(57)【要約】  本発明にはタンパク質源からＩＰＰを製造するための方法が記載されており、それによりタンパク質から製造されるＩＰＰとＶＰＰの比率は少なくとも５であり、好ましくは少なくとも１０、そしてより好ましくは少なくとも２０であり、該方法はプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質からＩＰＰを含む組成物を製造するための方法であって、前記タンパク質から製造されるＩＰＰ対ＶＰＰの重量比が少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、そしてより好ましくは少なくとも２０：１であり、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはプロリルオリゴペプチダーゼ活性を有する酵素活性と、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列のアミノ末端側で結合を加水分解することができる酵素活性との使用を含む方法。
【請求項２】
プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはプロリルオリゴペプチダーゼ活性を有する前記酵素活性と、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列のアミノ末端側で結合を加水分解することができる前記活性とが１つの酵素中に存在し、好ましくはこの酵素がプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼであり、より好ましくはこの酵素がプロリン特異的エンドプロテアーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼには、アミノペプチダーゼ活性および／またはカルボキシペプチダーゼ活性が存在しない請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーション時間が２４時間未満であり、好ましくは１０時間未満、そしてより好ましくは４時間未満である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーション温度が３０℃よりも高い、好ましくは４０℃よりも高い、そしてより好ましくは５０℃よりも高い請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＬＰＰも製造される請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
牛乳タンパク質、好ましくはカゼインが使用される請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質配列内に存在する−Ａ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−および／または−Ｐ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列が、ペプチドＩＰＰに少なくとも３０％変換される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質配列内に存在する−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−および／または−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列が、ペプチドＬＰＰに少なくとも４０％変換される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性ペプチド、好ましくはＩＰＰを含む組成物を調製するための方法であって、適切なタンパク質源の加水分解によって製造され、好ましくは請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって製造される組成物のｐＨを、加水分解タンパク質の一部が不溶性になるｐＨに変更することと、不溶性部分を可溶性ペプチドから分離して可溶性ペプチドを含む組成物をもたらすこととを含む方法。
【請求項１１】
最初に、タンパク質をプロリン特異的エンドプロテアーゼにより５〜３０％のＤＨまで加水分解することと、
任意で、第２の酵素処理と、
その後、選択されたｐＨ条件下で、好ましくは酸性ｐＨ条件下で、より好ましくは３．５と６の間のｐＨで、そして最も好ましくは４と５の間のｐＨで、加水分解タンパク質の不溶性部分を可溶性部分から分離して、可溶性ペプチドを含む組成物をもたらすことと、
によって製造される可溶性ペプチドを含む組成物を製造するための方法。
【請求項１２】
可溶性ペプチドを含む組成物であって、ペプチドの少なくとも７０重量％、好ましくは少なくとも８０重量％、そして最も好ましくは少なくとも９０重量％が３．５と６の間のｐＨ、好ましくは４と５の間のｐＨで可溶性であり、前記可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも前記可溶性ペプチドの４０重量％よりも多い量で存在せず、好ましくは前記可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも前記可溶性ペプチドの３０重量％よりも多い量で存在せず、そして最も好ましくは、前記可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも前記可溶性ペプチドの２０重量％よりも多い量で存在せず、請求項１１に記載の方法によって得ることができる組成物。
【請求項１３】
タンパク質からＩＰＰを製造するためのプロリン特異的エンドプロテアーゼの使用であって、ＶＰＰよりも少なくとも５倍（重量）多いＩＰＰが製造される使用。
【請求項１４】
タンパク質の加水分解により製造される組成物であって、前記組成物がＩＰＰを含み、前記組成物中のＩＰＰ対ＶＰＰの重量比が少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、そしてより好ましくは少なくとも２０：１である組成物。
【請求項１５】
さらに、ＬＰＰを含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
栄養補給食品として、好ましくは薬剤としての請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１２および１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１〜１１のいずれか一項に従って製造される組成物の、栄養補給食品、好ましくは薬剤としての使用、健康の改善もしくは疾患の予防および／または治療のために栄養補給食品、好ましくは薬剤を製造するための使用、あるいは高血圧（高血圧症）、心不全、前糖尿病または糖尿病、肥満、耐糖能障害またはストレスなどの疾患の治療または予防のために栄養補給食品、好ましくは薬剤を製造するための使用。
【請求項１９】
前記組成物が、食餌サプリメントの形であるか、ローション、ゲルまたはエマルジョンの形の局所用途を含むパーソナルケア用途の形であるか、あるいは食料、飼料またはペットフードの成分としての請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
肥満の予防または体重管理のために機能性食品を製造するための請求項１２および１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
心血管の健康維持のために機能性食品を製造するための請求項１２および１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
前記心血管の健康維持が、アンジオテンシン変換酵素の阻害を含む請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記心血管の健康維持が、血液のコレステロールレベルの制御を含む請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
健康上の利益をその消費者に提供することができる機能性食品であって、前記健康上の利益が肥満の予防、体重管理および心血管の健康維持から選択され、請求項１２および１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物を含む機能性食品。
【請求項２５】
前記心血管の健康維持の利益が、アンジオテンシン変換酵素の阻害および／または血液のコレステロールレベルの制御を含む請求項２４に記載の機能性食品。
【請求項２６】
５０〜２００ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または１５〜６０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または６〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋を含む請求項２４または２５に記載の機能性食品。
【請求項２７】
１１０〜１３５ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３５〜４５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１３〜２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋を含む請求項２６に記載の機能性食品。
【請求項２８】
１つまたは複数のＢ−ビタミンを含む請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の機能性食品。
【請求項２９】
葉酸、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２を含む請求項２８に記載の機能性食品。
【請求項３０】
３〜２５重量％のステロール、より好ましくは７〜１５重量％のステロールを含む請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の機能性食品。
【請求項３１】
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載のＩＰＰを含む組成物を製造することと、
（ｂ）前記ＩＰＰ含有組成物を食品、飲料品または食餌サプリメント中に取り込むことと、
を含む、食品、飲料品または食餌サプリメントの調製方法。
【請求項３２】
前記ステップａにおいて、牛乳タンパク質、好ましくはカゼインが使用される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップａにおいて、タンパク質配列内に存在する−Ａ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｐ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列がペプチドＩＰＰに少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％変換される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップａにおいて、タンパク質配列内に存在する−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−または−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列がペプチドＬＰＰに少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも４０％変換される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ｃ）好ましくは非アスパラギン酸プロテアーゼによって、より好ましくはセリンプロテアーゼによって加水分解された加水分解タンパク質からペプチドを精製するステップも含み、選択されたｐＨ条件下で前記加水分解タンパク質が沈殿することができ、加水分解タンパク質が沈殿するｐＨにｐＨを変更することと、沈殿したタンパク質を加水分解タンパク質から分離することとを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップｃが、ステップａ）の後、そしてステップｂ）の前に行われる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記食品、飲料品または食餌サプリメントが、マーガリン、スプレッド、バター、酪農製品または乳漿含有飲料、好ましくはヨーグルトまたは牛乳などのヨーグルトまたは牛乳ベースの製品の群から選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法によって得られる食品、飲料品または食餌サプリメント。
【請求項３９】
０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、最も好ましくは０．２〜４重量％の前記ＩＰＰ含有組成物を含む請求項３８に記載の食品、飲料品または食餌サプリメント。
【請求項４０】
製品１００グラムあたり０．０５〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜４０ｍｇ、最も好ましくは０．２〜３０ｍｇのＩＰＰを含む請求項３８または３９に記載の食品、飲料品または食餌サプリメント。
【請求項４１】
ＩＰＰ対ＶＰＰの重量比が、５：１〜１００：１、より好ましくは５：１〜４８：１である請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の食品、飲料品または食餌サプリメント。
【請求項４２】
ＩＰＰおよびＬＰＰを含み、ＩＰＰ対ＬＰＰの重量比が、１：１０〜１：１、より好ましくは１．５：７．１〜４．８対７．１である請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の食品、飲料品または食餌サプリメント。
【請求項４３】
ヒトの高血圧症の軽減に使用するための請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の食品、飲料品または食餌サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＰＰの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症はヒトの比較的一般的な病状であり、心血管疾患、腎不全および脳卒中の有力な危険因子を与える。カルシウム遮断薬、β遮断薬、利尿薬、α遮断薬、主要なアルファ拮抗薬（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｌｐｈａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬およびＡＣＥ阻害薬などのたくさんの医薬品の有効性は、高血圧症の根元的な生理学的メカニズムが多面的であることを説明する。
【０００３】
高血圧症の生理学的メカニズムの中で、特に、レニン−アンジオテンシンメカニズムは多くの科学的な注目を受けている。このメカニズムにおいて、アンジオテンシンは肝臓によって分泌され、ペプチダーゼレニンによって切断されて、生物学的に不活性なデカペプチドのアンジオテンシンＩをもたらす。アンジオテンシンＩが肺の毛細血管を通過する際、アンジオテンシン変換酵素（本明細書ではＡＣＥと称される）と呼ばれる別のペプチダーゼは、アンジオテンシンＩの最後の２つの残基（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を除去することによりアンジオテンシンＩに作用し、オクタペプチドのアンジオテンシンＩＩを形成する。アンジオテンシンＩＩオクタペプチドは強力な血管収縮活性を示し、従って血圧を上昇させる。低レベルのアンジオテンシンＩＩにつながるＡＣＥの阻害は血管収縮を防止し、従って高血圧を防止する。
【０００４】
アンジオテンシンＩを切断することのほかに、ＡＣＥは、やはり血圧の調節に関与するノナペプチドのブラジキニンを加水分解することもできる。後者のメカニズムでは、ＡＣＥの阻害はブラジキニンレベルの増大をもたらし、これは、血管拡張、そして低血圧も促進する。従って、ＡＣＥの阻害は、少なくとも２つの別個のメカニズムによって血圧低下効果をもたらす。
【０００５】
オクタペプチドのアンジオテンシンＩＩは、副腎皮質によるアルドステロンの放出を刺激することも知られている。アルドステロンの標的器官は腎臓であり、ここでアルドステロンは、腎臓の細管からのナトリウムの増加した再吸収（ｒｅａｂｓｏｒｂｔｉｏｎ）を促進する。この第３のメカニズムによっても、ＡＣＥの阻害は血圧を低下させるが、この場合、ナトリウムの再吸収を減少させることによる。
【０００６】
その多数の生理学的効果のために、ＡＣＥのタンパク質分解活性を阻害することは、血圧を低下させる有効な方法である。この知見は、カプトプリルおよびエナラプリルなどの多数の有効な血圧降下医薬品をもたらした（Ｍ．Ａ．オンデッティ（Ｏｎｄｅｔｔｉ）ら、１９７７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ワシントンＤＣ、１９６、４４１−４４４頁）。高血圧症は比較的一般的な病状なので、現代のライフスタイルのこの望ましくない結果を、穏やかな活性の天然成分で打ち消すことは有利であろう。特に、食料品または飲料品に取り込むことができる穏やかな活性の天然成分。何故なら、このような製品は定期的に消費されるからである。あるいは、このような穏やかな活性の天然成分は、食餌サプリメントに取り込まれ得る。この数十年の間に、発酵乳中に存在する特定のペプチドはＡＣＥ阻害能を有し、高血圧の患者において血圧降下を誘発できることが発見されている。今日では、多数のインビトロ試験およびいくつかの動物試験により、様々なタンパク質源から得られる様々なペプチドのＡＣＥ阻害効果が実証された。インビトロのＡＣＥの阻害アッセイは多くの様々なペプチド配列を明らかにしているが、ＡＣＥ阻害ペプチドは血液中を循環してインビボ効果を発揮する必要があることを強調しなければならない。効果的なＡＣＥ阻害ペプチドは、消化管のタンパク質消化系による分解に耐性でなければならず、そしてその後の腸管壁を越える輸送の間、インタクトなままでなければならないことが暗示される。
【０００７】
様々なＡＣＥ阻害ペプチドの構造−機能研究により、これらは多くの場合、そのＣ末端配列においてＰｒｏ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｌａ−Ｈｙｐを有することが示唆されている（Ｓ．マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）およびＨ．スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）、１９８２年、Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．４６（５）、１３９３−１３９４頁）。この発見は、ＡＣＥが、プロリンを含むペプチド結合を切断することができないペプチジルジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）であるという事実によって部分的に説明される。従って、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合は切断されないので、構造Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するトリペプチドから、ジペプチドＰｒｏ−Ｐｒｏを除去することはできない。そのため、比較的高濃度で存在する場合には、Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ構造を有するトリペプチドは、ＡＣＥ活性を阻害し得ると考えられる。ＡＣＥだけでなくほとんど全てのタンパク質分解酵素は、Ｘａａ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ結合を切断することが困難なので、ペプチドのカルボキシ末端における（多数の）プロリン残基の存在が比較的プロテアーゼ耐性の分子をもたらすという考えはほとんど自明である。同様に、プロリン（ｐｒｏｌｉｎ）の代わりにヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含有するペプチドは、比較的プロテアーゼ耐性である。このことから、そのカルボキシ末端に１つまたは複数の（ヒドロキシ）プロリン残基を有するペプチドは、消化管内のタンパク質分解から逃れる見込みがあると推論することができる。これらの結論は、特定のＡＣＥ阻害ペプチドのインビボの血圧降下効果が顕著であることの理解を助けるであろう。これらは、ＡＣＥの阻害の構造的要件を満たすだけでなく、消化管のタンパク質消化系による分解にも耐性であり、そしてその後の腸管壁を越える輸送の間もインタクトなままである。
【０００８】
トリペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（特開平０２−０３６１２７号公報）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＥＰ０５８３０７４号明細書）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７８：７７７−７８３１９９５））について、強力なＡＣＥ阻害活性が報告されている。最初に、全てのＡＣＥ阻害ペプチドはＡＣＥ活性におけるそのインビトロ効果に基づいて特徴付けられ、そしてトリペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下、ＩＰＰと称する）Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下、ＶＰＰと称する）およびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下、ＬＰＰと称する）が、その強力なＡＣＥ阻害効果が比較的低いＩＣ５０値をもたらすので突出していた。後で、トリペプチドＶＰＰおよびＩＰＰの推定降圧効果は、自然発症的に高血圧のラットにおいて確認することができた（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７８：１２５３１２５７（１９９５年））。これらの実験において、阻害性トリペプチドは乳酸菌発酵乳に由来した。乳発酵の間、望ましいペプチドは、成長する乳酸菌によって産生されるプロテイナーゼによって産生される。この発酵アプローチの欠点は、乳酸菌が生命体であり、排泄される酵素の種類および量を制御するのが困難なことである。そのためＡＣＥ阻害ペプチドの産生はほとんど再現不可能であり、最適な酵素セットが産生されて、必要とされるペプチドの最大収量が保証される見込みもない。また、必要とされる発酵時間が比較的長く、低収率と組み合わされて、生物活性ペプチドの好ましくないコスト構造を暗示する。さらに、発酵製品は、とりわけ固体食料への直接的な取り込みでは安定性が低く、厳しい
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制限を与える。このような発酵乳製品の低い嗜好性と、このような発酵ブロスからのＡＣＥ阻害ペプチドの回収中に遭遇される加工上の多くの困難とは、米国特許第６，４２８，８１２号明細書に記載されている。これらの不都合にもかかわらず、発酵乳製品は、経口投与される血管拡張薬のように実際の適用に付されている。ＡＣＥ阻害ペプチドは、電気透析、中空繊維膜透析またはクロマトグラフ法の後に発酵乳製品から濃縮され、錠剤またはロゼンジのような濃縮された食餌サプリメントの形態でのマーケティングを可能にする。
【０００９】
発酵製造経路の上記欠点は、とりわけ、特許出願の国際公開第０１／６８１１５号パンフレットおよびＥＰ１２３１２７９号明細書において認識された。後者の出願では、トリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを乳カゼインから回収するために純粋に酵素的な方法が記載されている。出願は、乳カゼインを含有する材料をプロテイナーゼおよびペプチダーゼで中間ペプチドを介して消化することによってこれらのトリペプチドを製造するための方法を権利請求の対象とする。これらの酵素インキュベーションはそれぞれ１２時間もかかり、そして汚染微生物の増殖に有利な条件下で行われ得る。ペプチダーゼとのインキュベーションの前に中間ペプチドは好ましくは精製され、高最終濃度のＡＣＥ阻害ペプチドは、中間ペプチドのさらなるクロマトグラフィー精製ステップの後に得られるだけである。これらの様々な不都合を考慮して、降圧性ペプチドの収率が高くかつ再現可能であり、刺激のない風味の製品を生成する、より簡単で微生物学的により信頼性のある酵素経路が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、タンパク質源からＩＰＰを含む組成物を製造するための方法に関し、それによりタンパク質から製造されるＩＰＰ対ＶＰＰの比率は少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、より好ましくは少なくとも２０：１（重量／重量）であり、該方法は、好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼの使用を含む。本発明の方法は、さらに、アミノペプチダーゼ活性のないプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼの使用に関する。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質自体のような大きいタンパク質分子を加水分解することができる。本発明に従う方法は、一般に、２４時間よりも短いインキュベーション時間を有し、好ましくは、インキュベーション時間は１０時間よりも短く、より好ましくは４時間よりも短い。インキュベーション温度は一般に、３０℃よりも高く、好ましくは４０℃よりも高く、より好ましくは５０℃よりも高い。
【００１１】
好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼなどのプロリンの末端で切断するプロテアーゼには、汚染エンドプロテアーゼ活性が存在しない。好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼなどのプロリンの末端で切断するプロテアーゼには、汚染カルボキシペプチダーゼ活性が存在しない。好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼなどのプロリンの末端で切断するプロテアーゼには、汚染アミノペプチダーゼ活性が存在しない。汚染エンドプロテアーゼ活性が存在しないプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼは、好ましくは１未満、より好ましくは０．０１未満のＥｎｄｏ／Ｐｒｏｌ特異的活性比（Ｓｐｅｃ  ａｃｔ  ｒａｔｉｏ）を有する酵素調製物である。
【００１２】
汚染カルボキシルペプチダーゼ活性が存在しないプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼは、好ましくは１０未満、より好ましくは１未満のＣＰＤ／Ｐｒｏ特異的活性比を有する酵素調製物である。
【００１３】
汚染アミノペプチダーゼ活性が存在しないプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼは、好ましくは１未満、より好ましくは０．１未満のＡＰ／Ｐｒｏ特異的活性比を有する酵素調製物である。
【００１４】
ＩＰＰの製造の間、有利に、ＬＰＰも形成される。本発明のもう１つの態様は、好ましくは非アスパラギン酸プロテアーゼ、より好ましくはセリンプロテアーゼによって加水分解された加水分解タンパク質からペプチドを精製または単離するための方法である。この加水分解タンパク質は、選択されたｐＨ条件下で沈殿することができる。精製または単離方法は、加水分解タンパク質が沈殿するｐＨにｐＨを変更し、沈殿したタンパク質を溶液中のペプチドから分離することを含む。
【００１５】
従って、本発明は、可溶性ペプチド、好ましくはＩＰＰを含む組成物の調製方法に関し、該方法は、適切なタンパク質源の加水分解によって製造される組成物のｐＨを、加水分解タンパク質の一部が不溶性になるｐＨに変更することと、不溶性部分を可溶性ペプチドから分離して可溶性ペプチドを含む組成物をもたらすこととを含む。
【００１６】
また本発明は、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、そしてより好ましくは少なくとも２０：１であるＩＰＰ対ＶＰＰの比率を有するタンパク質の加水分解によって製造され、好ましくはＬＰＰを含むペプチド組成物、あるいは栄養補給食品、好ましくは薬剤として使用するための本発明に従う可溶性ペプチドを含む組成物にも関する。本発明はさらに、健康の改善や、疾患の予防および／または治療のために栄養補給食品、好ましくは薬剤を製造するため、あるいは高血圧（高血圧症）、心不全、前糖尿病または糖尿病、肥満、耐糖能障害またはストレスの治療または予防のために栄養補給食品、好ましくは薬剤を製造するためのこれらのペプチド組成物の使用に関する。
【００１７】
好ましくは、本発明のペプチド組成物は、食餌サプリメントの形で、ローション、ゲルまたはエマルジョンの形の局所用途を含むパーソナルケア用途の形で、あるいは食料、飲料、飼料またはペットフードの成分として使用される。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
従来技術によると、有効なＡＣＥ阻害ペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に１つまたは２つのプロリン残基を取り込んでいると思われる。同一の構造的要件は、タンパク質分解に対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｙ）も増大したペプチドを与える。これにより、インタクトなペプチドが最終的に血流中に入る可能性が増大する。少なくとも単一の、しかし好ましくは多数のプロリン残基をそのカルボキシ末端に有するペプチドを得るために、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断することができるプロテアーゼの使用は、興味深い選択肢を提供する。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、ペプチドをプロリン残基のカルボキシル側で優先的に切断する唯一の可能性を有する。哺乳類および微生物源から単離された全ての適切に特徴付けられたプロリン特異的プロテアーゼにおいて、大きいペプチドを酵素の活性部位から排除する唯一のペプチダーゼドメインが識別されている。事実上、これらの酵素は、約３０よりも多いアミノ酸残基を含有するペプチドを分解することができず、これらの酵素は、現在「プロリルオリゴペプチダーゼ」と呼ばれている（フュロップ（Ｆｕｌｏｐ）ら、Ｃｅｌｌ、第９４巻、１６１−１７０頁、１９９８年７月２４日）。結果として、これらのプロリルオリゴペプチダーゼは、その加水分解作用を発揮する前に、他のエンドプロテアーゼによる広範な前加水分解を必要とする。しかしながら、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットに記載されるように、プロリルオリゴペプチダーゼと、このような別のエンドプロテアーゼとを組み合わせても、カルボキシ末端プロリン残基を有するペプチドの割合が著しく高いことを特徴とする加水分解物がもたらされる。このために、このような加水分解物は、インビトロのＡＣＥ阻害効果ならびに消化管タンパク質分解に対する改善された耐性を有するペプチドの単離の優れた出発点を形成する。これらの潜在的な利点にもかかわらず、本発明者らは、ＩＰＰの選択的製造はもちろんのこと、ＡＣＥ阻害ペプチドの回収のためのプロリン特異的プロテアーゼの使用を明確にする出願を知らない。
【００１９】
本発明は、タンパク質源からＩＰＰを含む組成物を製造するための方法に関し、それによりタンパク質から製造されるＩＰＰ対ＶＰＰの重量比は少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、より好ましくは少なくとも２０：１であり、該方法は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはプロリルオリゴペプチダーゼ活性を有する酵素活性と、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列のアミノ末端側の結合を加水分解することができる酵素活性との使用を含む。有利には、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性またはプロリルオリゴペプチダーゼ活性を有する酵素活性と、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列のアミノ末端側の結合を加水分解することができる活性とは１つの酵素中に存在し、好ましくは、この酵素はプロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリルオリゴペプチダーゼ（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｄａｓｅ）であり、より好ましくはこの酵素はプロリン特異的エンドプロテアーゼである。さらに、本発明は、可溶性ペプチド、好ましくはＩＰＰを含む組成物を調製するための方法に関し、該方法は、加水分解条件のｐＨを加水分解タンパク質の一部が可溶性になるｐＨに変更することと、可溶性ペプチドから不溶性部分を分離して、可溶性ペプチドを含む組成物をもたらすこととを含む。分離ステップの温度は、好ましくは０℃と２０℃の間であり、より好ましくは１℃と１０℃の間である。
【００２０】
また本発明は、食品、飲料品または食餌サプリメントを調製することにも関し、上記のようなＩＰＰを含む組成物を製造することと、このＩＰＰ含有組成物を食品、飲料品または健康食品中に取り込むこととを含む。
【００２１】
さらに、本発明は、
−  最初に、プロリン特異的エンドプロテアーゼによりタンパク質を５〜３０％のＤＨまで加水分解することと、
−  任意で、好ましくはプロテアーゼによる第２の酵素処理と、
−  その後、選択されたｐＨ条件下で、好ましくは酸性ｐＨ条件下で、より好ましくは３．５と６の間のｐＨで、そして最も好ましくは４と５の間のｐＨで、加水分解タンパク質の不溶性部分を可溶性部分から分離して、可溶性ペプチドを含む組成物をもたらすことと、
によって製造される可溶性ペプチドを含む組成物を製造するための方法に関する。
【００２２】
従って、本発明は、後者の方法から得ることができる組成物を提供し、該組成物は可溶性ペプチドを含み、３．５と６の間のｐＨ、好ましくは４と５の間のｐＨ、最も好ましくはｐＨ＝４．５において、ペプチドの少なくとも７０重量％、好ましくは少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも９０重量％が可溶性（４℃で決定）であり、可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも、可溶性ペプチドの４０重量％よりも多い量で存在せず、好ましくは、可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも、可溶性ペプチドの３０重量％よりも多い量で存在せず、最も好ましくは、可溶性ペプチドのどの単一のペプチドも、可溶性ペプチドの２０重量％よりも多い量で存在しない。
【００２３】
後者の方法および後者の組成物は、プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用のためにカルボキシ末端プロリンを有する多量のペプチドも含有する、多量の可溶性ペプチドを有する組成物を得ることができるという洞察の結果である。
【００２４】
上記のように、タンパク質は、初めにプロリン特異的エンドプロテアーゼによって加水分解され得る。加水分解タンパク質が次にさらなる（第２の）プロテアーゼによって加水分解される場合には、カルボキシ末端プロリンを有するペプチドは、第２の酵素によってさらに加水分解され得る。好ましくは、第２の酵素処理は、純粋で選択的な酵素によって実行される。この第２の酵素は、好ましくは、アミノペプチダーゼ（例えば、コロラーゼ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ）ＬＡＰ、実施例１２および１３を参照）またはエンドプロテアーゼであり、最も好ましくは、アミノペプチダーゼが使用される。
【００２５】
実施例１２および１３では、ＩＰＰに加えて、選択的にさらなるＩＰＰおよびＶＰＰがカゼインから形成されることが示される。
【００２６】
この第２の酵素の選択は、常に、使用されるタンパク質と関連して行われる。このようにして、問題のタンパク質から可溶性ペプチドを含む、目的に合わせた組成物を製造することが可能である。この第２の酵素処理は、好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼによる加水分解の後に行うことができるが、第２の酵素処理は、プロリン特異的エンドプロテアーゼによる加水分解と同時に行われるという別の選択肢もある。本発明のさらなる実施形態によると、この第２の酵素処理は、酸沈殿ステップの後に行うことができる。この場合、可溶性ペプチド組成物はこの第２の酵素によってさらに加水分解され、再度可溶性ペプチド含有組成物をもたらす。
【００２７】
好ましくは、可溶性ペプチドの少なくとも１０モル％、より好ましくは少なくとも２０モル％、さらにより好ましくは少なくとも３０モル％は、カルボキシ末端プロリンを有する。特許出願の国際公開第０２／４５５２３号パンフレットには、このモル％をどのようにして決定することができるかが記載されている。
【００２８】
本発明は、栄養補給食品、好ましくは薬剤としての、本発明のペプチドを含有する組成物に関する。また本発明は、栄養補給食品、好ましくは薬剤としての本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、栄養補給食品、好ましくは薬剤の製造のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、健康の改善もしくは疾患の予防および／または治療のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、栄養補給食品、好ましくは薬剤の製造のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、高血圧症および心不全などの心血管疾患の治療のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、前糖尿病または糖尿病の治療のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、肥満の治療または予防のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、血漿インスリンの増大または血漿インスリンに対する感受性の増大のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、血漿インスリンの増大または２型糖尿病または前糖尿病の血漿インスリンに対する感受性の増大のための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、２型糖尿病または前糖尿病の食後の血中グルコース濃度を低下するための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、２型糖尿病または前糖尿病の食後の血中のインスリン分泌を増大するための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、本発明のペプチド含有組成物が食餌サプリメントの形態である本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、ストレスの影響の治療的処置のための機能性食品を製造するための本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、局所用途、好ましくはパーソナルケア用途における本発明のペプチドを含有する組成物の使用と、飼料およびペットフードにおける本発明のペプチドを含有する組成物の使用とに関する。
【００２９】
さらに、本発明は、１型および２型の糖尿病を治療し、前糖尿病または耐糖能障害（ＩＧＴ）の個体において２型糖尿病を予防するための方法であって、このような治療を必要としている患者に本発明のペプチド含有組成物を投与することを含む方法と、高血圧症または心不全を患う人々の治療またはその予防の方法であって、このような治療を必要とする患者に本発明のペプチド含有組成物を投与し、それにより血圧降下効果を示すことを含む方法とに関する。ＡＣＥの阻害は、血管収縮の減少、血管拡張の増強、ナトリウムおよび水の排泄の改善をもたらし、これは次に、抹消血管抵抗および血圧の低下ならびに局所的な血流の改善につながる。従って、ペプチドを含む本発明の加水分解物は、高血圧症、心不全、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、抹消動脈閉塞性疾患、アテローム硬化症、腎症、腎不全、勃起不全、内皮障害、左室肥大、糖尿病性血管症、体液の停滞、および高アルドステロン症を含むが、これらに限定されないＡＣＥの阻害により影響を受けることができる疾患の予防および治療のために特に効果的である。また組成物は、消化管疾患（下痢、過敏性腸症候群）、炎症、糖尿病、肥満、痴呆、てんかん、老人性錯乱、およびメニエール病の予防および治療においても有用であり得る。さらに、組成物は、認知機能および記憶（アルツハイマー病を含む）、満腹感を高め、虚血性損傷を制限し、バイパス手術または血管形成術後の動脈の再閉塞を防止することができる。
【００３０】
糖尿病は広く行きわたった慢性疾患であり、これまで治療法がない。糖尿病の発生率および有病率は指数関数的に上昇しており、先進国および発展途上国において最も一般的な代謝性障害の１つである。糖尿病は、多数の原因となる因子から誘発される複雑な疾患であり、インスリン分泌の欠乏および／またはインスリン抵抗性に関連する炭水化物、タンパク質および脂肪の代謝の障害によって特徴付けられる。この結果、空腹時および食後の血清グルコース濃度が上昇し、これは、治療せずに放置すると合併症につながる。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｔ１ＤＭ）およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、Ｔ２ＤＭ）の２つの主な疾患のカテゴリーが存在する。Ｔ１ＤＭ＝１型糖尿病。Ｔ２ＤＭ＝２型糖尿病。
【００３１】
Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの糖尿病は、高血糖、高コレステロール血症および高脂血症に関連する。Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭにおける絶対的なインスリンの欠乏およびインスリンに対する非感受性はそれぞれ、肝臓、筋肉および脂肪組織によるグルコースの利用の減少、ならびに血糖レベルの上昇を導く。制御されない高血糖は、腎症、神経障害、網膜症、高血圧症、脳卒中、および心疾患を含む微小血管および大血管の疾患の危険の増大のために、死亡率の増大および早期の死亡に関連する。最近の証拠により、厳しい血糖コントロールは、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの両方において、これらの合併症の予防における主要な因子であることが示された。従って、薬物または治療計画による最適な血糖コントロールは、糖尿病の治療のための重要なアプローチである。
【００３２】
Ｔ２ＤＭの治療法は、初めに食事およびライフスタイルの変化を必要とし、これらの手段が適切な血糖コントロールを維持することができない場合、患者は、経口血糖降下剤および／または外因性インスリンにより治療される。Ｔ２ＤＭの治療のための現在の経口薬理作用物質には、インスリン分泌を増強する（ｐｏｔｅｎｔａｔｅ）もの（スルホニル尿素剤）、肝臓におけるインスリンの作用を改善するもの（ビグアナイド剤）、インスリン感作物質（チアゾリジンジオン）およびグルコースの摂取を阻害するように作用する物質（α−グルコシダーゼ阻害薬）が含まれる。しかしながら、現在利用可能な薬剤は、一般に、すい臓細胞機能の進行性の損失から起こる高血糖の進行性の悪化のために、適切な血糖コントロールを長期間維持することができない。目標の血糖レベルを維持することができる患者の割合は、追加／代替の薬理作用物質の投与を必要とする時間とともに著しく減少する。さらに、薬物は不要な副作用を有することがあり、一次的および二次的な高失敗率に関連する。最後に、血糖降下薬の使用は血糖レベルの制御において有効であり得るが、糖尿病の合併症の全てを予防することはできない。従って、全ての型の糖尿病のための現在の治療方法は、正常血糖の理想および糖尿病の合併症の予防を達成することができない。
【００３３】
従って、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの治療において好まれる治療法は、本質的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、糖尿病の治療および予防のために、最小限の副作用を有する安全で有効な栄養サプリメントが必要とされている。多くの患者は、高用量の薬物に関連する副作用を最小限にし、付加的な臨床的利益をもたらし得る別の治療法に関心を持っている。糖尿病の患者は、穏やかな抗糖尿病効果があるが大きな副作用がなく「自然」であると考えられ、補助的な治療として使用することができる治療に特別な関心を持っている。Ｔ２ＤＭは、インスリンの産生に関与するすい臓の細胞（ランゲルハンス島のβ−細胞）に著しい損傷が生じるまで通常は認識されない進行性および慢性の疾患である。そのため、危険のある人々、特にＴ２ＤＭを発生する危険の高い高齢者では、β−細胞の損傷、従って明白なＴ２ＤＭへの進行を防止するために使用することができる食餌サプリメントの開発への関心が高まっている。グルコースおよび脂質はβ−細胞に対して損傷作用を及ぼすので、すい臓のβ−細胞の保護は、血中のグルコースおよび／または脂質レベルを低下させることによって達成することができる。血糖レベルの低下は、例えば、インスリン感受性を高めることおよび／または肝臓のグルコース産生を低下させることによって、様々なメカニズムにより達成することができる。また、血中脂質レベルの低下は、例えば、脂質の酸化および／または脂質の貯蔵を高めることによって、様々なメカニズムにより達成することができる。すい臓のβ−細胞を保護するためのもう１つの可能な戦略は、酸化ストレスを低下させることであろう。酸化ストレスもβ−細胞の損傷を引き起こし、その後、インスリン分泌の損失と、明白なＴ２ＤＭへの進行が生じる。
【００３４】
従って、Ｔ２ＤＭは、多数の器官の部位における共存する欠陥：筋肉および脂肪組織におけるインスリン作用に対する耐性、欠陥のあるすい臓のインスリン分泌、無制限の肝臓のグルコース産生から生じる複雑な疾患である。これらの欠陥は、多くの場合、脂質異常および内皮障害に関連する。Ｔ２ＤＭにおける多数の病態生理学的な病変を仮定すると、併用療法は、その管理にとって魅力的なアプローチである。
【００３５】
本発明は、本発明のペプチド含有組成物を含む新規の栄養補給組成物に関する。本発明のペプチド含有組成物を含む栄養補給組成物は、糖尿病、またはシンドロームＸなどの耐糖能障害に関連する他の状態の治療または予防のための活性成分として非加水分解タンパク質および炭水化物も含むことができる。もう１つの態様では、本発明は、前記治療または予防のための栄養サプリメントとして、例えば、通常の代謝機能を維持するために必須であるが体内では合成されないビタミンおよびミネラルを含むマルチビタミン調製物への添加剤としてのこのような組成物の使用に関する。さらにもう１つの態様では、本発明は、このような治療を必要としている患者に本発明のペプチド含有組成物およびタンパク質加水分解物または非加水分解タンパク質および／または炭水化物を投与することを含む、１型および２型の両方の糖尿病の治療のため、そして前糖尿病、または耐糖能障害（ＩＧＴ）または肥満の個体におけるＴ２ＤＭの予防のための方法に関する。
【００３６】
本発明の組成物は、特に、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの両方の治療のため、そして前糖尿病または耐糖能障害（ＩＧＴ）の個体におけるＴ２ＤＭの予防のためのものである。
【００３７】
本発明のペプチド含有組成物は、好ましくは、食後のグルコース濃度を低下させるため、あるいは食後の血中のインスリン分泌を増大させるために、２型糖尿病または前糖尿病のために使用可能であることが分かる。
【００３８】
ペプチドおよび任意で炭水化物を含む組成物はインスリン分泌を刺激し、脂肪組織、骨格筋および肝臓などのインスリン感受性標的組織へのグルコースの処分を増大させ、従って、糖尿病の治療において相乗効果を提供する。
【００３９】
一般に、ストレス関連疾患、および体にかかるストレスの悪影響は、多くの人々に著しい影響を与えることが認識されている。近年、ストレスの影響、およびに様々な疾患および状態の様々な発生に対するその寄与は、医学界および科学界において広く受け入れられてきた。消費者は、現在、これらの潜在的な問題に次第に気付いてきており、その健康に対するストレスの悪影響の可能性を低減または防止することに次第に関心を持ってきている。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、体がストレスの悪影響に対処するのを助ける際に使用するのに適切な食品またはそれに取り込むことができる成分を提供することである。
【００４１】
さらなる目的は、体がストレスの悪影響に対処するのを助けるなどの健康上の利益を提供する本発明のペプチド含有組成物を含む食品を提供することである。
【００４２】
本明細書中で使用される栄養補給（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）という用語は、栄養および薬剤分野の両方の用途における有用性を示す。従って、新規の栄養補給組成物は、食料および飲料へのサプリメントとして、そしてカプセル剤または錠剤などの固体製剤もしくは溶液または懸濁液などの液体製剤であり得る経腸または非経口用途のための医薬製剤または薬剤としての使用を見出すことができる。上記から明らかであるように、栄養補給組成物という用語は、上記の前記活性成分を含む栄養補助組成物、例えば食餌サプリメントのみでなく、本発明のペプチド含有組成物と、任意で炭水化物とを含む食料および飲料も含む。
【００４３】
本明細書中で使用される食餌サプリメントという用語は、食餌を補うことを目的とする「食餌成分」を含有する口で摂取される製品を示す。これらの製品中の「食餌成分」は、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物性薬品、アミノ酸、ならびに酵素、器官組織、腺（ｇｌａｎｄｕｌａｒ）、および代謝産物などの物質を含むことができる。食餌サプリメントは抽出物または濃縮物でもよく、錠剤、カプセル剤、ソフトゲル、ゲルキャップ（ｇｅｌｃａｐ）、液体、または粉末などの多くの形態で見られる。これらは棒状などの他の形態でもよいが、そうである場合、食餌サプリメントのラベルの情報は、通常、従来の食料もしくは食事または食餌の唯一の品目としての製品を表さないであろう。
【００４４】
本発明の栄養補給組成物には、ある食餌において欠けている適切な量の必須栄養素を得るために、マルチビタミンおよびミネラルサプリメントが添加されてもよい。また、マルチビタミンおよびミネラルサプリメントは、糖尿病において観察されることもあるライフスタイルパターンおよび一般的な不適切な食餌パターンによる栄養の損失および欠如に対する疾患の予防および保護にも有用であり得る。さらに、酸化ストレスは、インスリン抵抗性の発生に関与している。活性酸素種は、インスリン受容体のシグナル伝達カスケードを妨害することによって、インスリン刺激によるグルコースの摂取を損ない得る。α−トコフェロール（ビタミンＥ）アスコルビン酸（ビタミンＣ）などの酸化防止剤による酸化ストレスの制御は、糖尿病の治療において価値があるであろう。従って、マルチビタミンサプリメントの摂取は、よくバランスのとれた栄養分を維持するために上記の活性物質に添加され得る。
【００４５】
さらに、本発明のペプチド含有組成物と、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）および／またはカリウム（Ｋ＋）などのミネラルとの組み合わせは、健康の改善のため、そして心血管疾患および糖尿病を含むがこれらに限定されない疾患の予防および／または治療のために使用することができる。
【００４６】
本発明の好ましい態様では、本発明の栄養補給組成物は、本発明のペプチド含有組成物を含有する。ＩＰＰは、投与を受ける患者の体重１ｋｇあたり約０．００１ｇ〜体重１ｋｇあたり約１ｇの１日の投与量を提供するような量で本発明に従う組成物中に適切に存在する。食料または飲料は、１回の摂取量あたり約０．０５ｇ〜１回の摂取量あたり約５０ｇのＩＰＰを適切に含有する。栄養補給組成物が医薬製剤であれば、このような製剤は、投与単位あたり、例えばカプセル剤または錠剤あたり約０．００１ｇ〜約１ｇの量、あるいは液体製剤の１日の用量あたり約０．０３５ｇ〜１日の用量あたり約７０ｇの量のＩＰＰを含有し得る。本発明のペプチド含有組成物は、投与を受ける患者の体重１ｋｇあたり約０．０１ｇ〜体重１ｋｇあたり約３ｇの１日の投与量を提供するような量で本発明に従う組成物中に適切に存在する。食料または飲料は、１回の摂取量あたり約０．１ｇ〜１回の摂取量あたり約１００ｇのタンパク質加水分解物を適切に含有する。栄養補給組成物が医薬製剤であれば、このような製剤は、投与単位あたり、例えばカプセル剤または錠剤あたり約０．０１ｇ〜約５ｇの量、あるいは液体製剤の１日の用量あたり約０．７ｇ〜１日の用量あたり約２１０ｇの量のペプチド含有組成物を含有することができる。
【００４７】
本発明のさらにもう１つの好ましい態様では、組成物は、上記で指定された本発明のペプチドと、任意で炭水化物とを含む。炭水化物は、投与を受ける患者の体重１ｋｇあたり約０．０１ｇ〜体重１ｋｇあたり約７ｇの１日の投与量を提供するような量で本発明に従う組成物中に適切に存在する。食料または飲料は、１回の摂取量あたり約０．５ｇ〜１回の摂取量あたり約２００ｇの炭水化物を適切に含有する。栄養補給組成物が医薬製剤であれば、このような製剤は、投与単位あたり、例えばカプセル剤または錠剤あたり約０．０５ｇ〜約１０ｇの量、あるいは液体製剤の１日の用量あたり約０．７ｇ〜１日の用量あたり約４９０ｇの量の炭水化物を含有し得る。
投与量の範囲（７０ｋｇのヒトに対する）
ＩＰＰ：０．００５〜７０ｇ／日
タンパク質加水分解物：０．０７〜２１０ｇ／日
非加水分解タンパク質：０．０７〜２１０ｇ／日
炭水化物：０．１〜４９０ｇ／日
【００４８】
本発明の目的は、消費した患者に健康上の利益を提供するために使用することができる食用材料を提供することである。またさらなる目的は、単独の形態か、あるいは食品に取り込まれるかのいずれかで、便利に摂取することができるこのような食用材料を提供することである。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、体重管理計画において使用するのに適切な食品またはそこに取り込むことができる成分を提供することである。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、例えばＡＣＥの阻害によって、心血管の健康の維持を助けるのに適切な食品またはそこに取り込むことができる成分を提供することである。
【００５１】
本発明のさらなる目的は、許容可能な安定性および／または感覚受容特性、特に、苦味がないことまたは許容可能なレベルであるなどの良好な風味を有する食品またはそこに取り込むことができる成分を提供することである。
【００５２】
さらなる目的は、肥満／体重管理の予防を補助する、および／または心血管の健康の維持を助けるなどの、健康上の利益を提供する高濃度の成分を有する食品を提供することである。
【００５３】
驚くことに、これらの目的の１つまたは複数は、本発明に従って、消費したときに健康上の利益を提供する食品の調製のための本発明のペプチド含有組成物の使用により達成される。
【００５４】
第１の態様によると、本発明は、肥満の予防または体重管理のための機能性食品を製造するための本発明のペプチド含有組成物の使用を提供する。
【００５５】
第２の態様によると、本発明は、心血管の健康維持のための機能性食品を製造するための本発明のペプチド含有組成物の使用を提供する。
【００５６】
本発明によると、心血管の健康維持は、アンジオテンシン変換（ＡＣＥ）酵素の阻害および／または血糖レベルの制御を含むことが特に好ましい。
【００５７】
第３の態様によると、本発明は、その消費者に健康上の利益を提供することができ、本発明のペプチド含有組成物を含む機能性食品を提供する。前記健康上の利益は、肥満の予防、体重管理および心血管の健康維持から選択される。
【００５８】
本発明に従うペプチド含有組成物のさらなる利点は、このペプチド含有組成物が、その安定性および／または感覚受容特性に許容できない影響を与えることなく、機能性食品を製造するために食品中に便利に取り込み可能なことである。
【００５９】
本発明に従う「健康上の利益のある作用物質（ｈｅａｌｔｈ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ａｇｅｎｔ）」は、健康上の利益を提供する、すなわち摂取したときに健康の状況によい影響をもたらすか、あるいは良好な健康の状況を維持するのを助ける材料であり、これらの良好な健康の状況は、肥満の予防、体重管理および心血管の健康維持である。「健康上の利益」は、健康の状況によい影響をもたらすこと、あるいは良好な健康の状況を維持するのを助けることを意味する。
【００６０】
本発明に従う「機能性食品」は、食品の消費者にとって顕著な健康上の利益が得られるように本発明のペプチド含有組成物が有効量の成分として使用され、ヒトが食べるのに適した食品（誤解を避けるために、飲料を含む）であると定義される。
【００６１】
本明細書中で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その後に記載される要素に対する限定を意味するのでなく、機能的な重要性が大きいまたは小さい非特定の要素を包含することを意味する。言い換えると、列挙されるステップ、要素または選択肢は、徹底的である必要はない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という語が使用される場合はいつでも、これらの用語は上記で定義した「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であることを意味する。
【００６２】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書中では、ペプチド結合により結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖と定義される。「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、類義語であると考えられ（一般に認識されるように）、各用語は、文脈の要求に応じて交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書では、３０よりも多いアミノ酸残基を含有する鎖と定義される。本明細書では、全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、一般的な習慣に従って、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に左から右に記載される。本明細書中で使用されるアミノ酸の一文字コードは当該技術分野では一般に知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ラボラトリーマニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）において見ることができる。
【００６３】
ＩＵＭＢからの全ての酵素の分類および命名のための国際的に認識されたスキームには、プロテアーゼが含まれる。プロテアーゼのＥＣ番号のための最新のＩＵＭＢテキストは、インターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ／ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／４／１１／において見ることができる。このシステムでは、酵素は、単一の反応を触媒するという事実によって定義される。これは、いくつかの異なるタンパク質が全て同一酵素として記載され、２つ以上の反応を触媒するタンパク質は、２つ以上の酵素として扱われるという重要な意味を有する。システムは、プロテアーゼをエンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼに分類する。エンドプロテアーゼは内部ペプチド結合を加水分解する酵素であり、エキソプロテアーゼは、末端アミノ基に隣接するペプチド結合を加水分解する（「アミノペプチダーゼ」）か、あるいは末端カルボキシル基と最後から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合を加水分解する（「カルボキシペプチダーゼ」）。エンドプロテアーゼは、触媒メカニズムに基づいてサブサブクラス（ｓｕｂ−ｓｕｂｃｌａｓｓ）に分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブサブクラスがある。
【００６４】
アミノペプチダーゼは、クラス３．４．１１に入る。細分類は、２０の異なるアミノ酸が除去される相対的な効率に基づく。狭い特異性および広い特異性を有するアミノペプチダーゼを区別することができる。アミノペプチダーゼは、単一のアミノ末端アミノ酸をタンパク質およびペプチド基質から順次除去することができる。狭い特異性を有するアミノペプチダーゼは、基質ペプチドから遊離されるＰ１位におけるアミノ酸残基のタイプに対して強い優先度を示す。広い特異性のアミノペプチダーゼは、Ｎ末端またはＰ１位において様々なアミノ酸を放出することができる（シェクター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）の命名法による：Ｉ．シェクター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）およびＡ．バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）、１９６７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７：１５７−１６２頁）。カルボキシペプチダーゼは、単一のカルボキシ末端アミノ酸をタンパク質およびペプチド基質から順次除去することができる。エンドプロテアーゼの状況と同等に、カルボキシペプチダーゼは、触媒メカニズムに基づいてサブサブクラスに分けられる。セリン型カルボキシペプチダーゼはクラスＥＣ３．４．１６に入り、メタロカルボキシペプチダーゼはクラスＥＣ３．４．１７に入り、システイン型カルボキシペプチダーゼはクラスＥＣ３．４．１８に入る。プロテアーゼのＥＣリストの価値は、様々なタイプのプロテアーゼ活性の標準的な用語法の提供、そして特に各プロテアーゼに対する唯一の識別番号および推奨名の割り当てにある。
【００６５】
ＥＰ１２３１２７９号明細書には、トリペプチドＶＰＰおよびＩＰＰを乳カゼインから回収するための純粋に酵素的な方法が記載されている。後者の出願は、配列−Ｖ−Ｐ−Ｐ−を含有するが、この配列内以外のＰｒｏを含有しないペプチドと、配列−Ｉ−Ｐ−Ｐ−を含有するが、この配列内以外のＰｒｏを含有しないペプチドとからなる群から選択されるいわゆる「中間ペプチド」を介して、乳カゼインを含有する材料をプロテイナーゼおよびペプチダーゼで消化することによってトリペプチドを製造するための方法を権利請求の対象とする。ＥＰ１２３１２７９号明細書の実施例に記載されるように、該方法は２段階の方法を含む。まず、ＶＰＰまたはＩＰＰのいずれかを含む中間ペプチドが製造される。これは、カゼインを適切なプロテイナーゼと共にインキュベートすることによって行われる。実施例の１つのよると、摂氏３７度で１２時間の期間である。次に、使用されるプロテイナーゼは、この第１の加水分解物を摂氏１００度で３分間加熱することにより不活性にされ、再度冷却した後、別の酵素調製物（実際には、エキソタンパク質分解活性を持つ調製物）が添加される。摂氏３７度でさらに１２時間のこの別の酵素調製物とのインキュベーションの後、トリペプチドＶＰＰおよびＩＰＰの存在が実証され得る。これらのＡＣＥ阻害ペプチドをより高収率で得るために、ＥＰ１２３１２７９号明細書はさらに、エキソタンパク質分解活性にさらす前に、中間ペプチドを精製および濃縮することを提言している。また、ＥＰ１２３１２７９号明細書は、中間ペプチドを得た後、そして手順の中で中間ペプチドがペプチダーゼと接触される前に、例えば５０００〜２００００ｒｐｍで３〜１０分間の遠心分離による未反応タンパク質の除去などの様々な操作が任意で実行されてもよいことも提言している。そのようにして、産業的にかなり扱いにくい２段階の酵素的方法で所望のトリペプチドが得られる。酵素インキュベーションのそれぞれは、４．５〜７．０のｐＨおよび摂氏２５〜５０度の温度で１２時間もの時間がかかり得るので、この手順が微生物学的な観点からも許容できないことは明らかである。２５〜５０℃の低いインキュベーション温度と組み合わせたこれらの長いインキュベーション時間は、タンパク質含有溶液の感染を容易にもたらし得る。
