(57)【要約】  本発明は、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）を測定するための生化学的方法に関する。具体的には、ＲＣＴの３つの成分（流出成分、血漿成分および排出成分）を、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体を投与するステップ、および続いて種々のコレステロールまたはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体での同位体の希釈または出現、ならびにステロール最終産物（ＲＣＴの一部分である）中への回収を測定するステップにより、ｉｎ ｖｉｖｏで測定する。生体で初めて、組織から血中へのコレステロール流出速度と血液から体外へのコレステロール排出速度との組み合わせを表す、包括的ＲＣＴ流（Global RCT flux）のパラメータが作成される。そのような方法は、創薬および薬物開発、アテローム硬化その他の血管疾患および症状の診断および予後診断、疾患治療のための適正な用量の選択、ならびにＲＣＴ流を標的とする治療法のための被験体の選択に用いられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子を、既知または測定可能な速度で生体系に投与するステップ；
（ｂ）１種以上の同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または該生体系からの排出中性ステロールを含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｃ）該同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールの同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｄ）該同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子から該コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールへの取り込み速度または移動速度を算出することにより、該生体系でのＲＣＴの肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記サンプルが、糞便、尿または血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが糞便サンプルであり、かつ標識中性ステロールおよび胆汁酸の同位体含量を測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の同位体標識が、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃまたは１８Ｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生体系がヒトまたは齧歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールを前記生体系に静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップ：
（ｉ）既知量の同位体標識胆汁酸を前記生体系に投与するステップ；
（ｉｉ）一定時間後に該生体系での胆汁酸の同位体含量または同位体含量の変化速度を測定するステップ；および
（ｉｉｉ）同位体標識胆汁酸の希釈量を測定することにより、該生体系中の胆汁酸の総量を測定するステップ
により、該生体系中の胆汁酸の総量を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標識胆汁酸が、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記同位体標識胆汁酸の同位体標識が、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃまたは１８Ｏである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールまたは２Ｈ４−コール酸を前記生体系に投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップ：
（ｉ）所定の標識濃度を有する同位体標識コレステロール前駆体を前記生体系に投与するステップ；
（ｉｉ）標識胆汁酸、排出中性ステロールまたは血中コレステロールを含む生物学的サンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｉｉｉ）該標識胆汁酸、排出中性ステロールまたは血中コレステロールの同位体含量もしくは同位体パターン、または同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｉｖ）該胆汁酸、中性ステロールまたはコレステロールの同位体含量もしくは同位体パターン、または同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、安定な同位体標識コレステロール前駆体の標識濃度と比較することにより、新規に合成されたコレステロールに由来するコレステロール、中性ステロールまたは胆汁酸の割合を測定し、それにより該胆汁酸、中性ステロールまたはコレステロールに対するｄｅ ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与を測定するステップ
を含む、胆汁酸に対するｄｅ ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与を測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記同位体標識コレステロール前駆体が重水素化水である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルが糞便であり、かつ単位時間当たりに被験体から排出される中性ステロールおよび胆汁酸の総含量を、該被験体に経口的に投与された、糞便中に検出される内部標準との比較により測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記内部標準がシトスタノールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）安定同位体標識コレステロール分子または安定同位体標識コレステロール関連分子を該生体系に投与するステップ；
（ｂ）該同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子のｉｎ ｖｉｖｏ変換産物を含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｃ）該ｉｎ ｖｉｖｏ変換産物の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｄ）該同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の希釈速度を算出することにより、該生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、糞便、尿または血液サンプルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の同位体標識が、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃまたは１８Ｏである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体系がヒトまたは齧歯類である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＤＬとの複合体中の１３Ｃ２標識コレステロールを前記生体系に投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬを含む血液サンプルであり、かつＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールエステルおよびＶＬＤＬコレステロールエステルの同位体含量をＧＣＣ−ＩＲＭＳにより測定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生体系での血中コレステロールの出現速度、またはコレステロール組織流出速度を測定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子を、既知または測定可能な速度で該生体系に静脈内投与するステップであって、該投与速度は該生体系体内で検出可能なレベルの標識遊離コレステロールの蓄積を生じるのに十分であること；
（ｂ）該標識遊離コレステロール分子を含むサンプルを、該生体系から取得するステップ；
（ｃ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；
（ｄ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、該同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の投与速度と比較することにより、該生体系での血中コレステロールの出現速度を算出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２２】
前記生体系がヒトまたは齧歯類である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体系での血中コレステロールの出現速度を、プラトーの原則（plateau principle）に従い同位体希釈により、同位体プラトーの存在の確立により、同位体プラトー値の推定により、または同位体プラトー値の外挿により算出する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
生体系でのコレステロール流速を算出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下のステップ：
（ｉ）脂質エマルジョン中の１３Ｃ、２Ｈまたは１８Ｏ標識コレステロールを、該生体系体内で検出可能なレベルの標識遊離コレステロールの蓄積を生じるのに十分な投与速度で該生体系に静脈内投与するステップ；
（ｉｉ）標識遊離コレステロール分子を含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｉｉｉ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｉｖ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、１３Ｃ、２Ｈまたは１８Ｏ標識コレステロールの投与速度と比較することにより、該生体系での血中コレステロールの出現速度を算出するステップ
により、血中コレステロールの出現速度を測定するステップ；
（ｂ）以下のステップ：
（ｉ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子を該生体系に投与するステップ；
（ｉｉ）１種以上の同位体標識胆汁酸または該生体系からの排出中性ステロールを含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｉｉｉ）同位体標識胆汁酸または排出中性ステロールの同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｉｖ）該同位体標識コレステロール関連分子の該胆汁酸もしくは排出中性ステロールへの取り込み速度または移動速度を算出することにより、該生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の回収割合を測定するステップ
により、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓部分（hepatic arm）または排出部分（excretory arm）の回収割合を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ａ）（ｉｉｉ）からの血中コレステロールの出現速度に、ステップ（ｂ）（ｉｖ）からのＲＣＴの肝臓部分または排出部分の回収割合を乗じることにより、該生体系でのコレステロール流速を算出するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２５】
前記生体系がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
生体系でのアテローム硬化のリスクおよび進行速度に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項２４に記載の方法により該生体系でのコレステロール流速を算出するステップ；
（ｂ）候補薬剤を該生体系に投与し、かつ／または該生体系の食餌を変更するステップ；
（ｃ）請求項２４に記載の方法により該生体系でのコレステロール流速を算出するステップ；
（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）とのコレステロール流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する該候補薬物および／または食餌変更の効果を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２７】
生体系でのアテローム硬化のリスクおよび進行速度に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１に記載の方法により生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ；
（ｂ）候補薬剤を該生体系に投与し、かつ／または該生体系の食餌を変更するステップ；
（ｃ）請求項１に記載の方法により該生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ；および
（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）との分子流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する該候補薬物および／または食餌変更の効果を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２８】
生体系でのアテローム硬化のリスクおよび進行速度に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項１２に記載の方法により生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定するステップ；
（ｂ）候補薬剤を該生体系に投与し、かつ／または該生体系の食餌を変更するステップ；
（ｃ）請求項１２に記載の方法により該生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定するステップ；および
（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）との分子流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する該候補薬物および／または食餌変更の効果を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２９】
生体系でのアテローム硬化のリスクおよび進行速度に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価する方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項２１に記載の方法により該生体系でのコレステロールの出現速度を測定するステップ；
（ｂ）候補薬剤を該生体系に投与し、かつ／または該生体系の食餌を変更するステップ；
（ｃ）請求項２１に記載の方法により生体系でのコレステロールの出現速度を測定するステップ；および
（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）との分子流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する該候補薬物および／または食餌変更の効果を評価するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３０】
糞便ステロール中の標識コレステロール回収を組織全体にわたるコレステロールの流出／流入速度について修正する方法であって、以下のステップ：
（ａ）以下のステップ：
（ｉ）同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子を、既知または測定可能な速度で生体系に投与するステップ；
（ｉｉ）１種以上の同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または該生体系からの排出中性ステロールを含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｉｉｉ）該同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールの同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｉｖ）該同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子から該コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールへの取り込み速度または移動速度を算出することにより、該生体系でのＲＣＴの肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ
によりＲＣＴの肝臓部分（hepatic arm）または排出部分（excretory arm）の回収割合を測定するステップ；
（ｂ）以下のステップ：
（ｉ）同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子を、既知または測定可能な速度で該生体系に静脈内投与するステップであって、該投与速度は該生体系体内で検出可能なレベルの標識遊離コレステロールの蓄積を生じるのに十分であること；
（ｉｉ）標識遊離コレステロール分子を含むサンプルを該生体系から取得するステップ；
（ｉｉｉ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および
（ｉｖ）該標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、該同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子の投与速度と比較することにより、該生体系での血中コレステロールの出現速度を算出するステップ
により、血中コレステロールの出現速度を測定するステップ；および
（ｃ）ステップ（ｂ）からのコレステロールの出現速度にステップ（ａ）の回収割合を乗じることにより、糞便ステロール中の標識コレステロール回収を組織全体にわたるコレステロールの流出／流入速度について修正するステップ
を含む、上記方法。
【請求項３１】
生体系でのＲＣＴ流速を算出するためのキットであって、以下のもの：
（ａ）１種以上の同位体標識ＨＤＬ粒子、同位体標識コレステロール分子、同位体標識コレステロール前駆体、または同位体標識胆汁酸；および
（ｂ）キットの使用説明書
を含み、生体系のコレステロール流速の算出のために用いられる、上記キット。
【請求項３２】
同位体標識ＨＤＬ粒子または標識胆汁酸の投与のための用具をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記生体系からの生物学的サンプル回収のための器具をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、コレステロール代謝の分野に関する。具体的には、コレステロール逆輸送に重点を置いたコレステロール代謝および輸送の定量的測定方法が記載される。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化の最も一般的な型であるアテローム硬化は、大動脈および中動脈（例えば、冠状動脈、頸動脈、および下肢動脈）、ならびに大動脈および腸骨血管などの弾性動脈の疾患である。アテローム、すなわち脂質コアおよび線維性被膜からなる血管内膜中の線維脂肪プラークが特徴的である（Robbins Pathologic Basis of Disease 557 (Cotranら編、第４版、1989)）。心筋梗塞および脳梗塞の第１のリスクファクターであるだけでなく、アテローム硬化は、慢性的な下肢虚血および壊疽のような症状、ならびに腸間膜閉塞の原因となる。近年の冠状動脈性心臓病による死亡率の減少にもかかわらず、米国における総死亡者数の約５０％は、今もなおアテローム硬化を原因とする（Scientific American Medicine 第１章(Rubensteinら編、1991)）。
【０００３】
疫学、解剖および血管造影法による研究は、血清コレステロール値の上昇とアテローム硬化の形成との間の因果関係を確証している（Levineら、Cholesterol Reduction In Cardiovascular Disease, N Eng J Med 332(8):512-521 (1995)）。リスクについてそれらを特定する単独の血漿コレステロールレベルはないが、一般的にそのレベルが高いほどリスクも高くなる。リスクは、２００ｍｇ／ｄｌを超えるコレステロールレベルで有意に上昇する（Robbins Pathologic Basis of Disease、上掲、559）。総コレステロールレベルは通常、望ましい値（＜２００ｍｇ／ｄｌ）、高境界値（２００〜２３９ｍｇ／ｄｌ）、または高値（＞２４０ｍｇ／ｄｌ）に分類される。食事療法は通常、リスクの高い低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルを有する被験体、および少なくとも２つのさらなるアテローム硬化に対するリスクファクター（例えば、高血圧、糖尿病、喫煙など）を有する高境界値の者に勧められる。しかし、食事療法は、彼らの食事がコレステロールおよび飽和脂肪について平均より高い被験体においてのみ有効であることが発見されており（Adult Treatment Panel II. National Cholesterol Education Program: Second Report of the Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adult, Circulation 89:1333-1445 (1994)）、高コレステロール血症の遺伝的素因を有する被験体には無効であろう。持続性の高コレステロールレベルの場合には、薬物療法が処方されうる。
【０００４】
高コレステロール血症の治療のために現在市販されている薬物は、ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の阻害および／もしくは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールのＬＤＬ受容体によるクリアランスの促進（例えば、ロバスタチン、その他のスタチン、図１参照）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の減少（例えば、ゲムフィブロジル）、または腸での胆汁酸再吸収の阻害（例えば、コレスチラミン）のような方法によって作用する。しかし、コレステロール代謝の試験はまた、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の過程がコレステロールを組織から除去し、体から排出しうる経路を可能にすることを示す。現在のところ、生体でＲＣＴ経路を介した組織から排出までのコレステロール流出速度を測定する既知の方法はない。
【０００５】
ＲＣＴは、コレステロールが細胞から体外へ動員され、輸送される生物学的経路である（図１）。ＲＣＴは３つの成分：すなわち（１）組織から血液中へのコレステロールの流出（「流出成分」）；（２）血漿中でのコレステロールの輸送および分布（「血漿成分」）；ならびに（３）肝臓または腸を介した糞便への排出（「肝臓成分」または「排出成分」）に分割され得る。コレステロールは胆汁酸または遊離コレステロールのいずれかとして胆汁分泌に取り込まれ、その後、腸管腔に分泌され、その一部は体から糞便内に出る。ステロールはまた、腸組織によって腸管内腔に直接放出され、その後一部の排出が起こり得る。これらのＲＣＴ経路は、コレステロールが体から除去され得る唯一の有効な機序である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ＲＣＴのこれらのステップの測定を可能にする方法を有することが望ましい。機能的観点から、流出成分ならびに肝臓成分または排出成分は、それぞれ細胞からおよび体からのコレステロールの出口に相当するため、重要なステップである。ＲＣＴ、ならびに具体的にはこれらのステップの測定方法は、製薬会社および他の薬物開発者が、被験体の利益のために組織からのおよび体外へのコレステロールの流出を調節する薬剤または候補治療法をスクリーニングすることを可能にし；臨床医がＲＣＴに影響を及ぼす薬剤の至適用量を選択することを可能にし；臨床医がコレステロール関連疾患の進行を診断および観察することを可能にし；臨床医がコレステロール関連疾患のリスクを評価することを可能にし；臨床医がＲＣＴに基づく候補治療法に反応するであろう被験体を選択する、または被験体群を同定することを可能にし；コレステロール関連疾患の機序の詳細な研究を可能にするであろう。このような方法は本明細書において開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
これらの必要性を満たすために、本発明は、コレステロール代謝および輸送速度の測定方法を提供し、ヒトおよび実験動物においてＲＣＴの測定を可能にする。
【０００８】
