(57)【要約】本発明は、唾液中の遺伝子産物の測定を通して、疾患状態の進行を診断、同定およびモニタリングする際に有用であるプローブおよび方法に関する。2008515384.tif 000016
2008515384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒトの疾患状態についてのマーカーを同定するための方法:
ヒトの唾液試料を得る工程;
該ヒトの唾液試料からヒトmRNAを得る工程;
該mRNAを増幅して核酸増幅産物を提供する工程;
該核酸増幅産物を分離する工程;および
正常個体と該疾患状態を示す個体との間で示差的に発現するmRNAを同定する工程。
【請求項２】
疾患状態が癌、自己免疫疾患、糖尿病および神経性障害から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ヒトmRNAを得る工程が、RNAse阻害剤でヒト唾液試料を処理する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
RNAse阻害剤がRNAlater(商標)組成物を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、唾液mRNAを保存する方法:
唾液試料を得る工程;
該試料をRNAlater(商標)組成物と混合する工程。
【請求項６】
唾液を収集するための容器およびRNAlater(商標)組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、ヒトの疾患状態の検出および診断、ならびにそれに関連する方法に関する。より詳しくは、本発明は、唾液中の遺伝子産物の測定を通して、疾患状態の進行を診断、同定およびモニタリングする際に有用であるプローブおよび方法に関係する。
【０００２】
政府の所有権
米国特許法第202条(c)に従って、アメリカ合衆国政府は、米国国立衛生研究所、助成金番号UO1 DE15018およびRO1 DE15018からの資金を用いて部分的になされた、本明細書に記載される発明において特定の権利を有することが認められる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
唾液は、血清の受動的「限外濾過液」ではないが(Rehak, N.N. et al. 2000 Clin Chem Lab Med 38:335-343(非特許文献１))、酵素、ホルモン、抗体、および他の分子の独特の組成物を含む。過去10年間、診断液としての唾液の使用は、診断において首尾よく適用され、種々の症状についてのリスクがある集団を予測してきた(Streckfus, C.F. & Bigler, L.R. 2002 Oral Dis 8:69-76(非特許文献２))。唾液中の診断用バイオマーカーは、カリエス、歯周炎、口腔癌、唾液腺疾患、および全身性障害、例えば、肝炎およびHIVをモニターするために同定されてきた(Lawrence, H.P. 2002 J Can Dent Assoc 68: 170-174.(非特許文献３))。
【０００４】
ヒトの遺伝子変化は、細胞内と細胞外の両方で検出可能である(Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1058(非特許文献４))。核酸は、血液、尿および脳脊髄液を含む大部分の体液中で同定されており、疾患の診断用バイオマーカーとしての使用のために首尾よく採用されてきた(Anker, P. et al. 1999 Cancer Metastasis Rev 18:65-73(非特許文献５); Rieger-Christ, K.M. et al. 2003 Cancer 98:737-744(非特許文献６); Wong, L.J. et al. 2003 Cancer Res 63:3866-3871(非特許文献７))。最近の関心は、唾液中で核酸マーカーを検出することに発展してきた。今日まで、唾液中のDNAまたはRNAの大部分は、ウイルス起源または細菌起源であることが見い出された(Stamey, F.R. et al. 2003 J Virol Methods 108:189-193(非特許文献８); Mercer, D.K. et al. 2001 FEMS Microbiol Lett 200:163-167(非特許文献９))。口腔癌患者の唾液において腫瘍細胞DNA異質性を実証する限られた数の報告が存在している(Liao P.H. et al. 2000 Oral Oncol 36:272-276(非特許文献１０); El-Naggar, A.K. et al. 2001 J Mol Diagn 3:164-170(非特許文献１１))。本発明者らは、唾液中で検出可能であるヒトmRNAの公開された証拠を見い出していない。
【０００５】
130万例を超える新規な癌の症例が、米国において2004年に診断されると予測されている(Cancer facts and figures 2004. Atlanta: American Cancer Society, 2004)。癌は、本年、約563,700例の米国人の死を引き起こし、毎分一人が亡くなっている。これらの数は、癌治療の進歩にも関わらず、過去10年間にわたり着実に増加してきた。さらに、口腔癌のようないくつかの癌については、全体的な5年生存率は、過去数十年間で改善されておらず、約30〜50%と低いままである(Epstein, J.B. et al. 2002 J Can Dent Assoc 68: 617-621(非特許文献１２); Mao, L. et al. 2004 Cancer Cell 5: 311-316(非特許文献１３))。予後診断の改善の欠如における決定的な要因は、有意な割合の癌が初期には無症候性病変であり、かつこれらが進行した段階に達するまで診断または治療されないという事実である。癌の初期の検出は、この病気からの死亡を減少させるために最も有効な手段である。
【０００６】
癌細胞の遺伝子異常は遺伝子発現パターンの変化をもたらし、これは、得られる癌の表現型が現れるよりずっと前に同定することができる。同じ起源の正常組織と比較して、癌において独占的または優先的に生じる変化は、分子バイオマーカーとして使用することができる(Sidransky, D. 2002 Nat Rev Cancer 2:210-219, 2002(非特許文献１４))。正確に同定されると、バイオマーカーは、癌の早期検出および癌のリスク評価のための新たな手段を提供し、ならびにそのための主要な標的を構成する可能性がある。種々の核酸ベースのバイオマーカーは、癌の検出のための新規かつ強力なツールとして実証されてきた(Hollstein, M. et al. 1991 Science 253:49-53(非特許文献１５); Liu, T. et al. 2000 Genes Chromosomes Cancer 27:17-25(非特許文献１６); Groden, J. et al. 1991 Cell 66:589-600(非特許文献１７))。しかし、これらのマーカーの大部分は、癌細胞株または後期の侵襲性癌および転移性癌からの生検試料のいずれかにおいて同定されてきた。我々は、その最初期段階の癌をバイオマーカーを使用して検出する、我々の能力においてなお限定されている。さらに、生検の侵襲的な性質は、高リスク集団における癌のスクリーニングのためにこれを不適切にする。このことは、初期の検出を改善する、新規な診断ツールを開発するための回避できない必要性を示唆する。その最初期段階または前癌段階における癌の発生を予測する、体液中の分子マーカーの同定は、このようなツールを構成する。
【０００７】
【非特許文献１】Rehak, N.N. et al. 2000 Clin Chem Lab Med 38:335-343
【非特許文献２】Streckfus, C.F. & Bigler, L.R. 2002 Oral Dis 8:69-76
【非特許文献３】Lawrence, H.P. 2002 J Can Dent Assoc 68: 170-174
【非特許文献４】Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1058
【非特許文献５】Anker, P. et al. 1999 Cancer Metastasis Rev 18:65-73
【非特許文献６】Rieger-Christ, K.M. et al. 2003 Cancer 98:737-744
【非特許文献７】Wong, L.J. et al. 2003 Cancer Res 63:3866-3871
【非特許文献８】Stamey, F.R. et al. 2003 J Virol Methods 108:189-193
【非特許文献９】Mercer, D.K. et al. 2001 FEMS Microbiol Lett 200:163-167
【非特許文献１０】Liao P.H. et al. 2000 Oral Oncol 36:272-276
【非特許文献１１】El-Naggar, A.K. et al. 2001 J Mol Diagn 3:164-170
【非特許文献１２】Epstein, J.B. et al. 2002 J Can Dent Assoc 68: 617-621
【非特許文献１３】Mao, L. et al. 2004 Cancer Cell 5: 311-316
