(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞レセプターとスーパー抗原との結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質を提供する。また、この二官能性タンパク質を含んでなる治療組成物及びその使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)Ｔ細胞レセプター(TCR)と(ｂ)スーパー抗原との結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質。
【請求項２】
成分(ａ)が、(ｉ)膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と(ii)膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなるTCRであり、(ｉ)及び(ii)は各々TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを含んでなり、天然型TCR中に存在しない定常ドメイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している、請求項１に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項３】
スーパー抗原のＮ末端が、TCRα鎖又はTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸に、直接又はリンカー基を介して間接的に共有結合で連結している、請求項２に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項４】
スーパー抗原のＮ末端が、
TCRα鎖若しくはTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸にペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により直接連結しているか、又は
それ自体がTCRα鎖若しくはTCRβ鎖のＣ末端にペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により連結しているリンカーアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸へのペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により間接的に連結している、請求項２又は３に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項５】
スーパー抗原のＮ末端が、TCRα鎖又はTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸に非ペプチド性ポリマー基を介して連結している、請求項２又は３に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項６】
スーパー抗原が野生型スーパー抗原の変異体であり、その変異はTCRβ可変ドメインに関するスーパー抗原の親和性を維持しつつ、クラスII MHC分子に関する親和性を減少させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項７】
スーパー抗原が野生型の又は変異したブドウ球菌性スーパー抗原である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項８】
スーパー抗原が配列番号：５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項９】
TCR部分において、(ｉ)及び(ii)がTCR鎖の細胞外定常Igドメインの全てを含んでなる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１０】
TCR部分において、(ｉ)及び(ii)がTCR鎖の細胞外ドメインの全てを含んでなる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１１】
TCR部分において、共有結合性ジスルフィド結合が、α鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結している、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１２】
TCR部分において、天然型TCR中に存在する鎖間ジスルフィド結合がない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１３】
TCR部分において、天然型のαTCR鎖及びβTCR鎖が、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されるようにＣ末端で切断されている、請求項１２に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１４】
TCR部分において、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が別の残基に置換されている、請求項１２に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１５】
TCR部分において、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基がセリン又はアラニンに置換されている、請求項１４に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１６】
TCR部分において、天然型TCRβ鎖中に存在する非対合のシステイン残基が存在しない、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１７】
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、β炭素原子が天然型TCR構造中で0.6nm未満離れている残基から置換されたシステイン残基同士間にある、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１８】
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 57から置換されたシステイン残基同士間にある、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項１９】
(ａ)(ｉ)膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と、(ii)融合した、膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなり、(ｉ)及び(ii)は各々TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを含んでなり、(ｉ)及び(ii)はTRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 57から置換されたシステイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している、Ｔ細胞レセプター(TCR)と；
(ｂ)配列番号：５のスーパー抗原
との結合を含んでなり、
TCR(ａ)とスーパー抗原(ｂ)との結合は、それぞれＣ末端からＮ末端への関係で結合している、請求項２に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項２０】
検出可能な標識を更に含んでなる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項２１】
TCRが所定のペプチド-MHCに関して１μMより高い親和性(Kd)を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質を複数含んでなる多価複合体。
【請求項２３】
ポリアルキレングリコールポリマー又はペプチド性配列を含んでなるリンカー基を介して互いに結合した２つ又は３つ又は４つの結合二官能性タンパク質を含んでなる、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
(ｉ)スーパー抗原部分がTCRβ鎖可変ドメインの所定のサブセットに選択的に結合する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質又は請求項２２又は２３に記載の多価複合体を提供し；
(ii)可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体を、クラスII MHC-ペプチド複合体を提示する抗原提示細胞(APC)及び多様なＴ細胞の集団と接触させ；
(iii)APC-可溶性二官能性タンパク質-Ｔ細胞複合体の形成に適切な条件下で(ii)の混合物をインキュベートすることを含んでなる、多様なＴ細胞の集団を、TCRβ鎖可変ドメインの所定のサブセットを提示するＴ細胞について富化する方法。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質及び/又は請求項２２又は２３に記載の多価複合体を医薬的に許容され得るキャリアと共に含んでなる医薬製剤。
【請求項２６】
可溶性TCRβ鎖をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子。
【請求項２７】
膜貫通ドメインを除きTCRβ鎖の全て又は一部をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなり、ここで、TCRβ鎖をコードする核酸配列は、コードされたTCRβ鎖及び更なる非天然型システイン残基を含有するTCRα鎖の定常ドメイン残基同士間の非天然型ジスルフィド結合を形成し得る導入システインコドンを含んでなる、核酸分子。
【請求項２８】
可溶性TCRα鎖をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子。
【請求項２９】
膜貫通ドメインを除きTCRα鎖の全て又は一部をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなり、ここで、TCRα鎖をコードする核酸配列は、コードされたTCRα鎖及び更なる非天然型システイン残基を含有するTCRβ鎖の定常ドメイン残基同士間の非天然型ジスルフィド結合を形成し得る導入システインコドンを含んでなる、核酸分子。
【請求項３０】
請求項２６〜２９に記載の１又は複数の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３２】
スーパー抗原に融合したTCRβ鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞及びTCRα鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を、それぞれTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖の発現を引き起こす条件下でインキュベートし；
それぞれのTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖を精製し；
それぞれのTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖を、共有結合性ジスルフィド結合がTCRα鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基をTCRβ鎖-スーパー抗原融合体の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結するようなリフォールディング条件下で混合する
ことを含んでなる、可溶性二官能性タンパク質を得る方法。
【請求項３３】
スーパー抗原に融合したTCRα鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞及びTCRβ鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を、それぞれTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖の発現を引き起こす条件下でインキュベートし；
それぞれのTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖を精製し；
それぞれのTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖を、共有結合性ジスルフィド結合がTCRβ鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基をTCRα鎖-スーパー抗原融合体の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結するようなリフォールディング条件下で混合する
ことを含んでなる、可溶性二官能性タンパク質を得る方法。
【請求項３４】
