(57)【要約】本発明は病原性微生物によって発現される抗原性ポリペプチド、該ポリペプチドを含むワクチン；該ポリペプチドに対する治療的抗体、並びに該ポリペプチド、ワクチン及び抗体を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）図１から６に示される核酸配列、
ｉｉ）病原体によって発現されるポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸配列、
ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）で同定される配列とハイブリダイズする核酸配列；及び
ｉｖ）遺伝子コードの結果として（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で同定される核酸配列に縮退する核酸配列：
からなるグループより選択される単離された核酸配列によってコードされる、医薬として使用するための抗原性ポリペプチド又はその一部。
【請求項２】
前記医薬がワクチンである請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原性ポリペプチドをコードする核酸がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図１から６に示される核酸配列、又はその相補鎖とアニールする、請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項４】
前記抗原性ポリペプチドが病原体によって発現される請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項５】
前記病原体が細菌である請求項４に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項６】
前記細菌がグラム陽性細菌である請求項５に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項７】
前記細菌が：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｉｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ａ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ；Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓａｐｓｕｌａｔｕｍ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｂ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍからなるグループより選択される、請求項５に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項８】
細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．属である請求項５に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項９】
細菌がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである請求項８に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項１０】
前記抗原性ポリペプチドが図７から１２に示されるアミノ酸配列の全て、又はその一部を含む請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗原性ポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換え抗原性ポリペプチドの製造方法であって：
（ｉ）請求項１１のベクターで形質転換／形質移入された細胞を提供し、
（ｉｉ）該ポリペプチドの製造に適した条件で該細胞を生育させ、及び
（ｉｉｉ）該細胞又はその生育環境から該ポリペプチドを精製する、
ことを含む製造方法。
【請求項１３】
請求項１１のベクターで形質転換又は形質移入された細胞又は株化細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の少なくとも１つの抗原性ポリペプチド又はその一部を含むワクチン。
【請求項１５】
前記ワクチンが担体及び／又はアジュバントをさらに含む請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
前記ワクチンが、サブユニットワクチンであって、該ワクチンの抗原性部分が請求項１の抗原性ポリペプチドの断片又はサブユニットである、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
動物に病原性微生物に対する免疫を獲得させる方法であって、該動物に対し請求項１の少なくとも１つの抗原性ポリペプチド、又はその一部を投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが請求項１４のワクチンの形式である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
薬理学的に許容な担体又は希釈剤と請求項１に記載の抗原性ポリペプチドの少なくとも１つ、又は請求項１４に記載のワクチンとの組み合わせの有効量を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１の少なくとも１つの抗原性ポリペプチド又はその一部と結合する抗体又は少なくともその有効な結合部分。
【請求項２１】
前記抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体である請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、該抗体可変領域を含み、ヒト抗体の不変又は定常領域を有する、組換法により製造されるキメラ抗体である請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、該抗体の相補性決定領域と定常（Ｃ）領域及びヒト抗体の可変（Ｖ）領域由来のフレームワーク領域の両方と結合させる組換え方法によってヒト化される請求項２０に記載の抗体。
【請求項２４】
請求項２２に記載のキメラ抗体又は請求項２３に記載のヒト化抗体をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４のベクターで形質転換又は形質移入された細胞又は株化細胞。
【請求項２６】
ｉ）請求項２４のベクターで形質転換又は形質移入された細胞を提供し；
ｉｉ）該抗体の製造に適した条件で該細胞を生育させ；及び
該細胞又はその生育環境から該抗体を精製することを含むヒト化又はキメラ抗体の製造方法。
【請求項２７】
ｉ）図７から１２に表されるアミノ酸配列又はその断片を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原で免疫応答性動物を免疫し；
ｉｉ）ハイブリドーマ細胞を作製するために免疫された免疫応答性動物のリンパ球とミエローマ細胞を融合させ；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体を（ｉ）のアミノ酸配列との結合活性についてスクリーニングし；
ｉｖ）増殖し、及び／又は該モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ株化細胞を培養し；
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する：
工程を含むハイブリドーマ株化細胞を調製する方法。
【請求項２８】
微生物の感染又は微生物関連疾患の治療又は予防のための医薬の製造における請求項１に記載の抗原性ポリペプチドの使用。
【請求項２９】
微生物の感染が：
