(57)【要約】本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞−表面に位置したポリペプチド、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する免疫化におけるそれらの使用、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの診断におけるそれらの使用、および抗−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ活性を持つ化合物の同定におけるそれらの使用に関する。さらなる態様において、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞表面に位置したポリペプチドを認識することができる抗体およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として用いるための、
−配列番号：２０のポリペプチドに結合することができるか、あるいは配列番号：１ないし１９よりなる群から、または配列番号：２１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体、または
−配列番号：１ないし１９のポリペプチドよりなる群から、または配列番号：２１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞；
を含む組成物。
【請求項２】
−配列番号：１６を含む、または配列番号：１６の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体；
を含むか、またはそれをさらに含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
−配列番号：１０を含む、または配列番号：１０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体；
を含むか、またはそれをさらに含む請求項１または２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
−配列番号：１３を含む、または配列番号：１３の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体；
を含むか、またはそれをさらに含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
−配列番号：２８を含む、または配列番号：２８の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体；
を含むか、またはそれをさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
−配列番号：２０を含む、または配列番号：２０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体；
を含むか、またはそれをさらに含む請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
配列番号：２６のポリペプチドに結合することができる抗体を含むか、またはそれをさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号：３３のポリペプチドに結合することができる抗体を含むか、またはそれをさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記変種は前記配列に対して少なくとも９６％、例えば、少なくとも９７％のような、少なくとも９８％、例えば、少なくとも９９％配列同一性のような、少なくとも９５％配列同一性を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原性断片が、前記配列の全長の７５％未満、例えば、５０％未満のような、２５％未満、例えば、２０％未満のような、１５％未満、例えば１０％未満のような、該配列の全長の９９％未満を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原性断片が前記配列の７０未満の連続アミノ酸残基、例えば、４０未満のような５０未満の、例えば、２０未満のような３０未満の連続残基を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原性断片が前記配列のうちの、７以上のような６以上の連続アミノ酸、例えば、９以上のような８以上の連続アミノ酸、例えば、１０以上の連続アミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が図１の組成物のいずれかのように、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドの２以上、好ましくは配列番号：１ないし４１のポリペプチドの２以上を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがヒスチジンタグのようなタグを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組換え細胞が、減弱化された、または低下した−ビルレンスのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞または減弱化された、または低下した−ビルレンスのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組換え細胞が生きている請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組換え細胞が死んでいる請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記医薬がワクチンである請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が担体蛋白質のような免疫原性担体を含み、ここに、該免疫原性担体は好ましくは前記ポリペプチドに結合している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物はアジュバントを含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、さらに、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体がポリクローナルである請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナルである請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体が抗体の結合断片である請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が１０−６Ｍ未満、例えば、５×１０−７Ｍ未満のような、１０−７Ｍ未満、例えば、５×１０−８Ｍ未満のような、１０−８Ｍ未満、例えば、５×１０−９Ｍ未満のような、１０−９Ｍ未満、例えば、５×１０−１０Ｍ未満のような、１０−１０Ｍ未満、例えば、５×１０−１１Ｍ未満のような、１０−１１Ｍ未満、例えば、５×１０−１２Ｍ未満のような、１０−１２Ｍ未満、例えば、５×１０−１３Ｍ未満のような、１０−１３Ｍ未満、例えば、５×１０−１４Ｍ未満のような、１０−１４Ｍ未満、例えば、５×１０−１５Ｍ未満のような、または１０−１５Ｍ未満のような、５×１０−６Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が医薬上許容される担体を含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が全身投与に適した請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が静脈内、筋肉内、または皮下投与に適した請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が経口投与に適した請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が鼻腔内投与に適した請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、好ましくは配列番号：１ないし４１よりなる群から選択されるポリペプチド、より好ましくは、配列番号：２０、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチドに結合することができる抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、さらに、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる請求項３２記載の抗体。
【請求項３４】
請求項２２ないし２６いずれかの特徴を含む請求項３２ないし３３いずれか記載の抗体。
【請求項３５】
ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換された、またはトランスフェクトされた組換え細胞であって、該ポリペプチドは：
―配列番号：１ないし１９よりなる群から、または配列番号：２１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１ないし１９よりなる群から、または配列番号：２１ないし４１よりなる群から選択される配列、より好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２８よりなる群から選択される配列、最も好ましくは配列番号：１６の配列、または
―該配列の抗原性断片または変種；
を含む、組換え細胞。
【請求項３６】
前記組換え宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である請求項３５記載の組換え細胞。
【請求項３７】
前記組換え細胞が減弱化された、または低下されたビルレンスの細胞である請求項３５または３６記載の組換え細胞。
【請求項３８】
細菌、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する動物またはヒトの免疫化用の医薬の調製のための、
―配列番号：１ないし１９よりなる群から、または配列番号：２１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチドまたは
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
を含む組成物の使用。
【請求項３９】
前記免疫化が保護的免疫応答を誘導する請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
前記医薬が非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内投与に適した医薬である請求項３８または３９記載の使用。
【請求項４１】
前記組成物が、
―配列番号：１６を含む、または配列番号：１６の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
を含むか、またはさらに含む請求項３８ないし４０いずれか記載の使用。
【請求項４２】
前記組成物が、
―配列番号：１０を含む、または配列番号：１０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
を含むか、またはさらに含む請求項３８ないし４１いずれか記載の使用。
【請求項４３】
前記組成物が、
―配列番号：１３を含む、または配列番号：１３の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
を含むか、またはさらに含む請求項３８ないし４２いずれか記載の使用。
【請求項４４】
前記組成物が、
―配列番号：２８を含む、または配列番号：２８の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
を含むか、またはさらに含む請求項３８ないし４３いずれか記載の使用。
【請求項４５】
前記組成物が、
―配列番号：２０を含む、または配列番号：２０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞：
をさらに含む請求項３８ないし４４いずれか記載の使用。
【請求項４６】
動物またはヒトにおけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の治療または予防用の医薬の製造のための、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは請求項３２ないし３４いずれか記載の抗体の使用。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが配列番号：１ないし４１よりなる群から選択され、好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択され、最も好ましくは該ポリペプチドは配列番号：１６である請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
ａ．−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１ないし４１よりなる群から選択される配列、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択される配列、最も好ましくは配列番号：１６の配列、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
―該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
―該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
―該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞；
を提供する工程
ｂ．該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウイルスまたは組換え細胞を含む組成物を非―ヒト動物に導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起させる工程、そして
ｄ．該抗体を単離し、所望により、それを精製する工程；
を含む、該動物において配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体を惹起させる方法。
【請求項４９】
請求項４８記載の工程、および無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる抗体を選択するさらなる工程を行うことを含む、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる抗体を作製する方法。
【請求項５０】
前記動物がヒト抗体を生産することができるトランスジェニック動物である請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５１】
ａ．配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、好ましくは、配列番号：１ないし４１よりなる群から選択されるポリペプチド、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチドに特異的に結合することができるインジケーター部位と試料とを接触させる工程、そして
ｂ．該インジケーター部位によってシグナルが発生されたか否かを判断し、それにより、該試料がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を含有するか否かを検出する工程；
を包含する、該試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を検出する方法。
【請求項５２】
前記インジケーター部位が、さらに、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記インジケーター部位が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜を通過しない請求項５１または５２いずれか記載の方法。
【請求項５４】
前記インジケーター部位が、請求項３２ないし３４いずれか記載の抗体のような抗体よりなる、またはそれを含む請求項５１ないし５３いずれか記載の方法。
【請求項５５】
マススペクトロメトリーによって試料を分析して、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドの１以上の存在および／または量を評価する工程を含む、該試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を検出する方法。
【請求項５６】
ａ．配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、好ましくは、配列番号：１ないし４１よりなる群から選択されるポリペプチド、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチド、またはその断片を提供する工程
ｂ．該ポリペプチドまたは断片を推定結合パートナーと接触させる工程、そして
ｃ．該推定結合パートナーが該ポリペプチドまたは断片に結合することができるか否かを判断する工程；
を含む配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、またはその断片の結合パートナーを同定する方法。
【請求項５７】
ａ．配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、好ましくは、配列番号：１ないし４１よりなる群から選択されるポリペプチド、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチドの低下したレベルを有する感作細胞を提供する工程、そして
ｂ．例えば、増殖アッセイによって、該細胞の推定抗菌化合物に対する感受性を測定する工程、
を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗菌活性を持つ化合物を同定する方法。
【請求項５８】
ａ．配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、好ましくは配列番号：１ないし４１よりなる群から選択されるポリペプチド、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチドのレベルが異なる２つの細胞を提供する工程、
ｂ．例えば、増殖アッセイによって、該細胞の推定阻害剤に対する感受性を測定する工程、そして
ｃ．該２つの細胞が該推定阻害剤の存在によって異なって影響されるか否かを判断する工程、
を含む、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドの阻害剤を同定する方法。
【請求項５９】
前記推定阻害剤はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜を通過しない請求項５８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願に引用された全ての特許文献および非特許文献は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。この特許出願は、２００５年２月１８日に出願された米国仮出願第６０／６５３，９３２号（この全体が、参考として本明細書に援用される）からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞−表面に位置したポリペプチド、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する免疫化における、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの診断における、および抗−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ活性を持つ化合物の同定におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染の発生
ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＰａｓｔｅｕｒは、最初は肺炎球菌として記載されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを同定した最初の者であった（非特許文献１）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはグラム−陽性被包性球菌である。多糖被膜の組成の差に基づき、約９０の血清型が同定されている。この被膜は必須のビルレンス因子である。幼児における肺炎球菌病の大部分が、領域によって変わり得る少数のこれらの血清型に関連付けられている。現在のデータは、１１のほとんどの共通の血清型が全ての領域における感染病の少なくとも７５％を引き起こすことを示唆する。
【０００４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはヒト病原体である。肺炎球菌のための貯蔵庫は、恐らくは、無徴候ヒトキャリアーの鼻咽頭である。動物または昆虫媒介体はない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは幼児において細菌血症、肺炎、髄膜炎および中耳炎の最も普通の原因である。肺炎球菌病は幼児において非常に深刻な病気である。合衆国においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは５歳以下の子供において、毎年、２００件の死亡、髄膜炎の７００の症例、細菌血症の１７，０００症例、中耳炎の（耳感染）４９０万の症例を引き起こすと見積もられている。欧州および合衆国においては、肺炎球菌肺炎は、毎年１０００００人の成人当たりほぼ１００人に影響すると見積もられている、最も普通の地域感染型の細菌肺炎である。発熱性細菌血症および髄膜炎に対する対応する数字は、各々、１００，０００人当たり１５ないし１９人、および１００，０００人当たり１ないし２人である。これらの発現の１以上に対する危険性は幼児および老齢の人々においてかなり高い。
【０００５】
髄膜炎は肺炎球菌病の最も重症なタイプである。肺炎球菌髄膜炎を持つ５歳未満の子供のうち、約５％がその感染で死亡し、他の者は聴覚喪失のような長期の問題を有し得る。肺炎球菌肺炎または血流感染を持つ多くの子供は入院するのに十分なくらい病気であり；血流感染または血流感染を伴う肺炎を持つ子供の約１％はその病気で死亡するであろう。耳感染を持つほとんど全ての子供は回復するが、再発感染を持つ子供は聴覚喪失を被り得る。
【０００６】
深刻な危険性があるのは、また、免疫抑制化学療法を受けている患者、（ＨＩＶ感染を含めた）先天性および後天性免疫不全を持つ者、および慢性腎臓病を持つヒトである。表１：合衆国で１年当たりに起こる、子供および老人での、主な病気の症状および入院患者の数ならびに死亡症例率：
【０００７】
【表１】
2008530037.tif 000002
非特許文献２
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の徴候
肺炎球菌肺炎は、成人の間において肺炎球菌病の最も普通の臨床的提示である。肺炎球菌肺炎の潜伏期間は短く、約１ないし３日である。徴候は、一般に、発熱および悪寒または硬直の突然の開始を含む。典型的には、単一の硬直があり、反復する悪寒戦慄は通常おこらない。他の普通の徴候は胸膜性の胸の痛み、粘液膿を生じる咳、さび色痰、呼吸困難（息の短さ）、頻呼吸（迅速な呼吸）、低酸素症（貧弱な酸素付加）、頻脈（迅速な心拍）、倦怠感および虚弱を含む。
【０００８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の治療および予防
ペニシリンに対する出現抵抗性および他の普通に用いられる抗生物質が、肺炎球菌病と戦う新規な戦略の開発の重要性を過小評価する。合衆国のいくつかの領域においては、侵入性肺炎球菌単離体の４０％まではペニシリンに対して抵抗性である。治療は通常、抗生物質感受性テストの結果が利用できるまでは、広スペクトルのセファロスポリンおよびしばしばバンコマイシンを含む。
【０００９】
市場で入手できるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する２つのワクチンがある：
１．Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ）、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆの多糖を含有する７−価肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
２．Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２３の精製された被膜多糖抗原（血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ）を含有する２３−価多糖ワクチン。
【００１０】
しかしながら、改良されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのワクチンの開発に対する大きな医学的要望が依然として存在する。理由は：
〇これらのワクチンのみがある血清型をカバーし、例えば、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）は合衆国については肺炎球菌単離体の８５％、欧州では６０ないし７０％、およびアジアでは約５５％の潜在的カバリッジを有する。
〇最高率の肺炎球菌保菌および病菌に罹った二歳未満の子供、および免疫寛容患者はこのワクチン接種に際してひどく損なわれた抗体応答を示す。
多糖ワクチンはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる急性中耳炎に効果的でない。
〇多糖ワクチンはＴ−細胞―依存性免疫応答を誘導しない。これは、記憶Ｂ細胞の不存在を意味し、保護の期間を制限する。
〇被膜多糖のいくつかは貧弱にしか免疫原性でない。これらはペニシリン耐性に関連するいくつかの血清型を含む。
【００１１】
現在、いくつかの肺炎球菌表面蛋白質が、それらの血清型−独立性のため、代替ワクチン候補として考えられる。しかしながら、現在まで、種−広肺炎球菌保護誘導すると考えられる蛋白質はない。これは、ほとんどの個々の蛋白質内での対立遺伝子変異の発生によって説明することができる。単一蛋白質に対して生起された抗体は対立遺伝子変異体を認識できない。肺炎に対する効率は、開発途上国における新しいワクチンの使用を決定するにおいて重要な因子である。
【００１２】
治療および予防の良好な方法に加え、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の診断のための新規な迅速かつ信頼性がある方法に対して要望が存在する。
【００１３】
前記目的は、標的、すなわち、免疫系および／または抗体についての標的、細胞傷害性阻害剤についての標的、診断におけるインジケーター部位についての標的として機能できる適当なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドの同定および使用を通じて達成することができる。
