(57)【要約】本発明は、免疫系障害の可能性の診断及び免疫応答の分析を含む分野に関する。詳細には、本発明は、AJ遺伝子とのエレメントδRec-1の組換え再配置V(D)Jに起因する接合部の構造の分子分析に基いて、生物学的サンプル中のＴリンパ球の多様性を決定する方法に関する。より具体的には、本発明は、所定のＴリンパ球集団の異質性を決定するために、δRec-1の再配置に起因する切除サークル(TREC)の組換えの多様性及び/又は接合多様性を分析する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
TCRD遺伝子座の全て又は一部の切除に起因する切除サークル(TREC)の組合せの多様性及び/又は接合多様性の分析工程を含んでなることを特徴とする、ヒト患者又は動物からの生物学的サンプル中のＴリンパ球の多様性を決定する方法。
【請求項２】
δRec-1の再配置に起因する切除サークル(TREC)の組合せの多様性及び/又は接合多様性の分析工程を含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
δRec-1の再配置に起因する切除サークルの組合せの多様性が、切除サークルのフラグメントに対して少なくとも３つの増幅反応を行うことにより分析され、各増幅反応が、AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
核酸増幅反応が、各プライマー対がδRec-1に特異的なプライマーとAJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域に特異的なプライマーとからなるプライマー対を用いて行われるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
３又は４の増幅反応が実施され、各増幅反応がAJ61、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部に特異的であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される少なくとも１つのAJ領域とのδRec-1の再配置に起因する切除サークルに存在するシグナル接合部多様性の分析工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
分析される各δRec-1/AJシグナル接合部について、接合多様性の分析が切除サークルのフラグメントの増幅工程を含んでなり、該フラグメントがシグナル接合部を含んでなることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
分析され、かつヒトのAJ61、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56又はマウスのAJ61、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因する各δRec-1/AJシグナル接合部について、接合多様性の分析が、増幅させた切除サークルのフラグメントのApaL1酵素での制限プロフィールを分析する工程も含んでなることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される少なくとも１つのAJ領域とのδRec-1の再配置に起因する切除サークルに存在するシグナル接合部を定性的に分析する工程を含んでなることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ApaL1での制限に部分的又は完全に抵抗性であるシグナル接合部を定性的に分析する工程もまた含んでなることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
シグナル接合部の定性分析が標識プライマー伸長により行われることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程：
ａ．生物学的サンプルからDNAを調製する工程；
ｂ．各プライマー対がδRec-1に特異的なプライマーとAJ61、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域に特異的なプライマーとからなるプライマー対を用いて、少なくとも３又は４のPCRを行う工程；
ｃ．PCR産物をApaL1制限酵素で制限する工程；
ｄ．工程ｃで得られる制限プロフィールを分析する工程；
ｅ．適切な場合には、ApaL1制限に抵抗性であるシグナル接合部を定性的に分析する工程
を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される少なくとも１つのAJ領域とのδRec-1の再配置に起因する切除サークルを定量する工程を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
DNA修復機構の障害の可能性を検出するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項１５】
少なくとも１つがδRec-1に特異的であり、且つ少なくとも３つが各々AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される異なるAJ領域に特異的である少なくとも４つのプライマーの集合を含んでなり、該プライマーは、該選択されたAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部のPCR増幅が可能となるように選択されることを特徴とする、生物学的サンプル中に存在するＴリンパ球の多様性を決定するための試薬キット。
【請求項１６】
少なくとも１つがδRec-1に特異的であり、且つ少なくとも１つがAJ61に特異的であり、且つ少なくとも３つが各々AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される異なるAJ領域に特異的である少なくとも５つのプライマーの集合を含んでなり、該プライマーは、該選択されたAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部のPCR増幅が可能となるように選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の試薬キット。
【請求項１７】
プライマーが、配列番号１〜28の配列のプライマーから選択されることを特徴とする、請求項４若しくは１２に記載の方法又は請求項１５若しくは１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系障害又は免疫系に対し悪影響(repercussion)を有する障害の可能性の診断の分野に関する。詳細には、本発明は、生物学的サンプル中のＴリンパ球の多様性を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成熟Ｔリンパ球は、表面に、２つの鎖の組合せα及びβ又はγ及びδにより形成される独特な抗原レセプター(TCR)を有する。TCRはＴリンパ球抗原認識(これはこれら細胞の活性化及び増殖の出発点を表す)の機能を実行する。TCRはクローン的に発現される：各Ｔリンパ球は、表面に、所定の抗原に特異的な異なるTCRを有する。異なる抗原特異性、したがって別個のTCRを有するＴリンパ球の集合は、「レパートリー」と呼ばれる。したがって、所定のサンプル中のTCRの多様性の分析により、このサンプル中のＴリンパ球の多様性を決定することができる。
【０００３】
TCR鎖のＶドメインをコードする遺伝子は、TCRα鎖及びTCRγ鎖についてはＶ遺伝子及びＪ遺伝子の並置により、TCRβ鎖及びTCRδ鎖についてはＶ遺伝子、Ｄ遺伝子及びＪ遺伝子の並置により形成される。これらは、Ｔリンパ球分化の間に、「V(D)J組換え」と呼ばれる方向付けられた体細胞組換えの機序により組み立てられる。TCR遺伝子は、幾つかの遺伝子座に群分けされる。TCRB遺伝子座はBV遺伝子、BD遺伝子及びBJ遺伝子を含んでなり、これら遺伝子の組換えによりTCRβ鎖をコードする遺伝子が得られる。TCRAD遺伝子座は特別である：これは、TCRα鎖をコードする遺伝子及びTCRδ鎖をコードする遺伝子の両方を含んでなる。この遺伝子座は数十のADV/DV遺伝子を含んでなり、その大部分はα鎖又はδ鎖のいずれかにも使用され得る。このADV/DV領域にはDD遺伝子及びDJ遺伝子が続き、その後にAJ遺伝子が続く。ADV/DV遺伝子とDD遺伝子とDJ遺伝子との間の再配置(rearrangement)はTCRδ鎖をコードする。ADV/DV遺伝子とAJ遺伝子との間の再配置はTCRα鎖をコードする。
【０００４】
V(D)J組換えにより、極めて膨大なTCRレパートリーを生成することが可能になる。TCRは、何よりも、再配置したＶセグメント、Ｄセグメント又はＪセグメントの組合せにより異なる(組合せの多様性)。TCRα鎖をコードするTCRA遺伝子については、例えば、マウスには約100のＶ遺伝子及び約60のＪ遺伝子がある。したがって、潜在的に、6000の可能な組合せが存在する(図１を参照)。(TCRβ鎖をコードする)TCRB遺伝子については、約450の可能な組合せが存在する(25のＶ遺伝子、２のＤ遺伝子及び12のＪ遺伝子)。
【０００５】
更に、V(D)J組換えの分子機序により接合多様性が導入される。Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子及びＪ遺伝子には、組換えシグナル配列(又はRSS)と呼ばれる短い保存ヌクレオチド配列が隣接している。これらRSSは、12塩基又は23塩基隔てられた、保存された七量体及び半保存された九量体から構成されるヌクレオチドモチーフである。組換えは、リンパ球中で特異的に発現する３つのタンパク質：タンパク質RAG 1及びRAG 2(組換え活性化遺伝子)及びTdT(末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ)を含んでなる複合体により行われる。V(D)J組換えに関与するその他の酵素活性は、非相同末端連結(nonhomologous end joining；NHEJ)によりDNA修復に関与する遍在性タンパク質により提供される。
