(57)【要約】  本発明は、酵素を使用する工業的発酵プロセスにおける、機能的外因性酵素またはその機能性断片、変異体または誘導体を示すウイルス、特にディスプレーバクテリオファージの使用に関する。本発明はさらに、2個の以上の異なる外因性酵素またはその機能性断片、変異体または誘導体を示すウイルス、特にディスプレーバクテリオファージ、ならびに酵素を使用する工業的発酵プロセスにおけるそれらの使用に関する。好ましい実施形態では、ディスプレーファージはα-アミラーゼおよびキシラナーゼの機能的コピーを示し、これを使用して混合オフィス廃棄紙のインク抜きをする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応物との酵素反応の産物を生成する方法であって、
a)非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスまたはその断片を与えるステップ、および
b)産物を生成するための反応物の酵素反応を酵素が触媒するのを可能にするのに適した条件および時間で、組換えウイルスまたはその断片と反応物を接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素反応の産物を回収する他のステップを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス中に挿入された核酸分子によって非原型酵素がコードされていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
核酸をウイルスゲノム中に組換えによって挿入することを特徴とする、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
非原型酵素をタンパク質としてウイルス中に取り込ませることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
組換えウイルスまたはその断片が複数の非原型酵素またはその断片、変異体、または誘導体を生成することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
非原型酵素またはその断片、変異体、または誘導体の少なくとも1個が異なることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
非原型酵素が同じ翻訳産物として与えられることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
非原型酵素が別の翻訳産物として与えられることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
非原型酵素が代謝経路中で作用することを特徴とする、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
非原型酵素が同じ翻訳産物の一部分として、ウイルスのコートタンパク質として与えられることを特徴とする、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスがファージであることを特徴とする、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
非原型酵素がα-アミラーゼまたはキシラナーゼであることを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項１４】
非原型酵素の1個がα-アミラーゼまたはキシラナーゼであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項１５】
酵素反応の産物が液状デンプンであることを特徴とする、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
代謝経路がマルトースまたはグルコースを生成することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【請求項１７】
複数の酵素が作用して、混合オフィス廃棄紙のインクを抜くことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【請求項１８】
産物が液状デンプンであり、反応物がデンプンであり、かつ酵素がα-アミラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
産物がインクを抜いた混合オフィス廃棄紙であり、反応物が雑多なオフィスの紙類であり、かつ酵素がα-アミラーゼおよびキシラナーゼであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項２０】
酵素反応を反応容器中で実施し、組換えウイルスを同じ反応容器中に与えることを特徴とする、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を生成する組換えウイルスを生成する方法であって、非原型酵素を含むようにウイルスを操作するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が異なることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
組換え酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体をコードする核酸分子をウイルスゲノム中に挿入することによってウイルスを操作することを特徴とする、請求項21または請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
酵素が同じ翻訳産物中に生成されるように核酸分子を挿入することを特徴とする、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
それぞれの酵素が別の翻訳産物として生成されるように核酸分子を挿入することを特徴とする、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
複数の酵素をウイルス中、それぞれの酵素を取り込んだカセット中に挿入することを特徴とする、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
複数の酵素を別の核酸分子としてウイルス中に取り込ませることを特徴とする、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子をウイルスゲノム中に組換えによって挿入することを特徴とする、請求項23から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
非原型酵素を別のタンパク質としてウイルス粒子中に取り込ませることによってウイルスを操作することを特徴とする、請求項21または請求項22に記載の方法。
【請求項３０】
非原型酵素を融合タンパク質としてウイルス粒子中に取り込ませることによってウイルスを操作することを特徴とする、請求項21または請求項22に記載の方法。
【請求項３１】
1個またはそれぞれの非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が代謝経路中で作用することを特徴とする、請求項21から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
1個またはそれぞれの非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が同じ翻訳産物の一部分として、ウイルスのコートタンパク質として生成されることを特徴とする、請求項21から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
大規模に酵素を生成することを特徴とする、請求項21から32のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項３４】
大規模が1リットルを超える反応体積であることを特徴とする、請求項33に記載の使用。
【請求項３５】
大規模が5リットルを超える反応体積であることを特徴とする、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
同じ翻訳産物中に複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含むことを特徴とする、組換えウイルスまたはその断片。
【請求項３７】
別の翻訳産物として複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含むことを特徴とする、組換えウイルスまたはその断片。
【請求項３８】
複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が異なることを特徴とする、請求項36または請求項37に記載の組換えウイルスまたはその断片。
【請求項３９】
1個またはそれぞれの非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が代謝経路中で作用することを特徴とする、請求項36から38のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたは断片。
【請求項４０】
1個またはそれぞれの非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体が同じ翻訳産物の一部分として、ウイルスのコートタンパク質として生成されることを特徴とする、請求項36から39のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたは断片。
【請求項４１】
請求項21から32のいずれか一項に記載の方法によって生成されることを特徴とする、請求項36から39のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはその断片。
【請求項４２】
請求項36から41のいずれか一項に記載のウイルスまたは断片を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項４３】
細菌細胞であることを特徴とする、請求項42に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
大腸菌細胞であることを特徴とする、請求項42または請求項43に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
複数の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を生成する方法であって、請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスを生成するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスによって生成されたときのものであることを特徴とする、酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体。
【請求項４７】
酵素がα-アミラーゼまたはキシラナーゼであることを特徴とする、請求項21から32または45のいずれか一項に記載の方法、請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはその断片、あるいは請求項46に記載の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体。
【請求項４８】
酵素が液状デンプンを生成することを特徴とする、請求項21から32または45のいずれか一項に記載の方法、請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはその断片、あるいは請求項46に記載の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体。
【請求項４９】
酵素によって触媒される酵素反応がマルトースまたはグルコースを生成する代謝経路の一部分であることを特徴とする、請求項21から32または45のいずれか一項に記載の方法、請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはその断片、あるいは請求項46に記載の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体。
【請求項５０】
酵素によって触媒される酵素反応が混合オフィス廃棄紙のインク抜きを助長することを特徴とする、請求項21から32または45のいずれか一項に記載の方法、請求項36から41のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたはその断片、あるいは請求項46に記載の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素に関する。特に本発明は、ウイルスによって生成される酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中に列挙した、任意の特許または特許出願を含めた全ての参照文献は、参照により本明細書に組み込まれている。如何なる参照文献も、従来技術を構成するとは認められない。幾つかの従来技術の刊行物を本明細書で言及するが、この参照文献は、これらの文書がいずれも当技術分野、オーストラリアまたは任意の他の国における共通の一般知識の一部分を形成することを認めるものではないことは明らかに理解されよう。
【０００３】
酵素は大きな複合分子であり、現在は原型宿主生物または酵素をコードする核酸分子に適した発現ベクターを使用してバイオリアクター中で生成されている。例えば、α-アミラーゼはバシラス種のバッチ発酵によって生成され、この場合酵素の生成は細菌細胞が10〜20時間増殖した後に始まり、さらに100〜150時間続く。次いで酵素を、限外濾過またはアセトン沈殿のいずれかを使用して濾過および濃縮によって細胞培養物から除去する。発酵のバッチの性質、ならびに長々しい生成および精製時間は、最終的な酵素産物のコストを大幅に増大させる。詳細には細胞溶解ステップが、細胞内から酵素を単離するために最も頻繁に必要とされる。多量の酵素が必要とされる工業プロセスにおいて、これは非常に関心が持たれている。一度単離した後、酵素を反応に加えて、その反応を引き起こすことが必要である。
【０００４】
例えば商業的な例では、B.licheniformis由来のα-アミラーゼは、エタノール、マルトースおよびグルコースシロップ生成の初期段階のデンプンの液状化などの高温プロセスにおいて、ならびに製紙および繊維産業おいて使用される。デンプンのグルコースまたはマルトースシロップへの加工中、3つの主なステップ;ゼラチン化、液状化、および糖化が存在する。ゼラチン化中は、デンプンのスラリーおよび熱安定性α-アミラーゼを、105℃の温度で5分間パイプを介して蒸気注入する。液状化中は、デンプン-アミラーゼ混合物を95℃で約2時間保持して、デンプンの粘度を低下させる。糖化中は、グルコースまたはマルトース単位を、グルコアミラーゼ、プルラナーゼまたは真菌α-アミラーゼなどの酵素を加えることによって生成させる。したがって、数種の酵素が1つの酵素反応において必要とされる可能性がある。使用するそれぞれの追加的酵素が、プロセスのコストを増大させる。
【０００５】  ファージディスプレーは、ファージ粒子の表面上でのタンパク質およびペプチドの発現、ならびに当該のペプチドまたはタンパク質の遺伝子型と表現型の間の直接の関連を可能にする。この方法は、例えばリガンド、酵素基質などの他の分子と相互作用するペプチドまたはタンパク質の能力に関して、それらの広範囲のライブラリーを同時にスクリーニングすることを可能にする。ファージディスプレーは、特定の活性を有する酵素に関してファージライブラリーをスクリーニングするために使用されている。このシナリオでは、酵素を生成するファージを分析スクリーニングアッセイで使用して、酵素の活性を試験することができる。しかしながら、適切な酵素を発現するファージが同定されるときは、当該の酵素をコードする核酸を増幅させ、大腸菌中の発現ベクターなどの発現系中にクローニングする。このような発現ベクターでは、タンパク質が輸送されない場合、細胞溶解ステップがタンパク質を単離するために必要とされ、このステップは処理用に他の酵素の添加を含むことができ、封入体が形成される場合は可溶化が必要とされる可能性がある。これは酵素の高コストをもたらす高価な下流行程の処理技術に関する、時間を浪費する手順である。さらに、ファージライブラリー中のそれぞれのファージは、ただ一種の酵素をコードする核酸を含む。したがってこの手順は、同定するそれぞれの適切な酵素に関して繰り返さなければならない。【非特許文献１】Sambrook and Russel、2001.Molecular Cloning : a laboratory manual、3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク
【非特許文献２】Dietmaier and Fabry、1995.Protocol : Di/Trinucleotide Sticky End Cloning(DI/TRISEC).In : Boehringer Mannheim PCR Applications Manual.Boehringer Mannheim GmbH、Biochemica.p136〜140
【非特許文献３】Doyle 1996(Protocols and Applications Guide、3rd Edition.USA : Promega Corporation.p187
【非特許文献４】T7Select(登録商標)System Manual(Novagen、2000)
【非特許文献５】Bernfeld1955(Amylases、alpha and beta.Methods Enzymol 1 :149〜158.
