(57)【要約】  本発明は、抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL)反応を増すのに使用するためのペプチドを同定するための方法を提供する。この方法は、抗-イディオタイプモノクローナル抗体のVHおよび/またはVL部分のアミノ酸配列を抗原のアミノ酸配列と比較して、Ab2と抗原の間の相同性領域を同定し、さらに、相同性領域においてHLA結合モチーフを同定するステップを含む。HLA結合モチーフを含む同定された相同性領域は、CTL反応を刺激するのに有用なペプチド配列を規定する。本方法により同定されたペプチド、およびかかるペプチドを使用して個人においてCTL反応を刺激する方法も提供される。
2008521820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する細胞傷害性T細胞(CTL)反応を刺激するのに使用するためのペプチド配列を同定するための方法であって、
ａ）前記抗原のエピトープを擬似する抗-イディオタイプ抗体(Ab2)のVHおよび/またはVL部分のアミノ酸配列を得ること；
ｂ）前記抗原のアミノ酸配列を得ること；および、
ｃ）前記抗原の8-11アミノ酸領域と少なくとも55%の相同性を有する、前記Ab2のVHおよび/またはVL部分の8-11アミノ酸領域を同定して、相同性領域を同定すること
を含み、
前記相同性領域がHLA結合モチーフを含み、かつ、ｃ）で同定される相同性領域が前記抗原に対するCTL反応を刺激することができるペプチドを規定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、前記抗原により刺激されるCTL反応よりも強くCTL反応を刺激することができる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相同性領域が、
ｉ）前記Ab2のVHおよび/またはVL部分の前記アミノ酸配列を前記抗原の前記アミノ酸配列と比較して、前記抗原の少なくとも１つの8-11アミノ酸領域と少なくとも55%の相同性を有する、前記Ab2の少なくとも１つの8-11アミノ酸領域を同定すること、
ｉｉ）ｉ）で同定された8-11アミノ酸領域内にHLA結合モチーフを同定すること、
により同定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記相同性領域が、
ｉ）前記Ab2のVHおよび/またはVL部分内に、HLA結合モチーフを含む少なくとも１つの8-11アミノ酸領域を同定すること；および、
ｉｉ）前記抗原のアミノ酸配列中に、ｉ）で同定されたAb2の領域に少なくとも55%相同な8-11アミノ酸領域を同定すること
により同定される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記相同性領域が、
ｉ）前記抗原内に、HLA結合モチーフを含む少なくとも１つの8-11アミノ酸領域を同定すること；および、
ｉｉ）前記Ab2の前記アミノ酸配列中に、ｉ）で同定された前記抗原の領域に少なくとも55%相同な8-11アミノ酸領域を同定すること
により同定される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
荷電アミノ酸または極性アミノ酸を、前記抗原に対してCTL反応を刺激することができる前記ペプチドに挿入すること、または前記ペプチドから削除することにより、前記抗原に対してCTL反応を刺激することができる前記ペプチドを変更するステップをさらに含み、当該変更されたペプチドが、請求項１に記載の抗原に対してCTL反応を刺激することができる前記ペプチドよりも強く、前記抗原に対するCTL反応を刺激することができることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップｃ）をコンピュータープログラムにより行う請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記HLA結合モチーフが、HLA-A、HLA-A2、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRAおよびHLA-DRB1結合モチーフから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記HLA結合モチーフがHLA-A2結合モチーフである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原が腫瘍関連抗原である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原がヒト高分子量メラノーマ-関連抗原(HMW-MAA)、CD55抗原または癌胎児(CEA)抗原である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記VH配列が前記Ab2のFR1領域に先行するユニークなVH配列であり、前記Ab2の前記VHアミノ酸配列を免疫グロブリンアミノ酸配列のデータベースと比較して、当該免疫グロブリンアミノ酸配列のデータベースに存在しない、前記Ab2の前記FR1領域に先行するVH配列を同定するコンピュータープログラムにより、前記ユニークなVH配列を同定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原によるCTLの活性化に匹敵するCTLの活性化の改善を可能とする、8-20アミノ酸長の単離ペプチドであって、前記抗原の8-20アミノ酸部分および前記抗原におけるエピトープを擬似するAb2の8-20アミノ酸部分に対して、少なくとも55%の相同性を有し、かつ、HLA結合モチーフを含む単離ペプチド。
【請求項１４】
前記抗原の9-11アミノ酸部分および前記Ab2の9-11アミノ酸部分に対して少なくとも55%の相同性を有する請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
前記抗原が腫瘍関連抗原である請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１６】
前記腫瘍関連抗原がHMW-MAA、CD55またはCEA抗原である請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドが配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有する請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドが前記Ab2の9-11アミノ酸部分と同一であり、当該Ab2の9-11アミノ酸部分が前記Ab2のFR1領域に先行するユニークVH配列であることを特徴とする請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１９】
個人において抗原に対するCTL反応を刺激する方法であって、前記個人に、9-11アミノ酸長の単離ペプチドの所定量を投与することを含み、当該ペプチドが、前記抗原の9-11アミノ酸部分および前記抗原のエピトープを擬似するAb2の9-11アミノ酸部分に対して少なくとも55%の相同性を有し、かつ、当該ペプチドがHLA結合モチーフを含み、前記抗原に対するCTL反応が前記個人において刺激されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記抗原が腫瘍関連抗原である請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2004年11月24日に出願された米国仮特許出願第60/630,718号に対する優先権を主張し、この開示を出典明示により本明細書中に組み込む。
