(57)【要約】【課題】本発明は、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを含む、細胞におけるペルオキシソームの生成および機能に関連する障害を処置するための医薬組成物を提供することを目的とする。さらに本発明は、細胞内におけるペルオキシソームの生成および／または機能に関連する疾患または症候群に診断された被検体を処置する方法であり、該被検体にプロテアーゼ活性を有しそしてペルオキシソーム酵素をプロセッシングするペプチドを投与する工程を含む方法を提供する。【解決手段】本発明は、細胞におけるペルオキシソームの生成に関連する障害を治療または診断するための医薬組成物であって、システインプロテアーゼ活性を有し、ＰＴＳ１またはＰＴＳ２シグナルによって標的化されるペルオキシソーム酵素を直接にプロセッシングするポリペプチドを含む医薬組成物に関する。ポリペプチドは好ましくは、Ｔｙｓｎｄ１によってコードされる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるペルオキシソームの生成および／または機能に関連する疾患または症候群を診断するための医薬組成物であって、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２】
ポリペプチドがＴｙｓｎｄ１によってコードされたペプチド、その哺乳類またはヒトオルソログ、その成熟型およびプロテアーゼドメインを含有するその断片からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ペルオキシソーム酵素が、哺乳類またはヒトの３−オキソアシル補酵素Ａチオラーゼ（Ａｃａａ１）、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、ステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
疾患または症候群が、代謝性疾患の中でも、代謝性症候群、レフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、およびメバロン酸尿症、男性不妊症、心臓血管疾患、ペルオキシソームの機能不全に関連する皮膚、肝臓、肺、腎臓、睾丸、脳または中枢神経系の疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞におけるペルオキシソームの生成および／または機能に関連する疾患または症候群を治療するための医薬組成物であって、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項７】
ポリペプチドがＴｙｓｎｄ１によってコードされたペプチド、その哺乳類またはヒトオルソログ、その成熟型およびプロテアーゼドメインを含有するその断片からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ペルオキシソーム酵素が、哺乳類またはヒトの３−オキソアシル補酵素Ａチオラーゼ（Ａｃａａ１）、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、ステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
疾患または症候群が、代謝性疾患の中でも、代謝性症候群、レフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、およびメバロン酸尿症、男性不妊症、心臓血管疾患、ペルオキシソームの機能不全に関連する皮膚、肝臓、肺、腎臓、睾丸、脳または中枢神経系の疾患からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｔｙｓｎｄ１およびその哺乳類またはヒトオルソログの生物活性のモジュレーター、アクチベーターまたはインヒビターであって、Ｔｙｓｎｄ１アンチセンス核酸、リボザイム、センスポリヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アプタマー、小分子アンタゴニストまたは小分子アゴニストからなる群より選択される、モジュレーター、アクチベーターまたはインヒビター。
【請求項１２】
プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体がヒト化抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１５】
少なくとも１つの容器、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物および／または請求項１１に記載のモジュレーター、アクチベーターまたはインヒビターおよび／または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
【請求項１６】
プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドのサンプル中での存在または量を測定するための方法であって、
ａ）サンプルを提供するステップと、
ｂ）サンプルに請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗体を接触させるステップと、
ｃ）前記ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を測定するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドに結合する薬剤を特定する方法であって、
ａ）前記ポリペプチドに候補薬剤を接触させるステップと、
ｂ）前記候補薬剤が前記ポリペプチドに結合するかどうかを判定するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
薬剤がペルオキシソームタンパク質、そのペプチド断片、小分子アンタゴニストまたは小分子アゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドの生物活性を調節、アンタゴナイズまたは増進する方法であって、ポリペプチドを発現する細胞または組織サンプルに、ポリペプチドの生物活性を調節、アンタゴナイズまたは増進するために十分な量の前記ポリペプチドに結合する化合物を接触させるステップを含む方法。
【請求項２０】
細胞または組織サンプルが哺乳類、ヒトまたは患者からである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類、ヒトまたは患者が、代謝経路調節に関連する疾患に罹患している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
疾患が、代謝性疾患の中でも、代謝性症候群、レフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、およびメバロン酸尿症、男性不妊症、心臓血管疾患、ペルオキシソームの機能不全に関連する皮膚、肝臓、肺、腎臓、睾丸、脳または中枢神経系の疾患からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞におけるペルオキシソームの生成および／または機能に関連する疾患または症候群と診断された被検体を処置する方法であって、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを該被検体に投与するステップを含む方法。
【請求項２４】
ポリペプチドがＴｙｓｎｄ１によってコードされたペプチド、その哺乳類またはヒトオルソログ、その成熟型およびプロテアーゼドメインを含有するその断片からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ペルオキシソーム酵素が、哺乳類またはヒトの３−オキソアシル補酵素Ａチオラーゼ（Ａｃａａ１）、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、ステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
疾患または症候群が、代謝性疾患の中でも、代謝性症候群、レフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、およびメバロン酸尿症、男性不妊症、心臓血管疾患、ペルオキシソームの機能不全に関連する皮膚、肝臓、肺、腎臓、睾丸、脳または中枢神経系の疾患からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドが、保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソームを標的とするポリペプチドをコードする核酸配列に関し、該ポリペプチドはプロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングする。特定の実施形態において、本発明は、ペルオキシソームプロテアーゼＴｙｓｎｄ１が、ペルオキシソームβ酸化およびα酸化に関与するＰＴＳ１およびＰＴＳ２シグナルを含有する酵素Ａｃａａ１、Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２およびＨｓｄ１７ｂ４を、プロセッシング可能であるという証拠を提供する。本発明はさらに、ペルオキシソームプロテアーゼをコードするこれらの哺乳類核酸のいずれか１つが関与する障害の診断、処置、および予防のための治療、診断および調査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペルオキシソームは、これまで研究されて来た全ての真核生物に存在するオルガネラである。ペルオキシソームはＤＮＡおよびタンパク質合成能力を欠いているため、全てのペルオキシソームタンパク質は、細胞質ゾルコンパートメント内で合成され、翻訳後にペルオキシソームに仕分けられる（非特許文献１および２）。２つの異なるペルオキシソームシグナル標的化配列（ＰＴＳ）およびその変異体、Ｃ末端ＰＴＳ１およびＮ末端ＰＴＳ２が明らかにされている。ほぼ全てのペルオキシソーム酵素が、その後［ＳＴＡＧＱＣＮ］−［ＫＲＨ］−［ＬＩＶＭＡＦＹ］に拡張されるＰＴＳ１シグナル［ＳＡ］−Ｋ−Ｌを有し（非特許文献３）、このＰＴＳ１シグナルはサイトゾル溶解性レセプターＰｅｘ５ｐによって認識される。数個のペルオキシソームタンパク質のみがＮ末端に位置するＰＴＳ２モチーフ［ＲＫ］−［ＬＶＩ］−［Ｘ５］−［ＨＱ］−［ＬＡＦ］を介して標的化される（非特許文献４−６）。ＰＴＳ１およびＰＴＳ２シグナルの両方を欠いている少数のペルオキシソームマトリクスタンパク質は、十分に明らかにされていない内部ＰＴＳによってオルガネラに対して標的化されている（非特許文献７）。
【０００３】
ペルオキシソームの機能は極めて多様であり、細胞タイプおよび外部刺激に依存している。ヒトにおいては、ペルオキシソームは、多様な同化および異化経路（例えばコレステロール生合成、脂肪酸酸化、プリン代謝、過酸化水素解毒、胆汁酸合成、プラスマロゲン合成、アミノ酸代謝）（非特許文献８および９）、ヒト免疫不全ウイルスおよびロタウイルスの感染性（非特許文献１０）および代謝状態とは独立したある種の発生プロセス（非特許文献１１）に関与している。酵母においては、ペルオキシソームは、普通でない炭素源、例えばオレイン酸、一級アミン、プリン、Ｄ−アミノ酸、およびメタノールの代謝には不可欠である（非特許文献１２および１３）。植物においては、ペルオキシソームは光呼吸に関与し（非特許文献１４）、トリパノソーマにおいては、ペルオキシソームは解糖に関与し（非特許文献１５および１６）、真菌類においては、それらは二次代謝産物、例えばβ−ラクタムペニシリンの合成に関与している（非特許文献１７）。
【０００４】
質量分析法（ＭＳ）は、配列データベースの急速な発展と相まって、モデル生物におけるペルオキシソームタンパク質組成の特徴づけを世界的に著しく向上させてきた。ＭＳに基づく方法はラット肝臓から、３４個の既知の、そして５個の推定のペルオキシソームタンパク質の同定を可能にした（非特許文献１８（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００４））。複数の遺伝子が、ペルオキシソーム生合成とも呼ばれる、細胞内でのペルオキシソームの生成に関与している。ペルオキシンをコードするいわゆるＰＥＸ遺伝子が、機能性ペルオキシソームを欠いた酵母変異株の機能相補性によってクローニングされている（非特許文献７）。配列データベースのスクリーニングによって１３個のヒトＰＥＸ相同体が同定され、そのうち１１個は、ペルオキシソーム障害を有する患者の細胞系にてペルオキシソーム生合成を回復することが証明された（非特許文献１９）。ペルオキシソーム生合成の欠陥は、複数の遺伝性ヒト障害、例えば代謝性疾患の中でもレフサム病（非特許文献２０）、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、メバロン酸尿症（非特許文献２１）の原因となっている。
【０００５】
ペルオキシソームタンパク質の移入には、著しいタンパク質の修飾が関与していないらしい（非特許文献２２）。折畳みポリペプチドおよびタンパク質ダイマーは、ペルオキシソームマトリクス中に取り込ませることができる（非特許文献２３および２４）。アルコールオキシダーゼモノマーは、酵素的に活性なオクタマーのアセンブリ前に、マトリクス中に取り込まれ（非特許文献２５および２６）、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ１は、ダイマーとしてでもモノマーとしてでも、同じ効率で取り込ませることができる（非特許文献２４）。２つのペルオキシソーム移入モデルが提案されている。１つのモデルでは、ペルオキシソーム移入レセプターがサイトゾルとペルオキシソームとの間で往復することを提案している（非特許文献２７−２９）。もう一方のモデルでは、ペルオキシソームレセプターがタンパク質をペルオキシソームに引き込むことが示唆されている（非特許文献３０−３１）。
【０００６】
しかしながら、そのプロセッシング、活性化、分解および関連する疾患に関するタンパク質の運命については、タンパク質がいったんペルオキシソーム内に入るとほとんど不明である。これまで２つのプロテアーゼ、すなわちインスリン分解酵素（ＩＤＥ）（非特許文献３２）およびＬｏｎプロテアーゼのペルオキシソーム特異的な型（非特許文献１８）が、ペルオキシソーム中で実験によって検出されている。ＩＤＥは、酸化ペルオキシソームリゾチームの分解で役割を果たし得、一方新規なＬＯＮプロテアーゼはペルオキシソーム生合成に関与する可能性がある。
【０００７】
Ｋｕｒｏｃｈｋｉｎら（非特許文献３３−３５）は、ＧｅｎＢａｎｋ  １３９．０のげっ歯類および霊長類ｍＲＮＡ配列の１３０６２９個の推定翻訳物を探索した中から、２９個の新規なペルオキシソームＰＴＳ１標的化タンパク質候補をコンピュータにより同定した。現在Ｔｙｓｎｄ１またはトリプシンドメイン含有１（ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔアクセッションＡＫ００５０６９およびＢＡＢ２３７９３）と呼ばれるそれらの候補の内の一つ１３０００１９Ｎ１０Ｒｉｋ、ならびにラット（ＸＭ＿３４５１０６およびＸＰ＿３４５１０７）およびヒト（ＮＭ＿１７３５５５およびＮＰ＿７７５８２６）でのそのオルソログは、シロイヌナズナに由来するプロテアーゼ関連タンパク質にわずかに似ている。それは、２つのプロテアーゼ関連ドメインであるグルタミルエンドペプチダーゼＩ（ＩＰＲ００８２５６）ならびにトリプシン様セリンおよびシステインプロテアーゼ（ＩＰＲ００９００３）も含有する。プロテアーゼのグルタミルエンドペプチダーゼＩファミリーのメンバーは、セリンタイプのペプチダーゼ活性を保有している。その触媒活動においてセリンを利用するタンパク質分解酵素は遍在的であり、ウイルス、細菌および真核生物に見られる。ペルオキシソームは、それぞれが独自の特異性を備えた、広範囲に渡るプロテアーゼを採用して（recruit）、オルガネラ中のタンパク質の効率的な分解を達成する可能性が高い。
【０００８】
Ｔｙｓｎｄ１は、マウス染色体１０に位置する。そのヒトオルソログは、染色体１０に対するシンテニック位置に位置する。Ｔｙｓｎｄ１は脂肪組織、大動脈、肝臓、腎臓および肺で発現される（表１を参照）。同時発現遺伝子は、ペルオキシソーム標的化遺伝子産物をコードすることが知られているＰｅｃｉ、Ｐｅｘ６、Ｐｅｘ１６を含む。他の同時発現遺伝子（例えばＦｓｐ２７およびＣａｓ１）は、脂質代謝に関連している。公開されている遺伝子発現リソース（ＧＮＦ  Ｕ７４Ａ、ＧＮＦ  Ａｔｌａｓ  ２、マウス遺伝子予測データベース）に由来するデータは、Ｔｙｓｎｄ１がペルオキシソーム調節脂質代謝に関与することを示唆している。
【０００９】
【表１】
2008543274.tif 000002
【００１０】
【非特許文献１】Subramani  S,  Koller  A,  Snyder  WB.  Import  of  peroxisomal  matrix  and  membrane  proteins.  Annu  Rev  Biochem.  2000;69:399-418.
