(57)【要約】  本発明は、免役調節ポリペプチド及び当該免役調節ポリヌクレオチドを用いて個体を免役調節する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )
[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]
で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
Ｘ1がＣ又はＡである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
以下の式：
ＧＧＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )
[式中、
ｍは１〜約１００又は１〜約２０の整数であり、
各Ｎはヌクレオチドであり、そして
Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3がヌクレオチドである。
但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]
で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Ｘ1がＣ又はＡである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
以下の式：
ＮiＴＣＣＮj(ＧＧ)kＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )
[式中、
各Ｎはヌクレオチドであり、
ｉは１〜約５０の整数であり、
ｊは１〜約５０の整数であり、
ｋは０又は１であり、
ｍは１〜約２０の整数であり、
Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。
但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]
で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｘ1がＣ又はＡである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
以下の式：
Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＧＧＧＡＡ(配列番号  )
[式中、
Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。
但し、Ｘ3＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ1Ｘ2は、ＧＧではない]
で表されるヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１のＧがＺ'により置き換えられ、ここでＺ'＝７-デアザＧである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１のＧがＺ'により置き換えられ、ここでＺ'＝７-デアザＧである、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１のＧがＺ'により置き換えられ、ここでＺ'＝７-デアザＧである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
少なくとも１のＧがＺ'により置き換えられ、ここでＺ'＝７-デアザＧである、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
以下の配列：
５'-ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ-３'(配列番号  (Ｃ６６１)  又は当該配列の断片であって、少なくとも１０塩基のパリンドローム部分を含む断片を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
以下の：
５'-ＴＧＣＮm-３'
[式中、
Ｎはヌクレオチドであり、
ｍは５〜約５０の整数であり、そして
配列Ｎ1〜Ｎmは、少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]
で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮmＡ-３'からなる、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮmＣＡ-３'からなる、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮmＧＣＡ-３'からなる、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
以下のヌクレオチド配列：
ＴＧＣＮmＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )
[式中、
各Ｎはヌクレオチドであり、そして
ｍは０〜約１００の整数である]
を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記配列Ｎ1-Ｎmが、配列：５'-ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ-３'(配列番号  )の断片を含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
以下のヌクレオチド配列：
５'-ＴＧＣＲＲＺＮＹＹ-３'(配列番号  )
[式中、
ＺはＣを除く任意のヌクレオチドであり、
Ｎは任意のヌクレオチドであり、そして
さらにここで、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎはグアノシン又はイノシンである]
を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
以下のヌクレオチド配列：
５'-ＴＧＣＲＲＺＮＹm-３'(配列番号  )
[式中、
ＺはＣを除く任意のヌクレオチドであり、
Ｎは任意のヌクレオチドであり、
Ｙはピリミジンヌクレオチドであり、
ｍは２〜１００の整数であり、そして
ここで、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎはグアノシン又はイノシンである]
を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
免疫系の細胞を請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む免役応答の阻害方法であって、当該細胞を免役応答に寄与する細胞からの応答を阻害するために有効な量の当該オリゴヌクレオチドと接触させる、前記方法。
【請求項２２】
個体において免疫応答を調節する方法であって、個体における免役応答を調節するために十分な量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
個体において免疫応答を調節する方法であって、個体において免役応答を調節するために十分な量の請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２４】
個体において免疫応答を調節する方法であって、個体において免役応答を調節するために十分な量の請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
個体においてＴＬＲ７／８依存性先天性免役応答を阻害する方法であって、個体においてＴＬＲ７／８依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量の請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
個体においてＴＬＲ９依存性先天性免役応答を阻害する方法であって、個体においてＴＬＲ９依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量の請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
個体においてＴＬＲ９依存性先天性免役応答及びＴＬＲ７／８依存性先天性免役応答を阻害する方法であって、個体においてＴＬＲ９依存性サイトカイン産生及びＴＬＲ７／８依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量の請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを当該個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
自己免疫疾患の１以上の症状を改善する方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を自己免疫疾患を患う個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)及びリューマチ様関節炎からなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
自己免疫疾患の１以上の症状を改善する方法であって、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを、自己免疫疾患を患う個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記自己免疫疾患が、ＳＬＥ及びリューマチ様関節炎からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を患う個体に投与することを含む、自己免疫疾患の１以上の症状を改善する方法。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びリューマチ様関節炎からなる群から選ばれる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクのある個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクのある個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクのある個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、当該方法が、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、炎症性疾患又は障害を患う個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、当該方法が、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、炎症性疾患又は障害を患う個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、当該方法が、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、炎症性疾患又は障害を患う個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの有効量を、慢性病原体感染又は疾患を患う個体に投与することを含む、慢性病原体刺激を抑制する方法。
【請求項４１】
適切な容器中に請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含み、そして個体の免役調節において当該オリゴヌクレオチドを使用するための説明書を含むキット。
【請求項４２】
適切な容器中に請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドを含み、そして個体の免役調節においてオリゴヌクレオチドを使用するための説明書を含むキット。
【請求項４３】
適切な容器中に請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドを含み、そして個体の免役調節においてオリゴヌクレオチドを使用するための説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節ポリヌクレオチドに関する。本発明は、免疫応答を調節するための当該ポリヌクレオチドの投与にも関する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００４年９月１日に出願された米国仮特許出願第60/606,833号の利益を主張する。当該文献をその全てについて本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００３】
免疫は一般的に先天性免疫又は獲得免疫として分類することができる。典型的に、先天性免疫は感染に際し即座に生じて、感染性疾患への早期の防御を提供する一方、獲得免疫応答は抗原特異的エフェクター細胞の生成を伴い、そしてしばしば長期間の防御免疫を伴い遅れて生じる。先天性免疫は、持続性の防御免疫を生じさせないが、後に生じる獲得免疫応答を生じさせる役割を果たしているようである。
【０００４】
多くの病原体に対して一般的である特徴を認識するため、そしてエフェクター分子の発現をもたらすシグナル伝達事象を活性化するために、先天性免疫は生殖細胞系列がコードする受容体を使用する。これらのエフェクター分子の幾つかは、最終的に獲得免疫応答を誘導しうる。トル様受容体(ＴＬＲ)のファミリーは、獲得免疫応答のシグナル伝達に関連し、そして微生物リガンドが幾つかの哺乳動物ＴＬＲについて同定されてきた。例えば、ＴＬＲ２はペプチドグリカン、細菌リポペプチド、及びリポ多糖(ＬＰＳ)のあるタイプと相互作用し、ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡと相互作用し、ＴＬＲ４はＬＰＳと相互作用し、そしてＴＬＲ-５は細菌フラジェリンと相互作用する。例えば、Poltorakら、(1998) Science 282:2085-2088; Akiraら、(2003) Immunol. Lett. 85:85-95; Alexopoulouら、(2001) Nature 413:732-738; Hayashiら、(2001) Nature 410: 1099-1103を参照のこと。ＴＬＲ７は、グアノシンアナログにより、イミダゾキノリン、イミキモド、及びＲ-８４８などの抗ウイルス低分子化合物により、そして一本鎖ウイルスＲＮＡにより活性化され、そしてＴＬＲ８もＲ-８４８及び一本鎖ウイルスＲＮＡにより活性化される。例えば、Leeら、(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651 ; Hemmiら、(2002) Nat. Immunol. 3: 196-200; Jurkら、(2002) Nat. Immunol. 3:499; Heilら、(2004) Science 303: 1526-1529; Dieboldら、(2004) Science 303: 1529-1531を参照のこと。ＴＬＲ-９は、細菌ＤＮＡ及び５'-ＣＧ-３'配列を含む免疫調節ＤＮＡなどの免疫調節核酸分子を認識することが示された。例えば、Hemmiら、(2000) Nature 408:740-745; Bauerら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9237-9242; Takeshitaら、(2001) J. Immunol. 167:3555-3558を参照のこと。さらに、あるＴＬＲ(例えば、ＴＬＲ-１、ＴＬＲ-２、及びＴＬＲ-６)はヘテロダイマー化し、その微生物リガンドと相互作用し、そして活性化を導くことができ、そうしてＴＬＲファミリーのリガンドレパートリーを拡張することができる(Ozinskyら、(2000) J. Endotoxin Res. 6:393-396; Ozinskyら、(2000) Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 13766-13771を参照のこと)。
【０００５】
免疫刺激核酸(ＩＳＮＡ)分子、例えば細菌ＤＮＡ又は非メチル化５'-ＣＧ-３'配列を含むポリヌクレオチドは、サイトカイン産生、並びに樹状細胞及びマクロファージの活性化などの先天性免疫応答を刺激することができ、次にＴｈ１型免疫応答を導くことができる。免疫刺激核酸分子は哺乳動物ＴＬＲ９との相互作用、並びにＴＬＲ９を介したシグナル伝達を通して免疫応答を刺激する(上記Hemmiら、(2000))。哺乳動物ＤＮＡは、一般的に、ＣＧ配列の出現頻度が低いこと、ＣＧ配列の大部分がメチル化シトシンを有することのため、免疫刺激活性を有しない。こうして、哺乳動物免疫システム細胞は、ＴＬＲ９受容体を介して自己のＤＮＡから細菌ＤＮＡを区別するようである。
【０００６】
免疫刺激核酸分子は、関節炎の発症機序に関連した。免疫刺激核酸は、自己反応性Ｂ細胞、例えばリュウマチ因子(ＲＦ)として知られているあるクラスの自己抗体を産生する細胞などの活性化において役割を果たすことが示されてきた。こうして、かかる免疫刺激核酸は、全身性の自己免疫に役割を果たすようである。さらに、免疫刺激核酸は、ＬＰＳの毒性を高めることができ、そして遺伝子治療のためのベクター投与の副作用の一因となる。例えば、Dengら、(1999) Nature Med. 5:702-705, Leadbetterら、(2002) Nature 416:603-607, Cowderyら、(1996) Ｊ. Immunol. 156:4570-4575、米国特許第6,225,292号を参照のこと。
【０００７】
不所望な免疫活性化、例えば先天性免疫応答の不所望な活性化を制御するための戦略を同定する必要性が残っている。
【０００８】
本明細書中に引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物を、その全てについて本明細書に援用する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、免疫調節ポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを用いて個体において免疫応答を阻害する方法に関し、そして特にヒトにおいて免疫応答を阻害する方法に関する。
【００１０】
一の態様では、本発明は免疫調節ポリヌクレオチド(ＩＲＰ)を提供する。ある実施態様では、本発明は、本明細書に開示される免疫調節ポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物を含む。当該組成物は、例えば、医薬として許容される賦形剤、又は多くの他の成分のうちのいずれかを含んでもよい。
【００１１】
別の態様では、本発明は免疫調節化合物(ＩＲＣ)を提供する。別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載される免疫調節化合物のいずれかを含む組成物を含む。当該組成物は、例えば、医薬として許容される賦形剤又は多くの他の成分のうちのいずれかを含んでもよい。
【００１２】
別の態様では、本発明は、免疫系の細胞を、免疫調節配列(ＩＲＳ)を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む免疫応答の阻害方法であって、当該細胞が、免疫応答に寄与する細胞からの応答を阻害するために有効な量のポリヌクレオチドと接触される、上記方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物を、個体において免疫応答を調節するために十分な量で当該個体に投与することを含む、個体の免疫応答の調節方法を提供する。本発明の方法に記載される免疫調節は、先天性免疫応答の不所望な活性化に関連する障害を患う個体を含む個体において行われてもよい。
【００１４】
別の態様では、本発明は、個体においてＴＬＲ７/８依存性の先天性免疫応答を阻害する方法であって、本発明の免疫調節化合物又は免疫調節ポリヌクレオチドを、当該個体においてＴＬＲ７/８依存性のサイトカイン産生を抑制するために十分な量で対象に投与することを含み、ここで当該ＩＲＰ又はＩＲＣがＴＬＲ７/８クラスのＩＲＳを含む、前記方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、個体においてＴＬＲ９依存性の先天性免疫応答を阻害する方法であって、本発明の免疫調節化合物又は免疫調節ポリヌクレオチドを、当該個体においてＴＬＲ９依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量で個体に投与することを含み、ここで当該ＩＲＰ又はＩＲＣがＴＬＲ９クラスのＩＲＳを含む、前記方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、個体においてＴＬＲ９依存性の先天性免疫応答とＴＬＲ７/８依存性の免疫応答を阻害する方法であって、本発明の免疫調節化合物又は免疫調節ポリヌクレオチドを、個体においてＴＬＲ９依存性のサイトカイン産生及びＴＬＲ７/８依存性のサイトカイン産生を抑制するために十分な量で個体に投与することを含み、ここで当該ＩＲＰ又はＩＲＣがＴＬＲ７/８/９クラスのＩＲＳを含む、前記方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、自己免疫疾患の１以上の症状を改善する方法であって、本発明の免疫調節化合物又は免疫調節ポリヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を有する個体に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明に記載される免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の投与は、ＳＬＥ及びリューマチ様関節炎を含む自己免疫疾患の１以上の症状を改善する。ある実施態様では、ＳＬＥの症状を抑制するために有効な免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物は、ＴＬＲ７/８クラス又はＴＬＲ９クラス又はＴＬＲ７／８／９クラスの免疫調節配列を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクを有する個体に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明に記載される免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の投与は、自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の有効量を、炎症性疾患又は障害を有する個体に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明に記載される免疫調節ポリヌクレオチドの投与は、炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する。ある実施態様では、本発明の組成物は、慢性炎症性疾患又は障害の症状を改善するのに有効である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、慢性の病原体刺激(pathogen stimulation)を抑制する方法であって、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の有効量を、慢性の病原体感染又は疾患を有する個体に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明に記載される免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物の投与は、個体における慢性病原体刺激、例えばマラリア及び慢性ウイルス感染に関連する刺激を抑制する。ある実施態様では、慢性の病原体刺激を抑制するために有効な免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫刺激化合物は、ＴＬＲ７／８クラスの免疫調節配列を含む。
【００２１】
幾つかの実施態様では、本発明の組成物は、Ｂ細胞又は形質細胞様樹状細胞の応答を阻害する。幾つかの実施態様では、本発明の組成物により阻害される免疫応答は、細胞によるＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＩＦＮ-α、及び／又はＴＮＦ-αなどのサイトカイン産生の阻害、細胞成熟の阻害、及び／又は細胞増殖の阻害を含む。幾つかの実施態様では、本発明の組成物は、ＴＬＲ９依存性細胞応答、ＴＬＲ７／８依存性細胞応答、及び／又はＴＬＲ７／８／９依存性細胞応答を阻害する。
【００２２】
本発明は、好ましくは、本発明の方法を行うためのキットに関する。一般的に、本発明のキットは、(一般的に適切な容器の中に)本発明の免疫調節ポリヌクレオチド及び／又は免疫調節化合物を含み、そして個体の免疫調節における免疫調節ポリヌクレオチド及び／又は免疫調節化合物を使用するための使用説明書をさらに含んでもよい。
【００２３】
さらに、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡの場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。オリゴヌクレオチドの幾つかの例において、Ｘ1はＣ又はＡである。式：ＧＧＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、ｍは１〜約１００、又は１〜約２０の整数であり、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてＸ1、Ｘ2、及びＸ3がヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの幾つかの例において、Ｘ1はＣ又はＡである。
【００２４】
式：ＮiＴＣＣＮj(ＧＧ)kＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｉは１〜約５０の整数であり、ｊは１〜約５０の整数であり、ｋは０又は１であり、ｍは１〜約２０の整数であり、そしてＸ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドの幾つかの例では、Ｘ1はＣ又はＡである。式：Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＧＧＧＡＡ(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ3＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ1Ｘ2はＧＧではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。上記オリゴヌクレオチドの幾つかの例において、少なくとも１のＧはＺ'により置換される。ここで、Ｚ'＝ｄ-デアザＧである。
【００２５】
配列：５'-ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ-３'(配列番号  (Ｃ６６１))又は当該配列の断片であって、その少なくとも１０塩基のパリンドローム部分を含む断片を含むオリゴヌクレオチドが提供される。ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎは、ヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは、少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む(つまり、ここで配列Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む)]からなるオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される。幾つかの例において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍＡ-３'からなる。別の例において、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍＣＡ-３'からなる。別の例では、当該オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍＧＣＡ-３'からなる。ヌクレオチド配列ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。当該オリゴヌクレオチドの幾つかの例において、配列Ｎ１-Ｎｍは、配列５'-ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ-３'(配列番号  )の断片を含む。
【００２６】
ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＲＲＺＮＹＹ-３'(配列番号  )[式中、ＺはＣを除く任意のヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてさらに、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎはグアノシン又はイノシンである]を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＲＲＺＮＹｍ-３'(配列番号  )、[式中、ＺはＣを除く任意のヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンヌクレオチドであり、ｍは２〜１００の整数であり、そしてここで、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎはグアノシン又はイノシンである]を含むオリゴヌクレオチドが本明細書に提供される。
【００２７】
免疫応答を阻害する方法であって、免疫系の細胞を、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで当該細胞が免疫応答に寄与する細胞からの応答を阻害するために十分な量のオリゴヌクレオチドと接触される、前記方法が本明細書に提供される。個体において免疫応答を調節する方法であって、個体に、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3がヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを、当該個体における免疫応答を調節するために十分な量で個体に投与することを含む、前記方法が提供される。
【００２８】
個体において免疫応答を調節する方法であって、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチドを、当該個体において免疫応答を調節するために十分な量で個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００２９】
個体において免疫応答を調節する方法であって、ヌクレオチド配列ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含むオリゴヌクレオチドを、当該個体において免疫応答を調節するために十分な量で個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３０】
個体においてＴＬＲ７／８依存性の先天性免疫応答を阻害する方法であって、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎがヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチドを、当該個体においてＴＬＲ７／８依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量で個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３１】
