(57)【要約】  本出願人は、本明細書中に目的のポリペプチド（例えば、タンパク質または抗原）をコード化する異種核酸の送達及び発現におけるアデノウイルスベクターの効率を向上させるための新規な方法、ベクター及びベクター組成物を開示する。アデノウイルス感染は一般住民において極めてよく起こり、大多数の人がより流行性のアデノウイルス血清型に対する中和抗体を有している。既存の抗アデノウイルス免疫は、異種タンパク質または抗原の送達及び発現のためのアデノウイルスの効果を弱めたり、事によると妨げる恐れがある。本明細書中に教示されている方法は、少なくとも２つのアデノウイルス血清型のカクテルによりタンパク質または抗原を送達させることにより既存免疫を相殺するように機能する。このように少なくとも２つのアデノウイルス血清型の組成物を用いるとアデノウイルス投与の効果が高められることが判明した。ヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）に対する免疫応答の誘発に使用されるアデノウイルスベクターも開示している。
2008508899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を同時期に投与することを含み、前記非複製アデノウイルス粒子は少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する異種核酸を含む、目的のポリペプチドをコード化する異種核酸の送達及び発現方法。
【請求項２】
精製非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型５からなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
精製非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型６からなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
精製非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型５及び６からなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
異種核酸がヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）抗原をコード化する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
精製非複製アデノウイルス粒子を同時期に投与する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を同時期に投与することを含み、前記非複製アデノウイルス粒子が少なくとも１つの共通ＨＩＶ抗原をコード化する異種核酸を含む、個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の誘発方法。
【請求項８】
異種核酸がＨＩＶ−１  Ｇａｇをコード化する配列またはその免疫原性修飾物または断片からなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異種核酸がＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する配列またはその免疫原性修飾物または断片からなる請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
異種核酸がＨＩＶ−１  Ｐｏｌをコード化する配列またはその免疫原性修飾物または断片からなる請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
精製非複製アデノウイルス粒子を同時に投与する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を含み、前記非複製アデノウイルス粒子が少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する、異種核酸を含む組成物。
【請求項１３】
異種核酸が、（ａ）ポリペプチドをコード化する核酸；（ｂ）前記ポリペプチドをコード化する核酸に機能し得る形で連結された異種プロモーター；及び（ｃ）転写終結配列を含む遺伝子発現カセットからなる請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドが抗原である請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
抗原がＨＩＶから誘導される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
生理学的に許容され得る担体を含む請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型５からなる請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型６からなる請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
非複製アデノウイルス粒子がアデノウイルス血清型５及び６からなる請求項１２に記載の組成物。
【請求項２０】
２つの別個のプロモーターに機能し得る形で連結されているＨＩＶ抗原Ｎｅｆ及びＧａｇをコード化する核酸を含むアデノウイルスベクター。
【請求項２１】
２つの別個のプロモーターがヒト及びマウスサイトメガロウイルスプロモーターの前初期プロモーターである請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２２】
Ｎｅｆをコード化する核酸が配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２３】
Ｇａｇをコード化する核酸が配列番号２のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２４】
核酸が、（ａ）配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列；及び（ｂ）配列番号２のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２５】
個体に対して請求項２０に記載のアデノウイルスベクターを投与することを含む前記個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の誘発方法。
【請求項２６】
ＨＩＶ  Ｇａｇ及びＰｏｌをコード化する核酸配列の融合物を含む血清型６のアデノウイルスベクター。
【請求項２７】
ＨＩＶ  Ｇａｇ及びＰｏｌをコード化する核酸配列がそれぞれ配列番号２及び配列番号５のオープンリーディングフレーム核酸配列である請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項２８】
個体に対して請求項２６に記載のアデノウイルスベクターを投与することを含む前記個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の誘発方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの別個のプロモーターに機能し得る形で連結されているＨＩＶ抗原Ｎｅｆ、Ｇａｇ及びＰｏｌをコード化する核酸を含むアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
（ａ）第１プロモーターに機能し得る形で連結されているＮｅｆをコード化する核酸配列；及び（ｂ）第２プロモーターに機能し得る形で連結されているＧａｇ及びＰｏｌをコード化する核酸配列の融合物を含む請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
Ｎｅｆをコード化する核酸が配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３２】
Ｇａｇをコード化する核酸が配列番号２のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
Ｐｏｌをコード化する核酸が配列番号５のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
核酸が、（ａ）配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列；及び（ｂ）配列番号２及び配列番号５のオープンリーディングフレーム核酸配列の融合物を含む請求項２９に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３５】
個体に対して請求項２９に記載のアデノウイルスベクターを投与することを含む前記個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の誘発方法。
【請求項３６】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆをコード化する核酸配列の融合物を含むアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
Ｇａｇをコード化する核酸が配列番号２のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３８】
Ｐｏｌをコード化する核酸が配列番号５のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３９】
Ｎｅｆをコード化する核酸が配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列を含む請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４０】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆをコード化する核酸配列が（ａ）配列番号２のオープンリーディングフレーム核酸配列；（ｂ）配列番号５のオープンリーディングフレーム核酸配列；及び（ｃ）配列番号７、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される配列のオープンリーディングフレーム核酸配列からなる請求項３６に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４１】
個体に対して請求項３６に記載のアデノウイルスベクターを投与することを含む、前記個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の誘発方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アデノウイルスは、幾つかのトリ及び哺乳動物宿主において同定されている皮膜を持たない正二十面体ウイルスである；Ｈｏｒｎｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１：８４−８６（１９５９）；Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，ｐ．１６７９−１７２１（１９９０）。最初のヒトアデノウイルス（Ａｄ）は４０年以上前に単離された。その後、各種哺乳動物種を感染させたアデノウイルス血清型が１００種以上単離されており、そのうちの５１個はヒト起源である；Ｓｔｒａｕｓ，“Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編，ｐ．４５１−４９８，ニューヨークに所在のＰｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４年）出版；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８：８０４−８１３（１９８８）；Ｓｃｈｎｕｒｒ及びＤｏｎｄｅｒｏ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６：７９−８３（１９９３）；ＤｅＪｏｎｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５（１９９９）。ヒト血清型は、ラット及びアカゲザル赤血球の赤血球凝集性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含有率及び発癌性を含めた多数の生物学的、化学的、免疫学的及び構造基準に基づいて６つの亜群（Ａ〜Ｆ）に分類されている；上掲のＳｔｒａｕｓ；上掲のＨｏｒｗｉｔｚ。
【０００２】
アデノウイルスは異種遺伝子を送達及び発現するために魅力的な標的である。アデノウイルスは各種（分裂性及び非分裂性）細胞を感染させることができ、そのＤＮＡを感染宿主細胞に導入させるのに非常に効率的である。アデノウイルスは免疫応答個体における重症なヒト病理に関係していることは判明していない。このウイルスは高ウイルス力価で大量に産生され得る。アデノウイルスゲノムは十分に特性づけられており、約３０，０００〜４５，０００塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ分子から構成されている（例えば、アデノウイルス血清型５（“Ａｄ５”）は〜３６，０００塩基対である）。更に、幾つかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、各種血清型の中では幾つかの一般的保存がある。
【０００３】
遺伝子送達ビヒクルとしてのアデノウイルスの安全性は、ウイルスゲノムの必須初期領域１（“Ｅ１”）を欠失／修飾させてウイルスを非複製とすることにより、Ｅ１活性を欠き（または、本質的に欠き）、よって所期宿主／ワクチンにおいて複製できないウイルスとすることにより強化される。例えば、Ｂｒｏｄｙら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１（１９９４）参照。更に、Ｅ１以外（例えば、Ｅ２、Ｅ３及び／またはＥ４中）のアデノウイルス遺伝子を欠失させると、異種遺伝子封入に関して高い能力を有するアデノウイルスベクターが作成される。現在、亜群Ｃの２つの十分に特性づけられているアデノウイルス血清型、すなわち血清型５（“Ａｄ５”）及び２（“Ａｄ２”）が最も広く使用されている遺伝子送達ベクターの基礎を形成している。
【０００４】
アデノベクターの使用を取り巻く１つの関心はウイルスにより誘発される細胞応答及び体液性応答に向けられている（Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：１５７４−１５８３（１９９９））。ベクターの初期投与に伴う免疫応答は有利であり得る（Ｚｈａｎｇら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３：６９７−７０７（２００１））が、全身レベルのアデノウイルス特異的中和抗体が生成するためにベクターを再投与するときの導入が悪くなる恐れがある（追加免疫化；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１５４−１６２（１９９６）；Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３：４４８−４５５（１９９９））。科学文献及び我々の疫学的研究のデータから、多くの北米人は抗Ａｄ５中和抗体力価を有し、約１／３は比較的高い力価（＞２００）を有していることが示唆される。世界中の他の人は通常より高い頻度及び高いレベルの抗Ａｄ５抗体を有している。ヒトにおける自然アデノウイルス感染により生ずる上記した及び他のアデノウイルス血清型に対する血清特異的抗体はアデノベクターによる異種ポリペプチドの投与に対する応答の程度に影響を与え得る；Ｃｈｉｒｍｕｌｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，６：１５７４−１５８３（１９９９）。
【０００５】
本発明は宿主免疫を回避するためのベクター組成物及び方法を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、異種ポリペプチドの送達及び発現におけるアデノウイルスベクターの効率を向上させるための新規な方法及び組成物を開示する。アデノウイルス感染は一般住民において比較的よく起こり、大多数の人が大部分がＣ群中に存在するより流行性のアデノウイルス血清型に対する中和抗体を有している。既存の抗アデノウイルス免疫は、異種タンパク質または抗原の送達及び発現のためのアデノウイルスの効果を弱めたり、事によると妨げる恐れがある。本明細書中に教示されている方法は、少なくとも２つのアデノウイルス血清型のカクテルにより異種ポリペプチドを送達及び発現させることにより既存免疫を相殺するように機能する。本明細書中に開示されている方法及び組成物に従って少なくとも２つのアデノウイルス血清型を用いるとアデノウイルス投与の効果が高められることが判明した。本明細書中にはヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）に対する免疫応答の誘発に使用されるアデノウイルスベクターも開示されている。
【０００７】
本出願人は、少なくとも２つのアデノウイルス血清型についての目的のポリペプチドをコード化する所望の核酸を投与することにより既存の抗アデノウイルス免疫を回避するための新規な方法及び組成物を本明細書中に開示する。この方法は、本出願人が目的の核酸の送達及び発現において高い相同性及び同じ群分類の血清型を同時期に使用することにより実施した実験の結果、及び同時期投与の個々の血清型を用いる単一血清型投与に対する前記送達方法の有利な比較に基づいている。
【０００８】
目的の核酸の少なくとも２つのアデノウイルス血清型による投与が既存の宿主免疫の回避並びに目的のポリペプチドの送達及び発現の達成の点で有効であることが示された。得られた発現は、既存免疫が問題となっていなかった単一血清型投与により引き起こされる宿主免疫応答に匹敵した発現ポリペプチドに対する宿主免疫応答を誘発させるのに十分であった。既存免疫は誘発免疫に対して明らかに有害でなかった。対照的に、既存免疫の対象となった血清型を使用した場合、既存免疫は単一血清型投与に対して強い影響を有していた。重要なことは、細胞免疫応答は既存免疫が問題となっていなかった個々の血清型投与の細胞免疫応答に匹敵することが判明した。
【０００９】
上記した所見及び本明細書中の他の所見に従って、本出願人は、開示されている方法及びベクター組成物は単一血清型送達に対する可能性ある既存免疫を解消することにより遺伝子治療及び／または予防接種プロトコルにおける患者の適用範囲を改善するに違いないことを提案する。従って、本発明の方法及び組成物は既存免疫、より流行性の（Ｃ群）アデノウイルス血清型に対する既存免疫に直面しても大量投与に対して実行可能な展望を形成する。
【００１０】
従って、本発明は、少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を同時期に投与することを含む目的のポリペプチドをコード化する異種核酸の送達及び発現の実施方法に関し、前記非複製アデノウイルス粒子は少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する異種核酸を含む。このポリペプチドは、目的の特定の細胞、組織または被験者において発現させたいタンパク質または抗原であり得る。投与は同一の組成物を用いて、または同時期に投与される別の処方物を用いてもよい。本明細書中の「同時期」とは同一の時間内を意味する。より具体的には、同時期投与は別の血清型のウイルス粒子を（同一または別の組成物の形で）同時に、または２つ以上の異なる血清型の投与の間に若干の時間をあけて投与することを指す。この時間間隔は任意の期間であり得、通常同時投与から投与間１８週間の期間に及ぶ。好ましくは、投与間の時間間隔は１８週以上超えない。より好ましくは、投与間の時間間隔は有意には１８週未満である。最も好ましくは、投与間の時間間隔は４週未満、２週未満、１週未満、２日未満、１日未満、１時間未満、５分以内（“同時”投与）であり、後者ほど好ましい。同時期投与が求めている結果は“初回免疫−追加免疫”効果ではなく、投与が初回免疫（すなわち、少なくとも２つの血清型を用いる初回免疫）投与の形態、（少なくとも２つの血清型を用いる）追加免疫の形態、または初回免疫及び追加免疫（独立していずれかの投与は少なくとも２つの血清型を含む）のいずれにせよ１回投与の効果である（別の投与が存在するかにかかわらず）。本発明では、初回免疫／追加免疫レジメンと無関係に１回投与で少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する少なくとも２つのアデノウイルス血清型の同時期投与も考えられる。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも２つのアデノウイルス血清型を含む組成物に関し、前記した少なくとも２つのアデノウイルス血清型は少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する異種核酸からなる。本発明の方法は少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を用い、本発明の組成物は少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を含む。本発明の方法／組成物において使用可能であり、今までに同定されたアデノウイルス血清型は１００種以上であり、そのうちの５１血清型はヒト起源であり、多数の血清型が各種哺乳動物種を含めた多種多様の種を感染させる；Ｓｔｒａｕｓ，“Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編，ｐ．４５１−４９８，ニューヨークに所在のＰｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ（１９８４年）出版；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８：８０４−８１３（１９８８）；Ｓｃｈｎｕｒｒ及びＤｏｎｄｅｒｏ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：７９−８３（１９９３）；ＤｅＪｏｎｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５（１９９９）；及びＷａｄｅｌｌら，“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，第７版，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）出版，ｐ．９７０−９８２。当業者は本発明の方法及び組成物に適した目的のための代替の別種の血清型（この中には上記した血清型が含まれるが、これらに限定されない）を容易に同定、開発できる。当業者は各種アデノウイルス血清型を周知しており、この中には（１）上記した亜群Ａ〜Ｆの各種血清型、（２）未分類のアデノウイルス血清型、（３）非ヒト血清型（この中には霊長類アデノウイルス（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０（３）：１４１６−１４２２（２００３）；Ｘｉａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）：２６６７−２６７５（２００２）参照）が含まれるが、これらに限定されない）、並びに前記した血清型の均等物、修飾物または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。アデノウイルスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）または他の公的／私的機関から容易に入手可能であり、アデノウイルス配列は別段の記載がない限り公表されている文献及び広くアクセス可能なパブリックデータベースから識別可能である。
【００１２】
本明細書中に開示されている方法及び組成物において使用するのに適した血清型の特定の組合せは無限である。多数の手段により血清型の候補組合せを選択できる。血清型の候補対の評価手段の１つは組合せ中のベクターの血清流行を評価する（すなわち、集団がすべての血清型組合せによりより多く／より少なく／等しく感染している傾向にあるかどうかを調べる）ことである。好ましくは、血清型成分の組合せに対する有効な中和抗血清力価は個々の血清型（特に、実際に目的の血清型）に対して示す中和抗血清力価よりも低く、或いはすべての血清型成分に対する血清型特異的中和抗血清力価を有する個体のパーセンテージは試験した個々の血清型（特に、実際に目的の血清型）に対する力価を有するものよりも少ない。候補組成物（すなわち、血清型成分の組合せ）に対する有効な中和抗血清力価は、ベクターの成分がより強力であるので試験した力価よりも低い。比較の目的で、特定血清型に対する測定血清の効力に対する定量基準として任意の範囲が、必要ではないけれども確立され得る（例えば、Ａｄ５に関して本明細書中で使用される範囲は次の通りである：非常に低いまたは検出不可能  ［＜１８］、低い［１８−２００］、中程度［２０１−１０００］及び高い［＞１０００］）。
【００１３】
適切な血清型アデノベクターの選択手段としての血清型特異的中和抗血清の評価は当業界で十分に理解されており、認識されており、その実際は当業者の範囲内である；Ａｓｔｅ−Ａｍｅｚａｇａ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５：２９３−３０４（２００４）；Ｐｉｅｄｒａら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１０１（６）：１０１３−１０１９（１９９８）；Ｓａｎｃｈｅｚら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：７１０−７１８（２００１）；Ｓｐｒａｎｇｅｒｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，４１（１１）；５０４６−５０５２（２００３）；及びＮｗａｎｅｇｂｏら，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（２）：３５１−３５７（２００４）。更に、アデノウイルス（Ａｄ）血清型に対する型特異的抗体を決定するためには幾つかの方法が利用可能である。幾つかの異なるアッセイフォーマット、例えばエンドポイトン希釈アッセイまたは遺伝子発現を評価すべく設計されている利用可能なアッセイが使用され得る。前記アッセイの基本的原理は、被験者集団中の既存抗血清の特異性／存在を確認することである。本研究では、候補集団の既存抗血清を評価するために血清中和研究を使用した；実施例１参照。血清中和アッセイは、通常、血清が細胞の感染を阻害するのに十分なウイルスに特異的な抗体を含んでいるかを確かめるために、目的の血清型のウイルス及び細胞と共に（候補者からの）血清とインキュベートすることを含む。感染は多数の方法により検出され得、細胞生存度または導入遺伝子発現が最も頻繁に使用されている；上掲のＳｐｒａｎｇｅｒｓら。
【００１４】
上記した各種アッセイに対する置換または補充として、所与の集団中の特定血清型に対する中和抗体の流行しているかどうかの調査における使用および基準のために各種の疫学的研究も使用され得る；例えば、上掲のＮｗａｎｅｇｂｏら参照。当業者が認識しているように、本発明は確かにその１つの実施態様として、上記した個体ベースの特定研究を行なう必要なく、所与集団中で流行していると当業界でみなされていないアデノウイルス血清型と該集団中に流行／中程度流行しているとして当業界でみなされているアデノウイルス血清型を投与することが考えられる。従って、同時期投与のためのアデノウイルスの組合せは既存の知識に基づいて構築され得る。
【００１５】
当業者は、多分本明細書の開示により可能となる各種可能性を想像できる。１つの血清型が個体集団中で流行していないと公知であるかまたは判明しているならば、その血清型は流行しているアデノウイルスに対する中和抗血清が脅威／攻撃を与える場合の投与を支えるように少しより流行性の血液型である１つ以上と共に使用され得る。別のシナリオでは、稀な血清型を同時期に投与してよい。更に、本明細書から明らかなように、２つ以上の比較的流行性の血清型は同時期に、特に血清型成分の組合せに対する有効な中和抗血清力価が個々の血清型（特に、実際に目的の血清型）に対して示す力価よりも低い場合、或いは血清型成分の組合せに対する血清型特異的抗血清力価を有する個体のパーセンテージが試験した個々の血清型（特に、実際に目的の血清型）に対する力価を有している個体のパーセンテージよりも少ない場合に投与され得る。従って、本発明は、いずれも目的の少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化するアデノウイルス血清型５及び６の同時期投与を包含し、本明細書中に例示されている。アデノウイルス血清型５及び６は当業界で公知である（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、それぞれ寄託番号ＶＲ−５及びＶＲ−６であり、その配列は公表されている；それぞれＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１８６：２８０（１９９２）及び２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号を参照されたい）。全人口基準で両血清型に対して中和抗血清力価を示す個体のパーセンテージは比較的高いが、本出願人は両血清型に対して比較的高い中和抗体力価を有する個体のパーセンテージは非常に低いことを知見した。更に、異種ポリペプチドの送達及び発現のためのベクターとして２つの比較的流行性の群Ｃアデノウイルス血清型が使用されているが、本出願人は既存の免疫がこの同時期送達に対して明らかな悪影響を及ぼさなかったことを知見した。対照的に、既存免疫は該既存免疫が存在する血清型の１つを用いる投与に対してかなりの影響を与えた。カクテルは、既存免疫により影響されないカクテルの個々の血清型のものに匹敵する細胞免疫応答を誘発するのに十分な量のポリペプチドを効果的に発現できた。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、アデノウイルスのヒト血清型を他の種を自然に感染させる血清型との組み合わせ／同時期投与を包含する。例示の目的で、これにはヒトアデノウイルスと霊長類（これにはチンパンジーが含まれるが、これらに限定されない）を自然に感染させるアデノウイルスを同時期に投与することを伴う。
【００１７】