【非特許文献２】Purdue  PE,  Lazarow  PB.  Peroxisome  biogenesis.  Annu  Rev  Cell  Dev  Biol.  2001;17:701-52.
【非特許文献３】Olivier  LM,  Kovacs  W,  Masuda  K,  Keller  GA,  Krisans  SK.  Identification  of  peroxisomal  targeting  signals  in  cholesterol  biosynthetic  enzymes.  AA-CoA  thiolase,  hmg-coa  synthase,  MPPD,  and  FPP  synthase.  J  Lipid  Res.  2000  Dec;41(12):1921-35.
【非特許文献４】Osumi  T,  Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T.  Amino-terminal  presequence  of  the  precursor  of  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  is  a  cleavable  signal  peptide  for  peroxisomal  targeting.  Biochem  Biophys  Res  Commun.  1991  Dec  31;181(3):947-54.
【非特許文献５】Swinkels  BW,  Gould  SJ,  Bodnar  AG,  Rachubinski  RA,  Subramani  S.  A  novel,  cleavable  peroxisomal  targeting  signal  at  the  amino-terminus  of  the  rat  3-ketoacyl-CoA  thiolase.  EMBO  J.  1991  Nov;10(11):3255-62.
【非特許文献６】Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T,  Osumi  T.  Characterization  of  the  signal  peptide  at  the  amino  terminus  of  the  rat  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  precursor.  J  Biol  Chem.  1994  Feb  25;269(8):6001-10.
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【非特許文献１０】Cohen  GB,  Rangan  VS,  Chen  BK,  Smith  S,  Baltimore  D.  The  human  thioesterase  II  protein  binds  to  a  site  on  HIV-1  Nef  critical  for  CD4  down-regulation.  J  Biol  Chem.  2000  Jul  28;275(30):23097-105.
【非特許文献１１】Gavva  NR,  Wen  SC,  Daftari  P,  Moniwa  M,  Yang  WM,Yang-Feng  LP,  Seto  E,  Davie  JR,  Shen  CK.  NAPP2,  a  peroxisomal  membrane  protein,  is  also  a  transcriptional  corepressor.  Genomics.  2002  Mar;79(3):423-31.
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【非特許文献１６】Moyersoen  J,  Choe  J,  Fan  E,  Hol  WG,  Michels  PA.  Biogenesis  of  peroxisomes  and  glycosomes:  trypanosomatid  glycosome  assembly  is  a  promising  new  drug  target.  FEMS  Microbiol  Rev.  2004  Nov;28(5):603-43.
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【非特許文献２１】Sacksteder  KA,  Gould  SJ.  The  genetics  of  peroxisome  biogenesis.  Annu  Rev  Genet.  2000;34:623-652.
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【非特許文献２８】Albertini  M,  Rehling  P,  Erdmann  R,  Girzalsky  W,  Kiel  JA,  Veenhuis  M,  Kunau  WH.  Pex14p,  a  peroxisomal  membrane  protein  binding  both  receptors  of  the  two  PTS-dependent  import  pathways.  Cell.  1997  Apr  4;89(1):83-92.
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【非特許文献３１】Zhang  JW,  Lazarow  PB.  PEB1  (PAS7)  in  Saccharomyces  cerevisiae  encodes  a  hydrophilic,  intra-peroxisomal  protein  that  is  a  member  of  the  WD  repeat  family  and  is  essential  for  the  import  of  thiolase  into  peroxisomes.  J  Cell  Biol.  1995  Apr;129(1):65-80.
【非特許文献３２】Morita  M,  Kurochkin  IV,  Motojima  K,  Goto  S,  TakanoT,  Okamura  S,  Sato  R,  Yokota  S,  Imanaka  T.  Insulin-degrading  enzyme  exists  inside  of  rat  liver  peroxisomes  and  degrades  oxidized  proteins.  Cell  Struct  Funct.  2000  Oct;25(5):309-15.
【非特許文献３３】Kurochkin  IV,  RIKEN  GER  Group,  GSL  Members,  Konagaya  A,  Nagashima  T,  Sch&ouml;nbach  C.  Identification  of  Potential  Peroxisomal  Proteins  in  Mouse.  Genome  Res.  2003  Jun;  13(6b):1560.  [http://www.genome.org/cgi/content/full/13/6b/1560]
【非特許文献３４】Kurochkin  IV,  Sch&ouml;nbach  C.  Konagaya  A.  In  Silico  Prediction  of  Peroxisomal  Proteins  in  Mouse.  Genome  Informatics  2003  Dec;  14:539-40  [http://www.jsbi.org/journal/GIW03/GIW03P068.pdf]
【非特許文献３５】Kurochkin  IV,  Nagashima  T,  Konagaya  A,  Sch&ouml;nbach  C.Sequence-based  Discovery  of  the  Human  and  Rodent  Peroxisomal  Proteome.  Appl  Bioinformatics;  in  press  June  2005.
【非特許文献３６】UCSC  Genome  browser;  mouse  Tysnd1  http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=mm5&position=chr10:61457382-61464634&hgsid=39784308
【非特許文献３７】UCSC  Genome  browser;  human  TYSND1  http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg17&position=chr10:71568974-71575956&hgsid=39784308
【非特許文献３８】Gene  Entrez  mouse  Tysnd1  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=71767
【非特許文献３９】Gene  Entrez  human  TYSND1  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=219743
【非特許文献４０】Swissprot/TrEMBL  mouse  Tysnd1  and  human  TYSND1  http://kr.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-de?TYSND1
【非特許文献４１】InterPro  domain:  Peptidase,  trypsin-like  serine  and  cysteine  proteases  http://www.ebi.ac.uk/interpro/ISpy?mode=single&ac=[SwissProt/TrEMBL  accession  number]
【非特許文献４２】UCSC  Genome  browser;  gene  expression  for  mouse  Tysnd1  and  neighbors  http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear?hgsid=39784308&org=Mouse&db=mm5&near_search=AK005069&submit=Go%21&near.order=expGnfAtlas2&near.count=50
【非特許文献４３】Mouse  Gene  Prediction  Database;  Search  Results  for  1300019N10Rik  (XM_125636.1)  and  top  100  correlated  genes;  http://mgpd.med.utoronto.ca/profile.php?nameofgene=XM_125636.1
【非特許文献４４】UCSC  Genome  browser;  gene  expression  for  human  TYSND1  and  neighbors  http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgNear?hgsid=73232388&org=Human&db=hg18&near_search=TYSND1&submit=Go%21&near_order=expGnfAtlas2&near.count=50
【非特許文献４５】Array  Prospector  gene  expression  for  human  TYSND1  (SwissProt/TrEBML  accession  Q96AR5)  http://string.embl-heidelberg.de:8080/prophecies_cgi/new_prophecies/new_prophecies.pl?genename=Q96AR5&species=9606&colorcode=1&maxgenes=10&submit=SUBMIT
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の概要
【００１２】
Ｔｙｓｎｄ１またはトリプシンドメイン含有１は最初に、仮説上のタンパク質として報告された（Kawai  J,  et  al.,  RIKEN  Genome  Exploration  Research  Group  Phase  II  Team  and  the  FANTOM  Consortium.  Functional  annotation  of  a  full-length  mouse  cDNA  collection.  Nature.  2001  Feb  8;409(6821):685-90；  Okazaki  Y  et  al.,  FANTOM  Consortium;  RIKEN  Genome  Exploration  Research  Group  Phase,  I  &  II  Team.  Analysis  of  the  mouse  transcriptome  based  on  functional  annotation  of  60,770  full-length  cDNAs.  Nature.  2002  Dec  5;420(6915):563-73.）。公開データベースで利用可能なタンパク質レベルに対する機能情報（Ｇｅｎｅ  Ｅｎｔｒｅｚ（Gene  Entrez  human  TYSND1  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=219743）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ（Swissprot/TrEMBL  mouse  Tysnd1  and  human  TYSND1  http://kr.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-de?TYSND1））はコンピュータにより推測され、タンパク質モチーフおよび配列相同性検索に基づいている。本明細書において初めて、Ｔｙｓｎｄ１タンパク質機能のインビトロにおける実証について記載される。その機能としては、１）ペルオキシソームへの局在化、２）ペルオキシソームプロテアーゼ機能、３）ＰＴＳ２含有ペルオキシソーム酵素のタンパク質分解開裂、４）ＰＴＳ１含有ペルオキシソーム酵素のタンパク質分解開裂、５）前駆型Ｔｙｓｎｄ１の成熟Ｔｙｓｎｄ１への翻訳後のプロセッシングが挙げられる。機能２）〜４）は、Ｔｙｓｎｄ１の基質として、ラット３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼＢ、ペルオキシソームの前駆体（ＲＧＤ１５６２３７３＿ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）、ラットアシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、マウスステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−b）デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）を用いて証明された。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを含む、細胞におけるペルオキシソームの生成および機能に関連する障害を処置するための医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、細胞内におけるペルオキシソームの生成および／または機能に関連する疾患または症候群に診断された被検体（例えば、ヒト患者）を処置する方法であり、該被検体にプロテアーゼ活性を有しそしてペルオキシソーム酵素をプロセッシングするペプチドを投与する工程を含む方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ポリペプチドは好ましくは、Ｔｙｓｎｄ１によってコードされる。ペルオキシソーム酵素は、３−オキソアシル補酵素Ｂチオラーゼ（以降、Ａｃａａ１と呼ぶ）、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、パルミトイルステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１つであってよい。疾患は、代謝性疾患の中でも、レフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、メバロン酸尿症、および男性不妊症からなる群より選択されてもよい。
