(57)【要約】  本発明は、発光指示色素としての用途を有する化合物、ならびに代表的には水系サンプルのほぼ中性のｐＨ値を測定するのに用いられる光学センサーに関するものである。その光学センサーは、例えば血液、血漿および血清などの体液のｐＨ測定に特定の用途を有する。【選択図】  図２
2008521985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉを有する化合物。
【化１】
2008521985.tif 000012
［式中、
Ｘは発光性部分であり、
ｍは数値０、１または２を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素、塩素またはフッ素を表し、
ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが塩素またはフッ素を表す。］
【請求項２】
Ｒ２および／またはＲ４が塩素またはフッ素を表し、Ｒ１およびＲ３が水素を表す請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記一般式Ｉ中の発光性部分Ｘが、
（ａ）下記一般式ＩＩのアミノ−ナフタルイミド基：
【化２】
2008521985.tif 000013
［式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０のうちの一つが基−ＮＨ−であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物の基−（ＣＨ２）ｍ−に結合し、残りの基およびＲ１１が独立に水素、親油性もしくは親水性基またはポリマーへのカップリングのための反応性基である。］；
（ｂ）下記一般式ＩＩＩのキサンテノン基：
【化３】
2008521985.tif 000014
［式中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９のうちの一つが化学結合であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物に直接（ｍ＝０）結合し、残りの基が−ＯＨ、−ＯＲ２７（Ｒ２７は親水性もしくは親油性基である）、−Ｏ−Ｒ２８−Ｇ（Ｒ２８は親水性または親油性基であり、Ｇはポリマーへのカップリングのための反応性基である）、または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０〜１７の数字である）、あるいはポリマーへのカップリングのための基もしくは反応性基を表す。］；または
（ｃ）下記一般式ＩＶの基：
【化４】
2008521985.tif 000015
［式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６のうちの一つが化学結合であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物の基−（ＣＨ２）ｍ−に結合し、残りの基が独立に水素、親油性もしくは親水性基またはポリマーへのカップリングのための反応性基であり、またはＲ２５がＲ２４とともに芳香環系を形成しており、Ｒ２１がＲ２２とともに芳香環系を形成している。］
である請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
下記式の化合物。
【化５】
2008521985.tif 000016
【請求項５】
発光色素を含む水系媒体のｐＨを測定するための光学センサーであって、該発光色素が請求項１に記載の化合物であり、該化合物が固定化形態で存在する光学センサー。
【請求項６】
発光色素を含む水系媒体のｐＨを測定するための光学センサーであって、該発光色素が請求項２に記載の化合物であり、該化合物が固定化形態で存在する光学センサー。
【請求項７】
発光色素を含む水系媒体のｐＨを測定するための光学センサーであって、該発光色素が請求項３に記載の化合物であり、該化合物が固定化形態で存在する光学センサー。
【請求項８】
発光色素を含む水系媒体のｐＨを測定するための光学センサーであって、該発光色素が請求項４に記載の化合物であり、該化合物が固定化形態で存在する光学センサー。
【請求項９】
水系媒体のｐＨを測定する方法であって、請求項５に記載の光学センサーを前記水系媒体と接触させることを含む方法。
【請求項１０】
前記水系媒体が血液、血漿または血清から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
水系媒体のｐＨを測定する方法であって、請求項６に記載の光学センサーを前記水系媒体と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
前記水系媒体が血液、血漿または血清から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