当業者は、代替の別種の血清型（例えば、上記した亜群Ａ〜Ｆ中の各種血清型；広くアクセス可能な公的寄託機関、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されているもの、並びに科学文献及び広く利用可能な公表配列データーベース中で公知である及び／または公開されている配列を有しているものが含まれるが、これらに限定されない）のアデノウイルスを容易に同定することができる。本明細書中に教示されているように、中和抗血清が血清型の所望組合せの投与を妨害しない限り、前記アデノウイルス血清型の組合せが本発明において使用するのに適している。上記したように、特定集団中の各種血清型の相対的流行に関する公表されている文献から、実際に実施した実験から、または目的の血清型／分類群に対する免疫の存在を同定／免疫を定量するために使用され得る上記した各種アッセイから当業者により非常に容易に決定し得る。
【００１８】
意図する宿主におけるその複製が安全の問題を生じないと分かっていないならば、本発明の方法及び組成物を用いて投与されるアデノウイルス血清型は意図する宿主において非複製でなければならない。好ましくは、ベクターは、生じたウイルスがＥ１活性を欠き（または、本質的に欠き）、ベクターを意図する宿主において複製不能とするようにＥ１が少なくとも部分的に欠失／変異されている。好ましくは、Ｅ１領域は完全に欠失または不活化されている。本発明の具体的実施態様では、２００２年３月２１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に記載されているアデノウイルスベクターを使用する。前記ベクターはＥ１が少なくとも部分的に欠失されており、幾つかのアデノウイルスパッケージングリピート（すなわち、塩基対番号は野生型Ａｄ５配列に対応して帰属するとして、Ｅ１欠失が約塩基対４５０−４５８まで始まらない）を含む。アデノウイルスは、Ｅ２及び／またはＥ４が欠失されている場合には組換え非複製アデノウイルスベクターを作成するためにＥ２及び／またはＥ４相補細胞系が必要とされ得るであろうとも、Ｅ３及び他の初期領域に追加の欠失を含み得る。アデノウイルスタンパク質コード領域を欠くベクター（“完全に破壊されたベクター”）も本発明において使用するのに適している。前記ベクターは通常その増殖及び発生のためにヘルパーウイルスの存在を必要とする。
【００１９】
アデノウイルスベクターは、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，ｐ．１０９（１９９１）；及びＨｉｔｔら，“Ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６（１９９７）において検討されているような公知技術を用いて構築され得る。実施例２には本発明で使用するのに適した幾つかのアデノウイルスベクター構築物の構築が詳記されている。
【００２０】
組換えアデノウイルスの増殖及びレスキューのために使用されるＥ１相補細胞系は、ウイルスが複製するのに必須のエレメントを含んでいなければならず、前記エレメントは細胞の遺伝子材料においてコード化されているかまたはイントランスで用意される。更に、Ｅ１相補細胞系及びベクターは、ベクターの核酸と細胞株の核酸の間の相補組換えを可能にし、複製能を持つウイルス（または、複製能を持つアデノウイルス“ＲＣＡ”）をもたらす恐れがある重複エレメントを含まないことが好ましい。多くの場合、増殖細胞は網膜または腎臓由来のヒト細胞であるが、適当なＥ１及び他の重要な欠失領域を発現できる任意の細胞系も本発明の方法において使用するのに適したアデノウイルスを作成するために利用され得る。羊膜細胞のような胎児細胞がＥ１相補細胞系を作成するのに特に適していることが判明した。幾つかの細胞系が利用可能であり、その中には公知細胞系ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、９１１、２９３，及びＥ１  Ａ５４９が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系は（１９９７年１月３日に公開された国際特許出願公開第９７／００３２６号）及び米国特許第６，０３３，９０８号に記載されている。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は非複製（ＦＧ）アデノウイルスの産生を補い、相同組換えにより複製能を持つアデノウイルスの作成を防ぐように設計されているＥ１遺伝子セグメントを導入した一次ヒト網膜芽細胞系である。２９３細胞はＧｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２（１９７７１）に記載されている。非群Ｃアデノウイルスベクターの増殖及びレスキューのために、増殖させるウイルス中で欠失されているＥ１領域に相補的なＥ１領域を発現する細胞系が利用され得る。或いは、同一血清型に由来するＥ１及びＥ４の領域を発現する細胞系が使用され得る；例えば、米国特許第６，２７０，９９６号参照。代替法は入手可能なＥ１発現細胞系（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、Ａ５４９または２９３）において非群Ｃアデノウイルスを増殖させることである。後者の方法は増殖させようとするアデノウイルスに重要なＥ４領域を組み込むことである。重要なＥ４領域は相補細胞系のＥ１遺伝子産物（特に、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ領域）の血清型と同一または非常に類似の血清型のウイルスに先天的であり、通常少なくともＥ４オープンリーディングフレーム６（ＯＲＦ６）を含む；２００４年３月４日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６１４５号参照。当業者は、本発明の方法で使用するのに適した組換え非複製アデノウイルスの産生のために適した多数の他の方法を容易に認識し、実施できる。いずれの手段を使用したにせよウイルス産生した後、ウイルスを精製し、製剤化し、宿主への投与前に保存され得る。
【００２１】
本明細書中に記載されている方法及び組成物は、異種ポリペプチの発現を、特に既存免疫が使用されるアデノウイルス血清型の少なくとも１つの投与または再投与を防ぐ状況下で達成するのに非常に適している。従って、本発明の特定実施態様は、少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を同時期に投与することを含む目的のポリペプチドをコード化する異種核酸を送達及び発現するための方法を含み、前記非複製アデノウイルス粒子は少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する異種核酸を含む。本発明の追加実施態様は少なくとも２つの異なる血清型の精製非複製アデノウイルス粒子を含む組成物であり、前記非複製アデノウイルス粒子は少なくとも１つの共通ポリペプチドをコード化する異種核酸を含む。発現核酸はＤＮＡ及び／またはＲＮＡであり得、二本鎖または一本鎖であり得る。核酸はＥ１平行（ベクター骨格に対して５’から３’に転写）または非平行（ベクター骨格に対して３’から５’に転写）方向に挿入される。核酸は所望宿主（例えば、哺乳動物宿主）における発現のためにコドン最適化され得る。異種核酸は発現カセットの形態であり得る。遺伝子発現カセットは、（ａ）目的のタンパク質または抗原をコード化する核酸、（ｂ）タンパク質／抗原をコード化する核酸に機能し得る形で連結されている異種プロモーター、及び（ｃ）転写終結シグナルを含む。
【００２２】
特定実施態様では、異種プロモーターは真核ＲＮＡポレメラーゼにより認識される。本発明で使用するのに適したプロモーターの１例は前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））である。当業者は意図する宿主において異種核酸を発現できる任意のプロモーターが本発明の方法に従って使用され得ることを認識でき、本発明において使用され得るプロモーターの更なる例は強免疫グロブリンプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びベーターアクチンプロモーターである。これらプロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能配列を含み得る。転写及び発現を調節できるような配列が遺伝子転写の抑制／調節が求められている状況において有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含んでいてもよく、その具体例はウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）または以下に規定する
ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号１）５０ヌクレオチド長を有する短合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）である。リーダーまたはシグナルペプチドを導入遺伝子に挿入してもよい。特定実施態様では、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質ｔＰＡから誘導される。
【００２３】
目的の異種核酸は通常免疫原性及び／または治療用タンパク質をコード化する。好ましい治療用タンパク質は、投与したとき各宿主において幾つかの測定可能な治療効果を誘発するものである。好ましい免疫原性タンパク質は、個体において防御的及び／または有効な免疫応答を誘発できるタンパク質である。本明細書中に例示されている本発明の特定実施態様は、ここに開示されている方法及び組成物により代表的免疫原性タンパク質（ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｎｅｆ及び／またはＰｏｌ）をコード化する核酸の送達であり、治療用または免疫原性タンパク質をコード化する任意の遺伝子が本明細書中に開示されている方法に従って使用され得、本発明の重要な実施態様を形成する。本明細書中に開示されている方法及び組成物は特定の異種核酸に影響されない。従って、本発明の方法及び組成物は、所与宿主において所望の効果、特に特定の核酸、タンパク質、抗原、断片または前記に関係する活性の存在または不在により、生起され、（積極的または消極的に）影響され、悪化されまたは修飾される、または前在在または不在在を伴う各種状態の治療／変化／修飾において、その存在または機能が有用な治療／免疫原性効果をもたらすペリペプチドの送達を達成するために使用され得る。
【００２４】
上記したように、本発明の１態様は、ＨＩＶ抗原／タンパク質をコード化する異種核酸を有するアデノウイルスベクターを用いる方法及び組成物に関する。ヒト免疫不全ウイルス（“ＨＩＶ”）は後天的ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連疾患の病原体である。ＨＩＶはレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’構成を示す。プロウイルスとして公知のＨＩＶの組込み形態は約９．８Ｋｂの長さである。ウイルスゲノムの各末端は長末端反復（ＬＴＲ）として公知の隣接配列を含む。
【００２５】
ＨＩＶ抗原／タンパク質をコード化する異種核酸はＨＩＶ株から誘導され得、前記株にはＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、株Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｏ、ＩＩＩＢ、ＬＡＶ、ＳＦ２、ＣＭ２３５及びＵＳ４が含まれるが、これらに限定されない；例えば、Ｍｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ”，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９５年）出版参照。本明細書中に開示されている方法で使用するのに適した別のＨＩＶ株はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１である；Ｍｙｅｒｓら編，“Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ”，ＩＩＡ３−１ＩＡ１９（１９９５）。この遺伝子はクレードＢ（北米人／ヨーロッパ人）配列のコンセンサスアミノ酸配列に非常に類似している。ＨＩＶ遺伝子配列はＨＩＶ−１の各種クレードに基づき得る；その具体例はクレードＡ、Ｂ及びＣである。多くのＨＩＶ株の遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋから公的に入手可能であり、ＨＩＶの一次圃場分離株はこれらの株を入手可能とすべくメリーランド州ゲイザースバーグに所在のＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌと契約を結んでいる国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。株はスイス国ジュネーブに所在の世界保健機構（ＷＨＯ）からも入手可能である。
【００２６】
ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９つのタンパク質をコード化し、３つのクラス、すなわち主要構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ）、調節タンパク質（Ｔａｔ及びＲｅｖ）及び補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ及びＮｅｆ）に分類される。ｇａｇ遺伝子は、非スプライスウイルスｍＲＮＡから発現され、ｐｏｌ遺伝子の産物であるＨＩＶプロテアーゼによりタンパク質分解的にプロセッシングされる５５キロダルトン（ｋＤａ）前駆体タンパク質（ｐ５５）をコード化する。成熟ｐ５５タンパク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（カプシド）、ｐ９（ヌクレオカプシド）及びｐ６である。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス複製に必要なタンパク質、すなわちプロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）及びＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼ、ｐ１５）活性をコード化する。これらのウイルスタンパク質は、リボソームフレームシフトにより作成されるＧａｇまたはＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質として発現される。５５ｋＤａ  ｇａｇ及び１６０ｋＤａ  ｇａｇｐｏｌ前駆体タンパク質はその後ウイルス的にコード化されるプロテアーゼによりタンパク質分解的に成熟産物にプロセッシングされる。ｎｅｆ遺伝子は、ＣＤ４発現のダウンレギュレーション、Ｔ細胞活性化の妨害及びＨＩＶ感染性の刺激のような幾つかの活性を有することが判明している初期補助ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコード化する。ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、その後細胞プロテアーゼにより切断されて、外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐｌ２０）及び貫膜４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４ｌ）を生ずるウイルスエンベローブ糖タンパク質をコード化する。ｇｐｌ２０及びｇｐ４１は結合されたままであり、ウイルス粒子及びＨＩＶ感染細胞の表面上で表示される。ｔａｔ遺伝子はＨＩＶ複製に必須の転写トランス活性化因子のＲＮＡ結合タンパク質であるＴａｔタンパク質の長形態及び短形態をコード化する。ｒｅｖ遺伝子は、ＲＮＡ結合タンパク質の１３ｋＤａ  Ｒｅｖタンパク質をコード化する。Ｒｅｖタンパク質はＲｅｖ応答エレメント（ＲＰＥ）と称されるウイルスＲＮＡの領域に結合する。Ｒｅｖタンパク質は非スプライスウイルスＲＮＡの核から細胞質への転移を促進する。Ｒｅｖタンパク質はＨＩＶ後期遺伝子発現のために、よってＨＩＶ複製のために必要である。
【００２７】
本発明の方法及び組成物ではＨＩＶ抗原をコード化する核酸が使用され得る（その具体例には上記遺伝子、その活性及び／または免疫原性断片をコード化する核酸及び／または前記の修飾物／誘導体が含まれるが、これらに限定されない）。本発明はまた、コドン最適化ＨＩＶ  ｇａｇ（この中にはコドン最適化完全長（“ＦＬ”）Ｇａｇ及びｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質のｐ５５バージョンが含まれるが、これらに決して限定されない）、ＨＩＶ  ｐｏｌ、ＨＩＶ  ｎｅｆ、ＨＩＶ  ｅｎｖ、ＨＩＶ  ｔａｔ、ＨＩＶ  ｒｅｖ、及び免疫学的に関連する修飾物／誘導体を含めたＨＩＶ抗原をコード化する核酸の各種コドン最適化形態をも意図する。本明細書中に例示されている実施形態では、コドン最適化Ｎｅｆ抗原、コドン最適化ｐ５５  Ｇａｇ抗原及びコドン最適化Ｐｏｌ抗原をコード化する核酸を使用する。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子は２００１年１月１１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２号（国際特許出願公開第０１／０２６０７号）に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子は１９９７年８月２８日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４号（国際特許出願公開第９７／３１１１５号）及び１９９７年１２月２４日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７号（国際特許出願公開第９７／４８３７０号）に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子は２０００年１２月２１日に出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号及び２０００年１２月２１日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４号に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子は２０００年１２月１５日に出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号及び２０００年１２月１５日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２号に開示されている。適当なヌクレオチド配列を選択することは当業者の範囲であり、その配列には特定のＨＩＶ抗原、或いはその免疫学的に関連する部分または修飾物／誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に規定されている「免疫学的に関連する」または「抗原性」は、（１）ウイルス抗原に関して、投与したときタンパク質はウイルスの増殖及び／または蔓延を遅らす及び／または個体内のウイルス量を低減及び／または増加させるのに十分な測定可能な免疫応答を個体内で誘発させることができる；または（２）ヌクレオチド配列に関して、配列は上記が可能なタンパク質をコード化し得ることを意味する。更に、当業者は、所望の結果を達成できるタンパク質、抗原、誘導体または断片をコード化する核酸（場合によりコドン最適化され得る配列）が本発明の方法及び組成物において使用されることを認識している。
【００２８】
本発明の方法及び組成物において使用され得るコドン最適化ｇａｇ遺伝子は２００１年１月１１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２号に開示されている（図１；配列番号２参照）。この配列はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１から誘導され、完全長ｐ５５  ｇａｇをコード化する。ＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１のｇａｇ遺伝子はクレードＢ（北米人／ヨーロッパ人）配列（ロスアラモスＨＩＶデータベース）のコンセンサスアミノ酸配列に非常に類似しているとして選択した。この配列は、インビボでの哺乳動物発現を最大化するためにヒト好ましい（“ヒト化”）コドンを含むように設計した（Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５））。
【００２９】
本発明で意図され、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４号に開示されている各種合成ｐｏｌ遺伝子のオープンリーディングフレームは、逆転写酵素（すなわち、ポリメラーゼ及びＲＮアーゼＨ活性からなるＲＴ）及びインテグラーゼ（ＩＮ）のコード配列を含む。タンパク質配列はＩＩＩＢのクローン分離株であるＨｘｂ２ｒのタンパク質配列に基づいている；この配列はコンセンサスクレードＢ配列に最も近似しており、８４８のうち１６だけが非同一の残基を有していることが判明している（Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８年）出版）。
【００３０】
本発明のこの部分の特定実施態様は、プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコード化する配列が欠失されており、ＲＴ（逆転写酵素及びＲＮアーゼＨ活性）及びＩＮインテグラーゼ活性をコード化するコドン最適化“野生型”配列が残っているｗｔ−ｐｏｌ構築物（本明細書中、“ｗｔ−ｐｏｌ”または“ｗｔ−ｐｏｌ”（コドン最適化））をコード化するコドン最適化ヌクレオチド配列を含む方法及び組成物に関する。このタンパク質をコード化するＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号３（図２Ａ−１〜２Ａ−２）として開示されており、オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基からヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンまで含む。野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレーム（配列番号４；図３Ａ−１〜３Ａ−２）は８５０アミノ酸を含む。
【００３１】
別の特定の実施態様は、プロテアーゼ活性をコード化する野生型配列の一部が欠失されていることに加えて、発現タンパク質のＨＩＶ−１  ｐｏｌ（ＲＴ−ＲＨ−ＩＮ）活性に有害な活性部位残基変異の組合せが導入されているコドン最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌを含むアデノウイルスベクター構築物を用いる方法及び組成物に関する。従って、本発明は、ＨＩＶ−１  ｐｏｌを含むアデノウイルス構築物を用いる方法及び組成物に関し、前記構築物はＰＲ活性をコード化する配列を欠き、ＲＴ、ＲＮアーゼ及び／またはＩＮ活性を少なくとも部分的に、好ましくは実質的に消滅させる変異を含む。本明細書中に開示されている方法及び組成物に使用されるアデノウイルスベクター構築物の一部である他のタイプのＨＩＶ−１  ｐｏｌ変異体には、発現タンパク質のＲＴ、ＲＮアーゼ及び／またはＩＮ領域内の活性部位を効果的に変更させて、ＨＩＶ−１  ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨ及び／またはＩＮ機能に対する酵素活性を少なくとも実質的に低下させる点変異をもたらす少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む変異核酸分子が含まれるが、これに限定されない。本発明のこの部分の特定実施態様では、Ｈ１Ｖ−１  ＤＮＡ  ｐｏｌ構築物は、ＲＴ、ＲＮアーゼＨ及びＩＮ活性を効果的に消滅させるＰｏｌコード領域内に少なくとも１つの変異を含む。具体的なＨＩＶ−１  ｐｏｌ含有構築物は、各活性が少なくとも実質的に消滅するようにＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨ及びＩＮドメインの活性部位を変更する少なくとも１つの点変異を含む。ＨＩＶ−１  Ｐｏｌ変異体は、それぞれＲＴ、ＲＮアーゼＨ及びＩＮ活性に関与する各触媒ドメイン中またはその周りに少なくとも１つの点変異を含む可能性が高い。このために、特定実施態様は、コード化核酸がＰＲ、ＲＴ、ＲＮアーゼまたはＩＮ活性を持たない不活化Ｐｏｌタンパク質（ＬＡ  Ｐｏｌ：配列番号６、図４Ａ−１〜４Ａ−３）を生ずる９つのコドン置換変異を含み、３つの点変異がＲＴ、ＲＮアーゼ及びＩＮ触媒ドメイン内にあるＨＩＶ−１  ｐｏｌを用いる方法及び組成物に関する。従って、考えられる１つの例では、適切な方法で下表１に示す９つの変異をすべて含むＩＡ−Ｐｏｌをコード化する核酸分子を含むアデノウイルスベクター構築物を使用する。置換のための追加アミノ酸残基はＰｏｌのＲＮアーゼドメイン内に位置するＡｓｐ５５１である。本明細書中に開示されている変異の組合せが適当であり得、よって本発明のベクター、方法及び組成物において使用され得る。付加及び欠失変異が考えられ、本発明の範囲内である、野生型アミノ酸を代替アミノ酸残基で置換する点変異が好ましい変異である。
【００３２】
【表１】
2008508899.tif 000003
【００３３】
ＨＩＶ−１  Ｐｏｌの活性部位中及びその周りのエピトープが変化する可能性を低下させるように点変異を本発明のＩＡｐｏｌ変異アデノウイルスベクター構築物中に導入することが好ましい。このために、配列番号５（図４Ａ−１〜４Ａ−３）は表１に示す９つの変異に加えてコドン最適化ｐｏｌをコード化し、本明細書中“ＩＡｐｏｌ”と称するヌクレオチド配列を開示している。
【００３４】
本発明のベクター、方法及び組成物中に使用するためのＩＡ−ｐｏｌを含むアデノウイルス構築物を作成するために、酵素サブユニット由来の全部で９つの活性部位残基をアラニン側鎖で置換することにより酵素機能を不活化させた。表１に示すように、ポリメラーゼの触媒トライアドからなるすべての残基、すなわちＡｓｐｌ１２、Ａｓｐ１８７及びＡｓｐｌ８８をアラニン（Ａｌａ）残基で置換した（Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３４８０７（１９８９））。ＲＮアーゼＨ活性を消滅させるために３つの追加変異をＡｓｐ４４５、Ｇ１ｕ４８０及びＡｓｐ５００に導入し（このＩＡ  Ｐｏｌ構築物中のＡｓｐ５５１は変化せずに残った）、各残基をそれぞれＡｌａ残基で置換した（Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３５３（１９９０））。ＨＩＶ  ｐｏｌインテグラーゼ機能をＡｓｐ６２６、Ａｓｐ６７８及びＧｌｕ７１４での３つの変異により消滅させた。ここでも、これら残基の各々をＡｌａ残基で置換した（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３））。配列番号６のアミノ酸残基Ｐｒｏ３でＲＴ遺伝子の開始をマークする。ＩＡ−Ｐｏｌの完全アミノ酸配列は本明細書中で配列番号６として開示されており、図４Ａ−１〜４Ａ−３に示す。
【００３５】
上記したように、上記変異のいずれの組合せも適切であり、よって、単独で投与したときも併用モダリティーレジメ及び／または初回免疫−追加免疫レジメンの一部として他の異種遺伝子と一緒に投与したときも、本発明のアデノウイルスＨＩＶ構築物、方法及び組成物において上記変異のいずれの組合せも使用され得ると理解される。例えば、各逆転写酵素ＲＮアーゼＨ内の３残基のうち２残基のみ及びインテグラーゼコード領域を変異させ、これらの酵素活性を依然消滅させることが可能であり得る。
【００３６】
本発明のこの部分の別の態様は、真核輸送シグナルペプチドまたは高発現されている哺乳動物タンパク質中に存在しているようなリーダーペプチド（例えば、免疫グロブリンリーダーペプチド）を含むコドン最適化ＨＩＶ−１  Ｐｏｌからなるアデノウイルスベクター構築物を用いる方法、ベクター及び組成物である。いかなる機能リーダーペプチドも効果について試験し得る。各ＤＮＡを公知の組み換えＤＮＡ技術により修飾してもよい。或いは、上記したように、リーダー／シグナルペプチドをコード化するヌクレオチド配列を目的のＰｏｌタンパク質についてのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡベクターに挿入してもよい。クローニング技術に関係なく、最終結果は有効な遺伝子発現のためのベクター成分を目的の修飾ＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質（この中にはリーダーペプチドを含むＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質が含まれるが、これに限定されない）をコード化するヌクレオチド配列と一緒に含むベクター構築物である。
【００３７】
本明細書中に開示されている遺伝子配列の設計は、インビボでの哺乳動物発現を最大とするための前記配列中の各アミノ酸に対するヒト好ましい（“ヒト化”）コドンの使用を含む（Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５））。配列番号３及び５におけるコドン使用を検査することにより認識され得るように、哺乳動物最適化のためには以下のコドン使用が好ましい：Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ａｒｇ（ＡＧＧ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ｌｅｕ（ＣＴＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）及びＴｙｒ（ＴＡＣ）。哺乳動物（ヒト）コドン最適化に関する追加検討に関しては国際特許出願公開第９７／３１１１５号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４）を参照されたい。当業者は本発明の範囲内のＨＩＶワクチン構築物を作成するときにコドン最適化の代替バージョンを使用したり、このステップを省略してもよいと意図される。従って、本発明は、核酸分子の非コドン最適化または部分コドン最適化バージョン及びＨＩＶタンパク質の各種野生型及び修飾形態をコード化する関連組換えアデノウイルスＨＩＶ構築物を含む／用いるベクター、方法及び組成物に関する。しかしながら、これらの構築物のコドン最適化が本発明の好ましい実施態様を構成する。
【００３８】
