(57)【要約】  本発明は、式Ｉ【化１】2008514551.tif 000052 で表される生物学的活性のあるジベンゾジアゼピノンアナログ（式中、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシル部分は水素化若しくはヒドロアルコキシル化された二重結合を１、２、又は３個有する。）又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、これらの化合物を含む医薬組成物、その製造方法、及びその腫瘍状態の治療のための薬剤の調整への使用に関する。
2008514551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物、又は式Ｉのファルネシル基が１、２、若しくは３個の水素化若しくはヒドロアルコキシ化二重結合を有するファルネシル誘導体、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ。
【化１】
2008514551.tif 000045
［式中、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルである。］
【請求項２】
Ｒ１が直鎖Ｃ１−１０アルキルであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項３】
化合物が一水素化ファルネシル誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項４】
化合物が二水素化ファルネシル誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項５】
化合物が全水素化ファルネシル誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項６】
Ｒ１が直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、且つファルネシルが全水素化されていることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項７】
Ｒ１が直鎖Ｃ１−６アルキルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項８】
Ｒ１が直鎖Ｃ１−６アルキルであり、且つファルネシルが全水素化されていることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項９】
Ｒ１がメチルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１０】
Ｒ１がエチルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１１】
Ｒ１がｎ−プロピルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１２】
Ｒ１がｎ−ブチルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１３】
Ｒ１がｎ−ヘキシルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１４】
化合物が化合物２〜２２から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【化２】
2008514551.tif 000046
【化３】
2008514551.tif 000047
【化４】
2008514551.tif 000048
【請求項１５】
化合物が化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１、及び２２から選択されることを特徴とする請求項１４記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１６】
化合物が化合物２〜５、及び７から選択されることを特徴とする請求項１５記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１７】
化合物が化合物２〜１３から選択されることを特徴とする請求項１４記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１８】
化合物が化合物１４〜２２から選択されることを特徴とする請求項１４記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物、若しくはプロドラッグ。
【請求項１９】
化合物２３〜２７から選択される化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【化５】
2008514551.tif 000049
【請求項２０】
化合物が化合物２３であることを特徴とする請求項１９記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項２１】
化合物２４、２６又は２７から選択される化合物であることを特徴とする請求項１９記載の化合物、又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項２２】
化合物が化合物２５であることを特徴とする請求項１９記載の化合物又はその薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグ。
【請求項２３】
化合物１を化学修飾することを含む、請求項１〜１８いずれか記載の化合物を生産する方法で、前記化学修飾がＮ−アルキル化の化学的ステップを含む方法。
【化６】
2008514551.tif 000050
【請求項２４】
ファルネシル水素化又はファルネシルヒドロアルコキシ化ステップが部分的又は完全であることを特徴とする、前記ファルネシル水素化又はファルネシルヒドロアルコキシ化いずれかのステップをさらに含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
Ｎ−アルキル化の化学反応段階が、請求項２３に記載されている化合物１の反応において化合物１をジアルキル硫酸又はハロゲン化アルキルいずれかのアルキル化剤と反応させることを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
化合物１を化学修飾することを含む、請求項１８〜２２いずれか記載の化合物を生産する方法で、前記方法がＯ−アシル化、芳香族ハロゲン化、及び完全なステップであることを特徴とするファルネシル水素化からなる群から選択される一つのステップを含むことを特徴とする前記方法。
【化７】
2008514551.tif 000051
【請求項２７】
化学修飾がファルネシル水素化ステップを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
治療に有効な量の請求項１記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
治療に有効な量の請求項２〜１４いずれか記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療に有効な量の請求項１５〜１８いずれか記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
治療に有効な量の請求項１９記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
治療に有効な量の請求項２０〜２２いずれか記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
腫瘍細胞の成長を抑制するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３４】
腫瘍細胞の成長を抑制するための、請求項２〜１３いずれか記載の化合物の使用。
【請求項３５】
腫瘍細胞の成長を抑制するための、請求項１４〜１８いずれか記載の化合物の使用。
【請求項３６】
腫瘍細胞の成長を抑制するための、請求項１９〜２２いずれか記載の化合物の使用。
【請求項３７】
腫瘍細胞の成長を抑制するための、請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３８】
腫瘍状態を治療するための薬剤の調製における、請求項２〜１３いずれか記載の化合物の使用。
【請求項３９】
腫瘍状態を治療するための薬剤の調製における、請求項１４〜１８いずれか記載の化合物の使用。
【請求項４０】
腫瘍状態を治療するための薬剤の調製における、請求項１９〜２２いずれか記載の化合物の使用。
【請求項４１】
腫瘍状態が、白血病、メラノーマ、乳癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸又は結腸直腸癌、前立腺癌及び中枢神経系癌から選択されることを特徴とする、請求項３７〜４０いずれか記載の使用。
【請求項４２】
請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、腫瘍状態を治療するための前記化合物の使用法を記載した書面とを含む商業用パッケージ。
【請求項４３】
請求項２〜１３いずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと腫瘍状態を治療するための前記化合物の使用法を記載した書面とを含む商業用パッケージ。
【請求項４４】
請求項１４〜１８いずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと腫瘍状態を治療するための前記化合物の使用法を記載した書面とを含む商業用パッケージ。
【請求項４５】
請求項１９記載の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと腫瘍状態を治療するための前記化合物の使用法を記載した書面とを含む商業用パッケージ。
【請求項４６】
請求項１９〜２２いずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、腫瘍状態を治療するための前記化合物の使用法を記載した書面とを含む商業用パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物１の化学的誘導体である改良された特性をもつジベンゾジアゼピノンアナログに関する。本発明はさらに、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、及びプロドラッグに関し、また、前記化合物を得る方法に関する。前記誘導体を得る１つの方法は、化合物１の生合成後化学修飾を含む。本発明はさらに、ジベンゾジアゼピノンアナログ及びその薬学的に許容される塩、溶媒和物、並びにプロドラッグの薬剤としての使用に関し、特に、癌細胞の成長阻害剤、哺乳類リポキシゲナーゼ阻害剤として、及び急性又は慢性炎症の治療へのそれらの使用、並びにジベンゾジアゼピノンアナログ又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正放線菌（euactinomycetes）は、放線菌（actinomycetes）として知られる大きく複雑なグラム陽性細菌のサブセットである。二次代謝産物として治療に有用な多くの化合物、特に抗生物質を生成することから、土壌に豊富に存在するこれらの生物は、過去数十年にわたり、商業的に、また科学的に重要な興味を人々に抱かせてきた。新規の抗生物質を生成することのできる株が徹底的に探索された結果、数百の新種が同定された。
【０００３】
多くの真生放線菌、特にストレプトミセス族（Streptomyces）及び近縁種であるSaccharopolyspora属が鋭意研究されてきた。これら２つの属は、非常に多様な生物学的活性のある代謝産物を生成する。これらの化合物が商業的に重要であることから、これらの生物の遺伝学的特徴や生理機能については、多くが知られている。その他の代表的な真正放線菌属であるMicromonosporaも人々に商業的な興味を抱かせてきた。例えば、米国特許第５，５４１，１８１号（Ohkuma et al.）はジベンゾジアゼピノン化合物を開示している。具体的には、既知の真正放線菌株であるMicromonospora sp．Ｍ９９０−６（ＡＴＣＣ  ５５３７８）によって生成される５−ファルネシル−４，７，９−トリヒドロキシ−ジベンゾジアゼピン−１１−オン（「ＢＵ−４６６４Ｌ」と命名）を開示している。カナダ特許第２，４６６，３４０号はＥＣＯ４６０１（化合物１）、及びMicromonospora sp.株０４６−ＥＣＯ１１並びに［Ｓ０１］０４６を開示しており、ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００７５１はその癌治療への使用を開示している。
【０００４】
【化１】
2008514551.tif 000003
【０００５】
カナダ公開特許出願第２，２４８，８２０号は、抗ヒスタミン特性をもつとして合成ジベンゾジアゼピノンアナログを開示している。
【０００６】
生物活性をもつ多くの化合物が細菌から同定されてきたが、依然として、より強化された特性をもつ新規の化合物を得ることが必要とされている。したがって、薬学的活性のある化合物を高収量且つ費用効率の高い方法で得る、然るべき必要性がある。本発明は、新規の治療用化合物及びその化合物の生合成後化学修飾による製造方法を提供することによって、これらの問題を解決する。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，５４１，１８１号（Ohkuma et al.）
【特許文献２】カナダ特許第２，４６６，３４０号
【特許文献３】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／０００７５１
【特許文献４】カナダ特許出願第２，２４８，８２０号
【発明の開示】
【０００８】
本発明の１つの観点では、ジベンゾジアゼピノンアナログは、以下で定義される式Ｉの化合物又は水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体で表されるか、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩，溶媒和物、又はプロドラッグである。別の実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは以下で定義される化合物２〜２７のいずれかで表されるか、又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグ、或いは化合物２〜２５のいずれかのプロドラッグの塩である。さらなる実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは、以下で定義される化合物２〜５、７，１３，１４，１５，１８、２１、及び２２のいずれかで表されるか、又は化合物２〜５、７，１３，１４，１５，１８、２１、及び２２のいずれか１つの薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグである。
【０００９】
本発明のまた別の観点では、ジベンゾジアゼピノンアナログは、以下で定義される化合物２３〜２５のいずれかで表される化合物、又は化合物２３〜２５のいずれかの薬学的に許容される溶媒和物若しくはプロドラッグである。
【００１０】
本発明はさらに以下のステップを含む方法で得られたジベンゾジアゼピノンアナログを包含する：（ａ）ＥＣＯ−４６０１を単離された形態で準備する、（ｂ）化合物１を化学修飾する。別の実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは、式Ｉの化合物若しくはその水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体であるか、又はその薬学的に許容される塩，溶媒和物、若しくはプロドラッグである。別の実施形態では、化学修飾のステップ（ｂ）は、Ｎ−アルキル化、Ｏ−トリアセチル化、アリール臭素化、及びファルネシル水素化又はヒドロアルコキシ化から選択される１つ以上のステップである。別の実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは化合物２〜２７から選択される。別の実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１及び２２から選択される。別の実施形態では、ジベンゾジアゼピノンアナログは化合物２３〜２５から選択される。
【００１１】
本発明は更にジベンゾジアゼピノン化合物の製造方法を包含するし、かかる方法はファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物の化学修飾、及び、場合によって、生産されたジベンゾジアゼピノン化合物の単離並びに精製を含む。１つの実施形態では、化学修飾のステップは、Ｎ−アルキル化、Ｏ−トリアセチル化、アリール臭素化、及びファルネシル側鎖二重結合の水素化並びにヒドロアルコキシ化などによる修飾から選択される少なくとも１つのステップを含む。かかる実施形態のサブクラスでは、ファルネシル側鎖の修飾反応は部分的である（１つ又は２つの二重結合が修飾されている）か、完全である（３つ全ての二重結合が修飾されている）。
【００１２】
本発明は更に、哺乳類の前癌又は癌状態の治療のための抗腫瘍薬剤としての、式Ｉの化合物又は水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体、或いはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグの使用を包含する。１つの実施形態では、前記化合物は化合物２〜２７から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１及び２２から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２３〜２５から選択される。
【００１３】
本発明は更に、哺乳類の増殖性疾患治療のための抗新生物剤としての、式Ｉの化合物又は水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体、或いはそれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの使用を包含する。１つの実施形態では、前記化合物は化合物２〜２７から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１及び２２から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２３〜２５から選択される。
【００１４】
本発明は更に、哺乳類の前癌又は癌状態治療のための薬剤の調製における、式Ｉの化合物又は水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの使用を包含する。１つの実施形態では、前記化合物は化合物２〜２７から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１及び２２から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２３〜２５から選択される。
【００１５】
本発明は更に、式Ｉの化合物又は水素化若しくはヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体、或いはそれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、腫瘍又は前癌若しくは癌状態の治療における使用方法を一緒にした商業用パッケージを包含する。１つの実施形態では、前記化合物は化合物２〜２７から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１及び２２から選択される。別の実施形態では、前記化合物は化合物２３〜２５から選択される。
【００１６】