【非特許文献１４】Sidransky, D. 2002 Nat Rev Cancer 2:210-219, 2002
【非特許文献１５】Hollstein, M. et al. 1991 Science 253:49-53
【非特許文献１６】Liu, T. et al. 2000 Genes Chromosomes Cancer 27:17-25
【非特許文献１７】Groden, J. et al. 1991 Cell 66:589-600
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本研究の目的は、正常被験体から得られた無細胞唾液中でのトランスクリプトームプロフィールを決定することである。高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイが、全体的なトランスクリプトームプロファイリングのために使用された。唾液トランスクリプトームパターンが、唾液トランスクリプトーム診断適用のための参照データベースを生成するために使用された。
【０００９】
唾液は、他の体液と同様に、ヒトの健康および疾患をモニターするために使用されてきた。本研究は、情報を与えるヒトmRNAが無細胞唾液中に存在することを示す。唾液mRNAは、口腔疾患および全身性疾患について高いリスクがある集団および患者を同定するための強力なバイオマーカーを提供する。高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイが、唾液mRNAをプロファイリングするために使用された。これらの結果は、無細胞唾液中に数千ものヒトmRNAが存在していることを実証した。定量的PCR(Q-PCR)分析は、本発明者らのマイクロアレイ研究によって同定されるmRNAの存在を確認した。参照データベースは、正常唾液中のmRNAプロフィールに基づいて生成された。本発明の1つの態様において、唾液トランスクリプトーム診断(STD)は、疾患診断ならびに正常な健康の監視において使用される。
【００１０】
別の態様において、唾液トランスクリプトーム診断のための唾液RNAの最適な保存のための実用的、使い勝手の良い、室温プロトコールが開発された。
【００１１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ヒトの疾患状態の初期検出、診断、および予後診断に関する。疾患状態を有する個体の唾液からの特定の配列の発現されたRNA分子、またはこれらのRNA分子から発現されたポリペプチドの形態の疾患状態のマーカーが開示される。これらのマーカーは、疾患状態の指標であり、および正常な被験体中での発現と比較して示差的に発現した場合に、患者における疾患状態の存在について診断する。このようなマーカーは、当技術分野における先行技術よりも顕著な利点を提供する。これらは、唾液試料中で検出されるので、試料が採取され得る前に個体が疾患状態(例えば、腫瘍)を示すことを疑う必要がなく、加えて、唾液試料の取り出しは、組織生検または血液の取り出しよりも、患者に対する侵襲性および痛みがはるかに少ない。従って、開示される検出方法は、無症候性個体の広範なスクリーニングのために適切である。
【００１２】
実施例1
マイクロアレイ技術を使用した無細胞唾液のRNAプロファイリング
材料および方法
正常被験体
唾液試料を、the UCLA Institutional Review Boardによって認可されたプロトコールに従って、the Medical Center, University of California, Los Angeles (UCLA), CAにおけるthe Division of Otolaryngology, Head and Neck Surgeryからの10例の正常ドナーから得た。以下の試験対象患者基準を使用した:年齢≧30歳;悪性腫瘍、免疫不全、自己免疫障害、肝炎、HIV感染または喫煙の履歴なし。研究集団は、6例の男性および4例の女性から構成され、平均年齢42歳(32歳から55歳の範囲)であった。
【００１３】
唾液の収集および処理
唾液試料を、公開されたプロトコール(Navazesh, M. 1993 Ann N Y Acad Sci 694:72-77)に従って、9amと10amの間に収集した。被験体は、唾液収集の前少なくとも1時間、食べること、飲むこと、喫煙または口腔衛生処置を控えるよう要求された。唾液試料を2,600×gで15分間4℃で遠心分離した。唾液上清を細胞相から分離した。次いで、RNase阻害剤(Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX, USA)およびプロテアーゼ阻害剤(Aprotinin, Sigma, St. Louis, MO, USA)を、無細胞唾液上清に加えた。
【００１４】
無細胞唾液からのRNA単離
RNAを、製造業者(QIAamp Viral RNA kit, Qiagen, Valencia, CA, USA)からの修飾プロトコールを使用して無細胞唾液上清から単離した。AVL緩衝液(2,240μL)と十分に混合した唾液(560μL)を、室温で10分間インキュベートした。無水エタノール(2,240μL)を加え、この溶液を、6,000×gで1分間の遠心分離によってシリカカラムを通過させた。次いで、このカラムを2回洗浄し、20,000×gで2分間遠心分離し、および9,000×gで2分間、30μLのRnaseを含まない水で溶出した。RNAのアリコートを、RNaseを含まないDNase(DNase I-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX, USA)を用いて、製造業者の指示書に従って処理した。単離したRNAの品質は、3つのハウスキーピング遺伝子転写物:グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、アクチン-β(ACTB)およびリボソームタンパク質S9(RPS9)についてのRT-PCRによって試験した。プライマーは、以下のように、PRIMER3ソフトウェア(genome.wi.mit.edu)を使用して設計され、および商業的に合成された(Fisher Scientific, Tustin, CA, USA):
GAPDHについて
2008515384.tif 000003
ACTBについて
2008515384.tif 000004
RPS9について
2008515384.tif 000005
。RNAの量は、Ribogreen(登録商標) RNA定量キット(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を使用して見積もった。
【００１５】
標的cRNAの調製
単離されたRNAは、公開された方法に従って、線形増幅に供した(Ohyama, H. et al. 2000 Biotechniques 29:530-536)。手短に述べると、プライマーとしてT7-オリゴ-(dT)24を使用する逆転写を、第1鎖cDNAを合成するために実施した。第1のラウンドのインビトロ転写(IVT)は、T7 RNAポリメラーゼ(Ambion Inc., Austin, TX, USA)を使用して実行した。BioArray(商標) High Yield RNA Transcript Labeling System (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)を、cRNA産物をビオチン化するために第2のラウンドのIVTのために使用した;標識したcRNAを、GeneChip(登録商標) Sample Cleanup Module (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)を使用して精製した。cRNAの量および品質を、分光光度法およびゲル電気泳動によって決定した。単離工程および増幅工程の各々からの少量のアリコートを使用して、RT-PCRによって品質を評価した。断片化されたcRNA(Kelly, J.J. et al. 2002 Anal Biochem 311:103-118によって記載されるように調製)の品質は、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)を使用するキャピラリー電気泳動によって評価した。
【００１６】
HG-U133Aマイクロアレイ分析
約19,000個の遺伝子を表す22,215個のヒト遺伝子cDNAプローブセットを含む(すなわち、各遺伝子が1つより多くのプローブセットによって表され得る)AffymetrixヒトゲノムU133Aアレイを、遺伝子発現プロファイリングのために適用した。アレイデータは標準化し、Microarray Suite (MAS) ソフトウェア (Affymetrix)を使用して分析した。検出p値を各プローブセットについて得た。p<0.04を有する任意のプローブセットを「存在する」に割り当て、これは一致した遺伝子転写物が確実に検出されることを示す(Affymetrix, 2001)。各アレイ上の存在するプローブセットの総数を得、存在する遺伝子の存在パーセント(P%)を計算した。Gene Ontology Mining Tool (netaffx.com)を使用することによって、選択された遺伝子(10個すべてのアレイ上に存在する、p<0.01)上で機能的分類を実施した。
【００１７】
Q-PCRによる定量的遺伝子発現分析
