(57)【要約】  細胞の透過処理と安定化のための試薬及びその使用方法を開示する。当該試薬は、Ｎ−アシルサルコシン又はその塩；前記試薬のｐＨを約４〜約６の範囲に調節するｐＨ調節剤；及び水性媒体を含み；前記試薬は９．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している。当該試薬は更にウシ血清アルブミン及びグリセロールを含む。当該試薬は更に、アルキル硫酸塩の界面活性剤を含むことがある。細胞を前記試薬とインキュベートする際、当該試薬は細胞膜を透過処理して細胞内マーカーの浸透を可能にし、細胞膜内での細胞内タンパク質の凝集を引き起こし、更に、フローサイトメトリーによるその後の解析のための細胞マーカーとの結合のために細胞構成要素を保存する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を透過処理して安定化する試薬であって：
（ａ）以下の分子構造：
Ｒ1−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＯＯＸ1
（ここで、Ｒ1は８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてＸ1はＨ、Ｎａ+、又はＫ+である）によって表されるＮ−アシルサルコシン又はその塩；
（ｂ）前記試薬のｐＨを７未満に調節するｐＨ調節剤；及び
（ｃ）水性媒体、
を含んで成り、
９．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している、試薬。
【請求項２】
以下の分子構造：Ｒ2−Ｏ−ＳＯ3Ｘ2
（ここで、Ｒ2は８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレン基であり；そしてＸ2はＮａ+、Ｋ+、ＮＨ4+又はＮＨ2Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3である）
によって表される陰イオン性界面活性剤を更に含んで成る、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
ウシ血清アルブミンを更に含んで成る、請求項１又は２に記載の試薬。
【請求項４】
グリセロールを更に含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
前記ｐＨが約４〜約６の範囲内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
前記導電率が１．２ｍＳ／ｃｍ未満である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
前記Ｎ−アシルサルコシンがＮ−ラウロイルサルコシンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】
前記Ｎ−アシルサルコシンが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲内にある、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
前記陰イオン性界面活性剤がラウリル硫酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１０】
前記陰イオン性界面活性剤が約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度範囲内にある、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
フローサイトメトリー解析のために細胞膜を透過処理し、そして細胞構成要素を保存する方法であって：
（ａ）細胞含有試料と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞を透過処理して安定化する試薬とを混合して、試料混合物を形成させるステップ；
（ｂ）細胞膜を透過処理し、細胞膜内で細胞内タンパク質の凝集が生じさせ、そして細胞マーカーと結合するための細胞構成要素を保存するのに十分な時間、前記試料混合物をインキュベートするステップ；及び
（ｃ）前記細胞マーカーを前記試料混合物に添加し、そして、当該細胞マーカーがステップ（ｂ）で保存された細胞構成要素と結合するのに可能な追加の時間、その後のフローサイトメトリーによる解析のために、前記試料混合物をインキュベートするステップ、
を含んで成る方法。
【請求項１２】
前記細胞構成要素が、細胞内抗原部位又は細胞表面抗原部位、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞骨格因子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞内抗原部位がヘモグロビン又はヘモグロビン変異体の抗原部位である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞骨格因子がチューブリン及びスペクトリンを含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞マーカーが前記細胞内抗原部位と特異的な抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞マーカーが前記ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と特異的な核酸プローブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞マーカーが前記細胞表面抗原部位と特異的な抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞マーカーが前記試料混合物中の前記細胞構成要素と結合した後に、前記細胞を固定することを更に含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構成要素の解析のために細胞含有試料を調製するために、細胞を透過処理して安定化する試薬及びその使用方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内部の分子レベルでの解析は関心の高まりを見せている問題である。