【０００６】
V(D)J組換えは、RSSに結合したRAGタンパク質による一本鎖開裂(single-stranded cleavage)の導入により開始される。この開裂は、前記遺伝子と該RSSとの間の接合部に正確に配置され、遊離3'OH末端を生成する。この遊離末端に対する求核性攻撃は、反対の鎖で、二本鎖開裂を生成する；前記遺伝子のコーディング末端はヘアピン構造で閉じる一方、RSS末端は平滑末端(blunt)でありリン酸化される。V(D)J組換えの次の期の間に、コーディング末端は、プロセシングを受けた後、NHEJに関与するタンパク質により互いに連結される。これには、特に、ヘアピン構造の開放(opening)が含まれる。ヘアピン構造の開放は不正確であり、「Ｐヌクレオチド」と呼ばれる２、３の塩基の逆向き反復を生成することがある。コーディングDNAの遊離末端から塩基が除去されることもある。最後に、TdTは、鋳型に依存することなく、これら遊離末端に、「Ｎヌクレオチド」と呼ばれる追加の塩基を付加できる。
【０００７】
その結果、コーディング接合部(CJ)は、該接合部の配列及び長さの両方の観点から、非常に高度な多様性を示す。実際、Ｔリンパ球中で作製される各接合部は独特であり、したがってこの接合部は、Ｔリンパ球の分子サイン(molecular signature)を構成する。構造的には、TCR鎖のＶドメイン内で、V(D)J接合部によりコードされるアミノ酸は、Ｖ遺伝子及びＪ遺伝子によりコードされる残基が隣接した「相補性決定領域３」(CDR3)と呼ばれるモチーフの中心部にある。各Ｔリンパ球は、TCRα鎖とTCRβ鎖又はTCRγ鎖とTCRδ鎖の独特の組合せを発現し、これら２つの鎖のCDR3は、TCRの抗原特異性を決定付ける。
【０００８】
V(D)J組換えの間に融合したセグメント同士間のDNAは、ほとんどの場合で切除され、RSSを含んでなるその末端が連結されて、切除サークルを形成する(図２を参照)。これらサークル(すなわち、TREC(Ｔ細胞レセプター切除サークル；T Cell Receptor Excision Circle))は、複製せず、細胞分裂の過程で希釈される。したがって、各TRECは、再配置イベントのマーカーであり、TCR鎖をコードする再配置とは対照的に、その絶対量は細胞増殖に従って変動しない。TRECの形成の間、RSSは、非相同末端連結(NHEJ)によるDNA修復に関与する因子によって連結される。再配置された遺伝子のRSSのこの融合に起因する接合部を「シグナル接合部(signal junction)」(SJ)と呼ぶ。
【０００９】
少数の例では、再配置した遺伝子が逆転写方向で存在する場合、V(D)J組換えはTREC形成に至らず、前記遺伝子を隔てるDNAフラグメントの反転を生じる；この場合にのみ、シグナル接合部は染色体上に保持され、細胞分裂の間に複製される。
【００１０】
Ｔリンパ球が胸腺で分化する場合、TCRβ鎖をコードする遺伝子は、TCRα鎖をコードする遺伝子の前に、再配置し発現する。これら２つの再配置期間は激烈な増殖により隔てられており、この増殖の間に、TCRβ鎖の発現を成し遂げたリンパ球が大いに増幅される(９つの分裂サイクルまで)。したがって、同じTCRB再配置を有する上限1000(２9)の細胞が存在し得、これらは、潜在的に、TCRA遺伝子を再配置し、異なるTCRA遺伝子を発現することができる。ADV遺伝子及びAJ遺伝子はTCRAD遺伝子座でTCRD遺伝子により隔てられている。ヒトでは、Ｔαβリンパ球の成熟の間に、TCRD遺伝子が該遺伝子座から切除された後にADV遺伝子及びAJ遺伝子が再配置されることが一般に受け入れられている。この切除は、最近接のAJ遺伝子、AJ61との特異的RSS、δRec-1の組換えの結果である。いずれのコーディング配列もこのRSSと結合していない。TCRδ鎖をコードする遺伝子セグメントの欠失(これは、Ｔリンパ球のαβ系への拘束(commitment)をマークする)の機序は、特に、Shutterら(Shutter, Cainら，1995)により、δ欠失エレメント及びTCRδ鎖遺伝子に対応するヒト配列が組み込まれたトランスジェニックマウスを用いて研究されている。この研究に記載された結果により、δ欠失はVα-Jα組換えの前に起こることが確証され、この欠失は、種々のAJセグメントとのδRecエレメントの接合部を含むことが示された。これら著者はまた、ヒト胸腺のサンプルからのDNAを用いて、δRec-1がAJ61、60、59、58及び57と組み換わることを示した。
【００１１】
コーディング末端のプロセシングに起因する接合多様性は、膨大なTCR多様性を担うV(D)J組換えプロセスの基本的な特徴の１つである。他方で、RSSがプロセシング/改変されることなく連結され、したがってTRECが有するシグナル接合部(SJ)は不変であることは一般に受け入れられている。この考えは、幾つかの刊行物が或るSJのレベルでの多様性を記述しているにもかかわらず、優勢に広まったままである。このように、Candeiasらは、マウスにおいて、TCRB遺伝子及びTCRD遺伝子の再配置に起因するシグナル接合部の有意な割合(上限24％)が改変されていることを示している(Candeias, Mueggeら，1996)。より最近の論文(これもまたVβ-Dβ組換えに起因するシグナル接合部を研究している)は、シグナル接合部でのＮヌクレオチドの出現が明らかにその組換えに使用したVβ遺伝子座に依存することを示している。このことは、著者らを、局所的な染色体の立体配置(configuration)がリコンビナーゼの接近可能性(accessibility)に影響するとの示唆に導いた(Kanari, Nakagawaら，1998)。しかし、これら論文はβ鎖の再配置に限られ、Candeiasらの論文に関してもδ鎖の再配置に限られている。β鎖及びδ鎖の再配置のレベルでSJ多様性を担う機序が、TCRα鎖をコードする遺伝子に関しても働くことは示唆されていない。
【００１２】
有力な定説(これによればシグナル接合部は接合多様性を有しない)−この定説はJungら(Jung及びAlt，2004)の最近の総説論文の図５に詳細に説明されている−はTCRα鎖をコードする遺伝子の再配列に関して疑問を投げ掛けて来なかった。対照的に、幾人かの著者らは、最近、δRec1/AJ61シグナル接合部をカバーするプローブ(Hochberg, Chillemiら，2001；Schonland, Zimmerら，2003)又は正にその境界に位置するプローブ(Hazenberg, Ottoら，2000)を用いるδRec1/AJ61シグナル接合部のリアルタイム増幅に基いて、患者における胸腺活性を評価するために、TCRD遺伝子の切除に起因するTRECを定量化する方法を記載している。このようなプローブの選択は、これら著者らがこのシグナル接合部が不変であると確信していることを示している。これら方法(例えば、Douekら(1998)により記載されたもの)は、胸腺による新たなＴリンパ球の産生を定量するために行われている。
【００１３】
或る状況では、循環Ｔリンパ球の異質性のレベルを決定することは有利であり得る。これは、後天性又は先天性の免疫不全に起因する免疫系の不十分性(新たなリンパ球の減少した産生又は産生なし)を検出するために有用であり得る。例えば、クローン性又は乏クローン性(pauciclonal)の集団の存在は、腫瘍細胞に対してか又は感染に応答してのいずれかの発達中の免疫反応の徴候であり得る。造血細胞移植(骨髄又は幹細胞)後の免疫系の再構築を追跡するために、循環Ｔリンパ球の異質性のレベルを決定することは有用である。事実、この再構築は、対宿主移植片(GvH)反応又は移植片拒絶反応に起因するクローン性拡大の可能性がある、リンパ球のデノボ産生を導く。次いで、クローン性又は乏クローン性の集団の存在は、特異的リンパ球プールの異常拡大の徴候であり得、これにより、GvH又は拒絶が明らかとなる可能性がある。
【００１４】
Ｔリンパ球集団の多様性の決定を目的とする幾つかの方法は、既に記載されている。その多くがHodgesら(Hodges, Krishnaら，2003)による総説論文で概説されている。
【００１５】
細胞レベルでは、種々のVβ遺伝子(Vβ領域)の産物を指向する一連のモノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリ(FACS)によりリンパ球集団の多様性を分析することが可能である。正常値と比較することで、この試験により、リンパ球分布が変化しているか否かを決定することが可能になる。しかし、上記のように、TCRβ鎖をコードする遺伝子は、TCRα鎖をコードする遺伝子の前に再配置して発現し、これら２つの再配置期間は、TCRβ鎖を発現するリンパ球の激烈な増殖により隔てられているので、Vβ領域の発現は、所定のリンパ球の特徴的なパラメータの僅か１つを表すに過ぎない。Vα遺伝子の産物を指向する抗体は少数しか存在せず、このことが、FACSによりこのパラメータを分析することを不可能としている。したがって、TCR多様性のフローサイトメトリ分析は、せいぜい、Ｔリンパ球集団の同質性の指標に過ぎない：同質性は、TCRβ鎖CDR3の接合多様性さえ考慮することなく、Vβ遺伝子の発現にのみ関係する。加えて、この分析は多量の細胞(少なくとも２、３百万のＴリンパ球)を必要とする。
【００１６】