水系媒体のｐＨを測定する方法であって、請求項７に記載の光学センサーを前記水系媒体と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
前記水系媒体が血液、血漿または血清から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
水系媒体のｐＨを測定する方法であって、請求項８に記載の光学センサーを前記水系媒体と接触させることを含む方法。
【請求項１６】
前記水系媒体が血液、血漿または血清から選択される請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光指示色素としての用途を有する化合物、ならびに代表的には水系サンプルの中性付近のｐＨ値の測定に用いられる光学センサーに関するものである。その光学センサーは、例えば血液、血漿および血清などの体液のｐＨ測定において特定の用途を有する。
【背景技術】
【０００２】
ｐＨの測定は、科学および技術の多くの分野で、例えば化学、プロセス工学、製造および環境分析での必須の作業である。ｐＨ測定用の多くの光学センサーが提案されている。光学センサーによる血液ｐＨの測定およびモニタリングに主眼を置いた調査が報告されている（Leiner and Wolfbeis, Fiber Optic pH Sensors, in CRC BOOK ON FIBER OPTIC CHEMICAL SENSORS AND BIOSENSORS (O.S. Wolfbeis ed., CRC Press Inc., Boca Raton, FL (1991)) and Leiner and Hartmann, Theory and practice in optical pH sensing, SENSORS AND ACTUATORS, B 11, 281-289 (1993)）。
【０００３】
血液ガス分析には、ｐＨを非常に正確に測定することが必須である（Leiner, Optical sensors for in vitro blood gas analysis, SENSORS AND ACTUATORS, B 29, 169-173 (1995)参照）。
【０００４】
最近、血清、血漿および全血検体中のナトリウムおよびカリウムの測定に好適な新たな光学センサーが報告されている。その光学センサーは、親水性ポリマー層に固定化されたＰＥＴ色素に基づいたものである（He et al., A fluorescent chemosensor for sodium based on photoinduced electron transfer, ANAL. CHEM. 75, 549-555 (2003)；He et al., A fluorescent sensor with high selectivity and sensitivity for potassium in water, J. AM. CHEM. Soc. 125, 1468-1469 (2003)参照）。「ＰＥＴ」効果（ＰＥＴ＝光誘起電子移動）とは、光子誘発による供与体から発光性部分への電子の移動を指す。
【０００５】
ｐＨに対して感受性であるＰＥＴ色素が知られており、その色素は最初に、溶媒中での発光ＰＥＴ系を研究するのに用いられた（Bissel et al., Luminescence and Charge Transfer. Part 2. Aminomethyl Anthracene Derivatives as Fluorescent PET (Photoinduced Electron Transfer) Sensors for Protons, J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS 2, 1559-1564 (1992)）。初期の研究では、脂肪族および芳香族アミン類が、ＰＥＴ色素用のｐＨ感受性部分（供与体部分）として提案された。後者は発光性芳香族化合物（受容体部分）に結合されて、ｐＨ感受性ＰＥＴ色素を生じた。アミノ基を含むＰＥＴ色素は、プロトン化体および脱プロトン化体の発光強度に強い差を示す。受容体部分にスペーサー基を介して結合した供与体部分は、発光クエンチャーとして作用する。プロトン化状態では、電子的に励起した受容体部分の発光のクエンチングは起こらない。脱プロトン状態では、ＰＥＴ基が電子的に励起された受容体部分の発光をクエンチングする。クエンチング効率は、クエンチャー部分が電子的に励起された受容体部分に電子を移動させる能力ならびに電子的に励起した受容体部分がその電子を受け取る能力によって決まる。
【０００６】
プロトン化および脱プロトン化色素化学種の比率は、ＰＥＴ供与基付近のｐＨ（ｐＨ＝−ｌｏｇ（プロトンの濃度または活量））およびＰＥＴ供与体部分のｐＨ感受性化学基のｐＫの両方によって決まることから、ＰＥＴ色素の発光強度はｐＨによって決まる。ｐＫは、プロトン化および脱プロトン化色素化学種の比率が１となるｐＨと定義される。