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｌｙｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ａ又はＢ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｐｐ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｐｐ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ；例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ及びＢ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、
からなるグループより選択される細菌種由来の細菌性病原体によって引き起こされる細菌性感染である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
微生物関連疾患が、敗血症；結核症；細菌性食中毒；血液感染；腹膜炎；心内膜炎；骨髄炎；セプシス；皮膚疾患；髄膜炎；肺炎；胃潰瘍；淋疾；連鎖球菌性咽頭炎；連鎖球菌性毒性ショック；壊死性筋膜炎；膿痂疹；ヒストプラスマ症；ライム病；胃腸炎；赤痢；細菌性赤痢、から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ関連疾患である、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
微生物感染の治療のための医薬の製造における請求項２０に記載の抗体の使用。
【請求項３２】
患者に請求項１に記載の抗原性ポリペプチド、又は請求項１４に記載のワクチン、又は請求項２０に記載の抗体を投与することを含む患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は病原性微生物によって発現される抗原性ペプチド、抗原性ポリペプチドを含むワクチン、及び抗原性ポリペプチドに対する治療的抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の医学的進歩に直面する問題は、多くの重大な病原性微生物の抗生物質耐性株の進化である。発達した抗生物質耐性を有する病原性生物の例として、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．）を上げることができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、その通常の生息場所が正常健康人の約２０−４０％の鼻の上皮裏打ちであり、また、通常は害を引き起こすことなくヒトの皮膚上に認められる細菌である。しかし、ある環境下、特に皮膚がダメージを受けている場合、この微生物は感染を引き起こす。このことが、患者が外科的治療及び／又は免疫抑制薬を受ける病院において特別な問題となっている。これらの患者は彼らが受けた治療の影響でＳ．ａｕｒｅｕｓの感染に極端に脆弱となる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの耐性株はここ数年増大している。メチシリン耐性株が蔓延しており、これら耐性株の多くは他のいくつかの抗生物質に対しても耐性を示す。現在、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する有効なワクチン接種方法は存在しない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、直接的耐性病原株の問題が回避又は減少される、潜在的なワクチンの成分及び療法の同定に関する。
【０００４】
土壌グラム陽性細菌である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体に存在するおよそ４１００遺伝子の中で、２７１は生育にとって不可欠（「必須」）であり、そのうち２３は、その生物の生理現象における役割が不確定である（ｇｃｐ，ｏｂｇ，ｐｐａＣ−ｙｙｂＱ−，ｔｒｍＵ，ｙａｃＡ，ｙａｃＭ，ｙｄｉＢ，ｙｄｉＣ，ｙｊｂＮ，ｙｋｑＣ，ｙｌａＮ，ｙｌｏＱ，ｙｌｑＦ，ｙｍｄＡ，ｙｎｅＳ，ｙｐｈＣ，ｙｑｅＨ，ｙｑｅＩ，ｙｑｊＫ，ｙｒｖＯ，ｙｓｘＣ，ｙｔａＧ，ｙｗｌＣ）（Ｋｕｎｓｔら  １９９７）。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質のホモログは、これまでに配列決定された他のグラム陽性細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．）の種々の株において見出されている。それらの中で、Ｇｃｐ及びＹｎｅＳオルソログは、膜タンパク質と予想されるが（付録Ｉを参照のこと）、その他は細胞質タンパク質として予想される（データは示さず）。それにも関わらず、ＯｂｇはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの膜に一部結合することが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら  ２００１）。
発明者らは、病原体であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｕｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの生育に必須の成分であるポリペプチドを単離し、これらのポリペプチドに対し抗体を作製した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉのポリペプチドに対する血清は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに関し極めて効果的な殺菌能力を示すことが明らかになった。この効果はこれまで予測されていないかった。
本発明の発見は、抗生物質耐性などの現在の治療のいくつかの問題を緩和するワクチン及び抗体療法の開発を促進するものである。
【０００５】
本開示の簡単な要約
本発明は、グラム陽性細菌である病原性枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の生育に必須で、微生物感染の治療又は防御において有用である抗原性ポリペプチドを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の最初の態様によると、
ｉ）図１から６に示される核酸配列、
ｉｉ）病原体によって発現されるポリペプチドをコードする（ｉ）の核酸配列、
ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）として同定される配列とハイブリダイズする核酸配列；及び
ｉｖ）遺伝子コードとして（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）として同定される核酸配列に縮退する核酸配列：
からなるグループより選択される核酸配列によってコードされる、医薬として使用するための抗原性ポリペプチド又はその一部が提供される
本発明の好ましい態様において、医薬はワクチンである。
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドをコードする核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で図１から６に示される核酸配列又はその相補鎖とアニールしてもよい。
【０００７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄条件とは、当該技術分野において周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の洗浄後において安定な核酸ハイブリッドなどである。核酸の配列が既知の場合、至適なハイブリダイゼーション条件を計算できることは当該技術分野においては周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの対象たる核酸のＧＣ含量によって決定される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。特定の相同性を持つ核酸間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための一般式は：
Tm= 81.5℃ + 16.6 Log [Na+] + 0.41 [% G + C] -0.63 (% ホルムアミド).
