(57)【要約】【課題】尿失禁治療のための化合物【解決手段】本発明は、式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物に関し、式中、Ｒ1は式（Ｉ）で表される化合物が、腎尿細管でその活性体又はその活性代謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。該化合物は尿失禁の治療又は予防に特定の使用が見出された。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物。
【化１】
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（式中、Ｒ1は、式（Ｉ）で表される化合物が、腎尿細管中でその活性体又はその活性代
謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。）
【請求項２】
Ｒ1がアミノトランスフェラーゼ酵素によって開裂可能な基であることを特徴とする、
請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1がγ−グルタミルトランスフェラーゼによって開裂可能な基であることを特徴とす
る、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1基がアミノ結合によって、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのアミノ基と連結することを
特徴とする、請求項１乃至請求項３のうち何れか一項に記載の化合物。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される化合物が、式（Ｉａ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物であることを特徴とする、請求項１乃至請求項４のうち何れか一項に記載の化合物。
【化２】
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【請求項６】
薬剤として使用する、請求項１乃至請求項５のうち何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
尿失禁の治療又は予防のための薬剤として用いられる、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
尿失禁の治療又は予防のための薬剤の製造のための、請求項１乃至請求項５のうち何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
請求項１乃至請求項７のうち何れか一項に記載の化合物、並びに薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
経口以外の経路による投与に適切な形態にあることを特徴とする、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
経皮投与に適切な形態にあることを特徴とする、請求項９又は請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
皮膚透過促進剤を含む、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記皮膚透過促進剤が、イソプロピルミリステート（ミリスチン酸イソプロピル）とファーマソルブ（登録商標：Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ）（Ｎ−メチルピロリドン）の混合物であることを特徴とする、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項５のうち何れか一項に記載の化合物の治療有効量、又は請求項９乃至請求項１３記載のうち何れか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を、尿失禁の治療の必要な哺乳動物に投与することを含む、尿失禁の治療方法。
【請求項１５】
前記組成物又は化合物を経皮的に投与することを特徴とする、請求項１４記載の方法又は請求項８記載の使用。
【請求項１６】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンを、適当なカップリング剤の存在下で、所望により塩基の存在下で式Ｒ1−ＯＨで表される化合物（式中、Ｒ1は請求項１で定義された通りである。）と反応させることを含む、請求項１乃至請求項５のうち何れか一項に記載の化合物の合成方法。
【請求項１７】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンを、所望により塩基の存在下で、式Ｒ1−Ｌで表される化合
物（式中、Ｒ1は請求項１で定義された通りであり、Ｌは適当な脱離基を表す。）と反応
させることを含む、請求項１乃至請求項５のうち何れか一項に記載の化合物の合成方法。
【請求項１８】
式（ＩＩ）
【化３】
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（式中、Ｐ1及びＰ2は１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの適当な保護基を表す。）
で表される化合物を、適当な塩基の存在下で、所望により一種以上の適当なカップリング剤の存在下で反応させ、続いて該保護基を除去することを含む、請求項５記載の化合物の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン（式（Ｉｂ））化合物のプロドラッグに関する。それはまた前記プロドラッグを含む医薬組成物にも関する。
【化１】
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【背景技術】
【０００２】
尿失禁は、様々な疾患に起因し得る。特に高齢者や、妊娠及び出産による障害を経験した女性の間で広まっている。男性と比較して２倍以上の多くの女性がその病気に冒されている。尿失禁はまた遺伝的条件にも起因し得る。
【０００３】
尿失禁の様々な形態としては、急迫性尿失禁、反射性尿失禁、溢流性尿失禁、神経性尿失禁、前立腺手術後の尿失禁、一過性尿失禁（感染症又は薬剤による一時的な状態）、及びストレス性又は負荷性尿失禁症が挙げられる。一部の患者は、これら尿失禁の形態の２種以上を有しており、それは混合型尿失禁と言われる。過活動膀胱に起因する急迫性尿失禁は、神経経路が異常に活発であることによって引き起こされ得る。ストレス性尿失禁は最も一般的な尿失禁の形態であり、そして、例えば、尿道括約筋上に過度の圧力がかかる位置への膀胱脱によって引き起こされ得る。
【０００４】
尿失禁に対抗するために現在使用される薬剤の多くは、治療遵守不良につながり得る副作用を有している。一部の形態の尿失禁の場合、外科手術が利用され得るが、外科手術は常にある種のリスクを伴うため、一部の患者には望ましくない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物を提供する。
【化２】
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（式中、Ｒ1は式（Ｉ）で表される化合物が、腎尿細管中でその活性体又は活性代謝物に
変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。）式（Ｉ）で表される化合物は、薬剤として使用され得る。
【０００６】
特に、本発明はまた、式（Ｉａ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物を提供する。
【化３】
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式（Ｉａ）で表される化合物は薬剤として使用され得る。式（Ｉａ）で表される化合物は、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグである。該化合物はしたがって、尿失禁の治療又は予防に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は式（Ｉ）で表される化合物、及び、例えば尿失禁の治療及び予防におけるそれら化合物の治療上の使用に関する。
【０００８】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンは、国際公開第０３／０５５４７４号パンフレットから便失禁に対して可能な治療として知られている。全身の１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンが相当なレベルに到達している実験的な研究において、驚くべきことに、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの副作用は、その他の点では健康な膀胱を有する被験者において排尿困難を生ずることであることが本発明者らによって見出された。排尿困難は膀胱及び／又は尿道に影響を有する１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンに起因するとみなされた。しかしながら、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンが例えば血圧の上昇といった好ましくない全身性副作用を生ずることも観察されたことから、この適応のための薬剤として、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンは好適でないとされている。
【０００９】
本発明者らはまた、単体で投与されたとき、生体外で、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン（式Ｉｂ）がブタの膀胱頸部筋の収縮の誘発に効果的であることを見出した。式（Ｉ）で表される化合物（式中、Ｒ1は、式（Ｉ）で表される化合物が、腎尿細管中でその活性体又は
活性代謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。）が、Ｒ1基の開裂に好適な酵素、及び所望によりカルボキシル基受容体と一
緒に投与されるとき、生体外でブタの膀胱頸部筋の収縮の誘発に効果的である。例えば、γ−グルタミルトランスフェラーゼ及びグリシルグリシン受容体と一緒に投与されるとき、式（Ｉａ）で表される化合物は、生体外で、ブタの膀胱頸部筋の収縮の誘発に効果的である。
【００１０】