【０００７】
概して、有用なｐＨ範囲、すなわち発光強度の有意な変化が起こるｐＨ範囲は、約ｐＫ±１．５単位である。
【０００８】
従って、水系サンプルの中性付近のｐＨを測定するには、水系環境でＰＥＴ供与基のｐＫがほぼ中性（７に近い）であることが必要である。光学センサーによって３７℃での血液ｐＨを測定するには、センサーを各種ｐＨの較正溶液に曝露することで測定される３７℃ｐＫが、最も好ましくは７．４±０．３ｐＨ単位に近いものである。
【０００９】
ＰＥＴクエンチングに好ましいアミンは、未置換脂肪族アミン類（すなわち、−ＣＨ２−ＮＨ２；ＮＯＴ−ＣＨ２−ＮＲＨまたは−ＣＨ２−ＮＲ２）および未置換芳香族アミン類（すなわちフェニル−ＮＨ２）である。未置換脂肪族アミン類の代表的なｐＨは、ほぼ９である。未置換芳香族アミン類の代表的なｐＫはほぼ３〜４であり、正確なｐＫは具体的な化学的環境および温度によって決まる。
【００１０】
色素部分が有利な吸光波長（好ましくは４５０ｎｍより高い）および発光波長（好ましくは５００ｎｍより高い）を有することがさらに必要である。
【００１１】
色素部分が酸素のような悪いクエンチャーに対して非感受性であることがさらに必要である。後者は特に、酸素感受性色素（すなわち、遷移金属錯体）には当てはまらない。
【００１２】
親水性マトリクス中に存在する水溶性色素は水系サンプルによって容易に洗い流されることから、最も好ましくは共有結合によって色素をマトリクスに結合させる必要がある。共有結合的結合、すなわち温和な環境条件下での化学反応を介した結合のための化学基を含む色素が好ましい。
【００１３】
さらに、対象とするｐＨ範囲内で、ＰＥＴ指示色素の色素部分がｐＨに対して実質的に非感受性であることが最も有利である。従って、例えばフルオレセイン色素は、中性付近のｐＨ範囲内のｐＫを有するプロトン化可能（protonable）基を有する。
【００１４】
ワーナーら（Werner et al., Novel optical pH-sensor based on a borodiaza-indacene derivative, FRESENIUS J. ANAL. CHEM. 359, 150-154 (1997)）は、ヒドロゲルマトリクスに固定化されたＰＥＴ色素（１，３，５，７−テトラメチル−８−（４−ジメチルアミノ）−４−ジフルオロボラ−３ａ，４ａ−ジアザ（ｓ）−インダセン）に基づくｐＨセンサーについて報告している。クエンチャー基は、ジメチルアミノフェニルである。芳香族窒素はプロトンと可逆的に反応する。ｐＫが低いために（ｐＫ＝３．３；ワーナーらの上記の報告における図３参照）、この指示色素の発光強度は、そのｐＨ範囲（約１．５〜４．５）でｐＨの関数として変化する。従ってその色素は、生理ｐＨ（すなわち、血液）の測定には有用性がない。
【００１５】
ガレイス（Gareis）ら（Phenol/phenolate-dependent on/off switching of the luminescence of 4,4- difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenes, CHEM. COMMUN. 1717-1718 (1997)）は、フェノール系クエンチャー基（ＰＥＴ供与基）を有する４，４−ジフルオロボラ−３ａ，４ａ−ジアザ（ｓ）−インダセンが強いＰＥＴ効果を示すことを報告している。
【００１６】
ウォルフバイス（Wolfbeis）らは、ｐＨ測定のための−ＮＲ２および−ＯＨ官能基を有する多くのＰＥＴ色素について記載している（米国特許第６００１９９９号明細書、第４欄、図２および請求項８参照）。
【００１７】
ＣＨＣｌ３に溶かしたその色素の滴定（ガレイスらの上記報告）で、その次にピリジンを加えた時に５２０ｎｍ発光バンドの強い低下が示された。ガレイスらは、光学センサーのヒドロゲルマトリクスにその色素を埋め込んでいる。そのマトリクスでは、その色素の塩基型（フェノレート種）は低い発光強度を示したが、指示色素の酸性型（フェノール種）は高い発光強度を示した。その調べた２つのフェノールのｐＨ滴定曲線から、ｐＫはそれぞれ１０．４および１０．８と測定された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記背景に対して、本発明は先行技術より優れたある種の非自明な利点および進歩を提供するものである。特に、本発明者らは、水系サンプルでの中性付近のｐＨ値の測定において発光指示色素および光学センサーに改良が必要であることを認めていた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