【０００８】
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドをコードする核酸は、図１から６に示される配列、又は図１から６に示される核酸配列と核酸残基レベルで少なくとも６０％，６５％，７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，例えば、９８％，又は９９％の同一である。
「同一性」とは、当技術分野で知られているように、配列を比較することにより決定される２又は複数のポリペプチド配列、又は２又は複数のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当該技術分野において、同一性はポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性のレベルも意味し、場合によっては、これらの配列の文字列間の一致度によって決定される。同一性は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編集，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編集，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列間の同一性を測定する数多くの方法が存在するが、そのターム（ｔｅｒｍ）は当業者にとって周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編集，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））。配列間の同一性を同定するために通常用いられる方法には、限定はしないが、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）中に開示されるものが含まれる。同一性を同定するための好ましい方法は、テストされる配列間に最大の一致度を与えるようにデザインされる。同一性を決定する方法はコンピュータープログラム中に体系化される。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、限定はしないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））が含まれる。
【０００９】
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドをコードする核酸は、その長さが、例えば、少なくとも３０塩基長、４０、５０、６０、７０、８０又は９０塩基である最初の配列の断片を含んでもよい。
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドは、細胞膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質又は細胞質性タンパク質である。
好ましくは、本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドは、病原性生物、例えば、細菌、ウィルス又は酵母によって発現される。好ましくは、病原性生物は細菌である。細菌はグラム陽性又はグラム陰性細菌であり、好ましくはグラム陽性細菌である。
【００１０】
細菌は以下のグループから選択されてもよい：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｉｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ａ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ；Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ；Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓａｐｓｕｌａｔｕｍ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｂ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ。
好ましくは、細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．属に含まれる。さらに好ましくは、細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓである。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドがここで定義される生物の感染性病原性に関連する。
本発明のさらに好ましい態様において、抗原性ポリペプチドは図７から１２に示されるアミノ酸配列の全て又は一部を含んでいる。
ここで使用される「一部」には、少なくとも１０，１５，２０又は３０アミノ酸長のポリペプチド断片が含まれてもよい。
本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチドは、例えば、ポリサッカライド抗原などの非タンパク質性抗原を含んでもよい。
ここで使用されるように、「ポリペプチド」なる用語は、概括的には、ペプチド結合によって結合される複数のアミノ酸残基を意味する。ペプチド、タンパク質、オリゴペプチド又はオリゴマーと交換可能に使用され、同じものを意味する。また、「ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの断片、アナログ及び誘導体を含むことが意図されており、該断片、アナログ又は誘導体は対照とされるタンパク質と同じ生物学的活性又は機能を本質的に保持している。
【００１２】
本発明の第２の態様において、本発明の最初の態様のポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
本発明の第２の態様のベクターは、プラスミド、コスミド又はファージであってもよい。該ベクターには、細胞特異的な発現をメディエートする転写制御配列（プロモーター配列）、例えば、細胞特異的、誘導性又は構成的プロモーター配列を含んでもよい。ベクターは、原核生物又は真核生物の遺伝子発現に適合された発現ベクターであり、例えば、該ベクターには１又は複数の選択マーカー及び／又は、真核細胞又は原核細胞のいずれかにおいて該ベクターの維持を促進する自立複製配列が含まれていてもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ及びこれに含まれる参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＶｏＩ  ＩＩＩ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ  Ｍ  Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４））。自律的に複製されるベクターはエピソーム型ベクターと呼ばれる。
【００１３】
