(57)【要約】  本発明は、最適な発酵パラメータ下でペニシリウム・アレニコラの新規株を使用する発酵によるMPAの製造を開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規株ペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３。
【請求項２】
以下の工程を具備するマイコフェノール酸（ＭＰＡ）を製造するための微生物的方法；
（i）株ペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３の種菌を準備すること、
（ii）産生培地に対して前記種菌を移すこと、
（iii）前記産生培地を発酵に供すること、
（iv）当該バイオマスからＭＰＡを抽出すること、および
（v）ＭＰＡを単離すること。
【請求項３】
請求項２の加工であって、前記株が、ペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３から得られた変異体、突然変異体または組換え株である製造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペニシリウム・アレニコラを使用するマイコフェノール酸(Mycophenolic acid(MPA))の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マイコフェノール酸（MPA）は、ペニシリウム(penicillium)属に属する菌類の培養物から初めに単離され、またＭＰＡはペニシリウム属に属する多くの種、例えば、Ｐ.ブレヴィコンパクタム（P. brevicompactum）、Ｐ．ストロニフェルム（P. stoloniferum）、Ｐ．スカブルム（P. scabrum）、Ｐ．ナゲミ（P. nagemi）、Ｐ．スザフェリ（P. szaferi）、Ｐ．パトリス−メイ（P. patris-mei）、Ｐ．グリスコブルンネウム（P. griscobrunneum）、Ｐ．ビリヂカツム（P. biridicatum）(Boiochem. J. 26: 1442-1458, 1932)およびＰ．ロクエフォルチ(P. roqueforti)(Apple. Env. Microbiol. 37: 365-368, 1979)により産生されることが知られている。
【０００３】
ＭＰＡは、広いスペクトルの活性、例えば、抗腫瘍、抗ウイルス、抗乾癬、免疫抑制および抗炎症活性などを有する。またそれは、抗細菌活性および抗真菌活性を示す。高用量に耐えられ、最少の副作用を有する。それはイノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ、プリンの前駆体、イノシンモノホスフェートの新規の合成において重要な酵素を阻害する。ＰＭＡはまた、免疫応答に責任があるリンパ球の増殖を阻害する。このマイコフェノール酸の免疫リプレッサー効果は臓器移植手術後の臓器拒絶の治療において重要とされている。
【０００４】
マイコフェノール酸のモノフォリノエステル(morpholino ester)は、リウマチ性関節炎、乾癬の治療のための医薬組成物において、並びに臓器移植患者における組織拒絶の予防においてプロドラッグとして使用される。
【０００５】
ペニシリン・ブレビ−コンパクタム株は、液中発酵で使用されており、それは２７℃で６日間に亘り振盪して２．４ｍｇＭＰＡ／ｍＬを産生し、２７℃で１４日間に亘り振盪なしで３．６ｍｇ／ｍＬ産生することが報告されている（US patent No. 4,452,891）。固体基質発酵(solid substrate fermentation(SSF))では、ふすま１ｋｇ当たり３２８６ｍｇ産生されたことが報告されている（Sadhukhan et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 33-38, (1999)）。しかしながら、ＭＰＡを産生するペニシリウム・アレニコラの報告はない。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、マイコフェノール酸のペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ  ７６７３、その変異体または突然変異体による産生に関する。
【０００７】
本発明に従うと、以下が提供される；
ａ)  ペニシリウム・アレニコラによるＭＰＡの産生
ｂ）  ペニシリウム・アレニコラの変異体によるＭＰＡの産生
ｃ）  ペニシリウム・アレニコラの突然変異体によるＭＰＡの産生、および
ｄ）  ペニシリウム・アレニコラを使用した発酵によるＭＰＡの産生およびＭＰＡの精製のための方法。
【０００８】
本発明の方法は以下の利点を有する：
１．新株によるより高い生産性
２．経済的魅力
