(57)【要約】植物における雄性稔性を仲介するヌクレオチド配列が、ＤＮＡ分子配列およびアミノ酸配列と共に記載される。プロモーター配列およびその必須領域も特定される。このヌクレオチド配列は、植物における雄性稔性の仲介に有用である。そのような一方法では、雄性不稔性誘発対立遺伝子のホモの劣性状態が、該ホモ状態を逆転するヌクレオチド配列を有する、回復性トランスジーン構築体を含む第２植物との交雑後においても維持される。この回復性配列は、雄性配偶子の形成または機能を抑制する産物をコードするヘミ接合体配列と連結する。維持植物は、回復性トランスジーン構築体を含まない、生存可能な雄性配偶子のみを生産する。維持植物の増加も、自家受精、および、構築体を含む種子または植物の選択によって実現される。
2008543341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雄性不稔性植物のホモ接合体劣性状態を維持する方法であって、
（ａ）Ｍｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含み、雄性不稔性である第１植物を準備すること；
（ｂ）Ｍｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第２植物に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）該第１植物において発現されると雄性稔性を回復する、Ｍｓ２６ヌクレオチド配列を含む第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）Ｍｓ２６の劣性対立遺伝子を含み、かつ該構築体を含まない該第２植物において生存可能な雄性配偶子が生産されるように、発現されると、該第２植物における生存可能な雄性配偶子の機能または形成を抑制する、第２ヌクレオチド配列
を含むことと；
（ｃ）該第２植物の雄性配偶子によって該第１植物を受精させ、該第１植物の該ホモ接合体劣性状態を維持する子孫を生産することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第３ヌクレオチド配列が、誘発性の物質または状態の存在下においてのみ機能する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第３ヌクレオチド配列が、５１２６、Ｍｓ２６、およびＭｓ４５の雄性組織調節配列から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２ヌクレオチド配列が、ＤＡＭメチラーゼ遺伝子、Ｚｅａ  ｍａｙｓアルファアミラーゼ遺伝子、および細胞毒素コード遺伝子のヌクレオチド配列から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２配列が、発現を雄性配偶子に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第４ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子の調節領域から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
第５ヌクレオチド配列をさらに含み、該第５ヌクレオチド配列の発現は、前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第５ヌクレオチド配列が、赤色蛍光遺伝子、シアン蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、アントシアニンｐ１遺伝子、およびフォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第５ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子から成る群から選択される調節領域に作動可能に連結されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記構築体を有する植物を特定することによって前記第２植物を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第１植物を第２植物に対し交雑する際、該第１植物のホモ接合体劣性状態を維持する方法であって、
（ａ）発現が雄性不稔性をもたらすＭｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第１植物を準備することと；
（ｂ）該Ｍｓ２６遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第二植物に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）該第１植物において発現されると雄性稔性を回復する、Ｍｓ２６ヌクレオチド配列を含む第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ＤＡＭメチラーゼ遺伝子、Ｚｅａ  ｍａｙｓアルファアミラーゼ遺伝子、および細胞毒素コード遺伝子の配列から成る群から選択される第２ヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）該第１ヌクレオチド配列に作動可能に連結されて、雄性植物組織に発現を優先的に導き、５１２６、Ｍｓ２６、またはＭｓ４５の雄性組織調節領域から成る群から選択される第３ヌクレオチド配列；
（ｉｖ）劣性対立遺伝子を含み、かつ該構築体を含まない第２植物において生存可能な配偶子が生産されるように、発現を植物雄性配偶子に指向させる第２ヌクレオチド配列と作動可能に連結されている第４ヌクレオチド配列
を含むことと；
（ｃ）該第２植物の雄性配偶子によって該第１植物を受精させ、雄性不稔性でありかつ該第１植物の前記ホモ接合体劣性状態を維持する子孫を生産することと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記構築体を含む植物選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第５ヌクレオチド配列が、赤色蛍光遺伝子、シアン蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、アントシアニンｐ１遺伝子、およびフォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子から成る群から選択される調節領域に作動可能に連結されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第５ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子から成る群から選択される調節領域に作動可能に連結されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、４、または１８のアミノ酸配列のいずれか一つをコードする配列；
ｂ）配列番号１、３、７、または１７のうちのいずれかの配列；
ｃ）該配列のいずれかに対し少なくとも９０％の同一性を有する配列；
ｄ）６５℃における０．１ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの洗浄の非常にストリンジェントな条件下で該配列のいずれかにハイブリダイズする配列；および、
ｅ）植物の雄性稔性にとって重要である機能的配列である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３ヌクレオチド配列が、誘発性の物質または状態の存在下においてのみ機能する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第３ヌクレオチド配列が、５１２６、Ｍｓ２６、およびＭｓ４５の雄性組織調節配列から成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２ヌクレオチド配列が、ＤＡＭメチラーゼ遺伝子、Ｚｅａ  ｍａｙｓアルファアミラーゼ遺伝子、および細胞毒素コード遺伝子のヌクレオチド配列から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２ヌクレオチド配列が、植物の雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第４ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子の調節領域から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記第５ヌクレオチド配列が、赤色蛍光遺伝子、シアン蛍光タンパク質遺伝子、黄色蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、アントシアニンｐ１遺伝子、およびフォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼコード遺伝子から成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第５ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子から成る群から選択される調節領域に作動可能に連結されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記構築体を有する植物を特定することによって前記第２植物を選択することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
雌性および雄性配偶子を有する植物から種子を生産する方法であって、
（ａ）Ｍｓ２６のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む雄性不稔性植物の中に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）Ｍｓ２６ヌクレオチド配列を含む第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）該構築体を含まない該植物において生存可能な雄性配偶子が生産されるように、発現されると該植物における雄性配偶子の機能または形成を抑制する第２ヌクレオチド配列を含むことと；
（ｂ）該植物を自家受粉することと；
（ｃ）該構築体を含む種子を生産することと、
を含む、方法。
【請求項３０】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記構築体を含む植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記構築体を有する植物を特定することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、４、または１８のアミノ酸配列のいずれかをコードする配列；
ｂ）配列番号１、３、７、または１７のうちのいずれかの配列；
ｃ）該配列のいずれかに対し少なくとも９０％の同一性を有する配列；
ｄ）６５℃における０．１ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの洗浄の非常にストリンジェントな条件下で該配列のいずれかにハイブリダイズする配列；および、
ｅ）植物の雄性稔性にとって重要である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
植物のホモ接合体劣性状態を維持する方法であって、
（ａ）植物形質の表現型発現に必要な遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第１植物を準備することと；
（ｂ）植物形質の表現型発現に必要な遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第２植物の中に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）該第１植物において発現された場合、ホモ接合体劣性の植物形質を機能的に相補する第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）劣性対立遺伝子を含むみ、かつ構築体を含まない第２植物において雄性配偶子が生産されるように、発現されると該第２植物における雄性配偶子の機能または形成を抑制する第２ヌクレオチド配列を含むことと；
（ｃ）該第１植物を該第２植物の雄性配偶子によって受精させ、該第１植物のホモ接合体劣性状態を維持する子孫を生産することと、
を含む、方法。
【請求項３６】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項３３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記構築体を有する植物を特定することによって前記第２植物を選択することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記形質が雄性稔性である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
雌性および雄性配偶子を有する植物から種子を生産する方法であって、
（ａ）植物形質の表現型発現のために必要な遺伝子についてホモ接合体劣性対立遺伝子を含む第１植物の中に、ヘミ接合性状態の構築体を導入することであって、該構築体は、
（ｉ）雄性稔性にとって必要な遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を有し、雄性不稔性である第２植物において発現されると雄性稔性を回復する、第１ヌクレオチド配列；
（ｉｉ）該第１ヌクレオチド配列を有さない生存可能な雄性配偶子が生産されるように、該植物における雄性配偶子の機能または形成を抑制する、第１ヌクレオチドに作動可能に連結されている第２ヌクレオチド配列を含むことと；
（ｂ）該植物を自家受粉することと；
（ｃ）該構築体を含む種子を生産することと、
を含む、方法。
【請求項４４】
前記第１ヌクレオチド配列が、雄性植物細胞に発現を優先的に指向させる第３ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記構築体を有する植物を特定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記形質が雄性稔性である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記第３ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号６；
（ｃ）配列番号７の塩基１から１０８８；
（ｄ）配列番号７の塩基８３０から９６２；
（ｅ）配列番号７の塩基８３０から９１４；
（ｆ）配列番号７の塩基９１７から９６２；
（ｇ）配列番号７の塩基８７５から９５４；
（ｈ）配列番号７の塩基９３５から９５４；
（ｉ）配列番号７の塩基８７５から９２４；
（ｊ）配列番号１９；
（ｋ）配列番号２０；および、
（ｌ）連結された配列の雄性組織発現にとって必須の機能的断片である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５０】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２ヌクレオチド配列が、ＤＡＭメチラーゼ遺伝子、Ｚｅａ  ｍａｙｓアルファアミラーゼ遺伝子、および細胞毒素コード遺伝子のヌクレオチド配列から成る群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第２配列が、植物雄性配偶子に対し発現を指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第４ヌクレオチド配列が、ポリガラクツロナーゼ４７遺伝子、Ｚｍ１３遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、カルモジュリン結合タンパク質遺伝子、アクチン脱重合因子遺伝子、プロルフィリン遺伝子、および硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子の調節領域から成る群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記構築体を有する植物を特定することによって前記第２植物を選択することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
生存可能な配偶子が、前記構築体を含まない第１植物において生産されるように、前記第３ヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号５；
（ｂ）配列番号６；
（ｃ）配列番号７の塩基１−１０８８；
（ｄ）配列番号７の塩基８３０から９６２；
（ｅ）配列番号７の塩基８３０から９１４；
（ｆ）配列番号７の塩基９１７から９６２；
（ｇ）配列番号７の塩基８７５から９５４；
（ｈ）配列番号７の塩基９３５から９５４；
（ｉ）配列番号７の塩基８７５から９２４；
（ｊ）配列番号１９；
（ｋ）配列番号２０；および、
（ｌ）連結された配列の雄性組織発現にとって必須の機能的断片である、該配列のうちのいずれかの配列の断片、
から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２ヌクレオチド配列が、雄性配偶子に発現を優先的に指向させる第４ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記構築体を有する植物細胞の選択のために使用することが可能な産物をコードする第５ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記構築体を有する植物を特定することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
Ｍｓ２６のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む雄性不稔性植物において雄性稔性を回復する方法であって、該植物に、ホモ接合体劣性状態の機能的相補体であるＭｓ２６ヌクレオチド配列を導入することを含む、方法。
【請求項６１】
雄性稔性にとって重要である遺伝子のホモ接合体劣性対立遺伝子を含む雄性不稔性植物において雄性稔性を回復する方法であって、該植物に、ホモ接合体劣性状態の機能的相補体であるヌクレオチド配列を導入することを含み、該ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、４、または１８のアミノ酸配列のいずれかをコードする配列；
ｂ）配列番号１、３、７、または１７のうちのいずれかの配列；
ｃ）該配列のいずれか一つに対し少なくとも９０％の同一性を有する配列；
ｄ）６５℃における０．１ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの洗浄の非常にストリンジェントな条件下で該配列のいずれかにハイブリダイズする配列；および、
ｅ）該配列のうちのいずれかの配列の断片であって、その機能的断片が、植物の雄性稔性にとって重要な配列である、断片、
から成る群から選択される、方法。
【請求項６２】
配列番号２６を含む、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項６３】
配列番号２６を含む、発現カセット。
【請求項６４】
配列番号２６を含む異種ヌクレオチド配列を含む、植物細胞。
【請求項６５】
配列番号２６を含む異種ヌクレオチド配列を含む、植物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
交雑植物育種法の発達は、生産作物の品質と量においてこれまで相当の進歩を可能としてきた。収率の増加および、所望の特徴、例えば、病気および害虫に対する抵抗性、熱および日照りに対する耐性などの特徴の組み合わせなどは全て、植物組成の変動と共に、交雑法によって可能とされる。これらの手法は、多くの場合、雄性親株が、雌性親株に花粉を供与して雑種を生産する供給過程に大きく依存する。
【０００２】
畑作物は、植物の受粉法を利用する技術を通じて育種される。植物は、１花から出た花粉が、同じ花、または同じ植物の別花に転送された場合、自家受粉する。植物は、花粉が別の植物の１花から出た場合、他家受粉する。
【０００３】
Ｂｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）の場合、植物は通常自家不稔性であり、他家受粉を通じてのみ受精される。自家稔性の植物種、例えば、大豆および綿では、雄性および雌性植物が解剖学的に接触している。自然な受粉の際は、ある１花の雄性生殖器官が、同じ花の雌性生殖器官に受粉させる。
【０００４】
トウモロコシ植物（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）は、自家受粉、および他家受粉のいずれの技術でも育種が可能であるという点で独特の位置を占める。トウモロコシは、同じ植物において花穂に配される雄花と、雌穂に配される雌花を有する。トウモロコシでは、自然の受粉は、発生したばかりの雌穂の頂上から突出する細毛に向かって、風が花穂から花粉を飛ばす時に起こる。
【０００５】
植物において稔性を調節する信頼度の高い方法が得られるならば、植物育種改良の機会が得られることになる。このことは、ある種の雄性不稔性に依存しながら、同時に、雌性不稔性があると生産コストの低下をもたらす可能性のあるトウモロコシ雑種の開発の場合特にそうである。
【０００６】
トウモロコシ雑種の開発では、ホモの近交配系、それらの系統同士の交雑、および交雑植物の評価が要求される。血統育種および反復選択は、集団から近交配系を育成するために用いられる育種法のうちの二法である。育種プログラムは、二つ以上の近交配系、または各種の広範な供給源から所望の特質を組み合わせて育種プールとし、このプールの中から、新規近交配系が、自家受粉および所望の表現型の選択によって育成される。トウモロコシ雑種は、このような二つの近交配系であって、それぞれが、他方の持たない一つ以上の望ましい特徴を持ち、他方を補足する二つの近交配系の交雑物である。この新規近交配系が、他の近交配系と交雑され、この交雑から得られる雑種は、どちらが商品としての価値を持つ可能性があるかを決めるために評価される。第１世代の雑種子孫は、Ｆ１と表示される。雑種育成の場合には、Ｆ１雑種植物のみが求められる。Ｆ１雑種は、その近交配系の親よりも生命力が旺盛である。この雑種の旺盛な生命力、すなわち雑種強勢は、多くの態様として、例えば、植物成長の増大および収率の増加を含む態様として現れることがある。
【０００７】
雑種トウモロコシの種子は、手作業による脱花穂を含む雄性不稔システムによって生産することが可能である。雑種種子を生産するためには、雄性花穂を、成長する雌性近交系の親から取り除く。このために、この雌性近交系の親は、雄性近交系親とは様々な互い違いの畝パターンに植えつけられる。したがって、外来のトウモロコシ花粉から十分に隔離されるので、雌性近交系の雌穂は、雄性近交系からの花粉によってのみ受粉される。したがって、得られた種子は、雑種（Ｆ１）であり、雑種植物を形成することになる。
【０００８】
