(57)【要約】グリコペプチド、特にグリコペプチド抗生物質の新規改良型精製法。この方法は、グリコペプチドの溶液をイオン交換クロマトグラフィー材と接触させるステップを含む。この方法で得られる生成物は驚異的な高純度を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコペプチド抗生物質の精製法であって、
（ａ）  グリコペプチド溶液の塩濃度を少なくとも０．２Ｍに調整すること、またはグリコペプチド溶液の導電率を少なくとも２０ｍＳ／ｃｍに調整することのうち少なくともいずれか一方を実施するステップ、
（ｂ）  グリコペプチド溶液をイオン交換材と接触させるステップ、
（ｃ）  任意選択で、イオン交換材を洗浄するステップ、および
（ｄ）  溶離剤を用いて、イオン交換材からグリコペプチドを分離するステップ
を含んでなる方法。
【請求項２】
グリコペプチド溶液の導電率を２０ｍＳ／ｃｍ以上に調整する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリコペプチド抗生物質が、ダルバヘプチド、グループＩグリコペプチド（バンコマイシン系）；グループＩＩグリコペプチド（アボパルシン系）；グループＩＩＩグリコペプチド（リストセチン系）；グループＩＶグリコペプチド（テイコプラニン系）；それらの個別因子；それらの誘導体；およびそれらの組み合せからなる群から選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
グリコペプチド抗生物質が、テイコプラニンおよびバンコマイシンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
イオン交換材が、アニオン交換樹脂、好ましくは骨格が高分子親水性を有するアニオン交換樹脂である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
グリコペプチド溶液の導電率が３０ｍＳ／ｃｍ以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
イオン交換時の塩濃度が約０．３Ｍより高い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
イオン交換時の塩濃度が約１．５Ｍより低い、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
溶液の塩濃度または導電率のうち少なくともいずれか一方を調整するために、例えば、以下のアニオン：Ｃｌ−、ＨＳＯ３−、ＢｒＯ３−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ３−、ＨＳＯ４−、ＨＣＯ３−、ＩＯ３−、ＨＰＯ４−、ギ酸、酢酸およびプロピオン酸のうちの１つのナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩からなる群から選択されるアルカリ金属塩などの塩、好ましくはＮａＣｌの添加を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
溶離剤が酸または塩溶液である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
溶離剤が、
（Ａ）  弱有機酸、好ましくは、酢酸またはクエン酸、および
（Ｂ）  弱有機酸と対応塩基とからなる、好ましくはｐＨ４．５以下の緩衝液
からなる群から選択される酸であり、好ましくは、酸の濃度が０．１Ｍ〜５．０Ｍの範囲である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
グリコペプチド抗生物質を含んでなる溶液であって、該溶液の塩濃度が少なくとも０．２Ｍであること、または該溶液の導電率が少なくとも２０ｍＳ／ｃｍであることのうち少なくともいずれか一方を特徴とする溶液。
【請求項１３】
グリコペプチド抗生物質が、テイコプラニンおよびバンコマイシンからなる群から選択される、請求項１２に記載の溶液。
【請求項１４】
請求項１２に記載の溶液からＴＡ２を沈殿させる方法であって、例えばアセトンなどの有機溶媒を該溶液に添加するステップを含んでなる方法。
【請求項１５】
溶液が無色である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコペプチド、特にグリコペプチド抗生物質の新規改良型精製法に関する。この方法は、グリコペプチド溶液をイオン交換クロマトグラフィー材と接触させるステップを含む。この方法で得られる生成物は驚異的な高純度を有する。
