(57)【要約】  植物に対して害虫耐性を付与するための方法および物質が提供される。植物は、害虫の生存、発達または病原性に必須である植物害虫の遺伝子に対して相同なサイレンシング構築物で形質転換される。これによって、選択された遺伝子に対するＲＮＡｉを生じる植物が生じ、これが害虫によって摂取された場合、遺伝子のサイレンシングおよび害虫が植物を害する能力の引き続く軽減を生じる。他の実施形態では、害虫が植物を害する能力の軽減は害虫の子孫に受け継がれる。害虫の病原性除去のための方法および物質も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）第一の害虫病原性遺伝子に対して相同性を有する第一のアンチセンス配列と、
（ｂ）第二の害虫病原性遺伝子に対して相同性を有する第二のアンチセンス配列と、
（ｃ）該第一のアンチセンス配列に対して実質的に相補的である第一のセンス配列と、
（ｄ）該第二のアンチセンス配列に対して実質的に相補的である第二のセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該第一のアンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび該第一のセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該第二のアンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび該第二のセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、かつ
該第一および第二のセンス配列ならびに第一および第二のアンチセンス配列は、各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記植物は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される少なくとも１つの害虫に対して、前記異種ポリヌクレオチドを欠く実質的に同じ植物に比較した場合、抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される異なるメンバーに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該少なくとも２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される同じメンバーの異なる亜種に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該少なくとも２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される同じメンバーの異なる種に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該少なくとも２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される同じメンバーの異なる属に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該少なくとも２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される同じメンバーの異なる科に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物は、少なくとも２つの害虫に対して耐性であり、該少なくとも２つの害虫の各々は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される同じメンバーの異なる目に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび該センス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、かつ
該アンチセンス配列は、異なる種由来の少なくとも２つの害虫の病原性遺伝子に対して相同であり、これによって該植物は、異種ポリヌクレオチドを欠く実質的に同じ植物に比較した場合、該２つの害虫に対して耐性である、
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つの害虫は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの害虫は２つの異なる亜種由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも２つの害虫は２つの異なる種由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも２つの害虫は２つの異なる属由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２つの害虫は２つの異なる科由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも２つの害虫は２つの異なる目由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）アンチセンス配列に対して作動可能に連結された第一のプロモーターであって、該アンチセンス配列は、害虫病原性遺伝子に対して相同性であり、かつターミネーターに対して作動可能に連結されている、第一のプロモーターと、
（ｂ）センス配列に対して作動可能に連結された第二のプロモーターであって、該センス配列は、該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であり、かつターミネーターに対して作動可能に連結されている、第二のプロモーターと、
を包含し、
該第二のプロモーターが、第一のプロモーターと比較して強力なプロモーターであり、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされる配列とセンス配列によってコードされる配列との間で二本鎖領域を形成することができ、かつ
該第一および第二のセンス配列ならびに第一および第二のアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である、
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同であるアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的である第一のセンス配列と、
（ｃ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的である第二のセンス配列と
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされる配列と第一のセンス配列によってコードされる配列との間で二本鎖領域を形成することができ、
該第一および第二のセンス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である、
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、かつ該第一の害虫病原性遺伝子の二重鎖部分を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
該害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、キナーゼ、リボソームＲＮＡｓ、アドヘシン、エリシチンおよびＧタンパク質からなる群より選択され；および
該害虫は真菌である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
（ｃ）該センスおよびアンチセンス配列に対して、該センス配列およびアンチセンス配列が別々の転写物に転写されるような方向で、該植物中で機能的な少なくとも２つのプロモーターと、
を包含し、
該別々の転写物は、ハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、かつ
該害虫は真菌である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
該害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、リボソームＲＮＡｓ、Ｇタンパク質、脱皮因子、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよび幼若ホルモンエステラーゼからなる群より選択され、かつ
該害虫は昆虫である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
（ｃ）該センスおよびアンチセンス配列に対して、該センス配列およびアンチセンス配列が別々の転写物に転写されるような方向で、該植物中で機能的な少なくとも２つのプロモーターと、
を包含し、
該別々の転写物は、ハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
該害虫は昆虫である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
該害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、リボソームＲＮＡｓ、Ｇタンパク質、クチクラコラーゲンタンパク質、およびカテプシンプロテアーゼからなる群より選択され、かつ
該害虫は線虫である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２４】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび該センス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
該害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、解離酵素、キナーゼ、リボソームＲＮＡ、アドヘシンおよびＧタンパク質からなる群より選択され、かつ
該害虫は細菌である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
植物に対して害虫耐性を付与するための方法であって、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、該異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列であって、
該異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、該アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができる、センス配列と、
（ｃ）該センスおよびアンチセンス配列に対して、該センス配列およびアンチセンス配列が別々の転写物に転写されるような方向で、該植物中で機能的な少なくとも２つのプロモーターと、
を包含し、
該センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、かつ
該害虫は細菌である、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
原出願は、その全体が参照によって本明細書に両方とも援用される、２００４年１０月２１日出願の米国仮特許出願第６０／６２１，５４２号および２００５年３月０１日出願の米国仮特許出願第６０／６５７，８２１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
植物の害虫（ｐｅｓｔ）（例えば、真菌病原体、細菌、線虫、昆虫、ウイルスなど）は、世界中で、特に発展途上国において、食物および線維の大きな損失を生じる。損失としては、直接の生成または収穫前の損失、収穫後および貯蔵の損失、ならびに、食物の質および安全性の低下（例えば、マイコトシキンの産生による）が挙げられる。植物の害虫から生じる他の損害は、審美的、嗅覚的または生態学的な特性について評価された植物において観察される。
【背景技術】
【０００３】
植物の害虫はしばしば、化学物質（例えば、殺菌剤、殺虫剤、殺線虫剤、殺寄生虫剤）の適用、微小環境の操作もしくは防除によって、またはその病原体に対して抵抗性の遺伝子によって防除され得る。
【０００４】
抵抗性のための「新規な（ｎｅｗ）」遺伝子の発見および導入はしばしば、その「新規な」遺伝子を含む植物に対して感染し得るその病原体の新規な品種の発達または選択を引き起こす。これは、禾穀類のサビ病および黒穂病によって最もよく実証されているが、それぞれ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅによって生じる、タバコのたばこ疫病および大豆の根茎腐病（ｒｏｏｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）のような土壌病害でも生じる。Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの少なくとも２つの品種およびＰ．ｓｏｊａｅの７０を上回る品種が存在し、全て疾患抵抗性に対する異なる遺伝子または遺伝子の組み合わせを要する。
【０００５】
真菌のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属は、植物の重篤な疾病を生じる極めて破壊的な病原体の多くの種を含む。これらとしては、焼け枯れ病（胴枯れ病、べと病）（ｂｌｉｇｈｔ）、立ち枯れ病（ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ）、胴枯病（ｃａｎｋｅｒ）、果実腐敗、根腐れ、立ち枯れ病（しおれ、萎凋病）（ｗｉｌｔｓ）、ならびにアボカド、カカオ、アブラナ、柑橘類、コショウ、ジャガイモ、ダイズ、タバコ、トマト、マツ、ゴム、ナラの木などを含む広範な種々の食物、線維および油料作物に影響する多くの他の症状が挙げられる。
【０００６】
過去１０年、遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象が、植物、真菌、線虫、ヒドラおよびヒトのような多様な生物体において記載され特徴付けられている（ＺａｍｏｒｅおよびＨａｌｅｙ，２００５）。これは、宿主生物体が、二本鎖ＲＮＡ分子を外来として認識してこれを加水分解するという、古代の防御機構であるとみなされる。得られた加水分解生成物は、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、２１〜３０ヌクレオチド長の小さいＲＮＡフラグメントである。次いで、このｓｉＲＮＡは、拡散するか、宿主全体に担持され、ここでｓｉＲＮＡは、その特定の遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズして、これを加水分解し、さらにｓｉＲＮＡを生じさせる。このプロセスは、毎回反復されて、ｓｉＲＮＡは、その相同なｍＲＮＡにハイブリダイズして、そのｍＲＮＡが転写されることを効率的に妨げ、これによってその特定の遺伝子の発現を「サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」する。
【０００７】
Ｆｉｒｅら（２００３）は、その宿主細胞の遺伝子に対して相同なセンス配列およびアンチセンス配列からなるＲＮＡを宿主に投与して、その宿主細胞の遺伝子をサイレンシングする方法を記載する。米国特許第６，５０６，５５９号。
【０００８】
ｖａｎ  Ｗｅｓｔら（１９９９）による結果で、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓにおける細胞内の遺伝子サイレンシングが実証された。彼らは、センス方向およびアンチセンス方向の両方でｉｎｆｌエリシチン遺伝子を用いてＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓを形質転換した。これによって、導入遺伝子および内因性遺伝子の両方のサイレンシングが生じた。サイレンシングされたトランスジェニック株および野性型株の体細胞融合によって、彼らは、２つの本質的なポイントを実証した。第一は、導入遺伝子自体の存在が、サイレンシングされた状態を維持するのに必要ではないことであり、第二は、後にｓｉＲＮＡであることが見出された、核と核との間にサイレンシングシグナルを移入し得るトランス作用因子が関与することである。
【０００９】
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＷＯ９９５３０５０Ａ１）は、植物ウイルス遺伝子に向けられた遺伝子サイレンシング構築物を用いて植物を形質転換することによって、植物に対してウイルス抵抗性を付与する方法を記載している。
【００１０】
Ｗａｎｇら（ＵＳ２００３０１８０９４５Ａ１）は、真菌遺伝子に対する遺伝子サイレンシング構築物を真菌に提供することによって、真菌において遺伝子をサイレンシングする方法を記載している。
【００１１】
当該分野において必要とされているものは、新規なおよび重篤な植物疾病のような、生物学的環境における変化に容易に適合し得る植物抵抗性方法である。例えば、２００４年１１月までは、米国にはダイズではアジア・サビ病（Ａｓｉａｎ  ｒｕｓｔ）の出現はなかった。アジア・サビ病は、２００５〜２００６年に１〜７０億ドル（ＵＳＤＡ）と見積もられた損失を生じると予測される。
【００１２】
真菌、昆虫、線虫、細菌などの広範な生物に対する抵抗性を植物に付与する汎用性の遺伝的方法が存在すれば、この技術は実質的に進歩するであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本発明においては、植物に対して害虫耐性を付与するための方法および構築物が提供され、該方法は、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
異種ポリヌクレオチドの転写物が、ハイブリダイズして、アンチセンス配列配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列が各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
アンチセンス配列が、異なる種由来の少なくとも２つの害虫の病原性遺伝子に対して相同であり、これによって、植物は、異種のポリヌクレオチドを欠く実質的に同じ植物に対して比較した場合、２つの害虫に対して抵抗性である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、植物に対して害虫耐性を付与するための方法および構築物を提供し、該方法は、異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）第一の害虫病原性遺伝子に対して相同性を有する第一のアンチセンス配列と、
（ｂ）第二の害虫病原性遺伝子に対して相同性を有する第二のアンチセンス配列と、
（ｃ）第一のアンチセンス配列に対して実質的に相補的である第一のセンス配列と、
（ｄ）第二のアンチセンス配列に対して実質的に相補的である第二のセンス配列と、
を包含し、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、第一のアンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび第一のセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、第二のアンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよび第二のセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、かつ
第一および第二のセンス配列ならびに第一および第二のアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である。
【００１５】
従って、植物は、昆虫、細菌、真菌、植物および線虫からなる群より選択される、同じメンバーに属するまたは異なるメンバーに属する、複数の害虫に対して抵抗性になり得る。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、植物に対して害虫耐性を付与するための方法および構築物を提供し、該方法は異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）アンチセンス配列に対して作動可能に連結された第一のプロモーターであって、アンチセンス配列が、害虫病原性遺伝子に対して相同性を有し、かつターミネーターに対して作動可能に連結されている、第一のプロモーターと、
（ｂ）センス配列に対して作動可能に連結された第二のプロモーターであって、センス配列が、アンチセンス配列に対して実質的に相補的であり、かつターミネーターに対して作動可能に連結されている、第二のプロモーターと、
を包含し、
第二のプロモーターは、第一のプロモーターと比較して強力なプロモーターであり、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされる配列とセンス配列によってコードされる配列との間で二本鎖領域を形成することができ、かつ
センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、植物に対して害虫耐性を付与するための方法および構築物を提供し、該方法は異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、を包含し、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
害虫は、昆虫、細菌、真菌、および線虫からなる群より選択され、かつ
害虫病原性遺伝子および害虫は、本明細書に教示されるものから選択される。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ  ＩＦである。
【００１９】
配列番号２は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ  ２Ｒである。
【００２０】
配列番号３は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ  ３Ｆである。
【００２１】
配列番号４は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ  ４Ｒである。
【００２２】
配列番号５は、本発明に従って用いられるサイレンシング構築物ｐＶＺＡ１００である。
【００２３】
配列番号６は、本発明に従って用いられるサイレンシング構築物ｐＶＺＡ２００である。
【００２４】
配列番号７は、本発明に従って用いられるサイレンシング構築物ｐＶＺＡ３００である。
【００２５】
配列番号８は、本発明に従って用いられるサイレンシング構築物ｐＶＺＡ４００である。
【００２６】
配列番号９は、本発明に従って用いられるフォワードＰＣＲプライマーＧＵＳである。
【００２７】
配列番号１０は、本発明に従って用いられるリバースＰＣＲプライマーＧＵＳである。
【００２８】
配列番号１１は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーｐＶＺＡ１００およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００２９】
配列番号１２は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーｐＶＺＡ１００およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００３０】
配列番号１３は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ１  ６５Ｒである。
【００３１】
配列番号１４は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ２  ６９Ｆである。
【００３２】
配列番号１５は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ３  ７３Ｆである。
【００３３】
配列番号１６は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ３  ７３Ｆである。
【００３４】
配列番号１７は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ１６５である。
【００３５】
配列番号１８は、本発明に従って用いられるプライマーＶＺＡ６  ７ＯＦである。
【００３６】
配列番号１９は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ７  ７２Ｆである。
【００３７】
配列番号２０は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ８  ７９Ｆである。
【００３８】
配列番号２１は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ９  ８４Ｆプライマーである。
【００３９】
配列番号２２は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１０  ８７Ｆプライマーである。
【００４０】
配列番号２３は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１１  ８９Ｆプライマーである。
【００４１】
配列番号２４は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１２  ９０Ｆプライマーである。
【００４２】
配列番号２５は、本発明に従って用いられるＰＣＲＶＺＡ１３  ９１Ｆプライマーである。
【００４３】
配列番号２６は、本発明に従って用いられるＰＣＲＶＺＡ１４  ８１Ｆプライマーである。
【００４４】
配列番号２７は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１５  ８２Ｆプライマーである。
【００４５】
配列番号２８は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ６  ８３Ｆである。
【００４６】
配列番号２９は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ１７  ８５Ｆである。
【００４７】
配列番号３０は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１８  ８６Ｆプライマーである。
【００４８】
配列番号３１は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ１９  ６４Ｒプライマーである。
【００４９】
配列番号３２は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ２０  ７７Ｆプライマーである。
【００５０】
配列番号３３は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ２１  ６３Ｆプライマーである。
【００５１】
配列番号３４は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ２２  ６６Ｒプライマーである。
【００５２】
配列番号３５は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ２３  ８ＯＦプライマーである。
【００５３】
配列番号３６は、本発明に従って用いられるＰＣＲ  ＶＺＡ２４  ９２Ｆプライマーである。
【００５４】
配列番号３７は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ２５  ９３Ｆである。
【００５５】
配列番号３８は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーＶＺＡ２Ｒである。
【００５６】
配列番号３９は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーカテプシンである。
【００５７】
配列番号４０は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーエリシチン（ｅｌｉｃｉｔｉｎ）である。
【００５８】
配列番号４１は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーｒＤＮＡ  ＦＰである。
【００５９】
配列番号４２は、本発明に従って用いられるＰＣＲプライマーｒＤＮＡ  ＲＰである。
【００６０】
配列番号４３は、本発明に従って用いられる、マーカーＰｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ  リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）である。
【００６１】
配列番号４４は、本発明に従って用いられる、遺伝子型ＢのＤＮＡマーカーＰｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）である。
【００６２】
配列番号４５は、本発明に従って用いられる、ポリメラーゼＩＩサブユニットＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの部分的ｒｐｂ２遺伝子のＲＮＡである。
【００６３】
配列番号４６は、本発明に従って用いられる、リボソームＲＮＡ遺伝子Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉ  １８Ｓである。
【００６４】
配列番号４７は、本発明に従って用いられる、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍのヘキソース輸送体（ｈｘｔ２）遺伝子である。
【００６５】
配列番号４８は、本発明に従って用いられる、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉクチナーゼのｍＲＮＡである。
【００６６】
配列番号４９は、本発明に従って用いられる、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのゲノムまたは保存されたタンパク質モチーフである。
【００６７】
配列番号５０は、本発明に従って用いられる、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉにおいて見出されるリボソームＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号５１は、本発明に従って用いられる、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍの翻訳伸長因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αである。
【００６９】
配列番号５２は、本発明に従って用いられる、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのゲノムに見出されるエリシチン遺伝子配列である。
【００７０】
配列番号５３は、本発明に従って用いられる、ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの部分的なｒｐｂ２遺伝子である。
【００７１】
配列番号５４は、本発明に従って用いられる、ｒＲＮＡ  Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓである。
【００７２】
配列番号５５は、本発明に従って用いられる、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓ第ＩＩ群由来の１８ＳのリボソームＲＮＡである。
【００７３】
配列番号５６は、本発明に従って用いられる、Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ由来のカテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｂプロテアーゼである。
【００７４】
配列番号５７は、本発明に従って用いられる、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ由来のシステインプロテアーゼである。
【００７５】
配列番号５８は、本発明に従って用いられる、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅのｒＤＮＡである。
【００７６】
配列番号５９は、本発明に従って用いられる、ＪＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｅのゲノムに見出される５．８ＳのリボソームＲＮＡの部分配列である。
【００７７】
配列番号６０は、本発明に従って用いられる、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｃｈｉｔｗｏｏｄｉのチトクロームオキシダーゼのゲノムサブユニットである。
【００７８】
配列番号６１は、本発明に従って用いられる、Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉのリボソームＲＮＡである。
【００７９】
配列番号６２は、本発明に従って用いられる、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓのリボソームＲＮＡである。
【００８０】
配列番号６３は、本発明に従って用いられる、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａのＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列である。
【００８１】
配列番号６４は、本発明に従って用いられる、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉの１８ＳのｒＲＮＡである。
【００８２】
配列番号６５は、本発明に従って用いられる、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉの５．８ＳのリボソームＲＮＡの部分的配列である。
【００８３】
配列番号６６は、本発明に従って用いられる、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａのチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである。
【００８４】
配列番号６７は、本発明に従って用いられる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｇａｅのｒＲＮＡである。
【００８５】
配列番号６８は、本発明に従って用いられる、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅのＣｅＩ  Ａ遺伝子である。
【００８６】
配列番号６９は、本発明に従って用いられる、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅのエンドＢ−グルコシダーゼ遺伝子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において用いる場合、以下の定義が適用される。
【００８８】
細胞（または宿主植物細胞）とは、植物細胞の細胞またはプロトプラストを意味し、そして単離された細胞および植物全体における細胞、植物器官、または植物のフラグメントを含む。これには単離されていない細胞も含まれる。
【００８９】
二本鎖領域とは、ヌクレオチドが互いに水素結合し得るポリヌクレオチドの領域を意味する。このような水素結合は、分子間であっても、または分子内であってもよい（例えば、いわゆるヘアピンを有する二本鎖領域を形成する単一の転写単位、または相補的な配列について適切に整列して水素結合する２つの転写単位）。本発明による二本鎖領域であるには、ヌクレオチドの１００％が相補的であって、かつある領域内で水素結合する必要はない。十分な塩基対については、実質的な二重鎖の特徴（例えば、示される融点）をＲＮＡに与える必要があるだけである。