植物育成時の環境変動が、雌親の花穂の手作業による除去が完了した後、植物の花穂発生をもたらすことがある。あるいは、花穂摘出作業者が、雌性近交系植物の花穂を完全には除去しなかった可能性もある。いずれにしろ、結果として、この雌性植物が花粉を無事放出し、いくつかの雌性植物が自家受粉することになる。これによって、正常に生産された雑種種子と共に、雌性近交系の種子が収穫されることになる。雌性近交系種子は、Ｆ１種子ほど生産的ではない。さらに、雌性近交系種子の存在は、雑種を生産する会社にとって、生殖質安全性リスクを負わせる可能性がある。
【０００９】
別のやり方として、雌性近交系について、機械によって機械的に花穂摘出することも可能である。機械的花穂摘出も、手作業による花穂摘出と同程度の信頼性を持つが、より高速で、コストが低い。しかしながら、多くの花穂摘出機は、手作業による花穂摘出よりも植物に対し多くの損傷を与える。したがって、今のところ、どの形態の花穂摘出も完全に満足すべきものではなく、雑種種子の生産において、生産コストをさらに下げ、雌親の自家受粉を排除する代替法が依然として求められている。
【００１０】
遺伝的雄性不稔性に関する高信頼度のシステムが得られれば有利であると考えられる。面倒な、花穂摘出工程は、ある種の遺伝型では、細胞原形質雄性不稔性（ＣＭＳ）近交系を用いることによって回避することが可能である。稔性回復遺伝子が無い場合、ＣＭＳ近交系の植物は、核ゲノムの場合とは反対に、細胞質ゲノムに由来する因子のために雄性不稔性となる。したがって、この特徴は、トウモロコシ植物では、もっぱら雌親を通じて遺伝される。なぜなら、雌のみが、受精種子に細胞質を供給するからである。ＣＭＳ植物は、雄性不稔ではない他の近交系からの花粉によって受精される。第２近交系由来の花粉は、雑種植物を雄性稔性とする遺伝子を供給する可能性も、供給しない可能性も有する。雑種植物が成長するとき、十分な花粉負荷が利用可能であり、かつ、細胞原形質の多様性を確保するためには、通常、脱花穂された正常トウモロコシの種子と、同じ雑種のＣＭＳ生産種子を混ぜ合わせなければならない。
【００１１】
ＣＭＳには他にも欠点がある。一つは、ＣＭＳの特定の変種は、ある種の作物病に対する感受性と関連することが歴史的に観察されることである。この問題は、雑種トウモロコシの生産におけるＣＭＳ変種の広範な使用をためらわせ、トウモロコシ全体においてＣＭＳの使用に対し否定的な影響を及ぼしている。
【００１２】
遺伝的不稔性の一型が、Ｂｒａｒらに付与された特許文献１および特許文献２に開示される。しかしながら、この形態の遺伝的雄性不稔性は、ゲノム内の別々の位置において複数の突然変異遺伝子の維持を必要とし、かつ、遺伝子を追跡し、システムを好適に利用するためには複雑なマーカーシステムを必要とする。Ｐａｔｔｅｒｓｏｎも、染色体転座の遺伝子システムを記載する。これも効果的ではあるが、複雑である。（特許文献３および特許文献４を参照されたい）。
【００１３】
これらの欠点を改善するために他にも多くの試みが為されている。例えば、Ｆａｂｉｊａｎｓｋｉらは、植物において雄性不稔性をもたらす方法をいくつか開発した（欧州特許８９／３０１０１５３．８公開第３２９，３０８号、および特許文献５で、特許文献６を参照されたい）。一方法は、雄性組織の特定のプロモーターと関連する細胞傷害性物質をコードする遺伝子を植物の中に輸送することを含む。別の方法は、稔性に必須の遺伝子が指定され、該遺伝子に対するアンチセンスが植物に挿入される、アンチセンスシステムを含む。Ｍａｒｉａｎｉらも、いくつかの細胞傷害性アンチセンスシステムを示す。特許文献７を参照されたい。さらに別のシステムでは、雄性稔性に必須の別の遺伝子の発現を抑制する「リプレッサー」遺伝子を用いる。特許文献８として公刊された国際出願ＰＣＴ／英国９０／００１０２。
【００１４】
このシステムのさらに別の改良例が、特許文献９に記載されるものである。この特許では、雄性稔性に必須で、植物に生得的に備わる遺伝子をサイレンシングし、その遺伝子の発現を調節する誘起性プロモーターに連結する雄性稔性に必須な遺伝子でこの生得ＤＮＡを置換することによって、調節可能な雄性稔性を付与する方法が実現される。したがって、この植物は、構成的には不稔であるが、プロモーターが誘起された場合にのみ稔性となり、その付属の雄性稔性遺伝子が発現される。
【００１５】
いくつかの状況において、雄性不稔性の植物性質は、ホモの劣性状態の維持によって発現される。維持のためにトランスジーン回復遺伝子を使用しなければならない場合、ホモ状態を維持するのに困難が生じる。例えば、雄性稔性に必須の遺伝子における天然突然変異は、この突然変異対立遺伝子がホモ状態である場合、植物に対し雄性不稔の表現型を付与する可能性がある。この不稔性は、該遺伝子の非突然変異形を植物に導入すると回復することがある。しかしながら、この形の回復は、所望のホモの劣性状態を取り除き、完全な雄性稔性を取り戻し、純粋な雄性不稔の母系系統の維持を阻止する。この問題は、回復遺伝子を含む花粉の生産を排除し、回復遺伝子を含まない花粉のみを生産する維持植物を供給することによって回避され、子孫は、ホモの状態を維持する。一つの対処法の例が、Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、６，７４３，９６８に示される。この例では、花粉特異的プロモーターと連結する、細胞に対して致死的産物を生産する遺伝子、および回復遺伝子を含むヘミ接合構築体を有する植物が生産される。劣性ホモの雄性不稔植物と交雑された場合、子孫はホモの劣性状態を保持する。
【００１６】
上述したように、雄性不稔性システムに関して現在進行中の作業の多くにとって死命を制する局面は、男性稔性を付与する遺伝子の特定である。
【００１７】
このような遺伝子は、本明細書に記載されるものを含め、雄性稔性を調節するための様々なシステムにおいて使用することが可能である。従来、雄性稔性遺伝子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）において特定され、雄性稔性植物の生産に使用されている。非特許文献１。特許文献９は、その明細書において、一つのそのような、雄性稔性を付与する遺伝子を開示する。本発明において、本発明人らは、植物における雄性稔性に必須な、新規ＤＮＡ分子、およびそれによってコードされるアミノ酸配列を提供する。これらは、前述のものも含めた、稔性の調節が有用なシステムのいずれのものにおいても使用が可能である。
【特許文献１】米国特許第４，６５４，４６５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７２７，２１９号明細書
【特許文献３】米国特許第３，８６１，７０９号明細書
【特許文献４】米国特許第３，７１０，５１１号明細書
【特許文献５】国際公開第９０／０００３７号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９０／０８８２８号パンフレット
【特許文献７】欧州特許第８９／４０１，１９４号明細書
【特許文献８】国際公開第９０／０８８２９号パンフレット
【特許文献９】米国特許第５，４７８，３６９号明細書
【非特許文献１】Ａａｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，（１９９３年６月２４日）３６３：７１５−７１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の一つの目的は、その発現が、植物の雄性稔性に必須である核酸配列を提供することである。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、その発現が、植物の雄性稔性に必須であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、そのようなヌクレオチド配列のプロモーター、およびその必須配列を提供することである。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの目的は、植物において雄性稔性を仲介するために、そのようなＤＮＡ分子を使用する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の、これ以上の目的は、下記の説明および特許請求項において明白になる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の概要）
本発明は、雄性稔性に必須な核酸配列、特に、ＤＮＡ配列、および該ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸に関する。前記ＤＮＡのプロモーター、およびその必須配列が特定される。本発明はさらに、植物において稔性を仲介するためのそのようなＤＮＡ分子の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の開示）
参照される参考文献は、全て、参照により本明細書に含められる。
【００２５】
別様に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は全て、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を持つ。別様に言明しない限り、本発明において採用されるか、または考察される技術は、当業者には周知の標準法である。材料、方法、および実施例は、例示のためにのみ挙げるものであって、限定的ではない。
【００２６】
遺伝的雄性不稔性は、突然変異、サプレッション、または、小胞子発生、これは花粉形成の全過程に対して適用される用語であるが、の特定の工程に対する必須の遺伝子の一つに対するその他の影響によってもたらされる。これらの遺伝子は、まとめて雄性不稔性遺伝子と（あるいは、別に、雄性繁殖不能性とも）呼ばれる。遺伝子機能が不稔性を付与する全体経路には多くのステップがある。これは、トウモロコシにおける遺伝的雄性不稔性の頻度によっても十分に支持される。雄性不稔性突然変異の新規対立遺伝子が、優良近交系から、未適応の集団に亘る範囲の材料において明らかにされている。
【００２７】
特許第５，４７８，３６９号に、Ｍｓ４５雄性不稔性遺伝子を標識し、トウモロコシの染色体９においてクローンする方法が記載されている。それ以前に、クローンも配列決定もされていない、染色体９上の雄性不稔性遺伝子ｍｓ２が記載されていた。これは、’３６９特許で名づけられた遺伝子に対する対立遺伝子ではない。Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ｏｆ  １３  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｍａｉｚｅ”  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ２３：１９５−２０８（１９８１年１月）を参照されたい。それ以前にクローンされた唯一の稔性遺伝子が、上記のＡｒａｔｓらの文献に記載されるＡｒａｂａｄｏｐｓｉｓ遺伝子である。
【００２８】
その後発見され、雄性稔性に必須である遺伝子の例は数多いが、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡＢＯＲＴＥＤ  ＭＩＣＲＯＳＰＯＲＥＳ  （ＡＭＳ）遺伝子、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００３）３３（２）：４１３−４２３）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＭＳ１遺伝子（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００１）３９（２）：１７０−１８１）；ＮＥＦ１遺伝子（Ａｒｉｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００４）３９（２）：１７０−１８１）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＡｔＧＰＡＴ１遺伝子（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００３）１５：１８７２−１８８７）；Ａｒａｂｄｉｏｐｓｉｓ  ｄｄｅ２−２突然変異は、アレン酸化物シンターゼ遺伝子において欠損を持つことが示された（Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ（２００２）２１６：１８７−１９２）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆａｃｅｌｅｓｓ  ｐｏｌｌｅｎ−１遺伝子（ｆｌｐ１）（Ａｒｉｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）５３：１０７−１１６）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  雄性減数分裂細胞死１遺伝子（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００３）１５：１２８１−１２９５）；ｔａｐｅｔｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｇｅｎｅ，ＴＡＺ１（Ｋａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００２）１４：２３５３−２３６７）；ＴＡＰＥＴＵＭ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴ１遺伝子（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００３）１５：２７９２−２８０４）が挙げられる。
【００２９】
下表は、いくつかの、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）由来の、既知の雄性稔性突然変異を掲げる。
【００３０】
【化１】
2008543341.tif 000003
【００３１】
【化２】
2008543341.tif 000004
上記から、本発明は、本発明の遺伝子を用いゲノムを操作することによって植物の雄性稔性に影響を及ぼすために、本明細書に示す配列を使用することを含む。限定するのではなく例示のために述べると、後述の方法のいずれにおいても、本発明の配列を、例えば、不稔性を誘起するように植物に突然変異配列を導入すること、生得の配列に突然変異を誘起すること、配列のアンチセンスを植物の中に導入すること、ヘアピン形成の使用、その発現を調節するために他の配列と連結させること、または、植物の雄性稔性に影響を及ぼすために当業者に利用可能な多数のプロセスのうちの任意のものを実現することに使用することが可能である。
【００３２】
本明細書に記載されるＭｓ２６遺伝子は、トウモロコシの染色体１の上に局在し、その優勢対立遺伝子が雄性稔性に必須である。図１にその配座マップが示される。これは、前述のシステム、および、雄性稔性に影響を及ぼす他のシステムにおいて使用が可能である。
【００３３】
稔性に関して共分離するトウモロコシファミリーをｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００と名づけたが、Ｍｕ８プローブにハイブリダイズする、約５．５Ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片を持つことが判明した（図２Ａ）。このファミリーから、Ｍｕ８トランスポゾンを含むゲノムクローンが単離された。このトランスポゾンと境界を接するＤＮＡから調製したプローブが、同じ、〜５．５Ｋｂ  ＥｃｏＲ１断片にハイブリダイズすることが判明した（図２Ｂ）。このプローブを用いて、花穂のｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離した。このｃＤＮＡは、１９０６ｂｐであり、この遺伝子のエキソン１にＭｕ挿入体が見られた。このプローブを、ＲＦＬＰマッピング集団において突然変異をマップするのにも用いた。突然変異は、染色体１の短腕の、Ｍｓ２６の近くにマップされた。ｍｓ２６−ｒｅｆおよびｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００間の対立遺伝子交差から、これらは対立遺伝子であることが示された。これは二つの突然変異が、同じ遺伝子に起こったことを示す。ｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００対立遺伝子の名前を改めてｍｓ２６−ｍｓ：：Ｍｕ８とした。Ｍｓ２６遺伝子に関しさらに二つの対立遺伝子がクローンされた。一つは、第２エキソンにミューテーター遺伝子を含むもので、ｍｓ２６−ｍ３：：Ｍｕ＊と名づけ、一つは、ｍｓ２６−ｒｅｆ対立遺伝子の第５エキソンに未知のトランスポゾンを含んでいた。図５（さらに詳細に後述）は、ゲノムヌクレオチド配列を示す。ノーザン分析によって決定した発現パターンは、小胞子発生の約４分子段階から４分子放出段階においてピーク発現を持つ花穂特異性を示す。
【００３４】
当業者には、変異種、突然変異、または、本明細書に記載される全体配列よりも小さい断片を含む誘導体であっても、本遺伝子の、雄性稔性調節性を保持するものであれば使用が可能であることが明白であろう。当業者であれば、Ｍｓ２６の安定な雄性不稔対立遺伝子に関してホモの植物に導入し、次いで、その植物の雄性組織の発達を観察することによって、変異種または断片を簡単に評価することが可能である。
【００３５】
本発明の配列は、任意の植物から単離されたものであってもよい。そのような植物として、とうもろこし（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ひまわり（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、たばこ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、きび（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、じゃがいも（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、さつまいも（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ）、柑橘類樹木（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、アボガド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、いちじく（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）、オート麦（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、野菜類、観賞植物類、および球果類が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。植物は、とうもろこし、大豆、ひまわり、紅花、カノーラ、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、米、綿、およびソルガムを含むのが好ましい。
【００３６】
他の植物の配列も、本明細書に記載されるコード配列の相同のコード領域に対し、その配列相同性に基づく周知の技術に基づいて単離することが可能である。これらの技術では、既知のコード配列の全てまたは一部が、ある選ばれた生命体から得られた、ゲノムＤＮＡのクローン断片の集団（すなわち、ゲノムライブラリー）中に存在する、他の配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。核酸配列のハイブリダイゼーションに関しては、従来技術においていくつかの方法がすぐに利用可能である。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な案内が、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）において見出される。
【００３７】
したがって、本発明はさらに、ストリンジェント条件の下で、Ｍｓ２６ヌクレオチド配列に対し選択的にハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列を含む。Ｍｓ２６と「選択的にハイブリダイズする」配列に言及する場合、この用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で、ある核酸配列が、非標的核酸に対するそのハイブリダイゼーションに比べ、特定の核酸標的配列に対し検出可能な程度に高度にハイブリダイズすることへの言及を含む。
【００３８】
「ストリンジェント条件」、または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブが、その標的配列に対し、他の配列に対してよりも検出可能な程度に高度にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェント条件は、標的配列依存的であり、ポリヌクレオチドの構造に応じて異なる。ハイブリダイゼーションのストリンジェント度および／または洗浄条件を調節することによって、プローブに対し１００％相補的な標的配列を特定することが可能である（相同的プローブ探査）。それとは別に、配列に若干のミスマッチを許容し、より低い類似度が検出されるようにストリンジェント条件を調節することも可能である（異種的プローブ探査）。一般に、このタイプのプローブは、約１０００ヌクレオチド長から約２５０ヌクレオチド長の範囲を持つ。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な案内が、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；および、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）において見出される。さらに、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【００３９】
一般に、本発明のヌクレオチド配列に一致し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする配列は、開示の配列に対し、少なくとも５０％の相同性、７０％の相同性、さらに８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する。すなわち、プローブと、標的との間の配列類似性は、少なくとも約５０％、約７０％、およびさらに約８５％以上の配列類似性を共有する範囲を持つ。
【００４０】
特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定因子は、最終洗浄液のイオン強度と温度である。一般に、ストリンジェント洗浄温度条件は、ある定義されたイオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列の融解点（Ｔｍ）よりも約５℃から約２℃低くなるように選択される。ＤＮＡの融解点、すなわち変性は、狭い温度範囲において起こり、２重螺旋が解けて、相補的１本鎖へ変わることを表す。この過程は、転移の中間温度Ｔｍによって記録され、Ｔｍはまた融解温度とも呼ばれる。融解温度を決めるための式が従来技術において利用可能である。
【００４１】