本発明は、概して、癌治療に関するものであり、より詳細には、腫瘍抗原よりもより免疫原性であるペプチドの同定および/または設計に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イディオタイプ特異的抗体、即ち、抗-イディオタイプ抗体の免疫原としての使用は、イディオタイプ-ネットワーク理論(Jerne, NK, Eur J Immunol 34: 1243-50, 2004; Jerne, NK等、EMBO J 1: 243-7, 1982)により進められた理論に基づく。この理論によれば、抗原(Ag)は、当該Agにユニークな規定されたアミノ酸配列および/または構造モチーフを特異的に認識するAb(Ab1)を誘導する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ab1のAg-結合配列はユニークであるので、Ab1は、それを産生した免疫システムにより異物として認められる。結果として、免疫化された宿主は、Ab1のAg-結合配列を特異的に認識する他のAb(Ab2)を生じる。Ab1と、宿主中に存在する他の特異性の抗体の間では、抗体のAg-結合領域の所定の領域(イディオトープ)のみが異なるので、Ab2はAb1におけるAg-結合配列のみを認識すると考えられる。それゆえ、Ab1のAg結合配列がAgのいくつかのアミノ酸を認識し、結果、Ag2はAgの「体内イメージ」を運搬すると一般に考えられている。(Jerne, NK, Eur J Immunol 34: 1243-50, 2004; Jerne, NK等、EMBO J 1: 243-7, 1982)。この理論に基づいて、多くの免疫治療研究はAg2を抗ガン剤として用いてきた(Pride, MW等、Clin Cancer Res 4: 2363-70, 1998)。しかし、腫瘍の増殖および転移の調節におけるイディオタイプ特異的免疫反応の役割は僅かしか理解されていない。
【０００４】
一つの仮説は、Ab2が免疫システムを刺激してAgの「体内イメージ」に対する新たな抗体を作成するというものである。一般にAb3と呼ばれるかかるAbは一度誘導されると、Ab1よりも高い親和性で、腫瘍細胞上の誘導Agと相互作用する。しかし、当初考えられていたよりも問題はもっと複雑である。例えば、腫瘍AgとAb2が直線的に相関する配列相同性を共有するなら、生じるT細胞は、自己反応性T細胞として、寛容化されるかまたは除去されるはずである。
【０００５】
Agと対応する抗-id抗体の間の構造類似性の基礎は不明確であるが、一の可能性は、腫瘍関連抗原(TAA)と対応する抗-id抗体の、抗-TAA抗体の抗原結合部位の同じ領域との相互作用の構造的基礎により説明される。これらの相互作用にはアミノ酸の側鎖が関与しており、これが、AbおよびTCRのAg結合領域において、（OH基が関与する）強いH-結合および、ポジティブ/ネガティブに帯電した末端基と逆に帯電した基の間のいっそう強固な電気的に安定な相互作用を形成し得ると考えられる。しかし、TAAから誘導されたペプチドは全て、概してCTL反応の弱いインデューサーである(Waters, S. J等, Cell Immunol., 111: 87-93, 1988)。
【０００６】
つまり、癌の治療に対する新規な免疫治療的アプローチを追跡するために、特定の抗原に対してCTL反応を誘発し得るペプチド配列であって、当該ペプチドが、抗原由来のペプチドにより刺激されるCTL反応よりも強いCTL反応を刺激するものを決定することが益々必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明により、免疫治療的アプローチにおける使用のためのペプチドを同定するための方法が提供される。このペプチドは、対応する抗原の領域と相同性を有し、かつ、１種以上のHLA結合モチーフをさらに含む、抗-イディオタイプ抗体の短領域(8-20アミノ酸）として同定される。これらのペプチドは細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応を刺激する能力を有する。抗-id抗体のペプチド領域は、免疫反応をさらに高めるために変更されてもよい。
【０００８】
一態様では、前記方法は、抗-イディオタイプ抗体(Ab2)のVHおよび/またはVL部分のアミノ酸配列を得ること、前記抗原の配列を得ること、前記配列を比較して、Ab2内の候補相同性領域（即ち、前記対応する抗原の領域に対して相同性を示す領域）を同定すること、およびさらに、HLA結合モチーフをさらに含むAb2のこれらの候補相同性領域を同定することを含む。これらのペプチドを次いで、CTL反応を刺激するその能力に関して試験する。好ましいペプチドは、対応する抗原または抗原由来のペプチドよりも強いCTL反応を刺激するものである。
【０００９】
他の態様では、本発明はまた、前記方法により同定されたペプチドも提供する。この点では、ペプチド配列はAb2の一部および抗原の一部と相同であり、かつ、さらにHLA結合モチーフを含む。
他の態様では、前記方法はさらに、Ab2の相同性領域として同定されたペプチド配列を変更して、CTL反応を刺激するその能力をさらに高めることを含む。
【００１０】
本発明により、前記方法により同定された前記ペプチドを、個人において腫瘍抗原に対する高まった免疫反応を生じるのに使用するための方法も提供される。この方法は、個人に、抗原の一部および抗原におけるエピトープを擬似するAb2の一部に対して相同性を有するペプチドの所定量を投与することを含み、かつ、前記ペプチドは、抗原に対するCTL媒介性免疫反応を刺激するのに有効なHLA結合モチーフを含む。
【００１１】
本発明は、抗-イディオタイプ抗体の配列内に入れ子状態にされた短領域であって、対応する抗原のエピトープと相同性を共有し、HLA結合モチーフを含み、かつCTL反応を刺激することができる領域の同定に関する。抗-id抗体のそのような同定された短領域に対応するペプチドはさらにこれを変更して、免疫反応を刺激するその能力を高めてもよい。
抗-イディオタイプモノクローナル抗体は、本明細書中で「Ab2」および「抗-Id抗体」とも称する。
「抗-イディオタイプ抗体に対応する抗原」または「対応する抗原」は、本明細書中、Ab2により擬似される抗原を称するのに使用する。Ab2は抗原のエピトープの「体内イメージ」を運搬すると考えられる。
本明細書中で使用する「相同性領域」または「相同性」は、アミノ酸配列が少なくとも55%同一であること、または電荷、OH基および側鎖において似通っていることを示す。
【００１２】
本発明の方法は概して、
１）Ab2のVHおよび/またはVL部分のアミノ酸配列を得ること；
３）抗原のアミノ酸配列を得ること；
４）Ab2と抗原の配列を比較してAb2と抗原間の相同性領域を同定すること；および、
５）抗-id抗体の同定された相同性領域内に、さらにHLA結合モチーフを同定すること
を含み、Ab2および抗原に対して相同で、かつHLA結合モチーフを含む当該同定された配列は、抗原に対するCTL反応を刺激することができるペプチドを規定する。抗-id抗体ペプチドにより刺激されるCTL反応が、抗原により誘発されるCLT反応よりも強いことが好ましい。
【００１３】
前記ステップの特定の順序は重要でないことが当業者により認識されるであろう。例えば、まず、抗-id抗体または対応する抗原の短領域内にHLA結合モチーフを同定し、次いでHLA結合モチーフを含んでいる当該短領域が当該抗原または抗-id抗体各々とさらに相同性を共有しているかどうかを決定することにより、同じ結果を達成できる。
【００１４】
抗体の重(H)および軽(L)鎖のNH2-末端領域は、かかる領域が抗原認識に関与しているので、本発明にとって特に関連がある。かかる領域は雑多なアミノ酸配列を認識し、その折り畳みを維持するので、最初の120から140のNH2-末端アミノ酸が重(VH)および軽(VL)鎖の可変領域を規定する。それゆえ、抗原の領域に対して相同性を示す、Ab2の配列内に入れ子状態にされた短領域は、VHまたはVL領域中で同定され得る。
【００１５】
さらに、VhおよびVLは、相補性決定領域、CDR1、CDR2およびCDR3として指定される３つの相補性規定領域を含む。これら３つの領域は、フレームワーク領域（FRs)として指定される介在領域と比較して変異が多い。抗原に対して相同性を示し、かつHLA結合モチーフを含むAb2上の短領域が存在し得、またはCDRsまたはFRsをまたぎ得る。
【００１６】
抗原構造における違いは、かかる領域におけるアミノ酸の違いに翻訳できる。抗体が蛋白質をその本来の形態で認識する場合、フレームワーク領域が抗原結合に関与すると考えられている(Li Y等、J Mol Biol 256: 577-589, 1996; Potter KN等、Mol Immunol 35: 1179-1187, 1998)。蛋白質に対する抗体がそのリガンドに対して高い親和性を有することを考慮すれば、特異的認識はフレームワーク領域とCDR3の両方の関与によるものである。つまり、抗原のイディオトープ/体内イメージは、Ab2のフレームワーク領域中やCDR3中に存在し得る。それゆえ、FR1またはCD3領域内またはその付近の範囲、またはリーダーとFR1領域間で、FR1領域の前にある結合領域中の範囲が、HLA結合モチーフおよび抗原相同性を評価するのに特に有用である。
【００１７】
前記態様のバリエーションでは、Ab2のVhおよびVL領域の配列を、ユニーク配列−即ち、他のIgG内の配列と相同性を示さないか、または最少限度の相同性しか示さない配列−の存在に関して調査する。かかるユニークなAb2配列を次いで、抗原配列に対する相同性およびHLA結合モチーフの存在に関して評価する。例えば、一態様では、Ab2配列をFR1領域に先行するユニークなVHペプチド配列に関して分析する（図１）。