【００９０】
外因性の遺伝子とは、本発明の形態の所定の宿主ゲノムに通常は存在しない遺伝子を意味する。この点で、遺伝子自体は、宿主ゲノムに天然に存在するものであってもよいが、外因性の遺伝子は、１つ以上の異なる調節性エレメントの付加または欠失によって変更された天然の遺伝子またはさらに別の遺伝子を含む。
【００９１】
遺伝子（単数または複数）とは、ＲＮＡ全体、タンパク質全体、または所望の特徴を保有するのに十分な、このようなＲＮＡ全体もしくはタンパク質全体の任意の機能的な部分の合成についての遺伝子情報をコードする核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの両方を含む）を意味する。
【００９２】
異種ポリヌクレオチドとは、形質転換されていない宿主植物においては見出されない任意のポリヌクレオチドを意味する。あるポリヌクレオチドは、内因性のポリヌクレオチド配列が存在することによって、異種ポリヌクレオチドであることから除外されることはない。
【００９３】
ホモログ（相同体）（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）とは、アンチセンス配列と害虫の病原性遺伝子（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてアンチセンス鎖である害虫の病原性遺伝子ｍＲＮＡの転写を指示するＤＮＡ鎖）との間の関係の状況において、アンチセンス配列と害虫の病原性遺伝子ｍＲＮＡとの間で低ストリンジェンシー条件下でインビボ、インビトロおよび／またはエキソビボでハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な配列類似性を有することを意味する。
【００９４】
宿主植物細胞の耐性（抵抗性）とは、ある植物が、この構築物で形質転換されていない宿主植物細胞と比較した場合、植物の害虫の有害な影響に対して感受性が低いことを意味する。
【００９５】
遺伝子発現の阻害とは、標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡの生成のレベルの減少を意味する。阻害の結果は、細胞または生物体の外見上の特性を調べることによって（下の実施例に示されるように）、または、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）のような生化学の技術によって確認され得る。
【００９６】
マーカー遺伝子とは、マーカー遺伝子を発現している細胞に対して別個の表現型を付与して、それによってこのような形質転換された細胞がその遺伝子を含まない細胞から識別されることを可能にする遺伝子を意味する。
【００９７】
作動可能に連結されるとは、同じ核酸分子の一部として連結され、プロモーターから転写が開始されるように適切に位置決めおよび配向されることを意味する。
【００９８】
害虫の病原性遺伝子とは、宿主植物に対するそのような害虫の有害な影響に役割を果たす任意の害虫遺伝子を意味する。有害な影響とは、例えば、植物の成長（その植物の数および／またはサイズ）、発達、質および／または再生に対する負の影響を意味する。例に過ぎないが、害虫の病原性遺伝子とは、害虫の成長、発達、複製および／もしくは繁殖、または害虫の侵襲、または宿主植物の感染のいずれかにおいてある役割を果たす遺伝子であり得る。
【００９９】
病原性とは、害虫に関しては、植物に有害な影響を生じる害虫の能力を意味する。病原性は、任意の害虫の病原性遺伝子によって増強される。
【０１００】
植物の害虫とは、植物の成長（その植物の数および／またはサイズ）、発達、質、収量、および／または繁殖に対して有害である任意の生きている生物体を意味する。このような害虫の非限定的な例は昆虫、真菌、線虫、細菌およびウイルスである。
【０１０１】
質とは、所望されるとみなされ得る植物の任意の特徴を意味する。非限定的な例として、質とは、植物の外観、収量、香味、栄養価、芳香または中身を指してもよい。
【０１０２】
実質的に相補的であるとは、センス配列およびアンチセンス配列に関して、二重鎖分子の形成を可能にする十分に相補的であることを意味する。
【０１０３】
形質転換とは、外因性のＤＮＡ配列（例えば、ベクター、組み換えＤＮＡ分子）を細胞またはプロトプラストに導入するプロセスであって、ここでその外因性ＤＮＡが染色体に組み込まれるか、または異種ＲＮＡが転写されるような方式で自律複製し得るプロセスを意味する。
【０１０４】
転写物とは、ＤＮＡによってコードされるＲＮＡを意味する。本発明のセンスおよびアンチセンス転写物の文脈では、このようなセンスおよびアンチセンス転写物は、同じポリヌクレオチドの一部であってもよいし、またはそれらは、２つの別々のポリヌクレオチド（すなわち、各々がそれ自体の５’末端および３’末端を有する）であってもよい。
【０１０５】
植物の害虫を処置することとは、その植物に対するある植物害虫の有害な影響を軽減、排除、逆転または予防するための方法を意味する。
【０１０６】
ベクターとは、宿主細胞中で複製し得るか、および／または別のＤＮＡセグメントが作動可能に連結され、それによってその結合されたセグメントの複製をもたらすことができるＤＮＡ分子を意味する。プラスミドは例示的なベクターである。
【０１０７】
本発明の種々の実施形態の根底にあるのは、外因性ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換することによって害虫耐性を付与するように植物を処置することであり、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、センス配列およびアンチセンス配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができ、かつセンス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長である。
【０１０８】
理論に拘束されないが、本発明に従って形質転換された植物は、害虫の病原性遺伝子に対して相同な領域および相補的な領域を有するＲＮＡ分子（単数または複数）を転写し、この転写物（単数または複数）は、二重ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を形成すると考えられる。この植物は、ｄｓＲＮＡを潜在的な外来の物質（例えばウイルス起源の物質）として認識する。植物のダイサー酵素は、この二本鎖ＲＮＡを切断して、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、約２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡの小片にする。これらのｓｉＲＮＡは、植物細胞の消化を介して植物に入った侵入害虫によって消費される（例えば、クチン（ｃｕｔｉｎ））。一旦吸収されれば、ｓｉＲＮＡは、害虫のＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれることができる。次いで、ＲＩＳＣ複合体は、害虫の異種遺伝子のｍＲＮＡを消化して、害虫が植物を損なう能力を制限することができる。
【０１０９】
１実施形態では、害虫耐性が植物に付与され、これは異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）該アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を含み、異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列が各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、キナーゼ、リボソームＲＮＡ、アドヘシン、エリシチンおよびＧタンパク質からなる群より選択され；かつ
害虫は真菌である。
【０１１０】
１実施形態では、植物に害虫耐性が付与され、これは異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を含み、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列が各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、リボソームＲＮＡ、Ｇタンパク質、脱皮因子、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼおよび幼若ホルモンエステラーゼからなる群より選択され、かつ
害虫は昆虫である。
【０１１１】
１実施形態では、植物に害虫耐性が付与され、これは異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を含み、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列は各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
害虫病原性遺伝子は、キナーゼ、リボソームＲＮＡ、Ｇタンパク質、クチクラコラーゲンタンパク質、およびカテプシンプロテアーゼからなる群より選択され、かつ
害虫は線虫である。
【０１１２】
１実施形態では、植物に害虫耐性が付与され、これは異種ポリヌクレオチドを用いて宿主植物細胞を形質転換する工程を包含し、異種ポリヌクレオチドは、
（ａ）害虫病原性遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配列と、
（ｂ）アンチセンス配列に対して実質的に相補的であるセンス配列と、
を包含し、
異種ポリヌクレオチドの転写物は、ハイブリダイズして、アンチセンス配列によってコードされるヌクレオチドおよびセンス配列によってコードされるヌクレオチドを含む二本鎖領域を形成することができ、
センス配列およびアンチセンス配列が各々少なくとも約１９ヌクレオチド長であり、
害虫病原性遺伝子は、クチナーゼ、解離酵素、キナーゼ、リボソームＲＮＡ、アドヘシンおよびＧタンパク質からなる群より選択され、かつ
害虫は細菌である。
【０１１３】
１実施形態では、宿主植物は、ダイズであり、そして害虫は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ（例えば、急性枯死）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（例えば、白カビ）、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ（例えば、落葉病）、Ｐｈａｋｏｓｐｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ（例えば、アジア・サビ病）およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ（例えば、茎根腐病）からなる群より選択される１つのメンバーである。
【０１１４】
１実施形態では、宿主植物は、アブラナ科の植物であり、そして害虫はＡｌｖｃｂｇｏ（例えば、白さび病）である。
【０１１５】
１実施形態では、宿主植物はタバコであり、そして害虫はＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、菌核病、根腐れ）である。
【０１１６】
１実施形態では、宿主植物はジャガイモであり、そして害虫はＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、疫病（ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ））である。
【０１１７】
１実施形態では、宿主植物はブロッコリーであり、そして害虫はＰｙｔｈｉｕｍ（例えば、立ち枯れ病（ｄａｍｐｉｎｇ−ｏｆｆ））である。
【０１１８】
１実施形態では、宿主植物はエンドウマメおよび／またはサトウダイコンであり、そして害虫はＡｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、根腐れ）である。
【０１１９】
１実施形態では、宿主植物はタバコであり、そして害虫はＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ（例えば、青かび病）である。
【０１２０】
本発明に従う害虫における遺伝子サイレンシングは、害虫の子孫（形質転換された宿主植物と直接接触されなかった子孫）に対して付与され得るということがさらに発見された。
【０１２１】
１実施形態では、本発明はさらに、形質転換された宿主植物細胞とともに害虫を培養する工程を包含する。
【０１２２】
１実施形態では、本発明の形質転換された宿主植物細胞は、害虫とともに同時培養される。
【０１２３】
場合により、この害虫の子孫は、形質転換された宿主植物細胞以外の植物細胞に対して病原性が小さい。
【０１２４】
１実施形態では、本発明に従って形質転換された宿主植物細胞から再生された植物は、害虫で汚染された土壌において培養される。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明に従って形質転換された宿主植物細胞から再生された植物は、害虫で汚染されているリスクのある土壌中で培養される。
【０１２６】
別の実施形態では、害虫は、本発明に従って形質転換された宿主植物細胞から再生された植物とともに同時培養され、次いで害虫で汚染された土壌中で培養される。
【０１２７】
別の実施形態では、害虫は、本発明に従って形質転換された宿主植物細胞から再生された植物とともに同時培養され、次いで害虫で汚染されているリスクのある土壌中で培養される。
【０１２８】
１実施形態では、害虫は、形質転換された植物とともに同時培養され、次いで害虫で汚染されているリスクのある土壌中で培養される。
【０１２９】
害虫病原性遺伝子相同性
本発明に従う遺伝子サイレンシングは、驚くほど広範な害虫に対して抵抗性を付与し得るということ、そしてセンス配列の領域と害虫感染性遺伝子との間の正確な同一性は、本発明が有効であるためには必要ではないということがさらに発見された。
【０１３０】
本発明の１実施形態では、害虫病原性遺伝子は、交差耐性を与える遺伝子である。このような害虫遺伝子は、害虫の門のうちで保存されており、その結果、本発明で用いられる場合、植物は、その害虫の門の複数のメンバーに対して抵抗性にされる（すなわち、交差耐性）。さらに、害虫病原性遺伝子は、当業者に公知のようなバイオインフォマティックの相同性分析によって本発明に従って選択して、種にまたがる、属にまたがる、科にまたがる、または目にまたがる抵抗性である交差耐性を提供することができる。例えば、本明細書における実施例から明白になるとおり、クチナーゼ遺伝子は、複数の真菌種に対する抵抗性を付与するために、植物において有用である。ｒＤＮＡの遺伝子は、本発明の害虫（すなわち、昆虫、細菌、真菌および線虫）において有用である。このような保存された遺伝子の他の非限定的な例は、キナーゼ、アドヘシオン（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、Ｇタンパク質、エリシチン、解離酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ、伸長因子、脱皮因子（ｍｏｕｌｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、幼若ホルモンエステラーゼ、クチクラコラーゲンタンパク質、およびカテプシンプロテアーゼおよび下に説明されるその他である。別の実施例では、害虫病原性遺伝子は、植物遺伝子と、宿主植物に対して異種ポリヌクレオチドの有害な影響を生じるのに十分な相同性を欠くように選択される（例えば、植物遺伝子のサイレンシングを妨げる）。例えば、１実施形態では、アンチセンス配列と害虫の病原性遺伝子との間の相同性は、約７０％未満である。
【０１３１】
１実施形態では、アンチセンス配列は、害虫の病原性遺伝子に対して、少なくとも約７０％の相同性を有する。
【０１３２】
場合により、その相同性は少なくとも約７５％である。
【０１３３】
場合により、その相同性は少なくとも約８０％である。
【０１３４】
場合により、その相同性は少なくとも約８５％である。
【０１３５】
場合により、その相同性は少なくとも約９０％である。
【０１３６】
場合により、その相同性は少なくとも約９５％である。
【０１３７】
１実施形態では、センス配列の転写物は、害虫の病原性遺伝子の転写物（例えば、害虫の病原性遺伝子のｍＲＮＡ）に対して少なくとも約７０％の相同性を有する。
【０１３８】
場合により、その相同性は少なくとも約７５％である。
【０１３９】
場合により、その相同性は少なくとも約８０％である。
【０１４０】
場合により、その相同性は少なくとも約８５％である。
【０１４１】
場合により、その相同性は少なくとも約９０％である。
【０１４２】
場合により、その相同性は少なくとも約９５％である。
【０１４３】
上述の相同性は場合により、少なくとも約２０ヌクレオチド、または少なくとも約２５ヌクレオチド、または少なくとも約５０ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチドのストレッチにわたって延びていることができる。
【０１４４】
場合により、アンチセンス配列と害虫の病原性遺伝子（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、害虫病原性遺伝子ｍＲＮＡの転写を指示するＤＮＡ鎖）との間の相同性は、少なくとも３つの方法のいずれかにより実証することができる。
（１）アンチセンス配列と害虫の遺伝子センス鎖の対応する領域との間のハイブリダイゼーション、
（２）アンチセンス転写物と害虫の病原性遺伝子の対応する領域との間のハイブリダイゼーション、
（３）アンチセンス配列に相補的なＤＮＡ（すなわち、アンチセンスｃＤＮＡ）の転写物と害虫の病原性遺伝子ｍＲＮＡの対応する領域との間のハイブリダイゼーション。
【０１４５】
ハイブリダイゼーションは、上記に記載のように、低ストリンジェンシーの条件下で実証され得る。場合により、この条件は、例えば、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．、Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ（１９８７）ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，第１６９〜１７０に記載のように、当該分野で周知の技術による中度〜高度のストリンジェンシーの条件である。
【０１４６】
中度〜高度のストリンジェンシーの条件の例は、本明細書に提供される。詳細には、３２Ｐ−標識した遺伝子特異的なプローブを用いて、ノーザンブロット上で固定されたＤＮＡのハイブリダイゼーションを、標準的な方法を用いて行う（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。一般には、ハイブリダイゼーションおよび引き続く洗浄は、本明細書に例示される配列に対する相同性を有する標的配列の検出を可能にする、中度〜高度のストリンジェンシーな条件下で行う。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性ＤＮＡに含まれるＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）の２０〜２５℃下で一晩行った。その融点は、Ｂｅｌｔｚら（１９８３）から以下の式によって記載される：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（ホルムアミド％）−６００／塩基対における二重鎖の長さ。
【０１４７】
洗浄は代表的には、以下のとおり行なう：
（１）室温で２回、１５分間、Ｉ×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー洗浄）
（２）Ｔｍ−２０℃で１回、１５分間、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（中ストリンジェンシー洗浄）。
【０１４８】
オリゴヌクレオチドプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性ＤＮＡに含まれるハイブリッドの融点（Ｔｍ）の１０〜２０℃下で一晩行った。オリゴヌクレオチドプローブについてのＴｍは、Ｓｕｇｇｓら（１９８１）から以下の式によって決定した：Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）。
【０１４９】
洗浄は代表的には、以下のとおり行なった：
（１）室温で２回、１５分間、Ｉ×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー洗浄）。
（２）ハイブリダイゼーション温度で１回、１５分間、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（中ストリンジェンシー洗浄）。
【０１５０】
一般には、塩および／または温度は、ストリンジェンシーを変化させるように変更され得る。約７０程度の塩基長より大きい標識されたＤＮＡフラグメントでは、以下の条件を用いてもよい：
低：１または２×ＳＳＰＥ、室温
低：１または２×ＳＳＰＥ、４２℃
中：０．２×または１×ＳＳＰＥ、６５℃
高：０．１×ＳＳＰＥ、６５℃
【０１５１】
二重鎖形成および安定性は、ハイブリッドの２つの鎖の間の実質的な相補性に依存し、そして、上記のように、特定の程度のミスマッチが耐容され得る。従って、本発明において有用なポリヌクレオチド配列は、記載された配列における変異（単一および複数の両方）、欠失および挿入、ならびにそれらの組み合わせを含み、ここでこの変異、挿入および欠失によって、目的の標的ポリヌクレオチドとの安定なハイブリッドの形成が可能になる。変異、挿入および欠失は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて所定のポリヌクレオチド配列で生成され得る。他の方法が将来的には公知になるかもしれない。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチド配列の変異、挿入および欠失改変体は、その改変体がもとの配列と実質的に配列類似性を有する限り、例示されたポリヌクレオチド配列と同じ方式で用いられ得る。本明細書において用いる場合、実質的な配列類似性とは、その改変体ポリヌクレオチドがもとの配列と同じ能力で機能し得るのに十分である程度のヌクレオチド類似性をいう。好ましくは、この類似性は、７５％より大きく；より好ましくは、この類似性は９０％より大きく；そして最も好ましくは、この類似性は、９５％より大きい。改変体がその意図される能力で機能するのに必要な類似性の程度は、その配列の意図される用途に依存する。配列の機能を改善するか、そうでなければ方法論的な利点を提供するように設計される変異、挿入および欠失的な変異を作成することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【０１５３】
ベクター
当業者は十分に、本発明のベクター（裸のＤＮＡに基づくものを含む）を構築することができ、そして組み換え遺伝子発現のプロトコールを設計し得る。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．を参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、このような、核酸の操作のための適用可能な技術およびプロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２のプロトコールに詳細に記載される。
【０１５４】
以前に用いられて植物で幅広く成功している特定の手順およびベクターは、Ｂｅｖａｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８４）１２，８７１１〜８７２１）、そしてＧｕｅｒｉｎｅａｕおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３）．Ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ  ＲＲＤ編）．Ｏｘｆｏｒｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１２１〜１４８頁に記載される。
【０１５５】
本発明によるベクターは、単離されるか、および／もしくは精製され（すなわち、それらの天然の環境から）、実質的に純粋なもしくは相同な形態で、または他の核酸を含まないかもしくは実質的に含まないで提供され得る。本発明による核酸は、完全にまたは部分的に合成のものであってもよい。
【０１５６】
宿主植物
本発明は、任意の植物の形質転換にために用いることができ、植物としては、限定されないが、コーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ａｄｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｚｖ  ａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅｄ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｄ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｓｐ．）、ココナツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、かんきつ系の植物（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（ＪＦｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ）、マカデミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｉｍｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、カラスムギ、オオムギ、野菜、観賞用植物および針葉樹が挙げられる。
【０１５７】
場合により、本発明の植物は、作物（例えば、穀類およびパルス（ｐｕｌｓｅｓ）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、コメ、ソルガム、キビ（雑穀）、キャッサバ、オオムギ、エンドウマメおよび他の根、塊茎または種子作物である。本発明に重要な種子作物は、菜種、サトウダイコン、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズおよびソルガムである。本発明が適用され得る園芸植物としては、レタス、エンダイブ、ならびにキャベツ、ブロッコリーおよびカリフラワーを含むアブラナ科の野菜、ならびにカーネーション、ゼラニウム、ペチュニアおよびベゴニアを挙げることができる。本発明は、タバコ、ウリ科の植物、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、コショウ、キク、ポプラ、ユーカリおよびマツに適用してもよい。
【０１５８】
場合により、本発明の植物は、穀物の種子、例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ソルガム、ライムギなどを含む。
【０１５９】
場合により、本発明の植物としては、油料種子の植物が挙げられる。油料種子の植物としては、アブラナ（ｃａｎｏｌａ）、ワタ、ダイズ、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、トウモロコシ、アルファルファ、ヤシ、ココナツなどが挙げられる。
【０１６０】
場合により、本発明の植物としては、マメ科の植物が挙げられる。マメ科の植物としては、マメおよびエンドウマメが挙げられる。マメとしては、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメなどが挙げられる。
【０１６１】
本発明において有用な宿主植物は、条植え作物および散布蒔き（ｂｒｏａｄｃａｓｔ）作物である。有用な宿主作物の非限定的な例は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、アマランス、野菜、コメ、ソルガム、コムギ、ミロ（ｍｉｌｏ）、オオムギ、ヒマワリ、デュラム（コムギ）、およびカラスムギである。
【０１６２】
有用な散布蒔き（ｂｒｏａｄｃａｓｔ）作物の非限定的な例は、ヒマワリ、キビ（アワ、雑穀）、コメ、ソルガム、コムギ、ミロ、オオムギ、デュラムコムギ、およびカラスムギである。
【０１６３】
本発明において有用な宿主植物は、単子葉植物および双子葉植物である。
【０１６４】
有用な単子葉植物の非限定的な例は、コメ、コーン、コムギ、ヤシの木、芝草、オオムギおよびカラスムギである。
【０１６５】
有用な双子葉植物の非限定的な例は、ダイズ、ワタ、アルファルファ、アブラナ、アマ、トマト、サトウダイコン、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、コーン、コムギ、コメ、レタス、セロリ、キュウリ、ニンジン、カリフラワー、ブドウ、および芝草である。
【０１６６】
本発明において有用な宿主植物としては、審美的なまたは嗅覚の利点のために培養された植物が挙げられる。非限定的な例としては、顕花植物、木、草、陰生植物、ならびに顕花および隠花性の観賞用植物が挙げられる。
【０１６７】
本発明において有用な宿主植物としては、栄養的価値のために培養される植物が挙げられる。
【０１６８】
宿主細胞タイプ
当業者は、本発明に従う異種ポリヌクレオチドと接触させることができる広範な種々の宿主細胞を認識する。このような細胞の非限定的な例は、胚形成組織、カルス組織Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、胚軸、成長点、根の組織、師部における発現のための組織における細胞などである。
【０１６９】
宿主植物細胞は場合により、成長した植物を形質転換させる高い能力、および／または再生させる高い能力を有する細胞について富化され得る。例えば、ＩＩ型カルスの表面から胚形成細胞を選択することによる、宿主植物細胞の手技的な選択は、培養（固体培地上でまたは懸濁物中のいずれかで培養）の前に宿主植物細胞を富化するために用いられ得る１方法である。場合により、細胞は、細胞集合物の表面に位置する細胞から選択されてもよいし、そしてそれらの分化の欠失、それらのサイズおよび細胞質の濃さによってさらに同定されてもよい。１実施形態では、宿主植物細胞は、あまり分化されていないか、またはまだ分化に方向付けられていない。従って、１実施形態では、細胞を同定し、そしてそれらの細胞から、細胞質が高密度で、比較的空胞化していない高い核対細胞質比（例えば、細胞学的な観察によって決定される）を有し、サイズが小さく（例えば、１０〜２０μｍ）、そして分裂および細胞体の前胚形成を維持し得る細胞を選択する。
【０１７０】
場合により、宿主植物細胞は、エバンブルー（Ｅｖａｎ’ｓ  ｂｌｕｅ）のような色素の使用によって同定される。この色素は、比較的非浸透性の膜を有する細胞、例えば、胚発生性細胞によって排除され、そして比較的分化した細胞、例えば、根状の細胞および蛇形細胞（そのヘビのような外観によってそう呼ばれる）によって取り込まれる。
【０１７１】
場合により、宿主植物細胞は、細胞化学的な染色によって検出され得るグルタミン酸デヒドロゲナーゼのような胚発生性細胞のアイソザイムマーカーの使用によって特定される（Ｆｒａｎｓｚら、１９８９）。当業者は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのようなアイソザイムマーカーが、根状細胞であって、それにもかかわらず比較的高い代謝活性を有する細胞のような非胚発生性細胞から、ある程度の偽陽性をもたらし得ることを認識する。
【０１７２】
ほとんど全ての植物組織が、本明細書に記載の適切な技術を用いて分化の間に形質転換され得る。レシピエント細胞標的としては、限定されないが、分裂組織細胞、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のカルス、未熟な胚および配偶子細胞、例えば、小胞子、花粉、精細胞および卵細胞が挙げられる。稔性の植物が再生され得るいずれの細胞もレシピエント細胞として有用であると考えられる。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型のカルスは、限定されないが、未熟な胚、未熟な花序、播種頂端分裂組織、ミクロスフェアなどを含む組織源から開始されてもよい。
【０１７３】
カルスとして増殖し得るそれらの細胞はまた、遺伝子形質転換のためのレシピエント細胞でもある。本発明は、未熟な胚を形質転換して引き続き稔性のトランスジェニック植物を再生するための技術を提供する。未熟な胚の直接形質転換は、レシピエント細胞培養の長期の発達の必要性を省く。花粉、およびその前駆細胞であるミクロスフェアは、遺伝子形質転換のためのレシピエント細胞として、または受精の間に組み込みのための外来ＤＮＡを運ぶベクターとして機能し得る。直接の花粉形質転換によって細胞培養の必要性が省かれる。
【０１７４】
分裂組織細胞（すなわち、根の先端、茎の尖端、側芽などのような植物の成長中の点または組織で通常見出される、継続的な細胞分裂が可能であって、未分化の細胞学的外観によって特徴付けられる植物細胞）は、別のタイプのレシピエント植物細胞を示し得る。それらの未分化の成長および器官分化の能力および全能性によって、単一の形質転換された分裂組織細胞は、形質転換された植物全体として回復され得る。実際に、胚発生性の懸濁培養は、インビトロにおける分裂組織細胞系であって、培地の環境によって制御される、未分化状態で継続して細胞分裂し得る能力を保持している細胞系であり得ることが提唱される。
【０１７５】
害虫
本発明において有用な植物の害虫（すなわち、本発明に従って非病原性にされ得る）としては、真菌、線虫、昆虫、細菌および寄生植物、例えば、ストライガ（ｓｔｒｉｇａ）、ネナシカズラ、およびヤドリギが挙げられる。
【０１７６】
有用な真菌の非限定的な例としては、表４に示される真菌が挙げられる。
【０１７７】
このような有用な線虫の非限定的な例としては、表３に示される線虫が挙げられる。
【０１７８】
このような有用な昆虫の非限定的な例としては、アブラムシ、ヨコバイ、ウンカ、コナカイガラムシおよびＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ  ｌａｒｖａｅが挙げられる。
【０１７９】
本発明によって有用に処置される植物の害虫としては細菌が挙げられる。このような細菌の例は、表１に示す。
【０１８０】
本発明によって有用に処置される植物の害虫としては、さび菌類が挙げられる。このようなさび菌類の例は、表５に示す。
【０１８１】
本発明によって有用に処置される植物の害虫としては、べと病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ）が挙げられる。このような非限定的な例は、表２に示す。
【０１８２】
【表１】
2008517604.tif 000002
【０１８３】
【表２】
2008517604.tif 000003
【０１８４】
【表３】
2008517604.tif 000004
【０１８５】
【表４】
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【０１８６】
【表５】
2008517604.tif 000006
【０１８７】
【表６】
2008517604.tif 000007
【０１８８】
【表７】
2008517604.tif 000008
【０１８９】
【表８】
2008517604.tif 000009
【０１９０】
害虫の病原性遺伝子
当業者は、本発明において標的するための害虫遺伝子を容易に同定することができる。このような遺伝子は、宿主植物に対するこのような害虫の悪影響において直接的または間接的な役割を果たす任意の害虫遺伝子であり得る。単なる例であるが、このような遺伝子は、害虫の成長、発達、複製および繁殖、ならびに侵襲または感染においてある役割を果たす遺伝子であり得る。
【０１９１】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約７０％を超える相同性を有する遺伝子は含まない。
【０１９２】
場合により、この相同性は、約６０％を超えない。
【０１９３】
場合により、この相同性は、約５０％を超えない。
