(57)【要約】  本発明は、抗原提示経路を変える目的のための、細胞におけるＩｉ発現の抑制を伴う組成物および方法に対向される。より具体的には、正常な環境下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して提示されないであろう抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子提示に関する組成物および方法が開示される。本発明は、正常にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞、ならびにＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導することができる細胞における提示に関する。ＩｉのＲＮＡ干渉に関する実施態様が具体的に開示される。
2008521410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項２の組成物。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項３の組成物。
【請求項５】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含んでなる組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ配列がプラスミドベクター中に存在する、請求項５の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡ配列がウイルスベクター中に存在する、請求項５の組成物。
【請求項８】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項７の組成物。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項９の組成物。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１３】
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１のＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２のＤＮＡ配列；
を含んでなる組成物であって、
第１および第２のＲＮＡ配列が、ハイブリダイズされた場合、Ｉｉ発現を抑制することができるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成することができるｓｉＲＮＡ二重らせんを形成する、組成物。
【請求項１４】
注射可能な用量単位形態物中に包み込まれる請求項１、５または１３の組成物。
【請求項１５】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡを含有する哺乳動物細胞。
【請求項１６】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１５の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１６の哺乳動物細胞。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１７の哺乳動物細胞。
【請求項１９】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡを発現することができる１または複数の外因性配列を含有する哺乳動物細胞。
【請求項２０】
外因性配列がプラスミドベクター中に存在する、請求項１９の哺乳動物細胞。
【請求項２１】
外因性配列がウイルスベクター中に存在する、請求項１９の哺乳動物細胞。
【請求項２２】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項２１の哺乳動物細胞。
【請求項２３】
いずれかの操作前に個体において存在する場合ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブである、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項２５】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項２４の哺乳動物細胞。
【請求項２６】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項２５の哺乳動物細胞。
【請求項２７】
センス配列が翻訳開始部位を含有するＩｉの配列を含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項２８】
センス配列がヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｎｔ内にＩｉ配列の一部を含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３０】
がん細胞か、あるいは感染性作用物の存在がなかったならば細胞中には存在しないであろうタンパク質の合成を指図する感染性作用物を含有する細胞か、いずれかである、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞である、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３２】
ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブであり、そしてタンパク質をコードしている発現可能な核酸配列を含んでなる組み換えベクターであって、これのトランスフェクションがＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞において細胞の表面にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導をもたらすベクターを含有する、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３３】
発現可能な核酸配列が、ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターによって担持される、請求項３２の哺乳動物細胞。
【請求項３４】
ウイルス性発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項３３の哺乳動物細胞。
【請求項３５】
タンパク質が、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターおよびγインターフェロンからなる群から選ばれる、請求項３２の哺乳動物細胞。
【請求項３６】
悪性細胞である、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３７】
ウイルス感染細胞である、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３８】
天然に存在する抗原提示細胞である、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項３９】
樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球およびＴリンパ球からなる群から選ばれる、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項４０】
関心のある抗原をさらに含んでなる、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項４１】
関心のある抗原が、関心のある抗原をコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で合成される、請求項４０の哺乳動物細胞。
【請求項４２】
細胞においてＩｉの発現を抑制する方法であって、ｓｉＲＮＡが直接または間接的に細胞中に導入され、さらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞においてＩｉの発現を抑制することことができるｓｉＲＮＡをＩｉを発現する細胞中に導入することを含んでなる方法。
【請求項４３】
ｓｉＲＮＡが細胞中に間接的に導入され、その結果、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で転写される、請求項４２の方法。
【請求項４４】
発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能なＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより形成される、請求項４３の方法。
【請求項４５】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つが精製されたＰＣＲ産物である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項４４の方法。
【請求項４７】
方法が、
ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞であるか、またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるかいずれかであり、かつ関心のある抗原エピトープを発現し、そしてさらにそこで細胞がＩｉを発現する細胞を提供し；そして
ｂ）ｓｉＲＮＡがいずれか直接または間接的に細胞に導入され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞においてＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを、段階ａ）の細胞中に導入すること；
を含んでなる、Ｉｉタンパク質発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面に、関心のある抗原エピトープを提示する方法。
【請求項４８】
ｓｉＲＮＡが細胞中に間接的に導入され、その結果、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で転写される、請求項４７の方法。
【請求項４９】
発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能な
ＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより形成される、請求項４８の方法。
【請求項５０】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つが精製されたＰＣＲ産物である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項４９の方法。
【請求項５２】
関心のある抗原エピトープががん細胞抗原のものである、請求項４７の方法。
【請求項５３】
関心のある抗原エピトープがウイルス抗原のものである、請求項４７の方法。
【請求項５４】
ＭＨＣクラスＩＩ分子発現が、段階ａ）の細胞中にタンパク質をコードしている発現可能な核酸配列を含んでなる組み換えベクターを導入することによって誘導され、これの発現が、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞において、細胞の表面にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導をもたらす、請求項４７の方法。
【請求項５５】
タンパク質をコードしている発現可能な核酸配列が、ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターによって担持される、請求項５４の方法。
【請求項５６】
タンパク質が、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターおよびγインターフェロンからなる群から選ばれる、請求項５４の方法。
【請求項５７】
段階ａ）の細胞が、がん細胞か、あるいは細胞中には存在していないが感染性作用物の存在に関するタンパク質の合成を指図する感染性作用物を含有する細胞か、いずれかである、請求項４７の方法。
【請求項５８】
関心のある抗原エピトープががん細胞抗原のものである、請求項４７の方法。
【請求項５９】
関心のある抗原エピトープがウイルス抗原のものである、請求項４７の方法。
【請求項６０】
発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがプラスミドベクター中に存在する、請求項５１の方法。
【請求項６１】
発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがウイルスベクター中に存在する、請求項５１の方法。
【請求項６２】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、フィロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項６１の方法。
【請求項６３】
方法が、
ａ）関心のある抗原エピトープを発現するＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞か、または関心のある抗原エピトープを発現し、かつその細胞表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞のいずれかを提供し；
ｂ）ｓｉＲＮＡが、いずれか直接または間接的に細胞に導入され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによってＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを、段階ａ）の細胞中に導入し；そして
ｃ）段階ｂ）の細胞によるか、または段階ｂ）の細胞由来の関心のある抗原エピトープと複合されたＭＨＣクラスＩＩ分子により哺乳動物を免疫化すること；
を含んでなる、免疫応答が、Ｉｉタンパク質の発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面における関心のある抗原エピトープに対向される、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。
【請求項６４】
ｓｉＲＮＡが細胞中に間接的に導入され、その結果、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で転写される、請求項６３の方法。
【請求項６５】
発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能なＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより形成される、請求項６４の方法。
【請求項６６】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つが精製されたＰＣＲ産物である、請求項６５の方法。
【請求項６７】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項６５の方法。
【請求項６８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子発現が、段階ａ）の細胞中にタンパク質をコードしている発現可能な核酸配列を含んでなる組み換えベクターを導入することによって誘導され、これの発現が、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞において、細胞の表面にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導をもたらす、請求項６３の方法。
【請求項６９】
タンパク質をコードしている発現可能な核酸配列が、ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターによって担持される、請求項６８の方法。
【請求項７０】
ウイルス性発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項６９の方法。
【請求項７１】
タンパク質が、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターおよびγインターフェロンからなる群から選ばれる、請求項６８の方法。  
【請求項７２】
段階ａ）の細胞が、がん細胞か、あるいは感染性作用物の存在がなかったならば細胞中には存在しないであろうタンパク質の合成を指図する感染性作用物を含有する細胞か、いずれかである、請求項６３の方法。
【請求項７３】
関心のある抗原エピトープががん細胞抗原のものである、請求項６３の方法。
【請求項７４】
関心のある抗原エピトープがウイルス抗原のものである、請求項６３の方法。
【請求項７５】
方法が、
ａ）抗原提示細胞を含む、個体の末梢血液単核細胞を培養物において提供し；
ｂ）ｓｉＲＮＡが、いずれか直接または間接的に細胞に導入され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによってＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを、段階ａ）の培養物の抗原提示細胞中に導入し；そして
ｃ）発現のために適当な条件下の培養物において、細胞中に同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）抗原をコードしている発現可能な核酸配列を、段階ａ）の抗原提示細胞中に導入すること；
を含んでなる、細胞のタイプが同定抗原の発現を特徴とする、免疫学的応答のための個体のあるタイプの細胞を標的化する方法。
【請求項７６】
ｓｉＲＮＡが細胞中に間接的に導入され、その結果、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で転写される、請求項７５の方法。
【請求項７７】
発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能なＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより形成される、請求項７６の方法。
【請求項７８】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがＰＣＲ産物である、請求項７７の方法。
【請求項７９】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項７７の方法。
【請求項８０】
抗原提示細胞が、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球およびＴリンパ球からなる群から選ばれる、請求項７５の方法。
【請求項８１】
段階ｃ）の細胞が、治療効果のために個体中に導入される、請求項７５の方法。
【請求項８２】
段階ａ）の末梢血液単核細胞が分画されて、抗原提示細胞について強化される、請求項７５の方法。
【請求項８３】
段階ｃ）の抗原提示細胞を含有する培養物において細胞の分画されたサブ集団が得られる、請求項７５の方法。
【請求項８４】
同定抗原ががん細胞抗原である、請求項７５の方法。
【請求項８５】
同定抗原がウイルス抗原である、請求項７５の方法。
【請求項８６】
個体中に段階Ｃ）の細胞を再導入することをさらに含んでなる、請求項７５の方法。
【請求項８７】
Ｉｉの発現を抑制することが、関心のある抗原エピトープによる細胞の小胞体におけるＭＨＣクラスＩＩ分子のチャージング（ｃｈａｒｇｉｎｇ）を促進する、請求項４２の方法。
【請求項８８】
ｓｉＲＮＡが、エレクトロポレーション、脂質媒介移送、リポソーム、低張性で導入される飲作用、およびストレプトリシンＯ媒介の細胞浸透化からなる群から選ばれる方法によって細胞中に導入される、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項８９】
ｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列が、カチオン性デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、脂質、リポソーム、金粒子、ポリラクチドコグリコリド粒子、およびポリアルキルオキシド・コポリマーからなる群から選ばれるメディエーターを用いる方法によって細胞中に導入される、請求項４３、４８、６４または７６のいずれかの方法。
【請求項９０】
第１の発現可能なＤＮＡ配列および第２の発現可能なＤＮＡ配列が哺乳動物細胞中にコ・トランスフェクトされる、請求項４４、４９、６５または７７のいずれかの方法。
【請求項９１】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項９２】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項９１の方法。
【請求項９３】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項９２の方法。
【請求項９４】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項９５】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項９４の方法。
【請求項９６】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項９５の方法。
【請求項９７】
ｓｉＲＮＡが翻訳開始部位を含有するＩｉの配列を含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項９８】
ｓｉＲＮＡがヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｎｔ内にＩｉ配列の一部を含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項９９】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の３プライムオーバーハングを含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１００】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の５プライムオーバーハングを含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０１】
ｓｉＲＮＡが、ヌクレアーゼ消化を防ぐために化学的に改変される、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０２】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含む、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０３】
Ｉｉの抑制が少なくとも１５％である、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０４】
Ｉｉの抑制が少なくとも３０％である、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０５】
Ｉｉの抑制が少なくとも４０％である、請求項４２、４７、６３または７５のいずれかの方法。
【請求項１０６】
ｓｉＲＮＡをコードしている配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結される、請求項４３、４８、６４または７６のいずれかの方法。
【請求項１０７】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＵ６またはＳＶ４０プロモーターである、請求項１０６の方法。
【請求項１０８】
センス配列が翻訳開始部位を含有するＩｉの配列を含む、請求項１、５または１３のいずれかの組成物。
【請求項１０９】
センス配列がヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｎｔ内にＩｉ配列の一部を含む、請求項１、５または１３のいずれかの組成物。
【請求項１１０】
ポックスウイルスがワクシニアである、請求項６２または７０のいずれかの方法。
【請求項１１１】
ポックスウイルスがワクシニアである、請求項８の組成物。
【請求項１１２】
ポックスウイルスがワクシニアである、請求項２２または３４のいずれかの哺乳動物細胞。
【請求項１１３】
方法が、
ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞であるか、またはその細胞表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるかいずれかであり、そしてさらにそこで細胞がＩｉを発現する細胞を提供し；そして
ｂ）関心のある抗原エピトープおよびＩｉのインヒビターを段階ａ）の細胞中に導入する
こと；
を含んでなる、Ｉｉタンパク質発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面に、関心のある抗原エピトープを提示する方法。
【請求項１１４】
Ｉｉのインヒビターが１０〜５０ヌクレオチド塩基のコポリマーであり、このコポリマーが、生理学的条件下で哺乳動物Ｉｉタンパク質をコードしているＲＮＡ分子の標的領域に特異的にハイブリダイズし、それよってＩｉ発現を抑制する能力を特徴とする、請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
Ｉｉのインヒビターが、エレクトロポレーション、脂質媒介移送、リポソーム、およびストレプトリシンＯ媒介の細胞浸透化からなる群から選ばれる方法によって導入される、請求項１１３の方法。
【請求項１１６】
Ｉｉのインヒビターが、発現可能な核酸配列から細胞内で生産される、請求項１１３の方法。
【請求項１１７】
発現可能な核酸配列が、ヒトＩｉタンパク質をコードしているｍＲＮＡ分子に相補的であるＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ分子を含む、方法であって、ＲＮＡ分子がｍＲＮＡ分子にハイブリダイズし、それによってｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する能力を有する、請求項１１６の方法。
【請求項１１８】
ＲＮＡ分子が、翻訳開始部位およびコーディング配列の約４２５までのヌクレオチドを含んでなるｍＲＮＡ分子の一部に相補的である、請求項１１７の方法。
【請求項１１９】
発現可能な核酸配列がウイルス性または非ウイルス性発現ベクターによって担持される、請求項１１６の方法。
【請求項１２０】
ウイルス性発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、フィロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群から選ばれる、請求項１１９の方法。
【請求項１２１】
ポックスウイルスがワクシニアである、請求項１２０の方法。
【請求項１２２】
ウイルス性または非ウイルス性発現ベクターが、関心のある抗原エピトープをまた発現する、請求項１１９の方法。
【請求項１２３】
関心のある抗原エピトープがウイルス抗原のものである、請求項１１３の方法。
【請求項１２４】
ＩｉのインヒビターがｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞においてＩｉの発現を抑制することができる、請求項１１３の方法。
【請求項１２５】
ｓｉＲＮＡが細胞において発現可能な核酸配列から生産され、そしてさらに、発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能なＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼ
ーションにより形成される、請求項１２４の方法。
【請求項１２６】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項１２５の方法。
【請求項１２７】
発現可能な核酸配列が、カチオン性デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、脂質、リポソーム、金粒子、ポリラクチドコグリコリド粒子、およびポリアルキルオキシド・コポリマーからなる群から選ばれるメディエーターを用いる方法によって細胞中に導入される、請求項１１６の方法。
【請求項１２８】
第１の発現可能なＤＮＡ配列および第２の発現可能なＤＮＡ配列が哺乳動物細胞中にコ・トランスフェクトされる、請求項１２５の方法。
【請求項１２９】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３０】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１２９の方法。
【請求項１３１】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１３０の方法。
【請求項１３２】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３３】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１３２の方法。
【請求項１３４】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
ｓｉＲＮＡが翻訳開始部位を含有するＩｉの配列を含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３６】
ｓｉＲＮＡがヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｎｔ内にＩｉ配列の一部を含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３７】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の３プライムオーバーハングを含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３８】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の５プライムオーバーハングを含む、請求項１２４の方法。
【請求項１３９】
ｓｉＲＮＡが、ヌクレアーゼ消化を防ぐために化学的に改変される、請求項１２４の方法。
【請求項１４０】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含む、請求項１２４の方法。
【請求項１４１】
Ｉｉタンパク質発現が少なくとも１５％抑制される、請求項１１３の方法。
【請求項１４２】
Ｉｉタンパク質発現が少なくとも３０％抑制される、請求項１１３の方法。
【請求項１４３】
Ｉｉタンパク質発現が少なくとも４０％抑制される、請求項１１３の方法。
【請求項１４４】
ｓｉＲＮＡが発現可能な核酸配列から生産され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡをコードしている配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に連結される、請求項１２４の方法。
【請求項１４５】
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＵ６またはＳＶ４０プロモーターである、請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子発現が、タンパク質をコードしている発現可能な核酸配列を含んでなる組み換えベクターによって誘導され、これの発現が、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞において、細胞の表面にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導をもたらす、請求項１１３の方法。
