(57)【要約】  ある種の天然のｍＲＮＡが代謝産物に感受性のある遺伝子スイッチとして役立つことが発見され、ここでＲＮＡは、小さい有機分子に直接的に結合する。この結合過程は、ｍＲＮＡの立体構造を変化させ、種々の異なる機構によって遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然の「リボスイッチ」の修飾したバージョン（様々な核酸の遺伝子操作戦略を用いることによって作製される）が、特定のエフェクター成分によって制御されるデザイナー遺伝的スイッチとして使用することができる。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、誘因分子として本明細書中に言及される。天然のスイッチは、抗体及び他の小分子療法のための標的である。さらに、リボスイッチの構築物は、天然のスイッチの現実の部分が新規な非免疫原性遺伝的制御エレメントを構築するために使用されるようにし、例えばアプタマー（分子認識）ドメインは、新規な認識ドメインが使用者定義のエフェクター化合物を用いて遺伝的変化を引き起こすように他の非天然のアプタマー（又は他に修飾される）と交換される。変化したスイッチは、治療の処方の部分となり、タンパク質合成を開始し、終了させ又は制御する。新規に構築した遺伝子制御ネットワークは、このような領域で、生きたバイオセンサー、生物の代謝的遺伝子操作、及び遺伝子治療の処方の有利な形態で適用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーディング領域に実施可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結したグリシン応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む制御可能な遺伝子発現構築物であって、ここで、リボスイッチが前記ＲＮＡの発現を制御し、リボスイッチ及びコーディング領域が異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）である、前記構築物。
【請求項２】
リボスイッチがアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、ここで、アプタマードメイン及びプラットフォームドメインが異種である、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
リボスイッチがアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、ここで、アプタマードメインがＰ１ステムを含み、ここで、前記Ｐ１ステムがアプタマー鎖及び調節鎖を含み、発現プラットフォームドメインが制御鎖を含み、ここで、制御鎖、調節鎖又はその両方がステム構造を形成するように設計されている、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
リボスイッチが２つ以上のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、ここで、少なくとも１つのアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインが異種である、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
少なくとも２つのアプタマードメインが協同的結合を提示する、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
リボスイッチが２つ以上のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、ここで、少なくとも１つのアプタマードメインがＰ１ステムを含み、ここで、前記Ｐ１ステムがアプタマー鎖及び調節鎖を含み、前記発現プラットフォームドメインが制御鎖を含み、ここで、制御鎖、調節鎖又はその両方がステム構造を形成するように設計されている、請求項１に記載の構築物。
【請求項７】
少なくとも２つのアプタマードメインが協同的結合を提示する、請求項６に記載の構築物。
【請求項８】
天然に発生するグリシン応答性リボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチ。
【請求項９】
アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含むリボスイッチであって、前記アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインが異種である、請求項８に記載のリボスイッチ。
【請求項１０】
１つ以上の追加のアプタマードメインをさらに含む、請求項９に記載のリボスイッチ。
【請求項１１】
少なくとも２つのアプタマードメインが協同的結合を提示する、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
誘因（ｔｒｉｇｇｅｒ）分子によって活性化されるリボスイッチであって、前記誘因分子によって活性化された場合にシグナルを産生する、請求項８に記載のリボスイッチ。
【請求項１３】
試料をリボスイッチと接触させることを含む関心のある化合物を検出する方法であって、ここで、リボスイッチが関心のある化合物によって活性化され、関心のある化合物によって活性化された場合にシグナルを産生し、試料が関心のある化合物を含有する場合にリボスイッチはシグナルを産生し、ここで、リボスイッチがグリシン応答性リボスイッチ又はグリシン応答性リボスイッチの誘導体を含む、前記方法。
【請求項１４】
リボスイッチが関心のある化合物によって活性化された場合に立体構造を変化させ、ここで、前記立体構造の変化が立体構造に依存したラベルを介してシグナルを産生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リボスイッチが関心のある化合物によって活性化された場合に立体構造を変化させ、前記立体構造の変化がリボスイッチに連結したＲＮＡ発現の変化を引き起こし、この発現の変化がシグナルを産生する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
シグナルがリボスイッチに連結したＲＮＡから発現するレポータータンパク質によって産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リボスイッチが２以上のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、ここで、少なくとも１つのアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインが異種である、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１８】
少なくとも２つのアプタマードメインが協同的結合を提示する、請求項１７に記載の構築物。
【請求項１９】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現の阻害に関して化合物を試験し、ここで、前記阻害がリボスイッチを介し、リボスイッチがグリシン応答性リボスイッチ又はグリシン応答性リボスイッチの誘導体を含み、
（ｂ）細胞を工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物と接触させることによって遺伝子発現を阻害する
ことを含む方法であって、ここで、前記細胞がリボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子発現を含み、前記化合物がリボスイッチへの結合によって該遺伝子発現を阻害する、前記方法。
【請求項２０】
グリシン応答性リボスイッチを同定する方法であって、グリシンの有無においてＲＮＡ分子の直列的な自然発生の開裂を評価し、該ＲＮＡ分子が該化合物によって制御された遺伝子によってコードされ、ここで、ＲＮＡ分子の直列的な自然発生の開裂のパターン変化がリボスイッチを指示する、前記方法。
【請求項２１】
遺伝子発現を活性化する方法であって、化合物と細胞とを接触させることを含み、ここで、前記化合物が、構造：
【化１】
2008515436.tif 000006
（式中、Ｌはリンカーであり、Ｘは部分であり、及びｎは１〜１０の整数である）
を有し、ここで、化合物はグリシンでなく、細胞はグリシン応答性リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、ここで、前記化合物は、グリシン応答性リボスイッチに結合することによって該遺伝子発現を活性化する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年１０月７日に出願された米国仮出願第６０／６１７，３０９号の利益を請求する。２００４年１０月７日に出願された米国仮出願第６０／６１７，３０９号は、参照により全体として本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による支援の研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成ＮＩＨ１０２４１９７−１−Ａ０５２７４−−６１５００２、及び国立科学財団によって授与された助成１０２４３５１−１−Ｄ０１０８４−−６１５００２における政府支援によってなされた。政府は、発明のある種の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
開示された発明は、一般的に、遺伝子発現の分野、具体的には、遺伝子発現の制御の領域である。
【背景技術】
【０００４】
正確な遺伝子調節は、生体系の本質的な特徴であり、それは、細胞が遺伝的発現パターンの変化による多数の生化学的シグナル及び環境合図に応答するに違いないからである。最も良く知られた遺伝的調節のメカニズムは、化学的又は物理的刺激を感知し、次に、関連するＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ配列と選択的に相互作用することによる遺伝子発現を調節するタンパク質因子の使用に関与する。タンパク質は、複雑な形状を採用し、生体系がそれらの化学的及び物理的環境を正確に感知することを可能にする種々の機能を実行することができる。代謝産物に応答するタンパク質因子は、典型的には、ＤＮＡに結合して転写開始を調節することによって（例えば、ｌａｃ抑制タンパク質；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｓ．，及びＮｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｃ．，１９９８、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８，１２７−１６４）、又はＲＮＡに結合して転写終結（例えば、ＰｙｒＲタンパク質；Ｓｗｉｔｚｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９９、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２，３２９−３６７）又は翻訳（例えば、ＴＲＡＰタンパク質；Ｂａｂｉｔｚｋｅ，Ｐ．，及びＧｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．，２００１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，５７９５−５８０２）のいずれかを調節することによって作用する。タンパク質因子は、アロステリック調節又は翻訳後の調節のような種々のメカニズムによる環境刺激に応答し、非常に応答性の遺伝的スイッチとして役立つこれらのメカニズムを生かすことに精通している（例えば、Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，及びＧａｎｎ，Ａ．（２００２）を参照されたい。遺伝子及びシグナル（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。
【０００５】
遺伝的調節におけるタンパク質因子の広範囲の関与に加えて、ＲＮＡが、遺伝的制御において積極的な役割を果たし得ることも知られている。最近の研究は、小さい非コーディングＲＮＡが破壊のためにｍＲＮＡを選択的に標的とし、遺伝子発現の下方制御の原因となる実質的な役割を示し始めている（Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．２００２，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２４４−２５１及び本明細書中の参考文献を参照されたい）。ＲＮＡ干渉のこの過程は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基相補性を介して選択的に意図されたｍＲＮＡ標的を認識し、その後、結合したｍＲＮＡがタンパク質の作用によって破壊される小ＲＮＡの能力を利用する。ＲＮＡは、この系において分子認識の理想的な試薬であり、それは、新規であるが非常に特異的なＲＮＡ結合部位を有するタンパク質因子を発生するに違いないであろう進化過程を通して新規な標的−特異的ＲＮＡ因子を発生することは非常に容易であるためである。
【０００６】
タンパク質は、酵素、受容体、及び構造機能に関して生物学が有する大部分の要求を満たすが、ＲＮＡもまたこれらの能力に役立ち得る。例えば、ＲＮＡは、かなりの酵素力及び正確な分子認識を提示する無数のリボザイムドメイン（Ｃｅｃｈ＆Ｇｏｌｄｅｎ、ＲＮのみを用いた触媒活性部位の構築（Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｌｙ  ＲＮＡ）Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ編集、ｐｐ．３２１−３５０（１９９８）；Ｂｒｅａｋｅｒ、触媒性ポリヌクレオチドのインビトロ選択（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７．３７１−３９０（１９９７））及び受容体ドメイン（Ｏｓｂｏｒｎｅ＆Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、核酸選択及びコンビナトリアル化学の挑戦（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７，３４９−３７０（１９９７）；Ｈｅｒｍａｎｎ＆Ｐａｔｅｌ、核酸アプタマーによる適応認識（Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ）。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，８２０−８２５（２０００））を形成するために十分な構造的柔軟性を有する。さらに、これらの活性物は、エフェクター分子によって選択的に調節されるアロステリック・リボザイムを作り出すために組み合わせることができる（Ｓｏｕｋｕｐ＆Ｂｒｅａｋｅｒ、精密なＲＮＡ分子スイッチの遺伝子操作（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，３５８４−３５８９（１９９９）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎら、複雑な化学的及び生物学的混合物の合成のための固相されたリボスイッチ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，３３６−３４１（２００１））。
【０００７】
ＲＮＡのこれらの特性は、ある種のｍＲＮＡが、特異的な代謝産物の存在に対する遺伝的制御応答を提供するアロステリック・メカニズムを採用し得るという推測（Ｇｏｌｄら、オリゴヌクレオチドの形状からゲノムＳＥＬＥＸまで：新規な生物学的制御ループ（Ｆｒｏｍ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｈａｐｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＳＥＬＥＸ：ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｏｐｓ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，５９−６４（１９９７）；Ｇｏｌｄら、ＳＥＬＥＸ及びゲノムの進化（ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅｓ）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．７，８４８−８５１（１９９７）；Ｎｏｕ＆Ｋａｄｎｅｒ，アデノシルコバラミンはｂｔｕＢ  ＲＮＡに結合するリボソームを阻害する（Ａｄｅｎｏｓｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｂｔｕＢ  ＲＮＡ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、７１９０−７１９５（２０００）；Ｇｅｌｆａｎｄら、細菌性リボフラビン合成遺伝子の制御に関与する保存されたＲＮＡ構造エレメント（Ａ  ｃｏｎｓｅｒｂｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅｓ）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎ．１５，４３９−４４２（１９９９）；Ｍｉｒａｎｄａ−Ｒｉｏｓら、保存されたＲＮＡ構造（ｔｈｉ  ｂｏｘ）は細菌中のチアミン生合成遺伝子発現の制御に関与する（Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ｔｈｉ  ｂｏｘ）ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉａｍｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，９７３６−９７４１（２００１）；Ｓｔｏｒｍｏ＆Ｊｉ、ｍＲＮＡは小分子の発現を調節するためにそれらの直接的なセンサーとして作用するのか？（Ｄｏ  ｍＲＮＡｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｅｉｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ？）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８、９４６５−９４６７（２００１））と一致する。チアミン・ピロホスフェート（ＴＰＰ）依存性センサー／制御性タンパク質は、チアミン生合成遺伝子の制御に関与することが予測されているが（Ｗｅｂｂ＆Ｄｏｗｎｓ、ネズミチフス菌におけるチアミン一リン酸塩キナーゼをコードするｔｈｉＬの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉＬ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｉａｍｉｎ−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ，ｉｎ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５７０２−１５７０７（１９９７））、このようなタンパク質因子は存在しないことが示されている。
【０００８】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｌｙｓＣ遺伝子転写は、高濃度のリジンによって抑制されるが（Ｋｏｃｈｈａｒ，Ｓ．及びＰａｕｌｕｓ，Ｈ．、Ｊ．１９９６、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２：１６３５−１６３９；Ｍａｄｅｒ，Ｕ．ら、２００２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：４２８８−４２９５；Ｐａｔｔｅ，Ｊ．Ｃ．１９９６．リジン及びスレオニンの生合成。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編集、Ｖｏｌ．１，ｐｐ．５２８−５４１．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｐａｔｔｅ，Ｊ．−Ｃ．ら、１９９８、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６９：１６５−１７０）、遺伝的制御因子として使用されるタンパク質因子は同定されていない（Ｌｉａｏ，Ｈ．−Ｈ．及びＨｓｅｕ，Ｔ．−Ｈ．１９９８、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６８：３１−３６）。ｌｙｓＣ遺伝子は、アスパルトキナーゼＩＩをコードし、それは、Ｌ−アスパラギン酸をＬ−リジンに変換する代謝経路における第一工程を触媒する（Ｂｅｌｉｔｓｋｙ，Ｂ．Ｒ．２００２．グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩ファミリー、アラニン並びにポリアミンのアミノ酸の生合成。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃｌｏｓｅｓｔ  Ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ．Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ及びＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編集、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
小さな有機分子に直接結合するある種の天然ｍＲＮＡが代謝産物感受性の遺伝的スイッチとして機能することが発見されている。この結合過程は、ｍＲＮＡの立体構造を変化させ、種々の異なったメカニズムによる遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然の「リボスイッチ」の修飾した変形体（種々の核酸の遺伝子操作戦略によって作製される）は、特異的なエフェクター化合物によって制御されるデザイナー遺伝子スイッチとして使用することができる。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物は、誘因（ｔｒｉｇｇｅｒ）分子として本明細書中に言及される。天然のスイッチは、抗体及び他の小分子治療のための標的となる。さらに、リボスイッチの構造は、天然のスイッチの実際の小片が新規な非免疫原性の遺伝子制御エレメント構築するために使用することができるようにし、例えば、アプタマー（分子認識）ドメインは、新規な認識ドメインがユーザー定義のエフェクター化合物を用いて遺伝的調節を引き起こすように他の非天然のアプタマー（又は他の修飾された）を用いて交換され得る。変化したスイッチは、治療の処方計画の部分となり−タンパク質合成のスイッチのオン又はオフ、あるいは制御である。新規に構築した遺伝的制御のネットワークは、生体のバイオセンサー、生物の代謝性遺伝子操作のような領域、及び遺伝子治療の処方計画の前進した形態で適用され得る。
【００１０】
リボスイッチは、１個又は複数個のアプタマードメインを有することができる。複数個のアプタマードメインを有するリボスイッチ中のアプタマードメインは、誘因分子の協同的結合を提示することができ、又は、誘因分子の協同的結合を提示することができない。後者の場合、アプタマードメインは、独立した結合剤であると言われ得る。複数個のアプタマーを有するリボスイッチは、１個又は複数個の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、誘因分子の協同的結合を提示する２つのアプタマードメインを有するリボスイッチは、両方のアプタマードメインによって制御される１個の発現プラットフォームドメインに連結することができる。複数個のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１つ以上のアプタマーを有することができる。このようなアプタマーが誘因分子の協同的結合を提示する場合、リンカーは、協同的リンカーであり得る。
【００１１】
単離した組換えリボスイッチ、このようなリボスイッチを含有する組換え構築物、このようなリボスイッチに実施可能に連結した異種の配列、及びこのようなリボスイッチを有する細胞及びトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、及び異種配列に実施可能に連結したリボスイッチが開示される。異種配列は、例えば、レポータータンパク質又はペプチドを含む関心のあるタンパク質又はペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に発生するリボスイッチであるか、又はそれから誘導したものである。
【００１２】
異種のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含有するキメラ・リボスイッチもまた開示される。つまり、キメラ・リボスイッチは、１つの供給源からのアプタマードメインと別の供給源からの発現プラットフォームドメインから作製される。異種供給源は、例えば、異なる特異的なリボスイッチ又は異なる分類のリボスイッチからであり得る。異種のアプタマーはまた、非リボスイッチアプタマー由来であり得る。異種の発現プラットフォームドメインはまた、非リボスイッチ供給源由来であり得る。
【００１３】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる化合物を選択及び同定するための組成物及び方法も開示される。リボスイッチの活性化は、誘因分子の結合に応じてリボスイッチの状態の変化を意味する。リボスイッチは、誘因分子以外の化合物によって、及び誘因分子の結合以外の方法で活性化することができる。用語「誘因分子」は、本明細書中において、リボスイッチを活性化することができる分子及び化合物を意味するものとして使用される。これは、リボスイッチの天然又は正常な誘因分子、及びリボスイッチを活性化することができる他の化合物を含む。天然又は正常な誘因分子は、天然における所定のリボスイッチに対する誘因分子であり、又はある種の非天然のリボスイッチの場合には、リボスイッチを設計するための誘因分子、若しくはリボスイッチを選択（例えば、インビトロ選択又はインビトロの進化技術のように）するための誘因分子である。非天然の誘因分子は、非天然の誘因分子を意味し得る。
【００１４】
リボスイッチの失活は、誘因分子が結合しない場合、リボスイッチの状態の変化を意味する。リボスイッチは、誘因分子以外の化合物の結合によって、そして、誘因分子の除去以外の方法で失活することができる。リボスイッチの遮断は、誘因分子の存在がリボスイッチを活性化しない場合、リボスイッチの状況又は状態を意味する。
【００１５】
リボスイッチを活性、失活又は遮断することができる化合物、及びこのような化合物を含有する組成物もまた開示される。リボスイッチを活性化、失活又は遮断するための組成物及び方法もまた開示される。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去を介して遺伝子発現を制御するように機能する。化合物は、リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用され得る。リボスイッチのための誘因分子（並びに他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用することができる。誘因分子以外の化合部は、一般的に、リボスイッチを失活又は遮断するために使用することができる。リボスイッチはまた、例えば、リボスイッチの存在から誘因分子を除去することによって失活することもできる。リボスイッチは、例えば、リボスイッチを活性化しない誘因分子の類似体の結合によって遮断することができる。
【００１６】
リボスイッチを含むＲＮＡ分子と化合物を接触させることによって、ＲＮＡ分子の発現を変更するための、又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の組成物及び方法もまた開示する。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去を通して遺伝子発現を制御するように機能する。このように、リボスイッチを含む関心のあるＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する条件に供することは、ＲＮＡ発現を変更するために使用することができる。発現は、例えば、転写の終結、リボソームのＲＮＡへの結合の遮断の結果として変更することができる。誘因分子の結合は、リボスイッチの性質に依存して、ＲＮＡ分子の発現を減少若しくは抑制し、又はＲＮＡ分子の発現を促進若しくは増加することができる。
【００１７】
リボスイッチをＲＮＡ分子に実施可能に連結することによって、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を制御する組成物及び方法もまた開示される。リボスイッチは、例えば、リボスイッチをＲＮＡ分子に物理的に結合させることによる方法、又は遺伝子操作された核酸から生産されるＲＮＡがＲＮＡ分子に実施可能に連結したリボスイッチを有するようにリボスイッチを含み、コードするようにＲＮＡ分子をコードする核酸を遺伝子操作することによる方法を含む任意の適切な方法で、ＲＮＡ分子に実施可能に連結することができる。リボスイッチを活性化、失活又は遮断する条件に関心のあるＲＮＡ分子に実施可能に連結したリボスイッチを供することは、ＲＮＡの発現を変更するために使用することができる。
【００１８】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによってリボスイッチを含有する天然に発生している遺伝子又はＲＮＡの発現を制御するための組成物及び方法はまた開示される。その遺伝子は、それを収容する細胞又は生物の生存に必須である場合、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することは、細胞又は生物の死、静止状態又は衰弱の原因となり得る。例えば、微生物の生存に本質的である天然に発生している遺伝子における天然に発生しているリボスイッチを活性化することは、（リボスイッチの活性化が、発現をオフにし又は抑制する場合）微生物の死の原因となり得る。これは、抗菌及び抗生物質効果のための開示された化合物及び方法の使用の１つの基本となる。
【００１９】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによって、リボスイッチを含有する単離された、遺伝子操作された又は組換えられた遺伝子又はＲＮＡの発現を制御するための組成物及び方法はまた開示される。この遺伝子又はＲＮＡは、いずれかの方法で遺伝子操作され、又は組換えることができる。例えば、リボスイッチ及びＲＮＡのコーディング領域は異種であることができ、リボスイッチは、組換え若しくはキメラ又はその両方であることができる。遺伝子が、所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチを活性化し又は失活することは、遺伝子の発現を誘導し、その結果、発現産物を生産するために使用することができる。この遺伝子は、遺伝子発現又は別の細胞過程の誘導因子又は抑制物をコードする場合、リボスイッチの活性化、失活又は遮断は、他の制御された遺伝子又は細胞過程の誘導、抑制、又は脱抑制の原因となり得る。多くのこのような二次的制御効果が知られ、リボスイッチを用いた使用に適合することが可能である。このような制御に対する一次制御としてリボスイッチの利点は、リボスイッチの誘因分子が小さく、非抗原的分子であり得ることである。
【００２０】
リボスイッチの発現プラットフォームドメインにアプタマードメインを実施可能に連結することによって、リボスイッチ（キメラ・リボスイッチである）の制御を変更する組成物及び方法はまた開示される。次に、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインに対する誘因分子の作用を通してリボスイッチの制御を仲介することができる。アプタマードメインは、例えば、リボスイッチの正常又は天然のアプタマードメインを新規なアプタマードメインで置換する方法を含む任意の適した方法でリボスイッチの発現プラットフォームドメインに実施可能に連結することができる。一般的に、アプタマードメインが誘導されるリボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる任意の化合物又は条件は、キメラ・リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用することができる。
【００２１】
リボスイッチを共有結合的に変更すること（例えば、リボスイッチの部分を架橋すること、又はリボスイッチに化合物をカップルすること）によってリボスイッチを不活性化する組成物及び方法はまた開示される。この方法によるリボスイッチの不活制化は、例えば、リボスイッチに対する誘因分子の結合を妨げ、誘因分子の結合に応じたリボスイッチの状態の変化を妨げ、又はリボスイッチの発現プラットフォームドメインが誘因分子の結合に応じた発現に影響することから妨げる変化が原因となり得る。
【００２２】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定する方法はまた開示される。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、そして、リボスイッチの活性化を評価することによって同定することができる。リボスイッチが活性化する場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適した方法で評価することができる。例えば、リボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結することができ、そして、リポーターＲＮＡの発現、発現レベル、又は発現レベルの変化を試験化合物の有無で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、立体構造に依存したラベルを含むことができ、そのシグナルは、リボスイッチの活性化状態に依存して変化する。このようなリボスイッチは、好ましくは、天然に発生するリボスイッチのアプタマードメイン又はそれからの誘導したアプタマードメインをしようする。見ることができるように、リボスイッチの活性化の評価は、対照アッセイ又は測定を使用して、あるいは対照アッセイ又は測定を使用しないで実行することができる。リボスイッチを失活する化合物を同定する方法は、類似の方法で実行することができる。
【００２３】
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切な方法で達成することができる。例えば、アッセイは、リボスイッチを活性化又は失活する既知の化合物の存在下で、及び試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化又は失活を評価するために実行することが可能である。活性化及び失活が、試験化合物が存在しない場合に観察されたであろうようには観察されないとすれば、試験化合物は、リボスイッチの活性化又は失活を遮断する化合物として同定される。
【００２４】