【０１９４】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約７０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する遺伝子を含まない。
【０１９５】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約６０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する遺伝子を含まない。
【０１９６】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約５０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する遺伝子を含まない。
【０１９７】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約７０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する２つ以上の遺伝子を含まない。
【０１９８】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約６０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する２つ以上の遺伝子を含まない。
【０１９９】
１実施形態では、宿主植物は、害虫病原性遺伝子に対して約５０％を超える相同性を有する、２５ヌクレオチドストレッチを有する２つ以上の遺伝子を含まない。
【０２００】
【表９】
2008517604.tif 000010
【０２０１】
例示にすぎないが、クチナーゼは、本発明に従って有用な遺伝子である。真菌の菌糸が植物細胞に侵入して栄養を吸収すると、これは植物からｓｉＲＮＡを吸収して、真菌の必須のかつ構成的なクチナーゼをサイレンシングする。
【０２０２】
例示にすぎないが、このような遺伝子は、害虫の成長、発達、複製および増殖、そして侵入または感染において役割を果たす遺伝子であり得る。他の非限定的な例としては表６における遺伝子が挙げられる。
【０２０３】
センス（およびアンチセンス）配列
本発明に従うセンス配列およびアンチセンス配列は、害虫の病原性遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対して（それぞれ）相同性を有する任意の配列であり得る。
【０２０４】
このセンス配列およびアンチセンス配列は、同じＤＮＡ鎖上でも、または異なるＤＮＡ鎖上でもよい。センス配列およびアンチセンス配列が、同じＤＮＡ鎖上である場合、これらの配列の転写は、同じプロモーターで駆動されても異なるプロモーターで駆動されてもよい（例えば、同じプロモーターの異なるコピー、または異なるプロモーター）。センス配列およびアンチセンス配列が異なるＤＮＡ鎖上である場合、これらの配列の転写は異なるプロモーター上で駆動される。
【０２０５】
センス配列およびアンチセンス配列は、ＤＮＡ中で相補的な二重鎖ＤＮＡとして配置されてもよく、またはこの配列は、ＤＮＡの異なる領域（すなわち、互いに二重鎖ＤＮＡを形成しない）であってもよい。
【０２０６】
センス配列およびアンチセンス配列の各々は、少なくとも約１９ヌクレオチドを含む。場合により、各々の配列は、少なくとも約５０ヌクレオチド、場合により少なくとも約１００ヌクレオチド、場合により少なくとも約１５０ヌクレオチド、場合により少なくとも約２５０ポリヌクレオチド、場合により少なくとも約５００ヌクレオチド、場合により少なくとも約６００ポリヌクレオチドを含む。
【０２０７】
１実施形態では、この配列は、２つ以上の害虫の病原性遺伝子に対する相同性を作成するかまたは増大するために害虫病原性遺伝子から改変される。
【０２０８】
別の実施形態では、この配列は、オープンリーディングフレームを短くするように害虫病原性遺伝子から改変される。
【０２０９】
別の実施形態では、この配列は、植物、動物またはヒトの遺伝子との相同性が少なくなるように害虫病原性遺伝子から改変される。
【０２１０】
別の実施形態では、センス配列およびアンチセンス配列は、害虫の病原性遺伝子の複製可能領域を含む。このような領域の選択は、本明細書における本発明の教示に従ってなされる（例えば、高度に保存された領域）。
【０２１１】
他の実施形態では、害虫病原性遺伝子の領域または害虫病原性遺伝子のコード領域全体でさえ、センス配列およびアンチセンス配列を含むように複製されて、このセンス配列およびアンチセンス配列によって形成される二本鎖領域の長さが増大されてもよい。理論によって拘束されないが、本発明のいくつかの実施形態では、害虫において有用な遺伝子サイレンシングを誘発するように、そして植物に対して害虫抵抗性を付与するように、ｓｉＲＮＡの閾値レベルを形成しなければならないと考えられる。遺伝子配列の複製は、二本鎖領域の長さを増大し、ｓｉＲＮＡの数を増大する１つの有用な方法である。
【０２１２】
このアプローチ（遺伝子複製）は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７６６２２８）のエリシチンＩＦＮ１を含む異種ポリヌクレオチドｐＶＺＡ３００（配列番号７）を用いて本明細書における実施例で実証される。この配列は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（疫病菌）属によって発現された多くの他のエリシチン遺伝子に対するその高い相同性によって選択され、このことは、これが多くの他のエリシチン遺伝子をサイレンシングして、それによってＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの多くの種に対して抵抗性を提供し得ることを示唆している。選択された配列は、２８２ヌクレオチド長であり、従って、この配列は、ｐＶＺＡ１００（配列番号５）、ｐＶＺＡ２００（配列番号６）およびｐＶＺＡ４００（配列番号８）のセンス部分およびアンチセンス部分の長さを近似するようにセンス方向およびアンチセンス方向の両方で反復されており（＝５６４ヌクレオチド）、これは顕著に成功した。
【０２１３】
このアプローチの成功は、ｐＣＡＭＢＩＡ１  ２０１、ｐＶＺＡ１００、またはｐＶＺＡ２００での形質転換の効果と比較した場合の、形質転換されたＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅの成長の低下、および菌糸の形成異常に及ぼすｐＶＺＡ３００の劇的な影響によって実証された（図１４Ｄ、Ｆ）。プラスミドｐＶＺＡ２００およびｐＶＺＡ３００は部分的には同一であって、両方ともカテプシン遺伝子を含むが、ｐＶＺＡ３００はまた、反復するエリチシン遺伝子も含む。従って、真菌に対するｐＶＺＡ３００の有害な影響は、エリシチン遺伝子に起因するはずである。このことは、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ抵抗性植物およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ汚染土壌の病原性除去に対するこのアプローチの適用を開発するために極めて肯定的な意味を有する。
【０２１４】
形質転換方法
本発明の異種ポリヌクレオチドの安定な維持および発現を可能にする条件下で標的宿主にこの異種ポリヌクレオチドを導入するためには、広範な種々の方法が利用可能である。形質転換技術の特定の選択は、それが特定の植物種を形質転換する能力、ならびに選択の特定の方法論によって本発明を行う当業者の経験および優先度によって決定される。植物細胞へ核酸を導入する形質転換システムの特定の選択は、本発明に必須でなく、本発明の限定でもなく、植物再生のための選り抜きの技術でもないことが当業者に理解される。
【０２１５】
種々の形質転換方法が別々の方法として本明細書において教示されているが、当業者は、特定の方法が、形質転換プロセスの有効性を増強するために組み合わせて用いられ得ることを容易に認識する。このような方法の非限定的な例としては、アグロバクテリウムコーティング微小粒子でのボンバードメント（ＥＰ−Ａ−４８６２３４）、またはアグロバクテリウムとの同時培養後の創傷を誘導する微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＥＰ−Ａ−４８６２３３）が挙げられる。
【０２１６】
直接送達は、本発明に従って植物宿主を形質転換するために用いられ得る。非限定的な例であるが、このような直接送達法としては、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性ＤＮＡ取り込み（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９：１３５３（１９８４））、またはボルテックス法（例えば、Ｋｉｎｄｌｅ、ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１２２８（１９９０ｄ）が挙げられる。直接のＤＮＡ送達の１形態は、例えば、胚形成細胞懸濁培養物からプロトプラストへの直接遺伝子移入である（ＬａｚｚｅｒｉおよびＬｏｒｚ（１９８８）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，第６巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２９１；ＯｚｉａｓＡｋｉｎｓおよびＬｏｒｚ（１９８４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２：１  １９）。
【０２１７】
受粉経路
当業者は、穀類の低い再生能力から生じる遺伝子型依存性の形質転換の特定の課題を承知している。従って本発明の１実施形態では、形質転換は、受粉経路に基づく遺伝子型非依存性の形質転換アプローチによって達成される（Ｏｈｔａ、Ｙ，１９８６）。トウモロコシでは、高い効率の遺伝子形質転換が、花粉および外因性ＤＮＡの混合によって達成され得る（Ｌｉｃｏ  Ｚ．Ｘ．およびＷｕ．Ｒ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７１５〜７１９）。トウモロコシは、自己受粉技術および交差受粉技術の両方によって交配され得る。トウモロコシは、それぞれ、房および穂に位置する、同じ植物上に、別々の雄性の花および雌性の花を有する。自然な受粉は、トウモロコシでは、穂の頂部から突き出した絹糸に対して、風が花粉を房から吹きつけた時に生じる。
【０２１８】
本発明によるコメの形質転換はまた、花粉管経路を介して達成され得る（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ６：１６５〜１７４）。花粉管経路のアプローチの主要な潜在的な利点としては以下が挙げられる：（ａ）遺伝子型非依存性；（ｂ）モザイク減少の欠失；（ｃ）複雑な細胞および組織培養技術の必要性が無い。本発明による異種ポリヌクレオチドでのトマトおよびメロンの形質転換は、花粉経路を介してインタクトな植物中に達成され得る（Ｃｈｅｓｎｏｋｏｖ，Ｙｕ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，１９９２，ＵＳＳＲ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．１７０８８４９；Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＳＲ  Ｐａｔｅｎｔｓ，Ｎｏ．４；  Ｃｈｅｓｎｏｋｏｖ  Ｙｕ．Ｖ．＆  Ｋｌｏｒｏｌ  Ａ．Ｂ．１９９３；  Ｇｅｎｅｔｉｋａ  ＵＳＳＲ，２９：１３４５〜１３５５）。受粉−受精経路に基づく遺伝的形質転換の手順としては、（ｉ）花粉および形質転換するＤＮＡの混合物（ペースト）の使用；（ｉｉ）受粉後の花粉管への異種のＤＮＡの送達；（ｉｉｉ）マイクロスフェアまたは花粉粒子の微小粒子ボンバードメント（撃ち込み）が挙げられる。
【０２１９】
アグロバクテリウム技術
本発明の１実施形態では、宿主植物は、アグロバクテリウム技術を用いて形質転換される。アグロバクテリウム媒介性の移入は、植物細胞に遺伝子を導入するために広範に利用可能なシステムである。なぜなら、ＤＮＡが植物組織全体に導入され、それによってプロトプラストからインタクトな植物を再生する必要性を迂回することができるからである。植物細胞へＤＮＡを導入するためにベクターを組み込むアグロバクテリウム媒介性植物の使用は、当該分野で周知である。例えば、その全体が参照によって本明細書に特に援用される、Ｆｒａｌｅｙら（１９８５）、Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）および米国特許第５，５６３，０５５号によって記載される方法を参照のこと。
【０２２０】
アグロバクテリウム媒介性形質転換は、非限定的な例として、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、コーン、ダイズ、ワタ、アブラナ、タバコ、トマトおよびジャガイモを含む本発明の双子葉植物で有効に用いられ得る。
【０２２１】
アグロバクテリウム媒介性形質転換はまた、本発明のほぼ全ての単子葉植物に適用可能である。非限定的な例として、このような単子葉植物技術は、コメ（Ｈｉｅｉら，１９９７；Ｚｈａｎｇら、１９９７；（Ｉｓｈｉｄａら、１９９６）；その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される米国特許第５，５９１，６１６号）、コムギ（ＭｃＣｏｒｍａｃら、１９９８）、およびオオムギ（Ｔｉｎｇａｙら、１９９７；ＭｃＣｏｒｍａｃら、１９９８）に適用可能である。
【０２２２】
本発明に従うアグロバクテリウム媒介性形質転換は、培養され単離されたプロトプラストで、そしてインタクトな細胞または組織の形質転換によって達成され得る。
【０２２３】
双子葉植物におけるアグロバクテリウム媒介性形質転換によって、粒子ボンバードメント（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール媒介性形質転換法などのような他の形質転換方法と比較して、異種核酸のより大きい片の送達が容易になる。さらに、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって、生じる遺伝子再配列は比較的少ないと考えられ、そしてさらに代表的には、植物染色体への低コピー数の遺伝子の組み込みが生じる。
【０２２４】
最新のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよびアグロバクテリウムにおいて複製可能であり、記載されたように簡便な操作が可能になる（Ｋｌｅｅら、１９８５）。さらに、アグロバクテリウム媒介性遺伝子移入のためのベクターにおける近年の技術的進歩によって、種々のポリペプチドコード遺伝子を発現し得るベクターの構築を容易にする、ベクターにおける遺伝子および制限部位の配置の改良がもたらされている。記載されたベクター（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７）は、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためにプロモーターおよびポリアデニル化部位に隣接する従来のマルチリンカーの領域を有しており、本発明の目的に適切である。さらに、アームのあるＴｉ遺伝子およびアームのないＴｉ遺伝子の両方を含むアグロバクテリウムは、形質転換のために用いられ得る。アグロバクテリウム媒介性形質転換が有効である植物株では、この遺伝子移入の容易でかつ定義された性質のおかげで、これは選り抜きの方法である。
【０２２５】
アグロバクテリウム（例えば、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いて、本発明に従い植物細胞を形質転換する場合、挿入されるべきＤＮＡは専門的なプラスミドに、すなわち、中間ベクターにまたはバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）ベクターにクローニングされ得る。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡにおける配列に相同である配列のおかげで相同組み換えによってＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込まれ得る。ＴｉまたはＲｉプラスミドはまた、Ｔ−ＤＮＡの移入に必須のｖｉｒ領域を含む。中間セクターは、アグロバクテリウムにおいてそれ自体複製できない。この中間ベクターは、ヘルパープラスミド（結合体）によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに移入され得る。
【０２２６】
バイナリーベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいておよびアグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）の両方において自己で複製できる。このようなベクターは、選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーであって、右および左のＴ−ＤＮＡ境界領域が隣接しているものを含んでもよい。それらは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｈｏｌｓｔｅｒｓら［１９７８］ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１〜１８７）に直接形質転換され得る。宿主細胞として用いられるアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を担持するプラスミドを含む。ｖｉｒ領域は植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入のために必須である。さらなるＴ−ＤＮＡが含まれてもよい。そのように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に用いられる。植物外植片は有利には、植物細胞へのＤＮＡの移入のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓとともに培養され得る。次いで植物全体が、選択のための抗生物質または殺生剤を含み得る適切な培地中で、感染された植物物質（例えば、葉の小片、茎の切片、根、ただしまたプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から再生され得る。次いで、そのようにして得られた植物は、挿入された異種ポリヌクレオチドの存在について試験され得る。注入およびエレクトロポレーションの場合にプラスミドの専門的な要求は行われない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような通常のプラスミドを用いることが可能である。
【０２２７】
他の形質転換技術としては、ウィスカー技術が挙げられる。両方ともＺｅｎｅｃａの米国特許第５，３０２，５２３号および同第５，４６４，７６５号を参照のこと。
【０２２８】
微小粒子撃ち込み
場合により、宿主植物細胞を、微小粒子撃ち込みによって本発明に従って形質転換する（米国特許第５，５５０，３１８；米国特許第５，５３８，８８０；米国特許第５，６１０，０４２；および米国特許第５，５９０，３９０；その各々がその全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）。この実施形態では、粒子を核酸でコーティングして、噴出力によって細胞に送達する。例示的な粒子としては、タングステン、白金および好ましくは金からなる粒子が挙げられる。ある場合には、金属粒子に対するＤＮＡ沈着は、微小粒子撃ち込みを用いるレシピエント細胞へのＤＮＡ送達のために必須ではないと考えられる。しかし、粒子がＤＮＡでコーティングされるのではなくＤＮＡを含んでもよいことが意図される。従って、ＤＮＡでコーティングされた粒子は、微小粒子撃ち込みを介するＤＮＡ送達のレベルを増大し得るが、それ自体が必須ではない。
【０２２９】
撃ち込み（ボンバードメント）のために、懸濁物中の細胞を、フィルターまたは固体培養培地上で濃くする。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞を固体培養培地上に配置する。撃ち込まれる細胞を、微量注入ストッピングプレートの下の適切な距離に置く。
【０２３０】
植物細胞に本発明のベクターを加速によって送達するための形質転換方法の例示的な実施形態は、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）であり、これを用いて、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンのようなスクリーンを通じて、懸濁物中で培養された植物細胞でカバーされたフィルター表面に対して、ＤＮＡまたは細胞でコーティングされた粒子を進ませる。このスクリーンは、粒子が大きい凝集物中でのレシピエント細胞に送達されないように、その粒子を分散する。理論によって拘束はされないが、噴出装置と撃ち込みされる細胞との間に介在するスクリーンは、噴出凝集物のサイズを小さくして、大きすぎる噴出物によってレシピエント細胞に対して課される損傷を軽減することによって高頻度の形質転換に寄与し得る。
【０２３１】
撃ち込み（ボンバードメント）のためには、懸濁物中の細胞を好ましくは、フィルター上でまたは固体培養培地上で濃くする。あるいは、未熟な胚または他の標的細胞は、固体培養培地上に配置されてもよい。撃ち込まれる細胞は、微粒子停止プレートの下で適切な距離に置かれる。所望の場合、１つ以上のスクリーンが加速装置と撃ち込まれる細胞との間に位置されてもよい。本発明に示される技術の使用によって、当業者は、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の１０００以上におよぶ焦点を得ることができる。撃ち込みの４８時間後に外因性の遺伝子産物を発現する焦点における細胞の数はしばしば、１〜１０に、そして平均は１〜３におよぶ。
【０２３２】
当業者は、安定な形質転換体の最大数を生じるように、ボンバードメント（撃ち込み）前培養条件および撃ち込みのパラメーターを最適化し得る。撃ち込みの物理的および生物学的なパラメーターの両方がこの技術で重要である。物理的な要因とは、ＤＮＡ／微小粒子沈殿物を操作することに関する要因、またはマクロプロジェクタイル（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）またはミクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）のいずれかの飛行および速度に影響する要因である。生物学的な要因としては、撃ち込みの前および直後の細胞の操作に関する全ての工程、撃ち込みに関する傷の軽減を助ける標的細胞の浸透圧の調節、そしてまた、直線化ＤＮＡまたはインタクトなスーパーコイルのプラスミドのような、形質転換するＤＮＡの性質が挙げられる。撃ち込みの前の操作は、未熟な胚の首尾よい形質転換のために特に重要であると考えられる。
【０２３３】
従って、当業者は、条件を完全に最適化するために小規模の研究で撃ち込みパラメーターを調節することができると考えられる。当業者は、ギャップ距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧のような物理的なパラメーターを調節することを特に望み得る。当業者はまた、レシピエント細胞の物理的な状態に影響して、これによって形質転換および組み込み効率に影響し得る条件を改変することによって、トラウマ減少因子（ｔｒａｕｍａ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）（ＴＲＦ）を最小化し得る。例えば、浸透圧状態、組織水和および継代培養段階またはレシピエント細胞の細胞周期は、最適の形質転換のために調節され得る。このような小規模の最適化研究の結果は本明細書に開示しており、他の慣用的な調節の履行は、本開示に照らして当業者に公知である。
【０２３４】
微粒子銃による形質転換は、広範に適用可能であり、これを用いて実質的にいかなる植物種も形質転換することができる。単子葉植物は、場合により、本発明に従って撃ち込み（ボンバードメント）によって形質転換される、例えば、トウモロコシ（米国特許第５，５９０，３９０号）、オオムギ（Ｒｉｔａｌａら、１９９４；Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、コムギ（米国特許第５，５６３，０５５号，その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）、コメ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、カラスムギ（Ｔｏｒｂｅｔら、１９９５；Ｔｏｒｂｅｔら、１９９８）、ライムギ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓら、１９９３）、サトウキビ（Ｂｏｗｅｒら、１９９２）およびソルガム（Ｃａｓａら、１９９３；Ｈａｇｉｏら、１９９１）。
【０２３５】
双子葉植物は、場合により、本発明に従う撃ち込みによって形質転換される、例えば、タバコ（Ｔｏｍｅｓら、１９９０；ＢｕｉｓｉｎｇおよびＢｅｎｂｏｗ，１９９４）、ダイズ（米国特許第５，３２２，７８３号、その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）、ヒマワリ（Ｋｎｉｔｔｅｌら、１９９４）、ピーナツ（Ｓｉｎｇｓｉｔら、１９９７）、ワタ（ＭｃＣａｂｅおよびＭａｒｔｉｎｅｌｌ、１９９３）、トマト（Ｖａｎ  Ｅｃｋら、１９９５）、および一般のマメ科植物（米国特許第５，５６３，０５５号、その全体が参照によって本明細書に詳細に援用される）。
【０２３６】
エレクトロポレーション
１実施形態では、植物細胞を、エレクトロポレーションの方法を用いて形質転換する、例えば、Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＯ８７／０６６１４；両方ともＤｅｋａｌｂの米国特許第５，４７２，８６９号および同第５，３８４，２５３号；ならびに両方ともＰｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＳｙｓｔｅｍｓのＷＯ９２／０９６９６およびＷＯ９３／２１３３５。
【０２３７】
Ｋｒｚｙｚｅｋらの方法（その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，３８４，２５３号）は、本発明によく適合される。この方法では、特定の細胞壁分解酵素、例えば、ペクチン分解酵素を使用して、標的レシピエント細胞をエレクトロポレーションによる形質転換に対して未処理の細胞よりも感受性にさせる。あるいは、レシピエント細胞を、機械的損傷による形質転換に対してさらに感受性にさせる。
【０２３８】
Ｔａｄａ，Ｙ．らの方法（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｉｃｅ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ：Ｕｓｅ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｏｎｓ，Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．８０：４７５〜４８０，１９９０）は、例えば、コメを形質転換するために適切である。
【０２３９】
１実施形態では、エレクトロポレーションによる形質転換を達成するために、もろい組織、例えば、細胞の懸濁培養物または胚形成カルスを用いる。
【０２４０】
場合により、未熟な胚または他の組織化された組織を直接形質転換する。この技術では、細胞壁を、それらをペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に曝露すること、または管理された方式での機械的な創傷によって部分的に分解する。
【０２４１】
本発明に従うインタクトな細胞のエレクトロポレーションによって形質転換され得る植物細胞宿主の非限定的な例は、コムギ（例えば、Ｚｈｏｕら、１９９３による）、トマト（例えば、ＨｏｕおよびＬｉｎ，１９９６による）、ダイズ（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、１９８７による）およびタバコ（Ｌｅｅら、１９８９）である。また、米国特許第５，３８４，２５３号；Ｒｈｏｄｅｓら、１９９５；およびＤ’Ｈａｌｌｕｉｎら、１９９２も参照のこと。
【０２４２】
１実施形態では、植物は、プロトプラストのエレクトロポレーションのために形質転換される（例えば、Ｂａｔｅｓ，１９９４；Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９５による）。本発明によるプロトプラスト細胞のエレクトロポレーションによって形質転換され得る植物細胞宿主の非限定的な例は、ダイズ（例えば、参照によって本明細書に詳細に援用される、ＤｈｉｒおよびＷｉｄｈｏｌｍのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１７５９８）、オオムギ（例えば、Ｌａｚｅｒｒｉ，１９９５）、ソルガム（例えば、Ｂａｔｔｒａｗら、１９９１）、（例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、１９９７）、コムギ（例えば、Ｈｅら、１９９４）およびトマト（例えば、Ｔｓｕｋａｄａ，１９８９）である。
【０２４３】
ウイルスベクター
さらに、ウイルスベクターはまた、本発明に従って植物を形質転換するために用いられ得る。例えば、単子葉植物は、Ｍｙｃｏｇｅｎ  Ｐｌａｎｔ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＣｉｂａ−Ｇｉｅｇｙ，ｎｏｗ  Ｎｏｖａｒｔｉｓの米国特許第５，５６９，５９７号に記載される方法を用いてウイルスベクターで形質転換され得る。
【０２４４】
米国特許第５，５８９，３６７号はまた、ウイルスベクターを用いる植物の形質転換を記載する。
【０２４５】
米国特許第５，３１６，９３１号は、ウイルスベクターを用いる植物の形質転換を記載する。
【０２４６】
本発明による高等植物（単子葉および双子葉植物を含む）に有用な多数のクローニングベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製システムおよび形質転換された細胞の選択を可能にするマーカーを含む。これらのベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などおよびｐＣＡＭＢＩＡ  １２０  １を含む。従って、本発明の異種ポリヌクレオチドを含む配列は、適切な制限部位でベクターに挿入され得る。得られたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉへの形質転換に用いられる。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、適切な栄養培地中で培養し、次いで収集して溶解する。このプラスミドを回収する。配列分析、制限分析、電気泳動および他の生化学的分子生物学方法は一般に、分析の方法として行われる。各々の操作後に、用いられるＤＮＡ配列は、切断されて、次のＤＮＡ配列に連結されてもよい。各々のプラスミド配列は、同じプラスミドにクローニングされても、または他のプラスミドにクローニングされてもよい。所望の遺伝子を植物に挿入する方法に依存して、他のＤＮＡ配列が必要であり得る。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いるならば、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界、ただししばしば右および左の境界を、挿入される遺伝子の隣接領域と連結させる（図１）。
【０２４７】
植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、欧州特許第１２０５１６号；Ｈｏｅｋｅｍａ（１９８５）：Ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｕｒｋｋｅｒｉｊ  ＫＬａｎｔｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ，第５章；Ｆｒａｌｅｙら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  ＳｃＬ  ４：１−４６；Ａｎら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２７７〜２８７；ならびに当業者に周知であってかつ利用可能な多くの引き続く引用文献に記載される。
【０２４８】
マーカー遺伝子
形質転換体を同定する能力を改善するために、当業者は、本発明の異種ポリヌクレオチドに１つ以上のマーカー遺伝子を使用することを所望し得る。
【０２４９】
本発明によるマーカー遺伝子としては、化学的な方法によって、すなわち、選択因子（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用を通じて、当業者が「選択（ｓｅｌｅｃｔ）」し得る形質をマーカーが付与するか否か、または観察もしくは試験を通じて、すなわち「スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」によって当業者が同定し得る単なる「レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）」形質であるか否かに依存して、選択マーカーをコードする遺伝子、およびスクリーニング可能なマーカーをコードする遺伝子が挙げられる。当然ながら、適切なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の多くの例が、当業者に公知であり、そして本発明の実施において使用され得る。
【０２５０】
選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子という用語にはまた、「分泌型マーカー（ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）」であってその分泌が、形質転換された細胞の同定または選択の方法として検出され得るマーカーをコードする遺伝子も含まれる。例としては、抗体相互作用によって同定され得る分泌型抗原、またはさらには触媒活性によって検出され得る分泌型酵素をコードするマーカーが挙げられる。分泌型タンパク質は、多数のクラスにおさまり、これには、小さい拡散性の、例えばＥＬＩＳＡによって検出可能なタンパク質、および細胞壁に挿入されるか捕獲されるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ−Ｓの発現単位に見出されるようなリーダー配列を含むタンパク質）が挙げられる。
【０２５１】
選択性の分泌型マーカーに関して、細胞壁において隔絶されるタンパク質であって、固有のエピトープを含むタンパク質をコードする遺伝子の使用が特に有利であると考えられる。このような分泌された抗原マーカーは理想的には、植物組織で低いバックグラウンドを提供するエピトープ配列、効率的な発現をもたらすプロモーター−リーダー配列、原形質膜を横切る標的化を使用し、そして細胞壁において結合されており、かつさらに抗体にアクセス可能なタンパク質を生成する。固有のエピトープを含むように改変された、正常に分泌された壁タンパク質は、このような要件の全てを満たす。
【０２５２】
この方式での改変のために適切なタンパク質の１例は、エクステンシンまたはヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）である。ＨＰＲＧの使用（Ｓｔｉｅｆｅｌら、１９９０）は、分子生物学、発現およびタンパク質構造の分野で十分に特徴付けられる。しかし、種々のエクステンシンおよび／またはグリシン−リッチ壁タンパク質の任意の１つ（Ｋｅｌｌｅｒら、１９８９）を、選択マーカーを作成するために抗原性部位の付加によって改変してもよい。
【０２５３】
本開示の要素は、特定のマーカー遺伝子の使用を通じて詳細に例示される。しかし、この開示に照らして、多数の他の可能な選択マーカーおよび／または分泌型マーカーの遺伝子は、本明細書の下に示されるものに加えて当業者に明白である。従って、以下の考察は、網羅的であるというよりも例示的であることが理解される。
