(57)【要約】  本発明は、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを有する、単離された組織特異的グルコース反応性プロモーターを提供する。プロモーターは、第２又は第３のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含むことができる。本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む宿主細胞も提供する。さらに、糖尿病を治療又は予防する方法を提供する。この方法は、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターを有するウイルス粒子の有効量を個体に投与することを含み、インシュリンをコードする核酸の発現は組織特異的かつグルコース反応性である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む、単離された組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２】
前記ポリメラーゼ結合性ドメインが肝ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）プロモーターを含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
前記ＨＮＦ−１エレメントが約２５〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項４】
前記ＨＮＦ−１エレメントが配列番号１を含む、請求項３に記載のプロモーター。
【請求項５】
前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメントが約２０〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項６】
前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメントが配列番号２を含む、請求項５に記載のプロモーター。
【請求項７】
前記ＧＲＥが約４５〜５０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項８】
前記ＧＲＥが配列番号３を含む、請求項７に記載のプロモーター。
【請求項９】
前記トリパルタイト転写因子結合性シスエレメント内の、前記ＨＮＦ−１エレメント、前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメント及び前記ＧＲＥが実質的に隣接している、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１０】
前記トリパルタイト転写因子結合性シスエレメント内の、前記ＨＮＦ−１エレメント、前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメント及び前記ＧＲＥが近接している、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１１】
図３Ａに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１２】
第２のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントをさらに含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１３】
図３Ｂ又は図４Ａに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項１２に記載のプロモーター。
【請求項１４】
第３のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントをさらに含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１５】
図４Ｂに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項１４に記載のプロモーター。
【請求項１６】
作動的に連結しているインシュリンをコードする核酸又はサブユニットをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項１７】
請求項１、１２又は１４に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターを有するウイルス粒子の有効量を個体に投与する工程を含み、前記インシュリンをコードする核酸の発現は組織特異的かつグルコース反応性である、糖尿病を治療又は予防する方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ結合性ドメインが肝ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）プロモーターを含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２０】
前記ＨＮＦ−１エレメントが約２５〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の組織特異的なグルコース反応性。
【請求項２１】
前記ＨＮＦ−１エレメントが配列番号１を含む、請求項２０に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２２】
前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメントが約２０〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２３】
前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメントが配列番号２を含む、請求項２２に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２４】
前記ＧＲＥが約４５〜５０個のヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２５】
前記ＧＲＥが配列番号３を含む、請求項２４に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２６】
前記トリパルタイト転写因子結合性シスエレメント内の、前記ＨＮＦ−１エレメント、前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメント及び前記ＧＲＥが実質的に隣接している、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２７】
前記トリパルタイト転写因子結合性シスエレメント内の、前記ＨＮＦ−１エレメント、前記Ｃ／ＥＢＰレスポンスエレメント及び前記ＧＲＥが近接している、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２８】
図３Ａに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項２９】
第２のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントをさらに含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項３０】
図３Ｂ又は図４Ａに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項２９に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項３１】
第３のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントをさらに含む、請求項１８に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項３２】
図４Ｂに示したエレメントから選択されるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、請求項３１に記載の組織特異的グルコース反応性プロモーター。
【請求項３３】
前記ベクターがアデノウイルスのベクターを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ウイルス粒子が医薬的に許容できる担体で投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、糖尿病を治療及び予防するための方法に関し、より具体的には糖尿病の治療的治療のためのインシュリンの調節発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコースの調節が正常である個体では、血糖レベルの上昇に反応して、膵臓ホルモンであるインシュリンが分泌される。血中グルコースの上昇は、一般的には食後に起こり、骨格筋及び脂肪等の末梢組織に対するインシュリンの作用をもたらす。インシュリンは、血液からグルコースを積極的に吸収し、それを貯蔵のための形態に転換するように、これらの末梢組織の細胞を刺激する。この過程は糖処理ともいう。血中グルコースのレベルは、一個体内でも、その人が空腹であるか、中程度であるか又は満腹状態であるかに応じて、一日を通して低レベルから正常レベル、高レベルに変化する。これらのレベルは、また、それぞれ、低血糖、正常血糖及び高血糖という。糖尿病の個体では、グルコースの恒常性におけるこれらの変化は、インシュリン分泌又は作用のいずれかが不完全であるので調節されておらず、慢性状態の高血糖をもたらす。
【０００３】
真性糖尿病は、罹患率が約４〜５％の一般的な疾患である。糖尿病を発症する危険性は、体重の増大と共に上昇し、成人発症型の糖尿病患者の９０％近くは肥満である。したがって、肥満の成人では発生率が高いため、成人発症型糖尿病の発生率は世界的に上昇している。真性糖尿病は、３つの主要な形態に分類される。２型糖尿病は、一形態であり、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）又は成人発症型糖尿病ともいう。１型糖尿病は、第２の形態であり、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）という。第３の型の糖尿病は、遺伝性であり、膵島のベータ（β）細胞の機能を制御する遺伝子における突然変異によるものである。糖尿病の診断はグルコース測定に基づくが、常に全ての患者を正確に分類できるわけではない。２型糖尿病は、成人の間ではより一般的であり、１型糖尿病は、小児及び１０代で優勢である。
【０００４】
１型及び２型の真性糖尿病は共に、平均余命の短縮に関連し、血管疾患及びアテローム性動脈硬化等の他の合併症にも関連する。後期の合併症を予防するための糖尿病の長期管理には、患者が１型に分類されるか２型に分類されるかに関わらず、インシュリン治療が含まれることが多い。１型糖尿病は、インシュリンを生成する膵臓のβ細胞がほとんど完全に失われることに付随する自己免疫疾患である。このβ細胞の喪失により、一生インシュリンに依存することになる。１型糖尿病は、あらゆる年齢で生じることがあり、白人の集団では全新生児の約０．３〜１％が、一生の間に本疾患を発症すると推定されている。
【０００５】
１型糖尿病及びある程度の２型糖尿病に対する治療の広く用いられている方法は、伝統的にインシュリン維持療法からなっていた。このような治療法は、その最も単純な形態では、食事摂取後又は１日中規則的な間隔で、患者中に精製又は組換えのインシュリンを注射して正常の血中グルコースレベルを維持することが必要とされる。理想的には、これらの注射は１日あたり４回の頻度で必要とされる。上記治療方法は患者に恩恵をいくらか与えるものの、それでもやはりこのインシュリン治療の方法は、血中グルコースの制御が十分でなく、また患者のコンプライアンスがかなり必要である。
【０００６】
１型糖尿病の他の治療方法には、定期的なインシュリンの送達を可能にするインシュリンポンプ等の装置の使用が含まれる。この方法は、頻繁な注射を必要としないので、上記した方法よりも好ましいことがある。しかし、インシュリンポンプ治療の使用は、依然として３日毎に１回針の交換が必要とされるという点で、欠点も有する。インシュリン維持療法同様、インシュリンの送達が血中グルコースレベルにおける変化に反応して調節されないので、インシュリンポンプ方法も最適のグルコース調節を達成するものではない。糖尿病を治療するこれらの方法は、したがって、煩わしく、不十分である。さらに、これらの方法は、また、平均的な成人の生涯にわたって完全に有効ではないか又は、この疾患を予防するのに有効であることが示されていた。
【０００７】
生理活性インシュリンを糖尿病の個体中に置換するための細胞治療の様々な取組みが、試みられている。これらには、遺伝子治療の取組み、免疫療法及び人工β細胞の使用があげられる。インシュリン又は他のポリペプチドの発現のためのｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療には、動物モデルにおける、肝臓を標的としたウイルス媒介の形質導入が含まれている。しかし、これらの取組みは、治療上有効な量の、グルコースが調節するインシュリン送達を提供するものではなく、インシュリンを生成するβ細胞を回復又は再生するものでもなく、したがって患者における適用に制限がみられた。
【０００８】