本発明のヌクレオチド配列に対する好ましいハイブリダイゼーション条件として、５０％（ｗ／ｖ）フォルムアミド、６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００（ｇ／ｍｌ）鮭精子ＤＮＡ溶液、４２℃でのハイブリダイゼーションが挙げられる。例示の低ストリンジェント度洗浄条件として、２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液、４２℃で３０分、および繰り返しのハイブリダイゼーションが挙げられる。例示の中等ストリンジェント度条件として、２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける洗浄、５０℃で３０分、および繰り返しが挙げられる。例示の高ストリンジェント度条件として、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳにおける洗浄、６５℃で３０分、および繰り返しが挙げられる。本発明のプロモーターに一致する配列も、上記条件の全てを用いることによって得ることが可能である。本発明を定義するためには、高ストリンジェント度条件が用いられる。
【００４２】
下記の用語が、二つ以上の核酸、またはポリヌクレオチド間の配列関係を記載するのに用いられる。（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」および、（ｄ）「配列同一性パーセント」である。
【００４３】
（ａ）、本明細書で用いる「参照配列」とは、配列比較の基礎として用いられる定義された配列である。参照配列は、ある特定配列のサブセット、またはその全体であってもよい。例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子配列全長の１セグメント、または、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列であってもよい。
【００４４】
（ｂ）本明細書で用いる「比較ウィンドウ」とは、あるポリヌクレオチド配列の、特定の連続セグメントに言及するもので、その際、該比較ウィンドウの中のポリヌクレオチド配列は、参照配列（付加または欠失を含まない）に対し、二つの配列の最適整列を実現するために、付加、または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０連続ヌクレオチド長であるが、任意に３０、４０、５０、または１００ヌクレオチド長以上であってもよい。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列の中にギャップを含めることによる、参照配列に対する高度の類似性を回避するために、通常、ギャップペナルティが導入され、それが、マッチの数から差し引かれることを理解する。
【００４５】
比較のために配列同士を整列させることは従来技術で周知である。したがって、数学的アルゴリスムを用いて、任意の二つの配列の間の配列同一性パーセントの定量を実現することが可能である。このような数学的アルゴリスムの非限定的例として、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２の局所的整列アルゴリスム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３の全体整列アルゴリスム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−２４４８の局所整列探求法；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４のアルゴリスムで、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７の場合のように修正したものがある。
【００４６】
配列同士を比較するために、これらの数学的アルゴリスムのコンピュータ実行体を利用して配列同一性を定量することが可能である。そのような実行体としては、ＰＣ／遺伝子プログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州から市販）、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０におけるＴＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，９６８５Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。これらのプログラムによる整列は、デフォールトパラメータを用いて実行してもよい。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１に十分に書き込まれている。ＡＬＩＧＮプログラムは、上記Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）のアルゴリスムに基づく。アミノ酸配列を比較する場合には、ＡＬＩＧＮプログラムと共に、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用することが可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）上記のアルゴリスムに基づく。本発明のタンパク質をコードするヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索を、ＢＬＡＳＴＩＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝２によって実行することが可能である。本発明のタンパク質またはポリペプチドに対して相同なアミノ酸配列を得るためには、ＢＬＡＳＴタンパク質探索を、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によって実行することが可能である。比較目的のためにギャップ入り整列を実現するためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるものと同様のギャップ入りＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を利用することが可能である。それとは別に、分子同士の間の離れた関係を検出する繰り返し探索を実行するにはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０に含まれる）を使用することが可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、ギャップ入りＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列の場合はＢＬＡＳＴＩＮ、タンパク質の場合はＢＬＡＳＴＸ）のデフォールトパラメータを使用してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ��を参照されたい。整列はまた、手動で目視によって実行してもよい。
【００４７】
別様に明言しない限り、本明細書に与えられる配列同一性／類似性は、下記のパラメータを用いたＧＡＰバージョン１０によって得られた値を指す。すなわち、ＧＡＰ重み５０、および長さ重み３によるヌクレオチド配列の同一性％および類似性％、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア行列；ＧＡＰ重み８、および長さ重み２によるアミノ酸配列の同一性％および類似性％；およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、またはそれと等価の任意のプログラムである。「等価なプログラム」とは、問題とする任意の二つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成される対応整列と比較して、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基について同一のマッチ、および配列同一性％について同一値を与える任意の比較配列プログラムを指すことが意図される。
【００４８】
ＧＡＰは、二つの完全配列について、マッチの数を最大とし、ギャップの数を最小とする整列を見つけるために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３のアルゴリスムを使用する。ＧＡＰは、全ての可能な整列およびギャップ位置を考慮し、最大数の塩基マッチおよび最小数のギャップを持つ整列を作成する。ＧＡＰは、ギャップ作成ペナルティーおよびギャップ延長ペナルティーを、マッチした塩基単位として表すことを可能とする。ＧＡＰは、挿入した各ギャップによるマッチ数から、ギャップ作成ペナルティー対する利益を出さなければならない。もしも、ゼロよりも大きいギャップ延長ペナルティーが選択された場合、ＧＡＰはさらに、ギャップの長さ×ギャップ延長ペナルティーに対し、挿入された各ギャップから利益を出さなければならない。タンパク質配列に関するＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０におけるギャップ作成ペナルティー、およびギャップ延長ペナルティーのデフォールト値は、それぞれ、８および２である。ヌクレオチド配列の場合、ギャップ作成ペナルティーのデフォールト値は５０であり、ギャップ延長のデフォールト値は３である。ギャップ作成およびギャップ延長ペナルティーは、０から２００までの整数から成る群から選択される整数で表されてもよい。したがって、例えば、ギャップ作成およびギャップ延長ペナルティーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５以上であってもよい。
【００４９】
ＧＡＰは、最良整列ファミリーの中から一つのメンバーを提供する。このファミリーには多くのメンバーがあってもよいが、他のどのメンバーでも、これより優れた品質を持つものはない。ＧＡＰは、整列について４種類の優良数字を示す。すなわち、品質、割合、同一性、および類似性である。品質とは、配列同士が整列される最大サイズである。割合とは、短い方のセグメントの塩基数で品質を割った値である。同一性パーセントとは、実際にマッチする符号のパーセントである。類似性パーセントとは、類似の符号のパーセントである。ギャップ間をまたぐ符号は無視される。一対の符号に対する行列スコア値が、類似性閾値である０．５０以上である場合、類似性にスコアが付けられる。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン１０で使用されるスコアリング行列式は、ＢＬＯＳＵＭ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）。
【００５０】
（ｃ）二つの核酸配列またはポリペプチド配列に関して、本発明で用いられる「配列同一性」または「同一性」とは、ある指定の比較ウィンドウにおいて最大の一致を与えるように整列された場合に同じになる二つの配列中の残基に対する言及を指す。配列同一性パーセントがタンパク質に関連して使用される場合、同一ではない残基の位置が、保存的アミノ酸置換だけ異なる場合がよくあり、その際、アミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を持つ他のアミノ酸残基と置換していて、そのために、その分子の化学的性質を変えないことが認識されている。配列同士が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方調整してもよい。そのような保存的置換だけ異なる配列同士は、「配列類似性」または「類似性」を持つと言われる。この調整を行うための手段は当業者にはよく知られる。通常、この手段は、保存的置換を、完全なミスマッチとはせず部分的ミスマッチとしてスコアし、そうすることによって配列同一性パーセントを増すことを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にゼロスコアが与えられる場合、保存的に置換には、ゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）において実行されるようして計算される。
【００５１】
（ｄ）本明細書において用いる「配列同一性パーセンテージ」とは、比較ウィンドウにおいて、最適に整列された二つの配列を比較することによって定められる値を意味する。その際、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列部分は、二つの配列の最適整列を実現するために、参照配列（付加または欠失を含まない）に対し、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、両配列において同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が出現する位置の数を定量してマッチ位置の数を得、このマッチ位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の全数によって割り、その結果を１００で倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定することを意図するものではない。当業者であれば、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、および、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含むことが可能であることを認めるであろう。このデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、天然分子と、合成類縁体の両方を含む。本発明のポリヌクレオチドはまた、あらゆる形態の配列、例えば、１本鎖形、２本鎖形、ヘアピン、ステム・ループ構造など、ただしこれらに限定されない、を含む。
【００５３】
本発明の配列に対する同一性は、少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５４】
プロモーター領域は、当業者には簡単に認識される。ＡＴＧモチーフを含む開始コドン候補が特定されると、その開始コドンの上流には予想されるプロモーターがある。「プロモーター」とは、ＤＮＡの制御領域を意図し、この領域は、通常、ある特定のコード配列について適切な転写開始部位においてＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを指示することが可能なＴＡＴＡボックスを含む。プロモーターはさらに、上流プロモーター要素と呼ばれ、一般にＴＡＴＡボックスの上流に配置されて、転写起動速度に影響を及ぼす、他の認識配列を含むことがある。本明細書に開示されるプロモーター領域のヌクレオチド配列を特定したならば、本明細書に特定される特定のプロモーター領域からＴＡＴＡボックスの上流領域の調節要素をさらに単離し、特定することは先端技術領域内にあることが認識される。したがって、本明細書に開示されるプロモーター領域は、一般に、上流の調節要素、例えば、コード配列の組織および時間的発現に与る要素、エンハンサーなどを含むことによってさらに定義される。同様にして、所望の組織、例えば、雄性組織における発現を可能とするプロモーター要素も、特定し、単離し、雄性組織の好ましい発現を確かなものとするために他のコアプロモーターと共に使用することも可能である。コアプロモーターとは、転写を起動するのに必要な最短配列、例えば、タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターに共通なＴＡＴＡボックスと呼ばれる配列を意味する。したがって、Ｍｓ２６の上流プロモーターは、任意に、それ自身のコアプロモーター、または、他の供給源から得られたコアプロモーターと組み合わせて使用してもよい。プロモーターは、それが見出された細胞に備わった内在性のものでもよいし、非内在性のものでもよい。
【００５５】
本発明の単離プロモーター配列は、異種ヌクレオチド配列の、一定範囲の発現を実現するように修飾することが可能である。全体よりも少ないプロモーター領域を利用し、かつ、葯に好ましい発現を駆動する能力を保持することが可能である。しかしながら、プロモーター配列の部分の欠失と共にｍＲＮＡの発現レベルが低下することが認められている。以上、プロモーターは、脆弱または強力プロモーターとなるように修飾することが可能である。一般に、「脆弱プロモーター」とは、コード配列の発現駆動が低レベルであるプロモーターであることが意図される。「低レベル」とは、約１／１０，０００転写産物から約１／１００，０００転写産物から約１／５００，０００転写産物のレベルであることが意図される。逆に、強力プロモーターとは、コード配列の発現を高レベルに、すなわち、約１／１０転写産物から約１／１００転写産物から約１／１，０００転写産物のレベルに駆動する。一般に、ヌクレオチド配列の駆動には、単離プロモーター配列の、少なくとも約３０ヌクレオチドが用いられる。転写レベルを増すためには、本発明のプロモーター領域と組み合わせてエンハンサーの利用が可能であることが認められる。エンハンサーとは、プロモーター領域の発現を増すように作用するヌクレオチド配列である。エンハンサーは従来技術で既知であり、ＳＶ４０エンハンサー領域、３５Ｓエンハンサー要素などが挙げられる。
【００５６】
本発明のプロモーターは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の天然コード領域の５’領域から単離してもよい。同様に、ターミネーターは、その終止コドンに側接する３’領域から単離されてもよい。「単離」という用語は、通常、その物質に付着するか、または相互作用を持つ種々の成分から実質的に、または事実上遊離される物質、例えば、核酸、またはタンパク質を指し、相互作用は、その物質の中に天然環境が存在する場合、または、その物質が天然環境の中に存在する場合に見られるが、物質は、ヒトの意図的な介入によって変えられて、その物質本来のものではない組成物に、および／または、その物質本来の座位ではない、細胞内の別の座位に転移させられる。
【００５７】
調節配列の「機能的変種」も、本発明の組成物の中に含まれる。機能的変種としては、例えば、本発明の天然調節配列であって、一つ以上のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を含む配列が挙げられる。本発明の機能的変種は、位置指定突然変異誘発、誘起突然変異によって作製されてもよいし、あるいは、対立遺伝子変異（多型）として出現してもよい。
【００５８】
本明細書で用いる、調節配列の「機能的断片」とは、より大きい配列からの、一つ以上の欠失によって形成される調節配列変種であるヌクレオチド配列である。例えば、転写開始部位近くのＴＡＴＡボックスまでの、プロモーターの５’部分は、Ｏｐｓａｈｌ−Ｓｏｒｔｅｂｅｒｇ，Ｈ−Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ４９−ｂｐ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨｖＬＴＰ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ａｌｅｒｕｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”Ｇｅｎｅ３４１：４９−５８（２００４）によって記載されるようにプロモーター活性を損なうことなく欠失させることが可能である。このような変種は、プロモーター活性、特に、雄性組織における発現を駆動する活性を保持していなければならない。活性は、ノーザンブロット分析、転写融合によるリポーター活性測定などによって測定することが可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。なお、この文献を引用により本明細書に含める。
【００５９】
機能的断片は、本明細書に開示される、天然の調節要素ヌクレオチド配列を切断する制限酵素を用いることによって；天然のＤＮＡ配列由来のヌクレオチド配列を合成することによって獲得することが可能であるが、あるいは、ＰＣＲ技術を用いることによって獲得することが可能である。特に、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０，およびＥｒｌｉｃｈ，ｅｄ．（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００６０】
本発明の調節配列にハイブリダイズする配列は、本発明の範囲内にある。本発明のプロモーター配列に一致し、かつ、本明細書に開示されるプロモーター配列にハイブリダイズする配列は、開示の配列に対し、少なくとも５０％相同、７０％相同、さらに８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同である。
【００６１】
それよりも短い断片でもなお、特定されたプロモーターの調節性を含む可能性があり、欠失分析が必須領域を特定する一つの方法である。欠失分析は、調節領域の５’および３’末端の両方から行ってもよい。位置指定突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応による突然変異誘発などによって実現することが可能である。（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照）。３’欠失が、必須領域の境界を定め、３’末端を特定する可能性があるが、それができれば次には、その領域を、選ばれたコアプロモーターに作動可能的に連結させることが可能である。一旦必須領域が特定されたならば、外来遺伝子の転写も、必須領域プラスコアプロモーターによって調節することが可能である。コアプロモーターとは、タンパク質をコードする全ての遺伝子のプロモーターに共通なＴＡＴＡボックスと呼ばれる配列を意味する。したがって、Ｍｓ２６の上流プロモーターは、任意に、それ自身のコアプロモーター、または、他の供給源から得られたコアプロモーターと組み合わせて使用してもよい。プロモーターは、それが見出された細胞に対し生得的なものでも、外来性のものでもよい。
【００６２】
このコアプロモーターは、既知のコアプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ、または１９Ｓのプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５号）、ユビキチンプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号）、ＩＮ２コアプロモーター（米国特許第５，３６４，７８０号）、またはゴマノハグサモザイクウィルス・プロモーター（Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．８９−１１９（１９９３））などのプロモーターのうちのいずれであってもよい。
【００６３】
Ｍｓ２６の調節領域は、ＴＡＴＡボックス候補の上流１００５ｂｐ領域を含むものと特定されている。図８を参照されたい。さらに上に概説した手順を用いて、このプロモーターの必須領域は、ＴＡＴＡボックスの上流−１８０ｂｐを含み、具体的に言うと、１７６から−４４領域が特に必須であることが決定された。
【００６４】