個体においてＴＬＲ９依存性先天性免疫応答を阻害する方法であって、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを、当該個体においてＴＬＲ９依存性のサイトカイン産生を抑制するために十分な量で、個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３２】
個体においてＴＬＲ９依存性先天性免疫応答及びＴＬＲ７／８依存性免疫応答を阻害する方法であって、式：ＴＧＣＮｍ [式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを、当該個体においてＴＬＲ９依存性のサイトカイン産生及びＴＬＲ７／８依存性サイトカイン産生を抑制するために十分な量で、個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３３】
自己免疫疾患の１以上の症状を改善する方法であって、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を有する個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。いくつかの実施例において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)及びリューマチ様関節炎からなる群から選ばれる。自己免疫疾患の１以上の症状を改善するための方法であって、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍが少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を有する個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。自己免疫疾患の１以上の症状を改善するための方法であって、ヌクレオチド配列：ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含むオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を有する個体へと投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。幾つかの例において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)及びリューマチ様関節炎からなる群から選ばれる。
【００３４】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ１＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクにある個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３５】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そしてＮ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクにある個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３６】
自己免疫疾患の発達を予防又は遅延する方法であって、ヌクレオチド配列：ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含むオリゴヌクレオチドの有効量を、自己免疫疾患を発達させるリスクにある個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。
【００３７】
炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ１＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの有効量を、炎症性疾患又は障害を有する個体に投与することを含む、前記方法が本明細書に提供される。炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、ヌクレオチド配列５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチドの有効量を、炎症性疾患又は障害を有する個体に投与することを含む方法が提供される。炎症性疾患又は障害の１以上の症状を改善する方法であって、ヌクレオチド配列：ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含む有効量のオリゴヌクレオチドを、炎症性疾患又は障害を有する個体へと投与することを含む、前記方法が本明細書において提供される。
【００３８】
慢性病原体刺激を抑制する方法であって、Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]を、慢性病原体感染又は疾患を有する個体に投与することを含む、前記方法が本明細書において提供される。
【００３９】
さらに、以下の：
ｉ.  式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号  )[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド；
ｉｉ.  ヌクレオチド配列：５'-ＴＧＣＮｍ-３'[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ１-Ｎｍは少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなるオリゴヌクレオチド；又は
ｉｉｉ.  ヌクレオチド配列：ＴＧＣＮｍＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号  )[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００の整数である]を含むオリゴヌクレオチド
を含むキットであって、当該オリゴヌクレオチドが適切な容器内に存在し、そして当該キットが個体を免疫調節する際にオリゴヌクレオチドを使用するための取扱説明書を含む、前記キットが本明細書において提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
我々は、免疫調節ポリヌクレオチド、及びこれらの免疫調節ポリヌクレオチドを用いて個体、特にヒトにおいて免疫応答を調節する方法を発見した。本発明の組成物は、本明細書に記載された免疫調節ポリヌクレオチドを含む。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、特に先天性免疫応答、例えば、ＴＬＲ７／８及び／又はＴＬＲ９を介したシグナル伝達に関する応答を含むを阻害する。
【００４１】
我々は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドがヒト細胞を含む免疫細胞を様々な方法で効果的に調節することを発見した。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドが、ＩＦＮ-α、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、及びＴＮＦ-αを含むサイトカインのヒト細胞からの産生を効率的に抑制できることを我々は観測した。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７／８及び／又はＴＬＲ９受容体を介して刺激された細胞応答、例えばサイトカイン産生を抑制する。我々は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドが、免疫刺激核酸で刺激された細胞、例えばＢ細胞及び形質細胞様樹状細胞の増殖及び／又は成熟を効果的に抑制できるということを観測した。こうして、本発明のＩＲＰは、遺伝子治療目的のために投与された核酸ベクターの感染又は抑制のため存在する微生物ＤＮＡなどのＩＳＮＡに対する免疫応答を抑制するのに有用である。
【００４２】
本発明は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを個体に投与することにより、個体において自己免疫障害及び慢性炎症性障害を治療及び予防する方法も提供する。
【００４３】
本発明のＩＲＰ及び／又はＩＲＣを含むキットがさらに提供される。当該キットはさらに、対象において免疫調節するための本発明の免疫調節ポリヌクレオチドを投与するための説明書をさらに含んでもよい。
【００４４】
一般技術
本発明の実施にあたり、他に記載がない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の慣用技術を利用するであろう。これらは当該技術分野の範囲内である。かかる技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第二版(Sambrookら、1989); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait編, 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & CC. Blackwell編); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos編, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編、1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganら編, 1991 ); The Immunoassay Handbook (D. Wild,編、Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson編、Academic Press, 1996);及びMethods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert及びN. A. Staines編, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)などの文献に十分に説明されている。
【００４５】
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、他に記載がない限り複数形を含む。例えばＩＲＰ(「an IRP」)は、１以上のＩＲＰを含む。
【００４６】
本明細書において交換して使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖ＤＮＡ(ｓｓＤＮＡ)、二本鎖ＤＮＡ(ｄｓＤＮＡ)、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)、及び二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)、改変オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はそれらの組合せを含む。オリゴヌクレオチドは直線状又は環状の形であってもよいし、又は当該オリゴヌクレオチドは直線状及び環状断片の両方を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一般的にホスホジエステル結合を介して結合されたヌクレオシドポリマーであるが、他の結合、例えばホスホロチオエート・エステルがオリゴヌクレオチド中に使用されてもよい。ヌクレオシドは、糖に結合されたプリン(アデニン(Ａ)又はグアニン(Ｇ)、又はその誘導体)或いはピリミジン(チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)、又はウラシル(Ｕ)、又はその誘導体)塩基からなる。ＤＮＡの４個のヌクレオシド・ユニット(又は塩基)は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００４７】
本明細書で使用される「免疫刺激核酸」又は「免疫刺激ポリヌクレオチド」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで計測される計測可能な免疫応答に影響し及び／又は寄与する核酸分子を指す。計測可能な免疫応答の例は、非限定的に、抗原特異的抗体の産生、サイトカインの分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球などのリンパ球集合の活性化又は増加を含む。免疫刺激核酸(ＩＳＮＡ)配列は、先天性免疫応答を刺激することが知られており、特にこれらの応答は、細胞におけるＴＬＲ-９シグナル伝達を介して生じる。当該技術分野に知られているように、免疫刺激核酸(ＩＳＮＡ)分子は、微生物源、例えば細菌から単離することができ、遺伝子治療において使用するための核酸ベクター中に存在することもあり、又は本明細書に記載されかつ当該技術分野において知られている技術及び装置を用いて合成することもできる。一般的に、免疫刺激核酸配列は、少なくとも１のＣＧジヌクレオチドを含み、当該ジヌクレオチドのＣはメチル化されていない。従って、微生物感染及び投与されたＤＮＡは、幾つかの場合、先天性免疫応答の刺激をもたらすことができる。
【００４８】
本明細書で使用される「免疫刺激」又は「免疫応答を刺激する」という用語は、免疫応答に参加する細胞型の刺激、及び特異抗原物質に対する免疫応答の亢進を含む。免疫刺激核酸により刺激される免疫応答は、一般的に、「Ｔｈ２型」免疫応答に対立する「Ｔｈ１型」免疫応答である。Ｔｈ１型免疫応答は、通常、抗原及び活性化マクロファージ機能に対する「遅延型高感受性」反応により特徴付けられ、そしてＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、及びＴＮＦ-βなどのＴｈ１関連サイトカインのレベルの増加により生化学レベルで検出することができる。Ｔｈ２型免疫応答は、一般的に、高レベルの抗体産生、特に、ＩｇＥ抗体産生、並びに好酸球の数及び活性化の増加、そしてＩＬ-４、ＩＬ-５、及びＩＬ-１３などのＴｈ２関連サイトカインの発現に関連する。
【００４９】
本明細書に使用される「先天性免疫応答」又は「先天性免疫」という用語は、細胞又は個体が病原体の存在を認識し、そして応答する様々な先天性の抵抗性メカニズムを含む。本明細書に使用されるとき、「先天性免疫応答」は、細胞内及び細胞間の事象及び反応であって、当該細胞が病原体関連分子のパターン又はシグナルを認識した際に生じるものを含む。先天性免疫応答において活性である細胞受容体は、トル様受容体(ＴＬＲ)のファミリーを含み、そして微生物リガンドは、本明細書に記載されるように、幾つかのＴＬＲについて同定されてきた。
【００５０】
本明細書に使用される「免疫調節配列」又は「ＩＲＳ」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで計測される計測可能な先天性免疫応答を阻害及び／又は抑制する核酸配列を指す。本明細書に使用される「免疫調節ポリヌクレオチド」又は「ＩＲＰ」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏにおいて計測される計測可能な先天性免疫応答を阻害及び／又は抑制する少なくとも１のＩＲＳを含むポリヌクレオチドを指す。ＴＬＲ、例えばＴＬＲ-７、８、又は９の阻害は、非限定的に、例えば、リガンド-受容体結合を阻害し、そしてリガンド-受容体結合後の下流シグナル経路を阻害することによる受容体部位での阻害を含む。計測可能な先天性免疫応答の例は、非限定的に、サイトカインの分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋リンパ球、ＣＤ８＋リンパ球、Ｂリンパ球などのリンパ球集合の活性化又は増加、形質細胞樹状細胞などの細胞集合の成熟を含む。
【００５１】
本明細書に使用される「免疫調節化合物」又は「ＩＲＣ」という用語は、免疫調節活性を有し、かつＩＲＳを含む核酸部分を含む分子を指す。ＩＲＣは、１より多くのＩＲＳを含むか、ＩＲＳからなるか、又はそれ自身では免疫刺激活性を有さない核酸部分からなってもよい。ＩＲＣは、ポリヌクレオチドからなってもよく(ポリヌクレオチドＩＲＣ)、又はさらなる部分を含んでもよい。従って、ＩＲＣという用語は、１以上の核酸部分を包含する化合物を含み、当該化合物の少なくとも１つは、非ヌクレオチドスペーサー部分に共有結合されたＩＲＣを含む。
【００５２】
「パリンドローム配列」又は「パリンドローム」という用語は、反転された繰り返し配列である核酸配列、例えば、ＡＢＣＤＤ'Ｃ'Ｂ'Ａ'[式中、塩基、例えばＡとＡ'、ＢとＢ'、ＣとＣ'、ＤとＤ'がワトソンクリック塩基対を形成できる。] を指す。このような配列は、一本鎖であってもよく、又は二本鎖構造を形成してもよく、又は同じ条件下でヘアピンループ構造を形成してもよい。例えば、本明細書に使用されるとき、「８塩基パリンドローム」は、パリンドローム配列が８塩基長、例えばＡＢＣＤＤ'Ｃ'Ｂ'Ａ'などである核酸配列を指す。パリンドローム配列が、非パリンドローム配列を含むポリヌクレオチドの一部であってもよい。ポリヌクレオチドは、１以上のパリンドローム配列部分及び１以上の非パリンドローム配列部分を含んでもよい。或いは、ポリヌクレオチド配列は、完全にパリンドローム状であってもよい。１超のパリンドローム配列部分を有するポリヌクレオチドにおいて、パリンドローム配列部分は、互いに重なり合ってもよいし、又はパリンドローム配列部分は互いに重なり合わなくともよい。
【００５３】
「３'」という用語は、一般的に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるある領域又は位置の３'側(下流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける領域又は位置を指す。
【００５４】
「５'」という用語は、一般的に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるある領域又は位置の５'側(上流)のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける領域又は位置を指す。
【００５５】
「会合」という用語は、ＩＲＰ及び／又はＩＲＣが結合された複合体を指す。かかる会合の結合は、共有及び／又は非共有結合を含む。
【００５６】
「アジュバント」は、抗原などの免疫原に加えられた場合に、当該混合物を受けた際に受容者において免疫原に対する免疫応答を非特異的に高めるか又は増強する物質を指す。
【００５７】
「ペプチド」という用語は、十分な長さであり、そして当該ペプチドがハプテンであろうとなかろうと生物学的応答、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性などの生物学的応答を発揮する組成物であるポリペプチドである。典型的に、当該ペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基の長さである。「ペプチド」という用語はさらに、改変されたアミノ酸(天然又は非天然型であろうとなかろうと)を含み、かかる改変は、非限定的に、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化(lipidization)、及びメチル化を含む。
【００５８】
「デリバリー分子」又は「デリバリービヒクル」は、特定の部位及び／又は特定のタイミングでＩＲＰ及び／又はＩＲＣのデリバリーを促進、許容、及び／又は亢進する化学部分(chemical moiety)である。
【００５９】
「個体」は、脊椎動物、例えばトリであり、そして好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は非限定的にヒト、霊長類、家畜、スポーツ動物、げっ歯類及びペットを含む。
【００６０】
物質の「有効量」又は「十分な量」は、有利又は所望の結果、例えば臨床結果を発揮するために十分な量であり、そしてその様なものとして、「有効量」は適用される状況に左右される。ＴＬＲ-９依存性免疫応答を抑制する組成物を投与する状況では、有効量のＩＲＰは、ＴＬＲ-９を介した刺激に対する細胞応答を阻害又は低減するために十分な量である。ＴＬＲ-７／８依存性免疫応答を抑制する組成物を投与する状況において、ＩＲＰの有効量は、ＴＬＲ-７／８を介した刺激に対する細胞応答を阻害又は低減するために十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
【００６１】
本明細書において使用される「共投与」という用語は、免疫応答を調節するために、十分近い時間のうちに少なくとも２個の異なる物質を投与することを指す。好ましくは、共投与は、少なくとも２個の異なる物質の同時投与を指す。
【００６２】
応答又はパラメーターの「抑制」又は「阻害」は、関心の条件又はパラメーターを除いて同じ条件に比べたとき、或いは他の条件と比べたとき、当該応答又はパラメーターを低下させることを含む。例えば、免疫刺激核酸誘導性のサイトカイン産生を抑制するＩＲＰを含む組成物は、例えば、免疫刺激核酸単独で誘導されるサイトカイン産生に比べてサイトカイン産生を低減する。他の例として、先天性免疫応答に関連するサイトカイン産生を抑制するＩＲＰを含む組成物は、例えば、先天性免疫応答単独で産生されるサイトカインの程度及び／又はレベルに比べて、サイトカイン産生の程度及び／又はレベルを低減する。Ｂ細胞「抑制」は、例えば、Ｂ細胞増殖の低下、Ｂ細胞活性化の低下、及び／又は刺激されたＢ細胞からのＩＬ-６及び／又はＴＮＦ-αなどのサイトカイン産生の低下を含む。ＴＬＲ応答、例えばＴＬＲ-７、８、又は９応答の阻害は、非限定的に、例えば、有効なリガンド-受容体結合を予防又は阻害することによる受容体部位での阻害、並びに例えば、有効なリガンド-受容体結合の後の下流シグナル経路の阻害を含む。
【００６３】
応答又はパラメーターの「刺激」は、当該応答又はパラメーターの誘発及び／又は亢進を含む。例えば、先天性免疫応答又はＴｈ１応答などの免疫応答の「刺激」は、応答の誘発及び／又は亢進から生じうる応答の増加を意味する。同様に、サイトカイン又は細胞型(例えばＣＴＬ)の「刺激」は、サイトカイン又は細胞型の量又はレベルの増加を意味する。Ｂ細胞「刺激」は、非限定的に、Ｂ細胞増殖の増加、Ｂ細胞活性化の誘導、及び／又は刺激されたＢ細胞からのＩＬ-６及び／又はＴＮＦ-αなどのサイトカインの産生の増加を含む。
【００６４】
本明細書に使用されるとき、当該技術分野において周知であるように、「治療」は、臨床結果を含む有益な又は所望される結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益又は所望される臨床結果は、非限定的に、検出できるか否かに関わらず、１以上の症状の軽減又は改善、疾患程度の低減、疾患状態の安定化(つまり悪化させないこと)、疾患拡大の予防、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び(一部又は完全な)寛解を含む。「治療」は、治療を受けていない場合の予期される余命に比べて、余命を延ばすことを意味する。
【００６５】
疾患又は障害の「緩和」は、障害を治療しない場合に比べて、障害又は疾患の程度及び／又は不所望な臨床徴候が減少され、及び／又は経過のタイムコースが減速又は延長されることを意味する。特に、自己免疫疾患の場合では、当業者によく理解されているように、緩和は、不所望な免疫応答の調節又は低減する際に生じうる。さらに、緩和は、１用量の投与により必ずしも生じるわけではないが、一連の用量を投与した際に生じることが多い。こうして、応答又は障害を軽減するために十分な量は、１回以上の投与において投与されてもよい。
【００６６】
本明細書に使用されるとき、「含む(comprising)」という用語及びその同語族は、包含的な意味で使用される。つまり、「含む(including)」及びその同語族と同義である。
【００６７】
本発明の組成物
本発明は、個体における先天性免疫応答を調節するための免疫調節配列(ＩＲＳ)、免疫調節ポリヌクレオチド(ＩＲＰ)、及び免疫調節化合物(ＩＲＣ)を提供する。本発明の各ＩＲＰ及びＩＲＣは、少なくとも１のＩＲＳを含む。
【００６８】
本発明の組成物は、免疫調節ポリヌクレオチド又は免疫調節化合物を単独(又は２以上のＩＲＰ及び／又はＩＲＣの組合せ)で含む。本発明の組成物は、ＩＲＰ若しくはＩＲＣ及び医薬として許容される賦形剤を含んでもよい。緩衝剤を含む医薬として許容される賦形剤は、本明細書に記載され、そして当該技術分野において周知である(Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、Mack Publishing (2000))。
【００６９】
免疫調節ポリヌクレオチド及び免疫調節化合物
本発明に従って、ＩＲＰ又はＩＲＣは、少なくとも１の免疫調節配列を含む。ある場合では、免役調節配列(ＩＲＳ)は５'-Ｇ,Ｃ-３'配列を含む。ある場合では、ＩＲＳは、当該ポリヌクレオチドの５'末端又はその付近で、少なくとも１のＴＧＣトリヌクレチド配列を含む(つまり、５'-ＴＧＣ)。ある場合では、ＩＲＳは、５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含む。ある場合では、ＩＲＳは５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含まない。従って、ある場合では、ＩＲＰ又はＩＲＣは５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含まない。ある場合では、５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含むＩＲＰ又はＩＲＣは、一本鎖形態において使用されるとき特に有効である。ある場合では、５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含むＩＲＰ又はＩＲＣは、ホスホチオエート骨格を用いて作成される場合に特に有効である。
【００７０】
本明細書に示されるように、特定のＩＲＰ及びＩＲＣはＴＬＲ-７及び／又はＴＬＲ-８依存性細胞応答を阻害する。また、特定のＩＲＰ及びＩＲＣは、ＴＬＲ-９依存性の細胞応答を阻害し、そして特定のＩＲＰ及びＩＲＣはＴＬＲ-７／８依存性細胞応答及びＴＬＲ-９依存性細胞応答を阻害する。本明細書に使用される場合、「ＴＬＲ-７／８」は「ＴＬＲ-７及び／又はＴＬＲ-８」を指す。従って、本明細書に使用される場合、「ＴＬＲ-７／８／９」は、「(ＴＬＲ-７及び／又はＴＬＲ-８)及びＴＬＲ-９」を指す。本明細書に示されるように、特定のＩＲＰはＴＬＲ４依存性の細胞応答を阻害しない。
【００７１】
免役刺激核酸及び先天性免役応答の他の刺激物質は当該技術分野に記載されており、そしてその活性は、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖、樹状細胞成熟などの先天性免役応答の様々な態様を指し示す標準アッセイを用いて容易に計測することができる。例えば、Kriegら、(1995) Nature 374:546-549; Yamamotoら、(1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Klinmanら、(1997) J Immunol. 158:3635-3639; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421 -423; Romanら、(1997) Nature Med. 3:849-854; 上記Hemmiら、(2000);上記Leeら、(2003)；WO 98/16247; WO 98/55495; WO 00/61151、及び米国特許第6,225,292号を参照のこと。従って、これらの及び他の方法は、免役調節性の配列、ポリヌクレオチド、及び／又は化合物を同定、試験、及び／又は確認するために使用することができる。例えば、ＩＲＰ又はＩＲＣの効果は、先天性免役応答が刺激されている細胞又は個体をＩＲＰ又はＩＲＣと接触させた際に、ＩＲＰ又はＩＲＣの効果を測定することができる。
【００７２】
本明細書に明らかに伝えられるように、本明細書に記載される式に関して、任意及び全てのパラメーターは独立して選択される。例えば、ｘ＝０〜２である場合、ｙはｘの値(又は式中で選択できる任意の他のパラメーター)に関わらず独立して選択することができる。好ましくは、ＩＲＳを含むＩＲＰ又はＩＲＣは、少なくとも１のホスホチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドである。
【００７３】
本明細書に示される様に、開示されたＩＲＳの１のクラスは、特にＴＬＲ９依存性の細胞刺激を阻害するのに有効である。従って、当該活性を有するＩＲＳは「ＴＬＲ９クラス」のＩＲＳと呼ばれる。
【００７４】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号１)[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表される配列を含んでもよい。幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、Ｘ1がＣ又はＡである配列番号１の配列を含んでもよい。幾つかの実施態様では、ＩＲＳは式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号２)[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]及び[式中、Ｘ1はＣ又はＡである]で表される配列を含んでもよい。
【００７５】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは式：ＧＧＮnＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号３)[式中、ｎは１〜約１００(好ましくは１〜約２０)の整数である。各Ｎはヌクレオチドであり、そしてＸ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない]で表される配列を含んでもよい。幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、Ｘ1がＣ又はＡである配列番号３の配列を含んでもよい。
【００７６】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、式：ＮiＴＣＣＮj(ＧＧ)kＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3(配列番号４)[式中、各Ｎはヌクレオチドであり、ｉは１〜約５０の整数であり、ｊは１〜約５０の整数であり、ｋは０又は１であり、ｍは１〜約２０の整数であり、そしてＸ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ1＝Ｃ又はＡであり、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない。]で表される配列を含んでもよい。幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、Ｘ1がＣ又はＡである配列番号４の配列を含んでもよい。
【００７７】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、式：Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＧＧＧＡＡ(配列番号５)[式中、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドである。但し、Ｘ3＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ1Ｘ2はＧＧではない]で表される配列を含んでもよい。
【００７８】
配列番号１、２、３、４、又は５を含むオリゴヌクレオチド配列の例は、以下の配列：
【化１】
2008514187.tif 000002
を含む。
