同定されているPUFA合成のためのPKS経路は、海洋細菌に広く行き渡っている可能性が高い。シュワネラ遺伝子クラスターに高い相同性を有する遺伝子は、フォトバクテリウムプロファンダムで(Photobacterium profundum)(Allen et al., Appli. Environ. Microbiol. 65:1710 (1999)（非特許文献15）)およびモリテラ・マリナ(Moritella marina) (ビブリオ・マリナス(Vibrio marinus)) (米国特許第6,140,486号、前記（特許文献1）、およびTanaka et al., Biotechnol. Lett. 21:939 (1999)（非特許文献16）を参照のこと)で同定されている。
【０００８】
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、栄養学的、薬学的、産業的、およびその他の目的に有用であると考えられている。天然供給源からのおよび化学的合成からの現在のPUFAの供給は、商業ニーズには十分でない。現在主要なPUFA供給源は海水魚からであるが、しかし、魚種資源は減少しつつあり、これは持続可能な資源にはなりえない。さらに、重金属と有毒な有機分子の両方からの汚染が、海水魚に由来する油分での深刻な問題である。油料種子作物に由来する植物油は比較的安価であり、魚油に付随する汚染の問題がない。しかしながら、商業的に開発された植物油に見られるPUFAは典型的には、リノール酸(デルタ9および12位中、2個の二重結合を有する18個の炭素-18:2デルタ9,12)およびリノレン酸(18:3 デルタ9,12,15)に限定される。従来のPUFA合成経路では、中間の鎖長の飽和脂肪酸(脂肪酸シンターゼ(FAS)系の産物)が一連の伸長および不飽和化反応によって修飾される。より飽和しかつ長鎖のPUFAを産生するには、いくつかの個別のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素がリノール酸およびリノレン酸からの脂肪酸合成に必要となるので、EPAおよびドコサヘキサ塩酸(DHA)のようなPUFAを発現するための植物宿主細胞の遺伝子操作には、合成を達成するために、いくつかの個別の酵素の発現が必要になりうる。さらに、このようなPUFAの使用可能量の産生のためには、例えば、基質と競合する酵素の下方制御の遺伝子操作、突然変異誘発などによるより高い酵素活性への遺伝子操作、またはプラスチドオルガネラへの酵素の標的化のような、追加の遺伝子操作の努力が必要であると思われる。従ってこれらの脂肪酸を天然に産生する種からPUFA生合成に関連した遺伝的材料を得て、かつ単独のおよび商業的量のPUFAを産生することができるように操作することができる異種系と組み合わせて単離された材料を発現することは興味深い。
【０００９】
上記の、シュワネラおよびビブリオ・マリナスのような海洋細菌におけるPUFA PKS系の発見(米国特許第6,140,486号（特許文献1）、同章を参照のこと)は、商業的PUFA産生の新たな方法のための供給源をもたらした。しかしながら、今までに同定されているPUFA PKS系を含む海洋細菌は、最終的に商業的なレベルではその実用性を制限する可能性のある限界がある。具体的には、米国特許第6,140,486号（特許文献1）は、これらの海洋細菌PUFA PKS系を使用して、植物を遺伝的に改変できることを開示しているが、この海洋細菌は天然には、冷たい海洋環境で生息しかつ増殖しており、これらの細菌の酵素系は22℃を超えるとうまく機能せず、もっと低い温度で最適に機能することができる。対照的に、PUFA PKS系を用いる遺伝子操作の魅力的な標的である多くの穀物植物は、22℃を超え、40℃よりも高い範囲に及ぶ温度の通常の増殖条件を有する。従って、これらの海洋細菌由来のPUFA PKS系は、通常の増殖条件下での植物発現に容易に順応できるとは予想できない。
【００１０】
特にエイコサペンタエン酸(EPA)の産生に関して、研究者らは微生物を用い、それらを光合成培養と従属栄養培養の両方で増殖させることによりEPAを産生しようと試みてきた。研究者らは同様に、培養条件下で生物の生産性を増大させようとして古典的および直接的な両遺伝学研究法を使用してきた。その他の研究者らは、種々のデサチュラーゼおよびエロンガーゼ酵素をコードする遺伝子の導入により油料種子作物でEPAを産生することを試みてきた。
【００１１】
研究者らは赤色の微細藻類(モノダス(Monodus))、珪藻(例えば、フェオダクティルム(Phaeodactylum)、その他の微細藻類および真菌(例えば、低温で培養されるモルティエレラ(Mortierella))の培養を使用しようと試みてきた。しかしながら、いかなる場合でも、DHAのようなその他の長鎖PUFAに対する既存の商業的微生物産生系に比べて、生産性は低かった。多くの場合、EPAはトリアシルグリセロール(TAG)型ではなくリン脂質(PL)型で主に生じた。従属栄養増殖条件下での微細藻類の生産性は、光合成条件下よりもはるかに高くなりうるので、研究者らは特定の糖輸送体をコードする遺伝子の導入によって栄養転換を試み、達成してきた。しかしながら、新たに獲得された従属栄養性の能力があったとしても、油分という観点での生産性は比較的低いままであった。
【００１２】
上記のように、いくつかの海洋細菌はPUFA (EPAおよびDHA)を産生することが明らかにされている。しかしながら、これらの細菌は顕著な量のTAGを産生しないので、EPAがPL膜型では主に見出される。これらの特定の細菌により産生されるEPAのレベルおよびその増殖特性(上記)によって、EPAの商業的生産のためのその有用性が制限されてしまう。
【００１３】
内因的に産生された脂肪酸の改変によって油料種子作物でEPAを産生するため多くの努力が払われてきた。脂肪酸エロンガーゼおよびデサチュラーゼに対する個々の各種遺伝子を用いたこれらの植物の遺伝的改変によって、顕著なレベルのEPAを含有するだけでなく顕著なレベルのより短鎖かつ不飽和の混合PUFAを含有する葉または種子が産生されている(Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)（非特許文献17）; PCT公開番号WO 04/071467（特許文献6）; Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)（非特許文献18）)。その一方、本明細書において記載される公知のEPA産生 PUFA PKS系は、本質的に純粋なEPAであるPUFAプロファイルをもたらす。
【００１４】
従って、商業的な用途に高い柔軟性を有する他のPUFA PKS系が、および商業的に有用な産生工程で、EPAなどの、所望のPUFAに富んだ多量の脂質(例えば、PLおよびTAG)を効率的に産生する生物系が必要とされている。
【００１５】
【特許文献１】米国特許第6,140,486号
【特許文献２】米国特許第6,566,583号
【特許文献３】米国特許出願20020194641号
【特許文献４】米国特許出願第10/124,800号
【特許文献５】米国特許出願第10/810,352号
【特許文献６】PCT公開番号WO 04/071467
【非特許文献１】Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40:1(2001)
【非特許文献２】McConn et al., Plant J. 15, 521(1998)
【非特許文献３】Heller et al., Drugs 55, 487(1998)
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【非特許文献７】Shanklin et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Nol. Biol. 49, 611(1998)
【非特許文献８】Hopwood et al., Annu. Rev. Genet. 24, 37(1990)
【非特許文献９】Bentley et al., Annu. Rev. Microbiol. 53, 411 (1999)
【非特許文献１０】Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598(1999)
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【非特許文献１４】Metz et al., Science 293:290-293 (2001)参照
【非特許文献１５】Allen et al., Appli. Environ. Microbiol. 65:1710 (1999)
【非特許文献１６】Tanaka et al., Biotechnol. Lett. 21:939 (1999)
【非特許文献１７】Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (2004)
【非特許文献１８】Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (2004)
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
本発明の1つの態様は、全体としてシュワネラ・ジャポニカ(Shewanella japonica)またはシュワネラ・オレヤナ(Shewanella olleyana)由来のPUFA PKSタンパク質およびドメインをコードする単離核酸分子、ならびに生物学的に活性なその相同体および断片に関する。1つの局面では、本発明は以下より選択される核酸配列を含んだ単離核酸分子を含む: (a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列; (b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片をコードする核酸配列; (c) SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:8に少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一であるならびにKS活性、MAT活性、KR活性、ACP活性、および非FabA様デヒドラーゼ活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列; (d) SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:9に少なくとも約60%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一であるおよびAT生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列; (e) SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:10に少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一であるならびにKS活性、CLF活性およびDH活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列; (f) SEQ ID NO:6またはSEQ ID NO:12に少なくとも約60%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一であるおよびPPTase生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列; (g) SEQ ID NO:11に少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一である、またはSEQ ID NO:5に少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一であるおよびER生物活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列。
【００１７】
1つの局面では、上記(b)に記載の断片は以下より選択される:
(a) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約29位から約513位までのSEQ ID NO:2の断片;
(b) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約625位から約943位までのSEQ ID NO:2の断片;
(c) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約1264位から約1889位までのSEQ ID NO:2の断片、およびそのサブドメイン;
(d) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2264位から約2398位までのSEQ ID NO:2の断片;
(e) 非FabA様デヒドラーゼ生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2504位から約2516位までを含むSEQ ID NO:2の断片;
(f) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:3の約378位から約684位までのSEQ ID NO:3の断片;
(g) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約5位から約483位までのSEQ ID NO:4の断片;
(h) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約489位から約771位までのSEQ ID NO:4の断片;
(i) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1428位から約1570位までのSEQ ID NO:4の断片;
(j) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約1881位から約2019位までのSEQ ID NO:4の断片;
(k) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:5の約84位から約497位までのSEQ ID NO:5の断片;
(l) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:6の約40位から約186位までのSEQ ID NO:6の断片;
(m) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約29位から約513位までのSEQ ID NO:8の断片;
(n) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約625位から約943位までのSEQ ID NO:8の断片;
(o) ドメインまたはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約1275位から約1872位までのSEQ ID NO:8の断片、およびそのサブドメイン;
(p) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2240位から約2374位までのSEQ ID NO:8の断片;
(q) 非FabA様デヒドラーゼ活性を有する、SEQ ID NO:8の約2480〜2492位までを含むSEQ ID NO:8の断片;
(r) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:9の約366位から約703位までのSEQ ID NO:9の断片;
(s) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約10位から約488位までのSEQ ID NO:10の断片;
(t) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約502位から約750位までのSEQ ID NO:10の断片;
(u) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1431位から約1573位までのSEQ ID NO:10の断片;
(v) ドメインがDH生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約1882位から約2020位までのSEQ ID NO:10の断片;
(w) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:11の約84位から約497位までのSEQ ID NO:11の断片; ならびに
(x) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:12の約29位から約177位までのSEQ ID NO:12の断片。
【００１８】
同様に本発明に含まれるのは、上記に定義される核酸分子のいずれかに完全に相補的である核酸配列から本質的になる核酸分子である。本発明の1つの局面はさらに、少なくとも1つの発現制御配列に作動可能に連結された、上記に定義される核酸分子のいずれかを含む組換え核酸分子に関する。本発明の別の局面は、そのような組換え核酸分子のいずれかをトランスフェクトされた組換え細胞に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は遺伝的に改変された植物または植物の一部分であって、上記の核酸分子のいずれかによってコードされる、多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なタンパク質またはそのドメインを含むPKS系を組換えによって発現するよう遺伝的に改変された植物に関する。1つの局面では、遺伝的に改変された植物または植物の一部分は、遺伝的改変の結果として、DHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、ω-3))、ARA (エイコサテトラエン酸もしくはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、ω-6もしくはω-3))、および/またはEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3)からなる群より選択される1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。特に好ましい態様では、植物または植物の一部分はDHA、EPA、EPAおよびDHA、ARAおよびDHA、またはARAおよびEPAを産生する。遺伝的に改変された植物は穀物植物、および任意の双子葉植物または単子葉植物を含むことができる。好ましい植物はキャノーラ、大豆、菜種、亜麻仁、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコを含むが、これらに限定されることはない。
【００２０】
本発明の別の態様は遺伝的に改変された微生物であって、上記の単離核酸分子のいずれかを組換えによって発現するよう遺伝的に改変された微生物に関する。1つの局面では、微生物は遺伝的改変の結果として、DHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、ω-3))、ARA (エイコサテトラエン酸もしくはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、ω-6もしくはω-3))、および/またはEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3)からなる群より選択される多価不飽和脂肪酸を産生する。特に好ましい態様では、微生物は遺伝的改変の結果として、DHA、EPA、EPAおよびDHA、ARAおよびDHAまたはARAおよびEPAを産生する。1つの局面では、微生物はシゾキトリウムおよびスラウストキトリウムを含むが、これらに限定されない、スラウストキトリドである。1つの局面では、微生物は細菌である。
【００２１】
1つの局面では、上記の遺伝的に改変された植物または微生物は、以下より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている: (a) SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12からなる群より選択されるアミノ酸配列; ならびに(b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。1つの局面では、植物は、以下より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている: SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、および/またはSEQ ID NO:6。別の局面では、植物または微生物は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、およびSEQ ID NO:6をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている。別の局面では、植物または微生物は、以下より選択される少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている: SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、および/またはSEQ ID NO:12。別の局面では、植物または微生物は、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、およびSEQ ID NO:12をコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている。別の局面では、植物または微生物は、上記の断片のいずれかをコードする少なくとも1つの核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている。
【００２２】
本発明の遺伝的に改変された植物もしくは植物の一部分または微生物の態様の1つの局面では、植物または微生物は、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムを含むが、これらに限定されない、スラウストキトリド由来の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なタンパク質またはドメインを発現するようさらに遺伝的に改変されている。1つの局面では、そのようなタンパク質またはドメインは、以下より選択されるアミノ酸配列を含む: (a) SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、およびSEQ ID NO:18; ならびに(b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。別の局面では、タンパク質またはドメインは、以下より選択されるアミノ酸配列を含む: (a) SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、およびSEQ ID NO:24; ならびに(b) エノイル-ACPレダクターゼ(ER)活性; アシルキャリヤータンパク質(ACP)活性; β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)活性; アシルトランスフェラーゼ(AT)活性; β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性; FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)活性; 非FabA様デヒドラーゼ活性; 鎖伸長因子(CLF)活性; マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)活性; および4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)活性からなる群より選択される少なくとも1つの生物活性を有する(a)のアミノ酸配列のいずれかの断片。
【００２３】
遺伝的に改変された微生物に関連する本発明の態様の1つの局面では、微生物は内因性PUFA PKS系を含む。この局面では、内因性PUFA PKSは、内因性PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインをコードする核酸配列に対しての異なるPKS系の少なくとも1つのドメインをコードする別の単離核酸分子の置換により改変することができる。異なるPKS系は、非細菌性PUFA PKS系、細菌性PUFA PKS系、I型モジュールPKS系、I型反復PKS系、II型PKS系、およびIII型PKS系を含むが、これらに限定されることはない。別の局面では、内因性PUFA PKS系は、内因性PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインをコードする核酸配列に対しての本発明の上記の単離核酸分子のいずれかの置換により遺伝的に改変されている。別の局面では、微生物は、C20単位の合成を指令する、鎖伸長因子、または鎖伸長因子に加えてβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメインをコードする核酸分子を組換えによって発現するよう遺伝的に改変されている。別の局面では、内因性PUFA PKS系は、FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメインをコードするドメインおよびβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)をコードするドメインからなる群より選択される1つのドメインまたは複数のドメインで改変されており、改変によって、改変のない場合に比べPUFA PKS系によって産生される長鎖脂肪酸の比率が変えられる。そのような改変は、内因性PUFA PKS系のFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)に対する異性化活性を保有しないDHドメインの置換を含むことができる。そのような改変は同様に、ドメインの全部または一部の欠失、ドメインに対しての異なる生物由来の相同ドメインの置換、およびドメインの突然変異を含むことができる。1つの局面では、内因性PUFA PKS系は、エノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメインで改変されており、改変によって、改変のない場合に比べ異なる化合物の産生がもたらされる。この局面では、そのような改変はERドメインの全部または一部の欠失、ERドメインに対しての異なる生物由来のERドメインの置換、およびERドメインの突然変異を含むことができる。
【００２４】
本発明の別の態様は、生物活性分子を産生させるのに効果的な条件の下で、上記の遺伝的に改変された植物を増殖させる段階を含む、ポリケチドシンターゼ系によって産生される生物活性分子を産生させる方法に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、生物活性分子を産生させるのに効果的な条件の下で、上記の遺伝的に改変された微生物を培養する段階を含む、ポリケチドシンターゼ系によって産生される生物活性分子を産生させる方法に関する。
【００２６】
真上の2つの態様のうちのいずれかにおいて、1つの局面では、遺伝的改変は野生型生物に比べて、内因性PKS系によって産生される少なくとも1つの産物を変化させる。別の局面では、生物は、遺伝的改変のない天然に存在する生物とは異なる多価不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルをもたらす。1つの局面では、生物活性分子は以下より選択される: 抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ（Helicobactor pylori）薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤。別の局面では、生物活性分子は抗生物質である。別の局面では、生物活性分子は多価不飽和脂肪酸(PUFA)である。別の局面では、生物活性分子はシス配置に炭素-炭素二重結合を含む分子である。別の局面では、生物活性分子は3個毎の炭素に二重結合を含む分子である。
【００２７】
本発明の別の態様は、上記の本発明の少なくとも1つの組換え核酸分子を含むPKS系を発現するよう植物の細胞を遺伝的に改変する段階を含む、天然に存在する植物とは異なる多価不飽和脂肪酸(PUFA)プロファイルを有する植物を作出する方法に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、上記の本発明の少なくとも1つの組換え核酸分子を発現するよう微生物細胞を遺伝的に改変する段階を含む、組換え微生物を作出する方法に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、上記の本発明の少なくとも1つの組換え核酸分子を発現する組換え宿主細胞により産生された油分を最終産物に添加する段階を含む、少なくとも1つの脂肪酸を含むよう最終産物を改変する方法に関する。例えば、最終産物は栄養補助食品、食品、薬剤、ヒト化畜乳、および調合乳を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【００３０】
本発明の別の態様は、上記の本発明の少なくとも1つの組換え核酸分子を用いて泌乳動物の泌乳細胞を遺伝的に改変する段階を含む、ヒト化畜乳を産生する方法に関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、PUFA PKSが反復および非反復の両酵素反応を触媒し、PUFA PKS系が、(a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン; (c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; (h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および(i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含む、組換え細菌の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系を発現するよう改変されている組換え宿主細胞に関する。PUFA PKS系は少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生する。1つの局面では、PUFA PKS系は、(a) 1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン; (c) 2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; (h) 1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および(i) 1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含む。1つの局面では、PUFA PKS系は、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナからなる群より選択される海洋細菌由来のPUFA PKS系である。
【００３２】
本発明の別の態様は、細菌性PUFA PKS系が反復および非反復の両酵素反応を触媒し、細菌性PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生し、かつ細菌性PUFA PKS系が、(a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン; (c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; (h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および(i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含む、細菌の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つのタンパク質またはドメインを含む遺伝的に改変された生物に関する。遺伝的改変はPUFA PKS系の活性に影響を及ぼす。1つの局面では、生物は、細菌性PUFA PKS系の少なくとも1つのタンパク質またはドメインで組換えによって発現するよう改変されている。別の局面では、生物は、細菌性PUFA PKS系を組換えによって発現するよう改変されている。生物は植物または微生物を含むことができる。1つの局面では、細菌性PUFA PKS系は、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナからなる群より選択される海洋細菌由来のPUFA PKS系である。別の局面では、生物は、第二の異なるPKS系由来の少なくとも1つのさらなるタンパク質またはドメインを発現する。
【００３３】
本発明の別の態様は、細菌性PUFA PKS系が反復および非反復の両酵素反応を触媒し、細菌性PUFA PKS系が少なくとも約25℃の温度でPUFAを産生し、かつ細菌性PUFA PKS系が、(a) 少なくとも1つのエノイルACP-レダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン; (c) 少なくとも2つのβ-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのケトレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; (h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および(i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含む、細菌性(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つのタンパク質または機能ドメインをコードする単離組換え核酸分子に関する。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は全体として、EPAを天然に産生するならびに約30℃までの温度でおよび場合によりさらに高い(例えば、35℃までのまたはそれを超える)温度で十分に増殖する海洋細菌のサブセット由来の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系に関し、このようなPUFA PKS系を含む遺伝的に改変された生物に関し、生物活性分子、具体的には、DHA、DPAおよびEPAなどのPUFAを含め、対象とする産物の産生のためにそのような系を作出するおよび使用する方法に関する。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、PUFA PKS系(PUFAシンターゼ系と呼ばれることもある)は、一般的に以下の同定的な性質を有する: (1) 系の天然産物としてPUFAを産生する性質; ならびに(2) 選択されたサイクルにおけるトランス-シス異性化およびエノイル還元反応を含む、脂肪酸鎖の反復性処理と非反復性処理との両方を行う複合体へと構築した数個の多機能性タンパク質を含む性質。PUFA PKS系への言及は、生物においてPUFAを産生するよう複合体中で働く遺伝子およびそのコードされる産物の全てのことをまとめて指す。従って、PUFA PKS系は、天然産物がPUFAであるPSK系のことを具体的に指す。
【００３６】
より具体的には、第一に、本発明の基礎を形成しているPUFA PKS系は、産物として多価不飽和脂肪酸(PUFA)を産生する(すなわち、そのようなPKS系を内因的に(自然に)含む生物がこの系を用いてPUFAを産生する)。本明細書で言及されるPUFAは、好ましくは少なくとも16個の炭素、好ましくは少なくとも18個の炭素、より好ましくは少なくとも20個の炭素、およびさらにより好ましくは22個またはそれ以上の炭素の炭素鎖長で、少なくとも3個またはそれ以上の二重結合、好ましくは4個またはそれ以上、より好ましくは5個またはそれ以上、およびさらにより好ましくは6個またはそれ以上の二重結合を有し、すべての二重結合がシス配置である多価不飽和脂肪酸である。望ましい鎖長の望ましい二重結合数をもつ多価不飽和脂肪酸を産生する最終産物、PKS系の遺伝子操作または操作を発見または作製することが本発明の目的である。PUFAの例としてはDHA (ドコサヘキサエン酸(C22:6、ω-3))、ARA (エイコサテトラエン酸もしくはアラキドン酸(C20:4、n-6))、DPA (ドコサペンタエン酸(C22:5、ω-6もしくはω-3))、およびEPA (エイコサペンタエン酸(C20:5、ω-3))が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３７】
第二に、本明細書に記載されるPUFA PKS系は、反復性および非反復性の反応の両方を組み入れており、その系を以前に記載されたPKS系(例えば、I型モジュールもしくは反復、II型またはIII型)と一般に区別している。より詳細には、本明細書に記載されるPUFA PKS系は、各サイクル間に機能すると思われるドメイン、加えてそのサイクルのいくつかのみの間に機能すると思われるドメインを含む。この機能性の鍵となる局面は、細菌のFab A酵素と相同性を示すドメインに関連している可能性がある。例えば、大腸菌のFab A酵素は、2つの酵素活性をもつことが示された。それは、水分子(H2O)がヒドロキシ基を含む炭素鎖から除去され、その炭素鎖にトランス二重結合を残す脱水活性をもつ。さらに、それは、そのトランス二重結合がシス配置へ転換されるイソメラーゼ活性をもつ。この異性化は、その二重結合位置の隣接する炭素への移動と組み合わせて完成される。PKS (およびFAS)系において、主炭素鎖は、炭素2個の増加で伸長される。それゆえ、これらのPKS系のPUFA産物を産生するために必要とされる伸長反応の数を予測することができる。例えば、DHA (C22:6、すべてシス)を産生するには、10回の伸長反応が必要になる。最終産物には二重結合が6個しか存在していないので、ある反応サイクルの間では、二重結合が維持され(シス異性体として)、その他では、その二重結合が次の伸長の前に還元されている。
【００３８】
海洋細菌におけるPUFA PKS系の発見(米国特許第6,140,486号を参照のこと)の前には、PKS系が反復性および選択性の酵素反応のこの組合せをもつことは知られておらず、それらは、シス配置で炭素-炭素二重結合を形成することができると考えられていなかった。しかしながら、本発明により記載されるPUFA PKS系は、シス二重結合を導入する能力、およびサイクルの反応順序を変える能力を有している。
【００３９】