【非特許文献６】（公序良俗違反につき、不掲載）
【非特許文献７】LIC Duet Minimal Adapter strategy(Novagen)
【非特許文献８】Philipps et al(2004、BioTechniques 36 : 80〜83
【非特許文献９】Willats、2002、Plant Molecular Biology 50 : 837
【非特許文献１０】Castillo et al、(2001、J Immunol Meth 257 : 117〜122
【非特許文献１１】Hoogenboom et al、1998、Immunotechnology 4:1〜20
【非特許文献１２】Technical Association of Paper and Pulp Industries(TAPPI)プロトコルT525 otn-92
【非特許文献１３】Pala et al、2004.J Biotech 108 : 79〜89
【非特許文献１４】Chakrabarti et al、1997(Biotechniques 23 (6) : 1094〜1097
【非特許文献１５】Earl PL and Moss B 1991(Generation of Vaccinia viruses pp 16.17.1〜16.17.16 in FM Ausbal et al、(ed) Current Protocols in Molecular Biology、vol2. Greene Publishing Associates and Wiley International Sciences、ニューヨーク、NY
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、酵素反応から所望の産物を生成するための、よりコスト効率が良く時間の浪費が少ない方法に関する必要性が当技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様では本発明は、反応物との酵素反応の産物を生成する方法であって、
a)非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスまたはその断片を与えるステップ、および
b)産物を生成するための酵素反応を酵素が触媒するのを可能にするのに適した条件および時間で、組換えウイルスまたはその断片と反応物を接触させるステップを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明の第一の態様は、酵素反応の産物を回収する他のステップを場合によっては含み得るが、これは全ての状況において必要とされるわけではなく、例えば酵素をバイオレメディエーションに使用する場合、あるいは複数の酵素を使用してある経路を触媒し、産物がその経路の中間体である場合に必要とされる。
【０００９】
本発明の第一の態様による方法は、商業規模で酵素反応を実施するのに有用である。反応中に非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスを使用することは、精製酵素を使用することの代替となり、酵素反応の実施に関するコストおよび時間を減らすことができるので、精製酵素は必要とされない。
【００１０】
精製酵素の代わりに、非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスを使用することは、非原型酵素の生成を可能にし、1つの反応容器中で酵素反応を引き起こすのを可能にする。これは1リットルを超える大規模な反応容器に役立つ。1〜5リットルあるいはそれを超える反応規模は、本発明の第一の態様の方法を使用して実施可能であることは想定される。
【００１１】
完全な酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体は、これらのいずれも酵素反応を引き起こすことが可能であると思われるので、使用することができると理解される。
【００１２】
非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスの断片を、ウイルス自体の代わりに使用することができることも理解される。このウイルス断片は、組換え酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含むウイルスコートの一部分であってよい。
【００１３】
非原型酵素は、ウイルス中、例えばウイルスゲノム中に挿入された核酸分子によってコードされる可能性があり、あるいはタンパク質としてウイルス粒子中に取り込ませることができる。
【００１４】
ウイルスは、ウイルスタンパク質、例えばコートタンパク質として、同じ翻訳産物中に非原型酵素を含み得る。
【００１５】
一実施形態では、組換えウイルスまたはその断片は、複数の非原型酵素、またはこのような酵素の機能性断片、変異体、または誘導体を含む。非原型酵素は別のタンパク質として、あるいは融合タンパク質として、ウイルス粒子中に取り込ませることができる。あるいは非原型酵素は、ウイルス中に挿入された核酸分子によって発現され得る。ウイルス中への核酸分子の挿入は、酵素が同じまたは別の翻訳産物として発現されるような挿入であってよい。核酸分子はウイルス中、複数の酵素のそれぞれを取り込んだカセットに、別個の核酸分子として、あるいは別個の核酸分子と2個以上の核酸分子を含むカセットの組合せに挿入することができる。それぞれの酵素をコードする核酸分子は、ウイルスゲノム中に組換えによって挿入することが好ましい。
【００１６】
非原型酵素はα-アミラーゼまたはキシラナーゼであってよく、液状デンプンを生成することができる。酵素反応は、マルトースまたはグルコースを生成する代謝経路の一部分であることが好ましい。複数の酵素が作用して、混合オフィス廃棄紙のインクを抜くことができる。
【００１７】
酵素の大きなサイズおよび複雑性、したがって酵素の活性に影響を与える可能性がある考えられる立体障害の問題、および機能性酵素において保持されなければならない高い特異性のために、複数の非原型機能性酵素を一種のウイルスに与えることができたことは予想外であった。さらに、伝統的なファージディスプレーでは、このような複数の酵素を評価することは必要とされていない。
【００１８】
さらに、酵素反応が一連の反応中の1つである場合、それぞれの組換えウイルスまたはその断片は、一連の反応において使用するのに適した複数の非原型酵素を発現することができる。したがって一連の反応は、より少ない物理的操作で実施することができる。
【００１９】
非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体は同じであるか、あるいは好ましくは異なってよく、同じであるかあるいは好ましくは異なる核酸分子によってコードされ得る。酵素はウイルス上またはウイルス中の異なる位置に位置する可能性があり、ウイルスの表面上に位置することが好ましい。
【００２０】
第二の態様では、本発明は、複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスを生成する方法であって、非原型酵素を含むようにウイルスを操作するステップを含む方法を提供する。
【００２１】
別のタンパク質として、あるいは融合タンパク質として、ウイルス粒子中に
非原型酵素を取り込ませることによって、ウイルスを操作して非原型酵素を含ませることができる。あるいは非原型酵素は、ウイルス中に挿入された核酸分子によって発現され得る。ウイルス中への核酸分子の挿入は、酵素が同じまたは別の翻訳産物として発現されるような挿入であってよい。核酸分子はウイルス中、複数の酵素のそれぞれを取り込んだカセットに、別個の核酸分子として、あるいは別個の核酸分子と2個以上の核酸分子を含むカセットの組合せに挿入することができる。それぞれの酵素をコードする核酸分子は、ウイルスゲノム中に組換えによって挿入することが好ましい。
【００２２】
複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体は異なることが好ましい。1個またはそれぞれの非原型酵素、またはその機能性断片、変異体、または誘導体は代謝経路中で作用することができる。複数の酵素が同じまたは別の翻訳産物として与えられるかとは無関係に、1個またはそれぞれの非原型酵素は、ウイルスのコートタンパク質として同じ翻訳産物の一部分を含むことができる。
【００２３】
第三の態様では、本発明は、同じ翻訳産物中に生成される複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスまたはその断片を提供する。
【００２４】
第四の態様では、本発明は、別の翻訳産物として生成される複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を含む組換えウイルスを提供する。
【００２５】
本発明の第三の態様と第四の態様で言及した複数の非原型酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体は、異なることが好ましい。
【００２６】
本発明の第三の態様または第四の態様で言及した1個またはそれぞれの非原型酵素、またはその機能性断片、変異体、または誘導体は代謝経路中で作用することができる。複数の酵素が同じまたは別の翻訳産物として与えられるかとは無関係に、1個またはそれぞれの非原型酵素は、ウイルスのタンパク質として、特にウイルスのコートタンパク質として同じ翻訳産物の一部分を含むことができる。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、本発明の第三または第四の態様による組換えウイルスは、本発明の第二の態様の方法によって生成する。
【００２８】
本発明はさらに、本発明の第三または第四の態様によるウイルスを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であることが好ましい。
【００２９】
第五の態様では、本発明は、複数の酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を生成する方法であって、本発明の第三または第四の態様の組換えウイルスを生成するステップを含む方法を提供する。
【００３０】
この方法は、1つの反応容器中での複数の酵素の大規模な生成を可能にし得る。この方法を使用して、1リットルを超える、およびおそらく約5リットル以上の反応の規模が実施可能であることは想定される。
【００３１】
この方法は、高濃度の酵素を生成するのも可能にし得る。1リットル当たり1011分子を超える酸素濃度、およびおそらく1リットル当たり1014分子の酸素濃度が、この方法に従って生成する可能性があることが予想される。
【００３２】
第六の態様では、本発明は、本発明の第三または第四の態様の組換えウイルスによって生成されたときのものである、酵素またはその機能性断片、変異体、または誘導体を提供する。
【００３３】
本発明の態様のいずれか1つでは、ウイルスはファージであることが好ましい。
【００３４】
本発明の態様のいずれか1つにおいて好ましい非原型酵素は、α-アミラーゼまたはキシラナーゼである。非原型酵素は、液状デンプンを生成する酵素反応を触媒することができる。非原型酵素は、例えばマルトース、またはグルコースを生成する代謝経路の一部分である酵素反応を触媒することができる。
【００３５】
特に本発明の第二〜第四の態様で言及した複数の酵素を使用して、混合オフィス廃棄紙のインクを抜くことができる。
【００３６】