最新技術は、単純な（モノ−またはビスヒドロキシ）フェノールに基づくＰＥＴ色素は、それのｐＫが高いために、酸性および中性付近ｐＨの測定を行うための光学センサーでの発光指示色素として使用できないことを示唆している。さらに、本出願人らが行った研究では、４−ジフルオロボラ−３ａ，４ａ−ジアザ（ｓ）−インダセン色素が、長時間にわたって水系溶媒または含水有機溶媒中で保存した場合にあまり安定でないことが示されている。本出願人らの結果は、４−ジフルオロボラ−３ａ，４ａ−ジアザ（ｓ）−インダセン色素が、長期間（すなわち、何日も）にわたる含水環境への色素の曝露を必要としないｐＨセンサー用途においてのみ有用であることを示唆している。
【００２０】
色素部分として４−アミノナフタルイミド発光団を用いるＰＥＴ色素が、光学Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ＋＋センサーに特に有用であることが認められている。特に複数の光学センサーを有する使い捨て品での使用の場合、「他の」色素と適合するスペクトル特性を持ったＰＥＴｐＨ色素を有することが非常に望ましいものと考えられる。
【００２１】
先行技術から公知のフェノレート供与基を分子で、生理的範囲（ｐＨ６〜８）のｐＨ測定に実際に用いることができるものはない。
【００２２】
本発明は具体的な利点や機能に限定されるものではないが、留意すべき点として、本発明は、水系サンプルで中性付近のｐＨ値を測定するのに好適な発光色素を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の１実施形態によれば、下記一般式Ｉを有する化合物が提供される。
【化１】
2008521985.tif 000003
【００２４】
式中、
Ｘは発光性部分であり、
ｍは数値０、１または２を意味し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素、塩素またはフッ素を表し、
ただしＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のうちの少なくとも一つが塩素またはフッ素を表す。
【００２５】
代表的な実施形態は、Ｒ２および／またはＲ４が塩素またはフッ素を表し、Ｒ１およびＲ３が水素を表すものである。
【００２６】
一般式Ｉ中の発光性部分Ｘは特には、
（ａ）下記一般式ＩＩのアミノ−ナフタルイミド基：
【化２】
2008521985.tif 000004
【００２７】
［式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０のうちの一つが基−ＮＨ−であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物の基−（ＣＨ２）ｍ−に結合し、残りの基およびＲ１１が独立に水素、親油性もしくは親水性基またはポリマーへのカップリングのための反応性基である。］；
（ｂ）下記一般式ＩＩＩのキサンテノン基：
【化３】
2008521985.tif 000005
【００２８】
［式中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９のうちの一つが化学結合であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物に直接（ｍ＝０）結合し、残りの基が−ＯＨ、−ＯＲ２７（Ｒ２７は親水性もしくは親油性基である）、−Ｏ−Ｒ２８−Ｇ（Ｒ２８は親水性または親油性基であり、Ｇはポリマーへのカップリングのための反応性基である）、または−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（ｎは０〜１７の数字である）、あるいはポリマーへのカップリングのための基もしくは反応性基を表す。］；または
（ｃ）下記一般式ＩＶの基：
【化４】
2008521985.tif 000006
【００２９】
［式中、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５およびＲ２６のうちの一つが化学結合であって、それを介してＸが一般式Ｉの請求項１で言及される化合物の基−（ＣＨ２）ｍ−に結合し、残りの基が独立に水素、親油性もしくは親水性基またはポリマーへのカップリングのための反応性基であり、またはＲ２５がＲ２４とともに芳香環系を形成しており、Ｒ２１がＲ２２とともに芳香環系を形成している。］
であることができる。
【００３０】
本発明の別の実施形態によれば、下記式の化合物が提供される。
【化５】
2008521985.tif 000007
【００３１】
本発明のさらに別の実施形態によれば、発光色素を含む水系媒体のｐＨを測定するための光学センサーであって、その発光色素が本発明の前記いくつかの実施形態のうちの一つによる化合物であることができ、その化合物が固定化形態で存在する光学センサーが提供される。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、本発明の前記いくつかの実施形態のうちの一つによる光学センサーを水系媒体と接触させることを含む、水系媒体のｐＨを測定する方法が提供される。その水系媒体は、血液、血漿または血清から選択することができる。