Q-PCRを、iCycler(商標) thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して実施した。単離された唾液RNA(増幅なし)の2μLアリコートを、MuLV Reverse Transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を使用してcDNAに逆転写した。得られるcDNA(3μL)を、iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用するPCR増幅のために使用した。プライマーは、Sigma-Genosys (Woodlands, TX, USA)によって以下のように合成した:
インターロイキン1-β(IL1B)について
2008515384.tif 000006
ストラティフィン(SFN)について
2008515384.tif 000007
チューブリン-α、遍在性(K-ALPHA-1)について
2008515384.tif 000008
。すべての反応を、特異的PCR産物についてカスタマイズされた条件を用いて、3連で実施した。特定の鋳型のcDNAの初期量は、LightCyclerソフトウェア3.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を使用して標準曲線から外挿した。標準曲線による定量についての詳細な手順は以前に記載されている(Ginzinger, D. 2002 Exp Hematol 30:503-512)。
【００１８】
結果
RNAの単離および増幅
平均で、60.5±13.1ng(n=10)の全RNAを560μLの無細胞唾液試料から得た(表1)。RT-PCRの結果は、10個すべての唾液試料が、ハウスキーピング遺伝子:GAPDH、ACTBおよびRPS9をコードするmRNAを含むことを実証した。これらの遺伝子のmRNAは、-80℃において6ヶ月より長くの間、有意な分解なしで保存することができた(図1)。2ラウンドのT7 RNA線形増幅後、ビオチン化cRNAの平均収量は、A260/280=2.067を用いて42.2±3.9μgであった(表1)。
【００１９】
（表1）10例の正常ドナーから得られた無細胞唾液における遺伝子発現プロファイリング
2008515384.tif 000009
a560μL無細胞唾液上清中の全RNA量
b2ラウンドのT7増幅後のcRNA量
cHG U133Aマイクロアレイ上の存在コールを示すプローブの数(検出p<0.04)
d存在パーセンテージ(P%)=存在コールに割り当てられたプローブの数/全体のプローブの数(HG U133A マイクロアレイについて22,283)
【００２０】
cRNAは断片化の前には200bpから4kbまでの範囲であり;および断片化後には約100bpまで濃縮された。cRNAプローブの品質は、ハイブリダイゼーションの前にキャピラリー電気泳動によって確認した。ACTB mRNAは、もともとの試料、ならびに各増幅段階:第1のcDNA、第1のインビトロ転写(IVT)、第2のcDNAおよび第2のIVTからの産物に対するPCR/RT-PCRを使用して検出可能であった(図2)。
【００２１】
唾液mRNAのマイクロアレイプロファイリング
10例の正常被験体の唾液mRNAプロフィールは、22,283個のcDNAプローブを含むHG U133Aアレイを使用して得た。平均で3,143±665.0個のプローブセット(P<0.04)を、割り当てられた存在コールを有する各アレイ(n=10)上で見い出した。これらのプローブセットは、約3,000個の異なるmRNAを表す。平均の存在コールのパーセンテージは14.11±2.98%(n=10)であった。10個のアレイからのデータを含む参照データベースを生成した。GAPDH、ACTBおよびRPS9を表すプローブセットは、10個すべてのアレイ上に存在コールを割り当てた。検出p<0.01を有する、10個すべてのアレイ上に存在コールを割り当てた185個の遺伝子を表す全体で207個のプローブセットが存在した。これらの遺伝子は、生物学的プロセスおよび分子機能におけるそれらの既知の役割に基づいて分類した(表2)。185個の遺伝子の主要な機能は、細胞の増殖/維持(119個の遺伝子)、分子結合(118個の遺伝子)および細胞構造組成(95個の遺伝子)に関連する。これらを、「正常唾液コアトランスクリプトーム(NSCT)」と名付けた。
【００２２】
（表2）10例の正常ドナーからの無細胞唾液中の185個の遺伝子の生物学的プロセスおよび分子機能(Gene Ontology Mining Toolを使用することによって得られたデータ)
2008515384.tif 000010
a1つの遺伝子は複数の分子機能を有するか、または異なる生物学的プロセスに関与する可能性がある。
b特定の群/亜群に分類された遺伝子の数。
【００２３】
Q-PCR確認および定量分析
リアルタイム定量的PCR(Q-PCR)を、185個の「正常唾液コアトランスクリプトーム」遺伝子から選択された遺伝子を定量することによって、唾液中のヒトmRNAの存在を確認するために使用した。IL1B、SFNおよびK-ALPHA-1をランダムに選択し、確認のために10個すべてのアレイ上で存在コールを割り当てた。Q-PCRの結果は、IL1B、SFNおよびK-ALPHA-1のmRNAが10個すべてのもともとの未増幅の無細胞唾液中で検出可能であったことを示した。これらの転写物(n=10)の相対量(コピー数)は:IL1Bについて8.68×103±4.15×103;SFNについて1.29×105±1.08×1O5;およびK-ALPHA-1について4.71×106±8.37×105であった。Q-PCRによって測定されるこれらの遺伝子の相対的なRNA発現レベルは、マイクロアレイによって測定されたものと同様であった。
【００２４】
唾液は、理想的な診断媒体として働くための安価な、非侵襲性かつ利用しやすい体液の要求性を満たしている。唾液中の特異的かつ情報を与えるバイオマーカーは、疾患を診断し、およびヒトの健康をモニターするために役立つことが非常に必要とされている(Bonassi, S. et al. 2001 Mutat Res 480-481:349-358; Streckfus, C.F. et al. 2002 Oral Dis 8:69-76; Sidransky, D. 2000 Nat Reviews 3:210-219)。唾液中の構成成分を知ることは、疾患の診断のための潜在的なバイオマーカーを同定するためにこの媒体を使用するために必須である(Pusch, W. et al. 2003 Pharmacogenomics 4:463-476)。本発明の前に、1つの批判は、情報を与える分子は、一般的に、唾液中で少ない量で存在するという考えであった。しかし、新たな増幅技術および高感度のアッセイを用いて、これはもはや制限でないかもしれない(Xiang, C.C. et al 2003 Nucleic Acids Res 31:e53)。本実施例において、ヒトRNAは、無細胞唾液上清から首尾よく単離された。唾液mRNAの品質は、RT-PCR、Q-PCRおよびマイクロアレイ実験における使用のために十分であることが判明した。
【００２５】
唾液と他の体液(例えば、血液)の間には、唾液がもともと微生物を含むという点で、明確な違いが存在している(Sakki, T. & Knuuttila, M. 1996 Eur J Oral Sci 104:619-622)。加えて、いくつかの外来性の物質(例えば、食物の残骸)が、唾液の組成をより複雑にする。それゆえに、バイオマーカーを検出するための媒体として、全唾液の代わりに、唾液の液体/上清相を使用することが、より単純かつより正確である。本実施例において、ペレットおよび唾液上清を分離するための条件は、液体の無細胞相中で検出されるRNAに寄与する、細胞要素の機械的破裂を回避するために最適化された(St. John, M.A.R. et al. 2004, 印刷中)。これらの結果は、トランスクリプトーム分析のために無細胞唾液を使用することが実行可能かつ効率的であることを実証する。ヒトmRNAが無細胞唾液上清に存在することは新たな知見であるが、核酸は、他の無細胞体液中で長い間検出されており、続いて疾患診断のために使用されてきた(Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1058)。例えば、特異的発癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子およびマイクロサテライト変化は、患者の血清中で同定されてきた(Anker, P. et al. 2003 Int J Cancer 103:149-152)。さらに、腫瘍mRNAは、異なる悪性度を有する患者の血清から、単離および増幅されてきた(Kopreski, M.S. et al. 1999 Clin Cancer Res 5:1961-1965; Fleischhacker, M. et al 2001 Ann NY Acad Sci 945:179-188)。これらの細胞外で検出されたゲノムメッセンジャーが疾患のためのバイオマーカーとして働くことができることは広く受け入れられている(Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1058)。
【００２６】