分子レベルで、転写物又はゲノムDNAのいずれかから再配置した遺伝子を増幅することによりPCRに基づく種々の技法によってＴリンパ球が発現するTCRA遺伝子及びTCRB遺伝子の構造を分析することは可能である。TCRB遺伝子座及びTCRA遺伝子座の完全配列は入手可能であるので、TCRβ鎖及びTCRα鎖の種々のドメインをそれぞれコードするBJ遺伝子及びAJ遺伝子、BC遺伝子及びAC遺伝子、並びにBV遺伝子及びADV遺伝子(又は遺伝子ファミリー)の各々に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを選択することは可能である。したがって、転写物を使用して、リアルタイム定量PCRにより種々のADVファミリー及びBVファミリーの再配置を分析することが可能である。各ファミリー(ヒトでは、41のADVファミリー及び30のBVファミリー)についてのコントロールサンプルから得た発現プロフィールとの比較により、１又はそれ以上の遺伝子が多すぎる(overrepresented)(リンパ球拡大を示す)かどうかを決定することが可能になる。この試験により、所定のサンプルにおけるADVファミリー又はBVファミリーの各々の発現レベルを規定することが可能になる。しかし、これは、ADV又はBVの遺伝子又は遺伝子ファミリーの各々の再配置の多様性に関するいかなる情報も与えない。
【００１７】
しかし、転写物を使用して、「イムノスコープ(immunoscope)」試験(標識プライマー伸長)により、再配置したTCRA遺伝子及びTCRB遺伝子のCDR3のサイズ分布を決定することが可能となる(国際出願WO 02/084567)。この試験は、各ファミリーについて行う２つのPCR反応を必要とする：第１は、所定のADV遺伝子及びBV遺伝子を使用して転写物を増幅し、十分な材料を得るためであり、第２は、標識プライマーの伸長により、標識した一本鎖DNA(これは次いで、アクリルアミドゲル上にロードされる)を産生するためである。この試験により、分析される集団において発現するTCRα鎖及びTCRβ鎖のCDR3の異質性を分析することが可能となる。他方、この試験により、分析される集団における種々のADV遺伝子及びBV遺伝子の分布を決定することはできない。
【００１８】
上記の試験は、サンプルからのRNAの調製、次いでcDNAの合成を必要とし、また全てのADVファミリー及びBVファミリーを分析するためには多数のPCR反応を行うことも必要となるので、実行が比較的困難である。加えて、RNAを用いる作業は、分解を防止して該サンプルの代表性(representativeness)を維持するために入念に用心することが必要である。
【００１９】
循環Ｔリンパ球の多様性の決定を目的とする別の方法が、特許出願US 2003/0228586に記載されている。この出願では、Sekalyらは、TCRβ鎖をコードする遺伝子の再配置の間に生成される切除サークルを分析することを提案している。Sekalyらにより観察された多様性は、再配置の組合せの多様性に限られている；所定の再配置の間に接合多様性が観察される可能性は、何ら言及されていない。
【００２０】
したがって、今日までにリンパ球集団の多様性を決定するために記載された方法は、全てTCRB遺伝子配置(及び随意にTCRA遺伝子再配置)の分析に基いている。これら方法のいずれもTCRD遺伝子座の不活化を生じる再配置を考慮していない。この点に関して、δRec-1再配置は、Ｔリンパ球分化の間に、TCRB遺伝子再配置の後ではあるがTCRA再配置の前に起きることが知られている。δRec-1のレベルでの組換えは、TCRA遺伝子組換えの開始イベントであると考えられている。この再配置は、該遺伝子座から、TCRδ鎖をコードするDD遺伝子、DJ遺伝子及びDC遺伝子を切除し、よってTCRδ鎖をコードする遺伝子の組換え及び発現を防止する。こうして、この再配置は、Ｔリンパ球をαβ経路に決定的に拘束する。したがって、この再配置の分析により、Ｔγδリンパ球を排除しつつＴαβリンパ球の多様性を特異的に決定することが可能になる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、今や、以下のことを証明した：
−  AJ遺伝子とのδRec1の再配置(これはTCRD遺伝子座全体の切除を生じる)に加え、他の再配置が存在し、それはTCRD遺伝子の不活化を生じる。詳細には、本発明者らは、マウスで、それぞれDD遺伝子の全て及びDC遺伝子の切除を生じそのためにTCRδ鎖が発現できなくする、δRec-1/DJ2再配置及びDD/AJ再配置を観察した；
−  マウスと同様にヒトで、δRec-1は、AJ61とだけではなく(少なくとも)AJ58、AJ57及びAJ56とも再配置する。ヒトでは、δRec-1はまた、少なくともAJ60及びAJ59とも再配置する；
−  マウスと同様にヒトで、AJ遺伝子とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部は不変でない。該接合部の有意な比率(10〜30％)が、連結の前のシグナル末端のプロセシング(TdTによるヌクレオチドの付加及び/又は２、３の塩基の欠失)の徴候を示す。この結果として、δRec-1/AJ再配置の各タイプについて特徴的なシグナル接合部異質性プロフィールを決定することが可能である。
【００２２】
これら新たな結果は、組換えの多様性及び接合多様性が、TCRD遺伝子の切除に起因するTREC上にあるシグナル接合部に存在することを示唆する。したがって、これら切除サークルは、サンプル中のＴリンパ球の多様性を分析するための新たな基準を構成する。Ｔリンパ球の多様性を分析する上記の現行方法にはないこの基準は、TCRD遺伝子切除がＴリンパ球分化の間にTCRB遺伝子再配置の後であるがTCRA再配置の前に起こるので、特に有利である。詳細には、本発明者らは、δRec-1組換えの間に作製されるシグナル接合部が、TCR遺伝子接合部と同様に、Ｔリンパ球の分子サインのエレメントを構成すること、及びδRec-1エレメントの再配置が、組合せの多様性及び接合多様性の両方を有するシグナル接合部レパートリーを生成することを証明した。
【００２３】
TCRD遺伝子座の全て又は一部の切除に起因するシグナル接合部の分析に関連する具体的利点は、これら接合部が、細胞増殖の間に複製しない切除サークルにより保有されていることである。したがって、これは、TCRの抗原特異性に応じたＴリンパ球のレパートリーを形作る、選択的エレメントに起因するいずれの変動も経験しない。したがって、この再配置は、TCRレパートリーが整う前の、胸腺における新たなＴリンパ球の出現に特徴的な分子マーカーである。このようなマーカーはその後定性的にも定量的にも改変されず、このマーカーにより、末梢Ｔリンパ球に基いて、生物中(特に、胸腺で)の新たなＴリンパ球の出現の間に生じるイベントを分析することが可能になる。
【００２４】
したがって、本発明は、第１には、ヒト患者又は動物からの生物学的サンプル中のＴリンパ球の多様性を決定する方法に関する。この方法は、V(D)J組換えの間のTCRD遺伝子座の全て又は一部の切除に起因する切除サークル(TREC)の組合せの多様性及び/又は接合多様性の分析工程を含んでなることを特徴とする。この方法は、有利には、δRec-1再配置に起因する切除サークル(TREC)の組合せの多様性及び/又は接合多様性を分析することにより実施することができる。
【００２５】
この方法が特に有用な患者は、免疫系の不全又は免疫系に悪影響を伴う疾患が疑われるか又は確立された患者、更に免疫系の再構築を追跡することが所望される造血細胞移植のレシピエントである。この方法は、上記のフローサイトメトリ分析方法の補完として使用できるが、独立して使用することもできる。この方法により、TCRB再配置より後で、かつTCRA再配置よりずっと複雑さが少ない再配置ステージを単純に分析することが可能になる。
【００２６】
本発明の方法はまた動物においても使用できる。マウスにおける実施の例を下記に説明するが、この方法は他の動物、特に哺乳動物、例えばウシ、サル、ブタ、ネコ、イヌ、ニワトリなどに置き換えることもできる。本発明の方法は、免疫系を含む病理の動物モデルの研究のために実験目的で有用であり得る。この点に関して、ヒトにおけるHIV感染の動物モデルを構成するサル免疫不全ウイルス(SIV)又はネコ免疫不全ウイルス(FIV)での感染に言及し得る。
【００２７】
配列データは、ある種のサルについて公表されており、δRec-1配列及びAJ RSS配列がヒト及びマウスのものに非常に類似していることを示している。したがって、本発明の方法は、サルに直接適用可能である。サルは、種々のヒト病理を研究するための動物モデルとして使用される。これら病理のうち、感染、特にＣ型肝炎ウイルス又は免疫不全ウイルス(ヒトのHIV、サルのSIV)での感染に言及し得る。これに関連して、上記の方法は、生検に基いて、例えばＴリンパ球の動員(recruitment)その後の増殖に対応する、感染の種々のステージで存在するＴリンパ球の多様性を研究するために使用することができる。生検は、当業者により、病理及び/又は免疫応答の進展を反映するように選択される。よって、Ｃ型肝炎ウイルス感染の間の免疫応答を研究するためには、生検は、有利には、肝臓から採取される。
【００２８】
本発明の方法は、Ｔリンパ球を含有する任意の生物学的サンプルを使用して行うことができる。使用することができる生物学的サンプルの非限定的な例としては、全血サンプル、総単核細胞、Ｔリンパ球を含有する生検、或いは種々の膜マーカー(TCR又は所定のVR領域を含む)の発現に基いてフローサイトメトリにより選別されるＴリンパ球集団に言及し得る。
【００２９】