ガンを患っている対象に、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体を投与することを含んでなるガンの治療方法。
【請求項３５】
ガンを患っている対象に、有効量の請求項８に記載の可溶性二官能性タンパク質又は請求項２２又は２３に記載のその多価複合体を投与することを含んでなるガンの治療方法。
【請求項３６】
ガンの治療用組成物の製造における請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体の使用。
【請求項３７】
ガンの治療用組成物の製造における請求項８項に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体の使用。
【請求項３８】
感染性疾患を患っている対象に、有効量の請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体を投与することを含んでなる感染性疾患の治療方法。
【請求項３９】
感染性疾患を患っている対象に、有効量の請求項８に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体を投与することを含んでなる感染性疾患の治療方法。
【請求項４０】
感染性疾患の治療用組成物の製造における請求項１〜２１のいずれか１項に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体の使用。
【請求項４１】
感染性疾患の治療用組成物の製造における請求項８に記載の可溶性二官能性タンパク質又はその機能的変形体若しくはフラグメント或いは請求項２２又は２３に記載のその多価複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞レセプター(TCR)とスーパー抗原との結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質に関する。このタンパク質は、疾患(例えばガン及び感染)の治療において有益である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
可溶性TCR
可溶性TCRの作製のために、今日まで多くの構築物が考案されてきた。これら構築物は２つの広範なクラス、単鎖TCR及び二量体TCRに分類される。これら構築物に関する文献を下記にまとめる。
【０００３】
単鎖TCR
単鎖TCR(scTCR)は、天然型へテロ二量体TCRのようにMHC-ペプチド複合体に結合する、一本のアミノ酸鎖からなる人工構築物である。不運にも、両方が１つのオープンリーディングフレームで発現するようにα鎖とβ鎖とを単純に連結することによって機能的なα/βアナログscTCRを作製しようとする試みは、成功していない。これは、おそらく、α-β可溶性ドメインの対合の本来的な不安定性に起因する。
【０００４】
したがって、scTCRの作製には、α鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の種々の切断型を使用する特別な技法が必要とされてきた。この形式は、非常に限られた範囲のscTCR配列にのみ適用可能であるように思われる。Soo Hooら(1992)(PNAS. 89 (10): 4759-63)は、25アミノ酸リンカーと連結した切断型のβ鎖及びα鎖並びに細菌ペリプラズム発現(periplasmic expression)を使用する、2CＴ細胞クローンからの単鎖形式でのマウスTCRの発現を報告している(Schodinら(1996) Mol. Immunol. 33 (9): 819-29も参照)。この設計はまた、Hollerら(2000)(PNAS. 97 (10): 5387-92)により報告されたm6単鎖TCR(これは2C scTCRに由来し、同じH2-Ld-制限アロエピトープに結合する)の基礎をなす。Shustaら(2000)(Nature Biotechnology 18: 754-759)は、酵母ディスプレイ実験において単鎖2C TCR構築物(これは増大した熱安定性及び溶解性を有する変異TCRを産生した)を使用することを報告している。この報告はまた、これらディスプレイされた2C TCRが同族pMHCを発現する細胞と選択的に結合することができることを証明した。Khandekarら(1997)(J. Biol. Chem. 272 (51): 32190-7)は、マウスD10 TCRについて同様な設計を報告している(ただし、このscTCRはMBPに融合され細菌細胞質で発現された)(Hareら(1999) Nat. Struct. Biol. 6 (6): 574-81も参照)。Hilyardら(1994)(PNAS. 91 (19): 9057-61)は、Vα-リンカー-Vβ設計を使用し細菌ペリプラズムで発現させた、インフルエンザマトリクスタンパク質-HLA-A2に特異的なヒトscTCRを報告している。
【０００５】
Chungら(1994)(PNAS. 91 (26) 12654-8)は、Vα-リンカー-Vβ-Cβ設計及び哺乳動物細胞株の表面での発現を使用するヒトscTCRの作製を報告している。この報告は、scTCRのペプチド-HLA特異的結合に関して何ら言及していない。Plaksinら(1997)(J. Immunol. 158 (5): 2218-27)は、HIV gp120-H-2Ddエピトープに特異的なマウスscTCRを作製するための同様なVα-リンカー-Vβ-Cβ設計を報告している。このscTCRは、細菌性封入体として発現し、インビトロでリフォールディングされる。
【０００６】
二量体TCR
多くの論文が、それぞれのサブユニットを接続する天然型ジスルフィドブリッジを含むTCRへテロ二量体の作製を記載している(Garbocziら(1996）Nature 384(6605):134-41；Garbocziら(1996）J Immunol 157(12):5403-10；Changら(1994）PNAS USA 91:11408-11412；Davodeauら(1993）J.Biol.Chem．268(21):15455-15460；Goldenら(1997）J.Imm.Meth．206:163-169；米国特許第6080840号)。しかし、このTCRはTCR特異的抗体により認識され得るが、いずれも、相対的に高い濃度以外ではその天然型リガンドを認識することを示されておらず、そして/又は安定でなかった。
【０００７】
WO99/60120には、天然型リガンドを認識し得るように正確に折り畳まれ、経時的に安定であり、合理的な量で作製することが可能な可溶性TCRが記載されている。このTCRは、一対のＣ末端二量体化ペプチド(例えばロイシンジッパー)により、それぞれTCRβ鎖又はδ鎖細胞外ドメインと二量体化したTCRα鎖又はγ鎖細胞外ドメインを含んでなる。TCRを作製するためのこの戦略は、一般に、全てのTCRに適用可能である。
【０００８】
Guillaumeら(2003)(Nature Immunology 4: 657-663)は、構築物のＣ末端に付着させたアミノ酸同士間に導入ジスルフィド鎖間結合を含有する可溶性JM22 TCRの構築を詳述する。この特別な構築物は、天然型ジスルフィド鎖間結合の位置から１アミノ酸Ｎ末端側で切断したJM22 TCRの細胞外部分から誘導された。Ｃ末端定常ドメイン伸長部(extension)がこのTCRのα鎖及びβ鎖の両方に付加された。これら伸長部は、天然型の位置に対して、α鎖中で３アミノ酸、β鎖中で６アミノ酸ほど下流への鎖間形成性システイン残基位置の移動を引き起こした。この一般的設計の可溶性TCR(すなわち、ジスルフィド鎖間ジスルフィド結合を含有する導入Ｃ末端定常ドメイン伸長部を含んでなる可溶性TCR)もまた、本発明の多価TCR複合体において使用され得る。
【０００９】
Reiterら(Immunity，1995，2:281-287)は、一方がシュードモナス(Pseudomonas)エクソトキシン(PE38)の切断型形態に連結しているジスルフィド安定化TCRα及びβ可変ドメインを含んでなる可溶性分子の構築を詳述している。述べられているこの分子を作製する理由の１つは、単鎖TCRの本来的な不安定性を克服することであった。TCR可変ドメイン中の新規ジスルフィド結合の位置は、これらが予め導入されている抗体の可変ドメインとの相同性により同定された(例えば、Brinkmannら(1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7538-7542及びReiterら(1994）Biochemistry 33:5451-5459を参照)。しかし、抗体とTCRの定常ドメイン同士間にそのような相同性はないので、この技法は、TCR定常ドメイン間の新たな鎖間ジスルフィド結合の適切な部位を同定するために用いることができなかった。
【００１０】
スーパー抗原
スーパー抗原は、抗原提示細胞(APC)の表面のクラスII MHC分子を規定のサブセットのβ鎖可変ドメインのTCRに架橋することにより免疫刺激を引き起こす、細菌性又はウイルス性のタンパク質である。この架橋は、致死性の毒素性ショック症候群を引き起こし得るサイトカイン(例えばIL-2及びTNF-β)の大量遊離を導くポリクローナルＴ細胞活性化を引き起こす。Liら(1999)(Annu Rev Immunol 17 435-466)は、スーパー抗原の構造及び機能の総説を提供する。
【００１１】
スーパー抗原融合タンパク質
スーパー抗原融合タンパク質の使用に関する多くの刊行物が存在する。
米国特許第6,692,746号は、対象に、ブドウ球菌エンテロトキシン若しくは化膿性連鎖球菌外毒素又はポリペプチド融合パートナーに融合したこれら毒素の生物学的に活性なホモログからなる組成物の殺腫瘍上の有効量を投与することを含んでなる腫瘍を有する対象を治療するための方法を提供している。
【００１２】
米国特許第6,514,498号は、標的探索成分と、TCRへの結合及びＴ細胞活性化を決定する領域中の１又はそれ以上のアミノ酸残基を改変させたスーパー抗原との接合体を開示している。
米国特許第6,197,299号は、細胞(好ましくはガン)上の細胞表面構造に特異的な抗体にペプチド結合により共有結合で連結したスーパー抗原を含んでなる可溶性抗体接合体、及びそのような接合体を使用する治療方法を開示している。
【００１３】
EP0998305は、Ｔ細胞活性化を誘導するスーパー抗原-標的化物質-免疫調節剤の接合体を用いる標的細胞の細胞溶解を引き起こすための方法及び組成物を開示している。
WO03094846は、スーパー抗原又はスーパー抗原融合タンパク質の腫瘍内投与及び/又はその鞘内への直接のスーパー抗原の鞘内若しくは腔内投与を含んでなる腫瘍を治療するための方法及び組成物を開示している。
【００１４】
Uenoら(2002)(Anticancer Res.22 (2A) 769-76)は、SEAの組換え融合タンパク質、及びガン腫に存在する糖タンパク質抗原(MK-1抗原と呼ぶ)を認識するFU-MK-1抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)の使用を詳述している。この研究は、この融合タンパク質がヒトMK-1発現腫瘍に関して有用である可能性のある免疫療法試薬として働き得ると結論付けた。
【００１５】
別の研究(Takemuraら(2002) Cancer Immunol Immunother. 51 (1) :33-44)は、変異ブドウ球菌エンテロトキシンＡ(SEA)及び抗MUC1/抗CD3ダイアボディ(diabody)(Mx3ダイアボディ)を含んでなる融合タンパク質の細菌性産生を詳述した。この融合タンパク質は、胆管ガン(BDC)異種移植重症複合免疫不全(SCID)マウスモデルにおいてMUC1特異的抗腫瘍効果を示した。
【００１６】
最後に、別の研究(Nielsenら(2000) J Immunother 23 (1): 146-53)は、進行した結腸直腸ガン又は膵臓ガンの患者における単回の上昇用量のスーパー抗原-抗体融合タンパク質(PNU-214565)の第Ｉ相試験を詳述した。この融合タンパク質は、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ(SEA)とヒト結腸直腸ガン(CRC)及び膵臓ガン(PC)を認識するモノクローナル抗体C242のFabフラグメントの組換え融合体とを含んでなっていた。著者らは、PNU-214565の単回の３時間注入は４ng/kgまで安全に投与することができると結論付けた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の簡単な説明）
本発明は、Ｔ細胞レセプター(TCR)とスーパー抗原との結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質を初めて利用可能にする。
（発明の詳細な説明）
本発明は、(ａ)Ｔ細胞レセプター(TCR)と(ｂ)スーパー抗原又はその機能的変形体との間の結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質を提供する。
【００１８】
本発明における使用に適切な多くの可溶性TCR構築物がある。これらには、以下が含まれるがこれらに限定されない；
Vα-リンカー-Vβ設計(Hilyardら(1994) PNAS. 91 (19): 9057-61)又はVα-リンカー-Vβ-Cβ設計(Chungら(1994) PNAS. 91 (26) 12654-8)の単鎖TCR(scTCR)