１つの実施形態では、上述の使用において、癌細胞、新生物、及び前癌状態又は癌状態は、白血病、メラノーマ、乳癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、及び中枢神経系癌から選択される．別の実施形態では、上述の方法及び使用において、癌細胞、及び前癌状態又は癌状態は、白血病、乳癌、前立腺癌、及び中枢神経系癌から選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は改善された特性を有する新規のジベンゾジアゼピノンアナログに関し、本明細書中では式Ｉの化合物及び水素化又はヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体、並びに化合物２〜２７として言及されている。本発明は更に、ジベンゾジアゼピノン化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物，及びプロドラッグに関する。本発明は更に、化合物１の化学修飾によって前記アナログを得る方法に関する。化合物１は、ＰＣＴ／ＣＡ０４／００００６９に開示されているように、放線菌Micromonospora sp. ０４６−ＥＣＯ１１（０４６（ＥＣＯ１１）ともいう）又は［Ｓ０１］０４６株から単離される。
【００１８】
本発明は又、発酵及び単離によって得られたファルネシルジベンゾジアゼピノンを化学修飾することによる新規ジベンゾジアゼピノンアナログの製造方法にも関する。かかる実施形態のサブクラスにおいては、製造される化合物は、式Ｉの化合物、又はその水素化若しくはヒドロアルコキシ化されたファルネシル誘導体化合物、或いは化合物２３〜２７から選択される化合物である。
【００１９】
本発明はまた、式Ｉ及び化合物２〜２７の化合物、並びにそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物及び誘導体を含有する医薬組成物にも関する。前記化合物は薬剤として有用であり、特に腫瘍細胞成長抑制剤としての使用に有用である。
【００２０】
以下の詳細な開示は、腫瘍の成長を抑制するためのジベンゾジアゼピノンアナログ及びこれらの化合物を含む組成物の製造方法及び使用方法を開示している。
【００２１】
したがって、本発明のある観点は、本発明のジベンゾジアゼピノン化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、及び前癌又は癌状態を治療するための前記医薬組成物の使用方法に関する。
【００２２】
I．定義
本明細書中で使用される科学技術用語は、本発明の属する技術分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を有している。便宜上、本明細書、実施例、及び添付の請求の範囲で用いられる特定の用語及びフレーズの意味を以下に示す。
【００２３】
本明細書で使用されているように「ファルネシルジベンゾジアゼピノン」という用語は化合物１、すなわち１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５，１０−ジヒドロジベンゾ［ｂ、ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンを指し、ＥＣＯ−４６０１とも呼ぶ。
【００２４】
本明細書中で使用されているように、「本発明の化合物」、「ジベンゾジアゼピノンアナログ」、「ジベンゾジアゼピノン化合物」、及び同等の表現は、ファルネシル部分を含むか又はファルネシル部分から誘導されたジベンゾジアゼピノン化合物群及びその薬剤的に許容される塩、溶媒和物、並びにプロドラッグを指す。かかる用語は、式Ｉの化合物、化合物２〜２７から選択される化合物若しくは本発明中で例示されている化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、及び２１〜２５の化合物、又は上記化合物のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物，若しくはプロドラッグを含む。本明細書中で使用されるように、「ジベンゾジアゼピノンアナログ」という用語は、化学合成の中間体として使用されるこの属の化合物及び及び原子の最も豊富に存在する同位体と異なる同位体を含む変種（例えば，ＨがＤで置換されている、１２Ｃが１３Ｃで置換されている等）を含む。本発明の前記化合物は、「活性成分」と言及されていることもある。
【００２５】
本明細書中で使用されているように、「化学修飾」という用語は、化学合成によってジベンゾジアゼピノン化合物（出発原料と言及されている）を修飾する１つ以上のステップを指す。化学修飾の過程において出発原料として使用される好ましい化合物は化合物１である。化学修飾ステップの例は、Ｎ−アルキル化、Ｏ−アシル化、芳香族臭素化、及び水素化並びにヒドロアルコキシ化を含むファルネシル側鎖二重結合の修飾を含む。側鎖の修飾反応は部分的（１つ又は２つの二重結合が修飾されている）又は完全（３つの二重結合が修飾されている）であってよい。化学修飾ステップはセクション３Ｂのスキームにおいて定義されており、又、実施例４〜８で例示されている。
【００２６】
「エステル」という用語は、以下のスキーム１（ｂ）で定義されるＯ−アシル化反応によってアルコールの水素原子をＣ（Ｏ）Ｒ’’置換基で置換することで得られるジベンゾジアゼピノンアナログを指す（スキーム中、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’はＣに結合したアミノ酸でも良い）。エステルという用語はまた、限定されるものではないが、炭酸エステル、カルバミン酸エステル等のエステル均等物も包含する。特に、「エステル」という用語は、４、６、及び８位のアルコールのエステルを包含する（原子の番号付けは実施例３〜８を参照）。
【００２７】
「Ｎ−アルキル化誘導体」という用語は、下のスキーム２（ａ）で定義されるＮ−アルキル化によって、窒素原子に結合した水素原子をＲ置換基で置換することで得られるジベンゾジアゼピノンアナログを指す。特に，「Ｎ−アルキル化誘導体」という用語は５位の窒素が置換された誘導体を包含する（原子の番号付けは実施例３〜８を参照）。
【００２８】
本明細書中で使用されているように、「水素化又はヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体」という用語は、１〜３箇所に修飾があるファルネシル側鎖を有する化合物を指し、かかる修飾は飽和（水素原子２個の付加）又はアルコール分子（水素原子及びＯＣ１−６アルキル）の付加によるものであり、それぞれスキーム３（ａ）及び３（ｂ）で定義され」、より具体的には実施例４及び７で定義される。
【００２９】
本明細書中で使用されているように、略語は通常の意味を有している。別に注記されていない限り、略語「Ａｃ」、「Ｍｅ」、「Ｅｔ」、「Ｐｒ」、「ｉ−Ｐｒ」、「Ｂｕ」、「Ｂｚ」、「Ｂｎ」及び「Ｐｈ」はぞれぞれ、アセチル、メチル、エチル、プロピル（ｎ−又はｉｓｏ−プロピル）、ｉｓｏ−プロピル、ブチル（ｎ−、ｉｓｏ−、ｓｅｃ−、又はｔｅｒｔ−ブチル）、ベンゾイル、ベンジル、及びフェニルを指す。計測単位、技術、特性，又は化合物に対する本明細書中の略語は以下の通りである：「ＲＴ」及び「Ｒｔ」は保持時間、「ｍｉｎ」は分、「ｈ」は時間、「μＬ」はマイクロリットル、「ｍＬ」はミリリットル、「ｍＭ」はミリモルの、「Ｍ」はモルの、「ｍｍｏｌｅ」はミリモル、「ｅｑ」はモル当量を意味する。「高圧液体クロマトグラフィー」又は「高速液体クロマトグラフィー」はＨＰＬＣと略した。
【００３０】
「アルキル」という用語は、直鎖、分岐，又は環状の飽和炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、限定するものではないが、メチル、エチル、 ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘキシメチルなどが挙げられる。アルキル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、オキソ、グアニジノ、及びホルミルから選択される置換基によって置換されていてもよい。
【００３１】
ｎが２〜１２の整数である「Ｃ１−ｎアルキル」という用語は、１〜指定される「ｎ」個の炭素を有するアルキル基を指す。前記Ｃ１−ｎアルキルは環状又は直鎖若しくは分岐鎖であってよい。
【００３２】
ｎが２〜１０の整数である「直鎖Ｃ１−ｎアルキル」という用語は、１〜指定される「ｎ」個の炭素を有し且つ直鎖状であるアルキル基、すなわち結合した原子（本明細書では窒素）の周辺において環状又は分岐状ではないアルキル基を指す。前記Ｃ１−ｎアルキルは、アミノ、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、及びアルコキシのような基によって置換されていてもよい。
【００３３】
「アルケニル」という用語は、直鎖、分岐，又は環状の、１〜６個の炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基を指す。アルケニル基の例としては、限定するものではないが、ビニル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン−４−イル、２−ブテン−４−イル、及び１−ペンテン−５−イルなどが挙げられる。アルケニル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、ホルミル、オキソ、及びグアニジノから選択される置換基によって置換されていてもよい。不飽和炭化水素鎖の二重結合部分は、シス又はトランス立体配置のどちらでもよい。
【００３４】
ｎが３〜１２の整数である「Ｃ２−ｎアルケニル」という用語は、２〜指定される「ｎ」個の炭素を有するアルケニル基を指す。Ｃ２−ｎアルケニルは、環状又は直鎖若しくは分岐鎖であってよい。
【００３５】
「アルキニル」という用語は、直鎖，分岐鎖，又は環状の、少なくとも一個の炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、限定するものではないが、エチニル、１−プロピン−３−イル、１−ブチン−４−イル、２−ブチン−４−イル、及び１−ペンチン−５−イルなどが挙げられる。アルキニル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、ホルミル、オキソ、及びグアニジノから選択される置換基によって置換されていてもよい。
【００３６】
ｎが３〜１２の整数である「Ｃ２−ｎアルキニル」という用語は、２〜指定される「ｎ」個の炭素を有するアルキニル基を指す。Ｃ２−ｎアルキニルは、環状又は直鎖若しくは分岐鎖であってよい。
【００３７】
「シクロアルキル」又は「シクロアルキル環」という用語は、上で定義したアルキル基でさらに、３〜１５個の環員を有する単一又は縮合炭素環系中において飽和又は部分的に不飽和の炭素環を有するアルキル基を指す。シクロアルキル基の例としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテン−１−イル、シクロペンテン−２−イル、シクロペンテン−３−イル、シクロヘキシル、シクロヘキセン−１−イル、シクロヘキセン−２−イル、シクロヘキセン−３−イル、シクロヘプチル、ビシクロ[４，３，０]ノナニル、及びノルボルニルなどが挙げられる。シクロアルキル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、及びホルミルから選択される置換基によって置換されていてもよい。
【００３８】
ｎが４〜１５の整数である「Ｃ３−ｎシクロアルキル」という用語は、３個〜指定される「ｎ」個の炭素を有するシクロアルキル環又はシクロアルキル環系を指す。
【００３９】
「へテロシクロアルキル」、「複素環式」、又は「ヘテロシクロアルキル環」という用語は、上記で定義したシクロアルキル基でさらに、３〜１５個の環員（例えば、テトラヒドロフラニルは、１個の酸素原子を含む５個の環員をもつ）を有する単一若しくは縮合複素環系中に１〜４個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）又はヘテロ基（例えば，ＮＨ、ＮＲＸ、ＰＯ２、ＳＯ、ＳＯ２）を含むシクロアルキル基を指す（例えば、テトラヒドロフラニルは、１個の酸素原子を含む５個の環員をもつ）。へテロシクロアルキル、複素環式、又はヘテロシクロアルキル環の例としては、限定するものではないが、ピロリジノ、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロジチエニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニン、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３，１，０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４，１，０］ヘプタニル、３Ｈ−インドリル、およびキノリジニルが挙げられる。前述のヘテロシクロアルキル基は、上記の化合物から派生するときに、可能な場所において炭素又は窒素が結合していてもよい。ヘテロシクロアルキル、複素環式、又はヘテロシクロアルキル環は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、オキソ、チオカルボニル、イミノ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル及びホルミルから選択される置換基によって置換されていてもよい。
【００４０】
ｎが４〜１５の整数である「Ｃ３−ｎヘテロシクロアルキル」という用語は、環の中に３〜指定される「ｎ」個の原子及び少なくとも１つの上で定義したヘテロ基を有するヘテロシクロアルキル基を指す。
【００４１】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は臭素、塩素、フッ素、又はヨウ素の置換基である。
【００４２】
「アリール」又は「アリール環」という用語は、共役した単環系又は多環系において「４ｎ＋２」（ｎは１〜３の整数）個のΠ（パイ）電子を有し且つ５〜１４個の環原子を有する通常の芳香族基である。アリールは直接、若しくはＣ１−３アルキル基を介して結合していてもよい（アラルキルともいう）。アリールの例としては、限定するものではないが、フェニル、ベンジル、フェネチル、１−フェニレチル、トリル、ナフチル、ビフェニル、及びテルフェニルなどが挙げられる。アリール基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、アジド、アルキチオ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、及びホルミルから選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい。
【００４３】
ｎが５〜１４の整数である「Ｃ５−ｎアリール」という用語は、炭素、窒素、酸素、及び硫黄を含む原子を５〜指定される「ｎ」個有するアリール基を指す。前記Ｃ５−ｎアリールは単環又は多環でもよい。
【００４４】
「ヘテロアリール」又は「ヘテロアリール環」という用語は、上で定義したアリール環でさらに、酸素，窒素、硫黄又はリンから選択されるヘテロ原子を１〜４個含むものを指す。ヘテロアリールの例としては、限定するものではないが、ピリジル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、チアゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンジミダゾリル、ベンゾフラニル、シノリニル、イミダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、チアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニル基が挙げられる。ヘテロアリールは、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、アジド、アルキチオ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルホニル、及びホルミルから選択される１つ以上の置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリールは、直接又はＣ１−３アルキル基を介して結合していてもよい（ヘテロアラルキルともいう）。前述のヘテロアリール基は、上記の化合物から派生するときに、可能な場所において炭素又は窒素が結合していてもよい。
【００４５】
ｎが５〜１４の整数である「Ｃ５−ｎヘテロアリール」という用語は、炭素，窒素、酸素、及び硫黄を含む原子を５〜指定される「ｎ」個有するヘテロアリール基を指す。前記Ｃ５−ｎヘテロアリールは単環又は多環でもよい。
【００４６】
「アミノ酸」という用語は、アミノ基を有する有機酸を指す。この用語は天然及び合成アミノ酸の両方を含む。したがって、アミノ基は、それを要件とするわけではないが、前記酸に隣接する炭素に結合していてもよい。炭素共役アミノ酸置換基は、カルボン酸官能基を介して親分子のへテロ原子（窒素又は酸素）に結合している。炭素共役アミノ酸は親分子と、ヘテロ原子が酸素のときエステルを形成し、ヘテロ原子が窒素のときアミドを形成する。アミノ酸の例として、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、ヒスチジン、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、デスモシン、オルニチン、２−アミノ酪酸、シクロヘキシルアラニン、ジメチルグリシン、フェニルグリシン、ノルバリン、ノルロイシン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、エチルグリシン、ベータ−アラニン、アミノアジピン酸、アミノ酪酸、エチルアルパラギン、及びＮ−メチルアミノ酸。アミノ酸は、純粋なＬ又はＤ異性体でもよいし、Ｌ異性体とＤ異性体の混合物であってもよい。
【００４７】
本発明の化合物は１つ以上の不斉炭素を含有してもよく、ラセミ化合物又は非ラセミ化合物の混合物を形成する光学異性体として存在してもよい。本発明の化合物は、単一の異性体として、又は立体化学異性体の混合物として有用である。ジアステレオ異性体、すなわち重ね合わせることができない立体化学異性体は、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化，又は昇華のような従来技術によって分離できる。光学異性体は、従来技術に従いラセミ混合物を分割することで得られる。かかる従来技術は、キラルクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）、イムノアッセイ、又は共有結合で結合したキラル試薬（例えば、モッシャー法のエステル）若しくは非共有結合で結合したキラル試薬（例えば、キラル塩）の使用を含む。かかるキラル試薬は、それぞれジアステレオマーエステル若しくはジアステレオマー塩を形成し、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化，又は昇華のような従来技術によってさらに分離することができる。前記キラルエステル又はキラル塩はその後，求める異性体に復元するために、従来技術により開裂又は置換される。
【００４８】
本発明は、単離又は精製された化合物を包含する。「単離された」又は「精製された」化合物とは、重量で混合物の少なくとも１０％、２０％、５０％、８０％、又は９０％を構成する化合物を指す。ただし、本発明の化合物を含む混合物は、当業者に知られている従来の生物検定において、実証可能な（すなわち、統計的に有効な）、細胞増殖抑制、細胞毒性、酵素阻害，受容体結合作用などの生物学的活性を有する。
【００４９】