【００７９】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、少なくとも１のＧが７-デアザ-ｄＧに置換されている配列番号１、２、３、４、又は５の任意の配列を含んでもよい。例えば、幾つかの実施態様では、ＩＲＳは５'-ＴＣＣＴＧＧＡＧＺ'ＧＧＴＴＧＴ-３'(Ｚ'＝７-デアザ-ｄＧ；配列番号２３(Ｃ９２０))を含んでもよい。
【００８０】
配列番号１、２、３、４、又は５を含むＩＲＰ或いは少なくとも１のＧが７-デアザ-ｄＧにより置換されている配列番号１、２、３、４、又は５を含むＩＲＰは、特にＴＬＲ９依存性細胞刺激を阻害するのに特に有効である。ＴＬＲ９依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに有効である他のＩＲＳ配列は、以下の：
【化２】
2008514187.tif 000003
を含む。
【００８１】
本明細書に示されるように、幾つかのＩＲＳは、ＴＬＲ７／８依存性細胞刺激を阻害するのに特に有用である。従って、当該活性を有するＩＲＳは、「ＴＬＲ７／８クラス」ＩＲＳと呼ばれる。例えば、５'-ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ-３'(配列番号２７(Ｃ６６１))を含むオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７／８依存性細胞刺激を阻害する。
【００８２】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、配列番号Ｃ６６１の断片を含み、そしてその少なくとも１０塩基のパリンドローム部分を含む。例えば、かかる配列は以下の配列：
【化３】
2008514187.tif 000004
を含む。
【００８３】
幾つかの実施態様では、ＩＲＰは、配列番号２７(Ｃ６６１)、又はその断片からなる。幾つかの実施態様では、ＩＲＰは配列番号２７(Ｃ６６１)の断片からなり、そしてその少なくとも１０塩基のパリンドローム部分を含む。
【００８４】
幾つかの実施態様では、ＴＬＲ７／８依存性の細胞刺激を阻害するのに有効なＩＲＰは、配列：５'-ＴＧＣＮm-３'[式中、Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして配列Ｎ1-Ｎmは、少なくとも１のＧＣジヌクレオチドを含む]からなる。幾つかの実施態様では、かかるＩＲＰは配列５'-ＴＧＣＮmＡ-３'、配列５'-ＴＧＣＮmＣＡ-３'、又は配列５'-ＴＧＣＮmＧＣＡ-３'からなる。例えば、幾つかの実施態様では、ＩＲＰは以下の配列：
【化４】
2008514187.tif 000005
からなってもよい。
【００８５】
ＴＬＲ７／８依存性細胞シグナル伝達を阻害するのに有効である他のＩＲＳ配列は、以下の：
【化５】
2008514187.tif 000006
を含む。
【００８６】
ＩＲＳの別のクラスは、ＴＬＲ７／８及びＴＬＲ９依存性細胞刺激の両方を阻害するのに特に有効であるものを含む。従って、当該活性を有するＩＲＳは、「ＴＬＲ７／８／９クラス」ＩＲＳと呼ばれる。幾つかの場合、ＴＬＲ７／８クラスＩＲＳとＴＬＲ９クラスＩＲＳの組合せは、ＴＬＲ７／８／９クラスのＩＲＳをもたらす。
【００８７】
ＴＬＲ７／８／９クラスのＩＲＳは、配列：ＴＧＣＮmＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ-３'(配列番号６)[ここで、各Ｎはヌクレオチドであり、そしてｍは０〜約１００、ある場合では０〜約５０、好ましくは０〜約２０の整数である。]を含む。
【００８８】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは、配列Ｎ1-Ｎmが配列：５'-ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ-３'(配列番号７)の断片を含む配列番号６を含む。配列番号７の断片は、当該配列の任意の部位であり、例えば、ＴＴＧＡＣ又はＧＣＴＴＧＡである。幾つかの実施態様では、配列番号７の断片は配列番号７の５'末端由来であり、例えばＴＴＧＡＣ又はＴＴＧである。
【００８９】
幾つかの実施態様では、ＩＲＳは配列５'-ＴＧＣＲＲＺＮＹＹ-３'(配列番号８)[式中、ＺはＣを除く任意のヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ここでＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎはグアノシン又はイノシンである]を含む。別の実施態様では、ＩＲＳは配列５'-ＴＧＣＲＲＺＮポリ(ピリミジン)-３'(配列番号９) [式中、ＺはＣを除いた任意のヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ここで、ＺがＧ又はイノシンでない場合Ｎはグアノシン又はイノシンである] を含む。
【００９０】
ＴＬＲ７／８／９依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに有効であるＩＲＳ配列の例は、以下の：
【化６】
2008514187.tif 000007
を含む。
【００９１】
本明細書に記載されるように、幾つかのＩＲＰは、ＴＬＲ９依存性細胞応答を抑制するのに特に有効である。かかるＩＲＰは、非限定的に、配列番号２４(Ｃ５３３)；配列番号２５(Ｃ７０７)；配列番号８６(１０１９)；配列番号９１(Ｃ８９１)；配列番号１０(Ｃ８２７)；配列番号１１(Ｃ８２８)；配列番号１２(Ｃ８４１)；配列番号１３(Ｃ８４２)；配列番号１４(Ｃ８４３)；配列番号１５(Ｃ８４４)；配列番号１６(Ｃ８４５)；配列番号１７(Ｃ８６９)；配列番号１８(Ｃ８７０)；配列番号１９(８７１)；配列番号２０(Ｃ８７２)；配列番号２１(Ｃ８７３)；配列番号２２(Ｃ８７４)；配列番号２３(Ｃ９２０)、及び配列番号６６(Ｃ９０８)を含む。
【００９２】
本明細書に記載されるように、幾つかのＩＲＰは、ＴＬＲ７／８依存性細胞応答を抑制するのに特に有効である。かかるＩＲＰは、非限定的に、配列番号１７(Ｃ８６９)；配列番号２３(Ｃ９２０)；配列番号２７(Ｃ６６１)；配列番号３８(Ｃ７９３)；配列番号２９(Ｃ７９４)；配列番号３３(Ｃ９１７)；配列番号３４(Ｃ９１８)；配列番号４０(Ｃ９１９)；配列番号２８(Ｃ９２１)；配列番号２９(Ｃ９２２)；配列番号４１(Ｃ９２３)、及び配列番号６６(Ｃ９０８)を含む。
【００９３】
ＩＲＰは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びに一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、又は他の改変ポリヌクレオチドであってもよい。ＩＲＰは、直線状であってもよく、環状であってもよく、又は環状部分を含んでもよく、及び／又はヘアピンループを含んでもよい。ＩＲＰは天然型又は修飾型、非天然型塩基を含んでもよく、そして改変された糖、リン酸エステル、及び／又は終端を含んでもよい。様々なかかる改変は本明細書に記載される。
【００９４】
複素環塩基又は核酸塩基であって、ＩＲＰに取り込まれたものは、天然の主要プリン及びピリミジン塩基(つまり、上記ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、及びグアニン)、並びに当該主要塩基の天然及び合成改変であってもよい。こうして、ＩＲＰは、２'-デオキシウリジン及び／又は２-アミノ-２'-デオキシアデノシンを含んでもよい。
【００９５】
ＩＲＰは、少なくとも１の改変塩基を含みうる。本明細書に使用されるとき、「改変塩基」という用語は、「塩基アナログ」と同義であり、例えば「改変シトシン」は「シトシンアナログ」と同義である。同様に、「改変」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、ヌクレオシド又はヌクレオチド「アナログ」と同義であると定義される。塩基改変の例は、非限定的に、電子吸引部分を、ＩＲＰのシトシンのＣ-５及び／又はＣ-６に加えることを含む。好ましくは、電子吸引部分はハロゲンであり、例えば、５-ブロモシトシン、５-クロロシトシン、５-フルオロシトシン、５-ヨードシトシンである。塩基改変の他の例は、非限定的に、免疫調節ポリヌクレオチドのウラシルのＣ-５及び／又はＣ-６に電子吸引部分を加えることを含む。好ましくは、当該電子吸引部分はハロゲンである。かかる改変ウラシルは、非限定的に、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-フルオロウラシル、５-ヨードウラシルを含みうる。
【００９６】
塩基改変の他の例は、１以上のチオール基を塩基に付け加えることを含む。例えば非限定的に、６-チオ-グアニン、４-チオ-チミン、及び４-チオ-ウラシルを含む。塩基改変の他の例は、非限定的に、Ｎ４-エチルシトシン、７-デアザグアニン、及び５-ヒドロキシシトシンを含む。例えば、Kandimallaら、(2001 ) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813を参照のこと。
【００９７】
ＩＲＰはリン酸エステル改変ヌクレオチドを含むことがある。その幾つかは、ポリヌクレオチドを安定化すると知られている。従って、幾つかの実施態様は、安定化免役調節ポリヌクレオチドを含む。例えば、ホスホジエステル結合に加えて、リン酸エステルの改変は、非限定的に、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホールアミデート(架橋又は非架橋)、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートを含み、そして任意の組合せで使用されてもよい。他の非ホスフェート結合が使用されてもよい。幾つかの実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格のみを含む。幾つかの実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を含む。幾つかの実施態様では、ＩＲＰは、ホスフェート骨格中のホスフェート結合の組合せ、例えばホスホジエステル及びホスホロチオエート結合の組合せなどを含んでもよい。
【００９８】
本発明において使用されるＩＲＰは、１以上のリボヌクレオチド(リボースを唯一又は主要糖成分として含む)、デオキシリボヌクレオチド(デオキシリボースを主要糖成分として含む)、又は当業者に知られているように改変糖を含むことがあり、或いは糖アナログがＩＲＰ中に取り込まれてもよい。こうして、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「アナログ」シクロペンチル基であってもよい。糖は、ピラノシル又はフラノシル形態であってもよい。ＩＲＰにおいて、糖部分は、好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノース、又は２'-０-アルキルリボースのフラノシドであり、そして糖は、α又はβアノマー配置のいずれかの複素環塩基にそれぞれ結合されうる。糖改変は、非限定的に２'-アルコキシ-ＲＮＡアナログ、２'-アミノ-ＲＮＡアナログ、２'-フルオロ-ＤＮＡ、及び２'-アルコキシ-又はアミノ-ＲＮＡ/ＤＮＡキメラを含む。例えば、ＩＲＰにおける糖の改変は、非限定的に、２'-Ｏ-メチル-ウリジン及び２'-Ｏ-メチルシチジンを含む。これらの糖又は糖アナログ、及びかかる糖又はアナログが複素環塩基(核酸塩基)に結合している対応する「ヌクレオシド」の製法が知られており、そしてかかる製法が具体的実施例のいずれかに関わる程度を除いて本明細書に記載することを要しない。糖の改変は、ＩＲＰの製造の際にリン酸エステルの改変と共に又は組み合わせてされてもよい。
【００９９】
ＩＲＰは、当該技術分野に周知である技術及び核酸合成装置、例えば非限定的に、酵素法、化学法、及び大きいオリゴヌクレオチド配列の分解を用いて合成することができる。例えば、Ausubelら、(1987);及びSambrookら、(1989)を参照のこと。酵素的に会合される場合、個々のユニットは、例えばＴ４・ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼなどのリガーゼを用いてライゲーションすることができる(米国特許第5,124,246号)。オリゴヌクレオチド分解は、米国特許第4,650675号に示されるように、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに晒すことを介して達成することができる。
【０１００】
ＩＲＰは、慣用されるポリヌクレオチド単離法を用いて単離することができる。かかる方法は、非限定的に、プローブをゲノム又はｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイゼーションさせて、共有された構造の特徴を検出すること、及び発現ライブラリーを抗体スクリーニングして、共有された構造の特徴を検出すること、そしてポリメラーゼ連鎖反応により特定の生来の配列を合成することを含む。
【０１０１】
環状の免役調節ポリヌクレオチドは、単離され、組換え法を介して合成されるか、又は化学的に合成することができる。環状ＩＲＰが単離又は組換え法を介して得られる場合、ＩＲＰは好ましくはプラスミドであろう。小さい環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載される任意の方法を用いて行うことができる。例えば、Gaoら、(1995) Nucleic Acids Res 23:2025-2029; 及びWangら、(1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照のこと。
【０１０２】
ポリヌクレオチド及び改変ポリヌクレオチドを製造する技術は当業者に知られている。ホスホジエステル結合を含む天然ＤＮＡ又はＲＮＡは、一般的に、３'末端において固体支持体に結合された伸張しているオリゴヌクレオチドの５'水酸基に、適切なヌクレオシド・ホスホロアミダイトを連続的に結合させ、続いてホスファイト・トリエステル中間体をホスフェート・トリエステルに参加することにより合成される。所望されるポリヌクレオチド配列が合成されると、ポリヌクレオチドは支持体から取り除かれ、ホスフェート・トリエステル基をホスフェートジエステルに脱保護し、そして水性アンモニア又は他の塩基を用いてヌクレオシド塩基を脱保護する。例えば、Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal編) Humana Press, Totowa, NJ の中のBeaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis"；Warnerら、(1984) DNA 3:401；及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。
【０１０３】
改変ホスフェート結合又は非ホスフェート結合を含むポリヌクレオチドの合成は、当該技術分野において知られている。総説については、Matteucci (1997) "Oligonucleotide Analogs: an Overview"  Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (DJ. Chadwick及びG. Cardew編) John Wiley and Sons, New York, NYを参照のこと。リン誘導体(又は改変リン酸エステル基)であって、本発明のポリヌクレオチドにおける糖又は糖アナログに結合できる誘導体は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどでありうる。上記ホスフェート・アナログの製法及びヌクレオチド、改変ヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド中への取り込みはまた知られており、そして本明細書で詳細に記載する必要はない(Peyrottesら、(1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvediら(1996) Nucleic Acids Res. 24:231 8-2323;及びSchultzら(1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973)。例えば、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの合成は、天然オリゴヌクレオチドについて上で記載した合成と、酸化ステップが硫化ステップに置き換えることを除いて同様である((Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" 、 Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal編) Humana Press, pp. 165-190)。同様に、他のホスフェート・アナログ、例えばホスホトリエステル(Millerら、(1971) JACS 93:6657-6665)、非架橋ホスホロアミデート(Jagerら、(1988) Biochem. 27:7247-7246)、Ｎ３'からＰ５'ホスホロアミデート(Nelsonら、(1997) JOC 62:7278-7287)、及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)が開示された。他のリンに基づかない改変オリゴヌクレオチドも使用することができる(Stirchakら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141)。
【０１０４】
様々な複素環塩基及び様々な糖部分(及び糖アナログ)を含む多くの「合成」非天然ヌクレオシドが当該技術分野で利用できるということ；及び本発明の他の基準が満たされるかぎり、ＩＲＰが天然核酸の主要な５個の塩基成分以外の１又は幾つかの複素環塩基を含むことができるということが当業者により認識されよう。しかしながら、好ましくは、ＩＲＰ中の複素環塩基は、非限定的にウラシル-５-イル、シトシン-５-イル、アデニン-７-イル、アデニン-８-イル、グアニン-７-イル、グアニン-８-イル、４-アミノピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-５-イル、２-アミノ-４-オキソピロロ［２,３-ｄ］ピリミジン-５-イル、２-アミノ-４-オキソピロロ［２.３-ｄ］ピリミジン-３-イル基を含み、ここで当該プリンは９位で、当該ピリミジンは１位で、当該ピラゾロピリミジンは７位で、そして当該ピラゾロピリミジンは１位でＩＲＰの糖部分に結合される。
【０１０５】
塩基改変ヌクレオシドの製法、及び当該塩基改変ヌクレオシドを前駆体として用いた改変オリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第4.910,300号、第4,948,882号、及び第5,093,232号において記載された。これらの塩基改変ヌクレオシドは、化学合成により、オリゴヌクレオチドの末端又は内部位置のいずれかに取り込むことができるように、設計された。このような塩基改変ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端の位置又は中間の位置において存在し、ペプチドの結合のための部位としての機能を果たすことができる。その糖部分において改変されたヌクレオシドが記載され(例えば、非限定的に、米国特許第4,849,513号、第5,015,733号、第5,118,800号、第5,118,802号を含む)、そして同様に使用することができる。
【０１０６】
幾つかの実施態様では、免役調節ポリヌクレオチドは、以下の長さ(塩基又は塩基対)：１０,０００；５,０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０；９；８；７；６；５；４のうちのいずれかより小さい。幾つかの実施態様では、免役調節ポリヌクレオチドは、以下の長さ(塩基又は塩基対)：４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００のうちのいずれかより大きい。或いは、免役調節ポリヌクレオチドは、１０,０００；５,０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０；９；８；７；６；５；４の上限及び４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００から独立して選ばれる下限を有する大きさの範囲のいずれかであってもよい。ここで、下限は、上限より小さい。幾つかの実施態様では、ＩＲＰは、好ましくは約２００以下の塩基長である。
【０１０７】
本発明は、本明細書に記載された免役調節ポリヌクレオチドの製造方法を提供する。当該方法は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかであってもよい。例えば、当該方法は、(例えば固体状態合成を用いて)ＩＲＰを合成することができ、そしてさらに任意の精製ステップを含んでもよい。精製方法は当該技術分野に知られている。
【０１０８】
ある実施態様では、本発明は免役調節活性を有し、そしてＩＲＳを含む核酸部分を含む免役調節化合物(ＩＲＣ）に関する。本発明のＩＲＣは、１以上の核酸部分を含み、そして１以上の非核酸スペーサー部分を含む。様々な構造式に合致する化合物は、ＩＲＣとして使用することについて予期され、以下の式Ｉ-ＶＩＩに記載される中心構造を含む。式Ｉ-ＩＩＩは、「直線状ＩＲＣ」についての中心配列を示す。式ＩＶ-ＶＩは「分枝状ＩＲＣ」についての中心配列を示す。式ＶＩＩは「シングル-スペーサーＩＲＣ」についての中心構造を示す。
【０１０９】
本明細書に与えられる各式において、「Ｎ」は、(５'→３'又は３'→５'向きの)核酸部分を指し、そして「Ｓ」は、非核酸スペーサー部分を指す。ダッシュ(「-」)は、核酸部分と非核酸スペーサー部分とのあいだの共有結合を示す。ダブルダッシュ(「--」は、非ヌクレオチド核酸スペーサー部分と少なくとも２個の核酸部分とのあいだの共有結合を指す。トリプルダッシュ(「---」)は、非核酸スペーサー部分と複数の(つまり少なくとも３の)核酸部分との間の共有結合を指す。下付き文字は、異なった一の核酸又は非核酸スペーサー部分を指すために使用される。しかしながら異なる核酸部分を区別するための下付き文字の使用は、当該部分が必ずしも異なる構造又は配列を含むということを示すことを意図するものではない。同様に、異なるスペーサー部分を区別するための下付き文字の使用は、当該部分が必ずしも異なる構造を有するということを示すことを意図しない。例えば、上記式ＩＩにおいて、Ｎ1及びＮ2と名付けられた核酸部分は、同じ又は異なる配列を有してもよく、そしてＳ1及びＳ2と名付けられたスペーサー部分は、同じ又は異なる構造を有してもよい。さらに、更なる化学部分(例えば、ホスフェート、モノヌクレオチド、さらなる核酸部分、アルキル、アミノ、チオ、又はジスルフィド基又は結合基、及び／又はスペーサー部分)は、中心構造の末端において共有結合されてもよい。
【０１１０】
直線状のＩＲＣは、中心構造における非核酸スペーサー部分が２以下の核酸部分に共有結合する構造を有する。代表的な直線状のＩＲＣは、以下の式：
Ｎ1-Ｓ1-Ｎ2                       (Ｉ)
Ｎ1-Ｓ1-Ｎ2-Ｓ2-Ｎ3               (ＩＩ)
Ｎ1-Ｓ1-Ｎ2-Ｓ2-[Ｎv-Ｓv]A        (ＩＩＩ)
[式中、Ａは１〜約１００の間の整数であり、そして[Ｎv-Ｓv]は、非核酸スペーサー部分に結合された核酸部分のＡ個のさらなる繰り返しを示す。下付きの「ｖ」は、Ｎ及びＳが「[Ｎv-Ｓv]の各反復のうちから独立して選ばれるということを指し、「Ａ」はある場合１〜約１０、ある場合１〜３、ある場合丁度１、２、３、４、又は５である]
に合致する。幾つかの実施態様において、Ａは１、２、３、４、又は５の下限と、１０、２０、５０、又は１００から独立して選ばれる上限により定義される範囲内の整数である(例えば、３〜１０)。
【０１１１】
代表的な直線状ＩＲＣは以下の：
【化７】
2008514187.tif 000008
[式中、ＨＥＧは、ヘキサ-(エチレングリコール)を指す。ＴＥＧはテトラ-(エチレングリコール)を指す。]
を含む。
【０１１２】
好ましい直線状ＩＲＣは以下の：
【化８】
2008514187.tif 000009
を含む。
【０１１３】
分枝状ＩＲＣは、少なくとも３個の核酸部分に共有結合された多価スペーサー部分(Ｓp)を含む。代表的な分枝状ＩＲＣは、以下の式：
[Ｎv]A---Ｓp                      (ＩＶ)
[Ｓv-Ｎv]A---Ｓp                  (Ｖ)
(Ｓ1-Ｎ1)-Ｓp--(Ｎv)A             (ＶＩ)
[式中、Ｓpは、「Ａ」の数量の独立して選択された核酸部分Ｎv又は(核酸部分に共有結合されたスペーサー部分を含む)Ｓv-Ｎvに共有結合された多価スペーサーである]
に記載される。式ＩＶ及びＶでは、Ａは少なくとも３である。式ＩＶ及びＶの様々な実施態様では、Ａは３〜１００(を含めた)整数であるが、Ａは約３、５、１０、５０、又は１００の下限と、約５、７、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、又は５００から独立して選択される上限により定義される範囲内の整数であってもよく、或いは、Ａは５００を超えてもよい。式ＶＩでは、Ａは少なくとも２であり、２、５、１０、５０、又は１００の下限と５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、又は５００のうちから独立して選択される上限により定義される範囲の整数であり、或いは５００を超える整数であってもよい。
【０１１４】
代表的な分枝状ＩＲＣは以下の：
(Ｎ1)2-グリセロール-Ｎ1                         (ＩＶａ)
(Ｎ2-ＨＥＧ)2-グリセロール-Ｎ1                  (ＩＶｂ)
(Ｎ1-ＨＥＧ-Ｎ2)2-グリセロール-Ｎ1              (ＩＶｃ)
［(Ｎ1)2-グリセロール-Ｎ1］2-グリセロール-Ｎ1   (ＩＶｄ)  
を含む。
【０１１５】
好ましい分枝状ＩＲＣは、(５'-Ｎ1-３'-ＨＥＧ)2-グリセロール-ＨＥＧ-５'-Ｎ1-３'及び(５'-Ｎ1-３'-ＨＥＧ)2-グリセロール-ＨＥＧ-５'-Ｎ1'を含む。
【０１１６】
１のスペーサーＩＲＣは、１のスペーサー部分に共有結合された１の核酸部分が存在する構造、つまり：
Ｎ1-Ｓ1            (ＶＩＩ)
を含む。
【０１１７】
好ましい実施態様では、Ｓ1は、例えば上で記載されるように典型的にエステル結合(例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエート・エステル)により結合される小ユニット(例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１'２'-ジデオキシリボース、Ｃ2アルキル-Ｃ12アルキル・サブユニットなど)を含むマルチマーの構造を有する。例えば、上記式ＶＩＩａを参照のこと。マルチマーは、ヘテロマー又はホモマーであってもよい。一の実施態様では、スペーサーは、エステル結合(例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエート・エステル)により結合されたモノマーユニットのヘテロマー(例えばＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１'２'-ジデオキシリボース、Ｃ2アルキル〜Ｃ12アルキルリンカーなど)である。例えば、上記式ＶＩＩｂを参照のこと。
【０１１８】
代表的な一のスペーサーＩＲＣは、以下の：
Ｎ1-(ＨＥＧ)15                                  (ＶＩＩａ)
Ｎ1-ＨＥＧ-プロピル-ＨＥＧ-プロピル-ＨＥＧ      (ＶＩＩｂ)
を含む。
【０１１９】
ある実施態様では、ＩＲＣの末端構造は共有結合されており(例えば、核酸部分-核酸部分；スペーサー部分-スペーサー部分、又は核酸部分−スペーサー部分)、環状の形態をもたらす。
【０１２０】
本発明の免役調節組成物において使用するためのＩＲＣは、少なくとも１の核酸部分を含む。本明細書に記載される「核酸部分」という用語は、ヌクレオチドモノマー(つまり、モノヌクレオチド)又はポリマー(つまり、少なくとも２個の連続ヌクレオチドを含む)を指す。本明細書に使用されるとき、ヌクレオチドは、(１)  ホスフェート基にエステル結合している糖に結合されたプリン又はピリミジン塩基、又は(２)  アナログであって、例えば上で記載されるように、塩基及び/又は糖及び/又はホスフェートエステルがアナログにより置き換えられたものを含む。１より多い核酸部分を含むＩＲＣにおいて、核酸部分は、同じであっても異なってもよい。
【０１２１】
免役調節組成物中に取り込まれたＩＲＣにおいて使用される核酸部分は、本明細書に開示されるＩＲＳ配列のうちのいずれかを含んでもよく、そしてさらに６塩基対以下の配列であってもよい。複数の核酸部分を含むＩＲＣにおいて、核酸部分が同じか又は異なる長さであってもよいということが予期される。ある実施態様では、ＩＲＣが１より多い核酸部分を含む場合、当該部分のうちのただ一つのみがＩＲＳを含むことを必要とする。
【０１２２】
複数の核酸部分を含むＩＲＣにおいて、当該核酸部分は同じであっても異なってもよいということが予期される。従って、様々な実施態様において、免役調節組成物中に取り込まれるＩＲＣは、(ａ)  同じ配列を有する核酸部分、(ｂ)  核酸部分の１より多い繰り返し、又は(ｃ)  ２以上の異なる核酸部分を含む。さらに、一の核酸部分は、１より多いＩＲＳを含んでもよく、当該ＩＲＳは隣接、重なり、又は核酸部分のうちの更なるヌクレオチドにより分離されてもよい。
【０１２３】
本明細書に記載されるように、幾つかのＩＲＰはＴＬＲ９依存性の細胞応答を抑制するのに特に効果的であり、そして幾つかのＩＲＰはＴＬＲ７/８依存性の細胞応答を抑制するのに特に効果的である。ＩＲＣは１より多いＩＲＰを含んでもよいので、特定用途のための特定の活性を有するＩＲＣを作り上げるために様々な活性を有するＩＲＰを組み合わせることができる。
【０１２４】
幾つかの場合において、ＩＲＣ中の２個のＩＲＰの組合せは、ＩＲＣの免役調節活性を、どちらかのＩＲＰ単独のものとは異なるものとする。例えば、ＩＲＣ配列番号６８(Ｃ９１３)は、ＨＥＧ部分を介してＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)に結合されたＩＲＰ配列番号３３(Ｃ９１７)を含む。ＩＲＰ配列番号３３(Ｃ９１７)は、ＴＬＲ-７/８依存性細胞応答を阻害するが、ＴＬＲ-９依存性細胞応答を阻害するものではない。ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、ＴＬＲ-９依存性細胞応答に対して、ＴＬＲ-７／８依存性細胞応答に対するより高い阻害活性を有する。しかしながら、ＩＲＣ配列番号６８(Ｃ９１３)は、ＴＬＲ-７／８依存性の細胞応答とＴＬＲ-９依存性細胞応答の両者を阻害することにかなり高い活性がある。同じことが、ＩＲＣ配列番号６９(Ｃ９１４)、並びにその成分であるＩＲＰ配列番号３４(Ｃ９１８)及び配列番号１７(Ｃ８６９)についていえる。
【０１２５】
ＩＲＣは、核酸部分に共有結合される１以上の非核酸スペーサー部分を含む。便宜のため、非核酸スペーサー部分を、本明細書中で単純に「スペーサー」又は「スペーサー部分」と呼ぶことがある。スペーサーは、一般的に、約５０〜約５００００、典型的に約７５〜約５０００、最も多くの場合約７５〜約５００の分子量であり、これらは様々な実施態様において、１、２、３の、又は３より多い核酸部分に共有結合される。様々な物質が、核酸部分を接続するために適している。例えば、科学文献において「非核酸リンカー」、「非ヌクレオチドリンカー」、又は「原子価プラットホーム分子(valency platform molecule)」と呼ばれる様々な化合物は、ＩＲＣ中のスペーサーとして使用されてもよい。ある実施態様では、スペーサーは、多価共有結合されたサブユニットを含み、そしてホモポリマーの又はヘテロポリマーの構造を有してもよい。モノヌクレオチド及びポリヌクレオチドが非核酸スペーサーの定義に含まれないこと、このような除外規定がない場合、核酸部分と隣接する非核酸スペーサー部分とのあいだに差がなくなってしまうことが理解されよう。
