(57)【要約】  骨または軟骨の状態を治療、予防または改善する薬剤組成物、および同組成物を作製し使用する方法を本明細書で提供する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における骨に関連する状態を治療、予防、または改善するための薬剤組成物であって、有効量のＮＥＬＬペプチド、またはＮＥＬＬ  ＲＮＡを含む薬剤組成物。
【請求項２】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬペプチドの最適な投与量の範囲を実質的に超えない投与量である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ１ペプチドの断片、ＮＥＬＬ２ペプチドの断片、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記骨に関連する状態が、頭蓋顔面骨発生、非頭蓋顔面骨発生、長骨発生、歯周部の骨発生、膜内骨発生、軟骨内骨発生、軟骨再生、軟骨肥大およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記骨に関連する状態が、骨粗鬆症、微小重力による骨の消失、廃用性萎縮、長期のベッド休養、および骨代謝が副次的作用である複数の症状を伴う疾患からなる群から選択される、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記複数の症状を伴う疾患により病的石灰化が生じる、請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記複数の症状を伴う疾患が、腎性骨形成異常および／または血管石灰化を引き起こす慢性腎疾患である、請求項６に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記骨に関連する状態が、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、または前立腺結石である、請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはその組合せである、請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
化学物質によって、あるいはナノケージまたは生体材料中にＮＥＬＬ  ＲＮＡを組み込むことによってＮＥＬＬ  ＲＮＡを安定化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
哺乳動物における頭蓋縫合にわたる骨過剰増殖の治療、予防または改善のための作用物質を有効量を含む薬剤組成物であって、前記作用物質が、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質、ＮＥＬＬペプチドの受容体のアンタゴニスト、およびその組合せからなる群から選択される薬剤組成物。
【請求項１２】
哺乳動物における軟骨に関連する骨状態を治療または予防するための薬剤組成物であって、軟骨の再生に有効な少なくとも１つの作用物質を有効量含み、前記作用物質が、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質、ＮＥＬＬペプチドの受容体のアンタゴニスト、ＮＥＬＬペプチドの亢進物質、ＮＥＬＬ  ＲＮＡおよびその組合せからなる群から選択される薬剤組成物。
【請求項１３】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ１ペプチドの断片、ＮＥＬＬ２ペプチドの断片、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはその組合せである、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
化学物質によって、あるいはナノケージまたは生体材料中に前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡを組み込むことによってＮＥＬＬ  ＲＮＡを安定化する、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記作用物質が、関節表面再建、顎関節再建、関節炎修復、または椎間円板修復に有効である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
骨に関連する状態の治療、予防または改善に有効な量の、ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
前記調節物質が、ＮＥＬＬペプチド受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＮＥＬＬペプチドを安定化または分解する分子、ＮＥＬＬペプチド受容体を安定化または分解する分子、最初の受容体連結反応後のＮＥＬＬペプチドと受容体との複合体の安定化およびリン酸化に関与する分子、ＮＥＬＬペプチド受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのアゴニスト、ＮＥＬＬペプチド受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのアンタゴニスト、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記骨に関連する状態が、骨粗鬆症、微小重力による骨の消失、廃用性萎縮、長期のベッド休養、および骨代謝が二次的作用である複数の症状を伴う疾患からなる群から選択される、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
前記複数の症状を伴う疾患により病的石灰化が生じる、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
前記複数の症状を伴う疾患が、腎性骨形成異常および／または血管石灰化を引き起こす慢性腎疾患である、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
前記骨に関連する状態が、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、または前立腺結石である、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
哺乳動物中の骨に関連する状態を治療、予防、または改善するための薬剤組成物であって、有効量のＮＥＬＬペプチドの誘導体を含む薬剤組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容される担体が、経口投与、局所投与、ｉｎ  ｓｉｔｕインプラント、静脈内投与、非経口投与、局部投与、動脈内注射、骨折部位への注射、および生体分解性基質での送達からなる群から選択される送達の形態用の担体である、請求項２４に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
骨に関連する状態が、微小重力による骨の消失、廃用性萎縮、長期のベッド休養、および骨代謝が副次的作用である複数の症状を伴う疾患からなる群から選択される、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
前記複数の症状を伴う疾患により病的石灰化が生じる、請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
前記複数の症状を伴う疾患が、腎性骨形成異常および／または血管石灰化を引き起こす慢性腎疾患である、請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
前記骨に関連する状態が、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、または前立腺結石である、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
前記ＮＥＬＬペプチドの誘導体が、物理的に修飾されたＮＥＬＬ１ペプチドまたはＮＥＬＬ２ペプチドである、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
前記ＮＥＬＬペプチドの誘導体が、化学的に修飾されたＮＥＬＬ１ペプチドまたはＮＥＬＬ２ペプチドである、請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
前記ＮＥＬＬペプチドの誘導体が、ＰＥＧ化ＮＥＬＬ１ペプチド、ＰＥＧ化ＮＥＬＬ２ペプチド、少なくとも１つの短い炭化水素基を含むＮＥＬＬ１ペプチド、または少なくとも１つの短い炭化水素基を含むＮＥＬＬ２ペプチドから選択される、請求項３１に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
前記化学的に修飾されたＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１ペプチド模倣物またはＮＥＬＬ２ペプチド模倣物である、請求項３１に記載の薬剤組成物。
【請求項３４】
製剤上許容される担体をさらに含む、請求項１から３３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項３５】
第２の作用物質をさらに含み、骨発生、あるいは骨に関連する状態の治療、予防、または改善に有効である、請求項１から３３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
前記第２の作用物質が、ＢＭＰタンパク質、ＴＧＦβタンパク質、ＦＧＦタンパク質、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＶＥＧＦ、およびその組合せからなる群から選択される、請求項３５に記載の薬剤組成物。
【請求項３７】
骨状態が、骨折、脊椎固定、長骨骨折、頭蓋顔面骨の治癒または形成、歯科または整形外科インプラントの組み込み、歯科インプラントの組み込み、あるいはその組合せからなる群から選択される、請求項３６に記載の薬剤組成物。
【請求項３８】
製剤上許容される担体をさらに含む、請求項３５に記載の薬剤組成物。
【請求項３９】
経口送達、非経口送達、肺送達および埋め込みからなる群から選択される送達の形態に適した製剤中の、請求項１から３３のいずれかに記載の薬剤組成物。
【請求項４０】
骨に関連する状態を治療、予防、または改善する方法であって、請求項１から３３のいずれかに記載の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
骨芽細胞または骨形成を誘導する方法であって、
細胞を、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬ  ＲＮＡおよび任意で第２の作用物質を含む組成物と接触させるステップ
を含む方法。
【請求項４２】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ１ペプチドの断片、ＮＥＬＬ２ペプチドの断片、およびその組合せからなる群から選択され、
前記第２の作用物質が、ＢＭＰタンパク質、ＴＧＦβタンパク質、ＦＧＦタンパク質、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、およびその組合せからなる群から選択され、
前記細胞が、幹細胞、骨髄間質細胞、線維芽細胞、または脂肪由来細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはその組合せである、請求項４１に記載の薬剤組成物。
【請求項４５】
化学物質によって、あるいはナノケージまたは生体材料中に前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡを組み込むことによってＮＥＬＬ  ＲＮＡを安定化する、請求項４１に記載の薬剤組成物。
【請求項４６】
骨形成を誘導する方法であって、
骨基質を、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬ  ＲＮＡおよび任意で第２の作用物質を含む組成物と接触させるステップ
を含む方法。
【請求項４７】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ１ペプチドの断片、ＮＥＬＬ２ペプチドの断片、およびその組合せからなる群から選択され、
前記第２の作用物質が、ＢＭＰタンパク質、ＴＧＦβタンパク質、ＦＧＦタンパク質、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＶＥＧＦ、およびその組合せからなる群から選択され、
前記骨基質が、脱無機化骨基質または無機化骨基質である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはその組合せである、請求項４６に記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
化学物質によって、あるいはナノケージまたは生体材料中に前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡを組み込むことによってＮＥＬＬ  ＲＮＡを安定化する、請求項４６に記載の薬剤組成物。
【請求項５０】
ＮＥＬＬ関連ペプチドの受容体の調節物質を同定する方法であって、
ＮＥＬＬペプチドの受容体分子を試験化合物と接触させるステップと、
前記ＮＥＬＬペプチドを前記受容体分子および前記試験化合物と接触させるステップと、
前記試験化合物がある状態での前記ＮＥＬＬペプチドと前記受容体分子の結合の程度を検出するステップと、
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の前記結合の程度を、前記試験化合物がない状態での前記ＮＥＬＬペプチドと前記受容体分子の結合の程度を検出することによって得られる対照の結合の程度と比較するステップと、
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の前記結合の程度が、前記対照の結合の程度と異なる場合に、前記試験化合物をＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質に指定するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記指定するステップが、
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の前記結合の程度が、前記対照の結合の程度より低い場合に、前記調節物質をＮＥＬＬペプチドの受容体のアンタゴニストに指定するステップ、または
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の前記結合の程度が、前記対照の結合の程度より高い場合に、前記調節物質をＮＥＬＬペプチドの受容体のアゴニストに指定するステップ
をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＮＥＬＬペプチドを産生する方法であって、宿主細胞中でＮＥＬＬ遺伝子をコードする核酸構築物を発現させるステップを含む方法。
【請求項５３】
前記核酸構築物がさらにシグナルペプチドの遺伝子をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記構築物が、配列番号１〜８１から選択される配列を有する遺伝子を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記構築物が、配列番号８２〜８７から選択されるプロモーター遺伝子および／または配列番号８８〜９５から選択されるシグナルペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸構築物が、ＮＥＬＬペプチドのゲノムＤＮＡ中の非コード遺伝子をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＮＥＬＬペプチドがＮＥＬＬ１である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記構築物が、分泌を促進するペプチドを発現する遺伝子をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
請求項５２から５９のいずれかに従って産生された組換えＮＥＬＬペプチド。
【請求項６１】
ＮＥＬＬペプチドの発現を誘導する分子を同定する方法であって、
ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子を試験化合物と接触させるステップと、
前記ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルを検出するステップと、
ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルを、前記試験化合物がない状態での前記ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルと比較するステップと、
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルと異なる場合に、前記試験化合物をＮＥＬＬペプチドの発現の調節物質に指定するステップと
を含む方法。
【請求項６２】
前記指定するステップが、
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルより低い場合に、前記調節物質をＮＥＬＬペプチドの発現の阻害物質に指定するステップ、または
試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の前記発現のレベルより高い場合に、前記調節物質をＮＥＬＬペプチドの発現の亢進物質に指定するステップ
をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
哺乳動物中のＮＥＬＬペプチドの発現を調節する方法であって、請求項６１および６２のいずれかに従って同定された調節物質を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【請求項６４】
請求項６１から６２のいずれかに従って同定された調節物質を含む薬剤組成物。
【請求項６５】
有効量のＮＥＬＬペプチド、またはＮＥＬＬ  ＲＮＡを含む足場。
【請求項６６】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬペプチドの最適な投与量の範囲を実質的に超えない投与量である、請求項６５に記載の足場。
【請求項６７】
前記ＮＥＬＬペプチドが、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＥＬＬ１ペプチドの断片、ＮＥＬＬ２ペプチドの断片、およびその組合せからなる群から選択される、請求項６５に記載の足場。
【請求項６８】
前記骨に関連する状態が、頭蓋顔面骨発生、非頭蓋顔面骨発生、長骨発生、歯周部の骨発生、膜内骨発生、軟骨内骨発生、軟骨再生、軟骨肥大およびその組合せからなる群から選択される、請求項６５に記載の足場。
【請求項６９】
前記骨に関連する状態が、骨粗鬆症、微小重力による骨の消失、廃用性萎縮、長期のベッド休養、および骨代謝が二次的作用である複数の症状を伴う疾患からなる群から選択される、請求項６５に記載の足場。
【請求項７０】
前記複数の症状を伴う疾患により病的石灰化が生じる、請求項６９に記載の足場。
【請求項７１】
前記複数の症状を伴う疾患が、腎性骨形成異常および／または血管石灰化を引き起こす慢性腎疾患である、請求項７０に記載の足場。
【請求項７２】
前記骨に関連する状態が、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、または前立腺結石である、請求項６９に記載の足場。
【請求項７３】
前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはその組合せである、請求項６５に記載の足場。
【請求項７４】
化学物質によって、あるいはナノケージまたは生体材料中に前記ＮＥＬＬ  ＲＮＡを組み込むことによってＮＥＬＬ  ＲＮＡを安定化する、請求項６５に記載の足場。
【請求項７５】
骨に関連する状態を治療、予防、または改善する方法であって、請求項１から３３のいずれかに記載の足場を哺乳動物に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、骨状態を治療または予防する薬剤組成物に関する。これらの薬剤組成物を使用して、創傷治癒および組織修復において骨および／または軟骨形成を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
整形外科的骨状態および頭蓋顔面骨状態の治療費は、著しい生物医学上のな負担となっている。２００２年米国医療費および利用事業（２００２  ＵＳ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｏｓｔ  ＆  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）によれば、頭蓋手術（開頭術および頭蓋骨切除術）および顔面外傷再建単独の病院費は、約５億４９００万ドルおよび４億ドルとそれぞれ概算されている（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｃ．，Ａ．Ｅｌｉｘｈａｕｓｅｒ、およびＪ．Ｓｃｈｎａｉｅｒ、Ｅｆｆ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、２００２．５（３）：ｐ．１４３〜５１）。整形外科手術（外傷と非外傷の両方）の病院費は、整形外科産業単独の売上高が２００２年で１３０億ドルと概算されている（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、Ｍｅｒｒｉｌｌ  Ｌｙｎｃｈ、２００３．ｐ．１１）ので、さらに高額である可能性が高い。
【０００３】
全体的に、整形外科的骨状態および頭蓋顔面骨状態の治療において遭遇する主要な問題は、骨および／または軟骨形成の調節に関係する。好ましくは、特定の状態の治療の一部として（例えば、整形外科的な骨折または頭蓋顔面の骨折の修復、脊椎固定手術、関節固定手術、損傷した骨粗鬆症の骨）、または特定の状態の予防の一部として（例えば、骨粗鬆症の骨の骨折予防）骨形成を高め、または促進させることが望ましい条件下で骨形成を増大させることができる。長骨骨折では、軟骨の肥大を促進させることにより軟骨内骨形成を促進させ、骨で置換することが望ましい。さらに好ましくは、特定の状態の治療または予防の一部として（例えば、頭蓋骨癒合症という、早期の縫合の癒合をもたらす、縫合にわたる早期の頭蓋冠の過剰増殖の状態；異所性骨化という、異所性の場所での異常な骨形成の状態）骨形成を低下させまたは阻害することが望ましい条件下で骨形成を低下させることもできる。同様に、軟骨形成を高め、または促進させることが望ましい条件下で（例えば、関節表面再建、顎関節再建、関節円板修復、椎間円板修復および再生）軟骨形成を増大させることが好ましい。
【０００４】