「薬学的に許容される塩」という用語は、従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を有する化合物から合成された非毒性の塩を指す。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の酸性型又は塩基性型を、水中又は有機溶媒中、若しくはその混合物中（一般的に、エーテル、酢酸エチル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性溶媒が好まれる。）で化学量論的量の適当な塩基又は酸と反応させることで調製される。塩を調製する別の方法は、イオン交換樹脂の使用である。「薬学的に許容される塩」という用語は、酸付加塩及び塩基付加塩の両方、親化合物又はプロドラッグのいずれか、又はそれらの溶媒和物を含む。薬学的に許容されるのであれば、塩の性質は重要ではない。酸付加塩に使用される酸の例としては、限定するものではないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸，炭酸、硫酸、スルホン酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、グルタミン酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボン酸、（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、マロン酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸などが挙げられる。好ましい薬学的に許容される塩基付加塩は、限定するものではないが、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛からできる金属塩、又はＮ，Ｎ，−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リシン及びプロカインなどからできる有機塩を含む。薬学的に許容される塩の追加例は、Berge et al (1977), Journal of Pharmaceutial Sciences, vol 66, no 1, pp 1-19,に挙げられており、その内容全体を本願に引用して援用する。
【００５０】
「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物と１つ以上の溶媒分子（有機でも無機でも）との物理的会合を指す。かかる物理的会合は水素結合を含む。ある場合においては、例えば１つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に組み込まれているとき、溶媒和物は分離可能である。「溶媒和物」は、液相及び分離可能な溶媒和物の両方を含む。溶媒和物の例としては、水和物、エタノール溶媒和物、メタノール溶媒和物、及びヘミエタノール溶媒和物などが挙げられる。
【００５１】
「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、本発明の化合物のあらゆる薬学的に許容されるエステル、エステル塩、又はその他のあらゆる誘導体を指す。これらは、対象（recipient）に投与されることで、直接又は間接的に本発明の化合物又はその生物学的に活性な代謝産物若しくはその残留物を提供することを可能とする。特に好ましい塩又はプロドラッグは、それが哺乳類に投与されたとき、本発明の化合物の溶解性、効果、又は生物学的利用能のような特性が強化される（例えば、経口投与した化合物の血中への吸収をより容易にする）ものであるか、親化合物の、その関連する生物学的な区画（例えば、脳やリンパ系）への送達を向上させるものである。本明細書中で使用されるように、プロドラッグは、担体に共有結合で結合した１つ以上の官能基を有するドラッグであり、かかる担体は、哺乳類対象に投与されたときにイン・ビボで代謝によって又は化学的にドラッグをリリースする。本発明の化合物の薬学的に許容されるプロドラッグは、限定されるわけではないが、アシルオキシメチル、アシルオキシエチル並びにアシルチオエチルエーテル、エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、スルホン酸並びに硫酸エステル、及びそれらの金属塩などのようなヒドロキシル基誘導体を含む。
【００５２】
II．本発明の化合物
１つの観点では、本発明は、本明細書中で本発明の化合物と呼んでいる新規のジベンゾジアゼピノンアナログ、及びその薬学的に許容される塩、溶媒和物並びにプロドラッグに関する。
【００５３】
本発明の化合物である化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、及び２１〜２５は、実施例４〜８に詳述されるように、マススペクトルやＮＭＲスペクトルのような物理化学的特性及びスペクトル特性のいずれかによって特徴付けられる。
【００５４】
別の観点では、本発明の化合物は、式Ｉによって特徴付けられる化合物、又は式Ｉのファルネシル基が１、２、若しくは３個の水素化若しくはヒドロアルコキシ化二重結合を有するファルネシル誘導体、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである。
【００５５】
【化２】
2008514551.tif 000004
【００５６】
［式中、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルである。］
【００５７】
１つの実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、他の全ての基はすでに開示された通りである。かかる実施形態のサブクラスでは、アルキル基は任意選択でハロ、フルオロ、アミノ及びカルボキシから選択される置換基で置換されているか、又はそれらの薬学的に許容される塩である。別の実施形態では、Ｒ１はメチルである。別の実施形態では、Ｒ１はエチルである。別の実施形態では、Ｒ１はｎ−プロピルである。別の実施形態では、Ｒ１はｎ−ブチルである。別の実施形態では、Ｒ１はｎ−ペンチルである。別の実施形態では、Ｒ１はｎ−ヘキシルである。別の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ファルネシルが完全に水素化（すなわち、飽和）されている。別の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ファルネシルの二重結合の１つが水素化されている。別の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ファルネシルの二重結合の２つが水素化されている。別の実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシルの二重結合の１つが水素化されている。別の実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシルの二重結合の２つが水素化されている。別の実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシルが完全に水素化（すなわち、飽和）されている。別の実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシルの二重結合の１つがヒドロメトキシ化されている。別の実施形態では、Ｒ１は直鎖Ｃ１−１０アルキルであり、ファルネシルの二重結合の２つがヒドロメトキシ化されている。別の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ファルネシルの二重結合の１つがヒドロアルコキシ化されている。別の実施形態では、Ｒ１はメチルであり、ファルネシルの二重結合の２つがヒドロアルコキシ化されている。別の実施形態では、Ｒ１はエチルであり、ファルネシルの二重結合の１つがヒドロアルコキシ化されている。別の実施形態では、Ｒ１はエチルであり、ファルネシルの二重結合の２つがヒドロアルコキシ化されている。本発明は、前述の化合物の全てのエステル又はＮ−アルキル化誘導体、及び薬学的に許容される塩、溶媒和物、並びにプロドラッグを包含する。
【００５８】
以下は本発明の化合物の例である。ここに挙げた化合物は、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００５９】
Ａ．Ｎ−アルキル化産物
【００６０】
【化３】
2008514551.tif 000005
【００６１】
【化４】
2008514551.tif 000006
【００６２】
Ｂ．Ｎ−アルキル化産物の水素化誘導体
【００６３】
【化５】
2008514551.tif 000007
【００６４】
Ｃ．Ｎ−アルキル化産物のヒドロアルコキシ化誘導体
【００６５】
【化６】
2008514551.tif 000008
【００６６】
Ｄ．その他の選択
【００６７】
【化７】
2008514551.tif 000009
【００６８】
又は化合物２〜２７のいずれかの薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグ。
【００６９】
本発明はさらに、前述の化合物のいずれのエステル又はＮ−アルキル化誘導体をも提供する。ある実施形態においては、１つ以上の式Ｉの化合物が明示的に除外されている。
【００７０】
本発明の化合物のプロドラッグは、４、６及び８−ヒドロキシ基の１つ以上の基又は分子上のその他のヒドロキシル基が、何らかの基に結合しており、哺乳類対象に投与されたときにその基が開裂されて遊離ヒドロキシル基を形成することを特徴とする化合物を含む。プロドラッグの例として、限定されるものではないが、ヒドロキシ基官能基の酢酸塩、ギ酸塩、ヘミコハク酸塩、安息香酸塩、ジメチルアミノ酢酸塩、及びリン酸オキシカルボニル誘導体や、ヒドロキシル基官能基のジメチルグリシンエステル、アミノアルキルベンジルエステル、アミノアルキルエステル、又はカルボキシアルキルエステルを含む。ヒドロキシ基のカルバメート誘導体及び炭酸塩誘導体も含まれる。さらに包含されるヒドロキシル基アナログとして、アシル基が、限定されるわけではないが、エーテル，アミノ、及びカルボン酸などの官能基で置換されていてもよいアルキル基を含むか、又はアシル基がアミノ酸エステルであることを特徴とする（アシルオキシ）メチル及び（アシルオキシ）エチルエーテルがある。また、リン酸及びホスホン酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステルも含まれ、これらはアルキル化状態（例えば、ビス−ピバロイルオキシメチル（ＰＯＭ）リン酸トリムエステル、つまり−Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｅｔ２）又は塩状態（例えば、リン酸ナトリウムエステル（−Ｐ（Ｏ）Ｏ−２Ｎａ＋２））で存在する。抗癌治療に使われるプロドラッグ及びその代謝についての更なる例として、本願に引用して援用するRooseboom et al (2004), Phamacol.Rev., vol56, 53-102を参照のこと。プロドラッグが酸性若しくは塩基性部分を含むとき、かかるプロドラッグはその薬学的に許容される塩として調製されてもよい。
【００７１】
本発明の化合物は、本発明の化合物からなる医薬組成物と、下のセクションＩＶに議論されているように、薬学的に許容される担体との組み合わせで処方されてもよい。
【００７２】
III．  ジベンゾジアゼピノンアナログの製造方法
Ａ．発酵
「ファルネシルジベンゾジアゼピノン生産微生物」及び「ファルネシルジベンゾジアゼピノン生産菌」という用語は、本明細書中で使用されているように、ファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物の生産に必要な遺伝情報を有する微生物を指し、かかる生物が天然に前記化合物を生産しているかどうかにかかわらない。該用語は、ファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物の生産に必要な遺伝情報を自然の環境で有する前記生物、及び組換え技術により遺伝情報を導入した生物に等しく適用される。
【００７３】
化合物は、本願に全体を引用して援用する米国特許出願第１０／７６２，１０７号に記載されているように、Micromonospora株０４６−ＥＣＯ１１及び［Ｓ０１］０４６の発酵培養液の単離によって生産される。化合物１の生産は、特定の株０４６−ＥＣＯ１１及び［Ｓ０１］０４６の使用だけに限定されるわけではない。むしろ、Ｘ線照射、紫外線照射、ナイトロジェンマスタード処理、ファージ感染、及び抗生物質耐性選択などの公知の方法による、若しくは組換え遺伝子工学技術の利用による、前記生物に由来する０４６−ＥＣＯ１１及び［Ｓ０１］０４６の変異体若しくはバリアントのような他のＥＣＯ−４６０１生産生物が使われてもよい。例えば，Manual of Industrial Microbiology and biotechnology, Demain and Solomon, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1986、Hesketh et al. (1997), J. Antibiotics, vol 50, no6, 532-535、 及びHosoya et al. (1998), Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol 42, no 8,2041-2047)を参照。これらの内容の全体を本願に引用し援用する。
【００７４】
前記ファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物はさまざまに微生物に生合成され得る。ファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物を合成し得る微生物には、限定されるわけではないが、Actinomycetales目（actinomycetesとも呼ぶ）の細菌が含まれる。Actinomycetes属に属するメンバーの例として、限定されないが、Nocardia, Geodermatophilus, Actinoplanes, Micromonospora, Nocardioides, Saccharothrix, Amycolatopsis, Kutzneria, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Kitasatospora, Streptomyces, Microbispora, Streptosporangium、及びActinomaduraが含まれる。actinomycetesの分類法は複雑であり、本発明の化合物を合成し得る属の参照として、Goodfellow, SupragenericClassification of Actinomycetes (1989)、Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4 (Williams and Wilkins, Baltimore, pp. 2322-2339)及びEmbley and Stackebrandt, “The molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes,” Annu. Rev. Microbiol. (1994) 48:257-289を用いた。これらの参照文献の内容全体を引用して援用する。
【００７５】
ファルネシルジベンゾジアゼピノン生産微生物は、actinomycetesの既知の栄養源を含む培地で培養した。そのような培地は、ｐＨ約６〜約９において、代謝可能な炭素源、窒素源、場合により無機塩、及びその他の成長因子を含む。好適な培地として、限定されるわけではないが、表１に示される増殖培地がある。微生物は約１８℃〜約４０℃、約３〜約４０日間培養された。
【００７６】
【表１】
2008514551.tif 000010
【００７７】
別記されていない限り、全ての成分はｇ／ｌである。
*１ｐＨは、ＣａＣＯ３の添加前に表示通り合わせた。
*２微量元素溶液は以下を含む：ＺｎＣｌ２  ４０ｍｇ；ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）；ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）；ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）；（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）／ｌ
【００７８】
ファルネシルジベンゾジアゼピノン生産微生物を植菌した培地は、攪拌（例えば、回転振盪機、振盪恒温槽での振盪又はファーメンターの使用）して通気してもよい。空気、酸素、又は適当な混合気体を培養中の培地に通すことで通気してもよい。培養後、例えば遠心、クロマトグラフィー、吸着、濾過などの当業者に知られている技術及び／又は本明細書中で開示されている技術を用いて、培養を行った培地からファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物を抽出及び単離することができる。例えば，培養培地は、任意選択で酸性化してからメタノール、エタノール、n−ブタノール、酢酸エチル、ｎ−ブチル酢酸又は４−メチル−２−ペンタノンのような適切な有機溶媒と混合してもよい。かかる有機相は、例えば遠心及びデカンテーション又はろ過によって菌糸体から分離することができる。任意選択で前記菌糸体をさらに有機溶媒で抽出して、前記有機抽出物と一緒にしてもよい。任意選択で、有機相をさらに、例えば水洗、沈殿生成、及び濾過などの処理をし、次いで、例えば真空下で蒸発乾燥させることによって溶媒を除去する。生じた残留物は、場合によって、例えば水、エチルエーテル、エタノール、酢酸エチル，メタノール又はそれらの混合物で再構成し、ヘキサン、四塩化炭素、塩化メチレン又はそれらの混合物のような適切な有機溶媒を用いた二相系で再抽出することができる。溶媒除去後、化合物はさらに、順相又は逆相液体クロマトグラフィー、結晶化，昇華、吸着、及び質量排除クロマトグラフィーのような標準的技術で精製することができる。
【００７９】
Ｂ．  化学修飾：
ファルネシルジベンゾジアゼピノン化合物１は微生物によって生合成され、本明細書及びカナダ特許第２，４６６，３４０号（及びＰＣＴ／ＣＡ０４／００００６９）に記載されている通りに単離される。化合物１は、誘導体又は構造アナログを形成するために、ランダム及び／又は直接に化学修飾を受ける。相同な機能的活性を有するこのような誘導体又は構造アナログは、本発明の範囲内に含まれる。ファルネシルジベンゾジアゼピノンは、この技術分野で既知の方法及び本明細書記載の方法を用いて、１つ以上の化学修飾ステップにより修飾されてもよい。化学修飾方法の例は実施例４〜８に提供されている。
【００８０】
化合物１の誘導体であるジベンゾジアゼピノンアナログ（例えば，本明細書中で、式Ｉの化合物及びその誘導体、及び化合物２〜２７として同定されている化合物）は標準的な有機化学の手法で製造される。本明細書に記載されている化合物を製造及び加工するために必要な、官能基、反応性、及び一般的なプロトコールを含む、有機化学の一般原則は、例えば、”Advanced Organic Chemistry,” 4thEdition by Jerry March (1992), Wiley-Interscience, USAに記載されており、この文献の全体を本願に引用して援用する。加えて，当業者は、本明細書に記載の合成方法は保護基を使用してもよいと、それが明示的に記載されていなくても、理解するだろう。本明細書で使用されているとおり、「保護基」とは、多官能基化合物において、反応が選択的に別の反応部位で行われるように、酸素，硫黄、又は窒素を有する反応基などの１つ以上の官能性部分を遮断するために使用される部分を意味する。保護基の使用のための一般原則、特定の官能基へのその適用可能性、及び使用法は，例えば，T. H. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rdEdition, John Wiley & Sons, New York (1999)に記載されており、この文献の全体を本願に引用して援用する。
【００８１】
アルコール及びフェノールは、必要があれば、例えばシリルエーテル（ＴＭＳ：トリメチルシリル、ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル）、アセタール（ＭＯＭ：メチルオキシメチル、ＢＯＭ：ベンジルオキシメチル）、エステル（酢酸、ベンゾイル）、及びエーテル（Ｂｎ：ベンジル）で保護される。アルコールは、シリルエーテルにはＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、アセタール及びエーテルには酸性水溶液触媒、エステルにはケン化、Ｂｎ及びＢＯＭには加水素分解のような条件下で脱保護される。アミンは、必要があれば、例えばカルバメート（例、ｔｅｒｔ−ブチル（ＢＯＣ）及びベンジル（ＣＢＺ））、並びにフルオレン誘導体（例、ＦＭＯＣ：Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−）などの、標準的なアミノ酸保護基を用いて保護される。アミンは、例えばＢＯＣには酸加水分解、ＣＢＺには加水素分解、又はＦＭＯＣには塩基処理のような条件下で脱保護される。全ての保護及び脱保護条件は、上記のGreene et alの文献に従って実施される。