【００６６】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットには、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から得られるプロリン特異的プロテアーゼが記載されている。Ａ．ニガー由来の酵素はプロリンのカルボキシ末端で優先的に切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端においても切断することができ、アラニンのカルボキシ末端では効率が低い。また、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットは、このＡ．ニガー由来の酵素と、他の微生物または哺乳類（ｍａｍｍｅｌｉａｎ）源からの既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間には明白な相同性は存在しないことも教示する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは対照的に、Ａ．ニガー酵素は、酸ｐＨの最適条件を有する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼおよびＡ．ニガー由来の酵素はいわゆるセリンプロテアーゼであるが、本発明者らは、本明細書（実施例１）において、Ａ．ニガー酵素は、完全に異なるサブファミリーに属することを示す。分泌されるＡ．酵素は、ほとんどの細胞質ゾルのプロリルオリゴペプチダーゼが分類されているＳ９ファミリーではなく、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであると思われる（Ｎ．Ｄ．ローリング（Ｒａｗｌｉｎｇ）およびＡ．Ｊ．バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２９８（１９９６年）１−３）。実施例２では、本発明者らは、Ａ．ニガー由来のプロリン特異的プロテアーゼのｐＨおよび温度の最適条件を示す。実施例３では、本発明者らは、純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンドタンパク質分解活性以外の顕著なエンドタンパク質分解活性が存在しないという、本発明の方法において使用されるＡ．ニガー由来の酵素調製物が本質的に純粋な意味であることを実証する。また、本発明者らは、本発明に従って使用される本発明者らのＡ．ニガー由来の酵素調製物が、エキソタンパク質分解性、より具体的には、アミノペプチド分解性の副活性を含有しないことを実証する。ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載される、明確に同定された全てのプロテイナーゼサンプルは、異なるタンパク質分解活性を示す様々な酵素の複雑な混合物である。当業者は、ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載されている方法が、エンドタンパク質分解活性と、１つまたは複数のエキソタンパク質分解酵素活性との組み合わせによって決まることを理解するであろう。このようなエキソタンパク質分解活性は、本発明の方法で使用されるＡ．ニガー由来の酵素調製物中には存在しない。逆も同様に、本発明に従う方法で使用される酵素は、ＥＰ１２３１２７９号明細書において記載される複雑なプロテイナーゼサンプル中には存在しない。この酵素が非組換え型アスペルギルス株中には本質的に存在しないという考えに対する実験的な証明は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットにおいて見ることができる。本発明の方法はプロリン特異的エンドプロテアーゼだけと共に可能なので、温度、ｐＨなどの最適なインキュベーション条件は容易に選択することができ、２つ以上の酵素が適用される場合のように最適以下の条件に固定する必要がない。反応条件の選択においてより多くの自由度があることは、他の基準のより容易な選択���可能にする。例えば、微生物感染に対する感受性の低い条件を今選択し、そしてその後のタンパク質の沈殿ステップに関連するｐＨ条件を最適化することはるかに容易である。実施例４において、本発明者らは、アスペルギルス酵素がオリゴペプチダーゼではないが、補助的なエンドプロテアーゼを必要とせずに、インタクトなタンパク質、大きいペプチドならびにより小さいペプチド分子を加水分解することができる真のエンドペプチダーゼであることを示す。この新しい驚くべき発見は、補助的なエンドプロテアーゼが必要とされないので、カルボキシ末端プロリン残基のあるペプチドを前例のない高い含量で有する加水分解物を調製するためにＡ．ニガー酵素を用いるという可能性を開く。このような新しい加水分解物は、植物由来でも動物由来でも、様々なタンパク質出発材料から調製することができる。このような出発材料の例は、乳漿タンパク質、乳漿ベータ−ラクトグロブリン、乳漿アルファラクトアルブミン、カゼイン、ゼラチン、魚または卵タンパク質、ジャガイモタンパク質、コムギおよびトウモロコシグルテン、大豆およびエンドウマメタンパク質、米タンパク質ならびにルピナスタンパク質である。当然ながら、出発タンパク質は、少なくとも−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列を有さなければならない。好ましくは、タンパク質は、そのタンパク質配列内に−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列も含む。上記で説明したように、タンパク質は、そのタンパク質中に−Ｖ−Ｐ−Ｐ−配列を有してもよい。プロリンおよびヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｙｐｒｏｌｉｎｅ）を高い含量で有するゼラチンのような基質から、カルボキシ末端プロリンまたはヒドロキシプロリン残基のいずれかがあるペプチドを前例のない高い含量で有する加水分解物を生成することができる。Ａ．ニガー酵素（既知のプロリルオリゴペプチダーゼのような）酵素はＰｒｏ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−ＰｒｏまたはＨｙｐ−Ｈｙｐ結合を切断できないので、このアプローチは、２つ、３つまたはそれよりさらに多いカルボキシ末端プロリンまたはヒドロキシプロリン残基を有するペプチドを前例のない高い含量で含有する加水分解物ももたらすであろう。明らかに、タンパク質出発材料の性質およびプロリン含量は、このようなペプチドを生成する可能性を規定する。好ましい基質は、カゼイン、ゼラチン、コムギおよびトウモロコシグルテンなどの６％よりも多いプロリンを含有する（すなわち、タンパク質１００グラムあたりこのアミノ酸が６グラムよりも多い）基質である。このようなカルボキシ末端アミノ酸配列を有するペプチドは、消化管内でのタンパク質分解活性に耐え抜く十分な見込みがあることが期待できるという事実を考慮して、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションにより形成される加水分解物は、既知の生物学的に活性なペプチドの単離のため、そして新しい生物学的に活性なペプチドの同定のために優れた出発材料を提供する。ナトリウムは、高血圧症において重要な役割を果たすことが分かっているので、ＡＣＥ阻害ペプチドの製造のために好ましい基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩ではなくカルシウムおよびカリウム塩である。
【００６７】
Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼのｐＨ最適条件は、４．３付近である（図１を参照）。この低いｐＨ最適条件のために、ウシの乳カゼイン塩をＡ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼと共にインキュベートすることは自明のことではない。ウシの乳カゼイン塩は、ｐＨが６．０よりも低くなれば沈殿するであろう。そして、このｐＨ値では、Ａ．ニガー酵素は限られた活性しか持たない。しかしながら、本発明者らは、実施例５において、このかなり好ましくない条件下でさえも、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションはいくつかのＡＣＥ阻害ペプチドをもたらし得ることを示す。本発明によると、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰおよびＬＰＰは、理論的にカゼイン中に存在する量のそれぞれ１０％およびほとんど６０％に相当する収率で製造される。実施例５において提供される説明によると、ＩＰＰの収率は、ＩＰＰがカッパーカゼインのみから遊離可能であるという事実に起因する。これを考慮に入れると、約４０％の収率が得られる。好ましくは、本発明の方法では、酸沈殿されたカゼインが基質として使用される。かなり驚くことに、ＶＰＰ前駆体のＶＶＶＰＰがＬＰＰと同様の収率、すなわち理論的に存在するもののほとんど６０％の収率で製造されるという事実にもかかわらず、ＶＰＰは製造されない。
【００６８】
好ましくは、タンパク質配列内に存在する−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、あるいはさらにより好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも６０％がペプチドＬＰＰに変換される。
【００６９】
好ましくは、タンパク質配列内に存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、あるいはさらにより好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも６０％が、ペプチドＩＰＰに変換される。プロリン特異的プロテアーゼは、好ましくは、基質タンパク質自体のような大きいタンパク質分子を加水分解することができる。
【００７０】
これらの結果は、簡単な１段階の酵素的方法でＡ．ニガー由来のエンドプロテアーゼと共にカゼイン塩をインキュベートする際に得られる。タンパク質を含有する水溶液は、特に５．０よりも高いｐＨ値および摂氏５０度以下の温度で何時間も保持されると、微生物感染の影響を非常に受けやすい。特に、このように長くかかるインキュベーションステップの間に産生可能であり、次の加熱ステップに耐える見込みがある微生物の毒素は、食品グレードの方法にとって潜在的な脅威となる。ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載される条件とは違って、本発明に従う方法は、好ましくは、摂氏５０度よりも高いインキュベーション温度を用いる。酵素インキュベーションが、２４時間よりも短い、好ましくは８時間よりも短い、より好ましくは４時間よりも短い時間で実行される１段階の酵素的方法との組み合わせで、本発明に従う方法は、改善された微生物学的安定性という利点を提供する。
【００７１】
ウシの乳カゼインには、ベータ−カゼインおよびカッパー−カゼインを含む多数の異なるタンパク質が取り込まれている。既知のアミノ配列によると、ベータ−カゼインは、ＡＣＥ阻害性トリペプチドＩＰＰ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）、ＶＰＰ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）およびＬＰＰ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）を包含する。カッパー−カゼインは、ＩＰＰのみを包含する。実施例５において、本発明者らは、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼと共にカゼインカリウムをインキュベートすることにより、既知のＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰが高収率で生成されることを示す。高温条件と組み合わせて本発明の酵素−基質比を用いて、ＩＰＰおよびＬＰＰの切除は３時間以内のインキュベーション時間で完了される。かなり驚くことに、著しい量のトリペプチドＶＰＰの付随的な（ｃｏｎｃｏｍｍｉｔｔａｎｔ）産生は実証することができない。Ａ．ニガー由来の酵素は測定可能なアミノペプチダーゼ活性を含有しないという事実は、形成されるＩＰＰが、カッパー−カゼイン中に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることを強く示唆する。おそらく、ＩＰＰのカルボキシ末端ペプチド結合は、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼの主活性によって切断されるのに対して、先行するＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断は、そのＡｌａ特異的な副活性によって達成される。従って、本発明は、製造されるＩＰＰ対ＶＰＰの比率が少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、そしてより好ましくは少なくとも２０である、タンパク質源からＩＰＰを製造するための方法を提供し、該方法は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を有する酵素と、ＩＰＰのアミノ末端側で結合を加水分解することができる酵素との使用を含む。好ましくは、−Ｉ−Ｐ−Ｐ−のアミノ末端結合を加水分解することができる酵素は、同時に、−Ｖ−Ｐ−Ｐ−のアミノ末端結合を加水分解することができないか、あるいはそのための活性が低い。２つの酵素活性が本発明の目的のために言及されているが、それぞれプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性および−Ｉ−Ｐ−Ｐ−のアミノ末端結合の加水分解活性の両方の活性を同時に有する酵素も本発明において使用することができ、その例は、好ましくは、Ａ．ニガーに由来する、本明細書中に記載されるようなプロリン特異的エンドプロテアーゼである。
【００７２】
本発明に従う選択された加水分解方法のために、従来技術の方法よりも少数の水溶性ペプチドが形成されるであろう。これらの中に、水溶性ペプチドＩＰＰおよび任意でＬＰＰが多量に存在する。これは、活性が低いことが多い多数の他の化合物なしに、高濃度のＩＰＰおよび任意でＬＰＰ化合物が必要とされる場合に特に重要である。
【００７３】
本発明の方法によると、タンパク質中に存在する−Ａ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、ＩＰＰまたはＬＰＰにそれぞれ変換される。さらに、本発明の方法によると、タンパク質中に存在する−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−または−Ｐ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％が、ＬＰＰまたはＩＰＰにそれぞれ変換される。
【００７４】
実施例６では、本発明者らは、新しい驚くべき精製ステップによるＩＰＰの５倍の精製効果を説明する。この方法では、加水分解物は、摂氏５５度、ｐＨ６．０において短い酵素インキュベーション時間の間に形成され、次に摂氏８０度よりも高い温度に加熱され、全ての汚染微生物を殺して、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドペプチダーゼを不活性化する。続いて、加水分解物は酸性にされ、４．５あるいは少なくとも５．０より低いｐＨへのｐＨ降下を実現する。酵素の最適条件を示すので、Ａ．ニガー由来のプロリルエンドペプチダーゼを不活性化するために使用することができないこのｐＨ値では、カゼイン塩からの全ての大きいペプチドは沈殿し、より小さいペプチドだけが溶液中に残る。沈殿したカゼイン塩はデカンテーションまたはろ過ステップもしくは低速（すなわち、５０００ｒｐｍより低い）遠心分離によって容易に除去することができるので、水相は、存在するタンパク質の量に対して高い割合の生物活性ペプチドを含有する。ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）データによると、カゼイン塩タンパク質の８０〜７０％は低速遠心分離ステップによって除去され、これにより、ＡＣＥ阻害ペプチドの４〜５倍の精製が暗示される。本発明者らは、この精製原理が、カゼイン以外のタンパク質材料から得られる生物学的に活性なペプチドを得るためにも有利に適用され得ることを発見した。また、酵素的に製造される加水分解物だけでなく、適切な微生物により発酵される（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄ）タンパク質も、本発明の方法に従って分離におよび精製することができる。基質が沈殿することができ、酵素がまだ活性であるｐＨに近いｐＨ値で酵素および基質をインキュベートすると、この精製ステップが可能にされるであろう。Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼのｐＨ最適条件が低いために、ｐＨが１．５と６．５の間の範囲の基質の沈殿を考慮することができる。その特異的な沈殿挙動を考慮して、ｐＨ３．５よりも高いグルテン沈殿物、ｐＨ３．５よりも高くｐＨ６．０よりも低い乳漿タンパク質沈殿物、ｐＨ３．５よりも高くｐＨ５．０よりも低い卵白沈殿物は、それによって加水分解タンパク質沈殿物そして沈殿したタンパク質を加水分解タンパク質またはペプチドから分離することができる条件の例を成す。加水分解物のこの可溶性画分は、加水分解物という表現によっても含まれる。この酸可溶性加水分解物は、本発明に従うタンパク質を加水分解し、その後不溶性の加水分解部分を可溶性ペプチドから分離できるように酸性条件を修正することによって形成される。この分離は、例えば不溶性部分の沈降または遠心分離によって行なうことができる。グルテン加水分解物では、酸性分離条件は好ましくはｐＨ＝４であり、乳漿加水分解物では、酸性条件は好ましくはｐＨ＝４．５であり、カゼイン加水分解物では、酸性条件は好ましくはｐＨ＝４．５であり、そして卵白では、酸性条件は好ましくはｐＨ＝５．０である。一般に、分離のための好ましい酸性条件は、ｐＨ＝４．５である。
【００７５】
加水分解物とは、タンパク質の加水分解によって形成される生成物（あるいは簡単に、タンパク質加水分解物または加水分解タンパク質）を意味し、酸可溶性加水分解物は、本明細書中では可溶性ペプチド含有組成物または可溶性ペプチドを含む組成物としても記載されているタンパク質加水分解物の可溶性画分、またはタンパク質加水分解物および酸可溶性加水分解物の混合物である。
【００７６】
栄養補給食品用途ならびに食料および飲料用途では、本発明の加水分解物は有利に使用される。タンパク質加水分解物、酸可溶性加水分解物およびその混合物は、栄養補給食品用途、食料用途または飲料において使用することができる。好ましくは、高含量の活性ペプチドが存在するため、酸可溶性加水分解物は栄養補給食品用途、食料用途または飲料において使用される。チーズの製造方法においてカゼイン凝乳を乳漿タンパク質から分離するために同様の原理が用いられるが、チーズの製造方法では、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）のみが使用される。この酵素の種類（ＥＣ３．４．２３）には、キモシンや、哺乳類の（ｍａｍｍｅｌｉａｎ）ペプシンならびにアスペルギロペプシンおよびムコールペプシンのような様々な微生物のペプシンなどの様々なペプシンのようなよく知られたチーズ製造酵素が組み入れられる。本出願では、チーズ製造方法における凝乳または乳漿は、加水分解物ではないと定義される。さらに、本発明の加水分解方法では、有利に、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）は使用されない。さらに、上記のように、本発明に従う精製方法は、非アスパラギン酸エンドプロテアーゼにより製造される加水分解物のためには知られていない。
【００７７】
チーズ製造方法または凝乳／乳漿分離方法は本発明の精製方法から排除され、従って、本発明の精製方法は、この方法がチーズ製造方法または凝乳／乳漿分離方法の一部ではないことを条件として、可溶性ペプチドを得ることに関する。
【００７８】
この精製ステップとチーズ製造方法とは、表面的な類似にもかかわらず完全に異なる。チーズの製造では、凝乳の形成は、酵素ステップ（「レンネッティング（ｒｅｎｎｅｔｉｎｇ）」）または酸性化ステップのいずれかによって開始される。しかしながら、レンネッティング方法が酸性化とは無関係に進行するのに対して、酸性化によるチーズ凝乳の凝固は酵素とは無関係に進行する。
【００７９】