骨状態の治療のための組成物について、多くが記載されている（表１）。全部ではないが、ほとんどは、骨伝導性および／または骨誘導性を介して骨形成を促進する組成物について記載するものである。一般に、骨誘導性のある組成物が骨伝導性のあるものより骨の形成に有効であることが、当技術分野で十分に明らかとなっている；しかし、どちらも最適な骨形成には必要である（表１）。多数の骨状態の治療で現在「最も標準的な」組成物は、自己骨移植片であり、それは骨誘導性も骨伝導性も有する。しかし、自己移植片採取は、疼痛、歩行障害、腸骨稜供与部位についての大腿感覚異常を含めて、著しい供与部位の病的状態を伴う可能性がある（Ｌａｕｒｉｅ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、１９８４．７３（６）：ｐ．９３３〜８）。したがって、より良好な自己移植片代替物の決定的な必要性が存在する。骨誘導能のある化合物のうち、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が広範に記載されている。骨伝導性の担体と合わせたとき、ＢＭＰは、多数の骨状態の治療について、自己移植片に等しい、またはそれをも超える最も大きな展望をもたらす（Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｏｐｒａｎ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ、２００２（３９５）：ｐ．１１０〜２０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＢＭＰの機能的異質性が知られており（Ｄｕｔｙ，Ｐ．およびＧ．Ｋａｒｓｅｎｔｙ、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ、２０００．５７（６）：ｐ．２２０７〜１４；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ、２００３．６３（６）：ｐ．２０３７〜４９）、骨誘導に必要なＢＭＰの投与量が高いことから、費用の検討、および上顎洞の嚢胞形成などの予測不能な副作用（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ、２０００．２７（９）：ｐ．６２７〜３６）によりその使用が制限される可能性がある。したがって、骨および／または軟骨形成を促進する、ＢＭＰに対して代替性のあるまたは相補的な骨誘導性分子の臨床的商業的な必要性が継続して存在する。さらに、骨誘導性ＢＭＰによって扱われない特定の条件下で骨および／または軟骨形成を阻害する臨床的商業的な必要性が継続して存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
下記に記載する実施形態は、上記で明らかとなった問題および必要性を検討するものである。
【０００７】
本発明の一態様では、１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドやＮＥＬＬ  ＲＮＡなどの１つまたは複数の作用物質を含む薬剤組成物を本明細書で提供する。一実施形態では、薬剤組成物は、損傷後の骨発生の促進、例えば、長骨骨折治癒、脊椎固定、および頭蓋顔面骨修復を介した骨状態の治療に有効な量の１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドを含む。他の実施形態では、薬剤組成物は、明らかな骨損傷（例えば、骨粗鬆症、股関節壊死、および顎堤骨再吸収）の証拠を必ずしも伴わない骨発生の促進を介した骨状態の治療または予防に有効な量の１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、骨代謝が二次的作用である複数の症状を伴う疾患／状態の症状の治療、予防、改善、緩和または軽減に有効であり、それを行うのに使用することができる。そのような疾患または状態の例には、それだけに限らないが、腎性骨形成異常および血管石灰化を含めた多数の全身作用を引き起こすことができる慢性腎疾患がある。Ｎｅｌｌは望ましくない骨形成を刺激せずに骨形成を増大させることができ、したがって、それは体内の非骨細胞（例えば、前癌細胞）の増殖を刺激せずに骨区画中で骨だけの形成を刺激することができ、結果的に、標的骨形成により、腎損傷による骨の消失が軽減される。ＮＥＬＬ誘導性の無機化はまた、その他の場合では血管などの正常な非石灰化組織中で病的石灰化をなすカルシウムおよびリン酸イオンをも消費する。他の形の病的石灰化は、多因性の原因（細菌性、パラクライン性、オートクライン性など）を有する。骨沈着と骨再吸収との均衡を促すＮｅｌｌの能力により、本明細書に記載の組成物が、骨区画中の不可欠なイオンの維持および非骨組織中のそのバイオアベイラビリティーの低下に有効な組成物となり、それによって、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、および／または前立腺結石のリスクが低下する。
【０００９】
本発明の他の態様では、本発明は、骨発生（例えば、頭蓋骨癒合症または異所性骨化、骨化石症）の阻害に有効な量のＮＥＬＬペプチド阻害物質を含む薬剤組成物を提供する。本発明のさらに他の態様では、本発明は、骨発生を阻害するのに十分高い投与量のＮＥＬＬペプチドを含む薬剤組成物を提供する。本発明のさらなる態様では、本発明は、骨発生、例えば、頭蓋顔面または長骨発生の促進に有効な量の、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む薬剤組成物を提供する。調節物質は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体のアゴニストでよい。他の実施形態では、薬剤組成物は、骨粗鬆症や顎堤骨再吸収など骨質量を低下させる骨状態の治療または予防に有効な量の、骨発生を促進するＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む。調節物質は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体のアゴニストでよい。
【００１０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、骨発生、例えば、頭蓋顔面または長骨発生の阻害に有効な量の、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む薬剤組成物を提供する。調節物質は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体のアンタゴニストでよい。一実施形態では、薬剤組成物は、骨化石症など骨質量を増大させる骨状態の治療または予防に有効な量の、骨発生を阻害するＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む。調節物質は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体のアンタゴニストでよい。
【００１１】
本発明のさらなる態様では、本発明は、ＮＥＬＬペプチドの１つまたは複数の亢進物質を含む、骨発生のための薬剤組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様では、本発明は、軟骨が関連する骨状態の治療または予防（例えば、関節表面再建、顎関節再建、関節炎修復、または椎間円板修復）に有効な量の、軟骨の発生を直接的にまたは間接的に促進する少なくとも１つの作用物質を含む薬剤組成物を提供する。軟骨発生を直接的に促進する作用物質の１つは、それだけに限らないが、軟骨芽細胞、軟骨細胞や、軟骨前駆細胞などの軟骨形成細胞、幹細胞、骨髄細胞、骨髄間質細胞、線維芽細胞、または脂肪由来細胞に適用するＮＥＬＬペプチドでよい。（例えば、軟骨芽細胞／軟骨細胞分化の誘導を介して）軟骨発生を間接的に促進する作用物質は、例えば、ＮＥＬＬペプチドの１つ、またはＮＥＬＬペプチド受容体のアゴニストでよい。
【００１３】
骨によるさらなる軟骨置換を予防するために軟骨内骨形成の阻害が所望されるある特定の条件下で、薬剤組成物は、例えば、ＮＥＬＬペプチド受容体の１つまたは複数の阻害物質またはアンタゴニスト、高投与量ＮＥＬＬペプチド、またはその組合せを含むことができる。そのような組成物は、それだけに限らないが、骨芽細胞、骨前駆細胞、幹細胞、骨髄細胞、線維芽細胞、硬膜細胞、骨膜細胞、周細胞、および／または筋細胞などの潜在的なまたはコミットした骨形成細胞の阻害による骨芽細胞分化の阻害に有効である。
【００１４】
本発明のさらなる態様では、ＮＥＬＬプロモーターを制御する小分子を介して骨形成を誘導することができる。
【００１５】
上記に記載の薬剤組成物は、場合によっては、全身または局所送達に適した形の送達用の製剤上許容される担体を含むこともできる。例えば、製剤上許容される担体は、経口送達、肺送達、非経口送達または植え込み用の担体でよい。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、本発明は、骨状態を治療または予防する方法を提供する。その方法は一般に、本明細書に記載の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００１７】
薬剤組成物を製剤して、適切な形の送達用の様々な製剤にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の一態様では、骨状態を治療または予防する１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドなどの１つまたは複数の作用物質を含む薬剤組成物を本明細書で提供する。一実施形態では、薬剤組成物は、調節（例えば、骨発生、例えば頭蓋顔面骨発生、歯科インプラントの組み込み、歯周部の骨発生、歯科または整形外科インプラントの組み込み、長骨骨折治癒、脊椎固定あるいはその組合せの促進）に有効な量の１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドを含む。他の実施形態では、薬剤組成物は、骨粗鬆症などの骨状態の治療または予防に有効な量の１つまたは複数のＮＥＬＬペプチドを含む。
【００１９】
本発明の他の態様では、本発明は、頭蓋縫合にわたる骨過剰増殖の治療または予防に有効な量のＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの阻害物質を含む薬剤組成物を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、骨発生、例えば、頭蓋顔面骨発生の促進に有効な量の、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む薬剤組成物を提供する。調節物質は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体のアゴニストまたはアンタゴニストでよい。調節物質は、それ自体で受容体を活性化または阻害することができる。他の実施形態では、薬剤組成物は、骨粗鬆症などの骨状態の治療または予防に有効な量の、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドの受容体の調節物質を含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、本発明は、軟骨に関連する骨状態の治療または予防に有効な量の、軟骨の発生を促進する少なくとも１つの作用物質を含む薬剤組成物を提供する。作用物質は、ＮＥＬＬペプチド阻害物質の１つ、ＮＥＬＬペプチド受容体のアンタゴニスト、およびその組合せでよい。
【００２２】
上記に記載の薬剤組成物は、場合によっては、全身または局所送達に適した形の送達用の製剤上許容される担体を含むこともできる。例えば、製剤上許容される担体は、経口送達、非経口送達または植え込み用の担体でよい。
【００２３】
本発明のさらなる態様では、本発明は、骨状態を治療または予防する方法を提供する。その方法は一般に、本明細書に記載の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。
【００２４】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の組成物を使用して、骨基質と併せて骨形成を誘導することができる。骨基質は、脱無機化骨基質でもよく、あるいは無機化骨基質でもよい。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、本明細書で提供する薬剤組成物を使用して、幹細胞をその組成物と接触させることにより幹細胞を誘導して骨芽細胞へと分化させることができる。幹細胞は、胚性幹細胞でもよく、あるいは成体幹細胞でもよい。さらに、その薬剤組成物を使用して、骨髄間質細胞を本明細書に記載の組成物と接触させることにより骨髄間質細胞を誘導して骨にすることができる。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の組成物は、例えば、微小重力による骨の消失、廃用性萎縮、長期のベッド休養などに関係する状態の症状の治療、予防、改善、緩和、または軽減に有効であり、それを行うのに使用することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、骨代謝が二次的作用である複数の症状を伴う疾患／状態の症状の治療、予防、改善、緩和または軽減に有効であり、それを行うのに使用することができる。そのような疾患または状態の例には、それだけに限らないが、腎性骨形成異常および血管石灰化を含めた多数の全身作用を引き起こすことができる慢性腎疾患がある。Ｎｅｌｌは望ましくない骨形成を刺激せずに骨形成を増大させることができ、したがって、それは体内の非骨細胞（例えば、前癌細胞）の増殖を刺激せずに骨区画中で骨だけの形成を刺激することができ、結果的に、標的骨形成により、腎損傷による骨の消失が軽減される。ＮＥＬＬ誘導性の無機化はまた、その他の場合では血管などの正常な非石灰化組織中で病的石灰化をなすカルシウムおよびリン酸イオンをも消費する。他の形の病的石灰化は、多因性の原因（細菌性、パラクライン性、オートクライン性など）を有する。骨沈着と骨再吸収との均衡を促すＮｅｌｌの能力により、本明細書に記載の組成物が、骨区画中の不可欠なイオンの維持および非骨組織中のそのバイオアベイラビリティーの低下に有効な組成物となり、それによって、異所性の軟組織石灰化、胆石、腎結石、松果体石灰化、白内障、唾石、心臓弁、および／または前立腺結石のリスクが低下する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞において骨形成を促進する薬剤組成物を提供する。そのような哺乳動物細胞の例には、それだけに限らないが、幹細胞、骨髄間質細胞、線維芽細胞、または脂肪由来細胞がある。
【００２９】
本明細書において、「ＮＥＬＬ（Ｎｅｌ様分子−１；Ｎｅｌ（上皮成長因子様ドメインをコードする、神経組織中で強く発現しているタンパク質））ペプチド」は、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ポリペプチド、あるいはその断片；ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２関連ポリペプチド、あるいはその断片；「ＮＥＬＬペプチド」と著しい相同性がある任意のポリペプチドまたはその断片でよい。著しい相同性は、「ＮＥＬＬペプチド」との＞５０％の相同性、例えば、「ＮＥＬＬペプチド」との＞６０％の相同性、「ＮＥＬＬペプチド」との＞７０％の相同性、または「ＮＥＬＬペプチド」との＞８０％の相同性を意味すると解釈することができる。ＮＥＬＬペプチドは、突然変異していない野生型配列を有する天然および／または組換えＮＥＬＬペプチド、あるいは依然としてＮＥＬＬペプチドとの著しい相同性を含む突然変異した野生型配列を有する組換えＮＥＬＬペプチドでよい。さらに、ＮＥＬＬペプチドは、それだけに限らないが、ヒト細胞、細菌、酵母、昆虫や植物の細胞などの生物に由来するものでよい。いくつかの実施形態では、「ＮＥＬＬペプチド」という用語は、ＮＥＬＬペプチドの構造的、機能的または高次構造的同等物を含む。本明細書において、ＮＥＬＬペプチドの構造的同等物とは、ＮＥＬＬペプチドまたはＮＥＬＬペプチドの機能ドメインのものと同等のまたは実質的に類似する構造を含むタンパク質またはペプチドを指す。ＮＥＬＬペプチドの機能的同等物とは、ＮＥＬＬペプチドまたはＮＥＬＬペプチドの機能ドメインのものと同等のまたは実質的に類似する機能を有するタンパク質またはペプチドを指す。ＮＥＬＬペプチドの高次構造的同等物とは、ＮＥＬＬペプチドまたはＮＥＬＬペプチドの機能ドメインのものと同等のまたは実質的に類似する高次構造を有するタンパク質またはペプチドを指す。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＥＬＬペプチドは、ＮＥＬＬペプチドの誘導体でよい。本明細書において「誘導体」という用語は、ＮＥＬＬペプチドに由来する任意の化学的または生物学的な化合物または物質、その構造的同等物、あるいはその高次構造的同等物を指す。例えば、そのような誘導体は、ＮＥＬＬペプチドの任意のプロドラッグ形態、ＰＥＧ化形態、あるいはＮＥＬＬペプチドをより安定にし、またはより骨親和性または親油性にする任意の他の形態を含み得る。いくつかの実施形態では、誘導体は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（アミノ酸）、Ｃ１〜Ｃ２０の炭素を有するヒドロカルビル短鎖、または生体適合性ポリマーが結合したＮＥＬＬペプチドでよい。いくつかの実施形態では、「誘導体」という用語は、ＮＥＬＬペプチド模倣物を含み得る。ペプチドの模倣物の合成は、当技術分野において十分に記載されている。下記に、ペプチド模倣物を含めたペプチドの合成についての基本的な手順の例を記載する：
【００３１】
ペプチド合成を開始する前に、アミノ酸（開始物質）のアミン末端を、ＦＭＯＣ（９−フルオロメチルカルバメート）または他の保護基で保護することができ、メリフィールド樹脂（遊離アミン）などの固体支持体を開始剤として使用する。次いで、ステップ（１）〜ステップ（３）の反応を行い、所望のペプチドが得られるまでそれを反復する：（１）カルボジイミドの化学反応を使用して遊離アミンをカルボキシル末端と反応させ、（２）アミノ酸配列を精製し、（３）弱酸性条件下で保護基、例えば、ＦＭＯＣ保護基を除去して、遊離アミンを得る。次いで、ペプチドを樹脂から切断して、まっすぐに伸びた遊離ペプチドまたはペプチド模倣物を得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチド誘導体は、物理的にまたは化学的に修飾されたＮＥＬＬペプチドを含む。物理的に修飾されたペプチドは、例えば、対イオンとのイオン対の形成などのイオン力による修飾、水素結合による修飾、ｐＨの調節による修飾、溶媒選択による修飾、またはフォールディング／アンフォールディングの温度、ｐＨ、溶媒、およびフォールディング／アンフォールディングの異なる段階での持続時間の選択が関与し得る異なるタンパク質フォールディング／アンフォールディング手順の使用による修飾による修飾物でよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ペプチド誘導体は、化学的に修飾されたＮＥＬＬペプチドを含み得る。例えば、短い（複数の）炭化水素基（例えば、メチルまたはエチル）を、ＮＥＬＬペプチド分子上の１つまたは複数の部位に選択的に結合して、ペプチドの化学的および／または物理的特性を修飾することができる。いくつかの実施形態では、通常知られているタンパク質ＰＥＧ化の手順（例えば、Ｍｏｋ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１１（１）：６６〜７９（２００５）を参照）により、（複数の）モノ−、オリゴ−、またはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）基を、ＮＥＬＬペプチド分子上の１つまたは複数の部位に選択的に結合して、ペプチドの化学的および／または物理的特性を修飾することができる。
【００３４】
「ＮＥＬＬペプチドの阻害物質」という用語は、ＮＥＬＬペプチドの活性を阻害することができる化学的または生物学的な化合物を指す。その用語はまた、ＮＥＬＬペプチドの発現を抑制することができる化学的または生物学的な化合物をも含む。ＮＥＬＬペプチドの阻害物質は、ＮＥＬＬペプチドの転写物または翻訳産物と直接的にまたは間接的に相互作用することができる。例として、相互作用の方法は、それだけに限らないが、ＮＥＬＬペプチドの転写または翻訳の低下、ＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の安定性の低下、ＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の活性の低下、およびＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の分解の増大を含み得る。「ＮＥＬＬペプチドの亢進物質」という用語は、ＮＥＬＬペプチドの活性を亢進することができる化学的または生物学的な化合物を指す。その用語はまた、ＮＥＬＬペプチドの発現を亢進することができる化学的または生物学的な化合物をも含む。例として、相互作用の方法は、それだけに限らないが、ＮＥＬＬペプチドの転写または翻訳の増大、ＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の安定性の増大、ＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の活性の増大、およびＮＥＬＬペプチド転写物またはタンパク質産物の分解の低下を含み得る。
【００３５】
「ＮＥＬＬペプチド受容体の調節物質」という用語は、ＮＥＬＬペプチドとの、またはそれによるＮＥＬＬペプチド受容体の結合を促進または阻害することができる化学的または生物学的な化合物、あるいは、ＮＥＬＬペプチドの存在の有無と無関係にＮＥＬＬペプチド受容体の活性を調節することができる化学的または生物学的な化合物を指す。ＮＥＬＬペプチドとの、またはそれによるＮＥＬＬペプチド受容体の結合および／または活性化を促進する調節物質を、受容体の「アゴニスト」と称し、ＮＥＬＬペプチドとの、またはそれによるＮＥＬＬペプチド受容体の結合および／または活性化を阻害する調節物質を、受容体の「アンタゴニスト」と称する。ＮＥＬＬペプチドと無関係にＮＥＬＬペプチド受容体の活性化を促進する調節物質を、受容体の「活性化物質」と称し、ＮＥＬＬペプチドと無関係にＮＥＬＬペプチド受容体の活性化を阻害する調節物質を、受容体の「阻害物質」と称する。
【００３６】
「ＮＥＬＬペプチド」、「ＮＥＬＬペプチドの阻害物質」、または「（複数の）ＮＥＬＬペプチド受容体の調節物質」という用語はまた、本明細書全体を通じて「作用物質」とも称する。
【００３７】