１つの態様では、ＲＣＴの流出成分が被験体において測定されうる。１種以上の同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が既知の速度で被験体に投与される。一定期間後、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を含有する1つ以上の生物学的サンプルを被験体から取得する。その後、コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンが測定される。その後、投与された標識分子の、対応する内在性非標識分子による希釈が算出されることにより、被験体におけるＲＣＴの流出成分の活性または速度（出現速度［Ｒａ］）が決定される。投与される分子は同位体標識遊離コレステロールであり、定常状態に静脈内注入され、血漿中の標識遊離コレステロールの希釈は、注入期間に渡って一定間隔を置いた多数の時点で血漿コレステロールの同位体含量または同位体パターンを測定することによって測定されうる。
【０００９】
別の態様では、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の活性（例えば、輸送速度、輸送もしくは変換されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の質量、あるいはＲＣＴに由来する胆汁酸または中性ステロールの割合）が測定されうる。１種以上の同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が被験体に投与される。一定期間後、胆汁酸、糞便中性ステロール、またはコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体を含有する１つ以上のサンプルを被験体から取得する。その後、コレステロール、コレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体から取り込まれた胆汁酸、排出中性ステロールにおける同位体含量または同位体パターンが測定される。その後、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分を介した同位体標識の取り込みが算出されることにより、被験体におけるＲＣＴの肝臓成分もしくは排出成分の活性または速度が決定される。上述のようなＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定は、一部には、静脈内投与された同位体標識遊離コレステロールに由来する同位体標識の胆汁酸への取り込みを測定することによって実施され、胆汁酸プールサイズの測定が同時に実施されうる。胆汁酸プールサイズは、既知量の１種以上の同位体標識胆汁酸を被験体に投与し、一定期間後に被験体から胆汁酸を含有するサンプルを取得し、サンプル中の胆汁酸の同位体含量、同位体パターン、または同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定し、投与された標識胆汁酸の内在性胆汁酸による希釈を算出し、その系における総胆汁酸プールサイズの測定を行うことによって測定されうる。本発明のこの態様に適した胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸およびリトコール酸を含むがそれらに限定されない。その胆汁酸はコール酸でありうる。
【００１０】
本開示の別の態様では、流出／動員速度（流出成分）を糞便ステロール中への標識回収効率（肝臓成分または排出成分）と組み合わせることによって、「包括的（global）ＲＣＴ」パラメータが測定され得ることが発見された。包括的ＲＣＴ流は、最終的に糞便ステロールとして排出される組織からのコレステロール流出、または糞便ステロールとして回収される、１日当たりに血漿プールに入るコレステロール分子数を示す。この包括的ＲＣＴ測定基準は、ヒト被験体をはじめとする生体において組織から糞便までのコレステロール流量の総合的な測定を初めて提供する。当業者は、この測定基準が組織から血流を介して体外へのコレステロール流速−包括的ＲＣＴの定義を示すことを理解し得る。この測定基準は、流出速度（Ｒａ）に排出効率を乗じることによって算出され得る。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、ＲＣＴの血漿成分が測定される。１種以上の同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が被験体に投与される。一定期間後、対象となるコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を含有する１つ以上の血漿サンプルが被験体から取得され、その後、コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンが測定される。その後、ＲＣＴの血漿成分の異なる部分（図２参照）を介したコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の輸送または代謝は、様々なコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体中の同位体標識の消失または出現によって測定される。
【００１２】
本発明の方法は、ＲＣＴに対する候補治療法の効果を評価するために適用されうる。その方法は、候補治療法を被験体に施行すること、ＲＣＴの成分のいずれかまたはすべてを候補治療法の施行前後の被験者において、または候補治療法を受けていない対応する被験者もしくは過去のデータと比較すること、および候補治療法の施行前後または候補治療法の有無でのＲＣＴの差異を算出することを含む。候補治療法は単一の薬剤または化合物でありうる。あるいは、候補治療法は薬剤または化合物の組合せでありうる。候補治療法はまた、生活様式の変更（例えば、食餌の変更、運動の増加）などのいくつかの他の介入と合わせた、単一の薬剤もしくは化合物または薬剤もしくは化合物の組合せでもありうる。
【００１３】
別の変形形態では、食餌変更の前後の被験者においてＲＣＴの速度を比較すること、および食餌変更の前後でのＲＣＴの速度の差異を算出することによって、アテローム硬化のリスクに対する食餌変更の効果が評価される。
【００１４】
さらなる変形形態では、ＲＣＴの速度を測定するためのキットが提供される。キットは、標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体、標識胆汁酸、またはそれらの組合せ、およびキットの使用説明書を含みうる。キットはまた、任意選択で、上記の標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体、または標識胆汁酸の被験体への投与のための用具、および被験体からサンプルを採取するための器具をも含みうる。
【００１５】
さらなる変形形態では、生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定する方法が記載される。その方法は、（ａ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子を生体系に投与するステップ；（ｂ）１種以上の同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または生体系からの排出中性ステロールを含むサンプルを生体系から取得するステップ；（ｃ）同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールの同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および（ｄ）同位体標識コレステロール分子もしくは同位体標識コレステロール関連分子の、コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールへの取り込み速度または移動速度を算出することにより、生体系でのＲＣＴの肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップを含みうる。
【００１６】
さらなる実施形態では、サンプルは糞便、尿または血液サンプルでありうる。
【００１７】
同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の標識は、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃまたは１８Ｏでありうる。
【００１８】
生体系は哺乳動物でありうる。哺乳動物は、ヒト、ハムスター、ウサギ、非ヒト霊長類および齧歯類を含む。
【００１９】
さらなる実施形態では、（ｉ）既知量の同位体標識胆汁酸を生体系に投与するステップ；（ｉｉ）一定時間後に生体系での胆汁酸の同位体含量または同位体含量の変化速度を測定するステップ；および（ｉｉｉ）同位体標識胆汁酸の希釈量を測定することにより、生体系中の胆汁酸の総量を測定するステップによって、生体系中の胆汁酸の総量が測定されうる。
【００２０】
標識胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸またはリトコール酸を含みうる。
【００２１】
別の実施形態では、胆汁酸に対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与を測定する方法が提供され、それは、（ｉ）所定の標識濃度を有する同位体標識コレステロール前駆体を生体系に投与するステップ；（ｉｉ）標識胆汁酸、排出中性ステロールまたは血中コレステロールを含む生物学的サンプルを生体系から取得するステップ；（ｉｉｉ）標識胆汁酸、排出中性ステロールまたは血中コレステロールの同位体含量または同位体パターンを測定するステップ；および（ｉｖ）胆汁酸、中性ステロールまたはコレステロールの同位体含量を、安定同位体標識コレステロール前駆体の標識濃度と比較することにより、新規に合成されたコレステロールに由来するコレステロール、中性ステロールまたは胆汁酸の割合を測定し、それにより胆汁酸に対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与を測定するステップを含む。さらなる実施形態では、サンプルは糞便サンプルであり、単位時間当たりに被験体によって排出される中性ステロールおよび胆汁酸の総量は、被験体に経口投与された、糞便中で検出される内部標準との比較によって測定される。内部標準はシトスタノールでありうる。
【００２２】
さらなる実施形態では、生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定する方法が記載される。その方法は、（ａ）安定な同位体標識コレステロール分子または安定な同位体標識コレステロール関連分子を生体系に投与するステップ；（ｂ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子のｉｎ  ｖｉｖｏ変換産物を含むサンプルを生体系から取得するステップ；（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏ変換産物の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および（ｄ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子の希釈速度を算出することにより、生体系でのコレステロール逆輸送の血漿成分の分子流速を測定するステップを含みうる。
【００２３】
さらなる実施形態では、生体系での血中コレステロールの出現速度を測定する方法が記載される。その方法は、（ａ）脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールを、生体系内で検出可能なレベルの標識遊離コレステロールの蓄積を生じるのに十分な投与速度で生体系に静脈内投与するステップ；（ｂ）標識遊離コレステロール分子を含むサンプルを生体系から取得するステップ；（ｃ）標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および（ｄ）標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、１３Ｃ２標識コレステロールの投与速度と比較することにより、生体系での血中コレステロールの出現速度を算出するステップを含みうる。
【００２４】
１つの実施形態では、生体系での血中コレステロールの出現速度は、プラトーの原則により、同位体希釈により、同位体プラトーの存在の確立により、同位体プラトー値の推定により、または同位体プラトー値の外挿により算出される。
【００２５】
生体系でのコレステロール流の包括的ＲＣＴ速度（the global rate of RCT the flux of cholesterol）を算出する方法もまた記載される。その方法は、（ａ）（ｉ）脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールを、生体系内で検出可能なレベルの標識遊離コレステロールの蓄積を生じるのに十分な投与速度で生体系に静脈内投与するステップ；（ｉｉ）標識遊離コレステロール分子を含むサンプルを生体系から取得するステップ；（ｉｉｉ）標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および（ｉｖ）標識遊離コレステロール分子の同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を、１３Ｃ２標識コレステロールの投与速度と比較することにより、生体系での血中コレステロールの出現速度を算出するステップにより、血中コレステロールの出現速度を測定するステップ；（ｂ）（ｉ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子を生体系に投与するステップ；（ｉｉ）１種以上の生体系からの同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールを含むサンプルを生体系から取得するステップ；（ｉｉｉ）同位体標識コレステロール分子、胆汁酸または排出中性ステロールの同位体含量、同位体パターン、同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度を測定するステップ；および（ｉｖ）同位体標識コレステロール分子または同位体標識コレステロール関連分子のコレステロール分子、胆汁酸もしくは排出中性ステロールへの取り込み速度または移動速度を算出することにより、生体系でのＲＣＴの肝臓成分または排出成分の回収割合を測定するステップにより、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓部分または排出部分の回収割合を測定するステップ；（ｃ）ステップ（ａ）（ｉｉｉ）からの血中コレステロールの出現速度に、ステップ（ｂ）（ｉｖ）からのＲＣＴの肝臓部分または排出部分の回収割合を乗じることにより、生体系でのコレステロール流の包括的ＲＣＴ速度を算出するステップを含みうる。
【００２６】
さらなる実施形態では、生体系でのアテローム硬化のリスクおよび発生率に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価する方法が記載される。その方法は、（ａ）生体系でのコレステロール流の包括的ＲＣＴ速度を算出するステップ；（ｂ）候補薬剤を生体系に投与し、かつ／または生体系の食餌を変更するステップ；（ｃ）生体系で２回目のコレステロール流の包括的ＲＣＴを算出するステップ；および（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）とのコレステロール流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価するステップを含みうる。
【００２７】
その方法はまた、（ａ）生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ；（ｂ）候補薬剤を生体系に投与し、かつ／または生体系の食餌を変更するステップ；（ｃ）生体系で２回目のコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の肝臓成分または排出成分の分子流速を測定するステップ；および（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）との分子流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価するステップを含みうる。
【００２８】
その方法はさらに、（ａ）生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定するステップ；（ｂ）候補薬剤を生体系に投与し、かつ／または生体系の食餌を変更するステップ；（ｃ）生体系でのコレステロール逆輸送（ＲＣＴ）の血漿成分の分子流速を測定するステップ；および（ｄ）ステップ（ａ）とステップ（ｃ）との分子流速の差異を比較することにより、アテローム硬化に対する候補薬剤および／または食餌変更の効果を評価するステップを含みうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、同位体および質量分析技術を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＣＴを定量的に測定する方法を提供する。
【００３０】
一般的方法
本発明の実施は通常、他に指示のない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用する。このような技術は、例えば、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編、1998); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、1987); Short Protocols in Molecular Biology (WileyおよびSons, 1999); Mass Isotopomer Distribution Analysis: A Technique for Measuring Biosynthesis and Turnover of Polymers (Hellersteinら、Am J Physiol 263 (Endocrinol Metab 26):E988-1001 (1992));ならびにMass Isotopomer Distribution Analysis at Eight years: Theoretical, Analytic, and Experimental Considerations (Hellersteinら、Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab 39):E1146-1170 (1999))などの文献において十分に説明される。さらに、市販のアッセイキットおよび試薬を用いる方法は通常、他に指定のない限り、製造業者に規定された手順に従って使用される。
【００３１】
本発明の実施はさらに、他に指示のない限り、当技術分野の技術の範囲内である化学および分析化学の従来技術を利用する。このような技術は、例えば、Fundamentals of Analytical Chemistry (D. Skoog, D West, F Holler, S Crouch著、2003); Analytical Chemistry (S. Higson著、2004); Advanced Instrumental Methods of Chemical Analysis (J. Churacek編、1994);およびAdvanced mass spectrometry: Applications in organic and analytical chemistry (U. Schlunegger) などの文献において十分に説明される。
【００３２】
本発明の実施はさらに、他に指示のない限り、当技術分野の技術の範囲内である前臨床研究および臨床研究の従来技術を利用する。このような技術は文献において十分に説明される。
【００３３】
定義
「コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体」とは、コレステロールの代謝および輸送に関与する分子および複合体を意味する。これらは、コレステロールおよびコレステロール代謝産物もしくは前駆体、またはコレステロール前駆体（例えば、水、アセチルＣｏＡ）ならびにリポタンパク質（例えば、高密度リポタンパク質）のようなコレステロールおよびコレステロールの代謝産物もしくは前駆体の担体との複合体を含む。下記の非限定的なリストは、「コレステロールまたはコレステロール関連分子もしくは複合体」の例を含む。すなわち、カイロミクロン、高トリグリセリドリポタンパク質（ＴＧＲＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に由来するコレステロール；カイロミクロン、ＴＧＲＬ、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、またはＶＬＤＬに由来するコレステロールエステル；血液、糞便、胆汁、尿、または任意の他の生物学的サンプルに由来する胆汁酸；血液、糞便、胆汁、尿、または任意の他の生物学的サンプルに由来する中性ステロール；ケノデオキシコレート、コレート、デオキシコレート、リトコレート、ウルソデオキシコレート、リン脂質、またはビリルビン；消化管微生物によって生成される胆汁酸の代謝産物；消化管微生物によって生成される中性ステロールの代謝産物（例えば、コプロスタノール、コプロスタノン、コレスタノール、コレスタノンおよびエピコプロスタノール）、などである。
【００３４】
「分子または複合体を含有するサンプル」とは、指示された分子または複合体を含む任意のサンプルを意味する。指示された分子または複合体の任意の濃度が考えられる。指示された分子もしくは複合体の同位体含量または同位体パターンは様々でありうる。それはゼロであってもよい。指示された分子または複合体は、サンプル中に別の複合体の一部としてしか存在しないかもしれない。
【００３５】
「複合体」とは、１つ以上の分子で構成される任意の高分子集合体を意味する。分子は、脂質、小分子、タンパク質、リポタンパク質、またはその他でありうる。複合体の一例はＨＤＬであり、より小さい分子（コレステロールおよびコレステロールエステルを含む）ならびにより大きい分子（例えば、リポタンパク質）を含む様々な分子を含有する。複合体の他の例はＬＤＬである。
【００３６】
「胆汁酸」とは、糞便、血液、または他の生物学的サンプルもしくは成分中に見られる任意の胆汁酸または胆汁酸代謝生成物（すなわち、代謝産物）を意味する。胆汁酸の例は、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、および任意の他の胆汁酸または胆汁酸代謝産物を含む。
【００３７】
「胆汁」とは、胆嚢から消化管腔内への分泌物を意味する。胆汁成分の部分的なリストは、胆汁酸、中性ステロール、ケノデオキシコレート、コレート、デオキシコレート、リトコレート、コレステロール、ウルソデオキシコレート、リン脂質、またはビリルビンを含む。消化管腔において、いくらかの胆汁成分は常在微生物により胆汁成分誘導体または代謝産物に代謝される（例えば、コプロスタノール、コプロスタノン、コレスタノール、コレスタノンおよびエピコプロスタノールは胆汁コレステロールの代謝産物である）。本発明の目的では、これらの誘導体は同様に胆汁の成分と見なされる。
【００３８】
「活性」とは、本発明の方法を用いて被験体で測定され得るＲＣＴまたはＲＣＴの成分の指標を意味する。活性は、速度（例えば、単位時間当たりの量、すなわち単位時間当たりに変換もしくは輸送されるコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の量）、質量（例えば、グラム、すなわちコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体のグラム）、割合またはパーセンテージ（例えば、ＲＣＴに由来する胆汁酸の割合、またはＲＣＴに由来する中性ステロールのパーセンテージ）、あるいは本明細書において開示される方法の実施中に得られるデータの任意の他の表現によって表されうる。活性は、異なる被験体間で比較されるもの、または同一の被験体の候補治療法の施行前後で比較されるもの、または過去のデータと比較されるものでありうる。状況によって、同一のデータは多数の異なる種類の活性として表されうる。新しい種類の活性を算出するために、データは、過去のデータ、ベースラインデータ、または新しいデータと組み合わされうる（例えば、胆汁酸に対するＲＣＴの寄与率は、胆汁酸プールサイズと組み合わせることにより、胆汁酸に変換されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の質量を決定し得る）。
【００３９】
「過去のデータ」とは、実験の開始前に存在する任意のデータを意味する。
【００４０】
「候補治療法」とは、本明細書において概説されるように有効性がスクリーニングされ得る、疾患を治療しうる任意の過程を意味する。候補治療法は、行動療法、運動療法、食事療法を含みうる。候補治療法はまた、医療機器による治療、または医療機器の移植をも含みうる。候補治療法はまた、任意の「候補薬剤」または「候補薬物」（下記参照）による治療をも含みうる。
【００４１】
候補治療法は、候補治療法の組合せを含みうる。このような組合せは、２つの異なる候補薬剤でありうる。組合せはまた、候補薬剤および食事療法でもありうる。組合せはまた、運動療法および食事療法でもありうる。組合せはまた、運動療法および食事療法および候補薬剤でもありうる。組合せはまた、運動療法もしくは食事療法またはその両方のような別の候補治療法と併用される候補薬剤または候補薬剤の組合せとの併用でもありうる。従って組合せは、同一の被験体に施行される複数の候補治療法である。
【００４２】
候補治療法は、適切な規制機関（例えば、米国食品医薬品局または他国の同等機関）によってヒトでの使用が既に認可されていてもよい。候補治療法は、アテローム生成、動脈硬化、アテローム硬化、または他のコレステロール関連疾患の治療もしくは予防のためのヒトでの使用が既に認可されていてもよい。
【００４３】
