(57)【要約】  キメラプロモーター配列、並びに、キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列の挿入のためのクローニング部位を含んでなる核酸構築物であって、キメラプロモーターが：(a) hCMV前初期プロモーター配列；(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及び少なくともエクソン２の一部；並びに(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロンを含んでなる、前記核酸構築物。【選択図】図１６
2008528020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
（i）（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含むキメラプロモーター配列、
（ii）キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン（HA）抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
（iii）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び
（iv）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)由来、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列、
を含んでなる前記核酸構築物。
【請求項２】
コード配列は二以上の前記HA、断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
コード配列は３つ〜５つの異なるインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
コード配列は３つ又は４つの非パンデミックインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項５】
コード配列はパンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構築物で被覆された担体粒子。
【請求項７】
請求項１に記載の少なくとも２つの異なる核酸構築物で被覆された担体粒子であって、前記各構築物は異なるインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、前記担体粒子。
【請求項８】
３つ〜５つの異なる前記構築物で被覆された、請求項７に記載の担体粒子。
【請求項９】
３つ又は４つの前記構築物は異なる非パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする、請求項８に記載の担体粒子。
【請求項１０】
パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする前記構築物で被覆された、請求項７〜９のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項１１】
プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含む核酸構築物でも同様に被覆され、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードする、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項１２】
プロモーター配列はキメラプロモーター配列であって、当該キメラプロモーター配列が
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含んでなる、請求項１１に記載の前記担体粒子。
【請求項１３】
ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項１１又は１２に記載の担体粒子。
【請求項１４】
核酸構築物は２つのコード配列を含み、それぞれが異なる前記サブユニット、断片又はバリアントを含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項１５】
２つのコード配列はそれぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項１４に記載の担体粒子。
【請求項１６】
核酸構築物は、さらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び
（b）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列、
を含む、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項１７】
金粒子である、請求項６〜１６のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項１８】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
【請求項１９】
請求項６〜１７のいずれか１項に記載に被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項２０】
無針注射器である、請求項１９に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項２１】
インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
（i）（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含むキメラプロモーター配列、
（ii）キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン（HA）抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
を含んでなる前記核酸構築物。
【請求項２２】
さらに
（iii）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、又は
（iv）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列、
を含んでなる、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項２３】
コード配列は二以上の前記HA、断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項２１又は２２に記載の核酸構築物。
【請求項２４】
コード配列は３つ〜５つの異なるインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項２３に記載の核酸構築物。
【請求項２５】
コード配列は３つ又は４つの非パンデミックインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項２４に記載の核酸構築物。
【請求項２６】
コード配列はパンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の核酸構築物で被覆された担体粒子。
【請求項２８】
請求項２１に記載の少なくとも２つの異なる核酸構築物で被覆された担体粒子であって、前記各構築物は異なるインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、前記担体粒子。
【請求項２９】
３〜５つの異なる前記構築物で被覆された請求項２８に記載の担体粒子。
【請求項３０】
３つ又は４つの前記構築物は異なる非パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする、請求項２９に記載の担体粒子。
【請求項３１】
パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする前記構築物で被覆された、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項３２】
プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含む核酸構築物でも同様に被覆され、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードする、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項３３】
プロモーター配列はキメラプロモーター配列であって、当該キメラプロモーター配列が
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含んでなる、請求項３２に記載の前記担体粒子。
【請求項３４】
ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項３２又は３３に記載の担体粒子。
【請求項３５】
核酸構築物は２つのコード配列を含み、それぞれが異なる前記サブユニット、断片又はバリアントを含む、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項３６】
２つのコード配列はそれぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項３５に記載の担体粒子。
【請求項３７】
核酸構築物は、さらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び／又は
（b）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列、
を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項３８】
金粒子である、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載の担体粒子。
【請求項３９】
請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
【請求項４０】
請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項４１】
無針注射器である、請求項４０に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項４２】
キメラプロモーター配列及び当該キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がインフルエンザウイルス抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つ前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードし、並びにキメラプロモーター配列が
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；及び
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含む、前記核酸構築物。
【請求項４３】
コードされた抗原はインフルエンザ・ヘマグルチニン(HA)、その免疫原性断片、又はいずれかと少なくとも80％のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４４】
コードされた抗原はインフルエンザ・ノイラミニダーゼ(NA)、M2、いずれか一方の免疫原性断片、又は前記NA、M2若しくは断片のいずれかと少なくとも80％のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項４５】
インフルエンザ抗原、免疫原性断片、又はバリアントはパンデミックインフルエンザ株由来である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項４６】
前記構築物は二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項４７】
前記構築物はパンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアント、及び一以上の非パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする、請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項４８】
コードされた少なくとも２つの異なる抗原、断片、又はバリアントが異なるインフルエンザウイルス株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項４６又は４７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項４９】
キメラプロモーター配列及び当該キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードしており、かつ前記キメラプロモーター配列が
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン；
を含む前記核酸構築物。
【請求項５０】
ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項４９に記載の核酸構築物。
【請求項５１】
２つのコード配列を含み、それぞれが異なるサブユニット、断片又はバリアントを含み、かつそれぞれが前記キメラプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項４９又は５０に記載の核酸構築物。
【請求項５２】
前記２つのコード配列は、それぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項５１に記載の核酸構築物。
【請求項５３】
前記２つのコード配列は逆方向である、請求項５１又は５２に記載の核酸構築物。
【請求項５４】
前記２つのコード配列は同方向である、請求項５１又は５２に記載の核酸構築物。
【請求項５５】
hCMV前初期プロモーター配列（a）は、
（i）配列番号１、配列番号５４のヌクレオチド903〜1587、配列番号６１のヌクレオチド1815〜1935、配列番号６１のヌクレオチド1948〜2632、配列番号６２のヌクレオチド1002〜1686、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド2624〜3308のヌクレオチド配列、
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント、又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
を含む、請求項４２〜５４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項５６】
エクソン配列（b）は、
（i）配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号５４のヌクレオチド1588〜1718、配列番号６１のヌクレオチド1684〜1814、配列番号６１のヌクレオチド2633〜2763、配列番号６２のヌクレオチド1687〜1817、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド3309〜3439のヌクレオチド配列、
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント、又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
を含む、請求項４２〜５５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項５７】
異種イントロン（c）がラットインスリン遺伝子イントロンA配列、ニワトリケラチン遺伝子イントロンA配列、ニワトリ心筋アクチン遺伝子イントロンA配列、それらいずれかの機能性断片、又は前記いずれかの機能性バリアントから選択される配列を含む、請求項４２〜５６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項５８】
ラットインスリン遺伝子イントロンA配列は、
（i）配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５４のヌクレオチド1725〜1857、配列番号６１のヌクレオチド1545〜1677、配列番号６１のヌクレオチド2770〜2902、配列番号６２のヌクレオチド1824〜1956、及び／又は配列番号６２のヌクレオチド3346〜3578のヌクレオチド配列；
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；或いは
（iii）（i）又は（ii）の機能性断片
を含む、請求項５７に記載の核酸構築物。
【請求項５９】
キメラプロモーター配列は、
（i）配列番号４のヌクレオチド配列、若しくは配列番号５４のヌクレオチド903〜1857のヌクレオチド配列；
（ii）（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
を含む、請求項４２〜５８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項６０】
核酸構築物が
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び／又は
（b）HBsAg配列の、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’非翻訳領域(UTR)由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつクローニング部位の下流にあるエンハンサー配列、
をさらに含む請求項４２〜５９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項６１】
（i）配列番号１４で提供されるpPJV7563ベクターの配列；又は
（ii）（i）の配列と少なくとも60％の配列同一性をもつ配列を含み、かつ
前記抗原、断片若しくはバリアントをコードする配列がキメラプロモーターに機能可能に連結されるように、前記配列（i）又は（ii）において提供される、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項６２】
コード配列はHA抗原、その免疫原性バリアント、又はいずれかの免疫原性断片をコードする、請求項６１に記載の核酸構築物。
【請求項６３】
配列番号５４で提供されるpPJV1671ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項６４】
配列番号５９で提供されるpPML7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項６５】
配列番号６１で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む、請求項４９に記載の核酸構築物。
【請求項６６】
配列番号６２で提供されるpPJV7788ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む、請求項４９に記載の核酸構築物。
【請求項６７】
プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がインフルエンザウイルス抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードし、さらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、並びに／或いは
（b）コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物。
【請求項６８】
コードされた抗原はインフルエンザ・ヘマグルチニン(HA)、その免疫原性断片、又はいずれかと少なくとも80％のアミノ酸配列相同性をもつ免疫原性バリアントである、請求項６７に記載の核酸構築物。
【請求項６９】
コードされた抗原はインフルエンザ・ノイラミニダーゼ(NA)若しくはM2、いずれか一方の免疫原性断片、又は前記NA、M2若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項６７に記載の核酸構築物。
【請求項７０】
コードされたインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかのバリアントはパンデミックインフルエンザ株由来である、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の核酸構築物
【請求項７１】
二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項７２】
パンデミックインフルエンザ株の抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアント、及び一以上の非パンデミックインフルエンザ株の抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする、請求項７１に記載の核酸構築物。
【請求項７３】
少なくとも２つの異なる抗原、断片、又はバリアントが異なるインフルエンザウイルス株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項７１又は７２に記載の核酸構築物。
【請求項７４】
プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードし、並びに、さらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；及び／又は
（b）コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物。
【請求項７５】
ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項７４に記載の核酸構築物。
【請求項７６】
２つのコード配列を含み、それぞれが異なるサブユニット、断片又はバリアントを含み、かつそれぞれが前記キメラプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項７４又は７５記載の核酸構築物。
【請求項７７】
前記２つのコード配列は、それぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項７６に記載の核酸構築物。
【請求項７８】
前記２つのコード配列は逆方向である、請求項７６又は７７に記載の核酸構築物。
【請求項７９】
前記２つのコード配列は同方向である、請求項７６又は７７に記載の核酸構築物。
【請求項８０】
プロモーターがhCMV前初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルスプロモーター配列、及びラウス肉腫ウイルスプロモーター配列から選択される、請求項６７〜７９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８１】
非翻訳リーダー配列は、
（i）配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号５４のヌクレオチド1864〜1984のヌクレオチド配列；
（ii）（i）と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
を含む、請求項６７〜８０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８２】
エンハンサー配列は、
（i）配列番号８、配列番号９、配列番号５４のヌクレオチド3699〜4231、配列番号６１のヌクレオチド3831〜4363、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド4507〜5038のヌクレオチド配列；
（ii）前記（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
を含む、請求項６７〜８１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８３】
ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項４２〜８２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８４】
前記ポリアデニル化配列はウサギβグロビン遺伝子、ヒトパピローマウイルス(HPV)初期若しくは後期遺伝子、HSV-2gB遺伝子、サルCMV前初期遺伝子、及びHSVgD後期遺伝子から選択される遺伝子のポリアデニル化配列である、請求項８３に記載の核酸構築物。
【請求項８５】
前記ポリアデニル化配列は、
（i）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５４のヌクレオチド4243〜4373、配列番号６１のヌクレオチド906〜1038、配列番号６１のヌクレオチド4375〜4050、若しくは配列番号６２のヌクレオチド2463〜2593のヌクレオチド配列；
（ii）前記（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片
から選択される、請求項８３に記載の核酸構築物。
【請求項８６】
配列番号１４の配列を含む、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項８７】
抗原、外毒素サブユニット、断片、又はバリアントをコードする配列に機能し得るように連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４２〜８６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８８】
シグナルペプチドはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド(hTPAsp)、アプロチニンシグナルペプチド、タバコエクステンシンシグナルペプチド、及びニワトリリゾチームシグナルペプチドから選択される、請求項８７に記載の核酸構築物。
【請求項８９】
プラスミドである、請求項４２〜８８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項９０】
請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なる構築物を含む核酸構築物の集団。
【請求項９１】
請求項４２〜４８、６１〜６４、及び６７〜７３のいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なる構築物を含み、該構築物は異なるインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする核酸構築物の集団。
【請求項９２】
少なくとも３つの異なる構築物を含み、それぞれが異なるインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする請求項９１に記載の核酸構築物の集団。
【請求項９３】
少なくとも２つの異なる抗原は異なるインフルエンザ株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項９１又は９２に記載の核酸構築物の集団。
【請求項９４】
少なくとも２つの異なる抗原、断片、又はバリアントは同種若しくは異種のインフルエンザ株の異なるインフルエンザポリペプチド由来である、請求項９１〜９３のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団。
【請求項９５】
請求項４９〜５４，６５，６６、及び７４〜７９のいずれか１項に記載の構築物を少なくとも１つ含み、該構築物は前記ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、その断片、又はそのバリアントをコードする、請求項９０〜９４のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団。
【請求項９６】
核酸構築物の集団であって、
（i）少なくとも一つの構築物がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし；並びに
（ii）少なくとも一つの構築物が単純ヘルペスウイルス(HSV)抗原をコードしており；
前記サブユニット、断片若しくはバリアント、及び／又はHSV抗原をコードする配列が、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、
当該プロモーターは
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに 
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロンを含む前記核酸構築物の集団。
【請求項９７】
核酸構築物の集団であって、
（i）少なくとも一つの構築物がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし；並びに
（ii）少なくとも一つの構築物がHSV抗原をコードしており；
前記少なくとも一つの構築物がさらに、
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、前記構築物のコード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；並びに／或いは
（b）前記構築物のコード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む前記核酸構築物。
【請求項９８】
核酸構築物の集団であって、
（i）キメラプロモーター配列、及び当該キメラプロモーター配列に機能し得るように連結されたコード配列を含んでなり、当該コード配列はADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントでアジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし、並びに前記キメラプロモーター配列は
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン
を含む、第１核酸構築物、並びに
（ii）少なくとも一つのHSV抗原をコードする第２核酸構築物、を含んでなる前記核酸構築物の集団。
【請求項９９】
核酸構築物の集団であって、
（i）プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる構築物で、当該コード配列はADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし、並びに前記構築物は
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；並びに／或いは
（b）コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む第１核酸構築物、並びに
（ii）少なくとも一つのHSV抗原をコードする第２核酸構築物、
を含んでなる前記核酸構築物の集団。
【請求項１００】
（i）配列番号６１で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む第１核酸構築物；及び
（ii）HSV抗原をコードする第２核酸構築物、
を含む、請求項９９に記載の核酸構築物の集団。
【請求項１０１】
請求項４２及び５５〜５７のいずれか１項に記載の精製単離されたキメラプロモーター配列。
【請求項１０２】
請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の核酸構築物、又は請求項９０〜１００のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団で被覆された担体粒子を含む被覆粒子。
【請求項１０３】
担体粒子が金粒子である、請求項１０２に記載の被覆粒子。
【請求項１０４】
請求項１０２又は１０３に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
【請求項１０５】
請求項１０２又は１０３に記載に被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項１０６】
無針注射器である、請求項１０５に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
【請求項１０７】
請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の核酸構築物、又は請求項９０〜１００のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団を、製薬上許容可能な担体若しくは賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１０８】
請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の核酸構築物、又は請求項９０〜１００のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団を含むワクチン組成物。
【請求項１０９】
請求項４２〜４８、６１〜６４、及び６７〜７３のいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なる構築物を含む多価ワクチンであって、当該構築物は異なるインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はそのいずれかの免疫原性バリアントをコードする、請求項１０８に記載のワクチン組成物。
【請求項１１０】
三価、四価、又は五価インフルエンザワクチンである、請求項１０９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１１】
請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の核酸構築物の、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団の、又は請求項１０２若しくは１０３に記載の被覆粒子の、インフルエンザの予防薬製造における使用。
【請求項１１２】
前記薬剤は注射、経皮粒子デリバリー、吸入で、局所的に、経口で、鼻腔内に、又は経粘膜で送達される、請求項１１１に記載の使用。
【請求項１１３】
前記薬剤は無針注射器で送達される、請求項１１１又は１１２に記載の使用。
【請求項１１４】
哺乳動物細胞で目的とするインフルエンザポリペプチドの発現を得るためのインビトロ方法であって、前記細胞に請求項４２〜８９のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項９０〜９５のいずれか１項に記載の核酸構築物の集団、又は請求項１０２若しくは１０３に記載の被覆粒子を移送することを含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び免疫学の分野に関するものであって、概して核酸免疫法に有用な試薬に関する。さらに具体的には、本発明は、ポリペプチドの、特に抗原ポリペプチドの、具体的にはインフルエンザ抗原の発現と、さらにアジュバントポリペプチドの発現のための核酸構築物、及びそうした試薬を使用する核酸免疫化戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療及び核酸免疫法は、後天性及び遺伝性疾患双方の治療及び予防に有望なアプローチである。こうした技術は、被験体への望ましい核酸の移入とその後のin vivo発現をもたらす。移入は、ex vivoで被験体の細胞若しくは組織にトランスフェクトし、その形質転換された材料を宿主に再導入することによって行うことができる。あるいはまた、核酸をin vivoで直接、レシピエントに投与してもよい。
【０００３】
こうした方法のそれぞれで、十分な量の治療用又は抗原性の遺伝子産物を提供するには、トランスフェクトされた細胞における核酸の効率的な発現が必要である。いくつかの要因が、獲得される発現レベルに影響を及ぼすことが知られている。そのような要因としては、トランスフェクション効率、並びに目的の遺伝子若しくは配列が転写され及びmRNAが翻訳される効率がある。
【０００４】
多くの発現系が、当該分野において記載されている。各発現系は、通常、発現制御配列に機能し得るように連結された目的の遺伝子若しくはヌクレオチド配列を含むベクターからなる。このような制御配列は、転写プロモーター配列、並びに転写開始及び終止配列を含んでいる。哺乳動物細胞発現系に広く使用されるプロモーターには、数ある中で、SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）前初期プロモーター等のCMVプロモーター（非特許文献１）、マウス乳癌ウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）及び単純ヘルペスウイルス（HSV）プロモーターがある。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターのような非ウイルス性プロモーターもよく使用される。
【０００５】
発現系は多くの場合、「エンハンサー」と呼ばれる転写調節因子を含む。エンハンサーは、概して、シス作用因子と定義され、プロモーター／遺伝子配列に機能し得るように連結されている場合には、その遺伝子配列の転写を強めることができる。エンハンサーは、他の発現制御エレメント（例えば、プロモーター）よりも、目的配列からより遠く離れた位置から機能することが可能であり、また目的配列に対してどちらの方向に位置している場合でも機能することができる（非特許文献２、３）。エンハンサーは、ポリオーマウイルス、BKウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、アデノウイルス、サルウイルス40（SV40）、モロニー肉腫ウイルス、ウシパピローマウイルス及びラウス肉腫ウイルスを含む多くのウイルス源から同定されている（非特許文献３〜８）。
【０００６】
核酸免疫法及び遺伝子治療のためのいくつかの発現系は、hCMV前初期プロモーターを利用する。例えば、Stinskiの特許文献１及び２、並びに特許文献３を参照されたい。hCMV前初期プロモーターを用いた発現ベクターには、例えば、pWRG7128（非特許文献９）、並びに特許文献４に記載のpBC12/CMV及びpJW4303がある。Chapmanら（非特許文献１）は、hCMVイントロンAがない場合hCMV前初期プロモーターからの発現レベルの低下を報告している。
【特許文献１】米国特許第5168062号
【特許文献２】米国特許第5385839号
【特許文献３】欧州特許第0323997 B1号
【特許文献４】国際公開WO 95/20660
【非特許文献１】Chapmanら、（1991）Nucl. Acids Res. 19:3979-3986
【非特許文献２】Banerjiら、(1981) Cell 27:299-308
【非特許文献３】deVilleirsら、(1981) Nucl. Acids Res 9: 6251-6264
【非特許文献４】Rosenthalら、(1983) Science 222:749-755
【非特許文献５】Hearingら、(1983) Cell 33:695-703
【非特許文献６】Weeksら、(1983) Mol. Cell. Biol. 3:1222-1234
【非特許文献７】Levinsonら、(1982) Nature 295: 568-572
【非特許文献８】Luciwら、(1983) Cell 33: 705-716
【非特許文献９】Royら、Vaccine 19, 764-778, 2001
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
操作されたウイルスプロモーター／発現配列を用いて、宿主細胞において増強される異種コード配列の発現を提供する核酸構築物が開発された。構築物は、遺伝子、特に抗原をコードする遺伝子の効率的な発現に適しており、それ故、核酸免疫法に使用することができる。構築物を使用して、アジュバントポリペプチドを発現することもできる。構築物は、粒子を介した核酸免疫付与に使用できるように担体粒子上に提供することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、構築物はインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれか一方の免疫原性バリアントをコードしている。さらに特に好ましい実施形態では、構築物はアジュバントポリペプチドをコードしている。
【０００８】
したがって、本発明は、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(血球凝集素：HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
（i）（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに 
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン；
を含むキメラプロモーター配列、
（ii）キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン（HA）抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
（iii）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、並びに
（iv）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)由来、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列を含んでなる前記核酸構築物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
（i）（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン；
を含むキメラプロモーター配列、並びに