本発明者らはまた、式（Ｉ）で表される化合物を生体内ブタの尿力学モデルで投与したとき、尿流量の妨害や排尿効率を損なうことなく、膀胱尿道移行部（ＶＵＪ）ベースライン圧、ＶＵＪ限界圧、及びＶＵＪ排尿圧の上昇に効果的であることを見出した。加えて、本発明者らは、式（Ｉ）で表される化合物を生体内ブタの尿力学モデルに投与したとき、動脈圧の最少上昇を実現することを見出した。
【００１１】
従って、本発明は、薬剤として使用される、特に尿失禁の治療又は予防に使用される、式（Ｉ）で表される化合物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、尿失禁の治療又は予防のための薬剤の製造への、上述で定義された式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物の使用を提供する。
【００１３】
本発明はまた、上述で定義された式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物の治療有効量を、尿失禁の治療の必要な哺乳動物に対して投与することを含む、尿失禁の治療方法を提供する。
【００１４】
失禁は、膀胱頸部、尿道、小胞状又は尿道括約筋における筋肉の緊張喪失に起因するとみられる；従って、本発明は膀胱頸部、尿道、小胞状又は尿道括約筋における平滑筋の緊張の増加への使用を見出す。
【００１５】
上述したように、Ｒ1は式（Ｉ）で表される化合物が、腎尿細管中でその活性体又は活
性代謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。すなわち、好ましくは、該化合物は体内において非常に低い活性を有し、そして、Ｒ1基は分子から開裂可能であり、生物学的活性体を生成する。より好ましくは、Ｒ1基は１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのアミノ基とアミド結合によって連結している。従って、好ましいＲ1基は、連結末端でカルボニル基を有している。例えば、Ｒ1は、カルボニル基、すなわち−Ｃ（＝Ｏ）で終結する置換されたアルキル基であり得る。前記アルキル基は、アミン基又はカルボン酸基で置換され得、例えばＲ1はＣＯ2Ｈ−ＣＨＮＨ2−（ＣＨ2）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）（式中、ｎは０乃至５、好ましくは１乃至３、最も好ましくはｎは２を表す。）であり得る。最も好ましくは、Ｒ1基はγ−グルタミルトランスフェラーゼによって
開裂可能な基である。例えば、Ｒ1基は、γ−Ｌ−グルタミン酸であり得る。式（Ｉ）で
表される好ましい化合物は、式（Ｉａ）で表される化合物である。
【００１６】
特に、本発明は、式（Ｉａ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物を提供する。
【化４】
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【００１７】
式（Ｉａ）で表される化合物は、γ−Ｌ−グルタミル−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンとしても知られる、（Ｓ）−２−アミノ−４−［（１Ｓ、２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸である。
【００１８】
式（Ｉａ）で表される化合物は、薬剤として使用され得る。式（Ｉａ）で表される化合物は、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのためのブロドラッグである。該化合物は、従って、尿失禁に治療又は予防において使用される。
【００１９】
本発明によって治療される対象は、主として哺乳動物である。哺乳動物は、一般に人であるが、商業飼育動物やコンパニオン・アニマルでもあり得る。
【００２０】
式（Ｉ）で表される化合物は、急迫性尿失禁、反射性尿失禁、溢流性尿失禁、神経性尿失禁、前立腺手術後の尿失禁、一過性尿失禁及びストレス性又は負荷性尿失禁などの、あらゆる種類の尿失禁の治療又は予防のための薬剤として使用され得る。式（Ｉ）で表される化合物は、混合型尿失禁の治療又は予防のための薬剤として使用され得る。式（Ｉ）で表される化合物は、ストレス性尿失禁の治療又は予防のための薬剤として特定用途を見出している。
【００２１】
レシピエントに対する投与すると、その投与状態において非活性であり、しかしながら、活性な１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン又はその活性代謝物を（直接的又は間接的に）提供可能である化合物は、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン“プロドラッグ”として知られている。プロドラッグは体内で薬剤効果を有する活性体に変換される。薬学的に許容されるプロドラッグ類は、Ｔ．ヒグチ及びＶ．ステラ、新規デリバリーシステムとしてのプロドラッグ類
（Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ、Ｖｏｌ．１４；及びエドワード  Ｂ．ロシュ編、ドラッグデザインにおけるバイオリバーシブル・キャリア類（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）、米国医薬品協会、ペルガモン出版、１９８７に示され、双方ともに参照することにより本書に組み込まれる。
【００２２】
体内でプロドラッグが活性体又は活性代謝物又はその残留物にどう変換され得るかの一つの例は、開裂によるものである。本発明のプロドラッグ化合物は、プロドラッグ分子を開裂できる特定の酵素の存在によって腎臓内で選択的に活性化されることを前提としている。前記酵素は肝臓においても見出されるが、肝臓におけるプロドラッグ化合物の有意な開裂は、初回通過代謝を回避する投与経路の選択によって回避される。
【００２３】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグの例は、式（Ｉａ）で表される化合物であり、すなわち、Ｒ1がγ−Ｌ−グルタミン酸である式（Ｉ）で表される化合物である。腎臓
はγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）を含有し、それはグルタミン酸とアミン間のペプチド結合を開裂させる。ＧＧＴは腎臓及び肝臓内で高レベルで見出されるが、上述したように、肝臓ＧＧＴによる有意な開裂は、例えば静脈注射などの、初回通過代謝を回避する投与経路の選択によって回避され得る。従って、適切に体内に投与されたプロドラッグの開裂は、ほぼ例外なく腎臓で起こる。
【００２４】
グルタミン酸が結合した薬剤は、腎臓に到達するまで血液中を循環し、そこでペプチド結合が開裂されて、尿とともに尿管を通る薬剤を膀胱及び続いて尿道内に放出させることが前提とされる。薬剤は従って、泌尿系システム及び膀胱において選択的に活性であり、従って全身性副作用は軽減される。例えば、ムスカリン性又は抗コリン作用性薬剤に起因する、ドライマウス、視覚障害、便秘及び頻脈といった典型的な副作用を減少し、前立腺肥大や緑内障を有する患者の治療のための抗コリン作用性薬剤の使用の可能性を拡大する。本発明は従って、好ましくは、現在使用中の抗コリン作用性及びムスカリン性薬剤の副作用なしに、尿失禁治療において効果的である薬剤への要求を実現する。
【００２５】
治療における使用の場合、式（Ｉ）で表される化合物はそのまま、すなわち、遊離塩基の形態で、或いは、それらの塩の溶媒和物を含む、薬学的に許容されるそれらの溶媒和物又は塩の形態で使用され得る。特に定めの無い限り、以下で使用される“式（Ｉ）で表される化合物”という用語は、遊離塩基、及び、薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物を含む。式（Ｉ）で表される化合物、又は、溶媒和物又は塩、或いは、該塩の溶媒和物の量又はパーセンテージが与えられるとき、それらの溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物の量又は濃度は、好ましくは式（Ｉ）で表される化合物の量又は濃度に基づいて算出される。
【００２６】
式（Ｉ）で表される化合物の塩は、例えば、酸付加塩などの、酸との塩である。塩の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸又はショウノウ酸とのものである。
【００２７】
有機化学に精通しているものであれば、多くの有機化合物が溶媒と反応して、又は溶媒から沈殿や結晶化して、複合体を形成することを理解するであろう。これら複合体は“溶媒和物”として知られている。例えば、水との複合体は“水和物”として知られている。
【００２８】
治療効果を獲得するのに必要な式（Ｉ）で表される化合物の量は、もちろん、投与経路、治療の対象者、扱っている尿失禁の形態によって様々である。臨床治療において、一般
に、望ましい効果を獲得する最低投与量の使用が好ましい。
【００２９】
本発明の化合物は、１日当り０．１乃至１５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当り０．１乃至５００ｍｇ／ｋｇの容量で投与され得る。単位用量形態は、本発明の化合物の、前記投薬量又は複数の前記投薬量で効果的な量を、例えば５ｍｇ乃至５００ｍｇ、通常約１０ｍｇ乃至２００ｍｇを含む単位で、都合よく含有する。
【００３０】
本発明の化合物は、１日当り１回以上、例えば１日当り２回又は３回、又はそれ以上、例えば１日当り４回又は５回投与される。
【００３１】
活性成分は単独でも投与可能であるけれども、医薬配合物又は医薬組成物中に存在することが好ましい。従って、本発明は、薬学的に好適な担体又は賦形剤と一緒に混合又は組み合わせた、上記に定義した式（Ｉ）で表される化合物、又は薬学的に許容されるその溶媒和物又は塩、又は該塩の溶媒和物を含む、医薬配合物を提供する。本発明の医薬組成物は、以下に示す医薬配合物の形態をとり得る。
【００３２】
最も好適な経路は、例えばレシピエント症状や疾患の性質及び段階により得るが、本発明の医薬配合物は、非経口投与（皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与及び関節内投与など）、吸入投与（様々なタイプの定量加圧エアロゾル、ネブライザー（噴霧器）又は吸入器の方法によって発生され得る微粒子ダスト又はミストなど）、局所投与（皮膚投与、口腔内投与及び舌下投与など）、及び直腸投与に好適なものを含む。
【００３３】