【００１８】
Ab2の同定された短領域に対応するペプチドは8-20アミノ酸長である。これは概して、免疫反応を生じるのに適当な長さと考えられる。個々の態様において、ペプチドは8〜20のあらゆる長さであってよい。特定の態様において、ペプチドは9〜11のアミノ酸長である。
【００１９】
Ab2および抗原がHLA結合モチーフに関して分析される当該HLA結合モチーフには、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRAおよびHLA-DRB1が含まれ、また、その個々のサブクラスも含まれる。HLA抗原分子に対する特異的結合のために必要とされるモチーフに対応する重要な残基が同定されている。（Sette, A等、Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J., Curr. Biol. 6:52, 1994; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994を参照されたい。）HLA-Aには、サブクラスHLA-A1、HLA-A2およびHLA-A3モチーフが含まれる。HLA-A1モチーフはポジション2での主要なアンカー残基としてのT、SまたはMの存在およびC末端ポジションでの主要アンカー残基としてのYの存在により特定される。別法として、主要アンカー残基は、ポジション2よりもむしろポジション3に存在してもよい。HLA-A2結合モチーフは、ポジション1、2および9での疎水性脂肪族残基およびポジション6での芳香族残基により特定される。HLA-A3結合モチーフは、ポジション2での主要アンカー残基としてのL、M、V、I、S、A、T、F、C、GまたはDの存在および、C末端ポジションでの主要アンカー残基としてのK、Y、R、H、FまたはAの存在により特定される。
【００２０】
本発明は、また、Ab2、抗原配列およびHLAモチーフの比較から同定されたペプチド配列に基づく、変更ペプチド配列の設計を提供する。概して3-5COOH末端残基は同じTCRの認識を維持するように、抗原エピトープと同様に保たれるべきである。ペプチドにおける荷電残基の導入、またはアミノ酸残基のポジションの、アミノ酸の挿入または欠失によるシフトを次いで用いて、T細胞反応を効果的に刺激するペプチドを作成できる。そのような変更はAb2および抗原において同定されるHLA結合モチーフに基づき、特定のHLAに対するペプチドの親和性は、特に、ペプチドとHLA分子の間のH結合の増加により改善される。さらに、ペプチドはプロテアソーム破壊に対して抵抗性にもなされ得る。
【００２１】
Ab2を得るための方法は当該分野の専門家に周知である。例えば、KohlerとMilsteinにより最初に記載されたハイブリドーマ法（1975, Nature 256: 495-497)およびヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor等、1983, Immunology Today 4:72)がAb2を得るのに適した方法である。さらに、Kusama等(J. Immunol, 1989 Dec 1; 143(11): 3844-52)はHMW-MAAに対するAb2の作製を記載している。Ab2は、ハイブリドーマ上清からの硫酸アンモニウム沈降後カラムクロマトグラフィーを行う等により、周知の方法により精製され得る。別法として、当該方法は、データベースまたは関連のある文献から得られるAb2の公知配列を用いて実施され得る。
【００２２】
Ab2のイディオトープ結合領域の配列を決定するための方法が公知である。例えば、Ab2 VHまたはVL領域のアミノ酸配列を決定するための適当なプロトコルがIwasaki等 Eur. J. Immunol., 24: 2874-2881, 1994に開示されている。抗原のアミノ酸配列は標準的なアミノ酸分析法により、または化学的な配列決定（例えばエドマン分解法）により決定してよい。さらに、Ab2VHおよび/またはVL領域のアミノ酸配列は、Ab2をコードしているゲノムDNAまたはcDNAを確立された方法により配列決定することにより決定できる。一態様では、VHアミノ酸配列だけを得る必要がある。
【００２３】
ペプチド抗原の配列とAb2のイディオトープ結合領域等のアミノ酸配列を比較するための方法も公知である。そのような方法には、(http://www.us.expasy.org/toolsで入手可能な)BLOSUM62、Accelrys, Incから入手可能なプロテオミクスプログラムおよび、ナショナルインスティテュート・オブ・ヘルスのバイオインフォルマティクス &モレキュラー・アナリシス・セクションから入手可能な配列分析プログラム等のアミノ酸配列比較ソフトウェアプログラムの使用が含まれる。
【００２４】
一態様では、Ab2配列を、FR1領域に先行するユニークなVHペプチド配列に関して、FR1領域に先行するVH領域を免疫グロブリン配列のデータベースと比較することにより分析する。ユニーク配列は、対応するVH領域に関して、データベース免疫グロブリン配列中に存在しないはずである。
【００２５】
Ab2および抗原アミノ酸配列中のHLA結合モチーフを同定するための方法も公知である。これに関しては、本発明は、あらゆる所望のHLAの結合モチーフをAb2中に、および抗原中に調査することを意図する。
HLA結合モチーフの存在に関して配列を分析するために、Ab2および抗原のアミノ酸配列を特定のHLA結合モチーフとの相同性に関して、http://hlaligand.ouhsc.edu/LigandDB/servlet/GenerateFormServlet?form_type=indexでアクセス可能なHLAリガンド/モチーフデータベース、またはhttp://bioresearch .ac.uk/browse/mesh/D006680.html.にてアクセス可能なBioresデータベース等の公に入手可能なデータベースおよびコンピュータープログラムを用いて分析できる。（例えば、Sette, A. and Grey, H.M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J., Curr. Biol. 6:52, 1994; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994 Kast, W.M等、J. Immunol., 152:3904, 1994を参照されたい。）
【００２６】
本発明のペプチドは、組換え遺伝子法または化学的合成による等の、当該分野の専門家に公知の、または後に開発されたあらゆる方法により調製できる。例えば、ペプチドは固相合成法（Merrifield, J. Am.Chem.Soc., 15: 2149-2154(1963); M. Bodanszky等 (1976) ペプチド合成、John Wiley & Sons, 第2版; Kent and Clark-Lewis, バイオロジーおよび医薬における合成ペプチド、p. 295-358, eds. Alitalo, K等、Science Publishers, (Amsterdam, 1985))を用いて調製できる。ペプチド合成法の概要は、J. Stuart and J.D.Young、固相ペプチド合成、Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. (1984)に見出すことができる。溶液法によるペプチドの合成も、蛋白質、VOl. II,第3版、p.105-237, Neurath, H等、Eds., Academic Press, New York, N.Y. (1976)に記載されるごとく用いてもよい。概して、ペプチドの合成には１種以上のアミノ酸残基または適当に保護されたアミノ酸残基の、成長しているペプチド鎖への連続的付加を含む。典型的には、第一アミノ酸残基のカルボキシル基を固体支持体に前もって結合し、アミノ酸を第一の、選択的に除去可能な保護基により保護する。第二に、別個の選択的に除去可能な保護基を、リジン等の反応性側鎖を含むアミノ酸と共に使用する。第一保護基の除去後、第二アミノ酸のカルボキシル基を第一アミノ酸のアミノ基に結合する。このプロセスを、ペプチドが完成するまで繰り返し、この時点でペプチドを固体支持体から除去して精製する。合成されたペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィー（例えば、Creighton, T.(1983) 蛋白質、構造および分子的原理、W H Freeman and Co., New York, N.Y.)または当該分野で利用可能な他の匹敵する方法により実質的に精製してよい。合成ペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認してよい。
