(57)【要約】  本発明はＩＡＰＰ−ペプチド誘導体を使用する糖尿病及びアルツハイマー病治療のための改善された薬剤及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）受容体に結合しうるＩＡＰＰペプチド類似体であって、前記ペプチド類似体がａ）最高３８個のアミノ酸を有し、そのうち３７個のアミノ酸がその天然の配列中に天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列を有し、ｂ）その天然の配列中に天然のＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７を有し、ｃ）少なくとも１つのアミド結合がＮメチル化されており、そして所望によりｄ）天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列の１位のＬｙｓ（リシン）がＯｒｎ（オルニチン）で置換されていてもよく、ならびに／あるいは、２位及び７位のＣｙｓ（システイン）が２位のＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）及び７位のＡｓｐ（アスパラギン酸）又は２位のＡｓｐ及び７位のＤａＰで置換されていてもよく、かつｅ）但し天然のヒトＩＡＰＰのアミノ酸配列を有する配列番号１〜５のペプチド類似体を除くものであるペプチド類似体。
【請求項２】
天然の膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）受容体に結合しうる、診断薬又は治療薬としてのＩＡＰＰペプチド類似体であって、前記ペプチド類似体がａ）最高３８個のアミノ酸を有し、そのうち３７個のアミノ酸が天然の配列中に天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列を有し、ｂ）その天然の配列中に天然のＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７を有し、ｃ）少なくとも１つのアミド結合がＮメチル化されており、そして所望によりｄ）天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列の１位のＬｙｓがＯｒｎで置換されていてもよく、ならびに／あるいは、２位及び７位のＣｙｓが２位のＤａｐ及び７位のＡｓｐ又は２位のＡｓｐ及び７位のＤａＰで置換されていてもよいペプチド類似体。
【請求項３】
天然のＩＡＰＰの完全なアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のペプチド類似体。
【請求項４】
天然のＩＡＰＰのアミノ酸８〜３７を有する請求項１、２又は３に記載のペプチド類似体。
【請求項５】
ＩＡＰＰの天然の受容体のアゴニストとして作用する請求項３に記載のペプチド類似体。
【請求項６】
ＩＡＰＰの天然の受容体のアンタゴニストとして作用する請求項４に記載のペプチド類似体。
【請求項７】
ＩＡＰＰの１個、２個、３個又は４個のアミド結合がＮメチル化されている上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項８】
少なくとも１つのアミド結合が、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、及び２９位のアミノ酸のαアミノ基のアミド結合からなるグループから選ばれる上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項９】
ペプチド類似体が配列番号１〜１７からなるグループから選ばれている上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１０】
ペプチド類似体が可溶である上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１１】
ペプチド類似体の特にＮ末端のαアミノ基が特にアセチル基、放射性マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカー又はスピンラベルで標識されている上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１２】
ペプチドがアシル基、機能性アシル基、芳香族基、アミノ酸、グリコール基及び脂質基からなるグループから選ばれた少なくとも１個の官能基で誘導されている上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１３】
マーカー及び／又は官能基がスペーサー、特にアミノ酸によってペプチド類似体と結合されている請求項１１又は１２に記載のペプチド類似体。
【請求項１４】
担体に固定化されている上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１５】
ＩＡＰＰがヒトＩＡＰＰである上記請求項のいずれか１項に記載のペプチド類似体。
【請求項１６】
ＩＡＰＰに対して特異的、又は請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体に対して特異的な抗体の調製方法において、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチド類似体を抗原として、所望によりＩＡＰＰモノマー又はそのオリゴマーとともに、抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る方法。
【請求項１７】
ＩＡＰＰ又はβアミロイドペプチドと請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体との混合物に対して特異的な抗体の調製方法において、ＩＡＰＰ又はβアミロイドペプチド又はそのオリゴマーと請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド類似体との混合物を抗原として、抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る方法。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体の混合物に対して特異的、又は請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体とβアミロイドペプチドの混合物に対して特異的であって、これに特異的に結合する、請求項１７に記載の方法により調製される抗体。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体に対して特異的、又はＩＡＰＰに対して特異的、又はＩＡＰＰ／ペプチド類似体複合体に対して特異的であって、これに特異的に結合する、請求項１６に記載の方法により調製される抗体。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチド類似体及び／又は請求項１８又は１９に記載の抗体を含む医薬品。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチド類似体及び／又は請求項１８又は１９のいずれか１項に記載の抗体並びにインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドを含む組合せ医薬品。
【請求項２２】
少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体を含む請求項２０〜２１のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項２３】
医薬品がデポー製剤として提供される請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項２４】
医薬品が錠剤形態、エーロゾル又は溶液である請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の医薬品。
【請求項２５】
タンパク質凝集病、特に糖尿病の予防又は治療のための医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項２６】
糖尿病の予防又は治療のための組合せ医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体とインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドの併用。
【請求項２７】
ペプチド類似体を糖尿病のＩＡＰＰ受容体調節治療のための受容体アンタゴニストとして使用する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２８】
ペプチド類似体を糖尿病のＩＡＰＰ受容体調節治療のための受容体アゴニストとして使用する請求項２５又は２６に記載の使用。
【請求項２９】
ペプチド類似体をＩＡＰＰ凝集及びＩＡＰＰ斑の形成の阻害剤として使用する請求項２５、２６、２７又は２８に記載の使用。
【請求項３０】
ａ）ＩＡＰＰ凝集又はＩＡＰＰによるアミロイド斑の形成の減少又は阻止と、ｂ）糖代謝の調節を同時に行なうための医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３１】