【０２５４】
選択マーカー
本発明と関連する使用のための選択マーカーとしては、限定されないが、カナマイシン耐性をコードしており、そしてカナマイシン、Ｇ４１８などを用いて選択可能であるｎｅｏ遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５）；ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子；変更されたＥＰＳＰシンターゼタンパク質（Ｈｉｎｃｈｅｅら、１９８８）をコードし、それによってグリホサート耐性を付与する遺伝子；ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）に対する耐性を付与するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ由来のｂｘｎのようなニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素または他のＡＬＳ阻害性化合物に対する耐性を付与する変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）またはアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子（ＡＨＡＳ）（欧州特許出願第１５４，２０４号）；メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８）；除草剤ダラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ（米国特許第５，７８０，７０８号）；または５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異したアントラニル酸シンターゼ遺伝子（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２６３６６）が挙げられる。変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を使用する場合、さらなる利点は、適切なクロロプラスト通過ペプチドＣＴＰの取り込みを通じて実現され得る（米国特許第４，９４０，８３５号）。また、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、米国特許第５，５０８，４６８号を参照のこと。
【０２５５】
形質転換体を選択するために本発明の実施形態で用いられ得る選択マーカー遺伝子の例示的な実施形態は、酵素フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来のｂａｒ遺伝子、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来のｐａｔ遺伝子（本明細書において参照によって援用される、米国特許第５，５５０，３１８号）である。酵素フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、除草剤ビアラホス、ホスフィノチリシン（ＰＰＴ）における活性成分を不活性化する。ＰＰＴは、アンモニアの急激な蓄積および細胞死を生じる、グルタミンシンターゼを阻害する（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８６；Ｔｗｅｌｌら、１９８９）。
【０２５６】
本明細書において意図される適切な選択マーカー遺伝子としては、とりわけ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、グリホセート耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、メトトレキサート耐性遺伝子、イミダゾリノン耐性遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子、トリアゾロピリミリジン除草剤耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、細菌性カナマイシン耐性遺伝子、ホスフィノチリシン耐性遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【０２５７】
スクリーニングマーカー
使用され得るスクリーニング可能なマーカーとしては、限定されないが、種々の発色基質が公知である酵素をコードするβグルクロニダーゼまたはｕｉｄＡの遺伝子（ＧＵＳ）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするＲ座遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８８）；種々の発色基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色セファロスポリン）が公知である酵素をコードする、βラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，１９７８）；発色カテコールを変換し得るカテコールジオキシゲナーゼをコードするキシル（ｘｙｌｅ）遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、１９８３）；αアミラーゼ遺伝子（Ｔｋｕｔａら、１９９０）；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパドーパキノンに酸化し、これが次に濃縮して容易に検出可能な化合物メラニンを形成することができる酵素をコードする、チロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚら、１９８３）；発色基質が存在する酵素をコードするβガラクトシダーゼ遺伝子；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子（Ｏｗら、１９８６）；カルシウム感受性生物発光検出において使用され得るエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｔｉｅｒら、１９８５）、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚら、１９９５）が挙げられる。
【０２５８】
Ｒ遺伝子複合体由来の遺伝子は、有用なスクリーニング可能マーカーとみなされる。Ｒ遺伝子複合体は、ほとんどの種子および植物の組織においてアントシアニン色素の生成を調節するように作用するタンパク質をコードする。トウモロコシの系統は、発育および組織特異的な方式で染色するように組み合わせるＲ対立遺伝子を１つまたは４つ程度の多さ有してもよい。従って、このような細胞に導入されたＲ遺伝子は、赤色色素の発現を生じ、そして安定に組み込まれている場合は、赤色のセクタとして視覚的にスコアリングされ得る。ある系統がアントシアニン生合成経路における酵素中間体をコードする遺伝子の優性の対立遺伝子（Ｃ２、Ａｌ、Ａ２、ＢｚＩおよびＢｚ２）を担持するが、Ｒ遺伝子座の劣性の対立遺伝子を担持する場合、Ｒを有する系統からの任意の細胞の形質転換は、赤色色素形成を生じる。例示的な系統としては、ｒｇ−Ｓｔａｄｌｅｒ対立遺伝子を含むＷｉｓｃｏｎｓｉｎ２２、およびｒ−ｇ，ｂ、ＰＩであるＫ５５誘導体であるＴＲ１  １２が挙げられる。あるいは、トウモロコシの任意の遺伝子型は、Ｃ１およびＲの対立遺伝子が一緒に導入される場合に利用可能である。
【０２５９】
Ｒ遺伝子調節領域が、このような異種ポリヌクレオチドの発現を制御するための機構を提供するために、本発明の異種ポリヌクレオチドにおいて使用されてもよいとさらに考えられる。表現性発現のさらなる多様性は、任意の他の遺伝子座よりもＲ遺伝子座で公知である（Ｃｏｅら、１９８８）。構造性Ｒ遺伝子の５’側領域から得られた調節領域は、遺伝子の発現、例えば、昆虫耐性、耐乾燥性、除草剤耐性または他のタンパク質コード領域を指示するのに有効であると考えられる。本発明の目的のためには、任意の種々のＲ遺伝子ファミリーメンバーが首尾よく使用され得ると考えられる（例えば、Ｐ、Ｓ、Ｌｃなど）。しかし、最も好ましいのは一般には、Ｓｎ（特にＳｎ：ｂｏｌ３）である。Ｓｎは、Ｒ遺伝子複合体の優勢なメンバーであり、Ｓｎが特定の幼苗および植物細胞においてアントシアニン色素の組織特異的な沈着を制御するという点でＲおよびＢ遺伝子座に対して機能的に類似であり、従ってその表現型はＲと同様である。
【０２６０】
本発明における使用について考えられるさらなるスクリーニング可能なマーカーは、ｌｕｘ遺伝子によってコードされる蛍ルシフェラーゼである。形質転換された細胞におけるｌｕｘ遺伝子の存在は、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーションカウント、蛍光分光光度法、低光量（微光）ビデオカメラ、光子計数カメラまたはマルチウェル・ルミノメトリーを用いて検出され得る。このシステムはまた、組織培養プレート上のような、バイオルミネセンスのポピュレーショナルスクリーニングのために、または植物全体のスクリーニングのため開発され得ると想定される。
【０２６１】
マーカー遺伝子の鎖の数
本発明によれば、マーカー遺伝子は、陽性または陰性のマーカーを生じるように異種ポリヌクレオチド内の配列および位置の選択によって設計され得る。異種ポリヌクレオチドがマーカー遺伝子の配列を含むが、マーカー遺伝子に対して十分に相補的な配列を含まない場合、異種ポリペプチドの転写物は、単鎖領域においてマーカー遺伝子を含み、そしてそれが発現され得る。従って、発現は、宿主植物への異種ポリヌクレオチドの組み込みと相関する。異種ポリヌクレオチドがマーカー遺伝子の配列およびこのマーカー遺伝子に対して十分な相補的な配列を含む場合、異種ポリヌクレオチドの転写物は二本鎖領域においてマーカー遺伝子を含み、そしてそれはサイレンシングされる。従って、このようなマーカー遺伝子の発現は、異種ポリヌクレオチドがその宿主植物でサイレンシングされていない（すなわち、「陰性マーカー（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）」ことを示す。植物細胞が、陽性マーカーおよび陰性マーカーの両方の遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドで形質転換される場合、陽性のマーカー遺伝子は発現するが、陰性のマーカー遺伝子は発現せず、このことは、この植物がこの異種ポリヌクレオチド少なくとも一部を転写しかつサイレンシングしていることを示す。このような発現は、宿主植物への異種ポリヌクレオチドの組み込みと相関する（すなわち、陽性の配列が選択され得る）。
【０２６２】
マーカー遺伝子配列の選択
当業者はここで、本発明の異種のポリヌクレオチド内の異なる位置におけるマーカーの組み合わせがどのように達成され得るかを容易に認識する。このような位置の相違は、マーカーがサイレンシングされるか否かに影響する（たとえば、水素結合による二本鎖構造を形成する領域内の遺伝子は、植物の内部防御機構によって外来と認識され、そしてｓｉＲＮＡに加水分解される［すなわち、「サイレンシングされる」］）。
【０２６３】
例えば、１実施形態では、本発明の異種ポリヌクレオチドは、二本鎖領域の上流の仮定上のＡ遺伝子（すなわち、本発明の任意のマーカー遺伝子）、および二本鎖領域内の仮定上のＢ遺伝子を含む。形質転換されていない細胞は、Ａ発現が欠けている（「Ａ−」。これはまたＢ−およびＣ−である。Ｂ領域を機能的に不活性化する形質転換された細胞（例えば、Ｂ遺伝子が存在する領域の遺伝子サイレンシングによる）は、Ａ＋およびＢ−である。Ｂ領域を不活性化できない形質転換細胞はＡ＋およびＢ＋である。
【０２６４】
マーカー遺伝子のセンス配列のほぼ下流に位置する、マーカー遺伝子のアンチセンス配列の存在は、このようなマーカー遺伝子の遺伝子サイレンシング（例えば、二本鎖形成）をさらに容易にすることをここで当業者は認識する。
【０２６５】
二本鎖領域の下流に局在するマーカーはまた、このような二本鎖領域とこのようなマーカーとの間にプロモーターが存在しない場合、サイレンシングされることはここで容易に理解されるべきである。
【０２６６】
１実施形態では、本発明の異種ポリヌクレオチドとしては、表７に示される構造を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【０２６７】
【表１０−１】
2008517604.tif 000011
【表１０−２】
2008517604.tif 000012
【表１０−３】
2008517604.tif 000013
【表１０−４】
2008517604.tif 000014
【表１０−５】
2008517604.tif 000015
【０２６８】
プロモーターおよび調節性エレメント
本発明によれば、異種ポリヌクレオチドまたはその一部が植物中で転写され得る。植物では、このような転写には、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを要する。このようなプロモーターは、植物に対して内因性であってもよい。例えば、異種ポリヌクレオチドは、構成的なまたは誘導性の植物プロモーターに隣接して挿入されてもよい。
【０２６９】
本発明の異種ポリペプチドは場合により、プロモーターを含んでもよい。このようなプロモーターは、植物プロモーターであっても、または植物中で機能する非植物プロモーターであってもよい。
【０２７０】
植物プロモーターとしては、限定されないが、リブロース−１，６−二リン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、βコングリシニンプロモーター、βファセオリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、熱ショックプロモーター、および組織特異的プロモーター、例えば、全ての細胞タイプおよび全ての時間で構成的な遺伝子発現を指示することが所望される構成的プロモーターが挙げられる（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓなど）。
【０２７１】
種々の供給源由来のプロモーターは、外来遺伝子を発現するために植物細胞中で効率的に用いられ得る。例えば、細菌起源のプロモーター調節性エレメント、例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、マンノピンシンターゼプロモーター；カリフラワーモザイクウイルス（３５Ｓおよび１９Ｓ）、３５Ｔ（これは、再操作された３５Ｓプロモーターである、米国特許第６，１６６，３０２号、詳細には実施例７Ｅを参照のこと）のようなウイルス由来のプロモーターなどが用いられ得る。
【０２７２】
以下のような特定のシグナルに応答性である遺伝子の発現を担う、誘導性プロモーターを用いることが所望され得る：物理的刺激（熱ショック遺伝子）、光（ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（Ｅｍ）、代謝物、化合物およびストレス。植物中で機能する他の所望される転写および翻訳エレメントが用いられ得る。多数の植物特異的な遺伝子移入ベクターが当該分野で公知である。
【０２７３】
植物の発達の特定の段階の間に活性であり、そして植物の組織および器官において活性であるプロモーターを使用することが所望され得る。このようなプロモーターの例としては、限定されないが、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ絹毛（ｃｏｒｎ−ｓｉｌｋ）特異的、綿花（ワタ繊維）特異的、根特異的、種子−胚乳特異的なプロモーターなどが挙げられる。葉または種子のような組織中での転写を促進することが所望される組織特異的なプロモーター調節性のエレメントが用いられてもよい（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ、グロブリンなど）。
【０２７４】
植物細胞で機能する（すなわち、異種ポリヌクレオチドの転写を支持する）任意のプロモーターが本発明において有用であるが、比較的強力なプロモーターまたは弱いプロモーターを選択することが所望され得る。本発明の１実施形態は、害虫の病原性遺伝子のセンス鎖を駆動する強力なプロモーター、および害虫の病原性遺伝子のアンチセンス配列を駆動する弱いプロモーターを用いる。当業者は、本発明の実施形態内でプロモーターの強度を経験的に容易に決定し得る。ある実施形態が２つのプロモーター（２つの異なる転写物を駆動する）を含む場合、相対的な転写速度は、転写物を定量すること（例えば、定量的ＰＣＲ）によって決定され得る。
【０２７５】
比較的強力なプロモーターの例は、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーターおよび強化されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターである。比較的弱いプロモーターの例は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。当業者は「弱い（ｗｅａｋｅｒ）」および「強い（ｓｔｒｏｎｇｅｒ）」プロモーターが、相対的な用語であり、そしてそれらは、そのプロモーターによって駆動される転写物に対する適切なプライマーを用いる、例えば、定量的ＰＣＲによって経験的に同定され得ることを容易に理解する。
【０２７６】
他のエレメント、例えば、マトリックス付着領域、足場付着領域、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などが存在してもよく、これによって転写の効率またはＤＮＡ取り込みを改善し得る。このようなエレメントは、ＤＮＡの機能に必須であっても、なくてもよいが、それらは、ＤＮＡのさらに良好な発現または機能を提供し得る。このようなエレメントは、植物中で形質転換されたＤＮＡの最適の能力を得ることが所望される場合ＤＮＡに含まれてもよい。代表的なエレメントとしては、限定されないが、Ａｄｈ−イントロン１、Ａｄｈ−イントロン６、アルファルファモザイクウイルスコートタンパク質リーダー配列、トウモロコシ線条ウイルス（ｓｔｒｅａｋ  ｖｉｒｕｓ）コートタンパク質リーダー配列、その他当業者に利用可能なものが挙げられる。
【０２７７】
ターミネーター
本発明の異種ポリヌクレオチドは場合によりターミネーターを含む。「ターミネーター」という用語は、転写の終止をシグナル伝達する転写ユニットの末端のＤＮＡ配列を指す。真核生物のターミネーターは、一次転写物の３’末端に対するポリ（Ａ）配列の付加を促進する、ポリアデニル化シグナルを含む３’−非翻訳ＤＮＡ配列である。
【０２７８】
ウイルス、酵母、カビ、細菌、昆虫、鳥類、哺乳動物および植物由来の細胞で活性なターミネーターは、公知であって、文献に記載されており、そして本発明において有用である。それらは、細菌、真菌、ウイルス、動物および／または植物から単離され得る。
【０２７９】
本発明における使用に適切なターミネーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｂｓのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネーター、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のゼイン遺伝子ターミネーター、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネーター配列、Ｓｕｂｃｌｏｖｅｒ  ｓｔｕｎｔウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子配列ターミネーター（国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９５／００５５２）、およびＦｌａｖｅｒｉｕ  ｂｉｄｅｎｔｓのリンゴ酸酵素遺伝子ＮＳＥＡ３のターミネーター（ＰＣＴ／ＡＵ９５／００５５２）が挙げられる。
【０２８０】
当業者は、本発明を行うのにおける使用に適切なさらなるプロモーター配列およびターミネーター配列を承知している。このような配列はいかなる過度の実験もなしに容易に用いられ得る。
【０２８１】
本発明の実施形態が本明細書において教示されており、ここでは、２つ以上のターミネーターを有することが所望される。このような例は、センス配列およびアンチセンス配列が別の転写物上に含まれる実施形態である（すなわち、各々がそれ自体の３’および５’末端を有する）。
【０２８２】
植物再生および繁殖
形質転換後、植物は、当該分野で標準的であるように、例えば、単一の細胞、カルス組織、または葉片から再生され得る。ほとんどすべての植物は、その植物の細胞、組織および器官から全体として再生され得る。利用可能な技術は、Ｖａｓｉｌら（１９８４）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ）；およびＷｅｉｓｓｂａｃｈら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に概説される。
【０２８３】
懸濁培養の成長の間、小細胞凝集物（１０〜１００個の細胞）を、外見上より大きい細胞の塊から形成して、その培養物に分散した外見を与える。固体培地へのこれらの細胞をプレートする際、体細胞胚の発達が誘導され、そしてこれらの胚が成熟され、出芽され、そして繁殖力のある種子を保有する植物へと成長することができる。あるいは、固体培養培地上で成長しているカルス細胞は、体細胞胚を形成するように誘導され、それから繁殖性の種子保有植物が発達し得る。胚形成、再生および植物の繁殖性の特徴は、懸濁培養中で時間の関数として徐々に失われる。懸濁細胞の凍結保存によって、培養物の発育が停止され、そして凍結保存期間の間のこれらの特徴の喪失が妨げられる。
【０２８４】
次いで、形質転換された植物は成長されて、同じ形質転換された株または異なる株で受粉されてもよく、そして所望の表現性の特徴の発現を有する得られた系統が同定され得る。所望の表現性の特徴の発現が安定に維持されかつ遺伝されることを確実にするために２つ以上の世代を成長させて、次いで種子を回収して所望の表現性の特徴の発現が達成されていることを保証してもよい。
【０２８５】
植物に加えて、本発明は、このような植物、種子、自家受粉またはハイブリッドの子孫の任意のクローン、そして、切断部分、花粉または種子のようなこれらのいずれかの任意の部分を提供する。本発明は、任意の植物珠芽、すなわち、切断部分、種子などを含む、有性生殖または無性生殖の、再生または繁殖に用いられ得る任意の部分を提供する。また有性生殖または無性生殖的に繁殖された、このような植物の子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）、クローンもしくは子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）である植物；またはこのような植物、子孫、クローンもしくは子孫の任意の一部もしくは珠芽も本発明によって包含される。植物抽出物および誘導体も提供される。
【０２８６】
遺伝子スタッキング
本発明による異種ポリヌクレオチドは、複数のセンス鎖および複数のアンチセンス配列を含む（すなわち、「多シストロン性異種ポリヌクレオチド」）。従って、ある異種ポリヌクレオチドは、複数の害虫に対して植物を防御し得る。
【０２８７】
当業者は、遺伝子スタッキングを用いることによって、植物が複数の害虫に対して耐性にされ得ることをここで認識する。複数の害虫は同じ門由来であっても、異なる門由来であってもよい。例えば、ある植物は複数の真菌害虫に対して耐性にされてもよい。本発明による遺伝子スタッキングの１つの非限定的な例として、ダイズは、落葉病｛Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ）、茎根腐病（ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）、白かび病（ｗｈｉｔｅ  ｍｏｌｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）、急性枯死症（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉｊｏｉｓｉ）、およびアジアさび病（Ａｓｉａｎ  ｒｕｓｔ）（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ）に対して耐性にされ得る。
【０２８８】
場合により、植物は、複数の昆虫の害虫に対して耐性にされ得る。本発明による遺伝子スタッキングの非限定的な例として、ジャガイモは、ジャガイモヨコバイ｛Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）、コロラド・ジャガイモ・ハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）｛Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、およびモモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）に対して耐性にされ得る。
【０２８９】
場合により、植物は、複数の真菌および非真菌の害虫に対して耐性にされ得る。本発明による遺伝子スタッキングの非限定的な例としては、ジャガイモは、ポテト・ゴールデン・ネマトーダ（ｐｏｔａｔｏ  ｇｏｌｄｅｎ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）、コロラド・ジャガイモ・ハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）｛Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、およびジャガイモ疫病（ｐｏｔａｔｏ  ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ）（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）に対して耐性にされ得る。
【０２９０】
本発明の１実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、２つの異なるセンス配列および２つの異なるアンチセンス配列を含む。
【０２９１】
本発明の１実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも３つの異なるセンス配列および少なくとも３つの異なるアンチセンス配列を含む。
【０２９２】
植物の害虫はしばしば、感染した植物を黄色または褐色にさせ、サイズを小さくさせ、根浸出液の精製を少なくさせ、そして急速に成長させる。従って、植物の単一の主な害虫を防除することは、次に植物を他の害虫に対してより感受性にし得る。植物の真菌病が防除されれば、健常な植物は、長期間にわたって大きく緑のままであり、従って、昆虫および空気中の真菌病に対して魅力的であってかつ感受性となる。緑色植物はまた、線虫および根感染真菌を誘引する根浸出液をより多く生成し得る。異なる分類群（例えば、亜種、種、属、科、目、綱）の害虫由来である複数の害虫遺伝子に対して相同な配列を含む異種ポリヌクレオチドを用いて植物を形質転換することは、驚くほど有利であり得ることが本明細書において発見されている。
【０２９３】
病原性除去（ｄｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）
本発明に従って形質転換された宿主植物細胞にある害虫が感染する場合、この害虫は、形質転換された宿主植物細胞および非形質転換宿主植物細胞に対して病原性が低くなることが発見されている。さらに、１実施形態では、害虫は、本発明に従って形質転換された宿主植物細胞に感染し、次いで、摂食によってこの植物由来の遺伝子サイレンシング分子が、この害虫の集団に対して交配（例えば、細胞質伝達、接合、菌糸融合など）を通じて引き続き伝達されて、病原性の少ない害虫が生じる。この方式では、害虫の集団は、例えば、増殖できない害虫によって非病原性（すなわち、病原性が少ない）にされてもよいし、そして害虫で汚染された微小環境（例えば、土壌、植物茎葉、植物細片、構築物）が、それから保護されるかまたは浄化されてもよい。
【０２９４】
場合により、害虫の子孫は、形質転換された宿主植物細胞および形質転換されていない宿主植物細胞に対して病原性が少ない。
【０２９５】
従って、本発明の１実施形態は、生物学的防除の機構であって、これは、真菌の病原性害虫単離物の重要な分野を欠き、そして殺虫剤の適用を軽減するために用いられ得るという点で大きな経済的価値を有する。この実施形態では、トランスジェニック植物は、ｓｉＲＮＡを、害虫供給挙動の方法で、害虫に伝達し、そして害虫はそれ自体の病原性遺伝子の引き続くサイレンシングに起因して病原性を失う。さらに、害虫の子孫は、次に非病原性になり（例えば、細胞質伝達、交配、接合、菌糸融合による）、それによってその害虫の局所環境を効率的に浄化して、その植物破壊挙動を妨げるかまたは有意に軽減する。
【０２９６】
病原性除去は、１実施形態では、病原性の害虫とともに、非病原性の（直接形質転換されるか、または得られたｓｉＲＮＡを有する）害虫を同時培養することによって達成される。このような同時培養は、非限定的な例によって、トランスジェニック害虫の伝播によって達成されて、増殖して土壌で群生し、ここで非病原性害虫が次に同様の種と交配される。このような伝播は、真菌について、非限定的な例では、オオムギまたはコムギの種子の上で形質転換された真菌を培養すること、次いでこのような種子を病原性除去されることまたは病原性害虫からの防御が必要な土壌に蒔くことによって達成され得る。
【０２９７】
この実施形態は、樹木（例えば、レッドウッド、オーク、ヤシ、カエデなど）のような樹立された有用な植物を保護するために適切である。
【０２９８】
前述の考察は例として真菌植物病原体を用いるが、病原性除去についてのストラテジーは、当業者に容易に明白であるとおり、それらの病原性に対して「サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）」形質を伝達する任意の他の植物害虫に適合され得る。
【０２９９】
第一に、害虫病原性遺伝子をサイレンシングすることによって害虫を「病原性除去する（ｄｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｚｅ）」することが可能である。次いで、害虫は、環境（例えば、土壌）中で生存し、そして集団全体にわたってｓｉＲＮＡを伝播させ、そしてもう植物を攻撃することはない。第二に、それぞれリボソームＲＮＡまたはエリシチン遺伝子のような主要な構造遺伝子または本質的な栄養遺伝子をサイレンシングすることによって、害虫を弱体化または殺傷させることが可能であり、これによって害虫は作物畑から排除されるかまたはその存在が経済的な閾値より低下される。
【実施例１】
【０３００】
実施例１．クローニングのストラテジー
プラスミドｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００、およびｐＶＺＡ４００は、限定されないが、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｕｍ，ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ）、ダイズ｛Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｃｖ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｔｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｍ  ｃｖ．Ａｌｐｈａ）およびコーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｃｖ．Ｈｉ  ＩＩ×Ｂ７３）を含む種々の植物種の形質転換のために設計された実施形態である。ｐＶＺＡ１００は、ｄＧＵＳと呼ばれる、Ｅ．ｃｏｌｉのβグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）の一部（８１７ｂｐ）を含むスペーサー領域によって隔てられる、センス（Ｓ）方向およびアンチセンス（ＡＳ）方向の両方において、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来の全長クチナーゼ遺伝子を含む。植物中のｐＶＺＡ１００発現は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、およびキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）キャプシドタンパク質遺伝子５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の制御下である。終止シグナルはまたＣａＭＶの３５Ｓ遺伝子由来である。ｐＶＺＡ１００プラスミドの骨格は、プラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１２０１である（図１）（Ｒｏｂｅｒｔｓら，２０００）。その植物の選択マーカーは抗生物質ハイグロマイシンである。ｐＣＡＭＢＩＡ  １２０１におけるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼの発現はまた、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよびターミネーターによって制御される。ｐＣ  ＡＭＢＩＡ  １２０１におけるレポーター遺伝子はＧＵＳであり、カタラーゼイントロンを有し、またＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターを有するが、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ターミネーターは有さない。
【実施例２】
【０３０１】
実施例２．中間のプラスミドｐＶＺＡ１の構築
その汎用性のために、遺伝子発現プラスミドｐＵＣＩ  Ｓｃｐｅｘｐ（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，１９９１）は、遺伝子サイレンシングカセットを含むように選択された。このプラスミドは、ｐＵＣ１８であり、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、続いてＣＭＶカプシドタンパク質遺伝子５’ＴＪＴＲおよびＣａＭＶ  ３５Ｓ遺伝子終止シグナルを含む。ＢｇＩ  ＩＩ部位を、ＣＭＶ  ５’ＵＴＲとＣａＭＶ  ３５Ｓターミネーターとの間のポリリンカー中に操作した。ｄＧＵＳを得るために、プラスミドｐＣ  ＡＭＢＩＡ  １２０１（図１）を、Ｎｃｏ  １およびＨｉｎｃ  ＩＩを用いて二重に設計した。ｐＣＡＭＢＩＡ１  ２０１のヌクレオチド９５４０〜１０３６１に相当する８２１ｂｐ長のＧＵＳフラグメントを、アガロースゲル電気泳動によって単離および精製した。次いで、フラグメントを３’ＮｃｏＩ部位においてリョクトウ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼを用いて８１７ｂｐに短縮するように消化した（平滑末端にした）。次いでこの平滑末端化ｄＧＵＳをアガロースゲル電気泳動によって再精製し、ｐＴＪＣ１８ｃｐｅｘｐのＢｇｌ  ＩＩ部位に連結して、中間プラスミドｐＶＺＡｌ（図２）を得た。
【実施例３】
【０３０２】
実施例３．ｐＶＺＡ２、ｐＶＺＡ３、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００プラスミドの構築
Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来の全長クチナーゼ遺伝子を、それぞれ、ＮｏｔＩおよびＮｃｏＩ制限部位を含むプライマーＶＺＡ  ＩＦ（配列番号１）およびＶＺＡ  ２Ｒ（配列番号２）を用いて、プラスミドｐＺＥｒＯ−２．１（ＮｌｕｎｏｚおよびＢａｉｌｅｙ，１９９８）中でクチナーゼクローンからＰＣＲによってアンチセンス方向で増幅した。次いで、これをアガロースゲル電気泳動によって精製し、プラスミドｐＶＺＡ１のＮｏｔ  ＩおよびＮｃｏ  Ｉ部位に連結した。得られたプラスミドｐＶＺＡ２を、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングして、精製した。センス方向のクチナーゼ遺伝子のコピーを、それぞれＡｐａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限部位を含む、プライマーＶＺＡ  ３ＦおよびＶＺＡ  ４Ｒ（それぞれ、配列番号３および配列番号４）を用いて、プラスミドｐＺＥｒＯ−２．１中の同じクチナーゼクローンからＰＣＲによって増幅した。これは、アガロースゲル電気泳動によって精製して、プラスミドｐＶＺＡ２中のＡｐａＩおよびＸｈｏＩ制限部位に連結して、最終の中間プラスミドｐＶＺＡ３（図３）を生成した。ｄＧＵＳを含み、かつセンス方向およびアンチセンス方向にクチナーゼ遺伝子を隔てる部分は、サイレンシング構築物と呼ぶ。サイレンシング構築物に加えて構築のための調節性エレメント（３５Ｓプロモーター、５’ＵＴＲおよび３５Ｓターミネーター）を含む部分は、サイレンシングカセットと呼ばれる（図３）。