【請求項１４７】
タンパク質が、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターおよびγインターフェロンからなる群から選ばれる、請求項１４６の方法。  
【請求項１４８】
タンパク質をコードしている発現可能な核酸配列が、ウイルス性発現ベクターによって担持される、請求項１４６の方法。
【請求項１４９】
ウイルス性発現ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、フィロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群から選ばれる、請求項１４８の方法。
【請求項１５０】
ウイルス性発現ベクターが関心のあるウイルス抗原を発現する、請求項１４８の方法。
【請求項１５１】
ポックスウイルスがワクシニアである、請求項１４９の方法。
【請求項１５２】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２１、２３、２５および２７からなる群から選ばれる第１の鎖ならびに配列番号：２２、２４、２６および２８からなる群から選ばれる第２の鎖、そ
れぞれからなる二重らせんを含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１５３】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２１、２３、２５および２７からなる群から選ばれる第１の鎖ならびに配列番号：２２、２４、２６および２８からなる群から選ばれる第２の鎖、それぞれからなる二重らせんを含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項１５４】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２１、２３、２５および２７からなる群から選ばれる第１の鎖ならびに配列番号：２２、２４、２６および２８からなる群から選ばれる第２の鎖、それぞれからなる二重らせんを含む、請求項４２、４７、６３、７５または１２４のいずれかの方法。
【請求項１５５】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の３プライムオーバーハングを含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１５６】
ｓｉＲＮＡが少なくとも１つの一本鎖の５プライムオーバーハングを含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１５７】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２９〜４０からなる群から選ばれるＩｉのセンス配列を含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１５８】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２９〜４０からなる群から選ばれるＩｉのセンス配列を含む、請求項１５または１９の哺乳動物細胞。
【請求項１５９】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：２９〜４０からなる群から選ばれるＩｉのセンス配列を含む、請求項４２、４７、６３、７５または１２４のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
特異的抗原に対する免疫応答は、Ｔリンパ球によるそれらの抗原のペプチドフラグメントの認識によって調節される。抗原提示細胞内では、プロセスされた抗原のペプチドフラグメントは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の抗原ペプチド結合部位中に結合されるようになる。次いで、これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、ヘルパーまたは細胞傷害性Ｔリンパ球上のＴ細胞レセプターによる認識（提示ＭＨＣ分子の外来ペプチドおよび隣接表面の両方の）のために細胞表面に移送される。ペプチドを送達するＭＨＣ分子の２種のクラス，ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが存在する。
【０００２】
ＭＨＣクラスＩ分子は、抗原をＣＤ８−ポジティブ細胞傷害性Ｔリンパ球に提示し、次いで、これが活性化され、そして抗原提示細胞を直接殺傷することができる。クラスＩＭＨＣ分子は、小胞体において内在的に合成されるタンパク質、例えば感染性ウイルスからのペプチドを、タンパク質合成の時間中独占的に受容する。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原をＣＤ４−ポジティブ・ヘルパ−Ｔリンパ球（Ｔヘルパー細胞）に提示する。一旦活性化されると、Ｔヘルパー細胞は、物理的接触およびサイトカイン放出を介して、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔキラー細胞）およびＢリンパ球の活性化に寄与する。ＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、非特異的または特異的エンドサイトーシスを介して取り込まれた外因性抗原を結合する。合成中、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、インバリアント鎖（ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ）タンパク質（Ｉｉ）を代わりに結合することによって内因性抗原の結合をブロックしている。これらのＭＨＣクラスＩＩ−ｌｉタンパク質複合体は、小胞体からポスト−ゴルジ分画（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）ヘ移送され、ここでＩｉはタンパク質分解作用によって遊離され、そして外因性抗原ペプチドが結合される（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００４】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子は、細胞において別個の分布状態を有する。ほとんど全ての核形成細胞は、発現レベルは細胞の種類間で変化するけれどもＭＨＣクラスＩ分子を発現する。免疫系の細胞はそれらの表面に豊富なＭＨＣクラスＩを発現するが、一方、肝細胞は比較的低いレベルを発現する。非核形成細胞はＭＨＣクラスＩをほとんど発現しないか、全く発現しない。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、Ｂリンパ球およびマクロファージにおいて高度に発現されるが、他の組織細胞では発現しない。しかしながら、多くの他の細胞種は、サイトカインへの曝露によってＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導することができる。
【０００５】
正常な条件下では、Ｉｉタンパク質は常にナセントＭＨＣクラスＩＩ分子と同時に合成されるので、内因性ペプチド（潜在的に自己免疫疾患へと誘導する自己決定基をもつ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して結合されない。自己決定基ペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する複合体は、身体の免疫監視系によって決して認められないので、寛容性はこれらの決定基に対して発達されない。ＭＨＣクラスＩＩ分子が発達された個体においてＩｉによって抑制されない場合は、内因性の自己決定基がＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるようになり、それらの内因性抗原に対する自己免疫応答を開始する。そのような状態がある種の自己免疫疾患における場合である。悪性細胞における影響をそのように技術的に変えることによって、腫瘍の内因性抗原に対する「自己免疫応答」が治療学的に使用されて、増殖を制限したり、または腫瘍細胞を除去することができる。
【０００６】
Ｉｉタンパク質の付随する増加なしに増加されたＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の治療学
的効果は、ＭＨＣクラスＩＩ−ネガティブ、Ｉｉ−ネガティブ腫瘍において例証された（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６および非特許文献７）。これらの研究では、ＭＨＣクラスＩＩ−ネガティブのマウス肉腫へのＭＨＣクラスＩＩ−分子の遺伝子のトランスフェクションはＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブを生成したが、Ｉｉ−ネガティブの腫瘍細胞系では生成しなかった。ＭＨＣに適合する宿主へのこれらの細胞の注入は親腫瘍の増殖の遅延をもたらした。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子とともに肉腫細胞系へのＩｉタンパク質の遺伝子の同時トランスフェクションは、Ｉｉ鎖が内因性腫瘍抗原の提示をブロックするために、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の腫瘍治療効果を阻害した。類似の結果がマウス黒色腫を用いて出された（非特許文献８）。
【０００７】
この治療学的アプローチの成功は、樹状細胞の本来の活性を必要とすると考えられた。樹状細胞は専門の捕捉細胞（ｓｃａｖｅｇｅｒ）であり、これは外来の抗原をペプチドにプロセスし、そしてそれらの細胞表面上のＭＨＣ抗原からＴリンパ球に対してそれらを提示する。樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方をとおして抗原を提示する能力を有するので、それらが両Ｔヘルパ−およびＴキラー細胞を活性化させる。有効なＴヘルパー細胞応答は、強力なＴキラー細胞応答を惹起するために必要であり、そして樹状細胞によって起こされる合体された活性化が、抗腫瘍応答の増強をもたらすと考えられた（非特許文献９；非特許文献１０）。マクロファージ系統の樹状細胞は、腫瘍細胞を発見すると、両腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原を摂取し、プロセスする。次いで、樹状細胞はリンパ節に移動し、これが腫瘍部位を枯渇させ、そして新しいＴ細胞が発芽する結節皮質（ｎｏｄｅ  ｃｏｒｔｅｘ）の近傍のそれらの結節に定着する。結節皮質では、樹状細胞上の腫瘍決定基を認識した休止しているＴキラー細胞が活性化され、続いて、応答能のある抗腫瘍キラーＴ細胞として循環中に放出される。
【０００８】
Ｔヘルパー細胞との相互作用は、樹状細胞を活性化または「認可（ｌｉｃｅｎｓｅ）」してＭＨＣクラスＩ分子をとおして抗原を提示し、その結果Ｔキラー細胞を活性化するけれども、Ｔヘルパー細胞およびＴキラー細胞との同時相互作用は必ずしも必要ではない；活性化された樹状細胞は、Ｔヘルパー細胞が活性化を媒介した後しばらくの間、Ｔキラー細胞を刺激する能力を維持する。ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩ決定基のいずれかによって提示されたそれぞれの抗原性ペプチドは、１種の抗原タンパク質由来である必要はなく、悪性細胞からの２種以上の抗原がプロセスされ、そして樹状細胞によって提示されてもよい。したがって、多分腫瘍に特異的ではない１種の決定基への認可は、それとともに、他の多分腫瘍に得意的な決定基に対するＴキラー細胞の活性化を認可する能力を保持している。そのような「マイナーな（ｍｉｎｏｒ）」または「隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）」決定基は、種々の治療目的のために使用されている（非特許文献１１）。
【０００９】
ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の実験的変更が、これらのマイナーな決定基に対する免疫応答を拡大するために考えられた。ＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷するために通常利用できないペプチド・シリーズは、ＭＨＣクラスＩＩ提示のために変えられるペプチドの豊富な給源を提供する。このシリーズの決定基の開発は、応答性Ｔヘルパー細胞の集団の拡大をもたらす。そのような拡大された集団は樹状細胞の認可を惹起することができ、これらのあるものは、腫瘍特異的および腫瘍関連決定基に対向される。正常細胞は潜在的に腫瘍細胞決定基を共有しているが、正常細胞に対しては小さな細胞損傷のみが生じる。これは、抗腫瘍応答の多数のエフェクター応答（大量のキラーＴ細胞、周囲の活性化するサイトカイン、食作用をするマクロファージおよびそれらの生産物など）が正常細胞には対向されないからである。
【００１０】
正常なＭＨＣクラスＩＩ抗原提示は、ＭＨＣクラスＩＩ分子とＩｉタンパク質との相互作用を抑制することによって変えることができる。このことは、総Ｉｉタンパク質を低下させる（例えば、発現を低下させる）ことによるか、またはＩｉ免疫調節機能を妨害する
他の方法によって達せられる。Ｉｉ発現の抑制は種々のアンチセンス技術を用いて達成された。Ｉｉタンパク質のためのｍＲＮＡのＡＵＧ部位と相互作用するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、外因性抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示を減少させることが記述されている（非特許文献１２）。しかしながら、Ｉｉタンパク質の発現およびＭＨＣクラスＩＩ分子による内因性抗原の提示に及ぼす影響は試験されなかった。近年、特許文献１は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞中への導入によって、Ｉｉタンパク質発現を有効に抑制する、３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび逆遺伝子構築物を同定した。このメカニズムによってＩｉを抑制されている腫瘍細胞を接種されたマウスは、処理されてない親の腫瘍細胞を接種されたマウスよりも有意に長く生残することが示された。この観察は、Ｉｉタンパク質の抑制が抗原決定基提示の範囲における増大を起こし、その結果、腫瘍細胞に対する一層有効な免疫応答を惹起することを示している。
【００１１】
肉腫細胞（Ｓａｌ１）腫瘍モデルにおいて、このＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された腫瘍細胞は、親腫瘍によるチャレンジに対する強力なワクチンである。臨床的に有用なインビボ治療のアンチセンス作用物として、発現可能なＩｉアンチセンス逆遺伝子構築物（Ｉｉ−ＲＧＣ）が創造された（特許文献２）。これらは、発現可能なプラスミドまたはアデノウイルス中に逆向きに異なるＩｉ遺伝子フラグメントをクローニングすることによって構築されて、腫瘍細胞投与の多数の方法が評価された（非特許文献１３；非特許文献１４）。Ｉｉ−ＲＧＣ遺伝子は、Ａ２０リンパ腫細胞、ＭＣ−３８結腸腺がん細胞、Ｒｅｎｃａ腎腺がん細胞、Ｂ１６黒色腫細胞およびＲＭ−９前立腺がん細胞を含む、数種のマウス腫瘍細胞系における安定または一過性のＤＮＡトランスフェクションによって評価された。もっとも活性のある１種のＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）（ＡＵＧ開始コドンのＡが位置１である）がインビボ研究のために選択された。
【００１２】
試験された細胞系の中で、Ａ２０は既にＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ＋である。Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）は、この構築物が脂質または遺伝子銃トランスフェクション法によって送達された場合、有意にＩｉ発現を抑制した。試験された他の腫瘍系はＭＨＣクラスＩＩ−／Ｉｉ−である。これらの細胞系は、Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）およびＣＩＩＴＡまたはＩＦＮ−γのいずれかまたは両方とともにインビトロで同時にトランスフェクトされて、ＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブ／Ｉｉ−抑制表現型が創造された（非特許文献１５；非特許文献１３；非特許文献１４）。またＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブ／Ｉｉ−抑制表現型のインビボ導入は、脂質とともにＩｉ−ＲＧＣおよびＣＩＩＴＡプラスミドの（非特許文献１５；非特許文献１４）、あるいはＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）、ＣＩＩＴＡおよびＩＦＮ−γを含有する組み換えアデノウイルスベクターの（非特許文献１３）腫瘍内注入によって生成された。
【００１３】
これらの治療学的構築物のインビボ活性は、２種の腫瘍モデル：Ｒｅｎｃａ腎がん腫およびＲＭ−９前立腺がん腫を用いて確立された皮下腫瘍における腫瘍内注射によって試験された。両腫瘍モデルにおいて、確立された腫瘍の完全退縮が達成された。Ｒｅｎｃａモデルでは、腫瘍の退縮は、ＩＬ−２プラスミドの最適以下の用量とともに与えられた４日にわたるＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣプラスミド構築物の４回の腫瘍内注入後、マウスの約５０％において観察された（非特許文献１５）。確立されたＲｅｎｃａ腫瘍における、ＣＩＩＴＡ、ＩＦＮ−γ、Ｉｉ−ＲＧＣ構築物およびＩＬ−２遺伝子を含有する組み換えアデノウイルスの肉腫内注射は、マウスの約６０〜７０％における完全な腫瘍退縮およびＲｅｎｃａ腫瘍の再チャレンジに対する防御を誘導した（非特許文献１３）。進行性の、乏しい免疫原性ＲＭ−９前立腺腫瘍モデルでは、放射線照射が、最適以下の用量のＩＬ−２およびＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブ／Ｉｉ−抑制表現型の効果を増大して、マウスの５０％に完全な腫瘍退縮を惹起した（非特許文献１４）。確立されたＲＭ−９皮下腫瘍は、選択的に照射され、そして１日後に、４日間連続してプラスミドｐＣＩＩＴＡ、ｐＩＦＮ−γ、ｐＩＬ−２およびｐＩｉ−ＲＧＣを用いる腫瘍内プラスミド遺伝子治療によって処置された。すべて４プラスミドによる腫瘍内処置は、腫瘍照射が遺伝子治療１日前に投与された場合のみ、マウスの５０％以上において完全な腫瘍の退縮を誘導した。照射および腫瘍内遺伝子治療によって腫瘍フリーにされ、そして６４日目に再チャレンジされたマウスは、ＲＭ−９チャレンジに対しては防御されたが、同系のＥＬ−４チャレンジに対しては防御されなかった。これらの知見は、ＲＭ−９モデルでは、照射が、腫瘍に特異的な免疫応答のインサイチュー誘導のための腫瘍内遺伝子治療の治療効果を増進することを例証した。
【００１４】
最適治療効果を得るために、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉは、ＣＩＩＴＡにより誘導されねばならず、そしてＩｉが、両ＲｅｎｃａおよびＲＭ−９腫瘍モデルにおいてＩｉ−ＲＧＣによって抑制されることが必要である（非特許文献１５；非特許文献１４）。この結果は、マウス肺がん腫モデルにおいて、ＣＩＩＴＡによるＭＨＣクラスＩＩの誘導が、有効な腫瘍細胞ワクチンを生成しなかったことを示したＭａｒｔｉｎら（非特許文献１６）の結果と一致する。この研究は、ＣＩＩＴＡをトランスフェクトすることによるＭＨＣクラスＩＩの誘導が、これはまたＩｉを誘導するが、治療効果のためには不十分であるという本発明者らの知見を確認する。１つは、Ｉｉタンパク質をまた抑制することによってＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−の治療用表現型を取得しなければならない。Ｉｉタンパク質の最適な抑制について試験するために、治療構築物ＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣが種々の比率において使用された。少なくとも１：４比（ＣＩＩＴＡ：Ｉｉ−ＲＧＣ）が、Ｉｉの良好な抑制を確保するために要求された。ＩＦＮ−γがＲＭ−９前立腺腫瘍において使用されて、親の細胞において発現されないＭＨＣクラスＩ分子を誘導する。Ｒｅｎｃａ細胞はＭＨＣクラスＩ−ポジティブ細胞であり、そしてＩＦＮ−γは、ＭＨＣクラスＩ分子を誘導するためには必要ではないが、それらの発現をさらに上方調節する。両腫瘍モデルにおいては、ＩＬ−２プラスミドの治療用以下の用量が免疫応答を促進するために必要とされる。
【００１５】
マウスにおいて確立された腫瘍の治癒における有効性、および最適な処置プロトコルを決定するための前臨床研究における堅実な前進という、この明らかな例証があれば、ヒトのがんを処置するための薬剤が創造される。マウスの研究において使用されたＣＩＩＴＡ遺伝子はヒトのものであり、その生産物は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉ遺伝子のためのマウス・プロモーターにおいて良好に機能する（非特許文献１７）。ヒト・Ｂ類リンパ芽球（Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）およびＨｅＬａ細胞系においてＩｉ発現を抑制する数種のヒトＩｉ−ＲＧＣが作成された。ＣＩＩＴＡ構築物による細胞の形質導入は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子および細胞内Ｉｉの上方調節を誘導し、一方、両ＣＩＩＴＡとｈＩｉ−ＲＧＣによる細胞の形質導入は、ＭＨＣクラスＩＩの発現の増進に影響することなく、Ｉｉの抑制を惹起した。これらのデータは、ヒトＢリンパ腫細胞系Ｒａｊｉ，およびヒト黒色腫細胞系を含む、さらなるヒトの腫瘍細胞系において再現された。
【００１６】
本発明では、これらの方法が、新しく設計されたＲＮＡｉ遺伝子構築物および合成オリゴヌクレオチドを用いて応用される。二本鎖ＲＮＡは、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による標的遺伝子発現の選択的抑制のために使用することができる。アンチセンスとは異なり、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡを後に切断するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）と命名される、ヌクレアーゼ複合体中への二本鎖ＲＮＡの取り込みによって媒介される。長さ２５ヌクレオチド未満の二本鎖ＲＮＡは、ウイルスインターフェロンのＲＮＡ応答特性を活性化しないことが知られている。ＲＮＡ配列は、一般にコーディング領域における標的遺伝子ＲＮＡのいずれの領域に基づいていてもよい。合成ＲＮＡｉを使用する場合、細胞は、ＲＮＡｉのナノモル濃度の送達のためにカチオン性脂質を用いる培養において処理される。また活性ＲＮＡｉは発現構築物中に技術的に作成されてもよい。全研究において、標的配列に対して相補的ではないＲＮＡｉが対照として使用される。遺伝子発現の抑制は、Ｗｅｓｔｅｒｎ，ＦＡＣＳおよび／または表現型アッセイを用いてＲＮＡｉ処理後１２〜７２時間に測定される。
【００１７】
ＩｉのＲＮＡｉ抑制という堅固な性質は、内因的に合成される抗原の提示からもたらされる免疫刺激に理想的に適している。免疫刺激を得るための短期間、細胞の分画において抑制されることだけが必要である。これは、実質的に全細胞において連続的な抑制を要するがん細胞の増殖に関連する他の特異的標的とは全く対照的である。
【００１８】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、その相補的配列を担持している遺伝子の発現を特異的に抑制するプロセスである（非特許文献１８；非特許文献１９）。ＤＩＣＥＲを含む、数種の遺伝子産物がこのプロセスに絡んでいて、これは、長いｄｓＲＮＡを２１〜２５ヌクレオチド長の二本鎖フラグメントに進行的に切断するＲＮアーゼである。これらのフラグメントは、短い干渉性（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）または小さい干渉性（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として既知である（非特許文献２０）。
【００１９】
ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（ショウジョウバエ）における研究は、ＤＩＣＥＲが長いｄｓＲＮＡを２つの２１ｎｔ鎖からなるｓｉＲＮＡにプロセスするが、これは、各々において他と正確に相補的な１９ｎｔ領域を含んで、２つのｎｔ−３’オーバーハングに接した１９ｎｔ二重領域を生成する（特許文献３；非特許文献２１）。ｓｉＲＮＡは、次いで、標的ｍＲＮＡを認識し、そして切断するアプロテイン（ａｐｒｏｔｅｉｎ）複合体の形成を誘導する。ＤＩＣＥＲ酵素の同族体は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）からヒトまでの範囲の種において同定されて（非特許文献２２；非特許文献２３）いて、このことは、ｓｉＲＮＡが、哺乳動物およびヒト細胞を含む多数の異なる細胞において遺伝子発現をサイレンスする能力を有することを示唆する。
【００２０】
続いて、ＲＮＡｉは、哺乳動物細胞において合成２１−ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重らせんを導入することによって開始できることが見出された（非特許文献２０）。哺乳動物細胞の培養において、ＲＮＡｉは、トランスフェクションのような技術によって細胞中に導入された合成ｓｉＲＮＡにより広範な異なる細胞種において成功裏に再生された（非特許文献２０）。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞においてインターフェロン応答を誘導するには短すぎる（非特許文献２４）が、標的遺伝子の配列特異的抑制を提供するにはまだ十分に長いので、それらは、研究道具および治療剤としての大きな可能性を保持している。
【特許文献１】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、米国特許第５，７２６，０２０号（１９９８）
【特許文献２】米国特許出願第１０／１２７，３４７号
【特許文献３】ＷＯ０１／７５１６４
【非特許文献１】Ｄａｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：２５５−２６０（１９９４）
【非特許文献２】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１：７２３−７３１（１９９４）
【非特許文献３】Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４；４０６８−４０７１（１９９０）
【非特許文献４】Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２３９１−２３９６（１９９２）
【非特許文献５】Ｂａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１２３−１３３（１９９４）
【非特許文献６】Ｂａｓｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：６１９−６２９（１９９５）
【非特許文献７】Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６８８６−６８９１（１９９７）
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ａｎａｎｔｈａｓｗａｍｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５１：２４４−２５５（１９９３）
【非特許文献９】Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９３：４７４−４７７（１９９８）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９３：４８０−４８３（１９９８）
【非特許文献１１】Ｍｏｕｇｄｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２５７４−２５７９（１９９７）
【非特許文献１２】Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：４３５−４４３（１９９１）
【非特許文献１３】Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０，１５１２−８（２００３）
【非特許文献１４】Ｈｉｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４，７６３−７７５（２００３）
【非特許文献１５】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｎｏｔｈｅｒ  ４８，４９２−８（２００３）
【非特許文献１６】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，６６６３−７０（１９９９）
【非特許文献１７】Ｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０９，５２１−３３（１９９９）
【非特許文献１８】Ｍｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：Ｒ７７２−５（２００１）
【非特許文献１９】Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８−２００（２００１）
【非特許文献２０】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献２１】Ｂｅｒｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３，２００１
【非特許文献２２】Ｓｎａｒｐ，２００１
【非特許文献２３】Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．ＢＩｉｏｌ．Ｂ：７４６，２００１
【非特許文献２４】Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，１９９８
【００２１】
［発明の要約］
本発明は、抗原提示経路を変える目的のための、細胞におけるＩｉ発現の抑制を伴う組成物および方法に対向される。１つの態様では、本発明はＩｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡに関する。１つの実施態様では、本発明のｓｉＲＮＡはＲＮＡ二重らせんを含む。ＲＮＡ二重らせんの１つの鎖はＩｉのセンス配列を含有する。ＲＮＡ二重らせんの第２の鎖はＩｉのセンス配列の逆の相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含有する。その他の態様では、ｓｉＲＮＡは、単一分子中に、Ｉｉのセンス配列、該センス配列の逆相補配列およびセンスおよび逆相補配列の間に二重らせん形成を可能にする介在配列を含む。すべての実施態様において、Ｉｉのセンス配列は、好ましくは、長さ１０〜２５ヌクレオチド、より好ましくは、長さ１９〜２５ヌクレオチド、またはもっとも好ましくは、長さ２１〜２３ヌクレオチドである。その他の態様では、本発明は、Ｉｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列、そのようなＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを含有する細胞、および同物の使用のための方法を提供する。