別の精製方法では、ペプチドは、エタノール、アセトン、プロパノール−１、プロパノール−２、メタノールまたはこれらの混合物などの水に混和性の溶媒を用いて、本発明の方法に従って加水分解タンパク質から便利および効率的に回収される。このアプローチでは、タンパク質加水分解物は、好ましくは、選択されたｐＨ条件下で、３０〜６０％（ｖ／ｖ）の水に混和性の溶媒と注意深く混合され、その結果、より大きいタンパク質は沈殿し、ＩＰＰなどの小さいペプチドは溶液中に残る。
【００８０】
分離、例えばデカンテーション、ろ過または低速遠心分離の後、生物学的に活性なペプチドを含有する上澄みは、精製した状態で回収することができる。この得られたペプチド含有組成物（または可溶性ペプチド含有組成物）は、例えば活性ＡＣＥ阻害ペプチドのレベルを上昇させるために（実施例１２および１３を参照）さらなる酵素により任意で処理されるか、あるいはペプチド組成物は、活性炭、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤ系列（ローム（Ｒｏｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂またはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により供給されるようなブチル−セファロース樹脂などの選択的なバインダーと接触されてもよい。次の蒸発および任意のスプレー乾燥ステップは、高生物活性を有する食品グレードのペーストまたは粉末を得るための経済的な経路をもたし得る。カゼイン塩の消化において、ＩＰＰおよびＬＰＰが豊富な高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを有する白色無臭の粉末が得られる。正確なトリペプチド濃度に適切に希釈されれば、全ての種類の食料および飲料にＡＣＥ阻害特性を与えるために適切な、優れた嗜好性を有する多用途の出発材料が得られる。必要であれば、生物活性成分の濃度は、ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰの疎水特性を用いる次の精製によってさらに増大させることができる。好ましい精製方法には、ナノろ過、例えばヘキサンまたはブタノールによる抽出の後、蒸発／沈殿、もしくは活性炭またはアンバーライトＸＡＤ系列（ローム（Ｒｏｅｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂のようなバインダーと、得られた酸性化加水分解物との接触が含まれる。また、ファルマシアにより供給されるようなブチル−セファロース樹脂を使用することもできる。このような材料からのＡＣＥ阻害ペプチドの脱離は、メタノール／エタノール混合物またはプロパノールのような有機溶媒を用いて行うことができる。
【００８１】
さらなる（例えば、クロマトグラフィー）精製ステップの前または後のいずれかに得られるようなペプチドは、定期的に広く消費される食料または飲料品に取り込むために使用され得る。このような製品の例は、マーガリン、スプレッド、バターまたはヨーグルトなどの様々な酪農製品、もしくは牛乳または乳漿含有飲料、好ましくはヨーグルトおよび牛乳などのヨーグルトまたは牛乳ベースの製品である。また、果実飲料または大豆飲料などの他の飲料においても、本発明の加水分解物を用いることができる。別の選択肢は、果実バー、タンパク質バー、エネルギーバー、シリアルベースの製品、例えば朝食用シリアルなどの健康製品における加水分解物の使用である。
【００８２】
本発明のもう１つの態様は、本明細書において前に記載した方法または記載したプロセスによって得ることができる食品、飲料品または食餌サプリメントに関し、食料または飲料品を調製するための前記方法は、（ａ）タンパク質から製造されるＩＰＰ対ＶＰＰの重量比が少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、そしてより好ましくは少なくとも２０：１であり、プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用を含む、タンパク質源からＩＰＰ含有組成物を製造するステップと、（ｂ）前記ＩＰＰ含有組成物を食品、飲料品または食餌サプリメント中に取り込むステップとを含む。好ましくは、本発明に従う前記食品、飲料品または食餌サプリメントは、０．０５〜１０重量％、より好ましくは０．１〜５重量％、最も好ましくは０．２〜４重量％の前記ＩＰＰ含有組成物またはタンパク質加水分解物を含む。また好ましくは、本発明に従う食料または飲料品または食餌サプリメントは、１００グラムの製品あたり、０．０５〜５０ｍｇのＩＰＰ、より好ましくは０．１〜４０ｍｇのＩＰＰ、最も好ましくは０．２〜３０ｍｇのＩＰＰを含む。また好ましくは、本発明の食料または飲料品または食餌サプリメントにおいて、ＩＰＰ対ＶＰＰの重量比は、５：１〜１００：１、より好ましくは５：１〜４８：１である。また好ましくは、本発明に従う食品、飲料品または食餌サプリメントはＩＰＰおよびＬＰＰの両方を含み、ＩＰＰ対ＬＰＰの重量比は、１：１０〜１：１、より好ましくは１．５：７．１〜４．８：７．１である。
【００８３】
好ましくは、食料または飲料品または食餌サプリメントは、マーガリン、スプレッド、バター、酪農製品または乳漿含有飲料、好ましくはヨーグルトまたは牛乳などのヨーグルトまたは牛乳ベースの製品の群から選択され、前記食料または飲料品または食餌サプリメントは、前述の量のタンパク質加水分解物または前述の量のＩＰＰを含む。
【００８４】
特に好ましいのは、ヒトの高血圧症の軽減に使用するための本明細書中の上記の食料または飲料品または食餌である。食料または飲料または食餌サプリメントの好ましい１回の摂取分量は、例えば、１回の摂取量あたり５〜３５０グラム、例えば５〜１５０グラムである。好ましくは、１日あたりの摂取の回数は１〜１０回、例えば２〜５回である。
【００８５】
このような組成物は通常ヒトに投与されるが、高血圧症を軽減するために動物、好ましくは哺乳類に投与されてもよい。さらに、得られる製品中のＡＣＥ阻害薬または他の生物学的に活性なペプチドが高濃度であれば、これらの製品は、丸薬、錠剤または高濃度の溶液またはペーストまたは粉末の形態の食餌サプリメント中に取り込むために非常に有用になる。ＡＣＥ阻害ペプチドまたは他の物学的に活性なペプチドの連続的な放出を保証できる緩効性の食餌サプリメントは特に関心がもたれている。本発明に従うＡＣＥ阻害ペプチドまたは他の生物学的に活性なペプチドは、例えば丸薬、錠剤、顆粒、サシェまたはカプセル剤において乾燥粉末として調剤することができる。あるいは、本発明に従う酵素は、例えばシロップ剤またはカプセル剤において液体として調剤されてもよい。様々な製剤において使用され、本発明に従う酵素を含有する組成物は、パッケージング、送達、吸収、安定化、あるいは補助剤の場合には酵素の生理学的効果を高めることを助ける生理学的に許容可能なキャリア、補助剤、賦形剤、安定剤、緩衝剤および希釈剤（これらの用語は物質を表すためにその普通の意味で使用される）からなる群の少なくとも１つの化合物も取り込むことができる。粉末形態の本発明に従う酵素と組み合わせて使用することができる様々な化合物の関連のある背景は、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ）」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２、マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）において見ることができる。乾燥粉末として調剤された本発明に従うＡＣＥ阻害ペプチドはかなり長期間保存することができるが、水蒸気または湿った空気との接触は、例えばアルミニウムブリスターなどの適切なパッケージングを選択することによって回避しなければならない。比較的新しい経口適用形態は、様々なタイプのゼラチンカプセル剤またはゼラチンベースの錠剤の使用である。
【００８６】
高血圧症に対抗するための天然ＡＣＥ阻害ペプチドの関連性を考慮して、本発明の費用効果の高い新しい経路は、穏やかな降圧性の栄養製品、あるいはまさに獣医製品のための魅力的な出発点を提供する。また本発明の経路は驚くほど簡単な精製ステップを含むので、血圧を低下させる濃縮食餌サプリメントの可能性も拡大される。
【００８７】
本発明に従う方法は、プロリン特異的オリゴ−またはエンドプロテアーゼを用いて達成することができる。本発明に従うかあるいは本発明に従って使用されるプロリン特異的オリゴペプチダーゼは、ＥＣ３．４．２１．２６に属する酵素を意味する。
【００８８】
本発明に従うかあるいは本発明に従って使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３において言及されるようなポリペプチドを意味する。従って、このプロリン特異的エンドプロテアーゼは、プロリン特異的エンドタンパク質分解活性を有するポリペプチドであり、
（ａ）配列ＩＤ番号２のアミノ酸１〜５２６またはその断片と少なくとも４０％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
（ｂ）低ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）６０、好ましくは１００のヌクレオチドにわたって少なくとも８０％または９０％同一であり、より好ましくは２００ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％同一である配列ＩＤ番号１の核酸配列またはその断片、もしくは（ｉｉ）配列ＩＤ番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、
からなる群から選択される。配列ＩＤ番号１および配列ＩＤ番号２は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示される。好ましくは、ポリペプチドは単離された形である。
【００８９】
本発明に従って使用される好ましいポリペプチドは、配列ＩＤ番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、あるいは配列ＩＤ番号２のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
好ましくは、ポリペプチドは、低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、最も好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列ＩＤ番号１の核酸配列またはその断片、あるいは（ｉｉ）配列ＩＤ番号１の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９１】
「ハイブリッド形成できる」という用語は、本発明の標的のポリヌクレオチドが、バックグラウンドよりも著しく高いレベルでプローブ（例えば、配列ＩＤ番号１で示されるヌクレオチド配列、またはその断片、または配列ＩＤ番号１の相補体）として使用される核酸とハイブリッド形成可能であることを意味する。また本発明は、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、およびそれと相補的なヌクレオチド配列も含む。ヌクレオチド配列はＲＮＡでもＤＮＡでもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡが含まれる。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡであり、最も好ましくはゲノムＤＮＡ配列である。通常、本発明のポリヌクレオチドは、選択的な条件下で配列ＩＤ番号１のコード配列またはコード配列の相補体とハイブリッド形成することができるヌクレオチドの近接する配列を含む。このようなヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られた方法に従って合成することができる。
【００９２】
本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドよりも著しく高いレベルで配列ＩＤ番号１のコード配列またはコード配列の相補体とハイブリッド形成することができる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリに存在する他のｃＤＮＡにより発生し得る。本発明のポリヌクレオチドと、配列ＩＤ番号１のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用によって発生されるシグナルレベルは、通常、他のポリヌクレオチドと配列ＩＤ番号１のコード配列との間の相互作用の強さの少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍である。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば３２Ｐで放射標識することによって測定され得る。選択的なハイブリダイゼーションは、通常、低ストリンジェンシー（約４０℃において０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃において０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃において０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて達成され得る。
【００９３】
ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定において使用される）。
【００９４】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ  Ｎアルゴリズムも、配列の同一性を計算するため、または配列を並べるため（例えばそのデフォルト設定において等価または対応する配列を同定するなど）に使用することができる。
【００９５】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワードと整列させたときにある正の値のしきい値スコアＴと一致するか、あるいは満足させるクエリー配列内の長さＷのショートワードを同定することによって、スコアの高い配列対（ＨＳＰ）同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコアしきい値と称される。これらの初期の近隣ワードヒットは、検索を開始してこれらを含むＨＳＰを見つけるための種の役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大され得る限りは、各配列に沿って両方向に拡張される。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか、１つまたは複数の負のスコアの残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロまたはそれ以下になるか、あるいはいずれかの配列の端部に到達したら、各方向のワードヒットの拡張は中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方のストランドの比較を用いる。
【００９６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は最小和の確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に発生し得る確率の表示を提供する。例えば、第２の配列に対する第１の配列の比較における最小和の確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、配列はもう１つの配列に類似していると考えられる。
【００９７】
アスペルギルス属の株は食品グレードの状態を有し、これらの微生物に由来する酵素は、疑いなく食品グレードの源からのものであることが知られている。もう１つの好ましい実施形態によると、酵素はその産生細胞により分泌され、分泌されないいわゆる細胞質ゾル酵素ではない。このようにして、酵素は、高価な精製ステップなしに、細胞ブロスから本質的に純粋な状態で回収することができる。好ましくは、酵素は、広いｐＨおよび温度条件下でその基質に対する高親和性を有する。
【００９８】
材料および方法
材料
食用カゼインカリウムスプレー（８８％）は、オランダのＤＭＶインターナショナル（ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から入手した。合成色素ペプチドは、オランダのペプスキャン・システムズ社（Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂ．Ｖ．）またはスイスのバヒェム（Ｂａｃｈｅｍ）のいずれかから入手した。
【００９９】
フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）１０００ＬバッチＨＰＮ００２１８は、ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）（デンマーク）から入手し、スミチーム（Ｓｕｍｉｚｙｍｅ）ＦＰはシンニホン（Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）（日本）から入手し、コロラーゼＬＡＰ  Ｃｈ．：４１２３はＡＢエンザイムズ（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＵＫ）から入手した。
【０１００】
Ａ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼ
アスペルギルス・ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼの過剰産生は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されるように達成した。酵素の活性は、クエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６中、摂氏３７度で合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡにおいて試験した。反応性生物を４０５ｎＭで分光光度的に監視した。単位は、これらの試験条件下で１分につき１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを遊離する酵素の量と定義される。
【０１０１】
Ａ．ニガー由来のエンドプロテアーゼのクロマトグラフィー精製
プロテアーゼのクロマトグラフィー精製のためにＡ．ニガー株を過剰産生することから得られる培養ブロスを使用して、汚染エンド−およびエキソタンパク質分解活性を除去した。そのために、発酵ブロスをまず遠心分離して真菌量の大部分を除去し、次に低下していく細孔サイズを有する多数のフィルターに上澄みを通過させて全ての細胞断片を除去した。最後に、２０ミリモル／リットルの酢酸ナトリウムｐＨ５．１で、得られた限外ろ過液を１０倍に希釈し、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦカラムに適用した。２０ミリモル／リットルの酢酸ナトリウムｐＨ５．１中、０〜０．４モル／リットルのＮａＣｌでタンパク質をグラジエント溶出させた。Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１、２０９−２１２頁（１９９５年）に記載される手順に従って、しかしわずかに変更したアッセイ条件下で、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの切断に対する活性を示すピークフラクションを捕集および貯蔵した。Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの酸性ｐＨ最適条件を考慮して、３７℃のクエン酸／二リン酸緩衝液中ｐＨ４．６で酵素アッセイを実行した。活性フラクションの貯蔵後に濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドのみを示すと共にＨＰ−ＳＥＣにおいて１つのピークを示す調製物を最終的にもたらした。疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる分析で、得られた酵素調製物の純度を確認した。
【０１０２】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
Ｐ４０００ポンプ（オランダ、ブレダのサーモ・エレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ））に結合されたイオントラップ質量分析計（オランダ、ブレダのサーモ・エレクトロン）を用いるＨＰＬＣを使用して、関心のあるペプチド、特に本発明に従う方法で製造された酵素的タンパク質加水分解物中のペプチドＩＰＰ（Ｍ＝３２５．２）、ＬＰＰ（Ｍ＝３２５．２）、ＶＰＰ（Ｍ＝３１１．２）、ＶＶＶＰＰ（Ｍ＝５０９．３）およびＶＶＶＰＰＦ（Ｍ＝６５６．４）を定量した。形成されたペプチドを、溶離のためのミリＱ水中０．１％のギ酸（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、溶液Ａ）およびアセトニトリル中０．１％のギ酸（溶液Ｂ）のグラジエントと組み合わせてイナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）３ＯＤＳ３、３μｍ、１５０＊２．１ｍｍカラム（ベルギー、ベルギーのバリアン（Ｖａｒｉａｎ））を用いて分離した。グラジエントは１００％の溶液Ａで開始し、そこで５分間保持し、５％のＢまで１０分で直線的に増大させた後、４５％の溶液Ｂまで３０分で直線的に増大させ、直ちに出発条件まで戻し、そして安定させるためにそこで１５分間保持した。使用した注入体積は５０マイクロリットル、流速は２００マイクロリットル／分であり、カラム温度は５５℃に保持した。注入サンプルのタンパク質濃度は、約５０マイクログラム／ミリリットルであった。