【非特許文献１】Ａｕｓｔｏｒｉａｎ  Ｒ．  Ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ：  ｎｏｔ  ｄｏｗｎ，  ｎｏｔ  ｏｕｔ．  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９９；１７９（Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ３３８−４１
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｃｈａｔ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｃｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｔｗｏｒｋ”，  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００１年１月-２月、Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面に位置するポリペプチドに関する。本出願の関連においては、「表面に位置した」ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜の外側に少なくとも部分的に位置した（すなわち、ポリペプチド鎖の部分、および／またはポリペプチド分子の集団の一部で）ポリペプチドと定義される。かくして、細胞の表面に位置したポリペプチドは、膜の外側の空間に十分にまたは部分的に露出されたポリペプチドである。表面に位置したポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載された高−ｐＨ表面−蛋白質抽出またはムタノリシン消化によって得られた画分中で確認することができる全てのポリペプチドまたはポリペプチド断片を含む。
【００１５】
表面に位置したポリペプチドは、細菌感染の抗菌療法および／または診断のための魅力的な標的である。というのは、細胞外空間へのそのようなポリペプチドの露出はこれらのポリペプチドと相互作用する化合物（例えば、細菌感染を予防し、治療し、または診断するのに用いられる化合物）は、しばしば、効果的となるために、膜に入り、またはそれを通過する必要はないからである。
【００１６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドの細胞−表面局所化の判断は、現在、通常のソーティングシグナルまたはモチーフはこの局所化について知られていないので、実験的にのみ行うことができ、バイオインフォーマティックスによっては行うことができない。ポリペプチドがペリプラズムに侵入するか否かをある程度の確実性でもって予測することは可能であるが、ポリペプチドの表面で−局所化について一般的なモチーフは同定されていない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する蛋白質ワクチン摂取についての候補の同定のための先行技術戦略は、主として、ゲノム配列決定およびイン・シリコ分析に基づくものであった。（ＷＯ  ０２／０７７０２１；Ｗｉｚｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：１５９３−１５９８）。これらの戦略は非常に成功したことがない。というのは、候補の小さなサブ集団のみがマウスモデルにおいて付与された保護を同定し、テストしたのに過ぎないからである。（Ｗｉｚｅ−ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：１５９３−１５９８）。
【００１７】
本発明者らは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細胞−表面画分において２８２の異なるポリペプチドを同定した。使用された方法は、比較的高レベルで発現されるポリペプチドを同定する。表面−露出されていること、および比較的高い量で存在することの組合せは、これらのポリペプチドを、抗体についての、かくして、受動的または能動的、免疫化／ワクチン接種用いるための標的としてかなり適切なものとする。
【００１８】
従って、第一の態様において、本発明は、医薬として用いるための：
−配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチドよりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリペプチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体を含む組成物に関する。
【００１９】
好ましい具体例において、該組成物は：
−配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３および配列番号：２８よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む、組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む。
【００２０】
なおより好ましい具体例において、該組成物は：
−配列番号：１６を含む、または配列番号：１６の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む、組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む。
【００２１】
配列番号：１６は、従前に同定されており、かつＥ．ｃｏｌｉおよびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより特徴付けされている酵素である。リポエート−蛋白質リガーゼＡのホモログを表す。（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６０９１；Ｏ‘Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２）。このファミリーの蛋白質は細胞表面では従前に同定されておらず、あるいは抗体療法のためのワクチン候補または適当な標的であることが判明している。
【００２２】
もう１つの好ましい具体例において、該組成物は、
配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体を含む。なおより好ましい具体例において、該ポリペプチドは配列番号：１６である。
【００２３】
さらなる主な態様において、本発明は、細菌、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓで、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する動物またはヒト免疫化用医薬の調製ための：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む組成物の使用に関する。好ましい配列は配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３および配列番号：２８である。最も好ましいのは配列番号：１６である。
【００２４】
さらなる主な態様において、本発明は、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体に関する。
【００２５】
さらに、本発明は主な態様において、動物またはヒトにおけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の治療または予防用の医薬の製造のための配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体に関することができる。配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８または配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体の使用が好ましい。
【００２６】
最も好ましいのは、動物またはヒトにおけるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の治療または予防用の医薬の製造のための配列番号：１６のポリペプチドに結合することができる抗体の使用である。
【００２７】
表面に露出されていること、および比較的多量に存在することの組合せは、本発明者らによって同定されたポリペプチドを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の診断用の標的としてかなり適当なものとし、高い感度での無傷細胞の検出を可能とする。かくして、さらなる主な態様において、本発明は、本明細書中に記載された細胞−表面に位置するポリペプチドを認識することができるインジケーター部位を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を検出する方法に関する。
【００２８】
加えて、ポリペプチドの表面−局所化はそれらを阻害剤のための標的として適切なものとする。そのような阻害剤は殺菌性または静菌性であるか、または宿主生物等Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとの相互作用を妨げることができる（ビルレンツ）。かくして、さらなる主な態様において、本発明は、本明細書中に記載された細胞−表面に位置するポリペプチドの阻害剤を同定する方法に関する。
【００２９】
（定義）
−ワクチンは、ヒトまたは動物において微生物に対して保護的免疫応答を誘導することができる組成物を示すのに用いられる。
−保護的免疫応答は生物において記憶を誘導し、その結果、感染剤、ここではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが一時応答よりはむしろ二次応答によって満足し、かくして、宿主生物に対するそのインパクトを低下させる免疫応答（液性／抗体および／細胞性）を示すのに用いる。
−ポリペプチド−特に断りのない限り、用語「ポリペプチド」は、本明細書中で用いる場合、ポリペプチドの変種または断片をいうこともできる。好ましいポリペプチドは抗原性ポリペプチドである。
−断片は、ポリペプチドの非−全長部分を示すのに用いられる。かくして、断片はそれ自体がポリペプチドでもある。
−変種−与えられた参照ポリペプチドの（変種）とは、該参照ポリペプチドに対してある程度の配列同一性を呈するが、該参照ポリペプチドと同一ではないポリペプチドをいう。
−抗原／抗原性の／抗原性／免疫原／免疫原性の／免疫原性とは、全て、免疫応答を誘導する能力をいう。
−免疫原性担体とは、免疫応答を直接的にまたは間接的に援助する、または強化する化合物をいう。
−発現ベクターとは、好ましくは、ポリヌクレオチド配列からのポリペプチドの生産で用いるべき組換え体、プラスミドまたはファージまたはウイルスをいう。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝子エレメントまたは複数エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳され、および（１）のエレメントに操作可能に連結された構造またはコーディング配列；および（３）適当な転写開始および終止配列の組立体を含む発現構築体を含む。
−ポリペプチドの結合パートナーとは、該ポリペプチドに結合することができる分子をいう。そのような結合はもう１つの分子を介する間接的なものとすることができるが、好ましくは直接的である。結合パートナーは、例えば、小さな疎水性分子のようないずれかのタイプの分子、あるいは例えば、蛋白質、炭水化物または核酸のような細胞または細胞外マクロ分子とすることができる。好ましいタイプの結合パートナーは抗体、リガンドまたは阻害剤を含む。
−複数−用語「複数」は１を超えて、好ましくは１０を超えてを示す。
−インジケーター部位−用語「インジケーター部位」は、与えられたポリペプチドおよび／または細胞に特異的に結合することができ、かつ検出可能なシグナルを生じることができる分子または分子の複合体をカバーする。好ましくは、インジケーター部位は抗体である、あるいは抗体分子を含む。かくして、好ましいインジケーター部位は検出可能な物質にカップリングした、またはそれと複合体化した抗体である。
−宿主−由来分子または宿主分子とは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させることができる宿主生物で通常は見出される分子をいう。宿主−由来分子は、好ましくは、宿主ポリペプチド、好ましくはヒトポリペプチドである。
−抗体−用語「抗体」は、本明細書中で用いる場合、抗体ならびにその機能的同等体をカバーすることを意図する。かくして、これはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化、ヒトまたはキメラ抗体、単一−鎖抗体、および、また、限定されるものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産される断片、抗−イディオタイプ抗体、抗体断片を含むハイブリッド、およびこれらのいずれかのエピトープ−結合断片のような抗体の結合断片を含む。該用語は、二特異的抗体およびモノクローナル抗体の混合物のような多価、多特異的なものも含む。
−解離定数Ｋｄは、マクロ分子の間、例えば、抗体およびその抗原の間の結合（または親和性または親和力）の強さを記載するための尺度である。より小さなＫｄであれば、より強い結合である。
−本明細書中に開示されたポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体との関連で用いる「単離された」とは、これらがそれらの天然の、典型的には細胞の環境の成分から同定され、および分離されおよび／または回収されたことをいう。天然環境の汚染成分は、典型的には、ポリペプチドについての診断または治療用途に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他の蛋白質性または非−蛋白質性溶質を含むことができる。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、好ましくは、単離されており、本発明のワクチンおよび他の組成物は、好ましくは、単離されたポリペプチドまたは単離されたポリヌクレオチドまたは単離された抗体を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（医薬として用いられる組成物）
第１の主な態様において、本発明は、医薬として用いるための：
−配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドよりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞、または
−該ポリペプチドに結合することができる抗体
を含む組成物に関する。
【００３１】
重要な具体例において、組成物は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む。
【００３２】
該組成物は、それを必要とする個体の能動的免疫化のためのワクチンとして用いることができる。これはセクション「本発明のワクチン組成物およびワクチン接種の方法」に記載されている。
【００３３】
１つの好ましい具体例において、組成物は、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含む配列を含む。
【００３４】
もう１つの重要な具体例において、組成物は、配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体を含む。該組成物は、例えば、それを必要とする個体の受動的免疫化で用いることができる。これはセクション「本発明の抗体および抗体を惹起させるための方法」に記載されている。
【００３５】
（本発明のワクチン組成物およびワクチン接種の方法）
ワクチン接種または能動的免疫化の目標は、抗原性または免疫原性組成物を用いて、感染性微生物に対する記憶応答を誘導することによって保護免疫性を提供することにある。かくして、ワクチンは、ヒトまたは動物において微生物に対する保護的免疫応答を誘導することができる組成物である。そのような免疫応答は細胞性応答および／または液性応答、例えば、特異的Ｔ細胞応答または抗体応答であり得る。
【００３６】
従って、重要な具体例において、組成物はワクチン組成物であり、すなわち、本発明は、ワクチンとしての：
−配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドよりなる群から選択される配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む組成物の使用に関する。
【００３７】
変種は、本明細書中においては、好ましくは、該配列に対して少なくとも９６％のような少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも約９８％のような少なくとも９７％、例えば、少なくとも９９％配列同一性を有する。
【００３８】
前記組成物の１つの好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００３９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００４９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１９、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２０、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００５９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：２９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００６９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：３９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００７９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：４９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００８９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：５９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【００９９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１００】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：６９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１０９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：７９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１１９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：８９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９０、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２５】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９６、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２６】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９７、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２７】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２８】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：９９、またはその抗原性断片または変種を含む
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１００、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１２９】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０１、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３０】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０２、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３１】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０３、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３２】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０４、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３３】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１０５、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３４】
前記組成物の別の好ましい具体例において、ポリペプチドは配列番号：１６８、またはその抗原性断片または変種を含む。
【０１３５】
医薬として用いるための配列番号：１６のポリペプチド、またはその抗原性断片または変種を含む組成物は、現在、最も好ましい具体例である。
【０１３６】
該組成物のいくつかの具体例において、ポリペプチドは配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列よりなる。他の具体例において、ポリペプチドは配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、または該配列の抗原性断片または変種、ならびにｈｉｓ−タグ、すなわち、ポリヒスチジンタグのようなタグを含む。
【０１３７】
もう１つの好ましい具体例において、本発明の組成物におけるポリペプチドは、トキシン、例えば、腸毒性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＳｔａｂｌｅまたはＬａｂｉｌｅトキシンと組み合わせるか、またはそれに融合させることができる。適当な熱安定性トキシンＩＩ（ＳＴｌｌ）はＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６４−２６８に記載されている。適当な融合蛋白質の例は配列番号：２９５および配列番号：２９６に与えられる。１つの具体例において、該組合せは本発明のポリペプチドおよび非共有結合的に連結されたトキシンを含み、ここに、該トキシンは単一のトキシンポリペプチド、またはトキシンの多数のコピーを含むマルチマー、例えば、ダイマー形態であってよい。もう１つの具体例において、本発明のポリペプチドおよびトキシンは、例えば、翻訳後結合、または単一の融合したオープンリーディングフレームから転写および翻訳によって、共有結合される。いずれの場合においても、２つの成分は直接的に、あるいは例えばペプチドリンカー、好ましくはプロテアーゼ−抵抗性および／または非免疫原性ペプチドリンカーであってよいスペーサーまたはリンカードメインを介して連結することができる。そのようなペプチドリンカーはいずれの長さであってもよく、例えば、それは長さが５および５０アミノ酸の間のような２および２００の間であってよい。トキシンの多数のコピーは本発明のポリペプチドに融合させてもよい。
【０１３８】
本発明のポリペプチド、例えば、配列番号：１６のポリペプチド、ならびに腸毒性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む組成物を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／または腸毒性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａでの感染の予防用のワクチンを製造することができる。
【０１３９】
さらなる具体例において、本発明の組成物は配列番号：１６のダイマーのような配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかのダイマーを含むことができる。ダイマーは、例えば、翻訳後結合によって形成してもよく、あるいは単一の融合されたオープンリーディングフレームから生じさせてもよい。いずれの場合にも、ダイマーの２つのモノマーユニットは直接的に、あるいは例えばペプチドリンカー、好ましくはプロテアーゼ−抵抗性および／または非−免疫原性ペプチドリンカーであってもよいスペーサーまたはリンカードメインを介して連結させてもよい。そのようなペプチドリンカーはいずれの長さであってもよく、例えば、それは長さが５および５０アミノ酸の間のような２および２００の間であってよい。
【０１４０】
該組成物は配列番号：１ないし２８２の群から選択される１つのポリペプチド、またはその抗原性断片または変種のみを含むことができる。しかしながら、他の具体例においては、該組成物は配列番号：１ないし２８２の群の１を超えるポリペプチド、および／または配列番号：１ないし２８２の群から選択されるポリペプチドの１を超える抗原性断片を含む。かくして、本発明による組成物は、５ないし１０、または例えば１０ないし２０の範囲のような１０を超える範囲の多数のポリペプチドおよび／または断片のような、２のような１を越える、例えば、４のような３を超える、例えば、６のような５を超える、例えば、８のような７を超える、例えば、１０のような９を超える、配列番号：１ないし２８２の群から選択される異なるポリペプチド、またはその抗原性断片または変種を含んでもよい。
【０１４１】
同様に、該組成物は本発明の１つのポリヌクレオチド、１つの発現ベクター、または１つの組換えウイルスもしくは組換え細胞のみを含んでもよい。しかしながら、他の具体例においては、組成物は本発明の１を超えるポリヌクレオチド、１つの発現ベクターまたは１つの組換えウイルスもしくは組換え細胞を含む。かくして、本発明による組成物は、例えば、１０ないし２０の範囲のような、２のような１を超える、例えば、４のような３を超える、例えば、６のような５を超える、例えば、８のような７を超える、例えば、１０のような９を超える、または１０を超えるような、本明細書中に記載された異なるポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組換えウイルスまたは組換え細胞を含んでもよい。
【０１４２】
さらに、いくつかの具体例において、本発明の組換え細胞は配列番号：１ないし２８２の群の１を超えるポリペプチド、および／または配列番号：１ないし２８２の群から選択されるポリペプチドの１を超える抗原性断片または変種を発現することができる。かくして、本発明による組成物は、５ないし１０の範囲、または例えば、１０ないし２０の範囲のような１０を超える範囲の多数のポリペプチドおよび／または抗原性断片または変種のような、２のような１を超える、例えば、４のような３を超える、例えば、６のような５を超える、例えば、８のような７を超える、例えば、１０のような９を超える、配列番号：１ないし２８２の群から選択される異なるポリペプチド、またはその抗原性断片または変種を含んでもよい。もう１つの具体例において、本発明で用いる組成物は、本明細書中で記載される多数の組換えウイルスまたは組換え細胞を含む。