本発明の方法の好ましい実施形態では、δRec-1の再配置に起因する切除サークルの組合せの多様性は、切除サークルのフラグメントについて少なくとも３つの増幅反応を行うことにより分析される。各増幅反応は、δRec-1と連結していてもよい、AJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部に特異的である。本発明者らは、これらAJ領域が基本的には領域AJ61 (ΨJαとも印される)、AJ58、AJ57及びAJ56であることを示した。領域AJ60及びAJ59も存在し得る。当然ではあるが、本発明の本実施形態では、増幅反応は、少なくとも３、好ましく４、おそらくは５又は６の別個のAJ領域との再配置を目的としている。他の再配置に対応するシグナル接合部の分析は、Ｔリンパ球集団の多様性の更に充実した研究を鑑みて、本発明による方法から排除されないことに留意することもまた重要である。事実、δRec-1は、マウスにおいては少なくともAJ18まで(この再配置に起因するシグナル接合部が証明されている)、ヒトにおいては少なくともAJ2まで(この再配置に起因するコーディング接合部が証明されている)と再配置することができる
【００３０】
上記方法では、用語「増幅反応」は、当業者に公知である任意の核酸増幅方法をいう。例として、非制限的様式で、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、TMA(転写媒介増幅)、NASBA(核酸配列に基づく増幅)、3SR(自己維持配列複製(self-sustained sequence replication)、SDA(鎖置換増幅)及びLCR(リガーゼ連鎖反応)に言及し得る。
【００３１】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、核酸増幅反応は、各々がδRec-1に特異的なプライマーとAJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56から選択されるAJ領域に特異的なプライマーとからなるプライマー対を用いて行われるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。これら反応は好ましくは別々の試験管中で行われる。増幅反応を行うために使用する技法にかかわらず、結果の分析は、どの反応により増幅産物を得ることが可能になったのかを調べることからなる。それらは、検査するリンパ球集団中に存在する再配置に対応する一方、δRec-1と所定のAJ領域との間のシグナル接合部の増殖がないことは、対応する再配置がこの集団にはないことを示す。当然のことではあるが、本発明の方法の実施に際しては、陽性コントロールが好ましくは使用される。
【００３２】
適切な場合、増幅は、例えば定量的PCRを行うことにより、リアルタイムでモニターすることができる。このことにより、生物学的サンプル中に存在するTRECを定量することが可能になり、後者が適切な場合(例えば、血液サンプル)、胸腺により最近産生されたＴリンパ球の量を評価することが可能になる。生物学的サンプル中のTRECの定量に基いてＴリンパ球の最近の合成を定量する方法は、特には、上記のSchonlandら、Hazenbergら及びHochbergらによる論文に記載されている。しかし、サンプル中に存在するTRECを定量するために、これら著者らは、δRec-1/AJ61シグナル接合部に位置するか又はこの接合部に直ぐ隣接するかのいずれかのプローブを用いている。したがって、このようなプローブにより、非改変SJのみを効率的に検出することが可能になる(SJに隣接するプローブの場合、このプローブにより、該接合部の他方の側でのみ改変SJを検出することも可能になる)。これは、おそらく、これら著者らにより正常な個体においてさえ観察された結果のばらついた性質を説明する(特にHochbergらによる論文の図１を参照)。改変SJを有するTRECとハイブリダイズし得るプローブの使用により、このばらつきを減少させることが可能になり、したがって臨床医による解釈が容易な結果が得られる。
【００３３】
したがって、１つの観点によれば、本発明は、AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される少なくとも１つのAJ領域とのδRec-1の完璧な再配置(改変なし)に起因するシグナル接合部から少なくとも５〜10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも15ヌクレオチド離れたプローブを使用して適切な生物学的サンプル中のTRECを定量することにより、Ｔリンパ球の最近の産生を評価する方法を提案する。この方法は、有利には、少なくとも２、３、又は４の異なるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するTRECを定量することにより行われる。この定量は、当然のことではあるが、本発明による切除サークルの組合せの多様性及び/又は接合多様性の分析の補完として行うことができる。本発明のこの観点によれば、プローブとシグナル接合部との間の距離は、２つの融合したRSS間の「接合部」自体に対して、したがって完璧なδRec-1/AJ再配置に起因するGTGCACモチーフ(このモチーフが生成される場合)の中心に対して測定される。
【００３４】
本発明の別の重要な観点は、δRec-1の再配置に起因する切除サークル(TREC)に存在するシグナル接合部での接合多様性の分析である。事実、本発明者らは、これらシグナル接合部の有意な比率(40％までの範囲)が「不完全」、特にＮヌクレオチドの付加を示すことを証明した。この性質は、下記で開示する研究の前には疑いもされなかったが、リンパ球集団の異質性の程度を決定するためにも利用することができる。したがって、本発明はまた、サンプル中に存在するＴリンパ球集団の多様性を決定するための方法に関し、この方法は、少なくとも１つのδRec-1/AJシグナル接合部の接合多様性の分析工程を少なくとも１つ含んでなる。好ましくは、最も通常のシグナル接合部、すなわちδRec-1/AJ61接合部の接合多様性が調べられる。より好ましくは、SJの接合多様性の分析は、上記の組合せの多様性の分析の補完として実施される。
【００３５】
上記のように、シグナル接合部は、再配置したフラグメントに隣接するRSS同士の融合に対応する。これらRSSは、12塩基又は23塩基で隔てられた保存された七量体及び半保存された九量体からなる。七量体の最初の３つの塩基は、極めて大部分のRSSがCACトリプレットで始まるという程度に、非常に高度な保存性を示す。その結果、シグナル接合部の生成の間のNHEJによる２つのRSSの「完全な」連結は、ApaL1酵素の制限部位に対応する5'-GTGCAC-3'配列を生成する。このことにより、付加も欠失も受けていないシグナル接合部を容易に区別することが可能になる。なぜならば、これらは、改変シグナル接合部とは異なり、ApaL1での制限に感受性であるからである。
【００３６】
しかし、或るRSSは、保存配列と比較してバリエーションを示す。これは、ヒト及びマウスのAJ60のRSS並びにマウスのAJ59のRSSの場合に特にそうである。したがって、これらRSSを含むシグナル接合部での接合多様性の分析は、その他の技法、例えば問題の接合部の配列決定の使用を必要とする。
【００３７】
したがって、SJでの接合多様性の分析を含む本発明の方法の好ましい実施形態によれば、接合多様性の分析は、分析するδRec-1/AJシグナル接合部の各々について、問題のシグナル接合部を含む切除サークルのフラグメントの増幅工程を含んでなる。この増幅の後には、好ましくは、ヒトのAJ61、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群又はマウスのAJ61、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因する、分析されるδRec-1/AJシグナル接合部の各々について、増幅フラグメントのApaL1制限プロフィールの分析工程が続く。所定の酵素により生成された所定のDNAフラグメントの制限プロフィールを分析するための種々の技法は、当業者に周知である。当然のことであるが、フラグメントは、この目的のための緩衝液中で該酵素の存在下にインキュベートされる。次いで、この消化の結果は、アガロースゲル上での移動及び任意の利用可能な技法を用いる可視化により、例えば、エチジウムブロミド(ETB)若しくはSybrGreen(登録商標)での染色により、さもなければメンブレン上へのブロッティング及び標識プローブ(放射活性、ペルオキシダーゼとのカップリング、Texas Red(登録商標)とのカップリングなど)とのハイブリダイゼーションにより、分析することができる。
【００３８】
接合多様性の分析がTRECの組合せの多様性の分析の補完として行われる場合、TRECのフラグメントの同じ増幅産物を２つの観点に使用することができる。
【００３９】
フラグメントのApaL1での消化の結果の解釈は、以下のとおりである：フラグメントが完全に消化される場合、このことは、分析したδRec-1/AJ接合部に対応するSJ全てが非改変の「正準」SJと同一であって対応することを意味し；フラグメントがApaL1での制限に完全に耐性であれば、分析したδRec-1/AJ接合部に対応するSJ全てが改変されており(これらは同一であるかもしれないし同一でないかもしれないことを意味し)；ハイブリッドプロフィール(ApaL1に部分的に感受性のフラグメント)は、調べたサンプル中における、分析されるAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するTRECを含んでなる少なくとも２つのリンパ球集団(一方は改変SJを含み、他方は含まない)の存在を示す。
【００４０】