式（Ｉ）で表される化合物、又はその医薬組成物又は医薬配合物は、尿失禁の治療又は予防のための薬剤として使用されるとき、好ましくは、経口投与以外の経路によって投与される。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、フォーム又は粘着パッチなどの、例えば皮膚への局所投与に適する形態であり得る。女性患者のために、該組成物は膣内投与に適した形態であり得る。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、例えば、座薬などの、直腸投与に適する形態であり得る。例えば徐放性座薬が好適である。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、例えば、経皮投与に適する形態であり得る。経皮投与に好適な医薬組成物は、式（Ｉ）で表される化合物の経皮輸送を増強するアジュバントを含み得る。前述の増強を獲得する方法のいかんにかかわらず、式（Ｉ）で表される化合物の経皮輸送を増強するいずれのアジュバントも、本発明の組成物で使用し得る。
【００３７】
好適なアジュバントは、経皮ドラッグデリバリーシステムにおいて皮膚透過促進剤又は可溶化剤として使用される、特定の薬学的に許容される物質を含む。典型的な物質としては、イソステアリン酸、オクタン酸、及びオレイン酸などの炭素原子数８乃至３６の脂肪酸類；オレイルアルコール及びラウリルアルコールなどの炭素原子数８乃至３６の脂肪アルコール類；エチルオレート、イソプロピルミリステート、ブチルステアレート及びメチルラウレートなどの炭素原子数８乃至３６の脂肪酸の低級アルキルエステル類；ジイソプロピルアジペートなどの炭素原子数６乃至８の二酸の二（低級）アルキルエステル類；グリセリルモノラウレートなどの炭素原子数８乃至３６の脂肪酸のモノグリセリド類；テトラグリコール（テトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコールエーテル）；テトラエチレングリコール（エタノール，２，２’（オキシビス（エチレンオキシ））ジグリコール）；炭素原子数６乃至３６のアルキルピロリドンカルボキシレート類；ポリエチレングリコール；プロピレングリコール；２−（２−エトキシエトキシ）エタノール；
ジエチレングリコールモノメチルエーテル；Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン  Ｎ−オキシド；ジエメチルスルホキシド；及び前述の組み合わせが挙げられる。
【００３８】
ポリエチレンオキシドのアルキルアリールエーテル類、ポリエチレンオキシドモノメチルエーテル類、及びポリエチレンオキシドジメチルエーテル類もまた好適であり、同様にグリセロール及びＮ−メチルピロリドンなどの可溶化剤も好適である。テルペン類は他の有用な種類の軟化剤であり、ピネン、ｄ−リモネン、カレン、テルピネオール、テルピネン−４−オール、カルベオール、カルボン、プレゴン、ピペリトン、メントン、メントール、ネオメントール、チモール、カンファー、ボルネオール、シトラール、イオノン及びシネオールの単独或いは任意の組合せを含む。
【００３９】
特に好ましいアジュバントは、イソプロピルミリステート（ＩＰＭ）（アドバンスサイエンティフィク＆ケミカル社、米国、より入手可能）及びファーマソルブ（登録商標）（Ｎ−メチルピロリドン、インターナショナルスペシャリティプロダクツ社、ウェイン、ニュージャージー州、米国、より入手可能）の８０：２０（ｖ／ｖ）混合物である。イソプロピルミリステート（ＩＰＭ）及びファーマソルブ（登録商標）の８０：２０（ｖ／ｖ）混合物に溶解した式１ａで表される化合物の飽和溶液における経皮吸収の治験調査を実施例６に示す。調査の結果は、式（Ｉａ）で表される化合物の対照溶液と比べて、ＩＰＭ／ファーマソルブに溶解した式（Ｉａ）で表される化合物の経皮吸収について１３．８４の増強率を実証した。
【００４０】
医薬組成物は、皮下投与向けであり得る。幾つかの組成物、例えば、皮下デポー（持続性）製剤及び粘着パッチは、遅発性又は持続性放出を提供し得る。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、単位用量形態であり得る。注射又は注入による投与では、単位用量形態は、例えばバイアル及びアンプルなどが挙げられる。皮膚への局所投与用の単位用量形態としては、ブリスターパック又はサシェなどが挙げられ、ブリスター又はサシェのそれぞれは、例えば上述のゲル、クリーム又は軟膏などの単位用量を含む。例えば、クリーム、軟膏又はゲルなどの局所組成物の一定量を投薬するための定用量デバイス、例えば、ポンプデバイスが提供され得る。持続性製剤又は粘着パッチのための製剤は持続性放出を提供する。
【００４２】
上述の医薬組成物は、式（Ｉ）で表される化合物に加えて、例えば、尿失禁の治療において効果を有するような、一種以上のさらなる活性成分をも含み得る。
【００４３】
上述の投与経路に適する、上述の様々なタイプの医薬組成物及び他の組成物が知られており、前記組成物の処方及びこれら調製方法も知られている。当該技術の文献としては、ＥＷ  マーティンによるレミントン医薬品科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのハンドブックが挙げられる。レビュー及び文献記事は、様々なタイプの粘着パッチ類などの、標準的な及びより高性能な処方及びデバイスを記載している。
【００４４】
メトキサミン（２−アミノ−１−（２，５−ジメトキシフェニル）−１−プロパノール）は、昇圧剤及び血管収縮剤として、現在臨床使用されている。メトキサミンは、２箇所のキラル中心を有するため、４種の立体異性体を有する。メトキサミンは異性体の混合物の形態で臨床使用されている。国際公開第０３／０５５４７４号パンフレットは、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの合成、ならびに核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法及び単結晶Ｘ線構造回折法によるキャラクタリゼーションが記載されている。それはまた、便失禁治療における１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの使用を記載している。
【００４５】
本発明は、式（Ｉ）で表される化合物（式中、Ｒ1は式（Ｉ）で表される化合物が、腎
尿細管中でその活性体又は活性代謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。）の製造に好適な方法を提供し、それは、
−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンを適当なカップリング剤の存在下、所望により塩基の存在下で、式Ｒ1−ＯＨ（式中、Ｒ1は請求項１で定義された通りである。）で表される基と反応させること
を含む。
【００４６】
好適なカップリング剤としては、ＥＤＣＩ、ＨＯＢＴ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵ、並びに、当業者に既知のその他ペプチドカップリング剤などが挙げられる。好適な塩基は、例えばジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、２，６−ルチジン及び１−メチルモルホリンといったアルキルアミン類などのアミン類、又は、炭酸カリウム、カリウム第三ブトキシド、炭酸ナトリウムなどの無機塩基類が挙げられる。反応混合物は室温で撹拌され、或いは出発物質が消費されるまで加熱される。反応は、保護基の存在を伴って実施され得、それら保護基は反応後に除去され得る。好適な保護基は当業者に既知である（Ｔ．Ｗ．グリーン、“有機合成における保護基”、第３版、ニューヨーク、１９９９、参照）。
【００４７】
本発明はまた、式（Ｉ）で表される化合物（式中、Ｒ1は式（Ｉ）で表される化合物が、
腎尿細管中でその活性体又は活性代謝物に変換されるところの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンのプロドラッグであるような基である。）の製造に好適な方法を提供し、それは
−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンを所望により塩基の存在下で、式Ｒ1−Ｌ（式中、Ｒ1は上記に定義された通りであり、Ｌは好適な脱離基を表す。）で表される基と反応させること
を含む。
【００４８】
好適な脱離基Ｌの例としては、クロリド、ブロミド、メチルスルホニル基又はトルエンスルホニル基などの、ハロゲン、炭素原子数１乃至４のアルキルスルホネートエステル類、炭素原子数５乃至１０のアリールスルホネートエステル類又は炭素原子数５乃至１０のａｒ−炭素原子数１乃至４のアルキルスルホネートエステル類が挙げられる。好適な塩基は、例えばジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、２，６−ルチジン及び１−メチルモルホリンといったアルキルアミン類などのアミン類、又は、炭酸カリウム、カリウム第三ブトキシド、炭酸ナトリウムなどの無機塩基類が挙げられる。反応混合物は室温で撹拌され、或いは出発物質が消費されるまで加熱される。反応は、保護基の存在を伴って実施され得、それら保護基は反応後に除去され得る。好適な保護基は当業者に既知である（Ｔ．Ｗ．グリーン、“有機合成における保護基”、第３版、ニューヨーク、１９９９、参照）。
【００４９】
本発明は、式（Ｉａ）で表される化合物の製造に好適な方法を提供し、それは
−式（ＩＩ）で表される化合物
【化５】
2008528474.tif 000007
（式中、Ｐ1及びＰ2は適当な保護基を表す。）を、適当な塩基の存在下で、所望により一種以上の適当なカップリング剤の存在下で、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンと反応させることを含む。
【００５０】
好適な塩基は、例えばジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、２，６−ルチジン及び１−メチルモルホリンといったアルキルアミン類などのアミン類、又
は、炭酸カリウム、カリウム第三ブトキシド、炭酸ナトリウムなどの無機塩基類が挙げられる。好適なカップリング剤としては、ＥＤＣＩ、ＨＯＢＴ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵ、並びに、当業者に既知のその他ペプチドカップリング剤が挙げられる。反応混合物は室温で撹拌され、或いは出発物質が消費されるまで加熱される。保護基Ｐ1及びＰ2は、反応後、一段階又は別々の段階で除去され得る。反応は、Ｐ1及びＰ2以外の保護基を存在させて実施され得、それら保護基は反応後に除去され得る。好適な保護基は当業者に既知である（Ｔ．Ｗ．グリーン、“有機合成における保護基”、第３版、ニューヨーク、１９９９、参照）。好ましくはＰ1はベンジルカルバメート基である。好ましくはＰ2はベンジル基である。