バイオセンサー・リボスイッチはまた開示される。バイオセンサー・リボスイッチは、同起源の誘因分子の存在下で、検出可能なシグナルを産生する遺伝子操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサー・リボスイッチは、誘因分子の閾値レベルで又はそれを超えて誘発することができる。バイオセンサー・リボスイッチは、インビボ又はインビトロでの使用のために設計され得る。例えば、シグナル産生として使用し又は関与するタンパク質をコードするリポーターＲＮＡに実施可能に連結したバイオセンサー・リボスイッチは、リボスイッチ／リポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を含むように細胞又は生物を遺伝子操作することによってインビボで使用することができる。インビトロでの使用のためのバイオセンサー・リボスイッチの例は、立体構造に依存したラベル、リボスイッチの活性状態に依存して変化するシグナルを含む。このようなバイオセンサー・リボスイッチは、好ましくは、天然に発生するリボスイッチのアプタマードメイン又はそれに由来するアプタマードメインを使用する。バイオセンサー・リボスイッチを用いた化合物を検出する方法はまた開示される。方法は、試験試料とバイオセンサー・リボスイッチとを接触させ、バイオセンサー・リボスイッチの活性化を評価することを含めることができる。バイオセンサー・リボスイッチの活性化は、試験試料中のバイオセンサー・リボスイッチのための誘因分子の存在を指示する。
【００２５】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定すること、及び同定された化合物を製造することによって作製された化合物はまた開示される。これは、例えば、同定された化合物を製造する方法を伴って、本明細書中の他に開示したような化合物同定方法を含むことによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化される場合、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって作製することができる。
【００２６】
リボスイッチの活性化、失活又は遮断を化合物によって調べ、そして、調べられた化合物を製造することによって作製された化合物はまた開示される。これは、例えば、調べられた化合物を製造する方法を伴って、本明細書中で他に開示されたように、化合物の活性化、失活又は遮断の評価方法を組み合わせることによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化される場合、化合物としてリボスイッチを活性化する試験化合物を製造することによって作製することができる。リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力についてそれらを調べることは、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することが以前には未知であった化合物の同定、及び、化合物がリボスイッチを活性化、失活又は遮断することが既に知られていた場合、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力を評価することの両方を意味する。
【００２７】
新規な誘因分子を認識する新規なリボスイッチ及び／又は新規なアプタマーを選択し、設計し、又は誘導するための方法はまた開示される。このような方法は、リボスイッチにおける一連のアプタマー変異体の産生を伴い、関心のある化合物の存在下で変異体のリボスイッチの活性化を評価すること、活性化された変異体のリボスイッチ（又は、例えば、最も非常に若しくは最も選択的に活性化されたリボスイッチ）、及び所望の活性、特異性、活性と特異性の組み合わせ、又は特性の他の組み合わせの変異体のリボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すことを含むことができる。これらの方法によって産生されたリボスイッチ及びアプタマードメインはまた開示される。
【００２８】
開示されたリボスイッチは、誘導体及びその組換え体を含み、一般的に、任意の供給源から由来し得て、天然に発生するリボスイッチ及びデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）で設計されたリボスイッチを含む。このような任意のリボスイッチは、開示された方法に又はその方法を用いて使用することができる。しかしながら、種々のタイプのリボスイッチが定義され得て、このようなサブタイプは、特定の方法で又はその方法を用いて（一般的に、本明細書中に他に開示される）有用でありえる。リボスイッチのタイプは、例えば、天然に発生するリボスイッチ、天然に発生するリボスイッチの誘導体及び修飾体、キメラ・リボスイッチ、及び組換えリボスイッチを含む。天然に発生するリボスイッチは、天然で発見されたリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然に発生するリボスイッチは、天然で発生するように天然で発生するリボスイッチの単離された又は組換え型であり得る。つまり、リボスイッチは、同じ一次構造を有するが、新規な遺伝的又は核酸状況で単離され又は遺伝子操作されている。キメラ・リボスイッチは、例えば、任意のリボスイッチの部分又は特定の分類若しくはタイプのリボスイッチの部分、及び異なるリボスイッチの同じ部分又は任意の異なる特定の分類若しくはタイプのリボスイッチの部分；任意のリボスイッチの部分又は特定の分類若しくはタイプのリボスイッチの部分、及びリボスイッチではない配列又は成分から作製することができる。組換えリボスイッチは、新規な遺伝的又は核酸状態で単離され又は遺伝子操作されたリボスイッチである。
【００２９】
リボスイッチの異なる分類は、同じか又は類似の誘因分子を有するリボスイッチ、又は（予測され、決定され、若しくは組み合わせ）同じか若しくは類似の全体構造を有するリボスイッチを意味する。同じ分類のリボスイッチは、一般的であるが、しかし、必ずしもそうではないが、同じか又は類似の誘因分子及び同じか又は類似の全体構造を有する。リボスイッチの分類は、グリシン応答性リボスイッチ、グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバアラミン応答性リボスイッチ、フラビン・モノヌクレオチド応答性リボスイッチ、及びＳ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチを含む。
【００３０】
開示された方法及び組成物の更なる利点は、部分的には下記に続く説明に記載され、部分的には、その記載から理解されるであろうし、又は開示された方法及び組成物の実施によって学ぶことができる。開示された方法及び組成物の利点は、添付の請求の範囲に具体的に指摘した要素及び組成物を用いて実現され、そして達成されるであろう。前述の一般的記載及び下記の詳細な説明の両方は、典型的なものであり、説明的なものに過ぎず、請求される発明を限定するものでないことは理解すべきである。
【００３１】
添付の図面は、本明細書に援用され、本明細書の一部を構成し、開示された方法及び組成物のいくつかの態様、並びにその説明を例証し、開示された方法及び組成物の原理を説明するために利用される。
【００３２】
発明の詳細な説明
開示した方法及び組成物は、特定の態様の下記の詳細な記載及び本明細書中に含まれる実施例、並びに図面及びそれらの前述及び後述の記載に言及することによってより容易に理解され得る。
【００３３】
ある種の天然のｍＲＮＡは、代謝産物に感受性の遺伝的スイッチとして使用され、このＲＮＡは、小さな有機分子に直接結合する。この結合過程は、ｍＲＮの立体構造を変化させ、種々の異なるメカニズムによって遺伝子発現の変化を引き起こす。これらの天然の「リボスイッチ」の修飾された変形体（種々の核酸遺伝子操作戦略を用いて作製される）は、特異的なエフェクター化合物（誘因分子として本明細書で言及される）によって制御されるデザイナー遺伝的スイッチとして使用することができる。天然のスイッチは、抗体及び他の小分子療法のための標的である。さらに、リボスイッチの構造は、天然のスイッチの実際の小片が新規な非免疫原性の遺伝的制御エレメントを構築するために使用されるようにし、例えばアプタマー（認識分子）ドメインが、他の非天然のアプタマー（又はそうでなければ修飾された）と交換することができ、新規な認識ドメインがユーザー定義のエフェクター化合物を用いて遺伝的変化を引き起こす。変化したスイッチは、タンパク質合成を開始し、又は終結し、あるいは制御するといった治療の処方計画の部分となる。新規に構築した遺伝的制御ネットワークは、生体バイオセンサー、生物の代謝的遺伝子操作のような領域で、遺伝子治療の処方計画の有利な形態で適用され得る。
【００３４】
メッセンジャーＲＮＡは、典型的には、翻訳過程中のタンパク質又は小ＲＮＡ制御因子及びリボソームによって作用する遺伝的情報の能動的な担体として考えられる。ある種のｍＲＮＡは、天然のアプタマードメインを担持し、そして、これらのＲＮＡドメインへの直接的な特異的代謝産物の結合が遺伝子発現の修飾へと導くことが発見された。天然のリボスイッチは、天然のＲＮＡとは典型的には関係しない２つの驚くべき機能を提示する。第一に、ｍＲＮＡエレメントは、１つの構造がその標的となる代謝産物のための正確な結合ポケットとして使用される区別される構造的状態を採用し得る。第二に、構造的状態の代謝産物を誘導するアロステリックな相互交換は、いくつかの明確なメカニズムの１つによって遺伝子発現のレベルの変化を引き起こす。リボスイッチは、典型的には、２つの別個のドメイン：１つは、標的（アプタマードメイン）に選択的に結合するもの、もう１つは、遺伝的制御（発現プラットフォーム）に影響するものに分けられる。遺伝子発現の代謝産物に依存したアロステリック制御に帰着するこれらの２つのドメインの間に活発な相互作用である。
【００３５】
リボスイッチの明確な分類が同定されており、活性化合物（本明細書中では誘因分子という）を選択的に認識することが示される。例えば、グリシン、補酵素Ｂ12、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、及びフラビン・モノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの化合物の代謝性又は輸送経路中の主要な酵素をコードする遺伝子に存在するリボスイッチを活性化する。各々のリボスイッチの分類のアプタマードメインは、非常に保存された共通配列及び構造に合致する。このように、配列のホモロジーサーチは、関連するリボスイッチのドメインを同定するために使用することができる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、及び真核細胞由来の種々の生物で発見されている。
【００３６】
グリシンを認識するリボスイッチの１つの分類が発見された。グアニン・リボスイッチの共通配列及び構造的特徴を担持する代表的なＲＮＡは、原核生物の無数の遺伝子の５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に局在し、それらは、グリシン開裂に関与するタンパク質の発現を制御する。枯草菌のｇｃｖＴオペロンに関連したグリシン応答性リボスイッチは、遺伝的な「ＯＮ」スイッチとして機能し、グリシン結合は、固有の転写終了ステムの形成を妨げる構造的再配列を引き起こす。さらに、ｇｃｖＴリボスイッチは、グリシンに対して協同的な結合を提示する２つのアプタマー、誘因分子を含む（実施例を参照されたい）。グリシン感受性リボスイッチは、この化合物の濃度の変化に応答して遺伝子発現を変更するＲＮＡ遺伝的制御エレメントのクラスである。
【００３７】
無数の他のリボスイッチが、グリシン感受性リボスイッチ及びそれらの成分と並んで、キメラ・リボスイッチと一緒に又はその一部として使用することができることが知られている。このようなリボスイッチ及びそれらの使用の例は、米国出願公開第２００５−００５３９５１号に記載され、参照により本明細書中に全体として、特に、特定のリボスイッチの構造及び操作の記載に関して援用される。
【００３８】
１．リボスイッチＲＮＡの一般的編成
細菌のリボスイッチＲＮＡは、特定のＲＮＡの主要なコーディング領域の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）内に主に局在する遺伝子調節エレメントである。構造プロービング試験は、リボスイッチエレメントが、一般的に、２つのドメイン：リガンド結合ドメインとして使用される天然のアプタマー（Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｌ．Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３）、及び遺伝子発現に関与するＲＮＡエレメント（例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）エレメント；転写ターミネーターステム）と相互作用する「発現プラットフォーム」から構成される。これらの結果は、インビトロで合成されたアプタマードメインが、発現プラットフォームが存在しない場合に、適切なリガンドと結合するという観察から導かれる（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２、３及び６を参照されたい）。さらに、構造プロービング調査は、大部分のリボスイッチのアプタマードメインが、独立に調べた場合、特に二次及び三次構造のフォールドを採用し、全体の５’リーダーＲＮＡの関連で調べた場合、アプタマー構造に本質的に同じであることを示唆した。これは、多くの場合、アプタマードメインが、発現プラットフォームに独立してフォールドするモジュラーユニットであることを暗に意味する（米国出願公開第２００５−００５３９５１号を参照されたい）。
【００３９】
究極には、アプタマードメインのリガンド結合又は非結合状態は、発現プラットフォームを通して解釈され、遺伝子発現への影響を引き出す原因となる。調節エレメントとしてのリボスイッチの見解は、アプタマードメインが種々の生物の間（及びＴＰＰリボスイッチに関して観察されるように各界の間でさえ（Ｓｕｄａｒｓａｎら、ＲＮＡ  ２００３，９，６４４））で非常に保存されているという事実によってさらに支持される一方で、発現プラットフォームは、添付のオープン・リーディング・フレームの発現が制御される配列、構造及び機構において変化する。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｔｅｎＡ  ｍＲＮＡのＴＰＰリボスイッチへのリガンド結合は、転写終結を引き起こす（Ｍｉｒｏｎｏｖら、Ｃｅｌｌ  ２００２，１１１，７４７）。この発現プラットフォームは、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｈｉＭ  ｍＲＮＡにおけるＴＰＰリボスイッチの発現プラットフォームと比較して配列及び構造において区別される一方で、ＴＰＰ結合は、ＳＤ遮断メカニズムによって翻訳の阻害を引き起こす（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照されたい）。ＴＰＰアプタマードメインは、これらの２つの転写ユニットとの間で容易に認識され、ほぼ同一の機能的特徴であるが、遺伝子調節メカニズム及びそれらを実行する発現プラットフォームは非常に異なる。
【００４０】
リボスイッチＲＮＡに関するアプタマードメインは、約７０〜１７０ｎｔの長さの範囲である（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１）。この観察は、インビトロの進化実験が多種の小分子結合のアプタマーを同定したことを提供したため、幾分予期しなかったが、長さが非常に短く、構造的に複雑である（Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，８２０；Ｇｏｌｄら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６４，７６３；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９，９，３２４）。人工的なアプタマーと比較して、天然のアプタマー配列の複雑さ及び情報量における実質的な増加の理由が証明されることを残すが、この複雑さは、高アフィニティー及び選択性を伴って機能するＲＮＡ受容体を形成するのに大概要求される。リガンド−リボスイッチ複合体についての見掛けのＫD値は、低いｎＭから低いｍＭの範囲である。いくつかのアプタマードメインは、添付の発現プラットフォームから単離される場合、原型のリボスイッチのアフィニティーに対して標的リガンドの改善されたアフィニティーを提示することはまた注目すべきである（約１０〜１００倍；米国出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照されたい）。推定されるように、完全な原型のリボスイッチＲＮＡによって必要とされる複数の異なるＲＮＡ立体構造をサンプリングするにはエネルギーコストがかかり、リガンドアフィニティーの喪失によって影響される。アプタマードメインは、分子スイッチとして使用されなければならないので、これはまた、より精緻な構造を合理的に説明する手助けとなるかもしれない天然のアプタマーに関する機能的な要求に加担するかもしれない。
【００４１】
２．微生物における転写終結のリボスイッチ制御
微生物は、主に、転写終結のための２種の方法を利用する。ある種の遺伝子は、Ｒｈｏタンパク質に依存する終結シグナルを組み込み（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００２，１５７７，２５１）、一方、他は、転写伸長複合体を不安定化するためにＲｈｏ非依存性ターミネーター（固有のターミネーター）を利用する（Ｇｕｓａｒｏｖ及びＮｕｄｌｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １９９９，３，４９５；Ｎｕｄｌｅｒ及びＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２，７，７５５）。後者のＲＮＡエレメントは、ＧＣに富んだステムループ、その後の６〜９個のウリジル残基のストレッチから構成される。固有のターミネーターは、微生物のゲノムの至る所で広範囲に及び（Ｌｉｌｌｏら、２００２，１８，９７１）、そして、典型的には、遺伝子又はオペロンの３’末端に位置する。興味深いことに、数多くの実施例は、５’−ＵＴＲ内に位置した固有のターミネーターに関して観察される。
【００４２】
微生物によって使用される多様な遺伝的制御戦略の中には、ＲＮＡポリメラーゼが、制御されるやり方で、５’−ＵＴＲ内の終結シグナルに応答する増加する例の類がある（Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００，３，１４９）。ある種の条件において、ＲＮＡポリメラーゼ複合体が終結シグナルを読み取るか又は無視するかのいずれかの外部シグナルによって指向される。転写開始は、制御なしに発生するかもしれないが、ｍＲＮＡ合成（及び遺伝子発現の）制御は、究極的には、固有のターミネーターの制御によって決定される。推定上、少なくとも２つの相互排他的なｍＲＮＡの立体構造の１つは、転写終結を合図するＲＮＡ構造の形成又は崩壊に帰着する。トランス作用因子は、ある場合においてはＲＮＡであり（Ｇｒｕｎｄｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００２，９９，１１１２１；Ｔ．Ｍ．Ｈｅｎｋｉｎ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２００２，２４，７００）であり、他の場合においてタンパク質であり（Ｓｔｕｌｋｅ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２，１７７，４３３）、一般的には、特定の細胞内シグナルを受け、その後、ＲＮＡ立体構造の１つを安定化するために要求される。リボスイッチは、遺伝子調節機構によって解釈されるＲＮＡ構造調節及び代謝産物シグナルとの間の直接的な連結を提供する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｍＲＮＡ由来のＦＭＮの概要は、このメカニズムを説明するために下記に提供される。
【００４３】
チアミン生合成に関与するある種のｍＲＮＡは、タンパク質因子の参入なしにチアミン（ビタミンＢ1）又はその生物活性のピロリン酸塩誘導体（ＴＰＰ）に結合することが発見された。ｍＲＮＡ−エフェクター複合体は、リボソーム結合部位を隔離し、そして、遺伝子発現の減少へと導く異なる構造を採用する。この代謝産物を感知するｍＲＮＡシステムは、起源がタンパク質の進化的発生を先行したかもしれない遺伝的「リボスイッチ」の例（本明細書中でリボスイッチという）を提供する。大腸菌のｂｔｕＢ遺伝子のｍＲＮＡリーダー配列が補酵素Ｂ12に選択的に結合し得て、そして、この結合事象が遺伝子調節に重要であるＲＮＡの構造変化を引き起こすことが発見されている（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例１を参照されたい）。チアミン生合成タンパク質をコードするｍＲＮＡはまたリボスイッチのメカニズムを採用することが発見された（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の実施例２を参照されたい）。
【００４４】
グリシンによって選択的に誘発される、以前は未知であったリボスイッチの分類が、微生物によって発見された。枯草菌由来のこれらのグリシン感受性ＲＮＡの代表例は、グリシン開裂システムを形成するタンパク質をコードするｇｃｖＴオペロンに対するスイッチに稀な発生として作用する。大部分のグリシン・リボスイッチは、２つの状態の遺伝的スイッチをより密接に接近するために協同的に機能する２種のリガンド結合ドメインを統一する。リボスイッチのこの有利な形態は、過剰なグリシンが、クエン酸サイクルを通して炭素フラックスを提供し、そして、タンパク質合成のための十分量のアミノ酸を維持するために効率的に使用されることを確実にするために進化したのかもしれない。このように、リボスイッチは、主要な制御する役割を実行し、そして、以前には、タンパク質因子とともにだけ観察された複雑な実行的特徴を提示する。
【００４５】
本明細書中に開示した特異的な天然のリボスイッチは、代謝産物の結合によって遺伝子発現を調節するｍＲＮＡエレメントの最初の例であるが、この遺伝子調節戦略は、生物学において広範囲に及ぶことが期待される。ＴＰＰ、補酵素Ｂ12及びＦＭＮは、ＲＮＡ世界で生物学的補因子として出現した（Ｊｏｙｃｅ，ＲＮＡを基礎とした進化のいにしえ（Ｔｈｅ  ａｎｔｉｑｕｉｔｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，２１４−２２１（２００２））ことが示唆されている（Ｗｈｉｔｅ  ＩＩＩ，初期の代謝的状態の化石としての補酵素（Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｆｏｓｓｉｌｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅａｒｌｉｅｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｔｅ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．７，１０１−１０４（１９７６）；Ｗｈｉｔｅ  ＩＩＩ，Ｔｈｅ  Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ｐｐ．１−１７（１９８２）；Ｂｅｎｎｅｒら、ＲＮＡ世界のパリンプセストとしての現代の代謝作用（Ｍｏｄｅｒｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｓ  ａ  ｐａｌｉｍｐｓｅｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｗｏｒｌｄ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，７０５４−７０５８（１９８９））。これらの代謝産物がタンパク質の出現前に生合成され及び使用される場合、ある種のリボスイッチは、遺伝子調節の最も古い形態の現代的な例であったかもしれない。ゲノム配列データベースの検索は、ＴＰＰアプタマーに対応する配列が微生物、古細菌及び真核生物由来の生物に存在し、大部分は、大きな変化はしないことを示している。新規な代謝産物を結合するｍＲＮＡは、進化過程として出現する可能性があるが、既知のリボスイッチは、ＲＮＡ世界からの分子化石である可能性がある。
【００４６】
開示した方法及び組成物は、特定の合成方法、特定の分析技術、又は他に特定されなければ、特別な試薬に限定されず、例えば、変化することができることは理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特別の実施態様を記載するだけの目的であって、限定することを意図するものではない。
【００４７】
材料
開示した方法及び組成物のために使用することができ、併用して使用することができ、製造のために使用することができる材料、組成物、及び成分、又はそのための製造物が開示される。これらの材料及び他の材料は本明細書中に開示され、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示されている場合に、これらの化合物の各々の種々の単一の及び集合的な組み合わせ及び置換に対する特定の参照文献は、明示的に開示することはできないが、各々は、具体的に意図され、本明細書中に開示される。例えば、リボスイッチ又はアプタマードメインは、開示され、検討され、そして、リボスイッチ又はアプタマードメインを含む多くの分子に対してなすことが可能な多くの修飾が検討される場合、リボスイッチ又はアプタマードメインの各々の及び全ての組み合わせ及び置換、そして、可能である修飾は、それとは反対に具体的に指示されなければ、具体的に意図される。このように、分子Ａ、Ｂ及びＣのクラスが、分子Ｄ、Ｅ及びＦのクラスと同様に開示され、そして、組み合わせの例であるＡ〜Ｄが開示されれば、たとえ、各々が個別に引用されなくても、各々は、個別に及び集合的に意図される。このように、この例では、各々の組み合わせのＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、及びＣ〜Ｆが具体的に意図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；そして、例示の組み合わせＡ〜Ｄの開示から考慮され、開示されるべきであろう。同様に、これらのいずれかの部分集合又は組み合わせはまた、具体的に意図され、開示される。このように、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、及びＣ〜Ｅのサブグループは、具体的に意図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；そして、例示の組み合わせＡ〜Ｄの開示から考慮され、開示されるべきであろう。この概念は、本出願の全てに当てはまり、限定されないが、開示された組成物を作成し、使用する方法における工程を含む。つまり、実行することが可能な種々の追加の工程があるけれども、各々のこれらの追加の工程は、開示した方法の任意の特定の実施態様又は組み合わせを用いて実行することができ、そして、各々のこのような組み合わせは、特異的に意図され、開示が考慮されるべきであることが理解される。
【００４８】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現されるべきＲＮＡ分子の部分であり、誘因分子によって結合された場合、状態を変化する発現調節エレメントである。リボスイッチは、典型的には、２つの別個のドメイン：１つは、標的物に選択的に結合するもの（アプタマードメイン）、もう１つは、遺伝子調節に影響を与えるものに分別することができる。それは、遺伝子発現の代謝産物依存性のアロステリック調節の原因となるこれらの２つのドメインの間の動的な相互作用である。単離された組換えリボスイッチ、このようなリボスイッチを含有する組換え構築物、このようなリボスイッチに実施可能に連結した異種配列、並びにこのようなリボスイッチ、リボスイッチの組換え構築物、及び異種配列に実施可能に連結したリボスイッチが開示される。異種配列は、例えば、受容体タンパク質又はペプチドを含む関心のあるタンパク質又はペプチドをコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に発生しているリボスイッチであり、又はそれから誘導される。
【００４９】
開示されたリボスイッチは、誘導体及びその組換え体を含み、一般的に、天然に発生しているリボスイッチ、及びデノボで設計されたリボスイッチであり得る。任意のこのようなリボスイッチは、開示した方法で又はそれを用いて使用され得る。しかしながら、異なったタイプのリボスイッチが定義され得て、いくつかのこのようなサブタイプは、具体的な方法で又はそれを用いて（一般的に、本明細書中で他に記載されるように）使用することができる。リボスイッチのタイプは、例えば、天然に発生しているリボスイッチ、天然に発生しているリボスイッチの誘導体及び修飾された形態、キメラ・リボスイッチ、及び組換えリボスイッチを含む。天然に発生しているリボスイッチは、自然界で見られるように、リボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然に発生しているリボスイッチは、それが自然界で発生するように、天然に発生しているリボスイッチの単離された又は組換え体であり得る。即ち、リボスイッチは、同じ一次構造を有しているが、新規な遺伝的又は核酸の状況で単離され又は操作されている。キメラ・リボスイッチは、例えば、任意の、又は特定のクラス若しくはタイプのリボスイッチ部分、及び異なったリボスイッチの同じ又は任意の異なった若しくはタイプのリボスイッチ部分；任意の又は特定のクラス若しくはタイプのリボスイッチのリボスイッチ部分及び任意の非リボスイッチの配列又は成分から作製することができる。組換えリボスイッチは、新規な遺伝子又は状況で単離され、又は遺伝子操作されたリボスイッチである。
【００５０】
リボスイッチは、１つの又は複数のアプタマードメインを有することができる。複数のアプタマードメインを有するリボスイッチのアプタマードメインは、誘因分子の協同的結合を提示することができ、又は誘因分子の協同的結合を提示することができない（即ち、アプタマーは、協同的結合を提示する必要はない）。後者の場合、アプタマードメインは、独立した結合剤であると言われ得る。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、１つ又は複数の発現プラットフォームドメインを有することができる。例えば、それらの誘因分子の協同的結合を提示する２つのアプタマードメインを有するリボスイッチは、両者のアプタマードメインによって制御される１つの発現プラットフォームに連結され得る。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して結合した１以上のアプタマーを有することができる。このようなアプタマーは、誘因分子の協同的結合を提示する場合、リンカーは、協同的リンカーであり得る。
【００５１】
アプタマードメインは、それらが、ｘ及びｘ−１の間のＨｉｌｌ係数ｎを有する場合には、協同的結合を提示すると言われ得て、ここで、ｘは、協同的結合に対して解析されているアプタマードメインの数（又はアプタマードメイン上の結合部位の数）である。このように、例えば、２つのアプタマードメイン（グリシン応答性リボスイッチ）を有するリボスイッチは、リボスイッチが、２と１との間のＨｉｌｌ係数を有する場合に、協同的結合を提示すると言われ得る。使用されるｘ値は、協同的結合について解析されているアプタマードメインの数に依存し、必ずしもリボスイッチに存在するアプタマードメインの数に依存しないことが理解されるべきである。これは、リボスイッチが、ほんの少しが協同的結合を提示する場合、複数のアプタマードメインを有してもよいため、意味がある。
【００５２】
異なったクラスのリボスイッチは、同じか又は類似の全体の構造（予測され、決定され、又は組み合わせ）を有する同じか又は類似の誘因分子又はリボスイッチを有するリボスイッチを意味する。同じクラスのリボスイッチは、一般的であるが、必ずしもそうである必要はなく、同じか又は類似の誘因分子及び同じか又は類似の全体構造の両者を有する。リボスイッチのクラスは、グリシン応答性リボスイッチ、グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビン・モノヌクレオチド応答性リボスイッチ、及びＳ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチを含む。
【００５３】
異種のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含有するキメラ・リボスイッチもまた開示される。つまり、キメラ・リボスイッチは、１つの供給源由来のアプタマードメイン、及び別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから作製される。異種の供給源は、例えば、異なった特別なリボスイッチ、異なったタイプのリボスイッチ、又は異なったクラスのリボスイッチ由来であり得る。異種のアプタマーはまた非リボスイッチアプタマー由来でもあり得る。異種の発現プラットフォームドメインはまた、非リボスイッチ供給源由来でもあり得る。
【００５４】
リボスイッチは、他の既知の、開発された又は天然に発生しているリボスイッチから修飾され得る。例えば、スイッチドメイン部分は、既知の又は予測される二次、三次、若しくは二次及び三次構造の両方のリボスイッチを保存中の１以上のヌクレオチドを変化することによって修飾され得る。例えば、塩基対の両ヌクレオチドは、塩基対でもあり得るヌクレオチドに対して変化することができる。塩基対の保持を可能にする変化は、塩基対の保存的変化として本明細書中で意味される。
【００５５】
修飾した又は誘導したリボスイッチはまた、インビトロ選択及び進化技術を用いて生産することができる。一般的に、リボスイッチに適用されるインビトロ進化技術は、リボスイッチ配列の部分が変化し、リボスイッチの他の部分が定常を維持する場合、一連の変異体のリボスイッチを生産することに関与する。次に、一連の変異体のリボスイッチの活性化、失活又は遮断（あるいは他の機能的又は構造的基準）を評価することができ、関心のある基準にあうそれらの変形体リボスイッチは、使用又は更なる進化の回転のために選択される。変形体の発生のための有用な塩基リボスイッチは、本明細書中に開示された特定及び総合的なリボスイッチである。総合的なリボスイッチは、リボスイッチのどの部分がインビトロでの選択及び進化について変化するかを知らせるために使用され得る。
【００５６】
変化した制御を有する修飾したリボスイッチはまた開示される。リボスイッチの制御は、アプタマードメインをリボスイッチの発現プラットフォームドメインに実施可能に連結することによって変化させることができる（これはキメラ・リボスイッチである）。次に、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインに対する誘因分子の作用を通じてリボスイッチの制御を仲介することができる。アプタマードメインは、任意の適したやり方でリボスイッチの発現プラットフォームドメインに実施可能に連結することができ、例えば、リボスイッチの正常又は天然のアプタマードメインを新規なアプタマードメインで置換することが含まれる。一般的に、アプタマードメインが誘導されるリボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる任意の化合物又は条件は、キメラ・リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用することができる。
【００５７】
不活化したリボスイッチはまた、開示される。リボスイッチは、共有結合的にリボスイッチを変化させることによって（例えば、リボスイッチの架橋部分、又はリボスイッチに化合物をカップリングすることによって）不活化することができる。このやり方によるリボスイッチの不活化は、例えば、リボスイッチに対する誘因分子を結合から妨げること、誘因分子の結合に応じてリボスイッチの状態で変化を妨げること、又はリボスイッチの発現プラットフォームドメインを誘因分子の結合に応じて発現に影響することから妨げることに起因し得る。