プロモーターは当該技術分野において認知されている用語で、遺伝子の転写開始部位の５’側にしばしば見出されるシス作用性の核酸配列であるエンハンサーエレメント（エンハンサーは遺伝子配列の３’側にも見出され、又はイントロン配列にさえも位置し、従って、位置非依存的である）を含んでいる。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用性転写因子（ポリペプチド）に応答する。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ  Ｓ  Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏによるＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓを参照のこと）は、中間代謝産物（例えば、グルコース、脂質）、環境影響因子（例えば、光、熱）を含む多くの環境的合図（ｃｕｅｓ）に応答する。
【００１４】
また、プロモーターエレメントは、いわゆるＴＡＴＡ  ｂｏｘと転写開始部位を選択するために機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列も含んでいる。また、これらの配列はＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を促進するために機能するポリペプチドにも結合する。
本発明の第２の態様のベクターは、転写終結又はポリアデニル化配列を含んでもよい。また、これには、リボソーム内部侵入部位（ＩＲＥＳ）が含まれてもよい。本ベクターには、２シストロニック又はマルチシストロニックな発現カセット中に配置される核酸配列が含まれていてもよい。
【００１５】
本発明の第３の態様によれば、
（ｉ）第２の態様のベクターで形質転換／形質移入された細胞を提供し、
（ｉｉ）該ポリペプチドの製造に適した条件で該細胞を生育させ、及び
（ｉｉｉ）該細胞又はその生育環境から該ポリペプチドを精製する、
ことを含む本発明の前述のいずれかの態様による組換え抗原性ポリペプチドの製造のための方法が提供される。
第３の態様の方法のより好ましい態様は、本ベクターがコードすることにより、該組換えポリペプチドには、該ポリペプチドの精製を促進するための分泌シグナルと共に提供される。
【００１６】
本発明の第４の態様よれば、本発明の第２の態様によるベクターで形質転換又は形質移入された細胞又は株化細胞が提供される。
本発明のより好ましい実体形態において、該細胞は原核細胞、例えば、酵母又は大腸菌などの細菌である。あるいは、該細胞は、カビ細胞、昆虫細胞、両生類細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ細胞、ボーズメラノーマ及び他の適当なヒト細胞などの哺乳類細胞、又は植物細胞である。
【００１７】
本発明の第５の態様によると、少なくとも１つの抗原性ポリペプチド又はその一部を含むワクチンが本発明の最初の態様により提供される。好ましくは、該ワクチンは担体及び／又はアジュバントをさらに含む。
ここで使用される「その一部」には、抗原性ポリペプチドの断片又はサブユニットが含まれてもよいが、該断片又はサブユニットはレシピエントの抗原性応答性を誘導するのに十分なものである。
第５の態様によるワクチンは、サブユニットワクチンであって、該ワクチンの抗原性部分が本発明の第５の態様による抗原性ポリペプチド断片又はサブユニットである。
アジュバント及び担体という用語は、以下の様に解釈される。いくつかのポリペプチド又はペプチド抗原はＢ細胞エピトープを含むが、Ｔ細胞エピトープは含まない。免疫応答性は、ポリペプチド／ペプチド中にＴ細胞エピトープを包含することにより、又はキーホールリンペットヘモシアニンや複数のＴ細胞エピトープを含む破傷風トキソイドなどの抗原性担体タンパク質とポリペプチド／ペプチドを結合させることにより、顕著に増強される。結合体は抗原提示細胞によって取り込まれ、プロセスされ、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ’ｓ）クラスＩＩ分子によって提示される。これにより、エピトープに由来する担体に特異的なＴ細胞により、オリジナルの抗原性ポリペプチド／ペプチドに特異的なＢ細胞に供されるＴ細胞の補助が可能になる。この結果、抗体の産生、分泌及びアイソタイプの変換が増大される。
【００１８】
アジュバントは、免疫細胞の活性を調節することにより、抗原への特異的な免疫応答性を増大させる物質又は手段である。アジュバントの例には、例としてのみ挙げると、同時刺激性分子に対するアゴニスト抗体、フロイントアジュバント、ムラミルジペプチド、リポーソームなどが含まれる。従って、アジュバントは免疫調節因子である。担体は第２の分子と結合したときに後者に対する免疫応答性を増大させる抗原性分子である。
またさらなる本発明の態様において、本発明の最初の態様にかかる少なくとも１つのポリペプチド又はその一部を動物に投与することを含む、病原性微生物に対する免疫性を動物に与える方法が提供される。好ましくは、該ポリペプチドは本発明の第５の態様によるワクチンの形態である。
より好ましい本発明の方法において、動物はヒトである。
【００１９】
好ましくは、本発明の最初の態様、又は第５の態様のワクチンは、経静脈的、筋肉に、又は皮下のいずれかに直接インジェクションすることにより供給することができる。さらにまた、ワクチン又は抗原性ポリペプチドは、経口的に摂取することもできる。該ポリペプチド又はワクチンは、種々の水性、脂質性の媒体、例えば、滅菌生理食塩水などの薬理学的に許容な担体と共に投与され、筋肉中及び皮下に投与される注射可能物質を調製するために利用されてもよい。従来の懸濁及び分散剤を使用することもできる。他の投与手段、例えば、生物学的に観測可能な（ｂｉｏ−ｏｂｓｅｒｖａｂｌｅ）ペレットの持続的な低投与量放出などの埋め込み手段等は、当業者にとって自明なことであろう。
ワクチンは、細菌種である、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，及びＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するものであってもよい。
ワクチン又は抗原性ポリペプチドはヒトよりもむしろ動物、例えば、限定はしないが、家族のペット（例えば、ネコ及びイヌなどの家庭の動物）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタなど）及びウマなどの状態を予防又は緩和するのに効果的であることも明らかであろう。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドの少なくとも１つ、又は本発明のワクチンの有効量を含む医薬組成物を提供する。また、これらのポリペプチドは、薬理学的に許容な担体又は希釈剤も含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明の少なくとも１つの抗原性ポリペプチド又はその一部と結合する抗体又は少なくともその有効な結合部分が提供される。