本発明者らは、PUFA PKS系のこれらの特徴を用いて、以前に記載された(I型反復もしくはモジュール、II型、またはIII型)PKS系によって産生されることができなかった一連の生物活性分子を産生することを提案する。これらの生物活性分子は、限定されるものではないが、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、抗生物質または他の生物活性化合物を含み、それらの多くを下記で考察する。例えば、本明細書で記載されるPUFA PKS遺伝子構造の知識を用いて、多数の方法のいずれかを、そのPUFA PKS遺伝子を改変する、または他のPKS系を含む他の合成系とこれらの遺伝子の部分を結合して、新規の産物が産生されるように用いる。反復性および選択性の両方の反応を行うこの特有なタイプの系に本来備わっている能力は、類似の方法をその他のタイプのPKS系に適用した場合に見出すことができなかった産物を、この系がもたらすことを可能にすると考えられる。
【００４０】
前記の米国特許出願第10/810,352号において、本発明者らは、PUFA PKS遺伝子の供給源として用いるのに特に適した2つの例示的な海洋細菌(例えば、シュワネラ・オレヤナおよびシュワネラ・ジャポニカ)を同定した。というのは、それらが、シュワネラの範囲内のその他の種および菌株を含めて、典型的にPUFAを産生し、はるかに低い温度で増殖する、既報のPUFA PKSを含有する海洋細菌とは対照的に、PUFA (例えば、EPA)を産生し、約30℃までの温度で増殖しうるという驚くべき特徴を有するからである。本発明者らは今回、シュワネラ・オレヤナ(Australian Collection of Antarctic Microorganisms (ACAM)菌株番号644; Skerratt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 52, 2101 (2002))およびシュワネラ・ジャポニカ(American Type Culture Collection (ATCC)菌株番号BAA-316; Ivanova et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1027 (2001))のそれぞれにおいてPUFA PKS読み取り枠(Orf)の全ての完全長ゲノム配列をクローニングし、配列決定し、これらの特殊な海洋細菌中のPUFA PKS系を含むドメインを同定した。従って、本発明は、商業的な用途に対して柔軟性を有するさらなるPUFA PKS系を提供するという上記の問題を解決する。
【００４１】
本発明のPUFA PKS系は同様に、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムなどのスラウストキトリアレス目の一員を含む、真核生物においてPUFAを産生するポリケチドシンターゼ様の系の操作による、PUFAに富んだ脂質をその各種形態(例えば、トリアシルグリセロール(TAG)およびリン脂質(PL))の1つまたは複数で効率的に産生する方法および遺伝的に改変された微生物の本発明者らの開発により、EPAなどの、所望のPUFAに富んだ商業的に価値のある脂質の産生に関する上記の問題を解決するための戦略の中で一手段として使用することができる。具体的には、および一例として、本発明者らは本明細書のなかで、以前には、PUFA、主にドコサヘキサエン酸(DHA; C22:6 n-3)およびドコサペンタエン酸(DPA; C22:5 n-6)に富んだ油分の商業的産生のために最適化されたシゾキトリウム菌株であって、今回は、生物の油分生産性の特徴を犠牲にすることなく、EPA (C20:5 n-3)産生(またはその他のPUFA産生)がDHA産生に置き換わるように遺伝的に改変されうるその菌株について記載する。1つの態様では、本発明において記載される海洋細菌由来の海洋細菌PUFA PKS遺伝子を用いて、そのような遺伝的に改変された微生物を作出することができる。これは本発明によって包含される技術の単なる一例にすぎない。以下に詳細に記載されるように本発明の概念はその他の産生用生物およびその他の所望のPUFAに容易に適合させることができるからである。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「脂質」という用語はリン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセリド、フォスファチド、ステロールおよびステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル(例えば、オキシカロテノイド)、炭化水素、ならびに当業者に公知の他の脂質を含む。「多価不飽和脂肪酸」および「PUFA」という用語は、遊離脂肪酸型だけでなく、TAG型およびPL型などの、その他の型も同様に含む。
【００４３】
1つの態様では、本発明によるPUFA PKS系は、少なくとも以下の生物学的に活性なドメインを含む: (a) 少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 少なくとも6つのアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン; (c) 少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; および(h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン。PUFA PKS系は同様に、少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメインを含み、このようなドメインはPUFA PKS系の一部分またはPUFA PKS系に対する付属のドメインもしくはタンパク質であると考えることができる。1つの態様では、本発明によるPUFA PKS系は同様に、デヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフを含有する少なくとも1つの領域を含む。これらのドメインおよびモチーフの機能は、一般的に、個々に、当技術分野において公知であり、本発明のPUFA PKS系に関連して以下に詳細に記載される。本発明のドメインは単一のタンパク質(すなわち、ドメインおよびタンパク質は同義語である)としてまたは単一のタンパク質中の2つまたはそれ以上(複数)のドメインの1つとして見出すことができる。これらのシュワネラ種におけるPUFA PKS系のドメイン構造は、以下にさらに詳細に記載されており、図2に図解されている。
【００４４】
別の態様では、PUFA PKS系は、少なくとも以下の生物学的に活性なドメインを含む: (a) 少なくとも1つのエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン; (b) 複数のアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン(少なくとも1つから4つ、好ましくは少なくとも5つ、より好ましくは少なくとも6つ、さらにより好ましくは7つ、8つ、9つまたはそれ以上); (c) 少なくとも2つのβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン; (d) 少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン; (e) 少なくとも1つのβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン; (f) 少なくとも2つのFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン; (g) 少なくとも1つの鎖伸長因子(CLF)ドメイン; (h) 少なくとも1つのマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン; および(i) 少なくとも1つの4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)ドメイン。1つの態様では、本発明によるPUFA PKS系は同様に、デヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフを含有する少なくとも1つの領域を含む。
【００４５】
本発明によれば、β-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)生物活性(機能)を有するドメインまたはタンパク質は、FAS(およびPKS)伸長反応サイクルの初期段階を行う酵素として特徴付けられる。「β-ケトアシル-ACPシンターゼ」という用語は、「3-ケトアシル-ACPシンターゼ」、「β-ケト・アシル-ACPシンターゼ」および「ケト-アシルACPシンターゼ」という用語、ならびに類似の派生語と同義的に用いることができる。伸長のために予定されているアシル基は、チオエステル結合によりその酵素の活性部位でのシステイン残基に連結されている。多段階反応において、アシル-酵素は、マロニル-ACPとの縮合を受けて、-ケトアシル-ACP、CO2および遊離の酵素を形成する。KSは、伸長サイクルにおいて鍵となる役割を果たし、多くの系において、反応サイクルの他の酵素より強い基質特異性をもっていることが示された。例えば、大腸菌は3つの別個のKS酵素を有する。それぞれ、その生物の生理機能においてそれ自身特定の役割をもつ(Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57, 522 (1993))。本明細書において記載されるPUFA-PKS系の2つのKSドメインは、PUFA生合成反応順序において別個の役割を持つことができる。
【００４６】
酵素の種類として、KS類は十分に特徴付けされてきた。多くの実証されたKS遺伝子の配列は知られており、その活性部位モチーフは同定され、いくつかの結晶構造が決定された。タンパク質(またはタンパク質のドメイン)は、既知のKS配列との相同性により酵素のKSファミリーに属するとして容易に同定されうる。
【００４７】
本発明によれば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)生物活性(機能)をもつドメインまたはタンパク質は、マロニル部分をマロニル-CoAからACPへ転移するものとして特徴付けられる。「マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ」という用語は、「マロニルアシルトランスフェラーゼ」および類似の派生語と同義的に用いることができる。活性部位モチーフ(GxSxG)に加えて、これらの酵素は、それらをMAT酵素と同定する(以下に記載されるATドメインと対比して)拡張モチーフ(extended motif) (鍵となる位置でのRおよびQアミノ酸)を有する。いくつかのPKS系(しかし、PUFA PKSドメインではない)において、MATドメインは、優先的に、メチル-マロネートまたはエチル-マロネートをACP群へと(対応するCoAエステルから)載せ、それにより、直鎖状炭素鎖へ分枝を導入する。MATドメインは、公知のMAT配列とのそれらの相同性およびそれらの拡張モチーフ構造により認識されうる。
【００４８】
本発明によれば、アシルキャリヤータンパク質(ACP)生物活性(機能)をもつドメインまたはタンパク質は、そのタンパク質の共有結合的に結合している補因子へのチオエステル結合を介して脂肪アシル鎖を伸ばすための担体として機能する、低分子ポリペプチド(典型的には、80個〜100個のアミノ酸長)として特徴付けられる。これらのポリペプチドは、単独のユニットとして、またはより大きなタンパク質内のドメインとして生じる。ACPは、ACPの高度に保存されたセリン残基へのCoAのホスホパンテテイニル部分の転移により、不活性のアポ型から機能するホロ型へと変換される。アシル基は、そのホスホパンテテイニル部分の遊離末端でチオエステル結合によりACPに付着される。ACPは、放射性パンテテインでの標識化および公知のACPとの配列相同性により同定されうる。活性部位モチーフ(LGIDS*; 例えば、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号1296-1300を参照のこと)の変異の存在もまた、ACPのシグナチャーである。
【００４９】
本発明によれば、β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)活性をもつドメインまたはタンパク質は、ACPの3-ケトアシル型のピリジン-ヌクレオチド-依存性還元を触媒するものとして特徴付けられる。「β-ケトアシル-ACPレダクターゼ」という用語は、「ケトレダクターゼ」、「3-ケトアシル-ACPレダクターゼ」、「ケト-アシルACPレダクターゼ」という用語およびその用語の類似の派生語と同義的に用いることができる。それは、新規な脂肪酸生合成伸長サイクルおよびポリケチド生合成においてしばしば行われる反応における最初の還元段階である。有意な配列類似性は、エノイルACPレダクターゼ(ER)の1ファミリー、FASの他のレダクターゼ(しかし、PUFA PKS系に存在するERファミリーではない)、および短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーで観察される。上記で示されているPUFA PKS領域のPfam解析は、そのコア領域における短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーとの相同性を明らかにすることができる。同じ領域のBlast解析は、公知のKR酵素とのコア域における整合、および他の特徴付けられたPUFA PKS系由来のドメインと相同性の拡張された領域を明らかにすることができる。
【００５０】
本発明によれば、以下の原理に基づくドメインまたはタンパク質は、鎖伸長因子(CLF)と呼ばれる。CLFは、当初は、II型(解離した酵素)PKS系の特性として記載され、伸長サイクルの数を決定する、ゆえに最終産物の鎖長を決定するにおいて役割を果たしているものと仮定された。CLFアミノ酸配列は、KSドメインと相同性を示すが(かつ、KSタンパク質とヘテロ二量体を形成すると考えられた)、それらは活性部位システインを欠如している。PKS系におけるCLFの役割は議論の余地があった。証拠(C. Bisang et al., Nature 401, 502 (1999))より、PKS系をプライミングする(伸長させるための最初のアシル基を供給することで)における役割が示唆されている。この役割において、CLFドメインは、マロネート(マロニル-ACPのような)からカルボキシル基を除去し、このようにKS活性部位へ転移されうる酢酸基を形成すると考えられる。それゆえ、この酢酸基は、最初の伸長(縮合)反応を受けうる「プライミング(priming)」分子として作用する。II型CLFの相同体は、いくつかのI型モジュールPKS系において「ローディング(loading)」ドメインとして同定された。しかしながら、その他の最近の証拠から、鎖長の決定にCLFドメインが果たす真の役割が示唆されている(Yi et al., J. Am. Chem. Soc. 125:12708 (2003))。CLFの配列特徴をもつドメインは、現在同定されているPUFA PKS系のすべてにおいて見出され、各場合においては、多領域タンパク質の一部として見出される。
【００５１】
「アシルトランスフェラーゼ」または「AT」への言及は、多数の別個のアシル転移反応を行うことができる酵素の一般的クラスを指す。「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、「アシル・トランスフェラーゼ」と同義的に用いることができる。シゾキトリウムドメインは、現在調べられている他のPUFA PKS系のすべてに存在するドメインと十分な相同性を示し、その特定の機能が同定されたいくつかのアシルトランスフェラーゼ(例えば、マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ、MAT)と非常に弱い相同性を示す。MATとその弱い相同性があるにもかかわらず、このATドメインは、それがそのような酵素に特有な拡張モチーフ構造をもたないことから、MATとして機能することが考えられない(上記のMATドメインの記載を参照)。この開示を目的として、PUFA PKS系におけるATドメインの機能は、限定されるものではないが、以下のものを含む: OrfA ACPドメインから水への脂肪アシル基の転移(すなわち、チオエステラーゼ-脂肪アシル基を遊離脂肪酸として放出すること)、CoAのようなアクセプターへの脂肪アシル基の転移、様々なACPドメイン中のアシル基の転移、または脂肪親和性アクセプター分子(例えば、リゾホスファチジン酸)への脂肪アシル基の転移。
【００５２】
本発明によれば、エノイル-ACPレダクターゼ(ER)生物活性を有するタンパク質またはドメインは、脂肪アシル-ACPにおけるトランス二重結合(DH活性により導入された)を還元し、結果として、それらの炭素を完全に飽和することになる。PUFA-PKS系におけるそのERドメインは、ER酵素の新しく特徴付けられたファミリーと相同性を示す(Heath et al., Nature 406, 145 (2000))。本発明によれば、「エノイル-ACPレダクターゼ」という用語は、「エノイルレダクターゼ」、「エノイルACP-レダクターゼ」および「エノイルアシル-ACPレダクターゼ」と同義的に用いることができる。HeathおよびRockは、ER酵素のこの新しいクラスを、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)から対象となる遺伝子をクローニングし、その遺伝子から発現されたタンパク質を精製し、かつインビトロのアッセイ法においてそれがER活性をもっていることを示すことにより、同定した。本明細書において記載される細菌PUFA PKS系は、1つのERドメインを含む。
【００５３】
本発明によれば、デヒドラーゼまたはデヒドラターゼ(DH)活性を有するタンパク質またはドメインは脱水反応を触媒する。本明細書で一般に用いられる場合、DH活性への言及は、通常、FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性のことを指す。FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性は、β-ケトアシル-ACPからHOHを除去し、炭素鎖にトランス二重結合を最初にもたらす。「FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」という用語は、「FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ」、「β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ」、「デヒドラーゼ」という用語および類似の派生語と同義的に用いることができる。PUFA PKS系のDHドメインは、そのFAS系と関連する細菌DH酵素に対して(その他のPKS系のDHドメインに対してよりも)相同性を示す。一部の細菌DHのもの、FabA様DHのものは、シス-トランスイソメラーゼ活性を保有する(Heath et al., J Biol. Chem., 271, 27795 (1996))。これはFabA様DHタンパク質に対する相同性であり、本明細書において記載されるDHドメインの一つまたは全てがPUFA PKS産物におけるシス二重結合の挿入に関与することを示唆する。
【００５４】
本発明のタンパク質は同様に、非FabA様DH活性、または非FabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)生物活性と本明細書において総称される、Fab様(例えば、上記のシス-トランス活性はFab様活性と関連する)と特徴付けられないデヒドラターゼ活性を有することができる。より具体的には、保存活性部位モチーフ(約13アミノ酸長: L*xxHxxxGxxxxP; SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2504-2516; *このモチーフでは、LをIとすることもできる)が、PKS系におけるデヒドラターゼドメインに見出される(Donadio S, Katz L. Gene. 1992 Feb 1;111(1):51-60)。本明細書においてデヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフまたはDHモチーフとも称される、この保存モチーフは、これまでに記載されている全ての公知のPUFA-PKS配列の類似領域に見出され、本明細書において記載されるPUFA PKS配列(例えば、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2504-2516、またはSEQ ID NO:8のアミノ酸番号2480-2492)に見出されるが、このモチーフは本発明まで、以前には未検出であったと考えられる。この保存モチーフは、PUFA-PKS配列中の未同定の高相同性領域内にある。PUFA-PKSを介したPUFAの提唱される生合成では、非FabA様の脱水が必要となり、このモチーフはその反応に関与することができる。
【００５５】
本発明によれば、4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)生物活性(機能)を有するドメインまたはタンパク質は、4'-ホスホパンテテイニル部分をコエンザイムAからアシルキャリヤータンパク質(ACP)に転移する酵素と特徴付けられる。ACPの不変セリン残基へのこの転移は、不活性なアポ型をホロ型に活性化する。ポリケチドと脂肪酸の両合成において、ホスホパンテテイン基は、成長中のアシル鎖とチオエステルを形成する。PPTaseは、脂肪酸合成、ポリケチド合成、および非リボソームペプチド合成において十分に特徴付けられている酵素のファミリーである。多くのPPTaseの配列が知られており、活性にとって重要なアミノ酸残基の突然変異分析(Mofid MR, Finking R, Essen LO, Marahiel MA. 「Structure-based mutational analysis of the 4'-phosphopantetheinyl transferases Sfp from Bacillus subtilis: carrier protein recognition and reaction mechanism」 Biochemistry. 2004 Apr 13;43(14):4128-36)に加えて結晶構造も決定されている(例えば、Reuter K, Mofid MR, Marahiel MA, Ficner R. 「Crystal structure of the surfactin synthetase-activating enzyme sfp: a prototype of the 4'-phosphopantetheinyl transferase superfamily」 EMBO J. 1999 Dec 1;18(23):6823-31)。これらの不変かつ高度に保存された、PPTase中のアミノ酸は、本明細書に記載される両シュワネラ菌株由来のpfaE ORFの範囲内に含まれる。さらに、シュワネラ種SCRC-2738のorf2におけるpfaE ORF相同体が天然菌株での活性に必要であることが明らかにされており(Yazawa K. 「Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria」. Lipids. 1996 Mar;31 Suppl:S297-300.)、標識実験によってそのPPTase活性が確認されている(WO 98/55625)。
【００５６】
PUFAを産生するならびに約25〜30℃までの温度で、および場合によりさらに高い温度(例えば、35℃)で十分に増殖する特定の海洋細菌(例えば、シュワネラ・オレヤナおよびシュワネラ・ジャポニカ)のPUFA PKS系は本発明の中心となるが、本発明は、例えば、米国特許第6,140,486号、米国特許第6,566,583号、米国特許出願第10/124,800号、および米国特許出願第10/810,352号に記載されているその他の細菌性および非細菌性PUFA PKS系由来のドメインと併せてこれらの細菌性PUFA PKS系由来のドメインを使用することを実際に企図する。より詳細には、本発明のPUFA PKS系をその他のPUFA PKS系とともに用いて、ハイブリッド構築体ならびに遺伝学的に改変された微生物および植物を、このような微生物および植物による生物学的産物の産生の向上およびまたは改変を目的に作出することができる。例えば、本発明によれば、非細菌性PUFA PKS機能ドメインを細菌性PUFA PKS機能ドメイン(好ましくは本発明のもの)、およびその他のPKS系(I型、II型、III型)またはFAS系由来のPKS機能ドメインまたはタンパク質とともに組み入れた遺伝学的改変生物を作出することができる。
【００５７】
本明細書において「非細菌性PUFA PKS系」への言及は、真核生物または古細菌などの、細菌ではない生物から単離されたPUFA PKS系、または細菌ではない生物由来のPUFA PKS系の相同体である、もしくはその系から派生するPUFA PKS系への言及である。真核生物は細胞の分化の程度に基づいて原核生物から区別され、その結果、真核生物はより高度に分化した細胞を有し、原核生物はあまり分化していない細胞を有する。一般的に、原核生物は核膜をもたず、細胞分裂の間有糸分裂を示さず、ただ1つの染色体を有し、それらの細胞質は70Sリボソームを含み、それらはミトコンドリア、小胞体、葉緑体、リソソームまたはゴルジ体を有さず、それらの鞭毛(存在する場合)は、単一の原線維からなっている。対照的に、真核生物は、核膜をもつ、それらは細胞分裂の間、有糸分裂を示す、それらは多くの染色体を有する、それらの細胞質は80Sリボソームを含む、それらはミトコンドリア、小胞体、葉緑体(藻類において)、リソソームおよびゴルジ体をもっている、およびそれらの鞭毛(存在する場合)は、多くの原線維からなる。一般的に、細菌は原核生物であり、一方、藻類、真菌類、原生生物、原生動物および高等植物は真核生物である。
【００５８】
非細菌性PUFA PKS系は上記の特許および出願に記載されているものを含み、詳しくは任意のスラウストキトリドから単離されるまたは得られる任意のPUFA PKS系を含む。米国特許第6,566,583号では、シュワネラ種菌株SCRC2738のPKS遺伝子に相同性を示すシゾキトリウム由来のいくつかのcDNAクローンが配列決定され、種々のクローンが2つの部分的な読み取り枠と1つの完全な読み取り枠に相当する核酸配列に構築された。本発明者らによるcDNAおよびゲノムクローンのさらなる配列決定により、シゾキトリウムでのOrfA、OrfBおよびOrfCのそれぞれの完全長のゲノム配列の同定ならびにシュワネラでのものに相同性を有するシゾキトリウムでのドメインの完全な同定が可能になった。これらの遺伝子は米国特許出願第10/124,800号、前記に詳細に記載されており、以下に少し詳しく記載される。同様に、米国特許出願第10/810,352号には、スラウストキトリウム(具体的には、スラウストキトリウム種23B (ATCC 20892))でのPUFA PKS系をコードする遺伝子の完全長のゲノム配列およびスラウストキトリウムでのPUFA PKS系を含むドメインが詳細に記載されている。
【００５９】
本発明によれば、「読み取り枠」という語句は「Orf」という略語で示される。読み取り枠によりコードされるタンパク質を「ORF」として全て大文字で示すこともでき、読み取り枠に対する核酸配列を「orf」として全て小文字で示すこともできるが、一貫性のため、「Orf」という綴りを本明細書では優先的に用いて、核酸配列またはそれによりコードされるタンパク質のいずれかを記載することに留意されたい。タンパク質または核酸配列が参照されているかどうかは、この用語が使われる文脈から明らかであると思われる。
【００６０】
図1はシュワネラ・ジャポニカ(コスミド3F3)およびシュワネラ・オレヤナ(コスミド9A10)由来の本発明の遺伝子クラスターと対比してシュワネラ種SCRC-2738 (「Yazawa」菌株; Yazawa K. 「Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria」 Lipids. 1996 Mar;31 Suppl:S297-300.)由来のPUFA PKS (「EPA産生」とも称される)クラスターの構造を示す。図2はシュワネラ・ジャポニカ(コスミド3F3)およびシュワネラ・オレヤナ(コスミド9A10)由来の遺伝子クラスターによりコードされるものと対比してシュワネラ種SCRC-2738 (「Yazawa」菌株)由来のPUFA PKS遺伝子クラスターのドメイン構造を示す。各読み取り枠のドメイン構造を以下に記載する。
【００６１】
シュワネラ・ジャポニカPUFA PKS
SEQ ID NO:1はシュワネラ・ジャポニカのコスミド3F3に対するヌクレオチド配列であり、表1に詳載されるように15個のORFを含むことが見出されている(実施例2を参照のこと)。この微生物でのPUFA PKS系に関連するORFは以下のように特徴付けられる。
【００６２】
pfaA (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号10491-18854)はPFAS A (SEQ ID NO:2)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: β-ケトアシル-シンターゼ(KS) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号10575-12029、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号29-513); マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号12366-13319、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号625-943); 6つのタンデムなアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン(SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号14280-16157、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号1264-1889); β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号17280-17684、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2264-2398); および本明細書においてDH-モチーフ領域と称される、デヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2504-2516)を含有するSEQ ID NO:2のアミノ酸番号2399と2787との間のPFAS Aタンパク質の領域。
【００６３】
PFAS Aでは、KS活性部位DXAC＊はSEQ ID NO:2のアミノ酸番号226-229に位置し、C＊がアシル付着の部位である。MAT活性部位GHS＊XGはSEQ ID NO:2のアミノ酸番号721-725に位置し、S＊がアシル結合部位である。LGXDS＊のACP活性部位は次の位置、SEQ ID NO:2のアミノ酸番号1296-1300、アミノ酸番号1402-1406、アミノ酸番号1513-1517、アミノ酸番号1614-1618、アミノ酸番号1728-1732、およびアミノ酸番号1843-1847に位置し、S＊がホスホパンテテイン付着部位である。SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2399と2787との間に、PFAS Aは同様に、上記に参照されるデヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO:2のアミノ酸番号2504-2516)を含む。
【００６４】
pfaB (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号18851-21130)はPFAS B (SEQ ID NO:3)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: アシルトランスフェラーゼ(AT) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号19982-20902、SEQ ID NO:3のアミノ酸番号378-684)。
【００６５】
PFAS Bでは、活性部位GXS＊XGモチーフはSEQ ID NO:3のアミノ酸番号463-467に位置し、S＊がアシル付着の部位である。
【００６６】
pfaC (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号21127-27186)はPFAS C (SEQ ID NO:4)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: KS (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号21139-22575、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号5-483); 鎖伸長因子(CLF) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号22591-23439、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号489-771); ならびにDH1 (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号25408-25836、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号1428-1570)およびDH2 (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号26767-27183、SEQ ID NO:4のアミノ酸番号1881-2019)と称される、2つのFabA 3-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ。
【００６７】
PFAS Cでは、KS活性部位DXAC＊はSEQ ID NO:4のアミノ酸番号211-214に位置し、C＊がアシル付着の部位である。
【００６８】
pfaD (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号27197-28825)はPFAS D (SEQ ID NO:5)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: エノイルレダクターゼ(ER) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号27446-28687、SEQ ID NO:5のアミノ酸番号84-497)。
【００６９】
pfaE (逆相補上のSEQ ID NO:1のヌクレオチド番号6150-7061)はPFAS E (SEQ ID NO:6)、すなわち同定済みのドメインを有する4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)をコードする(SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号6504-6944、SEQ ID NO:6のアミノ酸番号40-186)。
【００７０】
シュワネラ・オレヤナPUFA PKS
SEQ ID NO:7はシュワネラ・オレヤナのコスミド9A10に対するヌクレオチド配列であり、表2に詳載されるように17個のORFを含むことが見出された(実施例2を参照のこと)。この微生物でのPUFA PKS系に関連するORFは以下のように特徴付けられる。
【００７１】
pfaA (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号17437-25743)はPFAS A (SEQ ID NO:8)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: β-ケトアシル-シンターゼ(KS) (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号17521-18975、SEQ ID NO:8のアミノ酸番号29-513); マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT) (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号19309-20265、SEQ ID NO:8のアミノ酸番号625-943); 6つのタンデムなアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン(SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号21259-23052、SEQ ID NO:8のアミノ酸番号1275-1872); β-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR) (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号24154-24558、SEQ ID NO:8のアミノ酸番号2240-2374); および本明細書においてDH-モチーフ領域と称される、デヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO:8のアミノ酸番号2480-2492)を含有するSEQ ID NO:8のアミノ酸番号2241と2768との間のPFAS Aタンパク質の領域。
【００７２】
PFAS Aでは、KS活性部位DXAC＊はSEQ ID NO:8のAA番号226-229に位置し、C＊がアシル付着の部位である。MAT活性部位GHS＊XGはSEQ ID NO:8のアミノ酸番号721-725に位置し、S＊がアシル結合部位である。LGXDS＊のACP活性部位はSEQ ID NO:8のアミノ酸番号1307-1311、アミノ酸番号1408-1412、アミノ酸番号1509-1513、アミノ酸番号1617-1621、アミノ酸番号1721-1725、およびアミノ酸番号1826-1830に位置し、S＊がホスホパンテテイン付着部位である。SEQ ID NO:8のアミノ酸番号2241と2768との間に、PFAS Aは同様に、上記に参照されるデヒドラターゼ(DH)保存活性部位モチーフLxxHxxxGxxxxP (SEQ ID NO:8のアミノ酸番号2480-2492)を含む。
【００７３】
pfaB (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号25740-27971)はPFAS B (SEQ ID NO:9)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: アシルトランスフェラーゼ(AT) (SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号26837-27848、SEQ ID NO:9のアミノ酸番号366-703)。