【０１４３】
好ましくは、本発明の組成物は表１に掲げられたポリペプチド（またはその抗原性断片または変種）の組合せのうちの１つを含む。
【０１４４】
表１において、もう１つの配列番号によって指名される列と共に配列番号で指名される行の交差に位置する十字形（「ｘ」）の各々は、それらの２つの配列番号の２つのポリペプチド（またはその抗原性断片または変種）を含む組成物を示す。
【０１４５】
すなわち、その例として、まったく説明的目的で、かつ限定する意図はなく、配列番号：１（「１」）の列と共に配列番号：２（「２」）の行の交差における十字形（「ｘ」）は：
−配列番号：１のポリペプチド、またはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：２のポリペプチド、またはその抗原性断片または変種
を含む組成物を示す。
【０１４６】
かなり好ましい組成物は：
−配列番号：１６のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれか、またはその抗原性断片または変種、好ましくは、配列番号：１ないし４１のいずれか、またはその抗原性断片または変種、より好ましくは、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２８よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは、配列番号：２０のポリペプチド、またはその抗原性断片または変種
を含む組成物、
−配列番号：１０のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれか、またはその抗原性断片または変種、好ましくは配列番号：１ないし４１のいずれか、またはその抗原性断片または変種、より好ましくは、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２８よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは、配列番号：２０のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種
を含む組成物、
−配列番号：１３のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれか、またはその抗原性断片または変種、好ましくは配列番号：１ないし４１のいずれか、またはその抗原性断片または変種、より好ましくは、配列番号：２０および配列番号：２８よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは、配列番号：２０のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種
を含む組成物、
−配列番号：２８のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれか、またはその抗原性断片または変種、好ましくは、配列番号：１ないし４１のいずれか、またはその抗原性断片または変種、配列番号：２０のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種
を含む組成物；
を含む。
【０１４７】
少なくとも３つのポリペプチドを含む好ましい組成物は以下の：
配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：２０および配列番号：２８よりなる群から選択される３以上のポリペプチドを含む組成物、
−配列番号：１６のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：２０のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種、および
−配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかまたはその抗原性断片または変種、好ましくは配列番号：１ないし４１のいずれかまたはその抗原性断片または変種、より好ましくは配列番号：１０、配列番号：１３および配列番号：２８よりなる群から選択されるポリペプチド
を含む組成物；
を含む。
【０１４８】
本発明によるさらに好ましい組成物は配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：２０および配列番号：２８よりなる群から選択される４以上のポリペプチドを含む。
【０１４９】
なおさらなる好ましい具体例において、本発明の組成物は配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：１６、配列番号：２０および配列番号：２８の５つのポリペプチドを含む。
【０１５０】
２以上のポリペプチドを含む前記組成物のいくつかの具体例において、ポリペプチドは共有結合により連結していない。しかしながら、他の具体例においては、ポリペプチドは、翻訳後結合によって形成された、または単一の融合したオープンリーディングフレームから生じた融合ポリペプチドを形成することができる。いずれの場合においてなお、２以上のポリペプチドは直接的に、あるいは例えばペプチドリンカー、好ましくはプロテアーゼ−抵抗性および／または非−免疫原性ペプチドリンカーであってよいスペーサーまたはリンカードメインを介して連結していてもよい。そのようなペプチドリンカーはいずれの長さのものであってもよく、例えば、それは長さが５および５０アミノ酸の間のような２および２００の間であってもよい。
【０１５１】
ポリペプチドを含むワクチン
前記したように、好ましい具体例においては、本発明は、ワクチンとして用いられる、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチドを含む組成物に関する。好ましい断片および変種は、断片および変種に関する本明細書中でのセクションに記載されたものである。
【０１５２】
従って、この具体例においては、抗原性または免疫原性は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の表面に通常は位置するポリペプチドの直接的投与によって供される。１つの特別な具体例において、ポリペプチドは、ワクチン組成物が異なるＭＨＣクラスＩ分子のような異なるＭＨＣ分子と会合することができる多数のポリペプチドを含むように選択される。好ましくは、ワクチンとして用いられる組成物は最も普通に生じるＭＨＣクラスＩ分子に会合することができるポリペプチドおよび／または断片を含む。本発明の１つの特別な具体例において、組成物がＭＨＣクラスＩ分子に会合することができる１以上のポリペプチドおよび／または断片、およびＭＨＣクラスＩＩ分子に会合することができる１以上のポリペプチドおよび／または断片を含む。よって、ワクチン組成物は、ある具体例においては、特異的な細胞傷害性Ｔ−細胞応答および／または特異的なヘルパーＴ−細胞応答を惹起させることができる。ＭＨＣ分子への会合は、例えば、Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５４：１８５；または  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０９：２５によって記載されるように測定することができる。
【０１５３】
アジュバントおよび免疫原性担体
好ましくは、本発明のワクチンとして用いられる組成物、すなわち、ワクチン組成物はセクション「本発明で用いる組成物」にてここに記載された医薬上許容される担体を含む。
【０１５４】
該組成物はさらにアジュバントを含むことができる。アジュバントは、ワクチン組成物へのその混合がポリペプチドまたは他の抗原に対する免疫応答を増加させ、またはそうでなければそれを修飾する物質である。アジュバントは、例えば：ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソ−グルタミン（ノル−ＭＤＰともいわれるＣＧＰ１１６８７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥともいわれるＣＧＰ１９８３５Ａ）、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ−８０．ＲＴＭ．エマルジョン中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、脂質Ａを含めたリポ多糖および誘導体、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイントの不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのワックスＤ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、および属Ｂｒｕｃｅｌｌａのメンバーに見出される物質、リポソームまたは他の脂質エマルジョン、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ（米国特許第５８７６７および第５，５５４，３７２号参照）、脂質Ａ誘導体、コレラトキシン誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１のいずれかであり得る。本発明で用いるべき好ましいアジュバントはミョウバン、モンタニドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１を含む。モンタニドＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は、通常はエマルジョンとして投与されるフロイントの不完全アジュバントに似た鉱油−ベースのアジュバントである。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は、水性溶液として扱われる高度に精製された水溶性サポニンである。本発明の組成物で用いるべきもう１つの好ましいアジュバントはＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＩＭＳＡＶＡＣ−Ｌである。もう１つの好ましい具体例において、ポリペプチドまたは複数ポリペプチドはビロソームに含まれる。
【０１５５】
本発明に従って用いることができるアジュバントの望ましい機能性を以下の表にリストする。
【０１５６】
【表２】
2008530037.tif 000003
源：Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７  Ｆｅｂ；１５（３）：２４８−５６
本発明によるワクチン組成物は、１を越える異なるアジュバントを含んでもよい。また、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチド、または１以上のその抗原性断片、およびアジュバントはいずれかに適当な順番で別々に投与することができるとも考えられる。
【０１５７】
選択されたアジュバントは、例えば、ミョウバンで沈殿させた抗原と組み合わせて用いられる、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバント、または殺したＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ生物であってよい。アジュバントの一般的な議論はＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８６）の６１ないし６３頁において供される。しかしながら、Ｇｏｄｉｎｇは、注目する抗原が低分子量のものであるか、あるいは貧弱にしか免疫原性でない場合に、免疫原性担体へのカップリングが推奨されることを注記している（後記参照）。また、種々のサポニン抽出物およびサイトカインは、免疫原性組成物におけるアジュバントとして使用することも示唆されている。最近、アジュバントとしてよく知られたサイトカインである顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いることが提案されている（ＷＯ  ９７／２８８１６）。
【０１５８】
加えて、本発明のワクチン組成物は、それに対してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドまたはその断片が会合することができる足場構造、例えば、蛋白質または多糖のような免疫原性担体を含むことができる。かくして、ワクチン組成物に存在させるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチド、またはその抗原性断片または変種は、例えば、蛋白質のような免疫原性担体と会合することができる。ポリペプチドの担体蛋白質への結合または会合は共有結合または非共有結合であってよい。免疫原性担体蛋白質はアジュバントとは独立させて存在させることができる。担体蛋白質の機能は、例えば、特定の断片の分子量を増大させて、それらの活性または免疫原性を増加させ安定性を付与し、生物学的活性を増大させ、または血清中半減期を増大させることである。さらに、免疫原性担体蛋白質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドまたはその断片をＴ細胞へ転移するのを助けることができる。担体蛋白質は、限定されるものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、チログロブリンまたはオボアルブミンのような血清蛋白質、免疫グロブリンまたはインスリンのようなホルモンであり得る。破傷風トキソイドおよび／またはジフテリアトキソイドもまた本発明の１つの具体例において適当な担体である。別法としてまたは加えて、デキストラン、例えば、セファロースを加えることができる。なおもう１つの具体例において、例えば、該ポリペプチドまたはその断片をＴ細胞に提示することができる樹状細胞のような抗原−提示細胞を加えて、担体蛋白質と同一の効果を得ることができる。ワクチン組成物の調製方法は、例えば、米国特許第５，４７０，９５８号およびその中の引例に記載されている。
【０１５９】
さらなる具体例において、本発明のワクチン組成物は、本発明のポリペプチドに加えてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ炭水化物を含むことができる。１つの具体例において、加えられた炭水化物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１以上の血清型に由来するか、またはそれが特徴的な炭水化物である。好ましい具体例において、本発明のポリペプチドは、表４に掲げられた血清型のいずれかの１以上に由来する、またはそれが特徴的な多糖と組み合わせる。好ましい具体例において、ポリペプチドは、血清型４，６Ｂ，９Ｖ，１４，１８Ｃ，１９Ｆおよび２３Ｆに由来する、またはそれが特徴的な１以上、好ましくは、２、３、４、５、６または７の多糖と組み合わせる。もう１つの具体例において、ポリペプチドは、血清型１，２，３，４，５，６Ｂ，７Ｆ，８，９Ｎ，１０Ａ，１１Ａ，１２Ｆ，１４，１５Ｂ，１７Ｆ，１８Ｃ，１９Ａ，１９Ｆ，２０，２２Ｆ，２３Ｆおよび３３Ｆの多糖抗原の８以上、好ましくは１０以上、１５以上または２０以上と組み合わされる。これらの炭水化物は本発明のワクチン組成物へ遊離形態で加えることができ、あるいは別法として、それらはワクチン組成物へ用いるべき本発明のポリペプチドに融合させることができる。
【０１６０】
本発明のポリペプチドの有効量は、免疫モジュレーターの不存在下で検出可能な液性免疫応答を誘導できる量であろう。用いるべき免疫原の適当な量は、誘導することが望まれる免疫学的応答に依存する。さらに、必要な正確な有効量は、対象の種、年齢および一般的状態、治療すべき疾患の重症度、投与の態様などに応じて対象間で変化し得る。本発明のポリペプチドワクチンは、他のワクチンについて通常用いられるものよりも低い用量を含めた種々の用量で投与することができる。本発明のポリペプチドはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の表面で豊富であって、かくして、かなり低いレベルの応答であっても免疫性を供することができるのでこれは可能である。かくして、本発明のポリペプチドの用量は、免疫化で用いる場合、例えば、キログラム体重当たり８ないし２５マイクログラムの範囲、あるいはキログラム体重当たり０．１ないし５マイクログラム、または０．１ないし２マイクログラムのようなそれ未満のような、０．１ないし１００マイクログラムのようなキログラム体重当たり０．１ないし５００マイクログラム、例えば、０．１ないし２５マイクログラムのような０．１ないし５０マイクログラムであってよい。
【０１６１】
組換えウィルスまたは組換え細胞を含むＤＮＡワクチン組成物およびワクチン組成物
ＤＮＡまたはＲＮＡワクチンが、患者の細胞において、注目するポリペプチド、ここでは、配列番号：１ないし２８２のいずれかのポリペプチド、またはその抗原性断片または変種、好ましくは配列番号：１６のポリペプチドまたはその抗原性断片または変種をコードする配列に操作可能に連結された発現制御配列を含むポリヌクレオチド構築体を過剰発現させることによる、患者への、例えば、抗原性ポリペプチド決定基の導入に関する。そのような断片はメチオニン開始コドンを含有しなくてもよいので、そのようなコドンは所望により発現制御配列の一部として含める。ポリヌクレオチド構築体は非−複製および線状ポリヌクレオチド、環状発現ベクター、または自律的に複製するプラスミドまたはウィルス発現ベクターであってもよい。構築体は宿主ゲノムへ組み込まれてもよい。哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができるいずれの発現ベクターも、本発明に従って個体を免疫化する方法で用いることができる。発現ベクターを構築するための方法は当該分野でよく知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）。好ましいのは、本発明の配列番号：１ないし２８２から選択される多数のポリペプチド、および／または多数の抗原性断片を発現し、それにより、種々の予め選択された標的を用いる同時ワクチン接種を可能とする複数の遺伝子を含む組成物である。
【０１６２】
ワクチンは、減弱化または低下されたビルレンスのＥ．ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞のような、ウィルスまたは細胞のような生きているが有害でないベクターへ、注目する特異的抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことによって調製することもできる。有害でない組換えウィルスまたは組換え細胞を意図した受容体に注射する。そのような組換え細胞は死んでいても生きていてもよい。もし生きていれば、該組換え生物は、抗原性ポリペプチドを生産し、それを宿主の免疫系へ提示しつつ、宿主中で複製することができる。このタイプのワクチンは、非−複製タイプのワクチンよりも効果的であろうと考えられる。成功すべきそのようなワクチンでは、ベクター生物は生きていなければならず、天然に非−ビルレントなものであるか、または減弱化されたまたは低下した−ビルレンスの表現型を有しなければならない。
【０１６３】
そこで用いられる減弱化された細菌および適当な細菌株を用いるワクチン接種のための戦略は、例えば、Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３１：１−８；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：５７７−５８２；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９；ＷＯ９９／４９０２６；およびＷＯ０３／０２２３０７に記載されている。
【０１６４】
適用できるベクターのさらなる例は、例えば、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／２５６９８およびＷＯ９４／０３６２２に開示されたレトロウィルス、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２７，１９８８；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４、１９９３；およびＫｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２１５−２１９，１９９４によって開示されたアデノウィルス、米国特許第４，７６９，３３０号；米国特許第５，０１７，４８７号；およびＷＯ８９／０１９７３によって開示されたポックスウィルス、ＷＯ９０／１１０９２に開示された裸のＤＮＡ、ＷＯ  ９３／０３７０９に開示されたポリカチオン性分子に複合体化されたポリヌクレオチド分子、およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１，１９８７に開示されたリポソームに会合したポリヌクレオチドを含むベクターである。ある具体例においては、ＤＮＡは、Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６０９４，１９９２によって開示されたように殺したまたは不活化したアデノウィルスに連結されてもよい。他の適当な組成物は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９によって開示されたＤＮＡ−リガンド、およびＦｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８９によって開示された脂質−ＤＮＡ組成物を含む。加えて、細胞への裸のＤＮＡの取込の効率は、ＤＮＡを生分解性ラテックスビーズ上にコーティングすることによって増加させることができる。
【０１６５】
ワクチンベクターは、好ましくは、免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された適当なプロモーターを含む。標的細胞において高レベルの転写開始を指令することができるいずれのプロモーターも本発明で用いることができる。かくして、サイトメガロウィルス（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：９２５７−９２６１［１９９１］、およびその中の引用文献）、マウスメタロチオネイン  Ｉ（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎ  １：２７３−２８８［１９８２］）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５［１９８２］）、およびＳＶ４０初期（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０［１９８１］）プロモーターのような非−組織特異的プロモーターを用いることもできる。
【０１６６】
ワクチン接種の方法およびワクチン接種／免疫化のための使用
さらなる主な態様において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列を含み、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のうちのいずれかに１以上を含む組成物の、細菌感染に対する動物またはヒトの免疫化用の医薬の調製のための使用に関する。免疫化は、好ましくは、保護的免疫応答を誘導する。前記使用の１つの具体例において、該医薬は唯一度与えられる。
【０１６７】
好ましい具体例において、医薬はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する免疫化のためである。最も好ましくは、医薬はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化のためである。しかしながら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドでの免疫化は他の細菌種に対する交差−保護も与えることができる。これは、通常、他の種のポリペプチドの少なくとも一部に対する有意な相同性を必要とする。そのような相同性は、例えば、配列番号：１６と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（配列番号：２８３）  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）配列番号：２８４およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（配列番号：２８５）からのその変種との間に見出される。同様に、相同性は配列番号：２０と、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（配列番号：２８６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（配列番号：２８７）およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（配列番号：２８８）からのその変種との間に見出される。
【０１６８】
従って、医薬は、ある具体例においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（グループＡ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（グループＢ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの１以上に対する免疫化で用いられる。そのような医薬の調製で用いられるかなり好ましいポリペプチドは配列番号：１６および配列番号：２０である。
【０１６９】
１以上の細菌に対する免疫化のための別法戦略は、変種ポリペプチドを含む医薬で免疫化することである。従って、さらなる具体例において、医薬の調製で用いられるポリペプチドは配列番号：１ないし２８２のいずれかの変種、好ましくは配列番号：１６の変種および／または配列番号：２０の変種である。最も好ましくは、ポリペプチドは配列番号：２８３、配列番号：２８４、配列番号：２８５、配列番号：２８６、配列番号：２８７および配列番号：２８８、またはその断片またはその変種、例えば、配列番号：２８３、配列番号：２８４、配列番号：２８５、配列番号：２８６、配列番号：２８７または配列番号：２８８に対して９８％を超えるような９５％を超える配列同一性を有する変種よりなる群から選択される。
【０１７０】
従って、いくつかの具体例において：
−配列番号：２８３および／または配列番号：２８６、またはこれらの２つのいずれかの断片または変種を含む医薬を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／または他の細菌に対して免疫化し；
−配列番号：２８４および／または配列番号：２８７、またはこれらの２つのいずれかの断片または変種を含む医薬を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／または他の細菌に対して免疫化し、または
−配列番号：２８５および／または配列番号：２８８、またはこれらの２つのいずれかの断片または変種を含む医薬を用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび／または他の細菌に対して免疫化する。
【０１７１】