（ii）キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン（HA）抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性をもつ前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、を含んでなる前記核酸構築物を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、キメラプロモーター配列及び当該キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列挿入用のクローニング部位を含んでなる核酸構築物であって、キメラプロモーター配列が
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン；
を含む、前記核酸構築物を提供する。
【００１１】
好ましい例では、前記構築物が、前記クローニング部位に挿入されたコード配列を含む。したがって、コード配列をクローニング部位中に提供することができる。
【００１２】
さらなる好ましい実施形態で、本発明の構築物は、さらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び／又は
（b）HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列を含むことができる。
【００１３】
本発明はまた、プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、その構築物がさらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；及び／又は
（b）コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列の3’UTR、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来で、かつコード配列が3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物を提供する。
【００１４】
本発明はまた
（i）（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1及び少なくともエクソン２の一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロンを含んでなるキメラプロモーター配列；並びに
（ii）キメラプロモーターと機能し得るように連結されるコード配列挿入用のクローニング部位；並びに
（iii）（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列に由来し、キメラプロモーターと機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；及び／又は
（b）HBsAg配列の3’非翻訳領域（UTR）、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTRに由来し、キメラプロモーターと機能し得るように連結されたエンハンサー配列であって、そのエンハンサー配列がクローニング部位の下流にある、前記エンハンサー配列；
を含んでなる核酸構築物を提供する。
【００１５】
本発明は、また
（i）プロモーター配列；
（ii）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列に由来する非翻訳リーダー配列；並びに
（iii）（i）及び（ii）に機能し得るように連結されたコード配列；
を含んでなる核酸構築物であって、前記コード配列は非翻訳リーダー配列とは異種である、前記核酸構築物を提供する。
【００１６】
本発明は、また
（i）プロモーター配列；
（ii）プロモーター配列（i）に機能し得るように連結されたコード配列；及び
（iii）コード配列（ii）の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列（ii）に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列；
を含んでなる核酸構築物であって、エンハンサー配列（iii）がHBsAg配列の3’UTR又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTRに由来し、コード配列（ii）は3’側エンハンサー配列とは異種である前記核酸構築物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、その構築物がさらに
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；並びに／又は
（b）コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列の3’UTR由来、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であり、かつコード配列が3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む前記核酸構築物を提供する。
【００１８】
本発明は、さらに少なくとも２つの異なる本発明の構築物を含む核酸構築物の集団を提供する。
【００１９】
他の例において、本発明は単離精製されたキメラプロモーター配列であって、
（a）hCMV前初期プロモーター配列；
（b）hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１及びエクソン２の少なくとも一部；並びに
（c）hCMV主要前初期遺伝子のイントロンAの代わりに与えられる異種イントロン；
を含んでなる前記配列を提供する
本発明はまた、以下のものを提供する。すなわち、
−哺乳動物細胞において目的のインフルエンザポリペプチドの発現を得るための方法であって、前記細胞に本発明の核酸構築物、核酸構築物の集団、又は被覆粒子を移入することを含んでなる前記方法、
−粒子を介したデリバリーデバイスによる送達に適した被覆粒子であって、ポリペプチドをコードするコード配列を含む本発明の核酸構築物で被覆された担体粒子を含んでなる被覆粒子、
−  被覆粒子を含んでなる粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器、
−  被覆粒子を充填した粒子を介したデリバリーデバイス、
−  本発明の被覆粒子の有効量を被験体に投与することを含む核酸免疫付与の方法、
−  本発明の核酸構築物、又は本発明の核酸構築物の集団を、製薬上許容される担体若しくは賦形剤と共に含む医薬組成物、
−  本発明の核酸構築物、本発明の核酸構築物の集団、又は本発明の被覆粒子を含んでなるワクチン組成物である。
【００２０】
また、核酸免疫付与用の医薬品の製造における本発明の核酸構築物、本発明の核酸構築物の集団、若しくは本発明の被覆粒子の使用も提供される。
【００２１】
上記及び他の、本発明の対象、態様、実施形態及び利点が、本明細書の開示に照らして、容易に当業者に想起されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明を詳細に説明する前に、当然のことながら、本発明は特に例示された分子又はプロセスパラメータに限定されない。これはそれ自体が変動する可能性があるためである。また当然のことであるが、本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明することだけを目的とし、それを限定するつもりはない。さらに、本発明の実施には、特に示さない限り、ウイルス学、微生物学、分子生物学、組換えDNA技術及び免疫学の、いずれも当技術分野で通常の技術範囲内の、従来の方法を用いることができる。このような技術は文献で全て説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (第2版、1989); DNA Cloning:  A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover編); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait編、1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); 並びにFundamental Virology, 第2版、vol. I & II (B.N. Fields及びD.M. Knipe編)を参照されたい。
【００２３】
本明細書に引用した刊行物、特許及び特許出願の全ては、上記であろうが下記であろうが、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００２４】
留意すべきは、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形態は、内容上明確に他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象を包含する。
【００２５】
特定の作用剤が特定のユニットを含むと明記されている場合、好ましい例で、当該作用剤は実質的に前記ユニットで構成されていてもよい。
【００２６】
Ａ．  定義
他に特に定めない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者に広く理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記載の方法及び材料と類似した、又は同等の多くの方法及び材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００２７】
本発明の記述において、次の用語を使用することになるが、以下に示すように定義されるものとする。
【００２８】
「核酸免疫付与（核酸免疫化）」という用語は、本明細書において、抗原をin vivo発現させるため、１以上の選択された抗原又はポリペプチドをコードする核酸分子を、宿主細胞に導入することを示すのに使用される。核酸分子は、例えば、標準的な筋肉注射若しくは皮内注射；経皮的粒子デリバリー；吸入；局所的若しくは経口による、鼻内若しくは粘膜投与法によって、受け手（レシピエント）である被験体に直接導入することができる。特にヌクレオチドを、経皮粒子デリバリーを介して投与することができる。あるいは、核酸分子を被験体から取り出した細胞内にex vivoで導入することができる。後者の場合、目的の核酸分子を含有する細胞を被験体に再導入し、その結果、核酸分子によってコードされる抗原に対して免疫応答を開始することができる。このような免疫化において使用される核酸分子を、本明細書では通常「核酸ワクチン」と呼ぶ。本明細書で述べる核酸はいずれも、前記ワクチン中に存在することができる。特に本明細書で述べる核酸構築物がその中に存在することができる。
【００２９】
「アジュバント」という用語は、特異的若しくは非特異的に、抗原特異的免疫応答を変化させる、増強する、指示する、再指示する、可能にする、又は開始する能力を有する物質若しくは組成物を意味する。したがって、アジュバントを抗原と同時に投与すると、結果として、抗原が投与された被験体において望ましい免疫応答を達成するのに必要な抗原の投与量をより少なく、又は投与回数をより少なくすることができる。あるいは、同時投与は、結果として、被験体において質的に、及び／又は量的に異なる免疫応答をもたらすことができる。具体的には、アジュバントの投与は、免疫応答の大きさ、及び／又は持続時間のより一層の増大といった免疫応答の増強をもたらすことができる。アジュバントの有効性は、ワクチン組成物のみを動物に投与することと平行してアジュバントをワクチン組成物と共に投与すること、並びに、抗体及び／又は細胞性免疫を放射免疫アッセイ、ELISA及びCTLアッセイといった標準的なアッセイを用いて前記２つのグループで比較することによって判定することができる。本発明の構築物は、一以上のアジュバントペプチドを発現することができる。
【００３０】
「コア担体」は、規定された粒径、並びに細胞膜透過に必要な運動量を達成するのに十分な高密度を与えるためにゲスト核酸（例えばDNA、RNA）を被覆する担体を意味する。このコア担体によってゲスト分子を、粒子を介した技術を用いて送達することができる（例えば、米国特許第5,100,792号を参照されたい）。コア担体は、一般に、タングステン、金、白金、フェライト、ポリスチレン及びラテックスといった物質を含む。例えば、Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N.編、Oxford University Press, New York, NY 10-11ページを参照されたい。
【００３１】
「無針注射器」は、皮膚を刺す従来の針に依らず、経皮的に粒子性組成物を送達する器具を意味する。本発明とともに使用するための無針注射器は、本明細書で論ずる。
【００３２】
「経皮的」デリバリーという用語は、皮内（例えば、真皮若しくは表皮内）、経皮（例えば、「皮膚を通しての」）及び経粘膜投与を意味する。すなわち、皮膚若しくは粘膜組織内への、又はそれらを貫通しての薬剤の通過による送達を意味する。例えば、Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft 及びGuy (編), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson及びLee (編), Marcel Dekker Inc., (1987); 並びにTransdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus及びBerner (編), CRC Press, (1987)を参照されたい。それ故、この用語は、米国特許第5,630,796号に記載の無針注射器からの送達、並びに米国特許第5,865,796号に記載の粒子を介した送達を包含する。
【００３３】
「ポリペプチド」は、最も広い意味で使用され、２個以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチド模倣物からなる化合物を言う。サブユニットは、ペプチド結合又は他の結合、例えばエステル、エーテルなどによって連結することができる。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、天然及び／又は非天然若しくは合成アミノ酸を指すが、これらは、グリシン、及びD若しくはL型光学異性体の双方、並びにアミノ酸アナログ及びペプチド模倣物を包含する。３個以上のアミノ酸からなるペプチドは、ペプチド鎖が短いならば、通常オリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合には、そのペプチドは通常ポリペプチド又はタンパク質と呼ばれる。
【００３４】
「抗原」は、個体において免疫学的な反応を引き起こす能力のある、何らかの作用物質、一般に巨大分子を指す。この用語は、個々の巨大分子、又は抗原性巨大分子の相同若しくは非相同集団を表すために使用することができる。本明細書で使用される「抗原」という用語は、概して、一以上のエピトープを有するタンパク質分子、若しくはその一部を言うのに使用される。「抗原」は、例えば、自然発生的なポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫原性のある断片、又は前記いずれかの免疫原性を残す変異形態を含むことができる。好ましい例で、断片又はバリアントについて言う場合、生じた免疫応答は好ましくはその断片又はバリアントが誘導された元のポリペプチドを認識できる。
【００３５】
本発明のために、抗原をあらゆる適切な源から手に入れ、若しくは誘導することができる。本発明の目的上、「抗原」は、その天然型配列に欠失、付加及び置換といった改変を有するタンパク質（通常、性質は保存されている）を、そのタンパク質が十分な免疫原性を維持する限り、包含する。これらの改変は、例えば部位特異的変異誘発によって意図的に行うことができる。又は、抗原を産生する宿主の突然変異を介するように偶発的であってもよい。本発明の具体的な好ましい実施形態で、使用する若しくはコードされた抗原は、インフルエンザ抗原、インフルエンザ抗原の免疫原性断片、又はそれらいずれかの免疫原性のあるバリアントとすることができる。
【００３６】
所定の抗原に対する「免疫応答」は、個体における、その抗原に対する液性及び／又は細胞性免疫応答の成果である。本発明の目的上、「液性免疫応答」は抗体分子を介した免疫応答を表すのに対して、「細胞性免疫応答」はTリンパ球及び／又は他の白血球を介した免疫応答である。
【００３７】
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において相互に交換可能なものとして使用され、デオキシリボヌクレオチドであれ、リボヌクレオチドであれ、あるいはそれらのアナログであれ、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドは、何かしらの三次元構造を有し、何かしらの既知又は未知の機能を果たすことができる。ポリヌクレオチドの非限定的な例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。
【００３８】
ポリヌクレオチドは、主として４つのヌクレオチド塩基：アデニン（A）；シトシン（C）；グアニン（G）；及びチミン（T）（ポリヌクレオチドがRNAである場合チミン（T）の代わりにウラシル（U））からなる特有の配列で構成される。したがって、核酸配列という用語は、ポリヌクレオチド分子をアルファベットで表現したものである。このアルファベット表示は、中央演算処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力し、ゲノム機能解析及び相同性検索といったバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。
【００３９】
「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移入する能力を有する（例えば、ウイルスベクター、非ウイルス性ベクター、粒子性担体、及びリポソーム）。標的細胞は、原核細胞又は真核細胞とすることができる。一般的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は、所定の遺伝子の発現を指示する能力を有し、遺伝子配列を標的細胞に移行させることができる、あらゆる核酸構築物である。したがって、この用語は、ウイルスベクターと共に、クローニングビークル及び発現ビークルを包含する。「プラスミド」は、染色体外遺伝因子の形態をとるベクターである。
【００４０】
選択された抗原を「コードする」核酸配列は、適当な制御配列の支配下に置かれたとき、in vivo又はin vitroで転写され（DNAの場合）、ポリペプチドに翻訳される（mRNAの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、5’（アミノ）末端の開始コドン、及び3’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって定められる。本発明の目的上、こうした核酸配列に、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物のmRNAからのcDNA、ウイルス若しくは原核生物のDNA又はRNAからのゲノム配列、並びに合成DNA配列まで含めることができるが、これらに限定はされない。転写終結配列が、コード配列の3’側にあってもよい。
【００４１】
ある場合には、転写配列が複数のポリペプチドを生じてもよい。例えば、転写産物は複数の読み取り枠(ORF)や、また最初のORFに続くORFの翻訳を可能にする一以上の内部リボソーム侵入部位(Internal Ribosome Entry Sites：IRES)を含むことができる。転写産物が翻訳されてポリペプチドを生じ、その後当該ポリペプチドは切断されて、複数のポリペプチドを生じることができる。ある場合には、核酸構築物は複数の転写産物を生じ、それによって複数のポリペプチドを生じることができる。
【００４２】
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始し、調節するヌクレオチド配列である。プロモーターには、誘導性プロモーター（この場合、プロモーターに機能し得るように連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、アナライト、コファクター、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（この場合、プロモーターに機能し得るように連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、アナライト、コファクター、調節タンパク質などによって抑制される）、及び構成的プロモーターを含めることができる。「プロモーター」若しくは「調節因子」という用語は、全長プロモーター領域、及びこれらの領域の機能的（例えば転写若しくは翻訳を制御する）セグメントを包含するものとする。
【００４３】
「機能し得るように連結される」とは、記載のエレメントが通常の機能を果たせるように構成されるエレメントの配置を表す。したがって、核酸配列に機能し得るように連結された所定のプロモーターは、適当な酵素が存在する場合、その配列の発現を果たすことができる。プロモーターは、それが機能して配列の発現を指示する限り、配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモーター配列と核酸配列の間に存在してもよい。核酸配列とプロモーター配列は、まだなおコード配列に「機能し得るように連結されている」と見なすことができる。
【００４４】
「組換え体」は、本明細書において、ゲノム、cDNA、半合成、又は合成起源の核酸分子（ポリヌクレオチド）を表すために使用される。組換え体は、その起源若しくは操作により、自然状態で結びついているポリヌクレオチドの全部、若しくは一部と結合せず、及び／又は自然状態で結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと結合している。１つの組換え核酸分子の中に含まれる２つの核酸配列は、それらが自然状態で通常結びついていない場合には、互いに他に対して異種性である。
【００４５】
本明細書において、ポリヌクレオチドの相同体に言及する。一般に、他のポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドに対して少なくとも70%相同であり、好ましくは、それに対して少なくとも75、80若しくは90%、さらに好ましくは、少なくとも95%、97%若しくは99%相同である。相同性を測定する方法は当技術分野でよく知られており、当業者には当然のことである。そのような状況において、相同性は核酸の同一性に基づいて算出される。そうした相同性は、例えば、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも３０個、例えば、少なくとも４０、６０若しくは１００個以上の連続するヌクレオチドの領域にわたって、存在することが考えられる。相同領域は少なくとも１５０ヌクレオチドにわたって、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドにわたって、より一層好ましくは、少なくとも３００ヌクレオチドにわたって存在し得る。相同領域は、本明細書の核酸構築物に関して本明細書で言及するいずれかのエレメントと関係し得る。いくつかの例で、相同領域は問題となる全領域、例えば本明細書で特定するエレメントのいずれか１つの全領域にわたって存在し得る。
【００４６】
上記ヌクレオチド相同性に関して述べたものと同レベルのものがアミノ酸相同性に存在してもよい。それ故、上述したレベルの相同性のいずれかは、アミノ酸レベルでも適用することができる。アミノ酸レベルでの相同性は、例えば、少なくとも１５アミノ酸にわたり、好ましくは少なくとも２５アミノ酸にわたって、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸にわたって、さらにより好ましくは７５アミノ酸にわたって、より一層好ましくは少なくとも１００アミノ酸にわたって存在し得る。相同領域は、問題となるエレメントの全長にわたって存在し得る。
【００４７】
ポリヌクレオチド相同性若しくは同一性を測定する方法は、当分野で知られている。例えば、UWGCG Packageは、相同性の計算に使用することができるBESTFITプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用）（Devereuxら、（1984）Nucleic Acids Research 12, 387-395）。
【００４８】
PILEUP及びBLASTアルゴリズムも、例えば、Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, Fら (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のように、相同性を計算し、又は配列を並べるために使用することができる（通常はデフォルト設定で）。
【００４９】
BLAST解析を実施するソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公開され、利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列において同じ長さのワードとともに整列化したとき、ある正の数の閾値スコアTとマッチする、又はそれを満足する、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することによって、ハイスコア配列ペア（HSP）を同定することを含むものである。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、上記）。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含むHSPを見出すために検索を開始するシードとなる。ワードヒットを、その累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延ばしていく。各方向のワードヒットの延長は、次の場合に中止する：一以上の負のスコアとなる残基アラインメントが蓄積するために、累積のアラインメントスコアがゼロ以下になる；又はどちらかの配列の末端に達する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度及びスピードを決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワードの長さ（W）11、BLOSUM62スコア行列（Henikoff及びHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アライメント(B)50、期待値（E）10、M = 5、N = 4、及び二本の鎖の比較を使用する。
【００５０】
BLASTアルゴリズムは、２つの配列間の類似性について統計分析を行う；例えば、Karlin及びAltschul (1993) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性に関する１つの測定値が、最小総和確率(P(N))であって、これは２つのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じたものである可能性の指標を与える。例えば、第１の配列を第２の配列と比較した最小総和確率が約1未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、さらにより好ましくは０．００１未満であるならば、ある配列が別の配列に類似していると見なす。
【００５１】
相同体は、一般的に関連するポリヌクレオチドと、バックグラウンドを有意に越えるレベルでハイブリダイズする。相同体とポリヌクレオチドとの相互作用によって生じるシグナルレベルは、「バックグラウンドハイブリダイゼーション」より、通常１０倍以上強く、好ましくは１００倍以上である。相互作用の強さは、例えば、プローブを32Pで放射線標識することによって測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、一般的に中程度から高いストリンジェンシー条件（例えば、約50℃から約60℃にて、0.03M塩化ナトリウム及び0.003Mクエン酸ナトリウム）によって達成される。
【００５２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5×Denhardt’s溶液、5×SSC、0.1% SDS及び100μg/ml変性サケ精子DNAを包含し、洗浄条件には37℃にて2×SSC、0.1% SDS、続いて68℃にて1×SSC、0.1% SDSを含めることができる。適当なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、上記Sambrookらの文献を参照されたい。
【００５３】
相同体は、関連ポリヌクレオチドの配列と、３個未満、５個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、又はそれ以上の変異の数だけ異なっていると考えられる（変異はそれぞれ、重複、置換、欠失若しくは挿入とすることができる）。これらの変異を、相同体の少なくとも３０個、例えば少なくとも４０個、６０個、又は１００個以上の連続したヌクレオチド配列の領域にわたって測定することができる。いくつかの例で、前記変異を相同物の全領域にわたって測定することができる。ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、置換は、コードされたアミノ酸に「保存的な」変化を付与することが好ましい。このような保守的な変化を、下記の表１に定める。２列目で同じブロックにあるアミノ酸、及び好ましくは３列目で同じ行にあるアミノ酸は、保存的変化として相互に置き換えることができる。
【表１】
2008528020.tif 000003
【００５４】
「断片」という用語は、より大きな実体のより小さな部分を指す。本明細書で言及する特定のエレメントの断片を本発明で使用することができる。特に、このような断片は、元のエレメントのいくつかの又は全ての機能、具体的には本明細書で述べた機能のいずれかを保持することができる。好ましい例では、抗原の断片は、免疫原性を保持することができ、またアジュバントの断片はアジュバントとして機能する能力を保持することができる。いくつかの例で、断片は、元の長さの少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも90％、そしてさらにより好ましくは少なくとも95％であってもよい。断片は、元の長さの前記パーセンテージと同じかそれ未満とすることができる。
【００５５】
「個体」及び「被験体」という用語は、本明細書において相互に交換可能なものとして使用され、脊索動物亜門に属する何らかの動物を指す。この脊索動物亜門は、非制限的にヒト及び他の霊長類（チンパンジー及び他の類人猿、並びにサル類といった、ヒト以外の霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマといった家畜；イヌ及びネコといった愛玩哺乳動物；マウス、ラット及びブタと同様のモルモットといった齧歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ及び他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなどのような、家禽、野生、及び狩猟用の鳥を含めた鳥類を包含する。この用語は、特定の年齢を指すものではない。したがって、成体及び新生仔個体をいずれも対象とするものとする。本明細書に記載の方法は、上記の脊椎動物種のいずれにも使用することを意図している。なぜなら、これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同じように機能するからである。
【００５６】
いくつかの例で、本発明を使用して、いずれの適当な被験体、特に所与の種のいずれの適当な被験体に対しても免疫付与することができる。好ましい例で、いずれの適切な被験者にも免疫付与することができる。したがって、例えば可能な限り多くの被験体を、いずれかの特定のグループの被験体で強調することなく免疫付与することができる。例えば、被験体集団全体、又は可能な限り多数の被験体集団に免疫付与することができる。特に、本発明がインフルエンザの治療に使用された場合、特にインフルエンザのパンデミック株に対する免疫を付与する場合、本発明の構築物を使用して、いずれの被験体、好ましくは可能な限り多くの被験体に免疫付与することができる。
【００５７】
他の場合において、被験体又は個体は、感染のリスクがあるものであってもよく、又はその感染が被験体又は個体に対して特に有害なものであってもよい。感染は、好ましい一例では呼吸器感染であってもよい。特に、本発明を使用して呼吸器感染を予防又は治療する場合、具体的にはインフルエンザに対して予防又は治療する場合、被験体をヒトとすることができる。いくつかの場合には、本発明の核酸構築物を、リスク群で特定のものに、優先的に、又は最初に投与することができる。例えば、これはインフルエンザの非パンデミック株に対し免疫付与をするために構築物を投与する場合であってもよい。いくつかの場合で、被験体は、例えば以下の一以上のカテゴリーの中に属し得る。
【００５８】
−  呼吸器疾患、及び／又は心臓傷害を伴った患者、特に、喘息、肺気腫、気管支炎及び／又は、慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease：COPD)を伴った患者；
−  糖尿病、免疫抑制、免疫不全症、鎌状赤血球貧血、及び／又は腎臓病等の慢性的病気を伴った患者；
−  少なくとも５０歳、好ましくは少なくとも６０歳、より好ましくは少なくとも６５歳、より一層好ましくは少なくとも７５歳、そしてさらに好ましくは少なくとも８０歳の患者；
−  ２歳未満の子供、特に６〜２３ヶ月、例えば１８ヶ月未満の子供；
−  長期アスピリン療法を受けている患者、特に６ヶ月〜１８歳の者；
−  妊婦、特にインフルエンザシーズン期間に妊娠２〜３ヶ月に入る妊婦；
−  養護施設又は長期介護施設の住人；並びに／あるいは
−  上記いずれかの介護福祉士、又はそれらの者と通常接触しそうな人。
【００５９】
B. 総括
本発明は、宿主細胞において異種コード配列、特に抗原をコードする遺伝子の効率的な発現を可能にする、核酸構築物に関する。構築物は、いくつかの例で、一以上のアジュバントポリペプチドを発現することができる。さらに具体的には、本発明は、キメラプロモーター配列及びクローニング部位を含んでなる核酸構築物、又は、実施形態によっては、基本的にキメラプロモーター配列及びクローニング部位からなる核酸構築物を提供する。コード配列がクローニング部位に挿入される場合、そのコード配列は機能し得るようにキメラプロモーターと連結する。本発明はまた、クローニング部位に挿入されたコード配列を有する構築物を提供する。コード配列は、本明細書で言及した、いずれかのポリペプチド、具体的には抗原、特に本明細書に記載のいずれかの抗原及びアジュバントポリペプチドをコードすることができる。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、構築物はコード配列、具体的には抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードするコード配列を含む。特に好ましい実施形態で、コード配列はインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードする。さらに好ましい実施形態で、コード配列は、アジュバントポリペプチド、具体的にADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するいずれかのバリアントをコードすることができる。
【００６１】
キメラプロモーターは下記を含んでなり、またある実施形態においては、基本的に下記から構成される：
(a)hCMV前初期プロモーター配列；
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及び少なくともエクソン２の一部；並びに
(c) hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン。
【００６２】
hCMV前初期プロモーター配列(a)は下記を含むことができる：
(i)天然のhCMV前初期プロモーター配列；
(ii)機能的に相同な上記のバリアント；又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
【００６３】
通常、配列(a)は、約100〜600、好ましくは200〜600、例えば400〜600個のヌクレオチドを含む。一般的には、配列(a)は、転写因子若しくはRNAポリメラーゼと結合する(i)に含まれる配列、又はこれらの配列のいずれかに代えて、同じ転写因子及びRNAポリメラーゼと結合できるこれらの配列の相同体を含む。一般に、このような配列若しくはその相同体は、(i)と同じ順序で、及び／又は実質的に同じ相対的スペーシングで、プロモーター配列(a)中に存在する。
【００６４】
通常、(i)は、hCMV主要前初期遺伝子の、少なくともヌクレオチド−100〜−1、一般的には−150〜−1、例えば、−500〜−1、又は−600〜−1を含む。配列(i)は一般的には、hCMVコアプロモーター配列を含んでなり、さらにhCMV前初期プロモーター中に存在する１以上のエンハンサーエレメントを含めることもできる。例えば、(i)は、米国特許第6218140号に記載のようにヌクレオチド−118〜−1、若しくは−524〜−1、又は特許文献２に記載のようにヌクレオチド−62〜−1、若しくは−465〜−1を含んでなることができる。
【００６５】
通常、(i)は、プロモーター配列に共通して見られるTATAボックス又はCAATボックスを包含する。好ましくは、この配列は、hCMV前初期プロモーター中の１以上の反復配列を包含する。
【００６６】
好ましい実施形態において、(i)は配列番号1を含む。さらに好ましい一の実施形態で、(i)は、配列番号５４のヌクレオチド903〜1587を含む。他の実施形態で、(i)は配列番号１４のヌクレオチド903〜1587を含むことができる。さらに好ましい実施形態では、(i)は、配列番号５７のヌクレオチド1002〜1686、又は2624〜3308を含むことができる。さらに好ましい実施形態では、(i)は配列番号６１のヌクレオチド1815〜1935、及び／又は1948〜2632、特に配列番号６１のヌクレオチド1948〜2632を含むことができる。他の好ましい実施形態で、ヌクレオチド1815〜1935を使用することができる。
【００６７】
本発明の具体的な好ましい実施形態において、hCMV前初期プロモーター配列（a）は、以下のものを含んでなる：
（i）配列番号１、配列番号５４のヌクレオチド903〜1587、配列番号６１のヌクレオチド1815〜1935、配列番号６１のヌクレオチド1948〜2632、配列番号６２のヌクレオチド1002〜1686、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド2624〜3308のヌクレオチド配列、
（ii）（i）の機能性バリアントであって、（i）の一以上の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する前記バリアント、並びに／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片。
【００６８】
いくつかの例で、断片は、前記配列の少なくとも300ヌクレオチド、好ましくは少なくとも400ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500ヌクレオチド、そしてより一層好ましくは少なくとも600ヌクレオチドを含むことができる。断片は、最大800、最大600、又は最大400ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６９】
hCMV前初期プロモーター配列は、既知の方法を利用して得ることができる。天然のhCMV前初期プロモーターは、標準的な技法を用いてウイルスサンプルから直接単離することができる。例えば、特許文献２には、hCMVプロモーター領域のクローニングが記載されている。hCMV前初期プロモーターの配列は、Genbank #M60321（hCMV Towne株）及びX17403（hCMV Ad169株）として入手可能である。したがって、天然型配列は、既知の配列に基づくPCRプライマーを用いたPCRによって単離することができる。DNAを採取し、単離するために使用される方法の記述として、例えば、上記Sambrookらの文献を参照されたい。適当なhCMVプロモーター配列は、既存のプラスミドベクターから単離することもできる。プロモーター配列は、合成によって製造することもできる。
【００７０】
機能性バリアント(ii)、若しくは断片(iii)は、通常、天然型プロモーター(i)の活性を保持及び／又は補完するものである。一般的にこの活性は、機能し得るように連結されたポリヌクレオチドの、特にhCMV主要前初期遺伝子の転写を引き起こす能力（開始及び制御を含む）である。ある実施形態において、バリアント及び断片は、hCMVウイルスの天然型プロモーターの活性を補完することができるが、これは例えば、ウイルスが細胞に感染し、及び／又は細胞内で複製する能力を保持することを可能にしている。
【００７１】
相同なバリアント（ii）、若しくは断片（iii）を、(i)の活性を保持及び／又は補完する能力についてアッセイすることができる。例えば、バリアント若しくは断片を、天然hCMV前初期プロモーターが欠損した変異hCMVに機能（例えば感染及び／又は複製能力）を回復させる能力について、アッセイすることができる。
【００７２】
相同バリアント（ii）、若しくは断片（iii）を、下記の比較発現アッセイ法を用いて、その有用性について調べることができる。テストプロモーター配列を、天然のhCMV前初期プロモーターとの置換により、交換して基本ベクター内に導入する。通常、機能性バリアント若しくは断片は、基本ベクターを使用して提供される発現の少なくとも約50%、例えば、60、70、80、90%又はそれ以上の発現を可能にする。機能性バリアント又は断片は、本明細書で言及するいずれかの発現レベルを提供することができる。いくつかの例において、バリアント又は断片は、活性において、少なくとも50％、100％、150％、200％、300％、又はそれ以上の、より高い発現レベルを提供することができる。一般に発現は、少なくとも１つ、好ましくは２つの基準細胞型で提供される。通常、基準細胞は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。基準細胞は、いくつかの例では、SSC-15又はB16宿主細胞であってもよい。
【００７３】