ａ）ＩＡＰＰの細胞毒性又はその凝集の減少又は阻止と、ｂ）糖代謝の調節を同時に行なう医薬品の調整のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３２】
β−アミロイドペプチド凝集又はβ−アミロイドペプチドによるアミロイド斑の形成の減少又は阻止のための医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３３】
β−アミロイドペプチドの細胞毒性又はその凝集の減少又は阻止のための医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３４】
アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病の予防又は治療のための医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
ａ）アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病と、ｂ）糖尿病の予防又は治療を同時に行なう医薬品の製造のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３６】
医薬品がインスリン及び／又はプラムリンチド及び／又はＩＡＰＰを含む組合せ医薬品として作製されている請求項２５〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病の診断のための診断薬の調製のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３８】
タンパク質凝集病、特に糖尿病の診断のための診断薬の調製のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
診断、治療及び研究用の抗体の製造のための、取り扱いが改善された免疫原としての請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体の使用。
【請求項４０】
検出マーカーを備えた請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は検出マーカーを備えた請求項１８又は１９に記載の抗体をプローブとして、被検試料と接触させ、場合によって存在するＩＡＰＰ、β−アミロイドタンパク質、プリオンタンパク質、α−シヌクレイン又はポリグルタミン又はその凝集体を有するペプチド類似体又は抗体の形成を検出することを特徴とする、ＩＡＰＰ、β−アミロイドタンパク質、プリオンタンパク質、α−シヌクレイン又はポリグルタミンもしくはその凝集体の定性的及び／又は定量的検出方法。
【請求項４１】
液体に含まれるＩＡＰＰ、β−アミロイドタンパク質、プリオンタンパク質、α−シヌクレイン又はポリグルタミンの凝集体形成を調節、特に阻止するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体と前記液体を接触させ、インキュベーションし、凝集体形成を調節することを特徴とする方法。
【請求項４２】
研究目的のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体又は請求項１８又は１９に記載の抗体の使用。
【請求項４３】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチド類似体とＩＡＰＰ及び／又はβ−アミロイドタンパク質及び／又はプラムリンチドとの混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）のペプチド類似体、ＩＡＰＰ又はその凝集体の検出方法、タンパク質凝集病、特に糖尿病及びアルツハイマー病の予防及び治療のための医薬組成物、タンパク質凝集病、特に糖尿病及びアルツハイマー病の検出のための診断用組成物並びに疾病の診断及び治療目的のため又は基礎研究のための上記ペプチド類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は現在なお十分な治療策がない疾病である。通常Ｉ型及びＩＩ型糖尿病は区別されている。糖尿病患者の９０％はＩＩ型糖尿病又は老年性糖尿病を患っている。今日全世界に１億５０００万人以上のＩＩ型糖尿病患者がいる。糖尿病はインスリン不足又はインスリン依存性生物学的プロセスにおける障害によって発生する。一方では炭水化物代謝でのインスリンの中心的役割を他の分子で代行することができず、他方ではインスリンの投与だけでＩ型糖尿病の場合は疾病の病理的結果を、又はＩＩ型糖尿病の場合は疾病自体を除去することができないため、新しい治療策が必要である。このような方策は一方ではインスリン分子の分泌、吸収及び生物学的機能の展開を促進し、他方ではインスリンの望ましくない副作用、例えば体重増加又は高血糖を防止するものでなければならない。従って特にインスリンとともに炭水化物代謝の調節に寄与する新規な分子は、生物医学的に重要である。
【０００３】
この新規な分子の１つが膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ又はアミリン）である。ＩＡＰＰは、３７個のアミノ酸残基からなり、膵臓のβ細胞で合成され、インスリン及びグルカゴンとともに糖代謝の調節に寄与するペプチドホルモンである。ＩＡＰＰはインスリンのアンタゴニストである。９５％を超えるＩＩ型糖尿病患者の膵臓にいわゆるアミロイド斑が認められる。アミロイド斑はポリペプチドＩＡＰＰの不溶の凝集体からなる沈着物である。従ってアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン疾患又はハンチントン病と同様に、糖尿病もタンパク質凝集病（Ross & Poirier, Nature medicine, 2004年7月、10巻補遺、10-17頁）とみなすことができる。ＩＡＰＰは可溶性モノマー形であることから、ＩＡＰＰの生体活性はそのｃＡＭＰ結合受容体によって仲介される。ところがＩＡＰＰ−アミロイド斑、即ちＩＡＰＰの可溶性オリゴマー及び多量体は細胞毒性を有する。ＩＡＰＰ−アミロイド形成によって引き起こされるβ細胞の障害はＩＩ型糖尿病の病理発生の一連の相互作用におおいに寄与すると考えられる。従ってＩＡＰＰ−アミロイド形成過程の治療上有効な阻害剤の開発は重要な生物医学的関心事である。しかもＩＡＰＰ分子はインスリンのアンタゴニストとしての、かつインスリン分泌又は投与に関連する食後高血糖の調節剤としての生物学的機能に関して、それ自体がＩ型（例えばインスリンと組み合わせて）及びＩＩ型糖尿病の治療で有望な治療用途をもつと思われる重要なポリペプチドホルモンである。ところがＩＡＰＰの医学的適用はその難溶性と激しい凝集傾向のため大幅に限られている。
【０００４】
可溶性ＩＡＰＰ類似体、プラムリンチドは周知である。プラムリンチド（Symlin(R)）はヒトＩＡＰＰ分子の配列中の２５、２８及び２９位の３つのアミノ酸残基をプロリンで置換することによって合成される。このプロリン置換は、本来凝集傾向がないラットＩＡＰＰ配列で現れる。構造的には、プロリンを含む配列の凝集傾向の減少は、プロリン残基がβフォールドコンホメーションをとることができないことで説明される（プロリンはβフォールドを「破る」残基である）。実際にＩＡＰＰ類似体、プラムリンチドは凝集傾向が著しく減少しており、ヒトＩＡＰＰより良好な溶解度を有する。まだ完了していない臨床研究が示唆するところでは、この類似体はインスリンとともに糖尿病治療に適用できそうである。ところがプラムリンチドがｐＨ値５以上で凝集傾向があることがインスリンと併用した製剤及び適用を妨げる。そこでこの類似体はインスリンと別個に皮下注射により投与される。このため適用が大変面倒である（B.Nyholmら、Expert Opinion, Investig. Drug(2001) 10(9) 1641-1652）。
【０００５】