【００１５】
別の態様において、本発明は、プロテアーゼ活性を有し、ペルオキシソーム酵素をプロセッシングするポリペプチドを含む、細胞におけるペルオキシソームの生成および機能に関連する障害を診断する医薬組成物を提供する。
【００１６】
ポリペプチドは好ましくは、Ｔｙｓｎｄ１によってコードされる。ペルオキシソーム酵素は、３−オキソアシル補酵素Ｂチオラーゼ（Ａｃａａ１）、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、パルミトイルステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）からなる群より選択される少なくとも１つであってよい。疾患は、代謝性疾患の中でもレフサム病、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、メバロン酸尿症および男性不妊症からなる群より選択されてもよい。
発明の詳細な説明
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
定義
本発明の実施は、別途指示しない限り、当分野の技術範囲内である、分子生物学の従来技法を利用する。そのような技法は、文献に十分説明されている。
【００１８】
以下の定義が、以下に文書化した説明で使用される具体的な用語について与えられている。
【００１９】
「ペルオキシソーム」という用語は、本明細書で使用されるとき、真核細胞に見出される酵素を保持した、膜結合の小胞を指す。ペルオキシソームは時に、マイクロボディと呼ばれる。ペルオキシソームは、そのような酵素を残りの細胞部分から隔離する役割を果たし、細胞代謝を組織化する。
【００２０】
ポリペプチドを「プロセッシングする」という用語は、本明細書で使用されるとき、成熟タンパク質またはペプチドを形成するための、細胞における合成されたポリペプチドの開裂（特に加水分解開裂）を指す。ポリペプチドは、他の基の付加などによってアミノ酸残基を修飾されるか、その活性な三次元コンホーメーションに折畳まれるか、あるいは分解のために標的化されてもよい。
【００２１】
「Ｔｙｓｎｄ１」という用語は、第１０染色体（マウス）に位置するゲノムＤＮＡ配列およびその遺伝子産物を指す。そのヒトオルソログは第１０染色体に対するシンテニック位置に位置する。Ｔｙｓｎｄ１の特色付けは上の表１に示されている。
本発明はここで、本発明の実施形態が示されている添付図を参照して以下でより十分に説明される。
【００２２】
［実施形態］
＜材料および方法＞
＜発現ベクターの構築に使用するプライマー＞
プライマーＢ１およびＢ２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＫ００５０６９のＴｙｓｎｄ１ヌクレオチド配列に基づいている。Ｂ１およびＢ２は、構築プラスミドベクター、ｐＥＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１に使用した。
＜Ｂ１＞（フォワード）５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１）は、ＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）およびＴｙｓｎｄ１配列位置５９〜７７を含有する。
＜Ｂ２＞（リバース）５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＧＡＣ−３’（配列番号２）は、ＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）およびＴｙｓｎｄ１配列位置１７４５〜１７６５を含有する。
プライマーＡＸ１およびＡＸ２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＢＣ０８５７４３のラットＡｃｏｘ１ヌクレオチド配列に基づいている。
【００２３】
＜ＡＸ１＞（フォワード）
（化１）
5’-ACCATGGGCTACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCAACCCCGACCTGCGCAAGGAGC-3’  （配列番号３）
は、ＡＴＧ開始コドンを包囲する合成Ｋｏｚａｋ配列（太字）を含有する。ＨＡ−ｔａｇペプチドＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａは、下線の配列によってコードされる。プライマーの位置３７〜５８は、ＢＣ０８５７４３のＡｃｏｘ１配列位置９４〜１１５に相当する。
＜ＡＸ２＞（リバース）５’−ＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＴＴＣ−３’（配列番号４）は、Ａｃｏｘ１配列位置２０５２〜２０７６を含有する。停止コドンが含まれていた。
プライマーＳ５およびＳ２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＢＣ０３４６１３のマウスＳｃｐ２ヌクレオチド配列に基づいている。
【００２４】
＜Ｓ５＞（フォワード）
（化２）
5’-ACCATGGGCTACCCTTACGACGTGCCTGACTACGCCCCTTCTGTCGCTTTGAA-3’
ATCTCC  （配列番号５）  
は、ＡＴＧ開始コドンを包囲する合成Ｋｏｚａｋ配列（太字）を含有する。ＨＡ−ｔａｇペプチドＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａは、下線の配列によってコードされる。プライマーの位置３７〜５９は、Ｓｃｐ２配列位置２５〜５７に相当する。
＜Ｓ２＞（リバース）５’−ＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号６）は、Ｓｃｐ２配列位置１６４９〜１６６９に相当する。停止コドンが含まれていた。
プライマーＨｓｄ１７ｂ４−ＦｗｄおよびＨｓｄ１７ｂ４−Ｒｅｖは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＫ００４８６６のマウスＨｓｄ１７ｂ４ヌクレオチド配列に基づいている。
【００２５】
＜Ｈｓｄ１７ｂ４−Ｆｗｄ＞（フォワード）
５’−ＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＣＴＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＴＴＣＧＡＣ−３’（配列番号１７）  
は、ＡＴＧ開始コドンを包囲する合成Ｋｏｚａｋ配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）を含有する。ＨＡ−ｔａｇペプチドＴｙｒＡｓｐＶａｌＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｌａは、下線の配列によってコードされる。プライマーの位置３７〜５７は、Ｈｓｄ１７ｂ４配列位置１５５〜１７５に相当する。
＜Ｈｓｄ１７ｂ４−Ｒｅｖ＞（リバース）
５’−ＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＴ−３’（配列番号１８）は、Ｈｓｄ１７ｂ４−Ｒｅｖ配列位置２３５９〜２３３３に相当する。停止コドンが含まれていた。
Ｆｌａｇタグ付きＴｙｓｎｄ１のプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＫ００５０６９の配列に基づいている。
【００２６】
＜ＦＮ＞（フォワード）
５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号７）は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）、ＦＬＡＧエピトープ（ＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧ、配列番号８）およびＴｙｓｎｄ１配列位置６２〜７７（ＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号９）を含む。
＜ＦＣ１＞（フォワード）５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）は、Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ）およびＴｙｓｎｄ１配列位置６２〜７７（ＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＡＣ、配列番号９）を含む。
＜ＦＣ２＞（リバース）５’−ＴＣＡＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１１）は、Ｔｙｓｎｄ１配列位置１７２４〜１７４４、ＦＬＡＧエピトープ（ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣ、配列番号１２）およびヌクレオチド配列位置１７４５〜１７６５に相当するＴｙｓｎｄ１のＣ末端からの６個のアミノ酸（ＶａｌＰｒｏＡｒｇＳｅｒＬｙｓＬｅｕ、配列番号１３）を含む。
【００２７】
＜細胞およびトランスフェクション＞
ＣＯＳ−７（ＳＶ４０によって形質転換されたサル線維芽細胞）、２９３ＦＴ（ＳＶ４０の大型Ｔ抗原を発現するヒト２９３細胞の急速成長変異株）およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコの修飾イーグル培地中で維持し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの取扱説明書に従って使用して一時トランスフェクションした。
【００２８】
＜緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質の発現ベクターの構築＞
全長マウスＴｙｓｎｄ１をコードするＤＮＡ断片は、プライマーセットＢ１およびＢ２を用いたＰＣＲによって、クローニングしたｃＤＮＡ  １３０００１９Ｎ１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＫ００５０６９）をテンプレートとして使用して、増幅した。ＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にサブクローニングした。ＢａｍＨＩによる消化の後、得られた断片は、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＢａｍＨＩ部位に挿入した（ＥＧＦＰは増強ＧＦＰである；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。得られたベクターは、ｐＥＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１と名づけた。
【００２９】
＜エピトープタグ付きラットペルオキシソーム３−オキソアシル補酵素Ｂチオラーゼ（Ａｃａａ１）、ラットアシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、マウスパルミトイルステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）、およびヒドロキシステロイド(１７−β)デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）の発現＞
以下のベクターを利用した。即ち、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ中のラットタイプＢプレ−３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ−ＨＡ（ＨＡ＝赤血球凝集素）（九州大学のＹ．Ｆｕｊｉｋｉより寄贈）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＨＡ−Ａｃｏｘ１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＨＡ−Ｓｃｐ２である。ラットＡｃｏｘ１のＮ末端へのＨＡタグ付けは、ＨＡエピトープを含有するフォワードプライマーＡＸ１および停止コドンを含有するリバースプライマーＡＸ２を使用して、ＰＣＲをベースとする技法によって行った。同様にＨＡタグをＰＣＲによって、プライマーＳ５およびＳ２ならびにＨｓｄ１７ｂ４−ＦｗｄおよびＨｓｄ１７ｂ４−Ｒｅｖを使用して、それぞれＳｃｐ２およびＨｓｄ１７ｂ４内に導入した。増幅ＤＮＡ産物は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。プラスミド構築物は全て挿入の方向を点検し、トランスフェクションに使用した。
【００３０】
＜エピトープタグ付きＴｙｓｎｄ１の発現＞
培養細胞中でのマウスＴｙｓｎｄ１の発現では、２つのベクターを構築した。ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１は、Ｔｙｓｎｄ１のＮ末端にＦＬＡＧエピトープを含有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−Ｔｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧは、Ｔｙｓｎｄ１のＣ末端にＦＬＡＧエピトープを含有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１を作成するために、ＦＬＡＧエピトープを含有するフォワードプライマーＦＮ１および停止コドンを含有するリバースプライマーＢ２を用いて、全長Ｔｙｓｎｄ１のＰＣＲ増幅を実施した。ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−Ｔｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧを構築するために、ＦＬＡＧエピトープをアミノ酸５６２と５６３との間に導入し、これによってＴｙｓｎｄ１の未変性ＰＴＳ１含有Ｃ末端を保存した。ＰＣＲ増幅は、フォワードプライマーＦＣ１およびリバースプライマーＦＣ２を用いて実施した。後者はＦＬＡＧ配列に加えて、アミノ酸Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（位置５６３〜５６８）をコードするＣ末端Ｔｙｓｎｄ１配列および停止コドンを含有する。構築物は、上述のようにトランスフェクション実験に使用した。
【００３１】
＜ＧＦＰ融合タンパク質の局在化＞
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ガラスカバースリップに播種して、発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１およびペルオキシソーム標的化ＤｓＲｅｄ２レポータータンパク質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をコードしたｐＤｓＲｅｄ２−Ｐｅｒｏｘｉ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐからの赤色蛍光タンパク質の変異体２）によって一時トランスフェクションした。ＥＧＦＰ融合タンパク質およびＤｓＲｅｄ２−Ｐｅｒｏｘｉタンパク質の生細胞顕微鏡観察は、トランスフェクションの４８時間後に、６３×対物レンズを用いたレーザー走査共焦点顕微鏡ＴＣＳ  ＳＰ２（Ｌｅｉｃａ）で実施した。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを励起に使用した。ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ２によって放出された蛍光シグナルは、５３５ｎｍバンドパスフィルタおよび５７０ｎｍロングパスフィルタをそれぞれ使用して検出した。