日常的にだけでなく研究で使用され、そして細胞内構造を対象とする複数のプローブと抗体が近年登場している。これらのプローブと抗体は、それらの高分子の特徴により、それら自身では細胞膜を通過して細胞内に透過することができない。従って、細胞膜を透過性にするのには細胞の処理が必要である（透過段階）。この処理は、外側の脂質膜に重大な変更をもたらし、そして、使用する方法によっては、細胞の形態の損失、また、場合によっては細胞全体の損失を招くことがある。
【０００３】
標準的な透過処理方法は、顕微鏡のスライド上で、又は懸濁液中で、希釈したアルコールを用い、低温（−２０℃）で細胞を処理することから成る。この方法は、分子構造及び細胞内の標的の抗原をよく保存するという利点を有する。しかしながら、複雑な手順、及び使用する温度が低いことに加え、細胞の形態は処理の終わりには実質的に変更する。
【０００４】
複数の透過処理方法が、脂肪族アルデヒドを用いたタンパク質の化学修飾による細胞の固定を使用しており、その結果当該タンパク質は架橋及び凝集される。透過処理は、アルコール又は界面活性剤を用いた処理により達成される。脂肪族アルデヒドによる固定は、透過処理後の細胞の形態が良好に保持されることが特に知られている。しかしながら、タンパク質分子のレベルでは、多くの抗原部位が固定化法によって破壊される。
【０００５】
細胞を透過処理する試薬は、有機溶媒、アルコール、弱塩基及び弱酸の群においてより一般的に見られる。これらの試薬は、細胞膜を透過処理するが、それらは概して細胞の形態を安定化しない。
【０００６】
従って、透過処理後も細胞の形態を保護し、そして細胞の内側及び外側にある抗原部位を修飾しない細胞透過処理試薬が望ましい。
【０００７】
本発明の要約
１つの態様において、本発明は、細胞の透過処理と安定化のための試薬であって、以下の分子構造：Ｒ1−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＯＯＸ1（ここで、Ｒ1は、８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてＸ1はＨ、Ｎａ+、又はＫ+である）によって表されるＮ−アシルサルコシン又はその塩；前記試薬のｐＨを７未満に調節するｐＨ調節剤；及び水性媒体を含んで成る試薬に関する。当該試薬は、９．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している。好ましくは、Ｎ−アシルサルコシンはＮ−ラウリルサルコシン又はその塩であり、前記試薬のｐＨは約４〜６の範囲内であり、そして導電率は１．２ｍＳ／ｃｍ未満である。
【０００８】
好ましくは、前記透過処理安定化試薬は、細胞膜の透過性を増大させ、そして界面活性剤を安定化するために、ウシ血清アルブミン及びグリセロールを更に含んで成る。
【０００９】
任意に、前記透過処理安定化試薬は、以下の分子構造：Ｒ2−Ｏ−ＳＯ3Ｘ2（ここで、Ｒ2は８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレン基であり；そしてＸ2はＮａ+、Ｋ+、ＮＨ4+又はＮＨ2Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3である）によって表される陰イオン性界面活性剤を更に含んで成ってもよい。
【００１０】
追加の態様において、本発明は、フローサイトメトリー解析のために細胞膜を透過処理し、そして細胞構成要素を保存する方法に関する。当該方法は、細胞含有試料と、前記細胞透過処理安定化試薬とを混合して、試料混合物を形成させ；そして、細胞膜を透過処理して、細胞膜内で細胞内タンパク質の凝集が生じさせ、同時に、細胞マーカーと結合するための細胞構成要素を保存するのに十分な時間前記試料混合物をインキュベートし；；細胞マーカーを前記試料混合物に添加し、そして、当該細胞マーカーが保存された細胞構成要素と結合するのに可能な追加の時間前記試料混合物をインキュベートする、段階を含んで成る。当該方法は更に、細胞マーカーが試料混合物中の細胞構成要素と結合した後、細胞を固定する段階を更に含んで成ることがある。試料混合物は、フローサイトメトリー機器上で光散乱及び蛍光解析により解析することができる。
【００１１】
本発明の詳細な説明
１つの態様において、本発明はフローサイトメトリー解析のために細胞を準備するための細胞透過処理安定化試薬を提供する。当該細胞透過処理安定化試薬は：
（ａ）以下の分子構造：
Ｒ1−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＯＯＸ1
（ここで、Ｒ1は８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレンであり、そしてＸ1はＨ、Ｎａ+、又はＫ+である）によって表されるＮ−アシルサルコシン又はその塩；