「骨状態」という用語は、それだけに限らないが、１）不慮のまたは医原性の整形外科的損傷後［例えば、外傷（例えば、長骨骨折）（図７Ｂ〜Ｄを参照）、または手術（例えば、脊椎固定）（図２、９および１０を参照）に由来］などの骨形成の増大または低下による骨の治癒および再生の調節；２）明らかな整形外科的損傷［例えば、股関節部の骨壊死、骨粗鬆症（骨質量の低下）、骨化石症（骨質量の増大）］の証拠を伴わない骨形成の増大または低下による骨質量の調節；３）不慮のまたは医原性の頭蓋顔面骨および／または歯周部損傷後［例えば、外傷（例えば、頭蓋顔面骨折）、手術（例えば、口唇裂／口蓋裂修復、頭蓋欠損修復）（図４、５および６を参照）または歯科的手順（例えば、抜歯、歯科インプラント留置）に由来］などの骨形成の増大または低下による骨の治癒および再生の調節；４）明らかな頭蓋顔面骨および／または歯周部損傷の証拠を伴わない骨形成の増大または低下による骨質量の調節（例えば、上顎および下顎の顎堤の回復および／または保存；縫合にわたる早期の頭蓋冠の過剰増殖の阻害）；５）金属器具の植え込み部位での骨形成を増大して骨の組み込みを促進することによる骨の治癒および再生の調節（例えば、膝全体のインプラント、歯科インプラント、脊髄インプラント）；６）肥大型の軟骨形成の調節による軟骨の治癒および再生の調節（例えば、重度の関節損傷、進行性の関節表面の消失を伴う重度の骨関節炎または関節リウマチを引き起こす関節内骨折など、肥大していない軟骨が望ましい骨状態で軟骨の肥大を予防；軟骨内骨化の促進など、肥大した軟骨が望ましい骨状態で軟骨の肥大を促進；膜内骨化など、肥大した軟骨が望ましくない骨状態で軟骨の肥大を予防）を含み得る。
【００３８】
「幹細胞」という用語は、それだけに限らないが、成体幹細胞、胎性幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、および骨髄幹細胞を含み得る。
【００３９】
骨芽細胞の形成および機能
骨芽細胞の形成および機能は、骨の生物学の２つの重要な側面を包含する（Ａｕｂｉｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ、２００１．２（１）：ｐ．８１〜９４；Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９９．１３（８）：ｐ．１０２５〜３６）。どちらの概念も、骨誘導および骨再生にとって中心的なものである。Ａｕｂｉｎによれば（Ａｕｂｉｎ、２００１）、骨芽細胞の形成には、骨芽細胞への、最後には骨細胞およびアポトーシス細胞への最終的な分化を伴う、骨前駆体系列への初期の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のコミットメントからなるいくつかの分化段階が関与する。その一方で、骨芽細胞の機能には、基質沈着および骨形成においてすでに分化している骨芽細胞の活性が関与する。骨形成は、骨芽細胞の形成と機能をどちらも必要とし、胚発生、増殖、再構築、骨折修復の間に、また実験的には、脱石灰化骨基質を植え込み、または精製ＢＭＰを添加することにより生じ得る（同上）。したがって、骨芽細胞の分化および機能は、適切な骨芽細胞の機能が適切な骨芽細胞分化の状況の中でのみ生じ得る限りにおいて、２つであるが必ずしも区別できるわけではない過程である。
【００４０】
骨軟骨前駆体系列への未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のコミットメントは、Ｃｂｆａ１発現によって最初に特徴付けられる（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．およびＢ．ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、２００３．１９（８）：ｐ．４５８〜６６；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ａ．、Ｔ．Ｋｏｍｏｒｉ、およびＴ．Ｓｕｄａ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ、２０００．２１（４）：ｐ．３９３〜４１１）。Ｃｂｆａ１は、骨髄芽細胞の形成と機能の両方に不可欠である。Ｃｂｆａ１欠損（Ｃｂｆａ１−／−）マウスは、骨髄芽細胞および骨形成の完全な欠如を示し、呼吸を支持する堅い胸郭の不在による呼吸不全から周産期で死亡する（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７５５〜６４；Ｏｔｔｏ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７６５〜７１；Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７４７〜５４）。その一方で、ヘテロ接合性Ｃｂｆａ１機能欠失（Ｃｂｆａ１＋／−）マウスは、ヒトにおける鎖骨頭蓋骨異形成症（ＣＣＤ）に類似した表現型である鎖骨形成不全、膜性骨の発達遅延、および頭蓋骨の骨化の遅延を示し、それによって、開存した大泉門および小泉門、小さな頭頂骨および頭頂間骨、ならびに複数のウォーム骨（Ｗｏｒｍｉａｎ  ｂｏｎｅ）（縫合内の小さな骨）が生じる（Ｏｔｔｏ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７６５〜７１；Ｍｕｎｄｌｏｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７７３〜９）。Ｃｂｆａ１＋／−マウスの表現型から、膜内骨化が、Ｃｂｆａ１ハプロタイプの機能不全に特に感受性である可能性があることが示唆される。
【００４１】
発表された研究によれば、記載されている骨誘導性因子のほとんどは、Ｃｂｆａ１の上流で機能すると思われる（表１）。例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、およびトランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦ−β１）は、Ｃｂｆａ１の転写を上方制御することが知られている（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．およびＢ．ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、２００３．１９（８）：ｐ．４５８〜６６；Ｔｏｕ，Ｌ．、Ｎ．Ｑｕｉｂｒｉａ、およびＪ．Ｍ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００３．２０５（１〜２）：ｐ．１２１〜９；Ｐｅｉ，Ｙ．ら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ、２００３．２４（１０）：ｐ．９７５〜８４；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９９．７３（１）：ｐ．１１４〜２５）。表１に、記載されているいくつかの骨誘導性因子を示す：線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，Ｒ．Ｔ．およびＧ．Ｘｉａｏ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００３．８８（３）：ｐ．４４６〜５４；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３．２７８（１）：ｐ．３１９〜２６）、ＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ１）（Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｘ．ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０００．９（１３）：ｐ．２００１〜８）、血管由来の因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｚｅｌｚｅｒ，Ｅ．ら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、２００１．１０６（１〜２）：ｐ．９７〜１０６）、および成長板の血管新生においてＣｂｆａ１と協同的に機能することができる多機能性の成長因子である血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Ｈｉｍｅｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２００２．１７（７）：ｐ．１２９７〜３０５）。
【００４２】
【表１】
2008530227.tif 000003
【００４３】
Ｃｂｆａ１の骨誘導性についても研究されている。アデノウイルスＣｂｆａ１（Ａｄ  Ｃｂｆａ１）を導入した骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無機化が増大し、マウスの臨界サイズの頭蓋冠欠損において骨形成が増大することが示された（Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．ら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ、２００４．７４（２）：ｐ．１９４〜２０３）。さらに、ＡｄＣｂｆａ１とＡｄＢＭＰ２を、ネズミ多能性間葉系細胞系統であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中に同時導入すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞分化が相乗的に刺激され、導入したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を免疫不全マウスの皮下に植え込んだときに、ｉｎ  ｖｉｖｏで骨形成が著明に増大した（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ、２００４．１７６（１〜３）：ｐ．９５〜１０８；Ｙａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．１８（４）：ｐ．７０５〜１５）。これらの結果は、骨前駆体系列の主要な制御因子であるＣｂｆａ１によって、ＢＭＰに対する骨前駆細胞集団の反応性をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで亢進できることを示すものである（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ、２００４．１７６（１〜３）：ｐ．９５〜１０８）。
【００４４】
Ｃｂｆａ１の下流の標的としてのＮＥＬＬペプチド
ＮＥＬＬペプチドは、Ｃｂｆａ１の下流の標的であり得る（Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、１９９９．２６５：７９〜８６；Ｔｉｎｇ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９．１４：８０〜８９）。Ｃｂｆａ１は、骨芽細胞特異的シス作用性エレメント２（ＯＳＥ２）反応エレメントとそのプロモーター領域中で結合することによって、α１  Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１−α１）、骨シアロタンパク質（Ｂｓｐ）、オステオポンチン（Ｏｐ）やＯｃなどの多数の下流の骨芽細胞遺伝子の転写を促進することが知られている（Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１９９９．１３（８）：ｐ．１０２５〜３６）。ヒトＮＥＬＬ１遺伝子上での３つの機能的ＯＳＥ２反応エレメントの存在が研究により示され、このことからＮＥＬＬ１がＣｂｆａ１によって制御される遺伝子であることが確認される（図１１を参照）。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアデノウイルスＮＥＬＬ１過剰発現により、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞などの非骨芽細胞ではなく骨芽細胞で選択的に分化および無機化が著しく増大し（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００２．１１０（６）：ｐ．８６１〜７０）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＥＬＬ１過剰発現により、トランスジェニック動物の早期の骨形成および頭蓋縫合にわたる頭蓋冠の骨の過剰増殖が著しく増大したときに、ＮＥＬＬ１が骨形成と関係することが最初に示された。前段で述べたように、ＮＥＬＬ１発現は、骨芽細胞の形成および機能の重要な媒介物質であるＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２の下流であり、それによって直接制御され、このことから、ＮＥＬＬ１が、さらに分化した骨形成系列細胞（すなわち、コミットした骨芽細胞）に、より特異的にまたは優先的に働く可能性があることが示唆される。
【００４６】
ＮＥＬＬ１は、種を超えて高度に保存されている。ラットおよびヒトのＮＥＬＬ１は、９３％の予測アミノ酸相同性を有する（Ｔｉｎｇ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９．１４：８０〜８９）。ＮＥＬＬ１は、分泌シグナルペプチド、ＮＨ２−末端のＴＳＰ−１様モジュール、５つのコーディン様ＣＲドメインおよび６つのＥＧＦ様ドメインを含めて、いくつかの高度に保存されたモチーフを含む（図１）（Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、１９９９．２６５（１）：ｐ．７９〜８６）。ラットＮＥＬＬ１は、４００ｋＤａのタンパク質として培地中に分泌され、長い変性の後で、１３０ｋＤａのタンパク質に転換する（同上）。１３０ｋＤａの単量体は、コイルドコイル領域またはＣＲドメインを介して会合してホモ三量体となると推定される（Ｖｏｏｒｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１．１１３（１）：ｐ．１９５〜２０５）。研究から、ＮＥＬＬ１が、骨芽細胞の分化および機能の継続など、Ｃｂｆａ１のいくつかの下流効果を大いに媒介し（Ｔｉｎｇ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９．１４：８０〜８９）、Ｃｂｆａ１の下流で機能する（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００２．１１０（６）：ｐ．８６１〜７０；Ｏｔｔｏ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７６５〜７１）可能性があることが示唆される。
【００４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、内因性ＮＥＬＬ１発現が、癒合する縫合の骨形成面の進行と時間的および空間的に対応することが確認されている。トランスジェニックＮＥＬＬ１過剰発現マウスはまた、頭蓋縫合にわたる病的な頭蓋冠の骨の過剰増殖をも示した（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００２．１１０（６）：ｐ．８６１〜７０）。
【００４８】
骨芽細胞の分化および機能におけるＣｂｆａ１の下流の媒介物質としてのＮＥＬＬ１は、ＮＥＬＬ１による、Ｃｂｆａ１欠失のいくつかの側面の機能的補償によってさらに明らかにされている。１つの研究では、交雑させたＮＥＬＬ１過剰発現マウス（ＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐ）とＣｂｆａ１＋／−マウスのＦ２後代が調べられた。おそらくはコミットした骨芽細胞を欠くＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐ＋Ｃｂｆａ１−／−マウスで骨芽細胞の表現型の最小限の救済が観察された。さらに、ＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐＣｂｆａ１−／−マウスは、軟骨細胞の肥大の増大を示し（図７Ａを参照）、このことから、ＮＥＬＬ１が、軟骨内骨化に関係する重要な過程でもあることが示唆される。コミットしているが機能が不完全である骨芽細胞を含むはずであるＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐＣｂｆａ１＋／−マウス１１匹のうち９匹が、通常のＣＣＤ様表現型からの明確な救済を示した（Ｏｔｔｏ，Ｆ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９７．８９（５）：ｐ．７６５〜７１）。マイクロＣＴ分析と並行して行ったアリザリンレッドおよびアルシアンブルー染色から、救済されなかったＣｂｆａ１＋／−マウスと比較してＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐＣｂｆａ１＋／−マウスでは、泉門のサイズおよび縫合の幅がかなり小さく、鎖骨の形成不全の程度が低かったことが確認された（図２）。
【００４９】
その研究から、とりわけ、１）Ｃｂｆａ１がＮＥＬＬ１発現を上方制御すること、２）ＮＥＬＬ１発現により、感受性のある細胞型で骨芽細胞型の分化（すなわち、ＡＬＰ活性の増大、ＯＰおよびＯＣの発現）が選択的に増大すること、３）ＮＥＬＬ１過剰発現が、さらに分化した骨形成系列細胞（すなわち、コミットした骨芽細胞）に対して作用すること、４）ＮＥＬＬ１過剰発現により、頭蓋縫合にわたる骨の過剰増殖が増大すること、５）ＮＥＬＬ１過剰発現が、Ｃｂｆａ１欠失のいくつかの側面を機能的に補償できること、および６）ＮＥＬＬ１過剰発現が、軟骨内骨形成と関係する過程（例えば、軟骨細胞の肥大）を選択的に増大させることが示された。
【００５０】
ＮＥＬＬペプチドはまた、非頭蓋顔面骨発生にも有効である。例えば、長骨から単離された骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）に対する導入したＡｄＮＥＬＬ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果およびヌードマウスへのＡｄＮＥＬＬ１注射のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を調べた。この研究から、ＡｄＮＥＬＬ１を導入したＢＭＳＣが、Ａｄβ−ガラクトシダーゼ（Ａｄβ−Ｇａｌ）対照を上回る無機化骨結節形成の著しい増大を示し（図３）、一方、ＡｄＮＥＬＬ１注射の結果、筋における異所性の石灰化結節形成が生じたことが実証され、このことから、ＮＥＬＬ１が、非頭蓋顔面骨芽細胞の分化および骨形成を亢進できることが示された。
【００５１】
さらに、ＮＥＬＬペプチドはまた、骨芽細胞分化マーカーを上方制御し、ＢＭＰタンパク質、ＴＧＦβタンパク質、ＦＧＦ、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＶＥＧＦ、またはその組合せと相乗的に働いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨分化マーカー（例えば、ＡＬＰ、ＯＣ）の発現、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの骨形成を増大させることもできる（図８を参照）。例えば、ＮＥＬＬ２とＢＭＰ２は、骨芽細胞分化を誘導する際に相乗作用することができる。図８に示す例は、ＮＥＬＬ２やＮＥＬＬ１などのＮＥＬＬペプチドが、骨芽細胞の分化を調節して、骨形成を促進することができることを示すものである。
【００５２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＥＬＬペプチドの発現を誘導する分子を同定する方法を提供する。その方法は、（１）ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子を試験化合物と接触させるステップ、（２）ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルを検出するステップ、（３）ＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルを、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルと比較するステップ、および（４）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルと異なる場合に、試験化合物をＮＥＬＬペプチドの発現の調節物質に指定するステップを含む。いくつかの実施形態では、その方法のステップは、（５）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルより低い場合に、調節物質をＮＥＬＬペプチドの発現の阻害物質に指定するステップ、または（６）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルが、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬ１プロモーター遺伝子の発現のレベルより高い場合に、調節物質をＮＥＬＬペプチドの発現の亢進物質に指定するステップをさらに含む。その方法に従って同定した調節物質を使用して、哺乳動物中でのＮＥＬＬペプチドの発現を調節することができる。
【００５３】
ＮＥＬＬペプチドを発現させる系
ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＮＥＬＬ１の遺伝子またはｃＤＮＡまたはＲＮＡあるいはその任意の断片によって発現させることができるタンパク質である。そのようなＮＥＬＬ１の遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはその断片には、ヒトＮＥＬＬ１ペプチドまたはその断片をコードする配列番号１〜１１、マウスＮＥＬＬ１ペプチドまたはその断片をコードする配列番号１７〜７１、およびラットＮＥＬＬ１ペプチドまたはその断片をコードする配列番号７５および７６がある。ＮＥＬＬ１ペプチドは、骨形成細胞分化、骨芽細胞分化、骨形成、または軟骨再生を誘導する能力を保持するＮＥＬＬ１ペプチド断片を含み得る。
【００５４】
ＮＥＬＬ２ペプチドは、ＮＥＬＬ２の遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡあるいはその任意の断片によって発現させることができるタンパク質である。そのようなＮＥＬＬ２の遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡあるいはその任意の断片には、ヒトＮＥＬＬ２ペプチドまたはその断片をコードする配列番号１２〜１６、マウスＮＥＬＬ２ペプチドまたはその断片をコードする配列番号７２〜７４、およびラットＮＥＬＬ２ペプチドまたはその断片をコードする配列番号７７〜８１がある。ＮＥＬＬ２ペプチドは、本明細書に記載のＮＥＬＬ２ペプチドと類似した活性を保持するＮＥＬＬ２ペプチド断片を含み得る。
【００５５】
上記に記載のＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２遺伝子のいずれかを含む核酸構築物中でＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドを発現させることができる。一実施形態では、本発明は、昆虫細胞系統を使用して、ＮＥＬＬ１やＮＥＬＬ２ペプチドなどの機能的ＮＥＬＬペプチドを発現させる方法を含む。一実施形態では、昆虫細胞は、ｈｉｇｈ  ｆｉｖｅ細胞、Ｓｆ９、および他のＳｆ細胞でよい。
