(57)【要約】  血管内に位置する閉塞の通過のために、たとえばヒト動脈などの血管を準備するための方法、薬剤及び装置。該方法は、閉塞部位に血管新生薬剤を送達するなどによって閉塞における血管新生を誘導する工程を含む。閉塞内の血管新生は、たとえば血管形成術の際のガイドワイヤによる通過を促進する。
2008521523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内に位置する閉塞の通過のために血管を準備する方法であって、該方法は閉塞部位に血管新生薬剤を送達する工程を含んで成る、方法。
【請求項２】
血管新生薬剤を送達する工程が、薬剤を含有する送達装置を血管に直接挿入して該血管内に沈殿させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該装置がカテーテルを含み、閉塞部位に薬剤を送達する工程が該カテーテルを通じて薬剤を血管に運ぶ工程を含むか、又は薬剤が血管形成術バルーンを送達するためのオーバーザワイヤ装置のポートを通じて送達される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該カテーテルを通じて薬剤を該部位に運ぶ前に、カテーテルの遠位端が閉塞の１０ｃｍ以内に、より好ましくは該部位の５ｃｍ以内、又は４ｃｍ以内、又は３ｃｍ以内、又は２ｃｍ以内にまで持ってこられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該閉塞部位に薬剤を送達する工程が、薬剤を閉塞に直接接触させる工程を含む、請求項１乃至４の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
該血管新生薬剤を送達する工程が、閉塞に近接する血管内に装置を留める工程を含み、該装置には薬剤が装填され、該薬剤は長時間にわたって該装置から放出され、前記時間は最大約２時間、又は２０分から９０分の間、又は４０分から６０分の間であり、該装置は使用中に該装置から放出するための薬剤を含浸又はその他の態様で装填したビーズを任意に含み、又は／及び該装置は使用中に該装置から放出するための薬剤を装填したポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該薬剤を送達する工程の後に装置を血管内に送達することによって、薬剤を一定期間閉塞と直接接触させて保持する工程をさらに含んで成る、請求項１乃至５の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
該期間が、閉塞における血管新生を誘導するために十分な予め定められた期間である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該期間が、１日から１０週間の間、又は２から５０日の間、又は３から４０日の間、又は７から３０日の間、又は１４から２８日の間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該血管がヒトの動脈である、請求項１乃至９の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
該動脈がヒトの心臓内に位置し、又は該動脈が末梢動脈であり、又は該動脈が大腿動脈であり、又は該動脈が膝窩動脈であり、又は該動脈が鎖骨下動脈であり、又は該動脈が腕動脈である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該送達する工程の後に、閉塞内の微細血管の発達をモニターする工程をさらに含んで成る、請求項１乃至１１の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
該モニターする工程が、磁気共鳴を用いて閉塞を画像化する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該閉塞は慢性完全閉塞である、請求項１乃至１３の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
該血管新生薬剤が、血管新生もしくは血管新生促進増殖因子又は／及びサイトカイン又は本発明の増殖因子又は／及びサイトカインの組合せからなる薬剤の群から選択され、該薬剤が血管内皮増殖因子；アンジオポエチン１，２；ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、ＴＮＦ−α、内皮由来酸化窒素又は酸化窒素ドナー、増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ｔｉｅ２）、及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１−α、並びにその組合せを含む、請求項１乃至１４の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
該血管新生薬剤が幹細胞の一種であり、場合により胎児又は成人の骨髄もしくは循環血液又は血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する細胞であり、また場合によりｅＮＯＳ又はＶＥＧＦなどの血管新生増殖因子を過剰発現させるためのＥＰＣの遺伝子操作によって血管新生潜在性を増加させた細胞である、請求項１乃至１４の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン又は／及びスタチンなどの増殖因子の送達をさらに含んで成ることによって、血管新生促進因子を循環に動員する、請求項１乃至１６の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ヒアルロナン、フィブロネクチン、パールカン、又は／及びバーシカンなどのプロ血管新生的な細胞外マトリックス成分の閉塞内における過剰発現を誘導する工程をさらに含んで成る、請求項１乃至１７の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
コラゲナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼを閉塞に送達することによって閉塞における血管新生を高める工程をさらに含んで成る、請求項１乃至１８の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を閉塞に送達する工程をさらに含んで成る、請求項１乃至１９の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
慢性完全閉塞の閉塞の部位に、マクロファージの活性化又はマクロファージの走化性をもたらす物質を送達する工程をさらに含んで成る、請求項１乃至２０の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ヒトの慢性完全閉塞を通過する方法であって、該方法は
（ｉ）閉塞における血管新生を誘導する工程と、
（ｉｉ）閉塞を通過する工程とを含んで成る、方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）が、閉塞が位置する血管を請求項１乃至２１の内のいずれか一項に従って準備する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ガイドワイヤによって慢性完全閉塞を通過する方法であって、該方法は
（ｉ）閉塞部位に血管新生薬剤を送達する工程と、
（ｉｉ）閉塞の血管新生を通じた通過に対する感受性を増加させるために十分な期間待機する工程と、
（ｉｉｉ）閉塞を通過する工程とを含んで成る、方法。
【請求項２５】
該薬剤が全身的に送達される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該薬剤が閉塞の部位に経皮的に直接送達される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物のアテローム性動脈硬化症プラークにおける血管新生を誘導又は／及び促進する方法であって、該方法は、血管新生薬剤を管を通じて直接プラーク部位に経皮的に送達する工程を含んで成る、方法。