【背景技術】
【０００２】
グリコペプチド抗生物質は、その化学構造に基づいて４つのグループに分類し得る（例えば、非特許文献１参照）：
−  グループＩ（またはバンコマイシン系）は、１位と３位に脂肪族アミノ酸を有する；−  グループＩＩ（またはアボパルシン系）は、１位と３位に芳香族アミノ酸残基を有する；
−  グループＩＩＩ（またはリストセチン系）は、グループＩＩに似ているが、１位と３位に芳香族アミノ酸を結合するエーテル結合を有する；
−  グループＩＶ（またはテイコプラニン系）は、グループＩＩＩと同じアミノ酸配置に加えて、アミノ糖に結合した脂肪酸残基を有する。
【０００３】
グリコペプチド抗生物質の例は、例えば、特許文献１および２に列挙されているが、これらの文献では、グリコペプチド抗生物質に対して、ダルバヘプチド（ｄａｌｂａｈｅｐｔｉｄｅ）という用語が用いられている。グリコペプチドは、例えば発酵などの当技術分野で開示されている方法で製造し得る。
【０００４】
テイコプラニンは、アクチノプラネス・テイコミセチクス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ
ｔｅｉｃｈｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）が産生するグリコペプチド抗生物質であり、細菌の細胞壁合成を阻害する新規微生物起源分子を見出そうとする科学研究プログラムの最中に発見された（例えば、非特許文献２参照）。テイコプラニンは、１９７８年に初めて記載され、その１０年後、イタリアで臨床診療に導入された（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
多くのグリコペプチド抗生物質精製法が開示されている。例えば特許文献３に開示されている方法によれば、テイコプラニンＡ２の抽出効率を増大させるために、濾過前に発酵ブロスをｐＨ１０〜１１．５に調整する。発酵ブロスの濾液をポリアミド樹脂に充填し、過剰量のアセトンで溶出液からテイコプラニンを沈殿させ、３時間放置する。上清をデカントして捨て、残りを濾過する。得られたケークをアセトンで洗浄してテイコプラニンＡ２を回収する。この方法は、さまざまなステップで過剰量のアセトンを使うので、溶媒がたまるという問題を有する。
【０００６】
例えば特許文献１は、バンコマイシン系グリコペプチド抗生物質（例えば、テイコプラニンおよびバンコマイシン）の回収法を開示しており、この方法では、発酵ブロスに２％以下の架橋を有するカチオン交換樹脂を加えて樹脂にテイコプラニンを吸着させ、１００メッシュシーブを用いて樹脂から菌糸を分離する。次いで、樹脂を精製水で洗浄した後、溶出してテイコプラニンを回収する。
【０００７】
例えば特許文献４は、テイコプラニンＡ２の生産法を開示しており、この方法では、発酵ブロスをｐＨ１１に調整して遠心分離し、上清を、例えばＸＡＤ−１６、ＨＰ−２０などの合成吸着樹脂および活性炭またはシリカゲルに吸着させ、５０〜８０％メタノール溶液で溶出し、減圧下に回収して、粗粉末としてテイコプラニンを得る。粗テイコプラニンを酢酸ナトリウム溶液に溶かし、糖アフィニティクロマトグラフィー（ｓｕｇａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にかけて精製する。
【０００８】
例えば特許文献５は、テイコプラニンＡ２の精製法を開示しており、この方法は、（ｉ）合成吸着剤を用いて菌株発酵ブロスの濾液を精製する１次予備精製ステップと、（ｉｉ）高架橋を有するカチオン交換樹脂、触媒樹脂またはキレート樹脂を用いて１次予備精製溶液を精製する２次予備精製ステップと、（ｉｉｉ）逆相樹脂を用いて２次予備精製溶液を精製する最終精製ステップと、（ｉｖ）粉末成形ステップとを含む。
【特許文献１】米国特許第４，８４５，１９４Ａ号明細書
【特許文献２】欧州特許第８３６６１９Ｂ１号明細書
【特許文献３】欧州特許第４７９０８６Ｂ１号明細書
【特許文献４】韓国特許公報第２０００−００６６４７９号明細書
【特許文献５】米国特許出願第２００４００２４１７７Ａ１号明細書