本明細書に記載されるプロモーター配列に対する、その配列相同性に基づいて、周知の技術によって他の植物からプロモーター配列を単離してもよい。これらの技術では、既知のコード配列の全てまたは一部が、ある選ばれた生命体から得られた、ゲノムＤＮＡのクローン断片の集団（すなわち、ゲノムライブラリー）中に存在する、他の配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。核酸配列のハイブリダイゼーションに関しては、従来技術においていくつかの方法がすぐに利用可能である。
【００６５】
プロモーターの全配列、またはその部分を、対応するプロモーター配列に特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブとして使用することが可能である。種々の条件の下で特異的ハイブリダイゼーションを実現するためには、そのようなプローブは、独特で、かつ、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、もっとも好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチド長の配列を含む。このようなプローブは、よく知られたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって、選ばれた生命体から得られた対応プロモーター配列を増幅するために使用することが可能である。この技術は、所望の生命体からさらに別のプロモーター配列を単離したり、または、ある生命体においてプロモーターの存在を決定するための診断アッセイとして使用することが可能である。例としては、プレートに撒いたＤＮＡライブラリーに対するハイブリダイゼーションスクリーニング（プラークか、コロニーのどちらか；例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９９０）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００６６】
さらに、本発明のプロモーターは、Ｍｓ２６遺伝子以外のヌクレオチド配列に連結し、他の異種ヌクレオチド配列を発現させることも可能である。本発明のプロモーターのヌクレオチド配列ばかりでなく、その断片および変種も、対象植物、特に、植物の雄性組織における発現のために異種ヌクレオチド配列と共に発現カセットとして提供されてもよい。このような発現カセットは、プロモーターの転写調節下に置かれるべきヌクレオチド配列の挿入のために複数の制限部位と一緒に提供される。これらの発現カセットは、所望の表現型反応を実現するために任意の植物の遺伝子操作をする際に有用である。
【００６７】
Ｍｓ２６プロモーター、または本明細書に教示される他のプロモーター、または当業者に既知の他のプロモーターを有する発現ベクターの外来遺伝子として使用が可能な他のヌクレオチド配列の例としては、相補的ヌクレオチド単位、例えば、アンチセンス分子（カラーゼアンチセンスＲＮＡ，バルナーゼアンチセンスＲＮＡ、およびカルコン合成酵素アンチセンスＲＮＡ，Ｍｓ４５アンチセンスＲＮＡ）、リボザイムと外来ガイド配列、アプタマー、または１本鎖ヌクレオチドが挙げられる。この外来ヌクレオチド配列はまた、炭水化物分解または修飾性酵素、アミラーゼ、脱分枝酵素、およびペクチナーゼをコードするもの、例えば、図２４のアルファアミラーゼ遺伝子、オーキシン、ｒｏｌ  Ｂ、細胞毒素、ジフテリア毒素、ＤＡＭメチラーゼ、アビジンをコードしてもよく、あるいは、前核細胞の調節システムから選択されてもよい。例示として述べるのであるが、Ｍａｒｉａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３４７；ｐｐ．７３７；（１９９０）は、花穂における、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（麹菌）ＲＮａｓｅ−Ｔ１、または、「バルナーゼ」と表示される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（でん粉液化バチルス）のＲＮａｓｅの発現が、花穂細胞の破壊を招き、雄性不稔をもたらすことを示した。Ｑｕａａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１７３：ｐｐ．６１７（１９８８）は、ＲＮａｓｅ−Ｔ１の化学的合成を記載し、一方、バルナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．；Ｖｏｌ．２０２：ｐｐ．９１３（１９８８）に開示される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのｒｏｌＢ遺伝子は、インドキシル−β−グルコシドからの遊離インドールの放出を触媒することによってオーキシン代謝を妨害する酵素をコードする。Ｅｓｔｒｕｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｖｏｌ．１１：ｐｐ．３１２５（１９９１）およびＳｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．；Ｖｏｌ．８４：ｐｐ。５２０（１９９２）は、タバコのｒｏｌＢ遺伝子の葯特異的発現が、花粉生産が大きく低下した萎縮した葯を有する植物をもたらし、ｒｏｌＢ遺伝子が、花粉生産の調節に有用な遺伝子の一例であることを示した。Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６１：ｐｐ．１０８（１９８５）は、ｒｏｌＢ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ジフテリア毒素遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、米国基準菌株保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）、ＡＴＣＣ第３９３５９号、またはＡＴＣＣ第６７０１１号から入手することが可能であり、実例および使用法に関しては、Ｆａｂｉｊａｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅ．Ｐ．Ａｐｐｌ．Ｎｏ．９０９０２７５４．２，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”を参照されたい。米国特許第５，６８９，０４９号および国際出願ＰＣＴ／米国９５／１５２２９Ｃｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ，Ｍ．Ｃ．，“Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉ��ｙ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ”の中で論じられる方法には不稔を引き起こすためにＤＡＭメチラセーゼが用いられる。さらに、米国特許第５，９６２，７６９号、“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ａｖｉｄｉｎ”ｂｙ  Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．において不稔を起こすためにアビジン遺伝子が使用されるが、その説明を参照されたい。
【００６８】
本発明は、Ｍｓ２６遺伝子を有するベクターを含む。Ｍｓ２６、植物において該遺伝子の発現を駆動するプロモーター、およびターミネーター領域を含むベクターが調製される。前述したように、本構築体におけるプロモーターは、天然のプロモーターであっても、植物における発現を実現するものであれば、置換されたプロモーターであってもよい。本構築体のプロモーターは、誘発性プロモーターであり、したがって、構築体におけるセンスまたはアンチセンス分子の発現が、インデューサーに対する暴露によって調節可能となっていてもよい。この点で、本構築体では、植物と適合するものである限り、任意のプロモーター要素の使用が可能であり、所望の最終結果によってのみ影響される。そのような要素は、植物遺伝子プロモーター、例えば、リブロース−１，５−ビス−フォスフェートカルボキシラーゼの小型サブユニットのプロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｒｆａｃｉｅｎｓ由来の腫瘍誘発性プラスミドのプロモーター、例えば、ノパリン合成酵素およびオクトピン合成酵素のプロモーター、またはウィルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、または、ゴマノハグサモザイクウィルス３５Ｓプロモーターであってもよい。Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２９９および欧州特許出願第０  ３４２  ９２６号；大麦脂質転移タンパク質プロモーター、ＬＴＰ２（Ｋａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９４）６（６）：８４９−５０）；ユビキチンプロモーター（例えば、米国特許第５，５１０，４７４号を参照）；ＥＮＤ２プロモーター（Ｌｉｎｎｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，９０３，２０５号）；および、ポリガラクトナーゼＰＧ４７プロモーター（Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｓｄａｌｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９３）３：２６１−１７１；国際公開第９４／０１５７２号；米国特許第５，４１２，０８５号を参照）を参照されたい。本発明に好適に採用される、例示の植物プロモーターに関する総説については、国際公開９１／１９８０６号を参照されたい。
【００６９】
植物と適合する利用可能なプロモーターの範囲は、組織特異的および誘発性プロモーターを含む。誘発性調節要素は、インデューサーに反応して一つ以上のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接・間接に活性化することの可能な要素である。インデューサーが不在の場合、そのＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。通常、転写を活性化する誘発性調節要素に特異的に結合するタンパク質因子は、不活性形として存在し、これが、インデューサーによって、直接・間接に活性形に変換される。インデューサーは、化学的介在因子、例えば、タンパク質、代謝産物、増殖調節因子、除草剤またはフェノール系化合物、または、熱、冷気、塩、または毒性要素によって直接与えられるか、または、病原体、または疾病要素、例えば、ウィルスの活動によって間接的に与えられる生理的ストレスであってもよい。誘発性調節要素を含む植物細胞は、細胞または植物に対し外部から、例えば、噴射、散水、加熱、または類似の方法でインデューサーを浴びせることによって暴露させてもよい。
【００７０】
本発明では、任意の誘発性プロモーターの使用が可能である。Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３６１−３６６（１９９３）を参照されたい。例示の誘発性プロモーターとしては、エクジソン受容体プロモーター、米国特許第６，５０４，０８２号；銅に反応するＡＣＥ１システムのプロモーター（Ｍｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ９０：４５６７−４５７１（１９９３））；ベンゼンスルフォンアミド除草剤セーフナーに対して反応する、トウモロコシのＩｎ２−１およびＩｎ２−２遺伝子（米国特許第５，３６４，７８０号；Ｈｅｒｓｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２７：２２９−２３７（１９９１）およびＧａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４３：３２−３８（１９９４））；発芽前除草剤として使用される疎水性求核化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター；サリチル酸によって活性化されるタバコのＰＲ−１ａプロモーターが挙げられる。その他の、化学的に調節可能な興味深いプロモーターとしては、ステロイド反応性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５、およびＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７−２５７に記載されるグルココルチコイド誘発性プロモーターを参照）、および、テトラサイクリン−誘発性、およびテトラサイクリン−抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、および米国特許第５，８１４，６１８、および５，７８９，１５６号を参照）が挙げられる。
【００７１】
ある特定の植物組織において転写および／または発現の強化を標的するには、組織嗜好性プロモーターの利用が可能である。プロモーターは、他の植物組織と共に対象組織において発現されてもよく、対象組織において強力に発現されてもよく、他の組織よりもはるかに低度に発現されてもよく、あるいは、対象組織において極めて好まれて発現されてもよい。組織嗜好性プロモーターとしては、Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎａｖａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５１４；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  ＭｏｌＢｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（２０）：９５８６−９５９０；および、Ｇｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０５に記載されるものが挙げられる。一実施態様では、プロモーターは、植物の雄性または雌性組織に対し優先的に発現されるものである。本発明は、この過程において何か特定の雄性組織嗜好性プロモーターが使用されなければならないと要求しない。当業者に既知の、多くの同様のプロモーターのうちの任意のものを使用することが可能である。本明細書に記載される、天然のＭｓ２６プロモーターは、有用なプロモーターの一例である。もう一つの、同様のプロモーターとして５１２６プロモーターがある。これは、米国特許第５，８３７，８５１および５，６８９，０５１号に記載されるように、それが連結される遺伝子の発現を、植物の雄性組織に優先的に振り向けるプロモーターである。他の例としては、米国特許第６，０３７，５２３号に記載されるＭｓ４５プロモーター；米国特許第６，４５２，０６９号に記載されるＳＦ３プロモーター；国際公開第０２／０６３０２１号に記載されるＢＳ９２−７プロモーター；米国特許第５，４７０，３５９号に記載されるＳＧＢ６調節要素；ＴＡ２９プロモーター（Ｋｏｌｔｕｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｃｃｕｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｈｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２０１−１２２４；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｂ．，  Ｂｅａｌｓ，Ｔ．Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．，（１９９３）“Ａｎｔｈｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１２１７−１２２９；および、米国特許第６，３９９，８５６号）；２型マタロチオネイン−様遺伝子プロモーター（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅｌ−Ｃａｍｐａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（２０００）２５４：１９９−２０８）；および、Ｂｒａｓｓｉｃａ  Ｂｃａ９プロモーター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（２００３）２２：２６８−２７３）が挙げられる。
【００７２】
雄性配偶子嗜好性プロモーターとしては、上記のＰＧ４７プロモーターの外、ＺＭ１３プロモーター（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）３８：６６３−６６９）；アクチン脱重合因子プロモーター（例えば、Ｚｍａｂｐ１、Ｚｍａｂｐ２；例えば、Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：７４１５−７４２０を参照；トウモロコシペクチン・メチルエステラーゼ様遺伝子のプロモーターＺｍＣ５（Ｗａｋｅｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．(１９９８)３７：１８７−１９２）；プロルフィリン遺伝子プロモーターＺｍｐｒｏ１（Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２０００）１２：５８３−５９８）；硫化ペンタペプチドフィトスルフォキン遺伝子ＺｍＰＳＫ１（Ｌｏｒｂｉｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ（２００５）５６（４１７）：１８０５−１８１９）；カルモジュリン結合タンパク質のプロモーターＭｐｃｂｐ（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５（４５）：３５４５７−７０）が挙げられる。
【００７３】
これも遺伝子の意図される使用に応じてではあるが、ベクターには他の成分を含めてもよい。例としては、選択性マーカー、標的性または調節性配列、安定化またはリーダー配列、イントロンなどが挙げられる。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的説明および実例は、Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．８９−１１９（１９９３）に見出すことができる。適切な発現ベクターの選択は、宿主、および宿主に対する発現ベクターの導入法に依存する。発現カセットはさらに、対象とする異種ヌクレオチド配列の３’末端において、植物において機能する、転写および翻訳終止領域を含む。この終止領域は、本発明のプロモーターヌクレオチド配列に対し本来備わっていたものでもよいし、対象ＤＮＡ配列に対し本来備わっていたものでもよいし、別の供給源から得られたものであってもよい。好適な終止領域が、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミド、例えば、オクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素の終止領域から入手可能である。さらに、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４（１９９１）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ  ６４：６７１−６７４（１９９１）；Ｓａｎｆａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１４１−１４９（１９９１）；Ｍｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６１−１２７２（１９９０）；Ｍｕｎｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ９１：１５１−１５８（１９９０）；Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３（１９８９）；Ｊｏｈｓｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９（１９８７）を参照されたい。
【００７４】
発現カセットはさらに、５’リーダー配列を含んでもよい。このリーダー配列は、翻訳を強化するように作用することが可能である。翻訳リーダーは、従来技術で既知であるが、例示として、ピコルナウィルスリーダー、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）、Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６１２６−６１３０（１９８９）；ポチウィルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコＥｔｃｈウィルス）、Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ矮小化モザイクウィルス）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５４：９−２０（１９８６）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、Ｍａｃｅｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０−９４（１９９１）；アルファルファモザイクウィルスのコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）、Ｊｏｂｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：６２２−６２５（１９８７）；タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）リーダー、Ｇａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ２３７−２５６；およびトウモロコシ退縁斑紋ウィルス（ＭＣＭＶ）リーダー、Ｌｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：３８２−３８５（１９９１）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８４：９６５−９６８（１９８７）を参照されたい。カセットはさらに、翻訳、および／またはｍＲＮＡ安定性を強化する配列、例えば、イントロンを含んでもよい。
【００７５】