【００７４】
PFAS Bでは、活性部位GXS＊XGモチーフはSEQ ID NO:9のアミノ酸番号451-455に位置し、S＊がアシル付着の部位である。
【００７５】
pfaC (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号27968-34030)はPFAS C (SEQ ID NO:10)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: KS (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号27995-29431、SEQ ID NO:10のアミノ酸番号10-488); 鎖伸長因子(CLF) (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号29471-30217、SEQ ID NO:10のアミノ酸番号502-750); ならびにDH1 (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号32258-32686、SEQ ID NO:10のアミノ酸番号1431-1573)、およびDH2 (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号33611-34027、SEQ ID NO:10のアミノ酸番号1882-2020)と称される、2つのFabA 3-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラターゼ。
【００７６】
PFAS Cでは、KS活性部位DXAC＊はSEQ ID NO:10のアミノ酸番号216-219に位置し、C＊がアシル付着の部位である。
【００７７】
pfaD (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号34041-35669)はPFAS D (SEQ ID NO:11)、すなわち次のドメインを持つPUFA PKSタンパク質をコードする: エノイルレダクターゼ(ER) (SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号34290-35531、SEQ ID NO:11のアミノ酸番号84-497)。
【００７８】
pfaE (逆相補上のSEQ ID NO:7のヌクレオチド番号13027-13899)はPFAS E (SEQ ID NO:12)、同定済みのドメインを有する4'-ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)をコードする(SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号13369-13815、SEQ ID NO:12のアミノ酸番号29-177)。
【００７９】
上記の両シュワネラ菌株由来のpfaC ORFおよびシュワネラ・オレヤナ由来のpfaE ORFは、TTGをその開始コドンとして持つと予測される。TTGは細菌ではATGおよびGTGよりも多くは見られない開始コドンであるが、これは大腸菌遺伝子の1.1%および枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子の11.2%の場合には開始コドンであると予測されている(Hannenhalli SS, Hayes WS, Hatzigeorgiou AG, Fickett JW.「Bacterial start site prediction」. Nucleic Acids Res. 1999 Sep 1;27(17):3577-82)。これらのORFがTTGコドンで始まると注釈されるいくつかの証拠がある。第一に、コンピュータによる遺伝子発見の両手段(EasyGeneおよびGeneMark.hmm)によって、これらの3つのORFの場合にTTG開始コドンが予測された。第二に、これらの3つのORFでのTTG開始点からの翻訳は、GenBankデータベース中の相同遺伝子と同一のおよび類似のタンパク質残基の割付けと範囲を保存している。これらの遺伝子でのTTG開始コドンに関する別の証拠は、予測されるリボソーム結合部位(RBS)である。RBSは開始コドンのおよそ7〜12ヌクレオチド上流にあり、通常はプリンに富んでいる。表5 (実施例2参照)は、全てのpfa ORFの上流領域と有力なRBSを示している。どちらのpfaC ORFともTTG開始コドン上流の規範的なRBSに対し非常に高い相同性を示す。TTG開始コドンと注釈されたこれらの3つのORFに対する代替的な開始コドンおよびRBSが同様に表5に示されている。本明細書に記載されるシュワネラ菌株由来のpfaE ORFは、シュワネラ種SCRC-2738 (GenBankアクセッション番号U73935)由来のEPA生合成クラスター由来のorf2に相同性を示すことにも留意されたい。注釈されたATGからのシュワネラ種SCRC-2738 orf2の発現は、異種発現系においてEPAの産生を補助しないことが明らかにされた(PCT公開番号WO 98/55625を参照のこと)。代替的な上流TTG開始コドンが系で使われた場合、EPAの産生が異種発現系で認められた。本明細書に記載される両方のpfaE ORFに対する注釈された開始コドンは、シュワネラ種SCRC-2738のorf2由来の代替的なTTG開始コドンからコードされるものと類似のおよび同一のアミノ酸をコードする(図4)。これはSh.オレヤナ由来のpfaE ORFに対するTTG開始注釈も支持する。最後に、両シュワネラ菌株由来のpfaC ORF開始コドンは、pfaB終止コドンと重複する(図3)。ORFの重複は細菌のオペロンに共通の特徴であり、2つまたはそれ以上の遺伝子を転写レベルで連結させるための1つの手段であると思われる。
【００８０】
本発明の1つの態様は、本明細書において記載される細菌性PUFA PKS系由来の単離されたタンパク質もしくはドメイン、その相同体、および/またはその断片に関する。同様に本発明に含まれるのは、本明細書において記載される(以下に詳細に論じられる)タンパク質、ドメインまたはペプチドのいずれかをコードする単離核酸分子である。本発明によれば、PUFA PKS系由来のタンパク質またはペプチドなどの、単離されたタンパク質またはペプチドは、その天然の環境から取り除かれた(すなわち、人のよる操作に供された)タンパク質またはその断片(ポリペプチドまたはペプチドを含む)であり、例えば、精製されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、組換えによって産生されたタンパク質、および合成によって産生されたタンパク質を含むことができる。従って、「単離(された)」とは、タンパク質が精製された程度を反映するものではない。本発明の単離タンパク質は組換えによって産生されることが好ましい。単離ペプチドは合成によって(例えば、ペプチド合成によってなど、化合的に)または組換えによって産生することができる。さらに、および例証として、「シュワネラ・ジャポニカPUFA PKSタンパク質」とは、シュワネラ・ジャポニカ微生物由来のPUFA PKSタンパク質(天然に存在するPUFA PKSタンパク質の相同体を一般的に含む)のことをいい、またはシュワネラ・ジャポニカ由来の天然に存在するPUFA PKSタンパク質の構造(例えば、配列)、および恐らく機能に関する知識から別の方法で産生されたPUFA PKSタンパク質のことを指す。言い換えれば、シュワネラ・ジャポニカPUFA PKSタンパク質への一般的な言及は、シュワネラ・ジャポニカ由来の天然に存在するPUFA PKSタンパク質に実質的に類似の構造および機能を有する、または本明細書において詳細に記載されるシュワネラ・ジャポニカ由来の天然に存在するPUFA PKSタンパク質の生物学的に活性な相同体である(すなわち、生物活性を有する)、任意のPUFA PKSタンパク質を含む。従って、シュワネラ・ジャポニカPUFA PKSタンパク質は、精製タンパク質、部分的精製タンパク質、組換えタンパク質、突然変異/改変タンパク質および合成タンパク質を含むことができる。同じ説明がシュワネラ・オレヤナ由来のPUFA PKSタンパク質およびドメインなどの、本明細書において記載されるその他のタンパク質またはペプチドへの言及に当てはまる。
【００８１】
本発明によれば、「改変」および「突然変異」という用語は、本明細書において記載されるタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列(または核酸配列)に対する改変/突然変異に関してとりわけ、同義的に用いることができる。「改変」という用語は同様に、メチル化、ファルネシル化、カルボキシメチル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、および/またはアミド化を含むがこれらに限定されない、タンパク質またはペプチドに対する翻訳後修飾を記載するために用いることができる。改変は同様に、例えば、別の化合物とのタンパク質またはペプチドの複合体化を含むことができる。そのような改変は、例えば、その改変が天然の、野生型タンパク質またはペプチドで起こる翻訳後修飾とは異なる場合には、突然変異であると考えることができる。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、「相同体」という用語は、天然に存在するタンパク質またはペプチドに対する1つまたは複数の比較的重要でない改変または突然変異によって天然に存在するタンパク質またはペプチド(すなわち、「原型」または「野生型」タンパク質)とは異なるが、天然存在型の全体的な基礎タンパク質と側鎖の構造を維持する(すなわち、相同体が野生型タンパク質と関連していると同定可能であるように)タンパク質またはペプチドを
指すように用いられる。そのような変化は、1個もしくは数個のアミノ酸側鎖の変化; 欠失(例えば、タンパク質もしくはペプチドの切断型)、挿入および/もしくは置換を含め、1個もしくは数個のアミノ酸の変化; 1個もしくは数個の原子の空間的配置の変化; ならびに/またはメチル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、グリコシル化、カルボキシメチル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、および/もしくはアミド化を含むがこれらに限定されない、比較的重要でない誘導体化を含むが、これらに限定されることはない。相同体は天然に存在するタンパク質またはペプチドと比べて機能強化した、低下した、または実質的に類似した特性を有することができる。PUFA PKSタンパク質またはドメインの好ましい相同体は、以下に詳細に記載される。相同体は、合成によって産生された相同体、所与のタンパク質もしくはドメインの天然に存在する対立遺伝子変異体、またはその参照配列が由来する生物以外の生物からの相同的配列を含みうることを留意されたい。
【００８３】
保存的置換は典型的には、次の群内での置換を含む: グリシンおよびアラニン; バリン、イソロイシンおよびロイシン; アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミン; セリンおよびスレオニン; リジンおよびアルギニン; ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。置換は保存された疎水性もしくは親水性に基づいて(Kyte and Doolittle, J. MoI. Biol. 157:105 (1982))、または類似のポリペプチド二次構造をとる能力に基づいて(Chou and Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978))なされてもよい。
【００８４】
相同体は天然の対立遺伝子変異または天然の突然変異の結果であってよい。タンパク質をコードする核酸の天然に存在する対立遺伝子変異体は、そのようなタンパク質をコードするが、例えば、突然変異または組換えにより引き起こされる天然の変異によって、類似するが同一ではない配列を有する遺伝子とゲノム中で本質的に同じ遺伝子座に生じる遺伝子である。対立遺伝子変異体は典型的には、それらが比較されている遺伝子によりコードされるタンパク質のものと類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子変異体の1つのクラスは、同じタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重によって異なる核酸配列を有することができる。対立遺伝子変異体は同様に、遺伝子の5'または3'非翻訳領域中に(例えば、調節制御領域中に)変化を含むことができる。対立遺伝子変異体は当業者に周知である。
【００８５】
相同体は、単離された、天然に存在するタンパク質に対する直接的な改変、直接的なタンパク質合成、または、例えば、無作為もしくは標的突然変異誘発をもたらす古典的なもしくは組換えDNA技術を用いてのタンパク質をコードする核酸配列に対する改変を含むが、これらに限定されない、タンパク質の産生のための当技術分野において公知の技術を用いて産生することができる。
【００８６】
野生型タンパク質と比べて、タンパク質相同体における改変または突然変異は、天然に存在する(野生型)タンパク質と比べて相同体の基礎生物活性を増大させる、減少させる、または実質的に変化させないかのいずれかである。一般的に、タンパク質の生物活性または生物作用とは、インビボ(すなわち、そのタンパク質の自然生理的環境において)もしくはインビトロ(すなわち、実験室条件下)で測定または観察される、そのタンパク質の天然に存在する型に帰するそのタンパク質により示されるまたは行われる任意の機能を指す。PUFA PKS系およびPUFA PKS系を構成している個々のタンパク質/ドメインの生物活性は、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。相同体においてなど、タンパク質の改変は、結果として、その天然に存在するタンパク質と同じ生物活性を有するタンパク質、またはその天然に存在するタンパク質と比較して減少したもしくは増加した生物活性を有するタンパク質を生じうる。タンパク質の発現における減少または活性における減少を生じる改変は、タンパク質の不活化(完全または部分的な)、下方制御、または低下した作用(または活性)として言及されうる。同様に、タンパク質の発現における増加または活性における増加を生じる改変は、タンパク質の増幅、過剰産生、活性化、増強、上方制御または増大した作用(または活性)として言及されうる。野生型タンパク質の生物活性を有する相同体への一般的な言及は、相同体が生物活性のレベルに関してとりわけ、野生型タンパク質と必ずしも同一の生物活性を有することを意味するわけではないことに留意されたい。むしろ、相同体は野生型タンパク質と同じ生物活性を、但し、野生型タンパク質と比べて低下したまたは増加したレベルの活性で行うことができる。PUFA PKS系の機能ドメインは、生物機能を行う能力がある(すなわち、生物活性を有する)ドメイン(すなわち、ドメインはタンパク質の部分でありうる)である。
【００８７】
PUFA PKSタンパク質またはドメインの生物活性を検出するおよび測定する方法は、PUFA PKSタンパク質もしくはドメインの転写の測定、PUFA PKSタンパク質もしくはドメインの翻訳の測定、PUFA PKSタンパク質もしくはドメインの翻訳後修飾の測定、PUFA PKSタンパク質もしくはドメインの酵素活性の測定、および/またはPUFA PKS系の1つもしくは複数の産物の産生(例えば、PUFAの産生)の測定を含むが、これらに限定されることはない。本発明の単離タンパク質(相同体を含む)は必ずしも野生型タンパク質の生物活性を有する必要がないことに留意されたい。例えば、PUFA PKSタンパク質またはドメインは、例えば、切断タンパク質、突然変異タンパク質または不活性なタンパク質であってもよい。そのようなタンパク質は、例えば、スクリーニングアッセイ法で、または抗体産生などの他の目的に有用である。好ましい態様では、本発明の単離タンパク質は野生型タンパク質のものに類似する(上記に論じられるように、必ずしも等価である必要はないが)生物活性を有する。
【００８８】
タンパク質発現レベルを測定する方法は一般に、ウェスタンブロット法、イムノブロット法、酵素結合免疫吸着検定(ELISA)法、放射性免疫測定法(RIA)法、免疫沈降法、表面プラスモン共鳴法、化学発光法、蛍光偏光法、リン光、免疫組織化学分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析法、マイクロサイトメトリー法、マイクロアレイ法、顕微鏡検査法、蛍光活性化細胞分類(FACS)法、およびフローサイトメトリー法、ならびに酵素活性またはその他のタンパク質パートナーとの相互作用を含むがこれらに限定されない、タンパク質の特性に基づくアッセイ法を含むが、これらに限定されることはない。結合アッセイ法も当技術分野において周知である。例えば、BIAcore機器を用いて、2つのタンパク質間の複合体の結合定数を測定することができる。複合体の解離定数は、緩衝液がチップを通過する際の時間に対する屈折率の変化をモニターすることで測定することができる(O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457 (1993); Schuster et al., Nature 365:343 (1993))。あるタンパク質の別のタンパク質との結合を測定するのに適したその他のアッセイ法は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)および放射性免疫測定法(RIA)などのイムノアッセイ法、または蛍光、UV吸収、円偏光二色性、もしくは核磁気共鳴(NMR)を通じたタンパク質の分光学的もしくは光学的特性の変化のモニタリングによる結合の測定を含む。
【００８９】
1つの態様では、本発明は、以下より選択されるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、またはそのアミノ酸配列からなる単離タンパク質に関する: SEQ ID NO:2〜6もしくは8〜12のいずれか1つ、または生物学的に活性なそのドメインもしくは断片。SEQ ID NO:2〜6および8〜12により表されるPUFA PKSタンパク質内に含まれるドメインは、上記に詳細に記載されている。別の態様では、本発明はSEQ ID NO:2〜6および8〜12のいずれか1つにより表されるタンパク質の単離相同体に関する。そのような相同体は、SEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれか1つに少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列から本質的になり、またはそのアミノ酸配列からなり、SEQ ID NO:2〜6または8〜12により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、本発明は、SEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれか1つにより表されるPUFA PKSタンパク質のドメインの相同体であって、SEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれか1つ由来のドメインに少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列から本質的になり、またはそのアミノ酸配列からなり、かつSEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれか1つ由来のそのようなドメインの生物活性を有する相同体に関する。さらなる態様では、上記の相同体のいずれかはSEQ ID NO:2〜6もしくは8〜12のいずれか1つに、またはこれらの配列内に含まれるドメインに少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。上記のように、相同体は、それが由来するまたは関連するタンパク質またはドメインの生物活性を有する(すなわち、タンパク質またはドメインが参照アミノ酸配列を有する)ことが好ましい。
【００９０】
本発明の1つの態様は、SEQ ID NO:2に少なくとも約65%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:2により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:2内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:2により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:2またはそのドメインに少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、65%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９１】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:3に少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:3により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:3内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:3により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:3またはそのドメインに少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９２】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:4に少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:4により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:4内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:4により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:4またはそのドメインに少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９３】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:5に少なくとも約95%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:5により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:5内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:5により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:5またはそのドメインに少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99%同一である。
【００９４】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:6に少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:6により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:6内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:6により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:6またはそのドメインに少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９５】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:8に少なくとも約65%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:8により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:8内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:8により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:8またはそのドメインに少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９６】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:9に少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:9により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:9内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:9により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:9またはそのドメインに少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９７】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:10に少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:10により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:10内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:10により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:10またはそのドメインに少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９８】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:11に少なくとも約85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:11により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:11内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:11により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:11またはそのドメインに少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【００９９】
本発明の別の態様は、SEQ ID NO:12に少なくとも約60%同一であるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、もしくはそのアミノ酸配列からなるSEQ ID NO:12により表されるタンパク質の単離相同体に関し、または本明細書において先に記載されたSEQ ID NO:12内の生物学的に活性なドメインに関し、その際に相同体はSEQ ID NO:12により表される対応のタンパク質内に含まれる少なくとも1つのドメインの生物活性を有する。さらなる態様では、相同体はSEQ ID NO:12またはそのドメインに少なくとも約65%同一、より好ましくは少なくとも約70%同一、より好ましくは少なくとも約75%同一、より好ましくは少なくとも約80%同一、より好ましくは少なくとも約85%同一、より好ましくは少なくとも約90%同一、より好ましくは少なくとも約95%同一、より好ましくは少なくとも約96%同一、より好ましくは少なくとも約97%同一、より好ましくは少なくとも約98%同一、およびより好ましくは少なくとも約99% (または全ての単一の百分率増加での、60%〜99%の任意の百分率で)同一である。
【０１００】
本発明の1つの局面では、本明細書において記載される特定のPUFA PKSタンパク質またはドメインの相同体を含めて、本発明により包含されるPUFA PKSタンパク質またはドメインは、SEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれか1つより選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも約100個の連続したアミノ酸を含んだアミノ酸配列を含み、その際に相同体のアミノ酸配列は本明細書において記載される少なくとも1つのドメインまたはタンパク質の生物活性を有する。さらなる局面では、タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2〜6または8〜12のいずれかの少なくとも約200個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約300個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約400個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約500個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約600個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約700個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約800個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約900個の連続したアミノ酸、およびより好ましくは少なくとも約1000個の連続したアミノ酸を含む。
【０１０１】
本発明の好ましい態様では、本発明の単離タンパク質またはドメインは、以下より選択されるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、またはそのアミノ酸配列からなる: SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、または任意の生物学的に活性なその断片もしくはドメイン。
【０１０２】
1つの態様では、本明細書において記載されるおよび上記に参照されるPUFA PKS系の生物学的に活性なドメインは、(1) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約29位から約513位より; (2) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約625位から約943位より; (3) ドメインもしくはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約1264位から約1889位、およびそのサブドメインより; (4) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:2の約2264位から約2398位より; (5) ドメインがDH生物活性、好ましくは、非FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:2の約2504位から約2516位までを含む配列より; (6) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:3の約378位から約684位より; (7) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約5位から約483位より; (8) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:4の約489位から約771位より; (9) ドメインがDH生物活性、好ましくは、FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:4の約1428位から約1570位より; (10) ドメインがDH生物活性、好ましくは、FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:4の約1881位から約2019位より; (11) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:5の約84位から約497位より; (12) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:6の約40位から約186位より; (13) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約29位から約513位より; (14) ドメインがMAT生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約625位から約943位より; (15) ドメインもしくはそのサブドメインがACP生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約1275位から約1872位、およびそのサブドメインより; (16) ドメインがKR生物活性を有する、SEQ ID NO:8の約2240位から約2374位より; (17) DH生物活性、好ましくは、非FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:8の約2480〜2492位までを含む配列より; (18) ドメインがAT生物活性を有する、SEQ ID NO:9の約366位から約703位より; (19) ドメインがKS生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約10位から約488位より; (20) ドメインがCLF生物活性を有する、SEQ ID NO:10の約502位から約750位より; (21) ドメインがDH生物活性、好ましくは、FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:10の約1431位から約1573位より; (22) ドメインがDH生物活性、好ましくは、FabA様DH活性を有する、SEQ ID NO:10の約1882位から約2020位より; (23) ドメインがER生物活性を有する、SEQ ID NO:11の約84位から約497位より; または(24) ドメインがPPTase生物活性を有する、SEQ ID NO:12の約29位から約177位より選択されるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的になる、またはそのアミノ酸配列からなる。
【０１０３】
本発明によれば、「近接する」または「連続した」という用語は、本明細書に記載される核酸またはアミノ酸配列に関しては、間断のない配列として連結されていることを意味する。例えば、第一配列が第二配列の30個の近接した(または連続した)アミノ酸を含むとは、その第一配列が第二配列における30個のアミノ酸残基の間断のない配列と100%同一である30個のアミノ酸残基の間断のない配列を含むことを意味する。同様に、第一配列が第二配列と「100%の同一性」をもつとは、その第一配列がヌクレオチドまたはアミノ酸間にギャップを含まずにその第二配列と正確に整合していることを意味する。
【０１０４】
本明細書で用いられる場合、別に明記されない限り、同一性の割合(%)への言及は、以下のものを用いて行われる相同性の評価をいう: (1) アミノ酸検索についてはblastp、核酸検索についてはblastn、ならびにすべての6個の読み取り枠における核酸検索および翻訳されたアミノ酸の検索についてはblastXをすべて標準デフォルトパラメータで用いるBLAST2.0ベーシック(Basic)BLAST相同性検索、問合せ配列はデフォルトにより低複雑性領域についてフィルタリングされる(全体が参照により本明細書に組み入れられる、Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.およびLipman, D. J. (1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されている); (2) BLAST2アライメント(下記のパラメータを用いる); および/または(3) 標準デフォルトパラメータでのPSI-BLAST (位置特異的反復BLAST)。BLAST2.0ベーシック(Basic) BLASTとBLAST2間の標準パラメータにおけるいくらかの相違のせいで、2つの特定の配列がBLAST2プログラムを用いて有意な相同性をもつとして認識され得たとしても、問合せ配列としてその配列のうちの1つを用いるBLAST2.0ベーシック(Basic) BLASTにおいて行われた検索では二番目の配列をトップ整合において同定しない場合があることを留意されたい。さらに、PSI-BLASTは、「プロファイル」検索の自動化した使いやすいバージョンを提供しており、配列相同体を捜すための感度の高い方法である。そのプログラムは、まず、ギャップド(gapped) BLASTデータベース検索を行う。PSI-BLASTプログラムは、位置特異的スコアマトリックスを構成するために戻されたいずれの有意なアライメントからの情報も使用し、データベース検索の次のラウンドのためにその問合せ配列を取り替える。それゆえ、これらのプログラムのいずれか1つを使用することにより同一性の割合が決定されうることが理解されるはずである。
【０１０５】
2つの特定の配列は、全体が参照により本明細書に組み入れられるTatusovaおよびMadden, 「Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」, FEMS Microbiol Lett. 174:247 (1999)に記載されているように、BLAST2を用いて互いに整列されることができる。BLAST2配列アライメントは、その結果生じるアライメントにギャップの導入(欠失および挿入)を許してその2つの配列間でギャップドBLAST検索(BLAST2.0)を行うBLAST2.0アルゴリズムを用いるblastpまたはblastnにおいて行われる。本明細書において明確にする目的で、BLAST2配列アライメントは、以下の標準デフォルトパラメータを用いて行われる。
【０１０６】
blastnの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる:
一致についての報酬 = 1
不一致についてのペナルティ = -2
オープンギャップ(5)および伸長ギャップ(2)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(11)フィルタ(オン)
blastpの場合、以下の0 BLOSUM62マトリックスを用いる:
オープンギャップ(11)および伸長ギャップ(1)ペナルティ
ギャップx_ドロップオフ(50)期待(10)ワードサイズ(3)フィルタ(オン)。
【０１０７】
本発明によれば、PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、本明細書において詳細に記載されるPUFA PKS系の少なくとも1つのドメイン(例えば、KSドメイン、ATドメイン、CLFドメインなど)の生物活性を有するアミノ酸配列である。従って、本発明で有用な単離タンパク質は、任意のPUFA PKS読み取り枠の翻訳産物、任意のPUFA PKSドメイン、そのような翻訳産物もしくはドメインの任意の生物学的に活性な断片、または生物活性を有する天然由来PUFA PKS読み取り枠の産物もしくはドメインの任意の相同体を含むことができる。
【０１０８】
本発明の別の態様では、本発明のPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に (すなわち、それと)(すなわち、天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸鎖の相補体に)中程度、高度または非常に高度なストリンジェント条件(以下に記載)の下でハイブリダイズできる本明細書において具体的に記載される天然に存在するPUFA PKSタンパク質またはポリペプチドと十分に類似するアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明のPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列は、PUFA PKSタンパク質またはドメインについて上記されているアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列の相補体に中程度、高度または非常に高度なストリンジェント条件の下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされる。相補配列を推定するための方法は当業者に公知である。アミノ酸配列決定および核酸配列決定の技術は完全にエラーが無い訳ではないため、本明細書に提出される配列は、せいぜい、本発明のPUFA PKSドメインおよびタンパク質の見かけの配列を表していることに留意するべきである。
【０１０９】
本明細書で用いられる場合、ハイブリダイゼーション条件は、核酸分子が類似した核酸分子を同定するために用いられる標準ハイブリダイゼーション条件を指す。そのような標準的な条件は、例えば、Sambrook et al.,「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Labs Press, (1989)に開示されている。Sambrookら(同上)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる(具体的には、9.31-9.62頁を参照のこと)。さらに、ヌクレオチドのミスマッチの程度を変えることを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算する式が、例えば、Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138, 267 (1984)に開示され; Meinkothら(同上)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１０】
より詳しくは、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、本明細書で言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と少なくとも約70%核酸配列同一性をもつ核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約30%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)を指す。高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、本明細書で言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と少なくとも約80%核酸配列同一性をもつ核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約20%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)を指す。超高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、本明細書で言及される場合、そのハイブリダイゼーション反応において探索するために使用される核酸分子と少なくとも約90%核酸配列同一性をもつ核酸分子の単離を可能にする条件(すなわち、ヌクレオチドの約10%またはそれ未満のミスマッチを許容する条件)を指す。上記に論じられているように、当業者は、これらのヌクレオチドミスマッチの特定のレベルに到達するための適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を計算するためのMeinkothら(同上)における式を使用することができる。そのような条件は、DNA:RNAまたはDNA:DNAのハイブリッドのいずれが形成されることになっているのかに依存して、異なるものである。DNA:DNAハイブリッドについての計算された融解温度は、DNA:RNAハイブリッドについてよりも10℃低い。特定の態様では、DNA:DNAハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約20℃〜約35℃の間の温度(低度のストリンジェント)、より好ましくは約28℃〜約45℃の間の温度(よりストリンジェント)、およびさらにより好ましくは約35℃〜約45℃の間の温度(さらによりストリンジェント)で、6X SSC(0.9 M Na+)のイオン強度でのハイブリダイゼーションを適切な洗浄条件とともに含む。特定の態様では、DNA:RNAハイブリッドについてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約30℃〜約45℃の間の温度、より好ましくは約38℃〜約50℃の間の温度、およびさらにより好ましくは約45℃〜約55℃の間の温度(さらによりストリンジェント)で、6X SSC (0.9 M Na+)のイオン強度でのハイブリダイゼーションを同様にストリンジェントな洗浄条件とともに含む。これらの値は、約100ヌクレオチドより大きい分子、0%ホルムアミドおよび約40%のG+C含有量についての融解温度の計算に基づいている。または、Tmは、Sambrookら、前記、9.31〜9.62頁に示されているように、経験的に計算されうる。一般的に、洗浄条件は、可能な限りストリンジェントであるべきであり、その選択されたハイブリダイゼーション条件に対して適切であるべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリッドの計算されたTmより約20℃〜約25℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含んでもよく、かつ洗浄条件は、典型的には、その特定のハイブリッドの計算されたTmより約12℃〜約20℃低い、塩および温度条件の組み合わせを含む。DNA:DNAハイブリッドで用いるのに適したハイブリダイゼーション条件の1つの例は、約42℃で6X SSC(50%ホルムアミド)中での2時間〜24時間のハイブリダイゼーション、続いて、室温で約2X SSC中での1回またはそれ以上の洗浄を含む洗浄段階、続いて、より高い温度およびより低いイオン強度での追加の洗浄(例えば、約37℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄、続いて、約68℃で約0.1X〜0.5X SSC中での少なくとも1回の洗浄)を含む。
【０１１１】
本発明は同様に、1つまたは複数の融合セグメントに付着された、任意のPUFA PKSタンパク質もしくはドメインまたは任意のその相同体もしくは断片を含んだ融合タンパク質を含む。本発明で用いるのに適した融合セグメントは、タンパク質の安定性を増強できるセグメント、その他の望ましい生物活性を供与できるセグメント、および/またはタンパク質の精製を補助できる(例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより)セグメントを含むが、これらに限定されることはない。適当な融合セグメントは、所望の機能を有する(例えば、より一層の安定性、溶解性、生物活性を与える、および/またはタンパク質の精製を平易にする)任意のサイズのドメインとすることができる。融合セグメントはタンパク質のアミノおよび/またはカルボキシル末端に連結させることができ、所望のタンパク質の直接的な回収を可能とするために切断を受けやすくすることができる。融合タンパク質は、上記に論じられる本発明のタンパク質のカルボキシルおよび/またはアミノ末端のいずれかに付着された融合セグメントを含むタンパク質をコードする、融合核酸分子をトランスフェクトされた組換え細胞の培養によって産生されることが好ましい。
【０１１２】
本発明の1つの態様では、上記のPUFA PKSアミノ酸配列、およびそのような配列の相同体のいずれも、その所与のアミノ酸配列の各C末端および/またはN末端に隣接する、少なくとも1個から、約20個に達するまでの追加的な異種アミノ酸をもって作製されうる。その結果生じたタンパク質またはポリペプチドを、所与のアミノ酸配列「から本質的になる」と呼ぶことができる。本発明によれば、異種アミノ酸は、その所与のアミノ酸配列に隣接することを本来見出されない(すなわち、インビボで天然において見出されない)、またはその所与のアミノ酸配列が由来する生物のための標準的なコドン使用頻度を用いて本来存在する配列におけるそのようなヌクレオチドが翻訳された場合には、その遺伝子に存在している場合のその所与のアミノ酸配列をコードする本来存在する核酸配列に隣接しているヌクレオチドによりコードされないアミノ酸の配列である。同様に、「から本質的になる」という用語は、本明細書で核酸配列に関連して用いられる場合、その所与のアミノ酸配列をコードする核酸配列の各5'末端および/または3'末端における少なくとも1個から、約60個に達するまでの付加的な異種ヌクレオチドにより隣接されることができる所与のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、その本来の遺伝子に存在している場合のその所与のアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接していることが本来見出されない(すなわち、インビボで天然において見出されない)。
【０１１３】
本発明のタンパク質もしくはドメインおよび/またはその相同体もしくは断片の最小サイズは、1つの局面では、必要な生物活性を有するのに十分な、または抗体の作製用の抗原としてもしくはインビトロアッセイ法での標的として機能を果たすのに十分なサイズである。1つの態様では、本発明のタンパク質は、長さが少なくとも約8アミノ酸(例えば、抗体エピトープにまたはアッセイ法で検出可能なペプチドとして適当な)、または長さが少なくとも約25アミノ酸、または長さが少なくとも約50アミノ酸、または長さが少なくとも約100アミノ酸、または長さが少なくとも約150アミノ酸、または長さが少なくとも約200アミノ酸、または長さが少なくとも約250アミノ酸、または長さが少なくとも約300アミノ酸、または長さが少なくとも約350アミノ酸、または長さが少なくとも約400アミノ酸、または長さが少なくとも約450アミノ酸、または長さが少なくとも約500アミノ酸などであり、全整数値(例えば、8、9、10、...25、26、...500、501、...)での、8アミノ酸から本発明のタンパク質もしくはドメインの全長までの任意の長さまたはそれ以上の長さである。そのようなタンパク質の最大サイズに、実用的な限界以外には、タンパク質がPUFA PKSタンパク質の一部分、ドメイン、または生物学的に活性なもしくは有用なその断片、あるいは完全長のPUFA PKSタンパク質またはドメイン、その上、必要に応じて、さらなる配列(例えば、融合タンパク質配列)を含むことができるという点で制限はない。
【０１１４】
本発明の1つの態様は、本明細書において記載されるPUFA PKSタンパク質またはドメインのいずれかの相同体または断片を含め、そのようなタンパク質またはドメインのいずれかをコードする核酸配列、およびそれに完全に相補的である核酸配列を含む、その核酸配列から本質的になる、またはその核酸配列からなる単離核酸分子に関する。本発明によれば、単離された核酸分子はその自然環境から取り出された(すなわち、人による操作に供された)核酸分子であり、その自然環境はその核酸分子が本来見出されるゲノムまたは染色体である。従って、「単離された」とは、必ずしも、その核酸分子が精製されたという程度までを反映しているとは限らず、その核酸分子が本来見出されるゲノム全体または染色体全体をその分子が含んでいないことを示す。単離された核酸分子は遺伝子を含みうる。遺伝子を含む単離された核酸分子は、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、その遺伝子に関連するコード領域および制御領域を含むが、本明細書において記載されるPUFA PKS系のその他のタンパク質をコードするその他の遺伝子を除き、同じ染色体上に天然に見出される付加的な遺伝子を含まない。単離された核酸分子はまた、通常ではその特定の核酸配列に本来隣接していない追加的な核酸(すなわち、異種配列)に隣接されている(すなわち、その配列の5'末端および/または3'末端で)特定の核酸配列を含む。単離された核酸分子は、DNA、RNA (例えば、mRNA)、またはDNAもしくはRNAのいずれかの誘導体 (例えば、cDNA)を含みうる。「核酸分子」という語句はそもそも物質的な核酸分子をいい、「核酸配列」という語句はそもそも核酸分子上のヌクレオチドの配列をいうが、この2つの語句は、タンパク質もしくはタンパク質のドメインをコードする能力がある核酸分子、または核酸配列については特に、同義的に用いることができる。
【０１１５】
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、組換えDNA技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、クローニング)または化学的合成を用いて産生される。単離された核酸分子は、天然の対立遺伝子の変異体およびそのような改変が本明細書に記載されるようなPUFA PKS系生物活性に望ましい効果を与えるような様式においてヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および/または反転された改変核酸分子を含むがこれらに限定されない、天然の核酸分子ならびにその相同体を含む。タンパク質相同体(例えば、核酸相同体によりコードされるタンパク質)は上記に詳細に論じられている。
【０１１６】
核酸分子相同体は当業者に公知のいくつかの方法を用いて産生されうる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, (1989)を参照のこと)。例えば、核酸分子は、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のPCR増幅および/または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成および核酸分子の混合物を「構築する」ための混合群のライゲーション、ならびにそれらの組合せなどの、古典的な突然変異誘発技術および組換えDNA技術を含むがこれらに限定されない、様々な技術を用いて改変されうる。核酸分子相同体は、核酸によりコードされるタンパク質の機能のスクリーニングによりおよび/または野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションにより、改変された核酸の混合物より選択されうる。
【０１１７】
本発明の核酸分子の最小サイズは、本発明の核酸分子の相補配列と安定的なハイブリッドを形成できる(例えば、中程度、高度または非常に高度のストリンジェンシーな条件下で)プローブもしくはオリゴヌクレオチドプライマーを形成するのに十分なサイズであり、または本発明によるPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードするのに十分なサイズのものである。従って、そのようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成およびその核酸分子と相補配列間の相同性の割合または同一性の割合に加えてそれ自体でのハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、塩濃度およびホルムアミド濃度)に依存しうる。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用される核酸分子の最小サイズは、典型的には、核酸分子がGCに富む場合には少なくとも約12ヌクレオチド長〜約15ヌクレオチド長であり、それらがATに富む場合には少なくとも約15塩基長〜約18塩基長である。本発明の核酸分子の最大サイズに、実用的な限界以外には、核酸分子がPUFA PKS系のドメインの生物学的に活性な断片、PUFA PKS系のドメイン全体、PUFA PKS系の読み取り枠(Orf)内のいくつかのドメイン、PUFA PKS系の単一もしくは多ドメインタンパク質全体、またはPUFA PKS系の複数のタンパク質をコードするのに十分な配列を含むことができるという点で制限はない。
【０１１８】
本発明の1つの態様では、単離核酸分子は、本明細書において記載されるシュワネラ・ジャポニカまたはシュワネラ・オレヤナ由来の、アミノ酸配列のいずれか、またはその相同体を含め、上記のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を含む、その核酸配列から本質的になる、またはその核酸配列からなる。1つの局面では、核酸配列は、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:7または本明細書において記載されるPUFA PKS系の1つもしくは複数のドメインもしくはタンパク質をコードするSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:7の任意の断片(セグメント、部分)の群より選択される。別の局面では、核酸配列は、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:7の任意の相同体または本明細書において記載されるPUFA PKS系の1つもしくは複数のドメインもしくはタンパク質をコードするSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:7の任意の断片を含む(そのような配列に少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である配列を含む)。別の局面では、そのような核酸配列の断片および任意の相補配列が本発明により包含される。
【０１１９】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるPUFA PKSタンパク質の少なくとも1つのドメイン(またはその相同体もしくは断片)の生物活性を有するタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列および組換えベクターを含む組換え核酸分子を含む。そのような核酸配列は上記に詳細に記載されている。本発明によれば、組換えベクターは、選択の核酸配列を操作することおよびそのような核酸配列を宿主細胞へ導入することのための道具として使用される操作された(すなわち、人工的に作製された)核酸分子である。組換えベクターはそれゆえ、選択の核酸配列を宿主細胞に発現させるおよび/または送達させて組換え細胞を形成させるなど、選択の核酸配列のクローニング、配列決定、および/または別の方法による操作で用いるのに適している。そのようなベクターは、典型的には、本来、クローニングまたは送達される核酸配列に隣接して見出されない核酸配列である、異種核酸配列を含むが、そのベクターはまた、本来本発明の核酸分子に隣接して見出される、または本発明のその核酸分子の発現のために有用である制御核酸配列(例えば、プロモーター、非翻訳領域)を含みうる(下記に詳細に論じられている)。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかであってもよく、および典型的にはプラスミドである。ベクターは染色体外要素(例えば、プラスミド)として維持されうる、またはそれは組換え生物(例えば、微生物または植物)の染色体へと組み込まれうる。ベクター全体が宿主細胞内のしかるべき所へとどまりうる、またはある特定の条件下で、そのプラスミドDNAが除去されて、本発明の核酸分子を後に残しうる。その組み込まれた核酸分子は、染色体のプロモーター制御下、本来のもしくはプラスミドのプロモーター制御下、またはいくつかのプロモーターの組み合わせの制御下でありうる。核酸分子の1個または複数個のコピーが染色体へ組み込まれうる。本発明の組換えベクターは少なくとも1つの選択可能なマーカーを含みうる。
【０１２０】
1つの態様では、本発明の組換え核酸分子において使用される組換えベクターは発現ベクターである。本明細書で用いられる場合、「発現ベクター」という用語は、コード化された産物(例えば、対象となるタンパク質)の産生のために適しているベクターをいうために用いられる。この態様では、産生される産物(例えば、PUFA PKSドメインまたはタンパク質)をコードする核酸配列は、組換え核酸分子を産生するために組換えベクターへ挿入される。産生されるタンパク質をコードする核酸配列は、その核酸配列を組換え宿主細胞内でその核酸配列の転写および翻訳を可能にするベクター中の制御配列へ作動可能に連結する様式でベクターへ挿入される。
【０１２１】
別の態様では、本発明の組換え核酸分子において使用される組換えベクターは、ターゲティングベクターである。本明細書で用いられる場合、「ターゲティングベクター」という語句は、宿主細胞または微生物内で内因性遺伝子または遺伝子の一部分を欠失させる、不活性化させる、または交換するために用いられる(すなわち、標的化された遺伝子の破壊またはノックアウト技術のために用いられる)特定の核酸分子を組換え宿主細胞に送達するために使用されるベクターを指して用いられる。そのようなベクターは同様に、「ノックアウト」ベクターとして当技術分野において知られうる。この態様の1つの局面では、ベクターの一部分、しかしより典型的には、ベクターに挿入された核酸分子(すなわち、インサート)は、宿主細胞における標的遺伝子(すなわち、標的化されて欠失されるまたは不活性化される遺伝子)の核酸配列と相同性を示す核酸配列を有する。ベクターインサートの核酸配列は、標的遺伝子と結合して、標的遺伝子およびインサートが相同組換えを受けるようにデザインされており、それによって、内因性標的遺伝子が欠失される、不活性化される、減弱される(すなわち、内因性標的遺伝子の少なくとも一部分が突然変異されるまたは欠失されることにより)、または交換される。内因性のシゾキトリウム遺伝子を、例えば、組換え遺伝子と交換するためのこの種の組換えベクターの使用は、実施例の項に記載されており、スラウストキトリドの遺伝的形質転換のための一般的な技術は、2003年9月4日付で公開された、米国特許出願公開第20030166207号として公開済みの、米国特許出願第10/124,807号に詳細に記載されている。植物に対する遺伝的形質転換技術は当技術分野において周知である。本明細書において記載される海洋細菌遺伝子を用いて植物またはスラウストキトリドなどの微生物を形質転換し、そのような植物または微生物のPUFA PKS産生能を向上させられるおよび/または変更(改変、変化)させられることは、本発明の態様である。
【０１２２】
典型的には、組換え核酸分子は、1つまたは複数の発現制御配列に作動可能に連結された本発明の少なくとも1つの核酸分子を含む。本明細書で用いられる場合、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は、そもそも発現制御配列に作動可能に連結された核酸分子または核酸配列をいうが、そのような核酸分子が本明細書において論じられる組換え分子である場合、「核酸分子」という語句と同義的に用いることができる。本発明によれば、「作動可能に連結された」という語句は、分子が宿主細胞にトランスフェクトされた(すなわち、形質転換された、形質導入された、トランスフェクトされた、結合された、または導かれた)場合に発現されうるような形で核酸分子を発現制御配列(例えば、転写制御配列および/または翻訳制御配列)に連結することを指す。転写制御配列は、転写の開始、伸長、または終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびリプレッサー配列のような転写開始を制御するものである。適当な転写制御配列は、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物において機能できる任意の転写制御配列を含む。
【０１２３】
本発明の組換え核酸分子はまた、翻訳制御配列、複製開始点のような追加の制御配列、およびその組換え細胞に適合性のある他の制御配列も含みうる。1つの態様では、本発明の組換え分子は、宿主細胞染色体へ組み込まれるものも含めて、発現されるタンパク質がそのタンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル(すなわち、シグナルセグメント核酸配列)もまた含む。適当なシグナルセグメントは、発現されるタンパク質ともともと結合しているシグナルセグメント、または本発明によるタンパク質の分泌を指令できる任意の異種シグナルセグメントを含む。別の態様では、本発明の組換え分子は、発現されるタンパク質が宿主細胞の膜へ送達されかつ挿入されることを可能にするリーダー配列を含む。適当なリーダー配列は、タンパク質ともともと結合しているリーダー配列、または細胞膜へのタンパク質の送達および挿入を指令できる任意の異種リーダー配列を含む。
【０１２４】
本発明の1つまたは複数の組換え分子を用いて、本発明のコード化された産物(例えば、PUFA PKSドメイン、タンパク質、または系)を産生させることができる。1つの態様では、コード化された産物は、タンパク質を産生させるのに効果的な条件の下で本明細書において記載される核酸分子を発現させることにより産生される。コード化されたタンパク質を産生させるのに好ましい方法は、宿主細胞に1つまたは複数の組換え分子をトランスフェクトして、組換え細胞を形成させることによる。トランスフェクトするのに適した宿主細胞は、トランスフェクトできる任意の細菌、真菌(例えば、酵母)、昆虫、植物または動物細胞を含むが、これらに限定されることはない。本発明の1つの態様では、好ましい宿主細胞はスラウストキトリド宿主細胞(以下に詳細に記載される)または植物の宿主細胞である。宿主細胞は、非トランスフェクト細胞または少なくとも1つの他の組換え核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかとすることができる。
【０１２５】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子(すなわち、組換え核酸分子)を細胞に挿入できる任意の方法を指して用いられる。「形質転換」という用語は、このような用語が藻類、細菌および酵母などの微生物細胞への、または植物細胞への核酸分子の導入を指して用いられる場合、「トランスフェクション」という用語と同義的に用いることができる。微生物系および植物系では、「形質転換」という用語は、微生物または植物による外因性核酸の獲得に起因する遺伝性変化を記載するよう用いられ、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。しかしながら、動物細胞では、形質転換はもう1つの意味を獲得しており、例えば、それらががん性になった後の培養細胞の増殖特性の変化をいうことができる。それ故に、混乱を避けるため、「トランスフェクション」という用語は、動物細胞への外因性核酸の導入に関して用いられることが好ましく、「トランスフェクション」という用語は全体として、この用語が細胞への外因性核酸の導入に関係する限りにおいて、動物細胞のトランスフェクション、および微生物細胞または植物細胞の形質転換を包含するよう本明細書において用いられるものとする。それ故に、トランスフェクション技術は、形質転換、粒子衝突、拡散、能動輸送、槽内超音波処理（bath sonication）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合を含むが、これらに限定されることはない。
【０１２６】
組換えDNA技術の使用は、例えば、宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その結果として生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後の改変の効率を操作することにより、トランスフェクトされた核酸分子の発現の制御を向上できることを当業者は理解すると考えられる。さらに、プロモーター配列を遺伝子操作して、天然のプロモーターに比べて発現レベルを向上させることができる。核酸分子の発現を制御するのに有用な組換え技術は、1つまたは複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または改変、翻訳制御シグナル(例えば、リボソーム結合部位、シャイン-ダルガノ配列)の置換または改変、宿主細胞のコドン使用頻度に対応する核酸分子の改変、および転写物を不安定化させる配列の除去を含むが、これらに限定されることはない。
【０１２７】
組換え核酸分子および宿主細胞のトランスフェクションに関しての上記の一般的な論考は、PUFA PKS系由来の少なくとも1つのドメインの生物活性を有する任意のアミノ酸配列をコードするもの、他のPKS系由来のアミノ酸配列をコードするもの、および他のタンパク質またはドメインをコードするものを含む、本明細書において論じられているいずれの組換え核酸分子にも適用されるものとする。
【０１２８】
多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、高等真核生物における必須の膜成分および多くの脂質由来シグナル伝達分子の前駆体である。本発明のPUFA PKS系は、飽和脂肪酸の伸長および不飽和化を必要としないPUFA合成のための経路を使用する。PUFA PKS系により触媒される経路は、構造と機構の両方でこれまでに認識されているPKSとは異なる。シス二重結合の形成は位置特異的イソメラーゼを含むと示唆され;これらの酵素は新たなファミリーの抗生物質の産生に有用であると考えられる。
【０１２９】
有意に高い収量の1つまたは複数の所望の多価不飽和脂肪酸またはその他の生物活性分子を産生するため、生物、好ましくは微生物または植物を遺伝的に改変して、微生物もしくは植物中のPUFA PKS系の活性および特に、最終産物を変化させることができ、またはPUFA PKS系を微生物もしくは植物に導入することができる。
【０１３０】
それ故に、本発明の1つの態様は遺伝的に改変された微生物であって、本明細書において記載される多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なドメイン(例えば、シュワネラ・ジャポニカまたはシュワネラ・オレヤナ由来のPUFA PKS系の少なくとも1つのドメインもしくはタンパク質、または生物学的に活性なその断片もしくは相同体)を含むPKS系を発現する微生物に関する。微生物の遺伝的改変は、生物中のPKS系の活性に影響を与える。PUFA PKS系のドメインは、本明細書において記載される海洋細菌PUFA PKS系に対するドメインのいずれかを、その相同体を含めて、含むことができ、任意の真核微生物を含め、および詳しくは、任意のスラウストキトリド微生物を含め、その他任意の細菌性もしくは非細菌性の微生物由来のPUFA PKS系の任意のドメインまたは前記の米国特許出願第10/124,800号に記載されているスクリーニング法によって同定された微生物由来のPUFA PKS系の任意のドメインを含むこともできる。手短に言えば、米国特許出願第10/124,800号に記載されているスクリーニング工程は、(a) 少なくとも1つのPUFAを産生する微生物を選択する段階; および(b) 発酵培地において、約5%の飽和度より大きい、より好ましくは約10%、より好ましくは約15%、およびより好ましくは約20%の飽和度より大きい溶存酸素条件下でのその微生物によるPUFAの産生と比較して、発酵培地において約5%の飽和度未満の溶存酸素条件下で増加したPUFAを産生する能力をもつ(a) 由来の微生物を同定する段階を含む。その他の細菌のPUFA PKS系に対するタンパク質、ドメイン、およびその相同体は、全体が参照により組み入れられる前記米国特許第6,140,486号に記載されている。スラウストキトリドPUFA PKS系に対するタンパク質、ドメイン、およびその相同体は、米国特許第6,566,583号、前記; 米国特許出願第10/124,800号、前記; および米国特許出願第10/810,352号、前記に詳細に記載されており、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３１】
本発明の1つの局面では、遺伝的に改変された生物はPUFA PKS系を内因的に含み、発現することができ、遺伝的改変は、PUFA PKS系の活性に何らかの影響を及ぼす内因性PUFA PKS系の機能ドメインの1つまたは複数の遺伝的改変とすることができる。例えば、本明細書において記載されるシュワネラ・ジャポニカまたはシュワネラ・オレヤナ種を内因性PUFA PKS遺伝子の改変によって遺伝的に改変し、その微生物中のPUFA PKS機能の何らかの変更(変化、改変)を結果的にもたらすことができる。
【０１３２】
本発明の別の局面では、遺伝的に改変された生物はPUFA PKS系を内因的に含み、発現することができ、遺伝的改変は、第二のPKS系(PUFA PKS系または別の種類のPKS系を含む)由来の少なくとも1つの生物学的に活性なドメインもしくはタンパク質および/またはPUFA PKS系の活性に影響を及ぼすタンパク質をコードする少なくとも1つの外因性核酸配列(例えば、組換え核酸分子)の導入とすることができる。本発明のこの局面では、生物は同様に、その内因性PUFA PKS系を含む遺伝子に対する少なくとも1つの改変を有することができる。
【０１３３】
本発明の別の局面では、遺伝的に改変された生物は必ずしも内因的に(天然に)PUFA PKS系を含むとは限らないが、PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの組換え核酸分子を導入するように遺伝的に改変される。生物はPUFA PKS系の産物(PUFAまたは抗生物質などの、生物活性分子)の産生に必要不可欠なPUFA PKS系の成分をともにコードする複数の組換え核酸分子を導入するように、またはPUFA PKS産物の産生に必要不可欠なPUFA PKS系の成分を含む複数のドメインをコードする組換え核酸分子を導入するように遺伝的に改変されることが好ましい。これらの局面の各々と関連する様々な態様を以下により詳細に論じる。
【０１３４】
PUFA PKS系またはPUFA PKS系を含む生物の遺伝的改変は、PUFA PKS系の少なくとも1つのドメイン(ドメインの一部分を含む)、PUFA PKS系の複数のもしくはいくつかのドメイン(隣接するドメイン、非近接的なドメイン、もしくはPUFA PKS系中の異なるタンパク質のドメインを含む)、PUFA PKS系のタンパク質全体、およびPUFA PKS系全体(例えば、PUFA PKS遺伝子によりコードされるタンパク質の全て)または場合により複数のPUFA PKS系(例えば、天然にDHAを産生する生物由来のものと天然にEPAを産生する生物由来のもの)の改変および/または使用を含むことができることを理解すべきである。従って、改変は、内因性PUFA PKS系の単一のドメインに対する小規模の改変、内因性PUFA PKS系の1つもしくは複数のドメインもしくはタンパク質の置換、欠失もしくはそれらに対する付加、組換えPUFA PKS系由来の1つもしくは複数のドメインもしくはタンパク質の導入、内因性PUFA PKS系を有する生物での第二のPUFA PKS系の導入、生物中のPUFA PKS系全体の異なる生物由来のPUFA PKS系との交換、またはPUFA PKS系を内因的に持っていない生物への1つ、2つ、もしくはそれ以上のPUFA PKS系全体の導入を含むことができるが、これらに限定されることはない。PUFA PKS系に対する任意の遺伝的改変が本発明によって包含されることを当業者は理解すると考えられる。
【０１３５】
本明細書で用いられる場合、遺伝的に改変された微生物は、遺伝的に改変された細菌、原生生物、微小藻類、真菌、またはその他の微生物、および特に、本明細書において記載されるスラウストキトリアシエ(Thraustochytriaceae)科およびラビリンチュラシエ(Labyrinthulaceae)科の任意の微生物(例えば、シゾキトリウム、スラウストキトリウム、ジャポノキトリウム(Japonochytrium)、ラビリンチュラ(Labyrinthula)、ラビリンチュロイデス(Labyrinthuloides)など)を含め、スラウストキトリアレス目の属のいずれか(例えば、スラウストキトリド)を含むことができる。そのような遺伝的に改変された微生物は、望ましい結果が達せられるように(すなわち、増加したもしくは改変されたPUFA PKS活性および/またはPKS系を用いる所望の産物の生成)、その常態(すなわち、野生型または天然に存在する)から改変されている(すなわち、変異しているまたは変化している)ゲノムを有する。微生物の遺伝的改変は、古典的系統発生および/または分子遺伝学的技術を用いて達成されうる。そのような技術は当技術分野において公知であり、微生物について、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Pressで一般的に開示されている。この文献（Sambrook et al., 同上）は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。遺伝的に改変された微生物は、そのような改変がその微生物内に望ましい効果を与えるような様式において、核酸分子が挿入、欠失または改変された(すなわち、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換および/または反転により変異された)微生物を含みうる。
【０１３６】
遺伝的改変に適した宿主微生物の例としては、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)を含む酵母、もしくはカンジダ(Candida)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)のようなその他の酵母、またはその他の真菌、例えば、アスペルギルス(Aspergillus)、ノイロスポラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)のような繊維状真菌などが挙げられるが、これらに限定されることはない。これらは発酵工程で有用とできる大腸菌（Escherichia coli）を含むが、これに限定されることはない。または、かつほんの一例として、ラクトバチルス(Lactobaillus)種またはバチルス(Bacillus)種のような宿主を宿主として用いることができる。