【非特許文献１】ヤオ、アール．シー．（Ｙａｏ，Ｒ．Ｃ．）およびクランドール、エル．ダブリュ．（Ｃｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｗ．）、「Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」、ナガラジャン、アール．（Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｒ．）編、マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃａｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１章、ｐ．１−２７（１９９４年）
【非特許文献２】ゴールドシュタイン、ビー．（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂ．）ら、「Ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」、ナガラジャン、アール．編、マルセル・デッカー社、ニューヨーク州ニューヨーク、第８章、ｐ．２７３−３０７（１９９４年）
【非特許文献３】パレンチ、エフ．（Ｐａｒｅｎｔｉ，Ｆ．）ら、Ｊ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第１２巻、ｐ．５−１４（２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
高純度グリコペプチド抗生物質の大量生産に用い得る方法が依然として求められている。本発明によれば、新規イオン交換クロマトグラフィー法によって高純度グリコペプチド抗生物質を得ることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことには、本発明者らは、塩濃度および／または導電率を高めたグリコペプチド含有溶液のイオン交換クロマトグラフィーを含む方法を用いることにより、グリコペプチド、特にグリコペプチド抗生物質が高純度で得られることを発見した。特定の理論に拘泥するわけではないが、この方法は、共通構造を有する、すなわち、ダルバヘプチド構造を有するすべてのグリコペプチドの精製に用い得ると考えられる。
【００１１】
この知見により、イオン交換クロマトグラフィーを用いた、グリコペプチド、特にダルバヘプチド系グリコペプチドの精製法が提供され、この方法は、グリコペプチド溶液の塩濃度をこれまで開示されているものより高いレベルに上昇させ（それによって、溶液の導電率を高め）、グリコペプチドをイオン交換樹脂に結合させるステップを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、グリコペプチド抗生物質もしくはその誘導体（またはグリコペプチド抗生物質もしくはその誘導体を含む溶液）の精製法に関し、この方法は、
（ａ）  グリコペプチド溶液の塩濃度を少なくとも０．２Ｍに調整すること、またはグリコペプチド溶液の導電率を少なくとも２０ｍＳ／ｃｍに調整することのうち少なくともいずれか一方を実施するステップ、
（ｂ）  グリコペプチド溶液をイオン交換材と接触させるステップ、
（ｃ）  任意選択で、イオン交換材を洗浄するステップ、および
（ｄ）  溶離剤を用いてイオン交換材からグリコペプチドを分離するステップ
を含む。
【００１３】
グリコペプチド抗生物質は、場合により糖類基で置換された多重環状ペプチド骨格を特徴とするオリゴペプチド（例えば、ヘプタペプチド）抗生物質、例えば、ダルバヘプチド、グループＩグリコペプチド（バンコマイシン系）；グループＩＩグリコペプチド（アボパルシン系）；グループＩＩＩグリコペプチド（リストセチン系）；グループＩＶグリコペプチド（テイコプラニン系）；それらの誘導体；それらの個別因子；およびそれらの組み合せからなる群から選択される抗生物質であるのが好ましい。この定義に含まれるグリコペプチドの例は、レイモンド  シー．ラオ（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ．Ｒａｏ）およびルイーズ  ダブリュー．クランドール（Ｌｏｕｉｓｅ  Ｗ．Ｃｒａｎｄａｌｌ）による、「Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」〔「Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第６３巻、ラマクリシュナン・ナガラジャン（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｎａｇａｒａｊａｎ）編、マルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．）