【０３０３】
このサイレンシングカセットは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる二重の制限消化によってプラスミドｐＶＺＡ３から切り出して、アガロースゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＣＡＭＢｌＡ１２０１を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重に消化して、サイレンシングカセットをその部位に連結して、最終植物形質転換プラスミドｐＶＺＡ１００を生成した。全体的なサイレンシングカセットの存在を、Ｐｓｔ１を用いるｐＶＺＡ１００の制限消化（インサート全体を遊離する）によって、およびそのアセンブリにおいて用いられる種々の制限酵素での消化によって確認した。消化生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分離して、公知の分子鎖と比較した。サイレンシング構築物の２２０１ヌクレオチドの配列を、ＤＮＡの配列決定によって確認して、これを配列番号５とする。以下のオリゴヌクレオチド対をＰＣＲプライマーとして用いて、ｐＶＺＡ１００において、そしてトランスジェニック植物においてそれぞれの遺伝子の存在を検出した：クチナーゼ（配列番号１および２、または配列番号３および４）；ＧＵＳ（配列番号９および１０）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（配列番号１１および１２）。
【０３０４】
植物形質転換プラスミドｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００は、ｐＶＺＡ１００と同じ原理に基づいた。サイレンシング構築物は、ｄＧＵＳフラグメントによって隔てられる、センス方向およびアンチセンス方向の両方における、選択された病原性遺伝子の逆方向反復であった。しかし、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００のサイレンシング構築物は、それぞれ５’および３’末端でＡｐａｌおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位でＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって商業的に合成され、そしてｐＵＣ５７ベクターにクローニングされた。
【０３０５】
ｐＶＺＡ２００のサイレンシング構築物は、アブラムシＭｙｚｎｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅのカテプシンＢ遺伝子のヌクレオチド２２１〜８２０（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７０２８２２）を含んだ。このアブラムシは、主要な害虫であって、多くの植物ウイルスの最も効率的なベクターである。カテプシンＢは、Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅの生存および発達に必要な消化酵素であるシステインプロテアーゼである。ｐＶＺＡ２００のサイレンシング構築物の２０３１ヌクレオチドを配列番号６に示す。
【０３０６】
次いでその調節性エレメントをｐＶＺＡ２００サイレンシング構築物に添加して、ｐＶＺＡ２００サイレンシングカセットを生成した。このために、全体的なｐＶＺＡ１００サイレンシングカセットを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化によってｐＶＺＡ１００から切り出して、アガロースゲル電気泳動によって精製した。これを同時に消化したｐＵＣ１９にクローニングした。次いでこのプラスミドをＡｐａ１およびＮｏｔＩで消化した。ｐＶＺＡ１００由来の調節性エレメントを含むｐＵＣ１９を精製して、ＡｐａｌおよびＮｏｔＩを用いる消化によってｐＵＣ５７から遊離されたｐＶＺＡ２００サイレンシング構築物に連結した。ｐＶＺＡ２００サイレンシングカセットは、ここでｐＶＺＡ１００由来の調節性エレメントに隣接され、ｐＵＣ１９中で増大された。全体のｐＶＺＡ２００サイレンシングカセットを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる消化によってｐＵＣ１９から切り出し、次いでｐＣＡＭＢＩＡ１２０１のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結してｐＶＺＡ２００植物形質転換プラスミドを完成した。ｐＶＺＡｌ００と同様に、全体的なサイレンシングカセットの存在を、Ｐｓｔ１でのｐＶＺＡ２００の制限消化によって、およびそのアセンブリに用いられる種々の制限酵素での消化によって確認した。その消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離して、公知の分子鎖と比較した。以下のオリゴヌクレオチド対をＰＣＲプライマーとして用いて、ｐＶＺＡ２００において、そしてトランスジェニック植物において、それぞれの遺伝子の存在を検出した：カテプシン（配列番号３８および３９）；ＧＵＳ（配列番号９および１０）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（配列番号１１および１２）。
【０３０７】
植物形質転換プラスミドｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００は、同様に計画して合成した。ｐＶＺＡ３００のサイレンシング構築物は、二重遺伝子構築物であって、２つの異なる植物害虫由来の遺伝子配列を含む。これは、ｐＶＺＡ２００のサイレンシング構築物とｄＧＵＳフラグメントの周囲の同じカテプシンＢ遺伝子逆方向反復を含むように設計した。しかしさらに、各々の末端で、これは、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７６６２２８）のエリシチンＩＦＮ１の部分的コード配列を含んだ。このエリシチン遺伝子は、病原性についてＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって、そしてステロールレセプターとして必要である。なぜならＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．は、それらの成長および発達のために必須のステロールを合成しないからである。エリシチン配列は２８２ヌクレオチド長であった。従って、６００ヌクレオチドに達する配列を得るために、この配列を繰り返して５６４ヌクレオチドを得た。
【０３０８】
Ａｐａｌ制限部位は、エリシチンセンス配列の５’末端に含まれ、そしてＮｏｔｌ制限部位が、エリシチンアンチセンス配列の３’末端に含まれた。エリシチンセンス配列を、ｐＶＺＡ２００配列の５’末端に付加し、そしてエリシチンアンチセンス配列を、ｐＶＺＡ２００配列の５’末端に付加して、ｐＶＺＡ３００のサイレンシング構築物を完成させた。これは３１５９ヌクレオチド長であって、両方がセンス方向のエリシチン遺伝子およびカテプシン遺伝子、続いてｄＧＵＳ、続いて、両方ともアンチセンス方向の、それぞれカテプシン遺伝子およびエリシチン遺伝子から構成される。
【０３０９】
ｐＶＺＡ３００のサイレンシング構築物の配列は、配列番号７に示す。この配列は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成されて、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングされた。次いでこの調節性エレメントをｐＶＺＡ２００に記載されたとおり付加して、ｐＶＺＡ３００のサイレンシングカセットを完成させて、これをｐＣＡＭＢＩＡ１２０１のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。前のとおり、全体的なサイレンシングカセットの存在は、Ｐｓｔ１を用いたｐＶＺＡ３００の制限消化によって、そして、そのアセンブリに用いられる種々の制限酵素での消化によって確認した。その消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離して、公知の分子鎖と比較した。以下のオリゴヌクレオチド対をＰＣＲプライマーとして用いて、ｐＶＺＡ３００において、そしてトランスジェニック植物において、それぞれの遺伝子の存在を検出した：エリシチンおよびカテプシン重複（配列番号４０および３９）カテプシン（配列番号３８および３９）；ＧＵＳ（配列番号９および１０）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（配列番号１１および１２）。
【０３１０】
植物形質転換プラスミドｐＶＺＡ４００のサイレンシング構築物は、ｄＧＵＳによって隔てられる、それぞれ、センス方向およびアンチセンス方向で、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＪ８５４２９３）のリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）のヌクレオチド１〜６００を含んだ。Ａｐａ１およびＮｏｔ１制限部位をそれぞれ、５’および３’末端に含んだ。ｐＶＺＡ４００のサイレンシング構築物の配列（２０３１ヌクレオチド）は、配列番号８に示す。これは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成されて、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングされた。次いで、調節性エレメントをｐＶＺＡ２００に記載のとおり添加して、ｐＶＺＡ４００のサイレンシングカセットを完成させて、これをｐＣＡＭＢＩＡ１２０１のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。前のとおり、全体的なサイレンシングカセットの存在は、Ｐｓｔ１を用いたｐＶＺＡ４００の制限消化によって、そして、そのアセンブリに用いられる種々の制限酵素での消化によって確認した。その消化生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離して、公知の分子鎖と比較した。
【０３１１】
以下のオリゴヌクレオチド対をＰＣＲプライマーとして用いて、ｐＶＺＡ４００において、そしてトランスジェニック植物において、それぞれの遺伝子の存在を検出した：リボソームＤＮＡ（配列番号４１および４２）；ＧＸＪＳ（配列番号９および１０）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（配列番号１１および１２）。
【実施例４】
【０３１２】
実施例４．形質転換方法
植物細胞（タバコ、ダイズ、ジャガイモ、およびコーンを含む）を、微粒子銃を用いて形質転換プラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００で、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＰＧＶ  ２２６０株を用いて、ｐＶＺＡ１００で形質転換した。真菌培養物は、形質転換プラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００を用いる微粒子銃によってのみ形質転換した。
【０３１３】
ヘリウム駆動性の微粒子デバイスでのボンバードメント（撃ち込み）のためのタングステンまたは金のマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）の調製は、Ｓｈａｒｋら１９９１のプロトコールに従った。このマイクロプロジェクタイルは、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００、ｐＶＺＡ４００でコーティングするか、またはＤＮＡなしとした。植物組織および真菌培養物形質転換のために、Ｄｕｐｏｎｔ  ＰＤＳ−１０００装置を減圧下（２３ｍｍＨｇ）でおよび１２００ＰＳＩで、停止プレートから８および１２ｃｍの組織で用いた。幼苗および小植物の形質転換のためには、携帯型自家用粒子銃を２００ＰＳＩで用いて、成長点を成長させることができるようにできるだけ狭く保持した。
【０３１４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる形質転換は、本質的にＲｏｇｅｒｓら（１９８７）に記載のとおり行った。微粒子銃およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ形質転換を用いて、本発明のこの部分を例証したが、当該分野で公知である形質転換の目的のために、当業者に容易に理解されるとおり、そして標的種に依存して最適化されるとおり、標的細胞へ異種ＤＮＡを導入する任意の方法を用いてもよい。
【実施例５】
【０３１５】
実施例５．ｐＶＺＡ１００でのタバコ形質転換および再生
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｘａｎｔｈｉの有機カルス培養物を、実験室で振盪培養法において維持して、毎月新鮮なＭＳ培地に移した（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）。カルスを、フラスコから無菌的に取り出し、液体を濾過して除き、滅菌のプラスチックのペトリ皿中の無菌の濾紙に広げた。それらに、上記の方法に従ってｐＶＺＡ１００を撃ち込み、その濾紙を、植物ホルモンを含まないＭＳ培地中に一晩移した。翌日、その濾紙を、トランスジェニック細胞の選択のために、１ｍｇ／ｌの６−ベンジルアデニン、０．１ｍｇ／ｌナフタリン酢酸、１ｍｇ／ｌチアミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌのイノシトール、３０ｇ／ｌのスクロース、６ｇ／ｌのｐｈｙｔａｇａｒおよび３０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＭＳ培地に移した。再生のために、増殖中のカルスを２週ごとに新鮮なＭＳ培地に移した。次いで、出芽している苗条を植物ホルモンのないＭＳ培地に移して、根を形成した。根の出た植物を土壌に移植して、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対する耐性について直接試験した。植物を土壌中で成熟するまで育てて、引き続く分析のために種子を採集した。
【実施例６】
【０３１６】
実施例６．真菌形質転換および選択プロトコール
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ｐ．ｓｏｊａｅおよびＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓの５ｍｍの菌糸の円板を本発明の方法に従って、実施例３および５に記載の構築物を用いて撃ち込んだ。撃ち込まれた培養物を、Ｖ−８寒天のプレート上において、２７℃で一晩インキュベートした。翌日、それらを、４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＶ−８寒天プレートに移して、２７℃で３〜４日間インキュベートした。ディスク（５ｍｍ）を新規な増殖物から切り出して、１５ｍｌのＶ−８ブロスを含むペトリ皿に移して、２７℃で２日間インキュベートした。菌糸のマット滅菌水で洗浄して、プレス乾燥して、１０ｍｌの土壌抽出物とともに２日間インキュベートして、胞子嚢形成を誘導した。遊走子放出を誘導するために、マットを滅菌の脱イオン水に入れて、４℃で３０〜６０分冷却した。遊走子を、５，０００ｇで４℃の５分間の遠心分離によって収集した。選択のために、遊走子の濃度はほぼ１，０００／ｍｌに調節して、４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンおよびＸ−ｇｌｕｃを含むＶ−８寒天上にプレートして（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８６）、２７℃で数日間インキュベートした。
【０３１７】
ｐＣＡ＿ＭＢＩＡ１２０１中でのＧＵＳ遺伝子で安定に形質転換された単離物は、Ｘ−ｇｌｕｃ寒天上において、もともと遊走子に由来する小さい青色のコロニーとして現れた。それらを４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＶ−８寒天の個々のプレートに移したところ、その培養物は、一貫して青色に染色され、多くの移入後にＧＵＳについて陽性であった。ｐＶＺＡｌ００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００サイレンシングプラスミドで形質転換された単離物はまた最初に、もともと単一の遊走子に由来する小さい青色のコロニーとして出現した。それらを、４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンおよびＸ−ｇｌｕｃを含むＶ−８寒天のプレートに移した。この培地上での２〜３回の移入後、生存しているコロニーは白色になり、そのことはＧＵＳ遺伝子がサイレンシングされていることを示している。全ての培養物を、２７℃で維持して、毎月新鮮な培地に移した。
【実施例７】
【０３１８】
実施例７．コーン、ダイズおよびジャガイモの形質転換
コーンは、２つのプラスミドｐＶＺＡ１００およびｐＢＡＲ１８４でコーティングした金粒子を用いてＨｉＩＩ生殖質からＩＩ型カルスを撃ち込むことによって形質転換した（Ｆｒａｍｅら、２０００）。ハイグロマイシン以外の除草剤ビアラホスを含む培地上で同時形質転換体が選択および再生され得るように、ｐＢＡＲ１８４を含んだ。２ｍｇ／ｌの各々の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびビアラホスを含有するＴｓ［６−ベースの培地上でカルスを成長させて、選択した。再生および発根のために、胚を２ｍｇ／ｌのビアラホスを含有し、植物ホルモンを含まないＭＳ培地に移した。発根した小植物をＰＣＲによってアッセイした。
【０３１９】
ダイズをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよび微粒子銃の両方によって形質転換した。成熟胚をＷｉｌｌｉａｍｓダイズの水和した種子から無菌的に切り出した。次いでその胚を、２８℃において一晩シェーカーで増殖させて、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１またはｐＶＺＡ１００のいずれかを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの数ｍｌの培養物中に１５分間浸漬させた。この処理した胚を、１５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンおよび植物ホルモン（ＢＡＰおよびＮＡＡ）を含有するＭＳ培地上におき、次いで発根のために植物ホルモンなしのＭＳ培地に置いた。胚様の構造が形成され、成長し始め、そして葉が作成された（図６）が、多くの培地の試験にもかかわらず植物は再生されず、発根もしなかった。ダイズの微粒子銃形質転換を、携帯用の自家製の粒子銃を用いて行った。８〜１０日齢で６〜１０ｃｍの高さの苗にｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００またはｐＶＺＡ４００のいずれかで、またはＤＮＡなしでコーティングした金粒子を撃ち込んだ。植物を温室で成長させて、ＰＣＲでアッセイした。成熟種子を収集して、Ｐ．ｓｏｊａｅに対する耐性について試験した。
【０３２０】
ジャガイモをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよび微粒子銃の両方によって形質転換した。Ｒｕｓｓｅｔｔ  ＢｕｒｂａｎｋおよびαジャガイモをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによって形質転換した。塊茎を表面消毒して、ジャガイモの「芽（ｅｙｅｓ）」を切り出して、植物ホルモンなしの固形ＭＳ培地上においた。この芽を発芽させて、小植物を、１つの葉を含む区画を切断すること、および茎を新鮮なＭＳ培地に置くことによって生成した。発根した小植物を１０〜１５日で５〜７ｃｍの高さに成長させた。この小植物から葉をとって、茎を１ｃｍの長さの片に切った。次いでその小片を、２８℃において一晩シェーカーで増殖させて、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１またはｐＶＺＡ１００のいずれかを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの数ｍｌの培養物中に１５分間上記のように浸漬させた。この小片を、滅菌の濾紙上にブロットして、ＣｅａｒｌｅｙおよびＢｏｌｙａｒｄ（１９９７）の組織培養手順に従った。球根状の塊茎状および根状の構造が生成された（図８）が、多くの培地の試験にもかかわらず再生および発根された植物はなかった。微粒子銃形質転換のために、ジャガイモ植物の３〜５ｃｍの高さを土壌に移した。２〜３日後、それらに、携帯用の自家製の粒子銃、およびｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００またはｐＶＺＡ４００のいずれかで、またはＤＮＡなしでコーティングした金粒子を用いて撃ち込んだ。植物を温室で成長させて、ＰＣＲによって、そしてアブラムシおよびＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対するそれらの反応についてアッセイした。
【実施例８】
【０３２１】
実施例８．植物および真菌の組織からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出、ならびにＰＣＲおよびＲＴ／ＰＣＲプロトコール
総ＤＮＡをタバコの葉の組織およびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの菌糸体から、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８３の方法によって抽出した。通常は、１００ｍｇのサンプルの凍結組織を、液体窒素を含むミクロチューブ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）中で微細な粉末に粉砕し、次いでモーター駆動のステンレス鋼乳棒を用いて５００μｌの抽出緩衝液中でホモジナイズした。
【０３２２】
ＲＴ／ＰＣＲ反応のための総ＲＮＡを、葉の組織および真菌の菌糸体から、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＲＩｚｏｌ法によって抽出した。通常１００ｍｇの組織を、１．８ｍｌのミクロチューブ中で液体窒素中で凍結させた。これを微細な粉末に粉砕し、次いでモーター駆動乳棒を用いて１．０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ中でホモジナイズした。その混合物を室温で５分間インキュベートさせた。次いで２００μｌのクロロホルムを添加して、ボルテックスによって混合した。その懸濁物を室温で５分間インキュベートした。そのチューブを４℃において１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その水相を清浄なチューブに移して、５００μｌのイソプロパノールを添加して、サンプルを混合して室温で１０分間インキュベートした。そのチューブを４℃で１０分間再度遠心分離して、その上清を廃棄した。ペレットを、ボルテックスおよび４℃で５分の遠心分離によって、２５０μｌの７５％のエタノールで１回リンスした。ＲＮＡのペレットを短時間、風乾して、２０μｌのＲＮａｓｅなしの水に溶解して、用いるまで−７０℃で保管した。
【０３２３】
ｓｉＲＮＡ検出のための総ＲＮＡの大規模調製のために同様の方法を用いた。通常１グラムの凍結した葉または真菌の菌糸体を液体窒素中で微細な粉末に粉砕して、１５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬でホモジナイズした。次いで３ｍｌのクロロホルムを添加して上記のようにインキュベートした。その上清を遠心分離によって回収して、１／２容積のイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させた。そのペレットを７５％エタノールで洗浄し、風乾して、８０μｌのＲＮａｓｅなしの水に再懸濁した。
【０３２４】
植物および真菌の両方の組織についてのＰＣＲ反応を、反応容積が全部で５０μｌであったこと以外は、本質的にＭｕｎｏｚおよびＢａｉｌｅｙ，１９９８に記載されるように行った。この反応物は、１×ＰＣＲ緩衝液（１０×溶液：５００  ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０および１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各々のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＰｒｏｍｅｇａ）、１００ｐｍｏｌの適切なフォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号を参照のこと）、１〜１０μｌのテンプレート、および十分な脱イオン水を５０μｌまで含んだ。テンプレートとして用いられるＤＮＡ調製物は通常、１μｌあたり５０ｎｇに希釈して、１μｌをテンプレートとして用いた。
【０３２５】
ＰＣＲ反応条件は、アニーリング温度について以外は標準化し、アニーリング温度は、増幅される遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマーのＴｍに依存して変えた。標準化された条件は、融解のために９４℃２分間、続いて９４℃で１分、アニーリング温度で１分、そして伸長のための７２℃で２分が４０サイクルであった。４０サイクル後、７２℃で伸長が１０分、そして反応物はアッセイするまで４℃で保持した。
【０３２６】
ＲＴ／ＰＣＲ反応は、３つの別々の工程、ＤＮａｓｅ処理、逆転写で、次いでＰＣＲをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに推奨されるように行った。ＤＮＡｓｅ処理を行って、ＲＮＡ精製中に持ち込まれたＤＮＡを排除して、メッセンジャーＲＮＡのみが転写され、ゲノムＤＮＡが転写されないことを確実にする。ＤＮａｓｅ混合物は１つの反応物あたりに以下を含んだ：３μｇのＲＮＡ、１μｌの１０×ＤＮＡｓｅＩ緩衝液、２μｌのＤＮＡｓｅＩ、０．５μｌＲＮａｓｅＯＵＴおよび水を最終容積１０μｌまで（ＲＮａｓｅなし）。これを２６℃で３０分間インキュベートした。次いで、６．５μｌの２５ｍＭ  ＥＤＴＡを１つのチューブに添加して、６５℃で１５分間インキュベートした。
【０３２７】
逆転写酵素（ＲＴ）反応のためにＭｉｘＩおよびＭｉｘＩＩを調製した。ＭｉｘＩは、１反応物あたり以下を含んだ：１ｕｌのｄＮＴＰｓ、４μｌの５×ＲＴ緩衝液、および２μｌのジチオスレイトール。ＭｉｘＩＩは、１反応物あたり以下を含んだ：０．５μｌのＲＮａｓｅ  ＯＵＴ、１μｌの逆転写酵素および１μｌの水。適切なオリゴヌクレオチドプライマー（各々１μｌまたは水）を適切な試験管に入れて、適宜ＭｉｘＩおよびＭｉｘＩＩを添加した。ＭｉｘＩをあらゆる試験管に入れて、ＭｉｘＩＩは、奇数の試験管に、そして２．５μｌの水は偶数の試験管に入れた；次いで、ＲＮＡで処理した１０μｌのＤＮａｓｅを各々の試験管に添加した。ＲＴ反応物を４２℃で６０分間、次いで７０℃で１５分間インキュベートした。
【実施例９】
【０３２８】
実施例９．植物および真菌の組織におけるｓｉＲＮＡの検出
この手順は本質的に、Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，２０００に記載されたとおりであった。総ＲＮＡを、上記のとおりタバコの葉および真菌の菌糸体から抽出した。これを、分光光度計で２６０ｎｍで定量して、８０μｇを、１５％ゲル上で、０．０２５Ａｍｐで２．５時間の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。そのゲルを臭化エチジウムで染色して、写真を撮り、ＲＮＡを、４℃で１０ボルト１時間、ハイボンドＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写した。ハイブリダイゼーションは、ノーザンブロットについてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されたように行った。
【０３２９】
プローブを、クチナーゼ遺伝子の５００ｂｐのＰＣＲ生成物から転写して、ランダムプライミングによって３２Ｐで標識した。メンブレンを、ＡｍｅｒｓｈａｍのＨＹＢＡＩＤ緩衝溶液を用いて５０℃で１時間プレハイブリダイズさせて、５０℃で少なくとも１６時間ハイブリダイズさせた。洗浄は室温で５×ＳＳＣを用いて２回行った。ハイブリダイゼーションシグナルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｙｎａｍｉｃｓのＳｔｏｒｍ  ８６０ホスホルイメジャースキャナー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ｓｃａｎｎｅｒ）を用いて、リン光分析画像（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）によって検出した。
【実施例１０】
【０３３０】
実施例１０．植物および真菌の組織のＧＵＳ染色
Ｘ−ＧＬＵＣ基質の調製：２００ｍｌについては、１５０ｍｌの蒸留水をビーカーに入れて、以下の成分を添加する：リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０（１Ｍ）、２０ｍｌ、ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０（５００ｍＭ）、４ｍｌ、フェロシアン化カリウムＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６．３Ｈ２Ｏ、０．０４２ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．２  ｍｌ。１０分間撹拌する。ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節する。１００ｍｇのＸ−ＧＬＵＣを２ｍｌのＤＭＳＯまたはジメチルホルムアミド中に溶解する。ビーカーのＤＭＳＯにＸ−ＧＬＵＣを添加する。その溶液を濾過滅菌して、１０ｍｌのアリコートに分注し、−２０℃に保管する。増殖培地への組み込みのために、ＤＭＳＯに溶解された１００ｍｇのＸ−ＧＬＵＣ粉末を２５０ｍｌのＶ８寒天へ添加して、冷却し、そして真菌単離物のためにはいつでも分注できるように、または植物物質についてはＭＳ培地にした。
【０３３１】
染色手順：植物組織の小さい移植片を覆うのに十分なＸ−ＧＬＵＣ溶液を添加して、３７℃で３〜２４時間インキュベートする。真菌単離物または植物物質のためにはＸ−ｇｌｕｃ寒天プレート中で、２４〜２７℃で３〜２４時間インキュベートする。
【０３３２】
この手順は本質的にＪｅｆｆｅｒｓｏｎら、１９８６に記載されたとおりである。
【実施例１１】
【０３３３】
実施例１１．真菌による植物接種試験
Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅをタバコに接種する３つの方法を試験した。全てで満足な結果が得られたが、トゥースピック（ｔｏｏｔｈｐｉｃｋ）法がより厳格かつ信頼性であった。
【０３３４】
１．トゥースピック（つまようじ）法：この方法はＡ．Ｃｓｉｏｎｓ博士（個人通信）によって提供された。丸くした木の爪楊枝を半分に折り、Ｖ−８ブロス中でオートクレーブした。滅菌爪楊枝をＶ−８寒天のプレート中で平らにおき、そしてＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの６〜８の菌糸体のディスク（直径５ｍｍ）をプレート上に等距離に隔てて置いた。このプレートを２７℃で少なくとも２週間インキュベートして、このとき顕微鏡検査で厚膜胞子が透明になる。植物の接種は、植物の冠の隣に土壌に１または２つの爪楊枝を立てることによって行った。植物は、プラスチックテントで覆って１００％の相対湿度に維持して、２７℃でインキュベートした。徴候は２〜４日後に通常明白になり、そして感受性の植物は通常５〜８日後に死んだ。得られたトランスジェニック植物の反応は、無症状であることから限定された茎病変１〜４ｃｍを生じるまでに及んで変化して、植物の成長および引き続く花および種子の発達を妨害しない。
【０３３５】
２．菌糸体浸漬方法：Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの菌糸体をＶ−８ブロス中で２７℃で一晩増殖させた。土壌におけるトランスジェニックの苗または植物を、培地なしで洗浄して、１００ｍｌの滅菌脱イオン水に入れた。菌糸体マットを、鉗子で細かく刻み、水に添加した。植物をプラスチックテントで覆って、相対湿度１００％に維持して、２７℃でインキュベートした。症状は通常２〜４日後に明らかになり、感受性の植物は通常５〜８日後に死滅した。感受性の植物の根および冠を完全に漬け込んだ（図ＨＡ）。抵抗性のトランスジェニック植物の根は、先端部で「焦げた（ｂｕｒｎｅｄ）」ように見え（図１Ｂ）、または冠で規定の病変があったが、これは、植物が土壌に植えられた後、植物の成長およびその後の花および種子の発達を阻害しない。
【０３３６】
３．遊走子接種：豊富な胞子嚢を、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの増殖中の培養物中における表面滅菌したタバコの葉の条片を２７℃においてＶ−８ブロス中に一晩おく事によって生成した。数百万個の遊走子が、滅菌脱イオン水中にマットを置くことによって放出され、そして４℃で３０〜６０分間冷却された。遊走子を遠心分離によって５分間、５，０００ｇおよび４℃で収集した。
【０３３７】
ダイズ植物に、２つの異なる方法によってＰ．ｓｏｊａｅを接種した。穿孔器を用いてＶ８寒天上で活発に増殖している培養物から３ｍｍの円柱を切り出して、この円柱を１つの胚軸の葉軸に置くことによって苗を接種した。この接種物をパラフィルムによって適所に保ち、そしてこの植物をプラスチックバッグに入れて１００％湿度を得た。１０ｍｌの滅菌水を含むペトリ皿中に葉を置くこと、および１または２つのプラグの接種物を上記のように添加することによって、大豆の葉にＰ．ｓｏｊａｅを接種した。
【０３３８】
１０ｍｌの滅菌水を含むペトリ皿に葉を入れること、および１または２つのプラグの接種物を上記のように添加すること、または１小葉あたり１０μｌの遊走子懸濁物をおくことによって、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓをジャガイモの葉に接種した。
【０３３９】
全ての接種試験では、接種された植物または葉が死ぬのをやめるか、または感染の証拠を示さなくなるまで、毎日この植物または葉の反応を読みとって記録した。
【実施例１２】
【０３４０】
実施例１２．Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ耐性タバコ植物の分子特徴付け
ＤＮＡおよびＲＮＡを、実施例２７のＴ０およびＴ２世代の形質転換植物から抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写／ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）試験は、それぞれ、ＤＮＡおよびＲＮＡサンプルで行った。ＰＣＲ反応を行って、植物における導入遺伝子の存在を決定した。ＲＴ／ＰＣＲ反応を行って、導入遺伝子が発現されているかまたはサイレンシングされていたかを決定した。その結果は、Ｔ０およびＴ２世代の両方について同じであって、これを表８にまとめる。