（ｂ）前記試薬のｐＨを７未満に調節するｐＨ調節剤；及び
（ｃ）水性媒体、
を含んで成る。
【００１２】
前記試薬は、９．０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率によって定義される低イオン強度を有している。
【００１３】
前記透過処理安定化試薬は、好ましくは弱酸性であり、約４〜６の範囲内のｐＨを有する。更に好ましくは、前記試薬のｐＨは、約４．６〜約５．６である。好ましくは、ｐＨ調節剤は強塩基又は酸であり、そのため、少量の化学物質を使用することで、所望の範囲内にｐＨを調節することができる。１つの好ましい態様において、Ｎ−アシルサルコシン遊離酸が使用され、そして有機強塩基であるピロリジン、又は無機強塩基であるＮａＯＨを使用することでｐＨが４〜６の間に調節される。Ｎ−アシルサルコシン塩を使用する場合、強酸、例えばＨＣｌを使用することでｐＨを調節することができる。
【００１４】
細胞を透過処理安定化試薬に曝露する際、透過処理後の細胞の完全性を保存するのに必要な、細胞膜内での細胞内タンパク質の凝集は、低イオン強度のもとでより有効であることがわかっている。本発明のために、水性試薬組成物のイオン強度は、試薬の導電率によって定義される。イオン強度が高すぎる場合、例えば、試薬の導電率が９ｍＳ／ｃｍ超の場合、当該試薬はもはや細胞内タンパク質を凝集させることができず、そして細胞はその完全性を失う。好ましくは、透過処理安定化試薬は、１．２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する。イオン化合物、例えば塩は、前記試薬のイオン強度の主要原因であるため、前記試薬中では低塩濃度であることが好ましい。
【００１５】
好ましくは、細胞透過処理安定化試薬は、更に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びグリセロールを更に含んで成ることがある。ウシ血清アルブミンは、水溶液中の界面活性剤の溶解度を増強し、それ故に、試薬を長期間使用し、そして保存するのに有益である。ウシ血清アルブミンとグリセロールの組み合わせは、試薬による細胞膜の透過性を更に増強することが分かっている。
【００１６】
Ｎ−アシルサルコシンは、遊離酸形態で、そしてその塩で、市販されている。金属イオンを試薬中に導入しない遊離酸形態で使用するのが好ましい。遊離酸形態のＮ−アシルサルコシンは、水溶性ではない。これはエタノール溶液中で予め溶解することができ、そしてその後水溶液中に加えられる。試薬のｐＨはｐＨ調節試薬によって４〜６の間に調節されるので、Ｎ−アシルサルコシンは溶液中でアニオンの形態にある。
【００１７】
Ｎ−アシルサルコシンの好適な例として、Ｎ−オレオイルサルコシン、Ｎ−ステアロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン、Ｎ−ココイルサルコシン、及びそれらの塩が含まれる。好ましくは、Ｒ1のアルキル又はアルキレン基は、１２個の炭素原子を有する。好ましい態様において、Ｎ−ラウロイルサルコシンが用いられる。
【００１８】
更なる態様において、細胞透過処理安定化試薬は、以下の分子構造：
Ｒ2−Ｏ−ＳＯ3Ｘ2
（ここで、Ｒ2は８〜１８個の炭素原子を有するアルキル又はアルキレン基であり；そしてＸ2はＮａ+、Ｋ+、ＮＨ4+又はＮＨ2Ｃ（ＣＨ2ＯＨ）3である）によって表される陰イオン性界面活性剤（すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）を更に含んで成ることがある。
【００１９】
好ましくは、陰イオン性界面活性剤のＲ2のアルキル又はアルキレンは、１２個の炭素原子を有する。好適な例には、ナトリウム、カリウム、アンモニウム及びラウリル硫酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが含まれる。好ましい態様において、ラウリル硫酸トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが用いられ、これは以後トリスラウリル硫酸塩と称する。
【００２０】
Ｎ−アシルサルコシン又はその塩、あるいはアルキル硫酸塩又はアルキレン硫酸塩の界面活性剤とのその組み合わせは、前記試薬が、細胞内マーカーの浸透のために細胞の細胞膜を透過処理するのを可能にし、同時に、フローサイトメトリーによるそれらの細胞マーカーとの特異的な結合のために、細胞膜及び細胞構成要素を実質的に保存するのを可能にする十分な量で存在する。両方の界面活性剤の濃度は、約０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、更に好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭの範囲内にあってもよいことが明らかとなっている。１つの例示的な態様において、２．３ｍＭのＮ−ラウロイルサルコシンを使用した。別の態様において、０．５ｍＭのトリスラウリル硫酸塩と２．２ｍＭのＮ−ラウロイルサルコシンを使用した。
【００２１】
任意に、透過処理安定化試薬は更に、有機性のモル浸透圧濃度(somolarity)調節剤を更に含んで成ることがある。モル浸透圧濃度調節剤の好適な例には、限定しないが、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、糖類、又はグリセロールが含まれる。好ましくは、糖類又はグリセロールが用いられる。糖類は多糖、例えば二糖、又は単糖でもよい。好ましくは、単糖、例えば（Ｄ＋）グルコースが用いられる。