【請求項２８】
該管が、プラークを有する血管に挿入されるカテーテルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該血管が動脈であり、該カテーテルの送達端部が該部位の少なくとも１０ｃｍ以内、任意には５ｃｍ未満にまで持ってこられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
慢性完全閉塞を通過する方法であって、該方法は
（ｉ）血管新生薬剤を含んで成る組成物を閉塞部位に経皮的に送達する工程と、
（ｉｉ）閉塞の血管新生を通じた通過に対する感受性を増加させるために十分な期間待機する工程と、
（ｉｉｉ）閉塞を通過する工程とを含んで成る、方法。
【請求項３１】
前記期間が約２４時間から３ヵ月の間である、請求項２４、２５、２６又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
該期間が少なくとも５日間であるか、又はここに他に記載されるとおりである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
閉塞した動脈を治療する方法であって、該方法は
（ａ）薬物送達装置を動脈を通じて閉塞まで前進させる工程を含んで成り、該装置は血管新生薬剤を含んで成る組成物を含有し、該方法はさらに
（ｂ）装置から該組成物を放出して組成物と閉塞とを互いに接触させる工程と、
（ｃ）薬物送達装置を引抜く工程と、
（ｄ）ガイドワイヤによる閉塞の通過を可能にするために閉塞において十分な血管新生を起こさせるために十分な期間待機する工程と、
（ｅ）前記ガイドワイヤによって閉塞を通過する工程とを含んで成る、方法。
【請求項３４】
該組成物がコラゲナーゼを含む、請求項３０乃至３３の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
該血管新生薬剤が、請求項１乃至３４の内のいずれか一項に記載の薬剤の１つ又はそれ以上である、請求項７乃至１１の内のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
動脈の閉塞における血管新生を誘導するための医薬組成物であって、該組成物は、ヒトの動脈に位置する慢性完全閉塞への経皮的送達のために好適な形状の血管新生薬剤を含んで成る、組成物。
【請求項３７】
該薬剤が、請求項１５又は１６において定義される薬剤を含んで成る、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
動脈の閉塞における血管新生を誘導するための医薬組成物を含んで成るキットであって、該キットは、血管新生薬剤を含有する第１のパッケージと、希釈剤を含有する第２のパッケージとを含んで成り、第１及び第２のパッケージの内容を混合することによって、ヒトの動脈に位置する慢性完全閉塞へのカテーテルを通じた送達に好適な形状の血管新生薬剤が得られる、キット。
【請求項３９】
該薬剤が、請求項１５又は１６において定義される薬剤を含んで成る、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
閉塞への組成物の送達のための装置をさらに含んで成る、請求項３８又は３９に記載のキット。
【請求項４１】
ヒトの血管の閉塞、任意にはヒトの心臓内に位置する動脈の慢性完全閉塞における血管新生の誘導における血管新生薬剤の使用。
【請求項４２】
該薬剤が、請求項１５又は１６において定義される薬剤を含んで成る、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
ヒト血管の閉塞、任意にはヒトの心臓内に位置する動脈の慢性完全閉塞において血管新生を誘導するための薬の製造における血管新生薬剤の使用。
【請求項４４】
該薬剤が、請求項１５又は１６において定義される薬剤を含んで成る、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
該閉塞がコラーゲン及びカルシウム沈殿物を含んで成る、請求項４１乃至４４の内のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所的血管新生促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）療法によって管腔内微細血管形成を増大させることによる、例えば動脈など閉塞した血管・血管の経皮的介入に係る。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
冠動脈疾患は、依然として西欧諸国の主な死因である。１ヵ月を超える閉塞として定義される慢性完全閉塞部（ＣＴＯ）は、診断的冠動脈カテーテル法を受けている患者において極めてありふれたものであり、患者の最大２０％が一つ又はそれ以上のＣＴＯを有することが報告されている（１）。この中には実際には心筋梗塞になっていない多数の患者が含まれる。ＣＴＯの血管再生が成功すると、有症候患者におけるアンギーナが顕著に改善される（２，３）が、より最近のデータによれば、左心室の機能（４−７）及び死亡率の低下（８−１０）が改善されることが明らかとなっている。現在、ＣＴＯの血管再生については二つの治療戦略が可能である：即ち、冠動脈バイパスグラフト手術（ＣＡＢＧ）、又は経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）（血管形成術又はステント留置）である。血管形成術の成功のためには、手術者が、末端動脈内腔に達するためにＣＴＯ部の内腔を塞ぐ組織を貫通する小さな（直径３６０μｍ）ガイドワイヤーを配置することが要求される。ＣＴＯにおいてＰＣＩを行なうことの技術的困難さは、主としてガイドワイヤーによってＣＴＯを通過出来ないことによるものであって、その困難さは、好結果を得られるという利益にもかかわらず、ＣＴＯに対するＰＣＩの割合が低いことに反映されている（全ＰＣＩの＜８％を占めるに過ぎない）（１１）。ＰＣＩは、この種の患者群においては厳しい制約条件を有するため、臨床医はしばしば、かかる患者をＣＡＢＧに託することを決心するか、又は（しばしば効果的でない）医薬治療に固執することになる。生存心筋に供給する血管に一つ又はそれ以上のＣＴＯが存在することが、依然としてＰＣＩを試みる代わりにＣＡＢＧに託する最もありふれた理由の一つである（１２）。
【０００３】
ＣＴＯの定義は、心外膜冠動脈のある部分に造影剤が全く存在しないことが血管造影で認められることに基づいている。ＣＴＯ以降の末端動脈は見えないか又は血管内腔の外側の前向性側枝（「橋かけ側枝」と称される）もしくは隣接する冠血管から始まる逆向性側枝によって灌流される可能性がある。狭窄（但し閉塞していない）冠動脈病変における手術成功率は９５％を超える。しかし、ＣＴＯに対する手術成功率は、血管形成術に若干の技術的改善があった（２５，２６）にもかかわらず、６０から７０％の範囲に過ぎず（３，１３，１４）、１９８０年代における５０−６０％の成功率からわずかしか改善されていない（２３，２４）。ＣＴＯの現在の成功率は、大半のＣＴＯが、失敗が予測されるためにおそらく試みさえ行われないという意味において、過大評価である可能性が高い。
【０００４】
ガイドワイヤーによってＣＴＯを通過することが出来ないことが、ＰＣＩ失敗の内の７５％以上の原因である（１４，１５）。少数の症例において、ガイドワイヤー通過が成功したにもかかわらず、バルーン又はステントが病変部を通過出来ないことがある。頻繁に発生するにもかかわらず、ＣＴＯの病理生理学及びあるＣＴＯが通過可能であるのに、別のＣＴＯでは成功しない理由に関しては、情報が驚くほど少ない。
【０００５】
ＣＴＯの発生につながる初期の急性の事象発現は、アテローム性動脈硬化症プラークの破裂とこれに伴う両方向性の血栓形成である。血栓及び脂質の多いコレステロールエステルは、時間とともにコラーゲン及びカルシウム沈着物の形成によって徐々に置換される（１６，１７）。この繊維性組織は、病変の近位端及び遠位端において特に密であり、これが典型的にＣＴＯのガイドワイヤー通過に対して最も抵抗性のある領域である。プロテオグリカンも、一年以内のＣＴＯの重要な構成成分である（１６）。その後の段階では、病変は更に石灰化する（１６，１７）。ＣＴＯが血管造影により認められるにもかかわらず、微細血管は、閉塞持続時間に関係なくＣＴＯ中にかなりよく（＞７５％）存在する（図１）（１６）。
