(57)【要約】  本発明は、セネカバレーウイルス（「ＳＶＶ」）と呼ばれる新規ＲＮＡピコルナウイルスに関連する。本発明は、単離したＳＶＶ核酸及びこれらの核酸でコードされるタンパク質を提供する。更に、本発明はＳＶＶタンパク質に対して発生された抗体を提供する。ＳＶＶが腫瘍の幾つかの種類を選択的に死滅させる能力を有するので、本発明は、ＳＶＶ及びＳＶＶポリペプチドを使用して癌を治療する方法を提供する。ＳＶＶが特定の腫瘍を特異的に標的にするので、本発明は、ＳＶＶ核酸及びタンパク質を使用して癌を検出する方法を提供する。加えて、ＳＶＶの腫瘍特異的な機構により提供される情報によって、本発明は、新たな腫瘍溶解ウイルス誘導体を作製する方法、及び腫瘍特異的親和性を有するようにウイルスを変える方法を提供する。
2008533988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号：１６８又は（ｉｉ）少なくとも２０個のヌクレオチドの長さの配列番号：１６８の連続する部分と少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離核酸。
【請求項２】
前記核酸がＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
（ｉ）配列番号：１６９又は（ｉｉ）少なくとも１０個のアミノ酸の長さの配列番号：１６９の連続する部分と少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：１６８と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％又は６５％の同一性がある配列を含むゲノムを有する、単離セネカバレーウイルス又はその誘導体若しくは類縁体。
【請求項５】
次の特徴：腫瘍細胞における複製能、腫瘍細胞親和性及び正常な細胞における細胞溶解の欠如を含む、請求項４記載のウイルス。
【請求項６】
前記ウイルスが神経内分泌特性を有する腫瘍細胞型において複製能を有する、請求項５記載のウイルス。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項記載のウイルスの有効量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項３記載のポリペプチドに、又は請求項４若しくは５記載の単離ウイルスのいずれかのエピトープに特異的に結合する単離抗体。
【請求項９】
癌の治療のための少なくとも１００個のヌクレオチドの配列番号：１６８の連続する配列と少なくとも７５％の同一性がある配列を含むゲノムを有するウイルスの使用。
【請求項１０】
前記ウイルスがピコルナウイルスである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ピコルナウイルスがカルジオウイルスである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記カルジオウイルスがヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス及び脳心筋炎ウイルスからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ピコルナウイルスが、セネカバレーウイルスが属する属のメンバーである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ピコルナウイルスがセネカバレーウイルスである、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
前記ピコルナウイルスがセネカバレーウイルス様ピコルナウイルスである、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
前記セネカバレーウイルス様ピコルナウイルスが、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９からなる分離株の群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
異常増殖性細胞を請求項４〜６のいずれか１項記載のウイルスと接触させることを含む、前記細胞を死滅させる方法。
【請求項１８】
（ａ）セネカバレーウイルスゲノムが配列番号：１６８と少なくとも９５％の同一性がある配列を含むセネカバレーウイルスゲノム配列を、試験ウイルスゲノム配列と比較すること；
（ｂ）セネカバレーウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドと試験ウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドとの間の少なくとも最初のアミノ酸の差を同定すること；
（ｃ）試験ウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドがセネカバレーウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも１つ少ないアミノ酸の差を有するように、試験ウイルスゲノム配列を突然変異させること；
（ｄ）突然変異試験ウイルスゲノム配列を腫瘍細胞に形質移入すること；及び
（ｅ）腫瘍細胞が突然変異試験ウイルスゲノム配列により細胞溶解的に感染しているかを判断すること；
を含む腫瘍溶解ウイルスを作製する方法。
【請求項１９】
前記試験ウイルスがピコルナウイルスである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記試験ウイルスがセネカバレーウイルス様ピコナウイルスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記のアミノ酸の差がセネカバレーウイルスカプシドタンパク質と試験ウイルスカプシドタンパク質との間にある、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
試験ウイルスゲノム配列を突然変異することが試験ウイルスゲノム配列を有するｃＤＮＡを突然変異することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記突然変異試験ウイルスゲノム配列を形質移入することがＲＮＡを形質移入することを含み、前記ＲＮＡが突然変異試験ウイルスゲノム配列を有するｃＤＮＡから生成される、請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも１００個のヌクレオチドの長さの配列番号：１６８の連続する部分と少なくとも７５％の同一性がある核酸配列を含む親配列から作り出される、複数個の核酸配列を含むウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すこと；
（ｂ）ウイルス突然変異体のライブラリーを複数の突然変異ウイルスが産生されるように許容細胞に形質移入すること；
（ｃ）複数の突然変異ウイルスを単離すること；
（ｄ）単離した複数の突然変異ウイルスを非許容細胞と共にインキュベートすること；及び
（ｅ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収し、それによって変化した親和性を有する突然変異ウイルスを作製すること；
を含む変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法。
【請求項２５】
（ｆ）回収した突然変異ウイルスを非許容細胞でインキュベートすること；及び
（ｇ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収すること；
を更に含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（ｆ）及び（ｇ）を繰り返し反復することを更に含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
インキュベーションがマルチウエルハイスループットプラットフォームで実施され、前記プラットフォームがそれぞれのウエルに異なる非許容細胞型を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記プラットフォームをスクリーニングしてどのウエルが細胞を死滅させる突然変異ウイルスを含有するかを同定することを更に含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記スクリーニングがそれぞれのウエルにおける吸光度を分析することによって実施される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記非許容細胞が腫瘍細胞である、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことが、
（ｉ）親配列の一部と配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供すること；
（ｉｉ）ポリヌクレオチドを突然変異して複数の異なる突然変異ポリヌクレオチド配列を生成すること；及び
（ｉｉｉ）複数の突然変異ポリヌクレオチドを（ｉ）でポリヌクレオチドが含有するウイルスのゲノム配列部分以外のウイルスのゲノム配列を有するベクターと連結し、それによってウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すこと；
を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）において、ウイルスのゲノム配列がピコルナウイルスからのものである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ピコルナウイルスがセネカバレーウイルス様ピコルナウイルスである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記（ｉｉ）の突然変異がポリヌクレオチドへのヌクレオチドのランダム挿入により実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記（ｉｉ）の突然変異がポリヌクレオチドのカプシドコード領域で実施される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記のヌクレオチドのランダム挿入がトリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）により実施される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドに挿入される前記ヌクレオチドの少なくとも一部がエピトープタグをコードする、請求項３６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、２００５年３月２３日に出願された米国特許出願第６０／６６４，４４２号、２００５年１０月１３日に出願された米国特許出願第６０／７２６，３１３号、及び２００６年１月１９日に出願された米国特許出願第１１／３３５，８９１号の優先権を主張する。これらの出願は、その全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、著作権保護の対象となるものを含む。著作権所有者は、米国特許商標庁の特許ファイル又は記録に現れている、特許文献又は特許開示のいずれかのファクシミリ複製に対して異議はないが、そうでない場合はあらゆる全ての著作権を保持する。
【０００３】
本明細書に引用される全ての特許出願、公開特許出願、発行及び付与された特許、テキスト及び参照文献は、本発明が関わる技術の状態をより完全に記載するため、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ウイルス療法は癌を治療するのに大いに有望である。癌細胞に特異的に感染し、死滅させることを目的とする腫瘍溶解ウイルスは、天然及び／又は操作されているかにかかわらず、化学療法及び放射線のような代替的治療よりも効果的であり、毒性が少ない。加えて、複製能ウイルスを使用する腫瘍溶解ウイルス療法は、薬理学的に望ましい部位で治療を増強できることが知られている唯一の療法である。
【０００５】
癌療法の主な態様は、正常な細胞に対して高い率で癌細胞の死滅を達成することである。この目標を達成することは、関与する細胞型が広範囲であること、転移による癌細胞の全身的な播殖、及び正常な細胞と癌細胞との生物学的な差が狭いことを含む多くの理由によって困難であった。進展はあったが、現行の癌治療を改善するには依然として多くのことをする必要がある。
【０００６】
過去に、外科医は、患者を実質的に傷つけることなく外科的に腫瘍を除去しようと試みた。原発性腫瘍の完全な除去でさえも、体内の未知の部位への早期の転移が未検出のまま残されるので、生存を確実にはしない。また、外科的介入は、血管形成インヒビターを産生する腫瘍細胞の除去のために、遠隔転移の増殖を増強する場合があることを幾つかの研究が示唆している。最後に、多くの場合に、腫瘍は、外科的除去の後に元の部位で再び増殖する。放射線は、最も急速に増殖する細胞を他を犠牲にして選択的に破壊することを目的としている。しかし、腫瘍細胞は、治療の間に抵抗性になるか又は非分化状態になって、放射線療法を回避することができる。加えて、放射線は、多くの正常な細胞が活性的に分化し、治療により死滅する点において（骨髄の細胞、胃腸細胞、毛嚢など）、必ずしも選択的ではない。
【０００７】
放射線と同様に、化学療法は完全に選択的ではなく、したがって多くの正常な細胞を破壊し、薬剤耐性及び／又は細胞の分化状態に起因して全ての腫瘍細胞は死滅させない。したがって、化学療法及び放射線療法は、正常な細胞と癌細胞との間に存在する小さな分差感を利用し、治療指数が狭い。小さな治療指数は、癌を治療するあらゆるモダリティーにとって明らかに望ましくない特性である。したがって、これらの制限を克服する新規の癌治療の手法が望まれる。
【０００８】
そのような新規の手法の一つは、腫瘍溶解ウイルス療法である。最初に、細胞毒性導入遺伝子を持つ複製欠損ウイルスを利用して、癌を治療しようと試みた。しかし、これらは、腫瘍の形質導入が不十分であること、腫瘍腫瘤内の拡散が不十分であること、及び癌に対する選択性が不十分であることが見出された。この制限を克服するために、ウイルスを腫瘍細胞内で選択的に複製するように修飾したか、又は天然に腫瘍選択性を有するウイルスを発見した。したがってこれらの腫瘍溶解ウイルスは、ウイルスを局所的に注入すること又はウイルスを全身的に送達することによって、腫瘍体積の全体にわたって複製し、拡散し、腫瘍細胞を選択的に死滅させる特性を有した（図１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この新たに定義された種類の抗癌療法に対する初期の期待にもかかわらず、癌療法として使用するのを制限する可能性がある幾つかの制限が依然として存在する。したがって、癌療のために利用できる新規腫瘍溶解ウイルスの継続的な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要約）
新規ＲＮＡピコルナウイルスが発見され（本明細書以降ではセネカバレーウイルス（Seneca Valley virus）（「ＳＶＶ」）と呼ぶ）、この天然の特性には、幾つかの種類の腫瘍を選択的に死滅させる能力が含まれる。下記の実施例で実証されているように、ＳＶＶは、神経親和性をもって、ほとんどの場合、正常な細胞に対して腫瘍細胞の５０％を死滅させるのに必要なウイルスの量（すなわち、ＥＣ50値）で１０，０００倍を超える差をもって、腫瘍株を選択的に死滅させる。この結果は、インビボにも置き換えられ、マウスにおける腫瘍外植片は、選択的に排除されている。更に、インビボの結果は、ＳＶＶは、１×１０14vp/kg（１kgあたりのベクター又はウイルス粒子）までの全身投与が、免疫欠損又は免疫適格マウスにおいて死亡及び目に見える臨床症状を引き起こさないので、正常な細胞に毒性ではないことを示す。
【００１１】
ＳＶＶは、１×１０8vp/kgの低い濃度で効力を誘発し、したがって、＞１００，０００の非常に高い治療指数が達成される。効力は、マウスに既に確立している大型の腫瘍の１００％を完全に消滅させることができるという点において、非常に強力である（実施例１１を参照すること）。この効力は、あらゆる補助療法なしでＳＶＶの単回全身注入により仲介することができる。更に、ＳＶＶ注入マウスは、注入後少なくとも２００日間は臨床症状も、腫瘍の再発も示していない。ＳＶＶを精製してより高い力価にすることもでき、許容細胞株において１細胞あたり＞２００，０００個のウイルス粒子を産生することができる。したがって、ＳＶＶを基盤とするウイルス療法は、選択された種類の癌の治療において安全で有効な新規治療方針としてかなり有望である。更に、ＳＶＶは、小型で容易に操作できるゲノム、簡素で速い生活環、及びよく理解されている複製の生態学を有し、したがって修飾を受けやすい。これらの特性は、少なくとも部分的には、ＳＶＶを基盤とする治療法が元のＳＶＶ分離株による感染に抵抗性のある新規腫瘍型を対象とすることができるように、新規細胞及び組織特異的親和性を有する修飾ＳＶＶを生成する方法を可能にする。
【００１２】
したがって、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８に、若しくは少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は少なくとも１０、１５若しくは２０個のヌクレオチドの長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に９５％の同一性を有する核酸配列を含む単離核酸を提供する。本発明の単離核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。
【００１３】
本発明の全ての態様において、単離核酸は、本明細書のＳＶＶ核酸配列番号の配列のうちのいずれか１つの連続する部分に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むことができ、ここで連続する部分は、例えば、少なくとも約２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、２０００又は２５００個のヌクレオチドの長さである。ＳＶＶ核酸配列番号の配列としては、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１及び１６８が挙げられる。
【００１４】
本発明の全ての態様において、単離タンパク質又はペプチドは、本明細書のＳＶＶアミノ酸配列番号の配列のうちのいずれか１つの連続する部分に少なくとも約５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ここで連続する部分は、例えば、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００又は３５０個のアミノ酸の長さである。ＳＶＶアミノ酸配列番号の配列としては、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び１６９が挙げられる。
【００１５】
別の態様において、本発明は、配列番号：１６８に、又は少なくとも２０、５０、１００若しくは２００個のヌクレオチドの長さの配列番号：１６８の連続する部分に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離核酸を提供する。単離核酸は、配列番号：１６８のＳＶＶ架橋ヌクレオチド１〜６６６の５′非翻訳領域（ＵＴＲ）；配列番号：１６８のＳＶＶポリタンパク質架橋ヌクレオチド６６７〜７２０９のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ架橋ヌクレオチド６６７〜９０３のリーダーペプチドのコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ＶＰ４タンパク質架橋ヌクレオチド９０４〜１１１６のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ＶＰ２タンパク質架橋ヌクレオチド１１１７〜１９６８のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ＶＰ３タンパク質架橋ヌクレオチド１９６９〜２６８５のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ＶＰ１タンパク質架橋ヌクレオチド２６８６〜３４７７のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ２Ａタンパク質架橋ヌクレオチド３４７８〜３５０４のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ２Ｂタンパク質架橋ヌクレオチド３５０５〜３８８８のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ２Ｃタンパク質架橋ヌクレオチド３８８９〜４８５４のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ３Ａタンパク質架橋ヌクレオチド４８５５〜５１２４のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ３Ｂタンパク質架橋ヌクレオチド５１２５〜５１９０のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ３Ｃタンパク質架橋ヌクレオチド５１９１〜５８２３のコード配列；配列番号：１６８のＳＶＶ  ３Ｄタンパク質架橋ヌクレオチド５８２４〜７２０９のコード配列；及び配列番号：１６８のＳＶＶ架橋ヌクレオチド７２１０〜７２８０の３′ＵＴＲが挙げられるが、これらに限定はされない配列番号：１６８の特定の部分を含むことができる。
【００１６】
一つの態様において、本発明は、ＳＶＶ  ２Ａ、ＳＶＶリーダーペプチド又は他のＳＶＶタンパク質若しくはそのペプチド部分を使用して、宿主細胞タンパク質翻訳を遮断する方法を提供する。一つの態様において、そのようなＳＶＶタンパク質を使用して、宿主細胞においてキャップ結合タンパク質複合体で妨害又は阻害することによって宿主細胞タンパク質翻訳を遮断することができる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ＳＶＶ  ２Ａ又は他のＳＶＶタンパク質若しくはそのペプチド部分を使用して、ペプチド又はタンパク質を開裂する方法を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、高度、中度のストリンジェンシー又は低度のストリンジェンシー条件下で配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８とハイブリダイズするか、又は少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分とハイブリダイズする単離核酸を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８に、又は少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含むベクターを提供する。ベクター組成物は、ＳＶＶタンパク質をコードする配列番号：１６８の核酸領域を含むこともできる。
【００２０】
本発明は、また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１を含む核酸配列に、又は少なくとも５０個のヌクレオチドの長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する核酸でコードされる単離ポリペプチドを提供する。本発明は、また、ＳＶＶタンパク質をコードする配列番号：１６８の核酸領域に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸でコードされる単離ポリペプチドを提供する。
【００２１】
一つの態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、１６９に、又は少なくとも１０個のアミノ酸の長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、少なくとも９、１０、１５、２０又は５０個のアミノ酸の長さの配列番号：１６９の連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。例示的な配列番号：１６９の連続する部分には、リーダーペプチド架橋残基１〜７９；ＶＰ４架橋残基８０〜１５０；ＶＰ２架橋残基１５１〜４３４；ＶＰ３架橋残基４３５〜６７３；ＶＰ１架橋６７４〜９３７；２Ａ架橋残基９３８〜９４６；２Ｂ架橋残基９４７〜１０７４；２Ｃ架橋残基１０７５〜１３９６；３Ａ架橋残基１３９７〜１４８６；３Ｂ架橋残基１４８７〜１５０８；３Ｃ架橋残基１５０９〜１７１９；及び３Ｄ架橋残基１７２０〜２１８１のようなＳＶＶタンパク質を含む領域が挙げられるが、これらに限定はされない。 
【００２３】
別の態様において、本発明は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、１６９に、又は少なくとも９、１０、１５若しくは２０個のアミノ酸の長さのこれらの配列のうちのいずれか１つの連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する単離抗体を提供する。単離抗体は、配列番号：２又は１６９の任意のタンパク質エピトープ又は抗原に結合するように生成することができる。更に、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はキメラ抗体であることができる。
【００２４】
一つの態様において、本発明は、配列番号：１又は配列番号：１６８に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する、単離ＳＶＶ又はその誘導体若しくは類縁体を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、全て同定されている特徴及びアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の核酸配列を有する単離ウイルスを提供する。本発明の幾つかのウイルスは、ＰＴＡ−５３４３分離株、ＰＴＡ−５３４３分離株の変種、同族体、類縁体、誘導体及び突然変異体、並びに腫瘍溶解性の原因であると決定されている、ＳＶＶ（野生型と突然変異体の両方）の配列に対して修飾されている他のウイルスの変種、同族体、誘導体及び突然変異体を対象とする。
【００２６】
本発明は、更に、以下の特性を含む単離ＳＶＶを提供する：約７．５又は約７．３キロベース(kb）の一本鎖ＲＮＡゲノム（プラスセンス（＋）鎖）；直径約２７ナノメーター(nm）；約３１kDa、３６kDa及び２７kDaのおおよその分子量を有する少なくとも３個のタンパク質を含むカプシド；およそ１．３４g/mLの塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配の浮遊密度；並びに腫瘍細胞における複製能。この態様において、３１kDaカプシドタンパク質（ＶＰ１）は、配列番号：８に又は配列番号：１６９の残基６７４〜９３７に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含むことができ、３６Daカプシドタンパク質（ＶＰ２）は、配列番号：４に又は配列番号：１６９の残基１５１〜４３４に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含むことができ、２７kDaカプシドタンパク質（ＶＰ３）は、配列番号：に６又は配列番号：１６９の残基４３５〜６７３に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含むことができる。
【００２７】
別の態様において、本発明は、次の特徴：腫瘍細胞における複製能、腫瘍細胞親和性及び正常な細胞における細胞溶解の欠如を含む単離ＳＶＶ誘導体又は類縁体を提供する。ＳＶＶ類縁体には、次のＵＳＤＡ分離株：ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９からのウイルスが挙げられるＳＶＶ様ピコナウイルスが含まれる。ＳＶＶ様ピコナウイルスが、腫瘍細胞における複製能、腫瘍細胞親和性及び非腫瘍細胞における細胞溶解の欠如という特性を天然には有さない場合、ＳＶＶ様ピコナウイルスをこれらの特性を得るように突然変異することができる。そのような突然変異は、ＳＶＶ様ピコナウイルスとＳＶＶとの配列を比較し、アミノ酸配列がＳＶＶと（特定の領域において）同一か又は実質的に同一であるようにＳＶＶ様ピコナウイルスにおいて突然変異を起こすことによって設計することができる。別の態様において、ウイルスは、神経内分泌特性を有する腫瘍細胞型において複製能がある。
【００２８】
他の態様において、本発明は、本発明のウイルスの有効量と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物；本発明のウイルスを含む細胞；本発明のウイルスの抗原を含有するウイルス性溶解産物；並びに本発明のウイルスから得られる単離及び精製ウイルス抗原を提供する。
【００２９】
なお別の態様において、本発明は、細胞をウイルスで感染すること；細胞溶解産物を採取すること；細胞溶解産物を勾配遠心分離に少なくとも一回付すこと；及び勾配からウイルスを単離することを含む、本発明のウイルスの精製方法を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ウイルス又はその誘導体の有効量を癌の治療するために投与することを含む癌の治療方法を提供し、ここでウイルスは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８に、又は配列番号：１若しくは配列番号：１６８の一部に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する。一つの態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、ウイルス又はその誘導体を癌の治療のために投与することを含む方法を提供し、ここでウイルスは、配列番号：１に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性があるゲノム配列を有する。配列番号：１に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性があるゲノム配列を有するウイルスは、例えば、ＳＶＶ突然変異体、ＳＶＶ様ピコルナウイルス又はカルジオウイルスであることができる。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、例えば、次の分離株、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７７５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９のウイルスのうちの１つのウイルスであることができる。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、野生型又は突然変異体であることができる。
【００３１】
別の態様において、本発明は、配列番号：３、５、７に、配列番号：１６９のヌクレオチド９０４〜３４７７に、又は少なくとも７５、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含むカプシドコード領域を含むウイルスの有効量を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明は、また、配列番号：４、６、８に、配列番号：１６９の残基８０〜９３７に、又は少なくとも２５、５０若しくは１００個のアミノ酸の長さのその連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含むカプシドを含むウイルスの有効量を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
【００３２】
一つの態様において、本発明は、癌細胞をウイルス又はその誘導体と接触させることを含む癌の進行を阻害する方法を提供し、ここで、ウイルス又はその誘導体は、癌細胞に特異的に結合し、ウイルスは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は１６８に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、癌細胞をウイルス又はその誘導体と接触させることを含む癌の進行を阻害する方法を提供し、ここで、ウイルス又はその誘導体は、癌細胞に特異的に感染し、ウイルスは、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さの配列番号：１６８の連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、癌細胞を有効量のウイルス又はその誘導体と接触させることを含む癌細胞を死滅させる方法を提供し、ここでウイルスは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は１６８に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、癌細胞を有効量のウイルス又はその誘導体と接触させることを含む癌細胞を死滅させる方法を提供し、ここでウイルスは、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さの配列番号：１６８の連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含むゲノム配列を有する。
【００３６】
これらの癌を対象とする方法において、ウイルスはピコルナウイルスであることができる。ピコルナウイルスは、カルジオウイルス、エルボウイルス、アフトウイルス、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス、テッショウウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコルナウイルスであることができる。カルジオウイルスは、ヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス及び脳心筋炎ウイルスからなる群より選択することができる。ＳＶＶは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するウイルスであることができるか、或いは配列番号：１若しくは配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある核酸配列を含むウイルスであることができる。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある核酸配列を含むウイルスであることができる。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、例えば、次の分離株、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７７５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９のウイルスのうちの１つのウイルスであることができる。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、野生型又は突然変異体であることができる。