本発明者らの知見では、これは、唾液中のヒトmRNAが全体的にプロファイルされる最初の報告である。マイクロアレイ技術を使用して、本発明者らは、約3,000個の異なるヒトmRNAが、各々の正常被験体の無細胞唾液中に存在することを発見した。正常集団からの無細胞唾液中の唾液トランスクリプトームパターンは、健康モニタリングデータベースとして働くことが想定される。ここで、本発明者らが今では、30,000個を超える遺伝子から構成されるヒトゲノムを知っていること(Venter J.C. et al. 2001 Science 291:1304-1351)、ならびに本実施例において使用されたHG U133Aマイクロアレイ上のプローブセットが〜19,000個のヒト遺伝子のみを表し、HG U133Aマイクロアレイによって検出できないさらなる遺伝子転写物は、無細胞唾液中に存在することが予測され、本発明を使用して検出することができることが注目されるべきである。本実施例において同定された遺伝子転写物、特に、正常唾液コアトランスクリプトーム(NSCT)mRNAは、正常な無細胞唾液の共通のトランスクリプトームを表す。本発明者らは、異なる、情報を与える、および診断的なトランスクリプトームが、種々の疾患状態を有する患者からの唾液中で同定することができることを想定している。それゆえに、ヒト唾液mRNAは、口腔において徴候が現れる口腔および全身の疾患のために診断マーカーとして使用することが想定される。
【００２７】
本発明の1つの態様において、唾液トランスクリプトーム診断薬が、正常患者の健康をモニターするために使用される。別の態様において、唾液トランスクリプトーム診断薬は、癌(例えば、前立腺癌、結腸癌、乳癌、肺癌、口腔癌など)、ならびに全身性疾患、例えば、自己免疫疾患、糖尿病、骨粗鬆症;神経性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病などについての初期診断のための、疾患のためのマーカーを検出するために使用される。
【００２８】
実施例2
口腔癌検出のための唾液トランスクリプトーム診断薬
目的:口腔体液(唾液)は、非侵襲性で、利用しやすく、かつ高度に効率的な診断媒体のための要求性を満たしている。ヒトRNAの大きな一団を唾液中で確実に検出することができるという本発明者らの発見は、新規な臨床的アプローチ、唾液トランスクリプトーム診断を生じる。本実施例において、本発明者は、原理を証明する疾患として口腔扁平上皮癌(OSCC)を使用することによって、この新規なアプローチの診断的価値を評価する。
【００２９】
原発性腫瘍に存在する同一の変異は、罹患した患者からの試験された体液中で同定することができることが示された(Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1059)。血液、尿および脳脊髄液(CSF)中の癌関連核酸は、癌診断のためのバイオマーカーとして使用されてきた(Anker, P. et al 1999 Cancer Metastasis Rev 18:65-73; Rieger-Christ, K.M. et al. 2003 Cancer 98:737-744; Wong, L.J. et al. 2003 Cancer Res 63:3866-3871)。より最近では、血清または血漿中のmRNAバイオマーカーは、癌を有する患者におけるRT-PCRベースの検出方針のための標的であった(Kopreski, M.S. et al. 2001 Ann N Y Acad Sci 945:172-178; Bunn, P.J., Jr. 2003 J Clin Oncol 21:3891-3893)。体液中でのこのようなバイオマーカーの数の増加と並行して、遺伝子変化についての集団検診を可能にする、より強力かつコスト効果の高い方法を使用する技術の利用可能性が増大している。ヒトmRNAの大きな一団が唾液中に存在しているという、マイクロアレイ技術による本発明者らの発見(実施例1)は、疾患診断における応用のため、ならびに正常な健康の監視のための新規な臨床的アプローチ、唾液トランスクリプトーム診断を提供する。これは、唾液からのRNAの痕跡を役立てるための、ハイスループットの、強固な、かつ再現性のあるアプローチである。さらに、診断用体液として唾液を使用することは、安価な、非侵襲性の、かつ利用しやすい診断用方法論のための要件を満たす(Lawrence, H.P. 2002 J Can Dent Assoc 68:170-174, 2002)。本実施例において、本発明者らは、明確なmRNA発現パターンが癌患者からの唾液中で同定でき、示差的に発現された転写物が癌検出のためのバイオマーカーとして働くことができるという仮説を試験した。本研究における原理を証明する疾患は、口腔扁平上皮癌(OSCC)である。理論的根拠は、口腔癌細胞が唾液環境中に浸漬され、遺伝子の異質性がOSCCを有する患者からの唾液中で検出されてきたことである(El-Naggar, A.K et al. 2001 J Mol Diagn 3:164-170; Liao, P.H et al. 2000 Oral Oncol 36:272-276, 2000)。
【００３０】
実験設計:刺激されていない唾液を、一致した年齢、性別および喫煙の履歴を有する、原発性T1/T2 OSCCを有する患者(n=32)および正常被験体(n=32)から収集した。RNA単離を、唾液上清から実施し、続いてT7 RNAポリメラーゼを使用して、2ラウンドの線形増幅を行った。ヒトゲノムU133Aマイクロアレイを、ヒト唾液トランスクリプトームをプロファイリングするために適用した。10例の一致した癌患者および対照に対するt検定比較および倍数変化分析を組み合わせることによって、異なる遺伝子発現パターンを分析した。定量的PCR(qPCR)を使用して、マイクロアレイによって有意な差(p<0.01)を示した、選択された遺伝子を確認した。これらの唾液mRNAバイオマーカーの予測される能力は、受信者動作特性曲線および分類モデルによって分析した。
【００３１】
結果:マイクロアレイ分析は、癌患者と対照の間の、唾液中で有意に異なる発現レベル(P<0.05)を示した1,679個の遺伝子を示した。OSCC唾液中で少なくとも3.5倍の上昇(P<0.01)を示した7個の癌関連RNAバイオマーカーは、OSCC患者(n=32)および対照(n=32)からの唾液試料に対するqPCRによって一貫して確認した。これらの唾液RNAバイオマーカーは、インターロイキン8(IL-8)、インターロイキン1-β(IL1B)、二重特異的ホスファターゼ1(DUSP1)、H3ヒストン、ファミリー3A(HA3A)、オルニチンデカルボキシラーゼアンチザイム1(OAZ1)、S100カルシウム結合タンパク質PS(100P)およびスペルミジン/スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼ(SAT)の転写物である。これらのバイオマーカーの組み合わせは、対照からOSCCを区別する際に、感度(91%)および特異性(91%)を生じた。
【００３２】
結論:唾液トランスクリプトーム診断の有用性は、口腔癌検出のための本研究において首尾よく実証された。この新規な臨床的アプローチは、初期の癌検出のための強固な、ハイスループットの、かつ再現性のあるツールとして想定される。唾液トランスクリプトームプロファイリングは、他の主要な疾患、ならびに正常な健康の監視を評価するために、応用することが想定される。
【００３３】
患者および方法
患者の選択  口腔扁平上皮癌(OSCC)患者は、University of California, Los Angeles (UCLA); University of Southern California (USC), Los Angeles, CA;およびUniversity of California San Francisco (UCSF), San Francisco, CAの医療センターから募集した。原発性T1またはT2 OSCCと記録されている32名の患者を本研究に含めた。すべての患者は最近、原発性疾患と診断されており、化学療法、放射線療法、外科手術、または代替療法の形式の任意の事前の治療を受けていなかった。類似の喫煙の履歴を有する、年齢および性別が一致する同じ数の被験体を、対照群として選択した(St. John, M.A.R et al. 2004 IL-6 and IL-8: Potential Biomarkers for Oral Cavity and Oropharyngeal SCCA. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, 印刷中)。2つの被験体群の間で、平均年齢:OSCC患者、49.8±7.6年;正常被験体、49.1±5.9年(スチューデントt検定P>0.80);性別(P>0.90);または喫煙の履歴(P>0.75)に関して、有意な違いは存在しなかった。被験体は、以前の悪性疾患、免疫不全、自己免疫障害、肝炎、またはHIV感染の病歴を有していなかった。すべての被験体は、実験のための唾液ドナーとして働くことに同意する旨の、施設内審査委員会によって認可された同意書に署名した。
【００３４】