【００２２】
１つの態様では、本発明は、細胞においてＩｉの発現を抑制する方法に関する。この方法は、Ｉｉを発現する細胞中にｓｉＲＮＡを導入することを含み、この場合、ｓｉＲＮＡは細胞中にいずれか直接または間接的に導入される。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導
サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞におけるＩｉの発現を抑制する。
【００２３】
Ｉｉ発現の抑制は抗原提示経路を変えることを意図している。より具体的には、Ｉｉ発現の抑制は、これに関して正常には提示されないであろう抗原エピトープのＭＨＣクラスＩＩ分子への負荷を促進することを意図している。かくして、その他の態様では、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞への変換に関する。この変換は、例えば、タンパク質をコードしている発現可能な核酸配列を含んでなる組み換えベクターによるＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞のトランスフェクションによって実施することができ、このトランスフェクションが、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞において、トランスフェクトされた細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導をもたらす。
【００２４】
本発明のその他の態様では、本発明は、Ｉｉタンパク質発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面に、関心のある抗原エピトープを提示する方法に関する。この方法は、ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞であるか、またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるかいずれかであり、かつ関心のある抗原エピトープを発現する細胞を提供し；そしてｂ）ｓｉＲＮＡがいずれか直接または間接的に細胞に導入され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞においてＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを、段階ａ）の細胞中に導入することを伴う。その他の実施態様では、この方法は、ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブであるか、またはＭＨＣクラスＩＩ分子をその細胞表面において発現するように誘導されるかいずれかであり、さらに細胞がＩｉを発現する細胞を提供し；そしてｂ）関心のある抗原エピトープおよびＩｉのインヒビターを、段階ａ）の細胞中に導入することを含んでもよい。ＩｉのインヒビターはｓｉＲＮＡであってもよい。
【００２５】
その他の態様では、本発明は、免疫応答が、Ｉｉタンパク質の発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面において、関心のある抗原エピトープに対向される免疫応答を哺乳動物において刺激する方法に関する。この方法は、関心のある抗原エピトープを発現するＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞か、または関心のある抗原エピトープを発現し、かつその細胞表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞のいずれかを提供し；その後、ｓｉＲＮＡがいずれか直接または間接的に細胞に導入され、そしてさらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによってＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡを、該細胞中に導入し；そして該細胞によるか、または該細胞由来の関心のある抗原エピトープと複合されたＭＨＣクラスＩＩ分子により哺乳動物を免疫化することを含む。
【００２６】
その他の態様では、本発明は、細胞のタイプが、同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）抗原の発現を特徴とする、免疫学的応答のための動物のあるタイプの細胞を標的とする方法に関する。この方法では、培養物が抗原提示細胞を含む、個体からの末梢血液単核細胞の培養物が提供される。Ｉｉ発現のｓｉＲＮＡインヒビターは、発現のために適当な条件下の培養物において、細胞中に同定抗原をコードしている発現可能な核酸配列が存在するように、培養物の抗原提示細胞中にいずれか直接または間接的に導入される。
【００２７】
多数の関連する態様は、次の節において詳細に記述される。
【００２８】
［発明の詳細な記述］
１つの態様では、本発明は、個体における免疫応答の、病変に特異的な調節または標的化のための組成物および方法に関する。用語が本明細書で使用されるように、調節は、抗原に対する免疫系の感受性増大または感受性減少（寛容）を指すことを意味する。用語が
本明細書で使用されるように、標的化（ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ））は、抗原エピトープに対する感受性の増大を指すことを意味する。
【００２９】
本開示の全態様に関する必要な要素は、細胞におけるＩｉ合成の抑制である。用語「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）または（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、下方調節、あるいは本発明のインヒビターまたはサプレッサーの不在下で観察されるレベル以下に、Ｉｉの活性またはＩｉＲＮＡのレベルを低下させる作用を意味することを意図している。発明の背景の節で議論されたように、Ｉｉはタンパク質であり、これはＭＨＣクラスＩＩ分子と同時に調節（ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）される。ＩｉはＭＨＣクラスＩＩ分子を結合し、それによって、内因的に合成される抗原（すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現細胞内で合成される抗原）のＭＨＣクラスＩＩ分子への接近をブロックする。ＭＨＣクラスＩＩ分子／Ｉｉ複合体は、小胞体からポスト−ゴルジ分画ヘ移送され、Ｉｉは、ここで演じられる切断プロセスによって遊離され、これが外因性抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成されず、食作用、オプソニン作用、細胞表面抗体認識、補体レセプター認識およびＦｃレセプター認識のようなメカニズムによって抗原提示細胞中に取り込まれるために選択された抗原）の負荷（ｃｈａｒｇｉｎｇ）を可能にする。
【００３０】
複合されたＩｉタンパク質の存在により小胞体においてＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を排除される抗原類は、内因的に合成された抗原と呼ばれてもよい。そのような抗原は、細胞質タンパク質の検査を含み、これがプロテオソームによって消化され、そして抗原ペプチドのトランスポーター（ＴＡＰ）によって小胞体中にペプチドとして移送される。そのような内因的に合成される抗原は、通常は、小胞体においてＭＨＣクラスＩ分子に結合される。そのような抗原フラグメントは、Ｉｉタンパク質が抗原ペプチド結合部位をブロックするので、通常は、小胞体ではＭＨＣクラスＩＩ分子には結合されない。
【００３１】
ＭＨＣクラスＩへの結合と、続くＤ８＋Ｔリンパ球への提示のために小胞体中に移送されたこの広いレパートリーのペプチドは、Ｉｉタンパク質の発現を抑制することによって、その後のＣＤ４＋Ｔ免疫調節細胞への提示と、それの活性化のためにＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる。そのようなＣＤ４＋Ｔ免疫調節細胞は、免疫応答の種々の経路を統合する際にはヘルパー機能またはサプレッサー機能のいずれかをもつことができる。Ｔ免疫調節細胞は、物理的接触およびサイトカイン放出を介して、他の細胞、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔキラー細胞）、Ｂリンパ球および樹状細胞の活性化に貢献する。
【００３２】
本明細書で使用されるように、用語「関心のある抗原エピトープ」は、抗原提示が起きるであろう細胞内で産生されたタンパク質由来のペプチドに存在する抗原エピトープを指す。本明細書で使用されるように、この用語は既知または未知である抗原エピトープを包含することを意図している。かくして、「関心のある」修飾因子は、エピトープが予め決定されていることを暗に含まない。抗原エピトープは、提示が起きるであろう細胞の細胞質において合成されるタンパク質に含有されるという事実によってのみ関心がある。
【００３３】
治療的介入のための機会を提供する重要な生物学的結果は、ＭＨＣクラスＩ分子によってそこで結合するために小胞体中に移送されたペプチドの蓄積からのペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子による結合を追跡する。しばしば、Ｉｉ抑制の存在下でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されたエピトープは「隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ」エピトープであり、そのようなエピトープは、別には、抗原提示の古典的経路によってＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して免疫系に提示されることがない。隠れたエピトープは、試験抗原のアミノ酸配列の重複する合成ペプチドのライブラリーを解析することによって実験的に明らかにすることができる。試験抗原で免疫されたマウスの１株の動物が、そのライブラリーからの１セットのペプチド（「卓越した（ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープ」）に応答することが見出される。
しかしながら、同一マウスがそのライブラリーの単一ペプチドにより別に免疫される場合、以前には未同定のサブセット（免疫性ペプチドにおけるいずれかの卓越したエピトープに加えて）が、免疫学的エピトープを含有することが見出されている。これらの以前には未同定のエピトープは１セットの隠れたエピトープを含む。
【００３４】
本発明の方法は、卓越したエピトープおよび隠れたエピトープの両方に対して免疫を促進するけれども、若干の臨床状況では、隠れたエピトープに対する免疫応答の増強は、治療効果において特別の役割を演じる。例えば、がんに関連する抗原エピトープに対する治療応答を高める場合には、サプレッサーＴ細胞応答が決して起きなかった隠れたエピトープに対するＴヘルパー細胞応答が、効果的な樹状細胞の認可（ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ）を提供して、これが、順に、頑健な細胞傷害性Ｔリンパ球の抗腫瘍応答を生み出すことが十分ありそうである。がん関連抗原の卓越したエピトープに対するＴ細胞応答の抑制の開発は、腫瘍の微小転移巣の成長において役割を演じることが示されている。したがって、本発明の有意義な利用は、推定される隠れたがん関連決定基に対するＴヘルパー細胞応答の促進である。
【００３５】
その他の態様では、自己免疫疾患の場合、自己免疫疾患に関連する抗原の卓越したエピトープに対する応答が、そのような疾患の病状を促進する。ここで、代替法の開発、例えば、新規な隠れたエピトープに対する免疫応答の経路を抑制することは、治療学的に有用になり得る。これらの概念は、さらなる医学的症状、例えばアレルギー、移植片拒絶、および感染症および心臓血管病の治療において応用できるかもしれない。診断、処置のモニタリングおよびそのような症状を有する患者の治療において適用される化合物の開発における必須かつ有用な第１の段階は、Ｉｉタンパク質抑制の条件下で抗原提示細胞によって提示されるようになるＭＨＣクラスＩＩエピトープの同定である。そのようなエピトープは、両卓越したエピトープおよび隠れたエピトープを含む。免疫抑制性応答は、例えば、がんまたは感染性疾患の場合、それらには開発されていないし、そして活性化応答は、自己免疫疾患または移植片拒絶の場合には開発されていないので、隠れたエピトープは、特に有用であるかもしれない。したがって、その症例が、与えられた病状において存在しているかもしれないので、臨床医は、応答を活性化または抑制するＴｈ１またはＴｈ２を惹起することに新鮮なスタートを有する。そのようなエピトープを生成、単離および特性決定する方法は本発明の首題である。
【００３６】
その他の態様では、本発明は、Ｉｉタンパク質の不在下で小胞体においてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合される抗原エピトープを含有する個々のペプチドの提示、単離および同定を提供する。そのようなペプチドは合成することができ、そして起源となる疾病に関連する抗原に対して免疫応答を増進または抑制するために、ワクチン適用において、個々にまたは組み合わせて使用することができる。そのようなエピトープペプチドを単離および特性決定する方法は、米国特許第５，８２７，５２６号、米国特許第５，８７４，５３１号および米国特許第５，８８０，１０３号に示されており、これらは引用によって本明細書に組み入れられている。
【００３７】
「内因的に合成される」種類内に入る種々の抗原（通常は、ＭＨＣクラスＩＩ分子提示から排除される）は、ある種の病状と特異的に関連している。例えば、腫瘍細胞または他の悪性細胞を考えよ。そのような細胞は、がんに特異的なタンパク質およびがんに関連するタンパク質を合成し、これらは治療学的に有用なＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有する。しかしながら、これらのタンパク質は抗原提示細胞内で合成されるので、そのようなタンパク質の抗原エピトープは、同じ細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に関して提示から除外される。抗原タンパク質が合成される細胞による抗原エピトープの提示におけるこの制約は、ウイルスにより感染された細胞の場合にもまた適用される。ウイルス特異的抗原は、ウイルス感染細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子との会合における提示から除外されるが、一方
、それらの抗原は、同じ細胞のＭＨＣクラスＩ分子と会合して提示することができる。他の外因性病原体（例えば、細菌または寄生虫）が細胞を占拠し、そして細胞の機材を利用して病状に特異的なタンパク質を合成するという範囲までは、結果は同じである。事象の正常な経路を変え、それによってＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して病変に特異的な抗原を提示する能力は、新規なＭＨＣクラスＩＩ抗原エピトープによって始動される応答の増強をもたらす。
【００３８】
一連の治療様式は本発明の範囲内に入る。特許可能な組成物は多くのこれらの治療様式に関している。治療学的アプローチはインビボおよびエクスビボの実施態様を含む。Ｉｉ抑制のために標的化される細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージまたはＢリンパ球のような天然に存在する抗原提示細胞）でもよく、あるいはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されたＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞（例えば、腫瘍細胞）であってもよい。本明細書で使用されるように、表現「ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ」は、具体的には、細胞表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない細胞のみならず、天然に存在する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）のようにポジティブの対照細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の数に較べて、細胞表面に比較的低い数のＭＨＣクラスＩＩ分子を含有する細胞もまた含む。これに関して用語「比較的低い」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ対照細胞（例えば、天然に存在する抗原提示細胞）において見出されるようなそれらの細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子の数の約２５％またはそれ未満のみを含有すると評価される細胞を含むことを意味している。ＭＨＣクラスＩＩ分子の量の評価は、例えば、当該技術分野において周知である免疫蛍光技術を用いて実施することができる。
【００３９】
出願者らは、既に、免疫応答を調節する目的のためのＩｉ抑制を開示する特許出願を提出し、そして遂行した。これらの出願は、具体的には、細胞中に導入され、そしてＩｉｍＲＮＡに結合することによってＩｉ合成を直接抑制する抑制性コポリマー、ならびに核酸構築物として細胞中に導入され、これが続いて特異的なハイブリッド形成後にＩｉ発現を抑制するＲＮＡ分子に転写される逆遺伝子構築物を開示する。これらの早期に提出された特許出願は、米国特許出願公開第０８／６６１，６２７号、同第０９／２０５，９９５号、同第１０／０５４，３８７号および同第１０／１２７，３４７号を含み、これらの開示は、引用によって本明細書に組み入れられている。米国特許出願公開第０８／６６１，６２７号および同第０９／２０５，９９５号は、それぞれ米国特許第５，７２６，０２０号および同第６，３６８，８５５号として発行された。
【００４０】
簡単に言えば、米国特許出願公開第０９／２０５，９９５号は、約１０〜約５０ヌクレオチド塩基を含有する化学的に合成されたコポリマーに関する広範な開示を含有する。これらのコポリマーは、別にはアンチセンス配列として既知の、ＲＮＡ分子の標的部分に相補的であるヌクレオチド塩基配列を含有する。そのようなコポリマーの例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡを含む。アンチセンスコポリマーは２つのメカニズムによってＲＮＡからのタンパク質翻訳を抑制する。１つの方法は、ＲＮＡの成熟または翻訳のために必須のリボソーム、スプライセオソームまたは他の因子と相互作用することが必要なＲＮＡの一部分への接近をブロックすることである。第２の方法は、ＤＮＡにハイブリダイズされるＲＮＡの配列を切断する酵素、リボヌクレアーゼＨの増強作用を必要とする。かくして、ＲＮＡにおける対応するセグメントへのＤＮＡまたはＤＮＡ類似のコポリマーの結合は、コポリマー結合部位においてＲＮＡの切断をもたらす。
【００４１】
コポリマーは、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成によって標的ＲＮＡにハイブリダイズする。コポリマーの配列は標的ＲＮＡの相補的配列によって定められる。コポリマーは、通常、もっとも普通である１２〜２５個を含む、標的ＲＮＡの少なくとも６個の相補的ヌクレオチドにわたる長さのヌクレオチド配列を用いて化学的に合成される。
統計学的には、約１５ヌクレオチドの配列が、細胞内の全ＲＮＡの集団内では独特であり、いずれか特定のＲＮＡを高度の特異性により標的とさせる。ＲＮＡへの結合は、また、２０塩基対を包含するコポリマーについて約１０−１７ＭのＫｄ値をもち非常に安定である。
【００４２】
若干の場合には、培養中の細胞は、有用な効果を達成するのに十分な量においてコポリマーを取り込む。そのような取り込みは、生物化学的エネルギーおよびある種の細胞表面タンパク質の関与を必要とする活性プロセスであると思われる。また、取り込みは飲作用によっても起き得る。この経路は、コポリマーを含有する高張培地において細胞を培養し、続いてわずかに低張な培地における細胞の再懸濁によって増進されて、細胞内の飲作用小胞の破裂を誘導することができる。他の場合は、取り込みは、脂質、リポソームまたはポリアルキルオキシ・コポリマーの使用によって、またはエレクトロポレーションによって、または細胞膜を浸透性にするストレプトリシンＯ処理によって助長することができる。インビボの細胞は、しばしば、培養細胞よりも容易にコポリマーを取り込む。エレクトロポレーションによるコポリマーの細胞取り込みのための最適条件は、米国特許出願公開第０９／２０５，９９５号の実施例２において提供されている。
【００４３】
標的ＲＮＡの潜在的部位は、タンパク質の機能的複合体の結合のためのそれらの開放部であり、そしてさらなる部位がコポリマーの結合のために別に開放されている。そのような部位は、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）、ＤＮＡにハイブリダイズされるＲＮＡを切断する酵素を用いて同定することができる。リボヌクレアーゼＨの存在下で５’−放射性リン酸標識されたＲＮＡに、単独でも混合物においても、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを付加することによって、オリゴヌクレオチドと他のコポリマーがハイブリダイズするＲＮＡにおける部位は、ＲＮＡのゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーの後に同定される。ＲＮアーゼＨの切断のためにもっとも開放されている本発明において見出されたＩｉＲＮＡにおける部位は、ＡＵＧイニシエーターコドンの領域およびｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける第１スプライス部位の領域であった。
【００４４】
本発明に関する用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって連結された天然に存在する塩基およびペントフラノシル糖により形成されるヌクレオチド単位を含んでなるポリヌクレオチドを指す。用語「コポリマー」は、オリゴヌクレオチドおよびまた、天然に存在しないまたは改変されたオリゴヌクレオチドのサブユニットから形成された構造的に関連する分子を含む。これらの改変は、ヌクレオチドの塩基部分、ヌクレオチドの糖部分、またはヌクレオチド間の結合基のいずれにおいても起きる。また、さらなる結合基は、しばしば、以下において非常に詳細に議論されるコポリマーを生成するために、天然のオリゴヌクレオチドの糖およびリン酸骨格について置換される。
【００４５】
生成されるそのようなオリゴヌクレオチドの改変および特徴は、当業者には容易に利用できる。代表的な改変は、米国特許第４，４６９，８６３号（１９８４）；米国特許第５，２１６，１４１号（１９９３）；米国特許第５，２６４，５６４号（１９９３）；米国特許第５，５１４，７８６号（１９９６）；米国特許第５，５８７，３００号（１９９６）；米国特許第５，５８７，４６９号（１９９６）；米国特許第５，６０２，２４０号（１９９７）；米国特許第５，６１０，２８９号（１９９７）；米国特許第５，６１４，６１７号（１９９７）；米国特許第５，６２３，０６５号（１９９７）；米国特許第５，６２３，０７０号（１９９７）；米国特許第５，７００，９２２号（１９９７）；および米国特許第５，７２６，２９７号（１９９８）において示されており、これらの開示は引用によって本明細書に組み入れられている。
【００４６】
相補的ＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力は、化学的改変について非常に寛容である。したがって、多くの異なる機能的コポリマーが可能である。糖リン酸
骨格は、特に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する能力を失うことなく広く変えることができる。定義によって、ヌクレオチドは、糖、窒素複素環およびリン酸部分を含む。糖またはリン酸基のいずれかまたは両者を欠く若干のオリゴヌクレオチドの類似体は、なおまだアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じようにＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対によってハイブリダイズでき、そして同じ目的のために使用することができる。ヌクレオチド塩基を含有するこれらのコポリマーは、ＲＮＡにハイブリダイズする点ではオリゴヌクレオチドの機能的等価物である。アンチセンス適用のためにそれらの特性を変え、そして改良するオリゴヌクレオチドの若干の改変が以下に総括される。
【００４７】
非架橋酸素原子の置換、架橋酸素原子の置換、ヌクレオシド間リン酸基の置換、糖環の周りの立体化学に対する変更、リボフラノシル環構造の改変、ヌクレオチド結合改変、およびペプチジル核酸（ｐｎａ）を生成するためのペプチド骨格による糖リン酸骨格置換を含む、多数の特定の改変が開示されている。引用された特許出願の実行は、次に示す請求項の許可をもたらしたが、これは米国特許第６，３６８，８５５号の代表的な独立請求項である。
【００４８】
１．  哺乳動物のＢ７分子をコードしている外因性構築物を含有せず、そしてＩｉタンパク質発現または免疫調節機能の特異的レギュレーターを含有するＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブ抗原提示細胞であって、オリゴヌクレオチドＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＧＧは特に除外されて、特異的レギュレーターは、生理学的条件下で哺乳動物Ｉｉタンパク質をコードしているＲＮＡ分子の標的領域に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする１０〜５０ヌクレオチド塩基のコポリマーから本質的になり、この場合、特異的レギュレーターはＩｉ発現を抑制する能力を特徴とする、抗原提示細胞。
【００４９】
関連する背景情報、およびさらなる請求項の限定のための支持を提供する目的では、上記請求項における少なくとも２つの特定の限定が先行技術開示を申し出るために含まれたことが注目される。例えば、オリゴヌクレオチド３’ＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＧＧ−５’の特別の除外は、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（５）：４３５−４４３（１９９１）の開示に照らして組み入れられた。哺乳動物のＢ７分子をコードしている外因性構築物に対向された限定は、Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（米国特許第５、８５８、７７６号）の開示に照らして導入された。
【００５０】
従来、公表されてなかった本開示の重要な要素は、ヒト細胞におけるＩｉの発現を抑制するための逆遺伝子構築物の使用である。ヒトＩｉ配列は、既に報告されていた（Ｓｔｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８６９−８７２（１９８４））が、この配列の少なくとも一部を含有する逆遺伝子構築物の使用は、決して報告されていなかった。さらにまた、例えば、マウスＩｉ配列とヒトＩｉ配列との間の有意な保存は報告されたが、非ヒト逆遺伝子構築物は、ヒト細胞におけるＩｉの翻訳の抑制における使用については無効であった。
【００５１】
かくして、１つの態様では、本発明は、ヒトＩｉタンパク質をコードしているｍＲＮＡに相補的であるＲＮＡ分子であって、ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズして、ヒト細胞におけるｍＲＮＡの翻訳を抑制する能力を有するＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ分子を含んでなる、発現可能な逆遺伝子構築物に関する。本発明のこの態様は、次に示す例示の節において具体的に例証される。より具体的には、ｃＤＮＡインサートを含有する発現構築物がヒトリンパ腫細胞系におけるＩｉ発現の抑制に有効であることが例証される。このアッセイにおいて有効である構築物は、Ｉｉ  ｍＲＮＡ  ５’非翻訳領域の一部分に相補的なｃＤＮＡインサートを含み、かつ翻訳開始コドンを含んだ。有効な構築物は長さ約４３５ヌクレオチドまでの抑制性ＲＮＡをコードしていた。
【００５２】
ヒトＩｉ  ｍＲＮＡの一部と完全に相補的であるＲＮＡをコードしている逆遺伝子構築物の使用に加えて、当業者は、野生型ヒト配列からのある程度の相違が許容できることを認識できる。本発明の範囲は、日常的実験によって経験的に決定することができるそのような変異物を包含することを意図している（すなわち、それらはヒト細胞においてＩｉ発現を抑制する能力を特徴とする）。特に有用であり、かつヒト細胞においてＩｉ発現を抑制するのに有効であることが例証された野生型からの変異物の例は、ヒトＩｉ  ｍＲＮＡに相補的な長い半減期のアンチセンスＲＮＡ（野生型アンチセンスＲＮＡに較べて）の創造に関する。長い半減期の種では、アンチセンスＲＮＡの読み枠は、開始コドン、ＡＵＧ、同じ読み枠内で短く／直接に続く終止コドンの存在を避けるように設計される。この状態を避けるために、読み枠１における終止コドンの前近くに存在するＡＵＧに関して、新しいＡＵＧは、終止コドンが改変後にその読み枠に存在しないことを条件に、いずれか読み枠２または読み枠３において、読み枠１のＡＵＧの前に、計画され、そして導入することができる。
【００５３】
Ｉｉ逆遺伝子構築物の使用に加えて、Ｉｉ発現の他の抑制性コポリマーが容易に設計され、構築されることは当業者には認識することができる。例えば、二本鎖の小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの分子をコードしている遺伝子は、ＲＮＡ干渉によってＩｉを抑制するために使用されてもよい。
【００５４】
本発明の目的は、Ｉｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物、そのような組成物を含有するベクターおよび細胞、および同物を使用する方法を提供することである。
【００５５】
本明細書で使用されるように、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がその相補的配列を担持している遺伝子の発現を抑制するプロセスを指す（Ｍｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１（１９）：Ｒ７７２−５（２００１）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５（２）１８８−２００（２００１））。理論によって束縛されることを願わないが、ＲＮＡｉは、４つの主な段階：ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるｓｉＲＮＡの集合、ＲＩＳＣの活性化、標的認識および標的切断を特徴とする、複数のＲＮＡ−タンパク質相互作用を伴うメカニズムによって起きると理解される。本明細書で使用されるように、用語「短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、ＲＮＡｉまたは遺伝子サイレンシングを媒介することができるすべての核酸分子を指すことを意図している。用語ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機能をもつ、種々の天然に生成されるか、または合成の化合物を包含することを意図している。そのような化合物は、限定されることなく、２または３塩基対の末端オーバーラップをもつ約２１〜２３塩基対の二重の合成オリゴヌクレオチド；３〜５塩基対のループによって連結された２１〜２３塩基対のセンスおよび相補的なハイブリダイズしているセグメントを有する１つのオリゴヌクレオチド鎖のヘアピン構造物；および前記構造物または機能的等価物の発現へと導く種々の遺伝子構築物を含む。そのような遺伝子構築物は、通常、インビトロで作成され、そして試験系に導入されるが、また、宿主細胞または動物のゲノムによってコードされた天然に存在するｓｉＲＮＡ前駆体からのｓｉＲＮＡを含んでもよい。
