(57)【要約】【課題】エリンギ、五加皮及び三七根の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分として含む歯周疾患予防及び治療用組成物の提供。【解決手段】本発明は、エリンギ、五加皮及び三七根の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分として含む歯周疾患予防及び治療用組成物に関するもので、より詳細には、造骨細胞でＯＰＧの発現を促進させて破骨細胞の生成及び活性を減少させて、破骨細胞の増殖を抑制して歯槽骨の破壊を抑制して、歯周靭帯細胞及び歯肉繊維芽細胞の増殖を維持する混合生薬材抽出物及びそれを有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用組成物に関するものである。【選択図】図１
2008530203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリンギ、五加皮及び三七根を含む混合生薬材抽出物。
【請求項２】
前記抽出物が、エリンギ２５〜４５重量部、五加皮１〜２０重量部及び三七根３５〜６５重量部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項３】
前記抽出物が、エリンギ３５〜４５重量部、五加皮５〜１５重量部及び三七根４５〜５５重量部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項４】
前記抽出物が、エリンギ４０重量部、五加皮１０重量部及び三七根５０重量部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用組成物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、造骨細胞のオステオプロテゲリンの発現促進剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、破骨細胞の生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）及び三七根（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｒａｄｉｘ）の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
歯周組織は、歯槽骨、歯肉（歯茎）及び歯周靭帯から成り立っている。歯茎は、私たちが口内に見られる歯牙支持組織の一部分で、ここから疾患（歯肉炎）が始まり、疾患がひどくなって支持組織に段々と深く広がっていくと、歯牙根面と歯牙を取り囲んでいる骨組織に結合している歯周靭帯が破壊されて、歯牙を包んでいる歯槽骨も破壊されて歯周病が発生するようになる。
【０００３】
歯肉炎及び歯周病を含む歯周疾患は、細菌によって惹起される歯牙支持組織の炎症状態であり、出血、歯周嚢の形成及び歯槽骨の破壊などによって歯牙の喪失をもたらす疾患である。このような歯周疾患は細菌の集落形成、細菌の歯周組織浸透及び歯周組織破壊の過程で進行される。具体的に、口腔の不潔な衛生状態によって、口腔細菌が歯面細菌膜を形成すると炎症がおきて、時々歯茎から出血して口臭がするようになる。このような状態がさらに進行すると、歯牙と歯茎間の隙間がさらに深くなって歯周嚢が生じ、そこに歯周疾患を起こす細菌が繁殖して歯周炎が発生する。歯周炎が進行すると、歯磨きのような弱い刺激によっても歯茎から出血したり、腫れたり、次第に急性炎症に変化して痛症を誘発する。このような炎症は、膠原質、カルシウム及びリンの沈着物（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）で、堅い骨を作る造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）が骨を作る機能を低下させて、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）が骨を破壊または吸収（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）する作用が高くなって、歯槽骨がますます低くなって破壊され、結局、歯牙を喪失するようになる。ここで、破骨細胞は、骨髄内の単核球／大食細胞系統の細胞から由来し、この単核前駆細胞は、血液内に循環して骨内膜層で前駆細胞が増殖して、多核細胞を形成するために融合することが知られていて、破骨細胞には、特徴的に酒石酸塩（ｔａｒｔｒａｔｅ）に対して抵抗性を示す酸性フォスファターゼ（ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）であるＴＲＡＰ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を有し、これは他の骨組織細胞と区別することができる破骨細胞の細胞化学的標識酵素として使用されることが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
歯周疾患の原因には色々あるが、局所的要因としては、歯苔が歯周嚢内に蓄積すると、周辺に存在する嫌気性グラム陰性細菌の棲息地になり、歯周嚢の深部に増殖するようになる。ここで、増殖した嫌気性グラム陰性細菌の毒素及び産物のすべてが直接組織を破壊したり免疫系を刺激したりして、刺激された免疫系から様々な作用が起きて歯周組織破壊とともに炎症を誘発するようになる。これに対する防御機序として、多形核白血球の機能と免疫反応が、全身的な要因として作用するようになる。
【０００５】