唾液収集およびRNA単離  非刺激唾液試料を、以前に確立されたプロトコール(Navazesh, M. 1993 Ann N Y Acad Sci 694:72-77)を用いて、9amと10amの間に収集した。被験体は、唾液収集の前少なくとも1時間、食べること、飲むこと、喫煙または口腔衛生処置を控えるよう要求された。唾液試料を2,600×gで15分間4℃で遠心分離した。上清をペレットから除去し、RNase阻害剤(Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX)で処理した。RNAを、QIAamp Viral RNAキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して、560μlの唾液上清から単離した。単離したRNAのアリコートを、製造業者の指示書に従って、RNaseフリーDNase(DNaseI-DNA-free, Ambion Inc., Austin, TX)で処理した。単離したRNAの品質は、3つの細胞維持遺伝子転写物:グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、アクチン-β(ACTB)およびリボソームタンパク質S9(RPS9)についてのRT-PCRによって試験した。3つすべての遺伝子についてのPCR産物を示す試料のみを、次の分析のために使用した。
【００３５】
マイクロアレイ分析  10例のOSCC患者からの唾液(7例の男性、3例の女性、年齢=52±9.0)ならびに10例の性別および年齢が一致する正常ドナー(年齢=49±5.6)からの唾液を、マイクロアレイ研究のために使用した。唾液から単離したRNAを、RiboAmp(商標) RNA増幅キット(Arcturus, Mountain View, CA)による線形増幅に供した。RNA増幅効率を、5回の独立した実行における20個の試料と並行して実行する、既知量(0.1μg)の対照RNAを使用することによって測定した。実施例1に記載したプロトコールに従って、AffymetrixヒトゲノムU133Aアレイ(HG U133A, Affymetrix, Santa, Clara, CA)を、遺伝子発現分析のために適用した。
【００３６】
アレイをスキャンし、蛍光強度をMicroarray Suit 5.0ソフトウェア(Affimetrix, Santa Clara, CA)によって測定し、次いで、正規化およびモデルに基づく分析のために、DNA-Chip Analyzerソフトウェアに読み込んだ(Li, C. & Wong, W.H. 2001 PNAS USA 98:31-36)。S-plus 6.0 (Insightful, Seattle, WA)を、すべての統計学的試験を実行するために使用した。3つの判断基準を、示差的に発現された転写物を決定するために使用した。第1に、本発明者らは、すべての試料において「非存在」コールとして割り当てられた、アレイ上のプローブセットを除外した。第2に、両側スチューデントt検定を、OSCC(n=10)と対照(n=10)の間の平均遺伝子発現シグナル強度の比較のために使用した。0.05の臨界αレベルを、統計学的有意さとして規定した。第3に、倍数比率を、統計学的に有意な違い(P<0.05)を示した遺伝子転写物について計算した。少なくとも2倍の変化を示した遺伝子転写物のみを、さらなる分析のために含めた。
【００３７】
定量的PCR確認  qPCRを、マイクロアレイ分析によって同定された示差的に発現された転写物のサブセットを確認するために実施した。MuLV逆転写酵素(Applied Biosystems, Foster City, CA)、およびプライマーとしてランダムヘキサマー(ABI, Foster City, CA)を使用して、本発明者らは、もともとのかつ増幅していない唾液RNAからcDNAを合成した。qPCR反応を、iCycler(商標) PCRシステム(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)、iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA)中で実施した。プライマーセットを、PRIMER3ソフトウェアを使用することによって設計した。すべての反応を、特定の産物のためにカスタマイズした条件を用いて3連で実施した。特定の鋳型のcDNA/RNAの初期量を、以前に記載されたように、標準曲線から外挿した(Ginzinger, D.G. 2002 Exp Hematol 30:503-512)。この確認は、マイクロアレイ研究のために以前に使用された20個を含む、すべての試料(n=64)を試験することによって完了した。ウィルコクソン符号順位検定を、統計学的分析のために使用した。
【００３８】
受信者動作特性(ROC)曲線分析および予測モデル  RT-qPCRの結果を利用して、ROC曲線分析(Grunkemeier, G.L. & Jin, R. 2001 Ann Thorac Surg 72:323-326)を、S-plus 6.0によって行い、各々のバイオマーカーの予測能力を評価した。最適切点を、最大の対応する感度および特異性を生じたものを検索することによって、各バイオマーカーについて決定した。次いで、ROC曲線を、最適な感度および特異性の値のセットに基づいてプロットした。曲線の下の面積を、ROC曲線の数値積分法を介して算出した。ROC曲線の下の最大面積を有するバイオマーカーを、OSCCを検出することに関する最大の予測能力を有すると同定した。
【００３９】
次に、多変量分類モデルを、癌予測のための唾液マーカーの最良の組み合わせを決定するために構築した。最初に、独立変数として、疾患(OSCC)および非疾患(正常)の2値結果を使用して、ロジスティック回帰モデルを構築し、患者の年齢、性別、および喫煙の履歴について制御した。逆方向段階的回帰(backward stepwise regression)(Renger, R. & Meadows, L.M. 1994 Acad Med 69:738)を使用して、最良の最終モデルを見い出した。1要素除外交差確認(leave-one out cross validation)を使用して、ロジスティック回帰モデルを確認した。交差確認方針は、最初に1つの観察を除外し、次いで、すべてのマーカーを使用して、残りの場合からロジスティック回帰モデルをフィットさせる。段階的モデル選択は、モデルを改善しない変数を除去するために、これらのモデルの各々について使用した。その後に、その観察のために予測されたクラスを算出するために除外された場合について、マーカー値を使用した。次いで、交差確認エラー率は、試料の数で除算した、不正確に予測された試料の数であった。次いで、ROC曲線は、感度および特異性の算出のための可能な切点として、モデルからのフィットした確率を使用して、同様の手順によってロジスティックモデルについて算出した。
【００４０】
第2に、ツリーベースの分類モデルである、分類および回帰ツリー(CART)を、S-plus 6.0によって、予測変数として確認されたmRNAバイオマーカーを使用して構築した。CARTは、2値再帰分配によって分類モデルにフィットさせ、ここで各段階は、正常群に対する癌の最良の分割を生じる予測変数について検索することを含む(Lemon, S. C. et al. 2003 Ann Behav Med 26:172-181)。CARTは、S-plusについてデフォルト設定によって決定された分割判断基準とともに、エントロピー関数を使用した。このアプローチによって、全体の試料(n=64)を含む親の群は、その後、癌群および正常群に分けられた。最初のツリーは、異なる分類を有する亜枝を生じなかったすべての分割を除去するように切り取った。
【００４１】
結果
平均で、54.2±20.1ng(n=64)の全RNAを、560μlの唾液上清から得た。OSCCと、年齢および性別を一致させた対照との間で、全RNA量の有意な違いは存在しなかった(t検定、P=0.29、n=64)。RT-PCRの結果は、唾液試料のすべて(n=64)が、ヒト唾液RNAの品質対照として使用した3つの遺伝子(GAPDH、ACTBおよびRPS9)からの転写物を含むことを実証した(実施例1を参照されたい)。一貫した増幅の大きさ(658±47.2、n=5)は、2ラウンドのRNA増幅後に得ることができた。平均して、ビオチン化cRNAの収量は、39.3±6.0μg(n=20)であった。OSCCと対照の間で生じたcRNAの量の有意な違いは存在しなかった(t検定、P=0.31、n=20)。
【００４２】
HG U133Aマイクロアレイは、癌患者と、一致する正常被験体との間で唾液プロフィールRNAの違いを同定するために使用した。以前に記載された判断基準によって含まれる10,316個の転写物の中で、0.05未満のP値を有する1,679個の転写物を同定した。これらの転写物の中で、OSCC群において、836個が上方制御され、843個が下方制御された。観察されたこれらの転写物は、偶然のみに起因することはなさそうであり(χ2検定、p<0.0001)、p<0.05を使用して偽陽性と見なした。10例すべてのOSCC唾液試料における>3倍の調節の変化の所定の判断基準、およびより厳密なP値<0.01のカットオフを使用して、本発明者らは、表3に提示するような17個の転写物を同定した。これらの17個の唾液mRNAは、すべてがOSCC唾液中で上方制御されたのに対して、同じ選別判断基準を使用して、下方制御されることが見い出されたmRNAは存在しなかった。これらの遺伝子の生物学的機能は表3に提示される。
【００４３】
（表3）マイクロアレイによって同定された、OSCCにおいて上方制御される(>3倍、p<0.01)唾液mRNA
2008515384.tif 000011