【００５６】
本発明のｓｉＲＮＡがＲＮＡのみからなることは必ずしも必要ではない。本発明のｓｉＲＮＡは、１つ以上の化学的改変体および／またはヌクレオチド類似体を含んでもよい。改変体および／または類似体はＩｉ発現を抑制するｓｉＲＮＡの能力にネガティブに影響しない、それぞれいかなる改変体および／または類似体であってもよい。ｓｉＲＮＡにおける１つ以上の化学的改変体および／またはヌクレオチド類似体の含有は、ヌクレアーゼ消化を防ぐか、遅らせ、そして順次、実際的使用のためにより安定なｓｉＲＮＡを作成するることが好ましい。ＲＮＡを安定化させる化学的改変体および／またはヌクレオチド類似体は、当該技術分野において既知である。非架橋ホスホロイル酸素原子の硫黄原子によ
る置換を含むホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）誘導体は、ヌクレアーゼ消化に対する耐性の増大を示す類似体の１例である。化学的改変のために標的とされてもよいｓｉＲＮＡの部位は、ヘアピン構造物のループ領域、ヘアピン構造物の５’と３’末端（例えば、キャップ構造物）、二本鎖の線状ｓｉＲＮＡの３’オーバーハング領域、線状ｓｉＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’または３’末端、およびセンスおよび／またはアンチセンス鎖の１個以上のヌクレオチドを含む。
【００５７】
本明細書で使用されるように、用語ｓｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉを媒介できる分子として定義される当該技術分野における全ての用語に対して等価であることを意図している。そのような等価物は、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短い干渉性オリゴヌクレオチド、および転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）を含む。
【００５８】
理論によって束縛されるのを願わないが、ＲＮＡｉにおいて、二本鎖ＲＮＡは、相補的ｍＲＮＡに結合し、そしてその分解をもたらす２１〜２３塩基対フラグメントにプロセスされると一般に理解されている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９（６８１８）：３６３−６（２００１）、および国際公開ＷＯ  ０１７５１６４）。ｓｉＲＮＡは配列に特異的な翻訳後遺伝子サイレンシングを含む。そのような分子は、国際公開ＷＯ  ０１７５１６４に記述されるように、治療または予防目的のために遺伝子発現を抑制するように細胞中に導入されてもよい。そのような分子は、種々の特許、特許出願および報告書に記述されるように、治療または予防目的のために遺伝子発現を抑制するように細胞中に導入されてもよい。ＲＮＡｉ技術を記述している、引用によって本明細書に組み入れられている公表物は、限定されるものではないが、次のものを含む：米国特許第６，６８６，４６３号、米国特許第６，６７３，６１１号、米国特許第６，６２３，９６２号、米国特許第６，５０６，５５９号、米国特許第６，５７３，０９９号および米国特許第６，５３１，６４４号；国際公開ＷＯ０４０６１０８１；ＷＯ０４０５２０９３；ＷＯ０４０４８５９６；ＷＯ０４０４８５９４；ＷＯ０４０４８５８１；ＷＯ０４０４８５６６；ＷＯ０４０４６３２０；ＷＯ０４０４４５３７；ＷＯ０４０４３４０６；ＷＯ０４０３３６２０；ＷＯ０４０３０６６０；ＷＯ０４０２８４７１；ＷＯ０１７５１６４。これらの化合物の最適使用のための方法および概念を記述する報告書は、限定されるものではないが次のものを含む：Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３（２００２）；Ｃａｐｌｅｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：５７５−８６（２００３）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  ２１Ｍａｒ０３  １−６（２００３）；Ｙｕ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−５２（２００２）；Ｐａｕｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：５０５−８（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１４４３−８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：７９７−８０１（２００３）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：−５５０−３（２００３）；Ｓｕｉ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：５５１５−２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １６：９４８−５８（２００２）。
【００５９】
本発明の文脈中、Ｉｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物は、Ｉｉのセンス配列を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含んでもよい。この実施態様では、ＲＮＡ二重らせんは、Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖およびＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖を含む。１つの実施態様では、Ｉｉのセンス配列は、長さ１０〜２５ヌクレオチドからなる。より好ましくは、Ｉｉのセンス配列は、長さ１９〜２５ヌクレオチドからなる。もっとも好ましくは、Ｉｉのセンス配列は、長さ２１〜２３ヌクレオチドからなる。Ｉｉのセンス配列は、好ましくは、翻訳開始部位を含有するＩｉの配列を含み、より好ましくは、ヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｎｔ内にＩｉ配列の一部を含む。
【００６０】
その他の実施態様では、Ｉｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物は、単一分子において、Ｉｉのセンス配列、Ｉｉのセンス配列の逆相補配列、およびセンスと逆相補配列との間に二重らせんを形成させる介在配列を含んでもよい。Ｉｉのセンス配列は、長さ１０〜２５ヌクレオチド、またはより好ましくは、長さ１９〜２５ヌクレオチド、またはもっとも好ましくは、長さ２１〜２３ヌクレオチドを含んでもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含んでもよい。
【００６１】
本発明のｓｉＲＮＡが、Ｉｉのセンス配列あるいは互いにまたはＩｉの標的領域に完全には相補的ではないＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでもよいことは当業者には容易に理解できる。言い換えれば、ｓｉＲＮＡは、センスまたは逆相補配列内にミスマッチまたはバルジを含んでもよい。１つの態様では、センス配列またはその逆相補配列は、完全には接触していなくてもよい。配列は１個以上の置換、欠失および／または挿入を含んでもよい。本発明のただ１つの要件は、ｓｉＲＮＡセンス配列が、その逆相補配列およびＩｉの標的領域に対して十分な相補性を保持してＲＮＡｉ活性を可能にさせることである。したがって、本発明の目的は、ＲＮＡｉ活性を可能にするために十分な相補性を維持する本発明のｓｉＲＮＡの配列改変体を提供することである。本発明の改変されたｓｉＲＮＡ組成物が、Ｉｉの相補配列および標的領域に対して計算された改変配列の結合自由エネルギーに基づいて働くことを、当業者は予想できる。核酸に対する結合自由エネルギーの算出および標準のハイブリッド形成におけるそのような値の効果は当該技術分野において既知である。
【００６２】
広範な送達システムが、インビトロおよびインビボの標的細胞に対して本発明のｓｉＲＮＡを送達する際の使用のために利用できる。本発明のｓｉＲＮＡは、Ｉｉ抑制が望まれる細胞中に直接または間接的に導入できる。ｓｉＲＮＡは、例えば、注射によって細胞中に直接導入されてもよい。それ自体、本発明の目的は、注射可能な用量単位形態物においてＩｉを抑制するのに有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物を提供することである。本発明のｓｉＲＮＡは、本発明の方法および組成物と組み合わせて治療学的使用のために、例えば静脈内または皮下に注射されてもよい。そのような処置は、治療学的に有効なレベルが達成されて所望される組織においてＩｉ発現が抑制されるまでの、間断的または連続的投与を含む。
【００６３】
間接的に、ｓｉＲＮＡをコードしている発現可能なＤＮＡ配列が細胞中に導入され、その後、ｓｉＲＮＡがＤＮＡ配列から転写されてもよい。したがって、本発明の目的は、Ｉｉ発現を抑制するのに有効なｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含んでなる組成物を提供することである。
【００６４】
本発明のＤＮＡ組成物は、Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１のＤＮＡ配列およびＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２のＤＮＡ配列を含む。第１および第２のＲＮＡ配列は、ハイブリダイズされた場合、Ｉｉ発現を抑制することができるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成することができるｓｉＲＮＡ二重らせんを形成する。第１および第２のＤＮＡ配列は、化学的に合成されてもよく、またＩｉに対する適当なプライマーを用いてＰＣＲによって合成されてもよい。あるいはまた、ＤＮＡ配列は、当該技術分野において周知であるクローニング技術を用いて組み換え操作によって得られてもよい。一旦得られれば、ＤＮＡ配列は、精製され、合体され、次いでＩｉ抑制が所望される細胞中に導入することができる。あるいはまた、配列は、単一ベクターまたは別々のベクターに含有され、そしてこれらのベクターがＩｉ抑制が所望される細胞中に導入されてもよい。
【００６５】
本発明のＤＮＡ組成物を標的細胞に送達する際に使用できる送達システムは、例えば、ウイルスおよび非ウイルス系を含む。適当なウイルス系の例は、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルスベクター、ワクシニア、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、マウスの微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスを含む。また、例えば、非複合ＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡコートされた金粒子、サルモネラのような細菌のベクター、およびＶＰ２２輸送タンパク質、Ｃｏ−Ｘ−ｇｅｎｅおよびレプリコンベクターを伴う技術のような他の技術を用いて、非ウイルス送達システムが使用されてもよい。本発明の文脈におけるウイルスまたは非ウイルスベクターは、関心のある抗原を発現することができるであろう。
【００６６】
動物細胞における関心のある核酸配列の発現のための１つの選択肢はアデノウイルス系である。次に示す例示の節において、アデノウイルス系の使用が具体的に開示される。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡゲノムをプロセスし、そして宿主細胞の分裂とは独立に複製する。アデノウイルスベクターは、細胞中に発現構築物を導入するための代替方法に関連する種々の利点を提供する。例えば、アデノウイルスベクターは、広範囲のヒト組織を形質導入することができ、そして高レベルの遺伝子発現が分裂および非分裂細胞において得ることができる。アデノウイルスベクターは、標的細胞の分裂中の免疫系クリアランスおよび希釈損失による比較的短期間の導入遺伝子の発現を特徴とする。静脈内、胆管内、腹腔内、嚢胞内、頭蓋内および鞘内注射、および標的臓器または組織の直接注射を含む、いくつかの投与経路が使用できる。かくして、解剖学的境界に基づく標的化が達成できる。
【００６７】
アデノウイルスゲノムは約１５種のタンパク質をコードしており、そして感染は細胞表面の受容体に結合する繊維タンパク質を必要とする。この受容体相互作用はウイルスのインターナリゼーションをもたらす。ウイルスＤＮＡは感染細胞の核に入り、そして細胞分裂の不在下で転写が開始される。発現および複製はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の制御下にある（参照、Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，１９９０，ｐｐ．１７２５−１７４０）。Ｅ１遺伝子の除去はウイルスの複製不全をもたらす。
【００６８】
アデノウイルス血清型２および５はベクター構築のために広く使用されてきた。Ｂｅｔｔら（Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：８８０２−８８０６（１９９４）は、Ｅ１およびＥ３アデノウイルス遺伝子の欠失とともにアデノウイルス血清型５ベクター系を使用した。２９３ヒト胚性腎細胞が、Ｅ１タンパク質を発現するように工作され、その結果Ｅ１欠失ウイルスゲノムをトランスコンプルメント（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｎｔ）できた。ウイルスは２９３細胞培地から分離され、そして限界希釈プラークアッセイによって精製することができる（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｋ，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１，ｐｐ．１０９−１２８）。組み換えウイルスは２９３細胞系培養物において増殖され、そして感染細胞を溶解し、塩化セシウム密度遠心分離による精製によって単離できた。組み換えアデノウイルスの生産について２９３細胞に関する問題は、Ｅ１遺伝子の付加される隣接領域により、それらが、ウイルス粒子生産中、複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）を生じるかもしれないことである。この材料は、野生型アデノウイルスのみであり、そして複製能のある組み換えウイルスではないけれども、それは、所望のアデノウイルス材料の究極的収量に有意な影響を有し、そして製造コストの増大、生産試行のための品質管理発生（ｉｓｓｕｅ）および臨床使用のためのバッチの承認をもたらす。２９３細胞よりも明確なＥ１遺伝子組込みを有する（すなわち、隣接するウイルス配列を含有しない）ＰＥＲ．Ｃ６のような代替細胞系が開発されたが、これは、ＲＣＡを生産する組み換え事象を許さず、その結果上記ウイルス生産の発生を克服する潜在力を有する。
【００６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７９３−８０１（１９９４））は、非常に広い宿主範囲の非分裂細胞のゲノム中に組込むことができる一本鎖ＤＮＡの非自律性パルボウイルスである。ＡＡＶは、ヒトの疾病には関係しないことが分っており、そして免疫応答を惹起しない。
【００７０】
ＡＡＶは２つの明確なライフサイクル相を有する。野生型ウイルスは宿主細胞に感染し、組込まれ、そして潜伏したまま留まる。アデノウイルスの存在下で、このウイルスの溶菌期が誘導されるが、これは、初期アデノウイルス遺伝子の発現に依存し、そして活性ウイルスの複製をもたらす。ＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列によって隣接された２つのオープン読み枠（ｒｅｐおよびｃａｐと呼ばれる）からなる。ｒｅｐ領域は、ＡＡＶ複製、ウイルスＤＮＡ転写、および宿主ゲノム組込みにおいて使用されるエンドヌクレアーゼ機能を媒介する４種のタンパク質をコードしている。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製に必要とされるＡＡＶ配列のみである。ｃａｐ配列は、ウイルスのキャプシドを形成する構造タンパク質をコードしている。ＩＴＲはウイルスの複製起点を含有し、包膜シグナルを提供し、そしてウイルスのＤＮＡ組込みに寄与する。遺伝子治療のために開発された組み換え複製不全ウイルスは、ｒｅｐおよびｃａｐ配列を欠如する。複製不全ＡＡＶは、ＡＡＶ複製に必須の別々の要素を許容性２９３細胞系中に同時にトランスフェクトすることによって作成することができる。米国特許第４，７９７，３６８号は、関連する開示を含有し、そしてそのような開示は引用によって本明細書に組み入れられている。
【００７１】
レトロウイルスベクターは、分裂細胞に感染するために有用であり、そして宿主細胞膜由来のエンベロープに包まれたＲＮＡゲノムおよびウイルスタンパク質からなる。レトロウイルス遺伝子の発現は、ポジティブ鎖ＲＮＡゲノムが二本鎖ＤＮＡの合成を指図する鋳型として用いられ、次いで、宿主細胞ＤＮＡ中に組込まれる逆転写段階を伴う。組み込まれたプロウイルスは、遺伝子発現のために宿主細胞機構を使用することができる。
【００７２】
マウス白血病ウイルスは普通に使用されるレトロウイルス種である（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３））。レトロウイルスベクターは、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の欠失によって構築される。これらの配列の欠失は、関心のある核酸配列の挿入のための能力を提供し、そしてウイルスの複製機能を排除する。抗生物質耐性をコードしている遺伝子は、しばしば、選択の手段として含まれる。プロモーターおよびエンハンサー機能もまた、例えば、インビボ投与後の組織特異的発現を提供するために含まれてもよい。長い末端反復中に含有されるプロモーターおよびエンハンサー機能がまた使用されてもよい。
【００７３】
そのようなウイルス、および関心のある外因性核酸配列を保持するそのようなウイルスの改変物は、ウイルスパッケージング細胞系においてのみ生産できる。パッケージング細胞系は、欠失されたウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が異なる染色体上に存在して組み換えを防ぐように、それらを細胞中に安定に挿入することによって構築されてもよい。パッケージング細胞系は、組み換えプロウイルスＤＮＡを挿入することによって関心のある核酸配列を含有する複製欠陥レトロウイルスを生成できる生産細胞系を構築するために使用される。包膜配列を含有するｇａｇ遺伝子の小部分に隣接する長い末端反復配列および関心のある遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡが、ＤＮＡ転移と取り込みのための標準技術（エレクトロポレーション、カルシウム沈降など）を用いてパッケージング細胞系中にトランスフェクトされる。このアプローチの変法は、複製能のあるウイルスの産生の可能性を低下させるために用いられた（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅ
ｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４（１９９４））。ウイルスの宿主細胞範囲は、エンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）によって決定され、そして異なる細胞特異性によるｅｎｖ遺伝子の置換が用いられてもよい。また、エンベロープタンパク質への適当なリガンドの組み入れが標的化のために使用されてもよい。
【００７４】
組み換えレトロウイルスベクターの投与は、いかなる適当な技術によって達成されてもよい。そのような技術は、例えば、患者の細胞のエクスビボでの形質導入、組織へのウイルスの直接注射、およびレトロウイルス生産細胞の投与を含む。エクスビボのアプローチは患者の細胞の組織培養における分離および維持を要する。これに関して、標的細胞に対して高い比率のウイルス粒子が達成され、その結果、形質導入の効率を改良できる（参照、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号，これの開示は引用によって本明細書に組み入れられている）。米国特許第４，６５０，７６４号は、レトロウイルス発現系の使用に関連する開示を含有し、この関連特許の開示は引用によって本明細書に組み入れられている。
【００７５】
ある場合には、インビトロでのウイルスの直接導入が必要であり、または好適である。レトロウイルスは、分裂細胞（腫瘍細胞）のみに感染するレトロウイルの能力が特に得策である脳腫瘍を処置するために使用された。
【００７６】
患者における脳腫瘍中への直接レトロウイルス生産細胞系の投与がまた提案された（参照、例えば、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：３９−６９（１９９３））。そのような生産細胞は数日間脳腫瘍内で生存でき、そして周囲の脳腫瘍を形質導入することが可能なレトロウイルスを分泌するであろう。
【００７７】
発現のためのポックスウイルスに基づく系が開示された（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｘｎｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３０５−３２４（１９８７）：Ｍｏｓｓ，Ｂ．，Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，ｐｐ．２０７９−２１１１）。ワクシニアは、例えば、感染細胞の細胞質において複製する大きい包膜ＤＮＡウイルスである。多くの異なる組織からの非分裂および分裂細胞が感染され、そして組込まれてないゲノムからの遺伝子発現が観察されている。組み換えウイルスは、ワクシニア由来のプラスミド中に導入遺伝子を挿入し、そして相同組み換えがウイルス産生をもたらすワクシニア感染細胞中にこのＤＮＡをトランスフェクトすることによって作成できる。それが反復投与を疑わしくさせる１５０〜２００のウイルスにコードされたタンパク質に対して免疫応答を惹起することは明らかな欠点である。
【００７８】
単純ヘルペスウイルスは感染細胞の核において複製する大きい二本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは外因性核酸配列との結合において使用するために適用可能である（参照、Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．８６：６９７−７０２（１９９３））。利点は宿主細胞範囲、分裂および非分裂細胞の感染を含み、そして大きい外来ＤＮＡの配列が相同的組み換えによってウイルスゲノム中に挿入できる。欠点は、ウイルス調製物を複製適格ウイルスおよび強い免疫応答のないようにすることの難しさである。ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の欠失は、低レベルのチミジンキナーゼを含む細胞においてウイルスを複製欠陥にさせる。活性な細胞分裂を行っている細胞（例えば、腫瘍細胞）は、複製を可能にするのに十分なチミジンキナーゼを保持する。
【００７９】
ＨＩＶ、マウスの微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスを含む、種々の他のウイルスが遺伝子転移のためのベクターとして開示されている（参照、Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４（１９９４））。
【００８０】
非ウイルスＤＮＡ送達戦略もまた適用可能である。これらのＤＮＡ送達戦略は、無複合プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−脂質複合体、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡコートされた金粒子およびＤＮＡコートされたポリラクチドコグリコリド粒子に関する。精製核酸は組織中に直接注入することができ、そして例えば筋肉組織において、特に再生しつつある筋肉において効果的な、一過性遺伝子発現をもたらす（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０））。Ｄａｖｉｓら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：７３３−７４０（１９９３）は、成熟筋肉（骨格筋が一般に好適である）中へのＤＮＡの直接注射に関して公表した。
【００８１】
金粒子上のプラスミドＤＮＡは、遺伝子銃を用いて細胞（例えば、表皮または黒色腫）中に「発射」することができる。ＤＮＡは金粒子上に共沈され、次いで噴射剤として電気火花または加圧ガスを用いて発射される（Ｆｙｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１４７８−１１４８２（１９９３））。また、エレクトロポレーションが使用されて、多数の針の列およびパルス回転電場を用いるエレクトロポレーションプローブを使用して固形腫瘍中にＤＮＡを転移させた（Ｎｉｓｈｉ  ｅｙ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１０５０−１０５５（１９９６））。皮下腫瘍への高効率の遺伝子転移は、有意な細胞トランスフェクションの増進および腫瘍内注射操作以上のより良好な分配特性に関して特許請求された。
【００８２】
脂質媒介トランスフェクションは、両インビトロおよびインビボトランスフェクションのために好適である（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６２：６３７８（１９９９））。脂質−ＤＮＡ複合体は、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬のような市販の脂質を用いて、注射前１〜５分にＤＮＡと脂質を混合することによって形成される。
【００８３】
リポソームは疎水性分子により親水性分子を取り囲むことによって細胞侵入を容易にするように働く。リポソームは脂質から作成された単層または多層の球である。脂質組成および製造過程はリポソームの構造に影響を与える。他の分子は脂質膜中に組み入れることができる。リポソームはアニオンまたはカチオン性であってもよい。Ｎｉｃｏｌａｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１０６８−１０７２（１９８３））は、ラットに注射されたアニオン性リポソームからのインスリン発現に関する研究を発表した。アニオン性リポソームは、別に標的化されない限り、主に肝臓の網状内皮細胞を標的とした。分子はリポソームの表面に組み入れられて、それらの挙動、例えば細胞選択的送達を変えることができる（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７））。
【００８４】
Ｆｅｌｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７（１９８７））は、静電相互作用によって核酸の結合を例証し、そして細胞侵入を示したカチオン性リポソームに関する研究を公表した。カチオン性リポソームの静脈内注射は、臓器への求心性血液供給中への注射においてほとんどの臓器で導入遺伝子の発現をもたらす。カチオン性リポソームは肺の上皮を標的とするエアゾルによって投与することができる（Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８−２８１（１９８９））。カチオン性リポソーム導入遺伝子送達によるインビボ研究が公表された（参照、例えば、Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７９−９２（１９９４）；Ｈｙｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５０−２５５（１９９３）および；Ｃｏｎａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１８３４−１８４０（１９９４））。
【００８５】
微粒子が、食細胞にＤＮＡを送達するためのシステムとして研究されているが、そのようなアプローチはＰａｎｇａｅａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって報告された。そのようなＤＮＡ微小被包化（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）送達システムは、微小球を摂取するマクロファージのような食細胞の、より有効な形質導入を実施するために使用された。微小球は潜在的に免疫性ペプチドをコードしているプラスミドＤＮＡを被包化していて、これが、発現された場合、同じエピトープを含有するそのようなペプチドおよびタンパク質配列に対して免疫応答を刺激できる細胞表面上のＭＨＣ分子を介するペプチド提示をもたらす。このアプローチは、現在、抗−腫瘍および病原体ワクチンの開発における潜在的役割に狙いを定めているが、他の可能性のある遺伝子治療応用を有するかもしれない。
【００８６】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への均一な自己集合の可能な天然のウイルスコートタンパク質もまた、送達のためのＤＮＡを包むために使用された。ヒト・ポリオーマウイルスの主要な構造コートタンパク質（ＶＰ１）は、組み換えタンパク質として発現でき、そしてＶＬＰへの自己集合の間にプラスミドＤＮＡを包むことができる。得られる粒子は、続いて種々の細胞系を形質導入するために使用することができる。
【００８７】
ＤＮＡベクターにおける改良がまた行われ、多くの非ウイルス送達システムに応用できそうである。これらは、高次コイルのミニサークル（細菌の複製起点も抗生物質耐性遺伝子ももたず、その結果、それらは高レベルの生物学的包含を示すので潜在的により安全である）、エピソーム発現ベクター（プラスミドが核内ではあるが染色体の外側で増幅し、ゲノム組込み事象を避ける、エピソーム発現系を複製する）およびＴ７系（このベクター自体が、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現し、そして治療遺伝子が、第１のプロモーターによって生成されるポリメラーゼを用いて、第２のＴ７プロモーターから得られる厳密に細胞質性発現ベクター）の使用を含む。ＤＮＡベクター技術に対する他のより一般的改良は、高レベルの発現を実施するためのシス−作用要素，１細胞周期当たり１回（ｏｎｃｅ−ｐｅｒ−ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ）の複製を供給するための白斑様（ａｌｐｈｏｉｄ）反復ＤＮＡおよび核ターゲティング配列の使用を含む。
【００８８】
先に議論されたように、本発明は、いずれかインビボまたはエクスビボの種々の動物細胞タイプにおけるＩｉの抑制に関する。本議論に関連する動物細胞タイプにおける広範な区分は、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現の状態に基づいて作成することができる。この広範な区分は、本明細書では簡単に紹介されており、特定の治療学的アプローチの文脈内で再訪されるであろう。