「候補薬剤」または「候補薬物」とは、本明細書において概説されるように活性がスクリーニングされ得る、任意の化合物、分子、ポリマー、高分子または分子複合体（例えば、抗体および酵素などの生物製剤を含むタンパク質、既知の薬物および薬物候補を含む有機小分子、他の種類の小分子、多糖類、脂肪酸、ワクチン、核酸など）を意味する。候補薬剤は、本発明においてコレステロール代謝および輸送に影響を及ぼす潜在的な治療薬を発見するために評価される。
【００４４】
候補薬剤は多数の化学的分類を包含する。１つの実施形態では、候補薬剤は、通常１００〜約２，５００ダルトンの分子量を有する低分子有機化合物のような有機分子である。好ましくは、１００ダルトン以上約２，０００ダルトン以下、より好ましくは約１５００ダルトン以下、さらにより好ましくは約１０００ダルトン以下、さらにより好ましくは５００ダルトン以下の分子量を有する低分子有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質または他の宿主分子との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、通常、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補薬剤はしばしば、1つ以上の上記の官能基で置換された環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組合せを含む生体分子の中からも見いだされる。
【００４５】
候補薬剤は、「既知の薬物」または「既知の薬剤」または「既に認可された薬剤」を含み、このような用語は、米国もしくは他の法的権限においてヒトまたは動物での薬剤としての治療的使用が認可されている薬剤を指す。既知の薬物はまた、例えば、The Merck Indexの第１３版（米国の出版物、Whitehouse Station, N.J., USA）（参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）において開示される任意の化合物または組成物を含むが、それらに限定されない。
【００４６】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む幅広い種類の起源から入手される。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびペプチドの発現および／または合成を含む、幅広い種類の有機化合物ならびに生体分子のランダム合成ならびに指向性合成のために当技術分野においてよく知られている、多数の方法が利用可能である。あるいは、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形での天然化合物のライブラリーが利用可能であり、容易に作製される。加えて、天然または合成によって作製されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的方法によって容易に改変される。既知の薬剤は、構造的類似体を作製し、それによってそれらを異なる候補薬剤にするために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）などの、部位指定化学修飾またはランダム化学修飾を受けてもよい。
【００４７】
候補薬剤はタンパク質でありうる。本明細書において「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然のアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣薬構造で構成されうる。従って、本明細書において用いられる場合、「アミノ酸」または「ペプチド残基」とは、天然のアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、ノルロイシンは、本発明のためにはアミノ酸と見なされる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を含む。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれかでありうる。非天然の側鎖が用いられる場合、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解を防止または遅延させるために、非アミノ酸置換基が使用されうる。酵素のペプチド阻害剤は具体的な用途であると思われる。
【００４８】
候補薬剤は、天然のタンパク質または天然のタンパク質の断片でありうる。従って、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク質性細胞抽出物のランダム消化物もしくは部位指定消化物が使用されうる。このようにして、原核生物タンパク質および真核生物タンパク質のライブラリーは、本明細書に記載されるシステムにおけるスクリーニングのために作製されうる。この実施形態において特に好ましいのは、細菌、菌類、ウイルス、および哺乳動物のタンパク質のライブラリーであるが、後者が好ましく、ヒトタンパク質は特に好ましい。
【００４９】
候補薬剤は、タンパク質の一種である抗体でありうる。「抗体」という用語は、完全長ならびに、当技術分野において知られているような、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、一本鎖抗体（例えばＦｖ）を含む抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体など、完全な抗体の改変によって作製されるものまたは組換えＤＮＡ技術を用いてｄｅ  ｎｏｖｏ合成されるもののいずれか、およびそれらの誘導体を含む。
【００５０】
候補薬剤は核酸でありうる。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または本明細書における文法的同等物は、ともに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は通常ホスホジエステル結合を含むが、ある場合には、下記に概説されるように、代替骨格を有しうる核酸類似体が含まれ、例えば、ホスホルアミド（phosphoramide）（Beaucageら、Tetrahedron, 49(10):1925 (1993)およびその参考文献；Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzlら、Eur. J. Biochem., 81:579 (1977); Letsingerら、Nucl. Acids Res., 14:3487 (1986); Sawaiら、Chem. Lett., 805 (1984), Letsingerら、J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); およびPauwelsら、Chemica Scripta, 26:141 (1986)）、ホスホロチオエート（Magら、Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briuら、J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）、ならびにペプチド核酸骨格および結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meierら、Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlssonら、Nature, 380:207 (1996)参照、そのすべては参照により組み入れられる）を含む。他の類似体核酸は、正の骨格を有するもの（Denpcyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号；同第５，６３７，６８４号；同第５，６０２，２４０号；同第５，２１６，１４１号；および同第４，４６９，８６３号；Kiedrowshiら、Angew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsingerら、J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsingerら、Nucleoside & Nucleotide, 13:1597 (1994); ASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, 編Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cookの２章および３章; Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffsら、J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996）)ならびに、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号およびASC Symposium Series 580, “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, 編Y.S. SanghuiおよびP. Dan Cookの６章および７章に記載されるものを含む非リボース骨格を有するもの、ならびにペプチド核酸を含む。１つ以上の炭素環糖を含む核酸もまた核酸の定義に含まれる（Jenkinsら、Chem. Soc. Rev., (1995) pp. 169-176参照）。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News, June 2, 1997, 35ページに記載される。これらの参考文献はすべて、参照により本明細書に明確に組み入れられる。リボース−リン酸骨格のこれらの改変は、標識などのさらなる部分の付加を容易にするために、または生理環境においてこのような分子の安定性および半減期を増加させるために行われうる。さらに、天然の核酸と類似体の混合物が作製され得る。あるいは、異なる核酸類似体の混合物、および天然の核酸と類似体の混合物が作製されうる。核酸は、規定されているように、一本鎖または二本鎖でありえ、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含みうる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドでありえ、その核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組合せを含み、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン（xathanine）、ヒポキサンチン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボシキメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボシキメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンなどを含む塩基の任意の組合せを含む。
【００５１】
タンパク質について一般的に上述されたように、核酸候補薬剤は、天然の核酸、ランダムおよび／または合成核酸でありうる。例えば、原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノムの消化物は、タンパク質について上記に概説されたように使用されうる。加えて、ＲＮＡ干渉配列（ＲＮＡｉ）は本明細書に含まれる。
【００５２】
「被験体」とは、記載されている実験または手順または過程の、生きている対象を意味する。すべての被験体は生体系である。１つの実施形態では、被験体はヒトでありうる。別の実施形態では、被験体はウサギまたは齧歯類または非ヒト霊長類でありうる。さらに、「被験体」という用語は、任意の他の生体系を包含する。
【００５３】
「生体系」とは、本明細書において、細胞、細胞株、組織、器官または生物を含む任意の生きている存在を意味する。生物の例は、任意の動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。哺乳動物の例は、非ヒト霊長類、家畜、愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）、ならびに研究動物（例えば、マウス、ラット、およびヒト）を含む。
【００５４】
「生物学的サンプル」は、生体系または被験体から取得される任意のサンプルを包含する。その定義は、血液、組織、および生体系または被験体から採取され得る生物由来の他のサンプルを包含する。好ましくは、生物学的サンプルは最小限の侵襲性または非侵襲性の方法（例えば、採尿、便の採取、採血、針吸引、および最小限のリスク、不快感または労力を必要とする他の方法）によるサンプリングによって取得される。生物学的サンプルはしばしば液体（時に「体液」と呼ばれる）である。液体の生物学的サンプルは、尿、血液、腸液、浮腫液、唾液、涙液、炎症浸出液、滑液、膿腫、蓄膿症または他の感染体液、脳脊髄液、汗、気道内分泌物（喀痰）、精液、糞便、胆汁、腸分泌物などを含むが、それらに限定されない。生物学的サンプルは、それらの取得後、試薬による処理、可溶化、または例えばタンパク質もしくはポリヌクレオチドなど、特定の成分の濃縮などによる任意の方法で処理されたサンプルを含む。「生物学的サンプル」という用語はまた、血清、血漿、他の体液、または組織サンプルなどの臨床サンプルをも包含し、また培養細胞、細胞上清および細胞溶解液をも含む。
【００５５】
「同位体含量または同位体パターンまたは同位体含量もしくは同位体パターンの変化速度」は、同位体含量、同位体パターン、同位体含量の変化速度、同位体パターンの変化速度、または分子の同位体分布の他の測定結果を指す。同位体含量または同位体パターンまたは同位体含量の変化速度または同位体パターンの変化速度は、分子もしくは分子集団における同位体のパターンまたは含量または分布を指す。この用語は、幅広い意味および分子特性を含む。同位体含量または同位体パターンは、同位体含量の経時的な変化（例えば、時間の関数としての同位体含量）を含みうる。１つの実施形態では、同位体含量または同位体パターンは、サンプル中での特定の同位体のモルパーセントを表す。別の実施形態では、同位体含量または同位体パターンは、１つ以上の質量アイソトポマーの相対量を表す。別の実施形態では、同位体含量または同位体パターンは、質量アイソトポマーの分布全体を指す場合があり、巨大分子のそれは何百にも達しうる。同位体含量または同位体パターンはまた、高度に標識された単一の分子種（例えば、４つの重水素を有する前駆体）の相対量をも表しうる。同位体含量または同位体パターンは、単一アイソトポマーの超過モル百分率（molar percent excess）を指すことができ、またはそれは特定の同位体の超過原子百分率（atom percent excess）を指すことができる。同位体含量または同位体パターンは、本明細書に記載される本方法の実施の間に行われる質量分析により測定されるものを含む。これらの分析は、特定の質量アイソトポマーの超過モル百分率（ＭＰＥ）（例えば、コレステロールのＭ１アイソトポマーのＭＰＥ、またはコール酸のＭ４アイソトポマーのＭＰＥ、または血中の２Ｈ２ＯのＭＰＥ）の測定を含みうる。これらの分析は、特定の原子同位体の超過原子百分率（ＡＰＥ）（例えば、コレステロール中の１３ＣのＡＰＥ）の測定を含みうる。
【００５６】
「対象となる分子」とは、本明細書に記載される方法の実施の間に精製もしくは分析のために選択される、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を意味する。このような対象となる分子は、本明細書に記載される方法を実施する間に被験体において見いだされるかまたは生成される同位体標識生成物である。例えば、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定は、被験体の肝臓における１３Ｃ２標識コレステロールの１３Ｃ２標識コール酸への変換に基づきうる。この場合は、コール酸が対象となる分子であり、それはその１３Ｃ同位体含量または同位体パターンについて分析される。同様に、ＲＣＴの血漿成分の測定は、ＨＤＬ中の１４Ｃ２標識コレステロールの、ＶＬＤＬ中の１４Ｃ２標識コレステロールエステルへの変換に基づきうる。この場合は、ＶＬＤＬに由来するコレステロールエステルが対象となる分子であり、それはその１４Ｃ同位体含量または同位体パターンについて分析される。対象となる分子は被験体に投与された同位体標識分子（コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体もしくコレステロール前駆体）と同一であってもよく、またはそれは異なる同位体標識分子、例えば、被験体もしくは微生物のいずれかによる被験体内での代謝性事象により生成されたものであってもよい。
【００５７】
対象となる分子は、コレステロールまたはコレステロールエステルを含みうる。対象となる分子はまた、カイロミクロン、ＴＧＲＬ、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、またはＶＬＤＬに由来するコレステロールを含みうる。対象となる分子はまた、カイロミクロン、ＴＧＲＬ、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、またはＶＬＤＬに由来するコレステロールエステルを含みうる。対象となる分子はまた、血液、糞便、胆汁、尿、または任意の他の生物学的サンプル由来の胆汁酸を含みうる。対象となる分子はまた、血液、糞便、胆汁、尿、または任意の他の生物学的サンプル由来の中性ステロールを含みうる。対象となる分子はまた、ケノデオキシコレート、コレート、デオキシコレート、リトコレート、ウルソデオキシコレート、リン脂質、またはビリルビンを含みうる。対象となる分子はまた、消化管微生物によって生成される胆汁酸の代謝産物を含みうる。対象となる分子はまた、消化管微生物によって生成される中性ステロールの代謝産物（例えば、コプロスタノール、コプロスタノン、コレスタノール、コレスタノンおよびエピコプロスタノール）を含みうる。このような微生物代謝産物は糞便内において見いだされ、またはそれらは被験体に再吸収されて、他の生物学的サンプル中に出現しうる。
【００５８】
被験体または生物学的サンプル中の対象となる分子の全プールの一部である、同位体標識された対象となる分子は、本発明の方法の実施により生成された生成物である。
【００５９】
「モノアイソトピック質量」は、すべて１Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏ、３２Ｓなどを含む分子種の正確な質量を指す。Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるアイソトポログに関して、最も低い質量を有するアイソトポログの同位体組成は一つしかない一義的なものである。なぜなら、これらの元素の最も豊富な同位体もまた最も低い質量を有するからである。モノアイソトピック質量はｍ０と略され、他の質量アイソトポマーの質量は、それらの質量のｍ０との差異によって区別される（ｍ１、ｍ２など）。
【００６０】
「質量アイソトポマー」または「アイソトポマー」は、同位体組成よりむしろ見掛けの質量に基づいて分類される同位体異性体群を指す。質量アイソトポマーは、アイソトポログとは異なり、異なる同位体組成の分子を含みうる（例えば、ＣＨ３ＮＨＤ、１３ＣＨ３ＮＨ２、ＣＨ３１５ＮＨ２は同一の質量アイソトポマーの一部であるが、異なるアイソトポログである）。実務上の用語では、質量アイソトポマーは、質量分析計によって分離されないアイソトポログ群である。四重極質量分析計では、これは通常、質量アイソトポマーは見掛けの質量を共有するアイソトポログ群であるということを意味する。従って、アイソトポログＣＨ３ＮＨ２とＣＨ３ＮＨＤは見掛けの質量が異なり、異なる質量アイソトポマーとして区別されるが、アイソトポログＣＨ３ＮＨＤ、ＣＨ２ＤＮＨ２、１３ＣＨ３ＮＨ２およびＣＨ３１５ＮＨ２はすべて同一の見掛けの質量であり、従って同一の質量アイソトポマーである。従って、それぞれの質量アイソトポマーは通常、１つ以上のアイソトポログからなり、１つ以上の正確な質量を有する。すべての個々のアイソトポログは四重極質量分析計によって分離されず、より高い質量分解能を実現する質量分析計を用いても分離されないかもしれないため、質量分析データからの算出は、アイソトポログよりむしろ質量アイソトポマーの存在度で行われなければならないので、アイソトポログと質量アイソトポマーとの区別は実際面で有用である。最も低い質量の質量アイソトポマーはＭ０で表され；ほとんどの有機分子にとって、これはすべて１２Ｃ、１Ｈ、１６Ｏ、１４Ｎなどを含む分子種である。他の質量アイソトポマーは、それらの質量のＭ０との差異によって区別される（Ｍ１、Ｍ２など）。特定の質量アイソトポマーに関して、分子内の同位体の配置または位置は特定されず、異なりうる（すなわち、「位置アイソトポマー」は区別されない）。
【００６１】
「同位体標識」とは、同一の数の陽子を有し、従って同一の元素であるが、異なる数の中性子を有する原子による標識を意味する（例えば、１Ｈに対する２Ｈ）。同位体標識分子は任意の可能性のある同位体によって標識される。同位体は安定同位体（例えば、２Ｈ、１３Ｃ）であってもよく、またはそれらは放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ）であってもよい。
【００６２】
「同位体標識基質」は、生体系または被験体において対象となる分子に取り込まれ得る、任意の同位体標識前駆体分子を含む。同位体標識基質の例は、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ、２Ｈ−グルコース、２Ｈ標識アミノ酸、２Ｈ標識有機分子、１３Ｃ標識有機分子、１４Ｃ標識有機分子、１３ＣＯ２、１４ＣＯ２、１５Ｎ標識有機分子および１５ＮＨ３を含むが、それらに限定されない。
【００６３】
「精製」は、他の類似した化合物の混合物の１つ以上の成分を取り出す方法を指す。例えば、「タンパク質またはペプチドの精製」は、タンパク質またはペプチドの混合物中の１つ以上のタンパク質またはペプチドからタンパク質またはペプチドを取り出すことを指す。
【００６４】
「単離」は、化合物の混合物から１つの化合物を分離することを指す。例えば、「タンパク質またはペプチドの単離」は、１つ以上のタンパク質またはペプチドの混合物中の他のすべてのタンパク質またはペプチドから１つの特定のタンパク質またはペプチドを分離することを指す。
【００６５】
「前駆体分子」は、特定の分子の合成の間に用いられる代謝前駆体を指す。前駆体分子の例は、アセチルＣｏＡ、リボ核酸、デオキシリボ核酸、アミノ酸、グルコース、水などを含む。
【００６６】
「標識水」は、本明細書において用いられる場合、同位体を含有する水を指す。標識水の例は、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ、およびＨ２１８Ｏを含む。本明細書において用いられる場合、「同位体標識水」は「標識水」と同義に用いられる。
【００６７】
「分子流速」は、細胞、組織、もしくは生物内での分子の合成速度および／または分解速度を指す。「分子流速」はまた、分子プール内への分子の流入または分子プールからの移動を指し、従って分子プール内へまたは分子プールからの流量と同義である。
【００６８】
コレステロール輸送および代謝の測定方法
コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）は、コレステロールが動員され体外へ輸送される生物学的経路である（図１）。ＲＣＴの３つの成分：（１）組織、特に肝臓外の組織から血流へのコレステロールの流出（流出成分、図２）；（２）血漿画分内でのコレステロールの輸送および分布（血漿成分、図３）；ならびに（３）肝臓または腸を介した糞便内への排出（肝臓成分もしくは排出成分、図４）がある。コレステロールは、胆汁酸または遊離コレステロール（ステロール）のいずれかとして胆汁分泌に組み込まれ、その後、腸管腔に分泌され、その一部は体から糞便内に出る。ステロールはまた、腸から腸管内腔に直接放出され、その後一部が糞便内に排出されうる。これらの経路は、コレステロールが体から除去され得る唯一の有効な機序である。機能的観点から、成分＃１および＃３（すなわち、流出成分および肝臓成分または排出成分）は、それぞれ細胞からのおよび体からのコレステロールの出口であるため、重要なステップである。上述のように、アテローム生成、アテローム硬化ならびに他のコレステロール関連疾患および血管疾患におけるコレステロールの確立された役割のため、ＲＣＴは、重要な抗アテローム生成過程および抗アテローム硬化過程と考えられ、心血管系リスクの低下と血漿の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）画分との臨床相関と同様に、抗アテローム生成特性および抗アテローム硬化特性に対する理由であると一般に信じられている。
【００６９】
しかし、ＨＤＬレベルは、ＲＣＴの分子経路の１つの成分しか反映せず、ＲＣＴ経路を介したコレステロールの真の流れを必ずしも反映しないことが現在は認識されている。ＲＣＴ経路の分子詳細は、この数年間でさらに重視されるようになった。分子的理解におけるこれらの最近の進歩の１つの重要な意味は、単独での血漿ＨＤＬｃ（ＨＤＬ−コレステロール）レベルは、ＨＤＬｃの変化に関与する根底の機序によって、その経路を介した真の流れを反映するかもしれず、またはしないかもしれないという認識である。例えば、個体におけるＨＤＬｃの血漿濃度が、突然変異体ＡＢＣ（Ａ）−１ヘテロ接合体でのように、組織からＡＢＣ（Ａ）−１（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター）を介した血漿ａｐｏＡ１含有粒子への流れである場合、ＨＤＬｃは有用なマーカーである。しかし、別の個体においてＨＤＬｃが、そのアクセプターへのＨＤＬｃの送達阻害のために蓄積する場合（例えばコレステロールエステル輸送タンパク質活性の低下または肝臓のスカベンジャー受容体−Ｂ１［ＳＲ−Ｂ１］活性の低下による場合）、ＨＤＬｃレベルはＲＣＴを反映しない。スタチンのような、ａｐｏＢ含有粒子の産生および運命を変化させる治療のＲＣＴに対する影響を考慮した場合、状況は特に複雑であり得る。ａｐｏＢ粒子は逆方向（すなわち、肝臓に戻す）だけでなく、コレステロールを前方に（すなわち、組織に）運ぶこともできるため、個体におけるａｐｏＢ粒子の実際の運命は、いずれの血漿ＨＤＬレベルでもＲＣＴの効率に寄与しうる。従って、ＨＤＬｃ濃度とＲＣＴとの間の既存の解離を増加させる可能性は、効果的なスタチン治療もしくはＶＬＤＬおよびＬＤＬ粒子の肝臓への回帰を促進する他の治療の背景において、またはコレステロール代謝もしくは脂質代謝の改変に対して行われる事実上任意の治療（例えば、スタチン治療、フィブラート治療など）において生じる。