【００５６】
一実施形態では、その方法は、本明細書に記載のＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２ペプチドをコードする核酸配列を提供するステップを含むことができる。核酸配列はまた、上記に列挙した配列の任意の部分と少なくとも約７５％の配列類似性を有する配列など、実質的な配列類似性がある配列などの配列をも含み得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＮＥＬＬ１やＮＥＬＬ２ペプチドなどのＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を発現させる発現ベクターを含むことができる。例えば、発現ベクターは、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でよく、選択マーカーはまた、ブラストサイジンおよびネオマイシンをも含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、核酸配列はまた、遺伝子発現のレベルをモニターするレポーター産物をコードし、または当技術分野で既知の方法を使用して視覚化して、ペプチド発現のレベルをモニターすることができるペプチドタグをコードするさらなる核酸を含むこともできる。さらなる配列は、核酸の発現、または発現したペプチド産物の機能に干渉しないように選択することができる。
【００５９】
核酸構築物は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。そのようなシグナルペプチドは、任意のＮＥＬＬシグナルペプチドでよい。そのようなシグナルペプチドのいくつかの例には、ヒト、ラット、マウスまたはイヌのＮＥＬＬシグナルペプチドがある。ＮＥＬＬシグナルペプチドの他のいくつかの例には、それだけに限らないが、核酸の配列番号８８によってコードされるヒトＮＥＬＬ２シグナルペプチドの配列番号８９、核酸の配列番号９０によってコードされるラットＮＥＬＬ２シグナルペプチドの配列番号９１、核酸の配列番号９２によってコードされるマウスＮＥＬＬ２シグナルペプチドの配列番号９３、および核酸の配列番号９４によってコードされるイヌＮＥＬＬ２シグナルペプチドの配列番号９５がある。核酸は、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を発現させる発現ベクターを含むことができる。さらに、核酸配列は、遺伝子発現のレベルをモニターするレポーター産物をコードし、または当技術分野で既知の方法を使用して視覚化して、ペプチド発現のレベルをモニターすることができるペプチドタグをコードするさらなる核酸を含むことができる。
【００６０】
核酸構築物は、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子など、選択マーカーとも称される選択用遺伝子を含む発現およびクローン化用ベクターを含むことができる。この遺伝子の存在により、確実に、そのベクターを欠失する任意の宿主細胞は、形質転換した宿主を超える増殖または再生の利益を得られなくなる。典型的な選択用遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性の欠乏を補充するタンパク質をコードする。
【００６１】
核酸構築物はまた、宿主生物によって認識され、ＮＥＬＬをコードする核酸と作動的に連結したプロモーターを含むこともできる。プロモーターは、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターを含めて、構造遺伝子の開始コドンの上流（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置し、その調節下で核酸の転写および翻訳を調節する翻訳されない配列である。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば、栄養素の存在の有無または温度の変化に反応してそれらの制御下でＤＮＡからの転写のレベルの増大を開始するプロモーターである。現時点で、種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。ＮＥＬＬ１プロモーター核酸配列のいくつかの例には、それだけに限らないが、それぞれヒトＮＥＬＬ１プロモーター、マウスＮＥＬＬ１プロモーター、およびラットＮＥＬＬ１プロモーターをコードする配列番号８２、８４、および８６がある。ＮＥＬＬ２プロモーター核酸配列のいくつかの例には、それだけに限らないが、それぞれヒトＮＥＬＬ２プロモーター、マウスＮＥＬＬ２プロモーター、およびラットＮＥＬＬ２プロモーターをコードする配列番号８３、８５、および８７がある。
【００６２】
核酸は、それを他の核酸配列との機能的関係の中に置いたときに、作動的に連結することができる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡと作動的に連結し；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列と作動的に連結し；あるいはリボソーム結合部位は、それが置かれた結果翻訳が促進される場合、コード配列と作動的に連結する。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの哺乳動物細胞中でＮＥＬＬ１および／またはＮＥＬＬ２ペプチドなどのＮＥＬＬペプチドを発現させる核酸構築物を含み得る。核酸配列は、ＮＥＬＬペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡでよい。例えば、核酸配列は、上記に記載のＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸配列はまた、上記に列挙した配列の任意の部分と少なくとも約７５％の配列類似性を有する配列など、実質的な配列類似性がある配列などの配列をも含み得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中でのＮＥＬＬ１および／またはＮＥＬＬ２ペプチドの産生について、ＮＥＬＬ１および／またはＮＥＬＬ２の発現系は、内因性シグナルペプチドを発現する核酸またはｃＤＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬ１および／またはＮＥＬＬ２ペプチドの発現系は、ＮＥＬＬ２シグナルペプチドを発現する核酸またはｃＤＮＡを含むことができる。ＮＥＬＬ１ペプチドを発現する系の中へのＮＥＬＬ２シグナル核酸またはｃＤＮＡの組み込みにより、ＮＥＬＬ１ペプチドの産生をより効率よく行うことが可能となる。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、機能的ＮＥＬＬペプチドを発現する細胞を含み得る。一実施形態では、細胞は昆虫細胞でよい。一実施形態では、昆虫細胞はｈｉｇｈ  ｆｉｖｅ細胞でよい。
【００６６】
一実施形態では、細胞に、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物をトランスフェクトすることができる。例えば、細胞系統に、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物を一過性にまたは安定にトランスフェクトすることができる。一実施形態では、ＮＥＬＬを発現する核酸（例えば、（複数の）ｃＤＮＡ）を、細胞（昆虫細胞やチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）など）をトランスフェクトする能力がある遺伝子発現ベクターまたはウイルス粒子中にクローン化することができる。いくつかの実施形態では、その構築物は、シグナルペプチドを使用したｐＴＢ７０１などのベクターを含み得、それはプレプロトリプシン、ヒトｔＰＡ、Ｉｇのイムノグロブリン軽鎖、およびＦｃ断片、インターロイキンのいずれかを含んでもよい。ｐＴＢ７０１ベクターは、Ｋｕｒｏｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２６５：７９〜８６（１９９９）で報告されている。
【００６７】
核酸配列はまた、昆虫の分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列とインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で、ＮＥＬＬ１やＮＥＬＬ２ペプチドなどのＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列をも含み得る。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、機能的ＮＥＬＬペプチドを発現し、機能的タンパク質を分泌することができる細胞を含み得る。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、ＮＥＬＬ１やＮＥＬＬ２ペプチドなどのＮＥＬＬペプチドを含むポリペプチド（アミノ酸配列）を含み得、分泌シグナルペプチドを含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＮＥＬＬペプチドまたはタンパク質を発現する遺伝子配列は、ＮＥＬＬ分子全体またはその断片を発現する任意の遺伝子配列を含み得る。そのような遺伝子配列は、場合によっては、非コード配列を含み得る。一般に、ゲノム配列は、およそ（１）機能的タンパク質をコードするゲノム配列（これは異なるｍＲＮＡスプライス変異体を含み得る）、（２）機能的タンパク質の発現を調節することができる非コード非転写ゲノム配列（プロモーター領域、他の非転写ＤＮＡ領域など）、および（３）機能的タンパク質の発現を調節することができる非コード転写ゲノム配列（例えばｔＲＮＡおよびｒＲＮＡがあるが、イントロン、５’および３’−ＵＴＲ、転移エレメント、遺伝子間領域、ならびに興味深いことにアンチセンス能力を有するまたは有さない数千の異なる小さな安定ＲＮＡもある）に分類することができる。
【００７１】
各ＤＮＡ分子は、遺伝の基本的な物理的機能的単位である遺伝子を多数含む。遺伝子は、ヌクレオチド塩基の特定の配列であり、その配列は、細胞および組織の構造的構成成分ならびに不可欠な生化学反応のための酵素をもたらすタンパク質の構築に必要な情報を有する。ヒトゲノムは、３０，０００個を超える遺伝子を含むと推定される。
【００７２】
ヒト遺伝子は長さが幅広く様々であり、しばしば数千を超える塩基に及ぶが、ゲノムの約１０％しか、遺伝子のタンパク質コード配列（エキソン）を含まないことが知られている。多数の遺伝子内に散在しているのはイントロン配列であり、それはコード機能を有さない。ゲノムの均衡は、その機能が不明瞭な他の非コード領域（調節配列や遺伝子間領域など）から成り立つと考えられる。すべての生物は、タンパク質から大部分が構成される；ヒトは、少なくとも１００，０００個の異なる種類を合成することができる。タンパク質は、アミノ酸と呼ばれるサブユニットの長い鎖で構成される大きな複合分子である。２０個の異なる種類のアミノ酸が通常タンパク質中で認められる。遺伝子内で、３つのＤＮＡ塩基からなるそれぞれの特定の配列（コドン）が、細胞のタンパク質合成機構に、特定のアミノ酸を付加するように指示する。例えば、塩基配列ＡＴＧは、アミノ酸メチオニンをコードする。３つの塩基が１つのアミノ酸をコードするので、平均サイズの遺伝子（３０００ｂｐ）によってコードされるタンパク質は、１０００アミノ酸を含むことになる。したがって、遺伝コードは、特定のタンパク質の作製にどのアミノ酸を必要とするかを指定する一連のコドンである。
【００７３】
遺伝子からのタンパク質をコードする指示は、一本鎖のＤＮＡと類似する一過性の中間分子であるメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を介して間接的に伝達される。発現する遺伝子内の情報について、相補的なＲＮＡ鎖が、核中でＤＮＡ鋳型から作製される（転写と呼ばれる過程）。このｍＲＮＡは、核から細胞質へと移動し、細胞質でｍＲＮＡはタンパク質合成の鋳型として働く。次いで、細胞のタンパク質合成機構がコドンを翻訳して、それがコードするタンパク質分子を構成するアミノ酸の鎖にする。実験室で、ｍＲＮＡ分子を単離し、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成する鋳型として使用することができ、次いでそれを使用して、対応する遺伝子を染色体地図上に位置付けることができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、送達に成功するまで、他の化学物質と結合し、あるいはナノケージまたは生体材料中に組み込むことによって、記載した化合物を安定化することができる。ヒトではコード領域より非コード領域が大きい。ゲノムの非コード部分は、重要な制御の役割を果たす。ヒトゲノムの少なくとも半分が転写される。この転写産物の約９５％は、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡだけでなく、イントロン、５’および３’−ＵＴＲ、転移エレメント、遺伝子間領域、ならびに興味深いことに数千の異なる小さな安定ＲＮＡをも包含する非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。ナノケージまたは生体材料は、下記に記載する担体または足場でもよい。
【００７５】
これらの転写領域のいくつかは、ヒトとげっ歯類の間で進化上保存されており（ヒトとマウスの間で最大９５％の保存）、このことから機能の保存が示唆される。幅広い分画のこの非コードＲＮＡの本質的な特徴は、そのアンチセンス能力である：それは、塩基対形成の相補性の多少の拡張により他のＲＮＡを標的とすることができる。このことは、ｓｎｏＲＮＡおよびｍｉＲＮＡについて示されている。ｎｃＲＮＡは、いくつかの予想外の機能を果たしている。それは、発生、ヘテロクロマチンの形成、転写、選択的スプライシングおよび編集、核酸の化学修飾、ならびに真核生物のゲノム安定性を含めた細胞過程の制御に重要な役割を果たす。機能が正確に記載されているほとんどのｎｃＲＮＡは遍在性であるが、最も新しく同定されたｎｃＲＮＡは、発生上制御されている、すなわち、性、組織または細胞特異的な形で発現することが分かっている。アンチセンスｎｃＲＮＡの間で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）という大きなファミリーが急速に明らかになっている。それは、高等生物の間で高度に保存され、一時的な細胞系列決定および組織特異的な遺伝子制御に関与し、様々な発生上のかつ生理的な過程を制御する。その通常の形態の作用は、ｍＲＮＡを標的として破壊または翻訳の阻害を行うことである。
【００７６】
ＮＥＬＬペプチドの阻害物質
本発明の一態様では、本明細書で開示されている薬剤組成物は、早期のまたは過度の骨発生と関係する骨状態を治療、予防または改善するためにＮＥＬＬペプチドの活性を阻害する作用物質を含み得る。その作用物質は、それだけに限らないが、ＮＥＬＬ１阻害物質またはＮＥＬＬ２阻害物質あるいはその組合せでもよい。「ＮＥＬＬペプチドの阻害物質」という用語は、以前に概要（Ｓｕｍｍａｒｙ）の節で説明している。
【００７７】
タンパク質などの生体活性のある化合物の阻害物質をスクリーニングする任意のアッセイ法を使用して、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質をスクリーニングすることができる。いくつかのアッセイ法は、ＰＣＴ／２００３／０２９２８１（ＷＯ２００４／０２４８９３）に記載されている。
【００７８】
代表的なＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２阻害剤には、転写の段階（例えば、ＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２がプロモーター中にＣｂｆａ１結合部位を含むため、Ｃｂｆａ１特異的ｓｉＲＮＡ、抗体）および／または翻訳の段階（例えば、ＮＥＬＬ−１特異的ｓｉＲＮＡ、ＮＥＬＬ２特異的ｓｉＲＮＡ、あるいはＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ２特異的抗体などＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２と結合する受容体）でＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２を特異的に阻害する任意の作用物質がある。
【００７９】
ＮＥＬＬペプチドの亢進物質
他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの１つまたは複数の亢進物質を含む薬剤組成物が提供される。
【００８０】
ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質
本発明のさらなる態様では、本明細書で提供する薬剤組成物は、ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質を含み得る。ＮＥＬＬ１およびＮＥＬＬ２タンパク質は、膜結合受容体と結合する分泌性分子である（Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２６５（１）：ｐ．７９〜８６）（１９９９）。
【００８１】
ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質は、受容体の調節物質をスクリーニングする任意の確立された方法によって同定することができる。一実施形態では、競合的結合によってＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質をスクリーニングすることができる。例えば、そのような調節物質をスクリーニングする１つの方法は、下記のステップ：（１）ＮＥＬＬペプチドの受容体分子を試験化合物と接触させるステップ、（２）ＮＥＬＬペプチドを受容体分子および試験化合物と接触させるステップ、（３）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度を検出するステップ、（４）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度を、試験化合物がない状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度を検出することによって得られる対照の結合の程度と比較するステップ、ならびに（５）試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度が、対照の結合の程度と異なる場合に、試験化合物をＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質に指定するステップを含み得る。調節物質は、受容体のアンタゴニストまたは受容体のアゴニストに指定することができる。試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度が、対照の結合の程度より低い場合、調節物質はＮＥＬＬペプチドの受容体のアンタゴニストである。試験化合物がある状態でのＮＥＬＬペプチドと受容体分子の結合の程度が、対照の結合の程度より高い場合、調節物質をＮＥＬＬペプチドの受容体のアゴニストに指定する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＥＬＬ調節物質は、ＮＥＬＬおよび／またはＮＥＬＬ受容体を安定化または分解する分子、ならびに最初の受容体連結反応後のＮＥＬＬと受容体の複合体の安定化およびリン酸化に関与する分子を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調節物質は、上記のアゴニストおよびアンタゴニストのアゴニストおよびアンタゴニストを含み得る。例えば、ＮＥＬＬアンタゴニストの阻害物質を含む組成物は、骨代謝を増大させることができる。すべての場合で、前段で論じたものを含むように臨床応用の範囲をぜひ拡大して頂きたい。
【００８３】
ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質は、手動での試験、またはコンビナトリアルケミストリーに基づく系などの自動化された系によってスクリーニングすることができる。コンビナトリアルケミストリーに基づくスクリーニング系の１つの例は、ＰＣＴ／２００３／０２９２８１（ＷＯ２００４／０２４８９３）に記載されている。
【００８４】
軟骨再生
関節軟骨は、大部分が水（６０〜８０重量％）からなり、残りのＥＣＭは、ＩＩ型コラーゲン（乾燥質量で５０〜９０％）およびプロテオグリカン（５〜１０％）が大部分を占める。少量の他のコラーゲンおよびわずかなＥＣＭ分子が同定されている。それは、別個の領域となるＥＣＭの組織化であり、関節にわたる生体力学的な力の吸収および伝達に必要な強靭性、同時に関節の運動に必要な摩擦のない関節表面をもたらす、様々な領域での水とＥＣＭとの相互作用である。ヒト股関節において、日常的な歩行および跳躍の間にそれぞれ４および２０ＭＰａもの高い負荷が報告されている！関節軟骨は見事であるが、残念なことにそれは最小限の修復能力しか示さない。２０００万人を超える米国人が骨関節炎および変性関節疾患に罹患し、関連する年間の保健医療負担は６００億ドルを超える。軟骨組織工学用の広範な足場、サイトカイン、および成長因子が調べられている（例えば、Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｓ．Ｒ．ら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．３２：２６〜３４（２００４）；Ｔｕｌｉ，Ｒ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：２３５〜２３８（２００３）；ならびにＡｓｈａｍｍａｋｈｉ，Ｎ．およびＲｅｉｓ，ＲＬ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２巻、２００５を参照）。軟骨細胞の生物学的反応および組織再構築に対する静的対動的加圧、剪断負荷、静水圧、流動、流動電位、バイオリアクター、および複合荷重の役割が広範に調べられ、その機械的伝達経路は、Ａｓｈａｍｍａｋｈｉ，Ｎ．およびＲｅｉｓ，ＲＬ．、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２巻、２００５に総説されている（図７Ａ〜Ｄを参照）。
【００８５】
したがって、本発明のさらなる態様では、本明細書で提供する薬剤組成物は、軟骨芽細胞および軟骨細胞を誘導して軟骨にするのに有効な量の、ＮＥＬＬペプチドまたはＮＥＬＬペプチドの受容体のアゴニストを少なくとも含む。ＮＥＬＬタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＮＥＬＬアゴニスト、およびアンタゴニスト阻害物質は、さらなる成長因子の存在下または不在下で、単独で、あるいは細胞を伴う足場および細胞を伴わない足場と併せて、機械的刺激と併せてまたは併せずに使用することができる。例えば、一実施形態では、薬剤組成物は、椎間円板、関節軟骨の修復および再生における軟骨の再生で有効であり得る。他の実施形態では、薬剤組成物は、ｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療、および組織工学における足場を伴うまたは伴わない細胞へのタンパク質の適用を介する軟骨の形成に有効であり得る。