【０１３７】
本発明で用いるのに特に好ましい宿主細胞は、スラウストキトリアシエの範囲内のスラウストキトリウム、ジャポノキトリウム、アプラノキトリウム(Aplanochytrium)、エリナ(Elina)およびシゾキトリウム、ならびにラビリンチュラシエの範囲内のラビリンチュラ、ラビリンチュロイデス、およびラビリントミキサ(Labyrinthomyxa)を含むが、これらに限定されない属由来の微生物を含む。これらの属の範囲内の好ましい種は、ラビリンチュラ種、ラビリンチュラ・アルジェリエンシス(Labyrinthula algeriensis)、ラビリンチュラ・シエンコウスキイ(Labyrinthula cienkowskii)、ラビリンチュラ・シャトニイ(Labyrinthula chattonii)、ラビリンチュラ・コエノシスチス(Labyrinthula coenocystis)、ラビリンチュラ・マクロシスチス(Labyrinthula macrocystis)、ラビリンチュラ・マクロシスチス・アトランティカ(Labyrinthula macrocystis atlantica)、ラビリンチュラ・マクロシスチス・マクロシスチス(Labyrinthula macrocystis macrocystis)、ラビリンチュラ・マグニフィカ(Labyrinthula magnifica)、ラビリンチュラ・ミヌタ(Labyrinthula minuta)、ラビリンチュラ・ロスコフェンシス(Labyrinthula roscoffensis)、ラビリンチュラ・バルカノビイ(Labyrinthula valkanovii)、ラビリンチュラ・ビテリナ(Labyrinthula vitellina)、ラビリンチュラ・ビテリナ・パシフィカ(Labyrinthula vitellina pacifica)、ラビリンチュラ・ビテリナ・ビテリナ(Labyrinthula vitellina vitellina)、ラビリンチュラ・ゾプフィイ(Labyrinthula zopfii)を含む、ラビリンチュラの範囲内の任意の種; ラビリンチュロイデス種、ラビリンチュロイデス・ミヌタ(Labyrinthuloides minuta)、ラビリンチュロイデス・シゾキトロプス(Labyrinthuloides  schizochytrops)を含む、任意のラビリンチュロイデス種; ラビリントミキサ種、ラビリントミキサ・ポフリア(Labyrinthomyxa pohlia)、ラビリントミキサ・ソバージェウイ(Labyrinthomyxa sauvageaui)を含む、任意のラビリントミキサ種、アプラノキトリウム種およびアプラノキトリウム・ケルゲレンシス(Aplanochytrium  kerguelensis)を含む、任意のアプラノキトリウム種; エリナ種、エリナ・マリサルバ(Elina marisalba)、エリナ・シノリフィカ(Elina sinorifica)を含む、任意のエリナ種; ジャポノキトリウム種、ジャポノキトリウム・マリナム(Japonochytrium marinum)を含む、任意のジャポノキトリウム種; シゾキトリウム種、シゾキトリウム・アグレガツム(Schizochytrium aggregatum)、シゾキトリウム・リマシヌム(Schizochytrium limacinum)、シゾキトリウム・ミヌツム(Schizochytrium minutum)、シゾキトリウム・オクトスポルム(Schizochytrium octosporum)を含む、任意のシゾキトリウム種; ならびにスラウストキトリウム種、スラウストキトリウム・アグレガツム(Thraustochytrium aggregatum)、スラウストキトリウム・アルジメンターレ(Thraustochytrium arudimentale)、スラウストキトリウム・オーレウム(Thraustochytrium aureum)、スラウストキトリウム・ベンティコラ(Thraustochytrium benthicola)、スラウストキトリウム・グロボサム(Thraustochytrium globosum)、スラウストキトリウム・キンネイ(Thraustochytrium kinnei)、スラウストキトリウム・モティヴム(Thraustochytrium motivum)、スラウストキトリウム・パキデルマム(Thraustochytrium pachydermum)、スラウストキトリウム・プロリフェルム(Thraustochytrium proliferum)、スラウストキトリウム・ローゼウム(Thraustochytrium roseum)、スラウストキトリウム・ストリアツム(Thraustochytrium striatum)、ウルケニア種、ウルケニア・ミヌタ(Ulkenia minuta)、ウルケニア・プロファンダ(Ulkenia profunda)、ウルケニア・レイディエート(Ulkenia radiate)、ウルケニア・サルカリアナ(Ulkenia sarkariana)、およびウルケニア・ビサルゲンシス(Ulkenia visurgensis)を含む、任意のスラウストキトリウム種を含むが、これらに限定されることはない。これらの属の範囲内の特に好ましい種は、シゾキトリウム・アグレガツム、シゾキトリウム・リマシヌム、シゾキトリウム・ミヌツムを含む、任意のシゾキトリウム種; または任意のスラウストキトリウム種(U.ビサルゲンシス、U.アモエボイダ、U.サルカリアナ、U.プロファンダ、U.レイディエート、U.ミヌタおよびウルケニア種BP-5601などの前のウルケニア種を含む)、およびスラウストキトリウム・ストリアツム、スラウストキトリウム・オーレウム、スラウストキトリウム・ローゼウムを含む; ならびに任意のジャポノキトリウム種を含むが、これらに限定されることはない。スラウストキトリアレスの特に好ましい菌株は、シゾキトリウム種(S31)(ATCC 20888); シゾキトリウム種(S8)(ATCC 20889); シゾキトリウム種(LC-RM)(ATCC 18915); シゾキトリウム種(SR21); シゾキトリウム・アグレガツム(GoldsteinおよびBelsky)(ATCC 28209); シゾキトリウム・リマシヌム(HondaおよびYokochi)(IFO 32693); スラウストキトリウム種(23B)(ATCC 20891); スラウストキトリウム・ストリアツム(Schneider)(ATCC 24473); スラウストキトリウム・オーレウム(Goldstein)(ATCC 34304); スラウストキトリウム・ローゼウム(Goldstein)(ATCC 28210); およびジャポノキトリウム種(L1)(ATCC 28207)を含むが、これらに限定されることはない。
【０１３８】
本発明によれば、「スラウストキトリド」、「スラウストキトリアレス微生物」および「スラウストキトリアレス目の微生物」という用語/語句は、同義的に用いることができ、スラウストキトリアシエ科およびラビリンチュラシエ科の両方を含むスラウストキトリアレス目の任意の一員のことを指す。「ラビリンチュリド(Labyrinthulid)」および「ラビリンチュラシエ」という用語は、ラビリンチュラシエの一員を特に指して本明細書で用いられる。スラウストキトリアシエ科の一員であるスラウストキトリドを特に参照するため、「スラウストキトリアシエ」という用語が本明細書で用いられる。従って、本発明の場合、ラビリンチュリドの一員はスラウストキトリドの中に含まれると考えられる。
【０１３９】
進展の結果、スラウストキトリドの分類が頻繁に更新されている。分類学理論家は一般に、スラウストキトリドを藻類または藻類様原生生物に重きを置いている。しかしながら、分類の不確定性のため、本発明において記載される菌株をスラウストキトリドとみなして、以下の生物を含めることが本発明の目的に最善であると考えられる: 目: スラウストキトリアレス; 科: スラウストキトリアシエ(属: スラウストキトリウム、シゾキトリウム、ジャポノキトリウム、アプラノキトリウム、もしくはエリナ)またはラビリンチュラシエ(ラビリンチュラ属、ラビリンチュロイデス、もしくはラビリントミキサ)。同様に、次の属: アルトルニア(Althornia)、コラロキトリウム(Corallochytrium)、ディプロフィリス(Diplophyrys)、およびピロソラス(Pyrrhosorus)がスラウストキトリアシエ科またはラビリンチュラシエ科のいずれかに含まれることもあり、本発明の目的ではスラウストキトリドまたはスラウストキトリアレス目の一員への言及により包含される。本発明の時点で、スラウストキトリドの分類の更新ではラビリンチュラシエ科の中にラビリンチュロイデス属を配しており、ストラメノパイル系統内にスラウストキトリアシエとラビリンチュラシエの2つの科を配することを追認していると認識されている。ラビリンチュラシエはラビリンチュリドもしくはラビリンチュラと一般に呼ばれることもあり、またはラビリンチュロイデスおよびスラウストキトリアシエはスラウストキトリドと一般に呼ばれることもあるが、上記に論じられるように、本発明を明確にする目的で、スラウストキトリドへの言及はスラウストキトリアレス目の任意の一員を包含し、および/またはスラウストキトリアシエとラビリンチュラシエの両方の一員を含むことに留意されたい。最近の分類変更を下記に要約する。
【０１４０】
本明細書において開示されるある特定の単細胞微生物の菌株は、スラウストキトリアレス目の一員である。スラウストキトリドは、進化する分類学的変遷をもつ海洋真核生物である。スラウストキトリドの分類学的配置についての問題は、Moss (「The Biology of Marine Fungi」, Cambridge University Press 105頁(1986)中)、BahnwebおよびJackle(同書、131頁)ならびにChamberlainおよびMoss (BioSystems 21:341 (1988))により概説されている。
【０１４１】
便宜上、スラウストキトリドは、最初、分類学者により藻菌類(Phycomycetes)(藻類様真菌)における他の無色遊走子（zoosporic）真核生物と定められた。しかし、藻菌類という名前は、結局、分類学的地位から落とされ、スラウストキトリドは、卵菌類(Oomycetes)(二鞭毛遊走子の真菌)に保持された。卵菌類は不等毛藻類に関連していると最初に想定され、結局、Barr (Barr. Biosystems 14:359 (1981))により概説されているが、広範囲の超微細構造および生化学的研究がこの想定を裏付けた。卵菌類は、事実上、Leedale (Leedale. Taxon 23:261 (1974))および他の藻類学者により不等毛藻類の群として認められた。しかしながら、卵菌類およびスラウストキトリドは、それらの従属栄養の性質に起因する便宜上、藻類学者(藻類を研究する科学者)よりもむしろ、菌学者(真菌を研究する科学者)により、十分に研究されてきた。
【０１４２】
別の分類学的観点から、進化生物学者は、いかにして真核生物は進化したかについての考えの2つの一般的な学派を発展させてきた。一つの学説は、一連の内部共生を通しての膜結合型細胞小器官の外因性起源を提案している(Margulis, 1970, Origin of Eukaryotic Cells. Yale University Press, New Haven); 例えば、ミトコンドリアは細菌の内部共生に由来し、葉緑体は藍色植物に、および鞭毛はスピロヘータに由来した。他方の学説は、自生過程による、原核生物の祖先の非膜結合型系からの膜結合型細胞小器官の漸進的進化を示唆している(Cavalier-Smith, 1975, Nature(Lond.) 256:462-468)。しかしながら、進化生物学者の両グループは、卵菌類およびスラウストキトリドを真菌から除去し、それらを有色植物界(Chromophyta) (Cavalier-Smith, BioSystems 14:461 (1981)) (この界は、より最近に、他の原生生物を含むように拡大され、この界の一員は現在、ストラメノパイル(Stramenopile)と呼ばれている)における有色植物藻類かまたはプロトクチスタ(Protoctista)界における全藻類に定めている(Margulis and Sagen Biosystems 18:141 (1985))。
【０１４３】
電子顕微鏡の発達で、スラウストキトリドの2つの属、スラウストキトリウムおよびシゾキトリウム(Perkins, 1976, 279-312頁 「Recent Advances in Aquatic Mycology」(E.B.G. Jones編), John Wiley & Sons, New York; Kazama. Can J. Bot. 58:2434 (1980); Barr, 1981, Biosystems 14:359-370)の遊走子の超微細構造についての研究により、スラウストキトリアシエが卵菌類にただ遠縁であるという有力な証拠が提供された。さらに、5SリボソームRNA配列の一致分析(多変量統計学の型)を表す遺伝子データより、スラウストキトリアシエは明らかに、真菌と完全に区別される、真核生物の独自の群であり、赤色および茶色藻類、ならびに卵菌類の一員に最も近く近縁種であることが示されている(Mannella et al. Mol. Evol. 24:228 (1987))。ほとんどの分類学者は、スラウストキトリドを卵菌類から除去することに同意した(Bartnicki-Garcia. 389頁 「Evolutionary Biology of the Fungi」(Rayner, A.D.M., Brasier, C.M. およびMoore, D.編), Cambridge University Press, Cambridge)。
【０１４４】
要約すれば、カバリエル-スミスの分類体系(Cavalier-Smith. BioSystems 14:461 (1981); Cavalier-Smith. Microbio Rev. 57:953 (1993))を用いて、スラウストキトリドは、有色植物界(Chromophyta) (ストラメノパイル)における有色植物藻類に分類されている。この分類学的配置は、より最近に、不等毛門(Heterokonta)の18s rRNAシグナチャーを用いてスラウストキトリドが真菌ではないクロミスト(chromists)であることを実証し、カバリエル-スミス(Cavalier-Smith)らにより再確認された(Cavalier-Smith et al. Phil. Tran. Roy. Soc. London Series BioSciences 346:387 (1994))。これは、スラウストキトリドを、真正真菌界にすべてが配置されている真菌とは完全に異なる界に配置している。
【０１４５】
現在、71の異なる群の真核生物が存在しており(Patterson. Am. Nat. 154:S96(1999))、これらの群内で次の4つの主要な系統が確信をもって同定されている: (1) アルベオラータ(Alveolate)、(2) ストラメノパイル、(3) 陸生植物(Land Plant)-緑藻類-紅色植物門(Rhodophyte)_灰色植物門(Glaucophyte) (「植物」)分岐群および(4) オピストコンタ(Opisthokont)分岐群(真菌および動物)。以前は、これらの4つの主要な系統は界に分類されていたが、「界」という概念の使用はもはや一部の研究者らによって有用とは考えられていない。
【０１４６】
Armstrongにより指摘されているように、ストラメノパイルは3つに分割された管状毛のことをいい、この系統のほとんどの一員がそのような毛状物を持った鞭毛を有する。ストラメノパイル(単細胞生物、精子、遊走子)の運動性細胞は、2本の側方に挿入された鞭毛であって、1本は長く、鞭毛の推進力を反転させる3つに分割された管状毛を持ち、1本は短くて滑らかな鞭毛を有しており、非対称性である。以前、この群があまり広範でなかった場合には、ストラメノパイルはクロミスタ(Chromista)界または不等毛(=異なる鞭毛)藻類と呼ばれていた。何故なら、それらの群が黄緑藻類(yellow-green Algae)、黄金藻類(Golden-brown Algae)、ユースティグマトファイト（Eustigmatophyte）および珪藻とともに、褐藻類(Brown Algae)または褐藻(Phaeophyte)からなっていたからである。その後、一部の従属栄養性の真菌様生物、水生菌類、およびラビリンチュリド(粘網状アメーバ(slime net amoeba))が類似の運動性細胞を保有すると分かったので、光合成色素または藻類のことを指す群名は不適切になった。現在、ストラメノパイル系統内の科の2つが、ラビリンチュラシエおよびスラウストキトリアシエである。歴史的には、これらの独特な微生物に対する分類方略が多数あり、それらは同一目(すなわち、スラウストキトリアレス)の下で分類されることが多い。これらの群における一員の関係は依然として進展中である。PorterおよびLeanderは18S小サブユニットリボソームDNAに基づくデータを進展させて、単系統でのスラウストキトリドとラビリンチュリドとの間の分岐群を示唆している。しかしながら、その分岐群は2つの部門により支えられており; 第一のものはスラウストキトリウムの3種およびウルケニア・プロファンダを含み、第二のものはラビリンチュラの3種、ラビリンチュロイデスの2種およびシゾキトリウム・アグレガツムを含む。
【０１４７】
本発明において用いられるスラウストキトリドの分類学的配置を、したがって以下に要約する:
界: 有色植物界(ストラメノパイル)
門: 不等毛門
目: スラウストキトリアレス(スラウストキトリド)
科: スラウストキトリアシエまたはラビリンチュラシエ
属: スラウストキトリウム、シゾキトリウム、ジャポノキトリウム、アプラノキトリウム、エリナ、ラビリンチュラ、ラビリンチュロイデス、またはラビリンチュロミキサ(Labyrinthulomyxa)。
【０１４８】
ある初期の分類学者らは、スラウストキトリウム属(アメーバ状生活環をもつもの)の数個の最初の一員をウルケニアと呼ばれる異なる属へと分離した。しかし、すべてではないにしても、ほとんどのスラウストキトリド(スラウストキトリウムおよびシゾキトリウムを含む)は、アメーバ状期を現すことは現在知られており、従って、ウルケニアは、ある人たちには妥当な属であるとみなされていない。本明細書で用いられる場合、スラウストキトリウム属は、ウルケニアを含むものとする。
【０１４９】
門および界の上級分類内での分類学的配置の不確定性にもかかわらず、スラウストキトリドは、示差的かつ特徴的な分類のままであり、その一員はスラウストキトリアレス目内に分類可能なままである。
【０１５０】
本発明の別の態様は遺伝的に改変された植物であって、本明細書において記載される多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物学的に活性なドメインまたはタンパク質を含むPKS系を組換えによって発現するよう遺伝的に改変された植物に関する。PUFA PKS系のドメインは、上記されているPUFA PKS系に対する(例えば、シュワネラ・ジャポニカおよび/またはシュワネラ・オレヤナに対する)ドメインのいずれかを、その相同体を含めて、含むことができ、任意の細菌性もしくは非細菌性の微生物(任意の真核微生物ならびにシゾキトリウムおよび/もしくはスラウストキトリウムなどの、任意のスラウストキトリド微生物を含む)由来のPUFA PKS系の任意のドメインまたは前記の米国特許出願第10/124,800号に記載されているスクリーニング法によって同定された微生物由来のPUFA PKS系の任意のドメインを含むこともできる。植物は同様に、I型PKS系(反復もしくはモジュール)、II型PKS系、および/またはIII型PKS系を含むが、これらに限定されない、別のPKS系の少なくとも1つのドメインまたは生物学的に活性なその断片でさらに改変することができる。植物の改変は、PUFA PKS系の少なくとも1つのドメイン(ドメインの一部分を含む)、PUFA PKS系の複数のもしくはいくつかのドメイン(隣接するドメイン、非近接的なドメイン、もしくはPUFA PKS系中の異なるタンパク質のドメインを含む)、PUFA PKS系のタンパク質全体、およびPUFA PKS系全体(例えば、PUFA PKS遺伝子によりコードされるタンパク質の全て)または場合により複数のPUFA PKS系(例えば、天然にDHAを産生する生物由来のものと天然にEPAを産生する生物由来のもの)の改変および/または使用を含むことができる。
【０１５１】
本明細書で用いられる場合、遺伝的に改変された植物は、高等植物、特に、任意の消費可能な植物または本発明の望ましい生物活性分子を産生するのに有用な植物を含む任意の遺伝的に改変された植物を含むことができる。「植物部分」とは、本明細書で用いられる場合、種子、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎、外植片などを含むが、これらに限定されない、植物の任意の部分を含む。遺伝的に改変された植物は、望ましい結果が達せられるように(すなわち、増加したもしくは改変されたPUFA PKS活性および/またはPKS系を用いる所望の産物の生成)、その常態(すなわち、野生型または天然に存在する)から改変されている(すなわち、変異しているまたは変化している)ゲノムを有する。植物の遺伝的改変は、古典的系統発生および/または分子遺伝学的技術を用いて達成されうる。所望のアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子がその植物のゲノムへと組み入れられているトランスジェニック植物を作製するための方法は、当技術分野において公知である。本発明によって遺伝的に改変するのに好ましい植物は、ヒトを含め、動物による消費に適した植物であることが好ましい。
【０１５２】
本発明によって遺伝的に改変するのに好ましい植物(すなわち、植物宿主細胞)は、双子葉植物と単子葉植物の両方を含む任意の高等植物、詳しくは、穀物植物および具体的にはその油分を使われる植物を含む消費可能な植物を含むが、これらに限定されることはない。そのような植物は、例えば、キャノーラ、大豆、菜種、亜麻仁、トウモロコシ、ベニバナ、ヒマワリおよびタバコを含むことができる。その他の好ましい植物は、薬剤、調味料、栄養剤、機能性食品成分もしくは美容的活性剤として使用される化合物を産生することが知られている植物、またはこれらの化合物/薬剤を産生するよう遺伝的に操作されている植物を含む。
【０１５３】
本発明によれば、遺伝的に改変された微生物または植物は、組換え技術を用いてまたは古典的な突然変異誘発およびスクリーニング技術により改変された微生物または植物を含む。本明細書で用いられる場合、遺伝子発現の低下、遺伝子の機能の低下、遺伝子産物(すなわち、遺伝子によりコードされるタンパク質)の機能の低下をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の不活性化(完全または部分的)、欠失、中断、妨害または下方制御と呼ぶことができる。例えば、そのような遺伝子によりコードされるタンパク質の機能の低下をもたらす遺伝子における遺伝的改変は、遺伝子の完全な欠失(すなわち、遺伝子が存在しない、それゆえにタンパク質が存在しない)、タンパク質の不完全な翻訳をもたらすもしくはタンパク質の翻訳をもたらさない(例えば、タンパク質が発現されない)遺伝子における突然変異、またはタンパク質の本来の機能を低下させるもしくは消失させる(例えば、低下した酵素活性もしくは作用をもつまたは酵素活性もしくは作用をもたないタンパク質が発現される)遺伝子における突然変異の結果とすることができる。遺伝子発現または機能の増加をもたらす遺伝的改変は、遺伝子の増幅、過剰産生、過剰発現、活性化、増強、付加、または上方制御と呼ぶことができる。
【０１５４】
本発明による微生物または植物の遺伝的改変は、PKS系が内因性であれおよび生物への組換え核酸分子の導入により遺伝的に改変されて、内因性で(内因性の系を改変するまたは改変しないという選択で)あれ、または組換え技術によって完全に供与されているのであれ、微生物または植物により発現されるPKS系の活性に影響を及ぼすことが好ましい。PUFA PKS系またはこのような系を発現する生物のPUFA産生プロファイルを改変することは、遺伝的改変のない場合と比べて(すなわち、改変されていない野生型の微生物もしくは植物またはPUFA系に関しては少なくとも改変されていない微生物もしくは植物-すなわち、PUFA合成に関連しないその他の改変を有する可能性がある生物と比べて)、宿主微生物または植物による任意の1つもしくは複数のPUFA (またはPUFA PKS系により産生されるその他の生物活性分子)の産生の任意の検出可能なまたは測定可能な変化をもたらすことを含む。PKS系の活性に影響を及ぼすことは、遺伝的改変のない場合と比べて、生物により発現されるPKS系の任意の検出可能なまたは測定可能な変化または改変をもたらす任意の遺伝的改変を含む。PKS系の検出可能な変化または改変は、遺伝的改変のない場合の内因性PUFA PKS系と比べて改変されたPUFA PKS系におけるドメインの任意の1つまたは複数の発現および/または生物活性の変化または改変(その導入、増加または減少); 生物がPUFA PKS系の産物の産生などの、測定可能/検出可能なPKS系の活性を持つような、生物へのPKS系の活性の導入(すなわち、生物は遺伝的改変の前にはPKS系またはPUFA PKS系を含んでいなかった); PKS系の活性が改変されるような、生物により内因的に発現されるPKS系とは異なるPKS系由来の機能ドメインの生物への導入(例えば、本明細書において記載される細菌性PUFA PKSドメインをスラウストキトリドなどの、非細菌性PUFA PKS系を内因的に発現する生物に導入する); PKS系により産生される生物活性分子(例えば、PUFA)の量の変化(例えば、系が遺伝的改変のない場合と比べてより多く(増加した量)のまたはより少ない(減少した量の)所定の産物を産生する); PKS系により産生される生物活性分子の種類の変化(例えば、PUFAの種類の変化) (例えば、系がさらなるもしくは異なるPUFA、新たなもしくは異なる産物、または系により天然に産生されるPUFAもしくはその他の産物の変異体を産生する); ならびに/あるいはPKS系により産生される複数の生物活性分子の比率の変化(例えば、系が、あるPUFAと別のPUFAとの異なる比率をもたらす、遺伝的改変のない場合と比べて完全に異なる脂質プロファイルをもたらす、または天然の立体配置と比べてトリアシルグリセロールにおいて異なる位置に様々なPUFAを配置する)を含むことができるが、これらに限定されることはない。そのような遺伝的改変は、任意の種類の遺伝的改変を含み、具体的には、組換え技術によりおよび/または古典的な突然変異誘発により作出される改変を含む。
【０１５５】
PUFA PKS系における機能ドメインまたはタンパク質の活性を増加させることの言及は、そのドメインまたはタンパク質系の増加した機能性を生じるそのドメインまたはタンパク質を含む(またはそのドメインもしくはタンパク質が導入されることになっている)生物におけるいずれの遺伝的改変をも指し、そのドメインまたはタンパク質のより高い活性(例えば、特異的活性またはインビボでの酵素活性)、そのドメインまたはタンパク質系の低下した抑制または分解、およびそのドメインまたはタンパク質の過剰発現を含むことができることを留意されたい。例えば、遺伝子コピー数は増加されうる、発現レベルはその天然のプロモーターのレベルより高い発現レベルを与えるプロモーターの使用により増加されうる、または遺伝子は、その遺伝子によりコードされるドメインもしくはタンパク質の活性を増加させるように遺伝子操作もしくは古典的な突然変異誘発により変化されうる。
【０１５６】
同様に、PUFA PKS系における機能ドメインまたはタンパク質の活性を減少させることの言及は、そのドメインまたはタンパク質の減少した機能性を生じるそのようなドメインまたはタンパク質を含む(またはそのドメインもしくはタンパク質が導入されることになっている)生物におけるいずれの遺伝的改変をも指し、そのドメインまたはタンパク質の減少した活性、そのドメインまたはタンパク質の増加した抑制または分解、およびそのドメインまたはタンパク質の発現の低下もしくは消失を含む。例えば、本発明のドメインまたはタンパク質の作用は、そのドメインもしくはタンパク質の生成を遮断することもしくは低下させること、そのドメインもしくはタンパク質をコードする遺伝子もしくはその部分を「ノックアウトすること」、ドメインもしくはタンパク質活性を低下させること、またはそのドメインもしくはタンパク質の活性を阻害することにより減少されうる。ドメインまたはタンパク質の生成を遮断することまたは低下させることは、増殖培地において誘導化合物の存在を必要とするプロモーターの制御下にそのドメインまたはタンパク質をコードする遺伝子を配置することを含みうる。その誘導物質が培地から涸渇してしまうような条件を確立することにより、そのドメインまたはタンパク質をコードする遺伝子の発現(およびそれゆえに、タンパク質合成の発現)を止めることができる。本発明者らは実施例の項でスラウストキトリド微生物中の標的遺伝子を欠失させる(ノックアウトする)能力を実証する。ドメインまたはタンパク質の活性を遮断することまたは低下させることはまた、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,743,546号に記載される方法と類似した切除技術方法を用いることを含みうる。この方法を用いるために、対象となるそのタンパク質をコードする遺伝子は、そのゲノムからのその遺伝子の特定の制御された切除が可能となる特定の遺伝子配列の間にクローニングされる。切除は、例えば、米国特許第4,743,546号のように、培養の培養温度における転換により、またはいくらかの他の物質的もしくは栄養的シグナルにより促進することができる。
【０１５７】
本発明の1つの態様では、微生物の内因性PUFA PKS系が、例えば、古典的な突然変異誘発および選択技術ならびに/または遺伝子操作技術を含む、分子遺伝学的技術により遺伝的に改変される。遺伝子操作技術は、例えば、内因性遺伝子の一部分を欠失させるための(実施例で実証される)または内因性遺伝子の一部分を異種配列と交換するための(実施例で実証される)ターゲッティング組換えベクターの使用を含むことができる。宿主ゲノムに導入できる異種配列の例としては、別のPKS系または場合によりPUFA PKS系全体(例えば、PUFA PKS系と関連する全ての遺伝子)由来の少なくとも1つの機能性PUFA PKSドメインまたはタンパク質をコードする配列が挙げられる。異種配列は同様に、PUFA PKS系由来の天然ドメインの改変機能ドメイン(相同体)をコードする配列を含むことができる。宿主ゲノムに導入できるその他の異種配列は、それ自体PKS系のドメインではないが、内因性PKS系の活性に影響を及ぼしうるタンパク質または機能ドメインをコードする配列を含む。例えば、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を宿主ゲノムに導入することができる。内因性PUFA PKS系に対し作出されうる特異的な改変を本明細書において詳細に論じる。
【０１５８】
遺伝的に改変された植物の作出に関して、植物の遺伝子操作の方法は同様に、当技術分野において周知である。例えば、生物学的および物理学的な形質転換プロトコルを含めて、植物形質転換のための多数の方法が開発されている。例えば、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R.およびThompson, J.E. 編 (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) 67-88頁中のMikiら、「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」を参照されたい。さらに、植物細胞または組織の形質転換および植物の再生のためのインビトロ培養法およびベクターが使用可能である。例えば、Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R.およびThompson, J.E 編 (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) 89-119頁中のGruberら「Vectors for Plant Transformation」を参照されたい。
【０１５９】
植物に発現ベクターを導入するために最も広く用いられている方法は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)の天然の形質転換系に基づく。例えば、Horsch et al., Science 227:1229 (1985)を参照されたい。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)およびA.リゾゲネス(A. rhizogenes)は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性の土壌細菌である。A.ツメファシエンスおよびA.リゾゲネスの、それぞれ、TiおよびRiプラスミドは、植物の遺伝的形質転換に関与する遺伝子を保有する。例えば、Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991)を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウムを介した遺伝子移入の方法に関する記載は、Gruber et al., 前記、Miki et al., 前記、Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)、ならびに米国特許第4,940,838号および同第5,464,763号を含め、多数の文献によって供与されている。
【０１６０】
植物形質転換の別の一般的に適用可能な方法は、DNAがマイクロプロジェクタイルの表面で運搬されるマイクロプロジェクタイルを介した形質転換である。発現ベクターは、植物細胞壁および膜を貫通させるのに十分なスピードにまでマイクロプロジェクタイルを加速する遺伝子銃装置を用いて植物組織に導入される。Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)。
【０１６１】
植物へのDNAの物理学的送達のための別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Zhang et al. , Bio/Technology 9:996 (1991)。あるいは、リポソームまたはスフェロプラスト融合を用いて、発現ベクターを植物に導入している。Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987)。CaCl2沈殿、ポリビニルアルコールまたはポリ-L-オルニチンを用いたプロトプラストへのDNAの直接的な取込みも報告されている。Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)およびDraper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982)。プロトプラストならびに全細胞および組織のエレクトロポレーションも記載されている。Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)およびSpencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)。
【０１６２】
本発明のこの態様の1つの局面では、生物(微生物または植物)の遺伝的改変は、(1) PUFA PKS系の少なくとも1つのドメインの生物活性を有するアミノ酸配列をコードする組換え核酸分子の宿主への導入; および/または(2) PUFA PKS系の活性に影響を及ぼす少なくとも1つのタンパク質もしくは機能ドメインをコードする組換え核酸分子の宿主への導入を含むことができる。宿主は、(1) いずれのPKS系も発現しない宿主細胞であって、PKS系のすべての機能ドメインが宿主細胞に導入され、かつ少なくとも1つの機能ドメインが本明細書において記載されるPUFA PKS系由来である宿主細胞; (2) 本明細書において記載されるPUFA PKS系の少なくとも1つの機能ドメインを有するPKS系(内因性または組換え)を発現する宿主細胞、および(3) 必ずしも本明細書において記載されるPUFA PKS系由来のドメイン機能を含むとは限らないPKS系(内因性または組換え)を発現する宿主細胞(この場合、宿主細胞に導入される組換え核酸分子は、本明細書において記載されるPUFA PKS系の少なくとも1つの機能ドメインをコードする核酸配列を含む)。言い換えれば、本発明は、生物が本明細書において記載されるPUFA PKS系由来(例えば、シュワネラ・ジャポニカまたはシュワネラ・オレヤナに由来するまたはから)の少なくとも1つのドメインを含み(内因的にまたは組換え改変により導入されるかのいずれかで)、遺伝的改変が宿主細胞中のPUFA PKS活性に測定可能な影響を及ぼす、任意の遺伝的に改変された生物(例えば、微生物または植物)を包含することを意図する。
【０１６３】
本発明は特に、微生物および植物によるPUFA PKS産物の産生に影響を及ぼすよう微生物および植物を遺伝的に改変するための本明細書において記載される海洋細菌由来のPUFA PKS系およびその一部分の使用に関する。先に論じられるように、本発明の態様で有用な細菌は、約20℃に近いもしくは約20℃を超える温度で、好ましくは約25℃に近いもしくは約25℃を超える温度でおよびさらにより好ましくは約30℃に近いもしくは約30℃を超える温度(または全ての温度単位において、20℃〜30℃のもしくはそれより高い任意の温度、例えば、21℃、22℃、23℃...)で増殖でき、その温度でPUFAを産生できるPUFA PKS系(例えば、その温度で十分に機能する酵素およびタンパク質)を有することができる。好ましい態様では、そのような細菌はそのような温度でPUFAを産生する。本明細書において先に記載されているように、米国特許第6,140,486号に記載されている海洋細菌、その他のシュワネラ種(例えば、菌株SCRC2738)およびビブリオ・マリナスは、より高い温度(例えば、20℃の温度または20℃を超える温度)であったとしても、PUFAを産生せず(または実質的にほとんどもしくは全く検出できないPUFAを産生し)、仮にあったとしても、十分には増殖せず、このことがこれらの細菌に由来するPUFA PKS系の実用性を、特に野外条件下での植物の適用において制限している。
【０１６４】