改変がApaL1に耐性であるフラグメントの出現により証明された場合、またApaL1制限部位を示さないSJについては改変の不在下でさえも(例えば、δRec-1/AJ60 SJ)、特にはApaL1制限に耐性であるTRECを有するリンパ球集団が同質であるか否かを決定するために、シグナル接合部の定性分析を行うことが有利であり得る。用語「定性分析」は、連結してシグナル接合部を形成する前に、末端で導入した改変の性質(付加、欠失、置換)を決定することが可能になる分析を意味すると意図される。したがって、ApaL1制限に耐性であるシグナル接合部の定性分析工程もまた含む上記の方法もまた本発明の一部である。この定性分析は、当業者に公知の種々の技法(例えば、配列決定又は標識プライマー伸長)により行うことができる。これは、好ましくは、ApaL1に完全に又は部分的に耐性であるフラグメントのみを使用して行うが、適切な場合には、自動化を鑑みて、全てのフラグメントについて系統的に行うこともできる。
【００４１】
本発明による具体的な方法は、以下の工程を含んでなる：
ａ．生物学的サンプルからDNAを調製する工程；
ｂ．各々がδRec-1に特異的なプライマーと、AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択されるAJ領域に特異的なプライマーとからなるプライマー対を使用して、少なくとも３回又は４回のPCRを行う工程；
ｃ．PCR産物をApaL1制限酵素で制限する工程；
ｄ．工程ｃで得られた制限プロフィールを分析する工程；
ｅ．適切な場合には、ApaL1制限に耐性であるシグナル接合部を、標識プライマー伸長により定性的に分析する工程。
【００４２】
この方法の工程「ａ」では、DNAの調製は、当業者に公知の任意の技法により、例えば、Sambrook及びRussel(Molecular Cloning, 3rd edition, CSHL Press)によるマニュアルの第６章に記載される技法、又は市販のDNA調製キットを使用して行うことができる。
【００４３】
適切な場合には、この方法の工程「ｂ」と「ｃ」との間に、工程「ｂ」で行われる増幅の産物を、例えばアガロースゲル上での移動及び染色により、分析することからなる中間工程を行うことができる。これにより、ApaL1制限プロフィールの分析を、フラグメントが効率的に増幅された接合部のみに限定することが可能になる。
【００４４】
上記のように、シグナル接合部の形成は、DNA修復に関与する遍在性タンパク質により確実にされる。したがって、これらタンパク質の１つが完全には機能的でない場合、改変シグナル接合部の比率が増大する可能性がある。したがって、上記の方法は、非相同末端連結(NHEJ)により修復に関与する酵素の１つに影響する欠損であるか、非相同末端連結の上流若しくは下流で作用する因子であるかにかかわらず、DNA修復機序の障害の可能性を検出するために使用することができる。
【００４５】
本発明の別の観点は、上記のような方法により生物学的サンプル中に存在するＴリンパ球の多様性を決定するための試薬のキットである。このようなキットは、少なくとも４つのプライマーの集合を含んでなり、そのうちの少なくとも１つはδRec-1に特異的であり、少なくとも３つは各々AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される異なるAJ領域に特異的である。具体的実施形態によれば、このようなキットは、少なくとも５つのプライマーの集合を含んでなり、そのうちの少なくとも１つはδRec-1に特異的であり、少なくとも１つはAJ61に特異的であり、少なくとも３つは各々、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56からなる群より選択される異なるAJ領域に特異的である。上記のキットにおいて、これらプライマーは、当然のことながら、該選択されたAJ領域とのδRec-1の再配置に起因するシグナル接合部のPCR増幅を可能にするように選択される。本発明のキットに任意に存在してもよい追加の試薬のなかでも、増幅反応及び/又はApaL1での消化に必要な種々の緩衝液及び/又は酵素、DNA抽出及び/又は増幅及び/又は制限反応のコントロールとして働くことができるサンプル、などに言及し得る。
【００４６】
本発明の方法及びキットで使用することができるプライマー及びプローブとして、以下のオリゴヌクレオチドに言及し得る：
【００４７】
【表１】
2008528049.tif 000002
【００４８】
【表２】
2008528049.tif 000003
【００４９】
上記の表１及び２において、名称が「p」で終わるオリゴヌクレオチドは、標識されているときにはプローブとして使用することができるが、特にはネスティッドPCR又はセミネスティッドPCR(すなわち、PCRにより増幅された産物から、第１の増幅産物の内部のそれぞれ２つ又は１つのプライマーを使用して)を行うためのプライマーとしても使用することができる。
【００５０】
上記の提供に加えて、本発明はまた、本発明の主題である方法の実施の例に言及し、また添付図面にも言及する以下の記載から生じる他の提供を含み得る。添付図面では、
図１及び２：V(D)J組換えの説明用スキーム。
【００５１】
図３：患者から単離されたＴリンパ球集団に存在するシグナル接合部の増幅及びApaL1消化による分析。
δRec-1/AJ61、δRec-1/AJ58及びδRec-1/AJ57シグナル接合部を、患者のCD4+CD8+Vβ1+末梢リンパ球(FACSにより選別)及びヒト胸腺のサンプル(ポリクローナルコントロール)から抽出したDNAから増幅した。未消化のPCR産物(レーン１、３及び５)及びApaL1-消化PCR産物(レーン２、４及び６)をアガロースゲル上で分離し、次いでナイロンメンブレン上にブロットし、δRec-1に特異的な放射性プローブとハイブリダイズさせた。
【００５２】
患者については、δRec-1/AJ61の増幅及びδRec-1/AJ58の増幅(レーン１及び３)のみから産物が得られる一方、コントロールについては、３つの反応とも陽性である(レーン１、３及び５)。したがって、δRec-1シグナル接合部レパートリーの多様性は、患者で減少している。更に、患者からの増幅したδRec-1/AJ61及びδRec-1/AJ58のシグナル接合部は、ApaL1制限酵素での消化に完全に耐性であり(レーン２及び４)、このことにより、再配置した遺伝子のシグナル末端が連結前に再編成されたことが示される。他方、コントロールDNAから増幅したシグナル接合部は全て、消化に感受性である産物及び消化に耐性である産物の両方を含有する(レーン２、４及び６)。したがって、患者からの増幅した接合部は、非改変接合部を含んでいないので、コントロールサンプル中より多様化していない。このことより、患者から単離したCD4+CD8+Vβ1+リンパ球は、δRec-1再配置レパートリーが減少している：コントロールのポリクローナルサンプルと比較して、δRec-1再配置が少なく、その接合多様性も限られている。
【００５３】
図４：δRec-1/AJ58接合部の多様性の分析。
患者のCD4+CD+Vβ1+集団から増幅したδRec-1/AJ58のPCR産物(ApaL1での消化に耐性)が１又はそれ以上の分子種を含有するかどうかを決定するために、多様性の分析を行った。Texas Red(登録商標)にカップリングしたδRec-1プライマーを使用して標識一本鎖DNAを作製することを意図したPCR反応において、δRec-1/AJ58のPCR産物を鋳型として使用した。次いで、この一本鎖DNAを、コントロールサンプルから増幅した対応する産物と共にアクリルアミドゲル上にロードした。この方法により、種々の分子種をその長さに従って分離することが可能になる(各々のサイズで蛍光ピークが得られる)。コントロールサンプル(実線の曲線)では、優勢なピークが、非改変接合部について予想されるサイズで観察される。これら分子種は、大部分が、ApaL1での消化に感受性である接合部に対応する。より大きなサイズに対応する幾つかのピークは、少なくともヌクレオチド付加で改変した接合部を含んでなる分子種を表すが、これらも観察される(囲みの中)。これらピークは、このPCR産物中に存在する、ApaL1での消化に耐性である改変接合部に対応する。
【００５４】
患者のCD4+CD8+Vβ1+集団から増幅したδRec-1/AJ58 PCR産物において、１つのピークが観察される。したがって、この産物は１つの分子種のみを含有する。これは、非改変接合部について予測されるサイズに対応する位置に移動するが、これはApaL1での消化に耐性である(図１を参照)。したがって、このことから、この接合部がヌクレオチドの欠失及びその後の付加により改変されていることが結論付けられる。
【００５５】
図５：ADV/AJ SJ中のＮ改変の証明
AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56とのADV2及びADV8の再配置に起因するシグナル接合部を、C57BL/6マウス(wt)及びTdT欠損マウス(TdT)由来の胸腺細胞DNAから増幅した。PCR産物を消化せず(-)に又はApaL1で消化(+)した後、ゲル上で移動させ内部AJプローブとハイブリダイズさせた。
【００５６】
図６：野生型マウス及びTdT0/0マウスのサンプルに由来するADV2/AJシグナル接合部の配列決定の結果。
*は、同じ接合部を有するが異なるADV2遺伝子を使用する２つの配列を示す；^及び^^は、２つの異なるマウスに由来する胸腺細胞のDNAから増幅した同じ接合部を有する２つの配列を示す。
図７：DV102/DD2及びADV2/DD2のマウスシグナル接合部の配列決定の結果。
【００５７】
図８：ヒトδRec-1/AJシグナル接合部の分析。
10日齢(Ａ)及び６日齢(Ｂ)の２人の患者の胸腺細胞からのDNAのサンプルを使用して、AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56とのδRec-1の再配置に起因するSJを増幅した。PCR産物の一部をApaL1で消化した；次いで、消化及び未消化の産物をアガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上にブロットし、放射性標識δRec-1プローブとハイブリダイズさせた。