【０１２６】
ある実施態様では、スペーサーは、１以上の脱塩基ヌクレオチド(つまり、ヌクレオチド塩基を欠くが、当該糖及びリン酸エステル部分を有する)であってもよい。代表的な脱塩基ヌクレオチドは、１'２'-ジデオキシリボース、１'-デオキシリボース、１'-デオキシアラビノース、及びそのポリマーを含む。
【０１２７】
他の適切なスペーサーは、場合により置換されたポリグリコール、場合により置換されたポリアミン、場合により置換されたポリアルコール、場合により置換されたポリアミド、場合により置換されたポリエーテル、場合により置換されたポリイミン、場合により置換されたポリホスホジエステル(例えば、ポリ(１-ホスホ-３-プロパノール)などを含む。任意の置換基は、アルコール、アルコキシ(例えばメトキシ、エトキシ、及びプロポキシ)、直鎖又は分枝鎖アルキル(例えば、Ｃ1-Ｃ12アルキル)、アミン、アミノアルキル(例えば、アミノＣ1-Ｃ12アルキル)、ホスホロアミダイト、ホスフェート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン、(例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ)、アミド、アルキルアミド(例えば、アミドＣ1-Ｃ12アルキル)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、イミド酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、カルボジイミド付加化合物、アルデヒド類、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホナート、ＮＲ1Ｒ2[式中、Ｒ1Ｒ2は-Ｃ(＝Ｏ)ＣＨ＝ＣＨＣ(＝Ｏ)(マレイミド)、チオエーテル、シアノ、糖(例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース)、α,β-不飽和カルボニル、アルキル水銀、α,β-不飽和スルホンを含む。
【０１２８】
適切なスペーサーは、多環分子、例えばフェニル又はシクロヘキシル環を含む分子などを含んでもよい。スペーサーは、ポリエーテル、例えばポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、二官能性多環分子、例えば二官能性ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、アシムインダセン(asymindacene)、シム-インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナントリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアントレン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチインであってもよく、これらは置換又は改変されてもよく、或いはポリエーテル及び多環分子の組合せであってもよい。多環分子は、Ｃ1-Ｃ5アルキル、Ｃ6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、又はハロアルキル基で置換されても又は多置換されてもよい。窒素含有ポリ複素環分子(例えば、インドリジン)は、典型的に適切なスペーサーではない。スペーサーは、ポリアルコール、例えばグリセロール又はペンタエリスリトールであってもよい。一の実施態様では、スペーサーは、１-ホスホプロパン)3-ホスフェート又は１-ホスホプロパン)4-ホスフェート(テトラホスホプロパンジオール及びペンタホスホプロパンジオールとも呼ばれる)を含む。一の実施態様では、スペーサーは誘導化２,２'-エチレンジオキシジエチルアミン(ＥＤＤＡ)を含む。
【０１２９】
ＩＲＣに有用な非核酸スペーサーの具体例は、Cloadら、(1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324; Richardsonら、(1991) J. Am. Chem. Soc. 113:5109; Maら、(1993) Nucleic Acids Res. 21 :2585; Maら、(1993) Biochemistry 32: 1751; McCurdyら、(1991) Nucleosides & Nucleotides 10:287; Jaschkeら、(1993) Tetrahedron Lett. 34:301 ; Onoら、(1991) Biochemistry 30:9914; 及び国際公開第WO 89/02439号により記載された「リンカー」を含む。
【０１３０】
他の適切なスペーサーは、Salunkheら(1992) J. Am. Chem. Soc 114:8768; Nelsonら、(1996) Biochemistry 35:5339-5344; Bartleyら、(1997) Biochemistry 36: 14502-511; Dagneauxら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:4506-12; Durandら、(1990) Nucleic Acids Res. 18:6353- 59; Reynoldsら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:760-65; Hendryら(1994) Biochem. Biophys. Acta 1219:405-12; Altmannら(1995) Nucleic Acids Res. 23:4827-35に記載されるリンカーを含む。さらに別の適切なスペーサーは、欧州特許第EP0313219B1号及び米国特許第6,117,657号に記載される。
【０１３１】
代表的な非核酸スペーサーは、オリゴ-エチレングリコール(例えば、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールスペーサー、及び最大約１０、約２０、約４０、約５０、約１００、又は約２００のエチレングリコールユニットを含む別のポリマー)、アルキルスペーサー(例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、及びＣ2-Ｃ12アルキルスペーサー、例えば通常Ｃ2-Ｃ10アルキル、しばしばＣ2-Ｃ6アルキル)、脱塩基ヌクレオチドスペーサー；グリセロール、ペンタエリスリトール、又は１,３,５-トリヒドロキシシクロヘキサン(例えば、本明細書に記載される対称ダブラー及びトレブラースペーサー(doubler and trebler spacer)部分)から誘導される対称又は非対称スペーサーを含む。スペーサーは、(例えば、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、又は他の結合により結合される)前述の化合物のヘテロマー又はホモマーオリゴマー及びポリマーを含んでもよい。
【０１３２】
適切なスペーサー部分は、電荷及び/又は疎水性をＩＲＣに与えることができ、好ましい薬物動態学的性質(例えば、安定性の改善、血中での滞留時間の延長)をＩＲＣに与え、及び/又はＩＲＣを特定の細胞又は組織に標的することをもたらす。スペーサー部分は、所望される投与様式(例えば経口投与)についての所望される薬理学的性質又は適合性についてＩＲＣを調節するように選択又は改変することができる。便宜のため、スペーサー(又はスペーサー成分)が当該スペーサー成分の由来元である化合物の化学名(例えば、ヘキサエチレングリコール)により呼ばれることがあり、ＩＲＣが化合物と隣接する核酸部分又は他のスペーサー成分との複合体を実際に含んでいると理解されるということが、読者により認められよう。
【０１３３】
１より多いスペーサー部分を含むＩＲＣにおいて、当該スペーサーは、同じであってもよいし又は異なってもよい。こうして、一の実施態様では、ＩＲＣにおける非核酸スペーサー部分の全ては、同じ構造を有する。一の実施態様では、ＩＲＣは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６、又はそれより多い異なる構造を有する非核酸スペーサー部分を含む。
【０１３４】
本発明の幾つかの予期される実施態様では、ＩＲＣのスペーサー部分は、ある構造を排除するように定義される。こうして、本発明の幾つかの実施態様では、スペーサーは脱落塩基のヌクレオチド又は脱落塩基ヌクレオチドのポリマー以外のものである。本発明の幾つかの実施態様では、スペーサーはオリゴ(エチレングリコール)(例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧなど)又はポリ(エチレングリコール)以外のものである。幾つかの実施態様では、スペーサーは、Ｃ３アルキルスペーサー以外のものである。幾つかの実施態様では、スペーサーは、ポリペプチド以外のものである。こうして、幾つかの実施態様では、免疫原性分子、例えばタンパク質又はポリペプチドは、スペーサー成分の化合物として適切ではない。しかしながら、上で記載される様に、ある実施態様では、ＩＲＣは、ポリペプチドを含むスペーサー部分を含む「タンパク性ＩＲＣ」である。しかしながら、幾つかの実施態様では、スペーサー部分は、タンパク質性ではなく及び/又は抗原でもない(つまり、当該スペーサー部分は、ＩＲＣから単離されたならば抗原とはならない)。
【０１３５】
一般的に、適切なスペーサー部分は、当該部分が水溶液(例えば、ＰＢＳ、ｐＨ７.０)に不溶性であるところのＩＲＣを提供することはない。こうして、スペーサーの定義からマイクロキャリア又はナノキャリアが除外される。さらに、低い溶解度しか有さないスペーサー部分、例えばドデシルスペーサー(ジアルコール前駆体である１,１２-ジヒドロキシドデカンとして計測した場合に５ｍｇ/ｍｌ未満の溶解度)は、好ましくない。なぜなら、当該スペーサーは、ＩＲＣの親水性及び活性を低下しうるからである。好ましくはスペーサー部分は、ジアルコール前駆体として計測した場合に、５ｍｇ/ｍｌより大きい溶解度(例えば２０ｍｇ/ｍｌ以上、５０ｍｇ/ｍｌ以上、又は１００ｍｇ/ｍｌ以上)を有する。
【０１３６】
ＩＲＣの電荷は、ホスフェート、チオホスフェート、又は核酸部分の他の基並びに非核酸スペーサー部分の基により与えられてもよい。本発明の幾つかの実施態様では、非核酸スペーサー部分は、正味荷電を有している(例えば、ｐＨ７で計測した場合、全体で正の電荷又は負の電荷)。一の有用な実施態様では、ＩＲＣは、全体で負の電荷を有する。幾つかの実施態様では、ＩＲＣにおけるスペーサー部分の負電荷は、その電荷を増加させるために本明細書に記載されるスペーサーサブユニットを誘導体化することにより増加する。例えば、グリセロールは、２個の核酸部分に共有することができ、残りのアルコールは活性化ホスホロアミダイトと反応することができ、続いて酸化又はスルホン化してそれぞれホスフェート又はチオホスフェートを形成することができる。ある実施態様では、ＩＲＣ中の非核酸スペーサー部分により与えられる負電荷(つまり１より多いスペーサーが存在する場合電荷の合計)は、ＩＲＣの核酸部分により与えられる負の電荷より多い。電荷は、分子式に基づいて計算することができ、又は例えばキャピラリー電気泳動により実験的に測定することができる(Li編、1992, Capillary electrophoresis, Principles, Practice and Application Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, pp202- 206)。
【０１３７】
上で記載されるように、適切なスペーサーは、小さい非核酸(例えば非ヌクレオチド)化合物のポリマー、例えば本明細書に記載され、それ自身スペーサーとして有用であるポリマーであってもよく、非ヌクレオチド「リンカー」と一般的に呼ばれる化合物を含む。かかるポリマー(つまり「マルチユニット・スペーサー」)は、ヘテロマー又はホモマーであってもよく、そして、エステル結合(例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエート・エステル)により結合されたモノマーユニット(例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１'２'-ジデオキシリボースなど)を含むことが多い。こうして、一の実施態様では、当該スペーサーは、非ヌクレオチドユニット(例えば、２〜約１００ユニット、或いは２〜約５０、例えば２〜約５、或いは例えば約５〜約５０、例えば約５〜約２０)のポリマー(例えば、ヘテロポリマー)構造を含む。
【０１３８】
例示のため、配列番号１７(Ｃ８６９)を含むＩＲＣ及びマルチユニット・スペーサーは、以下の：
【化９】
2008514187.tif 000010
[式中、
(Ｃ３)15は、ホスホロチオエート・エステルを介して結合される１５個のプロピルリンカーを意味し；(グリセロール)15は、ホスホロチオエート・エステルを介して結合される１５個のグリセロール・リンカーを意味し；(ＴＥＧ)8は、ホスホロチオエート・エステルを介して結合された８個のトリエチレングリコール・リンカーを意味し；そして(ＨＥＧ)4は、ホスホロチオエート・エステルを介して結合された４個のヘキサエチレングリコール・リンカーを意味する]
を含む。あるマルチユニットのスペーサーが正味として負電荷を有すること、そして当該負電荷を、例えばエステル結合モノマーユニットの数を増加させることにより増加させることができるということが認められよう。
【０１３９】
ある実施態様では、スペーサー部分は多価非核酸スペーサー部分(つまり、「多価スペーサー」)である。この脈絡で使用される場合、多価スペーサーを含むＩＲＣは、３個以上の核酸部分に共有結合されたスペーサーを含む。多価スペーサーは、当該技術分野において「プラットホーム分子」と呼ばれることが多い。多価スペーサーは、ポリマー性又は非ポリマー性であってもよい。適切な分子の例は、グリセロール又は置換グリセロール(例えば、２-ヒドロキシメチルグリセロール、レブリニル-グリセロール)；テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、１,３,５-トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリスリトール、及びペンタエリスリトールの誘導体、テトラアミノペンタエリスリトール、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン(シクラム)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン(シクレン)、ポリエチレンイミン、１,３-ジアミノ-２-プロパノール、及び置換誘導体、プロピルオキシメチル]エチル化合物(例えば、トレブラー)、ポリエチレングリコール誘導体、例えばいわゆる「Ｓｔａｒ  ＰＥＧ」及び「ｂＰＥＧ」(例えば、Gnanouら、(1988) Makromol. Chem. 189:2885; Reinら、(WS) Acta Polymer 44:225; 米国特許第5,171,264号を参照のこと)及びデンドリマーを含む。
【０１４０】
デンドリマーは、当該技術分野に知られており、そして化学的に規定された球形分子であり、一般的に多官能性モノマーをステップ毎に又は反復して反応させて、分枝状の構造を得ることにより製造される(例えば、Tomaliaら、(1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138-75を参照のこと)。様々なデンドリマーが知られており、例えば、アミン-末端化ポリアミドアミン、ポリエチレンイミン、及びポリプロピレンイミン・デンドリマーが知られている。本発明において有用である代表的なデンドリマーは、「デンズ・スター(dense star)」ポリマー又は「スターバースト(starburst)」ポリマー、例えば、米国特許第4.587,329号；第5,338,532号;及び第6,177,414号に記載されるポリマーを含み、いわゆる「ポリ(アミドアミン)(ＰＡＭＡＭ)デンドリマー」を含む。本発明の使用に適したさらに別のマルチマー・スペーサー分子は、化学的に規定された非ポリマー性電荷プラットホーム分子、例えば米国特許第5,552,391号；及びPCT出願公開第WO 00/75105号、第WO 96/40197号、第WO 97/46251号、第WO 95/07073号、及び第WO 00/34231号に開示される分子を含む。多くの他の適切な多価スペーサーを使用することができ、そしてそれらは当業者に知られるであろう。
【０１４１】
核酸分子のプラットホーム分子への会合は、多くの方法により実行することができ、典型的に、１以上の架橋剤と、核酸分子及びプラットホーム分子上の官能基に関する。標準の合成化学技術を用いて、連結基をプラットホームに加える。連結基は、標準合成技術を用いて核酸分子に加えることができる。
【０１４２】
様々な電荷を有する多価スペーサーは、本発明の実施に有用であり、そして様々な実施態様において、ＩＲＣの多価スペーサーは、約３〜約４００個、しばしば３〜１００個、ときに３〜５０個、頻繁に３〜１０個の核酸部分、そしてある場合４００個より多い核酸部分に結合する。様々な実施態様では、多価スペーサーは、１０超、２５超、５０超、又は５００超の核酸部分(これらは同じであっても異なってもよい)に結合される。ＩＲＣが多価スペーサーを含む特定の実施態様では、本発明は、ＩＲＣの集合に少し異なった分子構造を提供する。例えば、デンドリマーを高原子価として用いてＩＲＣを製造する場合、いくらか分子の異種混合物である多価スペーサーが製造され、つまり各デンドリマー分子に結合された様々な数の(確定範囲内の又は主に確定範囲内の)核酸部分を含む。
【０１４３】
核酸部分への結合を許容するように誘導された多糖は、ＩＲＣ中でスペーサーとして使用することができる。適切な多糖は、天然多糖(例えば、デキストラン)及び合成多糖(例えばフィコール)を含む。例えば、アミノエチルカルボキシメチル-フィコール (ＡＥＣＭ-フィコール)はInman (1975) J. lmm. 1 14:704-709の方法により製造することができる。ＡＥＣＭ-フィコールは、異種２官能性架橋試薬、例えば６-マレイミドカプロン酸アシルＮ-ヒドロキシスクシンイミド・エステルと反応させることができ、そして次にチオール誘導体化核酸部分に結合することができる(Leeら、(1980) MoI. lmm. 17:749-56を参照のこと)。他の多糖を同様に改変してもよい。
【０１４４】
通常の方法を用いてＩＲＣを製造することは、本明細書及び当該技術分野における知識により導かれれば当業者の能力の範囲内であろう。核酸部分(例えばオリゴヌクレオチド及び改変オリゴヌクレオチド)を製造する技術は知られている。核酸部分は、非限定的に酵素学的方法及び化学的方法、並びに酵素学的アプローチと化学的アプローチとの組合せを含む技術を用いて合成することができる。例えば、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、３'末端において固体支持体に結合された伸張オリゴヌクレオチドの５'水酸基に適切なヌクレオシド・ホスホロアミダイトを順次結合することによって化学的に合成することができる。ＤＮＡ合成に有用な固体支持体は、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ(Applied Biosystems, Foster City, CA)、ポリスチレン・ビーズマトリクス(Primer Support, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)、及びＴｅｎｔＧｅｌ(Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)を含む。ひとたび所望されるオリゴヌクレオチド配列が合成されると、オリゴヌクレオチドは支持体から取り除かれ、当該ホスフェート・トリエステル基はホスフェートジエステルに脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は、アンモニア水又は他の塩基を用いて脱保護される。
【０１４５】
例えば、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド(核酸部分)は、以下のステップ：
ａ)固体支持体に３'-で結合されたヌクレオシド又は核酸の５'-水酸基から保護基を取り除き、
ｂ)活性化ヌクレオシド・ホスホロアミダイトを、当該５'-水酸基に結合させ、
ｃ)ホスファイト・トリエステルを酸化してホスフェート・トリエステルに酸化し、そして
ｄ)未反応の５'-水酸基をキャッピングする
を繰り返し反復することにより一般的に合成される。ホスホロチオエート結合を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、酸化ステップが硫化ステップに置き換えられることを除いて、上に記載される様に製造される。所望されるオリゴヌクレオチド配列が合成された場合、当該オリゴヌクレオチドは、支持体から外され、ホスフェート・トリエステル基を、ホスフェートジエステルに脱保護し、そしてアンモニア水又は他の塩基を用いて当該ヌクレオシド塩基を脱保護する。例えば、Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHESIS AND PROPERTIES (Agrawal編) Humana Press, Totowa, NJ；Warnerら、(1984) DNA 3:401 ；Tangら、(2000) Org. Process Res. Dev. 4: 194- 198；Wyrzykiewicaら、(1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4: 1519-1522；Radhakrishnaら、(1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699；及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。合成配列の核酸部分を自動的に合成するプログラム可能な機械が広く使用されている。例として、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９自動化ＤＮＡ合成機(Perseptive Biosystem, Framington MA); ＡＢＩ  ３９４ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA);及びＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩ(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)が挙げられる。
【０１４６】
例えば、酸分解性５'-保護基及び３'-ホスホロアミダイトを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を用いて、ポリヌクレオチドは３'から５'方向に組み立てることができる。かかるモノマーの例は、５'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-３'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルアミノ)２-シアノエチルホスホロアミダイトを含み、ここで保護ヌクレオシドの例は、非限定的に、Ｎ６-ベンゾイルアデノシン、Ｎ４-ベンゾイルシチジン、Ｎ２-イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジンを含む。この場合、使用される固体支持体は、３'-で結合された保護ヌクレオシドを含む。或いは、ポリヌクレオチドは、酸分解性３'-保護基及び５'-ホスホロアミダイトを含む塩基保護ヌクレオシドを用いて、５'から３'方向に組立てることができる。かかるモノマーの例として、非限定的に３'-Ｏ-(４,４'-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-５'-Ｏ-(Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルアミノ)２-シアノエチルホスホロアミダイトが挙げられ、ここで保護ヌクレオシドの例は、非限定的にＮ６-ベンゾイルアデノシン、Ｎ４-ベンゾイルシチジン、Ｎ２-イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジン(Glen Research、Sterling、VA)を含む。この場合、使用される固体支持体は、５'で結合された保護ヌクレオシドを含む。環状核酸成分は、単離でき、組換え法を通して合成でき、又は化学的に合成することができる。化学的な合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実施することができる。例えば、Gaoら、(1995)Nucleic Acids Res. 23:2025-2029及びWangら、(1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照のこと。
【０１４７】
非核酸スペーサー部分を加えることは、通常の方法を用いて行うことができる。特定のスペーサー部分を加える方法は、当該技術分野に知られており、例えば上で引用される参考文献に記載される。例えば、Durandら、(1990) Nucleic Acids Res. 18:6353-6359を参照のこと。スペーサー部分と核酸部分との間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート及び他のリンケージを含む多くのタイプのうちのいずれかであってもよい。核酸部分を合成するために使用されるのと同じホスホロアミダイト型の化学反応を用いて、スペーサー部分と核酸部分とを結合させることがしばしば都合がよいであろう。例えば、本発明のＩＲＣは、ホスホロアミダイト化学反応(例えば、上記Beaucage, 1993；上記Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)を用いて自動化ＤＮＡ合成機(例えば、Expeジte 8909; Perseptive Biosystems, Framington, MA)を用いてうまく合成することができる。しかしながら、所望される場合、自動化ＤＮＡ合成機により実行されるのと同じ(又は同等の)合成ステップを手動で行うことができるということが当業者により理解されよう。このような合成では、典型的に、スペーサーの１の末端(又はマルチマー・スペーサーのスペーサーサブユニット)は、４,４'-ジメチオキシトリチル基で保護され、もう一方の末端はホスホロアミダイト基を含む。
【０１４８】
必要とされる保護基及び反応基を有する様々なスペーサーは、市販されている。例えば以下の通りである：
【表１】
2008514187.tif 000011
【０１４９】
これら及び様々な他の保護スペーサー部分の前駆体(例えば、ＤＭＴ及びホスホロアミダイト基保護基)は購入することができるし、又は本明細書に開示されるＩＲＣを製造する際に使用する通常の方法を用いて合成することができる。当該装置は、製品説明書に従って、ヌクレオチドモノマー及びスペーサーを所望される順番で加えるようにプログラムされる。
【０１５０】
ホスホロアミダイト化学反応の使用が、あるＩＲＣの製造に都合がよいが、本発明のＩＲＣが合成又は製造の特定方法のいずれかにより製造される化合物に限られないことが認められよう。
【０１５１】
一の実施態様では、１より多いタイプの核酸部分に会合された多価スペーサーを有するＩＲＣが製造される。例えば、(チオール含有ポリヌクレオチドと反応することができる)２個のマレイミド基、及び(アミノ含有核酸と反応することができる)２個の活性エステル基を有するプラットホームが開示された(例えば、ＰＣＴ出願公開第WO 95／07073号を参照のこと)。これらの２種の活性基は、互いに独立して反応することができる。このことは、各々２個の配列、すなわち全体で４個の核酸部分を含むＩＲＣをもたらす。
【０１５２】
２個の異なる核酸配列を含む多価スペーサーを有するＩＲＣは、上で記載される対称分枝状スペーサー、及び慣用されるホスホロアミダイト化学反応を用いて(例えば、手動又は自動化方法を用いて)製造することができる。当該対称分枝状スペーサーは、ホスホロアミダイト基、並びに同じでありかつ同時に取り除かれる２個の保護基を含む。一のアプローチでは、例えば第一核酸を合成し、そして対称分枝状スペーサーに結合させ、その保護基を当該スペーサーから取り除く。次に、(同じ配列の)２個の更なる核酸が、(各ステップにおいて、１の核酸部分を合成するために使用される量の二倍量の試薬を用いて)スペーサー上で合成される。
【０１５３】
同様の方法は、３個の異なる核酸部分(以下において核酸Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと呼ぶ)を多価プラットホームに結合するために使用することができる(例えば、非対称分枝状スペーサー)。これは、最も一般的に、自動化ＤＮＡ合成機を用いて行われる。一の実施態様では、非対称分枝状スペーサーは、ホスホロアミダイト基及び独立して取り除くことができる２個のオルソゴナル保護基を含む。最初に、核酸Ｉを合成し、次に非対称分枝状スペーサーを核酸Ｉに結合させ、次に保護基のうちの１つを選択的に取り除いた後で核酸ＩＩを加える。核酸ＩＩを脱保護し、そしてキャップし、そして次にスペーサー上の他の保護基を取り除く。最後に核酸ＩＩＩを合成する。
【０１５４】
幾つかの実施態様では、核酸部分(単数又は複数)が合成され、そして反応性連結基(例えば、アミノ、カルボキシレート、チオ、ジスルフィドなど)が、標準合成化学技術を用いて加えられる。当該反応性連結基(これらは、結果として生じるスペーサー部分の一部を形成すると考えられる)は、さらなる非核酸化合物と結合して、スペーサー部分を形成する。連結基は、核酸合成についての標準方法を使用し、文献に記載されるか又は市販されている様々な試薬を使用して核酸に加えられる。例として、保護アミノ基、カルボキシレート基、チオール基、又はジスルフィド基、及びホスホロアミダイト基を含む試薬が挙げられる。ひとたび、これらの化合物が、活性化ホスホロアミダイト基を介して核酸に取り込まれ、そして脱保護されたならば、これらはアミノ、カルボキシレート、又はチオール反応基を核酸に提供する。
【０１５５】
様々な長さの親水性リンカーは、核酸部分とプラットホーム分子とを結合するために有用である。様々な長さのリンカーが知られている。適切なリンカーは、非限定的に、直線状のエチレングリコールのオリゴマー又はポリマーを含む。かかるリンカーは、以下の式：
Ｒ1Ｓ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＣＨ2ＣＨ2Ｏ(ＣＨ2)mＣＯ2Ｒ2
[式中、ｎ＝０〜２００、ｍ＝１又は２、Ｒ1＝Ｈ又は保護基、例えばトリチル、Ｒ2＝Ｈ又はアルキル又はアリールである]
を有するリンカー、例えば４-ニトロフェニルエステルを含む。これらのリンカーは、チオール反応基、例えば、ハロアセイル(haloaceyl)、マレイアミド(maleiamide)などを含む分子を、アミド結合を介してアミノ基を含む第二分子へとチオエーテルを介して結合させるのに有用である。結合の順番を変化させることができ、つまり、チオエーテル結合は、アミド結合が形成された後又は前に形成されてもよい。他の有用なリンカーは、Ｓｕｌｆｏ-ＳＭＣＣ(スルホスクシンイミジル４-[Ｎ-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-１-カルボキシラート)Pierce Chemical Co. 製品番号22322; Ｓｕｌｆｏ-ＥＭＣＳ(Ｎ-［ε-マレイミドカプロイルオキシル・スルホスクシンイミド・エステル) Pierce Chemical Co.製品番号22307; Ｓｕｌｆｏ-ＧＭＢＳ(Ｎ-［γ-マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミド・エステル)Pierce chemical co.製品番号22324(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)、及び一般式：マレイミド-Ｒ-Ｃ(Ｏ)ＮＨＳエステル[式中、Ｒ＝アルキル、環状アルキル、エチレングリコールのポリマーなど]の類似の化合物を含む。