【００３７】
本発明は、また、細胞を本発明のウイルスと接触させることを含む、異常増殖する細胞を死滅させる方法を提供する。一つの態様において、異常増殖する細胞は腫瘍細胞である。この方法の多様な態様において、腫瘍細胞は、ヒト小型細胞肺癌、ヒト網膜芽細胞腫、ヒト神経芽細胞腫、ヒト髄芽腫、マウス神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍及びヒト非小型細胞肺癌からなる群より選択される。
【００３８】
本発明は、哺乳動物に有効量の本発明のウイルスを被験者に投与することを含む、被験者における新生物形成状態を治療する方法も提供する。一つの態様において、新生物形成状態は神経内分泌癌である。別の態様において、被験者は哺乳動物である。別の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００３９】
本発明は、ウイルスの複製を可能にする条件下でウイルスに感染された細胞を培養し、細胞又は上澄みからウイルスを回収することを含む、本発明のウイルスを産生する方法も提供する。この方法の一つの態様において、細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。この方法の別の態様において、細胞はＨ４４６細胞である。この方法の多様な態様において、細胞は、細胞１つあたり２００，０００個を越えるウイルス粒子を産生することができる。
【００４０】
別の態様において、本発明は、本発明のウイルスを含有すると推定される試験材料からＲＮＡを単離すること、配列番号：１又は配列番号：１６８の少なくとも１５個の連続するするヌクレオチドに対応するＲＮＡを標識すること、試験材料を標識ＲＮＡでプローブすること、及び標識ＲＮＡと、試験材料から単離されたＲＮＡとの結合を検出することを含み、結合がウイルスの存在を示す、本発明のウイルスの検出方法を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号：１若しくは配列番号：１６８、又はその補体の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに対応するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供する。
【００４１】
本発明は、腫瘍溶解ウイルスを作製する方法であって、（ａ）ＳＶＶゲノム配列を試験ウイルスゲノム配列と比較すること；（ｂ）ＳＶＶゲノム配列によりコードされるポリペプチドと、試験ウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドとの間で少なくとも最初のアミノ酸の差を同定すること；（ｃ）試験ウイルスゲノム配列によりコードされるポリペプチドが、ＳＶＶゲノム配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも１つ少ないアミノ酸の差を有するように、試験ウイルスゲノム配列を突然変異させること；（ｄ）突然変異試験ウイルスゲノム配列を腫瘍細胞に形質移入すること；及び（ｅ）腫瘍細胞が突然変異試験ウイルスゲノム配列により細胞溶解的に感染しているかを判断することを含む方法も提供する。一つの態様において、試験ウイルスで突然変異したアミノ酸は、カプシドコード領域のような構造領域のアミノ酸である。別の態様において、試験ウイルスで突然変異したアミノ酸は、非構造領域のアミノ酸である。
【００４２】
腫瘍溶解ウイルスを作製する方法の一つの態様において、ＳＶＶゲノム配列は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する単離ＳＶＶから得られるか、又は配列番号Ｓ：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８若しくはその連続する部分に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性がある配列を含むウイルスから得られる。一つの態様において、ＳＶＶゲノム配列は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する単離ＳＶＶから得られるか、或いは配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含むウイルスから得られる。本発明の別の態様において、試験ウイルスゲノム配列を突然変異することは、試験ウイルスゲノム配列を有するｃＤＮＡを突然変異することを含む。本発明の別の態様において、突然変異試験ウイルスゲノム配列を形質移入することは、ＲＮＡを形質移入することを含み、ここでＲＮＡは、突然変異試験ウイルスゲノム配列を有するｃＤＮＡから生成される。
【００４３】
腫瘍溶解ウイルスを作製する方法の別の態様において、試験ウイルスはピコルナウイルスである。試験ピコルナウイルスは、テッショウウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、エルボウイルス、アフトウイルス、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス又はテッショウウイルスであることができる。別の態様において、試験ウイルスはカルジオウイルスである。別の態様において、試験ウイルスはＳＶＶ様ピコルナウイルスである。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、例えば、以下の分離株：ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９のうちの１つのウイルスであることができる。別の態様において、腫瘍溶解ウイルスを作製する方法で同定されるアミノ酸の差は、ＳＶＶカプシドタンパク質と試験ウイルスカプシドタンパク質配列との間である。腫瘍溶解ウイルスを作製する別の態様において、試験ウイルスゲノム配列は、ヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス及び脳心筋炎ウイルスからなる群より選択される。別の態様において、試験ウイルスゲノム配列は脳心筋炎ウイルスから選択される。なお別の態様において、脳心筋炎ウイルス、ＳＶＶ様ピコルナウイルス、又は他の任意の試験ウイルスは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶに、又は配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を含む核酸配列を有する分離株から選択することができる。
【００４４】
腫瘍溶解カルジオウイルスを作製する方法の別の態様において、試験ウイルスとＳＶＶとのアミノ酸の差は、ＳＶＶのカプシドタンパク質領域においてであり、アミノ酸の差は、ＳＶＶ  配列番号：４、６、８、配列番号：１６９の残基８０〜９３７、配列番号：１６９の残基８０〜１５０、配列番号：１６９の残基１５１〜４３４、配列番号：１６９の残基４３５〜６７３、又は配列番号：１６９の残基６７４〜９３７の範囲内で整列化される。
【００４５】
本発明は、変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法であって、（ａ）複数個の核酸配列を含むウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すこと；（ｂ）ウイルス突然変異体のライブラリーを、複数の突然変異ウイルスが産生されるように、許容細胞に形質移入すること；（ｃ）複数の突然変異ウイルスを単離すること；（ｄ）非許容細胞を、単離した複数の突然変異ウイルスと共にインキュベートすること；及び（ｅ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収し、それによって変化した親和性を有する突然変異ウイルスを作製することを含む方法も提供する。一つの態様において、この方法は、（ｆ）回収した突然変異ウイルスを非許容細胞でインキュベートすること；及び（ｇ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収することを更に含む。別の態様において、この方法は、（ｆ）及び（ｇ）を繰り返し反復することを更に含む。別の態様において、ウイルス突然変異体のライブラリーは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８又はその連続する部分を含む親配列から作り出される。
【００４６】
変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法の一つの態様において、インキュベーションは、マルチウエルハイスループットプラットフォームで実施され、ここでプラットフォームは、それぞれのウエルに異なる非許容細胞型を含む。この態様において、方法は、プラットフォームをスクリーニングして、どのウエルが細胞を死滅させる突然変異ウイルスを含有するかを同定することを更に含むことができる。別の態様において、スクリーニングは、それぞれのウエルにおける吸光度を分析することによって実施される。
【００４７】
変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法の別の態様において、非許容細胞は腫瘍細胞である。
【００４８】
変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法の別の態様において、ウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことは、（ｉ）ウイルスのゲノム配列の一部に配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供すること；（ｉｉ）ポリヌクレオチドを突然変異して、複数の異なる突然変異ポリヌクレオチド配列を生成すること；及び（ｉｉｉ）複数の突然変異ポリヌクレオチドを、（ｉ）でポリヌクレオチドが含有するウイルスのゲノム配列部分以外のウイルスのゲノム配列を有するベクターと連結し、それによってウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことを含む。一つの態様において、ウイルスのゲノム配列はピコルナウイルスからのものである。別の態様において、ウイルスのゲノム配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８又はその連続する部分に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の同一性がある配列を含む。別の態様において、ウイルスのゲノム配列は、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含む。一つの態様において、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性がある配列を含むウイルスは、ＳＶＶ様ピコナウイルスである。別の態様において、ウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことにおいて、（ｉｉ）の突然変異は、ポリヌクレオチドへのヌクレオチドのランダム挿入により実施される。一つの態様において、ヌクレオチドのランダム挿入は、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）により実施される。別の態様において、ポリヌクレオチドに挿入されるヌクレオチドの少なくとも一部は、エピトープタグをコードする。別の態様において、ウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことにおいて、（ｉｉ）の突然変異は、ポリヌクレオチドのカプシドコード領域で実施される。
【００４９】
本発明は、変化した細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法であって、（ａ）ウイルスの突然変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作り出すことであり、作り出すことが、ウイルスのカプシド領域をコードするポリヌクレオチドを提供すること、ポリヌクレオチドを突然変異させて複数の異なる突然変異カプシドコードポリヌクレオチド配列を生成すること、及び複数の突然変異カプシドコードポリヌクレオチドを、ウイルスの、カプシドコード領域以外のゲノム配列を有するベクターと連結し、それによってウイルスの突然変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを作り出すことを含むこと；（ｂ）複数の突然変異ウイルスが産生されるように、突然変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーを許容細胞に形質移入すること；（ｃ）複数の突然変異ウイルスを単離すること；（ｄ）非許容細胞を単離した複数の突然変異ウイルスと共にインキュベートすること；及び（ｅ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収し、それによって変化した親和性を有する突然変異ウイルスを作製することを含む方法も提供する。一つの態様において、この方法は、（ｆ）回収した突然変異ウイルスを非許容細胞でインキュベートすること；及び（ｇ）非許容細胞で産生された突然変異ウイルスを回収することを更に含む。別の態様において、この方法は、（ｆ）及び（ｇ）を繰り返し反復することを更に含む。別の態様において、突然変異は、カプシドコードポリヌクレオチドへのヌクレオチドのランダム挿入により実施される。別の態様において、カプシドコードポリヌクレオチドに挿入されたヌクレオチドの少なくとも一部は、エピトープタグをコードする。別の態様において、ヌクレオチドのランダム挿入は、ＴＲＩＭにより実施される。別の態様において、複数の異なる突然変異カプシドコードポリヌクレオチド配列は、１０8又は１０9を越える異なるカプシドコードポリヌクレオチド配列を含む。突然変異ポリヌクレオチド配列のライブラリーは、例えば、カルジオウイルス又はＳＶＶ様ピコルナウイルスからのものであることができる。
【００５０】
一つの態様において、変化した細胞型親和性を有する突然変異ＳＶＶを作製する方法は、（ａ）ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーを作り出すこと；（ｂ）ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーからＳＶＶ  ＲＮＡを生成すること；（ｃ）複数の突然変異ＳＶＶが産生されるように、ＳＶＶ  ＲＮＡを許容腫瘍細胞に形質移入すること；（ｄ）複数の突然変異ＳＶＶを単離すること；（ｅ）非許容腫瘍細胞を、複数の単離した突然変異ＳＶＶと共にインキュベートすること；及び（ｆ）非許容腫瘍細胞に細胞溶解的に感染した突然変異ＳＶＶを回収し、それによって変化した親和性を有する突然変異ＳＶＶを作製することを含む。別の態様において、この方法は、（ｇ）回収した突然変異ＳＶＶを非許容細胞でインキュベートすること；及び（ｈ）非許容腫瘍細胞に細胞溶解的に感染した突然変異ＳＶＶを回収することを更に含む。別の態様において、この方法は、（ｇ）及び（ｈ）を繰り返し反復することを更に含む。一つの態様において、インキュベーションは、マルチウエルハイスループットプラットフォームで実施され、プラットフォームは、それぞれのウエルに異なる非許容腫瘍細胞型を含む。別の態様において、この方法は、プラットフォームをスクリーニングして、どのウエルが細胞に細胞溶解的に感染する突然変異ＳＶＶを含有するかを同定することを更に含む。別の態様において、スクリーニングは、それぞれのウエルにおける吸光度を分析することによって実施される。一つの態様において、ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーは、複数の突然変異ＳＶＶカプシドポリヌクレオチド配列を含む。別の態様において、複数の突然変異ＳＶＶカプシドポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチドのランダム挿入によって生成される。別の態様において、ランダム挿入されたヌクレオチドの配列の少なくとも一部は、エピトープタグをコードする。一つの態様において、ヌクレオチドのランダム挿入は、ＴＲＩＭにより実施される。別の態様において、ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶから生成される。別の態様において、ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーは、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％又は６５％の配列同一性を有する配列を含むＳＶＶから生成される。一つの態様において、ＳＶＶ突然変異体のｃＤＮＡライブラリーは、配列番号：１６８に、又は少なくとも５０、１００、２００若しくは５００個のヌクレオチドの長さのその連続する部分に、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含むＳＶＶから生成される。別の態様において、非許容腫瘍細胞は、腫瘍細胞株又は親から単離された腫瘍細胞型である。
【００５１】
本発明は、インビボで腫瘍細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法であって、（ａ）複数の核酸配列を含むウイルス変異体のライブラリーを作り出すこと；（ｂ）複数の突然変異ウイルスが産生するように、ウイルス変異体のライブラリーを許容細胞に形質移入すること；（ｃ）複数の突然変異ウイルスを単離すること；（ｄ）単離した複数の突然変異ウイルスを、腫瘍を有する哺乳動物に投与すること（ここで哺乳動物は、突然変異ウイルスの未変異形態の天然宿主ではない）；及び（ｅ）腫瘍で複製されたウイルスを回収し、それによってインビボで腫瘍細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製することを含む方法も提供する。一つの態様において、ウイルス変異体のライブラリーを作り出すことは、ウイルスのカプシド領域をコードするポリヌクレオチドを提供すること、ポリヌクレオチドを突然変異して、複数の異なる突然変異体カプシドコードポリヌクレオチド配列を生成すること、及び複数の突然変異カプシドコードポリヌクレオチドを、ウイルスの、カプシドコード領域以外のゲノム配列を有するベクターと連結し、それによって、ウイルス突然変異体のライブラリーを作り出すことを含む。別の態様において、（ｅ）で回収されるウイルスは、腫瘍の細胞に細胞溶解的に感染する。インビボで腫瘍細胞型親和性を有する突然変異ウイルスを作製する方法の別の態様において、腫瘍は、異種移植腫瘍、同系腫瘍、同所性腫瘍、又は遺伝子形質転換性腫瘍である。別の態様において、哺乳動物はマウスある。
【００５２】
本発明の全ての方法において、ウイルスはピコルナウイルスであることができる。ピコルナウイルスは、カルジオウイルス、エルボウイルス、アフトウイルス、コブウイルス、ヘパトウイルス、パレコウイルス、テッショウウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、又はＳＶＶが属する属に属するウイルスであることができる。ウイルスはカルジオウイルスであることができる。ウイルスはＳＶＶ様ピコルナウイルスであることができる。ウイルスはＳＶＶであることができる。ＳＶＶは、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するＳＶＶであることができるか、又は配列番号：１、３、６、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８若しくはその連続する部分に少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性がある配列を含むＳＶＶであることができる。更に、カルジオウイルスは、ヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス及び脳心筋炎ウイルスからなる群より選択することができる。一つの態様において、ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９からなる群より選択される分離株から選択される。別の態様において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶに、又は配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、１６８、若しくはその連続する部分に、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％又は６５％の配列同一性を有する分離株から選択されるあらゆるウイルス、そうでなければ配列相同性によりＳＶＶに関連すると考えられるあらゆるウイルスを包含する。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３のＳＶＶに、配列番号：１６８に、又は少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００若しくは２０００個のヌクレオチドの長さの配列番号Ｓ：１若しくは１６８の連続する部分に、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性を有するあらゆるウイルスを包含する。
【００５４】
本発明は、本明細書に開示されている突然変異ウイルスを作製する方法のいずれかによって作製される腫瘍溶解ウイルスも提供する。一つの態様において、本発明は、腫瘍溶解ウイルスにより患者を治療する方法であって、（ａ）本明細書に開示されている突然変異ウイルスを作製する方法のいずれかによって作製される腫瘍溶解ウイルスを、腫瘍溶解ウイルスが非伝染性となり、かつ腫瘍溶解ウイルスの親和性が影響を受けないように不活性化すること；及び（ｂ）照射した腫瘍溶解ウイルスを、腫瘍に罹患している患者に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、患者を治療する方法は、不活性化腫瘍溶解ウイルスに毒素を結合することを更に含む。
【００５５】
別の態様において、本発明は、ＳＶＶにより腫瘍患者を治療する方法であって、（ａ）ウイルスが非伝染性となり、親和性が影響を受けないように、ＳＶＶを不活性化すること；及び（ｂ）不活性化ＳＶＶを腫瘍に罹患している患者に投与することを含む方法を提供する。別の態様において、腫瘍患者をＳＶＶで治療する方法は、不活性化ＳＶＶに毒性を結合することを更に含む。
【００５６】
別の態様において、本発明は、不活性化ＳＶＶ又は弱毒ＳＶＶを含むＳＶＶ組成物を提供する。別の態様において、本発明は、カプシド領域に組み込まれているエピトープタグを含むＳＶＶを提供する。
【００５７】
本発明は、ＳＶＶにより腫瘍患者を治療する方法であって、（ａ）カプシドにおいてコードされているエピトープタグを含む突然変異ＳＶＶを作り出すこと；（ｂ）エピトープタグに毒素を結合すること；及び（ｃ）毒素を結合した突然変異ＳＶＶを、腫瘍を罹患している患者に投与することを含む方法も提供する。一つの態様において、作り出すことは、エピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドを、ＳＶＶのポリヌクレオチドのカプシドコード領域に挿入することを含む。一つの態様において、突然変異ＳＶＶは変化した細胞型親和性を有さない。別の態様において、この方法は、突然変異ＳＶＶが伝染性でないか又は複製できないように、突然変異ＳＶＶを不活性化することを更に含む。
【００５８】
本発明は、（ａ）患者から腫瘍試料を単離すること；（ｂ）腫瘍試料をエピトープ標識ＳＶＶと共にインキュベートすること；及び（ｃ）腫瘍試料を、エピトープタグを検出することによって結合ＳＶＶについてスクリーニングすることを含む、試料から腫瘍細胞を検出する方法も提供する。
【００５９】
一つの態様において、本発明は、（ａ）不活性化エピトープ標識ＳＶＶを患者に投与すること（ここで標識は、エピトープタグに結合している）；及び（ｂ）患者において標識を検出することを含む、インビボで腫瘍細胞を検出する方法を提供する。本発明の腫瘍細胞を検出する方法において、ＳＶＶは、本明細書に開示されている方法により生成される突然変異ＳＶＶであることができる。
【００６０】
一つの態様において、本発明は、（ａ）被験者から細胞試料を単離すること；（ｂ）細胞試料をＳＶＶ（又はＳＶＶ様ピコルナウイルス）と共にインキュベートすること；（ｃ）前記（ｂ）の細胞試料をＳＶＶに特異的な抗体（又はＳＶＶ様ピコルナウイルスに特異的な抗体）と共にインキュベートすること；及び（ｄ）細胞試料を結合抗体についてスクリーニングすることを含み、結合抗体が、試料が腫瘍細胞を含有することを示す、試料から腫瘍細胞を検出する方法を提供する。
【００６１】
一つの態様において、本発明は、被験者がＳＶＶ治療の候補者であるかを判断する方法であって、（ａ）被験者から細胞を単離すること；（ｂ）細胞をＳＶＶと共にインキュベートすること；（ｃ）前記（ｂ）の試料を抗ＳＶＶ抗体と共にインキュベートすること；及び（ｄ）細胞上又は中の抗ＳＶＶ抗体の存在を検出することを含み、陽性検出は被験者がＳＶＶ治療の候補者であることを示す方法を提供する。
【００６２】
結合抗体について細胞試料をスクリーニングすること又は抗ＳＶＶ抗体の存在について検出することは、抗ＳＶＶ抗体の定常部領域又は非エピトープ結合領域に結合できる第２の抗体を添加することによって実施することができ、ここで第２の抗体は、検出可能なマーカーと結合しているか又はそれにより標識されている。検出可能なマーカーは、例えば、フルオレセインのような蛍光体であることができる。第２の抗体が検出可能なマーカーで標識される場合、検出可能なマーカーは、例えば蛍光顕微鏡検査法により検出することができる。被験者からの細胞は、被験者の生検組織からのものであることができる。生検組織は、被験者の腫瘍からのもの、又は腫瘍細胞を含むと推定される被験者の領域からのものであることができる。蛍光体で直接標識されたＳＶＶを、腫瘍細胞の同定に使用することもできる。
【００６３】
更に、新生物形成状態を治療する、新生物形成状態を検出する及びＳＶＶを産生する方法を、本発明の野生型ＳＶＶ、突然変異（修飾されたもの又は変種を含む）ＳＶＶ、ＳＶＶ類縁体、ＳＶＶ様ピコルナウイルス、及び他の腫瘍特異性ウイルスに適用する。
【００６４】
本発明のウイルス及びその組成物を、本明細書で記述されている疾患を治療する薬剤の製造において使用することができる。更に、本発明のウイルス及びその組成物を、本明細書で記述されている疾患の治療のために使用することができるしたがって、本発明の一つの態様において、本発明は、癌の治療における又は癌を治療する薬剤の製造におけるＳＶＶ（又はその突然変異体、誘導体、類縁体及び組成物）の使用を提供する。
【００６５】
遺伝子治療のためのＳＶＶ及びＳＶＶ様ウイルス：目的の複製欠損ＳＶＶ発現遺伝子を、遺伝子を送達して遺伝子障害を修正することに使用できる。ＳＶＶ及びＳＶＶ様ウイルスをｓｉＲＮＡのビヒクルとして使用して、任意の特定の遺伝子発現を防止することもできる。複製欠損ウイルスは、相補細胞株において及び／又はヘルパーウイルスの存在下で増殖して、組み換えウイルスに欠損機能を提供することができる。
【００６６】
ピコルナウイルスのＩＲＥＳは、遺伝子を組織特異的に発現するのに役割を演じることが知られている。ＳＶＶ及びＳＶＶ様ウイルスのＩＲＥＳを使用して、他のピコルナウイルスのＩＲＥＳを取り換えることができる。この戦略を使用して、変化した組織親和性を有するウイルスを生成することができる。一つの態様において、本発明は、２つの遺伝子を単一のプロモーターにより組織特異的に発現する目的で、ＳＶＶのＩＲＥＳ又はＳＶＶ関連ウイルスのＩＲＥＳを提供する。
【００６７】
ＳＶＶの２Ａプロテアーゼの自己開裂性を、単一のプロモーター及び転写終結シグナル配列を用いて、１つ以上の遺伝子を等量で発現するために使用できる。一つの態様において、本発明は、単一のプロモーター及び単一のポリ（Ａ）シグナルの制御下で、２つ以上のタンパク質を等量で発現する目的で、ＳＶＶ又はＳＶＶ関連ウイルスの自己開裂２Ａペプチドを提供する。別の態様において、本発明は、真核細胞でタンパク質を産生するためのポリペプチドの開裂における、ＳＶＶ及びＳＶＶ関連ウイルス３Ｃプロテアーゼの使用を提供する。別の態様において、本発明は、腫瘍細胞又は目的の他の細胞型で細胞タンパク質合成の遮断を引き起こす、ＳＶＶ又はＳＶＶ様ウイルスリーダーペプチドの使用を提供する。
【００６８】
ＳＶＶのウイルス様粒子を、ワクチンとして及び細胞の混合個体群で特定の細胞型を同定するために、生成及び使用することができる。 
【００６９】
（寄託情報）
以下の物質は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、米国、２０１１０−２２０９、バージニア州マサチューセッツ、ユニバーシティ・ブルバード１０８０１に寄託されている。寄託物質の利用性の対する全ての制限は、特許の付与によって変更不能に解除される。物質：セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）。ＡＴＣＣ特許寄託番号：ＰＴＡ−５３４３。寄託日：２００３年７月２５日。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
用語「ウイルス」、「ウイルスの粒子」、「ウイルス粒子」及び「ビリオン」は、互換的に使用される。
【００７１】
用語「ベクター粒子」及び「ウイルスベクター粒子」は、互換的に使用され、例えば、感染粒子の生成のために例えば本発明のウイルスベクターが適切な細胞又は細胞株に形質導入又は形質移入される場合に形成される感染性ウイルス粒子を意味するように、広義に理解されるべきである。
【００７２】
用語「誘導体」、「突然変異体」、「変種」及び「修飾された」は、一般に、誘導体、突然変異体、変種又は修飾ウイルスが、鋳型ウイルス核酸又はアミノ酸配列と異なる核酸又はアミノ酸配列を有することができることを示すように、互換的に使用される。例えば、ＳＶＶ誘導体、突然変異体、変種又は修飾ＳＶＶは、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の野生型ＳＶＶ核酸又はアミノ酸配列と異なる核酸又はアミノ酸配列を有するＳＶＶを意味することができる。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「ＳＶＶ様ピコルナウイルス」は、核酸レベルでＳＶＶと少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有することができ（配列番号：１６８、図８４及びＳＶＶ完全長ゲノム配列についてはＳ図８３を参照すること）、ここで配列比較は、全ゲノム分析に限定されず、５′ＵＴＲ、構造コード領域、非構造コード領域、３′ＵＴＲ及びこれらの部分のようなゲノムの特定の領域に焦点を合わせることができる。ＳＶＶに対する関連性／類似性を判断するのに適切な配列比較のためのゲノムの特定の長さは、当業者に既知であり、適切な長さは、存在する同一性の率によって変わることができる。配列比較のための長さは、例えば、少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００又は２５００個のヌクレオチドであることができる。長さが短い場合、当業者は、例えば配列間の同一性は、２つの配列が関連づけられることを考慮すると高くなりうることを理解する。しかし、そのような指針は、関連する種の間でゲノムの特定の領域が他方よりも保存されている点において、少なくとも配列保存を考慮すると適切である。加えて、ウイルスにより生成される抗血清がＳＶＶ許容細胞株のＳＶＶ感染を中和することができる場合、ウイルスは、ＳＶＶ様ピコルナウイルスであると考慮される。加えて、ウイルスにより生成される抗血清がＳＶＶ許容細胞株のＳＶＶ感染を中和することができる場合、及びこの抗血清が他のウイルスに結合することもできる場合（例えば、抗血清を、ウイルスを検出する間接免疫蛍光アッセイに使用することができる場合）、抗血清により結合されうる他のウイルスは、ＳＶＶ様ピコルナウイルスであると考慮される。本発明の目的において、ＳＶＶ様ピコルナウイルスにはカルジオウイルスを挙げることができる。ＳＶＶ許容細胞又は細胞学の例には、Ｙ７９、ＮＣＩ−Ｈ４４６、Ｎ１Ｅ−１１５、ＮＣＩ−Ｈ１７７０、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＣＩ−Ｈ６９ＡＲ、ＳＫ−ＮＥＰ−１、ＩＭＲ−３２、ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＨＣＣ３３、ＮＣＩ−Ｈ１１８４、Ｄ２８３  Ｍｅｄ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＢＥＫ  ＰＣＢ３Ｅ１、ＳＴ、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＤＭＳ  １５３、ＮＣＩ−Ｈ３７８、ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ、ＢＥＫ、ＰＰＡＳＭＣ、ＰＣＡＳＭＣ、ＰＡｏＳＭＣ、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＯＶＣＡＲ−３、ＮＣＩ−Ｈ２０７、ＥＳＫ−４、ＳＷ−１３、２９３、Ｈｓ  ５７８Ｔ、ＨＳ  １．Ｔｅｓ及びＬＯＸ  ＩＭＶＩが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「癌」、「癌細胞」、「新生細胞」、「新生物」、「腫瘍」及び「腫瘍細胞」は、互換的に使用され、細胞増殖の著しい制御不能によって特徴づけられる異常増殖表現型を示すような、相対的に自律増殖を示す細胞を意味する。新生細胞は、悪性又は良性であることができる。本発明によると、好ましい腫瘍細胞の一つの型は、神経親和性を有するものである。
【００７５】
２つ以上の核酸又はタンパク質配列の文脈における用語「同一性」又は「同一」率は、Protein-Protein BLAST（ジェンバンクデータベースのProtein-Protein BLAST（Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410））のような配列比較アルゴリズムを使用して又は目視検査により測定して最大一致を求めて比較及び整列化したとき、同じであるか又特定の率のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドが同じである２つ以上の配列若しくは部分配列を意味する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)に記載されており、公的に入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information（NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により提供される。