本発明の特定実施態様において使用されるＨＩＶ−１  ｎｅｆ及びＨＩＶ−１  ｎｅｆ修飾物のコドン最適化バージョンは２０００年１２月１５日に出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号及び２０００年１２月１５日に出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２号に見つけることができる。特定のコドン最適化ｎｅｆ及びｎｅｆ修飾物はＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ分離株由来のＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する核酸に関し、前記コドンはヒトのような哺乳動物系において発現させるために最適化されている。このタンパク質をコード化するＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号７（図５）として開示されており、発現オープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号８として開示されている。図７Ａ−１〜７Ａ−２には、野生型対ＨＩＶ−ｎｅｆのオープンリーディングフレームを含むコドン最適化ヌクレオチドの比較が示されている。配列番号７のオープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４に開始メチオニン残基及びヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンを含む。配列番号７のオープンリーディングフレームは、コドン最適化ＤＮＡワクチンベクターを用いて発現される２１６アミノ酸ＨＩＶ−１  Ｎｅｆタンパク質を与える。２１６アミノ酸ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）タンパク質は本明細書中に配列番号８（図６）として開示されている。別の修飾ｎｅｆ最適化コード領域は最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する核酸分子に関し、そのオープンリーディングフレームはアミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ２からＡｌａ−２）及びＬｅｕ−Ｉ７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフのＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコード化し、本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ、ＬＬＡＡ）として記載されている。このタンパク質をコード化するＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号９として開示されており、その発現オープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１０として開示されている。更に別の修飾ｎｅｆ最適化コード領域は最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する核酸分子に関し、そのオープンリーディングフレームはアミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）をコード化し、本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）として記載されている。このタンパク質をコード化するＤＮＡ分子は本明細書中に配列番号１２として開示されており、その発現オープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１３として開示されている。
【００３９】
ＨＩＶ−１  Ｎｅｆは、Ｇｌｙ−２のミリスチル化により宿主細胞細胞膜の内表面と結合している２１６アミノ酸細胞質タンパク質である（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５５：５９３−５９９（１９８６））。考えられるＮｅｆ機能のすべてが解明されてはいないが、ＨＩＶ−１生活周期の初期相を促進させるべく宿主細胞内環境を変化させることによる及び後代ウイルス粒子の感染性を増加させることによる内細胞膜へのＮｅｆの正しい輸送がはウイルス複製を促すことが明らかになった。本発明の１態様では、本発明の方法、ベクター及び組成物は発現タンパク質のアミノ末端領域がリーダーペプチドを含むように異種リーダーペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むように修飾されているコドン最適化ｎｅｆ配列を含むアデノウイルスベクターを用いる。真核細胞を代表する各種機能は膜境界の構造区別に依存している。前記構造を作成し、維持するために、タンパク質は小胞体中の合成部位から細胞を介して所定目的地に運ばれなければならない。このためには、輸送タンパク質が主要輸送経路へのアクセスポイントに位置するルート選択に関与する分子機構により認識される選別シグナルを表示する必要がある。多くのタンパク質に対する選別決定は、タンパク質がその機能を発揮する細胞位置の最終目的地でタンパク質は永久に常在するようになるのでタンパク質がその生合成経路を横断しているとき１回だけなされなければならない。細胞完全性の維持は一部選択的選別及びタンパク質の正しい最終地への正確な輸送に依存する。規定される配列モチーフは“アドレスラベル”として作用し得るタンパク質中に存在する。多数の選別シグナルが膜タンパク質の細胞質ドメインに関連していることが判明した。ＣＴＬ応答を効果的に誘発させるには、抗原を持続的に高レベルで内因発現させることがしばしば必要である。膜関連によるミリスチル化は多くのＮｅｆ機能の必須要件であるので、グリシンからアラニンへの変化、ジロイシンモチーフの変化及び／またはリーダー配列での置換によるミリスチル化を欠く変異体は機能的に欠損しており、よってＨＩＶ−１ワクチン成分として使用するために野生型Ｎｅｆに比して改良された安全性プロフィールを有する。
【００４０】
従って、特定実施態様では、ヌクレオチド配列は目的のリーダーまたはシグナルペプチドを含むように修飾されている。これは公知の組換えＤＮＡ法により達成され得る。或いは、上記したように、ヌクレオチド配列を目的のＮｅｆタンパク質のオープンリーディングフレームを有するＤＮＡベクター中に挿入してもよい。
【００４１】
エンドサイトーシスによるＣＤ４のＮｅｆ誘導下方制御（Ａｉｋｅｎら，Ｃｅｌｌ，７６：８５３−８６４（１９９４））のためにはタンパク質のカルボキシル領域中のジロイシンモチーフと共にＧｌｙ−２のミリスチル化が必須であることが判明している。Ｎｅｆ発現がエンドサイトーシスによるＭＨＣＩの下方制御（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２（３）：３３８−３４２（１９９６））を促進することも判明している。本発明は、輸送及び／または機能性の点で変化している修飾Ｎｅｆタンパク質をコード化する配列を含むアデノウイルスベクター及び本発明の方法及び組成物中でのその使用を意図している。本発明のアデノウイルスベクターＨＩＶ構築物中に導入される修飾にはアミノ末端リーダーペプチド、アミノ末端ミリスチル化部位の修飾または欠失、及びＮｅｆタンパク質内のジロイシンモチーフの修飾または欠失を含む修飾Ｎｅｆタンパク質を発現させ、感染宿主細胞内の機能を変化させるｎｅｆオープンリーディングフレームへの付加、欠失または置換が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書中に開示されている方法及び組成物に従って使用される組換えアデノウイルス構築物は、アミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）及びＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフのＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換を有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する配列を含み得る。このオープンリーディングフレームは本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載されており、ヌクレオチド１２−１４に開始メチオニン残基及びヌクレオチド６６０−６６２に“ＴＡＡ”終止コドンを含む配列番号９として開示されている。上記した修飾を有するＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子のコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列は本明細書中に配列番号９（図８）として開示されている。配列番号９のオープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１０（図９）として開示されているＮｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）をコード化する。
【００４３】
本明細書中に開示されている方法及び組成物に従って使用される別の組換えアデノウイルス構築物は、アミノ末端ミリスチル化部位に修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）を有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する配列を含み得る。このオープンリーディングフレームは本明細書中にｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）として記載されており、ヌクレオチド１２−１４に開始メチオニン残基及びヌクレオチド６６０−６６２に“ＴＡＡ”終止コドンを含む配列番号１３として開示されている。上記した修飾を有するＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子のコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列は本明細書中に配列番号１２（図１０）として開示されている。配列番号１２のオープンリーディングフレームは本明細書中に配列番号１３（図１１）として開示されているＮｅｆ（Ｇ２Ａ）をコード化する。
【００４４】
図１２は、ｎｅｆ及びｎｅｆ誘導体の模式図を示す。Ｎｅｆ誘導体中に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２並びにロイシン１７４及び１７５はそれぞれミリスチル化及びジロイシンモチーフに関与する部位である。
【００４５】
本発明の方法及び組成物において使用されるアデノウイルスベクターは１つ以上のＨＩＶ  遺伝子／コード化核酸を含み得る。２つ以上のＨＩＶ遺伝子、その誘導体または修飾物を含む組換えアデノウイルスベクターの少なくとも１つ（好ましくは、少なくとも２つ）の投与が本発明において考えられ、本明細書中に例示されている。２つ以上のＨＩＶ遺伝子は少なくとも１つの組換えアデノウイルスベクター構築物上で発現され得及び／または２つ以上のＨＩＶ遺伝子は２つ以上の構築物上で発現され得る。当業者ならば、異なる血清型のベクターの少なくとも２つの中で１つの抗原のみが共通しているが、ベクターは（１）異なる、（２）同一である、（３）該ベクターと共通していないが、ここに開示されている方法または組成物において使用される別のベクターと共通している、または（４）同一共通抗原から誘導される追加ＨＩＶ遺伝子を有していてもよい状況を本発明は包含することは容易に考えられ得る。従って、本発明は、宿主免疫を回避／バイパスし、多価ＨＩＶ遺伝子投与を実現するために本発明の方法及び組成物を用いる可能性を与える。具体例には（１）Ｇａｇ及びＮｅｆポリペプチド、（２）Ｇａｇ及びＰｏｌポリペプチド、（３）Ｐｏｌ及びＮｅｆポリペプチド、及び（４）Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆポリペプチドをコード化する核酸配列を含むアデノウイルスベクターの投与が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
複数の遺伝子／コード化核酸を、複数のオープンリーディングフレームを含むプレアデノウイルスプラスミドを作成するために適当なシャトルプラスミドに連結させてもよい。複数の遺伝子／コード化核酸のためのオープンリーディングフレームは別個のプロモーター及び転写終結配列に機能し得る形で連結され得る。他の実施形態では、オープンリーディングフレームは単一プロモーターに機能し得る形で連結され得、このオープンリーディングフレームは内部リボソームエントリー配列（ＥＭＳ；国際特許出願公開第９５／２４４８５号に記載されている）または単一プロモーターを取り除くために複数のオープンリーディングフレームを転写できる適当な代替物により機能し得る形で連結されている。ある実施態様では、オープンリーディングフレームは、２つのオープンリーディングフレームを融合させるための段階的ＰＣＲまたは適当な代替手法により融合させてもよい。本発明において使用するのに適した各種組合せモダリティー投与レジメンは２００２年３月２１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されている。
【００４７】
本発明の幾つかの多価ベクターは本明細書（例えば、実施例２及び対応の図参照）中にも開示されており、本発明の重要な態様を形成している。本発明中のＨＩＶ抗原に特異的な細胞性免疫応答を誘発させる際に前記多価ベクターを使用する方法も本発明に包含される。前記ベクターは、ｇａｇ、ｎｅｆ及び／またはｐｏｌ抗原からなる群から選択される少なくとも２つの抗原をコード化する核酸を含む。前記核酸は本明細書中に開示されているか、またはその修飾物、誘導体または機能均等物であり得る。好ましくは、核酸配列はコドン最適化されているかまたは部分的にコドン最適化されている。本発明の特定実施態様は、ジ／トリシストロンである（すなわち、各抗原は異なるプロモーターの制御下にある）前記構築物である。上記した特定構築物は、更に（１）ｇａｇ及びｎｅｆ、（２）ｇａｇ及びｐｏｌ、及び（３）ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆをコード化する核酸を含むアデノウイルスベクターとして記載されている。１実施態様では、アデノウイルス血清型はアデノウイルス血清型５または６を有する。更なる実施態様では、アデノウイルスベクターは、異種核酸を順応させるようにＥ１及びＥ３中で欠失している。追加実施態様では、本明細書中に開示されているアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型５のヌクレオチド４５１−３５１０またはアデノウイルス血清型６のヌクレオチド４５１−３５０７の領域に対応する領域のＥ１欠失中に存在して異種核酸を有する。特定実施態様では、アデノウイルスベクターは、抗原の少なくとも１つをコード化する核酸の発現を駆動するプロモーター及び少なくとも１つの他の抗原をコード化する核酸の発現を駆動する少なくとも１つのプロモーターという少なくとも２つのプロモーターの制御下で少なくとも２つの抗原をコード化する核酸を含む。本明細書中に開示されている特定構築物は、（１）２つの異なるプロモーターの制御下のｎｅｆ及びｇａｇ、（２）ｈＣＭＶ及びｍＣＭＶプロモーターの制御下のｎｅｆ及びｇａｇ（例えば、実施例２Ｈ及び２Ｉ、図１７及び２０参照）、（３）ｇａｇｐｏｌ（ｇａｇ及びｐｏｌのコード化配列の融合物）、（４）ｎｅｆ及びｇａｇｐｏｌ、（５）ｈＣＭＶ及びｍＣＭＶプロモーターの制御下のｎｅｆ及びｇａｇｐｏｌ（例えば、実施例２Ｋ及び２Ｍ、図２７及び３５参照）、及び（６）ｇａｇｐｏｌｎｅｆ（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆのコード化配列の融合物）をコード化する核酸を含む。他の特定実施態様は、２つ以上のｇａｇ、ｎｅｆ及び／またはｐｏｌ抗原を含み、Ｅｎｖ抗原をコード化する核酸は存在しないアデノウイルスベクターに関する。ＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐｌ２０）は、原則的にｇｐ１２０の可変性が高いために非常にウイルス分離株特異性である傾向にある中和抗体により代表される免疫応答を誘発する。Ｅｎｖをコード化する核酸を本明細書中に記載されている構築物に添加してもよいが、前記核酸が存在しない構築物も治療被験者において有意な免疫応答を誘発させるのに十分であることが分かっている。各種の融合／多価構築物を得、効果的に使用することは当業者の範囲内である。
【００４８】
本発明の更なる実施態様は、少なくとも２つの血清型により投与される１つ以上のベクターの同時期投与に関する。例えば、いずれも核酸Ａを含む２つ以上の血清型がいずれも核酸Ｂを含む２つ以上の血清型と同時投与され得る。このようにして、この投与方法の特性は、１つの理由または他の理由で所望される核酸を１つ以上のベクターを用いて投与するために利用され得る。非限定的に例示のための１例は、以下のベクター、すなわち（１）抗原Ａをコード化する核酸を含むＡｄ５、（２）抗原Ａをコード化する核酸を含むＡｄ５、（３）抗原Ｂ及びＣをコード化する核酸を含むＡｄ６、及び（４）抗原Ｂ及びＣをコード化する核酸を含むＡｄ５を同時期に投与するシナリオである。
【００４９】
選択する抗原／方法に関係なく、本発明の方法に従う組換えアデノウイルスの同時期投与は１回投与の主題であり得、またはより広い初回免疫−追加免疫投与レジメンの一部を形成し得る。初回免疫−追加免疫レジメンは、異なるウイルス（この中には、異なるウイルス血清型及び異なる起源のウイルスが含まれるが、これらに限定されない）、ウイルスベクター／タンパク質組合せ、及びウイルスとポリヌクレオチド投与の組合せを使用し得る。このタイプのシナリオでは、個体にはあるビヒクル（ウイルスビヒクル、精製及び／または組換えタンパク質、またはコード化核酸である）を用いてタンパク質／抗原／誘導体／修飾物の初回免疫量がまず投与される。複数の初回免疫、典型的には１〜４回の初回免疫が通常使用されるが、より多くの回数使用してもよい。この初回免疫は、循環免疫系中のタンパク質／抗原をその後同定したとき免疫応答が宿主内で直ちにタンパク質／抗原を認識し、応答し得るように、免疫応答を効果的に起動させる。しばらくした後、個体に対して既に送達されているタンパク質／抗原、その誘導体または修飾物の少なくとも１つの追加免疫量が投与される（ウイルスビヒクル／タンパク質／核酸により投与される）。初回免疫と追加免疫の間の時間は、典型的には約４ヶ月〜１年で変更され得、当業者が認識しているように他の時間枠を使用してもよい。追跡または追加免疫投与は選択した時間間隔で繰り返され得る。ある実施形態では、本発明に従う同時期投与が初回免疫投与及び追加免疫投与のために使用され得る。混合モダリティー初回及び追加接種スキームは強化免疫応答を生じるはずである。既存の抗ベクター免疫が存在する場合には特にそうである。
【００５０】
初回免疫−追加免疫投与レジメンにおいて本明細書中に開示されている方法及び組成物と一緒に使用される別の投与ビヒクル（ウイルス／核酸／タンパク質である）の選択は、その有効な実施のために重要でない。細胞及び／または体液性応答が誘発されるように十分なレベルまで抗原を送達（または、抗原の発現を実現）し得るいずれのビヒクルも、ここに開示されている投与を初回免疫または追加免疫するのに十分でなければならない。適当なウイルスビヒクルには非限定的にアデノウイルスの別の血清型（この中には、アデノウイルス血清型６、２４、３４及び３５（例えば、２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号（Ａｄ６）、２００４年３月４日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６１４５号（Ａｄ２４、Ａｄ３４）、２０００年１１月２３日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ００／００３２５号（Ａｄ３５）参照）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。或いは、アデノウイルス投与の前または後に、別種起源のウイルスビヒクルが投与され得る。別種ウイルスビヒクルの例にはアデノ関連性ウイルス（“ＡＡＶ”；例えばＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９）参照）；レトロウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１：５−１４（１９９０）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ参照）；ポックスウイルス（この中には複製欠陥ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ及びＭＶＡベクターが含まれるが、これらに限定されない；例えば、Ｐａｎｉｃａｌｉ及びＰａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７−３１（１９８２）；Ｎａｋａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：１５９３−１５９６（１９８２）；Ｐｉｃｃｉｎｉら，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１５３：５４５−６３，Ｗｕ及びＧｒｏｓｓｍａｎ編，サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ出版；Ｓｕｔｔｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：１０３２−４０（１９９４）；Ｗｙａｔｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１５：１４５１−８（１９９６）；並びに米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第４，７２２，８４８号、同第４，６０３，１１２号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１７４，９９３号及び同第５，１８５，１４６号参照）；及びアルファウイルス（例えば、国際特許出願公開第９２／１０５７８号、同第９４／２１７９２号、同第９５／０７９９４号、並びに米国特許第５，０９１，３０９号及び同第５，２１７，８７９号参照）が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ抗原を送達させるためにアデノウイルス及びポックスウイルスベクターを利用する初回免疫−追加免疫プロトコルは２００３年９月１８日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７５１１号で検討されている。上記免疫化スキームの代替法では、ポリヌクレオチド投与（この中には“裸ＤＮＡ”または容易化ポリヌクレオチド送達が含まれるが、これに限定されない）をアデノウイルス初回及び／または追加免疫と共に使用する；例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５（１９９０）；米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号及び同第５，６７９，６４７号；国際特許出願公開第９０／１１０９２号及び同第９８／０４７２０号参照。別の代替法では、初回／追加免疫スキームにおいて精製／組換えタンパク質投与をアデノウイルスと一緒に使用する。
【００５１】
本発明の組換えアデノウイルスベクターが投与され得る可能性ある宿主／ワクチン／個体には霊長類、特にヒト；及び非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されず、商業的または動物学的に重要な非ヒト哺乳動物も含まれる。
【００５２】
本発明の方法及び組成物に従って投与される単一または複数の血清型のアデノウイルスベクターの組成物（この中にはワクチン組成物が含まれるが、これに限定されない）は単独で、または他のウイルス−または非ウイルス−をベースとするＤＮＡ／タンパク質ワクチンと一緒に投与され得る。前記組成物は広い治療レジメンの一部としても投与され得る。よって、本発明は、ここに開示されているアデノウイルスカクテルを他の治療（この中には他の抗微生物（例えば、抗ウイルス、抗細菌）剤治療が含まれるが、これに限定されない）と一緒に投与する状況を包含する。選択される特定の抗微生物剤は本明細書中に開示されている方法を成功させるのには重要でない。抗微生物剤は、例えば抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたは小分子をベースとする及び／または抗体、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたは小分子から誘導され得る。個体内での微生物複製／蔓延／負荷を効果的に減ずる抗微生物剤が本発明で使用するのに十分である。
【００５３】
抗ウイルス剤はウイルスの機能／生活環を拮抗し、ウイルスの適切な生活環に必須のタンパク質／機能を標的とする。その効果はインビボまたはインビトロアッセイで容易に評価され得る。特定のウイルスタンパク質を標的とする幾つかの代表的抗ウイルス剤はプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤（この中にはヌクレオシドアナログ、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤及びヌクレオチドアナログが含まれる）及びインテグラーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤には、例えばインジナビル／ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）、リトナビル／ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）、サキナビル／ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標）、ネルフィナビル／ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）、アンプレナビル／ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）、ロピナビル及びリトナビル／ＫＡＬＥＴＲＡ（登録商標）が含まれる。逆転写酵素阻害剤には、例えば（１）ヌクレオシドアナログ、例えばジドブジン／ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）（ＡＺＴ）、ジダノシン／ＶＩＤＥＸ（登録商標）（ｄｄＩ）、ザルシタビン／ＨＩＶＩＤ（登録商標）（ｄｄＣ）、スタブジン／ＺＥＲＩＴ（登録商標）（ｄ４Ｔ）、ラミブジン／ＥＰＩＶＩＲ（ＤＯＴＣ）、アバカビル／ＺＩＡＧＥＮ（登録商標）（ＡＢＣ）；（２）非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばネビラピン／ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）（ＮＶＰ）、デラビルジン／ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）（ＤＬＶ）、エファビレンツ／ＳＵＳＴｌＶＡ（登録商標）（ＥＦＶ）；及び（３）ヌクレオチドアナログ、例えばテノホビルＤＦ／ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）（ＴＤＦ）が含まれる。インテグラーゼ阻害剤には、例えば２００３年３月２０日に公開された米国特許出願公開第２００３／００５５０７１号及び国際特許出願公開第０３／０３５０７７号に開示されている分子が含まれる。記載されている抗ウイルス剤はウイルス／ウイルスタンパク質の機能、例えば調節タンパク質ｔａｔまたはｒｅｖとそれぞれトランス活性化応答領域（“ＴＡＲ”）またはｒｅｖ応答性エレメント（“ＲＲＥ”）との相互作用をも標的とし得る。抗ウイルス剤は、好ましくはプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤及びインテグラーゼ阻害剤からなる化合物類から選択される。好ましくは、個体に対して投与される抗ウイルス剤は高活性な抗レトロウイルス治療（“ＨＡＡＲＴ”）中に存在するような有効な抗ウイルス治療剤の幾つかの組合せであり、この用語は通常当業界ではウイルスプロテアーゼ及び逆転写酵素の阻害剤のカクテルを指す。
【００５４】
当業者は、本発明は微生物感染の治療のために有用な医薬組成物と組み合わせて使用さされ得ることを認識し得る。抗微生物剤は、典型的にはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５４版，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（２０００年）発行に記載されているような用量を含めた当業界で報告されている慣用の用量範囲及びレジメンで投与される。
【００５５】
組換えウイルスベクターを含む組成物は生理学的に許容され得る成分、例えば緩衝剤、生理食塩液またはリン酸緩衝食塩液、スクロース、他の塩及びポリソルベートを含み得る。特定実施態様では、ウイルス粒子はＡ１９５製剤化緩衝液中で処方される。ある実施態様では、組成物は２．５〜１０ｍＭ  トリス緩衝剤、好ましくは約５ｍＭ  トリス緩衝剤；２５〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ  ＮａＣｌ；２．５〜１０％  スクロース、好ましくは約５％  スクロース；０．０１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；及び０．００１〜０．０１％  ポリソルベート８０（植物由来）を有する。ｐＨは約７．０〜９．０、好ましくは約８．０の範囲でなければならない。当業者は、他の慣用されているワクチン賦形剤も組成物中に使用され得ることを認識している。特定実施態様では、組成物は５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート８０を含み、ｐＨ８．０である。これは、ウイルス安定性のために最適に近く、ウイルスのガラス表面への吸着の可能性を最小限とするｐＨ及び２価カチオン組成を有する。筋肉内中心したとき皮膚を刺激させない。好ましくは、使用まで凍結される。
【００５６】