最も好ましい具体例において、組成物はここに以下のものを含み、さらに含む：
−配列番号：１６を含むまたは配列番号：１６の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞。
【０１７２】
もう１つの好ましい具体例において、該組成物はここに以下のものを含み、またはさらに含む：
−配列番号：１０を含む、または配列番号：１０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞。
【０１７３】
もう１つの好ましい具体例において、該組成物はここに以下のものを含み、またはさらに含む：
−配列番号：１３を含む、または配列番号：１３の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞。
【０１７４】
もう１つの好ましい具体例において、該組成物はここに以下のものを含み、またはさらに含む：
−配列番号：２８を含む、または配列番号：２８の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞。
【０１７５】
もう１つの好ましい具体例において、該組成物はさらに以下のものを含む：
−配列番号：２０を含む、または配列番号：２０の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞。
【０１７６】
同様に、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２の配列のいずれかを含む、または該配列のいずれかの断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含むまたは組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれかの１以上を投与し、それによりＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対して動物またはヒトを免疫化する工程を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対して動物またはヒトを免疫化する方法に関する。
【０１７７】
免疫化のための前記方法の１つの具体例において、配列番号：１ないし２８２の配列のいずれか、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列のいずれかの断片または変種を含む該ポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞；
は唯１回投与され、それにより、単一の投与を介してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対して該動物またはヒトを免疫化する。
【０１７８】
該動物はいずれの鳥類または哺乳動物、例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウシまたはブタであってよい。ヒトの特別な標的集団は４歳までの子供の集団、老齢の人々の集団、または開発途上国へのナイーブなまたは半−免疫旅行者の集団のような危険性がある集団からの個人であろう。
【０１７９】
本発明のポリペプチドは免疫原性であるので、かつそれらはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞で豊富であるので、保護的免疫応答は、若者、老齢の患者または免疫寛容患者のような、抗原刺激に応答する低下した能力を持つ患者であってさえ誘導することができる。さらに、同じ理由で、本発明のワクチンを用いて中耳炎を予防し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの鼻咽頭保菌を予防し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる敗血症を予防し、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる髄膜炎を予防することもできる。
【０１８０】
かくして、１つの具体例において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれか１以上の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する動物またはヒトの免疫化用の医薬の調製のための使用に関し、ここに、該ヒトは２歳未満、例えば、１歳未満のような４歳未満の子供および／または母性免疫性を有する（すなわち、循環において母性抗体を有する）子供である。
【０１８１】
さらなる具体例において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれか１以上の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染に対する動物またはヒトの免疫化用医薬の調製のための使用に関し、ここに、該ヒトは免疫寛容患者である。免疫寛容患者は、例えば、免疫抑制化学療法を受けている患者、または先天性または後天性免疫不全の患者であり得る。これらの患者において免疫化が効果的であるためには、患者は、依然として、ある程度、免疫応答を生じさせることができることが要求される。
【０１８２】
もう１つの具体例において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれか１以上の、中耳炎、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる中耳炎の予防用の医薬の調製のための使用に関する。
【０１８３】
なおもう１つの具体例において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれか１以上の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの鼻咽頭保菌の治療および／または予防用の医薬の調製のための使用に関する。
【０１８４】
なおさらなる具体例において、本発明は：
−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれか１以上の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ髄膜炎の予防用の医薬の調製のための使用に関する。
【０１８５】
ワクチンは、全ての投与された抗原の完全未満（例えば、５０％未満または９０％未満）の摂取をもたらす投与の態様を含めたいずれかの適当な投与の態様によって本明細書中に記載された用量で投与することができる。本発明のポリペプチドは、十分に免疫原性であるから、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の表面でのその豊富性のため、幾分最適下の応答でさえ免疫性を供することができるのでこれは可能である。かくして、本発明による組成物の投与の態様は、限定されるものではないが、静脈または皮下投与、経皮投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻内投与、経口投与、および粘膜投与の一般的ないずれかの形態のような全身投与を含む。
【０１８６】
効果的なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓワクチンの生産に関する重要な問題は、細菌の血清型とも言われる免疫学的に異なるタイプの発生である。これらのタイプはそれらの多糖プロフィールがかなり異なり、またはそれにも拘らず、いくつかの高度に可変な蛋白質もかなり異なる。そのような変動のため、当該分野で知られたワクチンは、しばしば、ある血清型に対してのみ働き、全ての血清型に対しては働かない。
【０１８７】
本発明のワクチンは、高度に可変でない豊富な表面に位置したポリペプチドに基づく。これらのワクチンは複数の血清型に対して効果的であろう。従って、１つの具体例において、本発明は：
−好ましくは配列番号１ないし４１よりなる群から選択させる、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される配列、最も好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞
のいずれかの１以上の、５以上の異なる、血清型、例えば、１５以上の異なる血清型のような８以上の異なる血清型、例えば、２４以上の異なる血清型のような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１を超える血清型に対する動物またはヒトの免疫化用の医薬の調製のための使用に関する。
【０１８８】
好ましくは、該１を超える血清型は６Ａ、７Ｃ、９Ａ、１０Ｂ、１３、１５Ｃ、１６Ｆ、１８Ｂ、２１、２３Ａ、２４Ｆ、２８Ｆ、３１、３４、３５Ｆ、３５Ｂ、３８の群から選択される血清型を含む。
【０１８９】
１つの好ましい具体例において、医薬は少なくとも血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ、好ましくは、さらに少なくとも１つのさらなる血清型に対する免疫化で用いられ、該さらなる血清型は、好ましくは、６Ａ、７Ｃ、９Ａ、１０Ｂ、１３、１５Ｃ、１６Ｆ、１８Ｂ、２１、２３Ａ、２４Ｆ、２８Ｆ、３１、３４、３５Ｆ、３５Ｂ、３８の群から選択される。
【０１９０】
もう１つの好ましい具体例において、医薬は少なくとも血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆおよび、好ましくは、６Ａ、７Ｃ、９Ａ、１０Ｂ、１３、１５Ｃ、１６Ｆ、１８Ｂ、２１、２３Ａ、２４Ｆ、２８Ｆ、３１、３４、３５Ｆ、３５Ｂ、３８の群から好ましくは選択される少なくとも１つのさらなる血清型に対する免疫化で用いる。
【０１９１】
さらなる好ましい具体例において、医薬は、表４に掲げられた血清型のいずれか、好ましくは、表４に掲げられた血清型から選択された少なくとも５以上の異なる血清型、例えば、１５以上の異なる血清型のような８以上の異なる血清型、例えば、表４に掲げられた血清型から選択された２４以上の異なる血清型で用いられる。
【０１９２】
本発明による免疫原性効果は、例えば、血清試料中の抗体のアッセイによって、例えば、ＲＩＡによって測定することができる。さらに、効果は、例えば、Ｔ−細胞依存性抗原性ポリペプチドに対する増大したＴ−細胞応答性を測定することによってイン・ビボで測定することができ、ここに、該増大した応答性は、そのような抗原性ポリペプチドに対する通常の免疫応答の増強に特徴的である。免疫刺激効果は、特に、ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの増強されたＴ細胞生産として測定することもできる。かくして、増強された免疫応答を誘導する能力を有するポリペプチドまたはその断片は、ここに引用して援用する、例えば、ＵＳ  ０７／７７９，４９９に記載されたように、Ｔ細胞による増強されたＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦ生産についてスクリーニングすることによって容易に同定できる。
【０１９３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するワクチン接種に関する多数の態様がＢｏｇａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：２２０９−２２２０で議論されている。このレビューは、そのようなワクチンのテストおよび評価のための方法を記載する他の書類への言及を含む。
【０１９４】
本明細書中に記載されたポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、例えば、ＩＳＣＯＭＳ、リポソームまたは赤血球ゴーストに取り込まれた裸のＤＮＡ（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８［１９９７］）としていずれかの標準的な方法によって、あるいはバイオリスティック導入、カルシウム沈殿、またはエレクトロポレーションによってイン・ビボまたはイン・ビトロにて標的細胞に導入することができる。別法として、動物またはヒトの細胞へ注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入するための手段としてウィルス−ベースのベクターを使用することができる。好ましいウィルスベクターは、複製−欠陥肝炎ウィルス（例えば、ＨＢＶおよびＨＣＶ）、レトロウィルス（例えば、ＷＯ８９／０７１３６；およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２３  （９）：５７０−５７８［１９９０］参照）、アデノウィルス（例えば、Ｍｏｒｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｕｐｐ．１７Ｅ［１９９３］参照）、アデノ−関連ウィルス（Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：２２１１−２２１５［１９９０］）、複製欠陥単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｅｐ．２２−２６，１９９２の会合のアブストラクト６６ページ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）、カナリアポックスウィルスに由来するもの、およびこれらのベクターのいずれかの修飾されたバージョンを含む。イン・ビトロでトランスフェクトされた細胞を培養し、所望であれば、患者への導入に先立ってクローン化することができる。
【０１９５】
直接的なイン・ビボ手法に加えて、エクス・ビボ手法を用いてもよく、そこでは、細胞を動物から取り出し、修飾し、同一またはもう１つの動物に入れる。エクス・ビボ関係で組織細胞への本発明による抗原性ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドの導入について前期した組成物のいずれかを利用できるのは明らかであろう。摂取のウィルス的、物理的および化学的方法についてのプロトコルは当該分野でよく知られている。かくして、本発明のポリペプチドの投与または患者へ直接的にそのようなポリペプチドを発現させることができるベクターに対する代替法として、患者からヘルパーＴ細胞を取り出し；同一の抗原性ポリペプチドまたはベクターを用いてそれらのＴ細胞をエクス・ビボ刺激し、刺激されたヘルパーＴ細胞を同一患者に導入することができる。
【０１９６】
（本発明の抗体および抗体を惹起させるための方法）
さらなる主な具体例において、医薬として用いられる組成物は、配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドよりなる群から選択される、好ましくは、配列番号：１ないし４１よりなる群から選択される、より好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、もっとも好ましくは配列番号：１６のポリペプチドに結合することができる抗体を含む。そのような医薬は、それを必要とする個体の受動的免疫化のような抗体療法で用いることができる。
【０１９７】
したがって、さらなる主な態様において、本発明は、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、および／またはその断片および／または変種に結合することができる、好ましくは特異的に結合することができる抗体に関する。「特異的に結合する」はこの関係では、絶対的な特性を意味することを意図しない。抗体は、いくつかの具体例においては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのポリペプチド、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのポリペプチドに対して９５％を超える、または９８％を超える配列同一性のような９０％を超える配列同一性をもつポリペプチドに対する高度な配列特異性でもって、他のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種からのポリペプチドに特異的に結合することもできる。
【０１９８】
好ましい具体例において、抗体は、配列番号：１のポリペプチド、例えば、配列番号：２のポリペプチドのような、配列番号：３のポリペプチド、例えば、配列番号：４のポリペプチドのような、配列番号：５のポリペプチド、例えば、配列番号：６のポリペプチドのような、配列番号：７のポリペプチド、例えば、配列番号：８のポリペプチドのような、配列番号：９のポリペプチド、例えば、配列番号：１０のポリペプチドのような、配列番号：１１のポリペプチド、例えば、配列番号：１２のポリペプチドのような、配列番号：１３のポリペプチド、例えば、配列番号：１４のポリペプチドのような、配列番号：１５のポリペプチド、例えば、配列番号：１６のポリペプチドのような、配列番号：１７のポリペプチド、例えば、配列番号：１８のポリペプチドのような、配列番号：１９のポリペプチド、例えば、配列番号：２０のポリペプチドのような、配列番号：２１のポリペプチド、例えば、配列番号：２２のポリペプチドのような、配列番号：２３のポリペプチド、例えば、配列番号：２４のポリペプチドのような、配列番号：２５のポリペプチド、例えば、配列番号：２６のポリペプチドのような、配列番号：２７のポリペプチド、例えば、配列番号：２８のポリペプチドのような、配列番号：２９のポリペプチド、例えば、配列番号：３０のポリペプチドのような、配列番号：３１のポリペプチド、例えば、配列番号：３２のポリペプチドのような、配列番号：３３のポリペプチド、例えば、配列番号：３４のポリペプチドのような、配列番号：３５のポリペプチド、例えば、配列番号：３６のポリペプチドのような、配列番号：３７のポリペプチド、例えば、配列番号：３８のポリペプチドのような、配列番号：３９のポリペプチド、例えば、配列番号：４０のポリペプチドのような、配列番号：４１のポリペプチド、例えば、配列番号：４２のポリペプチドのような、配列番号：４３のポリペプチド、例えば、配列番号：４４のポリペプチドのような、配列番号：４５のポリペプチド、例えば、配列番号：４６のポリペプチドのような、配列番号：４７のポリペプチド、例えば、配列番号：４８のポリペプチドのような、配列番号：４９のポリペプチド、例えば、配列番号：５０のポリペプチドのような、配列番号：５１のポリペプチド、例えば、配列番号：５２のポリペプチドのような、配列番号：５３のポリペプチド、例えば、配列番号：５４のポリペプチドのような、配列番号：５５のポリペプチド、例えば、配列番号：５６のポリペプチドのような、配列番号：５７のポリペプチド、例えば、配列番号：５８のポリペプチドのような、配列番号：５９のポリペプチド、例えば、配列番号：６０のポリペプチドのような、配列番号：６１のポリペプチド、例えば、配列番号：６２のポリペプチドのような、配列番号：６３のポリペプチド、例えば、配列番号：６４のポリペプチドのような、配列番号：６５のポリペプチド、例えば、配列番号：６６のポリペプチドのような、配列番号：６７のポリペプチド、例えば、配列番号：６８のポリペプチドのような、配列番号：６９のポリペプチド、例えば、配列番号：７０のポリペプチドのような、配列番号：７１のポリペプチド、例えば、配列番号：７２のポリペプチドのような、配列番号：７３のポリペプチド、例えば、配列番号：７４のポリペプチドのような、配列番号：７５のポリペプチド、例えば、配列番号：７６のポリペプチドのような、配列番号：７７のポリペプチド、例えば、配列番号：７８のポリペプチドのような、配列番号：７９のポリペプチド、例えば、配列番号：８０のポリペプチドのような、配列番号：８１のポリペプチド、例えば、配列番号：８２のポリペプチドのような、配列番号：８３ポリペプチド、例えば、配列番号：８４のポリペプチドのような、配列番号：８５のポリペプチド、例えば、配列番号：８６のポリペプチドのような、配列番号：８７のポリペプチド、例えば、配列番号：８８のポリペプチドのような、配列番号：８９のポリペプチド、例えば、配列番号：９０のポリペプチドのような、配列番号：９１のポリペプチド、例えば、配列番号：９２のポリペプチドのような、配列番号：９３のポリペプチド、例えば、配列番号：９４のポリペプチドのような、配列番号：９５のポリペプチド、例えば、配列番号：９６のポリペプチドのような、配列番号：９７のポリペプチド、例えば、配列番号：９８のポリペプチドのような、配列番号：９９のポリペプチド、例えば、配列番号：１００のポリペプチドのような、配列番号：１０１のポリペプチド、例えば、配列番号：１０２のポリペプチドのような、配列番号：１０３のポリペプチド、例えば、配列番号：１０４のポリペプチドのような、配列番号：１０５のポリペプチド、例えば、配列番号：１６８のポリペプチドのような、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに結合でき、好ましくは特異的に結合できる。
【０１９９】
好ましくは本発明の抗体は、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができ、すなわち、その構造的一体性を維持した生きたまたは死滅したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、好ましくは、膜の一体性を維持した細胞（すなわち、ここに、該膜は浸透されていない）に結合することができる。無傷細胞への抗体の結合は、例えば、Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５１６２−５１６５に記載されているような、またはＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．７１：３９３７−３９４６に記載されているようなフローサイトメトリーによって測定することができる。
【０２００】
好ましい抗体は、１０−６Ｍ未満のような５×１０−６Ｍ未満、例えば、１０−７Ｍ未満のような５×１０−７Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満のような５×１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満のような５×１０−９Ｍ未満、例えば、１０−１０Ｍ未満のような５×１０−１０Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満のような５×１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満のような５×１０−１２Ｍ未満、例えば、１０−１３Ｍ未満のような５×１０−１３Ｍ未満、例えば、１０−１４Ｍ未満のような５×１０−１４Ｍ未満、例えば、１０−１５Ｍ未満のような
５×１０−１５Ｍ未満のような解離定数またはＫｄでもって結合するものである。結合定数は、（例えば、ＯｒｏｓｚおよびＯｖａｄｉ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７０：１５５−１６２）に記載されているＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴分析のような当該分野でよく知られた方法を用いて測定することができる。
【０２０１】
哺乳動物、好ましくはヒト、より好ましくは免疫寛容患者の受動的免疫化のための抗体を用いることができる。抗体での治療は、肺炎または髄膜炎または肺炎球菌敗血症のような肺炎球菌病を含めたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を治癒し、または予防するためになすことができる。好ましい患者の群は４歳未満の年齢の子供、老齢の患者または免疫寛容患者を含む。
【０２０２】
本発明の抗体は以下の好ましいメカニズム群を含む：
１．（細菌の生存率に影響する）抗菌剤として働く機能−阻害抗体。そのような抗体は、患者の免疫状態に関わらず効果的なはずである。好ましくは、そのような抗体はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの成長をイン・ビトロにて、抗体を加えない対照の２５％未満、例えば、１０％未満、のような、５％未満のような５０％未満まで低下させることができる。
２．ファゴサイトーシス殺傷を増強させるように設計されたオプソニン化抗体。そのような抗体の有効性は患者の免疫状態に依存し得るが、それらは寛容患者においてされ、ファゴサイトーシス殺傷を増強するであろう可能性が非常に高い。
３．トキシンまたは殺菌剤、例えば、リシンまたは放射性同位体のような治療部位にコンジュゲートされた抗体。治療部位を抗体にコンジュゲートするための技術はよく知られている。例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２，１１９−１５８参照。これらの抗体は、患者の免疫状態に拘らず、やはり効果的なはずである。
【０２０３】
それにコンジュゲートした治療部位を持つまたは持たない抗体を、治療剤として用いることができ、これは単独で、または化学療法または他の治療剤と組み合わせて投与される。
【０２０４】
１つの具体例において、本発明の抗体はオプソニン性ならびに機能−阻害性である。もう１つの具体例において、本発明の抗体はオプソニン性であるが、機能−阻害性ではない。抗体の後者の群は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの生存率に対して必須ではない標的ポリペプチドに対して向けられた抗体で有り得る。
【０２０５】
さらなる主な態様において、本発明は：
ａ．−配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択され、好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８、および配列番号：３３よりなる群から選択される配列、最も好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含むポリペプチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞；
を供し、
ｂ．該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含む組成物を動物に導入し、
ｃ．該動物において抗体を生起させ、
ｄ．該抗体を単離し、所望により精製する；
工程を含む、非−ヒト動物において配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドに対して抗体を惹起させる方法に関する。
【０２０６】
好ましい具体例において、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる抗体は、前記工程、および無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合することができる抗体を選択するさらなる工程を行うことを含むことによって同定される。
【０２０７】
前記方法は、好ましくは、ヒト抗体を生産することができるトランスジェニック動物においてなされる。さらに好ましい具体例において、前記方法は非−治療性である。
【０２０８】
モノクローナル／ポリクローナル抗体
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体の混合物であってよい。好ましい具体例において、抗体はモノクローナル抗体またはその断片である。モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、各抗体分子が同様であって、かくして、同一エピトープを認識する抗体である。該抗体はいずれの種類の抗体であってもよいが、それは好ましくはＩｇＧまたはＩｇＡ抗体である。
【０２０９】