【００２７】
一度候補ペプチド配列が同定され、またペプチドが合成されたら、特定のHLAに対するその親和性を評価することが好ましい。従って、ペプチドとHLA間の相互作用の親和性を検出および定量するための種々のアッセイは当該分野の専門家に公知である(Sette, A. and Gray, H.M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J., Curr. Biol. 6:52, 1994; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994)。さらに、ペプチドの特定のHLAに対する親和性をコンピュータープログラムを用いて評価できる。
【００２８】
また、同定されたペプチド配列を、T細胞反応を誘発する能力に関して試験することが好ましい。そのような試験は確立された方法に従い行うことができる。かかる目的のための典型的なアッセイには、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接細胞毒性アッセイ、および限界希釈アッセイが含まれる。例えば、ペプチドと共にインキュべートされた抗原提示細胞を、反応細胞集団中でCTL反応を誘導する能力に関してアッセイすることができる。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹上細胞等の正常細胞であってよい。
【００２９】
末梢血リンパ球を、CTLプレカーサーの反応細胞源として使用してよい。適当な抗原提示細胞をペプチドと共にインキュべートし、ペプチドを載せた抗原提示細胞を次いで、最適化された培養条件下に反応細胞集団と共にインキュべートする。ポジティブなCTL活性を、放射能標識した標的細胞、特定のペプチドパルス標的並びに、ペプチド配列が由来する抗原の細胞内加工形態を発現している標的細胞の両方を殺滅するCTLの存在に関して培養物をアッセイすることにより決定できる。
【００３０】
本発明の一態様では、一次腫瘍等の腫瘍、転移性疾患またはその両方を有する個人または、鎮静状態にある個人に、本発明により同定されたペプチドを投与できる。本方法は、個人に、腫瘍の形成を阻害するおよび/または癌細胞を殺滅するのに有効な量のペプチドを投与することを含む。ペプチドは、免疫学的反応を高めるために、適当なアジュバントと共に処方されてよい。さらに、ペプチドは、当該ペプチドを標準的な医薬上許容されるキャリアまたは希釈剤と公知の方法に従い組み合わされることにより調製された便利な投与形態にて投与できる。医薬上許容されるキャリアまたは希釈剤の形態および特性は、組み合わされるペプチドの量、投与の経路および他の周知の可変物、個人のサイズや疾患の段階等により決定される。さらに、当該分野の専門家に公知の種々の方法を用いて、個人にペプチド製剤を導入してよい。かかる方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内経路が含まれる。
【００３１】
いかなる特定の理論により拘束されることを意図せず、本発明により同定されるペプチドの、腫瘍を有すると診断された個人への投与は、腫瘍抗原を含む関連エピトープを認識するCTLの活性化および分化を刺激すると考えられる。それゆえ、腫瘍抗原に対するCTLsの機能的結合活性が増すことが期待される。
以下の実施例は説明のためのものであり、如何にしても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００３２】
実施例１
本実施例は、抗-id mAb MF11-30のVHおよびVL配列を開示し、相同性HMW-MAAおよび抗-id mAb MF11-30配列を含むペプチド配列であって、当該相同性配列がHLA-A2結合ペプチドモチーフをさらに含むものの同定を示す。
抗-id mAb MF11-30のVHおよびVLヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図２に示す。抗-HLA-A2.1mAbs MA2.1およびBB7.2(McMichael等. Hum Immunol 1980; 1:121-9; Hoga,n等. J Immunol 1989; 142: 2097-104)は、対応するハイブリドーマ上清から、硫酸アンモニウム沈降の後カラムクロマトグラフィーを行うことにより精製した。両抗-HLA-A2mAb分泌ハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Rockville, MD)より入手した。FITC結合アイソタイプ特異的抗マウスIgGおよび、本明細書中で用いる他の抗体の全てはBD PharMingen(La Jolla, CA.)より購入した。VHおよびVL配列は、既に記載されているような（Iwasaki等、Eur J Immunol 1994; 24:2874-81)、標準的な方法を用いて決定した。
【００３３】
図２に関し抗-id mAb MF11-30VHおよびVL配列中のCDRs(相補性決定領域）の残基の番号付けおよび位置づけは、ウェブサイト：http://www.bioinf.org.uk/abs/.におけるCDRsのカバット・ナンバリング・スキームおよびカバット・ディフィニションに基づく。アミノ酸のイタリック体の文字コードはCDRを示す。アミノ酸の下線を付した文字コードは、挿入が生じる位置を示す。VHヌクレオチド配列は配列番号１９として提供される。VHアミノ酸配列は配列番号２０として提供される。VLヌクレオチド配列は配列番号２１として提供される。VLアミノ酸配列は配列番号２２として提供される。
【００３４】
mAb MF11-30のVH遺伝子セグメントは、Q52VH遺伝子ファミリーと高い相同性を示す。D遺伝子セグメントはDSP2ミニ-遺伝子ファミリーの部分である。JH遺伝子セグメントはJH3ファミリーから誘導される。VL遺伝子セグメントはVK遺伝子ファミリーのサブグループIIIと相同性を示す。JK遺伝子セグメントはJK2ミニ遺伝子と100%相同である。
【００３５】
mAb MF11-30VHおよびVLのアミノ酸配列をHMW-MAAコア蛋白質の公開されたアミノ酸配列(Pluschke等., Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:710-5)と、ExPASyウェブサイトからのプログラムBLOSUM62(Livingston等、Cancer Immunol Immunother 1997, 45: 10-9)を用いて比較した。10-17アミノ酸の短伸長上にのみ、かかる２つの蛋白質間に部分的（20%〜40%)な相同性が認められた。しかし、HLA-A2結合モチーフはかかる相同性領域において同定されなかった。
【００３６】
我々は、次いで、Http:/bimas.dcrt.nih.govにて入手可能なTaylor等によるプログラムを用いて、mAb MF11-30VHとVLのアミノ酸配列をHLA-A2結合モチーフに関して調査した。フレームワーク領域1中の配列VH(3-11)LLVLLYSKL(配列番号２２)は、HLA-A2結合ペプチドの特徴、即ち、ポジション2および9での疎水性脂肪族残基ならびにポジション1での疎水性脂肪族残基およびポジション6での芳香族残基を満たした。このペプチドは全VHペプチドのHLA-A2Agに対して最も高い結合親和性を有した。表１は、相同性領域における抗-id mAbおよびHMW-MAAアミノ酸配列のアライメントを示し、「ｂ」は、アライメントを説明するために誘導されたギャップを示し；「スコア」は、HLA-A2Agに対して算出された結合親和性を示し、「コード」は、ペプチド配列の名称を示す。表３は左欄に、「コード」下の文言に加え、本明細書中に使用されるペプチドの別名称を示す。
【００３７】
【表１】
2008521820.tif 000003
【００３８】
VHアミノ酸配列のプロテアソーム消化プログラム(Toes等、J.Exp Med 2001; 194:1-12; Nielsen等、Protein Sci 2003; 5: 1007-17)を用いる分析は、このペプチドがプロテアソーム消化から保護されることを示す（データは示さず）。このデータベースにおけるFASTA.3プログラムを用いる調査は、免疫グロブリン中のVH(3-11)と他の蛋白質を用いて、ごくわずかな部分的に相同な配列しか同定せず（データは示さず）、このペプチド配列がmAb MF11-30の「イディオタイプ」であることを示した。
【００３９】