【００３３】
本発明の発光色素は、約６．８〜約８．０のｐＨ範囲、特には約７．１〜約７．６のｐＨ範囲でそれの発光挙動の大幅な変化を示す。従って、本発明の化合物は、水系媒体、特には血液、血漿または血清での中性付近のｐＨの測定に用いることができる。
【００３４】
上記一般式による発光色素は、従来の合成方法（例えば、米国特許第６１２４１３５号明細書；米国特許第６００１９９９号明細書）を利用することで、当業者が製造することが可能である。下記において、実施例によって本発明についてさらに詳細に説明し、一部の好ましい指示薬の合成および特性について説明する。本発明による他の指示薬が、当業者によって同様の方法で製造可能である。
【００３５】
添付の特許請求とともに下記の本発明の詳細な説明から、本発明の上記および他の特徴および利点についての理解がさらに深まるであろう。留意すべき点として、特許請求の範囲はそこに記載の内容によって定義されるものであって、本説明に記載されている特徴および利点についての具体的な記述によって定義されるものではない。
【００３６】
本発明に実施形態についての下記の詳細な説明は、下記の図面と組み合わせて読んだ場合に最も良く理解できるものであり、その図面において、類似の構造は同様の参照数字で示している。
【００３７】
当業者であれば、図中の構成要素は簡潔性および明瞭性を期して示されているものであって、必ずしも寸法通りに描かれているわけではないことは明らかである。例えば、図中の構成要素の一部のものの寸法を他の構成要素に対して誇張することで、本発明の実施形態についての理解を深めることができる。
【実施例】
【００３８】
本発明をさらに容易に理解できるようにするため、下記の実施例を参照するが、それらは本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３９】
実施例
下記において、本発明の色素の代表的な実施形態（化合物Ａ４１）の化学合成、それのＰＶＰビーズ上への固定化、光学センサーディスクの製造ならびにｐＨ測定について説明する。
【００４０】
１．色素Ａ４１の合成
【００４１】
下記式を有する発光色素  Ａ４１
【化６】
2008521985.tif 000008
【００４２】
化学薬品
・ＤＣＭ（塩化メチレン）：リーデル・デ・ヘン（Riedel de Haen）２４２３３＞９９％
・ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）：フルカ（Fluka）９１７００＞９８％
・ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）：フルカ５６４８０＞９７％
・ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）：フルカ３８３７０＞９８％
・ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）：フルカ３９４０５＞９８％
・ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）：フルカ０３４４０＞９８％
・アセトニトリル：メルク（Merck）−ＨＰＬＣ用
・４−アミノメチルベンコン酸（bencoic acid）：フルカ：０８４００＞９８％
・ＳＯＣｌ２：フルカ：８８９５０＞９９％
・純粋ＥｔＯＨ：リーデル・デ・ヘン：３２２２１
・ＴＥＡ（トリエチルアミン）：メルク：８０８３５２
・ＳＯ２Ｃｌ２：フルカ：８６２２１２
・ヒドラジン・１水和物：フルカ：５３８５０
・無水フタル酸：フルカ：８００２０
・チラミン塩酸塩：フルカ９３８２０＞９７％
・ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）：フルカ：６９１１６
・４−クロロ−１，８−ナフタル酸無水物：アルドリッチ（Aldrich）：１９１４９−３約９５％
【００４３】
合成経路は図１Ａおよび図１Ｂに示してある。
【００４４】
４−アミノメチルベンコン酸−エチルエステル塩酸塩（１）：
４−アミノメチルベンコン酸２０．０ｇ（１３２ｍＭ）を純粋ＥｔＯＨ  ２００ｍＬに懸濁させ、氷で冷却した。塩化チオニル２８．０ｇ（１７ｍＬ）（２３６ｍＭ）を滴下した。得られた透明混合物を３時間還流した。冷却して室温とした後、ＥｔＯＨを留去した。トルエン／ＥｔＯＨの１／１を５０ｍＬ加え、３回留去した。残留物を乾燥させて、１を２７ｇ得た。
【００４５】
４−クロロ−ナフタルイミジル−メチルベンコン酸−エチルエステル（２）：
４−アミノメチルベンコン酸−エチルエステル塩酸塩２０．０ｇ（９３．２ｍＭ）、４−クロロ−１，８−ナフタル酸無水物２１．６８ｇ（９３．２ｍＭ）およびトリエチルアミン１９．７８ｇ（１９５．５ｍＭ）のＤＭＦ（４００ｍＬ）溶液を加熱して９０℃とし、終夜撹拌した。
【００４６】