上記に加えて、又は上記の代わりに、プロモーター配列を下記の比較免疫原性アッセイ法でテストすることができる。テストプロモーター配列を、天然のhCMV前初期プロモーターと交換して、基本ベクター内に導入する。機能性プロモーター配列は、少なくとも1つの、好ましくは２つの抗原に対して、一般的に基本ベクターによって達成される抗体価と少なくとも同程度の、若しくはそれより高い抗体価を提供する。好ましくは、抗体価は、基本ベクターについて得られるよりも、少なくとも5%、10%、20%、30%又は40%高い値である。いくつかの場合において、抗原力価のレベルは、本発明書で言及するいずれかであればよい。適切な抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びflu-M2抗原である。特に好ましい抗原はインフルエンザ抗原である。インフルエンザ抗原は、HA、NA、M2、NP、M1、PB1、PB2、PA、NS1及びNS2抗原、特にHA、NA及びM2抗原を含む。特に好ましい実施形態で、抗原はHA若しくはその断片、又はそれらいずれかのバリアントである。前記アッセイによれば、天然型プロモーター配列(i)の機能性相同バリアント（ii）又は機能性断片(iii)は、通常はこの天然型配列によって達成される最も高い抗体価を可能にするものである。いくつかの例において、抗体価は本明細書に記載のいずれかのレベルよりも僅かに低くてもよい。
【００７４】
本発明の構築物がアジュバントポリペプチドをコードしている場合、比較免疫原性テストを標準抗原を用いて使用することができる。当該テストでは未知のアジュバント活性ポリペプチドをコードするテストベクターを、標準アジュバントベクターと比較する。例えば、テストアジュバントベクターは、既知のアジュバントポリペプチドの断片又はバリアントをコードすることができ、また既知アジュバントポリペプチドを発現する標準ベクターとの、抗原を投与したときの免疫応答を促進する能力を比較することができる。断片又はバリアントは、本明細書に記載のいずれかの活性レベルをも有することができる。具体的には標準アジュバントのアジュバント活性の少なくとも50％、好ましくは75％、より好ましくは少なくとも85％、及びより一層好ましくは少なくとも100％のアジュバント活性を提供し得る。好ましくは、被試験のアジュバント／ポリペプチドをコードする配列は別として、テストベクターと標準ベクターが同一又は少なくとも実質的に同一である。
【００７５】
上記のように、構築物は、hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１及びエクソン２に由来する配列を含むエクソン配列(b)を含むことができる。エクソンとは、コード配列であり、自然界では一般にイントロンによって隔てられている。天然のhCMV主要前初期遺伝子において、エクソン１及びエクソン２は通常、天然型イントロンAで隔てられている。本発明のキメラ構築物では、エクソン２配列は、通常、エクソン１配列の3’側に存在し、イントロン配列を介在していない。すなわち、エクソン１及びエクソン２は隣接している。
【００７６】
エクソン配列(b)は下記を含むことができる：
(i)天然型エクソン配列、典型的にはエクソン１、及び（全体若しくは一部の）エクソン２；
(ii)機能性のある(i)の相同バリアント；又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性フラグメント。
【００７７】
配列(i)は、天然のhCMV主要前初期遺伝子エクソン１配列の約50〜100%、例えば、60〜90%、又は70〜80%を含むことができる。典型的には、天然型エクソン１配列の少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%又はそれ以上が存在する。エクソン配列(b)はまた、エクソン２配列の少なくとも一部を含む。配列(i)において、典型的には天然型エクソン２の２個以上の塩基、例えば２〜９個、２〜７個、又は３〜５個の塩基が存在する。100%を含めて100%までの天然型エクソン２配列が、例えば天然型エクソン２配列の5〜95%、20〜80%、又は40〜60%が存在し得る。通常、相同バリアントは、天然型配列について言及した上記の長さのいずれかを有する。
【００７８】
好ましくは(i)は、配列番号２を含んでなる。さらに好ましい実施形態では、(i)は配列番号５４のヌクレオチド1588〜1718を含んでなる。さらに好ましい実施形態で、(i)は配列番号１４のヌクレオチド1588〜1718を含んでなる。他の好ましい実施形態で、(i)は配列番号５１のヌクレオチド1684〜1814、及び／又は2633〜2763を含んでなる。さらに好ましい実施形態で、(i)は配列番号６２のヌクレオチド1687〜1817、及び／又は3309〜3439を含んでなる。
【００７９】
したがって、特に好ましい実施形態で、キメラプロモーターのエクソン配列(ｂ)は、以下のものを含む：
（i）配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号５４のヌクレオチド1588〜1718、配列番号６１のヌクレオチド1684〜1814、配列番号６１のヌクレオチド2633〜2763、配列番号６２のヌクレオチド1687〜1817、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド3309〜3439のヌクレオチド配列、
（ii）（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する一以上の（i）の機能性バリアント、並びに／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片。
【００８０】
適当なエクソン配列(b)は既知の方法によって得ることができる。DNAを採取し、単離するために使用する技術の説明については、例えば、上記Sambrookらの文献を参照されたい。天然型hCMV主要前初期遺伝子配列は、標準的な技法を用いてウイルスのサンプルから直接単離することができる（例えば、MacLean, A (1998) “Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus” in Herpes Simplex Virus Protocols S. Brown, A Maclean, editors, Humana Press, Totowa, NJ, pp.19-26を参照されたい）。エクソン１及びエクソン２の部位を含むhCMV主要前初期遺伝子の配列は、Genbank #M60321, X17403として入手できる。それ故、天然型エクソン１及び２配列を、天然の主要遺伝子配列を適当な制限部位で切断することによって、又は既知の配列に基づくPCRプライマーを用いたPCRによって、単離することができる。あるいはまた、適当なエクソン配列は、pWRG7128のような既存のプラスミドベクターから単離することもできる。エクソン配列はまた、クローニングではなく合成によって作製することもできる。バリアント配列は、部位特異的変異誘発のような、日常的な手法によって容易に構築することができる。
【００８１】
一般に、前記エクソン配列は、本発明の構築物に存在する場合、発現を強めるものであって、通常は、上記の天然型エクソン１及びエクソン２配列(i)に匹敵する増強をもたらす。
【００８２】
エクソン配列を、下記の比較発現アッセイを用いて機能性についてアッセイすることができる。テストエクソン配列を、すでに存在するエクソン配列に代えて基本ベクター中に置換する。一般にエクソン配列は、その配列を基本ベクターと比較した場合、少なくとも1つ、好ましくは２つの基準細胞型で、発現を抑制するのではなく、むしろ発現を高めるならば機能性である。通常、基準細胞は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。SSC15又はB16細胞を使用することができる。発現は、好ましくは少なくとも5%、10%、20%、30%、又は40%まで増加する。発現は、本明細書に記載したいずれかのレベルまで向上することができる。このアッセイによれば、天然型エクソン配列(i)の機能性相同バリアント(ii)若しくは機能性断片(iii)は、通常、天然型配列によって与えられる発現向上の少なくとも50%を可能にするものである。いくつかの例において、発現のレベルを規定レベルより低くする場合、その減少は本明細書に記載のいずれかのレベルとすることができる。
【００８３】
上記に加えて、若しくは上記の代わりに、エクソン配列を下記の比較免疫原性アッセイ法でテストすることができる。テストエクソン配列を、既に存在するエクソン配列と交換して、基本ベクターに導入する。機能性エクソン配列は、通常、基本ベクターによって達成される抗体価と少なくとも同程度の、若しくはそれより高い抗体価を、少なくとも1つの、好ましくは２つの抗原に提供する。好ましくは、抗体価は、基本ベクターで得られるそれよりも、少なくとも5%、10%、20%、30%又は40%高い。本増加は、本明細書に記載のいずれかのレベルであればよい。好ましい抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びflu-M2抗原である。特に好ましい抗原はインフルエンザ抗原であり、本明細書に記載されたもののいずれか、具体的にはHA、NA、及びM2抗原を含む。HA抗原、その免疫原性断片、又はそれらいずれかの免疫原性バリアントの使用は、特に好ましい。このアッセイ法によれば、天然型エクソン配列(i)の機能性相同バリアント（ii）又は機能性断片(iii)は、一般的には、この天然型配列によって達成される最も高い抗体価を可能にするものである。抗体価のレベルが僅かに低い場合、その減少は本明細書に記載のいずれかのレベルとすることができる。アジュバントベクターを上記と同様の方法で評価することができる。
【００８４】
キメラプロモーター構築物は、hCMV主要前初期遺伝子の天然イントロンAの代わりに異種イントロン(c)を含む。イントロンとは、遺伝子から転写されたｍRNAからスプライスされる非コード配列である。異種イントロンとは、自然状態ではコード配列中に存在しないイントロンである。
【００８５】
異種イントロン(c)は、全体が、又は部分的に、hCMV主要前初期遺伝子の天然イントロンAに置き換わっている。通常、天然イントロンAを欠いている。
【００８６】
一般に、異種イントロン(c)はエクソン配列(b)の3’側にある。
【００８７】
通常、異種イントロン(c)は下記を含む：
(i)天然のイントロン；
(ii)(i)の機能性相同バリアント；又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
【００８８】
異種イントロン(c)は、一般に、ウイルス若しくは真核生物のイントロンである。好ましくは、イントロンは、哺乳動物のイントロンであって、特に非ヒトイントロン、例えばラットイントロンを使用することができる。いくつかの例では、ニワトリのイントロンを使用してもよい。好ましくはイントロンは、イントロンA、例えばラットインスリンイントロンA、ニワトリケラチンイントロンA、又はニワトリ心筋アクチンイントロンAである。特に好ましい実施形態で、イントロンは、ラットインスリンイントロンAである。
【００８９】
好ましい実施形態で、異種イントロン（c）は、ラットインスリン遺伝子イントロンA配列、ニワトリケラチン遺伝子イントロンA配列、ニワトリ心筋アクチン遺伝子イントロンA配列、それらいずれかの機能性断片、又は前記いずれかの機能的なバリアントから選択される配列を含む。
【００９０】
一般的に、イントロン(c)の長さは、約50ヌクレオチド〜約1000ヌクレオチド、例えば約100〜約500ヌクレオチドである。イントロン(c)は、例えば50〜500ヌクレオチド、例えば最長100、200、300又は400ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、イントロンは、天然のラットインスリンイントロンAのヌクレオチドの約第50〜133番目に見られる配列、又はこの配列の相同体を含む。
【００９１】
好ましくは、異種イントロン(c)は、真核生物宿主細胞において、RNA転写物からスプライスされる能力を有する。一般に、このイントロンは、一以上のドナー配列（GT等）、アクセプター配列（AG等）、3’ピリミジンリッチ領域、及びブランチポイント配列を含む。ピリミジンリッチ領域は、もしあるとすれば、例えば、少なくとも5、8、10又はそれ以上のピリミジンを含むことができる。好ましくは、イントロンは、少なくともドナー配列、アクセプター配列及びブランチポイント配列を含んでなる。通常、キメラ構築物においてイントロン(c)は、エクソン配列に由来する非イントロンフランキング配列を含む。この配列は、天然のイントロン(i)のイントロン／エクソン境界に見られるエクソン配列に由来する。フランキングエクソン配列は、天然のエクソン配列、又はその配列の相同体とすることができる。この配列相同体は、天然配列と同じ活性、例えばスプライシング機能を保持するといった活性を実質的に保持する。通常、５〜１０塩基、好ましくは７〜１０塩基のエクソン配列がイントロンの各末端に含まれる。
【００９２】
イントロン(c)は、そのイントロンが機能するならば人工イントロンであってもよい。例えば、組換えイントロン若しくはキメライントロンを使用することができる。このようなイントロンは、２つ以上の天然イントロンに由来する配列を含むことができる。
【００９３】
一般的に、イントロン(c)は、転写因子若しくは制御タンパク質と結合したhCMVイントロンA中に存在する配列、又はこれらの配列のいずれかに代わって同じ因子若しくはタンパク質と結合することができる前記配列の相同体を含む。通常、こうした配列若しくはその相同体は、hCMVイントロンAと同じ順序で、及び／又は実質的に同じ相対的な間隔で、イントロン(c)中に存在する。
【００９４】
イントロン(c)は相同バリアント(ii)を含むことも可能であって、このバリアントでは、天然イントロン(i)の配列が改変され、配列内の制限部位は除かれている。例えば、配列内NheI部位が破壊されたラットインスリンイントロンAの相同バリアントを使用することができる。
【００９５】
好ましくは、イントロン(c)は下記を含む：
(i) 配列番号３；
(ii) (i)の機能性相同バリアント；又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
【００９６】
さらに好ましい例において、(i)は配列番号５４のヌクレオチド1725〜1857、又は配列番号１４の同一番号のヌクレオチドを含むことができる。さらに好ましい実施形態で、(i)は配列番号６１のヌクレオチド1545〜1677、及び／又は2770〜2902を含むことができる。他の好ましい例で、(i)は配列番号６２のヌクレオチド1824〜1956、及び／又は3446〜3578を含むことができる。
【００９７】
一の好ましい例において、ラットインスリン遺伝子イントロンA配列は下記を含む： 
（i）配列番号３のヌクレオチド配列、配列番号５４のヌクレオチド1725〜1857、配列番号６１のヌクレオチド1545〜1677、配列番号６１のヌクレオチド2770〜2902、配列番号６２のヌクレオチド1824〜1956、及び／又は配列番号６２のヌクレオチド3446〜3578のヌクレオチド配列；
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；並びに／或いは
（iii）（i）又は（ii）の機能性断片。
【００９８】
イントロン配列(c)は、標準的なクローニング技術によって得ることができる。例えば、ラットインスリンイントロンA配列は、GenBank J00748として入手可能であり、またニワトリケラチンイントロンA配列はGenBank J00847として、並びにニワトリ心筋アクチンイントロンA配列はGenBank X02212として入手できる。イントロン配列は、既知の配列に基づくプライマーを用いて、天然起源から単離することができる。配列を合成により調製してもよい。バリアント配列は突然変異誘発によって得ることができる。
【００９９】
一般に、機能性イントロン配列、例えば、機能性バリアント(ii)又は機能性断片(iii)は、天然イントロン(i)の活性と実質的に同じ活性を有し、及び／又はそれを補完するものである。ある実施形態において、その活性はスプライシング活性である。
【０１００】
イントロン(c)配列のスプライシング活性を、通常のスプライシングアッセイ法を用いてテストすることができる。一般に、機能性相同体(ii)又は機能性断片(iii)は、アッセイにおいて天然イントロン(i)のスプライシング効率の少なくとも50%、例えば、60%、70%、80%、90%、並びに100%に至るまでの、又はそれ以上の効率を示す。
【０１０１】
一般に、異種イントロン配列は、本発明の構築物中に存在する場合、発現を高める。通常、バリアント(ii)又は断片(iii)イントロンが、天然イントロン(i)に匹敵する増強を引き起こすことができる。いくつかの場合において、発現の減少は本明細書に記載のいずれかのレベルに含まれ得る。
【０１０２】
潜在するイントロン配列(c)の機能性は、下記の比較発現アッセイ法によってテストすることができる。異種イントロンを交換によって基本ベクター中に導入する。概して、異種イントロン配列を加えることによって、少なくとも1つ、好ましくは２つの基準細胞型において、発現が基本ベクターと比較して25%以上増加するならば、そのイントロン配列は、機能的である。通常、基準細胞は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。SSC15又はA16細胞を使用してもよい。発現の増加は、少なくとも35%、45%、55%、又はそれ以上とすることができる。増加は、本明細書に記載のいずれかのレベルとすることができる。このアッセイ法によれば、天然イントロン配列(i)の機能性バリアント(ii)又は機能性断片(iii)は、通常、天然配列によって達成される発現向上の50%を超える発現向上を可能にする配列である。発現の減少が見られた場合、減少は、例えば本明細書に記載のいずれかのレベルとすることができる。
【０１０３】
上記に加えて、又は上記に代えて、異種イントロン(c)配列を、下記の比較免疫原性アッセイを用いて機能性についてテストすることができる。イントロン(c)配列を基本ベクターに加える。機能性イントロン(c)配列は、少なくとも1つ、好ましくは２つの抗原に対し、基本ベクターによって達成される抗体価より高い抗体価を提供する。好ましくは、抗体価は、基本ベクターを用いた場合よりも少なくとも5%、10%、例えば、20%、30%又は40%高い。好ましい抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びFlu-M2抗原である。特に好ましい抗原はインフルエンザ抗原であり、本明細書に記載のそれらの抗原のいずれか、具体的にはHA、NA及びM２抗原を含む。特にHA抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントを使用することができる。このアッセイ法によれば、天然イントロン配列(i)の機能性バリアント（ii）又は機能性断片(iii)は、通常、この天然配列によって達成される最も高い抗体価を可能にするものである。減少が見られるいくつかの場合において、そのレベルは、例えば、本明細書に記載したいずれかとすることができる。アジュバントベクターを本明細書の他のどこかで記載したものと同様の方法で評価することができる。
【０１０４】
適当な異種イントロン配列は、標準的なクローニング技術を用いて得ることができる。例えば、ラットインスリンイントロンA配列は、GenBank J00748として、ニワトリケラチンイントロンA配列はGenBank J00847として、及びニワトリ心筋アクチンイントロンA配列はGenBank X02212として入手できる。イントロン配列は、既知の配列データに基づくプライマーを用いて、天然起源から単離することができる。合成により適当な配列を調製することもできる。
【０１０５】
成分配列(a)、(b)及び(c)を互いに適切に連結して与え、標準的なクローニング技術若しくは分子生物学の技法を用いてキメラプロモーターを形成させることができる。好ましくは、イントロン配列(c)はエクソン配列(b)の3'側に与えられる。キメラプロモーター構築物は、クローニング部位に連結される。適当な酵素が存在するとき、そのプロモーターがそのクローニング部位に挿入されたコード配列の発現をもたらすように機能する。マルチクローニング部位を含む適当なクローニング部位は、当技術分野で既知である。例えば、pUC19、pBC SK、pBluescript II KS、cDNA3.1、pSP72、pGEM 7Zマルチクローニング部位が挙げられる。例えば、任意の適当な制限部位を、クローニング部位として使用することで、クローニング配列を挿入することができる。
【０１０６】
ある好ましい実施形態で、使用するキメラプロモーターは、
（i）配列番号４のヌクレオチド配列、若しくは配列番号５４のヌクレオチド903〜1857のヌクレオチド配列；
（ii）（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；及び／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片を含む。
【０１０７】
さらに好ましい例で、前記使用するキメラプロモーターは、配列番号１４の配列を含むものであってもよい。
【０１０８】
一般的にクローニング部位に挿入するための（又は、挿入される）核酸は、治療に関連するポリペプチドをコードしている。コード配列は、核酸免疫法若しくは遺伝子治療への使用に適していることが好ましい。したがって、核酸の挿入は、免疫性を与えることができる配列、例えば、被験体に送達されたときに液性及び／又は細胞性免疫応答を引き起こす免疫原性配列を含む。あるいはまた、核酸は、治療用ポリペプチドをコードする一以上の遺伝子を含んでもよい。例えば、欠損のある若しくは標的細胞ゲノムから欠失したタンパク質、又は望ましい生物学的若しくは治療上の効果（例えば、抗ウイルス作用）を有する非天然タンパク質が挙げられる。構築物は、アジュバントポリペプチドをコードすることができる。遺伝性疾患の治療のために、特定の疾患において欠損していることが知られている遺伝子に相当する、機能性遺伝子を被験体に投与することができる。好ましくは、核酸はDNAである。核酸は、いくつかの例ではRNA又はPNAであってもよい。
【０１０９】
いくつかの例において、非コードRNAを本発明の構築物で発現させることができる。それ故、ベクターはクローニング部位に前記RNA、例えばアンチセンスRNAやSiRNAを生じさせることのできる領域を挿入されていてもよい。アンチセンスRNA又はSiRNAは、例えば、本明細書に記載したいずれかの遺伝子、又は本明細書に記載したいずれかの病原体の遺伝子の発現を阻害することができる。しかしながら、最も好ましい実施形態では、ポリペプチドがコードされている。
【０１１０】
挿入に適した核酸には、エイズ、癌、神経疾患、心臓血管疾患、高コレステロール血症のような疾患を含む炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性及び感染性疾患；各種貧血、サラセミア症、及び血友病を含む、各種血液疾患；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症、気腫などといった遺伝的欠損の治療に使用される核酸が含まれる。
【０１１１】
本発明の構築物を使用して、病気を治療又は予防することができる。構築物を使用して病気を改善すること、及び／或いは特定の若しくは全ての病気の症状を取り除き、又は抑制することができる。具体的な好ましい例で、構築物を使用して被験体に病気に対するワクチン接種を行ってもよい。
【０１１２】
例えば、固形腫瘍を治療する方法において、毒性ペプチド（すなわち、リシン、ジフテリア毒素及びコブラ毒因子等の化学療法剤）をコードする遺伝子、p53のような癌抑制遺伝子、形質転換癌遺伝子に対するアンチセンスｍRNA配列、腫瘍壊死因子（TNF）並びに他のサイトカイン類のような抗腫瘍性ペプチド、又は形質転換癌遺伝子のトランスドミナントネガティブバリアントをコードする遺伝子を、腫瘍部位に、又はその近傍に、発現のために挿入することができる。
【０１１３】
ある好ましい実施形態で、本発明の構築物は、癌を治療又は予防するためのポリペプチドをコードすることができる。具体的な好ましい実施形態で、本発明の構築物は、腫瘍抗原をコードすることができる。腫瘍関連抗原の例は、MAGEファミリー（MAGE1、2、3等）、NY-ESO-1、及びSSX-2のメンバーのような精巣癌抗原、チロシナーゼ、gp100、PSA、Her-2及びCEA等の分化抗原、突然変異した自己抗原、及び腫瘍HPV型由来のE6及び／又はE7等のウイルス腫瘍抗原を含む。ただし、これらに限定はされない。具体的な腫瘍抗原のさらなる例は、MART-1、Melan-A、p97、β-HCG、GaINAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、P1A、EpCam、黒色腫抗原gp75、Hker 8、高分子量黒色腫抗原、K19、Tyrl、Tyr2、pMel17遺伝子ファミリーのメンバー、c-Met、PSM (前立腺ムチン抗原)、PSMA (前立腺特異的膜抗原)、前立腺分泌タンパク質、αフェトプロテイン、CA125、CA19.9、TAG-72、BRCA-1及びBRCA-2抗原を含む。
【０１１４】
抗原を得ることができる具体的な癌の例は、肺、前立腺、乳房、大腸、卵巣、精巣、腸、黒色腫、リンパ腫、及び白血病の癌を含む。本発明の構築物は、そのような癌を治療、又は予防するのに使用することができる。
【０１１５】
同様に、抗ウイルス及び／又は抗菌活性を示すことが知られているポリペプチド、又は宿主免疫系を刺激することが知られているポリペプチドをコードする核酸も含めることができる。核酸は、インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子といった、さまざまなサイトカイン（又はその機能性断片）の１つをコードしていてもよい。
【０１１６】
好ましい例で、コード配列は、抗原、その免疫原性断片、又はそれらいずれかの免疫原性バリアントをコードすることができる。抗原は、具体的にはウイルス、細菌、寄生性若しくは菌類病原体抗原、又は腫瘍抗原であってもよい。好ましい例で、抗原は、ウイルス抗原、その免疫原性断片、又はそれらいずれかの免疫原性バリアントである。
【０１１７】
核酸は、多くの病気の治療又は予防のための抗原をコードしていてもよく、こうした病気には、癌、アレルギー、毒性、及び病原体による感染があるがそれに限定されない。さらに前記病原体には、真菌；ウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（HPV）、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス（A、B及びC型）、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス群、エンテロウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバールウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ腫ウイルス1型（HTLV-1）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、D型肝炎ウイルス（HDV）、ポックスウイルス、マールブルグウイルス及びエボラウイルス；細菌、例えば結核菌（M.tuberculosis）、クラミジア（Chlamydia）、淋菌（N.gonorrhoeae）、赤痢菌（Shigella）、サルモネラ菌（Salmonella）、コレラ菌（Vibrio Cholera）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidua）、シュードモナス（Pseudomonas）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ菌（Brucella）、野兎病菌（Francisella tularensis）、ピロリ菌（ヘリコバクター・ピロリHelicobacter pylori）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、ペスト菌（Yersinia pestis）、連鎖球菌（Streptococcus）（A及びB型)、肺炎球菌（Pneumococcus）、髄膜炎菌（Meningococcus）、b型インフルエンザ菌（Hemophilus influenza (type b)）、トキソプラズマ原虫（Toxoplama gondic）、カンピロバクター症（Complybacteriosis）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、鼠径リンパ肉芽腫症（Donovanosis）、及び放線菌症（Actinomycosis）；真菌病原体、例えばカンジダ症（Candidiasis）及びアスペルギルス症（Aspergillosis）；寄生病原体、例えば条虫（Taenia）、吸虫（Fluke）、線虫（Roundworm）、アメーバ症（Amebiasis）、ジアルジア症（Giardiasis）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、住血吸虫（Schitosoma）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、トリコモナス症（Trichomoniasis）及び旋毛虫症（Trichinosis）といったものがある。ただし、これらに限定はされない。また、核酸を使用して多数の獣医学分野の病気、例えば、口蹄疫、コロナウイルス、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ヘリコバクター（Helicobacter）、普通円虫（Strongylus vulgaris）、Actinobacillus pleuropneumonia、ウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV)、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（E. coli）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）及び気管支敗血症菌（Bordetella brochiseptica）等に対して適当な免疫応答を付与することができる。このように、ある態様において、本発明の核酸構築物は、ワクチンに用途を見出すことができる。本発明のワクチンを使用して、本明細書に記載したいずれかの病原体及び病気に対するワクチン接種をすることができる。したがって、本発明は、本発明の核酸構築物若しくは本発明の核酸構築物の集団、又は本発明の被覆粒子を含むワクチン組成物を提供する。
【０１１８】
ある好ましい例で、本発明の核酸構築物は、アデノウイルス科（adenoviridae；例えば、ヒトアデノウイルスを含む）、ヘルペスウイルス科（herpesviridae；例えば、HSV-1、HSV-2、EBV、CMV及びVZVを含む）、パポバウイルス科（papovaviridae；例えば、HPVを含む）、ポックスウイルス科（poxviridae；例えば、天然痘、及びワクシニアを含む）、パルボウイルス科（parvoviridae；例えば、パルボウイルスB19を含む）、レオウイルス科（reoviridae；例えばロタウイルスを含む）、コロナウイルス科（coronaviridae；例えば、SARSを含む）、フラビウイルス科（flaviviridae；例えば黄熱、西ナイルウイルス、デング、C型肝炎、及びダニ媒介脳炎を含む）、ピコルナウイルス科（picornaviridae；ポリオ、ライノウイルス、及びA型肝炎を含む）、トガウイルス科（togaviridae；例えば、風疹ウイルスを含む）、フィロウイルス科（filoviridae；例えば、マールブルグ、及びエボラを含む）、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae；例えば、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプス、及び麻疹を含む）、ラブドウイルス科（rhabdoviridae；例えば、狂犬病ウイルスを含む）、ブニヤウイルス科（bunyaviridae；例えば、ハンタウイルスを含む）、オルソミクソウイルス科（orthomyxoviridae；例えば、A、B及びC型インフルエンザウイルスを含む）、レトロウイルス科（retroviridae；例えばHIV及びHTLVを含む）、及びヘパドナウイルス科（hepadnaviridae；例えば、B型肝炎を含む）の構成種由来の抗原をコードすることができる。さらに好ましい例で、抗原は獣医学的疾患に関与する病原体由来であってもよい。具体的には、例えばレオウイルス（アフリカ馬疫、又はブルータングウイルス等）、及びヘルペスウイルス（ウマヘルペスを含む）を含むウイルス病原体由来であってもよい。抗原は、足口病ウイルス由来であってもよい。さらに好ましい例では、抗原はダニ媒介脳炎ウイルス、デングウイルス、SARS、西ナイルウイルス、及びハンターンウイルス由来とすることができる。
【０１１９】
他の好ましい場合において、抗原はレトロウイルス（例えば、HTLV-I；HTLV-11；又は、HIV-1（HTLV-111、LAV、ARV、hTLR等としても知られている。））由来とすることができる。具体的にはHIV由来であり、特に単離したHIVIIIb、HIVSF2、HTVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIV-1CM235、HIV-1；又はHIV-2由来である。具体的な好ましい実施形態で、抗原はヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原であってもよい。好ましいHIV抗原の例は、例えばgp120、gp160、gp41、gag抗原（例えば、p24gag及びp55gag等）、さらにHIVのpol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu又はLTR領域を含む。特に好ましい場合において、抗原は、HIV gp120又はHIV gp120の一部であってもよい。抗原は、免疫不全ウイルス由来であってもよく、また例えばSIV若しくはネコ免疫不全ウイルス由来とすることができる。
【０１２０】
したがって、コードされたポリペプチドは、抗原、その免疫原性断片、又はその免疫原性バリアントとすることができる。断片又はバリアントは、例えば本明細書で特定した相同性レベル、元の抗原の長さの割合、及び機能性のいずれか、具体的には免疫応答を生じさせる能力を有することができる。ある例において、核酸構築物のコード配列は、発現を最適化するため改変されたものであってもよい。例えば、コドンの使用を被験体に特有なものに改変することができる。被験体のコンセンサス・コザック配列を、開始コドン周辺の野生型の配列と置き換えることもできる。
【０１２１】
特に好ましい実施形態で、本発明の核酸構築物は、インフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードするコード配列を含む。断片、及び／又はバリアントは、本明細書で特定した配列相同性レベル、断片長、及び／又は機能性のいずれかのレベルを有することができる。特に好ましくは、構築物のコード配列は、インフルエンザウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原の免疫原性断片、又は先のいずれかと80％のアミノ酸相同性をもつ免疫原性バリアントをコードする。
【０１２２】
例えば、インフルエンザ抗原は、インフルエンザNP（核タンパク質／ヌクレオカプシドタンパク質）、HA（ヘマグルチニン：血球凝集素）、NA（ノイラミニダーゼ）、M1、M2、PB1、PB2、PA、NS1、及び／又はNS2抗原とすることができる。或いは、そのような抗原の断片やバリアントであってもよい。好ましい実施例では、コードされた抗原は、HA、NA、及び／又はM2インフルエンザ抗原、或いは、そのような抗原の断片若しくはバリアントであってもよい。特に好ましい例では、コードされた抗原は、HA若しくはNA抗原、又はそのような抗原の断片若しくはバリアントである。特に、HA抗原、又はその抗原の断片、若しくはバリアントである。
【０１２３】
したがって、特に好ましい本発明の構築物で、コードされた抗原は、インフルエンザ・ヘマグルチニン（HA）、その免疫原性断片、又はいずれかと80％のアミノ酸配列の相同性をもつ免疫原性バリアントである。さらに好ましい例で、コードされた抗原はインフルエンザ・ノイラミニダーゼ（NA）、M2、それらいずれかの免疫原性断片、又は先のいずれかと80％のアミノ酸配列の相同性をもつ免疫原性バリアントである。
【０１２４】
好ましい例で、本発明の構築物は、二以上のポリペプチド、具体的には二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードすることができる。好ましい例で二以上の抗原を使用する場合、HAとNA抗原を共に、又はそれらの抗原の断片若しくはバリアントを共に使用することができる。
【０１２５】
本発明の構築物が二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、若しくはいずれかの免疫原性バリアントを発現する場合、コードされている少なくとも２つの異なる抗原、断片若しくはバリアントは、インフルエンザウイルスの異なる株の同種インフルエンザポリペプチド由来である。
【０１２６】
ある好ましい実施形態で、抗原はインフルエンザのH5N1株及びその免疫原性断片由来であってもよい。また、いずれかの免疫原性を残しているバリアントも使用することができる。特に、抗原はH5N1株由来、又は前記抗原の断片由来のものとすることができる。
【０１２７】
いくつかの例で、抗原を天然のインフルエンザポリペプチドの断片、又はバリアントとすることができる。例えば、抗原は本明細書で言及した各種断片長のいずれかを含む天然インフルエンザポリペプチドのサブ領域に対応することができる。抗原は、天然インフルエンザ抗原、又はそのような抗原の断片のバリアントであってもよい。好ましくは、前記バリアント及び／又は断片は、その抗原、具体的にはその断片又はバリアントの由来となったインフルエンザウイルスを認識可能な免疫応答を生じ得る。
【０１２８】
インフルエンザ抗原は、いずれのインフルエンザウイルス由来であってもよい。抗原を、Ａ型、Ｂ型、又はＣ型インフルエンザウイルス由来、特にＡ型及び／又はＢ型由来とすることができる。抗原を変異型インフルエンザ株由来、具体的にはインフルエンザ株の感染性又は病原性の増大と関連する変異株由来とすることができる。例えば、世界保健機関(WHO)で毎年同定される株の一つに由来する抗原を、インフルエンザワクチンに使用することができる。また、具体的にはそのような使用のためにWHOで同定された抗原であってもよい。好ましい例で、本発明の核酸構築物、核酸集団、医薬組成物、又はワクチンは、３種のインフルエンザ株の各抗原、特にWHO若しくはその他の同等の権威ある当局で同定された３種の株をコードすることができる。
【０１２９】
好ましい例で、一以上のコードされたインフルエンザ抗原を、パンデミックインフルエンザ株起源とすることができる。したがって、インフルエンザ抗原、免疫原性断片、又はいずれかのバリアントは、パンデミックインフルエンザ株由来であってもよい。パンデミック株由来の抗原をコードする構築物を、例えばそのままで投与すること、又はそのままで存在させることができる。その他に本構築物は、他の抗原をコードすることができ、又は本構築物を他の抗原をコードする他の構築物と共に投与することができる。好ましいケースでは、パンデミックインフルエンザ株由来の抗原と非パンデミックインフルエンザ株由来の抗原を同一の、又は別々の構築物のいずれかにコードしてもよい。具体的にはパンデミックインフルエンザ抗原と、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の非パンデミックインフルエンザ株由来の抗原を投与することができる。好ましくは、３つ、４つ又は５つの非パンデミックインフルエンザ株のそれぞれに由来する抗原を投与してもよい。より一層好ましくは、３つ又は４つの非パンデミックインフルエンザ株を投与してもよい。
【０１３０】
いくつかの例で、構築物は二以上のポリペプチドをコードすることができる。具体的には、構築物は、二以上の抗原、特に二以上のインフルエンザ抗原をコードすることができる。例えば、構築物は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のポリペプチド、具体的には抗原を発現してもよい。好ましい場合として、構築物は、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の異なるポリペプチド、具体的には抗原をコードすることができる。より一層好ましい場合として、構築物は３つ、４つ、又は５つの異なるポリペプチド、具体的には抗原をコードすることができる。さらに一層好ましい場合として、構築物は３つ、又は４つの異なるポリペプチド、具体的には抗原、特にインフルエンザ抗原をコードしてもよい。少なくとも１つの抗原を、本発明のキメラプロモーターを用いて発現することができる。好ましくは、全ての抗原をそのようにして発現してもよい。通常、各抗原は、本発明の別々のキメラプロモーターから発現され得る。いくつかの場合では、単一プロモーターを用いて複数のポリペプチドを生じる転写産物を発生させることができる。ある例では、いくつかの抗原を、融合タンパク質として発現することができる。
【０１３１】
好ましい例では、本発明の構築物は、パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアント、及び一以上の非パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかのバリアントをコードする。
【０１３２】
本発明の核酸構築物を、ワクチンに使用することができる。それ故、本発明は、本発明の核酸構築物、核酸構築物の集団、又は被覆粒子を含むワクチン組成物を提供する。ワクチンは、適当な製薬上の担体、若しくは賦形剤を含んでいてもよい。ワクチンは、アジュバント、具体的には本発明のアジュバント構築物を含むことができる。あるいは、ワクチンを、前記アジュバントと別々に、連続して、又は同時に投与してもよい。
【０１３３】
ある好ましい例で、本発明は、異なる抗原、その免疫原性断片若しくはいずれかの免疫原性バリアントをコードする少なくとも２つの異なる本発明の構築物を含む多価ワクチンを提供する。抗原は、本明細書に記載したいずれのものであってもよい。好ましい例では、本発明は、異なるインフルエンザ抗原、その免疫原性断片若しくはいずれかの免疫原性バリアントをコードする少なくとも２つの異なる本発明の構築物を含む多価ワクチンを提供する。別の例では、複数の抗原を同一構築物から発現させて、多価ワクチンを提供することができる。或いは、単一の、及び複数抗原をコードする構築物の組合せで使用することができる。
【０１３４】
さらに好ましい例で、本発明の多価ワクチンは、三価、四価、又は五価ワクチンであって、３つ、４つ、５つの異なる抗原、免疫原性断片若しくは免疫原性バリアント、具体的にはインフルエンザ抗原、断片若しくはいずれかのバリアントをコードするものであってもよい。