VH3(3-11)配列をHMW-WAAにおける相同性検索のために用いた。我々は、HMW-MAA配列76-84中に部分的に相同なペプチド（9残基の5つ）を見出した。76-84の初めの4つのアミノ酸、LLQLはVH(3-11)配列からの初めの４つのアミノ酸と似通っていた。V→Qへの変化は有意な構造上の変化でも電荷における変化でもないが、極性の変化を生じる。最後の５つのアミノ酸、YSGRLは、VH(3-11)配列の最後の４つのアミノ酸、YSKLと似通っており、Tyr5がLeu5を置換し、かつGlyがSer7とArg8の間に挿入される違いを伴う。HMW-MAA(76-84)ペプチドは、VH(3-11)ペプチドよりもHLA-A2Agに対して低い結合親和性を有する（表３）。これは、また、VH(3-11)ペプチドほどプロテアソーム破壊から保護されないと考えられる。ヌクレオチド配列に基づき、Leu5→Tyr5の変化は、ポイント・ミューテーションの結果ではなくむしろLeuをコードしている塩基の三ツ組の欠失の結果である。つまり、VH(3-10)における基Tyr6Ser7の位置はHMW-MAA中ではTry5Ser6にシフトされた。TyrおよびSerは、共に、TCRと最もH結合を形成しやすい遊離OH基を含むので、TCRに対するAg結合を高めるはずである。Gly7はHMW-MAA中のCOOH-末端基Arg8Leu9およびVH(3-11)中のLys8Leu9の前に各々挿入される。ヌクレオチド配列に基づき、Lys→Argの変化はポイント・ミューテーションの結果である。
【００４０】
Tyr-Ser基のシフトはTCR認識およびAg免疫原性に影響を及ぼし得るので、側鎖を欠き、かつ柔軟性のある位置づけを許容するGlyをHMW-MAA(76-84)のポジション5に導入して、VH(3-11)とHMW-MAAペプチド両方におけるTyrとSerを並べた。生じた配列はLLQLGYSGRLであった。このデカペプチドにおいて、アミノ酸ポジション1、2、4、6および7およびCOOH末端アミノ酸9および10はVH(3-11)ペプチドと並ぶ。このデカペプチドは、ノナペプチドLLQLYSGRLと同じCOOH末端アンカーを含むので、同じTCRが、異なる親和性を伴うものの、両ペプチドと相互作用しそうである。VH3-11および変種HMW-MAA(vHMW)ペプチドはポジション6および7で同一のアミノ酸を有する。これらの相同性は9個の残基の内の7個(77%)である。HLA-A2Agに対する、野生型(wt)および変種(v)HMW-MAAペプチドの結合親和性は似通っている。対応するペプチドをI-100、VH:LLVLLYSKLとして；I-101、wtHMW-MAA：LLQLYSGRLとして；およびI-102、vHMW-MAA: LLQLGYSGRLとして指定した（表１）。
【００４１】
実施例２
本実施例は、MELIMMUNE、ネズミの抗-イディオタイプモノクローナル抗体MEL-2およびMF11-30の組合せ(Pride等、Clin Cancer Res 1998; 4:2363)で免疫化した患者からのリンパ球の、VH3-11(I-100)およびvHMW-MAA(I-102)ペプチド両方に対する、増強されたCTL増殖反応を刺激するための、本発明のペプチドの使用を示す。
【００４２】
ペプチドI-100(LLVLLYSKL)は、抗-id mAb MF11-30VH残基3-11由来のものである。ペプチドI-101(LLQLYSGRL)は、HMW-MAA残基76-84の野生型アミノ酸配列に対応する。ペプチドI-102(LLQLGYSGRL)は、ポジション80でのGlyの挿入により変更されたHMW-MAAストレッチ76-84のアミノ酸配列を有する。ペプチドF119(AAGIGILTV)は、MAA MART-1由来のCTLエピトープ（アミノ酸27-35)に対応する。ペプチドE71、HER-2(828-836)は、HER-2/neu蛋白質由来の不活性のHLA-A2エピトープに対応する。前記ペプチドの全てはM.D.アンダーソン・キャンサー・センター・ペプチド・コア・ラボラトリーで合成され、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。それらの同一性をアミノ酸分析により決定した。かかるペプチドの純度は＞95%であった。
【００４３】
我々は、MELIMMUNEで免疫化した患者が、免疫原として用いられる抗-id mAb由来のペプチド並びにHMW-MAA由来のペプチドを認識するT細胞を有するかどうかを試験した。10人の試験した患者の中で、5人が、MELIMMUNEでのワクチン化の後5〜7年疾患に患わず、5人がM.D.アンダーソン・キャンサー・センターでメラノーマ外来診察に従った。全患者は、試験の2ヶ月前に疾患を切除しており、０のイースタン・コーポレイティブ・オンコロジー・グループ・パフォーマンスステータスを有した。いずれも、現在、化学治療および/または生物学的治療を受けておらず、および/または試験から２ヶ月以内にかかる治療を受けなかった。
【００４４】
免疫化された患者から単離したPBMCsが、非免疫化患者からのPBMCsよりも強くペプチドI-100およびI-101に反応するかどうかを決定した。加えて、我々は、wtHMW-MAAおよびvHMW-MAAペプチドを認識するT細胞をPBMCsが含むかどうかを試験した。
【００４５】
増殖アッセイのために、96穴の平底マイクロタイタープレート(Costar Corp., Cambridge, MA)にて、L-グルタミンおよび10%仔牛血清を含む100μlの完全RPMI1640中2×105細胞/ウェルの濃度で、PBMCsを4-3倍で培養した。ペプチドI-100およびI-101を、200μlのトータル体積まで、血清を含まないRPMI1640中5、25および50μg/mlの濃度で添加した。PBMCsを、トリチウム標識化チミジンを1μCi/ウェルの濃度で添加する前に6日間37℃で5%のCO2雰囲気中で培養した。結果は取り込まれたトリチウム標識化チミジンのcpmとして、および刺激指標として表す(Hogan等、J Immunol 1989; 142: 2097-104)。後者はペプチドと共に培養されたリンパ球の平均cpmをペプチドなしで培養したリンパ球の平均cpmで割ったものである。増殖反応は、ペプチドと共に培養された培養物に関する平均cpm±SD値がペプチドなしで培養した培養物に関するものと有意に異なる場合に(P＜0.05、スチューデンツt試験）、ポジティブとスコアした。96時間37℃でペプチドと共に培養したPBMCsに、組換えインターロイキン(IL)2(90IU/ml; Biosource International, Camarillo, CA)を添加することにより、ペプチド特異的T細胞を増殖させた。37℃での培養のさらに５日後、細胞を洗浄し、再度播き、次いで1:1の刺激因子対反応因子の比率で、照射された(30Gy)自己PBMC刺激因子、および5、25および50μg/mlの濃度のペプチドで再刺激した。IL-2を96時間後に添加し、細胞をさらに5日間37℃で培養し、その後、これらをさらに10日間37℃で再刺激した。３サイクルかけて刺激したリンパ球を回収し、細胞毒性(CTL)アッセイにおけるエフェクターとして用いた。
【００４６】
予備的試験で、我々は、ペプチドI-101が増殖を刺激しないこと、またはHLA-A2＋患者6および4人のHLA-A2−患者からのPBMCsによるIFN-γおよびIL-10の分泌を刺激しないことを、かかるパラメータが、ペプチドなしで培養された自己PBMCsの培養物中に見出されたものと同様であったので、認めた。ペプチドI-101での再刺激の際、患者6のPBMCsはアポトーシスとなり、wtHMT-MAAが欠失メカニズムにより免疫寛容誘発性であることを示した（データは示さず）。それゆえ、我々は、刺激性と認められたVH3-11(I-100)およびvHMW-MAA(I-102)ペプチドの分析に、我々のその後の調査を集中した。
【００４７】
表２に示すように、I-100およびI-102ペプチドと6日間まで培養した時（1°刺激;STIM)、患者1、2、4、および6からのPBMCSは、ペプチドなし(NP)で培養した自己PBMCSよりも顕著に高い程度まで増殖した。I-100およびI-102ペプチドにより誘導された増殖の程度は同様であった。表２に関して、PBMCは末梢血単核細胞であり；NPはペプチドなしであり；S.I.は刺激指標（値＞2を有意とみなす）；ａ、P＜0.001；b、P＜0.01;c、ペプチドなし(NP)よりも有意な増加；ｄ、P＜0.05. d
【００４８】
【表２】
2008521820.tif 000004
【００４９】