冷却して室温とした後、１００ｍＬのＨ２Ｏを加えて所望の生成物を沈殿させた。
【００４７】
４−クロロ−ナフタルイミジル−メチルベンコン酸−エチルエステルをＥｔＯＨから再結晶させた。収量：１５．８ｇ
【００４８】
ＨＰＬＣ（バイダック（Vydac）１０−９０−１５）はｔ＝１４．０４で単一のピークを示し、質量ピークＭＨ＋＝３９４．８（Ｍ＝３９３．８２）が、マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析スペクトラムで認められた。
【００４９】
チラミンフタルイミド（３）：
無水フタル酸２９．６ｇ（２００ｍＭ）、チラミン塩酸塩３４．７３（２００ｍＭ）およびトリエチルアミン２７．７ｍＬ（２００ｍＭ）を加熱して１１５℃として４時間経過させた。冷却して室温とした後、混合物を氷水１．５リットルに投入した。沈殿を濾過し、水で洗浄した。収量：４５ｇ
【００５０】
ジクロロチラミンフタルイミド（４）：
沸騰している２４．７５ｇ（１７０ｍＭ）の塩化スルフリルおよび７５ｍＬのＣＨＣｌ３に、チラミンフタルイミド１５．３５ｇ（５７ｍＭ）をゆっくり少量ずつ加えた。混合物が透明になるまで還流を続けた。次に、溶液を開放状態で室温にて終夜撹拌して、塩化スルフリルを除去した。溶媒を留去によって除去し、粗生成物を７５ｍＬのＭｅＯＨから再結晶した。収量：７．２ｇ
【００５１】
ジクロロチラミン（５）：
ジクロロチラミンフタルイミド７．２ｇおよびヒドラジン１水和物１．６ｍＬを純粋ＥｔＯＨ  １７０ｍＬ中で終夜還流させた。冷却して室温とした後、沈殿を濾過した。得られた粗生成物を精製せずに以降の合成に用いた。
【００５２】
Ａ−０４０：
ジクロロチラミン１．５ｇ（７．２６ｍＭ）、４−クロロナフタルイミジルメチル安息香酸エチルエステル２．８５ｇおよびＤＩＰＥＡ  ４ｍＬのＮＭＰ（１５０ｍＬ）中混合物を加熱して９０℃として４日間経過させた。
【００５３】
冷却して室温とした後、１．５リットルの水および７ｍＬのＡｃＯＨを加えた。沈殿を濾過し、ＣＨＣｌ３  ４００ｍＬに溶かした。有機層を０．５Ｎ  ＮａＯＨで３回抽出し、ＮａＯＨ層を６Ｎ  ＨＣｌで酸性とした。水層を酢酸エチルで抽出し、色素を含む有機層をＭｇＳＯ４で脱水した。溶媒を留去によって除去した。最後に、粗Ａ−０４０をドライフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００５４】
・勾配：石油エーテル
・石油エーテル／酢酸エチル９／１
・石油エーテル／酢酸エチル８／２
・石油エーテル／酢酸エチル７／３
・石油エーテル／酢酸エチル１／１
【００５５】
ＨＰＬＣ（バイダック：１０−９０−１５）は、ｔ＝１３．４２分に単一ピークを示し、質量ピークＭ＝５６３（Ｍ＝５６３）がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定によって認められた。
【００５６】
Ａ−０４１：
Ａ−０４０をアセトニトリル５０ｍＬおよび１Ｎ  ＮａＯＨ  ５０ｍＬに溶かした。溶液を昇温させて６０℃とし、１時間撹拌した。次に、溶液をＨＣｌで酸性とし、酢酸エチルで抽出した。色素を含む酢酸エチル層を水で３回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で脱水した後、溶媒を留去によって除去した。収量：３５０ｍｇ
【００５７】
ＨＰＬＣ（バイダック：１０−９０−１５）はｔ＝１１．３分に単一ピークを示し、質量ピークＭＨ＋＝５３５．４（Ｍ＝５３４．４）がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定によって認められた。
【００５８】
２．ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）ビーズの合成
【００５９】
下記の合成図式を用いた。
【化７】
2008521985.tif 000009
【００６０】
脱気および脱イオン化した水４００ｇを、窒素導入管の取り付けられた５００ｍＬ丸底フラスコに入れる。フラスコに磁気撹拌バー（大きさ：直径７ｍｍ、長さ４０ｍｍ）および還流冷却管を取り付け、温度７０±２℃の油浴に入れる。テフロン（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン）締付けを用いてフラスコと冷却管を接続して、冷却管がフラスコに貼り付くのを回避する。高撹拌および緩やかな窒素気流下に、撹拌を４５分間続けて、酸素の除去を確実に行う。メチレン−ビスアクリルアミド（フルカ６６６６７）１０ｇおよびＮ−アミノ−プロピル−メタクリルアミド（ポリサイエンシーズ（Polysciences）２１２００）５００ｍｇを１回で加える。次に、ビニルピロリドン（アルドリッチ、Ｖ３４０−９）１０ｍＬを１回で加える。緩やかな窒素気流下で撹拌を１５分間続ける。
【００６１】