例えば、１型糖尿病に対するインシュリンの遺伝子治療は、インシュリンが血中グルコースレベルで上昇するとそれに反応して生成され、血中グルコースが低下すると抑制されるように、好適な調節システムを含むのが好ましい。天然に存在するグルコース調節のプロモーターを用いて、グルコース反応性のインシュリン生成を達成するための様々な取組みが行われていた。しかし、用いられたプロモーターは、十分に高い転写活性を達成することができず、非空腹の条件下で治療した動物では、少なくとも中程度の高血糖しか示されなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、グルコース反応性が有効な細胞特異的な発現エレメント及びインシュリンを生成するβ細胞の生理学的能力を回復する方法において、糖尿病の個体におけるグルコースの恒常性を調節することができる方法に対する要望がある。本発明は、この要望を満たし、また関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを有する、単離された組織特異的グルコース反応性プロモーターを提供する。プロモーターは、第２又は第３のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含むことができる。本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む宿主細胞も提供する。糖尿病を治療又は予防する方法も、さらに提供する。この方法は、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む、組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターを有するウイルス粒子の有効量を個体に投与することを含み、インシュリンをコードする核酸の発現は組織特異的かつグルコース反応性である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの調節されたインシュリンの発現のための、組織特異的グルコース反応性プロモーターの構築及び使用に関する。本発明の合成プロモーターは、グルコースに反応して、ｉｎ ｖｉｖｏでの緊密に調節されたインシュリン発現の肝臓特異的な活性を表した。これらの機能上の属性は、本発明の調節されたプロモーターを、インシュリンの遺伝子治療によるヒトにおける糖尿病の治療又は療養に、治療的に用いることができることを示す。さらに、本発明のグルコース反応性のプロモーターは、インシュリン発現のｉｎ ｖｉｖｏの調節に有益であり得るいくつかの利点を示す。例えば、本発明の合成プロモーターの転写活性は、天然のグルコース反応性のプロモーターよりも相対的に高く、したがって、血中グルコースレベルはｉｎ ｖｉｖｏで正常範囲内に維持された。当該合成プロモーターは、また、インシュリン遺伝子の肝臓特異的な発現を誘発したが、これは、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子治療中、インシュリンの偏在的な発現により、予想外の副作用の改善を促進することができる。さらに、本発明の合成プロモーターは、外因的に導入されたグルコースを速やかに除去し、天然のグルコース反応性のプロモーターに比べて速やかにインシュリンの発現を低減させる、より効果的なグルコース反応性の能力も示す。
【００１２】
一実施形態では、ランダムな組合せの、３つの特有な転写因子結合性エレメントからなる合成プロモーターを生成した。肝臓で豊富な転写因子結合性エレメントを、合成プロモーターの構築に用いた。肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）及びＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメントを、肝臓特異的な転写活性の増強に用いた。グルコース反応性を促進するためにグルコース反応性エレメント（ＧＲＥ）を用いた。個々のエレメントを合成し、組み立てて、全ての可能な組合せで各シスエレメントを３コピー含む３コピーモジュールを生成した。３つの３コピーモジュールから成る合成プロモーターをレポータープラスミドにクローニングして、ｉｎ ｖｉｖｏで転写活性の高い合成プロモーターを確認した。得られたプロモーターは、グルコースの変化に反応して肝臓特異的なインシュリン遺伝子の発現を誘導し、免疫不全のＳＴＺ誘導性ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス及び非空腹状態の免疫適格性糖尿病ＮＯＤマウスの両方で血中グルコースレベルを正常範囲内に十分維持した。
【００１３】
肝臓はインシュリンの作用の主な標的器官であり、グルコースの恒常性で重要な役割を果たしているので、他の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏのインシュリン発現を肝臓に対して標的にすることは、インシュリンの遺伝子治療に有利である（Taylor,R.及びAgius,L.(1988年)The biochemistry of diabetes.,Biochem.J.,250巻,625〜640頁）。さらに、肝臓は、グルコーストランスポーター（Rencurel,F.,Waeber,G.,Antoine,B.,Rocchiccioli,F.,Maulard,P.,Girard,J.ら,(1996年),Requirement of glucose metabolism for regulation of glucose transporter type2(GLUT2)gene expression in liver.,Biochem.J.,314巻(Pt3),903〜909頁）及びグルコキナーゼ(Bonini,C.,Ferrari,G.,Verzeletti,S.,Servida,P.,Zappone,E.,Ruggieri,L.ら,(1997年),HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogenic graft-versus-leukemia.,Science,276巻,1719〜1724頁)(Rencurel,F.,Waeber,G.,Antoine,B.,Rocchiccioli,F.,Maulard,P.,Girard,J.ら,(1996年),Requirement of glucose metabolism for regulation of glucose transporter type2(GLUT2) gene expression in liver.,Biochem.J.,314巻(Pt3),903〜909頁)等の必須のグルコース感知成分を有する。したがって、膵臓のβ細胞同様、肝臓には、血中グルコース濃度における変化に反応する本質的な能力がある。この観点から、肝臓は、１型糖尿病に対するインシュリンの遺伝子治療に適する標的器官である。
【００１４】
本明細書で用いられる「糖尿病」の語は、真性糖尿病として知られる糖尿病の状態を意味することを意図する。真性糖尿病は、耐糖能をもたらす、相対的又は絶対的なインシュリンの欠乏を特徴とする慢性疾患である。この語は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型及び遺伝性の糖尿病を含めた、全てのタイプの真性糖尿病を含むことを意図する。Ｉ型糖尿病は、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）ともいい、例えば、若年発症真性糖尿病も含む。Ｉ型糖尿病は、主として、膵臓のβ細胞の破壊による。ＩＩ型真性糖尿病は、インシュリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られ、一部は、食後のインシュリン放出の障害を特徴とする。インシュリン抵抗性もＩＩ型真性糖尿病の発生をもたらす因子であり得る。遺伝性の糖尿病は、β細胞の機能及び調節を妨害するような突然変異による。
【００１５】
糖尿病は、約７５ｇ経口投与のグルコース負荷約２時間後に評価して、空腹時血中グルコースレベルが約１４０ｍｇ／ｄｌに等しいか、若しくはそれを超えるか、又は血漿グルコースレベルが約２００ｍｇ／ｄｌに等しいか、若しくはそれを超えることを特徴とする。「糖尿病」の語は、また、慢性高血糖及び耐糖能の障害を含む、高血糖を有する個体を含むことも意図する。高血糖の個体における血漿グルコースレベルには、例えば、信頼できる診断指標で決定される、正常を超えるグルコース濃度が含まれる。このような高血糖の個体は、真性糖尿病の明らかな臨床症状を発症する危険性又は素因がある。
【００１６】
本明細書で用いられる「治療する」の語は、糖尿病を示す臨床症状の回復を意味することを意図する。臨床症状の回復には、例えば、治療前のレベル又は糖尿病の個体に比べて治療した個体における、血中グルコースレベルにおける低下又は血液からグルコースが消失する速度が増大することを意味する。「治療する」の語は、調節されていない高血糖に罹患している個体における正常血糖性の反応の誘導も含む。正常血糖は、臨床的に確立された血中グルコースレベルが正常又は低血糖の範囲を超えるが高血糖の範囲より低い範囲を意味する。したがって、正常血糖性の反応とは、血漿グルコース濃度を正常レベルに低下させるような、グルコース取込みの刺激を意味する。ほとんどの成人では、このレベルは、血中グルコース約６０〜１０５ｍｇ／ｄＬ、好ましくは約７０〜１００ｍｇ／ｄＬの濃度範囲に相当するが、例えば、個体の性別、年齢、体重、食事及び全体的な健康状態に応じて個体間で変化し得る。糖尿病の個体の効果的な治療は、例えば、高血糖又は血中グルコースレベルが上昇した個体のレベルを、正常化したか、又は正常血糖のレベルへ低下させることであり、この低下はインシュリンの分泌に直接起因する。あるいは、効果的な治療は、空腹時血中グルコースを、約１４０ｍｇ／ｄＬ以下のレベルに低減させることである。
【００１７】
「治療する」の語は、また、糖尿病に付随する病理学的状態又は慢性の合併症の重症度を低減することを含むことを意図する。このような病理学的状態又は慢性の合併症を、表１に列挙するが、それには、例えば、筋肉の消耗、ケトアシドーシス、糖尿、多尿、煩渇多飲症、糖尿病性細小血管症又は小血管疾患、アテローム硬化性血管疾患又は大血管疾患、ニューロパシー及び白内障があげられる。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
他の合併症としては、例えば、感染症及び傷の治癒に対する全般的な感受性の増大もあげられる。「治療する」の語は、糖尿病を治療していない個体に比べて糖尿病の個体の平均寿命が長くなることも含まれることも意図する。他の病理学的状態、慢性の合併症又は疾患の表現型の徴候は、当業者に公知であり、疾患に関連する状態、合併症又は徴候の重症度が低減する限り、糖尿病を治療する尺度として同様に用いられ得る。
【００２０】
本明細書で用いられる「予防する」の語は、糖尿病を示す臨床症状を未然に防ぐことを意味することを意図する。このような未然の予防には、例えば、疾患が明らかな症状を発症する前又は疾患の診断の前に、糖尿病を発症する危険性のある個体において正常レベルの血中グルコースを維持することが含まれる。したがって、「予防する」の語は、個体を糖尿病の発生から防御するための個体の予防的治療を含む。個体における糖尿病の予防は、疾患の発症を阻害し又は抑止することを含むことも意図する。疾患の発症を阻害又は抑止することとしては、例えば、グルコースが血漿から細胞中に輸送できない等の、異常なグルコース代謝の出現を阻害又は抑止することがあげられる。したがって、糖尿病の効果的な予防としては、肥満の個体又は糖尿病の家族歴を有する個体等、糖尿病の状態の素因となる個体におけるグルコースで調節されたインシュリンの発現によるグルコースの恒常性の維持があげられる。疾患の発症の阻害又は抑止には、例えば、糖尿病に関連する、１つ又は複数の病理学的状態又は慢性の合併症の進行を阻害又は抑止することも含まれる。糖尿病に関連するこのような病理学的状態の例を、表１に列挙してある。
【００２１】
本明細書で用いられる、「グルコース反応性」の語は、グルコースレベルの変化により、核酸配列の発現を調節することを意味することを意図する。例えば、グルコース反応性の発現としては、グルコースレベルの増加によるプロモーターの活性の誘発があげられる。このようなグルコース反応性のプロモーターとしては、ＨＮＦ−１、Ｃ／ＥＢＰ結合性エレメント及びＧＲＥ等の、トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントがあげられる。このようなグルコース反応性のプロモーターとしては、２つ、３つ又は４つ又はそれを超えるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、１つを超えるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントもあげられる。１つ又は複数のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む、グルコース反応性のプロモーターの詳細な例は、例えば、図３及び４に示してある。グルコース反応性のプロモーターとしては、また、組織特異的エレメント又はエンハンサーエレメントのないＧＲＥもあげられる。他のプロモーターに見出されるグルコース反応性エレメントの詳細な例としては、例えば、配列ＣＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧ（配列番号１１）のラットＡＣＣ（−１２２）、配列ＣＡＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧ（配列番号１２）のラットＳ14（−１４３９）、配列ＣＡＣＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＣ（配列番号１３）のマウスＳ14（−１４３９）、配列ＣＡＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＧ（配列番号１４）のラットＬ−ＰＫ（−１６６）及び配列ＣＡＴＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＧＴＧ（配列番号１５）のラットＦＡＳ（−７２１０）があげられる。
【００２２】
調節された遺伝子の発現に関して用いられる場合の「グルコース」の語は、代謝物がグルコース反応性のプロモーターからの発現を増大させ得る限り、グルコース及びグルコース代謝物を共に含むことを意図する。グルコース代謝物には、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、グリセラート−２−リン酸及びピルビン酸等のグルコース代謝物の中間生成物が含まれる。
【００２３】
本明細書で用いられる「実質的に」又は「実質的に同じ」の語は、１つ又は複数の転写因子結合性シスエレメントの近接に関して用いられる場合は、エレメントが、結合している転写因子がポリメラーゼを含む他のトランス結合性因子との相互作用できるくらい十分接近していることを意味することを意図する。トランス結合性因子の機能を行うのに十分である転写因子シスエレメント間の距離は、当技術分野では周知であり、例えば、Bolouri及びDavidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100巻,9371〜9376頁(2003年)、並びにDavidsonら,Science,295巻,1669〜78頁(2002年)に記載がある。
【００２４】