すなわち、嫌気性グラム陰性細菌の代謝の結果、歯周組織に有毒な硫化水素、アンモニア及び有毒なアミンのような細胞の毒素が分泌されると同時に、細胞壁構成成分である脂質多糖質（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のような内毒素によって直接組織を破壊したり、生体免疫系を刺激して刺激された体液性及び細胞性免疫系の様々な作用によって、細胞外部に分泌された活性酸素、プロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ）、ロイコトリエン（Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｓ）、ヒスタミン（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｃｋｉｎｓ）のような様々な種類のサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などによって歯茎炎症を誘発させる。また、細菌及び白血球から分泌されたコラゲナーゼのような酵素によって、歯周組織の基質であるコラーゲンが分解されて、歯茎退縮が起き、放置すると歯周疾患に進行するのである。
【０００６】
したがって、根源的な因子である嫌気性グラム陰性細菌に対する抗菌作用及び整菌作用とそれら細菌の毒性産物を除去する方法、または消失した歯周組織を原状回復させることが歯周疾患の予防及び治療に重要なカギになることが知られている。
【０００７】
歯周疾患の治療は、患者の口腔衛生改善の確立、非外科的なあるいは外科的なスケーリング、ルートプレーニング、歯肉掻爬術と新付着を応用した歯周組織の再生術等が用いられてきた。しかし、このような外科的な治療方法は、治療のために歯科に行かなければならない煩わしさのために効果的な治療が難しく、また病気の予防よりは病気がある程度進行した場合に行なう治療に限られていて、治療をしない場合は慢性疾患に進行する場合が大部分である。付加的な治療として全身的な抗生剤の服用と局所徐放型製剤が使用されてきたが、不必要な部位にも薬物が非常に多く伝達されて、それによる副作用と、最近、使用されている抗生剤に対する耐性を示す歯周疾患菌を分離した例が報告されている等、深刻な問題点を有している。
【０００８】
このような外科的治療の限界性と抗生剤使用の問題点を補って、歯周疾患予防及び治療効果を得るためには、破壊及び消失した歯周組織を原状回復させる活性を有する製剤の出現が求められている。
【０００９】
メルチャー（Ｍｅｌｃｈｅｒ）によると、歯周組織の再生に関与する細胞の由来によって、再生の結果に差があると言う。骨に由来した細胞が再生に関与すれば、骨癒着が起きて、結締組織に由来した細胞（歯肉繊維芽細胞など）が関与する場合、歯根の吸収が惹起され、上皮組織に由来した細胞が関与すれば、長い付着上皮ができるようになって、理想的な歯周組織の再生が起きなくなるが、歯周靭帯細胞に由来した細胞が再生に関与する場合、一番理想的な歯周組織の再生が誘導されると報告された。
【００１０】
本発明者等は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−６）を分泌するようにする、ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されるにつれて、造骨細胞表面にオステオプロテゲリンリガンド（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄ）が発現されて、破骨細胞生成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）を促進して骨破壊に決定的な役割をするという事実に基づいて、歯周疾患の治療のためには、サイトカインの遊離を抑制して炎症を抑制して歯槽骨の破壊を防ぎ、また、造骨細胞の増殖及び分化を促進し、破骨細胞の形成及び活性を減少させて歯槽骨を保護して、歯肉繊維芽細胞及び歯周靭帯細胞の増殖には大きい影響を与えない薬剤の開発が必要であると判断した（非特許文献２）。
【００１１】
このような意見を総合してみると、歯周靭帯細胞の成長を促進させながら、歯肉繊維芽細胞の成長は正常値を維持させられることが、歯周組織の再生に一番理想的な助けになり得る。また、二つの条件を全て満足することができないなら、次の選択としては、二つの細胞の増殖、特に歯肉繊維芽細胞の増殖による軟組織代替治癒を防止しながら、二つの細胞の増殖に大きく影響を与えないことが一番理想的である。
【００１２】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、生薬抽出物の中でサイトカインの遊離を抑制して、造骨細胞の増殖及び分化を促進して、破骨細胞の形成及び活性を減少させて、歯槽骨の破壊を防ぐことができる、エリンギ、五加皮及び三七根の混合生薬抽出物が、前記の作用によって歯周疾患の炎症を抑制して、歯肉繊維芽細胞及び歯周靭帯細胞の増殖には大きな影響を与えないで正常数値を維持することができるなど、効果的であることを確認して、本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｍｉｎｋｉｎ，Ｃ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．，１９８２年，第３４巻，２８５−２９０頁
【非特許文献２】Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９９年，第４０２巻，３０４−３０９頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、エリンギ、五加皮及び三七根の混合生薬材抽出物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）及び三七根（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｒａｄｉｘ）を含む、混合生薬材抽出物を提供する。