【００５１】
式（Ｉ）で表される化合物は、例えば酸と反応させることなどによって、酸との塩、例えば上述の塩などのその塩に変換され得る。該塩は所望により溶媒和物として単離され得る。
【００５２】
あるいは、式（Ｉ）で表される化合物は、溶媒和物として単離され得る。
【００５３】
本発明は以下の実施例によってここに説明するが、該実施例は本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
［略称］
ＥＤＣＩ      １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
ＨＯＰＴ      １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＢＯＰ        １−ベンゾトリアゾールオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（カストロ（Ｃａｓｔｒｏ’ｓ）試薬）
ＰｙＢＯＰ    １−ベンゾトリアゾールオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＡＴＵ      Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
【００５５】
［実施例１］
式（Ｉａ）で表される化合物の合成
（Ｓ）−２−アミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸（γ−Ｌ−グルタミル−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン）
〈工程１〉
（１Ｒ，２Ｓ）−２−アミノ−１−（２，５−ジメトキシフェニル）プロパン−１−オール（１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン、１６．１５ｍｍｏｌ、４ｇ）、（Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−カルバモイル酪酸ベンジルエステル（１３．５ｍｍｏｌ、５ｇ）及びＥＤＣＩ（１４．８５ｍｍｏｌ、２．８５ｇ）をアセトニトリル（１００ｍｌ）中に懸濁させ、十分量の水を滴下して加え、全ての試薬を完全に溶解させた。反応混合物を室温にて４８時間撹拌し、次に減圧下で蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：１）によって精製し、無色オイルとして、（Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸ベンジルエステル（２．３ｇ、３０％）を得た：ＭＳ（＋ＥＩ）５６５［Ｍ＋１］+
【００５６】
〈工程２〉
メタノール（８０ｍｌ）中で、（Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−［
（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸ベンジルエステル（４．０７ｍｍｏｌ、２．３ｇ）に対して１０％Ｐｄ−Ｃ（０．４１ｍｍｏｌ、０．４４ｇ）を加えた。フラスコに水素の入ったバルーンを取り付け、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をメタノールで洗浄したセライトでろ過した。減圧下の濃縮により、固体として（２Ｓ）−２−アミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸｛γ−Ｌ−グルタミル−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン｝（１．０ｇ、収率７２％）を得た：ＭＳ（＋ＥＩ）３４１［Ｍ＋１］+，３２３［Ｍ−ＯＨ］
【００５７】
［比較例２］
式（ＩＩＩ）で表される化合物の合成
（Ｓ）−４−アミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸（α−Ｌ−グルタミル−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン）
【化６】
2008528474.tif 000008
〈工程１〉
（１Ｒ，２Ｓ）−２−アミノ−１−（２，５−ジメトキシフェニル）プロパン−１−オール（１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン、１６．１５ｍｍｏｌ、４ｇ）、（Ｓ）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−カルバモイル酪酸ベンジルエステル（１３．５ｍｍｏｌ、５ｇ）及びＥＤＣＩ（１４．８５ｍｍｏｌ、２．８５ｇ）をアセトニトリル（１００ｍｌ）中に懸濁させ、十分量の水を滴下して加え、全ての試薬を完全に溶解させた。反応混合物を室温で７日間撹拌し、続いて減圧下で蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝１：１）で精製し、無色オイルとして、（Ｓ）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸ベンジルエステル（１．９、２５％）を得た：ＭＳ（＋ＥＩ）５６５［Ｍ；１］+
【００５８】
〈工程２〉
メタノール（３８ｍｌ）中、（Ｓ）−２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸ベンジルエステル（３．３７ｍｍｏｌ、１．９ｇ）に対して、１０％Ｐｄ−Ｃ（０．１９ｇ）を加えた。フラスコに水素の入ったバルーンを取り付け、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をメタノールで洗浄したセライトでろ過した。減圧下で濃縮し、固体として、（Ｓ）−４−アミノ−４−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチルカルバモイル］酪酸｛α−Ｌ−グルタミル−１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン｝（１．１ｇ、収率９６％）を得た。：ＭＳ（＋ＥＩ）３４１［Ｍ＋１］+，３２３［Ｍ−ＯＨ］
【００５９】
［実施例３］
ブタ膀胱頚部筋における式（Ｉａ）で表される化合物及び式（ＩＩＩ）で表される化合物の生体外スタディ
ａ）機能アッセイ
方法
試料採取及び調製
在来種のメスの白色ブタの膀胱及び尿道試料は、地方の食肉処理場において新鮮な解体
されたブタから得た。ブタは電気ショックによって最初に気絶させた後、瀉血によって殺された。肛門、直腸、膀胱及び尿道を、摘出の間、ひとまとめで切除し、すぐに事前に酸素添加したクレブ（Ｋｒｅｂｓ’）溶液（ｍｍｏｌ／ｌ：ＮａＣｌ  １２０、ＫＣｌ  ５．９、ＮａＨＣＯ3  １５．４、ＣａＣｌ2  ２．５、ＭｇＣｌ2  １．２、グルコース  
１１．５）に移し、実験室に運び、処理されるまで冷蔵庫（４℃）にて保管した。
【００６０】
膀胱及び尿道を上記試料から除去して、解剖用の皿の上に背部を下にして固定し、そこで膀胱を切り開いて三角部を露出し、尿道を三角部の頂部で膀胱と切り離した。
【００６１】
膀胱尿道移行部括約筋の場所を確認した。膀胱を経尿道カテーテルを通して２００ｍｌの液体で膨張させた。そして、鋭く狭い膀胱底が現れるまで、液体をそっと圧迫して出口に到達させた（ダス、１９９７；ダスら、２００１）。この部分の組織切片を尿路上部で剥皮し、横方向に解剖して幾つかの筋ストリップにした。
【００６２】
組織解剖
解剖を、解剖用顕微鏡を用いて、解剖用ペトリ皿（組織の一定の酸化を確保するために継続的に補充される酸素飽和されたクレブ（Ｋｒｅｂｓ’）溶液を含む。）のシリコンエラストマーコート底面中で実施した。
【００６３】
ストリップの取り付け及び平衡
平均質量７ｍｇを有する寸法約５−６ｍｍ×２−３ｍｍの筋ストリップに解剖し、ストリップの夫々の端に細い（５／０）絹糸をくくり、各ストリップを、０．２ｍｌ容量のパースペクス器官浴中、電界刺激（ＥＦＳ）を送達できる２枚の凹型白金電極の間に垂直に固定した。ストリップは継続的にクレブ溶液（３７℃）で１．５ｍｌ／分の割合で表面灌流させた。クレブ溶液を、９７％酸素と３％二酸化炭素でガス化した。目的濃度の薬剤含有溶液をクレブ溶液に対して置換することによって、薬剤を送達した。
【００６４】
装置
装置は、ブランディング（Ｂｒａｎｄｉｎｇ）及びシブレイ（Ｓｉｂｌｅｙ）（１９８３）によって記載された、６本のストリップのスタディを同時にできる、平行な６つの器官浴から構成された。各実験の前に、トランスデューサーに取り付けられた１質量ｇで各チャネルをキャリブレートし、組織片を取り付け後に１ｇで引っ張った。ストリップによって生じた等尺性張力をアイソメリックフォースディスプレイスメントトランスデューサー、ピオデン  ダイナモメーター  ＵＦＩ  トランスデューサー（ピオデンコントローズ社、カンタベリー、ケント）又はＡＤインスツルメンツ  ＭＬＴ０５０／Ｄ  フォーストランスデューサーを用いて測定し、増幅し（ハーバードトランスデューサー／アンプリファイド、ハーバード  アパラタス社、エデンブリッジ、ケント）、マックラボデータアクイジションシステム（ＡＤインスツルメンツ社、シドニー、オーストラリア）又は、パワーＬａｂ／８ＳＰ並びにチャートｖ３．６ソフトウェア（マッキントッシュ）又はチャートｖ５（ＰＣ）とつなげたＡＤインスツルメンツＯＣＴＡＬブリッジアンプリファー（ＡＤインスツルメンツ社、シドニー、オーストラリア）を用いて分析した。
【００６５】
用量応答曲線プロトコル
様々な化合物に対する用量応答曲線を、夫々の実験において一対のストリップに対して一種の薬剤を試験することによって作成した。標本を、流出期間で中断させながら、薬剤用量を増加する、一連の連続した１０ｓ（＠１．５ｍｐ／ｓ）適用に晒した。
【００６６】
薬剤及び試薬
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンヒドロクロリド、式（Ｉａ）で表される化合物及び式（ＩＩＩ）で表される化合物を、ノージンインターナショナルリサーチ社（ミドルセックス）よ
り入手した。
【００６７】
データ解析