本明細書で用いられる「作動的に連結している」の語又はそれと文法上の同等語は、各成分の必要な機能がその標的の核酸上で行われるようにする、周知の遺伝及び細胞の原理に従い核酸成分が結合していることを意味することを意図する。したがって、トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを形成するシスエレメントの作動的に連結しているグループは共に接続して、参照したコード領域配列の転写及び調節をもたらす。同様に、作動的に連結しているインシュリンをコードする核酸コード領域は、プロモーターがインシュリンをコードする核酸を転写及び調節するように、そのプロモーター及びトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントに接続している。
【００２５】
本明細書で用いられる「発現」の語又はその文法上の同等語は、細胞による核酸の転写、翻訳及びプロセシングを意味することを意図する。発現は、例えば、誘導性のプロモーター又は組織若しくは細胞に特異的なプロモーター等により、構成的又は調節され得る。２つ又はそれを超える核酸配列は、他の望ましい核酸と、同時又はそれに代替して独立して発現されてもよい。２つ又はそれを超える核酸配列を発現する詳細な例としては、インシュリンＡ及びＢ鎖の同時発現があげられる。発現しているアミノ酸又はヌクレオチドの配列の数及び機能に応じて、さらに同時発現の様式の様々な組合せの様式を用いることができる。当業者であれば、特定の目標を達成し又は要望を満たすのには、同時発現のどの様式を用いることができるかを知り又は決定することができる。トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを用いた、組織特異的かつ誘発性の発現の特定の例を、さらに下記の実施例Ｉに記載する。
【００２６】
本明細書で用いられる「インシュリン」の語は、グルコースレベルの上昇に反応して、細胞によるグルコースの取り込みを刺激することができるポリペプチドを意味するために用いられる。インシュリンは、獲得された発現した分子が、グルコースの取込みの刺激、グリコーゲン合成、アミノ酸の取込み又はタンパク質合成等の少なくとも１つの生理活性機能を保持する限り、ヒト、ブタ、ウマ、ラット又はウシ等様々な脊椎動物種からのアミノ酸配列又はその任意の部分に相当してもよい。この語は、細胞によるグルコースの取組みを刺激するポリペプチドの生理活性を増強するか又は大幅には低減しないアミノ酸置換がある修飾体のインシュリンも含む。インシュリンは、それがインシュリンの生理活性を保持する限り、アミノ酸残基の付加又は欠失を含んでもよい。生理活性のインシュリンは、したがって、野生型のインシュリンに類似する活性があるか、又は、生理活性のインシュリンが細胞によるグルコースの取り込みを刺激する限り野生型のインシュリンよりも高いか、若しくはそれより低い。
【００２７】
一般的に、ヒトインシュリンの分子量は約５．８ｋＤａである。ヒトインシュリンＡ鎖及びＢ鎖の配列は、本発明のインシュリンポリペプチドに対する例示の配列として提供される。ヒトインシュリンのＡ鎖は、ヌクレオチド２４９６〜２５９１（配列番号７）に相当し、配列番号８に示すアミノ酸配列であり、ヒトインシュリンのＢ鎖は、ヌクレオチド３４７７〜３５４２（配列番号９）に相当し、配列番号１０に示すアミノ酸配列である。ヒトインシュリンの遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００２６５で寄託されている。ヒトインシュリンのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５９１７２で寄託されている。ヒトインシュリンのｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７０５０８に見出すことができる。ヒト以外の種からのインシュリンポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸の配列は当業者には公知である。これら全ての配列、並びに実質的な同等物及びインシュリンの生理活性を維持するその機能上のフラグメントは、本明細書で用いられる「インシュリン」の語の中に含まれている。一般的に、インシュリンは、Ｂ鎖領域にジスルフィド連結しているＡ鎖領域からなる。
【００２８】
インシュリンのＡ鎖及びＢ鎖は、インシュリンの前駆体であるプロインシュリンに由来してもよい。本発明のプロインシュリンのポリペプチドは、それがインシュリンのＡ鎖又はＢ鎖領域又はその機能上のフラグメントを含む限り、ヒト、ブタ、ウマ、ラット又はウシ等の様々な脊椎動物種に相当するアミノ酸配列又はその部分であってよい。前駆ポリペプチドが、生理活性体のインシュリン又は生理活性体のインシュリンに構築されることができるインシュリンのＡ鎖若しくはＢ鎖領域に、プロセシングされるか又はプロセシングされるように修飾され得る限り、本発明のプロインシュリンは修飾体のプロインシュリンを含む。プロインシュリンポリペプチドの前駆体の領域は、生理活性体のインシュリン、Ａ鎖、Ｂ鎖又はその機能上のフラグメントへのプロインシュリンのプロセシングに、負の影響を及ぼさない限り、本質的にあらゆるアミノ酸配列であってよい。したがって、前駆領域の配列は、例えば、Ａ鎖とＢ鎖との配列の間に介在するプロインシュリン配列等のプロペプチドのインシュリンであってよい。あるいは、そのような前駆領域は、例えば、脊椎動物のプロインシュリン分子に通常見出されないリンカー配列等の、あらゆる様々なアミノ酸配列であってもよい。ヒトインシュリン配列のヌクレオチド及びアミノ酸の配列は、本発明のプロインシュリンポリペプチドに対する典型的な配列として、上記に提供してある。ヒト以外の種からのプロインシュリンポリペプチドのヌクレオチド及びアミノ酸の配列は当業者には公知である。生理活性のインシュリン又は生理活性体のインシュリンに構築することができるインシュリンのＡ鎖若しくはＢ鎖領域にプロセシングされる機能を維持している、これらの全ての配列、並びにその実質的な同等物及び機能上のフラグメントが、本明細書で用いられる語の中に含まれる。プロインシュリンは、例えば、Ｂ鎖及びＡ鎖の配列に連結しているＣ鎖からなり得る。
【００２９】
本明細書で用いられる「宿主細胞」の語は、本発明の核酸、ベクター、若しくはウイルス粒子によって、形質転換又は形質導入される細胞を意味する。この語は、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターをそのゲノムとして含むウイルス粒子が感染することができる細胞も意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる「有効量」の語は、組織特異的なグルコース反応性の態様でインシュリンを発現するベクターを有するウイルス粒子の投与に用いられる場合、投与されるウイルス粒子数が標的組織に感染し、糖尿病の１つ又は複数の症状を低減するレベルでグルコースを誘導する際にウイルス粒子のゲノムからインシュリンを発現するのに十分であることを意味することを意図する。例えば、インシュリンを発現する有効量のウイルス粒子は、血中グルコースレベルを低減させるか、又はグルコースの恒常性若しくはそれを共にもたらす粒子の数からなる。さらに、上記表１に記載したように、糖尿病の臨床上の徴候を、有効量のウイルス粒子の尺度として用いることもできる。同様に、有効量のウイルス粒子は、投与することができ、かつ個体の生物学的若しくは生化学的な成分の細胞又は組織に望ましい効果をもたらすのに十分なレベルでグルコースが調節するインシュリンの発現を指示することができるウイルス粒子の数を意味することも意図する。インシュリンを発現する有効量のウイルス粒子は、食事摂取すると正常血糖をもたらす。ヒト個体に対する有効量のウイルス粒子は、例えば、当業者には周知のものと共に本明細書に提供する教示及び指示で与えられている信頼できる糖尿病の動物モデルから外挿して推定することができる。マウスの動物モデルに対する有効量のウイルス粒子は、例えば、約１×１０8〜１×１０12個の間、好ましくは約１×１０9〜８×１０11個の間、より好ましくは約１×１０10〜１×１０11個の間を含む。特に有用な有効量は、約３×１０10個のウイルス粒子である。
【００３１】
本明細書で用いられる「医薬的に許容できる担体」の語は、個体に投与するのに好適である溶液又は媒体を意味することを意図する。このような溶液又は媒体は、化合物及びポリペプチドの安定性及び細胞の生存性を維持するように機能することができる。医薬的に許容できる担体は、当技術分野では周知であり、リン酸緩衝食塩水又は媒体等の水溶液を含む。医薬的に許容できる担体には、ウイルス粒子がｉｎ ｖｉｖｏの宿主細胞若しくは組織を標的にし、それに付着するか、又はそれに感染する機能を、増強又は増大するように機能し及び／又は持続性の送達若しくは免疫保護の目的の、他の部分、化合物及び／若しくは製剤も含まれる。このような部分、化合物及び／又は製剤は当業者には周知であり、例えば、受容体リガンド、細胞外マトリックス分子又はその成分及び化学的送達製剤があげられる。
【００３２】
本明細書で用いられる「単離された」の語は、混入物又は通常自然界で見出されるような材料が実質的にない核酸を意味することを意図する。したがって、「単離された」の語は、実質的に純粋な核酸及び異種性の細胞又は組織中に導入される核酸が含まれる。
【００３３】
本発明の合成プロモーターは、糖尿病を治療するためにデザインされ及び生成された。本明細書に提供する教示及び指示を考慮すれば、本明細書に記載した取組みは、広範囲のヒトの病態のデザイン及び治療に適用できることは理解されるべきである。このような病態には、遺伝子置換治療及び１つ又は複数の遺伝子生成物の導入により病理学的系統を調節することができる治療が含まれる。したがって、本発明は、糖尿病を治療するためのインシュリンの遺伝子置換療法を記載するが、当業者であれば、合成プロモーターの生成及び遺伝子の調節された発現は、糖尿病以外の広範囲の疾患に対して本発明の組成物及び方法を用いて達成することができることを理解するであろう。
【００３４】
簡潔には、インシュリンの遺伝子置換療法に対する１セットの判定基準としては、自己免疫性攻撃以外はβ細胞に類似する生化学的特徴を有する好適な標的細胞の選択があげられる。標的の細胞は、プロインシュリンの成熟した活性の、インシュリンへの、必要な生化学的機構のプロセシングも含まなければならない。グルコースレベルに反応してインシュリンを発現及び放出することができる調節システムも、グルコースの恒常性を維持するのに有益である。
【００３５】
標的細胞は、肝臓はグルコースの恒常性において重要な役割を果たす、インシュリン作用の主要な部位であるため、肝臓を好適なインシュリン生成性代替器官として用いることができる（Nguyen,T.H.及びFerry,N.,(2004年),Liver gene therapy:advances and hurdles.,GeneTher.,11補巻,S76〜S84頁）。さらに、肝臓の肝細胞は、膵臓のβ細胞に見出されるものに類似するグルコース感知システムがあり、これはグルコーストランスポーター２(Rencurel,F.,Waeber,G.,Antoine,B.,Rocchiccioli,F.,Maulard,P.,Girard,J.ら,(1996年),Requirement of glucose metabolism for regulation of glucose transporter type2(GLUT2)gene expression in liver.,Biochem.J.,314巻(Pt3),903〜909頁)及びグルコキナーゼ（Gould,G.W.及びHolman,G.D.,(1993年),The glucose transporter family:structure function and tissue-specific expression.,BiochemJ.,295巻(Pt2),329〜341頁;Iynedjian,P.B.,(1993年),Mammalian glucokinase and its gene.,Biochem.J.,293巻(pt1),1〜13頁）を含む。したがって、膵臓のβ細胞同様、肝臓には血中グルコース濃度の変化に反応する本質的な機能がある。
【００３６】
肝細胞は、また、十分特定されたフューリンエンドプロテアーゼを、十分特定された切断認識配列と共に含む（Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ(Van,d.,V,Roebroek,A.J.,及びVan Duijnhoven,H.L.,(1993年),Structure and function of eukaryotic proprotein processing enzmes of the subtilisin family of serine proteases.,CritRev.Oncog,4巻,115〜136頁)。切断認識配列は、インシュリンＡ鎖及びＢ鎖へのプロセシングを実現する天然の切断部位に対する異種性の置換として、プロインシュリン中に組み入れることができる。フューリン切断部位の組み入れとしては、Ｂ／Ｃ（Ａｒｇ−Ａｒｇ）及びＣ／Ａ（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）接続での塩基性アミノ酸残基の、フューリンが認識する四塩基性の配列（Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ；配列番号１６）への変化があげられる。あるいは、インシュリンＡ及びＢ鎖は、成熟した、分泌可能なポリペプチドとして同時発現することができ、ヘテロダイマーのインシュリンに自己集合できるようにした。
【００３７】
さらに、血中グルコースレベルの上昇に反応してインシュリンが生成され、放出され、かつ血中グルコース濃度が低下すると抑制されるように、インシュリン遺伝子上に正常なβ細胞の調節を付与すると有益でもある。グルコースの調節は、グルコーストランスポーターの機能(Rencurel,F.,Waeber,G,Antoine,B.,Rocchiccioli,F.,Maulard,P.,Girard,J.ら,(1996年),Requrement of glucose metabolism for regulation of glucose transporter type2(GLUT2)gene expression in liver.,Biochem.J.,314巻(Pt3),903〜909頁)、グルコキナーゼの機能及び細胞外グルコース濃度の変化に反応したインシュリンの分泌に利用されるカリウム／カルシウムチャンネルに必要な、転写の調節及び分泌の他いくつかの因子が含まれる。肝臓特異的なグルコース反応性のプロモーターを用いて、肝臓におけるグルコース反応性のインシュリンの生合成を回復するために、いくつかの試みがなされている。しかし、転写的に調節されている系は、インシュリンの生合成の上方調節及び下方調節共に、比較的動態が遅く、したがって、それぞれ、高血糖への曝露されることが長くなるか又は低血糖がもたらされる。本発明は、これらの緩慢な動態を回避するためにグルコースに反応してインシュリン生成を緊密に調節する、天然に存在しないプロモーターを提供するものである。