抗体は多くの方法で修飾することができので、「抗体」という用語は、抗原性ポリペプチドに対して獲得した特異性を有する結合ドメインを保持する、あらゆる結合メンバー又は物質をもカバーするものとして解釈するべきである。従って、この用語は、抗体の抗体断片、誘導体、機能的等価物及びホモログをカバーし  天然又は全体又は部分的合成物であろうと、イムノグロブリン結合ドメインを含む全てのポリペプチドを包含する。従って、イムノグロブリン又は等価物を含み、他のポリペプチドと融合したキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現については、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３中に記載されている。
【００２１】
本発明のより好ましい態様において、該抗体はポリクローナル又はモノクローナル抗体である。
本発明のさらに好ましい態様において、該抗体はヒト抗体の不変又は定常領域を備えた該抗体の可変領域含むように、組換法により製造されるキメラ抗体である。
本発明のさらに好ましい態様において、該抗体は、抗体の相補性決定領域と、定常（Ｃ）領域及びヒト抗体の可変（Ｖ）領域由来のフレームワーク領域の両方と結合させる組換え方法によってヒト化される。
好ましくは、該抗体は、従来の標識又はタグ、例えば、放射性及び／又は蛍光性及び／又はエピトープラベル若しくはタグなどを含むマーカーと共に提供される。
好ましくは、該ポリペプチドに対する該ヒト化モノクローナル抗体は、原核又は真核細胞の形質移入又は形質転換に適切に適合した発現ベクター中で、融合ポリペプチドとして製造される。
【００２２】
イムノグロブリンとしても知られる抗体は、外来分子（抗原）に対する特異性を有するタンパク質分子である。イムノグロブリン（Ｉｇ）は２対のポリペプチド鎖、１対は軽（Ｌ）（低分子量）鎖（κ又はλ）、及びもう１対は重（Ｈ）鎖（γ、α、μ、δ及びε）によって構成され、ジスルフィド結合によって４つ全てが結合された構造上関連したタンパク質のクラスである。Ｈ及びＬ鎖両方とも抗原の結合に寄与し、あるＩｇ分子からその他を通じて高度に可変な領域を保持している。さらに、Ｈ及びＬ鎖は不変又は定常な領域を含んでいる。
Ｌ鎖は２つのドメインによって構成される。カルボキシ末端ドメインは、特定のタイプのＬ鎖間で本質的に同一であり、「定常」（Ｃ）領域と呼ばれている。アミノ末端ドメインはＬ鎖毎に異なり、抗体の結合部位に寄与している。その可変性により、「可変」（Ｖ）領域と呼ばれている。
Ｉｇ分子のＨ鎖は、いくつかのクラス、α、μ、δ、α及びγ（いくつかのサブクラスが存在する）からなる。２つの同一のＨ及びＬ鎖の１又は複数のユニットから構成される会合したＩｇ分子は、その名が保持するＨ鎖に由来する。従って、５つのＩｇアイソタイプが存在する：ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ及びＩｇＧ（Ｈ鎖の違いに基づく４つのサブクラスが存在する。即ち、ＩｇＧｌ，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）。抗体の構造及びそれらの種々の機能に関する更なる詳細は、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ中に見出すことができる。
【００２３】
キメラ抗体はマウス又はラット抗体の全てのＶ領域がヒト抗体のＣ領域と結合されている組換抗体である。ヒト化抗体は、齧歯類抗体のＶ領域に由来する相補性決定領域と、ヒト抗体のＶ領域に由来するフレームワーク領域とを融合させた組換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体に由来するＣ領域も使用される。相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域であり、Ｖ領域の変動の多くがここに限局している。 これらの領域は抗体分子の表面上にあるループ形成している。これらのループは抗体と抗原間の結合表面を提供する。
【００２４】
非ヒト動物由来の抗体は外来抗体に対する免疫応答を引き起こし、血液循環から排除される。キメラ及びヒト化抗体は、ヒトに注射した場合、共に減少した抗原性を有するが、それは、組換えハイブリッド抗体中では、齧歯類（即ち、外来の）の抗体量が低減されているからである。一方、ヒト抗体領域は免疫応答に対し禁制ではない。この結果、より弱い免疫応答性となり、抗体のクリアランスの減少が生じる。ヒト疾患の治療において治療的抗体を用いる場合、これは明らかに望ましいことである。ヒト化抗体は「外来」抗体領域がより少なくなるようにデザインされており、従って、キメラ抗体よりもより低い抗原性を有すると考えられる。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、該抗体はその活性が補体によって媒介される、例えば、抗体の活性が補体によって活性化されるような抗体である。
本発明の他の態様において、本発明のヒト化又はキメラ抗体をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
本発明のさらなる態様において、本発明のヒト化又はキメラ抗体をコードするベクターを含む細胞又は株化細胞が提供される。該細胞又は株化細胞は、本発明のヒト化又はキメラ抗体をコードするベクターで形質転換又は形質移入されてもよい。
本発明のさらなる態様において、前述のようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株化細胞が提供される。
本発明のさらなる態様において、本発明のハイブリドーマ株化細胞を用いた本発明のモノクローナル抗体を生産する方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、
ｉ）本発明のヒト化又はキメラ抗体をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を提供し；
ｉｉ）該抗体の製造に適した条件で該細胞を生育させ；及び
該細胞又はその生育環境から該抗体を精製することを含む本発明のヒト化又はキメラ抗体の製造方法が提供される。
本発明のさらなる態様において、
ｉ）図７から１２に表されるアミノ酸配列又はその断片を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原で、免疫応答性動物を免疫し；
ｉｉ）ハイブリドーマ細胞を作製するために免疫された免疫応答性動物のリンパ球とミエローマ細胞を融合させ；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体を（ｉ）のアミノ酸配列との結合活性についてスクリーニングし；
ｉＶ）増殖し、及び／又は該モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ株化細胞を培養し；
ｖ）培養上清からモノクローナル抗体を回収する：
工程を含む本発明のハイブリドーマ株化細胞を調製する方法が提供される。
免疫応答性動物はマウス、ラット又はウサギでもよい。              
ハイブリドーマ細胞を用いたモノクローナル抗体の製造は当業者には周知である。モノクローナル抗体を製造するために使用される方法は、参考文献としてここに含まれるＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７  （１９７５）、及びＤｏｎｉｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｈｏｆｆｍａｎによる“Ｂａｓｉｃ  Ｆａｃｔｓ  ａｂｏｕｔ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”  ｉｎ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ．ＩＩｅｄ．ｂｙ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，１９８１に記載されている。