異種ヌクレトチド配列の発現産物を、特定の小器官、特に、プラスチド、アミロプラスト、または、小胞子に向けること、または、細胞表面において、または細胞外へ分泌させることが望ましい場合、発現カセットはさらに、転位ペプチドのコード配列を含んでもよい。このような転位カセットは周知であり、例えば、アシル輸送タンパク質、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニット、植物ＥＰＳＰ合成酵素の転位ペプチド、Ｚｅａ  ｍａｙｓのＢｒｉｔｔｌｅ−１転位ペプチド（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｉｓｉｏｌ  １１７（４）：１２３５−１２５２（１９９８）；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３（１２）：１３３７−４８；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ（１９９５）１９６（３）：４７７−８４；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７（２６）：１８９９９−９００４）などが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。当業者であれば、ある特定の小器官に向けて産物を発現させるために利用することが可能な数多くの選択肢を簡単に思いつくことが可能であろう。例えば、大麦アルファアミラーゼ配列は、発現を小胞子に向けるのにしばしば用いられる（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５））。転位ペプチドの使用は周知である（例えば、米国特許第５，７１７，０８４；５，７２８，９２５号を参照）。
【００７６】
発現カセットを準備する際、ＤＮＡ配列を、適切な方向に、かつ、適宜適切なリーディングフレームに納めて供給するように操作してもよい。この目的のために、ＤＮＡ断片同士を接合するためにアダプターまたはリンカーを用いてもよいし、あるいは、適切な制限部位の設置、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などを実行するために、他の操作手段を仕組んでもよい。この目的のため、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限消化、アニーリング、および再置換、例えば、トランジションおよびトランスバージョンを含めてもよい。
【００７７】
本明細書に述べるように、本発明は、対象遺伝子を発現させることが可能なベクターを提供する。一般に、ベクターは、植物細胞において機能的でなければならない。時として、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）において機能的なベクターを備えることが好ましいことがある（例えば、抗体誘発用のタンパク質の生産、ＤＮＡ配列分析、挿入体の構築、定量の核酸の獲得）。ベクター、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるクローニングおよび発現のための手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）の中に論じられている。
【００７８】
発現カセットの中の異種ヌクレオチド配列に作動可能的に連結された、本発明のプロモーター配列を含む形質転換ベクターはさらに、生命体において共同転換される遺伝子のための、少なくとも一つの、別のヌクレオチド配列を含んでもよい。それとは別に、追加配列（単数または複数）は、別の形質転換ベクターに載せて提供されてもよい。
【００７９】
形質転換ベクターにはリポーター遺伝子を含めてもよい。既知の、好適なリポーター遺伝子の例が、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐｐ．１−３３；ＤｅＷｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７（１９８７）；Ｇｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０）；Ｋａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：６５０−６５５（１９９５）、およびＣｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：３２５−３３０（１９９６）の中に見出すことができる。
【００８０】
形質転換細胞または組織の選択用として選ぶこと可能なリポーター遺伝子は、形質転換ベクターに含められてもよい。これらのベクターは、抗生物質耐性、または除草剤耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。好適な、選択可能なマーカー遺伝子の例としては、下記に対する耐性をコードする遺伝子、すなわち、クロラムフェニコール、Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２：９８７−９９２（１９８３）；メトトレキセート、Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３（１９８３）；Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８０７−８２０（１９９１）；ハイグロマイシン、Ｗａｌｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０３−１０８（１９８５）；Ｚｈｉｊｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２１９−２２７（１９９５）；ストレプトマイシン、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：８６−９１（１９８７）；スペクチノマイシン、Ｂｒｅｔａｇｎｅ−Ｓａｇｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．５：１３１−１３７（１９９６）；ブレオマイシン、Ｈｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：１７１−１７６（１９９０）；スルフォンアミド、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２７−１３６（１９９０）；ブロモキシニル、Ｓｔａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４１９−４２３（１９８８）；グリフォサート、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１（１９８６）；およびフォスフィノトリシン、ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２５１３−２５１８（１９８７）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００８１】
配列の存在が、測定可能な産物を生産する場合には、スコアリング可能な、またはスクリーニング可能なマーカーを用いてもよい。例として、β−グルクロニダーゼ、または、各種発色性基質が知られる酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（例えば、米国特許第５，２６８，４６３および５，５９９，６７０号）；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ．６  Ｎｏ．１３  ｐｐ．３９０１−３９０７）；およびアルカリフォスファターゼが挙げられる。他のスクリーニング可能なマーカーとしては、一般にアントシアニン／フラボノイド遺伝子（Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｂｒｉｇｇｓ，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９０）２：１１５−１２７の考察を参照）であって、例えば、植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生産を調節する産物をコードするＲ−座位遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｐｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ｅｄｓ．，ｐｐ．２６３−２８２（１９８８））；フラボノイド色素の生合成を調節する遺伝子、例えば、トウモロコシＣ１遺伝子（Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９６）８：１１７１−１１７９；Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）２４２：４０−４８）、およびトウモロコシＣ２（Ｗｉｅｎａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０３：２０２−２０７）；Ｂ遺伝子（Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１１７５−１１８３）、ｐ１遺伝子（Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：４５８７−４５９１；Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９４）７６：５４３−５５３；Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）３９：１１−１９）；ｂｒｏｎｚｅ座位遺伝子（Ｒａｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８８）１１９：１８５−１９７；Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９０）２（１１）：１０３９−１０４９）が、特に挙げられる。好適なマーカーの、さらに別の例としては、シアン蛍光タンパク質（ＣＹＰ）遺伝子（Ｂｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４、およびＫａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９：９１３−４２）、黄色蛍光タンパク質遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎから市販されるＰｈｉＹＦＰ（登録商標）；Ｂｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１７：９４３−５４を参照）；ルシフェラーゼをコードするｌｕｘ遺伝子で、その存在が、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション計数法、蛍光分光光度計、暗視野ビデオカメラ、フォトン計数カメラ、またはマルチウェル光度計によって検出可能な遺伝子（Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３４３）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（���ｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９５）８（５）：７７７−８４）；および、植物細胞がマーカー遺伝子によって形質転換されると赤色となり、したがって視覚的に選択可能となるＤｓＲｅｄ２（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２（２）：２８６−２９３）が挙げられる。追加例としては、ｐ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｈｌｉｆｆｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７８）７５：３７３７）で、種々の発色性基質（例えば、ＰＡＤＡＣ，発色性セファロスポリン）が知られる酵素をコードする遺伝子；ｘｙｌＥ遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：１１０１）で、発色性カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードする遺伝子；α−アミラーゼ遺伝子（Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９０）８：２４１）；および、チロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３）１２９：２７０３）で、チロシンを酸化してＤＯＰＡに変換し、このＤＯＰＡが次に縮合して検出可能な化合物メラニンを形成する酵素をコードする遺伝子が挙げられる。当業者には、このような多くのマーカーが利用可能であることは明らかである。
【００８２】
形質転換／トランスフェクションのための方法は、本法の結果を左右する重要性を持たない。現在、種々の形質転換法またはトランスフェクション法の利用が可能である。作物、または宿主細胞を形質変換するために比較的新しい方法の利用が可能であるならば、直接それらを応用してもよい。生命体において表現型変化を起こす配列の転写または転写物、または翻訳を実現することを目的として、宿主細胞のゲノムにＤＮＡ配列を挿入するために、これまでに多種多様な方法が開発されている。したがって、効率的な形質転換／トランスフェクションを実現するものであれば、任意の方法を用いてよい。
【００８３】
植物組織に発現ベクターを導入する方法は、当業者には利用が可能であるが、選択される植物に依存する。広く様々な植物種の形質を転換するための手法は周知であり、文献に広く記載されている。例えば、Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ，“Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｐｌａｎｔ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，上記；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２６８（１９９２）；および、Ｗｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）を参照されたい。例えば、ＤＮＡ構築体は、植物細胞のゲノムＤＮＡの中に、下記の技術、例えば、パーティクルガン輸送法、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７）；電気穿孔、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：５８２４（１９８５）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２（１９８４）；直接的遺伝子転送、米国特許第４，６８４，６１１号；および植物細胞のプロトプラスト、または胚性カルスのマイクロインジェクション、Ｃｒｏｓｓｗａｙ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０２：１７９−１８５（１９８５）のような技術を用いて導入してもよい。植物組織を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと共に培養することがもう一つの選択肢となる。この場合、ＤＮＡ構築体は、バイナリーベクターシステムの中に配される。例えば、米国特許第５，５９１，６１６号；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：７４５−７５０（１９９６）を参照されたい。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｒｆａｃｉｅｎｓ宿主の毒性機能は、植物細胞が該細菌によって感染されると、構築体挿入を、植物細胞ＤＮＡに向ける。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６−４９８（１９８４）、およびＦｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：４８０３（１９８３）を参照されたい。
【００８４】
カノーラ形質転換の標準法が、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｕｓｉｎｇ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８：２３８−２４２（１９８９）に記載される。トウモロコシ形質転換が、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：８３３（１９９０）、およびＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  ｅｔ  ａｌ，上記に記載される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは主に双子葉類に使用されるが、いくつかの単子葉類にも使われる。例えば、トウモロコシは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換することが可能である。上記、および米国特許第５，５５０，３１８号を参照されたい。コメ形質転換が、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｃｅ  (Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．)  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ＤＮＡ”Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６（２）：２７１−２８２（１９９４）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２３９（１９９２）；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：６３８９（１９９１）によって記載される。小麦も、トウモロコシまたはコメを形質転換するのに用いられたものと同じ技術によって形質転換することが可能である。ソルガムの形質転換が、Ｃａｓａｓ  ｅｔ  ａｌ，上記に、ソルガムが、Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｃｏｌ．１０４：３７（１９９４）に記載される。大豆の形質転換が、米国特許第５，０１５，５８０号を含めたいくつかの公刊物に記載される。
【００８５】
植物に対するヌクレオチド配列の「導入」に言及する場合、直接形質転換法、例えば、植物組織のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ転換、パーティクルガン発射、電気穿孔、または、当業者に既知の多くの方法のうちの任意の一法によって実行することが可能であること、あるいは、異種ヌクレオチド配列を有する植物を、別の植物と交雑し、かつ、交雑は、子孫が、該ヌクレオチド配列を自身のゲノムの中に組み込むように行われることによって実行されることを意味する。このような育種技術は当業者には周知である。
【００８６】
本発明で用いられる植物育種法は、当業者には周知である。植物育種技術の考察に関しては、Ｐｏｅｈｌｍａｎ（１９８７）Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ．ＡＶＩ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｐｏｒｔ  Ｃｏｎｎ．を参照されたい。本法においてもっとも好ましいと思われる植物の多くが、植物の受粉法を利用する技術によって育種される。
【００８７】
遺伝子を植物に導入するために戻し交雑を用いてもよい。この技術は、形質を植物に導入するために数十年に亘って用いられている。この技術、およびその他の、よく知られた植物育種技術に関する記載例が、例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔ．Ｎｅａｌ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）のような文献の中に見出される。典型的戻し交雑プロトコールでは、対象である、元の変種（反復親）が、転送される、単一の対象遺伝子を担う、第２変種（非反復親）と交雑される。次に、この交雑から得られる子孫は、再び反復親と交雑させられ、この過程が、最終的に、非反復親の、単一転送遺伝子の外に、反復親の、所望の形態学的、生理学的特徴が回収された転換植物が得られるまで繰り返される。
【００８８】
本発明のある実施態様では、トランスジェニック回収法を用いる場合には、雄性不稔植物の、不稔ホモの劣性状態を、植物の数、植え付け、および、このような性質を持つ維持植物に必要な工程を減らしながら、維持することが望ましい。ホモ接合性とは、同一の対立遺伝子が、相同染色体の対応座位に据わっているときに存在する遺伝的状態である。ヘテロ接合性とは、異なる対立遺伝子が、相同染色体の対応座位に据わっているときに存在する遺伝的状態である。半接合性とは、遺伝子（または遺伝子組）の一方のコピーしか存在せず、一つの姉妹染色体の上に対立遺伝子の片割れが据わっていないときに存在する遺伝的状態である。ある実施態様では、ホモの劣性状態は、植物に、対象とする性質を付与するが、これは、劣性遺伝型によってもたらされる、所望の任意の性質、例えば、日照りおよび低温に対する耐性、早熟性、油脂またはタンパク質含量の変化、あるいは、植物育種家にとって興味の対象となる数多くの性質のうちの任意のものであってもよい。一実施態様では、ホモの劣性状態は、植物に雄性不稔性を与える。ホモ接合体状態の機能的補償となる配列（すなわち、ホモ劣性状態を有する植物に導入され、発現されると、野生型状態を回復する配列）をその植物に導入すると、野生型稔性表現型が回復されるために稔性が回復される。
【００８９】
ホモの劣性状態の維持は、植物の中に、その植物の雄性配偶子の機能または形成を妨害する配列と連結した回復トランスジーン構築体を導入し、継代またはドナー植物を生成することによって実現される。回復性トランスジーンは、遺伝的性質についてホモの劣性である植物の中に導入されると、その性質の遺伝機能を回復し、かつ、植物は、劣性対立遺伝子のコピーは含むが、回復トランスジーンは含まない、生存可能な花粉しか生産しない。トランスジーンは、維持植物においてヘミ接合性状態で保存される。トランスジーンとは、遺伝子工学技術によって細胞のゲノムの中に導入される任意の核酸配列を意味する。トランスジーンは、本来のＤＮＡ配列であっても、異種ＤＮＡ配列（すなわち、「外来ＤＮＡ」）であってもよい。本来の生得ＤＮＡ配列という用語は、細胞において自然状態で見出されるが、その元の形から修飾されていてもよい、ヌクレオチド配列を指す。維持植物から得られる花粉は、劣性性質に対してホモの植物を受精するのに使用されるが、この場合、子孫は、そのホモの劣性状態を保持する。回復トランスジーン構築体を含む維持植物は自家受粉によって継代し、得られた種子は、ホモの劣性植物ではあるが、回復性トランスジーン構築体を含む植物をさらに生産するために使用される。
【００９０】