【００３８】
本発明は、単離された組織特異的グルコース反応性プロモーターを提供する。プロモーターは、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む。
【００３９】
本発明の、組織特異的グルコース反応性プロモーターには、ポリメラーゼ結合性部位又はポリメラーゼが認識し、転写を開始するのに十分なドメインがある。ポリメラーゼ結合性ドメインは、例えば、ＩＩ型ポリメラーゼ結合性ドメインを構成することができる。このようなポリメラーゼは、本発明の様々な転写因子と相互作用して、ｍＲＮＡの転写を増大又は調節する。しかし、選択されたポリメラーゼ結合性ドメインと適合性であるようにシス結合性エレメントに対応する修飾がなされる場合は、他のポリメラーゼ結合性ドメインも利用することができる。ポリメラーゼ結合性ドメインの詳細な例は、下記実施例Ｉに記載する転写開始部位に対して−９６ヌクレオチド（ｎｔ）から＋１２ｎｔまでの肝ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）プロモーターフラグメントである。本明細書に提供する教示及び指示を考慮すれば、当業者であれば、肝臓でメッセージを積極的に転写する他の真核生物のプロモーターを、本発明のプロモーター及び方法で同様に利用することができることを理解するであろう。
【００４０】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターは、少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む。トリパルタイトエレメントは、転写を増大するトリパルタイト転写因子シス結合性エレメントを１つ又は複数含む。シス結合性エレメントは、さらに下記に記載するように、肝臓における転写の増強に基づき選択された。しかし、本発明を肝臓以外の組織に適用するには、当業者であれば、肝臓で活性であるシス結合性エレメントが、このような他の標的組織が遺伝子置換療法に利用される場合は、他の標的組織で活性な、シス結合性エレメントで置換することができることを理解する。肝臓以外の組織で活性又は特異的な、このような他の転写因子シス結合性エレメントは、当技術分野では周知である。したがって、以下の記載は、肝臓で活性なシスエレメントに関する例示である。
【００４１】
肝臓に特異的なグルコース反応性の合成プロモーターは、例えば、肝臓における転写を増大する１つ又は複数の転写因子シス結合性エレメントを含むように生成され、選択された。ＬＰＫプロモーターの３’側に転写因子シス結合性エレメントがある様々な例示のプロモーターの生成及び選択を実施例Ｉに記載し、図３及び４に示す。
【００４２】
肝臓に特異的な様式で迅速な転写の活性化を達成するために、本発明のプロモーターは、肝細胞で豊富な転写因子結合性エレメントをグルコース反応性のシステム中に導入した。肝臓に特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びにシス作用性の調節エレメントの相対的な配置及び肝臓の調節因子とのその相互作用は当技術分野では周知である。転写又は制御を増大するあらゆる公知又は確認されている転写因子を、本発明のプロモーターで使用することができる。肝臓に特異的な遺伝子の発現において正の調節に関与する、例示の肝臓特異的な転写因子シス結合性エレメントとしては、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）及び肝細胞核因子−４（ＨＮＦ−４）があげられる(Cereghini,S.,(1996年),Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation,FASEB J,10巻,267〜282頁)。２つ又はそれを超えるこれらの因子は、細胞特異的な転写を刺激するための特有の組合せで相乗的に機能し、成人肝細胞における所与の遺伝子の転写の増強は、これらのシスエレメントの特定の組合せが必要と考えられる(De,S.,V及びCortese,R.,(1992年),Transcription factors and liver-specific genes.,Biochim.Biophys.Acta.,1132巻,119〜126頁)。本発明の肝臓に特異的なプロモーターの詳細な例としては、トリパルタイト配列は、肝臓におけるインシュリンの転写を増大するために１つ又は複数のこれらの因子があげられる。２つ又はそれを超える相乗的な組合せは、また、インシュリンの転写活性及び調節に含まれ得る。相乗的な組合せには、例えば、高活性を示す、図１〜４に示した組合せが含まれる。これらの組合せの任意なものは、本発明のプロモーター内のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントに含まれ得る。
【００４３】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターのグルコース反応性は、例えば、グルコース／炭水化物の反応エレメント（Ｇ１ＲＥ又はＣｈｏＲＥ）を含むものにより達成することができる。Ｇ１ＲＥ以外の転写因子シス結合性部位を、本発明のグルコース反応性エレメントとして使用することもできる。Ｇ１ＲＥエレメントは、例えば、ＬＰＫ及びＳｐｏｔ１４を含む、グルコースに反応性の遺伝子のいくつかの３’調節領域で見出すことができ(Doiron,B.,Cuif,M.H.,Kahn,A.,及びaz-Guerra,M.J.,(1994年),Respective roles of glucose,fructose,and insulin in the regulation of the liver-specific pyruvate kinase gene promoter.,J.Biol.Chem.,269巻,10213〜10216頁;Shin,H.M.,Liu,Z.,及びTowle,H.C.(1995年),Two CACGTG motifs with proper spacing dictate the carbohydrate regulation of hepatic gene transcription.,J.Biol.Chern.,270巻,21991〜21997頁;Shih,H.M.,及びTowle,H.C.,(1992年),Definition of the carbohydrate response element of the rat S14 gene.Evidence for a common factor requied for carbohydrate regulation of hepatic genes.,J.Biol.Chem.,267巻,13222〜13228頁)、転写因子のｃ−ｍｙｃファミリーに対してコンセンサスの結合性部位であるＣＣＴＧＴＧに関連する２コピーのモチーフを含む。この結合性部位は、グルコース反応性の調節に十分である。しかし、Ｇ１ＲＥは、グルコースに対する完全な反応を支持するために、ＬＰＫではＨＮＦ−４、Ｓ１４では未知の転写結合性部位等の付属の部位が必要になる(Shih,H.M.,Liu,Z.,及びTowle,H.C.,(1995年),Two CACGTG motifs with proper spacing dictate the carbohydrate regulation of hepatic gene transcription,J.Biol.Chern.,270巻,21991〜21997頁)。本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターは、ＬＰＫプロモーターがあるＨＮＦ−４結合性エレメントと組み合わさって、グルコース反応性活性の増強を達成する、ＧＲＥというハイブリッドのエレメントを生成する。
【００４４】
転写因子結合性シスエレメントの順番は、結果として生じる組織特異的グルコース反応性プロモーターの活性をもとに選択された。簡潔には、プロモーター及びエンハンサーの調節領域は、いくつかのシス調節性エレメントの組合せからなり、エレメントの組成及び配置が、転写調節因子間のコンビナトリアルの相互作用により調節領域の特徴を決定する(Carey,M.,(1998年),The enhanceosome and transcriptional synergy.,Cell,92巻,5〜8頁)。転写の効率及び活性レベルは、同族のシスエレメントに結合している多数の活性化因子のコンビナトリアル及び相乗的な相互作用により増大させることができ、多くの異なる組合せの転写因子が転写の相乗作用をすることができる。これらの相互作用からの利点の１つは、限定された数の活性化因子を、多くの可能な組合せで配置することができ、その各々は生物学的に異なってよいことである(Struhl,K.(2001年),Gene regulation.A paradigm for precision.,Science,293巻,1054〜1055頁)。
【００４５】
これらの特徴に基づき、ランダムな順番の３つのシス調節性エレメントを含む、特に有用な組織特異的グルコース反応性プロモーター、すなわち、肝臓特異的な転写活性の増強に対してはＨＮＦ−１及びＣ／ＥＢＰ、相乗効果のプロモーターのグルコース反応性に対してはＨＮＦ−４（ＧＲＥ）と組み合わせたグルコース反応性エレメントについて、ライブラリーを生成し、スクリーニングした。培養中のラット肝細胞腫細胞系を用いて高い転写活性を示すプロモーターに対して、合成プロモーターのライブラリーをスクリーニングし、その後、動物モデルを用いてｉｎ ｖｉｖｏで確認した。
【００４６】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターのライブラリーの構築に用いられるＨＮＦ−１転写因子結合性シスエレメントは、長さ約２７ｎｔであった。これは、配列番号１として示される。しかし、本発明のプロモーターに有用なＨＮＦ−１シスエレメントは、ＨＮＦ−１の転写活性が維持される限り、より長いフラグメント及びより短いフラグメントを含んでもよい。例えば、ＨＮＦ−１転写因子結合性シスエレメントは、約１５〜１００ヌクレオチド、好ましくは約２０〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約２５〜３０ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【００４７】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターのライブラリーの構築に用いられるＣ／ＥＢＰ転写因子結合シスエレメントの長さは約２２ｎｔであった。これは、配列番号２として示される。しかし、本発明のプロモーターに有用なＣ／ＥＢＰシスエレメントは、Ｃ／ＥＢＰの転写活性が維持される限り、より長いフラグメント及びより短いフラグメントを含んでもよい。例えば、Ｃ／ＥＢＰ転写因子結合性シスエレメントは、約１２〜１００ヌクレオチド、好ましくは約１６〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【００４８】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターのライブラリーの構築に用いられるＧＲＥ転写因子結合性シスエレメントの長さは約４８ｎｔであった。これは、配列番号３として示される。しかし、本発明のプロモーターに有用なＧＲＥシスエレメントは、ＨＮＦ−１の転写活性が維持される限り、より長いフラグメント及びより短いフラグメントを含んでもよい。例えば、ＧＲＥ転写因子結合性シスエレメントは、約１５〜１００ヌクレオチド、好ましくは約２５〜７５ヌクレオチド、より好ましくは約４５〜５０ヌクレオチドの間からの範囲であってもよい。
【００４９】
本発明のトリパルタイト転写因子結合性シスエレメント内のシスエレメントを、さらに下記実施例Ｉに記載するような様々な異なる組合せで組み入れることができる。この組合せは、全ての可能な組合せ及び順列、並びに、個々のシスエレメント間及びトリパルタイトエレメントとプロモーターエレメントとの間の空間的な変動を含めた、様々な順番の個々のエレメントを含むことができる。空間的な変動は、例えば、実質的に相互に隣接するか、又は直接近接するシスエレメントを含むことができる。さらに、転写因子は、核酸はループアウトすることができ、２つの因子は物理的に相互作用し、その同族のシス結合性領域は相互に実質的な距離をおいて位置するように、介在性の領域に十分な柔軟性がある、様々に間隔のあいた位置でも作動し得る。したがって、本発明の転写因子結合性シスエレメント間に広範囲の介在配列を含むように、間隔を調節することができる。本発明のプロモーターに含まれ得る他の修飾には、例えば、上記したトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントのサイズが含まれる。本発明のプロモーターの詳しい組合せ及び配列を、実施例Ｉ及び図１〜４にさらに例示する。
【００５０】
本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターは、少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを含む。トリパルタイトシスエレメントは下記に例示してあり、広範囲の組合せのＨＮＦ−１、Ｃ／ＥＢＰ及びＧＲＥがある。上記及び下記に記載した他のエレメントはまた、組織特異的な発現又はグルコースの反応性の増大を達成するために、このトリパルタイトエレメントに置換するか、又は含まれ得る。さらに、その転写及び調節性制御をさらに増大するために、トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントのシスエレメントの成分の様々な組合せ及び順列に対する、トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの様々な組合せ、順列及び高次の繰り返しが、本発明のプロモーターに含まれ得る。例えば、２つ又はそれを超えるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを、実質的に隣接し、連続するか、又は含む介在配列に組み合わせて、６つ又はそれを超える成分のシスエレメントを有するプロモーターを作製することができる。２つ又はそれを超えるトリパルタイトエレメントを、同一の、又は頭から足の方向で、組合せ又は接合することができる。あるいは、２つ又はそれを超えるトリパルタイトエレメントを、反対の、又はhead to headの方向に組み合わせることができる。実施例でさらに例示するように、どちらの方向も、本発明の方法に有用な転写の活性及び制御を達成する。