【００２２】
更に、透過処理安定化試薬は、更に１又は複数の保存剤を含んで成ることがある。好適な例には、試薬の保存寿命を延長するための、抗菌剤及び抗酸化剤が含まれる。保存剤は、試薬の機能を妨害しない量で存在しうる。
【００２３】
実施例１は、本発明の３つの例示的な試薬組成物を示す。
【００２４】
細胞と混合した場合、本発明の細胞透過処理安定化試薬は細胞膜を効果的に透過処理し、これにより細胞内マーカーは細胞解析のための細胞内に浸透することが可能となり；そして当該試薬はまた、細胞膜内で細胞内タンパク質の沈殿又は凝集をもたらす。しかしながら、同時に、試薬は細胞内構成要素、例えば細胞内の及び細胞表面の抗原部位、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子、並びに細胞骨格因子を保存する。
【００２５】
本発明において、用語「細胞構成要素」には、細胞膜の内側の細胞成分、そして細胞膜の外側の細胞成分、例えば細胞表面抗原部位が含まれる。用語「細胞内構成要素」は細胞膜の内側の細胞成分を指し、これには、限定しないが、細胞内タンパク質、例えば赤血球の内側にあるヘモグロビン及びヘモグロビン変異体、細胞骨格因子、並びにＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。細胞骨格因子には、限定しないが、チューブリン及びスペクトリンが含まれる。
【００２６】
上記濃度の界面活性剤は、弱酸性のｐＨでポリペプチド及びタンパク質の凝集を引き起こす特性を有する一方で、細胞内抗原部位を変性させず、そして細胞膜を破壊しない。浸透及び抗体と抗原の反応を生じさせるためには、ｐＨを上げつつ抗体を導入するのが好ましい。細胞を細胞透過処理安定化試薬で処理した後、細胞構成要素は、細胞を固定剤で固定する前に、抗体を細胞内抗原と反応させるために塩含有緩衝媒体を添加するのを可能にする十分な期間安定であることが分かっている。これらの特性については、後述する実施例において詳細に例示する。
【００２７】
本発明の細胞透過処理安定化試薬中の界面活性剤によって生じる効果は、血液試料を調製するのに典型的に使用される界面活性剤によって生じる、細胞溶解を引き起こす効果とは実質的に異なると解されるべきである。これらの条件下では、赤血球の細胞膜は、ヘモグロビンの測定のために、又は白血球の測定のために、ヘモグロビンを放出するために破壊される。
【００２８】
追加の態様において、本発明は、フローサイトメトリー機器上での細胞構成要素の解析のために、本発明の試薬を用いて、細胞膜を透過処理して細胞の細胞構成要素を安定化する方法を提供する。
【００２９】
更に具体的には、当該方法は、細胞含有試料と本発明の細胞透過処理安定化試薬とを混合して試料混合物を形成し；そして、細胞膜を透過処理し、前記細胞膜内の細胞内タンパク質の凝集を引き起こし、そして細胞マーカーと結合するための細胞構成要素を保存するのに十分な期間前記試料混合物をインキュベートする、段階を含んで成る。当該方法は更に、細胞マーカーを前記試料混合物に添加し、そして、細胞マーカーを保存した細胞構成要素と結合させるための第二の期間当該試料混合物をインキュベートする段階、を含んで成る。任意に、当該方法は、固定剤を試料混合物に添加して細胞を固定させる段階を、細胞マーカーが細胞構成要素と結合した後に更に含んで成ることもある。試料混合物は、注目の細胞構成要素の解析のために、フローサイトメトリー機器に導入することができる。
【００３０】
本明細書で使用する「細胞マーカー」という用語は、限定しないが、細胞内タンパク質の抗原部位、細胞表面抗原部位、又は細胞骨格因子に特異的な抗体；ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に特異的な核酸色素及び核酸プローブ、例えばオリゴヌクレオチドプローブ、が含まれる。好ましくは、細胞マーカーは、蛍光色素で標識される。更に、細胞内構成要素に特異的な細胞マーカーは、細胞内マーカーとも称される。
【００３１】
試料と細胞透過処理安定化試薬とのインキュベーションは、室温で５秒から、好ましくは約５分間でなされうることが明らかとなっている。細胞マーカー添加後の第二のインキュベーションは、約２分から、好ましくは約１５分間でありうる。
【００３２】
本発明の細胞透過処理安定化試薬を用いて解析される細胞は、顕微鏡用スライド上の組織細胞、又は培養中の細胞系に由来するか、又は体液、特に血球、具体的には赤血球及び白血球中に存在する細胞、であってもよい。解析される細胞は、ヒト組織中、顕微鏡用スライド上、又は懸濁液中に存在することがある。
【００３３】
更に具体的には、本発明の細胞透過処理安定化試薬は、赤血球の細胞構成要素の解析のために、血液学の分野で使用することができる。更に具体的には、当該試薬は異なる以上な形態のヘモグロビンに関連する疾患、例えば、胎児ヘモグロビンの存在による妊娠女性における胎児の出血、又はグリコールヘモグロビンの存在による糖尿病、の研究及び診断に使用することができる。これは、赤血球の感染物質、例えばマラリアの検出にも場合によって使用することができる。
【００３４】
実施例２〜４は、実施例１の組成物Ｃによる、透過処理安定化試薬におけるｐＨ及び界面活性剤の効果を例示する。
【００３５】