【０１５６】
核酸部分を多価スペーサーに共有結合するための特に有用な方法は、上で引用された参考文献に記載される。
【０１５７】
ある実施態様では、ポリペプチドは、複数の核酸部分が直接又はリンカーを介して共有結合して「タンパク質性ＩＲＣ」を形成する多価スペーサー部分として使用される。ポリペプチドは、担体(例えばアルブミン)でありうる。典型的に、タンパク質性ＩＲＣは、 (ａ)２〜７個のヌクレオチド長であり、４〜７個のヌクレオチド長であることが多く、或いは２〜６個、２〜５個、４〜６個、又は４〜５個のヌクレオチド長であり、及び／又は(ｂ)低い単離免役調節活性を有するか、又は単離免役調節活性を有さない少なくとも１の、そして通常幾つかの、又は多くの核酸分子を含む。タンパク質性ＩＲＣの製造方法は、本開示を参照することにより当業者に明らかであろう。例えば、核酸は、当該技術分野に知られている方法により、ポリペプチドスペーサー部分に共有結合することができ、例えば、核酸部分の３'又は５'末端(又は、核酸部分内の内部位置で適切に改変された塩基)と適切な反応基(例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステル、シトシン残基のＮ4アミノ基と直接反応することができる)を有するポリペプチドとの間の結合を含む。さらなる例として、ポリペプチドは、核酸部分に取り込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を通して核酸部分の遊離５'末端に結合することができる。或いは、当該ポリペプチドは、本明細書に記載される様に、スペーサー部分に結合できる。さらに、一の末端に保護アミン、チオール、又はカルボキシルを含む連結基及びホスホロアミダイトは、ポリヌクレオチドの水酸基に共有結合することができ、そして続いて脱保護されて、当該官能基は、ＩＲＣをペプチドに共有結合させるために使用できる。
【０１５８】
ＩＲＰ及び／又はＩＲＣ複合体及び組成物
ＩＲＰ又はＩＲＣは、個体に直接投与することができるか、又はそれらは、細胞へのＩＲＰ又はＩＲＣデリバリー及び／又は細胞による取り込みを高めるために組成物又は複合体中で投与することができる。組成物又は複合体は、２以上の異なるＩＲＰ及び／又はＩＲＣ種を細胞に共デリバリーすることを高めるために使用することができる。ある実施態様では、ＩＲＣとＩＲＰの混合物は、少なくとも１のＩＲＣ及びＩＲＰ種をデリバリーするために複合体形成されてもよい。かかるデリバリー組成物又は複合体は、非限定的に、本明細書に記載され、そして当該技術分野に知られている封入複合体及びコロイド様分散システムを含む。かかるデリバリー組成物は、水中油型乳濁液、ミセル、及びリポソームを含む。デリバリー組成物又は複合体は、本明細書に記載される様に、リンカー分子に結合されたＩＲＰ及び／又はＩＲＣ、プラットホーム分子、ナノ粒子又はマイクロ粒子を含む。かかる結合は、両方とも共有及び非共有結合を含む。他に記載がない限り、ＩＲＰについて使用するため本明細書に開示される複合体及び組成物は、ＩＲＣに関して使用するのに適している。
【０１５９】
幾つかの実施態様では、ＩＲＰ及び／又はＩＲＣは、リンカー分子と会合される。ＩＲＰ及び／又はＩＲＣタンパク質は、様々な方法、例えば共有及び／又は非共有相互作用で複合体のリンカー部分と会合されうる。
【０１６０】
ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの３'又は５'末端において、又はＩＲＰ及び／又はＩＲＣ中の内部位置で適切に改変された塩基において、部分間の結合がなされうる。リンカーがペプチドであり、そして適切な反応基(例えば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステル)を含む場合、リンカーは、シトシン残基のＮ4基と直接反応することができる。ＩＲＰ及び／又はＩＲＣのシトシン残基の数及び位置に依存して、１以上の残基での特異的結合が達成されうる。
【０１６１】
或いは、当該技術分野に知られている改変オリゴヌクレオシドは、ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの末端又は内部位置において取り込まれてもよい。これらは、脱保護された場合に、関心のリンカー上に存在するか又は関心のリンカーに結合している様々な官能基と反応する保護官能基を含んでもよい。
【０１６２】
リンカーがペプチドである場合、この会合部分は、固体支持体との化学反応を介して、ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの３'末端に結合することができる。例えば、ＩＲＰ部分は、支持体上に予め合成されたペプチド部分に加えられてもよい(Haralambidisら、(1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; 及びHaralambidisら、(1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505.)。或いは、３'-末端から伸張している切断可能なリンカーを介して固体支持体に結合されるように、ＩＲＰを合成することもできる。支持体からＩＲＰを化学切断した場合、末端チオール基はオリゴヌクレオチドの３'-末端に残る(Zuckermannら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321 ;及びCoreyら、(1987) Science 238: 1401-1403) か、又は末端アミノ基がオリゴヌクレオチドの３'末端に残る(Nelsonら、(1989) Nucleic Acids Res. 17: 1781 -1794)。アミノ改変ＩＲＰ及び／又はＩＲＣのペプチドのアミノ基への会合は、Benoitら、(1987) Neuromethods 6:43-72.に記載されるように行うことができる。チオール改変ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの複合体を、ペプチドのカルボキシル基へと結合することは、Sinahら、(1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press. に記載される様に行われてもよい。付随するマレイミドを有するオリゴヌクレオチドを、ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に結合することが記載された(Tungら、(1991 ) Bioconjug. Chem. 2:464-465)。
【０１６３】
会合のペプチド・リンカー部分は、合成の間にオリゴヌクレオチドに取り込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を通して、ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの５'末端に結合することができる。好ましくは、当該オリゴヌクレオチドが固体支持体に固定される間、保護アミン、チオール、又はカルボキシルを１の末端に含み、そしてもう一端にホスホロアミダイトを含む結合基は、５'-水酸基に共有結合される(Agrawalら、(1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremskyら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131 -3139; Bischoffら、(1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanksら、(1988) Nucleic Acids Res. 16: 10283- 10299;及び米国特許第4,849,513号、第5,015,733号、第5,1 18,800号、及び第5,1 18,802号)。脱保護に続き、アミン、チオール、及びカルボキシル官能基は、当該オリゴヌクレオチドをペプチドに共有結合させるために使用することができる。(Benoitら、(1987);及びSinahら、(1991))。
【０１６４】
ＩＲＰ及び／又はＩＲＣ複合体は、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、及び／又はファンデルワールス力などの非共有相互作用を介して形成することができる。
【０１６５】
非共有結合複合体は、ビオチン-ストレプトアビジン複合体などの非共有相互作用を含みうる。ビオチニル基は、例えば、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣの改変塩基に結合することができる(Rogetら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651)。ストレプトアビジン部分をペプチド部分中に取り込むことは、ストレプトアビジン結合ペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【０１６６】
非共有結合は、オリゴヌクレオチドと相互作用することができる荷電残基を含むリンカー部分を用いて、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣに関するイオン性相互作用介して生じうる。例えば、非共有結合は、一般的に負に荷電されたＩＲＰ及び/又はＩＲＣと、ペプチド・リンカー、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、及びポリヒスチジン残基の正に荷電されたアミノ酸残基との間で生じてもよい。
【０１６７】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣの脂質への結合は、標準的な方法を用いて形成することができる。これらの方法は、非限定的に、オリゴヌクレオチド-リン脂質複合体 (Yanagawaら、(1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19: 189-192)、オリゴヌクレオチド-脂肪酸複合体(Grabarekら、(1990) Anal. Biochem. 185: 131-135;及びStarosら、(1986) Anal. Biochem. 156:220-222)、並びにオリゴヌクレオチド-ステロール複合体(Boujradら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731)の合成を含む。
【０１６８】
オリゴヌクレオチドのオリゴ糖への結合は、標準的な既知の方法を用いて形成することができる。当該方法は、非限定的に、オリゴヌクレオチド-オリゴ糖複合体の合成を含み、ここで、当該オリゴ糖は、免疫グロブリンの一部である(O'Shannessyら、(1985) J. Applied Biochem. 7:347-355.)。
【０１６９】
環状ＩＲＰ及び/又はＩＲＣのペプチド結合への結合は、幾つかの方法で形成することができる。環状ＩＲＰ及び/又はＩＲＣが組換え又は化学方法を用いて合成する場合、改変ヌクレオシドが適切である(Ruth (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press.)。環状ＩＲＰ及び/又はＩＲＣをペプチドに結合するために、標準的な結合技術が使用することができる(Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1 : 165.)。環状ＩＲＰ及び/又はＩＲＣが、組換え又は化学方法を用いて単離又は合成される場合、結合は、ペプチド中に取り込まれた化学的に活性な又は光反応性の反応基(例えば、カルベン、ラジカル)により形成することができる。
【０１７０】
ペプチド及び他の分子をオリゴヌクレオチドに結合するための更なる方法は、米国特許第5,391,723号; Kricka(編) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Pressに掲載のKessler (1992) "Nonraジoactive labeling methods for nucleic acids";及び Geogheganら、(1992) Bioconjug. Chem. 3: 138-146.に見ることができる。
【０１７１】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、他の方法で近接(proximately associated)させることができる。幾つかの実施態様では、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、封入により近接される。他の実施態様では、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、プラットホーム分子に結合させることにより近接させることができる。「プラットホーム分子」(「プラットホーム」と呼ぶ)は、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣを結合することを許容する部分を含む分子である。別の実施態様では、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、表面、好ましくは担体粒子上に吸着することにより近接される。
【０１７２】
幾つかの実施態様において、本発明の方法は、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣに関連した封入物質を使用する。好ましくはＩＲＰ及び/又はＩＲＣ及び封入物質を含む組成物は、アジュバント水中油乳濁液、微粒子及び/又はリポソームの形態である。より好ましくは、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣを封入するアジュバント水中油乳濁液、微粒子、及び/又はリポソームは、約０.０４μｍ〜約１００μｍの大きさの粒子の形態であり、好ましくは以下の範囲：約０.１μｍ〜約２０μｍ；約０.１５μｍ〜約１０μｍ；約０.０５μｍ〜約１.００μｍ；約０.０５μｍ〜約０.５μｍのうちのいずれかである。
【０１７３】
微粒子、ビーズ、巨大分子複合体、ナノカプセル、及び液体に基づくシステム、例えば水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどのコロイド様分散システムは、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣ含有組成物の効果的な封入を提供することができる。
【０１７４】
封入組成物はさらに、様々な成分のいずれかをさらに含む。これらは、非限定的に、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造(ＬＭＳ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及び他のポリマー、例えば、ポリペプチド、グリコペプチド、及び多糖を含む。
【０１７５】
成分の封入に適したポリペプチドは、当該技術分野に知られている任意の物質を含み、そして非限定的に脂肪酸結合タンパク質を含む。改変ポリペプチドは、様々な改変のうちのいずれかを含み、非限定的に、グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化、及び水酸化を含む。本明細書に使用されるとき、適切なポリペプチドは、その免役調節活性を保存するために、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣ含有組成物を保護するポリペプチドである。結合タンパク質の例は、非限定的に、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)及びエンドウ豆アルブミンなどのアルブミンを含む。
【０１７６】
他の適切なポリマーは、医薬品の分野において知られている任意のポリマーであってもよく、非限定的に天然ポリマー、例えば、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、及び多糖、及び合成ポリマーを含む。天然ポリマーの例は、タンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン、及び脂質を含む。更なるポリマーは、合成ポリマーであってもよい。本発明において使用するために適した合成ポリマーの例は、非限定的に、 ポリアルキル・グリコール類(ＰＡＧ)、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチル化ポリオール類(ＰＯＰ)、例えば、ポリオキシエチル化グリセロール(ＰＯＧ)、ポリトリメチレングリコール(ＰＴＧ)ポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、ポリアミノ酸、ポリウレタン、及びポリホスファゼンを含む。合成ポリマーは、直線状又は分枝状、置換又は非置換のホモポリマー、コポリマー、又は２以上の異なる合成モノマーから構成されるブロックコポリマーであってもよい。
【０１７７】
本発明の封入組成物中に使用するためのＰＥＧは、化学品の販売元から購入するか、又は当業者に知られている技術を用いて合成することができる。
【０１７８】
「ＬＭＳ」という用語は、本明細書で使用されるとき、極性脂質の極性頭基が、界面の水相に向くように配置されて膜構造を形成する層状脂質粒子を意味する。ＬＭＳの例は、リポソーム、ミセル、コクリート(Cochleates)(つまり、一般的に円筒状のリポソーム)、マイクロ乳濁液、単層ベシクル、多層ベシクルなどを含む。
【０１７９】
本発明の任意のコロイド状分散システムは、リポソームである。本明細書に使用されるとき、「リポソーム」又は「脂質ベシクル」は、少なくとも１の、そして場合により２以上の二重層脂質膜により結合される小さいベシクルである。リポソームは、リン脂質、糖脂質、脂質、ステロイド、例えば、コレステロール、関連分子、又はその組合せから、非限定的に超音波処理、押出し、又は脂質-デタージェント複合体からデタージェントを取り除くことを含む任意の既知の技術により作成される。リポソームは、場合により、組織標的成分などの追加の成分を含んでもよい。「脂質膜」又は「脂質二重層」は、脂質単独からなる必要はないが、非限定的に、コレステロール及び他のステロイド、脂溶性化学物質、任意の長さのタンパク質、及び他の両親媒性分子を含む他の任意の適切な成分をさらに含むことができる。但し、当該膜の一般的な構造は、疎水性中心を挟み込む２個の親水性表面のシートである。膜構造についての一般的な考察については、例えばLasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdamを参照のこと。
【０１８０】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣ組成物を含むリポソームの製造方法は当該技術分野に知られている。脂質ベシクルは、当該技術分野に知られている任意の適切な技術により製造することができる。当該方法は、非限定的に、マイクロカプセル化、顕微溶液化、ＬＬＣ法、エタノール注入、フロン注入、「泡」法、デタージェント透析、水和、超音波処理、及び逆相蒸発を含む(Watweら、(1995) Curr. Sci. 68:715- 724.に総説される)。ベシクルに最も望ましい特性を与えるために技術を組み合わせてもよい。
【０１８１】
本発明は、組織又は細胞標的成分を含むＬＭＳの使用を包含する。かかる標的成分は、無傷動物、器官、又は細胞培養に投与された場合に、他の組織又は細胞部位に優先して特定の組織又は細胞部位への集合を促進するＬＭＳの成分である。標的成分は、一般的に、リポソームの外部からアクセス可能であり、その結果好ましくは、外側表面に結合されるか又は外側脂質二重層中に取り込まれる。標的成分は、とりわけ、ペプチド、大きいペプチドの或る領域、細胞表面分子又はマーカーに特異的な抗体又はその抗原結合断片、核酸、糖、糖複合体の領域、特別な脂質、小分子、例えば薬剤、ホルモン、又はハプテンであって、前述分子のいずれかに結合されるものでありうる。細胞型特異的細胞表面マーカーに特異性を有する抗体は当該技術分野に知られており、当該技術分野に知られている方法により即座に調製される。
【０１８２】
ＬＭＳは、治療対象である任意の細胞型、例えば、免役応答を制御し及び/又は免役応答に関与することができる細胞型、を標的することができる。かかる標的細胞及び器官は、非限定的にＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹状細胞、及びリンパ球、リンパ組織、例えばリンパ節及び脾臓、並びに非リンパ組織、特に樹状細胞が見られる組織を含む。
【０１８３】
本発明のＬＭＳ組成物は、さらにサーファクタントを含みうる。サーファクタントは、カチオン性、アニオン性、両親媒性、又は非イオン性であってもよい。サーファクタントの好ましいクラスは、非イオン性サーファクタントであり；水溶性であるサーファクタントが特に好ましい。
【０１８４】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣがプラットホーム分子に結合することにより近接する幾つかの実施態様では、当該プラットホームは、タンパク質性又は非タンパク質性(つまり、有機性)であってもよい。タンパク質性プラットホームの例は、非限定的にアルブミン、ガンマグロブリン、イムノグロブリン(ＩｇＧ)、及びオボアルブミンを含む(Borelら、(1990) Immunol. Methods 126: 159-168; Dumasら、(1995) Arch. Dematol. Res. 287:123-128; Borelら、(1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:264-267; Borelら、(1996) Ann. N.Y. Acad. Sci 778:80-87)。プラットホームは、１超のＩＲＰ及び/又はＩＲＣへの結合を含むために多価プラットホームである(つまり、１超の結合又は連結部位を含む)。従って、プラットホームは、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上の結合又は連結部位を含んでもよい。ポリマー性プラットホームの他の例は、デキストラン、ポリアクリルアミド、フィコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、及びポリＤ-グルタミン酸/Ｄ-リジンである。
【０１８５】
プラットホーム分子を使用する原理は、当該技術分野に知られている。一般的に、プラットホームは、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣについての適切な結合部位を含むために誘導体化される。さらに、又は或いは、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、適切な連結基を提供するために誘導体化される。例えば、単純なプラットホームは、二官能性リンカー(つまり、２個の結合部位を有する)、例えばペプチドである。更なる例を以下に記載する。
【０１８６】
プラットホーム分子は、生物学的に安定であってもよい。つまり、当該分子は、治療効力を与えるために数時間から数日、そして数ヶ月のｉｎ ｖｉｖｏ排出半減期を示し、そして好ましくは規定された組成の合成一本鎖から構成される。これらは、一般的に、約２００〜約１００００００の範囲、好ましくは以下の範囲：約２００〜約５０００００；約２００〜約２０００００；約２００〜約５００００(又はそれ以下、例えば３００００)のうちのいずれかの範囲内の分子量を有する。多価プラットホーム分子の例は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ；好ましくは、約２００〜約８０００の分子量を有する)、ポリ-Ｄ-リジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｄ-グルタミン酸、及びＤ-リジン(３：２の比)である。使用されうる他の分子はアルブミン及びＩｇＧなどのポリマーである。
【０１８７】
本発明における使用に適した他のプラットホーム分子は、米国特許5,552,391号に記載される化学的に規定された非ポリマー性の多価プラットホーム分子である。本発明での使用に適した他の化学的に均一に規定された多価プラットホーム分子は、誘導体化２,２'-エチレンジオキシジエチルアミン(ＥＤＤＡ)及びトリエチレングリコール(ＴＥＧ)である。
【０１８８】
さらに適した多価プラットホーム分子は、非限定的に、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリスリトール、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン(シクラム)及び１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン(シクレン)を含む。
【０１８９】
一般的に、これらのプラットホームは、標準的な化学合成技術により作成される。ＰＥＧは、誘導体化されかつ多価にされなければならず、これは標準技術を用いて達成される。複合体の合成に適した幾つかの物質、例えばＰＥＧ、アルブミン、及びＩｇＧは市販されている。
【０１９０】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣをプラットホーム分子へと結合することは、多くの方法により行われ、典型的に、１以上の架橋剤と、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣ並びにプラットホーム分子上の官能基とに関する。プラットホーム及びＩＲＰ及び/又はＩＲＣは、適切な連結基を有さなければならない。連結基は、標準合成化学技術を用いてプラットホームに加えられる。連結基は、標準固相合成技術又は組換え技術のいずれかを用いて、ポリペプチド・プラットホーム及びＩＲＰ及び/又はＩＲＣに加えられてもよい。組換えアプローチは、リンカーを結合するために翻訳後修飾を必要とすることもあり、そしてかかる方法は当該技術分野に知られている。
【０１９１】
一例として、ポリペプチドは、ポリペプチドをプラットホームへと結合するための部位として働く官能基、例えばアミノ、カルボキシル、又はスルフヒドリル基を含むアミノ酸側鎖部分を含む。かかる官能基を有する残基は、当該ポリペプチドがこれらの基を既に含んでいない場合、当該ポリペプチドに結合されてもよい。かかる残基は、固相合成技術又は組換え技術により取り込まれてもよい。これらの両者は、ペプチド合成技術において周知である。ポリペプチドが、糖側鎖を有する場合(又は当該プラットホームが糖である場合)、官能性アミノ、スルフヒドリル及び/又はアルデヒド基は、慣用の化学反応により取り込まれてもよい。例えば、一級アミノ基は、シアン化ホウ素水素ナトリウムの存在下で、酸化型の糖とエチレンジアミンとを反応することにより取り込まれてもよく、スルフヒドリルは、システアミン・ジヒドロクロリドと反応させ、続いて標準的なジスルフィド試薬で還元することにより取り込まれてもよく、一方アルデヒド基は、過ヨウ素酸酸化の後に生成されてもよい。似た様式において、プラットホーム分子は、適切な官能基を有さない場合、官能基を含むように誘導体化されてもよい。
【０１９２】
様々な長さの親水性リンカーが、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣをプラットホーム分子へと結合するために有用である。適切なリンカーは、エチレングリコールの直線状オリゴマー又はポリマーを含む。かかるリンカーは、式：Ｒ1Ｓ(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)nＣＨ2ＣＨ2Ｏ(ＣＨ2)mＣＯ2Ｒ2[式中、ｎ＝０〜２００、ｍ＝１又は２、Ｒ1＝Ｈ又はトリチルなどの保護基、Ｒ2＝Ｈ又はアルキル又はアリール、例えば４-ニトロフェニルエステルである]を有するリンカーを含む。これらのリンカーは、チオエーテルを介してハロアセイル(haloaceyl)、マレイミドなどのチオール反応性基を含む分子を、アミド結合を介してアミノ基を含む第二分子へと接続するのに有用である。これらのリンカーは、結合の順番を変えることができる。つまり、チオエーテルを最初に形成することもできるし、又は最後に形成することもできる。
【０１９３】
ある表面上に吸着させることによりＩＲＰ及び/又はＩＲＣが近接する実施態様では、当該表面は、無機又は有機コアのいずれかで作成されるキャリア粒子の形態であってもよい。かかるナノ粒子の例は、非限定的に、ナノ結晶粒子、アルキルシアノアクリレートの重合により作成されたナノ粒子、及びメチリデン・マロネートの重合により作成されたナノ粒子を含む。ＩＲＰ及び/又はＩＲＣが吸着されうる追加の表面は、非限定的に、活性炭粒子及びタンパク質-セラミックナノ粒子を含む。キャリア粒子の他の例が本明細書に提供される。
【０１９４】
吸着された分子を細胞へとデリバリーするためのポリヌクレオチド及びポリペプチド表面への吸着は、当該技術分野に周知である。例えば、Douglasら、(1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261 ; Hagiwaraら、(1987) In Vivo 1 :241-252; Bousquetら、(1999) Pharm Res. 16: 141 -147; 及びKossovskyら、米国特許第5,460,831号を参照のこと。好ましくは、吸着表面を含む物質は生分解性である。ＩＲＰ及び/又はＩＲＣの表面への吸着は、非共有相互作用、例えばイオン性及び/又は疎水性相互作用を介して生じてもよい。
【０１９５】
一般的に、ナノ粒子などのキャリアの特徴、例えば表面荷電、粒子サイズ、及び分子量は、重合過程の間の重合条件、モノマー濃度、及び安定剤の存在に依存する(Douglasら、1987)。キャリア粒子の表面は、例えば、表面被膜で改変されて、ＩＲＰ及び/又はＩＲＣの吸着を許容又は高めてもよい。吸着されたＩＲＰ及び/又はＩＲＣを有するキャリアタンパク質は、さらに他の物質で被膜されてもよい。かかる他の物質の添加は、本明細書に記載されるように、例えば、対象に投与された際の粒子の半減期を延長してもよいし、及び/又は当該粒子を特定の細胞型又は組織に標的化してもよい。
【０１９６】
ＩＲＰ及び/又はＩＲＣが吸着されうるナノ結晶表面が記載されてきた(例えば、米国特許第5,460,831号)。(１μｍ以下の直径を有する)ナノ結晶コア粒子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び/又は他の医薬品の吸着を促進する表面エネルギー改変層で被膜される。別の吸着表面は、アルキルシアノアクリレートの重合により作成されるナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン性重合の方法により、酸性水性溶媒中で重合することができる。重合条件に依存して、小さい粒子は、２０〜３０００ｎｍの範囲の大きさを有する傾向があり、そしてナノ粒子に特定の表面特性を与え、そして特定の表面荷電を有するものとすることが可能である(Douglasら、1987)。例えば、オリゴヌクレオチドは、テトラフェニルホスホニウム・クロリド又は四級アンモニウム塩、例えばセチルトリメチル・アンモニウム・ブロミドの存在下で、ポリイソブチル及びポリイソゲキシルシアノアクリレート・ナノ粒子に吸着されうる。これらのナノ粒子上へのオリゴヌクレオチドの吸着は、核酸鎖の負に荷電されたリン酸基と、疎水性カチオンとの間のイオン対の形成により媒介されるようである。例えば、Lambertら、(1998) Biochimie 80:969-976, Chavanyら、(1994) Pharm. Res. 11: 1370-1378; Chavanyら、(1992) Pharm. Res. 9:441-449を参照のこと。別の吸着表面は、メチリデン・マロネートの重合により作成されるナノ粒子である。