【０３４１】
【表１１】
2008517604.tif 000016
【０３４２】
表８の上部のパネルでは、第一列のデータによって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）が、野性型タバコに存在しないこと、これがｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独でまたはｐＶＺＡ１００のいずれかで形質転換された全ての植物に存在したことが実証される。第二列のデータによって、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が、これが存在する全ての植物で発現されたことが実証される。第三列のデータによって、ＧＵＳ遺伝子が野性型のタバコには存在しないが、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独でまたはｐＶＺＡ１００のいずれかで形質転換された全ての植物に存在したことが実証される。第４列のデータによって、ＧＵＳサイレンシング構築物が存在しなかったｐＣＡＭＢＩＡ１２０１形質転換植物においてのみＧＵＳ遺伝子が発現されたことが実証される。しかし、ＧＵＳは、ｐＶＺＡ１００サイレンシング構築物を含む全てのトランスジェニック植物でサイレンシングされた。
【０３４３】
表８の下部のパネルでは、第一列のデータによって、真菌クチナーゼ遺伝子は、野性型タバコに存在せず、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独で形質転換された植物でも存在しないことが実証される。しかし、これはｐＶＺＡ１００で形質転換された全ての植物に存在した。第二列のデータによって、真菌クチナーゼ遺伝子は、野性型植物でも、またはｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独でもしくはｐＶＺＡ１００のいずれかで形質転換された植物でも発現されなかったことが実証される。第三列のデータによって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は野性型および全てのトランスジェニックタバコ植物に存在するが、サイレンシング構築物には存在しないことが実証される。第四列のデータによって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、野性型であろうとトランスジェニックであろうと、全てのタバコ植物で発現されたことが実証される。
【０３４４】
野性型タバコ植物またはｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換されたタバコに、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅを接種した場合、それらは常に感受性であったが、ｐＶＺＡ１００で形質転換されたもの、例えば、トランスジェニック株４、２３、２６および２７は抵抗性であった（それぞれ、図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
【実施例１３】
【０３４５】
実施例１３．真菌の形質転換および特徴づけ
Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅまたはＰ．ｓｏｊａｅのいずれかの異なる培養物を、上記のようにｐＣＡＭＢＩＡ１２０１、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００、またはｐＶＺＡ４００のいずれかを用いて撃ち込んで、単一の遊走子培養物を、生きている培養物から生成する。
【０３４６】
ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１およびｐＶＺＡ１００を用いて撃ち込んだＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ培養物を、正常に感受性の野性型Ｘａｎｔｈｉタバコで病原性について試験した。ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換された培養物は、病原性のままであったが、ｐＶＺＡ１００で形質転換した培養物は非病原性であった。Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの野性型およびトランスジェニックの培養物を、液体のＶ８培地中で成長させて、ＤＮＡおよびＲＮＡを上記のように抽出した。それらのサンプルを上記のようにＰＣＲおよびＲＴ／ＰＣＲによって分析した。その結果を表９にまとめる。
【０３４７】
【表１２】
2008517604.tif 000017
【０３４８】
表９の上部のパネルでは、第一列のデータによって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）が、野性型Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに存在しないが、これはｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独でまたはｐＶＺＡ１００のいずれかで形質転換されたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの培養物に存在したことが実証される。第二列のデータによって、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が、これが存在する全ての植物で発現されたことが実証される。
【０３４９】
第三列のデータによって、ＧＵＳ遺伝子が野性型のＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅには存在しないが、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独でまたはｐＶＺＡ１００のいずれかで形質転換されたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの培養物に存在したことが実証される。第４列のデータによって、ＧＵＳサイレンシング構築物が存在しなかった、Ｐ．ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１形質転換Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおいてのみＧＵＳ遺伝子が発現されていたことが実証される。しかし、ＧＵＳは、ｐＶＺＡ１００サイレンシング構築物を含む全てのトランスジェニックＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅでサイレンシングされた。
【０３５０】
表９の下部のパネルでは、第一列のデータによって、真菌クチナーゼ遺伝子は、野性型Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに、そしてｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミド単独で、またはｐＶＺＡ１００サイレンシング構築物のいずれかで形質転換された培養物に存在したことが実証される。なぜなら、クチナーゼはＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの構成的な遺伝子であるからである。第二列におけるデータによって、真菌クチナーゼ遺伝子は、野性型Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおいて、そしてｐＣＡＭＢＩＡ１２０１プラスミドで形質転換された培養物の両方において発現されたことが実証される。しかし、このクチナーゼ発現は、ｐＶＺＡ１００サイレンシング構築物で形質転換したＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ培養物中ではサイレンシングされた。
【０３５１】
第三列のデータによって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は野性型および全てのトランスジェニックＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに存在するが、サイレンシング構築物には存在しないことが実証される。第四列のデータによって、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、野性型およびトランスジェニックの両方のＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ培養物において発現されていることが実証される。ｐＣＡＭＢＬＡ．１２０１、ｐＶＺＡ１００およびｐＶＺＡ２００を撃ち込まれたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅの培養物の顕微鏡的検査によって、全てが野性型のように正常に成長し、視覚的な形成異常はないことが示された（図１４Ａ）。感染した野性型タバコまたはｐＶＺＡ１００で形質転換されたタバコから再単離されたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの培養物について同様の結果が観察された。しかし、ｐＶＺＡ３００またはｐＶＺＡ４００を撃ち込んだＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの培養物（図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ）、そしてｐＶＺＡ３００またはｐＶＺＡ４００を撃ち込まれたＰ．ｓｏｊａｅの培養物（図１４Ｅ、図１４Ｆ）は、極めて緩徐に成長し、それらの菌糸は高度に奇形であって、いくつかの培養物は死滅した。
【０３５２】
ｐＣＡＭＢＬＡ１２０１およびｐＶＺＡ２００を用いるＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅの形質転換は、真菌に有害な影響を有さなかった。なぜなら、それらのプラスミドは、真菌遺伝子を含まず、そしてそれらの真菌においてサイレンシングを誘導できないからである。さらに、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼ遺伝子を含むｐＶＺＡ．１００を用いるＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅの形質転換によって、それらは、正常に成長できるようになるが、両方の種は非病原性にされた。なぜなら病原性について必須であるクチナーゼ遺伝子はｐＶＺＡｌ００によってサイレンシングされたからである。
【０３５３】
それぞれ、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓのエリシチンおよびリボソームＲＮＡ遺伝子を含むｐＶＺＡ３００またはｐＶＺＡ４００を用いるＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅの形質転換は両方とも、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅの両方の成長および発達に対して顕著な有害な影響を有した。病原性試験について十分な接種を得るのにさえ不十分な成長であった。これによって、エリシチンおよびリボソームＲＮＡ遺伝子が形質転換された真菌中でサイレンシングされたこと、そしてこれらの重要な遺伝子のいずれかのサイレンシングは、真菌にとって極めて有害であるか致死性であることが示唆される。このことは、ｐＶＺＡ２００およびｐＶＺＡ３００の両方ともＭｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅカテプシン遺伝子を含むという事実によってさらに支持される。しかし、さらに、ｐＶＺＡ３００は、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓエリシチン遺伝子を含む。ｐＶＺＡ２００は可視の効果を生じず、ｐＶＺＡ３００は、有害な効果を生じるので、エリシチン遺伝子は、ｐＶＺＡ３００によって生じる異常な形態を担うと考えられる。
【０３５４】
上記のとおり、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅクチナーゼが、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの他の種に対する植物耐性を誘導した場合、これらの結果によって、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の１つの種に由来する必須の遺伝子が、サイレンシング構築物において誘導される場合、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ（Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｓｏｊａｅ）の他の種に対して極めて有害な影響を生じ得ることが実証され、これはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．を植物中で直接防除することにおいて、または感染した土壌および圃場の病原性除去によって有用であるはずである。
【実施例１４】
【０３５５】
実施例１４．ｓｉＲＮＡ検出によるタバコでの遺伝子サイレンシングの実証
遺伝子サイレンシングが存在するというさらなる証拠は、称されるとおりサイレンシングされた形質転換植物（実施例５および１３）および形質転換された真菌（実施例１３）における低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）の検出である。ｓｉＲＮＡは、２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長であって、「サイレンシングされている（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）」ｍＲＮＡに対して相同性を有する。
【０３５６】
総ＲＮＡを野性型および称されるとおりサイレンシングされたトランスジェニックのＴＯおよびＴ１世代のタバコ植物、ならびに野性型および称されるとおりサイレンシングされたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅから抽出した。ＲＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離して、メンブレンにブロットして、クチナーゼ遺伝子の５００ｂｐのＰＣＲ産物から転写され、かつランダムプライミングによって３２Ｐで標識されたプローブを用いてハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションおよび検出条件は、上記の実施例９のとおりであった。
【０３５７】
図４ａおよび図４ｂは、野性型およびトランスジェニックのタバコ植物およびトランスジェニックＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来のＲＮＡに対するクチナーゼ遺伝子プローブのハイブリダイゼーションの結果を示す。図４ａでは、レーン１は、３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドＶＺＡ３Ｆ（配列番号３）およびＶＺＡ４Ｒ（配列番号４）の混合物に対するハイブリダイゼーションを示す。これらを用いて、ＰＣＲ反応物をプライムして、プローブの産生のためのテンプレートを合成した。従って、それらは、テンプレートに対して完全に同種であって、そしてまた公知の分子サイズである。レーン２および３は、野性型タバコ植物由来のＲＮＡを含む。クチナーゼ遺伝子もサイレンシング構築物も野性型植物にはないのでハイブリダイゼーションはなく、そのためｓｉＲＮＡは生成されない。レーン４〜１１は、トランスジェニック株４、２３、２６および２７のＴＯおよびＴＩ世代の植物由来のＲＮＡを含む。このハイブリダイゼーションは、トランスジェニック植物の各々におけるｓｉＲＮＡの存在を実証し、これは、クチナーゼｍＲＮＡの分解、およびそれに付随するトランスジェニック植物におけるクチナーゼ遺伝子のサイレンシングを示している。
【０３５８】
図４ｂでは、レーン１はここでも、３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドＶＺＡ３ＦおよびＶＺＡ４Ｒの混合物に対するハイブリダイゼーションを示す。レーン２は、野性型Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来のＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを示す。強烈な６２０ヌクレオチド長のスポットは、野性型Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおけるクチナーゼ遺伝子の全長転写物に相当する。クチナーゼ遺伝子は、この培養物中で構成的であって、サイレンシング構築物は存在しない。従って、全長ｍＲＮＡ転写物が生存しており、ｓｉＲＮＡへ消化はされない。レーン３〜６は、サイレンシング構築物で形質転換されたＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの４つの構築物由来のＲＮＡを含む。ハイブリダイゼーションによって、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのトランスジェニック培養物の各々におけるｓｉＲＮＡの存在が実証されており、このことは、クチナーゼｍＲＮＡの分解、およびトランスジェニックのＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおけるクチナーゼ遺伝子の付随するサイレンシングを示す。
【０３５９】
トランスジェニックのＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおける本質的なクチナーゼ遺伝子のサイレンシングについての生物学的な証拠は、クチナーゼ遺伝子サイレンシング構築物ｐＶＺＡ１００で形質転換された培養物は非病原性にされるが、ｐＣＡＭＢＩＡ  １２０１プラスミド単独で形質転換された培養物はそれが由来した野性型培養物に対して等しく病原性のままであるという事実から生じる。ｐＶＺＡ１００サイレンシング構築物の存在下での遺伝子サイレンシングのさらなる証拠は、ＧＵＳ遺伝子によって提供される。ＧＵＳ反応は、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換されて病原性であった培養物で常に陽性であった。ｐＶＺＡ１００で形質転換されて非病原性であった培養物ではこれは常に陰性であった。これは、同じ培養物中のクチナーゼ遺伝子の活性またはサイレンシングと直接相関している。
【実施例１５】
【０３６０】
実施例１５．本明細書において有用な高度に相同性のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａクチナーゼ配列
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの遺伝子配列の分析で、種交差耐性を付与する異種ポリヌクレオチドを設計するための基礎が得られる。本発明に従って有用な害虫病原性遺伝子配列を選択するためのバイオインフォマティクス分析の使用の例示として、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの２５個の異なる単離物をクローニングして配列決定した。単離物は、９つの種Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ、Ｐ．ｃｉｎｎａｍｏｍｉ、Ｐ．ｃｉｔｒｉｃｏｌａ、Ｐ．ｃｉｔｒｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐ．ｈｅｖｅａ、Ｐ．ｍｅｇａｋａｒｙａ、ＪＰ．ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ（Ｐ．ｓｏｊａｅ）、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰ．ｐａｈｎｉｖｏｒａを含んだ。これらの配列の各々（配列番号１３〜３７を参照のこと）が、本発明のポリヌクレオチドに有用である。
【０３６１】
例えば、配列のうち９つが同一であって、１１がＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼ遺伝子配列に対して９９％を超える同一性である。影付きの文字は、配列における相違を示す。
【０３６２】
表１０．Phytophthoraの９つの種を含む２５の単離物のクチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列
【表１３】
2008517604.tif 000018
【０３６３】
【表１４】
2008517604.tif 000019
【０３６４】
【表１５】
2008517604.tif 000020
【０３６５】
【表１６】
2008517604.tif 000021
【０３６６】
【表１７】
2008517604.tif 000022
【０３６７】
【表１８】
2008517604.tif 000023
【０３６８】
理論によって束縛はされないが、これらのクチナーゼ配列は、上記で実証された交差耐性の分子的な基礎を提供し、そして同様の結果を有する他の害虫病原性遺伝子を選択するための遺伝子配列決定およびバイオインフォマティクス分析の一般的な適用を支持する。
【実施例１６】
【０３６９】
実施例１６．タバコでの属間の耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｔａａｃｉｎａによって生じる疾患に対してＰ．ｎｉｅｏｔｉａｎａｅ  ｃｕｔｉｎａｓｅ遺伝子サイレンシングによって付与された。
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａによって生じるタバコのアオカビ病の自然な流行がタバコのある温室で生じた。アオカビの重篤度において明らかな相違が観察された。植物の以下の３つの遺伝子型が評価のために利用可能であった：クチナーゼ遺伝子を含んでおり、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対する耐性について既に選択されたトランスジェニック植物、Ｐ．ｎｉｅｏｔｉａｎａｅに対する耐性についてまだ選択されていないクチナーゼトランスジェニック植物、および野性型または非トランスジェニックのＸａｎｔｈｉタバコ植物。図５の写真の番号は、異なる疾患の格付けを指しており、異なる植物株または遺伝型を指すのではない。
【０３７０】
【表１９】
2008517604.tif 000024
【０３７１】
表１１によって、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ耐性植物のうち、その６８％がＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａによって中度に影響され（疾患の格付け１＋Ｔｙ）、そして３２％が重度に影響された（疾患の格付け３＋４）ことが示される；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａに対する耐性の支持が約２：１の比。トランスジェニックの未選択の植物については、４７％が中度に影響され、そして５３％が重度に影響され；Ｖｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａに対する耐性の支持が約１：１の比。野性型植物のうち、７％が中度に影響され、そして９３％が重度に影響され；感受性の支持が約１３：１の比であった。従って、図５および表１１によって、種々のタバコ遺伝子型における種々の耐性のレベルが、そしてＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来のクチナーゼ遺伝子が、Ｐｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して遠縁の真菌であるＰｅｒｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉａｎａに対するタバコの広範な耐性を誘導することが明確に実証される。
【０３７２】
表１２によって、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａが分類学的に近縁ではないことが実証される。ただし、上記のとおり、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼ遺伝子は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａの両方に耐性を付与する。従って、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼ遺伝子は、少なくとも３つの異なる真菌種および３つの真菌病に対して広範な耐性を提供する。これは、２つの異なる種、タバコにおけるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに、そしてダイズにおけるＰ．ｓｏｊａｅに対して防御し、そしてまたＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａの両方に対してタバコを防御する。これらの２つの真菌種は、同じ目に、ただし明確に異なる科および属に分類される（表１２）。
【０３７３】
【表２０】
2008517604.tif 000025
【実施例１７】
【０３７４】
実施例１７．Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ遺伝子サイレンシング構築物で形質転換され耐性にされたダイズ
ダイズ組織培養物：Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにより、そして微粒子銃によりｐＶＺＡ１００（実施例７）で形質転換されたダイズ胚の多くから苗条が出芽した（図６）。この植物上の他のカルスは、緑色を維持しており、そして極めてもろくなった（図７Ａ）。ＤＮＡを、各々が苗条、もろいカルスの３つのサンプルから抽出し、ＰＣＲは、ＧＵＳ（配列番号９および１０）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（配列番号１１および１２）遺伝子を増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。
【０３７５】
ＧＵＳおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）の両方の遺伝子とも、図７Ｂに示されるようにダイズカルスで検出された。図７Ｂの上部パネルは、サンプルのうち６つ全て（レーン１〜６）がＨＰＴについてトランスジェニックであったことを示す（レーン７はプラスミドコントロールである）。下部のパネルは、６つのサンプルのうち少なくとも４つ（レーン１、２、４、５）がＧＵＳ遺伝子にトランスジェニックであったことを示す（レーン７はプラスミドコントロールである）。これらのデータによって、宿主植物細胞は、ｐＶＺＡ１００異種ポリヌクレオチドでトランスジェニックであったことが実証される。
【０３７６】
１５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含有する培地上の小植物および苗条の継続的な成長によって、カルスが異種ポリヌクレオチドを発現したことが実証される。
【０３７７】
ダイズカルスがその染色反応においてＧＵＳ陰性であったという事実によって、宿主植物細胞におけるＧＵＳ発現は、異種ポリヌクレオチドによってサイレンシングされたことが実証される。
【０３７８】
次に、カルスを成長させ、発根させ、土壌に移植させ、そして花粉および種子を得るために成熟するまで成長させる。非形質転換植物を、成熟した形質転換した植物由来の花粉で受粉させ、得られた受精した種子を成熟植物に成長させる。成熟植物（ＦＯ植物）、ＦＯ植物の種子から成長した植物、ならびに形質転換された植物花粉および形質転換されていない植物の花由来の種子から再生された非形質転換植物は全てＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅに対して耐性を示す。
【０３７９】
ダイズ植物：ダイズ組織培養物を用いる本実施例（１７）は、実施例２７において明確に実証され、ここではｐＶＺＡ１００の撃ち込みによって形質転換されたダイズ植物は、Ｐ．ｓｏｊａｅに対して耐性であった（図１３）。この結果によってまた、広範な耐性がＰ．ｓｏｊａｅに対してＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼ遺伝子によって付与されたことが実証される。
【実施例１８】
【０３８０】
実施例１８．Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して形質転換された耐性にされたジャガイモ
実施例７から、根および小さい塊茎（ｍｉｎｉｔｕｂｅｒｓ）の両方とも培養プレート中で生成された（図８）。この小植物、根および小塊茎を、１５ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む培地で成長させ、カルスが形質転換されて、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ導入遺伝子を発現していることを実証する。ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換されたジャガイモのカルスはＧＵＳ陽性染色されたが、ｐＶＺＡ１００で形質転換されたジャガイモはＧＵＳ陰性の染色であった。これによって、ｐＶＺＡ１００で形質転換された組織ではＧＵＳがサイレンシングされたことが実証される。
【０３８１】
ＰＣＲ分析によって導入遺伝子の存在が実証される。切断部分および塊茎由来の子孫植物の試験はｓｉＲＮＡが陽性である。サイレンシング構築物で形質転換されたジャガイモはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して耐性である。
【０３８２】
ジャガイモ植物：ジャガイモ組織培養物を用いる本実施例（１８）は、実施例２７において明確に実証されており、ここではｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００を撃ち込むことによって形質転換されたジャガイモは、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対して耐性であった。
【実施例１９】
【０３８３】
実施例１９．ダイズを落葉病（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ  ｒＤＮＡに対して耐性にする
ダイズ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列がＰｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｕ６６７２８、配列番号４３）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から生成し、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａの接種後、落葉病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａに対して耐性の植物はまた、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓに対して耐性である。
【実施例２０】
【０３８４】
実施例２０．ダイズを、落葉病（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）（Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａ遺伝子型Ｂ  ＤＮＡマーカーに対して耐性にする
ダイズ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列がＰｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａのリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｕ６６７２８、配列番号４４）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から生成し、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａの接種後、落葉病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ  ｇｒｅｇａｔａに対して耐性の植物はまた、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓに対して耐性である。
【実施例２１】
【０３８５】
実施例２１．ダイズを、茎根腐病（ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）に対して耐性にする（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅクチナーゼ）
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列がＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅのクチナーゼ）（すなわち、配列番号３６）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から生成し、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅの接種後、茎根腐病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例２２】
【０３８６】
実施例２２．ダイズを、シロカビ病に対して耐性にする（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍのＲＮＡポリメラーゼサブユニット）
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの２番目に大きいサブユニットエキソン１、株１−８４（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＪ７４５７１６、配列番号４５）のＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの部分的なｒｐｂ２遺伝子に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から生成し、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの接種後、シロカビ病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍに対して耐性の植物はまた、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａｅ  ｏｒｉｚａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｊａｅ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅおよびＰｕｃｃｉｎｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓに対して耐性である。形質転換された植物は、正常な成長を示し、Ｓ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍのｒｐｂ２遺伝子に対して高い相同性を有する遺伝子を欠く。ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ１２５４１２（配列番号４６）の部分的配列であるＰｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉの１８ＳのリボソームＲＮＡ遺伝子に相当するセンス配列およびアンチセンス配列を用いて同様の結果を得る。