応答を張力ｇ数又は最大力％として報告し、平均値±標準誤差値として与えた。ＥＣ50（５０％効果濃度）を効力の尺度として使用した。ＥＣ50値をカレイドグラフ図示ソフトウエアアプリケーションを用いて、用量応答曲線のグラフより算出した。結果を、フィッシャー試験を伴うＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いた統計的分析ソフトウエア、スタットビュー（ＳｔａｔＶｉｅｗ）５．０（ＳＡＳインターナショナル社）を用いて評価した。データ間の著しい差はＰ＜０．０５が原因であると推測した。
【００６８】
結果
式（ＩＩＩ）で表される化合物、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン及び式（Ｉａ）で表される化合物に対する、単離されたブタの膀胱尿道移行部括約筋ストリップの応答の代表的なトレースを図１に示す。１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンは、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の非常に顕著で明確な収縮応答を引き起こした（図１、中のトレース）。比較実施例２に記載された化学合成によって製造された式（ＩＩＩ）で表される化合物もまた、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の非常に明確な収縮応答を引き起こした（図１、上のトレース）。実施例１に記載された化学合成によって製造された式（Ｉａ）で表される化合物は、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の有意な収縮を引き起こさなかった（図１、下のトレース）。
【００６９】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン、式（Ｉａ）で表される化合物又は式（ＩＩＩ）で表される化合物の用量の増加に対するブタの膀胱尿道移行部括約筋の収縮応答のグラフを図２ａ及び図２ｂに示す。１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンは、濃度１０-3Ｍにて最大応答１．１２ｇ±０．２６ｇを誘発した（図２ａ）。式（ＩＩＩ）で表される化合物もまた幾分かの膀胱活性を示したが、最大応答１．３３ｇ±０．２５ｇは、１０-2Ｍにおいてのみにて観察され、一方、試験された用量範囲（１０-6Ｍ−１０-2Ｍ）に亘って、式（Ｉａ）で表される化合物は殆ど応答を誘起しなかった（図２ａ）。１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン及び式（ＩＩＩ）で表される化合物の双方は、式（Ｉａ）で表される化合物で観察されたフラットな応答とは対象的に、特有のＳ字型用量応答曲線を作成した（図２ｂ）。相対効力（ＥＣ50）は１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン（０．０５６２ｍＭ）＞式（ＩＩＩ）で表される化合物（０．４９５ｍＭ）＞式（Ｉａ）で表される化合物（４．６４ｍＭ）の順であった。従って、式（ＩＩＩ）で表される化合物は１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの生物活性の約１０％を保持していた。
【００７０】
結論
式（Ｉａ）で表される化合物は、生体外筋ストリップ標準試験において、殆ど或いは全く活性を有さず（図１）、該化合物がプロドラッグ状態であることを示すものであった。しかしながら、式（ＩＩＩ）で表される化合物は、生体外筋ストリップ標準試験において幾らかの活性を有し、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの生物活性の約１０％を保持することを示した。したがって、α−カルボキシ基を経由して１Ｒ，２Ｓ−メトキサミングルタミン酸に結合した式（ＩＩＩ）で表される化合物は、γ−カルボキシル基を経由して１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンにグルタミン酸が結合した式（Ｉａ）で表される化合物と比して、尿失禁治療又は予防におけるプロドラッグとしての使用には適さないものであった。
【００７１】
ｂ）酵素アッセイ
方法
実証段階
市販のγ−グルタミルトランスフェラーゼ（γＧＴ）を、市販の基質、グルタミルｐ−ニトロアニリド（ＧｐＮＡ）及び補因子グリグリシン（ｇｌｙｇｌｙ）及びマグネシウムを用いて確認した。反応は以下の式によって特徴付けられ得る。
【化７】
2008528474.tif 000009
γＧＴは共役ＧｐＮＡからニトロアニリドを放出して、λ最高４０５ｎｍで測定可能な黄色みがかった色の反応生成物を生成する。
【００７２】
ａ）原液を以下の如く調製した。
ｐＨ８．２の５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー中、以下の原液を製造した：
Ａ．トリスＨＣｌバッファー中、グリシルグリシン（ｇｌｙｇｌｙ）（受容体）  ２０ｍｇ／ｍｌ
Ｂ．トリスバッファー中、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ３．３ｍｇ／ｍｌ
Ｃ．トリスバッファー中、γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド  ６ｍｇ／ｍｌ
Ｄ．酵素原液を、トリスバッファー１０ｍｌ中、γＧＴ（３０００Ｕ）を溶解することによって調製し（＝３００Ｕ／ｍｌ）、２０μｌ（＝５００）原液にアリコートして−２０℃にて保管した。
Ｅ．酵素希釈標準溶液。１アリコート（＝６単位）を１ｍｌトリスバッファー（＝６単位／ｍｌ）に再構成した。
【００７３】
ｂ）酵素アッセイプロトコル
ＧｐＮＡを以下の通り９６ウェル中で分光光度法で分析した。複製ウェル中に、以下をピペットで取った。
６０μｌ  溶液Ａ
６０μｌ  溶液Ｂ
６０μｌ  溶液Ｃ（＝０．３６ｍｇ又は１．２６μモル）
反応混合物群：
１＝バッファーのみ（２００μｌ）    ブランク
２＝溶液Ａ（６０μｌ）、溶液Ｂ（６０μｌ）、溶液Ｃ（６０μｌ）、バッファー（２０μｌ）    対照
３＝バッファー（１８０μｌ）＋溶液Ｅ（２０μｌ）    対照
４＝溶液Ａ（６０μｌ）、溶液Ｂ（６０μｌ）、溶液Ｃ（６０μｌ）、溶液Ｅ（２０μｌ）    テスト
【００７４】
２０μｌの溶液Ｅ（＝０．１２単位  γＧＴ）を受ける群に対して、３７℃で１０分間の平衡後、この溶液（Ｅ）のみを加えた。平衡期間中断後、プレートをすぐにタイム０から、そしてその後は５分毎に、安定状態に到達するまで読み取った（λ最高４０５ｎｍ）。ＮＢ．１Ｕは１分間当り１μモルを切断するので、０．１２単位は１０．４分で１．２６μモルを切断するだろう。
【００７５】
式（Ｉａ）で表される化合物からの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの再生
清潔なガラスバイアル（１ｍｌ容積）中に、以下の反応混合物を以下の通りピペットで取った：
１００μｌ  溶液Ａ
１００μｌ  溶液Ｂ
２００μｌ  式（Ｉａ）で表される化合物、トリスバッファー中１０ｍｇ／ｍｌ（ｍｏｌ．ｗｔ．３７６、従って＝式（Ｉａ）で表される化合物２ｍｇ＝５．３μモル）、１００μｌ  溶液Ｅ
反応混合物群：
１＝バッファーのみ（２００μｌ）    ブランク
２＝溶液Ａ（６０μｌ）、溶液Ｂ（６０μｌ）、溶液Ｃ（６０μｌ）、バッファー（２０μｌ）    対照
３＝バッファー（１８０μｌ）＋溶液Ｅ（２０μｌ）    対照
４＝溶液Ａ（６０μｌ）、溶液Ｂ（６０μｌ）、溶液Ｃ（６０μｌ）、溶液Ｅ（２０μｌ）    テスト
１００μｌ  溶液Ｅ＝０．６単位が８．８分間に５．３μモルを切断するだろう。
【００７６】
１，２及び３群の反応生成物は３７℃で３０分の培養期間後にのみ生物活性を試験し、一方４群は培養期間１０分、３０分及び６０分後にも試験を行った。４群に提示された反応混合物を３０分間の培養期間後、２倍に希釈した５群もまた、生物活性を試験した。
【００７７】
試薬
γ−グルタミルトランスフェラーゼ、２−１−１８  ブタ腎臓をカルザイムラボ社（サンルイス・オビスポ、カリフォルニア  ９３４０１  米国）より購入し、グリシルグリシンをアクロスオーガニクス（ニュージャージー、米国）より入手し、Ｌ−グルタミン酸５−（４−ニトロアニリド）をフルカケミー（スイス）より購入した。
装置
反応混合物をホットボックス（ＨＯＴ  ＢＯＸ）オーブン、サイズワンインキュベーター（ガレンパーク社、英国）中で培養し、吸光度をアンソズ（Ａｎｔｈｏｓ）２０２０ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計を用いて測定した（＠λ最高４０５ｎｍ）。
【００７８】
結果
様々な酵素反応生成物に対するブタの膀胱尿道移行部括約筋の応答の代表的なトレースを図３に示し、様々な酵素反応生成物に対するブタの近位括約筋の応答の代表的なトレースを図４に示した。試験した酵素反応生成物は以下の通りである。：
図３ａ−５０ｍＭ  トリスＨＣｌバッファー；
図３ｂ−５０ｍＭ  トリスＨＣｌバッファー、γ−グルタミルトランスフェラーゼ；
図３ｃ−５０ｍＭ  トリスＨＣｌバッファー、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、グリシルグリシン、式（Ｉａ）で表される化合物；
図４ａ−５０ｍＭ  トリスＨＣｌバッファー、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、グリシルグリシン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、式（Ｉａ）で表される化合物；
図４ｂ−０．３Ｍ  １Ｒ，２Ｓ−メトキサミン
【００７９】
１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンで観察されたもの（図４ｂ）と比べて、γ−グルタミルトランスフェラーゼ及びグリシルグリシンと一緒に投与された、式（Ｉａ）で表される化合物は、ブタの膀胱頸部筋の非常に顕著で明確な収縮応答を引き起こした（図４ａ）。
【００８０】