【００８６】
送達方法および局所環境に応じて、ＮＥＬＬペプチド（例えば、ＮＥＬＬ１ペプチド）を含む組成物を使用して、軟骨細胞や軟骨芽細胞などの骨形成細胞を誘導して分化させ軟骨だけを形成することができる。例えば、関節軟骨の欠損では、本明細書に記載の組成物は、軟骨細胞／芽細胞などの軟骨形成細胞を誘導して軟骨だけを形成することができる。組成物は、足場／担体として、欠損した軟骨領域に適用することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、場合によっては細胞（幹細胞、軟骨芽細胞など）を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療として、組成物を適用することができる。
【００８７】
いくつかのさらなる実施形態では、軟骨組織工学で組成物を使用することができる。例えば、「周期的に振動する」断続的な負荷張力の環境で軟骨芽細胞を培養するとき、ＮＥＬＬ１ペプチドは、分化し軟骨を形成する軟骨芽細胞を含み得る。これらの実施形態では、周期的に振動する負荷をかける持続時間も重要な役割を果たす。例えば、周期的に振動する力を継続してかけた場合、ＮＥＬＬ１ペプチドを有する組成物は、軟骨内骨形成を誘導することができる。したがって、周期的に振動する負荷を断続的にかけると、骨形成細胞（例えば、軟骨細胞／芽細胞）の分化を軟骨の段階で停止させ、それによって細胞が分化して軟骨内骨形成となることを防止することができる。
【００８８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物を軟骨の再生／修復、例えば、関節軟骨および椎間円板における円板修復に使用することができる。
【００８９】
本明細書で開示されている薬剤組成物によって治療、予防、または改善することができる他の例示的な軟骨状態には、それだけに限らないが、軟骨石灰化症、骨関節炎、および／または病的な軟骨変性を特徴とする他の疾患がある。
【００９０】
他の作用物質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬剤組成物は、ＮＥＬＬペプチド、および骨発生の促進に有効な他の作用物質を含み得る。そのような他の作用物質には、例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＢＭＰ−１９、ＢＭＰ−２０、ＢＭＰ−２１などの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３）、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング成長因子−β、例えば、ＴＧＦ−β１）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子、例えば、ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）／ＰＴＨｒｐ（ＰＴＨ制御タンパク質）、オキシステロール、親油性スタチン、成長／分化因子５（ＧＤＦ５）；および少なくとも３つのスプライス変異体が存在するＬＩＭ無機化タンパク質（ＬＭＰ）がある。これらの因子およびそれらが作用する機構に関するいくつかの研究が、Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．およびＢ．ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ、２００３．１９（８）：ｐ．４５８〜６６；Ｔｏｕ，Ｌ．、Ｎ．Ｑｕｉｂｒｉａ、およびＪ．Ｍ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｕｄｏｃｒｉｎｏｌ、２００３．２０５（１〜２）：ｐ．１２１〜９；Ｐｅｉ，Ｙ．ら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ、２００３．２４（１０）：ｐ．９７５〜８４；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９９．７３（１）：ｐ．１１４〜２５；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ，Ｒ．Ｔ．およびＧ．Ｘｉａｏ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００３．８８（３）：ｐ．４４６〜５４；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００３．２７８（１）：ｐ．３１９〜２６；Ｚｅｌｚｅｒ，Ｅ．ら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ、２００１．１０６（１〜２）：ｐ．９７〜１０６；Ｈｉｍｅｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２００２．１７（７）：ｐ．１２９７〜３０５；Ｋｈａ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １９、８３０〜４０、２００４；Ｉｚｕｍｏ，Ｎ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２３、３８９〜９４、２００１；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，Ｙ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９１、１２０４〜１７、２００４；Ｐｏｌａ，Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１、６８３〜９３、２００４に記載されている。１つの研究で、ＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ１）の活性化突然変異により、Ｃｂｆａ１の発現、骨芽細胞の増殖および分化、ならびにマウスでの頭蓋縫合にわたる頭蓋冠の骨の過剰増殖が劇的に増大したことが報告された（Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｘ．ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０００．９（１３）：ｐ．２００１〜８）。
【００９１】
一実施形態では、薬剤組成物は、ＮＥＬＬ１ペプチドおよびＢＭＰペプチドを含む。例として、ヒト骨肉腫細胞系統であるＳａｏｓ−２（ＭｃＱｕｉｌｌａｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｂｏｎｅ、１９９５．１６（４）：ｐ．４１５〜２６；Ｆｅｄｄｅ，Ｋ．Ｎ．、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ、１９９２．１７（２）：ｐ．１４５〜５１）を、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの組換えＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２タンパク質とともに培養する。その試験の結果から、ＢＭＰ２の培養物と比較して、ＮＥＬＬ１／ＢＭＰ２の混合培養物でＡＬＰ活性が最大で５倍増大したことが示され、このことから、ＮＥＬＬ１が、ＢＭＰに対する骨芽細胞様細胞集団の反応性を亢進することができることが判明した。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、場合によってはＬＩＭタンパク質を含むことができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つまたは複数の上記に記載の作用物質を特に除外することができる。
【００９４】
投与量
作用物質の型、疾患、および年齢や性などの他のファクターに基づいて、当技術分野で知られている方法に従って、ＮＥＬＬペプチドおよび他の作用物質の投与量を決定することができる。
【００９５】
一実施形態では、骨形成用のＮＥＬＬペプチドの投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｍｍ２〜１ｐｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２〜１ｎｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２〜１μｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２〜１ｍｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２〜１ｇ／ｍｍ２である。他の実施形態では、骨形成用のＮＥＬＬペプチドの投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌ〜１００ｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、骨形成用のＮＥＬＬペプチドの投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｋｇ〜１ｐｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇ〜１ｎｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇ〜１ｇｍ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇ〜１ｋｇ／ｋｇである。さらに、すべての投与量を連続して投与することもでき、あるいは所与の時間枠当たりに投与する投与量に分割することもできることが理解される。時間枠の例には、それだけに限らないが、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間毎、あるいは毎週、２週間毎、４週間毎、あるいは毎月、２カ月毎、４カ月毎などがある。
【００９６】
しかし、ＮＥＬＬペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨芽細胞のアポトーシスに影響を及ぼす可能性がある（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．１８（１２）：ｐ．２１２６〜３４）ので、最適範囲を著しく上回るＮＥＬＬ投与量（例えば、ＮＥＬＬ１投与量）では、骨形成が増大しない可能性がある。したがって、ＮＥＬＬペプチドのさらに好ましい投与量は、最適な投与量の範囲を著しく上回らない。ＮＥＬＬペプチドのさらに好ましい最適な投与量の範囲は、哺乳動物対象の型、齢数、居住場所、および性；使用する担体または足場の材料；様々なＮＥＬＬペプチドの純度および効力などのファクターに従って様々である可能性がある。一実施形態では、ＮＥＬＬペプチドのさらに好ましい最適な投与量の範囲には、それだけに限らないが、１ｎｇ／ｍｍ２〜１００ｎｇ／ｍｍ２、またはさらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｍ２〜１０００ｎｇ／ｍｍ２、またはさらに好ましくは１μｇ／ｍｍ２〜１００μｇ／ｍｍ２、またはさらに好ましくは１００μｇ／ｍｍ２〜１０００μｇ／ｍｍ２である。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドのさらに好ましい最適な投与量の範囲には、それだけに限らないが、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、またはさらに好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、またはさらに好ましくは１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、またはさらに好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、骨形成のためのＮＥＬＬペプチドのさらに好ましい最適な投与量の範囲は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、またはさらに好ましくは１００μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、またはさらに好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。さらに、すべての投与量を連続して投与することもでき、あるいは所与の時間枠当たりに投与する投与量に分割することもできることが理解される。時間枠の例には、それだけに限らないが、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間毎、あるいは毎週、２週間毎、４週間毎、あるいは毎月、２カ月毎、４カ月毎などがある。本明細書において、「最適範囲を著しく上回る」という用語は、例えば、最適範囲を約１％〜５０％、約５％〜５０％、約１０％〜５０％、約２０％〜５０％、約３０％〜５０％、または約４０％〜５０％上回ることを意味する。
【００９７】
ＮＥＬＬペプチドの阻害物質の投与量は、阻害物質の型、治療し、予防しまたは改善する骨または軟骨の状態、ならびに阻害物質を含む薬剤組成物を投与する哺乳動物対象の齢数、居住場所、および性に従って様々となる。一般に、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質の投与量は、それだけに限らないが、特定の担体または足場の有無に関わらず、０．００１ｐｇ／ｍｍ２〜１ｐｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２〜１ｎｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２〜１μｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２〜１ｍｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２〜１ｇ／ｍｍ２である。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質の投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌ〜１００ｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの阻害物質の投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｋｇ〜１ｐｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇ〜１ｎｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇ〜１ｇｍ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇ〜１ｋｇ／ｋｇである。さらに、すべての投与量を連続して投与することもでき、あるいは所与の時間枠当たりに投与する投与量に分割することもできることが理解される。時間枠の例には、それだけに限らないが、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間毎、あるいは毎週、２週間毎、４週間毎、あるいは毎月、２カ月毎、４カ月毎などがある。
【００９８】
ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質の投与量は、阻害物質の型、受容体の型、治療し、予防しまたは改善する骨または軟骨の状態、ならびにＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質を含む薬剤組成物を投与する哺乳動物対象の齢数、居住場所、および性に従って様々となる。一般に、ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質の投与量は、それだけに限らないが、特定の担体または足場の有無に関わらず、０．００１ｐｇ／ｍｍ２〜１ｐｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｍ２〜１ｎｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｍ２〜１μｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｍ２〜１ｍｇ／ｍｍ２、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｍ２〜１ｇ／ｍｍ２である。他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質の投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは０．００１ｇ／ｍｌ〜１００ｇ／ｍｌである。さらに他の実施形態では、ＮＥＬＬペプチドの受容体の調節物質の投与量は、特定の担体または足場の有無に関わらず、一般に０．００１ｐｇ／ｋｇ〜１ｐｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｎｇ／ｋｇ〜１ｎｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、またはより好ましくは０．００１ｇｍ／ｋｇ〜１ｇｍ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｋｇ／ｋｇ〜１ｋｇ／ｋｇである。さらに、すべての投与量を連続して投与することもでき、あるいは所与の時間枠当たりに投与する投与量に分割することもできることが理解される。時間枠の例には、それだけに限らないが、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、または７２時間毎、あるいは毎週、２週間毎、４週間毎、あるいは毎月、２カ月毎、４カ月毎などがある。
【００９９】
製剤の担体
経口および非経口（例えば、静脈内、皮下または髄内）、鼻内、坐剤としての、または「フラッシュ型」製剤を使用する、すなわち水の使用を必要とせずに口の中で薬物が溶解することを可能にする、局所、皮内、皮下ならびに／あるいは粘膜経路を介した液体または固体の形での投与を含めた様々な投与経路によって、治療を必要とする対象に本明細書に記載の薬剤組成物を投与することができる。薬剤組成物を製剤して、様々な剤形、例えば、抽出物、丸剤、錠剤、微小粒子、カプセル剤、経口用液体にすることができる。
【０１００】
製剤上適合性のある結合剤、および／または補助物質を、薬剤組成物の一部として含めることもできる。活性物質を、所望の作用を障害せず、かつ／または所望の作用を補充する抗生物質、抗真菌薬、他の殺ウイルス剤および免疫賦活剤を含めた他の活性物質と混合することもできる。
【０１０１】
一実施形態では、本明細書に記載の薬剤組成物の投与形態は経口である。経口用組成物は一般に、不活性な希釈剤または食用の担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入することもでき、あるいは固めて錠剤にすることもできる。治療用の経口投与の目的で、前記の化合物を添加剤とともに組み込み、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート、チューインガムなどの形で使用することができる。しかし、治療する対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に起こる。これらの製剤から、約０．０１ｎＭ〜１，０００，０００ｎＭ、例えば約０．２〜４０μＭの有効成分の血清濃度が得られるはずである。好ましい濃度範囲は０．２〜２０μＭであり、最も好ましくは約１〜１０μＭである。しかし、薬剤組成物中の有効成分の濃度自体は、その薬剤のバイオアベイラビリティーおよび当業者に知られている他のファクターに依存する。
【０１０２】
他の実施形態では、本明細書に記載の薬剤組成物の投与形態は、局所または粘膜投与である。特に好ましい粘膜投与形態は、女性生殖管を介した投与である。他の好ましい粘膜投与形態は直腸投与である。
【０１０３】
本明細書で開示されている薬剤組成物の粘膜接着性を亢進させる補助剤として、様々なポリマーおよび／または非ポリマー物質を使用することができる。補助剤に適したポリマー物質は、天然ポリマーでもよく、あるいは合成ポリマーでもよい。代表的な天然ポリマーには、例えば、デンプン、キトサン、コラーゲン、糖、ゼラチン、ペクチン、アルギン酸塩、カラヤゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースがある。代表的な合成ポリマーには、例えば、ポリ（アクリル酸）、トラガカント、ポリ（メチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）、ポリ（エチレンオキシド）、カーボポール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ヒドロキシエチルメチルアクリレート）、およびポリカルボフィルがある。製剤の分野で利用可能な他の生体接着物質を使用することもできる（例えば、Ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ、ＧｕｒｎｙおよびＪｕｎｇｉｎｇｅｒ編、１９９０を参照されたい）。
【０１０４】
投与量の値が、緩和する疾患状態の特定の重症度でも変動することに留意されたい。任意の特定の対象について、特定の投与法を、個々の要求、および投与を行う者または前記の組成物の投与を監督する者の専門的判断に合わせるべきであることがさらに理解されるはずである。本明細書で示す濃度範囲が例示的なものに過ぎず、本発明の範囲または実施を限定するものではないことがさらに理解されるはずである。有効成分は、一度に投与することもでき、あるいは様々な時間間隔で投与するいくつかの少ない投与量に分割することもできる。
【０１０５】
製剤は下記の成分を含んでよい：微結晶性セルロース、トラガカントゴムやゼラチンなどの結合剤；デンプンやラクトースなどの添加剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；およびスクロースやサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルやオレンジ着香剤などの着香剤を添加することができる。単位剤形がカプセル剤であるとき、それは、上記の型の物質に加えて、脂肪油などの液体担体を含んでよい。他の単位剤形は、例えば被覆のように用量単位の物理的な形態を改変する他の様々な物質を含んでよい。したがって、錠剤または丸剤は、糖、セラック、または他の腸溶被覆剤で被覆することができる。これらの様々な組成物を調製する際に使用する物質は、使用する量において製剤上純粋かつ非毒性であるべきである。
【０１０６】