【００７６】
例えば、本明細書で使用されるとき、用語「少なくとも９０％の同一性」は、基準ポリペプチド（又はポリヌクレオチド）に対して９０〜１００の同一率を意味する。９０％以上のレベルの同一性は、例示目的において、１００個のアミノ酸の長さの試験ポリペプチドと基準ポリペプチドが比較されると仮定すると、試験ポリペプチドの１０％以下（すなわち１００個のうちの１０個）のアミノ酸が基準ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。同様の比較を、試験ポリヌクレオチドと基準ポリヌクレオチドの間で行うことができる。そのような差は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布されている点突然変異として表れることができるか、又は最大許容可能までの異なる長さで、例えば１００個のうち１０個のアミノ酸の差（９０％同一性）で１つ以上の位置に集まることができる。差は、核酸若しくはアミノ酸置換、挿入又は欠失として定義される。約８５〜９０％を越える同一性のレベルでは、結果は、プログラム及びギャップパラメーターセットと無関係であるべきであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合にソフトウエアに依存することなく容易に評価することができる。
【００７７】
「高度ストリンジェンシー」、「中度ストリンジェンシー」又は「低度ストリンジェンシー」の概念は、核酸ハイブリダイゼーション条件を意味する。高度ストリンジェンシー条件は、標的とプローブの間に生じるアニーリング又はハイブリダイゼーションのために、標的核酸配列とプローブの核酸配列との間により大きな同一性を必要とする条件を意味する。低度ストリンジェンシー条件は、標的とプローブの間に生じるアニーリング又はハイブリダイゼーションのために、標的核酸配列とプローブの核酸配列との間により低い同一性を必要とする条件を意味する。ストリンジェンシー条件は、緩衝剤の塩濃度により又はハイブリダイゼーションを実施する温度により制御することができ、高塩濃度は、低いストリンジェント条件をもたらし、高温は、よりストリンジェントな条件をもたらす。ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションを受ける配列の長さ及び核酸内容に基づいて変わり、高度、中度及び低度ストリンジェンシーの代表的な条件は、以下の例示的な条件において記載される。慣用的に使用されるハイブリダイゼーション緩衝剤は、０．３Mのクエン酸三ナトリウム及び３MのＮａＣｌに対応する２０×貯蔵溶液濃度を有するＳＳＣ（塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム）である。高度ストリンジェンシー条件では、ＳＳＣの処理濃度は、０．１×〜０．５×（１．５〜７．５mMのクエン酸三ナトリウム、１５〜７５mMのＮａＣｌ）であり、ハイブリダイゼーション温度は６５℃に設定される。中度ストリンジェンシー条件は、典型的には０．５×〜２×ＳＳＣ濃度（７．５〜３０mMのクエン酸三ナトリウム、７５〜３００mMのＮａＣｌ）を５５〜６２℃の温度で利用する。低ストリンジェンシー条件下で実施されるハイブリダイゼーションは、２×〜５×ＳＳＣ濃度（３０〜７５mMのクエン酸三ナトリウム、３００〜７５０mMのＮａＣｌ）を５０〜５５℃の温度で使用することができる。これらの条件は、単に例示であり、限定するものとして考慮されるべきではないことに留意すること。
【００７８】
セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）：
ＳＶＶは新規であり、今まで未発見のＲＮＡウイルスであり、以前に特徴決定されたピコルナウイルスに関して、ＳＶＶはピコルナウイルス科のカルジオウイルス属のメンバーに最も密接に関連する（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１５９４を参照すること）。ＳＶＶと他のカルジオウイルスとの配列分析の結果が、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１５９４において考察されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１５９４に記載されたＳＶＶの配列分析の時点から、ピコルナウイルス研究グループは、ＳＶＶが新たな属のメンバーであるかを考察し始めた。図８９は、ピコルナウイルス科のメンバー間の遺伝子関連ツリーを表す。
【００７９】
ピコルナウイルスを知るための最初の配列比較において（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３１５０４を参照すること）、２つの表現型分類の選択肢が存在し、（１）ＳＶＶをカルジオウイルス属の新たな種として含めること、又は（２）ＳＶＶを新たな属に指定することであった。その時点及び国際出願において、ＳＶＶは、カルジオウイルス属の新規メンバーとして指定されていた。しかし、更なる分析の後、ＳＶＶの幾つかの特徴がカルジオウイルスと異なることが見出された。例えば、幾つかのカルジオウイルスのゲノムは、５′ＵＴＲに配列内延長ポリ（Ｃ）トラクトを含む。ＳＶＶは、ポリ（Ｃ）トラクトを含まない。追加的な５′配列情報において、ＳＶＶの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がマッピングされ、他のピコルナウイルスと比較されて、ＳＶＶ  ＩＲＥＳはＩＶ型であることが決定されたが、カルジオウイルスのＩＲＥＳは、ＩＩ型である。カルジオウイルスは長（１５０アミノ酸（ａａ））２Ａプロテアーゼを有し、一方、ＳＶＶは、短（９ａａ）２Ａプロテアーゼを有する。このタンパク質、並びに他（リーダーペプチド、３Ａ）の大きさは、ＳＶＶとカルジオウイルスとでは有意に異なる。他のピコルナウイルスの研究から、これらのタンパク質は、親和性及び病原性を含む、宿主細胞との相互作用に関わる可能性があることが知られている。最後に、配列の全体を通してゲノム領域の数が過大に異なり、したがってＳＶＶは、新たな属を形成すると考えるべきであると、現在考えられている。加えて、多数の独特なピコルナウイルスがＵＳＤＡによって発見されており、これらは、ＳＶＶが他のカルジオウイルスに対するよりもＳＶＶに似ている。したがって、ピコルナウイルス研究グループによる推奨に基づいて国際ウイルス分類委員会（ＩＣＶＴ）の実行委員会によって、ＳＶＶは、セネカバレーウイルスと呼ばれる、ピコルナウイルスの新たな種を構成することが決定された。しかし、現在、ＳＶＶ及びこれらの独特なＵＳＤＡピコルナウイルスの（本明細書では、ＳＶＶ様ピコルナウイルスの群のメンバーと呼ぶ）は、現在、いずれの属にも指定されていない。
【００８０】
ＵＳＤＡで発見された幾つかのＳＶＶ様ピコルナウイルスは、核酸レベルでＳＶＶと約９５〜９８％の同一性がある（例えば、図８７〜８９を参照すること）。１つのウイルス（ＭＮ８８−３６６９５）に対する抗血清はＳＶＶを中和し、このウイルスは、ＳＶＶを中和できる他の抗血清に対して反応性がある。ＳＶＶ様ピコルナウイルスをブタから単離し、したがって、ブタは、ＳＶＶ及び他のＳＶＶ様ウイルスの許容宿主である可能性がある。ブタから単離されるＳＶＶ様ピコルナウイルスの例には、次のＵＳＤＡ分離株、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９が挙げられるが、これらに限定はされない。ＳＶＶ様ピコルナウイルスには、ＳＶＶに密接に関連するカルジオウイルス（配列分析により又はＳＶＶ抗原に対して発生させた抗体との交差反応により決定）を挙げることもできる。したがって、本発明の目的において、ＳＶＶは、（１）ピコルナウイルス科のカルジオウイルス属（又はそのメンバー）に密接に関連する、及び（２）ピコルナウイルス科の新たな属のメンバーであると考慮することができ、ここで新たな属のメンバーには、他の属にメンバーであると分類されていないＳＶＶ及びＳＶＶ様ピコルナウイルスを含めることができる。
【００８１】
カルジオウイルスと同様に、ＳＶＶは、それらのゲノム構成、共通の病理特性及び０．１MのＮａＣｌ中、５〜７のｐＨでのバイロンの分離性の特別な特性によって他のピコルナウイルスと区別することができる（Scraba, D. et al., “Cardioviruses (Picornaviridae),” in Encyclopedia of Virology, 2nd Edition, R.G. Webseter and A. Granoff, Editors, 1999）。ＳＶＶのゲノムは、３０個のヌクレオチドの長さのポリ（Ａ）テールを含む、７，３１０個のヌクレオチドの大きさを有する１つの一本鎖プラス（＋）センス鎖ＲＮＡ分子から構成される（図８３Ａ〜８３Ｈ、図８４Ａ〜８４Ｄ；配列番号：１６８を参照すること）。ＳＶＶはピコルナウイルスであるので、全てピコルナウイルスに保存されている多数の特徴を有する：（ｉ）ゲノムＲＮＡは感染性であり、したがって、細胞に形質移入して、ウイルス−レセプター結合及びウイルス生活環への進入を回避することができる；（ｉｉ）ゲノムの５′末端（ＳＶＶでは、配列番号：１６８のヌクレオチド１〜６６６）での長（約６００〜１２００bp）非翻訳領域（ＵＴＲ）及び短３′非翻訳領域（約５０〜１００bp；ＳＶＶでは、配列番号：１６８のヌクレオチド７２１０〜７２８０）；（ｉｉｉ）５′ＵＴＲは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）として知られているクローバー葉第二次構造を含有する（例えば、配列番号：１６８のヌクレオチド約３００からヌクレオチド約３６６でありうる）；カルジオウイルスはＩＩ型ＩＲＥＳを有し、ＳＶＶはＩＶ型ＩＲＥＳを有する；（ｉｖ）残りのゲノムは単一のポリタンパク質をコードする（ＳＶＶでは、配列番号：１６８のヌクレオチド６６７〜７２０９がポリタンパク質（配列番号：１６９）をコードする）、並びに（ｖ）ゲノムの両端が修飾され、５′末端は小型の塩基性タンパク質「ｖｐｇ」と共有結合し、３′末端はポリアデニル化されている（ＳＶＶでは、配列番号：１６８のヌクレオチド７２８１〜７３１０）。
【００８２】
本発明は、単離ＳＶＶウイルス（特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３）及びＳＶＶからの完全ゲノム内容を提供する。最初に、配列決定されている最大のＳＶＶゲノムフラグメントは、ＰＴＡ−５３４３分離株由来の単離ＳＶＶ核酸であり、大多数のＳＶＶゲノム配列を含み、図５Ａ〜５Ｅ及び図６Ａ〜６Ｄに提示されており、本明細書で配列番号：１と指定されている。この核酸配列の翻訳は、ＳＶＶの大多数の単一ポリタンパク質が配列番号：１でコードされていることを示す。配列番号：１のヌクレオチド１〜５６７３でコードされているアミノ酸配列が図５Ａ〜Ｅに提示されており、図７Ａ〜７Ｂには、本明細書の配列番号：２が指定されている。完全長ゲノム又は完全長ゲノムと思われるものが得られ、図８３Ａ〜８３Ｈに提示され、配列番号：１６８である。核酸６６７〜７２０９はＳＶＶの完全長ポリタンパク質をコードし、ポリタンパク質のアミノ酸は、図８３Ａ〜８３Ｈに提示され、配列番号：１６９である。
【００８３】
本発明は、配列番号Ｓ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１を含む配列番号：１の単離（又は精製）部分、並びに５′ＵＴＲ領域（１〜６６６）、リーダーペプチドのコード領域（６６７〜９０３）、ＶＰ４タンパク質のコード領域（９０４〜１１１６）、ＶＰ２タンパク質のコード領域（１１１７〜１９６８）、ＶＰ３タンパク質のコード領域（１９６９〜２６８５）、ＶＰ１タンパク質のコード領域（２６８６〜３４７４）、２Ａタンパク質のコード領域（３４７８〜３５０４）、２Ｂタンパク質のコード領域（３５０５〜３８８８）、２Ｃタンパク質のコード領域（３８８９〜４８５４）、３Ａタンパク質のコード領域（４８５５〜５１２４）、３Ｂタンパク質のコード領域（５１２５〜５１９０）、３Ｃタンパク質のコード領域（５１９１〜５８２３）、３Ｄタンパク質のコード領域（５８２４〜７２０９）、及びポリ（Ａ）テールを含む３′ＵＴＲ領域（７２１０〜７３１０）を含む配列番号：１６８の単離部分を提供する。本発明は、上記に提示した特定の部分の一部である単離核酸も提供する。本発明は、そのような単離した部分の突然変異体又は誘導体も提供する。配列番号：１及び１６８の単離部分を、これらの部分でコードされたポリペプチドを単離できるように発現ベクターにサブクローン化することができる。本発明により更に包含されるものは、配列番号：１又は配列番号：１６８と、高度、中度又は低度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできる単離核酸又はその任意の部分である。以下の表は、ＳＶＶタンパク質をコードする配列番号：１６８のヌクレオチドを提示する。本発明は、単離（又は精製）ＳＶＶタンパク質又はその部分を提供する。表は、配列番号：１６９に提示されているポリタンパク質配列に関して、ＳＶＶタンパク質のアミノ酸配列も提示する。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
本発明は、配列番号：１６９の残基１〜７９のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶリーダー配列ペプチドを提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド６６７〜９０３でコードされている。
【００８６】
本発明は、配列番号：１６９の残基８０〜１５０のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ＶＰ４（１Ａ）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド９０４〜１１１６でコードされている。
【００８７】
本発明は、配列番号：１６９の残基１５１〜４３４のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ＶＰ２（１Ｂ）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド１１１７〜１９６８でコードされている。本発明は、図９で提示されている配列番号：４のアミノ酸配列を有する単離部分ＳＶＶ  ＶＰ２（１Ｂ）タンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸２〜１４３に対応する）。部分ＳＶＶ  ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列は、図８で示されている配列番号：３の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド４〜４２９に対応する）。
【００８８】
本発明は、配列番号：１６９の残基４３５〜６７８のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ＶＰ３（１Ｃ）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド１９６９〜２６８５でコードされている。本発明は、図１１で提示されている配列番号：６のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ＶＰ３（１Ｃ）タンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸１４４〜３８２に対応する）。ＳＶＶ  ＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列は、図１０で示されている配列番号：５の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド４３０〜１１４６に対応する）。
【００８９】
本発明は、配列番号：１６９の残基６７４〜９３７のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ＶＰ１（１Ｄ）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド２６８６〜３４７７でコードされている。本発明は、図１３で提示されている配列番号：８のアミノ酸配列を有する単離部分ＳＶＶ  ＶＰ１（１Ｄ）タンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸３８３〜６４１に対応する）。ＳＶＶ  ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列は、図１２で示されている配列番号：７の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド１１４７〜１９２３に対応する）。
【００９０】
本発明は、配列番号：１６９の残基９３８〜９４６のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ａタンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド３４７８〜３５０４でコードされている。本発明は、図１５で提示されている配列番号：１０のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ａタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸６４２〜６５５に対応する）。ＳＶＶ  ２Ａタンパク質のアミノ酸配列は、図１４で示されている配列番号：９の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド１９２４〜１９６５に対応する）。
【００９１】
本発明は、配列番号：１６９の残基９４７〜１０７４のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ｂタンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド３５０５〜３８８８でコードされている。本発明は、図１７で提示されている配列番号：１２のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ｂタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸６５６〜７８３に対応する）。ＳＶＶ  ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図１６で示されている配列番号：１１の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド１９６６〜２３４９に対応する）。
【００９２】
本発明は、配列番号：１６９の残基１０７５〜１３９６のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ｃタンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド３８８９〜４８５４でコードされている。本発明は、図１９で提示されている配列番号：１４のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ２Ｃタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸７８４〜１１０５に対応する）。ＳＶＶ  ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図１８で示されている配列番号：１３の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド２３５０〜３３１５に対応する）。
【００９３】
本発明は、配列番号：１６９の残基１３９７〜１４８６のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ａタンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド４８５５〜５１２４でコードされている。本発明は、図２１で提示されている配列番号：１６のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ａタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸１１０６〜１１９５に対応する）。ＳＶＶ  ３Ａタンパク質のアミノ酸配列は、図２０で示されている配列番号：１５の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド３３１６〜３５８５に対応する）。
【００９４】
本発明は、配列番号：１６９の残基１４８７〜１５０８のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｂ（ＶＰｇ）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド５１２５〜５１９０でコードされている。本発明は、図２３で提示されている配列番号：１８のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｂタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸１１９６〜１２１７に対応する）。ＳＶＶ  ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、図２２で示されている配列番号：１７の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド３５８６〜３６５１に対応する）。
【００９５】
本発明は、配列番号：１６９の残基１５０９〜１７１９のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｃ（「プロ」又は「プロテアーゼ」）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド５１９１〜５８２３でコードされている。本発明は、図２５で提示されている配列番号：２０のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｃタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸１２１８〜１４２８に対応する）。ＳＶＶ  ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列は、図２４で示されている配列番号：１９の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド３６５２〜４２８４に対応する）。
【００９６】
本発明は、配列番号：１６９の残基１７２０〜２１８１のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｄ（「ポル」又は「ポリメラーゼ」）タンパク質を提供し、これは、配列番号：１６８のヌクレオチド５８２４〜７２０９でコードされている。本発明は、図２７で提示されている配列番号：２２のアミノ酸配列を有する単離ＳＶＶ  ３Ｄタンパク質も提供する（これは、配列番号：２のアミノ酸１４２９〜１８９０に対応する）。ＳＶＶ  ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列は、図２４で示されている配列番号：１９の核酸配列でコードされている（これは配列番号：１のヌクレオチド４２８５〜５６７３に対応し、ヌクレオチド５６７１〜５６７３、「ｔｇａ」は、星印「*」でアミノ酸配列リストにおいて示されている終止コドンをコードする）。 
【００９７】
本発明の核酸は、ＲＮＡとＤＮＡの両方の形態を含み、暗黙的に、提供されたリストの相補配列を含む。
【００９８】
したがって、配列番号：１６８により示される単離ＳＶＶ核酸は、７，３１０個のヌクレオチドの長さを有し、配列番号：１６９により示されるアミノ酸配列を有するポリタンパク質をコードする。配列番号：１により示される単離ＳＶＶ核酸は、５，７５２個のヌクレオチドの長さを有し、配列番号：２により示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。ＳＶＶゲノム配列は、単一のポリタンパク質として翻訳され、多様な下流「翻訳産物」に開裂される。本発明は、配列番号：１６８及び配列番号：１の全ての核酸フラグメントを包含し、そのようなフラグメントでコードされる全てのポリペプチドを包含する。
【００９９】
完全長ＳＶＶポリタンパク質アミノ酸配列は、配列番号：１６９により示され、配列番号：１６８のヌクレオチド６６７〜７２０９でコードされる。完全長ＳＶＶポリタンパク質アミノ酸配列の大部分は、配列番号：１のヌクレオチド１〜５６７３でコードされる。ポリタンパク質は、３つの主な前駆体タンパク質、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３に開裂される（図４Ｂを参照すること）。Ｐ１、Ｐ２及びＰ３は、小さい産物に更に開裂される。構造領域Ｐ１（１ＡＢＣＤ又はカプシド領域）の開裂産物は、１ＡＢＣ、ＶＰ０、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ１である。非構造タンパク質Ｐ２（２ＡＢＣ）の開裂産物は、２Ａ、２ＢＣ、２Ｂ及び２Ｃである。非構造領域Ｐ３ポリタンパク質（３ＡＢＣＤ）の開裂産物は、３ＡＢ、３ＣＤ、３Ａ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｃ′及び３Ｄ′である。
【０１００】
特定の実施態様において、本発明は、（ｉ）１ＡＢＣＤ又はカプシド領域のコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド９０４〜３４７７）；（ｉｉ）１ＡＢＣのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド９０４〜２６８５）；（ｉｉｉ）ＶＰ０のコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド９０４〜１９６８）；（ｉｖ）２ＡＢＣのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド３４７８〜４８５４；配列番号：１のヌクレオチド１９２４〜３３１５）；（ｖ）２ＢＣのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド３５０５〜４８５４；配列番号：１のヌクレオチド１９６６〜３３１５）；（ｉｉｉ）３ＡＢＣＤのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド４８５５〜７２０９；配列番号：１のヌクレオチド３３１６〜５６７３）；（ｉｖ）３ＡＢのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド４８５５〜５１９０；配列番号：１のヌクレオチド３３１６〜３６５１）；及び（ｖ）３ＣＤのコード配列（配列番号：１６８のヌクレオチド５１９１〜７２０９；配列番号：１のヌクレオチド３６５２〜５６７３）を含む単離核酸を提供する。本発明は、上記のコード配列でコードされる単離タンパク質又はペプチドも提供し、そのフラグメントも含まれる。
【０１０１】
ピコルナウイルスの基本的なカプシド構造は、高密度で充填された二十面体配置の６０個のプロモーターから構成され、これらはそれぞれ４つのポリペプチド、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４から構成されており、全て元のプロモーターＶＰ０の開裂により誘導されている。ＳＶＶウイルス粒子は、直径が約２７nmであり（図２を参照すること）、直径が約２７〜３０nmである他のピコルナウイルス粒子の大きさと一致している。
【０１０２】
ピコルナウイルス複製のキネティクスは急速であり、サイクルは、約５〜１０時間（典型的には８時間）で完了する（ピコルナウイルス複製サイクルの概略図は図６８を参照すること）。レセプター結合すると、ゲノムＲＮＡが粒子から細胞質内へ放出される。次にゲノムＲＮＡはポリソームにより直接翻訳されるが、感染後、約３０分で細胞タンパク質合成は急激に低下し、ほぼゼロになる。この減少は「遮断」と呼ばれ、細胞変性効果（ｃｐｅ）の主な原因である。遮断は、翻訳が開始される際に全ての真核細胞のｍＲＮＡの５′末端でｍ７Ｇキャップ構造に結合することに関わる、宿主細胞の２２０kDaキャップ結合複合体（ＣＢＣ）の開裂に起因すると思われる。ＣＢＣの開裂は、２Ａプロテアーゼにより引き起こされると思われる。
【０１０３】
５′ＵＴＲはＩＲＥＳを含む。通常、真核細胞翻訳は、リボソームが５′メチル化キャップに結合し、次にｍＲＮＡに沿ってスキャンして最初のＡＵＧ開始コドンを見つけたときに開始される。ＩＲＥＳは、このプロセスを乗り切って、ピコルナウイルスのＲＮＡがＣＢＣの分解後も続けて翻訳されるようにする。一つの実施態様において、本発明は、ＳＶＶ  ＩＲＥＳを含む単離核酸を提供し、ＩＲＥＳは、５′ＵＴＲ内に収容されている。一つの態様において、ＳＶＶ  ＩＲＥＳは、配列番号：１６８のヌクレオチド３００〜３６６からのものでありうる。ＳＶＶの５′ＵＴＲは、配列番号：１６８のヌクレオチド１〜６６６に存在する。
【０１０４】
ウイルスポリタンパク質は、最初に２Ａプロテアーゼにより開裂されて、ポリタンパク質Ｐ１、Ｐ２及びＰ３となる（図４Ｂを参照すること）。次に更なる開裂事象が、主なピコルナウイルスプロテアーゼである３Ｃにより実施される。３Ｃにより作製される開裂産物の一つは、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（３Ｄ）であり、これはゲノムＲＮＡをコピーして、マイナス（−）センス鎖を産生する。（−）センス鎖は、（＋）センス鎖（ゲノム）ＲＮＡ合成のために鋳型を形成する。幾つかの（＋）鎖は翻訳されて追加のウイルスタンパク質を産生し、（＋）鎖の幾つかは、カプシドに詰め込まれて新たなウイルス粒子を形成する。
【０１０５】
ゲノムとカプシドの分子の相互作用は不明であるが、（＋）鎖ＲＮＡゲノムは、予め形成されたカプシドに詰め込まれると考えられる。空のカプシドは、全てのピコルナウイルス感染において一般的である。カプシドは、Ｐ１ポリタンパク質前駆体の、一緒になってゲノムを囲んでいるＶＰ０、ＶＰ３及びＶＰ１からなるプロモーターへの開裂によって構築される。ウイルス粒子の成熟及び感染力は、ＶＰ０のＶＰ２及びＶＰ４への内部自己触媒性開裂に依存する。新たに形成されたウイルス粒子の放出は、細胞が溶解したときに起こる。 
【０１０６】
本発明は、全て同定されている特徴及びＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３の核酸配列を有する単離ウイルスも提供する。本発明のウイルスは、ＰＴＡ−５３４３分離株、ＰＴＡ−５３４３分離株の変種、同族体、誘導体及び突然変異体、並びに腫瘍溶解性の原因であると決定されている、ＳＶＶ（本明細書に開示されている野生型と突然変異体の両方）の配列に対して修飾されている他のピコルナウイルスの変種、同族体、誘導体及び突然変異体を対象とすることができる。
【０１０７】
本発明は、更に、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有する単離ＳＶＶに特異性がある、並びにアミノ酸配列配列番号Ｓ：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び１６９（全ポリタンパク質、ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、及びその部分を含む；これらのタンパク質を構成する配列番号：１６９のアミノ酸は上記の表Ａを参照すること）を有する単離ＳＶＶタンパク質からのエピトープに特異性がある抗体を提供する。本発明は、配列番号：１又は配列番号：１６８のフラグメント又は一部でコードされているタンパク質からのエピトープに対して特異性がある抗体も含む。
【０１０８】
多様なカルジオウイルス分離株からのＲＮＡ配列の比較分析は、ゲノム間で＞４５％のヌクレオチド同一性を示した。カルジオウイルスは、ＥＭＣ様ウイルス（「ＥＭＣＶ」、例えばＭｅｎｇｏ、Ｂ、Ｒ；また、ＭＭ、ＭＥ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ−ＳＫ）、タイラー様ウイルス（「ＴＭＥＶ」、例えばＢｅＡｎ、ＤＡ及びＧＤ  ＶＩＩ株）、並びにヴィリュイスクウイルスに分類することができる。
【０１０９】
ＳＶＶ配列を他のウイルスに対して分析すると、ＳＶＶはカルジオウイルスであるように見える（実施例４及び本明細書で参照される図を参照すること）。ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶを標準的なカルジオウイルスであるとすると、ＳＶＶは明らかに典型的なカルジオウイルスではない。しかし、これら２つのウイルスでも差があり、とりわけ５′ＵＴＲにおいて差がある（Pevear et al., 1987, J. Virol., 61: 1507-1516）。系統学的には、ＳＶＶはそのポルタンパク質の多くがＥＭＣＶ及びＴＭＥＶに集まり（Ｐ１、２Ｃ、３Ｃpro及び３Ｄpol領域；図３１〜３７を参照すること）、ＳＶＶはカルジオウイルスである可能性が最も高いことを示す。
【０１１０】
ＳＶＶは、系統学的にはカルジオウイルスに類似しているが、現在異なるツリーであることが決定されている（図８６を参照すること）。ＳＶＶは異なる属であることができ、それは、（１）ＳＶＶ  ＩＲＥＳはＩＶ型である（カルジオウイルスはＩＩ型である）；（２）多数の特有のウイルス（「ＳＶＶ様ピコルナウイルス」）は、ＳＶＶが他のカルジオウイルスに対するよりもＳＶＶと類似している（実施例１８及び図８７〜８９を参照すること）；並びに許容細胞株のＳＶＶ感染を中和できる抗体又はＳＶＶに対して発生された抗体は、ＳＶＶ様ピコルナウイルスに結合できるからである。したがって、ＳＶＶ様ピコルナウイルスを、癌を治療する方法を含む本発明の方法のいずれかに使用することができ、ここで、ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、天然に腫瘍溶解性であるか、又は（例えば、ＳＶＶ配列に基づいてＳＶＶ様ピコルナウイルスゲノムに突然変異を設計することによって）腫瘍溶解性にすることができる。一つの実施態様において、ＭＮ８８−３６６９６が、癌を治療する本発明の方法に使用される。
【０１１１】
癌の治療方法：
本発明は、ピコルナウイルス（ＳＶＶ様ピコルナウイルスを含む）、その誘導体、変種、突然変異体又は同族体を含むＳＶＶの腫瘍溶解性に関して修飾されたウイルスを使用する、癌治療の方法を提供する。本発明は、野生型ＳＶＶ（すなわち、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３）が、幾つかの種類の腫瘍を選択的に死滅させる能力を有することを示す。例えば、ＳＶＶは、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び神経芽細胞腫を含む、神経親和性又は神経内分泌性を有する腫瘍細胞を選択的に死滅させることができる。本発明のウイルスで治療されることが考慮される神経内分泌腫瘍の他の例には、副腎褐色細胞腫、ガストリノーマ（ゾリンジャー・エリソン症候群を引き起こす）、グルガゴーマ、インスリノーマ、髄様癌（髄様甲状腺癌を含む）、多発性内分泌腫瘍症候群、膵内分泌腫瘍、パラガングリオーマ、ビポーマ（血管作動性腸管ポリペプチド腫瘍）、島細胞腫及びクロム親和性細胞腫が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１１２】