【００３２】
＜免疫ブロッティング分析＞
細胞は、上述のようにトランスフェクションした。４８時間後、細胞を緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨからのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテルを追加した、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に溶解させて、１２，０００×ｇにて１５分間遠心分離にかけた。上澄み画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ウェスタンブロット分析を、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐポリビニリデンジフルオリド膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）上に電気泳動によって移動させたサンプルを用いて、ＨＡ．１１モノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）または抗ＦＬＡＧ（商標）Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）および二次抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、実施した。抗原−抗体複合体は、ＥＣＬ  ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて可視化した。タンパク質バンドの見かけの分子量は、予備染色したＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の移動度と比較することによって推定した。
【００３３】
＜ペルオキシソームの精製＞
ペルオキシソームは、以前に記載された３つのプロトコル（Van  Veldhoven  PP,  Baumgart  E,  Mannaerts  GP.  Iodixanol  (Optiprep),  an  improved  density  gradient  medium  for  the  iso-osmotic  isolation  of  rat  liver  peroxisomes.  Anal  Biochem.  1996  May  15;237(1):17-23；  McClelland  GB,  Khanna  S,  Gonzalez  GF,  Butz  CE,  Brooks  GA.  Peroxisomal  membrane  monocarboxylate  transporters:  evidence  for  a  redox  shuttle  system?  Biochem  Biophys  Res  Commun.  2003  Apr  25;304(1):130-5；  Antonenkov  VD,  Sormunen  RT,  Hiltunen  JK.  The  behavior  of  peroxisomes  in  vitro:  mammalian  peroxisomes  are  osmotically  sensitive  particles.  Am  J  Physiol  Cell  Physiol.  2004  Dec;287(6):C1623-35）の組合せおよび改良に基づいた方法によって精製した。手短には、雄のウィスターラット（２５０〜３００ｇ）を一晩絶食させた。ジエチルエーテル吸入により動物を殺処分した後、肝臓を門脈を介して灌流した。肝臓を氷冷ホモジナイゼーション緩衝液（０．１６Ｍスクロース、１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ１５００、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール）中でハサミを用いて細かく刻み、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザー（ガラス上のＴｅｆｌｏｎ）でホモジナイゼーションした。核および重ミトコンドリアは、固定角ローター内で３，０００×ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離によってペレット化した。ペレットを再ホモジナイゼーションして、遠心分離を繰り返した。上澄み（ポスト核画分）を合わせて、２０，０００×ｇにて２０分間遠心分離して、「軽ミトコンドリアペレット」を生成した。このペレットは、ゆるくはめたＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して、ホモジナイゼーション緩衝液に再懸濁させた。体積は１５ｍｌ／開始時の肝臓重量１０ｇに調節して、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）イオジキサノール、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ  ＡＳ）５体積および希釈媒体（０．１６Ｍのスクロース、１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＰＥＧ  １５００、６０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、６ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴ、０．６％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノール）１体積より成る勾配溶液の等体積と混合した。この混合物を近垂直ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ＮＶＴ  ６５）で１８０，０００×ｇ、４℃にて３．５時間、低加速および減速モードを使用して遠心分離した。遠心分離の後、画分０．５ｍｌを上部から針および注射器によって取り出した。単離媒体を除去するために、画分材料を１７，０００×ｇにて２０分間沈殿させて、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１０および１ｍＭのＤＴＴを含有するＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させた。
【００３４】
＜マーカー酵素およびタンパク質含有量＞
ペルオキシソーム、ミトコンドリアおよびリソソームのＯｐｔｉｐｒｅｐ勾配画分中での局在を判定するために、カタラーゼ（Johansson  LH,  Borg  LA.  A  spectrophotometric  method  for  determination  of  catalase  activity  in  small  tissue  samples.  Anal  Biochem.  1988  Oct;174(1):331-6.）、スクシナートデヒドロゲナーゼ（Pennington  RJ.  Biochemistry  of  dystrophic  muscle.  Mitochondrial  succinate-tetrazolium  reductase  and  adenosine  triphosphatase.  Biochem  J.  1961  Sep;80:649-54.）およびβ−ガラクトシダーゼ（ｂ−Ｇａｌアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の活性がそれぞれ測定された。タンパク質含有量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイ試薬キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して測定した。
【００３５】
＜マウスＴｙｓｎｄ１に対するポリクローナル抗体＞
ウサギポリクローナル抗体を、Ｔｙｓｎｄ１のアミノ酸５０１〜５１５に相当するポリペプチドＳＮＴＲＤＮＮＴＧＡＴＹＰＨＬ（配列番号１４）と結合したキーホールリンペットヘモシアニンに対して産生し、ＳＣＲＵＭ  Ｉｎｃ．(東京)によりアフィニティ精製した。ウェスタンブロット分析には、抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。抗体予備吸収アッセイでは合成ペプチドＣＳＮＴＲＤＮＮＴＧＡＴＹＰＨＬ（配列番号１５）をＭｅ２ＳＯに２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、次に、ウェスタンブロッティング（４０μｇペプチド／５μｇ抗体；約７００倍の過剰モル数のペプチド）の前に、一次抗体溶液と混合した。
【００３６】
＜マウス(ラット)Ａｃａａ１に対するポリクローナル抗体＞
ウサギポリクローナル抗体を、マウスＡｃａａ１のアミノ酸２５９〜２７４に相当するポリペプチドＫＬＫＰＡＦＫＤＧＧＳＴＴＡＧＮ（配列番号１９）と結合したキーホールリンペットヘモシアニンに対して産生し、ＳＣＲＵＭ  Ｉｎｃ．(東京)によりアフィニティ精製した。ウェスタンブロット分析には、抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【００３７】
＜低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）＞
ヒトＴｙｓｎｄ１の発現を下方制御するためのＲＮＡ媒介干渉は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｋ．Ｋ．から購入した低分子干渉ｓｉＲＮＡ二本鎖、Ｈｓ＿Ｔｙｓｎｄ１＿１＿ＨＰ  ｓｉ  ＲＮＡ  （ｓｉＲＮＡ  Ｔｙｓｎｄ１＿１）  および  Ｈｓ＿Ｔｙｓｎｄ１＿２＿ＨＰ  ｓｉ  ＲＮＡ  （ｓｉＲＮＡ  Ｔｙｓｎｄ１＿２）を使用して、行われた。ｓｉＲＮＡ  Ｔｙｓｎｄ１＿１は、配列ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＧＡＡ（配列番号２０）を標的とし、ｓｉＲＮＡ  Ｔｙｓｎｄ１＿２は、配列ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＡ（配列番号２１）を標的とした。対照ｓｉＲＮＡ  （Ｑｉａｇｅｎ  Ｋ．Ｋ．）は、いかなる既知の哺乳類遺伝子配列に対しても相同性を持たない配列ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＣＧＴ（配列番号２２）を標的とした。２９３ＦＴ細胞を、１２ウェルプレートで培養した。ｓｉＲＮＡ（１．２mｇ）を、０．８mｇのｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＨＡ−Ａｃａａ１、ｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＨＡ−Ｓｃｐ２またはｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＨＡ−Ｈｓｄ１７ｂ４のいずれかとともに同時トランスフェクションした。トランスフェクションを、８０％−９０％コンフルエントな状態の細胞に、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）を使用して行った。各ｓｉＲＮＡサンプルについて、二重のトランスフェクションを行った。トランスフェクション開始後５４時間に、細胞を１５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で溶解した。溶解物を超音波で分解し、９５℃で５分間インキュベートし、そしてＨＡ．１１モノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を使用してウェスタンブロッティングによって分析した。
【００３８】
＜ＣＯＳ−７細胞からの組み換えＴｙｓｎｄ１の精製＞
ＣＯＳ−７細胞を、リポフェクトアミン２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）を使用して、ｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−Ｔｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧでトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間に、細胞をＰＢＳで洗い、そして振動下４℃で３０分間緩衝液Ａを用いて溶解した。細胞溶解物を１５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、細胞残渣の溶解物を取り除いた。この溶解物を、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）により、１００μｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティービーズを使用して、４℃下で９０分間インキュベートした。このビーズを、緩衝液Ａで４回洗い、次に緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ）で４回洗った。このビーズをカラム中に移し、結合していたタンパク質を５００μｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチドの緩衝液Ｂ溶液３００μｌで溶出した。
【００３９】
＜組み換えタンパク質のクローニング、発現、および精製＞
ラットＡｃｏｘ１、ラットＡｃａａ１、およびマウスＳｃｐ２のコード配列を、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ  ＣＯ．ＬＴＤ）を使用して、ＰＣＲで増幅した。結果として得られたＡｃｏｘ１およびＳｃｐ２のＰＣＲ産物を、ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）にクローニングし、Ｃ末端にｍｙｃ−６ｘＨｉｓ  タグを有する組み換えタンパク質のための発現ベクターを作った。Ａｃａａ１のＰＣＲ産物を、ｐＱＥ−８０Ｌ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ  Ｋ．Ｋ．）中にクローニングし、Ｎ末端に６ｘＨｉｓのタグを有するＡｃａａ１の発現構築物を作った。Ａｃｏｘ１およびＳｃｐ２の発現ベクターで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）を形質転換した。タンパク質発現の誘導は、製造業者の使用説明書に従い、行った。組換え体Ａｃｏｘ１およびＳｃｐ２を、ＢＤ  ＴＡＬＯＮ  樹脂（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、大腸菌の抽出物の可溶性画分から精製した。Ａｃａａ１の発現ベクターで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｓｔａｒ  （ＤＥ３）細胞を形質転換した。組換え体Ａｃａａ１は、不溶性画分に見られたが、その画分から６Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いて可溶化された。精製は、ＢＤ  ＴＡＬＯＮ樹脂を用いて、変性条件下で行われた。精製組換え体Ａｃａａ１のリフォールディングを、０．５ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液Ｂでの透析によって行った。組換え体タンパク質は、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）および２８０ｎｍでの分光光度法を用いて定量した。
【００４０】
＜インビトロＴｙｓｎｄ１プロセッシング活性のアッセイ＞