ワクチン受容体に導入されるワクチン組成物中のウイルス粒子の量は、使用する転写及び翻訳プロモーターの強度及び発現遺伝子産物の免疫原性に依存する。通常、アデノウイルスベクターあたり１×１０７〜１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１×１０１１粒子の免疫学的または予防的に有効な量が筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を介する圧痕及び他の投与モード（例えば、腹腔内、静脈内または吸入送達）も考えられる。当業者は、本明細書中に教示されている方法及び組成物の異なるウイルスを投与するために異なる投与モードが使用され得ることも認識し得る。例えば、当業者は、１つの血清型は１つの注射ルートを介して容易に投与され得、別の血清型は別のルートを介して投与し、同時期送達を維持し得ることを認識している。好ましくは、投与されるアデノウイルス粒子の総用量（異なる血清型の組合せ）は１×１０１２を超えない。
【００５７】
本発明のウイルスベクターの非経口導入と同時期またはその後に免疫応答を強化または拡大することができる追加物質（例えば、各種サイトカイン、インターロイキン）の投与が本発明で考えられ、有利であり得る。
【００５８】
本明細書中に記載されている投与の効果は、（１）組換えアデノウイルスベクターでうまく免疫化／治療される個体の匹敵するまたはより広い集団；及び（２）免疫化の状況で、未だ感染していない個体への低い伝播率（または、発生率）（すなわち、予防的適用）及び／または感染個体でのウイルス／細菌／前記物質のレベルの低減／抑制（すなわち、治療的適用）でなければならない。
【００５９】
本発明の実施をより深く説明するために以下の非限定的実施例を提示する。
【実施例１】
【００６０】
中和力価の評価
（Ａ）  ヒトサンプル
６カ国（北米、ブラジル、タイ、マラウィ、南アフリカ及びカメルーン）のＨＩＶ感染患者から血清サンプルを集めた。これらのサンプルは使用前に５６℃で９０分間補体不活化した。
【００６１】
（Ｂ）  中和アッセイ
アデノウイルス中和力価のインビトロ測定を既に報告されている手順に従って実施した。例えば、Ａｓｔｅ−Ａｍｅｚａｇａ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１５：２９３−３０４（２００４）参照。ヒトアデノウイルス血清型５及び６（それぞれ、Ａｄ５及びＡｄ６）に対する中和力価は分泌アルカリホスファターゼを発現するベクターを用いて測定した。
【００６２】
（Ｃ）  結果
力価は４つの範囲、すなわち（ａ）＜１８または検出不可、（ｂ）１８〜２００、（ｃ）２０１〜１０００及び（ｄ）＞１０００に分布していた。結果を図１３に示す。力価は通常Ａｄ５に対して最高であり、Ａｄ５＋Ａｄ６に対して最低であった。
【００６３】
個体が高いＡｄ５力価を有しているときＡｄ６は非常に低く、またはその逆であることが観察された。本出願人は、相互に対する高い中和活性のための限定を回避する際にＡｄ５−及びＡｄ６−ベースのワクチンベクターのカクテルの能力を試験することを決定した。前記のウイルスのカクテルに対する「有効な力価」は、該ベクターに対応するワクチン成分はより強力であるのでアデノウイルス力価（この場合、Ａｄ５またはＡｄ６力価）は低いことが判明した。図１３はこの有効なＡｄ５／Ａｄ６力価の分布を含む。本出願人はＡｄ５／Ａｄ６はＡｄ５またはＡｄ６よりも低い値に力価が分布していたことが判明した。
【実施例２】
【００６４】
ベクター構築
Ａ．  ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子
ＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１由来のＨＩＶ  Ｇａｇの合成遺伝子をヒトにおいてしばしば使用されているコドンを用いて構築した；Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ及びＡＩＤＳ，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔ’ｌ  Ｌａｂ．（１９９８年）出版；及びＲ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）参照。図１は、完全長ｐ５５  ｇａｇの例示最適化コドンバージョンのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。ＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１のｇａｇ遺伝子はクレードＢ（北米人／ヨーロッパ人）配列（ロスアラモスＨＩＶデーターベース）のコンセンサスアミノ酸配列に非常に似ているので選択した。この“コドン最適化”ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子のワクチン成分としての利点はマウスでの免疫原性研究において立証されている。“コドン最適化”ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子は、ＤＮＡワクチンとして送達したとき細胞免疫を誘発させるのに野生型ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子よりも５０倍以上強力であることが判明した。
【００６５】
最適発現のために、コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）をｇａｇ遺伝子の開始ＡＴＧの前に導入した。コザック配列を有するＨＩＶ  ｇａｇ断片をＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ  ｇａｇベクターからＰＣＲにより増幅させた。ＰＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇは、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター及びイントロンＡ、完全長コドン最適化ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化及び転写終結配列及び最小ｐＵＣ骨格を含むプラスミドである；プラスミド骨格についての記載についてはＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２：７７７−７８３（１９９３）参照。
【００６６】
Ｂ．ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ構築及びウイルスレスキュー
１．ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分の除去
ｈＣＭＶプロモーターを増幅するための出発材料としてＧＭＰグレードｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇを使用した。増幅は、ｈＣＭＶプロモーターに隣接するように適当に配置したプライマーを用いて実施した。５’プライマーをｈＣＭＶプロモーターのＭｓｃＩ部位の上流に、（ＢｇｌＩＩ認識配列を含むように設計した）３’プライマーはｈＣＭＶプロモーターの３’に配置した。（高フィデリティーＴａｑポリメラーゼを用いて）全ｈＣＭＶプロモーター（マイナスイントロンＡ）を含む生じたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＰＣＲブラントベクターにクローン化した後、ＭｓｃＩ及びＢｇｌＩＩを用いる二重消化により除去した。次いで、この断片をＭｓｃＩ及びＢｇｌＩＩ消化後オリジナルプロモーター、イントロンＡ及びｇａｇ遺伝子が除去されているオリジナルＧＭＰグレードｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇプラスミドに逆クローン化した。この連結反応により、オリジナルｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇベクター骨格内にｈＣＭＶプロモーター（マイナスイントロンＡ）＋ｂＧＨｐＡ発現カセットが構築された。このベクターをｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）と称する。
【００６７】
ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇからＢｇｌＩｌ消化を用いてＦＬｇａｇ遺伝子を切り出し、１，５２６ｂｐ遺伝子をゲル精製し、Ｂｇ１Ｉｌ部位でｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）にクローン化した。コロニーをＳｍａＩ制限酵素を用いてスクリーニングにかけて、ＦＬｇａｇ遺伝子を正しい方向に有しているクローンを同定した。このプラスミドはｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称されるが、配列整合性を確認するために完全に配列決定された。
【００６８】
２．修飾シャトルベクター“ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル”の構築
オリジナルＡｄ５シャトルベクター（ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ；塩基対１−３４１及び３５２４−５７９８を含み、Ａｄ５のヌクレオチド３４１〜５２４の多重クローニング領域を有するＡｄ５配列を有するベクター）への修飾は、逐次クローニングステップで実施される以下の３操作を含んでいた：
（１）ベクター骨格とアデノウイルス左ＩＴＲ配列の間の接合部にＰａｃＩ部位を含むように左ＩＴＲ領域を延長させた。こうすると、細菌性相同組換え系を用いて容易に操作できた；
（２）３４２−４５０ｂｐの野生型（ＷＴ）アデノウイルスの配列を含むようにパッケージング領域を延長させた；
（３）ｐＩＸの下流域を１３ヌクレオチド延長させた（すなわち、ヌクレオチド３５１１〜３５２３）。
【００６９】
これらの修飾により、形質転換ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系中に存在するＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子の一部と重複することなくＥ１欠失の大きさを効果的に縮小させた。すべての操作をＡｄシャトルベクターｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａを修飾することにより実施した。
【００７０】
シャトルベクターに修飾を加えたら、大腸菌ＢＪ５１８３化学的コンピテント細胞を用いる細菌性相同組換えによりオリジナルＡｄ５アデノベクター骨格ｐＡｄＨＶＥ３に変化が加えられた。
【００７１】
３．修飾アデノベクター骨格の構築
Ｅ１領域に修飾が含まれるように（Ｅ１領域を含むヌクレオチドを除くすべてのＡｄ５配列を含む）オリジナルアデノベクターｐＡＤＨＶＥ３を再構築した。これは、新たに修飾したシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）をＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１１０１で消化し、アデノウイルス配列に相当する２，７３４ｂｐ断片を単離することにより実現した。この断片をＣｌａＩ線形化ｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋アデノベクター）由来のＤＮＡと共に大腸菌ＢＪ５１８３コンピテント細胞に同時形質転換した。形質転換からの少なくとも２つのコロニーを選択し、濁りが生ずるまで６〜８時間Ｔｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス中で増殖させた。各細胞ペレットからＤＮＡを抽出した後、大腸菌ＸＬ１コンピテント細胞に形質転換した。形質転換からの１コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡ精製のために増殖した。プラスミドを制限消化により分析して、正しいクローンを同定した。修飾アデノベクターをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋プラスミド）と称した。新しいアデノベクター（ＭＲＫＨＶＥ３）由来のウイルス及び古いバージョンがＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系で生成した。加えて、オリジナルシャトルベクターの多重クローニング部位はＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ部位を含んでいた。このＭＣＳをＮｏｔＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ及びＡｓｃＩ部位を含む新しいＭＣＳで置換した。この新しいＭＣＳをパッケージング領域及びｐＩＸ遺伝子に修飾が加えられてなるＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プレプラスミドに移した。
【００７２】
４．修飾ｇａｇ導入遺伝子を含む新しいシャトルベクター“ＭＲＫｐｄｅＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ”の構築
修飾プラスミドｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＭｓｃＩで一晩消化した後、Ｓｆｉ１で５０℃で２時間消化した。次いで、ＤＮＡを緑豆ヌクレアーゼで３０℃で３０分間処理した。ＤＮＡ混合物をＱｉａｅｘ  ＩＩキットを用いて脱塩し、３７℃で３０分間クレノウ処理して、導入遺伝子断片の末端を完全にブラントとした。次いで、２，５５９ｂｐ導入遺伝子断片をゲル精製した。修飾シャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）をＥｃｏＲＶで消化することにより線形化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理した後、生じた６，４７９ｂｐ断片をゲル精製した。次いで、２つの精製断片を一緒に連結し、シャトルベクター内の導入遺伝子の挿入についてチェックするために数ダース個のクローンをスクリーニングにかけた。Ｅ１平行方向に導入遺伝子を有するクローンを同定するために診断制限消化を実施した。
【００７３】
５．ＭＲＫ  ＦＧアデノベクターの構築
Ｅ１平行方向にＨＩＶ−１  ｇａｇ導入遺伝子を含むシャトルベクターＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃＩで消化した。反応混合物をＢｓｆＺｌ７１で消化した。５，２９１ｂｐ断片をゲル抽出により精製した。ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プラスミドをＣｌａＩで３７℃で一晩消化し、ゲル精製した。約１００ｎｇの５，２９０ｂｐシャトル＋導入遺伝子断片及び〜１００ｎｇの線形化ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３  ＤＮＡを大腸菌ＢＪ５１８３化学的コンピテント細胞に同時形質転換した。数個のクローンを選択し、濁りが生ずるまで６〜８時間Ｔｅｒｒｉｆｉｃｍ（商品名）ブロス（２ｍｌ）中で増殖した。前記細胞ペレットからの総ＤＮＡをＱｉａｇｅｎアルカリ溶解及びフェノール−クロロホルム法を用いて精製した。ＤＮＡをイソプロパノールを用いて沈澱させ、ｄＨ２Ｏ（２０μｌ）中に再懸濁した。このＤＮＡの２μｌアリコートを大腸菌ＸＬ−ｌコンピテント細胞に形質転換した。形質転換からの単一コロニーを選択し、３ｍｌ  ＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中で一晩増殖した。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムを用いて単離した。ポジティブクローンをｇａｇ遺伝子及びプラスミド骨格内で切断する制限酵素ＢｓｔＥＩＩで消化することにより同定した。プレプラスミドクローンをＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称し、大きさは３７，４９８ｂｐである。ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−ｌｇａｇアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列及びその構築の詳細は２００２年３月２１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されている。
【００７４】
６．増強アデノウイルス構築物“ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１ｇａｇ”のウイルス生成
ＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇは、Ｅ１平行方向で新しいＥ３＋アデノベクター骨格のＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３が挿入されてなるｈＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ導入遺伝子を含む。本出願人はこのアデノベクターをＭＲＫ  Ａｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇと称する。この構築物は以下に概説するように作成した。
【００７５】
プレプラスミドＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（イントロンなし）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃＩで消化してベクター骨格を遊離し、３．３μｇをリン酸カルシウム法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）によりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を〜６０％集密度で含む６ｃｍ皿にトランスフェクトした。ＣＰＥに達したら（７〜１０日）、培養物を３回凍結融解し、細胞細片をペレット化した。この細胞ライゼート１ｍｌをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を８０〜９０％集密度で含む６ｃｍ皿に感染させた。ＣＰＥに達したら、培養物を３回凍結融解し、細胞細片をペレット化した。次いで、細胞ライゼートを用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を８０〜９０％集密度で含む１５ｃｍ皿に感染させた。この感染手順を継続し、継代６で拡大させた。次いで、ウイルスを細胞ペレットからＣｓＣｌ法により抽出した。２つのバンド形成を実施した（３勾配ＣｓＣｌ後、連続ＣｓＣｌ勾配）。第２バンド形成後、ウイルスをＡ１０５緩衝液中に透析した。ウイルスＤＮＡをプロナーゼ処理及びフェノール−クロロホルムを用いて順次抽出した。次いで、ウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、［３３Ｐ］ｄＡＴＰで放射標識した。ゲル電気泳動により消化産物を分離した後、ゲルをワットマンペーパー上で乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。この消化産物を、（標識前にＰａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した）プレプラスミドからの消化産物と比較した。予想されるサイズが観察された。これは、ウイルスがうまくレスキューされたことを示す。
【００７６】
Ｃ．  ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子
ＨＩＶ−１由来のＨＩＶ  Ｐｏｌの合成遺伝子をヒトにおいてしばしば使用されているコドンを用いて構築した；Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔ’ｌ  Ｌａｂ．（１９９８年）出版；及びＲ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）参照。タンパク質配列は、ＩＩＩＢのクローン分離株であるＨｘｂ２ｒのタンパク質配列に基づいている。この配列は、８４８残基のうち１６個のみが非同一であり、コンセンサスクレードＢ配列に最も似ていることが判明している（Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８年）出版）。プロテアーゼ遺伝子は、変異不活化にかかわらず残留プロテアーゼ活性から安全性を確保するためにＤＮＡワクチンから排除されている。
【００７７】
図４Ａ−１〜４Ａ−３は、ＨＩＶ−１  ｐｏｌの例示コドン最適化バージョンのヌクレオチド配列を示す。ｐｏｌ遺伝子は最適化ＨＩＶ−１  Ｐｏｌをコード化し、組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンのオープンリーディングフレームはプロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼまたはインテグラーゼ活性を持たないが、ＲＴ、ＲＮアーゼ及びＩｎ触媒ドメインの各々の内に３つの点変異が残存している不活化Ｐｏｌタンパク質（ＩＡ  Ｐｏｌ：配列番号６；図４Ａ−１〜４Ａ−３）をもたらす全部で９つのコドン置換変異をコード化する。
【００７８】
Ｄ．  ＭＲＫＡｄ５Ｐｏｌの構築及びウイルスレスキュー
１．ベクター：シャトルプラスミド及びプレアデノウイルスの構築
ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌで示されるプレアデノウイルスプラスミドを含めたベクターの構築において実施されるキーステップを図１４に示す。簡単に説明すると、完全長不活化ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子のためのアデノウイルスシャトルベクターは次の通りである。ベクターＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇアデノウイルスプレプラスミドの構築に使用されるシャトルベクターの誘導体である。ベクターは、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する発現カセットを含む。発現ユニットを、選択した遺伝子のユニークＢｇｌＩＩ部位での挿入によりＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１−／Ｅ３＋）ＣｌａＩ（または、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３）プレプラスミドに挿入したとき導入遺伝子の転写方向が確実にＡｄ５  Ｅ１平行であるようにシャトルベクターに挿入した。オリジナルシャトルベクターと同様に、前記ベクターはＰａｃＩ部位、パッケージングシグナル領域への延長及びｐＩＸ遺伝子への延長を含む。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子をプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ｐｏｌ−ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）から直接単離した。このプラスミドをＢｇｌＩＩで消化すると、（配列番号５に開示されているコドン最適化ＩＡ  ｐｏｌ配列を含む）ｐｏｌ遺伝子が無傷で遊離した。ｐｏｌ断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ部位でＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐｌＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）シャトルベクターに連結した。クローンを制限酵素ＤｒａＩＩＩ／ＮｏｔＩを用いて遺伝子の正しい方向についてチェックした。ポジティブクローンを単離し、ＭＲＫｐｄｅｌ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（ｓ）と命名する。このプラスミドの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列決定により確認した。プレアデノウイルスプラスミドは次のように構築した。シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（Ｓ）を制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔｌ１０７Ｉ（または、そのイソ制限酵素ＢｓｔＺ１０７Ｉ）で消化し、その後線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドＭＲＫｐＡｄ（Ｅ１−／Ｅ３＋）ＣｌａＩと共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。元々ＭＲＫｐＡｄ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（Ｓ）Ｅ３＋と命名されていた生じたプレプラスミドを今回“ｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ”と称する。生じたｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。調製規模産生のためにベクターをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。回収したプラスミドを制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により、及びｐｏｌ導入遺伝子の一過性トランスフェクション細胞培養物における発現により確認した。ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−ｌｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列及びその構築の詳細は２００２年３月２１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されている。
【００７９】
２．研究グレードの組換えアデノウイルスの作成
プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１２μｇのｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の６ｃｍ皿あたり３．３μｇをトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから６〜１０日目に感染細胞及び培地を収集した。感染細胞及び培地を≦−６０℃で保存した。このｐｏｌ含有組換えアデノウイルスを本明細書中“ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ”と称する。この組換えアデノウイルスは配列番号６として示す不活化ＨＩＶ−１  Ｐｏｌタンパク質を発現する。
【００８０】
Ｅ．  ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子
ＨＩＶ−１由来のＨＩＶ  Ｎｅｆの合成遺伝子をヒトにおいてしばしば使用されているコドンを用いて構築した；Ｋｏｒｂｅｒら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ニューメキシコ州ロスアラモスに所在のＬｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔ’ｌ  Ｌａｂ（１９９８年）発行；及びＲ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）参照。
【００８１】
図８は、ＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子の例示コドン最適化バージョンのヌクレオチド配列を示す。ｎｅｆ遺伝子は、組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンのオープンリーディングフレームがアミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）及びＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフのＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコード化する最適化ＨＮ−１  Ｎｅｆをコード化する。前記オープンリーディングフレームは本明細書中ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）と記載されており、ヌクレオチド１２−１４に開始メチオニン残基及びヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンを含む配列番号１０として開示されている。
【００８２】
図１０は、ＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆ遺伝子の例示コドン最適化バージョンのヌクレオチド配列を示す。ｎｅｆ遺伝子は、組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンのオープンリーディングフレームがアミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）をコード化する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する。前記オープンリーディングフレームは本明細書中ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）と記載されており、ヌクレオチド１２−１４に開始メチオニン残基及びヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンを含む配列番号１２として開示されている。
【００８３】
Ｆ．  ＭＲＫＡｄ５Ｎｅｆの構築及びウイルスレスキュー
１．ベクター：シャトルプラスミド及びプレアデノウイルスプラスミドの構築