図１は、実施例２に記載の、血清成分、可溶性細胞画分（サイトゾル）及び膜調製物の沈殿に対する実施例１の組成物ＣにおけるｐＨ及び界面活性剤の効果を示している。ウシ血清アルブミンを除き、各調製物において、タンパク質凝集に関して酸性ｐＨと界面活性剤との間の相乗作用が証明された。サイトゾル試料の当該相乗作用は、ヘモグロビンの存在のために非常に強力であり、そして透過処理試薬との反応で強力な凝集及び沈殿を伴う。膜画分のかかる相乗作用はやや強力なようであるが、この結果は、界面活性剤による膜の脂質部分の溶解によってマスキングされており、これによりカラム４のＯＤ６５０値が過小評価される。
【００３６】
図２Ａから図２Ｊは、細胞の形態保存及び抗体による赤血球の透過に対する、実施例１の組成物ＣにおけるｐＨ及び界面活性剤の存在の効果を示す。
【００３７】
ｐＨが７．０で、界面活性剤が不在のもと、赤血球は図２Ａの上方の集団として現れ、これは下方の集団における血小板及び残骸からよく分離されている。図２Ｂは、赤血球が抗チューブリン−フルオレセインＮ−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗体に対し透過性がないことを示している。
【００３８】
ｐＨが５．０で、界面活性剤が不在のもと（図２Ｃ及び２Ｄ）、形態及び透過性は前述の条件とほぼ同じである。他方、図２Ｅ及び２Ｆは、ｐＨ７．０で界面活性剤の存在下赤血球が破壊されることを示している。
【００３９】
図２Ｇ及び２Ｈは、実施例１の組成物と一緒に血液をインキュベーションした後、赤血球がよく保存されたことを示す。図２Ｈで示されている細胞のクラスターは、細胞と抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体との結合をはっきりと示しており、そして赤血球が抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体に対し透過処理されたことを例示している。図２Ｉ及び２Ｊは、実施例１の組成物Ｃで処理したが、ＦＩＴＣと接合したイソ型のコントロール抗体であって、既知の細胞構成要素のいずれについても非特異的なものとインキュベートした赤血球を示す。図２Ｊは、細胞と当該コントロール抗体との結合が非常にわずかであるか、又は全くないことを示しており、これにより、抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体反応の特異性が確認される。
【００４０】
図３Ａから図３Ｊは、白血球の保存及び透過性に対するｐＨと界面活性剤の効果を示す。赤血球及び顆粒球の分離後、抹消単核球を、ｐＨ７．０の界面活性剤を含まない透過処理試薬と混合した。図３Ａは、四角内にリンパ球群を示す。下方の集団は、血小板と残骸である。上記条件下で、リンパ球は、図３Ｂに示す通り、抗チューブリン抗体に対し透過性ではない。
【００４１】
図３Ｃ及び３Ｄは、ｐＨ５．０の界面活性剤を含まない透過処理試薬を用いて得られた結果を示し、これは図３Ａ及び３Ｂにおいて観察されたものと類似している。図３Ｅ及び３Ｆについては、透過処理試薬はｐＨ７．０で界面活性剤の存在下用いられる。リンパ球の破壊が観察された。
【００４２】
図３Ｇ及び３Ｈについては、界面活性剤を含みｐＨ５．０の実施例１の組成物Ｃを使用した。図３Ｈで示す細胞は、抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体によるリンパ球の透過をはっきりと例示している。図３Ｉ及び３Ｊは、非特異的なイソ型コントロール抗体を用いて得られた結果を示す。図３Ｊは、細胞とコントロール抗体との結合が極めて少ないか、又は全くないことを示しており、これにより抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体反応の特異性が確認される。
【００４３】
実施例５は、胎児ヘモグロビンの解析のための細胞透過処理安定化試薬を用いた方法を例示する。
【００４４】
図４から図４Ｆは、抗ＨｂＦ−ＦＩＴＣによる細胞内マーキング及び抗ｉフィコエリトリン（ＰＥ）による細胞外マーキングによる胎児赤血球の同定を示す。更に具体的には、個々の散乱図は以下の通りである：
図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ：カルシウム不在下でのマーキング。
図４Ｄ、４Ｅ及び４Ｆ：１ｍＭのカルシウムの存在下でのマーキング。
図４Ａ及び４Ｄ：血液構成要素の散乱図。血小板及び残骸は閾値を設けることで散乱図から除外した。
【００４５】
図４Ｂ及び４Ｅ：ＦＬ４におけるＣＤ４５−ＰＣ５による白血球の排除後に枠内に入れられた赤血球の集団。
【００４６】
図４Ｃ及び４Ｆは、Ｑｕａｄｒａｎｔ３（左下）に成体の赤血球（ＨｂＦ−、ｉ＋）を、Ｑｕａｄｒａｎｔ２（右上）に胎児赤血球（ＨｂＦ＋、ｉ＋）を、そしてＱｕａｄｒａｎｔ４（右下）にＦ細胞（ＨｂＦ＋、ｉ−）を示す。
【００４７】
実施例６は、本発明の細胞透過処理安定化試薬を用いた、フローサイトメトリー上での蛍光によるアルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の検出を例示する。
【００４８】
本発明の透過処理試薬は、細胞膜を透過処理し、細胞内タンパク質の沈殿を引き起こし、そして更に、光散乱及び蛍光を用いたフローサイトメトリー解析のための細胞マーカーに対する特異的結合のために細胞構成要素を保存すること、が可能である。
【００４９】
以下の実施例は本発明の例示であり、特許請求の範囲で定義するような本発明の範囲を限定するものと決して解されるべきではない。前述の開示に従い、種々の他の成分及び比率が採用されうることが理解されよう。