【００１６】
エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）は、ヒラタケ科ヒラタケ属に属する死物寄生菌で亜熱帯地方の大草原で発生して、ヨーロッパでは草原のきのこ（Ｂｏｌｅｔｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｅｐｐｅｓ）またはキングオイスターマッシュルーム（Ｋｉｎｇ  ｏｙｓｔｅｒ  ｍｕｓｈｒｏｏｍ）と呼ばれている。東医宝鑑によると、エリンギは無毒で、甘みがあって香りが濃く、胃と腸の機能を助け、気運の循環を促進し、手足が痺れて力がなかったり腰や膝の冷症があったりする場合に、良い薬剤として使用されている。その成分は、まだ完全には明かされていない状態であるが、アルカリ性食品で、コレステロール数値を下げて、抗癌作用をするという報告もある。タンパク質とビタミンが豊富で、扁桃腺、乳腺炎、脱下症及び各種成人病に薬効があることが知られている。特に、アルカリ性食品として日本では抗癌効果が大きい自然健康食品として、広く脚光を浴びている。
【００１７】
五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）は、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）に属する潅木植物で、北半球の極東アジアにのみ分布し、韓国南部では絶滅危機にある野生保護植物である。五加皮の種類には、刺五加皮、一般五加皮および香五加皮があって、漢方では毒性も副作用もない上薬に分類され、根と皮を薬剤に使用する。葉には、チイサノサイド（Ｃｈｉｉｓａｎｏｓｉｄｅ）が含まれていて、薬理的機能を有し、根には五加皮配糖体だけではなく、シリンギン（Ｓｙｒｉｎｇｉｎ）、クマリン配糖体などが含まれている。五加皮には、五加皮配糖体であるアカントサイド（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｄｅ）Ｂ、Ｄと免疫性を高める水溶性多糖体とがある。五加皮は、味は辛くて苦く、暖かい性質を持っていて、肝経、神経に作用して風湿を無くし、益気昇精を助けると知られている。また、五労（五臓が虚弱で生ずる虚労病）と七傷（男性が虚弱のために生じる七種の症状）を補い、足が不自由な場合に使用され、これを長く服用すると、身体の気を高め、胃を保護し、精力を増強し、精神をすっきりさせ、意志力を高めて身を軽くし、老化を防止して、体内の汚れた血を清くきれいにしてくれると知られている、腰や脊椎の痛症、男性陰萎症、嚢湿および女性の陰痒症などの様々な症状を治療すると知られている。
【００１８】
三七根（Ｐａｎａｘ  ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ（Ｂｕｒｋ．）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ；Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｒａｄｉｘ）は、ウコギ科の多年生草本で、高麗人蔘より小さくて側小葉が７枚で、根は小さな糸太鼓（ｔｈｒｅａｄ  ｄｒａｍ）模様の形態をしている。主に中国南部の雲南、四川などで栽培されている。前記植物は、三つの葉柄に７枚の葉が付いているので三七、その模様が朝鮮人蔘と似ているので三七人蔘と呼ばれたりする。根には、３〜８％のサポニンを含有し、その主成分は、ジンセノシド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｅとノ−トジンセノシド（ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）Ｒ１、Ｒ２、Ｆａ、Ｆｃであり、少量のジンセノシド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）Ｒ２、ｂ２、ｄ、ｅ、ｃがあって、Ｒ０は、ないかまたは非常に少なく含有されている。精油の組成成分は、高麗人蔘より少なくてオレアノール酸なども含有されている。根は止血作用、強心作用があり、動物実験で心臓動脈の血流量を増やして心筋の酸素消費量を減らし、血液内の脂質とコレステロール含量を減らす効能があることが明らかにされた。また、三七根は、優秀な消炎、鎮痛、止血作用があり、肝炎を含めた多くの炎症疾患に有効であるのみならず、外傷、切傷で生じた出血と内出血にも有効で、傷に直接塗ったり食べたりしても効果があることが知られている。
【００１９】
本発明の混合生薬材抽出物は、エリンギ、五加皮及び三七根を混合した混合生薬材を、水、アルコールまたは水とアルコールの混合溶媒で抽出して製造することができる。各生薬材の混合比は、エリンギ２５〜５５重量部、五加皮１〜２０重量部及び三七根３５〜７５重量部であることが好ましく、より好ましくは、エリンギ３５〜４５重量部、五加皮５〜１５重量部及び三七根４５〜５５重量部であり、エリンギ４０重量部、五加皮１０重量部及び三七根５０重量部であることが最も好ましい。
【００２０】
抽出方法は、前記溶媒を使用して冷浸、温浸、加熱など通常の抽出方法が可能であり、前記でアルコールは、エチルアルコールが好ましい。ここで、エチルアルコール抽出は、７０〜８０℃で３〜５時間行なうのが好ましい。
【００２１】
より具体的に、前記混合生薬材抽出物は、下記のように製造することができる。
【００２２】
不純物を除去したエリンギ、五加皮及び三七根を粉砕したものを混合して抽出容器に入れ、蒸留水を加えて熱水抽出を実施する。抽出物を室温で冷やして、ろ紙でろ過した後、その抽出液を集めて真空減圧で水分を除去して濃縮させる。より具体的には、前記濃縮は、２０〜４０℃で真空減圧することが好ましい。
【００２３】