本発明は、第一の態様の方法によって生成される酵素反応の産物、および本発明の第二の態様の方法によって調製したときの組換えウイルスも含む。広範囲のこのような産物を生成することができ、産物の性質および分子の大きさは特に使用する酵素および出発物質、ならびに酵素処理の時間に依存することは理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の好ましい実施形態を記載するために本明細書で使用する略語は、以下の通りである:
DE=デキストロース当量
DNS=ジニトロサリチル酸
IPTG=イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
MOI=感染多重度
PCR=ポリメラーゼ連鎖反応
PEG=ポリエチレングリコール
PPM=百万分率
SEC=サイズ排除クロマトグラフィー
TA=Terrific寒天
TB=Terrificブロス
【００３８】
他に示さない限り、本発明は従来の化学、タンパク質化学、分子生物学および酵素技法を当業者の能力の範囲内で利用する。このような技法は当業者にはよく知られており、文献中で完全に説明されている。本発明は本明細書に記載する特定の物質および方法に制限されないことは明らかに理解されよう、何故ならこれらは変わる可能性があるからである。本明細書で使用する用語は単に特定の実施形態を記載する目的のものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することは目的としないことも理解されよう。
【００３９】
本発明の記載中、表現する用語または必要な暗示のため文脈が他に要求する場合を除いて、語句「comprise」あるいは「comprises」または「comprising」などの変形は包括的な意味で、すなわち本発明のさまざまな実施形態中の他の特徴の存在または付加を除外するためではなく、言及する特徴の存在を特定するために使用する。
【００４０】
本明細書で使用する、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、対応する複数形の言及を含む。したがって、例えば「1つの酵素」という言及は複数のこのような酵素を含み、「1つのアミノ酸」という言及は1つまたは複数のアミノ酸を指す。
【００４１】
本明細書で使用する「複数」は、「複数の」すなわち「2個以上」を意味する。
【００４２】
値の範囲を表す場合、この範囲が範囲の上限および下限、ならびにこれらの限界値の間の全ての値を含むことは明らかに理解されよう。
【００４３】
本発明は第一の態様において、酵素反応の産物を生成する方法を提供する。この方法は、酵素の商業規模の使用を目的とする。
【００４４】
本明細書で使用する「酵素反応」は、反応物自体が反応中に消費されて産物を形成する、酵素によって触媒される反応を意味する。
【００４５】
酵素反応は、鋳型依存性のプロセスである転写反応とは異なる。例えばポリメラーゼ酵素は、鋳型と相補的であるRNAまたはDNAを合成する。鋳型を読み取るために、ポリメラーゼは、それがDNAまたはRNA合成を触媒する可能性がある前に、鋳型と複合体形成しなければならない。この鋳型は反応の反応物ではないが、しかしながらそれは反応全体で存在する、何故ならそれは、1つまたは複数の産物の生成中に分解または消費されないからである。
【００４６】
本明細書で使用する用語「触媒する」は、反応によって化学的に不変状態である基質によって、酵素反応の速度を加速させることを意味する。
【００４７】
酵素反応は、代謝経路などの一連の酵素反応の1つであってよい。本明細書で使用する「代謝経路」は一連の酵素反応であり、反応物からの産物の合成(同化)、および1つまたは複数の産物を生成させるための反応物の分解(異化)を含む。したがって酵素反応は、小さな分子から大きなマクロ分子を構築する可能性があり、あるいは大きな分子を分解して小さな分子を生成する可能性がある。
【００４８】
「酵素」は、酵素反応を触媒する分子または分子の集合体である。酵素は通常それらが触媒する反応、およびこれらの反応と関係がある反応物に特異的である。それらは一般に、活性部位および結合部位を含む大きな複合分子である。酵素の活性部位は、触媒反応が起こる結合部位である。活性部位の構造および化学的性質は、反応物の認識および結合を可能にする。結合部位は、特異的リガンドが結合するタンパク質上の領域である。
【００４９】
本発明は適切にはタンパク質酵素、ならびにその機能性断片、変異体、および誘導体に関する。酵素の機能性断片は、酵素の所望の触媒活性を保持する酵素の一部分である。例えば、酵素がα-アミラーゼまたはキシラナーゼである場合、機能性断片は、アミラーゼまたはキシラナーゼ活性をそれぞれ保持する任意の断片である。
【００５０】
酵素の機能性変異体は、その二次構造は不変状態であるが酵素の活性は保持されているような、1つまたは複数の置換基を有する。このような保存的置換基の例は、本来のアミノ酸残基と実質的に同じ疎水性、大きさおよび電荷を有するアミノ酸を含む。このような置換基は一般に、タンパク質またはペプチド化学の当業者によく知られている。例えば保存的置換には、グリシンの代わりにプロリンおよびこの逆、グリシンの代わりにアラニンまたはバリンおよびこの逆、ロイシンの代わりにイソロイシンおよびこの逆、リシンの代わりにヒスチジンおよびこの逆、システインの代わりにスレオニンおよびこの逆、アスパラギンの代わりにグルタミンおよびこの逆、ならびにグルタミン酸の代わりにアルギニンおよびこの逆がある。
【００５１】
機能性誘導体には、天然に存在するアミノ酸または20個の標準アミノ酸の合成アミノ酸相同体によって置換されているが、酵素の活性を保持している1個または数個のアミノ酸残基を有する酵素がある。このような相同体の例は、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリシン、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチン、[β]-アラニン、および4-アミノブタン酸、β-アラニン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ-アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなどである。
【００５２】
用語「酵素」は、酵素の相同体に及ぶ。酵素の相同体は、その酵素と相当な程度の配列類似性を共有するタンパク質配列である。80%を超える配列類似性有する相同体は用語「酵素」の範囲内にある。ただし相同体が酵素の触媒機能を保持しているものとする。
【００５３】
本発明で使用するのに適した酵素には、リパーゼ、フィターゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、デハロゲナーゼ、ラクチナーゼ、ペクチナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、トランスケトラーゼ、ラクターゼ、α-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、α-1,6-グルコシダーゼ、β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、加水分解デヒドロゲナーゼ、サブチリニン、フルクトース-2リン酸アルドラーゼおよびグルコースイソメラーゼがある。表1に、これらの酵素によって触媒される反応、およびこれらが有用であるプロセスの例を挙げる。
【００５４】
【表１−１】
2008514206.tif 000002
【００５５】
【表１−２】
2008514206.tif 000003
【００５６】
【表１−３】
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【００５７】
本発明で使用するのに適した具体的な酵素の例は、α-アミラーゼおよびキシラナーゼである。「α-アミラーゼ」は、α-1,4-オリゴ糖結合を切断してα-デキストリン、マルトース、G3、G4およびG5オリゴ糖を生成させるエンドヒドロラーゼである。本発明の好ましいα-アミラーゼは、Bacillus licheniformis由来の1,4-α-グルカングルカノヒドロラーゼ、(EC3.2.1.1)である。商業的には、B.licheniformis由来のα-アミラーゼが、エタノール、マルトースおよびグルコースシロップ生成の初期段階のデンプンの液状化などの高温プロセスにおいて、ならびに製紙および繊維産業において広く使用される。
【００５８】
「キシラナーゼ」は、ヘミセルロースの主要要素であるキシランの主鎖の内部加水分解を触媒する酵素である。本発明の好ましいキシラナーゼは、Bacillus halodurans C125由来のキシラナーゼA(1,4-β-D-キシランキシラノヒドロラーゼ、EC3.2.1.8)である。キシラナーゼAはキシラナーゼのファミリー10に属し、6〜10の範囲のpHで反応を触媒するその能力のため商業上望ましい。キシラナーゼは、紙の漂白およびパルプ製造のために製紙およびパルプ産業において、ならびに動物飼料の製造およびベーキング産業の製粉処理において重要である。
【００５９】
酵素反応は、反応物から産物を生成させる。「反応物」は酵素反応の出発物質であり、酵素反応中に消費される。酵素反応の「産物」は、最終産物または中間産物であってよい。前述のように、酵素反応は2個以上の産物を生成することが可能である。生成した1個、2個、数個または全ての産物は、回収ステップにおいて回収することができる。産物は回収することが好ましい。
【００６０】
本明細書で言及する「産物」は一般に、市販の望ましい産物である。本発明の第一の態様の目的は、直接あるいは中間体の生成を介して産物を蓄積させることである。したがって、本発明の第一の態様の方法は非分析的に実施され、ファージディスプレーを使用する酵素活性に関するスクリーニングとは完全に異なることは理解されよう。
【００６１】
産物を生成するために1個の酵素および1個または複数個の反応物を必要とする以外に、一酵素反応は酵素が反応を触媒するのを可能にするのに適した条件および時間を必要とする可能性がある。適切な条件は特異的温度、pH、塩濃度など、および1個または複数個のコファクターに関する要件を含み得る。それぞれの反応に関する条件は満足の行くものでなければならず、酵素反応を引き起こすためには、少なくとも酵素と反応物が接触しなければならない。
【００６２】
本発明の酵素は組換えウイルスによって生成される。本明細書で使用する「ウイルス」は、生きている宿主の細胞内でのみ独力で複製し、タンパク質の薄膜中に覆われた核酸からなる感染物質である。本発明で使用するのに適したウイルスの例は表2中に開示する。
【００６３】
用語「組換え体」は、2つの別々に分離した配列のセグメントの人為的な組合せによって作製される、すなわち化学合成、遺伝子工学処理などによって作製される粒子状分子を指す。
【００６４】
したがって「組換えウイルス」は、そのウイルスに固有でない1個または複数個のタンパク質が存在するウイルスである。
【００６５】
1種の酵素を生成する組換えウイルスを生成するための方法は、当技術分野で知られている。例えば適切な核酸分子を、コートタンパク質を生成するためのウイルス遺伝子と隣接した適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中へ酵素をコードする核酸分子の組換えによる挿入などの、当技術分野で知られているさまざまな手順によってウイルスに挿入することができる。
【００６６】