【００７０】
ＲＣＴ活性とＨＤＬｃレベルとの間の違いは、本開示の基礎を説明する。ＲＣＴなどの生化学的過程の測定は、生化学的分子の濃度の測定と同じではない。ＨＤＬｃの濃度の測定は技術的に単純な作業であるが、単独では、必ずしも情報を提供するとは限らない。対象となる過程は血漿中のＨＤＬｃ濃度ではなく、対象となる過程はコレステロールの体からの除去（すなわち、ＲＣＴ）である。ＨＤＬｃの測定、それ自体は、単に実際の過程の代用である。この違いのいくつかの例は、動物モデルならびにヒトについて当技術分野において知られている。アテローム硬化を生じやすいマウスにおけるＳＲ−ＢＩ受容体の遺伝子欠失は、ＨＤＬからのコレステロールの取り込みが低下することによってＲＣＴ過程を低下させ、それによって、血漿ＨＤＬコレステロールレベルを著しく増加させる。しかし、より高いＨＤＬレベルにもかかわらず、これらのマウスはより悪化したアテローム硬化を呈する。このＨＤＬコレステロールレベルと心臓保護との間の解離は、ＨＤＬの濃度よりも流れの優位性を反映する。同様に、アテローム硬化を生じやすいマウスにおけるタンパク質ＡＢＣ−Ａ１の遺伝子の過剰発現は、より低いＨＤＬコレステロールレベルをもたらすが、アテローム硬化に対する保護をもたらす。実際、通常のＨＤＬと血管系リスクとの間の関係とは反対に、ＨＤＬレベルがより高いほど、より悪化したアテローム硬化が観察された。さらに、突然変異ａｐｏＡ１−ミラノを有するヒトは、低いＨＤＬコレステロールレベルを有するが、著しく低下した心血管系リスクを有し、おそらく、血流中での蓄積なしにＲＣＴ経路を介してコレステロールを運ぶａｐｏＡ１−ミラノの優れた能力を反映している。
【００７１】
従って、ＲＣＴ経路によって組織から血液を介して体外へ輸送されるコレステロールの量を実際に測定しうる方法は、問題となっている過程の直接測定であろう。本開示は、ＲＣＴ経路に重点を置いて、生体系もしくは被験体によって合成され、輸送され、修飾され、代謝され、分泌され、または別の方法で移動される、コレステロールあるいはコレステロール関連分子あるいはコレステロール関連複合体の量（絶対量、相対量、または割合）の測定を記載する。これらのような方法は、必ずではないが、時に経時実験を含むため、またはデータを速度の形（すなわち、単位時間当たりの量）に返すため、しばしば「キネティック」測定の項目に分類される。本開示では、ＲＣＴ経路の異なる成分を介するコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の動きを追跡するために、同位体標識が用いられる。同位体標識分子は非標識分子と化学的に同一であり、生化学的に区別できないが、それらは異なる質量を有し、様々な質量分析またはレーザー分光光度法もしくはレーザー分光法などの他の方法によって測定され得る特性を有する。同位体標識分子の出現、希釈、濃縮、もしくは消失を追跡することによって、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の輸送あるいは代謝が測定され得る。
【００７２】
コレステロール関連疾患の世界的な影響の増大のため、ならびにコレステロール代謝の複雑さおよびその研究のため、ＲＣＴ速度を測定するｉｎ  ｖｉｖｏでの方法が必要とされ、医療ならびに創薬および薬剤開発に対して大きな実用性を有する。候補治療法の同定、選択、評価および開発（例えば、臨床または前臨床用量設定および用量の最適化、有効性の測定）、コレステロール関連疾患の診断、疾患進行または治療への反応の評価を含む被験体の管理、ならびにコレステロール関連疾患の管理、診断もしくは治療に使用するための医療機器または医療用具の設計および試験は、本発明の方法の実施から利益を受けるすべての過程である。臨床試験への登録前の被験体の評価は、本発明の１つの有益な用途である。彼らが候補治療法に反応するか否かを予測するために被験体を評価することは、本発明の別の有益な用途である。本発明は、コレステロール関連疾患のリスクを変える遺伝的要因の同定および研究、ならびに被験体を分類するためおよび治療を推奨するために使用され得る疾患基準（すなわち、疾患状態または前疾患状態を示すリスクファクターの組合せ）の開発に対するさらなる用途を有する。
【００７３】
本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのコレステロール輸送および代謝の測定方法を提供する。１つの実施形態では、本開示は、さらに具体的には、コレステロールを細胞および体から出す機序である、ＲＣＴの測定を対象とする。「コレステロール逆輸送」または「ＲＣＴ」という用語は、コレステロールが細胞から血流へ、および血流から体外へ移動する全過程を表すために用いられる。ＲＣＴ過程は、コレステロールの一時的もしくは永続的な代謝または修飾を含み、コレステロールの輸送だけを扱うのではなく、むしろ様々なコレステロール前駆体および派生生成物を扱う。さらに、ＲＣＴの間、コレステロールおよびその様々な代謝産物は、ＨＤＬサブクラスおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）などの様々な担体分子または複合体と関連し、それらの間を輸送される。ＲＣＴのいくつかの成分（例えば、胆汁酸）は分泌および再吸収され、他のものは可逆的に輸送または修飾されて平衡状態（すなわち、問題となっている過程の両方向での自由な輸送がある状態）で存在するように、ＲＣＴ過程は必ずしも一方向性ではない。本開示の文脈では、「ＲＣＴ」という用語は、コレステロールおよびコレステロール代謝産物またはコレステロール関連分子が生体（すなわち、生体系もしくは被験体）から最終的に除去される過程を表すために用いられる。ＲＣＴ過程は、「流出成分」、「血漿成分」、および「肝臓成分または排出成分」の３部の過程として特徴づけされうる（図１）。本開示は、３つの成分のいずれも他の成分を測定または評価することなく独立して測定され得るが、全体としてのＲＣＴの測定を対象とする。
【００７４】
測定は通常、ヒトを含む哺乳動物被験体において実施される。哺乳動物は、霊長類、家畜、競技動物、ネコおよびイヌなどの愛玩動物、モルモット、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、ヒトなどを含むが、それらに限定されない。
【００７５】
Ｉ．被験体におけるＲＣＴの流出成分の速度の測定
１つの態様では、ＲＣＴの流出成分が被験体において測定されうる。１種以上の同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が被験体に投与される。一定期間後、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を含有する、血漿サンプルなどの１つ以上のサンプルが被験体から取得され、その分子もしくは複合体の同位体含量または同位体パターンが測定される。組織由来の内在性コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の流出による、投与された標識の希釈量がこのデータから算出され、それは実験の間の流出量を直接反映する。さらに、標識分子または複合体の内在性非標識分子もしくは複合体による希釈速度を算出することによって、被験体におけるコレステロール逆輸送の流出成分の速度が測定され得る。この過程は下記の実施例１に例示される。
【００７６】
Ａ．同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の投与
同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、経口、非経口、皮下、血管内（例えば、静脈内もしくは動脈内）、腹腔内または筋肉内を含むがそれらに限定されない様々な経路によって被験体に投与され得る。
【００７７】
投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、下記のいずれかでありうるが、それらに限定されない：
・同位体標識コレステロール
・脂質エマルジョンに懸濁された同位体標識コレステロール
・高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子に結合した同位体標識コレステロール
・低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子に結合した同位体標識コレステロール
・超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）粒子に結合した同位体標識コレステロール
・中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）粒子に結合した同位体標識コレステロール
・カイロミクロンに結合した同位体標識コレステロール
・同位体標識コレステロールエステル
・脂質エマルジョンに懸濁された同位体標識コレステロールエステル
・ＨＤＬ粒子に結合した同位体標識コレステロールエステル
・ＬＤＬ粒子に結合した同位体標識コレステロールエステル
・ＶＬＤＬ粒子に結合した同位体標識コレステロールエステル
・ＩＤＬ粒子に結合した同位体標識コレステロールエステル
・カイロミクロンに結合した同位体標識コレステロールエステル。
【００７８】
コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を標識するために使用される同位体は、安定同位体（例えば、２Ｈ、１８Ｏ、もしくは１３Ｃ）であってもよく、またはそれは放射性同位体（例えば、３Ｈもしくは１４Ｃ）であってもよい。コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、複数の異なる同位体標識を有しうる。それは、複数の位置で同一の同位体標識によって標識されてもよい。それは、複数の位置で複数の異なる標識によって標識されてもよい。例えば、２Ｈおよび１８Ｏまたは２Ｈおよび１３Ｃまたは任意の標識の組合せによって標識することができる。
【００７９】
また、同位体標識されたものの代わりに修飾されたコレステロールまたはコレステロール関連分子もしくは複合体を用いることもできる。修飾されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体がその内在性対応物と識別され得る限り、本方法は修飾されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を用いて実施され得る。修飾されたコレステロール分子の一例は、メチル基によって修飾されているメチルコレステロールである。メチルコレステロールの場合、コレステロールに非常によく似ているが、質量分析、ＮＭＲまたはレーザー分光光度法もしくはレーザー分光法などの他の方法（下記参照）によって識別できるコレステロール分子を作製するために、単一のメチル基がコレステロールに付加される。付加的なメチル基を含む対象となる分子の割合の測定は、対象となる分子の同位体含量の測定に代わることができる（下記参照）。同様に、超過モル百分率は、対象となるメチル化分子について表される（例えば、ＭｍｅｔｈｙｌのＭＰＥ）。ＭＰＥの算出は下記において議論される。
【００８０】
上記に記載された同位体標識分子もしくは複合体、または他の同位体標識分子もしくは複合体の調製方法は、当業者にとって既知である。
【００８１】
同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、様々な方法で投与されうる。それらは、連続的、反復的、不連続的に、または他の方法によって投与され得る。１つの実施形態では、脂質エマルジョン中の既知量の同位体標識コレステロールは、一定の速度で、血漿コレステロールについて定常状態レベルに達するのに十分な時間注入される。
【００８２】
Ｂ．１つ以上の生物学的サンプルの取得
同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の投与後または投与の間に、生物学的サンプルが取得される。生物学的サンプリングの頻度は様々な要因によって異なりうる。このような要因は、生物学的サンプルの性質、サンプリングの容易さおよび安全性、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の生物学的速度定数および代謝回転の反応速度、ならびに被験体に施行される候補治療法の性質を含むが、それらに限定されない。１つの実施形態では、同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の注入後または注入の間に、被験体から複数の生物学的サンプルが採取される。
【００８３】
生物学的サンプルの性質は大きく異なりうる。１つの実施形態では、サンプルは尿または糞便である。別の実施形態では、サンプルは血液である。サンプルは、十分な量のコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体（対象となる分子）を得るために選択され、その同位体含量または同位体パターンについて分析される。対象となる分子は実験計画によって異なり、上記のＩ−Ａ項に記載されるように投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の選択に基づいて選択されうる。サンプルは複数の対象となる分子を含んでもよく、単一の対象となる分子を分析するために、複数のサンプルが採取されてもよい。１つの実施形態では、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は脂質エマルジョン中の１３Ｃ標識コレステロールであり、生物学的サンプルはコレステロールを含有するであろう血液サンプルである。血中のコレステロールの同位体含量または同位体パターンはその後、下記に記載されるように測定されるであろう。
【００８４】
続いて、対象となる分子の同位体含量または同位体パターンの測定が行われる。この測定は直接サンプルに対して行われてもよく、またはそれはサンプルを処理した後に行われてもよい。ある場合には、サンプルは、同位体含量または同位体パターンが測定される前に広範に処理されうる。サンプルは、ＨＤＬもしくはＨＤＬのサブクラスなど、特定のコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体を単離するために処理され、単離された分子または複合体はその後、質量分析に適した形にさらに処理されうる。
【００８５】
コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体を精製、部分精製、または単離するために生物学的サンプルに適用されうる技術のいくつかは、遠心分離、溶媒沈殿、塩析沈殿、またはｐＨによる沈殿、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、限外ろ過、超遠心分離法、アフィニティークロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、選択的タンパク質分解または示差的（differential）タンパク質分解、示差的（differential）化学分解、結晶化、再結晶化、制限タンパク質分解、制限化学的分解、ならびに／あるいは、当業者にとって既知の化学的なおよび／もしくは生化学的なおよび／もしくは高分子の化合物、生体分子または複合体を分離する任意の他の方法を含むが、それらに限定されない。さらに、コレステロールおよび／またはコレステロール関連分子および／またはコレステロール関連複合体を取得、精製、ならびに単離する方法は、例えば、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編、1998); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、1987); Short Protocols in Molecular Biology (WileyおよびSons, 1999)、ならびに当技術分野において周知の他の情報源において見いだされうる。
【００８６】
精製もしくは部分精製されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、化学的加水分解、熱加水分解、酸加水分解、化学誘導体化（例えば、アシル化、アセチル化）、水性・有機溶媒抽出、化学的乾燥、真空乾燥、および当技術分野において既知の他の技術を含むがそれらに限定されない技術によって、同位体含量または同位体パターンの分析のためにさらに処理されうる。精製もしくは部分精製されたコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、分析の前に他の分子とコンジュゲートされうる。例えば、コレステロールは、同位体含量または同位体パターンの分析の前に、そのトリメチルシリル誘導体に誘導体化されうる。
【００８７】
別の実施形態では、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、より小さい分子を形成するために加水分解または別の方法で分解されうる。加水分解法は、化学的加水分解（酸加水分解など）および生化学的分解を含むがそれらに限定されない、当技術分野において既知の任意の方法でありうる。加水分解または分解は、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の精製および／または単離の前後いずれかに実施されうる。
【００８８】
Ｃ．コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンの測定
その後、対象となるコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンが測定される。同位体含量または同位体パターンは、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、レーザー分光光度法、レーザー分光法、液体シンチレーション計数、または当技術分野において既知の他の方法を含むがそれらに限定されない方法によって測定されうる。同位体含量または同位体パターンは直接測定されてもよく、またはコレステロールが上述のように化学的もしくは生化学的に修飾された後に分析されてもよい。
【００８９】
コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体における同位体含量または同位体パターンは、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、同位体比質量分析、ＧＣ−同位体比燃焼ＭＳ、ＧＣ−同位体比熱分解ＭＳ、液体クロマトグラフィーＭＳ、エレクトロスプレーイオン化ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型ＭＳ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴ＭＳ、サイクロイドＭＳなどを含むがそれらに限定されない様々な質量分析法によって測定されうる。
【００９０】
質量分析計は分子を高速移動する気体イオンに変換し、それはその後、質量電荷比に基づいて分析される。従って、イオンもしくはイオン断片の同位体またはアイソトポログの分布は、複数の分子における同位体含量または同位体パターンを測定するために使用されうる。
【００９１】
通常、質量分析計はイオン化装置および質量分析器を含む。多数の異なる種類の質量分析器が当技術分野において知られている。これらは、磁場型分析器、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオントラップ、飛行時間型質量分析器、およびフーリエ変換分析器を含むが、それらに限定されない。
【００９２】
質量分析計はまた、多数の異なるイオン化方法を含みうる。これらは、電子衝撃、化学イオン化、および電場イオン化などの気相イオン化源、ならびに、電場脱離、高速原子衝撃、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、および表面増強レーザー脱離／イオン化などの脱離イオン化源を含むが、それらに限定されない。
【００９３】
加えて、最初に前駆イオンを分離し、次に気相断片イオンを分離、測定するために、２つ以上の質量分析計が連結されうる（ＭＳ／ＭＳ）。これらの機器は、分子の一連の初期イオン断片を発生させ、次に初期イオンの二次断片を発生させる。ＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンおよび質量分析によってもたらされる正確な分子質量決定は、分子の化学組成に関する固有の情報を提供する。未知の分子は、１回の質量分析の実行により数分のうちに同定され得る。現在利用可能な化学物質フラグメンテーションパターンのライブラリーは、複雑な混合物の成分をほぼ確実に同定する機会を提供する。このような技術は、対象となるコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンを、関連した生物学的サンプルのいかなる処理も必要とせずに（すなわち、直接測定で）分析するために使用されうる。
【００９４】
様々なイオン化方法もまた当技術分野において知られている。１つの重要な進歩は、大きな不揮発性の巨大分子をイオン化するための技術の開発であった。この種の技術は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含んでいる。これらは、ＭＳが液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーゾーン電気泳動などの強力なサンプル分離導入技術と組み合わせて利用されることを可能にした。
【００９５】
加えて、質量分析計は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分離手段と連結されうる。ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）では、ガスクロマトグラフィーからのキャピラリーカラムは、任意選択でジェットセパレーターを用いて、質量分析計に直接連結される。このような適用では、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムはサンプルガス混合物からサンプル成分を分離し、分離された成分は質量分析計においてイオン化され化学的に分析される。
【００９６】
加えて、同位体が放射性同位体である場合、同位体含量または同位体パターンまたは存在度は、液体シンチレーション計数、ガイガー計数、ＣＣＤによる検出、フィルムによる検出などを含むがそれらに限定されない、放射性同位体の測定のために当技術分野において既知の技術を用いて測定されうる。
【００９７】
通常、本明細書において企図される測定は、幅広い種類の機器によって実施され得る。上記の列挙は非限定的である。
【００９８】
本開示では、２つの分類の同位体標識分子が検討される。第一の分類は、被験体に投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体である。第二の分類は、対象となる分子である。対象となる分子とは、その同位体含量または同位体パターンが後に測定される分子である。対象となる分子は生物学的サンプル中に含まれる。対象となる分子はコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体でありうる。対象となる分子は被験体の代謝作用によって標識されうる。対象となる分子は、被験体に投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体と同一でありうる。要するに、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は被験体に投与され、対象となる分子の同位体含量または同位体パターンはその後に測定されるものである。
【００９９】
通常、本開示から導かれる生物学的サンプル中のコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンは、任意の同位体標識分子を投与する前の、同一分子のベースラインの同位体含量または同位体パターンと比較して表される。選択されたコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体（対象となる分子）に関するベースラインの同位体含量または同位体パターンを測定するため、サンプルは同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の投与前に採取され得、対象となる分子の同位体含量または同位体パターンはベースラインサンプルで分析され得る。このような測定は、生物体内での対象となる分子の天然の同位体含量または同位体パターンを確立する１つの方法である。多くの場合、ベースラインの同位体含量または同位体パターンは、いずれの種類の標識分子も投与されていない被験体から採取された生物学的サンプル由来の過去の（既存の）データに基づき推定され得る。これは、ある生物が類似の環境履歴を有する被験体の集団の一部である場合、特に当てはまる。さらに、このようなベースラインの同位体含量または同位体パターンは、同位体の既知の平均天然存在度を用いて推定されうる。例えば、天然では、有機炭素中に存在する１３Ｃの天然存在度は１．１１％である。このようなアイソトポマー頻度分布の予測方法は当技術分野においてよく知られており、文献に記載されている（下記参照）。
【０１００】
実際の同位体含量または同位体パターンは、上記に記載されたように得られたデータから算出されうる。これらの算出は、利用可能な過去のデータまたはベースラインデータの量、実施者の好み、目的とする測定の精度、分析に使用される機器の種類、および他の要因に応じて、様々な形式を取り得る。算出の例を下記に示す。
【０１０１】
１．相対的および絶対的な質量アイソトポマー存在度の測定