【０１３５】
他の好ましい例で、本発明の多価ワクチンを含むワクチンは、パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードする構築物を含むことができる。多価ワクチンは、パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアント、また、例えば３種、４種、若しくは５種の異なるインフルエンザ株それぞれに由来する抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードすることができる。
【０１３６】
アジュバントを本発明のワクチンに含めること、又は本発明のワクチンと同時に、別々に、若しくは連続して投与することができる。具体的には、本発明は、少なくとも一つの本発明の構築物であって、ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するそのバリアントをコードする構築物を含むワクチンを提供する。
【０１３７】
二以上の抗原を発現する核酸構築物を用いて、多価ワクチン、すなわち複数の異なる抗原に対して、特にインフルエンザ抗原に対して、免疫付与することを目的としたワクチンを作ることができる。いくつかの例で、インフルエンザ抗原、及び異なる病原体由来の抗原を与えることができる。したがって、本明細書に記載した構築物、核酸構築物の集団、ワクチン、医薬組成物、及び被覆担体粒子のいずれも、インフルエンザ抗原をコードする構築物を含むことができる。また、同一の、又は異なる構築物のいずれかが、異なる病原体由来の抗原をコードすることができる。本明細書に記載した様々な多価インフルエンザ構築物、集団、及びワクチンはまた、異なる病原体由来の抗原をコードしていてもよい。
【０１３８】
いくつかの場合で、コードされた抗原を同一病原体由来とすることができる。ある例では、異なる抗原が全て同一ウイルス由来とすることができる。したがって、好ましい例で、全ての抗原は、インフルエンザ抗原とすることができる。複数の抗原が同一インフルエンザウイルス株由来であってもよい。したがって、インフルエンザウイルスのいくつかの異なるポリペプチド由来とすることができる。あるいは、複数の抗原は、ウイルスの異なる株、特にインフルエンザウイルス由来であってもよい。多価構築物、及び／又はワクチンの場合には、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、又は５つの異なるインフルエンザ株由来の抗原を選択することができる。抗原は、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上の異なる株由来であってもよい。具体的には、３つ、４つ、又は５つの株由来の抗原を使用することができる。より一層好ましくは、３つ又は４つの異なる株由来である。
【０１３９】
多価ワクチンは、代わりに、又は加えて複数の異なる本発明の構築物を、異なる抗原をコードする異なる構築物と共に含むことができる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの異なる構築物を使用することができる。特に好ましい例では、２つ、３つ、４つ、又は５つの異なる構築物、特に３つ、又は４つの構築物を使用することができる。ある例で、二以上の構築物が存在する場合、それぞれの構築物は、抗原を一つだけコードする。さらなる例では、構築物は２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の異なる抗原、特に３つ、又は４つの異なる抗原をコードすることができる。
【０１４０】
本発明はまた、複数の本発明の構築物、特に上記いずれかの組合せを含む核酸構築物の集団を提供する。したがって、本発明は、集団が少なくとも２つの異なる本発明の構築物を含んでなる、核酸構築物の集団を提供する。核酸構築物を、お互いに対して適当な量で含めることができる。一般的に各核酸構築物は、お互いに対し約１：１０の重量比で含まれる。
【０１４１】
核酸構築物の集団を使用して、また本発明の様々な方法で、多価ワクチンを作ることができる。多価ワクチンはまた、二以上の抗原をコードする本発明のいずれかの構築物を含むため、多面的な意義があってもよい。
【０１４２】
ある好ましい例では、異なる抗原をコードする少なくとも２つの異なる構築物を含む核酸構築物の集団を提供する。特に、本発明は、インフルエンザ抗原、その免疫原性ペプチド、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードする少なくとも２つの異なる構築物を含む集団を提供する。そのような核酸構築物の集団において、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原が、異なるインフルエンザ株に由来する、例えばHA等の同種のインフルエンザポリペプチド由来であってもよい。インフルエンザ抗原をコードする少なくとも２つの異なる構築物を有する集団において、異なるインフルエンザポリペプチド由来である好ましくは少なくとも２つの異なる抗原、断片、又はバリアントは、同一、又は異なるインフルエンザ株由来であってもよい。さらに好ましい集団は、集団が少なくとも３つの異なる構築物を含み、各核酸構築物が異なるインフルエンザ株の抗原、若しくは免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードしている構築物の集団を含む。
【０１４３】
他の好ましい例で、本発明は、核酸構築物の集団であって、その集団が、抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアントをコードする少なくとも１つの構築物、及びADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するそのバリアントをコードする少なくとも１つの構築物を含む、前記核酸構築物の集団を提供する。抗原、免疫原性断片若しくは免疫原性バリアントをコードする一の又は各構築物は、ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するそのバリアントをコードする一の又は各構築物に対して、通常、約１０：１〜１：１０の重量比率で存在する。重量比率は、約１０：１〜約１：１、例えば９：１とすることができる。
【０１４４】
複数のポリペプチドがコードされている場合には、一以上のポリペプチドをコードする構築物の任意の組合せ、及び複数の構築物を使用することができる。例えば３つの抗原がコードされている場合、一の構築物が３つ全てをコードしてもよいし、一の構築物が２つの抗原をコードし、もう一つの構築物が一の抗原をコードしてもよい。あるいは、例えばそれぞれが１の抗原をコードする３つの構築物を使用することもできる。４つの抗原をコードしている場合には、それらは、４つ、３つ、２つ、又は１つの構築物を介して、１つ、２つ、３つ、又は４つの異なる抗原をコードする各構築物にコードされていてもよい。一例で、できる限り少ない構築物を使用してもよい。例えば、構築物１つだけ、又は２つを使用してもよい。本発明はまた、前記核酸構築物の組合せを含む核酸集団、及びワクチンを提供する。
【０１４５】
好ましい例で、本発明は、パンデミックインフルエンザウイルス由来の抗原をコードし、また３つ、４つ若しくは５つの、特に３つ若しくは４つの非パンデミックインフルエンザ抗原をコードする多価ワクチン、又は核酸集団を提供する。非パンデミックインフルエンザ抗原を、パンデミックインフルエンザ抗原と同一の構築物上に、又は異なる構築物上にコードすることができる。好ましい例で、３つ、４つ若しくは５つの他の非パンデミックインフルエンザ抗原を一の構築物、又は複数の構築物上に別々にコードすることができる。特に、単一の構築物上に別々にコードすることができる。その他の例で、パンデミック抗原をコードする構築物は、一以上の他の抗原をコードすることもできる。
【０１４６】
いくつかの実施形態で、核酸構築物はアジュバントをコードすることができる。又は、別々の構築物に同様にコードしてもよい。本発明の集団、組成物、又はワクチンは、いずれも前記アジュバント構築物を含み、又は同時に、連続して若しくは別々にそれを投与することができる。したがって、コード配列の挿入用のクローニング部位に挿入されるコード配列は、アジュバントとして作用することができるポリペプチドをコードしていてもよい。
【０１４７】
したがって、ある例において、本発明は、コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80％のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードする核酸構築物を含む。ある好ましい場合で、核酸構築物は、ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するいずれかのバリアントを含む２つのコード配列を含み、各コード配列は前記キメラプロモーターに連結されている。
【０１４８】
ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するいずれかのバリアントをコードする２つのコード配列を、ある例では、逆方向とすることができる。他の例では、ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はアジュバント活性を有するいずれかのバリアントをコードする２つのコード配列を、同方向とすることができる。キメラプロモーターに連結された二以上のコード配列を含む本発明のいずれかの構築物において、プロモーターを同方向、異なる方向とすることができる。あるいは、３つ以上の前記プロモーターが存在する場合、２つの方向を混合したものであってもよい。
【０１４９】
好ましい例で、いずれかのアジュバント構築物にコードされるアジュバントは、ADP-リボシル化細菌性毒素であってもよい。こうした毒素には、ジフテリア毒素（DT）、百日咳毒素（PT）、コレラ毒素（CT）、大腸菌易熱性毒素（LT1及びLT2）、シュードモナス・エンドトキシンA、シュードモナス・エンドトキシンS、セレウス菌（B. cereus）細胞外酵素、B.スファエリク（B. sphaericus）毒素、ボツリヌス菌（C. botulinum）C2及びC3毒素、C.リモサム（C. limosum）細胞外酵素、並びにウェルシュ菌（C.パーフリンジェンス：C. perfringens）、C.スピリホルマ（C. spiriforma）、及びクロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）起源の毒素、及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）EDINがある。ほとんどのADP-リボシル化細菌性毒素は、A及びBサブユニットを含有する。構築物はAサブユニット、Bサブユニット、及び／又は両方のサブユニットを発現することができる。
【０１５０】
好ましい例において、核酸構築物は、大腸菌易熱性毒素及び／又はコレラ毒素をコードすることができる。特に、大腸菌易熱性毒素を発現することができる。CTサブユニットA及びB遺伝子の完全な配列に関するGenBankエントリーは、Locus VIBCTXABB（アクセッション番号D30053）に見出され、一方、LTサブユニットA及びB遺伝子の完全な配列のGenBankエントリーは、Locus ABO116677（アクセッション番号ABO11677）に見出すことができる。特に好ましい例で、本発明の構築物は、pPJV2012、及び／若しくはpPJV778ベクターにコードされているLT A及び／又はLT Bサブユニット、或いはアジュバント活性を保持している前記サブユニットの断片、又はアジュバント活性を保持している前記いずれかのバリアントをコードすることができる。本発明の構築物は、pPJV2012、及び／若しくはpPJV778ベクターのLT A及び／又はLT Bサブユニットのコード配列、アジュバント活性を有するポリペプチドをコードするそれらの断片、或いはアジュバント活性を有する前記サブユニットの断片、又はアジュバント活性を保持している前記いずれかのバリアントを含むことができる。好ましい例で、本発明の構築物は、LT A及びLT Bサブユニットコード配列の両方を有している。
【０１５１】
他の好ましい例で、前記構築物は、配列番号６１で提供されるPJV2012ベクターの配列、又はそれと60％の配列相同性を持つ配列を含むことができる。さらなる例において、前記構築物は、配列番号６２で提供されるPJV7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含むことができる。
【０１５２】
構築物は、特定のアジュバントの、活性を有するバリアント若しくは断片を発現してもよい。このバリアント若しくは断片は、その起源である元のポリペプチドのアジュバント活性の少なくとも一部を保持しているならば、活性があるといえる。したがって、バリアント及び／又は断片は、抗原とともにアジュバントが投与されない場合に見られる免疫応答と比較して、依然、特定の抗原に対する免疫応答を増強することができる。コードされる配列は、CTのA及び／又はBサブユニットの活性断片若しくはバリアントであってもよいが、特に、LTのA及び／又はBサブユニットの活性断片とすることができる。使用できるバリアント及び断片は、例えば、バリアント及び断片に関して本明細書に記載した配列相同性の長さ、レベル、又は他の特徴のいずれかを有すればよい。それらは、例えば、特定の抗原を用いる比較免疫原性アッセイを使用して評価し、その後アジュバント基本ベクターと、アジュバントをコードする変異ベクターで見られる結果を比較することができる。具体的な好ましい実施形態で、構築物は、LTA及び／又はLTBサブユニット、特にその両方をコードすることができる。具体的な好ましい例で、構築物は、本明細書で提供された配列のpPJV2012又はpPJV7788であってもよい。
【０１５３】
本発明のアジュバント構築物はいずれも、抗原、又は抗原をコードする核酸と、同時に、連続して、又は別々に投与することができる。好ましい例で、本発明のアジュバント構築物は、抗原をコードする本発明の構築物と同時に、連続して、又は別々に投与することができる。アジュバント構築物、及び抗原をコードする構築物を含む組成物並びにワクチンが、与えられた両方の構築物で被覆されたコア担体として、又はアジュバント構築物で被覆されたコア担体と抗原をコードする構築物で被覆されたコア担体の混合物として、提供される。
【０１５４】
毒素サブユニットは、野生型のシグナル配列を欠失させておくことができる。外毒素の野生型のシグナル配列は、真核生物のシグナル配列、具体的にはニワトリのリゾチームシグナルペプチドで置換することができる。野性の毒素サブユニットを解毒するよう修飾してもよい。Aサブユニットを修飾して、ADPリボシルトランスフェラーゼ活性を妨害し、不活化することができる。いくつかの場合で、外毒素サブユニットは、毒性を残していてもよい。したがって、ある例では、外毒素サブユニットは、解毒中和しなくともよい。
【０１５５】
したがって、本発明のアジュバント構築物は、特定の抗原に対する免疫応答を強めるために使用することができる。増強された免疫応答は、程度の大きい、又は持続期間の長い免疫応答を含み得る。それは、抗原に再遭遇したときの免疫応答が、アジュバントが与えられなかった場合より大きいことを意味するものと考えられる。増強された免疫応答は、結果として高い抗体価をもたらすことができる。一部の構築物の場合、及び特に外毒素サブユニットを発現する構築物の場合、アジュバントは、当該抗原に対する細胞性応答の増大、及びTヘルパー1様免疫応答をもたらすことができる。
【０１５６】
アジュバント構築物を、本明細書に記載した他のいずれかの構築物と共に投与すること、ワクチン中に含めること、又は核酸の集団中に含めることでができる。アジュバント構築物はまた、本明細書で記載したいずれか、特にインフルエンザを含む抗原をコードすることができ、又はそのような抗原をコードする構築物と共に投与することができる。
【０１５７】
ある実施形態において、本発明の構築物は、免疫賦活剤、及び／又は免疫抑制剤をコードしてもよい。好ましい例で、構築物は、インターフェロンα、β、及び／又はガンマ、インターロイキン−1、−2、−4、−5、−7、−10、−12、−13、−18、−23、及び−24、GM-CSF、G-CSF、TGF-β、B7.1、B7.2、CTLA-4、CD40リガンド、CD40、OX40、OX40リガンド、Flt-3リガンド、TRAIL、TRANCE、Fasリガンド、TNFα、MCP-1α、PF-4、SLC、MIP-3α、IP-10のうち一以上をコードすることができる。いくつかの場合で、前記構築物を、他のいずれかの構築物と、具体的には本発明の構築物と、特に抗原をコードしている構築物と、同時に、別々に又は連続して投与することができる。
【０１５８】
本発明の構築物はポリアデニル化シグナルを含むことができる。クローニング部位に挿入する核酸は、ポリアデニル化（ポリA）配列を含むことができる。前記ポリA配列は、一般にコード配列に最初から存在する。あるいは、異種ポリA配列を本発明の核酸配列中に与えることができる。通常、ポリA配列は、クローニング部位の下流に与えられ、クローニング部位に挿入されるコード配列に機能し得るように連結される。標準的なクローニング技法によって、何らかの適当なポリA配列を構築物に含めることができる。こうしたポリA配列は当技術分野で知られている。
【０１５９】
ポリA配列は、下記とすることができる：
(i) 天然のポリA配列；
(ii) (i)の機能性相同バリアント；又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
【０１６０】
天然のポリA配列(i)は、例えば、ウサギβグロビン遺伝子ポリA、ヒトパピローマウイルス(HPV)初期若しくは後期遺伝子ポリA、HSV-2gB遺伝子ポリA、サルCMV前初期遺伝子ポリA、又はHSV gD後期遺伝子ポリAとすることができる。ポリアデニル化配列は、ウサギβグロビン遺伝子、ヒトパピローマウイルス(HPV)初期若しくは後期遺伝子、HSV-2gB遺伝子、サルCMV前初期遺伝子、及びHSV gD後期遺伝子から選択される遺伝子のポリアデニル化配列に由来するものであってもよい。
【０１６１】
好ましくは天然のポリA配列(i)は、配列番号１０（GenBank K03256）、配列番号１１（GenBank M16019）、配列番号１２（GenBank Z80699）及び配列番号１３（GenBank K02718）からなる一群から選択される。特に好ましいポリA配列は、配列番号５４のヌクレオチド4243〜4373を含む。或いはその機能性相同バリアント、又は断片である。好ましいポリA配列はまた、配列番号１４のヌクレオチド2556〜2686で提供される。或いは、それらいずれかの機能性断片又はバリアントも使用できる。
【０１６２】
さらに好ましい例で、本発明の構築物に使用されるポリアデニル化シグナルは、下記を含む：
（i）配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号５４のヌクレオチド4243〜4373、配列番号６１のヌクレオチド906〜1038、配列番号６１のヌクレオチド4375〜4050、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド2463〜2593のヌクレオチド配列；
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；並びに／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片。
【０１６３】
一般に、機能性ポリA配列は、ポリアデニル化活性を保持する配列である。
【０１６４】
ポリA配列がRNA転写物のポリアデニル化をもたらす能力を、通常の発現アッセイによってテストすることができる。機能性相同バリアント(ii)又は機能性断片(iii)は、典型的には、アッセイにおいて、天然のポリA配列の、少なくとも50%、例えば、60%、70%、80%、又はそれ以上のポリA活性を示す。
【０１６５】
概して、ポリA配列は、本発明の構築物中に存在する場合、発現を強め、一般的には、上記の天然ポリA配列(i)に匹敵する増強をもたらす。
【０１６６】
ポリA配列は、また、下記の比較発現アッセイによって機能をアッセイすることができる。テスト・ポリA領域を、RBGpAと交換して基本ベクター中に入れる。テスト・ポリAは、そのポリAが少なくとも1つ、好ましくは２つの基準細胞型において、基本ベクターと比較して、発現を抑制するのではなく、むしろ発現を増加させるのであれば機能性であると見なす。好ましくは、発現は少なくとも5%、10%、20%、30%、40%又は50%以上増加する。増加は、本明細書に記載したいずれかのレベルとすることができる。いくつかの場合において、本明細書に記載したいずれかのレベルを含めて、減少してもよい。好ましい細胞型は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。SSC15又はB16細胞も使用することができる。このアッセイによれば、相同バリアント(ii)若しくは断片(iii)は、通常、天然ポリA配列(i)によって達成される発現向上の50%を超える発現向上を可能にするならば、機能性である。
【０１６７】
上記の代わりに、若しくは上記に加えて、ポリA配列を下記の比較免疫原性アッセイでテストすることができる。ポリA配列を、RBGpAと交換して基本ベクターにいれる。機能性ポリA配列は、少なくとも1つの、好ましくは２つの抗原に対して、基本ベクターによって達成される抗体価と少なくとも同程度の、若しくはそれより高い抗体価を与える。好ましくは、抗体価は、基本ベクターで達成される抗体価よりも、少なくとも5%、10%、例えば、20%、30%又は40%高い。いくつかの場合において、本明細書に記載した発現の増加又は減少のいずれも見ることができる。好ましい抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びFlu-M2抗原である。特に好ましい抗原は、本明細書に記載したいずれかのインフルエンザ抗原、具体的にはHA、NA、及びM2抗原である。特に、HA抗原、若しくはその免疫原性断片、又はそれらいずれかの免疫原性バリアントを使用することができる。相同バリアント（ii）又は断片(iii)は、通常、この天然ポリA配列(i)によって達成される最も高い抗体価を可能にするならば、機能性である。
【０１６８】
核酸構築物は、クローニング部位に挿入されるコード配列の発現に影響を与える、追加の制御配列を包含してもよい。構築物は、非翻訳リーダー配列を包含することができる。この配列は、キメラプロモーターと、それ故クローニング部位に挿入されたコード配列とも、機能し得るように連結された構築物中に提供される。リーダー配列は、挿入されたコード配列の発現のための翻訳開始部位を提供し、通常Kozak配列を含む。
【０１６９】
一般的には、非翻訳リーダー配列は下記を含む：
(i) 天然の非翻訳リーダー配列；
(ii) (i)の機能性相同バリアント；又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
【０１７０】
通常、リーダー配列は、転写エレメント若しくは調節タンパク質と結合する(i)中に存在する配列、又は同じエレメント若しくはタンパク質と結合する能力を有する、前記配列の相同体を含む。一般的に、こうした配列又はその相同体は、(i)と同じ順序で、及び／又は実質的に(i)と同じ相対的間隔で、リーダー配列中に存在する。一般にリーダー配列は、挿入されたコード配列の発現のための翻訳開始部位を含む。通常、リーダー配列は、Kozak配列を含む。
【０１７１】
一般に、非翻訳リーダー配列の長さは、約10から約200ヌクレオチド、例えば、約15から150ヌクレオチド、好ましくは15から約130ヌクレオチドまでである。例えば、15、50、75、又は100ヌクレオチドを含むリーダー配列を使用することができる。
【０１７２】
概して、機能性非翻訳リーダー配列は、機能し得るようにリーダー配列と結合しているコード配列の、発現のための翻訳開始部位を提供することができる配列である。一般的に、機能性バリアント(ii)又は断片(iii)は、通常、その配列と機能し得るように連結されたコード配列の発現を促進し、又は増強することにおいて、天然の配列(i)と実質的に同じ活性を有し、及び／又は(i)の活性を補完する。
【０１７３】
バリアント(ii)又は断片(iii)の非翻訳リーダー配列としての活性を、天然のリーダー配列と比較して、標準的な方法によって、テストすることができる。例えば、天然のリーダー配列(i)を、その本来のコード配列と機能し得るように連結して含んでなる、発現ベクターを調製することができ、適当な宿主細胞、例えば哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞において発現をモニターすることができる。天然のリーダー配列が相同バリアント又は断片で置き換えられたテスト構築物を調製することができ、同じ宿主細胞においてやはり発現をモニターすることができる。一般に、バリアント(ii)又は断片(iii)は、天然の配列によって与えられる発現の少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、又は100%以上を与える。いくつかの場合では、本明細書に記載した発現の増加又は減少のいずれも見ることができる。
【０１７４】
潜在的リーダー配列の有用性を下記の比較発現アッセイにおいて、テストすることもできる。テストリーダー配列をHBV preS2 5'UTRと交換して基本ベクターに挿入する。機能性リーダー配列は、少なくとも1つの、好ましくは２つの基準細胞型において、基本ベクターと比較して発現を抑制しない。また、好ましくは発現を増加させる。一般に、発現は少なくとも5%、10%、20%、30%、40%又は50%増加する。好ましい細胞型は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。このアッセイによれば、相同バリアント(ii)若しくは断片(iii)は、通常、天然リーダー配列(i)によって達成される発現向上の50%を超えることが可能ならば、機能性である。
【０１７５】
上記の代わりに、若しくは上記に加えて、リーダー配列の活性を下記の比較免疫原性アッセイでテストすることができる。リーダー配列を、HBV preS2 5'UTRと交換して基本ベクターに挿入する。機能性リーダー配列は、少なくとも1つの、好ましくは２つの抗原に対して、基本ベクターによって達成される抗体価と少なくとも同程度の、若しくはそれより高い抗体価を与える。好ましくは、抗体価は、基本ベクターで達成される抗体価よりも、少なくとも5%、10%、20%、30%又は40%高い。好ましい抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びFlu-M2抗原である。特に好ましい抗原は、インフルエンザ抗原であり、本明細書に記載したいずれかのもの、具体的にはHA、NA及びM2抗原を含む。具体的には、HA抗原、又はその断片若しくはバリアントを使用してもよい。相同バリアント（ii）又は断片(iii)は、通常、天然リーダー配列(i)によって認められる最も高い抗体価を可能にするならば、機能性である。しかしながら、いくつかの例で、本明細書に記載した発現のレベルの減少を見ることがあってもよい。
【０１７６】
標準的な方法によって適当なリーダー配列を得ることができる。例えば、HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、及びHSV タイプ 2gD抗原配列は、それぞれGenBank M54923、M54923及びZ86099として利用可能である。この既知の配列に基づいて、プライマーをデザインし、それを用いて相同配列を単離することができる。リーダー配列は、既知の配列に基づいて合成してもよい。
【０１７７】
一般的に、天然配列(i)は、真核生物配列、又はウイルス配列、特に真核生物に感染するウイルスの配列である。好ましくは、天然配列(i)は、HBV、又はHSV配列である。例えば、HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列が該当する。特に好ましくは、(i)は、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７からなる群より選択される。さらに好ましい例で、非翻訳リーダー配列は、配列番号５４若しくは配列番号１４のヌクレオチド1864〜1984を含む。機能性断片、これらの配列のいずれかのバリアントもまた、使用することができる。
【０１７８】
一例において、非翻訳リーダー配列は以下を含む：
（i）配列番号５、配列番号６、配列番号７、若しくは配列番号５４のヌクレオチド1864〜1984のヌクレオチド配列；
（ii）（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；及び／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片。
【０１７９】
前記非翻訳リーダー配列は、本発明のいずれかの構築物で使用することができる。
【０１８０】
核酸構築物はエンハンサー配列を包含することができる。エンハンサー配列は、典型的にはクローニング部位の3'側に、キメラプロモーター及び挿入されたコード配列の両者と機能し得るように連結された状態で与えられ、挿入された配列の転写を増加させるように作用する。
【０１８１】
一般に、エンハンサーは下記を含んでなる：
(i) 天然エンハンサー；
(ii) (i)の機能性相同バリアント；又は
(iii) (i)若しくは(ii)の機能性断片。
【０１８２】
エンハンサー配列は概して、約50から約850ヌクレオチド、例えば、約75から約500ヌクレオチドを含んでなる。約100、200、300、又は400ヌクレオチドからなるエンハンサーを使用することができる。
【０１８３】
一般的に、(i)は真核生物又はウイルスのエンハンサーであって、特に真核生物に感染するウイルスのエンハンサーである。通常、こうしたエンハンサーは、遺伝子の3'非翻訳領域（3'UTR）に存在する。好ましくは、(i)は、HBV又はCMVエンハンサーであり、例えば、HBs Ag 3'UTR又はサルCMV前初期遺伝子3'UTRである。好ましくは、(i)は配列番号８又は配列番号９を含んでなる。好ましくは、(i)は、配列番号５４のヌクレオチド3699〜4231を含むことができる。他の好ましい例で、(i)は、配列番号１４のヌクレオチド2012〜2544を含むことができる。それらの配列のいずれかの機能性断片、又はバリアントを使用することができる。
【０１８４】
一般に、構築物中のエンハンサーは、例えば転写因子のような、転写エレメント若しくは調節タンパク質と結合する、(i)中に見られる配列、又は同じエレメント若しくはタンパク質と結合する、前記配列の相同体を含んでなる。好ましくは、こうした配列は、(i)と同じ順序で、及び／又は実質的に(i)と同じ相対的間隔で、エンハンサー中に存在する。
【０１８５】
概して、機能性エンハンサーは、機能し得るようにエンハンサー配列と結合しているポリヌクレオチド、例えばコード配列の発現を増強し、高めるものである。典型的には、機能性相同バリアント(ii)又は断片(iii)は、天然エンハンサー(i)の活性と実質的に同じ活性を有し、及び／又は(i)の活性を補完する。
【０１８６】
エンハンサートラップアッセイによって、エンハンサー活性をアッセイすることができる。手順は当技術分野において公知である。機能性相同バリアント(ii)又は断片(iii)は、好ましくは、上記アッセイにおいて天然エンハンサーの示すエンハンサー活性の、少なくとも50%の活性を与える。通常、その活性は、天然エンハンサーの活性の少なくとも60%、70%、80%、90%、100%、又はそれ以上である。一般に、機能性バリアント(ii)又は断片(iii)は、アッセイにおいて、天然エンハンサーの活性を補完することができる。例えば、本明細書に記載した増加又は減少のいずれかを見ることができる。
【０１８７】
一の好ましい例で、エンハンサー配列は、以下を含んでなる：
（i）配列番号８、配列番号９、配列番号５４のヌクレオチド3699〜4231、配列番号６１のヌクレオチド3831〜4363、及び／若しくは配列番号６２のヌクレオチド4507〜5038のヌクレオチド配列；
（ii）一以上の（i）の配列と少なくとも80％のヌクレオチド配列相同性を有する（i）の機能性バリアント；並びに／又は
（iii）（i）若しくは（ii）の機能性断片。
【０１８８】
エンハンサーの有効性を、下記の比較発現アッセイによって調べることもできる。テスト3'UTR配列を交換によって基本ベクターに入れる。3'UTRが、アッセイで基本ベクターと比較して、少なくとも１つ、好ましくは２つの基準細胞型において、発現を抑制することなく、むしろ発現を高めるならば、その3'UTRは有用である。好ましくは、発現は少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、又は50%増加する。好ましい細胞型は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。このアッセイによれば、相同バリアント(ii)若しくは断片(iii)は、通常、天然エンハンサー配列(i)によって達成される発現向上の50%を超える発現向上を可能にするならば、機能性である。
【０１８９】
上記に加えて、又は上記の代わりに、エンハンサー配列を下記の比較免疫原性アッセイでテストすることができる。3'UTRを交換によって基本ベクターにいれる。機能性エンハンサー配列は、少なくとも1つの、好ましくは２つの抗原に対して、基本ベクターによって達成される抗体価と少なくとも同程度の、若しくはそれより高い抗体価を与える。好ましくは、抗体価は、基本ベクターよりも、少なくとも5%、10%、20%、30%又は40%高い。好ましい抗原は、HBsAg、HSV 2gD及びFlu-M2抗原である。特に好ましい抗原は、インフルエンザ抗原であり、本明細書に記載したあらゆる抗原、具体的にはHA、NA、及びM2抗原を含む。特に、HA、又はその断片やバリアントを使用することができる。相同バリアント（ii）又は断片(iii)は、この天然エンハンサー配列によって認められる最も高い抗体価を可能にするならば、機能性である。
【０１９０】
適当なエンハンサー配列は、標準的なクローニング法によって得られる。例えば、HBsAg 3'UTR配列若しくはサルCMV前初期遺伝子3'UTR配列は、GenBank AF143308及びM16019で入手できる。この既知の配列に基づいて、プライマーをデザインすることができ、これを用いて相同配列を単離することができる。
【０１９１】
いくつかの例で、複数のポリペプチドが一の構築物にコードされている場合、特定の配列を除いて、構築物のサイズを減らすことが望ましい。具体的には、構築物は、発現用のポリペプチドをコードする配列に機能し得るように連結されたエンハンサー、及び／又は非翻訳リーダー配列をコードする領域を除くことができる。例えば、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のポリペプチドが同一構築物から発現される場合、特に、３つ、４つ、又は５つのポリペプチドが同一構築物から発現される場合があり得る。
【０１９２】
好ましい実施形態において、核酸構築物は、挿入されたコード配列の効率的な発現のために、異種ポリA配列、異種リーダー配列及び異種エンハンサーを、いずれも、キメラプロモーターと機能し得るように連結された状態で含んでなる。
【０１９３】
別の態様において、本発明はまた、下記を含んでなる、又は場合によっては基本的に下記で構成される、核酸構築物を提供する：
(i) プロモーター配列；
(ii) HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列又はHSV タイプ 2gD抗原配列に由来する非翻訳リーダー配列；及び
(iii) (i)及び(ii)と機能し得るように連結されたコード配列であって、そのコード配列が非翻訳リーダー配列に対して異種性である、前記コード配列。
【０１９４】
一般的に、プロモーター配列(i)は、ウイルス又は真核生物プロモーター配列に由来する。プロモーター配列は、天然プロモーター配列、天然配列の機能性相同体、又は両者の機能性断片とすることができる。適当な天然プロモーターには、例えば、hCMV前初期プロモーター、仮性狂犬病ウイルス（PRV）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターがある。好ましくは、天然プロモーターは、配列番号５２又は配列番号５３を含んでなる。
【０１９５】
上記のキメラプロモーターのような人工プロモーター構築物を使用してもよいが、そのプロモーターが機能することが条件である。
【０１９６】
機能性プロモーター配列は、一般に、適当な宿主細胞において機能し得るように連結されたコード配列の転写を引き起こすこと（開始及び制御することを含む）ができる配列である。
【０１９７】
プロモーター配列は、通常の発現アッセイによってプロモーター活性をテストすることができる。天然プロモーター配列の機能性相同体若しくは断片は、通常、こうしたアッセイで天然配列によって与えられる発現の、少なくとも50%、例えば、少なくとも60、70、80又は90%をもたらす。
【０１９８】
非翻訳リーダー配列(ii)は、上記の通りである。適当なコード配列(iii)は、キメラプロモーター構築物に関連してすでに記載したものを包含する。しかしながら、本発明のこの態様において、コード配列は非翻訳リーダー配列に対して異種性である。この構築物は、通常は、既述のようにコード配列の本来のポリA配列、又は構築物において異種ポリA配列として与えられるポリA配列を包含する。適当なポリA配列はすでに記載した。構築物は、コード配列の3'側にエンハンサー配列を追加して包含することができる。適当なエンハンサー配列は、キメラプロモーター構築物に関連して上記に記載している。
【０１９９】
もう一つの態様において、本発明は、下記を含んでなる、又は、実施形態によっては基本的に下記で構成される、核酸構築物を提供する：
(i) プロモーター配列；
(ii) プロモーター配列(i)に機能し得るように連結されたコード配列；及び
(iii) コード配列(ii)の3'側に、機能し得るように連結されたエンハンサー配列；
上記において、エンハンサー配列(iii)は、HBsAg配列の3'UTR、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3'UTRに由来し、コード配列(ii)は、エンハンサー配列に対して異種性である。
【０２００】
この構築物は、キメラプロモーター構築物に関連して既に記載したような非翻訳リーダー配列を含むことができる。
【０２０１】
一般的に、プロモーター配列(i)は、ウイルス又は真核生物プロモーター配列に由来する。プロモーター配列は、天然プロモーター配列、天然配列の機能性相同体、又は両者の機能性断片とすることができる。適当な天然プロモーターには、例えば、hCMV前初期プロモーター、仮性狂犬病ウイルス（PRV）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターがある。好ましくは、天然プロモーターは、配列番号５２又は配列番号５３を含む。
【０２０２】
上記のキメラプロモーターのような人工プロモーター構築物を使用してもよいが、そのプロモーターが機能することが条件である。
【０２０３】
機能性プロモーター配列とは、一般的には、適当な宿主細胞において機能し得るように連結されたコード配列の転写を引き起こすこと（開始及び制御することを含む）ができる配列である。
【０２０４】
プロモーター配列は、通常の発現アッセイによってプロモーター活性をテストすることができる。天然プロモーター配列の機能性相同体若しくは断片は、通常、こうしたアッセイで天然配列によって与えられる発現の、少なくとも50%、例えば、少なくとも60、70、80又は90%をもたらす。
【０２０５】
適当なコード配列(ii)は、キメラプロモーター構築物に関連してすでに記載したものを包含する。しかしながら、この態様において、コード配列は3'エンハンサー配列に対して異種性である。この構築物のエンハンサー配列(iii)は上に記載した。この構築物は、通常、ポリA配列も含む。キメラプロモーター構築物の場合と同様に、このポリA領域はコード配列(ii)の本来のものであってもよく、又は構築物において異種ポリAエレメントとして与えられてもよい。
【０２０６】
本発明のどの態様に係る構築物も、シグナルペプチド配列を包含することができる。したがって、核酸構築物は、コード配列に機能し得るように連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。シグナルペプチド配列は、プロモーターと結合して機能するように挿入され、その結果シグナルペプチドは発現され、やはりプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列によってコードされる、ポリペプチドの分泌を促進する。
【０２０７】
一般的には、シグナルペプチドは、10から30アミノ酸、例えば15から20アミノ酸からなるペプチドをコードする。多くの場合アミノ酸は、主に、疎水性である。典型的な状況において、シグナルペプチドは、そのシグナルペプチドを有する成長ポリペプチド鎖を、発現細胞の小胞体に向けて導く。シグナルペプチドは小胞体内で切断されてはずれ、ゴルジ装置を通してポリペプチドの分泌を可能にする。
【０２０８】
本発明に使用するシグナルペプチドは、下記を包含することができる：
(i) 天然シグナルペプチド配列；
(ii) シグナルペプチド活性を保持する、(i)の相同バリアント；又は
(iii) シグナルペプチド活性を保持する、(i)若しくは(ii)の断片。
【０２０９】
配列(i)は、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド（hTPAsp）（GenBank L00141）、アプロチニンシグナルペプチド（GenBank AAD13685）、タバコ エクステンシンシグナルペプチド（GenBank JU0465）、又はニワトリ リゾチームシグナルペプチド（GenBank AF10481）とすることができる。
【０２１０】
本発明で使用するのに適したシグナルペプチドは、異種タンパク質の分泌を可能にするものである。機能するシグナルペプチドは、テストシグナルペプチドの効果を既知のシグナルペプチド-例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド（hTPAsp）-の効果と比較し、さらにシグナルペプチドなしの効果と比較するアッセイにおいて、同定することができる。下記に述べる比較発現アッセイを用いるが、次のような変更を加えることができる。テストシグナルペプチドを有する基本ベクター、hTPAspを有する基本ベクター、又はシグナルペプチドなしの基本ベクターのいずれかを含有する、分泌発現ベクターを構築する。天然に存在するシグナルペプチドを欠いた、ポリペプチドのコード配列をベクターに挿入し、そのベクターを基準宿主細胞に形質転換する。好ましくは、細胞は、哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞である。細胞培養液のポリペプチド発現レベルを分析する。機能性シグナルペプチドは、少なくとも１つ、好ましくは２つのポリペプチドとともにシグナルペプチドを欠いたベクターよりも高レベルの、ポリペプチドの分泌を可能にする。一般的に、分泌は5%以上高いが、より好ましくは10%以上高く、例えば20又は50%以上高い。通常、分泌レベルはhTPAspを用いて得られレベルに匹敵する。ある場合には、本明細書で言及した増加又は減少が見られてもよい。