WO 99/60120、Guillaumeら(2003)(Nature Immunology 4: 657-663)又はReiterら(Immunity, 1995, 2:281-287)に記載されるような二量体TCR(dTCR)。
【００１９】
本発明の１つの観点は、膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなるＴ細胞レセプター(TCR)と、スーパー抗原又はその機能的変形体との間の結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質により提供される。ここで、各TCR鎖は、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを含んでなり、天然型TCR中に存在しない定常ドメイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している。
【００２０】
スーパー抗原は、抗原提示細胞(APC)の表面のクラスII MHC分子を規定のサブセットのβ鎖可変ドメインのTCRに架橋することにより免疫刺激を引き起こす、細菌性又はウイルス性のタンパク質である。本明細書中で使用する場合、用語 スーパー抗原の「機能的変形体」とは、同じ様式で機能し免疫刺激を生じる、所定のスーパー抗原のアナログをいう。例えば、当業者に公知のように、機能的変形体は、所定の野生型又は変異体と比較して、アミノ酸配列中の軽微な変更を組み込みむことができる。このような軽微な変更としては、クラスII MHC及びTCRβ鎖結合性ドメインから遠隔での保存的なアミノ酸置換、単一アミノ酸欠失、及び切断が挙げられる。機能的変形体は、通常、親スーパー抗原と、少なくとも75％、より頻繁には少なくとも90％、ほとんどの場合少なくとも95〜99％の配列同一性を有する。
【００２１】
本発明の二官能性タンパク質は可溶性である。可溶性の１つの試験は、二官能性タンパク質がリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(KCL 2.7mM、KH2PO4 1.5mM、NaCl 137mM及びNa2PO4 ８mM、pH7.1〜7.5, Life Technologies, Gibco BRL)中に１mg/mlの濃度にて単分散種として存在し、この二官能性タンパク質の90％より多くが25℃にて１時間のインキュベーション後に単分散種のままであることができることである。例えば、二官能性タンパク質の可溶性を評価するためには、先ず実施例３に記載のように二官能性タンパク質を精製する。この精製後、100μgの二官能性タンパク質を、例えばPBS中で平衡化したPharmacia Superdex 75 HRカラムを用いて、分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより分析する。更に、100μgの二官能性タンパク質を25℃にて１時間インキュベートし、次いで前回の様にサイズ排除クロマトグラフィーにより分析する。次いで、サイズ排除トレースを積分により分析し、単分散種に対応するピーク下面積を比較する。該当するピークは、分子量既知のタンパク質標準物の溶出位置との比較により同定してもよい。単分散へテロ二量体可溶性二官能性タンパク質は、約75〜80kDaの分子量を有する。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、用語「結合」は、TCR及びスーパー抗原をこの２つが生物学的に単一実体として振舞うように近接させるTCRとスーパー抗原との間の連結をいう。このような連結は通常共有結合である。結果的に、本明細書中で使用する用語「二官能性タンパク質」は、
TCR配列及びスーパー抗原配列を含んでなる融合タンパク質
非ペプチド性リンカーにより共有結合で連結しているTCR配列及びスーパー抗原配列
TCR配列及びスーパー抗原配列が非共有結合的に結合している複合体
を含むと理解されるべきである。
【００２３】
スーパー抗原がTCRにリンカー基を介して間接的である場合、本発明のTCRとスーパー抗原の結合に好ましい２つのクラスのリンカー基、非ペプチド性ポリマー基及びペプチド性基がある。これら２つのクラスのリンカー基は、本発明の可溶性二官能性タンパク質の多価複合体の形成における使用に関連して、下記で詳細に説明する。本明細書の実施例１は、TCRとスーパー抗原との間の結合を形成するために使用し得るペプチド性リンカーの例を提供する。
【００２４】
本発明の或る実施形態では、スーパー抗原のＮ末端は、TCRα鎖又はTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸に、直接又はリンカー基を介して間接的に共有結合で連結している。本発明の更なる実施形態では、スーパー抗原のＮ末端は、(ａ)TCRα鎖若しくはTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸にペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により直接にか、又は(ｂ)それ自体がTCRα鎖若しくはTCRβ鎖のＣ末端にペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により連結しているリンカーアミノ酸配列のＣ末端アミノ酸へのペプチド結合若しくはシステイン間ジスルフィド結合により間接的にかのいずれかで連結している。
【００２５】
本発明の具体的実施形態において、スーパー抗原のＮ末端は、TCRα鎖又はTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸に、ペプチド性リンカーを介して連結している。
【００２６】
当業者に公知のように、種々のペプチドリンカーが、TCRβ鎖をスーパー抗原に連結するために適切であり得る。以下は、この目的に使用し得るリンカー配列の例である。
ggcggtccg これはGly-Gly-Proリンカー(L1)をコードする。
ggatccggcggtccg (配列番号：１) − これは、BamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカー(L2)をコードする。
ggatccggtgggggcggaagtggaggcagcggtggatccggcggtccg (配列番号：３) − これは、２つのBamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：４)リンカー(L3)をコードする。
cccggg − これはXma1制限酵素部位を含むPro-Glyリンカー(L4)をコードする。
【００２７】
本発明の具体的実施形態において、スーパー抗原のＮ末端は、TCRα鎖又はTCRβ鎖のＣ末端アミノ酸に、非ペプチド性ポリマー基を介して連結している。
スーパー抗原が野生型スーパー抗原の変異体であり、その変異がTCRβ可変ドメインに関する当該スーパー抗原の親和性を保持するがクラスII MHC分子に関する親和性を減少させる本発明の１つの観点が提供される。
【００２８】
本発明の更なる観点において、スーパー抗原は野生型の又は変異したブドウ球菌性スーパー抗原である。
スーパー抗原が図9b(配列番号：５)に示されるアミノ酸配列を有する本発明の具体的実施形態が提供される。このスーパー抗原(SEA-E120, Active Biotech, Sweden)は、図8b(配列番号：６)に示される野生型SEA-Eスーパー抗原に対して、TCRβ可変ドメインに関する親和性を保持するがクラスII MHC分子に関する親和性を減少させるように変異している。
【００２９】
本明細書中に開示された可溶性二官能性タンパク質のTCR部分は、標的化成分(targeting moiety)である。これらはTCRリガンド(例えば、ペプチド-MHC又はCD1-抗原複合体)を標的する。このように、これらTCRは、TCRリガンドに関して、当該リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度を有していれば望ましい。
【００３０】
１つの広い観点では、本発明の可溶性二官能性タンパク質のTCR部分は、それぞれWO 04/033685及びWO 03/020763に記載されるような単鎖TCR(scTCR)又は二量体TCR(dTCR)のいずれかの形態である。詳細には：
可溶性二官能性タンパク質の適切なTCR部分は、膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と、膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなり、ここで各TCR鎖は、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを含んでなり、天然型TCR中に存在しない定常ドメイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している。
【００３１】
本発明の１つの具体的実施形態では、このようなTCR部分は、TCR鎖の細胞外定常Igドメインの全てを含んでなる。
本発明の別の具体的実施形態において、このようなTCR部分は、TCR鎖の細胞外ドメインの全てを含んでなる。
【００３２】
可溶性二官能性タンパク質のTCR部分は、天然型TCR中に存在しない定常ドメイン残基同士間にジスルフィド連結を有することにより特徴付けられる。
本発明の１つの観点では、この共有結合性ジスルフィド結合は、α鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結する。
【００３３】
TCR部分において、天然型TCR中に存在する鎖間ジスルフィド結合がない本発明の別の観点が提供される。TCR部分において、天然型のαTCR鎖及びβTCR鎖が、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除去されるようにＣ末端で切断されているこの観点の具体的実施形態が提供される。代替の実施形態では、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は別の残基に置換されている。別の具体的実施形態では、天然型鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、セリン又はアラニンに置換されている。
【００３４】
TCR部分において、天然型TCRβ鎖中に存在する非対合のシステイン残基が存在しない本発明の１つの観点が提供される。
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、β炭素原子が天然型TCR構造中で0.6nm未満離れている残基から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の別の観点が提供される。
【００３５】
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 57から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の具体的実施形態が提供される。
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 45及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 77から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の別の具体的実施形態が提供される。
【００３６】
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のTyr 10及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 17から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の別の具体的実施形態が提供される。
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のThr 45及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のAsp 59から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の別の具体的実施形態が提供される。
【００３７】
TCR部分において、天然型TCR中に存在しないジスルフィド結合が、TRAC*01のエキソン１のSer 15及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のGlu 15から置換されたシステイン残基同士間にある本発明の別の具体的実施形態が提供される。
【００３８】
本発明の別の具体的実施形態は、
(ａ)(ｉ)膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と(ii)膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなるTCRと
(ｂ)配列番号５のスーパー抗原