一つの実施態様において、本発明は、被験者にＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコナウイルスを投与することにより神経内分泌腫瘍を治療又は低減する方法を提供し、ここで神経内分泌腫瘍は、ＮＴＲ（ニューロテンシンレセプター）、ＡＴＯＨ（ＧＬ１１、Ｍｙｃ、ＧＲＰレセプター）、ＧＲＰ、ニューロンエノラーゼ（ニューロン特異性エノラーゼ（ＮＳＥ））、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、クロモガニンＡ、ＮＣＡＭ、ＩｇＦ２、ＢＣＬ−２、ソニックヘッジホッグ経路及びケモカインレセプターが挙げられるが、これらに限定はされない１つ以上の神経内分泌腫瘍マーカーを発現（過剰発現）する。
【０１１３】
また本発明に包含されるものは、４種類の神経内分泌肺腫瘍である。最も重篤な種類である、小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、全ての癌のうちで最も急速に増殖し拡散する。大型細胞神経内分泌癌は、希な癌であり、癌を形成する細胞の大きさを除いて、その予後及びどのように患者を治療するかは、ＳＣＬＣと非常に類似している。カルチノイドとしても知られているカルチノイド腫瘍には、他の２種類の肺神経内分泌癌が含まれる。これらの２種類は、定型カルチノイドと非定型カルチノイドである。
【０１１４】
理論に束縛されることなく、腫瘍細胞を特異的に死滅させるＳＶＶの能力には、選択的複製、細胞タンパク質合成遮断、アポトーシス、腫瘍選択的細胞進入による細胞溶解、腫瘍選択的翻訳、腫瘍選択的タンパク質分解、腫瘍選択的ＲＮＡ複製及びこれらの組み合わせを挙げることができるが、これらに限定はされない。
【０１１５】
ＳＶＶは、修飾アデノウイルスを含む他の腫瘍溶解ウイルスに対して多くの有益な特性を有し、例えば、（ｉ）ＳＶＶは、ＳＣＬＣ、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫及び神経芽細胞腫を含む、神経特性を有する癌に非常に高い選択性を有し、例えば、ＳＶＶは、 神経内分泌腫瘍細胞に対して１０，０００倍を超える選択性を示す；（ｉｉ）ＳＶＶは、化学療法よりも１，０００倍良好な細胞死滅特異性を有することが示されている；（ｉｉｉ）ＳＶＶは、１キログラムあたり１０14個の多さのウイルス粒子の全身投与後に、マウスにおいて明らかな毒性を示さない；（ｉｖ）予め確立された大型の腫瘍がマウスにおいて１００％消滅し、腫瘍増殖の再発がない点において、ＳＶＶの効力は非常に強力である；（ｖ）ＳＶＶを精製してより高い力価にすることができ、許容細胞株において１細胞あたり２００，０００個を越える粒子を産生することができる；（ｖｉ）ＳＶＶは、他の腫瘍溶解ウイルスよりも良好に腫瘍に侵入し拡散することができる小さいサイズを有する（ＳＶＶウイルス粒子は直径が３０nm未満である）；（ｖｉｉ）ＳＶＶは急速に複製する（１２時間未満）、及び（ｖｉｉ）特異的な抗腫瘍剤として使用するのに、ＳＶＶを修飾する必要がない。
【０１１６】
更に、初期研究は（実施例６を参照すること）、ＳＶＶを腫瘍溶解ウイルス療法に有益なツールにする幾つかの追加的な要素を示す：（ｉ）ヒト血清試料はＳＶＶに向けられている中和抗体を含有しない；（ｉｉ）ＳＶＶは補体により阻害されない；及び（ｉｉｉ）ＳＶはヒト赤血球の赤血球凝集を生じない。これらの要素は、全て、ＳＶＶが他の腫瘍溶解ウイルスよりもインビボで長い循環時間を示すという事実に寄与している（例えば、実施例７を参照すること）。
【０１１７】
本発明は、細胞個体群で新生細胞を選択的に死滅させる方法であって、ウイルスを細胞個体群中の新生細胞に形質導入し、複製し、新生細胞を死滅できる条件下で、有効量のＳＶＶを前記細胞個体群に接触させることを含む方法を提供する。ＳＶＶが腫瘍細胞をインビボで死滅させる方法の他に、本発明の方法は、腫瘍を、（１）ＳＶＶに感染したときインビトロで培養できる、（２）非腫瘍細胞の存在下で培養できる；及び（３）細胞が（腫瘍及び非腫瘍細胞の両方が）哺乳類のものであり、細胞がヒトの細胞である場合を含む実施態様を包含する。細胞のインビトロ培養及びＳＶＶによる感染は、多様な用途を有することができる。例えば、インビトロ感染は、多量のＳＶＶを産生する方法として、新生細胞が細胞個体群に存在するかを判断又は検出する方法として、又は突然変異ＳＶＶが多様な腫瘍細胞若しくは組織型を特異的に標的し、死滅させることができるかをスクリーニングする方法として使用される。
【０１１８】
本発明は、癌を治療するエキソビボ方法を更に提供し、ここで、細胞はヒト癌患者から単離され、インビトロで培養され、癌細胞を選択的に死滅させるＳＶＶにより感染され、非腫瘍細胞が患者に再び導入される。あるいは、ＳＶＶを患者に投与する方法として、患者から単離された細胞をＳＶＶで感染し、直ぐに患者に再び導入することができる。一つの実施態様において、癌細胞は造血由来のものである。場合によっては、患者は、培養細胞が再び患者に導入される前に、患者の腫瘍細胞をインビボで破壊するために、治療を受ける（例えば、化学療法又は放射線）ことができる。一つの実施態様において、治療を使用して患者の骨髄細胞を破壊することもできる。
【０１１９】
ポリマー被覆ＳＶＶを、ＳＶＶが任意の特定の細胞型を標的にするために使用することができる。この被覆戦略を使用して、ＳＶＶに対する抗体を切り抜けることもできる。
【０１２０】
ＳＶＶは、神経特性を有する腫瘍細胞型に対して強力な抗腫瘍活性を有する。ＳＶＶは、試験した正常なヒトに対して細胞溶解活性を示さない。更に、ＳＶＶは、初代培養ヒト肝細胞に対して細胞毒性がない。下記の表１は、選択した腫瘍細胞型に対するＳＶＶのインビトロ細胞毒性の効力を決定するために実施された初期研究をまとめる。
【０１２１】
【表２】
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【０１２２】
下記の表１−Ａは、ＳＶＶ感染に許容性及び非許容性である細胞株のリストを提供する。表は、ＳＶＶの細胞毒性効力及び選択性を示す。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
表１−Ａは、８種類の異なる種から２２種類の組織を表す、１６５個の初代細胞及び細胞株に対するＳＶＶ許容性実験の結果を提示する。結果は、実質的に全ての成人、成体の正常なものが、ＳＶＶに対して非許的であることを示す。試験した１３個の初代成人ヒト細胞培養は非許容的であった。試験した１２個のウシ、ヒツジ、ブタ及び霊長類の正常な細胞培養のうち、３つの細胞培養しか許容性がなく、これらはブタの平滑筋細胞であった。この結果は、ＳＶＶの天然の宿主がブタであるという仮説と一致している。ブタ平滑筋細胞の他に、神経内分泌癌細胞株のみか、又は大多数の胎児の株は許容性があった。
【０１２５】
マウスの研究（実施例を参照すること）は、ＳＶＶがインビボで大きな効力及び特性をもって腫瘍を特異的に死滅できることを示す。これらのインビボ研究は、ＳＶＶが他の腫瘍溶解ウイルスに対して数多くの利点を有することを示す。例えば、確立された腫瘍を消滅させる腫瘍溶解ウイルスの能力に影響を与える一つの重要な要素は、ウイルス侵入である。アデノウイルスベクターを用いた研究において、Ａｄ５に基づいたベクターは、胸腺欠損マウスにおけるＣＬＣ腫瘍発症に対して効果がなかった。免疫組織化学的な結果に基づいて、アデノウイルスは確立した腫瘍に侵入したとは思われなかった。対照的にＳＶＶは、単回の全身投与の後、胸腺欠損ヌードマウスにおいてＨ４４６  ＳＣＬＣ腫瘍を排除することができた。ＳＶＶは、他のウイルスより良好に腫瘍組織に侵入し拡散することを可能にする小さいサイズ（直径＜３０nm）を有し、したがって、ＳＶＶの小さいサイズは、確立した腫瘍に成功裏に侵入し、それを消滅させる能力に寄与することができる。 
【０１２６】
更なるインビボ試験は、胸腺欠損ヌードマウス及び免疫適格マウスを使用したマウス腫瘍モデルにおいて、ＳＶＶの単回静脈内用量の効力を実証している。試験した腫瘍モデルは、（１）Ｈ４４６（ヒトＳＣＬＣ）；（２）Ｙ７９（ヒト網膜芽細胞腫）；（３）Ｈ６９ＡＲ（ヒト多剤耐性ＳＣＬＣ）；（４）Ｈ１２９９（ヒトＮＳＣＬＣ）；及び（５）Ｎ１Ｅ−１１５（マウス神経芽細胞腫）であった。これらの試験の結果は、図９０Ａ〜Ｅ及び実施例１１に示されている。試験は、全ての動物モデルにおいてＳＶＶの単回静脈内用量の効力を実証し、ヒト異種移植モデルにおいてインビトロＥＤ50とインビボ効力の相対的な位置づけが一致することを示す。Ｎ１Ｅ−１１５免疫適格マウス神経芽細胞腫モデルでの結果は、ＳＶＶが正常な免疫系を有する被験者の腫瘍に対して有効でありうることを示す。
【０１２７】
化学抵抗性は、癌療法の一つの局面として化学療法を受けているあらゆる患者が直面している大きな問題である。化学抵抗性になった患者は、常にではないとしても多くの場合に予後がかなりひどいものになり、代替治療のない状態に置かれる可能性がある。化学抵抗性の主な原因の一つは、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）と呼ばれるタンパク質のファミリーの発現、過剰発現又は活性の増加であることがよく知られている。出願者たちは、特定の腫瘍細胞のＳＶＶに対する感受性も、癌細胞の化学抵抗性及びＭＲＰ発現と相関していることを見出した。Ｈ６９は、ＳＶＶにインビトロで抵抗性がある化学感受性（アドリアマイシン）細胞株であり、一方、Ｈ６９ＡＲは、ＭＲＰを過剰発現する化学耐性細胞株であり、ＳＶＶに感受性がある（表１を参照すること）。証拠は、ＭＤＲを含むＭＲＰの過剰発現がＳＶＶ死滅に対する細胞の感受性と相関することを示す。したがって、一つの実施態様において、本発明は、ＭＲＰを過剰発現する細胞をＳＶＶが死滅させる、癌治療の方法を提供する。
【０１２８】
本発明は、異常増殖細胞のような異常な細胞によりもたらされる疾患を治療する方法も提供する。この方法は、前記の異常細胞を、異常細胞の一部又は全ての破壊をもたらす方法でＳＶＶと接触させることを含む。ＳＶＶを使用して、異常細胞によりもたらされる多様な疾患を治療することができる。これらの疾患の例には、腫瘍細胞が神経内分泌特性及び神経線維腫症を示す癌が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１２９】
神経内分泌腫瘍は、多様な方法で同定することができる。例えば、神経内分泌腫瘍は多数のペプチドホルモン及びアミンを産生及び分泌する。これらの物質のうちの幾つかは、特定の臨床症状：カルチノイド、ゾリンジャー・エリソン症候群、高血糖症、グルカゴノーマ及びＷＤＨＡ症候群を引き起こす。これらの症候群の特定のマーカーは、尿５−ＨＩＡＡ、血清又は血漿ガストリン、インスリン、グルガゴン及び血管活性腸ポリペプチドそれぞれのベース及び／又は刺激レベルである。幾つかのカルチノイド腫瘍及び内分泌性膵腫瘍の三分の一は、臨床症状を何も表さず、非機能性腫瘍と呼ばれる。したがって、クロモグラニンＡ、膵ポリペプチド、血清神経特異エノラーゼ及び糖タンパク質ホルモンのサブユニットのような一般的な腫瘍マーカーが、明確な臨床ホルモン関連症状のない患者でのスクリーニングのために使用されている。これらの一般的な腫瘍マーカーのうち、クロモグラニンＡは、その正確な機能は未だに確立されていないが、多様な神経内分泌腫瘍に非常に感受性があり特異的である血清マーカーであることを示している。これは、既知のホルモンを分泌しない神経内分泌由来のあまり分化していない腫瘍の多くの種類において高値を示すこともできるからである。現在のところ、クロモグラニンＡは、診断及び治療評価の両方で利用可能な最適な一般的神経内分泌血清又は血漿マーカーであると考慮され、多様な神経内分泌腫瘍の患者で５０〜１００％増加される。クロモグラニンＡ血清又は血漿マーカーのレベルは腫瘍量を反映し、中腸カルチノイドの患者の予後のための独立したマーカーであることができる。
【０１３０】
本発明は、ＳＶＶ及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。薬学的に許容される担体の中に有効量のＳＶＶを含むことができるそのような組成物は、投与単位形態、滅菌非経口液剤若しくは懸濁剤、滅菌非−非経口液剤又は経口液剤若しくは懸濁剤、水中油若しくは油中水乳剤などで個人に局所又は全身投与するのに適している。非経口及び非−非経口薬剤送達用の製剤は当該技術で知られている。組成物は、ＳＶＶの凍結乾燥及び／又は再構成形態も含む。許容される医薬担体は、例えば、生理食塩水、硫酸プロタミン（Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ）、水、水性緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤及びトリス緩衝剤、又はポリブレン（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、及びリン酸緩衝生理食塩水、並びにスクロースである。適切な医薬担体の選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には明白であると思われる。これらの溶液は滅菌であり、一般にＳＶＶ以外の粒状物質を含まない。組成物は、生理学的条件に近づける必要がある場合には、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などのような薬学的に許容される補助物質を含んでもよく、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどである。ＳＶＶによる細胞の感染を増強する賦形剤を含めることができる。
【０１３１】
ＳＶＶは、腫瘍細胞内でのウイルスの複製を介して腫瘍細胞の増殖を阻害、防止又は破壊するのに有効な量で、宿主又は被験者に投与される。癌治療にＳＶＶを利用する方法には、腫瘍細胞の治療上有用な破壊を誘発する安全で展開性のある耐性用量でウイルスを、全身に、領域的に、又は局所的に送達することが含まれる。全身投与の後でも、ＳＶＶの治療指数は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１０００である。一般に、ＳＶＶは、１×１０8〜１×１０14vp/kgの量で投与される。投与される正確な用量は、患者の年齢、体重及び性別、並びに治療される腫瘍の大きさ及び重篤度を含む多様な要因により左右される。ウイルスを１回以上投与することができ、これは、宿主の免疫反応の可能性によって左右されうる。組成物の単回又は多回投与は、治療する医師により選択された用量レベル及びパターンで実施することができる。必要であれば、ウイルスに対する免疫反応を低減することによって反復投与及び／又は複製の増強が可能になるように、多様の免疫抑制剤を用いて免疫反応を減少させることができる。本発明の抗新生物性ウイルス療法を他の抗新生物性プロトコールと組み合わせることができる。送達は、リポソーム、直接注射、カテーテル、局所適用、吸入などを用いる多様な方法で達成することができる。ＳＶＶゲノムＲＮＡのＤＮＡコピー又はその一部も送達の方法であることができ、ＤＮＡは細胞により実質的に転写されて、ＳＶＶウイルス粒子又は粒状ＳＶＶポリペプチドを産生する。
【０１３２】
治療有効用量は、症状の減退又は患者の生存延長をもたらすウイルスの量を意味する。ウイルスの毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物での標準手順により、例えばＬＤ50（動物又は細胞の個体群の５０％が致死の用量；ウイルスでは、用量はvp/kgの単位）及びＥＤ50（動物又は細胞の個体群の５０％に治療上有効な用量−vp/kg）又はＥＣ50（動物又は細胞の個体群の５０％に有効な濃度−vp/細胞（例えば表１を参照すること））を決定することにより決定できる。毒性と治療効果の用量比率は、治療指数であり、ＬＤ50とＥＤ50又はＥＣ50の比率として表すことができる。高い治療指数を示すウイルスが好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得たデータを、ヒトに用いる投与量範囲を処方するのに使用できる。ウイルスの投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか又はまったくないＥＤ50又はＥＣ50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与形態及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。
【０１３３】
なお別の態様において、新生物形成状態を有する宿主生物体を治療する方法が提供され、前記宿主生物体に本発明のウイルス組成物の治療有効量を投与することを含む。一つの態様において、新生組織は異常に増殖しており、新生組織は悪性腫瘍組織であることができる。好ましくは、ウイルスは、腫瘍組織内で選択的に複製するその能力によって組織又は腫瘍体積の全体にわたって分布する。本発明の方法によって潜在的に治療されやすい新生物形成状態には、神経親和性のものが含まれる。
【０１３４】
本発明のウイルスを産生する方法：
本発明のウイルスを非常に高い力価及び収率で産生する方法は、本発明の更なる態様である。記載されているように、ＳＶＶを精製してより高い力価にすることができ、許容細胞株において１細胞あたり２００，０００個を越える粒子を産生することができる。多量のウイルスを産生できる細胞には、ＰＥＲ．Ｃ６（Fallaux et al., Human Gene Therapy, 9:1909-1917, 1998）、Ｈ４４６（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７１）及びＥＣ50値が１０未満である表１に提示されている他の細胞株が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１３５】
例えば、ピコルナウイルスの培養は、以下のように実施することができる。目的のウイルスをプラーク精製し、十分に単離されたプラークを取り出して、ＰＥＲ．Ｃ６のような許容細胞株で増幅する。感染細胞からの粗ウイルス溶解産物（ＣＶＬ）は、多サイクルの凍結融解により作製することができ、多数の許容細胞を感染するのに使用できる。許容細胞を、多様な組織培養フラスコにおいて、例えば、１０％ウシ胎児血清（Biowhitaker, Walkersvile, MD）及び１０mM塩化マグネシウム（Sigma, St Louis, MO）を含有するダルベッコー修飾イーグル培地（DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA)のような多様な培地を使用する５０×１５０cm2フラスコで増殖することができる。感染細胞を、感染の１２〜４８時間後又は完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られたときに採取することができ、４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により回収する。細胞ペレットを細胞培養上澄みに再懸濁し、多サイクルの凍結融解に付す。得られたＣＶＬを、４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により清澄化する。ウイルスを勾配遠心分離により精製することができる。例えば、２回のＣｓＣｌ勾配がＳＶＶの精製には十分でありうる：１工程勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４g/ml及び１．４g/ml）、続く１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３g/ml）。精製されたウイルス濃度は、分光光度的に決定され、１Ａ２６０＝９．５×１０12粒子であると推定される（Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999. Cardioviruses (Picornaviridae). In:Encyclopedia of Virology, Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds）。精製ウイルスの感染力価も、ＰＥＲ．Ｃ６又は他の任意の適切な細胞型を使用した標準プラーク及び／又は組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ50）アッセイにより決定される。ＰＥＲ．Ｃ６細胞からのＳＶＶの収率は、細胞１個あたり２００，０００個を越える粒子であり、粒子とＰＦＵの比率は約１００である。他の許容細胞（Ｈ４４６−ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７１）からのＳＶＶの収率は、少なくともこの高さであるか又はこれよりも高い。ＳＶＶをカラムクロマトグラフィーにより精製することもできる。
【０１３６】
加えて、商業的に魅力的な大規模な適性製造方法（Good Manufacturing Processes）（ＧＭＰ）の幾つかの工程をＳＶＶの精製に適用できる。本発明は、また、アデノウイルスを精製する方法に基づいて、ＳＶＶを精製する方法を考慮する。これらの方法には、ＳＶＶはアデノウイルスと非常に類似した密度を有し、アデノウイルスと共に精製できるので、その密度に基づいてＳＶＶを単離することが含まれる。  
【０１３７】
腫瘍の検出及び研究方法：
本発明は、本発明のウイルスを使用して、患者において腫瘍又は新生細胞を検出する方法を提供する。細胞試料を患者から得て、試料をエピトープ標識ＳＶＶ（又は本発明により提供される他の腫瘍特異性ウイルス、すなわち腫瘍特異性突然変異カルジオウイルス）と共にインキュベートし、次にエピトープタグを検出して試料をＳＶＶ結合についてスクリーニングすることによって、スクリーニングすることができる。あるいは、試料を、ＳＶＶがあらゆる細胞溶解を引き起こすかを検出することによってスクリーニングできる。ＳＶＶが細胞溶解を引き起こす場合、又はＳＶＶが試料中の細胞に特異的に結合する場合、このことは、試料が、ＳＶＶに結合及び／又は感染されうることが知られている新生又は腫瘍細胞を含有する可能性を示す。
【０１３８】
加えて、ＳＶＶを、インビボで腫瘍細胞を検出する方法に使用することができる。そのような方法において、ＳＶＶが腫瘍細胞に依然として特異的に結合しているが複製できないような方法で、エピトープ標識ＳＶＶを最初に不活性化することができる。ＳＶＶと結合している腫瘍細胞は、エピトープタグを評価することによって検出できる。エピトープタグの検出はエピトープに特異的に結合する抗体により達成することができ、抗体は標識されているか（例えば、蛍光的に）又は抗体は標識した第２抗体によって検出することができる。
【０１３９】
本発明の検出方法は、本発明の任意のウイルスによって特異的に標的にされるあらゆる種類の腫瘍又は新生細胞を検出することを包含する。特定の腫瘍型には、例えば、網膜芽細胞腫、ＳＣＬＣ、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫及び髄芽腫のような神経内分泌腫瘍が挙げられる。
【０１４０】
本発明は、腫瘍細胞を研究するツールとしてのＳＶＶの使用も提供する。ＳＶＶは、幾つかの腫瘍細胞型を選択的に破壊し、非腫瘍細胞に対して、あるとしても非常に僅かな毒性効果を有する。これらの特性のため、ＳＶＶを使用して、腫瘍を研究し、可能であれば新たな腫瘍特異性遺伝子及び／又は経路を発見することができる。換言すると、腫瘍細胞にはＳＶＶの複製を可能にする幾つかの特性があり、正常な細胞は前記特性を示さない。新たな腫瘍特異性遺伝子及び／又は経路を同定すると、治療用抗体又は小型分子を、これらの試薬が抗腫瘍剤であるかを決定するために設計又はスクリーニングすることができる。
【０１４１】
本発明は、ＳＶＶに反応する全ての種類の癌を同定する方法も提供する。一つの実施態様において、ＳＶＶ反応性細胞を同定する方法は、細胞を得ること、前記細胞をＳＶＶと接触させること、及び細胞死滅を検出する又は細胞複製を検出することを含む。細胞死滅は、当業者に既知の多様な方法を使用して検出することができる（例えば、ＭＴＳアッセイ、本明細書のハイスループットの章を参照すること）。ウイルス複製を検出する方法も当業者に既知である（例えば、ＣＰＥの観察、プラークアッセイ、ＤＮＡ定量化法、腫瘍細胞中のウイルスの量を検出するＦＡＣＳ、ウイルスＲＮＡを検出するＲＴ−ＰＣＲアッセイなど）一つの実施態様において、細胞は癌細胞である。癌細胞の例には、哺乳動物から得られる確立された細胞株及び腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。一つの実施態様において、哺乳動物はヒトである。更なる実施態様において、細胞は、ヒト癌患者から得られる癌細胞である。
【０１４２】
ＳＶＶ反応性癌細胞を同定する方法を使用して、ＳＶＶ複製に許容性がある腫瘍細胞株又は腫瘍組織を発見することができる。また、許容腫瘍細胞の特性を決定することによって、細胞がＳＶＶにより選択的に死滅させられる、腫瘍細胞の特性を同定することができる。これらの特性の発見は、癌薬剤に新たな標的をもたらすことのができる。また、ＳＶＶ反応性癌細胞を同定する方法を、ＳＶＶによる治療で利益を受けるヒト癌患者のためのスクリーニングとして使用することができる。
【０１４３】
例えば、ＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコルナウイルス（ポリクローナル、モノクローナルなど）に対する抗体を、ウイルス結合アッセイに使用して、ＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコルナウイルス治療の前に患者をプレスクリーニングすることができる。プレスクリーニングは一般に下記のように実施することができる：（１）患者から細胞を単離する（細胞は例えば腫瘍生検からのものであることができる）、（２）細胞を抗ＳＶＶ又は抗ＳＶＶ様ピコルナウイルス抗体で染色する、（３）抗ＳＶＶ又は抗ＳＶＶ様ピコルナウイルス抗体に特異的なマーカー（例えば、フルオレセイン又は他の検出可能な染料若しくは蛍光体）と結合している第２抗体を加える（例えば、抗体がウサギで発生される場合、第２抗体はウサギ免疫グロブリンに特異的である）、及び（４）マーカーの検出を実施する−例えば、マーカーがフルオレセインの場合は蛍光顕微鏡検査法を実施することができる。（抗ＳＶＶ又は抗ＳＶＶ様ピコルナウイルス抗体が直接結合している場合、すなわち抗体がモノクローナルである場合、工程３は任意である。抗体がポリクローナルである場合、間接免疫蛍光法−第２抗体の使用−が提案される。）患者の腫瘍細胞がＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコルナウイルス感染に許容性がある場合、患者はＳＶＶ又はＳＶＶ様ピコルナウイルス治療の候補者である。多様な結合アッセイにおいて、細胞が抗体染色に陽性である場合、患者の腫瘍細胞はＳＶＶに許容性があると決定することができる。例えば、図９２Ｂ〜９２Ｃは、ＳＶＶに許容性のであり、ＳＶＶに感染している細胞の免疫蛍光画像を示す。
【０１４４】
ウイルス結合アッセイにより患者をプレスクリーニングするに際し、患者からの細胞試料は、腫瘍細胞を含有すると推定される組織の組織片であることもできる。次に組織片を切片に調製し、抗ＳＶＶ又は抗ＳＶＶ様ピコルナウイルス抗体による組織化学の前に、ＳＶＶと共にインキュベートする。
【０１４５】
本発明は、ＳＶＶを検出する方法も提供する。一つの実施態様において、検出アッセイは、ＳＶＶポリペプチドエピトープに特異的な抗体に基づいている。別の実施態様において、検出アッセイは、核酸のハイブリダイゼーションに基づいている。一つの実施態様において、ＲＮＡは、ＳＶＶから単離され、標識されて（例えば、放射性、化学発光、蛍光など）プローブとなる。次にＲＮＡは試験材料から単離され、ニトロセルロース（又は同様の若しくは機能的に同等な物質）に結合され、標識ＳＶＶ  ＲＮＡによりプローブされ、結合プローブの量が検出される。また、ウイルスのＲＮＡを、直接的又は間接的に配列決定することができ、ＰＣＲアッセイをこの配列に基づいて開発することができる。一つの実施態様において、ＰＣＲアッセイはリアルタイムＰＣＲアッセイである。
【０１４６】
変化した親和性を有するウイルスの製造方法：
本発明は、ＳＶＶ突然変異体（又は変種若しくは誘導体）を構築する方法を提供し、これらの突然変異体は変化した細胞型親和性を有する。ＳＶＶ様ピコルナウイルスを突然変異させて、特定の細胞型親和性をもたらすこともできる。特に、ＳＶＶ及びＳＶＶ様ピコルナウイルス突然変異体は、野生型ＳＶＶ又は野生型ＳＶＶ様ピコルナウイルス結合に抵抗性であることが知られている腫瘍又は新生細胞に、特異的に結合する及び／又はそれらを死滅させる能力によって選択される。
【０１４７】
未変性又は野生型ＳＶＶは、他の癌の徴候を標的とする未変性ウイルスの修飾を可能にする簡素なゲノム及び構造を有する。これらの新たな誘導体は、非神経癌に対して拡大した親和性を有し、未変性ＳＶＶで見られる高い治療指数を依然として維持する。ターゲッティンの一つの可能な方法は、組織特異性ペプチド又はリガンドをウイルスに含めることである。 
【０１４８】
癌標的ウイルス候補を選択するために、本発明は、未変性ＳＶＶのカプシド領域のランダムペプチド配列をコードする遺伝子挿入を有する腫瘍溶解ウイルスライブラリーを構築し、スクリーニングする方法を提供する。１０8の多様性を有するランダムペプチドライブラリーは、ウイルスを腫瘍細胞に特異的に向かわせるペプチドを生じるのに十分であると思われ、生じるべきである。
【０１４９】
腫瘍細胞は正常な細胞と異なる特性を示すことを種々の研究が示しており、例えば：（１）腫瘍細胞は、より透過性のある細胞膜を有する；（２）腫瘍は、細胞型に特異的なレセプターを発現することが以前から示されている血管形成内皮細胞のような特定の間質細胞型を有する；及び（３）腫瘍細胞は、特定のレセプター、抗原及び細胞外マトリックスタンパク質を差次的に発現する（Arap, W. et al., Nat. Med., 2002, 8(2): 121-127; Kolonin, M. et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2001, 5(3): 308-313; St. Croix, B. et al., Science, 2000, 289(5482): 1997-1202）。これらの研究は、腫瘍及び正常組織が分子レベルで区別され、標的薬剤送達及び癌の治療が実現可能であることを実証した。特に、マウスモデルで血管にホーミングすることにより選択される幾つかのペプチドが、細胞毒性薬剤（Arap, W. et al., Science, 1998, 279(5349): 377-380）、アポトーシス促進性ペプチド（Ellerby, H.M. et al., Nat. Med., 1999, 17(8): 768-774）、メタロプロテアーゼインヒビター（Koivunen, E. et al., Nat. Biotechnol, 1999, 17(8): 768-774）、サイトカイン（Curnis, F. et al., Nat. Biotechnol., 2000, 18(11): 1185-1190）、蛍光体（Hong. F.D. and Clayman, G.L., Cancer Res., 2000, 60(23): 6551-6556）及び遺伝子（Trepel, M. et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11(14): 1971-1981）の標的送達に使用されてきた。腫瘍標的ペプチドは、親薬剤の抗力を増大し、毒性を低下することを実証した。
【０１５０】
ＳＶＶ誘導体のライブラリーは、ランダムペプチド配列をウイルスのカプシド領域に挿入することにより生成することができる。図５７で示されているように、ＳＶＶカプシド領域を含むベクター、すなわち「ｐＳＶＶカプシド」が最初に生成される。次に、例えば、ＤＮＡをランダムな位置で切断する制限酵素、すなわちＣｖｉＪＩ（ブラントカッター）でベクターを切断することによって、このカプシドベクターに突然変異を誘発することができる。ベクターは多数の位置で切断され、ＣｖｉＪＩで１回しか切断されなかったＤＮＡを、ゲル精製で単離することができる（図５７を参照すること）。この単離されたＤＮＡの個体群は、異なる場所でカプシド領域が切断されている複数の種を含む。次にこの個体群を、一定の割合のオリゴヌクレオチドが多数の異なる位置でベクターのカプシド領域に連結するように、オリゴヌクレオチド及びリガーゼと共にインキュベートする。この方法で、突然変異ＳＶＶカプシドのライブラリーを生成することができる。
【０１５１】
カプシドコード領域に挿入されるオリゴヌクレオチドは、ランダムオリゴヌクレオチド、非ランダムオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドの配列が予め決定されている）又は半ランダム（すなわち、リゴヌクレオチドの一部が予め決定されており、一部がランダム配列を有する）のいずれかであることができる。考慮されるオリゴヌクレオチドの非ランダム態様は、エピトープコード領域を含むことができる。考慮されるエピトープには、ｃ−ｍｙｃ−ヒトプロトオンコジーンｍｙｃの１０アミノ酸セグメント（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：３５））；ＨＡ−ヒトインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質からの赤血球凝集素（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：３６））；及びＨｉｓ6（配列番号：１１６）−６個の連続するヒスチジンをコードする配列が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５２】
次に突然変異カプシドポリヌクレオチドのライブラリー（例えば、図５７の「ｐＳＶＶカプシドライブラリー」）を、突然変異カプシドコード領域が切断されるように制限酵素で消化する。次にこの突然変異カプシドコード領域を、完全長ゲノム配列からカプシドコード領域を引いたものを含むベクターと連結する（例えば、図５８を参照すること）。この連列は、完全長ゲノム配列を有するベクターを生成し、ベクターの個体群（又はライブラリー）は、複数の突然変異カプシドを含む。図５８において、異なるカプシドを含むこのＳＶＶ突然変異体ライブラリーは、「ｐＳＶＶＦＬカプシド」と示されている。次にｐＳＶＶＦＬカプシドベクターライブラリーを直線化し、インビトロ転写して、突然変異ＳＶＶ  ＲＮＡを生成する（図５９を参照すること）。次に突然変異ＳＶＶ  ＲＮＡを許容細胞に形質移入し、これによりカプシドにデハビリテーション突然変異体を有さないこれらのＳＶＶ配列は、宿主細胞により翻訳されて複数の突然変異ＳＶＶ粒子を産生する。図５９には、複数の突然変異ＳＶＶ粒子が「ＳＶＶカプシドライブラリー」として示されている。