本発明の1つの態様では、PUFA PKS系と、高い温度で増殖しPUFAを産生する能力とを有するさらなる細菌を同定することができる。例えば、ナイスタチン(抗真菌性)またはシクロヘキシミド(真核生物のタンパク質合成の阻害剤)などの真核生物増殖の阻害剤を、海洋もしくは河口習性のような生息地/ニッチの類、またはそのような細菌を見出せるその他任意の生息地から収集される水サンプル/土壌サンプルより初期の菌株を培養/選択するために使われる寒天プレートに添加することができる。この工程は、真核生物株の混入がない(または最小限の)状態で細菌株の濃縮のための選択を補助できる。この選択工程では、高温(例えば、20〜30℃または25〜30℃)でのプレートの培養、次いで少なくとも1つのPUFAを産生する菌株の選択との併用で、(約20℃未満の温度およびより好ましくは約5℃を下回る温度でPUFA産生を示すにすぎない先行技術における細菌株とは対照的に)高温で作動するPUFA PKS系を有する候補細菌株を初期に同定することができる。任意の細菌供給源由来の遺伝子についてより高い温度でPUFA PKS機能を評価するため、無細胞抽出物を作出し、様々な温度でPUFA産生について試験した後に、より高い温度範囲(例えば、15℃、20℃、25℃、もしくは30℃または場合によりそれより高い)で酵素活性/生物活性を有するPUFA PKS遺伝子を含んだ微生物の選択を行うことができる。本発明者らは、PUFA PKS遺伝子の供給源として特に適している2つの例示的な細菌(例えば、シュワネラ・オレヤナおよびシュワネラ・ジャポニカ; 実施例参照)を同定しており、その他のものは容易に同定可能であり、またはPUFA PKS遺伝子を含むことが知られており、本発明の態様において有用とすることができる(例えば、シュワネラ・ゲリジマリナ(Shewanella gelidimarina))。
【０１６５】
本明細書において記載される特定の海洋細菌由来のPUFA PKS系、ならびに、例えば、スラウストキトリド由来のPUFA PKS遺伝子を使用する既報の非細菌性PUFA PKS系およびその他の真核生物PUFA PKS系を用いて、EPA、DHA、ARA、GLA、SDAおよびその他(以下に詳細に記載される)を含むようPUFA産物の範囲を拡大させるため、ならびに抗生物質、その他の薬学的化合物、およびその他の所望の産物を含む、多種多様な生物活性分子を産生させるため、遺伝子混合を使用することができる。これらの生物活性分子を得るための方法には、様々な生物由来の遺伝子の混合だけではなく、本明細書において開示されるPUFA PKS遺伝子を遺伝的に改変する様々な方法も含まれる。本発明の細菌性PUFA PKS系の遺伝的な根拠とドメイン構造に関する知識によって、様々な生物活性分子を産生する新規の遺伝的に改変された生物をデザインするための基礎が提供される。具体的には、本明細書において記載される細菌性PUFA PKS遺伝子の使用によって、既報の海洋細菌由来のPUFA PKS遺伝子を用いて可能であるよりも高い温度で機能し、高レベルの産物を産生する改変されたPUFA PKS系を作出するその能力が拡げられる。任意のPKSドメインおよび関連遺伝子の混合および改変が本発明者らにより企図されているが、例証として、PUFA PKS系の各種可能な操作が遺伝的改変および生物活性分子の産生に関して以下に論じられる。
【０１６６】
上記の海洋細菌PUFA PKS遺伝子と併せて用いるのに特に有用なPUFA PKS遺伝子およびタンパク質は、シゾキトリウムおよびスラウストキトリウムで同定されたものなどの、スラウストキトリド由来のPUFA PKS遺伝子を含む。そのような遺伝子は、本明細書において記載される海洋細菌遺伝子由来の様々な遺伝子、その一部分およびその相同体と組み合わせて、改変、ターゲティング、宿主細胞への導入におよび/またはそれ以外には上記の遺伝子混合と改変にとりわけ有用である。これらは米国特許出願第10/810,352号、前記(スラウストキトリウム)に、米国特許出願第10/124,800号、前記(シゾキトリウム)に、および米国特許第6,566,583号、前記(シゾキトリウム)に詳細に記載されている。シゾキトリウムとスラウストキトリウムの両者におけるPUFA PKS遺伝子は、本明細書においてOrfA、OrfBおよびOrfCと称される3つの多ドメインをコードする読み取り枠で構成されている。
【０１６７】
シゾキトリウムOrfAの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:13として表されている。OrfAは8730ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:14として表される2910アミノ酸の配列をコードする。OrfAの中には12個のドメインがある: (a) 1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン(SEQ ID NO:14の約1位から約500位により表される); (b) 1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン(SEQ ID NO:14の約575位から約1000位により表される); (c) 9個のアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン(SEQ ID NO:14の約1095位から約2096位により表され； および9個のACPドメインの各々に対する活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列に関して、次の通りである: ACP1 = S1157; ACP2 = S1266; ACP3 = S1377; ACP4 = S1488; ACP5 = S1604; ACP6 = S1715; ACP7 = S1819; ACP8 = S1930; およびACP9 = S2034); ならびに(d) 1個のβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン(SEQ ID NO:14の約2200位から約2910位により表される)。
【０１６８】
シゾキトリウムOrfBの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:15として表されている。OrfBは6177ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:16として表される2059アミノ酸の配列をコードする。OrfBの中には4個のドメインがある: (a) 1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン(SEQ ID NO:16の約1位から約450位により表される); (b) 1個の鎖伸長因子(CLF)ドメン(SEQ ID NO:16の約460位から約900位により表される); (c) 1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン(SEQ ID NO:16の約901位から約1400位により表される); ならびに(d) 1個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン(SEQ ID NO:16の約1550位から約2059位により表される)。
【０１６９】
シゾキトリウムOrfCの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:17として表されている。OrfCは4509ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:18として表される1503アミノ酸の配列をコードする。OrfCの中には3個のドメインがある: (a) 2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン(SEQ ID NO:18の約1位から約450位により表される; およびSEQ ID NO:18の約451位から約950位により表される); ならびに(b) 1個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン(SEQ ID NO:18の約1000位から約1502位により表される)。
【０１７０】
スラウストキトリウムOrfAの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:19として表されている。OrfAは8433ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:20として表される2811アミノ酸の配列をコードする。OrfAの中には11個のドメインがある: (a) 1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン(SEQ ID NO:20の約1位から約500位により表される); (b) 1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン(SEQ ID NO:20の約501位から約1000位により表される); (c) 8個のアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン(SEQ ID NO:20の約1069位から約1998位により表され； および9個のACPドメインの各々に対する活性部位セリン残基(すなわち、パンテテイン結合部位)の位置は、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列に関して、次の通りである: 1128 (ACP1)、1244 (ACP2)、1360 (ACP3)、1476 (ACP4)、1592 (ACP5)、1708 (ACP6)、1824 (ACP7)および1940 (ACP8)); ならびに(d) 1個のβ-ケトアシル-ACPレダクターゼ(KR)ドメイン(SEQ ID NO:20の約2001位から約2811位により表される)。
【０１７１】
スラウストキトリウムOrfBの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:21として表されている。OrfBは5805ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:22として表される1935アミノ酸の配列をコードする。OrfBの中には4個のドメインがある: (a) 1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン(SEQ ID NO:22の約1位から約500位により表される); (b) 1個の鎖伸長因子(CLF)ドメン(SEQ ID NO:22の約501位から約1000位により表される); (c) 1個のアシルトランスフェラーゼ(AT)ドメイン(SEQ ID NO:22の約1001位から約1500位により表される); ならびに(d) 1個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン(SEQ ID NO:22の約1501位から約1935位により表される)。
【０１７２】
スラウストキトリウムOrfCの完全なヌクレオチド配列は、本明細書においてSEQ ID NO:23として表されている。OrfCは4410ヌクレオチドの配列(終止コドンを含んでいない)であり、これは本明細書においてSEQ ID NO:24として表される1470アミノ酸の配列をコードする。Orfcの中には3個のドメインがある: (a) 2個のFabA様β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ(DH)ドメイン(SEQ ID NO:24の約1位から約500位により表される; およびSEQ ID NO:24の約501位から約1000位により表される); ならびに(b) 1個のエノイル-ACPレダクターゼ(ER)ドメイン(SEQ ID NO:24の約1001位から約1470位により表される)。
【０１７３】
従って、本発明により包含されるのは、本明細書において記載される細菌性PUFA PKS系(例えば、本明細書において記載されるシュワネラ・ジャポニカまたはシュワネラ・オレヤナPUFA PKS系に由来するまたはから)の少なくとも1つの機能ドメインもしくはタンパク質(または生物学的に活性なその断片もしくは相同体)をコードする生物において少なくとも1つの核酸配列を遺伝的に改変することにより、および/またはそのようなドメインもしくはタンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を発現することにより、微生物または植物の細胞を遺伝的に改変するための方法である。そのような配列の様々な態様、生物を遺伝的に改変するための方法、および特異的改変は、上記に詳細に記載されている。典型的には、その方法は、特定の生物活性分子を産生する特定の遺伝的に改変された生物を作出するために用いられる。
【０１７４】
本発明の特に好ましい態様は、遺伝的に改変された植物または植物の一部分であって、PUFA PKS系の所望の産物(例えば、PUFAまたはその他の生物活性分子)を産生するように本明細書において記載されるPUFA PKS遺伝子を用いて遺伝的に改変されている植物に関する。本発明の細菌性PUFA PKS系の遺伝的な根拠とドメイン構造に関する知識は、様々なスラウストキトリドPUFA PKS系に対する遺伝的な根拠とドメイン構造に関する知識と相まって、様々な生物活性分子を産生する新規の遺伝的に改変された植物をデザインするための基礎を提供する。例えば、今後は、本明細書において記載されるPUFA PKS系由来のドメインの様々な組合せから得られる新規のPUFA PKS構築体をデザインし、操作することができる。そのような構築体を最初に、所望の生物活性分子の産生を実証するため、大腸菌、酵母、またはスラウストキトリドなどの微生物において調製し、例えば、その後で構築体の単離および植物を形質転換して類似の生物活性分子の産生特性を植物に与えるための構築体の使用を行うことができる。植物はPUFA PKS系を内因的に含むことが知られておらず、それ故に、本発明のPUFA PKS系は、独特な脂肪酸産生能力を有する植物を作出するための機会となる。植物を遺伝的に操作して、その植物においてEPA、DHA、DPA、ARA、GLA、SDAおよびその他を含む、1つまたは複数のPUFAを産生させることは本発明の特に好ましい態様である。本発明は、様々な比率と形態でのいくつかの「デザイナーオイル」のいずれかの1つを作出する能力を供与する。さらに、本明細書において記載される特定の海洋細菌由来のPUFA PKS遺伝子の開示は、PUFA産生の範囲をいっそう容易に拡げ、大部分の穀物植物を増殖させるのに使われる温度範囲内でそのようなPUFAをうまく産生させる機会を供与する。
【０１７５】
本発明の別の態様は遺伝的に改変されたスラウストキトリド微生物であって、内因性の多価不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系を有し、内因性のPUFA PKS系が改変のないスラウストキトリド微生物と比べて、微生物による多価不飽和脂肪酸(PUFA)の発現プロファイルを変化させるように遺伝的に改変されている微生物に関する。本発明において宿主生物として有用なスラウストキトリド微生物は内因的に、PUFA PKSを含み、発現する。本発明に基づく遺伝的改変は、本明細書において記載される細菌性PUFA PKS由来のPUFA PKSドメインもしくはタンパク質(またはその相同体もしくは機能断片)をコードする少なくとも1つの組換え核酸配列のスラウストキトリドへの導入を含む。スラウストキトリドは同様に、置換、付加、欠失、突然変異を含めて、ならびにスラウストキトリドPUFA PKS遺伝子の部分的なまたは完全な欠失および本発明の好ましい海洋細菌由来のPUFA PKS遺伝子との交換を含めて、その内因性のPUFA PKS遺伝子内に遺伝的改変を含むことができる。
【０１７６】
本発明のこの態様は、遺伝的に改変された微生物およびPUFAに富む脂質(トリアシルグリセロール(TAG)および膜結合リン脂質(PL))を効率的に産生するための方法の本発明者らの開発により、EPAなどの、所望のPUFAに富む商業的に価値のある脂質の産生に特に有用である。そのような微生物は同様に、植物細胞の形質転換で後日用いるために最適な遺伝子の組合せを判定するための「代理」宿主として有用であるが、例えば、多くの細菌宿主および酵母宿主を含め、その他の微生物を「代理」宿主として用いることもできる。
【０１７７】
本発明のこの特定の態様は、一つには以下の知識から導かれる: (1) 選択の微生物の、詳しくは、商業的に開発されたシゾキトリウム菌株ATCC 20888などの、スラウストキトリドの生来のTAG産生能力の利用; (2) 真核生物における、具体的には、スラウストキトリアレス目の一員における、および本発明で用いられる海洋細菌におけるPUFA PKS生合成経路(すなわち、PUFA PKS系)の本発明者らの詳細な理解; ならびに(3) シゾキトリウムでの相同的遺伝子組換え系の使用。関与する系に関する本発明者らの知識に基づき、同じ一般的方法を活用して、EPA以外のPUFAを産生することができる。
【０１７８】
例えば、本発明の1つの態様では、DHAおよびDPAを通常産生するPUFA PKS酵素をコードするシゾキトリウム遺伝子などの、内因性のスラウストキトリドPUFA PKS遺伝子は、無作為もしくは標的突然変異誘発により改変され、本明細書において詳細に記載されるシュワネラ・ジャポニカもしくはシュワネラ・オレヤナ由来の海洋細菌PUFA PKS遺伝子などの、相同PKSタンパク質をコードするその他の生物由来の(例えば、細菌もしくはその他の供給源由来の)遺伝子と交換され、および/または遺伝的に改変されたシゾキトリウム、スラウストキトリウムもしくはその他のスラウストキトリドPUFA PKS遺伝子と交換される。上記に論じられるように、海洋細菌およびスラウストキトリドのまたはその他のPKS系由来の様々なドメインをコードする核酸分子の組合せを「混ぜ合わせ、適合させ」て、所望のPUFAまたはその他の生物活性分子の産生をもたらしうる構築体を作出することができる。これらの導入されおよび/または改変された遺伝子によりコードされる酵素の産物は、例えば、EPAとすることができ、あるいはその産物はその他のPUFAを含めて、他の何らかの関連分子とすることができることがある。この方法の1つの特徴は、例えば、EPAを産生するため、海洋細菌遺伝子の能力をさらに活用しながら、PLおよびTAGへのPUFAの効率的な産生と組込みに不可欠な蓄積機構とスラウストキトリドPUFA合成の内因性成分を使用することである。具体的には、本発明のこの態様は、親菌株の高い油分産生力を維持しながら、生物によって産生されるPUFAの種類を改変することに向けられる。
【０１７９】
以下の論考のいくつかでは例示的な宿主生物として生物シゾキトリウムが使われるが、スラウストキトリウム、ラビリンチュロイデス、およびジャポノキトリウム属の一員を含め、任意のスラウストキトリドを本発明によって改変することができる。例えば、上記のスラウストキトリウムは、本明細書において記載される方法による遺伝的改変のための宿主生物として機能を果たすこともできるが、スラウストキトリウムのPUFA PKS遺伝子はシゾキトリウムなどの、別のスラウストキトリドの内因性PUFA PKS遺伝子を改変するために使用される可能性がいっそう高い。さらに、米国特許出願第10/124,800号、前記に記載の生物をスクリーニングするための方法を用いて、本方法で有用なその他の生物を同定することができ、そのような全ての生物が本明細書において包含される。さらに、本明細書において提供される例示的な情報を用いてPUFA PKS系を構築し、細菌または酵母などの、その他の微生物で産生し、植物細胞に形質転換して、遺伝的に改変された植物を作出することができる。本明細書において論じられる概念を、必要に応じて様々な系に適用することができる。
【０１８０】
本発明のこの態様を以下のように例証することができる。例証として、シゾキトリウムにおけるPUFA合成と蓄積に関する本発明者らの現在の理解に基づき、全体の生化学過程を三分割することができる。
【０１８１】
第一に、シゾキトリウム油(DHAおよびDPA)の中に蓄積するPUFAは、上記に論じられるようにPUFA PKS系の産物である。シゾキトリウム中のPUFA PKS系は、かなりの量の中間体化合物の放出なしにマロニル-CoAを最終産物PUFAに変換する。シゾキトリウムではおよび同様にスラウストキトリウムでは、これらの生物におけるPUFAの実際の合成に必要とされることが知られている酵素ドメインの全てをコードする3つの遺伝子がこれまでに同定されている(OrfA、BおよびC; 同様に、それぞれ、シゾキトリウムではSEQ ID NO:13、15および17により表され、スラウストキトリウムではSEQ ID NO:19、21および23により表される)。類似セットの遺伝子(酵素ドメインの相同的なセットを含有するタンパク質をコードする)が、PUFAを産生するその他いくつかの非真核生物、すなわち、海洋細菌のいくつかの菌株からクローニングされ、特徴付けられており、今回、本発明において、本発明者らは海洋細菌の特に有用な2つの菌株、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナにおいてPUFA PKS遺伝子を同定し、配列決定した。これらの海洋細菌のPUFA産物はEPAである。発酵条件における産生生物(例えば、シゾキトリウム)の生理的増殖要件が満たされる限り、任意のPUFA PKS遺伝子セットまたはその組合せを、本明細書の実施例に記載されるシゾキトリウム遺伝子に置き換えられると想定できることは本発明の態様である。具体的には、前記のPUFA産生細菌株は比較的高い(例えば、25℃を超える)温度で十分に増殖し、このことはそのPUFA PKS遺伝子産物がシゾキトリウムに対する標準的な増殖温度(25〜30℃)で機能できることをさらに示唆している。その他の現在のところ研究されていないまたは同定されていないPUFA産生細菌もスラウストキトリドの改変に有用なPUFA PKS遺伝子を含みうることが、本開示から当業者には明らかであると考えられる。
【０１８２】
第二に、PUFA合成に直接的に関与する酵素をコードする遺伝子に加えて、「アクセサリー」酵素が必要とされる。その遺伝子は、PUFA PKS複合体に存在するアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメインを活性化するホスホパンテテイントランスフェラーゼ(PPTase)をコードする。この補因子の添加によるACPドメインの活性化は、PUFA PKS酵素複合体が機能するのに必要とされる。これまでに同定されているPUFA PKS系のACPドメインの全てが高度のアミノ酸配列保存を示しており、理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、シゾキトリウムおよびその他のスラウストキトリドのPPTaseがその他のPUFA PKS系由来のACPドメインを認識し活性化しうる、およびその逆の場合も同じであると考えている。この遺伝子は、本明細書において記載される海洋細菌PUFA PKS系におけるPUFA PKS系の一部として同定され、含まれており、本発明により包含される遺伝的改変のシナリオで用いることができる。異種のPPTaseおよびPUFA PKS遺伝子がともに機能して、PUFA産物を産生できるという原理の証拠として、本発明者らは、シゾキトリウム由来のPUFA PKS遺伝子とともに2つの異なる異種PPTaseを用いて、細菌宿主細胞でPUFAを産生することを実証した。
【０１８３】
第三に、シゾキトリウムおよびその他のスラウストキトリドでは、PUFA PKS系の産物はリン脂質(PL)とトリアシルグリセロール(TAG)の両方に効率的に向けられる。本発明者らのデータにより、PUFAがPKS複合体のACPドメインからコエンザイムA (CoA)へ転移されることが示唆される。その他の真核生物と同じように、このアシル-CoAはその後、PLおよびTAG分子を形成する様々なアシル-トランスフェラーゼに対する基質としての機能を果たすはずである。その一方で、データから細菌では、CoAへの転移は起こらず、むしろ、PLを形成するアシル-トランスフェラーゼへのPKS複合体のACPドメインからの直接的な転移が起こることが示される。PUFAをACPからCoAへ転移するシゾキトリウムの酵素系は明らかに、DHAとDPAの両方を認識することができ、それ故に、本発明者らは、PUFA PKS系の任意のPUFA産物(PUFA PKS ACPドメインに付着されるような)が基質としての機能を果たすものと予測できると考えている。
【０１８４】
それ故、本発明の1つの態様では、本発明者らは、シゾキトリウム、別のスラウストキトリド宿主由来の内因性PPTase、または本発明の海洋細菌由来のPPTase、ならびにPUFA-ACPからPUFA-CoAへのトランスフェラーゼ活性およびTAG/PL合成系(またはその他の内因性のPUFA ACPからTAG/PLへの機構)を使用しながら、スラウストキトリド宿主中のPUFA PKS酵素複合体の成分をコードする遺伝子を変化させること(例えば、本発明の海洋細菌PUFA PKS由来の少なくとも1つのドメインまたはその機能部分をコードする少なくとも1つの組換え核酸分子を導入することにより)を提案する。本発明のこれらの方法は実験データにより支持されており、そのうちのいくつかが実施例の項で詳細に示される。
【０１８５】
本発明者らおよび他者らは、PUFA PKS系を生物間で転移できること、およびいくつかの部分が交換可能であることを以前に明らかにしている。より詳しくは、海洋細菌、シュワネラSCR2738 (Yazawa Lipids 31:S297 (1996))およびビブリオ・マリナスのPUFA PKS経路(シュワネラ由来のPPTaseとともに) (米国特許第6,140,486号)を異種宿主に(すなわち、大腸菌に)うまく転移できることが以前に明らかにされている。さらに、これらの2つの生物(シュワネラSCRC2738およびビブリオ・マリナス)由来のPUFA PKS酵素のサブユニット間の構造相同性の度合いは、この2つの系由来の遺伝子を混合させ、適合させることが可能であったようなものである(米国特許第6,140,486号、前記)。これまでに同定されたPUFA PKS酵素の全ての機能ドメインが、互いに何らかの配列相同性を示す。同様に、これらのデータから、海洋細菌由来のものを含め、PUFA PKS系は、シゾキトリウムおよびその他のスラウストキトリドに転移でき、それらにおいて機能しうることが示された。
【０１８６】
本発明者らは、今回、シゾキトリウム由来のPUFA PKS遺伝子(OrfA、BおよびC)を大腸菌宿主で発現させており、その細胞がシゾキトリウムにおけるこれらのPUFAの内因性の産生とほぼ同じ比率でDHA およびDPAを作出していることを実証した(実施例3参照)。それ故に、組換えシゾキトリウムPUFA PKS遺伝子が機能的なPUFA合成系をコードすることが実証された。さらに、スラウストキトリウム23B OrfAおよびOrfC遺伝子の全部または一部分がシゾキトリウムで機能することが明らかにされた(実施例7参照)。さらに、本発明者らは同様に、シゾキトリウムorfCコード配列全体をスラウストキトリウム23B OrfCコード配列により完全かつ正確に交換し、この結果、シゾキトリウム宿主でのPUFA産生プロファイルをスラウストキトリウムのものへ移行させた(実施例8参照)。
【０１８７】
本発明者らは、PPTaseが異種のPUFA PKS ACPドメインを活性化できることを以前に見出した。ビブリオ・マリナス由来のPUFA PKS遺伝子で形質転換された大腸菌でのDHAの産生は、適切なPPTase遺伝子(この場合には、シュワネラSCRC2738由来)が同様に存在した場合にだけ起こった(米国特許第6,140,486号、前記を参照のこと)。このことから、シュワネラPPTaseがビブリオPUFA PKS ACPドメインを活性化できることが実証された。さらに、本発明者らは、今回、枯草菌(Bacillus subtilus)由来のPPTase (sfp)を用いたシゾキトリウムOrfA由来のACPドメインの活性化(パンテテイニル化)を実証した(実施例3参照)。本発明者らは同様に、ノストック(Nostoc)由来のHet Iと呼ばれるPPTaseによるシゾキトリウムOrfA由来のACPドメインの活性化(パンテテイニル化)を実証した(実施例3参照)。組換えシゾキトリウムPUFA PKS遺伝子を用いた大腸菌でのDHAおよびDPAの産生のための上記に論じられる実験のなかで、PPTaseとしてHetI酵素がさらに使われた(実施例3)。
【０１８８】
データから同様に、DHA-CoAおよびDPA-CoAがシゾキトリウムTAGおよびPL合成経路において代謝中間体である可能性が示される。公開されている生化学的データから、細菌では、新たに合成されたPUFAがPUFA PKS ACPドメインからリン脂質合成酵素に直接的に転移されることが示唆される。その一方、本発明者らのデータから、シゾキトリウム、つまり真核生物では、PUFA PKS ACPドメイン上のPUFAと標的TAGおよびPL分子との間には中間体が存在する可能性が示される。真核生物の細胞質において脂肪酸の典型的な運搬体はCoAである。本発明者らはシゾキトリウム細胞の抽出物を調べ、HPLC分画の間に確証的なDHA-CoA、DPA-CoA、16:0-CoAおよび18:1-CoAの標準物質と共に移動する相当なレベルの化合物を見出した。質量分析を使用し、推定されるDHA-CoAおよびDPA-CoAのピークの同一性を確認した。その一方、本発明者らはビブリオ・マリナスの抽出物でDHA-CoAを検出することができなかったことから、この場合もやはり、PUFAのその最終標的への転移(例えば、PLへの直接的な転移)のための異なる機構が細菌に存在していることが示唆された。このデータは、新たに合成されたPUFAのCoAへの転移のための(恐らくACPからCoAへの直接的な転移を介した)機構がシゾキトリウムに存在している可能性が高いことを示している。TAGとPLの両合成酵素はその後、このPUFA-CoAに接近することができる。DHAとDPAの両CoAが産生されるという観測結果から、酵素による転移機構が一連のPUFAを認識できることが示唆される。
【０１８９】
本発明者らは同様に、シゾキトリウムにおいてOrfA、OrfB、およびOrfCのノックアウトを作出した(実施例4参照)。このノックアウト戦略は、シゾキトリウムで起こることが実証されている相同組換えに依存している(米国特許出願第10/124,807号、前記を参照のこと)。いくつかの戦略をノックアウト構築体のデザインに活用することができる。これらの3つの遺伝子を不活性化するために使われた特異的な戦略では、Orfのクローニング部分への、チューブリンプロモーターに結合されたZeocin(商標)耐性遺伝子(pMON50000に由来、米国特許出願第10/124,807号を参照のこと)の挿入を使用した。分断化されたコード領域を含有する新たな構築体を次いで、粒子衝突による野生型シゾキトリウム細胞の形質転換に用いた(米国特許出願第10/124,807号を参照のこと)。Zeocin(商標)とPUFA供給物の両方を含有するプレートに、衝突を受けた細胞をスプレッドした(以下参照)。これらのプレートで増殖したコロニーを次いで、PUFAを補充していないZeocin(商標)プレートに画線した。増殖のためにPUFAの補充を必要としたコロニーを、PUFA PKS Orfが相同組換えによって不活性化された候補とした。3つ全ての場合において、この推測は、細胞に各シゾキトリウムOrfの完全長ゲノムDNAクローンを形質転換することでノックアウトを救出することにより確認された。さらに、場合によっては、救出された形質転換体においてZeocin(商標)耐性遺伝子が除去されていたことが分かり(実施例6参照)、導入された機能遺伝子が二重相同組換え(すなわち、耐性マーカーの欠失)によってオリジナル部位に組み込まれていたことが示唆された。この戦略を成功させる秘訣の1つが、PUFAを増殖培地に補充することであった。この場合、効果的な補充手段は、増殖培地に添加する前に、部分的にメチル化されたベータ-シクロデキストリンと混合することによるPUFAの隔離であることが分かった(実施例6参照)。統合的に、これらの実験から、当業者は、本明細書において提供されるガイダンスを考えれば、シゾキトリウムなどのPUFA PKS含有微生物においてPUFA PKS遺伝子の1つまたは複数を不活性化させて、PUFA栄養要求株を作出することができ、これを(例えば、組換え生物の脂肪酸プロファイルを変化させるため)本発明によるさらなる遺伝的改変(例えば、その他のPKS遺伝子の導入による)のために使用できるという原理が実証される。
【０１９０】
本発明の生物の遺伝的改変の1つの要素は、スラウストキトリドゲノムを直接的に形質転換する能力である。前記の米国特許出願第10/124,807号では、単一の交差相同組換えを介したシゾキトリウムの形質転換および二重交差相同組換えを介した標的化遺伝子置換が実証された。上記に論じられるように、本発明者らは今回、この相同組換えの技術を用いて、シゾキトリウム中のPUFA-PKA系のOrfA、OrfBおよびOrfCを不活性化させた。得られた突然変異体はPUFAによる培地の補充に依存している。いくつかの形質転換マーカー、導入遺伝子の高レベル発現のためのプロモーター要素および外因性遺伝物質の送達の方法が開発されており、使用可能である。それ故、その手段は、スラウストキトリドおよび類似のPUFA PKS系を有するその他の真核生物における内因性PUFA PKS遺伝子をノックアウトする代わりに、それらを本明細書において記載されるおよび上記に提案されるような海洋細菌遺伝子などの、その他の生物由来の遺伝子と置換することである。
【０１９１】
EPAに富むTAGの産生のための1つの手法では、シゾキトリウムのPUFA PKS系を、本明細書において記載されるシュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナ由来の遺伝子などの、産物がEPAであるPUFA PKS系をコードする異種遺伝子の付加によって変化させることができる。内因性PPTaseはその異種PUFA PKS系のACPドメインを活性化しうると予想されるが、本発明者らは海洋細菌由来のPPTaseもクローニングし、配列決定しており、これを宿主に導入することもできた。さらに、EPAはEPA-CoAに変換され、シゾキトリウムのTAGおよびPL膜に容易に組み込まれると予想される。それ故に、1つの態様では、EPAを産生する異種PUFA PKS系をコードする遺伝子(例えば、上記の海洋細菌由来の)を、得られる微生物がEPAとDHAの両方を産生するように、DHAを天然に産生する微生物(例えば、シゾキトリウム)に導入することができる。この技術は、例えば、上記の2つの異なるPUFA PKS系を植物細胞に導入してEPAもDHAも、または所望とされるどんな組合せのPUFAであっても産生する植物を作出することで、遺伝的に改変された植物にさらに適用することができる。
【０１９２】
この手法の改変の1つでは、内因性シゾキトリウム系の関連ドメインを(異種遺伝子の特異的領域の導入によりまたはシゾキトリウム遺伝子それ自体の突然変異誘発により)、その最終産物がDHAおよびDPAではなくEPAであるように、または最終産物がEPAならびにDHAおよび/もしくはDPAの両方であるように、または最終産物がDHAおよびDPAの代わりにEPAおよびARAであるように改変するため、技術を使用することができる。これは例示的な手法である。というのは、この技術はその他のPUFA最終産物の産生に適用することができ、PUFA PKS系を含みかつPUFA PKS系の産物を、リン脂質(PL)とトリアシルグリセロール(TAG)の両方に効率的に導く能力を有する任意の真核微生物に適用できるからである。具体的には、本発明は任意のスラウストキトリド微生物または内因性PUFA PKS系を有するその他任意の真核生物に適用可能であり、これを例証として以下に詳細に記載する。さらに、本発明は、本明細書において記載される様々なPUFAプロファイルの産生を目的に改変された遺伝物質を形質転換できる任意の適当な宿主生物に適用可能である。例えば、実施例においては、シゾキトリウム由来のPUFA PKS系が大腸菌に形質転換される。そのような形質転換された生物をその後、本明細書において記載される方法を使用し、PUFA産生プロファイルを変化させるためさらに改変することができる。
【０１９３】
本発明は特に、本明細書においておよび先行出願において記載されるPUFA PKS系以外のPKS系由来のタンパク質またはドメインをコードする遺伝子および核酸配列を使用し、前記の、I型(反復もしくはモジュール)、II型、またはIII型のPKS系を含めて、細菌性および非細菌性PKS系由来の遺伝子および核酸配列を含む。これらの種類のPKS系の各々を発現する生物は、当技術分野において公知であり、本発明の遺伝的改変工程で有用な核酸の供給源としての機能を果たすことができる。
【０１９４】
好ましい態様では、PUFA PKS系以外のPKS系由来のまたはその他のPUFA PKS系由来のタンパク質またはドメインをコードする遺伝子および核酸配列は、PUFAの産生に好ましい増殖特性を有する生物から単離され、または得られる。具体的には、約15℃の温度もしくは約15℃を超える温度で、20℃の温度もしくは20℃を超える温度で、25℃の温度もしくは25℃を超える温度で、または30℃の温度もしくは30℃を超える温度で、または約35℃までの温度で、あるいは1つの態様では、全増分度での、約20℃〜35℃の任意の温度で、遺伝的に改変されたスラウストキトリド微生物を培養できることが望ましい。それ故に、これらの温度で機能的な酵素活性を有するPKSタンパク質またはドメインが好ましい。本明細書において記載されるシュワネラ・オレヤナまたはシュワネラ・ジャポニカ由来のPUFA PKS遺伝子は、EPAを天然に産生し、25℃、30℃、または35℃までの温度で増殖し、このことがそれらを本発明のこの態様にとりわけ有用にしている(実施例1〜2を参照のこと)。
【０１９５】
別の好ましい態様では、ある脂肪酸プロファイルをもたらすPUFA PKS系由来のタンパク質またはドメインをコードする遺伝子および核酸配列を用いて、別のPUFA PKS系を改変し、それによって宿主の脂肪酸プロファイルを変化させる。例えば、スラウストキトリウム23B (ATCC 20892)は、その脂肪酸プロファイルがシゾキトリウム種(ATCC 20888)とはかなり異なる。スラウストキトリウム23Bは、シゾキトリウム種(ATCC 20888)でのわずか2〜3:1に比べて40:1もの高いDHA:DPA (n-6)比率を有することができる。スラウストキトリウム23Bは同様に、いっそう高いレベルのC20:5 (n-3)を有することができる。しかしながら、シゾキトリウム(ATCC 20888)はスラウストキトリウム23Bに比べ、優れた油分産生株である。シゾキトリウムは、DHAおよびドコサペンタエン酸(DPA; 22:5ω6); 例えば、乾燥重量で30% DHA + DPAに富む多量のトリアシルグリセロールを蓄積する。それ故に、本発明者らはスラウストキトリウム23Bにもっと似たDHA:DPAプロファイルを有する遺伝的に改変されたシゾキトリウム(すなわち、シゾキトリウムの産生能力がスラウストキトリウムのDHA:DPA比率と結び付いた「超DHA産生株」シゾキトリウム)を作出するため、スラウストキトリウム23BのPUFA PKS遺伝子によるシゾキトリウムの内因性PUFA PKS系の改変を本明細書において記載する。この改変は実施例8で実証される。
【０１９６】
それ故に、本発明者らは、ある種の海洋細菌のおよび任意のスラウストキトリドのまたはその他の真核生物のPUFA PKS系由来の遺伝子を使用し、遺伝子混合をさらに使用して、PUFA産物の範囲をEPA、DHA、DPA、ARA、GLA、SDAおよびその他を含むよう拡張させるおよび/または変化させる。これらのPUFA産生プロファイルの変化を得るための方法は、スラウストキトリドPUFA PKS遺伝子への様々な生物由来の遺伝子の混合だけでなく、本明細書において開示される内因性のスラウストキトリドPUFA PKS遺伝子を遺伝的に改変する様々な方法も含む。スラウストキトリドPUFA PKS系および海洋細菌PUFA PKS系の遺伝的な根拠とドメイン構造に関する知識によって、様々なPUFAプロファイルをもたらす新規の遺伝的に改変された生物をデザインするための基礎が提供される。スラウストキトリドなどの微生物において調製された新規のPUFA PKS構築体を単離し、植物を形質転換するのに用いて、類似のPUFA産生特性を植物に与えることができる。