【０２１１】
好ましい例で、シグナルペプチドは、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド(hTPAsp)、アプロチニンシグナルペプチド、タバコエクステンシンシグナルペプチド、及びニワトリリゾチームシグナルペプチドから選択される。
【０２１２】
コードされたタンパク質の、発現細胞外への分泌を可能にすることは、特に、そのタンパク質が抗原である場合には、多大な利点をもたらすことができる。例えば、抗原分泌の増加は、免疫細胞（マクロファージ、ランゲルハンス細胞、B細胞、T細胞など）による抗原の取り込み、及び応答の増大を可能にし、抗原が血流及びシグナル細胞（サイトカイン）に到達できる能力を与え、抗原が細胞リガンドを見出して機能を果たすことを可能にし（抗体、毒素、例えばコレラ毒素、大腸菌LT）、さらに正常な細胞生化学プロセス（細胞受容体）に関与することを可能にする。
【０２１３】
本発明の構築物はプラスミドの形態であっても良い。本発明の核酸構築物は、プラスミド発現ベクターの形をとることができる。好ましい例では、本発明の構築物は、DNA構築物であってもよい。別の例で、構築物はRNA又はPNA構築物であってもよい。
【０２１４】
ここでベクターは、複製開始点、又は選択遺伝子といった、追加のエレメントを包含することができる。こうしたエレメントは、当技術分野で知られており、標準的な技法によって含めることが可能である。ある実施形態において、プラスミドベクターは配列番号１４の配列を有する。あるいはまた、構築物は、ウイルスベクター構築物中に含まれていてもよい。
【０２１５】
ある実施形態において、本発明の核酸構築物は、本明細書に明記されたキメラプロモーターを２つ以上含んでなることがある。したがって、その構築物は複数のキメラプロモーターを含んでなり、特に構築物は、２、３、４、５又は６個以上のキメラプロモーターを有する可能性がある。キメラプロモーターは、コード配列挿入のためのクローニング部位に、それぞれ別個に機能し得るように連結されることが好ましい。したがって、この構築物は、２、３、４、５又は６個以上のコード配列を発現する可能性がある。発現されるコード配列は、本明細書に記載のいずれでもよい。好ましい場合において、構築物は、それぞれコード配列を機能し得るように連結された２つのキメラプロモーターを有する。特に、この２つのプロモーターは、互いに離れて転写されることがある。他の実施形態で、プロモーターをお互い向かい合った方向で転写することができる。したがって、プロモーターは逆方向であってもよく、又はある場合には同方向であってもよい。
【０２１６】
詳細には、２つのプロモーターを有する構築物は、ADP-リボシル化細菌性毒素のA及びBサブユニット（本明細書に記載のいずれでもよいが好ましくはLTA及びBサブユニット）を発現することができる。しかし、複数のプロモーターをもつ構築物は、本明細書に記載した、どのコード配列の組み合わせも発現することができる。さらに好ましい態様で、複数のプロモーターをもつ構築物は、本明細書に記載したどのインフルエンザ抗原の組み合わせも包含する複数のインフルエンザ抗原を発現することができる。他の好ましい態様で、構築物は、パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかの免疫原性バリアント、及び本明細書に記載の一以上のいずれかのコード配列を発現してもよい。
【０２１７】
構築物が複数のキメラプロモーターを有する場合には、各プロモーターは、上記の配列のいずれを包含してもよく、又は機能し得るように連結されていてもよい。特に好ましい例において、一以上のプロモーターの異種イントロンは、ラットインスリン遺伝子イントロンA配列とすることができる。一以上のキメラプロモーターはまた、HVB pre-S2の5'UTRを含んでなることも好ましい。一以上のプロモーターは、ウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化配列を含んでなることもある。
【０２１８】
好ましい状況において、本発明の核酸構築物は、２つのキメラプロモーター配列を包含することができるが、それぞれのプロモーターは、コード配列が挿入されるクローニング部位に機能し得るように連結されており、この場合、それぞれのキメラプロモーターは
(a) hCMV前初期プロモーター配列；
(b) hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１、及び少なくともエクソン２の一部；並びに
(c) hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン、
を含んでなり、一方のキメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列はLTAサブユニットをコードし、もう一方に結合したコード配列はLTBサブユニットをコードする。したがって、この構築物は２つのサブユニットをいずれも発現することができる。好ましくは：
−  各プロモーターの異種イントロンはラットインスリン遺伝子イントロンA配列である；
−  各LTサブユニットをコードする配列は、HBV pre-S2の5'UTRに機能し得るように連結されている；及び／又は
−  LTをコードする配列は、ウサギβグロビン遺伝子ポリアデニル化配列に機能し得るように連結される。
【０２１９】
特に好ましい例では、pPJV7563、及びpPJV1671ベクターの一以上のエレメントを本発明の核酸構築物中に使用することができる。このようなエレメントの機能性断片又はバリアントを使用してもよい。具体的には、表３に示したpPJV1671のいずれかのエレメント、そのようなエレメントの機能性バリアント、又はいずれかの機能性断片を使用することができる。同様に、実施例５で示したpPJV7563のいずれかのエレメント、そのようなエレメントの機能性バリアント、又はいずれかの機能性断片を使用してもよい。好ましくは、pPJV7563、及び／又はpPJV1671それら自身の一以上のエレメントの配列を使用することができる。他の好ましい実施形態で、構築物pPML7789の対応するエレメントを使用してもよい。それらの位置を具体的に、図２１及び本明細書で提供される配列リストに示す。さらに好ましい例で、pPJV2012、及びpPJV7788の対応するエレメントを使用してもよい。具体的には表６及び８に示したそれらのエレメントを使用することができる。pPML7789、pPJV2012ベクター、及びpPJV7788のエレメントの機能性断片及びバリアントを、本発明の構築物に使用することもできる。
【０２２０】
ある好ましい例において、本発明の構築物は、以下を含む：
（i）配列番号１４で提供されるpPJV7563ベクターの配列； 
（ii）（i）の配列と少なくとも60％の配列相同性をもつ配列。
【０２２１】
ただし、キメラプロモーターに機能的に連結するように、配列（i）又は（ii）中に挿入したインフルエンザ抗原、免疫原性断片若しくは免疫原性バリアントをコードする配列は別とする。好ましい例で、前記構築物のコード配列は、HA抗原、その免疫原性バリアント、又はいずれかの免疫原性断片をコードしている。
【０２２２】
本発明のさらに好ましい例で、ベクターが配列番号５４で提供されるpPJV1671ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む構築物を提供する。他の好ましい例で、ベクターは、配列番号５９で提供されるpPML7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列を含む。
【０２２３】
好ましい例では、pPJV7563及び／若しくはpPJV1671のCMVプロモーター、非翻訳リーダー配列、ラットインスリンイントロンA、非翻訳リーダー配列、HBVエンハンサー並びに／又はウサギポリA配列、或いはそのような配列の機能的なバリアント、又は断片を使用する。特に好ましい例では、pPJV7563及び／若しくはpPJV1671のラットインスリンイントロンA、並びに／又はHBVエンハンサー、或いはそのような配列の機能的な断片、又はバリアントを使用する。具体的には、ラットインスリンイントロンA及びHBVエンハンサーの双方、又はそのような配列の機能的なバリアント、若しくは断片を使用する。他の好ましい例で、pPML7789、pPJV2012、pPJV7788の対応する配列、そのような配列の機能性断片、又は前記配列のバリアントを使用することができる。
【０２２４】
構築物がいくつかのポリペプチド、特に抗原をコードする場合、特定の配列を除いて構築物のサイズを減らすことができる。特に構築物が３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の抗原をコードする場合、例えば、エンハンサー、及び／又は非翻訳リーダー配列を除くことができる。同数の抗原をコードする他の構築物において、これらの配列がそのまま存在していても良い。
【０２２５】
特に好ましい例で、pPJV7563ベクターを使用して、その中で所望のコード配列、具体的には、抗原のコード配列、例えば本明細書に記載したいずれかの抗原のようなコード配列をクローン化する。好ましい例で、所望のインフルエンザ抗原、その断片若しくはバリアントをベクター内でクローン化する。いくつかの場合では、pPJV7563を改変することができる。例えば、カナマイシン耐性遺伝子を別の遺伝子、具体的には、代替の選択可能な、若しくはスクリーニング可能なマーカーと交換することができる。本発明のいずれかの核酸構築物は、選択マーカーを含むことができる。pPJV7563のpUC19プラスミドバックボーンを、改変又は別のプラスミドバックボーンと置換することができる。pPJV7563の特定エレメントを、例えば同一機能を充足するいずれかのエレメントと、具体的にはpPJV7563における配列の機能性バリアント又は断片と、交換することができる。いくつかの例で、pPJV7563は、特定エレメントを、当該エレメントが置換したときに、同一機能を有する本明細書で言及したいずれかのエレメントと置換することにより、改変することができる。pPJV1671を使用する際には、同様の改変をそのベクターに対して行ってもよい。同様の改変を、本明細書に記載したいずれかのベクターに対して、具体的にはpPML7789、pPJV2012、及びpPJV7788に対して、行うことができる。pPML7789、 pPJV2012、及びpPJV7788のコード配列を、本明細書で記載したいずれかのコード配列と交換することができる。pPJV2012、及びpPJV7788の場合には、そのベクターの１つの、又は両方のコード配列を交換することができる。
【０２２６】
一の好ましい実施形態で、本発明の核酸構築物は、以下を含む：
（i）配列番号１４で提供されるpPJV7563ベクターの配列； 
（ii）（i）の配列と少なくとも60％の配列相同性をもつ配列。
【０２２７】
ただし、キメラプロモーターに機能的に連結するように挿入した所望のコード配列は別とする。好ましい例で、コード配列は、抗原をコードする。具体的には、インフルエンザ抗原、免疫原性断片、若しくは免疫原性バリアントをコードするコード配列を、キメラプロモーターに機能し得るように連結して（i）又は（ii）の配列の中に挿入する。
【０２２８】
構築物は、挿入されるコード配列を考慮した、又はそれらを無視した（i）の配列と少なくとも60％の配列相同性をもつ配列である。構築物は、本明細書で特定した配列同一性のいずれかの数値、具体的には少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、及びより一層好ましくは少なくとも95％の同一性を有している。好ましい実施形態で、構築物は、挿入コード配列を別としたpPJV7563である。
【０２２９】
付加的な配列を、pPJV7563の配列に追加して、さらに本発明の構築物を作成することができる。例えば、一以上の本発明のキメラプロモーターを、そのプロモーターに機能し得るように連結され得る本明細書に記載したいずれかの配列と共に加えることができる。pPJV7563のクローニング部位を改変して、異なる制限断片のクローニングを、具体的には異なる断片としてコード配列のクローニングを、可能にすることができる。同様の改変を、本明細書に記載したいずれかのベクターに、具体的にはpPML7789、pPJV2012及びpPJV7788に、行うことができる。
【０２３０】
他の好ましい例で、本発明の構築物は、異なる抗原をコードする配列と共に、抗原をコードしているpPJV1671のコード配列いくつかの、又は全てのコード配列を置き換えて作製することができる。さらに、pPJV7563に関して上記で論じたいずれかの改変を行い、pPJV1671を改変することもできる。このような改変はまた、pPML7789に対して行うこともできる。pPJV2012、及びpPJV7788のコード配列を他の所望のコード配列と、具体的には抗原をコードする配列と、置き換えることもできる。
【０２３１】
他の好ましい例で、本発明の構築物は、以下を含む：
−  配列番号５４で提供されるpPJV1671ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列、
−  配列番号５９で提供されるpPML7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列、
−  配列番号６１で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列、
−  配列番号６２で提供されるpPJV7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60％の配列同一性を持つ配列。
【０２３２】
前記例において、構築物は、本明細書で特定したいずれかのパーセンテージの配列同一性を有することができる。具体的には、pPJV7563に関して上記で特定したものである。
【０２３３】
本発明の構築物は、本明細書の表で特定したいずれかのエレメントを含むことができる。具体的には、表３、６、及び８で特定したものである。そのような配列の機能性断片、及びそのような配列のバリアント、並びにそれらの断片も使用することができる。好ましい例で、ベクターがアジュバントベクターの場合、表６及び／又は８で特定された一以上のエレメント、又はそのような配列の断片やバリアントを含んでいてもよい。
【０２３４】
本発明はまた、ポリペプチドのコード配列を欠いた本発明のベクター中にポリペプチドのコード配列、具体的には抗原のコード配列を挿入することを含む本発明の構築物を作る方法も提供する。コード配列は、本明細書に記載した、いずれかの抗原をコードすることができる。好ましい例で、本発明は、選択されたコード配列をpPJV7563、pPJV1671、又は本明細書で論じたベクターの改変版の一つの中に挿入することを含む前記方法を提供する。それらは、pPML7789、pPJV2012、及び／又はpPJV7788、特にはpPML7789の中に挿入することもできる。ある場合には、付加的なコード配列を挿入することもでき、及び／又は既に存在するコード配列を異なるコード配列と置き換えることができる。
【０２３５】
本発明はまた、プロモーター配列、及びプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を提供する。この場合、構築物はさらに、以下を含む：
（a）HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、前記構築物のコード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列；並びに／又は
（b）前記構築物のコード配列の、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、HBsAg配列の、又は又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR非翻訳領域(UTR)由来で、かつコード配列が3’エンハンサー配列と異種であるエンハンサー配列。
【０２３６】
ベクターの各種エレメントは、本明細書で特定したエレメントのいずれかとすることができる。一例で、プロモーター配列（i）は、hCMV前初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルスプロモーター配列、及びラウス肉腫ウイルスプロモーター配列から選択される。もう一つの例で、プロモーターは、本明細書で論じたキメラプロモーターの一つである。
【０２３７】
他の例で、本発明は本明細書に記載したいずれかの、精製され、分離された、キメラプロモーターを提供する。
【０２３８】
本発明のポリヌクレオチド構築物は実質的に、細胞若しくは細胞物質を含まない、又は細胞若しくは細胞物質を伴うことがある。構築物は実質的に単離された形をとる、又は、実質的に精製された形をとることができるが、その場合、構築物は、概して、標品中の乾燥質量の少なくとも90%、例えば少なくとも95%、98%又は99%のポリヌクレオチドを含んでなる。
【０２３９】
プロモーターに機能し得るように連結されているポリヌクレオチドの発現のために、本発明の核酸分子を適当な宿主細胞に送達することができる。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、特にヒト細胞である。核酸のそうした細胞への送達のための適当な方法は、当技術分野において知られており、例えば、デキストランを介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション及び核内への直接的なマイクロインジェクションがある。したがって、本発明は本発明のベクターで形質転換した細胞を提供する。
【０２４０】
上記のように、構築物中の核酸コード配列は、治療に関わるポリペプチドをコードすることができる。したがって、本発明の構築物は、標準的な遺伝子デリバリー法用いた核酸免疫法若しくは遺伝子治療に使用することができる。遺伝子デリバリーに適した方法は、当技術分野で知られており、下記に検討するとおりである。核酸分子は、直接被験体に送達することができる、あるいはまたex vivoで被験体由来の細胞に送達され、その後その細胞は被験体に再移植される。好ましい例で、コードされているポリペプチドが抗原である場合、具体的にはインフルエンザ抗原である場合、構築物を、直接被験体に送達する。本明細書に記載した送達経路のいずれかを、特に経皮デリバリーを、使用することができる。本発明のアジュバント構築物を投与して、抗原に対する、特に本発明の構築物から発現される抗原に対する、免疫応答を強化することができる。
【０２４１】
本発明はまた、核酸免疫付与の薬剤製造における本発明の核酸構築物、本発明の核酸構築物の集団、若しくは本発明の被覆粒子の使用を提供する。薬剤は、注射で、経皮粒子デリバリーで、吸入により、局所的に、経口で、鼻腔内に、又は経粘膜で送達できるものである。好ましい例は、薬剤を無針注射器で送達することである。
【０２４２】
核酸免疫法若しくは遺伝子治療に使用するために、核酸構築物を、従来型の医薬品として調剤することができる。これは、標準的な医薬品製剤化学及び方法論によって行うことができ、当業者に利用可能である。例えば、一以上の核酸配列を含有する組成物（例えば、DNAプラスミドのような適当なベクターの形で存在する）を、一以上の製薬上許容される賦形剤若しくはビヒクルと組み合わせて、液体製剤を与えることができる。したがって、本発明の核酸構築物、及び製薬上許容可能な担体若しくは賦形剤を含む医薬組成物も提供される。好ましい例で、医薬組成物は、本明細書の複数の構築物、又は本明細書に記載したいずれかの構築物を含む本発明の構築物の集団を含むことができる。
【０２４３】
湿潤剤若しくは乳化剤、pH緩衝物質などといった補助的物質が賦形剤若しくはビヒクル中に含まれていてもよい。これらの賦形剤、溶媒及び補助的物質は一般に、過度の毒性なしに投与することができる医薬用物質であり、ワクチン組成物の場合、組成物を投与された個体において免疫応答を引き起こさない物質である。製薬上許容される賦形剤には、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール及びエタノールといった液体があるがそれらに限定されない。製薬上許容される塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような無機酸塩；並びに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩を含めることができる。また、必須ではないにしても、特にペプチド、タンパク質若しくは他の類似の分子に対して、それらが組成物中に存在するものならば、安定化剤としての機能を果たす、製薬上許容される賦形剤を製剤が含有することも好ましい。ペプチドに対する安定化剤としても作用する、適当な担体の例としては、医薬品グレードのブドウ糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなどが挙げられるが限定するものではない。他の適当な担体には、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウム若しくはカリウム、クエン酸、酒石酸、グリセリン、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）、及びそれらの組み合わせがあるが、やはり限定するものではない。製薬上許容される賦形剤、溶媒及び補助的物質に関する詳細な検討は、REMINGTON'S PHARMAVEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991)で入手可能であり、参考として本明細書に含めるものとする。
【０２４４】
核酸の取り込み、及び／又は発現のある種の促進剤（「トランスフェクション促進剤」）も、組成物に含めることができるが、これは、例えば、ブピバカイン、心臓毒、及びショ糖といった促進剤、並びに、核酸分子の送達に通常使用される、リポソーム製剤若しくは脂質製剤といったトランスフェクション促進ビヒクルである。アニオン性及び中性リポソームは、広範に利用可能であって、核酸分子の送達でよく知られている（例えば、Liposomes: A Practical approach, (1990) RPC New Ed., IRL Pressを参照されたい）。カチオン性脂質製剤も、核酸分子の送達で使用される、よく知られた媒体である。適当な脂質製剤には、リポフェクチン（LipofectinTM）の商標名で利用可能なDOTMA (N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウム クロリド)、及びDOTAP (1,2-ビス(オレイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)があり、例えばFelgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081; 米国特許第5,283,185号及び第5,527,928号、並びに国際公開番号WO 90/11092、WO 91/15501及びWO 95/26356を参照されたい。これらのカチオン性脂質は、好ましくは中性脂質、例えばDOPE（ジオレイル ホスファチジルエタノールアミン）とともに使用される。上記脂質若しくはリポソーム製剤に添加することができる、さらに他のトランスフェクション促進組成物には、スペルミン誘導体（例えば、国際公開番号WO 93/18759を参照されたい）、並びに膜透過性にする化合物、例えばGALA、グラミシジンS及びカチオン性胆汁酸塩（例えば、国際公開番号WO 93/19768を参照されたい）がある。
【０２４５】
あるいはまた、本発明の核酸分子を微粒子担体に封入、吸着、若しくは結合することができる。適当な微粒子担体には、ポリメチルメタクリレート重合体から得られる微粒子担体、並びにポリ（ラクチド）及びポリ（ラクチド-グリコリド）共重合体から得られるPLG微粒子がある。例えば、Jefferyら、(1993) Pharm. Res. 10:362-368を参照されたい。他の微粒子系及び重合体、例えばポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、といった重合体、並びに前記分子の複合体も使用することができる。好ましい実施形態で、本発明の構築物は、核酸縮合剤及び金属イオンキレート剤の存在下で担体上に沈着されている。好ましい縮合剤は、カチオン性ポリマーを、特にポリアミン又はポリリジンを、含む。好ましい例で、ポリアミンは(Arg)4又は(Arg)6である。WO2004/208560に記載の技術を参照により使用して、本発明の被覆担体粒子を生産することができる。
【０２４６】
調剤すると、さまざまな既知の経路及び方法によって、組成物を、in vivoで被験体に投与することができる。例えば、液体製剤は、注射剤、懸濁剤、乳濁剤として与えられ、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内注射によって、従来の注射針と注射器を用いて、又は液体ジェット注射システムを用いて、投与することができる。液体製剤はまた、皮膚若しくは粘膜組織に局所的に投与することも可能であり、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微細なスプレーとして与えることもできる。他の投与法には、経口投与、座剤、及び能動又は受動経皮デリバリー法がある。
【０２４７】
あるいはまた、組成物はex vivoで投与され、例えば、形質転換細胞の被験体への送達及び再移植が知られている（例えば、デキストランを介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション及び核内への直接的なマイクロインジェクション）。
【０２４８】
組成物は、投薬形態に適合する量で、しかも予防及び／又は治療に有効な量で、被験体に投与される。適切な有効量は、比較的広い範囲となるが、日常的な試行によって当業者により容易に決定される。"Physicians Desk Reference"及び"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics"は、必要量を決定するために役立つ。例えば、一般に、ポリヌクレオチドの有効な用量は、約0.001〜1000μg、好ましくは0.001〜100μg、さらに好ましくは0.01〜10.0μgの範囲に含まれると予想される。いくつかの例で、用量を0.1〜100μg、好ましくは0.5〜25μgとすることができる。投与が無針注射を介して行われる場合には、用量を、ある場合には0.1〜25μg、好ましくは0.5〜10μg、より好ましくは1〜5μgとすることができる。特に、用量を4μgとすることができる。いくつかの場合で、複数の無針注射、例えば、１本、２本、３本、４本、又は５本の無針注射等を介して投与することができる。
【０２４９】
いくつかの場合で、最初の投与の後に構築物の連続投与を行ってもよい。具体的には、最初の免疫付与の後、被験体に追加免疫付与してもよい。被験体投与は、例えば、最初の投与後、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、又は半年で行うことができる。
【０２５０】
ある例において、本発明の核酸構築物は、別の核酸構築物と併せて使用することができる。ある場合において、核酸構築物は、アジュバントの発現を目的とする、本明細書に記載の構築物の一つであり、もう一つの構築物は一以上の抗原をコードする構築物とすることができる。好ましい場合において、２つの構築物はいずれも、本発明のキメラプロモーターを用いることができる。ここで、二以上の薬剤を所与する場合、それらを、具体的には、別々に、同時に、又は連続して投与することができる。
【０２５１】
一方の構築物がアジュバントを発現し、他方の構築物が一以上の抗原を発現する場合、抗原は特にHSV、HPV、又は肝炎ウイルス（なかでもB型肝炎ウイルス）起源とすることができる。抗原は、詳細には、HSV ICPO、ICP4、ICP22及び／又はICP27抗原とすることができるが、好ましくは４つ全てである。特に好ましい場合で、抗原は、本明細書に記載のいずれかを含むインフルエンザ抗原、具体的にはHA、NA、及び／又はM2、特にHA及びNA、そしてさらにはHAであってもよい。これらの抗原が発現する場合、アジュバント構築物は、特に、LTA及び／又はLTBを、特に両方を発現することができる。本明細書に記載したアジュバント構築物のいずれかは、同時に、別々に、又は連続して抗原をコードする構築物のいずれかと使用することができる。
【０２５２】
本発明の２つの構成物は、いずれも、別々に、連続して、若しくは同時に投与することができる。２つの構築物は、別々に投与されても、同時に、若しくは順次投与されてもよい。２つの構築物は、同一の組成物として、又は異なる組成物として投与することができる。特に、一方の構築物がアジュバント効果を有する場合、２つの構築物が投与されると、アジュバント効果が見られる、すなわち、生じる免疫応答が、アジュバントが抗原とともに投与されなかった場合より大きい、及び／又は長期間続く。好ましい例において、２つの構築物は、同一の組成物中で、好ましくは同一の担体粒子上で投与される。他の場合で、構築物を有する担体粒子を他の構築物を有する担体粒子と混合することができる。このような投与方法のいずれも、本明細書に記載した複数の構築物の組み合わせのいずれかで使用することができる。
【０２５３】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物は、粒子を介したデリバリー法によって標的細胞に送達される。核酸製剤を送達するための、粒子を介した方法は、当技術分野で知られている。
【０２５４】
したがって、好ましい例で、本発明は被覆粒子を提供する。この被覆粒子は、本発明の核酸構築物、又は本発明の核酸構築物の集団で被覆された担体粒子を含む。具体的に、被覆粒子は、粒子を介したデリバリーデバイスからの送達に適したものである。
【０２５５】
粒子を介したデリバリーのための粒子は、当技術分野において知られているさまざまな技術を用いて、本発明の核酸分子を担体粒子（例えば、コア担体）上にコーティングすることによって作製することができる。担体粒子は、一般的に、粒子を介したデリバリーデバイスからの細胞内デリバリーに使用される粒径の範囲内で適当な密度を持つ材料から選択される。一般的に、担体粒子は、0.1〜5μm、例えば0.5〜3μm、好ましくは1〜2μmの粒径である。ある場合には、粒子は1〜3μmの粒径であってもよい。担体粒子の最適な粒径は、当然、標的細胞の直径によって決まる。
【０２５６】
通常、担体粒子は、不活性金属から選択される。金属は、生理学的に活性ではなく、不活性である。本発明の目的では鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、白金、金、及びステンレス鋼を使用することができる。例えば、又特にはタングステン、金、白金及びイリジウム担体粒子を使用することができる。タングステン及び金の粒子が好ましい。したがって、好ましい例で本発明は、金又はタングステンの被覆担体粒子を提供する。タングステン粒子は平均粒径0.5〜2.0μmのものが容易に利用できる。こうした粒子は、粒子加速デリバリー法に使用するために最適の密度を有し、DNAによる非常に効率的なコーティングが可能ではあるが、タングステンは潜在的にある種の細胞に対して毒性があるかもしれない。金粒子又は微結晶性の金（例えば、金粉A1570、Engelhard Corp., East Newark, NJより入手可能）も、本発明の方法で使用することができる。金粒子はサイズの均一性（粒径1〜3μmがAlpha Chemicalsより、0.95μmを含むさまざまな粒径のものがDegussa, South Plainfield, NJより入手可能）、及び毒性の低下を与える。金の微結晶はさまざまな粒径分布を提供し、通常、0.1〜5μmの範囲である。しかしながら、微結晶性金の不規則な表面積は、非常に効率的な核酸によるコーティングを与える。
【０２５７】
金又はタングステン粒子上にDNA若しくはRNAをコーティングし、又は沈澱させるいくつかの方法が知られており、記載されている。そうした方法の大半は、概して、あらかじめ定められた量の金又はタングステンを、プラスミドDNA、CaCl2及びスペルミジンと混合する。得られた溶液を、コーティングが進行する間、連続してボルテックスで撹拌し、反応混合物の均一性を確保する。核酸の沈澱後、コーティングされた粒子を適当な膜に移して使用前に乾燥させる、サンプルモジュール若しくはカセットの表面上にコーティングする、又は特定の、粒子を介したデリバリー装置に使用するデリバリーカセット内に加えることができる。
【０２５８】
別の方法として、本発明のポリヌクレオチドを、粒子状組成物として製剤することができる。製剤は、上記の標準的な医薬製剤化学によって行うことができる。例えば、ポリヌクレオチドを、一以上の製薬上許容される賦形剤若しくはビヒクルと混合し、適当な組成物を与えることができる。調剤された組成物を次に、単純な蒸発（風乾）、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥、噴霧コーティング、沈澱、超臨界流体粒子製剤などといった標準的な技法を用いて、粒子として調製する。必要ならば、国際公開番号WO 97/48485（参考として本明細書に含める）に記載の技法を用いて、得られた粒子の密度を高めることができる。
【０２５９】
上記の方法を用いて、大きさが約0.01〜約250μm、好ましくは、約10〜150μm、もっとも好ましくは約20〜60μmであって、粒子密度が約0.1〜約25g/cm3、容積密度が約0.5〜約3.0g/cm3の範囲、若しくはそれ以上である、核酸粒子を得ることができる。
【０２６０】
一旦、粒子が形成されたら、核酸分子を含む粒子を単回投与製剤又は複数回投与容器に詰めることができる。本発明は、それ故、本発明の被覆粒子を含む粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器を提供する。こうした容器は、適当量の粒子を封入した気密封止容器を含めることができる。粒子を、滅菌製剤として詰めることができるので、気密封止容器は、被験体への投与で使用するまで製剤の無菌性を保つように設計される。容器は、粒子を介したデリバリーデバイスにそのまま使用するのに適していることが好ましい。一般的に、こうした容器は、カプセル、ホイルパウチ、包、カセットなどの形をとる。粒子デリバリーデバイスは、適当な量の粒子を含有し、あらかじめ充填された状態で与えられることもある。あらかじめ充填されたデバイスを、次に、気密封止容器内にあらかじめパッケージすることもできる。
【０２６１】
粒子を詰めた容器にラベルを付して、組成物を確認できるようにして、関連する製剤情報を与えることができる。加えて、容器に、政府機関、例えば、連邦食品医薬局によって規定された形式の通知を付すことができるが、この場合その通知は、ヒト投与用の、その容器に含まれる核酸製剤の製造、使用若しくは販売に関する、連邦法の下での政府機関による承認を示すものである。
【０２６２】
本発明はまた、本発明の被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイスを提供する。好ましくは、デリバリーデバイスは無針注射である。粒子を介したデリバリーに適した粒子加速デバイスは、当技術分野で知られている。例えば、現行の遺伝子銃デバイスは、爆発による、電気的な、又はガスによる発射を用いて、コーティングされた担体粒子を標的細胞に向かって推進する。コーティングされた担体粒子は、移動可能な担体シートに、放出可能であるように付着させ、又はガス流が通過する表面に離脱可能な状態で付着させることができるが、粒子をその表面からはずして、標的に向かって加速する。ガス発射装置の例は、米国特許第5,204,253号に記載されている。爆発型デバイスは、米国特許第4,945,050号に記載されている。本発明に使用するのに適した放電装置の一例が、米国特許第5,120,657号に記載されている。別の放電装置が米国特許第5,149,655号に記載されている。これらの特許の全ての開示は、参照によりその全てを本明細書に援用する。
【０２６３】
米国特許第5,630,796号、Bellhouseら( “the PowderJect（登録商標） needleless syringe device”) 並びに国際公開番号WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513及びWO 96/20022に記載のように、無針注射器を用いて、粒子を投与することもできる。これら全ては参照により本明細書に援用する。
【０２６４】
米国特許第5,630,796号に記載のようなデバイスは、上から下に作動する一列の順序で、ガスシリンダー、粒子カセット又はパッケージ、及び消音媒体を付随する超音速ノズルを入れたペン型の器具として与えられる。粒子は、適当な容器、例えば２枚の破断し得る高分子膜によって形成されたカセット内に与えられるが、前記の膜は、ワッシャー型スペーサーにヒートシールされ、内蔵型シールドユニットを形成する。超音速流を起こす条件を左右する、特定モードの開口圧力及び破裂圧力を達成するように膜材料を選択することができる。
【０２６５】
実施に際して、上記デバイスは、デバイス内部で、シリンダーから膨張室内へ圧縮ガスを放出するよう作動する。放出されたガスは粒子カセットと接触し、十分に圧力が高まったとき、突然、カセットの膜を破り、それに続く送達に向けて、粒子を超音速ノズル内へ吹き飛ばす。ノズルは、多くの粒子をあらかじめ決められた範囲の標的表面に送達するために、特定のガス速度及びフローパターンを達成するように設計される。超音速ガス流により生じる音を弱めるために消音器が用いられる。
【０２６６】
国際公開番号WO 96/20022に記載のデリバリーシステムは、粉末組成物を加速し、送達するために、圧縮ガス源のエネルギーも使用する。しかしながら、それは、粒子を加速するためにガス流の代わりに衝撃波を使用する点において、米国特許第5,630,796号に記載のシステムとは区別される。より詳細には、フレキシブルドームの後ろで発生する衝撃波によって生じる瞬間的な圧力上昇は、ドームの背部に当たり、標的表面に向かってフレキシブルドームの急激な反転を引き起こす。この急反転は、標的組織、例えば口腔粘膜組織に貫入するのに十分な速度、ひいては運動量で、（ドームの外側にある）粉末組成物を発射する。粉末組成物は、完全にドームが外反した時点で放出される。ドームはまた、高圧ガス流を完全に封じ込めるのにも役立ち、したがってガス流が組織に接触することはない。こうしたデリバリー操作の間、ガスは放出されないので、システムは本質的に静穏である。こうした設計を、他の封入アプリケーション、又はそうではなく、例えば低侵襲性手術部位に粒子を送達するといった、他の精密アプリケーションに用いることができる。
【０２６７】
粒子は、in vivoで被験体に直接、送達することができるが、被験体から採取した細胞にex vivoで送達してもよく、形質転換された細胞はその後被験体に再移植される。in vivoデリバリーのため、粒子注入は、通常、皮下、表皮、皮内、粘膜内（例えば、鼻、直腸及び／又は膣）、腹腔内、静脈内、口腔又は筋肉内に行われる。好ましくは、送達は、最終分化細胞に向けられる；しかしながら、粒子は、血液幹細胞及び皮膚線維芽細胞といった未分化細胞又は部分的に分化した細胞に送達されることもある。もっとも好ましくは、送達は皮膚表皮細胞に向けられる。
【０２６８】
粒子は、剤形に見合った方法で、予防上及び／又は治療上効果があると思われる量が、被験体に投与される。本発明の粒子状組成物の「治療上有効な量」は、病気若しくは病状の治療又は予防をもたらすのに十分であって、日常的な試行によって決定することができる比較的広い範囲に収まると思われる。概して、粒子は、単位用量当たり0.001から1000μg、より好ましくは0.01から10.0μgまでの核酸量として投与される。しかしながら、正確な必要量は、治療を受ける個体の年齢及び全身状態、及び選択された個別の核酸配列、並びに他の要因に応じて変動すると思われる。適切な有効量は、臨床試験によって容易に決定することができる。必要量を決定するために、”Physicians Desk Reference"及び"Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics"が有用である。
【０２６９】
＜アッセイ＞
比較発現アッセイ
エレメントの有用性についての適切なテストは、エレメントがポリペプチドの発現で示す効果を測定するものである。好ましい例で、ポリペプチドを、インフルエンザ抗原、そのバリアント、又はいずれかの断片とすることができる。エレメントの有用性を調べるための比較の基準は、「基本ベクター」であり、通常（特に明記しない限り）、コード配列の発現を駆動するように配置された、hCMVプロモーター、hCMVエクソン1、hCMVエクソン2の9塩基、HBV preS2由来の5'UTR、及びウサギβグロビンポリアデニル化領域を有するプラスミドである。一般的に、基本ベクターは、pPJV7384、pPJV7401、pPJV7450又はpPJV7533である。いくつかの場合で、上記のエレメントを有する本明細書に記載したいずれかのベクターを基本ベクターとして使用することができる。ある例では、pPJV1671を基本ベクターとして使用することができる。pPJV2012、pPJV7788、及びpPML7789もまた、基本ベクターとして使用できる。
【０２７０】
基本ベクターに、異種イントロン、及び3'UTRを加え、又はプロモーター配列、エクソン、5'UTR及びポリA部位を基本ベクターに交換により挿入して、テスト発現ベクターを作製する。本明細書で論じたベクターのいずれかのエレメントをテスト配列と交換すること、及び基礎配列と比較することができる。このようにして機能性バリアント若しくは断片をテストすることができる。
【０２７１】
基本ベクター及びテストベクターを適当な宿主細胞に入れて形質転換させ、その細胞のポリペプチド発現レベルを分析する。哺乳動物宿主細胞を使用することが好ましい。適当な細胞には、HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3又はCOS細胞がある。いくつかの例では、SSC15、又はB16細胞を使用することができる。
【０２７２】
一般的に、機能性エレメントは、基本ベクターに匹敵する発現、例えば、同等又はそれ以上の発現を引き起こす。発現を２つ以上の細胞型で２つ以上のコード配列について調べることが好ましい。いくつかの例では、機能性エレメントが、基本ベクターよりも僅かに少ない発現を生じてもよい。例えば、基本ベクターの発現の少なくとも25％、特に少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも90％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％等が挙げられる。通常、特定エレメントのバリアント又は断片が前記発現レベルを示すのであれば、それらはまだなお機能的な特定エレメントのバリアント又は断片であると考えることができる。しかしながら、好ましい機能性バリアント及び断片は、上記の基本ベクターよりも高い発現を生じることであろう。例えば、パーセンテージの増加は、上述のいずれかのパーセンテージであればよい。