ペルオキソ二硫酸アンモニウム（フルカ、０９９２０）８００ｍｇを再蒸留水１０ｍＬに溶かし、溶解が完了したら直ちに反応溶液へ加える（通常は、溶解時に多くの気泡が形成されるが、気泡が消えるまで溶液の添加を待ってはならない）。わずかなオパール色が生じるまで（通常は数分後）、緩やかな窒素気流下での撹拌および加熱を続けるべきである。窒素を切り、撹拌および加熱を２時間続ける。３０分〜１時間後、反応混合物は半固体となり、撹拌はそれ以上できなくなる。
【００６２】
反応混合物を水約５００ｍＬで希釈し、濾紙（Schleicher&Schull, Nr.589,1., Schwarzband, fast filtration）を用いて直径１５ｃｍの「ブフナー」漏斗で濾過する。沈殿を水１リットルに再懸濁させ（２リットルビーカー、撹拌バーの大きさ：直径１０ｍｍ、長さ８０ｍｍ）、少なくとも４時間撹拌し、再度濾過する。この洗浄手順を５回繰り返す（少なくとも、撹拌時間のうちの１回は延長して終夜とする）。その後、それを９９％エタノール５００ｍＬに再懸濁させ、少なくとも２時間撹拌し、再度濾過する。この手順を３回繰り返す。生成物を減圧下にデシケータ（exciscator）中で乾燥させる。
【００６３】
より容易に再分散可能な粒子を各種乾燥条件を用いて得ることができ、通常は凍結乾燥で微細粉末が得られる。
【００６４】
３．色素Ａ４１のＰＶＰビーズ上への固定化
【００６５】
下記の合成図式を用いた。
【化８】
2008521985.tif 000010
【００６６】
Ａ−０４１  ６０ｍｇ、ＮＨＳ  ２０ｍｇ、ＤＩＣ  ２０ｍｇおよび触媒量のＤＭＡＰをＤＭＦ  ２ｍＬおよびアセトニトリル２０ｍＬ中にて室温で３時間撹拌した。
【００６７】
その期間後、ＨＰＬＣでは、ＮａＦＩのＮＨＳ−エステルが定量的に形成されたことが示されている。
【００６８】
ＨＰＬＣ（バイダック：１０−９０−１５Ｖ４．Ｍ、２１５／４３０ｎｍ）ｔ＝１２．１分に単一ピーク。
【００６９】
ＰＶＰビーズ上へのＡ４１−カップリング：
ＰＶＰ  ４００ｍｇを水２０ｍＬ中にて室温で４時間弱めて（weaked）から、ＮａＦＩ−ＮＨＳエステルのアセトニトリル溶液（上記参照）および１ｍＬのＤＩＰＥＡを加えた。
【００７０】
懸濁液を室温で３日間撹拌させた。次に、懸濁液を遠心し、液体を注ぎ出して除去した。液体が無色となり、ＤＩＰＥＡの悪臭が消えるまで、ペレットをアセトニトリルで洗った。
【００７１】
この手順後、色素を負荷したＰＶＰビーズをデシケータで乾燥させた。
【００７２】
４．キャスト溶液の調製
【００７３】
キャスト溶液の成分
・色素負荷ＰＶＰビーズ
・親水性ポリエーテル−ポリウレタン、吸水率５０％（Cardiotech International, 78 E Olympia Avenue, Woburn, MA 01801-2057, USA）
・エタノール：水、体積比９０：１０
・カーボンブラック（フラムルス（Flammruss）１０１、デグッサ（Degussa））
【００７４】
指示薬層キャスト溶液：
色素負荷ＰＶＰビーズ１００ｍｇを、均一分布するまでエタノール：水４．７５ｍＬに懸濁させた。次に、ポリエーテル−ポリウレタンヒドロゲルを加え、混合物を終夜撹拌した。
【００７５】
被覆層キャスト溶液：
ヒドロゲル１ｇをエタノール：水９ｇに溶かした。カーボンブラック０．３ｇを加え、分散液を室温で１４時間撹拌した。
【００７６】
５．光学センサーディスクの製造
【００７７】
指示薬層キャスト溶液をポリエステル箔（Melinex foil, ICI America）上にコーティングし、溶媒を留去した。指示薬層の最終乾燥厚は約１０μｍであった。次に、被覆層キャスト溶液を指示薬層上にコーティングし、溶媒を留去した。被覆層の最終乾燥厚は、約５μｍであった。次に、小さいセンサーディスク（直径２．５ｃｍ）を打ち抜き、緩衝液中に少なくとも１７時間浸漬して活性化した。
【００７８】
センサーディスクのカットおよび測定の方法は、文献（M. J. P. Leiner and P. Hartmann, Theory and Practice in optical pH sensing, SENSORS AND ACTUATORS, B 11, 281- 289 (1993)およびM. J. P. Leiner, ANALYTICA CHIMICA ACTA 255, 209-222 (1991)）に記載されている。
【００７９】
６．ｐH緩衝液の調製
【００８０】
・溶液Ａ（０．０２ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ、０．１４６ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）
・溶液Ｂ（０．０５ｍｏｌ／ＬのＴＲＩＳ−ＨＣｌ、０．１４６ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ）
【００８１】