【００５８】
バイオセンサーリボスイッチはまた開示される。バイオセンサーリボスイッチは、誘因分子の同族体の存在下で検出可能なシグナルを生産する遺伝子操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、誘因分子の閾値で又はそれを超えて引き起こされ得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボ又はインビトロでの使用のために設計され得る。例えば、シグナルとして使用され、シグナルを生じることに関与されるタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに実施可能に連結したバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／リポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を収容するように細胞又は生物を遺伝子操作することによってインビボで使用することができる。インビトロでの使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、立体構造に依存したラベル、リボスイッチの活性状態に依存して変化するシグナルを含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に発生しているリボスイッチのアプタマードメイン又はそれから誘導されるアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチは、種々の状況及びプラットフォームで使用することができる。例えば、バイオセンサーリボスイッチは、プレート、チップ、ストリップ及びウェルのような固体支持体と一緒に使用することができる。
【００５９】
新規な誘因分子を認識する修飾した又は誘導したリボスイッチはまた開示される。新規な誘因分子を認識する新規なリボスイッチ及び／又は新規なアプタマーは、既知のリボスイッチから選択され、設計され又は誘導することができる。これは、例えば、リボスイッチにおける一連のアプタマー変異体を製造し、関心のある化合物の存在下で、種々のリボスイッチの活性化を評価し、活性化された種々のリボスイッチ（又は、例えば、最も高く又は最も選択的に活性化したリボスイッチ）を選択すること、そして、所望の活性、特異性、活性及び特異性の組み合わせ、又は性質の他の組み合わせの種々のリボスイッチが得られるまで、これらの工程を繰り返すことによって達成することができる。
【００６０】
特に有用なアプタマードメインは、本明細書中ではＰ１ステム構造（又は単にＰ１）と称されるステム構造を形成することができる。種々のリボスイッチのＰ１ステムは、米国仮出願第２００５−００５３９５１号の図１１に示される。図１及び８は、グリシン応答性リボスイッチのＰ１ステムを示す。Ｐ１ステム構造におけるハイブイダイズしている鎖は、アプタマー鎖（又はＰ１ａ鎖と称する）及び調節鎖（又はＰ１ｂと称する）と呼ばれる。調節鎖は、アプタマードメイン、及び調節鎖と呼ばれる連結した発現プラットフォームにおける配列（Ｐ１ｃ鎖とも呼ばれる）の両方を有するステム構造を形成することができる。このように、制御鎖（Ｐ１ｂ）は、アプタマー鎖（Ｐ１ａ）及び制御鎖（Ｐ１ｃ）を有する代替のステム構造を形成することができる。リボスイッチの活性化及び失活は、ステム構造の１つからその他への（Ｐ１ａ／Ｐ１ｂからＰ１ｂ／Ｐ１ｃ又はその反対）シフトへの原因となる。Ｐ１ｂ／Ｐ１ｃステム構造の形成は、リボスイッチを含有するＲＮＡ分子の発現に影響する。この調節機構を介して操作するリボスイッチは、本明細書中では、代替のステム構造リボスイッチ（又は代替のステムリボスイッチ）と呼ばれる。１つのアプタマーを有するいくつかのグリシン応答性リボスイッチは、第二のアプタマー中にＰ１ステムを用いてこの機構を利用する（図１及び８を参照されたい）。
【００６１】
一般的に、任意のアプタマードメインは、アプタマードメインの調節鎖に相補的である発現プラットフォームドメインにおける制御鎖を設計し又は適合することによって任意の発現プラットフォームドメインを用いて使用のために適合することができる。その代わりに、アプタマー及びアプタマードメインの調節鎖の配列は、調節鎖が発現プラットフォームにおける機能的に有意な配列に相補的であるように適合することができる。例えば、調節鎖は、調節鎖及びＳＤ配列の間のステム構造の形成に応じて、ＳＤ配列がリボスイッチに接近することができなくなり、つまり、翻訳開始を減少し又は妨げるようにＲＮＡのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列に相補的であるに適合することができる。アプタマー鎖は、アプタマードメインにおけるＰ１ステムの形成を可能にする配列の対応する変化を有するであろうことに気づかれたい。協同的結合を提示する複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー（発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー）の１つのＰ１ステムは、ＳＤ配列を有するステム構造を形成するように設計するのに必要である。
【００６２】
別の例として、翻訳ターミネーターは、ＲＮＡ分子に（最も都合よくは、ＲＮＡの非翻訳領域に）添加することができ、転写ターミネーターの配列部分は、アプタマードメインの調節鎖に相補的である（この配列は、制御鎖となるであろう）。これは、アプタマードメインの調節配列が、アプタマー鎖を有する代替のステム構造を形成することができるようにするであろうし、このように、リボスイッチの活性化又は失活に応じて、翻訳ターミネーターステムを形成するか又は崩壊するかのいずれかである。任意の他の発現エレメントは、代替のステム構造の類似の設計によってリボスイッチの調節下に分類することができる。
【００６３】
リボスイッチによって調節される転写ターミネーターについて、リボスイッチ及び発現プラットフォームエレメントの転写速度及び空間は、適切な制御にとって重要となり得る。転写速度は、例えば、転写を休止させ、リボスイッチが誘因分子を形成し、感知することを可能にするためのポリメラーゼ休止エレメント（例えば、一連のウリジン残基）を含むことによって調整することができる。例えば、ＦＭＮリボスイッチを用いて、ＦＭＮがそのアプタマードメインに結合する場合、抗ターミネーター配列が隠遁され、抗ターミネーター構造の形成にとって利用できなくなる（米国出願公開第２００５−００５３９５１号の図１２）。しかしながら、ＦＭＮが存在しない場合、抗ターミネーターは、そのヌクレオチドがポリメラーゼから出現した時点で形成することができる。次に、ＲＮＡＰは、別のＵ−ストレッチに到達し、再び休止するためだけの休止部位から振りほどかれる。その後、転写ターミネーターは、ターミネーターのヌクレオチドは抗ターミネーターによって結びつけられない場合にだけ形成する。
【００６４】
コーディング領域に実施可能に連結したリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む制御可能な遺伝子発現構築物が開示され、リボスイッチは、ＲＮＡの発現を制御し、リボスイッチ及びコーディング領域は異種である。リボスイッチは、アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインは異種である。リボスイッチは、アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインは、Ｐ１ステムを含み、Ｐ１ステムは、アプタマー鎖及び調節鎖を含み、発現プラットフォームドメインは、制御された鎖を含み、制御された鎖、調節鎖又はその両方は、ステム構造を形成するために設計されている。リボスイッチは、２以上のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含むことができ、少なくとも１つのアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインは異種である。リボスイッチは、２以上のアプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含むことができ、少なくとも１つのアプタマードメインは、Ｐ１ステムを含み、Ｐ１ステムは、アプタマー鎖及び調節鎖を含み、発現プラットフォームドメインは、制御された鎖を含み、制御された鎖、調節鎖又はその両方は、ステム構造を形成するように設計されている。
【００６５】
天然に発生しているリボスイッチの非天然な誘導体であるリボスイッチが開示される。リボスイッチは、アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインを含み、アプタマードメイン及び発現プラットフォームドメインは異種である。リボスイッチは、天然に発生しているグリシン応答性リボスイッチ、グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロリン酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビン・モノヌクレオチド応答性リボスイッチ、又はＳ−アデノシルメチオニン応答性リボスイッチから誘導することができる。リボスイッチは、誘因分子によって活性化することができ、リボスイッチは、誘因分子によって活性化される場合、シグナルを生じる。
【００６６】
無数のリボスイッチ及びリボスイッチ構築物は、本明細書中に開示され、言及される。任意の特定のリボスイッチ又はリボスイッチ構築物又はリボスイッチ若しくはリボスイッチ構築物のグループが、本明細書中に開示された発明のある側面から排除し得ることは、具体的に意図される。例えば、ｘｐｔ−ｐｂｕＸリボスイッチとリポーター遺伝子との融合は、リポーター遺伝子に融合した一連のリボスイッチから排除することができるであろう。
【００６７】
１．アプタマードメイン
アプタマードメインは、特定の化合物及び化合物のクラスに選択的に結合することができる核酸セグメント及び構造である。リボスイッチは、誘因分子の結合に応じて、リボスイッチの状態又は構造の変化の原因となるアプタマードメインを有する。機能的リボスイッチにおいて、アプタマードメインに連結した発現プラットフォームドメインの状態又は構造は、誘因分子がアプタマードメインに結合する場合に変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、任意の供給源から誘導することができ、例えば、リボスイッチの天然のアプタマードメイン、人工のアプタマー、遺伝子操作され、選択され、進化若しくは誘導されたアプタマー又はアプタマードメインを含む。リボスイッチのアプタマーは、一般的に、例えば、ステム構造を形成することによって、連結した発現プラットフォームドメインの部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、誘因分子の結合に応じて形成するか又は崩壊するかのいずれかであろう。
【００６８】
種々の天然のリボスイッチの共通のアプタマードメインは、本明細書中の図１、及び米国出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１に示される。これらのアプタマードメイン（本明細書中に具体化された直接的な変異体の全てを含む）は、リボスイッチにおいて使用することができる。共通配列及び構造は、配列及び構造における変異体を指示する。指示された変異体内にあるアプタマードメインは、直接的な変異体と言われる。これらのアプタマードメインは、修飾した又は変異のアプタマードメインを産生するために修飾され得る。保存的修飾は、対のヌクレオチドが相補的なままであるように塩基対をなしたヌクレオチドにおける任意の変化を含む。中程度の修飾は、指示された長さの範囲の２０％未満又は２０％に等しいステム又はループの長さ（長さ又は長さの範囲は指示される）における変化を含む。ループ及びステムの長さは、保存構造が特定の長さのステム若しくはループを示す場合、又は長さの範囲がリストされ若しくは描写される場合に、「指示された」と考えられる。中程度の修飾は、指示された長さの範囲のステム若しくはループの長さの４０％未満又はそれに等しいステム又はループの長さ（長さ又は長さの範囲は指示されない）における変化を含む。中程度の修飾はまた、アプタマードメインの特定されていない部分の機能的変異体を含む。アプタマードメインの特定されていない部分は、本明細書の図１及び米国出願公開第２００５−００５３９５１号に実線で示される。
【００６９】
Ｐ１ステム及び構成素鎖は、発現プラットホーム及びＲＮＡ分子を用いた使用のためのアプタマードメインを適合することにおいて修飾することができる。このような修飾は、広範囲であり得て、本明細書中においてＰ１修飾と言われる。Ｐ１修飾は、アプタマードメインのＰ１ステムの配列及び／又は長さに対する変化を含む。
【００７０】
図１及び米国出願公開第２００５−００５３９５１号の図１１に示されるアプタマードメイン（任意の直接的な変異体を含む）は、インビトロの選択又はインビトロの進化技術を介して誘導されたアプタマードメインを生産するための初期の配列として特に有用である。
【００７１】
開示されたリボスイッチのアプタマードメインはまた、任意の他の目的のために、例えば、任意の他の文脈において、アプタマーとして使用することができる。例えば、アプタマーは、リボザイム、他の分子スイッチ、及び任意のＲＮＡ分子を制御するために使用することができ、構造の変化は、ＲＮＡの機能に影響を与え得る。
【００７２】
２．発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、リボスイッチを含有するＲＮＡ分子の発現に影響するリボスイッチの一部である。発現プラットフォームドメインは、一般的に、ステム構造を形成することによって、連結したアプタマードメインの部分と相互作用することができる少なくとも１つの部分を有する。このステム構造は、誘因分子の結合に応じて、形成するか又は崩壊するかのいずれかであろう。ステム構造は、一般的に、発現制御構造であるか、又はその形成を妨げるかのいずれかである。発現制御構造は、この構造を含有するＲＮＡ分子の発現を可能にし、妨げ、増加し、又は阻害する構造である。例には、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列、開始コドン、転写ターミネーター、並びに安定性及び加工のシグナルが含まれる。
【００７３】
Ｂ．誘因分子
誘因分子は、リボスイッチを活性化することができる分子及び化合物である。これは、リボスイッチのための天然若しくは正常な誘因分子、及びリボスイッチを活性化することができる他の化合物を含むことができる。天然又は正常な誘因分子は、天然にある所定のリボスイッチのための誘因分子であり、又はある非天然のリボスイッチである場合には、リボスイッチが設計され、若しくはリボスイッチが（例えば、インビトロ選択又はインビトロ進化技術におけるように）選択される誘因分子である。非天然の誘因分子は、非天然の誘因分子と呼ばれることができる。
【００７４】
Ｃ．化合物
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる化合物、及びこのような化合物を含有する組成物はまた開示される。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去を通じて遺伝子発現を制御するように機能する。化合物は、リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用することができる。リボスイッチに対する誘因分子（並びに他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用することができる。誘因分子以外の化合物は、一般的に、リボスイッチを失活又は遮断するために使用することができる。リボスイッチはまた、例えば、リボスイッチの存在から誘因分子を除去することによって失活することができる。リボスイッチは、例えば、リボスイッチを活性化しない誘因分子の類似体の結合によって遮断することができる。
【００７５】
ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を変化させるための化合物が開示され、ＲＮＡ分子は、リボスイッチを含む。これは、化合物をＲＮＡ分子と接触させることによって達成することができる。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去を通じて遺伝子発現を調節するように機能する。このように、リボスイッチを含む関心のあるＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する条件に供することは、ＲＮＡの発現を変化するために使用することができる。発現は、例えば、転写の終結又はＲＮＡに結合するリボゾームの遮断の原因として変化させることができる。誘因分子の結合は、リボスイッチの性質に依存し、ＲＮＡ分子の発現を減少し若しくは妨げ、又はＲＮＡ分子の発現を促進し若しくは増加することができる。
【００７６】
ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を制御するための化合物はまた開示される。リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによって、リボスイッチを含有する天然に発生する遺伝子又はＲＮＡの発現を制御するための化合物はまた開示される。遺伝子が、それを収用する細胞又は生物の生存に本質的である場合、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することは、細胞又は生物の死、静止又は衰弱の原因となり得る。
【００７７】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによって、リボスイッチを含有する単離され、遺伝子操作され、又は組換え遺伝子又はＲＮＡの発現を制御するための化合物はまた開示される。遺伝子が所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチを活性化又は失活することは、遺伝子の発現を誘導し、つまり、発現産物の生産に帰着するために使用することができる。遺伝子が、遺伝子発現、又は別の細胞の過程の誘導剤又は抑制剤をコードする場合、リボスイッチの活性化、失活又は遮断は、他の制御された遺伝子又は細胞の過程の誘導、抑制又は低下に帰着し得る。このような多くの二次的制御効果は知られ、リボスイッチを用いた使用に適合され得る。このような制御に対する一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチの誘因分子が小さく、非抗原性分子であるということである。
【００７８】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定する方法はまた開示される。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価することによって同定することができる。リボスイッチが活性化される場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、任意の適したやり方で評価され得る。例えば、リボスイッチは、レポーターＲＮＡに連結することができ、そして、リポーターＲＮＡの発現、発現レベル、又は発現レベルの変化は、試験化合物の有無で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、立体構造に依存したラベルを含み、シグナルはリボスイッチの活性化状態に依存して変化する。このようなリボスイッチは、好ましくは、天然に発生するリボスイッチ由来のアプタマードメイン、又はそれから誘導されるアプタマードメインを使用する。見ることができるように、リボスイッチの活性化の評価は、対照アッセイ若しくは測定の使用を伴って、又は対照アッセイ若しくは測定の使用を伴わないで、実行することができる。リボスイッチを失活する化合物を同定するための方法は、類似のやり方で実行することができる。
【００７９】
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、任意の適切なやり方で達成することができる。例えば、アッセイは、リボスイッチを活性化又は失活することが知られた化合物の存在下で、そして、試験化合物の存在下で、リボスイッチの活性化又は失活を評価するために実行される。活性化又は失活が、試験化合物がない場合に観察されたであろうようには観察されなければ、試験化合物は、リボスイッチの活性化又は失活を遮断する化合物として同定される。
【００８０】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定し、そして、同定された化合物を製造することによって作成された化合物はまた開示される。これは、例えば、同定された化合物を製造するための方法を用いて、本明細書の他の場所で開示された化合物同定法を組み合わせることによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化された場合、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって作製され得る。
【００８１】
化合物によるリボスイッチの活性化、失活又は遮断をチェックし、そして、チェックされた化合物を製造することによって作製される化合物はまた開示される。これは、例えば、本明細書中に開示された化合物の活性化、失活又は遮断評価法と、チェックされた化合物を製造する方法とを組み合わせることによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化された場合、リボスイッチを活性する試験化合物を化合物として製造することによって作製することができる。リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力について化合物をチェックすることは、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することが以前には未知であった化合物の同定、及び化合物がリボスイッチを活性化、失活又は遮断することがすでに知られていた、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力を評価することの両方を意味する。
【００８２】
１．化学的定義セクション
本明細書中で使用するとき、用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことが意図される。広範な側面では、許容される置換基は、有機化合物の非環式及び環式の、分岐した及び分岐しない、炭素環式及びヘテロ環式の、そして、芳香族及び非芳香族の置換基を含む。例示的な置換基は、例えば、下記に記載したものを含む。許容される置換基は、１以上の、適切な有機化合物に対して同じか又は異なっていることができる。この開示の目的のために、ヘテロ原子、例えば、窒素は、水素置換基及び／又はヘテロ原子の原子価を満足する本明細書中に開示された有機化合物の任意の許容される置換基を有することができる。この開示は、有機化合物の許容される置換基によっていかなる方法でも限定することを意図しない。また、用語「置換」又は「で置換された」は、このような置換が、置換された原子の許容される原子価及び置換基に従っていること、及び、置換が、適切な化合物、例えば、再配列、環化、脱離等によって、自然に転換しない化合物に帰着することの暗黙の条件を含む。
【００８３】
「Ａ1」、「Ａ2」、「Ａ3」及び「Ａ4」は、種々の特異的置換基を表す遺伝的シンボルとして本明細書中で使用される。これらのシンボルは、任意の置換基を含むことができ、本明細書中に開示されたものに限定されず、そして、それらが、ある場合においては、ある種の置換基であると定義される場合、それらは、別の場合において、いくつかの他の置換基として定義され得る。
【００８４】
用語「アルキル」は、本明細書中で使用するとき、１〜４０個の炭素原子の分岐した又は分岐しない飽和した炭化水素基であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等である。アルキル基はまた、置換され又は未置換であり得る。アルキル基は、限定されないが、下記に記載されるようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換され得る。
【００８５】
本明細書を通じて、「アルキル」は、一般的に、未置換のアルキル基及び置換のアルキル基の両方を意味するように使用されるが；しかしながら、置換されたアルキル基はまた、アルキル基上の特定の置換基（又は複数）を同定することによって本明細書中に言及される。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、具体的には、１つ以上のハロゲン化物、例えば、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素で置換されるアルキル基を意味する。用語「アルコキシアルキル」は、具体的には、下記に記載されるように、１つ以上のアルコキシ基で置換されるアルキルを意味する。用語「アルキルアミノ」は、具体的には、下記に示されるような１つ以上のアミノ基で置換されるアルキル基等を意味する。「アルキル」がある場合において使用され、そして、「ハロゲン化アルキル」が別の場合において使用されるとき、用語「アルキル」は、「ハロゲン化アルキル」等のような特定の用語に言及しない。
【００８６】
この実施はまた、本明細書中で記載された他の基について使用される。つまり、「シクロアルキル」のような用語は、未置換及び置換シクロアルキル部分の両方を意味する一方で、置換された部分は、さらに、本明細書中で具体的に同定され得て；例えば、特定の置換されたシクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」に言及され得る。同様に、置換アルコキシは、具体的には、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」を意味することができ、具体的な置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」等であり得る。また、一般的用語、例えば、「シクロアルキル」、及び特定の用語、例えば、「アルキルシクロアルキル」を用いる実施は、一般的用語がまた特定の用語を含まないことを暗示することを意味しない。
【００８７】
用語「アルコキシ」は、本明細書中で使用されるとき、１個の末端のエーテル連結を通じて結合したアルキル基であり；つまり、「アルコキシ」基は、−ＯＡ1（ここで、Ａ2は、上記で定義されるように、アルキルである）として定義することができる。アルコキシ基のポリマーは、本明細書中、「ポリエーテル」を意味し、例えば、−ＯＡ1−ＯＡ2又は−ＯＡ1−（ＯＡ2）a−ＯＡ3（ここで、「ａ」は、ある整数であり、そして、Ａ1、Ａ2、及びＡ3は、アルキル基である）である。
【００８８】
用語「アルケニル」は、本明細書中で使用するとき、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する構造式を有する２〜４０個の炭素原子の炭化水素である。非対称構造、例えば、（Ａ1Ａ2）Ｃ＝Ｃ（Ａ3Ａ4）は、Ｅ及びＺ異性体の両方を含むことを意図する。これは、本明細書中の構造式に推測することができ、非対称アルケンが存在し、又は、結合記号Ｃ＝Ｃによって明示的に指示されることができる。アルケニル基は、限定されないが、下記に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換され得る。
【００８９】
用語「アルキニル」は、本明細書中で使用するとき、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する構造式を有する２〜４０個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は、限定されないが、下記に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン原子、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換され得る。
【００９０】
用語「アリール」は、本明細書中で使用するとき、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼン等を含む任意の炭素を基礎とした芳香族基を含有する基である。用語「アリール」はまた、芳香族基の環内に導入された少なくとも１つのハロゲン原子を有する芳香族基を含有する基として定義される「ヘテロアリール」を含む。ヘテロ原子の例は、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、及びリンを含む。同様に、用語「非ヘテロアリール」は、用語「アリール」にも含まれ、ヘテロ原子を含有しない芳香族基を含有する基を定義する。アリール基は、置換され又は置換されないことが可能である。アリール基は、限定されないが、本明細書中に定義されるようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換され得る。用語「ビアリール」は、アリール基の特別なタイプであり、アリールの定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンのような縮合した環構造を介して一緒に結合し、又は、ビフェニルのような１以上の炭素−炭素結合を介して結合される２つのアリール基を意味する。
【００９１】
用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用するとき、少なくとも３個の炭素原子からなる非芳香族の炭素を基礎とした環である。シクロアルキル基の例は、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。用語「ヘテロシクロアルキル」は、上記で定義されるようなシクロアルキル基であり、環の少なくとも１個の炭素原子は、ヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、又はリンで置換される。シクロアルキル基及びヘテロシクロアルキルは、置換されるか又は置換されないことが可能である。シクロアルキル基及びヘテロシクロアルキル基は、限定されないが、本明細書中に定義されるようなアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換することができる。
【００９２】
用語「シクロアルケニル」は、本明細書中で使用するとき、少なくとも３個の炭素原子からなり、少なくとも１つの二重結合、即ち、Ｃ＝Ｃを含有する非芳香族の炭素を基礎とした環である。シクロアルケニル基の例は、限定されないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル等を含む。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記で定義したシクロアルケニル基の１タイプであり、用語「シクロアルケニル」の意味に含まれ、環の少なくとも１つの炭素原子は、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、又はリンのようなヘテロ原子で置換される。シクロアルケニル基及びヘテロシクロアルケニル基は、置換され又は置換されないことが可能である。シクロアルケニル基及びヘテロシクロアルケニル基は、限定されないが、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む１以上の基で置換することができる。
【００９３】
用語「環状基」は、本明細書中、アリール基、非アリール基（即ち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニル基）、又はその両方のいずれかを意味するものとして使用される。環状基は、置換され又は置換されないことが可能である１以上の環系を有する。環状基は、１以上のアリール基、１以上の非アリール基、又は１以上のアリール基及び１以上の非アリール基を含有することができる。
【００９４】
用語「アルデヒド」は、本明細書中で使用するとき、式−Ｃ（Ｏ）Ｈによって表される。本明細書全体で、「Ｃ（Ｏ）」は、Ｃ＝Ｏに対する短い表記法である。
用語「アミン」又は「アミノ」は、本明細書中で使用するとき、式ＮＡ1Ａ2Ａ3によって表され、ここで、Ａ1、Ａ2、及びＡ3は、独立して、上記で記載したような、水素、アルキニル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００９５】
用語「カルボン酸」は、本明細書中で使用するとき、式−Ｃ（Ｏ）ＯＨによって表される。「カルボン酸塩」は、本明細書中で使用するとき、式−Ｃ（Ｏ）-によって表される。
用語「エステル」は、本明細書中で使用するとき、式−ＯＣ（Ｏ）Ａ1又は−Ｃ（Ｏ）ＯＡ1によって表され、ここで、Ａ1は、上記で記載されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００９６】
用語「ポリエステル」は、本明細書中で使用するとき、式−（Ａ1ＯＣ（Ｏ）Ａ2ＯＣ（Ｏ））a−によって表され、ここで、Ａ1及びＡ2は、独立して、本明細書中で定義されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基であり得て、そして、「ａ」は、ある整数である。「ポリエステル」はまた、少なくとも２つのカルボン酸基を有する化合物と少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物との間の反応によって製造される基を記載するために使用される用語である。
【００９７】
用語「エーテル」は、本明細書中で使用するとき、式Ａ1ＯＡ2によって表され、ここで、Ａ1及びＡ2は、独立して、上記で記載されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００９８】
用語「ケトン」は、本明細書中に使用するとき、式Ａ1Ｃ（Ｏ）Ａ2によって表され、ここで、Ａ1及びＡ2は、独立して、上記で定義されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケニル基であり得る。
【００９９】
用語「ハロゲン化物」は、本明細書中で使用するとき、ハロゲン、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を意味する。
用語「ヒドロキシル」は、本明細書中で使用するとき、式−ＯＨによって表される。
用語「スルホ−オキソ」は、本明細書中で使用するとき、式−Ｓ（Ｏ）Ａ1（即ち、「スルホニル」）、Ａ1Ｓ（Ｏ）Ａ2（即ち、「スルホキシド」）、−Ｓ（Ｏ）2Ａ1、Ａ1ＳＯ2Ａ2（即ち、「スルホン」）、−ＯＳ（Ｏ）2Ａ1、又は−ＯＳ（Ｏ）2ＯＡ1で表され、ここで、Ａ1及びＡ2は、上記で記載した水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクロアルケンリル基であり得る。本明細書全体で、「Ｓ（Ｏ）」は、Ｓ＝Ｏについての短い表記法である。
【０１００】
用語「スルホニルアミノ」又は「スルホンアミド」は、本明細書中で使用するとき、式−Ｓ（Ｏ）2ＮＨ−によって表される。
用語「チオール」は、本明細書中で使用するとき、式−ＳＨによって表される。
【０１０１】
「Ｌ］、「Ｘ」、「Ｒ」は、本明細書中で使用するとき、独立して、上記で列挙した１以上の基を所有することができる。例えば、Ｌが直鎖のアルキル基である場合、アルキル基の水素原子の１つは、場合により、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、ハロゲン化物等で置換することができる。選択される基に依存して、第一の基は、第二の基内に導入することができ、あるいは、第一の基は、第二の基にぶら下げる（即ち、結合する）ことができる。例えば、句「アミノ基を含むアルキル基」に関して、アミノ基は、アルキル基の骨格内に導入することができる。その代わりに、アミノ基は、アルキル基の骨格に結合することができる。選択される基の性質は、第一の基が第二の基に埋め込まれ又は結合するかどうかを決定するであろう。