好ましい抗体、より好ましくはモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの表面−露出領域に特異的に結合することができる抗体である。従って、配列番号：１６に結合することができる抗体の好ましい具体例において、該抗体は配列番号：２８９ないし配列番号：２９４のいずれかの１以上のアミノ酸を含む配列番号：１６上のエピトープに結合する。なおより好ましくは、該抗体は、配列番号：２８９、配列番号：２９０、配列番号：２９１、配列番号：２９２、配列番号：２９３、および配列番号：２９４よりなる群から選択される配列の５以上のアミノ酸のような、３以上の、例えば、４以上のような２以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【０２１０】
モノクローナル抗体は、一般には、ハイブリドーマ細胞系によって生産される。モノクローナル抗体および抗体−合成ハイブリドーマ細胞を作製する方法は当業者によく知られている。抗体−生産ハイブリドーマは、例えば、抗体−生産Ｂリンパ球と不滅化細胞系との融合によって調製することができる。モノクローナル抗体は以下の工程によって生産することができる。動物は、全長ポリペプチドまたはその断片のような抗原で免疫化される。免疫化は、典型的には、抗原を、免疫学的に有効な量、すなわち、免疫応答を生じさせるのに十分な量にて、免疫学的にコンピテントな哺乳動物に投与することによって達成される。好ましくは、哺乳動物はウサギ、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。次いで、哺乳動物を、高親和性抗体分子を生じさせるのに哺乳動物に十分な期間ブースタースケジュールに維持する。抗体−生産細胞の懸濁液は所望の抗体を分泌する各免疫化哺乳動物から取り出す。高親和性抗体を生じさせるのに十分な時間の後、動物（例えば、マウス）を犠牲にし、抗体−生産リンパ球をリンパ節、脾臓および末梢血液のうちの１以上から得る。脾臓細胞が好ましく、当業者によく知られた方法を用いて生理学的培地中の個々の細胞に機械的に分離することができる。抗体−生産細胞は、マウスミエローマ系の細胞への融合によって不滅化される。マウスリンパ球はマウス相同ミエローマとの高いパーセンテージの安定な融合を与えるが、ラット、ウサギおよびカエル体細胞も用いることができる。所望の抗体−生産動物の脾臓細胞は、一般には、ポリエチレングリコールのような融合剤の存在下でミエローマ細胞と融合させることによって不滅化される。融合パートナーとして適当な多数のミエローマ細胞系のいずれも、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手可能な、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系であり得る。
【０２１１】
モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術の分野における当業者によく知られた他の方法によって生じさせることもできる。「コンビナトーリアル抗体ディスプレイ」方法といわれる別法が、特定の特異性を有する抗体断片を同定し、単離するために開発されており、これを用いて、モノクローナル抗体を生産することができる。
【０２１２】
ポリクローナル抗体は特異的な与えられた抗原を認識する抗体分子の混合物であり、よって、ポリクローナル抗体は、例えば、ポリペプチド内の異なるエピトープを認識することができる。一般に、ポリクローナル抗体は、従前は抗原で免疫化されていた哺乳動物の血清から精製される。ポリクローナル抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８によって編集されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌに記載された方法のいずれかによって調製することができる。ポリクローナル抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギおよびヒツジからのいずれかの適当な哺乳動物種に由来することができる。
【０２１３】
特異性
本発明の抗体は、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかに対してモノ特異的であってよい。もう１つの具体例において、抗体は、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかに対して特異的である少なくとも１つの部分を有して二特異的または多特異的である。
【０２１４】
モノ特異的抗体は一価であってよく、すなわち、唯１つの結合ドメインを有する。一価抗体では、免疫グロブリン定常ドメインアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４として当該分野で知られた抗体分子の構造的部分を含む。好ましいのはＣＬ・として当該分野で知られているものである。さらに、定常領域が重鎖または軽鎖定常ドメインいずれかであり得る限り（各々、ＣＨまたはＣＬ）、種々の一価抗体組成物が本発明によって考えられる。例えば、軽鎖定常ドメインはもう１つの軽鎖定常ドメインに対して、または重鎖定常ドメインに対してジスルフィドブリッジすることができる。対照的に、重鎖定常ドメインは２つの独立したジスルフィドブリッジを形成でき、もう１つの重鎖および軽鎖へのブリッジングの可能性、または重鎖のポリマーを形成する可能性を可能とする。かくして、もう１つの具体例において、本発明では、定常鎖ドメインＣが少なくとも１つのジスルフィドブリッジを形成できるシステイン残基を有する一価ポリペプチドを含む組成物が考えられ、ここに、該組成物は該ジスルフィドブリッジによって共有結合連結された少なくとも２つの一価ポリペプチドを含む。
【０２１５】
本発明のもう１つの具体例において、抗体は少なくとも２つの結合ドメインを有する多価抗体である。結合ドメインは、同一のリガンドに対する、または異なるリガンドに対する特異性を有してもよい。
【０２１６】
二特異性を含めた多特異性
好ましい具体例において、本発明は、少なくとも２つの異なる存在に対して親和性を有し、およびそれに特異的に結合することができる多特異的抗体に関する。
【０２１７】
１つの具体例において、多特異的抗体は、そのうち少なくとも１つは抗体起源である少なくとも２つの異なる結合ドメインを運ぶ二特異的抗体である。本発明の二特異的分子は単一鎖二特異的分子でもあり得る。多特異的分子は単一−鎖分子とすることもでき、あるいは少なくとも２つの単一−鎖分子を含むことができる。二特異的抗体を含めた多特異的抗体は当業者に知られたいずれかの適当な方法によって生産することができる。ＷＯ  ９４／０９１３１；ＷＯ  ９４／１３８０４；ＷＯ  ９４／１３８０６または米国特許第５，２６０，２０３号；第５，４５５，０３０号；第４，８８１，１７５号；第５，１３２，４０５号；第５，０９１，５１３号；第５，４７６，７８６号；第５，０１３，６５３号；第５，２５８，４９８号；および第５，４８２，８５８号に記載されたもののような多数のアプローチが開発されている。本発明による二特異的または多特異的抗体を用い、本発明は、一特異的／一価抗体と比較していくつかの利点を供する。二特異的／多特異的抗体は、配列番号：１ないし２８２のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのいずれかを特異的に認識し、それに結合することができる第一の結合ドメインを有し、他方、他の結合ドメインは他の目的で用いることができる。１つの具体例において、少なくとも１つの他の結合ドメインを、第一の結合ドメインと同一のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチド上のもう１つのエピトープへの結合のように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドに結合するのに用いる。それにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する特異性は増大し、ならびに抗体の結合力を増加させることができる。もう１つの具体例において、少なくとも１つの他の結合ドメインはヒト細胞のような哺乳動物細胞に特異的に結合させるために用いることができる。少なくとも他の結合ドメインは白血球、マクロファージ、リンパ球、好塩基性細胞および／または好酸性細胞のような免疫活性細胞に結合して、治療方法における抗体の効率を増加させることができる。これは、少なくとも１つの他の結合ドメインがクラスター分化蛋白質（ＣＤ）、特にＣＤ６４および／またはＣＤ８９のいずれかから選択可能な蛋白質のような、ヒト蛋白質のような哺乳動物蛋白質に特異的に結合することができる。
【０２１８】
ヒト化抗体
ヒト療法について非−ヒト抗体を用いるのは常には望ましくない。というのは、非−ヒト「外来性」エピトープは治療すべき個体において免疫応答を誘導し得るからである。非−ヒト抗体に関連する問題を排除し、または最小化するために、キメラ抗体誘導体、すなわち、非−ヒトＦａｂ可変領域結合決定基をヒト定常領域（Ｆｃ）と組み合わせる「ヒト化」抗体分子を作製するのが望ましい。そのような抗体は前記したモノクローナルおよびポリクローナル抗体の同等な抗原特異性および親和性によって特徴付けられ、ヒトに投与した場合に免疫原性がより低く、従って、よりありそうには、治療すべき個体によって許容される。
【０２１９】
従って、１つの具体例において、本発明の抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、一般的には、ヒト抗体に由来する領域、およびげっ歯類抗体のような非−ヒト抗体に由来する領域を含むキメラ抗体である。（再形成またはＣＤＲ−グラフティングとも呼ばれる）ヒト化は、異種源（通常はげっ歯類）からのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低下させ、ヒト免疫グロブリンに対する相同性を増加させ、およびヒト免疫系のそれらの活性化を改良するためのよく確立された技術である。かくして、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および、おそらくは、いくつかのフレームワーク残基がげっ歯類抗体における類似の部位からの残基によって置き換えられたヒト抗体である。
【０２２０】
ヒト化抗体は抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的特性を保有することが重要である。この目標を達成するためには、好ましい方法に従い、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であって、当業者が精通している。選択された候補免疫グロブリン配列のおそらくは三次元立体配座構造を説明し、および提示するコンピュータープログラムが入手可能である。これらの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能におけるある種の残基のありそうな役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このように、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が最大化されるようにＦＲ残基を受容者から選択し、組み合わせ、配列を輸入することができるが、抗原結合に直接的に関する最も実質的に影響するのはＣＤＲ残基である。
【０２２１】
ＭＡｂをヒト化する１つの方法はキメラ抗体の生産に関しそこでは、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が第二の抗体、好ましくはヒト抗体に由来する定常ドメインに融合される。キメラ化手法を行うための方法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０  １２０  ６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ），ＥＰ−Ａ−０  １２５  ０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．），ＥＰ−Ａ−０  １７１  ４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ），ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびＥＰ−Ａ−０  １９４  ２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。
【０２２２】
本発明のヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部を非−ヒト抗体に由来するＣＤＲと置き換えることができるいずれかの方法によって作製することができる。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するのに用いることができる方法を記載し（英国特許出願  ＧＢ  ２１８８６３８Ａ）、その内容をここに引用して援用する。
【０２２３】
その例として、本発明のヒト化抗体は以下のプロセス：
（ａ）慣用的な技術によって、抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列と共にオペロンを含有する発現ベクターを構築し、ここに、ＣＤＲ、および抗体結合特異性を保有するのに必要な可変ドメインフレームワーク領域のそのような最小部分は非−ヒト免疫グロブリンに由来し、および抗体鎖の残りの部分はヒト免疫グロブリンに由来し；
（ｂ）慣用的な技術によって、相補的抗体をコードするＤＮＡ配列と共にオペロンを含有する発現ベクターを構築し、ここに、ＣＤＲ、およびドナー抗体結合特異性を保有するのに要求される可変ドメインフレームワーク領域のそのような最小部分は非−ヒト免疫グロブリンに由来し、および抗体鎖の残りの部分がヒト免疫グロブリンに由来し；
（ｃ）慣用的技術によって発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし；次いで、
（ｄ）慣用的技術によってトランスフェクトされた細胞を培養して、ヒト化抗体を生産する；
ことによって生産することができる。
【０２２４】
宿主細胞は本発明の２つのベクターでコ−トランスフェクトすることができ、第一のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有し、および第二のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有する。２つのベクターは異なる選択マーカーを含有するが、そうでなければ、抗体の重鎖および軽鎖コーディング配列とは別に、好ましくは同一であって、可能であれば、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を確実とする。別法として、単一ベクターを用いることができ、該ベクターは軽鎖および重鎖ポリペプチド双方をコードする配列を含む。軽鎖および重鎖についてのコーディング配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは双方を含むことができる。
【０２２５】
本発明の改変された抗体を発現するのに用いる宿主細胞はＥｓｈｅｌｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、または真核生物細胞いずれかであってよい。特に、ミエローマ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のようなこの目的のための良く規定されたタイプの哺乳動物細胞を用いることができる。
【０２２６】
本発明のベクターをそれによって構築することができる一般的な方法、本発明の宿主細胞を生産するのに必要なトランスフェクション方法およびそのような宿主細胞から本発明の抗体を生産するのに必要な培養方法は全て慣用的な技術である。同様に、一旦生産されれば、本発明のヒト化抗体は標準的な手法に従って精製することができる。
【０２２７】
ヒト抗体
より好ましい具体例において、本発明は抗体に関し、そこでは、結合ドメインがヒト抗体によって運ばれ、すなわち、抗体はヒト化抗体よりも大きな程度のヒトペプチド配列を有する。
【０２２８】
ヒト蛋白質に対して向けられたヒトｍＡｂ抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫系を運ぶトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。注目する抗原で免疫化されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾臓細胞を用いてハイブリドーマを生産し、これはヒト蛋白質からのエピトープに対する特異的親和性を持つヒトｍＡｂを分泌する（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９１／００９０６，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９２／０３９１８；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  ＰＮＡＳ  ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６参照）。そのようなトランスジェニックマウスは、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．，およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，Ｎ．Ｊ．から入手可能である。キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＩＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされると記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスへのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の結果、抗原挑戦に際してヒト抗体が生産される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）参照。ヒト抗体はファージ−ディスプレイライブラリーに由来することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０２２９】
高親和性抗体の単離のための好ましい方法は減算手法であり、標的に対する、特に、抗原０２９（配列番号：１６）および６０７（配列番号：２０）に対するヒト抗体または抗体断片は、それらの天然立体配座において、ファージ抗体ライブラリーから迅速に得ることができる（例えば、Ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：３９３８−３９４２（１９９５）；米国特許第６２６５１５０号；および米国特許出願第２００２１３２２２８号および第２００５０４３５２１号参照）。ファージ抗体ライブラリーは、例えば、注目する病気を持つ患者、ここに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染した患者から抗体生産細胞を用いて構築することができる。これらの細胞によって生産された抗体をコードする遺伝子を、クローン化された遺伝子のＣＤＲ３領域を再編成する縮重オリゴヌクレオチドを用いて半−合成ファージ抗体ライブラリーにクローン化することができる。その後、ライブラリーを標的抗原または標的−発現細胞、ここでは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと共にインキュベートし、標的に結合したファージ抗体を標準的な方法を用いることによって単離する。また、本発明は、前記手法によって同定された抗体、特に、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチドに結合することができる抗体、好ましくは、１０−７Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満のような１０−８Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満のような１０−１０Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する抗体および／またはこれらの標的のいずれかの表面−露出エピトープに結合する抗体に指向される。
【０２３０】
ヒトモノクローナル抗体を生産するための適当な方法は、ＷＯ  ０３／０１７９３５、ＷＯ  ０２／１００３４８、ＵＳ  ２００３  ０９１５６１およびＵＳ  ２００３  １９４４０３にさらに記載されている。
【０２３１】
抗体の結合断片
本発明の１つの具体例において、抗体は抗体の断片、好ましくは抗原結合断片または可変領域である。本発明で有用な抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。抗体のパパイン消化は、各々は単一抗原結合部位、および残りの「Ｆｃ」断片を持つ、いわゆる容易に結晶化するその能力のための、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生じる。ペプシン処理は、抗原と架橋することができる２つの抗原結合断片、および（ｐＦｃ’といわれる）残りの他の断片を有するＦ（ａｂ’）２断片を生じる。さらなる断片はダイアボディー、線状抗体、単一−鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異的抗体を含むことができる。
【０２３２】
抗体断片Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖは、抗体断片が単一の抗原−結合部位を運ぶに過ぎない点で全抗体とは異なる。２つの結合部位を持つ組み換え断片は、例えば、ＦｖのＶＨのＣ−末端において（Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、およびｓｃＦｖのＶＬのＣ−末端において（ＰａｃｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９２）導入されたシステイン残基の化学的架橋によって、あるいはＦａｂ’のヒンジシステイン残基を介して（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）いくつかの方法で作製することができる。
【０２３３】
好ましい抗体断片はその抗原に選択的に結合する抗体の能力のいくつかまたは実質的に全てを保有する。いくつかの好ましい断片は以下のように定義される：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原−結合断片を含有する断片である。Ｆａｂ断片は、無傷軽鎖および１つの重鎖の部分を生じさせるための全抗体の酵素パパインでの消化によって生じさせることができる。
（２）Ｆａｂ’は抗体分子の断片であり、全抗体をペプシンで処理し、続いて、還元して、無傷軽鎖および重鎖の一部を生じさせることによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片は抗体分子により得られる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における少数の残基の付加によってＦａｂ断片とは異なる。
（３）Ｆ（ａｂ’）２は、全抗体を、引き続いての還元なくして酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体の断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片のダイマーである。
（４）Ｆｖは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、密な非共有会合ＶＨ−ＶＬダイマー）にて、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーよりなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原結合部位を規定するのはこの配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲは抗原結合特異性を抗体に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、それに結合する能力を有するが、全結合部位よりもより低い親和性においてである。
【０２３４】
本発明の１つの具体例において、抗体は、遺伝的に融合された単一鎖分子として、適当なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学作製分子と定義される単一−鎖抗体である。そのような単一−鎖抗体は、「単一−鎖「Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片とも言われる。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能とするＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【０２３５】
本発明による抗体断片は、当業者に知られたいずれかの適当な方法により生産することができる。活性な抗体断片を生産するためのいくつかの微生物発現系が既に開発されており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母のような種々の宿主におけるＦａｂの生産が記載されている。断片はＦａｂとして、またはＦｖとして生産することができるが、加えて、ＶＨおよびＶＬはフレキシブルなポリペプチドリンカーによっていずれかの順番で遺伝子的に連結できることが示されており、その組合せはｓｃＦｖとして知られている。
【０２３６】
（本発明で用いられる組成物）
医薬として用いられる組成物の好ましい具体例において、該組成物は、有効成分に加えて、医薬上許容される担体を含む。
【０２３７】
本明細書中で用いるように、組成物または担体と組み合わせて用いられる用語「医薬上許容される」は、当該物質が、嘔吐、眩暈、胃の不調等のような望ましくない生理学的効果を生じさせることなくヒトまたは動物へ投与できることを表す。
【０２３８】
そこに溶解されたまたは分散された有効成分を含有する組成物の調製は当該分野で良く理解されている。しばしば、そのような組成物は、液状溶液または懸濁液、水性または非−水性いずれかとして滅菌注射剤として調製されるが、使用に先立って液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製することができる。調製物は乳化することもできる。有効成分は、医薬上許容され、有効成分と適合する担体と、本明細書中に記載された方法に用いるのに適した量にて混合することができる。適当な担体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組合せである。加えて、所望ならば、組成物は少量の、有効成分の有効性を増強させる湿潤または乳化剤、ｐＨ−緩衝剤のような補助的物質を含有することができる。
【０２３９】
本発明の組成物は、その中に有効成分の医薬上許容される塩を含むことができる。医薬上許容される塩は、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とで形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基とで形成される）酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来することもできる。
【０２４０】