糖尿病を早期に認識するとともに治療対策を早期に採用すれば、病気の進行を大幅に遅らせて、肯定的な影響を及ぼすことができる。ところがＩＩ型糖尿病でのＩＡＰＰの役割はまだ解明されていない。その凝集は濃度に依存するから、可溶性ＩＡＰＰ又は可溶性ＩＡＰＰ類似体の血中濃度と疾病の発症は十分に関連があるようである。慣用のＩＡＰＰ−ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）はＩＡＰＰ抗体が認識したＩＡＰＰ分子を決定することしかできない。しかし抗原抗体相互作用を担うタンパク質領域（抗原領域）は、タンパク質会合によってもはや簡単に識別できないことが知られている。それ故、ＩＡＰＰ分子の特異的に異なる会合形式を認識できる実験室的化学的ＩＡＰＰ測定方法を開発することが重要である。そのためにコンホメーション特異的抗体、即ちモノマー又はオリゴマーＩＡＰＰ分子に向けて作られた抗体の開発が必要と思われる。在来のＩＡＰＰ抗体はコンホメーション特異的でないからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明の課題は、タンパク質凝集病、特に糖尿病及び／又はアルツハイマー病の改善された予防、治療及び診断を可能にする薬剤及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、天然のＩＡＰＰ（膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド）受容体に結合しうるＩＡＰＰペプチド類似体において、ペプチド類似体がａ）最高３８個のアミノ酸、好ましくは最高３７個のアミノ酸を有し、そのうち３７個のアミノ酸がその天然の配列中に天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列を有し、ｂ）その天然の配列中に天然のＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７を有し、ｃ）少なくとも１つのアミド結合がＮメチル化されており、そして、所望によりｄ）天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列の１位のＬｙｓ（リシン）はＯｒｎ（オルニチン）で置換されていてもよく、ならびに／あるいは、２位及び７位のＣｙｓ（システイン）は２位のＤａｐ（ジアミノプロピオン酸）及び７位のＡｓｐ（アスパラギン酸）又は２位のＡｓｐ及び７位のＤａＰで置換されていてもよく、かつｅ）但しヒトＩＡＰＰの野性種アミノ酸配列を有する配列番号１〜５のＮメチル化ペプチド類似体を除くペプチド類似体を提供することによって前記課題を解決する。特に本発明は、天然のＩＡＰＰ（膵ランゲルハンス島アミロイドポリペプチド）受容体に結合しうる、診断薬又は治療薬としてのＩＡＰＰペプチド類似体において、ペプチド類似体がａ）最高３８個のアミノ酸、好ましくは３７個のアミノ酸を有し、そのうち３７個のアミノ酸がその天然の配列中に天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列を有し、ｂ）その天然の配列中に天然のＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７を有し、ｃ）少なくとも１つのアミド結合がＮメチル化されており、そして、所望によりｄ）天然のＩＡＰＰのアミノ酸配列の１位のＬｙｓ（リシン）はＯｒｎ（オルニチン）で置換されていてもよく、ならびに／あるいは、２位及び７位のＣｙｓは２位のＤａｐ及び７位のＡｓｐ又は２位のＡｓｐ及び７位のＤａＰで置換されていてもよいペプチド類似体を提供することによって、前記課題を解決する。
【０００８】
本発明によれば、これらのペプチド類似体、即ち修飾Ｎメチル化ＩＡＰＰ誘導体は、好ましくは単離された、特に好ましくは部分的又は完全に精製された形で提供される。
【０００９】
従って上記のペプチド類似体は必要不可欠な特徴ａ）、ｂ）及びｃ）によって特徴づけられ、所望により特徴ｄ）を有しうる。即ち本発明のこの任意選択的実施形態でペプチド類似体は天然のヒトＩＡＰＰ配列の１位のリシンをアミノ酸、オルニチンで、特にヒト天然のＩＡＰＰの２及び７位の２つのシステインを２位のＤａｐ（２，３−ジアミノプロピオン酸）及び７位のＡｓｐ又は２位のＡｓｐ及び７位のＤａｐで置換してもよいという点で、ＩＡＰＰ、特にヒトＩＡＰＰの天然の配列とは異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする。以下で、特徴ｄ）に基づき形成された、即ち天然のＩＡＰＰ配列、特にヒトＩＡＰＰ配列と異なり１位にオルニチン（リシンの代わりに）及び／又は２位にＡｓｐ又はＤａｐ及び７位にＤａｐ又はＡｓｐ（それぞれシステインの代わりに）を有する本発明のペプチド類似体を、本発明に係るペプチド類似体の誘導体と呼ぶ。
【００１０】
２位及び７位にＣｙｓを有する本発明のペプチド類似体は、好ましくは酸化されており、即ちＣｙｓ２及びＣｙｓ７のチオール残基の間のジスルフィド架橋が閉じている。
【００１１】
また２位及び７位にＤａｐ及びＡｓｐ又はＡｓｐ及びＤａｐを有する本発明のペプチド類似体は好ましくは架橋を有する。即ちＡｓｐとＤａｐの側鎖がラクタム架橋によって互いに共有結合されている。
【００１２】
好ましい実施形態で本発明のすべてのペプチド類似体のＣ末端はアミドをなす。
【００１３】
本発明に関連して「天然のＩＡＰＰ」の概念は、ＩＡＰＰの野性種アミノ酸配列、即ち感染生物、好ましくはヒトにおいてin vivoで天然に見られるアミノ酸配列を有するＩＡＰＰを意味する。特にヒトの様々な天然のＩＡＰＰ配列がKapurniotu（Biopolymers (Peptide Science) 60 (2001) 438-459）に公表されている。この学説の配列番号１８はヒトのＩＡＰＰの野性種配列を示す。従って本発明の枠内でアミノ酸又はアミド結合の位置データは、別に指示しないかぎり、常にKapurniotu（前記）の図式１又は配列番号１８に示された天然のヒトＩＡＰＰのアミノ酸配列に関する位置データである。同様に天然のＩＡＰＰ受容体の概念は、自然に存在する野性種ＩＡＰＰ受容体、特にヒト野性種受容体を意味する。
【００１４】
本発明に係るペプチド類似体は、一実施形態では天然のヒトＩＡＰＰとまったく同じ一次構造を、別の実施形態では特にヒトＩＡＰＰとおおむね同じ一次構造を有するが、本発明に基づき選択的に導入される特定のアミド結合のＮメチル化によりＩＡＰＰと異なるコンホメーションを有し、それとともに天然のヒトＩＡＰＰと比較して変化した生物学的、特に生化学的及び生物理学的性質を有する。特に本発明に係るペプチド類似体は、天然のＩＡＰＰ、特に天然のヒトＩＡＰＰと相互作用して、アミロイド細繊維への凝集、その後のアミロイド斑の形成及びそれに関連する細胞毒性を減少又は阻止しうるのが特徴である。同時に天然の、即ち野性種受容体、好ましくはヒトＩＡＰＰ受容体に特異的に結合しうるという有利な性質がある。本発明に係るペプチド類似体は細繊維形成能力がないか又は大幅に低下している。約７の生理的ｐＨで特に細繊維形成傾向の大幅な低下を示し、従って天然のＩＡＰＰ又はプラムリンチドと異なりインスリンとともに調合し、投与することができる。本発明に係るペプチド類似体は特に約ｐＨ７〜７．４の生理的ｐＨ値でＩＡＰＰの少なくとも１００倍の溶解度を有し、このため前述のようにインスリンとともに調合することが可能である。ＩＡＰＰと比較して溶解度が高いため、溶液（１ｍｇ／ｍｌ）として貯蔵時にその生物学的活性が減少しない（ＩＡＰＰの場合は減少する）。またＩＡＰＰ含有溶液の添加物として、ＩＡＰＰが可溶性の、即ち生物学的に活性の形態を保つことに寄与する。本発明に係るペプチド類似体はＩＡＰＰと比較して、プロテアーゼによる分解に対して安定である。このため本発明のペプチド類似体を錠剤の形で投与することが可能になる。さらに本発明に係るペプチド類似体は、アルツハイマー病の発症で役割を演じるβアミロイドペプチドと相互作用する。本発明に係るペプチド類似体は特にβアミロイドペプチドの細胞毒性を低下させるため、アルツハイマー病の診断、治療及び予防にも適している。
【００１５】
本発明に係るペプチド類似体は特にタンパク質凝集病、特に糖尿病、好ましくはＩ型糖尿病及び／又はＩＩ型糖尿病（Diabetes mellitus）の予防、治療及び診断に適している。所望により好ましい実施形態で本発明に係るペプチド類似体がインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドとともに糖尿病、特にＩ型及び／又はＩＩ型糖尿病の予防及び治療のために使用される。さらに体液中のＩＡＰＰのＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定法）／ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）に基づく検出のためのコンホメーション特異性抗体を提供し、かつ使用し、こうして改善された診断及び分析方法を提供するために、本発明に基づき提供されるコンホメーション安定化ペプチド類似体を抗原として、例えば単独で又は所定の量のＩＡＰＰモノマー又はＩＡＰＰオリゴマーと混合して使用することができる。
【００１６】