【０００６】
進行したアテローム性動脈硬化性病変を有する動脈においては、三種類の微細血管形成がある。第一のパターンは、外膜及び外部媒体における微細血管の微細ネットワークである血管の血管において起こる。これらの血管はアテローム性動脈硬化症において、また血管形成術及びステント留置などの血管の損傷に応答して増殖する（１８−２０）。血管壁の外側レベルにおける低酸素症が、重要な刺激として作用するようである（３６）。ＣＴＯにおいては時折、かかる外膜の血管がよく発生して「橋かけ側枝」として認識出来る。第二に、主として慢性炎症に応答して、新血管新生が、閉塞血管内膜プラーク内で発生し得る（２１）。プラーク新血管新生は、さまざまな動物モデルにおける実験的アテロームの進行と関連付けられてきた（２２−２５）。アテロームのショルダーのいわゆる「ホットスポット」にプラーク血管が局在化することは、これらのプラークに破裂及び急性冠動脈イベントを起こし易くするかもしれない（２６，２７）。第三のタイプは、血栓が繊維性組織によって置換されるＣＴＯの組織化相の部分として生起する微細血管形成のパターン（「再疎通」として知られる）である。これらの微細血管のサイズは、一般的に１００−２００μｍの範囲にあるが、５００μｍに達することもあり得る（２１）。半径方向に走行する血管の血管とは対照的に、これらの血管内膜微細血管は、血栓化した親血管の内側をこれと平行して走行する（２８）。
【０００７】
血栓組織化の知識は、多くは静脈の研究に由来する。このプロセスは、創傷治癒のパターンに類似している（２９）。最初は、新たに形成された血栓は、フィブリンメッシュ内に血小板と赤血球を含有し、その後急性炎症性細胞が侵入する（４４）。最初は好中球が優勢であるが、後に単核細胞に代替される（３０，３１）。内皮細胞もフィブリン格子に侵入し、組織化する血栓内にチューブ状構造及び微細血管を形成する（２９，３２）。
【０００８】
動脈血栓における微細血管形成のプロセスについては相対的に殆ど知られていない。該プロセスが、静脈及び動脈において同じであると仮定することはできない。動脈血栓は、静脈血栓よりも再疎通の頻度が低く、その度合いも低い（３３）。静脈細胞の挙動は、動脈の挙動とは実質的に異なり得る（３４，３５）。ブタ大動脈における形成後２週間の側壁血栓において微細血管が報告されたが、その原因は、血栓内で生じた単核血球とされ、血管壁に生来の細胞（３６）又は血管壁からの血管の血管の侵入（３７，３８７）からの明らかな寄与はなかった。自然発生ヒト血栓及び実験動物動脈血栓における再疎通の領域において、高濃度のマクロファージが検出されたため、炎症も一定の役割を果たしているかもしれない（３１，３９）。おそらく局所ＥＣＭ環境が、付加的な重要なモデフファイアーであり、特定のマトリックス成分が、血管新生促進効果（ヒアルロナン（４０，４１）、フィブロネクチン（４２，４３）、パールカン（４４−４６）、バーシカン（４７））又は血管新生抑制効果（Ｉ型コラーゲン（４０，４８）、デコリン（４９，５０））を及ぼすと考えられる。
【０００９】
本発明者らは、ＣＴＯにおいて異なる数の微細血管が存在するのを観察してきた。これらの予備観察から、これらの微細血管がＣＴＯガイドワイヤー通過の成功を援助している可能性が示唆される（下記を参照）。限られた数のヒト冠動脈ＣＴＯの研究においても微細血管が観察され（１６）、その結果本発明者らは、管腔内血管新生並びにそれが病変の構造的及び機械的特性に及ぼす影響が、ＣＴＯガイドワイヤー通過率を実質的に促進するのではないかという概念を持つに到った。このことは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）及び３Ｄマイクロコンピュータ断層撮影（ｍｉｃｒｏ  ＣＴ）を含む画像診断技術を用いて研究することが出来る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明に従えば、哺乳動物血管における閉塞部をガイドワイヤーが成功裏に通過出来る現時点での確率を改善するためのアプローチが、説明・記載される。典型的に、該閉塞部は、慢性完全閉塞部であり、血管は、しばしば心臓に位置するヒト動脈である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に従えば、閉塞部における血管新生を誘導することによって、該閉塞部が通過のために準備される。
【００１２】
一つの局面に従えば、本発明は、ヒトの慢性完全閉塞部を通過する方法である。該方法は、（ｉ）閉塞において血管新生を誘導する工程と；（ｉｉ）閉塞を通過する工程とを含む。
【００１３】
しばしば本発明は、（ａ）閉塞部位に血管新生薬剤を送達する工程と；（ｂ）閉塞部が血管新生により通過に対する感受性を増加させるために十分な時間を待機する工程と；（ｃ）閉塞部を通過する工程とを含む。該薬剤は、全身的に送達されてもよい。より典型的には、該薬剤は、閉塞部位に経皮的に直接送達される。
【００１４】
閉塞部における血管新生を誘導する工程に加えて、本明細書において例示されるとおり、通過のために閉塞部を準備するに際して他の工程を本発明に組み入れてもよい。
【００１５】
本発明の潜在的利点は、血管壁に有害な影響をもたらすことなく、ガイドワイヤー通過を促進し且つ手術成功率を改善する態様において管腔内微細血管形成を効果的に増加させることである。
【００１６】
本発明は、慢性的に閉塞した動物の管状器官、たとえば卵管、尿管及び胆管などを治療する方法に関する。
【００１７】
ある一つの具体的な実施態様において、本発明は、慢性的に閉塞した動物の管状器官及び腔を治療するための方法である。該方法における第一の工程は、閉塞しているアテローム性動脈硬化性プラークに治療上有効量の血管新生促進物質を投与する工程である。該物質は、プラークに隣接する場所に直接送達されてプラークに接触させられるか、又は幾つかの実施態様においては、該物質は、全身的に送達されて最終的にプラークにまで送達される。複数の送達方法の組合せも、意図される。その後、血管形成術ガイドワイヤーでプラークを通過する前に、血管形成術前（ｐｒｅ−ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）の待機期間がある。この待機期間（１日から８週間まで、より可能性が高いのは２日から７週間、もしくは３日から６週間、もしくは４日から５週間、もしくは５日から４週間の間、又は約１から３週間の間、しばしば約２週間）は、新たな微細血管形成のために必要とされる。待機期間に引き続き、閉塞プラークは、血管形成術ガイドワイヤーによって通過される。
【００１８】
別の局面において、本発明は、血管内に位置する閉塞部の通過のために血管を作製・準備する方法であり、該方法は、閉塞部位に血管新生薬剤を送達する工程を含む。血管新生薬剤の送達は、薬剤を含有する送達装置を血管に直接挿入して、そこに沈着させる工程を含んでもよい。ある特定の局面においては、該装置は、カテーテルを含み、閉塞部位への薬剤の送達は、カテーテルを通じて薬剤を血管に搬送する工程を含む。カテーテルを通じて薬剤を該部位に搬送するに先だって、カテーテルの遠位端を閉塞部の１０ｃｍ以内に持ってきてもよい。カテーテルの遠位端、即ち薬剤が血管内に移行する送達端部は、しばしば目標部位に直近して、該部位の５ｃｍ以内、又は４ｃｍ以内、又は３ｃｍ以内、又は２ｃｍ以内にまで近接される。閉塞部位への薬剤の送達はしばしば、薬剤を閉塞部に直接接触させる工程を含む。
【００１９】
血管新生薬剤の送達は、閉塞部に近接した血管内への装置の留置を含んでもよく、該装置には薬剤が装填される。該薬剤は、長期間、例えば最大約２時間、又は２０分と９０分の間、又は４０分と６０分の間にわたって装置から放出される。
【００２０】