【０１９７】
内因性のスラウストキトリドPUFA PKSドメインのいずれかの1つまたは複数は、改変により所望の結果(すなわち、微生物のPUFA産生プロファイルの変化)がもたらされる場合には、本発明によって変化させ、または(例えば、本発明の海洋細菌由来のドメインと)交換することができる。変化させるまたは交換するのに特に好ましいドメインは、シゾキトリウムOrfBまたはOrfC (β-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)、アシルトランスフェラーゼ(AT)、FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)、鎖伸長因子(CLF)、エノイルACP-レダクターゼ(ER)、トランス-2-アシル-ACPの合成を触媒する酵素、シス-3-アシル-ACPへのトランス-2-アシル-ACPの可逆的異性化を触媒する酵素、およびシス-5-β-ケト-アシル-ACPへのシス-3-アシル-ACPの伸長を触媒する酵素)におけるドメインに対応するドメインのいずれかを含むが、これらに限定されることはない。1つの態様では、変化させるまたは交換するのに好ましいドメインは、β-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)、FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)、および鎖伸長因子(CLF)を含むが、これらに限定されることはない。
【０１９８】
本発明の1つの局面では、スラウストキトリドのPUFA-PKS PUFA産生がCLF(鎖伸長因子)ドメインの改変によって変えられる。このドメインは、II型(分離した酵素)PKS系の特性を示している。そのアミノ酸配列は、KS(ケトシンターゼ対)ドメインと相同性を示すが、活性部位システインを欠損している。CLFは伸長サイクルの数、およびこのゆえに最終産物の鎖長を決定することに機能しうる。本発明のこの態様では、FASおよびPKS合成の最新状態の知識を用いて、非細菌PUFA-PKS系の定方向改変によるARAの産生のための合理的な戦略が提供される。PKS系におけるCLFの機能に関して論文で論議があり(Bisang et al., Nature 401:502 (1999); Yi et al., J. Am. Chem. Soc. 125:12708 (2003))、最終産物の鎖長の決定に他のドメインが関与している可能性があると理解されている。しかしながら、シゾキトリウムがDHA (C22:6、ω-3)およびDPA (C22:5、ω-6)の両方を産生することは意義深い。PUFA-PKS系において、シス二重結合が成長中の炭素鎖の合成の間に導入される。ω-3およびω-6二重結合の配置は分子の合成において初期に起こるため、それらがその後の最終産物の鎖長決定に影響を及ぼしうることは予想できなかったはずである。このように、理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、シゾキトリウムPUFA-PKS系へのC20ユニット(C22ユニットの代わりに)の合成を指令する因子(例えば、CLF)の導入が結果としてEPA(C20:5、ω-3)およびARA(C20:4、ω-6)の産生をもたらすものと考えている。例えば、異種の系において、EPA産生系由来のCLF(フォトバクテリウム由来の、または好ましくは以下に記載される好ましい増殖要件を有する微生物由来のものなどの)をシゾキトリウム遺伝子セットへ直接的に置換することによりそのCLFを活用することができる。得られた形質転換体の脂肪酸を次いで、EPAおよび/またはARAを産生する形質転換体を同定するため、プロファイルの変化について分析することができる。
【０１９９】
例証として、本発明のこの局面では、本明細書において詳細に記載される海洋細菌の系などの、C20 PUFA-PKS系由来のCLFと交換されたOrfBのCLFを有するクローンを構築することができる。マーカー遺伝子をコード領域の下流に挿入することができる。より具体的には、本明細書において記載されるおよび前記の米国特許出願第10/124,807号に詳細に記載されるスラウストキトリドの形質転換に向けた相同組換え系を使うことができる。次いで、野生型スラウストキトリド細胞(例えば、シゾキトリウム細胞)を形質転換し、マーカー表現型について選択し、その後、新たなCLFを組み入れたものをスクリーニングすることができる。この場合もやはり、脂肪酸プロファイルに及ぼす何らかの影響がないかこれらの形質転換体を分析して、EPAおよび/またはARAを産生する形質転換体を同定する。あるいは、および場合によっては、好ましくは、取替えられたドメインの影響についてのそのようなスクリーニングは、大腸菌で(以下に記載されるように)または、限定するものではないが、酵母などのその他の系で行うことができる。CLFに関連するもの以外の何らかの因子が最終産物の鎖長に影響を及ぼすと認められる場合には類似の戦略を活用して、その因子を変化させることができる。本発明の別の態様では、生物は、鎖伸長因子に加えてβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメインの両方を導入することにより改変される。
【０２００】
本発明の別の局面では、β-ヒドロキシアシル-ACPデヒドラーゼ/ケトシンターゼ対の改変または置換が企図される。大腸菌におけるシス-バクセン酸(C18:1、Δ11)合成の間、シス二重結合の形成は、fabA遺伝子の産物である、特定のDH酵素、β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼに依存していると考えられている。この酵素は、β-ケト・アシル-ACPからHOHを除去し、炭素鎖の中にトランス二重結合を初期にもたらす。FabA様のDHのサブセットは、シス-トランスイソメラーゼ活性をもつ(Heath et al., 1996、前記)。細菌および非細菌PUFA-PKS系の新規な局面は、2つのFabA様DHドメインの存在である。理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、これらのDHドメインの一方または両方がシス-トランスイソメラーゼ活性をもつものと考えている(DHドメインの操作は、以下でより詳細に論じられる)。
【０２０１】
大腸菌における不飽和脂肪酸合成の別の局面では、fabB遺伝子の産物である、特定のKS酵素、β-ケトアシル-ACPシンターゼが必要とされる。これは、マロニル-ACPと活性部位において（チオエステル結合によって）システイン残基に連結されて、脂肪酸の縮合を行う酵素である。その多段階反応において、CO2が放出され、その線状鎖が2炭素単位で伸長される。このKSのみが二重結合を含む炭素鎖を伸長できると考えられている。この伸長は、その二重結合がシス配置である場合のみ生じ； それがトランス配置である場合には、その二重結合は伸長の前にエノイル-ACPレダクターゼ(ER)により還元される(Heath et al., 1996、前記)。これまでに特徴付けられたすべてのPUFA-PKS系は、2つのKSドメインを有し、そのうちの1つは、他方より、大腸菌のFabB様KSと高い相同性を示す。この場合もやはり、理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、PUFA-PKS系において、DH (FabA様)およびKS (FabB様)の酵素のドメインの特異性ならびに相互作用が、最終産物におけるシス二重結合の数および配置を決定すると考えている。2炭素伸長反応の数がPUFA-PKS最終産物において存在する二重結合の数より多いことから、いくつかの伸長サイクルにおいて、完全な還元が起きることが決定されうる。このように、DHおよびKSドメインは、他の長鎖脂肪酸のDHA/DPA比率の変化の標的として使用されうる。これらは、他の系由来の相同ドメインの導入により、またはこれらの遺伝子断片の突然変異誘発により、改変および/または評価されうる。1つの態様では、FabA様DHドメインはKSパートナードメインを全く必要としない可能性がある。
【０２０２】
別の態様では、ER(エノイル-ACPレダクターゼ - 結果として完全な飽和化炭素を生じる脂肪アシル-ACPにおけるトランス-二重結合を還元する酵素)ドメインは、PKS系により作出される産物の型を変化させるために改変または置換されうる。例えば、シゾキトリウムPUFA-PKS系は、これが2つの(1つではなく)ERドメインを有する点で既報の細菌の系とは異なることを本発明者らは承知している。理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、これらのERドメインが、得られるPKS産生産物に強く影響を及ぼしうると考えている。得られるPKS産物は個々のドメインを別々にノックアウトすることにより、またはそのヌクレオチド配列を改変することにより、または本明細書において記載される海洋細菌由来のERドメインなどの、その他の生物由来のERドメインの置換により変化させることができる。
【０２０３】
本発明の別の局面では、異性化活性をもたないDHドメインに対するPUFA-PKS系のDH (FabA様)ドメインの1つの置換が企図され、結果的にシスおよびトランス二重結合の入り混じった分子を作出する可能性がある。シゾキトリウムPUFA PKS系の現行の産物はDHAおよびDPA (C22:5 ω6)である。C20脂肪酸を産生する系を操作した場合には、産物がEPAおよびARA (C20:4 ω6)であると期待すると考えられる。これはARAに対する新たな供給源を提供することができる。異なるDHAとDPAの比をもたらした関連のPUFA-PKS系由来のドメインを、例えば、スラウストキトリウム23B (そのPUFA PKS系は米国特許出願第10/124,800号、前記で同定されている)由来の遺伝子を用いることによって置換することもできる。
【０２０４】
さらに、1つの態様では、ERドメインの1つをスラウストキトリドPUFA PKS系のなかで変化させて(例えば、除去することまたは不活性化することで)、最終産物のプロファイルを変化させる。程度の差はあるが洗練された手法を使用し、同様の戦略をPUFA-PKSタンパク質の別個のドメインの各々に対して定方向様式で試みることができる。もちろん、単一のドメインの操作に限定されることはない。最後に、PUFA-PKS系およびその他のPKSまたはFAS系(例えば、I型、II型、III型)由来のドメインを混合することにより、この手法を新たなPUFA最終産物の全範囲を作出するまでに拡張させることができる。
【０２０５】
本明細書において詳細に記載される細菌PUFA PKS遺伝子をいかに用いて、シゾキトリウムでのPUFA産生を改変できるかという一例として、以下の論考を示す。この場合もやはり、本明細書において記載される例の全てをその他の遺伝的に改変された微生物の作出に、または遺伝的に改変された植物の作出に等しく適用することができる。全ての現在公知例の細菌由来PUFA PKS遺伝子が、3遺伝子のシゾキトリウムセットの場合と同じドメインを含む4つの密接に関連する遺伝子として存在する。実際に、本発明者らは、シュワネラ・オレヤナおよびシュワネラ・ジャポニカ由来のPUFA PKS遺伝子がこの高度にクラスター化された配置で見出されることを実証した。今や、本明細書において記載される細菌PUFA PKS遺伝子のDNA配列を用いて、内因性PUFA PKS遺伝子に欠損のあるシゾキトリウム菌株の形質転換用のベクターをデザインすることができる(例えば、実施例4、6および7を参照のこと)。細菌遺伝子(コード配列)全体を用いてシゾキトリウム遺伝子(コード配列)全体を置換し、それによってシゾキトリウム遺伝子発現領域を使用してもよく、第4の細菌遺伝子をゲノム内の異なる位置に向けてもよい。または、個々の細菌PUFA PKS機能ドメインを相同組換えの同様な技術によって、類似のシゾキトリウムドメインと「交換しても」または取り替えてもよい。別の代替方法として、細菌PUFA PKS遺伝子をスラウストキトリド由来のPUFA PKS系に付加して、複数のPUFAシンターゼ活性を有する生物を作出してもよい。細菌PUFA PKS遺伝子またはドメインの配列は、シゾキトリウムのコドン使用頻度の詳細に適合するように改変されなければならない可能性があるが、これは当業者の能力の範囲内であることが理解される。
【０２０６】
天然の(内因性の、自然の)PKS系に導入できる、無作為または定方向のいずれかの、遺伝的変化の多くは酵素機能の不活化をもたらしうると認識されている。それ故、制御された環境においてスラウストキトリドPUFA PKS系の遺伝的操作の影響を試験するため、大腸菌などの、別の宿主において組換え系を最初に用いて、系の様々な局面を操作し、その結果を評価することができる。例えば、大腸菌のFabB菌株は、不飽和脂肪酸を合成することができず、増殖のために、その正常な不飽和脂肪酸の代わりに用いることができる脂肪酸での培地の補充を必要とする(Metz et al. (2001)、前記を参照のこと)。しかしながら、その菌株が機能的なPUFA-PKS系(すなわち、その大腸菌宿主においてPUFA産物を産生するもの(Metz et al., (2001)、前記、その刊行物の図2Aを参照のこと))で形質転換される場合、この必要性(培地補充の)は取り除かれうる。形質転換FabB菌株は、補充なしで増殖するためには機能的なPUFA-PKS系(不飽和脂肪酸を産生するための)を必要とする。この例において鍵となる要素は、幅広い不飽和脂肪酸範囲の産生で十分であることである(分枝鎖脂肪酸のような不飽和脂肪酸置換体でさえも)。それ故に、本発明の別の好ましい態様では、本明細書において開示されるPUFA PKS遺伝子の1つまたは複数において多数の突然変異を作出し、その後、適切に改変されたFabB菌株を形質転換する(例えば、ERドメインを含む発現構築体において突然変異を作出し、単独のプラスミド上に、または染色体へと組み込まれた他の必須ドメインを有するFabB菌株を形質転換する)、および培地の補充なしで増殖する(すなわち、FabBの欠損を相補しうる分子を産生する能力をまだ保有している)形質転換体だけを選択する。大腸菌のFabA菌株はFabB菌株に似た表現型を持っており、上記の例のなかで代替的な菌株として使用することもできる。
【０２０７】
PUFA PKSの遺伝的改変のための試験系の1つが実施例の項に例示されている。手短に言えば、大腸菌などの宿主微生物に、スラウストキトリドPUFA PKS系(例えば、シゾキトリウムのOrfA、BおよびC)の全部または一部を含むPUFA PKS系をコードする遺伝子と、PKS系において活性なホロ-ACPを産生するようホスホパンテテイン補因子の付着に必要とされる、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ(PPTase)をコードする遺伝子とを形質転換する。PKS系をコードする遺伝子を遺伝的に改変して、1つもしくは複数の改変をスラウストキトリドPUFA PKS遺伝子に導入することができ、および/またはその他のPKS系由来のドメインをコードする核酸をスラウストキトリド遺伝子(スラウストキトリド以外の微生物由来の遺伝子および異なるスラウストキトリド微生物由来の遺伝子を含む)へ導入することができる。PUFA PKS系を大腸菌で発現させて、PUFA産生プロファイルを測定することができる。このように、潜在的な遺伝的改変を、スラウストキトリドPUFA産生生物の操作の前に評価することができる。
【０２０８】
本発明は、スラウストキトリドPUFA PKS系における内因性核酸分子の操作および/またはシュワネラ・ジャポニカPUFA PKS系由来の、シュワネラ・オレヤナPUFA PKS系由来の核酸配列を含む単離核酸分子の使用を含み、ならびにスラウストキトリドPUFA PKS系由来の核酸配列、もしくはそのような核酸配列のいずれかの相同体をさらに含むことができる。1つの局面では、本発明は、以下のタンパク質の少なくとも1つの生物活性を有するPUFA PKS系由来のドメインをコードする核酸配列を含む核酸分子の改変および/または使用に関する: マロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)、β-ケト・アシル-ACPシンターゼ(KS)、ケトレダクターゼ(KR)、アシルトランスフェラーゼ(AT)、FabA様β-ヒドロキシ・アシル-ACPデヒドラーゼ(DH)、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ、鎖伸長因子(CLF)、アシルキャリヤータンパク質(ACP)、エノイルACP-レダクターゼ(ER)、トランス-2-アシル-ACPの合成を触媒する酵素、シス-3-アシル-ACPへのトランス-2-アシル-ACPの可逆的異性化を触媒する酵素、および/またはシス-5-β-ケト-アシル-ACPへのシス-3-アシル-ACPの伸長を触媒する酵素。宿主スラウストキトリドのPUFA産生プロファイルを変化させるため、改変するのに好ましいドメインは、本明細書において先に論じられている。
【０２０９】
本発明による生物の遺伝的改変は、生物が遺伝的に改変される内因性PUFA PKS系を持っていようが、および/または組換え核酸分子が生物に導入されようが、生物によって産生されるPUFAの種類、量、および/または活性に影響を及ぼすことが好ましい。本発明によれば、PUFA産生プロファイルに影響を及ぼすことなどの、PUFA PKS系の活性に影響を及ぼすことは、遺伝的改変のない場合と比べて生物により発現されるPUFA PKS系に、任意の生物活性の任意の検出可能なまたは測定可能な変化または改変をもたらすPUFA PKS系と相互作用するPUFA PKS系または遺伝子の任意の遺伝的改変を含む。本発明によれば、「PUFAプロファイル」、「PUFA発現プロファイル」および「PUFA産生プロファイル」という語句は、同義的に使用することができ、生物によって発現される/産生されるPUFAのプロファイル全体について記載する。PUFA発現プロファイルは、生物によって産生されるPUFAの種類、ならびにPUFA産生の絶対量および相対量を含むことができる。それ故に、PUFAプロファイルは、生物によって産生されるPUFAの相互との比率という点で、生物によって産生されるPUFAの種類という点で、ならびに/または生物によって産生されるPUFAの種類および絶対量もしくは相対量という点で記載することができる。
【０２１０】
上記に論じられるように、宿主生物は、内因性PUFA PKS系の有るまたは無い任意の原核生物または真核生物を含むことができ、PUFA PKS系の産物を、リン脂質(PL)とトリアシルグリセロール(TAG)の両方に効率的に導く能力を有する真核微生物であることが好ましい。好ましい宿主微生物は、スラウストキトリアシエおよびラビリンチュラシエ科を含め、スラウストキトリアレス目の任意の一員である。これらの科のうちの特に好ましい宿主細胞が前記されている。好ましい宿主植物細胞は、任意の穀物植物または商業的に有用な植物由来の植物細胞を含む。
【０２１１】
本発明の1つの態様では、遺伝子操作および/または突然変異誘発プログラムを選択的スクリーニング工程と組み合わせて、対象とするPUFA産生プロファイルを有するスラウストキトリド微生物を得ることができると企図される。突然変異誘発法は、化学的突然変異誘発、遺伝子のシャフリング、特異的な酵素ドメインをコードする遺伝子領域のスイッチング、またはそれらの遺伝子の特異的な領域に制限された突然変異誘発、およびその他の方法を含むことができるが、これらに限定されることはない。
【０２１２】
例えば、ハイスループットな突然変異誘発法を用いて、所望のPUFAプロファイルの作出に影響を及ぼすまたはその作出を最適化することができる。効果的なモデル系が開発されたら、ハイスループットな形式でこれらの遺伝子を改変することができる。これらの技術の使用は、2つのレベルで想定することができる。第一に、対象となる産物(例えば、EPA)の産生についての十分な選択的スクリーニングを工夫できる場合には、それを用いて、この産物を産生するよう系を変化させることを試みることができる(例えば、上記のものなどのその他の戦略に代えて、または合わせて)。さらに、先に概略を述べた戦略が、対象とするPUFAプロファイルを実際に作出する遺伝子のセットをもたらした場合には、次にハイスループット技術を用いて系を最適化することができる。例えば、導入されたドメインが比較的低い温度でのみ機能した場合には、選択方法を工夫して、その制限を取り除くことを可能にすることができる。
【０２１３】
上記のように、本発明の1つの態様では、遺伝的に改変された微生物または植物は、所望の生物活性分子(産物)を合成する能力の増強を有する微生物もしくは植物または特異的な産物を合成する(例えば、特異的な抗生物質を合成する)新たに導入された能力を有する微生物もしくは植物を含む。本発明によれば、産物を「合成する能力の増強」とは、微生物または植物が同じ条件の下で、培養されたまたは増殖された野生型の微生物または植物と比べ、(以前にはなかった産物の任意の産生を含め)増加した量の産物を産生するような、産物の合成に関連する経路における任意の増強、または上方制御のことを指す。そのような遺伝的に改変された生物を作出する方法が上記に詳細に記載されており、実際に、PUFA PKS系のいずれかを用い記載されているいずれかの例示的な改変を植物での発現に適合させることができる。
【０２１４】
本発明の1つの態様は、本発明の遺伝的に改変された微生物もしくは植物(上記に詳細に記載される)を増殖させるまたは培養することにより、所望の生物活性分子(産物または化合物とも呼ばれる)を産生するための方法である。そのような方法は本明細書において先に記載されているように、および本発明に従って、遺伝的改変を有する微生物もしくは植物をそれぞれ、発酵培地中で培養する段階、または土壌などの適当な環境中で増殖させる段階を含む。本発明のPUFA PKS系に関連する遺伝的改変に好ましい宿主細胞は、前記されている。
【０２１５】
本発明の1つの態様は、本発明の遺伝的に改変された微生物(上記に詳細に記載される)を培養することにより、所望のPUFAを産生するための方法である。そのような方法は本明細書において先に記載されているように、および本発明に従って、遺伝的改変を有する微生物を、PUFAを産生させるのに有効な条件の下でおよび発酵培地中で培養する段階を含む。適切な、または有効な培地とは、スラウストキトリドおよびその他の微生物を含め、本発明の遺伝的に改変された微生物が、培養される場合、所望のPUFA産物を産生することができる任意の培地のことを指す。そのような培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素およびリン酸源を含む水性培地である。そのような培地は同様に、適切な塩、ミネラル、金属およびその他の栄養素を含むことができる。本発明の任意の微生物は、従来の発酵バイオリアクター中で培養することができる。微生物は、バッチ、流加培養、細胞再利用、および連続発酵を含むがこれらに限定されない、任意の発酵工程により培養することができる。本発明によるスラウストキトリド微生物に好ましい増殖条件は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第5,130,242号、米国特許第5,340,742号、および米国特許第5,698,244号に詳細に記載されており、それらの文献の各々はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１６】
1つの態様では、遺伝的に改変された微生物は、約15℃の温度または約15℃を超える温度で、別の態様では、約20℃の温度または約20℃を超える温度で、別の態様では、約25℃の温度または約25℃を超える温度で、別の態様では、約30℃の温度または約30℃を超える温度で、別の態様では、約35℃までの温度またはそれより高い温度で、別の態様では、全増分度での、約20℃〜35℃の任意の温度で培養される。
【０２１７】
遺伝的に改変された微生物により産生された所望のPUFAおよび/またはその他の生物活性分子は、従来の分離および精製技術を用いて発酵培地から回収することができる。例えば、発酵培地をろ過または遠心分離して、微生物、細胞残屑およびその他の粒状物質を除去することができ、例えば、イオン交換、クロマトグラフィー、抽出、溶剤抽出、相分離、膜分離、電気透析法、逆浸透法、蒸留、化学的誘導体化および結晶化などの従来の方法により、産物を無細胞上清から回収することができる。または、PUFAを産生する微生物、もしくはその抽出物および様々な画分を、産物からの微生物成分の除去なしに用いることができる。
【０２１８】
好ましくは、本発明の遺伝的に改変された微生物は、EPA (C20:5、ω-3)、DHA (C22:6、ω-3)、DPA (C22:5、ω-6)、ARA (C20:4、ω-6)、GLA (C18:3、n-6)、およびSDA (C18:4、n-3)を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の多価不飽和脂肪酸を産生する。1つの好ましい態様では、野生型では、高レベルのDHAおよびDPAを産生するシゾキトリウムが、高レベルのEPAを産生するよう本発明によって遺伝的に改変される。上記に論じられるように、PUFAを産生するよう遺伝的に改変されたスラウストキトリド微生物を用いることの1つの利点は、PUFAがリン脂質(PL)とトリアシルグリセリド(TAG)の両方に直接的に組み込まれるということである。
【０２１９】
好ましくは、PUFAは微生物の乾燥重量の約5%を超える量で、1つの局面では、6%を超える量で、別の局面では、7%を超える量で、別の局面では、8%を超える量で、別の局面では、9%を超える量で、別の局面では、10%を超える量でなど、微生物の90%乾燥重量を超えるまでの、全整数の割合(例えば、15%、20%、30%、40%、50%、およびその間の任意の割合)で産生される。
【０２２０】
本発明の所望の生物活性化合物の産生のための方法において、遺伝的に改変された植物は、発酵培地で培養されるか、または土壌のような適した培地において増殖する。適切なまたは有効な発酵培地は、上記に詳細に論じられている。高等植物に適した増殖培地は、土壌、砂、根の成長を補助するその他任意の粒状培地(例えば、バーミキュライト、パーライトなど)または水耕栽培、ならびに適当な光、水および高等植物の増殖を最適化する栄養補給剤を含むが、これらに限定されない、植物のための任意の増殖培地を含む。本発明の遺伝的に改変された植物は、本発明によって遺伝的に改変されているPKS系の活性を通じてかなりの量の所望の産物を産生するように操作される。化合物は、植物から化合物を抽出する精製工程を通じて回収することができる。好ましい態様では、化合物は植物を収穫することによって回収される。この態様では、植物はその自然の状態で消費されてもよく、または消費可能な製品へさらに加工処理されてもよい。
【０２２１】
生物活性分子を産生するのに有用な多くの遺伝的改変は、本開示を考慮すれば、当業者には明らかであり、様々な他の改変が本明細書において先に論じられている。本発明は、所望の生物活性分子の産生をもたらす本明細書に記載のPUFA PKS系に関連する任意の遺伝的改変を企図する。
【０２２２】
本発明による生物活性分子は、生物活性を有し、かつ本明細書に記載される非細菌PUFA PKS系の少なくとも1つの機能ドメインの生物活性を有する少なくとも1つのアミノ酸配列を含むPKS系により産生可能な任意の分子(化合物、産物など)を含む。そのような生物活性分子は、多価不飽和脂肪酸(PUFA)、抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤を含むことができるが、これらに限定されることはない。本発明のPUFA PKS系の1つの利点は、シス配置に炭素-炭素二重結合を導入し、分子が3炭素ごとに二重結合を含んでいるそのような系の能力である。この能力を様々な化合物を産生するために利用することができる。
【０２２３】
対象とする生物活性化合物は、微生物の乾燥重量の約0.05%を超える、好ましくは約0.1%を超える、より好ましくは約0.25%を超える、より好ましくは約0.5%を超える、より好ましくは約0.75%を超える、より好ましくは約1%を超える、より好ましくは約2.5%を超える、より好ましくは約5%を超える、より好ましくは約10%を超える、より好ましくは約15%を超える、およびさらにより好ましくは約20%を超える量で、遺伝的に改変された微生物により産生されることが好ましい。脂質化合物の場合、そのような化合物は、微生物の乾燥重量の約5%を超える量で産生されることが好ましい。抗生物質またはもっと少ない量で合成される化合物などの、その他の生物活性化合物の場合、そのような化合物を微生物の乾燥重量のなかで保有する菌株は、上記の種類の新規なPKS系を予想通り含有すると同定される。いくつかの態様では、特定の生物活性分子(化合物)は蓄積するのではなく、微生物によって分泌される。それ故、そのような生物活性分子は一般に培地から回収され、産生された分子の濃度は、微生物および培養のサイズに応じて変わると考えられる。
【０２２４】
本発明の1つの態様は、PUFA PKS系の少なくとも1つの生物学的に活性なドメインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を発現する組換え宿主細胞(微生物または植物)によって産生された油分を最終産物に添加する段階を含む、最終産物が少なくとも1つの脂肪酸を含む(最終産物が少なくとも1つの脂肪酸を既に含むこともあるので、従って、本方法により少なくとも1つのさらなる脂肪酸が提供される)ように最終産物を改変するための方法に関する。PUFA PKS系は、シュワネラ・ジャポニカもしくはシュワネラ・オレヤナ由来の細菌PUFA PKS系を含めて、本明細書において記載される任意の適当な細菌もしくは非細菌PUFA PKS系、または通常(すなわち、通常のもしくは自然の条件下)22℃を超える温度で増殖し、PUFAを産生しうるその他の細菌由来の任意のPUFA PKS系を含む。
【０２２５】
最終産物は、食品、栄養補助食品、薬剤、ヒト化畜乳、および調合乳からなる群より選択されることが好ましい。適当な薬剤は、抗炎症製剤、化学療法剤、活性賦形剤、骨粗鬆症治療薬、抗鬱薬、抗痙攣薬、抗ヘリコバクター・ピロリ薬、神経変性疾患の治療用薬物、変性肝疾患の治療用薬物、抗生物質、およびコレステロール低下製剤を含むが、これらに限定されることはない。1つの態様では、最終産物は、慢性炎症、急性炎症、胃腸障害、がん、悪液質、心臓再狭窄、神経変性疾患、肝臓の変性疾患、血中脂質疾患、骨粗鬆症、骨関節炎、自己免疫疾患、子癇前症、早産、年齢に関連した黄斑症、肺疾患、およびペルオキシソーム疾患からなる群より選択される状態を治療するために使用される。
【０２２６】
適当な食品は、洗練されたベーカリー製品、パンおよびロールパン、朝食用シリアル、加工および非加工チーズ、香辛料(ケチャップ、マヨネーズなど)、乳製品(ミルク、ヨーグルト)、プリンおよびゼラチンデザート、炭酸飲料、茶、粉末飲料ミックス、加工魚製品、果物飲料、チューインガム、固形型菓子類、冷凍乳製品、加工肉製品、ナッツおよびナッツのスプレッド、パスタ、加工家禽肉製品、肉汁およびソース、ポテトチップスおよび他のチップスまたはクリスプ、チョコレートおよび他の菓子類、スープおよびスープミックス、大豆製品(ミルク、飲料、クリーム、漂白剤)、植物油主材料のスプレッド、および野菜飲料を含むが、これらに限定されることはない。
【０２２７】
本発明の別の態様は、ヒト化畜乳を産生するための方法に関する。この方法は、本明細書において記載されるPUFA PKS系の少なくとも1つの生物学的に活性なドメインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの組換え核酸分子を用いて泌乳動物の泌乳細胞を遺伝的に改変する段階を含む。
【０２２８】
宿主細胞を遺伝的に改変するための方法および遺伝的に改変された非ヒト泌乳動物を作出するための方法は、当技術分野において公知である。改変するための宿主動物の例としては、導入遺伝子発現個体群の迅速な拡大のため遺伝子操作およびクローニングに従順な、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヤクなどが挙げられる。動物の場合、PKS様導入遺伝子は、遺伝子制御領域の改変を通じて、標的の細胞小器官、組織および体液での発現に適応させることができる。特に関心対象となるのは、宿主動物の乳房中でのPUFAの産生である。
【０２２９】
以下の例は、例証のために提供されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【０２３０】
実施例
実施例1
以下の実施例は、ある種のEPA産生細菌がシゾキトリウムの改変に適していると思われるPUFA PKS様遺伝子を含むことを明らかにする。
【０２３１】
シュワネラ属の2種のEPA産生海洋細菌株はシゾキトリウム発酵に特有の温度で増殖することおよびPUFA PKS様遺伝子を保有することが明らかにされている。シュワネラ・オレヤナ(Australian Collection of Antarctic Microorganisms (ACAM)菌株番号644; Skerratt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol 52, 2101 (2002))はEPAを産生し、25〜30℃までで増殖する。シュワネラ・ジャポニカ(American Type Culture Collection (ATCC)菌株番号BAA-316; Ivanova et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1027 (2001))はEPAを産生し、30〜35℃までで増殖する。
【０２３２】
これらの細菌株由来のPUFA-PKS遺伝子を同定し、単離するため、細菌orf5/pfaA遺伝子のKS-MAT領域および細菌orf7/pfaC遺伝子のDH-DH領域に対する縮重PCRプライマー対をシュワネラSCRC-2738、シュワネラ・オネイデンシス(Shewanella oneidensis) MR-1; シュワネラ種GA-22; フォトバクター・プロファンダム(Photobacter profundum)、およびモリテラ・マリナに対して公表されている遺伝子配列に基づきデザインした(上記の考察を参照のこと)。具体的には、プライマーおよびPCR条件を以下のようにデザインした。
【０２３３】
KS/AT領域に対するプライマー; 
以下の公表されている配列に基づく: シュワネラ種SCRC-2738; シュワネラ・オネイデンシスMR-1; フォトバクター・プロファンダム; モリテラ・マリナ:
2008515461.tif 000003
【０２３４】
DH領域に対するプライマー; 
以下の公表されている配列に基づく: シュワネラ種GA-22; シュワネラ種SCRC-2738; フォトバクター・プロファンダム; モリテラ・マリナ:
2008515461.tif 000004
【０２３５】
PCR条件(鋳型として細菌染色体DNAとともに)は以下のようであった。
反応混合物:
0.2 μM dNTPs
0.1 μM各プライマー
8% DMSO
染色体DNA 250 ng
2.5U Herculase(登録商標) DNAポリメラーゼ(Stratagene)
1×Herculase(登録商標)緩衝液
総量50 μL。
【０２３６】
PCRプロトコル: 
(1) 3分で98℃; (2) 40秒間98℃; (3) 30秒間56℃; (4) 90秒間72℃; (5) 工程2〜4を29サイクル繰り返す; (6) 10分間72℃; (7) 6℃で保持。
【０２３７】
両プライマー対について、シュワネラ・オレヤナまたはシュワネラ・ジャポニカのいずれか由来の染色体DNA鋳型を使用し、PCRによって、予想サイズを有する異なる産物が得られた。4つの各PCR産物をpCR-BLUNT II-TOPO (Invitrogen)にクローニングし、インサートの配列をM13フォワードおよびリバースプライマーにより決定した。いかなる場合でも、このようにして得られたDNA配列は、公知の細菌性PUFA PKS遺伝子領域に極めて相同であった。
【０２３８】
細菌のPCR産物から得られたDNA配列を公知の配列と比較し、標準的なBlastx検索(BLASTパラメータ: 低複雑性(Low Complexity)フィルタ: オン; マトリックス: BLOSUM62; ワードサイズ(Word Size): 3; ギャップコスト(Gap Costs): 存在(Existance) 11、伸長(Extension) 1 (全体が参照により本明細書に組み入れられるAltschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.およびLipman, DJ. (1997) 「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているBLAST))でシゾキトリウムATCC 20888由来のPUFA PKS遺伝子と比較した。
【０２３９】
アミノ酸レベルで、シュワネラ・オレヤナACAM644のケトアシルシンターゼ/アシル・トランスフェラーゼ(KS-AT)の推定アミノ酸配列に最も高い相同性を有する配列は以下であった: フォトバクター・プロファンダムpfaA (同一性 = 70%; 陽性 = 81%); シュワネラ・オネイデンシスMR-1「多ドメインβ-ケトアシルシンターゼ」(同一性 = 66%; 陽性 = 77%); およびモリテラ・マリナORF8 (同一性 = 56%; 陽性 = 71%)。シゾキトリウム種ATCC20888のorfAはシュワネラ・オレヤナKS-ATに対する推定アミノ酸配列に41%同一であり、56%陽性であった。
【０２４０】
アミノ酸レベルで、シュワネラ・ジャポニカATCC BAA-316のケトアシルシンターゼ/アシル・トランスフェラーゼ(KS-AT)の推定アミノ酸配列に最も高い相同性を有する配列は以下であった: シュワネラ・オネイデンシスMR-1「多ドメインβ-ケトアシルシンターゼ」(同一性 = 67%; 陽性 = 79%); シュワネラ種SCRC-2738のorf5 (同一性 = 69%; 陽性 = 77%); およびモリテラ・マリナORF8 (同一性 = 56%; 陽性 = 70%)。シゾキトリウム種ATCC20888のorfAはシュワネラ・ジャポニカKS-ATに対する推定アミノ酸配列に41%同一であり、55%陽性であった。
【０２４１】
アミノ酸レベルで、シュワネラ・オレヤナACAM644のデヒドロゲナーゼ(DH)の推定アミノ酸配列に最も高い相同性を有する配列は以下であった: シュワネラ種SCRC-2738のorf7 (同一性 = 77%; 陽性 = 86%); フォトバクター・プロファンダムpfaC (同一性 = 72%; 陽性 = 81%); およびシュワネラ・オネイデンシスMR-1「多ドメインβ-ケトアシルシンターゼ」(同一性 = 75%; 陽性 = 83%)。シゾキトリウム種ATCC20888のorfCはシュワネラ・オレヤナDHに対する推定アミノ酸配列に26%同一であり、42%陽性であった。
【０２４２】
アミノ酸レベルで、シュワネラ・ジャポニカATCC BAA-316のデヒドロゲナーゼ(DH)の推定アミノ酸配列に最も高い相同性を有する配列は以下であった: シュワネラ種SCRC-2738のorf7 (同一性 = 77%; 陽性 = 86%); フォトバクター・プロファンダムpfaC (同一性 = 73%; 陽性 = 83%)およびシュワネラ・オネイデンシスMR-1「多ドメインβ-ケトアシルシンターゼ」(同一性 = 74%; 陽性 = 81%)。シゾキトリウム種ATCC20888のorfCはシュワネラ・ジャポニカDHに対する推定アミノ酸配列に27%同一であり、42%陽性であった。