【００８２】
当業者は、化合物１の派生体を生産するのに多くの化学合成過程が使用できることを認識するだろう。以下のスキームは、本発明の化合物を生成するのに使われてもよい通常の化学修飾の例である。本明細書に記載されている構造を提供するどんな化学修飾方法も使用されてよいし、それらは本発明に含まれる。
【００８３】
スキーム１：アルコール修飾（Ｏ−アシル化）
【００８４】
【化８】
2008514551.tif 000011
【００８５】
スキーム中、Ｒ’’は酢酸塩である。
【００８６】
スキーム１において、フェノールアルコールは、カップリング剤（例：ＥＤＣ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−ジイソプロピルエチルカルボジイミド塩酸塩；又はＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩））と塩基（例として、ピリジン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ））及び任意でＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物）並びに／又はＤＭＡＰ（４−（ジメチルアミノ）ピリジン）などの非触媒とで活性化した酸ハロゲン化物、無水物、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、又はカルボン酸のような、活性カルボン酸（Ｒ’’Ｃ（Ｏ）Ｘ）と反応させることでエステルに変換される。同じ反応は、ファルネシル修飾反応（スキーム３）で形成されたアルコールに対してなされてもよい。
【００８７】
スキーム１は，例えば化合物１から化合物２５を得るために、及び本発明の化合物のエステルを生成するために利用される。
【００８８】
スキーム２：アミン修飾（Ｎ−アルキル化）
【００８９】
【化９】
2008514551.tif 000012
【００９０】
スキーム中、Ｒは任意に置換されている直鎖Ｃ１−１０アルキルから選択される。
【００９１】
スキーム２において、５位（位置は実施例３参照）のアミン基がアルキル化される。スキーム２（ａ）において、ジアルキル硫酸及びハロゲン化アルキルのようなＲＸアルキル化剤を用いて、好ましくは塩基（例、重炭酸ナトリウム及びピリジンなど）存在下で、アミンがアルキル化される。
【００９２】
スキーム２は、例えば化合物１から化合物２〜１３、及び化合物２３から化合物１４を調製するために、及びＮ−アルキル基を含む式Ｉの化合物のいずれかを生成するために利用される。
【００９３】
スキーム３：二重結合修飾
【００９４】
【化１０】
2008514551.tif 000013
【００９５】
式中、ＲＺはＯＣ１−６アルキルである。
【００９６】
スキーム３において、二重結合は（ａ）水素化、及び（ｂ）ヒドロアルコキシ化、によって修飾される。（ａ）において水素化は、水素源（例、水素、ギ酸）及び触媒（例えばロジウム、白金、又はパラジウム）を用いて行われる。（ｂ）において、酸性条件下（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、及びアルキル硫酸／ＮａＨＣＯ３／ＭｅＯＨなど）のプロトン付加によるカルボカチオンの形成及びアルコール（Ｃ１−６アルキルアルコール、ヒドロアルコキシ化）による前記カルボカチオンの捕獲によって、二重結合への求電子付加が達成される。
【００９７】
スキーム３は、例えば（ａ）は化合物１から化合物２３、並びに化合物２から化合物１４〜１６を得るために、（ｂ）は化合物２から化合物１７〜１９、化合物３から化合物２０〜２２を得るために利用される。スキーム３（ａ）及び（ｂ）はまた、式Ｉの化合物の水素化又はヒドロアルコキシ化ファルネシル誘導体のいずれかを生産するのにも利用される。
【００９８】
スキーム４：芳香族置換
【００９９】
【化１１】
2008514551.tif 000014
【０１００】
式中、ＸはＢｒである。
【０１０１】
スキーム４において、アリール基は芳香族置換によって修飾される（臭素化）。臭素化剤は、臭素、Ｎ−ハロアミド（例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、ポリハロゲン化テトラアルキルアンモニウム）などを含む。
【０１０２】
スキーム４は、化合物１から化合物２４を、化合物２から化合物２６を、及び化合物１４から化合物２７を調製するのに利用される。
【０１０３】
プロドラッグは、上記のJerry Marchに記載されているような通常の化学修飾によって調製され、かかる修飾は、エステル化（スキーム１）及びアルキル化反応、すなわち活性酸若しくは混合酸無水物の使用（ハロゲン化アシルなど、カップリング試薬の使用、）及びアルキル化剤（Ｒ−Ｘ、式中Ｘはジアゾのような脱離基で、Ｒは目的とする基）の使用を含む。リン酸塩プロドラッグは、例えばジアルキル亜リン酸で、Silverberg et al. (1996), Tet. Lett., Vol. 37, 711-774、 U.S. patent 5,561,122 (Pettit et al) 及びHwang and Cole (2004), Org. Lett., vol 6, no 10, 1555-1556 ((POM)2phosphate triester from (POM)2phosphoryl chloride)に記載されているような手法でリン酸化することで調製される。これらの文献の内容全体を本願に引用し援用する。
【０１０４】
ＩＶ．  本発明の化合物を含む医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と組み合わせられた、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩，溶媒和物、若しくはプロドラッグを含む医薬組成物提供する。ジベンゾジアゼピノンアナログを含有する医薬組成物は、腫瘍状態のような制御不能な細胞成長及び細胞増殖に関連した疾患や障害を治療するのに有用である。該医薬組成物はまた、炎症，自己免疫疾患、感染症、神経変性疾患及びストレスを含むその他の疾患や障害の治療にも有効である。ジベンゾジアゼピノンアナログを含む該医薬組成物は、該医薬組成物及び腫瘍状態を治療するためのその使用法を記載した書面のような必要なものを適切な容器に入れて提供する便利な商業用パッケージにされていてもよい。
【０１０５】
本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグは、腫瘍及び増殖性の疾患及び障害の治療的又は予防的処置のために、経口、舌下、経鼻腔、眼内、経直腸、経皮、粘膜、局所、又は非経口投与に処方できる。非経口による投与の例として、限定されるわけではないが、皮内、皮下（ｓ．ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、骨液内（関節液）、脳内又は頭蓋内、髄腔内、大槽内、及び鞘内（髄液）が挙げられる。製剤の非経口的注射又は注入に有用な既知の装置は、非経口投与に用いられ得る。経口又は非経口投与のためには、本発明の化合物は、従来の薬剤担体及び賦形剤と混合でき、液剤、乳剤、錠剤、カプセル剤、ソフトゲル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、及びウエハースなどの形態であってよい。本発明の化合物を含む組成物は、重量で約０．１％〜約９９％、約１％〜約９８％、約５％〜約９５％、約１０％〜約８０％、約１５％〜約６０％の有効成分を含む。
【０１０６】
本明細書に記載されている薬剤調製は標準的手法に従い調製され、癌を減少、予防、又は解消するように選択された投与量で投与される（ヒトの治療に用いるさまざまな薬剤の投与法についての一般的記載は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA；及びGoodman and Gilman, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY参照。これらの文献の内容を本願に引用して援用する。）。
【０１０７】
本明細書中で使用されているように、「単位投与量」という用語は、ヒト対象及びその他の動物への単位投与量として適した、固体に個別の単位量を指し、各単位量は、求める治療効果を発揮するように計算された規定量のジベンゾジアゼピノンアナログを薬学的に許容される適切な担体と共に含有する。１つの実施形態では、単位投与量は１０〜３０００ｍｇの有効成分を含有する。別の実施形態では、単位投与量は２０〜１０００ｍｇの有効成分を含有する。本発明の組成物は、制御放出（例、カプセル剤）又は徐放性送達システム（例、生分解性マトリックス）を用いて運搬されてよい。本発明の組成物の投与に適した薬物送達の遅延放出送達システムの例は、米国特許第４，４５２，７７５号（Kentに付与）、第５，０３９，６６０号（Leonardに付与）、及び第３，８５４，４８０号（Zaffaroniに付与）に記載されている。これらの文献の全体を本願に引用して援用する。
【０１０８】
本発明の薬学的に許容される組成物は、１つ以上の非毒性で薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバント及び／又は賦形剤（本明細書中では、これらをまとめて「担体」材料と呼ぶ）、並びにもしあれば所望のその他の有効成分と共に、１つ以上の本発明の化合物を含んでいる。薬学的に許容される担体には、例えば溶剤（solvents）、運搬体（vehicles）、又は溶媒（medium）があり、それらの例として、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール，エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ）、ポリ（エチレン）グリコール３００及び４００（ＰＥＧ３００及び４００）、ペグ化ヒマシ油（例、Cremophor EL）、ポロキサマー４０７及び１８８、疎水性担体、並びにそれらの組合せが挙げられる。疎水性担体には、例えば脂肪乳液、脂質、ペグ化リン脂質、ポリマーマトリックス、生体適合性ポリマー、脂質小胞（liposphere）、小胞、粒子、及びリポソームがある。該用語は特に細胞培養培地を含まない。
【０１０９】
製剤に含まれる賦形剤（excipient）又は添加剤（additive）は、例えば薬の性質や投与方法などによって異なる目的をもっている。一般的に使用される賦形剤の例として、限定されるわけではないが、安定剤、可溶化剤又は界面活性剤、緩衝液、酸化防止剤並びに保存剤、等張化剤、充填剤、平滑剤、乳化剤、沈殿防止剤若しくは増粘剤、不活性希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、平滑剤、抗菌剤、キレート剤、甘味料、香剤、香味剤、着色剤、投与補助剤、及びその組合せが挙げられる。
【０１１０】
前記組成物は、コーンスターチ若しくはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム、及びアルギン酸などの一般的な担体及び賦形剤を含有していてよい。組成物は、クロスカルメロースナトリウム、微結晶セルロース、ナトリウムスターチグリコレート、及びアルギン酸を含有していてもよい。
【０１１１】
非経口投与用の製剤は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む水性若しくは非水性の等張性無菌注射溶液、懸濁液、又は脂肪乳液の形態であってよい。注射に使われる非経口用の形態は容易に注射可能な程度に流動的でなければならない。これらの溶液又は懸濁剤は無菌の濃縮液体、散剤、又は顆粒剤から調製される。化合物は、溶剤や媒体のような担体、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、ベンジルアルコール、グリコフロール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドＮ−メチルピロリドン、グリセリン、生理食塩液、デキストロース、水、グリセロール、疎水性担体、及びその組合せに溶かすしてよい。
【０１１２】
非経口用の調製に使用される賦形剤の例として、限定されるわけではないが，安定剤（例えば炭水化物、アミノ酸，及びポリソルベート）、可溶化剤（例えばセトリミド、ドキュセートナトリウム、グリセリルモノオレエート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、界面活性剤（例えばポリソルベート、トコフェロール、ペグコハク酸、ポロキサマー、及びCremophorＴＭ）、緩衝剤（例えば酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、及びアミノ酸など）、抗酸化剤並びに保存剤（例えばＢＨＡ、ＢＨＴ、ゲンチシン酸、ビタミンＥ、アスコルビン酸、並びに硫黄含有薬剤として亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩、チオグリセロール、及びチオグリコレートなど）、等張化剤（生体適合性を調節するため）、懸濁若しくは増粘剤、抗菌性物質（例えばチメルソール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール並びにクロロブタノール）、キレート剤、及び投与補助剤（局所麻酔薬、抗炎症剤、抗凝固剤、長引かせるための血管収縮薬、並びに組織浸透性を上昇させるための薬剤）、及びその組合せが挙げられる。
【０１１３】
疎水性担体を用いた非経口用製剤には、例えば脂肪乳液があり、又、脂質、油相（liposphere）、小胞、粒子、及びリポソームを含有する製剤もある。脂肪乳液は、上述した賦形剤に加え、脂質相並びに水相、及び例えば乳化剤（例、リン脂質、ポロキサマー、ポリソルベート及びポリオキシエチレンヒマシ油）並びに浸透物質（例、塩化ナトリウム、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、及びグルコース）のような添加剤を含有する。リポソームは、天然又は派生リン脂質、及び任意でコレステロールのような安定化剤を含む。
【０１１４】
別の実施形態では、本化合物の非経口単位投与量の形態は、適切な担体中ですぐに使用できる本化合物の溶液として、無菌密封アンプル中にあるか若しくは無菌的に注射筒に充填されていてよい。適切な担体は上述の賦形剤のいずれかを任意選択で含んでいてよい。
【０１１５】
あるいは、本発明の化合物の単位投与量は、薬学的に許容される担体中で、送達のときにその場で再構成されるように濃縮液体、パウダー、又は顆粒の形態をしていてよい。上述の賦形剤に加えて、パウダー剤は充填剤（例、マンニトール、グリシン、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、及びゼラチン）及び凍結防止剤又は溶解剤を任意で含んでいてよい。
【０１１６】
例えば、静脈内（ＩＶ）での使用において、式Ｉの化合物の無菌製剤、及び任意選択で、溶解剤又は界面活性剤を含む１つ以上の添加物は、一般的に使用される静脈輸液のどれにでも溶解又は懸濁され、注入によって投与されてよい。静脈輸液の例として、限定されるものではないが、生理食塩液、リン酸緩衝食塩水、５％グルコース又はリンゲル液TMが挙げられる。
【０１１７】
別の実施形態では、筋肉内用の製剤において、本発明の化合物、又は本化合物を形作る好適な可溶性塩若しくはプロドラッグの無菌製剤は、例えば注射用蒸留水（ＷＦＩ）、生理食塩液、又は５％グルコースのような薬学的希釈剤に溶かして投与されてよい。本化合物の適切な不溶性形態は、水性溶剤又は薬学的に許容される油性溶剤中に懸濁液として調製して投与されてもよい。かかる油性溶剤の例として、例えばエチルオレエートのような、長鎖脂肪酸のエステルがある。
【０１１８】
経口での使用には、錠剤及びカプセル剤のような固形製剤が特に有効である。徐放性又は腸溶性コーティングされた製剤が考案されてもよい。小児や高齢者に適用するには、懸濁剤、シロップ剤、及びチュアブル錠が特に好ましい。医薬組成物は経口投与のために、例えば錠剤、カプセル剤、懸濁剤若しくは液状シロップ又はエリキシル剤、及びウエハースなどの形態をとる。一般的な経口投与に用いられる賦形剤又は添加剤の例として、限定されるものではないが、不活性希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、平滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤、及び保存剤が挙げられる。
【０１１９】
前記経口用医薬組成物は、好ましくは治療有効量の有効成分を含む単位投与量の形態で作られる。そのような投与量単位の例として錠剤及びカプセル剤がある。治療目的のために、錠剤及びカプセル剤は有効成分に加えて公知の担体を含有できる。かかる担体の例として、不活性希釈剤（例、炭酸ナトリウム並びに炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム並びにリン酸カルシウム、及びラクトース）、結合剤（例、アカシアガム、デンプン、ゼラチン、スクロース、ポリビニルピロリドン（プロビドン）、ソルビトール、又はトラガカントメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びエチルセルロース）、増量剤（例、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトール、又はスクロース）、潤滑剤若しくは平滑剤（例、ステアリン酸マグネシウム若しくはその他の金属のステアリン酸塩、ステアリン酸、ポリエチレングリコース、ろう、オイル、シリカ、並びにコロイカルシリカ、シリコン溶液又はタルク）、崩壊剤（例、ジャガイモでんぷん、コ−ンスターチ、及びアルギン酸）、着香剤、着色剤、又は許容される湿潤剤が挙げられる。担体は、消化管での吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルのようなコーティング兼賦形剤を含有していてよい。
【０１２０】
経口用液体製剤は、一般的に水溶液又は油性溶液、懸濁液、乳液、シロップ又はエリキシル剤の形態であって、公知の添加物、例えば懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤（non-aqueous agent）、保存剤、着色剤、及び着香剤などを含有していてもよい。液体製剤の添加剤の例として、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分留ヤシ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、食用硬化油、レシチン、メチルセルロース、パラヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、プロピレングリコール、ソルビトール、又はソルビン酸が挙げられる。
【０１２１】
液体及び固体の経口用製剤に、ペパーミント、ウィンターグリーンオイル、チェリー、ブドウ、又は果物着香料などの着香剤なども使われてよい。また、剤形の外見をきれいにするために若しくは製品を識別しやすいように着色剤を加えることが望ましいこともある。局所的な使用には、本発明の化合物は、皮膚又は鼻やのどの粘膜に適用するのに適した形態で調剤されてもよいし、クリーム、軟膏、液体スプレー若しくは吸入剤、ロゼンジ、又はのど用塗り薬の形態であってもよい。そのような局所的な製剤はさらに、有効成分の表面浸透を促進するために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような化学化合物を含有してよい。眼や耳への適用するために、本発明の化合物は、軟膏剤、クリーム、ローション剤、塗り薬、又は散剤として、親水性基材又は疎水性基材中に、液状又は半液状で含まれてよい。経直腸投与のために、本発明の化合物は、ココア脂、ろう、又はその他のグリセリドのような公知の担体と混合して坐剤の形状で投与されてもよい。
【０１２２】
Ｖ．  腫瘍治療における医薬用途