【００８９】
天然に存在する抗原提示細胞（ある場合には専門抗原提示細胞と呼ばれる）は、獲得免疫応答に関与している。樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球およびある種の他の単核細胞を含む、これらの細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブである。さらに、Ｔリンパ球のような若干の細胞は、休止状態ではＭＨＣクラスＩＩ分子を表さないが、適当な活性化によりＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導することができる。抗原ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ−限定提示の機能へ、インビボまたはインビトロで誘導できるそのような細胞は、天然に存在する抗原提示細胞の部類に含まれる。細胞は、オートロガス血清、多形核細胞について記述されるＩＦＮ−γＧＭ−ＣＳＦとの同時培養を経てＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されてもよい（Ｒａｓｄａｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５２１−３０（２０００））。またＴ細胞は、マイトジェンおよび異種間ＡＰＣとともに培養される場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、そして抗原提示細胞機能を身につけるように誘導されてもよい（Ｐａｔｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１０）：５２０１−１０（１９９９））。
【００９０】
次節でより詳細に議論されるように、関心のある抗原エピトープをコードしている発現可能な核酸配列を、そのような細胞中に導入することは可能である。このエピトープ発現がＩｉ抑制と合わされる場合、関心のある抗原エピトープが、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されて抗原提示細胞の表面に提示される。
【００９１】
天然に存在する抗原提示細胞は、身体中を、かつ末梢のリンパ様組織をとおして循環する。末梢リンパ様組織は、身体の２つの流体系、血液およびリンパ液を含めて組織されている。これらの２つの流体系は対照的である。リンパ液は、血液から組織内および組織周囲の区間まで移送される流体によって形成される。これらの細胞外空間から、リンパ液は薄い壁のリンパ管中に流動し、ここで、それは、より大きい中央収集管にゆっくりと移動される。最後には、リンパ液は血管に戻され、ここで、血液に再び入る。血液では、リンパ球は核形成細胞の２０〜３０％を構成し；リンパ液では、それらは９９％を構成する。これらの流体系内を循環する抗原提示細胞は、リンパ節および脾臓の濾胞中心を通過する。身体のリンパ節および脾臓の濾胞中心における高濃度のＴリンパ球とＢリンパ球は、細胞の相互作用およびクローン拡大を容易にする。
【００９２】
典型的にはＭＨＣクラスＩＩ分子を殆どまたは全く発現しない関心のある他の細胞は、大多数の悪性およびウイルス感染細胞を含む。特に、通常、ＭＨＣクラスＩＩ−ネガティブであると思われているある種の腫瘍が、若干または全ての細胞において低レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子を発現すると報告されたことは注目される。これらは、例えば、乳房、肺または結腸のがん腫を含む。これらの細胞は病変に特異的な抗原を発現できるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子の不在か、比較的低い量を与えるので、そのような細胞によるそのような抗原由来のペプチドの有意な程度のＭＨＣクラスＩＩ提示は存在しない。これらの細胞では、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現の誘導ならびにＩｉ発現の抑制の両方が可能である（Ｉｉ発現およびＭＨＣクラスＩＩ発現は同時に調節される）。この組み合わせ介入は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されて、細胞の表面に病変関連する抗原エピトープ含有ペプチドの提示をもたらす。
【００９３】
関心のあるその他の細胞類は、悪性、ウイルス感染または天然に存在する抗原提示細胞のいずれの細胞でもない。そのような細胞の例は、繊維芽細胞、ケラチン細胞および筋細胞を含む。細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブであり、そして天然に存在する抗原提示細胞として分類されてない。そのような細胞はインビボまたはエクスビボのいずれでも予防接種方法に関連して有用である。例えば、筋細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子と会合される抗原提示のための標的とされるインビボでの文脈を考慮せよ。関心のある抗原エピトープをコードしている発現可能な核酸配列およびＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導物質が筋組織中に注射されてもよい。そのような配列が組織内の筋細胞によって取り込まれ、そして発現される。注射領域内の一定パーセントの筋細胞が、究極的に、細胞表面上にＭＨＣクラスＩＩ分子と会合された関心のある抗原エピトープを発現するであろう。刺激応答能のある細胞はリンパ液中を循環しているので、そのような提示による刺激に応答能のある細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞）は提示細胞に接触できる。前述のように、リンパ球は循環リンパ液中の核形成細胞の９９％を構成する。刺激された抗原提示細胞は、脾臓のリンパ節においてＴリンパ球およびＢリンパ球と協力し、ここで、高濃度の細胞および他の因子が相互作用を容易にし、そしてクローン選択を拡大する。分泌性Ｂリンパ球およびそれらの成熟子孫、形質細胞によって産生される抗体は、リンパ節を離れ、血液に輸送される。
【００９４】
直前の節は、限定された文脈の議論によって、Ｉｉ抑制のための関心のある細胞タイプを紹介するのに役立った。次に示す議論はこれらの紹介された細胞タイプおよび関連する方法をさらに詳細に考察するであろう。
【００９５】
Ｉｉ抑制療法が新生物疾患に関連して示される。例えば、これらは、決定された原発部位を有するがん、ならびに未知原発部位の転移がんを含む。前者の種類は、乳がん、頭頸部の悪性腫瘍、卵巣のがん腫、睾丸がんおよび他の栄養膜疾患、皮膚がん、および黒色種および他の色素形成皮膚病巣を含む。
【００９６】
またＩｉ療法は、ＰＡＩ−１を過剰発現し、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されたある種の細胞について示される。そのような細胞は、冠状動脈、頸動脈、腎動脈、静脈におけるアテローム性硬化斑、およびがん細胞において見出される。ＰＡＩ−１の過剰発現は、腫瘍の浸潤、新脈管形成および転移、ならびに心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、再狭窄、および血栓塞栓疾患に関連している（米国特許第６，２２４，８６５号；Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１０３（１）：６８−７８（２００２）；Ｈａｒｂｅｃｋ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（４）：１０００−７（２００２）；ＤｅＹｏｕｎｇ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１６）：１９７２−１ａｎｄ（２００１）；Ｒｅｃｏｌｌｅ，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２２（１）：５−１３（２００１））。プラスミノーゲン・アクチベーター・インヒビター１型（ＰＡＩ−１）は、糖尿病をもつ患者の動脈壁において増強され、糖尿病患者において臨床的に観察される動脈硬化の促進および病斑の進行に関与している（Ｐａｎｄｏｌｆｉ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１（８）：１３７８−８２（２００１））。ＰＡＩ−１活性は、特異的抗体、ペプチド競合、アンチセンスおよびおとりのオリゴヌクレオチドの使用によって抑制された（Ｐｅｒｏｌｌｅ，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１（８）：１３７８−８２（２００１））。
【００９７】
またＩｉ抑制療法は感染性疾患に関連して示される。これらは、ウイルス性疾患（ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス）、細菌性疾患（グラム陽性およびグラム陰性）、ミコバクテリア疾患、スピロヘータ疾患、リケッチア疾患、マイコプラズマおよびクラミジア疾患、真菌感染症、原虫および蠕虫類感染症および外部寄生虫感染症を含む。
【００９８】
天然に存在する抗原提示細胞に関して、インビボおよびエクスビボの応用が含まれる。本開示において、用語「ターゲティング、標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」は、時には、抗原タンパク質または抗原タンパク質内の特定の抗原エピトープに対する免疫応答の指図を記述するために使用される。この免疫応答は、一部分、Ｔ免疫調節細胞、Ｔヘルパー細胞またはＴサプレッサ−細胞の活性化を特徴とし、これらの細胞は、応答の背景に応じて、可変的にＴｈ１、またはＴｈ２、またはＴｈ３細胞であってもよい。例えば、Ｔｈ１応答は、応答が腫瘍細胞の殺傷をもたらす腫瘍抗原に対するＣＴＬ応答の発達に関してはヘルパー応答である。しかしながら、アレルゲンに対するＴｈ１応答は、病原性のＩｇＥ抗体の生産をもたらすＴｈ２応答から離れてアレルゲンに対する応答を免疫偏移する（ｉｍｍｕｎｏｄｅｖｉａｔｉｎｇ）ことに関しては、機能的に、抑制性応答であってもよい。さらに、標的化の概念は、新規であるかまたは量の増加におけるＭＨＣクラスＩＩ−提示抗原の提示によって刺激される免疫応答の初期部分のみならず、Ｔ免疫調節細胞における初期作用によって誘導または調節される免疫応答下流のエフェクター応答もまた含む。かくして、例えば、標的化は、ここで教示される標的化の方法によって開始されてもよいＣＴＬ−抗がん応答または免疫グロブリン抗ウイルス応答を含む。
【００９９】
標的化は、抗原が特定されていても、また未知であっても、または過度の実験により同定されても、免疫応答が抗原に対向される概念を含む。例えば、標的化は、免疫応答の生成に寄与するであろう各大多数の抗原を発現する細胞に対向されてもよい。細胞内のいかなる特定の抗原が免疫応答に関与するかは、個人の遺伝子構造に応じて人によって異なってもよい。遺伝因子に対する免疫応答の感受性は十分に記述されてきた。結果的に、有用な治療または診断目的のための標的化方法の使用では、細胞の特定成分は特定される必要なく、そしてしばしば特定することはできない。
【０１００】
標的化の工程は、インビボでもインビトロでも存在する工程を含む。例えば、インビボでは、腫瘍細胞または樹状細胞のいずれかであるＭＨＣクラスＩＩ−ポジティブ細胞によって提示された抗原に対する免疫調節Ｔ細胞の活性化は、非腫瘍場所においても、また浸潤する腫瘍において起きてもよい。同様に、免疫応答のエフェクター部分の拡大は、インビボでもまたインビトロで起きてもよい。インビトロ応答の場合は、治療学的応答に影響するように、個人またはその他の選ばれた個人に再導入されてもよい生産物が生成できる。そのような生産物の例は、樹状細胞調製物、細胞傷害性Ｔ細胞調製物、およびそのようなインビトロで標的化された培養物からＢ細胞をクローン化した後、例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマの作成後に生産された抗体を含む。
【０１０１】
この目的のために、末梢血液単核細胞が得られた個人への再導入に望ましい治療学的生産物に応じて、最初の培養物が分画されて、所望の細胞集団、例えば樹状細胞またはＴリンパ球について強化される。さらに、本明細書で教示される標的化工程が実施された後の培養物が、所望の細胞集団、例えば樹状細胞またはＴリンパ球について分画されてもよい。確立された方法は、単離後でかつ本発明の標的化工程直前に、または標的化工程が実施された後続いて、いずれでも個人から得られた細胞の分画について利用できる。さらにまた、確立された方法は、末梢血液単核細胞が最初に得られた個人へのそのような生産物の導入のために利用できる。この目的について、標的化に関する本発明の方法は、末梢血液単核細胞に限定されず、口腔咽頭または他の領域からの粘膜細胞、気管支または胃の洗浄後に得られる細胞、いずれかの臓器、例えば、肝臓、膵臓、前立腺、骨格筋、脂肪、皮膚からの腫瘍組織または正常組織から生検または切除によって得られる細胞、を含む個人から得ることができるすべての細胞調製物を含む。
【０１０２】
すべての場合において、目的は天然に存在する抗原提示細胞中に関心のある抗原エピトープを導入することであり、このエピトープは処置される病状ならびにＩｉ発現の抑制に特異的である。腫瘍またはウイルス遺伝子感染樹状細胞は、強い抗腫瘍または抗ウイルス免疫応答を惹起する。そのような抗原遺伝子をトランスフェクトされた樹状細胞におけるＩｉタンパク質発現の抑制は、そのようなＤＮＡ予防接種の効力を増進することができる。天然に存在する抗原提示細胞を必要とする両インビボおよびエクスビボ実施態様の場合、関心のある抗原エピトープをコードしている発現可能な核酸配列、およびアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ組成物のような逆遺伝子構築物またはコポリマーであってもよいＩｉのインヒビターを導入することが好ましい。
【０１０３】
用語「発現可能な核酸配列」は、翻訳応答能のあるＲＮＡ種、ならびに導入前に転写される翻訳応答能のあるｍＲＮＡ種をコードしている転写応答能のあるＤＮＡ構築物を含むことを意図している。当業者は転写および翻訳受容能を与えるために必要な分子のシグナルを熟知している。
【０１０４】
本発明のすべての実施態様では、単一の分子構築物としてのこれらの必要な要素の両方を提供することである（例えば、両エピトープおよびＩｉインヒビターをコードしている核酸を受け入れるのに十分な能力を有するウイルスベクター送達系を使用して）。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞をＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞に変換することが所望される場合には、さらなる配列がこの単一の分子構築物において含まれてもよい。この場合、変換を実施するタンパク質をコードしている発現可能な核酸配列が含まれてもよい。そのようなタンパク質は、例えば、本明細書で議論されるようにＣＩＩＴＡおよびγインターフェロンを含む。あるいはまた、別々の発現構築物が各々の要素を担持するように使用されてもよい。独立した方式で送達される別々の構築物の場合、２種の構築物の各々を取り込む単一の抗原提示細胞の可能性は統計的確率の結果である。さらにまた、単一ウイルス粒子における１つ以上の構築物のパッケージングは、Ｉｉ抑制の治療学的に有効な誘導、および指示される場合、ＭＨＣクラスＩＩの誘導および／または有害な免疫応答が生成されるウイルスタンパク質の合成に較べて所望のタンパク質抗原の合成の誘導を最大化するという実益を有する。そのような抗ウイルス免疫応答は、例えば、そのような治療学的介入が可能である頻度を限定することができる。
【０１０５】
結果的に、Ｉｉタンパク質発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞の表面上に関心のある抗原エピトープを提示する方法は、ａ）ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブであるか、またはその細胞表面上にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように誘導されるか、いずれかの細胞であり、さらに細胞がＩｉを発現する細胞を提供し；そして段階ａ）の細胞中に関心のある抗原エピトープおよびＩｉのインヒビターを導入すること、を含んでもよい。ＩｉのインヒビターはＩｉのいかなるインヒビターであってもよく、そして本発明の逆遺伝子構築物またはコポリマー、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンス組成物であってもよい。関心のある抗原エピトープは、Ｉｉのインヒビターの導入の前、後、または同時に導入されてもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞への変換が所望されるこの方法では、変換を実施するタンパク質をコードしている発現可能な核酸配列は、厳格に要求されるわけではないが、Ｉｉのインヒビターおよび／または関心のある抗原エピトープと同時に導入されてもよい。
【０１０６】
非ウイルス送達系による導入は、同様に特定の配慮を必要とする。非ウイルス送達系を使用して、非複合ＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡにコートされた金粒子が細胞中に送達することができる。これらの方法の各々は、特定の病気の選択を制御する利点および欠点を与える。複合ＤＮＡ（例えばＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡにコートされた金粒子、およびポリラクチドコグリコリド粒子における微小被包化物）の使用は、エピトープをコードしている核酸配列およびＩｉ発現のインヒビターをコードしている核酸配列の両方の単一細胞への確実な送達に向かうであろう。別の分子種によってコードされていても、それらは「パッケージ」（例えば、リポソームに被包化されても、また金粒子上にコートされていても））されているので、両分子は単一細胞に送達され易いであろう。
【０１０７】
ＤＮＡにコートされた金粒子は、通常、いわゆる「遺伝子銃」技術を用いる発射方法によって送達される。この技術を用いれば、金粒子は皮膚または筋組織中に発射され、そして細胞に侵入するために使用できる。侵入された細胞は、この方式で導入された核酸配列を発現することが示された。樹状細胞は、この技術を用いて効果的にトランスフェクトされる天然に存在する抗原提示細胞である。そのような発現構築物は、単一樹状細胞中に導入された場合、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されて抗原提示細胞の表面に関心のある抗原エピトープの提示をもたらすことができる。抗原提示細胞の表面上のエピトープ／ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体の提示は、免疫応答の向上を提供するさらなる免疫細胞を刺激できる。
【０１０８】
あるいはまた、特定の解剖学的位置（例えば、新生物疾患の一次腫瘍または若干の転移物）を有する病状を指向する場合、特定の解剖学的部位への直接注射が指定されてもよい。そのような部位は、樹状細胞のような抗原提示細胞に富む傾向がある。腫瘍は導入のそのような局部的部位の例である。細胞中への関連する発現可能な核酸構築物の導入を達成する手段が適当である。局在する腫瘍部位中にそのような構築物を導入する場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を刺激するタンパク質をコードしているさらなる発現可能な核酸配列を含むことが好ましい。この第３の成分の包含が腫瘍細胞自体について意図される。Ｉｉ発現を抑制する構築物、およびＭＨＣクラスＩＩ分子産生の発現可能なインデューサーが病状を表す細胞（例えば、腫瘍細胞）によって取り込まれる場合、細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して細胞表面に病気に特異的なエピトープを提示するであろう。また、これらの細胞はＴヘルパー細胞およびＢリンパ球を刺激できる。その結果、局部的病変に指向される治療に関してこれらの３種の発現可能な要素の直接注射は、病変を表している正常な抗原提示細胞およびＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞が標的とされる組み合わせ療法として考察することができる。
【０１０９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子産生を誘導するための発現可能な核酸配列の使用に加えて、当業
者はこの文脈および関連する文脈において核移送プロセスの応用性を認識できる（Ｗｏｌｆ，Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．３２（６）：６０９−１３（２００１）；Ｗａｋａｙａｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２（５５１７）：７４０−３（２００１））。さらに、抗原提示細胞は、脱分化してがん胎児性抗原を発現するように誘導された体細胞由来であってもよい（Ｒｏｈｒｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１１）：６８８０−９２（１９９９））。そのような細胞が使用されて関心のある抗原エピトープへの免疫攻撃が誘導されてもよい。インビボで完全に分化した細胞が未成熟形態物に脱分化するように誘導されて、臓器再生が実施されてもよい（Ａｂｂａｔｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７（３ｐｔ２）：Ｆ４５４−６３（１９９０））。これらの細胞は、また、異常細胞への免疫攻撃を刺激するために抗原提示細胞として機能してもよい（Ｆｕ，Ｌａｎｃｅｔ  ３５８（９２８７）：１０６７−８（２００１））。
【０１１０】
抗原提示細胞がインビボで標的化される本発明の実施態様では、正常な組織がサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の皮下注射によって刺激される。この皮下「感作（ｐｒｉｍｉｎｇ）」は、その領域の樹状細胞を攻撃する。感作注射は、その後に、関心のある抗原エピトープならびにＩｉ合成のインヒビター（例えばｓｉＲＮＡ）をコードしている発現可能な核酸配列の注射へと続く。新生物細胞は、病気に特異的なペプチドの生産細胞であるが、一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合してその細胞表面にそれらを提示しない。そのような細胞では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の誘導ならびにＩｉ発現の抑制の両方が可能である。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、ＭＨＣクラスＩＩ分子産生を刺激するタンパク質をコードしているｃＤＮＡを、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ネガティブ細胞中に導入することによって誘導できる。そのようなタンパク質は、例えば、ＣＩＩＴＡまたはγインターフェロンを含む。この組み合わせ介入は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して細胞の表面に、病変に特異的な抗原エピトープ含有ペプチドの提示をもたらす。既に議論されたように、発現可能な核酸配列の導入はこれらの目的を達成する好適な方法である。
【０１１１】
先に議論されたように、直接注射は、病変が特定の原発性部位を呈する場所（例えば、腫瘍）に指定される。場合によっては、関心のある抗原エピトープをコードしている発現可能な核酸配列は、その領域の抗原提示細胞を標的化するために注射材料中に含まれてもよい。再び、抗原提示細胞への送達のゴールは、Ｉｉサプレッサーおよび関心のある抗原エピトープである。病変細胞では、送達のゴールはＩｉサプレッサーおよびＭＨＣクラスＩＩ分子誘導物質である。
【０１１２】
腫瘍内注射に関連して続く特定のプロトコルは、例えば、核酸配列をコードしているサイトカインまたはサイトカイン類の腫瘍内注射を伴う確立された治療プロトコルに基づく。そのようなプロトコルは、例えば、次に示すものを含む多数の公表物において記述されている：Ｓｃｈｌｔｚ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１２）：１５５７−６５０（２０００）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（５）：４０９−２２（１９９９）；Ｔｏｄａ，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（４）：３２４−９（２０００）；Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（９）：１２２０−３０（２０００）；Ｎａｒｖａｉｚａ，Ｉ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４（６）：３１１２−２２（２０００）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１４（１）：４９−５７（１９９９）：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（８）：１６７７−８３（１９９８）；Ｓｔａｂａ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（３）：２９２−３００（１９９８）；米国特許第５，８３３，９７５号；米国特許第６，２６５，１８９Ｂ１号；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３（１３）：９９８−１００７（２００１）；Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（５）：４０３−１２（２０００）；Ｓａｃｃｏ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（１１）：１８９３−７（１９９９）；Ｃａｏ，Ｘ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８（２）：１９１−２０００（１９９９）；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（６）：３７１−３７９（１９９８）；Ｎａｓｕ，Ｙ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（３）３３８−４９（１９９９）；米国特許第６，０３４，０７２号；Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６１−６６（２０００）；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｖ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３４（１）：７２−８１（２００１）；Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８（７）：５４２−５０（２００１）；Ｄｏｗ，Ｓ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（１１）：２４０６−１４（１９９８）；Ｋａｇａｗａ，Ｓ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（８）：３３３０−８（２００１）；Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５（１０）：１４０９−９（１９９８）；Ｌｏｈｒ，Ｆ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（８）：３２８１−４（２００１）；Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｙ．Ｉ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（３）：１００５−１２（２００１）；Ｋｉｒｋ，Ｃ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（５）：２０６２−７０（２００１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２（５）：４８９−５０２（２００１）；Ｐｕｔｚｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３（６）：４７２−９（２００１）；Ｍｅｎｄｉｒａｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（１３）：１８５１−６２（２０００）；国際公開ＷＯ９９／４７６７８；Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４７（２）：１１７−２４（２０００）；Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉ��Ｇ．Ｒ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  １１８（２）：１８５−９０（１９９５）；ｄｅＷｉｌｔ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２（５）：４８９−５０２（２００１）；Ｅｍｔａｇｅ，Ｐ．Ｃ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０（５）：６９７−７０９（１９９９）；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３（１２ｔ２）：２６２３−９（１９９７）；Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２（１）：３９−４６（２０００）；Ｐｕｔｚｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（２０）：１０８８９−９４（１９９７）；Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（６）：８９３−９００（２０００）；Ｆｕｓｈｉｍｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（１０）：１３８３−９３（２０００）；Ｘｉａｎｇ，Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（７）：１０２３−３３（２０００）。
【０１１３】
エクスビボの応用に関しては、腫瘍細胞が個人から単離され、そしてエクスビボ培養が確立される。そのような培養物は、随伴する正常細胞からの分離の有無によらず、個人から得られた悪性細胞の無選択集団から確立されてもよく、あるいは細胞は、細胞系またはそのような細胞系由来のクローンとして得られてもよい。あるいはまた、そのような細胞は、無関係の患者の確立された悪性細胞系から、または新鮮な悪性組織（例えば、結腸または卵巣がん腫）の外植片として得られる。
【０１１４】
ＩｉサプレッサーおよびＭＨＣクラスＩＩ分子インデューサーが培養細胞中に導入されて、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原エピトープの所望のＭＨＣクラスＩＩ分子と会合された提示がもたらされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子発現のインデューサーは当該技術分野において周知であり、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子トランス作用因子（ＣＩＩＴＡ）、γインターフェロン遺伝子およびγインターフェロンサイトカインを含む。この様式で処理された細胞は、複製適格性にされ（例えば、照射または固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）によって）、そして慣用の免疫化プロトコル（例えば、皮下、静脈内、腹腔内または筋肉内免疫）において使用される。総細胞調合物に加えて、それらの他の誘導物が免疫化調合物において使用されてもよい。