医薬上許容される担体は当該分野で良く知られている。適当な液体の担体の例は、有効成分および水以外に物質を含有しない、あるいは生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウムのような緩衝液、リン酸−緩衝化生理食塩水のような生理食塩水または双方を含有する滅菌水性溶液である。なおさらに、水性担体は１を超える緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含有することができる。液体組成物は、水に加えて、およびその排除に加えて、液体相を含有することもできる。そのようなさらなる液体相の例はグリセリン、綿実油のような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル、および水−油エマルジョンである。
【０２４１】
組成物は、さらに、バンコマイシン、β−ラクタム、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、マクロライド抗生物質（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、またはアジスロマイシン）およびフルオロキノロン抗生物質（シクロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、またはモキシフロキサシン）から選択される抗生物質のような抗生物質製剤を含めた、および／またはサイトカイン、インターフェロン、成長因子のような免疫刺激剤、例えば、ＧＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含めたキット−イン−パートとしても良い。該キット−イン−パートは同時、順次または別々の投与で使用しても良い。
【０２４２】
本発明は、さらに、本明細書中に記載された方法を実施するのに有用な医薬組成物に関する。かくして、本発明は、医薬上許容される担体および
−好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０および配列番号：２８の群から選択される、配列番号：１ないし２８２の配列のいずれか、最も好ましくは配列番号：１６を含む、または該配列のいずれかの断片または変種を含む単離されたポリペプチド
−該ポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド
−該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または
−該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウイルスまたは組換え細胞
を含む医薬組成物に関する。
【０２４３】
さらに、本発明は、本明細書中に記載された、本発明の抗体、好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチド、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチドに結合することができる抗体、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０２４４】
（本発明のポリペプチド）
本発明の断片
さらなる態様において、本発明は、配列番号：１ないし２８２のいずれか、好ましくは配列番号：１６に記載されたポリペプチドの断片、好ましくは抗原性断片に関する。抗原性は当該分野で知られた種々の方法によって予測することができる。そのような断片の長さは、ポリペプチドの２連続アミノ酸残基から、全長ポリペプチドから１つのアミノ酸残基を除いたものまで変化し得る。好ましくは、断片は、７０または５０未満の連続アミノ酸のような、例えば、３０未満の連続アミノ酸のような４０未満の連続アミノ酸、例えば、２０未満の連続アミノ酸のような２５未満の連続アミノ酸のような、長さが１００未満の連続アミノ酸である。かくして、例えば、断片は長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０連続アミノ酸であり得る。さらなる好ましい具体例において、断片は、対応する全長配列の７以上のような６以上、例えば、９以上のような８以上、例えば、１０以上の連続アミノ酸を含む。好ましい範囲は、長さが５および２５の間の連続アミノ酸のような、例えば、長さが５および２０の間の連続アミノ酸のような長さが５および５０の間の連続アミノ酸の断片を含む。もう１つの方法で表して、断片は、全長ポリペプチドと比較して、長さが１００％未満であるアミノ酸配列の一部よりなる。好ましくは、断片の長さが全長ポリペプチドの７５％未満、例えば、２５％未満のような５０％未満、例えば、１５％未満のような２０％未満、例えば、１０％未満のような９９％未満である。さらなる好ましい具体例において、断片は、全長ポリペプチドの長さの１００％未満であるが５％を超える、例えば、１００％未満であるが１０％を超える、１００％未満であるが、２０％を超えるような、例えば、１００％未満であるが２５％を超えるような、１００％未満であるが５０％を超えるような、全長ポリペプチドと比較して長さが１００％未満であるが、１％を超えるアミノ酸配列の一部よりなる。
【０２４５】
好ましくは、本発明の断片は、そこで組換えにより発現された場合、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞または他の細胞において表面−露出されている。表面−露出は、例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３９７３−３９４６に記載されたような、該断片に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて測定することができる。また、好ましいのは、無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に特異的に結合することができる抗体を誘導することができる断片である。これは、例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３９７３−３９４６に記載されているように、該断片を用いるモノクローナル抗体の作製、および個々の抗体の無傷細胞への結合の引き続いての特徴付けによって測定することができる。配列番号：１６の好ましい断片は配列番号：２８９ないし配列番号：２９４の配列の１以上を含む、またはそれよりなる断片を含み、より好ましい断片は配列番号：２８９および／または配列番号：２９０を含む、またはそれよりなる断片を含み、配列番号：２９１および／または配列番号：２９２を含むまたはそれよりなる断片、および配列番号：２９３および／または配列番号：２９４を含むまたはそれよりなる断片を含む。
【０２４６】
配列番号：１ないし２８２の全長ポリペプチド、ならびに本発明の断片は当該分野で知られた慣用的な技術によって組換えにより生産することができる。適当な宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＨＥＫ２９３細胞であり得る。別法として、昆虫細胞、細菌細胞または真菌細胞を用いることができる。前記リストの細胞型におけるポリヌクレオチド配列の不均一発現、および精製後に除去することができるヒスチジンタグのようなタグ配列を用いる生じたポリペプチドの引き続いての精製のための方法は当業者によく知られている。別法として、本発明の断片は合成により生産することができる。
【０２４７】
本発明の変種
さらなる主な態様において、本発明は、配列番号：１ないし２８２、好ましくは配列番号：１６に記載されたポリペプチドのいずれかの変種、または配列番号：１ないし２８２、好ましくは配列番号：１６に記載されたポリペプチドいずれかの変種または断片の、医薬として用いるための組成物における使用に関する。ここに用いる場合、「配列番号：Ｘに対して少なくとも９５％配列同一性を有するポリペプチド」のようなフレーズは相互交換的に用いられ、「配列番号：Ｘのポリペプチドおよびその変種、ここに、該変種は該配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する」のようなフレーズと同一の主題に向けられることを意図する。
【０２４８】
変種は、好ましくは、与えられたポリペプチドまたは断片に対して少なくとも７５％配列同一性、例えば、少なくとも８５％配列同一性のような少なくとも８０％配列同一性、例えば、少なくとも９２％配列同一性のような少なくとも９１％配列同一性のような少なくとも９０％配列同一性、例えば、少なくとも９４％配列同一性のような少なくとも９３％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性のような少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性のような少なくとも９７％配列同一性、例えば、９９％配列同一性を有する。配列同一性は、デフォルトギャップ重み付けを用い、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０におけるアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴまたはＦＡＳＴＡのいずれかで決定される。
【０２４９】
与えられたポリペプチドまたは断片の好ましい変種は、該変種および与えられた参照ポリペプチドまたは断片の間の全てのアミノ酸置換が保存的置換である変種である。保存的アミノ酸置換とは、同様な側鎖を有する残基の交換可能性を言う。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり、アミド−含有側鎖を有するアミノ酸のグループがアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；および硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０２５０】
ポリペプチドの、またはその断片の変種は、１以上のアミノ酸が欠失され、または挿入されたポリペプチドまたは断片の形態も含む。好ましくは、４未満のような５未満、例えば、２未満のような３未満、例えば、唯１つのアミノ酸が挿入され、または欠失されている。ポリペプチドの、またはその断片の「変種」は、アミノ酸配列の翻訳後修飾によって修飾されたこれらのポリペプチドまたは断片の形態も含む。
【０２５１】
（本発明の組み換え細胞）
さらなる主な態様において、本発明は、ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換されたまたはトランスフェクトされた組換え細胞の使用に関し、該ポリペプチドは配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される。好ましくは配列番号：１６の配列を含む、または該配列の抗原性断片または変種を含む。好ましくは、該組換え細胞はＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、より好ましくは、減弱化されたまたは低下した−ビルレンスのＥｓｈｅｒｉｃｈｉａまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞である。
【０２５２】
ここに用いるのに適した細菌株は、例えば、Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３１：１−８；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：５７７−５８２；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９；ＷＯ９９／４９０２６；およびＷＯ０３／０２２３０７、およびその中の引用文献に記載されている。適当なＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例はＣｖＤ９０８−Ｔ７ｐｏｌ（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｍａｃｈｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｓｍｉｄ  ４７：１０８−１１９）、ＡＴＣＣ  ３９１８３、ＡＴＣＣ  ５３６４７およびＡＴＣＣ  ５３６４８である。適当なＥ．ｃｏｌｉ株の例はＹＴ１０６およびＥ１３９２／７５−２Ａである。
【０２５３】
（本発明の方法および使用）
前記定義の組成物および他の産物を用いて、それを必要とする動物またはヒトにおいて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染、および／またはそのような感染に由来する病気を治療または予防することができる。
【０２５４】
ここに、治療および予防は、限定されるものではないが、ワクチン接種、予防、能動的免疫化、受動的免疫化、抗体の投与、治癒的処置、軽減処置を含めたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと戦うための全てのタイプの治療的処置および予防的処置および他の処置を含む。特に、本発明の抗体を用いる受動的免疫化は、免疫寛容個体のための適当な処置である。
【０２５５】
（本発明の診断方法）
表面に露出されていること、および細胞中に比較的高コピー数で存在することの組み合わせは、本発明者らによって同定されたポリペプチドを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出用の標的としてかなり適切なものとし、この生物の高感度での検出を可能とする。
【０２５６】
従って、さらなる主な態様において、本発明は：
ａ．試料を、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択される、好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチドに特異的に結合することができるインジケーター部位と接触させ、次いで、
ｂ．インジケーター部位によってシグナルが生じたか否かを判断し、それにより、該試料がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を含有するか否かを検出する；
工程を含む、試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を検出する方法に関する。好ましくは、該インジケーター部位は無傷Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞に結合でき、好ましくは特異的に結合できる。
【０２５７】
前記診断方法の好ましい具体例において、接触工程および判断工程の間に洗浄工程を行って、検出の特異性を改良する。
【０２５８】
試料は、例えば、糞、尿、組織、組織抽出物、流体試料、あるいは血液、血漿、血清、痰、または鼻または肺から採取された試料のような体液試料とすることができる。試料のもう１つの例は肉試料のような食品試料である。
【０２５９】
もう１つの態様において、本発明は、試料をマススペクトロメトリーによって分析して、
配列番号：１ないし２８２、特に、配列番号：１６および／または配列番号：２０のポリペプチドの１以上の存在および／または量を評価する工程を含む。試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分を検出する方法に関する。１つの具体例において、試料、例えば、血液試料を予備処理して、検出すべきポリペプチドを豊富化する。そのような予備処理は試料中に存在する蛋白質のサイズ−分画を含むことができる。
【０２６０】
前記方法は、例えば、個体においてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を診断するのに用いることができる。前記方法の好ましい具体例において、該インジケーター部位が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜を通って通過しない。該インジケーター部位の好ましいタイプは、本明細書中に定義された本発明の抗体のような抗体よりなり、またはそれを含む。
【０２６１】
当業者であれば、インジケーター部位を用いて、その量が試料中のリガンド、ここではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはその部分の量に関連する結合反応産物を形成することができる多数のよく知られた臨床的診断化学手法があることを理解するであろう。かくして、例示的アッセイ方法を本明細書中に記載するが、本発明はそれに制限されるものではない。
【０２６２】
また、本発明は、生物学的試料中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在および、好ましくは量をアッセイするための好ましくはキットの形態の診断系に関する。診断キットの調製方法は、例えば、米国特許第５、４７０、９５８号およびその中の引用文献に開示されている。
【０２６３】
診断系は、少なくとも１つのアッセイを行うのに十分な量にて、好ましくは別々にパッケージされた試薬としての本発明によるインジケーター部位および、より好ましくは、使用のための指令書を含む。パッケージされたとは、本発明のインジケーター部位を固定された限界内に保持することができるガラス、プラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカルボネート）、紙、ホイル等のような固体マトリックスまたは材料の使用を言う。かくして、例えば、パッケージは、考えられる標識されたインジケーター部位調製物のミリグラム量を含有するのに用いられるガラスバイアルであり、あるいはそれは、マイクログラム量の考えられるインジケーター部位を操作可能に固定した、すなわち、連結して、リガンドに結合できるようにされているマイクロタイタープレートであり得る。
【０２６４】
「使用用の指令書」は、典型的には、試薬濃度、または混合すべき試薬および試料の相対的量のような少なくとも１つのアッセイ方法パラメーター、試薬／試料の混合のための維持時間、温度、緩衝液条件等を記載する触知可能表現を含む。
【０２６５】
ほとんどの具体例において、本発明の診断方法および系はインジケーター部位の部分として、予め選択されたリガンド（配列番号：１ないし２８２の配列のいずれかおよび／またはその断片を含むポリペプチド）と複合体化されたインジケーター部位を含有する結合反応複合体の形成をシグナリングできる標識または表示手段を含む。そのような標識はそれ自体が臨床診断化学において良く知られている。
【０２６６】
標識手段は、有用な免疫蛍光トレーサーであるフルオロクローム（染料）を形成するようにそれらを変性することなく、化学的に抗体または抗原に結合する蛍光標識剤であり得る。適当な蛍光標識剤はフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスサミン、ローダミン８２００塩化スルホニル（ＲＢ  ２００  ＳＣ）のようなフルオロクロームである。適当な蛍光物質の他の例はウンベリフェロン、ジクロロトリアジミルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリン等を含む。免疫蛍光分析技術の記載は、ＤｅＬｕｃａ，”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ，Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｌｉｄ．，ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）に見出される。
【０２６７】
放射性元素は標識剤として有用であり得る。例示的な放射性標識剤は、ガンマ線発光を生じる放射性元素である。１２４ｌ、１２５ｌ、１２８ｌ、１３２ｌおよび５１Ｃｒのようなそれ自体がガンマ線を発する元素は、ガンマ線発光を生じる放射性元素を指示基の１つのクラスを表す。特に好ましいのは１２５ｌである。有用な標識手段のもう１つのグループは、それ自体が陽電子を発する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素、または３Ｈの１１１インジウムのようなベーターイミッターである。他の適当な放射性物質は１３１ｌおよび３５Ｓを含む。
【０２６８】
抗体を用いる検出は、他の具体例において、抗体を、酵素、補欠分子族、ルミネセント物質またはバイオルミネセント物質のようなもう１つの検出可能な物質にカップリングさせることによって容易とすることができる。適当な酵素の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；ルミネセント物質の例はルミノールを含み；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンを含む。
【０２６９】
好ましい具体例において、指示基はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはグルコースオキシダーゼのような酵素である。主な指示基がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合には、インジケーター−部位／リガンド複合体（免疫反応体）が形成されるという事実を可視化するのにさらなる試薬が必要とされる。ＨＲＰのためのそのようなさらなる試薬は過酸化水素、およびジアミノベンジジンのような酸化染料前駆体を含む。グルコースオキシダーゼで有用なさらなる試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）である。
【０２７０】
標識、すなわち、抗体のようなポリペプチドの標識の連結は当該分野で良く知られている。例えば、蛋白質は、培養基における成分として供される放射性同位体−含有アミノ酸の代謝取込によって標識することができる。例えば、Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）参照。活性化された官能基を介する蛋白質コンジュゲーションまたはカップリングの技術は特に適用可能である。例えば、Ａｕｒａｍｅａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８  Ｓｕｐｐｌ．７：７−２３（１９７８），Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：８８９−８９４および米国特許第４、４９３、７９５号参照。
【０２７１】
前記インジケーター部位を利用する種々の診断アッセイは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて試料テストするように設定することができる。例示的なアッセイはＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は：向流免疫−電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈澱、酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ、イムノスティック（ディップスティック）アッセイ、同時イムノアッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイオセンサーアッセイおよび低−光検出アッセイを含む（例えば、米国特許第４、３７６、１１０号および第４、４８６、５３０号参照）。適当なアッセイの例は、試料、例えば、血清試料が電気泳動によって分離され、注目するポリペプチド、例えば、配列番号：１６が引き続いてウエスタンブロッティングによって検出されるアッセイである。
【０２７２】
１つの具体例において、本発明の診断キットを「ＥＬＩＳＡ」様式で用いて、流体試料中の予め選択されたリガンドの量を検出することができる。「ＥＬＩＳＡ」とは、固相に結合した抗体または抗原、および酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを使用して、試料中に存在する抗原の量を検出し、定量する酵素−結合免疫吸着検定法をいう、本発明の方法に容易に適用される。かくして、いくつかの具体例において本発明のインジケーター部位を固体マトリックスに付着させて、対象診断系におけるパッケージを含む固体支持体を形成することができる。試薬は、典型的には、水性媒体からの吸着によって固体マトリックスに固定されるが、抗体のようなポリペプチドへの適応可能な固定の他の態様を用いることができ、これは当業者によく知られている。有用な固体マトリックスはやはり当該分野でよく知られている。そのような物質は水に不溶性であり、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）からの商標ＳＥＰＨＡＤＥＸ下で入手可能な架橋されたデキストラン；アガロース；Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＩＩのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な直径が約１ミクロンないし約５ミリメートルのポリスチレンビーズのビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド、シート、ストリップまたはパドルのようなニトロセルロース−またはナイロン−系のウェッブ；ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルから作製されたもののようなマイクロタイタープレートのチューブ、プレートまたはウェルを含む。
【０２７３】
さらなる診断方法は、本発明の一つの具体例の抗体組成物の多価性を利用して、リガンドを架橋し、それにより、多数のリガンドおよびポリペプチドの凝集を形成し、沈殿可能な凝集体が表示させることができる。この具体例は、免疫沈澱のよく知られた方法と匹敵する。この具体例は、試料を本発明の抗体を含む組成物と混合して、結合条件下で結合混合物を形成する工程、続いての、形成された結合複合体を単離するための分離工程を含む。典型的には、単離は、混合物から凝集体を除去するための遠心または濾過によって達成される。結合複合体の存在は、検出すべき予め選択されたリガンドの存在を示す。
【０２７４】
（本発明のポリペプチドの結合パートナーおよび阻害剤）
本発明が関するポリペプチドの表面−局所化は、それらを、阻害剤のような結合パートナーのための標的としてかなり適したものとする。病原性微生物の表面に位置したポリペプチドは、しばしば、宿主生物と相互作用する。かくして、表面に位置したポリペプチドのいずれかのタイプの結合パートナーは宿主−病原体相互作用に干渉することができる。かくして、結合パートナーは、しばしば、微生物の病原性（ビルレンス）に拮抗する。結合パートナーはそれが結合するポリペプチドの阻害剤でもあり得る。
【０２７５】
かくして、さらなる主な態様において、本発明は、配列番号：１ないし２８２に記載された表面に位置したポリペプチドの結合パートナーの同定方法に関する。そのような方法は生化学的であるか、または細胞−ベースであってよい。
【０２７６】
生化学方法
主な態様において、本発明は；
ａ．配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択され、好ましくは配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択される、最も好ましくは配列番号：１６のポリペプチド、あるいはその断片を供し、
ｂ．該ポリペプチドまたは断片を推定結合パートナーと接触させ、次いで、
ｃ．該推定結合パートナーが該ポリペプチドまたは断片に結合できるか否かを判断する；
工程を含む。配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチド、またはその断片の結合パートナーを同定する方法に関する。好ましい具体例において、該推定結合パートナーは宿主−由来分子である。