質量分析計は、サンプル中の異なる質量の分子または原子の相対量を測定する。これらの量は、時に存在度と呼ばれる。測定された質量スペクトルピークの高さ、あるいはピーク下面積は、元の（ゼロ質量アイソトープ（zero mass isotope））アイソトポマーに対する比として表されうる。本開示のためのこのようなデータの記載において、サンプル中のアイソトポマーの存在度に対する相対値および絶対値を提供する任意の算出方法を使用できることが認識される。１つの実施形態では、異なる質量アイソトポマーの相対存在度がＧＣ／ＭＳによって測定され、所定のアイソトポマーの超過モル百分率が算出される。別の実施形態では、異なる同位体の相対存在度が、ＧＣ燃焼同位体比質量分析（ＧＣＣ−ＩＲＭＳ）、またはＧＣ熱分解同位体比質量分析（ＧＣＰ−ＩＲＭＳ）によって原子レベルで測定され、所定のアイソトポマーの超過原子百分率が算出される。
【０１０２】
２．同位体含量または同位体パターンの算出
ａ．超過モル百分率（ＭＰＥ）
同位体含量または同位体パターンは、上記のＩ−Ｃ−１項に記載されるように収集された存在度データから算出されうる。１つの実施形態では、同位体含量または同位体パターンは超過モル百分率（ＭＰＥ）として表される。ＭＰＥを決定するために、実施者はまず、対象となる分子のアイソトポマーの存在度の割合を決定する（アイソトポマーは、対象となる分子の性質および被験体に投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の性質に基づいて選択される）。これは、ＧＣ／ＭＳに由来するような存在度データから、質量アイソトポマーＭｘの存在度の割合を決定するための一般的な形式である、下記の方程式を用いて算出され得る。すなわち、
【数１】
2008542688.tif 000003
【０１０３】
であり、式中、０〜ｎは、存在量が生じる、最も低い質量の（Ｍ０）質量アイソトポマーに対する見掛けの質量の範囲である。
【０１０４】
存在度の割合を決定したら、それをベースライン、過去のベースライン、理論上のベースライン、または（上述のようにして得られる）他のこのような参照値と比較することにより、ＭＰＥを決定する。これは下記の方程式を用いて算出される。すなわち、
【数２】
2008542688.tif 000004
【０１０５】
であり、式中、下付きのｅは富化（enriched）を指し、ｂはベースライン（baseline）すなわち天然の存在量を指す。
【０１０６】
ＭＰＥを決定したら、新たに合成された分子の割合または内在性分子による希釈の程度が決定され得る。両方の場合において、ＭＰＥは、最大限可能な超過モル百分率を示す値と比較される。対象となる分子が同位体標識前駆体の代謝によって生成される場合（例えば、２Ｈ４−コレステロールから２Ｈ４−コール酸の生成）、前駆体のＭＰＥが測定され、最大限可能なＭＰＥの算出に直接またはその基盤として使用されうる。最大限可能なＭＰＥはまた、過去のデータ、投与される同位体標識の量に基づく計算、被験体の性質（例えば、体重、身体組成）を考慮に入れた同様の計算、純粋に理論上の計算、ならびに他の概算、測定、および遡及的データ分析の組合せからも決定されうる。最大限可能なＭＰＥはまた、完全に標識された対象となる分子を含有することが知られている別の生物学的サンプルにおけるＭＰＥを測定することによっても決定されうる。標識の希釈の場合には、最大限可能なＭＰＥは、投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体のＭＰＥに基づく。
【０１０７】
出願者は同位体標識の取り込みおよびアイソトポマー分布の分野において十分な経験を有し、同位体含量または同位体パターンの算出および分析に関する多数の技術および算出方法を開発している。これらは質量アイソトポマー分布解析（ＭＩＤＡ）を含み、詳細には米国特許第５，３３８，６８６号、同第５，９１０，４０３号、および同第６，０１０，８４６号に広範に記載され、それらは参照により全文が本明細書に組み入れられる。ＭＩＤＡの変形形態および他の関連技術はさらに、HellersteinおよびNeese (1999)、ならびに Chinkesら(1996)、ならびにKelleherおよびMasterson (1992)、ならびに米国特許出願第１０／２７９，３９９号を含む、当業者にとって既知の多数の異なる情報源に記載され、それらすべては参照によりその全文が本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
上記の参考文献に加えて、その方法を実行する計算ソフトウェアは、University of California, BerkeleyのMarc Hellerstein教授から公的に入手可能である。
【０１０９】
ｂ．超過原子百分率（ＡＰＥ）
同位体含量または同位体パターンは、上記に記載されるように収集された存在度データから算出されうる。１つの実施形態では、同位体含量または同位体パターンは超過原子百分率（ＡＰＥ）として表される。ＡＰＥを決定するために、実施者はまず、対象となる分子中の対象となる同位体の存在度の割合を決定する（対象となる同位体は、対象となる分子の性質および被験体に投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の性質に基づいて選択される）。これは、ＧＣＣ−ＩＲ−ＭＳまたはＧＣＰ−ＩＲ−ＭＳに由来するような存在度データから、同位体Ｉｘの存在度の割合を決定するための一般的な形式である、下記の方程式を用いて算出され得る。すなわち、
【数３】
2008542688.tif 000005
【０１１０】
であり、式中、０〜ｎは、存在量が測定される選択された原子の可能性のある同位体の範囲である。
【０１１１】
存在度の割合を決定したら、それをベースライン、過去のベースライン、理論上のベースライン、または（上述のようにして得られる）他のこのような参照値と比較して、超過原子百分率（ＡＰＥ）を決定する。これは下記の方程式を用いて算出される。すなわち、
【数４】
2008542688.tif 000006
【０１１２】
であり、式中、下付きのｅは富化（enriched）を指し、ｂはベースライン（baseline）すなわち天然の存在量を指す。
【０１１３】
ＡＰＥを決定したら、新たに合成された分子の割合または内在性分子による希釈の程度が決定され得る。これは上述のように実施されるが、理論上の最大ＡＰＥの場合にはさらなる計算を必要としうる。このような計算は当業者にとって公知である。
【０１１４】
３．同位体含量または同位体パターンの種類
本開示では、同位体含量または同位体パターンはしばしば、ＭＰＥまたはＡＰＥとして表される。超過モル百分率は時にＥＭＸと書かれ、（ベースラインサンプル、過去のベースラインデータ、または予測されるベースライン値と比較した分析されている分子の考えられる質量すべてに対する）所定の質量の超過モル百分率を指す。投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体および対象となる分子の多数の組合せが、本開示において検討される。可能性のある方法の範囲の説明を目的とする非限定的な計画は下記のとおりである。
【０１１５】
計画１：１３Ｃ２−コレステロール（天然の存在分子において主要な１２Ｃ原子の代わりに２原子の１３Ｃを含有するコレステロールと定義される）を被験体に投与し、その後、血中コレステロールをＧＣ／ＭＳにより分析することによって、コレステロールの同位体含量または同位体パターンが測定されうる。このような場合、ベースラインまたは同様のデータと組み合わせて、ＥＭ２（他の天然のアイソトポログに加えて、２原子の１３Ｃで標識されたコレステロールを表す）が決定されてもよく、これは同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。あるいは、同一サンプル由来のコレステロールは、１３ＣのＡＰＥを測定するために、ガスクロマトグラフィー／熱分解／同位体比質量分析によって分析されてもよく、それもまた同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。
【０１１６】
計画２：２Ｈ４−コレステロールを被験体に投与し、その後、血中コレステロールをＧＣ／ＭＳにより分析することによって、コレステロールの同位体含量または同位体パターンが測定されうる。このような場合、ベースラインまたは同様のデータと組み合わせて、ＥＭ４（他の天然のアイソトポログに加えて、４原子の２Ｈで標識されたコレステロールを表す）が決定されてもよく、これは同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。あるいは、同一サンプル由来のコレステロールは、２ＨのＡＰＥを測定するために、ガスクロマトグラフィー／熱分解／同位体比質量分析によって分析されてもよく、それもまた同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。
【０１１７】
計画３：２Ｈ４−コレステロールを被験体に投与し、その後、血中コレステロールエステルをＧＣ／ＭＳにより分析することによって、コレステロールの同位体含量または同位体パターンが測定されうる。このような場合、ベースラインまたは同様のデータと組み合わせて、ＥＭ４（他の天然のアイソトポログに加えて、４つの２Ｈ原子で標識されたコレステロールエステルを表す）が決定されてもよく、これは同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。あるいは、同一サンプル由来のコレステロールエステルは、２ＨのＡＰＥを測定するために、ガスクロマトグラフィー／熱分解／同位体比質量分析によって分析されてもよく、それもまた同位体含量または同位体パターンの関連測定値である。
【０１１８】
Ｄ．同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の希釈速度の算出
生物学的サンプルにおいて測定される対象となるコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンは、被験体に投与された同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンと比較されうる。この比較は、標識されていない内在性の対象となる分子による希釈の算出を可能にする。希釈方程式は当技術分野において既知であり、例えば、上記のHellersteinら(1992)によって記載されている。希釈速度またはＲａはその後、ＲＣＴの流出成分に相当する、組織コレステロールの血中リポタンパク質への分子流速を決定するために使用される。
【数５】
2008542688.tif 000007
【０１１９】
１つの実施形態では、脂質エマルジョンに懸濁された安定同位体標識コレステロールを、血漿コレステロール富化の定常状態レベルに達するのに十分な時間注入する。注入の間、血漿サンプルを定期的に採取し、血漿サンプル中のコレステロールの同位体含量または同位体パターンを上述のように測定する。同位体含量または同位体パターンの経時的な変化は、同位体含量または同位体パターンの定常状態レベルならびに血漿コレステロールの半減期を決定するために使用される。この場合、血漿コレステロールの希釈速度は、上記の方程式を用いて直接決定されうる。希釈速度はコレステロール流出速度と同一であり、研究中の被験体におけるＲＣＴの流出（Ｒａ）成分の速度を表す。
【０１２０】
本開示の他の実施形態、特に、対象となるコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の定常状態富化が達成されない実施形態では、ＲＣＴの流出成分の算出はより複雑である。しかし、血漿中の標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の出現が数学的に（時間の関数としての注入に由来する血清中での量で）記述され得る限り、ＲＣＴの流出成分は本開示の方法を用いて、当技術分野においてよく知られている方程式および数学的手法の使用によって測定され得る。
【０１２１】
Ｅ．体内の代謝回転の速いコレステロールプールのプールサイズの算出
代謝回転の速いプールサイズは、本明細書に記載される方法によって、流出モデルから導かれる方程式を用いて算出され得る。すなわち、
【数６】
2008542688.tif 000008
【０１２２】
ＩＩ．被験体におけるＲＣＴの肝臓成分または排出成分の分子流速の測定
別の態様では、本開示はＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定を対象とする。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分では、コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、胆汁酸に変換されその後腸管内腔に分泌される、または直接中性ステロールとして分泌される（胆汁中性ステロールは胆汁コレステロールを含む）。排泄物中の胆汁酸もしくは中性ステロール、または両方に対するＲＣＴの寄与が測定されうる。
【０１２３】
Ａ．１種以上の同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の投与
安定同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、上述のように投与される。任意の投与方法、投与経路、または任意の量の安定同位体標識が、上述のように使用され得る。
【０１２４】
Ｂ．１つ以上の生物学的サンプルの取得
同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の投与後または投与と投与の間に、生物学的サンプルが取得される。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分を測定する場合、サンプルは好ましくは糞便胆汁酸および糞便中性ステロールを含有する。生物学的サンプルの数、それらの頻度、およびそれらの時期は様々な要因によって変更しうる。このような要因は、生物学的サンプルの性質、サンプリングの容易さおよび安全性、対象となるコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の生物学的速度定数または代謝挙動、ならびに被験体に施行される候補治療法の性質を含むが、それらに限定されない。サンプルは１つだけでもよい。それは同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の投与の間に採取されてもよく、または投与後に採取されてもよい。投与後に採取される場合、サンプルは投与後直ちに採取されてもよく、または投与後サンプリングの前に一定期間が経っていてもよい。１つの実施形態では、糞便、尿、および血液を含む、複数の生物学的サンプルが被験体から採取されうる。別の実施形態では、血液の単一の生物学的サンプルが取得されうる。生物学的サンプルは、上述のように広範に処理されうる。１つの実施形態では、胆汁酸および胆汁中性ステロールは生物学的サンプルから単離され、質量分析のために誘導体化されうる。
【０１２５】
Ｃ．胆汁酸および中性ステロールの同位体含量または同位体パターンの測定
胆汁酸および中性ステロールの同位体含量または同位体パターンが測定され、胆汁酸および中性ステロールのＡＰＥまたはＭＰＥを決定するために、投与前の胆汁酸もしくは中性ステロールの同位体含量または同位体パターンと比較されうる。このＡＰＥまたはＭＰＥはその後、胆汁酸もしくは中性ステロールに対する最大限可能なＡＰＥまたはＭＰＥと比較される（この最大値は、被験体において適切な期間後、胆汁酸もしくは中性ステロールに変換されている同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンを測定することによって決定されうる）。それはまた、過去のデータから算出されてもよく、または文献に由来してもよい。対象となる胆汁酸もしくは中性ステロールに対して観察されたＡＰＥまたはＭＰＥを、同一の胆汁酸もしくは胆汁中性ステロールの最大限可能なＡＰＥまたはＭＰＥで割ると、ＲＣＴに由来する胆汁酸または胆汁中性ステロールの割合を生じる。同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子の中性ステロールへの輸送または変換もまた算出される。このように、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分（図１）が測定され得る。
【０１２６】
さらに、生物学的サンプルが糞便である場合、コレステロール自体の同位体含量または同位体パターンが測定されうる。
【０１２７】
糞便コレステロールは、ＲＣＴによって体から除去されるコレステロールの重要な部分に相当する。上述のように、糞便コレステロールの同位体含量または同位体パターンは、生物学的サンプルが糞便である場合に測定され得る。一旦分泌されると、腸管腔のコレステロールの一部は消化管から再吸収され、循環コレステロールの血漿プールに再度加わる。腸内コレステロールと血漿中の循環コレステロールとの混合は、排出コレステロールの同位体含量または同位体パターンが糞便以外のいずれの生物学的サンプルにおいても正確に直接測定できないことを意味する。この制限を克服するために、代わりに、腸に特異的なコレステロールの代謝産物の同位体含量または同位体パターンが非糞便生物学的サンプルから測定され得る。胆汁コレステロールは、消化管微生物によって、コプロスタノール、コプロスタノン、コレスタノール、コレスタノンおよびエピコプロスタノールを含む多数の代謝産物に変換される。これらのコレステロール代謝産物もまた再吸収され、全身に分布し、血液や尿を含むがそれらに限定されない他の組織および体液に向かう。１つの実施形態では、これらのコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンは尿において測定される。別の実施形態では、これらのコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンは血液において測定される。このようなコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンは、胆汁コレステロールにおいて見いだされるものと同一であり、このような測定は、糞便中の胆汁コレステロールの同位体含量または同位体パターンの直接測定に代わり得る。別の実施形態では、腸に特異的なコレステロール代謝産物および胆汁酸の同位体含量または同位体パターンの両方が、単一の尿サンプルから測定される。
【０１２８】
同位体含量または同位体パターン、合成速度または変換速度、およびＭＰＥまたはＡＰＥ値は、上述のように決定される。
【０１２９】
Ｄ．胆汁酸プールサイズの測定
総胆汁酸量（胆汁酸プールサイズ）は、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定と同時、測定前または測定後に測定されうる。これは、実施者が異なる胆汁酸プールサイズを有する異なる被験体間で結果を比較することを可能にする目的を果たし、胆汁酸に変換された対象となる同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子の絶対質量の決定を可能にする。この絶対質量は、投与された同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子に由来する胆汁酸の割合（上述のように決定される）に胆汁酸プールサイズを乗じた積である。
【０１３０】
胆汁酸プールサイズは、例えば希釈法によって測定され、そこでは、既知量の同位体標識胆汁酸が被験体に投与され、一定期間後、被験体における胆汁酸の同位体含量または同位体パターンが単一のサンプルまたは複数のサンプルから測定される。同位体標識胆汁酸の希釈量（すなわち、問題となっている胆汁酸に対するＡＰＥもしくはＭＰＥの減少）またはＡＰＥもしくはＭＰＥの減少速度を示す曲線からの逆外挿（back-extrapolation）は、被験体における胆汁酸の全質量を算出するために用いられる。
【０１３１】
１．同位体標識胆汁酸の投与
１種以上の同位体標識胆汁酸が被験体に投与されうる。胆汁酸プールサイズの測定をＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定と同時に行う場合、同位体標識胆汁酸は、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体とは異なる形で標識される。例えば、胆汁酸は４つの重水素（２Ｈ）原子で標識され、コレステロールは２つの１３Ｃ原子で標識される。胆汁酸およびコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が異なる同位体で標識される限り、任意の数の同位体が使用されうる。あるいは、胆汁酸は同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体と同一の同位体で標識され得るが、コレステロールまたはコレステロール前駆体の投与に使用される方法と識別可能な方法で投与される（例えば、異なる時間、パルス、停止対連続、および当業者にとって周知の他の識別可能な特性）。
【０１３２】
適切な同位体標識胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびリトコール酸を含む。１つの実施形態では、標識胆汁酸はコール酸またはケノデオキシコール酸でありうる。胆汁酸の標識に使用されうる同位体は、２Ｈ、１３Ｃ、または１８Ｏを含むが、それらに限定されない。
【０１３３】
同位体標識胆汁酸は、同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体と同時に、またはそれとは別に投与されうる。同位体標識胆汁酸は、適切な担体中、既定の容量および同位体含量または同位体パターンで投与される。適切な担体は、食塩溶液、トリグリセリドエマルジョンおよびイントラリピド（intralipid）を含む。標識胆汁酸の被験体への投与は、上述のようなあらゆる経路によって行われうる。１つの実施形態では、胆汁酸は経口投与される。
【０１３４】
２．生物学的サンプルの取得
一定期間後、胆汁酸を含有する生物学的サンプルが取得される。同位体標識胆汁酸の投与と生物学的サンプルの採取との間の期間は、投与経路および投与方法、被験体の性質（例えば、被験体の動物種または病状）、同位体標識胆汁酸の選択、ならびに当業者にとって既知の他の要因に応じて変更しうる。生物学的サンプルは、血液、糞便、尿、または任意の他の種類の生物学的サンプルでありうる。生物学的サンプルは、他の同位体含量または同位体パターンの測定のため、例えばＲＣＴの肝臓成分もしくは排出成分の測定（上記のＩＩ−Ｂ項参照）などのために採取されたものと同一のサンプルであってもよい。
【０１３５】
採取されたら、サンプルは処理または部分的に処理されてもよく、胆汁酸は上述のように精製、単離、または部分精製されうる。一般的に、このような操作は当技術分野において知られている。
【０１３６】
３．胆汁酸の同位体含量または同位体パターンの測定
生物学的サンプル中の胆汁酸の同位体含量または同位体パターンは、上述のように測定され、算出される。対象となる胆汁酸は、被験体に投与される同位体標識胆汁酸の性質に基づいて決定される。例えば、被験体が既知量および既知濃度の２Ｈ４−コール酸を投与される場合、対象となる適切な胆汁酸はコール酸であり、Ｍ４アイソトポマーのＭＰＥが決定される。あるいは、２ＨのＡＰＥが決定されてもよい。
【０１３７】
４．胆汁酸プールサイズの算出
被験体における胆汁酸のプールサイズは、下記の方程式を用いて決定されうる。すなわち、
【数７】
2008542688.tif 000009
【０１３８】
であり、式中、質量（ｇ）ａｄｍは被験体に投与された同位体標識胆汁酸のグラム表示での質量であり、ＭＰＥａｄｍは投与された安定同位体標識胆汁酸の超過モル百分率であり、ＭＰＥｓａｍｐｌｅは生物学的サンプル中の同一の胆汁酸アイソトポマーのピークまたは最大の超過モル百分率である。
【０１３９】
この方程式の代替形式は、
【数８】
2008542688.tif 000010
【０１４０】
であり、式中、質量（ｇ）ａｄｍは被験体に投与された同位体標識胆汁酸のグラム表示での質量であり、ＡＰＥａｄｍは投与された同位体標識胆汁酸中の同位体標識胆汁酸を標識するために使用された同位体の超過原子百分率であり、ＡＰＥｓａｍｐｌｅは生物学的サンプル中の同一の胆汁酸内の同一の同位体のピークまたは最大の超過原子百分率である。
【０１４１】
あるいは、血流中の同位体標識胆汁酸の同位体富化のピークは、当技術分野において周知の方法によって、標識減衰曲線の形から推定され得る。体内の胆汁酸のプールサイズはその後、希釈法によって算出され得る。
【０１４２】
Ｅ．胆汁酸、中性ステロールおよびコレステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与の測定
任意選択で、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定と同時に、胆汁酸、中性ステロールおよびコレステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールの寄与が測定されうる。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の一部では、コレステロールおよび／またはコレステロール関連分子および／またはコレステロール関連複合体は、胆汁酸に変換され、または中性ステロールとして分泌され、その過程の測定は上記のＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｃ項に記載される。しかし、いくらかの胆汁酸および中性ステロールは、他の組織から除去された既存のコレステロールに由来するのではなく、むしろＲＣＴの測定期間に肝臓または他の組織においてｄｅ  ｎｏｖｏ合成されたコレステロールに由来する。ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成はまた、本明細書に記載されるような同位体に基づく方法によって測定され得る過程である。ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の測定およびその胆汁酸に対する寄与の測定は、候補治療法が疾患に影響を及ぼす方法の理解に関連し、個体におけるＲＣＴ流に関して補足的または補助的な情報を提供しうる。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分および胆汁酸もしくは中性ステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与の被験体での同時測定は、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定を改善する。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分に由来する胆汁酸および中性ステロールは、上記のＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｃ項に記載されたように測定される。ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成に由来する胆汁酸は、下記に記載されるように測定される。残りの胆汁酸は、既存の、すなわち実験の開始時に既に存在している胆汁酸に由来する。