【実施例２３】
【０３８７】
実施例２３．ダイズを、シロカビ病に対して耐性にする（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍのヘキソース輸送体）
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍヘキソース輸送体（ｈｘｔ２）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ６４７２６８．１、配列番号４７）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から再生し、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍの接種後、シロカビ病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍに対して耐性の植物はまた、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａに対してある程度の耐性を示す。
【実施例２４】
【０３８８】
実施例２４．ダイズを、急性枯死症（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ  クチナーゼ）に対して耐性にする
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｆ．ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉのクチナーゼのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｋ０２６４０．１、配列番号４８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から再生し、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｇｌｙｃｉｎｅｓの接種後、急性枯死症に対して付与された耐性について首尾よく選択する。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｇｌｙｃｉｎｅｓに対して耐性の植物はまた、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓに対してある程度の耐性の増大を示す。
【実施例２５】
【０３８９】
実施例２５．ダイズを、アジア・さび病（Ａｓｉａｎ  ｒｕｓｔ）に対して耐性にする（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉクチナーゼのホモログ）
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのＰｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉ保存タンパク質モチーフに相当し、そしてＰｈａｋｏｓｐｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＣ１４９３６７．２、配列番号４９）に見出される以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅのクチナーゼとの相同性に基づいて、この保存されたタンパク質モチーフは、クチナーゼ相同体と同様であって、ダイズクチンの浸透率に関与する。ダイズ植物は、形質転換された細胞から再生して、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの接種後にアジア・さび病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例２６】
【０３９０】
実施例２６．ダイズを、アジア・さび病（Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉのｒＤＮＡ）に対して耐性にする
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＦ３３３４９１、配列番号５０）に見出されるリボソームＤＮＡ配列に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物は、形質転換された細胞から再生して、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの接種後にアジア・さび病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例２７】
【０３９１】
実施例２７．遺伝子導入、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．に対する耐性およびアブラムシに対する耐性についてのタバコ、ダイズ、ジャガイモおよびコーンの試験
タバコ
ｐＶＺＡ１００を用いる形質転換による、実施例５において生成した成熟タバコ植物を、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対する耐性について試験した。Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅでの接種について３つの方法を試験した。全てで満足な結果が得られたが、上記で例証されるとおり、トゥースピック法がより厳格でかつ信頼できた。一般にはｐＶＺＡ１００で形質転換されたＴＯ植物（初めのトランスジェニック世代）の約２０％が、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅの感染に生存し、一方野性型植物およびｐＣＡＭＢＩＡ  １２０１で形質転換された植物のうち生存したのは０％であった。
【０３９２】
ｐＶＺＡ１００で形質転換された生存している植物を土壌中で成長させ、そして種子を引き続く分析のために収集した。種子の子孫（＝Ｔ１世代）を３０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するＭＳ培地で成長させ、そしてその生存している植物をＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅについて再度試験した。
【０３９３】
生存している形質転換された植物をまた、土壌中で成熟するまで成長させ、そして種子をその後の分析のために収集した。これらの植物の４つの異なる株（株＃４、＃２３、＃２６および＃２７；＝異なる形質転換事象）の種子子孫（＝Ｔ２世代）の群に連続して２回接種して、いずれの生存物もＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して耐性であったことを確認した。最初の接種では、４４２の植物のうちの１９２が耐性であった（＝４３％）。再接種の際：１９２の植物のうち１５０が耐性であった（＝７８％）。要するに、４４２の植物のうち１５０が耐性であった（＝３４％）。これらの１５０の耐性の植物のうちの全てをまたＧＵＳ活性についてアッセイして、陰性であることを見出した。
【０３９４】
タバコ植物による反応は図１１に示される。植物Ａは、野性型タバコ植物またはｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換されたものの代表的な反応を示す。この植物は、感受性であり、大きな茎病変があり、そして根系は本質的に破壊される。このような植物は通常、接種後５〜８日で死滅する。植物Ｂは、トランスジェニック株２６由来である（下を参照のこと）。これはｐＶＺＡ１００で形質転換された植物に代表的である。これは、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して極めて耐性であって、上部の根の先端上の小病変以外の症状は示さなかった。このような植物は成熟するまで成長して、稔性の種子をもうけた。
【０３９５】
ダイズにおけるｐＶＺＡ１００：
ダイズ植物にｐＶＺＡ１００を撃ち込んだ。適切なプライマーでのＰＣＲによって、撃ち込まれた３２の植物のうち１５がトランスジェニックであったことが実証された。トランスジェニック植物を培養して、種子を産生させ、そして種子植物をＰ．ｓｏｊａｅに対する耐性について試験した。図１３に示されるとおり、試験した４９５の種子植物のうち４３が、Ｐ．ｓｏｊａｅに対して耐性であって（図１３）、一方野性型およびｐＣＡＭＢＩＡ１２０１形質転換（すなわち「コントロールの形質転換（ｃｏｎｔｒｏｌ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」）植物の同様の数のうち１００％が死滅した。
【０３９６】
ジャガイモにおけるｐＶＺＡ１００
ジャガイモにｐＶＺＡ１００を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、１８の撃ち込まれた植物のうち１５がトランスジェニックであったことが実証された。トランスジェニック植物をＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対する耐性について試験した。これらの植物の１００％が、野性型またはコントロール形質転換された植物における０％の耐性に比較して抵抗性である。
【０３９７】
コーンにおけるｐＶＺＡＷ０
コーンにｐＶＺＡ１００を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、４４の撃ち込まれた植物のうち３３がトランスジェニックであったことが実証された。トランスジェニック植物を培養して種子を生成し、そして種子の植物をＰｙｔｈｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａに対する耐性について試験した。試験したＦ１植物の２５％が、野性型またはコントロール形質転換された植物における０％の耐性に比較して抵抗性である。
【０３９８】
上記の結果によって、本発明において有用な植物としては、単子葉植物および双子葉植物が挙げられることが実証される。
【０３９９】
同様に、コーンをｐＶＺＡ１００で形質転換して、試験して、ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａおよびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａに対する交差耐性を例証する。
【０４００】
ジャガイモにおけるｐＶＺＡ２００
ジャガイモにｐＶＺＡ２００（Ｍｙｚｖｉｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅのカテプシンＢ）を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、１２の撃ち込まれた植物のうち７がトランスジェニックであったことが実証された。トランスジェニック植物をアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）に対する耐性について試験した。このような植物のうち８０％が、コントロールまたは野性型の植物における０％と比較して、抵抗性である。
【０４０１】
形質転換された植物に対する供給後のアブラムシを検査する。本発明によるアブラムシでのカテプシンＢのサイレンシングは、植物を防御する（すなわち、植物に対するアブラムシ耐性を生じる）だけでなく、アブラムシ集団を減少もすることが確認される。
【０４０２】
本発明および本実施例によれば、昆虫の耐性は、カテプシンＢのような昆虫遺伝子を含むサイレンシング構築物での形質転換を通じて植物に付与される。
【０４０３】
ジャガイモにおけるｐＶＺＡ３００
Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ由来のカテプシンＢおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのエリシチンＤＮＥＦ１に対して相同で相補的なセンスおよびアンチセンス配列を含む構築物であるｐＶＺＡ３００をジャガイモに撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、１８の撃ち込まれた植物のうち１５がトランスジェニックであることが実証された。このようなトランスジェニック植物をアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）に対する、そしてＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対する耐性について試験する。
【０４０４】
１セットの実験では、形質転換されたジャガイモ植物の１群にはアブラムシのみをチャレンジし、そして１つの群にはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｒｉｆｅｓｔａｎｓのみをチャレンジする。
【０４０５】
アブラムシをチャレンジした植物については、試験したこのような植物のうち８０％が、野性型またはコントロールで形質転換した植物における０％の耐性と比較して、抵抗性である。
【０４０６】
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓをチャレンジした植物については、試験したこのような植物の７５％が、形質転換されていないかまたはコントロールの植物における０％の耐性に比較して耐性であった。
【０４０７】
別のセットの実験では、同様に形質転換されたジャガイモおよび形質転換されていないジャガイモ植物に、アブラムシおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓを同時にチャレンジする。試験したトランスジェニック植物のうち６０％は、野性型またはコントロールで形質転換した植物における０％の耐性に比較して両方の害虫に対して抵抗性である。
【０４０８】
形質転換された植物に対する供給後、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓを単離して培養する。このような培養物は、極めて緩徐に成長するかまたは死滅する。顕微鏡検査によって、菌糸が重度に奇形であることが明らかになる。
【０４０９】
さらに、本発明によるｒＲＮＡのサイレンシングはさらに、土壌中の病原集団が劇的に減少される実施形態を例証する。
【０４１０】
ダイズにおけるｐＶＺＡ３００
ダイズに、ｐＶＺＡ３００（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ由来のカテプシンＢおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのエリシチンＩＮＦ１に対して相同でかつ相補的なセンス配列およびアンチセンス配列を含む構築物）を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、撃ち込まれた植物のうち６０％がトランスジェニックであることが実証された。トランスジェニック植物を培養して種子を産生させ、そして種子植物を成長させる。このようなＦ１植物をアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）に対する、そしてＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅに対する耐性について試験する。
【０４１１】
１セットの実験では、形質転換されたダイズ植物の１群にはアブラムシのみをチャレンジし、そして１つの群にはＭｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅのみをチャレンジする。
【０４１２】
アブラムシをチャレンジした植物については、試験したＦ１植物のうち７０％が、野性型またはコントロールで形質転換した植物における０％の耐性と比較して、抵抗性である。
【０４１３】
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅをチャレンジした植物については、試験したＦ１植物の１５％が、野性型およびコントロールの形質転換された植物における０％の耐性に比較して耐性であった。
【０４１４】
別のセットの実験では、形質転換されたダイズおよび形質転換されていないダイズに、アムラムシおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅを同時にチャレンジする。試験したＦ１植物のうち１０％は、野性型またはコントロールで形質転換した植物における０％の耐性に比較して両方の害虫に対して抵抗性である。
【０４１５】
本発明およびこれらの実験に従って、昆虫耐性および真菌耐性が、複数の遺伝子を含む単一の異種ポリヌクレオチドによって（すなわち、遺伝子スタッキングによって）植物に（単子葉および双子葉種の両方に）付与される。さらに、驚くべきレベルの害虫耐性が、２つ以上の害虫由来の遺伝子をサイレンシングすることによって植物に付与される。
【０４１６】
形質転換された植物に対する供給後、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅを単離して培養する。このような培養物は、極めて緩徐に成長するかまたは死滅する。顕微鏡検査によって、菌糸が重度に奇形であることが明らかになる。
【０４１７】
ダイズにおけるｐＶＺＡ４００
ダイズ植物に、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのｒＲＮＡ遺伝子に対して相同でかつ相補的なアンチセンス配列およびセンス配列を含むｐＶＺＡ４００を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、１８の撃ち込まれた植物のうち１２がトランスジェニックであることが実証された。トランスジェニック植物を培養して種子を産生させ、そして種子植物をＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅに対する耐性について試験する。試験されるＦ１植物のうち１５％が、形質転換されていない植物またはコントロールのトランスジェニック植物における０％の耐性と比較して、抵抗性である。
【０４１８】
形質転換された植物に対する供給後、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅを単離して培養する。このような培養物は、極めて緩徐に成長するかまたは死滅する。顕微鏡検査によって、菌糸が重度に奇形であることが明らかになる。
【０４１９】
次に、野性型ダイズに、ｐＶＺＡ４００で形質転換した植物由来のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ培養物をチャレンジする。このようなＰ．ｓｏｊａｅ培養物は、野性型またはコントロール形質転換のダイズ由来であるｓｏｊａｅ培養物に比較して非病原性である。
【０４２０】
上記の結果によって、害虫（例えば、真菌）におけるｒＲＮＡのサイレンシングの有用性が実証され、そしてさらに、害虫病原性遺伝子が構築された害虫以外の害虫種に対する交差耐性が例証される。
【０４２１】
形質転換された植物に対する供給後、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅを単離して培養する。このような培養物は、極めて緩徐に成長するかまたは死滅する。顕微鏡検査によって、菌糸が重度に奇形であることが明らかになる。
【０４２２】
さらに、本発明によるｒＲＮＡのサイレンシングはさらに、土壌中の病原集団が劇的に減少される実施形態を例証する。
【０４２３】
ジャガイモにおけるｐＶＺＡ４００
ジャガイモに、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのｒＲＮＡ遺伝子に対して相同でかつ相補的なアンチセンスおよびセンス配列を含むｐＶＺＡ４００を撃ち込んだ。適切なプライマーを用いるＰＣＲによって、１２の撃ち込まれた植物のうち６つがトランスジェニックであることが実証された。トランスジェニック植物を培養して、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓに対する耐性について試験した。これらの植物を試験したところ、野性型またはコントロールの形質転換植物における０％の耐性と比較して、これらの植物のうち１００％で抵抗性が示された。
【０４２４】
形質転換された植物に対する供給後、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｃｔａｎｓを単離して培養する。このような培養物は、極めて緩徐に成長するかまたは死滅する。顕微鏡検査によって、菌糸が重度に奇形であることが明らかになる。
【０４２５】
上記の結果によって、害虫（例えば、真菌）に対する複数の植物における害虫耐性の付与におけるｒＲＮＡの単一のサイレンシング構築物の有用性が例証される。
【実施例２８】
【０４２６】
実施例２８．ジャガイモを、塊茎腐れ病に対して耐性にさせる（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ翻訳伸長因子１α）
ダイズ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ翻訳伸長因子１αのＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＪ５４３６０５、配列番号５１）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ジャガイモ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍの塊茎腐れに対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例２９】
【０４２７】
実施例２９．トマトを、疫病に対して耐性にさせる（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓエリシチン遺伝子）
トマト宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓのゲノムで見出されるエリシチン遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７６６２２８、配列番号５２）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。トマト植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓを接種した後、トマトの疫病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３０】
【０４２８】
実施例３０．アブラナを、菌核病（ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）に対して耐性にさせる（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍのＲＮＡポリメラーゼサブユニット）
アブラナ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの２番目に大きいサブユニットのＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ部分的ｒｐｂ２遺伝子、エキソン１、株４８４  １０９６ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＪ７４５７１６、配列番号５３）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。アブラナ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍを接種した後、菌核病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３１】
【０４２９】
実施例３１．ワタを、ワタ萎凋病（ｃｏｔｔｏｎ  ｗｉｌｔ）に対して耐性にさせる（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉのクチナーゼ相同体）
ワタ宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｆ．ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｋ０２６４０．１、配列番号４８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。この配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属内の遺伝子の相同性によって本明細書において拾い上げる。ワタ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｎｉｕｍを接種した後、ワタ萎凋病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３２】
【０４３０】
実施例３２．コーンを、マイコトキシンに対して耐性にさせる（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉのクチナーゼ）
コーン宿主細胞を、センスおよびアンチセンス配列が、Ｆ．ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｋ０２６４０．１、配列番号４８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。この配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属内の遺伝子の相同性によって本明細書において拾い上げる。コーン植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅを接種した後、マイコトキシンに対して増大した耐性について選択する。
【実施例３３】
【０４３１】
実施例３３．コーンを、茎腐れ病に対して耐性にさせる（Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓのｒＤＮＡ）
コーン宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓのｒＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ３３２４８９、配列番号５４）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。この配列は、ＳｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａおよびＦｕｓａｒｉｕｍ内の遺伝子の相同性によって本明細書において拾い上げる。コーン植物を、形質転換された細胞から生成して、属Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａ  ｍａｙｄｉｓおよびいくつかのＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．を接種した後、茎腐れ病に対して増大した耐性について選択する。
【実施例３４】
【０４３２】
実施例３４．コーンを、疫病に対して耐性にさせる（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓの１８ｓのｒＤＮＡ）
コーン宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓの第ＩＩ群由来の１８ＳリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＦ２９１７１０、配列番号５５）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。コーン植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｚｅａｅ−ｍａｙｄｉｓを接種した後、疫病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３５】
【０４３３】
実施例３５．ジャガイモを、モモアカアブラムシに対して耐性にさせる（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅのカテプシンＢプロテアーゼ）
ジャガイモ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ由来のカテプシンＢプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７０２８２２、配列番号５６）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ジャガイモ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅを接種した後、モモアカアブラムシに対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３６】
【０４３４】
実施例３６．ジャガイモをコロラドハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）に対して耐性にさせる（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａシステインプロテアーゼ）
ジャガイモ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ由来のシステインプロテアーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ１５９３７７、配列番号５１）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ジャガイモ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａを接種した後、コロラドハムシに対して付与された耐性について首尾よく選択する。このように再生されたジャガイモは、以下の各々に対する耐性の増大を実証する：Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｅｓ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇ−ｉｆｅｒａ、Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ、Ｔｏｘｏｐｔｅｒａ  ｃｉｔｒｉｃｉｄａ、Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｐａｎｄａｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ、Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ、Ｄｅｌｉａ  ｒａｄｉｃｕｍ、Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ、Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｚｅａｍａｉｓ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ、Ｈｙｐｅｒａ  ｐｏｓｔｉｃａ、Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、およびＨ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ。
【実施例３７】
【０４３５】
実施例３７．ジャガイモをバーティシリウム萎凋病（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｗｉｌｔ）に対して耐性にさせる（Ｖ．ｄａｈｌｉａｅのｒＤＮＡ）
ジャガイモ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅのｒＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＦ１０８４７８、配列番号５８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ジャガイモ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄａｈｌｉａｅを接種した後、バーティシリウム萎凋病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例３８】
【０４３６】
実施例３８．ダイズを、べと病に対して耐性にさせる（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｅのｒＤＮＡ）
ダイズ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｂｅｒｔｅｒｏａｅのゲノムに見出される５．８ＳのリボソームＲＮＡの内部転写されたスペーサー１部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ５３１４５０、配列番号５９）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ダイズ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍａｎｃｈｕｒ−ｉｃａを接種した後、べと病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。このように選択されたダイズはまた、Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ種（例えば、Ｈ．ｃａｍｅｌｉｎａｅ、Ｈ．ｎｉｅｓｓｌｅａｎａ、Ｈ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ、およびＨ．ｔｈｌａｓｐｅｏｓ−ｐｅｒｆｏｌｉａｔｉ）およびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ種（例えば、Ｐ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｄｉｓ、Ｐ．ａｒａｂｉｓ−ａｌｐｉｎａｅ、Ｐ．ｂｕｎｉａｄｉｓ、Ｐ．ｃａｒｄａｍｉｎｏｐｓｉｄｉｓ、Ｐ．ｃｏｃｈｌｅｃｚｒｉａｅ、Ｐ．ｄｅｎｔａｒｉａｅ、Ｐ．ｇａｌｌｉｇｅｎａ、Ｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｓ、Ｐ．ｉｂｅｒｉｄｉｓ、Ｐ．ｉｓａｔｉｄｉｓ、Ｐ．ｎｅｓｌｅａｅ、Ｐ．ｓｉｓｙｍｂｒｉｉ−ｌｏｅｓｅｌｉｉ、Ｐ．ｓｉｓｙｍｂｒｉｉ−ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｐ．ｓｉｓｙｍｂｒｉｉ−ｓｏｐｈｉａｅ、Ｐ．ｔｈｌａｓｐｅｏｓ−ａｌｐｅｓｔｒｉｓ、およびＰ．ｔｈｌａｓｐｅｏｓ−ｕｉｖｅｎｓｉｓ）に対する耐性の増大を有する。
【実施例３９】
【０４３７】
実施例３９．ジャガイモを、ジャガイモ根こぶ線虫（ｐｏｔａｔｏ  ｒｏｏｔ  ｋｎｏｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）に対して耐性にさせる（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｃｈｉｔｗｏｏｄｉのチトクロームオキシダーゼＨ）