本発明の混合生薬材抽出物は、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、ＯＰＧ）の発現を増加させて破骨細胞の生成を抑制する（図１）。
【００２４】
また、本発明の混合生薬材抽出物は、破骨細胞と思われるＴＲＡＰ（＋）多核細胞の形成及び破骨細胞の活性を大きく減少させ、破骨細胞形成及び活性を強く抑制して骨組織破壊を大きく減少させる（図２）。
【００２５】
また、本発明の混合生薬材抽出物は、ヒトの歯周靭帯細胞と歯肉繊維芽細胞増殖を効果的に維持させる（図３、４）。
【００２６】
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞に対する細胞毒性が少なくて、造骨細胞からＯＰＧの発現を増加させて、破骨細胞の形成及び活性を抑制し、歯槽骨の破壊を抑制することができる。また、ヒト歯周靭帯細胞及び歯肉繊維芽細胞の増殖を維持することによって、歯周疾患の予防及び治療に効果的で、医薬品及び健康食品に使用することができる。
【００２７】
本発明は、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）及び三七根（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｒａｄｉｘ）を含む混合生薬材抽出物を有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用組成物を提供する。
【００２８】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物に、同一または類似の機能を有する有効成分をさらに１種以上含むことができる。
【００２９】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物に、他の機能を有する有効成分をさらに１種以上含むことができる。
【００３０】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む、歯周疾患予防及び治療用製薬組成物を含む。
【００３１】
本発明の前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む歯周疾患予防及び治療用製薬組成物投与のために、前記記載の有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んで製造することができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができる。また、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、整菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当業界の通常の方法でまたはレミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を使用して、各疾患によって、または成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３２】
本発明の製薬組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）したり、経口投与したりすることができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様である。一日投与量は、経口投与時に本発明の三七根抽出物を基準に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇで、より好ましくは０．１〜３ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与するのが好ましい。
【００３３】
本発明の前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む組成物は、歯周疾患の予防及び治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００３４】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む歯周疾患予防及び治療用口腔用組成物を提供する。本発明の前記混合生薬材抽出物は、歯肉炎、歯周炎などの歯周疾患に効果があり、抗生物質ではないけれど、歯茎の炎症を減少させるだけでなく、歯茎を丈夫にして、細菌感染に対する抵抗性を付与するので、歯周疾患の予防及び治療のための口腔用組成物として製造することができる。
【００３５】
本発明の前記混合生薬材抽出物を含む口腔用組成物は、その剤形においては、特別に限定されず、通常の剤形を有することが可能で、具体的には、歯磨き、口腔洗浄剤または口腔清浄剤などの剤形とすることができる。本発明で提供する口腔用組成物は、その剤形によって製剤化に必要な各種の基剤と添加物を含むことができ、それら成分の種類と量は、当業者によって容易に選定され得る。例えば、口腔用組成物の剤形が歯磨き類の場合、研磨剤、湿潤剤、気泡剤、結合剤、甘味料、ｐＨ調節剤、防腐剤、薬効成分、香料、増白剤、色素、溶剤などを添加して製造することができる。
【００３６】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物を有効成分として含む歯周疾患の改善を目的とする健康食品組成物を含む。
【００３７】