【０１５３】
カプシドコード領域に挿入されているオリゴヌクレオチドでコードされているペプチドは、特定のウイルス感染の標的部分として役立つことができる。特定の癌型を標的にするウイルスは、ペプチドに対してレセプターを有する癌細胞のみに選択的に感染し、それらの細胞で複製し、それらの細胞を死滅させ、同じ型の細胞にしか拡散しない。この方法論は、新規腫瘍標的ペプチド及びリガンド、腫瘍選択的レセプター、治療ＳＶＶ誘導体、並びにピコルナウイルス誘導体を含む他の誘導体の同定を可能にする。
【０１５４】
ＳＶＶ突然変異体ライブラリーのインビトロ及びインビボスクリーニングは、ペプチドビーズライブラリー及びファージライブラリーのような他の技術に対して幾つか利点を有する。これらの他の技術と異なり、望ましい候補、すなわち癌細胞に選択的に結合するＳＶＶ誘導体は、その場で複製する。この複製を基盤とするライブラリーの手法は、新たな細胞結合部分を発見する従来の方法、例えばファージディスプレーに対して多数の利点を有する。第一に、ＳＶＶライブラリーのスクリーニングは、複製に基づいている。望ましいウイルス誘導体だけが、標的組織において、この場合は、特定の癌細胞において複製することができる。スクリーニング／選択プロセスは、非常に特異的なウイルス候補を生じ、それは、ペプチド部分を標的にし、またそれ自体癌治療性でもありうる。その反対に、ファージディスプレースクリーニングは、結合事象だけをもたらし、標的ペプチド候補しか生じない。したがって、ＳＶＶライブラリーのスクリーニングは、より速く選択的な手法を提供する。第二に、インビトロ又はインビボファージディスプレースクリーニングにおいて、標的細胞から回収されるファージは、バクテリアで増幅しなければならず、一方、ＳＶＶ誘導体は、感染細胞から（又は溶解的に感染した細胞の培養上澄みから）直接回収し、精製することができる。第三に、ＳＶＶは、より容易な操作を可能にする小型のゲノムを有し、したがってゲノム情報をカプシド領域にランダムに挿入して、最適化された挿入を確実にすることが可能である。したがって、ＳＶＶライブラリーの構築及びスクリーニングは、極めて有効なウイルス誘導体を産生する高い可能性を有する。これらの誘導体は、非神経性を有する癌に特異的に感染するために設計及びスクリーニングされる。  
【０１５５】
オリゴヌクレオチドの、カプシドコード領域への挿入は、幾つかの欠損突然変異体の生成をもたらす。突然変異体は、オリゴヌクレオチド配列の挿入が終止コドンをもたらし、これによりウイルスポリタンパク質が産生されないという意味において欠損がありうる。また、突然変異体は、オリゴヌクレオチド配列の挿入がカプシド構造に変化もたらし、これによりカプシドがもはや構築できないという意味において欠損がありうる。オリゴヌクレオチド配列の挿入が終止コドン又は支持できないカプシド構造をもたらしうる可能性を減少するため、ＴＲＩＭのような方法を使用して、終止コドン又は特定のアミノ酸をコードしないようにランダムオリゴヌクレオチドを設計することができる。  
【０１５６】
カプシド領域にオリゴヌクレオチドの最適挿入点があるかを決定するため、ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーを生成することができる（実施例１６を参照すること）。ＳＶＶカプシドをコードするポリヌクレオチドを、例えばＣｖｉＪＩでランダムに切断する。次にランダムに直線化したカプシドポリヌクレオチドを、少なくともＲＧＤアミノ酸配列（アルギニン−グリシン−アスパルギン酸）をコードするオリゴヌクレオチドと連結する。次にこれらのＲＧＤカプシド配列を、カプシド配列を欠いているＳＶＶ完全長配列ベクターと連結する。ＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体ウイルスを産生し、特定のインテグリン発現細胞株で感染及び複製するそれらの能力について試験する（ＲＧＤペプチドは、実体をインテグリンレセプターに向けさせることが示されている）。次にインテグリン発現細胞株に成功裏に感染しているＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体を、ＲＧＤオリゴヌクレオチドの挿入が優性である部位があるかを決定するために分析する。次にこの部位を、ランダム、非ランダム又は半ランダムオリゴヌクレオチドの部位特異的挿入のために使用することができる。 
【０１５７】
更に、ＳＶＶと他のピコルナウイルスとの間のカプシドコード領域の部分を比較すると（図２８を参照すること）、配列類似性が最低である、囲まれていない多様な領域がウイルスの間で存在する。これらの領域は、ウイルスの間で異なる親和性に寄与することにおいて重要でありうる。したがって、これらの領域は、ＳＶＶカプシド（及び他のウイルスカプシド）のオリゴヌクレオチド挿入突然変異誘発の候補位置であることができる。
【０１５８】
腫瘍特異的治療薬としての不活性化ＳＶＶ
ＳＶＶ及びＳＶＶカプシド誘導体が特定の腫瘍細胞型及び／又は組織を標的にすることができるので、ＳＶＶ粒子それ自体を、治療薬の送達ビヒクルとして使用することができる。そのような方法において、送達された治療薬が標的腫瘍細胞を死滅させることができるので、ＳＶＶの腫瘍溶解能力の必要性は任意となる。
【０１５９】
例えば、野生型ＳＶＶを不活性化することができ、これによってウイルスは感染細胞をもはや溶解しないが、ウイルスは依然として特異的に結合し、標的腫瘍細胞型に進入することができる。ウイルスの複製機能を不活性化する、当該技術で既知の多くの標準的な方法が存在する。例えば、ウイルスが複製できないように、ウイルスワクチン全体が、ホルマリン又はβプロピオラクトンにより不活性化される。野生型ＳＶＶは、それ自体細胞のアポトーシスを引き起こすペプチドを含む場合もある。あるいは、ＳＶＶを照射することができる。しかし、特定の照射条件はタンパク質を、したがってカプシドを変化させるので、依然として特異的に腫瘍細胞を標的とすることを確認するために、照射されたウイルスを最初に試験するべきである。更に、突然変異ＳＶＶを生成することができ、パッケージングシグナル配列が欠失される。これらのＳＶＶ突然変異体は、標的細胞に特異的に結合し、進入することができるが、複製ＳＶＶゲノムＲＮＡは、カプシドに詰め込まれず、構築されない。しかし、この方法は、これらの変異体ＳＶＶの最初の進入が宿主タンパク質合成を遮断し、これによっても腫瘍細胞の死が達成されるので、有用であることを証明することができる。
【０１６０】
突然変異体カプシドを有する誘導体ＳＶＶを不活性化して、癌細胞の死滅に使用することもできる。カプシド領域に挿入されたエピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドを有する誘導体ＳＶＶを、毒素を腫瘍細胞に送達するビヒクルとして使用することができる。本明細書で記載されているように、誘導体ＳＶＶに、ランダムに突然変異を誘発し、腫瘍特異的親和性についてスクリーニングすることができる。ウイルスが毒素を腫瘍細胞に送達するように、毒素をエピトープタグに結合することができる。あるいは、ウイルスが治療抗体を腫瘍細胞に送達するように、エピトープタグに特異的に結合する治療抗体を使用することができる。
【０１６１】
ハイスループットスクリーニング：
本発明は、異なる細胞株に特異的に感染する能力を有するウイルスをスクリーニングするハイスループット法を包含する。感染の特異性は、細胞変性効果を評価することによって検出できる。例えば、多数の異なる腫瘍細胞株を、ハイスループットスクリーニングを受けやすいマルチウエルプレート、例えば３８４ウエルプレートの異なるウエルで増殖することができる。それぞれのウエルに、ウイルスの試料を加えて、細胞がウイルス仲介溶解により死滅したかを試験する。細胞変性効果を示すこれらのウエルから培地を回収し、これによって、培地中の任意のウイルスを、フラスコ中又は大型組織培養プレート中の許容細胞株に感染させることによって増幅することができる。ウイルスを増殖し、これによって、ＲＮＡを単離し、配列分析して、ウイルスの腫瘍細胞型特異的親和性を提供する原因でありうる配列突然変異を決定することができる。
【０１６２】
蛍光染料系アッセイ、ＡＴＰ系アッセイ、ＭＴＳアッセイ及びＬＤＨアッセイを含む多様な比色法及び蛍光定量法は、細胞変性効果を素速くアッセイすることができる。蛍光染料系アッセイは、死細胞の個体群を検出する核酸染色を含むことができ、細胞不透過核酸染色は、死細胞個体群を特異的に検出することができる。生存細胞と死細胞の両方の個体群を同時に検出することが望ましい場合、核酸染色を、生存細胞個体群を検出する細胞内エステラーゼ基質、膜透過性核酸染色、膜電位感受性プローブ、オルガネラプローブ又は他の細胞透過性インジケーターと組み合わせて使用することができる。例えば、Invitrogen（Carlsbad, CA）は、原形質膜が損われた細胞だけに浸透する多様なSYTOX（商標）核酸染色を提供する。臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウムを使用して、死又は瀕死細胞を検出することもできる。これらの染色は、任意の吸光度読取機で検出することができる高親和性核酸染色である。
【０１６３】
例えば、溶解は、損傷を受けた細胞のサイトゾルから上澄みへ放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性の測定を基盤とすることができる。細胞培養上澄み中のＬＤＨの存在を検出するために、ＬＤＨが共役酵素反応によりテトラゾリウム塩ＩＮＴをホルマザンに還元するように、基質混合物を加えることができる。次にホルマザン染料を、吸光度読取機で検出することができる。あるいは、フェニジンメトスルフェート（ＰＭＳ）を電子カップリング試薬として使用するＭＴＳアッセイ〔３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩〕を、細胞毒性の検出に使用することもできる。Promega（Madison, WI）は、CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assayキットを提供し、ここで、溶液試薬が培養ウエルに直接添加され、１〜４時間インキュベートされ、次に吸光度が４９０nmで記録される。４９０nmの吸光度の量で測定されたホルマザン産物の量は、培養中の生存細胞の数に正比例している。
【０１６４】
吸光度を読み取る多数のハイスループット装置が存在する。例えば、SpectraMax Plus 384 Absorbance Platereader（Molecular Devices）は、１nmで増加する１９０〜１０００nmの波長で検出することができる。この装置は、超高速試料スループットでは、９６ウエルマイクロプレートを５秒間で読み取ることができ、３８４ウエルマイクロプレートを１６秒間で読み取ることができる。 
【０１６５】
ウイルス複製を感染が成功した指標としてアッセイすることもでき、そのような検出方法をハイスループットの方法で使用することができる。例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、細胞培養上澄み中のウイルス転写物の存在を検出することができる。ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写すると、ｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ結合染料（例えば、SYBR（登録商標）Green, Qiagen GmbH, Germany）を使用したＰＣＲにより増幅及び検出することができる。次にＰＣＲ産物の量は、蛍光計を使用して直接測定することができる。
【０１６６】
細胞変性効果を示すウエルからのウイルスを増殖させ、更に、インビトロモデル（腫瘍及び正常細胞株について再試験する）及びインビボモデル（ウイルスが、マウスに外植した腫瘍を死滅できるかを試験する）で試験する。
【０１６７】
抗体：
本発明は、ウイルスのタンパク質を含む、本発明のウイルスに特異的に結合する抗体も対象とする。本発明の抗体には、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体及びヒト化抗体、並びにそれらの抗原結合フラグメントがあげられる、天然に生じる、並びに非天然に生じる抗体が含まれる。そのような非天然に生じる抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができるか、組み換え的に産生することができるか、又は例えば多様な重鎖及び多様な軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして得ることができる（Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989）。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、単鎖及び二機能性の抗体を作製するこれらの及び他の方法は、当業者にはよく知られている（Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246, 1993; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach, IRL Press 1992; Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed., Oxford University Press 1995）。本発明の抗体には、本発明のポリペプチドに存在するエピトープ決定要因に結合することができる、無処置分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖのようなそのフラグメントが挙げられる。
【０１６８】
抗体生成の免疫原として使用される本発明のＳＶＶポリペプチドのペプチド部分（すなわち、配列番号：２若しくは配列番号：１６９の任意のペプチドフラグメント）又は本発明の別のウイルスポリペプチドのペプチド部分が非免疫原性である場合、ヘプテンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような担体分子に結合させることにより、又は融合タンパク質としてペプチド部分を発現させることにより免疫源性にすることができる。ヘプテンを担体分子に結合させる他の多様な担体分子及び方法は、当該技術でよく知られている（例えば、Harlow and Lane, supra, 1988により）。例えば、ウサギ、ヤギ、マウス又は他の動物にポリクローナル抗体を生じる方法は、当該技術でよく知られている（例えば、Manson, ed., Humana Press 1992, pages 1-5; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters," in Curr. Protocols Immunol. (1992), section 2.4.1を参照すること）。
【０１６９】
モノクローナル抗体も当該技術で周知であり慣用の方法を使用して得ることができる（Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975; Coligan et al., supra, 1992, sections 2.5.1-2.6.7; Harlow and Lane, supra, 1988）。例えば、ウイルス、ウイルスポリペプチド又はそのフラグメントで免疫化されたマウスの脾臓細胞を適切な骨髄腫細胞株に融合して、ハイブリドーマ細胞を産生することができる。クローン化ハイブリドーマ細胞株を、例えば標識ＳＶＶポリペプチドを使用してスクリーニングして、適切な特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定することができ、望ましい特異性及び親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離し、抗体の連続供給源として利用することができる。同様にポリクローナル抗体も、例えば免疫化動物の血清から単離することができる。そのような抗体は、本発明の方法を実施するのに有用であることに加えて、例えば、標準的なキットを調製するためにも有用である。例えば単鎖抗体を発現する組み換えファージは、標準的なキットを調製するのに使用できる抗体も提供する。例えばモノクローナル抗体を単離し、例えば、 Protein-A SEPHAROSEゲルを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを含む十分に確立された多様な技術によりハイブリドーマ培養から精製することができる（Barnes et al., in Meth. Mol. Biol. 10:79-104, Humana Press 1992); Coligan et al., supra, 1992, sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3を参照すること）。
【０１７０】
抗体の抗原結合フラグメントは、特定の抗原のタンパク質分解加水分解により、又はフラグメントをコードするＤＮＡを発現することにより調製できる。抗体フラグメントは、従来の方法による抗体全体のペプシン又はパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素開裂により、Ｆ（ａｂ′）２と示される５Ｓフラグメントを生じることによって産生することができる。このフラグメントを、チオ還元剤を使用し、場合により、ジスルフィド結合の開裂によりもたらされるスルフヒドリル基の保護基を使用して更に開裂して、３．５ＳＦａｂ′一価フラグメントを生成することができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素開裂は、２つの一価Ｆａｂ′フラグメント及びＦＣフラグメントを直接産生する（例えば、Goldenberg、米国特許第4,036,945号及び同第4,331,647号; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230. 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al., Meth. Enzymol., 1:422 (Academic Press 1967); Coligan et al., supra, 1992, sections 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4を参照すること）。
【０１７１】
抗体の抗原結合フラグメントの別の例は、単一の相補性決定用域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応使用して、抗体産生細胞から得たＲＮＡによりコードされる可変部領域を合成して調製することができる（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991）。
【０１７２】
本発明の抗体は、例えばイムノアッセイでの使用に適しており、ここで水相で利用することができるか又は固相担体に結合することができる。加えて、このイムノアッセイにおける抗体を、多様な方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗体を利用できるイムノアッセイの種類の例は、直接的な又は間接的なフォーマットの競合的及び非競合的イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明の抗体を使用する抗原の検出は、生理学的試料の免疫組織化学アッセイを含む、前方、逆又は同時方式のいずれかで実施されるイムノアッセイを利用して実行することができる当業者は、過剰な実験をすることなく他のイムノアッセイのフォーマットを知るか、又は容易に認識することができる。
【０１７３】
当業者に既知の多くの異なる標識及び抗体を標識する方法が存在する。本発明で使用できる標識の種類の例には、酵素、放射線同位体、蛍光化合物、コロイド物質、化学発光化合物、リン光性化合物及び生物発光化合物が挙げられる。当業者は、抗体に、あるいは抗原に結合する他の適切な標識を知っているか、又は慣用的な実験を使用してそれらを確認することができる。
【０１７４】
記載される本発明の範囲及び精神から逸脱することなく上記の方法及び組成物に多様な変更を加えることができ、上記の記載に含まれるか、添付の図面に示されるか、又は添付の請求項で定義される主題は、全て、例示的であり、制限的ではないことが意図される。
【実施例】
【０１７５】
下記に記載される実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を制限する目的で含まれるのではない。
【０１７６】
実施例１
ウイルスの増幅及び精製
ＰＥＲ．Ｃ６でのＳＶＶの培養：ＳＶＶを１回プラーク精製し、十分に単離されたプラークを取り出し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で増幅した（Fallaux et al., 1998）。感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞からの粗ウイルス溶解産物（ＣＶＬ）を、凍結融解の３サイクルにより作製し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染するのに使用した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、１０％ウシ胎児血清（Biowhitaker, Walkersvile, MD, USA）及び１０mM塩化マグネシウム（Sigma, St Louis, MO, USA）を含有するダルベッコー修飾イーグル培地（DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して、５０×１５０cm2Ｔ．Ｃ．フラスコ中で増殖した。感染の３０時間後か、ＣＰＥの完了が見られたとき、感染細胞を採取し、４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを細胞培養上澄み（３０ml）に再懸濁し、凍結融解の３サイクルに付した。得られたＣＶＬを、４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により清澄化した。ウイルスを２回のＣｓＣｌ勾配により精製した：１工程勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４g/ml及び１．４g/ml）、続く１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３g/ml）。精製されたウイルス濃度は、分光光度的に決定され、１Ａ260＝９．５×１０12粒子であると推定される（Scraba D.G., and Palmenberg, A.C. 1999. Cardioviruses (Picornaviridae). In:Encyclopedia of Virology, Second edition, R.G. Webster and A Granoff Eds）。精製ウイルスの力価も、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を使用する標準プラークアッセイにより決される。ＰＥＲ．Ｃ６細胞からのＳＶＶの収率は、細胞１個あたり２００，０００個を越える粒子であり、粒子とＰＦＵの比率は約１００であった。他の許容細胞（Ｈ４４６−ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７１）からのＳＶＶの収率は、少なくともこの高さであるか又はこれよりも高い。
【０１７７】
実施例２
電子鏡検法
ＳＶＶを、直接適用法を使用してホルムバールカーボン被覆グリッドに載せ、酢酸ウレニルで染色し、透過型電子顕微鏡で調べた。ウイルスの代表的な顕微鏡写真を高倍率で撮る。透過型電子顕微鏡では、ＳＶＶ感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞の超薄切片を埋め込みブロックから切り取り、得られた切片を透過型電子顕微鏡で調べた。
【０１７８】
精製したＳＶＶ粒子は球状であり、直径が約２７nmであり、グリッド上に単独で又は小型の凝集体として表れる。ＳＶＶの代表的な画像を図２に示す。幾つかの場所で、染色浸透を有する破壊されたウイルス粒子及び空のカプシドも見られる。感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞の超微細構造研究は、細胞質内に結晶質含有物があることを明らかにした。ＳＶＶ感染しているＰＥＲ．Ｃ６細胞の代表的な画像を図３に示す。ウイルス感染細胞は、数個の大型の小胞体（空小胞）を明らかにした。
【０１７９】
実施例３
ＳＶＶの核酸単離
ＲＮＡ単離：ＳＶＶゲノムＲＮＡを、チオシアン酸グアニジウムを使用し、Trizol（Invitrogen）を用いるフェノール抽出法を使用して抽出した。単離を供給者の推奨に従って実施した。簡潔には、２５０μlの精製ＳＶＶを３容量のTRIZOL及び２４０μlのクロロホルムと混合した。ＲＮＡを含有する水相を、６００μlのイソプロパノールに沈殿させた。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出されたＲＮＡの量を、２６０nmでの光学密度測定により推定した。ＲＮＡのアリコートを１．２５％変性アガロースゲル（Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., Rockland, ME USA）により分割し、バンドを臭化エチジウム染色により可視化し、写真を撮った（図４）。
【０１８０】
ｃＤＮＡ合成：ＳＶＶゲノムのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより合成した。ｃＤＮＡの合成は、１μgのＲＮＡ、ＡＭＶ逆転写酵素及びランダム１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチド又はオリゴｄＴを使用する標準的な条件下で実施した。ｃＤＮＡのフラグメントを増幅し、プラスミドにクローン化し、クローンを配列決定した。
【０１８１】
実施例４
ＳＶＶ配列分析及び疫学：
パートＩ：ＳＶＶ  配列番号：１
ＳＶＶ  配列番号：１のヌクレオチド配列を分析して、他のウイルスとのその進化関係を決定した。このＯＲＦの翻訳産物（配列番号：２）はピコルナウイルス様であり、ＶＰ２の中間から３Ｄポリメラーゼの末端の終止コドンまで延びており、１８９０個のアミノ酸の長さであった（図５Ａ〜５Ｅ及び７Ａ〜７Ｂ）。ＯＲＦに続く３′非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヌクレオチド５６７１〜５７３４は、終止コドンを含みポリ（Ａ）テールを除く、６４個のヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり、１８個の残基が提供されている（図５Ｅ）。
【０１８２】
ＳＶＶの３つの部分ゲノムセグメントの予備比較（図示されず）は、ＳＶＶがカルジオウイルス属（ピコルナウイルス科）のメンバーに最も密接に関連することを明らかにした。したがって、ＳＶＶのポリタンパク質配列、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ、脳心筋炎ウイルス種）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ、サイロウイルス（Theilovirus）種）、ヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス（ＶＨＥＶ、サイロウイルス種）及びラットＴＭＥＶ様作用物質（ＴＬＶ、サイロウイルス種）の整列を構築した（図２８）。この整列から、ＳＶＶポリタンパク質プロセッシングを、カルジオウイルス属の最も密接に関連するメンバーのポリタンパク質プロセッシングと比較した。個々のポリペプチドの間の開裂部位を、図２８において文字「／」で画定した。
【０１８３】
ピコルナウイルスでは、大部分のポリタンパク質の開裂は１つ以上のウイルスコードプロテアーゼにより実施されるが、カルジオ−、アフト−、エルボ−及びテッショウウイルスでは、Ｐ１−２Ａと２Ｂの間の開裂は、２Ａ配列それ自体に関連し、配列「ＮＰＧ／Ｐ」が決定的に関連するあまり理解されていないシス作用性機構により実施され、ここで「／」は、２Ａと２Ｂのポリペプチドの間の中断を表す（Donnelly et al., 1997, J. Gen. Virol. 78: 13-21）。パレコウイルスのうちの一つ、ユンガン（Ljungan）ウイルスは、典型的なパレコウイルス２Ａの上流に存在する配列（ＮＰＧＰ）を有し、追加的な２Ａであるか又はＰ１カプシド領域のＣ末端である。現在確認されているピコルナウイルス属の９つ全てにおいて、３Ｃproは、シス作用性自己開裂反応以外の全て実施する（すなわち、２Ａは、エンテロ−及びライノウイルスでＮ末端を開裂し、Ｌは、アフトウイルス及びエルボウイルスでＣ末端を開裂する）。カプシドペプチドＶＰ０〜ＶＰ４及びＶＰ２の構築後の開裂は、３Ｃproにより実施されないが、ウイルスＲＮＡが関与する可能性がある不明な機構により実施される。ＶＰ０開裂は、パレコウイルス及びコブウイルスでは生じない。正常なカルジオウイルス３Ｃpro開裂部位は、−１位置のグルタミン（Ｑ）又はグルタミン酸（Ｅ）、及び＋１位置のグリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アデニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）のいずれかを有する（表２）。ＳＶＶポリタンパク質の開裂は、ヒスチジン（Ｈ）／セリン（Ｓ）であるＶＰ３／ＶＰ１部位以外はこのパターンに一致するが（表２）、Ｈ／Ｓは、おそらく、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＥＡＶ、アフトウイルス属）の少なくとも１つの株の３Ａと３ＢVPgの間に開裂部位として存在する（Wutz et al., 1996, J. Gen. Virol. 77:1719-1730）。
【０１８４】
【表４】
2008533988.tif 000012
【０１８５】
ＳＶＶの一次開裂（Ｐ１／Ｐ２及びＰ２／Ｐ３）：これらの一次開裂事象は、カルジオ−、アフト−、エルボ−及びテッショウウイルスで生じると予測され、配列ＮＰＧ／Ｐ（配列番号：１１１）が関わる新規機構による２ＢからのＰ１−２Ａの分離、及び２ＢＣとＰ３の間の３Ｃproによる従来の開裂を含む（表２）。
【０１８６】
Ｐ１開裂：ＳＶＶ  Ｐ１カプシドコード領域内の開裂は、ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶの配列との整列によって比較的容易に予測された（表２）。
【０１８７】
Ｐ２開裂：２Ｃタンパク質がＲＮＡ合成に関与する。ＳＶＶの２Ｃポリペプチドは、推定ヘリカーゼ及び全てのピコルナウイルス２Ｃに存在する、ＮＴＰ結合モチーフＧｘｘＧｘＧＫＳ／Ｔ（配列番号：１１２）（ドメインＡ）及びｈｙｈｙｈｙｘｘＤ（ここで、ｈｙは、任意の疎水性残基である；ドメインＢ）を含む（図２９）。
【０１８８】
Ｐ３開裂：Ｐ３開裂部位の予測も比較的直接的であった。３Ａポリペプチドの機能についてはほとんど知られていない。しかしピコルナウイルスの３Ａタンパク質は、全て推定膜貫通αヘリックスを含む。一次配列同一性は、ＳＶＶとカルジオウイルスとの間でこのタンパク質については低い（図２８の位置１６１２〜１７１０を参照すること）。
【０１８９】
３Ｂ領域でコードされているゲノム結合ポリペプチド、ＶＰｇは、他のカルジオウイルスと共通するアミノ酸がほとんどないが、第３の残基はチロシンであり、ウイルスゲノムの５′末端への結合と一致している（Rothberg et al., 1978）。図２８の位置１７０３〜１７２４を参照すること。
【０１９０】
４つのピコルナウイルス３Ｃシステインプロテアーゼの三次元構造が解明され、活性部位残基が同定された（HAV, Allaire et al., 1994, Nature, 369: 72-76; Bergmann et al., 1997, J. Virol., 71: 2436-2448; PV-1, Mosimann et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 1032-1047; HRV-14, Matthews et al., 1994, Cell, 77: 761-771;及びHRV-2, Matthews et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 11000-11007）。図２９で太字になっているシステインは求核剤であり、一方、最初の太字のヒスチジンは一般的な塩基であり、グルタミン残基への特異性は、主に第２の太字のヒスチジンにより定義され、３つの残基は全て、ＳＶＶ配列に保存され（図３９）、他は全て既知のピコルナウイルスに保存されている（図２８；３Ｃ配列比較は、位置１７２６〜１９４６を参照すること）。
【０１９１】
３Ｄポリペプチドは、ＲＮＡ依存性ＲＡＮポリメラーゼの主な成分であり、ＳＶＶは、ピコルナ様ウイルスＲＮＡ依存性ＲＡＮポリメラーゼに保存されたモチーフを含み、すなわち、ＫＤＥＬ／ＩＲ（配列番号：１１３）、ＰＳＧ、ＹＧＤＤ（配列番号：１１４）及びＦＬＫＲ（配列番号：１１５）である（図３；図２８の位置１９４８〜２４１０）。
【０１９２】
Ｐ１のＮ末端のミリストイル化：大部分のピコルナウイルスにおいて、Ｐ１前駆体ポリペプチドは、そのＮ−末端グリシン残基により（存在する場合は、Ｎ末端メチオニンは除去される）、アミド結合を介してミリスチン酸の分子に共有結合している（Chow et al., 1987, Nature, 327: 482-486）。したがって、Ｐ１  Ｎ末端を含む開裂産物ＶＰ０及びＶＰ４もミリストイル化される。このミリストイル化は、グリシンから始まる８つのアミノ酸シグナルを認識するミリストイルトランスフェラーゼにより実施される。ピコルナウイルスでは、５つの残基コンセンサス配列モチーフＧ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｔ／Ｓが同定されている（Palmenberg, 1989, In Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection, pp. 211-241, Ed. Semler & Ehrenfeld, Washington D.C., Amer. Soc. for Micro.）。パレコウイルス（ヒトパレコウイルス及びユンガンウイルス）、並びにＶＰ０の成熟開裂を有さないものは、明らかにミリストイル化されないが、これらのウイルスためにＶＰ０のＮ末端をブロックしている幾つかの種類の分子があると思われる。
【０１９３】
個々のＳＶＶペプチドと公的な配列データベースとの比較