血管に第二の装置を導入して、薬剤をある期間閉塞と直接接触させて保持してもよい。好ましくは、かかる期間は、閉塞部における血管新生を誘導するために十分である所定の期間である。勿論、必要に応じ、閉塞部内の血管新生は直接的又は間接的にモニターされる。かかる期間は、一日と十週間との間、又は二日と五十日との間、又は三日と四十日との間、又は七日と三十日との間、又は十四日と二十八日との間であり得る。
【００２１】
本発明に主として関連する閉塞した血管構造は、ヒト動脈系、一般的には特に心臓の動脈、末梢動脈、大腿動脈、膝窩動脈、鎖骨下動脈、又は腕動脈である。
【００２２】
本発明は、血管新生薬剤の送達に引き続き、閉塞部内の微細血管発達を監視するための閉塞部モニタリングを含んでもよい。かかるモニタリングは、磁気共鳴を用いた閉塞部の画像診断を包含し得る。
【００２３】
本発明の血管新生薬剤は、血管新生もしくは血管新生促進増殖因子又は／及びサイトカイン、又は本発明の増殖因子又は／及びサイトカインの組合せであって、血管内皮増殖因子；アンギオポエチン１，２；ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、ＴＮＦ−α、内皮由来酸化窒素又は酸化窒素ドナー、増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ｔｉｅ２）、及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１−α、並びにその組合せを含む。
【００２４】
本発明の血管新生薬剤は、幹細胞であってもよく、おそらくは胎児又は成人の骨髄もしくは循環血液又は血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に由来する幹細胞であり、またおそらくはｅＮＯＳ又はＶＥＧＦなどの血管新生増殖因子を過剰発現するようにＥＰＣの遺伝子操作によって血管新生潜在性を増加させた幹細胞である。
【００２５】
本発明は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン又は／及びスタチンなどの増殖因子の送達をさらに含むことによって、血管新生促進因子を循環に動員させるようにしてもよい。
【００２６】
また本発明は、例えばヒアルロナン、フィブロネクチン、パールカン、又は／及びバーシカンなどの血管新生促進性である細胞外マトリックス成分の閉塞部内における過剰発現を誘導することを含んでもよい。
【００２７】
また本発明は、コラゲナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼを閉塞部に送達することによって閉塞部における血管新生を高めることを含んでもよい。
【００２８】
本発明はまた、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を閉塞部に送達することを含んでもよい。
【００２９】
別の局面において、本発明は、慢性完全閉塞症の閉塞部位に、マクロファージの活性化又はマクロファージの走化性をもたらす物質を送達することを含む。
【００３０】
別の局面において、本発明は、哺乳動物のアテローム性動脈硬化性プラークにおける血管新生を誘導又は／及び促進する方法を含み、該方法は、血管新生薬剤をチューブを通じてプラーク部位に経皮的に直接送達することを含んで成る。該チューブは典型的には、プラークを含有する血管に挿入されるカテーテルである。
【００３１】
別の局面に従えば、本発明は、以下の工程を有して成る慢性完全閉塞部を通過する方法である：即ち、（１）血管新生薬剤を含んで成る組成物を閉塞部位に経皮的に送達する工程；（２）血管新生により閉塞部が有する通過に対する感受性を増大させるために十分な時間待機する工程；及び（３）閉塞部を通過する工程。該時間は通常、約２４時間と３ヵ月との間であり、時には少なくとも５日間、又はその他本明細書に記載されるとおりである。
【００３２】
本発明の実施態様の一つは、閉塞した動脈を治療する方法を含み、該方法は、（Ｉ）薬物送達装置を動脈を介して閉塞部にまで前進させるに際して、該装置が血管新生薬剤を含有する組成物を含有すること；（ＩＩ）装置から該組成物を放出して組成物及び閉塞部を相互に接触させること；（ＩＩＩ）該薬物送達装置を取り出すこと；（ＩＶ）ガイドワイヤーによる閉塞部の通過を可能にするために閉塞部において十分な血管新生を生起させるのに十分な時間待機すること；及び（Ｖ）前記ガイドワイヤーを用いて閉塞部を通過することを含む。
【００３３】
本発明は、動脈の閉塞部における血管新生を誘導するための医薬組成物において実施可能であるが、なお該組成物は、ヒトの動脈に位置する慢性完全閉塞部への経皮的送達に好適な形状とした血管新生薬剤を含んで成る。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、動脈の閉塞部における血管新生を誘導するための医薬組成物を含んで成るキットである。該キットは、血管新生薬剤を含有する第一のパッケージと、希釈剤を含有する第二のパッケージとを含む。これらのパッケージの内容物が混合されることによって、カテーテルを介してヒトの動脈内に位置する慢性完全閉塞部に即時送達するのに好適な形状の血管新生薬剤が得られる。
【００３５】
該キットは、閉塞部への組成物送達を行う装置、又は／及び本発明の方法に従ったキットの構成部の使用に関する指示書をさらに含んでもよい。
【００３６】
本発明は、ヒトの血管の閉塞部、要すればヒトの心臓に位置する動脈の慢性完全閉塞部内において血管新生を誘導するための血管新生薬剤の使用を含む。
【００３７】
本発明は、ヒト血管の閉塞部、要すればヒトの心臓に位置する動脈の慢性完全閉塞部内において血管新生を誘導するための医薬を製造するための血管新生薬剤の使用を含む。
【００３８】
例示及び説明の目的のために本発明の特定の局面を選択したのであるが、本発明の範囲を制限することは一切意図されない。本発明の好ましい実施態様は、図面を含む下記する説明・記載に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
血管新生及び血管新生増殖因子
血管新生は、既存の血管構造からの新たな血管の形成に到るプロセスである（５１−５３）。このプロセスは、現存する微細血管の血管拡張及び透過性の増加によって開始される。その後、統合調整されたタンパク質分解が生起し、その結果血管壁の不安定化、内皮細胞の移動及び増殖、並びにその後の管形成がもたらされる（５４，５５）。これら初期内皮管の成熟には支持細胞、周細胞又はＳＭＣの加入及びＥＣＭの沈着が必要である（５６）。血管新生のさまざまな局面に複数の増殖因子が含まれており、該増殖因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及びその受容体ＰＤＧＦＲ−β（５７，５８）、アンギオポエチン−１及びｔｉｅ２受容体（５５，５６，５９−６１）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）（６２）、ＴＧＦβ（６３）、及び内皮由来酸化窒素（６４，６５）を含む。ＶＥＧＦ及びその受容体ＶＥＧＦＲ２は、ここに記載される発明に特に密接な関係がある。
【００４０】
ＶＥＧＦは、主要なプロ血管新生増殖因子であり、内皮細胞の分化、管形成、移動及び増殖を刺激し、内皮透過性を増加させ、内皮生存因子として作用する（６６，６７）。ＶＥＧＦは、組織低酸素の際にアップレギュレートされ（６８−７１）、低酸素に応答して発芽血管新生を促進し（６９，７０，７２）、応答は、ＶＥＧＦ発現の転写調節因子、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）の誘導を含む（７２，７３）。ＶＥＧＦは、内皮細胞に存在する特定の高親和性チロシンキナーゼ受容体ｆｌｋ−１／ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）を通じて自身の生物的効果に介在する（７４，７５）。ラット静脈血栓症モデルにおいて、血栓中のＶＥＧＦ濃度は、１日目から７日目までに倍増した。ＶＥＧＦ抗原は、形成後７日経過した血栓内の単球、内皮細胞及び紡錘状細胞に局在した（７５）。ラットモデルにおける静脈血栓へのＶＥＧＦタンパク質の注入は、対照に比べて血栓再疎通を増加させた（２倍）（７６）。