本発明の混合生薬材抽出物を食品添加物に使用する場合、前記混合生薬材抽出物をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって相応しく決定することができる。一般的に、食品または飲料製造時には、本発明の混合生薬材抽出物を原料に対して１００重量部以下、好ましくは５０重量部以下の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的としたり、または健康調節を目的としたりする長期間摂取の場合には、前記量は前記範囲以下があり得、安全性の面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００３８】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられ、通常的な意味での健康食品を全て含む。
【００３９】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．１〜２０ｇ、好ましくは約１〜１０ｇである。
【００４０】
前記の外に本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色料、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当り０．０５〜５０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明をより易しく理解するために提供するだけのものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４２】
実施例１．混合生薬材抽出物の製造
エリンギ、五加皮及び三七根は、漢方薬材の卸商から購入して使用した。
【００４３】
＜１−１＞混合生薬材抽出物アルコール粗抽出物
各々の生薬材を１〜２ｃｍの大きさの切片にした後、流水で洗浄して不純物を除去した。切片にした生薬材を粉末に粉砕して、エリンギ：五加皮：三七根を４：１：５で混合した粉末２００ｇを３ｌフラスコに入れて、エチルアルコール２，０００ｍｌを使用して、７８．５℃で還流撹拌させながら４時間の加熱抽出を３回繰り返し実施した。前記抽出液をろ過した後、４０℃以下で回転式真空濃縮蒸発器（ｖａｃｕｕｍ  ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を使用して、真空減圧濃縮させて混合生薬材抽出物を収得した。
【００４４】
＜１−２＞混合生薬材抽出物水粗抽出物
抽出溶媒にエチルアルコールの代わりに水を使用したことを除いて、前記１−１の抽出方法と同一に抽出した。
【００４５】
＜１−３＞混合生薬材抽出物混合溶媒粗抽出物
抽出溶媒にエチルアルコールの代わりに水２５％とエチルアルコール７５％の混合溶媒を使用したことを除いて、前記１−１の抽出方法と同一に抽出した。
【００４６】
＜１−４＞各生薬材抽出物の製造
エリンギ、五加皮あるいは三七根の単一抽出物は、各々前記の方法と同じ方法で抽出した。
【００４７】
実験例１．混合生薬材抽出物による造骨細胞からＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）の発現促進実験
前記実施例１で分離した本発明の混合生薬材抽出物及び単一抽出物が、造骨細胞からＯＰＧ発現に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を実施した。
【００４８】
＜１−１＞造骨細胞の選別及び細胞培養
下記の３種類の細胞を使用して、本発明の混合生薬材抽出物及び単一抽出物が、造骨細胞の増殖に及ぼす影響を確認した。ヒト細胞としては、ヒト骨肉腫から由来した細胞株であるＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ、ＣＲＬ−１４２７）を、マウスの細胞としては、マウス筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１７７２）をアメリカ細胞株銀行（ＡＴＣＣ，米国）から購入して、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ，米国）培地で、５％ＣＯ２培養器で３７℃、１００％湿度の条件で培養して実験に使用した。
【００４９】
また、一次培養細胞では、スプラグ・ダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの頭蓋冠から得られた造骨細胞群（ＲＣＣ）を使用した。すなわち、生後１９日目のスプラグ・ダウレイラットの頭蓋冠から前頭骨と頭頂骨を摘出した後、０．１％コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、０．０５％トリプシン及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む酵素溶液で、３７℃で各々１０分、１０分、１０分、２０分、２０分間ずつ連続的に処理して、Ｉ〜Ｖ群の細胞を分離して、その中で造骨細胞の特性を有する細胞が主に存在するＩＶ及びＶ群の細胞を混合して、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭで一次培養した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を収集して、細胞数を測定して各実験に使用した。
【００５０】
＜１−２＞破骨細胞生成を抑制する造骨細胞ＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）の発現