図３ａ−ｃ及び図４ａ−ｂに示された、様々な反応条件下におけるブタの膀胱頸部筋の収縮応答の比較グラフを図５に示す。該グラフは、膀胱尿道括約筋の１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン並びに、式（Ｉａ）で表される化合物と酵素γ−グルタミルトランスフェラーゼ間の反応の個々の生成物に対する収縮応答を示している。バッファーのみ（０．０６ｇ±０．０３ｇ）又は酵素添加したバッファーはいずれも有意な活性を生じなかった（０．５ｇ±０．０６ｇ）。バッファー−Ｍｇ2+−グリシルグリシン−式（Ｉａ）で表される化合物からなる反応混合物もまた、どんな有意な活性をも生じなかった（０．１２ｇ±０．０９ｇ）。一方、Ｍｇ2+−グリシルグリシン−式（Ｉａ）で表される化合物−酵素の混合物は、強い膀胱活性を誘起した（１．６２ｇ±０．１７ｇ）。１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンもまた膀胱活性（１．１５ｇ±０．１８ｇ）を誘起したが、これはＭｇ2+−グリシルグリシン−式（Ｉａ）で表される化合物−酵素において観察されたもの（１．６２ｇ±０．１７ｇ）と比べて２９％少ない活性であった。この結果は、式（Ｉａ）で表される化合物がγ−グルタミルトランスフェラーゼの存在下におけるアッセイで活性を有することを実証した。本観察は、該化合物が単体では強い活性を示さないという前記観察とあいまって、該化合物がブロドラッグであることを示唆するものであった。
【００８１】
膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける経時的な反応混合物の効果を図６に示す。本目的は、式（Ｉａ）で表される化合物との反応が筋肉において最も顕著な効果を生ずる時間を測定することにあった。反応混合物の有効性を、培養１０分後、３０分後、６０分後に測定した。培養１０分後（１．５２ｇ±０．３４ｇ）及び３０分後（１．６２ｇ±０．１７ｇ）の反応混合物間の応答においては顕著な違いを見られなかったが、６０分の培養後（１．１０ｇ±０．２４ｇ）において、活性の少量の減少が観察された。
【００８２】
酵素とともに３０分間培養した後、２倍に希釈した、膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける式（Ｉａ）で表される化合物の効果を、図７に示す。反応混合物の膀胱活性は２倍希釈後、３８％減少した。
【００８３】
膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける、トリスバッファー又は生理食塩水で調製した１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン（０．３ｍＭ）の効果を図８に示す。トリスバッファー（１．２２ｇ±０．５０ｇ）と食塩（１．１５ｇ±０．１８ｇ）で調製した式（Ｉａ）で表される化合物の応答の間には明確な差はなかった。
【００８４】
［実施例４］
排尿における１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンの効果試験
方法
本スタディを以下のプロトコルに従って実施した。
【００８５】
試験物質
ａ）４％ｗ／ｗゲル中、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン１質量％
ｂ）４％ｗ／ｗゲル中、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン３質量％
４％ｗ／ｗゲルは、０．５Ｍ酢酸バッファー９６ｍｌ中、４ｇのヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。
４％ｗ／ｗゲル中、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン１質量％は、９９ｇの４％ゲル中、１ｇの１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンを含む。
【００８６】
治験
４４人の被験者を含む、他の目的のためのスタディにおいて、各被験者に３％メトキサミンゲル又は１％メトキサミンゲルを肛門内に適用した。約１ｇのゲルを使用した。
【００８７】
結果
１％ゲルを適用された２人、３％ゲルを適用された２人、計４人の被験者が排尿困難を報告した。他のボランティアは排尿困難の経験を報告しなかった。
【００８８】
結論
１％又は３％の１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンゲルの肛門内適用は、泌尿系システムに影響を与え、排尿困難を引き起こした。
【００８９】
観察された効果は、特に排尿困難は、膀胱頸部、尿道及び尿道括約筋の何れか一つ以上の緊張喪失及び／又は機能喪失に由来する尿失禁又はその他の状態の治療における、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン又は腎尿細管中で１Ｒ，２Ｓ−メトキサミンに変換される１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン誘導体の有用性を実証した。
【００９０】
［実施例５］
ブタモデルにおける尿力学及び循環器系パラメーターに基づく式（Ｉａ）で表される化合物の生体外スタディ
方法
外科的処置
本スタディで使用される動物モデルは、ミルズ（Ｍｉｌｌｓ、１９９９）によって既に記載されたブタの生体内尿力学モデルを少々変更したものである。外科的処置を、ホームオフィスパーソナルライセンス所有者によって実施した。約６０質量ｋｇの在来種のメスブタを本スタディに使用した。
【００９１】
麻酔
ブタを、最初に、静脈内中心線を通じて、ケタミンヒドロクロリド１５ｍｇ／ｋｇ（ケタセット、ウィロウズ  フランシス  ベタリナリー社、クラウリー、英国）、及び、ミダゾラム０．２ｍｇ／ｋｇ（ハイプノベル、ロシュプロダクツ社、ウェルウィンガーデンシティ、英国）を用いて沈静化した。。通常、沈静化は全身麻酔を導入する前に１５乃至２０分間導入される。全身麻酔の導入段階を、ブタの鼻を覆うコニカルマスクを通じて麻酔装置から供給される亜酸化窒素５０％／酸素５０％中、５％ハロタン（フルオタン、アストラゼネカ社、マックルズフィールド、英国）を用いて実施した。導入段階に続いて、全身麻酔の維持段階を、２００ｍｇ／ｈｒ割合にて静脈内１％プロポフォールを用いて達成した。
【００９２】
カテーテルの調製
図９に示すように、１．５ｍｍ口径と１ｍｍ壁厚のシラスティック（Ｓｉｌａｓｔｉｃ：登録商標）チューブ（ビブリースターリン社、ストーン、英国）を約１００ｃｍ長さのカテーテルに切断した：各動物ごとに、膀胱線（１本は膀胱の充填のため、他方は膀胱内線の計測のため）に対して２本の前記カテーテルが必要とされ、腹腔圧の測定のために腹膜腔に対して３本目が必要とされた。それぞれの近位端部は、端から約３ｃｍをシリコン接着剤（ＲＳコンポーネンツ社、コービー、英国）で固めた、単一ベロアポリエステル織物のカフを有していた。遠位末端を細くし、移植直後の閉鎖防止の助けになるよう、幾つかの穴をその中に空けた。２本の膀胱カテーテルを、端から２０ｃｍで２分し、そしてより小さい半分の約半分の所にシラスティックシートの小片（２ｃｍ×１ｃｍ）を糊付けすることによって、製造した。これら２つの半分のものをナイロンコネクタ（ミクロプラスティックス社、コベントリ、英国）を用いて接続した。
【００９３】
留置カテーテルの移植
外科処置の開始時、ブタを膀胱背面部に接近できるように左側臥位に位置させた。各カテーテルのための穿刺切開を腰部背面中線にて行い、同様に単一小右腸骨窩切開を行った。近位端部でカフが小さな皮下ポケット内で終了するように、特殊なデザインの外套針を用いて、腹膜カテーテル及び膀胱近位部カテーテルを背面腰部切開部から右腸骨窩に通した。カテーテルの閉鎖を避けるように注意しながら、各切開部を２本の中断２／０ナイロン縫合で近づけた。ブタを次に仰臥位に返し、下腹部切開をなした。スペンサー−ウェル鉗子を用いて、腰部壁筋及び腹部壁筋を中から外に貫通し、３本のカテーテルをつかんで腹膜孔に入れた。より長い腹膜カテーテルを膀胱−膣嚢中に位置させた。２／０絹の２本の巾着縫合糸を膀胱の先端に位置させ、穿刺切開をそれらの各中央を通ってなした。膀胱線の遠位のより短い半分をそれら切開部を通して膀胱中に導入し、そして各カテーテルの内腔が開存性を保つようにしながら巾着縫合糸を結んだ。それらカテーテルにおけるシラスティックシート小片の各端部を、次の線移動に対して更なる安全性を提供するために、膀胱の漿膜に縫合した。これら２本の膀胱カテーテルの遠位部を、ナイロンコネクタを用いて近位部に接合した。腹部損傷を、１ナイロンで、続いて脂肪に対して２／０クロム腸線、そして皮膚に対して中断２／０ナイロンでそろって閉鎖した。右腸骨窩損傷を、内腹斜筋及び外腹斜筋をビクリルで、皮膚を中断２／０ナイロンで、層を形成して閉鎖した。膀胱線の一つを、外側から他の管組織部分に付着させ、膀胱の治療をさせるように４８時間フリードレナージさせた。
【００９４】
尿道及び動脈血管挿管
麻酔の導入に続いて、動物を仰臥位にし、体温を維持するために温水ブランケットで覆った。その後、左鼠径部に小さい切開部を作り、該切開部を通して左大腿部動脈を触診で特定した。動脈に動脈１４Ｆｒカニューレ（アボカテ−Ｔ、アボットアイルランド、及びスリゴ、アイルランド）を挿入し、該カニューレを次に、動脈圧を測定するために圧力トランスデューサーにつなげた。膀胱尿道移行部内圧測定法を、マイクロトランスデューサー（ガエルテック社、スカイ島）とつなげたカテーテルを用いて得た。尿道に挿入するために、膣を鉗子で開き、膣の前面壁の上部である、外側尿道開口部をさらした。外側開口部を特定し、次に、カテーテルを直接視によって尿道内に挿入し、その後、膀胱尿道移行部内に位置させるまで徐々にひっぱった。
【００９５】
プロトコル
動物に対する器械使用及び安定化期間の後、３つの排尿サイクルを、式（Ｉａ）で表される化合物の非存在下、続いてボーラス投与後（１ｍｇ／ｋｇ．ｉｖ）に測定した。本スタディにおいて使用された式（Ｉａ）で表される化合物の用量は、ミニブタの生体内スタディにおける式Ｉｂで表される化合物の心血管効果をベースとした（ノージンインターナショナルリサーチ、非出版）。そのスタディにおいて、式Ｉｂで表される化合物は、ミニブタの心臓収縮期及び拡張期の圧力を１ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｖで一時的に増加させた。式Ｉｂで表される化合物の効果は、薬剤投与１５分後に最大となり、心臓収縮期及び拡張期の圧力は２３％及び５７％夫々上昇した（ノージンインターナショナルリサーチ、非出版）。これら観察は、酵素スタディと共に、式（Ｉａ）で表される化合物の１ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｖにおける試験の基礎となった。
【００９６】