【００５８】
図９：胸腺細胞DNAのサンプル(Ａ)及び４人の異なる患者の血液から精製した白血球に由来するDNAの４サンプル(Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ)における、AJ61、60、59、58、57及び56遺伝子とのhδRec-1の組換えの間に生じたシグナル接合部の増幅及び分析。
シグナル接合部をPCRにより増幅し、次いで消化なし(-)で又はApaL1制限酵素での消化の後(+)でアガロースゲル上で分析した。ナイロンメンブレン上にブロットした後、産物は、hδRec-1に特異的な放射性プローブのハイブリダイゼーションにより顕在化される。
【００５９】
Thyサンプル及びPBL#1サンプル(Ａ及びＢ)については、星印は、hδRec-1/AJ59シグナル接合部に対応するバンドの位置を示す。hδRec-1/AJ59シグナル接合部は、当該遺伝子同士の近接に起因して、時にAJ60に特異的なオリゴヌクレオチドで増幅されることがある。
得られた産物のプロフィールは、血液白血球の各サンプルで異なり、これら患者におけるレパートリーの多様性を示している。
【００６０】
図10：AJ61、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56とのhδRec-1の再配置についてのApaL1制限に耐性であるδRec-1/AJシグナル接合部の配列決定の結果、及びヒトサンプル中に存在するhδRec-1/AJ60再配置についての総てのシグナル接合部の配列決定の結果。
図11：マウス胸腺細胞DNAを用いる、AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56とのδRec-1の再配置に起因するSJの増幅。
PCR産物をアガロースゲル上で分離し、次いでナイロンメンブレン上にブロットし、放射性標識δRec-1プローブとハイブリダイズさせた。
【００６１】
図12：マウスサンプル中に存在するδRec-1/AJ61シグナル接合部の配列決定の結果。
しかし、これらの実施例は本発明の主題の例示のためだけに提供され、如何なる様式であっても本発明を限定するものではないことを明確に理解すべきである。
【実施例】
【００６２】
実施例
実施例１：患者からのＴリンパ球集団の異質性の程度の決定
1.A. 手順
1.A.1. DNAの調製
DNA抽出には、Machery Nagel(登録商標)のヌクレオスピン組織抽出キット(nucleospin tissue extraction kit)を提供された指示書に従い使用した。
【００６３】
・  細胞を５分間1200rpm(300ｇに相当)の遠心分離によりペレット化する。乾燥ペレット(10百万細胞まで)を、上記キットで提供されるプロティナーゼＫ 25μlと混合した185μlのT1溶解緩衝液中に採取する。
・  サンプルを強くボルテックスし、56℃で一晩消化する。
・  次いで200μlの緩衝液B3を加え、溶解物をボルテックスし、70℃にて10分間インキュベートする。
・  210μlの無水エタノールを加え、混合物を上記キットで提供されるカラムに充填する。
【００６４】
・  カラムを11,000ｇにて１分間ボルテックスする(DNAをシリカに結合)。
・  次いでカラムを500μlのBWで、続いて600μlのB5で、各回11,000ｇにて１分間の遠心分離を伴って洗浄する。
・  シリカを11,000ｇにて３分間の遠心分離により乾燥させる。
・  次いでDNAを、最初に溶解した細胞の量に応じて50〜200μlの容量のBEで溶出させる。このためには、70℃に予熱したBEをカラムに充填し、全体をインキュベーター中で70℃にて２分間インキュベートする。DNAを11,000ｇにて１分間の遠心分離により回収する。
【００６５】
1.A.2. シグナル接合部の増幅
この工程の目的は、構造を研究するに十分な材料を得るために、目的のシグナル接合部をPCRにより増幅することである。
100〜200ngのトータルDNAを各PCR反応に使用する。サンプルによっては第２のPCR(ネスティッドPCR)が必要であり得る。
【００６６】
増幅は、提供される「Master Mix」緩衝液中で、TaqGold酵素(Applied Biosystem)を用いて行う。最初にδRec-1に特異的なプライマー(配列番号１)を使用し、２番目にAJ61、AJ 58、AJ57及びAJ56に特異的なプライマー(それぞれ、配列番号３、配列番号９、配列番号11及び配列番号13)を使用した。これらプライマーは、シグナル接合部のみを増幅するように選択される。サンプル当たり４つのPCR反応を行う。
【００６７】
25μlの反応について：
DNA：                      100又は200ng
２×Master Mix：           12.5μl
センスオリゴ(５μM)：      ２μl
リバースオリゴ(５μM)：    ２μl
H2O：                   qs 25μl
PCR条件：94℃にて10分間
以下のシーケンスからなる35サイクル：
94℃にて30秒間、64℃にて30秒間及び72℃にて30秒間
その後
72℃にて10分間。
【００６８】
AJ領域に特異的なもう１つの内部オリゴヌクレオチド：AJ61については配列番号４、AJ58については配列番号10、AJ57については配列番号12及びAJ56については配列番号14、更にはδRec-1については配列番号１を用いる第２のPCR(ネスティッドPCR)。
【００６９】
25μlの反応について：
第１のPCRの産物：          ４μl
２×Master Mix：           12.5μl
センスオリゴ(５μM)：      ２μl
リバースオリゴ(５μM)：    ２μl
H2O：                   qs 25μl
PCR条件：94℃にて10分間  １×
以下のシーケンスからなる35サイクル：
94℃にて30秒間、64℃にて30秒間及び72℃にて30秒間
その後
72℃にて10分間。
【００７０】
PCR産物をアガロースゲルにロードする。４つの反応が陽性であるか否かに従い、サンプル中に含有されるリンパ球の異質性の程度の第１の指標をこの段階で得る。
【００７１】
1.A.3. ApaL1酵素での消化によるシグナル接合部の多様性の検出：
この工程の目的は、前工程で増幅したシグナル接合部が多様化しているかどうかを決定することである。選択した遺伝子(δRec-1、AJ61、AJ58、AJ57、AJ56)のRSSは、コンセンサスRSS配列に対応し、したがって３ヌクレオチドGTG又はCACで始まる。結果として、シグナル接合部を形成するためのこの２つのRSSの完璧な連結は、ApaL1制限酵素により認識される部位(5'-GTGCAC-3')を生成する。
【００７２】
TCRAD遺伝子座が有する遺伝子のV(D)J組換えに起因するシグナル接合部の大きな割合(30％まで)は、再配置した遺伝子のRSSの完璧な連結によって形成されていないが、連結前のRSS末端でのヌクレオチドの欠失及び/又は付加によるプロセシングの徴候を示す。これに起因する接合多様性はApaL1制限部位の形成を妨げ、したがってこれら改変接合部はこの酵素での消化に耐性である。したがって、PCR産物のApaL1での消化後における２つの分子種(１つは感受性、１つは耐性)の存在は、増幅された接合部の多様性の指標である。この多様性は、異なるV(D)J組換えイベントを行ったＴリンパ球の存在を明らかにする。
【００７３】
他方、１つの分子種のみが検出される場合、分析したサンプルの多様性は、コントロールサンプルと比較して、減少している。
消化は、５ＵのApaL1酵素を用いて、20μlの最終容量で37℃にて３時間行う。
PCR産物：         10μl
10×消化緩衝液：  ２μl
10U/μl酵素：     0.5μl
H2O：             7.5μl
【００７４】
コントロールは、制限酵素を省略して同じ条件下で行う：
PCR産物：         10μl
10×消化緩衝液：  ２μl
H2O：             ８μl
【００７５】
消化又は未消化の産物を、ETBの存在下で１×TBE緩衝液中２％アガロースゲル上での電気泳動により分離する。
次いでDNAを毛管作用によりナイロンHybond N+メンブレン(Amersham)に移し、次いでUV(700Ｊ)下で固定する。
【００７６】
次いでメンブレンをRapid Hyb緩衝液(Amersham)と42℃にて30分間プレハイブリダイズさせ、次いで供給業者により指定された条件下でT4ファージポリヌクレオチドキナーゼ及びATPγ32Pとインキュベートすることにより32Pで標識した、δRec-1に特異的なオリゴヌクレオチドプローブと42℃にて４時間ハイブリダイズさせる。
放射性シグナルは蛍光画像化装置を用いて検出する。
【００７７】
1.A.4. 標識プライマー伸長によるヒトシグナル接合部の定性分析
この技法により、Ｔリンパ球集団から増幅された種々のδRec-1/AJシグナル接合部の長さを決定することが可能になる。したがって、シグナル接合部中に導入された改変を定性的に決定することが可能である。得られたフラグメントの分布により、分析した集団の多様性を推定することが可能になる。この方法は、一本鎖DNAを、蛍光色素：Texas-redを含有するプライマーを用いるPCRにより増幅することからなる。次いで、これらフラグメントはポリアクリルアミドゲル上で分離する。
【００７８】
最終容量：Applied Biosystemsのamplitaq Gold master Mixキットを含む12.5μl
PCR産物：         0.5μl