１００ｍｍの細胞培養皿に、約１０６細胞／２０ｍｌ程度に育てられたＭＧ−６３の培養液を除去して、ＤＰＢＳ５ｍｌで培養皿の表面を洗浄して捨てた。トリプシン−ＥＤＴＡ０．５ｍｌを添加して、培養皿に均一に広がるようにした後、ＣＯ２培養器に約１分程度入れて置いて細胞がはがれるようにした。１０％ＦＢＳが入っているＤＭＥＭ５ｍｌを入れてよく混ぜた後、１５ｍｌの試験管に入れて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、細胞が沈んだのを確認して、上澄み液を除去し、再び１０％ＦＢＳが入っているＤＭＥＭ５ｍｌを入れて細胞がよく溶けるように混ぜた。細胞計数器（Ｈａｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞数を計算し、１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに分注した。分注して２４時間後に抽出物を０．５％ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンが入っているＤＭＥＭ培養液に、各々０．２２、０．６６、２、６ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈して細胞に処理した。
【００５１】
実験の信頼性を高めるために、陽性対照群にＯＰＧ発現を陰性対照群に対して２〜５倍高める２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を処理した。処理して２４時間後、各々の培養上澄み液をＤＰＢＳを使用して１／２００に希釈して、１００μｌをエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートに入れて分析した。エライザキットは、ＯＣＴ社のＯＰＧエライザキットを使用し、吸光波長は４５０ｎｍの波長を使用して測定した。分析して得られたＯＰＧの発現量を、標準曲線を使用して換算後、抽出物をなにも処理していない無処理対照群に対する処理群のＯＰＧ発現程度を、下記の数式１を使用して相対的％に換算して計算した。
【００５２】
（数１）
＜数式１＞
ＯＰＧ発現率（％）＝（１−実験群のＯ．Ｄ．４５０／対照群のＯ．Ｄ．４５０）×１００
（前記式中、Ｏ．Ｄ．４５０は、４５０ｎｍでの吸光度である。）
【００５３】
前記過程で、造骨細胞で破骨細胞の生成を抑制する物質であるＯＰＧの発現を測定した結果、混合生薬材抽出物は、濃度依存的にＯＰＧ発現を促進させ、６ｍｇ／ｍｌの濃度で最大２３０％まで造骨細胞のＯＰＧの発現を促進する傾向を示した。また、各々の生薬材抽出物を処理した時より、ＯＰＧ発現を卓越して促進させることが分かった（図１）。
【００５４】
実験例２．混合生薬材抽出物による破骨細胞増殖抑制実験
混合生薬材抽出物及び単一抽出物による、破骨細胞の生成抑制と細胞活性度減少確認のために、本発明者等は、下記の実験を行った。
【００５５】
＜２−１＞破骨細胞前駆細胞の純粋分離及び成熟した破骨細胞への分化誘導及び混合生薬材抽出物の処理
マウス骨髄細胞を分離するために７〜９週になった雄のマウスを頚部捻転で犠牲にした後、大腿骨と頚骨を無菌的に摘出して、軟組織を除去して腸骨の両端を切断した後、２６Ｇ注射針を使用して、一方端の骨髄腔に０．１％コラーゲン分解酵素（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５％トリプシン及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれた酵素溶液１ｍｌを注射して、骨髄を取り出した後、３０分間撹拌して骨髄細胞を集めて、１０％ＦＢＳが含まれたα−最小必須培地（α−ＭＥＭ）に、２４時間全培養した後、未付着細胞を得た。破骨細胞の前駆細胞になる未付着細胞を、ウェル当り２×１０５個の細胞になるように分注して培養した。８日間培養する間、２０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，米国）と３０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，米国）が含まれたα−ＭＥＭに、実施例１で製造された混合生薬材抽出物及び単一抽出物を処理して培養した。培養を完了後、破骨細胞の生成を検査するために、細胞を固定してＴＲＡＰ染色を行った。また、破骨細胞の活性を検査するために細胞を引き離した後、吸収された部位を観察した。
【００５６】
＜２−２＞ＴＲＡＰ（＋）である多核細胞生成抑制
前記骨髄細胞培養後、付着細胞をＰＢＳで洗浄した後、シトレートアセテートホルムアルデヒド（ｃｉｔｒａｔｅ−ａｃｅｔａｔｅ−ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で５分間固定させて、ナフトール（ｎａｐｈｔｈｏｌ）ＡＳ−ＢＩホスファート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ファーストガーネット（ｆａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ）ＧＢＣ溶液と７ｍＭ酒石酸塩（ｔａｒｔｒａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ５）を含む、３７℃アセテート（ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１時間培養して、ＴＲＡＰ染色をした。ここで、３個以上の核を有するＴＲＡＰ（＋）多核細胞を破骨細胞とみなした。
【００５７】
本実験例では、破骨細胞の分化を誘導するために破骨細胞の前駆細胞があることが知られている骨髄を使用した。ＴＲＡＰに陽性（＋）で多核である細胞を破骨細胞とみなして、破骨細胞前駆細胞を培養しながら、実施例１で製造した混合生薬材抽出物及び単一抽出物を処理して８日間培養した後、ＴＲＡＰ陽性多核細胞の数の変化を測定して、下の数式２で生成の抑制率を表記した。前記過程で破骨細胞の標識酵素であるＴＲＡＰ活性を測定した結果、混合生薬材抽出物を処理した群は、抽出物をなにも処理していない対照群に比べて、ＴＲＡＰ（＋）多核細胞の生成を１００％まで抑制することを確認した。前記結果から、本発明の混合生薬材抽出物が破骨細胞の生成抑制作用をすることを確認した（図２）。
【００５８】
（数２）
＜数式２＞