各排尿サイクルに対して、排尿が開始されるまで、膀胱内線を通じて室温の生理食塩水を４８ｍｌ／分の速度で、膀胱をゆっくり充填した。各サイクルで以下のパラメータを記録した：膀胱内圧（ＩＶＰ）、排尿筋排尿圧（ＤｖＰ）、膀胱尿道移行部限界排尿圧（ＶＵＪＴＶＰ）、膀胱尿道移行部排尿圧（ＶＵＪＶＰ）、腹部圧（ＡｂＰ）及び動脈圧（ＡＰ）。他のパラメータとして、排尿サイクル期間、すなわち排尿サイクルの完了にかかる時間（ＤＶＣ）や、排尿のラップにかかる時間（ＤＶ）が含まれる。排尿量（ＶＶ）及び残留量（ＲＶ）をも得た。膀胱容量（ＢＣ）はＶＶ及びＲＶの和として算出され、一方、流量（ＦＲ）は１分間当りのＶＶの尺度であった。排尿効率もまた規定され、ＢＣからのＶＶのパーセンテージとして測定される。排尿筋最高圧は、ＤｖＰ＝ＩＶＰ−ＡｂＰとして表される膀胱内圧及び腹部圧の差の尺度である。データを一匹の動物で、式（Ｉａ）で表される化合物の非存在下（対照）及びボーラス投与後における３回の排尿サイクルの平均を表す各データポイントとともに、作成した。
【００９７】
結果
図１０ａに示すように、対照実施群において、充填期の間、膀胱内圧は徐々にベースライン圧力（８．４０±０．１７ｃｍ  Ｈ2Ｏ）から限界排尿圧（１６．６０±１．６１ｃ
ｍ  Ｈ2Ｏ）まで上昇した。同様の観察（図１１ａ）が、式（Ｉａ）で表される化合物の
存在下における実施において記録された−ベースライン圧において８．５３±０．３４ｃｍ  Ｈ2Ｏから１６．２３±１．１６ｃｍ  Ｈ2Ｏ限界圧まで上昇。同様に、排尿段階の間に生じた排尿圧において、対照実施群（４３．９±７．５７ｃｍ  Ｈ2Ｏ）及び式（Ｉａ
）で表される化合物の存在下（４１．１±８．３ｃｍ  Ｈ2Ｏ）との間に顕著な違いはな
かった。（図１０ａ及び１１ａ、表１及び図１３）。排尿中、対照については圧力３８±８．１１ｃｍ  Ｈ2Ｏ、式（Ｉａ）で表される化合物については圧力２８±１０．１１ｃ
ｍ  Ｈ2Ｏでの排尿をもたらす、充填期の排尿筋圧における穏やかな上昇もまた記録され
た（表１及び図１３）。対照の実施から式（Ｉａ）で表される化合物への排尿筋排尿圧力の変化は３６．５％の降下に相当した。
【００９８】
膀胱圧パラメータにおける式（Ｉａ）で表される化合物の穏和な効果とは対照的に、膀胱内圧測定図の更なる分析は、式（Ｉａ）で表される化合物がＶＵＪの活性を変化させることを示した。対照実施群（図１０ｂ）と式（Ｉａ）で表される化合物のもの（図１１ｂ）とを比較すると、式（Ｉａ）で表される化合物実施群で、ＶＵＪベースライン圧において一時的な上昇である独特な図が明らかとなった。この効果は、排尿サイクルを通じて存続する、より顕著な自発的活性を伴うことが示された。式（Ｉａ）で表される化合物で生じるＶＵＪ限界圧は、対照群で見られたものより約３１％大きかった。限界ＶＵＪ排尿圧における１５％の上昇は、式（Ｉａ）で表される化合物の投与でもまた観察される。
【００９９】
残留量における３１％の減少を、式（Ｉａ）で表される化合物において観察した一方で、他の全ての尿力学パラメータは殆ど変化せずのままであるように見え、流量、排尿期間及び排尿間隔は、対照値からそれぞれ２．４、４．１及び−４．７％とわずかながら変化した。排尿効率もまた損なうことなく残存しているように見え、式（Ｉａ）で表される化合物を用いた処置下で９５％を達成した一方で、対照実施群で９０％排尿効率を達成した。
【０１００】
動脈圧効果に関して、式（Ｉａ）で表される化合物は、対象から１５％の変化を引き起こした。しかしながら、薬剤投与直後、動脈線はラインの凝固の結果として洗浄を必要とした。この作用は、観察された血圧の上昇に寄与し得た（図１２、表１及び図１３）。
【０１０１】
結論
これらのデータは、式（Ｉａ）で表される化合物は、生体内ブタ尿力学モデルにおいて、尿流量を妨害することや排尿効率を損なうことなく、膀胱尿道移行部ベースライン圧、限界圧及び排尿圧を上昇させることができることを実証した。加えて、式（Ｉａ）で表される化合物は僅かに動脈圧を上昇させるが、該効果は式Ｉｂで表される化合物で見られるものと比べてあまり顕著でない−式Ｉｂで表される化合物でそれぞれ観察された収縮期圧及び拡張期圧における２３％及び５７％の上昇に対して、式（Ｉａ）で表される化合物は、動脈圧における１５％の上昇を観察した（１ｍｇ／ｋｇ、１．ｖ．）。上述したように、式（Ｉａ）で表される化合物で観察された動脈圧における増加は、ライン洗浄による人為的な結果であるとみられる。
【０１０２】
従ってデータは、活性な１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン（式Ｉｂで表される化合物）を膀胱へ輸送し、さらに式Ｉｂで表される化合物でみられる望まれない血圧の副作用を最少にする、プロドラッグシステム（式（Ｉａ）で表される化合物）の実行可能性を示すものである。
【０１０３】
［実施例６］
切除した人間の皮膚における、式（Ｉａ）で表される化合物の飽和溶液の生体外経皮吸収試験
本実施例において、式（Ｉａ）で表される化合物の皮膚透過を試験した。
【０１０４】
方法
切除した人間の皮膚
全ての実験に関して（１実施につき９セル）、一人の女性患者からの皮膚を用いた。皮膚を大腿外科処置から全ての皮膚を切除し、付着した脂肪組織から洗浄し、使用する前（但し６ヶ月以下）に−１８℃で保管した。
【０１０５】
テスト設計
本実験において、生体外皮膚透過試験を以下に記載する通りに実施した。図１４に示す
ようにセルを取り付けた。
【０１０６】
条件
セル：フランツセル、改良型（ｓ．Ｐｉｃ．１）、容積３５ｍｌ、ｎ＝９
アクセプター：０．９％ＮａＣｌ  ８０％（Ｖ／Ｖ）、ＰＥＧ４００  ２０％（Ｖ／Ｖ）、０．１％ＮａＮ3（水  ＨＰＬＣ品質、脱気）、１００ｍｌ
透過面積：１．７７ｃｍ2
温度：３２℃±０．５℃（水浴）
回転速度：３（ＩＫＡ磁気撹拌器）：星型フィッシュ
試験量：２．０ｍｌ
置換量：２．０ｍｌ
試験間隔：６、１２、２４、４７、７２時間
試験手順：試験溶液に対してドナー溶液３ｍｌを溶液装置中にピペットを用いて適用し、ネジで閉鎖した。これを試験の開始とした。
【０１０７】
生成物
（値の計算は４．６を参照されたい）
試験溶液＃１：式（Ｉａ）で表される化合物のエウタノールＧ（登録商標：Ｅｕｔａｎｏｌ  Ｇ）溶液。試験の前日、式（Ｉａ）で表される化合物５５１．５ｍｇを２５ｍｌのエウタノールＧ（登録商標：Ｅｕｔａｎｏｌ  Ｇ）に加えることにより溶液を調製した（２２，１ｍｇ／ｍｌ飽和溶液）。濃度は０．０３０ｍｇ／ｍｌであった（ＨＰＬＣで測定、溶解度濃度）。
試験溶液＃２：式（Ｉａ）で表される化合物のトルエンとＤＭＳＯの８０：２０（Ｖ／Ｖ）混合溶液。試験の前日、式（Ｉａ）で表される化合物１２３６．２ｍｇを、トルエン及びＤＭＳＯの８０：２０（Ｖ／Ｖ）混合物２５ｍｌに加えることにより、溶液を調製した（４９，５ｍｇ／ｍｌ飽和溶液）。濃度は５．４ｍｇ／ｍｌであった（ＨＰＬＣで測定、溶解度濃度）。
試験溶液＃３：式（Ｉａ）で表される化合物のイソプロピルミリステートとファーマソルブ（登録商標：Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ）の８０：２０（Ｖ／Ｖ）混合溶液。試験の前日、式（Ｉａ）で表される化合物５５０．４ｍｇを、イソプロピルミリステート及びファーマソルブの８０：２０（Ｖ／Ｖ）混合物２５ｍｌに加えることにより、溶液を調製した（２２ｍｇ／ｍｌ飽和溶液）。
濃度は０．０５２ｍｇ／ｍｌであった（ＨＰＬＣで測定、溶解度濃度）。
【０１０８】
分析
試料を茶色のガラス製ＨＰＬＣバイアルに移し、分析前に−２０℃で保管した。
ＨＰＬＣパラメーター
カラム：ヌクレオシルＣ−１８、２５０×３ｍｍ、５μｍ
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．０１Ｍ  ギ酸アンモニウム（ギ酸アンモニウム０．６３ｇを水１０００ｍｌに溶解）
移動相Ｂ：アセトニトリル
グラジエントプログラム：ｔ0、９５％Ａ／５％Ｂ
ｔ10、９５％Ｂ、線形増加
ｔ15、９５％Ｂ、一定組成
ｔ17、５％Ｂ、線形減少
ｔ25、停止
流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：５０μｌ
検出：２９０ｎｍ
保持時間：式（Ｉ）で表される化合物  約５．９分
停止時間：２５分
注入回数：２
【０１０９】
品質保証
全ての実験研究はＥＧ−ｃＧＭＰルールにて概説される品質要件に従って行った。使用した試験装置を定期的にモニターし、国内及び国際規格に対してチェックした。
【０１１０】
使用した全ての化学物質及び試薬は、分析時に、製造業者によって特定された有効期間内にあった。試験薬の原料は上記実施例１に記載された合成された物質であり、１００％、指示通りに使用した。
【０１１１】
全ての実験の間、シンク状態を維持した（アクセプター媒体中の溶解度は、最大透過試験溶液の７２時間後の測定量と比べて、少なくとも１０倍であった）。溶液＃２は４９．５ｍｇ／ｍｌの最高濃度の薬剤を含むため、アクセプター中測定された絶対透過量は２００倍低い０．２４ｍｇ／ｍｌであり、よってシンク状態が保たれた。アクセプター媒体中の式（Ｉａ）で表される化合物の飽和濃度は１３０ｍｇ／ｍｌであり、それは透過させた量の５４０倍以上であった。検出限界は０．１２μｇ／ｍｌと測定された。レセプター相のセルの堅固さ及び空気泡のなさをモニターし、各サンプリング点で得た。
【０１１２】
全ての薬剤含有溶液を光から保護して保管した。溶液は、開始時と比べて、純度に関して３２℃で７２時間安定し、容量が少し増えたのみであった；よりＡＰＩの可溶化によるものとみられる。
【０１１３】
未加工データからの数値計算
飽和率の計算
異なる透過速度が比較されることになっており、適用したビヒクルにおける異なる溶解度が期待される、全てのケースにおいて、全ての溶液は無限投与を必要とした、すなわち、たとえ多くの量が浸透したとしても、ドナー溶液中において十分量の薬剤を必要とした。これは、可溶性のものより高い濃度の薬剤を含有する溶液（すなわち懸濁液となる）である、飽和溶液の適用によって獲得された。したがって、溶液の製造から、溶媒容積当りの式（Ｉａ）で表される化合物の量は知られていた（平衡印刷による文書化）。その量は飽和溶液と名づけられた。その後、飽和溶液は遠心分離され、溶液の上澄み液の溶解性濃度をＨＰＬＣによって定量的に測定した。飽和率を飽和溶液：溶解性濃度の比率から算出した。高比率は高レベルの無限投与を意味した。
【０１１４】
［μｇ／ｃｍ2／ｈ］における流量及び遅延時間の算出
全ての配合物に対して、定常状態間の時間（ｈ）に対する平均累積透過量（μｇ／ｃｍ2）から直線回帰法によって、流量を算出した（エクセルソフトウェアを用いて実施；回
帰係数＞０．９８）。試験溶液＃１に対する直線回帰を、１２−４８時間から算出した（４８時間後、透過が減少したため、７２時間までではない）。試験溶液＃２に対する直線回帰を、２４−７２時間から算出した（遅延時間のために定常状態が１２時間より遅れて開始したため）。試験溶液＃３に対する直線回帰を、１２−７２時間のすべての時間に亘って算出した。遅延時間（適用後に透過の定常状態が開始した時間）を回帰直線と時間軸との交点から得た。