【０１４３】
ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の測定およびその胆汁酸、中性ステロールまたはコレステロールに対する寄与の測定は、１種以上の同位体標識コレステロール前駆体の投与によって測定される。１種以上の同位体標識コレステロール前駆体の投与間もしくは投与後の、一定期間後、胆汁酸、中性ステロールまたはコレステロールを含有する１つ以上の生物学的サンプルが採取される。これらのサンプル中の胆汁酸、コレステロール、中性ステロール、もしくはコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンは上述のように測定され、結果として生じるデータは新たに合成されたコレステロールに由来する胆汁酸の割合または質量を算出するために使用される。
【０１４４】
１．同位体標識コレステロール前駆体の投与
１種以上の同位体標識コレステロール前駆体の投与方法は、同位体標識コレステロール前駆体の吸収特性およびそれが標的とする特定の生合成プールにより異なりうる。前駆体は、上記において以前に企図された任意の経路を介して、または当技術分野において既知の他の経路によって投与されうる。
【０１４５】
１つの実施形態では、投与方法は、生合成プール内および／または少なくとも一時的な期間このようなプールを供給する貯蔵部に、定常状態レベルの前駆体を生じるものである。血管内投与または経口投与経路は、このような前駆体を被験体に投与するために一般的に使用される。任意で徐放性基質組成物とともに使用される場合、皮下投与または筋肉内投与などの他の投与経路もまた適切である。注射用組成物は通常、滅菌した医薬品賦形剤で調製され、それらは当業者によく知られている。
【０１４６】
本明細書において議論されるように、投与は連続的に（例えばサンプリング時までおよび／もしくはそれを含んで）または不連続的に（長期間の単回投与もしくは反復投与のいずれかとして）行われ得る。不連続投与が行われる場合、個々の投与時間は同一であり得、または異なり得る。
【０１４７】
同位体標識前駆体の例は、米国特許出願第１１／０６４１９７号（参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）、特に「precursor molecules (isotope-labeled substrates)」と題されたＩＶ−Ｂ−１−ａ−２項、および「Method for measuring in vivo synthesis of biopolymers」と題された米国特許第５，３３８，６８６号（参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）において詳細に議論される。同位体標識コレステロール前駆体は、被験体に投与された場合、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールへの同位体の取り込みをもたらす安定同位体標識分子でありうる。同位体標識コレステロール前駆体は、同位体標識前駆体に由来するコレステロール、中性ステロールまたは胆汁酸分子が、ＲＣＴの肝臓成分もしくは排出成分の測定（上記のＩＩ−Ａ〜ＩＩ−Ｃ項）のために投与された同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体に由来するものとは同位体的に異なり、また胆汁酸プールサイズの測定（上記のＩＩ−Ｄ項）のために投与された同位体標識胆汁酸とも同位体的に異なるように選択される。あるいは、同様の識別が行われることを可能にするために、同位体標識コレステロール前駆体の投与の時期および投与経路は変更されうる。１つの実施形態では、同位体標識コレステロール前駆体は重水素標識水（２Ｈ２Ｏ）である。別の実施形態では、同位体標識コレステロール前駆体はＨ２１８Ｏである。
【０１４８】
２．１つ以上の生物学的サンプルの取得
一定期間後、胆汁酸、胆汁中性ステロールまたはコレステロールを含有する１つ以上の生物学的サンプルが取得されうる。同位体標識コレステロール前駆体の投与と生物学的サンプルの採取との間の期間は、投与経路および投与方法、被験体の性質、同位体標識コレステロール前駆体の選択、ならびに当業者にとって既知の他の要因に応じて変更しうる。１つ以上の生物学的サンプルは、血液、糞便、尿、または任意の他の種類のサンプルでありうる。１つ以上の生物学的サンプルは、ＲＣＴの肝臓成分もしくは排出成分の測定（上記のＩＩ−Ｂ項参照）のため、または胆汁酸プールサイズの測定（上記のＩＩ−Ｄ項参照）のためなどの、他の同位体含量あるいは同位体パターンの測定のために採取されたものと同一のサンプルでありうる。
【０１４９】
採取されたら、サンプルは処理または部分的に処理されてもよく、胆汁酸は上述のように精製、単離、または部分精製されうる。一般的に、このような操作は当技術分野において知られている。
【０１５０】
３．胆汁酸もしくは中性ステロールの同位体含量または同位体パターンの測定
対象となる分子（胆汁酸もしくはコレステロールもしくは他のコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体）の同位体含量または同位体パターンは、上述のように測定され、算出される。胆汁酸に対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与は、胆汁酸の同位体含量または同位体パターンの測定によって測定される。中性ステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与は、中性ステロールの同位体含量または同位体パターンの測定によって測定される。１つの実施形態では、両方が測定される。
【０１５１】
本開示の１つの態様では、胆汁酸および腸管微生物の胆汁コレステロールに対する作用に由来するコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンが、尿および血液において測定される。上述のように、非糞便生物学的サンプル中のコレステロールは、糞便コレステロールの同位体含量を測定するために直接分析されることはできない。しかし、遊離コレステロールは、消化管微生物によってコプロスタノール、コプロスタノン、コレスタノール、コレスタノンおよびエピコプロスタノールを含む多数の代謝産物に変換される。これらもまた再吸収され、他の組織および血液または尿を含む体液中に出現する。これらの代謝産物は腸コレステロールからしか生じないため、腸コレステロールを反映する同位体含量または同位体パターンを有する。従って、尿中のこれらのコレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンの測定は、胆汁コレステロールもしくは他の中性ステロールの同位体含量または同位体パターンの測定方法に相当する。
【０１５２】
４．胆汁酸および中性ステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の寄与の算出
胆汁酸もしくは中性ステロールもしくは胆汁コレステロール代謝産物の同位体含量または同位体パターンを、測定されたもしくは既知の同位体標識コレステロール前駆体の濃度と比較することにより、新たに合成された中性ステロールの割合、または新たに合成されたコレステロールに由来する胆汁酸の割合を決定しうる。割合の算出は、上述のように、または米国特許出願第１１／０６４１９７号（参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）および「Method for measuring in vivo synthesis of biopolymers」と題された米国特許第５，３３８，６８６号（参照によりその全文が本明細書に組み入れられる）に既述されたように行われる。このような計算はまた、当業者にとって既知の多数の出版物に広く記載されている。
【０１５３】
Ｆ．ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の活性の算出
ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の活性（すなわち、コレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体を含む投与されたコレステロール、または血中コレステロールの、対象となる排出ステロール生成物への変換速度または分泌速度；分泌される、コレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体を含むコレステロール、または血中コレステロールの質量；あるいはＲＣＴに由来する胆汁酸および／または中性ステロールの割合）は、単離された胆汁酸もしくは中性ステロールの同位体含量または同位体パターンを用いて算出されうる。胆汁酸の同位体含量または同位体パターンは、被験体に投与された同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の総量と比較されうる（すなわち、投与された標識の対象となる生成物中への同位体回収）。胆汁酸プールサイズのデータが利用できる場合、投与された標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の胆汁酸中への回収は、胆汁酸プールの質量を乗じて、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分により輸送された質量を与える。利用可能な場合には、異なる標識コレステロール前駆体に由来する胆汁酸の同位体含量または同位体パターンは、同様の方法で、胆汁酸合成に対するｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロール（ＤＮＣ）の寄与を算出するために使用され得る。ＲＣＴおよびＤＮＣからの糞便中性ステロールに対する寄与は、同様に算出される。
【０１５４】
ＩＩＩ．ＲＣＴの血漿成分の測定
ＲＣＴの血漿成分は様々な代謝および輸送ステップを含む（図３）。ＲＣＴの血漿成分の測定は、同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の投与、およびそれに続く異なるコレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体の同位体含量または同位体パターンの測定によって行われる。この「異なる」コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は、投与された分子のｉｎ  ｖｉｖｏ変換産物である；すなわち、それはｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。このようにしてＲＣＴの特定の成分の活性または速度が測定され得る。例えば、コレステロールのコレステロールエステルへの変換（ＬＣＡＴ活性、図３）は、同位体標識コレステロールの投与、およびコレステロールエステルの同位体含量または同位体パターンの測定によって測定され得る。同様にコレステロールエステルのＨＤＬからＬＤＬまたはＶＬＤＬへの輸送（ＣＥＴＰ活性、図３）は、ＨＤＬと複合した同位体標識コレステロールエステルの投与、およびＬＤＬもしくはＶＬＤＬ中のコレステロールエステルの同位体含量または同位体パターンの測定によって測定され得る。血漿ＲＣＴの複数のステップの合計は、例えば、ＨＤＬと複合した同位体標識コレステロールの投与、およびその後のＬＤＬもしくはＶＬＤＬ由来のコレステロールエステルの同位体含量または同位体パターンの測定によって測定され得る（すなわち、ＬＣＡＴ活性およびＣＥＴＰ活性の合計の同時測定）。
【０１５５】
ＲＣＴの血漿成分では、様々な種類のコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体が、異なる種類のコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体に変換される。ＲＣＴの血漿成分を測定するために、ある種類が投与され、別の種類（対象となる分子）が測定される。
【０１５６】
１．同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の投与
同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体は上述のように投与される。任意の投与方法、投与経路、または任意の同位体標識の量が、上述のように使用されうる。１つの実施形態では、投与経路は静脈内である。標識分子または複合体の選択は、ＲＣＴの血漿成分のどの部分を測定したいかによって行われる。
【０１５７】
２．１つ以上の生物学的サンプルの取得
一定期間後、生物学的サンプルが取得される。取得される生物学的サンプルの性質および時期は、ＲＣＴの血漿成分のどの部分を測定しているかによって決定される。好ましい実施形態では、生物学的サンプルは血液サンプルである。複数の生物学的サンプルが取得されうる。
【０１５８】
３．対象となる分子の同位体含量または同位体パターンの測定
同位体含量または同位体パターンは、上述のように対象となる分子について測定される。対象となる分子は投与された同位体標識分子または複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ変換産物である。
【０１５９】
４．ＲＣＴの血漿成分の速度の算出
標準的な前駆体−生成物の関係は、投与される同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体と下流の対象となる分子との間にも存在しうる。このような関係は当技術分野においてよく知られている。前駆体プール同位体含量または同位体パターンは、投与された標識の量に基づいて推定されるか、または過去のデータもしくは他のデータの使用によって決定されるかのいずれかであり、あるいはそれは直接測定される。投与された同位体標識コレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体の、対象となるコレステロールまたはコレステロール関連分子またはコレステロール関連複合体に対する寄与率は、上述のように決定される。
【０１６０】
ＩＶ．要約：
Ａ．希釈法およびプラトーの原則の使用による、組織から血液へのコレステロール流出／動員速度の算出
注入されたトレーサーの希釈は、その中に注入される（またはそれと迅速に連絡している）プールの出現（Ｒａ、流出、代謝回転）速度を示し、同位体プラトーが実現され実証され得る場合、確実に行われる。代謝研究では、この多数の一般的な例が存在する（例えば、Ｒａグルコース、ＦＡ、グリセロール、アミノ酸）。しかし、このアプローチは、いくつかの理由から以前にはコレステロールに対して使用されたことがなかった。第一に、複雑な調節性のコレステロール流出系（輸送体、血漿アクセプター、ドッキングタンパク質など）の発見以前には、Ｒａコレステロールを測定する生理学的な論理的根拠がなかった。第二に、コレステロールは生理食塩水に難溶性であるため、持続注入によって投与することが容易ではない。さらに、血漿コレステロール特異的活性または富化においてプラトーに達するために必要とされる時間もまた不明であり、数日または数週間かかるかもしれないと思われていた。
【０１６１】
重要な発見は、ヒトおよび実験動物における血漿コレステロール富化におけるプラトーの観察であった。プラトーの達成（下記および図５参照）は、機能的に分離した、測定可能な代謝回転の速いプールの存在を支持し、末梢組織から血液と連絡しているこの代謝回転の速いプール（図４）へのコレステロールのＲａまたは流出／動員速度の算出を可能にする。これは方法論上主要な発見である。
【０１６２】
別の重要な発見は、流出／動員（Ｒａ）および排出効率を測定するために、標識コレステロールはＨＤＬ複合体または他のリポタンパク質関連粒子の形で投与される必要はなく、遊離コレステロールの形で投与され得ることである（下記および図５参照）。
【０１６３】
流出速度（Ｒａ）は、１時間当たりに、大きな細胞内貯蔵プールから代謝回転の速いプールに入る分子数、すなわち貯蔵プールに出入りする動員された遊離コレステロール（「フラッシュ速度（flush-rate）」）を表す。これは、それ自体で重要な新しいＲＣＴの測定基準であり（図１および３〜７）、末梢組織全体にわたる流入／流出への糞便ステロール中への標識回収の修正をも可能にする（下記参照）。
【０１６４】
そのデータはまた、コレステロールを用いた組織の食餌負荷による調節を実証する（図７）。Ｒａおよびプールサイズはともに、ヒトにおいて妥当ではあるが過度ではない個人差を示し（例えば、多くの調節性生理的パラメータと一致する、約２０％の標準偏差（図６Ａ））、それが改変可能なパラメータであることを示唆する。また、プールサイズ（Ｒａ／ｋとして算出され得る）も約５〜１０ｇであり、Schwartzのデータ（６ｇ（Schwartzら、J Clin Invest））と一致する。
【０１６５】
Ｂ．末梢組織を超える流入／流出に対する糞便ステロール中への標識コレステロール排出効率の補正
投与された血漿コレステロールの糞便中への標識回収は、排出効率および血漿コレステロールから糞便ステロール中への流速を示す（ＲＣＴの部分２、図１参照）。しかし、この測定は、血漿コレステロール代謝回転（組織からおよび組織への流出／流入）の変化によって混乱させられる可能性がある。投与された標識が個体において代謝回転の遅い組織プールに迅速に出入りして交換される場合（すなわち、流出／流入速度が大きい場合）、例えば、血漿中の標識は組織中に失われ、非標識コレステロールに置換されるため、糞便ステロール中に回収されないであろう（図９Ａ）。これは小さい回収速度として解釈されるであろう。しかし、この状況は、実際には抗アテローム硬化リスクに関して良いこと（組織からのより高いコレステロール動員速度またはフラッシュ速度（flush-rate））であるかもしれず、個体における包括的ＲＣＴ過程の効率に対して不利に作用しないはずである。従って、標識された血漿コレステロール排出の任意の機能的指標は、好ましくは組織全体にわたる流出／流入へと修正すべきである（図９Ｂ）。これらの考慮はまた、コレステロール標識を細胞中に投与する方法（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで標識されたマクロファージ）にも当てはまる。
【０１６６】
Ｃ．「包括的ＲＣＴ」パラメータの算出
本明細書において開示されるように、流出／動員速度を糞便ステロール中への標識回収効率と組み合わせることによって、「包括的ＲＣＴ」パラメータが測定され得る（図９Ｂ〜Ｃ、図１０〜１３）。この包括的ＲＣＴ測定基準は、ヒト被験体を含む生体において組織から糞便までのコレステロール流の総合的な測定を提供する。
【０１６７】
包括的ＲＣＴ流は、最終的に糞便ステロールとして排出される組織からのコレステロール流出を表す。これは、糞便ステロールとして回収される血漿コレステロール分子の割合を乗じた、１日当たりに血漿プールに入るコレステロール分子数として直感的に理解され得る。この測定基準が組織から血流を介して体外へのコレステロール流速−包括的ＲＣＴの定義を表すことは、当業者に理解され得る。
【０１６８】
加えて、このパラメータは、生物全身での包括的ＲＣＴ流に対する潜在的な治療薬の効果を解析するために広く使用された（下記の実施例参照）。
【０１６９】
Ｄ．ＲＣＴを増加させる治療薬の作用部位を分析するための、包括的ＲＣＴパラメータのＲＣＴの２つの部分への分割
本明細書において開示されるように、ＲＣＴを増加させる治療薬の作用部位を分析するために、包括的ＲＣＴパラメータを２つの成分（流出／動員および排出、図９Ｃおよび図１０〜１３）に分割することが有用であることも発見された。薬物または症状によってＲＣＴのどちらの特徴が変化するかを知ることは、創薬または被験体研究において非常に有用であり得る。この実施例が提供される（図１０〜１３および下記参照）。
【０１７０】
ＩＶ．さらなる実施形態
本明細書に記載される方法は、実施者の好みに応じて様々な方法で実施されうる。これらの実施形態の一部は下記において議論されるが、それらは限定することを意図しない。
【０１７１】
Ａ．ＲＣＴの流出成分の測定
本発明の１つの実施形態では、ＲＣＴの流出成分は、ヒトもしくは実験動物モデルにおいて脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールの定速での静脈内注入によって測定され、血中総コレステロールの同位体含量または同位体パターンは、同位体プラトーを解析する必要に応じて、または簡易には約１２〜１８時間、約１〜２時間毎に測定される。血中総コレステロールまたは血漿遊離コレステロールまたはリポタンパク質結合タンパク質が精製され、同位体含量または同位体パターンがＧＣ／Ｃ−ＩＲ／ＭＳもしくは他の当技術分野において既知の方法によって測定され、その後１３Ｃの超過原子百分率として表される。流出速度はその後上述のように算出される。
【０１７２】
本明細書において開示されるように、いくつかの重要な発見が、ヒトを含む生体の細胞からのコレステロール流出速度の測定を可能にする。すなわち、（１）希釈法による流量の測定は、「プラトーの原則」が利用できる場合に最適に行われる。この原則は、基本的には、トレーサーの持続注入の間の同位体プラトー到達は、単に到達した同位体富化または比放射能から内在性プールの代謝回転（出現速度、流量）の算出を可能にするということを述べる。血漿コレステロールが、このアプローチによる流量の算出を可能にするために妥当な期間にわたって同位体プラトーを実現するかどうかは、以前には知られていなかった。本明細書において開示されるように、この状況はヒトと動物被験体との両方において実際に当てはまる（図５および下記参照）。（２）血漿コレステロールプールの流出速度または出現速度は、流量およびプールサイズに関する今までの間接的な発見と一致する範囲内（ヒトでは約１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ、図６Ａ）であることが発見された。また（３）流出速度は、予期されるように組織コレステロール負荷によって影響を受ける（図７および下記参照）。
【０１７３】
本発明の別の実施形態では、血漿リポタンパク質の特定のサブクラス（例えば、小型もしくは大型ＨＤＬ粒子）中へのＲＣＴの流出成分が、ヒトまたは実験動物モデルにおいて脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールの定速での静脈内注入によって測定される。対象となる血漿リポタンパク質粒子中のコレステロールの同位体含量または同位体パターンは、約１２〜１８時間、約１〜２時間毎に測定される。遊離コレステロールが精製され、同位体含量または同位体パターンがＧＣＣ−ＩＲ−ＭＳもしくは他の当技術分野において既知の方法によって測定され、その後１３Ｃの超過原子百分率として表される。血漿リポタンパク質の特定のサブクラス中への流出速度は、その後上述のように算出される。
【０１７４】
Ｂ．ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定
本発明の別の実施形態では、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分は、ヒトにおいて脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールを静脈内経路で投与することによって測定される。尿または糞便の生物学的サンプルは、ボーラス投与の前、およびその後２８日までの期間毎日採取される。コール酸およびデオキシコール酸、ならびに中性ステロールが尿または糞便サンプルから精製され、その後ＧＣＣ−ＩＲＭＳまたは同位体含量もしくは同位体パターンを検出するための他の当技術分野において既知の方法によって分析される（図８Ａ）。同位体含量または同位体パターンは１３Ｃの超過原子百分率（ＡＰＥ）として表される。１３Ｃ２標識コレステロールの投与前に測定されるコール酸の同位体含量または同位体パターンはベースライン値として用いられ、最大限可能なＡＰＥは被験体に投与される１３Ｃ２標識コレステロールの量ならびに被験体の体重および身体組成に基づいて推定される。胆汁酸として回収される投与された１３Ｃ２標識コレステロールの割合、投与された１３Ｃ２標識コレステロールの胆汁酸または中性ステロールへの総変換速度、および血漿コレステロールに由来する胆汁酸の割合はその後、上述のように算出される（図８Ｂ）。
【０１７５】
Ｃ．胆汁酸プールサイズの測定を含むＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定
本発明のさらに別の実施形態では、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分は、例えばヒトにおいて脂質エマルジョン中の１３Ｃ２標識コレステロールの静脈内ボーラスを投与することによって測定される。加えて、既知量の２Ｈ４−コール酸が経口投与される。尿の生物学的サンプルは、ボーラス投与の前、およびその後２８日までの期間毎日採取される。血液の生物学的サンプルは、標識投与前（０日目）および標識投与後２、４、７、１４日目に採取される。コール酸は標識投与後０〜４８時間の間に採取された血液サンプルから精製され、コール酸の２Ｈ同位体含量または同位体パターンはＧＣ／ＭＳもしくは他の当技術分野において既知の方法によって測定され、Ｍ４イオンの超過モル百分率として表される。コレステロールはすべての血液サンプルから精製され、１３Ｃ同位体含量または同位体パターンはＧＣＣ−ＩＲＭＳもしくは他の当技術分野において既知の方法によって測定され、１３ＣのＡＰＥとして表される。コール酸は尿から精製され、１３Ｃ同位体含量または同位体パターンはＧＣＣ−ＩＲＭＳもしくは他の当技術分野において既知の方法によって測定され、１３ＣのＡＰＥとして表される。血中コール酸の２Ｈ同位体含量または同位体パターンは、胆汁酸プールサイズを算出するために用いられる。胆汁酸として回収される投与された１３Ｃ２標識コレステロールの割合、投与された１３Ｃ２標識コレステロールの胆汁酸への総変換速度、および血漿コレステロールに由来する胆汁酸の割合は、ベースライン値として用いられる０日目の尿中コール酸の１３Ｃ同位体含量または同位体パターン、および尿中コール酸について最大限可能な１３ＣのＡＰＥを決定するために用いられる血中コレステロールの１３Ｃ同位体含量または同位体パターンとともに、尿中コール酸の１３Ｃ同位体含量または同位体パターンを用いて決定される。これらの値はその後、質量排出速度（これは当技術分野において既知の簡単な方法によって直接測定される）と組み合わされることにより、実験期間中の胆汁酸および胆汁ステロールへの血中コレステロール変換速度または輸送速度が算出される。これは下記の単位を有する質量変換速度（流量）として表されうる。