ＴＲＡＰ（＋）である多核細胞生成抑制率（％）＝１００−｛（実験群多核細胞数／対照群多核細胞数）×１００｝
【００５９】
実験例３．混合生薬材抽出物によるヒトの歯肉繊維芽細胞と歯周靭帯細胞増殖確認
前記実施例１で分離した混合生薬材抽出物及び単一抽出物が、ヒト歯周靭帯細胞と歯肉繊維芽細胞の増殖と細胞活性度増加に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を行った。
【００６０】
＜３−１＞ヒト歯周靭帯細胞及び歯肉繊維芽細胞の選別及び細胞培養
健康な人の矯正治療目的で抜去した小臼歯の歯周靭帯部分をキューレット（ｃｕｒｅｔｔｅ）を使用して無菌的に掻いて培養皿に乗せた後、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ，米国）培養液を少量入れて培養した。歯肉繊維芽細胞は、同所で抜去した歯肉を一部剥ぎ取って同様な方法で培養した。ここで、培養しながら顕微鏡で観察して組織から細胞が移植片（ｅｘｐｌａｎｔ）に出ることを確認する。細胞が群集を成して育った後、各々の組織標本を除去して細胞が単層に育つようにした後、継代培養して実験に使用した。
【００６１】
＜３−２＞ヒト歯周靭帯細胞と歯肉繊維芽細胞の増殖測定
ヒト歯周靭帯細胞と歯肉繊維芽細胞を２４ウェルプレートに各ウェル当り２００００個の細胞が入るようにして、５％ＣＯ２培養器で４８時間培養した後、各濃度の混合生薬材抽出物及び単一抽出物が入っている培養液に入れ替えて、再び４８時間培養した。培養液を除去後、トリプシン−ＥＤＴＡを添加して、細胞数をヘマシトメータ（Ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数して、抽出物をなにも処理していない群を対照群にして、下記の数式３で増殖率を表記した。混合生薬材抽出物による歯肉繊維芽細胞及び歯周靭帯細胞の増殖は、各々の生薬材を単独で処理した場合より、増殖が正常に維持されることを確認した（図３、４）。
【００６２】
（数３）
＜数式３＞
細胞増殖率（％）＝実験群細胞数／対照群細胞数×１００
【００６３】
本発明の混合生薬材抽出物の各成分の効果は、前記記述された理想的な特性を示すことはできないが、各成分を配合した混合生薬材抽出物は、理想的な特性を示しているように、歯肉繊維芽細胞と歯周靭帯細胞全てに対しては、正常数値を維持することができることを確認することができる。
【００６４】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００６５】
製剤例１：製薬製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
混合生薬材抽出物                                                            ２ｇ
乳糖                                                                        １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【００６６】
＜１−２＞錠剤の製造
混合生薬材抽出物                                                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                                      １００ｍｇ
乳糖                                                                  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                                  ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００６７】
＜１−３＞カプセル剤の製造
混合生薬材抽出物                                                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                                      １００ｍｇ
乳糖                                                                  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                                  ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００６８】
製剤例２：口腔清浄剤の製造
混合生薬材抽出物                                              ０．０１〜１．０ｇ
キリシトール                                                          ５〜１０ｇ
エチルアルコール                                                      ５〜１５ｇ
ソルビトール                                                          ５〜１５ｇ
サッカリンナトリウム                                            １０〜１００ｍｇ
ナトリウムモノフルオロホスファート                          ５００〜１０００ｍｇ
ナトリウムラウリルスルファート                                １００〜２００ｍｇ