発行〕で見られる。グリコペプチドの追加例は、米国特許第４，６３９，４３３号、同第４，６４３，９８７号、同第４，４９７，８０２号、同第４，６９８，３２７号、同第５，５９１，７１４号、同第５，８４０，６８４号、および同第５，８４３，８８９号明細書；欧州特許（出願）第０８０２１９８号、同第０８０１０７５号、同第０６６７３５３号明細書；国際公開第９７／２８８１２号、同第９７／３８７０２号、同第９８／５２５８９号、同第９８／５２５９２号パンフレット、ならびに、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９６年、第１１８巻、ｐ．１３１０７−１３１０８；Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１２０４１−１２０４７；およびＪ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４年、第１１６巻、ｐ．４５７３−４５９０に開示されている。代表的なグリコペプチドとしては、Ａ４７７、Ａ３５５１２、Ａ４０９２６、Ａ４１０３０、Ａ４２８６７、Ａ４７９３４、Ａ８０４０７、Ａ８２８４６、Ａ８３８５０、Ａ８４５７５、ＡＢ−６５、アクタプラニン、アクチノイジン（Ａｃｔｉｎｏｉｄｉｎ）、アルダシン、アボパルシン、アズレオマイシン（Ａｚｕｒｅｏｍｙｃｉｎ）、バルヒマイシン（Ｂａｌｈｉｍｙｃｉｎ）、クロロオリエンチエイン（Ｃｈｌｏｒｏｏｒｉｅｎｔｉｅｉｎ）、クロロポリスポリン、デカプラニン（Ｄｅｃａｐｌａｎｉｎ）、Ｎ−デメチルバンコマイシン、エレモマイシン（Ｅｒｅｍｏｍｙｃｉｎ）、ガラカルジン（Ｇａｌａｃａｒｄｉｎ）、ヘルベカルジン（Ｈｅｌｖｅｃａｒｄｉｎ）、イズペプチン（Ｉｚｕｐｅｐｔｉｎ）、キブデリン（Ｋｉｂｄｅｌｉｎ）、ＬＬ−ＡＭ３７４、マンノペプチン（Ｍａｎｎｏｐｅｐｔｉｎ）、ＭＭ４５２８９、ＭＭ４７７５６、ＭＭ４７７６１、ＭＭ４９７２１、ＭＭ４７７６６、ＭＭ５５２６０、ＭＭ５５２６６、ＭＭ５５２７０、ＭＭ５６５９７、ＭＭ５６５９８、ＯＡ−７６５３、オレンチシン（Ｏｒｅｎｔｉｃｉｎ）、パルボジシン（Ｐａｒｖｏｄｉｃｉｎ）、リストセチン（Ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ）、リ���トマイシン（Ｒｉｓｔｏｍｙｃｉｎ）、シンモニシン（Ｓｙｎｍｏｎｉｃｉｎ）、テイコプラニン、ＵＫ−６８５９７、ＵＫ−６９５４２、ＵＫ−７２０５１、バンコマイシンなど、およびそれらの誘導体が挙げられる。現在最も興味深い精製すべきグリコペプチド抗生物質は、（Ａ２因子を含む）テイコプラニン複合体であり、これは発酵ブロスから得られる。
【００１４】
グリコペプチドは、Ａ４０９２６、Ａ８４５７５、アルダシン、キブデリン、ＭＭ５５２６６、パルボジシン、バンコマイシン、テイコプラニン複合体およびその因子、ならびにそれらの誘導体から選択するのがなお好ましい。
【００１５】
用語「誘導体」は、環状ペプチド骨格（例えば、ダルバヘプチド骨格）を有してはいても、環状ペプチド骨格に直接または間接的に結合した置換基が除去または他の置換基で置換されているという点で上述のグリコペプチドとは異なるグリコペプチドを包含する。誘
導体に関する例としては、例えばアグリコーンなどの完全または部分脱グリコシル化グリコペプチドや、国際公開第０１９８３２８Ａ号、同第０１８３５２１Ａ号、同第０３０１８６０７Ａ号、同第０３０１８６０８Ａ号、同第０３０２９２７０Ａ号パンフレット、欧州特許出願第２０１２５１Ａ号明細書、米国特許出願第２００４００８７４９４Ａ１号明細書、米国特許第５，１６４，４８４Ａ号明細書、同第５，９１６，８７３Ａ号明細書などの当技術分野、および上記特許文書に引用されている参考文献で開示されている誘導体がある。
【００１６】
アニオンおよびカチオン交換材のどちらを用いてもよいが、イオン交換材はアニオン交換樹脂であるのが好ましく、またアニオン交換樹脂のなかでも、例えば、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｑ  Ｓｕｐｐｏｒｔ〔バイオラド社（ＢｉｏＲａｄ）〕などの、骨格が高分子で親水性のアニオン交換樹脂がなお好ましい。
【００１７】
グリコペプチド溶液の導電率は、好ましくは１５ｍＳ／ｃｍ以上、より好ましくは２０ｍＳ／ｃｍ以上、２５ｍＳ／ｃｍ以上、または３０ｍＳ／ｃｍ以上である。導電率は４０ｍＳ／ｃｍ以上であり得る。