本発明においては、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等のために、マーカー、例えばスピンラベル、蛍光又は発光マーカーとともに、特にＮ末端標識化、特に好ましくはＮ末端ビオチニル化形態で、又はＮ末端蛍光標識化、又はその他の蛍光マーカーを付した本発明のペプチド類似体を使用することができる。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明は、天然のＩＡＰＰ、特に天然のヒトＩＡＰＰの完全なアミノ酸配列１〜３７又は上記の誘導体のアミノ酸１〜３７を有し又はこの３７個のアミノ酸だけを有し、即ちこれらのアミノ酸からなるペプチド類似体を提供する。特に好ましい実施形態では、本発明は、ヒトの天然のＩＡＰＰの３７個のアミノ酸又は天然のヒトＩＡＰＰの順序で配列された上記の誘導体のアミノ酸からなり、このペプチド類似体のアミノ酸のαアミノ基のアミド結合の少なくとも１つがＮメチル化されているペプチド類似体を提供する。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、本発明は、天然のヒトＩＡＰＰの完全なアミノ酸配列、即ち完全長のアミノ酸配列１〜３７又は上記の誘導体のアミノ酸配列を有し又はこれからなる本発明ＩＡＰＰペプチド類似体が、天然のＩＡＰＰ受容体の受容体アゴニストとして作用することを教示する。この実施形態では、ペプチド類似体がＩＡＰＰ受容体を活性化する。この教示によれば、本発明のペプチド類似体は糖代謝及び天然のＩＡＰＰ分子のその他の生物学的作用の調節のために特に適している。同時にこのペプチド類似体はアミロイド細繊維及び／又はアミロイド斑の形成の阻害剤、即ち不溶の細胞障害性ＩＡＰＰ凝集体の形成の阻害剤として作用するとともに、これに原因する細胞毒性を減少又は阻害する。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、野性種配列に比して短縮され、特にＮ末端が短縮され、天然のＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７、好ましくは８〜３７又は上記誘導体のアミノ酸を有するか、もしくは天然の順序のアミノ酸だけからなるペプチド類似体を提供する。この実施形態では短縮されたペプチド類似体が特に天然のヒト野性種ＩＡＰＰの少なくともアミノ酸１９〜３７、好ましくは８〜３７、最大でアミノ酸２〜３７又は上記の誘導体のアミノ酸を有し、もしくはこれらのアミノ酸からなり、ペプチド類似体のアミド結合の少なくとも１つがＮメチル化されている。
【００２０】
また本発明は特に天然のヒトＩＡＰＰの完全アミノ酸配列又は上記の誘導体の完全アミノ酸配列をもたない、本発明に基づき短縮されたペプチド類似体、即ち２〜３７位あるいは１９〜３７位のアミノ酸又は上記の誘導体のアミノ酸を有するか、又はこれらのアミノ酸からなるペプチド類似体が、同じく天然のＩＡＰＰの野性種受容体に結合するが、そこで受容体アゴニストとして作用し、かくして糖代謝の調節剤として機能するために同じく適していることを教示する。この実施形態ではペプチド類似体はＩＡＰＰ受容体を阻害する。これらの特に好ましいペプチド類似体は同時にアミロイド細繊維及び／又はアミロイド斑の形成の阻害剤として作用し、従ってそれに伴う細胞毒性を減少又は阻害する。
【００２１】
こうして本発明は、天然のＩＡＰＰ、特に天然のヒトＩＡＰＰのアミノ酸７〜３７、６〜３７、５〜３７、４〜３７、３〜３７及び２〜３７又は上記の誘導体のアミノ酸を有するか、又はこれらのアミノ酸だけからなり、これらのどの実施形態でもペプチド類似体のアミド結合の少なくとも１つがＮメチル化されている実施形態、即ち野性種ＩＡＰＰのペプチド類似体も包含する。
【００２２】
好ましい実施形態では、本発明のペプチド類似体は、Ｎメチル化された、即ちペプチドのアミノ酸のαアミノ基の水素原子がメチル基で置換された２、３又は４個のアミド結合を有する。本発明の好ましい実施形態では本発明のペプチド類似体の２２及び／又は２３及び／又は２４及び／又は２５及び／又は２６及び／又は２７及び／又は２８及び／又は２９位のアミノ酸のαアミノ基に属するアミド結合がＮメチル化されている。特に好ましい実施形態ではＮメチル化アミド結合が４〜８個のアミノ酸からなるペプチド類似体の領域に、切れ目のない順序でアミノ酸配列に配置されている。別の好ましい実施形態でＮメチル基は、４〜８個のアミノ酸からなるペプチド類似体の領域に、特に上記アミノ酸位置中、ペプチド類似体のアミド結合に１つおきに存在する。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、本発明はヒト野性種ＩＡＰＰの天然アミノ酸配列を有するともに、配列番号１〜５に示されるＮメチル化を有するペプチド類似体を除き、配列番号１〜１７からなるグループから選ばれたペプチド類似体に関する。本発明の別の好ましい実施形態は配列番号１〜１７からなるグループから選ばれた治療用又は診断用のペプチド類似体に関する。従って本発明は特に配列番号１〜１７の本発明のペプチド類似体をヒト又は動物の身体の治療方法及びヒト又は動物の身体で行われる診断方法で初めて応用するものである。また本発明は上記の本発明のペプチド類似体、特に配列番号１〜１７からなるグループから選ばれたペプチド類似体を含む医薬品及び診断薬に関する。
【００２４】
特に好ましい実施形態では、本発明はヒト野性種ＩＡＰＰ又はその誘導体のアミノ酸１〜３７を有する本発明のペプチド類似体のグループから選ばれ、位置（２４及び２６）、（２５及び２７）、（２３及び２５）、（２６及び２７）、（２５及び２６及び２７）、（２４及び２５）、（２５及び２６）、（２２及び２４）、（２３及び２４）、（２４及び２６）、（２３）、（２４）、（２５）、（２６）、（２７）、（２８及び２９）、（２５及び２８及び２９）にアミノ酸のαアミノ基のアミド結合を有するペプチド類似体に関する。これらのペプチド類似体は、ヒト野性種ＩＡＰＰのアミノ酸配列を有する限り、上記の順序でＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＦＡ、ＩＡＰＰ−ＩＬ、ＩＡＰＰ−ＡＩＬ、ＩＡＰＰ−ＧＡ、ＩＡＰＰ−ＡＩ、ＩＡＰＰ−ＮＧ、ＩＡＰＰ−ＦＧ、ＩＡＰＰ−ＧＡＩＬ、ＩＡＰＰ−Ｆ、ＩＡＰＰ−Ｇ、ＩＡＰＰ−Ａ、ＩＡＰＰ−Ｉ、ＩＡＰＰ−Ｌ、ＩＡＰＰ−ＳＳ及びＩＡＰＰ−ＡＳＳとも称する。
【００２５】
自明のことだが、本発明は特に医薬品又は診断薬の調製並びに研究及び試験目的のための、野性種ＩＡＰＰの上記のペプチド類似体又はその誘導体と、天然非修飾ＩＡＰＰ及び／又はβアミロイドペプチド又はＩＡＰＰのその他の周知のペプチド類似体もしくはβアミロイドペプチド（Ａ−β）又はＩＡＰＰのその他の誘導体もしくはＡ−βとの混合物、例えば１：１混合物に関する。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、好ましくは約７．０〜８．０の生理的ｐＨ値、好ましくはｐH＝７．４で、特に水又は生理的食塩水に可溶の、特に天然のＩＡＰＰ、特に天然のヒトＩＡＰＰの１００倍の溶解度を有する本発明のペプチド類似体に関する。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、本発明のペプチド類似体は特にＮ末端αアミノ基が特にアセチル基、放射性マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカー又はスピンラベルで標識され、好ましくは上記マーカーがスペーサーを介してペプチド類似体と結合されるようになっており、スペーサーはアミノ酸であることが可能である。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るペプチド類似体はアシル基、機能性アシル基、芳香族基、アミノ酸、グリコール基及び脂質基からなるグループから選ばれた少なくとも１つの官能基により誘導されたものである。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、官能基自体がアミノ酸でないとして、官能基がスペーサー例えばアミノ酸によりペプチド類似体と結合されている。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るペプチド類似体は担体、例えばマトリックス、ウェルの表面、マイクロタイタープレート、膜等に固定化されている。
【００３１】
本発明に係るペプチド類似体は通常化学的に合成及び／又は修飾することができる。
【００３２】
また本発明は、ａ）ＩＡＰＰ又はｂ）ペプチド類似体／ＩＡＰＰ複合体に対して特異的な、もしくはｃ）本発明のペプチド類似体に対して特異的な抗体の調製方法において、本発明のペプチド類似体を抗原として、所望によりＩＡＰＰモノマー又はオリゴマーとともに抗体形成能力を持つ系と接触させ、例えば動物の身体に注射し、生じた抗体を得る調製方法に関する。また自明のことであるが、本発明はＩＡＰＰ又はＩＡＰＰ／ペプチド類似体複合体に対して特異的な、又は特異的に本発明のペプチド類似体に対して特異的な抗体の調製方法において、抗体がポリクロナール抗体のみならずモノクロナール抗体であってもよい調製方法に関する。従って本発明は上記の方法により調製されるモノクロナール又はポリクロナール抗体及びその断片にも関し、その場合抗体又はその断片は本発明のペプチド類似体対して特異的又はＩＡＰＰ又はペプチド類似体／ＩＡＰＰ複合体に対して特異的であって、即ちこれを特異的に認識して結合することができる。抗体は常法により修飾し、例えば標識することができる。また抗体は固定化した形で担体又はペレットに固定されていてもよい。本発明に係るポリクロナール又はモノクロナール抗体は、例えば本発明に係るペプチド類似体で治療した患者の病状の分析又はその他の治療上有効なペプチドの単離と同定のために利用することができる。本発明に係るペプチドは免疫原としての使用に関連して、診断及び治療用抗体の調製について、天然由来の難溶性ペプチドに比して取り扱いやすさが大幅に改善されているため、特に有利である。こうして調製された抗体は、一実施形態では本発明のペプチドを特異的に、別の実施形態では天然に存在する、所望により凝集形態の野性種ＩＡＰＰを特異的に認識することができるため、本発明の抗体を例えばアルツハイマー病又は糖尿病の診断に使用することができる。また本発明は、本発明のペプチド類似体をヒト又は動物の生体に適用して、ＩＡＰＰ又はその誘導体に対する免疫化を得るヒト又は動物の生体の免疫化方法に関する。