ヒトゲノムU133Aマイクロアレイを、10例の癌患者および10例の一致した正常被験体からの唾液におけるRNA発現パターンの違いを同定するために使用した。すべてのOSCC唾液試料における>3倍の調節の変化の判断基準、およびP値<0.01のカットオフを使用して、OSCC唾液中で有意な上方制御を示す17個のmRNAを同定した。
【００４４】
定量的PCRを、32例のOSCCを有する患者および32例の一致した対照からの唾液を含む、拡大された試料サイズに対して、マイクロアレイの知見を確認するために実施した。9個の唾液mRNAバイオマーカー候補:DUSP1、GADD45B、H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1、RGS2、S1OOPおよびSATを、それらの報告された癌との関連性に基づいて選択した(表3)。表4は、qPCRによって決定された、OSCC患者からの唾液におけるそれらの定量的変化を表す。これらの結果は、9個の候補mRNAのうちの7個、DUSP1、H3F3A、IL1B、IL8、OAZ1、S1OOPおよびSATの転写物(78%)が、OSCC患者の唾液中で有意に上昇したことを確認した(ウィルコクソン符号順位検定、P<0.05)。qPCRによるRGS2(P=0.149)およびGADD45B(P=0.116)の量の統計学的に有意な違いは、検出されなかった。確認された7個の遺伝子は、増加の大きさによって、3つのランク:IL8を含む高度に上方制御されたmRNA(24.3倍);H3F3A(5.61倍)、IL1B(5.48倍)およびS1OOP(4.88倍)を含む、中程度に上方制御されたmRNA;ならびにDUSP1(2.60倍)、OAZ1(2.82倍)およびSAT(2.98倍)を含む、低く上方制御されたmRNAに分類することができた。OSCCについての7個の潜在的な唾液mRNAバイオマーカーの各々についての、受信者動作特性(ROC)曲線の下の面積の詳細な統計学、閾値、ならびに対応する感度および特異性は表5に列挙する。これらのデータは、OSCCの存在を予測するための7個の潜在的なバイオマーカー間で、IL-8 mRNAが最高の能力を発揮したことを示した。IL-8についてのROC曲線の下の計算した面積は0.85であった。3.19E-18mol/Lの閾値で、唾液中のIL-8 mRNAは、88%の感度および81%の特異性を生じ、正常からOSCCを区別する。
【００４５】
（表4）唾液中の9個の選択された転写物の定量的PCR確認(n=64)a
2008515384.tif 000012
qPCRを、32例のOSCCを有する患者および32例の一致した対照被験体からの唾液を含む、拡大された試料サイズに対して、マイクロアレイの知見を確認するために実施した。9個の潜在的な唾液mRNAバイオマーカーを、表3に示した17個の候補から選択した。それらの7個をqPCRによって確認した(P<0.05)。試料は、32例のOSCC患者および32例の一致した対照被験体からの唾液を含む。
ウィルコクソン符号順位検定:P<0.05の場合、確認され(あり);P≧0.05の場合、確認されなかった(なし)。
【００４６】
（表5）OSCC関連唾液mRNAバイオマーカーの受信者動作特性(ROC)曲線分析
2008515384.tif 000013
qPCR結果を利用して、本発明者らは、バイオマーカーの各々の予測能力を評価するためにROC曲線分析を実行した。最大の対応する感度および特異性を生じる最適な切点を決定した。ROC曲線の下の最大面積を有するバイオマーカーを、OSCCを検出することに関する最大の予測能力を有するとして同定した。
【００４７】
疾患の識別のための唾液mRNAの有用性を実証するために、2つの分類/予測モデルを試験した。ロジスティック回帰モデルを、組み合わせて最良の予測を提供した、7個の確認したバイオマーカーのうちの4個、IL1B、OAZ1、SATおよびIL-8に基づいて構築した(表6)。係数値はこれらの4個のマーカーについて正であり、唾液中でのこれらの濃度の同期化された上昇は、試料がOSCC被験体から得られた可能性を増加させたことを示す。ロジスティック回帰モデルに基づく1要素除外交差確認エラー率は、19%(12/64)であった。同じ4個のマーカーのセットを使用する1要素除外分析において生成したモデルの1つ以外のすべて(64個から)は、表6において特定される完全データモデルにおいて有意であることが見い出された。ROC曲線を、ロジスティック回帰モデルについて算出した。50%のカットオフ確率を使用して、91%の感度および91%の特異性を得た。ROC曲線の下の計算した面積は、ロジスティック回帰モデルについて0.95であった(図3)。
【００４８】
（表6）ロジスティック回帰モデルによって選択されたOSCCについての唾液mRNAバイオマーカー
2008515384.tif 000014
ロジスティック回帰モデルは、組み合わせて最良の予測を提供した、7個の確認したバイオマーカーのうちの4個(IL1B、OAZ1、SATおよびIL-8)に基づいて構築した。係数値はこれらの4個のマーカーについて正であり、唾液中でのこれらの濃度の同期化された上昇は、試料がOSCC被験体から得られた可能性を増加させたことを示す。
【００４９】
第2のモデル、「分類および回帰ツリー(CART)モデル」を生成した(図4)。フィットしたCARTモデルは、OSCCについての予測変数として、IL-8、H3F3AおよびSATの唾液mRNA濃度を使用した。3.14E-18mol/Lの閾値を用いて初期の分割として選択したIL-8は、全体で64個の試料を含む親の群から2つの子の群を産生した。<3.14E-18mol/LのIL-8濃度を有する30試料を「正常-1」群に割り当てたのに対して、≧3.14E-18mol/LのIL-8濃度を有する34個を「癌-1」に割り当てた。「正常-1」群を、1.13E-14mol/Lの閾値を用いてSATによってさらに分配した。得られる亜群:「正常-2」は、<1.13E-14mol/LのSAT濃度を有する25個の試料を含み、「癌-2」は、≧1.13E-14mol/LのSAT濃度を有する5個の試料を含んだ。同様に、「癌-1」群を、2.07E-16mol/Lの閾値を用いて、H3F3Aによってさらに分配した。得られる亜群:「癌-3」は≧2.07E-16mol/LのH3F3A濃度を有する27個の試料を含み;「正常-3」群は<2.07E-16mol/LのH3F3A濃度を有する7個の試料を含んだ。結果として、本研究に含まれる64個の唾液試料は、CART分析によって、「癌」群および「正常」群に分類された。「正常」群は、「正常-2」群からの試料および「正常-3」群からの試料から構成された。「正常」群において全体で32個の割り当てられた試料が存在し、29個は正常被験体から、および3個は癌患者からであった。従って、OSCC予測のためにIL-8、SAT、およびH3F3Aの組み合わせを使用することによって、全体の感度は90.6%(29/32)である。「癌」群は、「癌-2」群および「癌-3」群からの試料から構成された。最終的な「癌」群において、全体で32個の割り当てられた試料、癌患者からの29個および正常被験体からの3個が存在した。それゆえに、OSCC予測についてのこれら3つの唾液mRNAバイオマーカーの組み合わせを使用することによって、全体の特異性は90.6%(29/32)である。
【００５０】
癌スクリーニングプログラムの目的は、治療が成功する可能性がある十分に初期の段階で腫瘍を検出することである。高い感度および高い特異性の組み合わせた特徴を示すスクリーニングツールが必要とされている。さらに、スクリーニングツールは、広範な適用可能性を許容するために十分に非侵襲性でありかつ安価でなければならない。バイオテクノロジーの顕著な発展ならびに癌の開始および進行の本発明者らの基本的な理解の向上が、今や腫瘍の痕跡、例えば、腫瘍に罹患した器官から流出する体液中の、発癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の変化を同定することを可能にする(Sidransky, D. 1997 Science 278:1054-1059)。本実施例において提示された結果は、唾液トランスクリプトーム診断が、癌の非侵襲的な診断、予後診断および追跡試験の開発のための適切なツールであることを示す。
【００５１】
以前の研究は、ヒトのDNAバイオマーカーが唾液中で同定可能であり、口腔癌の検出のために使用可能であることを示してきた(El-Naggar, A.K et al. 2001 J Mol Diagn 3:164-170; Liao, P.H. et al. 2000 Oral Oncol 36:272-276)。唾液中のヒトmRNAの存在は、翻訳的適用および臨床的適用のための診断用分析物のレパートリーを拡大する。しかし、RNAはDNAよりもより不安定であり、RNaseによる分解に対して高度に感受性であることが推測される。さらに、唾液中のRNase活性は、癌を有する患者において上昇していると報告されている(Kharchenko, S.V. & Shpakov, A.A. 1989 Izv Akad Nauk SSSR Biol 58-63)。従って、ヒトmRNAは唾液中で細胞外的に残ることができないと一般的に推測されている。驚くべきことに、RT-PCRを使用して、本発明者らは、唾液中で着実にヒトmRNAを検出し、従って、唾液に基づく発現プロファイリングに道を開いた。記載された収集および処理プロトコールを使用して、対照RNAの存在は、RT-PCR/qPCRによって、すべての唾液(患者および対照)において確かめられた。RNAの品質は、PCR、qPCRおよびマイクロアレイアッセイのための要求を満たすことができた。本実施例において、本発明者らは、新鮮に収集した口腔液へのRNase阻害剤の迅速な添加、続いて超低温保管(-80℃)を利用した。