【０１０３】
約３０％の最適衝突エネルギーを用いて、関心のあるペプチドのための専用のＭＳ／ＭＳを使用することにより個々のペプチドの詳細な情報を得た。内部較正を用い、イソロイシンＮ１５、Ｃ１３標識ＩＰＰ（Ｍ＝３３２．２）を全体的に用い、分析した全ての関連のあるペプチドのためのＭＳ／ＭＳモードにおいて観察された最も豊富な断片イオンを用いることによって、個々のペプチドの定量を実施した。使用した全てのペプチドは、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）（オランダ、レリスタッド）により合成された。
【０１０４】
トリペプチドＬＰＰ（Ｍ＝３２５．２）を用いて、５μｇ／ｍｌの一定の注入を行いながらＭＳモードにおける最適感度、およびＭＳ／ＭＳモードにおける最適断片化を調整し、ＭＳモードにおいてプロトン化分子が得られ、ＭＳ／ＭＳモードにおける約３０％の最適衝突エネルギーはＢ−およびＹ−イオン系列を発生した。
【０１０５】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に、酵素的タンパク質加水分解物を周囲温度および１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．２２μｍフィルターによりろ過し、上澄みをミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）水ろ過装置によりろ過した脱塩水（ミリ（Ｍｉｌｌｉ）Ｑ水）で１：１００に希釈した。
【０１０６】
加水分解度
様々なタンパク質分解混合物とのインキュベーション中に得られる加水分解度（ＤＨ）を、高速ＯＰＡ試験を用いて監視した（Ｐ．Ｍ．ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）、Ｄ．ピーターセン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）、Ｃ．ダンブマン（Ｄａｍｂｍａｎｎ）、食品タンパク質の加水分解度を決定するための改善された方法、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第６６巻、６４２−６４６頁）。
【０１０７】
ケルダール窒素
全ケルダール窒素をフローインジェクション分析により測定した。ＴＫＮメソッド・カセット（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）５０００−０４０を備えたテカトール（Ｔｅｃａｔｏｒ）フィアスター（ＦＩＡＳＴＡＲ）５０００フローインジェクションシステム、ＳＯＦＩＡソフトウェアを有するペンティアム（Ｐｅｎｔｉｕｍ、登録商標）４コンピュータ、およびテカトール５０２７オートサンプラーを用いて、タンパク質含有溶液から放出されたアンモニアを５９０ｎｍで定量した。方法のダイナミックレンジに対応するサンプル量（０．５〜２０ｍｇＮ／ｌ）を９５〜９７％硫酸およびケルタブ（Ｋｊｅｌｔａｂ）と一緒に消化管内に置き、摂氏２００度で３０分、その後摂氏３６０度で９０分の消化プログラムを受けさせた。フィアスター５０００システムに注入した後、窒素ピークを測定し、それから測定されたタンパク質の量を推定することができる。
【０１０８】
栄養補給製品
本発明に従う栄養補給製品は、どんな食品のタイプでもよい。これらは食品に加えて、適切な量のフレーバー、糖、果実、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤などの普通の食品成分を含むことができる。
【０１０９】
好ましくは、栄養補給製品は、５０〜２００ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または１５〜６０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または６〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋、より好ましくは１００〜１５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３０〜５０ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１０〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋、そして最も好ましくは１１０〜１３５ｍｍｏｌ／ｋｇのＫ＋および／または３５〜４５ｍｍｏｌ／ｋｇのＣａ２＋および／または１３〜２０ｍｍｏｌ／ｋｇのＭｇ２＋を含む。これらのカチオンは、本発明に従う栄養補給製品中に取り込まれたときに血圧をさらに低下させるという有益な効果を有する。
【０１１０】
有利に、栄養補給製品は、１つまたは複数のＢ−ビタミンを含む。
【０１１１】
Ｂ−ビタミン葉酸は、ヒトの食餌におけるアミノ酸であるホモシステインの代謝に関与することが分かっている。何年もの間、高ホモシステインレベルは、心血管疾患の高発生率と関連付けられている。ホモシステインを低下させると、心血管疾患の危険が低減され得ると教示されている。
【０１１２】
ビタミンＢ６およびＢ１２はプリンおよびチアミンの生合成を妨害して、メチオニンを産生するためのホモシステインのメチル化の過程およびいくつかの成長過程でメチル基の合成に関与することが分かっている。ビタミンＢ６（ピリドキシン塩酸塩）は既知のビタミンサプリメントである。ビタミンＢ１２（シアノバラミン）は神経系の健康に寄与し、赤血球の産生に関与する。食品サプリメント中のビタミンとしても知られている。
【０１１３】
心血管疾患の危険の低減に対するこれら組み合わされたよい影響のために、本発明に従う製品は、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２および葉酸を含むことが好ましい。
【０１１４】
栄養補給製品中のＢ−ビタミンの量は、本明細書中で与えられるこれらのＢ−ビタミンの１日の量に基づいて当業者により計算され得る。葉酸では、２００〜８００μｇ／日、好ましくは２００〜４００μｇ／日であり、ビタミンＢ６では、０．２〜２ｍｇ／日、好ましくは０５〜１ｍｇ／日であり、そしてビタミンＢ１２では、０．５〜４μｇ／日、好ましくは１〜２μｇ／日である。
【０１１５】
好ましくは、栄養補給製品は、３〜２５重量％のステロール、より好ましくは７〜１５重量％のステロールを含む。ステロールを取り込むことの利点は、ヒトの血液中のＬＤＬ−コレステロールのレベルの低下を引き起こし、その結果心血管の危険が低減し得ることである。
【０１１６】
ステロールについて言及する場合、これには、飽和スタノールおよびステロール／スタノールのエステル化誘導体またはこれらのいずれかの混合物が含まれる。
【０１１７】
本出願では、ステロールエステルについて言及する場合、これには、その飽和誘導体、スタノールエステル、およびステロールエステルとスタノールエステルの組み合わせも含まれる。
【０１１８】
ステロールもしくは植物ステロールまたはベジタブルステロールとしても知られるフィトステロールは、４−デスメチルステロール、４−モノメチルステロールおよび４，４’−ジメチルステロールの３つのグループに分類することができる。油の中で、これらは、主に、遊離ステロールおよび脂肪酸のステロールエステルとして存在するが、ステロールグルコシドおよびアシル化ステロールグルコシドも存在する。３つの主要なフィトステロール、すなわちベータ−シトステロール、スチグマステロールおよびカンプエステロールがある。意図される構成要素の概略図は、「食用植物性油のステロールにおける処理の影響」、Ｓ．Ｐ．コチャール（Ｋｏｃｈｈａｒ）、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．第２２巻、１６１−１８８頁において与えられる。
【０１１９】
シトスタノール、カンプエスタノールおよびエルゴスタノールならびにその誘導体などのそれぞれの５アルファ−飽和誘導体は、本明細書ではスタノールと称される。好ましくは、（任意でエステル化された）ステロールまたはスタノールは、β−シトステロール、β−シトスタノール、カンプエステロール、カンプエスタノール、スチグマステロール、ブラシカステロール、ブラシカスタノールまたはこれらの混合物の脂肪酸エステルを含む群から選択される。
【０１２０】
ステロールまたはスタノールは、任意で、少なくとも部分的に脂肪酸でエステル化される。好ましくは、ステロールまたはスタノールは、１つまたは複数のＣ２〜２２脂肪酸でエステル化される。本発明の目的のために、Ｃ２〜２２脂肪酸という用語は、Ｃ２〜２２主鎖と、少なくとも１つの酸基とを含む分子を指す。本発明の関係においては好ましくないが、Ｃ２〜２２主鎖は部分的に置換されていてもよく、あるいは側鎖が存在してもよい。しかしながら好ましくは、Ｃ２〜２２脂肪酸は、１つまたは２つの酸基を末端基として含む線状分子である。最も好ましいのは、天然油中に存在するので、線状のＣ８〜２２脂肪酸である。
【０１２１】
このような脂肪酸の適切な例は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸である。他の適切な酸は、例えば、クエン酸、乳酸、シュウ酸およびマレイン酸である。最も好ましいのは、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、セトレイン酸、エルカ酸、エライジン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０１２２】
所望される場合、ステロールまたはスタノールのエステル化のために脂肪酸の混合物が使用されてもよい。例えば、脂肪酸源として天然に存在する脂肪または油を使用すること、そしてエステル交換反応によりエステル化を実行することが可能である。
【０１２３】
心血管の健康の増進に寄与する上記の栄養補給成分、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、Ｂ−ビタミン（葉酸、Ｂ６、Ｂ１２）ならびにステロールは、本明細書中では、集合的に心臓の健康成分（ｈｅａｒｔ  ｈｅａｌｔｈ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）と称される。
【０１２４】
実施例１
Ａ．ニガーから得られる酵素は、新しい種類のプロリン特異的酵素を表す。
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットにおいて提供されるようなＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの全コード配列から、５２６アミノ酸タンパク質配列を決定することができる。ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲおよびｔｒＥＭＢＬなどのデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって酵素の新規性を確認した。驚くことに、Ａ．ニガー酵素と、既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に、明白な相同性は検出できなかった。しかしながら、アミノ酸配列をさらに精密に検査すると、Ｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、および胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）特異的セリンプロテアーゼに対して、低いが有意な相同性が明らかになった。これらの酵素は全て、セリンペプチダーゼのクラン（ｃｌａｎ）ＳＣのファミリーＳ２８に割り当てられている（タンパク質分解酵素のハンドブック、Ａ．Ｊ．バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、Ｎ．Ｄ．ローリングス（Ｒａｗｌｉｎｇｓ）、Ｊ．Ｆ．ウェスナー（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、英国ロンドン、１９９８年、３６９−４１５頁）。また、活性部位セリンのまわりのＧｘＳＹｘＧ配置は、これらの酵素とＡ．ニガー由来のエンドプロテアーゼとの間で保存される。さらに、ファミリーＳ２８のメンバーは酸性ｐＨの最適条件を有し、プロリン残基のカルボキシ末端側での切断に対する特異性を有し、そしてＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼと同様のシグナル配列およびプロペプチドを用いて合成される。また、Ａ．ニガー酵素のサイズは、ファミリーＳ２８のメンバーと類似している。従って、Ａ．ニガープロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られる酵素を含むほとんどの細胞質ゾルのプロリルオリゴペプチダーゼが分類されるＳ９ファミリーではなく、セリンプロテアーゼのファミリーＳ２８のメンバーであると思われる。これらの構造的および生理学的な特徴に基づいて、本発明者らは、Ａ．ニガー酵素は、セリンプロテアーゼのクラン（ｃｌａｎ）ＳＣのＳ９ファミリーではなくＳ２８に属すると結論を出した。Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼからＡ．ニガー由来の酵素を区別するさらなる特徴は、前者のファミリーに属する細胞質ゾルのプロリルエンドプロテアーゼとは違って、新しく同定されたＡ．ニガー酵素は、成長培地中に分泌されるという事実である。
【０１２５】
実施例２
Ａ．ニガーから得られるプロリン特異的エンドプロテアーゼのｐＨおよび温度の最適条件
Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼのｐＨ最適条件を確立するために、様々なｐＨ値を有する緩衝液を調製した。０．０５モル／ｌの酢酸Ｎａおよび０．０２ＭのＣａＣｌ２を用いてｐＨ４．０−４．５−４．８−５．０−５．５および６．０の緩衝液を作製し、０．０２ＭのＣａＣｌ２を含有する０．０５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を用いてｐＨ７．０および８．０の緩衝液を作製した。酢酸およびＨＣｌをそれぞれ用いてｐＨ値を調整した。基質として色素性合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを用いた。「ｐＮＡ」（ｐ−ニトロアニリド）基質は、Ｘ−ｐＮＡペプチド結合が切断されると色の変化を引き起こす。緩衝溶液、基質溶液およびプロリルエンドプロテアーゼ前希釈物（０．１Ｕ／ｍＬの活性）を水浴中で正確に３７．０℃に加熱した。混合した後、４０５ｎｍにおいて３７．０℃で３．５分間、０．５分毎に測定しながら反応を分光光度的に追跡した。図１に示される結果から、Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、４付近でｐＨ最適条件を有することが明らかである。
【０１２６】
また、プロリルエンドプロテアーゼの温度最適条件を確立した。そのために、基質としてカゼイレ・リゾルフィン（Ｃａｓｅｉｎｅ  Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎｅ）（オランダ、アルメアのロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、異なる温度において、０．０２ｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２を含有する０．１モル／ｌの酢酸Ｎａ中、ｐＨ５．０で２時間、精製した酵素調製物をインキュベートし、そして５７４ｎｍで測定することにより酵素活性を定量した。得られた結果によると、Ａ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼは、摂氏５０度付近で温度最適条件を有する。
【０１２７】
実施例３
Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性
発現カセットの多数のコピーを含有するＡ．ニガー株から得られたクルードサンプルおよびクロマトグラフィー精製した酵素サンプル（国際公開第０２／４５５２４号パンフレットを参照）を、色素ペプチド基質の捕集に対して試験して、コード化エンドプロテアーゼの特異性を確立した。ＡＡＸｐＮＡ基質において酵素のエンドタンパク質分解活性を試験した。ここで「Ｘ」は、異なる天然アミノ酸残基を表す。
【０１２８】
ＡＡＸ−ｐＮＡ基質のストック溶液（１５０ｍｍｏｌ／ｌ）を、２０ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４．０中で１００×に希釈した。テカン・ジェニオス（ＴＥＣＡＮ  Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰリーダー（ザルツブルク、ウィーン）において４０５ｎｍで、摂氏４０度で１０分の反応速度測定は、光学濃度の増大を記録した。生成したデータをさらにエクセル（Ｅｘｃｅｌ）で処理して、図２に示される絵をもたらした。結果から、Ａ．ニガー由来のエンドプロテアーゼは、アラニル結合に対する副活性と共に、プロリルペプチド結合に対して非常に特異的であることが明らかである。クルード調製物およびクロマトグラフィー精製した調製物は、同様の活性プロファイルを示した。
【０１２９】
実施例４
Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きいタンパク質も小さいペプチドも加水分解することができ、従って真のエンドプロテアーゼである。
特異的な構造上の特徴により、セリンプロテアーゼのクラン（ｃｌａｎ）ＳＣのＳ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼは、３０アミノ酸よりも大きいペプチドを消化することができない。この制限は、できるだけ速くかつ効率的に様々なタンパク質を加水分解すべき酵素にとって明らかな不都合である。Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼが、基質分子のサイズに関して同じ制限を示すかどうかを見るために、本発明者らは、Ａ．ニガーからのクロマトグラフィー精製したプロリルエンドペプチダーゼを、小さい合成ペプチドおよび大きいオボアルブミン分子と共にインキュベートして、これらの基質分子の分解速度論を研究した。
【０１３０】
使用した合成ペプチドは、配列ＮＨ２−ＦＲＡＳＤＮＤＲＶＩＤＰＧＫＶＥＴＬＴＩＲＲＬＨＩＰＲ−ＣＯＯＨの２７−ｍｅｒであり、ペプスキャン・カンパニー（Ｐｅｐｓｃａｎ  ｃｏｍｐａｎｙ）（オランダ、レリスタッド）から得られた。そのアミノ酸配列により示されるように、このペプチドは２つのプロリン残基を含有し、１つはペプチドの中央にあり、１つは最後にある。
【０１３１】
使用したインタクトなオボアルブミン分子（ピアス・イムジェクト（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｊｅｃｔ）、２０ｍｇの凍結乾燥材料を含有するバイアル）は３８５のアミノ酸からなり、４２７５０Ｄａの分子量を有する。この分子は１４個のプロリン残基を含有し、その１つは分子の最後のＣ末端部に位置し、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって切断されることができない。
【０１３２】
オボアルブミンおよびオリゴペプチドを、精製したＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼと共に５０℃で別々にインキュベートした。いくつかの時間間隔で、サンプルを採り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。
【０１３３】
４．５単位／ｍｌの活性を有するクロマトグラフィー精製したＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼを、２０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍの酢酸緩衝液ｐＨ４で１００倍に希釈した。オボアルブミンを酢酸緩衝液ｐＨ４中に溶解して、１ｍｇ／ｍｌ（２２μＭ）の濃度にした。２７−ｍｅｒを同じ緩衝液中に溶解して、０．４８ｍｇ／ｍｌ（１５２μＭ）の濃度を得た。オボアルブミンおよび２７−ｍｅｒ溶液のモル濃度は、両方の溶液が切断可能なプロリン残基において同じモル濃度を含有するように選択した。オボアルブミンが１３個の潜在的なプロリン切断部位を含有するのに対して、２７−ｍｅｒペプチドは２つだけ有する。両基質溶液のうち０．５ｍｌを、エッペンドルフ・サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）中５０℃で、１０μｌ（０．４５ｍｉｌｌｉＵ）の酵素溶液と共にインキュベートした。いくつかの時間間隔で、インキュベーション混合物から１０μｌのサンプルを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで２０℃で保持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色のために使用した全ての材料は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（オランダ、ブレダ）から購入した。サンプルは、製造業者の指示に従ってＬＤＳ緩衝液を用いて調製し、製造業者の指示に従ってＭＥＳ−ＳＤＳ緩衝系を用いて１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにおいて分離した。染色は、シンプリー・ブルー・セーフ・ステイン（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ）（コロイダル・クーマシー（Ｃｏｌｌｏｄｉａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）Ｇ２５０）を用いて実行した。