「非原型酵素」は、野生型の天然に存在するウイルスによって発現されない酵素である。例えば非原型酵素は、本来の組合せにおいて見られない2個以上の核酸分子の人為的な組合せによって作製された、核酸分子によって発現され得る。
【００６７】
本明細書で使用する「接触」または「接触させる」は、反応物と1種の酵素を生成する組換えウイルスを互いに接触させることを意味する。反応物と組換えウイルスは、任意の順序で組合せることができる。したがって、酵素を生成する組換えウイルスを反応物に加えることができ、あるいは逆も然りである。
【００６８】
本明細書で使用する「回収する」は、例えば酵素から産物を単離または精製することを意味する。酵素反応の産物は任意の知られている手段によって、目的とする産物の使用に適した任意の純度で回収することができる。酵素反応の産物を回収する方法は当技術分野で知られており、回収する産物に依存すると思われる。適切な方法には親和性クロマトグラフィー、1個または複数個の精製タグの使用、抽出、沈殿および/または濾過がある。回収した産物は他の反応に施すことができる。回収した産物、場合によってはその後の他の処理または反応ステップを、その目的とする使用のために適切に準備する。
【００６９】
用語「コードされた」または「コードする」は一般に、翻訳可能な形で存在する核酸配列の情報を指す。アンチセンス鎖も配列をコードすると考えられる。何故なら特にセンス鎖の発現を助長する配列と結合しているとき、同じ情報含有物が容易にアクセス可能な形で存在するからである。
【００７０】
本明細書で使用する「核酸分子」はDNAまたはRNA、またはアンチセンス核酸分子であってよく、核酸分子の機能性断片を含む。核酸分子の機能性断片は、タンパク質として発現されるときに、そのように発現されるタンパク質が完全なタンパク質の活性を保持している断片である。
【００７１】
核酸分子は、ウイルスのゲノム中に組換えによって挿入することができる。本明細書で使用する「組換えによって挿入する」は、ウイルスゲノムなどの他の核酸分子に核酸分子を人為的に挿入または添加することを意味する。
【００７２】
本明細書で使用する「ゲノム」は、生物の全ての遺伝子を含む生物の完全な遺伝的相補体を意味する。したがってウイルスゲノムは、ウイルスの全ての遺伝子を含む。
【００７３】
「遺伝子」は、特定の機能に関する情報を含む核酸分子である。したがってウイルス遺伝子は、コートタンパク質などの個々のウイルスタンパク質をコードする核酸分子である。ウイルス遺伝子は、1個または複数個のシグナル配列、複製起点、エンハンサー要素、プロモーター、および/または転写終了配列も含み得る。
【００７４】
シグナル配列はウイルス遺伝子の要素であってよく、あるいはそれは、ウイルス中に挿入される酵素をコードする核酸の一部分であってよい。シグナル配列は原核細胞のシグナル配列、哺乳動物のシグナル配列、または昆虫のシグナル配列であってよい。例えばシグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIのリーダーの配列であってよい。
【００７５】
組換えウイルスはさらに、酵素をコードする核酸配列と動作可能に連結したプロモーターを含むことができる。さまざまな考えられる宿主細胞によって認識されるプロモーターは、よく知られている。細菌宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、p-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターがあり、これらは全て当業者に知られていると思われる。
【００７６】
機能性プロモーターがその配列の転写または発現を増大させるとき、配列はプロモーターと「動作可能に連結している」。
【００７７】
組換えウイルスは、選択可能マーカーとも呼ばれウイルスを保有する生物の単離を助長するタンパク質をコードする、クローニングした選択遺伝子も含み得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える、(b)栄養要求性の欠陥を補う、あるいは(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする、例えばBacilliのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【００７８】
酵素をコードする核酸分子またはその断片は、ウイルスコートタンパク質をコードする核酸分子と同じ翻訳産物の一部分として発現し得る。コートタンパク質は、ウイルスの核酸中心を囲むコートの一部分を形成するタンパク質である。表2に、本発明で使用するのに適したコートタンパク質の例を挙げる。本発明はファージT7のコートタンパク質10を使用することが好ましい。
【００７９】
本発明の第一の態様の方法において使用するための組換えウイルスは、ウイルスのタンパク質と同じ翻訳産物の一部分として、1種または複数種の酵素を生成することが好ましい。本明細書で使用する「ウイルスのタンパク質と同じ翻訳産物」は、例えばウイルスのコートタンパク質と同じ、タンパク質の一部分として酵素が生成されることを意味する。「ウイルスのタンパク質と別の翻訳産物」は、例えばウイルスのコートタンパク質と別のタンパク質として酵素が生成されることを意味する。
【００８０】
一実施形態では、酵素をコードする核酸分子を、ウイルスのコートタンパク質、例えばT7のコートタンパク質10をコードする核酸分子中に組換えによって挿入する。
【００８１】
【表２】
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【００８２】
【表３】
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【００８３】
【表４】
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【００８４】
【表５】
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【００８５】
【表６】
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【００８６】
ウイルスがウイルスのタンパク質と同じまたは異なる翻訳産物中に酵素を含むかどうかとは無関係に、組換えウイルスが複数の酵素を含む場合、同じまたは異なる翻訳産物として、これらの酵素を生成することができる。
【００８７】
図1G中に示すように、一種の酵素をコードする核酸分子を一種のウイルスのタンパク質をコードする核酸分子に組換えによって挿入することができ、一方で他の酵素をコードする核酸分子を他のウイルスのタンパク質をコードする核酸分子に組換えによって挿入することができる。
【００８８】
あるいは、両方の酵素をコードする核酸分子を、それらが同じ翻訳産物の一部分として発現されるように、ウイルスのタンパク質をコードする核酸に組換えによって挿入することができる(図1Ai、ii)。ウイルスのタンパク質は同じタンパク質の異なるコピーである可能性があるか、あるいは異なるタンパク質である可能性がある。
【００８９】
複数の非原型酵素をウイルスに導入するための他の技法は、当業者であれば理解されよう(例示用の図1および実施例の項を参照)。
【００９０】
酵素およびウイルスのタンパク質または複数の酵素は、同じ翻訳産物として生成されるとき、リンカー、切断部位、および/または精製タグによって分離することができ、あるいは直接結合させることができる。本明細書で使用する「リンカー」は、それが結合するタンパク質の機能活性を可能にする立体配座をとる配列である。リンカーはペプチドであることが好ましく、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30または50あるいはこれを超えるアミノ酸を有し得る。使用する任意のリンカーの長さは、酵素の性質、確固たる立体配座を有することが好ましいか、短いリンカーまたはリンカーなしであることが好ましいかどうか、酵素が柔軟な立体配座を有することが好ましいかどうかに依存する。
【００９１】
「切断部位」は、プロテアーゼが作用してコートタンパク質から酵素を切断する可能性があるアミノ酸配列である(TEV、Factor Xa)。「精製タグ」は、hexHis、Flag(商標)、またはI.SPY(商標)などの、それを使用して溶液または培養物から酵素および/または組換えウイルスを精製することができる、アミノ酸配列またはビオチンなどの非アミノ酸配列である。
【００９２】
表2に示したようにウイルスは、哺乳動物、昆虫、植物、真菌、または細菌細胞を含めた広範囲の宿主細胞に感染し得る。ウイルスは特定の宿主型を有する。したがって、適切なウイルスも使用するという条件で、任意の適切な宿主細胞を使用することができることは、当業者によって理解されよう。哺乳動物宿主細胞の例にはBSC-1、HeLaS3、CV-1、RK13、Cos-7、Huh-T7、BHKおよびEB9がある。
【００９３】
バクテリオファージとしても知られるファージは、細菌細胞に感染するウイルスである。ファージは毒性または溶原性ファージ、繊維状ファージ、溶解性、非溶解性、エンベロープ、非エンベロープ、DNAまたはRNAであってよい。例えばファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、リポスリクスウイルス科、ミクロウイルス科、ミオウイルス科、プラズマウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、Sulpholobus shibataeウイルス、またはテクチウイルス科に由来してよい。特異的ファージの例にはP2、コリファージfd、アコレプラズマファージ、コリファージMS2、コリファージQbeta、コリファージT4、コリファージT7、コリファージラムダ、バクテリオファージSPBc2、ファージPRD1、およびBacillusファージφ29がある。本発明はT7ファージを使用することが好ましい。T7は、6本の短い尾部線維を有する同寸法の頭部を有し直線状の二本鎖DNAを含む、大腸菌の溶解性ファージである。
【００９４】
(実施例)
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例および図面を参照することによって詳細に記載する。
【００９５】
(実施例1 組換えウイルスの設計および構築)
Bacillus licheniformis(菌株B2659)は、粘着性のあるパン粉(Food Science Australia North Ryde、NSW、オーストラリア)から単離した。T7ファージおよび大腸菌、菌株BLT5403はT7Select(登録商標)10-3クローニングキット(Novagen、2000)と共に供給された。
【００９６】
B.licheniformisは、TY培地(16gL-1のトリプトン(BD)、10gL-1の酵母菌エキス(Difco)、5gL-1のNaCl、およびプレート用の20gL-1の寒天(Oxoid)(Martirani et al、2002)中で増殖させた。振とうフラスコ量のBLT5403を、12gL-1のトリプトン(Oxoid)、24gL-1の酵母菌エキス(Merck)、0.4%(v/v)グリセロール、(およびプレート用の20gL-1の寒天)を含むTerrificブロス(TB)またはTerrific寒天(TA)中で増殖させた。23.1gL-1のKH2PO4および125.4gL-1のK2HPO4からなる10%(v/v)の滅菌リン酸溶液を、培地の滅菌後に加えた。カルベニシリン(Sigma)は、フィルター(0.2μm)を介した滅菌後に50mgL-1の濃度で加えた。プラーク生成用の上部アガロースは、10gL-1のトリプトン(Oxoid)、5gL-1の酵母菌エキス(Merck)、5gL-1のNaCl、および6gL-1のアガロースLE(Promega)からなっていた。