との間の結合を含んでなる可溶性二官能性タンパク質により提供される。ここで、(ｉ)及び(ii)は各々、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを含んでなり、そしてTRAC*01のエキソン１のThr 48及びTRBC1*01又はTRBC2*01のエキソン１のSer 57から置換されたシステイン残基同士間のジスルフィド結合により連結している。また、TCR(ａ)とスーパー抗原(ｂ)の結合は、それぞれＣ末端からＮ末端への関係で結合している。
【００３９】
TCR部分が、膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全て又は一部と膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全て又は一部とを含んでなり、各TCR鎖は各々、第２のTCRの定常ドメインの全て又は一部に融合した第１のTCRの機能的可変ドメインを含んでなり、第１及び第２のTCRは同じ種に由来する本発明の更なる実施形態が提供される。
本発明の可溶性二官能性タンパク質が検出可能な標識を更に含んでなる、更なる観点が提供される。
【００４０】
TCRが１μMより高い所定のペプチド-MHCに関する親和性(Kd)を有する更なる観点が、本発明の可溶性二官能性タンパク質により提供される。本発明者らの同時係属中の出願WO 2004/044004は、TCRリガンドに関して、当該リガンドに特異的な天然型TCRより高い親和性及び/又は遅い解離速度を有するTCRを作製する方法を詳述している。好ましくは、TCRリガンドに関するTCRの親和性(KD)は１μMより高く及び/又は解離速度(kOFF)は１×10-3 S-1より遅い。より好ましくは、TCRリガンドに関するTCRの親和性(KD)は10nMより高く及び/又は解離速度(kOff)は１×10-4 S-1より遅い。最も好ましくは、TCRリガンドに関するTCRの親和性(KD)は１nMより高く及び/又は解離速度(kOff)は１×10-5 S-1より遅い。
【００４１】
親和性(KD)及び/又は解離速度(koff)の測定は、任意の公知の方法により行うことができる。好ましい方法は、実施例４の表面プラズモン共鳴(Biacore)法である。
上記で言及した非天然型ジスルフィド結合に加えて、本発明の可溶性二官能性タンパク質のTCR部分は、天然型TCR中でジスルフィド結合により連結している残基に対応する残基同士間のジスルフィド結合を含み得る。
本発明の可溶性二官能性タンパク質のTCR部分は、好ましくは、天然型TCRの膜貫通配列に対応する配列も細胞質配列に対応する配列を含有しない。
【００４２】
多価複合体
本発明の１つの観点により、複数の可溶性二官能性タンパク質を含んでなる多価複合体が提供される。この観点の１つの実施形態は、ポリアルキレングリコールポリマー又はペプチド性配列を含んでなるリンカー基を介して互いに結合した２つ又は３つ又は４つの結合二官能性タンパク質により提供される。好ましくは複合体は水溶性であり、したがってリンカー基はそれ相応に選択されるべきである。更に、リンカー基は、形成される複合体の構造的多様性が最小限化するように、可溶性二官能性タンパク質上の規定位置に付着することができるべきであることが好ましい。この観点の１つの実施形態は、ポリマー鎖又はペプチド性リンカー配列がTCR部分の可変領域配列中に位置しない各可溶性二官能性タンパク質のアミノ酸残基同士間に伸びている本発明の多価複合体により提供される。
【００４３】
本発明の複合体は医学用であり得るので、リンカー成分は医薬的適合性、例えば免疫原性に関して当然に注意して選択されるべきである。
上記の望まれる基準を満たすリンカー成分の例は、当該分野、例えば抗体フラグメントの連結の分野で公知である。
【００４４】
本発明の多価複合体の製造における使用に好ましい２つのクラスのリンカーが存在する。可溶性二官能性タンパク質がポリアルキレングリコール鎖により連結している本発明の多価複合体は、この観点の１つの実施形態を提供する。
【００４５】
第１は、親水性ポリマー、例えばポリアルキレングリコールである。このクラスの最も一般に使用されるものは、ポリエチレングリコール又はPEG(この構造を下記に示す)をベースにする：
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
(式中、ｎは２より大きい)。しかし、他の適切な(任意に置換されていてもよい)ポリアルキレングリコール(ポリプロピレングリコールを含む)及びエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーをベースにするものもある。
【００４６】
このようなポリマーは、治療剤、特にポリペプチド治療剤又はタンパク質治療剤を処理するか又はこれに接合するかして、該治療剤のPKプロフィールに有益な変化(例えば、減少した腎クリアランス、向上した血漿半減期、減少した免疫原性及び向上した溶解性)を達成するために使用され得る。PEG−治療剤接合体のPKプロフィールのこのような改善は、PEG分子が該治療剤の周囲に、免疫系との反応を立体的に障害しタンパク質分解性分解を減少させる「殻」を形成することに起因すると考えられる(Caseyら(2000) Tumor Targetting 4 235-244)。使用する親水性ポリマーのサイズは、具体的には、TCR複合体の意図する治療用途に基づいて選択し得る。したがって、例えば、製品が、例えば腫瘍治療における使用のために、循環中を出て組織に浸潤するよう意図される場合、５KDaのオーダーの低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。医薬製剤におけるPEG及び類似分子の使用を詳述する多くの総説論文及び本が存在する。例えば、Harris (1992) Polyethylene Glycol Chemistry - Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York, NY.、又はHarris & Zalipsky (1997) Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books，Washington，D.C.を参照。
【００４７】
使用するポリマーは、直鎖状又は分枝状の構造を有することができる。分枝状PEG分子又はその誘導体は、グリセロール及びグリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、ソルビトール並びにリジンを含む分枝成分の付加により誘導することができる。
【００４８】
通常、ポリマーは、該ポリマーが可溶性二官能性タンパク質中の標的部位へ連結することが可能となるように、その構造中、例えば一方又は両方の端部及び/又は主鎖からの分枝上に、化学反応性の基を有する。下記に示すように、この化学反応性の基は親水性ポリマーに直接付着させてもよいし、又は親水性ポリマーと反応性化学成分との間にスペーサ基/成分が存在していてもよい：
反応性化学成分−親水性ポリマー−反応性化学成分
反応性化学成分−スペーサ−親水性ポリマー−スペーサ−反応性化学成分
【００４９】
上記で概説したタイプの構築物の形成に使用するスペーサは、非反応性の化学的に安定な鎖である任意の有機成分であり得る。このようなスペーサには、以下が含まれるがそれらに限定されない：
-(CH2)n- (式中、ｎ=２〜５)
-(CH2)3NHCO(CH2)2
【００５０】
ポリアルキレングリコール鎖と複合体の可溶性二官能性タンパク質へのその付着点との間に二価アルキレンスペーサ基が位置する本発明の多価複合体により、この観点の更なる実施形態が提供される。
ポリアルキレングリコール鎖が少なくとも２つのポリエチレングリコール反復単位を含んでなる本発明の多価複合体により、この観点の更なる実施形態が提供される。
【００５１】
本発明に有用であり得る反応性化学成分に直接か又はスペーサーを介して連結される親水性ポリマーの商業的供給業者は多く存在する。これら供給業者としては、Nektar Therapeutics(CA、米国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韓国)及びEnzon Pharmaceuticals(NJ、米国)が挙げられる。
【００５２】
本発明に有用であり得る反応性化学成分に直接か又はスペーサーを介して連結される市販の親水性ポリマーとしては、以下のものが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５３】
【表１】
2008520227.tif 000002
【００５４】
種々のカップリング化学成分を使用して、ポリマー分子をタンパク質治療剤及びペプチド治療剤とカップリングすることができる。最も適切なカップリング化学成分の選択は、所望するカップリング部位に大きく依存する。例えば、以下のカップリング化学成分が、PEG分子の１又はそれ以上の末端に付着させるために使用されてきた(出典：Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003)：
【００５５】
Ｎ−マレイミド
ビニルスルホン
炭酸ベンゾトリアゾール
スクシンイミジルプロピオネート
スクシンイミジルブタノエート(succinimidyl butanoate)
チオエステル
アセトアルデヒド
アクリラート
ビオチン
一級アミン
【００５６】
上記のように、非PEGベースのポリマーもまた、本発明の可溶性二官能性タンパク質を多量化するために適切なリンカーを提供する。例えば、脂肪族鎖により連結したマレイミド末端を含有する成分、例えばBMH及びBMOE(Pierce，製品番号22330及び22323)が使用できる。
【００５７】
ペプチド性リンカーが他方の好ましいクラスのリンカー基である。これらリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカー又は可溶性二官能性タンパク質を付着させ得る多量体化ドメインを作製するために機能する。ビオチン/ストレプトアビジン系は、以前に、インビトロ結合研究用の可溶性TCRの四量体(WO/99/60119を参照)を作製するために使用された。しかし、ストレプトアビジンは微生物由来のポリペプチドであり、よって治療剤における使用に理想的には適していない。
【００５８】
可溶性二官能性タンパク質がヒト多量体化ドメインに由来するペプチド性リンカーにより連結している本発明の多価複合体により、この観点の更なる実施形態が提供される。
多価複合体の作製に使用できる多量体化ドメインを含有する多くのヒトタンパク質が存在する。例えば、p53の四量体化ドメインは、単量体scFvフラグメントと比較して、増大した血清残存率及び有意に減少した解離速度を示すscFv抗体フラグメント四量体を作製するために利用されている(Willudaら(2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392)。ヘモグロビンもまた、この種の適用におそらく使用できる四量体化ドメインを有する。
【００５９】
少なくとも１つが本発明の可溶性二官能性タンパク質である少なくとも２つの可溶性二官能性タンパク質を含んでなる多価複合体により、この観点の別の実施形態が提供される。
【００６０】
上記の観点及びその実施形態は、以下の形態の本発明の多価複合体を作製する方法を詳述する：
(AB)n
ここで、Aは可溶性二官能性タンパク質のTCR部分であり、Bは可溶性二官能性タンパク質のスーパー抗原部分である。可溶性二官能性タンパク質のTCR部分及び/又はスーパー抗原部分が多量体化されている代替構築物も有益であり得ると考えられる。これら構築物は以下のいずれかの形態であり得る：
【００６１】
本発明の１つのTCRが少なくとも２つのスーパー抗原に連結している
A(B)n
又は、少なくとも２つの本発明のTCRが１つのスーパー抗原に連結している
(A)nB
又は、少なくとも２つの本発明のTCRが少なくとも２つのスーパー抗原に連結している
(A)n(B)n
【００６２】
(治療用途)
本発明はまた、標的細胞にスーパー抗原を送達する方法を提供する。この方法は、潜在的な標的細胞を本発明に従う可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体と、標的細胞への可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体の付着を可能にする条件下で接触させることを含んでなる。ここで、可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体は、所定のペプチド-MHC複合体に特異的である。
【００６３】
詳細には、本発明の可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体は、特定の抗原を提示する細胞の位置までスーパー抗原を送達するために使用することができる。このことは、多くの状況で、例えば腫瘍に対して又は感染性疾患の部位で有用である。スーパー抗原は、その効果が局所的に(しかしスーパー抗原が結合する細胞のみではない)発揮されるように送達することができる。
【００６４】
このように、１つの特定の戦略は、腫瘍抗原に特異的である、本発明による二官能性タンパク質又は多価複合体を使用する。ガン治療には、腫瘍又は転移の近傍への局在がスーパー抗原の効果を増強する。或いは、本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体は、感染性疾患に関連する特定の抗原を提示する細胞の位置までスーパー抗原を送達するために使用することができる。.