１つの観点では、本発明は、哺乳類における癌細胞の成長及び／又は増殖の抑制方法に関する。別の観点では、本発明は哺乳類の腫瘍状態の治療方法を提供する。哺乳類には、有蹄動物（例、ヒツジ、ヤギ、牝牛、ウマ、ブタ）、並びに、齧歯動物、ネコ科、イヌ科及び霊長類（すなわち、ヒト及び非ヒト霊長類）を含む非有蹄動物が含まれる。好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【０１２３】
本発明のジベンゾジアゼピノンアナログは、他の癌関連タンパク質及びポリペプチドに結合又は相互作用してもよい。このようなタンパク質及びポリペプチドの例として、限定されるものではないが、癌遺伝子にコードされるポリペプチド、血管形成を誘導するポリペプチド、転移及び／又は侵食の過程に関わるタンパク質、並びにアポトーシス及び細胞周期を調節するプロテアーゼが挙げられる。作用機序に関わらず、本発明のジベンゾジアゼピノンアナログは、インビトロ及びインビボにおいて抗癌活性が実証された。出願人は、かかる発見に基づいて腫瘍の治療方法を開発した。
【０１２４】
本明細書中で使用されているように、「新生物（neoplasm）」、「腫瘍疾患（neoplastic disorder）」、「新組織形成（neoplasia）」、「癌」、「腫瘍」及び「増殖性疾患」という用語は、自律的に増殖できる細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常状態を指す。このような急速に増殖する細胞成長は、はっきりと識別できる塊を一般的に形成し、構造的な組織化や正常細胞との機能的連携が、一部又は完全に失われている。前記用語は、固形腫瘍（例、肉腫又は癌腫）に加えて造血器腫瘍（例、リンパ腫瘍、又は白血病）も包含し、組織病理学上の侵襲性の種類又は段階に関係なく、全ての種類の前癌及び癌成長、又は発癌過程、転移組織、若しくは悪性形質転換した細胞、組織又は器官を含む。造血器腫瘍は、造血機構（血球形成に関する機構）及び免疫系に影響する悪性腫瘍であり、脊髄、リンパ系若しくは赤血球系統、及び（リンパ球に関係する）リンパ腫から生じる（血中及び骨髄中の白血球及びその前駆体に関係する）白血病を含む。固形腫瘍としては、例えば筋肉、軟骨、血管、繊維組織、脂肪、又は骨などの結合組織から生じる悪性腫瘍である肉腫がある。また、固形腫瘍の例としてさらに、上皮構造（外部の上皮（例えば皮膚、消化管上皮、肺上皮、並びに頚部上皮）、及びさまざまな腺（例えば乳腺、膵臓腺、甲状腺）に並んでいる内部上皮を含む）から発生する悪性新生物である癌腫がある。本発明の方法による治療に特に影響を受けやすい新生物の例として、白血病、肝細胞癌、肉腫、血管内皮癌、乳癌、中枢神経系癌（例えば星状細胞腫、神経膠肉腫、神経芽細胞肉腫、乏突起膠腫、及びグリア芽腫）、前立腺癌、肺並びに気管支癌、喉頭癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、消化管癌、メラノーマ、卵巣並びに子宮内膜癌、腎臓並びに膀胱癌、肝臓癌、内分泌癌（例えば甲状腺）、及び膵臓癌がある。
【０１２５】
ジベンゾジアゼピノンアナログは、癌細胞又は癌組織に接触又は導入される。一般的に、本発明の化合物をインビボで送達するための本発明の方法は、当該技術分野で認識されている治療薬剤を送達するためのプロトコールを利用し、実質的な変更は、前記プロトコールの治療薬剤を本発明のジベンゾジアゼピノンアナログに替えることだけである。ジベンゾジアゼピノンが投与される経路は、製剤、担体又は媒体もだが、新生物の種類及び場所に依存する。多種多様な投与経路が使用可能である。ジベンゾジアゼピノンアナログは、静脈内又は腹腔内に、注入又は注射によって投与してもよい。例えば、接近可能な固形腫瘍に対しては、本発明の化合物を腫瘍内に直接注射してもよい。造血器腫瘍に対しては、化合物を静脈内又は血管内投与してもよい。転移や脳腫瘍のように体内で容易に接近できない新生物に対しては、本化合物は、哺乳類の体を系統的に輸送されて新生物及び離れた転移に到達するように投与してよい。その例としては髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、又は経口投与がある。又、本化合物を腫瘍に直接投与してもよい。本化合物の投与は又、皮下、髄腔内、腹腔内、局所（例えばメラノーマに対して）、経直腸（例えば結腸直腸腫瘍に対して）、経膣（例えば子宮頚又は膣腫瘍に対して）、鼻腔内又は吸入スプレー（例えば肺腫瘍に対して）による投与であってよい。
【０１２６】
ジベンゾジアゼピノンアナログは、腫瘍細胞の増殖若しくは成長の抑制又は腫瘍疾患の治療に十分な量で投与される。「抑制」という用語は、癌細胞の抑制、死滅、停滞、又は破壊を指す。本方法による哺乳類癌細胞の成長抑制は複数の方法で観察できる。インビトロで成長させた癌細胞を本化合物で処置して、同じ細胞を本化合物の非存在下で培養したものと比較して、その成長又は死滅をモニターすることができる。成長停止又は成長速度（すなわち、倍加時間）の低下（例えば１００ｍＭで５０％以上）は、癌細胞の抑制を示している（Anticancer Drug Development Guide: preclinicalscreening, clinical trials and approval; B.A. Teicherand P.A. Andrews, ed., 2004, Humana Press, Totowa, NJ参照）。また、本化合物を関心のある癌のモデル動物に投与することで、癌細胞抑制をモニターすることができる。実験的非ヒト動物癌モデルの例は当該分野で知られており、以下及び本明細書中の実施例に記載されている。本化合物で処置していない対照動物と比べて、本化合物で処置した動物で腫瘍の成長が停止（すなわち、それ以上サイズが大きくならないこと）又は腫瘍サイズが縮小（すなわち、腫瘍体積で最低５８％分）していれば、それは有意な腫瘍成長抑制を示している（Anticancer Drug Development Guide: preclinicalscreening, clinical trials and approval; B.A. Teicherand P.A. Andrews, ed., 2004, Humana Press, Totowa, NJ参照）。
【０１２７】
「治療（treatment）」という用語は、哺乳類にジベンゾジアゼピノンアナログを適用又は投与すること、若しくは腫瘍疾患、腫瘍疾患の症状、又は腫瘍疾患になりやすい性質をもつ哺乳類から単離された組織又は細胞株に、疾患、疾患の症状、又は疾患になりやすい性質を治療、治癒、軽減、緩和、改変、改良、改善、調節する目的で、ジベンゾジアゼピノンアナログを適用又は投与することを指す。「治療している（treating）」という用語は、哺乳類の新生物細胞を予防、縮小、又は消失するのに十分な量（「治療有効量」）のジベンゾジアゼピノンアナログを哺乳類に投与すること、と定義する。治療に有効な投与の量及び時期は個別の基準で決定され、またそれは、少なくとも一部において、適用対象の年齢、体重、性別、食習慣、及び一般的な健康状態の考慮、疾患状態の属性並びに重篤性、及び以前の治療並びにその他のもっている疾患に基づいていてよい。また、その他のファクターとして、投与の経路並びに頻度、投与された化合物の活性、代謝安定性、化合物の作用期間並びに排出期間、薬の組合せ、化合物に対する適用対象の耐性、及び腫瘍又は増殖疾患の種類が挙げられる。１つの実施形態において、本化合物の治療有効量は、哺乳類の体重に対して約０．０１〜約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。別の実施形態において、治療有効量は、１日あたり、体重に対して約０．０１〜約３００ｍｇ／ｋｇの範囲にある。さらに別の実施形態において、治療有効量は１日あたり、体重に対して１０〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。上記実施例の治療有効投与量はまた、ヒト患者の場合には、ミリグラム／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）で表されてもよい。異なる哺乳類種への換算係数は、Freireich et al, Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, dog, monkey and man, Cancer Chemoth. Report, 1966, 50(4): 219-244に見出され、その全体を本願に引用して援用する。（例えば小児患者に対して）特別な必要があるときには、上記の治療有効量は本明細書中で述べられている範囲から外れてもよい。そのような、上記範囲を上回る又は下回る投与量は本発明の範囲内である。
【０１２８】
ヒトの腫瘍治療の効果をモニターするには、治療開始の前後で腫瘍サイズ及び／又は腫瘍形態を計測し、もし腫瘍サイズがさらなる成長を停止したか、若しくは、例えば少なくとも１０％以上（例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％、つまり腫瘍の消滅であれ）腫瘍サイズが縮小していれば、治療は有効であるとみなされる。生存、発症進行、部分反応、及び客観的反応割合の延長は、治験薬の臨床活性の代替尺度となる。腫瘍の縮小は、治療特異的な反応とみなされる。このシステムには、正確な測定が可能な内臓塊を患者がもっている必要があるという制限がある。インビボにおける腫瘍サイズの決定方法は、腫瘍の種類によって異なり、組織学的方法及びフローサイトメトリーに加えて、例えばメディカルイメージング又は腫瘍学の分野（ＭＲＩ、ＣＡＴ、ＰＥＴなど）で良く知られているさまざまなイメージング技術が含まれる。ある種類の癌では、反応の評価に血清腫瘍マーカーの評価が利用されている（例、前立腺癌に対して前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、結腸癌に対して癌胎児性抗原（ＣＥＡ））。癌の成長をモニターするためのその他の方法として、血中細胞計数（例、白血病）、又は骨痛の緩和（例、前立腺癌）がある。
【０１２９】
ジベンゾジアゼピノン化合物は１日１回投与してもよいし、１日を通して適切な間隔で２回、３回、４回、又はそれ以上の回数に分割投与してもよい。その場合、それに対応して、各分割投与に含有されるジベンゾジアゼピノン化合物を、１日の総投与量を達成するように、少なくする必要がある。投与量単位は、数日間に渡って送達されるように混合されてもよく、例えば公知の徐放性製剤を用いて数日間に渡ってジベンゾジアゼピノン化合物を持続放出することができる。徐放性製剤は当該分野でよく知られている。かかる実施例では、対応して、投与量単位は、１日投与量の複数倍を含有する。有効投与量は、一度に投与されてもよい（例、ボーラス注入法）し、例えば３０分〜約２４時間かけてゆっくり注射若しくは注入によって投与してもよい。本化合物は、治療薬として、３０日間まで投与してもよい。さらに、治療有効量での化合物で対象の処置には、一度の処置、又は一連の処置（例、４週間の処置を２ヶ月おきに３回）が含まれる。本発明に包含されるジベンゾジアゼピノン化合物の有効投与量、毒性、及びインビボでの半減期は、公知の方法を用いるか若しくは適切なモデル動物を利用したインビボでの試験に基づいて評価することができる。
【０１３０】
ジベンゾジアゼピノン化合物は、放射線治療のような公知の抗癌治療又はその他の公知の抗癌化合物や化学療法薬と組み合わせて又はそれに加えて投与してもよい。そのような薬剤の例として、限定するものではないが、５−フルロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（エピルビシン及びドキソルビシン）、エトポシド、プレグナソーム（pregnasome）、カルボプラチン及びシスプラチンのような白金化合物、パクリタキセルTM（PaclitaxelTM）及びドセタキセルTM（DocetaxelTM）などのタキサン類；タモキシフェン及び抗エストロゲン剤のなどのホルモン療法；ハーセプチン及びイレッサなどの受容体抗体；アロマターゼ阻害剤、黄体ホルモン薬及びＬＨＲＨアナログ；ＩＬ１２及びインターフェロンのような生物反応修飾物質；シクロスプリンアナログＰＳＣ８３３などの多剤克服剤が挙げられる。
【０１３１】
ジベンゾジアゼピノン化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準的薬学的手法によって決定できる。治療効果は、上述したモデル動物及び本明細書中の実施例によって決定される。毒性試験によって、実験された動物の１０％が致死する、致死投与量（ＬＤ１０）が決定される。動物は最大耐量（ＭＴＤ）（致死又は２０％を超える体重の減少をもたらさない、最大の投与量）で処置される。化合物の治療指数を決定するための腫瘍モデルにおいて、有効投与量（ＥＤ）はＭＴＤに関係する。１．０に近い治療指数（ＭＴＤ／ＥＤ）がいくつかの化学療法薬に許容されることが知られており、標準的な化学治療薬に好ましい治療指数は１．２５以上である。
【０１３２】
細胞培養試験及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を決定するのに使用することができる。本発明の化合物の投与量は一般的に血中濃度の範囲内となり、ＭＴＤを含む。投与量はこの範囲内で、選んだ投与剤形及び利用される投与経路によって変わり得る。本発明の方法で使用されるどの化合物の治療有効量も、初めに細胞培養試験によって評価することができる。モデル動物で化合物の循環血漿濃度の範囲を得るために１回分の投与量が処方されてよい。そのような情報は、ヒトにおける有効な投与量をより正確に決定するのに利用できる。血漿中濃度は、例えばＨＰＬＣによって計測できる。
【０１３３】
化合物の抗腫瘍効果を決定するためのモデル動物は、一般的にマウスである。マウスの後脇腹（hind flank）に同じ種（同種モデル）由来のマウス腫瘍細胞を、皮下接種するか、若しくはヒト腫瘍細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス又はその他の免疫不全マウス（ヌードマウス）（異種移植モデル）の後脇腹に皮下接種する。
【０１３４】
マウス遺伝学の進歩は、癌を含むさまざまなヒト疾患を研究するための多くのモデルマウスを産み出してきた。国立癌研究所が出資するＭＭＨＣＣ（Mouse models of Human Cancer Consortium）のウェブページ（emice.nci.nih.gov）では、ＮＣＩ−ＭＭＨＣＣマウスレポジトリーに加えて、疾患部位特異的な公知の癌モデルマウスの抄録を提供しており、検索可能なCancer Models Database（cancermodels.nci.nih.gov）へのリンクがある。また、マウスレポジトリーは、The Jackson Laboratory, Charles River Laboratories, Taconic, Harlan, Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) National Network及びEuropean Mouse Mutant Archiveにもある。このようなモデルは治療有効量を決定するためや、ジベンゾジアゼピノン化合物のインビボ実験に使用できる。
【０１３５】
本発明の化合物に加えて、該化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物、又はプロドラッグもまた、上述の疾患を治療又は予防するために組成物中に用いられてもよい。
【実施例】
【０１３６】
他に記載がない限り、全ての試薬はSigma Chemical Co．（St. Louis, MO）Aldrich社から購入した。
【０１３７】
全てのＮＭＲスペクトルは，Varian 500TM Spectrometer（１ＨＮＭＲ、５００ＭＨｚ；１３Ｃ ＮＭＲ、１２５ＭＨｚ）を用いて重水素化溶媒中で測定した。ＵＶ及びマススペクトルの計測には、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ、２１０−４００ｎｍ）検出器を使用したWaters ２６９０TM HPLCをWaters MicromassTMZQTMマス検出器に連結して用いた。
【０１３８】
他に示されていない限り、本明細書及び請求項中で使用されている成分量、分子量、反応条件、モル当量（ｅｑ）、結合並びに／又は阻害パーセンテージ、ＧＩ５０、及びＩＣ５０などの属性を表す数字は全て、「約」という用語によってあらゆる場合において変更可能であると解釈される。したがって、別に示されていない限り、本明細書及び添付の請求項で説明されている数値パラメータは概数である。最低でも、請求項範囲の均等論の適用を制限するものではないが、各数値パラメータは最低でも、有効桁数を考慮にいれて、通常の四捨五入の方法を適用して解釈されるべきである。本発明の広い範囲を説明している数値範囲並びにパラメータは概数であるが、実施例、表並びに図で示されている数値は可能な限り正確に報告されている。いずれの数値にも本質的に、実験、試験測定法、及び統計分析などのばらつきによって生じる誤差が含まれることがある。
【０１３９】
以下のセクションで、実施例は、本発明の代表的化合物の化学合成を詳細に記載する。これらの手法は例であって、実施例で示された化学反応及び条件によって、本発明が限定されて解釈されるべきではない。これらの反応で得られる収率を最適化するための試みはされていないが、反応時間、温度、溶媒及び／又は試薬を変更すれば収率が増すことがあることは当業者には明らかである。
【０１４０】
加えて、材料、方法、及び例えばインビボ並びにインビトロでの効果、生物学的利用能、毒性、及び薬理学的特性を含む実施例、はただの例であり、限定する意図はない。本明細書に記載されている方法及び材料の類似物又は均等物は、本発明の実施又は試験に使用可能であるが、好ましい方法及び材料は以下に記載されているものである。本明細書中で言及する全ての印刷物、特許出願、特許、及びその他の参照文献は、その全体を本願に引用して援用する。不一致があった場合、定義を含め、本明細書に従う。
【０１４１】
実施例１：発酵による化合物１の生産
発酵手順例
ａ）発酵方法
Micromonospora sp．（登録アクセッション番号ＩＤＡＣ  ０７０３０３−０１）を、ＩＳＰ２寒天（Difco Laboratories社製、Detroit, MI）を用いた寒天培地上に静置した。寒天培地の表面に成長したMicromonospora sp．を、グルコース１０ｇ、ポテトデキストリンタイプＩＶ（Sigma社製）２０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮＺＡｍｉｎｅ−Ａ５ｇ、ＣａＣＯ３１ｇを水道水で１Ｌにメスアップした無菌培地２５ｍｌ（ｐＨ７．０）の入った１２５ｍｌフラスコに移すことで、生産段階での接種材料を準備した。その培養液を、２５０ｒｐｍにセットしたロータリーシェーカー上で、約２８℃、およそ７０〜７２時間培養を行った。培養後、培養液１０ｍｌを、ポテトデキストリンタイプＩＶ（Sigma社製）２０ｇ／Ｌ、グリセロール３０ｇ／Ｌ、バクトペプトン２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス８．３４ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３３ｇ／Ｌを含むｐＨ７．０の無菌生産培地６００ｍＬの入った２Ｌのバッフル付きフラスコに移した。発酵培地は、２５０ｒｐｍにセットしたロータリーシェーカー内で、約２８℃、５日間培養することで調製した。
【０１４２】
ｂ）代替方法：
２００４年１月２１日付けで提出されているカナダ特許出願２，４６６，３４０に記載の改良された方法を用いて、１０Ｌを一度に１４．５Ｌの発酵槽（BioFlo １１０TM Fermentor、 New Brunswick Scientific社製、Edison, NJ, USA）で発酵させることができた。
【０１４３】