【０２７７】
該方法のさらなる好ましい具体例において、該ポリペプチドまたはその断片は、例えば、カランまたはマイクロタイタープレートのような固体支持体に固定して供され、接触工程の後に、推定結合パートナーが固体支持体に結合したか否かを判断する。ポリペプチドまたはその断片の固定化は固体支持体への直接的結合を介する。あるいは例えば特異的抗体を用いて間接的結合を介するものであってよい。好ましい具体例において、接触工程および判断工程の間に洗浄工程を行って、検出の特異性を改良する。さらなる好ましい具体例において、推定結合パートナーを検出可能な標識と複合体化する。推定パートナーは、接触が起こる前に標識してもよい。別法として、標識は接触工程後に行うこともできる。さらに、この方法のいくつかの具体例においては、ポリペプチドまたはその断片が結合パートナーに結合してしまった後、固定化を行ってもよい。好ましい具体例においては、該方法は、該方法が複数の推定結合パートナーについて反復されるスクリーニング方法である。結合を測定するのに適した方法は当該分野で良く知られており、それらのうちいずれかを本明細書中において、他の箇所で言及した。
【０２７８】
もう一つの態様において、配列番号：１ないし２８２のグループから選択される、好ましくは配列番号：１６のポリペプチドの宿主−由来結合パートナーは以下のように同定することができる：精製された宿主膜を電気泳動により分離し、膜にブロットし、注目するポリペプチドまたはその断片と共にインキュベートする。次いで、注目するポリペプチドにまたはその断片に特異的な抗体を用い、結合を検出することができる。ポリペプチドまたはその断片が結合した宿主結合パートナーを、引き続いて、マススペクトロメトリーによるブロットおよび引き続いての分析からの溶出によって、または当該分野で公知のいずれかの他の技術によって同定することができる。
【０２７９】
病原性生物の表面に位置したポリペプチドの結合パートナーがもし宿主−由来分子であるならば、表面に位置したポリペプチドおよび宿主の間のそのような相互作用は細菌のビルレンスで重要である。表面に位置したポリペプチドおよび宿主−由来結合パートナーの相互作用に干渉する化合物は、かくして、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の予防または治療に適しているであろう。従って、本発明のもう１つの方法は：
ａ．配列番号：１ないし２８２の好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択されるポリペプチドのいずれか、最も好ましくは配列番号：１６のいずれか、またはその断片を供し、
ｂ．（前記したように、またはいずれかの他の方法によって同定された）該ポリペプチドの宿主−由来結合パートナーを供し、
ｃ．該相互作用の推定阻害剤の不存在下において、該ポリペプチドを該宿主−由来結合パートナーと接触させ、
ｄ．該推定阻害剤の存在下において、該ポリペプチドを該宿主−由来結合パートナーと接触させ、次いで、
ｅ．工程ｄから得られる該宿主−由来結合パートナーに対する該ポリペプチドの結合の強さが、工程ｃから得られるものと比較して低下したか否かを判断する；
工程を含む、配列番号：１ないし２８２の表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのいずれかと宿主−由来結合パートナーとの相互作用の阻害剤を同定する方法に関する。
【０２８０】
いくつかの具体例において、工程ｃおよびｄは２つの異なる試料区画において行うことができる。他の具体例において、工程ｄは、工程ｃの混合物に推定阻害剤を加えることによって行うことができる。好ましい具体例において、該方法は複数の推定阻害剤について反復される。
【０２８１】
特に興味深いのは、表面に位置するポリペプチドの活性を阻害する結合パートナーである。そのような活性は酵素活性、輸送活性、または他の生化学的もしくは細胞活性のいずれかのタイプ、好ましくは酵素活性であろう。
【０２８２】
好ましい宿主−由来結合パートナーは宿主ポリペプチドおよび宿主脂質である。結合は、例えば、ＳｚｙｍａｎｓｋｉおよびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：３４６７−３４７４によって記載されているように行うことができる。前記した生化学的方法の好ましい具体例において、結合パートナーおよび表面に位置するポリペプチドまたはその断片の間の結合が、１０−６Ｍ未満、例えば、５×１０−７Ｍ未満のような、１０−７Ｍ未満、例えば、５×１０−８Ｍ未満のような、１０−８Ｍ未満、例えば、５×１０−９Ｍ未満のような１０−９Ｍ未満、例えば、５×１０−１０Ｍ未満のような、１０−１０Ｍ未満、例えば、５×１０−１１Ｍ未満のような、１０−１１Ｍ未満、例えば、５×１０−１２Ｍ未満のような、１０−１２Ｍ未満のような、５×１０−６Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有する。解離定数は、例えば、表面プラズモン共鳴分析によって測定することができる。
【０２８３】
細胞−ベースの方法
それについての構造遺伝子の欠失または破壊による、あるいは遺伝子発現をダウンレギュレートすることによる（後記参照）表面に位置したポリペプチドのレベルの低下は、細菌細胞に影響し得る。該細胞は細胞傷害性化合物に対してより感受性となり得る。特に、表面に位置したポリペプチドについては、それらのレベルの低下は、細胞に化合物が入るのを妨げるにおいて、膜または細胞壁のような細胞の外部部分の機能に影響し得る。かくして、表面に位置したポリペプチドのレベルの低下は、細胞を、種々の化合物に対してより「浸透性」とすることができる。
【０２８４】
かくして、本発明の態様は：
ａ．好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択される、最も好ましくは配列番号：１６の、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかの低下したレベルを有する感作細胞を供し、次いで、
ｂ．例えば、増殖アッセイによって、推定抗菌化合物に対する該細胞の感受性を測定する；
工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗菌活性を持つ化合物を同定する方法に関する。
【０２８５】
好ましくは、該方法は、該手法が複数の推定抗菌化合物について反復されるスクリーニング方法である。好ましい推定抗菌化合物は、野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜を通過しないものである。
【０２８６】
このアプローチの背後にある理念は、より低いレベルの表面に位置したポリペプチドを持つ細胞が、細胞傷害性化合物に対して増大した感度を呈し、アッセイについて野生型細胞を用いた場合に失われる低能力を持つ抗菌化合物の同定を可能とするということである。この方法によって同定された化合物は、しばしば、能力を改良するために修飾する必要があろう。これは、化学的修飾によってなすことができる。
【０２８７】
表面に位置したポリペプチドの活性の阻害は、細菌の生存率（すなわち、生存、成長および／または増殖）に影響し得る。特に興味深いのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの生存率に必須である表面に位置したポリペプチドの阻害である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子の必須性をテストするための方法は先行技術において、例えば、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５：２０５１−２０５８およびＴｈａｎａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３０：３１５２−３１−６２に記載されている。必須の表面に位置するポリペプチドの阻害剤は、細菌細胞に入って、その生存率に影響し得る必要はないであろう。かくして、一般的に、抗菌剤として効果的であるために、細胞内標的の阻害剤よりは必須の表面に位置する標的ポリペプチドの阻害剤の構造に対してより少ない要件が課される。
【０２８８】
従って、本発明は：
ａ．好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択され、最も好ましくは配列番号：１６の、配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかのレベルが異なる２つの細胞を供し、
ｂ．例えば、増殖アッセイによって、推定阻害剤に対する該細胞の感度を測定し、次いで、
ｃ．該２つの細胞が、該推定阻害剤の存在によって異なって影響されるか否かを判断する；
工程を含む、配列番号：１ないし２８２よりなる群から選択されるポリペプチドの阻害剤を同定する方法に関する。
【０２８９】
好ましくは、該方法は複数の推定阻害剤について反復される。好ましい阻害剤は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞の膜を通過しないものである。
【０２９０】
このアプローチの背後にある理念は、より低い活性の必須ポリペプチドを持つ細胞の生存率は、より高いレベルを持つ細胞の生存率よりもポリペプチドの阻害剤によってより影響されるであろうということである。もし２つの細胞が異なって影響されれば、これは、該阻害剤が標的に対して、あるいは少なくとも同一生化学的経路において作用することを示す。
【０２９１】
該方法のいくつかの具体例において、注目するポリペプチドの異なる活性を持つ２つの細胞は野生型細胞（または注目する遺伝子の野生型活性を持つ他の細胞）および注目するポリペプチドの低下した活性を持つ感作細胞である。いくつかの具体例において、感作細胞における異なるまたは低下したレベルは、注目する遺伝子の異なるまたは低下した発現レベルであり得（その結果、ポリペプチドの異なったまたは低下したコピー数がもたらされる）。これは、遺伝子を調節可能なプロモーターの制御下に置くことによって、あるいは必須ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡの調節可能な発現によって達成することができる。他の具体例において、異なるまたは低下した活性は、例えば、温度−感受性突然変異のような突然変異による、注目するポリペプチドの異なるまたは低下した活性であり得る。
【０２９２】
感受性化細菌細胞を作製する、および阻害剤についてスクリーニングするにおいてこれらを用いる適当な方法はＷＯ  ０２／０７７１８３に記載されている。感作細胞は、ある濃度のインデューサーまたはリプレッサーの存在下において、あるいはその機能の存在または不存在が生存率に対する律速工程となるように、細菌生存率に必要な遺伝子産物のレベルを供する他の条件において、条件−発現Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ突然変異体株を増殖させることによって得ることができる。標的遺伝子の致死下発現は、増殖阻害が少なくとも約２５％、例えば、少なくとも約５０％のような、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも９０％のような、少なくとも９５％のような、少なくとも約１０％であるようなものとすることができる。
【０２９３】
本発明の細胞−ベースのアッセイのもう１つの具体例において、感作細胞は、ポリペプチドにおいて、温度−感受性突然変異のような突然変異を用いる細菌生存率に必要なポリペプチドのレベル活性の低下によって得られる。許容されるおよび制限的温度の間の中間的温度におけるそのような細胞の成長は、遺伝子産物の低下した活性を持つ細胞を生じる。前記方法は、細菌生存率に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低下するが、それを無くさないいずれかの突然変異で行うことができると認識されるであろう。このアプローチは、条件−発現アプローチと組み合わせることもできる。この組み合わされたアプトーチにおいて、注目する遺伝子において温度−感受性突然変異があり、かつこの遺伝子がやはり条件付で発現される細胞が作製される。
【０２９４】
必須のポリペプチドの阻害剤についてスクリーニングすると、成長阻害は、対照試料のそれと、実験試料における、非接種増殖培地に対する培養の光学密度によって測定された、成長の量を直接的に比較することによって測定することができる。細胞増殖をアッセイするための別の方法は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）レポーター構築体の発光の測定、種々の酵素活性アッセイ、および当該分野で良く知られた他の方法を含む。生存率を測定するのに用いる他のパラメーターは、例えば、コロニー形成単位を含む。前記方法は固相、液相、２つの先行培地の組合せにて、あるいはイン・ビボで行うことができる。複数の化合物を寒天プレートに移し、自動化されたおよび半自動機器を用いて同時にテストすることができる。
【０２９５】
本発明の細胞−ベースのアッセイは、注目する標的分子に対して低いまたは中程度の能力を呈する化合物を検出することができる。なぜならば、そのような化合物は非−感作細胞に対するよりも感作細胞に対して実質的に優れているからである。該効果は、非−感作細胞と比較して、感作細胞でテストした場合、テスト化合物が２ないし数倍より優れている、例えば、少なくとも２０倍より優れているように少なくともより１０倍優れている、例えば、少なくとも１００倍より優れているように少なくとも５０倍、より優れている、例えば、少なくとも１０００倍より優れている、あるいは１０００倍を超えてより優れているであるようなものであろう。
【０２９６】
表面に位置するポリペプチドを過剰発現する突然変異体Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を用いて、そのようなポリペプチドを阻害する化合物を同定することもできる。もし該化合物が細胞傷害性であれば、標的ポリペプチドの過剰発現は細胞をより抵抗性とすることができる。かくして、本発明は：
ａ．好ましくは、配列番号：１６、配列番号：１０、配列番号：１３、配列番号：２０、配列番号：２６、配列番号：２８および配列番号：３３よりなる群から選択される、最も好ましくは配列番号：１６の、配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのいずれかの活性が異なる２つの細胞を供し、ここに、１つの細胞は該ポリペプチドの実質的に野生型コピー数を含有し、他の細胞は該ポリペプチドの野生型よりも高いコピー数を含有し、
ｂ．例えば、増殖アッセイによって推定阻害剤に対する該細胞の感度を測定し、次いで、
ｃ．該２つの細胞が該推定阻害剤の存在によって異なって影響されるか否かを判断する；
工程を含む、配列番号：１ないし２８２の表面に位置するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのいずれかの阻害剤を見つけ出す方法にも関する。
【０２９７】
過剰発現は、強力なプロモーターを用いて、あるいは表面に位置するポリペプチドに対する構造遺伝子の複数コピーを導入することによって達成することができる。阻害剤の細胞標的ではないポリペプチドの過剰発現もまた細胞を阻害剤に対して抵抗性とできるので、推定阻害剤による注目する標的ポリペプチドの阻害は、例えば、生化学アッセイのような他の手段によって確認される必要があろう。
【０２９８】
表面に位置するポリペプチドの生化学的または他の細胞活性の阻害剤に加えて、前記した細胞方法を用いて、標的の発現レベルを低下させ、それにより、例えば、遺伝子調節に干渉することによって、そのコピー数を低下させる化合物を同定することができる。
【０２９９】
結合パートナーまたは阻害剤を見出すための細胞−ベースの−または生化学的方法のいずれかの好ましい具体例において、該方法は複数の候補化合物について反復される。
【０３００】
さらなる態様において、本発明は、表面に位置するポリペプチドをコードする遺伝子が異種調節可能プロモーターの制御下に置かれている株、表面に位置するポリペプチドの温度−感受性対立遺伝子を運ぶ株、および表面に位置するポリペプチドを過剰発現する株のような、本明細書中に記載された細胞−ベースの方法で用いられる突然変異体Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株に関する。
【０３０１】
配列番号：１ないし２８２のポリペプチドのいずれかのような表面に位置するポリペプチドを標的化することによって細菌の成長に干渉する他の方法は、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡのような特異的アンチセンス分子を用いる、および必須の表面に位置するポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対して特異的なリボザイム分子を用いる遺伝子発現の抑制を含む。
【実施例】
【０３０２】
（実施例１）
（戦略：）
プロジェクトにおける実験工程は以下の通りである：表面蛋白質を、高ｐＨ溶出によって、またはムタノリシン消化によって単離した。単離された表面蛋白質を、３つの補充的マススペクトロメトリーベースの戦略：１）２−Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、２）１Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび３）溶液中消化によって同定した。全ての３つの戦略は、マススペクトロメトリー分析による蛋白質同定を含む。表面の同定された蛋白質はＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターにクローン化する。発現された組換え蛋白質を精製し、それを用いて、マウスを免疫化して、抗原の免疫原性を確認する。免疫化されたマウスを挑戦実験で用い、そこでは、マウスをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで挑戦し、病気および／または死亡に対する保護をモニターする。
【０３０３】
（マウス：）
６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを特異的−病原体−フリー条件下で収容し、滅菌食品および水を自由に与えた。
【０３０４】
（細菌：）
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をルーチン的プラスミドクローニング用の宿主として用いた。組換え蛋白質をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉを抗生物質を補充したＬｕｒｉａブロス中で培養した。ビルレントＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｄ３９（血清型２、Ｍ．Ｔｒｏｍｂｅ博士、ＣＩＣＴ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅによって購入）をプロテオミックス、挑戦実験のために、およびＰＣＲ増幅実験用のゲノムＤＮＡを源として用いた。肺炎球菌感染の大部分を担う４０の血清型を含めたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床単離体を選択し、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋから購入した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを血液寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ）上でルーチン的に増殖させた。
【０３０５】
（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞被膜画分の単離：）
肺炎球菌細胞壁のムタノリシン消化。細菌を血液寒天プレート上で一晩成長させ、２０％スクロースを含有するリン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に収穫し、６０００ｇにおける１０分間の遠心によってペレット化した。ペレットを、プレート当たり０．５ｍｌの浸透圧消化緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣＩ、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび１００Ｕ／ｍｌムタノリシン（Ｓｉｇｍａ）中２０％スクロース）に再懸濁させた。酵素消化を３７℃にて１ないし２時間進行させた。無傷プロトプラストを、７，０００×ｇにおける１５分間の遠心によって除去した。上清を集め、アセトン沈殿させ、マススペクトロメトリーベースの技術を用いて分析した。
【０３０６】
表面蛋白質の高ｐＨ溶出。細菌を血液寒天プレート上で一晩増殖させ、２０％スクロースを含有するＰＢＳに収穫し、６０００ｇにおける１０分間の遠心によってペレット化する。ペレットを、２０％スクロースを含有するＰＢＳに再懸濁させ、前記したように再度遠心した。次いで、プレート当たり２０％スクロースを含有する２ｍｌの５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１２）に細菌を再懸濁させた。細胞表面蛋白質のアルカリ抽出を行って、温和に振とうしつつ、室温にて３０分間進行させた。懸濁液を１５，０００ｇにおいて２０分間遠心し、上清を集め、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ７に調整し、アセトン沈殿させ、１−Ｄおよび２−Ｄゲル電気泳動によって分析した。
【０３０７】
（表面蛋白質の同定：）
表面抽出後に得られた蛋白質の複雑な混合物を、全て、マススペクトロメトリーに基づく３つの補充的な戦略：２−Ｄゲルベースの戦略、１Ｄゲルベースの戦略および溶液中消化戦略によって分析した。
【０３０８】
２−Ｄゲルベースの戦略（２Ｄ−ゲル  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）：二次元ゲル電気泳動を、ゲル系に備えられたマニュアルに従い、Ｅｔｔａｎ  Ｄａｌｔ２系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＮｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）いずれかで行った。簡単に述べれば：製造業者の指示に従い、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、第一次元泳動を７ｃｍまたは２４ｃｍプレキャストＩＰＧストリップ（ｐＨ範囲３ないし１０または４ないし７）いずれかで行った。等電点電気泳動は以下の条件で行った：７ｃｍストリップ：８０００Ｖｈ、２４ｃｍストリップ：５２０００Ｖｈ。第二の次元は、プレキャスト１２．５％ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ゲル当たり５Ｗにて１５分、次いで、合計１７０Ｗにて４ないし６時間、２４ｃｍストリップについて行った。７ｃｍストリップは、２００ボルトにおける４０分間のプレキャスト４ないし１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いＮｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動させた。元来、Ｍｏｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １（１１）、１３５９−１３６３によって記載された修飾された方法に従ってゲルを銀染色し、マススペクトロメトリー分析用のスポットを、製造業者の指示に従い、ＡｍｅｒｓｈａｍからのＥｔｔａｎ  Ｓｐｏｔ  Ｐｉｃｋｅｒを用いて拾った。
【０３０９】
特異的な蛋白質スポットを拾い、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に入れた。これらのゲルプラグを５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／５０％エタノール中で洗浄し、９６％エタノール中のインキュベーションによって脱水した。５６℃において還元溶液（１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中でインキュベートし、続いて、暗所にてアルキル化溶液（５５ｍＭヨードアセタミド、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中での室温でのインキュベーションによって、還元およびアルキル化を行った。次いで、５ｕｌのトリプシン溶液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１０％アセトニトリル中１２．５ｎｇ／ｕｌ  Ｐｒｏｍｅｇａトリプシン）の添加に先立って、２サイクルの洗浄および脱水を次いで行った。次いで、さらなる量の重炭酸ナトリウム溶液を加え、消化物を３７℃にて一晩インキュベートした。トリフルオロ酢酸を一晩消化物に加え、続いて、振とうしつつインキュベートした。
【０３１０】
抽出物の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチド質量フィンガープリントおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で用い、ピーク−リストを、特異的なＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅデーターベースに対するデーターベースサーチングで用いた。Ｍａｓｃｏｔサーチプログラムおよびスコアリングアルゴニズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）をデーターベースサーチングで用いた。ペプチド質量トレランスは、各々、６０ｐｐｍおよび０．７Ｄａに設定した。サーチパラメーターは、Ｍｅｔの酸化、Ｃｙｓへのカルバミドメチル基の付加を含めるように調整し、トリプシンは、ペプチド当たり１つの切断部位を失わせた。
【０３１１】
１Ｄゲルベースの戦略（ＧｅＬ  Ｃ−ＭＳ／ＭＳ）：一次元ゲル電気泳動は、ゲル系に備えられたマニュアルに従い、Ｎｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。簡単に述べれば、我々は、ＮｕＰａｇｅ−ＭＯＰＳ−ＳＤＳ泳動緩衝液中にて、２００ボルトにおける６０分間の、サイズ８ｃｍ×８ｃｍ、１ｍｍ厚みのプレキャスト１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。元来、Ｍｏｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１（１１）、１３５９−１３６３によって記載された修飾された方法に従い、ゲルを銀染色した。全レーンをレーザーブレードで０．５ｃｍゲルスライスに切断した。ゲルスライスを２Ｄゲルベースの戦略下で記載したように消化したが、トリプシンの量は２０ｕｌトリプシン溶液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１０％アセトニトリル中１２．５ｎｇ／ｕｌ  Ｐｒｏｍｅｇａトリプシン）であった。
【０３１２】