【０２７３】
適当な実験法は、例えば下記の実施例１から1８で提供される。
【０２７４】
比較免疫原性アッセイ
発現するポリペプチドが抗原である場合、さらなるテストを行い、機能的な、又は特に好ましい構築エレメントを同定することができる。特に、このようなテストは、抗原が、例えばインフルエンザ抗原、その断片、又はいずれかのバリアントである場合に、行うことができる。アッセイでは、免疫応答に対するエレメントの効果を、供試生物に発現ベクターを送達した後に測定する。抗原に対する抗体レベルは、免疫応答を判断する最も簡単な方法である。マウス群に基本ベクター、又は上記のように構築されたテストベクターをワクチン接種する。適当な時間の後、血清を採取し、抗体レベルを分析する。
【０２７５】
この実験は２回行い、両方の実験における全群の抗体レベルをプロットする。機能的なエレメントは、通常、両方の実験で特定の抗原について、少なくとも基本ベクターと同程度、又は基本ベクターより高い抗体価を生じる。結果は、２以上の抗原について観察し、発現パネルにおけるそのエレメントの有用性の幅を明らかにすることが好ましい。いくつかの例で、機能性エレメントは基本ベクターで見られるよりも僅かに少ない抗体価を生じてもよい。例えば基本ベクターで見られる抗体価の少なくとも25％、特に少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、より一層好ましくは少なくとも90％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％等が挙げられる。一般的に、特定エレメントのバリアント又は断片が前記抗体価を生じるのであれば、それらはまだなお機能的な特定エレメントのバリアント又は断片であると考えてよい。しかしながら、好ましい機能性バリアント及び断片は、上記の基本ベクターよりも高い力価を生じることであろう。例えば、パーセンテージの増加は、上述のいずれかのパーセンテージであればよい。
【０２７６】
アジュバントベクターも、テストアジュバントベクターと標準アジュバントの双方を同一の抗原と共に投与することで、それらの比較によって評価することができる。両ベクターのアジュバント効果の比較は、コントロールとして抗原を単独投与したものを使用して行う。本明細書に記載したいずれかのアジュバントベクターを標準として使用することができる。アジュバント効果におけるパーセンテージの増加、又は減少は、本明細書に記載したいずれかのレベルであればよい。
【０２７７】
適当な実験法は、例えば下記の実施例１４で提供される。適切なプロトコルはまた、下記実施例１５〜１８にも記載されている。
【０２７８】
C. 実験
下記は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０２７９】
使用する数字（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確保するよう努めたが、ある程度の実験誤差及び逸脱は、当然、考慮に入れるべきである。
【０２８０】
方法
標準的なPCR条件
ベクターの構築に使用する標準的なPCR条件は、下記の通りとした：1x PCR コア バッファー w/ 1.5mM MgCl2(Promega Corporation, Madison, WI)、0.400μM 各プライマー、200μM 各dNTP (USB, Inc, Cレベルand, OH)、2.5μ Taqポリメラーゼ(Promega Corporation, Madison, WI)、1.0 ng テンプレートDNA、水で100μlとし、ミネラルオイル(Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI)でおおう。PTC-200サーモサイクラー(MJ Research, Inc, Waltham, MA)をプログラムして以下の型どおりの操作を行った：95℃にて4分、（95℃にて1分／55℃にて１分15秒／72℃にて1分）を30サイクル、72℃にて10分、4℃に保持。QIAquick PCR Purification キット (Qiagen Inc, Valencia, CA)を用いて増幅産物をPCR反応液から取り出した後、制限酵素(New England Biolabs, Beverly, MA)で切断した。
【０２８１】
PCR産物は全て、クローニングして増幅のフィデリティを確認した後、配列決定した。
【実施例１】
【０２８２】
B型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）ベクターパネルの構築
HBsAg発現のために、多数のプラスミド発現ベクターを構築した。
【０２８３】
出発材料
(i) hCMV前初期プロモーター配列、hCMV主要前初期遺伝子の第１のエクソン、第１のイントロン、及び部分的な第２のエクソン、フランキング領域（HBV preS2 5'UTR由来の配列、及び3'転写後応答エレメント）を有するHBsAgコード配列、並びにウシ成長ホルモンポリアデニル化領域（BGHpA）を含有するpWRG7128（非特許文献９）。
【０２８４】
(ii) BGHpAとウサギグロビンポリアデニル化領域(RBGpA)を交換した、pWRG7128の誘導体である、pPJV7284。
【０２８５】
(a) pPJV7384 (CMV(イントロンなし)、HBV preS2 5'UTR及びRBGpA)
pWRG7128は、JF93（配列番号15）及びF110（配列番号16）を用いて標準的な条件でPCR増幅を行い、Sal1及びBamH1で切断して、CMVプロモーター、エクソン１、及びエクソン2の一部の配列を含有する挿入断片を単離した。pAM6（ATCC, Mannassas, VA）を、BamH1及びBstX1で切断して、HBsAgの5'UTR及び約70%のHBsAgコード領域を含有する挿入断片を単離した。pJV7284をSal1及びBstX1で切断して、ベクター断片を生成し、その断片内に２つの挿入断片を結合して、pJV7293を得た。
【０２８６】
pWRG7128を、プライマーGW1（配列番号17）及びJF254（配列番号18）でPCR増幅して、BstX1及びBgl2で切断し、HBsAgコード領域の3'末端を含有する挿入断片を単離した。pPJV7293をBstX1及びBgl2で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合してベクターpPJV7384を得た。
【０２８７】
(b) pPJV7382 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7293をXho1及びXba1で切断して、CMVプロモーター／エクソン、並びにHBsAgコード配列の5'末端とともに5'UTRを含有する挿入断片を生成した。pWRG7128をXba1及びBcl1で切断して、HBsAgコード配列の大部分、及び3'UTRを含有する挿入断片を生成した。pPJV7284をXho1及びBgl2で切断して、ベクター断片を生じ、それに２つの挿入断片を結合して、結果としてpPJV7382を得た。
【０２８８】
(c) pPJV7389 (CMV (RIA)、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5'UTR及びRBGpA)
プラスミドp5'rInsから、プライマーGW150（配列番号19）及びJF255（配列番号20）を用いて、ラットインスリンイントロンA（RIA）をPCR増幅した。PCR産物をBamH1で切断し、BamH1で直鎖状としたpPJV7382に挿入して、pPJV7389を得た。
【０２８９】
(d) pPJV7387 (CMV( RIA)、HBV preS2 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7384をBstX1及びEcoR1で切断して、HBsAgコード領域の3'末端及びRBGpAを含有する挿入断片を生成した。pPJV7389をBstX1及びEcoR1で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7387が得られた。
【実施例２】
【０２９０】
単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D抗原（HSVgD）ベクターパネルの構築
HSVgDの発現のために、多数のプラスミド発現ベクターが構築された。
【０２９１】
出発材料
(a) HBsAgコード配列を、ATG開始コドンのすぐ下流でインフレームのNhe1と置き換え、続いてHBV Enhのすぐ5'側にBamH1部位を有するstuffer断片がある、pWRG7284（pPJV7284）の誘導体である、pPJV7334。
【０２９２】
(b) Nhe1部位の下流でコード配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）シグナルペプチドに融合しているstuffer断片を有する、pGem3Z(Promega)の誘導体である、pWRG7202。
【０２９３】
(a) pPJV7392(CMV(天然のイントロン)、HBsAg 3'UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
HSV2 gDに対するコード領域を、ウイルスDNAストック（Advanced Biotech, Inc, Columbia, MD）から、プライマーDS1（配列番号21）及びDA1（配列番号22）を用いてPCR増幅し、Nhe1及びEcoR1で切断して、挿入断片を生成した。pWRG7202をNhe1及びEcoR1で切断してベクター断片を生じ、それに前記挿入断片を結合して、pPJV7391が得られた。
【０２９４】
pPJV7391をNhe1及びBgl2で切断して、HSV2 gDコード配列を含有する挿入断片を生成した。pPJV7334をNhe1及びBamH1で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7392が得られた。このベクターは下記の発現エレメントからなる：hCMV前初期プロモーター配列、hCMV主要前初期遺伝子の第１のエクソン、第１のイントロン、及び部分的な第２のエクソン、HBsAg由来の5'UTR、HSV2 gD遺伝子のコード配列、HBsAg由来の3'UTR、並びにRBGpA。
【０２９５】
(b) pPJV7399 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 3’UTR、 HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7392のイントロンのない形を、下記のように構築した。pPJV7384をHindIII及びNde1で切断し、カナマイシン耐性遺伝子の5'末端及びCMVプロモーターを含有する挿入断片を単離した。pPJV7384をNde1及びSsp1で切断して、CMVプロモーターの3'末端、CMVエクソン1/2及びHBsAg由来5'UTRの5'末端を含有する挿入断片を単離した。これらの挿入断片を、Hind3-Ssp1断片を除去したpPJV7392に挿入し、pPJV7399が得られた。
【０２９６】
(c) pPJV7400 (CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7392のRIA型を、下記のように構築した。pPJV7384をHindIII及びNde1で切断して、カナマイシン耐性遺伝子の5'末端及びCMVプロモーターを含有する挿入断片を単離した。pPJV7387をNde1及びSsp1で切断して、CMVプロモーターの3'末端、CMVエクソン1/2（一部）、RIA及びHBsAg由来5'UTRの5'末端を含有する挿入断片を単離した。これらの挿入断片を、Hind3-Ssp1断片を除去したpPJV7392に挿入し、pPJV7400が得られた。
【０２９７】
(d) pPJV7401 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7399の3'UTRを欠いた形を、下記のように構築した。pPJV7391をBsp120I及びBgl2で切断して、HSV2 gD遺伝子の3'末端を含有する挿入断片を単離した。pPJV7284をBgl2及びEcoR1で切断して、RBGpAシグナルを単離した。これらの挿入断片を、Bsp120I-EcoR1断片を除去したpPJV7399に挿入し、その結果pPJV7401を得た。
【０２９８】
(e) pPJV7402 (CMV(RIA)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7400の3'UTRを欠いた形を、下記のように構築した。pPJV7391をBsp120I及びBgl2で切断して、HSV2 gD遺伝子の3'末端を含有する挿入断片を単離した。pPJV7284をBgl2及びEcoR1で切断して、RBGpAシグナルを単離した。これらの挿入断片を、Bsp120I-EcoR1断片を除去したpPJV7400に結合し、その結果pPJV7402が得られた。
【実施例３】
【０２９９】
Flu M2抗原ベクターパネルの構築
(a) pPJV7450 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
Flu M2のコード領域を、プラスミドpFL-M2（Joel Haynes, pPJV）から、プライマーJF301（配列番号23）及びJF302（配列番号24）を用いてPCR増幅し、Nhe1及びBgl2を用いて切断し、挿入断片を生成した。pPJV7401をNhe1及びBgl2を用いて切断し、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合してpPJV7450を得た。
【０３００】
(b) pPJV7452 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
3'UTR断片を、pPJV7389から、プライマーJF84（配列番号25）及びJF225（配列番号26）を用いてPCR増幅し、Bsp120Iで切断し、T4 DNAポリメラーゼで埋め込んで、Bgl2リンカー（カタログ番号1036、New England Biolabs）をつける。その後、断片をBgl2及びEcoR1で切断し、HBsAgの3'UTR、及びRBGpA領域を含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7452が得られた。
【０３０１】
(c) pPJV7458 (CMV(RIA)、 HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7450のRIA含有型を下記のように構築した：pPJV7389をBamH1で切断して、RIAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、その結果pPJV7458が得られた。
【０３０２】
(d) pPJV7468 (CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
HBsAgの3'UTRを含有する形のpPJV7458を、下記のように構築した：pPJV7452をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg 3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を生成した。pPJV7458をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、pPJV7468を得た。
【実施例４】
【０３０３】
β-galベクターパネルの構築
(a) pPJV7488 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
CMV-β-gal（Clontech）を、プライマーJF335（配列番号27）及びJF336（配列番号28）を用いてPCR増幅し、Nhe1及びBgl2で切断して、βガラクトシダーゼをコードする挿入断片を単離した。pPJV7452をNhe1及びBgl2で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7488を得た。
【０３０４】
(b) pPJV7533 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7450をBgl2及びEcoR1で切断し、RBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7488をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7533を得た。
【０３０５】
(c) pPJV7551(CMV(RIA/NheI)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7530（実施例５を参照されたい）をXho1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7488をXho1及びBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7551を得た。
【０３０６】
(d) pPJV7552(CMV(RIA/NheI)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
pPJV7530をXho1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7533をXho1及びBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7552を得た。
【実施例５】
【０３０７】
pPJV発現ベクター（pPJV7563）の構築
(a) pPJV7496
pPJV7389をプライマーJF357（配列番号29）及びJF365（配列番号30）でPCR増幅し、T4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、Sal1で切断して、カナマイシン耐性をコードする挿入断片を単離した。pPJV7389をAva1で切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、さらにSal1で切断してベクター断片を単離し、それに挿入断片を結合して、pPJV7496を得た。
【０３０８】
(b) pPJV7530
pPJV7389をプライマーJF393（配列番号31）及びJF406（配列番号32）でPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、配列内Nhe1部位を欠いたRIAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7496をBamH1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7530を得た。
【０３０９】
(c) pPJV7549
pPJV7468をBamH1及びEcoR5で切断して、M2、及びHBV 3'ENHの一部を含有する挿入断片を単離した。pPJV7530をBamH1及びEcoR5で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7549を得た。
【０３１０】
(d) pPJV7563
プライマーJF256（配列番号33）及びJF257（配列番号34）をアニールして、複数のクローニング部位からなる挿入断片を調製した。pPJV7549をNhe1及びBgl2で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7563を得た。pPJV7563プラスミドマップは図12で与えられる。pPJV7563プラスミドの塩基組成は図13において与えられる。プラスミドpPJV7563における構成成分及びその位置は下記の通りである：
1-44            トランスポゾン903配列
45-860          トランスポゾン903由来のカナマイシン耐性コード配列
861-896         トランスポゾン903配列
897-902         Sal1部位
903-1587        CMVプロモーター
1588-1718       CMV前初期遺伝子由来の非翻訳リーダー配列
1719-1724       BamH1及びBglII制限酵素の融合
1725-1857       ラットインスリンイントロンA
1858-1863       BamH1部位
1864-1984       HBV表面抗原5'非翻訳リーダー配列
1985-1993       合成開始コドン／Nhe1クローニング部位
1994-2011       合成クローニング部位
2012-2544       HBVエンハンサー
2545-2555       古いベクター配列。NCBIデータベースと対照して該当なし
2556-2686       ウサギβグロビンポリアデニル化領域
2687-3759       pUC19ベクター配列
【実施例６】
【０３１１】
モデル抗原としてヒト分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）及びヒトIgG Fcフラグメント（hFc）を使用するシグナルペプチド発現パネルの構築
(i) pPJV7507 (hTPAsp及びSEAP)
pSEAP-Basic (Clontech)を、プライマーJF320（配列番号35）及びJF321（配列番号36）でPCR増幅した後、Nhe1及びBgl2で切断して、ヒトSEAP断片からなる挿入断片を単離した。pPJV7079（Macklinら）をNhe1及びBgl2で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7507を得た。
【０３１２】
(ii) pPJV7508 (hTPAsp及びhFc)
ヒトDNAを、プライマーJF386（配列番号37）及びFcAS（配列番号38）でPCR増幅した後、Nhe1及びBgl2で切断して、ヒトIgG Fcフラグメントからなる挿入断片を単離した。pPJV7079をNhe1及びBgl2で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7508を得た。
【０３１３】
(iii) アプロチニンシグナルペプチドコード配列の調製
合成オリゴJF354（配列番号39）を、プライマーJF355（配列番号40）及びJF356（配列番号41）でPCR増幅して、アプロチニンシグナルペプチドのコード配列を生成した。
【０３１４】
(iv) タバコ エクステンシンシグナルペプチドコード配列の調製
合成オリゴJF348（配列番号42）を、プライマーJF349（配列番号43）及びJF350（配列番号44）でPCR増幅して、タバコ エクステンシンシグナルペプチドのコード配列を生成した。
【０３１５】
(v) ニワトリ リゾチームシグナルペプチドコード配列の調製
合成オリゴJF351（配列番号45）を、プライマーJF352（配列番号46）及びJF353（配列番号47）でPCR増幅して、ニワトリ リゾチームシグナルペプチドのコード配列を生成した。
【０３１６】
(a) Flu M2抗原シグナルペプチドパネル
pPJV7499 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンシグナルペプチド(s.p.))
pPJV7497 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.)
PPJV7500 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.)
シグナルペプチドのコード配列を、Spe1及びNhe1で切断して挿入断片を単離した。pPJV7450をNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7499（アプロチニン）、pPJV7497（タバコエクステンシン）、及びpPJV7500（ニワトリリゾチーム）が得られた。
【０３１７】
(b) SEAPシグナルペプチドパネル
pPJV7513（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンs.p.）
pPJV7512（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.）
pPJV7510（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7499、7497、及び7500をXho1及びNhe1で切断して、CMVプロモーターからプラスミドのシグナルペプチドコード配列までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7507をXho1及びNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7513（アプロチニン）、pPJV7512（タバコエクステンシン）、及びpPJV7510（ニワトリリゾチーム）を得た。
【０３１８】
(c) hFcシグナルペプチドパネル
pPJV7524（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンs.p.）
pPJV7525（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.）
pPJV7526（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7499、7497、及び7500をXho1及びNhe1で切断して、CMVプロモーターからプラスミドのシグナルペプチドコード配列までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7508をXho1及びNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7524（アプロチニン）、pPJV7525（タバコエクステンシン）、及びpPJV7526（ニワトリリゾチーム）を得た。
【実施例７】
【０３１９】
ヒト分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）パネルの構築
(a) pPJV7531（CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7510をSal1及びBgl2で切断し、CMVプロモーターからリゾチームシグナルペプチドまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をSal1及びBgl2で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7531を得た。
【０３２０】
(b) pPJV7554（CMV(RIA/Nhe1)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7530をXho1及びBamH1で切断して、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7531をXho1及びBamH1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7554を得た。
【０３２１】
(c) pPJV7568（CMV(イントロンなし)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7563をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7531をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7568を得た。
【０３２２】
(d) pPJV7572（CMV(RIA/Nhe1)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.）
pPJV7563をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7554をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7572を得た。
【実施例８】
【０３２３】
ニワトリケラチン及びニワトリ心筋アクチンイントロンを用いたβ-gal及びHBsAgベクターの構築
(a) pPJV7557（β-gal、CMV(cAイントロン)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、及びRBGpA）
プライマーJF430（配列番号48）及びJF442（配列番号49）を用いて、ニワトリDNAをPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、ニワトリ心筋アクチンに由来するイントロン及びフランキングエクソン配列からなる挿入断片を単離した。pPJV7488をBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7557を得た。
【０３２４】
(b) pPJV7558（β-gal、CMV(cKイントロン)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、及びRBGpA）
プライマーJF421（配列番号50）及びJF444（配列番号51）を用いて、ニワトリDNAをPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、ニワトリケラチン遺伝子に由来するイントロン及びフランキングエクソン配列からなる挿入断片を単離した。pPJV7488をBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7558を得た。
【０３２５】
(c) pPJV7578（HBsAg、CMV(cAイントロン)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、及びRBGpA）
pPJV7557をSal1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからイントロン領域までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7496をSal1及びBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7578を得た。
【０３２６】
(d) pPJV7579（HBsAg、CMV(cKイントロン)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、及びRBGpA）
pPJV7558をSal1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからイントロン領域までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7496をSal1及びBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7579を得た。
【実施例９】
【０３２７】
HBsAgベクターパネルによる抗原発現のin vitro分析
第１日に、SCC15（ATCC）又はB16（起源不明、ATCCにて入手可能な型）細胞を、20-40%コンフルエントとなるよう6ウェル組織培養プレートに撒き、インキュベーター内で一晩増殖させた。宿主細胞をATCC推奨の培地で増殖させた。
【０３２８】
第2日に、トランスフェクション反応を行った。テストする各ベクターについて、Lipofectin（登録商標）試薬（Life Techologies Inc., Grand Island, NY）20μlを180μlのOptimem（登録商標）培地（Life Techologies Inc., Grand Island, NY）に加え、室温で45分間インキュベートしておいた。40分の時点で、テストすべき各ベクター当たり、2μgのベクターを200μlのOptimem（登録商標）に混ぜ入れた。45分の時点で、ベクター及びLipofectin（登録商標）溶液を混合し、さらに10分間室温で放置した。この最後のインキュベーションの間に、プレートに撒いた宿主細胞をインキュベーターから取り出し、Optimem（登録商標）培地で２回洗浄した。10分の時点で、Optimem（登録商標）1.6mlをLipofectin（登録商標）／ベクター混合物に添加し、その結果得られた混合物のうち1mlを、２つの細胞ウェルのそれぞれに加えた。宿主細胞をインキュベーターに戻して、5時間静かに放置したが、5時間の時点で、Lipofectin（登録商標）／ベクター混合物を除去し、標準的な細胞維持培地に置き換えた。
【０３２９】
培地交換の18から24時間後に、50から100μlの細胞維持培地を組織培養プレートから採取し、AUSZYME（登録商標）モノクローナル診断キット(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中に用意された反応容器にサンプルを入れることによって、抗原の発現を分析した。テストサンプルの容量を、PBSで200μlとした後、50μlの複合体及び反応ビーズを各サンプルに添加した。容器を40℃にて80分間インキュベートし、その後、ウェルを洗浄して、全ての液体反応成分を除去した。ビーズを新たなチューブに移し、その後300μlの発色バッファーを添加した。30分で、1M硫酸の添加によって発色反応を止め、反応液の490nmでの吸光度を測定した。図１に示すデータは、２つの実験からの2連のウェルの平均吸光度測定値である。
【０３３０】
図１に示すように、RIA、HBV 3'UTR又は両方のエレメントを基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン、及びポリアデニル化領域）に加えると、SCC15細胞においてHBsAgの発現が増加した。図２に示すように、ニワトリケラチン若しくはニワトリ心筋アクチンイントロンを基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン、HBV 3'UTR及びポリアデニル化領域）に加えると、SCC15細胞においてHBsAgの発現が増加した。
【実施例１０】
【０３３１】
β-galベクターパネルによる抗原発現のin vitro分析
実施例９に記載のようにSSC15又はB16宿主細胞にトランスフェクトした。
【０３３２】
培地交換の18から40時間後に、培養上清を除去し、細胞をPBSで洗浄した。洗液を除去後、細胞を500μl溶解バッファー（50mM NaPO4、0.1% Triton X-100、pH 7）中で5分間インキュベートすることによって、細胞を溶解し、その後プラスチックシャーレから細胞を物理的に掻き取った。溶解物を２分間微量遠心にかけて、細胞残渣を除き、10から25μlの透明となった溶解液を500μlの反応バッファー（80μg/ml O-ニトロフェニルガラクトピラノシド、50mM NaPO4、pH 7）に加えて、37℃にて10から20分間インキュベートした。500μlの1M Na2CO3を添加して反応を終了させ、405nmで測定した。データは、増強された（イントロン、HBVenh、又はその両方を含有する）ベクターの基本ベクターに対する発現の比として提示される。
【０３３３】
RIA、HBV 3'UTR、又は両方のエレメントを基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン及びポリアデニル化領域）に加えることによって、２つの細胞株のいずれにおいてもβ-galの発現が増加した。SCC15細胞の結果を図３に示す。ニワトリケラチン若しくはニワトリ心筋アクチンイントロンのいずれかを基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン、HBV 3'UTR及びポリアデニル化領域）に加えると、２つの細胞株のいずれにおいてもβ-galの発現が増加した。B16細胞の結果を図２に示す。
【実施例１１】
【０３３４】
HSV gDベクターパネルによる抗原発現のin vitro分析
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例９に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの18時間後に、プレートを15分間氷上に置いた。その後、各ウェルを2mlのPBS（Biowhittaker, Walkerville, MD）で洗浄した。PBSで希釈した0.05%グルタルアルデヒド（Polysciences Inc., Warrington, PA）で細胞を固定し、室温で30分間インキュベートした。以後のインキュベーションは全て室温で1時間持続するものとし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。プレートを2mlの5% 粉乳含有PBS（Bio Rad Laboratories, Melville, NY）でブロックした。続いて、抗gDモノクローナル抗体（ABI, Columbia, MD）の2% 粉乳/PBS/0.05% Tween-20(登録商標)（Sigma, St. Louis, MO）による1:1000希釈物、1ml、及びヤギ抗マウスHRP（KPL, Gaithersburg, MD）のPBS/0.1% Tween-20(登録商標)による1:2500希釈物、1mlとともにインキュベーションを行った。1mlのTMBマイクロウェル基質（BioFX, Owings Mills, MD）を用いて発色させた。1M H2SO4で反応を止め、液体をプラスチックキュベットに移し、450nmで吸光度を読み取った。データは、増強された（イントロン、HBVenh、又はその両方を含有する）ベクターの基本ベクターに対する発現の比として提示される。
【０３３５】
RIAをHBV 3'UTRとともに、又はRIAをHBV3'UTRなしで、基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン及びポリアデニル化領域）に加えることによって、２つの細胞株のいずれにおいてもHSV gDの発現が増加した。SCC15細胞の結果を図４に示す。
【実施例１２】
【０３３６】
SEAPベクターパネルによる抗原発現のin vitro分析
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例９に記載のようにトランスフェクトした。培地交換の18から40時間後に、培養上清を採取し、70℃にて30分間加熱した。熱不活化上清10から25μlを1/10量の100mM L-ホモアルギニンとともに5分間インキュベートした。500μlのアルカリホスファターゼ反応バッファー（カタログ番号172-1063, Bio Rad, 説明書にしたがって調製）をこの溶解液に加え、37℃にて10から20分間インキュベートした。500μlの1M NaOHを添加して反応を止め、405nmで吸光度を測定した。データは、増強された（イントロン、HBVenh、又はその両方を含有する）ベクターの基本ベクターに対する発現の比、又は実験のシグナルペプチドの、ヒトTPAシグナルペプチドベクターに対する発現の比として提示される。
【０３３７】
図５に示すように、RIA、HBV 3'UTR又は両方のエレメントを基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン、及びポリアデニル化領域）に加えると、B16細胞においてSEAPの発現が増加した。予想外なことに、基本ベクター（CMVプロモーター、エクソン、及びポリアデニル化領域）にHBV 3'UTRを加えた場合のみ、SCC15細胞におけるSEAPの発現が増加した。
【０３３８】
ウシ アプロチニン、ニワトリ リゾチーム、又はタバコ エクステンシンのいずれかに由来するシグナルペプチドを成熟SEAPのN末端に付加することによって、２つの細胞株の細胞培養上清中へのSEAPの効率的な分泌が可能となった。B16細胞に関する結果を図６に示す。
【実施例１３】
【０３３９】
ヒトIgG Fcフラグメントシグナルペプチドパネルによる抗原発現のin vitro分析
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例９に記載のようにトランスフェクトした。培地交換後18から40時間までに、培養上清を採取した。
【０３４０】
ELISAプレート（Costar）をウェル当たり100μlのヤギ抗ヒトIgG（Sigma #I3382、炭酸コーティングバッファーで1/1000希釈）とともに4℃にて一晩インキュベートした。以後のインキュベーションは全て室温にて1時間持続し、それぞれのインキュベーションの間に洗浄した（10mM Tris、150mM NaCl、0.1% Brij-35、pH8.0）。その後、ウェルを100μlの5%粉乳含有PBSでブロックし、続いて希釈バッファー（2% 粉乳、PBS、0.05% Tween-20(登録商標)）で連続希釈した培養上清とともにインキュベートした。この後、ウェル当たり100μlのヤギ抗ヒトIgG/HRP（Sigma #A6029、希釈バッファーにて1/5000希釈）とともにインキュベートし、次いで100μlのTMBマイクロウェル基質を用いて発色させた。反応を100μlの1M H2SO4で止め、450nmで吸光度を読み取った。データは、実験シグナルペプチドの、ヒトTPAシグナルペプチドベクターに対する発現の比として提示される。
【０３４１】
ウシ アプロチニン、ニワトリ リゾチーム、又はタバコ エクステンシンのいずれかに由来するシグナルペプチドをヒトFcフラグメントのN末端に付加することによって、２つの細胞株のいずれにおいても細胞培養上清へのhFcの効率的な分泌が可能となった。B16細胞に関する結果を図６に示す。
【実施例１４】
【０３４２】
マウスを免疫するためのHBsAg、HSVgD及びFlu-M2プラスミド発現ベクターの使用
(a) 免疫化カートリッジの調製