Micromonospora sp．（登録アクセッション番号ＩＤＡＣ  ０７０３０３−０１）を、ＩＳＰ２寒天（Difco Laboratories社製、Detroit, MI）を用いた寒天培地上に静置した。寒天培地の表面に成長したMicromonospora sp．を、グルコース１０ｇ、ポテトデキストリン２０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮＺＡｍｉｎｅ−Ａ５ｇ、ＣａＣＯ３１ｇを水道水で１Ｌにメスアップした無菌培地５００ｍｌ（ｐＨ７．０）の入った２Ｌフラスコに移すことで、生産段階での接種材料の準備した。その培養液を、２５０ｒｐｍにセットしたロータリーシェーカー上で約２８℃でおよそ７０時間培養を行った。培養後、培養液３００ｍＬを、無菌生産培地１０Ｌの入った１４．５Ｌの発酵槽に移した。生産培地はリッター当たり、ポテトデキストリン２０ｇ、グリセロール３０ｇ、バクトペプトン２．５ｇ、酵母エキス８．３４ｇ、シリコーン消泡剤オイル（Chem Service社製）０．３ｍＬ、Proflo oilTM（Traders protein社製）０．０５ｍＬ、ＣａＣＯ３３ｇを含有し、これらは蒸留水で１Ｌにし、ｐＨ７．０に調整した。培養液は、循環ループ（ｃａｓｃａｄｅ  ｌｏｏｐ）中で２５％に調節された溶存酸素（ｄＯ２）と共に、３２０〜６００ＲＰＭの間で振盪し、且つ０．５ｖ／ｖ／ｍに固定しエアレーションを行い、２８℃で培養した。
【０１４４】
上記の培地に加えて、発酵による化合物１の生産に好ましいその他の培地を表１に示した（ＱＢ、ＭＡ、ＫＨ、ＲＭ、ＪＡ、ＦＡ、ＣＬ）。Micromonospora sp．０４６−ＥＣＯ１１又は［Ｓ０１］０４６のいずれもこれらの方法例に使用されてよい。
【０１４５】
実施例２：化合物１の単離
単離方法の例
ａ）単離方法１：
上記の実施例１に記載の通り調製された発酵培地５００ｍＬに酢酸エチル５００ｍＬを加えた。オービタルシェーカーで２００ｒｐｍ、３０分間、混合液を攪拌し、乳濁液にした。遠心及びデカントにより、相を分離した。有機相に４〜５ｇの無水ＭｇＳＯ４を添加し、濾過後、減圧下で溶媒を除去した。
【０１４６】
２Ｌの発酵液からの酢酸エチル抽出物を、３００ｍＬの水中でＨＰ−２０樹脂（１００ｍＬ；Mitsubishi Kasei Corp.社製、日本、東京）と混合した。酢酸エチルを減圧除去し、樹脂をブフナー漏斗で濾過して濾液を捨てた。その後、吸着させたＨＰ−２０樹脂を、５０％アセトニトリル水溶液１２５ｍＬで２回、７５％アセトニトリル水溶液１２５ｍＬで２回、及びアセトニトリル１２５ｍＬで２回、続けて洗った。
【０１４７】
化合物１を含む画分を蒸発乾燥し、１００ｇをクロロホルム、シクロヘキサン、メタノール、水を体積比５：２：１０：５で調製した混合液の上相５ｍＬ中で処理した。該試料を、２００ｍＬのカートリッジの取り付け及び２相系の上相の充填がされている高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣ）システム（KromatonTechnologies社製、Angers, France）を用いた遠心分配クロマトグラフィーに供した。ＨＳＣＣは下相を移動性として行い、化合物１はおよそ１．５カラム体積で溶出された。画分を集め、市販のKieselgel 60F２５４上で各画分のＴＬＣを行い、化合物１を検出した。化合物は、紫外線下で乾燥プレートを観察するか、バニリン（０．７５％）及び濃硫酸（１．５％、ｖ／ｖ）のエタノールを含むスプレーをプレートに噴霧後にプレートを加熱することで可視化できた。画分には強く色が着いていたが、実質的に純粋な化合物１を含んでいた。以下に示すように、ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーで鈍黄色の試料が得られた。
【０１４８】
試料６ｍｇをアセトニトリルに溶解し、分取ＨＰＬＣカラム（XterraTM ODS（１０μｍ）、１９×１５０ｍｍ、Waters Co.社製、Milford, MA）に注入した。流速は９ｍＬ／ｍｉｎとし、３００ｎｍにおけるＵＶピークを検出した。カラムは、表２で示したグラジエントにしたがって、アセトニトリル／緩衝液（５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）で溶出した。
【０１４９】
【表２】
2008514551.tif 000015
【０１５０】
化合物１を含む画分を混合、濃縮、及び凍結乾燥し、３．８ｍｇの化合物が得られた。
【０１５１】
ｂ）単離方法２：
化合物１はまた、以下の代替プロトコールでも単離された。培養期間の終わりに、実施例１のバッフル付きフラスコの発酵培地を遠心し、菌糸を含む沈殿から上清をデカントした。該菌糸沈殿に１００％ＭｅＯＨ１００ｍＬを加え、試料を１０分間攪拌後、１５分間遠心した。メタノールの上清をデカントし、保存した。菌糸沈殿にアセトンを１００ｍＬ加え、１０分間攪拌後、１５分間遠心した。アセトン上清をデカントで前記メタノール上清と混ぜた。最後に、菌糸沈殿に２０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを加え、１０分間攪拌後、１５分間遠心した。上清を、アセトン及びメタノール上清と混ぜた。
【０１５２】
混合した上清を、４００ｍＬのＨＰ−２０樹脂を含有する水１０００ｍＬに加え、有機物を減圧除去した。それによって生じたスラリーをブフナー漏斗で濾過し、濾液を捨てた。ＨＰ−２０樹脂を、５００ｍＬの５０％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏで２回、５００ｍＬの７５％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏで２回、５００ｍＬのＭｅＯＨで２回続けて洗った。
【０１５３】
各洗液を別々に集めて、上述したようにＴＬＣで分析した。化合物１を含む画分は、蒸発させてほぼ乾燥させてから、凍結乾燥した。凍結物をメタノールに溶かして、分取ＨＰＬＣカラム（XterraTM ODS（１０μｍ）、１９×１５０ｍｍ、Waters Co.社製、Milford,MA）に注入した。流速を９ｍＬ／ｍｉｎ、ピークの検出を３００ｎｍで行った。
【０１５４】
カラムは、表３で示したグラジエントにしたがって、アセトニトリル／緩衝液（５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）で溶出した。
【０１５５】
【表３】
2008514551.tif 000016
【０１５６】
化合物１を含む画分を混合、濃縮、及び凍結乾燥し、約３３．７ｍｇの化合物が得られた。
【０１５７】
ｃ）単離方法３：
実施例１の全培地１０リットルを等容量の酢酸エチルで2回抽出し、抽出物を合わせてから濃縮乾燥させた。乾燥抽出物の重量を測り、１ｇにつき、ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（２：１  ｖ／ｖ）１００ｍＬ及びヘキサン１００ｍＬを加えた。この混合液を穏やかによく回転させ溶解させた。２つの相を分離し、水相を１００ｍＬのヘキサンで洗浄した。２つのヘキサン相を合わせ、その溶液をメタノール：水（２：１、ｖ／ｖ）１００ｍＬで洗浄した。２つのメタノール：水相を合わせ、ＥｔＯＡｃ２００ｍＬと水４００ｍＬで処理した。相を分離し、ＥｔＯＡｃ２００ｍＬで水相をさらに２回洗浄した。ＥｔＯＡｃ相を合わせ、濃縮した。得られた残留物（２２０ｍｇ）は、上述したＨＳＣＣ又はＨＰＬＣによる最終精製に適していた。本抽出法では、（ａ）又は（ｂ）で用いた抽出法の１０倍の精製物が得られた。
【０１５８】
実施例３：化合物１の構造の解明
【０１５９】
【化１２】
2008514551.tif 000017
【０１６０】
化合物１の主要同位体の計算上の分子量（４６２．２５）及び式（Ｃ２８Ｈ３４Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって４６１．２の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４６３．３の（Ｍ−Ｈ）＋分子イオンが生じた。ＵＶＭＡＸは２３０ｎｍであり、２９０ｎｍに肩をもっていた。
【０１６１】
プロトン及び炭素ＮＭＲスペクトル解析を表４に示す。ＮＭＲのデータは、プロトン、炭素、及び多次元パルスシークエンスｇＤＱＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ、ｇＨＭＢＣ、並びにＮＯＥＳＹを含有するＭｅＯＨ−ｄ４に溶解して収集した。化合物１の二次元スペクトルにおける多くのクロスピークが構造決定の鍵である。例えば、ファルネシル鎖は、４．５２ｐｐｍにおける該鎖の末端メチレンのプロトンシグナルとｇＨＭＢＣの実験における１７０ｐｐｍにおけるアミドカルボニル基に由来する炭素の間の強いクロスピークによって、アミド窒素上に位置され、この結論は、ＮＯＥＳＹスペクトルでの、４．５２ｐｐｍにおける同じメチレンシグナルと６．２５ｐｐｍにおける４置換ベンゼノイド環の２つのプロトンのうちの１つに由来する芳香族プロトンシグナルの間のクロスピークによって確認された。プロトン及び炭素シグナルの帰属を表４に示す。
【０１６２】
【表４】
2008514551.tif 000018
【０１６３】
マス、ＵＶ、及びＮＭＲスペクトル分析法のデータに基づいて、該化合物の構造が上記の化合物１の構造であると決定された。
【０１６４】
実施例４：ジアルキル硫酸反応
ａ）  化合物２及び１８の合成及び構造解析
【０１６５】
【化１３】
2008514551.tif 000019
【０１６６】
化合物２、すなわち１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−メチル−５，１０−ジヒドロージベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オン及び
【０１６７】
【化１４】
2008514551.tif 000020
【０１６８】
化合物１８、すなわち１０−（７−メトキシ−３，７，１１−トリメチルドデカ−２，１０−ジエニル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５−メチル−５，１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンの調製及び同定は以下のようにされた。
【０１６９】
調製：
化合物１（５００．０ｍｇ）をメタノール（ＭｅＯＨ、２０ｍＬ）に溶かし、硫酸ジメチル（０．５ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３（２５０ｍｇ）と共に、室温で４８ｈｒｓ、攪拌した。反応混合液に水を加えて２００ｍＬに希釈し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、３００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を分離、減圧乾燥し、ＭｅＯＨに再び溶かして、０．４５μｍ１３ｍｍのAcrodiscTM GHPシリンジフィルター濾過した。濾液をNova-PackTM ＨＲ Ｃ１８ ６μｍ ２５×２００ｍｍカラムにマルチプルインジェクションし（２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８分；３０：７０〜０：１００、８〜１８分）、１４．５及び１６．８分に、それぞれ化合物１８（１２．１ｇ）及び化合物２（３０８．５ｍｇ）が溶出され、単離された。
【０１７０】
化合物２及び１８の構造解析：
化合物２の主要同位体の計算上の分子量（４７６．２７）及び式（Ｃ２９Ｈ３６Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって４７５．６の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４９９．４の（Ｍ＋Ｎａ）＋分子イオンが生じた。プロトン及び炭素ＮＭＲスペクトル解析を表５に示す。シグナルは、化合物１の構造知見に基づいて容易に帰属された。化合物１８の主要同位体の計算上の分子量（５０８．２９）及び式（Ｃ３０Ｈ４０Ｎ２Ｏ５）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって５０７．３の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５０９．３の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。メタノールを加えたことによる、特徴的なファルネシル鎖上のＮ−メチル（シグナル５）、メトキシ（シグナル７’−ＯＭｅ）、及びメチレン基（６’）は容易に表５に示すように帰属された。
【０１７１】
【表５】
2008514551.tif 000021
【０１７２】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない
ａ．化合物２中ではＣＨ、化合物１８中ではＣＨ２
ｂ．４’、５’、８’及び９’のシグナルは非常に近接している；帰属は化合物１に基づいた
【０１７３】
ｂ）  化合物３、２１及び２２の合成及び構造解析
【０１７４】
【化１５】
2008514551.tif 000022
【０１７５】
化合物３：１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−エチル−５，１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オン；
【０１７６】
【化１６】
2008514551.tif 000023
【０１７７】
化合物２１：１０−（１１−メトキシ−３，７，１１−トリメチル−２，６−ドデカジエニル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５−エチル−５，１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オン；
【０１７８】
【化１７】
2008514551.tif 000024
【０１７９】
化合物２２：１０−（７，１１−ジメトキシ−３，７，１１−トリメチル−２−ドデセニル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５−エチル−５，１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オン
【０１８０】
調製：
化合物１（８５，３ｍｇ）を、硫酸ジエチル（２．０ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３（９９．９ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（２ｍＬ）の混合液中で、室温、７２時間攪拌した。できた混合液を０．４５μｍ１３ｍｍのAcrodiskTM GHPシリンジフィルターで濾過した。溶液を分取ＨＰＬＣにより精製し（NovaPackTM ＨＲ Ｃ−１８ ２５×２００ｍｍカラムにマルチプルインジェクションを用い（２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８分；３０：７０〜０：１００、８〜１８分）、４つの主要なピークを生じた：化合物３（２０．０ｍｇ及びいくらかの不純物、ＲＴ：１６．６ｍｉｎ）、化合物２１（１７．５４ｍｇ、ＲＴ：１４．３ｍｉｎ）、及び化合物２２（７．８２ｍｇ、ＲＴ：１２．６ｍｉｎ）が得られた。化合物２１及び２２の非エチル化アナログを含む画分も、それぞれ５．６５ｍｇ（ＲＴ：１１．６ｍｉｎ）及び２．２０ｍｇ（ＲＴ：１０．３ｍｉｎ）単離された。化合物３を含む画分をさらに同じカラム（２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８ｍｉｎ；３０：７０〜０：１００、８〜１８ｍｉｎ、曲線７）を用いたＨＰＬＣで精製し、実質的に純粋な化合物３（１３．８５ｍｇ、ＲＴ：１７．９ｍｉｎ）を得た。
【０１８１】
化合物３，２１及び２２の構造解析：
化合物３の主要同位体の計算上の分子量（４９０．２８）及び式（Ｃ３０Ｈ３８Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって４８９．３の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４９１．３の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。プロトンＮＭＲシグナルは、化合物１及び２の構造の知見に基づいて容易に帰属された。特徴的なＮ−エチル基（５−Ｎ−Ｅｔ）は容易に表６に示すように帰属された。
【０１８２】
化合物２１の主要同位体の計算上の分子量（５２２．３１）及び式（Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ５）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって５２１．３の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５２３．５の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンの他に４９１．３の（Ｍ＋Ｈ−ＨＯＣＨ３）＋分子イオンを有する断片が生じた。特徴的なＮ−エチル基（５−Ｎ−Ｅｔ）、及びメタノールを加えたことによるファルネシル鎖上のメトキシ基（１１’−ＯＭｅ）並びにメチレン（１０’）基は容易に表６に示すように帰属された。
【０１８３】
化合物２２の主要同位体の計算上の分子量（５５４．３４）及び式（Ｃ３２Ｈ４６Ｎ２Ｏ６）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化によって５５３．４の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５５５．４の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンの他にそれぞれ５２３．５並びに４９１．３の（Ｍ＋Ｈ−ＨＯＣＨ３）＋並びに（Ｍ＋Ｈ−ＨＯＣＨ３−ＨＯＣＨ３）＋分子イオンを有する断片が生じた。特徴的なＮ−エチル基（５−Ｎ−Ｅｔ）、及びメタノール２分子を加えたことによるファルネシル鎖上のメトキシ（７’−ＯＭｅ及び１１’−ＯＭｅ）基は容易に表６に示すように帰属された。メチレン基（５’、６’、８’、９’、及び１０’）は全て類似した化学シフトを示し、これは飽和アルキル基と一致する。
【０１８４】
【表６】
2008514551.tif 000025
【０１８５】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない
＊＊１．２２〜１．４９ｐｐｍのシグナル、１０個のプロトン
ａ．化合物３及び２１中ではＣＨ、化合物２２中ではＣＨ２
ｂ．化合物３中ではＣＨ、化合物２１及び２２中ではＣＨ２
【０１８６】
ｃ）  化合物４の合成及び構造解析
【０１８７】
【化１８】
2008514551.tif 000026
【０１８８】
化合物４、すなわち１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−ｎ−プロピル−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンの調製及び同定は以下の通り行った。
【０１８９】
調製：
化合物１（４６．７ｍｇ）を、ジプロピル硫酸（０．５ｍＬ）及びＮａＨＣＯ３（４６．３ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（３ｍＬ）の混合液中で、７２ｈｒｓ室温で攪拌した。できた混合液を０．４５μｍ １３ｍｍのAcrodiskTM GHPシリンジフィルターで濾過した。溶液を分取ＨＰＬＣ（NovaPackTM ＨＲ Ｃ−１８ ２５×２００ｍｍカラムにマルチプルインジェクションを用い２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８ｍｉｎ；３０：７０〜０：１００、８〜１８ｍｉｎ）で精製し、実質的に純粋な化合物４を得た（１８．０ｍｇ，ＲＴ：１７．３ｍｉｎ）。
【０１９０】
化合物４の構造解析：
化合物４の主要同位体の計算上の分子量（５０４．３０）及び式（Ｃ３１Ｈ４０Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって５０３．４の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５０５．５の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。プロトンＮＭＲシグナルは、化合物１及び２の構造の知見に基づいて容易に帰属された。特徴的なＮ−プロピル基（５−Ｎ−Ｐｒ（Ｃ１〜Ｃ３））は容易に以下の表７に示すように帰属された。