３．産業的な実行可能性。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、新規に分離され、精製された株であるＭＰＡを産生するペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３である。
【００１０】
本発明の第二の態様は、当該新規株の変異体である。
【００１１】
本発明の第三の態様は、当該新規株の突然変異体である。当該新規株の突然変異体は、古典的な突然変異誘発または組換え技術により得られる。
【００１２】
本発明の第四の態様は、ＭＰＡを産生するための当該ペニシリウム・アレニコラ、その変異体または突然変異体の使用である。
【００１３】
本発明の第五の態様は、ペニシリウム・アレニコラにより産生されたＭＰＡの精製の方法である。
【００１４】
当該株の単離および精製
真菌コロニーをインド、ニューデリーから入手した土壌サンプルから単離した。使用した土壌単離培地は、０．５％酵母抽出物を含有しリン酸でｐＨ４．０に酸性化されたツァベックス−ドックス寒天(Czapex-Cox Agar)であった。ウォーカップ(Warcup)により設計された土壌プレート法(soil plate method)は以下の通りであった。土壌プレートは、滅菌したペトリ皿にニクロムニードルを使用して白金耳量の土壌を移すことにより準備した。８〜１０ｍＬの上記土壌単離培地を添加し、穏やかに回旋して当該土壌粒子を分散した。１０のそのようなプレートを作成し、２３セ氏温度で２４時間に亘りインキュベートした。土壌粒子から現れた成長した菌糸の先端部を掻き取り、メート抽出物寒天板(malt extract agar plates)に移した。成長を１０日間追跡し、単離物は、メート抽出物寒天上でこれらの真菌単離物を成長させることによって精製した。このサンプルは主にペニシリウム種の単離物を示した。当該真菌単離物の一つをビオコン・カルチャー・コレクションにＢＩＣＣ７６７３として寄託した。
【００１５】
株の同定
コロニー習性：メート抽出物寒天上のコロニーは２５セ氏温度で７日で２４ｍｍの直径にまで成長、分生子集団褐色、背面蒼白。
【００１６】
形態：分生子柄滑らかで薄い壁、４μｍ直径；枝存在、１２μｍまでの基底梗子、非小胞化および等長；鉢状体８−１０μｍ長、短い頸状部を有するフラスコ形。４μｍ長までの略球形の分生子、粗い壁。
【００１７】
当該株はペニシリウム・アレニコラとして同定される。
【００１８】
ＭＰＡの産生のための発酵
播種に使用される種菌は胞子または栄養菌糸でよい。播種培地は２２から３０℃で４０−５５時間インキュベートしてよい。産生培地は２２−３０℃で１４８〜３００時間インキュベートしてよい。ＭＰＡは、固体基質および液中発酵の両方で産生される。
【００１９】
産生物の分離および精製
産生物は、何れかの水性溶液または下に記述した何れかの順序での組み合わせた工程若しくは全ての工程によって、発酵ブロスまたは基質から分離および精製されてよい。
【００２０】
当該産生物を含む水性相は水不混和性の有機溶剤で抽出されてよい。当該水不混和性の有機溶剤を、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、ブタノールなどのうちの１以上で選択されてよい。任意に、産生物を含む有機相を適切な技術を用いて部分的に濃縮してもよい。
【００２１】
本発明に従うと、ＭＰＡの製造および精製のための方法であって、以下により特徴付けられる方法が提供される；
（i）  ペニシリウム・アレニコラの株の播種用種菌を準備すること、
（ii）  当該播種用種菌を産生培地に移すこと、
（iii）  当該産生培地を固体基質または液中発酵に供すること、
（iv）  異なる間隔で前記産生培地に移されるべき当該基質を供給すること、
（v）  発酵されたバイオマスから当該産生物を抽出し、ＭＰＡを分離すること。
【００２２】
ここで、当該ペニシリウム・アレニコラの株がペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３である方法。
【００２３】
ここで、当該ペニシリウム・アレニコラＢＩＣＣ７６７３がＭＴＣＣ（ミクロバイアル・タイプ・カルチャー・コレクション）、インスティチュート・オブ・ミクロバイアル・テクノロジー、チャンディガル、インド、でアクセッションナンバーＭＴＣＣ５１４５で寄託された株である方法。
【００２４】
ここで、当該播種のために使用された株種菌が胞子懸濁液または栄養菌糸である方法。
【００２５】
ここで、当該播種培地の成分がモルト抽出物から選択される方法。
【００２６】
ここで、当該播種培地が２２〜３０セ氏温度で４０〜５５時間インキュベートされる方法。
【００２７】
ここで、前記産生培地の成分がショ糖、トリプトン、ペプトンおよび酵母抽出物から選択される方法。
【００２８】
ここで、前記産生培地が２２〜３０セ氏温度で１２０〜２４０時間インキュベートされる方法。