【０１１５】
大部分の関連腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉ−ネガティブであるけれども、若干の腫瘍（例えば、乳房、肺および結腸を冒す、例えばある種のリンパ腫、黒色腫および腺がん）がＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブおよびＩｉ−ポジティブであることは周知である。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するこのサブセットでは、Ｉｉサプレッサーのみの導入が所望の免疫刺激を達成するのに十分であろう。そのような細胞にＭＨＣクラスＩＩ分子インデューサーを導入することは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に会合された抗原とＴヘルパー細胞との相互作用の可能性を増大することによって所望の刺激を増強するのに役立つ。
【０１１６】
興味ある細胞の他の種類は、悪性細胞でも、ウイルス感染細胞でも、または天然に存在する抗原提示細胞でもない。発現可能な核酸配列は個人の組織の間質空間に送達される。そのような組織は、例えば、筋肉、皮膚、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ液、血液、骨、軟骨、肝臓、腎、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む。組織の間質空間は、臓器組織の網状繊維、管または房の壁中の弾性繊維、繊維状組織のコラーゲン繊維内に細胞間液、ムコ多糖基質、あるいは筋細胞を鞘で包む結合組織または骨の小窩中の同じ基質を含む。それは、同様に、循環液の血漿およびリンパチャネルのリンパ流体によって占められる空間である。
【０１１７】
インビボの筋細胞が、発現可能な核酸配列を取り込みそして発現する能力において特に適格であることが報告されている（参照、例えば、米国特許第６，２１４，８０４号、この開示は引用によって本明細書に組み入れられている）。この送達の利点は、多核細胞、筋小胞体および横行小管系を含んでなる、筋肉の単一組織構造によるのであろう。発現可能な核酸配列は、細胞外流体を含有し、筋細胞中に深く伸びる横行小管をとおして筋肉に侵入できる。また、そのような発現可能な核酸配列は、後に回復する損傷された筋細胞に侵入することもできる。
【０１１８】
また、動物は皮膚をとおしての直接注射によって便利に接近される比較的大きい筋肉塊を有するので、筋肉は、治療学的適用における発現可能な核酸配列の送達の部位として有利に使用される。この理由で、比較的大きい用量の発現可能な核酸配列が多数かつ反復注射によって筋肉に沈着することができる。治療は長期間延長することができ、そして特別な技術および装置なしに安全かつ容易に遂行できる。筋肉以外の、かつ発現可能な核酸配列のやや非効率の取り込みおよび／または発現を特徴とする組織もまた、注射部位として使用されてもよい。
【０１１９】
本発明に関して、標的細胞においてＩｉ合成を抑制し、そしてまた関心のある抗原エピトープ（処置されるべき病状に具体的に関連する抗原エピトープ）を発現することが望ましい。当該技術分野において既知であるように、発現可能な核酸配列の有効な用量は、一般に、約０．０５μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に入る（普通には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ）。有効な用量は多数の関連ファクターに応じて変えられるを認識できる。
【０１２０】
前記タイプの病変関連抗原を生成し、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合して細胞表面にそれを提示する細胞を作成するその他の方法は、細胞融合方法である。より具体的には、天然においてＭＨＣクラスＩＩ分子を生産する細胞（例えば、樹状細胞のような天然に存在する抗原提示細胞）と、関心のある病変を示す細胞（例えば、腫瘍細胞）との融合体を作成することは日常的実験の問題である。そのような融合細胞では、腫瘍特異的抗原は、融  合細胞の表面にＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されて提示される。ほとんどの場合、生成物は、天然に存在する抗原提示細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、またはある種の多分化能細胞、および関心のある抗原エピトープを発現する細胞類の融合体である。関心のある抗原エピトープを発現するそのような細胞は、例えば、悪性細胞、ウイルス感染細胞または形質転換細胞、自己免疫応答の誘発に関連する細胞、および自己免疫応答を調節する細胞を含む。後者の種類は抗イディオタイプ・ネットワークメカニズムを通じてそれらの影響を発揮する細胞（例えば、類リウマチ性関節炎において病原性関連の
Ｔ細胞受容体を発現する）を含む。この種類の細胞融合体はエクスビボで作成される。Ｉｉ抑制および予防接種はこの開示においていずれかに記述されるように実施される。
【０１２１】
本発明の方法がサイトカイン療法（すなわち、サイトカインコーディング核酸配列、またはサイトカインそれ自体の導入）と組み合わせられることは、当業者によって認識できる。他の免疫同時刺激分子が良好に使用できる（Ａｋｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（２４）：２１１３−２１（２０００）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１（１）：５３−６５（２０００）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９４（２）：２８７２９２（２００１）；Ｊａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８（６）：３２１−３０（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｂｌｏｏｄ  ９６（１）：９１−９（２０００）；Ｍｅｌｅｒｏ，Ｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１４）：１１６７−７０（２０００）；Ｌｅｉ，Ｈ．，Ｚｈｏｎｇｕａ  Ｚｈｏｎｇ  Ｌｉｕ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２０（３）：１７４−７（１９９８））。
【０１２２】
従来述べられたように、当業者は、過度の実験なしに、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合された提示が免疫応答の増強を提供する、病変特異的抗原を同定できるであろう。再び、すべての場合において、Ｉｉ抑制は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されたそのような抗原の提示を実施するために、要求されるであろう。次のリストは、この種類に入る抗原の例の限定されることのない非徹底的なリスティングであることを意図している：ＨＩＶｇｐ１２０（Ｂａｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１６８：５６２−８（２００２））；ＨＩＶｇａｇ（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：５９４−６０２（２００１））；インフルエンザＭ１およびＭ２（Ｏｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３６８１−９１（２００１））；Ｂ型肝炎表面抗原およびコア抗原（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２：４４２−６（２００１））；ヒト・テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）（Ｈｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：３３８８−９３（２００１））；Ｇｐ７５ＴＲＰ−１（Ｂｏｗｎｅ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：２１７−２５（１９９９））；ＴＲＰ−２およびｇｇ１００（Ｘｉａｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５４９２−７（２０００））：ＰＳＡ（Ｋｉｍ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０（３３）：４４９７−５０６（２００１））；ＣＥＡ（ｖｏｎ  Ｍｅｈｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：１１８１−９１（２００１））；Ｅｒｂ２／Ｎｅｕ（Ｐｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３２０１−６（２００１）およびＴｕｔｉｎｇ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：６２９−３６（１９９９））。
【０１２３】
その他の態様では、本発明は、予防的または治療的ワクチンとして投与される場合、そのような構築物に対する免疫応答を促進する様式での感染性ウイルスにおける遺伝子組み換えを指向する。遺伝子組み換え、およびそれらの構築および使用方法は、関心のあるウイルスにより異なるけれども、広範囲のウイルスワクチンがこれらの遺伝子改変の方法に適している。この目的について、始原型の例としてのワクシニアによる組み換えＤＮＡウイルスの、そして始原型の例としてのインフルエンザウイルスによるＲＮＡウイルスの設計および使用に対する特定のアプローチが考慮される。
【０１２４】
ＤＮＡ型でもＲＮＡ型でもワクチンウイルスのための２つの形式が存在する。１つは、感染細胞におけるＩｉタンパク質発現の抑制をもたらす、Ｉｉ−ＲＧＣまたはｓｉＲＮＡの発現のための構築物を含有し、そして第２は、両ａ）感染細胞におけるＩｉタンパク質発現の抑制をもたらす、Ｉｉ−ＲＧＣまたはｓｉＲＮＡの発現のための構築物ならびにｂ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現をもたらす遺伝子構築物、例えば、ＣＩＩＴＡまたはγインターフェロンの遺伝子を有する。ワクシニアのようなＤＮＡウイルスの場合は、遺伝子は古典的な哺乳動物プロモーター、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｕｂｅ、ＥＦ−１ａおよびＵ６の制御下にある。インフルエンザのようなＲＮＡウイルスの場合は、挿入された構築物のＲＮＡからの翻訳は、ＲＮＡ転写および翻訳機構を媒介するインフルエンザウイルスの酵素によって発現される。感染細胞においてＩｉタンパク質の発現を抑制する能力のみを有するウイルスの第１のタイプは、既に外因的にＩｉタンパク質およびＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している細胞類に対して標的化される。そのような細胞類は、皮膚のランゲルハンス細胞、皮膚におけるまたは呼吸管もしくは腸の粘膜表面における他の樹状細胞、または骨髄から移動されたかまたは骨髄または脾臓から得られる樹状細胞、末梢血液または他の体腔の腹部、胸膜、心臓周囲において生じているか誘導される滲出性または漏出性の流体のような他の体液のマクロファージを含む。さらなる細胞類は、Ｂ細胞、またはＢ直系白血病およびリンパ腫、およびＴ細胞や形質転換された悪性または正常細胞の若干のサブセットのような、活性化によってＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質を発現するようになった細胞を含む。ウイルス構築物の第２のタイプ（前記タイプｂ）は、タイプａ）ウイルスによる感染のために先に挙げられた細胞類のすべてにおいてＩｉ発現をトランスフェクトしたり、調節することができるが、さらに、ケラチン細胞、または筋細胞、またはＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質を通常は発現しないが、例えばＣＩＩＴＡまたはインターフェロンによってそれらの分子の誘導をもたらすウイルスに組込まれた遺伝子配列の影響下で誘導される細胞をトランスフェクトすることができる。
【０１２５】
これらの２種類のＤＮＡまたはＲＮＡウイルスの例の構築は、標準の分子生物学的技術により達成することができる。ＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡをコードしているｃＤＮＡが、標準分子クローニング方法を用いてワクシニア、カナリア・ポックスウイルスまたは他のＤＮＡウイルス中に導入することができる（Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２；１６：４９２７−３１）。インタクトのワクシニアウイルスＤＮＡならびにＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡの発現カセットが、ウイルス配列に隣接するベクター中にクローン化できる。クローン化ＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡ発現カセット間の相同的組み換えが起き、そして新しいウイルスが適当な条件下で選択できる（Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２；１６：４９２７−３１；Ｍａｒｔｉ  ＷＲ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７：１７９：１４６−５２；Ｂｅｒｔｌｅｙ  ＦＭＮ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１７２：３７４５−５７）。組み換えＲＮＡウイルスは、同様に、ウイルスｃＤＮＡをコードしているプラスミドを用いて構築することができる。インフルエンザＡウイルスのためのプラスミドに基づく逆遺伝子系が開発された（Ｐｌｅｓｃｈｋａ  Ｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  １９９６；７０：４１８８−９２）。この系は、末端を切り取ったヒトポリメラーゼＩプロモーターを含有するプラスミドを使用してウイルスＲＮＡを発現する。ＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡ発現カセットは、インフルエンザＨＡまたはＮＡ遺伝子をコードしているプラスミド中にクローン化できる。ウイルスゲノムの全８個のセグメントをコードしているプラスミドは、組織培養細胞中に同時トランスフェクトされて、予防接種目的で使用できる感染性組み換えウイルスを回復できる。あるいはまた、ＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡをコードしている組み換えプラスミドは、インフルエンザヘルパーウイルスにより感染された細胞系中にトランスフェクトされてもよい。選別方法を用いて、遺伝的に工作されたトランスフェクタントウイルスを含有するウイルスが単離できる（Ｐａｌｅｓｅ  Ｐ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  １９９６；９３：１１３５４−８）。これらの種々の構築物の設計および調製、およびそれらのワクチンとしての応用は、次に示す米国特許の材料および方法を用いて実施できる。米国特許第５，９７６，５５２号、米国特許第５，２９２，５０６号、米国特許第４，８２６，６８７号、米国特許第６，７４０，３２５号、米国特許第６，６５１，６５５号、米国特許第５，９４８，４１０号、米国特許第５，８２４，５３６号、米国特許第４，０２９，７６３号、米国特許第４，００９，２５８号、米国特許第６，６８４，６３号、米国特許第６，６７６，１１号、米国特許第６，６２３，９６２号および米国特許第６，５０６，５５９号。ＣＩＩＴＡおよびＩｉ特異的ｓｉＲＮＡを発現する組み換えウイルスは、インビトロおよびインビボモデルを用いてＭＨＣクラスＩＩ応答を増進する能力についてアッセイすることができる。
【実施例】
【０１２６】
例１
ＣＩＩＴＡｃＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターの構築
この実験の最初のゴールは、ＭＨＣクラスＩＩ分子ネガティブ細胞（例えば、ＭＣ−３８およびＲｅｎｃａ）におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の効果的導入のためのアデノウイルスベクターを構築することであった。ＣＭＶプロモーターおよびポリＡテールを含むＣＩＩＴＡ遺伝子構築物は、Ｓａｌ１を用いてＣＩＩＴＡを含有するｐＣＥＰ４ベクター（Ｄｒ．Ｌ．Ｇｌｉｍｃｈｅｒより得る）から切り取られた。このフラグメントがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に連結されてｐＢｌｕｅ／ＣＩＩＴＡを作成した。次に、ｐＢｌｕｅ／ＣＩＩＴＡがＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩにより消化されて、ＣＭＶプロモーター、ＣＩＩＴＡｃＤＮＡおよびポリＡシグナルを含むＤＮＡフラグメントが遊離され、これがｐＱＢＩ／ＢＮ（Ｑｕａｎｔｕｍ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）中に連結されて、ｐＱＢＩ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡが作成された。
【０１２７】
このベクターは、製造者の指示にしたがって、Ｃｌａ１消化アデノウイルスＤＮＡ（ウイルスの左アームが欠失されてバックグラウンドを減少させた）とともに２９３Ａアデノウイルスパッケージング細胞中にコ・トランスフェクトされた。コ・トランスフェクション後３週目に、得られたプラークが、ＣＩＩＴＡｃＤＮＡの−７〜＋１２および＋７５１〜＋７６９に置かれる２種のプライマーを用いるＰＣＲによって選別されて、ＣＩＩＴＡ遺伝子の存在を確認した。１つのクローンが使用されて、２種のマウス腫瘍細胞系：ＭＣ−３８結腸腺がんおよびＲｅｎｃａ腎細胞腺がんにおけるＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導を試験した。ＭＨＣクラスＩＩ分子の誘導の時間経過が、アデノ／ＣＩＩＴＡ組み換えアデノウイルスベクターによる感染後のこれらの細胞系においてアッセイされた。ＣＩＩＴＡインサートを欠如する別の同一アデノウイルスベクターが対照として使用された。ＭＨＣクラスＩＩ分子が９５％以上の細胞において感染後４８〜７２時間に強く誘導されることが決定された。
【０１２８】
例２
アデノ／ＣＩＩＴＡによる感染およびＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理によるＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型の作成
この実施例は、アデノ／ＣＩＩＴＡによる細胞の感染および定義されたＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩｉ発現の抑制によるＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型を発現する細胞の作成を例証する。Ｉｉアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有効であると既に例証されていた（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４９９−５０６（１９９９））。対照実験は、ａ）無処理；ｂ）アデノ／ＣＩＩＴＡ構築物のみ；ｃ）センスの対照オリゴヌクレオチドとともにアデノ／ＣＩＩＴＡ構築物；およびｄ）４−ヌクレオチドミスマッチの対照アンチセンスオリゴヌクレオチドとともにアデノ／ＣＩＩＴＡ構築物を含む。簡単に言えば、１．５ｘ１０６ＭＣ−３８細胞が、オリゴによるエレクトロポレーションの２４時間前に２５ｃｍ２フラスコ中に接種され、そして１．５ｍｌのウイルス保存液（１．２６ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌ）を含有する５ｍｌ総容量の培地において４８時間感染された。感染の最初の２４時間後、新鮮な培地１０ｍｌが添加され、そして細胞はさらに２４時間培養された。次いで、細胞は、アンチセンス、センスまたはミスマッチのオリゴヌクレオチドによるエレクトロポレーション前に、トリプシン処理され、そして洗浄された。エレクトロポレーションの条件は、次のとおりである：３〜５ｘ１０６細胞が５０μＭオリゴヌクレオチドを含有する０．５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０におけるエレクトロポレーションキュベットに添加された。細胞は１０分間氷上でインキュベートされ、そしてＢＴＸ６００エレクトロポレーターを用いて２００ボルト／１２５０μＦに懸けられた。次いで、キュベットはさらに１０分間氷上でインキュベートされ、この後、細胞は１回洗浄され、新鮮な２５ｃｍ２フラスコ中に接種され、そして２４時間インキュベートされた。この時点で、細胞はトリプシン処理され、そして前記のようにＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質についての染色後に流動細胞計測法によって分析された（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４９９−５０６（１９９９））。
【０１２９】
図１において示される典型的な実験では、Ｉｉアンチセンス処理およびアデノ／ＣＩＩＴＡ処理された細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現にはほとんど、または全く影響することなくＩｉの良好な選択的抑制を示した。対照オリゴヌクレオチド処理された細胞（すなわち、ミスマッチまたはセンス配列を用いて）は、Ｉｉの抑制を示さず、そしてアデノ／ＣＩＩＴＡ処理細胞に匹敵するＭＨＣクラスＩＩ分子発現を有した。
【０１３０】
動物研究の期待、およびＭＨＣクラスＩＩ．ｓｕｐ．＋／Ｉｉ．ｓｕｐ．−細胞を大量に生成する必要において、上記研究はスケールアップした系において繰り返された。５ｘ１０６ＭＣ−３８細胞が、感染前１８〜２４時間に７５ｃｍ２フラスコ中に接種された。細胞は５ｍｌのウイルス保存液（１．２６ｘ１０６ＰＦＵ／ｍｌ）を用いて９０分間感染され、そして新鮮な培地２０ｍｌが添加された。次いで、細胞は４８時間培養され、エレクトロポレーションに懸けられて上記のようにオリゴヌクレオチド（５０μＭ）が送達された。次いで、細胞は蓄えられ、さらに２４時間新鮮な７５ｃｍ２フラスコにおいて培養され、この後、培地が変えられ、そして細胞はさらに３時間培養された。次いで、細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質の発現ならびにマウスの免疫について分析された。Ｉｉタンパク質発現の配列特異的抑制は、先の実験で観察されたように、アデノ／ＣＩＩＴＡにより感染され、Ｉｉアンチセンスで処理された細胞においてのみ得られた。
【０１３１】
例３
ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−腫瘍ワクチンによる腫瘍防御
これらの研究では、ＭＣ−３８腫瘍ワクチン細胞が上記のように調製され、そして６〜７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に接種するために使用された。具体的には、ＭＣ−３８細胞が上記のようにアデノ／ＣＩＩＴＡで感染され、４群に分けられ、そしてａ）無処理；ｂ）５０μＭＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチド；ｃ）５０μＭミスマッチ対照オリゴヌクレオチド；またはｄ）５０μＭセンス対照オリゴヌクレオチド；を用いてエレクトロポレーションにより処理され、そしてフラスコ中に接種された。２４時間後、新鮮な培地が添加され、そして細胞がさらに３時間培養された。次いで、細胞はトリプシン処理され、５０Ｇｙ（セシウム源）を致死的に照射され、そして１．２ｘ１０６細胞／マウスがマウス中に接種された。５週間後、マウスは５ｘ１０５親ＭＣ−３８細胞でチャレンジされ、そして腫瘍の出現について追跡された。図２において示されるように、Ｉｉアンチセンス処理され、アデノ／ＣＩＩＴＡ感染されたＭＣ−３８細胞による接種は、すべての他の対照群に較べて腫瘍の成長に対して良好な防御を与えた。これらのデータは、ＣＩＩＴＡで安定にトランスフェクトされ、かつＩｉアンチセンスで処理されたＭＣ−３８細胞を用いる本研究者らの前記研究と一致している（図３）。見て分るように、安定にＣＩＩＴＡトランスフェクトされたＭＣ−３８またはＩｉアンチセンスで処理された一過性のアデノ／ＣＩＩＴＡ感染細胞のいずれかを用いる防御のレベルは、匹敵するレベルの防御を与える。
【０１３２】
例４
ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−腫瘍ワクチンおよびＧＭ−ＣＳＦによる腫瘍防御
その他の動物研究のセットでは、後続する親ＭＣ−３８細胞の成長に及ぼすＧＭ−ＣＳ
Ｆ処理とともにＩｉ抑制されたＭＣ−３８ワクチン細胞の役割が検討された。これらの研究では、マウスは、ＭＣ−３８細胞免疫化の１日前に右後足においてＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）の１８μｇをＳ．Ｃ．注射されて樹状細胞が誘引された。また、マウスを免疫化するために使用されるＭＣ−３８細胞の数は、前実験で使用された数より低い、わずか３ｘ１０５細胞／マウスであった。図４に示されるように、ＧＭ−ＣＳＦはクラスＩＩ＋／Ｉｉ−ＭＣ−３８細胞によって惹起される防御効果を増進する。３ｘ１０５のクラスＩＩ＋／Ｉｉ−細胞のみを接種されたマウスは、同様に、それがＧＭ−ＣＳＦの不在下でクラスＩＩ＋／Ｉｉ−ＭＣ−３８細胞の１．２ｘ１０６によって誘導されたように、親細胞の増殖を抑制した。従来の研究では、ＩＦＮ−γによって誘導されたＭＨＣが、ＣＩＩＴＡによるよりもはるかに強い抗腫瘍免疫応答の誘導を与えることが示された（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４９９−５０６（１９９９））。
【０１３３】
これらの研究は、サイトカインとＩｉ抑制との間の相乗効果が達成可能であることを示した。さらなる研究は、Ｉｉアンチセンス戦略とともにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの使用を合体させ、そしてこの免疫化プロトコルを最適化および拡大するように計画された。
【０１３４】
例５
ＩＦＮ−γｃＤＮＡを含有するアデノウイルスベクターの構築
ＩＦＮ−γは、免疫応答の管理を調節することに重要な役割を演じ、そしてそれは、種々の組織および若干の悪性細胞を含む細胞においてＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉを誘導する。ＩＦＮ−γ構築物によるトランスフェクションおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩｉ抑制によって作成されたＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−腫瘍ワクチンは、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現がＣＩＩＴＡトランスフェクションによって誘導される別の同一腫瘍ワクチンに較べて増強された免疫原性を有する（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４９９−５０６（１９９９））。発現可能なマウスＩＦＮ−γ配列がアデノウイルス中にクローン化されている。両ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質の発現は、非常に低濃度においてアデノ／ＩＦＮ−γの感染後に誘導された（図５参照）（ＭＯＩ  １においてさえ、データ未掲載）。アデノ／ＩＦＮ−γ構築物を作成するために、マウスＩＦＮ−γｃＤＮＡ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２４４−５５（１９９３））が、ＩＦＮ−γｃＤＮＡにおいて開始および停止コドンを含有する領域に相補的な２種の特異的オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅された。ＩＦＮ−γフラグメントが、具体的に設計されたエンドヌクレアーゼ消化部位を用いることによってｐＣＤＮＡ（３＋）プラスミド中にクローン化され、そして配列決定によって確認された。ＣＭＶプロモーター、ＩＦＮ−γおよびポリＡシグナルが適当なオリゴヌクレオチドを用いてさらにＰＣＲ増幅され、次いで、適当な制限部位を使用してｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ中にクローン化された。アデノ／ＩＦＮ−γ組み換えウイルスの生成は実施例１に記述された同じ手順によって実施された。
【０１３５】
例６
Ｉｉ−ＲＧＣを含有するアデノウイルスベクターの構築
数種のＩｉ逆遺伝子構築物がＲＳＶ．５およびｐＣＤＮＡ（３＋）発現ベクター中にクローン化された。構築物のサブセットは、古典的なトランスフェクション法（例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ））を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ分子−ポジティブ細胞（Ａ２０）においてＩｉを抑制する能力を有することが示された。Ｉｉアンチセンスオリゴヌクレオチドがまた有効であることは分っているけれども、それらは、エレクトロポレーションまたは有意な関連する傷害性をもつ他の方法を必要とする。また、オリゴヌクレオチドにより処理された細胞の３０〜７０％以上はＩｉ発現の有意な抑制を例証し
ない。これに反して（そしてアデノ／ＣＩＩＴＡ構築物を用いて示されたように）、遺伝子送達のためにアデノウイルスベクターを使用することは、全細胞に１００％近い送達、所望の表現型変化および事実上無傷害をもたらす。数種のＩｉ−ＲＧＣが、ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型のさらに良好な誘導のためにアデノウイルス中にクローン化された。Ｉｉ−ＲＧＣを含有する組み換えアデノウイルスを作成するために、ＲＳＶ（またはＣＭＶ）プロモーター、Ｉｉ逆遺伝子フラグメントおよびポリＡシグナルからなる発現カセットは、ＰＣＲによって増幅され、そしてＮｏｔ１およびＸｈｏ１または他の適当な制限酵素部位を使用してｐＱＢＩ／ＢＮベクター中にクローン化されて、ｐＱＢＩ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣが作成された。アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣの最終構築は実施例１に記述された同じ手順によって達成された。ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型の誘導の実験では、アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣの濃度がアデノ／ＣＩＩＴＡの濃度の約４倍に増加された場合に、Ｉｉは細胞の＞９５％において抑制されたが、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現はほとんど影響されなかったことが観察された（図６、参照）。