【０１０２】
それとは反対に記述がない限り、楔形又は破線ではなく実線でのみ示される化学結合を含む式は、各々、可能な異性体、例えば、各鏡像異性体及びジアステレオマー、そして、異性体の混合物、例えば、ラセミ又はスカレミック混合物を意図する。
参照は、現在、開示した材料、化合物、組成物、製造品、及び方法の特定の側面、添付に実施例及び図に例示される具体例に詳細になされるであろう。
【０１０３】
２．材料及び組成物
本明細書中に開示したある種の材料、化合物、組成物、及び成分は、商業的に、又は当業者に一般的に既知である技術を用いて容易に得ることができる。例えば、開示した化合物及び組成物を製造するために使用される出発材料及び試薬は、商業的な供給者、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｃａｌ  Ｃｏ．，（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、又はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から利用可能であるか、又はＦｉｅｓｅｒ及びＦｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，１９９１）；Ｒｏａｄｄ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８９）；Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，１９９１）；Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，第４版）；及び、Ｌａｒｏｃｋ’ｓ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）。
【０１０４】
一態様において、１以上の部分を有するリンカーに結合したグリシン残基を有する組成物が本明細書中に開示され、この組成物は、リボスイッチに結合することができる。開示した化合物は、式Ｉ：
【化１】
2008515436.tif 000002
（式中、Ｌはリンカーであり、Ｘは部分であり、そして、ｎは１〜１０の整数である）
によって表すことができる。開示された化合物は、生物学的に利用することができ、リボスイッチにしっかりと結合し、患者に非毒性であり、そして、期待される薬物速度論的特性を有することが期待される。このような化合物は、グアニン応答性リボスイッチ（及び、グアニン応答性リボスイッチから誘導されたリボスイッチ）とともに有用である。
【０１０５】
上記の定義内の全ての化合物は、本明細書中に具体的に開示されることが意図され、そうであると考えるべきである。さらに、上記の定義内に特定することができる全てのサブグループは、本明細書中に具体的に開示されることが意図され、そうであると考えるべきである。結果として、任意の化合物、又は化合物のサブグループは、使用のために具体的に含まれるか若しくは排除されるか、あるいは化合物のリストに含まれるか若しくは排除されるかのいずれかであり得る。例えば、１つの選択肢として、化合物のグループは、各化合物が上記で定義されるが、グリシンではない場合に意図される。別の例として、化合物のグループは、各化合物が上記で定義され、グリシン応答性リボスイッチを活性化することができる場合に意図される。
【０１０６】
ｉ．リンカー（Ｌ）
開示した組成物のリンカー部分（Ｌ）は、１以上の部分（Ｘ）にグリシン残基を接合できる任意の部分であり得る。本明細書中に開示されるように、部分（Ｘ）は、元々、リンカーに存在しているか、官能基の変換を通じてリンカー上に存在する官能基から誘導されるか、あるいは連結部分がグリシン残基にカップルする前、その最中若しくはその後に連結部分に結合することができる。グリシン残基及び／又は部分へのリンカー（Ｌ）の結合は、当該技術分野において既知の反応方法によって共有結合を介してなすことができる。例えば、部分（Ｘ）は、すでにリンカー上に存在し、又は初めにリンカーにカップルさせ、次に、グリシン残基に結合することができる。あるいは、リンカーは、初めにグリシン残基にカップルさせ、その後、この部分に結合させることができる。
【０１０７】
リンカーは、長さにして１〜５０個の原子のように、長さを変化させることができる。例えば、リンカーは、長さにして１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６４７、４８、４９又は５０個の原子であり得て、表示した値のいずれかは、必要に応じて、上方及び／又は下方終端を形成することができる。さらに、リンカーは、置換され又は置換されないことが可能である。置換される場合、リンカーは、リンカーの骨格、又はリンカーの骨格に組み込まれた置換基に結合した置換基を含有することができる。例えば、アミン置換したリンカーは、リンカーの骨格、又はリンカーの骨格中の窒素に結合したアミノ基を含有することができる。適した置換基の例は、限定されないが、本明細書中に開示されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールを含む。
【０１０８】
適したリンカーは、限定されないが、置換若しくは未置換の、分岐した若しくは分岐していないアルキル、アルケニル、又はアルキニル基、エーテル、エステル、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリアミン、ヘテロ原子置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロアルケニル基等、及びその誘導体を含む。
【０１０９】
ある態様において、リンカーは、Ｃ1−Ｃ12分岐鎖又は直鎖のアルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、又はドデシル基を含むことができる。これらのアルキルリンカーは、置換されないか、あるいは、限定されないが、本明細書中で開示されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールのような置換基で置換することができる。特定の実施例において、リンカーは、−（ＣＨ2）m−（ここで、ｍは、１〜１２である）を含むことができる。他の実施例において、リンカーは、−（ＣＨ2）m−（ここで、ｍは、２、３、５、６、７、８、９、又は１１である）を含むことができ；つまり、これらの実施例において、ｎは、１、４、１０又は１２ではない。このような化合物の実施例は、式ＩＩ：
【化２】
2008515436.tif 000003
（式中、ｍは、１〜１２の整数であり、そして、Ｘは、部分である）
で例示される。
【０１１０】
他の実施例では、リンカーは、Ｃ2−Ｃ12分岐鎖又は直鎖アルケニル又はアルキニルを含むことができる。このようなリンカーは、１以上の二重又は三重炭素−炭素結合を有することができる。このようなアルケニル又はアルキニルリンカーは、置換されないか、又は、限定されないが、本明細書中に記載されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールのような置換基で置換することができる。
【０１１１】
他の実施例では、リンカーは、Ｃ2−Ｃ20分岐鎖又は直鎖アルキルを含むことができ、ここで、１以上の炭素原子は、酸素（例えば、エーテル）又はアミノ基で置換される。例えば、適切なリンカーは、限定されないが、メトキシメチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、メトキシブチル、エトキシメチル、エトキシエチル、エトキシプロピル、プロポキシメチル、プロポキシエチル、メチルアミノメチル、メチルアミノエチル、メチルアミノプロピル、メチルアミノブチル、エチルアミノメチル、エチルアミノエチル、エチルアミノプロピル、プロピルアミノメチル、プロピルアミノエチル、メトキシメトキシメチル、エトキシメトキシメチル、メトキシエトキシメチル、メトキシメトキシエチル等、及びそれらの誘導体を含むことができる。このようなリンカーは、置換されないか、又は限定されないが、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールのような置換基で置換することができる。１つの特定の態様において、リンカーは、ポリエーテル、即ち、−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）m−（ここで、ｍは、１〜２０の整数である）を含むことができる。このような化合物の例は、式ＩＩＩ：
【化３】
2008515436.tif 000004
（式中、ｍ及びｐは、１〜２０の整数であり、Ｙは、Ｏ又はＮＨであり、そして、Ｘは、部分である）
において例示される。
【０１１２】
リンカーの更なる他の例は、ポリエステルであり得る。ポリエステルは、置換されないか、又は限定されないが、本明細書に記載されるアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、スルホ−オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、又はチオールのような置換基で置換することができる。
【０１１３】
適切なリンカーは、容易に商業的に利用することができ、及び／又は当業者によって合成することができる。そして、開示した組成物に使用することができる特定のリンカーは、費用、利便性、利用可能性、種々の反応条件との適合性、リンカーが相互作用されるべき第一及び／又は第二の活性物質のタイプ等に基づいて、当業者によって選択され得る。
【０１１４】
ｉｉ．部分（Ｘ）
開示した化合物は、１以上の部分（Ｘ）を有することができる。このような部分は、不活性であり得て、又は反応性であり得る。例えば、このような部分は、−Ｈであるか、又は存在しないことが可能である。別の例として、このような部分は、求核部分と反応することができ、結合を形成する求電子性部分であり得る。
【０１１５】
「求核部分」は、電子に富んだ原子を含有し、又は含有するように作製され得る任意の部分を意味する；求核性官能基の例は、本明細書中に開示される。「求電子性部分」は、電子を不足した原子を含有し、又は含有するように作製され得る任意の部分を意味する；求電子官能基の例はまた、本明細書中に開示される。
【０１１６】
ａ．求核部分
求核部分の例は、限定されないが、アミノ基、カルボキシレート基、ヒドロキシル基、及びチオール基を含む。このような求核基は、上述のように、リンカー上に存在することができ、リンカーに添加することができ、又はリンカー上の官能基から誘導することができる。いくつかの実施例では、求核部分は、アミノ酸残基であり得る。例えば、開示した化合物では、この部分は、天然に発生するアミノ酸の２０分の１の残基であり得る。例えば、２０個のアミノ酸のいずれかに存在する求核性又は潜在的に求核性のアミンを使用することができる。このような化合物の例は、式ＩＶ：
【化４】
2008515436.tif 000005
｛式中、Ｌは、リンカーであり、そして、Ｒは、アミノ酸の側鎖（例えば、グリシンに対するＨ、アラニンに対する−ＣＨ3、バリンに対する−ＣＨ（ＣＨ3）2、セリンに対するＣＨ2ＯＨ等）である｝
において開示される。
【０１１７】
具体的な例において、官能基は、別のグリシン残基である。
アミン基への添加又はそれに代えて、多くのアミノ酸上の他の基はまた、求核性であり得て、つまり、求電子性基に結合することができることがまた意図される。例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸の側鎖にあるカルボキシレート又はカルボン酸基、セリン、スレオニン及びチロシンの側鎖にあるヒドロキシル基、システインのチオール基、又はリジンのアミノ基が結合することができる。求核性部分の他の例は、限定されないが、炭水化物、多糖、脂質、飽和及び不飽和脂肪酸、又は求核性若しくは潜在的に求核性のアミン、カルボキシレート、アルコール、又はチオール官能基を所有するコレステロールを含む。これら及び他の例は、本明細書中に開示される。
さらに、求核部分の１より多くのタイプは、開示した化合物に存在し得ることが意図される。
【０１１８】
ｂ．求電子性部分
このような求電子性部分の例は、限定されないが、アルデヒド、エステル及び活性化エステル（例えば、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル）、誘導化カルボン酸及びカルボキシレート、イミン、イソシアネート、イソチオシアネート、及びマレイミドを含む。これらの部分は、有機化学の技術分野において周知である。
【０１１９】
適した求電子性部分のいくつかの具体的な例は、限定されないが、グルタールアルデヒド、グリオキサル、メチルグリオキサル、ベンズアルデヒド、ジアルキルオキシレート、ジアルキルフマレート、ジアルキルマロネート、ジアルキルスクシネート、ジアルキルアジペート、ジアルキルアゼレート、ジアルキルスベレート、ジアルキルセバケート、ジアルキルテレフタレート、ジアルキルイソフタレート、ジアルキルフタレート等を含む。
【０１２０】
スクシンイミジルエステル部分はまた、アミン、カルボキシレート、アルコール、又はチオール官能基と反応することができる。スクシンイミジルエステルは、アミンに対して特に反応性であり、形成される得られたアミド結合は、ペプチド結合と同程度に安定である。しかしながら、いくつかのスクシンイミジルエステルリンカーは、水溶液に全く不溶性であり得るため、特定の応用と適合しないかもしれない。この制限を克服するために、スルホスクシンイミジルエステルは、典型的には、スクシンイミジルエステルリンカーよりも高い水溶性を有し、使用することができる。スルホスクシンイミジルエステルは、一般的に、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含有するアミン不含緩衝液中に酸を溶解することによって、単なるカルボン酸からそのままで製造することができる。また、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（ＳＴＰ）エステルは、スルホスクシンイミジルエステルと同様の方法で、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノールから製造することができる。
【０１２１】
Ｄ．構築物、ベクター及び発現系
開示したリボスイッチは、いずれかの適した発現系で使用することができる。組換え発現は、プラスミドのようなベクターを用いて実用的に達成される。ベクターは、発現されるべき配列及びＲＮＡ（タンパク質をコードするＲＮＡ）をコードするリボスイッチに実施可能に連結したプロモータを含むことができる。ベクターはまた、転写及び翻訳に必要とされる他のエレメントを含むことができる。本明細書中に使用するとき、ベクターは、外因性ＤＮＡを含有する任意の担体を意味する。このように、ベクターは、外因性の核酸を分解なしに細胞に運搬し、輸送される細胞に核酸の発現を生じるプロモータを含む試薬である。ベクターは、限定されないが、プラスミド、ウイルス性核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、及び人工染色体を含む。リボスイッチを制御した構築物を担持するのに適した種々の原核性及び真核性発現ベクターを製造することができる。このような発現ベクターは、例えば、ｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、及び酵母ベクターを含む。ベクターは、例えば、種々のインビボ及びインビトロの状況で使用することができる。
【０１２２】
ウイルス性ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓ及び他のＲＮＡウイルスを含み、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。また、ベクターとしての使用に適したものとするこれらのベクターの性質を共有する任意のウイルス性ファミリーはまた有用である。レトロウイルスベクターは、Ｖｅｒｍａ（１９８５）に記載され、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａウイルス、ＭＭＬＶ、及びベクターとしてのＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスを含む。典型的には、ウイルスベクターは、非構造性初期遺伝子、構造性後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びカプセル化に必要な逆方向末端反復、及びウイルスゲノムの転写及び複製を制御するプロモータを含有する。ベクターとして遺伝子操作した場合、ウイルスは、典型的には、取り除かれた初期遺伝子の１以上を有し、そして、遺伝子又は遺伝子／プロモータ・カセットは、取り除かれたウイルス性ＤＮＡの場所にウイルスゲノムに挿入される。
【０１２３】
「プロモータ」は、一般的に、転写開始部位に対して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列（又は複数）である。「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基礎的な相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流のエレメント及び反応性エレメントを含有することができる。
【０１２４】
「エンハンサー」は、一般的に、転写開始部位から固定されていない距離で機能するＤＮＡの配列を意味し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，１９８１）又は３’（Ｌｕｓｋｙら、１９８３）のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｉｊら、１９８３）、並びにそれ自身のコーディング配列内（Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９８４）にあり得る。それらは、通常、長さにして１０〜３００ｂｐの間であり、そして、それらはシスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモータからの転写を増加するように機能する。エンハンサーはまた、プロモータと同じく、しばしば、転写の制御を仲介する反応性エレメントを含有する。エンハンサーは、しばしば、発現の制御を決定する。
【０１２５】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）に使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写の終結に必要な配列を含有することができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域を含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットがｍＲＮＡのように加工され、そして、輸送されるであろう可能性を増加することである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、十分に確立される。同族のポリアデニル化シグナルは、トランス遺伝子構築物において使用されることが好ましい。
【０１２６】
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に輸送されたかどうかを測定するために使用され、一度輸送されれば発現される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１２７】
ある態様において、マーカーは、選択可能なマーカーであり得る。このような選択可能なマーカーは、宿主細胞に十分に移入される場合、形質転換した宿主細胞は、選択圧下で置換された場合に生き残ることができる。２種の幅広く使用される異なったカテゴリーの選択的形態がある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝に基づき、添加培地とは無関係に成長する能力を欠如した突然変異した細胞株の使用である。第二のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームに言及する優性選択であり、突然変異した細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の増殖を止める薬物を使用する。新規な遺伝子を有するそれらの細胞は、薬物耐性を搬送するタンパク質を発現し、選択を生き残るであろう。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ、１９８２）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ、１９８０）又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、１９８５）を使用する。
【０１２８】
遺伝子導入は、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、及び人工染色体中の遺伝的材料の直接的な移入を用いて得ることができ、又は細胞若しくはカチオン性リポソームのような担体中の遺伝的材料の移入を介して得ることができる。このような方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に記載した方法において使用に対して容易に適合することができる。移入ベクターは、細胞への遺伝子を輸送するために使用される任意のヌクレオチド構築物であり得て（例えば、プラスミド）、又は、遺伝子を輸送するための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルス若しくはアデノウイルス（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８（１９９３））の一部としての構築物である。トランスフェクションの適切な手段は、ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、又はエレクトロポレーションのような物理的機械的方法、及び直接的なＤＮＡの拡散を含み、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；及び、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）に記載される。
【０１２９】
１．ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓ及び他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。また、ベクターとしての使用のために適したようにするこれらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーが好ましい。好ましいレトロウイルスは、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍａｌｏｎｅｙ  Ｌｅｕｋｅｍｉａウイルス、ＭＭＬＶ、及びベクターとしてＭＭＬＶの所望の性質を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝的積載量、即ち、トランス遺伝子又はマーカー遺伝子を担持することができ、このために、共通して使用されるベクターである。しかしながら、それは、非増殖性細胞において有用ではない。アデノウイルスベクターは、作用するのに比較的安定かつ容易であり、高い力価を有し、エアロゾル形成で輸送することができ、非分割性細胞に導入することができる。ポックスウイルスは、挿入した遺伝子に対して大きく、しかもいくつかの部位を有し、それは、温度安定性であり、室温で保存することができる。好ましい態様は、ウイルス抗原によって発揮される、宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されているウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０に対するコーディング領域を担持するであろう。
【０１３０】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための大部分の化学的又は物理学的方法よりもより高い導入能力（遺伝子を導入する能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的な初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びカプセル化に必要な逆方向性末端繰り返し、そして、ウイルスゲノムの転写及び複製を制御するプロモータを含有する。ベクターとして遺伝子操作した場合、ウイルスは、典型的には、取り除かれた初期遺伝子の１以上を有し、遺伝子又は遺伝子／プロモータカセットを取り除かれたウイルスＤＮＡの場所でウイルス遺伝子に挿入される。このタイプの構築物は、外来遺伝的材料の約８ｋｂまで担持することができる。取り除かれた初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように遺伝子操作されている細胞株によって供給される。
【０１３１】
ｉ．レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、任意のタイプ、サブファミリー、種、又は動向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を含む、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９８５）に記載され、これは、本明細書中に参照により援用される。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを用いる方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号及び第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６及びＷＯ８９／０７１３６号；及び、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載され；これらの教示は、参照により本明細書中に援用される。
【０１３２】
レトロウイルスは、本質的には、核酸の積荷をそれに包むパッケージである。核酸の積荷は、複製した娘分子がパッケージされた被覆内で効率的にパッケージされるであろうことを確かめるパッケージ・シグナルをそれと一緒に担持する。パッケージ・シグナルに加えて、複製、及び複製されたウイルスのパッケージングのために、シスで必要とされる多くの分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質被覆の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含有する。それは、標的細胞に移入されるべきである外来遺伝子によって典型的に置換されるｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスは、典型的には、パッケージコートに導入のためのパッケージ・シグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始の合図を送る配列、逆転写に必要なエレメントを含有し、逆転写ｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位、ＤＮＡ合成中のＲＮＡ鎖のスイッチを指揮する末端繰り返し配列、ＤＮＡ合成の二次鎖の合成のためのプライミング部位として使用する３’ＬＴＲに対するプリンリッチな５’配列、及び宿主ゲノム内に挿入するためにレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲ端近辺の特異的な配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の除去は、外来配列の約８ｋｂをウイルス性ゲノム内に挿入されるのを可能にし、逆転写され、そして、複製に応じて、新規なレトロウイルス性粒子内にパッケージされる。この核酸の量は、各転写物のサイズに依存した多くの遺伝子のうちの１つの輸送には十分である。挿入物の他の遺伝子と共に、ポジティブ又はネガティブな選択可能なマーカーのいずれかを含むことが好ましい。
【０１３３】
複製機構、及び大部分のレトロウイルスベクターのパッケージング・タンパク質が除去さされているため（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）は、ベクターは、典型的には、それらをパッケージング細胞株に置換することによって発生される。パッケージング細胞株は、複製及びパッケージング機構を含有するが、いずれのパッケージングシグナルを欠損しているレトロウイルスを用いて移入され又は形質転換されている細胞株である。選択のＤＮＡを担持するベクターが、これらの細胞株へトランスフェクトされる場合、挿入物の遺伝子を含有するベクターは、複製され、そして、ヘルパー細胞によるｃｉｓに与えられる機構によって、新規なレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。この機構のためのゲノムは、それらが必要なシグナルを欠損しているため、パッケージされない。
【０１３４】
ｉｉ．アデノウイルスベクター
複製欠損のアデノウイルスの構築は記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ「リポソームを介したトランスフェクション及びＰＣＲ分析による組換えアデノウイルスの発生及び同定」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２（１９９３））。ベクターとしてのこれらのウイルスの使用の利益は、それらが、他の細胞型に広がることができる程度に制限され、これは、それらが、初期の感染した細胞内で複製することができるが、新規な感染性ウイルス粒子を形成することができないためである。組換えアデノウイルスは、気道の上皮細胞、肝細胞、血管内皮細胞、ＣＮＳ実質細胞及び多数の他の組織部位への直接的なインビボの輸送後に、高効率な遺伝子導入を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１（１９９３）；及びＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、野生型又は複製欠損のアデノウイルスと同様なやり方で、受容体を介したエンドサイトーシスによってウイルスが内在化した後、特異的な細胞表面受容体に結合することによって、遺伝子導入を達成する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ及びＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ及びＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ及びＰｅｒｓｓｏｎ、Ｊ．Ｖｉｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９（１９９３））。
【０１３５】
好ましいウイルスベクターは、除去されたＥ１遺伝子を有するアデノウイルスに基づくものであり、そして、これらのバイロンは、ヒト２９３細胞株のような細胞株において発生される。別の好ましい態様において、Ｅ１及びＥ３遺伝子の両方がアデノウイルスゲノムから除去される。
【０１３６】
別のタイプのウイルスベクターは、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損したパルボウイルスは、多くの細胞型に感染し、ヒトには非病原的であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型のベクターは、約４〜５ｋｂを運搬することができ、そして、野生型ＡＡＶは、第１９染色体内に安定に挿入することが知られている。この部位特異的な統合特性を含有するベクターが好ましい。本質的に好ましい態様のこのタイプのベクターは、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃ，ＣＡによって生産されるＰ４．１Ｃベクターであり、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、及び／又はマーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子を含有することができる。
【０１３７】
ウイルス及びレトロウイルス内に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を手助けするためのプロモータ、及び／又はエンハンサーを含有する。プロモータは、一般的に、転写開始部位と比較して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列又は複数の配列である。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互用のために要求されるコアエレメントを含有し、そして、上流エレメント及び応答エレメントを含有することができる。
【０１３８】
２．ウイルス性プロモータ及びエンハンサー
哺乳動物の宿主細胞へのベクター由来の転写を制御する好ましいプロモータは、種々の供給源、例えば、ポリーマ、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びのようなウイルス、最も好ましくは、サイトメガロウイルスのようなゲノムから、又は、異種の哺乳動物のプロモータ、例えば、ベータアクチンプロモータから得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期のプロモータは、複製のＳＶ４０ウイルス起源をも含有するＳＶ４０制限断片として好都合には得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））。ヒトのサイトメガロウイルスの前初期プロモータは、好都合には、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２））。当然、宿主細胞又は関連する種由来のプロモータはまた本明細書中で有用である。
【０１３９】
エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から固定されていない距離で機能し、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））又は３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡの配列を意味する。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９（１９８３））、並びにそのコーディング配列内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））にあり得る。それらは、通常、１０〜３００ｂｐの長さであり、ｃｉｓで機能する。エンハンサーは、プロモータの近傍から転写を増加するように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写制御を仲介する応答性エレメントを含有する。プロモータはまた、転写制御を仲介する応答性エレメントを含有する。エンハンサーは、しばしば、遺伝子発現の制御を決定する。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）から知られる一方で、典型的には、真核性の細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。好ましい例は、複製起源の後期部位（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモータエンハンサー、複製起源の後期部位のポリオーマエンハンサー、そして、アデノウイルスエンハンサーである。