溶液ＡおよびＢの少量ずつを適切な配合量で混合して、それぞれｐＨ２．６７、３．６６、５．４１、６．３５、６．７４、７．２８、７．７６、８．２９、８．７８、９．８１、１０．７９の１１種類のｐＨ緩衝液を得た。それらのｐＨは、標準ガラス電極を用いて３７℃で測定した。
【００８２】
７．測定
【００８３】
こうして得られたセンサーディスクを、図２に模式的に示した測定機構で用いた。図２において、参照文字Ｓはセンサーディスクの一部を示す。親水性イオン透過性ポリマー（ヒドロゲル）に懸濁させ、ＰＶＰビーズ上に固定化した本発明の化合物はＩによって示している。この層Ｍは、透明材料である励起および測定光線に対して透過性の基板Ｔによって担持されている。
【００８４】
本発明によれば、本発明の化合物Ｉを、共有結合的にイオン透過性マトリクスに直接結合させることができるか、それを物理溶解条件下でマトリクスまたはサンプル中に存在させることができる。
【００８５】
測定においては、センサーディスクを光に対して不透過性な恒温の（３７℃）フロースルーセルに入れ、異なるｐＨを有するサンプルＰ（＝緩衝液）と接触させた。
【００８６】
光学測定システムは、光源Ｌとしての青色ＬＥＤ、検出器としての光ダイオードＭ、波長選択用の光学フィルターＡおよびＦ、ポリマーＭへの励起光伝導および光検出器Ｍへの発光光の伝導のための光ファイバー配置、ならびに電子信号処理のための装置（不図示）からなるものであった。励起終了後には干渉フィルター（４８０ｎｍにピーク透過率）を用い、発光終了後には５２０ｎｍカットオフフィルターを用いた。
【００８７】
８．結果
【００８８】
図３に、各種ｐＨの関数として、親水性ポリマー層に分散させたＰＶＰビーズ上に固定化した本発明のＡ４１の相対発光強度（縦軸）を示してある。図３におけるデータは、最大強度値１００が得られるようなスケールとしている。
【００８９】
強度データ（図３中の丸印）を、市販の最小二乗回帰アルゴリズムを用いて下記の等式に適合させた。
【数１】
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【００９０】
Ｌは発光強度を示し、Ｌｍは最大発光強度を示す。そのアルゴリズムからは、ｐＫ値７．２５およびｑ値０．０５が得られた。後者は、「オフ」強度が「オン」強度の５％であることを意味している（オン強度＝プロトン化体の発光強度（すなわち、図３において、ｐＨ＜５での強度）、オフ強度＝脱プロトン化体の強度（すなわち、図３において、ｐＨ＞１０での強度）。
【００９１】
この実施例は、ほぼ中性のｐＨの測定に本発明による化合物を用いることが可能であることを示している。
【００９２】
留意すべき点として、「好ましくは」、「一般的には」および「代表的には」のような用語は、本明細書においては特許請求される発明の範囲を限定したり、あるいはある種の特徴が特許請求される発明の構造もしくは機能にとって必須、本質的または重要であることを示唆するために用いられるものではない。むしろ、これらの用語は単に、本発明の特定の実施形態で使用可能であるか使用可能ではない代替の特徴または追加の特徴を強調するためのものである。
【００９３】
本発明の説明および定義に関して、留意すべき点として、「実質的に」という用語は、本明細書においては、何らかの量的比較、値、測定値その他の表現形態に起因し得る固有の不確定度を表すのに用いられるものである。「実質的に」という用語はまた、本明細書においては、問題となっている主題の基本的機能に変化を生じない限りにおいて、ある量的表現が記載されている言及内容から変動し得る度合いを表すのに用いられる。
【００９４】
以上、本発明について詳細に、本発明の具体的な実施形態を参照しながら説明したが、添付の特許請求の範囲で定義の本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、修正および変更が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本発明のいくつかの態様が好ましいまたは特に有利であると本明細書において確認されているが、本発明は必ずしも本発明のこれら好ましい態様に限定されるものではないことが想到される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】本発明の１実施形態による発光色素の合成経路を示す図である。
【図１Ｂ】本発明の１実施形態による発光色素の合成経路を示す図である。
【図２】本発明の少なくとも一つの実施形態に従って用いることができるセンサーディスクの断面で示した部分図である。
【図３】各種ｐＨの関数としての、親水性ポリマー層中に分散されたＰＶＰビーズ上に固定化された本発明のＡ４１の相対発光強度（縦軸）を示すプロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2008521985.tif 000022
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