【０１３６】
例７
ＩＦＮ−γおよびＩｉ−ＲＧＣを含有するアデノウイルスベクターの構築
感染を簡単にするために、アデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ構築物が作成された。プロモーター、Ｉｉ−ＲＧＣフラグメントおよびポリＡシグナルが、適当なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅され、そしてｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ中にクローン化されて、ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣが作成され、これが続いて使用されてアデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣが作成された。アデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣを用いる感染によるＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型誘導実験では、ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型がｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ構築物の１種（アデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，＋９７））による感染によって、感染後９６時間にＭＣ／３８細胞において生成されることが観察された（図７、参照）。
【０１３７】
例８
多数のＩｉ−ＲＧＣを含有するアデノウイルスベクターの構築
Ｉｉ−ＲＧＣの効力を最大にするために、数種のＩｉ−ＲＧＣが１つのアデノウイルス中にクローン化された。ＰＣＲ増幅および他の適当な分子生物学的方法が使用されて、Ｉｉ−ＲＧＣの異なる組み合わせ物を含有するｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ構築物が生成された。そのような構築物の例は、以下に示されるセットを含んだ。マウスＩｉインサート（−９２，＋９７）、（＋３２，＋１３６）、（＋３１４，＋４５８）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：１、２および３として配列リストにおいて提示される。
アデノ（−９２，＋９７）（＋３１４，＋４５８）
アデノ（−９２，＋９７）（＋３１４，＋４５８）ｘ２
アデノ（−９２，＋９７）（＋３１４，＋４５８）ｘ３
アデノ（−９２，＋９７）（＋３２，＋１３６）
アデノ（−９２，＋９７）（＋３２，＋１３６）（＋３１４，＋４５８）
【０１３８】
また、Ｉｉ−ＲＧＣのあるものは、以下に示されるセットを含む、ＩＦＮ−γを用いてクローン化された。
アデノ／ＣＩＩＴＡ／ＩＦＮ−γ
アデノ／ＣＩＩＴＡ／ＩＦＮ−γ（−９２，＋９７）
アデノ／ＩＦＮ−γ（−９２，＋９７）
アデノ／ＩＦＮ−γ（−９２，＋９７）（＋３１４，＋４５８）
アデノ／ＩＦＮ−γ（−９２，＋９７）（＋３２，＋１３６）（＋３１４，＋４５８）
【０１３９】
Ｉｉ−ＲＧＣの多数のコピーを含有するＩｉ−ＲＧＣプラスミドの効果を最大にするそ
の後の努力では、各々が異なるプロモーターで作動されるように生成された。これらのプラスミドが以下に記される。
【０１４０】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／−９２，９７）．プロモーターは、それぞれＲＳＶ、ＥＦ−１ａである。
【０１４１】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／−９２，９７／−９２，９７）．プロモーターは、それぞれＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４２】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／３２，１３６／３１４，４５６）．プロモーターは、それぞれＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４３】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／−９２，９７／−９２，９７）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４４】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／３２，１３６／３１４，４５６）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４５】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／−９２，９７／−９２，９７）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４６】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／３２，１３６／３１４，４５６）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａ、ＵｂＣである。
【０１４７】
プロモーター略語：ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルスプロモーター）、ＥＦ−１ａ（ヒト延長因子−ａプロモーター）、ＵｂＣ（ユビキチンＣプロモーター）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）。
【０１４８】
例９
ヒトＩｉ−ＲＧＣを含有するプラスミドの構築
ヒトＩｉ遺伝子配列から得られるヒトＩｉ−ＲＧＣ（ｈＩｉ−ＲＧＣ）によるヒトＩｉ発現の抑制が本明細書で開示される。ヒト細胞におけるＩｉ発現を抑制するためのｈＩｉ−ＲＧＣを用いる実験の結果が表１において示される。ヒトＩｉｃＤＮＡ配列（Ｓｔｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８６９−７２（１９８４））は、Ｄｒ．Ｅｒｉｃ  Ｌｏｎｇより贈られた。Ｉｉ遺伝子の種々の長さのフラグメントが適当なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって生成された。すべてのＩｉフラグメントは複数のＡＵＧ開始および停止コドンを含有する。すべては、アンチセンスＲＮＡの半減期を増加させるために、いずれの読み枠においても停止コドンに直接接続されるＡＵＧを避けるように設計された。これを実施するために、ＡＵＧは種々の読み枠における停止コドンを無効にする（ｏｖｅｒｒｉｄｅ）ように作成された。これらのＩｉＰＣＲフラグメントは、適当な制限部位によってｐｃＤＮＡ３（＋）発現ベクター中にクローン化された。ヒトリンパ腫細胞系、Ｒａｊｉが使用されて、これらのｈＩｉ−ＲＧＣを用いるＩｉ抑制が決定された。Ｒａｊｉ細胞は、製造者の指示にしたがってｈＩｉ−ＲＧＣプラスミドＤＮＡの１μｇを用いてＰｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）により一過性にトランスフェクトされた。４８時間の培養後、細胞は、抗ヒトＩｉ抗体、ＬＮ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＤＲ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による細胞の染色によって、ＩｉおよびＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉの発現について染色され、続いて流動細胞計測法が実施された。
【０１４９】
Ｉｉ発現はバックグラウンド以上に細胞の一部（細胞の４〜９％）において抑制された（図８、参照）。この抑制は高度に再現性があった。さらに、そのような一過性トランスフェクションアッセイでは、培養における細胞の１０％のみ、またはそれ以下が実際に、添加されたＤＮＡ構築物を取り込むことが一般的である。かくして、バックグラウンド以上の細胞の４〜９％は、アッセイ系の実際のトランスフェクションの有効性を反映している。これらの細胞では、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現に及ぼす影響は観察されなかった。
【０１５０】
【表１】
2008521410.tif 000003
【０１５１】
ｈＩｉ−ＲＧＣの活性を最大化する試みにおいて、発現カセットの各々が異なるプロモーターによって作動される複数のコピーｈＩｉ−ＲＧＣ（１個のプラスミドにおけるｈＩｉ−ＲＧＣの数個のコピー）が作成された。これらのプラスミドが以下に列挙される。
【０１５２】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶである。
【０１５３】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａである。
【０１５４】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＵｂＣ、ＣＭＶ、ＲＳＶである。
【０１５５】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＵｂＣ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａである。
【０１５６】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＵｂＣ、ＣＭＶ、ＲＳＶである。
【０１５７】
ｐＱＢＩ／Ａｄ／ＢＮ／ＩＦＮ−γ／ｈＩｉ−ＲＧＣ（−１０，４２５／−１０，４２５／−１０，４２５）．プロモーターは、それぞれＵｂＣ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１ａである。
【０１５８】
例１０
ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型の誘導のためのＩＬ−２とともにＩｉ−ＲＧＣベクターの腫瘍内注射および治療効力
ＢＡＬＢ／ｃマウスが１０５Ｒｅｎｃａ細胞によりｓ．ｃ．注射された。ＣＩＩＴＡ：Ｉｉ−ＲＧＣＤＮＡ比１：６（ｗ；ｗ）において、ＣＩＩＴＡｃＤＮＡ遺伝子、ＣＩＩＴＡｃＤＮＡ遺伝子とＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）を含有するプラスミド、またはＣＩＩＴＡ遺伝子に加えて３重Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７／３２、１３６／３１４、４５９）を含有するプラスミドが、Ｒｅｎｃａ腫瘍、サイズ０．０５〜０．２ｃｍ３中に注射された。総ＤＮＡの２５μｇが、注射前１〜５分にＤＭＲＩＥ／Ｃ（１，２−ジメリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）（ＧＩＢＣＯ）とともに１：１（ｗ／ｗ）の比でインキュベートされた。ＤＮＡ注射後５日目に、切除された腫瘍の凍結切片からスライドが作成された。スライドはマウスＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉに対する抗体により染色されて、腫瘍細胞のクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型が決定された。腫瘍におけるクラスＩＩ＋細胞がＴ細胞、Ｂ細胞またはマクロファージを表しているかもしれない可能性を除外するために、染色は、またＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１９（Ｂ細胞の）およびＭＡＣ（マクロファージ）に対する抗体を用いて実施された。結果（データ未掲載）は、ＣＩＩＴＡのみを注射された腫瘍において匹敵するＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉ染色を示したが、一方、いずれかＣＩＩＴＡ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）かまたはＣＩＩＴＡプラスミドに加えて三重Ｉｉ−ＲＧＣを含有するプラスミドを注射された腫瘍においてＩｉ抑制の証拠が存在した。ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３染色は非常に少ないポジティブ細胞を示したので、このことは、腫瘍におけるクラスＩＩ＋細胞が侵入しているＴ細胞ではないことを示している。また、Ｂ細胞およびマクロファージ染色は、クラスＩＩ＋細胞がＢ細胞またはマクロファージではないことを除外した。同時に、脾臓サンプルのスライドがまた、ポジティブ対照として上記抗体のすべてにより染色された。
【０１５９】
Ｉｉ抑制の治療学的効能を試験する研究では、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｒｅｎｃａ腎臓腺がん細胞をｓ．ｃ．注射され、そして１日目にはＩＬ−２（２μｇ）、ＣＩＩＴＡ（３μｇ）およびＩｉ−ＲＧＣ（−９２，９７）（１８μｇ）からなる種々のプラスミド調製物、そして２〜４日にはＣＩＩＴＡなしの同じ調製物の腫瘍内注射によって処置された。対照マウスは、ＩＬ−２の２μｇとともに４日連続で空のベクターを受けた。次いで、腫瘍は２〜３日毎に測定された。マウスは３１日間追跡され、そして腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達した時点で終了された。結果は、ＩＬ−２とともにＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣ含有ベクターにより処置されたマウスが腫瘍増殖における劇的退縮を表し、一方、ＩＬ−２のみおよび対照ベクターを受けているマウスにおける腫瘍増殖は進行性であり、そしてマウスの終末が求められることを示している（図９、参照）。
【０１６０】
例１１
ｓｉＲＮＡを用いるヒト細胞におけるＩｉの抑制
ｓｉＲＮＡ構築物は、Ｉｉタンパク質発現の抑制においてＩｉ逆遺伝子構築物と同様に有効であることが合理的に期待できる。ここでは、そのような構築物の例が、ＩｉｃＤＮＡ遺伝子とのコ・トランスフェクションによって誘導されるＩｉタンパク質発現を抑制することが示される。１０種のｓｉＲＮＡ構築物が、ヒト腎系２９３細胞におけるＩｉ発現の抑制について試験された。発現可能なｓｉＲＮＡ構築物は、次に示す理由のために合成オリゴヌクレオチドが好ましいであろう。１）ＲＮＡオリゴヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションはＤＮＡ発現構築物によるトランスフェクションよりも困難である。２）合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの大規模な合成は、ＤＮＡプラスミドまたは他のベクターの調製よりも費用がかかる。３）構築物の発現（したがってＩｉ抑制活性）は、組織特異的プロモーターを用いて特定の臓器または組織に対して標的化できる。４）ｓｉＲＮＡの活性（合成されても、また遺伝子ベクターから発現されても）は、一般に、逆遺伝子構築物の活性よりもはるかに高い。これらの理由で、発現可能なｓｉＲＮＡ構築物はインビボの使用のために大きな潜在的利益を有する。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物の設計：１０種のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物が、表２に提示されるそれらの構築において使用されるオリゴヌクレオチドを用いて設計された。構築物は、ｓｉＲＮＡのクローニングのために具体的に設計されたｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて作成された。プラスミドは、ｓｉＲＮＡ発現のために最適化された両Ｕ６およびＳＶ４０プロモーターを含有し、ｓｉＲＮＡ配列の挿入のために便利なクローニング部位を備え、そして広範な細胞への送達を可能にする。さらに、このプラスミドはまた、ｓｉＲＮＡ発現構築物を含有する組み換えアデノウイルスの構築にも使用できる。２つのアプローチがこれらのｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物の設計に続いて行われる。第１に、Ｉｍｇｅｎｅｘコンピュータープログラムが使用されて、５種の構築物を予測する（表２における１１〜１５）。このプログラムはＩｉＲＮＡにハイブリダイズするような塩基組成（すなわち、適当なＧ−Ｃ含量など）を有するＲＮＡ配列を同定する。得られる５種のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物（表２における１１〜１５）は、それらがＩｉｍＲＮＡと実際にハイブリダイズする場合は、強力なインヒビターであることが期待される。しかしながら、すべての与えられたｍＲＮＡの三次構造を予測することは困難であるので、そのようなコンピューター設計されたｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物は、ＩｉｍＲＮＡに接近できることを実験的に見出すことはできないであろう。したがって、第２のアプローチが、さらなる５種の構築物（表２における１６〜２０）の設計においてまた使用される。Ｉｉタンパク質の発現を抑制するためのＩｉ−ＲＧＣの使用における過去のデータは、若干のＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｑｉｕ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８：４９９−５０６（１９９９））（Ｘｕ米国特許第６，３６８，８５５号）およびＩｉ−逆遺伝子構築物（ＲＧＣ；Ｌｕ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：５９２−５９８（２００３））（米国特許出願公開第１０／１２７，３４７号）が、ヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｂｐにハイブリダイズして、結果的にＩｉタンパク質発現の強い抑制を起こすことを示した。ヒトＩｉｍＲＮＡのこの領域がｓｉＲＮＡ構築物に非常に接近できるであろうことがこのデータから推論できる。さらにまた、この提案は、翻訳を開始するＡＵＧ部位を含有するｍＲＮＡ領域が、一般に、ｍＲＮＡに結合するアンチセンス構築物にとって感受性の領域であるという文献のデータと一致する。したがって、点検によって、その他の５種のＩｉｓｉＲＮＡ構築物は、ＡＵＧ開始部位周辺のヒトＩｉｍＲＮＡの最初の４００ｂｐ内のＩｉｍＲＮＡの部分にハイブリダイズするように設計された。両方が、機能的な翻訳開始部位であると考えられるヒトＩｉｍＲＮＡの初めの部分には２個のＡＵＧが存在するので、ｓｉＲＮＡ配列はこれらの部位の両方を標的化するように設計された。具体的には、２つのオーバーラップ配列が第１のＡＵＧ周辺に設計され、そして３個のオーバーラップｓｉＲＮＡ配列が第２のＡＵＧ周辺に設計された。これらの５個のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）配列は、最適な���ニーリングパラメーターをもたないのに対して、一方、それらはＩｉＲＮＡとハイブリダイズすることが期待できる。全配列は、発現されたｓｉＲＮＡ配列のヘアピン形成を可能にするように短いループ配列とともに設計された。ヘアピンの形成は、機能的二本鎖ｓｉＲＮＡをもたらす。標的ｍＲＮＡと相互作用し、そしてそれを切断するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する際の二本鎖ＲＮＡの要件が明白に例証されている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１１０−１１９，２００１）。
【０１６２】
【表２】
2008521410.tif 000004
【０１６３】
二本鎖オリゴヌクレオチドは、先に示されたようにセンスおよび相補鎖のためのそれぞれｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）をコードしている２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによって作成される。アニールされたオリゴヌクレオチドは、「ｔｃｇａ」（上記）および「ｇａｔｃ」オーバーハングを有して、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ消化されるｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒベクター中へのクローニングを助けることができる。センス配列は一本の下線を施されている。ループ配列は太字である。逆配列は二本の下線を施されている。
【０１６４】
実験手順および結果．
１０種のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）構築物は、標準の分子生物学的技術にしたがって、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ酵素部位を用いて、ｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に上記配列をクローニングすることによって作成された。２９３ヒト腎系（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１５７３）の細胞が、これらのＩｉｓｉＲＮＡ構築物の各々（０．８２μｇ）とともにヒトＩｉｃＤＮＡ遺伝子プラスミド（０．１８μｇ）によりコ・トランスフェクトされた。数種の活性のあるＩｉｓｉＲＮＡ構築物が決定された。簡単に言えば、２９３細胞（２ｘ１０５／ウェル）が６穴プレートにおいて一夜培養された。ＤＮＡ混合物が、製造者の指示にしたがってＥｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて２９３細胞中にトランスフェクトされた。細胞はＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３６時間培養された。細胞は抗ヒトＩｉ抗体（ＬＮ−２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）により細胞内染色され、次いで、流動細胞計測法によって分析された（表３）。装置の感度（ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ））は、Ｉｉ−ネガティブ２９３細胞の９９％が検出できるように設定された。ＩｉｃＤＮＡは、ポジティブ対照としての、すなわちＩｉ抑制のない、空のｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミドとともにコ・トランスフェクトされた。各々３つの別々の実験では、Ｉｉ＋細胞のパーセンテージは、空のｐＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＡｄｅｎｏプラスミドまたはそれぞれ１０種のｓｉＲＮＡプラスミド（表３）の各々によりトランスフェクトされた細胞について決定された。各場合におけるＩｉ＋対照細胞との差異は、種々のｓｉＲＮＡ構築物によるＩｉ抑制の程度を反映している。プラスミド１１〜１８の平均抑制（２９％）は実質的である。これらのデータから、プラスミド１１〜１８（２９％の平均抑制）は強い活性を有し、そしてプラスミド１９、２０および「空」はＩｉ抑制活性をもたないと結論できる。
【０１６５】
【表３】
2008521410.tif 000005
【０１６６】
それぞれのプラスミド１１〜２０の構造は表３に示される。Ｏｂｓ＝Ｉｉ＋細胞の観察されたパーセンテージ。Ｄｉｆｆ＝［空の」プラスミドにより見出されたパーセンテージからの観察された％における差異。％ｓｕｐ＝パーセンテージ抑制（「空の」プラスミドによる差異／観察されたパーセンテージ）。ｍｅａｎ  ｓｕｐ＝３実験の％抑制の平均。
【０１６７】
Ｒａｊｉ細胞におけるｓｉＲＮＡの効果を試験する実験方法。
遺伝子銃送達方法がＲａｊｉ細胞中にｓｉＲＮＡ構築物トランスフェクトするために使用された。プラスミドＤＮＡが金粒子上に沈殿された。金の微小担体（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）（１μｍ粒子の０．５ｍｇ）が０．０５Ｍスペルミジンの１００μｌ中に音波処理によって懸濁された。エンドトキシンを含有しない水中に、１ｍｇ／ｍｌの濃度におけるＤＮＡの指示量が添加され、そして１ＭＣａＣｌ２の１００μｌが滴下された。この金−ＤＮＡ混合物は１０分間静置された後１００％エタノール２５０μｌにより３回洗浄された。最終洗浄後、ペレットは１００％エタノール中０．０２５ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の２００μｌに再懸濁され、１５ｍｌチューブに移され、そしてＰＶＰ／エタノールにより１ｍｌに作成された。１ショット当たり金０．５ｍｇおよび可変ＤＮＡ装填比（ＤＬＲ）の得られる微小担体装填量（ＭＬＱ）がマウスに送達された。ＤＮＡ／微小担体懸濁液の１ｍｌは、１７の被覆０．５−インチカートリッジを作成し、これは使用前に乾燥剤とともに４℃で一夜保存された。遺伝子銃送達法によるマウスの免役では、各マウスの腹部の毛が、各予防接種前に電気バリカンで除去された。遺伝子銃の銃身は腹部皮膚に対して直接据えられ、そして１回の微小担体ショットが４００〜５００ｐｓｉ．のヘリウム圧を用いて送達された。注入はヘリウム活性化Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ）を用いて実施された。
【０１６８】
例１２
ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）二重らせんによるヒト細胞におけるＩｉの抑制
Ｉｉ遺伝子発現をサイレンスするためのｓｈＲＮＡの使用に加えて、ｓｉＲＮＡ二重らせんの化学合成を伴う第２の方法が試験された。合成ｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡプラスミドベクター以上の若干の利点を提供する。第１に、合成ｓｉＲＮＡの送達は、挿入変異誘発を含む、真核細胞への有害な影響を有する外来プラスミドＤＮＡの導入を必要としない。第２に、合成ｓｉＲＮＡは、本明細書において提示されるように、治療目的のために一層有効であるかもしれない一過性遺伝子抑制をもたらす。
【０１６９】
二本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験．  アンチセンスＲＮＡは細胞中に導入される場合、特定の遺伝子をサイレンスすることができる（Ｇｕｏ，Ｃｅｌｌ  ８１，６１１）。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を使用して、二本鎖ＲＮＡの注入が、センスまたはアンチセンス鎖の注入よりも遺伝子サイレンシングにおいて有効であることが例証された（Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６）。したがって，さらなるｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）が設計され、そしてＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって合成された（表４および５）。合理的なｓｉＲＮＡの設計および緊縮な相同性解析は、標的遺伝子の最適なサイレンシングを達成するため、そして標的を外した影響を最小にするために決定的である。ＱＩＡＧＥＮは、ＲＮＡｉの高度に機能的な標的配列の選択のためのＮｏｖａｒｔｉｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＨｉＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを認可された。このアルゴリズムは、現在までのｓｉＲＮＡ機能性の最大の独立した研究に基づいていて、ここでは、３４の標的に対向される３０００以上の合成ｓｉＲＮＡ二重らせんの遺伝子サイレンシング効力が解析された。これらのデータが使用されて、精巧なパターン認識アルゴリズムが開発された。ＨｉＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、全体的かつ正確な相同性解析を可能にするために、特許権のある相同性解析ツールおよび包括的な重複していない遺伝子データベースを組込んでいる。結果的に、注文設計された４−ｆｏｒ−Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｓが高度に特異的かつ強力なｓｉＲＮＡを提供する。４−ｆｏｒ−Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘｅｓは高度に純粋なＨＰＰ  Ｇｒａｄｅ  ｓｉＲＮＡである。高い純度はｓｉＲＮＡの特異性を増大し、そして標的を外した影響の可能性を低下させる。
【０１７０】
実験結果．
次に示す実験は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合されるインバリアント鎖（Ｉｉ）に特異的なｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされたヒト細胞においてＩｉの発現を抑制することを明らかにした。これらの実験では、ＨｅＬａ細胞が、トランスフェクション２４時間前に、６穴プレートにおいて１ウェル当たり２．５ｘ１０４細胞においてプレートされた。ＨｅＬａ細胞は、製造者の指示にしたがってｓｉＲＮＡｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いてインバリアント鎖に特異的な４個のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）によりトランスフェクトされた。ＬａｍｉｎＡ／Ｃに特異的なｓｉＲＮＡおよび非サイレンシング蛍光標識ｓｉＲＮＡがＩｉ遺伝子サイレンシングについての対照として使用された。細胞は、トランスフェクション後６時間に、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）１００ユニット／ｍｌおよびチロキシン１ｘ１０−７Ｍにより処理されて、ＭＨＣクラスＩＩ発現を誘導した。トランスフェクション後４８時間目に、細胞がＩｉ、ＨＬＡ−ＤＲおよびイソ型対照に対する抗体によって染色された。細胞は実施例１１におけるようにＦＡＣＳ解析された（表６）。全４種のｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）二重らせんがＩｉタンパク質発現の有意な抑制を示した。
【０１７１】
【表４】
2008521410.tif 000006
【０１７２】
【表５】
2008521410.tif 000007
【０１７３】
【表６】
2008521410.tif 000008
【０１７４】
例１３
Ｉｉ抑制によるＨＩＶｇｐ１２０ＤＮＡワクチンの免役調節
ワクチン抗原をコードしているＤＮＡが導入された樹状細胞または他の専門抗原提示細胞のいずれかにおけるＩｉタンパク質抑制の誘導は、両Ｔヘルパー細胞記憶および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を増進する強力なＴヘルパー細胞応答をもたらす。そのような応答は、従来欠いていたＤＮＡワクチンの強力な治療学的効果を可能にする。
【０１７５】