【００９７】
遺伝子増幅
Bacillus licheniformisのα-アミラーゼの遺伝子(受託番号X03236;X01386)は、iCycler(Biorad)中において表3に列挙したプライマー1および2を使用して増幅させた。回転式インキュベーター-シェーカー(INFORS AG CH-4103 Bottmingen)中において200RMPで攪拌しながら30℃において、TY培地中で増殖させたB.licheniformisの一晩培養物20mLから、DNAを抽出した。細胞はペレット状にし、200μLのリゾチームバッファー(50mMのグルコース、10mMのEDTAおよび25mMのTris-HCL(pH8.0)、および5g/Lのリゾチーム(ニワトリ卵白[ムラミダーゼ]、ICN biomedicals))の中に再懸濁させ(Sambrook and Russel、2001.Molecular Cloning : a laboratory manual、3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク)、37℃で20分間インキュベートした。リゾチームで処理した後、500μLのトリゾール試薬(Invitrogen)を加え、製造者の教示書に従いDNAを抽出した。
【００９８】
【表７】
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【００９９】
240ngの鋳型DNA、1μMの各プライマー、1.25Uのポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼ(Promega)、1PFUのDNAポリメラーゼ(Promega)、0.2mMのそれぞれのdATP、dCTP、dTTP、およびdGTP(Promega)、Mg2+を含まない1×バッファー(Promega)および)2mMのMgCl2(Promega)を含む50μLの反応体積中で増幅を実施した。以下のサイクルのパラメータを使用した:95℃で2分間の変性の1サイクル、次に95℃で1分間の変性の30サイクル、47℃で30秒間のアニーリング、および75℃で3分間の伸張、次に72℃で5分間の伸張の1サイクル。増幅産物は1%アガロースゲルを使用して分析した。増幅後、1448bpのバンドはWizard(登録商標)PCRPrepsDNA精製システム(Promega)を使用して精製した。
【０１００】
α-アミラーゼコード核酸のT7Selectベクター中へのクローニング
α-アミラーゼ増幅産物を、トリヌクレオチド粘着端クローニング法(Dietmaier and Fabry、1995.Protocol : Di/Trinucleotide Sticky End Cloning(DI/TRISEC).In : Boehringer Mannheim PCR Applications Manual.Boehringer Mannheim GmbH、Biochemica.p136〜140)を使用してT7SELECTベクター中へクローニングした。精製増幅産物は、Doyle 1996(Protocols and Applications Guide、3rd Edition.USA : Promega Corporation.p187)に従いT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、次に0.5×体積の7.5Mの酢酸アンモニウムおよび3×体積の100%エタノールを使用して沈殿させた。混合後、最高速度で15分間4℃において、ベンチトップ型マイクロ遠心分離機(SIGMA1〜13、B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)中の遠心分離によってDNAを沈殿させた。70%(v/v)エタノールで洗浄した後、10μLのヌクレアーゼを含まない水(Promega)中にDNAを再懸濁させた。次いでリン酸化させた増幅産物を、以下の反応混合物:64ng/35μLの反応混合物、1gL-1のウシ血清アルブミン(Sigma、FractionV)、1×制限酵素バッファーC(Promega)、1mMのdTTP(Promega)、および3U/35μLの反応混合物において、12℃で30分間中T4DNAポリメラーゼ(Roche)で処理し、次に80℃で15分間熱失活させ、前に記載したのと同様に酢酸アンモニウム沈殿させた。精製DNAを1μLの滅菌dH2O中に再懸濁させた。T7Select10-3ベクターアーム(1μg/20μLの反応体積)は、0.1mMのdATP(Promega)、1×制限酵素バッファーA(Promega)、4U/20μLの反応体積のクレノウ酵素(Roche)で、15分間室温において処理し、次に75℃で15分間酵素を失活させた。前に記載したのと同様に酢酸アンモニウム沈殿法を使用してDNAを沈殿させ、2μLの滅菌dH2O中に再懸濁させた。T7Select(登録商標)System Manual(Novagen、2000)中に記載されたのと同様に連結を実施した。連結させたDNAをパッケージ化し、T7Select(登録商標)System Manual(Novagen)に従いプラークアッセイを実施した。
【０１０１】
ファージディスプレーα-アミラーゼから生成したプラークは、Red Starch(Megazyme)を含む上部アガロース中での増殖によって同定した。α-アミラーゼは、Red Starchを低分子量染色断片に脱重合させる。これらの低分子量断片は、BLT5403宿主細胞によって代謝されるかあるいは放散され、図2中に示すようにプラークの周囲にα-アミラーゼを示す透明な領域が生じた。
【０１０２】
陽性クローニングの遺伝的確認
PCR増幅および塩基配列決定を使用して、アミラーゼ陽性プラーク中のα-アミラーゼ遺伝子の存在を確認した。α-アミラーゼ遺伝子の増幅は、遺伝子特異的プライマー(表3中に列挙したプライマー1および2)を使用して1448ヌクレオチドの増幅産物の生成をもたらした。
【０１０３】
DNA配列を分析するために、記載されたのと同様に(Novagen、2000)、50mgL-1のカルベニシリン(Sigma)を含むTB中で増殖させたBLT5403の60mL体積中においてファージ溶解物を生成させた。クローニングしたα-アミラーゼ遺伝子は、10分間沸騰させたファージ溶解物から増幅させた。T7Select(登録商標)(Novagen)正方向および逆方向プライマーを、増幅用に使用した。表3に、これらのプライマーの配列をプライマー番号5および6として挙げる。
【０１０４】
反応条件は、B.licheniformis由来の遺伝子の増幅に関する前の反応条件と同様であった。T7Select(登録商標)(Novagen)正方向および逆方向プライマーを使用する増幅産物は、前に記載したのと同様に酢酸アンモニウム沈殿法を使用して精製した。T7Select(登録商標)(Novagen)正方向および逆方向プライマー、ならびにこの遺伝子の内部領域から設計した他のプライマー(表3中に列挙するプライマー3および4)を、塩基配列決定用に使用した。ファージにおいて示されたα-アミラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、B.licheniformisアミラーゼ遺伝子由来のそれと同一であった(受託番号M13256)。アミラーゼ遺伝子を含むT7Select構築体はT7-アミラーゼと示した。
【０１０５】
キシラナーゼコード核酸のT7Selectベクター中へのクローニング
37℃でTryptone Soy Agar(Oxoid)において増殖させたBacillus halodurans C-125(JCM-9153、微生物系統保存施設(Japanese collection of Microorgenisms))の一晩プレート培養物由来のDNAを、供給者によって与えられた教示書に従いトリゾール試薬(Invitrogen)を使用して抽出した。プライマー7および8(表4)を使用して、iCycler(Biorad)を使用して以下の50μLの反応混合物中でxynA遺伝子を増幅させた:0.1μgのDNA、1μMの各プライマー、1.25Uのポリメラーゼ(TaqDNAポリメラーゼ(Promega)、1PFUのDNAポリメラーゼ(Promega)、0.2mMのそれぞれのdATP、dCTP、dTTP、およびdGTP(Promega)、Mg2+を含まない1×バッファー(Promega)および2mMのMgCl2(Promega)。以下のサイクルのパラメータを使用した:95℃で2分間の変性の1サイクル、次に95℃で1分間の変性の30サイクル、53℃で30秒間のアニーリング、および72℃で3分間の伸張、次に72℃で5分間の伸張の1サイクル。増幅産物は1%アガロースゲルを使用して分析した。
【０１０６】
0.5×体積の7.5Mの酢酸アンモニウムおよび3×体積の100%エタノールを使用する、酢酸アンモニウム沈殿法によって増幅産物を精製した。混合後、ベンチトップ型マイクロ遠心分離機(SIGMA1〜13、B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)の最高速度、15分間4℃での遠心分離によってDNAを沈殿させた。70%(v/v)エタノールで洗浄した後、10μLのヌクレアーゼを含まない水(Promega)中にDNAを再懸濁させた。
【０１０７】
次いで、EcoRI(Promega)およびHindIII(Promega)を使用して、製造者の教示書に従い断片の両端を消化した。前に記載したのと同様の酢酸アンモニウム沈殿法によって消化したDNAを精製した。生成した断片は、T4DNAリガーゼ(Roche)を使用してT7Selectベクターアーム(Novagen)と連結させた。連結は一晩4℃で実施した。T7Selectベクターアームに連結した後、T7SelectSystem(Novagen)から供給される手順および試薬を使用して、クローニングしたDNAをビリオンでパッケージングした。構築体(T7-xyn)の完全性は、DNAの塩基配列によって確認した。
【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
(実施例2 α-アミラーゼの動的分析)
Kmおよびkcatの測定
その未精製形でのファージが発現した酵素の酵素活性と、0.05Mグリシン-NaOH(pH9.0)に再懸濁させたPEG6000沈殿ファージ発現酵素(Novagen、2000)の酵素活性を、TBと0.05Mグリシン-NaOH(pH9.0)の両方に溶かした市販のα-アミラーゼ(Sigma、カタログ番号A3403)の酵素活性と比較した。0%[w/v]〜2.5%[w/v]の濃度範囲のデンプン(ジャガイモデンプン、電気泳動用に加水分解した;Aldrich)を、Kmおよびkcatを測定するために使用した。全てのアッセイは三連で実施した。TBまたは0.05Mグリシン-NaOH(pH9.0)中で15分間、デンプンを沸騰させた。
【０１１０】