【実施例】
【００５０】
実施例１：透過処理試薬組成物
組成物Ａ
以下の透過処理安定化試薬組成物を調製した。
【表１】
2008530526.tif 000002
【００５１】
更に具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシンのストック溶液を最初に作った。１．０ｇのＮ−ラウロイルサルコシン（Ｆｌｕｋａ）を１．５ｍｌのエタノール（９６％）に予め溶解した。１８０μｌのピロリジン（Ａｌｄｒｉｃｈ）を９５ｍｌの脱イオン水に添加した。続いて、Ｎ−ラウロイルサルコシン／エタノール溶液をピロリジン溶液に添加し；ｐＨをピロリジン又はＨＣｌで５．６に調節し、そして容積を脱イオン水で１００ｍｌに調節してストック溶液を形成した。試薬の全容積を脱イオン水で１００ｍｌに調節した。透過処理安定化試薬は、６．２５ｍｌのストック溶液を脱イオン水で１００ｍｌに希釈し、そしてｐＨをピロリジン又はＨＣｌで５．３に調節することによって調製した。組成物Ａは０．１ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。
【００５２】
組成物Ｂ
以下の透過試薬組成物は、各化合物を脱イオン水に溶解することで調製した。
【表２】
2008530526.tif 000003
【００５３】
当該試薬組成物は、０．２５ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。Ｎ−ラウロイルサルコシンを上述のようにストック溶液として添加した。
【００５４】
組成物Ｃ
以下の透過試薬組成物は、各化合物を脱イオン水に溶解することで調製した。
【表３】
2008530526.tif 000004
【００５５】
当該試薬組成物は、０．５ｍＳ／ｃｍの導電率を有していた。Ｎ−ラウロイルサルコシンを上述のようにストック溶液として添加した。
【００５６】
実施例２：赤血球の異なる成分の沈殿に対する、ｐＨ、界面活性剤及びｐＨと界面活性剤の組み合わせの効果
０．７ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を抗凝固剤として用いて処理した大量の血液を使用することで血清を調製した。別の大量のＥＤＡＴ処理済みの血液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、９倍量の水で希釈して細胞可溶化物を取得した。細胞可溶化物を２００ｇの遠心に１５分間かけて、可溶性の細胞画分と膜画分とを分離した。ペレット含有膜画分を、可溶性細胞画分を体積当たり５％含むように大量の水と混合した。
【００５７】
血清、可溶性細胞画分、膜画分、並びにコントロールとしてのウシ血清アルブミンを、実施例１の組成物Ｃと、そして以下の修飾試薬との混合後にモニタリングした：
１．修飾試薬１：界面活性剤（トリスラウリル硫酸塩及びＮ−ラウリルサルコシン）無添加で、ｐＨ７．０の実施例１の組成物Ｃ。
２．修飾試薬２：界面活性剤（トリスラウリル硫酸塩及びＮ−ラウリルサルコシン）無添加で、ｐＨ５．０の実施例１の組成物Ｃ。
３．修飾試薬３：ｐＨ７．０の実施例１の組成物Ｃ。
４．透過処理試薬４：上述の（ｐＨ５．０の）実施例１の組成物Ｃ。
【００５８】
試料混合物は、２ｍｌの上述の特定の試薬を以下の４つの成分のうちの１つと混合することで生成した：
−０．０１ｍｌの血清（Ａ）、
−０．０１ｍｌの１５％重量／体積のウシアルブミン調製物（Ｂ）、
−０．１ｍｌの膜画分（Ｄ）。
【００５９】
タンパク質の沈殿を測定するために、試料混合物の１時間後に、試料混合物の光学密度を、前記画分の主要構成要素であるヘモグロビンが吸収しない６５０ｎｍの波長で測定した。
【００６０】
図１は、血清；１５％重量／体積のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の調製物；可溶性細胞画分（サイトゾル）；及び膜画分、における細胞成分の沈殿に対する前記試薬におけるｐＨ及び界面活性剤の効果を示す。上文で言及した細胞成分のそれぞれについての棒グラフは、左から右へ、修飾試薬１〜３及び透過処理試薬４を用いて得られた結果を示す。
【００６１】
図１は、上述の通り、低ｐＨで界面活性剤を含む透過処理試薬４のみがタンパク質の凝集及び沈殿をもたらしたことを示している。
【００６２】
実施例３：赤血球内への抗体の浸透に対する、ｐＨ、界面活性剤、及び酸性ｐＨと界面活性剤の組み合わせの効果
０．０１ｍｌの全血を１００μｌの生理食塩水と混合し、続いて２ｍｌの実施例２に記載の各透過処理試薬の変形版と混合した。５分間インキュベーションした後、５０μｌの各混合物を、０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン及び、ＦＩＴＣと接合した、アルファチューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．米国マイアミ）を含む５０μｌのＰＢＳ溶液に添加した。アルファチューブリンは、専ら細胞の内側で発現する分子である。１５分間のインキュベーション後、混合物は、０．５％ホルムアルデヒドを含む１ｍｌのＰＢＳと混合することで反応を停止させ、そして細胞を固定し、これにより解析用の試料混合物を形成させた。
【００６３】
試料混合物をＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．米国マイアミ）上で解析した。細胞の完全性は、前方散乱及び側方散乱によって解析した。細胞の透過性は、ＦＩＴＣ抗体の蛍光によって解析した。結果を図２Ａ〜２Ｊに示す。更に具体的には、個々の散乱図は以下の通りである：