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆで示されるプレアデノウイルスプラスミドを含めたベクターの構築において実施されるキーステップを図１５に示す。簡単に説明すると、ベクターＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇアデノウイルスプレプラスミドの構築に使用されるシャトルベクターである。ベクターは、ＰａｃＩ部位、パッケージングシグナル領域への延長及びｐＩＸ遺伝子への延長を含むように修飾されている。ベクターは、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡなし）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを有する発現カセットを含む。発現ユニットを、選択した遺伝子のユニークＢｇｌＩＩ部位での挿入によりＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１−／Ｅ３＋）ＣｌａＩプレプラスミドに挿入したとき導入遺伝子の転写方向が確実にＡｄ５  Ｅ１平行であるようにシャトルベクターに挿入した。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子をプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）から直接単離した。このプラスミドをＢｇｌＩＩで消化すると、配列番号９に開示されているヌクレオチド配列を含むｐｏｌ遺伝子が無傷で遊離する。ｎｅｆ断片をゲル精製し、ＢｇｌＩＩ部位でＭＲＫｐｄｅｌＥ１＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）シャトルベクターに連結した。クローンを制限酵素ＳｃａＩを用いて遺伝子の正しい方向についてチェックした。ポジティブクローンを単離し、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）と命名した。このプラスミドの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列決定により確認した。プレアデノウイルスプラスミドは次のように構築した。シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）を制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＩ１０７Ｉ（または、そのイソ制限酵素ＢｓｔＺ１０７Ｉ）で消化し、その後線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドＭＲＫｐＡｄ（Ｅ１／Ｅ３＋）ＣｌａＩと共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。元々ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）と命名されていた生じたプレプラスミドを今回“ｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ”と称する。生じたｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。調製規模産生のためにベクターをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。回収したプラスミドを制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により、及びｎｅｆ導入遺伝子の一過性トランスフェクション細胞培養物における発現により確認した。ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−ｌｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列及びその構築の詳細は２００２年３月２１日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１号に開示されている。
【００８４】
２．研究グレードの組換えアデノウイルスの作成
プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１２μｇのｐＭＲＫＡｄｎｅｆを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の６ｃｍ皿あたり３．３μｇをトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから６〜１０日目に感染細胞及び培地を収集した。感染細胞及び培地を≦−６０℃で保存した。このｎｅｆを含有する組換えアデノウイルスを今回“ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ”と称する。
【００８５】
Ｇ．  アデノウイルス血清型６ベクター構築物の作成
１．Ａｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
ｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−細菌性プラスミドを回収するために使用される一般的方法を図１６に示す。一般的に、Ａｄ６  ＩＴＲカセットと称する第２ＤＮＡ断片及び精製ｗｔ  Ａｄ６ウイルスをＢＪ  ５１８３細菌に同時形質転換すると、相同組換えによりウイルスゲノムが循環する。ＩＴＲカセットは、細菌性複製起源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により分離されたＡｄ６ゲノムの右端（ｂｐ３５４６０−３５７５９）及び左端（ｂｐ１−４５０及びｂｐ３５０８−３８０７）から配列を含む。これら３つのセグメントをＰＣＲにより作成し、ｐＮＥＢ１９３（細菌性複製起源、アンピシリン耐性遺伝子、及びＰＣＲ産物を導入する多重クローニング部位を含有する市販のクローニングプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログ番号Ｎ３０５１Ｓ））に順次クローン化して、ｐＮＥＢＡｄ６−３（ＩＴＲカセット）を生成した。このＩＴＲカセットは、Ａｄ６配列から４５１〜３５０７のＥ１配列の欠失を含む。ＩＴＲカセット中のＡｄ６配列は、組換えを起こし得る精製Ａｄ６ウイルスＤＮＡと相同な領域を与える。
【００８６】
その後、ｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−はＥ１に導入遺伝子を含有するＡｄ６ベクターを最初に作成するために使用され得る。
【００８７】
２．ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子を含むＡｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
（Ａ）  アデノウイルスシャトルベクターの構築
ｂｐ１−４５０及びｂｐ３５０８−３８０７（塩基対４５１〜３５０７は欠失されている）のアデノウイルス血清型６（“Ａｄ６”）配列、ＣＭＶプロモーター（マイナスイントロンＡ）及びｂＧＨｐＡを含む万能シャトルベクターに合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子を挿入した。転写方向はＥ１平行であった。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子は、プラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ＦＬｇａｇ−ｏｐｔからＢｇ１１Ｉ消化により得、ゲル精製し、シャトルベクター中のＢｇ１ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に連結した。完全長ｇａｇを含む生じたシャトルベクターの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【００８８】
（Ｂ）  プレアデノウイルスプラスミドの構築
シャトルベクターを制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＩ１０７１で消化し、その後線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋と共に大腸菌株Ｂ１５１８３に同時形質転換した。生じたｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇの遺伝子構造を制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。大量産生のためにベクターをコンピテント大腸菌ＸＬ−ｌ  Ｂｌｕｅに形質転換した。回収したプラスミドを、制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により、及びｇａｇ導入遺伝子の一過性トランスフェクション細胞培養物における発現により確認した。
【００８９】
ｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇはＡｄ６  ｂｐ１−４５０及びｂｐ３５０８−３５７５９（ｂｐ番号はＡｄ６配列のものに相当する；例えば、２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号参照）を含んでいる。プラスミド中、ウイルスＩＴＲは細菌性複製起源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により連結されている。
【００９０】
（Ｃ）  研究グレードの組換えＭＲＫＡｄ６ｇａｇの作成
前臨床免疫原性研究のためのウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の６ｃｍ皿にトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞での多重継代により増幅させた。最終継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ超遠心により細胞ペレットから精製した。精製ウイルスの同一性及び純度を、精製ウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析により、及びインビトロで増殖させたウイルス感染哺乳動物細胞からの培養上清のＧａｇ  ＥＬＩＳＡにより確認した。制限分析のために、消化したウイルスＤＮＡをＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００９１】
すべてのウイルス構築物をウェスタンブロット分析によりＧａｇ発現について確認した。
【００９２】
３．ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子を含むＡｄ６プレアデノウイルスプラスミドの構築
（Ａ）  アデノウイルスシャトルベクターの構築
ｂｐ１−４５０及びｂｐ３５０８−３８０７（塩基対４５１〜３５０７は欠失されている）のアデノウイルス血清型６（“Ａｄ６”）配列、ＣＭＶプロモーター（マイナスイントロンＡ）及びｂＧＨｐＡを含む万能シャトルベクターに合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子（ｏｐｔ  ｎｅｆ  Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を挿入した。転写方向はＥ１平行であった。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｎｅｆ遺伝子は、プラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ＦＬｎｅｆ−ｏｐｔからＢｇ１ＩＩ消化により得、ゲル精製し、シャトルベクター中のＢｇ１ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位へ連結した。完全長ｎｅｆを含む生じたシャトルベクターの遺伝子構造をＰＣＲ、制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【００９３】
（Ｂ）  プレアデノウイルスプラスミドの構築
シャトルベクターを制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＩ１０７Ｉで消化し、その後線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋と共に大腸菌株Ｂ１５１８３に同時形質転換した。生じたｐＭＲＫＡｄ６ｎｅｆの遺伝子構造を制限酵素及びＤＮＡ配列分析により確認した。大量産生のためにベクターをコンピテント大腸菌ＸＬ−ｌ  Ｂｌｕｅに形質転換した。回収したプラスミドを制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により、及びｎｅｆ導入遺伝子の一過性トランスフェクション細胞培養物における発現により確認した。
【００９４】
ｐＭＲＫＡｄ６ｎｅｆはＡｄ６  ｂｐ１−４５０及びｂｐ３５０８−３５７５９（ｂｐ番号はＡｄ６配列のものに相当する；例えば、２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号参照）を含んでいる。プラスミド中、ウイルスＩＴＲは細菌性複製起源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により連結されている。
【００９５】
（Ｃ）  研究グレードの組換えＭＲＫＡｄ６ｎｅｆの作成
前臨床免疫原性研究のためのウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ６ｎｅｆをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ６ｎｅｆを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の６ｃｍ皿にトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞での多重継代により増幅させた。最終継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ超遠心により細胞ペレットから精製した。精製ウイルスの同一性及び純度を精製ウイルスＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析により、及びインビトロで増殖させたウイルス感染哺乳動物細胞からの培養上清のｎｅｆ  ＥＬＩＳＡにより確認した。制限分析のために、消化したウイルスＤＮＡをＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【００９６】
すべてのウイルス構築物をウェスタンブロット分析によりｎｅｆ発現について確認した。
【００９７】
Ｈ．  ＨＩＶ  ｇａｇ及びｎｅｆ導入遺伝子を含むＡｄ５ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆを図１７に示し、前記形質の配列は図１８（配列番号１６）に示されている。ベクターは、遺伝子配列が既知であるプロトタイプ群Ｃアデノウイルス血清型５の修飾物である；Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１８６：２８０−２８５（１９９２）。野生型Ａｄ５のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５１０）が欠失され、ｎｅｆ発現カセット及びｇａｇ発現カセットで置換されている。ｎｅｆ発現カセットは、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されている。ｎｅｆ発現カセットの直後に、１）マウスサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｋｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１９０１−１９０８（１９８７））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル配列から構成されるｇａｇ発現カセットがある。Ｎｅｆ及びＧａｇタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームは、Ｇｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異し、ジロイシン配列（Ｌｅｕ−１７４及びＬｅｕ−１７５）をジアラニンに変異することにより変化させた。これらの変異により、Ｎｅｆの細胞膜への接着及びエンドソームへのレトロトラフィッキングが防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化される；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。ミリスチル化部位のみが変異されているｎｅｆオープンリーディングフレームを含むこの構築物の他の点で同一のバージョンも作成した。
【００９８】
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの構築に関与するキーステップは図１９に示し、以下に記載する。
【００９９】
１．アデノウイルスシャトルベクターの構築
ｇａｇ発現カセットをｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡのＡｓｃＩ部位に挿入することによりシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５−ＨＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡ−ＭＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓを構築した。ｇａｇ発現カセットは、Ｓ−ＭＲＫＡｄ５ＭＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０ｐＡを鋳型として用いてＰＣＲにより得た。導入遺伝子の各末端にＡｓｃＩ部位を導入するようにＰＣＲプライマーを設計した。ＡｓｃＩ消化したＰＣＲ断片をこれもＡｓｃＩで消化したｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡと連結して、ｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓを生成した。ｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓの遺伝子構造を制限酵素分析及び配列決定により確認した。
【０１００】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆを構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓから制限酵素ＢｓｔＺ１７Ｉ＋ＳｇｒＡＩで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＨＶＥ３と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌Ｓａｂｌ２（商品名）に形質転換した。所望プラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆ（ｐＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶ−ｎｅｆ−ＢＧＨ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓとも称される）を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１０１】
３．組換えＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから７日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。Ｇａｇ及びＮｅｆの発現もＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆと称した（ＲＫ−Ａｄ５−ｈＣＭＶｎｅｆｂＧＨ−ＭＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓとも称した）。
【０１０２】
Ｉ．  ＨＩＶ  ｇａｇ及びｎｅｆ導入遺伝子を含むＡｄ６ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆを図２０に示し、前記形質の配列は図２１（配列番号１７）に示されている。ベクターは、プロトタイプ群Ｃアデノウイルス血清型６（ＶＲ−６；２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号）の修飾物である。野生型Ａｄ６のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５０７）が欠失され、ｎｅｆ発現カセット及びｇａｇ発現カセットで置換されている。ｎｅｆ発現カセットは、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されている。ｎｅｆ発現カセットの直後に、１）マウスサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｋｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１９０１−１９０８（１９８７））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル配列から構成されるｇａｇ発現カセットがある。Ｎｅｆ及びＧａｇタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームは、Ｇｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異することにより変化させた（ｏｐｔ  ｎｅｆ  Ｇ２Ａ）。この変異により、Ｎｅｆの細胞膜への接着が防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化される；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。
【０１０３】
ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの構築に関与するキーステップを図２２に示し、以下に記載する。
【０１０４】
１．アデノウイルスシャトルベクターの構築
ｇａｇ発現カセットをｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡのＡｓｃＩ部位に挿入することによりシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓを構築した。ｇａｇ発現カセットは、Ｓ−ＭＲＫＡｄ５−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０を鋳型として用いてＰＣＲにより得た。導入遺伝子の各末端にＡｓｃＩ部位を導入するようにＰＣＲプライマーを設計した。ＡｓｃＩ消化したＰＣＲ断片をこれもＡｓｃＩで消化したｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡと連結して、ｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓを生成した。ｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓの遺伝子構造を制限酵素分析及び配列決定により確認した。
【０１０５】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆを構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨｐＡ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓから制限酵素ＰａｃＩ及びＰｍｅＩで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆ（ｐＭＲＫＡｄ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｆＧ２Ａ−ＢＧＨ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓとも称される）を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１０６】
３．組換えＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆをＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で部分消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆは３つのＰａｃＩ制限部位を含んでおり、各ＩＴＲに１つ、初期領域３に１つ位置している。ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルスＤＮＡ複製を開始させるためにはたった１つのＩＴＲの放出が必要であるので、ｐＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆ（３つのＰａｃＩ部位の１つのみで消化）の線形化に有利な消化条件を使用した。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから７日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。Ｇａｇ及びＮｅｆの発現もＥＬＩＳＡにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆと称した（Ａｄ６−ｈＣＭＶｎｅｆＧ２ＡｂＧＨ−ＭＣＭＶ３６ｇａｇＳＶ４０−Ｓとも称した）。
【０１０７】
Ｊ．  ＨＩＶ−１  ｇａｇｐｏｌ融合導入遺伝子を含むＡｄ５ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌを図２３に示し、前記形質の配列は図２４（配列番号１８）に示されている。ベクターは、その遺伝子配列が既知であるプロトタイプ群Ｃ  Ａｄ５（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１８６：２８０−２８５（１９９２））の修飾物である。野生型Ａｄ５のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５０７）が欠失され、導入遺伝子で置換されている。導入遺伝子は、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｐｏｌ（株ＩＩＩＢ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されているｇａｇｐｏｌ発現カセットを含む。ＧａｇＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオシドタンパク質をコード化する。ｐｏｌオープンリーディングフレームは逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びインテグラーゼタンパク質をコード化し、その各々は全部で９つの部位変異のために酵素活性部位の一部であった各アミノ酸残基（逆転写酵素  Ａｓｐ−１１２、Ａｓｐ−１８７及びＡｓｐ−１８８；ＲＮアーゼＨ  Ａｓｐ−４４５、Ｇｌｕ−４８０及びＡｓｐ−５００；インテグラーゼ  Ａｓｐ−６２６、Ａｓｐ−６７８及びＧｌｕ−７１４）をアラニン残基で置換することにより完全に不活化されていた；Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３−４８０７（１９８９）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３６３（１９９０）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３）；Ｗｉｓｋｅｒｃｅｈｎ及びＭｕｅｓｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）。導入遺伝子を順応させるために、ベクターはＥ１領域の欠失に加えてＥ３欠失（ｎｔ  ２８１３８−３０８１８）をも有している。
【０１０８】
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを図２５及び２６に示し、以下に記載する。
【０１０９】
１．アデノウイルスシャトルベクターの構築
合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇｐｏｌ融合遺伝子をＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）に挿入することによりシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌを構築した。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１  ｇａｇｐｏｌは図２６に示す重複ＰＣＲにより得た。最終ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）中のＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に連結して、プラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌを生成した。ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの遺伝子構造を制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定分析により確認した。
【０１１０】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌＢＧＨｐＡＤＥ３を構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌから制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ５ＨＶＯ（ｐＡｄ５  Ｅ１−Ｅ３−とも称される）と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌＢＧＨｐＡＤＥ３（ｐＡｄ５ＨＶＯＭＲＫｇａｇｐｏｌとも称される）を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１１１】