この維持植物は、ホモの劣性を持つ植物に対し花粉ドナーとなる。維持体は、ホモの劣性を持つが、さらに、劣性ホモの対立遺伝子によって形成される性質を回復する意図で、その内部にヌクレオチド配列を導入された植物から生成されるのがもっともよい。さらに、回復配列は、雄性配偶子の機能または形成を妨害するヌクレオチド配列と連結される。この遺伝子は、既知の各種の方法のうちの任意のものではあるが、特定のものに限定されない方法によって、雄性配偶子の形成、または雄性配偶子の機能を阻止するように動作することが可能である。例示として限定する意図なく述べるのであるが、これは、雄性配偶子に対し毒性を持つ産物を発現する遺伝子（例えば、第５，７９２，８５３；５，６８９，０４９号、国際出願ＰＣＴ／欧州８９／００４９５を参照）；雄性配偶子の機能または形成にとって重要な別の遺伝子の産物形成を抑制する遺伝子（米国特許第５，８５９，３４１；６，２９７，４２６号を参照）；配偶子機能または形成を阻止する物質を生産する、別の遺伝子産物と組み合わさる遺伝子（米国特許第６，１６２，９６４；６，０１３，８５９；６，２８１，３４８；６，３９９，８５６；６，２４８，９３５；６，７５０，８６８；５，７９２，８５３号を参照）；雄性配偶子機能または形成にとって必須な遺伝子に対しアンチセンス、または共抑制をもたらす遺伝子（米国特許第６，１８４，４３９；５，７２８，９２６；６，１９１，３４３；５，７２８，５５８；５，７４１，６８４号を参照）；ヘアピン形成の使用によって発現を妨害する遺伝子（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：３１９−３２０；国際公開第９９／５３０５０号および国際公開第９８／５３０８３号を参照）などの使用を含む。花粉形成または機能を抑制する、ヌクレオチド配列は多く知られているが、この機能を実行するものであれがいずれの配列でも十分である。適切な発達または機能に影響を及ぼす可能性のある遺伝子に関する考察が、米国特許第６，３９９，８５６号に含まれるが、このような遺伝子は、否定的優勢遺伝子、例えば、細胞毒遺伝子、メチラーゼ遺伝子、および増殖阻害遺伝子を含む。否定的優勢遺伝子としては、ジフテリア毒素Ａ−鎖遺伝子（Ｃｚａｋｏ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｎ，Ｇ．（１９９１）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ａ  ｉｓ  ｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５  ６８７−６９２．および、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ８０：６８５３（１９８３），Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ５０：４３５（１９８７））；細胞周期分裂突然変異、例えば、トウモロコシのＣＤＣ（Ｃｏｌａｓａｎｔｉ，Ｊ．，Ｔｙｅｒｓ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｕｎｄｅｒｅｓａｎ，Ｖ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐ３４  ｃｄｃ２  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｆｒｏｍ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ”  ＰＮＡＳ  ８８，３３７７−３３８１（１９９１））；ＷＴ遺伝子（Ｆａｒｍｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｌｏｆｔｕｓ，Ｔ．Ｍ．，ＭＩＬＬＳ，Ａ．Ａ��，Ｓａｔｏ，Ｋ．Ｖ．，Ｎｅｉｌｌ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｍ．，Ｔｒｏｎ，Ｔ．，Ｔｒｕｍｐｏｗｅｒ，Ｂ．Ｌ．ａｎｄ  Ｓｔａｎｂｒｉｄｇｅ，Ｅ．Ｇ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３，７２３−７２８（１９９４））；およびＰ６８（Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｐａｌ，Ｊ．Ｋ．，Ｐｅｔｒｙｓｈｙｎ，Ｒ．，Ｋｕｏ，Ｉ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｈｒｏｏｐ，Ｍ．Ｓ．，Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，Ｉ．Ｍ．“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅｓ”ＰＮＡＳ  ８８，３１５−３１９（１９９１））が挙げられる。
【００９１】
いわゆる「細胞傷害性」遺伝子のさらに別の例が、既に上に論じられているが、例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｒｍｉのペクテートリアーゼ遺伝子ｐｅｌＥ（Ｋｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｌ  １６８：５９５（１９８６））；ｃｍｓ−ＴトウモロコシミトコンドリアゲノムのＴ−ｕｒｆ１３遺伝子（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１５３（１９９０）；Ｄｅｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８４：５３７４（１９８７））；細胞膜の破壊をもたらすＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＩｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓのＣｙｔＡ毒素遺伝子（ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：１０１７（１９８７），米国特許第４，９１８，００６号）；ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ（米国特許第５，６３３，４４１号）；プロテアーゼ、または、アンチセンスＲＮＡを発現する遺伝子が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。適切な遺伝子はさらに、雌しべの発達、花粉柱頭相互作用、花粉管成長または受精、またはそれらの組み合わせの抑制に与るタンパク質をコードしてもよい。さらに、花粉における、でん粉の正常な蓄積を妨害するか、または花粉内部の浸透圧バランスに影響を及ぼす遺伝子も好適である可能性がある。
【００９２】
例示の実施態様では、ＤＡＭ−メチラーゼ遺伝子が使用され、上記、ならびに、米国特許第５，７９２，８５２および５，６８９，０４９号で論じられる。この遺伝子の発現産物は、植物のＤＮＡのアデニン残基のメチル化を触媒する。メチル化されたアデニンは、細胞の生存性に影響を及ぼすので、ＤＡＭ−メチラーゼ遺伝子が発現される組織にしか認められない。別の実施態様では、α−アミラーゼ遺伝子が、雄性組織嗜好性プロモーターと共に使用される。穀物種子の初期の発芽時期に、糊粉層細胞がα−アミラーゼを合成し、これが、でん粉の加水分解に参加し、グルコースおよびマルトースを形成し、胚の成長に必要な栄養分を供給する（Ｊ．Ｃ．Ｒｏｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｌｉｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１９）：１２２３４−１２２４０，１９８４；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：３７３１−３７３８，１９８５）。ある実施態様では、使用されるα−アミラーゼ遺伝子は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  α−アミラーゼ−１遺伝子であってもよい。Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  α−ａｍｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ａｌｅｕｒｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍａｉｚｅ  ｓｅｅｄ”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０５（２）７５９−７６０、およびＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｌ２５８０５，ＧＩ：４２６４８１）。α−アミラーゼをコードする配列は、通常、花粉細胞には見られないが、発現が雄性組織に向けられると、花粉粒のエネルギー源の破壊、および花粉発達の減衰が生ずる。
【００９３】
当業者であれば、本明細書に記載される方法は、多家受粉する可能性のある、他の任意の作物に対しても応用が可能であることを直ちに理解するであろう。限定のためではなく例示として述べるのであるが、そのような作物として、トウモロコシ、大豆、ソルガム、または、多家受粉する能力を持つ任意の植物が挙げられる。
【００９４】
通常、劣性状態を持つ植物をより多く生産するには、その劣性植物を、別の劣性植物と交雑させることがある。これは、いくつかの劣性にとっては好ましくなく、かつ、生殖器官の発達に影響を及ぼす劣性の場合には不可能な場合がある。それとは別に、ホモの植物を、回復遺伝子を有する第２の植物と交雑することも可能であるが、これは、回復遺伝子を分離棄却し、再び、劣性の表現型状態を獲得するためには、さらに交雑することを必要とする。代わりに、一つのプロセスとして、ホモの劣性状態を維持しながら、一方では、それを維持植物と交雑することが可能である。この方法は、劣性状態を続けることが望ましい任意の状態において使用することが可能である。これによって、劣性ホモの植物集団を維持するのに比較的操作が簡単で、コスト当たり有効なシステムが得られる。
【００９５】
胞子体遺伝子は、配偶子とは独立に動作するものである。ホモの劣性状態が、雄性胞子体の発達を阻止することによって雄性不稔を招くものである場合、維持植物は、必然的に、その突然変異を補償し、このホモの劣性植物を、生存可能な花粉の生産を可能とさせる、機能回復トランスジーン構築体を含まなければならない。この胞子体回復遺伝子を、その植物の雄性配偶子の機能または形成を妨害する、第２の機能的ヌクレオチド配列と連結することによって、花粉形成または機能を妨害する第２ヌクレオチド配列の作用のために、その本来の座位には胞子体遺伝子の劣性対立遺伝子のみを含む花粉を生産する植物が生成される。この生存可能な花粉分画は、回復トランスジーン構築体に関して非トランスジーン性である。
【００９６】
さらに別の実施態様では、上に論じたマーカー遺伝子が、回復トランスジーンと共に構築体の中に供給されてもよい。限定することなく例示として述べるのであるが、除草剤耐性マーカー、例えば、ｂａｒの使用によって、回復トランスジーンを持たない細胞を除去することが可能となる。さらに別の例では、スコアリング可能なマーカー、例えば、赤色蛍光マーカー、例えば、ＤｓＲｅｄ２を用いた場合、トランスジーンが思いがけず継代されることがあっても、それを視覚的に検出することが可能であり、このような逸出は、子孫から排除される。構築体を回収するには、この外にも多くの変法が当業者に利用可能であることは明らかである。
【００９７】
ある例示の実施態様では、遺伝的座位において雄性不稔植物のホモの劣性状態を維持する方法が提供される。この方法では、雄性稔性の成否を決める遺伝子である第１ヌクレオチド配列、生存性を有する雄性配偶子の機能または形成を抑制する第２ヌクレオチド配列、第１配列に作動可能的に連結され、雄性植物細胞の配列を発現することが好ましい、要すれば任意に設けられる第３ヌクレオチド配列、第４ヌクレオチド配列に作動可能的に連結され、発現を雄性配偶子に向ける、任意の第４ヌクレオチド配列、および、植物の選択を可能とする、選択可能な、またはスコアリング可能な、任意の第５ヌクレオチド配列が用いられる。
【００９８】
例えば、雄性稔性の成否を決める遺伝子である、Ｍｓ４５遺伝子における突然変異においてホモであるために不稔である、雄性不稔な雌性植物を、雑種生産プロセスにおいて使用することが望ましい。このＭｓ４５対立遺伝子突然変異は、ｍｓ４５と表され、ｍｓ４５についてホモである植物（表示ｍｓ４５／ｍｓ４５によって表される）は、劣性ホモの雄性不稔表現型を示し、機能的花粉を生産しない。米国特許第５，４７８，３６９；５，８５０，０１４；６，２６５，６４０；および５，８２４，５２４号を参照されたい。近交系および雑種生産プロセスいずれの場合においても、この劣性ホモ状態を維持することはきわめて望ましい。Ｍｓ４５遺伝子をコードする配列がホモ状態を持つ植物に導入されると、雄性稔性が得られる。本発明の方法では、ｍｓ４５／ｍｓ４５ホモ劣性である植物は、機能的胞子体Ｍｓ４５遺伝子を導入されて、したがって雄性稔性となってもよい。この遺伝子は、回復的トランスジーン構築体を含む花粉を、非機能的とするか、または、その形成を阻止するように働く遺伝子に連結されるか、あるいは、花粉において致命的な産物を生産する遺伝子で、その発現を、雄性配偶子に振り向けるように指令するプロモーターと連結する遺伝子に連結される。その結果、回復的トランスジーン構築体を持たないが、ｍｓ４５は含む花粉しか生産しない植物が得られる。
【００９９】
一例は、５１２６プロモーター、すなわち雄性組織嗜好性プロモーター（米国特許第５，７５０，８６８；５，８３７，８５１；および５，６８９，０５１号を参照）に連結され、さらに、半接合状態においてポリガラクツロナーゼプロモーター、ＰＧ４７プロモーター（米国特許第５，７９２，８５３；５，６８９，０４９号）の調節下に置かれる細胞傷害性ＤＡＭメチラーゼ遺伝子に連結されるＭｓ４５遺伝子を含む構築体である。したがって、得られる植物は、花粉を生産するが、生存可能な花粉は、回復性のＭｓ４５／ＤＡＭメチラーゼ構築体を含まない対立遺伝子から得られ、したがってｍｓ４５遺伝子しか含まない。したがって、このものは、ホモの劣性植物（ｍｓ４５／ｍｓ４５）を受精するための花粉媒体として使用されるが、生産される子孫は、ｍｓ４５に対してホモ接合性を維持するために雄性不稔であり続ける。子孫はまた、導入された回復性トランスジーン構築体を含まない。
【０１００】
さらに別の回復性構築体の例では、Ｍｓ２６遺伝子は、５１２６プロモーターに、さらに、雄性組織嗜好性ＰＧ４７プロモーターの調節下に置かれるＺｅａ  ｍａｙｓα−アミラーゼ遺伝子に連結される。ある実施態様で使用されるスコアリング可能なマーカーは、ＤＳ−ＲＥＤ  ＥＸＰＲＥＳＳである。
【０１０１】
本発明のプロセスの好ましい結果は、回復性ヌクレオチド配列を持つ植物が、自家受粉すること、すなわち、その植物の花粉が、同じ植物の花に転送されて、回復性植物の継代を実現することである。（「自家受粉」という言葉は、花粉を生産する植物が、その同じ花粉によって受精される状況、および、二つ以上の、同一の近交系植物が一緒に植えられて、同一の近交系植物由来の花粉が、異なる、同一近交系植物に授粉する状況を含む）。この花粉は、回復性トランスジーン構築体を持たないが、しかし、構築体は、胚珠（雌性配偶子）の５０％に含まれる。自家受粉によって得られた種子は植えられ、回復性トランスジーン構築体を持つ種子について選択が行われる。この選択プロセスは、多くの既知のプロセスのうちの任意の一つによって行われてよい。もっとも一般的なものは、回復性ヌクレオチド配列が、マーカー遺伝子に連結されるものである。マーカーは、スコアリング可能であっても、選択可能であってもよく、これによって、回復性遺伝子を持つ種子から生産された植物が特定される。
【０１０２】
本発明のある実施態様では、雄性組織嗜好性プロモーターが誘発可能となることが可能とされる。このため、このプロセスにおいて、そのように所望された場合には、回復性ヌクレオチド配列を持つ植物は構成的に雄性不稔となるように、さらに追加の調節をすることが可能となる。このタイプの雄性不稔が、米国特許第５，８５９，３４１号に記載される。植物が稔性を得るためには、誘発物質を供給しなければならず、そこで植物は稔性を持つようになる。再び、上述の本発明のプロセスと組み合わされると、生産される花粉は、回復性ヌクレオチド配列を含まないもののみである。
【０１０３】
案内と例示のために、下記に、さらに詳細な説明を提供するが、これは、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
ｍｓ２６−ｍｓ：：Ｍｕ８の特定と共分離
ミューテーター（Ｍｕ）集団から、多くは雄性不稔であり、花粉を持たない、はみ出した異常な葯を全く、またはほとんど含まない植物について分離された植物群が特定された。雄性不稔は、Ｍｕ要素が、小胞子形成の何らかのステップに与る遺伝子の中にランダムに組み込まれて、小胞子の発現を損傷したという状況から発したものと予想される。雄性不稔突然変異がｍｓ２６＊−ＳＢＭｕ２００と表示される、分離Ｆ２ファミリーの植物を育成し、雄性稔性／不稔性について、前記基準に基づいて分類した。葉のサンプルを取り、次に、雄性稔性・対・雄性不稔性の表現型分類当たり、約２０植物についてＤＮＡを単離した。
【０１０５】
Ｍｕと不稔性の関連を確認するためにサザーン分析を行った。サザーン分析は当業者には周知の技術である。この一般的手法は、植物ＤＮＡを単離すること、制限酵素で切断すること、切断されたＤＮＡを、アガロースゲル上で分子量に応じて分画すること、ナイロン膜に転送して、分離ＤＮＡを固定することを含む。次に、これらの膜を、Ｐ３２Ｐ−ｄＣＴＰによって放射性標識されたプローブ断片とハイブリダイズさせ、ＳＤＳ液中で洗浄する。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｍｏｎｇ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７（１９７５）。分離Ｆ２  ｍｓ２６＊−ＳＢＭｕ２００ァミリーの植物を育成し、雄性稔性／不稔性について分類した。葉サンプルの採取、およびその後のＤＮＡ単離を、表現型分類当たり２０個の植物について行った。５個の稔性、および１２個の不稔性植物からのＤＮＡ（〜７ｕｇ）を、ＥｃｏＲＩで消化し、０．７５％アガロースゲルを通じて電気泳動した。消化されたＤＮＡは、サザーン転送によってナイロン膜に転送した。膜は、Ｍｕ８トランスポゾンから得られた内部断片とハイブリダイズさせた。膜のオートラジオグラフィーによって、図１に示すように、約５．６ＫｂのＥｃｏＲＩ断片と、不稔性表現型とが共分離することが明らかになった。このＥｃｏＲＩバンドは、稔性植物では分離した。これは、この対立遺伝子ついてヘテロの野生型状態であることを示唆する。
【０１０６】
実施例２
ライブラリー構築、スクリーニング、およびマッピング
ゲノムライブラリースクリーニング・プロセスは、当業者には広く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９）に記載される。ライブラリーは下記のようにして作製された。
【０１０７】
不稔性植物のＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、予備的ゲルの上を走らせた。５．０から６．０Ｋｂの分子量を持つＤＮＡをゲルから切り出し、電気溶出し、エタノール沈殿させた。このＤＮＡを、メーカーのプロトコールに従ってラムダＺａｐベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））に連結した。この連結ＤＮＡを、Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を用いてファージ粒子にパックした。約５００，０００ＰＦＵをプレートに撒き、ニトロセルロース膜に移した。膜を、Ｍｕ８プローブとハイブリダイズさせた。３回のスクリーニングによって純粋クローンが得られた。ファージから挿入体をプラスミドとして切り出し、ＳＢＭｕ２００−３．１と表示した。このクローンからＰｓｔＩ境界断片を単離し、これを用いて、図２Ｂに示すように、元のＥｃｏＲＩ共分離ブロットにプローブを再度適用した。約５．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は、全ての不稔性植物においてホモ接合体であった。これは、正しいＭｕ断片が単離されたことを裏付ける。稔性植物の内３例が、５．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩバンドおよび４．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩバンドに対してヘテロである。稔性植物の内２例は、４．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩバンドに対してホモである。恐らく野生型対立遺伝子と考えられる。
【０１０８】
Ｐｓｔｌプローブを用いて、ＲＦＬＰマッピング集団におけるｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００突然変異のマッピングを行った。この突然変異は、染色体１の短腕で、雄性不稔座位、Ｍｓ２６の近くにマップされた（Ｌｏｕｋｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ  ８２，１０１７−１０２３）。ｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００が、ｍｓ２６−ｒｅｆの対立遺伝子であるかどうかを調べるために、花粉ドナーとして既知のヘテロ接合体を用いて、ｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００とｍｓ２６−ｒｅｆとを互いに交雑させた。試験交雑子孫は、雄性不稔植物と野生型植物を１：１比で分離した。これは、ｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００とｍｓ２６−ｒｅｆの間の対立性を示す。このｍｓ＊−ＳＢＭｕ２００は、ｍｓ２６−ｍｓ：：Ｍｕ８と表示された。マップ位置を図１３に示す。
【０１０９】
実施例３
追加ｍｓ２６対立遺伝子の特定およびクローニング
Ｍｓ２６におけるさらに別のＭｕ挿入突然変異が、Ｍｕに対するプライマー、およびＭｓ２６に対する遺伝子特異的プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い、Ｍｕ  Ｆ１ファミリーをスクリーニングすることによって特定された。このＰＣＲ産物の配列分析から、三つのＭｕ挿入体は全て第２エキソン内に出現することが示された。これらのファミリーから得られたＦ２種子を育成し、雄性稔性／不稔性について調べた。このファミリーのサザーンブロット分析から、Ｍｓ２６におけるＭｕ挿入体と、雄性不稔表現型との共分離が確認され、この対立遺伝子は、ｍｓ２６−ｍ３：：Ｍｕと表示された。
【０１１０】
Ｌｏｕｋｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｂｏｔ  ８２，１０１７−１０２３に記載され、ｍｓ２６−ｒｅｆと表示されるｍｓ２６対立遺伝子についても調べた。ｍｓ２６−ｒｅｆにおける突然変異を分析するために、Ｍｓ２６ゲノム配列を、ｍｓ２６−ｒｅｆ不稔性および稔性植物からクローンした。Ｍｓ２６は、〜４．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片として、ｍｓ２６−ｒｅｆは、〜６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩ断片としてクローンされ、不稔性植物から〜２．３ｋｂの重複ＥｃｏＲＩ断片があった。配列分析から、図１に示すｍｓ２６−ｒｅｆ対立遺伝子の最後のエキソンに新規セグメント（１，４３０ｂｐ）の存在が明らかとなった。この挿入要素に側接するのは、８ｂｐの宿主部位重複（ＧＣＣＧＧＡＧＣ）であることが認められ、この要素はさらに、１５ｂｐの末端逆転反復列（ＴＩＲ）（ＴＡＧＧＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧ；配列番号２３９）を含んでいた。図１５にこのトランスポゾン配列を示す（配列番号１０）。ｍｓ２６−ｒｅｆの変異種も見出された。この対立遺伝子、ｍｓ２６’−０４０６と表示される、はｍｓ２６−ｒｅｆ対立遺伝子の最後のエキソンに見られる１４３０ｂｐセグメントを欠くが、挿入部位において８ｂｐの足跡を残していることが認められた。このｍｓ−２６’−０４０６対立遺伝子についてホモの植物は、雄性不稔であった。欠損対立遺伝子、ｍｓ２６’−０４０６（配列番号８）と、野生型Ｍｓ２６遺伝子（配列番号９）の領域との比較を図１４に示す。