８μｌの精製組換え体Ｔｙｓｎｄ１を、６μｌの組換え体Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、またはＡｃａａ１の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＤＴＴ溶液と、３７℃でインキュベートした。反応を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液の添加および９５℃下での５分間の加熱によって停止した。反応生成物を４％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン上にブロットした。組換え体Ａｃｏｘ１およびＳｃｐ２の開裂生成物を、抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、Ｉｎｃ）を用い、検出した。Ａｃａａ１のプロセッシング生成物を、抗Ａｃａａ１抗体によるか、または、０．０５％  Ａｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋを用いたＨｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレンの染色によるかして可視化した。
【００４１】
＜プロセッシングを受けたＡｃａａ１のＮ末端配列決定＞
組換え体Ａｃａａ１を、精製Ｔｙｓｎｄ１と、上記したようにしてインキュベートした。プロセッシングされたＡｃａａ１を、前駆体型から４％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレン上にブロットし、そして０．０５％Ａｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋを用い染色した。プロセッシングされた４１ｋＤａのバンドを、メンブレンから切り取り、そして６サイクルのＥｄｍａｎ分解分析にかけた。配列決定分析は、Ａ．Ｕｒｏｓｈｉｂａｔａ（理化学研究所、ゲノム科学総合研究センター、タンパク質基盤研究グループ）によってなされた。
【００４２】
＜プロテアーゼ阻害活性＞
阻害活性のアッセイのために、精製組換え体Ｔｙｓｎｄ１を、様々なプロテアーゼ阻害剤と３０分間２５℃で、プレインキュベートした。基質タンパク質の添加の後、インキュベーションを３７℃で１２時間続行した。以下のプロテアーゼ阻害剤を使用した（最終濃度）：ペプスタチンＡ（１μＭ）、ＥＧＴＡ（２ｍＭ）、ＥＤＴＡ（２ｍＭ）、１，１０−フェナントロリン（１ｍＭ）、１，７−フェナントロリン（１ｍＭ）、ベンズアミジン（１ｍＭ）、ＡＥＢＳＦ（１ｍＭ）、アプロチニン（４μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１０μＭ）、Ｅ６４（２０μＭ）、ＮＥＭ（１ｍＭ）。プロセッシング生成物を、上記のようにしてアッセイした。
【００４３】
＜ベザフィブレート処置および細胞下分画＞
６頭の７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオスマウスを、実験に使用した。対照のグループ（ｎ＝３）を、標準飼料で飼育し、一方実験グループ（ｎ＝３）を、０．５％（ｖ／ｗ）ベザフィブレートを含有する標準飼料で飼育した。細胞下分画では、同じグループに属する３頭の動物の肝臓を混合し、そして上記したようにしてホモジナイゼーションした。ポスト核（ＰＮ）画分および軽ミトコンドリア（ＬＭ）画分の調製を、「ペルオキシソームの精製」の項で記載したようにして行った。ポストミトコンドリア画分（ＰＭ）は、ＰＮ画分の２０，０００×ｇで２０分間の遠心分離の後の上清を示す。
＜結果＞
（実施例１）
【００４４】
＜Ｔｙｓｎｄ１はペルオキシソームに対して標的化される＞
Ｔｙｓｎｄ１はＰＴＳ１シグナルを含有するので、このタンパク質がペルオキシソームに対して標的化されているかどうかが調べられた。ＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１融合構築物を、ＤｓＲｅｄ２−Ｐｅｒｏｘｉをコードするプラスミドと同時トランスフェクションさせた。Ｔｙｓｎｄ１の全長ｃＤＮＡ配列をＧＦＰのＣ末端に付加して、融合タンパク質対照のＣ末端にてＰＴＳ１配列を保存した。対照はＰＴＳ１シグナルと融合した蛍光タンパク質であり、ペルオキシソームに局在する。ＧＦＰ蛍光は、多数のスポット様構造物中で観察された（図１Ａ）が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の他の部分では観察されなかった。同じ切片内のＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１融合タンパク質陽性顆粒は全て、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｐｅｒｏｘｉタンパク質（赤色）について陽性であった（図１Ｂおよび図１Ｃ）。この同時局在は、ＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１がペルオキシソームに対して標的化されていたという強力な証拠となる。
（実施例２）
【００４５】
＜ＰＴＳ２含有ペルオキシソーム酵素の細胞ベースでの分解＞
ペルオキシソームタンパク質の一部は、そのＮ末端領域に、各前駆体がその最終目的地に到達すると切断されるＰＴＳ２ペルオキシソーム標的化配列を含有する（Osumi  T,  Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T.  Amino-terminal  presequence  of  the  precursor  of  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  is  a  cleavable  signal  peptide  for  peroxisomal  targeting.  Biochem  Biophys  Res  Commun.  1991  Dec  31;181(3):947-54；.Swinkels  BW,  Gould  SJ,  Bodnar  AG,  Rachubinski  RA,  Subramani  S.  A  novel,  cleavable  peroxisomal  targeting  signal  at  the  amino-terminus  of  the  rat  3-ketoacyl-CoA  thiolase.  EMBO  J.  1991  Nov;10(11):3255-62；.Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T,  Osumi  T.  Characterization  of  the  signal  peptide  at  the  amino  terminus  of  the  rat  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  precursor.  J  Biol  Chem.  1994  Feb  25;269(8):6001-10.）。ＰＴＳ２シグナル配列を切断させるタンパク質分解酵素は、まだ同定されていない。潜在的候補は、既知のペルオキシソームプロテアーゼインスリン分解酵素（Ｉｄｅ）およびペルオキシソーム型Ｌｏｎプロテアーゼおよび本研究で記載した新規なペルオキシソームプロテアーゼＴｙｓｎｄ１である。３つのプロテアーゼうちで、Ｔｙｓｎｄ１が最も有望な候補である。Ｉｄｅは大型のタンパク質には作用せず、アミノ酸５０個未満の長さのペプチドを代わりに開裂させる一方で（Duckworth,  W.  C.,  Bennett,  R.  G.  &  Hamel,  F.  G.  (1998)  Insulin  degradation:  progress  and  potential.  Endocr  Rev.  1998  Oct;19(5):608-24.；Kurochkin,  I.  V.  (2001)  Insulin-degrading  enzyme:  embarking  on  amyloid  destruction.  Trends  Biochem  Sci.  2001  Jul;26(7):421-5）、ＡＴＰ依存性Ｌｏｎプロテアーゼは、変性タンパク質を分解するシャペロンとして機能し得る（Kikuchi  M,  Hatano  N,  Yokota  S,  Shimozawa  N,  Imanaka  T,  Taniguchi  H.  Proteomic  analysis  of  rat  liver  peroxisome:  presence  of  peroxisome-specific  isozyme  of  Lon  protease.  J  Biol  Chem.  2004  Jan  2;279(1):421-8）。
【００４６】
ＰＴＳ２含有シグナル配列の除去でのＴｙｓｎｄ１の役割を究明するために、ペルオキシソーム３−オキソアシル補酵素Ａチオラーゼ（Ａｃａａ１）のプロセッシングが分析された。Ａｃａａ１は、残基３６個のＮ末端除去可能配列を持つ大型前駆体として合成される（Osumi  T,  Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T.  Amino-terminal  presequence  of  the  precursor  of  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  is  a  cleavable  signal  peptide  for  peroxisomal  targeting.  Biochem  Biophys  Res  Commun.  1991  Dec  31;181(3):947-54；.Swinkels  BW,  Gould  SJ,  Bodnar  AG,  Rachubinski  RA,  Subramani  S.  A  novel,  cleavable  peroxisomal  targeting  signal  at  the  amino-terminus  of  the  rat  3-ketoacyl-CoA  thiolase.  EMBO  J.  1991  Nov;10(11):3255-62.；Tsukamoto  T,  Hata  S,  Yokota  S,  Miura  S,  Fujiki  Y,  Hijikata  M,  Miyazawa  S,  Hashimoto  T,  Osumi  T.  Characterization  of  the  signal  peptide  at  the  amino  terminus  of  the  rat  peroxisomal  3-ketoacyl-CoA  thiolase  precursor.  J  Biol  Chem.  1994  Feb  25;269(8):6001-10.）。Ｃ末端にＨＡタグが付いたＡｃａａ１のみがＣＨＯ細胞において過剰発現された場合、主に４４ｋＤａのプロセッシングされていない前駆体型が検出された。ＨＡ−Ａｃａａ１は少量のみが成熟４１ｋＤａ型に変換された（図２、レーン１）。増加する量のｐｃＤＮＡ３．１／ＴＯＰＯ−ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１との同時トランスフェクションは、４４ｋＤａ前駆体の段階的な消失および成熟４１ｋＤａタンパク質の並行した増加を引き起こした（図２、レーン２〜４）。同様の結果がＣＯＳ−７細胞でも得られた（データは示さず）。結果は、Ｔｙｓｎｄ１がＰＴＳ２を含有ずる先行ペプチドを除去する真のペルオキシソームプロセッシングプロテアーゼであるか、あるいは第二の、まだ同定されていないペルオキシソームプロセッシングプロテアーゼの活性化を通じてＡｃａａ１の成熟を促進することを意味している。
【００４７】
したがってＴｙｓｎｄ１は、他のＰＴＳ２シグナル含有タンパク質全てのプロセッシングに関与し得る。ＰＴＳ２タンパク質のペルオキシソーム内プロセッシングの生理学的重要性は、まだ理解されていない。ミトコンドリアの場合、前駆体タンパク質の大多数がミトコンドリア標的化のための切断可能アミノ末端延長配列を含有する。ミトコンドリアプロセッシングプロテアーゼによるシグナル配列の除去は、タンパク質折畳みおよびオルガネラ内でのさらなる仕分けのために必要であると考えられる（Gakh  O,  Cavadini  P,  Isaya  G.  Mitochondrial  processing  peptidases.  Biochim  Biophys  Acta.  2002  Sep  2;1592(1):63-77.）。ミトコンドリアタンパク質とは異なり、ペルオキシソームタンパク質は、事前のアンフォールディングなしに首尾よく移動される（Subramani  S,  Koller  A,  Snyder  WB.  Import  of  peroxisomal  matrix  and  membrane  proteins.  Annu  Rev  Biochem.  2000;69:399-418）。その上、ペルオキシソームマトリクスは単一コンパートメントより成るようであるが、ミトコンドリアスペースは、数個の明確なサブコンパートメントに分割される。近年、Ｎａｉｒらは、ＰＴＳ２レセプターＰｅｘ７ｐがＰＴＳ１レセプターＰｅｘ５と同様に（Dammai  V,  Subramani  S.  The  human  peroxisomal  targeting  signal  receptor,  Pex5p,  is  translocated  into  the  peroxisomal  matrix  and  recycled  to  the  cytosol.  Cell.  2001  Apr  20;105(2):187-96）、輸送の「拡張シャトル」（“ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｈｕｔｔｌｅ”）モードに従うことを証明した（Nair  DM,  Purdue  PE,  Lazarow  PB.  Pex7p  translocates  in  and  out  of  peroxisomes  in  Saccharomyces  cerevisiae.  J  Cell  Biol.  2004  Nov  22;167(4):599-604.）。Ｐｅｘ７ｐは、ＰＴＳ２タンパク質移入の進行の間にペルオキシソームに入り、サイトゾル中へ再出現して、さらに数回のタンパク質移入を実行する。ＰＴＳ２タンパク質がシグナル配列を維持した場合、これらのタンパク質はＰｅｘ７ｐと共にペルオキシソームに入り、ペルオキシソームから出て、したがってオルガネラへのその蓄積が防止しされ得る。
（実施例３）
【００４８】
＜ＰＴＳ１含有ペルオキシソーム酵素のプロセッシング＞