等量のデンプンおよび溶解物/酵素調製物を、10分間別のチューブ中で70℃に平衡状態にした。酵素とデンプンの試験サンプルを組合せ、10分間70℃でインキュベートした。対照として使用したデンプンと酵素のサンプルは、別のチューブ中で10分間70℃に放置した。対照のデンプンと酵素は、着色反応の開始時のみで組合せて、マルトース生成を最小にした。ジニトロサリチル酸(DNS)による着色反応は、Bernfeld1955(Amylases、alpha and beta.Methods Enzymol 1 :149〜158.)の方法に従い実施した。デンプン-酵素溶液(1mL)を1mLの着色試薬に加え、10分間沸騰水浴中で沸騰させた。氷上ですぐに冷却した後、10mLのdH2Oを加え、UV-1601分光光度計(Shimadzu Corporation、京都、日本)を使用してOD540値を読み取った。還元糖の濃度は、標準としてマルトースを使用して測定した。KmおよびVmaxの値は、ラインウィーバー-バルクプロットを使用して測定した。kcatの値は以下の等式を使用して計算した:
kcat=Vmax/[E]i
上式でVmaxはラインウィーバー-バルクプロットから計算した最大速度であり、[E]iは初期酵素濃度である。
【０１１１】
ファージ当たり平均10個の酵素分子を推定することによって、ファージの酵素濃度を計算し(T7Select(登録商標)System Manual、Novagen)、プラークアッセイを使用して溶解物中のファージ濃度を測定し、以下の等式を使用して濃度を測定した:
質量=分子数×分子量/アヴォガドロの定数
【０１１２】
ファージが発現したα-アミラーゼの動的性質を、Sigmaによって供給されるα-アミラーゼ(B.licheniformis由来のA3403)の性質と比較し、その結果を表5中に示す。
【０１１３】
【表９】
2008514206.tif 000012
【０１１４】
T7-amyファージによって生成された粗製酵素は、デンプンに対する高い親和性、および0.05%のKmを示した。デンプンに対する粗製酵素の親和性は、TB中の市販のα-アミラーゼ(Sigma)と比較可能であった。T7-amyファージによって生成された粗製酵素とTB中の市販の酵素の両方が、0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0バッファー中の同じ酵素より低いKm値を示した。T7-amyファージによって生成された粗製酵素は、TB中の市販の酵素のわずかに低い315min-1のkcat値と比較して、581min-1の計算値kcatを有していた。T7-amyファージによって生成された粗製酵素と市販の酵素の両方が、TB中より低い0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中のkcat値を有していた。グリシンバッファー中のT7-amyファージによって発現された酵素の高いkcat値は、市販の酵素と比較すると、酵素活性を増大させたファージの沈殿後に存在した残りの培地要素から生じた可能性がある。粗製酵素は11614%-1min-1のkcat/Km値で非常に有効であった。この有効性はTB中の市販の酵素の有効性とほぼ同じであり、市販の酵素と0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中のT7-amyファージによって生成された沈殿酵素の両方よりもはるかに高かった。
【０１１５】
図3中に示すように、T7-amyファージによって生成された酵素と市販の酵素の両方が70℃で最適活性を示し、80℃および90℃で活性は急激に低下した。
【０１１６】  活性化エネルギーの測定  活性化エネルギーを測定するために、デンプン(ジャガイモデンプン、電気泳動用に加水分解した;Aldrich)を、10gL-1の最終濃度で使用した。30℃(303.1K)〜90℃(363.1K)の範囲の温度でアッセイを実施したこと以外、酵素アッセイは前に記載したのと同様であった。活性化エネルギーはJava Arrhenius計算機(（公序良俗違反につき、不掲載）)を使用して計算し、これは以下の等式を使用する  Ea=-R*勾配  上式でRは気体定数[8.314J/molK]であり、勾配は温度(K)および速度の値を使用する1/T[K]とLn速度[mol/L/秒]のプロットから得る。一定の基質濃度では、以下の式から、速度は速度定数kに比例する。  速度=k[基質]  上式において、プロット1/T(K)とLn速度(mol/L/秒)の直線部分中の値のみを、活性化エネルギーの計算において使用した。【０１１７】
表5中に示すように、市販の酵素とT7-amyファージによって生成された酵素の両方の活性化エネルギーは低く、α-アミラーゼの存在下でデンプンの加水分解を引き起こすためには少量のエネルギーが必要とされることが示された。T7-amyファージによって生成された酵素は、粗製溶解物中において、ならびに0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中で沈殿および再懸濁させたとき、TBおよび0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中の市販のアミラーゼ酵素と比較して、わずかに高い活性化エネルギーを有していた。
【０１１８】
これらの結果は、T7によって発現されるα-アミラーゼは、有効性(kcat/Km)、最適温度および活性化エネルギーの点で市販のα-アミラーゼに非常に都合よく匹敵することを示す。これらの結果は、粗製溶解物中でT7によって生成されるα-アミラーゼの活性は、0.05Mグリシン-NaOH(pH 9.0)、精製α-アミラーゼに関する最適活性を与えることが示されているバッファー中の活性を上回ることも実証する。このことは、使用前にコストがかかり時間を浪費するファージから酵素を精製する工程なしで、デンプン液状化プロセスに酵素の生成を組み込むことは、非常に実現可能であることを実証する。
【０１１９】
(実施例3 大規模なファージの生成)
T7-amyファージは、10LのBiostat(登録商標)C (B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)発酵槽中で生成させた。発酵培地は36gL-1のトリプトン(Oxoid)、72gL-1の酵母菌エキス(Merck)、0.4%(v/v)グリセロールからなっており、23.1gL-1のKH2PO4および125.4gL-1のK2HPO4からなる10%(v/v)のリン酸溶液を滅菌後に加えた。滅菌リン酸溶液は、FE411(B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)ペリスタルティックポンプを使用して、培地滅菌後に発酵槽中にポンプで注入した。カルベニシリン(Sigma)(50mgL-1)は、滅菌0.2μmフィルター(Sartorius)を介して発酵槽中に溶液を注入することによって接種の直前に加えた。
【０１２０】
消泡剤(5mL;Sigma)を滅菌前に初期培地に加え、他の消泡剤は不必要であることが分かった。大腸菌菌株BLT5403の種培地は、37℃で50mgL-1のカルベニシリンを含むTB中において200RPMで攪拌しながら一晩増殖させ、0.3と0.4の間の0D600に6Lの発酵培地を接種するために使用した。培養物は37℃およびpH7.4に保った。pHはMettler Toledo 405-DPAS-SC-K8S/120コンビネーションpHプローブを使用して測定し、10%(v/v)の水酸化アンモニウム溶液および10%(v/v)のオルトリン酸溶液を使用して自動調節した。溶存酸素は20%に設定し、Mettler Toledo InPro 6310/100/T/N02センサーを使用して測定した。通気は他の攪拌気および空気流を使用して保った。気体混合物は最初に40%酸素、60%空気で設定し、培養物の酸素要求に従い酸素濃度を増大させた。0.2μmのSartofluorカプセル(Sartorius)を使用してフィルターの空気を発酵槽中にポンプで注入し、0.1μmのSartofluor Miniカートリッジ(Sartorius)は排気フィルターとして使用した。脱イオン水を使用して72%(v/v)に希釈したグリセロール(Sigma、99%+)を、増殖の2.5時間後にFE411(B.Braun BiotechInternational GmbH、Melsungen、ドイツ)ペリスタルティックポンプを使用して発酵槽に供給した。使用した供給の概略は以下の通りであった:
y=1.88e0.11t
上式でyはポンプの最大流速(100%)の割合であり、1.88は(最大流速の割合としての)開始流速であり、0.11は曲線の対数の勾配であるμであり、したがって、供給の流速を決定し、tは時間(h)である。1.6mm(内径)×4.8mm(外径)シリコーンゴム製チューブ(JehbsilR)中の72%(v/v)グリセロールの流速は以下の等式に従う:
y= 0.2773×+0.4726
上式でyは流速(mL/分)であり、xは最大流速の割合である。発酵槽を調節するために使用したソフトウェアは、MFCS/win IFB RS-422(B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)であった。
【０１２１】
50mgL-1のカルベニシリンを含むTB中で指数関数期に急激に増殖する大腸菌菌株BLT5403宿主細胞に、(接種後4時間において)29.5の0D600で、0.007と0.01の間のMOIでT7-amyファージを接種した。培養物の溶解は、培養物の酸素要求の急速な低下によって明らかなように接種後約3時間起こった。溶解後の発酵槽中のファージの濃度は6.2×1010pfu/mLであった、これはおよそ4×1014pfu/発酵槽総容積に等しい。ファージ当たり10個の酵素分子を想定すると(Novagen、2000)、発酵中に0.4mgの酵素が生成された(0.06mgL-1)。
【０１２２】
発酵槽中の酵素濃度の指標としてのファージ力価の使用は、酵素濃度の過小評価をもたらした可能性がある、何故なら、攪拌および酸素化の結果として生じた発酵槽中の増大したせん断力が、細菌培養物の溶解後にファージ感染率を低下させたと思われるからである。粒子へのファージの吸着によりウイルスの不活性化を低下させることが示されている、モンモリロナイトおよびアタパルジャイトのコロイドクレイ粒子などの懸濁物質を加えることによって、ファージの生成を最適化することができる。
【０１２３】
2%デンプン(ジャガイモ、加水分解済)を使用した、溶解物中のα-アミラーゼ活性の小規模アッセイによって、70℃において0.111gの還元糖/溶解物1L/1分が生成されたことが明らかになった。
【０１２４】
(実施例4 発酵槽の溶解物のデキストロース当量(DE)の計算)
コムギデンプン(Sigma)を、30%(w/v)の濃度で80PPM酢酸カルシウムを含む脱イオンH2O中でスラリー状にし、丸底フラスコ中において500mLの体積にした。次いで発酵槽の溶解物を1Lの最終体積まで加え、手持ちのホモジェナイザー(Ultraturrax T25 Basic、IKA Works、[アジア]、Selangor、マレーシア)を使用して連続的に均質化しながら、Electromantle MV(Electrothermal、UK)加熱マントル上で混合物を加熱して、デンプンを切断した。デンプン混合物を煮沸し、さらに5分間煮沸した。次いで93℃において溶液を水浴中でインキュベートした。等分試料(1g)を周期的に除去し、9mLの蒸留水を使用して希釈し、グルコース標準曲線に対する還元糖の濃度に関して試験した(Bernfeld、1955上記)。固形性デンプンは、ベンチトップ型マイクロ遠心分離機(SIGMA1〜13、B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)中での30秒間の遠心分離によってOD540の読み取り前に、DNS着色試薬中での沸騰後に溶液からペレット状にした。DEは、全炭水化物から遊離した、グルコースとして表される還元糖の割合として計算した。