【００４１】
微細血管画像診断技術
ＣＴＯの画像診断は、従来コントラスト血管造影法に限定されているが、この造影法は、検出器解像度がほぼ２５０ｕｍであること及びより細い冠血管におけるＸ線信号を不透明にするために必要とされるコントラスト濃度が不十分であることの双方によって制約を受ける。またコントラスト血管造影法では、完全閉塞部の組成に関する情報が得られない。血管は、Ｘ線において可視となるためにヨウ素化造影剤によって不透明にされる必要があるため、閉塞部の形状に関して一切情報が得られない。血管造影法において見られるようなＣＴＯ内においてコントラストの「かぶり（ｂｌｕｓｈ）」が存在することは、微細血管の存在を示す可能性があるが、Ｘ線によって像出される画像は、身体全体を投影した画像であるため、このような微細血管の正確な場所、寸法及び数を決定することは出来ない。さまざまな血管画像診断技術があるが、これらは我々のインビボモデルにおけるＣＴＯの研究においては特に有用である。
【００４２】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、インビボでは非侵襲的に比較的低解像度であるものの、高コントラスト感度が得られる。提案されるウサギＣＴＯモデルにおいて小型の局所画像化コイルによる高磁界（３Ｔ）で操作作業することによって、平面内（ｉｎ  ｐｌａｎｅ）で１００−２００ｕｍ（本出願明細書においてｕｍ＝マイクロメートル（すなわちμｍ）である）まで、切断平面（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｌａｎｅ）で約１ｍｍという妥当な空間解像度が得られる。ＭＲＩは、ＣＴＯ画像診断について複数の利点がある。ＭＲＩは、Ｔ１−、Ｔ２−、及びプロトン密度（ＰＤ）強調画像における信号強度に基づいて、脂質、血栓、線維状組織及びカルシウムなどのアテローム性動脈硬化症プラーク成分の空間的組成を決定するための軟組織を識別出来る（７７，７８）。特定のＭＲ造影剤（Ｇｄ−ＤＴＰＡ、クラリスキャン（Ｃｌａｒｉｓｃａｎ））を使用することによって、ＣＴＯの領域内の相対的な細胞外容積及び血液容積の算定が可能となる。Ｇｄ−ＤＴＰＡは、血管構造から細胞外空間に漏出して、当該閉塞部への侵入と分布のＭＲ尺度（７９）は、微細血管の密度と透過性に関連付けることが出来るので、新たな血管形成の環境を反映することが可能となる。第二の造影剤であるクラリスキャン（ＮＣ１００１５０−インジェクション又はフェルグロース（ｆｅｒｕｇｌｏｓｅ）とも称される）は血管内に留まるため、ＣＴＯ内での相対的血液容積を見積もるために用いることが出来る（８０，８１）。Ｇｄ−ＤＴＰＡ及びクラリスキャンのそれぞれによる分布容積及び血液容積の尺度は、Ｔ１強調画像における信号強度から誘導されるが、その理由は、異なるプール間での水の急速な交換を想定して、Ｔ１が、組織中の造影剤の濃度に一次線形的に関連付けられるからである。このように、これらの尺度は、画像診断解像度以下の空間において累積する造影剤に関する情報を提供する。
【００４３】
３ＤマイクロＣＴ（マイクロＣＴ）は、複雑な微視的血管構造の詳細な描画（レンダリング、２０ｕｍ解像度）を提供する比較的新しい高解像度画像診断技術であり、動脈微細血管構造の正確な３Ｄ画像を生成する（８２）。マイクロＣＴは、低密度のクロム酸鉛でドープ処理したシリコンポリマー化合物であるマイクロフィル（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ）（Ｆｌｏｗ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｖｅｒ、Ｍａｓｓ）で灌流された切除血管について、ｅｘ  ｖｉｖｏで行なわれる。この薬剤は、血管空間を小動脈のレベルまで満たし、静脈系にまで到達することはない。我々のグループ及び他のグループによって最近報告されたように（２０，８３，８４）、ＣＴＯにおける微細血管の密度及び分布を評価することによって血管新生応答が定量化される。
【００４４】
実例を見ると、図１（ａ）及び図１（ｂ）は、ヒト冠動脈の慢性完全閉塞部を示す。図１（ａ）は、内皮細胞についてモバット染色（Ｍｏｖａｔ  Ｓｔａｉｎ）したものであるのに対し、図１（ｂ）は、第ＶＩＩＩ因子染色したものである。コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要な構造成分であり、プロテオグリカン類は、閉塞後１年未満のＣＴＯにおいて共通して認められるものである。血管内膜プラークの血管新生チャンネル（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）は、共通して認められ、ＣＴＯの７５％以上において発生する。壊死したコア２０と微細血管２２を認めることが出来る。図１は、ＣＴＯ内において異なる数の微細血管が存在すること及び細胞外マトリックスにおいてコラーゲンが多数を占めることを示す。本発明者らは、ウサギ大腿動脈においてＣＴＯモデルを開発した（８５，８６）が、これは、図２（ａ）から図３（ｂ）に示されるとおり、例えば成熟線維状組織、細い管腔内血管チャンネル、稀な細胞外脂質沈着物、マクロファージ及びリンパ球など、ヒト冠動脈と多くの類似点がある。図２（ａ）及び図２（ｂ）のモバット染色断面は、細胞外マトリックスにおいて稠密なコラーゲンが多数を占めることを示しており、これは、モバット染色において薄茶色−帯黄色染色となる。矢印で示される小さい微細血管は、少数しか存在しない。これらの図において、一般にＣＴＯは参照番号２４で示され、また外膜２６、内部弾性板２８及び媒質３０も認められる。図２とは対照的に、図３（ａ）のＣＴＯには、矢印で示されるマイクロチャンネル（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）が豊富に存在する。このＣＴＯは、病理学上の目的にのみ用い、ガイドワイヤーの試みは行わなれなかった。図３（ｂ）には、矢印で示される複数の微細血管、即ち薄肉のチャンネル及びより肉厚の小動脈の両方を認めることが出来る。プロテオグリカンに一致する微細血管領域に、青色染色が観察された。図３（ｂ）は、ＣＴＯの通過に成功したガイドワイヤーを番号（３２）で示す。図３（ｃ）は、微細血管が多いＣＴＯの別の例である。図３（ｃ）は、矢印で示される広範囲のマイクロチャンネルを有する閉塞後１３週間のＣＴＯのモバット染色を示す。ここでも、プロテオグリカンに富む組織の存在により、微細血管に隣接する青色染色が見られた。図３（ｃ）においては、ガイドワイヤー通過は試みられなかった。
【００４５】
我々は近年、バクテリアコラゲナーゼ調合物の局部送達によりＣＴＯのＥＣＭ組成を変えることによってガイドワイヤー通過を改善する新たなアプローチを報告した。この戦略により、プラシーボと比較したガイドワイヤー通過成功率は、２９％から６２％へと顕著に増加した（８５）。最初の結果は、ヒューマングレードに精製したバクテリアコラゲナーゼを用いて確認された（８６）。
【００４６】
本発明はまた、コラゲナーゼ療法を補足するか、又はコラゲナーゼ欠乏の症例を治療出来る。我々のＣＴＯモデルにおける予想外だが重要な観察結果は、プラーク内微細血管の著しい変動性であった。実験用ＣＴＯ病変の組織学的評価により、微細血管形成の程度とＣＴＯガイドワイヤー通過の成功との相関が示唆された。図２（ａ）及び図２（ｂ）がガイドワイヤー通過に失敗した微細血管のほとんど存在しないＣＴＯを示すのに対し、図３（ｂ）はガイドワイヤー３２による通過に成功した豊富な微細血管を有するＣＴＯの例を示す。微細血管の存在が、より先細り状の閉塞と血管造影上相関することが示され（８７）、これはガイドワイヤー通過の成功にとって好ましい特徴の一つとして確認された。
【００４７】
ＥＣＭ成分の存在が微細血管形成の違いに寄与し得るかどうかを考察するためにモバットスライドを検討したところ、ＣＴＯの無血管領域におけるプロテオグリカンの少ない密性コラーゲン沈着（図２（ａ）、（ｂ））に比べて、血管領域におけるプロテオグリカン豊富な組織（図３（ａ）から（ｃ））に対する染色が増加しているように見えた。｛Ｊｏｈｎ：図４はＶＥＧＦ処理細胞断面のものだ−リナンバーが必要
【００４８】