図２Ａ及び２Ｂ：血液と修飾試薬１とのプレインキュベーション。
図２Ｃ及び２Ｄ：血液と修飾試薬２とのプレインキュベーション。
図２Ｅ及び２Ｆ：血液と修飾試薬３とのプレインキュベーション。
図２Ｇ及び２Ｈ：血液と透過処理試薬４とのプレインキュベーション。
【００６４】
図２Ｉ及び２Ｊ：透過処理試薬４とのプレインキュベーションであって、ＦＩＴＣと接合したイソ型コントロール抗体と反応させるもの。
【００６５】
ここで、ＦＳは前方光散乱であり；ＳＳは側方光散乱であり；ＦＬ１、ＦＬ２及びＦＬ４は、それぞれ５２５ｎｍ、５７５ｎｍ、及び６７５ｎｍで測定した蛍光シグナルである。
【００６６】
コントロール抗体は、ＦＩＴＣと接合したイソ型抗体であり、これは既知の細胞構成要素のいずれにも特異的ではない。
【００６７】
界面活性剤を含み、且つｐＨが低い透過処理試薬４のみが、赤血球の透過及び保存に効果を有していたことが観察された。
【００６８】
実施例４：白血球内への抗体の浸透に対する、ｐＨ、界面活性剤、及びｐＨと界面活性剤の組み合わせの効果
単核白血球は、ＥＤＴＡの存在下、フィコールを用い、A. Boyem (1968, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 Suppl. 97)の方法に従い抹消血から調製した。１０００万の細胞を１００μｌの生理食塩水と混合し、続いて２ｍｌの実施例２に記載の各透過処理試薬の変形版と混合した。細胞のインキュベーションと抗チューブリンＦＩＴＣ抗体による細胞内マーキングを実施例３に記載のように実施した。結果を図３Ａから３Ｊに示す。更に具体的には、個々の散乱図は以下の通りである：
図３Ａ、３Ｂ：細胞と修飾試薬１とのプレインキュベーション。
図３Ｃ、３Ｄ：細胞と修飾試薬２とのプレインキュベーション。
図３Ｅ、３Ｆ：細胞と修飾試薬３とのプレインキュベーション。
図３Ｇ、３Ｈ：細胞と透過処理試薬４とのプレインキュベーション。
図３Ｉ、３Ｊ：細胞と透過処理試薬４とのプレインキュベーション、ＦＩＴＣと接合したイソ型コントロール抗体との反応。
【００６９】
界面活性剤を含み、且つｐＨが低い透過処理試薬４のみが、白血球の透過及び保存に効果を有していたことが観察された。
【００７０】
実施例５：細胞の内側及び表面にある胎児抗原に基づく胎児赤血球の検出のための透過処理試薬の使用
９９％（ｖ／ｖ）の正常な血液及び１％（ｖ／ｖ）の臍帯血の混合物を胎児赤血球の検出に使用した。１００μｌの生理食塩水、続いて１ｍｌの組成物Ｃを５μｌの血液混合物に添加した。１０分間のインキュベーション後、５０μｌの試料混合物を、以下のものを含む２つのチューブに添加した：
−チューブＡには、０．２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンと以下の抗体混合物：
−ＦＩＴＣと接合した抗胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）モノクローナル抗体（フランス国特許第９８  ０９００６号）；
−フィコエリトリンと接合した抗胎児血液群ｉモノクローナル抗体（フランス国特許第９８  ０９００６号）；及び
−抗ＣＤ４５−ＰＣ５モノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．フランス国マルセーユ）、
を含む５０μｌのＰＢＳ溶液を含めた。
【００７１】
−チューブＢには、チューブＡと同内容のものを含め、更に１０μｌの１０ｍＭＣａＣｌ2を添加した。
【００７２】
チューブＡは、ＨｂＦとの反応のネガティブコントロールとしての役割を果たし、これは、当該反応がカルシウム（Ｃａ2+）イオンの存在に依存するためである。
【００７３】
前記混合物をＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．米国マイアミ）上で解析した。細胞の完全性は、前方散乱及び側方散乱によって解析した。ＣＤ４５を使用して、この解析から白血球を排除した。胎児赤血球は、抗体の蛍光によって検出した。結果を図４Ａ〜４Ｆに示す。図４Ａ〜４Ｃは、チューブＡから得られた結果を示し、図４Ｄ〜４ＥはチューブＢから得られた結果を示す。
【００７４】
図４Ｃ及び４Ｆにおいて、Ｑｕａｄｒａｎｔ３（左下）に成体の赤血球（ＨｂＦ−、ｉ＋）が配置され、Ｑｕａｄｒａｎｔ２（右上）に胎児赤血球（ＨｂＦ＋、ｉ＋）が配置され、そしてＱｕａｄｒａｎｔ４（右下）にＦ細胞（ＨｂＦ＋、ｉ−）が配置されていたことが観察された。
【００７５】
注目すべきは、カルシウムイオンの不在下では、図４ＣのＱｕａｄｒａｎｔ２には胎児赤血球が見られなかったことである。従って、赤血球は接合した抗体に対し透過性ではなく、そしてＨｂＦ抗原と抗ＨｂＦ抗体との反応がカルシウムイオンに依存する。一見、ＨｂＦ抗原はその天然の状態で保存され、これは、赤血球と本発明の透過処理試薬とのインキュベーション後の、ＨｂＦと抗体との間の相互作用のカルシウム依存性の保存によって確認された。
【００７６】
実施例６：赤血球におけるアルファチューブリン及びＨｂＡ１Ｃの検出