【００５１】
実施例に例示したのは、単一のトリパルタイトエレメント及び各トリパルタイトエレメント間に制限認識配列だけがある、実質的に隣接して接続している２つ又は３つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの組合せである。これらの組織特異的グルコース反応性プロモーターの活性を実施例に記載し、図１〜１２におけるいくつかのアッセイで例示する。単一の、二重の又は三重のトリパルタイトエレメントの他に、他のより高次の繰返しが、本発明のプロモーターに含まれ得る。３つを超えるトリパルタイトシスエレメントの付加は、同様に、相互に関して同一又は反対方向の、同じ、反対又は任意の組合せであり得る。したがって、本発明は、１、２、３、４若しくは５又はそれを超えるトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントを有する組織特異的グルコース反応性プロモーターを提供する。トリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの成分である転写因子シスエレメントには、ＨＮＦ−１、Ｃ／ＥＢＰ又はＧＲＥが含まれ得る。上記及び下記に記載した他のエレメントも、このトリパルタイトエレメントに置換するか、又は含まれて、組織特異的な発現又はグルコース反応性の増大を達成することができる。
【００５２】
本明細書にｉｎ ｖｉｔｒｏとしても言及する、培養細胞における活性な組織特異的グルコース反応性プロモーターのレパートリーの構築、スクリーニング及び同定の他に、本発明のプロモーターの転写の活性の調節性制御もｉｎ ｖｉｖｏで確認した。簡潔には、本発明のプロモーターの制御下で異種性の遺伝子をコードする核酸を送達するために、アデノウイルスのベクターを使用し、これにより培養物の測定におけるのに比べて、本発明の様々なトリパルタイト含有プロモーターの、類似のｉｎ ｖｉｖｏの転写及び調節活性を確認した。したがって、本発明は、標的の核酸を発現することができる、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む細胞を有する宿主細胞及び宿主も提供する。さらに以下に記載するように、標的の核酸は、インシュリン、プロインシュリン、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖又はインシュリンのＡ及びＢ両鎖であり得る。
【００５３】
本発明の他の一実施形態では、組織特異的なグルコース反応性の様式で生理活性のインシュリンにプロセシングされ得るプロインシュリンを発現する宿主細胞又は細胞の集団が提供される。本発明の宿主細胞は、本質的にあらゆる組織又は器官に由来し得る。治療的治療に特に適用可能な１つの細胞型は、インシュリンにプロセシングされ得る本発明の肝臓に特異的なグルコース反応性のプロモーターのもとでプロインシュリンを発現する肝細胞である。しかし、あらゆる細胞型を本発明の宿主細胞として使用することができ、例えば、治療の、診断の又は研究の目的を含む、その意図された使用に基づいて選択することができる。宿主の主要な細胞には、容易に利用でき、望ましい増殖及び発現の特徴を示す細胞を含む組織を選択しなければならない。組織の供給源を選択する場合にさらに考慮することとしては、生理活性のインシュリンを発現するように単離され、培養され、修飾され得る細胞を含む組織を選択することがあげられる。肝臓以外の組織の供給源の例としては、膵臓、筋肉、脂肪、腸、神経内分泌の細胞又は皮膚組織及び造血起源の供給源があげられる。したがって、これらの組織内の細胞型を、組織特異的及びグルコース調節の様式で標的の遺伝子を発現するように修飾することができ、また、単離し、かつ、例えば、実験上の試験、ベクターの維持及び継代を含めた目的並びに細胞治療のプロトコールのために使用することができる。このような細胞型としては、例えば、肝細胞、β島細胞、筋肉（平滑筋、骨格筋又は心筋）、線維芽細胞、肝臓、脂肪、造血、上皮、内皮、内分泌、外分泌、腎臓、膀胱、脾臓、幹及び胚の細胞があげられる。特に有用な宿主細胞は、肝細胞に分化することができる前駆細胞及び幹細胞を含む肝細胞である。修飾されてグルコース反応性のインシュリンを発現することができ、また、上記のような組織の供給源から同様に得られるか、又は単離され得る、他の細胞型が、同様に当技術分野では公知である。ヒトの組織の供給源は治療目的では利点があるが、細胞がプロインシュリンの生理活性インシュリンへのプロセシング及び分泌の発現を可能にする特徴を示す限り、細胞の起源の種は本質的にあらゆる哺乳動物から考案されてもよい。
【００５４】
本発明は、糖尿病を治療又は予防する方法も提供する。この方法には、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）エレメント、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）レスポンスエレメント及びグルコースレスポンスエレメント（ＧＲＥ）を有する少なくとも１つのトリパルタイト転写因子結合性シスエレメントの３’側にポリメラーゼ結合性ドメインを含む組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターを有する有効量のウイルス粒子を個体に投与することを含み、インシュリンをコードする核酸の発現は組織特異的及びグルコース反応性である。
【００５５】
他の一実施形態では、任意の本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターは、プロインシュリン等のインシュリンをコードする核酸に作動的に連結し、遺伝子置換療法で用いることができる。さらに下記に記載するように、当技術分野では周知のあらゆる様々な方法を使用して、組織特異的グルコース反応性インシュリンをコードする核酸を、インシュリンのｉｎ ｖｉｖｏの生成及び糖尿病の治療的治療のために標的細胞又は組織に導入することができる。本発明のプロモーターの制御下でインシュリンをコードする核酸を標的にし、組み入れるための特に有用な方法は、ウイルス粒子を生成するために遺伝子構築物をウイルスのベクター中に組み入れることである。本発明のベクターを含むこのようなウイルス粒子の投与では、糖尿病の治療及び予防のための感染の後に、組織特異的及びグルコース反応性の様式で生理活性のインシュリンを発現することができる。
【００５６】
この点に関して、また、以下の実施例Ｉでさらに例示するように、本明細書に記載した組織特異的グルコース反応性プロモーターの制御下でプロインシュリン遺伝子等のインシュリンをコードする核酸を発現する組換えのアデノウイルスを生成することができ、コードする核酸を感染させ組み入れるために個体中にウイルスを注射することができ、本発明のプロモーターをレシピエントの宿主細胞中に注射することができる。ウイルスのベクターに応じて、発現は、例えば、エピソームの、又は宿主細胞のゲノム中への組入れによることができる。コードするインシュリンの核酸はヒトであってよく、肝臓においてプロインシュリンを成熟インシュリンにプロセシングするためのフューリン認識部位を導入するように修飾してよい。
【００５７】
アデノウイルスのベクターは十分に特定されており、ヒトの遺伝子治療で用いるために容易に適用できるので、遺伝子置換療法に特に有用である。
したがって、本発明の方法で例示するウイルス粒子は、アデノウイルスのベクター粒子である。しかし、ベクターに関して、予め及びさらに下記に記載するように、本明細書に提供する教示及び指示を考慮すれば、組織特異的グルコース反応性インシュリン遺伝子の送達、発現及び生理活性のインシュリンの分泌に、広範囲のウイルス粒子を使用することができることを、当業者であれば理解するであろう。アデノウイルス、他のＤＮＡウイルスベース、レトロウイルス又はその他であろうと、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターの制御下で治療用の遺伝子を含むベクターが内部にあるウイルス粒子は、そのゲノムを糖尿病の治療的治療又は予防のために本発明の方法で使用することができる。本発明のウイルス粒子は、例えば、ウイルスのゲノムをパッケージングするための当技術分野では周知の任意の広範囲の方法を用いて生成することができる。このような方法を、本発明のベクターが内部にあるアデノウイルス粒子について下記の実施例Ｉで例示する。
【００５８】
グルコースが恒常性でない糖尿病の個体を、様々な投与の経路及び方法により、上記したウイルス粒子で治療することができる。本発明の方法を用いて治療するのに適する個体を、当技術分野では周知の糖尿病の臨床基準及び予後指標を用いて選択する。本明細書で記載した、糖尿病の症状及び糖尿病に関連する病理の少なくとも１つの明確な臨床上の診断は、本発明の細胞を投与する根拠となる。例示の病理学的症状の例を、表１にあげる。
【００５９】
家族歴、空腹時血中グルコースレベル又は耐糖能の低下等の公知の予後指標により評価して、糖尿病を発症する危険性のある個体はまた、グルコース調節の様式でプロインシュリン及びプロテアーゼを発現するように修飾した細胞を投与する根拠となる。当業者であれば、個体を糖尿病又はグルコース取込みの非調節と診断する方法を理解するか又は知っており、疾患の程度又は重症度に応じて、本発明のウイルス粒子を投与する時期の好適な決定を行うことができ、投与の最も望ましい様式を選択することもできる。例えば、１型疾患を長年患っているヒトは、組織特異的グルコース反応性プロモーターの調節下でインシュリンをコードする核酸を感染及び発現するためにウイルス粒子の即時の投与が必要になることがあるが、２型疾患長年患っているヒトは、他の処方された治療の有効でないことが示された後まで治療を遅らせてもよい。
【００６０】
プロインシュリン等、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターがあるウイルス粒子を、個体の疾患を回復させるために糖尿病に対する治療が必要であるか、又はその恩恵を受けると決定された個体に投与することができる。ウイルス粒子も、糖尿病の１つ又は複数の徴候又は症状を回復するために投与することができる。例えば、糖尿病の個体に、疾患の診断後、グルコースが調節する発現、プロセシング及び生理活性のインシュリンの分泌のためにインシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むゲノムがあるウイルス粒子を投与することができる。ウイルス粒子は標的の組織及び細胞に感染し、そのベクターのゲノムのｉｎ ｖｉｖｏでの発現時に、グルコース調節の様式で生理活性のインシュリンを発現する。インシュリンの生成は、例えば、グルコースの恒常性を修復する。糖尿病に対して効果的に治療された個体は、異種性に生成されたインシュリンの生成後に、疾患を示す少なくとも１つの症状の重症度が低減したことを示す。症状の重症度が低減したと決定することができ、低減したことは当業者であれば明らかである。
【００６１】
重症度の低い糖尿病に罹患した個体にも、本発明のウイルス粒子を投与することができる。当業者であれば、そのような個体における治療が必要であることを決定することができる。例えば、標準の治療方法には反応しないか、又は反応の劣る糖尿病の個体を、本発明の方法により治療することができる。例えば、長期間体重が低減したままであるか、又は運動のレジメンを固守することを試みたが成功しなかった２型疾患に罹患した患者を、本発明の細胞を集団移植することにより患者のインシュリン耐性を治療することができる。
【００６２】
本発明の方法を用いて、糖尿病に対する他の治療の有効性を改善することもできる。本発明の方法を、既存又は他の治療方法と組み合わせて用いて、他の方法の使用の有効性又は簡便性を改善することができる。例えば、インシュリンの注射を毎日受けている患者又はインシュリンポンプを用いている患者に本発明のウイルス粒子を投与した後に、インシュリンを生成する肝細胞が生成され得る。インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子を投与し、感染させ、その後生理活性のインシュリンの生成を調節することで、そのような患者のインシュリン注射の頻度を低減することができる。インシュリン治療を受けていないが、体重を低減させるための食事及び運動等の行動修正療法を受けている糖尿病患者にも本発明のウイルス粒子を投与することができる。そのような個体においてインシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子を、体重低減及び運動レジメンと組み合わせて投与することで、疾患の再発予測を低減することができるか、又は疾患の徴候若しくは症状を回復することができる。インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む本発明のウイルス粒子を用いて、内因性のインシュリン分泌性細胞に対して自己免疫反応を有する糖尿病の個体を治療することもできる。このような糖尿病の個体は、自己免疫反応の免疫療法の介入により治療することが多い。このような個体は、免疫治療単独で達成するよりも高い治療効果を達成するために、肝臓特異的なグルコース反応性である生理活性のインシュリンでさらに治療することができる。
【００６３】
インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む本発明のウイルス粒子を、個体に投与して、グルコースの恒常性を高めることができる。ウイルス粒子のゲノムを組み込むことにより、インシュリン機能の発現の修復により、グルコースの恒常性を延長できる。糖尿病に罹患している個体に、有効量のウイルス粒子を投与して、糖尿病を低減又は予防することができる。このような個体の空腹時血中グルコースレベルは、約１４０ｍｇ／ｄｌ又はそれを超えることがある。
【００６４】
感染に適する有効量のウイルス粒子は、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むように得られるか、又は修飾され得る範囲内である大きさ又は粒子数からなり、肝臓等のｉｎ ｖｉｖｏで治療上有益である標的の細胞又は組織中にウイルスを感染させた後、グルコースが調節する生理活性のインシュリンの量を発現するのに十分である。ヒトの個体に対する有効量のウイルス粒子は、例えば、当業者には周知のものと共に本明細書に提供する教示及び指示に与えられた信頼できる動物の糖尿病モデルから推定することができる。マウスの動物モデルに対するウイルス粒子の有効量としては、例えば、約１×１０8〜１×１０12個、好ましくは約１×１０9〜８×１０11個、より好ましくは約１×１０10〜１×１０11個があげられる。特に有用な有効量は、３×１０10個のウイルス粒子である。ウイルス粒子数の選択は、粒子の起源、レシピエントの個体の状態及び必要なインシュリン分泌のレベルに依存し得る。当業者であれば、当技術分野では周知の方法を用いて、治療効果をもたらすウイルス粒子の好適な数を決定する方法を理解している。