テストするそれぞれのプラスミドについて、25mgの2ミクロン金粉末を秤量して微量遠心管に入れた。50mMスペルミジン（Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI）を250μlに分けて添加した後、微量遠心管をボルテックス撹拌し、短時間超音波処理した。微量遠心して金を分離し、スペルミジンを新たな100μlに交換した。金をボルテックスして再懸濁し、その後DNA 25μgをマイクロチューブに加えて混合した。微量遠心管を軽くボルテックスしながら、100μlの10% CaCl2（Fujisawa USA, Inc, Deerfield, IL）を添加してDNAを金ビーズ上に沈澱させた。沈澱反応を卓上で10分間続行した後、微量遠心の短時間回転によって金を採集し、無水エタノール（Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA）で３回洗浄して、過剰な沈澱試薬を除去した。洗浄した金／DNA複合体を、0.05 mg/mlポリビニルピロリドン（360KD, Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA）含有無水エタノール3.6ml中に再懸濁した。次に、このスラリーをテフゼルチューブ（McMaster-Carr, Chicago, IL）に注入したが、これは金／DNA複合体でテフゼルチューブの内側をコーティングするチューブターナー（PowderJect ワクチンs）内にある。チューブターニング手順が完了した後、チューブをワクチンの0.5"「ショット」に切り、マウスにデリバリーするためのXR1デバイス（PowderJect ワクチンs）内に充填した。
【０３４３】
(b) ワクチン接種法
4から6週齢のマウスをKetaset（Fort Dodge）及びRompun（Bayer）の混合物で麻酔した。１対の電気バリカンを用いて腹部を剪毛して、毛を取り除き、２つの重複しないワクチン「ショット」を、XR1デバイス（450psi）を通して剪毛部にデリバリーした。動物をケージに戻し、ワクチン接種後６週間の時点で採血した。Balb/cマウスを用いて、HBsAg発現ベクターを評価し、Swiss Websterマウスを用いてHSV gD及びFlu M2発現ベクターを評価した。
【０３４４】
抗HBsAg抗体に関する血清の分析
6週間で、血液サンプルをワクチン接種した動物から採取した。これらのサンプルから分離された血清の一定量を、AUSAB(登録商標) EIA Diagnostic キット (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)に同梱の反応容器のウェルに入れた。入れる血清の量はサンプルの抗体価によって決まり、サンプルはサンプル希釈バッファーで希釈して、定量パネルで得られる値の範囲内とした。AUSAB（登録商標）定量 パネル (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)の各バイアルから200μlを反応容器のウェルに添加した。各ウェルにビーズを添加し、その後、容器を密封して40℃にて2時間インキュベートした。その後、ウェルを洗浄して反応液の全成分を除去した。洗浄した各ウェルに、200μlのコンジュゲート混合物を添加した後、容器を密封して40℃にて2時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄して反応液の全成分を落とした。ビーズを新しいチューブに移した後、300μlの発色バッファーを添加した。30分で、1M硫酸の添加により発色反応を止め、反応液の吸光度をQuantum II（登録商標）分光光度計 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)において490nmで測定した。この分光光度計は、サンプルの吸光度を、定量パネルを用いて作成された標準曲線と比較することによって、サンプルの抗体レベルを計算する。これらの抗体レベルを次に、希釈係数で補正した。図７に示すデータは、特定のベクターでワクチン接種された全動物の力価の幾何平均である。
【０３４５】
抗Flu M2抗原抗体に関する血清の分析
96ウェルCoster中結合性ELISAプレート（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）を、合成Flu M2ペプチド（QCB / Biosource, Hopkinton, MA）によって、PBS（Biowhittaker, Walkerville, MD）中1μg/mlの濃度でコートし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、10mM Tris (Sigma, St. Louis, MO) / 150mM NaCl (Fisher Scientific) / 0.1% Brij-35 (Sigma)で３回洗浄した後、5% 粉乳(Bio Rad Laboratories, Melville, NY)含有PBSで、室温にて１時間ブロックした。以後のインキュベーションは全て室温で１時間とし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。マウス血清サンプル、標準（高力価の抗M2マウス血清）及びネガティブコントロール（抗HBsAgマウス血清）を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20(登録商標)(Sigma)で希釈し、ELISAプレート内でインキュベートした。次にヤギ抗マウスIgG(H+L)ビオチン結合抗体（Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL）を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20(登録商標)で1:8000に希釈し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Southern Biotechnology）をPBS / 0.1% Tween-20で1:8000に希釈して、続行した。TMB基質（BioFX, Owings Mills, MD）を用いて、発色させた。1M H2SO4で反応を止め、プレートを、Emax 精密マイクロプレートリーダー（Molecular デバイスs, Sunnyvale, CA）を用いて450nmで測定した。SoftMax Pro 4.1 ソフトウェア(Molecular デバイスs)を用いて、4-パラメーター解析によって最終力価を計算した。力価は、アッセイごと、及びプレートごとの変動が最小限となるよう、所定の力価を有する標準血清に対して標準化した。結果を図７に示す。
【０３４６】
抗HSV GD抗原抗体に関する血清の分析
96ウェルCoster中結合性ELISAプレート（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）を、HSVｇD（(Viral Therapeutics, Ithaca, NY）タンパク質によって、PBS（Biowhittaker, Walkerville, MD）中1μg/mlの濃度でコートし、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、10mM Tris (Sigma, St. Louis, MO) / 150mM NaCl (Fisher Scientific) / 0.1% Brij-35 (Sigma)で３回洗浄した後、5% 粉乳(Bio Rad Laboratories, Melville, NY)含有PBSで、室温にて１時間ブロックした。以後のインキュベーションは全て室温で１時間とし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。マウス血清サンプル、標準（高力価の抗gDマウス血清）及びネガティブコントロール（抗HBsAgマウス血清）を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20 (Sigma)で希釈し、ELISAプレート内でインキュベートした。次にヤギ抗マウスIgG(H+L)ビオチン結合抗体（Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL）を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20で1:8000に希釈し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Southern Biotechnology）をPBS / 0.1% Tween-20で1:8000に希釈して、続行した。TMB基質（BioFX, Owings Mills, MD）を用いて、発色させた。1M H2SO4で反応を止め、プレートを、Emax 精密マイクロプレートリーダー（Molecular デバイスs, Sunnyvale, CA）を用いて450nmで測定した。SoftMax Pro 4.1 ソフトウェア(Molecular デバイスs)を用いて、4-パラメーター解析によって最終力価を計算した。力価は、アッセイごと、及びプレートごとの変動が最小限となるよう、所定の力価を有する標準血清に対して標準化した。結果を図７に示す。
【実施例１５】
【０３４７】
プラスミドpPJV1671、インフルエンザDNAワクチンベクターの構築
インフルエンザA/Panama/2007/99(H3N2)のヘマグルチニン(HA)抗原をコードし、発現することができるプラスミドpPJV1671を構築した。
【０３４８】
pPJV1671の構築は、主要な3つの段階で最も良く表現される：
(i)     発現遺伝子のクローニング；
(ii)    ベクター骨格の設計；及び
(iii)   最終プラスミドの設計。
【０３４９】
発現遺伝子のクローニング
インフルエンザHAのコード配列は、米国疾病対策予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)(Atlanta, GA)から入手したA/Panama/2007/99ウイルスのサンプルをテンプレートリボ核酸(RNA)源として使用し、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)クローニング技術によって得た。
【０３５０】
発現遺伝子であるHAのクローニングには、以下のステップを用いた：
・A/Panama/2007/99(H3N2)のRNAセグメント4からの、dsDNA断片のRT-PCR生成；
・標準的なpUC19ベースのベクター中の、RNAセグメント4のDNAクローンの大腸菌(E.coli)における増殖；
・RNAセグメント4クローン中のH3 Panama HAコード配列の配列解析；及び
・pPJV7563 DNAワクチン「空」ベクターに適合する末端(Nhe IとBsp 120I)を有するH3 Panama HAコード配列(そのATGコドンを含まない)を含有するDNA断片を作製するための第2のPCR反応。
【０３５１】
ベクター骨格、pPJV7563の設計
pPJV1671用のプラスミド骨格はpPJV7563である。pPJV7563中のプラスミド骨格配列の大部分は、数回のヒト臨床試験において評価されているDNAワクチンベクター、pWRG7128中にも見出される。この節では、pPJV7563構築の概要を提供する。詳細なフローチャートは、図14のpPJV7563及びpPJV1671の構築で提供し、以下の、プラスミドpWRG7128及びpPJV1671における主要なエレメントの比較表(表2)を提供する。pPJV1671のマップを図16に示す。
【表２】
2008528020.tif 000004
【０３５２】
最終プラスミド、pPJV1671の設計
最終プラスミドpPJV1671の、プラスミド骨格であるpPJV7563からの設計には2つの主要なステップが含まれ(図14に示すとおり)、これらのステップは：
・pPJV7563からNhe1-Bgl II部位を欠失させるステップ；及び
・H3 Panama HAコード配列をpPJV7563に挿入し、最終のpPJV1671、H3 Panama HA DNAワクチンベクターを生成するステップである。
【０３５３】
pPJV1671の完全な配列解析により、下記の表3にリストされる全てのベクター骨格とHAコード配列を確認した。
【０３５４】
pWRG7128とpPJV1671の比較
臨床試験を行った、HBsAgをコードするpWRG7128と、H3 Panama HAをコードするインフルエンザワクチンpPJV1671ベクターとのベクター骨格中の主要な相違点は上記の表2に示される。これらの相違点には、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)イントロンAエレメントの代わりにラットインスリンイントロンAを使用すること、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の代わりにウサギβグロビンポリアデニル化配列を使用することが含まれる。現在報告されている、pPJV1671を用いた広範囲に及ぶ動物実験は、小型動物及び大型動物の両方においてpPJV1671がインフルエンザDNAワクチンとして優れた効果を奏することを示している。プラスミドpPJV1671は、以下の実施例16で論じるとおり、ヒトにおいてもDNAワクチンの粒子媒介表皮送達(PMED)後に優れた効果を奏する。
【０３５５】
pPJV1671の特性と機能マップ
pPJV1671の機能マップを図16に示す。このマップの特性を表3にリストする。プラスミドpPJV1671は、hCMV前初期プロモーター、並びにエクソン1及びエクソン2に由来する5'非コード配列を利用する。このプロモーターは、ラットインスリンイントロンAとHBV pre-S2遺伝子の5'UTR（非翻訳領域）に結合している。H3 Panama HAコード配列の翻訳は、ベクターのコンセンサスKozak翻訳開始配列のコンテキスト中に固定されているATGコドンから開始する。HAコード配列にHBVの転写エンハンサー(HBVenh)が続いている。最終的に、ウサギβグロビンポリアデニル化部位によって転写終結が促進される。
【０３５６】
A/Panama/2007/99(H3N2)のHA遺伝子の天然のATG翻訳開始コドンは翻訳開始用Kozakコンセンサス配列に適合しないため、pPJV7563 DNAワクチンベクターにより供給されるATGエレメントを翻訳開始に用いることを選択した。DNAワクチンベクターからの抗原発現は、Kozakコンセンサスに適合するATGコドンを用いて増強される。ベクターにより供給されるATGコドンの使用(Nhe I部位への挿入による)は、図16に表されるように、HA遺伝子コード配列のアミノ末端に非主要2アミノ酸の挿入を生じさせる。
【０３５７】
pPJV1671におけるヌクレオチド配列の起点
pPJV1671に関する詳細な構築履歴及び配列決定の調査報告により、このプラスミド内の全てのヌクレオチド位置の起点の指定が可能となる。実際にベクター中のコンポーネントが正確に割り当てられていることを確認するため、ベクターコンポーネント配列とGenBankデータベース間でBLASTアラインメントを行った。
【表３】
2008528020.tif 000005
【０３５８】
pPJV1671の配列(マスターセルバンク)
PowderJect Research Departmentは、新たに構築したpPJV1671プラスミドから調製したQiagen Megaprep DNAを用いて配列決定を行った。実際の配列データは、pPJV1671について予測される理論配列と100%一致していた。製造工程中の配列決定も、プラスミド配列が理論配列及び検索配列と100%一致していることを示していた。プラスミドの種々のエレメント及び配列中の位置は、上記の表3に与えられる。
【実施例１６】
【０３５９】
pPJV1671の非臨床評価：大型動物モデルにおける一価インフルエンザDNAワクチンpPJV1671の免疫原性
pPJV1671の免疫原性を研究するため、飼育ブタのモデルを用いた。pPJV1671の作製は上記の実施例15で説明されている。この研究には8週齢の飼育白ブタ(去勢ブタと雌ブタ)を利用した。対象動物について、赤血球凝集抑制(HI)抗体力価を測定したところ、この研究に含めた全ての動物について、抗体力価は1：10未満であった。
【０３６０】
1グループ当たり8動物の2つのグループに、pPJV1671DNAワクチンの粒子媒介表皮送達(PMED)によってワクチンを接種した。両グループとも、一次免疫と追加免疫を受け、これらの免疫は4週間の間隔をおいた。各ワクチン接種は、皮膚への2並列投与で構成されていた。各投与につきDNAワクチン投与量は、0.5 mg金粒子の表面上に凝縮させた1μg DNAであった。XR-1臨床研究デバイスを500 psiヘリウム圧力で操作し、このDNAワクチンを送達した。
【０３６１】
ブタに対して、0日目にワクチン接種し、28日目に追加免疫し、追加ワクチン接種の2週間後の42日目に採血した。標準HIアッセイを使用して、HI抗体応答について血清を試験した。この研究の結果は図17に示されるが、pPJV1671 DNAワクチンが、100%の試験動物において有意なHI抗体力価を誘導し、平均HI抗体力価は、ヒトのインフルエンザを防御するための1：40サロゲート(surrogate)HI抗体力価をはるかに超えていたことを示している。
【実施例１７】
【０３６２】
ヒトにおけるインフルエンザDNAワクチン構築物を評価する臨床試験
序
pPJV1671DNAワクチン(A/Panama/2007/99(H3N2)由来のHA(ヘマグルチニン)遺伝子を含有する一価PMEDインフルエンザDNAワクチン)の安全性及び免疫原性を評価するため、第1相の用量漸増臨床研究を行った。安全性は、ワクチン接種に起因する局所及び全身の有害事象を、研究が完了するまでモニターすることによって評価した。免疫原性は、血清の赤血球凝集抑制(HI)抗体レベルを測定することによって評価した。
【０３６３】
1グループ当たり健常な成人被験者12人の3グループが、0日目に、1μg、2μg又は4μgのいずれかのDNAワクチンを、1、2又は4PMED投与として送達され、単回投与を受けた。このPMEDインフルエンザDNAワクチンは、3つの投与量レベル全てにおいて血清の赤血球凝集抑制(HI)抗体応答を誘発し、最も高い投与量レベルでワクチン接種した被験者においては、最も高くかつ最も一貫した応答が誘発された。抗体応答は、試験の最終時点である56日目が最も大きかった。治療関連の反応性は、ワクチン接種部位における軽度〜中程度の皮膚反応に限られ、主に自己限定的であった。これらの結果は、作製されたインフルエンザ用DNAワクチンの安全性及び免疫原性の示唆を提供する。
【０３６４】
材料と方法
ワクチンと送達系
臨床プラスミド用に、テンプレートRNA源としてA/Panama/2007/99 ウイルスのサンプル(ウイルスは米国疾病対策予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)J. Katz氏の贈与による)を用いる標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)クローニング技術によってHAコード配列を取得した。上記実施例15で説明したとおり、H3 Panama HAコード配列をpPJV7563ベクターに挿入し、最終のpPJV1671 H3 Panama HA DNAワクチンベクターを得た。pPJV1671の完全配列の解析により、全ベクター骨格とHAコード配列を確認した。
【０３６５】
Strathman GmbH(Hannover, Germany)の医薬品製造管理基準の下でプラスミドpPJV1671を製造した。このプラスミドDNAを1-3μmの金粒子上に被覆し、PowderJect XR-1デバイスを使用して、先に報告されている方法(非特許文献９)でPMED用に製剤化した。各投与量には、0.5 mgの金の上に被覆された、名目値で1μgのDNAが含まれていた。解析したワクチン特性のパラメータとしては、金とDNAの量、in vitro発現、マウスにおける免疫力価が挙げられ、バイオバーデンと内毒素のパラメータは欠如していた。
【０３６６】
患者集団と設定
本研究の臨床段階は、MDS Pharma Services, Lincoln, NEにおいて実施し、現地の施設内治験審査委員会の承認を得た。36人の成人のボランティアが登録していた(表4)。
【表４】
2008528020.tif 000006
【０３６７】
被験者は、健康で、19〜50歳で、妊娠も授乳もしておらず、インフォームド・コンセントを提出することが可能で、ワクチン接種前のインフルエンザA/Panamaに対する赤血球凝集抑制(HI)力価が10以上且つ40以下である場合に適格とされた。
【０３６８】
除斥原因としては、最近6ヶ月以内に免疫抑制療法を受けたこと、皮膚病歴、瘢痕、あざ、ワクチン接種部位の切り傷又は入墨、金に対するアレルギー、金療法歴、過去12ヶ月間のインフルエンザワクチンの受容、今シーズンのインフルエンザ様の症状若しくはインフルエンザであるとの診断、又はインフルエンザワクチンの接種を勧められない任意の病状の存在、が挙げられた。
【０３６９】
全ての被験者について研究を完了し、安全性と免疫原性について評価したが、2人の被験者は例外であった。1人の被験者は消息不明となり、別の被験者は不適合(non-compliant)であった。しかし、36人の被験者全員がワクチン接種前のサンプルを提供し、ワクチン接種を受け、少なくとも1回はワクチン接種後の安全性と免疫原性について評価を受けたため、全ての被験者の安全性と免疫原性の評価についてデータを入手することができた。研究手順は全て、ヘルシンキ宣言(1975年)のエジンバラ修正、スコットランド修正(2000年)及び医薬品の臨床試験実施に関する基準-ハーモナイゼーション国際会議(International Conference on Harmonization guidelines on Good Clinical Practice)(ステップ4、1996年5月1日)に従った。
【０３７０】
臨床研究の設計
被験者を1グループ当たり12人の3つの治療グループに順番に割り当てた。PMEDによるDNAワクチン投与は各々、0.5mgの金に被覆した1μgのDNA、プラスミドpPJV1671(H3 Panama)を送達するものであった。第1グループは、0日目に、上腕の内側面に単独ワクチン投与を受けた。第2グループの被験者は、0日目に、2回で合計2μg DNAのワクチン接種を受け、ワクチンは上腕内側面の隣接部位に投与された。第3グループの被験者は、4日目に、4回で合計4μg DNAのワクチン投与を受けた。ワクチンは、PowderJect XR-1デバイスを500 psiのヘリウム圧力で用いて投与されたが、この圧力は、先の研究においてよく耐容されることが示されている(非特許文献９、Rottinghausら(2003) Vaccine 21(31):4604-8及びTacketら(1999) Vaccines
17(22):2826-9)。
【０３７１】
臨床的な安全性と免疫原性の評価
ワクチン接種部位の反応をモニターし、研究中の局所及び全身の有害事象の発生を記録することにより安全性を評価した。全ての被験者は、ワクチン接種時、接種後1時間と接種後2時間の時点で、ワクチンの安全性及び局所耐性について評価を受けた。被験者は、3、7、14、21、28、56、及び180日目に局所耐性についてさらに評価を受けた。全身的有害事象は、身体検査、バイタルサイン、実験室安全性試験、及び抗二本鎖DNA抗体試験によりモニターした。これらの試験は、ワクチン接種の前及び後に実施した。
【０３７２】
各ワクチンの免疫原性は、0日目(ワクチン接種前)、及びワクチン接種後14、21、及び56日目に血液サンプルを採取し、先に報告されている方法(Kendalら(1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control: B17-35)の変法を用いてA/Panama/2007/99に対するHAI力価を測定することによって判定した。
【０３７３】
臨床データの解析
安全性データを表化した。各HI力価は、通常は同一又は類似の結果を与える2つの別々の測定値の幾何平均(GMT)として報告された。サンプルの力価が10以下であった場合、アッセイの検出限界値である力価5を割り当てた。各グループについて、各時点のGMTと95%信頼区間(CI)を、対数変換した力価を用いて計算した。各時点について、各投与量グループの基線からのGMT比を、SAS（システム）のCATMOD法を用いたカイ二乗検定により比較した。3つのグループ間のGMTの差も比較した。
【０３７４】
血清転換率(HAI力価がワクチン接種前の力価から4倍以上増加した被験者のパーセント)、及び血清防御率(ワクチン接種後力価40以上を達成した被験者の割合）を計算し、ロジット応答リンク関数を用いて応答者の%を比較する、SAS（システム）のCATMOD法を用いたカイ二乗検定によりグループ間で比較した。
【０３７５】
結果
安全性と反応性
84のワクチン投与部位全てについて、局所反応を評価した(図18)。3つのグループ全てから得た局所皮膚反応スコア(84の全ワクチン接種部位)を平均した。皮膚反応は、下記の基準に従ってスコア化した：
-  紅斑： 0 = なし； 1 = 紅潮； 2 = 軽度の日焼け； 3 = 真赤。
【０３７６】
-  浮腫： 0 = なし； 1 = わずかに厚い； 2 = 著しく厚い； 3 = 広範囲の固いじんましん。
【０３７７】
-  変色： 0 = なし； 1 = わずかに見られる； 2 = 著しい変色； 3 = 褐色の靴墨色。
【０３７８】
-  剥離： 0 = なし； 1 = 微細な白いふけ様； 2 = 日焼け様の剥皮； 3 = 厚い黄色の痂皮。
【０３７９】
-  掻痒/不快感： 0 = なし； 1 = 軽度の掻痒又は触れた際のわずかな痛み； 2 = 中程度の掻痒又は痛み。
【０３８０】
先の研究(非特許文献９、Rottinghausら(2003)及びTacketら(1999)全て上記参照)に基づいて予測されるとおり、被験者は局所的な皮膚反応を経験したが、重度(スコア = 3)の局所反応は起こらなかった。記録される出血又は皮膚損傷は生じなかった。典型的な局所反応は、軽度〜中程度の紅斑、浮腫及び皮膚変色、並びに時折生じる掻痒/不快感、それに続く軽度の表皮剥離により特徴付けられる。
【０３８１】
まれに起こる局所反応として、点状出血(2/84部位)、軽い挫傷(2/84部位)及び小さな痂皮(15/84部位)が挙げられる。通常、浮腫はワクチン接種後14日目までに回復したが、紅斑及び皮膚変色は28日間持続した。84の全ワクチン接種部位のうち、ワクチン接種後56日目で30部位に、180日目で21部位に、軽度の皮膚変色が依然として存在していた。
【０３８２】
研究中に観察された全身的有害事象は軽度であり、治療とは無関係であると考えられた。ワクチン接種後7〜56日目に報告された事象としては、頭痛(10人の被験者で11事象)、疲労(3人の被験者で4事象)、筋肉痛(1人の被験者で3事象)、発熱(2人の被験者で2事象)、手の冷え(2人の被験者で2事象)、背痛(1人の被験者で2事象)並びに吐き気、関節痛、筋肉の緊張、震え、断続的高血圧症及び断続的低血圧症(1人の被験者で1事象)が挙げられる。抗二本鎖DNA抗体は検出されなかった。全ての調査グループに関する、局所及び全身の有害事象の総合プロファイルは、PMEDにより送達されるインフルエンザDNAワクチンの安全性の示唆を与える。
【０３８３】
抗体応答
インフルエンザA/Panamaに対するHI力価の10以上40以下について被験者をプレスクリーニングしたが、数人の被験者の力価は、ワクチン接種の当日で10以下であった。基準HI力価は全て40未満であり、グループ間で基準力価に著しい相違は存在しなかった(p=0.439；上記の表4参照)。
【０３８４】
ワクチン接種は、3つのグループ全ての全時点において幾何平均力価(GMT)の著しい上昇をもたらした(以下の表5に示されるとおり)。
【表５】
2008528020.tif 000007
【０３８５】
用量反応様式でHI力価と血清転換%がより高くなる傾向があったが、3グループ間で、GMT、血清防御%又は血清転換%における統計的差異は存在しなかった。3つのワクチン投与量レベル全てにおいて、GMT、血清転換%及び血清防御%はワクチン接種後の時間に応じて増加し、力価は56日目に最も高くなった(表5参照)。グループ1では、33%の被験者が56日目までに血清転換し、58%の被験者が血清防御HAI力価を達成し、GMPは2.8倍増加した。グループ2では、56日目の血清転換率は67%であり、92%の被験者が血清防御され、GMTは3.9倍増加した。最も高く且つ最も一貫した力価は、グループ3で56日目に観察され、ここでは100%の血清防御が観察され、GMTは基準に対して8.1倍増加した。このグループの血清転換は100%未満であったが、これは血清保護された被験者の何人かが、基準HAI力価が比較的高いことに起因し4倍以上の力価の増大を示さなかったためであった。
【０３８６】
考察
本実施例において報告される研究は、インフルエンザ予防に有効と予測される抗インフルエンザ抗体応答を初めて成功裏に生じさせるものである。
【０３８７】
免疫学的分析により、全ての投与量レベルが抗インフルエンザ抗体応答を生じさせることが示された。年次インフルエンザワクチンの使用許可についての許可医薬品委員会(CPMP(Committee for Proprietary Medical Products))の指針との比較から、1μgの投与量グループは56日目に幾何平均力価(GMT)の基準を達成し、2μgの投与量グループは56日目に3つの全ての基準(血清転換、血清防御及びGMT)を達成し、4μgの投与量グループは21日目にGMTの基準を、そして56日目に3つの基準全てを達成したことが示された。
【０３８８】
ワクチン部位の反応を含み、治療下で発現した有害事象(AE)が計320件、投与を受けた36人の被験者のうち34人(94%)について報告された。研究中、1つの重篤有害事象(SAE)として足の骨折が報告されたが、研究対象のワクチンと関係があるとは考えにくいものであった。7人の被験者が、FDAに報告義務のある有害事象を経験したが、全て研究対象のワクチンと関係があるとは考えにくいものであった。有害事象(AE)の大部分(71%)は、軽度のものであった。報告された最も一般的なAEは頭痛であった(被験者全員の53%)。AEのために研究を中止した被験者はいなかった。ワクチン投与を受けた36人の被験者のうち27人について、合計89のワクチン接種部位関連のAEが報告され、12人の被験者(33%)について、最も一般的な局所AEとして軽度の投与部位疼痛が報告された。3度(重症)と評価される局所反応性の指標は存在せず、このため有害事象と見なされた。典型的なワクチン接種部位反応としては、発赤/紅斑、浮腫、剥離、変色及び痂皮/瘡蓋形成が挙げられる。
【０３８９】
結論として、全ての被験者においてpPJV1671の投与はよく許容され、強力な抗インフルエンザ抗体応答を誘発した。最高投与量の4μgは、21日目に、年次インフルエンザワクチンの使用許可についてCPMPにより規定される基準を満たした。
【実施例１８】
【０３９０】
ブタにおける三価DNAワクチンの非臨床評価
2001-2002年インフルエンザワクチン株のHA分子をコードする3つのDNAワクチンベクターを構築し、関連動物モデルにおいて、候補ヒト三価インフルエンザDNAワクチンの免疫原性を評価した。ヒトとブタの皮膚の構造が酷似しているため、飼育ブタは歴史的にヒトにおけるPMED DNAワクチンのモデルとして使用されている。ヒトにおけるPMED DNAワクチン性能の予測の判断材料としてのブタモデルの関連性は、B型肝炎表面抗原DNAワクチンの第I相ヒト臨床試験によって示され、この試験では、ブタにおける優れたワクチン性能がヒトにおいても反映されていた。
【０３９１】
3つの2001-2002年インフルエンザワクチン株のサンプル(A/Panama/2007/99 (H3N2)、A/New Caledonia/20/99 (H1N1)、及びB/Victoria/5/00)を米国疾病対策センター(Centers for Disease Control (CDC))から入手し、逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)実験に用いて、対応するHA抗原をコードするDNA断片を作製した。下記のステップを用いて、最終の3つのHA DNAワクチンベクターを開発した：
・A/Panama/2007/99(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、及びB/Victoria/5/00株のRNAセグメント＃4のdsDNA断片のRT-PCR生成。
【０３９２】
・標準的なpUC19ベースのベクター中の、RNAセグメント＃4 DNAクローンの大腸菌(E. coli)における増殖。
【０３９３】
・RNAセグメント＃4クローン中のHAコード配列の配列解析。
【０３９４】
・HAコード配列(ATGコドンを有さない)を含み、pPJV7563 DNAワクチン発現ベクターに適合する末端(Nhe IとBsp 120I)を有する、各ウイルスに由来するDNA断片を作製するための、第2の一連のPCR反応(実際のHA遺伝子配列データに基づく)。
【０３９５】
・最終の3つのDNAワクチンベクターを生じる、臨床DNAワクチンベクターpPJV7563への3つのHAコード配列断片の挿入。
【０３９６】
・変異が生じていないことを確認する、3つの全てのベクター中のHAコード配列の配列解析。
【０３９７】
結果として生じたベクターは、本発明のキメラプロモーターを用いている。こうして、このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期プロモーター並びに前初期エクソン1及び2に由来する5'非コード配列を利用する。このプロモーターは、ラットインスリンイントロンA及びB型肝炎ウイルス(HBV)pre-S2遺伝子の5'非翻訳領域(UTR)に結合している。HAコード配列の翻訳は、ベクターのコンセンサスKozak翻訳開始配列のコンテキスト中に固定されているATGコドンを起点としている。このHAコード配列の後にHBVの転写エンハンサー(HBVenh)が続いている。最終的に、ウサギβグロビンポリアデニル化部位により転写終結が促進される。
【０３９８】
HA遺伝子の天然のATG翻訳開始コドンは翻訳開始用Kozakコンセンサス配列に適合しないため、pPJV7563 DNAワクチンベクターにより供給されるATGエレメントを翻訳開始のために用いた。DNAワクチンベクターからの抗原発現は、通常、Kozakコンセンサスに適合するATGコドンを用いて増強する。ベクターにより供給されるATGコドンの使用(Nhe I部位への挿入による)は、HA抗原コード配列のアミノ末端における非主要2アミノ酸の挿入を生じさせる。
【０３９９】
これらのベクターの免疫原性を、飼育ブタモデルにおいて、三価の剤形で評価した。3つのベクターを1:1:1で混合し、1mgの金当たり計2 μg DNAの割合で金粒子上に製剤化し、1投与当たり0.5 mgの金を使用した。各ワクチン接種は、合計2 μg DNAと1 mgの金の、2連タンデム方式によるPMED投与から成っていた。ワクチン投与計画は、このようなワクチン接種を2回、4週間あけて行うことを含んでいた。インフルエンザ未処理のブタを、実際に利用した送達デバイスに基づいて、2つのワクチン接種群に分けた。1つのグループの動物は、様々な動物において多数の抗原に対する免疫応答の誘導に成功裏に用いられている、再利用可能な「研究用」PMEDデバイスを用いて、三価インフルエンザDNAワクチンの接種を受けた。第2グループの動物は、HBV DNAワクチンを用いて首尾よくヒトにワクチン接種するために使用されていた臨床デバイスを利用して、ワクチン接種を受けた。後者のデバイスは、研究用デバイスに付随する12ショットの再利用可能ノズルの代わりに、「シングルショット」プラスティック使い捨てノズルを利用する点において、研究用デバイスと異なる。
【０４００】
2回目のワクチン接種の2週間後、血清サンプルを採取し、同属のH3、H1及びBウイルスに特異的な赤血球凝集抑制(HI)抗体力価を測定した。これらのデータを図19に示す。いずれのデバイスを用いた場合もH3抗原及びB抗原に対する100%の血清転換が観察され、幾何平均HI力価は、インフルエンザに対する免疫原性に必要であると一般的に考えられている1：40サロゲートレベルを優に超えていた。得られたデータは、この技術プラットフォームがヒトにおいて有意な応答を誘発することができると考えられることを示す。
【０４０１】
H1特異的免疫応答は低かった。これは、後にH1 DNAワクチンベクターにおいてプラスミド生産中に起こるH1 HA遺伝子の再配列に起因するものであることが判明した。この再配列は、製剤化及びワクチン接種前の最初のDNA解析では検出されなかったが、さらに厳密な解析を行うことにより検出されたであろう。H3ベクター及びBベクターを用いた結果に基づくと、機能性プラスミドを利用したとすれば、H1特異的応答が極めて大きくなった可能性がある。
【実施例１９】
【０４０２】
プラスミドpPJV2012の構築
プラスミドpPJV2012 を構築した。pPJV2012は、腸管毒素原性大腸菌の易熱性毒素(LT)のAサブユニット及びBサブユニットを発現する。in vivoでのpPJV2012からの機能性LT毒素の発現は、pPJV2012と共に投与されるプラスミドから発現される他のタンパク質に対する免疫応答を増強するために用いることができる。
【０４０３】
LTは、単一のAサブユニットと、同一のBサブユニットの5量体とから成る84 kD多量体タンパク質である。LTは大腸菌中で発現して分泌され、Bサブユニット5量体を介して腸細胞上のGM1ガングリオシドに結合する。この毒素は内部に取り入れられ、その後Aサブユニットが腸管腔の全域で過剰cAMP産生及び電解質バランスの崩壊を活性化する(Tauschekら (2002) Proc Natl Acad Sci, USA 99: 7066-7071)。このように、in vivoで発現されるLTの生物学的活性のために、発現細胞からの分泌を媒介するシグナルと共にAサブユニット及びBサブユニット両方の産生が必要とされる。LT Aサブユニット及びLT Bサブユニットをコードするプラスミドベクターは、粒子媒介表皮送達を用いて共に送達された場合に、多数のウイルス抗原に対して誘導される免疫応答を増大させることが示されている(Arringtonら (2002) J Virol 76 (9): 4536-46)。
【０４０４】
LT毒素のAサブユニット及びBサブユニットのコード配列に加えて、pPJV2012は、効率的な遺伝子発現を確実にするための本発明のキメラプロモーター配列、ウサギβグロビンポリA配列、発現細胞からの分泌を媒介するシグナル配列、カナマイシン耐性遺伝子及び細菌性複製起点も組み込んでいる。このプラスミドを図22に示す。
【０４０５】
プラスミドpPJV2012を、下記のステップにより構築した：
・大腸菌ゲノムDNAに由来するLT Aコード配列のPCR増幅及び中間プラスミドへの挿入；
・LT Aコード配列の切り出し及びCMVプロモーターの制御下にある「アクセプター」プラスミドへの挿入。
【０４０６】
・大腸菌ゲノムDNAに由来するLT Bコード配列のPCR増幅及びトランケートされた（短縮）CMVプロモーターの制御下にある中間プラスミドへの挿入。
【０４０７】
・LT A発現カセットの切り出し。
【０４０８】
結果として得られたプラスミド、pPJV2012は、哺乳類細胞中でLTの両方のサブユニットを発現する。
【０４０９】
pPJV2012のプロモーター配列とエンハンサー配列
LT Aサブユニットは、CMV前初期(IE)プロモーターから発現する。LT BサブユニットはトランケートされたCMV IEプロモーターから発現する。両遺伝子の発現を高めるための付加配列、特にHBV pre-S2 5'UTR(Moriartyら (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 2606-2610)、CMVエクソン1/2(天然のイントロンの欠失により一緒にスプライスされた最初の2つのCMV IEエクソンで構成される)、ラットインスリンイントロンA(Lomedicoら (1979) Cell 2: 545-558)及びウサギβグロビンポリA(rGpA)が含まれる。発現細胞からの分泌を確実にするため、両方のLTサブユニットにニワトリリゾチームシグナルペプチド(CLSP；Genbank登録番号CR390743)が挿入されている。さらに、発現を高めるため、HBV env エンハンサー(Vannice及びLevinson (1988) J Virol. 62: 1305-1313)をAサブユニットの後ろに挿入した。
【０４１０】
LT AサブユニットとLT Bサブユニットのクローニング
大腸菌株E078:H11をATCC(カタログ＃35401)から入手し、5'末端及び3'末端に相同であって、GenBank accession file AB011677を参照して設計したプライマーを用いて、別々のPCR反応によりAサブユニット及びBサブユニットを増幅した。両サブユニットについて作製されたこのコード配列は、アミノ末端に見出される細菌性シグナルペプチドをコードする配列は含まない。Aサブユニット断片とBサブユニット断片を、プラスミドWRG7054に別々に結合させた。
【０４１１】
pPJV2012の構築
LT Aコード配列を切り出し、pPJV7592のベクター骨格と、CMVプロモーター、5'非翻訳領域及びCLSPを含む、pPJV7572に由来する断片に結合させた。結果として得られたプラスミドをA1とした。A1を切断し、pPJV7592に由来する断片と結合してマルチクローニングサイトを再創出し、結果として得られたプラスミドをアクセプターとした；このプラスミドはpPJV2012のLT A 成分を提供した。
【０４１２】
LT Bコード配列を切り出し、pPJV7591のベクター骨格と、非翻訳領域の3'末端及びCLSPを含有する、pPJV7572に由来する断片と結合させた。結果として得られたプラスミドをドナーとし、このドナーはpPJV2012のLT B成分を提供した。
【０４１３】
pPJV2012を作製するために、ドナーに由来するLT B発現カセットを含む断片を、アクセプターに由来するベクター断片と結合させた。結果として得られたプラスミドは、哺乳類細胞中で、LT AとBの両方を発現する。
【０４１４】
pPJV2012のヌクレオチド配列の起点
pPJV2012を完全に配列決定し、データベースとアラインして各配列の起点を指定した。以下の表６に示す誘導配列が予測された。
【表６】
2008528020.tif 000008
【０４１５】
さらに、配列ストレッチ中の短くとも19塩基の配列相同性を求めて、BLAST検索を全ヒトゲノムに対する配列相同性について実施した。「有意な相同性は見出されず」；最大の相同性はrGpAの68塩基の配列に見出されたが、同一配列の最長ストレッチは18塩基のみであった。
【０４１６】
pPJV1671に対するPJV2012配列の比較
pPJV2012の配列を、pPJV1671の配列と比較した。結果を以下の表7に示す。
【表７】
2008528020.tif 000009
【０４１７】
解析は、pPJV2012中の5578塩基対のうち4418塩基対(79%)が、pPJV1671インフルエンザDNAワクチン中にも存在していることを示している。LT A及びBサブユニットのコード配列を除いて、pPJV2012の4544塩基対のうち4418塩基対(97%)が、pPJV1671中にも存在している。
【０４１８】
pPJV1671は、体内分布/組込みの研究を経ており、各事例において、組込みの証拠は見出されていないことに留意されたい。
【実施例２０】
【０４１９】
哺乳類細胞中で大腸菌LTサブユニットを発現するプラスミドpPJV7788の構築
下記のプラスミドを用いて、プラスミドpPJV7788を作製した：
pPJV7275、pPJV7284、pPJV7389、pPJV7586及びpPJV7293から派生したプラスミドpPJV7563とpPJV7592。
【０４２０】