【００３３】
そこで本発明は、本発明のペプチド類似体に対して特異的な抗体の調製方法において、少なくとも１つの本発明のペプチド類似体を抗原として、抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る調製方法に関する。また本発明はＩＡＰＰ及び本発明のペプチド類似体に対して特異的な抗体の調製方法において、少なくとも１つの本発明のペプチド類似体を抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る調製方法に関する。また本発明はＩＡＰＰとペプチド類似体の混合物に対して特異的な抗体の調製方法において、ＩＡＰＰモノマーと本発明のペプチド類似体の混合物を抗原として（所望によりオリゴマーとしてのＩＡＰＰも使用することができる）、抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る調製方法に関する。また本発明はβアミロイドペプチドと本発明のペプチド類似体の混合物に対して特異的な抗体の調製方法において、βアミロイドペプチド・モノマー又はオリゴマーと少なくとも１つの本発明のペプチド類似体との混合物を抗体形成能力をもつ系と接触させ、生じた抗体を得る調製方法に関する。
【００３４】
また本発明は、疾病、特にタンパク質凝集病、特に糖尿病及び／又はアルツハイマー病の診断、予防又は治療のために、上記方法により調製された、抗原を特異的に認識して結合する特異的抗体又はその特異的断片に関する。従って本発明は、糖尿病及び／又はアルツハイマー病の診断、予防又は治療のための診断薬又は医薬品の製造のための上記抗体又はその特異的断片の使用にも関する。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、本発明は、前述のように作用物質として好ましくは予防又は治療上有効な量の少なくとも１つの本発明のペプチド類似体及び／又は抗体を、好ましくは少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体とともに含む医薬品に関する。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、この医薬品は所望により必要ならばさらに離型剤、潤滑剤、溶剤、分散媒、被覆、抗菌又は抗真菌剤、保存剤、着色料、乳化剤、調味料又はその他の慣用の製剤助剤を含む。例えば血液脳関門を経て標的器官に至る輸送に役立つその他の物質を医薬組成物に使用することができる。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、医薬品はデポー剤の形態で提供され、作用物質即ち本ペプチド類似体のゆるやかな放出を可能にし、例えばいわゆる「徐放性」基質を含み、又は医薬品が患者の中で徐々に溶解する糖衣で被覆されている。
【００３８】
特に好ましい実施形態では、上記の種類の医薬品が組合せ医薬品として提供され、即ち同じ製剤又は同じ薬品包装の中にさらにインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドを含むようになっている。そこで本発明はａ）上記のペプチド類似体の少なくとも１つ及び／又はその抗体を含む製剤並びにｂ）インスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドを含む製剤を、所望により薬学的に許容しうる担体及びその他の製剤助剤とともに含む医薬品キットにおいて、作用物質、即ちペプチド類似体及びインスリン及び／又はプラムリンチド及び／又はＩＡＰＰが予防又は治療上有効な量で存在する医薬品キットに関する。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、医薬品は錠剤形態であり、もしくはエアロゾール又は溶液、特に注射液である。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、タンパク質凝集病、特に糖尿病、好ましくはＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療のための医薬品の製造のための本発明のペプチド類似体又は上記の抗体の使用に関する。
【００４１】
また本発明は、糖尿病、例えばＩ型又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療用の作用物質、即ちペプチド類似体及び／又はインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドの２つの互いに分離された製剤を同時に又は時間的にずらせて投与するための組合せ薬剤キット、例えば共同製剤又は医薬品キットの調製のための本発明のペプチド類似体又は上記の抗体とインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドの使用に関する。
【００４２】
特に好ましい実施形態では、本発明は、糖尿病、例えばＩ型又はＩＩ型糖尿病の予防又は治療用の医薬品の製造のための、所望によりインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドを併用した本発明のペプチド類似体の使用において、本発明のペプチド類似体、特に天然のＩＡＰＰの１〜３７個のアミノ酸又はその誘導体のアミノ酸配列を有するペプチド類似体が糖尿病のＩＡＰＰ受容体調節治療のため、特に天然のＩＡＰＰ受容体の活性化のための受容体アゴニストの役割をする使用に関する。従って本発明に係る使用では、その範囲において、上記の種類のペプチド類似体が天然のＩＡＰＰ受容体にin vivoで結合し、これを活性化し、これにより糖代謝を調節するものである。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、本発明の使用は、本発明のペプチド類似体、特に短縮された、特にＮ末端で短縮されたペプチド類似体、好ましくは天然のＩＡＰＰの少なくとも８〜３７個又は少なくとも１９〜３７個、最大で２〜３７個のアミノ酸を有するか、又はその誘導体であるペプチド類似体を、所望によりインスリン及び／又はＩＡＰＰ及び／又はプラムリンチドとともに、糖尿病治療用の医薬品の製造のために用いるものであり、その場合ペプチド類似体は糖尿病のＩＡＰＰ受容体調節治療のための受容体アンタゴニストとして使用され、即ち天然のＩＡＰＰ受容体にin vivoで結合してこれを阻止し、こうして糖代謝及びＩＡＰＰのその他の生理的機能を調節することができる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、すべての本発明のペプチド類似体又はその抗体はＩＡＰＰ凝集阻害剤として、特にＩＡＰＰ−アミロイド斑形成阻害剤として使用される。また別な実施形態では、本発明のペプチド類似体又はその抗体をＩＡＰＰの細胞毒性の減少又は阻害のために、特に適当な医薬品の製造のために使用する。別の好ましい実施形態では、受容体アゴニスト又は受容体アンタゴニストのいずれであれ、本発明のペプチド類似体又は本発明の抗体は、同時にａ）ＩＡＰＰ凝集又はアミロイド斑形成の減少又は阻止と、ｂ）糖代謝の調節のための医薬品の製造のために使用される。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、受容体アゴニスト又は受容体アンタゴニストのいずれであれ、本発明のペプチド類似体又は本発明抗体は、同時にａ）ＩＡＰＰ又はその凝集体の細胞毒性の減少又は阻止と、ｂ）糖代謝の調節のためにペプチド類似体又は抗体を利用する医薬品の製造のために使用される。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病、例えばパーキンソン病又はハンチントン病又はプリオン病の予防又は治療のための医薬品の製造のために利用される上記の種類のペプチド類似体又はその抗体に関し、ペプチド類似体及び／又は抗体が治療又は予防上有効な量で使用され、特にペプチド類似体又はその抗体が凝集体の形成又はβアミロイドペプチドのアミロイド斑の形成を減少又は阻止し、もしくはその細胞毒性を減少又は阻止するものである。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ａ）アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病例えばプリオン病、パーキンソン病又はハンチントン病及びｂ）糖尿病、特にＩ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病の同時的予防又は治療のための医薬品の製造のための上記の種類のペプチド類似体又はその抗体に関する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病、例えばパーキンソン病、プリオン病又はハンチントン病の予防又は治療、特にａ）アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病、例えばプリオン病、パーキンソン病又はハンチントン病とｂ）糖尿病の同時治療のための医薬品は、インスリン、プラムリンチド又はＩＡＰＰとの混合製剤として提供される。
【００４９】