２×Master Mix：  6.25μl
１μM オリゴ：    0.5μl
H2O：             5.25μl
PCRサイクル：94℃にて６分間
以下のシーケンスからなる12サイクル：
94℃にて２分間、64℃にて１分間及び72℃にて７分間、次いで
72℃にて12分間。
【００７９】
次いで、９μlのPCR産物を16μlのホルムアミド及び１μlの蛍光標識と混合した。混合物を96℃で５分間加熱し、次いでABI Prism 310シークエンサー中に注入した。
【００８０】
1.B. 結果
患者に由来する血液サンプル中のＴリンパ球のフローサイトメトリ分析により、種々のVβ遺伝子の非常に変化した使用分布が示された。この患者のＴリンパ球は、非常に優勢にVβ1遺伝子を使用している。更に、通常でないＴリンパ球集団(CD4分子及びCD8分子の両方を発現する)がこの患者において検出された。この集団のＴリンパ球もまた、実質的に専らVβ1遺伝子を使用している。
【００８１】
これらCD4+CD8+Vβ1+Ｔリンパ球をフローサイトメトリにより選別し、DNAを調製した。このDNAを鋳型として使用してδRec-1/AJ61、δRec-1/AJ58及びδRec-1/AJ57のシグナル接合部を増幅させた(第４の組合せδRec-1/AJ56はこの例では行わなかった)。δRec-1/AJ61及びδRec-1/AJ58の増幅のみから産物が得られた一方、総胸腺細胞(正常に多様化した集団)から抽出したDNAのコントロールサンプルで３つの反応について産物が得られた(図１、レーン１、３及び５)。この結果は、患者の血液から精製したCD4+CD8+Vβ1+Ｔリンパ球が制限されたδRec-1再配置レパートリーを有することを示す。
【００８２】
PCR産物をApaL1制限酵素での消化に付し、患者に由来するPCR産物が耐性であることを見出した(図1、レーン２、４及び６)。この結果は、増幅したシグナル接合部の全てが患者で改変されている一方で、胸腺細胞から増幅したコントロールサンプルでは、シグナル接合部の大部分が非改変であり、したがってApaL1での消化に感受性の産物と耐性の産物が識別されることを示す(図１、レーン２、４及び６)。この結果は、患者のCD4+CD8+Vβ1+Ｔリンパ球から増幅したシグナル接合部の接合多様性は限定的であることを示す。
【００８３】
CD4+CD8+Vβ1+集団から増幅したシグナル接合部がポリクローナル性であるか又はモノクローナル性であるかを決定するために、イムノスコープタイプの標識プライマー伸長試験をδRec-1/AJ58 PCR産物について行った。このPCR産物には１つの分子種が見出された(図２)。
【００８４】
これら実験は、１)δRec-1再配置のレパートリーが分析した集団で限定的であること(試験した３つの再配置のうち２つのみ)、および２)見出される接合部は、コントロールのポリクローナルサンプルと比較して、非常に制限された多様性の程度を示すことを示す。
したがって、これら結果は、CD4+CD8+Vβ1+Ｔリンパ球集団は、少数の最初のリンパ球の増殖に起因することを示唆する。
【００８５】
実施例２：マウスのTCRAD遺伝子座の遺伝子のV(D)J組換えの間のシグナル接合部の改変
2.A. 材料及び方法
2.A.1. マウス
C57BL/6マウスを、グレノーブルのコミッサリア  ア  エネルジ  アトミック[原子力エネルギー委員会]の動物舎で飼育した。４〜８週齢でCO2の吸入によりマウスを屠殺し、胸腺を取り出した。
【００８６】
2.A.2. DNAの調製
Machery Nagel(登録商標)ヌクレオスピン組織抽出キットを製造業者の指示に従い使用して、C57BL/6マウス胸腺細胞のDNAを107細胞から調製した。TdT0/0マウスからTdT0/0胸腺細胞のDNAを得た(Gilfillan, Dierichら，1993)。
【００８７】
2.A.3. シグナル接合部の増幅及び消化
AmpliTaqGold PCR混合物を使用して胸腺細胞DNA(100ng)を適切なプライマーで以下のとおり増幅させた：94℃にて10分間、次いで以下のシーケンス：94℃にて30秒間、60℃にて30秒間及び72℃にて30秒間からなる35サイクル、続いて72℃にて10分間。PCR反応をPerkin-Elmerの「GenAmp PCR system 9600」装置にて、最終容量25μlで行った。プライマー配列は上記の表１及び２に示す。
【００８８】
増幅後、５〜10μlのPCR増幅産物を、５単位のApaL1制限酵素(Amersham Pharmacia Biotech)で、該酵素を供給した緩衝液中で37℃にて３時間消化した。コントロールを、ApaL1なしで同じようにインキュベートした。消化又は未消化の産物を２％アガロースゲル上で並べて分離し、N-Hybond+メンブレン(Amersham Biosciences)上にブロットし、上記表１及び２に示した、増幅したシグナル接合部のAJ領域に特異的な放射性標識オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号16、18、20及び24のプローブ)の混合物とハイブリダイズさせた。これらプローブとハイブリダイズしたブロットの分析を「Personal FX Imager」(Biorad)で、「Quantity One」ソフトウェアを用いて行った。
【００８９】
2.A.4. シグナル接合部のクローニング及び配列決定
PCR産物をゲル上で精製し、製造業者の指示に従いベクターpGEM-T Easy(Promega(登録商標))中にクローニングし、コンピテントな細菌中に形質転換させた。プレーティング後、AJ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより陽性コロニーを同定した。シグナル接合部を含有するコロニーから、Wizard miniprepキット(Promega(登録商標))又はMontage Plasmid Miniprep 96システム(Millipore Corporation(登録商標))のいずれかを用いて、プラスミドを調製した。次いで、SJを含有するプラスミドを個々にApaL1で消化した。プラスミドpGEM-T easyはこの酵素の２つの部位を含有する。組換えプラスミドが、RSSの完璧な融合により形成された非改変シグナル接合部を含有する場合、追加のApaL1部位が導入され、消化によりアガロースゲル上で移動後に３つのバンドが得られる。組換えプラスミドが改変シグナル接合部を含有する場合、そのような追加の部位は導入されず、消化により２つのバンドのみが得られる。DNAフラグメントの数又はサイズに関して予期しないプロフィールを示すプラスミドは、その後の分析からは排除した。改変の性質を同定するために、改変シグナル接合部を含有するプラスミドを配列決定した(Genome Express, Meylan, France)。同じサンプルから得られた同一シグナル接合部は、一度だけカウントした。なぜならば、これら複数回の発生が、１つのシグナル接合部の独立したイベントの結果であるのか又は過剰増幅の結果であるのか決定することは不可能であるからである。
【００９０】
2.B. 結果
2.B.1. ADV/AJシグナル接合部は、TdTの作用に関係付けられる接合多様性を示す
AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56とのADV2遺伝子及びADV8遺伝子の組換えに由来するSJを、C57BL/6マウス胸腺細胞DNAから増幅させた。その後、未消化及びApaL1消化のPCR産物をアガロースゲル上での移動、続くブロッティング及びAJ領域に特異的な放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションによる顕在化により分析した。試験した全てのADV-AJ組換えについて、PCR産物の有意な割合がApaL1制限に耐性であった。この耐性は、幾つかのシグナル接合部が改変されており、RSSの単純な連結からなっていないことを示す。
【００９１】
TdT欠損胸腺細胞からのDNAを用いる同じ実験を行い、ApaL1制限に耐性であるシグナル接合部(SJ ApaL1-R)の生成へのTdTの関与の可能性を分析した。このことにより、TdT発現の不在下では、試験した全ての組合せについてSJ ApaL1-Rは実質的に存在しないことが疑いなく明らかになった(図５)。
【００９２】
同じAJ遺伝子とのADV1、ADV20及びADV6の再配置の後に生じたSJを分析することにより類似の結果が得られた。したがって、SJ改変は、δRec-1の5'側のADV/DV領域に位置する21のADV遺伝子ファミリーのうちの少なくとも５つの再配置の間に起こる。
これら結果により、(i)ADV-AJシグナル接合部は接合多様性を示し、(ii)この多様性は、ほぼ完全に、TdTによるＮヌクレオチドの付加に起因することが示される。
【００９３】
2.B.2. 改変シグナル接合部の定量及び構造
改変シグナル接合部のパーセンテイジを現実に決定するために、各SJを対応する組換えプラスミドのApaL1消化により独立して分析することができるように、ADV2/AJシグナル接合部を野生型胸腺細胞DNAから増幅させ、クローニングした。下記の表３に示すように、SJ ApaL1-Rの頻度は、ADV2/AJ58についての9.7％から、ADV2/AJ61についての39.1％までの範囲であり、平均33.6％である。したがって、改変の頻度が、再配置されたAJ遺伝子に応じて僅かに変化するように見える場合であっても、ADV2/AJ SJの有意な割合が改変されている。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