【００６５】
二官能性タンパク質又は多価複合体の投与前及び/又は投与と同時の患者へのインターフェロン(IFN)(例えば、IFN-γ)の投与は、標的細胞でのペプチド−MHC発現レベルを増加させることができる。このことはガンの治療において特に有益であり得る。
本発明の更なる実施形態は、本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体を医薬的に許容され得るキャリアと共に含んでなる医薬組成物により提供される。
【００６６】
本発明はまた、ガン疾患を患っている対象に、有効量の本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体を投与することを含んでなるガンの治療方法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、ガンの治療用組成物の製造における、本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体の使用を提供する。SEA E120又はその機能的変形体若しくはフラグメントは、ガン治療での本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体における使用のための特に好ましいスーパー抗原である。
【００６７】
本発明はまた、感染性疾患を患っている対象に、有効量の本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体を投与することを含んでなる感染性疾患の治療方法を提供する。関連する実施形態では、本発明は、感染性疾患の治療用組成物の製造における本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体の使用を提供する。SEA E120又はその機能的変形体若しくはフラグメントは、感染性疾患の治療での本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体における使用のための好ましいスーパー抗原である。
【００６８】
本発明の組成物及び方法により治療されるガンには、白血病、頭部及び頸部、肺、胸部、結腸、子宮頸部、肝臓、膵臓、卵巣、前立腺、結腸、肝臓、膀胱、食道、胃、黒色腫及び精巣が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
本発明の組成物及び方法により治療される感染性疾患は、細胞内感染性生物により引き起こされるものである。本明細書中で使用する用語「細胞内感染性生物」は、ヒト細胞に侵入し得る任意の生物を包含すると理解される。このような生物は、直接に疾患を引き起こし得るか、又は直接には変化した細胞機能を導き得る。これら生物は以下のもののいずれかであり得る：
細菌、真菌、ウイルス、原生動物及びマイコバクテリア。
【００７０】
これら疾患及び該疾患を引き起こす細胞内感染性生物の例としては、ペスト菌(Yersinia pestis)により引き起こされる腺ペスト及びHTLV-1ウイルスにより引き起こされるＴ細胞白血病が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明に従う治療用の二官能性タンパク質又は多価複合体は、通常、医薬的に許容され得るキャリアを一般には含む滅菌医薬組成物の部分として供給される。この医薬組成物は、(これを患者に投与する望ましい方法に依存して)任意の適切な形態であり得る。これは、単位投薬剤形で提供されてもよく、一般には密封容器で提供され、キットの部分として提供されてもよい。このようなキットは、(必ずしもではないが)通常、使用のための指示書を含む。キットは、複数の単位投薬剤形を含んでもよい。
【００７２】
医薬組成物は、任意の適切な経路による投与、例えば非経口経路、経皮経路又は吸入による投与、好ましくは非経口(皮下、筋肉内又は静脈内(最も好ましい)を含む)経路による投与に適合され得る。このような組成物は、薬学の分野において任意の公知方法により、例えば滅菌条件下で活性成分をキャリア又は賦形剤と混合することにより製造し得る。
【００７３】
本発明の物質の投薬量は、処置すべき疾患又は障害、治療すべき個体の年齢及び症状などに依存して、幅広い制限範囲内で変化し得、究極的には、医師が、使用すべき適切な投薬量を決定する。
【００７４】
（追加の観点）
本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体は、実質的に純粋な形態で、又は精製若しくは単離した調製物として提供され得る。例えば、本発明の二官能性タンパク質又は多価複合体は、他のタンパク質を実質的に含まない形態で提供され得る。
【００７５】
また、可溶性TCRβ鎖をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子も提供される。関連する実施形態は、膜貫通ドメインを除きTCRβ鎖の全て又は一部をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子により提供される。ここで、TCRβ鎖をコードする核酸配列は、コードされるTCRβ鎖及び更なる非天然型システイン残基を含有するTCRα鎖の定常ドメイン残基同士間に非天然型ジスルフィド結合を形成し得る導入システインコドンを含んでなる。
【００７６】
更に、可溶性TCRα鎖をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子が提供される。関連する実施形態は、膜貫通ドメインを除きTCRα鎖の全て又は一部をコードする第２の核酸に融合したスーパー抗原をコードする第１の核酸配列を含んでなる核酸分子により提供される。ここで、TCRα鎖をコードする核酸配列は、コードされるTCRα鎖及び更なる非天然型システイン残基を含有するTCRβ鎖の定常ドメイン残基間に非天然型ジスルフィド結合を形成し得る導入システインコドンを含んでなる。
【００７７】
また、本発明の１又は複数の核酸分子を含んでなるベクター及びそのようなベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。
【００７８】
また、スーパー抗原に融合したTCRβ鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞及びTCRα鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を、それぞれTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖の発現を引き起こす条件下でインキュベートし；
それぞれのTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖を精製し；
それぞれのTCRβ鎖-スーパー抗原融合体及びTCRα鎖を、共有結合性ジスルフィド結合がTCRα鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基をTCRβ鎖-スーパー抗原融合体の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結するようなリフォールディング条件下で混合する
ことを含んでなる可溶性二官能性タンパク質を得る方法が提供される。
【００７９】
更に、スーパー抗原に融合したTCRα鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞及びTCRβ鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞を、それぞれTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖の発現を引き起こす条件下でインキュベートし；
それぞれのTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖を精製し；
それぞれのTCRα鎖-スーパー抗原融合体及びTCRβ鎖を、共有結合性ジスルフィド結合がTCRβ鎖の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基をTCRα鎖-スーパー抗原融合体の定常ドメインのイムノグロブリン領域の残基に連結するようなリフォールディング条件下で混合する
ことを含んでなる可溶性二官能性タンパク質を得る代替方法が提供される。
【００８０】
また、(ｉ)スーパー抗原部分がTCRβ鎖可変ドメインの所定のサブセットに選択的に結合する本発明の可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体を提供し；
(ii)可溶性二官能性タンパク質又は多価複合体を、クラスII MHC-ペプチド複合体を提示する抗原提示細胞(APC)及び多様なＴ細胞の集団と接触させ；
(iii)APC-可溶性二官能性タンパク質-Ｔ細胞複合体の形成に適切な条件下で(ii)の混合物をインキュベートする
ことを含んでなる、TCRβ鎖可変ドメインの所定のサブセットを提示するＴ細胞について多様なＴ細胞の集団を富化する方法が提供される。
【００８１】
本発明の各観点の好ましい特徴は、その他の観点の各々についても、必要な変更を加えてではあるが同様である。本明細書中で言及する先行技術文献は、法が許す最大限度で本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
（実施例）
本発明を以下の実施例で更に説明するが、以下の実施例は本発明の範囲を如何なる様式でも制限しない。
【００８３】
以下に、添付図面について言及する。
図1a及び1bはそれぞれ、システインコドンが導入されるように変異させた可溶性A6 (Tax) TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。影付きは、α鎖核酸中の導入システインコドン及び導入BamH1制限部位を示す；
【００８４】
図2aは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するT48→C変異(下線)を含むA6 (Tax) TCRα鎖細胞外アミノ酸配列を示す。図2bは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するS57→C変異(下線)を含むA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列を示す；
【００８５】
図3a及び3bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたJM22 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す；
図4a及び4bはそれぞれ、図3a及び3bのDNA配列から作製したJM22 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す；
【００８６】
図5a及び5bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたA6 (Tax) TCRβ鎖の高親和性変形体のDNA配列及びアミノ酸配列を示す。導入したシステインコドンは影付きで示し、親和性増大変異は太字で示している；
図6a及び6bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたテロメラーゼTCRの高親和性変形体のα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示している；
【００８７】
図7a及び7bはそれぞれ、図6a及び6bのDNA配列から作製したテロメラーゼTCRα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体を示す；
図8a  −  野生型SEA-EのDNA配列
図8b  −  野生型SEA-Eのアミノ酸配列
図9a  −  変異体スーパー抗原SEA-E120のDNA配列
図9b  −  変異体スーパー抗原SEA-E120のアミノ酸配列。変異アミノ酸は影付きで示している；
【００８８】
図10a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【００８９】
図10b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【００９０】
図11a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【００９１】
図11b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【００９２】
図12a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【００９３】
図12b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【００９４】
図13a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【００９５】
図13b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【００９６】