我々の研究は、ＭＲ画像によりＣＴＯを画像診断し、特徴付けられることを示した。一例を図４（ａ）及び（ｂ）に示すが、これはそれぞれ６週間経過後及び１２週間経過後に画像診断したＣＴＯである。いずれの時点においても、コントラスト血管造影によりＣＴＯ内の流動を示すことはできなかったが、時間によるＣＴＯの伸長が明らかになった。これはＣＴＯの入口部３６と出口部３８との間の距離の増加により示される。図５（ａ）及び（ｂ）が示す通り、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（オムニキャン（Ｏｍｎｉｃａｎ）、Ｎｙｃｏｍｅｄ）を用いたＭＲ画像は、ＣＴＯ内部に造影剤が存在することを示したが、いずれの時点においても入口部３６及び出口部３８におけるものではなかった。これらの図に見られる閉塞した動脈４０の動脈解剖図は、Ｘ線血管造影図において見られるものと類似している。動脈の下に平行脈４２が見られる（図５（ｂ）においてより明らかである）が、これはＸ線よりもＭＲの造影剤に対する感度が高いためである。これは灌流及び血管チャンネルと一致している。しかし、ＭＲは特有の相違点を示した。６週間では、内腔の端縁における２つの長手方向のチャンネル並びに中央及び周囲領域における拡散信号があった。１２週間では、長手方向のチャンネルはもはや存在せず、拡散信号は減少した。Ｇｄ−ＤＴＰＡによるＴ１強調信号変化を用いて、組織容積に占める造影剤のパーセンテージ（「分布容積スコア」）を見積もると、６週間ではＣＴＯの中心（「本体」）で１８％、出口部で４％であった。１２週間では、本体における分布容積スコアが３％に減少したのに対し、出口部では６％という比較的一定の値を有した。これらの測定の対象領域を図６（ａ）及び（ｂ）に示す。前述のとおり、入口部３６及び出口部３８がガイドワイヤーによる通過に対する主要な障害を示し、ＣＴＯ中心体による抵抗はずっと少ない。さらに古い病変ほど抵抗は大きい。ガドリニウム系細胞外造影剤であるオムニスキャンの注入４秒後の容積分布は、直接充填された微細血管構造及び閉塞した血管内の間隙容積に関係する。よって、分布容積スコアと血管分布及び通過の容易さとの間に正の相関があるという仮説が立てられた。６週間の時点で見られる長手方向のパターン及びより高い分布容積は、微細血管形成（すなわちＣＴＯの大部分を通る直接の経路）か、又は微細血管形成の重要な要因となる刺激である炎症もしくはＥＣＭ組成による細胞外空間の増加のいずれかによるものと考え得る。Ｇｄ−ＤＴＰＡは、血管空間に限らず細胞外空間にも分布するため、両方の可能性がある。
【００４９】
図７から図９に見られるとおり、マイクロＣＴを用いることにより、慢性完全閉塞内の実際のマイクロチャンネルを実証することが出来る。図７Ｃに示す解像度の低いマイクロＣＴ（８６ミクロン）は内腔の外側の側副血管を示すためには非常に有用であるが、管腔内微細血管は検出しないことがある。しかし、図８に示す解像度の高いマイクロＣＴ画像（１７ミクロン）を使用すると、ＣＴＯの入口部の直遠位及び出口部位の直近位の極小微細血管を実証出来る。図９では、ＭＲ画像においてＧｄ−ＤＴＰＡが出口部の直近位に見られ、出口部直前に微細血管が存在することを示唆している。しかし、この微細血管の直近位には、Ｇｄ−ＤＴＰＡがＣＴＯ内腔に存在する証拠はなく、そこに微細血管がないことを示している。
【００５０】
本発明は、管腔内微細血管形成を増進することによってＣＴＯにおけるガイドワイヤー通過率を改善するための戦略を含む。初期の研究により、細胞ベースのアプローチによる遺伝子療法の実行可能性が確立された。これは、コラゲナーゼ注入の項で先に説明したように（８５）、オーバーザワイヤー（ｏｖｅｒ−ｔｈｅ−ｗｉｒｅ）血管形成バルーンカテーテルのワイヤーポートを通じて、生存細胞のみに存在する赤色セルトラッカー（ｃｅｌｌ−ｔｒａｃｋｅｒ）色素である蛍光標識クロロメチルトリメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ）でラベルしたウサギ線維芽細胞（ＦＢ）を送達することによって達成された。ＣＭＴＭＲはエクスビボラベルしたＦＢを検出する方法を提供するが、それはこの分子が細胞の細胞質に入った後に不可逆的にエステル化及びグルクロン酸化され、膜不浸透性の最終生成物を生じるためである。この活性蛍光標識は、ラベルされた元の細胞から隣接細胞又は組織に拡散不可能なため、インビボで数ヵ月間検出され得る。注入の４時間後、我々はＣＴＯのいくつかのレベルにおいてこれらの蛍光ラベルされたＦＢの集団を見出し（図１０）、局所遺伝子発現に対する妥当な滞留時間を示した。ＣＭＴＭＲラベルされたウサギ線維芽細胞３４は、閉塞後１２週間のＣＴＯにおいて、注入の４時間後に図１０（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）において暗色として出現した。これらの断面は、閉塞開始部から約６−１０ｍｍに位置する。図４（ａ）及び図４（ｂ）において、自己蛍光作用により、内弾性板２８が顕著に示されている。
【００５１】
ＶＥＧＦは実験的血管モデルにおいて血管新生を誘導することが示されており（８８−９０）、現在心筋虚血及び末梢血管疾患に対する臨床試験において有望な予備結果が得られている（９１−９４）。研究により、細胞送達の部位における高レベルのＶＥＧＦ発現及び肺高血圧モデルにおける細胞ベースの送達を利用した平滑筋細胞の移植（９５）が明らかになった。動物モデルを用いた血管新生誘導の実行可能性確立において細胞ベースの戦略を用いるもう一つの理由は、他の方法による場合と比較して、トランスフェクションに必要な、１２週間経過時のコラーゲンに富むＣＴＯにおける「天然」細胞数が比較的少ないためである。
【００５２】
慢性的に閉塞した動脈における管腔内微細血管を増加させるためのＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞の局所送達を用いた血管新生療法の実行可能性研究は、以下のように行なわれた。最初に、静脈平滑筋細胞を培地で育て、送達に十分な数の細胞を得た。これには約２週間を要した。ウサギの外頸静脈を取出し、外植法により静脈平滑筋細胞を培地に入れた。
【００５３】
平滑筋細胞はヒトＶＥＧＦトランスジーンを用いてトランスフェクトした。継代培養（ｐａｓｓａｇｅ）＃２＿から得た平滑筋細胞に、スーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）（登録商標）トランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、血清及び抗生物質を含まないＤＭＥＭ中でＶＥＧＦプラスミド又はヌル（ｎｕｌｌ）プラスミドをトランスフェクトし、これを３時間インキュベートした。プラスミドを含有する媒質を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。次いで、抗生物質及び１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを５ｍｌ加え、４８時間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、ヒトＶＥＧＦイムノアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて条件付媒質においてＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡを行ない、ＶＥＧＦタンパク質発現（１．７３−１．８２ｎｇ  ＶＧＦ／ｍｌの範囲）を確認した。トランスフェクションの４８時間後、平滑筋細胞をトリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した（２０００ｒｐｍ、２分間）。細胞を０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、動物への注入前は氷上に保った。
【００５４】