３．組換えＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌＢＧＨｐＡＤＥ３をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌＢＧＨｐＡＤＥ３を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから１０日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。Ｇａｇｐｏｌ融合物の発現もウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌと称した。
【０１１２】
ｇａｇ及びｐｏｌオープンリーディングフレームを融合させるために従う方法を図２６に概説する。３つのＰＣＲ反応を実施した。第１反応では、ｇａｇオープンリーディングフレームをＰＣＲプライマー、すなわちＧＰ−１及びＧＰ−２（ＧＰ−１＝５’ＡＧＴＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＡＧＧ（配列番号１４）、ＧＰ−２＝５’ＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡＣ  配列番号１５））を用いて増幅させた。クローニングのためにＢｇ１ＩＩ部位（下線部分）を含むようにＰＣＲプライマーＧＰ−１を設計した。ｇａｇとｐｏｌ間に所望接合領域を規定するようにＰＣＲプライマーＧＰ−２を設計した。プライマーの半分はｇａｇの３’末端（太字部分）、他方はｐｏｌの５’末端（イタリック部分）から構成されている。第２ＰＣＲ反応では、ｐｏｌオープンリーディングフレームをＰＣＲプライマー、すなわちＧＰ−３及びＧＰ−４（ＧＰ−３＝５’ＧＴＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣ（配列番号２３）、ＧＰ−４＝５’ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＧＴＣ（配列番号２４））を用いて増幅させた。プライマーＧＰ−２に相補的であり、ｇａｇとｐｏｌの間に所望接合領域が規定されるようにＰＣＲプライマーＧＰ−３を設計した。クローニングのためにＢｇ１ＩＩ部位（下線部分）を含むようにプライマーＧＰ−４を設計した。ＰＣＲ反応３では、ＰＣＲ反応１及び２の産物をＰＣＲプライマーＧＰ−１及びＧＰ−４と混合した。ＰＣＲ産物１及び産物２中の相同配列により完全ｇａｇｐｏｌ融合産物の増幅が起動される。
【０１１３】
Ｋ．  ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌ及びｎｅｆ導入遺伝子を含むＡｄ５ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌを図２７に示し、前記形質の配列は図２８（配列番号１９）に示されている。ベクターは、その遺伝子配列が既知であるプロトタイプ群Ｃ  Ａｄ５（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１８６：２８０−２８５（１９９２））の修飾物である。野生型Ａｄ５のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５１０）が欠失され、導入遺伝子で置換されている。３抗原導入遺伝子は、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されているｎｅｆ発現カセットを含む。ｎｅｆ発現カセットの直後に、１）マウスサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｋｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１：１９０１−１９０８（１９８７））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｐｏｌ（株ＩＩＩＢ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル配列から構成されるｇａｇｐｏｌ発現カセットがある。Ｎｅｆ、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームはＧｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異することにより変更されていた。この変異によりＮｅｆの細胞膜への接着及びエンドゾームへのレトロトラフィッキングが防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化される；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。ｐｏｌオープンリーディングフレームは逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びインテグラーゼタンパク質をコード化し、その各々は全部で９つの部位変異のために酵素活性部位の一部であった各アミノ酸残基（逆転写酵素  Ａｓｐ−１１２、Ａｓｐ−１８７及びＡｓｐ−１８８；ＲＮアーゼＨ  Ａｓｐ−４４５、Ｇｌｕ−４８０及びＡｓｐ−５００；インテグラーゼ  Ａｓｐ−６２６、Ａｓｐ−６７８及びＧｌｕ−７１４）をアラニン残基で置換することにより完全に不活化されていた；Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３−４８０７（１９８９）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３６３（１９９０）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３）；Ｗｉｓｋｅｒｃｅｈｎ及びＭｕｅｓｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）。導入遺伝子を順応させるために、ベクターはＥ１領域の欠失に加えてＥ３欠失（ｎｔ  ２８１３８−３０８１８）をも有している。
【０１１４】
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを図２９に示し、以下に記載する。
【０１１５】
１．Ａｄシャトルベクターの構築
シャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌを２ステップで構築した。まず、ｇａｇｐｏｌ融合オープンリーディングフレームを（実施例２Ｊに記載されている）ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌからＢｇ１ＩＩ消化により得、Ｓ−ＭＲＫＡｄ５−ｍＣＭＶ３６−ＳＶ４０中のＢｇ１ＩＩ部位に挿入して、ＭＲＫＡｄ５ＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０を生成した。その後、ＭＲＫＡｄ５ＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０をＭｆｅＩ及びＸｈｏｌで消化してｇａｇｐｏｌ導入遺伝子含有断片を作成し、これをＭＲＫＡｄ５−ｈＣＭＶｎｅｆＧ２ＡＢＧＨ−ｍＣＭＶ３６ｇａｇＳｖ４０−Ｓ中のＭｆｅｌ及びＸｈｏｌ部位にクローン化して、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌを生成した。ｐＭＲＫＡｄ５ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌの遺伝子構造を制限酵素分析及び配列決定により確認した。
【０１１６】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＡｄ５ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＧ２ＡＢＧＨＭＣＭＶ３６ｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌから制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ５ＨＶＯ（ｐＡｄ５Ｅ１−Ｅ３−とも称される）と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から遊離させたプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＡｄ５ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＧ２ＡＢＧＨＭＣＭＶ３６ｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１１７】
３．組換えＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＡｄ５ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＧ２ＡＢＧＨＭＣＭＶ３６ｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＡｄ５ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＧ２ＡＢＧＨＭＣＭＶ３６ｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから１０日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。Ｎｅｆ及びＧａｇＰｏｌ融合タンパク質の発現もウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌと称した。
【０１１８】
Ｌ．  ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌｎｅｆ融合導入遺伝子を含むＡｄ５ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆを図３０に示し、前記形質の配列は図３１（配列番号２０）に示されている。ベクターは、その遺伝子配列が既知であるプロトタイプ群Ｃ  Ａｄ５（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１８６：２８０−２８５（１９９２））の修飾物である。野生型Ａｄ６のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５１０）が欠失され、導入遺伝子で置換されている。導入遺伝子は、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｐｏｌ（株ＩＩＩＢ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＭＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されているｇａｇｐｏｌｎｅｆ発現カセットを含む。Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。ｐｏｌオープンリーディングフレームは逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びインテグラーゼタンパク質をコード化し、その各々は全部で９つの部位変異のために酵素活性部位の一部であった各アミノ酸残基（逆転写酵素  Ａｓｐ−１１２、Ａｓｐ−１８７及びＡｓｐ−１８８；ＲＮアーゼＨ  Ａｓｐ−４４５、Ｇｌｕ−４８０及びＡｓｐ−５００；インテグラーゼ  Ａｓｐ−６２６、Ａｓｐ−６７８及びＧｌｕ−７１４）をアラニン残基で置換することにより完全に不活化されていた；Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３−４８０７（１９８９）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３６３（１９９０）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３）；Ｗｉｓｋｅｒｃｅｈｎ及びＭｕｅｓｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームは、Ｇｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異することにより変更された。この変異によりＮｅｆの細胞膜への接着及びエンドソームへのレテロトラフィッキングが防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化された；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：��２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）。導入遺伝子を順応させるために、ベクターはＥ１領域の欠失に加えてＥ３欠失（ｎｔ  ２８１３８−３０８１８）をも有している。
【０１１９】
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの構築に関与するキーステップを図３２〜３４に示し、以下に記載する。
【０１２０】
１．アデノウイルスシャトルベクターの構築
シャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆを３ステップで構築した（図３２）。まず、ｇａｇｐｏｌ導入遺伝子の一部を除去するために（実施例２Ｊに記載されている）シャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌをＢａｍＨＩで消化して、ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌＢａｍＨＩｃｏｌｌａｐｓｅを生成した。部分ｇａｇｐｏｌ導入遺伝子を含有するＢａｍＨｌ断片をゲル精製し、ステップ３で使用した。次ステップでは、図３３に示す重複ＰＣＲにより得たｐｏｌｎｅｆ融合遺伝子をｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌＢａｍＨＩｃｏｌｌａｐｓｅ中のＢａｍＨｌ及びＢｇ１Ｉ１部位に連結して、ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌＢａｍＨＩｃｏｌｌａｐｓｅｎｅｆを生成した。最終ステップで、ステップ１で得た部分ｇａｇｐｏｌ導入遺伝子を含有するＢａｍＨＩ断片をｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌＢａｍＨＩｃｏｌｌａｐｓｅｎｅｆ中のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆを生成した。ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの遺伝子構造を制限酵素分析及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１２１】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３（図３４）を構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆから制限酵素ＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ５ＨＶＯ（ｐＡｄ５Ｅ１−Ｅ３−とも称される）と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌＢＧＨｐＡＤＥ３（ｐＡｄ５ＨＶＯＭＲＫｇａｇｐｏｌとも称される）を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１２２】
３．組換えＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＭＲＫＡｄ５ＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから１０日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。ＧａｇＰｏｌＮｅｆ融合物の発現もウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆと称した。
【０１２３】
ｐｏｌ及びｎｅｆオープンリーディングフレームを融合させるために従う方法を図３３に概説する。３つのＰＣＲ反応を実施した。第１反応では、ｐｏｌオープンリーディングフレームの一部をＰＣＲプライマー、すなわちＰＮ−Ｉ及びＰＮ−２（ＰＮ−１＝５’ＣＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧ（配列番号２５）、ＰＮ−２＝５’ＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡ（配列番号２６））を用いて増幅させた。クローニングのために使用したｐｏｌ配列中に存在するＢａｍＨＩ部位（下線部分）を重複するようにＰＣＲプライマーＰＮ−１を選択した。ｐｏｌとｎｅｆ間に所望接合領域を規定するようにＰＣＲプライマーＰＮ−２を設計した。プライマーの半分はｐｏｌの３’末端（太字部分）、他方はｎｅｆの５’末端（イタリック部分）から構成されている。第２ＰＣＲ反応では、ｎｅｆオープンリーディングフレームをＰＣＲプライマー、すなわちＰＮ−３及びＰＮ−４（ＰＮ−３＝５’ＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＣＧ（配列番号２７）、ＰＮ−４＝５’ＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＡＧＣＡＧ（配列番号２８））を用いて増幅させた。プライマーＰＮ−２に相補的で、ｐｏｌとｎｅｆ間に所望接合領域が規定されるようにプライマーＰＮ−３を設計した。クローニングのためにＢｇ１ＩＩ部位を含むようにプライマーＰＮ−４を設計した。ＰＣＲ反応３では、ＰＣＲ反応１及び２の産物をＰＣＲプライマーＰＮ−１及びＰＮ−４と混合した。ＰＣＲ産物１及び産物２中の相同配列により完全ｇａｇｐｏｌ融合産物の増幅が起動される。
【０１２４】
Ｍ．  ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌ及びｎｅｆ導入遺伝子を含むＡｄ６ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌを図３５に示し、前記形質の配列は図３６（配列番号２１）に示されている。ベクターは、プロトタイプ群Ｃアデノウイルス血清型６（Ｖｒ−６；２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号）の修飾物である。野生型Ａｄ６のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５１０）が欠失され、導入遺伝子で置換されている。導入遺伝子は、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されているｎｅｆ発現カセットを含む。ｎｅｆ発現カセットの直後に、１）マウスサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｋｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１：１９０１−１９０８（１９８７））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｐｏｌ（株ＩＩＩＢ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）サルウイルス４０ポリアデニル化シグナル配列から構成されるｇａｇｐｏｌ発現カセットがある。Ｎｅｆ、Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームはＧｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異させることにより変更された。この変異によりＮｅｆの細胞膜への接着及びエンドソームへのレトロトラフィッキングが防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化される；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：４２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。ｐｏｌオープンリーディングフレームは逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びインテグラーゼタンパク質をコード化し、その各々は全部で９つの部位変異のために酵素活性部位の一部であった各アミノ酸残基（逆転写酵素  Ａｓｐ−１１２、Ａｓｐ−１８７及びＡｓｐ−１８８；ＲＮアーゼＨ  Ａｓｐ−４４５、Ｇｌｕ−４８０及びＡｓｐ−５００；インテグラーゼ  Ａｓｐ−６２６、Ａｓｐ−６７８及びＧｌｕ−７１４）をアラニン残基で置換することにより完全に不活化されていた；Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３−４８０７（１９８９）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（��９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３６３（１９９０）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３）；Ｗｉｓｋｅｒｃｅｈｎ及びＭｕｅｓｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）。導入遺伝子を順応させるために、ベクターはＥ１領域の欠失に加えてＥ３欠失（ｎｔ  ２８１３８−３０８１８）をも有している。
【０１２５】
ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを図３７に示し、以下に記載する。
【０１２６】
１．Ａｄシャトルベクターの構築
（実施例２Ｋに記載されている）ｐＭＲＫＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌ由来のｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌ導入遺伝子をｐＮＥＢＡｄ６−２中のＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することによりシャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ６−２ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌを構築した。ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌ導入遺伝子断片を得るためには、ｐＭＲＫＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌをＮｏｔＩ及びＰｖｕＩで完全に消化した後、ＡｓｃＩで部分消化した。所望ＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ導入遺伝子断片がより容易にゲル精製されるように消化し、よって望ましくないプラスミド断片のサイズを小さくするためにＰｖｕＩを使用した。いったん精製したら、ＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ導入遺伝子断片をこれもまたＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化したｐＮＥＢＡｄ６−２と連結させて、ｐＮＥＢＡｄ６−２ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌを生成した。ｐＮＥＢＡｄ６−２ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌの遺伝子構造を制限酵素分析及び配列決定により確認した。
【０１２７】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＢＧＨＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ６−２ＨＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌから制限酵素ＰａｃＩ及びＰｍｅｌで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＤＥ３と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離させたプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＢＧＨＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を制限酵素消化及びＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１２８】
３．組換えＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＢＧＨＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｎｅｆＢＧＨＭＣＭＶｇａｇｐｏｌＳＶ４０ＤＥ３を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから１０日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。Ｎｅｆ及びＧａｇＰｏｌ融合タンパク質の発現もウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌと称した。
【０１２９】
Ｎ．  ＨＩＶ  ｇａｇｐｏｌｍｅｆ融合導入遺伝子を含むＡｄ６ベクターの構築
ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆを図３８に示し、前記形質の配列は図３９（配列番号２２）に示されている。ベクターは、プロトタイプ群Ｃアデノウイルス血清型６（ＶＲ−６；２００３年４月１７日に公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／３２５１２号）の修飾物である。野生型Ａｄ６のＥ１領域（ｎｔ  ４５１−３５１０）が欠失され、導入遺伝子で置換されている。導入遺伝子は、１）ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期遺伝子プロモーター（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））、２）ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｎｅｆ（株ＪＲ−ＦＬ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｐｏｌ（株ＩＩＩＢ）遺伝子のコード配列に融合しているヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（株ＣＡＭ−１）遺伝子のコード配列、及び３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６３３０−１６３３４（１９９２））から構成されているｇａｇｐｏｌｎｅｆ発現カセットを含む。Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆタンパク質のアミノ酸配列はクレードＢコンセンサスアミノ酸配列（Ｇ．Ｍｙｅｒｓら編，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ，ＩＩ−Ａ−１〜ＩＩ−Ａ−２２（１９９５））に非常に似ており、コドン使用頻度はヒト細胞での発現のために最適化されていた；Ｒ．Ｌａｔｈｅ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１８３：１−１２（１９８５）。ｇａｇオープンリーディングフレームはマトリックス、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質をコード化する。ｐｏｌオープンリーディングフレームは逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ及びインテグラーゼタンパク質をコード化し、その各々は全部で９つの部位変異のために酵素活性部位の一部であった各アミノ酸残基（逆転写酵素  Ａｓｐ−１１２、Ａｓｐ−１８７及びＡｓｐ−１８８；ＲＮアーゼＨ  Ａｓｐ−４４５、Ｇｌｕ−４８０及びＡｓｐ−５００；インテグラーゼ  Ａｓｐ−６２６、Ａｓｐ−６７８及びＧｌｕ−７１４）をアラニン残基で置換することにより完全に不活化されていた；Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７１６−７１７（１９８７）；Ｌａｒｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：４８０３−４８０７（１９８９）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：８８−９５（１９９１）；Ｓｃｈａｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５７：３１１−３１４（１９８９）；Ｍｉｚｒａｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：５３５９−５３６３（１９９０）；Ｌｅａｖｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２１１３−２１１９（１９９３）；Ｗｉｓｋｅｒｃｅｈｎ及びＭｕｅｓｉｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９：３７６−３８６（１９９５）。ｎｅｆオープンリーディングフレームは、Ｇｌｙ−２に位置するミリスチル化部位をアラニンに変異することにより変更された。この変異によりＮｅｆの細胞膜への接着及びエンドソームへのレテロトラフィッキングが防止され、これによりＮｅｆが機能的に不活化された；Ｐａｎｄｏｒｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０���４２８３−４２９０（１９９６）；Ｂｒｅｓｎａｈａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，８：１２３５−１２３８（１９９８）、導入遺伝子を順応させるために、ベクターはＥ１領域の欠失に加えてＥ３欠失（ｎｔ  ２８１３８−３０８１８）をも有している。
【０１３０】
ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの構築に関与するキーステップを図４０に示し、以下に記載する。
【０１３１】
１．Ａｄシャトルベクターの構築
（実施例２Ｋに記載されている）ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆ由来のｇａｇｐｏｌｎｅｆ導入遺伝子をｐＮＥＢＡｄ６−２中のＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入することによりシャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ６−２ｇａｇｐｏｌｎｅｆを構築した。ｇａｇｐｏｌｎｅｆ導入遺伝子断片を得るために、ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆをＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化し、ゲル精製した。その後、ＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ導入遺伝子断片をこれもまたＮｏｔＩ及びＡｓｃＩで消化したｐＮＥＢＡｄ６−２と連結して、ｐＮＥＢＡｄ６−２ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆを生成した。ｐＮＥＢＡｄ６−２ｇａｇｐｏｌｎｅｆの遺伝子構造を制限酵素分析及び配列決定により確認した。
【０１３２】
２．プレアデノウイルスプラスミドの構築
プレアデノウイルスｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３を構築するために、導入遺伝子含有断片をシャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ６−２ｇａｇｐｏｌｎｅｆから制限酵素ＰａｃＩ及びＰｍｅｌで消化することにより遊離させ、ゲル精製した。その後、精製した導入遺伝子断片を線形化（ＣｌａＩ消化した）アデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＤＥ３と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。その後、制限分析によるスクリーニングのためにＢＪ５１８３形質転換体から単離したプラスミドＤＮＡをコンピテント大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質転換した。所望プラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３を制限酵素消化により確認した。
【０１３３】
３．組換えＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの作成
ウイルスを作成するために、プレアデノウイルスプラスミドｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養物において感染性ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするためには、１０μｇのｐＡｄ６ＭＲＫＤＥ１ＨＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆＢＧＨｐＡＤＥ３を制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の１つのＴ２５フラスコにトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離し、ＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞に侵入後ウイルス複製が生じた。完全ウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたら、トランスフェクションから１０日目に感染細胞及び培地を収集した。ウイルスストックをＰＥＲ．Ｃ６（商品名）細胞での２代継代により増幅させた。第２継代時に、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配により精製した。レスキューされたウイルスが正しい遺伝子構造を有していることを確認するために、ウイルスＤＮＡを単離し、制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）分析により分析した。ＧａｇＰｏｌＮｅｆ融合タンパク質の発現もウェスタンブロットにより確認した。レスキューされたウイルスをＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆと称した。
【実施例３】
【０１３４】
ＭＲＫＡｄ５及びＭＲＫＡ５６  ｈｉｖ  ｎｅｆを用いる免疫化
（Ａ）  免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべてにおいて、総用量の各ワクチンを緩衝溶液（１ｍｌ）中に懸濁した。アカゲザルをケタミン−キシラジンで麻酔し、ワクチンをツベルクリン注射器（ニュージャージー州フランクリンレークスに所在のＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて両方の三角筋に０．５ｍＬずつ筋肉内に（“ｉ．ｍ．”）送達した。採取した血漿及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準プロトコルにかけた。
【０１３５】
（Ｂ）  ＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＣＳアッセイ
９６ウェル平底プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に１μｇ／ウェルの抗ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）ｍＡｂ  ＭＤ−１（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ−ＢＶ）を４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  Ｌ−グルタメート、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％  ウシ胎児血清）を用いて３７℃で２時間ブロックした。プレートから培地を捨て、新しく単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１〜４×１０５細胞／ウェルで添加した。ｎｅｆペプチドプール（４μｇ／ｍＬ−ペプチド）の不在（偽）または存在下で細胞を刺激した。４ａａだけシフトしている１５アミノ酸（“ａａ”）（１５−ａａ）ペプチド（カリフォルニアに所在のＳｙｎｐｅｐ）からなるプールをＨＩＶ−１  ＪＲＦＬ  ｎｅｆ配列から構築した。次いで、細胞を５％  ＣＯ２中３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。プレートをＰＥＳＴ（ＰＢＳ，０．０５％  ツウィーン２０）で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルの抗ＩＦＮ−γポリクローナルビオチニル化検出抗体溶液（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ−ＢＶ）の１：４００希釈物を添加した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した。ＮＢＴ／ＢＣＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１０分間インキュベートすることにより発色させた。ＩＦＮ−γ分泌細胞を表すスポットを解剖顕微鏡を用いて計数し、１×１０６ＰＢＭＣに正規化した。
【０１３６】
（Ｃ）  結果
このプロトコル前、９匹のアカゲザルに非−Ｎｅｆコード化Ａｄ５ベクターを複数回与えた。これらの動物におけるＡｄ５特異的中和力価は２８００〜＞４６００の範囲であった。動物を３匹のアカゲザルの３コホートに等しく分布した。第１コホートには０、４及び３０週目に１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ６  ＨＩＶ  ｎｅｆを与えた。第２コホートには０、４及び３０週目に１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ  ｎｅｆを与えた。第３コホートには０、４及び３０週目に５×１０９ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ  ｎｅｆ及び５×１０９ｖｐ  ＭＲＫＡｄ６  ＨＩＶ  ｎｅｆの混合物を与えた。対照として、３匹の未処置アカゲザルの３コホートには上記した３ワクチンのそれぞれを与えた。図４１は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより測定したＮｅｆ特異的Ｔ細胞の偽補正レベルを表で示す。
【０１３７】
既存Ａｄ５免疫の存在または不在下でＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ  ｎｅｆベクターを与えた動物における免疫応答を比較すると、前暴露されている動物では最初のＡｄ５免疫化後応答が減衰したことは明らかである。既存Ａｄ５免疫は、ＭＲＫＡｄ６  ＨＩＶ  ｎｅｆまたはＡｄ５／Ａｄ６カクテルのいずれを使用する場合誘導Ｎｅｆ特異的免疫に対して明らかな悪影響を有していなかった。これから、１つのＡｄ血清型に対するベクター特異的免疫は別の血清型を使用することにより回避され得ることが示唆される。従って、この研究は異なるＡｄ血清型ベクターのカクテルが患者適用範囲及び／または誘導免疫の程度を改善するために使用されることを裏付ける。
【実施例４】
【０１３８】
ＭＲＫＡｄ５及びＭＲＫＡｄ６  ＨＩＶ−１  ｇａｇを用いる免疫化
（Ａ）  免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべてにおいて、総用量の各ワクチンを緩衝液（１ｍｌ）中に懸濁した。アカゲザルをケタミン−キシラジンで麻酔し、ワクチンをツベルクリン注射器（ニュージャージー州フランクリンレークスに所在のＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて両方の三角筋に０．５ｍＬずつｉ．ｍ．送達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を免疫化レジメン中数回採取した血液サンプルから調製した。動物のケア及び処置はすべてナショナル・リサーチ・カウンシル、実験動物資源協会のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに記載されている原則に従ってＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが認可している基準に従った。
【０１３９】
（Ｂ）  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、幾つか改変したが既報のプロトコル（Ａｌｌｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２）：７３８−７４９（２００１））に従って実施した。抗原特異的刺激のために、１１−ａａ重複を有する全ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む１５−ａａペプチド（カリフォルニア州ダブリンに所在のＳｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．）からペプチドプールを作成した。各ウェルに５０μＬの２〜４×１０５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加した。細胞を、低サイズカットオフを８０ｆＬに設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて計数した。５０μＬの培地またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬ濃度のｇａｇペプチドプールをＰＢＭＣに添加した。サンプルを５％  ＣＯ２中３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。こうしてスポットが発生し、プレートをＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（メリーランド州シルバースプリングに所在）に基づく注文生産のイメージャー及び自動計数サブルーチンを用いて処理した。カウントを１０６細胞入力に正規化した。
【０１４０】
（Ｃ）  結果
既存Ａｄ５特異的中和活性を有する４匹のアカゲザルの２コホートを（１）１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ｇａｇまたは（２）１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ｇａｇ及び１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ６  ｇａｇの混合物を用いて免疫化した。既存Ａｄ５中和活性を持たない動物から構成されている対照コホートには１０１０ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５  ｇａｇを与えた。ＨＩＶ−１  Ｇａｇに対するワクチン誘導Ｔ細胞応答を、全タンパク質配列を含む１５−ａａペプチドのプールに対するＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて定量した。結果を図４２に示す。結果は、ペプチドプール及び偽ペプチドまたはペプチドなし対照に応答した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１００万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表示した。
【０１４１】
ＭＲＫＡｄ５  ｇａｇワクチンにより誘導されるＧａｇ特異的応答は、免疫化前有意なＡｄ５特異的中和力価を有する動物では対照コホートに比して減衰した（４週目で１０倍、８週目で５倍）。類似レベルの既存Ａｄ５力価を有する動物をＭＲＫＡｄ５及びＭＲＫＡｄ６ワクチンの混合物を用いて免疫化すると、Ｇａｇ特異的Ｔ細胞応答が改善された。これは、多分既存抗Ａｄ５力価により影響されないＭＲＫＡｄ６成分が供給されたためであろう。
【実施例５】
【０１４２】
ＭＲＫＡｄ５  ＨＩＶ−１  ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ構築物を用いる免疫化
（Ａ）  免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべてにおいて、総用量の各ワクチンを緩衝液（１ｍｌ）中に懸濁した。アカゲザルをケタミン−キシラジンで麻酔し、ワクチンをツベルクリン注射器（ニュージャージー州フランクリンレークスに所在のＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて両方の三角筋に０．５ｍＬずつｉ．ｍ．送達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を免疫化レジメン中数回採取した血液サンプルから調製した。動物のケア及び処置はすべてナショナル・リサーチ・カウンシル、実験動物資源協会のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに記載されている原則に従ってＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが認可している基準に従った。
【０１４３】
（Ｂ）  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、幾つか改変したが既報のプロトコル（Ａｌｌｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２）：７３８−７４９（２００１））に従って実施した。抗原特異的刺激のために、１１−ａａ重複を有する全ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｌ配列を含む１５−ａａペプチド（カリフォルニア州ダブリンに所在のＳｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．）からペプチドプールを作成した。各ウェルに５０μＬの２〜４×１０５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加した。細胞を、低サイズカットオフを８０ｆＬに設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて計数した。５０μＬの培地またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬ濃度の各ペプチドプールをＰＢＭＣに添加した。サンプルを３７℃、５％  ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。こうしてスポットが発生し、プレートをＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（メリーランド州シルバースプリングに所在）に基づく注文生産のイメージャー及び自動計数サブルーチンを用いて処理した。カウントを１０６細胞入力に正規化した。
【０１４４】
（Ｃ）  結果
３〜４匹の動物のコホートを０または４週目に１０１０ｖｐ／ベクターまたは１０８ｖｐ／ベクター用量の（１）ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ＋ＭＲＫａｄ５ｎｅｆ、（２）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆｍＣＭＶｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ、（３）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆｍＣＭＶｇａｇｐｏｌ及び（４）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆの１つのワクチンを用いて免疫化した。１０１０ｖｐ／ベクター用量のこれらのワクチンから誘導したＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を図４３に示す。
【０１４５】
４つのベクターすべては、１０１０ｖｐ／ベクター用量で３抗原すべてに対して特異的Ｔ細胞応答を誘導させることができた。２ウイルスまたは１ウイルスワクチンにより誘導される応答は３ワクチンカクテルに比して低い傾向にあるようであるが、その差は統計上有意でなかった。１０８ｖｐ／ベクター用量でのワクチンの免疫原性を図４４に示す。
【０１４６】
１０８ｖｐ／ベクターの低い用量であっても、４つのベクターはすべて３抗原すべてに対して検出可能な特異的Ｔ細胞応答を誘発させることができた。
【実施例６】
【０１４７】
ＭＲＫＡｄ６及びＭＲＫＡｄ６  ＨＩＶ−１  ｇａｇ、ｐｏｌ及びｎｅｆ構築物に対する免疫化
（Ａ）  免疫化
アカゲザルは体重３〜１０ｋｇであった。すべてにおいて、総用量の各ワクチンを緩衝液（１ｍｌ）中に懸濁した。アカゲザルをケタミン−キシラジンで麻酔し、ワクチンをツベルクリン注射器（ニュージャージー州フランクリンレークスに所在のＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて両方の三角筋に０．５ｍＬずつｉ．ｍ．送達した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を免疫化レジメン中数回採取した血液サンプルから調製した。動物のケア及び処置はすべてナショナル・リサーチ・カウンシル、実験動物資源協会のＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに記載されている原則に従ってＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ及びＵｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが認可している基準に従った。
【０１４８】
（Ｂ）  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルに対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、幾つか改変したが既報のプロトコル（Ａｌｌｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２）：７３８−７４９（２００１））に従って実施した。抗原特異的刺激のために、１１−ａａ重複を有する全ＨＩＶ−１  ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｌ配列を含む１５−ａａペプチド（カリフォルニア州ダブリンに所在のＳｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．）からペプチドプールを作成した。各ウェルに５０μＬの２〜４×１０５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を添加した。細胞を、低サイズカットオフを８０ｆＬに設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを用いて計数した。５０μＬの培地またはペプチドあたり８μｇ／ｍＬ濃度の各ペプチドプールをＰＢＭＣに添加した。サンプルを３７℃、５％  ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。こうしてスポットが発生し、プレートをＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（メリーランド州シルバースプリングに所在）に基づく注文生産のイメージャー及び自動計数サブルーチンを用いて処理した。カウントを１０６細胞入力に正規化した。
【０１４９】
（Ｃ）  プロトコル
３匹のアカゲザルのコホートを０または４週目に１０１０ｖｐ／ベクターまたは１０８ｖｐ／ベクター用量の（１）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ、（２）ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌ及び（３）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ＋ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌの１つのワクチンを用いて免疫化した。１０１０ｖｐ／ベクター用量のこれらのワクチンから誘導されたＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を図４５に示す。
【０１５０】
３つのワクチン接種群すべてにおいて、ベクターは１０１０ｖｐ／ベクター用量で３抗原すべてに対して特異的Ｔ細胞応答を誘導させることができた。Ａｄ５及びＡｄ６ベクターの免疫原性は単独または組み合わせて送達してときに匹敵する。１０８ｖｐ／ベクター用量でのワクチンの免疫原性を図４６に示す。１０８ｖｐ／ベクターの低用量であっても、３抗原すべてに対する特異的Ｔ細胞応答が検出された。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】完全長ｐ５５  ｇａｇのコドン最適化バージョンのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ−１】プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコード化する配列が欠失されており、ＲＴ（逆転写酵素及びＲＮアーゼＨ活性）及びＩＮインテグラーゼ活性をコード化するコドン最適化“野生型”配列は残っているコドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ配列（配列番号３）を示す。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基で始まり、ヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンで終止している。
【図２Ａ−２】プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコード化する配列が欠失されており、ＲＴ（逆転写酵素及びＲＮアーゼＨ活性）及びＩＮインテグラーゼ活性をコード化するコドン最適化“野生型”配列は残っているコドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ配列（配列番号３）を示す。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基で始まり、ヌクレオチド２５６０−２５６２の終止コドンで終止している。
【図３Ａ−１】配列番号３に開示されている野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレーム（配列番号４）を示す。
【図３Ａ−２】配列番号３に開示されている野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレーム（配列番号４）を示す。
【図４Ａ−１】ＬＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を示す。下線部分のコドン及びアミノ酸は本明細書中の表１に示す変異を示す。
【図４Ａ−２】ＬＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を示す。下線部分のコドン及びアミノ酸は本明細書中の表１に示す変異を示す。
【図４Ａ−３】ＬＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を示す。下線部分のコドン及びアミノ酸は本明細書中の表１に示す変異を示す。
【図５】ＨＩＶ−１  ｊｒｆｌ  ｎｅｆのコドン最適化バージョン（配列番号７）を示す。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンで終止している。
【図６】コドン最適化ＨＩＶ  ｊｒｆｌ  Ｎｅｆのオープンリーディングフレーム（配列番号８）を示す。
【図７Ａ−１】野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆのヌクレオチド配列比較を示す。ｊｒｆｌ分離株からの野生型ｎｅｆ遺伝子は２１６アミノ酸ポリペプチドをコード化し得る６４８ヌクレオチドから構成されている。ＷＴは野生型配列（配列番号１１）、ｏｐｔはコドン最適化配列（配列番号７内に含まれる）である。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字コード（配列番号８）で示す。
【図７Ａ−２】野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆのヌクレオチド配列比較を示す。ｊｒｆｌ分離株からの野生型ｎｅｆ遺伝子は２１６アミノ酸ポリペプチドをコード化し得る６４８ヌクレオチドから構成されている。ＷＴは野生型配列（配列番号１１）、ｏｐｔはコドン最適化配列（配列番号７内に含まれる）である。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字コード（配列番号８）で示す。
【図８】アミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）及びＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフのＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコード化するオープンリーディングフレームを有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する核酸（本明細書中“ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）”；配列番号９）を示す。前記オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンで終止する。
【図９】ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）のオープンリーディングフレーム（配列番号１０）を示す。
【図１０】アミノ末端ミリスチル化部位での修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）をコード化するオープンリーディングフレームを有する最適化ＨＩＶ−１  Ｎｅｆをコード化する核酸（本明細書中“ｏｐｔ  ｎｅｆ  （Ｇ２Ａ）”；配列番号１２）を示す。オープンリーディングフレームはヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基で始まり、ヌクレオチド６６０−６６２の“ＴＡＡ”終止コドンで終止する。
【図１１】ｏｐｔ  ｎｅｆ（Ｇ２Ａ）のオープンリーディングフレーム（配列番号１３）を示す。
【図１２】ｎｅｆ及びｎｅｆ誘導体の模式図を示す。Ｎｅｆ誘導体中に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２並びにロイシン１７４及び１７５はそれぞれミリスチル化及びジロイシンモチーフに関与する部位である。
【図１３】アデノウイルス亜型５及び６の血清流行を表で示す。ブラジル人及びタイ人の被験者はＨＩＶ感染に対する高リスク挙動のために選択した。＊＝タイ人被験者は主にＨＩＶ感染リスクが非常に高かった。
【図１４】プレアデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｐｏｌの構築を概略的に示す。
【図１５】プレアデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｎｅｆの構築を概略的に示す。
【図１６】ｐＭＲＫＡｄ６Ｅ１−を回収するために使用される相同組み換えプロトコルを示す。