抽出物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃａｐ−ＬＣおよびＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｕｌｔｉｍａ  ＴＯＦ  ＭＳ）で分析した。各抽出物を１１５分のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付した。断片化ペプチドから生じたピークリストを、特異的Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅデーターベースに対するデーターベースサーチングで用いた。Ｍａｓｃｏｔサーチプログラムおよびスコアリングアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）をデーターベースサーチングで用いた。ペプチド質量トレランスは断片イオンについて２００ｐｐｍおよび０．４Ｄａに設定した。サーチパラメーターは、Ｍｅｔの酸化、Ｃｙｓへのカルバミドメチル基の付加を含むように調整し、トリプシンはペプチド当たり１つの切断部位を失わせた。
【０３１３】
溶液中ベースの戦略（ＩＳＤ−ＭＳ／ＭＳ）：蛋白質混合物を５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３１０％アセトニトリルに再懸濁させた。トリプシン溶液（５０μｌ）（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１０％アセトニトリル中１２．５ｎｇ／μｌ  Ｐｒｏｍｅｇａトリプシン）を加え、混合物を３７℃にて一晩インキュベートした。消化を、ＴＦＡ（最終濃度１％）での酸性化によって停止し、１Ｄ−ベースの戦略下で記載されたようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。データーベースサーチもまた、１Ｄ−ベースの戦略下で記載されたように行った。
【０３１４】
（異なるＳ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株における蛋白質ワクチン候補についての遺伝子の検出：）
ＰＣＲ増幅を用いて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床単離体にリストされた抗原をコードする遺伝子の存在を示した。この目的で、細胞を血液寒天上で増殖させ、ＰＢＳに希釈した。ゲノムＤＮＡを４０肺炎球菌株から加熱（５分間９５℃）によって調製し、アリコットを、遺伝子特異的プライマーと共にＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）でのＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。増幅産物を１％アガロースゲルを通して電気泳動に付し、臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌ）での染色によって可視化した。
【０３１５】
（逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを肺炎球菌攻撃下で後に述べるようにＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９で感染させた。感染から１日後に、このマウスを犠牲にし、脾臓を抽出し、２つのピースに分けた。組織からの無傷全細菌ＲＮＡの単離では、器官の１つの半分を液体窒素中で迅速に凍結させ、ＲＮＡ単離前に−８０％で貯蔵した。各器官の他の半分を、ＲＮＡ単離前に血液寒天プレートを用いて細菌についてテストした（データは示さず）。Ｒｎｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）にて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含有する動物組織から全ＲＮＡを単離した。第一のストランドｃＤＮＡ合成を、全ＲＮＡおよびｉＳｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）で行った。１μｌｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーでの引き続いてのＰＣＲ−工程で用いた。
【０３１６】
（組換えワクチン（ｒｅｃ．ｖａｃ．）の生産：）
組換えワクチンの生産は、肺炎球菌の遺伝子のＰＣＲ増幅、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子の引き続いてのクローニングおよび発現を用いることによって達成した。ＰＣＲ増幅実験で用いてオリゴヌクレオチドプライマーは、全て、ＭＷＧ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。蛋白質発現で用いた肺炎球菌遺伝子は、高忠実度熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｄ３９のゲノムＤＮＡから増幅した。コーディング配列を、開始コドンを含有するが、オープンリーディングフレームの停止コドンを排除するプライマーで増幅した。蛋白質発現で用いたコーディング配列を、細菌宿主としてのＥ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０と共に、指向性Ｔｏｐｏクローニングキットを用いてプラスミドｐＥＴ１０１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。プラスミドがコードするＣ−末端ポリヒスチジンタグは各組換え蛋白質に近接する。組換え蛋白質発現では、各組換えｐＥＴ１０１プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）にサブクローンした。組換え蛋白質発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）での誘導によって開始し、蛋白質は、製造業者の指示に従って、金属アフィニティクロマトグラフィー樹脂および緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、組換えＥ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分から精製した。蛋白質濃度は、ＢＣＡテスト（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）を用いることによって見積もった。組換え蛋白質をＰＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して透析し、−８０℃で貯蔵した。組換え蛋白質を、精製後に、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ技術で同定した。
【０３１７】
（ウエスタンブロット分析：）
精製された蛋白質を一次元（約２０μｇ蛋白質）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。固定化された蛋白質の免疫学的検出は製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）後に行った。患者の血清は親切にもＭ．Ｔｒｏｍｂｅ博士（ＣＩＣＴ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から贈られた。我々は、免疫検出用の単一のプールされた患者血清での１：１００の希釈を用いた。二次抗体の希釈は１：５０００であった。
【０３１８】
（能動的に免疫化されたマウスの肺炎球菌挑戦：）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを挑戦実験で用いた（群当たり１０匹のマウス）。抗原特異的ワクチン接種では、０日に、ＡＬＵＭアジュバント（１００μｇ）を含有する各抗原の２５μｇで感作した。動物に１４日および２８日に同一抗原濃度でブースター注射した。我々は、陰性対照としての無関係なセルロース−結合ドメインＣＢＤ（ｓｉｇｍａ）で処理していないＢＡＬＢ／ｃマウスおよび処理したマウスを用いた。全てのワクチンは皮下（Ｓ．Ｃ．）投与した。全てのマウスから０、２１および３６日に血液を採取し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９で３５日に挑戦した。各免疫化マウスからの個々の血清を、挑戦に先立って特異的抗体の存在についてテストした。血液寒天プレートで増殖させたビルレントなＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｄ３９）を、能動的に免疫化されたマウスまたは対照群において、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して挑戦用に調製した。挑戦感染では、マウスに、ＰＢＳに懸濁化させたビルレントなＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｄ３９のマウス当たりほぼ１０７ＣＦＵを腹腔内注射した。投与されたＣＦＵの現実の数は、接種物の系列希釈を血液寒天上で平板培養することによって遡及的に測定した。マウスの生存は７日間モニターしその時点で、実験を停止した。
【０３１９】
（免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）マウスの検出のためのＥＬＩＳＡ：）
ワクチン接種から０日、２１日および３５日後にマウス血清中の抗原特異的ＩｇＧを検出するために、Ｅｌｉｓａアッセイを開発した。異なるＥＬＩＳＡプレートを組換えワクチン（２μｇ）およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＤ３９の全細胞溶解物（２μｇ）で被覆した。２倍系列希釈を一次抗体としてマウス血清から作製した。二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーテッド）の希釈は１：５０００であった。ＯＰＤ基質は発色で用いた。プレートを４９２ｎｍで読んだ。ワクチン接種から２１日および３５日後におけるＩｇＧ状態の結果を、ワクチン接種の０日におけるＩｇＧ状態と比較した。
【０３２０】
（結果：）
我々は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのムタノリシン作製細胞−表面画分において２８２の異なるポリペプチドを同定した。同定されたポリペプチドの配列を図２に掲げる。使用された方法は、比較的高レベルで発現されるポリペプチドを同定する。我々は、単離されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ表面蛋白質の検出のために３つの異なる戦略：ａ）２−Ｄゲルベースの戦略、ｂ）１−ＤゲルおよびＬＣ＿ＭＳ／ＭＳでの戦略、ｃ）溶液中ベースのＭＳ戦略を用いた。我々は、特徴付けのために同定された表面蛋白質のＯＲＦを選択した。遺伝子のＯＲＦをＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ１０１に指向的にクローン化した。組換え蛋白質を材料および方法に記載したように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。４つの組換え蛋白質をさらなる実験のために選択した。（表３）：
【０３２１】
【表３】
2008530037.tif 000004
ＰＣＲ調査は、これらの４つの選択された蛋白質の各々の遺伝子がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの４０の異なる血清型において示されることを示した（表４）。
【０３２２】
（表４：異なるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型および以下の遺伝子についての特異的プライマーでのＰＣＲ（＋＝検出；−＝検出されず））
【０３２３】
【表４】
2008530037.tif 000005
これらの４つの遺伝子の転写体の同定では、我々はＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
ＢＡＬＢ／ＣマウスをＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させ、感染から１日後に、全ＲＮＡを脾臓から単離した。脾臓からのＲＮＡでのＲＴ−ＰＣＲは、選択された遺伝子が動物感染後にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて発現されることを示した（図３）。加えて、患者血清でのウエスタンブロット（ＷＢ）を、表３にリストされた蛋白質の免疫原性をテストするために行った。さらに、３つのさらなる蛋白質（１４４、ＡｎｒＰ４５４１４４（１４ｋＤａ  ｒｅｃ．ｖａｃ．）；４８７、ＡｎｒＰ９８４８７（３２ｋＤａ）；６４６；ＡｎｒＰ３７３６４６（２５ｋＤａ））もまた、ウエスタンブロットでの免疫原性についてテストした。我々は、単一患者から単離された（図４）または異なる患者からプールされた（データは示さず）血清でのイムノブロット（ＷＢ）において組換えワクチン０２９、０６０、６０７、６４６および６５３を検出した。ＷＢにおいては、非特異的シグナルが精製された蛋白質１４４および４８７で検出されるか、またはシグナルは検出されず、しかしながら、シグナルの欠如は、これらの２つの蛋白質がワクチンとして適当であり得ることを排除しない。
【０３２４】
我々は、マウスを蛋白質ワクチンとしての表３における蛋白質でワクチン接種し、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する保護効率についてテストした。抗原はミョウバンで調製し、３つの時点（０、１４、２８日）において、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに皮下注射した。陰性対照では、マウスを処理しないままでおくか（グループ５）、あるいは１００μｇミョウバン（グループ６）で、または無関係な蛋白質（グループ７）で処理した。我々はＥＬＩＳＡアッセイにて、ワクチン接種から０日、２１日および３５日に各蛋白質の免疫原性をテストした。マウスは抗原０２９、０６０、６０７および６５３に対する免疫グロブリン（ＩｇＧ）を生じた（図５）。肺炎球菌抗原に対する免疫応答は、グループ５、６および７の動物においては予測したように検出されなかった。細菌挑戦では、各マウスを、ワクチン接種から３５日において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＤ３９（マウス当たり１０７ＣＦＵ）で感染させた。蛋白質０２９および６０７でワクチン接種した２つのグループから誘導されたマウスは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株での感染後により低い死亡率およびより低いＣＦＵ−力価を示した（図６、図７）。蛋白質０６０および６５３もまたより低いＣＦＵ−力価に対する傾向を示した（図６）。
【０３２５】
Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの異なる株の間における配列の変異を調べるために、抗原０２９および６０７の配列は、血清型１５ｂ、１５ｃおよび３５ｆから、およびＳｔｒｅｐｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株Ｄ３９から部分的に決定した。これらの配列をタイプ４（ＴＩＧＲ）およびＲ６（Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）からの０２９および６０７のデーターベース配列と比較した。アミノ酸位置１からアミノ酸位置３１５への０２９の領域は、６つの株の間においてアミノ酸レベルで９８％を超える配列同一性を示した。６０７では、６つの株の間でアミノ酸レベル９８％を超える配列同一性が、位置２０ないし位置１９０までの領域で見出された。これらのデータは、０２９および６０７が異なる株を横切ってよく保存されていることを示す。
【０３２６】
抗原０２９（配列番号：１６）（推定リポエート蛋白質リガーゼ）の構造は決定されており、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）およびＥＢＩのＨＳＳＰデーターベース、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいてアクセション番号１ＶＱＺ下でアクセス可能である。表面−露出領域は高水接近性（ＡＣＣ）でのアミノ酸の同定によって予測され、これは、同時に、配列において低い変異性（ＶＡＲ）を有するはずである（以下の表参照）。いくつかのアミノ酸によって隔てられた異なる領域のアミノ酸ストレッチは３Ｄ構造においては隣接しており、従って、一緒に対合する。
【０３２７】
表面に露出されたアミノ酸：
１５５−１６０＋１８５−１９１［ＤＬＳＶＬＡ（配列番号：２８９）／ＩＩＮＥＬＰＫ（配列番号：２９０）］
１２７−１２８＋１６６−１８０［ＩＤＧ／ＳＫＤＫＦＥＳＫＧＶＫＳＶＲＡ（配列番号：２９１）］
１９５−２０４＋２０７−２１１［ＶＥＫＦＲＤＬＬＬＥ（配列番号：２９２）／ＫＫＥＹＰ（配列番号：２９３）］
【０３２８】
【表５】
2008530037.tif 000006
【０３２９】
【表６】
2008530037.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０３３０】
【図１】本発明の好ましい組成物の表。行および列中の数字は配列番号を示す。各十字形とは、十字形が属する行のポリペプチド（抗原性断片またはその変種）ならびに十字形が属する列のポリペプチド（または抗原性断片またはその変種）を含む組成物をいう。
【図２−１】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−４】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−５】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−６】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−７】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−８】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−９】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１０】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１１】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１２】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１３】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１４】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１５】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１６】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１７】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１８】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−１９】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２０】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２１】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２２】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２３】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２４】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２５】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２６】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２７】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２８】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−２９】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３０】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３１】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３２】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３３】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３４】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３５】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３６】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３７】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３８】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−３９】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−４０】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図２−４１】表面に位置したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチドのアミノ酸配列のリスト。
【図３】感染の１日におけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９に感染したマウスからの脾臓に由来するｃＤＮＡでのＲＴ−ＰＣＲ。抗原０２９（配列番号：１６）、０６０（配列番号：２６）、６０７（配列番号：２０）および６５３（配列番号：３３）についての転写体に特異的なプライマーを用いた。さらに、肺炎球菌ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ハウスキーピング遺伝子）のＳｉｇｍａ７０サブユニットの転写体に特異的なプライマーを用いた。−ＲＴ：逆転写酵素無しの対照；＋ＲＴ：ＲＴ−ＰＣＲ；Ｎ：非−鋳型対照。
【図４】ｒｅｃ．ｖａｃ．（抗原）０２９、０６０、１４４、４８７、６０７、６４６および６５３の検出のための患者血清（単一患者）でのイムノブロット。
【図５】ワクチン接種の０、２１および３５日における、抗原（ａｇｓ）０２９、０６０、６０７、６５３および未処理動物（免疫化していない）での対照、ミョウバンアジュバント単独、および無関係な抗原の免疫原性
【図６】抗原（ａｇｓ）０２９、０６０、６０７、６５３をワクチン接種したマウスの血液中のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９での挑戦６時間後のＣＦＵ、および未処理動物での対照（免疫化していない）、ミョウバンアジュバント単独、および無関係な抗原。
【図７】未処理動物（免疫化していない）での対照群、ミョウバンアジュバント単独および無関係な抗原（ｓｉｇｍａ）と比較した、抗原（ａｇｓ）０２９および６０７でワクチン接種したマウスのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｄ３９での挑戦後の生存体。
【図１】
2008530037.tif 000008
【図２−１】
2008530037.tif 000009
【図２−２】
2008530037.tif 000010
【図２−３】
2008530037.tif 000011
【図２−４】
2008530037.tif 000012
【図２−５】
2008530037.tif 000013
【図２−６】
2008530037.tif 000014
【図２−７】
2008530037.tif 000015
【図２−８】
2008530037.tif 000016
【図２−９】
2008530037.tif 000017
【図２−１０】
2008530037.tif 000018
【図２−１１】
2008530037.tif 000019
【図２−１２】
2008530037.tif 000020
【図２−１３】
2008530037.tif 000021
【図２−１４】
2008530037.tif 000022
【図２−１５】
2008530037.tif 000023
【図２−１６】
2008530037.tif 000024
【図２−１７】
2008530037.tif 000025
【図２−１８】
2008530037.tif 000026
【図２−１９】
2008530037.tif 000027
【図２−２０】
2008530037.tif 000028
【図２−２１】
2008530037.tif 000029
【図２−２２】
2008530037.tif 000030
【図２−２３】
2008530037.tif 000031
【図２−２４】
2008530037.tif 000032
【図２−２５】
2008530037.tif 000033
【図２−２６】
2008530037.tif 000034
【図２−２７】
2008530037.tif 000035
【図２−２８】
2008530037.tif 000036
【図２−２９】
2008530037.tif 000037
【図２−３０】
2008530037.tif 000038
【図２−３１】
2008530037.tif 000039
【図２−３２】
2008530037.tif 000040
【図２−３３】
2008530037.tif 000041
【図２−３４】
2008530037.tif 000042
【図２−３５】
2008530037.tif 000043
【図２−３６】
2008530037.tif 000044
【図２−３７】
2008530037.tif 000045
【図２−３８】
2008530037.tif 000046
【図２−３９】
2008530037.tif 000047
【図２−４０】
2008530037.tif 000048
【図２−４１】
2008530037.tif 000049
【図３】
2008530037.tif 000050
【図４】
2008530037.tif 000051
【図５】
2008530037.tif 000052
【図６】
2008530037.tif 000053
【図７】
2008530037.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月9日(2007.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008530037000001.app
【国際調査報告】
2008530037.tif 000055
2008530037.tif 000056
2008530037.tif 000057
2008530037.tif 000058
2008530037.tif 000059
2008530037.tif 000060
2008530037.tif 000061