ポリソルベート２０                                          １００〜１０００ｍｇ
ペパーミントフレーバー                                          １０〜１００ｍｇ
ナトリウムベンゾエート                                            １０〜１００ｇ
精製水                                                                      適量
色素                                                                        適量
合計                                                                    １００ｇ
前記成分によって通常の口腔清浄剤の製造方法にしたがって、歯周炎予防及び治療効果がある口腔用組成物を製造した。
【００６９】
製剤例３：食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物を含む食品を下記のように製造した。
【００７０】
＜３−１＞小麦粉食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物０．５〜５．０重量％を小麦粉に添加して、その混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
【００７１】
＜３−２＞乳製品（ｄａｉｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明の混合生薬材抽出物５〜１０重量％を牛乳に添加して、該牛乳を使用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００７２】
＜３−３＞禅食の製造
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７３】
黒豆、黒胡麻、荏胡麻も公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７４】
本発明の混合生薬材抽出物を真空濃縮器で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【００７５】
前記で製造した穀物類、種実類及び混合生薬材抽出物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
【００７６】
穀物類（玄米３０重量％、ハト麦１５重量％、麦２０重量％）、
種実類（荏胡麻７重量％、黒豆８重量％、黒胡麻７重量％）、
混合生薬材抽出物の乾燥粉末（３重量％）、
霊芝（０．５重量％）、
地黄（０．５重量％）
【００７７】
製剤例４：飲料の製造
＜４−１＞炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ０．１〜１％の添加物を混合して、そこに７９〜９４％の精製水を混ぜてシロップを作る。前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して、冷却水と１：４の割合で混合した後、０．５〜０．８２％の炭酸ガスを注入して、本発明の混合生薬材抽出物を含む炭酸飲料を製造した。
【００７８】
＜４−２＞健康飲料の製造
液状果糖０．５％、オリゴ糖２％、砂糖２％、食塩０．５％、水７５％のような副材料と混合生薬材抽出物を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、ＰＥＴ瓶など小容器に包装して健康飲料を製造した。
【００７９】
＜４−３＞野菜ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００８０】
＜４−４＞果物ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物１ｇをリンゴまたはぶどうジュース１，０００ｍｌに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のエリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）及び三七根（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ  Ｒａｄｉｘ）を含む混合生薬材抽出物は、造骨細胞からＯＰＧの発現を促進させて、破骨細胞の生成及び活性化を抑制するだけでなく、破骨細胞の増殖を抑制して、歯周靭帯細胞及び歯肉繊維芽細胞の増殖維持に効果があり、歯肉炎、歯周炎などの歯周疾患の予防及び治療のための医薬品または健康食品に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】混合生薬材抽出物と各々の抽出物が歯肉繊維芽細胞のオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）発現に及ぼす影響を示した図である。
【図２】混合生薬材抽出物が破骨細胞の形成及び活性に及ぼす影響を示した図である。
【図３】混合生薬材抽出物がヒト歯周靭帯細胞に及ぼす影響を示した図である。
【図４】混合生薬材抽出物がヒト歯肉繊維芽細胞の増殖活性に及ぼす影響を示した図である。
【図１】
2008530203.tif 000003
【図２】
2008530203.tif 000004
【図３】
2008530203.tif 000005
【図４】
2008530203.tif 000006
【国際調査報告】
2008530203.tif 000007
2008530203.tif 000008