【０１１５】
増強率の算出
増強率は、試験溶液＃１（対照ビヒクル）：試験溶液＃２又は＃３（エンハンサーを有するビヒクル）からの流動速度比（μｇ／ｃｍ2／ｈ）であった。より率が高いほど、使
用したエンハンサー組成物は強力である。
【０１１６】
推測される経皮デリバリー速度の算出
経皮デリバリー速度を、生体外のものと生体内ものが同一であるとして推測した（これは当然さらなる動的スタディによる証明を要する）。パッチサイズを、並寸法である２０ｃｍ2（小型パッチは５ｃｍ2、大型パッチは６０ｃｍ2）に調製し、デリバリー速度を日
々算出した（１日＝２４時間）。
トータル：
（流量速度  定常状態［μｇ／ｃｍ2／ｈ］×２０［ｃｍ2］×２４［ｈ］／１０００＝デリバリー速度［ｍｇ／２０ｃｍ2／２４ｈ］
デリバリー速度を［１日当りパッチ当りのｍｇ数］で表した。
【０１１７】
結果
図１５−１８における結果の概要
図１５は試験溶液＃１（式（Ｉａ）で表される化合物をエウタノールＧ（登録商標）に溶解した）の単一値及び平均を示す。図１６は試験溶液＃２（式（Ｉａ）で表される化合物をトルエン：ＤＭＳＯに溶解した）の単一値及び平均を示す。図１７は試験溶液＃３（式（Ｉａ）で表される化合物をイソプロピルミリステート：ファーマソルブ（登録商標）に溶解した）の単一値及び平均を示す。図１８において３溶液から得た平均値を一緒に示した。
【０１１８】
試験溶液＃１
遅延時間（定常状態流量に到達するまでの時間）は６時間であり、それは局所適用にとって全く普通のことであった。定常状態流量は０．３１８μｇ／ｃｍ2／ｈとして算出さ
れた。生体外の流量が生体内のものと同じであり、治療部位を２０ｃｍ2であると仮定し
た場合、１日当り０．１５ｍｇの式（Ｉａ）で表される化合物が体内に輸送されるとみられる。
【０１１９】
本溶液は“対照”として扱われた。当初は水を予定していたが、化合物の高い水溶性のために、エンハンサーとして報告は無いが、皮膚への優れた適合性を有する、エウタノールＧ（２−オクチル−ドデカノール）が使用された。
【０１２０】
６つの結果のうちの一つは、評価から排除した。このセルは１０倍も高い透過を有しており、他の５つの平均値を著しく増加させた。皮膚中の小さな異常が実験終了後認められ、これが偽の高値の結果の理由になったとみなされ、よってこのセルを異常値として排除した。
【０１２１】
試験溶液＃２
遅延時間（定常状態流量に到達するまでの時間）は１８時間であり、局所適用としては非常に長いものであった。定常状態流量は８５．０９μｇ／ｃｍ2／ｈとして算出された
。生体外の流量が生体内のものと同じであり、治療部位を２０ｃｍ2であると仮定した場
合、１日当り４０．８ｍｇの式（Ｉａ）で表される化合物が体内に輸送されるとみられる。当初、溶液は水：ＤＭＳＯの３０：７０混合物を含んでいた。しかしながら、式（Ｉａ）で表される化合物の双方の媒体への高い溶解性のために、ＤＭＳＯ量を２０％減少させた。ＤＭＳＯに混和性で、水より溶解性の低い媒体が望ましい。我々がすぐに特定できた、活性の過度な消費の無い唯一のものはトルエンであった。ＰＥＧ４００、パラフィン、ｎ−ヘキサンなどのビヒクル及びテンシデ（ｔｅｎｓｉｄｅ）トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０の添加は不成功であった。皮膚の脂肪酸を消費するため、トルエンはより多い量で皮膚においてビヒクルとしては通常使用されない。脂肪酸は角質層のバリア機能に対して必要である。式（Ｉａ）で表される化合物のような親水性薬剤にとって、角質層は強力なバリアであり、トルエンによってそれが弱められるとみられている。それゆえこの透過結果
は式（Ｉａ）で表される化合物に対して事実上最大の増強可能性を示すことがほぼ確実視される。
【０１２２】
試験溶液＃３
遅延時間（定常状態流量に到達するまでの時間）は９時間であり、局所適用としては全く普通であった。定常状態流量は４．４μｇ／ｃｍ2／ｈとして算出された。生体外の流
量が生体内のものと同じであり、治療部位を２０ｃｍ2であると仮定した場合、１日当り
２．１ｍｇの式（Ｉａ）で表される化合物が体内に輸送されるとみられる。
【０１２３】
当初ビヒクルはエタノール、イソプロピルミリステート（ＩＰＭ）及びＮ−メチル−２−ピロリドン（ファーマソルブ）の２７：６４：９三元混合物を予定していた。この混合物は文献から得た（スワニピドックル  Ｎ．ら）。この混合物はブタの皮膚においてジドブジン（ＡＺＴ）の経皮デリバリーに対するエンハンサーとして試験され、治療目的で効果的であることが見出された。ＡＺＴは３’−アジド−３’−デオキシチミジンであり、式（Ｉａ）で表される化合物の溶解性及び分子量に匹敵する親水性分子であり、そのため、これらのエンハンサーを試験する価値があるとみなされた。しかしながら、式（Ｉａ）で表される化合物のエタノールにおける高い溶解性のために、混合物は二元混合物、すなわち、ＩＰＭ：ファーマソルブの８０：２０混合物に変えた。両賦形剤ともにクリームや自己粘着経皮性パッチの基礎配合物に組み込むことができる。
【０１２４】
文献
ミルズ  Ｉ．Ｗ．（１９９９）排尿筋不安定性の病態生理学及びその原因論における膀胱虚血の役割、オックスフォード大学ＤＭ論文：３２
スワニピドックル  Ｎ．ら（２００４）ＡＡＰＳ  ファーマ  サイエンス  テクノロジー、５（３）
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、式（ＩＩＩ）で表される化合物、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン及び式（Ｉａ）で表される化合物に対する、単離されたブタの膀胱尿道移行部括約筋ストリップの応答の代表的なトレースを示す図である。
【図２】図２は、１Ｒ，２Ｓ−メトキサミン及び式（Ｉａ）で表される化合物又は式（ＩＩＩ）で表される化合物の容量増加に対する、膀胱尿道移行部括約筋の収縮応答のグラフを示す図である。
【図３ａ】図３は、様々な酵素反応生成物に対する、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の応答の代表的なトレースを示す図である：図３ａは、５０ｍＭトリスＨＣｌバッファーの投与直後の、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の収縮応答を示す図である。
【図３ｂ】図３は、様々な酵素反応生成物に対する、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の応答の代表的なトレースを示す図である：図３ｂは、５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー及びγ−グルタミルトランスフェラーゼの投与直後の、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の収縮応答を示す図である。
【図３ｃ】図３は、様々な酵素反応生成物に対する、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の応答の代表的なトレースを示す図である：図３ｃは、５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、グリシルグリシン及び式（Ｉａ）で表される化合物の投与直後の、ブタの膀胱尿道移行部括約筋の収縮応答を示す図である。
【図４ａ】図４ａは、５０ｍＭトリスＨＣｌバッファー、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、グリシルグリシン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ及び式（Ｉａ）で表される化合物の投与直後の、ブタの近位括約筋の収縮応答を示す図である。
【図４ｂ】図４ｂは、０．３ｍＭの式（Ｉｂ）で表される化合物の投与直後の、ブタの近位括約筋の収縮応答を示す図である。
【図５】図５は、図３ａ−ｃ及び図４ａ−ｂに表された様々な反応条件下におけるブタの膀胱頸部筋の収縮応答の比較グラフを示す図である。
【図６】図６は、１０分、３０分及び６０分間培養後の、膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける反応混合物の効果の比較グラフを示す図である。
【図７】図７は、３０分間酵素と培養後に２倍に希釈した後の、膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける、式（Ｉａ）で表される化合物の効果を示す図である。
【図８】図８は、生理食塩水中で調製した場合と比較した、トリスバッファー中で調製した式（Ｉｂ）で表される化合物（０．３ｍＭ）の膀胱尿道移行部括約筋ストリップにおける効果を示すグラフである。
【図９】図９は、生体内ミニブタ尿力学スタディで用いた腹膜及び膀胱カテーテルの略図を示す図である。
【図１０】図１０は、生理食塩水で充填した膀胱の、膀胱内圧、膀胱内排尿圧、膀胱尿道移行部（ＶＵＪ）圧、ＶＵＪ限界排尿圧及びＶＵＪ排尿圧への効果を示す図である。
【図１１】図１１は、式（Ｉａ）で表される化合物のボーラス投与後の、生理食塩水での膀胱の充填の、膀胱内圧、膀胱内排尿圧、膀胱尿道移行部（ＶＵＪ）圧、ＶＵＪ限界排尿圧及びＶＵＪ排尿圧への効果を示す図である。
【図１２】図１２は、式（Ｉａ）で表される化合物の非存在下（対照）及び存在下における尿力学測定間の動脈圧への効果を示す図である。
【図１３】図１３は、在来種のブタにおける、尿力学及び心血管パラメータにおける式（Ｉａ）で表される化合物の効果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、生体内皮膚透過試験セルを示す図である。
【図１５】図１５は、エウタノールＧ（登録商標：Ｅｕｔａｎｏｌ  Ｇ）に溶解した式（Ｉａ）で表される化合物の皮膚透過レベルを示すグラフである。
【図１６】図１６は、トルエン：ＤＭＳＯ（８０：２０、ｖ／ｖ）に溶解した式（Ｉａ）で表される化合物の皮膚透過レベルを示すグラフである。
【図１７】図１７は、イソプロピルミリステート：ファーマソルブ（登録商標：Ｐｈａｒｍａｓｏｌｖｅ）（８０：２０、ｖ／ｖ）に溶解した式（Ｉａ）で表される化合物の皮膚透過レベルを示すグラフである。
【図１８】図１８は、全ての３つの試験溶液に対する式（Ｉａ）で表される化合物の平均皮膚透過レベルを示すグラフである。
【図１】
2008528474.tif 000013
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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