MELIMMUNEで免疫化したHLA-A2＋患者1、2および6からのリンパ球（表４）は、有意に強い増殖を伴って、I-100およびI-102ペプチド両方に対して反応し、免疫化されなかったHLA-A2−患者3、5、9および10よりも有意に高い刺激指標(2.7±0.7)を有した（1.2±0.4; P＜0.001)。つまり、I-100およびI-102ペプチドによる増殖の誘導は、HLA-A2Ag発現と関連しており、抗原配列を有するペプチド(I-101)よりも高いレベルであった。かかる結果はまた、VH3-11(I-100)およびvHMW-MAA(I-102)ペプチドの両方に反応し得るT細胞の多集団が免疫化により活性化されたことを示す。VH3-11およびvHMW-MAAペプチドの有糸分裂促進効果は、無関係なHER-2/neu-特異的ペプチドE71がHLA-A2＋免疫化患者1、2および6 (NP=353±84cpm対E71=411±190cpm; P=0.65)およびHLA-A2−患者8(NP=560±22対E71=685±103; P=0.06) 由来のリンパ球に関して有糸分裂促進性ではなかったので、特異的であった。E71ペプチド同様、MART-1ペプチドF119は患者1（330±36cpm;刺激指標=0.7)および10(215±26cpm;刺激指標=1.1)由来のPBMCsに関して有糸分裂促進性ではなかった。
【００５０】
実施例３
本実施例は、免疫化された患者からのPBMCsにおけるVH3-11(I-100)およびvHMW-MAA(I-102)ペプチドによるサイトカインの誘導を示す。AgとのT細胞の相互作用は、数サイクルの分裂を誘導し得、Ag-刺激されたコミットされていないT細胞を生じるか、またはT細胞を分化させ得、またエフェクター機能を獲得させ得る。エフェクター機能は、Ag刺激T細胞の、Th1サイトカインを分泌し、かつ特定の標的の溶菌を媒介する能力により、最もよく特徴づけられる。免疫化された患者からのT細胞がサイトカインエフェクター機能を獲得したかどうかを決定するために、IFN-γおよびIL-10を、I-100およびI-102ペプチドで刺激されたPBMC培養物から回収した上清中で測定した。サイトカインの放出を測定するために、5、25および50μl/mlのペプチドでの一次および二次刺激後24、48および72時間で上清を回収し、-20℃で凍結保存した。IFN-γおよびIL-10レベルを、Biosource Internationalにより供給される対応するキットを用いてダブルサンドウィッチELISAにより測定した。アッセイはヒト組換えIFN-γおよびIL-10を用いて校正し、各サイトカインを15-1000pg/mlの範囲内に検出した。
【００５１】
反応因子として用いたPBMCsはメラノーマを有する患者由来であったので、典型的なTh2サイトカインとしてIL-4の代わりにIL-10をアッセイした。それゆえ、それらは調節細胞を含む虞がある。患者6は２つの別個の試験から保存した上清を有した。これにより、別個の時間点で行った反復分析にて結論の確証を得た。刺激の後、刺激されたPBMCsの全てがIL-2において増殖したので、我々は、IL-2中でPBMCsを培養することの、IFN-γ誘導における効果を測定した。IFN-γおよびIL-10誘導に関する典型的な個々の患者の例を図３に示す。HLA-A2＋患者6およびHLA-A2−患者7からのペプチド刺激されたPBMCsからのIFN-γおよびIL-10両レベルは、ペプチドI-100を用いる1°STIM後では低かった（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００５２】
I-100およびI-102ペプチドにより誘導されるサイトカインレベルの有意性を確証するために、ペプチドF119により表される主要なMART-1エピトープにより誘導されるサイトカイン反応をパラレルに測定した。ペプチドI-100、I-102およびF119の各々で刺激されたHLA-A2＋患者6からのPBMCsにより産生されたIFN-γレベルは似通っていた（P＞0.05; 図３Ｃ）。対照のF119ペプチドで再刺激後のIL-10レベルは、ペプチドI-102を用いて得られたものよりも有意に低かった(F119=58±11pg/ml対I-102=212±24pg/ml; P＜0.025)が、ペプチドI-100を用いて得られたものから有意な差は無かった（86±11pg/ml; P＞0.05; 図３Ｄ）。
【００５３】
患者のPBMCsの全てからのIFN-γおよびIL-10反応を図４に示す。ピーク反応は患者毎異なっていたが、概して、ペプチド(25μl/ml)と共に48-または72時間培養した後に測定した場合に反応は最も高かった。患者8および9からのPBMCによるサイトカイン分泌は、さらなるリンパ球がこれら二人の患者からは得られなかったので、試験しなかった。インビトロ刺激後、I-100ペプチドでの刺激後に分泌されたIFN-γ±SDの、I-102ペプチドでの刺激に対する有意な差は、平均pg/mlにおいて無かった（図４Ａ）。両ペプチドでの刺激時点でのIFN-γ:IL-10比は＜1.0であったが、これらは、I-102ペプチドを用いるよりもI-100ペプチドを用いてより低かった。INF-γ:IL-10比は再刺激の際＞3.0まで変化した。INF-γレベルは、1°STIM後よりも2°STIM後に有意に高く(P＜0.05)、IL-10レベルは異ならなかった（図４Ｂ）。再刺激後、患者2および6におけるIFN-γレベルは＞1logまで増した。2°STIM後の平均IFN-γレベルは、HLA-A2＋患者からのPBMCsに関してHLA-A2−患者からのPBMCsに関するもの(59.5±24.4; P＜0.007;図４Ｃ）よりも有意に高かった(616.1±86.3)。IL-10に関する同様の分析は、有意な差を検出しなかった（pg/ml IL-10: HLA-A2＋=155.7±36.3対HLA-A2−=61.1±25; P=0.06)。HLA-A2＋患者に関するIFN-γ:IL-10比は、HLA-A2−患者に関するもの(0.97)よりも4倍高く(3.96)、HLA-A2＋患者におけるTh1反応への傾向を示す。それ故、抗-id mAb MF11-30での免疫化を採用し、T細胞を活性化して、IFN-γ産生のポテンシャルを得た。エフェクターサイトカインの活性化の実証には、インビトロでのペプチドでの予備刺激と再刺激、または、ペプチドでの刺激前の、PBMCsのIL-2中での培養のいずれかを必要とした。つまり、本発明のペプチドは特定の抗原に対する反応にてサイトカイン産生を刺激できる。
【００５４】
実施例４
本実施例は、MELIMMUNEでの免疫化後、CTLsを本発明のペプチドでパルスすることによる、VH3-11およびvHMW-MAAペプチド-特異的CTLsの誘導を示す。MELIMMUNEでの免疫化の、メラノーマ細胞溶菌性CTLsの活性化における効果を決定するために、我々は免疫化されたHLA-A2＋患者1および6の反応を、非免疫化HLA-A2＋患者4のものと比較した。特異性および限界対照として、我々は非免疫化HLA-A2−患者3および5の反応を分析した。CTLsの全てを、刺激ペプチドでパルスしたT2細胞およびA375smメラノーマ細胞を溶菌するその能力に関して試験した。3ラウンドのペプチド刺激後に回収したリンパ球を、既に記載されているごとく(Fisk等、J Exp Med 1998; 181:2109-17; Murray等、Clin Cancer Res 2002; 11: 3407-18)、51Crで標識された標的を溶菌するその能力に関して試験した。CTL認識におけるHLA-A2制限を立証するために、標的を50μg/mlの抗-HLA-A2mAb MA-2.1と共に培養した。腫瘍細胞溶菌試験に関する冷標的阻害(Cold target inhibition)を記載のごとく(Murray等、Clin Cancer Res2002; 11: 3407-18)行った。
【００５５】
HLA-A2＋患者1および6からのI-100-CTLおよびI-102-CTLは、対照標的T2-NP、即ちペプチドでパルスされなかったT2細胞よりも有意に高い程度まで、I-100パルスT2細胞(T2-I-100)を溶菌した（図５、ＡおよびＢ）。HMW-MAAペプチドI-102により誘導されたCTLsも、VH(3-11)ペプチドI-100を認識した（データは示さず）。HLA-A2＋患者4のI-100-CTLはT2-I-100を溶菌しなかったが、自己I-102-CTLはT2-I-102を溶菌した（図５Ｃ）。かかる結果は、MELIMMUNEでの免疫化が、VH3-11ペプチドおよびHMW-MAAペプチド両方に対するCTLプレカーサーを活性化したが、非免疫化患者からのHLA-A2＋PBMCsの、同じペプチドを用いたインビトロ刺激は既存の、HMW-MAAのためのCTLプレカーサーのみを活性化したことを示す。MELIMMUNEで免疫化されなかったが、インビトロでVH3-11およびHMW-MAAペプチドで刺激されたのみのHLA-A2−患者3および5からのPBMCsは、刺激ペプチドを認識するCTLsを増殖させなかった。図５ＤおよびＥに示すように、I-102ペプチドで反復的に刺激された患者3からのCTLによるT2-I-102標的の特異的な溶菌は、ペプチドを用いずに培養された標的(T2-NP)と比較して、なかった。患者5からのリンパ球はまた、T2-I-100およびT2-I-102標的を特異的には溶菌できなかった（図５Ｅ）。これは、I-100およびI-102ペプチドによるCTL活性化がHLA-2結合モチーフにより制限されることを示す。