【００６５】
本発明の肝臓に特異的なグルコース反応性のプロモーターの制御下で発現されるインシュリンをコードする核酸を送達するための本発明のウイルス粒子は様々な経路により投与することができる。静脈注射（ｉ．ｖ．）の他に、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内又は組織若しくは器官部位内への注射により、有効量のウイルス粒子を個体中に投与することもできる。投与に用いられるウイルス粒子を、当技術分野では周知の方法により入手し、調製し、好適な生理学的な担体に懸濁する。例えば、ウイルス粒子を、粒子を含む装置に接続したカテーテル及び静脈中に挿入したカテーテルを通して直接的に注入することができ、又は組織中に直接注射することができる。ウイルス粒子を、上記で定義し、以下にさら記載する医薬的に許容できる担体で注射する。ウイルス粒子を、送達、ターゲティング及び／又は治療上の有効性を促進する他の分子と共に投与することもできる。グルコースが調節する生理活性のインシュリンを治療レベルで十分に発現させるのに必要な、ウイルス粒子を、単一又は複数回投与で投与することができる。
【００６６】
ウイルス粒子で治療した個体について、食事摂取後にインシュリン分泌のレベルを測定することで治療の有効性をモニターすることができる。この測定は、例えば血中レベルのインシュリンをラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡで測定することからなり得る。あるいは、ウイルス粒子投与後の個体の空腹時血中グルコースレベルの測定を用いて、治療の有効性を決定することができる。糖負荷試験で決定した糖処理速度の低下を用いて、治療の有効性を検証することもできる。さらに、糖尿病に関連する少なくとも１つの症状が軽減したことを用いて治療の有効性を決定することもできる。当業者であれば、治療の有効性を評価し、診断する好適な手段を理解する。
【００６７】
本発明を糖尿病の予防に用いることもできる。例えば、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子を、糖尿病を発症する危険性のある個体又は高血糖に罹患している個体に対する予防として投与することができる。本発明を、例えば、遺伝的に糖尿病を発症する素因のある個体又はインシュリン抵抗性若しくは非調節の高血糖を発症する危険性のある肥満の個体に用いることもできる。これらの個体は、臨床的に明らかな高血糖を発症する前又は発症している間に、標的細胞に感染した後グルコースが調節するインシュリンを生成するために、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子の有効量を受けることができる。後者の場合は、疾患の予防とみなすことができるが、慢性的な血中グルコースレベルの上昇が指摘される前に正常のグルコースの恒常性が得られるので、疾患の治療とみなすこともできる。
【００６８】
感染のため及び個体におけるグルコースが調節する生理活性のインシュリンを生成するために、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子を投与する他に、本発明のベクターを個体に、遺伝子の修飾のために、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの治療のために直接投与することもできる。
【００６９】
インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む本発明のウイルス粒子又はベクターを、個体中に直接導入するか、又は医薬的に許容できる担体を含む薬剤組成物として配合することができる。医薬的に許容できる担体は、当技術分野では周知であり、水、生理学的な緩衝食塩水又は他の溶剤若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、オリーブ油等の油又は注射可能な有機エステル等の水溶液が含まれる。
【００７０】
医薬的に許容できる担体としては、例えば、ウイルス粒子の感染、ベクターの核酸配列の吸収、若しくはその両方を安定化するか、又は増大するために働く、生理学的に許容できる化合物があげられる。当業者であれば、生理学的に許容できる化合物を含む、医薬的に許容できる担体の選択は、例えば、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子の投与経路及びウイルス粒子の特定の特徴、例えば、ウイルス粒子がＤＮＡウイルスをベースにするか、レトロウイルスをベースにするかに依存することを理解している。
【００７１】
薬剤組成物は、所望により、水中油型乳剤、マイクロエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、ミクロスフェア又は他のポリマー材料中に組み入れることもできる(Gregoriadis,Liposome Technology,I巻からIII巻,第2版,CRC Press,Boca Raton,フロリタ゛州(1993年);Fraleyら,Trends Biochem Sci.,6巻,77頁(1981年))。例えば、リン脂質又は他の脂質からなるリポソームは、作製及び投与するのが比較的容易である、無毒性で、生理学的に許容できる、代謝可能な担体である。さらに、リポソームは、効率が高いながらも薬剤の生理学的活性を損なわずに、本発明の核酸をコードするインシュリンに作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターをカプセル化することができるので、リポソームは特に有用であり、優先的かつ実質的に標的細胞に結合し、高い効率で標的細胞中に小胞の水性成分を送達する(Manninoら,Biotechniques,6巻,682頁(1988年)を参照されたい)。
【００７２】
個体への本発明のベクターを送達するためのリポソームのターゲティングは、受動的又は能動的でもよい。受動的ターゲティングは、例えば、リポソームが細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞及び洞様毛細血管を含んでいる肝臓等の器官に蓄積する傾向を用いるものである。リポソームとして配合されたベクターを肝臓の門脈中に直接注入することができ、肝臓におけるＲＥＳ細胞の集中及び肝臓における循環系のシヌソイドの性質により、肝臓の細胞を効果的に修飾してインシュリンを発現させる。ベクターを含むリポソームの能動的ターゲティングは、リポソームに対する特異的なリガンドの連結により達成することができる。このようなリガンドとしては、標的細胞によって発現される受容体に対するリガンド等の、モノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質があげられる。ターゲティングのどちらかの方法が、インシュリンの発現のために修飾される組織の細胞型又は位置に応じて選択され得る。
【００７３】
核酸をコードするインシュリンに作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むウイルス粒子又はベクターの個体への投与は、インシュリン生成物のレベル又は修飾すべき細胞の数に応じて、単一の治療としてもよく、又は複数の治療としてもよい。ポリペプチドをコードする核酸配列を送達するための方法は、例えば、１９９６年１２月３日発行の、Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号に記載されているように、当技術分野では公知である。修飾した細胞の比率を増大するために、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターに作動的に連結しているインシュリンをコードする核酸の細胞１個あたりのコピー数を増やすため、又は望ましい期間修飾された細胞の有効な数を維持するために、複数投与も行うことができる。糖尿病の少なくとも１つの症状が軽減され、低減された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏの治療の有効性が達成される。治療した個体における糖尿病の症状の重症度の低減は、当業者であれば、上記のように決定することができる。
【００７４】
組織特異的グルコース反応性プロモーターの制御下でインシュリンをコードする核酸を導入し発現するための遺伝子置換療法の例示的な様式を以下に例示する。このような様式には、アデノウイルスのベクターの使用が含まれ、組織特異性は肝臓として例示される。
【００７５】
疾患を治療するための遺伝子置換療法をデザインし、最適化する上で、考慮すべき一般的な成分は３つある。これらの成分には、遺伝子を輸送するためのベクター、ベクターを好適な組織又は器官に送達するための装置及び手段並びに治療用の遺伝子が含まれる。各成分を、特定の対象とする疾患の詳しい特徴に応じて、当技術分野では周知の判定基準に基づいて、選択又は修飾することができる。
【００７６】
数々の遺伝子導入のビヒクルが開発されており、その任意のものを本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターと組み合わせて用いて、調節された治療用の遺伝子を送達するのに用いることができる。遺伝子導入のビヒクルは、ウイルスの及び非ウイルスの送達システムに、大別することができる。
【００７７】
ウイルス送達システムは、遺伝情報を宿主細胞中に送達することができるウイルスの複製に基づくものである。一般的に、複製しているウイルスのゲノムは、コード領域及びシス作用性の調節エレメントを含む。コード配列は、感染性のウイルスの複製に不可欠であるウイルスの構造タンパク質及び調節タンパク質の生成を担っており、一方、シス作用性の配列は、ウイルスのゲノムのパッケージング及び宿主細胞中への組込みに必要とされる。ウイルスのコード領域は、治療用の遺伝子によって置換され、複製欠損のウイルスのベクターを生成するために完全であるシス作用性の配列を後に残す。ウイルスのベクターが、構造上のウイルスタンパク質をトランスで提供する生成細胞中に導入された場合、治療用遺伝子の遺伝情報を含む複製欠損のウイルス粒子がこれらの細胞で生成される。
【００７８】
遺伝子治療に現在利用可能なウイルスのベクターは、様々なウイルスに基づく。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレトロウイルスに基づくベクターには、それらのウイルスのゲノムを宿主細胞の染色体のＤＮＡ中に組み込む機能があり、宿主細胞は、おそらく一生遺伝子の発現を実現する。アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）に基づくベクターは、非組込みベクターを代表する。これらのベクターは、そのゲノムを標的細胞の核内に送達しエピソームのままである。
【００７９】
レトロウイルスは、すべての脊椎動物で見出されるエンベロープで包まれたＲＮＡウイルスの大ファミリーであり、オンコレトロウイルス、レンチウイルス及びスプーマウイルスに分類することができる。これらには、７から１１ｋｂｐの、２コピーの、線状の、ポジティブ鎖の、一本鎖のＲＮＡゲノムがある。標的細胞中に侵入した後、ＲＮＡゲノムは、ウイルスの酵素である逆転写酵素によって線状の二重鎖ＤＮＡに変換され、細胞のクロマチン中に組み込まれる(Goff,S.P.(2004年),Retrovirus restricition factors.,Mol.Cell.,16巻,849〜859頁)。レトロウイルスのゲノムは全て、その終端に２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）を有する(Wilheim,M.及びWilhelm,F.X.(2001年),Reverse transcription of retroviruses and LTR retrotransposons.,Cell Mol.Life Sci.,58巻,246〜1262頁)。ＬＴＲ及び付近の配列は、ウイルスゲノムの発現及びパッケージング、逆転写及びゲノムの組込みの間はシスで作用する。ＬＴＲに隣接するｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子は、それぞれ、構造上のコアタンパク質、核酸ポリメラーゼ／インテグラーゼ及び表面の糖タンパク質をコードしている。レンチウイルスはそのゲノムに、ゲノムの発現に必須である、ｔａｔ及びｒｅｖ等、２つの他の遺伝子、並びに付属の遺伝子の可変性のセットを有する(Roebuck,K.A.及びSaifuddin,M.,(1999年),Regulation of HIV-1 transcription.,Gene Expr.,8巻,67〜84頁)。
【００８０】
末端領域にほとんどのシス作用性の配列が位置するので、レトロウイルスをウイルス遺伝子の輸送ベクターとして生成するのが日常的である。８ｋｂまでの治療用の遺伝子を挿入し、ウイルスの遺伝子の代わりに発現させる。レトロウイルスのベクターをパッケージングするために、構造タンパク質が、パッケージング細胞系ではトランスで提供される(Mann,R.,Mulligan,R.C.,及びBaltimore,D.,(1983年),Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus.,Cell,33巻,153〜159頁),Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus.,Cell,33巻,153〜159頁)。相同組換えを予防するために、別々の構築物から構造タンパク質を発現するパッケージング細胞が開発されている(Danos,O.,及びMulligan,R.C.,(1988年),Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85巻,6460〜6464頁)。
【００８１】