【０２４３】
実施例2
以下の例は、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナ由来の完全なPUFA PKS系をコードするDNAクローンの作出、同定、配列決定および分析を示す。
【０２４４】
大きなゲノムDNA断片(およそ40 kB)からなる、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナ組換えライブラリーは標準的な方法により、コスミドベクターSupercos-1 (Stratagene)中に作出された。このコスミドライブラリーを標準的なコロニーハイブリダイゼーション手順によりスクリーニングした。Sh.オレヤナのコスミドライブラリーは、2つの別個のジゴキシゲニン標識プローブを用いてスクリーニングした。各プローブには、上記の実施例1に記載されているEPA生合成遺伝子クラスターのセグメントに相同な、かつそれぞれがクラスターの両端に相当するDNAの断片が含まれていた。これらのプローブは鋳型としてSh.オレヤナDNAと一方のプローブの場合にはプライマーprRZ23 (SEQ ID NO:25)およびprRZ24 (SEQ ID NO:26)、もう一方のプローブの場合にはprRZ28 (SEQ ID NO:27)およびprRZ29 (SEQ ID NO:28)とを用い、PCRによって作出された。上記の実施例1は、これらの縮重プライマーとEPA生合成遺伝子のセグメントに相同なDNA断片を含有する生成されたPCR産物について記載している。Sh.ジャポニカ特異的なプローブを同様の方法で作出し、コスミドライブラリーをスクリーニングした。いかなる場合でも、ある種のコスミドとの個々のプローブの強力なハイブリダイゼーションによって、EPA生合成遺伝子クラスターに相同なDNAを含有するクローンが示唆された。
【０２４５】
両プローブとの強力なハイブリダイゼーションを伴うクローンを次に、大腸菌でのEPAの異種産生を目的にアッセイした。大腸菌コスミドクローンの個々の分離株の細胞を200 rpmで振盪させながら30℃で一晩、LBブロス2 mL中で増殖させた。この継代培養液0.5 mLを用いてLBブロス25 mL中に植菌し、細胞を20時間20℃で増殖させた。次いで、細胞を遠心分離によって集菌し、凍結乾燥により乾燥させた。標準的なガスクロマトグラフィー手順を使用し、乾燥細胞を脂肪含有量ならびに脂肪酸プロファイルおよび含有量について分析した。空のSupercos-1ベクターを含有する大腸菌の対照細胞から調製された脂肪酸ではEPAが検出されなかった。S.ジャポニカおよびS.オレヤナ由来のある種のコスミドを含有する大腸菌株では、典型的には全脂肪酸のうち3〜8%のEPAが産生された。
【０２４６】
Sh.オレヤナ由来のコスミド9A10およびSh.ジャポニカ由来のコスミド3F3を全面的な無作為配列決定のために選択した。コスミドクローンを無作為に断片化し、サブクローニングし、得られた無作為クローンを配列決定した。クロマトグラムを分析し、Phred、PhrapおよびConsedプログラムを用いてコンティグに構築した(Ewing, et al., Genome Res. 8(3):175-185 (1998); Ewing, et al., Genome Res. 8(3): 186-194 (1998); Gordon et al., Genome Res. 8(3):195-202 (1998))。最終コンティグの各ヌクレオチド塩基対は、少なくとも最小限の集合Phredスコア40 (信頼水準99.995%)で網羅されていた。
【０２４７】
コスミド3F3由来の39669 bpのコンティグのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1として示されている。コスミド9A10由来の38794 bpのコンティグのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:7として示されている。シュワネラ・ジャポニカ(コスミド3F3)およびシュワネラ・オレヤナ(コスミド9A10)由来のPUFA PKS遺伝子クラスターに対する各種のドメインおよびタンパク質の配列は、本明細書において先に詳細に記載されており、それぞれ、SEQ ID NO:2〜6および8〜12に表されている。
【０２４８】
本明細書において記載されるタンパク質の比較は、標準的なBLAST解析を用いて行われた(BLASTパラメータ: Blastp、低複雑性フィルタ オン; プログラム-BLOSUM62、ギャップコスト- 存在: 11、伸長1; (Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W.およびLipman, D.J. (1997) 「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているBLAST))。ドメインの同定は保存ドメインデータベースおよび検索サービス(Conserved Domain Database and Search Service) (CD-Search), v2.01により行われた。CD-Searchは、米国立医学図書館(National Library of Medicine)および米国立衛生研究所(National Institutes of Health)の後援による、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)の公開データベースを通じて使用可能な公開プログラムである。CD-Searchは様々なデータベース由来のタンパク質ドメインを含む。CD-SearchはBLASTアルゴリズムを用いて、問い合わせされるタンパク質配列中のドメインを同定する(Marchler-Bauer A, Bryant SH. 「CD-Search: protein domain annotations on the fly.」Nucleic Acids Res. 32:W327-331 (2004))。最後に、EasyGene 1.0 Server (Larsen TS, Krogh A. 「EasyGene - a prokaryotic gene finder that ranks ORFs by statistical significance」, BMC Bioinformatics 2003, 4:21)およびGeneMark.hmm 2.1 (Lukashin A. and Borodovsky M., 「GeneMark.hmm: new solutions for gene finding」Nucleic Acids Res., Vol. 26, No. 4, pp. 1107-1115. 1998)の使用によって、読み取り枠(ORF)の同定を補助した。初期設定をEasyGene解析で使用し、コレラ菌(Vibrio cholerae)を参照生物として使用した。初期設定をGeneMark.hmmプログラムで使用し、モデル生物に対する設定としてPseudonative.modelを使用した。これらのプログラムは隠れマルコフモデル(Hidden Markov Models)アルゴリズムを用いて、細菌遺伝子を予測する。
【０２４９】
表1は、SEQ ID NO:1に基づく開始および停止コドンの変数(coordinates)、各ORFの全ヌクレオチド長、各予測タンパク質に対する全アミノ酸、各予測タンパク質の計算分子量、GenBank公開データベースに対するBLASTpでの問合せで一番の相同体、GenBankデータベース中で最も相同性の高いエントリーのGIアクセッション番号(「GenInfo Identifier」配列識別番号)、ならびに提唱される機能(EPA産生に関連するなら)を含めて、シュワネラ・ジャポニカ由来コスミド3F3のORFの概要/分析を示す。
【０２５０】
表2は、SEQ ID NO:7に基づく開始および停止コドンの変数、ならびにシュワネラ・ジャポニカの場合には表1に示されたのと同一の追加情報を含めて、シュワネラ・オレヤナ由来コスミド9A10のORFの概要/分析を示す。
【０２５１】
表3は、シュワネラ・オレヤナ(コスミド9A10)に比べておよび同様に公開配列データベース中で最高レベルの同一性を有するEPA産生生物由来のタンパク質に比べてシュワネラ・ジャポニカ(コスミド3F3)のEPAクラスター由来の推定タンパク質の同一性の割合を示す。表4はヌクレオチド同一性に関する表3と同じ分析を示す。
【０２５２】
表5は、有力なリボソーム結合部位に下線を引いてある注釈されたpfa ORFの全てより23ヌクレオチド上流、ならびにTTG開始コドンから始まると注釈されたORFに対する代替的な開始コドンおよび上流のヌクレオチドを示す。
【０２５３】
（表１）シュワネラ・ジャポニカ由来コスミド3F3のORF分析
2008515461.tif 000005
＊逆相補鎖上
【０２５４】
（表２） シュワネラ・オレヤナ由来コスミド9A10のORF分析
2008515461.tif 000006
＊逆相補鎖上
【０２５５】
（表３）アミノ酸の同一性の割合
2008515461.tif 000007
【０２５６】
（表４）核酸の同一性の割合
2008515461.tif 000008
【０２５７】
（表５）EPA生合成クラスター由来ORFの予想開始部位(開始コドンを太字で表示)
有力なリボソーム結合部位に下線を引いてある。
2008515461.tif 000009
pfaC代替物＃1はSEQ ID NO:1のヌクレオチド番号21514で始まる。
これは注釈されたpfaCの始まりから387ヌクレオチド下流である。
pfaC代替物＃2はSEQ ID NO:1のヌクレオチド番号21460で始まる。
これは注釈されたpfaCの始まりから333ヌクレオチド下流である。
2008515461.tif 000010
pfaC代替物＃1はSEQ ID NO:7のヌクレオチド番号28370で始まる。
これは注釈されたpfaCの始まりから402ヌクレオチド下流である。
pfaC代替物＃2はSEQ ID NO:7のヌクレオチド番号28151で始まる。これは注釈されたpfaCの始まりから183ヌクレオチド下流である。
2008515461.tif 000011
pfaE代替物＃1はSEQ ID NO:7のヌクレオチド番号13821で始まる。これは注釈されたpfaEの始まりから78ヌクレオチド上流である。
pfaE代替物＃2はSEQ ID NO:7のヌクレオチド番号13743で始まる。これは注釈されたpfaEの始まりから156ヌクレオチド上流である。
【０２５８】
実施例3
以下の例は、大腸菌での機能的発現を介してシゾキトリウムのOrfA、BおよびCが機能的なDHA/DPA合成酵素をコードすることを実証する。
【０２５９】
大腸菌形質転換体の一般的調製
DHAおよびDPAを産生するシゾキトリウムPUFA PKS系をコードする3つの遺伝子(OrfA、BおよびC; それぞれSEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:17)を単一の大腸菌発現ベクター(pET21c (Novagen)に由来)にクローニングした。これらの遺伝子は単一の伝達暗号として転写され(T7 RNA-ポリメラーゼにより)、遺伝子のそれぞれの直前にクローニングされたリボソーム結合部位が翻訳を開始する。OrfBをコードする遺伝子の改変は、大腸菌において完全長のOrfBタンパク質の産生を得るのに必要とされた(以下参照)。PPTaseをコードするアクセサリー遺伝子(以下参照)を第二のプラスミド(pACYC184に由来、New England Biolabs)にクローニングした。
【０２６０】
OrfB遺伝子は約224 kDaの質量を有するタンパク質をコードすると予測される。大腸菌における遺伝子発現での最初の試みでは、約165 kDa (SDS-PAGEの間に公知の質量のタンパク質との比較によって判定された場合)の見掛け上の分子量を有するタンパク質の蓄積が起こった。OrfBヌクレオチド配列の検査により、15個の連続セリンコドン-それらの全てがTCTコドンである、を含有する領域が明らかにされた。この遺伝暗号は6つの異なるセリンコドンを含み、これらのうちの3つは大腸菌で頻繁に使われる。本発明者らは4つの重複オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルと併用して、セリンコドン反復領域を含んだOrfB遺伝子のごく一部分(約195塩基対、BspHIからSacIIの制限酵素断片)を再合成した。合成OrfB断片では、大腸菌でよく使われる3つのセリンコドンの無作為混合物を使用し、他に何らかの潜在的に問題のあるコドン(すなわち、大腸菌で滅多に使われない他のコドン)も変えた。オリジナルのOrfBに存在するBspHIからSacIIの断片を、再合成された断片に置き換え(OrfB＊を得るため)、改変された遺伝子を該当の発現ベクターにクローニングした。改変されたOrfB＊はそれでもなお、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列をコードする。大腸菌での改変OrfB＊クローンの発現により、約224 kDaのタンパク質の出現に至ったことから、OrfBの完全長の産物が産生されたことが示唆された。再合成されたOrfB＊のBspHIからSacII断片の配列は、SEQ ID NO:29として本明細書に表されている。SEQ ID NO:29を参照して、OrfBの再合成されたBspHIからSacII領域のヌクレオチド配列が示されている。BspHI制限部位およびSacII制限部位が確認される。BspHI部位はOrfB CDSのヌクレオチド番号4415で始まる(SEQ ID NO:15) (OrfB CDSの中には合計で3つのBspHI部位が存在しているのに対し、SacII部位はユニークであることに留意されたい)。
【０２６１】
OrfAタンパク質(シゾキトリウムではSEQ ID NO:14)のACPドメインは、機能するためにはホスホパンテテイン基の付加によって活性化されなければならない。この一般型の反応を触媒する酵素は、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ(PPTase)と呼ばれる。大腸菌は2つの内因性PPTaseを含むが、それらはシゾキトリウム由来のOrfA ACPドメインを認識できないと思われた。このことは付加的なPPTaseを加えずOrfA、B＊ (上記参照)およびCを大腸菌で発現させることで確認された。この形質転換体では、DHA産生が検出されなかった。本発明者らは、大腸菌のPUFA PKS発現系において次の2つの異種PPTaseを試験した: (1) sfp (枯草菌(Bacillus subtilis)に由来)および(2) Het I (藍色細菌(cyanobacterium)ノストック(Nostoc)菌株7120由来)。
【０２６２】
sfp PPTaseは十分に特徴付けられており、広範囲の基質を認識するその能力によって広く使われている。公開されている配列情報(Nakana, et al., 1992, Molecular and General Genetics 232: 313-321)に基づき、コード領域を、定義済みの上流および下流の隣接DNA配列とともに、pACYC-184クローニングベクターにクローニングすることにより、sfpに対する発現ベクターを構築した。オリゴヌクレオチド:
2008515461.tif 000012
を用いて、枯草菌ゲノムDNA由来の対象とする領域を増幅した。好都合な制限酵素部位をオリゴヌクレオチドの中に含ませて、中間の、高コピー数のベクターでのクローニングと、最終的にはpACYC184のEcoRV部位へのクローニングを円滑にし、プラスミドpBR301を作出した。このプラスミドを用いて形質転換された大腸菌の抽出物の検査により、sfpの場合に期待される移動度を有する新たなタンパク質の存在が明らかになった。ある種の条件の下、OrfA、B＊、Cタンパク質を発現する細胞でのsfp構築体の同時発現により、DHAの産生が起こった。この実験によって、sfpがシゾキトリウムOrfA ACPドメインを活性化できることが実証された。さらに、sfp遺伝子に付随する調節要素を用いて、その他の遺伝子を挿入できるような発現カセットを作出した。具体的には、pBR301中のsfpコード領域(ATGのすぐ上流の3ヌクレオチドとともに)を、構築体がいくつかの(この構築体にとって)ユニークな制限酵素部位を含むようにデザインされた53塩基対のDNA部分と置き換えた。この領域内の最初の制限酵素部位はNdeIである。この部位に組み込まれたATG配列は、導入遺伝子に対する開始メチオニンコドンとして使用される。さらなる制限部位(BglLL、NotI、SmaI、PmelI、HindIII、SpeIおよびXhoI)を含ませて、クローニング過程を円滑にした。この発現ベクターカセットの機能性をPCRの使用により試験して、NdeI部位を5'末端におよびXhoI部位を3'末端に有するsfp型を作出した。この断片を発現カセットにクローニングし、OrfA、B＊、C発現ベクターとともに大腸菌に移入した。適切な条件下で、これらの細胞はDHAを蓄積し、機能的なsfpが産生されていることが実証された。
【０２６３】
本発明者らの知るかぎりでは、Het Iは異種の状況ではこれまでに試験されていなかった。Het Iは、ノストックの異質細胞に存在する糖脂質層の成分である長鎖ヒドロキシ脂肪酸の合成に関与することが知られているその生物中の遺伝子クラスターに存在する。理論により束縛するわけではないが、本発明者らは、そのクラスターに存在するタンパク質HgI EのACPドメインをHet Iが活性化すると考えている。HgI Eの2つのACPドメインは、シゾキトリウムOrfAに見られるACPドメインに対し高度の配列相同性を有する。SEQ ID NO:32はノストックHet Iタンパク質のアミノ酸配列を表す。Het Iの内因性の開始コドンは同定されていない(推定タンパク質にはメチオニンが存在していない)。読み取り枠の5'末端近傍にいくつかの有力な代替的開始コドン(例えば、TTGおよびATT)が存在する。メチオニンコドン(ATG)は配列中に存在していない。Het I発現構築体はPCRを使用して、最も5'側の有力な代替的開始コドン(TTG)をメチオニンコドン(ATG、上記のNdeI制限酵素認識部位の一部として)と交換し、XhoI部位をコード配列の3'末端に導入することにより作製された。改変されたHet Iコード配列を次いで、sfp調節要素を含有するpACYC184ベクター構築体のNdeIおよびXhoI部位に挿入した。大腸菌でのこのHet I構築体の発現によって、配列データから予想されるサイズの新たなタンパク質の出現に至った。いくつかの条件の下、大腸菌でのシゾキトリウムOrfA、B＊、CとのHet Iの同時発現により、その細胞でDHAおよびDPAの蓄積が起こった。sfpおよびHet Iが比較された実験の全てで、sfp構築体を含有する細胞でよりもHet Iを含有する細胞で、多くのDHAおよびDPAが蓄積した。
【０２６４】
大腸菌形質転換体でのDHAおよびDPAの産生
(1) シゾキトリウムPUFA PKS遺伝子(OrfA、B＊およびC)ならびに(2) PPTase (sfp由来またはHet I由来)をコードする2つのプラスミドを、誘導性T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含む大腸菌株BL21に形質転換した。シゾキトリウム・タンパク質の合成は培地へのIPTGの添加によって誘導し、その一方でPPTaseの発現は別個の調節要素(上記参照)によって制御した。種々の定義済みの条件下でおよび2つの異種PPTase遺伝子のいずれかを用いて、細胞を増殖させた。細胞を集菌し、脂肪酸をメチルエステル(FAME)に変換し、ガス液体クロマトグラフィーにより分析した。
【０２６５】
いくつかの条件の下で、2つの異種PPTaseのいずれかに加えて、シゾキトリウムPUFA PKS遺伝子を発現する大腸菌細胞においてDHAおよびDPAが検出された(データは示されていない)。対照細胞(すなわち、Orfの1つを欠くプラスミドを用いて形質転換された細胞)から調製されたFAMEでは、DHAまたはDPAが検出されなかった。大腸菌で確認されたDHAとDPAとの比率は、シゾキトリウムで確認された内因性DHAおよびDPAの産生の比率に近い。全FAMEの約17%に相当する、最高レベルのPUFA (DHAに加えてDPA)は、10% (重量で)グリセロールの補充された765培地(配合表はAmerican Type Culture Collectionから入手可能)の中で32℃にて増殖させた細胞で見出された。PUFAの蓄積は、細胞を5または10%グリセロールの補充されたLuria Broth中で増殖させた場合、および20℃で増殖させた場合にも確認された。各プラスミドの存在に対する選択は増殖の間に適切な抗生物質を含めることで維持し、IPTG (0.5 mMの終濃度まで)を用いて、OrfA、B＊およびCの発現を誘導した。
【０２６６】
実施例4
以下の例は、シゾキトリウムPUFA PKS酵素複合体をコードする遺伝子を選択的に不活性化(ノックアウト)できること、および培地に多価不飽和脂肪酸が補充されていなければそれが致死表現型となることを実証する。
【０２６７】
相同組換えがシゾキトリウムで実証されている(全体が参照により本明細書に組み入れられる、同時係属中の米国特許出願第10/124,807号を参照のこと)。シゾキトリウムOrfA (SEQ ID NO:13)を不活性化するためにデザインされたプラスミドは、OrfAコード配列を含有するクローンのSma I部位にZeocin(ゼオシン) (商標)耐性マーカーを挿入することで作出された。Zeocin(商標)耐性マーカーはプラスミドpMON50000から得られた - Zeocin(商標)耐性遺伝子の発現がシゾキトリウム由来のチューブリンプロモーター要素によって推進される(米国特許出願第10/124,807号、同章を参照のこと)。ノックアウト用構築体は従って、全てpBluescript II SK (+)ベクター(Stratagene)にクローニングされた5'シゾキトリウムOrfAコード配列、tub-Zeocin(商標)耐性要素および3'シゾキトリウムOrfAコード配列からなる。
【０２６８】
プラスミドを粒子衝突によりシゾキトリウム細胞に導入し、形質転換体を、Zeocin(商標)を含有し多価不飽和脂肪酸(PUFA)を補充したプレートで選択した(実施例5参照)。Zeocin(商標)に加えてPUFAのプレートで増殖したコロニーを、PUFA補充なしのプレートで増殖する能力について試験し、PUFAを要求するいくつかを見出した。これらのPUFA栄養要求株が推定上のOrfAノックアウトである。これらの突然変異体のいくつかより抽出されたRNAのノザンブロット解析から、完全長のOrfAの伝達暗号がこれらの突然変異体では産生されなかったことが確認された。
【０２６９】
これらの実験は、シゾキトリウム遺伝子(例えば、OrfA)を相同組換えにより不活性化できること、OrfAの不活性化が致死表現型をもたらすこと、およびPUFAを培地に補充することでそれらの突然変異体を救い出せることを実証している。
【０２７０】
シゾキトリウムのOrfB (SEQ ID NO:15)およびOrfC (SEQ ID NO:17)の不活性化を対象にする類似の実験セットにより、類似の結果が得られた。つまり、OrfBおよびOrfCは相同組換えによって個別に不活性化されることができ、それらの細胞は増殖のためにはPUFAの補充が必要になる。
【０２７１】
実施例5
以下の例はPUFA栄養要求株をEPAの補充された培地で維持できることを明らかにし、EPAがシゾキトリウムでのDHAの代わりとなりうることを実証する。
【０２７２】
実施例4に示されるとおり、PUFA PKS複合体が不活性化されたシゾキトリウム細胞では、生存するにはPUFAの補充が必要とされた。シゾキトリウムが増殖のためこの系の産物に依存することの実証に加えて、この実験系により、突然変異体を救い出す能力について種々の脂肪酸を試験することが可能になる。突然変異体細胞(3つの遺伝子のうちのいずれかが不活性化されている)は、それらがDHAの補充された培地で増殖したのと同じくらいEPAの補充された培地でよく増殖することが発見された。この結果から、DHAを産生する内因性PUFA PKS複合体を、産物がEPAであったものと交換しても、細胞が生存可能であったことが示唆される。さらに、これらの突然変異体細胞をARAまたはGLAのいずれかの補充により救い出すことができたことから、これらの産物を産生する遺伝的に改変されたシゾキトリウムを作出する実現可能性が実証された。PUFAの補充に好ましい方法には、培地へのPUFAの添加前に部分的にメチル化されたβ-シクロデキストリンと脂肪酸を組み合わせることが含まれることに留意されたい。
【０２７３】
実施例6
以下の例は、PUFA合成を回復させるため、不活性化PUFA遺伝子をこの遺伝子の活性型と同じ部位で交換できることを明らかにする。
【０２７４】
アセト乳酸シンターゼ遺伝子部位での二重相同組換えがシゾキトリウムで実証されている(米国特許出願第10/124,807号、前記を参照のこと)。本発明者らは、完全長のシゾキトリウムOrfAゲノムクローンを用いたシゾキトリウムOrfAノックアウト菌株(実施例3に記載されている)の形質転換により、シゾキトリウムPUFA PKS遺伝子の置換についてこの概念を試験した。形質転換体をPUFA補充のない培地で増殖するその能力によって選択した。次いで、これらのPUFA原栄養株をZeocin(商標)に対する耐性について試験し、いくつかは抗生物質に感受性を示すことが分かった。これらの結果から、導入されたシゾキトリウムOrfAが二重相同組換えを介してノックアウト菌株中のZeocin(商標)耐性遺伝子に置き換わったことが示唆される。この実験により、PUFA PKS遺伝子内での遺伝子置換の概念の裏付けが示される。シゾキトリウムOrfBおよびOrfCノックアウトに対する類似の実験により、同一の結果が得られた。
【０２７５】
実施例7
この例は、スラウストキトリウム23B PUFA PKS遺伝子の全部または一部がシゾキトリウムで機能できることを明らかにする。
【０２７６】
米国特許出願第10/124,800号(前記)に記載されるとおり、DHA産生原生生物スラウストキトリウム23B (Th. 23B)はorfA、orfB、およびorfC相同体を含むことが明らかにされている。その3つのTh. 23B遺伝子の完全なゲノムクローンを用いて、同種のorf「ノックアウト」を含有するZeocin(商標)耐性シゾキトリウム菌株を形質転換した(実施例4参照)。補完された形質転換体の直接的な選択をPUFAの補充がない状態で行った。この方法により、Th. 23B orfAおよびorfC遺伝子が、それぞれ、シゾキトリウムorfAおよびorfCノックアウト菌株をPUFA原栄養株に補完できることが明らかにされた。補完された形質転換体はZeocin(商標)耐性(シゾキトリウム遺伝子に挿入されたマーカーであって、これによりノックアウトを規定できる)を保持または喪失していたかのいずれかであると分かった。Zeocin(商標)耐性の補完形質転換体は、各orf領域外でのシゾキトリウムゲノムへのスラウストキトリウム遺伝子全体の単一の交差挿入によって生じた可能性が高い。この結果から、スラウストキトリウム遺伝子全体がシゾキトリウムで機能していることが示唆される。Zeocin(商標)感受性の補完形質転換体は二重交差事象によって生じた可能性が高く、その事象では、スラウストキトリウム遺伝子の一部(またはたぶん全部)が、破壊的なZeocin(商標)耐性マーカーを含んでいたシゾキトリウム遺伝子の同種領域に機能的に置き換わった。この結果から、スラウストキトリウム遺伝子の一部分がシゾキトリウムで機能していることが示唆される。
【０２７７】
実施例8
この例では、シゾキトリウムorfCコード配列全体がスラウストキトリウム23B orfCコード配列に完全かつ正確に置き換えられる結果、PUFAプロファイルがスラウストキトリウムのものに移行される。
【０２７８】
シゾキトリウムorfCコード配列を欠失させるため、すぐ上流(ATG開始コドンまでの、但しATG開始コドンを含まない)およびすぐ下流(TAA終止コドン直後から始まる)のおよそ2 kbのDNAをZeocin(商標)耐性マーカー前後にクローニングした。この上流および下流の領域は、orfCコード配列をマーカーと効果的に置き換える二重交差組換えのための相同性を供与する。形質転換体をPUFA補充がある状態でZeocin(商標)耐性について選択し、PUFA栄養要求性についてスクリーニングし、PCRおよびサザンブロット解析により特徴付ける。同様に、シゾキトリウムorfC遺伝子領域の同じ上流および下流配列がTh. 23B orfCコード配列(SEQ ID NO:23)の前後にクローニングされたプラスミドを構築した。上記のZeocin(商標)耐性PUFA栄養要求株へのこのプラスミドの形質転換は、PUFA原栄養株の選択を用いて行い、これによりTh. 23B orfC遺伝子に依存して、シゾキトリウムで正確に機能させ、PUFA栄養要求性を補完させた。Zeocin(商標)感受性形質転換体のその後のスクリーニングによって、Th. 23B orfC遺伝子とのZeocin(商標)耐性マーカーの置換から生じた可能性が高いものが同定された。これらのorfC置換菌株でのDHA:DPA比率は、平均して、2.3の正常(「野生型」)値に対して8.3であった。この高い比率は、これらの増殖条件下のスラウストキトリウム23Bでの値10に近い。従って、PUFAシンターゼ酵素複合体の成分を置換することによってシゾキトリウムのPUFAプロファイルを操作できることは明らかである。
【０２７９】
より具体的には、最初のプラスミド対はシゾキトリウムorfC遺伝子のすぐ「上流」および「下流」の領域を捕捉し、orfC欠失ベクターおよびTh. 23B置換ベクターの両方を構築するために使われた。
【０２８０】
プライマーprRZ15 (SEQ ID NO:49)およびprRZ16 (SEQ ID NO:50)を用いて、シゾキトリウムorfC領域のクローンからorfCコード領域上流の2000 bpの断片を増幅させた。プライマーprRZ15は断片の5'末端にKpnI部位を組み入れ、prRZ16は、ATG開始コドンまでの、但しATG開始コドンを含まないシゾキトリウム配列に対する相同性を有し、断片の3'末端にBamHI部位を組み入れる。PCR産物をpCR-Blunt II (Invitrogen)にクローニングし、プラスミドpREZ21を得た。同じように、プライマーprRZ17 (SEQ ID NO:51)およびprRZ18 (SEQ ID NO:52)を用いて、orfCコード領域のすぐ下流の(TAA終止コドンを含有しない)、但し5'末端にBamHI部位および3'末端にXbaI部位を組み入れた1991 bpの断片を増幅させた。このPCR断片をpCR-Blunt II (Invitrogen)にクローニングして、pREZ18を作出した。3成分のライゲーションにおいて、pREZ21由来の上流領域(KpnI-BamHI断片として)およびpREZ18由来の下流領域(BamHI-XbaI断片として)をpBlueScriptII SK(+)のKpnI-XbaI部位にクローニングして、pREZ22を得た。pTUBZEO11-2 (別名pMON50000; 米国特許出願第10/124,807号、前記を参照のこと)由来のZeocin(商標)耐性マーカーを1122 bpのBamHI断片としてpREZ22のBamHI部位に挿入して、pREZ23AおよびpREZ23B (Zeocin(商標)耐性マーカーをいずれかの方向で含有する)を作出した。次いで、pREZ23プラスミドを用いて、上記の粒子衝突形質転換によりorfCコード領域の正確な欠失をもたらした。所望の構造を有する菌株をB32-Z1と名付けた。
【０２８１】
Th. 23B orfC遺伝子の挿入用プラスミドを開発するため、1) シゾキトリウム上流領域とTh. 23B orfCコード領域の5'末端との間および2) Th. 23B orfCコード領域の3'末端とシゾキトリウム下流領域との間の正確な接合部を含有する中間構築体を初めに作出する。次いで、Th. 23B orfCコード領域の内部部分を導入する。
【０２８２】
プライマーprRZ29a (SEQ ID NO:53)およびprRZ30 (SEQ ID NO:54)を用いて、シゾキトリウムorfCコード配列のすぐ上流のおよそ100 bpを増幅する。プライマーprRZ29aはシゾキトリウムorfCのATG開始コドンのおよそ95 bp上流にSpeI制限部位を含み、prRZ30はシゾキトリウムorfCのATG開始コドンの19 bpすぐ上流に対する相同性を有し、Th. 23B orfCコード領域の開始部分(開始ATGを含む)に15 bp相同である。別に、鋳型としてクローンニングされたTh. 23B遺伝子を用いて、およそ450 bpのPCR産物をTh. 23B orfCコード領域の5'末端から作出する。プライマーprRZ31は開始ATGのすぐ上流のシゾキトリウムorfCコード配列の15 bpを含み、Th. 23B orfCコード領域の開始部分の17 bpに対する相同性を有し、プライマーprRZ32はTh. 23B orfCのATG開始コドンのおよそ450 bp下流に位置するNruI部位を組み入れ、NruI部位のすぐ下流の人為的なSwaI制限部位をさらに含む。これらの2つのPCR産物は従って、開始ATG部位で互いと約30 bpの重複する相同性を有し、本質的にprRZ30 (SEQ ID NO:54)およびprRZ31 (SEQ ID NO:55)の配列を含む。鋳型として2つの第1ラウンドPCR産物(prRZ29a (SEQ ID NO:53) X prRZ30 (SEQ ID NO:54); 約100 bp; prRZ31 (SEQ ID NO:55) X prRZ32 (SEQ ID NO:56); 約450 bp)の混合物ならびに外側のプライマーprRZ29a (SEQ ID NO:53)およびprRZ32 (SEQ ID NO:56)を用いた第2ラウンドのPCRによって、上流のシゾキトリウムorfC領域とTh. 23B orfCコード領域の開始部分との間の「完全な縫い目」を含有するおよそ520 bpの産物が得られた。このPCR産物をプラスミドpCR-Blunt IIにクローニングしてpREZ28を作出し、インサートの配列を確認した。
【０２８３】
鋳型としてクローニングされたTh. 23B遺伝子を用いてTh. 23B orfCコード領域の3'末端におよそ65 bpの断片を作出するためのPCRに、プライマーprRZ33 (SEQ ID NO:57)およびprRZ34 (SEQ ID NO:58)を用いた。この断片(prRZ33由来)の上流末端は人為的なSwaI制限部位を含み、Th. 23B orfCのTAA終止コドンのおよそ60 bp上流にSphI制限部位を包含する。この断片(prRZ34由来)の下流末端はTh. 23B orfCコード領域の3'末端に16 bpとorfCコード領域(終止コドンを含む)からすぐ下流のシゾキトリウム配列に相同性を有する18 bpを含む。プライマーprRZ35 (SEQ ID NO:59)およびprRZ36 (SEQ ID NO:60)を用いて、orfCコード領域のすぐ下流のシゾキトリウムDNAに相同なおよそ250 bpの断片を作出した。このPCR断片(prRZ35由来)の上流末端にはTh. 23B orfCコード領域の末端に相同な15 bp (TAA終止コドンをカウントして)が含まれ、下流末端にはシゾキトリウム終止コドンの約240 bp下流のSalI制限部位が含まれた。鋳型として2つの第1ラウンドPCR産物(prRZ33 (SEQ ID NO:57) X prRZ34 (SEQ ID NO:58); 約65 bp; prRZ35 (SEQ ID NO:59) X prRZ36 (SEQ ID NO:60); 約250 bp)の混合物ならびに外側のプライマーprRZ33 (SEQ ID NO:57)およびprRZ36 (SEQ ID NO:60)を用いた第2ラウンドのPCRによって、スラウストキトリウム23B orfCのコード領域の末端とorfCコード領域のすぐ下流のシゾキトリウムDNAの領域との間の「完全な縫い目」を含有するおよそ310 bpの産物が得られた。このPCR産物をプラスミドpCR-Blunt IIにクローニングしてpREZ29を作出し、インサートの配列を確認した。
【０２８４】
次に、上流および下流の「完全な縫い目」領域をpREZ22 (上記参照)の中で連結した。3成分のライゲーションにおいて、pREZ28由来のSpeI/SwaI断片およびpREZ29のSwaI/SalI断片をpREZ22のSpeI/SalI部位にクローニングして、pREZ32を作出した。最後に、スラウストキトリウム23B orfCコード領域の内側の大部分をNruI/SphI断片としてpREZ32にクローニングして、pREZ33を作出した。その後、このプラスミドを使ってorfCノックアウト菌株B32-Z1を形質転換し、PUFA原栄養株の選択に用いた。
【０２８５】
本明細書において引用されるまたは論じられる各刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２８６】
本発明の様々な態様を詳細に記載してきたが、それらの態様の変更および適応が当業者に想到することは明らかである。しかしながら、そのような変更および適応は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内であることが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】シュワネラ種株SCRC-2738、シュワネラ・ジャポニカ、およびシュワネラ・オレヤナ由来のEPA産生クラスターの読み取り枠(ORF)構造を示す概略図である。
【図２】シュワネラ種株SCRC-2738、シュワネラ・ジャポニカおよびシュワネラ・オレヤナ由来のEPA産生遺伝子クラスターのドメイン構造を示す概略図である。
【図３】図3Aは、シュワネラ・ジャポニカ(コスミド3F3)由来のpfaB ORFの終わりとpfaC ORFの始まり(相補鎖を含め、SEQ ID NO:1のヌクレオチド番号21101-21150が示されている)との間の重複を示す配列アライメントおよびその対応するアミノ酸翻訳(pfaB: SEQ ID NO:3の751-759位; pfaC: SEQ ID NO:4の1-9位)である。図3Bは、シュワネラ・オレヤナ(コスミド9A10)由来のpfaB ORFの終わりとpfaC ORFの始まり(相補鎖を含め、SEQ ID NO:7のヌクレオチド番号27943-28008が示されている)との間の重複を示す配列アライメントおよびその対応するアミノ酸翻訳(pfaB: SEQ ID NO:9の735-742位; pfaC: SEQ ID NO:10の1-9位)である。
【図４】シュワネラ種株SCRC-2738由来のorf2の注釈された始まり(orf2_ATG: SEQ ID NO:61)およびシュワネラ種株SCRC-2738由来のorf2の実験上機能的な始まり(WO 98/55625) (orf2_TTG: SEQ ID NO:62)と対比してpfaE ORFのN末端(Sja_pfaE: SEQ ID NO:6の1-70位; Sol_pfaE: SEQ ID NO:12の1-59位)を示す配列アライメントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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