ＰＴＳ２タンパク質に加えて、数個のＰＴＳ１ペルオキシソーム酵素もペルオキシソームに移動されたときにプロセッシングを受ける。これらはペルオキシソーム脂肪酸β酸化に関与する鍵酵素である、アシル補酵素Ａオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）およびステロールキャリアタンパク質２（Ｓｃｐ２）を含む。それゆえ、Ｔｙｓｎｄ１がラットＡｃｏｘ１、マウスＳｃｐ２、およびマウスＨｓｄ１７ｂ４タンパク質を切断できるかどうかが調査された。Ａｃｏｘ１は、ポリペプチド成分Ａ（７５ｋＤａ）、Ｂ（５３ｋＤａ）およびＣ（２２ｋＤａ）より成る。それはＡ２、ＡＢＣ、およびＢ２Ｃ２を含むヘテロオリゴマーとしても存在する（Tsukamoto  T,  Yokota  S,  Fujiki  Y.  Isolation  and  characterization  of  Chinese  hamster  ovary  cell  mutants  defective  in  assembly  of  peroxisomes.  J  Cell  Biol.  1990  Mar;110(3):651-60；Miyazawa  S,  Hayashi  H,  Hijikata  M,  Ishii  N,  Furuta  S,  Kagamiyama  H,  Osumi  T,  Hashimoto  T.  Complete  nucleotide  sequence  of  cDNA  and  predicted  amino  acid  sequence  of  rat  acyl-CoA  oxidase.  J  Biol  Chem.  1987  Jun  15;262(17):8131-7）。ＢおよびＣ断片は、ペルオキシソームへの移動時にＡポリペプチドのタンパク質分解変換によって生成される（Miyazawa  S,  Osumi  T,  Hashimoto  T,  Ohno  K,  Miura  S,  Fujiki  Y.  Peroxisome  targeting  signal  of  rat  liver  acyl-coenzyme  A  oxidase  resides  at  the  carboxy  terminus.  Mol  Cell  Biol.  1989  Jan;9(1):83-91；Wirtz  KW.  Phospholipid  transfer  proteins  revisited.  Biochem  J.  1997  Jun  1;324  (Pt  2):353-60）。分子量５９ｋＤａを有するタンパク質、Ｓｃｐ２は、ペルオキシソームにおいて４６ｋＤａおよび１３ｋＤａ断片に変換される（Seedorf  U,  Ellinghaus  P,  Roch  Nofer  J.  Sterol  carrier  protein-2.  Biochim  Biophys  Acta.  2000  Jun  26;1486(1):45-54；Otera  H,  Nishimura  M,  Setoguchi  K,  Mori  T,  Fujiki  Y.  Biogenesis  of  nonspecific  lipid  transfer  protein  and  sterol  carrier  protein  x:  studies  using  peroxisome  assembly-defective  pex  cell  mutants.  J  Biol  Chem.  2001  Jan  26;276(4):2858-64）。ペルオキシソームでは、Ｓｃｐ２はアシルＣｏＡエステルのβ酸化に関与する。その上、Ｓｃｐ２は、α酸化依存性基質の可溶化共タンパク質（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）として作用する（Mukherji  M,  Kershaw  NJ,  Schofield  CJ,  Wierzbicki  AS,  Lloyd  MD.  Utilization  of  sterol  carrier  protein-2  by  phytanoyl-CoA  2-hydroxylase  in  the  peroxisomal  alpha  oxidation  of  phytanic  acid.  Chem  Biol.  2002  May;9(5):597-605.）。
【００４９】
Ｈｓｄ１７ｂ４は、二機能タンパク質であり、２−メチル分岐鎖脂肪酸、Ｃ２７胆汁酸中間体、超長鎖脂肪酸のペルオキシソームでのβ酸化、およびポリ不飽和脂肪酸の合成に関与する。最近、Ｈｓｄ１７ｂ４活性が、ロイコトリエンの不活性化（Ferdinandusse  S,  Denis  S,  Van  Roermund  CW,  Wanders  RJ,  Dacremont  G.  Identification  of  the  peroxisomal  beta-oxidation  enzymes  involved  in  the  degradation  of  long-chain  dicarboxylic  acids.  J  Lipid  Res.  2004  Jun;45(6):1104-11）および精巣のセルトリ細胞における脂質ホメオスタシスを維持することによって雄性生殖機能（Huyghe  S,  Schmalbruch  H,  De  Gendt  K,  Verhoeven  G,  Guillou  F,  Van  Veldhoven  PP,  Baes  M.  Peroxisomal  multifunctional  protein  2  is  essential  for  lipid  homeostasis  in  Sertoli  cells  and  male  fertility  in  mice.  Endocrinology.  2006  Feb  16;  [Epub  ahead  of  print  as  doi:10.1210/en.2005-1571]）に必要であることが示された。具体的には、Ｈｓｄ１７ｂ４は、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化の第２および第３ステップの、エノイルＣｏＡヒドラターゼ反応および３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ反応を触媒する（Jiang  LL,  Kurosawa  T,  Sato  M,  Suzuki  Y,  Hashimoto  T.  Physiological  role  of  D-3-hydroxyacyl-CoA  dehydratase/D-3-hydroxyacyl-CoA  dehydrogenase  bifunctional  protein.  J  Biochem  (Tokyo).  1997  Mar;121(3):506-13）。Ｈｓｄ１７ｂ４（７９ｋＤａ）はペルオキシソームに到達した後、一箇所で切断されて、３５ｋＤａおよび４４ｋＤａのサイズを有する別々の酵素成分を生じる。
【００５０】
ラットＡｃｏｘ１、マウスＳｃｐ２およびマウスＨｓｄ１７ｂ４のタンパク質分解変換に対するＴｙｓｎｄ１の効果を評価するために、タンパク質の発現構築物をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＨｓｄ１７ｂ４はそのＮ末端をＨＡエピトープでタグ付けして、ＰＴＳ１シグナルを保存した。ウェスタンブロットでは、Ｓｃｐ２は主として、未プロセッシング酵素型に相当する５９ｋＤａタンパク質バンドとして現れた（図３、レーン２）。約４８ｋＤａの非常に微弱なバンドは、プロセッシング型に相当する（図３、レーン２）。Ｔｙｓｎｄ１との同時トランスフェクションは、未プロセッシング５９ｋＤａ型の著しいレベル低下を、４８ｋＤａタンパク質の付随する増加と共に引き起こした（図３、レーン３）。１３ｋＤａ  Ｃ末端断片はＨＡタグを欠いているため、検出されなかった。ＨＡ−Ａｃｏｘ１を用いてトランスフェクションした細胞からの抽出物の分析は、主要な未プロセッシング７５ｋＤａ型および４８ｋＤａの見かけのサイズを有する酵素のＮ末端断片の存在を明らかにした（図３、レーン４）。Ｔｙｓｎｄ１の同時発現は、プロセッシング済４８ｋＤａタンパク質の著しい蓄積を引き起こした（図３、レーン５）。同様にＨＡ−Ｈｓｄ１７ｂ４は、Ｔｙｓｎｄ１と同時発現した場合、プロセッシングを受けＮ末端の３５ｋＤａ断片を与えた(図４)。これらのデータは、Ｔｙｓｎｄ１がペルオキシソーム鍵酵素の細胞プロセッシングに関与していることを明らかに立証するものである。
【００５１】
Ｓｃｐ２のタンパク質分解切断は、それぞれ異なる活性を有する２つの断片を生成する。４６ｋＤａ断片は、分岐鎖脂肪酸チオラーゼとして酵素活性がある（Seedorf  U,  Brysch  P,  Engel  T,  Schrage  K,  Assmann  G.  Sterol  carrier  protein  X  is  peroxisomal  3-oxoacyl  coenzyme  A  thiolase  with  intrinsic  sterol  carrier  and  lipid  transfer  activity.  J  Biol  Chem.  1994  Aug  19;269(33):21277-83；Antonenkov  VD,  Van  Veldhoven  PP,  Waelkens  E,  Mannaerts  GP.  Substrate  specificities  of  3-oxoacyl-CoA  thiolase  A  and  sterol  carrier  protein  2/3-oxoacyl-CoA  thiolase  purified  from  normal  rat  liver  peroxisomes.  Sterol  carrier  protein  2/3-oxoacyl-CoA  thiolase  is  involved  in  the  metabolism  of  2-methyl-branched  fatty  acids  and  bile  acid  intermediates.  J  Biol  Chem.  1997  Oct  10;272(41):26023-31）。非特異的脂質転移タンパク質（ｎｓＬＴＰ）としても知られる１３ｋＤａ断片は、基質、例えば脂肪アシル−ＣｏＡ誘導体のＡｃｏｘ１への転移において機能し得る（Wouters  FS,  Bastiaens  PI,  Wirtz  KW,  Jovin  TM.  FRET  microscopy  demonstrates  molecular  association  of  non-specific  lipid  transfer  protein  (nsL-TP)  with  fatty  acid  oxidation  enzymes  in  peroxisomes.  EMBO  J.  1998  Dec  15;17(24):7179-89.）。タンパク質（５９ｋＤａ）の無傷の完全長型は、両方の機能をなお実施できる。したがってプロセッシングの生理学的重要性は明白ではない。Ａｃｏｘ１の場合、ペルオキシソーム内プロセッシングの役割は、生成した断片が結合したままであるため、なお一層明らかでない。最近、Ｗｏｕｔｅｒｓら（Wouters  FS,  Bastiaens  PI,  Wirtz  KW,  Jovin  TM.  FRET  microscopy  demonstrates  molecular  association  of  non-specific  lipid  transfer  protein  (nsL-TP)  with  fatty  acid  oxidation  enzymes  in  peroxisomes.  EMBO  J.  1998  Dec  15;17(24):7179-89.）は、ｎｓＬＴＰがＡｃｏｘ１、Ａｃａａ１、およびＨｓｄ１７ｂ４と結合されていることを証明した。これらの結果は、β酸化のペルオキシソーム酵素が機能性複合体内に組織化されていることを示唆する（Wouters  FS,  Bastiaens  PI,  Wirtz  KW,  Jovin  TM.  FRET  microscopy  demonstrates  molecular  association  of  non-specific  lipid  transfer  protein  (nsL-TP)  with  fatty  acid  oxidation  enzymes  in  peroxisomes.  EMBO  J.  1998  Dec  15;17(24):7179-89.）。複合体形成によって、酵素の局所濃度が一時的に増加するため、脂質中間体の酵素間での効率的転移が可能となると考えられる。ペルオキシソーム内プロセッシングは、酵素のコンホメーション変化をもたらし得、これは複合体の形成を向上させると考えられる。Ｔｙｓｎｄ１は、このプロセスを調節する役割を果たし、したがって向上したペルオキシソーム脂肪酸β酸化を促進し得る。
【００５２】
Ｔｙｓｎｄ１の発現パターンに類似した、５５の組織からサンプリングしたマウス遺伝子の同時発現パターン（Mouse  Gene  Prediction  Database;  Search  Results  for  1300019N10Rik  (XM_125636.1)  and  top  100  correlated  genes;  http://mgpd.med.utoronto.ca/profile.php?nameofgene=XM_125636.1）は、示唆された調節の役割を間接的に支持する。Ｔｙｓｎｄ１（ＸＭ＿１２５６３６．１）、Ａｃａａ１（ＸＭ＿１３５２４９．１）およびＳｃｐ２（ＸＭ＿１３５２６７．１）転写物は、プロテアーゼ−基質関係から予想されるように、大動脈、褐色脂肪、小腸、肝臓、前立腺および副腎において中〜高レベルで同時発現される。アクセッション番号は、Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子モデルアクセッションであり、参考文献（Mouse  Gene  Prediction  Database;  Search  Results  for  1300019N10Rik  (XM_125636.1)  and  top  100  correlated  genes;  http://mgpd.med.utoronto.ca/profile.php?nameofgene=XM_125636.1）から引用した。
（実施例４）
【００５３】
＜Ｔｙｓｎｄ１の翻訳後プロセッシング＞
他のペルオキシソームタンパク質と同様に、Ｔｙｓｎｄ１はサイトゾル内で合成される。ペルオキシソームへの移入が完了するまで潜在的なＴｙｓｎｄ１基質がプロセッシングされないようにするために、タンパク質がペルオキシソームに到達するまでＴｙｓｎｄ１のタンパク質分解活性は作動させるべきではない。異なるプロテアーゼが、タンパク質分解活性をサイレンシングさせるのに異なる方法を利用する。大半のプロテアーゼは、不活性前駆体として合成され、したがってタンパク質分解経路の鍵となる事象は、チモーゲンの活性酵素への変換である。
【００５４】
推定上のＴｙｓｎｄ１プロセッシングを調査するために、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のどちらかにＦＬＡＧエピトープを含有するこの酵素の真核発現ベクターを用いてＣＯＳ−７細胞がトランスフェクションされた。Ｃ末端へのＦＬＡＧエピトープは、アミノ酸５６２と５６３との間に導入されて、ＰＴＳ１シグナルを含有するＴｙｓｎｄ１の未変性Ｃ末端を保存することに注目すべきである。Ｔｙｓｎｄ１のＮ末端でＦＬＡＧエピトープをコードするプラスミドを用いたトランスフェクションは、細胞溶解物のウェスタンブロットによって判定されるように、５９ｋＤＡタンパク質バンドの出現をもたらした。分子量は、ｃＤＮＡ配列の翻訳ＣＤＳの計算重量と一致している（図５Ａ、レーン３）。しかしながら約１０ｋＤａの追加のバンドも検出された（図５Ａ、レーン３）。この小型タンパク質種は、Ｔｙｓｎｄ１のＮ末端の約９０個のアミノ酸残基に結合されたＦＬＡＧエピトープに相当する（図５Ｂ）。他方Ｔｙｓｎｄ１のＣ末端でＦＬＡＧエピトープをコードするプラスミドを用いて細胞にトランスフェクションした場合、抗体は４９ｋＤａの追加のバンドを検出した（図５Ａ、レーン２）。サイズの相違は、１０ｋＤａ断片がＮ末端タグ付きＴｙｓｎｄ１から分離されることを示し、したがってＣ末端タグ付きＴｙｓｎｄ１タンパク質によって得られた結果を確証している。
【００５５】
他のプロテアーゼと同様に、５９ｋＤａ  Ｔｙｓｎｄ１タンパク質は、触媒的に活性な４９ｋＤａ型を生成することが予想される不活性前駆体型を示す。９ｋＤａ  Ｎ末端断片の除去は、残基１８７〜２８２および３１１〜５３６における２つのプロテアーゼ関連ドメインに影響を及ぼさない。結果として、Ｎ末端セグメントは、ペルオキシソームに到達するまでＴｙｓｎｄ１の活性を抑制する活性化ペプチドであり得る。
【００５６】
不活性前駆体の活性Ｔｙｓｎｄ１への変換は、自己触媒的に、または別の同定されていないプロテアーゼによって、媒介されている可能性がある。活性化のタイミングおよび程度は最終的に、上述のようにペルオキシソーム脂肪酸β酸化の速度を調節し得る。
（実施例５）
【００５７】
＜マウスＴｙｓｎｄ１に対する抗体の特徴づけ＞
成熟Ｔｙｓｎｄ１タンパク質のＣ末端に近い領域（アミノ酸５０１〜５１５）に対するウサギポリクローナル抗体が作成された。抗体の特異性を、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物から精製された組換えマウスＴｙｓｎｄ１および一時トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞中のＮ−ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１−Ｃ産物も認識する能力について試験した。組換えＴｙｓｎｄ１のウェスタンブロット分析は、５９ｋＤａの予測サイズに相当するシグナルを明らかにした（図６、レーン１）。モックトランスフェクションＣＯＳ−７細胞の溶解物では、バンドは検出できなかった（図６、レーン２）。Ｎ末端Ｆｌａｇタグ付きＴｙｓｎｄ１を発現する細胞は、２つの顕著なバンドを示した（図６、レーン３）。５９ｋＤＡバンド断片は、アミノ末端領域を含むＴｙｓｎｄ１に相当する。４９ｋＤＡ断片は、アミノ末端領域なしのＴｙｓｎｄ１タンパク質に相当する（図５を参照）。抗Ｔｙｓｎｄ１抗体の特異性を試験するために、免疫化に使用された合成ペプチドを用いた競合アッセイが実施された。シグナルは、抗体の予備吸収後に完全に消滅し、高い特異性が立証された（図６、レーン４〜６）。Ｔｙｓｎｄ１に対する抗体を産生するために使用したペプチドの配列（アミノ酸５０１〜５１５）は、ラットＴｙｓｎｄ１およびヒトＴｙｓｎｄ１で共有され、抗体がこれらの種の組織におけるタンパク質発現を研究するためにも有用であり得ることが示唆される（以下を参照）。