【０１３４】
図３において分かるように、オボアルブミンは、アスペルギルス由来の酵素によって、最初の４．７５時間のインキュベーションで約３５〜３６ｋＤの別々のバンドに切断される（レーン３）。長期のインキュベーション時間の結果、さらに、様々な分子量を有する小さい生成物に破壊される（レーン７）。
【０１３５】
また、２７−ｍｅｒペプチドおよび酵素とのインキュベーションは、レーン４、６および８におけるいくらかぼやけて、よりファジーなバンドから判断できるように、急速な分解をもたらす。２７−ｍｅｒペプチドは、はるかに大きいオボアルブミン分子と同じペースで破壊されるので、Ｓ９ファミリーに属する既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは違って、Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、はるかに大きいタンパク質よりも小さいサイズのペプチドを切断するための特異的な優先度を持たないと結論することができる。この観察により、Ａ．ニガー由来の酵素が真のエンドプロテアーゼを表し、様々なタイプのタンパク質を加水分解する好ましい酵素であることが実証される。この発見は、以下の実施例で説明されるように、酵素の驚くべき使用を導く。
【０１３６】
実施例５
Ａ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にカゼインカリウムをインキュベートすると、ＩＰＰおよびＬＰＰが急速に生じるが、ＶＰＰは生じない。
この実験では、過剰産生した本質的に純粋なＡ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼをカリウムカゼイン塩と共にインキュベートして、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰの遊離を試験した。使用したエンドプロテアーゼは、純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンドタンパク質分解活性（すなわち、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端の切断）以外の顕著なタンパク質分解活性が存在しない（実施例７を参照）という本質的に純粋な意味であった。ＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウムの摂取をできるだけ制限するために、このインキュベーションではカゼインカリウムを基質として使用した。
【０１３７】
１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度でカゼイン塩を摂氏６５度の水中に懸濁させ、その後、リン酸を用いてｐＨを６．０に調整した。次に、懸濁液を摂氏５５度に冷却し、４単位／グラムタンパク質の濃度のＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼを添加した（単位定義については材料および方法セクションを参照）。連続的に攪拌しながら、この混合物を２４時間インキュベートした。この期間中、さらなるｐＨ調整は実行しなかった。インキュベーションの１、２、３、４、８および２４時間後にサンプルを採った。各サンプルについて、サンプルを摂氏９０度に５分間迅速に加熱することによって酵素活性を終了させた。冷却後、リン酸を用いて各サンプルのｐＨを４．５まで急速に低下させ、その後、ヘレウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）卓上遠心分離機において、懸濁液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために完全に透明な上澄みを用いて、上澄み中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦを定量した（材料および方法セクションを参照）。
【０１３８】
ウシの乳カゼインは、ベータ−カゼインおよびカッパー−カゼインを含む多数の異なるタンパク質を取り込んでいる。既知のアミノ配列によると、ベータ−カゼインは、ＡＣＥ阻害性トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。ベータ−カゼイン中に、ＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−で含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−で含有され、そしてＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−で含有される。ベータ−カゼイン濃度のほとんど５０％のモル濃度で酸沈殿カゼイン塩調製物中に存在するカッパー−カゼインは、ＩＰＰのみを包含する。カッパー−カゼイン中に、ＩＰＰは、配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−で含有される。カゼインの他のタンパク質成分は、ＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含有しない。
【０１３９】
表１および２は、酸性化して遠心分離した上澄み中に存在し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量されたペプチドの濃度を示す。これらの表において、様々なペプチドの濃度は、インキュベーション混合物に添加されたカゼインカリウムのグラムあたりで計算されて与えられる。表１に示されるように、ＩＰＰは、インキュベーションの１時間後にその最大濃度に到達する。それを超えると、ＩＰＰ濃度はこれ以上増大しない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成は、ＩＰＰの生成と同じ速度論を示す。理論的に予期されるように、ＶＶＶＰＰのモル収率は、ＬＰＰペプチドのモル収率と同様である。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの両方の収率は、理論的に実現可能なもののほとんど６０％に達する。インキュベーションのわずか３時間後にＬＰＰの最大濃度に達するという事実は、ベータ−カゼイン分子のその特定の部分の切断が、おそらく、いくらかより困難であることを示唆する。ＶＶＶＰＰとは対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦはまったく形成されない。この観察は、プロリン特異的エンドプロテアーゼが−Ｐ−Ｆ−結合を効率的に切断し、それによりＶＶＶＰＰが生成されることを示唆する。トリペプチドＩＰＰは即座に形成されるが、そのモル収率は、ＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれかの最大モル収率の約３分の１以下である。ＩＰＰトリペプチドはベータ−カゼインとカッパー−カゼインの両方に含有されるので、この結果は予想外である。この観察に対する適当な説明は、プロリン特異的プロテアーゼがＩＰＰを生成できるが、カゼイン塩のカッパー−カゼイン部分からだけであるということである。カッパー−カゼインの関連のアミノ酸配列を考慮すると、これは、−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合は酵素のアラニン特異的活性によって切断されることを示唆する。本当であれば、遊離されるＩＰＰの量は、カッパー−カゼイン中に存在する量の約４０％に達するが、ベータ−およびとカッパー−カゼイン中に理論的に存在するＩＰＰの約１０％以下である。ＩＰＰの放出のこの切断メカニズムは、何故ＶＰＰをその前駆体分子ＶＶＶＰＰから形成することができないかも説明し、単に必要とされるエンドタンパク質分解（またはアミノペプチダーゼ）活性が、使用されるＡ．ニガー由来の酵素調製物中に存在しない。
【０１４０】
【表１】
2008505653.tif 000002
【０１４１】
【表２】
2008505653.tif 000003
【０１４２】
実施例６
酸カゼイン沈殿ステップの取り込みが５倍濃度のＡＣＥ阻害ペプチドをもたらす。
実施例５で説明したように、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度のカゼインカリウムを、Ａ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にｐＨ６．０でインキュベーションにさらした。様々なインキュベーション時間の後、サンプルを加熱してさらなる酵素活性を停止し、その後ｐＨを４．５に低下させ、カゼイン溶解度を最小限にした。低速遠心分離によって、不溶性カゼイン分子を除去した。表１および２において、本発明者らは、１０％タンパク質の出発濃度に基づいて計算されたＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供した。しかしながら、酸性化およびその後の遠心分離ステップの結果として、添加したタンパク質の大部分が除去されている。酸性化した上澄みのこれらの低下したタンパク質含量を考慮するために、窒素（ケルダール）分析を実行した。後者のデータによると、様々な上澄みは、以下のタンパク質レベルを含有することが分かった。
【０１４３】
【表３】
2008505653.tif 000004
【０１４４】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、各上澄み中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算したが、今回はこれらの実際のタンパク質含量を用いた。これらの再計算したデータは表４に示される。
【０１４５】
【表４】
2008505653.tif 000005
【０１４６】
表２および４に与えられるデータの比較は、簡単な酸性化ステップ、そしてその後の産業的に実現可能なデカンテーション、ろ過または低速遠心分離ステップの結果、特異的ＡＣＥ阻害ペプチドの濃度の５倍の増大が得られることを明らかに示す。後者の実験では、酸性化した懸濁液をデカンテーション、ろ過または低速遠心分離の前に一晩貯蔵することによって、酸沈殿ステップの効力がさらに改善されたことが示されるであろう。
【０１４７】
実施例７
ＡＣＥ阻害ペプチドの製造における汚染酵素活性の定量
本発明によると、ＡＣＥ阻害性ペプチドは、適切なタンパク質基質とプロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションによって簡単な一段階法で得ることができる。その後の水溶性ＡＣＥ阻害性ペプチドの濃縮は、より大きい分子量のタンパク質断片を酸性化により沈殿させることによって達成される。後者の酸濃縮法の効力は、基質分子の非常に選択的な切断次第である。タンパク質分解活性が多く存在するほど、多くの水溶性ペプチドが形成され、これによりＡＣＥ阻害ペプチドの濃縮係数が低下する。例えば、基質とのインキュベーション中にさらなる非プロリンまたは非アラニン特異的エンドプロテアーゼが存在すると、より多くの非生物活性ペプチドの可溶化がもたらされ、これにより最終濃縮物中のＩＰＰおよびＬＰＰの相対的な濃度が薄くなる。さらに、例えばカルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼなどの汚染エキソプロテアーゼの存在は、遊離アミノ酸の放出をもたらす。これらの余分な遊離アミノ酸もＡＣＥ阻害性ペプチドの相対的な濃度を薄くし、さらにメイラード反応の増大の結果としてブロスのない風味（ｂｒｏｔｈｙ  ｏｆｆ  ｔａｓｔｅ）を与える。これらの望ましくない副反応全てを最小限にするために、本質的に純粋なプロリン特異的プロテアーゼの使用が好ましい。本質的に純粋とは、使用されるインキュベーション条件下で汚染エンドプロテアーゼおよび汚染エキソプロテアーゼの活性が最小限であるか、あるいは好ましくは存在しないことを意味する。このような汚染活性を定量するために以下の試験手順を考案した。
【０１４８】
試験手順の基礎は、様々な選択的色素ペプチドの捕集によって形成される。これらの全ての色素ペプチドにおいて、「Ｚ」はベンジルオキシカルボニルを表し、「ｐＮＡ」は、発色団パラ−ニトロアニリドを表す。プロリン特異性オリゴ−およびエンドプロテアーゼのみが、そのＮ末端において「Ｚ」基でブロックされたペプチドから着色ｐＮＡを放出できるので、所望のプロリン特異的エンドタンパク質分解活性を定量するためにペプチドＺ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡを用いた。多くのエンドプロテアーゼは、ペプチドＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡからｐＮＡを放出できるので、汚染非プロリン特異的エンドタンパク質分解活性を定量するためにこれらの２つのペプチドを用いた。ペプチドＱＮＩＰＰおよびＶＶＶＰＰのＩＰＰおよびＶＰＰへのそれぞれの変換は、Ｇｌｎ（Ｑ）およびＶａｌ（Ｖ）残基を効率的に除去することができるアミノペプチダーゼを必要とするので、このような汚染アミノペプチダーゼ活性を定量するためにペプチドＱ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを用いた。多くのカルボキシペプチダーゼは、ペプチドからＰｈｅ（Ｆ）およびＡｒｇ（Ｒ）残基を放出できるので、これらの残基を含有するペプチドを選択して、汚染カルボキシペプチダーゼ活性を定量した。しかしながら、カルボキシペプチダーゼ活性を測定するために適切な色素基を利用することができないので、合成ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲを用いる別の方法を開発しなければならなかった。この別の方法は、下に提供される。
【０１４９】
全ての色素ペプチドは、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）（オランダ、レリスタッド）から入手した。ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲは、バヒェム（Ｂａｃｈｅｍ）（スイス）から購入した。全てのインキュベーションは、４０℃で実行した。方法を説明するために、市販の酵素調製物フレーバーザイム１０００Ｌ（ノボザイムズ（デンマーク）から得られるバッチＨＰＮ００２１８）、シンニホン（Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）（日本）からのスミチームＦＰ、およびＡＢエンザイムズ（ＵＫ）からのコロラーゼＬＡＰ（Ｃｈ．：４１２３）を試験し、そしてＡ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼと比較した。試験した市販の酵素調製物を希釈して最適なインキュベーション条件を作成したが、最終データの提示において市販の製品の濃度に再計算した（表５を参照）。
【０１５０】
汚染アミノペプチダーゼ活性の測定
１００％ＤＭＳＯ中の１５０ｍｍｏｌ／ｌのＶ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡのストック溶液を、０．１ＭのＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ６中に８０倍で希釈して、Ｖ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡを１：１の比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌのＶ−ｐＮＡ＋Ｑ−ｐＮＡ−基質溶液を作製した。このアミノペプチダーゼ基質溶液の２００μｌの一定分量を、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の別々のウェル内にピペットで取った。ＭＴＰは、マゼラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）４ソフトウェアで実行されるテカン・ジェニオス（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰ（ザルツブルク、ウィーン）において、４０℃でプレインキュベートされる。５０μｌの適切な酵素溶液を添加することによって、インキュベーションが３ｍＭの基質濃度で行なわれるように反応を開始させた。通常、液体酵素サンプルのフレーバーザイム、コロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０の希釈物を用いた。乾燥スミチームＦＰ製品については、１％溶液を用いた。
【０１５１】
アミノ酸−ｐＮＡ結合の切断の結果として生じるテカン・ジェニオスＭＴＰにより４０５ｎｍで測定される黄色は、次に、少なくとも２０回のカイネティックサイクル（約１０分）が行なわれる。ソフトウェアは、ＯＤ４０５／分で得られたデータを生成した。
【０１５２】
プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定
この測定はアミノペプチダーゼアッセイと本質的に同じに実行したが、この場合は、唯一の基質として３ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度のＺ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡを用いた。ｐＨ６緩衝液中の懸濁液を５０〜５５℃に加熱することによってこの基質を可溶化し、室温で透明な溶液が得られた。測定は、４０℃で実行した。
【０１５３】
通常、液体酵素サンプルフレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰの１：５０の希釈物を用いた。スミチームＦＰは、１％溶液で使用した。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、通常、１：５０００希釈物で使用される。ソフトウェアは、ＯＤ４０５／分でデータを生成した。
【０１５４】
汚染非プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定
この測定も、アミノペプチダーゼアッセイについて記載したのと本質的に同じに実行したが、この試験では、１：１の比率および３ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度のＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡを基質として用いた。基質Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡは、使用したｐＨ６．０の試験条件下で可溶性が低いことが分かったが、サブチリシンによる試験インキュベーションは、ｐＮＡの放出と同時に基質の急速な可溶化もたらした。測定は、４０℃で実行した。しかしながら、この低い溶解度を補うために、ＭＴＰリーダーをカイネティックサイクルの間に振動するようにプログラムした。この場合も、ソフトウェアは、ＯＤ４０５／分でデータを生成した。
【０１５５】
汚染カルボキシペプチダーゼ活性の測定
カルボキシペプチダーゼ活性を測定するために感受性の色素ペプチドは利用できないので、カルボキシペプチダーゼＣを定量するためにベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）手順に基づく方法を用いた。
【０１５６】
エタノール中の２つの１５０ｍｍｏｌ／ｌのＺ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒのストック溶液を、０．１ｍｏｌ／ｌのＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ６中で８０倍に希釈し、Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒを１：１の比率で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌのＺ−Ａ−Ｆ＋Ｚ−Ａ−Ｒ基質溶液を作製した。次に、２００μｌの基質溶液を、ピペットでエッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）バイアル中に取り、４０℃でプレインキュベートした。５０μｌの適切な酵素希釈物を添加することによって、反応を開始させた。通常、フレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０の希釈物が使用される。スミチームＦＰでは１％溶液を使用した。２５０μｌのニンヒドリン試薬を添加することによって５分後に反応を停止させた。１５ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解された４００ｍｇのニンヒドリン（メルク（Ｍｅｒｃｋ））および６０ｍｇのヒドリンダンチンのニンヒドリン試薬を作製し、これに、５ｍｌの４．０ｍｏｌ／ｌの酢酸リチウム緩衝液ｐＨ５．２を添加した。ＬｉＯＨ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を溶解することによって、４．０ｍｏｌ／ｌの酢酸リチウム緩衝液を作製し、その後、氷酢酸（メルク）を用いて溶液のｐＨをｐＨ５．２に調整した。