改変の性質を正確に同定するために、これらSJ ApaL1-Rの大部分を配列決定した。これら改変は、本質的には、Ｎヌクレオチドの付加からなっていた。これら配列が、鋳型の支持なしで、１〜７(平均で配列当たり2.8)のヌクレオチドを含有することが見出された。これらＮヌクレオチドの付加は、主に、Ｇ及びＣのヌクレオチドに対応し、これらは併せて付加された塩基の70％を超える(図６)。これは、TdT活性の代表的なバイアスを構成する。２つの例外を別として、ApaL1耐性ADV2/AJ SJは独特である。このことにより、改変SJのレパートリーが高度の多様性を示すことが示される。
【００９６】
４つのＮヌクレオチドが挿入されたADV2/AJ57 SJが、ADV2七量体の３塩基の欠失もまた示すことに留意することは重要である。このことにより、RSS末端からのヌクレオチドの喪失はSJ多様性に寄与できることが示唆される。この観察が、本発明者らを、TdT発現の不在下でのSJの構造を調べるように導いた。TdT欠損マウスから増幅したADV2/AJ56 SJをクローニングし、得られた組換えプラスミドを分析した。ApaL1-Rプラスミドの頻度は2.7％であった(74のうち２)。これら配列の一方では、ADV2及びAJ56に有される２つのシグナルから、ヌクレオチドが欠失していた(それぞれ、１ヌクレオチド及び３ヌクレオチド)。他方では、AJ56七量体から４塩基が欠失している一方で、ADV2のシグナルは完全である。この接合部はまた、追加のヌクレオチドも含有している(図６、最下行)。
【００９７】
したがって、RSSからの塩基の喪失は稀であり、TCRAのSJで観察されるほとんどの改変は、Ｎヌクレオチドの付加に起因するようである。
【００９８】
2.B.3. TCRDのシグナル接合部は、Ｎヌクレオチドの付加及びヌクレオチド鎖分解性活性により改変される
Candeiasら(上記)による以前の研究は、TCRD遺伝子再配置が、Ｎヌクレオチドの付加及び塩基の喪失の両方により改変されたシグナル接合部を生成することを示した。これらデータは、DD2とのDV105の再配置の分析の後に得られた。しかし、DV105は反転により再配置し、したがってSJ形成は、染色体の完全性を維持すること及び細胞の生存を確実にするために必須である。SJの形成を確実にするために、反転による組換えの間に、RSSが、ヌクレオチド鎖分解性活性を含むV(D)J組換え複合体とより強固に結合することは理論的には可能である。このことは、DV105及びDD2のRSS末端での欠失の存在を説明し得る。結果として、シグナルエレメント(SE)の塩基の欠失がTCRD遺伝子再配置の一般的な特徴であるか、又は逆にこれが反転による再配置の特異性を構成するかを決定するために、本発明者らは、DV102とDD2との間の欠失により起こる再配置の間に生じるSJの構造を分析した。
【００９９】
C57BL/6マウス胸腺細胞DNAからのDV102/DD2 SJの増幅及びクローニングの後に得られた組換えプラスミドのApaL1消化により、34％のSJ ApaL1-Rの存在が明らかになった(表４)。とりわけ、配列決定分析により、これら改変シグナル接合部の４つ(17の異なる接合部のうち)が、DV102及び/又はDD2のRSSの末端部でヌクレオチドを喪失したことが示された(図７)。したがって、連結前のSEからのヌクレオチドの喪失は、TCRD遺伝子が欠失により再配置しているのか又は反転により再配置しているのかに依存しない。
【０１００】
次いで、C57BL/6胸腺細胞DNAから増幅したADV2/DD2 SJについて同じ分析を行った。ApaL1-R組換えプラスミドの比率は、44.7％であった(表４)。配列決定分析により、21の異なる改変接合部が明らかになった。これらのうちの５つで、改変は、Ｎヌクレオチドの付加及びシグナル末端からの塩基の欠失の両方からなっていた(図７)。この比率は、DV102/DD2 SJにおいて見出された比率と類似している。しかし、これは、ApaL1耐性ADV2/AJ SJで見出された欠失の比率(野生型胸腺細胞で34のシグナル接合部のうち１つの欠失)とは統計学的に異なる(Mann-Whitney検定によりp=0.01)。このことにより、ADV遺伝子ファミリーが２つのタイプの再配置で使用されている場合でさえ、TCRA遺伝子再配置の間より、TCRD遺伝子再配置の間に生じたSJ中に更なる欠失が導入されていることが示される。
【０１０１】
【表４】
2008528049.tif 000005
【０１０２】
したがって、シグナル接合部の多様性を担う機序は、問題のSJがTCRA遺伝子の再配置に起因するか又はTCRD遺伝子の再配置に起因するかにより異なるようである。
【０１０３】
2.B.4. δRec-1エレメントの再配置は組合せの多様性及び接合多様性を示す
本発明者らは、続いて、AJ遺伝子とのδRec-1エレメントの組換えにより生じたシグナル接合部の構造をより詳細に分析した。AJ61、AJ60、AJ59、AJ58、AJ57及びAJ56とのδRec-1の組換えにより生じたSJを、ヒト胸腺細胞DNAから増幅させ、これら増幅産物をApaL1で消化した。図８及び9Aは、胸腺で、PCR産物の相当な割合がApaL1制限に耐性であることを示す。このことにより、AJ60を含むものを除いて試験した全ての再配置について、改変シグナル接合部の存在が明らかになる。hδRec-1/AJ60シグナル接合部に関しては、これら接合部の全てがApaL1制限酵素での消化に耐性である。なぜならば、AJ60組換えシグナル配列は、確立されたコンセンサスモチーフと一致せず、CATトリプレットで始まり、CACトリプレットで始まらないからである。したがって、シグナル接合部が形成される場合、ApaL1制限部位の生成はない。
【０１０４】
図9B〜9Eは、この分析を種々のドナーから精製した血液白血球のサンプルに適用する場合、得られるプロフィールは各患者について異なることを示す。このことにより、各患者は、患者に特異的なシグナル接合部レパートリーを有することが示される。
【０１０５】
改変の性質を決定するために、上記の理由のために前消化なしでクローニングしたAJ60の組換えに由来するものを除き、ApaL1耐性産物をゲル上で精製しクローニングした。無作為に選択したコロニー中に存在するプラスミドを配列決定した(図10)。Ｎヌクレオチドの存在は、分析した全てのSJ ApaL1-R及びhδRec-1/AJ60 SJの幾つかで明らかであった。平均で配列当たり5.35ヌクレオチドが付加されており、その数は１〜11の範囲であった。６つの場合(19％)で、シグナルエレメントの１つから塩基が喪失していた。これら欠失は１〜13塩基の範囲である。再度、２つの配列のみが２度見出された。このことより、改変SJのレパートリーの多様性が示される。
したがって、ヒト胸腺細胞のδRec-1/AJシグナル接合部は、接合多様性を示す。
【０１０６】
続いて、本発明者らは、マウスδRec-1エレメントの再配置がAJ61偽遺伝子に制限されるか、又はヒト胸腺と同様に、他のAJ遺伝子もまた使用できるかを決定しようとした。同じアプローチを使用し、AJ61、AJ58、AJ57及びAJ56とのδRec-1の組換えに由来するSJを、マウス胸腺細胞DNAから増幅させた。これらSJは、図11に示されるように、容易に検出可能であった。加えて、本発明者らは、他のより遠隔のAJ遺伝子(AJ18まで)とのδRec-1の再配置を検出した。これら結果は、マウスδRec-1エレメントを含むSJが、ヒトと同様に、組合せの多様性を示すことを証明する。マウスδRec-1エレメントのRSSはApaL1部位を含有するので、これらSJの接合多様性は、制限により直接試験することはできない。結果として、δRec-1/AJ61 SJを直接クローニングし、配列決定した。分析した34のSJのうち11(31.42％)が改変していた(図12)。これらは全てＮヌクレオチドを含有し、配列当たり２〜12であり、配列当たりの平均は4.4であった。１つのSJでは、δRec-1から３つの塩基もまた欠失していた。再度、重複配列がないことにより、δRec-1を含むSJのマウスレパートリーの多様性が示される。
【０１０７】
これら結果は、野生型胸腺細胞におけるマウスδRec-1エレメントの組換えが、組合せの多様性及び接合多様性を示すSJレパートリーを生成することを証明する。
【０１０８】
参考文献
Candeias, S., K. Mueggeら，(1996). "Junctional diversity in signal joints from T cell receptor beta and delta loci via terminal deoxynucleotidyl transferase and exonucleolytic activity." J Exp Med 184(5): 1919-26.
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Gilfillan, S., A. Dierichら，(1993). "Mice lacking TdT: mature animals with an immature lymphocyte repertoire." Science 261(5125): 1175-8.
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2008528049.tif 000014
【図１０】
2008528049.tif 000015
【図１１】
2008528049.tif 000016
【図１２】
2008528049.tif 000017
【配列表】
2008528049000001.app
【国際調査報告】
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2008528049.tif 000019
2008528049.tif 000020
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