【０１９１】
ｄ）化合物１３の合成及び解析
【０１９２】
【化１９】
2008514551.tif 000027
【０１９３】
化合物１３：１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−（トリジュウテリオメチル）−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オン
【０１９４】
調製：
化合物（１２１．３ｍｇ）を、ジメチル硫酸−ｄ６（１５０μＬ、CDN isotpes Inc.社製）及びＮａＨＣＯ３（５８．１ｍｇ）を含むＭｅＯＨ（３．０ｍＬ）に溶かし、反応液を室温で一晩攪拌した。その反応混合液を濾過し、濾液をWaters社製のＨＰＬＣで精製し（NovaPackTM ＨＲ Ｃ−１８ ２５×２００ｍｍカラムにマルチプルインジェクションし、２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント７０：３０〜２０：８０、０〜４ｍｉｎ；２０：８０〜０：１００、４〜９ｍｉｎ、１００％ＣＨ３ＣＮ、９〜１２ｍｉｎ）、化合物１３を得た（８２．７ｍｇ、ＲＴ：９．４ｍｉｎ）。
【０１９５】
構造解析：
化合物１３の主要同位体の計算上の分子量（４７９．２９）及び式（Ｃ２９Ｈ３３Ｄ３Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって４７８．５の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４８０．６の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。さらに、以下の表７に示すように、プロトンＮＭＲによって構造を確認した。
【０１９６】
【表７】
2008514551.tif 000028
【０１９７】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない
ａ．化合物４ではＣＨ２、化合物１３ではＣＤ３
【０１９８】
実施例５：ハロゲン化アルキル反応
ａ）化合物５の合成及び構造解析
【０１９９】
【化２０】
2008514551.tif 000029
【０２００】
化合物５、すなわち１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−ｎ−ブチル−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンを以下の通り調製及び同定した。
【０２０１】
調製：
化合物１（４３．５ｍｇ）を、ピリジン（５０μＬ）を含む１−ブロモブタン（２．０ｍＬ）中で、８０℃、一晩攪拌した。この反応混合液をＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）で希釈し、濾過後、上述したように（実施例４（ｃ））Waters ＨＰＬＣにかけ、半精製された化合物５を得た（ＲＴ：１８．１ｍｉｎ）。かかる半精製化合物を同じ条件（曲線７を除く）でさらに精製し、実質的に純粋な化合物５（１０．５ｍｇ、ＲＴ：１７．９ｍｉｎ）を得た。
【０２０２】
構造解析：
化合物５の主要同位体の計算上の分子量（５１８．３１）及び式（Ｃ３２Ｈ４２Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって５１７．４の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５１９．５の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。特徴的なＮ−ｎ−ブチル基（５−Ｎ−アルキル（Ｃ１−Ｃ４））が容易に以下の表８に示すように帰属された。
【０２０３】
ｂ）化合物７の合成及び構造解析
【０２０４】
【化２１】
2008514551.tif 000030
【０２０５】
化合物７、すなわち１０−ファルネシル−４，６，８−トリヒドロキシ−５−ｎ−ヘキシル−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンの調製及び同定は以下の通り行った。
【０２０６】
調製：
化合物１（３９．２ｍｇ）を、ピリジン（５０μＬ）を含む１−ブロモヘキサン（２．０ｍＬ）中で、８０℃、一晩攪拌した。この反応混合液をＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）で希釈し、濾過後、Waters ＨＰＬＣにかけ（NovaPackTM ＨＲ  Ｃ−１８  ２５×２００ｍｍカラムへのマルチプルインジェクション：２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８ｍｉｎ；３０：７０〜０：１００、８〜１８ｍｉｎ、均一濃度ＣＨ３ＣＮ１８〜２４ｍｉｎ）、実質的に純粋な化合物７（１４．０ｍｇ、ＲＴ：２０．１ｍｉｎ）を得た。
【０２０７】
構造解析：
化合物７の主要同位体の計算上の分子量（５４６．３５）及び式（Ｃ３４Ｈ４６Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって５４５．６の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって５４７．６の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。プロトンＮＭＲシグナルは化合物１及び２の構造の知見に基づいて容易に帰属された。特徴的なＮ−ｎ−ヘキシル基（５−Ｎ−アルキル（Ｃ１−Ｃ６））が容易に下の表８に示すように帰属された。
【０２０８】
ｃ）化合物２〜４、６、及び８〜１２の合成
化合物２〜４、６、及び８〜１２は、ａ）及びｂ）に記載の方法で、使用するアルキル化剤をそれぞれ以下のアルキル化剤に変えることで生産される：ヨードメタン、ブロモエタン、１−ブロモプロパン、１−ブロモペンタン、１−ブロモヘプタン、１−クロロオクタン、ヨウ化トリフオロメチル、ヘプタフルオロ−１−ヨードプロパン、及び２−ヨード−１，１，１−トリフルオロエタン。
【０２０９】
【表８】
2008514551.tif 000031
【０２１０】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない
ａ．  ４’，５’，８’、及び９’のシグナルは非常に近接している；化合物１に基づいて帰属された。
ｂ．  化合物５中ではＣＨ３、化合物７中ではＣＨ２。
【０２１１】
実施例６：Ｏ―アシル化
化合物２５（Ｏ−アセチル化）の合成及び構造解析
【０２１２】
【化２２】
2008514551.tif 000032
【０２１３】
化合物２５：４，６，８−トリアセトキシ−１０−ファルネシル−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンを以下の方法で調製及び同定した。
【０２１４】
調製：
化合物１（１２０.５ｍｇ）をピリジン（Aldrich社製）６滴を含む無水酢酸（７２０μＬ、２９ｅｑ、Aldrich社製）と一晩攪拌した。この反応混合液をＨＰＬＣ分離に供した。WatersTM RCM Nova-Pak HRTMC18、６μｍ、６０Ａ  ２５×２００ｍｍカラムへのマルチプルインジェクションによる精製によって（２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ８０：３０〜７０：７５、０〜８ｍｉｎ；３０：７０〜０：１００、８〜１８ｍｉｎ、１００％ＣＨ３ＣＮ、１８〜２０ｍｉｎ）、保持時間１８．５ｍｉｎに化合物２５（９１．２ｍｇ）を得た。保持時間１６．２、１７．６、１８．０に、それぞれ４，８−ジアセトキシ（１１．４ｍｇ）、４，６−ジアセトキシ（９．２ｍｇ）、及び６．８−ジアセトキシ（１１．４ｍｇ）が単離された。
【０２１５】
構造解析：
化合物２５の主要同位体の計算上の分子量（５８８．２８）及び式（Ｃ３４Ｈ４０Ｎ２Ｏ７）は、マススペクトル（ＭＳ）解析によって確認された。化合物２５のＭＳにおいて、負イオン化では５８７．６の（Ｍ−Ｈ）−分子イオンが、正イオン化では６１１．５の（Ｍ＋Ｎａ）＋分子イオンが生じた。化合物２５のプロトンＮＭＲスペクトル解析を表９に示す。シグナルは化合物１のスペクトルとの比較に基づいて容易に帰属された。
【０２１６】
【表９】
2008514551.tif 000033
【０２１７】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない。
ａ．４’、５’、８’、及び９’のシグナルは非常に近接している；化合物１に基づいて帰属された。
【０２１８】
実施例７：ファルネシル側鎖修飾
ａ）化合物１４の合成及び構造解析
【０２１９】
【化２３】
2008514551.tif 000034
【０２２０】
化合物１４、すなわち１０−（３，７，１１−トリメチルドデシル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５−メチル−５，１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンを以下のように調製及び同定した。
【０２２１】
調製：
ＭｅＯＨ（２．０ｍＬ）に化合物２（２３．７ｍｇ）を溶かした溶液を、水素ガス及び触媒としての酸化白金（ＰｔＯ２、１０ｍｇ、触媒）存在下で一晩攪拌した。この反応混合液を濾過及び減圧濃縮することで２１．６ｍｇの化合物１４が得られた。
【０２２２】
構造解析：
化合物１４の計算上の分子量（４８２．３１）及び式（Ｃ２９Ｈ４２Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって４８１．３の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４８３．３の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。ファルネシルオレフィンプロトンのＮＭＲスペクトルは、約０.７６〜１．８６ｐｐｍ付近の脂肪族プロトンシグナルとして現れ、積分値は３ＣＨ、７ＣＨ２の１７個のプロトンを示した。特徴的なＮ−メチル基（５−Ｎ−Ｍｅ）が下の表１０に示すように容易に帰属された。
【０２２３】
ｂ）化合物１５の合成及び構造解析
【０２２４】
【化２４】
2008514551.tif 000035
【０２２５】
化合物１５、すなわち、１０−（３，７，１１−トリメチル−２−ドデセニル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５−メチル−５−１０−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンを以下のように調製及び同定した。
【０２２６】
調製：
ＭｅＯＨ（２２０ｍＬ）に化合物２（３０８．５ｍｇ）を溶かした溶液を、水素ガス及び触媒として酸化白金（ＰｔＯ２、１０ｍｇ）存在下で一晩攪拌した。この反応混合液を濾過し、実施例４（ｃ）記載の方法に従ってＨＰＬＣによる精製を行い、純粋な化合物１５（８２．３ｍｇ、ＲＴ：１７．０ｍｉｎ）が得られた。
【０２２７】
構造解析：
化合物１５の計算上の分子量（４８０．３０）及び式（Ｃ２９Ｈ４０Ｎ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認され、負イオン化によって４７９．３の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４８１．６の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。ＮＭＲスペクトル解析は化合物２及び１４の構造解析に基づいて行った。結果を表１０に示す。ＮＭＲスペクトル上の６’〜７’位及び１０’〜１１’のファルネシルオレフィンプロトンシグナルは脂肪族のプロトンで置換されており、５’、８’、及び９’位の脂肪族プロトンと共に１．０７〜１．５１ｐｐｍの範囲に観察された。その積分値は１２個の水素、２ＣＨ、５ＣＨ２を示した。２’位（ＣＨ）のファルネシルオレフィンプロトンは、ＮＭＲ上で５．４１ｐｐｍの化学シフトを示した。４’位のメチレン基は２．０３ｐｐｍに示された。特徴的な５−Ｎ−メチル基は２．９３ｐｐｍの化学シフトに容易に帰属された。
【０２２８】
ｃ）化合物２３の合成及び構造解析
【０２２９】
【化２５】
2008514551.tif 000036
【０２３０】
化合物２３：１０−（３，７，１１−トリメチルドデシル）−４，６，８−トリヒドロキシ−５，１０−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン―１１―オンは以下の手法に従って調製及び同定した。
【０２３１】
調製：
５１．１ｍｇの化合物１をＭｅＯＨ３．０ｍＬに溶かした溶液を、水素ガス及び触媒として酸化白金（ＰｔＯ２、１０ｍｇ、０．４ｅｑ）存在下で一晩攪拌した。反応混合液を濾過し、Phenomenex SynergiTM MAX RP ２１．２×２００ｍｍカラムを用いた直接分取ＨＰＬＣにより精製した（２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント３０：７０〜３０：７０、０〜２分；３０：７０〜０：１００、２〜２０ｍｉｎ）。保持時間１２．８ｍｉｎの画分を合わせ、４５．２ｍｇの化合物２３を得た。
【０２３２】
構造解析
主要同位体の計算上の分子量（４６８．３０）及び式（Ｃ２８Ｈ４０Ｎ２Ｏ４）を、マススペクトル解析によって確認した。化合物２３のマススペクトルは、負イオン化によって４６７．４の（Ｍ−Ｈ）−分子イオン、正イオン化によって４６９．４の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンを生じた。化合物２３のプロトンＮＭＲスペクトル解析を下の表１０に示す。シグナルは化合物１の構造の知見に基づいて容易に帰属された。予測通り、２’位〜１１’の脂肪族プロトンシグナルは全て、１〜１．７５ｐｐｍの範囲に非常に近接した化学シフトをもっており（プロトン１７個分）、１２’及び１’’〜３’’位のメチルプロトンも非常に近接していた（０．８〜０．９５ｐｐｍのシフト。プロトン１２個分）。又、混合物中に３’位と７’位の２つのジアステレオマーが異なる比率で存在することから、これらのシグナルは複雑になっている。ＮＭＲは重メタノール中で行ったので、不安定なプロトンは観察されなかった。
【０２３３】
【表１０】
2008514551.tif 000037
【０２３４】
Ｎ／Ａ：非適用、分子中に基が存在しない。
ａ．シグナルは非常に近接している。
ｂ．異性体混合物
ｃ．化合物１４及び２３では３ＣＨ、７ＣＨ２（１７Ｈ）；化合物１５では５．４１ｐｐｍに２’（ＣＨ）、２．０３ｐｐｍに４’（ＣＨ２）、１．０７〜１．５１ｐｐｍに５’〜１１’（１２Ｈ）
ｄ．化合物１４及び２３では４ＣＨ３（１２Ｈ）；化合物１５では１．７５ｐｐｍに１’’（ＣＨ３）、０．８８〜０．８０ｐｐｍに２’’、３’’、及び１２’（９Ｈ）。
【０２３５】
実施例８：芳香族置換反応
ａ）化合物２４の臭素化による合成及び構造解析
【０２３６】
【化２６】
2008514551.tif 000038
【０２３７】
化合物２４：１０−（ファルネシル）−７−ブロモ−４，６，８−トリヒドロキシ−５、１０−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−オンは以下の手法に従い調製及び同定した。
【０２３８】
調製：
化合物１（１１６．０ｍｇ）とＮ―ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ、４５．５ｍｇ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ３．０ｍＬ）に溶かし、室温で４日間攪拌した。反応混合液を濾過し、Waters ＨＰＬＣでの精製に供し（Nova-PackTMＨＲ  Ｃ−１８  ２５×２００ｍｍカラム：２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエント８０：２０〜３０：７０、０〜８ｍｉｎ；３０：７０〜０：１００、８〜１８ｍｉｎ）、化合物２４（１３．６ｍｇ）及びいくらかの不純物を得た。かかる半精製試料をさらにＨＰＬＣで精製し（SymmetryTM Ｃ−１８  ２５×１００ｍｍカラム：２０ｍＬ／ｍｉｎ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ、グラジエント７０：３０〜３０：７０、０〜１５ｍｉｎ）、純粋な化合物２４（９．５ｍｇ、ＲＴ１３．０ｍｉｎ）を得た。
【０２３９】
構造解析
化合物２４の主要同位体の計算上の分子量（５４０．１６及び５４２．１６）及び式（Ｃ２８Ｈ３３ＢｒＮ２Ｏ４）は、マススペクトル解析によって確認された。負イオン化では５３９．２及び５４１．１の（Ｍ−Ｈ）−分子イオンが、正イオン化では５４１．３及び５４３．２の（Ｍ＋Ｈ）＋分子イオンが生じた。各マススペクトルに２つの分子イオンが存在することから、ブロム基が分子中に存在することが確認された。下の表１１に示す通り、プロトンＮＭＲスペクトルで芳香族（７’位）シグナルが無いことから構造がさらに確認された。
【０２４０】
【表１１】
2008514551.tif 000039
【０２４１】
ｂ）化合物２６の合成
化合物２及びＮ−ブロモスクシンイミドをテトラヒドロフランに溶かし、室温で４日間攪拌した（条件は（ａ）記載の通り）。この反応混合液を濾過し、ＨＰＬＣ精製して純粋な化合物２６を得た。
【０２４２】
ｃ）化合物２７の合成
化合物１４及びＮ−ブロモスクシンイミドをテトラヒドロフランに溶かし、室温で４日間攪拌した（条件は（ａ）記載の通り）。この反応混合液を濾過し、ＨＰＬＣ精製して純粋な化合物２７を得た。
【０２４３】
実施例９．本発明化合物のインビトロにおける特性分析
（ａ）４つの細胞株に対する式Ｉの化合物のインビトロ抗癌活性：
実施例に挙げた化合物のインビトロにおける細胞毒性活性、及び各化合物の溶血作用を表１２に示す。化合物は４つの細胞株、ＨＴ−２９（結腸直腸癌）、ＳＦ２６８（ＣＮＳ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（哺乳類腺癌）、及びＰＣ−３（前立腺癌）で試験した。各試験に用いた手法を以下に示す。
【０２４４】
【表１２】
2008514551.tif 000040
【０２４５】
ａ．方法（ａ）で得られた結果。
ｂ．方法（ｂ）で得られた結果。
ｃ．平均ＧＩ５０値（単位はμＭ）。
【０２４６】
表１２に示した全ての化合物は、化合物１よりも高い抗癌活性を示した．これらの化合物には化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、及び２１〜２５が含まれる。化合物２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１、及び２２は化合物１のＮ−直鎖アルキル誘導体であり、式Ｉ及びその水素化若しくはヒドロキシル化ファルネシル誘導体に包含される。水素化ファルネシル派生化合物２３、臭素化アリール派生化合物２４、及びトリアセチル化化合物２５も一般に、化合物１よりも活性が高かった。
【０２４７】
方法（ａ）
細胞増殖を５０％抑制するのに必要な化合物１、２３及び２５の濃度（ＧＩ５０）を求めることで、各化合物のインビトロにおける細胞毒性活性を決定した。ＧＩ５０値では時間ゼロにおける細胞カウントの正確性が重要であり、７つの吸収測定［時間ゼロ、（Ｔｚ）コントロールの成長、（Ｃ）、及び５種類の薬剤濃度下における成長、（Ｔｉ）］を用いて、ＧＩ５０は［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝−５０として計算される。これは、薬剤インキュベート期間中に、非処理のコントロール細胞に比べて純ＤＮＡ量が５０％減少する薬剤濃度である。
【０２４８】
化合物をＤＭＳＯに１０ｍＭで溶かした。媒体（vehicle）中の濃度が、３０、１０、３、１及び０．３μＭである希釈液を、試験の直前に調製した。細胞株の成長特性によって、４０００〜１００００細胞を２つの９６ウェルプレートに蒔いて（０日目）、１６時間インキュベートした。次の日、２つのプレートのうちの１つにヨウ化プロピジウムを加え、蛍光を測定した（Ｔｚ）。試験物質及び媒体単独を、２番目のプレートに加え、細胞をさらに９６時間インキュベートした。各化合物を、各濃度において、３つ試験した。ヨウ化プロピジウム添加後、蛍光によるシグナルを測定することで等量の細胞数を決定した（Ｃはコントロール）。ＧＩ５０の結果は上記の式を用いて計算し、表１２に示した。