【００２７】
本発明のさらなる態様では、微生物感染又は微生物関連疾患の治療又は予防のための医薬の製造に対し、本発明の最初の態様にかかる抗原性ポリペプチドの使用が提供される。
好ましくは、微生物感染は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ；Ｌｙｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｓｉｓ；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｏｕｐ  Ａ又はＢ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｐｐ；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｐｐ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ；  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ、例えば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐｐ；例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ及びＢ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉに由来する細菌性病原体によって引き起こされる細菌性感染である。
【００２８】
細菌関連疾患は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ関連疾患であってもよい。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ関連疾患には、敗血症；結核症；細菌性食中毒；血液感染；腹膜炎；心内膜炎；骨髄炎；セプシス；皮膚疾患；髄膜炎；肺炎；胃潰瘍；淋疾；連鎖球菌性咽頭炎；連鎖球菌性毒性ショック；壊死性筋膜炎；膿痂疹；ヒストプラスマ症；ライム病；胃腸炎；赤痢；細菌性赤痢が含まれる。
本発明のさらなる態様では、微生物感染の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用が提供される。
本発明のさらなる態様において、本発明の最初の態様の抗原性ポリペプチド、又は本発明の第５の態様のワクチン、又は本発明の抗体を患者に投与することを含む患者の治療方法が提供される。
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「包含する（ｃｏｎｔａｉｎ）」なる語句及び該語句のバリエーション、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「限定はしないで含む」ことを意味し、また、他の部分、付加物、成分、完全なもの又は段階を排除（しない）することを意図しない。
本明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、別途前後関係で要求されなければ、単数は複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、別途前後関係で要求されなければ、本明細書は、単数と同様に複数をも意図するものとして理解される。
本発明の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記載される特徴、完全体、性質、化合物、化学成分、化学基は不整合がない限り、ここで記載される全ての他の態様、実施態様、実施例に適用できると理解される。
本発明の実施例は、以下の物質、材料、方法及び図を参照しながら、例示としてのみ、ここに記載される。
【実施例】
【００２９】
材料と方法
株
対象の遺伝子配列のＰＣＲ増幅のために使用した染色体ＤＮＡは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．１６８，Ｓ．ａｕｒｅｕｓＮＣＴＣ８３２５，Ｓ．ａｕｒｅｕｓＮ３１５及びＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣＯＬ（ＤＮＡ配列のローカスに関する情報は表１を参照のこと）であった。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＨ１０００（Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１）のエリスロマイシン耐性ｓｏｄＡ：：ｌａｃＺ転写融合誘導体は、本アッセイで使用された菌株であった（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら，２００２）。
【表１】
2008533982.tif 000002
注記：異なる菌株のＳ．ａｕｒｅｕｓは、配列中へのファージ挿入に起因して、同一遺伝子に対して異なるローカス名を持つ。本書類においては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子について使用される該ローカス名はＳ．ａｕｒｅｕｓＮ３１５配列中のものに対応している。
【００３０】
抗原の調製
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（Ｏｂｇ，ＹｄｉＢ，ＹｐｈＣ）(図１)、ＹｓｘＣ(図２)、ＹｗｌＣ(図３)、及びＳ．ａｕｒｅｕｓＮ３１５（ＳＡ１３８７，Ｇｃｐ／ＳＡ１８５４（図６））から選択されたタンパク質をコードする遺伝子をＰＣＲで増幅した。得られた産物をプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１にクローン化し、大腸菌ＴｕｎｅｒＴＭ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にて、使用説明書に従い過剰発現させた。過剰発現したタンパク質は、陰イオン交換、ハイドロフォービック及びゲル濾過クロマトグラフィーによる３ステップスキームで精製した。タンパク質の過剰発現のレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、その精製度は平均９０％であった。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３１５タンパク質ＳＡ１１８７（ＹｎｅＳ−７３１（図４）及びＹｎｅＳ−７３３（図５））は、Ｆ−ｍｏｃ化学法を使用したＭｉｌｌｉｇｅ９０５０  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成した。Ｆ−ｍｏｃアミノ酸（Ｎｏｖｏｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｅｒｃｋ）は、１０％モルの過剰ＨＯＢｔの存在下、ＨＣＴＵ又はＨＢＴＵの当モルを使用したカップリングの直前に活性化された。いずれの場合においても、ペプチドをＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＥＧ−ＰＳレジン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に会合させることにより、キャリアプロテインと結合可能にするため、ペプチドのＣ末端にシステインを導入した。ペプチドはＣ１８Ｖｙｄａｃカラム（２２×２５０ｍｍ）を使用し、０．１％ＴＦＡ中、アセトニトリルのグラディエントにより精製した。ペプチドは、マススペクトロメーターで確認した。精製したペプチドはウサギのハプテンの抗原性を高めるため、ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ）（キャリアプロテイン）と結合させた。結合は、ＭＢＳ（Ｓｉｂｍａ）を使用して、１０×ＰＢＳ中で行った。