ＳＶＶポリペプチド（配列番号Ｓ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２）を、それぞれ、ヨーロッパバイオインフォマティクス研究所（EBI; http://www.ebi.ac.uk/）のＦＡＳＴＡオンラインプログラムを使用して公的なタンパク質配列データベースと比較した。これらの比較の結果（最適マッチ）を表３に示す。カプシドポリペプチド（ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ１）を、２Ｃ、３Ｃpro及び３Ｄpolと共に全体として考慮すると、カルジオウイルス属のメンバーに最も密接に関連しているが、予測される短２Ａ配列は、ユンガンウイルス（パレコウイルス属）により近い。ＳＶＶ  ２Ａヌクレオチド配列と同様の配列とのより詳細な比較を図２８に示す（２Ａ様ＮＰＧ／Ｐタンパク質の比較は、図７０も参照すること）。
【０１９４】
【表５】
2008533988.tif 000013
【０１９５】
ＳＶＶ  ２Ｂとウレアプラズマ・ウレアリチカム多重バンド抗原とのマッチ、又は３Ａと緑色硫黄細菌エノラーゼ２とのマッチの有意性は不明であるが、これらの関連性は、更に調査する価値があると思われる。
【０１９６】
ＳＶＶポリペプチドと他のピコルナウイルスとの系統学的比較
カルジオウイルス（ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１、２Ｃ、３Ｃ及び３Ｄ）と整列化できるこれらのＳＶＶポリペプチドを、ピコルナウイルス種のそれぞれの代表的なメンバーの幾つかのタンパク質と比較した（表４）。プログラムBioEdit v5.0.9（Hall, 1999, Nucl. Acids. Symp. Ser., 41: 95-98）及びClustal X v1.83（Thompson et al., 1997, Nucl. Acids Res., 25:4876-4882）を使用して整列化を行い、Saitou及びNei（Satiou and Nei, 1987, Mol. Biol. Evol., 4: 406-425）のアルゴリズムに従って、距離行列を構築し、隣接連結ツリーを脱根した。枝の信頼限界を、ブートストラップ再サンプリング（１０００個の偽複製）により評価した。ツリーはTreeView 1.6.6（Page, 1996）を使用して描いた（図３１〜３７）。ツリーを構築するのに使用した距離行列は、多重置換と相関する値を使用したが、図３８〜４４は、アミノ酸同一性の実際の率を示す。表４は、現在のピコルナウイルス科の分類及びこれらの比較に使用した代表的なウイルス配列を示す。
【０１９７】
【表６】
2008533988.tif 000014
【０１９８】
ツリーの全てのポリペプチドを合わせたとき（図３４）、個々のカプシドタンパク質のツリー（図３１〜３３）は、生成されたツリーを全て代表しているわけではない。これは、おそらく、特にＶＰ２の場合のように（図３１）完全長ではないので、カプシドポリペプチドを整列化するのが困難であることから生じている。しかし、Ｐ１、２Ｃ、３Ｃpro及び３Ｄpolツリーは、全て一致しており、ＳＶＶがＥＭＣＶ及びＴＭＥＶと群れをなしていることを示す。
【０１９９】
カルジオウイルス属のメンバーとしてのセネカバレーウイルス
明らかにＳＶＶの３Ｄpolは、ＥＭＣＶとＴＭＥＶが互いに密接であるのとほぼ同じようにカルジオウイルスと関連している（図３７；図４４）。ピコルナウイルス２Ｃ及び３Ｃに比較的保存されていると一般に考えられている他のポリペプチドにおいて、ＳＶＶもカルジオウイルスに最も密接に関連しているが、ＭＣＶとＴＭＥＶが互いに密接に関連しているほどではない（それぞれ図４２及び図４３）。外側のカプシドタンパク質において（全体として考慮される）、ＳＶＶもカルジオウイルスに最も密接に関連しており、２つのアフトウイルス種、口蹄疫ウイルス及びウマ鼻炎Ａウイルスとほぼ同様の関連性を有する（約３３％）。ＳＶＶは２Ｂ及び３Ｂポリペプチドではカルジオウイルスから大きく逸脱し、あらゆる既知のピコルナウイルスと検出可能な関連性を有さない。しかし、このことは、前例がないわけではなく、トリ脳脊髄炎様ウイルスは２Ａ、２Ｂ及び３ＡではＡ型肝炎ウイルスとかなり異なるが（Marvil et al., 1999, J. Gen. Virol., 80:653-662）、ＨＡＶと共にヘパトウイルス属に一時的に分類されている。
【０２００】
セネカバレーウイルスは、ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶを標準として考えると、明らかに典型的なカルジオウイルスではない。しかし、これら２つのウイルスでも差があり、とりわけ５′ＵＴＲにおいて差がある（Pevear et al., 1987, J. Gen. Virol., 61: 1507-1516）。しかし、系統学的にはＳＶＶは、そのポリタンパク質の多く（Ｐ１、２Ｃ、３Ｃpro及び３Ｄpol領域）がＥＭＣＶ及びＴＭＥＶに集まる。最終的に、ピコルナウイルスの範囲内のＳＶＶの分類学上の位置は、ピコルナウイルス研究グループによる推奨及び支持文献に従って、国際ウイルス分類委員会（ＩＣＶＴ）の実行委員会によって決定されるであろう。２つの選択肢がある：ｉ）ＳＶＶをカルジオウイルス属の新たな種として含めること、又は（２）ＳＶＶを新たな属に指定すること。 
【０２０１】
パートＩＩ：ＳＶＶ  配列番号：１６８
ＳＶＶの完全長ゲノム（図８３Ａ〜８３Ｈ；配列番号：１６８；実施例１５）によって更なる疫学的研究が可能である。更なる疫学的研究の結果が図８６に示されており、ＳＶＶは、ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶのようなカルジオウイルスと遺伝子的に関連していることが示されているが、異なるツリーである。
【０２０２】
ＳＶＶ完全長ゲノムのその非翻訳及びコード領域に関する特徴は、上記の表Ａに提示されている。ＥＭＣＶ及びＴＭＥＶ−ＧＤＶＩＩと比較した完全長ＳＶＶの特性を下記の表に提示する。
【０２０３】
【表７】
2008533988.tif 000015
【０２０４】
ＳＶＶの開裂部位（完全長配列を基盤とする、図８３Ａ〜８３Ｈのタンパク質の境界線の間の太字アミノ酸も参照すること）を、他のカルジオウイルスの開裂部位と下記の表で比較する。
【０２０５】
【表８】
2008533988.tif 000016
*リボソームスキッピング配列
【０２０６】
多数の独特なウイルスがＵＳＤＡによって発見されており、これらは、ＳＶＶが他のカルジオウイルスに対するよりもＳＶＶに似ている。本明細書において「ＳＶＶ様ピコルナウイルス」と呼ばれる群のメンバーであると考えられるこれらのＵＳＤＡウイルス分離株は、ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９である。これらのＳＶＶ様ピコルナウイルス及びＳＶＶは、新たなピコルナウイルス属を含むと考えられる。
【０２０７】
これらのＳＶＶ様ピコルナウイルスは、それぞれ独特であり、ヌクレオチドレベルでＳＶＶと約９５〜９８％の同一性がある（ＳＶＶとこれらのＵＳＤＡ分離株とのヌクレオチド配列比較は、図８７〜８９を参照すること）。
【０２０８】
パートＩＩＩ：血清研究
ブタは、上記で同定したＵＳＤＡウイルス分離株の許容宿主である。分離株ＭＮ８８−３６６９５をノトバイオートブタに接種し、抗血清を生成した（ＧＰ１０２）。抗血清は、上記で提示した他の全てのＵＳＤＡ分離株及びＳＶＶに結合する。抗血清は、２４個の一般的なブタウイルス病原体と反応せず、特異的であることを示す。ブタ血清を、また、中和抗体について１２７８（プラムアイランドウイルス）で試験した。血清を米国で収集し、血清の８／２９が１：５７〜１：３６，５００の範囲の力価で陽性であった。
【０２０９】
ブタがＳＶＶの天然供給源であるかを試験するために、多様な動物から血清試料を得て、許容細胞のＳＶＶ感染に対して中和抗体として作用するその能力について試験した。血清中和アッセイを以下のように実施した：（１）多様な血清を１：２及び１：４で希釈する；（２）１００ＴＣＩＤ50のウイルス（ＳＶＶ；しかし、任意のウイルスを、血清がその感染を中和できるかについて試験することができる）と混合する；（３）３７℃で１時間インキュベートする；（４）１×１０4個のＰＥＲ．Ｃ６細胞（又は他の許容細胞型）に加える；（５）３７℃で３日間インキュベートする；及び（６）ＭＴＳアッセイを使用してＣＰＥを測定する。中和力価は、ＳＶＶ（又は他の目的のウイルス）を中和する最も希釈された血清を１００％として定義する。
【０２１０】
血清中和の結果は、ヒト及び霊長類個体群において中和抗体の存在が最小限であるか又は存在しないことを示した。一つの実験では、ヒト血清の０／２２が、ＳＶＶに対する中和抗体を含有した。別の実験では、ヒト血清の１／２８しか中和抗体を含有しなかった。第３の実験では、アーミッシュ農民からのヒト血清の０／５０が中和した。別の実験では、４種の霊長類からの血清の０／５２が中和した。
【０２１１】
血清中和の結果は、家畜個体群において中和抗体が広く存在することを示した。一つの実験において、農場のブタ血清の２７／７１が中和した。別の実験において、無疾患の農場のブタ血清の４／３０が中和した。別の実験において、ウシ血清の１０／５０が中和した。なお別の実験において、野生マウス血清の５／３５が中和した。ＳＶＶ及び／又はＳＶＶ様ピコルナウイルスと交差反応する抗体が、ブタ、ウシ及びマウスにおいてことが見出されたので、これらのデータは、ＳＶＶ及び／又はＳＶＶ様ピコルナウイルスが多種多様な非霊長類動物において広く存在することを示す。
【０２１２】
ＭＮ８８−３６６９５の粗ウイルス溶解産物を試験してＳＶＶの２つの許容性細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４４６；ＨＥＫ２９３）に対する、並びにＳＶＶの２つの非許容性細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＳ８）に対するその細胞毒性を評価した。ＭＮ８８−３６６９５の細胞毒性プロフィールは、ＳＶＶと同一であった：ＮＣＩ−Ｈ４４６に対するＴＣＩＤ５０は、１．６×１０-6であり；ＨＥＫ２９３に対するＴＣＩＤ５０は、１．３×１０-2であり、ＮＣＩ−Ｈ４４６及びＳ８はＭＮ８８−３６６９５に対して非許容性であった。このデータは、ＳＶＶ様ピコルナウイルスが、癌治療を対象とする本発明の方法に使用される可能性があることを示す。一つの実施態様において、本発明は、癌治療、診断又はスクリーニングを対象とする方法のいずれかにおいて、ＭＮ８８−３６６９５ＳＶＶ様ピコルナウイルスの使用を提供する。
【０２１３】
ＭＮ８８−３６６９５及びＳＶＶに対する抗血清を、それぞれウイルスにより血清中和アッセイで試験した。抗ＳＶＶマウス血清は、ＭＮ８８−３６６９５とＳＶＶの両方による感染を中和することができた（感染に対する中和力価は、ＭＮ８８−３６６９５では１：６４０であり、ＳＶＶでは１：１０００であった）。抗ＭＮ８８−３６６９５ノトバイオートブタ血清は、ＭＮ８８−３６６９５とＳＶＶの両方による感染を中和することができた（感染に対する中和力価は、ＭＮ８８−３６６９５では１：５１２０であり、ＳＶＶでは１：１００であった）。
【０２１４】
これらのデータは、ＳＶＶが、ブタＵＳＤＡウイルス分離株に遺伝子的及び血清学的に関連していることを示す。
【０２１５】
実施例４
ＳＶＶカプシドタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＮ末端配列分析
精製ＳＶＶを、ＮｕＰＡＧＥプレキャストビス−トリスポリアクリルアミドミニゲル電気泳動系（Novex, San Diego, Ca, USA）を使用して、電気泳動に付す。ゲルの半分を銀染色で可視化し、一方、他の半分を使用して、カプシドタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列決定のための試料を調製する。タンパク質を膜に移す前に、ゲルを、１０mMのＣＡＰＳ緩衝剤、ｐＨ１１に１時間浸け、ＰＶＤＦ膜（Amersham）をメタノールで湿潤する。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移す。移した後、タンパク質をアミドブラックでおよそ１分間染色して可視化し、目的のバンドを小刀で切除し、空気乾燥する。タンパク質を、パルス位相配列決定機を使用して、エドマン分解により、自動化Ｎ末端配列決定に付すことができる。
【０２１６】
精製されたＳＶＶの３つの主な構造タンパク質を図４５に示す（およそ３６kDa、３１kDa及び２７kDa）
【０２１７】
実施例５
ヒト血清試料中のＳＶＶに対する中和抗体のアッセイ
特定のウイルスベクターに予め存在する抗体は転移性癌の治療のような全身送達用途でのそのようなベクターの使用を制限する場合があり、それは、予め存在する抗体は、ベクターが標的組織又は器官に形質導入する機会を得る前に、全身送達ベクターに結合して、それらを中和する場合があるからである。したがって、ヒトが全身送達のために選択されたウイルスベクターに対する中和抗体を持っていないことを確実にすることが望ましい。ヒト血清試料がＳＶＶ特異性中和抗体を含むかを決定するために、無作為に収集したヒト血清試料を使用して中和アッセイを実施した。
【０２１８】
組織培養感染用量５０：  実験の１日前に、１×１０4個の細胞を含有する１８０μlのＰＥＲ．Ｃ６細胞懸濁液を、９６ウエル組織培養皿で平板培養した。ＳＶＶの粗ウイルス溶解産物（ＣＶＬ）を１０-0から１０-11の対数工程でＤＭＥ培地（ダルベッコー修飾イーグル培地）に希釈し、２０μlの各希釈を、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有するFalcon９６ウエル組織培養プレートの３つのウエルに移す。プレートを５％ＣＯ2中、３７℃でインキュベートし、細胞変性効果（ＣＰＥ）の顕微鏡証拠を３日間読み取り、組織培養感染用量５０（ＴＣＩＤ50）を計算した。
【０２１９】
中和アッセイ：  最初に、４０μlの培地を全てのウエルに入れ、次に４０μlの熱不活性化血清を最初のウエルに加えて、ピペット操作により混合し、スクリーニング目的に使用するために１：４希釈を作る。次に４０μlを次のウエルに移して、血清試料の２倍希釈を実施した。１００ＴＣＩＤ50を含む４０μlのＳＶＶウイルスを、希釈血清試料を含有するウエルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。４０μlの混合物を取り出し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有するプレート（１×１０4細胞／１６０μlウエル）に移した。プレートを３７℃で３日間インキュベートする。この時間の後、培養をＣＰＥについて顕微鏡で読み取った。
【０２２０】
上記で記載されたように実施される代表的な中和アッセイにおいて、米国、ヨーロッパ及び日本で無作為に収集した２２個のヒト血清試料を、ＳＶＶ特異性中和抗体について調べた。血清試料を連続的に希釈し、１００ＴＣＩＤ50を含む固定量のＳＶＶと混合した。次に血清ウイルス混合物を使用してＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染し、２４時間インキュベートした。中和抗体力価は、ＣＰＥ形成を阻止できた血清の最高希釈の逆数として決定した。この実験では、希釈した血清でＣＰＥ形成を阻止したものはなく、ヒト血清試料がＳＶＶ中和抗体を含有しないことを示した。
【０２２１】
更に、ＰＥＲ．Ｃ６のＳＶＶ感染は、ヒト血液とのインキュベーションにより阻害されず（実施例６を参照すること）、ＳＶＶ感染は、補体又は赤血球凝集により阻害されないことを示した。結果として、ＳＶＶは、他の腫瘍溶解ウイルスよりもインビボで長い循環時間を示し、これは腫瘍溶解アデノウイルスを使用するのに重大な問題である。
【０２２２】
実施例６
ヒト赤血球へのＳＶＶの結合及び赤血球凝集
多様なウイルス血清型が、多様な動物種の血液から単離された赤血球のインビトロ赤血球凝集を引き起こすことを示している。赤血球凝集又は赤血球への結合は、インビボで毒性を引き起こす場合があり、また、インビボ体内分布及びウイルスベクターの効力に影響を与える場合がある。しがたって、転移性癌を治療するために全身投与される、選択されたウイルスベクターの赤血球凝集性を分析することが望ましい。
【０２２３】
赤血球凝集アッセイ：ＳＶＶがヒト赤血球の凝集を引き起こすかを決定するために、赤血球凝集アッセイを、Ｕ底９６ウエルプレートで実施した。精製したＳＶＶを２５μlのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で連続して二重に希釈し、等容量の１％赤血球懸濁液をそれぞれのウエルに加えた。赤血球を単離するのに使用した血液試料は、抗凝血薬としてヘパリンを用いて健康な個人から得た。赤血球は、血液を冷ＰＢＳ中で３回洗浄して、血漿及び白血球を除去することによって調製した。最後の洗浄の後、赤血球をＰＢＳに懸濁して、１％（V/V）細胞懸濁液を作った。ウイルス及び赤血球を穏やかに混合し、プレートを室温で１時間インキュベートし、赤血球凝集のパターンをモニタリングした。
【０２２４】
全血不活性化アッセイ：血液成分によるＳＶＶの直接的な不活性化を排除するために、ウイルスのアリコートを血漿を分離する前に、Ａ、Ｂ、ＡＢ及びＯ血液型に属するヘパリン処理済みヒト血液と共に又はＰＢＳと共に３０分間又は１時間室温でインキュベートし、その後ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染し、力価を計算した。
【０２２５】
上記のように実施された代表的なアッセイにおいて、異なる血液型（Ａ、Ｂ、ＡＢ及びＯ）でのヒト赤血球の赤血球凝集は、試験したＳＶＶの希釈のいずれにおいても見られなかった。ＳＶＶがヒト血液試料と混合され、３０分間及び１時間インキュベートされたときウイルス力価に僅かな増加が見られ、ウイルスは、血液成分により不活性化されるのではなく、試験条件でより感染性になることを示す。
【０２２６】
実施例７
インビボクリアランス
血液循環時間：血液循環時間及び腫瘍中のウイルスの量を決定するために、Ｈ４４６腫瘍担持ヌードマウスを尾静脈注射によりＳＶＶの１×１０12vp/kgの用量で処置した。マウスを、注射の０、１、３、６、２４、４８、７２時間後、及び７日目（１８９時間後）に出血させ、収集した直後に血液から血漿を分離し、感染培地で希釈し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染するために使用した。注射マウスを、注射の６、２４、４８、７２時間後及び７日目に殺処理し、腫瘍を収集した。腫瘍を小型の切片に切断し、１mlの培地に懸濁し、３回の凍結融解に付して、感染細胞からウイルスを遊離させた。上澄みの段階対数希釈法を行い、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で力価をアッセイした。ＳＶＶ力価をpfu/mlで表した。腫瘍切片をＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学にも付して、腫瘍中のウイルスカプシドタンパク質を検出した。
【０２２７】
血液中のウイルス粒子の循環レベルを、マウスの体重の７．３％が血液であるという仮説に基づいて決定した。実質的に上記に記載されたように実施した代表的なアッセイにおいて、ウイルス投与の６時間以内に、ＳＶＶの循環レベルはゼロ粒子に低減し、ＳＶＶは後の時点では検出できなかった（図４６Ａ）腫瘍ではＳＶＶは注射の６時間後に検出可能であり、その後、ウイルスの量は２対数で一定に増加した（図４６Ｂ）。ウイルスは、注射後７日目まで検出可能であった（図４６Ｂ）。腫瘍切片は、免疫組織化学に付されたとき、腫瘍細胞中にＳＶＶタンパク質があることを明らかにした（図４７、上側のパネル）。Ｈ＆Ｅで染色された場合、腫瘍切片は、幾つかの丸くなった腫瘍細胞があることを明らかにした（図４７、下側のパネル）。
【０２２８】
ＳＶＶは、静脈内アデノウイルスの同様の用量と比較して、血液中の残留時間が著しく長いことも示す。単回静脈内投与の後、ＳＶＶは血液中に６時間まで存在し続け（図４６Ｃ；図４６Ｃは、図４６Ｄと比較する目的で、図４６Ａの複製である）、一方、アデノウイルスは、約１時間で血液から取り除かれた（図４６Ｄ）。
【０２２９】
実施例８
腫瘍細胞選択性
ＳＶＶのインビトロ細胞死滅活性：ヒト、ウシ、ブタ及びマウス細胞の感受性を決定するために、正常及び腫瘍細胞を多様な供給源から得て、ＳＶＶで感染した。全ての細胞型を、培地及び供給者により推奨された条件下で培養した。初代ヒト肝細胞は、In Vitro Technologies（Baltimore, MD）から購入することができ、Hepatocye Culture Media（HCM（商標）、BioWhittaker/Clonetics Inc., San Diego, CA）で培養することができる。
【０２３０】
インビトロ細胞変性アッセイ：どの種類の細胞がＳＶＶ感染に感受性があるかを決定するために、増殖している正常細胞及び腫瘍細胞の単層を、精製ＳＶＶの段階希釈で感染した。細胞をＣＰＥについてモニタリングし、非感染細胞と比較した。感染の３日後、ＭＴＳ細胞毒性アッセイを実施し、１細胞あたりの粒子の有効濃度５０（ＥＣ50）値を計算する。下記の表５及び６、並びに上記の表１Ａを参照すること。
【０２３１】
【表９】
2008533988.tif 000017
【表１０】
2008533988.tif 000018
【０２３２】
ＭＴＳアッセイを、製造会社の説明書に従って実施した（Promega, Madison, WIによるCellTiter 96（登録商標）AQueous Assay）。CellTiter 96（登録商標）AQueous Assayは、好ましくは、テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、ＭＴＳ）及び電子カップリング試薬フェニジンメトスルフェート（ＰＭＳ）を使用する。この研究で評価される接触阻害正常ヒト細胞には、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＨＡＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞、Clonetics/BioWhittaker番号ＣＣ−２５３５）、Ｗｉ３８（正常ヒト胎児肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）、ＩＭＲ９０（正常ヒト肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８６）、ＭＲＣ−５（正常ヒト肺線維芽細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１７１）及びＨＲＣＥ（ヒト腎皮質上皮細胞、Clonetics/BioWhittaker番号ＣＣ−２５５４）が挙げられる。  
【０２３３】
ＳＶＶは上記の接触阻害正常細胞のいずれにおいてもＣＰＥを生じない。ウイルス誘導ＣＰＥは、以下のヒト腫瘍細胞株において見られなかった：Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６４）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）、ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０９９５）、ＰＣ３Ｍ−２ＡＣ６、ＳＷ６２０（ヒト結腸直腸腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２７）、ＳＷ８３９（ヒト腎臓腺癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−４９）、５６３７（ヒト膀胱癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−９）、ＤＭＳ−１１４（小型細胞肺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０６６）、ＤＭＳ１５３（ヒト小型細胞肺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２０６４）、Ａ５４９（ヒト肺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５）、ＨｅＬａ  Ｓ３（ヒト子宮頸腺癌、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２．２）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト大型肺癌、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７７）、ＫＫ（グリア芽細胞腫）及びＵ−１１８ＭＧ（ヒトグリア芽細胞腫、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１５）。注意−１０００を越えるＥＣ50値を有する表６の細胞株は、ＳＶＶ複製及び／又はバイロン産生に許容性がない可能性が高いが、ＳＶＶがこれらの細胞に結合及び進入することができるがＣＰＥが観察されない可能性も残り、それは、ＳＶＶ複製が細胞の中で起こることができないか、又は他の何らかの進入後阻止がある（すなわち、複製ＳＶＶゲノムのバイロンへの詰め込みがない）ので複製は起こるがＣＰＥは観察されないからである。しかし、これらの細胞株でＣＰＥが不在であることを考えると、これらの細胞株及び潜在的にはその腫瘍型は、どの細胞及び腫瘍型がＳＶＶ複製に対して許容性又は非許容性であるかを試験する良好な候補である。野生型ＳＶＶは腫瘍特異的であり、小型細胞肺癌及び神経芽細胞腫を含む神経内分泌腫瘍を標的にすることが示されているが、ＳＶＶが神経内分泌腫瘍のそれらの形態において許容性ではないような病因の型を有する個々の患者が存在してもよい。したがって、本発明は、腫瘍が野生型ＳＶＶに非許容性である個々の患者から単離される腫瘍細胞型を死滅させることができるＳＶＶ誘導体の生成を考慮し、これらの個人から単離される細胞型は、例えば、グリア芽細胞腫、リンパ腫、小型細胞肺癌、大型細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、肝癌、結腸癌、腎癌、結腸癌、膀胱癌、直腸癌及び扁平上皮細胞肺癌を含むことができる。
【０２３４】
初代ヒト肝細胞（In Vitro Technologies）に対するＳＶＶ仲介細胞毒性を、ＬＤＨ放出アッセイ（CytoTox（登録商標）96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, # G1780）により決定した。コラーゲン被覆１２ウエルプレートで平板培養した初代ヒト肝細胞を、ＳＶＶにより細胞１個あたり１、１０、１００及び１０００個の粒子（ppc）で感染させた。感染の３時間後、感染培地を２mlの増殖培地に代えて、ＣＯ2インキュベーターで３日間インキュベートした。細胞関連乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）及び培養上澄み中のＬＤＨを別々に測定した。細胞毒性の率は、最大細胞ＬＤＨ＋上澄みＬＤＨに対する上澄み中のＬＤＨ単位の割合として決定する。
細胞毒性率＝培養上澄み中のＬＤＨ単位×１００
上澄み中のＬＤＨ単位と細胞溶解産物の合計
図４８に示されているデータは、試験した多数の感染においてＳＶＶ仲介肝毒性の不在を示している。
【０２３５】
実施例１０
ウイルス産生アッセイ
ＳＶＶの複製能力を評価するために、幾つかの選択された接触阻害正常細胞及び活性分化腫瘍細胞をＳＶＶにより細胞１個あたり１個のウイルス粒子（ppc）で感染させた。７２時間後、細胞及び培地を３回の凍結融解サイクルに付し、遠心分離して上澄みを収集した。上澄みの段階対数希釈法を行い、ＰＥＲ．Ｃ６細胞で力価をアッセイした。それぞれの細胞株において、ＳＶＶ複製の効力をpfu/mlとして表した（図４９）。
【０２３６】
実施例１０
毒性
最大耐量（ＭＴＤ）を、動物（例えば、マウス）がＳＶＶによる処置の後で用量制限毒性（ＤＬＴ）を示す用量の直前の投与量として定義する。ＤＬＴを、動物が、研究の持続期間中全体にわたってＳＶＶ投与に起因する体重の減少、症状及び死を示す用量として定義する。ＳＶＶに対する中和抗体を、ベースライン、１５日目及び２１日目に評価した。中和アッセイを前記のように実施した。
【０２３７】
ＳＶＶの漸増用量（１×１０8〜１×１０14vp/kg）を、Harlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN, USA）から購入した免疫欠損ヌードマウスと帝王切開由来１（ＣＤ−１）非近交系免疫適格マウスの両方に、ＭＴＤを決定するために１用量レベルあたり１０匹のマウスに静脈内投与した。ウイルスは、あらゆる臨床症状を示すことなく、体重の減少もなく、全ての試験用量レベルで耐性が十分であった（図５０）。マウスを、１５及び２１日目に出血させ、血清をＳＶＶ特異性中和抗体の存在について中和アッセイでモニタリングした。ＳＶＶ注射ＣＤ１マウスは中和抗体を生じ、力価は、１／１０２４〜１／４０９５超である。
【０２３８】
別の毒性試験を免疫適性マウス系（Ａ／Ｊ）で実施した。ＳＶＶは、Ｎ１Ｅ−１１５細胞で細胞死滅活性及び複製を示すことが実証されている（表１を参照すること）。マウス細胞株Ｎ１Ｅ−１１５（神経芽細胞腫細胞株、すなわち神経内分泌癌）は、Ａ／Ｊマウス系から誘導される。このように、Ｎ１Ｅ−１１５細胞をＡ／Ｊマウスに皮下移植して腫瘍を形成し、次にマウスをＳＶＶで処理してその効力及び毒性を調査する、同系マウスモデルが確立された。  
【０２３９】
Ａ／Ｊ研究において、マウスにＳＶＶを静脈内注射して、Ａ／ＪマウスがＳＶＶの全身投与に耐えられるかを決定した。血液学の結果を得て毒性の徴候を探し、血清化学の結果も得ることができる。研究設計を下記の表７に示す。
【０２４０】
【表１１】
2008533988.tif 000019
【０２４１】
Ａ／Ｊマウスは、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine）から得た８〜１０週齢の雌であった。ＳＶＶは、単離ビリオンを使用するまで−８０℃で保存することによって準備した。ＳＶＶは、氷上で融解し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で希釈することにより新たに調製した。ＳＶＶを、群２では１０7粒子／mL、群３では１０10粒子／mL、群４では１０13粒子／mLの濃度に希釈した。ＨＢＳＳを群１のビヒクル対照として使用した。全ての投与溶液を投与するまでウェットアイス（wet ice）上で保持した。
【０２４２】
ＳＶＶを、１０mL／kg体重の投与量で尾静脈を介して動物に静脈内注射することで投与した。動物を投与日に体重を計り、投与量を体重に基づいて調整した（すなわち、０．０２００kgのマウスは、０．２００mLの投与溶液を受ける）。マウスを罹患及び死亡について１日２回モニタリングした。マウスの体重を毎週２回計った。瀕死動物及びあらゆる異常な症状（身体的又は行動的）を示す動物に関する情報は直ぐに記録した。  
【０２４３】
死後観察及び測定には、標準的な血液学及び血清化学のために殺処理末期で全ての生存動物からの血液の収集が必要である（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＵＮ、ＣＫ、ＬＤＨ）。殺処理時に次の器官を収集した：脳、心臓、肺、腎臓、肝臓及び生殖腺。それぞれの器官試料の半分をドライアイスで素速く凍結し、他の半分をホルマリンに入れる。
【０２４４】
最初の血液学の結果（ＣＢＣ、鑑別）をＳＶＶ注射の２週間後に得て、結果を下記の表８にまとめる。各試験群から５匹のマウスを試験した（表７を参照すること）。
【０２４５】
【表１２】
2008533988.tif 000020
2008533988.tif 000021
【０２４６】
これらの結果は、未処置マウスから得られた血液学プロフィールと比較して、低、中及び高用量のＳＶＶで処置したマウスから得た血液学プロフィールにおいて異常がないことを示す。この研究から、ＳＶＶの全身投与の後で毒性の計測可能な徴候がなく、ＳＶＶは静脈内注射の後でＡ／Ｊマウスに耐性があったと結論づけることができる。
【０２４７】
実施例１１
効力
Harlan Sprague Dawley（Indianapolis, IN）から購入した６〜７週齢の胸腺欠損雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、効力研究に使用した。マウスには、手動拘束を使用して、右側腹部に５×１０6個のＨ４４６細胞を皮下注射した。腫瘍サイズを定期的に測定し、容量を、式：π／６×Ｗ×Ｌ2（式中、Ｌ＝腫瘍の長さ及びＷ＝腫瘍の幅である）を使用して計算した。腫瘍がおよそ１００〜１５０mm3に達したとき、マウス（ｎ＝１０）を無作為に群に分けた。マウスには、１０ml/kgの投与量で尾静脈注射によりＳＶＶの漸増用量を注射した。マウスの対照群には、ＨＢＳＳの等量を注射した。漸増用量は、体重１キログラムあたり１×１０7から１×１０13個の粒子まで続けた。抗腫瘍効力は、ＳＶＶ投与後に腫瘍量を毎週２回測定して決定した。完全寛解は、異種移植片の完全な消滅、部分反応は腫瘍量の５０％以上の退縮、反応なしは対照群と同様の腫瘍の連続的増殖として定義した。
【０２４８】
ＨＢＳＳで処置されたマウスの腫瘍は、急速に増殖し、腫瘍量は、研究の２０日目までには２０００mm3超に達した（図５１，中空菱形の線を参照すること）。対照的に、ＳＶＶの全身注入を全ての試験用量（最低用量を除く）で１回与えたマウスは、研究の２０日目までには腫瘍がなくなった。最低用量群では、研究の３１日目までには、８匹のマウスでは腫瘍がなくなり、１匹のマウスは非常に大型の腫瘍を有し、他は、小型の触知可能な腫瘍（２５mm3）を有した。ＳＶＶの大型の腫瘍に対する抗腫瘍活性を評価するために、ＨＢＳＳ群の＞２０００mm3の腫瘍を担持する５匹のマウスに、研究の２０日目に１×１０１１vp/kgの単回用量で全身注入した。追跡期間の間（ＳＶＶ注射後１１日間）、腫瘍量の劇的な退縮が見られた（図５１）。
【０２４９】
ＳＶＶの単回静脈内用量の効力を試験する追加的な実験を、神経内分泌マーカーを発現するマウス腫瘍モデルで実施した。試験した腫瘍モデルには、Ｈ４４６（ヒトＳＣＬＣ）（図９０Ａを参照すること）、Ｙ７９（ヒト網膜芽細胞腫）（図９０Ｂを参照すること）、Ｈ６９ＡＲ（ヒト多剤耐性ＳＣＬＣ）（図９０Ｃを参照すること）、Ｈ１２９９（ヒトＮＳＣＬＣ）（図９０Ｄを参照すること）及びＮ１Ｅ−１１５（マウス神経芽細胞腫）（図９０Ｅを参照すること）が挙げられる。
【０２５０】
結果は、ＳＶＶの単回静脈内用量は、全てのマウス神経内分泌腫瘍モデルにおいて効力を有することを示す。この結果は、ＳＶＶがＮ１Ｅ−１１５免疫適性マウス神経芽細胞腫モデルにおいて効果的であることも示す。
【０２５１】
図５２は、ＳＶＶで「未処置」である（すなわち、ＨＢＳＳで処置された）マウス又はＳＶＶで「処置」されたマウスの写真を示す。見て判るように、未処置マウスは非常に大型の腫瘍を有し、処置マウスは目に見える腫瘍の徴候を示さなかった。更に、ＳＶＶで処置した未殺処理マウスでは、研究の期間中、２００日間で腫瘍の再増殖は観察されなかった。
【０２５２】
特定の腫瘍細胞株に対するＳＶＶのインビトロ効力のデータを、表１、１Ａ及び５に示す。このデータは、ＳＶＶが特定の腫瘍細胞型に特異的に感染し、成人の正常細胞には感染しない（ブタ正常細胞を除く）ことを示し、これは他の任意の既知の腫瘍溶解ウイルスに対する顕著な利点である。ＳＶＶは、化学療法処置よりも１，０００倍良好な細胞死滅特異性を有することを示した（ＳＶＶの細胞死滅特異性値は、１０，０００を越えることが示されているが、化学療法の細胞死滅特異性値は、およそ１０である）。
【０２５３】