【０１４０】
プロモータ及び／又はエンハンサーは、それらの機能を誘発する簡易又は特定の化学的事象のいずれかによって具体的に活性化され得る。システムは、テトラサイクリン及びデキサメタゾンのような試薬によって制御することができる。ガンマ線照射のような照射に晒すこと、又はアルキル化化学療法薬によってウイルス性ベクターの遺伝子発現を増加する方法もある。
【０１４１】
プロモータ及び／又はエンハンサー領域は、全ての真核性細胞型において活性であることが好ましい。このタイプの好ましいプロモータは、ＣＭＶプロモータ（６５０塩基）である。他の好ましいプロモータは、ＳＶ４０プロモータ、サイトメガロウイルス（全長のプロモータ）、及びレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１４２】
全ての特定の制御エレメントがクローニングされ、メラノーマ細胞のような特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用することができることが示されている。グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータは、グリア起源の細胞において選択的に遺伝子を発現するために使用されている。
【０１４３】
真核性宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を与えることができる転写の終結に必要な配列を含有し得る。これらの制御は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳起源はまた、転写終結部位を含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域を含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットが加工され、ｍＲＮＡのように運搬されるであろうという可能性を増加することである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、十分に確立される。異種のポリアデニル化シグナルがトランス遺伝子構築物に使用されることが好ましい。転写ユニットの好ましい態様において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、及び約４００塩基からなる。転写されたユニットが、単独で、又は、上記配列と一緒に他の標準的な配列を含有し、その構築物からの発現又はその安定性を改善することも好ましい。
【０１４４】
３．マーカー
ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に輸送される場合に測定するために使用され、一度、輸送されると発現する。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１４５】
ある態様において、マーカーは、選択可能なマーカーであることが可能である。哺乳動物細胞に適した選択可能なマーカーは、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシン、及びプロマイシンである。このような選択可能なマーカーは、哺乳動物の宿主細胞に首尾よく移入される場合、形質転換した哺乳動物の宿主細胞は、選択圧下に置かれても生存可能である。選択処方の２つの幅広く使用される異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは、細胞の代謝に基づき、添加培地に依存せずに成長する能力を欠如している突然変異した細胞株の使用である。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ-細胞及びマウスＬＴＫ-細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養の添加なしに成長する能力を欠如している。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠如しているため、それらは、欠けているヌクレオチドが添加培地に提供されない限り、生存することができない。培地を添加することの代わりは、そのままのＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子をそれらの遺伝子を欠損している細胞に導入することであり、つまり、それらの成長の要求を変化させることである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質添加していない個々の細胞は、非添加培地で生存できないであろう。
【０１４６】
第二のカテゴリーは、いずれかの細胞型において使用される選択スキームを意味し、突然変異した細胞株の使用を要求しない優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を阻む薬物を使用する。薬物耐性を搬送するタンパク質を発現するさいぼうは、選択に対して生き残るであろう。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．及びＢｅｒｇ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））又はハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。この３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８若しくはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性を搬送するために真核性制御下で細菌遺伝子を使用する。他は、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びプラマイシンを含む。
【０１４７】
Ｅ．バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチはまた開示される。バイオセンサーリボスイッチは、それらの同族の誘因分子の存在下で検出可能なシグナルを産生する遺伝子操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、誘因分子の閾値で又はそれを超えて誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボ又はインビトロで使用するために設計することができる。例えば、シグナルとして使用し、又はシグナルの産生に関与するタンパク質をコードするレポーターＲＮＡに実施可能に連結したバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を収容するように細胞又は生物を遺伝子操作することによってインビボで使用することができる。インビトロで使用するためのバイオセンサーリボスイッチの例は、立体構造に依存したラベルを含むリボスイッチ、リボスイッチの活性化状態に依存して変化するシグナルである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは、天然に発生しているリボスイッチのアプタマードメイン又はそのリボスイッチから誘導されるアプタマードメインを使用する。
【０１４８】
Ｆ．リポータータンパク質及びペプチド
リボスイッチの活性化の評価、又はバイオセンサーリボスイッチに関して、リポータータンパク質又はペプチドを使用することができる。レポータータンパク質又はペプチドは、ＲＮＡによってコードされ得て、その発現はリボスイッチによって制御される。実施例は、いくつかの特定のリポータータンパク質の使用を記載する。リポータータンパク質及びペプチドの使用は、周知であり、リボスイッチと一緒に使用するために容易に適合することができる。レポータータンパク質は、検出可能であるか、又は検出可能なシグナルを産生するいずれかのタンパク質又はペプチドであることが可能である。好ましくは、タンパク質又はペプチドの存在は、標準的な技術（例えば、ラジオイムノアッセイ、放射線ラベル、イムノアッセイ、酵素活性のためのアッセイ、吸光度、蛍光、ルミネッセンス、及びウェスタンブロット）を用いて検出することができる。より好ましくは、リポータータンパク質のレベルは、低いレベルでさえあっても、標準的な技術を用いて容易に定量可能である。有用なレポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質及びそれらの誘導体を含み、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓのホタル・ルシフェラーゼ（ＦＬ）、及びＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ＲＬ）である。
【０１４９】
Ｇ．立体構造に依存したラベル
立体構造に依存したラベルは、そのラベルが関連した分子又は化合物（例えば、リボスイッチ）の形態又は立体構造の変化に基づく蛍光強度又は波長の変化を生む全てのラベルを意味する。プローブ及びプライマーの状況で使用される立体構造に依存したラベルの例は、ビーコン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ、ＦＲＥＴプローブ、開裂可能なＦＲＥＴプローブ、ＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンプライマー、蛍光三重オリゴ（限定されないが、三重分子ビーコン又は三重ＦＲＥＴプローブを含む）、蛍光水溶性結合ポリマー、ＰＮＡプローブ及びＱＰＮＡプローブを含む。このようなラベルは、特に、それらの機能の原理は、リボスイッチとの使用に適合することができる。立体構造に依存したラベルのいくつかのタイプは、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ及びＫｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：２１−２７（２００１）に概要される。
【０１５０】
ステム沈静化ラベル、立体構造に依存したラベルの形態は、ステム構造が形成する場合、ラベルからの蛍光が沈静されるように近接にもたらされるように、クエンチング部分が核酸に位置した蛍光ラベルである。このステムが崩壊（そのラベルを含有するリボスイッチが活性化される場合のように）される場合、クエンチング部分は、蛍光ラベルにもはや近接せずに、蛍光が増加する。この効果の例は、分子ビーコン、蛍光三重オリゴ、三重分子ビーコン、三重ＦＲＥＴプローブ、及びＱＰＮＡプローブに見ることができ、操作原理はリボスイッチを用いた使用に適合することができる。
【０１５１】
ステム活性化ラベル、立体構造に依存したラベルの形態は、蛍光がステム構造の形成によって増加又は変更する場合のラベル又はラベル対である。ステム活性化ラベルは、アクセプター及びドナーが近接している場合（ラベルを含有する核酸鎖がステム構造を形成する場合）、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギーの移動によってアクセプターが蛍光を発するようになるように、アクセプター蛍光ラベル及びドナー部分を含むことができる。ステム活性化ラベルは、典型的には、ステム構造が核酸分子中に形成される場合、アクセプター及びドナーが接近するようになるように核酸分子（例えば、リボスイッチ）に位置した対のラベルである。ステム活性化ラベルのドナー部分がそれ自身、蛍光ラベルであれば、アクセプターに近接していない場合（つまり、ステム構造が形成されない場合）、蛍光としてエネルギー（典型的には、アクセプターの蛍光より異なる波長で）放出することができる。ステム構造が形成する場合、全体的な効果は、ドナー蛍光の減少及びアクセプター蛍光の増加となるであろう。ＦＲＥＴプローブは、ステム活性化ラベルの使用の一例であり、その操作原理は、リボスイッチを用いた使用に適合することが可能である。
【０１５２】
Ｈ．検出ラベル
リボスイッチ活性化、失活若しくは遮断、又はリボスイッチの活性化、失活若しくは遮断に応じて産生される核酸又はタンパク質の発現の検出及び定量を手助けするために、検出ラベルは、検出プローブ若しくは検出分子に導入されるか、又は発現した核酸若しくはタンパク質に直接導入され得る。本明細書中で使用するとき、検出ラベルは、直接的又は間接的に、核酸又はタンパク質に関連付けることができるいずれかの分子であり、それは、直接的又は間接的に測定可能であり、検出可能なシグナルに帰着する。このような多くのラベルは当業者に既知である。開示した方法の使用に適した検出ラベルの例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、及びリガンドである。
【０１５３】
適した蛍光ラベルの例は、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリトロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｙｅ（商標）のようなランタニドイオンの大環状キレート、蛍光エネルギー変換色素、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、並びにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７を含む。他の特定の蛍光ラベルは、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリン・コンプレクソン、アリザリン・レッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾン・ブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾン・オレンジＲ、アストラゾン・レッド６Ｂ、アストラゾン・イエロー７ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビサミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、硫酸ベルベリン、ビスベンザミン、ブランコフォアーＦＦＧ溶液、ブランコフォアーＳＶ、ボディピーＦ１、ブリリアント・スルホフラビンＦＦ、カルシエンブルー、カルシウムグリーン、カルコフロアーＲＷ溶液、カルコフロアーホワイト、カルコフォアーホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォアーホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンＯ、
【０１５４】
クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、Ｄａｎｓ（１−ジメチルアミノナファリン５スルホン酸）、Ｄａｎｓａ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロン・ジフロリド、ジフェニル・ブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリトロシンＩＴＣ、エウキリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレスカミン、フラ−２、ゲンアクリル・ブリリアントレッドＢ、ゲンアクリル・ブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲンアクリル・ピンク３Ｇ、ゲンアクリルイエロー５ＧＦ、グロキサリン酸、グラヌラーブルー、ヘマトポルフィリン、インド−１、イントラホワイトＣｆ液、ロイコフォアーＰＡＦ、ロイコフォアーＷＳ、リサミン・ローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファー・イエローＣＨ、ルシファー・イエローＶＳ、マグダラ・レッド、マリナ・ブルー、マキシロン・ブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロン・ブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、ニトロベンゾキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアー・ファースト・レッド、ヌクレアー・イエロー、ナイロサン・ブリリアント・フラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフックブルー、パラロサニリン（Ｆｅｕｌｇｅｎ）、ホルワイトＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセン・ポントクローム・ブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオン・イエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザール、ブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリン・マスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロン・ブリリアントレッド２Ｂ、セブロン・ブリリアントレッド４Ｇ、セブロン・ブリリアントレッドＢ、セブロン・オレンジ、セブロン・イエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベン・イソチオスルホン酸）、スチルベン、スナルフ１、スルホ・ローダミンＢキャンＣ、スルホ・ローダミンＧエクストラ、テトラサイクリン、チアジン・レッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チオゾール・オレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ウビテックスＳＦＣ、キシレン・オレンジ、及びＸＲＩＴＣを含む。
【０１５５】
有用な蛍光ラベルは、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチル・ローダミン）、及びシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７である。吸収及び発光極大は、それぞれ、これらの蛍光について：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、つまり、それらの同時検出を可能にする。蛍光色素の他の例は、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）、２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）、及び２’−クロロ−７’−フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）を含む。蛍光ラベルは、種々の商業的供給源から得ることができ、Ａｍｅｒｓｈｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｎｏを含む。
【０１５６】
関心のある追加のラベルは、それらが結合されるプローブが、標的分子に特異的に結合した場合にのみ、シグナルに対して提供するものを含み、この場合、このようなラベルは、「分子ビーコン」を含み、Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１４：３０３及びＥＰ００７０６８５Ｂ１に記載される。関心のある他のラベルは、米国特許第５，５６３，０３７号；ＷＯ９７／１７４７１及びＷＯ９７／１７０７６に記載されるものを含む。
【０１５７】
ラベルしたヌクレオチドは、合成中の発現した核酸への直接的な導入のための検出ラベルの有用な形態である。核酸に導入することができる検出ラベルの例は、核酸誘導体、例えば、ＢｒｄＵｒｄ（５−ブロモデオキシウリジン、Ｈｏｙ及びＳｃｈｉｍｋｅ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、アミノアリルデオキシウリジン（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４８（２０００））、５−メチルシトシン（Ｓａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９５１：１５７−１６５（１９８８））、ブロモウリジン（Ｗａｎｓｉｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））及びビオチン（Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））又はハプテン、例えばジオキシゲニン（Ｋｅｒｋｈｏｆ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））で修飾したヌクレオチドを含む。適した蛍光ラベルしたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ及びシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡに対する好ましいヌクレオチド類似体検出ラベルは、ＢｒｄＵｒｄ（ブロモデオキシウリジン、ＢｒｄＵｒｄ、ＢｒｄＵ、ＢＵｄＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ）である。ＤＮＡへの検出ラベルの導入のための他の有用なヌクレオチド類似体は、ＡＡ−ｄＵＴＰ（アミノアリル−デオキシウリジン・トリホスフェート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、及び５−メチル−ｄＣＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。ＲＮＡへの検出ラベルの導入のための有用なヌクレオチド類似体は、ビオチン−１６−ＵＴＰ（ビオチン−１６−ウリジン−５’−トリホスフェート、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３及びＣｙ５は、直接ラベルのためにｄＵＴＰに連結することができる。Ｃｙ３．５及びＣｙ７は、ビオチン−又はジゴキシゲニンをラベルしたプローブの二次的検出のためのアビジン又は抗ジゴキシゲニン結合体として利用することができる。
【０１５８】
核酸に導入される検出ラベル、例えばビオチンは、その後、当該技術分野において周知な高感度法を用いて検出することができる。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（Ｔｒｏｐｉｘ、Ｉｎｃ．）を用いて検出することができ、これは、ビオチンに結合し、その後、適した基質（例えば、ケミルミネッセント基質ＣＳＰＤ：ジソジウム、３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート；Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．）のケミルミネッセンスによって検出される。ラベルはまた、酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、ソイビーンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びポリメラーゼであり得て、これは、例えば、化学的シグナル増強を用いて、又は光（例えば、ケミルミネッセント１，２−ジオキセタン基質）又は蛍光シグナルを産生する酵素に対する基質を用いることによって検出することができる。
【０１５９】
２個以上のこれらの検出ラベルを合わせる分子はまた、検出ラベルであると考えられる。いずれかの既知の検出ラベルは、活性化した又は不活化したリボスイッチ、あるいは、開示した方法において産生された核酸又はタンパク質をラベル及び検出するために、開示したプローブ、タグ、分子及び方法とともに使用することができる。検出ラベルによって生じたシグナルを検出し、そして、測定するための方法はまた、当業者に既知である。例えば、放射活性同位元素は、シンチレーションカウンティング又は直接的な視覚化によって検出することができ；蛍光分子は、蛍光分光光度計を用いて検出することができ；リン蛍光分子は、蛍光分光光度計を用いて検出することができ、カメラを用いて直接的に視覚化することができ；酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出又は視覚化によって検出することができ；抗体は、その抗体に結合した二次的検出ラベルを検出することによって検出することができる。本明細書中で使用するとき、検出分子は、検出されるべき化合物又は組成物と相互作用する分子であり、又は１以上のラベルが結合している分子である。
【０１６０】
Ｉ．配列の類似性
本明細書中で検討されるように、用語「ホモロジー」及び「同一性」の使用は、「類似性」と同じものを意味することが理解される。つまり、例えば、用語「ホモロジー」の使用は、２つの配列（例えば、非天然の配列）の間で使用される場合、これは、これらの２つの配列の間の進化的な関係を必ずしも含むものではなく、むしろ、それらの核酸配列の間の類似性又は関連性を見ることである。２つの進化的に関連した分子の間のホモロジーを測定するための多くの方法は、それらが進化的に関係あるかどうかは関係なく、配列の類似性を測定するという目的のために、いずれかの２以上の核酸又はタンパク質に日常的に適用される。
【０１６１】
一般的に、いずれかの既知の変異体及び誘導体、又は本明細書中に開示したリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子及びタンパク質の生じ得るものを提示する１つのやり方は、特定の既知の配列に対するホモロジーの点から変異体及び誘導体を定義すると考えられる。本明細書中に開示した特定の配列のこの同定はまた、本明細書の他に開示されている。一般的に、本明細書に開示した種々のリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子及びタンパク質の変異体は、典型的には、規定の配列又は天然配列に対して、少なくとも、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントホモロジーを有する。当業者は、２つのタンパク質又は核酸、例えば遺伝子のホモロジーの決定の仕方を容易に理解する。例えば、ホモロジーは、そのホモロジーが最大レベルになるように２つの配列を整列した後に計算することができる。
【０１６２】
ホモロジーを計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実行することができる。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的ホモロジーアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似の方法のためのサーチ、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は検査によって実行することができる。
【０１６３】
同じタイプのホモロジーは、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示したアルゴリズムによって核酸について得ることができ、これらの文献は、少なくとも核酸整列に関連した材料について、参照により本明細書に援用される。いずれかの方法は、典型的には、使用することができ、ある種の場合にあっては、これらの種々の方法の結果は、異なることができることが理解され、しかし、当業者は、同定が、少なくとも１つのこれらの方法を用いて見出される場合、配列は規定の同一性を有すると言われるであろうことを理解する。
【０１６４】
例えば、本明細書中で使用するとき、別の配列に対する特定のパーセントホモロジーを有するものとして引用される配列は、上述した計算方法のいずれかの１以上によって計算されるような引用したホモロジーを有する配列を意味する。例えば、第一の配列は、本明細書に提示されるように、第一の配列が、他の計算方法のいずれかによって計算されるように二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有しない場合でさえ、Ｚｕｋｅｒ計算法を用いて、一次配列が二次配列に対して８０パーセントホモロジーを有するものとして計算される場合、二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有する。別の例として、一次配列がＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、又はいずれかのほかの計算法によって計算されるように、二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有しない場合でさえも、一次配列は、Ｚｕｋｅｒ計算法及びＰｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有するものと計算される場合、本明細書で定義されるように、二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有する。さらに別の例として、一次配列は、一次配列が各々の計算方法を用いて二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有すると計算される場合、本明細書で定義されるように、二次配列に対して８０パーセントのホモロジーを有する（しかし、実際には、異なる方法が、しばしば、異なる計算したホモロジーパーセントに帰着するであろう）。
【０１６５】
Ｊ．ハイブリダイゼーション及び選択的ハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイゼーション」は、典型的には、少なくとも２つの核酸分子、例えば、プライマー又はプローブ及びリボスイッチ又は遺伝子の間の相互作用を促進する配列を意味する。相互作用を促進する配列は、２つのヌクレオチド又はヌクレオチド類似体又はヌクレオチド誘導体の間にヌクレオチドの特定のやり方で発生する相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、又はＴと相互作用するＡは、相互作用を促進する配列である。典型的には、相互作用を促進する配列は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ力又はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ力で発生する。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に既知の多くの条件及びパラメータによって影響される。例えば、塩濃度、ｐＨ、反応温度の全ては、２つの核酸分子がハイブリダイズするであろうかどうかに影響する。
【０１６６】
２つの核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションについてのパラメータは、当業者に周知である。例えば、ある態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として定義することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のいずれか又はそれらの両方の温度及び塩濃度の両方によって調節される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（半分の分子がそれらのハイブリダイゼーションパートナーから解離する融解温度）の約１２〜２５℃以下である温度で、高イオン強度溶液（６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ）中でのハイブリダイゼーション、その後、洗浄温度がＴｍの約５℃〜２０℃以下になるように選択される温度及び塩濃度の組み合わせと関連することができる。温度及び塩条件は、フィルターに固相化した参照ＤＮＡの試料が関心のあるラベルした核酸にハイブリダイズし、その後、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される予備実験で実験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、典型的には、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに対するものよりも高い。この条件は、ストリンジェンシーを達成するために上述したように使用することができ、又は当業者に既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７、これは、核酸のハイブリダイゼーションに少なくとも関連した材料について、参照により、本明細書中に援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに対する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ中で約６８℃（水溶液）であり、その後、６８℃で洗浄され得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及び洗浄は、必要に応じて、所望の相補性の程度が減少するに従って、そして、いずれかの領域のさらに、Ｇ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて減らすことができ、ここで、可変性が検索される。同様に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及び洗浄は、必要に応じて、所望のホモロジーが増加するに従って、そして、さらに、いずれかの領域のＧ−Ｃ又はＡ−Ｔの豊富さに応じて、増加することができ、ここで、高いホモロジーが望まれ、全ては当該技術分野において既知である。
【０１６７】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、他の核酸に結合した核酸のうちの１つの量（パーセント）で見ることによる。例えば、ある態様において、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、制限的な核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが非制限的な核酸に結合した場合であろう。典型的には、非制限的な核酸は、例えば、１０又は１００又は１０００倍の過剰状態である。このタイプのアッセイは、制限的及び非制限的核酸の両方が、例えば、それらのｋdの１０倍又は１００倍又は１０００倍以下である場合、又はただ１つの核酸分子が１０倍又は１００倍又は１０００倍である場合、あるいは、１つの若しくは両方の核酸分子がそれらのｋdを超える場合の条件下で実行することができる。
【０１６８】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素的操作を促進するために必要とされる場合の条件下で酵素的操作される核酸のパーセントで検索することによる。例えば、ある態様において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００が、酵素的操作を促進する条件下で、例えば、酵素的操作がＤＮＡ抽出であるとして、酵素的に操作される場合であり、次いで、選択的ハイブリダイゼーション条件が、核酸分子の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長する場合である。好ましい条件はまた、製造業者によって示唆され、又は操作を実行する酵素に適しているように当該技術分野において指示されたものを含む。