【００３１】
血清
血清は、シェフィールド大学の抗体資源センターにおいて、以下から取得した：
ｉ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｏｂｇ，ＹｄｉＢ，ＹｐｈＣ，ＹｗｌＣ及びＹｓｘＣ）及びＳ．ａｕｒｅｕｓ（Ｇｃｐ，ＳＡ１３８７）に対し免疫したウサギ；ｉｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質ＳＡ１１８７（ＹｎｅＳ−７３１，ＹｎｅＳ−７３３）から選択されたＫＬＨを結合したペプチドに対し免疫されたウサギ；ｉｉｉ）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのサイクロフィリン由来のＫＬＨを結合させたペプチドに対し免疫されたウサギ；ｉｖ）天然（免疫をしていない）ウサギ血清；及びｖ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症から回復期にある患者由来のヒト血清
【００３２】
免疫の工程は以下のように行った。各ウサギあたり２００から５００μｇの抗原（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ中、最大量２５０μｌ）を等量の完全フロイトアジュバントと混合した。静置させて分離しないエマルジョンが形成されるまで、溶液を２３Ｇニードルを通してろ過した。各ウサギに最大５００μｌを皮下に接種した。２２、４３及び６４日目に繰り返し注射を行ったが、不完全フロイトアジュバントを用いた。サンプル血液を５３日及び６４日目に集めた。注射の日取りは３〜６週間の範囲で適宜選択された。適当な力価が試験血清で確認されたら、その１０日後に採血を行う最終的なブーストを計画することができる。
血清は、凍結して保管し、殺菌実験の直前に、解凍して、直径０．２μｍ穴のフィルター（Ｍｉｎｉｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ  Ｆｌｏｗ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通してろ過した。
ウェスタンブロット解析（データは示さず）により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｓ  ＹｄｉＢに対する抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓのＹｄｉＢホモログに対応するサイズのバンドを認識することが示され、この結果、これらの抗体の種間クロス反応が示唆された。
【００３３】
培地及び生育条件
血清実験に関する接種材料を調製するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＪＦ７４１を最終濃度５μｇ／ｍｌ（ＢＨＩ−Ｅｒｙ）となるようにエリスロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＢｒｅｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地（ＢＨＩ；Ｏｘｏｉｄ）中、３７℃で生育させた。
接種材料の調製
研究室の凍結ストックからＢＨＩ−Ｅｒｙプレート上でフレッシュに生育させたＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＪＦ７４１の単一コロニーを、５ｍｌのＢＨＩ−Ｅｒｙを含む通用の媒体に接種し、回転式シェーカー中（２５０ｒｐｍ）、３７℃で一晩（１２から１６時間の間）インキュベートした。得られた培養物のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈物は、血清に接種する直前に調製した。
【００３４】
血清実験
１．５ｍｌ遠心管中の種々の血清由来の２００μｌアリコットに対し、最終細胞密度が１×１０６から１×１０７細胞／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈したＳ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１を接種し、回転シェーカー中、３７℃でインキュベーションを行った。これらの血清培養物から１０μｌのサンプルを定期的に集め、連続的に希釈し、各希釈物から１０μｌをＢＨＩ−Ｅｒｙプレート上にプレーティングし、その後、３７℃で一晩インキュベートした。さらに、各血清培養物から１０μｌをとり、そのままＢＨＩ−Ｅｒｙプレート上に直接プレーティングした。１から４０コロニーを生じさせる希釈物についてのみカウントを行い、ｍｌあたりの生存細胞の数（コロニー形成ユニット、ＣＦＵ）を決定した。
【００３５】
結果
種々の血清のｓｔａｐｙｌｏｃｏｃｃａｌ殺菌能力を評価するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを種々のウサギ抗血清で調べ、生存時間を評価した。その結果、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、Ｇｃｐ及びＹｎｅＳに対する抗体を含む血清に接触後２から３時間後に、他の表面タンパク質に対する場合と同様に、劇的に死滅することが示された（図１６）。これに対し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞質タンパク質（Ｏｂｇ及びＹｄｉＢ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の膜タンパク質（サイクロフィリン）、種々の正常ウサギ血清に対する抗体は、殺菌性の表現型を示さなかった（図１５）。
また、特記すべきは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の細胞質タンパク質と推定されるもの（ＹｓｘＣ及びＹｐｈＣ及びＹｗｌＣ）に対して免疫されたウサギ由来の血清は、Ｇｃｐ及びＹｎｅＳ（７３１及び７３３）抗体について観察されたのと類似の殺菌性の表現型を示した。このことは、ＹｓｘＣ，ＹｐｈＣ及びＹｗｌＣが細胞質タンパク質と推測されることから、表面には露出されておらず、血清がそれらを認識できないと予想されたことから、意外なことであった。