CMVプロモーターのすぐ上流にマルチクローニングサイト(MCS)を含むpPJV7389の誘導体である、pPJV7590。
【０４２１】
コードされる抗原のすぐ上流にニワトリリゾチームシグナルペプチド(CLSP)のコード配列を含有するpPJV7389の誘導体である、pPJV7572。このシグナルペプチドが、C末端で融合している抗原の細胞外分泌を可能とする。
【０４２２】
(i)  pPJV7785(LTAアクセプタープラスミド)の構築
pPJV7563をSal1で切断し、平滑末端化し、Nde1で切断してベクター断片を作製した。pPJV7590をSph1で切断し、平滑末端化し、Nde1で切断してMCSとCMVプロモーターの5'末端を含有する挿入断片を作製した。これらの断片を結合し、pPJV7592を作製した。
【０４２３】
pPJV7592をNco1とBgl2で切断し、ベクター断片を作製した。pPJV7572をNco1とNhe1で切断し、CMVプロモーターの3'末端、5'非翻訳領域、及びCLSPを含有する挿入断片を作製した。pPJV2004をNhe1とBamH1で切断し、LTAサブユニットを含有する挿入断片を作製した。これらの断片を結合し、プラスミドpPJV7785を作製した。
【０４２４】
(ii)  pPJV7787(LTBドナープラスミド)の構築
pPJV7389をNco1とEcoR1で切断し、ベクター断片を作製した。pPJV7572をNco11とNhe1で切断し、CMVプロモーターの3'末端、5'非翻訳領域、及びCLSPを含有する挿入断片を作製した。pPJV2005をNhe1とBamH1で切断し、LTBサブユニットを含む挿入断片を作製した。pPJV7586をBgl2とEcoR1で切断し、ウサギβグロビンポリアデニル化領域を含有する挿入断片を作製した。これらの断片を連結し、pPJV7787を作製した。
【０４２５】
(iii)  pPJV7788の構築
pPJV7785をXho1とMfe1で切断し、LTA発現カセットを含有するベクター断片を作製した。pPJV7787をXho1とEcoR1で切断し、LTB発現カセットを含有する挿入断片を作製した。これらの断片を結合し、哺乳類細胞に導入されるとLTAサブユニット及びLTBサブユニットを発現するpPJV7788を作製した。
【０４２６】
以下の表8は、構築物pPJV7788における様々なエレメントの位置を提供する。
【表８】
2008528020.tif 000010
【実施例２１】
【０４２７】
哺乳類細胞中でH5/VN1194ヘマグルチニンタンパク質を発現するプラスミド、pPML7789の構築
本発明のキメラプロモーターを利用してH5/VN1194ヘマグルチニンタンパク質を発現することができるさらなる構築物、pPML7789を作製した。実施例5に記載した構築物、pPJV7563を構築物pPML7789の骨格として用いた。
【０４２８】
H5/VN1194 HA遺伝子のコード配列を含有するプラスミドをPCRのテンプレートとして用いた。PCRプライマーを5'末端及び3'末端の部位について設計し、pPJV7563に挿入した。pPJV7563をNhe1とBsp120Iで切断し、ベクター断片を作製した。H5/VN1194テンプレートから増幅されたPCR断片を同じ酵素で切断し、挿入断片を作製した。これらの2つの断片を結合し、pPML7789を作製した。配列決定によりコード配列とフランキング配列を確認した。
【０４２９】
pPML7789における様々なエレメントのヌクレオチド位置を、以下の表9に示す。
【表９】
2008528020.tif 000011
【実施例２２】
【０４３０】
HSV-2 ICP27及び大腸菌易熱性毒素を用いたDNAワクチン接種により生じる強力な防御細胞免疫応答
材料と方法
ウイルス
HSV-2ウイルス(Nancy Sawtell, University of Cincinnatiから贈られたMS株、ATCC VR-540及びHG52株G)をVERO細胞(ATCC CCL-81)上で増殖させ、使用前にスクロース勾配上で精製した。
【０４３１】
DNAワクチンとDEIベクター
全ICP27遺伝子(UL54)をpTarget(Promega, Madison WI)に組み込んだPCR断片を挿入することにより、HSV-2 ICP27(図27)をコードするプラスミドを作製した。このPCR断片は、HSV-2のMS株の精製ゲノムDNAから、5'(GCCACTCTCTTCCGACAC、配列番号63)プライマーと3'(CAAGAACATCACACGGAAC、配列番号64)プライマーを用いて増幅した。増幅された配列は、HSV-2のHG52 クローンの公開されているゲノム配列(GenBank登録番号NC_001798)のヌクレオチド114,523〜116,179に対応する。University of Wisconsin, MadisonのDNA Sequencing Core FacilityによりpICP27を完全に配列決定した。
【０４３２】
プラスミドPJV2012は、単一ベクターからのLTのAサブユニットとBサブユニットの両方をコードし、このプラスミドは図22に示される。pPJV2012の構築は、実施例19で説明される。pPJV2012において、LT Aサブユニット遺伝子は、下記の成分：ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期プロモーター、hCMV由来の融合エクソン1及び2(非コード配列)、ラットインスリンイントロンA、B型肝炎ウイルス(HBV)pre-S2遺伝子の5'非コード領域、ATGコドン、リゾチームシグナルペプチドコード配列、LT Aサブユニットコード配列、3'非コードHBV転写エンハンサー領域、及びウサギβグロビンポリアデニル化配列からなる転写ユニットから発現される。
【０４３３】
pPJV2012はまた、逆方向に転写される第2の転写ユニットからLT Bサブユニット産物もコードする(図22)。このLT B転写ユニットは、LT A産物をコードしている転写ユニットと類似しているが、hCMV及びHBV転写エンハンサーエレメントの複製物を含んでいない。LT A転写ユニット中に位置するhCMV及びHBVエンハンサーエレメントは、LT B転写ユニットとしての機能も果たす。
【０４３４】
プラスミドPJV2013(図示せず)は、pPJV2012と類似しているが、単一のベクターからの、コレラ毒素のAサブユニット産物及びBサブユニット産物の両方をコードする。pPJV2013の機能マップは、図22のpPJV2012の機能マップと同じである。
【０４３５】
粒子媒介表皮送達(PMED)によるDNAワクチン接種
6〜8週齢の雌Balb/cマウスに対するPMED DNAワクチン接種は先に報告されたとおりであるが(Arringtonら、J. Virol. 76, 4536-4546, 2002)、各送達が合計0.5μgのDNAワクチン/DEIベクター製剤で被覆した0.5 mgの金を含む、単一のPMED送達からなる腹部皮膚に対する各々のワクチン接種については報告されていない。このような「シングル・ショット」ワクチン接種を2回、4週間あけて投与し、第2の、すなわち「追加」ワクチン接種の2週間後に動物を屠殺又は曝露した。
【０４３６】
ペプチドプールとペプチド
MS株ウイルスに由来するICP27の誘導アミノ酸配列を、ライブラリのテンプレートとして使用した。ICP27タンパク質は、HG52株の配列とMS株の配列との間で高度に保存されているため(図28及び配列番号65参照)、このライブラリでは両方の株に対する応答を検出することができると考えられた。隣接ペプチドと11アミノ酸重複を有する長さ18アミノ酸のペプチドを用いて、ICP27の全配列に及ぶペプチドライブラリを合成した(Mimotopes, Fisher Scientific)。合計72個のペプチドを作製した。
【０４３７】
陽性ペプチドの同定を容易にするため、Tobery ら J. Immunol. Methods 254, 59-66, 2001により報告された方法を用いてライブラリをペプチドプールに分割した。ペプチドプールは、表10に示すパターンを用いて作製した。1プール当たり6ペプチドの12プール(C1-C12と名付けた)と、1プール当たり12ペプチドの6プール(R1-R6)であった。ペプチド番号45及び番号46を含むプールを太字で示す。
【表１０】
2008528020.tif 000012
【０４３８】
ELISPOTアッセイ
先に報告されているとおり、新鮮な脾細胞及びリンパ節細胞上でIFN-γ ELISPOTアッセイを実施したが、刺激用抗原は、結果の項の各実験について示されるように、単一ペプチド又はペプチドプールを用いた。場合により、ELISPOTアッセイの前に、使用説明書に従って磁性ビーズ(Dynal)によりT細胞集団を枯渇させた。
【０４３９】
サイトメトリービーズアレイ(CBA)アッセイ
2回目のワクチン接種の2週間後、新鮮な脾細胞を採取し、SM(MEMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び2-メルカプトエタノールを添加したRPMI培地 + 10% ウシ胎仔血清(Invitrogen, Carlsbad, CA))中で、1ml当たり1 x 107 細胞の濃度で再懸濁した。細胞サンプルを、1ウェル当たり1 x 106細胞(100μl)の濃度で96ウェル平底プレートに撒いた。脾細胞は、100μlアリコートのICP27ペプチド含有SM又は培地単独で処理した。最終ペプチド濃度は10-8Mであった。未処理の動物から採取した対照脾細胞もペプチドと共にまたペプチドを伴わずに、さらにCon-A(最終濃度2.5 mg/ml)と共にまたCon-Aを伴わずに撒き、それぞれ陰性対照及び陽性対照としての役割を果たした。
【０４４０】
プレートを37℃で48時間インキュベートし、その後各サンプルを160μlずつ採取して、BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2 kit(BD Biosciences, San Jose, CA (カタログ♯551287))を用いたアッセイを行うまで-20℃で保存した。簡単に説明すると、このキットはマウスIL-2、IL-4、IL-5、INF-γ、及びTNF-αに対して特異的な捕捉抗体で被覆されている、異なる蛍光強度を有する5つのビーズ集団を利用している。5つのビーズ集団を共に混合してアレイを形成し、これをBD FACSCaliburフローサイトメーターのFL3チャンネル上で解像する。サイトカイン捕捉ビーズをPEコンジュゲート検出抗体と混合し、その後標準物質又は試験サンプルと共にインキュベートしてサンドイッチ複合体を形成した。サンプル回収後、BD CBA Analysis Softwareを用いて結果を生成した。サイトカイン濃度の定量を容易にするため、各サイトカインについてサンプル強度を標準曲線と比較する。使用説明書に従い、サンプルを希釈せずに、あるいは1：10希釈で流した。
【０４４１】
HSV-2ウイルス曝露
Anesthetized Balb/cマウスの鼻腔内に約50LD50(2 x 106 PFU)のHSV株MSを含有する30 μlのPBSを曝露した。感染後20日間マウスを追跡調査し、罹患率及び死亡率についてスコア化した。罹患率は、下記のスケジュールに従って、0〜4のスケールでスコア化した：4、健康；3、毛が逆立ち、くしゃみをする；2、ただれ目又は尻痛、動作減少；1、体を丸める、動作ほとんどなし；0、死亡。曝露の前後にIFN-γ-(eBioscience, San Diego, CA (カタログ♯16-7311)及び/又はTNF-α-(カタログ♯16-7332)特異的モノクローナル抗体で処理したマウスは、ウイルス曝露に対して-2日目、0日目、2日目、4日目、6日目、及び8日目に90 μgの抗体を含む腹腔内注射を受けた。T細胞枯渇実験において、ウイルス曝露に対して-2日目及び0日目に、マウスはCD4細胞集団又はCD8細胞集団のいずれかに特異的な抗体200μgを含む腹腔内注射を受けた(ファンクショナルグレード精製抗マウスCD4、eBioscienceカタログ♯：16-0041;ファンクショナルグレード精製抗マウスCD8、eBioscience；カタログ♯:16-0081)。
【０４４２】
結果
Balb/cマウスにおける強力なCD8エピトープの同定
ICP27タンパク質に対するT細胞応答を同定するため、HSV-2(HG52株G)の弱毒化株を感染させた、Balb/cマウスとC57Bl/6マウスから回収した細胞上でIFN-γELISPOTアッセイを行った。T細胞を刺激するため、ICP27コード配列の全長にわたるペプチドからなるペプチドライブラリを使用した。このペプチドの長さは18アミノ酸で、隣接ペプチドと11アミノ酸だけ重複していた。ペプチドプールは、材料と方法、及び表10に記載されるとおり、6ペプチド(プールC1-C12)又は12ペプチド(プールR1-R6)のいずれかから成り、その構成は、ライブラリ内の陽性ペプチドの同定を容易にした。感染の7日後にBalb/cマウスから回収した脾臓細胞とリンパ節細胞は、プールC10、C11、R2及びR5内のペプチドに対して極めて強い応答を示し(図29A)、他の幾つかのプールにおいてはやや弱い応答を示した。C57Bl/6マウスから回収した細胞では弱い応答しか検出されなかった。陽性応答のパターンは、アッセイした脾臓細及びリンパ節細胞集団と類似していることが分かった。
【０４４３】
IFN-γ ELISPOTの結果に基づき、2つの隣接ペプチド(#45、#46)は、優性T細胞エピトープを含むことが予測された。このことは、各ペプチドを個別に試験することにより確認した(データ示さず)。ペプチド45と46は、強力なIFN-γ分泌を刺激し、Ddアレルに結合することが予測される相同の9アミノ酸配列HGPSLYRTFを含んでいた(図29B、配列番号68)。興味深いことに、ペプチド46もまた、Balb/cマウスにおけるHSV-1由来ICP27について先に報告されているエピトープ(Banksら, J. Virol. 67, 613-616, 1993)に対応する領域を含有する。HSV-1とHSV-2のICP27配列の比較から、この領域は単一のアミノ酸のみが異なることが示された。すなわち、HSV-2 ICP27のアラニン(A)残基(LYRTFAANPRA、配列番号69)がHSV-1のグリシン(G)(LYRTFAGNPRA、配列番号70)で置換されている。しかしながら、この領域は、ペプチド45が極めて強い応答を刺激するにも関わらず、このペプチドには存在していない。
【０４４４】
IFN-γ ELISPOTアッセイにおいて、ペプチド46の2つの潜在的エピトープの相対的重要性を判定するため、ペプチドLYRTFAANPRAとHGPSLYRTFを合成して試験した。感染したマウスから単離した脾臓細胞はHGPSLYRTFペプチドに対して強く応答したが、LYRTFAANPRA配列に対しては、バックグラウンドを超える応答は検出されなかった。IFN-γ ELISPOTアッセイの前に磁性ビーズを用いてT細胞集団を枯渇させ、強いCD8 + ICP27応答を生じさせた。このデータは、Balb/cマウス中で、配列HGPSLYRTFに特異的な、HSV-2 ICP27タンパク質に対する強いCD8応答が生じることを示す。
【０４４５】
In vitroでのICP27ワクチンに対する免疫応答
HSV-2のMS株由来のICP27配列を用いて、DNAワクチン「pICP27」を作製した(図27)。配列決定した構築物と、公開されているHG52 ICP27遺伝子配列との差は2ヌクレオチドのみであった(図28)。ヌクレオチド57位に、サイレント変化と考えられるGからAへの変化があり、484位におけるAからCへの変化は、HG52株のリシンをMS型のアスパラギンへと変化させたと考えられた。したがって、上記DNAワクチンから発現されるMS株ICP27タンパク質は、推定CD8エピトープ領域に差異がなく、該タンパク質のHG52株型とほぼ同一であったと考えられる。
【０４４６】
pICP27 DNAワクチンは、Balb/cマウスとC57Bl/6マウスをPMEDにより免疫するために使用した。IFN-γ ELISPOTアッセイ中で、脾細胞とリンパ節細胞を、図29に記載されるペプチドプールのパネルに対して試験した。
【０４４７】
DNA免疫したマウスに見られた、ICP27ペプチドに対する陽性応答のパターンは、感染したマウスに見られた応答パターンと同じであった(データ示さず)。
【０４４８】
ICP27ワクチンに対するin vivo応答
pICP27DNAワクチン接種により生じた免疫応答のin vivo活性を、Balb/cマウスの予防的経鼻感染モデルで研究した。12週齢Balb/cマウスにおける、様々な投与量のHSV-2 MS株を用いた感染は、LD50の約3 x 104 PFUを確立した(データ示さず)。DNA防御実験において、50 LD50のウイルス曝露量を用いた。なぜなら、この用量は未処理の動物において常に100%の死亡率をもたらしたからである。
【０４４９】
一連の実験は、pICP27 DNAのみを用いたワクチン接種(初期免疫及び追加免疫)では、マウスを防御する能力が限られていることを示した。そこで、防御を改善するために、コレラ毒素(CT)又は大腸菌（E. coli）由来易熱性毒素(LT)をコードするDEIベクターを、ICP27 DNAワクチンと共送達した。A及びB毒素サブユニットを、2つの毒素各々について同一のプラスミドから発現させた。ICP27DNAワクチンを単独で、又はCT若しくはLTのDEIベクターを9：1の比で添加して(0.45 μg抗原DNA + 0.05 μg DEIベクターDNA)使用しマウスを免疫した。ICP27特異的サイトカイン産生について研究するため1つのワクチン接種グループ当たり計16動物を使用し、半数はウイルスに曝露し、他の半数は曝露時に屠殺した。
【０４５０】
この研究の結果を図31に示す。この結果は、ICP27 + CT製剤を用いたワクチン接種は部分的防御をもたらし、ICP27のみの製剤は防御をもたらさないが、ICP27 + LT製剤については100%の防御が認められたことをそれぞれ示している(図31A)。これらの結果は、DEIベクターとICP27ベクターとの共送達が防御を強化し、DNAワクチン接種における免疫賦活剤として、CTに対するLTの優位性を強めることを裏付ける。CBAキットを用いた、CD8エピトープペプチドによるin vitro刺激後のサイトカイン産生の定量は、曝露後の生存率と、INF-γ(図31B)及びTNF-α産生(図31C)の両方のレベルとの間の優れた相関関係を示した。
【０４５１】
サイトカインとT細胞集団の役割
曝露した動物の防御におけるIFN-γ又はTNF-αのICP27-特異的産生を評価した。pICP27 + pPJV2012(LT)-ワクチンを接種した動物をINF-γ-及び/又はTNF-α-特異的モノクローナル抗体で曝露の前後数日間処理し、これらのサイトカインをin vivoで中和した。罹患率データを図32に示す。先のとおり、2つのICP27 + LT DEIワクチンの接種を受けた動物は、曝露から完全に防御され、軽度の一時的な罹患率(4動物のうち、1動物において毛が逆立っていた)しか示さなかったが、100%の未処理マウス又はpICP27ベクターのみで免疫したマウスは、曝露により罹患した。ICP27 + LT DEI製剤で免疫し、その後抗TNF-αで処理したグループにおいて、経鼻曝露接種の直後に、麻酔の合併症により1個体の死亡が観察された。重要なことに、残りの3マウスは一時的な毛の逆立ちしか示さず、完全に回復し、TNF-α産生が防御に大きく寄与した可能性が低いことを示していた。対照的に、曝露時に抗IFN-γ又は抗IFN-γ + 抗TNF-αの接種を受け、ICP27 + LT DEIで免疫した2つのグループのマウスは強く罹患し、8動物のうち7動物が死亡し、このことは防御の必須のメディエーターとしてのIFN-γの重要性を明らかに示していた。
【０４５２】
防御におけるCD48細胞集団とCD8細胞集団の役割を調べるため、CD4又はCD8に対する抗体を使用し、感染曝露前にこれらの細胞集団を枯渇させた(図33)。死亡率について、20日以上マウスを追跡調査したとき、興味深いパターンが出現した。予想どおり、pICP27を空ベクターと共に与えられたマウスは、感染から有意に防御されなかった。pICP27 + LT DEIワクチン接種は100%の生存率を与えたが、同様に免疫したマウスからCD4細胞とCD8細胞の両方を除去すると、ワクチン接種の防御効力は抑制され、マウスを、未処理のマウスとほぼ同じレベルで易感染性とした。pICP27 + LT DEIワクチンで免疫したマウスでは、感染前のCD8細胞集団の枯渇によりマウスが感染し、感染又は脳炎からの防御におけるこれらの細胞の重要な役割を示していた。pICP27 + LT DEIのワクチンを接種したマウスでは、CD4細胞集団の枯渇は、これらのマウスについても発病し死亡する前の9日の遅延(未処理のマウスと比較して)をもたらし、長期生存率に関するCD4 T細胞の役割を示唆していた。
【実施例２３】
【０４５３】
マウスにおけるインフルエンザH5N1 DNAワクチンの免疫原性
材料と方法
インフルエンザA/Vietnam/1194/2004[H5N1]ウイルスのHAをコードするDNAプラスミドpPML7789(実施例21、図20)を金粒子上に沈着させ、PowderMed社の独占的送達技術を用いて粒子媒介表皮送達(PMED)によりマウスに送達した。
【０４５４】
送達は、アジュバントとしての大腸菌(E. coli)易熱性毒素サブユニットA及びBをコードする追加プラスミドpPJV2012(実施例19、図22)と共に、又はこれを伴わずに達成した。pPJV2012が存在する場合は、この追加プラスミドとpPML7789プラスミドとを同一の金粒子上に沈着させた。このことは、最初にpPJV2012とpPML7789とを液状で、1：9の重量比で前もって混合し、その後プラスミドを金粒子の集団上に共送達することにより達成した。陰性対照として、表面にプラスミドを沈着させていない金粒子をPMEDにより送達した。この実験に用いたマウスは下記のとおり：
株：Balb/Cマウス
数：36匹
性別：雌
体重の範囲：15.0-19.6 g(第1手順の日)
齢：42-49日(到着日)
食餌：RM1ペレット
供給者：Charles River UK Ltd
マウスを以下の表11に示す6つのグループに分けた。マウス上で実施した手順、及びこの手順を行った日を、以下の表12に示す。標準方法に従い、血清上でHAIアッセイを行った。
【表１１】
2008528020.tif 000013
【表１２】
2008528020.tif 000014
【０４５５】
結果
NIBRG-14[H5N1]ウイルスに対するHAI力価を測定した
全ての対照が許容限度内におさまるように注意した。陰性対照項目(NIBRG-14[H5N1]ウイルス)は全てのプレート上で陰性であった。陽性対照項目(シチメンチョウ赤血球細胞)は、全てのプレート上で陽性であった。幾何平均が28、40、56又は80HAIU(40 HAIU +/- 2倍の許容限度内)となるまで第2の陽性対照項目(インフルエンザA/Chicken/Scotland/59[H5N1]ウイルスに対する抗体を含む血清）を全てのプレート上に流した。
【０４５６】
0日目、14日目及び21日目のサンプルは全て10HAIU未満(検出限度未満)であったが、例外として、ID：1074(グループ6)の21日目は採血することができず、ID：1059(グループ4)の21日目は、アッセイを実施するのに十分な血清が入手されていなかった。
【０４５７】
35日目の採血については、採血することができなかったID：1074(グループ6)を除いて、各グループについてのグループ算術平均、中央値及び標準偏差と共に各サンプルの幾何平均力価を計算した。これらを、以下の表13に示す。
【表１３】
2008528020.tif 000015
【０４５８】
この結果は、pPML7789プラスミドがマウスにおいて免疫原性であり、この免疫原性がpPJV2012の介在によって強化されることを示す。
【０４５９】
このように、新規核酸構築物、多様な構築物を含んでなる組成物、並びにこれらの構築物を用いた核酸免疫法について述べてきた。本発明の好ましい実施形態を少し詳しく記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、変更を行うことができることが理解されよう。
【０４６０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、hCMV前初期プロモーター配列である（GenBank #M60321, X17403）。 
配列番号２は、hCMV主要前初期遺伝子のエクソン１及び２由来の配列である（GenBank #M60321, X17403）。 
配列番号３は、ラット インスリン イントロンA配列である（GenBank #J00748）。 
配列番号４は、本発明によるキメラプロモーターの配列である。 
配列番号５は、HBV preS2抗原5’UTR配列に由来するリーダー配列である（GenBank #M54923）。 
配列番号６は、HSV 2gD型 5’UTR配列に由来するリーダー配列である（GenBank #Z86099）。 
配列番号７は、HBV e抗原5’UTR配列に由来するリーダー配列である（GenBank #M54923）。 
配列番号８は、HBVenh 3’UTR配列である（GenBank #AF143308）。 
配列番号９は、サル前初期遺伝子3’UTR配列である（GenBank #M16019）。 
配列番号１０は、ウサギβグロビン ポリA配列である（GenBank #K03256）。 
配列番号１１は、サルsCMV前初期遺伝子ポリA配列である（GenBank #M16019）。 
配列番号１２は、HSV2 gB遺伝子ポリA配列である（GenBank #Z86099）。 
配列番号１３は、HPV16初期遺伝子ポリA配列である（GenBank #K02718）。 
配列番号１４は、pPJV発現ベクターの配列である。 
配列番号１５は、PCRプライマーJF93である。 
配列番号１６は、PCRプライマーF110である。 
配列番号１７は、PCRプライマーGW1である。 
配列番号１８は、PCRプライマーJF254である。 
配列番号１９は、PCRプライマーGW150である。 
配列番号２０は、PCRプライマーJF255である。 
配列番号２１は、PCRプライマーDS1である。 
配列番号２２は、PCRプライマーDA1である。 
配列番号２３は、PCRプライマーJF301である。 
配列番号２４は、PCRプライマーJF302である。 
配列番号２５は、PCRプライマーJF84である。 
配列番号２６は、PCRプライマーJF225である。 
配列番号２７は、PCRプライマーJF335である。 
配列番号２８は、PCRプライマーJF336である。 
配列番号２９は、PCRプライマーJF357である。 
配列番号３０は、PCRプライマーJF365である。 
配列番号３１は、PCRプライマーJF393である。 
配列番号３２は、PCRプライマーJF406である。 
配列番号３３は、PCRプライマーJF256である。 
配列番号３４は、PCRプライマーJF257である。 
配列番号３５は、PCRプライマーJF320である。 
配列番号３６は、PCRプライマーJF321である。 
配列番号３７は、PCRプライマーJF386である。 
配列番号３８は、PCRプライマーFcASである。 
配列番号３９は、オリゴヌクレオチドJF354である。 
配列番号４０は、PCRプライマーJF355である。 
配列番号４１は、PCRプライマーJF356である。 
配列番号４２は、オリゴヌクレオチドJF348である。 
配列番号４３は、PCRプライマーJF349である。 
配列番号４４は、PCRプライマーJF350である。 
配列番号４５は、オリゴヌクレオチドJF351である。 
配列番号４６は、PCRプライマーJF352である。 
配列番号４７は、PCRプライマーJF353である。 
配列番号４８は、PCRプライマーJF430である。 
配列番号４９は、PCRプライマーJF442である。 
配列番号５０は、PCRプライマーJF421である。 
配列番号５１は、PCRプライマーJF444である。 
配列番号５２は、仮性狂犬病ウイルス（PRV）プロモーター配列である。 
配列番号５３は、ラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーター配列である。 
配列番号５４は、pPJV1671ベクターのヌクレオチド配列、及びコードされたH3N2 HA抗原のアミノ酸配列を提供する。
【０４６１】
配列番号５５は、pPJV1671にコードされたH3N2 HA抗原単独のアミノ酸配列を提供する。
【０４６２】
配列番号５６は、H3パナマHA抗原の野生のN末アミノ酸配列を提供する。
【０４６３】
配列番号５７は、pPJV1671にコードされたH 3パナマHA抗原のN末アミノ酸配列を提供する。
【０４６４】
配列番号５８は、配列番号５６及び５７の配列のコンセンサス配列を提供する。
【０４６５】
配列番号５９は、pPML7789ベクターのヌクレオチド配列、及びVN1194H5抗原のアミノ酸配列を提供する。
【０４６６】
配列番号６０は、VN1194H5抗原単独のアミノ酸配列を提供する。
【０４６７】
配列番号６１は、pPJV2012ベクターのヌクレオチド配列を提供する。
【０４６８】
配列番号６２は、PJV7788ベクターのヌクレオチド配列を提供する。
【０４６９】
配列番号６3及び６４は、実施例２２で使用されたHSV-2のMS株のDNAを増幅する5’及び3’プライマーである。
【０４７０】
配列番号６５は、実施例２２のpICP27のヌクレオチド配列に基づくHSV-2のMS株由来のICP27のアミノ酸配列である。
【０４７１】
配列番号６６及び６７は、実施例２２でBalb/cマウス由来の細胞により認識されるペプチド４５及び４６である。
【０４７２】
配列番号６８は、ペプチド４５及び４６に含まれる相同的な９つのアミノ酸配列である。
【０４７３】
配列番号６９及び７０は、１アミノ酸が相違するHSV-2 ICP27及びHSV-1 ICP27のアミノ酸領域である。
【図面の簡単な説明】
【０４７４】
【図１】さまざまなプラスミド発現ベクターを用いて得られたB型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）の発現レベルを示す。
【図２】SCC15細胞におけるHBsAgの発現、及びB16細胞でのβ-galの発現におけるイントロン含有の効果を示す（3回の実験の平均値）。
【図３】SCC15細胞でのβ-galの発現におけるラットインスリンイントロンA及びHBV3’UTRの効果を示す（3回の実験の平均値）。
【図４】SCC15細胞でのHSVgDの発現におけるラットインスリンイントロンA及びHBV3’UTRの効果を示す（3回の実験の平均値）。
【図５】SCC15及びB16細胞でのSEAPの発現におけるラットインスリンイントロンA及びHBV3’UTRの効果を示す（細胞株あたり3回繰り返し）。
【図６】B16細胞でのSEAP又はhFc断片の分泌を指示する、異種シグナルペプチドの能力を示す。
【図７】さまざまなプラスミド発現ベクターに含まれる、抗原をコードする核酸で免疫されたマウスの血清中に検出された抗体のレベルを示す。
【図８】pPJV発現ベクターの概略図である。
【図９】pPJV7389の概略図である。
【図１０】pPJV7400の概略図である。
【図１１】pPJV7468の概略図である。
【図１２】pPJV7563の概略図である。
【図１３】pPJV7563に関する塩基組成を示す。
【図１４】プラスミドpPJV7563及びpPJV1671の誘導体化のフローチャートを提供する。
【図１５（ａ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１５（ｂ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１５（ｃ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１５（ｄ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１５（ｅ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１５（ｆ）】pPJV1671の構築において重要なプラスミドのマップを提供する。
【図１６】pPJV1671の特徴マップ、並びに野生のH3パナマHA抗原、及びpPJV1671にコードされたH3パナマHA抗原のN末配列の配列比較を提供する。
【図１７】pPJV1671でワクチン接種したブタにおけるヘマグルチニン阻害抗体価を示す。
【図１８】ヒトに対するpPJV1671の粒子を介した上皮デリバリー後の局所的皮膚反応を示す。
【図１９】３価ワクチンを基礎とするPMEDで免疫化したブタにおけるヘマグルチニン阻害抗体価を示す。H3、H1及びBウイルスに特異的なHI力価を、２つのPMEDデバイスについて示す。
【図２０】pPML7789の概略図である。
【図２１（ａ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｂ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｃ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｄ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｅ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｆ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｇ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｈ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｉ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｊ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２１（ｋ）】pPML7789の注釈付き配列を示す。
【図２２】pPJV2012の概略図である。
【図２３】pPJV2012構築のためのフローチャートである。
【図２４（ａ）】pPJV2012の注釈付き配列を提供する。
【図２４（ｂ）】pPJV2012の注釈付き配列を提供する。
【図２４（ｃ）】pPJV2012の注釈付き配列を提供する。
【図２４（ｄ）】pPJV2012の注釈付き配列を提供する。
【図２４（ｅ）】pPJV2012の注釈付き配列を提供する。
【図２５】ベクターpPJV7788の概略図である。
【図２６】制限部位を示したベクターpPJV7788の概略図である。
【図２７】pICP27の概略図である。
【図２８】pICP27のヌクレオチド配列に基づくHSV-2のMS株由来のICP27のアミノ酸配列（配列番号６５）である。HSV-2のMS株由来の公表されているICP27配列（アスパラギン＝N）とHG52株（リジン）間の１アミノ酸の相違を太字で示す。HSV-2のMS株において推定CD８エピトープとして同定された配列を下線で示す。
【図２９】Balb/cマウスにおける優性ICP27エピトープの同定を示す。A：HSV-2感染したBalb/cマウス又はC57BL/6マウス由来の膵臓（S）及びリンパ節（Ｎ）細胞（それぞれBS及びBN、CS及びCN）をIFN-γ ELISPOT活性について、実施例２２で記載したさまざまなペプチドプール（C1〜C12、R1〜R6）を用いて解析した。5×105細胞を各ウェル内にプレーティングし、結果をネガティブ（空四角）、弱（＜25 ELISPOT/ウェル：灰四角）、強（＞25 ELISPOT/ウェル：黒四角）で表にした。B： Balb/cマウス由来の細胞によって認識される２つのペプチドの配列（配列番号６６及び６７）。これまでに同定されたHSV-1エピトープ(Banksら, J. Virol. 67, 613-616, 1993)に対応する潜在的なHSV-2 Ddエピトープ（太字）及び領域（下線）を強調している。
【図３０】IFN-γ ELISPOTアッセイを用いたICP27に応答するBalb/cの特徴を報告している。感染したBalb/cマウス由来の膵臓細胞を、IFN-γ ELISPOT活性について、ICP27(プール)由来の全ペプチド、又はHGPSLYRTF (P1、配列番号６８)、及びLYRTFAANPRA (P2、配列番号６９)の個々のペプチドで構成されたペプチドプールを用いて解析した。5×105細胞を各ウェルにプレーティングし、結果をELISPOT数／ウェルで表した。さらに、膵臓細胞の分割サンプルを磁気ビーズで処理し、実施例２２に記載したように、CD8＋細胞のサンプルを枯渇させた。元のサンプル（＋CD8）及び枯渇サンプル（−CD8）をIFN-γ ELISPOT活性について、ICP27(プール)由来の全ペプチドで構成されたペプチドプールを用いて解析した。
【図３１】HSV-2曝露予防とICP27特異的サイトカイン産生との間の相関関係を示す。
【０４７５】
16匹のマウス群に対し、CT DEIベクターpPJV2013(二重A+Bサブユニット)、又はサブユニットLT DEIベクターpPJV2012 (二重A+B)を付加、及び非付加したpICP27 DNAワクチンからなるPMED DNAの第一予防接種、及び追加予防接種を行った。pICP27対DEIベクター比は、９：１であった。パネルA：曝露後の生存データ。各群の半数のマウスを50 LD50のHSV-2で第２予防接種した２週間後に曝露した。パネルB及びC：それぞれ、各群におけるICP2特異的IFN-γ、及びTFN-αの産生を示す。生き残ったマウスを同時期に屠殺し、サイトカインビーズアレイキットを用いてICP27特異的サイトカインを測定するため脾細胞を回収した。
【図３２】HSV-2致死的曝露に対する予防におけるIFN-γ、及びTNF-αの役割−罹患率評価を示している。４匹のマウス群に、pICP27 PMED DNAワクチンを用いて、pPJV2012二重A+B LT DEIベクター付加(４群)、又は非付加(１群)で第一予防接種、及び追加予防接種を行った。pICP27対DEIベクター比は９：１であった。２週間後、50 LD50のHSV-2をマウスの鼻腔内に曝露した。T細胞枯渇については、マウスに対して200μgのIFN-γ、及び／又はTNF-αに特異的なモノクローナル抗体を含む腹腔内注射を、実施例２２で記載したようなウイルス曝露に対して−２、０、２、４、６、及び８日目に行った。マウスを死亡率（生存％）と罹患率についてモニターし、以下のスケジュールにより０〜４の尺度でスコアした。すなわち、４、健康；３、毛を逆立てる、くしゃみする；２、ただれ目、又は臀部のただれ、動きの減退；１、背中を丸める、僅かな動き；０、死亡。
【図３３】HSV-2致死的曝露からの防御におけるT細胞集団の役割を示している。４匹のマウスからなる５つの群に、pICP27 PMED DNAワクチンを用いて、pPJV2012二重A+B LT DEIベクターあり(+LT、４群)、又はなし(−LT、１群)で第一予防接種、及び追加予防接種を行った。pICP27対DEIベクター比は９：１であった。２週間後、50 LD50のHSV-2でマウスの鼻腔内に曝露した。ICP27+LT DEIで予防接種したマウス３群に、ウイルス曝露に対して−２、及び０日目に抗CD4及び／又は抗CD8特異的モノクローナル抗体90μgで腹腔内注射して処理した。pICP27単独群（−LTで示す）中の総DNAをpICP27+LT群と等量に維持するため、空のベクターをpICP27単独群に加えた。
【図１】
2008528020.tif 000016
【図２】
2008528020.tif 000017
【図３】
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【図４】
2008528020.tif 000019
【図５】
2008528020.tif 000020
【図６】
2008528020.tif 000021
【図７】
2008528020.tif 000022
【図８】
2008528020.tif 000023
【図９】
2008528020.tif 000024
【図１０】
2008528020.tif 000025
【図１１】
2008528020.tif 000026
【図１２】
2008528020.tif 000027
【図１３】
2008528020.tif 000028
【図１４】
2008528020.tif 000029
【図１５（ａ）】
2008528020.tif 000030
【図１５（ｂ）】
2008528020.tif 000031
【図１５（ｃ）】
2008528020.tif 000032
【図１５（ｄ）】
2008528020.tif 000033
【図１５（ｅ）】
2008528020.tif 000034
【図１５（ｆ）】
2008528020.tif 000035
【図１６】
2008528020.tif 000036
【図１７】
2008528020.tif 000037
【図１８】
2008528020.tif 000038
【図１９】
2008528020.tif 000039
【図２０】
2008528020.tif 000040
【図２１（ａ）】
2008528020.tif 000041
【図２１（ｂ）】
2008528020.tif 000042
【図２１（ｃ）】
2008528020.tif 000043
【図２１（ｄ）】
2008528020.tif 000044
【図２１（ｅ）】
2008528020.tif 000045
【図２１（ｆ）】
2008528020.tif 000046
【図２１（ｇ）】
2008528020.tif 000047
【図２１（ｈ）】
2008528020.tif 000048
【図２１（ｉ）】
2008528020.tif 000049
【図２１（ｊ）】
2008528020.tif 000050
【図２１（ｋ）】
2008528020.tif 000051
【図２２】
2008528020.tif 000052
【図２３】
2008528020.tif 000053
【図２４（ａ）】
2008528020.tif 000054
【図２４（ｂ）】
2008528020.tif 000055
【図２４（ｃ）】
2008528020.tif 000056
【図２４（ｄ）】
2008528020.tif 000057
【図２４（ｅ）】
2008528020.tif 000058
【図２５】
2008528020.tif 000059
【図２６】
2008528020.tif 000060
【図２７】
2008528020.tif 000061
【図２８】
2008528020.tif 000062
【図２９】
2008528020.tif 000063
【図３０】
2008528020.tif 000064
【図３１】
2008528020.tif 000065
【図３２】
2008528020.tif 000066
【図３３】
2008528020.tif 000067
【配列表】
2008528020000001.app
【国際調査報告】
2008528020.tif 000068
2008528020.tif 000069
2008528020.tif 000070
2008528020.tif 000071
2008528020.tif 000072
2008528020.tif 000073
2008528020.tif 000074