【００５６】
実施例５
本実施例は、MELIMMUNEでの免疫化および本発明のペプチドでCTLsをパルスすることによるHMW-MAA特異的CTLsの誘導を示す。ペプチドでのインビトロ刺激が、HMW-MAA＋/HLA-A2＋メラノーマ細胞上のエピトープを認識するCTLsを産生するかどうかを決定するために、免疫化されたHLA-A2＋患者1および6からのPBMCsをI-100およびI-102ペプチドで刺激し、次いで、A375SMメラノーマ細胞を溶菌するその能力に関して試験した。図６Ａに示すように、患者1からのI-100-刺激されたPBMCsおよびI-102刺激PBMCsは、A375SM細胞を効果的に溶菌し、CTLsがペプチド刺激PBMCs中に存在したことを示す。それゆえ、かかるエフェクターをI-100CTLおよびI-102CTLとして各々指定する。溶菌は「冷(cold)」T2-I-100により効果的にブロックされた。この結果は、VH3-11ペプチドに対するCTLsの特異性および、メラノーマ細胞における、構造上類似するペプチドHLA-A2エピトープの発現を示す。
【００５７】
本結果は、I-100およびI-102ペプチドにより形成されたエピトープの配列中の有意な程度の相同性（＞67%)が、CTLsにおいて、腫瘍細胞により提示されるHMW-MAAエピトープの交差認識を生じることを確証した。加えて、溶菌はHLA-A2-特異的mAb MA2.1により＞50%まで阻害され、この分子がCTLsの制限要素であることを確認した（図６Ｂ）。同様の結果が患者6からのCTLsを用いて得られた。図６Ｃは、I-100-CTLおよびI-102-CTLによるA375SM細胞の溶菌の動態を示す。対照として使用したエフェクターは、HMW-MAAペプチドでパルスしたまたは増殖因子としてのIL-2と共に培養したT2細胞と同じ実験におけるおよび同じ実験条件下での刺激により、自己PBMCsから産生された。後者をNP-CTLと指定する。NP-CTLをエフェクターとして用いて、ワクチンにより誘導されるメモリーCTLsがこの患者に存在するかどうか、および、サイトカインおよび同族のAgを提示していないHLA-A2Ag での刺激後のその細胞溶解機能をアップレギュレートするかどうかを決定した。結果は、NP-CTLs (「メモリー様」)が、T2-I-100により形成されたものに構造上類似する腫瘍細胞上のエピトープを特異的に認識したことを示す。しかし、その溶菌活性は弱く、時間中増加しなかった。これに対して、I-100-CTLは、最初の5時間中に、I-102-CTLよりも速い動態で同じエピトープを認識した。溶菌に関するその動態は、時間中緩慢になった。I-102-CLTは、最初の5時間の間、I-100CTLより明らかに緩慢な動態で腫瘍細胞上の同じエピトープを認識したが、溶菌の動態は、I-100-CTLのものと比較して時間中幾分早くなった（5時間から20時間までで59%増加）。我々は、必要な試薬が入手できなかったので、各ペプチドに対する特異的TCRsを保持している各集団におけるエフェクターの正確な数を決定することができなかった。それにもかかわらず、I-100-CTLとI-102-CTLの間の溶菌の動態上の差は、腫瘍細胞に対するその機能的結合活性の少量の差を示唆する。つまり、本発明のペプチドは抗原特異的CTLsを活性化することができる。
【００５８】
実施例６
抗原エピトープに対して相同性を示し、かつHLA結合部位を含むAb2内の短配列の存在がよりグローバルな現象であるかどうかを決定するために、他のAb2を分析した。我々は、Ab2/公知のアミノ酸配列を有するヒト腫瘍抗原に関連する抗-イディオタイプ抗体の、4つの公知のアミノ酸配列を調査した。2つのAb2が産生され、我々の一人により配列を決定したところ、それらは、高パーセントのメラノーマ病変にて発現される(Campoli M等、Crit Rev Immunol 2004; 24:267-96)ヒト高分子量メラノーマ関連抗原(HMW-MAA)の明確な決定因子である体内イメージを有する。これらAb2をMF11-30およびMK2-23として各々指定する(Kusama M, J Immunol 1989; 143: 3844-52)。105AD7と指定される第三のAb2は、CD55抗原の内部イメージを有する。CD55は結腸直腸癌細胞により広く発現される(Medof ME, Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:2007-11. Spendlove L等、Eur J Immunol 2000; 30: 2944-53)。3H1と指定される第四のAb2は、胎児癌抗原の内部イメージを有する(Potter等、Mol Immunol 1998; 35: 1179-87; Beauchemin等、Mol Cell Biol 1987; 7: 3221-30)。
【００５９】
これらAb2とその個々の抗原の間の相同性を同定するために、我々はFR1に先行するユニークなVHペプチドに関して調査した。次いで、http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bindで入手可能なプロテオミクスプログラムを用いて、我々は、我々が同定したユニークなVHペプチド中にHLA-A2結合モチーフを検索した。
【００６０】
腫瘍抗原における相同アミノ酸配列を同定するために、HLA-A2結合モチーフを含む同定されたユニークなVHペプチドの配列を、対応する腫瘍抗原(HMW-MAA、CD55およびCEA)のアミノ酸配列と比較した。他の免疫グロブリンアミノ酸配列との相同性を欠くか、または最小限度の相同性を示すAb2CDR3からのペプチドをパラレルに分析した。我々は、4つのAb2の内の2つ（mAb MF11-30および105AD7)がFR1の前に位置するユニークなアミノ酸配列を含むことを見出した。FR1は独特のモチーフ：ポジション17〜19中のEVQ、QVQ、EDQで始まる。かかるユニークなVHペプチドは、図１に示すように、mAb MF11-30および105AD7VHの最初の各々の18および24アミノ酸を含む。他の2つのAb2(mAb MK2-23および3H1)は、FR1に先行するユニークなVHペプチドを含まない。mAb105AD7およびMF11-30からのHLA-A2結合モチーフを有するユニークなVHペプチドを表３に示す。候補のCTLエピトープを太字で示す。アミノ酸18後に、mAb105AD7アミノ酸配列を追加し、第二のCTLエピトープの完全なアミノ酸配列を示す。mAb MF11-30からの表３の配列は配列番号１として提供され、mAb105AD7からの配列は配列番号２として提供される。
【００６１】
【表３】
2008521820.tif 000005
【００６２】
Ab2のVHおよび腫瘍抗原HMW-MAA、CD55およびCEA間のアミノ酸配列相同性（表４において「Ｈ」を付した）を表４に示す。アミノ酸配列類似性は、Expasy SIMアライメントプログラムを用いて決定した。同一または非常に似通った残基を太字で示す。Ab2中で置換されたまたは挿入された残基を拡大表記する。また、Ab2および腫瘍抗原ペプチド両方により結合されるHLAアロ特異性も示す。最も高い親和性で結合したHLAアロ特異性に下線を付す。アロ特異性の決定は、HLAペプチドモチーフ検索プログラムBIMASを用いて行った。
【００６３】
簡便のため、表記「105AD7(7-16)」は、VHのアミノ酸ナンバー7の開始ポジション（「SP」）を有するペプチド配列であって、アミノ酸7-16を含むものを示す。105AD7(7-16)および105AD7(2-10)として指定されるmAb105AD7ペプチドの２つは、表２に示すように、CD55(14-23)およびCD55(373-381)アミノ酸配列と、各々6/10(60%)と5/9(55%)の有意な相同性を示す。この表「SI」は、アミノ酸配列の各々に関する配列番号を指定する。Ab2抗原対HMW-MAAおよびmAbMF11-30の特徴は実施例１に示す。
【００６４】
【表４】
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【００６５】