図14はPEX821プラスミドのDNA配列を詳述する。
図15は、高親和性A6 (Tax) TCR-SEA-E120スーパー抗原融合タンパク質を使用するAPCのペプチド-MHC特異的なCTL媒介性殺傷を示す。
図16は、T2細胞の殺傷に対するTaxペプチドパルス滴定濃度(１×10-10〜１×10-6Ｍ)及び高親和性Tax TCR-L2-SEA E-120滴定濃度(6.4×10-13〜１×10-7Ｍ)の効果を示す。
【００９７】
図17は、固定濃度(10-6Ｍ)のTaxペプチド又は無関係のテロメラーゼペプチド(ILAKFLHWL)コントロールを用いる高親和性Tax TCR-L2-SEA E-120融合タンパク質により誘発されるT2細胞殺傷を示す。
図18a及び18bはそれぞれ、導入システインを含有する高親和性NY-ESO TCRα鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を詳述する。
【００９８】
図19a及び19bはそれぞれ、SEA E-120に融合された、導入システインを含有する切断型高親和性NY-ESO TCRβ鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を詳述する。切断型NY-ESO TCRβ鎖は、「正常な」可溶性TCRと比較して、Ｃ末端から最後の３アミノ酸(RAD)が除去されている。図19aでは切断型TCRβ鎖のDNA配列中の最後のグリシン残基をコードするコドンに下線を付し、図19bでは対応するグリシン残基に下線を付した。
【００９９】
図20a〜20cはそれぞれ、多くのTCR-スーパー抗原融合体、Tax TCR-L2-SEA E120、テロメラーゼTCR-L1-SEA E120及びNY-ESO TCR-LM1-SEA E120のT2細胞殺傷能力を示す。全ての融合タンパク質を２nMの濃度で供給した。T2標的細胞を、10-6Ｍの同族ペプチド又は無関係のペプチドでパルスした。種々のエフェクター：標的細胞(E:T)比を使用した。
【０１００】
図21a及び21bは、共に２nMの濃度で供給した２つの異なるTCR-スーパー抗原融合体(それぞれTax TCR-L2-SEA E120及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120)のT2標的細胞殺傷能力を示す。標的細胞を、これらTCR-スーパー抗原融合体の１つに関しての同族ペプチド10-6Ｍでパルスし、種々のエフェクター：標的細胞(E:T)比を使用した。
【０１０１】
図22は、共に２nMの濃度で供給したTax TCR-L2-SEA E120及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質のSK-Mel 37腫瘍細胞株殺傷能力を示す。標的細胞を10-6ＭのTaxペプチドでパルスし、種々のエフェクター：標的(E:T)細胞比を調べた。
【０１０２】
図23は、pEX821ベクターのプラスミドマップを提供する。
図24は、pEX954ベクターのDNA配列を詳述する。
図25は、pEX954ベクターのプラスミドマップを提供する。
【０１０３】
実施例１  −  可溶性高親和性A6 (Tax) TCR-スーパー抗原融合タンパク質をコードするDNAの作製
図8a及び9aにそれぞれ詳述する野生型SEAスーパー抗原又は変異SEA E120スーパー抗原のいずれかをコードするDNAの5’末端にペプチドリンカーをコードするDNA配列を介して連結している図5aに詳述する可溶性高親和性A6 (Tax) TCRβ鎖をコードするDNA配列を含んでなる合成遺伝子を合成した。
適切なDNAサービスを提供する多くの会社、例えばGeneart(ドイツ)が存在する。
【０１０４】
図10aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカー(配列番号：２)を介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を詳述する。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【０１０５】
図10bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカー(配列番号：２)を介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を詳述する。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【０１０６】
図11aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカー(配列番号：２)を介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を詳述する。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【０１０７】
図11bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカー(配列番号：２)を介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を詳述する。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【０１０８】
当業者に公知のように、種々のペプチドリンカーが、TCRβ鎖をスーパー抗原に連結するために適切であり得る。以下は、この目的に使用され得るリンカー配列の例である。
【０１０９】
リンカー配列:
当業者に公知のように、種々のペプチドリンカーが、TCRβ鎖をスーパー抗原と連結するために適切であり得る。以下は、この目的に使用され得るリンカー配列の例である。
【０１１０】
ggcggtccg − これはGly-Gly-Proリンカー(L1)をコードする。
ggatccggcggtccg (配列番号：１) − これは、BamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカー(L2)をコードする。
ggatccggtgggggcggaagtggaggcagcggtggatccggcggtccg (配列番号：３) − これは、２つのBamH1制限酵素部位を含むGly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：４)リンカー(L3)をコードする。
cccggg − これはXma1制限酵素部位を含むPro-Glyリンカー(L4)をコードする。
【０１１１】
直接融合体としての可溶性TCR鎖とスーパー抗原との結合を引き起こすこともまた可能である。可溶性TCRβ鎖と必要なスーパー抗原との直接融合により形成される融合タンパク質は、本明細書中で、リンカー配列を欠いていることを意味するようにTCR-L0-スーパー抗原と示される。TCR-スーパー抗原の直接融合タンパク質は、該融合タンパク質のTCR部分又はスーパー抗原部分のいずれかの切断を含んでいてもよい。例えば、以下の２つのタイプの切断型TCR-スーパー抗原融合体が形成された。「TCR-LM1-スーパー抗原」融合体は、スーパー抗原のＮ末端に直接融合した、TCR鎖のＣ末端から最後の３アミノ酸を除去するように切断された可溶性TCRβ鎖を含んでなる。「TCR-LM2-スーパー抗原」融合体は、Ｎ末端から最初の３アミノ酸を除去するように切断されたスーパー抗原に直接融合した可溶性TCRβ鎖を含んでなる。
【０１１２】
次いで、TCRβ鎖-リンカー-スーパー抗原融合タンパク質をコードする上記合成遺伝子の１つを、pEX821プラスミド中にサブクローニングした。pEX821のDNA配列及びプラスミドマップはそれぞれ図14及び図23に提供されている。
次いで、非天然型システインコドンを含有する可溶性A6 (Tax) TCRのα鎖をコードする合成遺伝子を独立してpEX954プラスミド中にサブクローニングした(pEX954のDNA配列及びプラスミドマップについてはそれぞれ図24及び25を参照)。
図1aに、この可溶性A6 (Tax) TCRα鎖のDNA配列を詳述する。
【０１１３】
実施例２  −  可溶性高親和性テロメラーゼTCR-スーパー抗原融合タンパク質をコードするDNAの作製
図8a及び9aにそれぞれ詳述する野生型SEAスーパー抗原又は変異SEA E120スーパー抗原のいずれかをコードするDNAの5’末端にペプチドリンカーをコードするDNA配列を介して連結している図6bに詳述する可溶性高親和性テロメラーゼTCRβ鎖をコードするDNA配列を含んでなる合成遺伝子を合成した。
適切なDNAサービスを提供する多くの会社、例えばGeneart(ドイツ)が存在する。
【０１１４】
図12a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【０１１５】
図12b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【０１１６】
図13a  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【０１１７】
図13b  −  Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【０１１８】
当業者に公知のように、種々のペプチドリンカーが、TCRβ鎖をスーパー抗原と連結するために適切であり得る。実施例１に、この目的に使用され得るリンカー配列の例が提供されている。
【０１１９】
次いで、TCRβ鎖-リンカー-スーパー抗原融合タンパク質をコードする上記合成遺伝子の１つを、pEX821プラスミド中にサブクローニングした。図14にPEX821プラスミドのDNA配列が詳述されている。図23にはこのベクターのプラスミドマップが提供されている。
【０１２０】
次いで、非天然型システインコドンを含有する可溶性テロメラーゼTCRのα鎖をコードする合成遺伝子を独立してpEX954プラスミド中にサブクローニングした(pEX954のDNA配列及びプラスミドマップについてはそれぞれ図24及び25を参照)。
図6aに、この可溶性テロメラーゼTCRα鎖のDNA配列を詳述する。
【０１２１】
当業者に明らかであるように、実施例１及び２に記載の方法は、DNA配列が既知である任意のTCRから、本発明の可溶性TCR-スーパー抗原融合タンパク質を作製するために使用し得る。例えば、図３及び４に詳述する可溶性Flu-HLA-A2特異的JM22 TCRを含有するTCR-スーパー抗原融合タンパク質は、これら方法に従って作製することができる。
【０１２２】
実施例３ − 可溶性TCR-スーパー抗原融合タンパク質の発現、リフォールディング及び精製
変異TCRα鎖及びTCRβ鎖-スーパー抗原融合タンパク質をそれぞれ含有するpEX954発現プラスミド及びpEX821発現プラスミドを、別々にE.coli株BL21pLysSに形質転換し、１つのアンピシリン耐性コロニーを、TYP(アンピシリン100μg/ml)培地中で37℃にて0.4のOD600まで増殖させた後、0.5mMのIPTGでタンパク質発現を誘導した。誘導の３時間後にBeckman J-6B中での4000rpmにて30分間の遠心分離により細胞を採集した。細胞ペレットを、50mMのTris-HCl、25％(w/v)のスクロース、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、10mMのDTTを含有する緩衝液(pH8.0)中に再懸濁した。一晩の凍結−解凍工程の後、再懸濁細胞を、Milsonix XL2020ソニケータ中での標準の12mm径プローブを使用する１分間のバーストで合計約10分間の超音波処理に付した。封入体ペレットを、Beckman J2-21遠心機における13000rpmにて30分間の遠心分離により回収した。次いで、３回の界面活性剤での洗浄を行い、細胞残渣及び膜成分を除去した。各回、封入体ペレットをTriton緩衝液(50mMのTris-HCl、0.5％のTriton-X100、200mMのNaCl、10mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0)中でホモジナイズした後、Beckman J2-21における13000rpmにて15分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、以下の緩衝液中での同様な洗浄により界面活性剤及び塩を除去した：50mMのTris-HCl、１mMのNaEDTA、0.1％(w/v)のNaAzide、２mMのDTT、pH8.0。最後に、封入体を30mgずつ小分けし、−70℃にて凍結させた。封入体タンパク質の収率を、６Ｍグアニジン-HClで可溶化し、Bradford色素結合アッセイ(PerBio)で測定することにより定量した。
【０１２３】
可溶性ポリペプチドの変性：30mgの可溶化TCRβ鎖-スーパー抗原封入体及び60mgの可溶化TCRα鎖封入体を凍結ストックから解凍した。封入体を、６Ｍグアニジン溶液中５mg/mlの最終濃度に希釈し、DTT(２Ｍストック)を10mMの最終濃度まで添加した。混合物を37℃にて30分間インキュベートした。
【０１２４】