【図１７】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５１０）が欠失されており、ｎｅｆ及びｇａｇ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型５ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆを示す。
【図１８Ａ−１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−３】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−４】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−５】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−６】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−７】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−８】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−９】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１８Ａ−１２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１９】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ５ｇａｇｎｅｆの構築に関与するキーステップを示す。
【図２０】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５０７）が欠失されており、ｎｅｆ及びｇａｇ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型６ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆを示す。
【図２１Ａ−１】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−２】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−３】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−４】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−５】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−６】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−７】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−８】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−９】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２１Ａ−１２】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図２２】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ６ｇａｇｎｅｆの構築に関与するキーステップを示す。
【図２３】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５１０）が欠失されており、ｇａｇｐｏｌ融合物発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型５ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌを示す。
【図２４Ａ−１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−３】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−４】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−５】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−６】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−７】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−８】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−９】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２４Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図２５】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを示す。
【図２６】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌ中に使用するためのｇａｇｐｏｌ融合断片を作成するためのＰＣＲ法を示す。
【図２７】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５１０）が欠失されており、ｎｅｆ及びｇａｇｐｏｌ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型５ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌを示す。
【図２８Ａ−１】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−２】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−３】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−４】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−５】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−６】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−７】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−８】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−９】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２８Ａ−１２】ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号１９）を示す。
【図２９】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを示す。
【図３０】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５１０）が欠失されており、ｇａｇｐｏｌｎｅｆ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型５ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆを示す。
【図３１Ａ−１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−３】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−４】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−５】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−６】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−７】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−８】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−９】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３１Ａ−１２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２０）を示す。
【図３２】アデノウイルスシャトルプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの構築に関与するキーステップを示す。
【図３３】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆ中に使用するためのｐｏｌｎｅｆ融合断片を作成するためのＰＣＲ法を示す。
【図３４】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌｎｅｆの構築に関与するキーステップを示す。
【図３５】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５０７）が欠失されており、ｎｅｆ及びｇａｇｐｏｌ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型６ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌを示す。
【図３６Ａ−１】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−２】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−３】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−４】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−５】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−６】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−７】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−８】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−９】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３６Ａ−１２】ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの核酸配列（配列番号２１）を示す。
【図３７】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ６ｎｅｆ−ｇａｇｐｏｌの構築に関与するキーステップを示す。
【図３８】Ｅ１領域（ヌクレオチド４５１−３５０７）が欠失されており、ｇａｇｐｏｌｎｅｆ発現カセットで置換されているプロトタイプＣ群アデノウイルス血清型６ベクターの修飾物であるＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆを示す。
【図３９Ａ−１】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−２】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−３】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−４】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−５】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−６】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−７】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−８】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−９】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−１０】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図３９Ａ−１１】ＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの核酸配列（配列番号２２）を示す。
【図４０】アデノウイルスベクターＭＲＫＡｄ６ｇａｇｐｏｌｎｅｆの構築に関与するキーステップを示す。
【図４１】免疫化中のＮｅｆ特異的Ｔ細胞のレベルを表で示す。値はＰＢＭＣ１００万個あたりのＩＦＮ−γ分泌細胞の偽減算した数を表している。ｗｋは週である。太字の数字（各群の最終列）はＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣのコホート相乗平均である。
【図４２】ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ及びＭＲＫＡｄ５ｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ６ｇａｇカクテルの効率に対する既存のＡｄ５特異的免疫の影響を表で示す。第１及び第２コホートはｇａｇ発現ベクターで免疫化する前平均１３００〜１４００のＡｄ５特異的中和力価を有している。第３コホートは検出可能な既存中和力価を有していなかった。全ｇａｇペプチドプール及び偽対照に対する４週目及び８週目での各動物についてのＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ値を示す。Ｔ細胞応答のコホート相乗平均を太字で示す。
【図４３】１０１０ｖｐ／ベクターのワクチン、すなわち（１）ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ＋ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ；（２）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆｍＣＭＶｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ；（３）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆＭＣＭＶｇａｇｐｏｌ；及び（４）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆの１つで免疫化したアカゲザルにおけるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ特異的Ｔ細胞のレベルを表で示す。１１−ａａ重複を有する１５−ａａペプチドからなる全ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｌペプチドプールを用いてサイトカイン分泌を誘導した。４週目及び８週目での各動物についての偽補正したＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ値を示す。各抗原に対するＴ細胞応答のコホート相乗平均を太字で示す。
【図４４】１０８ｖｐ／ベクターのワクチン、すなわち（１）ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ＋ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ；（２）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆｍＣＭＶｇａｇ＋ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ；（３）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｎｅｆｍＣＭＶｇａｇｐｏｌ；及び（４）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｇａｇｐｏｌｎｅｆの１つで免疫化したアカゲザルにおけるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ特異的Ｔ細胞のレベルを表で示す。１１−ａａ重複を有する１５−ａａペプチドからなる全ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｌペプチドプールを用いてサイトカイン分泌を誘導した。４週目及び８週目での各動物についての偽補正したＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ値を示す。各抗原に対するＴ細胞応答のコホート相乗平均を太字で示す。
【図４５】１０１０ｖｐ／ベクターのワクチン、すなわち（１）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ；（２）ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌ；（３）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ＋ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌの１つで免疫化したアカゲザルにおけるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ特異的Ｔ細胞のレベルを表で示す。１１−ａａ重複を有する１５−ａａペプチドからなる全ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｔペプチドプールを用いてサイトカイン分泌を誘導した。４週目及び８週目での各動物についての偽補正したＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ値を示す。各抗原に対するＴ細胞応答のコホート相乗平均を太字で示す。
【図４６】１０８ｖｐ／ベクターのワクチン、すなわち（１）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ；（２）ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌ；（３）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆｇａｇｐｏｌ＋ＭＲＫＡｄ６ｎｅｆｇａｇｐｏｌの１つで免疫化したアカゲザルにおけるＧａｇ、Ｐｏｌ及びＮｅｆ特異的Ｔ細胞のレベルを表で示す。１１−ａａ重複を有する１５−ａａペプチドからなる全ｎｅｆ、ｇａｇ及びｐｏｌプチドプールを用いてサイトカイン分泌を誘導した。第４週及び第８週での各動物についての偽補正したＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ値を示す。各抗原に対するＴ細胞応答のコホート相乗平均を太字で示す。
【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１】
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【図１８Ａ−２】
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【図１８Ａ−３】
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【図１８Ａ−４】
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【図１８Ａ−５】
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【図１８Ａ−６】
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【図１８Ａ−７】
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【図１８Ａ−８】
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【図１８Ａ−９】
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【図１８Ａ−１０】
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【図１８Ａ−１１】
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【図１８Ａ−１２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ａ−３】
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【図２１Ａ−４】
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【図２１Ａ−５】
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【図２１Ａ−６】
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【図２１Ａ−７】
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【図２１Ａ−８】
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【図２１Ａ−９】
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【図２１Ａ−１０】
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【図２１Ａ−１１】
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【図２１Ａ−１２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−１】
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【図２４Ａ−２】
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【図２４Ａ−３】
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【図２４Ａ−４】
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【図２４Ａ−５】
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【図２４Ａ−６】
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【図２４Ａ−７】
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【図２４Ａ−８】
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【図２４Ａ−９】
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【図２４Ａ−１０】
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【図２４Ａ−１１】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ−１】
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【図２８Ａ−２】
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【図２８Ａ−３】
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【図２８Ａ−４】
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【図２８Ａ−５】
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【図２８Ａ−６】
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【図２８Ａ−７】
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【図２８Ａ−８】
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【図２８Ａ−９】
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【図２８Ａ−１０】
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【図２８Ａ−１１】
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【図２８Ａ−１２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ−１】
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【図３１Ａ−２】
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【図３１Ａ−３】
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【図３１Ａ−４】
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【図３１Ａ−５】
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【図３１Ａ−６】
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【図３１Ａ−７】
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【図３１Ａ−８】
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【図３１Ａ−９】
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【図３１Ａ−１０】
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【図３１Ａ−１１】
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【図３１Ａ−１２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ−１】
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【図３６Ａ−２】
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【図３６Ａ−３】
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【図３６Ａ−４】
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【図３６Ａ−５】
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【図３６Ａ−６】
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【図３６Ａ−７】
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【図３６Ａ−８】
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【図３６Ａ−９】
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【図３６Ａ−１０】
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【図３６Ａ−１１】
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【図３６Ａ−１２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ−１】
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【図３９Ａ−２】
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【図３９Ａ−３】
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【図３９Ａ−４】
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【図３９Ａ−５】
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【図３９Ａ−６】
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【図３９Ａ−７】
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【図３９Ａ−８】
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【図３９Ａ−９】
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【図３９Ａ−１０】
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【図３９Ａ−１１】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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