【０１６９】
ホモロジーとちょうど同じく、２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションレベルを測定するための本明細書に開示した種々の方法があることが理解される。これらの方法及び条件は、２つの核酸分子の間の異なるパーセントのハイブリダイゼーションを提供することができることが理解されるが、しかし、他に指示がない限り、いずれかの方法のパラメータを合わせることが十分であろう。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが要求され、これらの方法のいずれか１つにおける要求されるパラメータ内でハイブリダイゼーションが生じる限り、本明細書中に開示されたと考えられる。
【０１７０】
当業者は、組成物又は方法が、共同的又は単独のいずれかでハイブリダイゼーションを測定するためのこれらの基準のいずれか１つを適合する場合、本明細書中に開示される組成物又は方法であると理解することが認識される。
【０１７１】
Ｋ．核酸
核酸を基礎とした種々の分子が本明細書中に開示され、例えば、リボスイッチ、アプタマー、並びにリボスイッチ及びアプタマーをコードする核酸を含む。開示した核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はヌクレオチド置換体から作製することができる。これらの非制限的な例、及び他の分子は、本明細書中に開示される。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現したｍＲＮＡは、典型的には、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵからなるであろうことが理解される。同様に、核酸分子が、例えば外因性輸送を通して細胞又は細胞環境に導入される場合、核酸分子は、細胞の環境において核酸分子の分解を減少する核酸類似体からなることは利点である。
【０１７２】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム及びいずれかの他のオリゴヌクレオチド及び核酸は、修飾したヌクレオチド（ヌクレオチド類似体）からなり又は含むことができる。多くの修飾したヌクレオチドは知られ、オリゴヌクレオチド及び核酸に使用することができる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、又はリン酸塩部分のいずれかに対していくつかのタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。塩基部分に対する修飾は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕの天然及び合成の修飾、並びに例えばウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、及び２−アミノアデニン−９−イルのような異なるプリン又はピリミジン塩基を含むであろう。修飾した塩基は、限定されないが、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル並びに他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２−プロピル並びに他のアデニン及びグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザアデニン及び３−デアザアデニンを含む。追加の塩基修飾体は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に見出すことができる。ある種のヌクレオチド類似体、例えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシンを含む５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンは、二重鎖形成の安定を増加することができる。他の修飾した塩基は、ユニバーサル塩基として機能するものである。ユニバーサル塩基は、３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールを含む。ユニバーサル塩基は、普通の塩基の代用であるが、塩基対における偏りを有しない。即ち、ユニバーサル塩基は、いずれの他の塩基と塩基対をなすことができる。塩基修飾体は、しばしば、例えば、２’−Ｏ−エトキシエチルのような糖修飾と組み合わせることができ、二重鎖の安定性のような独特の特性を達成する。数多くの米国特許が存在し、例えば、第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７���号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；及び第５，６８１，９４１号であり、これらは、塩基修飾体の範囲を詳述し、そして記載する。これらの特許の各々は、参照により全体として、特に、塩基修飾体、それらの合成、それらの使用、及びオリゴヌクレオチド及び核酸へのそれらの導入に関して、本明細書中に援用される。
【０１７３】
ヌクレオチド類似体はまた、糖部分の修飾体を含むことができる。糖部分に対する修飾体は、リボース及びデオキシリボースの天然の修飾体、並びに合成修飾体を含むであろう。糖修飾体は、限定されないが、下記の２’位の修飾体：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルを含み、ここで、前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。２’糖修飾体はまた、限定されないが、−Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、−Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、−Ｏ（ＣＨ2）n−ＯＮＨ2、及び−Ｏ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3）］2（ここで、ｎ及びｍは１〜約１０である）を含む。
【０１７４】
他の２’位の修飾体は、限定されないが、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論的特性を改善する基、又はオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善する基、及び類似の特性を有する他の置換基を含む。類似の修飾体はまた、糖の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位置、又は２’−５’連結のオリゴヌクレオチド、及び５’末端のヌクレオチドの５’位置内でなされ得る。修飾した糖はまた、ＣＨ2及びＳのような架橋環酸素で修飾体を含有するものを含むであろう。ヌクレオチド糖類似体はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖擬似体を有することができる。このような修飾した糖構造の調製を教示する数多くの米国特許が存在し、例えば、第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号であり、各々は、全体として、特に、修飾した糖構造、それらの合成、それらの使用、及びヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び核酸へのそれらの導入に関して、参照により本明細書中に援用される。
【０１７５】
ヌクレオチド類似体はまた、リン酸塩部分で修飾されることが可能である。修飾したリン酸塩部分は、限定されないが、２つのヌクレオチドの間の連結が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンリン酸塩及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホールアミデート及びアミノアルキルホスホールアミデートを含むホスホールアミデート、チノホスホールアミデート、チノアルキルホスホールアミデート、チノアルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートを含有するように修飾することができるものである。２つのヌクレオチド間のこれらのホスフェート又は修飾したホスフェート連結は、３’−５’連結又は２’−５’連結を通じてなすことができ、そして、その連結は、例えば３’−５’〜５’−３’又は２’−５’〜５’−２’のような反転した極性を含有することができることは理解される。種々の塩、混合した塩及び遊離酸形態はまた含まれる。数多くの米国特許は、修飾したリン酸塩を含有するヌクレオチドの作製及び使用の仕方を教示し、限定されないが、第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；及び第５，６２５，０５０号を含み、各々は、全体として、特に、修飾したリン酸塩のそれらの記載、それらの合成、それらの使用、及びヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び核酸へのそれらの導入に関して、参照により本明細書中に援用される。
【０１７６】
ヌクレオチド類似体は、１つの修飾を含むことのみを必要とするが、１つの部分内又は異なる部分の間に複数の修飾体を含有することができることは理解される。
ヌクレオチド置換体は、ヌクレオチドに対して類似した機能特性を有する分子であるが、リン酸塩部分を含まず、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド置換体は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ又はＨｏｏｇｓｔｅｅｎのやり方で相補的な核酸（に対する塩基対）を認識し、ハイブリダイズするであろう分子であるが、リン酸塩部分以外の部分を通じて一緒に連結される。ヌクレオチド置換体は、適切な標的核酸とともにインターカレートする場合、二本鎖ヘリックスタイプの構造に順応することができる。
【０１７７】
核酸置換体は、置換されたリン酸塩部分及び／又は糖部分を含んだヌクレオチド又はヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド置換体は、標準的なリン原子を含有しない。リン酸塩に対する置換体は、例えば、短鎖アルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド内連結、混合したヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルのヌクレオシド内連結、又は１以上の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環のヌクレオシド連結であり得る。これらは、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；サルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合したＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものを有するものを含む。数多くの米国特許は、これらのタイプのリン酸塩置換体の作製及び使用の仕方を開示し、限定されないが、第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；及び第５，６７７，４３９号を含み、各々は、全体として、特に、リン酸塩置換体のそれらの記載、それらの合成、それらの使用、及びヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び核酸へのそれらの導入に関して、参照により本明細書中に援用される。
【０１７８】
ヌクレオチドの糖及びリン酸塩部分の両方は、例えば、アミド型の連結（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）によって置換され得る核酸置換体において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号は、ＰＮＡ分子の作製及び使用の仕方を教示し、各々は、参照により本明細書中に援用される（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１）も参照されたい）。
【０１７９】
オリゴヌクレオチド及び核酸は、ヌクレオチドから構成され得て、異なるタイプのヌクレオチド又は同じタイプのヌクレオチドからなることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチド中の１以上のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物；約１０％〜約５０％のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物；約５０％以上のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物；あるいは、全てのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチド及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物である。このようなオリゴヌクレオチド及び核酸は、キメラオリゴヌクレオチド及びキメラ核酸を意味し得る。
【０１８０】
Ｌ．固相支持体
固相支持体は、分子（例えば、誘因分子）及びリボスイッチ（又は開示した方法で使用される又はその方法によって製造される他の成分）が関連され得る固相状態の基質又は支持体である。リボスイッチ及び他の分子は、直接的又は間接的に固相支持体と関連付けることができる。例えば、分析物（例えば、誘因分子、試験化合物）は、固相支持体の表面に結合し、又は固相支持体に固相化させた捕捉剤（例えば、分析物を結合する化合物又は分子）と関連付けることができる。別の例として、リボスイッチは、固相支持体の表面に結合し、又は固相支持体に固相化されたプローブと関連付けることができる。アレイは、複数のリボスイッチ、プローブ又は他の分子がアレイ、グリッド、又は他の系統的なパターンで関連付けられている固相支持体である。
【０１８１】
固相支持体での使用のための固相状態の基質は、成分が直接的又は間接的に関連付けることができるいずれかの固相材料を含むことが可能である。これは、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレン、酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、官能基化シラン、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸のような材料を含む。固相状態基質は、薄いフィルム、メンブレン、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織布ファイバー、造形したポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、又は組み合わせを含むいずれかの有用な形態を有することができる。固相状態基質及び固相支持体は、多孔質であるか又は孔質でないことが可能である。チップは、長方形又は正方形の小片の材料である。固相状態基質の好ましい形態は、薄いフィルム、ビーズ又はチップである。固相状態基質の有用な形態は、マイクロタイターディッシュである。いくつかの態様において、マルチウェルのガラススライドをしようすることができる。
【０１８２】
アレイは、固相支持体上に同定した又は所定の位置で固相化した複数のリボスイッチ、誘因分子、他の分子、化合物又はプローブを含むことができる。固相支持体上の各々の所定の位置は、一般的に１つのタイプの成分（即ち、その位置の全ての成分は同じである）を有する。あるいは、複数のタイプの成分は、固相支持体上の同じ所定の位置で固相化することができる。各々の位置は、所定の成分の複数のコピーを有するであろう。固相支持体上の異なる成分の空間的な分離は、別個の検出及び同定を可能にする。
【０１８３】
有用であるけれども、固相支持体は、単一なユニット又は構造であることは必要ない。一連のリボスイッチ、誘因分子、他の分子、化合物及び／又はプローブは、いずれかの数の固相支持体に亘って分布されることができる。例えば、一端に、各々の成分は、別個の反応管又は容器内に、あるいは、別個のビーズ又は微粒子上に固相化され得る。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドを固相状態基質に固相化する方法は、十分に確立されている。問題となっているプローブ及び検出プローを含むオリゴヌクレオチドは、確立したカップリング法を用いて基質にカップルさせることができる。例えば、適した結合法は、Ｐｅａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、及びＫｈｒａｐｋｏら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）に記載される。３’−アミンオリゴヌクレオチドをカゼイン被覆したスライドに固相化する方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６２７９−６３８３（１９９５）に記載される。オリゴヌクレオチドを固相状態基質に結合する有用な方法は、Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載される。
【０１８５】
固相支持体に固相化した各々の成分（例えば、リボスイッチ、誘因分子、又は他の分子）は、固相支持体の異なる所定の領域に位置することができる。異なる位置は、異なる反応チャンバーであり得る。各々の異なる所定の領域は、異なる他の各々の領域から物理的に離れていることができる。固相支持体の異なる所定の領域間の距離は、固定であるか又は可変的であるかのいずれかで可能である。例えば、アレイでは、各々の成分は、互いに固定した距離で配列することができ、一方、ビーズに関連した成分は、固定した空間的関係ではないであろう。特に、複数の固相支持ユニット（例えば、複数のビーズ）の使用は、可変的な距離に帰着するであろう。
【０１８６】
成分は、いずれかの距離で、固相支持体上に関連し、又は固相化されることができる。成分は、１立方センチメートル当り４００を超える異なる成分の密度で固相支持体に固相化することができる。成分のアレイは、いずれかの数の成分を有することができる。例えば、アレイは、固相支持体上に固相化した少なくとも１，０００個の異なる成分、固相支持体上に固相化した少なくとも１０，０００個の異なる成分、固相支持体上に固相化した少なくとも１００，０００個の異なる成分、又は固相支持体上に固相化した少なくとも１，０００，０００個の異なる成分を有することができる。
【０１８７】
Ｍ．キット
上述した材料、並びに他の材料は、いずれかの適した組み合わせで、開示した方法を実行するために、又はその実行を援助するのに有用なキットとして一緒に包装することができる。所定のキットのキット成分が設計され、開示した方法で一緒の使用に適合する場合に有用である。例えば、化合物を検出するためのキット、１以上のバイオセンサーリボスイッチを含むキットが開示される。キットはまた、リボスイッチの活性化を検出するための試薬及びラベルを含有することができる。
【０１８８】
Ｎ．混合物
開示した方法を実行すること、又は実行するために準備することによって形成される混合物が開示される。例えば、リボスイッチ及び誘因分子を含む混合物が開示される。
この方法は、組成物又は成分又は試薬を混合しあるいは接触することに関与するときはいつも、この方法を実行することは、多くの異なる混合物を作製する。例えば、この方法が３つの混合工程を含む場合、これらの工程の各１つの後に、工程を別々に実行する場合、独特の混合物が形成される。加えて、混合物は、工程がどのように実行されるかに関わらずに、全工程の完了で形成される。この開示は、これらの混合物を意図し、それらは、開示した方法の実行によって得られ、並びに、混合物は、いずれかの開示した試薬、組成物、又は成分、例えば本明細書中に開示されたものを含有する。
【０１８９】
Ｏ．システム
開示した方法を実行し、又はその実行を援助するのに有用なシステムが開示される。システムは、一般的に、構造、機械、装置等、及び組成物、化合物、材料等のような製造品の組み合わせを含む。開示されている又は開示から明白であるこのような組み合わせが意図される。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固相支持体及びシグナル読み取り装置を含むシステムが開示され及び意図される。
【０１９０】
Ｐ．データ構造及びコンピュータ制御
開示した方法に使用され、それによって発生し、又はそれから発生したデータ構造が開示される。データ構造は、一般的に、組成物又は媒体に回収され、組織化され、保存され、及び／又は具体化されたデータ、情報及び／又は対象のいずれかの形態である。電子的形態、例えば、ＲＡＭ又は保存ディスク中に保存されたリボスイッチ構造及び活性化測定値は、データ構造の１タイプである。
【０１９１】
開示した方法、又はそのいずれかの部分若しくはそのための準備は、制御され、管理され、又はその他にコンピュータ制御によって援助され得る。このようなコンピュータ制御は、コンピュータ制御のプロセス又は方法によって達成することができ、データ構造を使用及び／又は生じることができ、そして、コンピュータプログラムを使用することができる。このようなコンピュータ制御、コンピュータ制御のプロセス、データ構造、及びコンピュータプログラムが意図され、そして、本明細書中に開示されると理解されるべきである。
【０１９２】
方法
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する方法が開示される。このような方法は、例えば、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる化合物又は誘因分子とリボスイッチを接触させることに関与し得る。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去を通じて遺伝子発現を制御するように機能する。化合物は、リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用することができる。リボスイッチに関する誘因分子（並びに他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用することができる。誘因分子以外の化合物は、一般的に、リボスイッチを失活又は遮断するために使用することができる。リボスイッチはまた、例えば、リボスイッチの存在から誘因分子を除去することによって失活することができる。つまり、リボスイッチを失活するための開示した方法は、例えば、リボスイッチの存在又は接触から誘因分子（又は他の活性化化合物）を除去することに関与し得る。リボスイッチは、例えば、リボスイッチを活性化しない誘因分子の類似体の結合によって遮断することができる。
【０１９３】
ＲＮＡ分子（ここで、ＲＮＡ分子はリボスイッチを含む）又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を、化合物とＲＮＡ分子との接触によって変更するための方法が開示される。リボスイッチは、誘因分子の結合又は除去と通じて遺伝子発現を制御するように機能する。つまり、リボスイッチを含む関心のあるＲＮＡ分子を、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する条件に晒すことは、ＲＮＡの発現を変更するために使用することができる。発現は、例えば、転写の終結、又はＲＮＡに結合するリボスイッチを遮断することの結果として変更され得る。誘因分子の結合は、リボスイッチの性質に依存して、ＲＮＡ分子の発現を減少し又は阻害することができ、あるいは、ＲＮＡ分子の発現を促進し又は増加することができる。
【０１９４】
ＲＮＡ分子に操作的にリボスイッチを連結することによって、ＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードする遺伝子の発現を制御する方法はまた開示される。リボスイッチは、いずれかの適したやり方でＲＮＡ分子に実施可能に連結することができ、例えば、ＲＮＡ分子にリボスイッチを物理的に結合すること、又は、遺伝子操作した核酸から生じるＲＮＡがＲＮＡ分子に実施可能に連結したリボスイッチを有するように、リボスイッチを含み及びコードするＲＮＡ分子をコードする核酸を操作することを含む。関心のあるＲＮＡ分子に実施可能に連結したリボスイッチを、リボスイッチを活性化、失活又は遮断する条件に晒すことは、ＲＮＡの発現を晒すために使用することができる。
【０１９５】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによってリボスイッチを含有する天然に発生する遺伝子又はＲＮＡの発現を制御する方法はまた開示される。この遺伝子は、それを収用する細胞又は生物の生存に本質的である場合、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することは、細胞又は生物の死、静止又は衰弱の原因となり得る。例えば、微生物の生存に本質的である天然に発生している遺伝子において天然に発生しているリボスイッチを活性化することは、（リボスイッチの活性化が発現を止め又は抑制する場合）微生物の死の原因となり得る。これは、抗微生物及び抗生物質の効果に対する開示した化合物及び方法の使用に関する１つの基本である。
【０１９６】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することによってリボスイッチを含有する、単離され、遺伝子操作され、若しくは組換え遺伝子又はＲＮＡの発現を制御する方法はまた開示される。この遺伝子又はＲＮＡは遺伝子操作することができ、あるいはいずれかの方法で組換えることも可能である。例えば、リボスイッチ及びこのＲＮＡのコーディング領域は異種であり、リボスイッチは、組換え又はキメラ、あるいは両方であり得る。この遺伝子は、所望の発現産物をコードする場合、リボスイッチを活性化し又は不活性化することは、この遺伝子の発現を誘導するために使用することができ、即ち、発現産物の製造の原因となる。この遺伝子は、遺伝子発現又は別の細胞プロセスの誘導因子又は抑制因子をコードする場合、リボスイッチの活性化、失活又は遮断は、他の制御された遺伝子若しくは細胞プロセスの誘導、抑制又は脱抑制の原因となり得る。多くのこのような二次的制御効果は既知であり、リボスイッチを用いた使用に適合することができる。このような制御のための一次的制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチの誘因分子が小さく非抗原性の分子であり得ることである。
【０１９７】
リボスイッチの発現プラットフォームドメインにアプタマードメインを実施可能に連結することによってリボスイッチ（キメラ・リボスイッチである）の制御を変更する方法はまた開示される。次に、アプタマードメインは、例えば、アプタマードメインに対する誘因分子の活性化を通じてリボスイッチの制御を仲介することができる。アプタマードメインは、いずれかの方法によって、リボスイッチの発現プラットフォームドメインに実施可能に連結することができ、例えば、新規なアプタマードメインを用いてリボスイッチの正常な又は天然のアプタマードメインを置換することを含む。一般的に、アプタマードメインが誘導されるリボスイッチを活性化、失活又は遮断することができるいずれかの化合物又は条件は、キメラ・リボスイッチを活性化、失活又は遮断するために使用することができる。
【０１９８】
リボスイッチを共有結合的に変更することによって（例えば、リボスイッチの部分を架橋すること、又は化合物とリボスイッチとをカップリングさせることによって）リボスイッチを不活化するための方法はまた開示される。この方法によるリボスイッチの不活化は、例えば、誘因分子のリボスイッチに対する結合を妨げ、誘因分子の結合に応じてリボスイッチの状態の変化を妨げ、又は誘因分子の結合に応じてリボスイッチの発現プラットフォームドメインの発現に影響を与えることを妨げる変更に起因し得る。
【０１９９】
新規な誘因分子を認識する新規なリボスイッチ及び／又はアプタマーを選択し、設計し、又は誘導する方法はまた開示される。このような方法は、リボスイッチにおける一連のアプタマー変異体の生産、関心のある化合物の存在下における様々なリボスイッチの活性化を評価すること、活性化された様々なリボスイッチ（又は、例えば最も高度に又は最も選択的に活性化されたリボスイッチ）を選択すること、そして、所望の活性、特異性、活性及び特異性の組み合わせ、あるいは特性の他の組み合わせの種々のリボスイッチが得られるまでこれらの工程を繰り返すこと関与し得る。これらの方法によって製造したリボスイッチ及びアプタマードメインはまた開示される。
【０２００】
機能的核酸分子のインビトロでの選択及びインビトロでの進化の技術は知られ、リボスイッチ及びそれらの成分を用いた使用に適合することができる。有用な技術は、例えば、Ａ．Ｒｏｔｈ及びＲ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（２００３）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ−Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．，ｅｄ）、Ｈｕｍａｎａ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（２００２）Ｅｎｇｉｎｅｅｅｒｅｄ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：３１−３９；Ｇ．Ｍ．Ｅｍｉｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（２００２）Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｍｅｓ：Ｎｅｗ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５９：５９６−６０７；Ｙ．Ｌｉ，Ｒ．Ｒ．Ｂｅａｋｅｒ（２００１）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３：１７９−１９０；Ｇ．Ａ．Ｓｏｕｋｕｐ，Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（２０００）Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｉｎ：Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｒ．Ｋ．Ｇａｕｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｋｒｕｐｐ  ｅｄｓ．Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ｇ．Ａ．Ｓｏｕｋｕｐ，Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（２０００）Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：３１８−３２５；Ｇ．Ａ．Ｓｏｕｋｕｐ，Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：４６９−４７６；Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９９）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−ｃｋｅａｖｉｎｇ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．Ｉｎ：Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｌ．Ｃｏｕｎｔｕｒｅ，Ｊ．Ｒｏｓｓｉ  ｅｄｓ．Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｒ．Ｒ．Ｂｒｅａｋｅｒ（１９９７）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：３７１−３９０；及びそれらに引用された参考文献に記載され；これら刊行物の各々は、具体的には、インビトロの選択及び進化技術の記載に関して、参照により本明細書中に援用される。
【０２０１】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断することができる化合物を選択及び同定する方法はまた開示される。リボスイッチの活性化は、誘因分子の結合に応じてリボスイッチの状態の変化を意味する。リボスイッチは、誘因分子以外の化合物によって活性化され、誘因分子の結合以外の方法で活性化され得る。用語「誘因分子」は、リボスイッチを活性化することができる分子及び化合物を意味するように本明細書中で使用される。これは、リボスイッチのための天然又は正常な誘因分子、及びリボスイッチを活性化することができる他の化合物を含む。天然又は正常な誘因分子は、天然において、又はいくつかの非天然リボスイッチの場合において所定のリボスイッチに対する誘因分子、リボスイッチが設計され、又は（例えば、インビトロの選択、又はインビトロの進化技術で）リボスイッチが選択される誘因分子である。非天然の誘因分子は、非天然の誘因分子を意味し得る。
【０２０２】
リボスイッチの失活は、誘因分子が結合しない場合、リボスイッチの状態の変化を意味する。リボスイッチは、誘因分子以外の化合物の結合によって、及び誘因分子の除去以外の方法で不活化することができる。リボスイッチの遮断は、誘因分子の存在がリボスイッチを活性化しない場合リボスイッチの条件又は状態を意味する。
【０２０３】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定する方法はまた開示される。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、試験化合物と接触させ、リボスイッチの活性化を評価することによって同定することができる。リボスイッチが活性化された場合、試験化合物は、リボスイッチを活性化する化合物として同定される。リボスイッチの活性化は、いずれかの適した方法で評価することができる。例えば、リボスイッチは、リポーターＲＮＡに連結することができ、リポーターＲＮＡの発現、発現レベル、又は発現レベルの変化は、試験化合物の有無で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、リボスイッチの活性状態に依存して変化する立体構造に依存したレベル、シグナルを含み得る。このようなリボスイッチは、好ましくは、天然に発生するリボスイッチからのアプタマードメイン、又はそれから誘導されるアプタマードメインを使用する。見ることができるように、リボスイッチの活性化の評価は、対照アッセイ若しくは測定の使用を用いて、又は対照アッセイ若しくは測定の使用なしに実行することができる。リボスイッチを不活化する化合物を同定する方法は、類似した方法で実行することができる。
【０２０４】
リボスイッチを遮断する化合物の同定は、いずれかの適した方法で達成することができる。例えば、アッセイは、リボスイッチを活性化若しくは失活することで知られた化合物の存在下で、及び試験化合物の存在下でリボスイッチの活性化又は失活を評価するために実行することができる。活性化又は失活は、試験化合物が存在しない場合には観察されるであろうようには観察されない場合、試験化合物は、リボスイッチの活性化又は失活を遮断する化合物として同定される。
【０２０５】