ジャガイモ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｃｈｉｔｗｏｏｄｉのゲノムに見出される配列（すなわち、チトクロームオキシダーゼサブユニット遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ７５７８８２、配列番号６０）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。ジャガイモ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｃｈｉｔｗｏｏｄｉを接種した後、ジャガイモ根こぶに対して付与された耐性について首尾よく選択する。このように選択されたジャガイモ植物はまた、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｃｈｉｌｏ  ｔｖｉｍｉｄｉｃｏｓｔａｌｉｓ、Ｈｅｍｉｌｅｕｃａ、Ｈｙｄｒｏｔａｅａ  ａｅｎｅｓｃｅｎｓ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｈａｐｌａ、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｐａｒｔｉｔｙｌａ、Ｏｅｃｅｔｉｓ  ａｖａｒａ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ａｅｇｅｕｓ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｄｅｍｏｌｅｕｓ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｅｒｉｔｈｏｎｉｏｉｄｅｓ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｈｉｐｐｏｎｏｕｓ、Ｚ−’ａｐｉｌｉｏ  ｏｒｉｈａｚｕｓ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｐｒｏｔｅｎｏｒ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｔｒｏｉｌｕｓ、Ｐａｐｉｌｉｏ  ｘｕｔｈｕｓ、Ｓａｂｅｔｈｅｓ  ｃｙａｎｅｕｓ、およびＳａｒｎｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉに対して耐性であることが見出される。
【実施例４０】
【０４３８】
実施例４０．ダイズを線虫感染に対して耐性にさせる（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｎｓ  ｓｃｒｉｂｎｅｒｉおよびＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓのリボソームＲＮＡ遺伝子）
本発明は、さらなる線虫に対する耐性の増大を有する宿主植物を生成するために用いられ得る。公知であってかつＮＣＢＩ／ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋのような公的なデータベースにおいて検索可能である線虫のポリヌクレオチド配列は、種々の線虫の属のなかでも保存されたヌクレオチドモチーフを示す。保存されたヌクレオチドモチーフによって、これらの配列は、生存度および／または寄生虫感染に関連しており、そしてＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ（根こぶ線虫）ならびにＧｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧｌｏｂｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄｓ（ジャガイモ・シスト線虫（ｐｏｔａｔｏ  ｃｙｓｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ））の両方で、そしてまたよく研究されたＨｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓおよびＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓにおいても機能的に保存されかつ発現される。従って、これらの配列およびその改変体の使用は有利である。なぜなら、このようなＲＮＡｉは、広範なＲＮＡｉ特異性を有するように設計することができ、従って、植物において多数の植物寄生線虫を防除するために有用であるからである。本明細書において同定された遺伝子は、線虫の生存および／または寄生虫感染に関連するので、これらの遺伝子のＲＮＡｉ阻害（例えば、本明細書において教示されたように形質転換された植物に線虫を与えることを可能にすることによるなどの、ＲＮＡｉ分子を含む組成物と線虫とを接触させることから生じる）は、寄生性の線虫の成長、発達および／または寄生虫感染を予防および／または軽減する。
【０４３９】
線虫の供与は、本発明の方法の有効性の有用な指標である。Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｃｒｉｂｎｅｒｉのインビトロの供給アッセイは、コーンの根の浸出液を、供与の刺激として、そして赤い色素アマランス、またはヒ酸カリウムの両方を供与の指標として用いる。供与は、アマランス（Ａｍａｒａｎｔｈ）に曝された生きたぜん虫の赤く染色された腸細胞の存在、またはヒ酸塩に曝されたぜん虫の死によって数日後に確認する。Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉは、コーン、コメおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの野性型の根で、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒ−ｈｉｚｏｇｅｎｅｓ誘導性のサトウダイコンおよびトマトの毛状根で培養され得る。Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉは、これらのぜん虫の非特異的な供給のおかげで、トランスジェニックの毛状根を評価するのに極めて有用である（理想的には、形質転換ベクターとして当該分野で公知のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ株の使用によって開発される）。
【０４４０】
コーン、コメ、トマトおよびサトウダイコンを、Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉのリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座、配列番号６１）の相補的なセンス配列およびアンチセンス配列を含む異種ポリヌクレオチドで形質転換する。Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉを、形質転換された、および野性型のコーン、コメ、トマトおよびサトウダイコンを用いて供給アッセイで試験する。形質転換された植物は、Ｐ．ｓｃｒｉｂｎｅｒｉに対して耐性の増大を示す。
【０４４１】
ダイズを、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓのリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ６６７４５６、配列番号６２）の相補的なセンス配列およびアンチセンス配列を含む異種ポリヌクレオチドで形質転換する。Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓを、形質転換された、および野性型のダイズを用いて供給アッセイで試験する。形質転換されたダイズは、Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓに対して耐性の増大を示す。
【実施例４１】
【０４４２】
実施例４１．種々の植物を種々のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．による感染に対して耐性にさせる（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅクチナーゼ）
１実施形態では、ｐＶＺＡ１００異種ポリヌクレオチド（実施例３）を用いて、種々の植物を形質転換して、種々のＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ種に対して耐性を付与する。例えば、耐性は、Ｃｈｒｙｓａｌｉｄｏｃａｒｐｕｓ  ｐａｌｍ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ、ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、インパチェンス、セージ、スパティフィルムまたはタマネギのいずれかを、ｐＶＺＡ１００（配列番号５）で形質転換する場合に、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．誘導性の葉および茎の感染に対して付与される。耐性は、ポインセチア、トマト、パイナップルまたはアンスリウムのいずれかをｐＶＺＡ１００で形質転換するとき、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．誘導性の根腐れに対して付与される。
【０４４３】
耐性は、スイカ、プロテア（ｐｒｏｔｅａ）またはアフリカスミレ（Ａｆｒｉｃａｎ  ｖｉｏｌｅｔ）のいずれかをｐＶＺＡ１００で形質転換するとき、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．誘導性の花の冠および輪の腐（ｃｒｏｗｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｒ  ｒｏｔｓ）に対して付与される。
【０４４４】
耐性は、トマト、パパイヤまたはナスのいずれかを、ｐＶＺＡ１００で形質転換するとき、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐｐ．誘導性の果実腐敗に対して付与される。
【実施例４２】
【０４４５】
実施例４２．アガーベを、アガーベ根腐れ病（Ａｇａｖｅ  ｒｏｏｔ  ｒｏｔ）に対して耐性にさせる（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉのクチナーゼ）
アガーベ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｐｉｓｉ由来のクチナーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｋ０２６４０．１、配列番号４８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。この配列は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属内の遺伝子の相同性によって本明細書において拾い上げる。アガーベ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍを接種した後、アガーベ腐れ病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例４３】
【０４４６】
実施例４３．コメを胴枯れ病に対して耐性にする（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａのＲＮＡポリメラーゼＩＩ）
コメ宿主細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａＲＮＡポリメラーゼＩＩ配列（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＸＭ３６２２６８、配列番号６３）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｉｔｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの電気泳動によって達成した。コメ植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａを接種した後、コメ胴枯れ病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例４４】
【０４４７】
実施例４４．種々の植物を、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ誘導性の根の病気に対して耐性にさせる（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｔｒｉｃｏｌａのクチナーゼ）
Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ（例えば、Ｒｈ．ｃａｔａｗｂｉｅｎｓｅ、Ｒｈ．ｓｉｍｓｉｉ、Ｒｈ．Ｃａｔａｗｂｉｅｎｓｅ）、Ｅｒｉｃａ  ｓｐ．、Ｃａｌｌｕｎａ  ｓｐ．、アボカドの木、柑橘類の木、およびホップ由来の細胞を含む種々の植物細胞を、異種のポリヌクレオチドｐＶＺＡ１００で形質転換する（実施例３）。この構築物は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ配列番号１４とＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｔｒｉｃｏｌａ配列番号３４との間の相同性によって選択した。宿主植物を形質転換した細胞から生成して、疾患に対して付与された耐性についてＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｔｒｉｃｏｌａの接種後に首尾よく選択する。
【実施例４５】
【０４４８】
実施例４５．オオムギを葉さび病に対して耐性にさせる（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉの１８ＳリボソームＲＮＡ）
オオムギの細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉの１８ＳのｒＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ１２５４１２、配列番号６４）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｈｏｒｄｅｉを接種した後、オオムギ葉さび病に対して付与された耐性について首尾よく選択する。
【実施例４６】
【０４４９】
実施例４６．オオムギをべと病に対して耐性にさせる（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉ  ｒＤＮＡ）
オオムギ細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉの単離物ＨＶ  １４８内部転写スペーサー１、部分配列；５．８ＳリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ１９８３０５、配列番号６５）由来の配列に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、べと病に対して付与された耐性について、Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｈｕｍｕｌｉを接種した後、首尾よく選択する。
【実施例４７】
【０４５０】
実施例４７．オオムギを灰色かび病に対して耐性にさせる（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａのチトクロームｐ４５０モノオキシゲナーゼ）
オオムギ細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａのチトクロームｐ４５０モノオキシゲナーゼのａｂｄｌ遺伝子、エキソン１〜５（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＪ８５１０８８、配列番号６６）由来の配列に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、灰色かび病に対して付与された耐性について、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａを接種した後、首尾よく選択する。
【実施例４８】
【０４５１】
実施例４８．トマトをトマト斑点病（ｓｐｅｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）に対して耐性にさせる（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓＴｒｉｎｇａｅのｒＤＮＡ
トマト細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅのリボソームＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ３４２２１０、配列番号６７）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、トマト斑点病に対して付与された耐性について、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅを接種した後、首尾よく選択する。
【実施例４９】
【０４５２】
実施例４９．トマトを青枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｗｉｌｔ）に対して耐性にさせる（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅのＣｅＩ  Ａ遺伝子
トマト細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ＣｅＩ  Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座ＡＹ００７３１１、配列番号６８）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、青枯病に対して付与された耐性について、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅを接種した後、首尾よく選択する。
【実施例５０】
【０４５３】
実施例５０．コーンをゴス（Ｇｏｓｓ）の青枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｗｉｌｔ）および胴枯れ病Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ  エンドβグルコシダーゼ遺伝子に対して耐性にさせる
コーン細胞を、センス配列およびアンチセンス配列が、エンドβグルコシダーゼのＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座Ｘ６２５８２、配列番号６９）に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換する。宿主植物を、形質転換された細胞から生成して、ゴス青枯病および胴枯れ病（葉の斑点および立ち枯れ病）に対して付与された耐性について、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅを接種した後、首尾よく選択する。
【実施例５１】
【０４５４】
実施例５１．１つ以上の真菌病に対してダイズを防御するサイレンシング構築物方法
ダイズ植物細胞を、図１０の遺伝子サイレンシング構築物のいずれかで形質転換して、それから成熟植物を生成する。成熟植物を２つの主な真菌病、すなわち、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅによって生じるダイズ根茎腐病、およびＰｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉによって生じるダイズのアジア・サビ病に対する耐性についてスクリーニングする。これらの２つの疾病のいずれかに対して、そして両方に対して耐性である植物を同定する。上の構築物で形質転換された植物は、ダイズの根茎腐病に対して耐性である。真ん中の構築物で形質転換された植物は、ダイズのアジアサビ病に対して耐性である。下の構築物で形質転換された植物は、ダイズの根茎腐病およびダイズのアジア・さび病の両方に耐性である。
【実施例５２】
【０４５５】
実施例５２．３つの真菌病に対してダイズを防御する多シストロン性サイレンシング構築物方法
ダイズ宿主植物細胞を、図９の多シストロン性遺伝子サイレンシング構築物で形質転換して、それから成熟植物を生成する。成熟植物を３つの主な真菌病、すなわち、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅによって生じるダイズ根茎腐病、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ  ｆ．ｓｐ．ｇｌｙｃｉｎｅｓによって生じるダイズ急性枯死症、およびＰｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉによって生じるダイズのアジア・サビ病に対する耐性についてスクリーニングする。これらの３つの疾病のいずれかに対して、そして３つ全てに対して耐性である植物を同定する。
【実施例５３】
【０４５６】
実施例５３．トランスジェニック植物に対する供給による、またはｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ３００もしくはｐＶＺＡ４００による直接形質転換による、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｉｏｒａ種の病原性除去
タバコ宿主細胞を、サイレンシング構築物ｐＶＺＡ１００（配列番号５）で形質転換して、それから成熟植物を生成する。このような形質転換された植物は、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して極めて耐性であった。タバコ植物による代表的な反応を図１１に示す。植物Ａは、野性型タバコ植物の、またはｐＣＡＭＢＩＡ１２０１で形質転換された植物の代表的な反応を示す。この植物は、感受性であって、大きな茎の病変があり、根系は本質的に破壊される。このような植物は通常、接種の５〜８日後に枯死する。植物Ｂは、トランスジェニック株２６由来である（下を参照のこと）。これはｐＶＺＡ１００で形質転換された植物に代表的である。これは、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して極めて耐性であって、根の上部の先端に対する小さい病変以外の症状は示さない。このような植物を成熟するまで成長させて、繁殖性の種子をもうける。
【０４５７】
Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅを、耐性植物上の限られた病変から再単離して、野性型植物で再試験した場合、これはもはや病原性ではなかった。実施例１４において上記されるような、この真菌からのＲＮＡの単離および放射性のクチナーゼプローブとのハイブリダイゼーションによって、Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅにおけるクチナーゼ遺伝子についてｓｉＲＮＡの存在が示され、これによって病原性の消失が説明される。図１２では、レーン１はここでも、分子サイズコントロールとして働く３５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドＶＺＡ  ３Ｆ（配列番号３）およびＶＺＡ  ４Ｒ（配列番号４）を示し、レーン２は、野性型真菌由来の６２０ヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡを示し、レーン３は、サイレンシングされたタバコ植物由来のｓｉＲＮＡを示し、そしてレーン４は、耐性のトランスジェニックタバコから単離された非病原性真菌由来のｓｉＲＮＡを示す。
【０４５８】
実施例１３に示されるとおり、サイレンシング構築物で直接害虫の種を形質転換すること、またはサイレンシング構築物で形質転換された植物に害虫種を供給することによって、害虫（この実施例では真菌）の病原性、成長および生存に対する大きな影響があった。これらの結果によって、害虫に対する作物の損失を最小化して、農業生産性を増強するための、本発明のこの実施形態の有用性が直接または間接的に支持される。
【実施例５４】
【０４５９】
実施例５４．病原性除去：クチナーゼサイレンシング異種ポリヌクレオチドで形質転換したスイカ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｃｔｉｔｉｉｉａｓｅ）
フロリダ州およびジョージア州では、スイカは、１年間しか圃場で作付けできない。次に、農業従事者は、その圃場を再度使うには６年または７年待たなければならない。なぜなら、単年の使用でもＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍの病原性単離物の高度な構築が生じるからである。ある圃場を連続年で使用するには、農業従事者は、臭化メチルまたは他の強力な化合物を用いる、高価でかつ厳格な毎年の処理を行わなければならない。
【０４６０】
スイカは、センス配列およびアンチセンス配列が、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍにおけるクチナーゼ遺伝子に相当する以外は、ｐＶＺＡ１００（実施例３）と同様の異種ポリヌクレオチドで形質転換された宿主植物細胞から再生する。Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍは、スイカに感染し、そしてＦ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍクチナーゼ遺伝子がサイレンシングされる。他のスイカ種（本発明で形質転換されていない）を、再生された（トランスジェニック）スイカの６フィート内に植え付ける。このような他のスイカ種は、それに隣接する再生された（トランスジェニック）スイカの栽培についてでない場合、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍによる感染は予想されるよりも低い程度までである。
【実施例５５】
【０４６１】
実施例５５．リボソームＲＮＡサイレンシング異種ポリヌクレオチドでの広範にわたる植物耐性および病原性除去
場合により、病原性除去を効率的に実現するため、病原性の真菌のいくつかの種に対する広範にわたるかまたは交差した一般的防御を得ることができる。これは、リボソーム
ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を含むサイレンシング構築物を利用することによって達成され得る。真菌の病原因子のｒＤＮＡ配列は同様に、密接に関連する真菌種の制御において十分に機能するが、真菌の群の間での分化を可能にするのには十分に異なっており、これによって、単一または複数の多シストロン性の遺伝子サイレンシング構築物で真菌病原性の特定の群の選択的な標的が可能になる。
【０４６２】
このアプローチは、表１３に例示される。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅおよびＰｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの１８ＳのｒＤＮＡを、ＮＣＢＩ／ＮＩＨ  ＧｅｎＢａｎｋにおけるデータに対して「ブラストし（ｂｌａｓｔｅｄ）」た。Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅの配列は、１６のさらなる密接に関連する真菌種の配列に対して高いな相同性（１００〜９３％）を示したが、これは、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの配列に対して有意な相同性を示さなかった。逆に、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉの１８Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、１９のさらなる密接に関連する真菌種の配列に対して高いな相同性（１００〜９３％）を示したが、これはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅの配列に対しては有意な相同性を示さなかった。従って、個々の遺伝子サイレンシング構築物は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅに対して、またはＰｈａｋｏｐｓｏｒａ  ｐａｃｈｙｒｈｉｚｉに対して関連する真菌の群を防除するように、本明細書における教示に従って開発されてもよいし、あるいはポリシストロニック遺伝子サイレンシング構築物が、同時に両方の群を防除するように開発されてもよい。
【０４６３】
【表２１】
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【実施例５６】
【０４６４】
複数のサイレンシング異種ポリヌクレオチドを用いる複数の植物害虫の防除
植物はしばしば複数の害虫に攻撃される。場合により、同じ植物でいくつかの害虫を防除することが有用であり得る。複数の害虫を防除するための遺伝子スタッキングの方法および有用な遺伝子配列（例えば、リボソームＲＮＡ、クチナーゼ、カテプシン、および他の必須の酵素およびタンパク質をコードする遺伝子）が本明細書において教示される。非限定的な例は、ダイズおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの根茎腐病、アジア・さび病、ダイズ・シスト線虫、急性枯死症およびアブラムシの同時防除である。この目的のためのスタッキングされた例示的な遺伝子としては、Ｐｙｔｏｐｈｔｈｏｒａの根茎腐病の配列番号１４、アジア・さび病の配列番号５０、ダイズ・シスト線虫の配列番号６２、急性枯死症の配列番号４８、およびアブラムシの配列番号５６が挙げられる。
【０４６５】
同様に、コーンを、根茎腐病、マイコトキシン、葉枯れ病、柄および穂の穿孔動物、アブラムシおよび線虫に対して耐性にし得る。同様に、ワタを、さく腐病（ｂｏｌｌ  ｒｏｔ）、ＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍおよびＦｕｓａｒｉｕｍの立ち枯れ病、苗の胴枯れ病、立ち枯れ病（ｄａｍｐｉｎｇ  ｏｆｆ）、メキシコワタノミゾウムシ（ｂｏｌｌ  ｗｅｅｖｉｌ）、ワタキバガの幼虫（ｂｏｌｌｗｏｒｍｓ）、アブラムシ、およびシャクトリムシ（ｌｏｏｐｅｒｓ）に対して耐性にし得る。同様に、アブラナは、根朽ち病、菌核病、黒斑病、立ち枯れ病（ｄａｍｐｉｎｇ  ｏｆｆ）、および苗の胴枯れ病、ノミトビ甲虫（ｆｌｅａ  ｂｅｅｔｌｅｓ）、ゾウムシおよびアブラムシに対して耐性にされ得る。
【０４６６】
同様に、コムギは、葉および茎のさび病、頭部胴枯れ病（ｈｅａｄ  ｂｌｉｇｈｔ）、Ｓｅｐｔｏｒｉａ斑点（ｂｌｏｔｃｈｅｓ）、立ち枯れ病（ｔａｋｅ−ａｌｌ）、黒穂病、粉状および綿毛状のうどん粉病、アブラムシおよび線虫に対して耐性にされ得る。同様に、トマトは、疫病（ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｌｉｔ）、炭疽病、灰色かび病、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ萎凋病（ｗｉｌｔ）、線虫およびアブラムシに対して耐性にされ得る。同様に、ジャガイモは、疫病、夏疫病（ｅａｒｌｙ  ｂｌｉｇｈｔ）、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ萎凋病、線虫、コロラドハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｐｏｔａｔｏ  ｂｅｅｔｌｅ）およびアブラムシに対して耐性にされ得る。
【０４６７】
本明細書に引用される全ての引用文献は、それらが本明細書における明白な教示と矛盾しない程度まで、それらが教示する全てについて、そして全ての目的のために本明細書において参照によって援用される。本発明は、その詳細な説明と組み合わせて記載されているが、前述の説明は、例示を意図するものであって、添付の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【０４６８】
配列表は参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０４６９】
【図１】図１は、本教示全体にわたって例として用いられ、ｐＶＺＡ１００、ｐＶＺＡ２００、ｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００の骨格である、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１植物形質転換プラスミドの遺伝子マップである。
【図２】図２は、中間のプラスミドｐＶＺＡ１におけるインサートの図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＶＺＡ３にクローニングされ、ｐＣＡＭＢＩＡ１２０１にいつでも移入できる状態の、ｐＶＺＡ１００サイレンシングカセットである。
【図４】図４は、トランスジェニックタバコから、そしてトランスジェニックＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅから単離されたｓｉＲＮＡを示すオートラジオグラフである。図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、野性型およびトランスジェニックのタバコ植物およびＰ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ由来のｓｉＲＮＡに対するクチナーゼ遺伝子プローブのハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図５】図５は、温室でＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｔａｂａｃｉｎａによって生じたタバコのアオカビ病の自然な流行に対する植物の反応を示す。
【図６】図６は、トランスジェニックダイズ胚から出現した苗条を示す。
【図７】図７は、ｐＶＺＡ１００で形質転換されたダイズの結果を示す。図７Ａは、形質転換されたダイズのカルスを示す。図７Ｂは、形質転換されたダイズのカルスで検出されたＧＵＳおよびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を示す。
【図８】図８は、ｐＶＺＡ１００を用いて形質転換されたジャガイモ細胞の培養プレートにおいて生成された根および微小塊茎（ｍｉｎｉｔｕｂｅｒ）を示す。
【図９】図９は、ダイズの重篤な病を生じる３つの真菌の種における必須の遺伝子をサイレンシングし得る多シストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の遺伝子サイレンシング構築物を示す。
【図１０】図１０は、ｒＤＮＡに基づき、かつＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａにおいて、Ｐｈａｋｏｐｓｏｒａにおいて、そして両方の種においてこれらの必須の遺伝子をサイレンシングし得る遺伝子サイレンシング構築物を示す。
【図１１】図１１は、それぞれＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅに対して感受性および耐性である、野性型のタバコ植物（Ａ）およびｐＶＺＡ１００トランスジェニックタバコ植物（Ｂ）を示す。
【図１２】図１２は、トランスジェニックタバコ植物（３）から、そしてサイレンシングされたトランスジェニックタバコ植物（４）で成長しているＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅから単離されたｓｉＲＮＡを示すオートラジオグラフである。
【図１３】図１３は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅに対して耐性であるトランスジェニックダイズ植物を示す。
【図１４】図１４は、トランスジェニックのＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅおよびＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅの成長および発達に対するｐＶＺＡ３００およびｐＶＺＡ４００の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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