【０２４９】
方法（ｂ）：
化合物１、２〜５、７、１３、１４、１５、１８、２１、２２、及び２４のインビトロにおける細胞毒性活性（ＧＩ５０）は、５０％成長抑制を生じる濃度の薬剤としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、以下の方法で決定した。
【０２５０】
各細胞株を適切な接種濃度（ＨＴ２９：３，０００；ＳＦ２６８：３，０００；ＰＣ−３：３，０００；及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１：７，５００細胞）で、各細胞株のデータシートに従って、２つの９６ウェルプレートに同じように播種した（列Ａ〜Ｇ、各ウェルに培地７５μＬ）。列Ｈは培地のみで満たした（１５０μＬ、ネガティブコントロール培地）。プレートを適切な温度及びＣＯ２濃度で２４ｈｒｓインキュベートした。
【０２５１】
試験化合物は、適切な培地中に１５×ストック溶液として、４５０、４５、０．４５、０．０４５、及び０．００４５μＭで調製した（実験当日に調製した）。それぞれを適切な実験培地中に７．５倍希釈し、６つの２×濃度溶液（６０、６、０．６、０．０６、０．００６、及び０．０００６μＭ）を１組作製した。各濃度７５μＬずつを、２つ目のプレートの対応するウェル（列Ａ〜Ｆ）に加えた。列Ｇは培地／０．６％ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール細胞）７５μＬのみで満たした。２つ目のプレートを適切な温度、ＣＯ２の濃度で９６ｈｒｓインキュベートした。
【０２５２】
１つ目のプレート：ＰＩ（３０μＬ、５０μｇ／ｍＬ）を、１つ目のプレートの各ウェルに、培養培地を除去せずに加えた。プレートを３５００ｒｐｍ／１０ｍｉｎ遠心した（Sorvall Legend-RT,スウィングバケット）。蛍光強度（Thermo, varioskan、λｅｘ：５３０ｎｍ；λｅｍ：６２０ｎｍ）を測定し、１回目測定値（死細胞）を得た（Ｔ０におけるＤＣ；凍結前）。凍結（−８０℃）／解凍（３７℃）を２回行い、蛍光強度を決定し、２回目測定値（全細胞）を得た（Ｔ０におけるＴＣ；凍結／解凍後）。
【０２５３】
２つ目のプレートに、凍結／解凍を２回の代わりに３回行った以外は１つ目のプレートと同じ処置を行った。１回目測定で処理死細胞値（ＴＤＣ）を、２回目の測定で処理総細胞値（ＴＴＣ）を得た。両方の値は、それぞれの処理ウェル及びコントロール（ＣＴＣ及びＣＤＣ）で集めた。
【０２５４】
各値（ＤＣ、ＴＣ、ＴＤＣ、ＴＴＣ、ＣＴＣ、及びＣＤＣ）からバックグラウンド値（培地のみ）を引いて値を修正し（ＦＵＤＣ（Ｔ＝０）、ＦＵＴＣ（Ｔ＝０）、ＦＵＴＤＣ、ＦＵＴＴＣ）、ＦＵＣＴＣ、ＦＵＣＤＣ）、それぞれの濃度におけるＴ／Ｃ（％）（処理／コントロール）の計算に用いた。各濃度のＴ／Ｃ（％）は以下の式を用いて計算した：
【０２５５】
【数１】
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【０２５６】
ＧＩ５０値では、細胞の生存のために、時間ゼロにおける細胞数の正確性が重要である。Ｔ／Ｃ値をグラフで入れ換えて、Ｔ／Ｃが５０％であるときの濃度であるＧＩ５０値を決定した。
【０２５７】
（ｂ）３６細胞株に対する化合物２の抗癌活性特性の分析（ＩＣ５０）：
培養条件、及び３６癌細胞株に対する化合物２の活性評価は、実施例９（ａ）の方法（ａ）の通り行ったが、結果は細胞成長を５０％抑制する薬剤濃度（ＩＣ５０、次の式を用いて計算した：［Ｔｉ／Ｃ］×１００＝−５０）で表示した。表１３で示された、マイクロモルからナノモルレベルという低いＩＣ５０値は、さまざまな３６個の腫瘍タイプに対する化合物２の細胞毒性の薬理学的関連性を実証している。かかる腫瘍タイプには、メラノーマ、膵臓、肺、結腸、胃、膀胱、直腸、ＣＮＳ、頭並びに首、前立腺、子宮、卵巣、及び乳癌が含まれる。
【０２５８】
【表１３】
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【０２５９】
ｃａ＝癌腫；ｐｄ＝分化低い；ｐａｐ＝乳頭；ｍｄ＝分化中程度；ｗｄ＝分化高い；ｍｍ＝悪性メラノーマ；ｎｄ＝未決定
【０２６０】
実施例１０：インビボにおける化合物１及び２の効果
グリア細胞腫における化合物１及び２のインビボ活性
本研究の目的は、化合物１及び２が、Ｃ６グリア芽腫を有するマウスの腫瘍成長を予防又は遅延させるかどうかを試験し、効果的な用法を決定することである。
【０２６１】
動物：  体重１８〜２５ｇの、全部で６０頭の６週齢の雌マウス（ヌードマウスＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を処置前７日間観察した。動物実験は、動物実験の倫理的指針（Charte du comite d’ethiquedu CNRS, juillet 2003）及び英国の腫瘍実験における動物の福祉に関する指針（WORKMAN, P., TWENTYMAN,P., BALKWILL, F., et al.(1998).United Kingdom CoordinatingCommittee on Cancer Research(UKCCCR) Guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia(Second Edition, July 1007; British Journal of Cancer, 77:1-10)）に沿って行われた。死亡した、又は明らかに病気のマウスは速やかに取り除き、健康なマウスと換えた。病気のマウスはケージから取り除いてすぐに安楽死させた。温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期（１２ｈｒｓ明期、１２ｈｒｓ暗期）、及び空気交換の条件を保った部屋で動物は飼育された。動物は、餌及び水を供するように装備されたポリカーボネートのケージで飼育された（５頭／ケージ）。動物の床敷には無菌木屑を用い、１日おきに取り替えた。餌は、ケージの上部の金属のふた（metal lid）の中に置いて、常時供された。オートクレーブした水道水が常に供されていた。水のボトルには、ゴムのストッパーと吸うためのチューブがついていた。水のボトルは週に１回、綺麗にして滅菌して取り替えた。両耳に刻印した２つの異なる数字を用いて動物を識別した。各ケージには個別のコードを付した。
【０２６２】
腫瘍細胞株：一連の交互培養（alternate culture）及び動物継代の後、Premont et al.(Premont J, Benda P, Jard S., [3H] norepinephrinebinding by rat glial cells in culture. Lack of correlation between binding and adenylate cyclase activation. Biochim Biophys Acta. 1975 Feb 13;381(2):368-76.)に従って、Ｎ−ニトロメチル尿素（ＮＭＵ）で誘導したラットグリア腫瘍からＣ６細胞株をクローン化した。細胞は、３７℃の湿った大気中（５％ＣＯ２、９５％空気）で接着性の単層状に成長した。培養培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭである。実験に使用するために、トリプシンベルセンで１０ｍｉｎ処理して、培養フラスコから腫瘍細胞を剥がした。血球計算版中の細胞を計測し、０．２５％トリパンブルー染色によって生存率を評価した。
【０２６３】
被検物質の調製：被検物質に対して、以下の操作を行い再構成した（注射の直前に行われた）。媒体（vehicle）は、ベンジルアルコール（１．５％）、エタノール（８．５％）、プロピレングリコール（２７％）、ＰＥＧ４００（２７％）、ジメチルアセトアミド（６％）、及び水（３０％）の混合物から成る。最初に、均一な液体にするために、媒体溶液を激しくボルテックスした。ボルテックスされた媒体溶液０．６ｍＬを被検物質（化合物１）を含む各バイアルに加えた。バイアルを１分間ボルテックスし、激しく振って、完全に混合した。バイアルは、各動物に注射する前に再度混合した。
【０２６４】
動物への腫瘍細胞接種：実験は０日目（Ｄ０）に始めた。Ｄ０で、Ｃ６腫瘍細胞（５×１０５細胞）を含む０．１ｍＬのＤＭＥＭ完全培地を、マウスの右前肢上部に筋肉表層内注射した。
【０２６５】
治療計画及び結果
実験第１群
実験第１群においては、Ｃ６細胞接種後２４ｈｒｓに処置を始めた。Ｃ６細胞接種後２４ｈｒｓで処置を開始した。処置の日に、各マウスに１００μＬの被検物質又は対照物質をゆっくり腹腔経路で注射した。全てのグループにおいて、生理食塩液処置グループ（グループ１）の腫瘍体積が約３ｃｍ３になるまで（約１６日目）、処置を行った。グループ１のマウスは、等浸透圧の生理食塩液で１６日間毎日処置した。グループ２のマウスは、媒体溶液で１６日間毎日処置された。グループ３のマウスは、１０ｍｇ／ｋｇの化合物１で１６日間毎日処置された。グループ４のマウスは、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１で１日おきに８回処置した。グループ５のマウスは、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１で２日おきに６回処置した。腫瘍体積の測定は、腫瘍が知覚できるようになるとすぐに開始し（＞１００ｍｍ３；接種後１１日目）、処置の終わりまで１日おきに、キャリパーを用いて評価した。表１４及び図１に示されるとおり、化合物１処置グループ（６マウス／グループ）の全てで腫瘍体積の平均値が優位に減少したことが、一元配置分散分析（Ａｎｏｖａ）法及びダネットのノンパラメトリック多重比較検定で処置グループと生理食塩液グループを比較することで実証された。表１４のＰ値の欄のアスタリスクは統計的に有意な値を意味し、「ｎｓ」は有意でないことを示す。
【０２６６】
【表１４】
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【０２６７】
実験第２群：
実験第２群では、Ｃ６細胞接種後１０日目の、腫瘍が知覚できる（約１００〜２００ｍｍ３）ようになったときに処置を開始した。処置は連続５日間、毎日続けて行った。処置日に、各マウスに１００ｍＭの化合物１を腹腔経路でゆっくり注射した。グループ１のマウスは、等浸透圧の生理食塩液で毎日処置した。グループ２のマウスは、媒体溶液で毎日処置した。グループ３のマウスは、２０ｍｇ／ｋｇの化合物１を毎日処置した。グループ４のマウスは、３０ｍｇ／ｋｇの化合物１を毎日処置した。マウスの処置は、生理食塩液処置の対照マウス（グループ１）の腫瘍体積が約４ｃｍ３に達するまで行った。腫瘍体積の測定は、処置の終わりまで１日おきに、キャリパーを用いて行った。表１５及び図２に示されるとおり、化合物１処置グループ（６マウス／グループ）の全てにおいて、腫瘍体積の平均値が有意に減少していることが、一元配置分散分析（Ａｎｏｖａ）法及びダネットのノンパラメトリック多重比較検定で処置グループと生理食塩液グループを比較することで実証された。表１５のＰ値の欄のアスタリスクは統計的に有意な値を意味し、「ｎｓ」は有意でないことを示す。
【０２６８】
腫瘍切片の組織学的解析により、化合物１処置マウスの腫瘍と対照グループの腫瘍の間で顕著な形態的変化が示された。化合物１（２０〜３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの腫瘍では、細胞濃度が減少し、残った腫瘍細胞の核は大きくなっており且つ濃縮されていた。媒体で処置したマウスの腫瘍ではこのような変化はみられなかった（図３）。
【０２６９】
【表１５】
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【０２７０】
化合物２のインビボにおける抗腫瘍効果：
雌のスイス系ヌードマウスへのラットグリア芽腫（Ｃ６）異種移植に対する化合物２の抗腫瘍効果が、上述の方法で確認された。この結果及び用法の概要を、図４に示す。７５ｍｇ／ｋｇ（ｑｄ５／２／ｑｄ５）の用法での静脈内投与後、有意な効果が示された。
【０２７１】
実施例１１：薬物動態分析
エタノール（５％）、ポリソルベート８０（１５％）、ＰＥＧ４００（５％）、及びデキストロース（５％）に、化合物１及び２を別々に最終濃度６ｍｇ／ｍｌで溶かした（全ての非経口投与経路に対して）。経口投与用には、Cremophor EL／エタノール（５０％：５０％）に化合物１を最終濃度６ｍｇ／ｍｌで溶かした。投与に先立って、動物（雌Ｃｒｌ：ＣＤ１マウス；６週齢、２２〜２４ｇ）の体重を量り、ランダムに選び、異なる処置グループに割り振った。化合物１を、割り振った動物に、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、腹腔内（ｉｐ）、又は経口（ｐｏ）経路で投与した。化合物２は、割り振った動物に、静脈内（ｉｖ）、又は腹腔内（ｉｐ）経路で投与された。化合物１及び２の投与体積は、体重１ｋｇあたり５ｍＬとした。動物は出血の前に、５％イソフルランで麻酔された。血液は、抗凝固剤Ｋ２ＥＤＴＡを含むマイクロティナチューブ（microtainer tube）に、各出血時間（２ｍｉｎ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、及び８ｈ）につき４動物から、心臓穿刺によって採血された。採血後、各試料を遠心し、各試料から得られた血漿を再生後、分析まで凍結保存した（約−８０℃）。５ｍｉｎ及び３０ｍｉｎの時点で、各動物から以下の臓器を摘出した：脳、肺、骨格筋、脂肪組織、腎臓、脾臓、胸腺及び肝臓。組織は分析まで冷凍（約−８０℃）された。試料はＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析された。検量線の範囲は２５〜２０００ｎｇ／ｍＬで、定量限界（ＬＯＱ）≧２５ｎｇ／ｍＬ、検出限界（ＬＯＤ）１０ｎｇ／ｍＬであった。
【０２７２】
定量限界（ＬＯＱ）を下回った化合物１及び２の血漿値をゼロにセットした。平均濃度及び標準偏差（ＳＤ）を薬物動態研究の各時点で計算した（ｎ＝４動物／時点）。以下の薬物動態パラメータを計算した：時間ゼロ〜最後の計測可能な時点までの血漿濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ０−ｔ）、無限大に外挿した血漿濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣinf）、観測された血漿濃度の最大値（Ｃｍａｘ）、血漿濃度が最大のときの時間（ｔｍａｘ）、見かけの一次消失速度定数（first-order terminal elimination rate constant）（ｋｅｌ）、０．６９３／ｋｅｌ（ｔ１／２）で計算される見かけの一次消失半減期（first-order terminal elimination half-life）。化合物１の静脈内投与後の全身クリアランス（ＣＬ）は、Ｄｏｓｅ／ＡＵＣｉｎｆを用いて計算した。薬物動態パラメータの計算にはKineticaTM 4.1.1（InnaPhase Corporation社製、Philadelphia, PA）を用いた。
【０２７３】
結果：
３０ｍｇ／ｋｇの化合物１を静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、皮下（ｓｃ）、及び経口（ｐｏ）投与した後の化合物１の平均血漿濃度を図５に示した。３０ｍｇ／ｋｇの化合物２をｉｖ及びｉｐ投与した後の化合物２の平均血漿濃度を、同じ経路で投与した化合物１と比較して、図６に示した。ｉｖ投与において、化合物２では、ＡＵＣは９２．０８μＭ・ｈであり、Ｃｍａｘは１０５μｇ／ｍＬであったのに対し、化合物１ではＡＵＣは４０．４μＭ・ｈであり、Ｃｍａｘは１３０μｇ／ｍＬであった。ｉｐ投与においては、化合物２では、ＡＵＣは５８．７５μＭ・ｈであり、Ｃｍａｘは５．８μｇ／ｍＬであったのに対し、化合物１ではＡＵＣは９．５μＭ・ｈであり、Ｃｍａｘは２．２５μｇ／ｍＬであった。
【０２７４】
用量３０ｍｇ／ｋｇの化合物１のＩ．Ｖ．投与後の平均（±ＳＤ）プラズマ濃度は、２変数の指数関数（biexponential）的に急速に減少し、半減期が非常に短かった（ｔ１／２α及びβはそれぞれ４．６ｍｉｎ及び２．５６ｈであった。）。腹腔内投与及び皮下投与後の化合物１、並びに腹腔内投与及び皮下投与後の化合物２の薬物動態学は、ゆっくりした放出を示唆するＰＫを示した。これらの投与経路では、化合物の血漿濃度は持続され、８時間以上、治療に関係するレベルが維持されていた。化合物２はＩＰ及びＩＶ投与の両方の後で、４０時間以上の半減期（ｔ１／２）を示した。化合物１の経口投与においては、中程度ではあるが薬物レベルは持続された。これらのデータは、化合物１が経口で５〜８％レベルの生体利用性をもつことを示している。
【０２７５】
３０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、又は皮下（ｓｃ）投与後３０ｍｉｎにおける化合物１の平均組織濃度を図７に示す。３０ｍｉｎの時点を選んだのは、３つ全ての投与経路で、血漿濃度が類似していたからである。化合物１は、ｉｖ及びｉｐ投与後、よく分散されている。驚くべきことに、ｉｐ及びｓｃ投与ではＰＫの特性が類似していたにも関わらず、ｓｃ投与後の組織レベルは有意に低かった。これは、ｉｖ及びｉｐ投与と比べたときに、ｓｃ投与後にはピークレベルがないことで説明され得る。
【０２７６】
同じ製剤を用いた、ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕマウスにおける化合物２の急性毒性試験は、ＭＴＤ≧５０ｍｇ／ｋｇ（ｉｐ、ＮＯＡＥＬ：３０ｍｇ／ｋｇ）及び≧１００ｍｇ／ｋｇ（ｉｐ、ＮＯＡＥＬ：７５ｍｇ／ｋｇ）となり、注射後数日での体重減少は７％であった。化合物１はＭＴＤは、ｉｖ投与では１５０ｍｇ／ｋｇであった。急性毒性試験の結果、化合物４６のＭＴＤは３０ｍｇ／ｋｇであった（ｉｐ）。
【０２７７】
本明細書で引用したすべての特許、特許出願、及び発行されている参照文献の全体を本明細書に引用し援用する。本発明を特にその好ましい実施形態に即して示し、述べてきたが、当業者ならば、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、そこに形態及び細部の様々な変更を行なってもよいことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０２７８】
【図１】Ｃ６グリア芽腫を有するマウスに対して腫瘍細胞接種１日後に１０〜３０ｍｇ／ｋｇの化合物１をボーラス投与したことによる、腫瘍成長抑制を示す図。
【図２】Ｃ６グリア芽腫を有するマウスに対して腫瘍細胞接種１０日後に２０〜３０ｍｇ／ｋｇの化合物１をボーラス投与したことによる、腫瘍成長抑制を示す図。
【図３】生理食塩液又は化合物１で処置したＣ６グリア芽腫を有するマウスの腫瘍切片の顕微鏡写真。化合物１で処置された腫瘍の細胞密度が明らかに減少し、腫瘍細胞の核が大きくなり、濃縮されていることから、細胞毒性効果が示唆される。
【図４】処置１１日目〜２０日目における、Ｃ６グリア芽腫を有するマウスに対する２０〜７５ｍｇ／ｋｇの化合物２ボーラス投与による腫瘍成長抑制を示す図。
【図５】スイスマウスにおける、３０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、皮下（ｓｃ）及び経口（ｐｏ）ボーラス投与後の、化合物１の平均（±ＳＤ）血漿濃度を示す図。
【図６】ＣＤ−１マウスにおける、３０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉｖ）及び腹腔内（ｉｐ）ボーラス投与後の、化合物１及び２の平均（±ＳＤ）血漿濃度を示す図。
【図７】３０ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、及び皮下（ｓｃ）ボーラス投与３０分後の、様々な組織における化合物１の平均濃度を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008514551.tif 000057
【図６】
2008514551.tif 000058
【図７】
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【国際調査報告】
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