【００１８】
イオン交換時の塩濃度は、約０．２５Ｍより高く、例えば、０．３０Ｍより高いか、さらには０．３５Ｍまたは０．４５Ｍより高いのが好ましく、またイオン交換時の塩濃度は、約２．０Ｍより低く、例えば、１．５Ｍより低く、１．０Ｍまたはさらには０．７Ｍより低いのが好ましい。塩濃度は０．４〜０．７Ｍの範囲内であるのが好ましい。ＮａＣｌ調整は添加塩を測定して実施し得る。
【００１９】
本発明に関連して溶液の塩濃度および／または導電率の調整に用い得る塩の例としては、例えば、以下のアニオン：Ｃｌ−、ＨＳＯ３−、ＢｒＯ３−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ３−、ＨＳＯ４−、ＨＣＯ３−、ＩＯ３−、ＨＰＯ４−、ギ酸、酢酸およびプロピオン酸のうちの１つのナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩からなる群から選択されるアルカリ金属塩がある。現在のところ、ＮａＣｌが好ましい。種々の塩の混合物を用いてもよい。
【００２０】
（特にアニオン交換樹脂に関連して）用い得る溶離剤の例としては：
例えば、
（Ａ）  弱有機酸、好ましくは酢酸もしくはクエン酸、または
（Ｂ）  弱有機酸と対応塩基とからなる、好ましくはｐＨ４．５以下の緩衝液
とからなる群から選択される酸などの酸や、
上記塩などの塩、それらの混合物を含めた塩溶液
がある。
【００２１】
溶離剤は酢酸であり、かつ／または酸の濃度は０．１Ｍより高い（例えば、０．３Ｍ、０．５Ｍ、０．８Ｍより高い）のが好ましく、酸濃度は１．０Ｍより高いのが好ましい。しかし、酸の濃度は６．０Ｍより低くなければならず、４．０Ｍより低ければなお好ましい。種々の酸の混合物を用いてもよい。溶離剤として塩の水溶液を用いる場合、塩の濃度は、１．５Ｍより高いのが好ましい。溶離剤は酢酸であり、かつ／または酸の濃度は０．１〜６．０Ｍであるのが好ましく、酸濃度が１．０〜４．０Ｍであればなお好ましい。種々の酸の混合物を用いてもよい。
【００２２】
本発明の実施形態は上記のような方法に関し、この方法はさらに以下のステップ：
（ａ）  グリコペプチド抗生物質産生微生物を含有する粗製発酵ブロスを得るステップ、（ｂ）  粗製発酵ブロスのｐＨをｐＨ８〜１２に調整するステップ、および
（ｃ）  例えば、遠心分離または濾過により、グリコペプチド抗生物質産生微生物（菌糸
塊）から発酵ブロスを分離して、グリコペプチド抗生物質含有溶液を得るステップ
を含む。
【００２３】
ｐＨは９〜１１に調整し、かつ分離は０〜２５℃の温度で実施するのが好ましく、分離は５〜１５℃の温度で実施するのがなお好ましい。
本発明の方法は、より純粋なグリコペプチドを得るための１つ以上の精製ステップ、例えば、
（ａ）  逆相クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣ、
（ｂ）  吸着クロマトグラフィー、
（ｃ）  濾過、
（ｄ）  逆浸透、
（ｅ）  活性炭もしくは吸着樹脂での処理による脱色、
（ｆ）  カチオン交換クロマトグラフィー、
（ｈ）  沈殿、
（ｉ）  遠心分離、
（ｊ）  アフィニティクロマトグラフィー、および
（ｋ）  液液抽出
からなる群から選択される精製ステップ、または例えば上記（ａ）〜（ｉ）から選択される精製ステップを含み得る。
【００２４】
固体グリコペプチドは、当業者には周知の方法、例えば凍結乾燥により精製溶液から単離し得る。
本発明の説明の文脈中（特に、特許請求の範囲の文脈中）の用語「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）や同様な指示対象は、本明細書中に別段の断りがないか、文脈と明らかに矛盾していない限り、単数と複数を共に含むとみなされる。用語「含んでなる」（「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）、「有する」（「ｈａｖｉｎｇ」）、「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）および「含有する」（「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」）は、特に断りのない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「〜を含む」が「〜には限定されない」ことを意味する）と解釈されるものとする。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、その範囲内に包含される１つ１つの値を個別に指す簡便な方法として役立つに過ぎず、１つ１つの値は、本明細書に個別に列挙されたかの如く本明細書に組み込まれる。本明細書で規定するすべての値は、「おおよそ」（「ａｂｏｕｔ」）の値と解釈すべきであり、例えば、「２．０Ｍ」は、「約２．０Ｍ」と解釈すべきである。