（実施例６）
【００５８】
＜内在性Ｔｙｓｎｄ１の局在化およびサイズ＞
共焦点顕微鏡法実験はＴｙｓｎｄ１のペルオキシソーム局在化を示したが、証拠は人為的条件に基づいている。例えばＴｙｓｎｄ１は培養細胞中のＴｙｓｎｄ１−ＧＦＰ産物として過剰発現された。したがってＴｙｓｎｄ１のペルオキシソーム局在化を独立して確認することが選択された。ラット肝臓ホモジネートが分画され、抗Ｔｙｓｎｄ１抗体を使用した免疫ブロッティングによって細胞下画分が分析された。対照マーカー酵素の活性を調べた結果（図７Ａ）は、ペルオキシソームが自己発生性Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配の底部付近に位置することを示した（画分１８〜２０）。ペルオキシソームは上部画分（画分１〜４）に見出された他のオルガネラ（すなわちミトコンドリアおよびリソソーム）からうまく分離され、このサンプルの主なタンパク質含有量を構成する（図７Ｂ）。抗Ｔｙｓｎｄ１抗体を用いた画分のウェスタンブロット分析では、カタラーゼも検出された勾配の領域である、画分１８〜２０のみで免疫反応性物質が示された（図７Ｃ）。これらの結果は、内在性Ｔｙｓｎｄ１のペルオキシソーム局在化を強力に支持する。ウェスタンブロットによって検出された２つの顕著なバンドは、４９ｋＤａおよび２７ｋＤａの分子量を有するタンパク質型に相当する（図７Ｃ）。興味深いことにＣＯＳ−７トランスフェクション細胞では、検出された主なＴｙｓｎｄ１種は、無傷のもの（５９ｋＤａ）および部分的にプロセッシングされたもの（４９ｋＤａ）に相当するが、２７ｋＤａ型はほとんど検出できなかった（図５）。これは、Ｔｙｓｎｄ１のプロセッシング経路を飽和させ得るｐｃＤＮＡ３．１ベクターによって発生された過剰発現の結果であるらしい。
結論として本発明者のデータは、Ｔｙｓｎｄ１が最終的に少なくとも２つのプロテアーゼ型の形成をもたらす一連のタンパク質分解事象を受け得ることを示唆している。第一の型は、両方のプロテアーゼ関連ドメイン（４９ｋＤａ）を含有する。第二の型（２７ｋＤａ）は、Ｃ末端プロテアーゼ様ドメイン（３０８−５３１）のみを含有する。哺乳類組織における単一翻訳産物からの別々のプロテアーゼドメインの生成は、前例が無いわけではない。最近Ｃａｌらは、ヒトのポリセラーゼ１（ｐｏｌｙｓｅｒａｓｅ−Ｉ）（Cal  S,  Quesada  V,  Garabaya  C,  Lopez-Otin  C.  Polyserase-I,  a  human  polyprotease  with  the  ability  to  generate  independent  serine  protease  domains  from  a  single  translation  product.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  2003  Aug  5;100(16):9185-90）およびポリセラーゼ２（ｐｏｌｙｓｅｒａｓｅ−２）（Cal  S,  Quesada  V,  Llamazares  M,  Diaz-Perales  A,  Garabaya  C,  Lopez-Otin  C.  Human  polyserase-2,  a  novel  enzyme  with  three  tandem  serine  protease  domains  in  a  single  polypeptide  chain.  J  Biol  Chem.  2005  Jan  21;280(3):1953-61）が、一連のタンパク質分解プロセッシング事象を受けて、３個の独立なセリンプロテアーゼユニットを発生させることを証明した。Ｔｙｓｎｄ１プロセッシングの複雑な特性は、ペルオキシソームにおける複数の生物学的プロセスの調節を可能にする細胞制御機構を反映しているように思われる。例えばＴｙｓｎｄ１の２つの型の、基質特異性およびタンパク質分解効率は異なり得る。
（実施例７）
【００５９】
＜Ｔｙｓｎｄ１は、２９３ＦＴ細胞における、Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＨｓｄ１７ｂ４のプロセッシングに関与する主要な酵素である＞
Ｔｙｓｎｄ１は、同時発現研究において数個のペルオキシソーム酵素の切断を促進することが示されたが、この過程に他のプロテアーゼも関与し得る可能性が残っている。そこで低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が利用され、ペルオキシソーム酵素の細胞プロセッシングにおけるＴｙｓｎｄ１の相対的貢献度が調査された。ｓｉＲＮＡを使う戦略は、細胞における特定のタンパク質の選択的ノックダウンを達成する、強力で新しい手段を提供する（Sandy  P,  Ventura  A,  Jacks  T.  Mammalian  RNAi:  a  practical  guide.  Biotechniques.  2005  Aug;39(2):215-24.）。試験された多数のマウスおよびヒト細胞系の中で、２９３ＦＴ細胞のみが、トランスフェクション研究において、完全長ＨＡ−Ａｃｏｘ１、完全長ＨＡ−Ｓｃｐ２、および完全長ＨＡ−Ｈｓｄ１７ｂ４から生成された検出可能な量の断片を示した。観察されたプロセッシング生成物は、２９３ＦＴ細胞に存在する内在性のペルオキシソームプロセッシングプロテアーゼによって、生成された。本明細書において、ヒトのＴＹＳＮＤ１特異的ｓｉＲＮＡのＴｙｓｎｄ１＿１およびＴｙｓｎｄ１＿２が、Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＨｓｄ１７ｂ４のＮ末端ＨＡタグ含有断片の生成を本質的に阻害することが証明された(図８)。対照的に、対照の非サイレンシングｓｉＲＮＡは、効果がなかった(図８)。ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡを完全にはノックダウンし得ないこと、およびＴｙｓｎｄ１が長い半減寿命を有している可能性があることを考慮すると、観察された効果によって、Ｔｙｓｎｄ１が、Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、Ｈｓｄ１７ｂ４、およびおそらく他のペルオキシソーム酵素のプロセッシングにおいて、唯一のとまでは行かなくとも主要な役割を果たしていることが、立証される。
（実施例８）
【００６０】
＜インビトロの研究が、Ｔｙｓｎｄ１によって直接ペルオキシソーム酵素がプロセッシングされることを立証する＞
Ｔｙｓｎｄ１が、数個のペルオキシソーム酵素のプロセッシングに関与していることが、細胞ベースのアッセイで示された。Ｔｙｓｎｄ１は、その標的を直接にか、または別の真のペルオキシソームプロセッシングプロテアーゼを活性化することによって間接的に、プロセッシングし得る。Ｔｙｓｎｄ１が直接にペルオキシソーム酵素をプロセッシングするか評価するために、組換え体Ｔｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧタンパク質を、ＣＯＳ−７細胞で発現させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｔｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧと組換え体Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＡｃａａ１とをインキュベートすると、無傷のペルオキシソームにおいて生成されたものと同じサイズの開裂生成物が形成された（図９）。Ａｃｏｘ１は、切断されて２８ｋＤａのＣ末端断片を生成し、Ｓｃｐ２は、プロセッシングされて１６ｋＤａのＣ末端断片を生成した（図９）。Ｔｙｓｎｄ１とＡｃａａ１とのインキュベーションは、３ｋＤａのＰＴＳ２含有Ｎ末端ペプチドの除去をもたらして、成熟Ａｃａａ１を生成させた(図９)。Ｎ末端配列決定分析によって、Ｔｙｓｎｄ１はＡｃａａ１を、Ｃｙｓ２６残基とＳｅｒ２７残基の間で開裂し、インビボで見られるＡｃａａ１の成熟型を生成させることが確証された。これらの実験は、Ｔｙｓｎｄ１が真のペルオキシソームのプロセッシングプロテアーゼであることを立証する。
【００６１】
Ｔｙｓｎｄ１によるペルオキシソーム酵素のプロセッシングは、高度に特異的である。数個のペルオキシソーム酵素が切断部位周囲の配列としてＡｌａ−［ＡｌａＶａｌ］−Ｐｒｏモチーフを共有しているようであるが（Biermann  J,  van  den  Bosch  H.  In  vitro  processing  of  the  human  alkyl-dihydroxyacetonephosphate  synthase  precursor.  Arch  Biochem  Biophys.  1999  Aug  1;368(1):139-46）、これは一般的法則ではない。例えばＳｃｐ２は、約アミノ酸２５個分離れた２つの位置で切断される。これらの部位の一方は、切断部位周囲にＡｌａ−［ＡｌａＶａｌ］−Ｐｒｏモチーフを含有する。Ａｃｏｘ１において、モチーフはプロセッシング部位周囲には見られなかった。Ｔｙｓｎｄ１基質切断機構は、単純なペプチド結合認識を包含しないが、むしろ二次および三次構造の認識に基づいていることが示唆される。
（実施例９）
【００６２】
＜Ｔｙｓｎｄ１はシステインエンドペプチダーゼである＞
Ｔｙｓｎｄ１のプロテアーゼクラスを決定するために、様々なプロテアーゼインヒビターの存在下で、酵素プロセッシング活性を評価した。この実験のために、２個の基質が選択された。それはＡｃａａ１およびＡｃｏｘ１である。異なるペルオキシソーム標的クラス（ＰＴＳ１およびＰＴＳ２）を代表するのに加えて、Ａｃａａ１およびＡｃｏｘ１は、プロセッシング部位を囲むアミノ酸配列が異なる。Ｔｙｓｎｄ１のプロセッシング活性は、システインプロテアーゼインヒビターＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）を用いたとき、完全に無くなった（図１０）。Ｔｙｓｎｄ１は、スルフヒドリル活性試薬ＮＥＭに対して感受性であるが、２個の他のシステインプロテイナーゼインヒビターであるロイペプチンおよびｔ−エポキシスクシニル−１−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン（Ｅ６４）（株式会社ペプチド研究所（大阪府））に対しては抵抗性である。ロイペプチンは、いくつかのリソソームのセリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼを阻害することが知られ、一方Ｅ６４はパパインプロテアーゼファミリーの特異的阻害剤である（Salvesen  GS,  Nagase  H.  In  Proteolytic  Enzymes  (ed.  Beynon  R  and  Bond  JS),  p.  110.  Oxford  University  Press）。同様の阻害パターンが、ペルオキシソームプロテアーゼＩＤＥについて観察された（ＩＤＥはＮＥＭによって阻害されるがロイペプチンおよびＥ６４によっては阻害されない）。金属キレート剤、とりわけ１，１０−フェナントロリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ  Ｋ．Ｋ．）によってＴｙｓｎｄ１は部分阻害されるが、これと関連する非キレート化化合物の１，７−フェナントロリン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）によっては部分阻害されないことは（図１０）、Ｚｎイオンが、Ｔｙｓｎｄ１のコンホメーションまたはその基質との複合体形成を安定化させるのに関与している可能性を示す。
（実施例１０）
【００６３】
＜低脂血症薬ベザフィブレートによるＴｙｓｎｄ１の誘導＞
ＰＰＡＲ−α−アクチベーターであるベザフィブレートは、部分的には、Ａｃａａ１、Ａｃｏｘ１、およびＨｓｄ１７ｂ４（これらはＴｙｓｎｄ１によってプロセッシングされる）のβ酸化の原因となるペルオキシソーム酵素を誘導することによって、肝臓での脂肪酸のβ酸化を増加させることが知られている（Beier  K,  Volkl  A,  Hashimoto  T,  Fahimi  HD.  Selective  induction  of  peroxisomal  enzymes  by  the  hypolipidemic  drug  bezafibrate.  Detection  of  modulations  by  automatic  image  analysis  in  conjunction  with  immunoelectron  microscopy  and  immunoblotting.  Eur  J  Cell  Biol.  1988  Aug;46(3):383-93）。それゆえ、Ｔｙｓｎｄ１もまたベザフィブレートによって誘導されるかどうか試験された。以前の報告に一致して、肝臓のＡｃｏｘ１、Ｈｓｄ１７ｂ４、およびＡｃａａ１のｍＲＮＡの誘導が観察された（データは示さず）。肝臓の細胞下分画を行い、Ｔｙｓｎｄ１タンパク質の含有量が評価された。ベザフィブレート処理は、ペルオキシソームに富む軽ミトコンドリア画分において、４９ｋＤａ型のＴｙｓｎｄ１の著しい増加をもたらした（図１１）。対照的に、（ポスト核画分、ポストミトコンドリア画分では、）カタラーゼの総量の僅かな増加がみられ、軽ミトコンドリア画分のカタラーゼの含有量は増加しなかった（図１１）。これらのデータは、代謝要求に応じるために、特に脂肪酸のβ酸化が促進される条件で、Ｔｙｓｎｄ１の発現がその基質タンパク質の発現と同時制御される可能性を示唆する。
（実施例１１）
【００６４】
＜疾患に対するＴｙｓｎｄ１のＰＴＳ１およびＰＴＳ２タンパク質プロセッシング活性の意味＞
Ａｃｏｘ１、Ａｃａａ１、Ｓｃｐ２、Ｈｓｄ１７ｂ４、ならびにおそらく他のＰＴＳ２およびＰＴＳ１含有ペルオキシソームタンパク質のＴｙｓｎｄ１によるプロセッシングは、代謝性疾患例えば食事性肥満、脂肪肝疾患または高コレステロール血症における脂肪酸β酸化、ケトン生成およびコレステロール合成の病原化に関して、潜在的な治療上または診断上の意味を有し得る。Ｔｙｓｎｄ１と脂肪代謝の関連および微小血管内皮細胞におけるその差次的発現（Keen  HL,  Ryan  MJ,  Beyer  A,  Mathur  S,  Scheetz  TE,  Gackle  BD,  Faraci  FM,  Casavant  TL,  Sigmund  CD.  Gene  expression  profiling  of  potential  PPARgamma  target  genes  in  mouse  aorta.  Physiol  Genomics.  2004  Jun  17;18(1):33-42、この参考文献の表６）も、心臓血管疾患の病原論におけるＴｙｓｎｄ１機能不全の役割を意味し得る。心虚血の間、ミトコンドリア脂肪酸酸化の高い速度は、グルコース酸化を阻害する（Dyck  JR,  Cheng  JF,  Stanley  WC,  Barr  R,  Chandler  MP,  Brown  S,  Wallace  D,  Arrhenius  T,  Harmon  C,  Yang  G,  Nadzan  AM,  Lopaschuk  GD.  Malonyl  coenzyme  a  decarboxylase  inhibition  protects  the  ischemic  heart  by  inhibiting  fatty  acid  oxidation  and  stimulating  glucose  oxidation.  Circ  Res.  2004  May  14;94(9):e78-84）。ラノラジンおよび長鎖３−ケトアシル補酵素Ａチオラーゼインヒビターのトリメタジジンは、脂肪酸酸化を阻害し、したがってグルコース酸化および心臓効率を向上させることが示されている（Lopaschuk  GD.  Inhibiting  fatty  acid  oxidation  as  a  novel  therapeutic  approach  to  treating,  ischaemic  heart  disease.  Cardiovasc  J  S  Afr.  2004  Jul;15(4  Suppl  1):S1）。心虚血へのペルオキシソームチオラーゼの寄与は知られているところでは調査されていないが、除外することはできない。Ｔｙｓｎｄ１の阻害は、チオラーゼの有効性を低下させ、それにより脂肪酸酸化を低下させると同時に心臓効率を向上させる。