液剤または懸濁剤はまた、下記の構成成分をも含み得る：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールや他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸や二亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩やリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムや右旋糖など張性を調整する作用物質。非経口用製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１０７】
本発明の薬剤組成物は、製剤上許容される担体とともに、製剤として調製することができる。インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含めて、徐放性製剤など、活性化合物を身体からの急速な排泄から保護する担体が好ましい。ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲンやポリ乳酸などの生体崩壊性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者によって容易に行うことができる。
【０１０８】
リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、製剤上許容される担体として好ましい。化合物をリポソーム中に封入しまたは取り込む方法は、Ｃｏｚｚａｎｉ，Ｉ．；Ｊｏｒｉ，Ｇ．；Ｂｅｒｔｏｌｏｎｉ，Ｇ．；Ｍｉｌａｎｅｓｉ，Ｃ．；Ｓｉｃｕｒｏ，Ｔ．、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．５３、１３１〜１４３（１９８５）、およびＪｏｒｉ，Ｇ．；Ｔｏｍｉｏ，Ｌ．；Ｒｅｄｄｉ，Ｅ．；Ｒｏｓｓｉ，Ｅ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４８、３０７〜３０９（１９８３）に記載されている。これらは、当業者に知られている方法に従って、例えば、（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように調製することもできる。例えば、適当な（複数の）脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ホスファチジルコリンや、コレステロールなど）を無機溶媒中に溶解し、次いでそれを蒸発させ、乾燥させた脂質の薄膜を容器の表面上に残すことによって、リポソーム製剤を調製することができる。次いで、活性化合物の水溶液を容器中に導入する。次いで、容器を手動で回旋して、容器の側面から脂肪性物質を遊離させ、脂質凝集物を分散させ、それによってリポソーム懸濁剤が形成する。
【０１０９】
リポソーム内に化合物を封入し体内の領域に標的を定める他の方法は、Ｓｉｃｕｒｏ，Ｔ．；Ｓｃａｒｃｅｌｌｉ，Ｖ．；Ｖｉｇｎａ，Ｍ．Ｆ．；Ｃｏｚｚａｎｉ，Ｉ．、Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．１５（１）、６７〜７０（１９８７）およびＪｏｒｉ，Ｇ．；Ｒｅｄｄｉ，Ｅ．；Ｃｏｚｚａｎｉ，Ｉ．；Ｔｏｍｉｏ，Ｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５３（５）、６１５〜２１（１９８６）に記載されている。
【０１１０】
本明細書に記載の薬剤組成物は、単回（例えば、１日１回）投与することもでき、あるいは複数回投与することもでき、あるいは持続注入を介して投与することもできる。本発明の化合物はまた、単独で、あるいは製剤上許容される担体、媒体または希釈剤と組み合わせて、単回または複数回投与することもできる。適切な製剤上の担体、媒体および希釈剤には、不活性な固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液および様々な有機溶媒がある。次いで、本発明の化合物と、製剤上許容される担体、媒体または希釈剤を混合することによって形成される薬剤組成物を、錠剤、散剤、ロゼンジ、シロップ剤、注射可能な液剤などの様々な剤形で直ちに投与する。これらの薬剤組成物は、必要なら、特定の剤形に従って、着香剤、結合剤、添加剤などのさらなる成分を含むことができる。
【０１１１】
したがって、例えば、経口投与の目的で、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよび／またはリン酸カルシウムなどの様々な添加剤を含む錠剤を、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチンおよび／またはアカシアなどの結合剤に加えて、デンプン、アルギン酸および／または特定の複合ケイ酸塩などの様々な崩壊剤と一緒に使用することができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムや滑石などの潤滑化剤は、錠剤にする目的でしばしば有用である。軟および硬充填ゼラチンカプセルにおける充填剤として、同様の型の固体組成物を使用することもできる。これにとって好ましい物質には、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールがある。水性懸濁剤またはエリキシル剤が経口投与にとって望ましいとき、その中の活性のある薬剤作用物質は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび／またはその組合せなどの希釈剤に加えて、様々な甘味剤または着香剤、着色剤または色素と、必要なら乳化剤または懸濁化剤と組み合わせることができる。
【０１１２】
非経口投与では、ゴマ油またはラッカセイ油、水性プロピレングリコール、または滅菌水溶液中に溶かした本発明の化合物の液剤を使用することができる。そのような水溶液は必要ならば適切に緩衝を受け、また液体希釈剤を十分な食塩水またはグルコースで最初に等張にするべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関して、使用される滅菌水性媒体はすべて、当業者に知られている標準技術により直ちに利用可能である。
【０１１３】
鼻内投与または吸入による投与では、好都合なことに、本発明の化合物は、患者により押し出されまたは汲み出される、ポンプ噴霧容器からの液剤または懸濁剤の形で、あるいは、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用した加圧容器または噴霧器からのエアロゾル噴霧で提供するものとして送達される。加圧エアロゾルの場合では、投与量の単位は、計量された量を送達する弁を供給することによって決定することができる。加圧容器または噴霧器は、本発明の化合物の液剤または懸濁剤を含むことができる。本発明の１つまたは複数の化合物と、ラクトースやデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含む、吸入器または注入器で使用する（例えば、ゼラチンで作られた）カプセルおよびカートリッジを製剤することができる。
【０１１４】
本明細書で提供する薬剤組成物はまた、神経疾患、心血管疾患、腫瘍、ＡＩＤＳ、抑うつ、ならびに／または１型および２型糖尿病などの疾患に有効な、薬剤として活性のある他の作用物質とともに使用することもできる。そのようなさらなる作用物質は、例えば、抗ウイルス薬、抗生物質、抗うつ薬、抗癌剤、免疫抑制薬、抗真菌薬、およびその組合せでよい。
【０１１５】
本明細書に記載の薬剤組成物は、単独でまたは他の作用物質と一緒に、単一の剤形または分離した剤形で製剤することができる。特定の量の有効成分で様々な製剤を調製する方法は、当業者に知られており、またはこの開示に照らせば当業者には明らかとなるであろう。製剤を調製する方法の例としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ、第１９版（１９９５）を参照されたい。
【０１１６】
足場
一実施形態では、本発明は、担体または基質中にＮＥＬＬペプチドを組み込む方法、および得られた基質を含み得る。
【０１１７】
一実施形態では、骨形成を誘導する組成物は、それだけに限らないが、ＮＥＬＬペプチド、例えばＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチド、ＮＥＬＬ１ペプチドの発現を変化させる作用物質、ＮＥＬＬ１ペプチドの活性を変化させる作用物質、ＮＥＬＬ２ペプチドの発現を変化させる作用物質、ＮＥＬＬ２ペプチドの活性を変化させる作用物質、および場合によっては担体を含む群から選択される、骨形成を誘導する有効量の第１の作用物質を含み得る。
【０１１８】
その組成物は、それだけに限らないが、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＶＥＧＦ、コラーゲン、骨、骨基質、腱の基質または靭帯の基質、骨形成細胞および／または骨芽細胞を含めた第２の作用物質を含み得る。
【０１１９】
一実施形態では、担体は、酵素のまたは加水分解の機構により分解性があるような、生体分解性があるものでよい。担体の例には、それだけに限らないが、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリレート、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）、プロピレン−ｃｏ−フマレート、ポリラクトン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアニオン系ポリマー、ポリ無水物、ポリエステル−アミド、ポリ（アミノ酸）、ホモポリペプチド、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（グラクサノン（ｇｌａｘａｎｏｎｅ））、ポリサッカリド、およびポリ（オルトエステル）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエートなどのポリ（α−ヒドロキシ酸）；そのコポリマーおよび混合物、ならびに任意の誘導体および修飾物などであるがそれだけに限らない合成吸収性ポリマーがある。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，５６３，４８９号、およびＰＣＴ国際出願＃ＷＯ／０３０２４３１６を参照されたい。担体の他の例には、それだけに限らないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースや、そのカチオン性塩などのセルロース系ポリマーがある。担体の他の例には、それたけに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン灰石、生体活性ガラス物質やサンゴ由来リン灰石などの合成および天然のバイオセラミックスがある。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第２００２１８７１０４号；ＰＣＴ国際出願ＷＯ／９７３１６６１；およびＰＣＴ国際出願ＷＯ／００７１０８３を参照されたい。
【０１２０】
一実施形態では、担体は、ゾル−ゲル技術、または、それだけに限らないが、カルシウムおよびリン酸の濃度が天然の血清濃度の約１．５〜７倍であり、様々な手段によって約１５〜６５℃でｐＨ約２．８〜７．８の溶液に調整された擬似体液などの浸漬技術に由来するバイオガラスおよび／またはリン灰石を含む組成物によってさらに被覆することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４２６，１１４号および第６，０１３，５９１号；ならびにＰＣＴ国際出願ＷＯ／９１１７９６５を参照されたい。
【０１２１】
担体の他の例には、コラーゲン（例えば、Ｃｏｌｌａｓｔａｔ、Ｈｅｌｉｓｔａｔコラーゲンスポンジ）、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギン酸塩、およびゼラチン、あるいはその混合物がある。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際出願ＷＯ／９５０５８４６；ＷＯ／０２０８５４２２を参照されたい。
【０１２２】
一実施形態では、担体は、それだけに限らないが、ヘパリン様ポリマー、例えばデキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、フカン、アルギン酸塩またはその誘導体；およびヘパリン親和性が増大するアミノ酸修飾を有するペプチド断片を含めたヘパリン結合作用物質を含み得る。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれているＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）、２７８（４４）、ｐ．４３２２９〜４３２３５を参照されたい。
【０１２３】
一実施形態では、基質は、液体、固体またはゲルの形態のものでよい。
【０１２４】
一実施形態では、基質は、流動可能なゲルの形態である担体を含み得る。ゲルは、骨形成が所望される部位で注射器を介してなど、注射可能となるように選択することができる。ゲルは、化学的なゲルでよく、それは主結合により形成され、ｐＨ、イオン性基、および／または溶媒濃度によって調節される化学的なゲルでよい。ゲルはまた、物理的なゲルでもよく、それは副結合により形成し、温度および粘性によって調節することができる。ゲルの例には、それだけに限らないが、プルロニック、ゼラチン、ヒアルロナン、コラーゲン、ポリラクチド−ポリエチレングリコール溶液および結合体、キトサン、キトサン＆ｂ−グリセロリン酸塩（ＢＳＴ−ゲル）、アルギン酸塩、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中のポリラクチド／グリコリドがある。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれているＡｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ（２００１）、２６３（４）、３４２〜３４９を参照されたい。
【０１２５】
一実施形態では、担体は、波長が少なくとも約２５０ｎｍの電磁放射によるものなど、光重合可能でよい。光重合可能なポリマーの例には、ポリエチレン（ＰＥＧ）アクリレート誘導体、ＰＥＧメタクリレート誘導体、プロピレンフマレート−ｃｏ−エチレングリコール、ポリビニルアルコール誘導体、ＰＥＧ−ｃｏ−ポリ（−ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー、およびヒアルロン酸誘導体やデキストランメタクリレートなどの修飾ポリサッカリドがある。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，４１０，０１６号を参照されたい。
【０１２６】
一実施形態では、基質は、温度感受性である担体を含み得る。例として、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮｉＰＡＭ）、または下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が低く、エチルメタクリレートおよびＮ−アクリルオキシスクシンイミドの取り込みによるペプチド（例えば、ＮＥＬＬ１）結合が亢進した修飾ＮｉＰＡＭ；またはブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレートやドデシルメタクリレートなどのアルキルメタクリレートで作られた担体がある（その教示が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００１０７０２８８；米国特許第５，１２４，１５１号）。
【０１２７】
一実施形態では、担体は、受容体媒介性の機構により細胞と基質の結合を促進することができる細胞接着分子、接着ペプチド、および接着ペプチド類似体、ならびに／または、それだけに限らないが、ポリカチオン性ポリアミノ酸ペプチド（例えば、ポリリシン）、ポリアニオン性ポリアミノ酸ペプチド、Ｍｅｆｐクラスの接着分子および他のＤＯＰＡに富むペプチド（例えば、ポリリシン−ＤＯＰＡ）、ポリサッカリドやプロテオグリカンなど、受容体非媒介性の結合機構により接着を促進することができる分子部分で装飾および／または固定化した表面を有し得る。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００４００５４２１；ＷＯ／２００３００８３７６；ＷＯ／９７３４０１６を参照されたい。
【０１２８】
一実施形態では、担体は、それだけに限らないが、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含めたアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、血液、フィブリン、ポリオキシエチレンオキシド、硫酸カルシウム半水化物、リン灰石、カルボキシビニルポリマーや、ポリ（ビニルアルコール）などの金属イオン封鎖剤からなるものを含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，６２０，４０６号を参照されたい。
【０１２９】
一実施形態では、担体は、それだけに限らないが、ポリオキシエステル（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０またはＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−６８）など、担体物質内でのＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２の安定性および／または分配を促進する表面活性物質を含み得る。
【０１３０】
一実施形態では、担体は、それだけに限らないが、グリシン、グルタミン酸塩酸塩、塩化ナトリウム、グアニジン、ヘパリン、グルタミン酸塩酸塩、酢酸、コハク酸、ポリソルベート、デキストラン硫酸、スクロースやアミノ酸などの緩衝化剤を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，３８５，８８７号を参照されたい。一実施形態では、担体は、上記に列挙したものなどの物質の組合せを含み得る。
【０１３１】
一例として、担体は、ＰＬＧＡ／コラーゲン担体膜でよい。例えばＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチド、またはその混合物を含む作用物質の溶液中に膜を浸すことができる。
【０１３２】
一実施形態では、ヒト体内で使用するインプラントは、例えばＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチド、またはその混合物を含めて、インプラントの近くで骨形成を誘導するのに十分な量の、上記に記載の１つまたは複数の作用物質を含む基質を含み得る。
【０１３３】
一実施形態では、ヒト体内で使用するインプラントは、インプラントの近くで骨形成を誘導するのに十分な量の、ＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやその混合物などの作用物質を含む表面を有する基質を含み得る。
【０１３４】
一実施形態では、ヒト体内で使用するインプラントは、骨形成を誘導するのに十分な量の骨形成細胞および例えばＮＥＬＬ１またはＮＥＬＬ２を含む表面を有する基質を含み得る。一実施形態では、それだけに限らないが、自己細胞、骨形成細胞または骨芽細胞、ＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやその混合物などのＮＥＬＬペプチドまたは他の骨形成分子を発現する細胞を含めた細胞とともにインプラントを播くことができる。
【０１３５】
インプラントは、メッシュ、ピン、ネジ、プレート、または人工関節の形にした基質を含み得る。一例として、基質は、歯科または整形外科インプラントの形態のものでよく、例えば、ＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやその混合物など、インプラントの近くで骨での組み込みを亢進するのに使用することができる作用物質を含み得る。インプラントは、コラーゲンを含む基質など、再吸収可能な基質を含み得る。
【０１３６】
一例では、本発明による組成物は、持続放出性錠剤の中に含めることができる。
【０１３７】
ＮＥＬＬペプチド、例えばＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやそのペプチドの混合物などの作用物質を、許容される担体と組み合わせて、薬剤組成物を形成することができる。許容される担体は、例えば、組成物の安定化、あるいは作用物質の吸収の増大または低下に作用する、生理的に許容される化合物を含むことができる。生理的に許容される化合物には、例えば、グルコース、スクロースやデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸やグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート化剤、低分子量タンパク質、有糸分裂阻害剤の排除または加水分解を低下させる組成物、または添加剤あるいは他の安定化剤および／または緩衝剤が含まれ得る。
【０１３８】
他の生理的に許容される化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、あるいは微生物の増殖または作用の防止に特に有用である保存剤がある。様々な保存剤が周知であり、それには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸がある。当業者なら、生理的に許容される化合物を含めて、担体の選択が、例えば投与経路に依存することを理解するであろう。
【０１３９】
投与の方法に応じて、様々な単位剤形で組成物を投与することができる。例えば、適切な単位剤形には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が含まれ得る。
【０１４０】
本発明の組成物は、水溶性ペプチド用の水性担体などの製剤上許容される担体中に溶解したＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやそのペプチドの混合物などのＮＥＬＬペプチドなどの作用物質の溶液を含み得る。例えば緩衝食塩水など、様々な担体を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、望ましくない物質を一般に含まない。従来のよく知られている滅菌技術によって、これらの組成物を滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整および緩衝化剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、生理的条件に近づけるのに必要となる製剤上許容される補助物質を含むことができる。
【０１４１】