【００５２】
本発明者らの報告した知見は、癌および疾患の診断の分野に対して、実質的な関心をもたらす。これらの関心は、唾液に基づく癌についての診断およびスクリーニングの試験が、単純かつ魅力的な概念であるという事実に起因するのみならず、従来の診断的な癌の試験が不完全である傾向があるという事実にもまた起因する。1つの例としての口腔癌を使用して、明白に期待はずれの生存率は、おそらく大部分は診断の遅れに帰する可能性がある(Wildt, J. et al. 1995 Clin Otolaryngol 20:21-25)。多くの口腔癌は、それらの初期段階においては無症候性の小さな病変として生じるので、臨床医または患者が異常な組織に気付いた場合にのみ、公式な診断手順が開始する(Epstein, J.B. et al. 2002 J Can Dent Assoc 68:617-621)。進行性の癌についての顕微鏡レベルは、首尾よい処置のためには多くの場合遅すぎる(Fong, K.M. et al. 1999 in: In: S. S. HD and G. AF (編), Molecular Pathology of Early Cancer, pp. 13-26: IOS Press)。癌のスクリーニングのために画像化技術を使用することもまた、それらが時間がかかり、かつ高価であるので実用的ではない。これらの技術は、小さな病変に対するそれらの感度のなさのため、典型的には、確認のために使用される(Myers, L.L. & Wax, M.K. 1998 J Otolaryngol 27:342-347)。研究は、良好な陽性の予測値が、トルイジンブルーを用いる口腔癌組織染色によって達成することができることを実証した(Mashberg, A. & Samit, A. 1995 CA Cancer J Clin 45:328-351)。しかし、広範な経験が、この技術を応用する際に、およびその結果を解釈する際に必要とされる。脱落細胞診断法は、口腔癌検出のための侵襲性が少ない方法であり得る(Rosin, M.P. et al. 1997 Cancer Res 57:5258-5260)。しかし、脱落した癌細胞は腫瘍負荷と相関する傾向があり、最小のまたは初期の疾患を有する細胞において見られる検出のより低い頻度を伴う。本研究において同定された唾液mRNAバイオマーカーは、OSCC検出のための新たな手段を提供する。唾液トランスクリプトーム診断は、十分な予測能力を有する非侵襲性の診断ツールのための要求を満たす。
【００５３】
正常個体については、唾液RNAの供給源は、以下の3つの供給源:唾液腺(耳下腺、顎下腺、舌下腺ならびに少数の腺)、歯肉溝液および口腔粘膜細胞(内層または剥離したもの)の1つからである可能性がある。口腔癌患者については、検出された癌関連のRNAの痕跡は、一致した腫瘍および/または全身性応答(局所的または遠位性)から生じる可能性があり、これは、3つの主要な供給源(唾液腺、歯肉溝液および口腔粘膜細胞)の各々に由来する全唾液中でそれ自体をさらに反映する。疾患関連RNAは、唾液腺、または歯肉溝液を通した循環を経由しての口腔へのその経路を見い出し得ることが想定可能である。よい例は、乳癌患者の唾液中のHER-2タンパク質の存在の上昇である(Streckfus, C. et al. 2000 Clin Cancer Res 6:2363-2370)。口腔癌については、局所的腫瘍が上昇した唾液mRNAの供給源である。本発明者らは、最近、最も顕著に上昇した口腔癌組織転写物、IL8を選択し、そのタンパク質レベル(ELISAによる)もまた、口腔癌患者の唾液中で有意に上昇していることを確認した(St. John, M.A.R. et al. 2004 IL-6 and IL-8: Potential Biomarkers for Oral Cavity and Oropharyngeal SCCA. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, 印刷中)。Chen et al.は、頭頚部癌組織中でのIL8タンパク質発現の上昇を以前に独立して実証した(Chen, Z. et al. 1999 Clin Cancer Res 5:1369-1379)。これらのデータは、mRNAレベルおよびタンパク質レベルにおいて、腫瘍組織および唾液中での口腔癌関連発現変化の一致した変化を一緒に支持する。
【００５４】
IL8に加えて、DUSP、H3F3A、OAZ1、SAT、S1OOPおよびIL-IBのような、6個の他の癌関連遺伝子が、口腔癌患者からの唾液中で上方制御されると同定された。DUSP1遺伝子は、二重特異性ホスファターゼをコードし、腫瘍サプレッサーPTENシグナル伝達経路のメディエーターとして関係付けられている(Unoki, M. & Nakamura, Y. 2001 Oncogene 20:4457-4465)。DUSP1の発現は、卵巣腫瘍中で減少することが示されており、DUSP1遺伝子中の新規な一塩基多型(SNP)が同定されている(Suzuki, C. et al. 2001 J Hum Genet 46:155-157)。H3F3A mRNAは、増殖マーカーとして一般的に使用されており、そのレベルは、前立腺癌および結腸癌において上方制御されることが示されてきた(Bettuzzi, S. et al. 2000 Cancer Res 60:28-34; Torelli, G. et al. 1987 Cancer Res 47:5266-5269)。OAZ1は、オルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)に対するその既知の阻害機能に基づいて、腫瘍サプレッサーとして予想されている(Tsuji, T. et al. 2001 Oncogene 20:24-33)。しかし、OAZ1 mRNAは、前立腺癌において上方制御されることが報告されてきた(Bettuzzi, S. et al. 2000 Cancer Res 60:28-34)。興味深いことに、ポリアミン代謝にもまた関与するSATの発現は、前立腺癌において有意に高いことが示されてきた(Bettuzzi, S et al. 2000 Cancer Res 60:28-34)。S100Pは、前立腺癌の進行に関与することが知られており、その過剰発現は、インビトロでのヒト乳房上皮細胞の不死化、およびインビボでの乳癌の発生の初期段階に関与する(Gribenko, A. et al. 1998 Protein Sci 7:211-215; Guerreiro Da Silva, L.D. et al. 2000 Int J Oncol 16:231-240; Mousses, S. et al. 2002 Cancer Res 62:1256-1260; Mackay, A. et al. 2003 Oncogene 22:2680-2688)。最近の研究は、S100Pの示差的発現が、膵臓癌と関連することを示している(Logsdon, CD. et al. 2003 Cancer Res 63:2649-2657; Crnogorac-Jurcevic, T. et al. 2003 J Pathol 201:63-74)。IL-1Bの発現もまた、癌と関連している。血清レベルのIL-1Bは、口腔の扁平上皮癌を有する患者においてより高いことが示されてきた(Jablonska, E. et al. 1997 Pathol Oncol Res 3:126-129)。また、IL-1Bのレベルは、卵巣癌を有する女性の腹水中で有意に増加していることが報告されてきた(Chen, CK. et al. 1999 J Formos Med Assoc 98:24-30)。IL-1Bの遺伝子多型は、胃癌および乳癌のような疾患のリスクと潜在的な関連性を有することが報告されてきた(Hamajima, N. & Yuasa, H. 2003 Nippon Koshu Eisei Zasshi 50:194-207; El-Omar, E.M. et al. 2003 Gastroenterology 124:1193-1201)。
【００５５】
唾液は、HIV(Malamud, D. 1997 Am J Med 102:9-14)、真正糖尿病(Guven, Y. et al. 1996 J Clin Periodontol 23:879-881)、および乳癌(Streckfus, C. et al. 2000 Clin Cancer Res 6:2363-2370)のような全身性疾患の診断における研究の補助としてますます使用されている。最も重要なことに、本実施例において適用された複数のバイオマーカーの概念、技術およびアプローチは、他の疾患をスクリーニングおよびモニターするために容易に修飾することができた。口腔癌については、唾液トランスクリプトーム診断アプローチの最も重要な応用の1つは、口腔の前悪性病変の癌への転換を検出することである。全体の悪性形質転換の割合は、11〜70.3%の範囲である(Lee, J.J. et al. 2000 Clin Cancer Res 6:1702-1710; Silverman, S., Jr. & Gorsky, M. 1997 Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 84:154-157)。口腔白板症の細胞中のDNA含量の分析は、口腔癌のリスクを予測するために有用であることが実証された(Sudbo, J. et al. 2001 N Engl J Med 344:1270-1278)。しかし、これは、なお生検後の方法論である。本発明者らは、「唾液トランスクリプトーム診断」が口腔癌および他のヒト疾患の初期診断のための新規な機会を提供することを想定する。