【００６５】
マウスへの高脂肪食の長期的影響に関する研究は、Ａｃｏｘ１、Ａｃａａ１の肝臓における発現が著しくアップレギュレートされることを立証している（Murase,  T.,  Mizuno,  T.,  Omachi,  T.,  Onizawa,  K.,  Komine,  Y.,  Kondo,  H.,  Hase,  T.,  Tokimitsu,  I.,  2001.  Dietary  diacylglycerol  suppresses  high  fat  and  high  sucrose  diet-induced  body  fat  accumulation  in  C57BL/6J  mice.  J.  Lipid  Res.  42,  372&#8211;378；Kim  S,  Sohn  I,  Ahn  JI,  Lee  KH,  Lee  YS,  Lee  YS.  Hepatic  gene  expression  profiles  in  a  long-term  high-fat  diet-induced  obesity  mouse  model.  Gene.  2004  Sep  29;340(1):99-109）。したがって成熟Ｔｙｓｎｄ１の特異的阻害または活性化は、原因となっている肝臓脂質代謝の病態および男性不妊症を制御する新たな戦略を開拓し得る（Huyghe  S,  Schmalbruch  H,  De  Gendt  K,  Verhoeven  G,  Guillou  F,  Van  Veldhoven  PP,  Baes  M.  Peroxisomal  multifunctional  protein  2  is  essential  for  lipid  homeostasis  in  Sertoli  cells  and  male  fertility  in  mice.  Endocrinology.  2006  Feb  16;  [Epub  ahead  of  print  as  doi:10.1210/en.2005-1571]）。マウスの成熟Ｓｃｐ２の欠損は、フィタン酸の蓄積および成人レフサム病様症候群の発達に関与している（Mukherji  M,  Kershaw  NJ,  Schofield  CJ,  Wierzbicki  AS,  Lloyd  MD.  Utilization  of  sterol  carrier  protein-2  by  phytanoyl-CoA  2-hydroxylase  in  the  peroxisomal  alpha  oxidation  of  phytanic  acid.  Chem  Biol.  2002  May;9(5):597-605）。フィタン酸は、ペルオキシソームα−酸化経路でフィタノイル−ＣｏＡ  ２−ヒドロキシラーゼによって分解される。フィタノイル−ＣｏＡ  ２−ヒドロキシラーゼによるフィタノイル−ＣｏＡの効率的な２−ヒドロキシル化は成熟Ｓｃｐ２を必要とし、Ｔｙｓｎｄ１は成熟Ｓｃｐ２の利用可能性を調節する重要な役割を果たし得ている。したがってＴｙｓｎｄ１の機能的不全は、レフサム様疾患症状をもたらし得る。
【００６６】
Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｙらによる研究（Raychaudhury  B,  Banerjee  S,  Datta  SC.  Peroxisomal  function  is  altered  during  leishmania  infection.  Med  Sci  Monit.  2003  Apr;9(4):BR125-9）は、リーシュマニア感染が、ペルオキシソーム損傷につながるペルオキシソーム酵素の複数の機能不全を引き起こすことを示した。注目すべきは、本発明者らがリーシュマニア感染時のペルオキシソームタンパク質分解活性の低下も検出したことである。感染時の活性低下は、成熟Ｔｙｓｎｄ１プロテアーゼ活性またはＴｙｓｎｄ１前駆体の成熟Ｔｙｓｎｄ１への変換を阻害するリーシュマニアタンパク質によって引き起こされている可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】融合タンパク質ＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１がペルオキシソームに局在することを示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、融合されたＧＦＰ−Ｔｙｓｎｄ１およびＤｓＲｅｄ２−Ｐｅｒｏｘｉを発現するプラスミドと共に同時トランスフェクションした。生細胞は、蛍光顕微鏡法によって分析し、ＧＦＰ（Ａ）、ＤｓＲｅｄ（Ｂ）チャネル、および併合シグナル（Ｃ）の代表的な画像を示す。
【図２】ラットＡｃａａ１前駆体の成熟Ａｃａａ１（ｍＡｃａａ１）へのプロセッシングに対するＴｙｓｎｄ１発現の効果を示す。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ａｃａａ１−ＨＡおよびＴｙｓｎｄ１発現プラスミドの示された組合せを用いて一時トランスフェクションした。プラスミドの総量は、空ｃＤＮＡ３．１の追加により、４μｇで一定に維持した。
【図３】Ｔｙｓｎｄ１の同時発現時のＳｃｐ２およびＡｃｏｘ１のタンパク質分解変換を示す。ＣＯＳ−７細胞を、ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１およびＨＡマウスＳｃｐ２またはＨＡラットＡｃｏｘ１の示された組合せでトランスフェクションした。プラスミドの総量は、ｐｃＤＮＡ３．１を使用して４μｇに調節した。トランスフェクションの４８時間後に細胞溶解物を調製し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロットで分析した。矢印は、Ｓｃｐ２およびＡｃｏｘ１前駆体およびその成熟形（ｍＳｃｐ２およびｍＡｃｏｘ１）の位置を示す。
【図４】Ｔｙｓｎｄ１の同時発現時のマウスペルオキシソームヒドロキシステロイド(１７−β)デヒドロゲナーゼ  ４（Ｈｓｄ１７ｂ４）のタンパク質分解変換を示す。ＣＯＳ−７細胞を、ＦＬＡＧ−Ｔｙｓｎｄ１およびＨＡ−マウスＨｓｄ１７ｂ４の示された組合せでトランスフェクションした。プラスミドの総量は、ｐｃＤＮＡ３．１を使用して４μｇに調節した。トランスフェクションの４８時間後に細胞溶解物を調製し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離して、抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロットで分析した。矢印は、Ｈｓｄ１７ｂ４前駆体（７９ｋＤａ）およびＨｓｄ１７ｂ４成熟形（３５ｋＤａ）の位置を示す。
【図５】４μｇＤＮＡのｐｃＤＮＡ３．１によって（ｍｏｃｋ、レーン１）、およびＣ末端にＦｌａｇタグをつけたＴｙｓｎｄ１によって（レーン３および６）トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞におけるＴｙｓｎｄ１切断の分析を示す。これらは４％−２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして抗Ｔｙｓｎｄ１抗体を使用したウェスタンブロッティングでアッセイした。レーン４−６で使用した抗体は、合成ペプチドＣＳＮＴＲＤＮＮＴＧＡＴＹＰＨＬを予備吸収させた。
【図６】ポリクローナル抗体のＴｙｓｎｄ１との特異的反応性を示す。精製した組換えＴｙｓｎｄ１（レーン１および４）、空ベクターｐｃＤＮＡ３．１を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞からの溶解物（レーン２および５）、およびＮ末端Ｆｌａｇタグ付きＴｙｓｎｄ１のベクターを用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞からの溶解物（レーン３および６）を勾配４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗Ｔｙｓｎｄ１抗体を用いてウェスタンブロッティングによってアッセイした。レーン４〜６で使用した抗体は、合成ペプチドＣＳＮＴＲＤＮＮＴＧＡＴＹＰＨＬを予備吸収させた。
【図７】Ｏｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配での細胞下分画の結果を示す。軽ミトコンドリア画分は、自己形成Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配により分画した。画分は、管の上から開始して採取した。カタラーゼ（縞模様の棒）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（黒棒）およびβ−ガラクトシダーゼ（中空棒）を、それぞれペルオキシソーム、ミトコンドリアおよびリソソームのマーカー酵素として測定した（図７Ａ）。結果を、全勾配活性のパーセンテージとして与える。図７Ｂは、タンパク質含有量を示す。等体積の各画分からのタンパク質を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、マウスＴｙｓｎｄ１に対する抗体を用いて免疫ブロットした（図７Ｃ）。
【図８】Ｔｙｓｎｄ１特異的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による、２９３ＦＴ細胞系におけるＡｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＨｓｄ１７ｂ４のプロセッシングの阻害を示す。２９３ＦＴ細胞を、ヒトＴＹＳＮＤ１に特異的なｓｉＲＮＡ（Ｔｙｓｎｄ１＿１およびＴｙｓｎｄ１＿２）または非サイレンシングｓｉＲＮＡ（対照）とともに、Ａｃｏｘ１−ＨＡ、Ｓｃｐ２−ＨＡ、またはＨｓｄ１７ｂ４−ＨＡ発現プラスミドにトランスフェクションさせた。細胞溶解物を、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。矢印は、Ａｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＨｓｄ１７ｂ４の前駆体およびこれらの成熟形（ｍＡｏｘ１、ｍＳｃｐ２、およびｍＨｓｄ１７ｂ４）の位置を示す。βアクチンのウェスタンブロット分析を、ｓｉＲＮＡ特異性およびサンプル添加の対照として用いた。
【図９】組み換えＴｙｓｎｄ１によるＡｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＡｃａａ１のインビトロの切断を示す。組み換えＡｃｏｘ１、Ｓｃｐ２、およびＡｃａａ１を、「材料と方法」で説明されるようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物から精製した。マウスＴｙｓｎｄ１を、Ｔｙｓｎｄ１−Ｆｌａｇ発現プラスミドを用い一時トランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の抽出物から精製した。Ａｃｏｘ１およびＳｃｐ２のプロセッシングを、抗ｃＭｙｃ抗体を用いたウェスタンブロティングによって分析した。Ａｃａａ１切断を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからタンパク質を移した後の、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐメンブレンの０．０５％Ａｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋ染色によって検出した。
【図１０】Ｔｙｓｎｄ１によるＡｃａａ１（Ａ）およびＡｃｏｘ１（Ｂ）のプロセッシングへの各種プロテアーゼインヒビターの影響を示す。組み換えＨｉｓ６−Ａｃａａ１およびＡｃｏｘ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６を、単独で０時間（レーン１）もしくは単独で１２時間（レーン２）またはＣＯＳ−７細胞溶解物から精製したＴｙｓｎｄ１−ＦＬＡＧとともに１２時間（Ａ、レーン３〜１４；Ｂ、レーン３〜１７）インキュベートした。Ｈｉｓ６−Ａｃａａ１のプロセッシングを、抗Ａｃａａ１抗体を用いたウェスタンブロットによって評価した。Ａｃｏｘ１−ｍｙｃ−Ｈｉｓ６の切断を、抗ｃＭｙｃ抗体を用いて検出した。
【図１１】マウス肝臓におけるＴｙｓｎｄ１の含有量へのベザフィブレート処置の効果を示す。マウスを、０．５％（ｖ／ｗ）のベザフィブレートを含有する標準飼料で、３週間飼育した。肝臓細胞下画分を、「材料および方法」でラット肝臓について記載されているようにして調製した。ポスト核画分（ＰＮ）、軽ミトコンドリア画分（ＬＭ）、およびポストミトコンドリア画分（ＰＭ）の１００mｇのタンパク質を、抗Ｔｙｓｎｄ１抗体または抗カタラーゼ抗体を用いたウェスタンブロットによって分析した。Ｃ、対照マウス；Ｂ、ベザフィブレート処置マウスサンプル。
【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月9日(2007.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるペルオキシソームの生成および機能のいずれかに関連する疾患または症候群を治療するための薬剤をスクリーニングする方法であって、
候補となる薬物を動物または、細胞に投与すること
動物または、細胞におけるTysnd1またはそのオルソログの量を判断すること
Tysnd1またはそのオルソログの量が調節された場合、該薬剤として候補となる薬物を特定すること
を含む方法。
【請求項２】
Tysnd1またはそのオルソログの量が増える、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
Tysnd1またはそのオルソログの量が減る、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
疾患が、虚血性心臓病、食事性肥満症、脂肪肝、高コレステロール血症、レフサム病、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、男性不妊症、またはメバロン酸尿症である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、Tysnd1の発現を誘導できる、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、Tysnd1の発現を阻害できる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
細胞におけるペルオキシソームの生成および機能のいずれかに関連する疾患または症候群を診断するための医薬組成物であって、Tysnd1、哺乳類またはヒトのそのオルソログに対する抗体を含む医薬組成物。
【請求項８】
疾患が、虚血性心臓病、食事性肥満症、脂肪肝、高コレステロール血症、レフサム病、X染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、男性不妊症、メバロン酸尿症である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項7に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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