可溶性TCR-スーパー抗原融合タンパク質のリフォールディング：１Ｌのリフォールディング緩衝液を５℃±３℃にて勢いよく撹拌した。レドックスカップル(2-メルカプトエチルアミン及びシスタミン)を約５分間加えた(それぞれ6.6mM及び3.7mMの最終濃度まで)後、変性TCR/TCR-スーパー抗原ポリペプチドを添加した。次いで、このタンパク質を、５℃±３℃にて撹拌しながら、約５時間±15分間リフォールディングさせた。
【０１２５】
リフォールディングした可溶性TCR-スーパー抗原融合タンパク質の透析：リフォールディングしたTCR-スーパー抗原融合タンパク質を、Spectrapor 1メンブレン(Spectrum；製品番号132670)において、10Ｌの10mM Tris(pH8.1)に対して、５℃±３℃にて18〜20時間透析した。その後、透析緩衝液を新鮮な10mM Tris(pH8.1)(10Ｌ)に交換し、透析を５℃±３℃にて更に20〜22時間続けた。
【０１２６】
実施例４ − 特異pMHCへのTCR-スーパー抗原融合タンパク質の結合のBIAcore表面プラズモン共鳴特徴付け
表面プラズモン共鳴バイオセンサ(BIAcore 3000TM)を使用して、同族ペプチド−MHCリガンドへのTCR-スーパー抗原融合タンパク質の結合を分析した。これは、半配向様式(semi-oriented fashion)でストレプトアビジン被覆結合表面に固定した単一pMHC複合体(下記で説明)を作製し、同時に４つまでの異なるpMHC(別個のフローセルに固定)へのTCR-スーパー抗原融合タンパク質の結合の効率的な試験を可能にすることにより容易となった。HLA複合体の手動での注入により、正確なレベルの固定化クラスＩ分子を容易に操作することが可能となった。
【０１２７】
この固定化複合体は、Ｔ細胞レセプター及びコレセプターCD8αα(共に可溶相に注入され得る)の両方に結合することができる。TCR-スーパー抗原融合タンパク質の特異的結合は低濃度(少なくとも40μg/ml)でさえ得られ、このことはTCR-スーパー抗原融合タンパク質が比較的安定であることを示唆する。
【０１２８】
ビオチン化クラスＩ HLA-A2−ペプチド複合体を、構成サブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有する細菌発現封入体から、インビトロでリフォールディングさせ、続いて精製し、インビトロにて酵素でビオチン化した(O'Callaghanら(1999) Anal. Biochem. 266: 9-15)。そのタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインと置換したＣ末端ビオチン化タグを有するHLA−重鎖を適切な構築物中で発現させた。〜75mg/リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。HLA−軽鎖又はβ2-ミクログロブリンもまた、E.coli中で適切な構築物から封入体として〜500mg/リットル細菌培養物のレベルで発現させた。
【０１２９】
E. coli細胞を溶解し、封入体を約80％純度まで精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍのグアニジン-HCl、50mMのTris(pH8.1)、100mMのNaCl、10mMのDTT、10mMのEDTA中で変性させ、５℃より低いリフォールディング緩衝液中に変性タンパク質の単一パルス(single pulse of denatured protein)を添加することにより、0.4ＭのL-アルギニン-HCl、100mMのTris(pH8.1)、3.7mMのシスタミン、mMのシステアミン、４mg/mlのペプチド(例えば、Tax 11-19)中で30mg/リットルの重鎖、30mg/リットルのβ2mの濃度にてリフォールディングさせた。リフォールディングは、４℃にて少なくとも１時間で完了に到達させた。
【０１３０】
緩衝液を、10容量の10mM Tris(pH8.1)での透析により交換した。溶液のイオン強度を十分に減少させるために、２回の緩衝液交換が必要であった。次いで、タンパク質溶液を1.5μm酢酸セルロースフィルターに通して濾過し、POROS 50HQアニオン交換カラム(８ml床容量)に充填した。タンパク質を０〜500mMのNaCl線形勾配で溶出させた。HLA-A2−ペプチド複合体は約250mM NaClで溶出した。ピーク画分を収集し、プロテアーゼインヒビターのカクテル(Calbiochem)を加え、画分を氷上で冷却した。
【０１３１】
ビオチン化タグを付したHLA複合体を、10mM Tris(pH8.1)、５mM NaCl中に、同じ緩衝液中で平衡化したPharmacia迅速脱塩カラムを使用して移して緩衝液を交換した。溶出に際して即座に、タンパク質含有画分を氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Calbiochem)を加えた。次いで、ビオチン化試薬を加えた：１mMビオチン、５mM ATP(pH８に緩衝化)、7.5mM MgCl2及び５μg/ml BirA酵素(O’Callaghanら(1999）Anal．Biochem．266：9-15に従って精製)。次いで、混合物を室温にて一晩インキュベートした。
【０１３２】
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用してビオチン化HLA複合体を精製した。Pharmacia Superdex 75 HR 10/30カラムを濾過PBSで予め平衡化し、１mlのビオチン化反応混合物を充填し、カラムをPBSで0.5ml/分にて展開した。ビオチン化HLA複合体は、約15mlで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、氷上で冷却し、プロテアーゼインヒビターカクテルを加えた。クーマシー結合アッセイ(PerBio)を使用してタンパク質濃度を測定し、ビオチン化HLA複合体のアリコートを−20℃で凍結保存した。標準的なアミンカップリング法によりストレプトアビジンを固定化した。
【０１３３】
TCR-スーパー抗原融合タンパク質とその同族MHC複合体又は無関係のHLA−ペプチド組合せ(これらの製造は上記で説明)との間の相互作用を、BIAcore 3000TM表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサで分析した。SPRは、レセプターリガンド相互作用を検出しその親和性及び動力学的パラメータを分析するために使用することができる原理である、小さなフローセル内のセンサ表面近くでの屈折率の変化(応答単位(RU)で表示)を測定する。β2mに架橋したビオチンとフローセルの活性化表面に化学的に架橋されているストレプトアビジンとの間の結合を介して、個々のHLA−ペプチド複合体を別個のフローセルに固定化することにより、プローブフローセルを準備した。次いで、異なるフローセルの表面上にTCR-スーパー抗原融合タンパク質を一定流速で通過させ、そうしている間のSPR応答を測定することにより、アッセイを実施した。最初に、TCR-スーパー抗原融合タンパク質を５μl/分の一定流速で２つの異なる表面(一方は〜5000RUの特異ペプチド−HLA複合体を被覆し、２つめは〜5000RUの非特異ペプチド−HLA複合体を被覆)上を通過させることにより、相互作用の特異性を検証した。ペプチド−HLA複合体上に一定流速で異なる濃度の可溶性TCR-スーパー抗原融合タンパク質を注入してバックグランドの共鳴を規定した。これらコントロールの測定値を、特異ペプチド−HLA複合体を用いて得られた値から減算し、これを使用して解離定数Kdとして表される結合親和性を算出した(Price及びDwek、Principles及びProblems in Physical Chemistry for Biochemists(第２版)1979，Clarendon Press、Oxford)。
【０１３４】
実施例５  −  高親和性TCR-SEA E-120融合タンパク質媒介性細胞溶解のインビトロ細胞アッセイ
エフェクター細胞の作製
０日目に、６ウェルプレート(Nunc)における８mlのR10培地中のバフィーコートから単離した２×107のPBMCを、10ng/mlの野生型SEA及び25μlのIL-7(２μg/ml)で刺激した。次いで、培養物を37℃、５％CO2にてインキュベートした。４日目、20ユニット/mlのIL-2をこれら培養物に加えた。
【０１３５】
７日目、SEA刺激細胞を、Taxペプチド(LLFGPVYV)(配列番号：７)をコードするミニ遺伝子でトランスフェクトした１×106の照射J82ガン細胞で再度刺激した。１μg/mlの高親和性Tax TCR-SEA E-120及び20ユニット/mlのIL-2もまたこの時点で培養物に加えた。11日目、20ユニット/mlのIL-2をこれら培養物に加えた。
【０１３６】
インビトロ細胞溶解アッセイ
14日目、50μlのR10培地中5000標的細胞/ウェル(PP-LCL細胞、EBV形質転換Ｂ細胞株の１つ)(１×10-6Ｍ Taxペプチド又はコントロールウェルについては１×10-6Ｍの無関係のFluペプチド、及びユーロピウム/DELFIAアッセイキット(Perkin Elmer)で供給される指示書により指示されているように３μlのBATDA試薬/１×106細胞でパルスした)を、96ウェルプレート(Nunc)に配置した。10μg/mlの抗MHCクラスII抗体を追加的に含む更なるコントロールウェルもまた準備した。
【０１３７】
次いで、以下を上記標的細胞培養物に添加した：
50μlのR10培地中の、上記のように調製した2.25×105のエフェクター細胞(45:1のエフェクター：標的比を得るため)
50μlのR10培地中の、一連の濃度(２×10-11Ｍ〜２×10-6Ｍ)の高親和性Tax TCR-SEA E-120融合タンパク質。
【０１３８】
次いで、これら培養物を37℃、５％CO2にて２時間インキュベートした。次いで、20μlの上清を各ウェルから取り出し、黒色不透明の96ウェルプレート(Nunc)中に配置した。次いで、ユーロピウム/DELFIAアッセイキットの200μlのユーロピウム溶液を各ウェルに加え、生じた標的細胞溶解のレベルを、Wallac Victor 2(Perkin Elmer)中での時間分解蛍光によりアッセイした。
【０１３９】
計算：
％細胞溶解 ＝ 100×(RFUExp − RFUSpont) / (RFUMax − RFUSpont)
式中：
RFUは、相対蛍光単位であり、
RFUExpは、(サンプルウェル中で測定したRFU)−(細胞フリーのバックグランドRFU)である
RFUSpontは、(エフェクター細胞を含有しないサンプルウェル中で測定したRFU)−(細胞フリーのバックグランドRFU)である
RFUMaxは、(triton x-100を添加したサンプルウェル中で測定したRFU)−(細胞フリーのバックグランドRFU)である。
【０１４０】
結果
0.2〜0.3nMのEC50及び２nMでの最大殺傷(ほぼ100％)を有する、高親和性Tax TCR-SEA E120融合体媒介性の特異的殺傷が証明された(図15を参照)。
【０１４１】
実施例６  −  高親和性Tax TCR-SEA E-120融合タンパク質媒介性細胞溶解の更なるインビトロ細胞のアッセイ
エフェクター細胞作製
０日目に、６ウェルプレート(Nunc)における８mlのR10培地中の同族ペプチド(１×10-5Ｍ)でパルスしたバフィーコートから単離した２×107のPBMCを、１μg/mlのTax TCR-L2-SEA E-120及び25μlのIL-7(２μg/ml)で刺激した。次いで、培養物を37℃、５％CO2にてインキュベートした。３日目、20ユニット/mlのIL-2をこれら培養物に加えた。
【０１４２】
７日目、Tax TCR-L2-SEA-E120刺激細胞を、Taxペプチド(LLFGPVYV)(配列番号：７)をコードするミニ遺伝子でトランスフェクトした３×106の照射J82ガン細胞で再度刺激した。１μg/mlの高親和性Tax TCR-SEA E-120及び20ユニット/mlのIL-2もまたこの時点で培養物に加えた。11日目、20ユニット/mlのIL-2をこれら培養物に加えた。
【０１４３】
インビトロ細胞溶解アッセイ
14日目、50μlのR10培地中2500標的細胞/ウェル(T2細胞、T-B細胞ハイブリドーマ株の１つ)(一連(１×10-6〜１×10-10Ｍの同族ペプチド又はコントロールウェルについては１×10-6Ｍの無関係のFluペプチド、及びユーロピウム/DELFIAアッセイキット(Perkin Elmer)で供給される指示書により指示されているように３μlのBATDA試薬/１×106細胞でパルスした)を、96ウェルプレート(Nunc)に配置した。
【０１４４】
次いで、以下を上記標的細胞培養物に添加した：
50μlのR10培地中の、上記のように調製した５×104のエフェクター細胞(20:1のエフェクター：標的比を得るため)
50μlのR10培地中の、一連の濃度(２×10-11Ｍ〜２×10-6Ｍ)の高親和性Tax TCR-SEA E-120融合タンパク質。
【０１４５】
次いで、これら培養物を37℃、５％CO2にて２時間インキュベートした。次いで、20μlの上清を各ウェルから取り出し、黒色不透明の96ウェルプレート(Nunc)中に配置した。次いで、ユーロピウム/DELFIAアッセイキットの200μlのユーロピウム溶液を各ウェルに加え、生じた標的細胞溶解のレベルを、Wallac Victor 2(Perkin Elmer)中での時間分解蛍光によりアッセイした。