【０１１１】
実施例４
発現分析およびｃＤＮＡ分離
小胞子発生の種々の段階における葯に特徴的な遺伝子の発現を検出するためにノーザン分析を用いることが可能である。ノーザン分析も、当業者には既知の広く使用される技術で、ＤＮＡではなくｍＲＮＡが分離されてゲルの上に載せられることを除いては、サザーン分析と同様である。次に、ＲＮＡは、標識プローブにハイブリダイズされる。Ｐｏｔｔｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｙｒｏｔｒｏｔｒｏｐｉｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｅｘｅｒｔｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｔｏ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６６２−６６６６（１９８１）；Ｌｅｃｈｅｌｔ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌｏｗｓ，”Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１９：２２５−３４（１９８９）。ＳＢＭｕ２００−３．１クローンから得られたＰｓｔＩ断片を、種子、未熟雌穂、実生、および花穂のＲＮＡを含むノーザンブロットのプローブに用いた。図３に反映されるように、小胞子発生のほぼ４分子段階の花穂ＲＮＡにのみ信号が見られた。この転写物は約２．３ｋｂ長であった。同じプローブを用いて、減数分裂期から後期単一核期の葯から単離されたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。一つのクローン、Ｍｓ２６−８．１と表示される、がこのライブラリーから単離された。
【０１１２】
実施例５
配列と発現分析
ＳＢＭｕ２００−３．１ゲノムクローンおよびＭｓ２６−８．１ｃＤＮＡクローを、Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄに配列決定してもらった。Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｅｎ，Ｓ．，Ｃｏｕｌｓｏｎ  Ａ．Ｒ．（１９７７）“ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７。これらの配列を図４と５に記載する。比較は図６に載せる。ｃＤＮＡ／ゲノム比較は、ゲノムクローンの中には５個のイントロンがあることを明らかにする。Ｍｕ８の挿入はエキソン１で起こっている。各コドンの第３位置におけるコドンの優勢および非ランダム性について試験したところ、ｃＤＮＡの主要ＯＲＦは、予想されるタンパク質コードＯＲＦと一致した。ゲノムクローンの位置１０８９にＭｅｔ開始コドン候補が存在する。ゲノムクローンに関するｃＤＮＡ相同性は、ヌクレオチド１０９４から開始する。したがって、Ｍｓ２６−８．１は、完全長クローンを表すものではなく、Ｍｅｔ開始コドン候補までの５塩基を欠く。データベース探索から、酵母、植物、および哺乳類に見出されるＰ４５０に対し有意の相同性を示した。Ｐ４５０酵素は、広く研究され、三つの特徴的タンパク質ドメインが明らかにされている。Ｍｓ２６タンパク質は、真核細胞のＰ４５０に特徴的な、いくつかの構造的モチーフを含む。その中には、ヘム結合ドメインＦｘｘＧｘＲｘＣｘＧ（ドメインＤ、配列番号２４）、ドメインＡ  Ａ／ＧＧＸＤ／ＥＴＴ／Ｓ（ジオキシゲン−結合性）、ドメインＢ（ステロイド−結合性）、およびドメインＣが含まれる。ＭＳ２６では、高度に保存されるヘム結合性モチーフが、Ｃ末端から５１アミノ酸離れたところにＦＱＡＧＰＲＩＣＬＧ（配列番号２５）として見つかった。ジオキシゲン結合ドメインＡＧＲＤＴＴ（配列番号２６）は、アミノ酸３２０−３２５の間に配されていた。ステロイド結合性ドメインは、ＬＶＹＬＨＡＣＶＴＥＴＬＲ（配列番号２７）アミノ酸３９７−４０９と認められた。Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースにおいて検出されたもっとの有意性の高い相同配列は、コメから演繹されたタンパク質配列である（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセス番号、１９０７１６５１）。２番目に相同性が高い配列は、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＰ４５０遺伝子候補（ＣＹＰ７０４Ｂ１）である。この機能も未知である。図１７Ａは、ＣＹＰ７０４Ｂ１（配列番号１２）と、Ｍｓ２６（配列番号１３）との配列整列を示す。いくつかのＰ４５０遺伝子の系統樹分析を行ったところ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＶｉｃｉａ  ｓａｔｉｖａに認められる、脂肪酸オメガ−ヒドロキシル化に与るＰ４５０にもっとも近縁であることが明らかになった。ｍｓ２６’−０４０６欠失突然変異において誘発された翻訳フレームシフトが、ヘム結合ドメインの活性を破壊し、不稔性をもたらしたと考えられる。図１８の比較を参照されたい（Ｍｓ２６  ｃＤＮＡは配列番号１４；稔性エキソン５領域は配列番号１５、および、不稔性エキソン５領域は、配列番号１６）。
【０１１３】
さらに、小胞子発生の別々の段階で、ｍＲＮＡを含むノーザン標本に対し、Ｍｓ２６  ｃＤＮＡを用いて発現実験を行った。図７Ａは、根（１）、葉（２）、皮（３）、穂軸（４）、雌穂小棘（５）、細毛（６）、未熟胚（７）、成熟胚（８）、および稔性植物の花穂（９）、ｍｓ２６−ｍｓ：：Ｍｕ８不稔性植物の花穂（１０）、ｍｓ２６−ｒｅｆ不稔性植物の花穂（１１）、および稔性植物の花穂（１２）を含む種々の組織から得られたＲＮＡサンプルとのノーザンブロットを示す。Ｍｓ２６  ｃＤＮＡによるハイブリダイゼーション信号は、雌穂組織にのみ検出された。図７Ｂは、小胞子発生の別々の段階においてｍＲＮＡを含むノーザンブロットを示す。Ｍｓ２６  ｃＤＮＡによるハイブリダイゼーション信号は、減数分裂ＩＩ／４分子段階（４）から後期単一核段階（１０）まで検出され、最大信号は、早期単一核から後期単一核段階（１０）において観察された。
【０１１４】
実施例６
プロモーターとその必須領域の特定
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ．４．８．１−４．８．５（１９８７）に記載されるように、プライマー伸長分析を行うことによってＴＡＴＡボックス候補を特定した。
【０１１５】
葯遺伝子の調節領域、例えば、プロモーターは、機能的分析によってゲノムサブクローンにおいて特定され、通常、葯組織のリポーター遺伝子発現、および、非葯組織におけるリポーター遺伝子発現の低レベルまたは欠如を観察することによって確かめられる。翻訳開始部位の「上流」または５’方向に存在する調節領域の可能性を、その上流領域を含むＤＮＡ断片を発現ベクターにサブクローンし、一過性発現実験をすることによって調べた。短いサブゲノム断片の方が、雄性組織嗜好性発現にとって必須の領域を含むことが予想される。例えば、ＣａＭＶ  １９Ｓおよび３５Ｓプロモーターは、米国特許第５，３５２，６０５号に記載されるように、長い断片から得られた比較的短い断片において特定された。
【０１１６】
機能的発現を調べるのに適切なベクターの選択は、宿主、および、その発現ベクターの宿主への導入法に依存するが、そのような方法は、当業者にはよく知られる。真核細胞では、ベクターの領域は、転写の開始を調節し、処理を調節する領域を含む。これらの領域は、リポーター遺伝子、例えば、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはルシフェラーゼをコードするＵｉｄＡに作動可能的に連結される。植物発現ベクターおよびリポーター遺伝子の一般的説明および実例は、Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．８９−１１９（１９９３）に見出すことができる。ＧＵＳ発現ベクターおよびＧＵＳ遺伝子カセットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州から市販されており、一方、ルシフェラーゼ発現ベクターおよびルシフェラーゼ遺伝子カセットは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウィスコンシン州から市販されている。Ｔｉプラスミド、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクターは、Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．１４：ｐｐ．７４５−７５０；（１９９６）、および米国特許第５，５９１，６１６号、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ”（１９９４）に記載される。
【０１１７】
ゲノム断片の中に調節領域候補を含む発現ベクターは、自然の組織、例えば、葯、胚、またはカルスの中に導入することが可能である。ＤＮＡ輸送法としては、パーティクルガン照射法、ＤＮＡ注入、電気穿孔、およびＡｇｒａｂａｃｔｅｒｉｕｍ−介在性遺伝子転送法（Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、およびＩｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｖｏｌ．１４：ｐｐ．７４５−７５０；（１９９６）が挙げられる。植物細胞培養の一般的方法は、Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．上記、およびＧｌｉｃｋ，上記の中に見出される。
【０１１８】
一過性アッセイシステムでは、単離された葯が、直ちに花穂培養媒体に置かれる（Ｐａｒｅｄｄｙ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｐｅｔｅｌｉｎｏ，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．Ｊ．；Ｖｏｌ．２９；ｐｐ．１５６４−１５６６；（１９８９））、０．５％Ｐｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス）、または他の固化媒体によって固化される。発現ベクターＤＮＡは、５時間以内に、好ましくは、１０００−１１００Ｐｓｉで１．２μｍのパーティクルを照射するパーティクルガン輸送法によって導入される。ＤＮＡ輸送後、葯を、同じ花穂培養媒体にて２６℃で１７時間インキュベートし、全体組織ホモジェネートを調製し、ＧＵＳ、またはルシフェラーゼ活性について定量することによって分析する。
【０１１９】
Ｍｓ２６の予想される翻訳開始コドンの上流に、１０８８ｂｐのＤＮＡが、ゲノムクローンｍｓ２６−ｍｓ：：Ｍｕ８の中に存在した。このＤＮＡ断片が、照射植物組織の一過性発現アッセイにおいてプロモーター活性を示すかどうかを調べるために、ルシフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼをコードするリポーター遺伝子によって、挿入ＮｃｏＩ部位を介して翻訳融合が形成された。活性は、葯には証明されたが、子葉鞘、根、およびカルスには見られなかった。これは、葯嗜好性か、または葯特異的プロモーター活性を示唆する。
【０１２０】
翻訳開始コドンの約８３−７７ｂｐ上流に、ＴＡＴＡボックス相当と思われるものが目視で観察された。したがって、ゲノムクローンｍｓ２６−ｍ２：：Ｍｕ８は、予想されるＴＡＴＡボックスの上流に約１００５ｂｐを含む。典型的植物遺伝子では、転写の開始は、ＴＡＴＡボックスの２６−３６ｂｐ下流にある。そうなると、Ｍｓ２６  ｍＲＮＡは、約４８−５８ｎｔの、５’−非翻訳リーダーを持つことになる。このようにして、非翻訳リーダー、転写開始、ＴＡＴＡボックス、およびＴＡＴＡボックスの上流配列を含む、全長１０８８ｂｐの、ｍｓ２６−ｍ２：：Ｍｕ８サブゲノム断片が、プロモーター活性に十分であることが示された。配列番号５の図８を参照されたい。ＴＡＴＡボックス候補（ＴＡＴＡＴＣＡ）に下線を施す。このようにして、本発明は、配列番号５のヌクレオチド配列（または、配列同一性を持つもの）を持ち、雄性組織嗜好性調節領域の機能を持つＤＮＡ分子を含む。
【０１２１】
この調節領域の５’および３’末端の両方から欠失分析を行うことが可能である。部位指定突然変異誘発によって断片を得、突然変異誘発はポリメラーゼ連鎖反応などを用いて行う（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；（１９９１））。この雄性組織嗜好性調節領域の３’末端は、ＴＡＴＡボックス候補の近傍性、または要すれば３’欠失によってその境界を定めることが可能である。次に、必須領域を、選択したコアプロモーターに作動可能的に連結させてもよい。一旦必須領域が特定されたならば、外来遺伝子の転写は、Ｍｓ２６の雄性組織嗜好性領域、プラスコアプロモーターによって調節されてもよい。このコアプロモーターは、既知の任意のコアプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ、または１９Ｓのプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５号）、ユビキチン（米国特許第５，５１０，４７４号）、ＩＮ２コアプロモーター（米国特許第５，３６４，７８０号）、またはゴマノハグサモザイクウィルス・プロモーター（Ｇｒｕｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｇｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．８９−１１９（１９９３））などのプロモーターのうちのいずれであってもよい。好ましくは、プロモーターは、雄性組織嗜好性遺伝子のプロモーターか、または、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターである。より好ましくは、プロモーターは、雄性組織嗜好性遺伝子のプロモーター、特に、Ｍｓ２６コアプロモーターである。
【０１２２】
さらに、例えば、従来技術で周知の方法であるリンカー走査法によって突然変異分析を行うことによって、葯嗜好性発現に必要な配列を含む短いセグメントが特定された。これらの突然変異は、発現レベル、発現タイミング、または発現組織のような、機能性における修飾を導入する可能性がある。突然変異はまた、サイレントであり、観察される結果を持たない可能性もある。
【０１２３】
上述の手法を用いて、Ｍｓ２６プロモーターの必須領域を特定した。図９に示すように、プロモーターをルシフェラーゼマーカー遺伝子に連結させた後、欠失分析を、ＴＡＴＡボックス候補の上流のプロモーター領域に対して行った。棒グラフのｘ−軸は、プロモーターの５’末端から始めた一連の欠失誘導体において保持される、ＴＡＴＡボックス候補のすぐ上流の塩基対の数を示す。ｙ−軸は、全長のプロモーター活性のパーセントで表した、正規化ルシフェラーゼ活性を示す。
【０１２４】
グラフから明らかなように、葯の一過性発現には、ＴＡＴＡボックスのすぐ上流約１７６ｂｐが、コアプロモーター（ＴＡＴＡボックスから転写開始まで）、プラス５’非翻訳リーダーと結合されると、十分であった。一方、５’末端から、ＴＡＴＡボックス候補の９１ｂｐ上流までさらに欠失されると、ルシフェラーゼ活性は最小となった。ＴＡＴＡボックス候補上流の非翻訳リーダーまでの、この１７６ｂｐは最小プロモーターと考えることができる。これはさらに図１０に表される。ＴＡＴＡボックスには下線を施す。全長プロモーター内部の、ＴＡＴＡボックスに対し−１７６から−９２を欠失させると、活性を、野生型の約１％に下げた。−３９から−８まで欠失させても活性はあまり下がらなかった。−１７６から−４４ｂｐの領域が、必須領域であり、プロモーターに葯発現を付与する、上流エンハンサー領域を構成すると考えられる。我々はこれを「葯ボックス」と呼ぶ。
【０１２５】
９−１０ｂｐずつ増やしながらこの葯ボックスを横断して、リンカー走査分析を行った。この領域のリンカー走査置換の位置を図１０に示し、野生型配列と比較した突然変異の発現レベルを図１１に示す。葯の一過性発現に対するもっとも過激な作用は、ＴＡＴＡボックス候補の上流の５２−７１ｂｐにおける突然変異ＬＳ１２およびＬＳ１３において観察された。葯の一過性発現に対する大きな作用が、ＴＡＴＡボックス候補の上流８２−１３１ｂｐ内の、突然変異ＬＳ０６、ＬＳ０７、ＬＳ０８、およびＬＳ１０においても観察された。これから、葯の一過性発現の野生型レベルに必要な、葯ボックス内の配列は、ＴＡＴＡボックス候補に対し−５２から−１３１ｂｐ、特に−５２から−７１の領域にあることが示された。必須領域は、配列番号６（図１０）に示され、ゲノム配列、配列番号７（図５）と比較した場合、塩基１−１０８８；８３０−９６２；８３０−９１４；９１７−９６２；８７５−９５４；９３５−９５４；および８７５−９２４でる。
【０１２６】
実施例７
Ｍｓ２６ソルガム、コメ、およびトウモロコシの比較
前述したように、Ｍｓ２６は、トウモロコシにおける雄性稔性遺伝子である。これが突然変異を起こし、ホモの劣性になると、雄性の不稔となる。ソルガムにおいて、Ｍｓ２６のオーソログが特定された。Ｍｓ２６  ｃＤＮＡのソルガムオーソログは、ソルガム花穂のｃＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応においてトウモロコシＭｓ２６遺伝子のプライマーを用いることによって単離された。得られたｃＤＮＡ断片を、上述の方法によって配列決定し、トウモロコシのＭｓ２６  ｃＤＮＡと比較した。ヌクレオチド配列比較を、図１２に示すが、９０％の同一性を示す。コメのオーソログも特定され、予想コード配列（配列番号１７）およびタンパク質配列（配列番号１８）が図１９に示される。コメのオーソログは、トウモロコシおよびソルガムのＭｓ２６よりも１イントロン少なく、コード配列が高度に保存される。
【０１２７】
ソルガムおよびコメのプロモーターの特定が実現された。図２０は、トウモロコシ（配列番号５）、ソルガム（配列番号１９）、およびコメ（配列番号２０）の整列を示す。図示の、トウモロコシプロモーターの最後の３個の塩基は、翻訳のＡＴＧ開始点である。
【０１２８】
図２１に、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２）、コメＭｓ２６タンパク質（配列番号１８）、ソルガムＭｓ２６タンパク質（配列番号４）、および、共通配列（配列番号２１）の整列を示す。タンパク質配列の比較から、これらのオーソログの間でタンパク質が高度に保存されること、コメのタンパク質は、トウモロコシのオーソログに比べ９２％の類似性、および８６％の同一性を共有することが示された。コメおよびソルガムの予想される組織特異性は、円錐花序（花）ライブラリーから得られた、ソルガムおよびコメのＥＳＴデータベースにおけるＭｓ２６タンパク質の比較においても見られた。有意な整列を示すソルガムの配列（特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｂ１０７５４４１．１；Ｂ１０７５２７３．１；Ｂ１２４６０００．１；Ｂ１２４６１６２．１；ＢＧ９４８６８６．１；Ｂ１０９９５４１．１；およびＢＧ９４８３６６．１）は全て、ソルガムの未熟な円錐花序から得られた配列であった。コメにおいて有意な整列を示す配列（特に、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｃ７３８９２．１；ＣＲ２９０７４０．１）も、コメの未熟な円錐花序由来のものであった。
【０１２９】
上記から明らかなように、Ｍｓ２６遺伝子、ｍｓ２６−ｍ２：：Ｍｕ８、およびその対立遺伝子と同じ部位において、Ｚｅａ  ｍａｙｓゲノムの、染色体１の短腕にマップされるヌクレオチド配列は、植物における稔性を左右する遺伝子である、すなわち、植物の稔性に必要なものであり、稔性植物に認められる配列から突然変異した場合、その植物に不稔をもたらす。
【０１３０】
実施例８
選択可能なマーカー、雄性不稔遺伝子Ｍｓ４５、および花粉傷害性遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
図２２に示す、ＰＨＰ１８０９１と表示される構築体を、下記のＤＮＡ成分を集合することによって作製する。
１．  プラスミドｐＳＢ１１バックボーンＤＮＡ（３５ＳＧＵＳおよび３５ＳＢＡＲ遺伝子を担うＥｃｏＲＩ断片を欠くｐＳＢ３１、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．(１９９６)１４：７４５−７５０）。このＤＮＡバックボーンは、ｐＢＲ３２２由来のＴ−ＤＮＡ境界部配列、および複製起点を含む。
２．  カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、およびターミネーター（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８０，Ｃｅｌｌ２１：２８５−２９４のそれぞれ、ヌクレオチド６９０８−７４３２および７４３９−７６３２；配列番号２３および配列番号２４）の転写調節の下における、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｏｍａｇｅｎｅｓの、酵素フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）（アクセス番号Ａ０２７７４のヌクレオチド６−５５７、Ｓｔｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第０２７５９５７−Ａ；配列番号２２）をコードする３５Ｓ：ＰＡＴ遺伝子。
３．  トウモロコシ葯特異的プロモーター５１２６（ヌクレオチド９８５−１４９０、アクセス番号１７５２０４；配列番号２６）の調節の下における、トウモロコシ雄性稔性遺伝子のコード領域を含む５１２６：Ｍｓ４５遺伝子（ヌクレオチド１３９２−３３４３、アクセス番号ＡＦ３６０３５６、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．（１９９３）８０：１６；配列番号２５）。