【０１５７】
反応を停止した後、各サンプルを９５℃で１５分間加熱して色の形成を容易にし、そして次に純粋なエタノールで１０倍に希釈した。形成された色を、ユビコン（Ｕｖｉｋｏｎ）分光光度計において５７８ｎｍで測定した。活性サンプルと同じようにしてブランクを作製したが、ニンヒドリン試薬および酵素の添加を逆にした。カルボキシペプチダーゼ活性により生じた遊離アミノ酸の量を定量するために、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンを用いて較正曲線を作成した。０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．５および３．０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−フェニルアラニン（シグマ）を含有する緩衝液ｐＨ６中の溶液を、サンプルと同じようにして処理した（すなわちバイアル中に２５０μｌ）。得られたＯＤ５７８値から、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）において曲線を構築した。サンプル中に存在し、Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒ基質を含有する遊離アミノ酸の濃度は、この曲線を用いて計算した。得られた値から、試験酵素の量あたり、１分あたりのマイクロモルでカルボキシ−ペプチダーゼ活性を計算した。
【０１５８】
活性比の計算
本発明に従う方法に対する様々な酵素調製物の適合性を確立するために、関係のある酵素活性の商を計算した。ＭＴＰリーダーベースのアッセイにおいて、時間に対するｐＮＡの放出によって、すなわちΔＯＤ４０５／分で酵素活性を特徴付けた。ＭＴＰリーダーによって得られる酵素活性の商は、同一量の酵素について得られたΔＯＤ／分の値を単に割ることによって計算した。
【０１５９】
しかしながら、カルボキシ−ペプチダーゼアッセイの場合、ＭＴＰ−ｐＮＡベースのアッセイにより生成されるΔＯＤ／分に直接比較することができないＯＤが生成される。ここで、測定されたＯＤを、まず１分あたりに放出されるμｍｏｌアミノ酸（μｍｏｌ／分）に変換した。次に、放出されたｐＮＡのΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換した。そのために、ＭＴＰリーダーにおいて較正曲線を生成し、ここで純粋なｐＮＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の希釈液０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２および０．０１５ｍｍｏｌ／ｌならびにウェルあたり２５０μｌが測定される。得られたデータから、較正曲線をエクセルにおいて構成した。この較正曲線から、ΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換し、ｐＮＡベースの測定が、ニンヒドリンベースの測定と比較され得る。
【０１６０】
上記の試験で生成されるデータに基づいて、使用される様々な酵素調製物を、望ましいプロリン特異的および汚染エンドプロテアーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性に関して特徴付けた。各酵素調製物中に存在する望ましいプロリン特異的活性は、表５の「Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ活性」の欄に示される。汚染アミノペプチダーゼ活性（ＡＰ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）および汚染カルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）およびエンドタンパク質分解活性（Ｅｎｄｏ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）のデータは、存在するプロリン特異的活性に対して示される。各調製物中に存在する汚染カルボキシペプチダーゼ活性に対する汚染アミノペプチダーゼ活性は、（ＡＰ／ＣＰＤ）として示される。
【０１６１】
明白なのは、試験した市販の酵素調製物はどれも、著しいプロリン特異的オリゴ−またはエンドタンパク質分解活性を含有しないことである。さらに、試験した全ての市販の酵素調製物は、汚染エンド−およびエキソタンパク質分解活性を含有する。
【０１６２】
【表５】
2008505653.tif 000006
【０１６３】
Ａ．医薬組成物は、以下に指定される成分を用いて従来の製剤手順によって調製され得る。
【０１６４】
実施例８
ソフトゼラチンカプセル剤
ソフトゼラチンカプセル剤は、以下に指定される成分を用いて従来の手順によって調製される。
活性成分：タンパク質加水分解物  ０．３ｇ
他の成分：グリセロール、水、ゼラチン、植物油
【０１６５】
実施例９
ハードゼラチンカプセル剤
ハードゼラチンカプセル剤は、以下に指定される成分を用いて従来の手順によって調製される。
活性成分：タンパク質加水分解物  ０．７ｇ
他の成分：
充填剤：ラクトースまたはセルロースまたはセルロース誘導体  適量
潤滑剤：必要であればステアリン酸マグネシウム（０．５％）
【０１６６】
実施例１０
錠剤
錠剤は、以下に指定される成分を用いて従来の手順によって調製される。
活性成分：タンパク質加水分解物  ０．３ｇ、非加水分解タンパク質    ０．４ｇ
他の成分：微結晶性セルロース、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、ステアリン酸マグネシウム、クロスカルメロースナトリウム
【０１６７】
Ｂ．食品は、以下に指定される成分を用いて従来の製剤手順によって調製され得る。
【０１６８】
実施例１１
３０％のジュースを有するソフトドリンク
典型的な１回の摂取量：２４０ｍｌ
活性成分：
タンパク質加水分解物および炭水化物源としてのマルトデキストリンがこの食品に取り込まれる：
タンパク質加水分解物：１．５〜１５ｇ／１回の摂取量
マルトデキストリン：３〜３０ｇ／１回の摂取量
【０１６９】
Ｉ．  ソフトドリンク化合物は、以下の成分から調製される。
ジュース濃縮物および水溶性フレーバー
【０１７０】
［ｇ］
１．１  オレンジ濃縮物
６０．３°Ｂｒｉｘ，５．１５％酸性             ６５７．９９
レモン濃縮物
４３．５°Ｂｒｉｘ，３２．７％酸性             ９５．９６
オレンジフレ−バ−、水溶性                     １３．４３
アプリコットフレ−バ−、水溶性                 ６．７１
水                                             ２６．４６
１．２  色
β-カロテン１０％ＣＷＳ                        ０．８９
水                                             ６７．６５
１．３  酸および酸化防止剤
アスコルビン酸                                 ４．１１
クエン酸無水物                                 ０．６９
水                                             ４３．１８
１．４  安定剤
ペクチン                                       ０．２０
安息香酸ナトリウム                             ２．７４
水                                             ６５．６０
１．５  油溶性フレ−バ−
オレンジフレ−バ−、油溶性                     ０．３４
蒸留したオレンジオイル                         ０．３４
１．６  活性成分
活性成分（これは、上記の活性成分：上記濃度のタンパク質加水分解物およびマルトデキストリンを意味する。
【０１７１】
果実ジュース濃縮物および水溶性フレーバーは、空気を取り込むことなく混合される。色は脱イオン水中に溶解される。アスコルビン酸およびクエン酸は、水中に溶解される。安息香酸ナトリウムは、水中に溶解される。ペクチンは攪拌下で添加され、沸騰しながら溶解される。溶液は冷却される。オレンジオイルおよび油溶性フレーバーは予め混合される。１．６で言及した活性成分は乾燥混合され、次に好ましくは、果実ジュース濃縮混合物中に攪拌される（１．１）．
【０１７２】
ソフトドリンク化合物を調製するために、全ての部分３．１．１〜３．１．６は一緒に混合された後、ターラックス（Ｔｕｒｒａｘ）を用いて均質化され、次に高圧ホモジナイザーで均質化される（ｐ１＝２００バール、ｐ２＝５０バール）。
【０１７３】
ＩＩ．瓶詰めシロップは、以下の成分から調製される。
［g］
ソフトドリンク化合物                             ７４．５０
水                                               ５０．００
糖シロップ６０°Ｂｒｉｘ                         １５０．００
【０１７４】
瓶詰めシロップの成分は一緒に混合される。瓶詰めシロップは１ｌの水ですぐに飲める飲料に希釈される。
【０１７５】
変形例
安息香酸ナトリウムを用いる代わりに、飲料は殺菌されてもよい。また飲料は、炭化され（ｃａｒｂｏｎｉｚｅｄ）てもよい。
【０１７６】
実施例１２
様々な市販の酵素調製物のアミノペプチド分解活性
ベータ−カゼインにおいて、ＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−において含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−において含有され、ＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−において含有される。カゼインの他のタンパク質成分のうち、カッパー−カゼインのみがＩＰＰ含有配列を取り込んでいる。プロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性から、ベータ−カゼインをＡ．ニガー由来の酵素と共にインキュベートすると、ペプチドＱ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−、Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−およびＬ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−が形成され得ると推測することができる。ＬＰＰとは対照的に、形成される２つのペンタペプチドは、低いＡＣＥ阻害活性しか示さない。例えばＥＰ０５８３０７４号明細書は、８７３マイクロモル／ｌのＶＶＶＰＰのＩＣ５０値を報告するが、切断型ＶＰＰ分子は、９マイクロモル／ｌのＩＣ５０値を有する。従って、カゼイン加水分解物の十分なＡＣＥ阻害の可能性を生じるために、プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションで形成されるペンタペプチドＶＶＶＰＰおよびＱＮＩＰＰが、それぞれトリペプチドＶＰＰおよびＩＰＰに転換されなければならないことは明白である。アミノペプチダーゼは、ペプチドのＮ末端側からアミノ酸を連続して除去することができるので、アミノペプチド分解酵素活性は、ＶＰＰ配列に先行する２つのバリン（「Ｖ」）残基ならびにＩＰＰ配列に先行するグルタミン（「Ｑ」）およびアスパラギン（「Ｎ」）残基を効率的に遊離できることが必要とされる。ＸＰＰトリペプチドに存在するＸ−ＰおよびＰ−Ｐペプチド結合は酵素による切断に耐えることが分かっているので、このようなアミノペプチド分解活性は、２つのペンタペプチドを所望のＶＰＰおよびＩＰＰトリペプチドに転換し得ると思われる。
【０１７７】
３つの市販の酵素調製物、すなわち、フレーバーザイム１０００ＬバッチＨＰＮ００２１８（デンマークのノボザイムズ）、スミチームＦＰ（日本のシンニホン（Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ））およびコロラーゼＬＡＰ  Ｃｈ．４１２３（ＵＫのＡＢエンザイムズ）を、そのアミノペプチド分解活性について試験した。フレーバーザイムおよびスミチームＦＰは両方とも、特定化されないエンドタンパク質分解活性およびカルボキシペプチド分解活性に加えて、いくつかのアミノペプチド分解酵素活性を含有する複雑な酵素調製物であることが分かっている。コロラーゼＬＡＰは、アスペルギルスからクローン化および過剰発現された比較的純粋なロイシンアミノペプチダーゼ活性を表す。
【０１７８】
これらの３つの市販の調製物中に存在するアミノペプチド分解活性を、色素基質Ｆ−ｐＮＡ（リファレンス）、Ｑ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを用いて試験した。そのために、ＤＭＳＯ中の１５０ｍＭのＸ−ｐＮＡのストック溶液をＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６中で１００×に希釈した。マイクロタイタープレートにウェルあたり２００μｌの緩衝基質溶液を充填し、マゼラン４ソフトウェアで制御されるテカン・ジェニオスＭＴＰリーダーにおいて４０℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌの適切な酵素溶液を添加することによって開始させた（使用の前に、スミチームＦＰ粉末を１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６中に溶解した）。次に、４０５ｎｍで１０分間、黄色のｐＮＡの遊離が起こる。ソフトウェアによりＯＤ／分が計算される。様々な基質に対する各酵素調製物の活性を、Ｆ−ｐＮＡに対するその活性に関して標準化した。得られたデータは、図４に示される。明らかに、３つ全ての酵素調製物は、Ｆ−ｐＮＡに対して最も高い活性を呈するが、Ｑ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡも、これらの酵素の基質を形成する。これらの結果は、アミノペプチダーゼの活性がプロリン特異的プロテアーゼにより形成されるペプチドＱＮＩＰＰおよびＶＶＶＰＰを、それぞれＩＰＰおよびＶＰＰに変換し得るので、プロリン特異的プロテアーゼと組み合わせられると、市販の調製物のそれぞれは、所望のＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを形成できるはずであることを示す。実施例１３に記載される実験においてこの仮説を試験した。
【０１７９】
実施例１３
様々なアミノペプチド分解酵素調製物と一緒にカゼイン塩とＡ．ニガーからのプロリン特異的エンドプロテアーゼとをインキュベートすると、高収率のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰが生成される。
この実施例では、本発明者らは、単一のインキュベーションステップにおいてＡ．ニガーからのプロリン特異的プロテアーゼとアミノペプチド分解活性とを組み合わせることが、様々なＡＣＥ阻害ペプチドの形成に与える効果を研究した。そのために、５０グラムのカゼインナトリウムを５０６グラムの摂氏７０度の水中に溶解することによってカゼイン塩溶液を調製し、１ｌあたり８１グラムタンパク質を含有する溶液を得た。この溶液を摂氏５０度まで冷却し、その後リン酸を用いてｐＨを６．０（２０℃で測定）まで低下させ、その後、様々な酵素の組み合わせを添加した。全てのサンプル（それぞれ１０ｍｌ）に、プロリン特異的プロテアーゼを添加して、タンパク質１グラムあたり４単位の濃度を達成した（単位定義については材料および方法セクションを参照）。サンプルＡ１は、このプロリン特異的プロテアーゼのみを含有した。サンプルＢ１は、プロリン特異的プロテアーゼと、５グラムの水中に希釈した１１４０ｍｇの濃縮フレーバーザイム液体を含有する３８マイクロリットルの溶液とを含有した。サンプルＢ２では、プロリン特異的プロテアーゼと、８マイクロリットルのこのフレーバーザイム溶液とを組み合わせた。サンプルＣ１では、プロリン特異的プロテアーゼと、１００マイクロリットルのコロラーゼＬＡＰ液とを組み合わせた。サンプルＣ２では、プロリン特異的プロテアーゼと、１０マイクロリットルの１０倍に希釈したコロラーゼＬＡＰ液のサンプルとを組み合わせた。５つのサンプルすべてにおいて、インキュベーションを、摂氏５０度で６時間進行させた。混合物を摂氏９０度で５分間加熱することによって、酵素反応を終了させた。エッペンドルフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機において１０分間の遠心分離後に得られた透明な上澄みを捕集して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析まで冷凍で保持した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析後に得られたデータは、表５に示される。
【０１８０】
以前に実証したように、サンプルＡ１のインキュベーション条件（ただプロリン特異的プロテアーゼだけが存在）は、ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰを効率的に生成するが、あまりたくさんの量のＶＰＰは生成しない。ペプチドＶＶＶＰＰＦの不在は、プロリン特異的プロテアーゼが、適用される条件下で、プロリン残基のカルボキシ末端を効率的に切断することを説明する。サンプルＡ１では、ＩＰＰの収率は、ＶＶＶＰＰの収率のだいたい３分の１である。しかしながら、プロリン特異的プロテアーゼと、フレーバーザイム（サンプルＢ１およびＢ２）またはコロラーゼＬＡＰ（サンプルＣ１）のいずれかとを組み合わせることは、ＩＰＰの収率に対して明白な促進効果を有する。サンプルＣ２（低濃度のコロラーゼＬＡＰを有する）では、ＩＰＰの収率は増大されなかった。これはおそらく、アミノペプチダーゼ活性の濃度が、プロリン特異的プロテアーゼにより形成された全てのＱＮＩＰＰを変換するのに不十分であったためである。１グラムのカゼインは、理論的には６．９ｍｇ（２１．１マイクロモル）のＩＰＰ（ベータ−カゼインおよびカッパー−カゼインから）をもたらすことができるので、サンプルＢ１およびＣ１中に存在するＩＰＰレベルはそれぞれ、獲得可能な最大収率の７０％および５５％を表す。本発明者らの期待と一致して、アミノペプチド分解活性を増大させた結果、ＶＶＶＰＰ濃度が低下し、ＶＰＰ濃度が増大した。サンプルＢ２およびＣ２において少量の中間ペプチドＶＶＰＰが検出可能であるという事実は、これらのサンプルでは、アミノペプチド分解活性が、プロリン特異的プロテアーゼにより形成されたＶＶＶＰＰをＶＰＰに完全に変換するために不十分であることを示す。１グラムカゼインは、理論的には４．５８ｍｇ（１４．７マイクロモル）のＶＰＰをもたらすことができるので、サンプルＢ１、Ｂ２およびＣ１では、最大ＶＰＰ収率が得られる。結論として、この実験は、プロリン特異的プロテアーゼと、適切なアミノペプチド分解活性との組み合わせは、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを効率的に生成可能であることを明白に実証する。プロリン特異的エンドプロテアーゼと、アミノペプチダーゼとのこの組み合わせは、プロリン特異的酵素とのインキュベーション後に行われるのが最もよい。特定の方法の要件次第では、余分な酵素とのインキュベーションは、低ｐＨ条件または水と混和性の溶媒を用いる精製ステップの前または後に行うことができる。さらに、インキュベーションは、ＡＣＥ阻害効果を有するアミノ酸配列に先行する望ましくないアミノ酸残基を除去することができるアミノペプチダーゼ活性と共に実行することができる。あるいは、適切なエンドタンパク質分解活性を用いて実行することもできる。このようなエンドタンパク質分解活性の適切な例は、パパイン（オランダ、デルフトのＤＳＭフード・スペシャリティーズ（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ）からコラパリン（Ｃｏｌｌｕｐｕｌｉｎ）で入手可能）により与えられ、Ａｓｎ（Ｎ）およびＶａＩ（Ｖ）残基のカルボキシ末端を効率的に切断することができる。余分な酵素とのインキュベーションが酸またはエタノール沈殿ステップの前に実行されれば、インキュベーションは、コロラー��ＬＡＰなどの比較的純粋なアミノペプチダーゼと共に実行されるのが最もよい（実施例７を参照）。
【０１８１】
【表６】
2008505653.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼのｐＨ最適条件を示す図。
【図２】Ａ．ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼの特異性プロファイル。
【図３】クロマトグラフィー精製したＡ．ニガー由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートした後のインタクトなオボアルブミン及び合成２７−ｍｅｒペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４】合成基質Ｆ−ｐＮＡ、Ｑ−ｐＮＡ及びＶ−ｐＮＡにおいてｐＨ６で試験した３つの市販アミノペプチダーザ含有酵素調製物の相対的な活性。
【図１】
2008505653.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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