【０１９７】
ＩＲＰ又はＩＲＣは、マイクロキャリア(ＭＣ)複合体の形態で投与されてもよい。従って、本発明は、ＩＲＰ/ＭＣ複合体又はＩＲＣ/ＭＣ複合体を含む組成物を提供する。ＩＲＰ/ＭＣ複合体は、マイクロキャリアの表面に結合されたＩＲＰを含み(つまり、ＩＲＰはＭＣ内に封入されていない)、そして好ましくは各マイクロキャリアに結合された複数のＩＲＰ分子を含む。ある実施態様では、異なるＩＲＰの混合物は、当該マイクロキャリアが１超のＩＲＰ種に結合されるように、マイクロキャリアと複合体形成されうる。ＩＲＰとＭＣとの間の結合は、共有又は非共有結合であってもよい。当業者により理解されるように、ＩＲＰは改変又は誘導体化されてもよく、そしてマイクロキャリアの組成は、ＩＲＰ/ＭＣ複合体形成について所望される結合のタイプを収容するように選択及び/又は改変されてもよい。当該同じ記載は、ＩＲＣ/ＭＣ複合体に適用される。ある実施態様では、ＩＲＣ及びＩＲＰの混合物は、当該マイクロキャリアが少なくとも１のＩＲＣ及びＩＲＰ種に結合されるように、マイクロキャリアと複合体形成されてもよい。
【０１９８】
本発明において有用なマイクロキャリアは、約１５０、１２０、又は１００μｍの大きさより小さく、より一般的に約５０〜６０μｍの大きさであり、好ましくは約１０μｍの大きさであり、そして純水に不溶性である。本発明に使用されるマイクロキャリアは、好ましくは生分解性であるが、生分解性ではないマイクロキャリアも許容される。マイクロキャリアは、一般的に固相、例えば「ビーズ」又は他の粒子であるが、生分解性のポリマー又は油などを含む水中油乳濁液などの液相マイクロキャリアも予期される。マイクロキャリアとして使用するために適した広範囲の生分解性の物質及び生分解性でない物質が当該技術分野に知られている。
【０１９９】
本発明の組成物又は方法において使用するためのマイクロキャリアは、一般的に約１０μｍの大きさ未満であり(例えば、約１０μｍ未満の平均直径、又は１０μｍのスクリーン・フィルターを通過する少なくとも約９７％の粒子)、そしてナノキャリア(つまり、約１μｍの大きさ未満のキャリア)を含む。好ましくは、マイクロキャリアは、約９、７、５、２、又は１μｍ或いは９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、又は１００ｎｍの上限と、約４、２、又は１μｍ或いは約８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、又は１０ｎｍの独立して選ばれる下限との間の大きさを有するマイクロキャリアから選ばれる。ここで当該下限値は、上限値より小さい。幾つかの実施態様では、マイクロキャリアは、約１.０〜１.５μｍ、約１.０〜２.０μｍ、又は約０.９〜１.６μｍの大きさを有する。ある好ましい実施態様では、マイクロキャリアは、約１０ｎｍ〜約５μｍ又は約２５ｎｍ〜約４.５μｍ、約１μｍ、約１.２μｍ、約１.４μｍ、約１.５μｍ、約１.６μｍ、約１.８μｍ、約２.０μｉｍ、約２.５μｍ又は約４.５μｍの大きさを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい実施態様は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ又は約２００ｎｍのナノ粒子を含む。
【０２００】
固相生分解性マイクロキャリアは、非限定的に生分解性のポリエステル類、例えばポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、及びそのコポリマー(ブロックコポリマーを含む)、並びにポリ(乳酸)及びポリ(エチレングリコール)のブロックコポリマー；ポリオルソエステル類、例えば３,９-ジエチリデン-２,４,８,１０-テトラオキサスピロ［５.５］ウンデカン(ＤＥＴＯＳＵ)に基づくポリマーなど；ポリ無水物、例えばセバシン酸などの比較的親水性のモノマーに基づくポリ(無水物)ポリマーなど；ポリ無水物イミド類、例えばグリシン又はアラニンなどのアミノ酸を取り込むセバシン酸誘導性モノマーに基づく(つまり、アミノ末端窒素を介したイミド結合によりセバシン酸に結合される)ポリ無水物ポリマー；ポリ無水物エステル類；ポリホスファゼン類、特にカルボン酸基の生成を介してポリマー骨格の切断を触媒できる加水分解性エステル基を含むポリ(ホスファゼン類)(Schachtら, (1996) Biotechnol. Bioeng. 1996: 102)；及びポリアミド類、例えばポリ(乳酸-コ-リジン)を含む生分解性ポリマーから製造されうる。
【０２０１】
マイクロキャリアの製造に適した様々な非生分解性の物質が知られており、非限定的に、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性物質を含む。ある実施態様は、金、ラテックス及び／又は磁性ビーズを除外する。ある実施態様では、マイクロキャリアは、第二物質(例えば、ポリスチレン)で封入した第一物質(例えば、磁性物質)から作られてもよい。
【０２０２】
固相マイクロスフィアは、当該技術分野に知られている技術を用いて製造される。例えば、それらは、乳濁液-溶媒抽出／蒸発技術により調製することができる。一般的に、当該技術において、ポリ無水物、ポリ(アルキル-α-シアノアクリレート類)、及びポリ(α- ヒドロキシエステル類)、例えば、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(Ｄ,Ｌ-乳酸-コ-グリコール酸)及びポリ(カプロラクトン)などの生分解性ポリマーは、塩化メチレンなどの適切な有機溶媒中に溶解されて、分散相(ＤＰ)の乳濁液を構成した。ＤＰは、溶解したサーファクタント、例えば、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)又はポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)を含む過剰体積の水性連続相(ＣＰ)中で高速ホモジェナイズすることにより乳化する。ＣＰ中のサーファクタントは、分離されそして適切な大きさの乳濁液滴の形成を保証することになる。有機溶媒は次にＣＰ中に抽出され、そしてシステム温度を上昇させることにより蒸発される。固体マイクロ粒子は、次に遠心又はろ過により分離され、そして例えば、凍結乾燥又は吸引を適用することにより乾燥させて、その後４℃で貯蔵する。
【０２０３】
平均サイズ、サイズ分布、及び乾燥マイクロスフィアの表面電荷などの物理化学的性質を測定することができる。サイズ特性は、例えば動的光散乱技術により測定され、そして表面電荷は、ゼータ電位を計測することにより測定される。
【０２０４】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴、及び他の脂質又は油に基づく粒子であって、生分解性ポリマー又は油を取り込むものを含む。ある実施態様では、生分解性のポリマーは、サーファクタントである。他の実施態様では、液相マイクロキャリアは、スクアレン又は植物油などの生分解性油を取り込んでいるため生分解性である。一の好ましい液相マイクロキャリアは、水中油乳濁液の油滴である。好ましくはマイクロキャリアとして使用される水中油乳濁液は、生分解性の物質、例えばスクアレンを含む。
【０２０５】
共有結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、当該技術分野に知られている任意の共有架橋技術を用いて結合されてもよい。典型的に、ＩＲＰ部分は、当該ＩＲＰ部分がマイクロキャリアに結合される部位を提供するために、さらなる部分(例えば、遊離アミン、カルボキシル基又はスルフヒドリル基)を取り込むか又は改変されたヌクレオチド塩基(例えばホスホロチオエート)を取り込むように改変されよう。当該複合体のＩＲＰ部分とＭＣ部分との間の結合は、ＩＲＰの３'又は５'末端でなされるか、又はＩＲＰの内部で適切に改変された塩基においてなされうる。マイクロキャリアは、一般的に、共有結合が形成される部分を取り込むように一般的に改変されるが、マイクロキャリア上に通常存在する官能基が使用されてもよい。ＩＲＰ／ＭＣは、共有複合体の形成を許容する条件下(例えば、架橋剤の存在下で、又はＩＲＰとの共有結合を形成する活性化部分を含む活性化マイクロキャリアを使用することにより)で、ＩＲＰとマイクロキャリアとをインキュベーションすることにより形成される。
【０２０６】
様々な架橋技術は当該技術分野において知られており、そしてアミノ、カルボキシル、及びスルフヒドリル基と反応する架橋剤を含む。当業者に明らかであるように、架橋剤及び架橋プロトコルの選択は、ＩＲＰ及びマイクロキャリアの形態、並びにＩＲＰ／ＭＣ複合体の所望される最終形態に左右されるであろう。架橋剤は、同種二官能性又は異種二官能性のいずれであってもよい。同種二官能性架橋剤が使用される場合、架橋剤はＩＲＰ及びＭＣ上の同じ部分を利用する(例えば、アルデヒド架橋剤は、ＩＲＰ及びＭＣの両者が１以上の遊離アミンを含む場合ＩＲＰとＭＣを共有結合するために使用されてもよい)。異種二官能性の架橋剤は、ＩＲＰ及びＭＣ上の異なる部位を利用し(例えば、マレイミド-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド・エステルは、ＩＲＰ上の遊離スルフヒドリル及びＭＣ上の遊離アミンを共有結合するために使用されうる)、そしてマイクロキャリア間の結合の形成を最小限にするため好ましい。多くの場合、マイクロキャリア上の第一架橋部分とＩＲＰ上の第二架橋部分とを介して架橋することが好ましい(ここで、第二架橋部分は、マイクロキャリア上に存在することはない)。ＩＲＰ／ＭＣ複合体を生成する１の好ましい方法は、異種二官能性の架橋剤とインキュベーションすることによりマイクロキャリアを活性化し、次に反応に適した条件下でＩＲＰと活性化ＭＣとをインキュベーションすることによりＩＲＰ／ＭＣ複合体を形成することによる。架橋剤は、反応性部分の間に「スペーサー」部分を含んでもよいし、又は架橋剤中の２個の反応性部分は直接結合されていてもよい。
【０２０７】
一の好ましい実施態様では、ＩＲＰ部分は、マイクロキャリアに架橋するために少なくとも１の遊離スルフヒドリル(例えば、５'-チオール改変塩基又はリンカーにより提供される)を含み、一方当該マイクロキャリアは遊離アミン基を含む。これらの２個の基と反応する異種二官能性架橋剤(例えば、マレイミド基及びＮＨＳ-エステルを含む架橋剤)、例えばスクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレートなどは、ＭＣを活性化するために使用され、次にＩＲＰを共有結合により架橋して、ＩＲＰ／ＭＣ複合体を形成する。
【０２０８】
非共有結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、結合対がＩＲＰとＭＣを連結する場合と同様に、任意の非共有結合又は相互作用、例えばイオン性(静電)結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又は２以上の異なる相互作用の組合せ、により連結されてもよい。
【０２０９】
好ましい非共有結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、典型的に、疎水性又は静電(イオン性)相互作用、又はその組合せにより複合体形成される(例えば、結合対を利用して、ＩＲＰと、ＭＣに結合されたポリヌクレオチドとの間の塩基対を介して形成される)。ポリヌクレオチド骨格の親水性性質のため、複合体を形成するために疎水性相互作用に頼るＩＲＰ／ＭＣ複合体は、疎水性の高い部分を取り込むために、一般的に当該複合体のＩＲＰ部分を改変することを必要とする。好ましくは、疎水性部分は、生体適合性、非免疫原性であり、そして当該組成物の対象とする個体(例えば哺乳動物、特にヒトにおいて見られる)において天然に生ずる。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、ステロール、例えばコレステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をＩＲＰに結合する方法は、ＩＲＰの形態と、疎水性部分の性質に当然左右されるであろう。当該疎水性部分は、ＩＲＰにおける任意の都合のよい部位、好ましくは５'又は３'末端で加えられてもよく、コレステロール部分をＩＲＰに加える場合、当該コレステロール部分は、好ましくは、慣用される化学反応を用いてＩＲＰの５'末端に加えられる(例えば、Godardら、(1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410を参照のこと)。好ましくは、疎水性結合により結合されるＩＲＰ／ＭＣ複合体において使用するためのマイクロキャリアは、疎水性物質、例えば油滴又は疎水性ポリマーから作製されるが、疎水性部分を取り込むように改変された親水性物質は、同様に利用されてもよい。マイクロキャリアがリポソームであるか、又はルーメンを含む他の液相マイクロキャリアであり、かつＩＲＰがＭＣの外面に会合することが所望される場合、ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、ＭＣ製造過程の間にＩＲＰの封入を避けるために、ＭＣを製造後ＩＲＰとＭＣを混合することによって形成される。
【０２１０】
静電結合により結合される非共有ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチド骨格の高い負電荷を利用する。非共有結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体において使用するマイクロキャリアは、生理的ｐＨ(例えば約ｐＨ６.８〜７.４)において一般的に正に荷電されている(カチオン性である)。当該マイクロキャリアは本質的に正電荷を有してもよいが、通常正電荷を有していない化合物から作られたマイクロキャリアが誘導体化されるか、又はそうでなければ改変されて正電荷(カチオン性)にされてもよい。例えば、当該マイクロキャリアを製造するために使用されるポリマーは、正に荷電された基、例えば一級アミンなどを加えるように誘導体化されてもよい。或いは、正に荷電された化合物は、製造の間にマイクロキャリアの構築において取り込まれてもよい(例えば、正に荷電されたサーファクタントが、結果として得られるマイクロキャリア粒子に正電荷を与えるために、ポリ(乳酸)／ポリ(グリコール酸)の製造のあいだに使用されてもよい)。
【０２１１】
例えば、カチオン性マイクロスフィアを製造するために、例えば、１,２-ジオレオイル-１,２,３-トリメチルアンモニオプロパン(ＤＯＴＡＰ)、セチルトリメチルアンモニウム・ブロミド(ＣＴＡＢ)、又はポリリジンは、これらの相における溶解度に従ってＤＰ又はＣＰのいずれかに加えられる。
【０２１２】
ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、好ましくは水性混合物中でポリヌクレオチドと粒子をインキュベーションすることによりカチオン性マイクロスフィア上に吸着させることにより前もって形成することができる。かかるインキュベーションは、任意の所望される条件下、例えば室温又は冷蔵庫の温度(例えば４℃)で行われてもよい。カチオン性のマイクロスフィアとポリヌクレオチドとは比較的迅速に会合するので、インキュベーションは、５、１０、１５分又はそれ以上、例えば一晩及びそれより長いインキュベーションのいずれであってもよい。例えば、ＩＲＰは、ポリヌクレオチドと粒子とを一晩４℃にて水中でインキュベーションすることにより、カチオン性マイクロスフィア上に吸着することができる。しかしながら、カチオン性マイクロスフィア及びポリヌクレオチドが同時に会合するので、ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチド及びＭＣを単純に共投与することにより形成することができる。マイクロスフィアは、ポリヌクレオチド会合の前において及び後において大きさ及び表面電荷について特徴付けられてもよい。選択されたバッチは、例えばヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びマウス脾臓細胞アッセイにおいて、適切な対照に対する活性について評価してもよい。当該製剤は、適切な動物モデルにおいて評価されることもある。
【０２１３】
ヌクレオチド塩基対により結合される非共有結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、慣用される方法論を用いて製造されてもよい。一般的に、塩基対結合性ＩＲＰ／ＭＣ複合体は、ＩＲＰに少なくとも部分的に相補するポリヌクレオチド(「捕捉ポリヌクレオチド」)が結合された(好ましくは共有結合された)マイクロキャリアを用いて製造される。ＩＲＰと捕捉ヌクレオチドとの間の相補性断片は、好ましくは少なくとも６、８、１０、又は１５の連続塩基対であり、より好ましくは少なくとも２０の連続する塩基対である。捕捉ヌクレオチドは、当該技術分野において知られている任意の方法によりＭＣに結合されてもよく、そして好ましくは５'又は３'末端においてＩＲＰに共有結合される。幾つかの実施態様では、５'-ＧＧＧＧ-３'配列を含むＩＲＰは、この配列の当該部分を一本鎖のまま維持するであろう。
【０２１４】
別の実施態様では、結合対は、ＩＲＰ／ＭＣ複合体においてＩＲＰとＭＣとを連結するために使用されてもよい。当該結合対は、受容体及びリガンドであってもよく、抗体及び抗原(又はエピトープ)でもよく、又は高い親和性で(例えば約１０〜８より小さいＫｄ)で結合する他の任意の結合対であってもよい。好ましい結合対の一のタイプは、ビオチンとストレプトアビジン、又はビオチンとアビジンであり、これらはかなり強固な複合体を形成する。ＩＲＰ／ＭＣ複合体結合を媒介するために結合対を使用する場合、ＩＲＰは典型的に共有結合により、当該結合対の一のメンバーで誘導体化され、そしてＭＣは結合対のもう一方のメンバーで誘導体化される。２個の誘導体化された化合物がＩＲＰ／ＭＣ複合体形成をもたらす。
【０２１５】
本発明の方法
本発明は、個体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいて免役応答を調節する方法であって、当該個体に本明細書に記載されるＩＲＳ含有ポリヌクレオチドを投与することを含む、前記方法を提供する。本発明により提供される免役調節方法は、非限定的に、免役刺激性核酸分子、例えば細菌ＤＮＡにより刺激される免役応答を抑制及び／又は阻害する方法を含む。本発明はまた、ＴＬＲ７／８及び／又はＴＬＲ９誘導性の細胞応答を阻害する方法を提供する。本発明は、非限定的に自己免疫に関連する症候を含む、不所望の免役活性に付随する症候を改善するための方法を提供する。
【０２１６】
ＩＲＳ含有ポリヌクレオチドは、免役応答を調節するために十分な量で投与される。本明細書に記載されるように、免役応答の調節は、液性及び／又は細胞性であってもよく、そして本明細書に記載されるように、当該技術分野において標準技術を用いて計測される。
【０２１７】
ある実施態様では、当該個体は、不所望な免役活性化に関連する障害、例えばアレルギー性疾患又は病気、アレルギー及び喘息を患う。アレルギー性疾患又は喘息を有する個体は、現存するアレルギー疾患又は喘息の目立った症状を患う個体である。
【０２１８】
ある実施態様では、個体は、不所望の免役活性化に関連する障害、例えば自己免疫疾患及び炎症性疾患を患う。自己免疫疾患又は炎症性疾患を患う個体は、現存する自己免疫疾患又は炎症性疾患の目立った症状を患う個体である。
【０２１９】
自己免疫疾患は、２個の広いカテゴリー：器官特異的及び全身性に分けることができる。自己免疫疾患は、非限定的に、リューマチ様関節炎(ＲＡ)、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症 (MS)、早発閉経などの免役関連不妊症、強皮症、シュ-グレン疾患、白斑、脱毛症(禿)、多内分泌腺機能低下、グレーブス病、甲状腺機能低下症、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉天疱瘡、炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)及びＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)に関連する自己免疫肝炎、下垂体機能不全、移植片-対-宿主疾患(ＧｖＨＤ)、心筋炎、アジソン病、自己免疫皮膚疾患、ブドウ膜炎、悪性貧血、及び副甲状腺機能低下症を含む。
【０２２０】
自己免疫疾患は、非限定的に、橋本甲状腺炎、Ｉ型及びＩＩ型自己免疫多内分泌腺症候群、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ疾患、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、本態性混合クリオグロブリン血症、小児性慢性水疱性疾患、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、自己免疫性好中球減少、重症筋無力症、イートン・ランバート筋無力症症候群、スティフマン症候群、急性播種性脳脊髄炎、ギラン-バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、伝導遅延を伴う多巣性運動ニューロパチー、モノクローナル免疫グロブリン血症を伴う慢性ニューロパチー、オプソノクローヌス-筋クローヌス症候群(opsonoclonus-myoclonus syndrome)、小脳変性症、脳脊髄炎、網膜症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、グルテン感受性腸疾患、強直性脊椎炎、反応性関節炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、混合性結合組織病、ベーチェット症候群、乾癬、結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎、及び肉芽腫症(チャーグ・ストラウス疾患)、多発性血管炎オーバーラップ症候群、過敏性血管炎、ウェーゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、タカヤス動脈炎、川崎病、中枢神経系の孤在性血管炎、閉塞性血栓血管炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、及び寒冷症を含んでもよい。これらの病気は医学分野において周知であり、そして例えば、「Harrison's Principles of Internal Medicine」、第１４版、Fauci A Sら編、New York: McGraw-Hill, 1998を参照のこと。
【０２２１】
全身性疾患ＳＬＥは、ほぼ全ての細胞に豊富に存在する抗原に対する抗体、例えば抗クロマチン抗体、抗スプライソソーム抗体、抗リボソーム抗体、及び抗-ＤＮＡ抗体の存在により特徴付けられる。結果として、ＳＬＥの影響は、様々な組織、例えば皮膚及び腎臓において見られる。自己反応性Ｔ細胞はＳＬＥに関与する。例えば、マウス・ループス・モデルにおける研究により、非ＤＮＡヌクレオソーム抗原、例えばヒストンが、自己反応性Ｔ細胞であって、抗ＤＮＡ産生Ｂ細胞を働かせることができるＴ細胞を刺激することが示された。ＩＦＮ-αの血清レベルの増加がＳＬＥ患者において観察され、そして熱及び皮膚発疹を含む疾患活性及び重篤度の両方に、並びに疾患プロセスに関連する必須マーカー(例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体タイター)に相関することが示された。循環系において存在する免役複合体が、患者のＩＦＮ-αを引き起こすことができ、そうして増加したＩＦＮ-αの慢性的な存在を維持することが示された。免役複合体の２の異なるタイプ：ＤＮＡ／抗ＤＮＡ抗体複合体、及びＲＮＡ／抗リボヌクレオタンパク質-ＲＮＡ抗体複合体が、ヒトＰＤＣからＩＦＮ-αを誘発することが記載された。ＤＮＡがＴＬＲ-９のリガンドであり、そしてＲＮＡがＴＬＲ-７／８のリガンドであるので、これら二つの経路がＴＬＲ-９及びＴＬＲ-７／８シグナル伝達をそれぞれ利用し、その結果ＩＦＮ-αを慢性的に誘導し、そうしてＳＬＥの病因に関与するということが予期される。従って、ＴＬＲ-７／８及びＴＬＲ-９応答を阻害するのに効果的であるＩＲＰ及び／又はＩＲＣ組成物は、ＳＬＥを治療するのに特に有効であろう。
【０２２２】
ある実施態様では、個体は自己免疫疾患を発達させるリスクを有し、そしてＩＲＰ又はＩＲＣが、当該自己免疫疾患を遅延又は予防するために有効な量で投与される。自己免疫疾患を発達させるリスクを有する個体は、例えば、自己免疫疾患を発達させる遺伝性の又は他の素因を有する個体を含む。ヒトにおいて、特定の自己免疫疾患への感受性は、ＨＬＡ型に関連し、あるものは特定のＭＨＣクラスＩＩアレルと強く関連し、そして他のものはＭＨＣクラスＩアレルに関連する。例えば、強直性脊椎炎、急性前部ブドウ膜炎、及び若年性リューマチ様関節炎はＨＬＡ-Ｂ２７と関連し、グッドパスチャー症候群及びＭＳはＨＬＡ-ＤＲ２と関連し、グレーブス疾患、重症筋無力症及びＳＬＥはＨＬＡ-ＤＲ３と関連し、リューマチ様関節炎及び尋常性天疱瘡はＨＬＡ-ＤＲ４と関連し、そして橋本甲状腺炎はＨＬＡ-ＤＲ５と関連する。自己免疫疾患に対する他の遺伝的素因は、当該技術分野に知られており、そして個体は、当該技術分野に知られているアッセイ及び方法によりかかる素因の存在について試験することができる。従って、幾つかの場合では、自己免疫疾患を発達させるリスクを有する個体を同定することができる。
【０２２３】
本明細書に記載されるように、本発明のＩＲＰは、特にサイトカイン、例えば非限定的に、ＩＬ-６、ＩＬ-１２、ＴＮＦ-α、及び／又はＩＦＮ-αの産生を特に阻害し、そしてＢ細胞増殖及び／又は形質細胞様樹状細胞の分化の活性化を抑制してもよい。従って、本発明のＩＲＰ及びＩＲＣは、個体において免役刺激核酸に応答した免役を抑制するのに特に有効である。
【０２２４】
自己免疫疾患を研究するための動物モデルが当該技術分野に知られている。例えば、ヒト自己免疫疾患に最も似ているようである動物モデルは、高発生率の特定疾患を自然に発達させる動物種を含む。かかるモデルの例は、非限定的に、Ｉ型糖尿病に似た疾患を発達させる非肥満糖尿病(ＮＯＤ)マウスを含み、そしてニュージーランド・ハイブリッド、ＭＲＬ-Ｆａｓlpr及びＢＸＳＢマウスなどのループス様疾患を引き起こす傾向を有する動物を含む。自己免疫疾患が誘導される動物モデルは、非限定的に、多発性硬化症のモデルである実験自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ)、リューマチ様関節炎のモデルであるコラーゲン誘導性関節炎(ＣＩＡ)、及びブドウ膜炎のモデルである実験自己免疫ブドウ膜炎(ＥＡＵ)を含む。自己免疫疾患の動物モデルは、遺伝子操作により作製され、そして例えば炎症性腸疾患についてはＩＬ-２／ＩＬ-１０ノックアウトマウス、ＳＬＥについてはＦａｓ又はＦａｓリガンドのノックアウトマウス、及びリューマチ様関節炎についてはＩＬ-１受容体アンタゴニストノックアウトマウスを含む。
【０２２５】
従って、当該技術分野において標準的である動物モデルは、自己免疫障害の治療について本発明の方法及び組成物の活性及び／又は有効性をスクリーニング及び／又は評価するのに適している。
【０２２６】
ある実施態様では、個体は、慢性炎症性応答に関連する障害を患う。ＩＲＰの投与は、免役調節、つまり、炎症応答の低下をもたらしうる１以上の先天性免役応答関連サイトカインのレベルの低下をもたらす。不所望な免役応答に関連する記載された障害を患う個体の免役調節は、当該障害の１以上の症状の低減又は改善をもたらす。
【０２２７】
本発明の他の実施態様は、ウイルスに晒されたか又は感染した個体の免役調節治療に関する。ウイルスに晒されるか又は感染した個体へのＩＲＰ又はＩＲＣの投与は、ウイルス誘導性のサイトカイン産生の抑制をもたらす。ウイルスに応答して産生されたサイトカインは、ウイルス感染に適した環境を助長しうる。ウイルス誘導性のサイトカイン産生の抑制は、ウイルス感染を制限するか又は予防するように働くこともある。
【０２２８】
ある実施態様では、個体は、慢性病原体刺激、例えば慢性ウイルス感染及びマラリアに関連する病原体刺激に関連する疾患又は障害を患う。ＴＬＲ-７／８応答を阻害するのに有効であるＩＲＰ及び／又はＩＲＣ組成物は、慢性病原体刺激に関連する疾患及び症状を治療するのに特に効果的であろう。
【０２２９】
本発明の方法は、当該障害の標準的なケアをなす他の治療、例えば全身性コルチコステロイド治療(コルチソン)などと組み合わせて実施されてもよい。
【０２３０】
幾つかの状況では、自己抗原に対する末梢寛容は、失われる(か又は破壊され)、そして結果として自己免疫応答が生じる。例えば、ＥＡＥに対する動物モデルにおいて、先天性免役受容体ＴＬＲ９又はＴＬＲ４を介した抗原提示細胞(ＡＰＣ)の活性化は、自己寛容性を破壊し、そしてＥＡＥの誘導をもたらすことが示された(Waldnerら、(2004) J. Clin. Invest. 113:990-997)。
【０２３１】
従って、幾つかの実施態様では、本発明は、ＴＬＲ９依存性の細胞刺激を抑制又は低減する方法を提供する。ＩＲＰの投与は、ＴＬＲ９依存性の細胞応答の抑制をもたらし、１以上のＴＬＲ９関連サイトカインのレベルの低下を含む。ＴＬＲ９依存性細胞刺激の抑制において使用するのに適したＩＲＰは、ＴＬＲ９と関連する細胞応答を阻害又は抑制するＩＲＰである。
【０２３２】
幾つかの実施態様では、本発明は、ＴＬＲ７／８依存性の細胞刺激を抑制又は低減するための方法を提供する。ＩＲＰの投与は、１以上のＴＬＲ７／８関連サイトカイン・レベルの低下を含むＴＬＲ７／８依存性細胞応答の抑制をもたらす。ＴＬＲ７／８依存性細胞刺激の抑制において使用するために適したＩＲＰは、ＴＬＲ７／８に関連する細胞応答を阻害又は抑制するＩＲＰである。
【０２３３】
本明細書に記載されるように、幾つかのＩＲＰは、ＴＬＲ９依存性細胞応答及びＴＬＲ７／８依存性細胞応答の両方を抑制する。幾つかのＩＲＰは、ＴＬＲ９依存性細胞応答を抑制するが、ＴＬＲ７／８依存性細胞応答を抑制しない。幾つかのＩＲＰはＴＬＲ７／８依存性細胞応答を抑制するが、ＴＬＲ９依存性細胞応答を抑制しない。従って特定のＩＲＰは、特定の免役応答を制御するために投与することができる。
【０２３４】
投与及び免役応答の評価 
ＩＲＰ又はＩＲＣは、本明細書に記載されるように他の医薬品と組み合わせて投与することができ、そして生理的に許容されるその担体と組み合わせることができる(及びその様なものとして本発明はこれらの組成物を含む)。ＩＲＰ又はＩＲＣは、本明細書に記載されるもののいずれであってもよい。
【０２３５】
免役応答の調節用の全ての組成物と同様に、特定のＩＲＰ又はＩＲＣ製剤の投与の有効量及び方法は、個体、どの病気が治療されるのか、及び当業者に明らかである他の因子に基づいて変えられてもよい。考慮される因子は、ＩＲＰ又はＩＲＣがデリバリー分子と共に又はデリバリー分子と共有結合させて投与されるか否か、投与経路、及び投与される用量の回数を含む。このような因子は、当該技術分野に知られており、そして必要以上の実験をすることなくかかる決定をすることは、当業者の技術の範囲内である。適切な用量範囲は、所望される免役応答の調節(例えば、免役刺激核酸に応答するＩＦＮ-α又は他のサイトカイン産生の抑制)を提供する範囲である。免役刺激核酸に対する免役応答の抑制が所望される場合、適切な用量範囲は、免役刺激核酸による所望された免役刺激を提供する範囲である。一般的に、用量は、投与されるＩＲＰ含有組成物の全体量よりはむしろ、患者に投与されるＩＲＰの量により決定される。デリバリーされるＩＲＰの量で与えられるＩＲＰの有用な用量範囲は、例えば以下の：０.５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜９ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、３〜７ｍｇ／ｋｇ、４〜６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇのいずれかから選ばれてもよい。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、クリアランス率、及び投与経路などの薬理学的特性に左右される。