mAb MK2-23および3H1はユニークなNH2-末端VHアミノ酸配列を発現しない。しかし、2つのmAb MK2-23ペプチド、MK2-23(12-20)およびMK2-23(37-46)は、HMW-MAA(1020-1028)および(825-834)アミノ酸配列と有意な相同性を示す。CDR3中のmAb MK2-23アミノ酸配列は他のVHアミノ酸配列と僅かしか相同性を示さない。VHCDR3(100-117)アミノ酸配列がHMW-MAA(690-706)アミノ酸配列と50%相同であることに注目すべきである。CDR3アミノ酸配列は、MHCクラスIIアンカーを形成することが公知の疎水性脂肪族および芳香族アミノ酸の存在により、MHCクラスIIエピトープを擬似する。この配列を有するペプチドは、mAb3H1からのCDR3ペプチドに関して報告されているように、CD4＋T細胞を活性化し得る。驚くべきことに、我々は、NH2-末端VH3H1ペプチド(12-20)とCEAイソ形態1(100-108)の間に有意な相同性を見出した。2つのノナマー、3H1(12-20)およびCEA-1(100-108)は55%相同であり、HLAクラスI抗原と結合できる。IMGTプログラム(http://imgt.cines.fr)を用いるアライメントに基づき、mAb MF11-30および105AD7のVHは、VHファミリーQ52およびIgG VHII各々に属する。mAb mF11-30VHの最初の23アミノ酸は、分析した全ての他のIgGにはない。mAb105-AD7VHの最初の6つのNH2-末端アミノ酸は殆どのIgGにない。いくつかのより相同なIgGまたは仮説上の蛋白質と比較して、その後の11アミノ酸は1つの欠失を有し、これは、誤整列化と、少なくとも4〜5の非保存的な変化を生じた。
【００６６】
腫瘍抗原とAb2アミノ酸配列間の相同性はでたらめではない。それは、免疫グロブリン軽鎖からのアミノ酸配列を用いては認められなかった。また、ユニークなFR1を含むヒトメラノーマのVH(Trojan等、Nat Med 2000; 6:667-72)は、ここに報告したような、HMW-MAAおよびCD55との高い相同性を示さなかった（データは示さず）。
【００６７】
それゆえ、纏めて、本実施例で分析したAb2の内の2つは、ユニークなNH2-末端VH配列を運搬するが、2つのAb2は運搬しない。全4つのNH2-末端VHは、誘導因子腫瘍抗原と50%を越えて相同である。我々は、これらのAb2/抗イディオタイプ抗体NH2-末端VH配列を、これらが体細胞抗原と相同であるので、T-細胞イディオトープとして指定した。
【００６８】
腫瘍抗原ペプチドと対応するT細胞イディオトープの間の主要な構造上の差には、(a)荷電残基の導入または除去；(b)誤整列に至る基の挿入；および(c)H-結合を形成する極性残基の導入が含まれる。表２に示すAb2-腫瘍抗原の8対の内、荷電残基における変化は、対mAb105AD(7-16)/CD55(14-23)、mAbMK2-23(37-46)/HMW-MAA(825-834)およびmAb3H1(12-20)/CEA(100-108)中に存在する。誤整列は、(a)殆ど同一の基(RVL)をCD55(14-23)基:RLLと入れ替える、mAb105AD7(7-16)中のSer'；(b)殆ど同一の基:RKLをHMW-MAA基RRLとさらに入れ替える、mAb MD2-23中のSer6；および(c)殆ど同一の基KKGをHMW-MAA中の基RKG(825-833)とさらに入れ替える、mAb MK2-23中のAsp6の挿入により作成される。荷電残基における変化を欠くAb2-腫瘍抗原ペプチド対は、Ser7→Gly7(対1)、Thr5→Phe5(対2)並びにCys3→Val3(対3)等の極性基における変化を示す。
【００６９】
つまり、本明細書中に開示されるT細胞エピトープを同定する方法は、Ab2中に入れ子状態にされた腫瘍抗原のCTLエピトープの配列を同定することにより、およびその中にHLA結合モチーフを同定することにより、候補となるCTLの作成のためのメカニズムが先行技術の方法から異なる。従って、腫瘍抗原ペプチドと相同で、かつHLA結合モチーフを含むAb2ペプチドは、腫瘍抗原ペプチドと比較した場合、これら抗原を発現している腫瘍を認識するCTLの誘導のためのより強力な免疫原である。
【００７０】
本発明を特定の態様により説明したが、通常の変更が当該分野の専門家に明らかであり、そのような変更は本発明および添付の請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、VH領域構造を図示したものである。Ab2MF11-30およびAb2 105Ad7のユニーク領域の相対位置を示す。
【図２】図２は、抗-id mAb MF11-30VHおよびVLヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。CDR（相補性規定領域）の残基の番号付けと位置づけは、ウェブサイト：http://www.bioinf.org.uk/abs/.でのCDRsのカバット・ナンバリング・スキームおよびカバット・デフィニションに基づく。アミノ酸のイタリック体の文字コードはCDRsを示す。アミノ酸の下線を付した文字コードは、挿入が生じる位置を示し、さらに、ヌクレオチド配列における挿入注釈により示される。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ−３Ｄは、ペプチドI-100およびI-102でのインビトロ刺激の後（各々、図６Ａおよび６Ｂ）、HLA-A2＋患者から得たPBMCにより分泌されたIFN-γとIL-10のレベルを図示したものである。増加濃度のペプチドI-100(図３Ａ)およびI-102(図３Ｂ）を用いる1°STIM後72時間の培養物から回収した培地中のIFN-γ（▲）およびIL-10(■）のレベル(pg/ml)。ペプチドI-100、I-102およびF119(25μg/ml)での2°STIM後の培養物から回収した培地中のIFN-γ（図３Ｃ）およびIL-10(図３Ｄ)レベル（pg/ml)。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、ペプチドI-100およびI-102(25μg/ml)での1°(図４Ａ）および2°(図４Ｂ)STIM後のHLA-A2＋およびHLA-A2−患者からのPBMCにより分泌されたIFN-γおよびIL-10のレベルを図示したものである（図４Ｃ）。HLA-A2＋患者からのPBMCにより分泌されたIFNγレベル(pg/ml)は、HLA-A2−患者からのものよりも有意に(*p＜0.007)高かった。IL-10レベルはこれら２つのグループの患者の間で異ならなかった。
【図５Ａ−５Ｅ】図５Ａ−５Ｅは、HLA-A2免疫化患者#1および#6(各々図５Ａおよび５Ｂ）、およびHLA-A2、非免疫化患者#4(図５Ｃ)由来のNP、I-100およびI-102-CTLの、T2-NP(■)およびT2-I-100(□)標的に対する細胞溶解活性を図示したものである。図５Ｄは、HLA-A2−患者#3からのNP-およびI-102-CTLの、T2-NP(■)およびT2-I-100(□)標的に対する溶菌活性を示す。図５Ｅは、HLA-A2＋患者#5からのNP-、I-100-、およびI-102-CTLエフェクターによる、T2-I-100標的に対するCTL溶菌を示す。４時間の51Cr放出アッセイにおけるE:T比は30:1であった。；バー、±SD.
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、A375SMメラノーマ細胞の溶菌により立証されるI-100-およびI-102-CTLにより認識されるエピトープの類似性を図示したものである。図６Ａは、HLA-A2＋患者#1からのI-100-およびI-102-CTLによるA375SM細胞の溶菌のT2-I-100細胞（■）による有意な(p＜0.001)阻害を示す。横座標のNP-、I-100およびI-102は対応するCTLエフェクターを示す。NP-CTLは、ペプチドの添加なしでT2細胞およびIL-2により刺激されたCTLを示す。図６Ｂは、HLA-A2＋患者#6A375SMからのI-100-およびI-102-CTLによるA375SMメラノーマ細胞の溶菌の抗HLA-A2mAb MA2.1による有意な阻害(**p＜0.001対NP-STエフェクター）を示す。20時間の51Cr放出アッセイにおけるE:T比は20:1であった。図６Ｃは、NP-CTL(○)、I-100-CTL(●)およびI-102-CTL(▲)によるA375SMメラノーマ細胞溶菌の動態を示す。CTLは、20時間までの間、標的細胞と共にインキュべートした。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｅ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【配列表】
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