これらの製剤中での、ＮＥＬＬペプチド、例えばＮＥＬＬ１ペプチド、ＮＥＬＬ２ペプチドやそのペプチドの混合物などの作用物質の濃度は幅広く変動する可能性があり、選択した特定の投与形態および患者の要求に従って、主として液量、粘性、体重などに基づいてそれを選択することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、足場は含み得る。担体の他の例には、それたけに限らないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン灰石、生体活性ガラス物質やサンゴ由来リン灰石などの合成および天然のバイオセラミックスがある。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第２００２１８７１０４号；ＰＣＴ国際出願ＷＯ／９７３１６６１；およびＰＣＴ国際出願ＷＯ／００７１０８３を参照されたい。バイオセラミック担体のさらなる例には、自己、同種、および異種骨移植片があり、それは無処理でもよく、あるいはタンパク質除去または脱無機化してもよい。担体の他の例には、局所微小環境の局所カルシウムおよびリン酸濃度がそれぞれ０．０１〜１０ｍＭ（カルシウム）および０．０１〜３ｍＭ（リン酸）であるときに、骨芽細胞またはその前駆体のオステオポンチン遺伝子発現を少なくとも１．５倍増大させる合成および天然のバイオセラミックスならびにそのポリマーおよび複合体；局所微小環境の局所リン酸およびカルシウム濃度が０．０１〜１０ｍＭ（リン酸）および０．０１〜３ｍＭ（カルシウム）であるときに、骨芽細胞またはその前駆体のオステオポンチン遺伝子発現を少なくとも１．５倍増大させる合成および天然のバイオセラミックスならびにそのポリマーおよび複合体がある。
【０１４３】
一実施形態では、担体は、ゾル−ゲル技術、または、それだけに限らないが、カルシウムおよびリン酸の濃度が天然の血清濃度の約０．１〜１０倍であり、担体の材料に応じて、様々な手段によって約１５〜６５℃でｐＨ約２．８〜９．８の溶液に調整された擬似体液などの浸漬技術に由来するバイオガラスおよび／またはリン灰石を含む組成物によってさらに被覆することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４２６，１１４号および第６，０１３，５９１号；ならびに国際出願ＷＯ／９１１７９６５を参照されたい。被覆物質の他の例には、局所微小環境の局所カルシウムおよびリン酸濃度がそれぞれ０．０１〜１０ｍＭ（カルシウム）および０．０１〜３ｍＭ（リン酸）であるときに、骨芽細胞またはその前駆体のオステオポンチン遺伝子発現を少なくとも１．５倍増大させる合成および天然のバイオセラミックスならびにそのポリマーおよび複合体；局所微小環境の局所リン酸およびカルシウム濃度が０．０１〜１０ｍＭ（リン酸）および０．０１〜３ｍＭ（カルシウム）であるときに、骨芽細胞またはその前駆体のオステオポンチン遺伝子発現を少なくとも１．５倍増大させる合成および天然のバイオセラミックスならびにそのポリマーおよび複合体がある。
【０１４４】
薬剤組成物の使用
本発明の実施形態に従って、骨状態または骨に関連する状態を治療または予防するために、記載した様々な実施形態の薬剤組成物を哺乳動物に投与することができる。本明細書において、「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび動物を含めたすべての哺乳動物対象を包含する。
【０１４５】
一実施形態では、骨発生が望ましい骨状態を治療、予防、または改善するために、薬剤組成物を哺乳動物に投与することができる。
【０１４６】
他の実施形態では、骨発生が過度であり、または望ましくない骨状態を治療、予防、または改善するために、本明細書で提供する薬剤組成物を哺乳動物に投与することができる。さらなる実施形態では、骨状態を治療、予防、または改善するために、本明細書で提供する薬剤組成物を哺乳動物に投与することができる。
【０１４７】
本明細書に記載の薬剤組成物によって治療、予防、および／または改善することができる様々な骨状態は、上記に記載されている。
【実施例】
【０１４８】
本発明の実施形態を、下記に示す実施例によって説明する。すべてのパラメーターおよびデータは、本発明の実施形態の範囲を過度に限定するものと解釈すべきでない。
【０１４９】
（実施例１）
頭蓋冠創傷モデルを使用した骨形成
一般的手順
一実施形態では、非癒合モデルでの臨界サイズの欠損を使用して、頭蓋冠修復でのＮＥＬＬ１の適切な濃度を決定することができる。荷重がかからない条件下で骨再生を試験するモデルとして頭蓋冠欠損が使用されている（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏ．およびＪ．Ｃ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ、１９９０．１（１）：ｐ．６０〜８）。例示的な手順を下記に記載する。
【０１５０】
標準化。骨修復の特性を標準化するために、成長中の動物（骨が未成熟な動物）ではなく骨が成熟した５カ月齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを生存手術に使用する（Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｒ、およびＳ．Ａ．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００３．９４（２）：ｐ．６４２〜５０）。麻酔の導入後、成体ラットの頭皮領域を剃り、アルコールおよびベタジンで３回処置し、次いで滅菌布で覆う。全層頭皮切開を行い、骨膜を反転させて両側の頭頂骨を露出する。骨辺縁の過熱を防止する滅菌食塩水での持続灌注下で穿孔ドリルを使用する。下にある硬膜への損傷を回避するよう注意して、各頭頂骨で全層開頭術による欠損を生成する［すなわち、ラット１匹当たり２つの頭頂欠損；各欠損の直径＝５ｍｍ（臨界サイズ）］。両側の５ｍｍ未処置欠損の推定治癒率を表２に示した。
【０１５１】
【表２】
2008530227.tif 000004
【０１５２】
生成した後、各欠損を食塩水で流して骨破片を除去し、次いで、滅菌食塩水と混合した対照セラミック担体、または差をつけたＮＥＬＬ１投与量と混合したセラミック担体を移植して、最適なＮＥＬＬ１治療濃度を決定する。欠損面積に従ってＮＥＬＬ１濃度を標準化する（すなわち、１ｍｍ２当たりのＮＥＬＬ１タンパク質の量（ｎｇ））（表２、第Ｉ群）。ラット５匹（Ｎ＝欠損１０個）を、第Ｉ群（Ｎ＝ラット合計３５匹）における各介入の下位群に使用する（表２）。さらに、異なる濃度のＢＭＰ２およびＢＭＰ７を同一の形で５ｍｍ欠損モデルに適用する（表２、第ＩＩ群）（Ｎ＝ラット４５匹）。ＮＥＬＬ１試験の濃度は、予備試験に基づいている。ＢＭＰ試験の濃度は、ＢＭＰ濃度（面積単位で）が約２０ｎｇ／ｍｍ２〜約６００ｎｇ／ｍｍ２であった直径８ｍｍのラット頭蓋冠欠損についての発表された試験に基づいている（表３）。
【０１５３】
【表３】
2008530227.tif 000005
【０１５４】
第Ｉ群および第ＩＩ群の各介入の下位群のラット５匹（表２）に、確立されたプロトコールを使用して、マイクロＣＴを用いた毎週の生体連続画像化を連続８週間行う（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｈｅａｌ  ｃｒｉｔｉｃａｌ−ｓｉｚｅ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｌｖａｒｉａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００４．２２（５）：ｐ．５６０〜７）。生体用マイクロＣＴは、異なる介入の下位群中での、骨密度ならびに骨再生の面積および体積に対する正確なリアルタイム定量的データも、骨形態に対するいくらか定性的なデータももたらす。８週目で、高解像度の死体用マイクロＣＴ分析および組織検査のために動物を屠殺する。頭蓋冠切片にヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行って、骨形成の質について組織学的に評価する。軟骨が観察される場合、アルシアンブルーを使用してその所見を検証する。ＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ７の最適濃度を、８週目でＣＴに由来する最大面積の組織学的に確認された骨を誘導する濃度と定義する。骨形成においてプラトーが特定の濃度を超えて観察される場合、プラトーに達する最低濃度を「最適」と称する。
【０１５５】
機器。高解像度マイクロＣＴは、以前に発表されているように（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００２．１１０（６）：ｐ．８６１〜７０）、μＣＴ４０（Ｓｃａｎｃｏ、ペンシルバニア州）の最新の解像度９〜２０μｍの技術を利用する。マイクロＣＴのデータを５０ｋＶｐおよび１６０μＡで収集し、ＳｃａｎｃｏによりマイクロＣＴスキャナーとともに供給される円錐ビームアルゴリズムを使用して再構成することができる。２Ｄと３Ｄの両方のデータを取得し、分析して、生物学的挙動の最適な特徴付けを確実に行う。データの視覚化および再構成は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）画像化システム（２−Ｄ用）（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ペンシルバニア州Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ）、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ第５．０版（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）（２Ｄ用）、およびＡｍｉｒａ（商標）（３−Ｄ用）（Ｖｉｓｕａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、Ｂｅｒｌｉｎ）を使用して行うことができる。
【０１５６】
１）骨体積／組織体積−関心体積（ＶＯＩ）中の組織ボクセルの合計数で割ったＶＯＩ中の骨ボクセルの数；２）無機化密度−骨塊の体積で割った骨塊の放射線不透過性；ならびに３）（骨の体積および表面積に由来する）骨梁の厚さ、骨梁の数、および骨梁の離開を含めて、知られているいくつかの骨特異的３−Ｄ構造パラメーターのＣＴに基づく形態測定分析を行うことができる（Ｂｏｒａｈ，Ｂ．Ｄ．、Ｔ．Ｅ．ら、ＪＢＭＲ、２０００．１５（９）：ｐ．１７８６〜１７９７）。
【０１５７】
足場の製作。ＭＴＦにより供給されるセラミック担体が、Ｓｙｎｔｈａｃｅｒの名称の下で売買されている。Ｓｙｎｔｈａｃｅｒは、塊の円柱形（水酸化リン灰石９５％；孔サイズ２００〜８００ミクロン、有孔性６５〜８０％）、および疎性の粉末形で入手可能である。その実験では、ＭＴＦにより供給される、対応する欠損に適合するように作られた塊のＳｙｎｔｈａｃｅｒの円板を利用する。リン灰石担体での初期の試験から、コラーゲンを含まない対照と比較して、コラーゲン／成長因子で被覆したリン灰石で骨誘導反応時間が速いことが示され、したがって、Ｉ型コラーゲン溶液中にすべての成長因子を混合する。ｐＨを調整したコラーゲン溶液に０℃で成長因子を添加することによって、その溶液を調製することができる。次いで、所定の量のコラーゲンＩ／成長因子溶液を各円板上につけ、調製した足場を２０℃にしてゲル化し、次いでそれを空気乾燥させてコラーゲン／成長因子の薄層にする。必要なら、他の生体材料（ヒアルロナン、フィブリン、またはアルギン酸塩）を使用して、コラーゲン成分を置換することができる。
【０１５８】
最適化したＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ７の濃度を使用した頭蓋顔面骨形成の分析。臨界欠損（非癒合）モデルについて上記に記載のように動物の手術を行う。最適化したＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、およびＢＭＰ７の濃度を、セラミック担体を使用して適用する（表４）。対照は、セラミック担体および滅菌食塩水からなる。組織検査上で新たに形成された骨に時間的に輪郭をつけるために、動物に、０日目のカルセインブルー（体重１ｋｇ当たり３０ｍｇ）の単回腹腔内注射、１４日目のキシレノールオレンジ（体重１ｋｇ当たり９０ｍｇ）の単回腹腔内注射、および２８日目のカルセイン（体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ）の単回腹腔内注射で順次ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光標識を行う。（青色を発する）カルセインブルー、（オレンジ色を発する）キシレノールオレンジ、および（緑色を発する）カルセインは、放射標識したカルシウムに対して類似した分布パターンを示し、骨または軟骨基質無機化の活発な無機化部位中で沈着するキレート化蛍光色素である（Ｌｅｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｊ  Ａｎａｔ、２００３．２０３（２）：ｐ．１６１〜７２で総説されている）。Ｉｗａｍｏｔｏらにより記載のように（Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｊ．、Ｊ．Ｋ．Ｙｅｈ、およびＪ．Ｆ．Ａｌｏｉａ、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２０００．１５（９）：ｐ．１８４２〜９）、投与間隔で割った、異なる蛍光色素の帯域間の距離を測定すると、鉱質付着率（ＭＡＲ）の算出が可能となる。
【０１５９】
さらに、各動物に、確立されたプロトコールを使用して、マイクロＣＴおよびマイクロＰＥＴを用いた毎週の生体連続画像化を屠殺するまで行う（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００４．２２（５）：ｐ．５６０〜７；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、２００２．２９（９）：ｐ．１２２５〜３６）。
【０１６０】
【表４】
2008530227.tif 000006
【０１６１】
マイクロＰＥＴは、どのようにＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、またはＢＭＰ７の添加が時間的空間的に区別される形で骨代謝活性に影響を及ぼすことができるかの定量的分析を促進する。下位群の動物を１、２、４、および８週目で屠殺する。同一処置を行った、各動物の対の頭蓋冠標本は、異なる形で採取し処理する。一方の標本は、正常組織の大縁とともに採取し、組織検査およびその後の第ＩＩ相（Ｐｈａｓｅ  ＩＩ）の細胞分析用に４％パラホルムアルデヒド中で固定する。他方の標本は、正常組織の小縁（＜２ｍｍ）とともに採取し、直ちに液体窒素で凍結させ、より詳細な第ＩＩ相の分子分析を見越して−７０℃で貯蔵する。
【０１６２】
固定した標本に、上記に記載の高解像度マイクロＣＴおよび画像化ソフトウェアを使用して、最初に形態分析を行う。この後、固定した標本を二分する。標本の半分を脱無機化し、脱水し、パラフィンで包埋し、（厚さ５μｍで）薄切し、Ｈ＆Ｅ染色する；他方の半分は脱灰せずに処理し、メタクリル酸メチルのどちらかで包埋する。ｉｎ  ｖｉｖｏ標識の視覚化では、４つの非染色の脱灰していない不連続切片（厚さ１０μｍ）を、蛍光顕微鏡法を使用して調べる。さらなる切片（厚さ４μｍ）を、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらにより記載のように（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏ．、Ｄ．Ｂｕｃｋ、およびＪ．Ｐ．Ｓｃｈｍｉｔｚ、Ｃｌｉｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ、２１（３）：ｐ．４６３〜７５）（１９９４）、骨梁骨の体積や表面密度などの組織形態測定のためのマッソンゴルドナー三重染色法で染色する。
【０１６３】
マイクロＰＥＴは、活性が穿孔の縁または損傷の中心部のどちらで最も強いか、および最適化したＮＥＬＬ１またはＢＭＰの添加がどのようにこの活性に影響を及ぼすかについての詳細な代謝情報をもたらす。ＮＥＬＬ１とＢＭＰのどちらでも、穿孔の縁および損傷の中心部で骨代謝活性は増大する。さらに、異なるキレート化蛍光色素の使用により、算出したＭＡＲと、マイクロＣＴ上で観察された骨形成およびマイクロＰＥＴ上で観察された代謝活性との相関をとることもでき、新たに沈着した骨の時間的空間的順序（例えば、中心部対縁の骨の沈着率、硬膜対骨膜の骨の沈着率）もより正確に決定される。
【０１６４】
ＮＥＬＬ１による頭蓋冠骨の再生
頭蓋冠欠損の生成。臨界サイズ頭蓋冠欠損は非骨癒合モデルとなる［それは３カ月までの３次元（Ｄ）体積測定での＜１０％の治癒として定義されている］が、臨界未満サイズの頭蓋冠欠損は遅延骨癒合モデルとなる（それは３カ月までの３Ｄ体積測定での≦１５％の治癒として定義することができる）。ラットモデルにおける両側の未処置臨界サイズ（直径５ｍｍ）および臨界未満サイズ（直径３ｍｍ）頭蓋冠欠損の推定治癒率を表５に示す。５ｍｍ欠損での１０％未満の治癒は、文献中の他の報告と一致する（Ｂｏｓｃｈ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ、１９９８．９（４）：ｐ．３１０〜６）。いくつかのラット臨界サイズ欠損モデルは、矢状縫合を越えて中心部にある単一の直径８ｍｍの欠損を含むが（Ｋｅｎｌｅｙ，Ｒ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、１９９４．２８（１０）：ｐ．１１３９〜４７；Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ，Ｈ．ら、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ、２００４．２２（２）：ｐ．３７６〜８１）、（最大５ｍｍの二重欠損に適応することができる）両側モデルを、下記の理由で選択した：１）矢状縫合内の線維組織が含まれることを特に避けるため；２）正中矢状洞への損傷を最小限にするため；および３）対をなす実験の設計を可能にするため（Ｂｏｓｃｈ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ、１９９８．９（４）：ｐ．３１０〜６）。
【０１６５】
遅延癒合モデル（すなわち、直径３ｍｍの臨界未満サイズ欠損）の、骨が未成熟な動物（約３カ月齢）を利用した。ラットでは、約５カ月で骨の成熟に達する（Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＳ．Ａ．Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２００３．９４（２）：ｐ．６４２〜５０）。ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）の１）立証された生体適合性および既存のＦＤＡ承認器具での使用；２）相対的な不活性さ（非骨誘導性）；３）取り扱い易さおよび生体活性分子の放出動態の調節についての利用可能性（Ｄｈｉｍａｎ，Ｎ．ら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ、２０００．３８（８）：ｐ．７４６〜５２；Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．およびＶ．Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２００３．５５（３）：ｐ．３２９〜４７）；ならびに４）分解プロファイル（Ｂｅｓｓｈｏ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ、２００２．６１：ｐ．６１〜６５）により、ＰＬＧＡ／コラーゲン担体膜を使用して、生体活性分子を取り込んだ。
【０１６６】
以前に記載されているように（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００４．２２（５）：ｐ．５６０〜７）、ＰＬＧＡ足場を調製した。足場の製作後、適当な量のＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、または滅菌食塩水対照と予め混合したＩ型コラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）；Ｃｏｈｅｓｉｏｎ、カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）で足場を被覆した。穿孔の欠損にぴったり合う、予備試験でのＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２の総投与量は、各直径３ｍｍＰＬＧＡ足場当たり２００ｎｇであった。対照は、ＰＬＧＡ膜単独からなるものであった。頭蓋冠のマイクロＣＴおよび組織分析のために、０、１、２、３、および４週目で動物を屠殺した。
【０１６７】
これらの試験では、最初の投与量の２００ｎｇは、経験的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＥＬＬ１細胞培養データおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＭＰ２臨界サイズ欠損データ（表３、上記）から得たものであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの５〜５０ｎｇ／ｍｌのＮＥＬＬ１濃度ではアポトーシスおよび骨結節形成が付随的に増大したが、１００ｎｇ／ｍｌを超える濃度ではアポトーシスは増大したが骨結節形成は低下し、２００ｎｇ／ｍｌを超える濃度はアポトーシスの増大および最小限の骨結節形成を伴った（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ、２００３．１８（１２）：ｐ．２１２６〜３４）。したがって、このことから過度のＮＥＬＬ１投与により骨形成が低下することが示唆される。発表されたＢＭＰ２の研究では、比較的少ない１μｇの総適用量で、３週間で直径８ｍｍの欠損が有効に４６％〜７４％閉鎖した（Ｓｃｈｍｏｅｋｅｌ，Ｈ．ら、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ、２００４．２２（２）：ｐ．３７６〜８１）。総欠損面積に対して標準化したとき、１μｇの投与量は２０ｎｇ／ｍｍ２と同等であった（体積ではなく欠損面積に対して標準化したことは、体積を算出するための頭蓋冠の厚さが常に得られるわけではなかった、発表されている研究と、この実施例での投与量の比較を容易にするためであった）。直径３ｍｍの欠損の総面積（すなわち、７ｍｍ２＝総面積）で割った、本明細書で使用する２００ｎｇの総投与量は、２８ｎｇ／ｍｍ２に対応する。
【０１６８】
ＮＥＬＬ１による頭蓋冠骨再生の誘導。ＰＬＧＡ膜上に載せた総投与量２００ｎｇ（２８ｎｇ／ｍｍ２）のＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２を利用する試験から、載せていないＰＬＧＡ対照を超える、ＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の両方で処理した標本の著しい骨形成が示された（処理の下位群当たり、１時点当たりでＮ＝欠損４〜６個）。体積分析から、４週間の試験期間にわたって、対象と比べてＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の両方処理で骨形成の著しい増大が示された（図４）。図４に示すように、ＮＥＬＬ１は、１週目でＢＭＰ２より著しく大きく骨を誘導した。