【数９】
2008542688.tif 000011
【０１７６】
この量はＲＣＴの肝臓成分または排出成分を介した流量を表す。
【０１７７】
Ｄ．胆汁酸プールサイズの測定ならびにｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成およびその胆汁酸への寄与の定量を含むＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定
さらに別の実施形態では、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分は、上記のＩＶ−Ｃ項に記載されるように測定される。加えて、好ましい実施形態では、被験体は約７０％の重水の複数回経口投与を受ける。１３ＣのＡＰＥおよびＭ１のＭＰＥは、尿中コール酸に対して測定される。１３ＣのＡＰＥおよびＭ１のＭＰＥは、尿中胆汁中性ステロール代謝産物に対して測定される。血液中の重水の濃度もまた血液サンプルから測定されうる。胆汁酸および中性ステロールに対するｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールの寄与はその後、Ｍ１  ＭＰＥ、０日目のＭ１  ＭＰＥ（ベースラインとして）、および血液中の重水（同位体標識コレステロール前駆体）の濃度に基づいて算出される最大限可能なＭ１  ＭＰＥを用いて決定される。これらの算出は上述のように行われる。
【０１７８】
この実験に由来するデータは、ＲＣＴの肝臓成分もしくは排出成分に由来する胆汁酸および中性ステロールの質量または割合、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来する胆汁酸および中性ステロールの質量または割合、ならびに、研究の開始前に被験体に存在していた、もしくは研究の開始前に被験体に存在する胆汁酸および中性ステロールに由来する胆汁酸および中性ステロールの質量または割合を算出するために使用され得る。
【０１７９】
この実験に由来するデータはまた、組織から出るすべてのコレステロールは組織中でのコレステロールのｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって定常状態で平衡が保たれなければならないという原則に基づき、組織からのＲＣＴ速度の補足的な証拠としても使用され得る。従って、末梢組織からのコレステロールの流出および／または体からのコレステロールの排出の証拠は、コレステロールのｄｅ  ｎｏｖｏ合成速度の増加をもたらすと期待されうる（図１４）。
【０１８０】
（当技術分野において既知の技術を用いて）排出速度が決定された場合、その後、ＲＣＴまたはＤＮＣのいずれかに由来する胆汁酸および中性ステロールの排出速度が同様に算出され得る。
【０１８１】
Ｅ．ＲＣＴの流出成分および肝臓成分または排出成分の同時測定
さらに別の実施形態では、ＲＣＴの流出成分および肝臓成分または排出成分は同時に測定される。この場合には、被験体に投与される１３Ｃ２標識コレステロールは、１２〜１８時間の持続静脈内注入として投与される。血液サンプルは、ＲＣＴの流出成分を測定するために注入の間１〜２時間毎に採取される。ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定のための他の要素は、上述のように行われる（図１０〜１３）。
【０１８２】
Ｆ．ＲＣＴの血漿成分の測定
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、ＲＣＴの血漿成分の一部（ＬＣＡＴ／ＣＥＴＰ媒介性の成分）が測定される。ＨＤＬと複合した１３Ｃ２−コレステロールは静脈内ボーラスとして被験体に投与される。血液サンプルは、ボーラス投与前、ボーラス投与後２４時間まで２時間ごとに、およびより低い頻度でその後さらに３日後まで採取される。ＨＤＬ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬが血液サンプルから単離され、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールエステル、およびＶＬＤＬコレステロールエステルの同位体含量または同位体パターンがＧＣＣ−ＩＲＭＳによって測定される。コレステロールのコレステロールエステルへの変換およびコレステロールエステルのＨＤＬからＬＤＬまたはＶＬＤＬへの輸送はこの方法によって測定される。血漿ＲＣＴのＬＣＡＴ成分はまた、同様にＨＤＬコレステロールエステルの同位体含量または同位体パターンの測定によって特異的に測定されうる。
【０１８３】
Ｇ．動物におけるコレステロール輸送および代謝
上記の実施形態は、動物において上記にヒトのために記載されたような方法を用いて実施され得る。１つの実施形態では、動物はサルなどの霊長類である。別の実施形態では、動物は、ウサギ、モルモットまたはハムスターである。さらに別の実施形態では、動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【０１８４】
Ｈ．組合せ
上記の方法は、異なる同位体または同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体、同位体標識胆汁酸もしくは同位体標識コレステロール前駆体を用いて、様々な形に組み合わされうる。このような標識分子の様々な組合せが使用されうる。あるいは、様々な投与経路および投与方法、生物学的サンプリングの種類および時期、サンプル処理の方法、ならびに同位体含量分析の方法、データの算出方法、データの解析方法、ならびにデータの解釈方法が上記において企図され、実施者の要求に合うように組み合わされてもよく、それらは当技術分野の技術の範囲内である。
【０１８５】
Ｖ．本発明の生成物
本発明の実施を通じて、多数の生成物が生じる。特に、同位体標識成分を含有する対象となる分子が生じる。このような生成物は多くの形をとる。
【０１８６】
Ａ．生物学的サンプル
本発明の実施は、対象となる分子を含有する生物学的サンプルの採取を伴う。対象となる分子の一部は安定同位体標識される。生成物は、対象となる分子のプール（例えば、１ミリグラムのデオキシコール酸）を含有し、そのうちのいくらかは同位体標識されている生物学的サンプルである。
【０１８７】
Ｂ．生物学的サンプルの一部
生成物はまた、本発明の方法の実施によって取得される生物学的サンプルに由来する、（分析のために）精製、単離、部分精製された、または誘導体化もしくは修飾された対象となる分子のプール（例えば、ヒトの尿から単離された５００マイクログラムのコプロスタノール）でありうる。生成物は、対象となる分子を濃縮するため、または分析を妨害しうる不要な分子を除去するために調製された、生物学的サンプルの画分（例えば、血液のリポタンパク質画分）でありうる。
【０１８８】
Ｃ．対象となる標識分子
本発明によって生じる生成物はまた、特定の同位体標識分子を含む。このような分子の非限定的なリストは図１５および１６に示され、それらは様々な対象となる分子を図解し、１３Ｃに関する標識位置を示す。本明細書に記載される実施形態は他の同位体によって標識されるものを含む様々な対象となる同位体標識分子を生じうるが、これらの特定の分子は、本発明の実施の間の１３Ｃ２標識コレステロールの投与に由来する。
【０１８９】
本発明の使用
本発明の方法は、様々な目的のために使用されうる。例えば、本方法は、被験体においてＲＣＴの成分の速度を測定するために使用されうる。次に、その速度は、アテローム生成および／もしくはアテローム硬化または冠状動脈性心臓病、末梢血管疾患および脳血管疾患を含む他のコレステロール関連疾患に対する、様々な候補治療法の効果を評価するために使用されうる。
【０１９０】
１つの態様では、本方法は、ＲＣＴに対する候補治療法の効果を決定するために使用されうる。候補治療法を被験体に施行した後、候補治療法の施行前後での被験体におけるＲＣＴの１つ以上の成分の速度が比較されうる。被験体はアテローム硬化を有しても、有さなくてもよい。候補治療法の効果は、候補治療法の施行前後に測定される速度の変化（例えば、増加、減少、または差異なし）によって決定される。このような効果はまた、被験体の１群に候補治療法を施行し、他の群にプラセボ治療を施行するかまたは治療を施行せずに、２群でのＲＣＴを比較することによっても測定され得る。同様に、候補治療法は１群に施行され、この群の流出成分はコレステロール流出に関する過去のデータと比較されてもよい。当業者にとって既知の他の種類の前臨床試験または臨床試験計画は、本発明の方法の実施の際に使用され得る。
【０１９１】
本発明の別の態様では、本方法は、創薬、薬剤開発および認可（ＤＤＡ）計画において使用される。ＲＣＴに対する効果は、生体系が候補治療法または候補治療法の組合せを受けた後で観察される。作成され分析されたデータはＤＤＡの方針決定過程を容易にする；すなわち、それは、（例えば、ＲＣＴデータが有望であると思われる場合）候補治療法のさらなる開発を続ける、または、例えば、ＲＣＴデータが好ましくないと思われる場合、試みを停止するという決断において方針決定に有用な情報を提供する。この方法により、提案された分子標的は、例えば、コレステロール輸送、および特にＲＣＴに対する阻害または促進によって、それらの活性の変化の効果について評価され得る。コレステロール輸送、およびＲＣＴにおける提案された分子標的の機能的重要性ならびに役割は、それによってヒトおよび実験動物において効率的に評価され得る。
【０１９２】
本発明のさらに別の態様では、本方法は、用量設定および／または用量の最適化に使用される。候補治療法は、様々な用量または投与計画にわたって被験体（動物もしくはヒト）に施行され、その後、候補治療法に対するＲＣＴの用量反応に基づいて最適な用量が選択されうる。本方法はさらに、いずれの用量が、異なる種類の被験体、例えば、既にスタチン治療もしくはフィブラート治療を受けている被験体、またはＲＣＴに対して有益な効果を持つために異なる用量の候補治療法を必要としうる、コレステロール代謝に遺伝的欠損を有する被験体に適しているかを決定するために使用されうる。
【０１９３】
本発明のさらに別の態様では、本方法は、処方開発のために使用される。候補治療法は様々な賦形剤中に処方されてもよく、または様々な経路で投与されうる。ＲＣＴに対する効果はその後、いずれの賦形剤または経路が最適であるかを決定するために使用される。例えば、候補治療法は、１日２回投与される場合、または食事時間に投与される場合、ＲＣＴの調節においてより効果的であることが見いだされるかもしれない。候補治療法はまた、徐放性製剤で与えられる場合により効果的であることが見いだされるかもしれず、または、迅速に吸収される単回投与で与えられる場合により効果的であることが見いだされるかもしれず、または、特定の賦形剤もしくは特定の賦形剤の比率によって処方される場合により効果的であることが見いだされるかもしれない。
【０１９４】
本発明のさらに別の態様では、本方法は、候補治療法の評価のための（例えば、臨床試験において）、または候補治療法に反応する彼らの能力について、被験体の選択を可能にする。コレステロール関連疾患の原因の範囲を考慮すると、特定の患者だけが所定の候補治療法に反応しうる可能性がある。この場合、本方法は、被験体が臨床試験に適しているか否かを決定するために使用され得る。例えば、高レベルの血漿ＨＤＬをも有する高コレステロール血症の被験体は、ＲＣＴ治療に対して有利に反応しないかもしれない。このような被験体は臨床試験から除外されうる。同様に、被験体を治療するために使用されている候補治療法（すなわち、ヒトでの使用が認可されている候補治療法−候補治療法のサブクラス）に関して、本発明の方法は、臨床医が特定の被験体または被験体に対する特定の候補治療法の妥当性を決定することを可能にする。
【０１９５】
本発明のさらに別の態様では、本方法は、当業者が１群の候補治療法（例えば、同一のリード化合物に由来する複数の候補治療法、もしくは部分的に開発されている複数の候補治療法、もしくは同一の化合物ライブラリー由来の複数の候補治療法）から最適な候補治療法を同定、選択、および／または特性化することを可能にする。同定、選択、および／または特性化された時点で、当業者は、本発明の方法によって作成された情報に基づいて、最適な候補治療法をさらに開発もしくは評価すること、または製薬会社もしくはバイオ企業などの他の企業に候補治療法の使用を許諾することを決定しうる。
【０１９６】
さらに別の態様では、本発明の方法によって作成されたデータは、１つ以上のコレステロール関連疾患の根本的な分子病態論または原因の理解に関連しうる。別の態様では、本発明の方法によって作成されたデータは、対象となるコレステロール関連疾患の発生、進行、重症度、病理学、攻撃性、悪性度、活動性、障害、死亡率、罹患率、疾患の下位分類、または根本的な病原性もしくは病理学的特性の基本的な特徴を解明しうる。
【０１９７】
さらに別の態様では、本発明の方法によって作成されたデータは、対象となるコレステロール関連疾患の予後、生存率、罹患率、死亡率、病期、治療効果、症状、障害または他の臨床学的要因の基本的な特徴の解明を提供しうる。
【０１９８】
別の態様では、本方法は、ＲＣＴを含むコレステロール代謝および輸送に対する食餌変更の効果を評価するために使用されうる。上述のものと同様に、その効果は、食餌変更の前後に測定されるＲＣＴの１つ以上の成分の速度における変化（例えば、増加、減少、または差異なし）によって決定される。
【０１９９】
別の態様では、本方法は、コレステロール代謝および輸送に対する運動の効果を評価するために使用されうる。
【０２００】
別の態様では、候補薬剤の投与、食餌変更、および／または運動などの候補治療法の組合せが本発明の方法の使用によって評価されることにより、ＲＣＴの１つ以上の成分の速度に対してこのような候補治療法の組合せを評価しうる。
【０２０１】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、様々な同位体濃度および事前に測定された容量で、同位体標識コレステロールもしくはコレステロール関連分子もしくはコレステロール関連複合体、同位体標識胆汁酸、または同位体標識コレステロール前駆体、またはそれらの組合せなどの成分を含むように構成されうる。キットは、キット成分の使用説明書およびコレステロール希釈の算出方法の説明書とともに包装されうる。
【０２０２】
様々な同位体標識成分の投与のための用具（例えば、計量カップ、針、注射器、ピペット、ＩＶチューブ）などの他のキット構成部品は、任意選択でキット内に提供されうる。同様に、被験体からサンプルを取得するための器具（例えば、試料カップ、針、注射器）もまた、任意選択で提供されうる。
【０２０３】
下記の実施例は、本発明の方法がヒトおよび動物においてコレステロール逆輸送の様々な成分を測定するために使用されうることを示すために提供される。当業者は、特定の実施形態が説明され、記載されているが、それらが本発明の限定を意図していないことを認識するであろう。
【実施例】
【０２０４】
実施例１
ヒトにおけるＲＣＴの流出成分の測定
序論
ＲＣＴの流出成分は、組織および生物全身からのコレステロールの除去の第一段階である。
【０２０５】
方法
６人の健康なヒトボランティアに２００ｍｇの１００％１３Ｃ２−コレステロールを１６．６６ｍｇ／時間の速度で１２時間静脈内投与した（図１７Ａ）。注入の間に６〜８回、各被験者から２０〜４０ｍｌの血液を採取した。６人の被験者のうち５人については注入の直前に血液を採取した。当技術分野において既知の方法を用いた水性・有機溶媒抽出によって血清総コレステロールを単離した。その後、塩化アセチルを用いてコレステロールをそのアセチル誘導体に誘導体化し、石油エーテル中に抽出し、硫酸ナトリウムを用いて、窒素下で乾燥させ、トルエン中に再調製した。続いてそれを燃焼モードで稼動するMAT 253 Thermo-Finnigan  ＩＲＭＳに連結したAgilent model 6890ガスクロマトグラフに注入した。各サンプルのＡＰＥを決定するために、データを既知の１３Ｃ  ＡＰＥを有する一連の標準と比較した。
【０２０６】
図５は、３人の被験者に関する注入時間の関数としてのＡＰＥデータを示す。３人の被験者すべてにおいて、血清総コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥはプラトーに向かって上昇しているのが見て取れる。プラトー値は、標識コレステロールの内在性コレステロール流出による希釈を算出するために使用され得る定常状態富化の値に相当する。すべての被験者が実験の終わりまでに定常状態富化に達するとは限らないため、プラトーは利用可能なデータを下記のような指数曲線にフィッティングすることによって決定され、
【数１０】
2008542688.tif 000012
【０２０７】
式中、「ａ」はプラトー値である。
【０２０８】
内在性コレステロールによる希釈速度（すなわち、内在性コレステロールの出現速度）は下記の（および上述のような）方程式を用いて算出された。
【数１１】
2008542688.tif 000013
【０２０９】
例えば、被験者３は０．００１３８％のプラトー１３Ｃ  ＡＰＥ値を有し、１６．６６ｍｇ／時間の速度でコレステロールを投与された。注入されたコレステロールは２７個の炭素のうち２個が標識されたので、測定された１３Ｃ  ＡＰＥに対する倍率は２７／２である（これは概念的には１３Ｃ  ＡＰＥのコレステロールＭ２  ＭＰＥへの変換と考えることができる。このような倍率は当技術分野において知られている）。希釈速度方程式はその結果、下記のようになる：
【数１２】
2008542688.tif 000014
【０２１０】
結果および意義
コレステロール流出速度は、６人の被験者すべてに対して、記載したように測定した：
被験者ＩＤ                流出速度
００１              ８９１ｍｇ／ｈｒ
００２              ６４０ｍｇ／ｈｒ
００３              ６４７ｍｇ／ｈｒ
００４              ８７８ｍｇ／ｈｒ
００５              ９７９ｍｇ／ｈｒ
００６              ９５９ｍｇ／ｈｒ
これらの速度は各被験体でのＲＣＴの第１の成分を表す。
さらに１５人の被験者を研究し、プラトーフィットへの上昇から算出されるｋおよびＲａの両方についての測定の個人差を実証した（図６Ａ）。
【０２１１】
この実験は、ＲＣＴの流出成分がヒトにおいて測定され得ることを説明する。その技術は正確であり、比較的迅速である。ＲＣＴの流出成分の測定は、ＲＣＴに対する様々な候補治療法の作用を評価するため、またはアテローム生成、アテローム硬化、もしくは動脈硬化の予防もしくは治療に対する様々な候補治療法の有用性を評価するために使用されうる。例えば、薬剤の投与前後で被験体におけるＲＣＴの流出成分を比較することができる。被験体はアテローム硬化を有しても有しなくてもよい。候補治療法の効果は、候補治療法の施行前後に測定した場合のＲＣＴの流出成分の変化（例えば、増加、減少、または差異なし）によって決定されるであろう。このような差異はまた、被験体の１群に候補治療法を施行し、他の群にプラセボ治療を施行するかまたは治療を施行せずに、２群でのＲＣＴの流出成分を比較することによっても測定され得る。同様に、候補治療法を１群に施行し、この群の流出成分をコレステロール流出に関する過去のデータと比較してもよい。
【０２１２】
この方法によって特定された候補治療法は、重要な商業的価値を有する。
【０２１３】
実施例２
ヒトにおけるＲＣＴの血漿成分の測定；コレステロールエステルの生成
序論
コレステロールの代謝および様々なキャリア分子間でのその輸送はＲＣＴの重要な成分である。製薬産業にとって主要な現在の分子標的はＣＥＴＰである（図１参照）。同様に、ＬＣＡＴの阻害はＲＣＴ経路を介するコレステロールの動きを有利に調節しうるため、ＬＣＡＴの活性の調節は、新規の治療法を開発するための合理的な標的である。本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＣＡＴ作用、ＣＥＴＰ作用、または両方の作用の測定方法を含む、ＲＣＴの血漿成分の測定のための手段を提供する。
【０２１４】
方法
２人の健康なボランティアに脂質エマルジョンに懸濁された１００ｍｇまたは２００ｍｇの１３Ｃ２−コレステロールの静脈内ボーラスを投与した。標識の投与後最初の２４時間に３〜４回、ならびにその後、標識投与後約５日目および１０日目に２回、２０〜４０ｍｌの血液サンプルを採取した。各血液サンプルから、遠心分離とそれに続くメタノール／クロロホルム抽出およびその後の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）よってコレステロールを単離した。同じ技術によるが、異なるＴＬＣ法を用いて、コレステロールエステルを単離した。コレステロールとコレステロールエステルはともに、上述のようにそれらの塩化アセチル誘導体に変換された。各サンプル由来のコレステロールおよびコレステロールエステルに対する１３Ｃ  ＡＰＥを、上述のようにＧＣＣ−ＩＲＭＳによって測定した。
【０２１５】
結果および意義
両被験者について、コレステロールおよびコレステロールエステルの１３Ｃ  ＡＰＥを時間に対してプロットした（データは示していない）。コレステロールからコレステロールエステルへの変換は１２時間の間に起こる。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＣＡＴの活性を直接示し、ＲＣＴの血漿成分のこの部分が迅速に起こることを示す。ＲＣＴの流出成分と同様に、ＲＣＴの血漿成分の一部または全体の測定は、特に候補治療法の開発という背景において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの候補治療法活性および薬効について有益な情報を与えうる。
【０２１６】
この実験は、ＲＣＴの血漿成分がヒトにおいて測定され得ることを説明する。ＲＣＴの血漿成分の測定は、ＣＥＴＰ阻害剤、ＬＣＡＴ阻害剤、もしくは他のこのような候補治療法を含む、ＲＣＴまたはコレステロール輸送に対する様々な候補治療法の作用を評価するために使用されうる。ＲＣＴの他の成分と同様に、ＲＣＴの血漿成分を調節できる候補治療法の特定は、重要な商業的価値を有するであろう。
【０２１７】
実施例３
ラットにおけるＲＣＴの流出成分の測定
序論
ＲＣＴの流出成分はＲＣＴの最初の成分であり、候補治療法の標的となりうるプロセスである。あらゆる候補治療法は、開発プロセスの一環として動物で試験されなければならない。実施例１は、流出成分がヒトにおいて測定されうることを実証した。本実施例は、ラットにおいて実施された同一の実験を示す。
【０２１８】
方法
方法は、わずか１．２ｍｇの１３Ｃ２−コレステロールが静脈内注入によって投与され（１００μｇ／時間）、わずか１００μｌの血液が各時点で採取されたこと以外は、上記の実施例１において記載されたものと同一である。さらに４つの動物群：標準的なラットの食餌を与えたラット；高コレステロール食を与えたラット；コール酸を加えた高コレステロール食を与えたラット；およびコール酸を加えた高コレステロール食を１４日間与え、その後通常食に４日間戻したラットが研究された。この場合、疾患の動物モデルは食餌誘導性高コレステロール血症であり、血漿コレステロールを増加させることに対するコール酸の効果に続いて、食餌の切り替えによる比較的迅速な正常コレステロールレベルへの回復が起こる。図７は、血漿中へのコレステロールの流出に対するコレステロール／コール酸摂食（コレステロール負荷）の効果、およびその後の通常食への回復（コレステロール除荷）の効果を示す。
【０２１９】
結果および意義
図７は、各処理群についての平均流出速度を示す。コレステロール／コール酸摂食動物は最も高い流出速度を有し、コレステロール負荷食のコレステロール代謝への影響を補償するためにＲＣＴの流出成分がアップレギュレートされうることを示唆する。通常食への回復では、Ｒａはより低くなるがまだ正常化されず、それはラットからの持続性のコレステロール流出を示唆し、コレステロール／コール酸食が組織にコレステロールを負荷し、これがいまだに除去されているという見解と一致する。ここでのデータは、前臨床（齧歯類）モデルにおける介入試験を実証することに成功した。
【０２２０】
実施例４
ラットにおけるコレステロール排出ＲＣＴの測定；コレステロールの胆汁中への輸送およびコレステロールの胆汁酸への変換の測定
序論
ＲＣＴの肝臓成分は、それがＲＣＴの最後の成分に相当し、コレステロールが実際に体から出る点であるため、ＲＣＴの研究にとって有意義である。理想的には、ＲＣＴの肝臓成分の測定は、特に、中性ステロール（例えば、ＲＣＴまたは肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成に由来する胆汁コレステロール）ならびに胆汁酸（例えば、ＲＣＴコレステロールまたは肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来するデオキシコレート）をはじめとする胆汁のすべての成分の供給源および合成速度の決定を可能にする。
【０２２１】
方法
標識投与および生物学的サンプリング
あらゆる安定同位体標識の投与前（「０日目」と呼ばれる）に、血液および糞便サンプルを採取する。
【０２２２】
体内水分が約５％過剰な重水素の同位体含量に達するように、ラットに１００％重水のＩＰボーラスを投与した。その後、体内水分の重水素の定常状態レベルを維持するために、ラットに飲料水中８％過剰な重水を与えた。重水に由来する重水素の肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールへの取り込みは、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来する胆汁コレステロールまたは胆汁酸の割合の測定を可能にする（図１１Ｂ）。
【０２２３】
また、重水ボーラスと同時に、ラットに脂質エマルジョン中の１．２ｍｇの１３Ｃ２−コレステロールの静脈内ボーラスをも投与した。