【００２５】
本明細書に記載する方法はすべて、本明細書に別段の指示がないか、文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適当な順序で実施し得る。本明細書で用いるありとあらゆる例または例を表す言語〔例えば、「〜などの」（「ｓｕｃｈ  ａｓ」）〕は、特に別段の断りのない限り、単に本発明をより明らかにすることを目的とするに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの言語も、特許請求の範囲に記載されていない要素を本発明の実施に必須であると指示するものと解釈してはならない。
【００２６】
実験
【実施例１】
【００２７】
テイコプラニン水溶液の調製
実施例１ａ
例えば米国特許第４，２３９，７５１号に開示されているようなそれ自体周知の方法で、Ａ．テイコミセチクスの培養物を発酵させてテイコプラニン含有発酵ブロスを得る。
【００２８】
実験室の発酵装置由来のテイコプラニン含有全培養物発酵ブロス５Ｌを（１ＭのＮａＯＨを加えて）ｐＨ９．５に調整し、攪拌した。この溶液を、室温で１００μｍデプス型フィルター〔Ｐｏｌｙｇａｒｄ（商標）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）〕に通して濾過し、その後、１２〜１４℃で限外濾過（５００，０００Ｄａ、Ｂｉｏｍａｘ（商標）、ミリポア社）した。４×０．５Ｌの水を用いてバッチ式でバイオマスを透析濾過して残留テイコプラニンを回収した。発酵ブロス中に存在するテイコプラニンの約８０％を最終透明溶液で回収した。
【００２９】
実施例１ｂ
実施例１ａと同様にして得たテイコプラニン発酵ブロス５００ｍｌに１ＭのＮａＯＨを加えてｐＨを９．５に調整し、１０℃にて実験室遠心分離機で遠心分離して無細胞溶液を得た。発酵ブロス中に存在するテイコプラニンの約８５％を最終透明溶液で回収した。
【実施例２】
【００３０】
イオン交換クロマトグラフィー精製
実施例２ａ：  テイコプラニン因子Ａ２（ＴＡ２）のアニオン交換クロマトグラフィー精製
０．５ｇの生成物を含有する実施例１ａ由来の透明なテイコプラニン溶液に１ＭのＨＣｌを加えてｐＨ８に調整した。ＮａＣｌを加えて最終濃度０．５Ｍとし、約５０ｍＳ／ｃｍの導電率を得た。メタクリレートコポリマーアニオン交換樹脂Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｑ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（バイオラド社）をクロマトグラフィーカラム〔内径（ｉ．ｄ．）１．６ｃｍ、ベッド高１２ｃｍ、容積２４ｍｌ〕に充填し、このカラムに調製テイコプラニン溶液を流速３．４ｍｌ／分で加えた。カラムを４８ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で洗浄してから、生成物を１９２ｍｌの３Ｍ酢酸で溶出した。溶出プール中に０．４２ｇのテイコプラニンを回収したが、この操作と併せて相当量の着色成分を除去すると、同プールのＨＰＬＣ純度は約７０面積％から９０面積％ＴＡ２に向上した。
【００３１】
任意選択で、このクロマトグラフィープロセスに高ＮａＣｌ濃度（すなわち、最高２Ｍまでの濃度）を含む洗浄ステップを組み込むと、最終生成物プールの純度がさらに高まり、色が薄くなったが、テイコプラニンの損失は極くわずかであった。
【００３２】
実施例２ｂ：  ＴＡ２のアニオン交換クロマトグラフィー精製