本発明の別の好ましい実施形態は、アルツハイマー病又はその他のタンパク質凝集病、例えばプリオン病、パーキンソン病及び／又はハンチントン病の診断用の診断薬の調製のための本発明のペプチド類似体又は抗体に関する。
【００５０】
本発明の別の好ましい実施形態は、タンパク質凝集病、特に糖尿病の診断用の診断薬の調製のための本発明のペプチド類似体又は本発明抗体に関する。
【００５１】
また本発明は研究目的のための本ペプチド類似体の使用に関する。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、本発明は、診断、治療及び研究用の抗体、特にモノクロナール又はポリクロナール抗体の調製のための取り扱いやすい免疫原としての本発明のペプチド類似体に関する。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、検出マーカーを備えた本発明のペプチド類似体又は検出マーカーを備えた本発明抗体をプローブとして被検試料とin vivoで、即ちヒト又は動物の生体で、もしくはin vitroで接触させ、ペプチド類似体又は抗体と所望により存在するＩＡＰＰ又はそのオリゴマー又は凝集体との結合を検出するＩＡＰＰ又はその凝集体の定性的又は定量的検出方法に関する。
【００５４】
種々のアミロイド原性ペプチド類似体又はタンパク質、例えばβアミロイドペプチド、プリオンタンパク質、ポリグルタミン（ハンチントン病）、αシヌクレイン（パーキンソン病）等の可溶性オリゴマーは同様な空間構造を有するという証拠がある（Kayedら、Scie-nce (2003) 300, 486-489）。要するにKayedら（前掲書）は、βアミロイドペプチド（アルツハイマー病）の可溶性オリゴマー構造のモデルに対して作られた抗体は、種々の他のタンパク質、例えばＩＡＰＰ、αシヌクレイン、プリオンタンパク質断片を認識して、その細胞毒性をin vitroで中和する性質があることを示すことができた。従って本発明の類似体又はその抗体は凝集の変化のため、又は他のアミロイド原性ポリペプチド、例えばβアミロイドペプチド、プリオンタンパク質、ポリグルタミン又はαシヌクレインの検出のための方法に適している。
【００５５】
また本発明は、アミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体、特にＩＡＰＰペプチド、ＩＡＰＰオリゴマー又はＩＡＰＰ凝集体の凝集の追跡及び変化、特に定性的又は定量的検出もしくはＩＡＰＰペプチド、そのオリゴマー又は凝集体の細胞毒性の阻止のための方法において、本発明のペプチド類似体又はその抗体をin vivo又はin vitroでアミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体と接触させ、アミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体の凝集挙動を変化し、特に凝集を減少又は阻止し及び／又はそれによって追跡することができる方法（診断）に関する。
【００５６】
また本発明は、アミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体、特にβアミロイドペプチド、プリオンタンパク質、αシヌクレイン又はポリグルタミン、そのオリゴマー又はその凝集体の凝集の追跡及び変化、特に定性的又は定量的検出のため、もしくはβアミロイドペプチド、プリオンタンパク質、αシヌクレイン又はポリグルタミン又はそのオリゴマー又は凝集体の細胞毒性の阻止のための方法において、本発明のペプチド類似体又はその抗体をin vivo又はin vitroでアミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体と接触させ、アミロイド原性ペプチド、そのオリゴマー又は凝集体の凝集挙動を変化し、特に凝集を減少又は阻止し、及び／又はそれによって追跡することができる方法（診断）に関する。
【００５７】
本発明の別の好ましい実施形態は、液中にあるＩＡＰＰ、ポリグルタミン、αシヌクレイン、プリオンタンパク質又はβアミロイドペプチドの凝集体形成の修飾、特に阻止のための方法において、本発明のペプチド類似体を液体と接触させ、インキュベーションし、ＩＡＰＰ、プリオンタンパク質、αシヌクレイン、ポリグルタミン又はβアミロイドペプチドの凝集挙動を修飾する方法に関する。
【００５８】
本発明のその他の実施形態は従属請求項で明らかである。
【００５９】
配列プロトコル：
配列番号は次のことを示す：
配列番号１〜１７は本ペプチド類似体の好ましい実施形態を示す。個々の配列番号はそれぞれＮメチル化パターンが同じで、一次構造が異なる本発明の複数の異なるペプチド類似体を示す。従って個々の配列番号はいずれも特定のＮメチル化パターンを示し、このＮメチル化パターンは例えば天然のヒトＩＡＰＰの野性種アミノ酸配列又は上記で定義したその誘導体、即ち１位のリシン及び／又は２位及び７位の２つのシステイン残基が１位のオルニチン（リシンの代わりに）及び／又はアスパラギン酸及びＤａｐ（２つのシステイン残基の代わりに）によって置換される誘導体の種々の一次構造、即ち種々のアミノ酸配列で現れる。従って個々の配列番号はいずれも、一方では特定のＮメチル化パターンを有する天然のヒト野性種ＩＡＰＰの一次構造、さらには同じＮメチル化パターンを有する上記の誘導体を表す。２位及び７位にＣｙｓをもつ本発明のペプチド類似体は好ましくは酸化されており、即ちＣｙｓ２及びＣｙｓ７のチオール残基の間のジスルフィド架橋が閉じている。
【００６０】
同様に２位及び７位にＤａｐ及びＡｓｐ又はＡｓｐ及びＤａｐをもつ本発明のペプチド類似体は好ましくは架橋されている。即ちＡｓｐとＤａｐの側鎖がラクタム架橋により互いに共有結合されている。発明の一実施形態で本発明のすべてのペプチド類似体のＣ末端が、好ましい実施形態ではアミドをなす。
【００６１】
配列番号と、下記の実施例で使用する好ましいペプチド類似体の略称との対応関係が実施例８で明らかである。
【００６２】
配列番号１８は天然のヒトＩＡＰＰのアミノ酸配列を示す。
【００６３】
下記の実施例及び後述する図面に基づいて発明をより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
【実施例１】
【００６５】
本発明のペプチド類似体の溶解度特性の特徴づけ及びＩＡＰＰとの比較
天然のＩＡＰＰと比較した本発明のペプチド類似体の溶解度特性を沈降試験、電子顕微鏡研究及びチオフラビンＴ結合試験により調べた。
【００６６】
ａ）類似体の溶解度をＩＡＰＰと比較して検査するために沈降試験を使用した。沈降又は溶解ペプチドの量は経時的に測定した。代表試験として、まず１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の所定の濃度（１、１０又は１００μＭ）のペプチド溶液を調製した。所定の時点でこの溶液のアリコートを遠心分離し（２０２００ｇ、２０分）、ペレットと上清の沈降タンパク質をＢＣＡタンパク質決定アッセイ（ＢＣＡはビシンコニン酸を表す）により定量化した。図１にこの試験の幾つかの結果を示す。この図で分かるように、濃度１０μＭでのＩＡＰＰの凝集は溶液の調製の直後に始まる。２０時間後にＩＡＰＰは完全に沈降していた。これに対してＮメチル化類似体、ＩＡＰＰ−ＬＡ、ＩＡＰＰ−ＧＩ及びＩＡＰＰ−ＡＦは濃度１００μＭでも１４日間溶解していた。ＩＡＰＰは後者の条件（１００μＭ）で僅か２時間後に完全に沈降した。
【００６７】
ｂ）様々なタンパク質種のアミロイド細繊維は色素ＴｈＴを結合し、その蛍光放出最大値の増加をもたらす。それゆえＴｈＴ結合は、アミロイド細繊維の定量化のために広範な用途で使用される特異的テストである。類似体のアミロイド結合能力をＩＡＰＰと比較して測定するために、このテストを使用した。このテストのためにアッセイ緩衝液中６２．５μｍの濃度の類似体及びＩＡＰＰをインキュベーションした（２％ＨＦＩＰ、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）。所定の時点でこのインキュベーション物の４０ｍｌのアリコートを１６０ｍｌの５μＭ−ＴｈＴ溶液（０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５中の）に添加し、かき混ぜ、４５０ｎｍで励起の後に４８５ｎｍで溶液の放出を測定した。
【００６８】
その場合ＩＡＰＰはすでに６２５ｎMの濃度で細繊維を形成することが判明した。これに対して類似体は６２．５μＭの濃度でもなお細繊維を形成しなかった（図２）。
【００６９】
ｃ）電子顕微鏡研究のために類似体とＩＡＰＰの５μＭ溶液（１％ＨＦＩＰを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の）を室温で約２０時間インキュベーションした。次に１０μｌの溶液を電子顕微鏡プレートに塗布し、前述のように（Kayed, J.Mol.Biol.(1999) 287, 781-796）１％酢酸ウラニルで染色した後、細繊維の有無を電子顕微鏡で調べた。主としてＩＡＰＰアミロイド細繊維からなるＩＡＰＰ溶液と対照的に、ＩＡＰＰ類似体の溶液は細繊維を含まないことが明らかになった（図３）。
【００７０】
これらのデータはＴｈＴ結合アッセイ及び沈降アッセイの結果とともに、類似体はアミロイド原性がなく、ＩＡＰＰの少なくとも１００倍の溶解度を有することを示す。