【０２２４】
ボーラス投与後６日間にわたり血液サンプルを毎日採取した。ボーラス投与後６日間にわたり糞便サンプルを毎日採取した。
【０２２５】
ステロール排出速度の測定
当技術分野において既知の技術を用いて、毎日排出される各胆汁成分（コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸）の質量を測定した。あるいは、質量値はまた、過去のデータから、または対象となるラットの系統が以前に同様の条件下で研究されている場合には文献からも取得される。
【０２２６】
同位体含量または同位体パターン測定：ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロールの寄与の測定
様々な同位体含量または同位体パターン測定が行われた。１日目〜６日目に採取した血液サンプルでの２Ｈ２Ｏの濃度は、血漿を炭化カルシウムと反応させ、その結果生じたアセチレンガスをMonitor series 3000サイクロイド質量分析計を用いて分析することにより測定された。このデータは、対象となる分子の最大限可能なＭＰＥの算出根拠を提供する。
【０２２７】
コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコレートは、１日目〜６日目の糞便サンプルから、以下のようにして精製した：糞便を一晩水酸化ナトリウム溶液中でインキュベーションし、中性ステロールを単離するためにヘキサン抽出を行い、残りの水相を塩酸で中和し、その後胆汁酸を単離するために酢酸エチルで抽出した。その後、コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸のＭ１同位体のＭＰＥをＧＣ／ＭＳによって測定した。血漿重水濃度と組み合わせた場合、これらの測定結果は、肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来する対象となる各分子の割合（図１４）およびＲＣＴの他の測定基準と組織コレステロールバランスとの相関の決定を可能にする。
【０２２８】
同位体含量または同位体パターン測定：肝臓ＲＣＴの寄与の測定
様々な同位体含量または同位体パターン測定が行われた。０日目〜６日目に採取した血液サンプルからコレステロールを精製し、ＧＣＣ−ＩＲＭＳによって上述のように１３Ｃ  ＡＰＥについて分析した。０日目の測定は、上述のような１３Ｃ  ＡＰＥ算出のためのベースライン測定を提供する。血中コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥは、糞便コレステロール、コプロスタノール、またはデオキシコレートにおいて予期され得る最大限可能なＡＰＥを算出するために使用される。
【０２２９】
０日目〜６日目に採取した糞便サンプルからコプロスタノール、コレステロール、およびデオキシコレートを精製した。それらの分子をその後、ＧＣＣ−ＩＲＭＳにより１３Ｃ  ＡＰＥについて分析した。血中コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥと組み合わせた場合、これらの測定結果は、ＲＣＴに由来するそれぞれの対象となる分子の割合の決定を可能にする。
【０２３０】
寄与率の算出
ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールについては、最大限可能なＭ１アイソトポマーのＭＰＥは、血漿中の過剰な重水の量に、ＭＩＤＡの計算により決定されるスカラー係数を乗じることによって、または過去のデータによって決定される。観察された糞便コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸のＭＰＥ  ＥＭ１富化をこの最大限可能な値で割ることによって、肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来するそれぞれの割合を得る。
【０２３１】
ＲＣＴについては、糞便コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸で観察される１３Ｃ  ＡＰＥを、適切なサンプリング期間（サンプル採取の頻度に基づいて決定される）にわたって平均された血漿コレステロールで観察される１３Ｃ  ＡＰＥで割ることによって、ＲＣＴに由来する各分子の割合を得る。この場合には、平均期間は２４時間であった。例えば、２日目の糞便サンプル由来の糞便コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸の１３Ｃ  ＡＰＥを、２日目および１日目の血中コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥ値の平均で割った。この時間の平均化は、寄与率を算出するために使用される最大限可能なＡＰＥが、サンプリングされた対象となる分子が合成されていた期間全体にわたる血中コレステロール濃度を反映することを確実にする。理論的には、ラットの場合、理想的な平均期間は、２つの糞粒の含量（生物学的サンプルサイズ）が排出されるためにかかる期間にわたって平均化される。しかし、当業者は、（図８の３日目以降から観察されるように）血中コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥがサンプリング頻度ごとに定常状態に近づいていく場合、平均化の重要性は低下することを理解し得る。これらの状況では、単一サンプルからの血中コレステロールの実際の１３Ｃ  ＡＰＥが最大値として使用され得る。
【０２３２】
結果および意義
対象となる各分子（コレステロール、コプロスタノール、およびデオキシコール酸）に対するそれぞれのコレステロール供給源（ＲＣＴまたはｄｅ  ｎｏｖｏ合成）の寄与率に、各分子の排出速度を乗じることにより、それぞれの供給源から１日当たりに排出される質量を得た。
【０２３３】
本発明の方法は、候補治療法の発見および開発のために幅広い前臨床用途を有する。胆汁排出に対するｄｅ  ｎｏｖｏ合成およびＲＣＴの寄与を理解することは、このような分析にとって不可欠であり、単にいずれかまたはすべての胆汁成分の分泌速度を測定するだけでは不十分である。例えば、胆汁の排出速度を増加させた治療は、ＲＣＴの増加によってそのような結果をもたらしたのかもしれないが、それはまた肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成の増加によるのかもしれず、その場合、その治療は、ＲＣＴの増加（すなわち、ＲＣＴを介した体からのコレステロールの除去の増加）およびアテローム硬化のリスクまたは発生率の減少に有効ではないだろう。あるいは、胆汁分泌速度を増加させるが、ＲＣＴが実質的に減少するようなレベルまで肝臓でのコレステロール合成が増加することによってそのような結果がもたらされる候補治療法は、望ましくない作用機序であり、まったく治療しないよりも事実上有害であるかもしれない。本発明の方法は、ＲＣＴを増加させる候補治療法と、胆汁分泌を増加させるが実質的にＲＣＴを減少させる候補治療法との識別を可能にする。本発明の方法はまた、至適用量を特定するためにも使用され得る。
【０２３４】
ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定はまた、様々な動物モデルにおいて候補治療法の効果を評価するためにも使用されうる。例えば、薬剤の投与前後でのＲＣＴの肝臓部分が比較され得る。候補治療法の効果は、候補治療法の施行前後に測定した場合の肝臓ＲＣＴの変化（例えば、増加、減少、または差異なし）によって決定されるであろう。ＲＣＴ関連作用に関する、用量範囲または有効量、用量反応曲線の性質、および候補治療法の作用機序の他の指標もまた、この方法で測定され得る。
【０２３５】
別の変形形態では、本方法は、ＲＣＴの肝臓成分に対する食餌変更の効果を評価するために使用されうる。上述のものと同様に、その効果は、食餌変更の前後に測定した場合の肝臓ＲＣＴの変化（例えば、増加、減少、または差異なし）によって決定される。
【０２３６】
このような差異はまた、動物の１群に候補治療法を施行し、他の群にプラセボ治療を施行するかまたは治療を施行せずに、２群でのＲＣＴの肝臓成分を比較することによっても測定され得る。
【０２３７】
実施例５
ラットにおける「包括的コレステロールＲＣＴ」パラメータの測定
実施例１において概説されたアプローチの改良は、血漿コレステロールのＲａを算出すること、およびその測定結果を実施例４に記載された投与コレステロールの排出速度と組み合わせることを含む。
【０２３８】
方法
血漿コレステロールの糞便中への回収は、糞便中性ステロール中に排出された投与標識コレステロールの割合と定義される。それは、注入後１〜４日目の回収された標識の割合（％）として表される。それは、糞便中性ステロール中の１３Ｃ富化の割合（％）（中性ステロール排出（ｍｇ／日）を投与された１３Ｃコレステロールの全ｍｇで割ったもの）から算出される。
【数１３】
2008542688.tif 000015
【０２３９】
糞便中に排出される胆汁酸中への血漿コレステロールの回収について、同じ計算が行われる。ラットを一般的な試験用のコレステロール降下薬であるコレスチラミン、エゼチミブ、ＬＸＲアゴニスト（ＴＯ−９０１３１７）で処理した。コレステロールのＲａは記載されたように算出され、投与されたコレステロールの糞便ステロールまたは胆汁酸中への回収は記載されたように算出される。
【０２４０】
結果および意義
図１１に示されるのは、コレスチラミンで処理された、中性ステロール（図１１Ａ）および胆汁酸（図１１Ｂ）中へのＲＣＴ流で観察される変化である。コレスチラミンは胆汁酸吸収を選択的に阻害するが、中性ステロール吸収を阻害しないことが知られている。これは、中性ステロールで観察されるものより大きな血漿コレステロールの糞便胆汁酸中への流量の増加に反映されている。
【０２４１】
図１２に示されるのは、ＲＣＴに対するエゼチミブの効果である。中性ステロールへの血漿流量の増加は、肝臓から胆汁および腸内に分泌された内在性コレステロールの再吸収を含む腸のコレステロール吸収を阻害する、エゼチミブの既知の作用機序と一致する。
【０２４２】
図１０に示されるのは、血漿コレステロールの中性ステロール中への排出およびＲＣＴの包括的パラメータに対するＬＸＲアゴニストの効果である。ＬＸＲアゴニストはマウスモデルにおいてアテローム硬化に拮抗することが示されている。観察されるＲＣＴの増加はこの効果と一致する。遺伝子発現との相関（図１０Ｂ）はまた、測定されるＲＣＴ流との相関によって創薬および薬剤開発の治療標的の有効性を確認する戦略を支持する。
【０２４３】
これらの結果は、ＲＣＴに対する薬剤介入の効果を記述することの有効性を実証し、その経路における活性の改善を評価または特定するために、それらがどのように使用されうるかを説明する。
【０２４４】
実施例６
ヒトにおけるＲＣＴの肝臓成分の測定；胆汁酸のｄｅ  ｎｏｖｏ合成、胆汁酸プールサイズの測定、血漿コレステロールから胆汁酸への変換の測定
序論
ＲＣＴの肝臓成分または排出成分はＲＣＴの研究に有意義であり、コレステロールが実際に体から出るときのＲＣＴの成分に相当する。ヒトにおいてＲＣＴの肝臓成分または排出成分を測定することは様々な目的を果たすことができ、そのいくつかは上述されている。ＲＣＴの肝臓部分または排出部分の測定によるヒト被験体での候補治療法の評価は、本発明の例示的な用途である。臨床試験を正当化し、計画し、もしくは中止するため、または候補治療法の開発の継続もしくは認可に関する規制当局への申請を支持するためのこのようなデータの使用もまた、本発明の例示的な用途である。
【０２４５】
理想的には、ＲＣＴの肝臓成分または排出成分の測定は、特に、中性ステロール（例えば、ＲＣＴまたは肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成に由来する胆汁コレステロール）ならびに胆汁酸（例えば、ＲＣＴコレステロールまたは肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来するデオキシコレート）をはじめとする胆汁のすべての成分の供給源および合成速度の決定を可能にする。
【０２４６】
方法
標識投与および生物学的サンプリング
いずれの安定同位体標識の投与前（「０日目」と呼ばれる）にも、ヒト被験体およびラットにおいて血液、糞便、ならびに尿サンプルを採取した。
【０２４７】
体内水分が約１％過剰な重水素の富化に達するように、被験体に重水の複数回投与を行った。また、被験体に１３Ｃ２−コレステロールの静脈内ボーラスを投与し、５０ｍｇの２Ｈ４−コール酸を経口投与した。重水に由来する重水素の肝臓でのｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールへの取り込みは、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールに由来する胆汁コレステロールまたは胆汁酸の割合の測定を可能にする。１３Ｃの胆汁酸および胆汁コレステロール中への出現は、血中コレステロール（すなわち、ＲＣＴ）に由来するこれらの分子の割合の測定を可能にする。２Ｈ４−コール酸の希釈は、胆汁酸プールサイズの測定を可能にする。
【０２４８】
複数の生物学的サンプルが採取された。ラットでは標識投与後７日目まで毎日、ヒトでは４、７および１４日目に糞便を採取した。血液は定期的に１０日目まで採取された（１〜２ｍｌ）。尿はヒトでは定期的に１０日目まで採取された（少なくとも５０ｍｌのサンプル）。
【０２４９】
異なる被験体は異なる標識分子を投与されてもよく、異なる生物学的サンプリング計画を受けてもよい。被験体または被験体群からのデータは、被験体集団（例えば、健康な成人、高コレステロール血症の人など）におけるＲＣＴの全体像を形成するために、他の同様の被験体からのデータと組み合わされうる。１つの実施形態では、すべての測定結果は、異なる薬物治療計画を受けたラットにおいて作成される。
【０２５０】
同位体含量または同位体パターン測定：ｄｅ  ｎｏｖｏコレステロールの寄与の測定、胆汁成分に対するＤＮＣの寄与率の算出
０日目〜７日目に採取した血液サンプルでの２Ｈ２Ｏの濃度を、血漿を炭化カルシウムと反応させ、その結果生じたアセチレンガスをMonitor series 3000サイクロイド質量分析計を用いて分析することにより測定した。このデータは、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成コレステロールの最大限可能なＭＰＥの算出根拠を提供する。
【０２５１】
コレステロールおよびコール酸を４日目〜７日目の糞便サンプルから精製し、コール酸を４日目〜７日目の尿サンプルから精製した。これらの分子を（上述のように）さらに処理し、その後、ＧＣ／ＭＳによって分析する。Ｍ１  ＭＰＥは、ベースラインについては過去の参照値を用いて、上述のように算出された。最大限可能なＭＰＥは、重水とコレステロール合成との間の関係に関する過去のデータを用いて、血液中で測定された体内水分の値から算出された。
【０２５２】
ｄｅ  ｎｏｖｏ合成肝臓コレステロールに由来する尿中コール酸、糞便コール酸、または糞便コレステロールの割合は、対象となる各分子で観察されるＭ１  ＭＰＥを、血中重水素値から算出される最大限可能なＭ１  ＭＰＥで割ることによって算出された。
【０２５３】
同位体含量または同位体パターン測定：肝臓ＲＣＴの寄与の測定、胆汁成分に対するＲＣＴの寄与率の算出
ＲＣＴについては、ＲＣＴに由来する各分子の割合を得る１つの方法として、尿中コール酸で観察される１３Ｃ  ＡＰＥを、適切なサンプリング期間（サンプル採取の頻度に基づいて決定される）にわたって平均された血漿コレステロールで観察される１３Ｃ  ＡＰＥで割る。ヒトの場合には、血漿コレステロールの１３Ｃ  ＡＰＥは、過去のデータから、サンプルを採取した期間中は約０．０２で一定であることが知られている。２人の健康な被験者由来の２つのサンプル（２週目および３週目）からのデータが図１２に示される。その計算は、被験者１では約８１％の胆汁酸がＲＣＴに由来し、被験者２では５１％の胆汁酸がＲＣＴに由来することを示す。これらの差異は、ＲＣＴにおいて臨床的に意義のある差異であり、より少ないコレステロールを胆汁中に排出する被験者２でのアテローム生成またはアテローム硬化のリスクを示唆しうる。
【０２５４】
同位体含量または同位体パターン測定：胆汁酸プールサイズの決定のための測定、胆汁酸プールサイズの算出
１０日の研究期間中に採取された血液サンプルからコール酸を単離した。その後、コール酸を精製し、ＧＣ／ＭＳによって分析し、ベースライン値として過去のデータを用いてＭ４イオンのＭＰＥを決定した。その後、コール酸の希釈を、投与したコール酸の量に基づいて算出した。胆汁酸プールサイズは、当技術分野において既知の方程式、具体的には、Measurement of parameters of cholic acid kinetics in plasma using a microscale stable isotope dilution technique: application to rodents and humans, Hulzebos et al, J. of Lipid Research, volume 42, 2001, pp 1923-1929に見られるものを用いて算出された。
【０２５５】
胆汁ステロールの代用としての尿中ステロールの使用
尿由来の胆汁酸および尿由来の胆汁コレステロールへの腸管微生物の作用に由来するコレステロールの代謝産物の同位体含量または同位体パターンを測定した。この場合、胆汁コレステロールおよび胆汁酸の同位体含量または同位体パターンは尿サンプルから測定され得る。この技術の詳細は、上記のＩＩ−Ｃ項に記載されている。標識水を投与された被験体での糞便コプロスタノールおよび尿中コプロスタノールの２Ｈ同位体含量または同位体パターン測定結果は、その２つが平衡状態にあることを示す。尿中コプロスタノールの同位体含量または同位体パターンを測定することによって、糞便中の胆汁コレステロールの同位体含量を決定した。様々な処理計画は、研究されたとおりに、ラットでのｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成を変化させた（図１４）。
【０２５６】
実施例７
ヒトにおける「包括的コレステロールＲＣＴ」パラメータの測定
実施例６において概説されたアプローチの改良は、血漿コレステロールのＲａを算出すること、およびその測定結果を実施例４および５に記載された投与コレステロールの排出速度と組み合わせることを含む。
【０２５７】
方法
同位体は実施例６に記載されるように投与される。経口投与シトスタノールは１日３回投与され、その糞便サンプル中への回収は、当技術分野において既知の方法を用いて絶対的な糞便中性ステロールおよび胆汁酸排出速度を決定するために用いられた。
【０２５８】
結果
研究された７人の被験者に対するＲＣＴが示され、被験者間の個人差が示される。さらに、低い血漿ＨＤＬコレステロール濃度（＜４０ｍｇ／ｄｌ）および高い血漿ＨＤＬコレステロール濃度（＞６０ｍｇ／ｄｌ）を有する被験者が特定される。最も低いＲＣＴ値は最も低いＨＤＬを有する被験者で見られ（図１３Ａおよび１３Ｂにおいて＊で示される）、最も高いＲＣＴ値は最も高いＨＤＬを有する被験者で見られる（＃で示される）。
【０２５９】
この実験は、中性ステロールおよび胆汁酸中へのＲＣＴ流がヒトにおいて効果的に測定され得ることを示す。さらに、血漿ＨＤＬレベルはＲＣＴ流パラメータ、特に包括的ＲＣＴ流パラメータと関連しうることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】図１は、ＲＣＴ経路およびコレステロールの全身プールを図解する。略語；「ＲＢＣ」は赤血球である。末梢組織中の大きな代謝回転の遅いコレステロールプール、ならびに血漿、ＲＢＣおよび肝臓遊離コレステロールを含む代謝回転の速いコレステロールプールの存在が示されている。代謝回転の速いプールに投与された標識コレステロールは、組織と交換され得、または糞便ステロールの形で排出され得る。
【図２】図２は、認識されているＲＣＴ経路の分子要素を図解する（A.Tall, Journal of Clinical Investigation, 2001から）。
【図３】図３は、ＲＣＴ経路の２つの成分または部分である流出／動員および排出を説明する。
【図４Ａ】図４Ａは、プラトーの原則、および同位体希釈による分子流速または分子出現速度（Ｒａ）の測定のためのモデルを図解する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、コレステロールのＲａを測定するためのプラトーの原則の適用、およびＲａコレステロールを測定するためのプロトコルを説明する。
【図５】図５は、３人のヒト被験体についての１３Ｃ２−コレステロール注入時間に対する１３Ｃ  ＡＰＥを示す。プラトーへの指数近似のための曲線フィッティングおよびフィッティングパラメータはそれぞれのグラフ上に含まれる。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒト被験体において測定されたコレステロール流出／動員速度、すなわちＲａコレステロールの代表値を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｒａコレステロールの反復測定に対する被験体内再現性を示す。
【図７】図７は、様々な食餌を与えられたラットにおけるコレステロールの流出速度を示す。コレステロール／コール酸摂食により増加した血漿コレステロールＲａの変化は、通常食に戻した４日後も持続する。
【図８Ａ】図８Ａは、投与された標識コレステロールの糞便ステロール中への排出効率の測定プロトコルを説明する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、投与された標識コレステロールの排出効率に対する、７日間のラットのＬＸＲアゴニストによる処理の効果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｒａが個体において増加した場合、アーチファクトとして排出効率が低下するため、投与された標識コレステロールの排出効率を、組織での流出／流入（Ｒａコレステロール）に対して修正することの必要性を図解する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、組織からの血液を介した糞便内へのコレステロールの流れを示す、包括的ＲＣＴパラメータの算出の基礎を説明する。
【図９Ｃ】図９Ｃは、組織から血液への流れ（流出／動員）および血液から糞便への流れ（排出）を包含する、測定される包括的ＲＣＴ過程を図解する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＬＸＲアゴニスト（ＴＯ−９０１３１７）を投与されたラットでの、ＲＣＴの成分および中性ステロール中へのＲＣＴの「包括的パラメータ」の算出を示す。ラットにＬＸＲアゴニストを７日間投与し、ＲＣＴ流を測定した。Ａ）Ｒａコレステロール。Ｂ）血漿コレステロールの胆汁酸中への排出。Ｃ）２つの成分の積（有意な増加が観察された）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＬＸＲ誘導性遺伝子発現と包括的ＲＣＴ流との間の関係を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、コレスチラミンを投与されたラットでの、ＲＣＴの成分および中性ステロール中へのＲＣＴの「包括的パラメータ」の算出を示す。ラットに胆汁酸結合物質であるコレスチラミンを７日間投与し、ＲＣＴ流を測定した。Ａ）Ｒａコレステロール。Ｂ）血漿コレステロールの中性ステロール中への排出。Ｃ）２つの成分の積（有意な効果は観察されなかった）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、コレスチラミンを投与されたラットでの、ＲＣＴの成分および胆汁酸中へのＲＣＴの「包括的パラメータ」の算出を示す。ラットに胆汁酸結合物質（コレスチラミン）を７日間投与し、ＲＣＴ流を測定した。Ａ）Ｒａコレステロール。Ｂ）血漿コレステロールの胆汁酸への排出。Ｃ）２つの成分の積（有意な増加が観察された）。
【図１２】図１２Ａは、エゼチミブを投与されたラットでの、ＲＣＴの成分および中性ステロール中へのＲＣＴの「包括的パラメータ」の算出を示す。ラットにエゼチミブを７日間投与し、その後ＲＣＴ流を測定した。Ａ）Ｒａコレステロール。Ｂ）血漿コレステロールの中世ステロールへの排出。Ｃ）２つの成分の積（有意な増加が観察された）。
【図１３Ａ】図１３Ａは、包括的ＲＣＴおよびＲＣＴの２つの成分を含む、ヒト被験体で測定された糞便中性ステロール中へのＲＣＴパラメータを示す。被験体での低濃度または高濃度のＨＤＬコレステロールとの関係が示される。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、包括的ＲＣＴおよびＲＣＴの２つの成分を含む、ヒト被験体で測定された糞便胆汁酸中へのＲＣＴパラメータを示す。被験体での低濃度または高濃度のＨＤＬコレステロールとの関係が示される。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ヒト被験体での糞便中性ステロールおよび胆汁酸中への包括的ＲＣＴの平均値を示す。
【図１４】図１４は、ラットにおいて測定されたｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成速度、ならびにｄｅ  ｎｏｖｏコレステロール合成速度に対する薬物および食餌の効果を示す。
【図１５】図１５は、同位体標識コレステロール誘導体（コレステロールを含む）およびコレステロールエステルの非限定的なリストを示し、それらの構造および標識が各分子に付加されうる位置を詳述する。
【図１６】図１６は、同位体標識胆汁酸および胆汁酸代謝産物の非限定的なリストを示し、それらの構造および標識が各分子に付加されうる位置を詳述する。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ヒトでの流出／動員（Ｒａ）の測定プロトコルを図解する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ヒトでのコレステロール排出効率の測定プロトコルを図解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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