【０２３６】
特定のＩＲＰ又はＩＲＣ製剤の投与の有効量及び方法は、個々の患者、所望される結果及び／又は障害のタイプ、疾患ステージ、及び当業者に明らかな他の因子に基づいて変わりうる。特定の適用において有用な投与経路は、当業者に明らかである。投与経路は、非限定的に、局所、皮内、経皮、経粘膜、表皮、非経口、胃腸管、及び鼻咽頭及び肺、例えば経気管支及び経肺胞(transalveolar)を含む。適切な用量範囲は、血中レベルにより計測したとき約１〜５０μＭの組織濃度を達成するために、十分なＩＲＰ含有組成物を提供する範囲である。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、クリアランス率、及び投与経路などの薬理学的特性に左右される。
【０２３７】
本明細書に記載されるとき、不所望の免役活性化が生じているか、又は生じそうである組織は、ＩＲＰ又はＩＲＣの好ましい標的である。こうして、リンパ節、脾臓、骨髄、血液、並びにウイルスに晒された組織へのＩＲＰ又はＩＲＣの投与は、投与の好ましい部位である。
【０２３８】
本発明は、非限定的に、生理学的に許容されるインプラント、軟膏、クリーム、リンス、及びゲルを含む局所適用に適したＩＲＰ又はＩＲＣ製剤を提供する。代表的な皮膚投与の経路は、侵襲性が少ない経路、例えば経皮透過、上皮投与、及び皮下注射などである。
【０２３９】
経皮投与は、ＩＲＰ又はＩＲＣが皮膚に浸透し、そして血流に入ることを許容できるクリーム、リンス、ゲルなどを適用することにより達成される。経皮投与に適した組成物は、非限定的に、医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム、及び軟膏であって、皮膚に直接適用されるか、又は経皮装置(いわゆる「パッチ」)などの保護担体中に取り込まれるものを含む。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えば、医師用卓上参考書において見つけることができる。経皮透過は、イオントフォレシスにより、例えば数日またはそれより長い期間のあいだ無傷の皮膚を介して連続的に生成物をデリバリーする市販のパッチを使用して達成されてもよい。当該方法の使用は、比較的高い濃度での医薬組成物の制御透過を許容し、組合せ薬の導入を許容し、そして吸収促進剤を同時に使用することを許容する。
【０２４０】
非経口投与経路は、非限定的に、中心静脈ラインへの直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、又は皮下注射を含む。非経口投与に適したＩＲＰ又はＩＲＣ製剤は、一般的に注射のためにＵＳＰ水又は水中に剤形され、そしてさらにｐＨ緩衝液、塩充填剤、保存剤、及び他の医薬として許容される賦形剤を含む。非経口注射用の免役調節ポリヌクレオチドは、注射液用の医薬として許容される滅菌等張溶液、例えば生理食塩水及びリン酸緩衝生理食塩水中に剤形されてもよい。
【０２４１】
胃腸管投与経路は、非限定的に、経口摂取及び直腸経路を含み、そして例えば、経口摂取用の医薬として許容される粉末、ピル、又は液体、及び直腸投与用の座剤の使用を含むことができる。
【０２４２】
鼻咽頭及び肺投与は、吸入により達成され、そして鼻腔内、経気管支、及び経肺胞経路などのデリバリー経路を含む。本発明は、乾燥粉末吸入デリバリーシステム用に、非限定的にエアロゾル並びに粉末形態を形成するための液体懸濁液を含む、吸入による投与に適したＩＲＰ又はＩＲＣの製剤を含む。ＩＲＰ又はＩＲＣ製剤の吸入による投与に適した装置は、非限定的に、アトマイザー、バポライザー、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入デリバリー装置を含む。
【０２４３】
当該技術分野に周知であるように、本明細書に記載される投与経路に使用される溶液又は懸濁液は、以下の成分：注射用の水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレン・グリコール、又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又は メチルパラベンなどの抗菌物質；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化物質；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、並びに塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張調節剤のうちのいずれか１以上を含むことができる。ｐＨは酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチック製の多用量バイアル中に封入されてもよい。
【０２４４】
当業者に周知であるように、注射用途に適した医薬組成物は、滅菌水溶液(水溶性の場合)又は分散液、及び滅菌注射水溶液又は分散液の即席調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ(商標)(BASF, Parsippany, NJ)又はリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)を含む。全ての場合、当該組成物は、滅菌性でなければならず、そして容易にシリンジに充填できる程度に流動性であるべきである。製造及び貯蔵条件下で安定であるべきであり、そして細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレン・グリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及びその適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜を使用することにより、分散の場合において必要とされる粒子サイズを維持することにより、そしてサーファクタントを用いることにより維持することができる。微生物活動の予防は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。等張剤、例えば、糖、ポリアルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいこともある。注射用組成物の長期間の吸収は、組成物内に吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０２４５】
当該技術分野において周知であるように、滅菌注射溶液は、上で記載された成分の１つ又は組合せた適切な溶媒中において必要とされる量の活性化合物を取り込み、必要に応じてろ過滅菌することにより製造することができる。一般的に、分散は、塩基性分散媒及び上で記載されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌注射溶液の製造のための滅菌粉末の場合、好ましい製法は、前もって滅菌ろ過された溶液から活性成分の粉末及び所望の追加成分をもたらす吸引乾燥及び凍結乾燥である。
【０２４６】
上記組成物及び投与方法は、非限定的に本発明のＩＲＰ及びＩＲＣの製剤を投与する方法を記載することを意味する。様々な組成物及び装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、そして本明細書において詳細に記載しない。
【０２４７】
免役刺激の抑制におけるＩＲＰ又はＩＲＣの活性の分析(定量的及び定性的の両方)は、本明細書に記載される任意の方法によるものであり、例えば非限定的に、Ｂ細胞などの特定の細胞集合の増殖の抑制又は低下を計測すること、樹状細胞(形質細胞様樹状細胞)及びＴ細胞などの特定の細胞集合の成熟の抑制を計測すること、並びに非限定的にＩＦＮ-α、ＴＮＦ-α、ＩＬ-６、及び／又はＩＬ-１２などのサイトカインの生成の抑制を計測することを含む。特定の細胞型の数を計測することは、例えば、蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)を用いて達成することができる。細胞の特定集合の成熟を計測することは、細胞成熟の特定のステージに特異的なマーカー、例えば、細胞表面マーカー、計測することにより達成することができる。細胞マーカーの発現は、例えば、ＲＮＡ発現を計測すること、又はＦＡＣＳ分析により特定のマーカーの細胞表面発現を計測することにより計測することができる。樹状細胞の成熟を計測することは、例えば、Hartmannら、(1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-9310に記載されるように実行することができる。サイトカイン濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡにより計測することができる。先天性免役応答を含む免役応答の抑制を評価するためのこれらの及び他のアッセイは当該技術分野に知られている。
【０２４８】
本発明のキット
本発明はキットを提供する。ある実施態様では、本発明のキットは、一般的に本明細書に記載される任意のＩＲＰ及び／又はＩＲＣを含む１以上の容器を含む。当該キットは、さらに、本明細書に記載される方法のいずれか(例えば、免役刺激核酸に応答する抑制、ＴＬＲ-７／８及び／又はＴＬＲ-９依存性応答の抑制、自己免疫疾患の１以上の症状の改善、慢性炎症性疾患の症状の改善、ウイルスに応答したサイトカイン産生の低下)についてＩＲＰ及び／又はＩＲＣを使用することに関する適切な使用説明のセット、一般的に書面の使用説明書を含む。
【０２４９】
当該キットは、任意の都合のよい適切なパッケージング中にパッケージされたＩＲＰ及び／又はＩＲＣを含んでもよい。例えば、ＩＲＰ又はＩＲＣが乾燥製剤である場合(例えば凍結乾燥又は乾燥粉末)、弾力性のある栓を通して液体を注入することにより容易に再懸濁されるように、弾力性のある栓を備えるバイアルが通常使用される。弾力性のない取り外し可能な蓋(例えば密封ガラス)又は弾力性のある栓を備えるアンプルは、ＩＲＰ又はＩＲＣの液体製剤に通常多く使用される。特定の装置、例えば吸入器、鼻腔内投与装置(例えばアトマイザー)、シリンジ又は輸液装置、例えばミニポンプなどと組み合わせて使用するためのパッケージが考慮される。
【０２５０】
ＩＲＰ及び／又はＩＲＣの使用に関する使用説明は、一般的に、意図された使用方法についての用量、投与スケジュール、及び投与経路についての情報を含む。ＩＲＰ又はＩＲＣの容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば多用量パッケージ)、又は単位用量未満であってもよい。本発明のキットにおいて与えられた使用説明は、典型的にラベル又はパッケージ内容物に記載された使用説明であるが(例えば、キット中に含まれた紙面)、機械により読み込み可能な使用説明(例えば磁気又は光学保存ディスク)も許容される。
【０２５１】
幾つかの実施態様では、本発明のキットは、投与用の複合体としてＩＲＰ及び／又はＩＲＣを生成させるための物質、例えば封入物質、マイクロキャリア複合体物質などを含む。一般的に、当該キットは、ＩＲＰ又はＩＲＣ及び複合体物質の分離された容器を含む。ＩＲＰ又はＩＲＣ及び複合体は、好ましくは提供されたＩＲＰ又はＩＲＣと複合体物質とを混合して、ＩＲＰ又はＩＲＣ-複合体の形成を許容する形態で供給される。当該形態は、ＩＲＰ又はＩＲＣ-複合体が非共有結合により結合される場合に好ましい。当該形態は、ＩＲＰ又はＩＲＣ複合体が異種二官能性架橋剤を介して架橋されるか；或いはＩＲＰ／ＩＲＣ又は複合体のいずれかが「活性化」形態で提供される場合に(例えば、ＩＲＰ／ＩＲＣと反応性の部分が利用できるように、異種二官能性架橋剤に結合される場合に)好ましい。
【０２５２】
以下の例は、非限定的に本発明を説明するために提供される。
【実施例】
【０２５３】
実施例１：ＩＲＳ含有ポリヌクレオチドによる細胞の先天性免役応答の調節
免役調節ポリヌクレオチド(ＩＲＰ)(つまり、少なくとも１のＩＲＳを含むポリヌクレオチド)又は対照サンプルを、ヒト及びマウス細胞において先天性免役応答の免役調節(ＩＲ)活性についてアッセイした。ＩＲ活性を、サイトカイン応答、細胞成熟、及び細胞増殖を含む先天性免役応答の幾つかの指標を測定することによりアッセイした。他に記載がない限り、試験されたポリヌクレオチドは、完全に改変されたホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドであった。
【０２５４】
免役刺激核酸(ＩＳＮＡ)を細胞培養に加えることにより、被験細胞において先天性免疫応答を刺激した。ＩＲＰ又は対照サンプルを次に細胞培養に加えた。細胞をインキュベーションした後に、培養培地中の特定のサイトカインのレベルについて、細胞成熟及び／又は細胞増殖の状態について細胞培地及び／又は細胞を試験した。
【０２５５】
マウス細胞アッセイについて、ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７Ｂｌ／６マウス脾臓の断片を、当該切断された断片を金属性の篩に押し通すことにより機械的に分散させた。分散した脾臓細胞を遠心によりペレット化し、次に新たな培地(１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０、及び５０ユニット／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、及び０.０５ｍＭβ-メルカプトエタノール)中に再懸濁した。幾つかのアッセイについて、Miltenyi Biotec(Auburn, CA, カタログ番号130-052-501)から販売されるＣＤ１１ｃ-被膜マイクロビーズを用いて、そして製品指針に従って脾臓細胞から精製されたマウスＣＤ１１ｃ＋細胞を当該アッセイに使用した。
【０２５６】
マウス脾臓細胞を９６ウェルプレートのウェルに分注した(７×１０7細胞／ｍｌ)。配列番号  (１０１８)又は配列番号  (Ｃ２７４)などのＩＳＮＡを細胞に０.７μＭの濃度で加え、そしてＩＲＰ試験サンプル又は対照サンプルを細胞に加えた。細胞をさらに４８時間インキュベーションした。各ウェルから培地を回収し、そしてＩＬ-６及びＩＬ-１２サイトカイン濃度について、免役アッセイＥＬＩＳＡを用いて試験した。ＥＬＩＳＡを実行するために、我々は、抗ＩＬ-６抗体(カタログ番号５５４４００及び５５４４０２、Pharmingen, SanDiego, CA)及び抗-ＩＬ-１２抗体(カタログ番号５５１２１９及び５５４４７６、Pharmingen, SanDiego)を使用し、そして製造者により推奨されるプロトコルを用いた。１.４μＭ、０.７μＭ、０.１４μＭ、及び０.０７μＭ、又は２：１、１：１、１：５、及び１：１０の比のＩＲＰ：ＩＳＮＡを含む様々な濃度で試験した。他の比を、実験デザインに依存して試験した。対照サンプルは、ＩＳＮＡのみ、ＩＲＰのみ、培地のみ、及びＩＳＮＡ又はＩＲＳのいずれも含まない対照オリゴヌクレオチド配列番号  (Ｃ５３２)を含んだ。
【０２５７】
ＩＲＰは、ＩＳＮＡ刺激マウス脾臓細胞及びＣＤ１１ｃ＋細胞からのＩＬ-６及びＩＬ-１２の分泌を阻害した。マウス細胞についてのかかるアッセイからえた結果の例を、図１Ａ〜１Ｂに示す。図１Ａは、ＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)単独で、様々な量の異なる二種のＩＲＰ(配列番号９２(５３０)及び配列番号１７(Ｃ８６９))と共にＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)で、並びに対照配列(配列番号７６(Ｃ５３２))で刺激された脾臓細胞の結果を示す。図１Ｂは、ＩＳＮＡ配列番号  ：５'-ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＡＣ ＧＴＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＧＡＴ-３'(Ｃ２７４)単独で、及び異なる２種のＩＲＰ(配列番号９２(５３０)及び配列番号１７(Ｃ８６９))と共にＩＳＮＡ配列番号：  (Ｃ２７４)で、並びに対照配列(配列番号７６(Ｃ５３２))で刺激されたＣＤ１１ｃ＋細胞の結果を示す。図１Ａ及び１Ｂで示唆されるように、ＩＲＰのいずれかの存在が、ＩＳＮＡに応答して細胞により産生されるＩＬ-６及びＩＬ-１２の量の低下をもたらす。ＩＲＰによるサイトカイン産生の阻害は、ＩＲＰの用量に応答した。
【０２５８】
ヒト細胞アッセイでは、ヘパリン化シリンジを用いて静脈穿刺により被験者から末梢血を回収した。血液をＦＩＣＯＬＬ(商標)(Amersham Pharmacia Biotech)クッション上に積層し、そして遠心した。ＦＩＣＯＬＬ(商標)界面に位置したＰＢＭＣを回収し、次に冷リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で２回洗浄した。細胞を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清及び５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３００μｇ／ｍｌのグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１×ＭＥＭ非必須アミノ酸(ＮＥＡＡ)を含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁し、そして２×１０6細胞／ｍｌで４８又は９６ウェルプレートにて培養した。
【０２５９】
Marshallら (2003) J. Leukoc Biol. 73:781 -92に記載される方法を用いて、ヒトＢ細胞及びヒトＰＤＣを単離した。ヒトＢ細胞を分散させ、インキュベーションし、そして各ウェルから培地を回収し、そしてMarshallら、(2003)に記載されるようにＥＬＩＳＡによりＩＬ-６サイトカイン濃度について試験した。ＩＲＰ(配列番号９２(５３０)及び配列番号１７(８６９))を、２.８μＭ、０.７μＭ、及び０.１７５μＭを含む様々な濃度で、又は４：１、１：１、及び１：４のＩＲＰ：ＩＳＮＡの比で試験した。対照サンプルは、ＩＳＮＡ(配列番号７５(１０１８))、ＩＲＰ(配列番号９２(５３０)及び配列番号１７(８６９))のみ、培地のみ、及びＩＳＮＡ又はＩＲＳのどちらも含まない対照オリゴヌクレオチド(配列番号７６(５３２))を含んだ。
【０２６０】
図２に示されるように、いずれかのＩＲＰが存在すると、ＩＳＮＡで刺激された精製ヒトＢ細胞により産生されるＩＬ-６の量の低下をもたらした。
【０２６１】
ＩＲＰのｉｎ ｖｉｖｏ活性をマウスで試験した。１群のマウス(１群あたり５匹)を各々２５μｇのＩＳＮＡ(配列番号７５(１０１８))単独で、又は７５μｇ、２５μｇ、又は８.５μｇの対照オリゴヌクレオチド若しくはＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)と組み合わせて皮下注射した。３：１、１：１、及び１：３のＩＲＰ：ＩＳＮＡ比を動物に共投与した。他の対照群に生理食塩水、対照オリゴヌクレオチド単独、又はＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)単独を注射した。核酸の注射後２時間で血清を回収し、そしてＩＬ-６、ＩＬ-１２、及びＴＮＦ-αの血清レベルを、以前にＩＬ-６及びＩＬ-１２について記載されたようにイムノアッセイを用いて、そしてマウス抗ＴＮＦ-α Quantikine(R&D System, Inc., Minneapolis, MN)を用いて測定した。これらのアッセイの結果を図３〜５に示した。ＩＳＮＡと共にＩＲＰを投与することは、ＩＳＮＡのみを受けた動物の血清中のサイトカイン量に比較して低減された血清中の各サイトカインの量をもたらした。
【０２６２】
図３に示されるように、試験された全ての比でＩＲＰとＩＳＡの投与は、ＩＳＮＡ単独の投与に比べてＩＬ-６の血清レベルを少なくとも約６分の１に低減した。図４により、ＩＲＰによるＩＬ-１２の阻害が用量依存的であり、試験されたＩＲＰ：ＩＳＮＡの全ての比がＩＳＮＡ単独の投与に比べてサイトカインの低下をもたらすということが示された。図５により、試験されたＩＲＰ：ＩＳＮＡの比の全てが、ＩＳＮＡ単独の投与に比較してＴＮＦ-αの低減をもたらすことが示された。
【０２６３】
ＩＲＰ及びＩＳＮＡが動物に異なる部位で投与された場合のＩＲＰのｉｎ ｖｉｖｏ活性を試験した。当該実験において、２５μｇのＩＳＮＡ(配列番号７５(1018))を単独で、又は２５μｇのＩＲＰ(配列番号１７(Ｃ８６９))と組み合わせて皮下注射したマウスの群(１群あたり５匹)において、サイトカイン応答を比較した。ＩＳＮＡが全ての動物において皮下注射された一方、ＩＲＰはＩＳＮＡと同じ側の脇腹に皮下(ＳＣ１)、ＩＳＮＡとは反対の脇腹に皮下(ＳＣ２)、腹腔内(ＩＰ)、静脈内(ＩＶ)、筋肉内(ＩＭ)、又は鼻腔内(ＩＮ)注射した。対照群に生理食塩水、ＩＲＰ(配列番号１７(Ｃ８６９))を単独で、又はＩＳＮＡ(配列番号７５(１０１８))と共に対照オリゴヌクレオチドを同じ脇腹に皮下注射した。
【０２６４】
核酸の注射の２時間後に血清を回収し、そしてＩＬ-６及びＩＬ-１２の血清中のレベルを測定した。図６に示されるように、試験された全ての部位(つまり、ＳＣ１、ＳＣ２、ＩＰ、ＩＶ、ＩＭ、及びＩＮ)でＩＲＰの投与は、ＩＳＮＡに応答して産生されたＩＬ-６の量の明らかな抑制をもたらした。図７に示されるように、試験された全ての部位でＩＲＰの投与は、ＩＳＮＡに応答した血清ＩＬ-１２の量の抑制をもたらした。
【０２６５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで行われたアッセイにより、ＩＲＰがＩＳＮＡの刺激活性を抑制するために、ＩＲＰ及びＩＳＮＡが同じ時間に同じ部位に共投与される必要がないということが示された。
【０２６６】
実施例２：ＩＲＰ活性及びＴＬＲ-依存性細胞応答
本明細書に記載されるように、ＩＲＰは、ＴＬＲ-９シグナル伝達に関連する活性又は応答を阻害する。ＩＲＰ活性並びにＴＬＲ-９及び他のＴＬＲに関連する活性又は応答をさらに調査するために、実験を行った。
【０２６７】
Ｉ型単純ヘルペス(ＨＳＶ-１)に感染させたマウス脾臓細胞及びヒトＰＢＭＣ及びＰＤＣは、ＩＦＮ-αを産生することにより応答し、そして当該応答はＴＬＲ-９シグナル伝達に依存する。インフルエンザウイルス(ＰＲ／８株)で感染したマウス脾臓細胞及びヒトＰＢＭＣ及びＰＤＣは、ＩＦＮ-αを産生することにより応答するが、当該応答はＴＬＲ-７／８シグナル伝達によって生じ、そしてＴＬＲ-９には依存しない。感染細胞により産生される先天性免役応答サイトカインについてのＩＲＰの効果が試験された。
【０２６８】
上で記載されたように製造したマウスＣＤ１１＋脾臓細胞に、様々な量のＨＳＶ-１を感染させた。免役アッセイ(ＰＢＬ Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)により計測されるＩＦＮ-αの量及び当該細胞により産生されるＩＬ-１２の量を計測し、そして感染について使用されたウイルス量と比較した。図８Ａ-８Ｂは、感染に用いられたＨＳＶ-１の量(感染多重度、ＭＯＩ)に応答したＩＦＮ-α及びＩＬ-１２の産生の例を記載する。１０ＭＯＩのＨＳＶ-１で感染された細胞は、明らかにＩＦＮ-α及びＩＬ-１２ｂの両方を産生した。
【０２６９】
次にマウスＣＤ１１＋脾臓細胞に、様々な量のＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)(７、３.５、又は１.７５μＭ)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下で１０ＭＯＩのＨＳＶ-１を感染させ、そして産生されたＩＦＮ-α及びＩＬ-１２の量を測定した。図９Ａ及び９Ｂに示されるように、配列番号Ｃ８６９は、試験された濃度の各々において脾臓細胞からのＩＦＮ-α及びＩＬ-１２の産生を明らかに阻害した。ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、図９Ｃに示されるようにＨＳＶ-１感染ヒトＰＤＣからのＩＦＮ-αの産生を阻害した。これらの結果は、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)がＴＬＲ-９依存性細胞応答を阻害することに合致する。
【０２７０】
ヒトＰＤＣに様々な量のインフルエンザウイルス(ＰＲ／８株)を感染させた。当該細胞により産生されるＩＦＮ-αの量が計測され、そして感染に使用されたウイルス量と比較された。図１０Ａは、感染に使用したインフルエンザウイルスの量(感染多重度、ＭＯＩ)に応答したＩＦＮ-αの産生の例を記載する。１０ＭＯＩのインフルエンザウイルス(ＰＲ／８株)で感染された細胞は、明らかに感染に応答してＩＦＮ-αを産生した。
【０２７１】
次に、ヒトＰＤＣに、様々な量の配列番号１７(Ｃ８６９)(７、３.５、又は１.７５μＭ)、又は対照オリゴヌクレオチドの存在下で１０ＭＯＩのインフルエンザウイルス(ＰＲ／８)株を感染させ、そして産生されたＩＦＮ-αの量を測定した。図１０Ｂに示されるように、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、用量依存性の様式で細胞からのＩＦＮ-αの産生を明らかに阻害した。これらの結果は、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)がＴＬＲ-７／８依存性の細胞応答を阻害することに一致した。
【０２７２】
配列番号２７(Ｃ６６１)が、ＨＳＶ-１及びインフルエンザウイルス(ＰＲ／８)で刺激された細胞を示差的に阻害することが発見された。ヒトＰＤＣに、配列番号１７(Ｃ８６９)、配列番号２７(Ｃ６６１)、又は対照オリゴヌクレオチドの存在下で３０ＭＯＩでＨＳＶ-１を感染させた。幾つかの実験では、ＨＳＶ-１の他の濃度を使用して同様の結果を得た。Duramadら、(2003) Blood 102:4487に記載されるようにＰＤＣを濃縮し、そして致死量のＵＶを照射したＨＳＶ-１とインキュベーションした。図１１Ａ-１１Ｂに示されるように、配列番号２７(Ｃ６６１）は、当該細胞からのＩＦＮ-αの産生に対し阻害効果を示さなかったが、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は完全にＩＦＮ-αの産生を阻害した。配列番号１７(Ｃ８６９)、配列番号２７(Ｃ６６１)、又は対照オリゴヌクレオチドの存在下で、インフルエンザウイルス(ＰＲ／８)を１０ＭＯＩでヒトＰＤＣに感染させた。図１１Ａ-１１Ｂに示されるように、当該細胞によるＩＦＮ-αの産生についての配列番号２７(Ｃ６６１)の阻害効果は、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)の効果に匹敵した。従って、異なるＩＲＰ種は、細胞に対して異なる阻害効果を有することがある。例えばＩＲＰ配列番号２７(Ｃ６６１)は、ＴＬＲ-７／８依存性細胞応答を阻害するが、ＴＬＲ-９細胞応答を阻害しない。
【０２７３】
マウス脾臓細胞は、ＴＬＲ-４刺激を介してＬＰＳに応答してＩＬ-６を産生する。ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)及び配列番号９２(５３０)及び対照オリゴヌクレオチドを、ＬＰＳ刺激脾臓細胞によるＩＬ-６産生に対するその効果について試験した。図１２Ａ-１２Ｂに記載されるように、いずれのＩＲＰもＬＰＳ刺激脾臓細胞からのＩＬ-６の産生を阻害しなかった。対照的に、４分の１以下の濃度のいずれかのＩＲＰは、ＩＳＮＡ刺激脾臓細胞からのＩＬ-６産生を阻害した。従って、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)又はＩＲＰ配列番号９２(５３０)のどちらも、ＴＬＲ-４依存性細胞応答を阻害しない。
【０２７４】
ＴＬＲ-７／８依存性応答についてのＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)の効果を、２個のＴＬＲアクチベーターを用いてさらに試験した。ロキソリビン(７-アリル-７,８-ジヒドロ-８-オキソ-グアノシン)は、抗腫瘍応答における合成アジュバントとして作用し、そして先天性免役システムの細胞をＴＬＲ-７依存性シグナル経路を介して選択的に活性化することが示される(Heilら、(2003) Eur. J. Immunol 33:2987-2997)。マウス脾臓細胞を、様々な濃度のＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でロキソリビン(１００μＭ)で刺激し、そして産生されるＩＬ-６及びＩＬ-１２の量を測定した。図１３Ａ-１３Ｄに示されるように、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、用量依存性の様式で細胞からのＩＬ-６のＴＬＲ-７誘導性の産生を阻害したが、細胞によるＩＬ-１２産生には影響しなかった。
【０２７５】
レシキモド(Ｒ-８４８)は、ＴＬＲ-７及びＴＬＲ-８シグナル伝達の刺激薬である。マウス脾臓細胞を、様々な濃度のＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でＲ-８４８(１μＭ)で刺激し、そして産生されたＩＬ-６及びＩＬ-１２の量を測定した。図１４Ａ-１４Ｄに示されるように、ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、用量依存性の様式で細胞からのＴＬＲ-７/８誘導性のＩＬ-６産生を阻害したが、当該細胞によるＩＬ-１２産生には影響しなかった。
【０２７６】
様々なＴＬＲ刺激の阻害について試験した場合、配列番号２７(Ｃ６６１)はＴＬＲ-７/８依存性の細胞応答を阻害するが、ＴＬＲ-４依存性又はＴＬＲ-９依存性の細胞応答を阻害しないことが発見された。図１５Ａ-１５Ｄに記載される様に、ＩＲＰ配列番号２７(Ｃ６６１)は、１００μＭのロキソリビンで刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６産生、及び１μＭのＲ８４８で刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６産生を阻害した。これにより、配列番号２７(Ｃ６６１)がＴＬＲ-７/８依存性細胞応答を阻害するのに有効であることが示された。しかしながら、図１５Ａ-１５Ｄはまた、配列番号２７(Ｃ６６１)は、ＩＳＮＡ刺激された脾臓細胞又はＬＰＳ刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６産生を阻害しないことも示す。こうして、配列番号２７(Ｃ６６１)は、ＴＬＲ-９又はＴＬＲ-４依存性の細胞応答を阻害するのに有効ではない。
【０２７７】
ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)は、ＩＳＮＡ刺激、ウイルス感染、及び化学刺激に応答したＴＬＲ７/８及びＴＬＲ-９依存性のサイトカイン応答の両方を阻害する。ＩＲＰ配列番号２７(Ｃ６６１)は、ウイルス感染、化学刺激、及びＩＳＮＡ刺激に応答したＴＬＲ７/８依存性のサイトカイン産生の両方を阻害するが、ＴＬＲ-９依存性サイトカイン産生を阻害しない。ＩＲＰ配列番号１７(Ｃ８６９)、ＩＲＰ配列番号９２(Ｃ５３０)、又はＩＲＰ配列番号２７(Ｃ６６１)のいずれも、ＴＬＲ-４依存性ＩＬ-６産生を阻害しない。
【０２７８】
実施例３：ＩＲＳ-含有ポリヌクレオチドのＴＬＲ依存性活性化
一連の実験において、マウス脾臓細胞は、様々なＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドと共に、Ｒ８４８(ＴＬＲ７/８シグナル伝達)又はＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(ＴＬＲ-９シグナル伝達)のいずれかで刺激した。表１は、２回の実験からの結果を含む。与えられた値は、Ｒ８４８単独でのＩＬ-６応答に比較した、ＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でのＩＬ-６応答の割合である。
【０２７９】
【表２】
2008514187.tif 000012