懸濁液中のＶＥＧＦトランスフェクト細胞は、次いで血管形成バルーンカテーテルのワイヤーポートを通じて局所送達した。各ウサギは、当該ウサギの頸静脈由来の静脈平滑筋細胞を用いて処理した。ウサギに麻酔をかけ、４Ｆ動脈鞘を左頸動脈に挿入した。オーバーザワイヤー血管形成バルーンカテーテルを、透視法ガイダンス下で大腿動脈完全閉塞に直接隣接するまで前進させた。血管形成バルーンは、逆流及び側枝へ落ち込むことを防ぐため、４気圧で膨張させた。ガイドワイヤーをガイドワイヤーポートから取り除き、ＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞を含有する懸濁液（０．５ｍｌ）をワイヤーポートからゆっくりと注入し、膨張させたバルーンと慢性完全閉塞との間の狭い空間を充填した。次いでカテーテルを０．５ｍｌの０．９％食塩水ですすぎ、カテーテル中に細胞懸濁液が全く残らないようにした。血管形成バルーンは４５分間膨張したままの状態を保った後、収縮させて取り除いた。次いで動物を回復させた。
【００５５】
約３週間微細血管を形成させた後、ウサギのＧｄ−ＤＴＰＡによるＭＲＩ画像診断を行った。ＭＲＩ走査後に動物を殺し、マイクロＣＴ検査のためにマイクロフィルを８０ｍｍＨｇの圧力下で腹大動脈を経て閉塞動脈に注入した。動脈部分を取り出して組織を１０％ホルマリン中で固定し、処理した後、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）並びにモバット染料によって染色した。
【００５６】
殺した時点で約９ヵ月であったウサギＣＴＯの結果を図１１（ａ）、図１１（ｂ）及び図１１（ｃ）に示す。図１２（ａ）は左大腿動脈のＣＴＯのＧｄ−ＤＴＰＡ注入後のＭＲ画像であり、この閉塞は平滑筋細胞処理を受けていない。図１１（ｂ）は同じウサギの右大腿動脈のＧｄ−ＤＴＰＡ注入後のＭＲ画像であるが、この閉塞には８ヵ月の時点で３×１０５ＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞を注入し、その３週間後に殺したものである。図１１（ｂ）の慢性完全閉塞におけるガドリニウム吸収の存在（矢印で示される）は、そこでの新たな血管形成の証拠であり、閉塞の通過成功の可能性の増加を立証している。図１２はやはり８ヵ月においてＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞で処理し、３週間後に殺した別のウサギのＣＴＯである。モバット染色した動脈断面は、黒色マイクロフィルムで充填した微細血管を多数有するＣＴＯ（２４）を示し、ガイドワイヤー通過の成功にとって重要な微細血管形成を再度示唆している。
【００５７】
本研究の結果は、ＶＥＧＦ処理した慢性完全閉塞において微細血管形成が実証されたことを示唆している。図１１（ｂ）に例示されるとおり、ＶＥＧＦ処理されたＣＴＯ内のＭＲ画像のいくつかは、ＣＴＯの近位及び中間部分へのガドリニウム吸収を示した。これは図１１（ａ）に例示される同じ動物の未処理ＣＴＯとは対照的である。本研究及びＣＴＯに対する過去のＭＲＩ研究において、かかる未処理ＣＴＯは、１２週間又はそれ以上の慢性完全閉塞において本質的にガドリニウム吸収を示さなかった。８ヵ月を超える慢性完全閉塞におけるガドリニウム吸収の存在は、新たな血管形成の証拠である。ＶＥＧＦ処理ＣＴＯにおけるこれらの微細血管は、図１２に見られる複数の血管チャンネルを示すモバット染色した動脈断面において確認された。これらの血管チャンネルは、マイクロＣＴ画像診断に用いたマイクロフィルムで充填した。マイクロフィルはＣＴＯ内の血流の部位を特定し、これらの微細血管が機能したことを示すものである。
【００５８】
こうして、ＣＴＯにおいて血管新生及び微細血管形成をもたらすＶＥＧＦの効用が実証された。当業者に認識されるとおり、血管新生を誘導するための他の方法も利用可能であり、本発明の部分として用いられ得る。かかる方法のいくつかは、ここに記載するアプローチよりも実用的又は経済的理由からより有効又は好ましいことが見出されるかもしれない。血管新生を誘導するためのこれら他のアプローチは本発明に包含されることが意図される。本発明の状況において、「血管新生薬剤」とは血管新生を促進することが知られる薬剤、分子、薬物、タンパク質又はその他の因子であり、当該技術分野において公知である血管新生因子及びプロ血管新生因子の両方を含む。
【００５９】
本発明の血管新生もしくはプロ血管新生増殖因子又は／及びサイトカイン、又は増殖因子又は／及びサイトカインの組合せは、血管内皮増殖因子；アンジオポエチン１，２；ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−β、肝細胞増殖因子、ＴＮＦ−α、内皮由来酸化窒素又は酸化窒素供与体、増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ｔｉｅ２）、及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１−αを含む。
【００６０】
胎児又は成人の骨髄もしくは循環血液又は血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）から生じる幹細胞も本発明に包含される。どちらの細胞型も高度な血管新生性を有する（９５，９６）。これらの細胞の潜在的血管新生性は、ｅＮＯＳ又はＶＥＧＦなどの血管新生増殖因子を過剰発現させる遺伝子操作をＥＰＣに施すことにより、さらに強めることが出来る（９７，９８）。加えて、プロ血管新生因子骨髄幹細胞及び血管内皮前駆細胞を循環部に移動させる増殖因子（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン及びスタチンなど）（９９）も本発明の部分である。
【００６１】
ヒアルロナン、フィブロネクチン、パールカン、又は／及びバーシカンなどのプロ血管新生性を有する細胞外マトリックス成分のＣＴＯにおける過剰発現。コラゲナーゼなどのマトリックスメタロプロテイナーゼは血管新生を高めることが示されており、コラゲナーゼとの組合せ療法も本発明の部分として用いられ得ることを示唆する。
【００６２】
炎症性細胞及びメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）も本発明の部分である。特にマクロファージは血管新生を高めることが示されている。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）は造血増殖因子であり、単核食細胞の生存、増殖、分化及び活性化を誘導し、血管新生を促進する（１００）。さらに、マクロファージの活性化、慢性完全閉塞へのマクロファージの走化性、又は腹膜洗浄流体から予め得られた自己活性化マクロファージ（ラット及びウサギにおいて既に成功しているこの手順では、リン酸緩衝生理食塩水を腹膜内に注入し、２０−３０分間の待機期間の後に回収する。マクロファージを単離し、特定の培地で培養する（１０１））の局所送達を引き起こす物質も含まれる。
【００６３】
本発明の血管新生薬剤の投与、又はかかる投与のための血管新生薬剤の調製に対する他のアプローチも本発明に包含される。投与に対するアプローチは、遊離物質としての、又は他の送達方法と組み合わせた増殖因子又はプロ血管新生物質の局所又は全身的な注入を含む。局所送達方法は、細胞ベースの送達（例、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞又は幹細胞（胎児又は成人の骨髄もしくは循環血液から単離）、血管新生因子を過剰発現するよう遺伝子操作されていてもいなくてもよい）、又は、裸のＤＮＡプラスミド、ウイルス性ベクター、ナノ粒子、ビーズ、ポリマープラットフォーム、及び血管内ステントなどの細胞ベースでない送達療法を含む。血管新生ポリマープラットフォームの例には、血管新生セラマー（Ｔｈｅｒａｍｅｒｓ）（Ｒｉｍｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、トロント、カナダ）が含まれる。セラマー（登録商標）は、薬物の使用なしに、それ自体が生物活性を有する医療ポリマーであり、固体（例、ビーズ、骨格及びコーティング）として使用されることが意図される。代替的には、血管新生ポリマーは可溶性物質として、ゲルに取り入れて、又は他の注入可能調合物に発展させて局所的に送達されてもよい。