０．５ｇの生成物を含有する実施例１ａ由来の透明なテイコプラニン溶液に１ＭのＨＣｌを加えてｐＨ８に調整した。ＮａＣｌを加えて最終濃度０．５Ｍとし、約５０ｍＳ／ｃｍの導電率を得た。アガロースベースのアニオン交換樹脂Ｑ‐Ｓｅｐａｈｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ〔アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）〕をクロマトグラフィーカラム〔内径（ｉ．ｄ．）１．６ｃｍ、ベッド高１２ｃｍ、容積２４ｍｌ〕に充填し、このカラムに調製テイコプラニン溶液を流速３．４ｍｌ／分で加えた。カラムを４８ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で洗浄してから、生成物を１９２ｍｌの３Ｍ酢酸で溶出した。０．３５ｇのテイコプラニンを溶出プール中に回収したが、同プールのＨＰＬＣ純度は約８５面積％ＴＡ２まで向上した。
【００３３】
実施例２ｃ：  ＴＡ２を精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー
０．５ｇの生成物を含有する実施例１ａ由来の透明テイコプラニン溶液にＮａＨＣＯ３を加えて濃度０．７Ｍとし、１ＭのＨＣｌを加えて溶液のｐＨを８に調整する。その後、実施例２ｂに記載のように、この溶液をカラムに加える。カラムを４８ｍｌの０．７Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、１９２ｍｌの３Ｍ酢酸で溶出する。精製テイコプラニンを溶出プールで回収する。
【００３４】
実施例２ｄ：  バンコマイシンを精製するためのアニオン交換クロマトグラフィー
米国特許第５，２２３，４１３号の手順に従って、バンコマイシンを含有する粗製発酵ブロスを生成し、遠心分離により清澄にし得る。０．５ｇの生成物を含有する透明バンコマイシン溶液にＮａＣｌを加えて濃度０．５Ｍとし、溶液のｐＨを（１ＭのＮａＯＨを加えて）ｐＨ１０に調整する。その後、実施例２ａに記載のように、バンコマイシン溶液をカラムに加える。カラムを４８ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液で洗浄した後、１９２ｍｌの０．５Ｍ酢酸で目的物を溶出する。精製バンコマイシンを溶出プールで回収する。
【００３５】
実施例２ｅ：  カチオン交換クロマトグラフィー
０．５ｇの生成物を含有する実施例１ａ由来の透明テイコプラニン溶液に１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを２．８に調整する。ＮａＣｌを０．３Ｍの最終濃度まで加える。溶液を、メタクリレートコポリマーカチオン交換樹脂、すなわち、Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（バイオラド社）を充填したカラム（ｉ．ｄ．１．６ｃｍ、ベッド高１２ｃｍ、容積２４ｍｌ）に加える。カラムを４８ｍｌの０．３Ｍ  ＮａＣｌ溶液で洗浄してから、目的物をｐＨ６．０の０．２Ｍ酢酸ナトリウム１９２ｍｌで溶出する。精製テイコプラニンを溶出プールで回収する。
【実施例３】
【００３６】
実施例１ａに記載のように、発酵によりテイコプラニンを産生させ、清澄にした。１．０ｇのテイコプラニンを含有する等量の透明ブロスを、種々の量のＮａＣｌ（以下の表１参照）と混合して、溶液中０〜１ＭのＮａＣｌとした。溶解後、実施例２ａに記載のように、サンプルを流速３．４ｍｌ／分でカラムに加えた。カラムを、等モル濃度の４８ｍｌのＮａＣｌ溶液で洗浄した後、目的物を１９２ｍｌの３Ｍ酢酸で溶出した。テイコプラニンの結合能力とＨＰＬＣ純度を標準的なＨＰＬＣ法で測定した。プールは、ＴＡ２の面積％が約９０％になるように選択した。
【００３７】
結果を以下の表１に要約する：
【００３８】
【表１】
2008517971.tif 000002
【実施例４】
【００３９】
追加精製
透明（例えば、濾過または遠心分離後の）発酵ブロスをイオン交換ステップにかける前に精製することもできるし、かつ／または、イオン交換ステップ由来の溶液を、例えばそれ自体周知であるか、以下に記載のような１つ以上の精製法を用いて追加精製することができる。
【００４０】
実施例４ａ：  テイコプラニンのアニオン交換前予備精製  −  疎水性骨格への装荷
０．５ｇの生成物を含有する実施例１ａ由来の透明なテイコプラニン溶液に１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを８に調整し、巨大網目形脂肪族架橋ポリマー〔ＸＡＤ７ＨＰ、ローム・アンド・ハース社（Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ）〕を充填したカラム〔内径（ｉ．ｄ．）１．６ｃｍ、高さ１０ｃｍ、容積２０ｍｌ〕に流速０．７ｍｌ／分で加える。結合後、カラムを８０ｍｌの水で洗浄してから、エタノールと水の５０／５０混合物１００ｍｌで溶出してテイコプラニンを回収する。得られた溶出液を、ロータリーエバポレータ装置を用い、４０℃、８０ミリバールで蒸発させる。得られたエタノールを含まない溶液を実施例２ａに記載のように処理する。