０．０１ｍｌの全血を１００μｌの生理食塩水、続いて２ｍｌの実施例１の組成物Ｂと混合した。５分間のインキュベーション後、５０μｌの混合物を、ＦＩＴＣと接合した、アルファチューブリンに対するモノクローナル抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．米国マイアミ）を含むか、あるいはＨｂＡ１Ｃに対する、ＦＩＴＣと接合したモノクローナル抗体（抗ＨｂＡ１ｃ−ＦＩＴＣ抗体）であって、米国特許第４，７２７，０３６号に記載のKnowles et alの方法に従い調製したものを含む５０μｌのＰＢＳ溶液に添加した。１５分間のインキュベーション後、混合物は、０．５％ホルムアルデヒドを含む１ｍｌのＰＢＳと混合することで反応を停止させ、そして細胞を固定し、これにより解析用の試料混合物を形成させた。
【００７７】
試料混合物をＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．米国マイアミ）上で解析した。細胞の完全性は、前方散乱及び側方散乱によって解析した。細胞の透過性は、ＦＩＴＣ抗体の蛍光によって解析した。結果を図５Ａ〜５Ｆに示す。更に具体的には、個々の散乱図は以下の通りである：
図５Ａ及び５Ｂ：抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体との反応。
図５Ｂ及び５Ｄ：抗ＨｂＡ１ｃ−ＦＩＴＣ抗体との反応。
図５Ｅ及び５Ｆ：ＦＩＴＣと接合したイソ型コントロール抗体との反応。
【００７８】
前記コントロール抗体は、ＦＩＴＣＴと接合したイソ型抗体であり、これは既知の細胞構成要素のいずれについても非特異的である。
【００７９】
図示したように、赤血球は抗チューブリン−ＦＩＴＣ抗体、及び抗ＨｂＡ１ｃ−ＦＩＴＣ抗体の両方に透過性があり、これにより、フローサイトメーターによる赤血球中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出が可能となった。
【００８０】
本発明を詳細に説明し、そして添付図面において絵を用いて本発明を示したが、これらは本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではなく、むしろそれらの好ましい態様の例示としてみなされるべきである。しかしながら、種々の修飾及び変更が本明細書に記載され、そして特許請求の範囲で定義された発明及びその均等物の精神及び範囲内で行われうることは自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は血液の異なる画分中でのタンパク質の沈殿に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す：左上、血清；右上、ウシ血清アルブミン；左下、可溶性細胞画分及び右下、膜画分。
【図２Ａ】図２Ａは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、赤血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、白血球の保存及び透過処理に対するｐＨ及び界面活性剤の使用の効果を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、胎児ヘモグロビン抗原（ＨｂＦ）及びｉの使用による血中のＦ細胞及び胎児細胞の検出結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、アルファチューブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）抗原の使用による、血中のアルファチューブリン及びＨｂＡ１ｃの検出結果を示す。
【図１】
2008530526.tif 000005
【図２Ａ】
2008530526.tif 000006
【図２Ｂ】
2008530526.tif 000007
【図２Ｃ】
2008530526.tif 000008
【図２Ｄ】
2008530526.tif 000009
【図２Ｅ】
2008530526.tif 000010
【図２Ｆ】
2008530526.tif 000011
【図２Ｇ】
2008530526.tif 000012
【図２Ｈ】
2008530526.tif 000013
【図２Ｉ】
2008530526.tif 000014
【図２Ｊ】
2008530526.tif 000015
【図３Ａ】
2008530526.tif 000016
【図３Ｂ】
2008530526.tif 000017
【図３Ｃ】
2008530526.tif 000018
【図３Ｄ】
2008530526.tif 000019
【図３Ｅ】
2008530526.tif 000020
【図３Ｆ】
2008530526.tif 000021
【図３Ｇ】
2008530526.tif 000022
【図３Ｈ】
2008530526.tif 000023
【図３Ｉ】
2008530526.tif 000024
【図３Ｊ】
2008530526.tif 000025
【図４Ａ】
2008530526.tif 000026
【図４Ｂ】
2008530526.tif 000027
【図４Ｃ】
2008530526.tif 000028
【図４Ｄ】
2008530526.tif 000029
【図４Ｅ】
2008530526.tif 000030
【図４Ｆ】
2008530526.tif 000031
【図５Ａ】
2008530526.tif 000032
【図５Ｂ】
2008530526.tif 000033
【図５Ｃ】
2008530526.tif 000034
【図５Ｄ】
2008530526.tif 000035
【図５Ｅ】
2008530526.tif 000036
【図５Ｆ】
2008530526.tif 000037
【国際調査報告】
2008530526.tif 000038