【００６４】
２００３年４月１０日に公開されたＷＯ０３／０２８７５６にはＣＴＯへの異なる局所送達方法が記載及び例示されており、これはステント支柱上に直接、又は被覆されたステント内に、又は他の送達装置によってステントに組み入れられた、バルーン血管形成カテーテル中のオーバーザワイヤーポートを含む。
【００６５】
本発明は、動脈の閉塞における血管新生を誘導するための医薬組成物で構成されるキットであってもよい。該キットは、血管新生薬剤を含有する第一のパッケージと、希釈剤を含有する第２のパッケージとを含む。これらのパッケージの内容物を混合すると、ヒトの動脈に位置する慢性完全閉塞へ、カテーテルを通して直接送達するのに適した形態の血管新生薬剤が生成する。一般的な医薬投与のガイドラインは、たとえば「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、及び「最新の薬剤学（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）」第２版，Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０などに与えられており、その両方がここに引用により一体化・合体される。
【００６６】
血管新生を誘導するための機械的な方法が公知であり、本発明の部分であることが意図される。かかる方法は局所のカテーテルベースの寒冷療法（温度範囲１０℃から−５０℃）を含む。ＣＴＯの入口へ寒冷カテーテル（ｃｒｙｏｃａｔｈｅｔｅｒ）を直接当てることにより、その部位における血管新生を高めることが出来る（１０２）。ＣＴＯの入口部位に対するさまざまな形の局部レーザ切除によっても同様の効果が起こり得る（１０３）。
【００６７】
たとえば肢などの末梢ＣＴＯの場合には、たとえば小さな切開部を通じた注入などによって血管外膜周囲から血管新生薬剤を送達してもよい。
【００６８】
構成要素の特定の組合せを記載したが、発明者の意図はそれを本発明の部分として含むことであり、ここに記載される構成要素の他の組合せも本発明の部分として含まれる。
【００６９】
参考文献
本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体がここに再現されたのと同様にここに引用により一体化・合体される。
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ヒト冠動脈慢性完全閉塞を示す図である：（ａ）モバット染色；及び（ｂ）第ＶＩＩＩ因子染色（内皮細胞に対する）。
【図２】ガイドワイヤー通過に失敗した１６週間の動物モデルＣＴＯの（ａ）モバット染色；並びに（ｂ）ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を示す図である。
【図３】（ａ）豊富なマイクロチャンネルを有する１２週間のＣＴＯ；（ｂ）ガイドワイヤーによる通過に成功した１８週間のＣＴＯ；及び（ｃ）広範囲のマイクロチャンネルを有する１３週間のＣＴＯのモバット染色を示す図である。
【図４】ウサギの大腿動脈ＣＴＯの（ａ）６週間及び（ｂ）１２週間におけるＸ線血管造影図である。
【図５】ＭＲ画像である。（ａ）６週間及び（ｂ）１２週間におけるＣＴＯに対するＧｄ−ＤＴＰＡの注入前対注入後の信号差を表わす３Ｄマップからの最大値投影法（ＭＩＰ）。元の画像は、病変上で３×５ｃｍ表面コイルを用いたＧＥ社製３Ｔスキャナにおける３Ｄスポイル型グラジエントエコー（ｓｐｏｉｌｅｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｃｈｏ）法によって得られた。データセットの面内解像度は約２７０uｍであり、面垂直解像度は１ｍｍである。
【図６】さまざまな領域におけるＧｄ−ＤＴＰＡ分布容積スコアの算出に用いられた目的の領域を、（ａ）６週間及び（ｂ）１２週間におけるこれらの算出に用いられたコントラスト強調画像において示す図である。これらの画像に対する取得パラメータは図５に対して記載されたものと同じであった。
【図７】（ａ）１２週間における慢性完全閉塞のＸ線血管造影図；（ｂ）Ｇｄ−ＤＴＰＡ注入後のＭＲＩ信号を注入前の信号から差し引くことによって得られた差分画像からの、同じ閉塞の３Ｄ  ＭＩＰ；（ｃ）同じ領域の低解像度（８６ミクロン）マイクロＣＴ画像を示す図である。マイクロＣＴを含むすべての画像が、閉塞をブリッジするさまざまな側副枝を示す。
【図８】図７において示される閉塞領域の高解像度（１７ミクロン）マイクロＣＴ画像を示す図である。閉塞内には、微細血管とともに、出口部及び入口部並びに側副血管が見られる。入口及び出口における「微細血管」は元の内腔の伸張部が狭窄したものであるかもしれない。図９（ａ）乃至（ｃ）のスライス位置をそれぞれａ乃至ｃとラベルした線で示す。
【図９】図９（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、閉塞した動脈を通るさまざまなスライスにおけるＧｄ−ＤＴＰＡ分布を示す（図８（ｂ）と同様のデータセットからの）断面ＭＲＩ差分画像を示す図である。出口部に関する断面の位置は、図８（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）においてそれぞれ線ａ、ｂ及びｃとして示す。
【図１０】ＣＭＴＭＲラベルしたウサギ線維芽細胞の注入後４時間における閉塞後１２週間のＣＴＯからの（ａ）及び（ｂ）：共焦点蛍光画像；（ｃ）及び（ｄ）：Ｈ＆Ｅ染色した動脈断面を示す図である。ＣＭＴＭＲラベルしたウサギ線維芽細胞は異なるレベルのＣＴＯにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）において暗色を示す。
【図１１（ａ）】ウサギ左大腿動脈におけるＣＴＯのＭＲ画像を示す図である。ＣＴＯは閉塞後約９ヵ月である。この未処理ＣＴＯはＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞の注入を受けていない。Ｇｄ−ＤＴＰＡ後のＭＲ画像診断は、ＣＴＯ内の血流のいかなる証拠も示さなかった。
【図１１（ｂ）】図１１（ａ）と同じウサギからの右大腿動脈を示す図である。このＣＴＯは８ヵ月において３×１０５ＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞で処理された。図１１（ｂ）の慢性完全閉塞の内腔におけるガドリニウム吸収の存在（矢印）（図１１（ａ）に示される未処理ＣＴＯにはない）は、ＣＴＯの閉塞した内腔における微細血管形成の証拠であり、閉塞の通過成功の可能性増加を確立するものである。
【図１２】約７ヵ月においてＶＥＧＦトランスフェクト平滑筋細胞で処理され、その３週間後に殺された異なるウサギＣＴＯからの図である。モバット染色した動脈断面は、黒色のマイクロフィルムで充填された多くの微細血管を有するＣＴＯ（２４）を示し、ガイドワイヤー通過の成功にとって重要な微細血管形成を再度示している。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図１０（ｃ）】
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【図１０（ｄ）】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１２】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図８】
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【図９】
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【図１０（ａ）】
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【図１０（ｂ）】
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【国際調査報告】
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