【実施例２】
【００７１】
ＩＡＰＰと比較した類似体の細胞毒性の研究
ＩＡＰＰアミロイド凝集体は膵臓β細胞及びその他の一連の細胞に対して細胞毒性を有する。ＩＡＰＰ及びその他のアミロイドポリペプチドの細胞毒性効果はアミロイドへの凝集を伴って現れることが前提となる。このことから、類似体はアミロイド原性がないので細胞毒性もないはずであるという仮定がでてくる。この仮定を検証するために、ＭＴＴ細胞毒性テストを使用した。このテストは無傷のレドックス電位をもつ「健全な」細胞による色素３−［４，５−ジメチルチアゾールー２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の還元に基づいている（Shearmanら、J. Neurochem. (1995) 65, 218-227；Shearmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 1470-74）。これは細胞生存性又は障害の初期指示薬である。ＩＡＰＰを含むアミロイド凝集体の細胞毒性効果をこのテストにより定量化できることが判明した。ＩＡＰＰ及び類似体の細胞毒性を膵臓細胞株ＲＩＮ５ｆｍに基づき前述のように調べた（Kapurniotuら、J. Mol. Biol. (2002) 315, 339-350）（図４）。代表的なＭＴＴテストで、ペプチドのインキュベーション物を調合し（１％ＨＦＩＰを含む又は含まない１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の５μＭ）、室温で２０時間後に細胞（２０時間前に５×１０5／ｍｌの細胞密度で播種した）に加えた。細胞とともに約２０時間インキュベーションした後、ＭＴＴをこれに加え、２時間作用させた後、細胞のＭＴＴ還元電位を分光測光法で測定した。結果は、対照細胞によるＭＴＴ還元のパーセントに相当する％細胞生存性として示され（ＭＴＴの１００％還元は１００％生存性に相当する）、少なくとも２つの独立のテストの平均値（±ＳＥＭ［標準誤差］）に相当する。
【００７２】
図４で分かるように、類似体ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＧＩ及びＩＡＰＰ−ＦＡはＩＡＰＰと対照的に細胞毒性を示さなかった。
【実施例３】
【００７３】
ＩＡＰＰのアミロイド形成能力の阻害剤又はモジュレーターとしての類似体の効果
ＩＡＰＰのアミロイド形成能力に対する類似体の効果をＥＭ（電子顕微鏡）及びＴｈＴ結合テストで調べた。
【００７４】
代表的なＴｈＴ結合テストの出発点としてアッセイ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐH７．４及び２％ＨＦＩＰ）中の６．２５μＭ−ＩＡＰＰを単独で、又は類似体との１／１混合物で含むインキュベーション物を調合した。所定の時点で溶液のアリコートを上記のようにＴｈＴと混合し、その蛍光放出を検査した。図５で明らかなように、類似体はＩＡＰＰのアミロイド形成能力に対して強い阻害効果を有する。
【００７５】
電子顕微鏡で追跡した代表的な凝集テストにおいて、ＩＡＰＰ（５μＭ）を単独で、又は類似体（１／１の割合）の存在下でインキュベーションした（１％ＨＦＩＰを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で）。２０時間後に１０μｌの溶液を電子顕微鏡プレートに塗布し、上記のように１％酢酸ウラニルで染色した後（Kayed, J. Mol. Biol. (1999) 287, 781-96）、細繊維の存在を電子顕微鏡で調べた。主としてＩＡＰＰ−アミロイド細繊維からなるＩＡＰＰ溶液とは対照的に、ＩＡＰＰ−類似体混合物では細繊維の形成が完全に抑制されていた（図６）。
【実施例４】
【００７６】
ＩＡＰＰの細胞毒性の阻害剤としての類似体の効果
ＩＡＰＰ−アミロイド凝集体のβ細胞毒性に対する類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡの効果を２つの異なるテストで調べた。まずＭＴＴ−細胞生存性テストを使用した（上記を参照）。テストが示したところでは、ＩＡＰＰ／ペプチド類似体混合比１／１ですべての類似体はＩＡＰＰの細胞毒性を著しく阻止することができる（図７Ａ）。その場合ＩＡＰＰ−ＧＩはＩＡＰＰ細胞毒性の最も強い阻害剤であることが証明された。
【００７７】
第２のテストではＩＡＰＰ−アミロイドによって引き起こされるアポプトーシスβ細胞死に対するＩＡＰＰ−ＧＩの効果を調べた（ＩＡＰＰ仲介性細胞死は主としてアポプト−シスによって引き起こされることが知られている）。そのためにＩＡＰＰの溶液を単独で、及びＩＡＰＰ−ＧＩ（１／１）（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中５μＭ）の存在下で調製し、平板培養した細胞とともに５００ｎＭの最終濃度で２０時間インキュベーションした。次に市販のアポプト−シスＥＬＩＳＡ（RocheのCell Death Detection Kit）によりアポプト−シスを定量化した。このＥＬＩＳＡアッセイによって、アポプト−シス細胞死の早期の特異的な証拠である細胞質ゾルヌクレオソームが定量化された。このテストも、ＩＡＰＰ−ＧＩは膵臓β細胞をＩＡＰＰ誘導性アポプト−シス細胞死から守る性質があることを示した（図７Ｂ）。
【実施例５】
【００７８】
ＩＡＰＰ受容体アゴニストとしての類似体の効果
（ヒト）ＩＡＰＰ受容体アゴニストとしての類似体の効果をテストするために、まずこの受容体を発現する細胞で受容体結合アフィニティーをテストした。このような細胞はヒト乳癌細胞に由来するＭＣＦ−７細胞株である（Zimmermannら、J. Endocrinology (1997), 155, 423-31）。特異的ＩＡＰＰ受容体がＭＣＦ−７細胞株で発現されるため、この細胞株はＩＡＰＰアゴニスト／アンタゴニストのテストに広く適用される。
【００７９】
受容体結合テストをZimmermannら、J. Endocrinology (1997), 155, 423-31に記載されたのと同様に行った。今まで知られている最強の受容体リガンドである125Ｉ標識ラットＩＡＰＰ（ｒＩＡＰＰ）配列をＩＡＰＰ又はペプチド類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ又はＩＡＰＰ−ＦＡの存在下で定量的に測定した。種々の最終濃度（図８Ａ）の放射性標識リガンドｒＩＡＰＰ（〜８０ｐＭ）と当該のペプチドの混合物をＭＣＦ−７細胞とともに室温で１時間インキュベーションした。次に細胞をテスト用緩衝液（テスト用緩衝液は０．１％ＢＳＡを含むDulbecco MOD EagleとＦ１２栄養混合物（ＨＡＭ）の１／１混合物からなる）で洗浄し、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）と、続いてシンチレーション液と混合し、膜結合放射能をシンチレーションカウンターで測定した。図８Ａで明らかなように、ここでテストした３つのすべての類似体は、ＩＡＰＰ受容体を結合することができた。そＩＡＰＰ−ＡＬは最高の受容体アフィニティーを有するアゴニストであり、ＩＡＰＰ−ＧＩは最も弱いアゴニストであることが示された（図８Ａ）。
【００８０】
続いて類似体のアゴニスト能力をテストするために、アデニルシクラーゼ活性化能力（ＡＣ活性化）をテストした。ＩＡＰＰの受容体仲介性生物学的効果の幾つかはアデニルシクラーゼ活性化によって仲介されることが判明している。ＡＣ活性化は、種々の濃度のＩＡＰＰ又は類似体で細胞を処理した後（１５分、３７℃）に産生されるｃＡＭＰをcAMP Bio-trak ELISA（Amersham）で定量化することによって測定される。テストはZimmerma-nnら、J. Endocrinology (1997)（前掲個所）の記録と同様にＭＣＦ−７細胞で行う。図８Ｂで明らかなように、テストしたすべての類似体（ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＦＡ）は完全ＩＡＰＰアゴニストであった。ＩＡＰＰ−ＡＬは最も有力なアゴニストであり、ＩＡＰＰより優れたＡＣ活性化リガンドであることが示された。ＩＡＰＰ−ＡＦはＩＡＰＰと同様なＡＣ活性化能力を有し、ＩＡＰＰ−ＧＩはＩＡＰＰより弱いアゴニストである。
【００８１】
このようにＡＣ活性化テストの結果は受容体結合テストの結果と一致する。
【実施例６】
【００８２】
ＩＡＰＰと比較した溶液（濃度１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）中の安定性及び生体活性（ホルモン効果）の維持の比較：治療でのＩＡＰＰ代替物としての可能な使用
糖尿病及び／又はその他の疾病の治療でＩＡＰＰ又はプラムリンチド代替物として類似体を使用する可能性について、その溶液の安定性及びそのホルモン作用を、凝集しやすいＩＡＰＰと比較して調べた。代表調合物ではＩＡＰＰ、ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＧＩの水溶液又は１０μｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中の類似体とＩＡＰＰ（２５０μＭ又は１ｍｇ／ｍｌ）の１／１混合物を室温で使用し、４日間インキュベーションする。この溶液のＡＣ活性化能力を種々の時点で、例えば０、４８及び９６時間に前述のＡＣ活性化アッセイにより測定した（細胞の最終濃度１μＭ、最大活性化に相当）（図９）。