ＳＶＶの特異的細胞毒性活性を、Ｈ４４６ヒトＳＣＬＣ細胞で実証した。ＳＶＶの増加濃度を用いる２日間のインキュベーションの後、細胞生存率を決定した。結果を図５３に示す。図５３は、Ｈ４４６  ＳＣＬＣ腫瘍細胞（上側グラフ）又は正常なヒトＨ４６０細胞（下側グラフ）とのＳＶＶのインキュベーションの後の細胞生存を示す。ＳＶＶは、細胞１個あたりおよそ１０-3個の粒子のＥＣ50で腫瘍細胞を特異的に死滅させた。対照的に、正常なヒト細胞はＳＶＶのいずれの濃度でも死滅しなかった。更に、表１、１Ａ〜３でまとめられているように、ＳＶＶは、ＳＣＬＣ多剤耐性腫瘍細を含む多数の他の腫瘍細胞株、並びに幾つかの胎児細胞及び細胞株に対しても細胞毒性がある。他の腫瘍細胞株に対するＳＶＶ細胞毒性のＥＣ50値は、細胞１個あたり、１０-3〜２０，０００個を越える粒子の範囲であった。ＳＶＶは、他の多様な非神経性腫瘍及びヒト正常組織に対して非細胞毒性であった。加えて、ＳＶＶは、ＬＤＨ放出により測定すると、細胞１個あたり１０００個の粒子まで初代ヒト肝細胞に対して細胞毒性がなかった（図４８を参照すること）。
【０２５４】
実施例１２
齧歯類における体内分布及び薬物動態研究
ＳＶＶの薬物動態及び体内分布研究を、正常なマウス及びＨ４４６  ＳＣＬＣ腫瘍を担持する免疫無防備状態の胸腺欠損ヌードマウスで実施した。この研究は、正常なマウスと免疫無防備状態の腫瘍担持マウスの両方に単回静脈内投与した後、ＳＶＶの体内分布、排除及び残存率を評価した。群のマウスは、それぞれ単回静脈内用量の対照緩衝剤又は１〜３用量のＳＶＶ（１０8、１０10又は１０12vp/kg）を摂取し、臨床徴候についてモニタリングした。血液試料を、投与の１、６、２４及び４８時間後、並びに投与の１、２、４及び１２週間後に５匹のマウスの群から得た。用量レベルには、ウイルス排除の直線性を決定するために、既知の低効能用量と２つの高用量レベルが含まれていた。マウスの群を、投与の２４時間後、並びに２、４及び１２週間後に殺処理した。肝臓、肺、脾臓、腎臓、リンパ節、骨髄、脳及び脊髄組織を含む選択された組織を無菌的に収集し、検証済みのＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用してＳＶＶ  ＲＮＡの存在について試験した。
【０２５５】
尿及び糞の試料を、殺処理時、投与の２４時間後、並びに２、４及び１２週間後に得て、感染ウイルスの存在について調べた。この実施例における実験の設計を下記の表９に示す。
【０２５６】
【表１３】
2008533988.tif 000022
【０２５７】
急性静脈内毒性研究も、正常なマウスと、Ｈ４４６  ＳＣＬＣ腫瘍を担持する免疫無防備状態の胸腺欠損ヌードマウスの両方で実施した。正常なマウスとＳＣＬＣ腫瘍担持マウスでの予備静脈内研究は、ＳＶＶが１０14vp/kgまでの用量で安全であることを示す。有害な臨床徴候は観察されず、単回静脈内用量の１０14vp/kgの２週間後まで、体重の減少はなかった。
【０２５８】
実施例１３
正常な成体及び妊娠マウスにおけるウイルス伝染研究
この実施例の目的は、非感染正常マウスと高濃度のＳＶＶを注射したマウスとの共存の後で、ＳＶＶが伝染するかを決定することである。ＳＶＶは、正常な非腫瘍担持マウスでは複製しないので、腫瘍担持マウスに高濃度のＳＶＶを注射し、続いて正常で健康な動物に触れさせて臨床のシナリオをより良好にシミュレートすることもできる。第２の目的は、感染した雌から非感染妊娠雌親、続いて発育中の胎児へのＳＶＶの感染の可能性を評価することである。
【０２５９】
５匹の未処置の雄及び雌ＣＤ−１マウスの３つ群を、１０8、１０10又は１０12vp/kgのいずれかで感染された同じ性別の単独のマウスに触れさせ、血液サンプリングによりＳＶＶの存在をモニタリングした。
【０２６０】
同様に、ＳＶＶに暴露した雌を多数の妊娠時期の雌と一緒にして、感染した雌から非感染妊娠雌へ、続いて発育中の胎児へウイルスが伝染する能力を決定した。
【０２６１】
実施例１４
非ヒト霊長類研究
ＳＶＶの安全性、毒性及び毒物動態を非ヒト霊長類においても決定した。用量範囲発見段階において、個々のサルにＳＶＶの単回静脈内用量を１０8vp/kgで摂取し、感染又は毒性の臨床徴候について密接にモニタリングした。この用量の耐性が十分である場合、更なる動物を１０12vp/kgの用量が達成されるまでより高い静脈内用量で処置した。続いて、主要研究は３匹の雄及び雌サルの群から構成され、それぞれのサルにはビヒクル単独又は３用量のＳＶＶのいずれかを毎週１回で６週間投与し、毒性の徴候をモニタリングした。追加の雄雌１対の２匹のサルにビヒクル単独又は高用量レベルのＳＶＶを６週間投与し、殺処理の前に更に４週間回復させた。
【０２６２】
血液試料を、投与期間の１週目及び６週目に得る。臨床病理学的及び血液学的血液試料を、最初の投与の前及び殺処理の前に得た。ＳＶＶに対する中和抗体の存在を評価するために、更なる血液試料を各投与後に得た。
【０２６３】
生存サルを安楽死させ、完全な全体屍検に付し、完全な組織リストを主要研究及び回復サルから集めた。対照及び高用量群からの組織を組織病理学的に評価した。尿及び糞試料を、投与後の１週目及び６週目に収集し、感染ＳＶＶの存在について評価した。この実施例の全体的な設計を下記の表１０に示す。
【０２６４】
【表１４】
2008533988.tif 000023
*用量は、用量範囲発見段階の結果に基づいて変わりうる。
【０２６５】
実施例１５
感染性の完全長及び機能ゲノムＳＶＶプラスミドの構築
配列番号：１によると、ＳＶＶの５′ゲノム配列の約１．５〜２kbしか配列決定されるために残っておらず、５′ＵＴＲ、１Ａ（ＶＰ４）及び１Ｂ（ＶＰ２）の部分を網羅するヌクレオチド領域を表す。５′末端欠失配列番号：１をクローン化するために、高温で機能するポリメラーゼ及びポリメラーゼが二次構造を読み通すことを可能にする試薬を使用した。更なるＳＶＶ  ｃＤＮＡを、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５３４３の単離ＳＶＶから調製した。ＳＶＶ粒子を、ＰＥＲ．Ｃ６のような許容性細胞株に感染し、ウイルスを単離した。次に、ｃＤＮＡコピーが作られるように、ウイルスＲＮＡをウイルス粒子から回収した。選択されたｃＤＮＡクローンが合わせされて、ＳＶＶ配列の５′末端の上流にＴ７プロモーターを有するプラスミド中で一つの完全長クローンになるように、個々のｃＤＮＡクローンを配列決定した。ＳＶＶの完全長ゲノム配列は、図８３Ａ〜８３Ｈ及び配列番号：１６８に提示されている。このプラスミドからの完全長ＳＶＶを、Ｔ７ポリメラーゼ及びインビトロ転写系を利用して逆転写し、完全長ＲＮＡを生成する（図５５を参照すること）。次に完全長ＲＮＡを許容性細胞株に形質移入して、完全長クローンの感染力を試験する（図５５を参照すること）。
【０２６６】
方法論は以下であった。ＲＮＡ単離：ＳＶＶゲノムＲＮＡを、チオシアン酸グアニジウムを使用し、Trizol（Invitrogen）を用いるフェノール抽出法を使用して抽出した。簡潔には、２５０μlの精製ＳＶＶ（約３×１０12個のウイルス粒子）を３容量のTrizol及び２４０μlのクロロホルムと混合した。ＲＮＡを含有する水相を、６００μlのイソプロパノールに沈殿させた。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、乾燥し、滅菌ＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出されたＲＮＡの量は、２６０nmでの光学密度測定により推定することができる。ＲＮＡのアリコートを１．２５％変性アガロースゲル（Cambrex Bio Sciences Rockland Inc., Rockland, ME USA）により分割し、バンドを臭化エチジウム染色により可視化し、写真を撮ることができる。
【０２６７】
ｃＤＮＡ合成：ＳＶＶゲノムのｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより合成した。ｃＤＮＡの合成は、１μgのＲＮＡ、ＡＭＶ逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを使用する標準的な条件下で実施した。ランダム４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを使用することもできる。ｃＤＮＡのフラグメントを増幅し、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ（Promega）にクローン化し、クローンを配列決定した。ウイルスゲノムの５′末端の配列を、ＲＡＣＥによりクローン化して、配列を決定した。配列データをまとめて、ＳＶＶの全ゲノム配列を生成した。
【０２６８】
完全長ゲノムのクローニング：完全長ＳＶＶゲノムを表す３つのｃＤＮＡのフラグメントを、６セットのＳＶＶ特異性プライマーを用いた３回のＰＣＲ反応で増幅した。Turbo pfuポリメラーゼ（Stratagene）をＰＣＲ反応に使用した。第１に、ＳＶＶゲノムの５′末端を表すフラグメントをプライマー５′ＳＶＶ−Ａ（配列番号：２１９）及びＳＶＶ１０２９ＲＴ−ＲＩ（配列番号：２２０）で増幅し、得られたフラグメントをＡｐａｌ及びＥｃｏＲＩで切断し、ゲル精製した。ゲル精製フラグメントを、Ｎｄｅ−ＡｐａＴ７ＳＶＶ（配列番号：２２１）、５′末端に操作されたＮｄｅ１部位を含むアニールされたオリゴ二本鎖、中央のＴ７コアプロモーター配列及び３′末端に使用準備済みのＡｐａ１部位を有するＳＶＶの最初の１７個のヌクレオチドに連結し、３方向連結によりｐＧＥＭ−３Ｚ（Promega）のＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩ部位にクローン化してｐＮＴＸ−０３を生成した。第２に、ウイルスゲノムの３′末端を表すフラグメントを、プライマーＳＶＶ６０５６（配列番号：２２２）及びＳＶＶ７３０９ＮｓｉＢ（配列番号：２２３）を用いてＰＣＲで増幅した。アンチセンスプライマーＳＶＶ７３０９ＮｓｉＢを使用して、３′末端の３０個のヌクレオチドの長さの導入ポリ（Ａ）テール及びＮｓｉ  Ｉ認識配列を、ｐＧＥＭ−３ＺプラスミドのＰｓｔＩ部位にクローン化した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製した。ウイルスゲノムの内部部分を網羅するフラグメントを、プライマーＳＶＶ９１１Ｌ（配列番号：２２４）及びＳＶＶ６１５７Ｒ（配列番号：２２５）で増幅した。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ゲル精製した。ＳＶＶゲノムの中央及び３′末端を表す２つのゲル精製フラグメントを、３方向連結によりｐＧＥＭ−４ＺのＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ部位にクローン化してｐＮＴＸ−０２を生成した。完全長ＳＶＶ  ｃＤＮＡを生成するために、ｐＮＴＸ−０２をＥｃｏＲＩ及びＮｓｉＩで消化し、得られた６．３kbのフラグメントをゲル精製し、ｐＮＴＸ−０３のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩ部位にクローン化した。得られた完全長プラスミドをｐＮＴＸ−０４と呼んだ。
【０２６９】
完全長プラスミドｐＮＴＸ−０４を、５′と３′の両方の末端で更に修飾してインビトロ転写を促進し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのＲＮＡ転写後のウイルスの救出を促進した。第１に、SwaI制限酵素部位を、ポリ（Ａ）テールの直ぐ下流に挿入して、インビトロ転写の前に、プラスミド骨格からＳＶＶ−ｃＤＮＡの３′末端を遊離させた。ＰＣＲ手法を使用し、プライマー対ＳＶＶ６０５６（配列番号：２２２）及びＳＶＶＳｗａＲｅｖ（配列番号：２２６）と、鋳型としてｐＮＴＸ−０４とを利用して部位を挿入した。アンチセンスプライマーＳＶＶ３ＳｗａＲｅｖは、ＳＶＶ配列の３′末端を表す５８個のヌクレオチド及びＳｗａＩ及びＳｐｈＩ制限酵素部位の認識配列を含有した。得られたＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化し、ｐＮＴＸ−０４の対応するフラグメントを代えるために使用して、ｐＮＴＸ−０６を生成した。第２に、ｐＮＴＸ−０６におけるＳＶＶ  ｃＤＮＡのＴ７プロモーター転写開始部位と５′末端の間に存在する余分な４個のヌクレオチドを、アニールしたオリゴ二本鎖を使用する手法で除去した。二本鎖ヌクレオチドを、ＫｐｎＩ認識部位、Ｔ７コアプロモーター配列及び３′末端に使用準備済みＡｐａ１部位を有するＳＶＶの最初の１７個のヌクレオチドに含むように操作した（配列番号：２２７）。アニールしたオリゴを使用し、ＫｐｎＩ及びＡｐａＩ部位を用いてｐＮＴＸ−０６の対応する部分を代えて、ｐＮＴＸ−０７を生成した。最後に、ｐＮＴＸ−０７のポリメラーゼコード領域で見つけられた２つの塩基対の欠失は、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩフラグメントを、ＰＣＲによりＳＶＶ  ｃＤＮＡから増幅された対応するフラグメントに代えることによって修復し、ｐＮＴＸ−０９を生成した。
【０２７０】
インビトロ転写：インビトロ転写ＲＮＡの感染力を、最初にｐＮＴＸ−０９をＳｗａＩで消化して、プラスミド骨格からＳＶＶ配列の３′末端を遊離することにより試験した。直線化プラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼ（Promega）を使用してインビトロ転写に付した。
【０２７１】
インビトロ転写ＲＮＡのＰＥＲ．Ｃ６細胞への形質移入：形質移入の１日前に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を６ウエル組織培養皿で平板培養した。翌日に、Lipofetamine試薬（Invitrogen）使用し、供給者の推奨に従ってインビトロ転写ＲＮＡ（１．５μg）を細胞に形質移入した。ウイルス産生に起因する細胞変性効果（ＣＰＥ）が、形質移入の３６時間後に見られた。形質移入細胞を、３サイクルの凍結融解に付し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染させることにより、溶解産物中のウイルスを更に確認した。このように、完全長ＳＶＶ  ｃＤＮＡクローンは感染性であることを実証した。
【０２７２】
上記に記載したように、ＳＶＶの完全長ゲノムを有するプラスミドを、標準的なプロトコールに従って逆転写することができる。ウイルスＲＮＡ（１００ng）を使用して、未変性ＳＶＶに許容性であることが知られているあらゆる細胞株を形質移入することができるが、ウイルスＲＮＡ形質移入に最も効率的な細胞株は、多様な細胞株のうちから経験的に決定することができる。
【０２７３】
実施例１６
ＲＧＤ表示ＳＶＶライブラリーの構築
ランダムペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドによりランダムに生成されたＳＶＶカプシド突然変異体の構築に最適な挿入位置を見つけるために、簡単なモデル系（ＲＧＤ）を用いる。ＲＧＤ（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）は、インテグリンに結合する短ペプチドリガンドである。成功したＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体は、以下の特性を含むはずである：（１）遺伝子挿入が、ＳＶＶに特有で望ましい特性のいずれも変えるはずではないこと；及び（２）成功したＲＧＤ誘導体ウイルスが、細胞を含有するαVβ5インテグリンに対して親和性を有するはずであること。
【０２７４】
近接するカプシド領域を含有するＳＶＶプラスミドをランダムな位置で一つずつ開裂し、ＲＧＤと呼ばれる短モデルペプチド配列を各位置に挿入した。ウイルスＳＶＶ−ＲＧＤライブラリーを、図５６及び５７に記載される一般的な技術を利用して、このプラスミドライブラリーから構築した。
【０２７５】
ｃＲＧＤオリゴヌクレオチドのカプシド領域へのランダム挿入を実施した。簡潔には、プラスミドをＳＶＶの２．１kbカプシド領域をちょうどコードするように構築した（図５６「ｐＳＶＶカプシド」を参照すること）。単一のランダム開裂を、下記に記載するＣｖｉＪＩ又はエンドヌクレアーゼＶ方法を利用してプラスミドを部分的に消化することにより、ｐＳＶＶカプシド中で行った（図５７を参照すること）。単一開裂プラスミドを単離した後、ＲＧＤオリゴヌクレオチドを挿入して、ｐＳＶＶカプシド−ＲＧＤライブラリーを作り出した。
【０２７６】
制限酵素ＣｖｉＪＩは、超音波処理又は剪断のような他のランダム開裂方法に対して幾つかの利点を有する。第１に、ＣｖｉＪＩは平滑末端カッターであり、修復の必要性がない。第２に、ＣｖｉＪＩは、ホットスポットを生じないようにランダム位置で開裂することが実証されている。手順も簡単で素速い。簡潔には、ＣｖｉＪＩの濃度及び／又は消化の時間は、開裂されたＤＮＡの大部分が直線化プラスミドになるまで、すなわち単一開裂になるまで次第に低下していく。これは、図５７で示されている標準アガロースゲル電気泳動により観察することができる。次にバンドを単離し、生成し、ＲＧＤオリゴと連結した。
【０２７７】
ＤＮＡをランダムに開裂するのに利用できる別の方法は、エンドヌクレアーゼＶの方法である（Kiyazaki, K., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): e139）。エンドヌクレアーゼＶは、ウラシル部位への第２又は第３ホスホジエステル結合３′において、ウラシル含有ＤＮＡに切れ目を入れた。この方法もＤＮＡをランダムに開裂することが予測され、当該頻度は簡単に、ポリメラーゼ連鎖反応におけるｄＵＴＰの濃度を調整することによって決定される。開裂部位は常にチミジン（ウラシルで置換される）の塩基２又は３個下流であるが、この方法は、他の方法論よりもかなり少ないホット及びコールドスポットを生じることが予測される。
【０２７８】
ランダムに直線化されたプラスミドをｃＲＧＤオリゴヌクレオチドと連結した。次に得られたｐＳＶＶカプシドライブラリーを増幅し、これにより、ランダムに挿入されたｃＲＧＤ領域を有するカプシド領域をコードするポリヌクレオチドの個体群を精製することができた（図５７及び５８を参照すること）。次にカプシドポリヌクレオチドの個体群を、完全長ＳＶＶ配列からカプシド領域を引いたものを含有するベクターにサブクローン化して、それにより、完全長ＳＶＶ配列のライブラリーが生成された（ライブラリーは、ｃＲＧＤ配列がランダムに挿入されているので、カプシド領域において配列多様性を表す）。次にこのライブラリーをＲＮＡに逆転写し、ＲＮＡを許容細胞株に形質移入して、異なるカプシドを有するＳＶＶ粒子の個体群を生成した（図５９を参照すること）。このウイルス粒子のＲＧＤ−ＳＶＶ個体群を回収し（「ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリー」）多数のウイルス（すなわち、１０個以上）を配列決定のために無作為に取り出して、ＲＧＤ配列の挿入及び挿入部位の多様性を確認した。
【０２７９】
ＲＧＤ表示ＳＶＶライブラリーのインビトロ選択。ＳＶＶ−ＲＧＤライブラリーをスクリーニングして、どの挿入部位がＳＶＶに対する拡大した親和性を可能にするかを決定した。ＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーを、αvβ5インテグリン発現ＮＳＣＬＣ株（非小型細胞肺癌細胞株、すなわちＡ５４９発現αvβ5）に感染させた。機能的であり正常に表示されるＲＧＤモチーフを含むこれらのＳＶＶ誘導体しか、これらの細胞に感染し、複製することができない。
【０２８０】
インビトロスクリーニングを、液体を扱うこと、２０個の細胞株を同時にインキュベートすること及び３８４ウエルプレートを測定することができるハイスループット自動システム（TECAN）で実施した（図６２及び図６３を参照すること）。感染の３０時間後か、ＣＰＥの完了が見られたとき、細胞を採取し、次に細胞を４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により回収した。次に細胞ペレットを細胞培養上澄みに再懸濁し、３サイクルの凍結融解に付す。得られた懸濁液を、４℃、１５００rpmで１０分間の遠心分離により清澄化した。ウイルスを２回のＣｓＣｌ勾配により精製する：１工程勾配（ＣｓＣｌ密度１．２４g/ml及び１．４g/ml）、続く１連続勾配遠心分離（ＣｓＣｌ密度１．３３g/ml）。精製されたウイルス濃度を分光光度的に決定し、１Ａ260＝９．５×１０12粒子であると推定された（Scraba, D.G. and Palmenberg, A.C., 1999）。このプロセスを、十分な量のウイルスをαvβ5細胞から回収するまで何回も繰り返すことができる。
【０２８１】
回収されたＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体の分析。個々のＲＧＤ表示ＳＶＶ誘導体の少量のプール（約１０〜５０個の異なる誘導体）を分析した。ウイルス混合物を希釈し、単一のウイルス粒子を分析のために拡大した。それぞれの誘導体を試験して、これらがαvβ5発現細胞を効率的かつ特異的に感染する能力を得ているかを判定した。次に、この特性を有するそれぞれの誘導体のカプシド領域を配列決定して、ＲＧＤ挿入の部位を決定した。回収されたｃＲＧＤ表示ＳＶＶ誘導体は以下の特性を有するはずである：（１）ウイルスの元の特性が無傷のままであること；及び（２）誘導体が、ＲＧＤに結合する高レベルのインテグリンを発現する細胞を感染する能力を得ること。この手法は、ランダムオリゴヌクレオチドを部位に挿入して、変化した親和性を有するＳＶＶ誘導体を生成することができるように、ＲＧＤ挿入による親和性の拡大を可能にする１つ以上の部位を同定することを目的とする。
【０２８２】
配列決定されたｃＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体を、インテグリンへの結合能力によって番号付けし順位付けした。結合活性を試験するために、組み換えβ2インテグリンを、ＰＢＳ中の９６ウエルマイクロタイタープレートに固定化し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡでブロックし、次に独特のＲＧＤ表示ウイルスと共にインキュベートした。ペプチド挿入のない未変性ウイルスを、陰性対照として使用する。インキュベーションの１〜５時間後、ウエルをＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。次に、プレートに結合しているウイルスを、抗ＳＶＶ抗体により検出した。インテグリンに対するＲＧＤペプチド又は抗体は、インテグリン結合プレートへのＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体の結合と競合することができるはずである。
【０２８３】
インテグリンへの最強の結合を有するｃＲＧＤ−ＳＶＶ誘導体（２０）を分析して、ｃＲＧＤオリゴヌクレオチドの挿入が「成功する」位置を決定した。挿入部位はＳＶＶの親和性について洞察を提供した。挿入部位及び他の既知の構造の分析にもとづいて、ランダムペプチドライブラリーを配置する理想的な位置を決定した（この方法は、オリゴヌクレオチド（既知の配列又はランダム配列）をカプシド中のランダムな位置に挿入する、ＳＶＶ誘導体を生成する代替的な方法である）。ランダム配列オリゴヌクレオチドにより生成されるＳＶＶ誘導体を、２つの追加的で新規な方法論を除いて、上記のＲＧＤ−ＳＶＶライブラリーについて記載された方法と実質的に同じ方法で構築した。望ましいコード領域内に不要な終止コドン及び有害なアミノ酸挿入（例えば、システイン又はプロリン）を避けるために、Morphosys（Munich, Germany）により開発されたＴＲＩＭ（トリヌクレオチド−突然変異誘発）技術を使用して、カプシド挿入のためにランダムオリゴヌクレオチドを生成した。ＴＲＩＭは、所望の位置でアミノ酸をコードするだけのトリ−ヌクレオチドを利用する（Virnekas, B. et al., Nucleic Acids Res, 1994, 22(25): 5600-5607）。１０8の多様性でＳＶＶを表示するランダムペプチドは、ウイルスを標的腫瘍組織に特異的に向かわせるペプチドを生じるのに十分であると思われ、生じると予測された。ランダムペプチド表示ＳＶＶを、上記で記載したようにインビトロで又は腫瘍担持マウスを使用してインビトロで試験した。
【０２８４】
実施例１７：血清研究
ブタは、上記で同定したＵＳＤＡウイルス分離株の許容宿主である。分離株ＭＮ８８−３６６９５をノトバイオートブタに接種し、抗血清を生成した（ＧＰ１０２）。抗血清は、上記で提示した他の全てのＵＳＤＡ分離株及びＳＶＶに結合する。抗血清は、２４個の一般的なブタウイルス病原体と反応せず、その特異性を示している。ブタ血清は、また、中和抗体について１２７８（プラムアイランドウイルス）で試験した。血清を米国で収集し、血清の８／２９が１：５７〜１：３６，５００の範囲の力価で陽性であった。
【０２８５】
ブタがＳＶＶの天然供給源であるかを試験するために、多様な動物から血清試料を得て、許容細胞のＳＶＶ感染に対して中和抗体として作用するその能力について試験した。血清中和アッセイを以下のように実施した：（１）多様な血清を１：２及び１：４で希釈し、必要であれば希釈を増大する；（２）１００ＴＣＩＤ50のウイルス（ＳＶＶ；しかし、任意のウイルスを、血清がその感染を中和できるかを決定するために試験することができる）と混合する；（３）３７℃で１時間インキュベートする；（４）混合物を１×１０4個のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（又は他の許容細胞型）に加える；（５）３７℃で３日間インキュベートする；及び（６）テトラゾリウム系染料細胞毒性（例えばＭＴＳ）アッセイを使用してＣＰＥを測定する。中和力価は、ＳＶＶ（又は他の目的のウイルス）を中和する最も希釈された血清を１００％として定義する。
【０２８６】
血清中和の結果は、ヒト及び霊長類個体群において中和抗体の存在が最小限であるか又は存在しないことを示した。一つの実験では、ヒト血清の０／２２が、ＳＶＶに対する中和抗体を含有した。別の実験では、ヒト血清の１／２８しか中和抗体を含有しなかった。第３の実験では、アーミッシュ農民からのヒト血清の０／５０が中和した。別の実験では、４種の霊長類の血清の０／５０が中和した。
【０２８７】
血清中和の結果は、家畜個体群にＳＶＶ中和抗体が広く存在することを示した。一つの実験において、農場のブタ血清の２７／７１が中和した。別の実験において、無疾患の農場のブタ血清の４／３０が中和した。別の実験において、ウシ血清の１０／５０が中和した。なお別の実験において、野生マウス血清の５／３５が中和した。
【０２８８】
ＭＮ８８−３６６９４に対する抗血清を、ＳＶＶの血清中和アッセイで試験した（実施例２を参照すること）。抗ＭＮ８８−３６６９５ノトバイオートブタ血清は、ＳＶＶの感染を中和することができた（感染に対する中和力価はＳＶＶでは１：１００であった）。上記で記述したように、抗血清は他のＵＳＤＡ分離株の全て及びＳＶＶに結合し、本明細書に開示されているＵＳＤＡ分離株は、間接免疫蛍光アッセイで測定されたノトバイオートブタ血清との血清学的交差反応の結果、ＳＶＶ様ピコルナウイルスであることが示されている。
【０２８９】
これらのデータは、ＳＶＶが、ブタＵＳＤＡウイルス分離株に遺伝子的及び血清学的に関連していることを示す。
【０２９０】
実施例１８：ＳＶＶ及びＳＶＶ様ピコルナウイルス
次の分離株：ＭＮ８８−３６６９５、ＮＣ８８−２３６２６、ＩＡ８９−４７５５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＣＡ１３１３９５、ＬＡ１２７８、ＩＬ６６２８９、ＩＬ９４−９３５６、ＭＮ／ＧＡ９９−２９２５６、ＭＮ９９１９７及びＳＣ３６３６４９の群を、間接免疫蛍光実験で部分的に推定した。抗血清ＧＰ１０２は、ウイルスをノトバイオートブタに接種することによって、単離ＭＮ８８−３６６９５に対して発生させた。抗血清は１２個の分離株の全てに結合し、これらが互いに血清学的に関連していることを実証する。
【０２９１】
ＧＰ１０２抗血清を、ＳＶＶによる中和アッセイで試験した。このアッセイでは、抗血清の段階希釈を既知の量のＳＶＶ（１００ＴＣＩＤ50）と混合した。混合物を３７℃で１時間置いた。次に混合物のアリコートを、１×１０4個のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞又は同様にＳＶＶに許容性がある別の細胞株に加え、混合物を３７℃で３日間置いた。次にウエルを、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）について調べた。血清が中和抗体を含有する場合、ウイルスを中和し、ウイルスによるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の感染を阻害するであろう。ＣＰＥを、存在する生存細胞の数に基づいて吸光度を変えるテトラゾリウム系染料試薬を使用して定量的に測定した。結果を、血清の対数希釈に対する非感染対照の生存細胞の率として表し、図９３に示す。このデータは、ＳＶＶが、ブタＵＳＤＡウイルス分離株に血清学的に関連していることを示す。
【０２９２】
加えて、ＭＮ８８−３６６９５のウイルス溶解産物を、４つの異なる細胞株による細胞毒性アッセイで試験し、結果を表４に示す。許容性プロフィールは、ＮＣＩ−Ｈ４４６及びＨＥＫ２９３がＳＶＶに許容性であり、ＮＣＩ−Ｈ４６０及びＳ８が許容性ではない点において、ＳＶＶと同一である。加えて、ＳＶＶと同様に、ＭＮ８８−３６６９５はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に対して細胞毒性であった。更に、マウスで発生されたＳＶＶに対するポリクローナル抗血清を、ＭＮ８８−３６６９５ウイルスと共に中和アッセイに使用した。結果を図９４に示す。抗ＳＶＶ抗血清はＭＮ８８−３６６９５を中和し、更にＳＶＶをＵＳＤＡウイルスと血清学的に関連づけた。
【０２９３】
【表１５】
2008533988.tif 000024
【０２９４】
幾つかのＵＳＤＡ分離株のゲノム部分配列分析は、これらが全てＳＶＶと密接に関連していることを明らかにした（配列の整列化について図８７〜８９を参照すること）。表１２は、ＳＶＶと６個の他の分離株との配列同一性の率を示す。３Ｄpol及び３′ＵＴＲをコードするゲノムの３′末端の４６０ｎｔにわたって、ヌクレオチド（ｎｔ）レベルで約９５〜９８％の同一性が見出された。ＵＳＤＡウイルスは、それぞれ独特であり、ヌクレオチドレベルでＳＶＶに対して約９５〜９８％の同一性がある。
【０２９５】
【表１６】
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【０２９６】
分離株のうちの２つのＰ１（図８７）及び２Ｃ（図８８）遺伝子の一部分の更なる配列決定が、ＳＶＶとのこの密接な関係を確認した。ＵＳＤＡ分離株は、カルジオウイルス属のメンバーを含む他のあらゆる既知のウイルスよりもＳＶＶにより高度に関連する。ＵＳＤＡウイルスのうちの７個の幾つかの領域からの配列をＳＶＶと比較して、隣接連結ツリーを構築した（図９５Ａ及び９５Ｂ）。これらのツリーは、ウイルス間の高度な関係性を更に確認し、ＣＡ１３１３９５をＳＶＶの現在の最も密接な類似体であると同定する。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１】腫瘍溶解ウイルスを使用するウイルス療法の概略図を示す。腫瘍溶解ウイルスは、ウイルスを局所的に注入すること又はウイルスを全身的に送達することによって、腫瘍体積の全体にわたって複製し、拡散し、腫瘍細胞を選択的に死滅させる特性を有する。
【図２】酢酸ウレニルで染色し、透過型電子顕微鏡で調べた精製ＳＶＶを示す。球状ウイルス粒子は直径約２７ｎｍである。
【図３】大型の結晶質封入体及び大型の小胞体を有するＳＶＶ感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞の電子顕微鏡写真である。
【図４Ａ】ＳＶＶ  ＲＮＡの分析を示す。ＳＶＶゲノムＲＮＡを、チオシアン酸グアニジウムを使用し、Trizol（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いるフェノール抽出法を使用して抽出する。ＲＮＡを１．２５％変性アガロースゲルで分割する。バンドを臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色により可視化し、写真を撮る。レーン２では、優勢なＳＶＶゲノムＲＮＡバンドが観察され、完全長ＳＶＶゲノムの大きさが約７．５キロベースであることを示す。
【図４Ｂ】ＳＶＶを含むピコルナウイルスのポリタンパク質プロセッシングで生成されたゲノム構造及びタンパク質産物を示す概略図である。
【図５Ａ−Ｅ】ＳＶＶ（配列番号：１）のヌクレオチド配列及びコードされたアミノ酸配列（配列番号：２）を表す。終止コドンは位置５６７１〜３で「*」により示されている。一般的な注意事項として、正確なヌクレオチドが確認されている位置を含む配列開示において、これらの位置は「ｎ」により表される。したがって、「ｎ」を有するコドンでは、関連するアミノ酸は「ｘ」で示される。
【図６Ａ−Ｄ】ＳＶＶの完全長ゲノムの大部分のヌクレオチド配列（配列番号：１）を表す。ヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するＳＶＶ分離株から誘導された。寄託日：２００３年７月２５日。
【図７Ａ−Ｂ】配列番号：１でコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を表す。
【図８】ＳＶＶの部分１Ｂ又はＶＰ２コード領域のヌクレオチド配列（配列番号：３）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド４〜４２９と同一である。
【図９】配列番号：３でコードされる部分ＳＶＶ  ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：４）を表す。配列番号：４で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸２〜１４３と同一である。
【図１０】ＳＶＶの１Ｃ又はＶＰ３コード領域のヌクレオチド配列（配列番号：５）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド４３０〜１１４６と同一である。
【図１１】配列番号：５でコードされるＳＶＶ  ＶＰ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：６）を表す。配列番号：６で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸１４４〜３８２と同一である。
【図１２】ＳＶＶの１Ｄ又はＶＰ１コード領域のヌクレオチド配列（配列番号：７）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド１１４７〜１９２３と同一である。
【図１３】配列番号：７でコードされるＳＶＶ  ＶＰ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：８）を表す。配列番号：８で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸３８３〜６４１と同一である。