本開示の背景において詳細に示されたように、この効果に関するメカニズムは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の小胞体（ＥＲ）におけるＩｉタンパク質発現の抑制に依存する。また、プロテオソームによって処理され、そこでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するためにＥＲ中に移送される細胞質ペプチドは、Ｉｉタンパク質によってブロックされていない主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合できるようになる。正常には、Ｉｉタンパク質はＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位をブロックしているが、その後、三量体（ＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖＋Ｉｉタンパク質）は、ポスト−ゴルジ分画（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）ヘ移送され、この中に、選ばれた外部抗原が移送されて、Ｉｉタンパク質のタンパク質分解とともに抗原がタンパク質分解的に消化され、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子に抗原ペプチドが結合される。
【０１７６】
Ｉｉタンパク質の発現の抑制とともに細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子のＥＲ結合部位の改変は、Ｔヘルパー細胞への提示のために細胞表面への細胞内移送の進行を続ける、ＭＨＣクラスＩＩ分子中に結合されるＭＨＣクラスＩＩエピトープの蓄積を拡大する。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子の大フラクションが、トランスフェクトされたＤＮＡワクチン遺伝子から合成された決定基を結合し、発現するようになるので、多くのエピトープの提示能力が増強される。その遺伝子の用量、そのプロモーターの能力、プロテオーム処理に及ぼす細胞質で合成されたタンパク質またはタンパク質フラグメントの安定性の影響、および他のファクターが、すべて，ＥＲにおける「ブロックされてない」ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるようになるワクチンペプチドのＥＲ中濃度に寄与する。
【０１７７】
この実施例で示されるように、ＨＩＶｇｐ１２０抗原のＤＮＡによるマウスの免疫化への応答は、Ｉｉタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズするＲＮＡの転写を誘導してＩｉタンパク質の抑制をもたらす、Ｉｉ逆遺伝子構築物（Ｉｉ−ＲＧＣ）によるマウスの同時免疫化によって、大きく増強される。金ビーズ免疫化技術の利点は、ＤＮＡワクチンおよびＩｉ−ＲＧＣに関するプラスミドＤＮＡの最終的な最適有効比率および濃度が、金ビーズ吸着のＤＮＡが押し込まれる細胞内に、細胞ベース当たりで投与することができることである。
【０１７８】
実験１
ＤＮＡ被覆された金ビーズの調製．
ＤＮＡによる金ビーズのコーティング前に、次のパラメーターが各研究について決定されなければならない：１カートリッジ当たりの金ビーズ装填比（ＧＬＲ）、１カートリッジ当たりのＤＮＡ装填比（ＤＬＲ）、ＤＮＡ／金ビーズ比（ＤＧＲ）、１回の免疫化当たり使用されるカートリッジ（ショット）数、および必要な免疫化回数。次の実験１および２では、ＤＧＲ＝４、ＧＬＲ＝０．５、ＤＬＲ＝２。
【０１７９】
【表７】
2008521410.tif 000009
【０１８０】
マウスの免疫化．
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）が、ケタミン溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）２００μｌ、キシラジン溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌおよび通常の生理食塩水３００μｌを含んでなる溶液（総量７５０μｌ）により麻酔され、各マウスは６週目に５０μｌのｉ．ｐ．注射を受ける。次いで、マウスは直ちに電気カミソリで剃られ、そして遺伝子銃発射にかけられる。銃はマウスの皮膚から０．０〜０．５ｃｍにある。発射は４００ｐｓｉヘリウムガスによる。各マウスは４ショットを与えられ、その後のブースターはない。３週後に、インビトロで実施されたＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイは、長いＰ１８ペプチド（ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫ）および短いＰ１８ペプチド（ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ）をそれぞれ使用する。
【０１８１】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ．
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの市販のプロトコルにしたがって実施された。簡単に言えば、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（リン酸バッファー生理食塩液、ＰＢＳ）中、６μｇ／ｍｌにおけるサイトカイン特異的捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体の溶液１００μｌが、４℃で一夜のインキュベーションのために９６穴Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレート（Ｍ２００）の各ウェルに添加される。吸引後、１０％胎児ウシ血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有するリン酸バッファー生理食塩液２００μｌがＲＴで２時間各ウェルに添加される。ＰＢＳ中１％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄後、１０５〜１０６細胞／ウェルにおける免疫マウスの脾臓からの単細胞懸濁液１００μｌが、培地中、５μｇ／ウェルまたは２５μｇ／ウェルにおけるエピトープのみのペプチド１００μｌにより再刺激され、３７℃、５％ＣＯ２において２４〜７２時間インキュベートされる。ＰＢＳで２回および洗浄バッファーで４回洗浄後、１０％胎児ウシ血清（希釈バッファー）を含有するＰＢＳ中２μｇ／ｍｌビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γの１００μｌが、ＲＴで２時間各ウェルに添加される。洗浄バッファーＩで５回洗浄後、希釈バッファー中ストレプトアビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ共役液１００μｌがＲＴで１時間各ウェルに添加される。洗浄バッファーＩで４回およびＰＢＳで２回洗浄後、３−アミノ−９−エチルカルバゾール／Ｈ２Ｏ２基質（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５５１９５１）１００μｌがＲＴで暗所において３０〜６０分間添加される。反応は脱イオン水１００μｌで３回洗浄することによって停止される。ＥＬＩＳＰＯＴデータの解析は、Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ１．７ｅソフトウエア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いることによって実施される。
【０１８２】
【表８】
2008521410.tif 000010
【０１８３】
実験２
実験手順は実験１と同じである。
【０１８４】
【表９】
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【０１８５】
上記データで示されるように、ＨＩＶｇｐ１２０およびＩｉ−ＲＧＣのためのＤＮＡの同時注入は、両細胞数および細胞当たりの出力（ｏｕｔｐｕｔ）（スポットサイズ）に関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮ−γ応答の実質的増強をもたらす。この増強された応答は、より強力なＣＴＬ、およびより強いＣＤ４＋記憶細胞応答をもたらすであろう。
【０１８６】
また上記実験は、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）の同時注入が、ＣＩＩＴＡなしで見られる応答に比較して抑制された応答を誘導することを例証している。このパターンは、ケラチン細胞中に押し込まれたＤＮＡ被覆ビーズが、ＣＩＩＴＡのＤＮＡがまたビーズ上に存在するか否かに応じて２パターンの応答をもたらすという事実から得られる。ＣＩＩＴＡなしでは、ワクチンＤＮＡは、ＨＩＶｇｐ１２０の発現、ＭＨＣクラスＩ決定基の発現をもたらし、これはＭＨＣクラスＩに限定されるＣＴＬ応答を
開始できる。あるいはまた、ＨＩＶｇｐ１２０抗原は、ケラチン細胞によって遊離されることもあり、次いで、マクロファージまたは樹状細胞によって捕捉されて、それらの細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される。ケラチン細胞中に押し込まれたＤＮＡから合成されたタンパク質由来のＴ細胞提示のＭＨＣクラスＩＩエピトープの量は、少なくともそのような細胞によって提示されるＭＨＣクラスＩエピトープの量に較べて非常に低い。そのような細胞では、これらの細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子またはＩｉタンパク質のいずれも発現しないので、発現されたＩｉ−ＲＧＣは有用な機能を有しない。内因性の合成抗原タンパク質は、まれにポスト−ゴルジ抗原負荷分画（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）への小胞移送後を除いて、または細胞外遊離と専門的なＡＰＣによる取り込み後を除いて、発現されるようにはならない。
【０１８７】
しかしながら，ケラチン細胞がＣＩＩＴＡとともに同時にトランスフェクトされる場合には、ＭＨＣクラスＩＩ分子はケラチン細胞において発現される。Ｉｉ−ＲＧＣがそのような細胞中にコ・トランスフェクトされない場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、それらの細胞によるＭＨＣクラスＩＩエピトープ提示について影響力をもたない、何故ならば、それらは、専門的ＡＰＣのポスト−ゴルジ抗原負荷分画に存在するＭＨＣクラスＩＩプロセシングおよび提示機能の残りの部分を欠如するからである。しかし、Ｉｉ抑制がまたＩｉ−ＲＧＣ構築物、ｓｉＲＮＡ（Ｉｉ）またはアンチセンスＩｉオリゴヌクレオチドにより生じる場合には、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは遺伝子をトランスフェクトされたケラチン細胞によって提示することができる。しかしながら、そのような細胞における応答の生物学的タイプは、ここでは、活性化表現型よりもむしろ抑制表現型である。それは、Ｔ細胞提示のためのＢ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、および他のＡＰＣ補助因子の不在下での、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるＴヘルパー細胞へのエピトープの提示という理由で起きるからである。補助因子なしのＭＨＣクラスＩＩ分子により提示された抗原エピトープによるＴ細胞活性化の不履行応答経路は、Ｔｈ２抑制化表現型である。そのような免役抑制効果の誘導および使用方法は、米国特許第６，１０６，８４０号、米国特許第６，２１８，１３２号および米国特許第６，４０５，７９６号からの引用によって組み入れられている。自己免役疾患は、疾病の発病に関連する少なくとも１種の基本的抗原性抗原が既知であり、そして抗原のＤＮＡコーディング部分または全部が利用できる場合に、この抑制誘導方法によって処置することができる。処置プロトコルは、例えば、一定の濃度および比率における金ビーズにおいて、次の３種のＤＮＡ：発病に関連する抗原のためのＤＮＡ、Ｉｉ−ＲＧＣプラスミドのためのＤＮＡおよびＣＩＩＴＡのためのＤＮＡを投与することからなる。そのような免疫化は、次の米国特許で具体的に述べられる、用量、スケジュールおよび方法において、かつそのようなアジュバントを用いて実施される：米国特許第６，７１０，０３５号、米国特許第６，５８６，４０９号、米国特許第６，２１４，８０４号、米国特許第６，３３９，０６８号、米国特許第５，６２０，８９６号、米国特許第６，７０６，６９４号、米国特許第６，６４９，４０９号、米国特許第６，２５８，７９９号、米国特許第６，７４３，４４４号、米国特許第６，６５６，７０６号および米国特許第６，７８３，７５９号。
【０１８８】
１つの態様では、本治療方法は、類リウマチ性関節炎、多発性硬化症およびＩ型真性糖尿病のような自己免役疾患の処置に適用することができる。例えば、ヒトミエリン基礎タンパク質、オリゴグリオデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｇｌｉｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）タンパク質、および他のＭＳ関連抗原に対するＤＮＡワクチンが、多発性硬化症を抑制するために両ＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣとともに投与することができる。同様に、Ｈｃｇｐ４２、コラーゲンおよび類リウマチ関節炎−または骨関節炎関連抗原のためのＤＮＡが、類リウマチ性関節炎を抑制するために両ＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣとともに投与することができる。インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルコーストランスポーター−２および他のＩ型真性糖尿病関連抗原のためのＤＮＡが、Ｉ型真性糖尿病を抑制するために両ＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣとともに投与することができる。その他の態様では、移植片拒絶が、エンコーディングｃＤＮＡとともに移植片の適当な抗原が既知である場合には、拒絶を抑制するためにこの方法によって処置されてもよい。処置プロトコルは、例えば、一定の濃度および比率の次の３種のＤＮＡ：移植片拒絶に関連する抗原のためのＤＮＡ、ＣＩＩＴＡのためのＤＮＡおよびＩｉ−ＲＧＣのためのＤＮＡをもつ金ビーズを投与することからなる。
【０１８９】
例１４
ヒトＩｉｓｉＲＮＡプラスミドによるヒト樹状細胞におけるＩｉの抑制
ｓｉＲＮＡが使用されて、新鮮なヒト末梢血液単球由来の樹状細胞においてＩｉタンパク質の発現が抑制された。ヒト単球樹状細胞は、ヒト末梢血液市販調製物（Ｌｅｕｋｏｐａｃｋ  ｆｒｏｍ  Ａｌｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ）から調製された。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）（２．５ｘ１０６）が，Ｘ−ＶＩＶＯ１５培養培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．０４−４１８，Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％ヒトＡＢ血清（Ｃａｔ．Ｎｏ．１００−５１２，Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン保存液（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３７８−０１６，ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌｅ  ＮＹ；保存液濃度：ペニシリン１０，０００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍｌ；Ｌ−グルタミン，２９．２ｍｇ／ｍｌ）を含んでなる２５ｍｌのＤＣ培地において５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で一夜培養されて、単球をプラスチックウェルの底に接着させた。非接着Ｔ細胞およびＢ細胞は、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー０．１４ＭＮａＣｌ溶液（リン酸バッファー生理食塩液；ＰＢＳ）で静かに洗浄して除去された。次いで、接着単球は、０．２〜２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）および０．２〜２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する２５ｍｌのＤＣ培地において５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で７日間培養されて、単球を樹状細胞に分化させた。その培地は３日および６日目に変えられた。樹状細胞はトリプシンによって回収され、そして２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および０．２〜２ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＤＣ培地中に再懸濁された。Ｌｅｕｋｏｐａｃｋの約２．５ｘ１０６ＰＢＭＣから、約２ｘ１０６樹状細胞が培養７日後に得られた。それらの単球由来の樹状細胞が、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含有する３ｍｌのＤＣ培養培地において１ウェル当たり３．３ｘ１０５細胞において６穴プレートにプレートされた。プラスミドのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｃａｔ．Ｎｏ．４０８７２７，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）調合物が培養物に添加され、そして５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養されて、対照およびヒトＩｉｓｉＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡにより樹状細胞をトランスフェクトした（表１０）。トランスフェクション４８時間後の細胞がＩｉに対する抗体により染色された。細胞は実施例１１において示されるようにＦＡＣＳ−解析された。２種のヒトＩｉｓｉＲＮＡ発現プラスミドが、ヒト樹状細胞においてＩｉタンパク質発現の有意な抑制を誘導した。
【０１９０】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】比蛍光強度を表す図である。ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型は、アデノ／ＣＩＩＴＡアデノウイルスベクターによるマウス結腸腺がん細胞（ＭＣ３８）の感染と、それに続くＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理によって生成された。Ａ）親のＭＣ３８細胞（無処理）；Ｂ）アデノ／ＣＩＩＴＡにより感染されたＭＣ３８細胞；Ｃ）アデノ／ＣＩＩＴＡにより感染され、かつセンスの対照オリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ３８細胞；Ｄ）アデノ／ＣＩＩＴＡにより感染され、かつミスマッチの対照オリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ３８細胞；Ｅ）アデノ／ＣＩＩＴＡにより感染され、かつＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ３８細胞。
【図２】ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−細胞で予防接種されたマウスにおけるＭＣ−３８結腸腺がんの抑制を表す図である。凡例：（円）ＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス；（三角）アデノ／ＣＩＩＴＡおよびミスマッチ対照オリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス；（菱形）アデノ／ＣＩＩＴＡおよびセンスの対照オリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス；および（四角）アデノ／ＣＩＩＴＡおよびＩｉアンチセンスのオリゴヌクレオチドにより処理されたＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス。
【図３】ＣＩＩＴＡで安定的にトランスフェクトされ、そしてＩｉアンチセンスを用いてＩｉ発現について抑制された致死的に放射線照射されたＭＣ−３８細胞を接種されたマウスにおける親腫瘍細胞の抑制を表す図である。マウスは、ＰＢＳ（三角）、センスオリゴヌクレオチド（円）またはＩｉアンチセンス（四角）で処理された、ＣＩＩＴＡトランスフェクトされたＭＣ−３８細胞を接種された（５マウス／群）。
【図４】ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−細胞で予防接種され、そしてＧＭ−ＣＳＦで処理たマウスにおけるＭＣ−３８結腸腺がんの抑制を表す図である。例：（三角）親ＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス；（円）ＭＣ−３８細胞およびＧＭ−ＣＳＦで免疫化されたマウス；（白い四角）ＣＩＩＴＡ、センスの対照オリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦにより処理されたＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス；および（菱形）ＣＩＩＴＡ、ＩｉアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＧＭ−ＣＳＦにより処理されたＭＣ−３８細胞で免疫化されたマウス。
【図５】ＭＣ−３８細胞における、ＭＨＣクラスＩＩ分子およびアデノ／ＩＦＮ−γによるＩｉ誘導を表す図である。ＭＣ−３８はアデノ／ＩＦＮ−γ（３ＭＯＩ）により指示された時間感染され、次いで抗ＭＨＣクラスＩＩ分子またはＩｉ抗体により染色され、そして流動細胞計測法によって分析された。
【図６】比蛍光強度を表す図である。ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型は、アデノ／ＣＩＩＴＡおよびアデノ／Ｉｉ−ＲＧＣ（Ｉｉ−９２，９７）による細胞の同時感染によってＲｅｎｃａ細胞において生成された。Ｒｅｎｃａ細胞は、アデノ／ＣＩＩＴＡ対アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣの種々の比により同時感染され、７２時間放置インキュベートされ、そしてＭＨＣクラスＩＩ分子またはＩｉタンパク質発現について染色された。Ａでは、親のＲｅｎｃａ細胞；Ｂではアデノ／ＣＩＩＴＡ感染細胞；Ｃでは、１：２比におけるアデノ／ＣＩＩＴＡ対アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣによる同時感染；Ｄでは、１：４比におけるアデノ／ＣＩＩＴＡ対アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣによる同時感染が示される。
【図７】ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型が、アデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ（ｍＩｉ−９２，９７）による細胞の感染によって生成された継時的実験の表示である。Ｉｉ−であるがクラスＩＩ＋の表現型は、アデノ／ＩＦＮ−γ／Ｉｉ−ＲＧＣ（ｍＩｉ−９２，９７）後、１２０時間において生成された（左）が、一方、アデノ／ＩＦＮ−γのみによる感染はＭＣ−３８細胞においてＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型を産生しなかった（右）。
【図８】一過性にトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ＋）、ヒトＢリンパ腫細胞系におけるＩｉ−抑制の表示である。細胞は、１．２５．ｔｉｍｅｓ．１０．ｓｕｐ．５細胞／ウエルにおいて一夜１２穴プレート中にプレートされ、そしてＩｉ発現を抑制するためにヒトＩｉ−逆遺伝子構築物（ｈＩｉ−ＲＧＣ）によりトランスフェクトされた。Ｅｆｆｅｃｔｅｎトランスフェクション試薬（２５．ｍｕ．ｌ，ＱＩＡＧＥＮ）が，濃縮されたｈＩｉ−ＲＧＣプラスミドＤＮＡ（１ｕｇ）とともにインキュベートされて、培地と混合されたＥｆｆｅｃｔｅｎＤＮＡ複合体が生成され、これが細胞に直接添加された。４８時間のインキュベーション培養後、細胞は、抗ヒトＩｉ抗体、ＬＮ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＭＨＣクラスＩＩ分子の染色のための抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による免疫染色によってＩｉおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現について分析された。見られるように、Ｉｉ発現は、ポジティブ対照細胞に較べて、使用されたＩｉ−ＲＧＣ配列に応じて細胞の４％〜９％で抑制（左パネル）されたが、一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子発現には影響がなかった（右パネル）。
【図９】アデノ／Ｉｉ−ＲＧＣベクターのインビボ投与による腫瘍増殖の抑制、およびＭＨＣクラスＩＩ＋／Ｉｉ−表現型の生成の表示である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは５．ｔｉｍｅｓ．１０．ｓｕｐ．５Ｒｅｎｃａ腎腺がん細胞を皮下に注射された。腫瘍が、腫瘍細胞の注射後、約１０日に５０〜２００ｍｍ．ｓｕｐ．３の大きさに達した時点で、この腫瘍は、ＤＭＲＩＥ／ｃとともに連続４日の毎日に異なるベクター組み合わせ物を注射された。次いで、腫瘍は大きさについて各２または３日毎に測定された。マウスは腫瘍の大きさが１０００ｍｍ．ｓｕｐ．３に達する時点で終末とされた。左パネルのデータは、４頭のマウスのデータを表し、これらのマウスの腫瘍は、２ｍｕ．ｇＩＬ−２、３ｍｕ．ｇアデノ／ＢＮ／ＣＩＩＴＡおよび１８ｍｕ．ｇアデノ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２、９７）を１日目に、続いて２〜４日間、２ｍｕ．ｇＩＬ−２、１８ｍｕ．ｇアデノ／ＢＮ／Ｉｉ−ＲＧＣ（−９２、９７）および３μｇ空の（ｅｍｐｔｙ）プラスミド（アデノ／ＢＮ）（ＣＩＩＴＡなし）を注射された。ＩＬ−２とともにＣＩＩＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣ含有ベクターで処置されたマウスは、腫瘍増殖において劇的な退縮を示したが、一方、対照ベクターは進行的であり、そしてマウスの終末が必要であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月8日(2008.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡを含んでなる組成物。
【請求項２】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉのセンス配列、長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）におけるセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項２の組成物。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡが、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列を含んでなる第１の鎖；および
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列を含んでなる第２の鎖；
を含んでなるＲＮＡ二重らせんを含む、請求項３の組成物。
【請求項５】
Ｉｉ発現を抑制するために有効なｓｉＲＮＡをコードしているＤＮＡ配列を含んでなる組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ配列がプラスミドベクター中に存在する、請求項５の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡ配列がウイルスベクター中に存在する、請求項５の組成物。
【請求項８】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスおよびレトロウイルスからなる群から選ばれる、請求項７の組成物。
【請求項９】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１０〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１０】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）長さ１９〜２５ヌクレオチドのＩｉのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項９の組成物。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡが、単一分子中に、
ａ）Ｉｉの２１〜２３ヌクレオチドのセンス配列；
ｂ）ａ）における配列の逆相補配列；および
ｃ）センスと逆相補配列との間に二重らせんの形成を可能にする介在配列；
を含む、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
ｓｉＲＮＡが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選ばれる配列のＲＮＡを含む、請求項１または５の組成物。
【請求項１３】
細胞においてＩｉの発現を抑制する方法であって、ｓｉＲＮＡが直接または間接的に細胞中に導入され、さらに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を形成し、それによって細胞においてＩｉの発現を抑制することができるｓｉＲＮＡをＩｉを発現する細胞中に導入することを含んでなる方法。
【請求項１４】
ｓｉＲＮＡが細胞中に間接的に導入され、その結果、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡをコードしている発現可能な核酸配列から細胞内で転写される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
発現可能な核酸配列が、
ａ）Ｉｉのセンス配列を含んでなる第１のＲＮＡ配列をコードしている第１の発現可能なＤＮＡ配列；および
ｂ）段階ａ）におけるＩｉのセンス配列の逆相補配列を含んでなる第２のＲＮＡ配列をコードしている第２の発現可能なＤＮＡ配列；
を含む方法であって、
ｓｉＲＮＡ二重らせんが、第２のＲＮＡ配列に対する第１のＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより形成される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つが精製されたＰＣＲ産物である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
第１および第２の発現可能なＤＮＡの少なくとも１つがベクター中に存在する、請求項１５の方法。