バイオセンサーを用いて化合物を検出方法はまた開示される。この方法は、試験試料とバイオセンサーリボスイッチとを接触させ、バイオセンサーリボスイッチの活性化を評価することを含むことができる。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、試験試料中のバイオセンサーリボスイッチに対する誘因分子の存在を指示する。バイオセンサーリボスイッチは、それらの同族の誘因分子の存在下で、検出可能なシグナルを生産する遺伝子操作されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、誘因分子の閾値で又はそれを超えて誘引され得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボ又はインビトロでの使用のために設計され得る。例えば、シグナルとして使用され、又はシグナルの産生に関与するタンパク質をコードするリポーターＲＮＡに実施可能に連結したバイオセンサーリボスイッチは、リボスイッチ／レポーターＲＮＡをコードする核酸構築物を有するように細胞又は生物を操作することによってインビボで使用することができる。インビトロでの使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、立体構造に依存したラベルを含み、リボスイッチの活性化状態に依存して変化するシグナルを含むリボスイッチである。このようなリボスイッチは、好ましくは、天然に発生するリボスイッチからのアプタマードメイン又はそれから誘導されるアプタマードメインを使用する。
【０２０６】
誘因分子の濃度が減少した場合、リボスイッチの活性化が可逆的となり、そのため誘因分子の濃度が変化するにつれてシグナルが変化し得るため、バイオセンサーリボスイッチは、変化する条件を監視するために使用することができる。検出可能な誘因分子の濃度範囲は、誘因分子の異なる解離定数を有するリボスイッチを操作することによって変化し得る。これは、例えば、誘因分子に対する高アフィニティーを有するリボスイッチの感受性を「分解すること」によって容易に達成することができます。濃度範囲は、同じセンサー又はアッセイにおいて異なる感受性の複数のバイオセンサーリボスイッチを用いることによって監視することができる。
【０２０７】
リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物を同定し、この同定した化合物を製造することによって作製される化合物はまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他で開示した化合物同定をこの同定した化合物を製造する方法と組み合わせることによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化された場合、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって作製することができる。
【０２０８】
リボスイッチの活性化、不活化又は処断を化合物によって調べ、そして、調べた化合物を製造することによって作製した化合物はまた開示される。これは、例えば、本明細書中の他で開示した化合物の活性化、不活化又は遮断評価法と調べた化合物を製造する方法とを組み合わせることによって達成することができる。例えば、化合物は、試験化合物とリボスイッチとを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、リボスイッチが試験化合物によって活性化された場合、リボスイッチを活性化する試験化合物を化合物として製造することによって作製することができる。リボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力について化合物を調べることは、リボスイッチを活性化、失活又は遮断することが以前には未知であった化合物の同定、及び化合物がリボスイッチを活性化、失活又は遮断することが既に知られている場合にはリボスイッチを活性化、失活又は遮断する化合物の能力を評価することの両方を意味する。
【０２０９】
関心のある化合物を検出する方法が開示され、その方法は、試料とリボスイッチとを接触することを含み、ここで、リボスイッチは、関心のある化合物によって活性化され、リボスイッチは、関心のある化合物によって活性化される場合にはシグナルを産生し、リボスイッチは、その試料が関心のある化合物を含有する場合にはシグナルを産生する。リボスイッチは、関心のある化合物によって活性化される場合には、立体構造を変化することができ、立体構造の変化は、立体構造に依存したラベルを介してシグナルを産生する。リボスイッチは、関心のある化合物によって活性化される場合には立体構造を変化することができ、立体構造の変化は、リボスイッチに連結したＲＮＡの発現の変化を引き起こし、発現の変化はシグナルを産生する。シグナルは、リボスイッチに連結したＲＮＡから発現したレポータータンパク質によって産生され得る。
【０２１０】
（ａ）リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子の遺伝子発現を阻害するために化合物を試験し、その阻害はリボスイッチを介して行われ、そして、（ｂ）細胞と工程（ａ）において遺伝子発現を阻害した化合物とを接触させ、その細胞は、リボスイッチを含むＲＮＡをコードする遺伝子を含み、その化合物はリボスイッチに結合することによって遺伝子発現を阻害することを含む方法が開示される。
【０２１１】
リボスイッチを同定する方法はまた開示され、この方法は、化合物の有無でＲＮＡ分子の直列的な自然発生の開裂を評価することを含み、ここで、ＲＮＡ分子は、化合物によって制御される遺伝子によってコードされ、ＲＮＡ分子の直列的な自然発生の開裂のパターンの変化は、リボスイッチを指示する。
【０２１２】
Ａ．抗菌性化合物の同定
リボスイッチは、小さい有機分子を結合することを目的として進化した構造化されたＲＮＡの新規分類である。リボスイッチの天然の結合ポケットは、代謝類似体を用いて、又は天然代謝産物の形状空間を模倣する化合物によって標的化することができる。リボスイッチは、（１）炭疽菌を含む無数のグラム陽性菌及びグラム陰性菌に見出され、（２）これらの細菌における遺伝子発現の基本的な調節因子であり、（３）同時耐性を進化しそうにないであろう複数のコピーで存在し、そして、（４）ヒトにおいて存在することがまだ証明されていない。この特徴の組み合わせは、新規な抗菌性化合物に対してリボスイッチの興味ある標的を作製する。さらに、リボスイッチの小分子リガンドは、薬物候補を製造するための誘導体化に有用な部位を提供する。
【０２１３】
１クラスのリボスイッチは同定され、薬物標的としてその潜在性が（例えば、標的生物における多くの遺伝子がそのクラスのリボスイッチによってどのように制御されるかを測定することによって）評価されれば、候補分子を同定することができる。下記は、ＳＡＭリボスイッチを用いてこの例示を提供する（米国出願公開第２００５−００５３９５１号）。
【０２１４】
反応性メチル及びスルホニウムイオン中心を安定な硫黄を基礎とした連結で置換するＳＡＭ類似体（ＹＢＤ−２及びＹＢＤ３）は、リボスイッチによって適当なアフィニティー（中低ｎＭの範囲）で認識され、追加のＳＡＭ類似体の合成のためのプラットフォームとして使用する。加えて、広範囲な連結類似体（Ｎ−及びＣ−基礎とした連結）は合成され、アミノ酸及びヌクレオシド誘導体を作製する最適なプラットフォームを提供するために試験することができる。
【０２１５】
スルホキシド及びＳＡＭのスルホン誘導体は、類似体を生じるために使用することができる。Ｒｏｎａｌｄ  Ｔ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ及びＹｉｈ  Ｓｈｉｏｎｇ  Ｗｕ，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．１．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１７，８６２−８６８，１９７４に記載された確立した合成プロトコールが、例えば使用することができる。これら及び他の類似体が合成され、続く又は小グループにおいて結合することによって評価することができる。追加のＳＡＭ類似体は、各ラウンドで確立される認識決定因子に基づく化合物同定の進行中に設計されることができる。単純な結合アッセイは、本明細書中の他で記載した枯草菌及び炭疽菌のリボスイッチＲＮＡで実行することができる。より有利なアッセイはまた使用することができる。
【０２１６】
最も有望なＳＭＡ類似体リード化合物は、微生物細胞に入り、代謝的に不活性な状態のままでリボスイッチを結合しなければならない。加えて、有用なＳＭＡ類似体は、リボスイッチによってしっかりと結合されなければならず、しかし、タンパク質酵素の活性部位でＳＭＡに対して競合してもならず、あるいは、患者の細胞の望まれない毒性効果を生じるリスクがある。これらの問題の予備の評価として、化合物は、枯草菌の成長を崩壊するが、大腸菌の培養物には影響しない（ＳＭＡを使用するが、ＳＡＭリボスイッチを欠損しない）化合物の能力について試験することができる。リード化合物候補についてのスクリーニングするために、並行した微生物培養物は下記のように成長することができる。
１．枯草菌は、外的に添加したＳＡＭ類似体がない場合にグルコース最小培地で培養することができる。
２．枯草菌は、外的に添加したＳＡＭ類似体の存在下でグルコース最小培地で培養することができる（高投与量を選択することができ、その後、推定上の薬物化合物の濃度範囲を試験するために設計された繰り返しの実験がなされる）。
３．大腸菌は、外的に添加したＳＡＭ類似体の存在下でグルコース最小培地で培養することができる（高投与量が選択されるであろうし、推定上の薬物化合物の濃度範囲を試験するために設計された繰り返しの実験がなされる）。
【０２１７】
種々の培養物の適用は、細胞の倍加時間の測定によって比較することができる。薬物化合物の濃度範囲は、マイクロタイタープレートで増殖した培養物を用いて試験し、そして別の実験室からのマイクロプレートリーダーを用いて分析することができる。培養１は、十分に成長することが期待される。培養２を阻害する薬物は、培養３の増殖を阻害してもよく、又は阻害しなくてもよい。広範囲な薬物濃度への曝露に応じて培養２及び培養３の両方を同じく阻害する薬物は、外的な化合物によって誘導される一般的な毒性を反映することが可能である（即ち、リボスイッチの阻害の添加又は置換して、多くの異なる細胞の阻害）。このスクリーニングにおいて同定した上手くいった薬物候補は、非常に高い濃度で、仮にあったとしても、大腸菌を阻害するであろうし、そして、非常に（１０倍を超える）低い濃度で枯草菌を阻害するであろう。
【０２１８】
ＳＡＭに関する誘導化点が同定されるので、リード薬物化合物の効率的な同定は、適したＳＡＭ類似体又はジェネリックな化学ライブラリーの大規模なスクリーニングを必要とするであろう。ハイスループットスクリーニングは、核酸を操作した原理を用いて１又は２の異なる方法によって作製することができる。ハイスループットスクリーニングアッセイと互換性のあるフォーマットへの下記に概要した蛍光センサーデザインの両方の適合は、固相化法又は溶液を基礎として方法を用いて達成することができる。
【０２１９】
レポーターを創作する１つの方法は、ＳＡＭによるリボスイッチドメインへの結合に応じて、蛍光タグの放出を触媒するドメインを添加することによってリボスイッチに第三の機能を付加することである。最終的なレポーター構築物において、この触媒ドメインは、蛍光シグナルを発生するために触媒ドメインの正しいフォールディングを可能にすることによってリガンドの結合事象を中継するコミュニケーションモジュールを介してｙｉｔＪ  ＳＡＭに連結することができる。これは、下記に概要したように達成することができる。
【０２２０】
ＳＡＭリボリポーター（ＲｉｂｏＲｅｐｏｒｔｅｔ）プールデザイン：ＲＮＡに対するインビトロの転写のためのＤＮＡ鋳型は、適切なＤＮＡ鋳型及びプライマー配列を用いてＰＣＲ増幅によって構築することができる。この構築物は、ハンマーヘッドのステムＩＩ（ＳＡＭアプタマーのステムＰ１）は、２５０万を超える可能な配列の組み合わせを提示するために無作為化されており、アプタマーがＳＡＭ又は関連した高アフィニティー類似体によって占拠される場合にのみ、いくつかは、不可避的にリボザイムの機能を容認するであろう。構築物群の各分子は、ランダムドメインであることを除いて、配列で同一であり、複数コピーの全ての可能な配列の組み合わせは、その群で示されるであろう。
【０２２１】
ＳＡＭリボレポーター選択：インビトロの選択プロトコールは、下記の工程の反復であることができる：
１．標準的な方法によってインビトロでＲＮＡを転写する。ＲＮＡを通じて放射活性を取り込むための［α−32Ｐ］ＵＴＰを含む。
２．標準的な方法によって変性ＰＡＧＥ上で全長ＲＮＡを精製する。
３．触媒活性に十分なマグネシウム（２０ｍＭ）を含有するが、ＳＭＡは含有しないネガティブ選択緩衝液において全長ＲＮＡ（約１００ピコモル）をインキュベートする。温度循環しながら、利己的分子の出現を排除するために必要とされるアルカリ変性を伴って、室温（約２３℃）で４時間インキュベートする。
４．変性ＰＡＧＥ上で全長ＲＮＡを精製し、ＳＡＭが存在しない場合に反応するＲＮＡを廃棄する。
５．２０ｍＭ  Ｍｇ2+及びＳＡＭを含有するポジティブ選択緩衝液中でインキュベートする（ｐＨ７．５、２３℃で）。室温で２０分インキュベートする。
６．ＳＡＭを結合し、ＲＮＡの自己開裂を容認したスイッチを回復するために変性ＰＡＧＥ上で開裂したＲＮＡを精製する。
７．ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する。
８．ＰＣＲは、ＲＮＡの開裂した部分を再導入するプライマーを用いてＤＮＡを増幅する。
【０２２２】
工程４におけるＳＡＭの濃度は、初期には１００μＭであり得て、選択が進行するにつれて減少し得る。上手くいったコミュニケーションモジュールを回復する過程は、工程６における精製ゲル上で観察される開裂の量によって評価することができる。選択の終点は、その群が１０ｎＭ  ＳＡＭで１００％開裂（親のリボザイム及びリボスイッチの最大活性の条件）に到達する場合、又は複数回のラウンドに亘って改善しない活性における停滞期に到達する場合のいずれかである。その後、終結した群をシークエンスすることができる。個々のコミュニケーションモジュールのクローンは、ＳＡＭの存在下でスクリーニングしている構築物中に蛍光シグナルの発生について評価することができる。
【０２２３】
蛍光シグナルはまた、分子ビーコンのリボスイッチを介した誘発によって生じることが可能である。この設計では、リボスイッチの立体構造変化は、リボスイッチとヘリックスを形成することによって反応停止剤から離れて発光物を展開し、強要する発光物及び反応停止剤の両方とタグ化された折り畳まれた分子ビーコンを引き起こす。この方法は転写制御に関与する終結因子及び抗終結因子ステムのリガンドを介した形成を利用することができるので、この機構は既存のリボスイッチに容易に適合する。
【０２２４】
分子ビーコンを結合することによってリガンド結合をリポートするリボスイッチを使用するために、適切な構築物が実験的に決定されなければならない。分子ビーコン及びリボスイッチ上の結合部位の最適な長さ及びヌクレオチド組成物は、最大のシグナル／ノイズ比の原因となるように系統的に試験することができる。この評価の有効性は、分子ビーコンをカップルしたリボスイッチに対する異なるＳＡＭ類似体の見かけの相対的な結合アフィニティー（蛍光シグナルの発生率によって測定される）と標準的な直線的プロービングによって決定される結合定数を比較することによって決定することができる。
【実施例】
【０２２５】
実施例
Ａ．実施例１：グリシン応答性リボスイッチ
以前には未知であったリボスイッチのクラスは、グリシンによって選択的に誘発される微生物において発見された。枯草菌由来のこれらのグリシン感受性ＲＮＡの代表的なものは、グリシン開裂システムを形成するタンパク質をコードするｇｃｖＴオペロンのスイッチに関する稀な遺伝的なものとして操作する。大部分のグリシン・リボスイッチは、２つの状態の遺伝的スイッチをより密接に接近するように協同的に機能する２つのリガンド結合ドメインを統合する。このリボスイッチの有利な形態は、過剰なグリシンが、クエン酸サイクルを通じて炭素フラックスを提供し、そして、タンパク質合成のためのアミノ酸の適当な量を維持するために効率的に使用される。つまり、リボスイッチは、中心的な制御的役割を実行し、そして、タンパク質因子とのみ以前には観察された複雑な動作特性を提示する。
【０２２６】
ｍＲＮＡの非コーディング領域内に位置したリボスイッチによる遺伝子制御は、細菌の中で広範囲に及ぶ（Ｗｉｎｋｌｅｒ及びＢｒｅａｋｅｒ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ４，１０２４（２００３）；Ｖｉｔｒｅｓｃｈａｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０，４４（２００４）；Ｎｕｄｌｅｒ及びＭｉｒｏｎｏｖ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２９，１１（２００４））。枯草菌中の約２％の遺伝子は、これらの代謝産物結合ＲＮＡドメインによって制御される（Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３））。これまでに発見された全てのリボスイッチは、それらの対応する標的分子に関してセンサーとして単一の高度に構造化したアプタマーを使用する。アプタマーによる代謝産物の選択的結合は、ｍＲＮＡの５’−非翻訳良識（５’−ＵＴＲ）の二次及び三次構造のアロステリック修飾を引き起こし、転写終結（Ｍｉｒｏｎｏｖら、Ｃｅｌｌ  １１１、７４７（２００２）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１５９０８（２００２））、転写開始（Ｎａｈｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，１０４３（２００２）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，９５２（２００２））、又はｍＲＮＡプロセッシング（Ｓｕｄａｒｓａｎら、ＲＮＡ  ９，６４４（２００３）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，２８１（２００４））に影響する１以上の機構によって遺伝子発現を変化する。
【０２２７】
最新の細胞におけるリボスイッチの存在は、ＲＮＡ分子がタンパク質受容体に匹敵する複雑な構造を形成することに関して考慮し得る可能性を有する。さらに、リボスイッチは、それらの遺伝子制御任務を実行し、つまり、代謝産物の濃度に感受性であり、その変化に応答する簡潔な遺伝子スイッチとして使用するために追加のタンパク質因子にとって必須の必要性を有する。しかしながら、本明細書中に記載したリボスイッチの前には、いくつかのタンパク質因子によって提示した高次機能は天然のリボスイッチを用いて観察されなかった。例えば、多くのタンパク質酵素、受容体、及び遺伝子制御因子は、リガンド濃度の小さな変化に急速に応答するための手段を細胞に施すために協同的結合を利用する（例えば、Ｐｔａｓｈｎｅ及びＧａｎｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｓｉｇｎａｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，２００２）；Ｋｕｒｇａｎｏｖ，Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）；Ａｎｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，６９３（１９９５））。
【０２２８】
既知のリボスイッチに類似した特徴を有する無数の細菌種における高度に保存したＲＮＡモチーフが同定された（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，６４２１（２００４））。これらのモチーフの１つは、ｇｃｖＴ（図１Ａ）と称し、多くの細菌中に見出され、典型的にはグリシン開裂システムのタンパク質成分を発現する遺伝子の上流に存在する。枯草菌では、３つの遺伝子オペロン（ｇｃｖＴ−ｇｃｖＰＡ−ｇｃｖＰＢ）は、このタンパク質の複合体の化合物をコードし、エネルギー源としてグリシンの使用に関して初期の反応を触媒する（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１，１６９（１９７３）；Ｄｕｃｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６，１６７（２００１））。この実施例は、グリシン応答性リボスイッチのいくつかの特徴の分析を記載する。
【０２２９】
１．材料及び方法
ｉ．化合物質及びオリゴヌクレオチド
グリシン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、サルコシン、β−アラニン、ハイドロキサム酸グリシン、グリシル−グリシン、及びグリシン−２−3Ｈは、Ｓｉｇｍａから購入した。メルカプト酢酸、グリシンメチルエステル、グリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル、塩酸グリシンアミド、及びスルホン酸アミノメタンは、Ａｌｄｒｉｃｈから得た。オリゴヌクレオチドは、エール大学のＨＨＭＩ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒによって合成し、変性ＰＡＧＥによって精製した。ＤＮＡは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、２３℃）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液中で砕いて浸すことによってゲルから溶離した。
【０２３０】
ｉｉ．バイオインフォマティックス
付加的なｇｃｖＴモチーフは、保存した配列と、ｇｃｖＴ様ＲＮＡ（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，６４２１（２００４））の元来の系統発生から誘導される二次構造を導入している共分散モデル（Ｅｄｄｙ及びＤｕｒｂｉｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２０７９（１９９４））を創作することによって同定された。フィルター技術（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＲｕｚｚｏ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｉｇｈｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＡＣＭ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２４３−２５１（２００４）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＲｕｚｚｏ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０（Ｓｕｐｐｌ．１），ｉ３３４（２００４））は、細菌ゲノムのスキャンを急速に実行させるために適用され、そして、新規なモチーフは、その後のスキャンに関して洗練された共分散モデルを反復して生じるために系統発生に導入された。
【０２３１】
ｉｉｉ．直列的プロービングアッセイ
ＶＣ  Ｉ−ＩＩ構築物の直列的プロービング（図１Ｂ）は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＶＣ１４２２遺伝子から誘導され、Ｎａｈｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，１０４３（２００２）及びＷｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，９５２（２００２）において他に記載されたものと類似した方法を使用して、微量の５’32ＰラベルＲＮＡを用いて実行した。ＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータを担持する適切なＤＮＡ鋳型からの転写によって調製され、プライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＧ（配列番号：８）及び５’−ＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡ（配列番号：９）を用いて、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｃ６７０６−ｓｔ２）ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって発生させた。下線のヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに関するプロモータに対応する配列を同定する。
【０２３２】
典型的な直列的プロービングアッセイにおいては、約１５ｎＭのラベルしたＲＮＡをリガンドが存在しない場合又は存在する場合で、緩衝液（２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３、２５℃、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で４０時間２３℃でインキュベートする。インキュベーション後、自然発生的に開裂した産物は、１０％の変性ＰＡＧＥを用いて分別し、ＰｈｏｓｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて視覚化し定量した。２１０を超えるヌクレオチド（図１Ａ）は、自然発生の開裂の部位を正確に描くには十分に分離されなかった。
【０２３３】
枯草菌由来のタンデム型アプタマーの直列的プロービング（図８）は、類似の方法を用いて実行した。ＰＣＲ  ＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡプライマー５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧ（配列番号：１０）及び５’−ＧＧＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＣＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＴＧＣ（配列番号：１１）を用いて枯草菌のゲノムＤＮＡ（１Ａ２）から調製した。図１Ｂ及び図８Ａの小文字は、ＲｉｂｏＭＡＸ転写（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてインビトロでの効率的な転写を可能にする構築物に添加したヌクレオチドを特定する。図５に提示したデータに関して、固定した画分は、１マイナスＶＣ  ＩＩに対するＵ２０７−Ｃ２０８及びＶＣ  Ｉ−ＩＩに対するＵ７４での直列的なプロービングアッセイにおいて開裂した標準化した画分に等しい。
【０２３４】
ｉｖ．平衡透析アッセイ
平衡透析に使用される方法は、Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３）に記載されるものに類似した。具体的には、平衡透析アッセイは、ＥｉｓｐｏＥｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実行し、ここで、チャンバーａ及びｂは５，０００ＭＷＣＯメンブレンによって分別される。チャンバーａは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５、２５℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１００ｍＭ  ＫＣｌを含有する緩衝液中で１０ｎＭのグリシン−２−3Ｈを含有した。チャンバーｂは、同じ緩衝液中に懸濁させた１００μＭ濃度でＶＣ  ＩＩ又はＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡ転写物を含有した。平衡化は、２３℃で１０時間継続することを可能にする。その後に、５μＬの試料を各チャンバーから取り出し、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。指示した場合（図４Ｂ）、過剰の１ｍＭ  未標識グリシン、アラニン又はセリンをチャンバーｂに輸送した。両ＲＮＡについては、実験ｉ−ｉｉｉ（図４Ｂ）は、チャンバー（左のデータポイント）をまず予め平衡化し、次に、指示した未ラベル競合物を添加し、第二の平衡化（右のデータポイント）によって実行した。ＲＮＡは、上述したように、適切なＰＣＲ  ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロの転写によって調製した。
【０２３５】
ｖ．１ラウンドの転写アッセイ
転写終結アッセイは、以前に記載されたように実行した（Ｓｕｄａｒｓａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７，２６８８（２００３）；Ｌａｎｄｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７４，３３４（１９９６））。転写物は、図８Ｂ中で「＋」でラベルされた誤ったＲＮＡ産物を日常的に産生した。このバンドは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列での開始とは対照的に、ＰＣＲで生じた転写鋳型の開始での誤った転写開始によって引き起こされるようである。このバンドは、追加のＤＮＡ配列が、プロモータ及びプロモータの上流のＰＣＲ  ＤＮＡ末端との間に存在する場合、よりゆっくりした移動産物によって置換される。類似の誤った転写産物は、類似の転写アッセイに供され、そして、適切な大きさのリボスイッチＲＮＡの機能に逆行して影響を与えるとは見出されない無数の他のＰＣＲで生じた転写鋳型から生産される。
【０２３６】
図８Ｂに観察される終結因子の読み合わせの漏れは、転写混合物におけるＮＴＰの濃度を調整することによって変化させることができ、インビボでの条件は、全長ＲＮＡの産物のよりしっかりした制御レベルを可能にするであろう（図９を参照されたい）。
【０２３７】
ｖｉ．インビボでの遺伝子発現レポーターアッセイ
枯草菌由来のタンデム型ｇｃｖＴモチーフは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を用いて融合し、Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０，７０１（２００３）に記載される方法を用いて枯草菌（１Ａ２株）のゲノム中に導入した。具体的には、ｇｃｖＴオペロンの第一のオープンリーディングフレームの枯草菌のｇｃｖＴ転写開始部位と比較してヌクレオチド−４２９〜＋７が、枯草菌の１Ａ２株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）由来のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片としてＰＣＲで増幅した。野生型の構築物は、ｌａｃＺレポーター遺伝子の直接的な上流の部位のｐＤＧ１６６１にクローニングした。構築物の完全性は、シークエンシングによって確かめ、適切なプライマー及びＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位特異的な突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて突然変異体を作製するための鋳型として使用した。本研究（図８Ａ）のために使用したＩＧＲは、ゲノムデータベースと比較して３つのヌクレオチド（１５１−１５３、ＴＴＴ〜ＡＡＡ）で配列において相違した。発生したプラスミドは、１Ａ２株のａｍｕＥ遺伝子座内に導入した。転写物は、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）耐性について選択し、及びスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）に対する感受性についてスクリーニングした。細胞は、Ａ595が０．１になるまで、合成培地（０．５％ｗ／ｖグルコース、２ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２５ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4−３Ｈ2Ｏ、６ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／Ｌ  クエン酸ナトリウム、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4−７Ｈ2Ｏ、２μＭ  ＭｎＣｌ2、１５ｍＭ  グルタミン酸塩、及び５ｍｇ／Ｌ  クロラムフェニコール）中で増殖させ、ペレットにし、そして、各実験で指示したように５００μｇ／Ｌのアミノ酸を添加した最小培地に再懸濁させた。培養物をさらに３時間インキュベートし、β−ガラクトシドアッセイを以前に記載されるように実行した（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２））。プロットしたＭｉｌｌｅｒユニットは、６つの値（二重に実行した３つのアッセイ）の平均である。
【０２３８】
２．結果
Ｉ型及びＩＩ型のｇｃｖＴモチーフは、グリシンに対する天然のＲＮＡアプタマーである。図１Ａは、代表的な配列の８０％（黒）及び９５％（赤）以上で存在する共通ヌクレオチドがバイオインフォマティックスによって同定されたことを示す（材料及び方法；図２を参照されたい）。サークル及び太線は、塩基同定が保存されていないヌクレオチドを表す。Ｐ１〜Ｐ４は、共通の塩基対エレメントを特定する。ＯＲＦは、オープンリーディングフレームを意味する。図１Ｂは、グリシンが存在しない場合及び存在する場合のＶＣ  Ｉ−ＩＩを用いて発生する自然な開裂パターンが記述されたことを示す。自然発生の開裂を変化する部位に近い数は、図１Ｃのアステリスクで示したゲルバンド及び図１Ｄに記載したデータに対応する。図１Ｃは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ（Ｎａｈｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，１０４３（２００２）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，９５２（２００２））；図３）による分別に応じてＶＣ  Ｉ−ＩＩの自然な開裂産物を示す。ＮＲ、Ｔ１、及び−ＯＨは、それぞれ、反応なし、ＲＮａｓｅ  Ｔ１による部分消化、及びアルカリによる部分消化を示す。Ｐｒｅは前駆体ＲＮＡを意味する。Ｔ１消化（Ｇ残基の後での開裂）に対等するある断片のバンドがラベルされる。番号を付したアステリスクは、グリシンに応答した主要な構造的修飾の位置を同定する。２つの最も右端のレーンは、示した１ｍＭのアミノ酸を実行する。括弧で記したＩ及びＩＩは、それぞれ、Ｉ型及びＩＩ型のアプタマーにおける開裂事象に対応するＲＮＡ断片を同定する。図１Ｄは、自然な開裂産物の範囲対アプタマーＩ（部位１〜３）、アプタマーＩＩ（部位５〜７）、及びリンカー配列（部位４）に対するグリシンの濃度増加のプロットを示す。Ｃは、濃度を意味する。
【０２３９】
ｇｃｖＴ  ＲＮＡモチーフ、Ｉ型及びＩＩ型（図１Ａ）の２つの形態は、それらの保存されたコアを側面にする配列における相違の塩基に関して同定した（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，６４２１（２００４））。より感受性のあるコンピューターによるスキャン（材料及び方法を参照）は、両モチーフが、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のＶＣ１４２２遺伝子（推定上のナトリウム及びアラニンシンポート）のすぐ上流の領域の構造によって示されるように、互いに近接して存在することを示した（図１Ｂ）。別個に、Ｉ型及びＩＩ型エレメントは、別々のアプタマードメインを示すようであり、各々は、別個の標的分子を結合する。さらに、２つのアプタマーの間のリンカー配列は、配列及び長さの両方のある保存を示し、これらアプタマーが機能的にカップルしていることを示す（図２）。