本研究は、ＹｓｘＣのＳ．ａｕｒｅｕｓ膜画分中への局在を示唆するものである。さらに、本研究は、殺菌効果が、補体のある成分に対応するような血清中に存在する熱不安定な成分（熱処理で不活性化される、材料及び方法を参照のこと）を通じてメディエートされることを明らかにした（図１６）。
【００３６】
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【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｙｐｈＣポリペプチドのＤＮＡ配列を示す。
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｙｓｘＣポリペプチドのＤＮＡ配列を示す。
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｙｗｌＣポリペプチドのＤＮＡ配列を示す。
【図４】図４は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のｙｎｅＳオルソログペプチド７３１のＤＮＡ配列を示す。
【図５】図５は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のｙｎｅＳオルソログペプチド７３３のＤＮＡ配列を示す。
【図６】図６は、共に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来する（ａ）膜の外側に露出されると推定されるｇｃｐ領域をコードするＤＮＡ配列；及び（ｂ）ｇｃｐオルソログポリペプチドの全長ＤＮＡ配列を示す。
【図７】図７から図１１は、各々、図１から５に示すＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図８】図７から図１１は、各々、図１から５に示すＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図９】図７から図１１は、各々、図１から５に示すＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図１０】図７から図１１は、各々、図１から５に示すＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図１１】図７から図１１は、各々、図１から５に示すＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２（ａ）及び（ｂ）は、各々、図６（ａ）及び（ｂ）に対応するアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３及び図１４は、膜タンパク質ｙｎｅＳ及びｇｃｐのハイドロパシープロットを示す。前述のタンパク質のハイドロパシープロットの計算及び膜貫通トポロジーモデルを予測するためのグラフィック表示がＣｏｎＰｒｅｄＩＩ  Ｍｅｔｈｏｄにより決定され、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｓｉ．ｈｉｒｏｓａｋｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ＣｏｎＰｒｅｄ２／；サーバーで実行された。
【図１４】図１３及び図１４は、膜タンパク質ｙｎｅＳ及びｇｃｐのハイドロパシープロットを示す。前述のタンパク質のハイドロパシープロットの計算及び膜貫通トポロジーモデルを予測するためのグラフィック表示がＣｏｎＰｒｅｄＩＩ  Ｍｅｔｈｏｄにより決定され、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｓｉ．ｈｉｒｏｓａｋｉ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ＣｏｎＰｒｅｄ２／；サーバーで実行された。
【図１５】図１５は、ヒト患者（□）、非免疫ウサギ（○）又はＡ．ｔｈａｌｉａｎａサイクロフィリンタンパク質（△）に対して作製された血清に由来する血清の熱処理が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１の死を誘導しなかったことを示している。Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１の不死は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染から回復した患者（■）（パネルＡ）、及び非免疫ウサギ（●）（パネルＢ）由来の天然の血清を使用する場合に観察された。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａサイクロフィリンタンパク質（▲）（パネルＣ）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓタンパク質Ｏｂｇ（▼）及びＹｄｉＢ（＋）（パネルＤ）及びＳ．ａｕｒｅｕｓＳＡ１３８７（◆）（パネルＥ）に対する天然血清の場合、最初の６時間で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１の数に僅かな減少が観察され、その後リカバーされた。
【図１６】図１６は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓタンパク質ＹｓｘＣ(●)、ＹｐｈＣ(■)、及びＹｗｌＣ(▲)(パネルＡ及びＢ)に対して作製された天然血清がＳ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ４７１を劇的に殺傷し、２から４時間の間に５ｌｏｇ減少したことを示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓペプチドＹｎｅＳ−７３１(▼)及びＹｎｅＳ７３３(◆)及びＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質Ｇｃｐ(＋)（パネルＣ−Ｅ）に対する天然血清を使用した場合、同様の効果が観察された。これに対し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＹｓｘＣタンパク質（○）又はＳ．ａｕｒｅｕｓペプチドＹｎｅＳ−７３１(▽)及びＹｎｅＳ−７３３(◇)（パネルＡ，Ｃ，Ｄ）に対する血清の熱処理は、これらの血清の殺菌能力、つまり、上述のような天然型において（非熱処理型）Ｓ．ａｕｒｅｕｓＳＪＦ７４１を殺菌することができる能力を消失さる。従って、血清の殺菌能力は熱不安定で、熱処理サンプル中では不活性な構成成分に起因する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓタンパク質ＹｐｈＣ(■)及びＹｗｌＣ(▲)、又はＳ．ａｕｒｅｕｓ  ｇｃｐタンパク質（＋）に対する熱処理血清を用いた実験は本図には示されていない。また、上述の通り、これに対応する天然血清（パネルＢ及びＥ）による実験は、これらの血清のＳ．ａｕｒｅｕｓ殺菌能力を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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