【図１４】ＳＶＶの２Ａコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：９）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド１９２４〜１９６５と同一である。
【図１５】配列番号：９でコードされるＳＶＶ  ２Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１０）を表す。配列番号：１０で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸６４２〜６５５と同一である。
【図１６】ＳＶＶの２Ｂコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド１９６６〜２３４９と同一である。
【図１７】配列番号：１１でコードされるＳＶＶ  ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１２）を表す。配列番号：１２で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸６５６〜７８３と同一である。
【図１８】ＳＶＶの２Ｃコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：１３）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド２３５０〜３３１５と同一である。
【図１９】配列番号：１３でコードされるＳＶＶ  ２Ｃタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１４）を表す。配列番号：１４で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸７８４〜１１０５と同一である。
【図２０】ＳＶＶの３Ａコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：１５）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド３３１６〜３５８５と同一である。
【図２１】配列番号：１５でコードされるＳＶＶ  ３Ａタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１６）を表す。配列番号：１６で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸１１０６〜１１９５同一である。
【図２２】ＳＶＶの３Ｂコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：１７）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド３５８６〜３６５１と同一である。
【図２３】配列番号：１７でコードされるＳＶＶ  ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１８）を表す。配列番号：１８で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸１１９６〜１２１７と同一である。
【図２４】ＳＶＶの３Ｃコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：１９）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド３６５２〜４２８４と同一である。
【図２５】配列番号：１９でコードされるＳＶＶ  ３Ｃタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２０）を表す。配列番号：２０で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸１２１８〜１４２８と同一である。
【図２６】ＳＶＶの３Ｄコード領域のヌクレオチド配列（配列番号：２１）を表す。この配列は配列番号：１のヌクレオチド４２８５〜５２７３と同一である。
【図２７】配列番号：２１でコードされるＳＶＶ  ３Ｄタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２２）を表す。配列番号：２２で提示される配列は、配列番号：２のアミノ酸１４２９〜１８９０と同一である。
【図２８Ａ−Ｈ】ＳＶＶ  配列番号：２と、カルジオウイルス属の多様なメンバー、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ、脳心筋炎ウイルス種）、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ、サイロウイルス種）、ラットＴＭＥＶ様作用物質（ＴＬＶ、サイロウイルス種）及びヴィリュイスクヒト脳脊髄炎ウイルス（ＶＨＥＶ、サイロウイルス種）との間の配列整列化を表す。多様なカルジオウイルスの特定の配列は、配列番号Ｓ：２３（ＥＭＣＶ−Ｒ）、２４（ＥＭＣＶ−ＰＶ２１）、２５（ＥＭＣＶ−Ｂ）、２６（ＥＭＣＶ−Ｄａ）、２７（ＥＭＣＶ−Ｄｂ）、２８（ＥＭＣＶ−ＰＶ２）、２９（ＥＭＣＶ−Ｍｅｎｇｏ）、３０（ＴＭＥＶ／ＤＡ）、３１（ＴＭＥＶ／ＧＤＶＩＩ）、３２（ＴＭＥＶ／ＢｅＡｎ８３８６）、３３（ＴＬＶ−ＮＧＳ９１０）及び３４（ＶＨＥＶ／Ｓｉｂｅｒｉａ−５５）に表されている。  図２８の位置の数字は、配列リストの数字付けに対応していない。符号「／」は、ポリタンパク質が開裂されて最終的な機能性産物になる開裂位置を示す。例えば、位置１と１５７との整列化は１Ａ（ＶＰ４）領域においてである。位置間の整列化は以下である：１５９と４２８は１Ｂ（ＶＰ２）領域においてであり；４３０と６６８は１Ｃ（ＶＰ３）領域においてであり；６７０と９６７は１Ｄ（ＶＰ１）領域においてであり；９６９と１１１１は２Ａ領域においてであり；１１１２と１２７６は２Ｂ領域においてであり；１２７８と１６０９は２Ｃ領域においてであり；１６１１と１７００は３Ａ領域においてであり；１７０２と１７２３は３Ｂ領域においてであり；１７２５と１９４６は３Ｃ領域においてであり；１９４８と２４１０は３Ｄ領域においてである。整列化は、潜在的な保護の領域及びウイルス配列間の類似性も示し、標準配列分析プログラムで決定することができる。整列化は、BioEdit 5.0.9及びClustal W 1.81を使用して生成された。
【図２９】配列番号：２に関するＳＶＶの最終ポリペプチド産物を提示する。幾つかの保存モチーフが太字になり下線を付けられている：２Ａ／２Ｂ「開裂」（ＮＰＧＰ（配列番号：１１１））；２Ｃ  ＡＴＰ−結合（ＧｘｘＧｘＧＫＳ／Ｔ（配列番号：１１２）及びｈｙｈｙｈｙｘｘＤ）；３Ｂ（ＶＰｇ）／ＲＮＡ結合残基（Ｙ）；３Ｃ（ｐｒｏ）活性残基（Ｈ、Ｃ、Ｈ）；３Ｄ（ｐｏｌ）モチーフ（ＫＤＥＬ／ＩＲ（配列番号：１１３）、ＰＳＧ、ＹＧＤＤ（配列番号：１１４）、ＦＬＫＲ（配列番号：１１５））。
【図３０】ＳＶＶとピコルナウイルスとの統計学的関連性を決定するため配列番号Ｓ：１及び２を用いた配列分析に使用されたピコルナウイルス種を提示する（実施例４、パートＩを参照すること）。
【図３１】ＶＰ２配列分析の観点からＳＶＶ（配列番号：４）とピコルナウイルスとの統計学的関連性を示す。この表はブートストラップ隣接連結ツリーを示す（実施例４、パートＩを参照すること）。
【図３２】ＳＶＶ（配列番号：６）と他のピコルナウイルスとの間のＶＰ３のブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３３】ＳＶＶ（配列番号：８）と他のピコルナウイルスとの間のＶＰ１のブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３４】ＳＶＶ（すなわち、部分Ｐ１−配列番号：２のアミノ酸２〜６４１）と他のピコルナウイルスとの間のＰ１（すなわち、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄ）のブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３５】ＳＶＶ（配列番号：１４）と他のピコルナウイルスとの間の２Ｃのブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３６】ＳＶＶ（配列番号：２０）と他のピコルナウイルスとの間の３Ｃ（ｐｒｏ）のブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３７】ＳＶＶ（配列番号：２２）と他のピコルナウイルスとの間の３Ｄ（ｐｏｌ）のブートストラップ隣接連結ツリーを示す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３８】ＳＶＶ（配列番号：４）と他のピコルナウイルスとの間のＶＰ２の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図３９】ＳＶＶ（配列番号：６）と他のピコルナウイルスとの間のＶＰ３の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４０】ＳＶＶ（配列番号：８）と他のピコルナウイルスとの間のＶＰ１の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４１】ＳＶＶ（部分カプシド又はＰ１−配列番号：２のアミノ酸２〜６４１）と他のピコルナウイルスとの間のＰ１の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４２】ＳＶＶ（配列番号：１４）と他のピコルナウイルスとの間の２Ｃの実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４３】ＳＶＶ（配列番号：２０）と他のピコルナウイルスとの間の３Ｃ（ｐｒｏ）の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４４】ＳＶＶ（配列番号：２２）と他のピコルナウイルスとの間の３Ｄ（ｐｏｌ）の実際のアミノ酸同一率を表す（施例４、パートＩを参照すること）。
【図４５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されるＳＶＶのＶＰ２（約３６kDa）、ＶＰ１（約３１kDa）及びＶＰ３（約７kDa）タンパク質を示す。精製されたＳＶＶをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、タンパク質を銀染色により可視化した。レーン「ＭＷｔ」は、分子量マーカーであり、レーン「ＳＶＶ」は、ＳＶＶの構造タンパク質を含む。３つの分子量マーカーの大きさ及びウイルスタンパク質の名称も提示されている。
【図４６Ａ−Ｂ】全身投与後の血液中及び腫瘍中のＳＶＶの量を示す（実施例７）。Ｈ４３６腫瘍担持ヌードマウスを、ＳＶＶの１×１０12vp/kgの用量で尾静脈注射により処置した。マウスを、注射の０、１、３、６、２４、４８、７２時間後、及び７日後に出血させ、収集した直後に血液から血漿を分離し、感染培地で希釈し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染するために使用した。腫瘍を、注射の６、２４、４８、７２時間後及び７日後に採取した。腫瘍を小型の切片に切断し、１mLの培地に懸濁し、ＣＶＬを作製した。
【図４６Ｃ−Ｄ】ＳＶＶインビボクリアランスに関連するデータを表す。この図は、ＳＶＶが、静脈内アデノウイルスの同様の用量と比較して著しく長い血中残留時間を示し（実施例７）、したがってＳＶＶは、インビボでアデノウイルスよりも遅いクリアランス率を有する。単回静脈内投与の後、ＳＶＶは血液中に６時間まで存在し続け（図４６Ｃ；図４６Ｃは、図４６Ｄと比較する目的で、図４６Ａの複製である）、一方、アデノウイルスは、約１時間で血液から排除又は枯渇される（図４６Ｄ）。
【図４７】Ｈ４４６異種移植片の免疫組織化学、並びにマトキシリン及びエオシン染色を示す（実施例７）。Ｈ４３６腫瘍担持ヌードマウスを、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）によるか又はＳＶＶの１×１０12vp/kgの用量で尾静脈注射により処置した。マウスを注射の３日後に殺処理し、腫瘍を収集した。腫瘍細胞中のウイルスタンパク質を、ＳＶＶ特異性マウス抗体を使用して免疫組織化学により可視化する。（上側のパネル）。ＨＢＳＳ又はＳＶＶ処置マウスから収集したＨ４４６腫瘍細胞の一般的な形態をＨ＆Ｅ染色で染色した（下側のパネル）。
【図４８】初代ヒト肝細胞におけるＳＶＶ仲介細胞毒性を示す（実施例９）。コラーゲン被覆１２ウエルプレートで平板培養した初代ヒト肝細胞を、ＳＶＶにより細胞１個あたり１、１０、１００及び１０００個の粒子（ppc）で感染させた。感染の３日後、細胞関連乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）及び培養上澄み中のＬＤＨを別々に測定した。細胞毒性の率は、最大細胞ＬＤＨ＋上澄みＬＤＨに対する上澄み中のＬＤＨ単位の割合として決定した。
【図４９】選択した細胞株におけるＳＶＶによるウイルス産生を示す。ＳＶＶの複製能力を評価するために、選択された正常細胞及び腫瘍細胞をＳＶＶにより細胞１個あたり１個のウイルス粒子（ppc）で感染させた（実施例９）。７２時間後、細胞を採取し、ＣＶＬをＰＥＲ．Ｃ６細胞で力価についてアッセイした。それぞれの細胞株では、ＳＶＶ複製の効率を１ミリリットルあたりのプラーク形成単位（pfu/ml）として表した。
【図５０】体重によるヌードマウス及びＣＤ１マウスにおける毒性を示す（実施例１０）。それぞれの処置群におけるマウスの平均体重を、ウイルス投与後の異なる日数で測定した。マウスには、１日目に尾静脈に単回用量のＳＶＶ又はＰＢＳを注射した。
【図５１】Ｈ４４６異種移植モデルでの効力を示す。Ｈ４４６腫瘍をヌードマウスに確立し、マウスを群に分け（ｎ＝１０）、ＨＢＳＳか又は６つの異なる用量のＳＶＶのいずれかで尾静脈注射により処置する（実施例１１）。研究の２０日目に、大型の腫瘍（平均腫瘍量＝２０００mm3）を担持するＨＢＳＳ群の５匹のマウスに、１×１０11vp/kgを注射した（矢印で示す）。データを平均腫瘍量＋標準偏差（ＳＤ）として表す。
【図５２】ＳＶＶで未処置又は処置されたＨ４４６異種移植ヌードマウスの写真を示す（実施例１１）。ＳＶＶの効力は、既に確立している大型の腫瘍の１００％を完全に消滅させたという点において、非常に強力である。ＳＶＶ処置マウスは、注射後少なくとも２００日間は臨床症状も、腫瘍の再発も示していない。
【図５３】ＳＶＶ腫瘍特異性及びインビボでの効力に関するデータを表す（実施例１１）。グラフは、Ｈ４４６ヒト小型細胞肺癌（ＳＣＬＣ）腫瘍細胞（上側グラフ）又は正常なヒトＨ４６０細胞（下側グラフ）とのインキュベーションの後の細胞生存を示す。ＳＶＶは、細胞１個あたりおよそ１０-3個の粒子のＥＣ50で腫瘍細胞を特異的に死滅させた。対照的に、正常なヒト細胞はＳＶＶのいずれの濃度でも死滅しなかった。
【図５４】ＳＶＶの全ゲノムを含む代表的なプラスミドを示す（実施例１５）。ＳＶＶ配列の上流のベクターにおけるＴ７プロモーターの存在は、ＳＶＶ配列のインビトロ転写を可能にし、それによりＳＶＶ  ＲＮＡ分子を生成することができる。
【図５５】完全長及び機能ゲノムＳＶＶプラスミドの構築、続くＳＶＶウイルス産生の概略図を示す（実施例１６）。機能ゲノムＳＶＶクローンを得るために、ＳＶＶの全ゲノムをＴ７プロモーターによりベクターにクローン化することができる。これは、ウイルスのｃＤＮＡクローンを作製し、それらを配列決定し、隣接片を一つのプラスミドにクローニングして、「ｐＳＶＶ」と示されるプラスミドをもたらすことによって達成することができる。次にＳＶＶの完全ゲノムを有するプラスミドを逆転写して、ＳＶＶ  ＲＮＡを生成することができる。次にＳＶＶ  ＲＮＡを許容性哺乳類細胞に形質移入し、次にＳＶＶウイルス粒子を回収し、精製する。
【図５６】ＳＶＶカプシドのコード配列（すなわち、１Ａ〜１Ｄのコード領域）を含むベクター（「ｐＳＶＶカプシド」）を構築する概略図を示す（実施例１６）次にｐＳＶＶカプシドを使用して、ＳＶＶカプシド突然変異体のライブラリーを生成することができる。
【図５７】ＳＶＶカプシド突然変異体のライブラリーを生成するためにＳＶＶカプシドを突然変異させる一つの方法を示す（実施例１６）。この図は、プラスミドのランダム部位へのオリゴヌクレオチド配列の挿入を示す。オリゴヌクレオチドは、ランダムオリゴヌクレオチド、既知の配列を有するオリゴヌクレオチド、又はエピトープタグをコードするオリゴヌクレオチドであることができる。この図において、制限酵素ＣｖｉＪＩは、ｐＳＶＶカプシドＤＮＡをランダムに開裂する。単一部位で切断された直線化ｐＳＶＶカプシドＤＮＡを単離し、ゲルで精製し、オリゴヌクレオチドと連結する。
【図５８】カプシドコード領域に配列突然変異体を含む完全長ＳＶＶ突然変異体のライブラリーを生成するスキームを表す（実施例１６）。例えば、ｐＳＶＶカプシド突然変異体のライブラリー（例えば、図５７で示されているスキームに従って生成された）からのカプシドコード領域を、制限消化により単離し、ゲル精製する。完全長ＳＶＶ配列を含むベクターも消費され、それによりカプシドコード領域が切り出される。次にｐＳＶＶカプシド突然変異体のライブラリーからのカプシドコード領域を、野生型カプシド配列を欠いているｐＳＶＶベクターに連結し、それによって、カプシドコード領域に複数の突然変異体を有する完全長ＳＶＶ突然変異体（「ｐＳＶＶＦＬ」ベクター）のライブラリーを生成する。
【図５９】カプシド突然変異体のライブラリーを含むＳＶＶウイルス粒子を産生する一般的な方法を表す（実施例１６）。ｐＳＶＶＦＬベクターを逆転写してＳＶＶ  ＲＮＡを生成する。ＳＶＶ  ＲＮＡを許容性細胞に形質移入し、ＳＶＶ突然変異ウイルス粒子を産生する。ウイルス粒子は細胞を溶解し、複数のカプシド突然変異体を含むＳＶＶウイルス粒子の個体群「ＳＶＶカプシドライブラリー」を単離する。
【図６０】図６０は、腫瘍細胞を特異的に感染することができるが、非腫瘍細胞を感染することができないＳＶＶカプシド突然変異体をスクリーニングする一般的な方法を示す。ＳＶＶカプシドライブラリーを、目的の腫瘍細胞株又は組織と共にインキュベートする。最初のインキュベーション時間の後、細胞を洗浄し、それにより、細胞に進入できなかったＳＶＶウイルス粒子を排除する。次に、ウイルス溶解産物が観察されるまで、細胞を培養に維持する。次に培養上澄みを収集して、腫瘍細胞を細胞溶解的に感染することができたＳＶＶカプシド変異体を単離する。次にこれらのウイルスを、逆スクリーニングする前に、既知の許容性細胞株に感染させることによって増殖することができる。逆スクリーニングは、腫瘍細胞に感染することができたＳＶＶカプシド突然変異ウイルスと、正常な細胞をインキュベートすることによって実施される。上澄み中で非結合のままでいるウイルスのみを収集し、それによって、腫瘍特異性を有する突然変異ＳＶＶウイルスを単離する。このプロセスを繰り返して、ＳＶＶ腫瘍特異性ウイルスの単離を更に精密化することができる。
【図６１】ウイルス変異体が細胞株に結合及び／又は感染するかを試験する伝統的な方法を示す。伝統的な方法は、細胞株を増殖させるには多くの場合非効率な方法、すなわちフラスコを必要とし、それによって多数の異なる細胞株に関するウイルス突然変異体のライブラリーをマススクリーニングすることが煩わしくなる。
【図６２】異なる細胞株に特異的に感染する能力を有するウイルス突然変異体をスクリーニングする本発明のハイスループット方法を示す（実施例１６）。この図では、多数の異なる腫瘍細胞株を３８４ウエルプレートで増殖させる。それぞれのウエルに、ウイルスの試料を加える（例えば、ＳＶＶカプシドライブラリーの試料）。細胞変性効果を示すこれらのウエルから培地を回収し、これによって、培地中の任意のウイルスを、フラスコ中又は大型組織培養プレート中の許容細胞株（例えば、ＳＶＶでは、Ｈ４４６又はＰＥＲ．Ｃ６）に感染させることによって増幅することができる。ウイルスを増殖させ、それによりＲＮＡを単離し、配列分析して、カプシドのオリゴヌクレオチド挿入突然変異誘発により挿入されたコードペプチド配列を決定することができる。次にペプチドそれ自体を試験して、腫瘍細胞型に特異的に結合できるかを決定することができる。
【図６３】別のハイスループットスクリーニングの概略図を示す（実施例１６）。腫瘍及び正常細胞株をマルチウエルプレートで増殖させる。ウイルスをそれぞれのウエルに加え、細胞がウイルス仲介細胞溶解により死滅するかを試験する。それぞれのウエルで吸光度を読み取ることによって、細胞変性効果を素速く評価することができる。細胞変性効果を示すウエルからのウイルスを増殖させ、更に、インビトロモデル（腫瘍及び正常細胞株について再試験する）及びインビボモデル（ウイルスが、マウスに外植した腫瘍を死滅できるかを試験する）で試験する。
【図６４】新たな腫瘍特異的親和性を有するＳＶＶカプシド突然変異体（表れる順番でそれぞれ配列番号Ｓ：４５〜４８）を分析して、腫瘍選択的ペプチドを生成することができることを示す。腫瘍細胞の特異的感染を可能にするこれらのＳＶＶカプシド突然変異体を配列決定して、オリゴヌクレオチド挿入によりコードされるペプチドを決定する。それよってアミノ酸コンセンサス配列を、成功したカプシド突然変異体から決定することができる。次にコンセンサス配列を有するペプチドを試験して、これらが目的の腫瘍細胞型に特異的に結合できるかを決定することができる。次に腫瘍選択的ペプチドを毒素又は薬剤に結合して、腫瘍特異性標的ビヒクルとして役立てることができる。
【図６５】ＳＶＶカプシドライブラリーを最初にインビボで試験できることを示す。マウス（正常、胸腺欠損、ヌード、ＣＤ−１トランスジェニックなどを含む）を、特定の腫瘍で外植することができる。次にこれらのマウスに、ＳＶＶカプシドライブラリーのようなＳＶＶ誘導体ライブラリーを注射する。特定の時点で、腫瘍細胞をマウスから回収し、それにより、腫瘍の排除を示すマウスにおいて、ウイルスを最初の腫瘍試料から単離し、許容細胞で増殖させる。
【図６６】本発明のＳＶＶ誘導体の臨床試験プログラムを示す。
【図６７】カプシドにおいてエピトープタグをコードする（新たな腫瘍親和性を有する）ＳＶＶ誘導体を、多様な目的に使用できることを示す。これらをスクリーニング試薬として使用して、エピトープの存在をアッセイすることによって特定の腫瘍細胞が組織試料に存在するかを検出することができる。あるいは、毒素又は他の治療薬をエピトープタグに結合し、次にウイルスを患者に投与することができる。更に、ＳＶＶの野生型又は誘導体を照射又は不活性化することができ、それによりウイルス粒子それ自体が治療薬剤として使用される。ウイルス粒子は、アポトーシス誘発ペプチドの存在により細胞アポトーシスを誘発するか、又は粒子に毒素又は他の何らかの治療薬を結合させて、それによりウイルスを特異的な標的送達装置として使用することができる。
【図６８】ピコルナウイルスの基本的な生活環を示す。
【図６９】他のピコルナウイルスと比較したＳＶＶのポリペプチドの長さの比較を示す。
【図７０】ピコルナウイルス２Ａ様ＮＰＧ／Ｐタンパク質のアミノ酸比較（表れる順番でそれぞれ配列番号Ｓ：４９〜１１０）を提示する。ＳＶＶの配列は、配列番号：２の残基６３５〜６５６で提示されている。
【図７１】ＥＭＣＶ−Ｒのアミノ酸配列（配列番号：２３）を提示する。
【図７２】ＥＭＣＶ−ＰＶ２１（受入番号ＣＡＡ５２３６１）のアミノ酸配列（配列番号：２４）を提示する。
【図７３】ＥＭＣＶ−Ｂ（受入番号Ｐ１７５９３）のアミノ酸配列（配列番号：２５）を提示する。
【図７４】ＥＭＣＶ−Ｄａ（受入番号Ｐ１７５９３）のアミノ酸配列（配列番号：２６）を提示する。
【図７５】ＥＭＣＶ−Ｄｂのアミノ酸配列（配列番号：２７）を提示する。
【図７６】ＥＭＣＶ−ＰＶ２（受入番号ＣＡＡ６０７７６）のアミノ酸配列（配列番号：２８）を提示する。
【図７７】ＥＭＣＶ−ｍｅｎｇｏ（受入番号ＡＡＡ４６５４７）のアミノ酸配列（配列番号：２９）を提示する。
【図７８】ＴＭＥＶ／ＤＡ（受入番号ＡＡＡ４７９２８）のアミノ酸配列（配列番号：３０）を提示する。
【図７９】ＴＭＥＶ／ＧＤＶＩＩ（受入番号ＡＡＡ４７９２９）のアミノ酸配列（配列番号：３１）を提示する。
【図８０】ＴＭＥＶ／ＢｅＡｎ８３８６（受入番号ＡＡＡ４７９３０）のアミノ酸配列（配列番号：３２）を提示する。
【図８１】ＴＬＶ−ＮＧＳ９１０（受入番号ＢＡＣ５８０３５）のアミノ酸配列（配列番号：３３）を提示する。
【図８２】ＶＨＥＶ／Ｓｉｂｅｒｉａ−５５（受入番号ＡＡＡ４７９３１）のアミノ酸配列（配列番号：３４）を提示する。
【図８３Ａ−Ｈ】ＳＶＶ（配列番号：１６８）の完全長ゲノム配列及びコードされたポリタンパク質アミノ酸配列（配列番号：１６９）を表し、この完全長ゲノム配列は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するＳＶＶ分離株から増殖されたＳＶＶウイルスから得た。ＳＶＶゲノム配列の特定の特徴、例えばポリタンパク質配列から開裂したタンパク質の特定のコード領域がここで記載されている。
【図８４Ａ−Ｄ】ＳＶＶ（配列番号：１６８）の完全長ゲノム配列を表す。この配列は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ−５３４３を有するＳＶＶ分離株から増殖されたＳＶＶから得た。
【図８５Ａ−Ｂ】配列番号：１６８のヌクレオチド６６７〜７２０９でコードされたＳＶＶの完全長ポリタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１６９）を表す。
【図８６】配列番号：１６８及び１６９のＳＶＶの完全長ゲノム及びポリタンパク質配列に関するＳＶＶの統計学的分析又は疫学を提供する。ＳＶＶは独特のウイルスであり、系統学的にはカルジオウイルスに類似しているが、異なるツリーである。ＳＶＶ様ピコルナウイルスは、ＳＶＶとＳＶＶ様ピコルナウイルスの間に高レベルの配列同一性があるので（図８７〜８９を参照すること）、及びＳＶＶ様ピコルナウイルスに対して発生された抗体のＳＶＶに結合する能力のために（その逆も同様である）（実施例４パートＩＩＩ、血清研究を参照すること）、ＳＶＶと同じツリー又は属である可能性が最も高い。
【図８７Ａ−Ｄ】Ｐ１構造領域及び２Ａの地域でＳＶＶと幾つかのＳＶＶ様ピコルナウイルスとの間の核酸配列の比較を示す。特に、比較は、ＶＰ２（部分）−ＶＰ３−ＶＰ１−２Ａ（部分）領域においてである。提示されているＳＶＶ配列は、配列番号：１７０であり、単離ＩＡ８９−４７７５２の提示されている配列は、配列番号：１７１であり；単離ＣＡ１３１３９５の提示されている配列は、配列番号：１７２であり；単離ＮＣ８８−２３６２６の配列は、配列番号：１７３であり；単離ＭＮ８８−３６６９５の提示されている配列は、配列番号：１７４であり；単離ＮＪ９０−１０３２４の提示されている配列は、配列番号：１７５であり；単離ＩＬ９２−４８９６３の提示されている配列は、配列番号：１７６であり；単離ＬＡ１２７８（９７−１２７８）の提示されている配列は、配列番号：１７７であり；提示されているコンセンサス配列は、配列番号：１７８である。
【図８８】２Ｃコード領域（部分）におけるＳＶＶと単離ＩＡ９−４７７５２及びＣＡ１３１３９５の核酸配列の比較を示す。提示されているＳＶＶ配列は、配列番号：１７９であり；単離ＩＡ８９−４７７５２の提示されている配列は、配列番号：１８０であり；単離ＣＡ１３１３９５の提示されている配列は、配列番号：１８１であり；提示されているコンセンサス配列は、配列番号：１８２である。
【図８９Ａ−Ｂ】３Ｄポリメラーゼコード領域（部分）及び３′ＵＴＲ領域において、ＳＶＶと単離ＮＣ８８−２３６２６、ＭＮ８８−３６６９５、ＩＡ８９−４７７５２、ＮＪ９０−１０３２４、ＩＬ９２−４８９６３、ＬＡ９７−１２７８及びＣＡ１３１３９５との間の核酸配列の比較を示す。提示された配列は、ＳＶＶ（配列番号：１８３）、ＮＣ８８−２３６２６（配列番号：１８４）、ＭＮ８８−３６６９５（配列番号：１８５）、ＩＡ８９−４７７５２（配列番号：１８６）、ＮＪ  ９０−１０３２４（配列番号：１８７）、ＩＬ  ９２−４８９６３（配列番号：１８８）、ＬＡ  ９７−１２７８（配列番号：１８９）、ＣＡ  １３１３９５（配列番号：１９０）及びコンセンサス配列（配列番号：１９１）である。
【図９０Ａ−Ｅ】ＳＶＶの単回用量がマウスの外植腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止するのに有効であることを示す。図９０Ａは、ＳＶＶが外植Ｈ４４６ヒトＳＣＬＣ腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止できることを示す（ＥＤ50＝０．０００７）。図９０Ｂは、ＳＶＶが外植Ｙ７９ヒト網膜芽細胞腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止できることを示す（ＥＤ50＝０．０００７）。図９０Ｃは、ＳＶＶが外植Ｈ６９ＡＲヒトＳＣＬＣ−ＭＤＲ（多剤耐性）腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止できることを示す（ＥＤ50＝０．０５）。図９０Ｄは、ＳＶＶが外植Ｈ１２９９ヒトＨＳＣＬＣ腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止できることを示す（ＥＤ50＝４．８）。図９０Ｅは、ＳＶＶがＡ／Ｊマウス（正常な免疫適性マウス）において外植Ｎ１Ｅ−１１５マウス神経芽細胞腫瘍の大きさを低減し、増殖を防止できることを示す（ＥＤ50＝０．００１）。
【図９１】ＳＶＶの配列と比較したＥＭＣＶ及びＴＭＥＶカプシド構造の分子モデルを示す。抗原予測のアルゴリズムの使用を伴う分子モデルは、ペプチド配列をポリクローナル抗体生成のために選択することを可能にする。βシートは茶色で示され、αヘリックスは緑色で示され、ポリクローナル生成のために選択される１２−ｍｅｒペプチド配列は、黄色で示される。このモデルによると良好な表面露出を表すので、（ＶＰ２領域において）特定の配列が選択される。
【図９２Ａ−Ｄ】ＳＶＶに対するポリクローナル抗体の特異性を示す。図９２Ａは、陰性対照であり、非特異性抗マウス血清及び第２抗体により染色された、ＳＶＶで感染された細胞の免疫蛍光画像を表す。図９２Ｂ及び９２Ｃは、１：５０に希釈されたマウス抗ＳＶＶ血清及び第２抗体（蛍光体に結合した抗マウスＩｇ）により染色された、ＳＶＶで感染された細胞を示す。図９２Ｄは、ポリクローナル抗ＳＶＶ抗体をウイルス結合アッセイに使用できることを示し、ＳＶＶの内部移行を防止するために細胞を氷の上に置いたので、画像は、細胞の輪郭の周りＳＶＶが集中している免疫蛍光画像を示す。
【図９３】ＳＶＶのＧＰ１０２血清の中和アッセイの結果を示す（実施例１８を参照すること）。中和力価（ウイルスを中和する最も高い希釈を１００％として計算）は１：１００である。
【図９４】ＭＮ８８−３６６９５に対する抗ＳＶＶ抗血清の中和アッセイの結果を示す（実施例１８を参照すること）。中和力価は１：５６０である。
【図９５Ａ−Ｂ】隣接連結ツリーを示す。これらのツリーは、ＰＨＹＬＩＰ（Phylogeny Inference Package Computer Programs for Inferring Phylogenies）を使用して構築し、Ｐ１及び部分２Ａ（図９５Ａ）の領域、並びにゲノムの３′末端（図９５Ｂ）の領域からの配列を比較したときの、ＳＶＶと７個のＳＶＶ様ピコルナウイルスとの間の関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２８Ｈ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８２】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８３Ｃ】
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【図８３Ｄ】
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【図８３Ｅ】
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【図８３Ｆ】
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【図８３Ｇ】
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【図８３Ｈ】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【図８４Ｃ】
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【図８４Ｄ】
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【図８５Ａ】
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【図８５Ｂ】
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【図８６】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８７Ｃ】
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【図８７Ｄ】
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【図８８】
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【図８９Ａ】
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【図８９Ｂ】
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【図９０Ａ】
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【図９０Ｂ】
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【図９０Ｃ】
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【図９０Ｄ】
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【図９０Ｅ】
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【図９１】
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【図９２Ａ】
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【図９２Ｂ】
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【図９２Ｃ】
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【図９２Ｄ】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５Ａ】
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【図９５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008533988.tif 000175