４．  トウモロコシ花粉特異的プロモーターＰＧ４７（ヌクレオチド１−２８７０、アクセス番号Ｘ６６６９２、Ａｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｎｓｄａｌｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．(１９９３)３：２６１−２７１；配列番号２７）によって駆動される、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ（アデノシン−Ｎ６）メチルトランスフェラーゼ（ＤＡＭ）のコード領域を含むＰＧ４７：ＤＡＭ。この遺伝子の転写は、じゃがいもプロテイナーゼ阻害剤ＩＩ（ＰｉｎＩＩ）ターミネーター（ヌクレオチド２−３１０、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１１５−１２２；配列番号２８）によって終息される。
５．  Ｍｓ４５：Ｍｓ４５を含む、３．３４ｋｂ  ＮｃｏＩ  ＤＮＡ断片が、ｐＵＣ８において３５Ｓ：ＰＡＴの上流においてクローンされ、ＰＨＰ６６４１を作製した。ＰＨＰ６６４１から得られたＭｓ４５：Ｍｓ４５−３５Ｓ：ＰＡＴを含む、４．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片をｐＳＢ１１にクローンして、ＰＨＰ１０８９０を作製した（Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）１４：１３５−１４２）。ＰＨＰ１０８９０における、天然のＭｓ４５プロモーターを、トウモロコシ５１２６プロモーターを含む、５２８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ断片と置換して、ＰＨＰ１１９４３を作製した。
６．  ＰＧ４７プロモーターを含む２．８７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＤＡＭコード領域、ＰｉｎＩＩターミネーター、および、ＰＨＰ１０４０４から得られた３５Ｓエンハンサー（Ｕｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．（２００１）１０：４０９−４２２）を含む、０．８ｋｂのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、ＰＧ４７：ＤＡＭ遺伝子融合（３５Ｓエンハンサーと共に）を含む、３．６７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を作製した。次に、この３．６７ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＰＨＰ１１９４３のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンし、ＰＨＰ１８０７１を作製した。このＰＨＰ１８０７１を、プラスミドｐＳＢ１を担うＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＬＢＡ４４０４の中に、３親交配によって導入した（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４：７４５−７５０）。この、ＰＨＰ１８０７１およびｐＳＢ１の共同組み込み体をＰＨＰ１８０９１と名づけた。
【０１３１】
実施例９
実施例８の回復性トランスジーン構築体によるトウモロコシの形質転換
ｍｓ４５の突然変異、Ａｃ切り出し対立遺伝子ｍｓ４５’−９３０１（ｍｓ４５）に対してホモである雄性不稔の雌を、Ｈｉ型ＩＩのトウモロコシ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  １９９４，Ｉｎ：Ｆｒｅｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ（ｅｄｓ）．Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ６６３−６７１）から得られた大量の花粉と繰り返し交雑させたところ、複数世代に亘って形質転換感受性のトウモロコシ胚形質の中にこのｍｓ４５対立遺伝子の移入が行われた。この、形質転換用材料供給源は、ｍｓ４５について（１：１または３：１）で分離する胚から成り、ホモのｍｓ４５背景への直接的転換、および、Ｔ０植物におけるｍｓ４５突然変異に対する遺伝的補償試験の両方を可能とした。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在性形質転換は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，（米国特許第５，９８１，８４０号）に従って実行した。形質転換体の遺伝子型決定および分子分析（組み込みおよびＰＴＵ）は、Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）１４：１３５−１４２）に従って行った。単一組み込みと完全なＰＴＵを持つ形質転換体をその後の研究に選んだ。
【０１３２】
実施例１０
トウモロコシ形質転換体の分析
実施例９のトランスジェニック植物（Ｔ０）を、植物全体の形態について評価し、花粉と卵細胞の両方におけるトランスジーンの伝達について分析した。雄性不稔の程度を除いては、トランスジェニック植物と、非トランスジェニックコントロール植物の間には全く形態的差は認められなかった。単一組み込みおよび完全ＰＴＵを持つ形質転換体は、部分的雄性稔性であったが、一方、非トランスジェニックコントロール植物は、完全な雄性不稔であり、Ｍｓ４５遺伝子の発現が、ｍｓ４５ホモ劣性の、雄性不稔表現型を補償することを示した。この分析はさらに、ＤＡＭ遺伝子の発現が、トランスジーンを担う花粉粒を排除することによって部分的雄性不稔を招くことも示した。ＤＡＭ遺伝子が無いと、Ｍｓ４５トランスジーンは、ｍｓ４５の雄性不稔突然変異を完全に回復させる（Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）１４：１３５−１４２）。ＤＡＭ遺伝子の適切な機能はさらに、Ｔ０トランスジェニック植物と、非トランスジェニック植物の間の、調節された受粉によって決定された。受粉後１８日目に、これらの非トランスジェニック植物の花穂から未熟な胚を採取し、ＭＳ媒体、または３．０ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含むＭＳ媒体において培養した（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ（１９６２）１５：４３７−４３９）。１００％の胚が、対照媒体において発芽することができたが、一方、３ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含む媒体では胚のいずれも発芽することができなかった。これは、回復遺伝子が、花粉から子孫に伝えられなかったことを示す。
【０１３３】
さらに、非トランスジェニック植物由来の花粉を用いて、Ｔ０トランスジェニック維持植物を授粉した。授粉１８日後に、これらのＴ０トランスジェニック維持植物の花穂から未熟胚を採取し、前述のコントロール媒体、または、３ｍｇ／Ｌのビアラフォスを含む媒体において培養した。コントロール媒体では全ての胚が発芽したが、一方、ビアラフォスを含む媒体では、胚の５０％が発芽することが可能であった。これは、回復遺伝子構築体が、予想された頻度で胚珠から子孫へ伝えられたことを示す。胚救済の結果を表１および２にまとめる。
【０１３４】
【化３】
2008543341.tif 000005
【０１３５】
【化４】
2008543341.tif 000006
実施例１１
Ｔ０植物の、各種近交系への変換およびＴｎ植物の分析
近交系、例えば、ＰＨ０９Ｂの授粉によるもどし交雑の繰り返しにより、実施例９のＴ０維持植物を、種々の近交系背景に変換した。これを実現するために、ｍｓ４５ヘテロ背景を持つＰＨ０９Ｂによって生産された花粉を用いて、ｍｓ４５突然変異対立遺伝子についてホモであるＴ０維持植物の花穂に授粉した。これらのＴ０植物から採取したＴ１種子は、トランスジーンと、ｍｓ４５対立遺伝子の両方について分離した。回復トランスジーン構築体を含まないＴ１植物は、除草剤選択によって除去した。トランスジーンを含むＴ１植物を、Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．，（２００１）１４：１３５−０１４２）に従って、ｍｓ４５背景、および雄性稔性に関して分析した。一般に、回復トランスジーン構築体を含み、ホモのｍｓ４５状態を持つＴ１植物は、Ｔ０植物において観察されたと同様の部分的雄性不稔性を示したが、一方、ホモのｍｓ４５状態を持つが、トランスジーンを含まないＴ１植物は、完全に雄性不稔性であった。このことは、Ｍｓ４５トランスジーンが、異なる遺伝的背景においても適正に機能し続けたことを示す。Ｔ１植物の花粉粒を、顕微鏡および組織化学的染色を用い生存性について調べた。種々の発達段階における花粉粒を採取し、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）、４’、６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、および臭化エチジウム（ＥＢ）で染色した。トランスジェニックＴ１植物から得られた花粉粒の約５０％は、花粉の第１減数分裂後に、ＦＤＡによる染色後の蛍光が見られないことから判断して生存性を失った。一方、非トランスジェニックコントロールからの花粉粒は、均一なＦＤＡ染色を示した。この所見はさらに、インビトロ花粉発芽実験によって支持された。トランスジェニックＴ１植物から得られた花粉粒の発芽率は、非トランスジェニックコントロール植物のものの約半分であった。さらに、花粉からのトランスジーンの伝達を調べるために、トランスジェニックＴ１植物の花粉粒を用いて、非トランスジェニック植物に授粉した。例えば、Ｔ１植物（２０１１８９５４）によって授粉された非トランスジェニック植物から得られた２４８個の胚のいずれも、３ｍｇ／ｌのビアラフォスを含む媒体において発芽することができなかった。これらの実験は、Ｍｓ４５およびＤＡＭトランスジーンのいずれも、異なる遺伝的背景の下で適正に機能することを裏付けた。突然変異ｍｓ４５対立遺伝子についてヘテロの、父方近交系親から得た花粉を用いて、所望の性能を持つＴ１植物について、次の戻し交雑反復実験を行った。このプロセスを第６世代が得られるまで繰り返した。
【０１３６】
実施例１２
実施例８の構築体による、大規模伝達およびｍｓ４５雄性不稔の維持
実施例９に記載されるようにＴ０  １４０８９２７７から得られたＴ１植物を雄性として用い、野生型近交系植物、またはｍｓ４５／ｍｓ４５雄性不稔近交系植物のいずれかを授粉した。野生型交雑から得られた１０，１１７個のＴ２子孫、および、ｍｓ４５／ｍｓ４５交雑から得られた６６８８個のＴ２子孫を、除草剤耐性に関してスクリーニングすることによってトランスジーンの伝達について評価した。二つの交雑型について、合計１６７８６個のＴ２植物が、除草剤感受性であることが判明した。これは、９９．８９％の非伝達頻度をもたらす。トランスジーンを含まない、ｍｓ４５／ｍｓ４５交雑から得られたＴ２植物は全て、完全に雄性不稔であった。これは、このトランスジェニック系統は、ｍｓ４５不稔性を維持することを示す。
【０１３７】
実施例１３
スクリーニング可能マーカー、雄性稔性遺伝子Ｍｓ２６、および花粉傷害性遺伝子を含む植物形質転換ベクターの構築
図２３に示す、ＰＨＰ２４１０１と表示される構築体は、下記のＤＮＡ成分を集合することによって構築される。
１．  プラスミドｐＳＢ１１バックボーンＤＮＡ（３５ＳＧＵＳおよび３５ＳＢＡＲ遺伝子を担うＥｃｏＲＩ断片を欠くｐＳＢ３１、Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．(１９９６)１４：７４５−７５０）。このＤＮＡバックボーンは、ｐＢＲ３２２由来のＴ−ＤＮＡ境界部配列、および複製起点を含む。
２．  図２４に記載するＺｅａ  ｍａｙｓの、α−アミラーゼ１コード領域（配列番号２６）を含む、ＰＧ４７ＰＲＯ：ＺＭ−ＡＡ１遺伝子。この遺伝子の転写は、ＩＮ２−１ターミネーター（米国特許第５，３６４，７８０号）によって終息される。
３．  トウモロコシ雄性稔性遺伝子のコード領域を含むＭｓ２６（ＳＢ２００）ＧＥＮＯＭＩＣ遺伝子（配列番号７）。
４．  ＬＴＰ２プロモーター、上記によって駆動される赤色蛍光コード領域を含むＬＴＰ２：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）。（赤色コード領域は、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈから入手したもので、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）の変種であり、突然変異を受けると、コドン配列はそのままでＢｓｔＥＩＩ部位を除く）。
５．  ＰＨＰ２１７３７由来のＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を含む２．１４３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩ  ＤＮＡ断片を、ＳＫベクターのＭｓ２６  ＧＥＮＯＭＩＣ遺伝子の下流にクローンして、ＳＫ−Ｍｓ２６  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ２）を作製した。
６．  ＰＨＰ２１７３７由来のＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を含む２．１４３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩ  ＤＮＡ断片を、ＳＫベクターのＭｓ４５ＰＲＯ：Ｍｓ４５ＧＥＮＯＭＩＣ遺伝子の下流にクローンして、ＳＫ−Ｍｓ４５−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を作製した。
７．  ＰＨＰ２０５３２の５１２６ＰＲＯ：Ｍｓ４５  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＵＢＩ：ＭＯＰＡＴ：ＰＩＮＩＩを含む、５．４２９ｋｂのＮｏｔＩ断片を、ＳＫ−Ｍｓ４５−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）由来のＭｓ４５−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を含む、４．３１８ｋｂのＮｏｔＩ断片によって置換して、ＰＨＰ２２６２３を作製した。
８．  ＰＨＰ２２６２３のＭｓ４５−ＬＴＲ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を含む、４．３１８ｋｂのＮｏｔＩ断片を、ＳＫ−Ｍｓ２６  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）由来のＭｓ２６  ＧＥＮＯＭＩＣ−ＬＴＰ２ＰＲＯ：ＤＳ−ＲＥＤ２（ＡＬＴ１）を含む、５．９６０ｋｂのＮｏｔＩ断片によって置換して、ＰＨＰ２４０１４を作製した。このＰＨＰ２４０１４を、プラスミドｐＳＢ１を担うＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＬＢＡ４４０４の中に、電気泳動によって導入した。この、ＰＨＰ２４０１４およびｐＳＢ１の共同組み込み体をＰＨＰ２４１０１と名づけた。
【０１３８】
実施例１４
実施例１３の回復性トランスジーン構築体によるトウモロコシの形質転換
ｍｓ２６突然変異対立遺伝子（ｍｓ２６）に対してホモである雄性不稔の雌を、Ｈｉ型ＩＩのトウモロコシ（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  １９９４，Ｉｎ：Ｆｒｅｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｌｂｏｔ（ｅｄｓ）．Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ６６３−６７１）から得られた大量の花粉と繰り返し交雑させたところ、複数世代に亘って形質転換感受性のトウモロコシ胚形質の中にこのｍｓ２６対立遺伝子の移入が行われた。この、形質転換用材料供給源は、ｍｓ２６について（１：１または３：１）で分離する胚から成り、ホモのｍｓ２６背景への直接的転換、および、Ｔ０植物におけるｍｓ２６突然変異に対する遺伝的補償試験の両方を可能とした。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在性形質転換は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，（米国特許第５，９８１，８４０号）に従って実行した。形質転換体の遺伝子型決定および分子分析（組み込みおよびＰＴＵ）は、Ｃｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００１）１４：１３５−１４２）に従って行った。単一組み込みと完全なＰＴＵを持つ形質転換体をその後の研究に選んだ。
【０１３９】
実施例１５
トウモロコシ形質転換体の分析
実施例１４のトランスジェニック植物（Ｔ０）を、植物全体の形態について評価し、花粉からのトランスジーンの伝達について分析した。雄性不稔の程度を除いては、トランスジェニック植物と、非トランスジェニックコントロール植物の間には全く形態的差は認められなかった。単一組み込みおよび完全ＰＴＵを持つ形質転換体は、部分的雄性稔性であったが、一方、非トランスジェニックコントロール植物は、完全な雄性不稔であり、Ｍｓ２６遺伝子の発現が、ｍｓ２６ホモ劣性の、雄性不稔表現型を補償することを示した。この分析はさらに、アルファアミラーゼ（ＡＡ）遺伝子の花粉発現が、トランスジーンを担う花粉粒の正常機能を破壊することによって部分的雄性不稔を招くことも示した。でん粉粒子を染めるヨウ化カリ（ＫＩ）によって、形質転換体から得られた花粉を染色することによって、花粉粒子の約半分がでん粉（黒色粒子、非トランスジェニック）を含み、他の半分が、でん粉（黄金色粒子、トランスジェニック）を含んでいないことが示された。ＡＡ遺伝子の適切な機能はさらに、Ｔ０トランスジェニック植物と、非トランスジェニック植物の間の、調節された受粉によって決定された。得られたＴ１種子を赤色蛍光の表現型について評価した。もしもトランスジーンが花粉から伝達されるのであれば、Ｔ１種子は、糊粉層におけるＲＦＰ発現によって赤色蛍光のカーネルを含むと考えられる。表３に示す四つの独立事象に関して言うと、Ｔ１種子にはＲＦＰ発現は認められなかったが、Ｔ０花穂自身からの種子（Ｔ１種子）は、約５０％の赤色蛍光カーネルを含んでいた。
【０１４０】
【化５】
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以上から、本発明が、その目的の少なくとも全てを達成したことが見て取れる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、雄性稔性遺伝子Ｍｓ２６の配座マップである。
【図２】図２Ａは、Ｍｕ８プローブとハイブリダイズする、ｍｓ２６：：Ｍｕ８ファミリーのサザーンブロットであり、図２Ｂは、ｍｓ２６から単離したＰｓｔｌ断片とハイブリダイズするｍｓ２６−ｍ２：：Ｍｕ８ファミリーのサザーンブロットである。
【図３】図３は、Ｍｓ２６遺伝子から単離されたＰｓｔＩ断片とハイブリダイズさせたノーザンブロット分析ゲルである。
【図４】図４Ａ−４Ｄは、Ｍｓ２６の配列である（ｃＤＮＡは配列番号１、タンパク質は配列番号２である）。
【図５】図５Ａ−５Ｃは、Ｍｓ２６のゲノム配列である（また、配列番号７とも呼ばれる）。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、Ｍｓ２６のゲノム配列（配列番号７の残基１０５１−３３２６）と、Ｍｓ２６のｃＤＮＡ（配列番号１）との比較である。
【図７】図７Ａは、種々の植物組織における発現を示すノーザン分析ゲルを示し、図７Ｂは、小胞子発生の発現段階を示すゲルである。
【図８】図８は、Ｍｓ２６のプロモーター全長である（配列番号５）。
【図９】図９は、Ｍｓ２６プロモーターの選ばれた領域の欠失の後に見られるルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、Ｍｓ２６プロモーターの必須領域（配列番号６）を示す。
【図１１】図１１は、Ｍｓ２６の必須プロモーター断片の選ばれた小（９−１０ｂｐ）領域において、制限酵素リンカー走査による置換後に見られる、ルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ソルガム円錐花序のＭｓ２６オーソログのヌクレオチド配列（配列番号３）と、トウモロコシＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１の残基２０１−７５０）との比較、および、ソルガムタンパク質配列（配列番号４）と、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２の残基８７−２４４）との比較である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂは、ソルガム円錐花序のＭｓ２６オーソログのヌクレオチド配列（配列番号３）と、トウモロコシＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１の残基２０１−７５０）との比較、および、ソルガムタンパク質配列（配列番号４）と、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２の残基８７−２４４）との比較である。
【図１３】図１３は、雄性不稔性遺伝子ｍｓ２６のマッピングを表す。
【図１４】図１４は、ｍｓ２６−ｒｅｆ（配列番号８）の欠損領域と、野生型Ｍｓ２６（配列番号９）との配列比較を示す。
【図１５】図１５は、ｍｓ−ｒｅｆ内部のトランスポゾン配列を示す（配列番号１０）。
【図１６】図１６は、ｍｓ２６−ｒｅｆの全体配列（配列番号１１）を示す。
【図１７】図１７Ａは、ＣＹＰ７０４Ｂ１、Ｐ４５０遺伝子（配列番号１２）の領域と、Ｍｓ２６（配列番号１３）の領域の間の、翻訳タンパク質配列の整列を示す。図１７Ｂは、選ばれたＰ４５０遺伝子の系統樹分析を示す。
【図１８】図１８は、ヘム結合ドメインのフレームシフトを示す。ここには、Ｍｓ２６  ｃＤＮＡの領域（配列番号１４、および２８−２９）、稔性植物（配列番号１５、および３０−３１）および不稔性植物（配列番号１６、および３２−３３）のエキソン５のゲノム領域の、翻訳配列の整列が示される。
【図１９】図１９は、コメのＭｓ２６  ｃＤＮＡ（配列番号１７）およびタンパク質（配列番号１８）を示す。
【図２０】図２０は、トウモロコシ（配列番号５の残基６５０−１０８９）、ソルガム（配列番号１９）、およびコメ（配列番号２０）の整列を示す。
【図２１】図２１は、トウモロコシＭｓ２６タンパク質（配列番号２１）、コメＭｓ２６タンパク質（配列番号１８）、ソルガムＭｓ２６タンパク質（配列番号２２）の整列を、共通配列と共に示す。
【図２２】図２２は、花粉プロモーター、細胞傷害性遺伝子、および選択可能マーカーと共にＭｓ４５稔性遺伝子を含むＰＨＰ１８０９１のプラスミドマップである。
【図２３】図２３は、花粉プロモーターを有するＭｓ２６稔性遺伝子、細胞傷害性遺伝子、および選択可能マーカーを含むＰＨＰ２４１０１のプラスミドマップである。
【図２４】図２４は、Ｚｅａ  ｍａｙｓのα−アミラーゼ１コード領域の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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