【００５６】
実施例3
唾液RNAのための実用的室温保管プロトコール
診断適用のための唾液RNAの最適な保存のための、実用的な、使い勝手の良い、室温プロトコールを開発した。本発明のこの態様は、唾液トランスクリプトーム診断のための最高の品質および量の唾液RNAを提供する。
【００５７】
ヒトmRNAの検出および定量は、RNALater(商標)処理唾液中で実施した。唾液を、1または2体積のRNAlater(商標)(レーン1または2)と混合した。140μL唾液上清からの全RNAをQiagenキットを使用して単離した。単離したRNAのアリコートをDNAseI(Ambion)で処理した。RT-PCRを使用して、3つの遺伝子、β-アクチン(ACTB)、グルタルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびインターロイキン8(IL-8)からの転写物を検出した(図5A)。Ribogreen(登録商標)キット(Molecular Probes)を使用することによるRNA定量は、Superase-In (Ambion)処理試料以外のRNAlater(商標)処理試料から、より高いRNA収量を示した(図5B)。1体積のRNAlater(商標)(L1)または2体積のRNAlater(商標)(L2)を使用することで、Superase-In(S)よりも、それぞれ、〜10倍および〜3.3倍多いRNAを生じた。これらのデータは、異なる時点で1つの同じ個体から収集した試料、および同じ時点で5つの異なる個体から収集した試料において再現された。
【００５８】
定量的PCR(qPCR)は、唾液GAPDHおよびIL-8を定量するために実施した。唾液試料は、RNAlater(商標)(1:1比率)およびSuperase-Inで処理されたアリコートに分割した。処理なしの唾液(なし)は対照として使用した。試料を室温で24時間保持し、次いで4℃で保管した。全RNAを、連続して5日間、140μL唾液上清から単離した。RT-qPCRを、GAPDHおよびIL-8によってコードされるcDNA/RNAを定量するために、1日目から5日目まで実施した。図6に提示するデータは、RNAlater(商標)が唾液RNAの完全性に対してより良好な保護効果を有することを示す。「RNAlater(商標)」という用語は、Ambion, Inc.の商標である(USP 6,528,641およびUSP 6,204,375)。
【００５９】
ヒト唾液mRNAは、HG U133 plus 2.0アレイ(Affymetrix)を使用することによってプロファイルした。表7における数字は、MAS 5.0およびDchip 1.3によって存在すると割り当てられたmRNAの数を表す。
【００６０】
（表7）マイクロアレイ上に存在するmRNAの数
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【００６１】
データは、「Superase-In」で処理された試料よりも、RNAlater(商標)で処理された試料によってより多くのmRNAが回収されたことを示す。
【００６２】
本発明のこの態様は、唾液中のRNAの保存が所望される任意の設定(例えば、小児科医、主治医、歯科医、他の医療提供者の診察室、共同体の診療所、在宅治療キット)において使用されることが想定される。次いで、保存されたRNAは、実施例1または2に記載されるように、特定のRNAに基づくスクリーニングまたは診断のために診断センターに発送される。本発明者らは、RNAlater(商標)型のRNAse阻害組成物と組み合わせた、例えば、USP番号6,652,481; 6,022,326; 5,393,496; 5,910,122; 5,376,337; 4,019,255; および4,768,238に記載されているような唾液を収集するためのキットを想定する。
【００６３】
ここで本発明を十分に説明してきたが、本発明が、本発明の範囲またはその任意の態様に影響を与えることなく、広くかつ等価な範囲の条件、処方、および他のパラメーターを用いて実施可能であることが当業者には理解される。本明細書に引用されるすべての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】RT-PCRを使用した無細胞唾液中での遺伝子特異的RNAの検出である。(A)1、3、および6ヶ月(それぞれレーン2、3、4)の保存後、アクチン-β(ACTB)についてのRT-PCRタイピングによって試験した唾液中のRNAの安定性。レーン1、分子量マーカー(100bpラダー);レーン5、陰性対照(鋳型を除外)。(B)グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、リボソームタンパク質S9(RPS9)およびACTBを、10例すべてにおいて一貫して検出した。レーン1、2および3は、それぞれ、唾液RNA、陽性対照(ヒト全RNA、BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)および陰性対照(鋳型を除外)である。
【図２】マイクロアレイ研究のための無細胞唾液からのRNAの増幅である。(A)アガロースゲル電気泳動によるRNA増幅のモニタリング。レーン1〜5は、それぞれ、1kb DNAラダー、RNA単離後の5μl唾液(検出不可能)、1μlの2ラウンド増幅cRNA(200bpから〜4kbまでの範囲)、断片化後のcRNA(約100bp)、およびAmbion RNA Century Markerである。(B)ACTBは、唾液RNA増幅の間の各主要段階において検出することができる。アガロースゲルは、予測された単一バンド(153bp)のPCR産物を示す。レーン1〜8は、それぞれ、100bp DNAラダー、無細胞唾液から単離された全RNA、1回目のラウンドのcDNA、RT後の1回目のラウンドのcRNA、2回目のラウンドのcDNA、RT後の2回目のラウンドのcRNA、陽性対照(ヒト全RNA、BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)および陰性対照(鋳型を除外)である。(C)マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションの前のAgilent 2100バイオアナライザーによって分析された標的cRNA。狭い範囲(50〜200bp)における1つの単一ピークのみが検出され、産物の高純度を実証した。
【図３】組み合わされた唾液mRNAバイオマーカーの予測能力についての受信者動作特性(ROC)曲線分析である。最終ロジスティックモデルは、4つの唾液mRNAバイオマーカー:インターロイキン1β(IL1B)、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素1(OAZ1)、スペルミジン/スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼ(SAT)およびインターロイキン8(IL-8)を含んだ。50%のカットオフ確率を使用して、本発明者らは、ROCによって91%の感度および91%の特異性を得た。ROC曲線の下の算出面積は0.95であった。
【図４】口腔扁平上皮癌(OSCC)についての唾液mRNA予測物を評価する、分類および回帰ツリー(CART)モデルである。最初の分割として選択されたIL-8(カットオフ値=3.14E-18)は、全体で64個の試料を含む親の群から2つの子の群を生じた。正常-1群は、SAT(カットオフ値=1.13E-14)によってさらに分配されたのに対して、癌-1群は、H3F3Aによってさらに分配された(カットオフ値=2.07E-16)。本研究に含まれる64個の試料は、CARTによって、最終的な癌または正常群に分類された。全体の感度は90.6%(29/32、正常群において)であり、OSCC分類についての特異性は90.6%(29/32、癌群において)である。
【図５】RNAlater(商標)処理した唾液中のヒトmRNAの検出および定量である。(A)RT-PCRが、3つの遺伝子、ベータアクチン(ACTB)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびインターロイキン8(IL-8)からの転写物を検出するために使用された。(B)Ribogreen(登録商標)キット(Molecular Probes)を使用することによるRNA定量は、Superase-In (Ambion)で処理された試料以外のRNAlater(商標)で処理された試料からより高いRNA収量を示した。
【図６】唾液GAPDHおよびIL-8を定量するための定量的PCR(qPCR)である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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