【０１２５】
15%コムギデンプンおよび4OPPMカルシウムイオンおよび発酵槽の溶解物を使用して得た、DE値を図4中に示す。最適条件を使用する液状化に従ったデンプン産業技術によって、8と14の間のDEが予想される。これらの条件は研究室規模では利用可能ではなかったが、しかしながら、これらの工業的に予想された領域中のDE値は、現在産業上使用されている酵素より相当少ない酵素を使用して得た。粗製溶解物を使用してこれらのDE値を得たことを我々は強調する。酵素を精製することは必要ではなく、かつファージまたは細菌は93℃で2時間のインキュベーション後生存していなかった。デンプンから得た糖化シロップは、活性炭およびイオン交換樹脂を介して一般的に濾過および精製するので、酵素生成プロセスから生じるいかなる大きな汚染物質も、最終産物の使用前に除去されると思われる。デンプンをエタノールの生成において使用するとき、液状化デンプンはさらにバッチ中の酵母菌発酵生産に施し、したがって本来のサンプルの純度が問題を呈するとは予想されない。
【０１２６】
(実施例5 それらが同じ翻訳産物として発現されるような、α-アミラーゼコード核酸およびキシラナーゼコード核酸のT7Selectベクター中へのクローニング)
この試験で使用した2種の酵素をコードする核酸分子を、それらが同じ翻訳産物として発現されるように、図1Aiおよびii中に示すようにT7ファージ中にクローニングした。同じファージ中での2種の酵素のクローニングが非常に望ましい、何故なら多くの産業上の酵素反応は、2種以上の酵素の使用を必要とするからである。これらはビールの製造、洗濯物の漂白、ベーキング、洗濯用洗剤の製造、酵素によるコットンの漂白、コーンファイバーからの脂質分画の分離、および紙材料を製造するための脂肪酸酸化系酵素の使用を含む。
【０１２７】
Bacillus licheniformis由来のα-アミラーゼ(1,4-α-グルカングルカノヒドラーゼ、EC3.2.1.1)、およびBacillus halodurans C125(JCM9153)由来のキシラナーゼA(1,4-β-D-キシランキシラノヒドロラーゼ、EC3.2.1.8)を、それらが1つの翻訳産物として生成されるようにT7Selectベクター(Novagen)中にクローニングした。生成した翻訳産物はさらに、T7コートタンパク質10(CP10)を含んでいた。両方の配向のα-アミラーゼおよびキシラナーゼ;CP10-α-アミラーゼ-キシラナーゼ(T7-AX)およびCP10-キシラナーゼ-α-アミラーゼ(T7-XA)を作製した。
【０１２８】
(伸張時間を2分に減らしたこと以外は)前に概略した条件を使用して、T7-AX用にプライマー11および12(表6)、ならびにT7-XA用にプライマー13および14を用いて、Bacillus haloduransのゲノムDNAからキシラナーゼ遺伝子を増幅させた。49℃のアニーリング温度以外ほぼ同じ条件を使用して、(前に実施例1中で記載した)10μlの沸騰させたT7-アミラーゼ溶解物からアミラーゼ遺伝子を増幅させた。プライマー9および10(表6)はT7-AX構築体用に使用し、プライマー15および16はT7-XA構築体用に使用した。PCR産物を分析、精製し、適切な制限酵素(BamH1、EcoR1、HindIII)で消化し、T7Selectベクターアームに連結させ、前に記載した技法を使用してビリオンにパッケージ化した。α-アミラーゼおよび/またはキシラナーゼを生成したプラークは、それぞれレッドスターチ(Megazyme)およびBirchwoodアゾ-キシラン(Megazyme)を含む上部アガロース中での増殖によって同定した(図5)。最終構築体の完全性は、プライマー1〜17(表3、5、6)を使用してDNAの塩基配列決定によって確認した。
【０１２９】
【表１０】
2008514206.tif 000013
【０１３０】
(実施例6 同じ翻訳産物としてα-アミラーゼおよびキシラナーゼを含むキシラナーゼとT7の構築体の動的分析)
その非精製形でファージが発現した酵素の酵素活性を、市販のα-アミラーゼ(Sigma、カタログ番号A3403)の酵素活性と一緒に比較した。α-アミラーゼの活性は、前に記載したのと同様にジニトロサリチル酸(DNS)による着色反応を使用して測定した。
【０１３１】
キシラナーゼの活性は、凍結乾燥オート麦スペルト小麦キシラン(Sigma oat spelts、X-0627)を使用して測定した。キシラン(3g、150mL中)を沸騰水に加え、次に2倍体積の無水エタノールを加え、および12.5%のWhatman's #4フィルターを介した濾過によって、凍結乾燥キシランを生成した。濾過後、100mLのエタノール、次に100mLの95%エタノール、次いで100mLの99.9%エタノール、および次いで100mLのアセトンをフィルターに通した。キシランはデシケーター中で一晩乾燥させた。1%キシランストック溶液を、凍結乾燥キシランをTBに加えることによって作製し、15分間沸騰させ放置冷却した。キシラナーゼの活性のアッセイはα-アミラーゼ(DNS反応)とほぼ同じであった。ただし、キシランが基質であり、4mlの水を反応の最後に加え、OD540の読み取り前に、ベンチトップ型マイクロ遠心分離機(SIGMA1〜13、B.Braun Biotech International GmbH、Melsungen、ドイツ)中において、1mlのサンプルを最高速度で1分間スピン処理した。キシラナーゼのアッセイは、Bacillus haloduransクローニング酵素の最適温度である70℃で実施した。還元糖の濃度は、標準としてキシロースを使用して測定した。全ての構築体のKmおよびkcatの値を表7中に示す。ファージ系酵素動態と遊離キシラナーゼ酵素動態を直接比較するために、同等の市販のキシラナーゼ酵素は利用できなかった。
【０１３２】
【表１１】
2008514206.tif 000014
【０１３３】
基質としてのデンプンとT7-amy、T7-AXおよびT7-XAファージの構築体の見た目のKmは、市販の遊離α-アミラーゼ(Sigma)を使用して同じ条件下で得たそれと類似しており、全てが0.02〜0.08%デンプンであった。T7-xynはデンプンに対する活性を示さなかった。キシランを基質として使用したとき、キシラナーゼ酵素を発現した全ての構築体(T7-xyn、T7-AXおよびT7-XA)はさらに、0.03〜0.09%の類似したKm値を示した。T7-アミラーゼファージおよび市販の酵素によって生成されたα-アミラーゼはさらに、キシランに対する活性を示したが、Kmはわずかに高かった。これらはおそらくこの試験で使用したオート麦スペルト小麦キシランの低い純度によるものである。対応する基質に対する酵素に関して非常に類似したKm値を得たが、デンプンに対する最高KmはT7-AXファージに関して見られ、キシランに対する最高KmはT7-XAファージであった(T7-アミラーゼファージと市販の酵素は差し引いた)。T7-AXおよびT7-XAファージ構築体(すなわち、α-アミラーゼとデンプンまたはキシラナーゼとキシラン)中の当該の酵素は、ファージのコートタンパク質と第二の酵素の間にサンドウィッチ状態であった。これは、基質に対する酵素の親和性は、同じ翻訳産物としての酵素の生成によってわずかに影響を受ける可能性があることを示唆する。代謝回転率、または見た目の触媒定数(kcat)は構築体間で変化した。しかしながら、酵素の制約(すなわち、コートタンパク質または他の酵素との結合および/または2タンパク質間のサンドウィッチ状態)は、代謝回転率(kcat)に影響を与え、おそらく改善することは明らかである。高いkcatは高い代謝回転での速い反応を意味する。したがってこのことは、特異性定数(kcat/Km)に影響を与えると思われる。最終的に高いkcatは、コストの節約をもたらすと思われる。
【０１３４】
(実施例7 異なる翻訳産物としてのα-アミラーゼコード核酸およびキシラナーゼコード核酸の同じT7Selectベクター中へのクローニング)
標準的な分子生物学のクローニング技法を使用して、以下の型の構築体を作製することができた:
【０１３５】
2個の異なる翻訳産物をコードする1個の転写単位
2種の異なる酵素をコードする核酸分子(核酸分子1および2)を、例えば前に記載したのと同様に(T7Selectキットの教示書-Novogenに基づいて)、ファージベクターDNA中に別々に挿入する。停止コドンおよび隣接(下流)遺伝子の翻訳に関するエンハンサー配列を含む3'側面ベクター配列を含む、核酸分子1をPCRによって増幅させる。核酸分子2とインフレームである停止コドンの5'配列およびCP10タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸分子2もPCRによって増幅させる。PCR産物の5'および3'末端中に組み込んだ適切な制限酵素部位を使用して、PCR断片を含む核酸分子1および核酸分子2をファージベクターアームに連結させる。
【０１３６】
図1B中に示したように、連結後ベクター配列は、いずれもベクターアームに由来する適切なプロモーターおよび転写開始配列およびCP10コード配列、次にインフレームで翻訳停止コドンを含む核酸分子1を含むと思われる。これに増大した翻訳と関係がある配列を含む短い介在配列、および次に開始コドンおよび核酸分子2のコード配列とインフレームで接合したCP10遺伝子のコード配列が続く。
【０１３７】
2個の転写(タンデム)単位および2個の翻訳産物
図1C中に示したように、核酸分子1と2の間の短い介在領域を、核酸分子2のプロモーターおよび転写開始部位、およびリボソーム結合部位をコードする長い(100bpまでの)二本鎖オリゴヌクレオチド、または短いPCR産物で置換すること以外、前と同じ手順を使用することができる。この戦略は、LIC Duet Minimal Adapter strategy(Novagen)中に見られるそれと類似している。核酸分子1の停止配列も介在領域中に含めることができる。
【０１３８】
2個の転写(分岐)単位および2個の翻訳産物
2個の別々のプロモーターを使用して、当該の融合核酸分子を発現させる。分岐(近似)性のプロモーターは、1個の転写単位から次の転写単位への読み過しから生じる発現を低下させる。これを図1D中に示す。Philipps et al(2004、BioTechniques 36 : 80〜83)はこの手法を使用して、新規のバキュロウイルス発現系を作製した。
【０１３９】
プラスミドが有した1個または2個の酵素コード核酸分子
ウイルスのコートタンパク質をコードする核酸分子と翻訳によって融合する核酸分子1および/または2は、プラスミドベクター内に位置する核酸配列から発現させることができる。ウイルス内での発現後、発現した産物はウイルスゲノムから発現した他のタンパク質と共に取り込ませて、ウイルス粒子を形成する。これを図1E中に示す。この例には、ヘルパーファージ/ファージミド系(Willats、2002、Plant Molecular Biology 50 : 837中に総説された)、またはT7Select系(Novagen)の幾つかにおいて野生型CP10A遺伝子を発現する相補的プラスミドがある。
【０１４０】
ゲノムによって発現された1個または2個の酵素コード核酸分子
ファージの表現型と遺伝子型の間の関連はこの方法にとって重要ではない、何故なら関連する淘汰プロセスが存在しないからである。ファージ生成の重要な結果は、当該の酵素を発現することである。したがって、融合タンパク質をコードする核酸分子をファージ粒子中に取り込ませる限り、融合タンパク質をコードする構築体はゲノムによって発現させることができる(図1F)。融合構築体の組込みは当技術分野で知られている方法によって実施することができる。