【０２８０】
表２はＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(ＴＬＲ-９シグナル伝達)で刺激された細胞からの結果を含む。与えられた値は、ＩＳＮＡ単独でのＩＬ-６又はＩＬ-１２応答に比較した、ＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でのＩＬ-６又はＩＬ−１２応答の割合である。
【０２８１】
【表３】
2008514187.tif 000013
【０２８２】
表３は、３個の実験からの結果を含む。与えられた数値は、Ｒ８４８単独(ＴＬＲ-７/８シグナル伝達)でのＩＬ-６応答に比較したＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でのＩＬ-６応答の割合である。
【０２８３】
【表４】
2008514187.tif 000014
【０２８４】
表４及び５は、ＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(ＴＬＲ-９シグナル伝達)刺激細胞からの結果を含む。与えられた数値は、ＩＳＮＡ単独でのＩＬ-６又はＩＬ-１２応答に比較した、ＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でのＩＬ-６(表４)又はＩＬ-１２(表５)の割合である。
【０２８５】
【表５】
2008514187.tif 000015
【０２８６】
【表６】
2008514187.tif 000016
【０２８７】
表６は、代表的なＩＲＳと、ＴＬＲシグナル伝達の阻害におけるその有効性を載せる。
【表７】
2008514187.tif 000017
【０２８８】
一連の用量応答実験において、マウス脾臓細胞を、様々なＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドと共にＲ８４８(ＴＬＲ-７／８シグナル伝達)又はＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(ＴＬＲ-９シグナル伝達)で刺激した。表７は、様々な割合のＩＲＰ：ＩＳＮＡで存在するＩＬ-６産生の結果を含む。与えられる数値は、ＩＳＮＡ単独でのＩＬ-６応答に比較した、ＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下におけるＩＬ-６の割合である。
【０２８９】
【表８】
2008514187.tif 000018
【０２９０】
表８は、様々な比率のＩＲＰ：ＩＳＮＡの存在下でのマウス脾臓細胞からのＩＬ-１２産生の結果を含む。与えられた数値は、ＩＳＮＡ単独でのＩＬ-１２に比較した、ＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でのＩＬ-１２の割合である。
【０２９１】
【表９】
2008514187.tif 000019
【０２９２】
表９は、Ｒ８４８(ＴＬＲ７／８シグナル伝達)の存在下での様々な濃度のＩＲＰの存在下でのマウス脾臓細胞からのＩＬ-６産生の結果を含む。与えられた数値は、Ｒ８４８単独でのＩＬ-６応答に比較したＩＲＰ又は対照オリゴヌクレオチドの存在下におけるＩＬ-６応答の割合である。
【０２９３】
【表１０】
2008514187.tif 000020
【０２９４】
表７〜９に示されるように、配列番号５２(Ｃ９５４)、配列番号５３(Ｃ９５６)、配列番号５４(Ｃ９５７)、及び配列番号５５〜６５(Ｃ９６２〜Ｃ９７２)は、ＴＬＲ-７／８及びＴＬＲ-９依存性細胞応答の両方を阻害するのに特に有効である。
【０２９５】
実施例４
マウス脾臓細胞を、ＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(０.７μＭ)又はＲ８４８(１μＭ)単独で、及びＩＲＰ配列番号１７(８６９)、ＩＲＰ配列番号２７(６６１)、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)の増加量と共に活性化した。図１６Ａ-１６Ｂに記載されるように、ＩＲＰ配列番号１７(８６９)及びＩＲＰ配列番号５２(９５４)は、ＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)に応答したＩＬ-６産生の強力な阻害剤であり、一方ＩＲＰ配列番号２７(６６１)及びＩＲＰ配列番号５２(９５４)は、Ｒ８４８の活性化の強力な阻害剤である。
【０２９６】
ある群のマウスに２.５μｇのＲ８４８を単独で、又は４５０〜５００μｇ又は１００〜１５０μｇの対照オリゴヌクレオチド又はＩＲＰ配列番号５２(９５４)と組み合わせて皮下注射した。Ｒ８４８の注射の１時間後に血清を回収し、血清中のＩＬ-１２及びＴＮＦ-αのレベルを上で記載した免役アッセイを使用して測定した。これらのアッセイの結果を、図１７Ａ〜１７Ｂに示した。Ｒ８４８と共にＩＲＰを投与することは、Ｒ８４８のみを受けた動物の血清中のサイトカイン量に対して、血清中の各サイトカイン量の低下をもたらした。
【０２９７】
６〜１２週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに２０ｍｇのＤ-ガラクトサミンを溶解させた生理食塩水を腹腔内注射し、そして５０μｇのＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)を単独で、或いは２００μｇ、１００μｇ、又は５０μｇのＩＲＰ配列番号５２(９５４)若しくはＩＲＰ配列番号１７(８６９)又は対照オリゴヌクレオチドＯＤＮと組み合わせて皮下注射した。次に７日間にわたりマウスの生存率について評価した。通常のマウスでは、５０μｇのＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)は死を誘導しなかったが、マウスにＤ-ガラクトサミンを前処理した場合、炎症に極めて感受性になりそしてすぐに死亡した。図１８に示されるように、不活性対照ＯＤＮが死を防がない一方、ＩＲＳは用量依存性の様式で死を防ぐことができる。最も高い用量では(２００μｇのＩＲＳ)、１００％のマウスが保護され、１００μｇのＩＲＳでは約９０％、そして１：１の比で６０％超が保護された。こうして、これらのデーターにより、ＩＲＳの強力なｉｎ ｖｉｖｏ活性が裏づけされる。
【０２９８】
マウス脾臓細胞を、ＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)(図１９Ａ)又はＲ８４８(図１９Ｂ)単独で活性化し、そして配列番号５２(９５４)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０１９)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２０)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２１)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２２)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２３)、及びＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２４)からなる分解産物と共に活性化した。
【０２９９】
ＤＶ０配列は、「ＩＲＳ９５４Ｎマイナス配列」(Ｎ＝１〜６のヌクレオチドが３'末端から取り除かれたＩＲＳ９５４)：
配列番号  ＤＶ０１９：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧ
配列番号  ＤＶ０２０：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴ
配列番号  ＤＶ０２１：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴ
配列番号  ＤＶ０２２：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧ
配列番号  ＤＶ０２３：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧ
配列番号  ＤＶ０２４：５'-ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧ
である。
【０３００】
図１９Ａ及び図１９Ｂに記載されるように、細胞をＩＲＰ配列番号５２(９５４)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０１９)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２０)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２１)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２２)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２３)の存在下で培養した場合にＩＬ−６産生が低下し、配列番号  (ＤＶ０２４)では阻害がなかった。このことにより、ＩＲＰ配列番号５３(９５４)の活性が３'末端配列を切断した後においても保持されるということが示唆された。
【０３０１】
(ＮＺＢ×ＮＺＷ)Ｆ1マウスを治療をしないままにするか、又は週二回、１５μｇ又は４５μｇのＩＲＰ配列番号５２(９５４)を用いて治療した。疾患の第一徴候がマウスに現れた場合に４〜５月齢で治療を開始した。図２０に記載される様に、治療を施さない場合に血清中の抗-ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルが時間とともに増加した。ＩＲＰ配列番号５２(９５４)を注射されたマウスは、自己抗体のレベルを低減した。当該自己抗体は、狼瘡になりやすいマウスの疾患の進行に影響する能力を示す。
【０３０２】
８〜９月齢でありそして既に疾患状態の(ＮＺＢ×ＮＺＷ)Ｆ1マウスに１００μｇのＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照オリゴヌクレオチドを週３回注射した。図２１に記載されるように、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)での治療は、対照オリゴヌクレオチドでの治療に比べて、マウスの死亡率を低減した。
【０３０３】
精製したヒトＢ細胞を、ＩＳＮＡ配列番号(１０１８)又はＲ８４８単独で、そしてＩＲＰ配列番号１７(８６９)、ＩＲＰ配列番号２７(６６１)、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に活性化した。図２４に示されるように、これらのオリゴヌクレオチドの阻害活性のパターンは、マウス及びヒトにおいて似ている。特にＩＲＰ配列番号５２(９５４)は、両方の刺激で刺激されたヒトＢ細胞からのＩＬ-６産生を阻害した。
【０３０４】
ヒトＰＤＣをＵＶ不活性化ＨＳＶ-１ウイルス(ＭＯＩ：５)単独で、そしてＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照ヌクレオチドと共に感染させた。図２３は、ウイルス単独に応答したＩＦＮ-αの産生に関してＩＲＰ配列番号５２の強い阻害効果の例を示す。
【０３０５】
ヒトＰＤＣを熱不活性化インフルエンザウイルス単独で(ＭＯＩ：２)、そしてＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に感染させた。図２４は、ウイルス単独に応答したＩＦＮ-αの産生について、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)の強力な阻害効果の例を示す。
【０３０６】
ヒトＰＤＣを、ＵＶ不活性化(６０ｍＪ)Ｕ９３７細胞の存在下で、抗-ｄｓＤＮＡ陽性ＳＬＥ患者から取得された１０％血清のみの存在下で、及びＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと組み合わせて培養した。図２５に記載されるように、抗-ｄｓＤＮＡを含む血清はＰＤＣを活性化することができ、そしてＩＦＮ-αを誘導することができる。培地に加えられた場合、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)は、ＩＦＮ-α応答を阻害することができる一方、対照オリゴヌクレオチドは影響を与えることはなかった。これにより、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)が、ＳＬＥ患者から得たサンプルを使用する当該ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＰＤＣ活性化を有意に阻害することができることが示される。
【０３０７】
ヒトＰＤＣを、ＵＶ不活性化(６０ｍＪ)Ｕ９３７細胞の存在下で、抗-ＲＮＰ陽性ＳＬＥ患者から精製されたＩｇＧ(０.５ｍｇ／ｍｌ)のみの存在下で、及びＩＲＰ配列番号５２(９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと組み合わせて培養した。ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰカラム(GE Healthcare, Waukesha, WI)を用いて患者の血清からＩｇＧを精製した。精製した時点でＩｇＧを脱塩し、そして定量した。図２６に記載されるように、抗-ＲＮＰ-特異的ＩｇＧはＰＤＣを活性化することができ、そしてＩＦＮ-αを誘導することができる。培地に加えられた場合、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)は、ＩＦＮ-α応答を阻害することができる一方、対照オリゴヌクレオチドは影響を与えることがなかった。これにより、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)が、ＳＬＥ患者から得たサンプルを使用する当該ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＰＤＣ活性化を有意に阻害することができることが示される。
【０３０８】
マウス脾臓細胞をＩＳＮＡ配列番号７５(１０１８)又はＲ８４８のみで、及びＩＲＰ配列番号１７(８６９)、ＩＲＰ配列番号７７(６６１)、ＩＲＰ配列番号５２(９５４)、ＩＲＰ配列番号  (９８３)、ＩＲＰ配列番号  (９８４)、ＩＲＰ配列番号  (９８５)、ＩＲＰ配列番号  (９８６)、ＩＲＰ配列番号  (９８７)、ＩＲＰ配列番号  (９８８)、ＩＲＰ配列番号  (９８９)、ＩＲＰ配列番号  (９９０)、ＩＲＰ配列番号  (９９１)、又は対照オリゴヌクレオチドと共に活性化した。図２７及び図２８に記載される様に、非ヌクレオチド群を加えることは、活性の完全な消失をもたらすことはなかったが、応答レベルを調節することができた。
【０３０９】
前述された発明は、明確にしそして理解することを目的として、説明及び例示の方法によりある程度詳細に記載されたが、ある変化及び改変が行われうるということが当業者に明らかであろう。その結果、記載及び実施例は、本発明の範囲を制限する物として解釈すべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０３１０】
【図１】図１Ａ-１Ｂは、ＩＲＰが免疫刺激核酸(ＩＳＮＡ)により刺激された細胞からのＩＬ-６及びＩＬ-１２の産生を阻害することを示すグラフである。図１Ａは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (５３０)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)、又は対照配列番号  (Ｃ５３２)と共に刺激されたマウス脾臓の結果を示す。図１Ｂは、ＩＳＮＡ配列番号  (Ｃ２７４)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (５３０)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)、又は対照配列番号  (Ｃ５３２)と共に刺激されたマウスＣＤ１１ｃ＋細胞の結果を示す。
【図２】図２は、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (５３０)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)、又は対照オリゴヌクレオチド配列番号  (Ｃ５３２)と共に刺激されたヒトＢ細胞からのＩＬ-６産生を示すグラフである。
【図３】図３は、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドと共に、そしてＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)単独で注射されたマウスから得た血清中のＩＬ-６レベルを示すグラフである。共投与されるＩＲＰ：ＩＳＮＡの比、又はＩＲＰ：対照オリゴヌクレオチドの比は、３：１〜１：３で変化する。
【図４】図４は、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドと共に、そしてＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)単独で注射されたマウスから得た血清中のＩＬ-１２レベルを示すグラフである。共投与されるＩＲＰ：ＩＳＮＡの比、又はＩＲＰ：対照オリゴヌクレオチドの比は、３：１〜１：３で変化する。
【図５】図５は、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドと共に、そしてＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)単独で注射されたマウスから得た血清中のＴＮＦ-αレベルを示すグラフである。共投与されるＩＲＰ：ＩＳＮＡの比、又はＩＲＰ：対照オリゴヌクレオチドの比は、３：１〜１：３で変化する。
【図６】図６は、一の部位において皮下にＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)を注射され、そして同じ部位又は異なる部位で投与される対照オリゴヌクレオチド又はＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)を注射されたマウスから得た血清中のＩＬ-６レベルを示すグラフである。
【図７】図７は、一の部位において皮下にＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)を注射され、そして同じ部位又は異なる部位で投与される対照オリゴヌクレオチド又はＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)を注射されたマウスから得た血清中のＩＬ-１２レベルを示すグラフである。
【図８】図８Ａ-８Ｂは、様々な量のＨＳＶ-１感染に応答してマウスＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞によるＩＦＮ-α(図８Ａ)及びＩＬ-１２(図８Ｂ)の産生を示すグラフを示す。
【図９Ａ】図９Ａ-９Ｃは、ＩＲＰがＨＳＶ-１刺激細胞からのサイトカイン産生を阻害することを示すグラフを図示する。図９Ａは、様々な濃度のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でＨＳＶ-１に応答したマウスＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞によるＩＦＮ-αの産生を図示する。
【図９Ｂ−Ｃ】図９Ａ-９Ｃは、ＩＲＰがＨＳＶ-１刺激細胞からのサイトカイン産生を阻害することを示すグラフを図示する。図９Ｂは、様々な濃度のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でＨＳＶ-１に応答したマウスＣＤ１１ｃ＋脾臓細胞によるＩＬ-１２の産生を図示する。図９Ｃは、様々な濃度のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でＨＳＶ-１に応答したヒトＰＤＣによるＩＦＮ-αの産生を図示する。
【図１０】図１０Ａ-１０Ｂは、ＩＲＰがインフルエンザウイルス(ＰＲ／８)刺激細胞からのサイトカインの産生を阻害することを示すグラフを図示する。図１０Ａは、様々な量のインフルエンザウイルスに応答したヒトＰＤＣによるＩＦＮ-α産生を図示する。図１０Ｂは、様々な濃度のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)又は対照オリゴヌクレオチドの存在下でインフルエンザウイルスに応答したヒトＰＤＣによるＩＦＮ-α産生を示す。
【図１１】図１１Ａ-１１Ｂは、ＩＲＰがウイルス刺激ヒトＰＤＣ細胞からのＩＦＮ-αの産生を阻害することを示すグラフを図示する。ウイルス単独、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ６６１)、又は対照オリゴヌクレオチドの存在下で、ＨＳＶ-１(図１１Ａ、左のグラフ)及びインフルエンザウイルス(図１１Ｂ、右のグラフ)に応答した細胞によるＩＦＮ-α産生を示す。
【図１２】図１２Ａ-１２Ｂは、ＩＳＮＡ(図１２Ａ)又はＬＰＳ、ＴＬＲ４刺激物(図１２Ｂ)のいずれかで刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６産生についてのＩＲＰの効果を示すグラフを図示する。刺激された細胞をＩＳＮＡ又はＬＰＳ単独で、及びＩＲＰ配列番号  (５３０)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)、又は対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした。
【図１３】図１３Ａ-１３Ｄは、ＴＬＲ７刺激物であるロキソリビンで刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６(図１３Ａ-１３Ｂ)及びＩＬ-１２(図１３Ｃ-１３Ｄ)産生についてのＩＲＰの効果を示すグラフを図示する。刺激された細胞を、ロキソリビン単独で及び様々な量のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)(図１３Ａ-１３Ｃ)又は対照オリゴヌクレオチド(図１３Ｂ-１３Ｄ)と共にインキュベーションした。
【図１４】図１４Ａ-１４Ｄは、ＴＬＲ７／８刺激物であるレシキモド(Ｒ８４８)で刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６(図１４Ａ-１４Ｂ)及びＩＬ-１２(図１４Ｃ-１４Ｄ)産生についてのＩＲＰの効果を示すグラフを図示する。刺激された細胞を、Ｒ８４８単独で、及び様々な濃度のＩＲＰ配列番号  (Ｃ８６９)(図１４Ａ-１４Ｃ)又は対照オリゴヌクレオチド(図１４Ｂ-１４Ｄ)と共にインキュベーションした。
【図１５】図１５Ａ-１５Ｄは、ＴＬＲ刺激物であるＩＳＮＡ(配列番号  (１０１８))(図１５Ａ)、ＬＰＳ(図１５Ｂ)、ロキソリビン(図１５Ｃ)、及びＲ８４８(図１５Ｄ)で刺激された脾臓細胞からのＩＬ-６産生についてのＩＲＰの効果を示すグラフを図示する。刺激された細胞を、指示したＴＬＲ刺激物単独で、そしてＩＲＰ配列番号(Ｃ８６９)、ＩＲＰ配列番号  (Ｃ６６１)、又は対照オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションした。
【図１６】図１６Ａ-１６Ｂは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)刺激された細胞又はＲ８４８刺激された細胞からのＩＬ-６産生をＩＲＰが阻害することを示す。図１６Ａは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (８６９)、ＩＲＰ配列番号  (６６１)、又はＩＲＰ配列番号  (９５４)と共に刺激されたマウス脾臓細胞の結果を示す。図１６Ｂは、Ｒ８４８単独で、及びＩＲＰ配列番号  (８６９)、ＩＲＰ配列番号  (６６１)、又はＩＲＰ配列番号  (９５４)と共に刺激されたマウス脾臓細胞の結果を示す。
【図１７】図１７Ａ-１７Ｂは、Ｒ８４８単独で、そしてＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に注射された１時間後にマウスから得た血清中のＩＬ-１２(図１７Ａ)及びＴＮＦ-α(図１７Ｂ)を示すグラフである。
【図１８】図１８は、Ｄ-ガラクトサミン及びＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)、ＩＲＰ配列番号  (８６９)、又は対照オリゴヌクレオチドと共に処理された後の生存しているマウスの割合を示すグラフである。
【図１９】図１９Ａ-１９Ｂは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)刺激細胞又はＲ８４８刺激細胞からのＩＬ-６産生をＩＲＰが阻害することを示すグラフを図示する。図１９Ａは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０１９：Ｎ-１)、ＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２０：Ｎ-２)、ＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２１：Ｎ-３)、ＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２２：Ｎ-４)、ＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２３：Ｎ-５)、又はＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２４：Ｎ-６)と共に刺激されたマウス脾臓細胞の結果を図示する。図１９Ｂは、Ｒ８４８単独で、及びＩＲＰ配列番号(９５４)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０１９)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２０)、ＩＲＰ配列番号：(ＤＶ０２１)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２２)、ＩＲＰ配列番号  (ＤＶ０２３)、又はＩＲＰ配列番号(ＤＶ０２４)と共に刺激されたマウス脾臓細胞の結果を図示する。
【図２０】図２０は、治療無し又は１５μｇ又は４５μｇのＩＲＰ配列番号  (９５４)を週二回注射した後における(ＮＺＢ×ＮＺＷ)Ｆ1マウスの血清中の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体のレベルを示すグラフである。
【図２１】図２１は、１００μｇのＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドを８〜９月齢で週３回注射された後の生存している(ＮＺＢ×ＮＺＷ)Ｆ1マウスの割合を示すグラフである。
【図２２】図２２Ａ-２２Ｂは、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)(図２２Ａ)又はＲ８４８(図２２Ｂ)単独で、及びＩＲＰ配列番号(８６９)、ＩＲＰ配列番号  (６６１)、ＩＲＰ配列番号  (９５４)、又は対照オリゴヌクレオチドで刺激されたヒトＢ細胞からのＩＬ-６産生を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ＵＶ不活性化ＨＳＶ-１ウイルス単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたヒトＰＤＣ細胞からのＩＦＮ-αの産生を示すグラフである。
【図２４】図２４は、熱不活性化インフルエンザウイルス単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたヒトＰＤＣ細胞からのＩＦＮ-αの産生を示すグラフである。
【図２５】図２５は、抗ｄｓＤＮＡ免疫複合体を含む血清単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたヒトＰＤＣ細胞からのＩＦＮ-αの産生を示すグラフである。
【図２６】図２６は、抗ＲＮＰ免疫複合体単独で、及びＩＲＰ配列番号  (９５４)又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたヒトＰＤＣ細胞からのＩＦＮ-αの産生を示すグラフである。
【図２７】図２７は、ＩＳＮＡ配列番号  (１０１８)単独で、及びＩＲＰ配列番号  (８６９)、ＩＲＰ配列番号  (６６１)、ＩＲＰ配列番号  (９５４)、ＩＲＰ配列番号  (９８３)、ＩＲＰ配列番号  (９８４)、ＩＲＰ配列番号  (９８５)、ＩＲＰ配列番号  (９８６)、ＩＲＰ配列番号  (９８７)、ＩＲＰ配列番号  (９８８)、ＩＲＰ配列番号  (９８９)、ＩＲＰ配列番号  (９９０)、ＩＲＰ配列番号  (９９１)又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたマウス脾臓細胞からのＩＬ-６産生を示すグラフである。
【図２８】図２８は、Ｒ８４８単独で、及びＩＲＰ配列番号(８６９)、ＩＲＰ配列番号  (６６１)、ＩＲＰ配列番号  (９５４)、ＩＲＰ配列番号  (９８３).ＩＲＰ配列番号  (９８４)、ＩＲＰ配列番号  (９８５)、ＩＲＰ配列番号  (９８６)、ＩＲＰ配列番号  (９８７)、ＩＲＰ配列番号  (９８８)、ＩＲＰ配列番号  (９８９)、ＩＲＰ配列番号  (９９０)、ＩＲＰ配列番号  (９９１)、又は対照オリゴヌクレオチドと共に刺激されたマウス脾臓細胞からのＩＬ-６産生を示すグラフである。
【図１】
2008514187.tif 000021
【図２】
2008514187.tif 000022
【図３】
2008514187.tif 000023
【図４】
2008514187.tif 000024
【図５】
2008514187.tif 000025
【図６】
2008514187.tif 000026
【図７】
2008514187.tif 000027
【図８Ａ】
2008514187.tif 000028
【図８Ｂ】
2008514187.tif 000029
【図９Ａ】
2008514187.tif 000030
【図９Ｂ−Ｃ】
2008514187.tif 000031
【図１０】
2008514187.tif 000032
【図１１】
2008514187.tif 000033
【図１２】
2008514187.tif 000034
【図１３】
2008514187.tif 000035
【図１４】
2008514187.tif 000036
【図１５】
2008514187.tif 000037
【図１６】
2008514187.tif 000038
【図１７】
2008514187.tif 000039
【図１８】
2008514187.tif 000040
【図１９】
2008514187.tif 000041
【図２０】
2008514187.tif 000042
【図２１】
2008514187.tif 000043
【図２２】
2008514187.tif 000044
【図２３】
2008514187.tif 000045
【図２４】
2008514187.tif 000046
【図２５】
2008514187.tif 000047
【図２６】
2008514187.tif 000048
【図２７】
2008514187.tif 000049
【図２８】
2008514187.tif 000050
【国際調査報告】
2008514187.tif 000051
2008514187.tif 000052
2008514187.tif 000053
2008514187.tif 000054
2008514187.tif 000055
2008514187.tif 000056
2008514187.tif 000057