【００４１】
実施例４ｂ：  疎水性相互作用樹脂への装荷によるイオン交換プール中のＴＡ２の追加精製
直径１．６ｃｍ、ベッド高１０ｃｍ（容積２０ｍｌ）のカラムに、疎水性相互作用樹脂、すなわち、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャム・バイオサイエンス社）を充填する。実施例２ａ由来の溶出プールに硫酸アンモニウムを加えて濃度０．１Ｍとし、カラムに、ｐＨ２．５、流速２．５ｍｌ／分で装荷する。カラムを４０ｍｌの０．１Ｍ硫酸アンモニウム溶液で洗浄し、１２０ｍｌの水で溶出する。この作業で、薄色の精製テイコプラニン溶液を回収する。
【００４２】
実施例４ｃ：  カチオン交換樹脂への装荷によるイオン交換プール中のＴＡ２の追加精製
酢酸溶液（ｐＨ２．５）中０．３５〜０．４５ｇのテイコプラニンを含有する実施例２ａ〜２ｃの１つ由来の生成物をカチオン交換樹脂〔Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（バイオラド社）、内径１．６ｃｍ、高さ１０ｃｍ、容積２０ｍｌ〕に流速２．５ｍｌ／分で加える。カラムを４０ｍｌの０．１Ｍ酢酸溶液で洗浄した後、目的物を１２０ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で溶出する。精製テイコプラニンを溶出プールで回収する。
【００４３】
実施例４ｄ：  カーボン濾過によるイオン交換プール中のＴＡ２の脱色
実施例２ａで回収した溶出プールを７５ｍｌのエタノールに加えて、５０／５０容量％混合物を生成した後、固定化活性炭フィルター（ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）、１３ｃｍ２濾過面積、ミリポア社）を通して濾過した。フィルターを２５ｍｌの５０／５０容量％の水／エタノール混合物ですすいだ。テイコプラニンをほぼ無色の生成物溶液で回収した。
【００４４】
実施例４ｅ：  サイズ排除クロマトグラフィーによるイオン交換プール中のＴＡ２の脱色
実施例２ａ由来の溶出プール１０ｍｌを３０ｍｌのサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）３０  精製用（ｐｒｅｐｇｒａｄｅ）、アマシャム・バイオサイエンス社）に流速１ｍｌ／分で装荷する。サンプル中のテイコプラニンより大きい着色成分はテイコプラニンの前に溶出されて除去される。
【００４５】
実施例４ｆ：  有機溶媒の添加によるイオン交換プール中のＴＡ２の沈殿
実施例２ａ由来の溶出プール中のテイコプラニンを、１３７０ｍｌのアセトンを添加して最終濃度９５％とすることにより溶液から沈殿させる。沈降物を濾過して収穫し、得られたフィルターケークを１０ｍｌのアセトンで２回洗浄する。その後、フィルターケークを真空オーブン中４０℃で乾燥させる。精製テイコプラニンを乾燥フィルターケークで回収する。
【００４６】
本明細書では、本発明を実施するための本発明者らに周知の最良の態様を含む本発明の好ましい実施形態を説明している。上記説明を読めば、これらの好ましい実施形態の変形形態が当業者には明らかになるであろう。熟練した技術者は、本明細書に開示する方法をスケールアップすることができる。本発明者らは、熟練した技術者がそのような変形態様を必要に応じて用いることを予期しており、また本発明を本明細書に具体的に説明したものとは異なるやり方で実施することも意図している。したがって、本発明は、適用法で認められた本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題の変更形態および均等物をすべて包含する。さらに、本明細書に別段の指示がないか、文脈に明らかに矛盾していない限り、すべての可能な変形形態における上記要素の任意の組み合せも本発明に包含される。上述の特許文書および科学論文はすべてそのまま本明細書に文献援用される。
【国際調査報告】
2008517971.tif 000003
2008517971.tif 000004
2008517971.tif 000005
2008517971.tif 000006
2008517971.tif 000007