【０１４１】
融合産物に使用した2個の異なるコートタンパク質
幾つかのファージ系(例えばM13)は、その表面に数種の異なるタンパク質を提示する。これは、数種の異なるコートタンパク質で異なる当該の遺伝子を発現する機会を与える(図1G)。例えばFfバクテリオファージ(例えばM13)は、必要とされる融合タンパク質の大きさおよび数に応じて、pVIIIまたはpIIIコートタンパク質のいずれかと融合した当該のタンパク質/ペプチドを提示することができる(Willats、2002上記中に総説された)。
【０１４２】
別のファージ粒子および混合溶解物における各核酸分子の発現
多種の酵素を得るための簡潔な手法は、別の融合構築体としてそれぞれの酵素を生成させることである。異なる融合構築体から生じた溶解物を混合して、適切な割合で多種の酵素活性を有する溶解物の集合を作製することができる(図1H)。Castillo et al、(2001、J Immunol Meth 257 : 117〜122)はこの手法を使用して、2つの別個のファージベクターにおいて標的ペプチドのライブラリーおよび標的結合剤(scFv)のライブラリーを発現させ、候補結合剤を首尾良く単離した。
【０１４３】
コートタンパク質との融合タンパク質、第二の遺伝子産物として発現される核酸分子1は非共有結合を介して会合する
マルチマー産物のサブユニットの会合が比較的強い場合、1つのサブユニットのみが、コートタンパク質との融合によってファージ粒子と結合する必要がある。他のサブユニットの構築が細胞内で起こり、ファージ表面に存在するマルチマー産物が生成する可能性がある(図1I)。(例えば、Hoogenboom et al、1998、Immunotechnology 4:1〜20中に総説されたように)抗体のさまざまなサブユニットを使用するとき、これは一般的な方法である。
【０１４４】
(実施例8 ファージが発現する酵素を使用する混合オフィス廃棄紙のインク抜き)
混合オフィス廃棄紙(MOW)はリサイクル可能な廃紙の多大な供給源であるが、インク抜きするのが最も困難な原材料であると考えられ、従来のアルカリによるインク抜き法に対する代替法を発見することが望ましくなる。幾つかの研究は酵素系のインク抜きは実行可能な代替法であることを示してきており、油系インクを分解するリパーゼおよびエステラーゼ、およびペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ/キシラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、およびインク粒子が会合する線維表面または結合を改変することによってインク粒子を遊離させる他のリグニン分解酵素を含めた一定範囲の酵素が、インク抜きを改善することが示されてきている。キシラナーゼとα-アミラーゼはいずれも、インク抜き法を改善することが示されてきている。α-アミラーゼおよびキシラナーゼをコードする核酸分子を含み、T7ファージコートタンパク質10をコードする核酸分子と結合したT7構築体を、インク抜きアッセイにおいて使用し、これらは酵素によるMOWのインク抜きを実施するために実行可能なオプションであることが分かった。
【０１４５】
パルプの調製
約22%のインク含量を有するMOWを切断し(600g)、Technical Association of Paper and Pulp Industries(TAPPI)プロトコルT525 om-92に従いパルプ処理した。パルプは75%水:25%線維に部分的に乾燥させ、4℃で保存した。
【０１４６】
酵素の調製
ファージ溶解物を、PEG沈殿法(Novagen)を含めたT7Select製造者の教示書に従い調製した。ほぼ等しい単位(例えば20単位)の活性の遊離酵素またはファージ上の酵素を170mlのTBに再懸濁させた。
【０１４７】
酵素反応
(前に記載した)170mlの酵素調製物をホットプレート上で70℃に加熱し、次に10gのオーブンで乾燥させた(OD)線維を加えた(40gのパルプ)。混合物は30分間軽く攪拌しながら室温に保った。温度を100℃に上昇させ、混合物は10分間沸騰させた。沸騰後、混合物中に生命力のあるファージは存在しなかった。
【０１４８】
ハンドシートの浮選および調製
10分間の沸騰後、混合物を室温において水で2Lに希釈し、次いで浮選用デバイス(Pala et al、2004.J Biotech 108 : 79〜89)に移した。3mlの浮選助剤を加えた(1/50希釈、Buckman BDR2331)。浮選は0.5L分-1の空気流で20分間生じた。浮選の最後に、残留泡を除去し、低速遠心分離濾過を使用してパルプを濃縮し、次いでオーブンで乾燥させた。
【０１４９】
3gのOD線維を300mlの水に湿らせ、1分間で分解させた(Black and Decker FP15X、設定II)。ハンドシートを作製し(TAPPIプロトコルT272 om-92)、TAPPIプロトコルT272 om-92を使用して輝度を測定した(ColorTouch装置(モデルISO)光源D65)。
【０１５０】
インク抜き法の結果
図6は、アミラーゼおよびキシラナーゼ酵素によるインク抜きの結果としての、ハンドシートの輝度の増大を示す。これらの酵素をコードする核酸配列の欠如のために、アミラーゼまたはキシラナーゼ活性を含んでいなかったT7ファージ溶解物(T7-NE)は、陰性対照として使用した。一種の酵素をコードする核酸分子を含むファージ(T7-アミラーゼまたはT7-キシラナーゼファージ)は、陰性対照を超える輝度の改善を示した(いずれも3.8%)。同じファージ粒子上の2つの酵素の組合せ(T7-AX)は、4.1%の輝度の増大でより良い改善を示した。この傾向は数個の独立した反応で観察された。溶解物生成のさらなる最適化は、T7-NE由来の溶解物中の市販のアミラーゼに関して見られるレベルまで輝度を改善するはずである(5.6%の改善)。
【０１５１】
(実施例9 哺乳動物宿主細胞を使用した酵素の生成)
強力な合成プロモーターを有するプラスミドを、例えばChakrabarti et al、1997(Biotechniques 23 (6) : 1094〜1097)によって記載されたのと同様の、当技術分野で知られている技法を使用して作製する。ワクシニア配列、プロモーター、および選択マーカー、例えばTKキナーゼまたは抗生物質選択マーカーなどをコードする側面の核酸間に位置する当該の酵素をコードする、核酸分子を作製する。適切なプロモーターおよび選択マーカーは当技術分野で知られており、Chakrabarti et al、上記中で例示されている。
【０１５２】
菌株IHDJなどの組換えワクシニアウイルスを、例えばEarl PL and Moss B 1991(Generation of Vaccinia viruses pp 16.17.1〜16.17.16 in FM Ausbal et al、(ed) Current Protocols in Molecular Biology、vol2. Greene Publishing Associates and Wiley International Sciences、ニューヨーク、NY)によって記載されたのと同様の、当技術分野で知られている方法によって調製する。このウイルスは、ウイルスの細胞外エンベロープのB5Rタンパク質の細胞質および膜貫通ドメインをコードする核酸と翻訳によって融合したウイルスゲノム中に、挿入された作製済みの核酸を含む。
【０１５３】
CV-1細胞などの宿主細胞に組換えウイルスを感染させ、その組換えウイルスを、B5Rタンパク質の一部分をコードする核酸と翻訳によって融合した作製済みの核酸が発現されるように、例えばEarl PL and Moss B 1991、上記によって記載されたのと同様の、当技術分野で知られている方法に従って増殖させる。
【０１５４】
簡潔性および理解の目的で本発明をある程度詳細に記載してきたが、本明細書に記載した実施形態および方法に対するさまざまな改変および変形を、本明細書に開示した本発明の概念の範囲から逸脱せずに作製することができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】組換えウイルスを生成するための異なる方法を示す図である。v ウイルスゲノムDNA/RNA(例えばT7) ; m 転写産物(mRNA) ; p プラスミドDNA ; g 細菌ゲノムDNA(例えば大腸菌) ; φ組換え酵素を有するファージ粒子。→転写プロモーター領域 ; ■リボソーム結合部位(rbs) ; 中空矢印/ボックス、ウイルスタンパク質遺伝子/タンパク質(例えばコートタンパク質10) ; ストライプ状矢印/ボックス、酵素1遺伝子/タンパク質(例えばα-アミラーゼ) ; 点線矢印/ボックス、酵素2遺伝子/タンパク質(例えばキシラナーゼ) ; 破線矢印/ボックス、他のコートタンパク質遺伝子/タンパク質。AiおよびAiiは、いずれかの配向の酵素1(α-アミラーゼ)と酵素2(キシラナーゼ)のタンデム生成を示す図である。B〜Iは、酵素を用いた別の翻訳産物としての組換えウイルスの考えられる生成法を示す。Iは酵素の非共有結合を示す。
【図２】Red Starch(Megazyme)を含む上部アガロース中で増殖させたT7ファージプラークにおいて発現された、α-アミラーゼの発現を示す図である。プラーク周辺の白いゾーン(白矢印)は、α-アミラーゼの活性によるRed Starchの加水分解を示し、透明ゾーンの不在はα-アミラーゼ活性の不在を示す(黒矢印)。
【図３】1%デンプン(電気泳動用に加水分解したジャガイモ、Aldrich)を使用した異なる温度における、粗製溶解物中のファージディスプレー型酵素(A)、TB中のα-アミラーゼ(Sigma、A3404)(B)、0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中のファージディスプレー型α-アミラーゼ(C)、および0.05Mグリシン-NaOH、pH9.0中のα-アミラーゼ(Sigma、A3403)(D)による還元糖の生成を比較するグラフを示す図である。
【図４】粗製α-アミラーゼディスプレーファージ溶解物および15%コムギデンプン(Sigma)を使用し93℃でインキュベートして得た、デキストロース当量のグラフを示す図である。
【図５】1%Red Starch(Megazyme)(A、C、EおよびG)、ならびに1%アゾ-キシラン (Megazyme)(B、DおよびF)におけるプラーク生成を示す図である。A: T7-キシラナーゼ、透明ゾーンなし。B: T7-キシラナーゼ、透明ゾーン。C: T7-α-アミラーゼ、透明ゾーン。D: T7-α-アミラーゼ、透明ゾーンなし。E: T7-キシラナーゼ-α-アミラーゼ、透明ゾーン。F T7-キシラナーゼ-α-アミラーゼ、非常に小さなプラークの周囲に存在する透明ゾーン(矢印)。G: T7-α-アミラーゼ-キシラナーゼ、透明ゾーン。
【図６】ファージ構築体-酵素を含まないT7NET7(100%)、アミラーゼを含むT7AmyT7、キシラナーゼを含むT7XynT7、アミラーゼとキシラナーゼの両方を含むT7AXT7、T7-NE溶解物と混合させた市販のアミラーゼを含む7NE+com Amyを用いた処理後にパルプ状MOWから作製したハンドシートの輝度の相対的%を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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