【００２９】
以下の例は、更に本発明を説明するものであるが、当該発明は、その中に開示された細部で限定されると意図するものではないと理解される。
【００３０】
例１
ペニシリン・アレニコラ胞子（ＢＩＣＣ７６７３）を含む一つの凍結バイアルを、２％モルト抽出物を含む滅菌培地の４０ｍＬを含む滅菌した２５０ｍＬのフラスコに対して無菌的に移し、２８セ氏温度の振盪器で４８時間に亘って成長させる。４ｍＬのこの種菌を取り、２５０ｍＬフラスコに入れた４０ｍＬの滅菌産生培地に播種し、１０日間２８セ氏温度で成長させた。当該産生培地組成物を以下に記載する。
【００３１】
ショ糖：１５０ｇ／Ｌ
トリプトン：１８ｇ／Ｌ
塩化カリウム：２ｇ／Ｌ
リン酸カリウム：４ｇ／Ｌ
クエン酸カリウム：２ｇ／Ｌ。
【００３２】
総収量として最終の発酵ブロスの１ｇ当たり３．８８ｍｇのＭＰＡが得られた。
【００３３】
例２
ペニシリウム・アレニコラ菌子体種菌を含む一つの冷凍バイアルを取り出し、残りの実験は例１で言及した通りに行った。総収量は、最終発酵ブロスの１ｇ当たりで３．７６ｍｇのＭＰＡを得た。
【００３４】
例３
ペニシリウム・アレニコラの形態学的変異体を含む一つの冷凍バイアルを取り出し、残りの実験は例１で言及した通りに行った。総収量は、最終発酵ブロスの１ｇ当たりで２．５２ｍｇのＭＰＡを得た。
【００３５】
例４
ペニシリウム・アレニコラ突然変異体を含む一つの冷凍バイアルを取り出し、残りの実験は例１で言及した通りに行った。総収量は、最終発酵ブロスの１ｇ当たりで４．６６ｍｇのＭＰＡを得た。
【００３６】
例５
例１で言及した通りの３０Ｌの産生培地を５０Ｌの発酵槽において１２１−１２３セ氏温度で６０分間滅菌した。その同じものを１０％ｖ／ｖの十分に成長した種菌を植え付けた。１６２時間で、当該発酵槽を収穫し、産生物含有量（ＭＰＡ）をＨＰＬＣ分析を用いて評価した。４．６９ｍｇ／ｇの力価が得られた。
【００３７】
例６
ペニシリウム・アレニコラの単一胞子単離物を使用した。その生物体を新鮮なＭＥＡ（モルト抽出物寒天）傾斜上で継代培養し、２６℃でインキュベートした。５日後、胞子形成した傾斜培養物を０．０１％のｔｗｅｅｎ８０を含有する１０ｍＬの水に懸濁した。５００μＬのこの胞子懸濁液をＭＥＡを含む新鮮なプレートに塗布した。当該プレートを５日間成長させた。５日後、当該胞子を当該プレートより滅菌ループで掻き取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この胞子懸濁液を種菌として使用した。１５ｋｇの小麦ふすまを約２２６００ｃｍ２のプレート領域のバイオリアクター（plafractor US 6,197,573）に負荷した。当該バイオリアクターは、その連絡チャネルと非連絡チャネルに同時に蒸気を送達し、当該バイオリアクターおよびその内容物を温度１２１℃まで９０分間加熱することにより滅菌した。当該蒸気圧を放出し、同時に滅菌した空気を当該連絡チャネルに送ると同時に冷却水を約２５℃で、非連絡チャネルに送った。
【００３８】
培養物の播種のための親種は、２０％のグリセロールを含む滅菌蒸留水の１４Ｌ中で１ｍＬ当たり１０６胞子のペニシリウム・アレニコラ懸濁液であった。これは、当該滅菌された小麦ふすまを播種するために使用し、それにより播種後の最終湿気は６０％にした。当該種菌は、滅菌したふすまと十分に混合した。滅菌した気流を、初日には２０Ｌｐｍの速度で、二日目および三日目は４０Ｌｐｍ、並びに４日および５日には２０Ｌｐｍでバイオリアクターに連続して送った。温度は２４℃に全５日間、伝導性の加熱および冷却により制御した。マイコフェノール酸産生力価は、抽出に続いてＨＰＬＣを用いて評価した。
【００３９】
例７
例１から得られた５ｋｇの発酵した小麦ふすまを次に、１０Ｌの酢酸エチルを使用して抽出し、当該抽出物を回収し、分析し、更なる過程のために得た。当該酢酸エチルの抽出効率は、ＨＰＬＣによる定量によると９８％であることが明らかになった。
【００４０】
例８
例７から得た抽出物を蒸留により部分的に濃縮して酢酸エチルを除去して３Ｌの残留物を残した。その残留物を等用量の水中の１０％ＮａＯＨ溶液で三度抽出した。その水性抽出物を合わせた。当該水層のｐＨをＨＣｌを使用して３〜３．５に調整した。水性溶液を３Ｌの酢酸エチルで抽出した。この層を水で最初に洗い、次に塩水溶液で洗った。酢酸エチル層を濃縮して、５〜１０℃で４時間維持して結晶化した。当該結晶を濾取し、酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥した。このように得た当該結晶は許容される薬学的な等級であった。
【表１】
2008515422.tif 000002
【国際調査報告】
2008515422.tif 000003
2008515422.tif 000004
2008515422.tif 000005