【０１４６】
計算：
上記実施例５のとおり。
結果
T2標的細胞を用いて初期実験を行い、Taxペプチドパルス濃度(１×10-10〜１×10-6Ｍ)及び高親和性Tax TCR-L2-SEA E-120濃度(6.4×10-13〜１×10-7Ｍ)での滴定の効果を調べた。最大80〜90％細胞溶解が得られた(図16を参照)。
【０１４７】
固定濃度(10-6Ｍ)のTaxペプチド又は無関係のテロメラーゼペプチド(ILAKFLHWL)コントロールを使用して上記の実験を繰り返した。同族Taxペプチドを使用して最大80〜90％細胞溶解が得られたのに対し、無関係のペプチドを使用しては約20％の細胞溶解が得られた(図17を参照)。
【０１４８】
全て２nMの濃度で供給した多くのTCR-スーパー抗原融合体(Tax TCR-L2-SEA E120、テロメラーゼTCR-L1-SEA E120及びNY-ESO TCR-LM1-SEA E120)の細胞殺傷能力を、10-6Ｍの同族ペプチド又は無関係のペプチドでパルスしたT2標的細胞に対して、一連のエフェクター：標的(E:T)細胞比で上記のアッセイを用いて試験した。
【０１４９】
導入システインを含有する高親和性NY-ESO TCRα鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を、図18a及び18bにそれぞれ詳述する。SEA E-120に融合された、導入システインを含有する切断型高親和性NY-ESO TCRβ鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を図19a及び19bにそれぞれ詳述する。切断型NY-ESO TCRβ鎖は、「正常な」可溶性TCRと比較して、Ｃ末端から最後の３アミノ酸(RAD)が除去されている。図19aにおいて切断型TCRβ鎖のDNA配列中の最後のグリシン残基をコードするコドンに下線を付し、図19bにおいて対応するグリシン残基に下線を付した。
【０１５０】
得られた最大溶解は、Tax TCR-L2-SEA E120融合タンパク質、テロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質及びNY-ESO TCR-LM1-SEA E120融合タンパク質についてそれぞれ約50％、約75％及び約100％であった(それぞれ図20a〜20cを参照)。
【０１５１】
共に２nMの濃度で供給した２つの異なるTCR-スーパー抗原融合体(Tax TCR-L2-SEA E120及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120)の細胞殺傷能力を、これらTCR-スーパー抗原融合体の１つについての同族ペプチド10-6ＭでパルスしたT2標的細胞に対して、一連のエフェクター：標的(E:T)細胞比で上記のアッセイを用いて試験した。得られた最大溶解は、Tax TCR-L2-SEA E120融合タンパク質及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質についてそれぞれ約65％及び約75％であった(それぞれ図21a及び21bを参照)。
【０１５２】
共に２nMの濃度で供給したTax TCR-L2-SEA E120融合タンパク質及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質の細胞殺傷能力を、10-6ＭのTaxペプチドでパルスしたSK-Mel 37腫瘍細胞株標的細胞に対して、一連のエフェクター：標的(E:T)細胞比で上記のアッセイを用いて試験した。得られた最大溶解は、同族Tax TCR-L2-SEA E120融合タンパク質を用いて約35〜40％であったのに対し、テロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質については約10％であった(図22を参照)。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図1a及び1bはそれぞれ、システインコドンが導入されるように変異させた可溶性A6 (Tax) TCRのα鎖及びβ鎖の核酸配列を示す。影付きは、α鎖核酸中の導入システインコドン及び導入BamH1制限部位を示す。
【図２】図2aは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するT48→C変異(下線)を含むA6 (Tax) TCRα鎖細胞外アミノ酸配列を示す。図2bは、新規なジスルフィド鎖間結合を作製するために使用するS57→C変異(下線)を含むA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列を示す。
【図３】図3a及び3bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたJM22 TCRのα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。
【図４】図4a及び4bはそれぞれ、図3a及び3bのDNA配列から作製したJM22 TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列を示す。
【図５】図5a及び5bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたA6 (Tax) TCRβ鎖の高親和性変形体のDNA配列及びアミノ酸配列を示す。導入したシステインコドンは影付きで示し、親和性増大変異は太字で示している。
【図６】図6a及び6bは、非天然型ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むように変異させたテロメラーゼTCRの高親和性変形体のα鎖及びβ鎖のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示している；
【図７】図7a及び7bはそれぞれ、図6a及び6bのDNA配列から作製したテロメラーゼTCRα鎖及びβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体を示す。
【図８】図8aは野生型SEA-EのDNA配列を示し、図8bは野生型SEA-Eのアミノ酸配列を示す。
【図９】図9aは変異体スーパー抗原SEA-E120のDNA配列を示し、図9bは変異体スーパー抗原SEA-E120のアミノ酸配列を示す。変異アミノ酸は影付きで示している。
【図１０ａ】図10aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【図１０ｂ】図10bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【図１１ａ】図11aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：２)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【図１１ｂ】図11bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するA6 (Tax) TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【図１２ａ】図12aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【図１２ｂ】図12bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介して野生型SEA Eスーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【図１３ａ】図13aは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のDNA配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-ProリンカーをコードするDNA配列には下線を付した。
【図１３ｂ】図13bは、Gly-Ser-Gly-Gly-Pro(配列番号：2)リンカーを介してSEA E120スーパー抗原に連結している、新規な鎖間結合の形成に関与する非天然型システインコドンを含有するテロメラーゼTCRβ鎖細胞外アミノ酸配列の高親和性変形体のアミノ酸配列を示す。導入システインは影付きで示されている。Gly-Ser-Gly-Gly-Proリンカーには下線を付した。
【図１４−１】図14はPEX821プラスミドのDNA配列を詳述する。
【図１４−２】図14-1の続きである。
【図１５】図15は、高親和性A6 (Tax) TCR-SEA-E120スーパー抗原融合タンパク質を使用するAPCのペプチド-MHC特異的なCTL媒介性殺傷を示す。
【図１６】図16は、T2細胞の殺傷に対するTaxペプチドパルス滴定濃度(１×10-10〜１×10-6Ｍ)及び高親和性Tax TCR-L2-SEA E-120滴定濃度(6.4×10-13〜１×10-7Ｍ)の効果を示す。
【図１７】図17は、固定濃度(10-6Ｍ)のTaxペプチド又は無関係のテロメラーゼペプチド(ILAKFLHWL)コントロールを用いる高親和性Tax TCR-L2-SEA E-120融合タンパク質により誘発されるT2細胞殺傷を示す。
【図１８】図18a及び18bはそれぞれ、導入システインを含有する高親和性NY-ESO TCRα鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を詳述する。
【図１９】図19a及び19bはそれぞれ、SEA E-120に融合された、導入システインを含有する切断型高親和性NY-ESO TCRβ鎖のDNA配列及びアミノ酸配列を詳述する。図19aでは切断型TCRβ鎖のDNA配列中の最後のグリシン残基をコードするコドンに下線を付し、図19bでは対応するグリシン残基に下線を付した。
【図２０】図20a〜20cはそれぞれ、多くのTCR-スーパー抗原融合体、Tax TCR-L2-SEA E120、テロメラーゼTCR-L1-SEA E120及びNY-ESO TCR-LM1-SEA E120のT2細胞殺傷能力を示す。
【図２１】図21a及び21bは、共に２nMの濃度で供給した２つの異なるTCR-スーパー抗原融合体(それぞれTax TCR-L2-SEA E120及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120)のT2標的細胞殺傷能力を示す。
【図２２】図22は、共に２nMの濃度で供給したTax TCR-L2-SEA E120及びテロメラーゼTCR-L1-SEA E120融合タンパク質のSK-Mel 37腫瘍細胞株殺傷能力を示す。
【図２３】図23は、pEX821ベクターのプラスミドマップを提供する。
【図２４−１】図24は、pEX954ベクターのDNA配列を詳述する。
【図２４−２】図24-1の続きである。
【図２５】図25は、pEX954ベクターのプラスミドマップを提供する。
【図１】
2008520227.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008520227.tif 000009
【図８】
2008520227.tif 000010
【図９】
2008520227.tif 000011
【図１０ａ】
2008520227.tif 000012
【図１０ｂ】
2008520227.tif 000013
【図１１ａ】
2008520227.tif 000014
【図１１ｂ】
2008520227.tif 000015
【図１２ａ】
2008520227.tif 000016
【図１２ｂ】
2008520227.tif 000017
【図１３ａ】
2008520227.tif 000018
【図１３ｂ】
2008520227.tif 000019
【図１４−１】
2008520227.tif 000020
【図１４−２】
2008520227.tif 000021
【図１５】
2008520227.tif 000022
【図１６】
2008520227.tif 000023
【図１７】
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【図１８】
2008520227.tif 000025
【図１９】
2008520227.tif 000026
【図２０】
2008520227.tif 000027
【図２１】
2008520227.tif 000028
【図２２】
2008520227.tif 000029
【図２３】
2008520227.tif 000030
【図２４−１】
2008520227.tif 000031
【図２４−２】
2008520227.tif 000032
【図２５】
2008520227.tif 000033
【国際調査報告】
2008520227.tif 000034
2008520227.tif 000035
2008520227.tif 000036
2008520227.tif 000037
2008520227.tif 000038