【００８３】
この実験は、ＩＡＰＰは上記の条件で貯蔵すると、その当初のホルモン作用の半分以上が失われる（おそらくその凝集のため）ことを示した。これに対し、類似体及びＩＡＰＰ／類似体混合物（１／１）のホルモン作用は完全に維持された。選んだ１ｍｇ／ｍｌの濃度は、Amylin Pharmaceuticals社が糖尿病の治療のために臨床研究で使用するSymlin（酢酸プラムリンチド）製剤の濃度に相当する。
【実施例７】
【００８４】
アルツハイマー・ペプチド、βアミロイドペプチド（Ａ−β）の細胞毒性に対する類似体の阻害効果：アルツハイマー病（ＡＤ）の治療のための可能な使用
Ａ−βの細胞毒性に対するＩＡＰＰ−ＧＩ（１／１混合物）の効果をＭＴＴテストで調べた。このために、Ａ−β（１００μＭ）を単独で、又はＩＡＰＰ−ＧＩとともに、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２．２％ＨＦＩＰを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温で４日間インキュベーションした。次に希釈後に溶液をＰＣ−１２及びＨＴＢ−１４細胞に加えた。２つの細胞株はＡ−β細胞毒性阻害剤候補の阻害効果の検査のためにしばしば使用される。実際にＩＡＰＰ−ＧＩはＡ−βペプチドの細胞毒性を大幅に低下し得ることが、２つの細胞株で明らかになった（図１０）。Ａ−βとＩＡＰＰ−ＧＩの相互作用が別の結合テストで確認された。すなわち、ＩＡＰＰ−ＧＩ及びその他のＮメチル化ＩＡＰＰ類似体はアルツハイマー病（ＡＤ）の治療に特に適している。
【実施例８】
【００８５】
本発明のペプチド類似体
【表１】
2008517885.tif 000002
【００８６】
本発明に係るペプチド類似体は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を使用してＲＩＮＫ−アミド−ＭＢＨＡ樹脂による慣用の固相ペプチド合成法で簡単な化学合成により高い純度と良好な収量で調製された（Kazantzisら、Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791）。代表的な合成ではＮα−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸（側鎖保護は次の通り：Lys(Boc)、Cys(Tet)、Arg(Pmc)、Asn(Tet)、His(Tet)、Ser(tBu)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)）が使用された。Ｎメチル化Ｆｍｏｃ−アミノ酸はこの形（例えばFmoc-(N-Me)Ile；Fmoc-(N-Me) Gly等）でも使用された。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＡＳ）の結合はＤＭＦ及び／又はＮＭＰ中でＴＢＴＵ及びＤＩＥＡ（C末端ＡＳのモル数の４倍の過剰ＡＳ、４倍の過剰ＴＢＴＵ、６倍の過剰ＤＩＥＡ）で行われた。Ｎメチル化ＡＳ又はＮメチル化ＡＳへの結合には、２倍〜ｘ倍に及ぶ大過剰の結合、結合数、溶媒の混合物及び長い結合時間が使用された。Ｆｍｏｃ基の開裂はＤＭＦ中で２５％ピペリジンによって行われた。樹脂からのペプチドの分離は混合物ＴＦＡ／水／チアニゾール／エタンジチオール／フェノール（８３／４．５／２／６（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｗ））で行われた（Kazantzisら、Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791）。濾過により樹脂をペプチド溶液から分離し、溶媒を蒸発し、１０％ＨＡｃに受けてエーテルで抽出し、含水相を凍結乾燥した後、還元した形で粗生成物が得られた。Ｃｙｓ2／Ｃｙｓ7のジスルフィド架橋の結合は、３ＭのＧｄｎＨＣｌを含む０．１Ｍ−ＮＨ4ＨＣ3中で行われ、２−４時間かかった。粗生成物を酸化の後に再び逆相クロマトグラフィーによりＣ18カラムでＡＣＮ含有勾配により高純度に精製した（Kazantzisら、前掲書）。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ＩＡＰＰ（１０及び１００μＭ）及び類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＦＡ、ＩＡＰＰ−ＩＬの沈降アッセイの吸収を示す。５７０ｎｍでの吸収は（ペレット又は上清の）タンパク質の量に相当する。
【図２】図２は、細繊維結合テストの結果を示す：６２．５μＭのＩＡＰＰと６２．５μＭのＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＩＬの細繊維結合能力をＴｈＴ結合アッセイにより定量化した。
【図３】図３は、ＩＡＰＰ及び類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡのアミロイド原性潜在力の電子顕微鏡研究の結果を示す。電子顕微鏡に基づく凝集テストによりペプチドのインキュベーション物（５μＭ、２０時間）を調べた。左から右へ、下記のインキュベーション物のアリコートを示す：ＩＡＰＰ単独、ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＦＡ及びＩＡＰＰ−ＡＬ（横棒：１００ｎｍ）。
【図４】図４は、ＩＡＰＰと比較した類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ、ＩＡＰＰ−ＦＡの潜在細胞毒性効果の決定のためのＭＴＴ−還元アッセイの結果を示す。
【図５】図５は、細繊維結合テストの結果を示す：ＩＡＰＰ（６．２５μＭ）の細繊維結合能力に対するＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡ（１／１混合物）の効果をＴｈＴ結合アッセイによって定量化した。
【図６】図６は、凝集テストの結果を示す：ＩＡＰＰ（５μＭ）の細繊維結合能力に対するＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡ（１／１混合物）の効果を電子顕微鏡に基づく凝集アッセイにより調べた。左から右へ、下記のインキュベーション物のアリコートを示す（２０時間）：ＩＡＰＰ単独、ＩＡＰＰとＩＡＰＰ−ＧＩの混合物、ＩＡＰＰとＩＡＰＰ−ＦＡの混合物及びＩＡＰＰとＩＡＰＰ−ＡＬの混合物。
【図７】図7Ａは、ＩＡＰＰの膵臓細胞毒性（ＲＩＮ５ｆｍ細胞株）に対する類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡの効果を決定するためのＭＴＴ−還元アッセイの結果を示す。図７Ｂは、単独及びＩＡＰＰ−ＧＩ（１／１）の存在下のＩＡＰＰ誘導性アドプトーシスの決定を示す。同じ条件でＩＡＰＰ−ＧＩ単独もテストしたが、細胞毒性は認められなかった。少なくとも２つの独立したアッセイの平均値（±ＳＥＭ）を示す。
【図８】図８Ａは、ＭＣＦ−７細胞でＩＡＰＰ及び類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡによる（ヒト）ＩＡＰＰ受容体結合アッセイの結果を示す。ラジオリガンド［１２５Ｉ］−ｒＩＡＰＰの特異的結合をリガンド濃度に対してプロットする。図８Ｂは、ＭＣＦ−７細胞でＩＡＰＰ及び類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ、ＩＡＰＰ−ＡＬ及びＩＡＰＰ−ＦＡによる受容体活性化アッセイの結果を示す。cAMP Biotrak ELISA(Amersham)でｃＡＭＰを定量化することによってアデニルシクラーゼ活性化（最大の％）を測定した。１μＭのＩＡＰＰで得られた活性化を最大ＡＣ活性化とみなした。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡの結果を示す：ＲＴ（室温）で４日静置した２５０μＭのＩＡＰＰ溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中の）のＭＣＦ−７細胞での受容体活性化能力の時間依存性を類似体ＩＡＰＰ−ＧＩ及びＩＡＰＰ−ＬＡ並びに類似体とＩＡＰＰの混合物の受容体活性化能力と比較する。cAMP Biotrak ELISA(Amersham)でｃＡＭＰを定量することによってアデニルシクラーゼ活性化（最大の％）を測定した。１μＭのＩＡＰＰで得られた活性化を最大ＡＣ活性化とみなした。
【図１０】図１０は、Ａ−β（ＰＣ１２細胞株）の細胞毒性に対する類似体ＩＡＰＰ−ＧＩの効果を決定するためのＭＴＴ−還元テストの結果を示す。結果は代表的なアッセイ（３回の決定）の平均値（±ＳＥＭ）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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