【０２４０】
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＲＮＡの代謝産物結合能力は、直列的プロービングという方法（Ｓｏｕｋｕｐ及びＢｒｅａｋｅｒ，ＲＮＡ  ５，１３０８（１９９９））を用いて評価され、自然発生的なＲＮＡ開裂のレベルの変化を追跡することによってアプタマー構造における代謝産物誘導の変化を示すことが可能である（Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１５９０８（２００２）；Ｎａｈｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，１０４３（２００２）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，９５２（２００２）；Ｓｕｄａｒｓａｎら、ＲＮＡ  ９，６４４（２００３））。例えば、１ｍＭのグリシンの添加は、両方のアプタマーのタイプを担持する２２６−ヌクレオチドＲＮＡ構築物（ＶＣ  Ｉ−ＩＩ）の自然な開裂のパターンの変化を引き起こしたが（図１Ｃ）、１ｍＭ  Ｌ−アラニンは変化を誘導しなかった。
【０２４１】
同様の結果は、ＩＩ型のアプタマーのみを担持する１０５−ヌクレオチドＲＮＡ（ＶＣ  ＩＩ）が直列的プロービングに使用された場合に観察された（図３）。Ｉ型及びＩＩ型ドメインの両方は、グリシンの誘導に応じて同様の構造変化を被るため、そして、ＶＣ  ＩＩのみがリガンドに依存した構造変化を提示するため、各ドメインは、別個のグリシン結合アプタマーとして使用する。さらに、ＶＣ  Ｉ−ＩＩ構築物の３つのセクション（アプタマーＩ、リンカー、及びアプタマーＩＩ）の全ては、種々の濃度で等しくグリシンに応答した（図１Ｄ）。グリシンに対するこの協調した応答は、２つのアプタマーが非常に保存された方法でグリシンに結合することを指示する（２つのアプタマーがグリシンに対して完全に調和のとれたアフィニティーを有するが、協同的結合は、リボスイッチの他の特性と一致する可能性もある）。
【０２４２】
図２は、グリシン・リボスイッチ部分及び整列を示す。図２Ａ−２Ｂは分布を示す。各アプタマーの同定した位置は、ＧｅｎＢａｎｋ記録におけるＰ１ステムの最内部の塩基対に対するものである。遺伝子名は、以前に記載されるように割り当てられたＣＯＧを有する元々の配列ファイル由来である（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，６４２１（２００４））。図２Ｃ−２Ｆは整列を示す。構造線は、保存された塩基対を示す。着色した背景は、個別に整列した配列における塩基対を示す。保存線は、＞９５％（上段ケース）及び＞８０％（下段ケース）の配列保存（Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｃ、Ｕ）を有する位置を示す。保存されたエレメントに対して＞９０％の配列同一性を共有する代表例は、共通決定前に削除した。
【０２４３】
図３は、ＶＣ  ＩＩ  ＲＮＡ構築物の直列的プロービングを示す。図３Ａは、ＶＣ  ＩＩ構築物の配列、二次構造、及び修飾を示す。自然発生的な開裂におけるグリシンを介した変化の定量に使用される修飾部位は、図１にあるようにラベルした５〜８である。図３Ｂは、グリシンの濃度増加を伴った直列プロービングに応じたＶＣ  ＩＩ  ＲＮＡのＰＡＧＥ分析を示す。５’32ＰラベルしたＲＮＡ（約１５ｎＭ）は、指示したようにグリシンが存在しない場合及び存在する場合において、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、２５℃）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、及び１００ｍＭ  ＫＣｌ中で、２３℃で４０時間インキュベートした。注記は図１Ｃについて記載される通りである。図３Ｃは、開裂したＲＮＡの標準化した断片対図３Ｂから誘導されるようにグリシン濃度のログのプロットを示す。方法は、図１について記載したものである。
【０２４４】
ＶＣ  Ｉ−ＩＩの分子認識特性は、種々のグリシン類似体を用いた直列的プロービングを使用することによって調べた。ＲＮＡは、グリシンのメチルエステル及び三級ブチルエステル類似体を用いた測定可能な構造修飾を提示したが、１ｍＭで試験した場合、他の全ての類似体を拒絶した（図４Ａ）。ＶＣ  ＩＩの最大の半分の構造修飾を引き起こすのに必要であるリガンドの濃度は、グリシンについて１０μＭ、グリシンメチルエステルについて１００μＭ、グリシン三級ブチルエステルについて１ｍＭ、そして、ヒドロキサム酸グリシンについて１ｍＭである。グリシンに対する特異性はまた、平衡透析を用いることによって観察された。例えば、平衡透析システムは、ＶＣ  ＩＩ又はＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡのずれかを用いて予め平衡化する場合、過剰のグリシンは、その後のインキュベーションに応じて３Ｈ−グリシンの等しい分布を回復した（図４Ｂ）。しかしながら、Ｌ−アラニン又はＬ−セリンのいずれかの添加は、等しい分布を回復せず、ＲＮＡはグリシンに対して正確なセンサーとして機能を果たすことを確かめた。
【０２４５】
図４は、ＶＣ  ＩＩ及びＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡのリガンド特異性を示す。図４Ａは、グリシン（化合物１）又は類似体Ｌ−アラニン（２）、Ｄ−アラニン（３）、Ｌ−セリン（４）、Ｌ−スレオニン（５）、サルコシン（６）、メルカプト酢酸（７）、β−アラニン（８）、グリシンメチルエステル（９）、グリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０）、ヒドロキサミン酸グリシン（１１）、グリシンアミド（１２）、スルホン酸アミノメタン（１３）、及びグリシル−グリシン（１４）が存在しない場合（−）又は存在する場合において、ＶＣ  Ｉ−ＩＩの直列プロービングを示す。他の注釈は、図１Ｃについて記載したものと同じである。図４Ｂは、指示したように過剰な（１ｍＭ）未標識グリシン、アラニン、又はセリンが存在しない場合（−）又は存在する場合（＋）のＶＣ  ＩＩ及びＶＣ  Ｉ−ＩＩ（１００μＭ）についての平衡透析データを示す。チャンバーｂの３Ｈ−グリシンの分画は、ＲＮＡに結合したグリシンの量プラスチャンバーａ及びｂの遊離のグリシンの全量の半分対３Ｈ−グリシンの全量を反映する。ｉ〜ｉｉｉは、ＲＮＡ及び３Ｈが平衡化され（左）、競合物質がその後に添加される場合の別個の実験を表す。
【０２４６】
これらのＲＮＡに結合するグリシンの化学量論は、高濃度のグリシンを用いた平衡透析の使用によって調査した。アミノ酸の３つの平衡物は、ＶＣ  ＩＩ  ＲＮＡ（１００μＭ）の１つの平衡物に対して存在する場合に、本出願人は、０．８当量（１が期待される）のグリシンがＲＮＡに結合したことを示すグリシン分布のシフトを観察した。対象的に、１当量のＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡが存在する場合（２つのアプタマードメインの同等物）、ＲＮＡに結合したグリシンの量の１．６倍の増加（２が期待される）があった。これらのデータは、グリシン及び各々の別個のアプタマーの間で１：１の化学量論に対する証拠を提供する。
【０２４７】
協同的に機能するＶＣ  Ｉ−ＩＩの２つのアプタマーを用いて、次に、ＲＮＡの構造変化は、１つのグリシンアプタマーの濃度と比較して、増加したグリシン濃度に不規則に応答するであろう。グリシンによるＶＣ  ＩＩ構造のリガンドに依存した変化（図５）は、既知のリボスイッチ（Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、１５９０８（２００２）；Ｎａｈｖｉら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９，１０４３（２００２）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，９５２（２００２）；Ｓｕｄａｒｓａｎら、ＲＮＡ  ９，６４４（２００３）；Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０，７０１（２００３）；Ｍａｎｄａｌ及びＢｒｅａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｌ．１１，２９（２００４）；Ｎａｈｖｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，１４３（２００４））の１つのアプタマードメインに対して観察されるものに特有であった。ＶＣ  Ｉ  ＲＮＡに結合したリガンドの１０％から９０％の変化は、グリシン濃度の１００倍の増加に亘って発生し、１つのリガンドを結合する受容体に対して予測された反応と一致する（図６）。
【０２４８】
対照的に、ＶＣ  Ｉ−ＩＩは、グリシン濃度のたった１０倍増加に亘ってリガンド占有における同じ変化を被った（図５）。グリシンを介した応答に対するダイナミックレンジのこの減少は、他の部位に結合するグリシンのアフィニティーを実質的に改善する１つの部位で結合するグリシンと一致する。ＶＣ  Ｉ−ＩＩに対して計算したＨｉｌｌ係数（Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ４０，ｉｖ（１９１０）；Ｗｅｉｓｓｂｌｕｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ａ．Ｋｌｅｉｎｚｅｌｌｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７４）、ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２７−４１）は１．６４であり、一方、２つの結合部位についての最大値は２である。相対的に、酸素を担持するタンパク質ヘモグロビンについてのＨｉｌｌ係数は、２．８であり（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，２０９（１９７５））、一方、４つの結合部位についての最大値は４である。つまり、２つのＶＣ  Ｉ−ＩＩアプタマーを用いた結合部位当りの協同性の程度は、ヘモグロビンの４つの部位の各々について誘導したものに等しいか又はそれより大きい。
【０２４９】
図５は、ＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡによって２つのグリシン分子の協同的結合を示す。プロットは、リガンドに結合したＶＣ  ＩＩ（白丸）及びＶＣ  Ｉ−ＩＩ（黒丸）の断片対グリシン濃度を示す。定数ｎは、４つの異なる領域からの統計値を最良に適合することを指示するように、その線に対するＨｉｌｌ係数である（図６）。斜線のボックスは、１０％〜９０％結合の状態を進行するＲＮＡによって必要とされるグリシン濃度のダイナミックレンジ（ＤＲ）と一線を画する。
【０２５０】
図６は、１つのアプタマーを担持するか、又は協同性を提示する２つのアプタマーを担持するＲＮＡ構築物と結合するリガンドに対して期待され、測定される応答を示す。図６Ａは、曲線が差込図（Ｎａｈｖｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，１４３（２００４）；Ｈｉｌｌ，Ｊ．Ｐｙｓｉｏｌ．４０，ｉｖ（１９１０））に示される実験による平衡を反映することを示し、一方、定数Ｋは、任意の単位である。協同性がない場合の曲線（青色の曲線、ｎ＝１）、及び２つの結合部位での完全な協調性がある場合（オレンジ色の曲線、ｎ＝２）が示される。青色（ＩＩ）及びオレンジ色（Ｉ−ＩＩ）のバーは、１０％〜９０％のリガンドを結合した状態を進行するためにＶＣ  ＩＩ及びＶＣ  Ｉ−ＩＩのようなＲＮＡ構築物に必要とされるグリシン濃度の期待される範囲を示す。図６Ｂは、１つのグリシン・リボスイッチ（ＶＣ  ＩＩ、左パネル）又はタンデム型のグリシンリボスイッチ（ＶＣ  Ｉ−ＩＩ、右パネル）に対するＨｉｌｌプロットを示す。両方のＲＮＡ構築物の４つの領域で開裂したＲＮＡの分画は、直列プロービングによって決定した。開裂の量は、各領域の最小及び最大量を用いて０〜１の範囲に標準化した。開裂した最小及び最大量は、ＶＣ  ＩＩについては、３つの最低及び２つの最高のグリシン濃度を平均することによって決定し、そして、開裂した量は、タンデム型のＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡ（開裂が本質的に一定である領域を表す）については５つの最低及び４つの最高のグリシン濃度に対する。グリシン結合に応じてより配列されないようになる領域に関して、リガンド（Ｙ）に結合したＲＮＡの分画は、直列的プロービングアッセイにおいて開裂したＲＮＡの標準化した分画に等しい。グリシン結合に応じてより配列されるようになる領域に関して、Ｙは、１マイナス開裂した分画に等しい。４つのデータセットの各グループに関して、定数Ｋ及びＨｉｌｌ係数ｎは、パネルＡの式に最もフィットする直線を達成するように確立した。ＶＣ  ＩＩに関して、これらの値は、それぞれ、２４±１２μＭ及び０．９７±０．０４であった。ＶＣ  Ｉ−ＩＩに関して、これらの値は、４０±１μＭ及び１．６４±０．０７であった。各プロットにおける赤色の線は、これらのＨｉｌｌ係数を反映する傾きを有する。プロットした領域は、ＶＣ  ＩＩについては下記の通りである：Ｕ２０７−Ｃ２０８、黄色の菱形；Ａ１７８、オレンジ色の菱形、Ｇ１７０、青色の四角、Ｇ１４６、紫色の四角（図３）。プロットした連結は、ＶＣ  Ｉ−ＩＩについては次の通りである：Ｇ１３３−Ｇ１３７、黄色の菱形；Ａ１２１−Ｇ１２３、オレンジ色の菱形、Ｕ７４、青色の四角、Ｕ２０、紫色の四角（図１）。
【０２５１】
リガンド結合に対する協同的メカニズムは、さらに、ＶＣ  Ｉ−ＩＩの保存されたコアのいずれかになされた１つの突然変異は、突然変異したアプタマーに対するグリシン結合アフィニティーの実質的な喪失を引き起こし、また、変化しないアプタマーに対するアフィニティーの劇的な喪失を引き起こすという観察によって支持される（図７）。つまり、１部位でのグリシンの結合は、１００〜１０００倍のリガンド結合アフィニティーの改善を提示するように隣接部位を誘導する。
【０２５２】
図７は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＩ型及びＩＩ型アプタマーの間の協同的結合に関する証拠示す。図７Ａは、ＶＣ  Ｉ−ＩＩ構築物についての突然変異体Ｍ５及びＭ６を定義するヌクレオチド変化の位置を示す。図７Ｂは、ＶＣ  Ｉ−ＩＩのＭ５変異体の直列的プロービングを示し、アプタマーＩは突然変異されている。ヌクレオチド１７でのＴ１レーンにおけるＧ特異的開裂が現在存在しない（矢印）ことに気づかれたい。アステリスクは、グリシン添加に応じて調節する変化していないアプタマーＩＩドメインにおける位置を特定するが、アプタマーＩＩが野生型ＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡと関連する場合より約１００倍高い濃度である。グリシン濃度は、１００ｎＭ〜１０ｍＭの範囲である。図７Ｃは、変異体ＶＣ  Ｉ−ＩＩ構築物の直列的プロービングを示し、アプタマーＩＩは突然変異されている。ヌクレオチド１４６でのＴ１レーンにおけるＧ特異的開裂は現在存在しない（矢印）ことに気づかれたい。変化していないアプタマーＩにおけるアフィニティーの喪失は、１，０００倍以上である。
【０２５３】
タンデム型アプタマー構造体（図８）及び選択的グリシン認識はまた、枯草菌由来のｇｃｖＴの５’−ＵＴＲに対応するＲＮＡを用いて観察される。これは、遺伝的制御に関するｇｃｖＴ  ＲＮＡの重要性を評価する実験に影響をより受け易い。１ラウンドの転写アッセイ（材料及び方法を参照されたい）は、枯草菌ｇｃｖＴオペロンの上流の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に対応するＤＮＡ構築体が、グリシンによって終結部位が影響される転写を生じるかどうかを決定するために使用した。グリシンが存在しない場合、インビトロの転写によって生じたたった３０％のＲＮＡ生産物が全長であった（図８）。残りの７０％は、第二のグリシンアプタマーを部分的に重なり合う推定上の固有のターミネーター（Ｇｕｓａｒｏｖ及びＮｕｄｌｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ３，４９５（１９９９）；Ｙａｒｎｅｌｌ及びＲｏｂｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，６１１（１９９９））でＲＮＡポリメラーゼが失速するかどうか期待されるものに長さで対応する未成熟な終結産物であった（同様に図９）。
【０２５４】
図８は、インビトロ及びインビボにおける枯草菌ｇｃｖＴ  ＲＮＡ発現の制御を示す。図８Ａは、アプタマーＩ及びＩＩを包含する枯草菌のｙｇｈＨ及びｇｃｖＴの間のＩＧＲが、インビトロ転写及びインビボ発現アッセイに使用されることを示す。直列的プロービングの結果をマップにし、リボスイッチの機能を評価するために使用した突然変異は、赤色のボックスで示した。オレンジ色の陰は、推定上の固有のターミネーターステムを特定し、グリシンに結合した場合、アプタマーＩＩの成熟的な排他的形成を提示することが期待される。ｎｔは、ヌクレオチドを表す。図８Ｂは、全長（Ｆｕｌｌ）の転写物は、＞１０μＭのグリシンが転写混合物に添加された場合に有利に働くことを測定する１ラウンドのインビトロの転写アッセイを示し、セリン及び大部分のグリシン類似体（図９）は、リボスイッチによって拒絶される。線は、Ｈｉｌｌ係数１．４を有して協同的結合を反映する式に対する最良の適合曲線を反映する。追加の転写産物は、「＋」と称し、誤った転写開始に従うようである（材料及び方法）。図８Ｃは、野生型（ＷＴ）ｇｃｖＴ  ＩＧＲ又は一連の突然変異ＩＧＲ（Ｍ１−Ｍ６）に融合したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の発現のプロットを示す。データは、２つの複製物の各々を用いて３つのアッセイの平均を反映する。誤差バーは、±２つの標準偏差を示す。
【０２５５】
グリシンの添加は、切断されたＲＮＡの量と比較して、全長のＲＮＡ転写物の量の実質的な増加を引き起こした（図８）。この改善は、グリシン、又はＲＮＡ構造変化を引き起こす他の類似体によってのみ誘導される。セリン、アラニン、及び変化に影響しない他の類似体のような化合物はまた、全長の転写物の産生の増加を誘発しなかった（図９）。
【０２５６】
さらに、全長の転写物の収率におけるグリシンに依存した増加は、２つのリガンド結合事象を必要とする協同的ＲＮＡスイッチに期待されるものと対応した。転写データを適合することは、Ｈｉｌｌ係数１．４を伴って協同的なリガンド結合に対応した曲線を生じる（図８Ｂ）。したがって、枯草菌のｇｃｖＴ  ５’−ＵＴＲによる転写制御は、協同的なＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡの直列的プロービングを実行する場合に観察されるものを平衡する特徴を伴ってグリシンに応答する。
【０２５７】
グリシン結合及びインビトロ転写制御は、インビボでの遺伝子制御事象に対応するかどうかを評価するために、レポーター構築物は、枯草菌由来のｇｃｖＴオペロンの上流のＩＧＲとβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子とを融合することによって生じ、そして、細菌ゲノムにそれらを組み込む（材料及び方法を参照されたい）。野生型ＩＧＲを担持するレポーター融合構築物は、グリシンが増殖培地に存在する場合、高い量のβ−ガラクトシダーゼを発現し、一方、低い量の遺伝子発現は、アラニンが存在する場合の結果である（図８Ｃ）。これらの結果は、ｇｃｖＴモチーフが、オフであるデフォルト状態でのグリシン応答性リボスイッチの部分であることを示す。グリシン結合は、インビトロ転写アッセイを用いて観察されたのと同様に、遺伝子発現を活性化するために必要とされる（図８Ｂ）。
【０２５８】
モチーフの重要ないくつかの保存された特徴は、塩基対を崩壊し（それぞれ、変異体Ｍ１及びＭ３）、及び保存する（それぞれ、Ｍ２及びＭ４）ための第一のアプタマードメインのＰ１及びＰ２ステムを突然変異することによって調べた（図８Ａ）。突然変異ＩＧＲを担持する構築物から得られた遺伝子発現レベルは、系統発生的分析（Ｂａｒｒｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１，６４２１（２００４））から推測される塩基対をなしたエレメントと位置する（図２）。さらに、突然変異のアプタマーＩ又はアプタマーＩＩ（それぞれ、変異体Ｍ５及びＭ６）の保存されたコアへの突然変異の導入は、レポーター遺伝子活性の完全な喪失を引き起こした。この後者の結果は、両アプタマーに結合するグリシンは、遺伝子発現を誘発するために必要であることを示し、協同的グリシン結合がリボスイッチ機能に重要であるモデルと一致する。
【０２５９】
図９は、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−セリン、及び種々のグリシン類似体の存在下で、枯草菌由来のｇｃｖＴ  ５’−ＵＴＲの１ラウンドのインビトロ転写を示す。図９Ａは、１ラウンド転写反応に関して、終結の収量におけるリボヌクレオチド三リン酸塩（ｒＮＴＰ）濃度対全長ＲＮＡ転写物の効果を示す。転写アッセイは、初期に記載されたもの（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，２０９（１９７５））から適合した方法を用いて実行した。ＤＮＡ鋳型は、枯草菌由来のｘｐｔ−ｐｂｕＸ（Ｍａｎｄａｌら、Ｃｅｌｌ  １１３，５７７（２００３））由来のプロモータ配列（下線）を担持するプライマー配列（５’−ＣＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＧ；配列番号：１２）を用いてＰＣＲによって発生させた。枯草菌におけるｇｃｖＴオペロンに対する転写開始部位と比べて、ヌクレオチド−４０６〜＋７を包含するＤＮＡ鋳型を使用した。転写アッセイは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、２３℃）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、及び１％ｖ／ｖ  グリセロールを含んだ。各反応（１０μＬ）は、１ｐｍｏｌのＤＮＡ及び９Ｕの大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を含有し、各実験で示したように標的分子のタイプ及び濃度で実行した。転写物は、ジヌクレオチドＡｐＡ（１３５μＭ）、ＧＴＰ及びＵＴＰ（各２．５μＭ）、ＡＴＰ（１μＭ）、及び［α−32Ｐ］−ＡＴＰ（４＿Ｃｉ）の添加によって開始した。３７℃で５分間インキュベーション後、各ＮＴＰの５０μＭは、ＲＮＡポリメラーゼによる再開始を妨げるために、０．１ｍｇ／ｍＬのヘパリンとともに添加した。１０分間のインキュベーション後に生じた転写産物は、変性した６％のＰＡＧＥによって分別し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いることによって視覚化した。図９Ｂは、転写終結におけるグリシン、Ｌ−アラニン、及びＬ−セリンの増加の効果を示す。グリシン及びＬ−アラニンに対して記述された線は、図８Ｂのデータから決定したのと同じく、Ｈｉｌｌ係数１．４である曲線を反映する。１ラウンド転写アッセイは、図９Ａについて記載したように実行した。図９Ｃは、１０ｍＭの試験リガンドの存在下での枯草菌のグリシン・リボスイッチの特異性を示す（同様に図４Ａを参照されたい）。１ラウンドアッセイは、５０μＭのｒＮＴＰを用いて、図９Ａについて記載したように実行した。グリシン類似体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０２６０】
図１０Ａ及び１０Ｂは、グリシン・リボスイッチによって結合される結合したグリシン部分を有する化合物を示す。図１０Ａは、構造変化を被っているＶｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｇｃｖＴと関連したグリシン・リボスイッチの領域は、示したＲＮＡの５’32Ｐ標識したバージョンを用いた直列的プロービングアッセイを用いて決定したことを示す。個々のインキュベーションは、１ｍＭのグリシン（ｇｌｙ）及び図１０Ｂに記載される類似体Ｄ−００１〜Ｄ−０１２（１−１２）の存在下でリガンドが存在しない場合（−）で実行した。ＮＲ、Ｔ１、及び-ＯＨで示されるレーンは、反応しなかったＲＮＡを含有し、それぞれ、ＲＮａｓｅ  Ｔ１を用いた部分的消化に供し、又は、部分的なアルカリ消化に供した。選択されたＲＮａｓｅ  Ｔ１開裂産物は、図１Ｂの番号を付したスキームに一致し、そして対応する。Ｐｒｅは、全長の前駆体ＲＮＡの位置を示す。グリシン、Ｄ−００２及びＤ−００９に対する解離定数は、分別の直列的プロービング実験から誘導し、それぞれ、約３０ｍＭ、約５０μＭ及び約１５０μＭである。
【０２６１】
グリシン依存性リボスイッチは、いくつかの理由で顕著な遺伝的制御エレメントである。第一に、グリシン・リボスイッチは、たった１０個の原子から構成されるリガンドに対する選択的結合ポケットを形成し、つまり、既知の天然及び遺伝子操作したＲＮＡアプタマーのうちの最小の有機化合物を結合する。この観察は、ＲＮＡが広範な生体分子を選択的に結合するのに十分な構造的潜在性を有するという仮説と一致する。
【０２６２】
第二に、枯草菌ｇｃｖＴオペロンの５’−ＵＴＲは、スイッチに関して遺伝的であり、つまり、リガンド結合を利用し、遺伝子発現を活性化することを証明した稀なタイプのＲＮＡとして、アデニンリボスイッチを接合する（Ｍａｎｄａｌ及びＢｒｅａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２９（２００４））。大部分の場合、リボスイッチは、それらの関連した遺伝子の発現を引き起こし、標的代謝産物の生合成又は移入にこれらの多くの遺伝子が関与するために期待されるべきである。しかしながら、枯草菌由来のグリシン・リボスイッチは、グリシン分解に要求される３つの遺伝子の発現を制御する。リガンドを活性化したリボスイッチは、十分なアミノ酸基質がグリシン開裂システムの産生を請け負うことを提示するかどうかを決定するために必要されるであろうし、それによって、スイッチに関するこの稀なものが何故使用されるかに対する論拠を証明する。
【０２６３】
第三に、これは、タンデム型アプタマー立体構造を制御的に利用する唯一の既知の代謝産物結合リボスイッチクラスである。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ及び枯草菌の両方において、アプタマーの並列が２つのグリシン分子の協同的結合を可能にする。枯草菌リボスイッチについて、この特徴は、それぞれ、グリシンの濃度増加及び減少に応答して、グリシン開裂システムをコードする遺伝子の通常の急速な活性及び抑制の原因となる。グリシン・リボスイッチのタンデム型構築体の普及を与えるので、このより「デジタル」スイッチは、同様に、グリシンにおける小さな変化に応答して遺伝子発現を調節することによって重要な選択的利点を微生物に与える。
【０２６４】
開示した方法及び組成物は、これらが変化してもよいように記載した特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されないことは理解される。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施態様のみを記載することを目的としたものであり、添付した特許請求の範囲にのみ限定されるであろう本発明の範囲を制限することを意図しないことも理解されるべきである。
【０２６５】
本明細書中及び添付した特許請求の範囲で使用するように、単数形「１の（ａ）」、「１の（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の関係を含む。つまり、例えば、「１の（ａ）リボスイッチ」と言った場合、複数のこのようなリボスイッチを含み、「その（ｔｈｅ）リボスイッチ」と言った場合、１又はそれより多くのリボスイッチ、及び帯び当業者に既知のその均等物に言及される。
【０２６６】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に」は、実質的に記載した事象、環境、又は材料が、発生又は存在してもよく又はそうでなくてもよいことを意味し、そして、その記載は、その事象、環境、又は材料が発生し又は存在する場合、及びそれが発生せず及び存在しない場合を含むことを意味する。
【０２６７】
範囲は、本明細書中、「約」１つの特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までを表現してもよい。このような範囲が表現され、同様に、具体的に意図されそして考慮される場合、文脈が特別に他を指示しない限り、１つの特定の値から及び／又は他の特定の値までの範囲が開示される。同様に、値が前例の「約」の使用によって、近似として表現される場合、特定の値が別のものを形成することが理解され、具体的には、文脈が特別に他を指示しない限り、考慮されるべき実施態様が開示されることが意図されるであろう。さらに、この範囲の各々の終端は、その文脈が特別に他を指示しない限り、他の終端と比べて、及び他の終端とは独立しての両方に有意であることが理解されるであろう。最後に、個々の値の全て、及び明示的に開示した範囲内に含有される値のサブ範囲はまた、具体的に意図され、その文脈が特別に他を指示しない限り、開示されたものと考慮すべきであると理解されるべきである。前述のものは、特定の場合において、これらの態様のいくつか又は全部が明示的に開示されるかどうかに関わりなく適用される。
【０２６８】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学的用語は、開示された方法及び組成物が属する当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似し又は均等のいずれかの方法及び材料は、本方法及び組成物の実施又は試験に使用することができるが、具体的に有用な方法、装置、及び材料は記載される通りである。本明細書中に引用した刊行物及びそれらが引用する材料は、それによって、参照により具体的に援用される。本明細書に記載がないことは、本発明が先行する発明のためにこのような開示を予期する権利を付与しないという許諾として解釈されるべきである。いずれの参照も先行技術を構築するという承認はなされない。参考文献の検討は、それの著者者が主張することを述べ、出願人は、引用した文献の正確性や妥当性を厳密に調べる権利を留保する。多くの刊行物は、本明細書中に言及されるが、このような参考文献は、これらの文献のいずれかが当該技術分野において共通の常識の部分を形成するという承認を構築しないことは、明確に理解されるであろう。
【０２６９】
本明細書の記載及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその語の変形体、例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「限定されずに含むこと」を意味し、例えば、他の付加物、成分、整数又は工程を排除することを意図しない。
【０２７０】
当業者は、本明細書中に記載した方法及び組成物の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し、又はせいぜい日常的な実験を用いて確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のグリシン応答性リボスイッチの構造及び特性を示す。図１Ａの配列は、配列番号１である。図１Ｂの配列は、ＧＧＧＵＵＧＡＡＧＡＣＵＧＣＡＧＧＡＧＡＧＵＧＧＵＵＧＵＵＡＡＣＣＡＧＡＵＵＵＵＡＡＣＡＵＣＵＧＡＧＣＣＡＡＡＵＡＡＣＣＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＵＡＡＡＵＣＵＵＵＡＣＧＧＵＧＣＡＵＵＡＵＵＣＵＵＡＧＣＣＡＵＡＵＡＵＵＧＧＣＡＡＣＧＡＡＵＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＵＧＵＡＧＵＵ（配列番号２（ＶＣ  Ｉ））、ＧＧＡＧＧＡＡ（リンカー）、及びＣＣＵＣＵＧＧＡＧＡＧＡＡＣＣＧＵＵＵＡＡＵＣＧＧＵＣＧＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＵＣＵＧＣＧＣＡＵＡＵＧＣＡＧＡＧＵＧＡＡＡＣＵＣＵＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＡＧＧＡ（配列番号３（ＶＣ  ＩＩ））である。
【図２Ａ】図２Ａは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、種々の生物のグリシン応答性リボスイッチの分布及び整列を示す。
【図３】図３Ａ−３Ｃは、グリシン応答性リボスイッチのＶＣ  ＩＩ  ＲＮＡの構造及び直列プロービングを示す。図３Ａの配列は、配列番号４である。
【図４】図４Ａ−４Ｂは、グリシン応答性リボスイッチのリガンド特異性を示す。
【図５】図５は、グリシン応答性リボスイッチのＶＣ  Ｉ−ＩＩ  ＲＮＡによる２つのグリシン分子の協同的結合を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、グリシン応答性リボスイッチの１つのアプタマー又は２つのアプタマーを担持するＲＮＡ構築物とのリガンド結合に対する期待され、測定された応答を示す。
【図７】図７Ａ−７Ｃは、コレラ菌のグリシン応答性リボスイッチのＩ型及びＩＩ型アプタマーの間の協同的結合を示す。図７Ａの配列は、配列番号５である。
【図８】図８Ａ−８Ｃは、枯草菌由来のグリシン応答性リボスイッチの構造及び特性を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｃは、種々の化合物の存在下での枯草菌のグリシン応答性リボスイッチのインビトロ転写を示す。図９Ａの配列は、配列番号６（Ｉ）及び配列番号７（ＩＩ）である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、グリシン応答性リボスイッチのグリシン及びグリシン類似体の効果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、グリシン応答性リボスイッチのグリシン及びグリシン類似体の効果を示す。
【図１】
2008515436.tif 000007
【図２Ａ】
2008515436.tif 000008
【図２Ｂ】
2008515436.tif 000009
【図２Ｃ】
2008515436.tif 000010
【図２Ｄ】
2008515436.tif 000011
【図２Ｅ】
2008515436.tif 000012
【図２Ｆ】
2008515436.tif 000013
【図３】
2008515436.tif 000014
【図４】
2008515436.tif 000015
【図５】
2008515436.tif 000016
【図６】
2008515436.tif 000017
【図７】
2008515436.tif 000018
【図８】
2008515436.tif 000019
【図９】
2008515436.tif 000020
【図１０Ａ】
2008515436.tif 000021
【図１０Ｂ】
2008515436.tif 000022
【配列表】
2008515436000001.app
【国際調査報告】
2008515436.tif 000023