【０１６９】
全体的に、３カ月目で１５％以下の骨体積の再生が推定される（表５）。２週間目で、ＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２では表面分析による約７０〜８０％の欠損閉鎖、および体積分析による３５〜４５％の体積の再生が示された（図４）。組織切片から骨の存在が確認された。骨状の沈着および骨梁分岐パターンは、ＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の間で著明には異ならなかった。図５で、ＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２で処理した４週目の標本における表面分析による９０〜１００％近い欠損閉鎖が示され、それは、３Ｄ体積分析による４５〜５０％の体積の再生に対応するものであった。組織切片から骨の存在が確認された（図６Ａ〜６Ｃ）。やはり、ＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の誘導した骨の間で著明な組織学的相違は認められなかった（図６Ａ〜６Ｃ）。
【０１７０】
注目すべきことに、表面分析での標準偏差は、体積分析のものより著しく高かった。このことは、２Ｄに基づく線形的測定が、３Ｄの生物中での組織事象すべてを必ずしも反映できるわけではないことを強調するのに役立つ。
【０１７１】
【表５】
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【０１７２】
２Ｄに基づく「欠損閉鎖」がＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２で処理した頭蓋冠で起こっているが、欠損中で再生した骨の横断面の厚さが、創傷のない骨のと同じ厚さではないことを、実際に組織標本（図６Ａ〜６Ｃ）から認めることができる。したがって、２Ｄに基づく欠損の「閉鎖」が、３Ｄに基づく欠損の「再構成」と必ずしも対応するわけではない。Ｇｏｓａｉｎらはまた、臨界サイズ、および特に臨界未満サイズの欠損の評価における横断面またはより「３Ｄ」に基づくデータの取得および分析パラメーターの重要性についても言及している（Ｇｏｓａｉｎ，Ａ．Ｋ．ら、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ、２０００．１０６（２）：ｐ．３６０〜７１；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３７２）。
【０１７３】
これらの研究は、組換えＮＥＬＬ１がｉｎ  ｖｉｖｏで骨誘導性を示し、ＮＥＬＬ１が誘導する骨が、ＢＭＰ２が誘導する骨と４週目で区別できないことを示すものである。
【０１７４】
（実施例２）
組換えヒトＮＥＬＬ（ｒｈＮＥＬＬ１）を発現させる哺乳動物の系
ＮＥＬＬ１およびＮＥＬＬ２タンパク質／ペプチドの機能を研究するために、そのペプチドを産生および精製しようとする試みに成功した。本発明における非ウイルスＤＮＡ送達によるｒｈＮＥＬＬ１の産生に使用する哺乳動物発現系には、それだけに限らないが、表６に列挙するこれらの通常使用される安定発現系が含まれ得る。ベクターの設計、宿主細胞系統の培養、トランスフェクション、および安定細胞系統の選択、ならびにＨＥＫ２９３およびＣＨＯ系でのｒｈＮＥＬＬ１の精製を含めた詳細なプロトコールを、参照用に下記で説明する。
【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
Ａ．ＣＨＯ系
ベクター設計：ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐ３×Ｆｌａｇ−ＣＭＶ（Ｓｉｇｍａ）中に連結した。得られた発現用構築物ｐＣＭＶ−ｒｈＮｅｌｌ−３×ｆｌａｇは、プレプロトリプシン先導配列、成熟ヒトＮＥＬＬ１コード領域のｃＤＮＡ断片、およびｃ−末端にある３×ｆｌａｇ配列を含む。
【０１７７】
宿主細胞系統：ＣＨＯ−Ｋ１は付着細胞系統であり、無血清培地中での懸濁培養に適合させることができる。ｐＣＭＶ−ｒｈＮＥＬＬ１−３×ｆｌａｇの構築物を、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはリン酸カルシウム処理によりトランスフェクトした。Ｇ４１８（４００〜６００ｕｇ／ｍｌ）を細胞培地中に添加して約２週間置くことによって安定細胞系統を選択した。限界希釈法により、ｒｈＮＥＬＬ１の産生力が高い単一クローンについて、安定な形質転換体をさらにスクリーニングした。選択した安定細胞系統は、ｒｈＮＥＬＬ１を産生する実験室または産業規模のバイオリアクターで使用することができる。
【０１７８】
精製手順：抗ｆｌａｇ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）アフィニティーカラムを介して、その固有の条件で、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチドを含む培地または細胞溶解液を精製し、それを３×ｆｌａｇペプチドで溶出させた。
【０１７９】
Ｂ．ＨＥＫ２９３系
ベクター設計：ｃＤＮＡ断片を発現ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。得られた発現用構築物ｐＳｅｃ−ｈＮＥＬＬ１−Ｔａｇは、ネズミイムノグロブリンκ鎖リーダー配列、成熟ヒトＮＥＬＬ１コード領域のｃＤＮＡ断片、ならびにｃ−末端にあるＭｙｃおよびＨｉｓ配列の二重タグを含む。
【０１８０】
宿主細胞系統：無血清培地に適合させ、懸濁液の形で増殖させたヒト胎児腎細胞系統のＨＥＫ−２９３に、ＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターｐＳｅｃ−ｈＮＥＬＬ１−Ｔａｇをトランスフェクトした。細胞は、一過性のトランスフェクションとして２〜３日間培養した後、ｒｈＮＥＬＬ１を精製するために馴化培地を収集し、または安定発現細胞系統を選択するためにＺｅｏｃｉｎ（２５０ｕｇ／ｍｌ）で処理した。限界希釈法により、ｒｈＮＥＬＬ１の産生力が高い単一クローンについて、安定な形質転換体をさらにスクリーニングした。選択した安定細胞系統は、ｒｈＮＥＬＬ１を産生する実験室または産業規模のバイオリアクターで使用することができる。
【０１８１】
精製手順：Ｎｉ２＋アフィニティーカラムを介して、その固有の条件で、ｒｈＮＥＬＬ１ペプチドを含む培地を精製し、それを１Ｍイミダゾールで溶出させた。少なくとも１０００容のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃で２０時間大規模に透析を行った後、その完全性、純度および生体活性についてｒｈＮＥＬＬ１を試験した。
【０１８２】
さらに、既存のリーダー配列を、ラット血清アルブミン、ＣＤ３３、ｔＰＡやヒトインターロイキン−２リーダー配列などの新たなものと置換し、またはＤＨＦＲやＧＳなどの遺伝子増幅標的を骨格配列中に付加する親ベクターの改変の結果、新たな発現ベクターおよび発現系が得られる。本発明では、ヒトＮＥＬＬ１の天然シグナルペプチドは、タンパク質分泌を誘導するほど十分に有効ではなく、外部の先導配列もどちらもうまく働かないことがある。したがって、タンパク質内部のＨｉｓタグおよび「ＭＰＨＨＨＨＨＨＧＧＧＤＤＤＤＫＤＰＭ」のようなタンパク質分解性切断部位を含むスペーサーによってヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などの小さな天然分泌タンパク質をインフレームで融合した発現ベクターの構築を必要とする可能性がある。ＮＥＬＬ１の精製に使用するエピトープタグは、６×ヒスチジン、３×Ｆｌａｇ、Ｍｙｃ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＥＧＦＰまたはＣＴＨＳ（小さなユビキチン修飾タンパク質を表すＳＵＭＯのＣ−末端側の半分）などの１つでよいが、表６で列挙したプラスミドｐＳｅｃＴａｇのようなＨｉｓプラスＭｙｃの二重のものでもよい。
【０１８３】
さらに、特定の状況下での制御性または誘導性発現用に、ＩＲＥＳを使用する２シストロン性または多シストロン性ベクターを構築することができる。ｒｈＮＥＬＬ１産生の向上のために、増殖の長い持続およびアポトーシスの遅延を獲得する、またはテトラサイクリン誘導系やＦｌｐ−Ｉｎ特定部位組み込み系などの特別な要求に適合性のある宿主細胞系統の遺伝子改変を考慮することができる。
【０１８４】
上記で述べたｒｈＮＥＬＬ１を産生する系の安定発現のほかに、複数ミリグラムで精製したプラスミドベクター（ｐＲＥＰ４）を使用する大規模一過性トランスフェクション（ＬＳＴ）の手法を使用して、カチオン性ポリマーＰＥＩを予備の代替物または安定な系と相補的なものとして、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ懸濁細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１８５】
本発明の具体的な実施形態を示し説明してきたが、本発明から逸脱せずにその広い態様の中で変更および改変を行うことができることが当業者には明らかとなるであろう。したがって、添付した特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨および範囲に入るそのような変更および改変すべてをその範囲内で包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】ラットＮＥＬＬ１タンパク質およびマウストロンボスポンジン（ＴＳＰ）−１の概略的構造を示す図である。シグナルペプチド領域（黒一色の箱）、ＴＳＰ−Ｎモジュール（ＴＳＰ−Ｎ、影付きの箱）、システインリッチ（ＣＲ）ドメイン（ＣＲ、白一色の箱）、上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン（Ｅ、斜線を付けた箱）、コイルドコイル領域（ＣＣ、棒）、Ｃａ２＋結合型ＥＧＦ様ドメイン（＊）、およびＲＧＤペプチドドメイン（ＲＧＤ、白一色の箱）を示す。
【図２Ａ】野生型マウスの骨格パターンを示す図であり、骨格染色（上段、中段）、およびマイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）（下段）での正常な骨格パターンを示している。図２Ａではまた、無機化の典型的な境界（薄い青色の点線）ならびに大泉門（赤い星印）および小泉門（青い星印）の位置も示す。右冠状縫合のかすかな輪郭（緑色の矢印）を認めることができる。冠状縫合は、縫合に隣接するのではなく重複しているので、通常見えることが少ない。中段の写真では、正常サイズの鎖骨（黒い矢印）にも留意されたい。マイクロＣＴにより、典型的な頭蓋顔面骨形態が明らかとなる。冠状縫合（緑色の矢印）および大泉門（赤い星印）が強調されている。
【図２Ｂ】ヘテロ接合性コア結合因子  １ノックアウト動物（Ｃｂｆａ１＋／−）の骨格パターンを示す図である。Ｃｂｆａ１欠失動物は骨形成の欠損を有する。これらのマウスは、広く開存した正中線の縫合および泉門を示す。欠陥のある無機化および骨形成が、正中線の頭蓋冠欠損の側方にある染色が不十分な組織（黄色と薄い青色の点線の間）中に存在する。冠状縫合の領域中に輝きを認めることもできる（緑色の矢印、上段および下段の写真）。中段の写真では、相当大きな程度の鎖骨形成不全（黒い矢印）に留意されたい。
【図２Ｃ】ＮＥＬＬ１過剰発現動物（ＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐ）と交配させたＣｂｆａ１＋／−動物の後代の骨格パターンを示す図である。Ｃｂｆａ１＋／−＋ＮＥＬＬ１ｏｖｅｒｅｘｐ動物は、骨格染色およびマイクロＣＴで、Ｃｂｆａ１＋／−半数体欠失動物と比べて頭蓋冠骨形成の著しい増大を示す。中段の写真では、小さな程度の鎖骨形成不全（黒い矢印）がある。この図はまた、冠状縫合での骨の重複の回復をも示す（緑色の矢印、上段および下段の写真）。
【図２Ｄ】ＮＥＬＬ１を過剰発現させ、またはＮＥＬＬ１タンパク質を添加したときの、ｅｘ  ｖｉｖｏでの頭蓋冠骨臓器培養物における頭蓋冠骨の過剰増殖および異所性の骨形成を示す図である。
【図２Ｅ】ＮＥＬＬ１タンパク質を添加した正常マウス頭蓋冠外植片を示す図である。緑色蛍光は、新たな骨の増殖を表す。ＮＥＬＬ１タンパク質は、骨の過剰増殖（赤い矢印）、および正所性の骨形成（黄色の矢印）を誘導する。まとめると、図２は、ＮＥＬＬ１の過剰発現の結果、頭蓋顔面領域（例えば、頭蓋冠）でも中軸骨格領域（例えば、鎖骨）でも骨の増殖が増大することを示すものである。
【図３Ａ】アデノウイルスＮＥＬＬ１（ＡｄＮＥＬＬ１）を導入した、長骨に由来する骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）のフォンコッサ染色を示す図である。細胞を集密度８０％になるまで培養し、次いで細胞１個当たり５０プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＡｄＮＥＬＬ１に感染させた（右側）。対照は、細胞１個当たり５０ｐｆｕのＡｄβ−Ｇａｌに感染させた（左側）。１１日目にフォンコッサ染色した骨結節を計数し、骨結節数を平均＋ＳＥＭで示す。各実験を３連で行った。染色した骨結節の代表的な試料を示す（緑色の矢印）。ＡｄＮＥＬＬ１を導入したＢＭＳＣは、著しく多くの無機化および骨形成を示した。
【図３Ｂ】図３Ｂ〜Ｄは、ヌードマウスの筋肉中に注射した導入ＢＭＳＣを示す図である。図３Ｂは、層状のパターンを有する比較的より成熟した骨の組織像を示す。
【図３Ｃ】放射線写真上、より成熟した骨のパターンが認められるＡｄＮＥＬＬ１を導入したＢＭＳＣを示す。
【図３Ｄ】放射線写真上、より多くの骨形成が認められるＡｄＮＥＬＬ１を導入したＢＭＳｃを示す。まとめると、図３Ａ〜３Ｄは、頭蓋冠でない供給源に由来する細胞中でのＮＥＬＬ１の過剰発現の結果、骨の無機化および骨形成が増大することを示すものである。この場合、ＮＥＬＬ１が幹細胞を誘導して骨を形成させた。
【図４】ＮＥＬＬ１またはＢＭＰ２で処置した頭蓋冠欠損の体積分析を示す図であり、ＮＥＬＬ１（緑色の線）およびＢＭＰ２（赤色の線）で、対照（青色の線）を超えて著しく骨形成が増大したことを示している。このことは、ＮＥＬＬ１が骨を再生／修復できることを示すものである。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、処置した頭蓋冠の、４週目のマイクロＣＴ画像である。図５Ａは、ＮＥＬＬ１を載せた膜（緑色で示した元の欠損の輪郭）、およびＢＭＰ２を載せたＰＬＧＡ膜（赤色で示した元の欠損の輪郭）で処置した、４週目の頭蓋冠切片を表す（頭蓋内からの像）。
【図５Ｂ】図５Ａと同じ標本を表す（頭蓋外からの像）。
【図５Ｃ】ＮＥＬＬ１を載せたＰＬＧＡ膜（緑色で示した元の欠損の輪郭）で処置した、４週目の頭蓋冠切片を表す（頭蓋内からの像）。反対側の未処置対照も示す（黄色で示した元の欠損の輪郭）。
【図５Ｄ】図５Ｃと同じ標本を表す（頭蓋外からの像）。バーの長さ：３ｍｍ（黄色、左側の下部）。まとめると、図５Ａ〜５Ｄは、ＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２の処置から、骨の無機化および骨形成が同様に増大することを示すものである。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、処置した頭蓋冠の、４週目の組織切片を示す図である。切片はマッソン三重染色法を使用して染色した。図６Ａは、ＮＥＬＬ１を載せた膜で処置した、４週目の頭蓋冠切片を表す。欠損にわたる完全な骨再生が認められる。
【図６Ｂ】ＢＭＰ２を載せた膜で処置した、４週目の頭蓋冠切片を表す。欠損にわたって完全な骨再生がやはり認められる。
【図６Ｃ】何も載せていない膜で処置した、４週目の頭蓋冠切片を表す。欠損にわたって最小限の骨再生が認められる。まとめると、図６Ａ〜６Ｃも、ＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２の処置から骨形成が同様に増大することを示すものである。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、異なる微小環境の条件下でＮＥＬＬ１が軟骨形成および軟骨内骨形成を誘導することを示す図である。図７Ａは、関節軟骨領域（上部パネル）も、また軟骨内長骨形成領域（下部パネル）も含めて、脛骨全体にわたってＮＥＬＬ１が発現していることを示す。上部パネルは、関節軟骨領域中でＮＥＬＬ１が軟骨分化を調節し増大させることができることを示すものである。したがって、これらのデータは、ＮＥＬＬペプチド活性の増大により、直接的に（例えば、ＮＥＬＬペプチドの添加またはＮＥＬＬペプチド発現の増大を介して）または間接的に（例えば、ＮＥＬＬペプチド亢進物質ならびに／あるいはＮＥＬＬペプチド受容体アゴニストおよび／または活性化物質の添加を介して）軟骨形成が促進されることを示す。下部パネルでは、軟骨内骨形成が始まる長骨幹領域中で、ＮＥＬＬ１の増大により軟骨の形成、次いでその肥大、および軟骨内骨形成の増大が起こるが、ＮＥＬＬ１の不在により、Ｃｂｆａ１ノックアウトモデルで軟骨内骨形成を起こさずに低分化の関節軟骨芽細胞／軟骨細胞の表現型の維持が可能となる。したがって、これらのデータは、ＮＥＬＬペプチド活性の増大により、直接的に（例えば、ＮＥＬＬペプチドの添加またはＮＥＬＬペプチド発現の増大を介して）または間接的に（例えば、ＮＥＬＬペプチド亢進物質ならびに／あるいはＮＥＬＬペプチド受容体アゴニストおよび／または活性化物質の添加を介して）軟骨形成、軟骨肥大および軟骨内骨化が促進されることを示す。それは、骨折などの軟骨内骨形成で有用である。外因性ＮＥＬＬ１の不在は、関節軟骨芽細胞／軟骨細胞の表現型の調節、および骨で置換された関節軟骨を予防するのに重要である肥大の抑制と関係する。したがって、ＮＥＬＬペプチド活性の阻害により、直接的に（ＮＥＬＬペプチド発現の低下、またはＮＥＬＬペプチド阻害物質の使用を介して）または間接的に（ＮＥＬＬペプチド受容体アンタゴニストおよび／または阻害物質を介して）粘骨肥大および軟骨内骨化を予防し、関節軟骨の表現型の維持を促進することができる。全体的に、これらのデータは、限定的とされるものではなく、むしろ、ＮＥＬＬが骨軟骨前駆細胞型に対して幅広い効果を有し、ＮＥＬＬによって誘導される的確な表現型が、ＮＥＬＬ適用の量およびタイミング、的確な細胞型、細胞の分化状態、ならびに微小環境の間にある複雑な相互関係に依存することを示すものである。
【図７Ｂ】口蓋骨延長モデルで、ＮＥＬＬ１タンパク質が軟骨の形成を誘導する（青い染色）ことを示す。
【図７Ｃ】ＮＥＬＬ１が軟骨芽細胞の増殖を増大させ、それがＳｏｘ９の染色性の増大によって示唆されることを示す。Ｓｏｘ９は、軟骨形成細胞増殖のマーカーである。
【図７Ｄ】ＮＥＬＬ１が軟骨のさらなる分化を誘導し、それがＸ型コラーゲンの染色性の増大によって示唆されることを示す。さらに、図７Ｄは、ＮＥＬＬ１が軟骨分化／形成を、また軟骨に基づく軟骨内骨形成をも促進することができることを示すものである。まとめると、図７Ａ〜Ｄは、ＮＥＬＬ１が軟骨の分化および肥大を調節することができることを示すものである。ＮＥＬＬ１の増大により、異なる微小環境下で軟骨の形成および肥大、ならびに軟骨内骨形成の増大が起こるが、ＮＥＬＬ１の不在により、低分化の関節軟骨芽細胞／軟骨細胞の表現型の維持が可能となる。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ａ）およびｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂ、Ｃ）でのＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の相乗効果を示す図である。これらのデータは、ＮＥＬＬ１とＢＭＰが、骨芽細胞分化マーカー発現の誘導および骨形成の誘導で相乗作用を有することを示すものである。
【図９】脱無機化骨基質を担体とするＮＥＬＬ１の脊椎固定を示す図である。固定されたＮｅｌｌ１処置脊椎の６週目の試料（Ａ、ＢおよびＣ）および癒合していない対照試料（Ｄ、ＥおよびＦ）の放射線写真およびマイクロＣＴ三次元再構成画像。（Ａ）赤い矢印により、Ｌ４およびＬ５分節で脊椎の両側にある放射線不透過性の組織塊が確認される。各塊の内側の縁（緑色の矢印）は、皮質骨に類似する最高の密度を示した；（Ｂ）このマイクロＣＴ  ３Ｄ画像は、２つの横突起の背面に詰め込まれた骨と密度が類似する、境界の明瞭な組織塊（赤い矢印）、およびその間にある空間（緑色の矢印）を示した；（Ｃ）３ＤマイクロＣＴのこの冠状切断面画像で示されているように、架橋状の骨（緑色の矢印）が両方の横突起（黄色の矢印）と明らかに結合していた；（Ｄ）この放射線写真で認められる放射線透過性が低い小さな組織塊（赤い矢印）；（Ｅ）横突起との密接な接触がないＬ４およびＬ５領域にわたる組織塊（赤い矢印）；（Ｆ）３ＤマイクロＣＴの冠状切断面で、裂け目（桃色の矢印）が確認された。このデータは、ＮＥＬＬ１が、１つの架橋形成を介して脊椎固定を誘導することができることを示すものである。
【図１０】ＮＥＬＬ１によって固定された６週目の試料（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＧおよびＨ）および癒合していない対照（Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＩおよびＪ）の組織像である。（Ａ）緑色の矢印は、Ｈ＆Ｅ染色切片上で点線で示す、２つの横突起と結合している皮質骨様の架橋状骨を示す。（ＢおよびＣ）Ａの架橋状骨の一定の領域における層状の骨の高倍率像。（Ｄ）Ｈ＆Ｅ染色から、点線で示す横突起に近接した小さな骨塊が示された；（ＥおよびＦ）Ｄの一定の領域における早熟な骨の高倍率像。（ＧおよびＨ）マッソン三重染色切片上でセメント質の線を形成する骨細胞とともに示される新たな骨の増殖。（ＩおよびＪ）再構成中のＤＢＭＤＢＭ粒子から現れるより軟骨性の組織（矢印）。元の倍率、ＡおよびＤ：９．８×；Ｂ、Ｅ、ＧおよびＩ：１００×；Ｃ、Ｆ、ＨおよびＪ：２００×。このデータは、ＮＥＬＬ１が骨の架橋形成を介して脊椎固定を誘導することができることを示すものである。
【図１１】ヒト、マウスおよびラットＮＥＬＬ１プロモーターが複数のＯＳＥ２共通モチーフを含むことを示す図である。図１１Ａは、推定されるＯＳＥ２結合部位Ａ、ＢおよびＣが転写開始部位と相対的な順序および位置に沿って示されていることを示す。潜在性のＯＳＥ２部位を縞模様の箱で示す。図１１Ｂは、ヒト、マウスおよびラットＮＥＬＬ１プロモーターの比較概略図である（原寸に比例して描かれていない）。マウスおよびラットのプロモーター中の２つのＯＳＥ２部位（それぞれ部位ｍ１および２、ならびに部位ｒ１および３）は、８１％の相同性がある領域中に位置する。潜在性の部位を縞模様の箱で示す。このデータは、Ｎｅｌｌのプロモーターの配列を、Ｎｅｌｌ発現を誘導する薬剤のスクリーニングに使用することができることを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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