ウイルスのエンベロープの糖タンパク質は、標的細胞上の受容体とのその相互作用により、レトロウイルスの粒子の宿主の範囲を決定する。シュードタイピングのような過程で、特定のウイルスのＥｎｖを異なるウイルスからの他のものに置換することにより、細胞の指向性を修飾することができる(Naldini,L.,Blomer,U,Gage,F.H.,Trono,D.,及びVerma,I.M.,(1996年),Efficient transfer,integration,and sustained long-term expression of the trans gene in adult rat brains injected with a lentiviral vector.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93巻,11382〜11388頁;Zufferey,R,Nagy,D.,Mandel,R.J.,Naldini,L.,及びTrono,D.,(1997年),Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.,Nat.Biotechnol.,15巻,871〜875頁)。このような取組みは、無関係のウイルスからの配列を組み入れることにより、レトロウイルスのベクターの宿主範囲を拡張することができる。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のＧ糖タンパク質にシュードタイピングされるレトロウイルスのベクターは、ほとんどの細胞に感染することができ、１×１０10転写単位／ｍｌを超える力価に濃縮することができる(Burns,J.C.,Friedmann,T.,Driever,W.,Burrascano,M.,及びYee,J.K.,(1993年),Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90巻,8033〜8037頁)。
【００８２】
レトロウイルスのベクターが標的の細胞のゲノム中に組み込まれる機能は、遺伝子治療を適用するのに有用な特徴である。プレインテグレーション複合体をクロマチン中に組み込むのに核膜の破壊が必要であり(Roe,T.,Reynolds,T.C.,Yu,G.,及びBrown,P.O.(1993年),Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.,EMBO J,12巻,2099〜2108頁)、レトロウイルスのベクターによる生成の形質導入は、進入直後の標的細胞の有糸分裂に依存する(Miller,D.G.,Adam,M.A.,及びMiller,A.D.,(1990年),Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.,Mol.Cell Biol.,10巻,4239〜4242頁)。したがって、レトロウイルスのベクターを、リンパ球及び造血前駆細胞等の増殖性の標的に適用することができる(Halen,S.及びKohn,D.B.(2000年),Gene therapy using hematopoietic stem cells:Sisyphus approaches the crest.,Hum.Gene Ther.,11巻,1259〜1267頁)。
【００８３】
５０を超える様々なヒトアデノウイルスの血清型が存在する。その中で、現在のベクターは、公知の血清型２及び５に主に由来する。さらに、様々な血清型のカプシドを用いた、２次的なベクターの送達が、ベクターの再投与に対する動物モデルで実証されている(Morral,N.,O'Neal,W.,Rice,K.,Leland,M.,Kaplan,J.,Piedra,P.A.ら,(1999年),Administration of helper-dependent adenoviral vectors and sequential delivery of different vector serotype for long-term liver-directed gene transfer in baboons.,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,96巻,12816〜12821頁;Parks,R.,Evelegh,C.,及びGraham,F.,(1999年),Use of helper-dependent adenoviral vectors of alternative serotypes permits repeat vector administration.,Gene Ther.,6巻,1565〜1573頁)。細胞の指向性又は免疫学的反応の改変は、主なウイルス細胞受容体の結合を担う様々な血清型からのウイルスの線維タンパク質を変化させるものであった(Curiel,D.T.,(1999年),Strategies to adapt adenoviral vectors for targeted delivery.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,886巻,158〜171頁;Wickham,T.J.,(2000年),Targeting adenovirus.,Gene Ther.,7巻,110〜114頁)。
【００８４】
細胞に侵入した後、ウイルス粒子は、エンドソームを効果的に溶解及びエスケープさせるタンパク質を含んでおり、ゲノムが核中への侵入できるようにしている(Kasamatsu,H.,及びNakanishi,A.,(1998年),How do animal DNA viruses get to the nucleus?,Annu.Rev.Microbiol.,52巻,627〜686頁)。１個の細胞は、１００００個ほどのウイルス粒子を生成することができ、精製した濃度で、１ｍｌあたり１×１０13個のベクター粒子を日常的に達成できる(Vorburger,S.A.,及びHunt,K.K.,(2002年),Adenoviral gene therapy.,Oncologist.,7巻,46〜59頁)。Ｅ３遺伝子は、免疫監視の役割を果たすことが公知であるが、ウイルスの生活環ではなくてもよい(Wold,W.S.,及びGooding,L.R.(1991年),Region E3 of adenovirus:a cassette of genes involved in host immunosurveillance and virus-cell interactions.,Virology,184巻,1〜8頁)。この領域を除去すると、最高８ｋｂの、より大型の外来ＤＮＡ挿入物に対する余地が新たにできる。
【００８５】
有用なベクターは、Ｅ１及びＥ２及び／又はＥ４遺伝子が欠失している(Lusky,M.,Christ,M.,Rittner,K.,Dieterle,A.,Dreyer,D.,Mourot,B.ら,(1998年),In vitro and in vivo biology of recombinant adenovirus vectors with E1,E1/E2A orE1/E4 deleted.,J.Virol.,72巻,2022〜2032頁;Armentano,D.,Smith,M.P.,Sookdeo,C.C.,Zabner,J.,Perricone,M.A.,St.George,J.A.ら,(1999年),E40RF3 requirement for achieving long-term transgene expression from the cytomegalovirus promoter in adenovirus vectors.,J.Virol.,73巻,7031〜7034頁;Gorziglia,M.I.,Lapcevich,C.,Roy,S.,Kang,Q.,Kadan,M.,Wu,V.ら,(1999年),Generation of an adenovirus vector lacking E1,e2a,E3,and all of E4 except open reading frame 3,J.Virol.,73巻,6048〜6055頁;Christ,M.,Louis,B.,Stoeckel,F.,Dieterle,A.,Grave,L.,Dreyer,D.ら,(2000年),Modulation of the inflammatory properties and hepatotoxicity of recombinant adenovirus vectors by the viral E4 gene products.,Hum.Gene Ther.,11巻,415〜427頁)。考えられうるウイルスの毒性を低減させるために、ヘルパーウイルスが、パッケージング領域において条件的に欠損することで複製に必要とされるウイルスの遺伝子を全て含み、それがウイルスのカプシド中へパッケージングされるのを防ぐ、ヘルパー依存のベクター系が利用できる(Morsy,M.A.及びCaskey,C.T.、(1999年)、Expanded-capacity adenoviral vectors――the helper-dependent vectors.、Mol.Med.Today,、5巻、18〜24頁)。第２のベクターは、ウイルスの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、治療用遺伝子配列及び正常なパッケージングの認識シグナルだけを含み、認識シグナルはこのゲノムが選択的にパッケージングされ細胞から放出されるようにしている。パッケージング領域以外ではウイルスのゲノムは存在していないので、これらのベクターの毒性は低減される(Balague,C.,Zhou,J.,Dai,Y.,Alemany,R.,Josephs,S.F.,Andreason,G.ら,(2000年),Sustained high-level expression of full-length human factor VII and restoration of clotting activity in hemophilic mice using a minimal adenovirus vector.,Blood,95巻,820〜828頁;Morral,N.,Parks,R.J.,Zhou,H.,Langston,C.,Schiedner,G.,Quinones,J.ら,(1998年),High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha 1-antitrypsin with negligible toxicity.,Hum.Gene Ther.,9巻,2709〜2716頁)。ベクターのＤＮＡのゲノムはエピソームに存在し、形質導入された細胞では複製されない。したがって、トランスジーンの発現は、複製している細胞における希釈又は非分裂の細胞におけるエピソームのゲノムが分解するかのいずれかのために、徐々に失われ得る。発現は、治療用ベクターをさらに投与することにより回復できる。
【００８６】
ほとんどのアデノウイルスのベクターが、静脈内投与により主に肝臓に形質導入されたが、アデノウイルスのベクターの直接注射でほとんどの組織に形質導入することもできる(Vrancken Peeters,M.J.,Perkins,A.L.,及びKay,M.A.,(1996年),Method for multiple portal vein infusions in mice:quantitation of adenovirus-mediated hepatic gene transfer.,Biotechniques,20巻,278〜285頁)。これらのベクターは、トランスデューサーである肝臓、骨格筋、心臓、脳、肺、膵臓及び腫瘍に対する前臨床の動物試験で用いられていた(Bramson,J.L.,Graham,F.L.,及びGauldie,J.,(1995年),The use of adenoviral vectors for gene therapy and gene transfer in vivo.,Curr.Opin.Biotecnol.,6巻,590〜595頁)。
【００８７】
ＡＡＶは、パルボウイルス亜科であるデペンドウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）のメンバーである。このウイルスは非病原性であり、それ自体は非複製である。したがって、増殖性の感染を媒介するのに、アデノウイルス等のヘルパーウイルスが必要である(Muzyczka,N.,(1992年),Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158巻,97〜129頁)。６つの公知の血清型が存在し、その各々が異なる細胞に指向性がありうる。ＡＡＶには非病原性という特徴があるので、遺伝子治療には特に有用なビヒクルとみなされる。このウイルスのゲノムは、ｒｅｐ及びｃａｐの２つの遺伝子からなる。ｃａｐ遺伝子はウイルスのカプシドを形成する構造タンパク質をコードし、調節タンパク質はｒｅｐ遺伝子から生成される(Muzyczka,N.,(1992年),Use of adeno-associated virus as a general transduction vector for mammalian cells.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158巻,97〜129頁;Russell,D.W.,及びKay,M.A.,(1999年),Adeno-assosiated virus vectors and ematology.,Blood,94巻,〜874頁;Monahan,P.E.,及びSamulski,R.J.,(2000年),AA V vectors:is clinical success on the horizon?,Gene Ther.,7巻,24〜30頁;Tal,J.,(2000年),Adeno-associated virus-based vectors in gene therapy.,J.Biomed.Sci.,7巻,279〜291頁)。これら２つの遺伝子には、１４５ヌクレオチドの長さであるウイルスのＩＴＲが隣接している。ウイルス粒子は各々、単一の二重鎖ゲノムを含んでいる。ＡＡＶのパッケージング機能は約５．０ｋｂであり、これがこのベクター系の主な限界である(Monahan,P.E.,及びSamulski,R.J.,(2000年),Adeno-associated virus vectors for gene therapy:more pros than cons?,Mol.Med.Today,6巻,433〜440頁)。野生型のウイルスには、ｒｅｐの存在下で、ヒト第１９染色体の特異的な領域中に組み込まれる性向がある。しかし、この性質は、ベクターではｒｅｐ遺伝子が存在しないために失われる(McCarty,D.M.,Young,S.M.,Jr.,及びSamulski R.J.,(2004年),Integration of adeno-associated virus(AAV) and recombinant AAV vectors.,Annu.Rev.Genet.,38巻,819〜845頁)。
【００８８】
ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を、プロモーター及びトランスジーンの配列で置換することにより、生成することができる。組換えのＡＡＶを生成する場合には、ｃａｐ及びｒｅｐ配列がヘルパープラスミドから提供され、感染性のウイルスはアデノウイルスの同時感染により容易にレスキューされる(Matsushita,T.,Elliger,S.,Elliger,C.,Podsakoff,G.,Vilarreal,L.,Kurtzman,G.J.ら,(1998年),Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus.,GeneTher.,5巻,938〜945頁;Xiao,X.,Li.J.,及びSamulski,R.J.,(1998年),Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absense of helper adenovirus.,J.Virol.,72巻,2224〜2232頁)。複製するアデノウイルスがない、他のベクター生成系が開発されており(Xiao,X.,Li,J.,及びSamulski,R.J.,(1998年),Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.,J.Virol.,72巻,2224〜2232頁)、野生型のアデノウイルスが汚染する可能性が低減される。
【００８９】
ＡＡＶベクターは、エピソームのトランスジーンの発現及びランダムな染色体の組込みの両方により、細胞を形質導入することが示されている(Nakai,H.,Iwaki,Y.,Kay,M.A.,及びCouto,L.B.,(1999年),Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver.,J.Virol.,73巻,5438〜5447頁;Miao,C.H.,Snyder,R.O.,Schowalter,D.B.,Patijin,G.A.,Donahue,B.,Winther,B.ら,(1998年),The kinetics of rAAV integration in the liver.,Nat.Genet.,19巻,13〜15頁)。ＡＡＶベクターは、また、遺伝子又は発現カセットを２つのベクターに分割し、それらを筋肉又は肝臓に同時に投与できるようにする(Yan,Z.,Zhang,Y.,Duan,D.,及びEngelhardt,J.F.,(2000年),Trans-splicing vectors expand the utility of adeno-associated virus for gene therapy.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97巻,6716〜6721頁;Sun,L.,Li,J.,及びXiao,X.,(2000年),Overcoming adeno-associated virus vector size limitation through viral DNA heterodimerization.,Nat.Med.,6巻,599〜602頁;Nakai,H.,Storm,T.A.,及びKay,M.A.,(2000年),Increasing the size of rAAV-mediated expression cassettes in vivo by intermolecular joining of two complementary vectors.,Nat.Biotechnol.,18巻,527〜532頁)。さらに、ＡＡＶベクターのゲノムにはウイルスをコードする配列がないので、ベクター自体は、いずれかのベクターのｓｓＤＮＡのアニーリングによるｄｓＤＮＡゲノムの生成の、他の毒性又はいかなる炎症反応と関係しておらず、あるいは、コンカテマーを形成するように連結しているベクターのゲノムが後に続く第２の鎖の合成とも関連していなかった(Nakai,H.,Storm,T.A.,及びKay,M.A.,(2000年),Recruitment of single-stranded recombinant adeno-associated virus vector genomes and intermolecular recombination are responsible for stable transduction of liver in vivo.,J.Virol.,74巻,9451〜9463頁;Vincent-Lacaze,N.,Snyder,R.O.,Gluzman,R.,Bohl,D.,Lagarde,C.,及びDanos O.,(1999年),Structure of adeno-associated virus vector DNA following transduction of the skeltal muscle.,J.Virol.,73巻,1949〜1955頁;Duan,D.,Yan,Z.,Yue,Y.,及びEngelhardt,J.F.,(1999年),Structual analysis of adeno-associated virus transduction circular intermediates.,Virology,261巻,8〜14頁;Yang,J.,Zhou,W.,Zhang,Y.,Zidon,T.,Ritchie,T.,及びEngelhardt,J.F.,(1999年),Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.,J.Virol.,73巻,9468〜9477頁;Ferrari,F.K.,Samulski,T.,Shenk,T.,及びSamulski,R.J.,(1996年),Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors.,J.Virol.,70巻,3227〜3234頁;Fisher,K.J.,Gao G.P.,Weitzman,M.D.,DeMatteo,R.,Burda,J.F.,及びWilson J.M.,(1996年),Transduction with recombinant adeno-associated virus for gene therapy is limited by leading-strand synthesis.,J.Virol.,70巻,520〜532頁)。ベクター粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏの投与により、中枢神経系（ＣＮＳ）、肝臓、肺及び筋肉等の多くの異なる器官中に送達することができ(Monahan,P.E.,及びSamulski,R.J.,(2000年),AAV vectors:is clinical success on the horizon?,GeneTher.,7巻,24〜30頁)、ＡＡＶベクターは、非分裂の細胞に効果的に形質導入することが見出されている(Miao,C.H.,Nakai,H.,Thompson,A.R.,Storm,T.A.,Chiu,W.,Snyder,R.O.ら,(2000年),Nonrandom transduction of recombinant adeno-associated virus vectors in mouse hepatocytes in vivo:cell cycling does not influence hepatocyte transduction.,J.Virol.,74巻,3793〜3803頁)。
【００９０】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）は、遺伝子移入の目的で操作されたヘルペスウイルスである。ベクターは、協調的又は同時に発現され得る大型の単一の遺伝子又は複数のトランスジーンを可能にする、少なくとも３０ｋｂの非−ＨＳＶ配列の外来遺伝子が挿入できる大きな容量を示す(Krisky,D.M.,Marconi,P.C.,Oligino,T.J.,Rouse,R.J.,Fink,D.J.,Cohen,J.B.ら,(1998年),Development of herpes simplex virus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications.,GeneTher.,5巻,1517〜1530頁)。
【００９１】
ＨＳＶアンプリコンベクター系は、シス作用性の配列であるｏｒｉ（ウイルスＤＮＡの複製の起源）及びｐａｃ（パッケージング及び切断のシグナル）を含む、欠損したゲノムをパッケージングするＨＳＶ−１の機能に基づく。ＨＳＶアンプリコンベクターは、シス作用性のエレメント以外はウイルスの遺伝子を含まない(Spaete,R.R.,及びFrenkel,N.,(1982年),The herpes simplex virus amplicon:a new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector.,Cell,30巻,295〜304頁)。これらの長さは、一般的に約１５ｋｂである。標準的なアンプリコン系は、粒子の生成及びゲノム長のコンカテマー化したベクターＤＮＡのパッケージングに、ヘルパーＨＳＶの機能が必要である。アンプリコンベクターの生成は、シグナルをパッケージングするために削除されたヘルパーウイルスのゲノムのプラスミドの使用により改善されており、ヘルパーのゲノムは細菌の人工染色体として細菌で増殖する(Saeki,Y.,Ichikawa,T.,Saeki,A.,Chiocca,E.A.,Tobler,K.,Ackermann,M.ら,(1998年),Herpes simplex virus type 1 DNA amplified as bacterial artificial chromosome in Escherichia coli:rescue of replication-competent virus progeny and packaging of amplicon vectors.,Hum.GeneTher.,9巻,2787〜2794頁)。このパッケージング系は、複製可能なウイルス及び細胞毒性の生成を著しく低減する。
【００９２】
非ウイルスのベクターはある種の利点も示し：（１）調製及びスケールアップが容易であり、（２）伝達されるＤＮＡの大きさについてより柔軟であり、（３）ｉｎ ｖｉｖｏで概ね安全であり、（４）特異的な免疫反応の誘発を最小にし、したがって繰り返し投与することができることがあげられる。裸のＤＮＡ、ＤＮＡ−陽イオン性−リポソーム複合体、ＤＮＡ−ポリマー複合体及びこれらの組合せを用いた数々の研究が報告されている(Lollo,C.P.,Banaszczyk,M.G.,及びChiou,H.C.,(2000年),Obstacles and advances in non-viral gene delivery.,Current Opinion In Molecular Therapeutics,2巻,136〜142頁;Feigner,P.L.,Barenholz,Y.,Behr,J.P.,Cheng,S.H.,Cullis,P.,Huang,L.ら,(1997年),Nomenclature for synthetic gene delivery systems.,Human Gene Therapy,8巻,511〜512頁;Zauner,W.,Ogris,M.,及びWagner,E.,(1998年),Polylysine-based transfection systems utilizing receptor-mediated delivery.,Advanced Drug Delivery Reviews,30巻,97〜113頁;Ledley,F.D.,(1995年),Nonviral gene therapy:The promise of genes as pharmaceutical products.,Human gene Therapy,6巻,1129〜1144頁)。
【００９３】
特に、ＤＮＡ−陽イオン性−リポソーム複合体（Ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）の、リガンドに向けられたターゲティングで、ヒトを治療するための遺伝子の、様々な非ウイルスの薬剤製剤も利用可能である。葉酸、トランスフェリン又は抗トランスフェリン受容体抗体等のリガンドと組み合わせたＬｉｐｏｐｌｅｘｅｓは、標的とされた遺伝子の送達及びヒトの乳房、前立腺、頭部及び頚部の癌における発現を実現している（Rolland,A.P.,(1998年),From genes to gene medicines:recent advances in nonviral gene delivery.,Critical Reviews In Therapeutic Drug Carrier Systems,15巻,143〜198巻;Audouy,S.A.L.,de Leij,L.F.M.H.,Hoekstra,D.,及びMolema,G.,(2002年),In vivo characteristics of cationic liposomes as delivery vectors for gene therapy.,Pharmaceutical Research,19巻,1599〜1605頁）。
【００９４】
合成の化学ベクターも安定であり、化学修飾が潜在的に容易であるため、送達用のビヒクルとして用いることができる。さらに、低コストの一貫した生成基準、より大きな安全性及び高い柔軟性により、これらの化合物は、やはり特に有用である(Lollo,C.P.,Banaszczyk,M.G.,及びChiou,H.C.,(2000年),Obstacles and advances in non-viral gene delivery.,Current Opinion In Molecular Therapeutics,2巻,136〜142頁)。さらに、非ウイルスの物質を様々な組合せで用いることができ、特定の治療目的を達成する上で柔軟性がもたらされる。
【００９５】
物理的な遺伝子送達方法を用いて、裸のＤＮＡを、エンドソーム及びリソゾームを迂回して細胞質に直接送達し、それゆえ酵素の分解を回避する。例えば、皮膚の遺伝子治療は、典型的には、微粒子銃又は微粒子銃の誘導を含めて、局所適用、直接注射及び電気穿孔を含めた、直接的な送達方法に関連する(Vogel,J.C.,(2000年),Nonviral skin gene therapy,Human Gene Therapy,11巻,2253〜2259頁)。
【００９６】
遺伝子治療に現在使用中の１つの非ウイルスの遺伝子導入系は、裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の、局所組織中又は全身循環中への注射である(Horn,N.A.,Meek,J.A.,Budahazi,G.,及びMarquet,M.,(1995年),Cancer gene therapy using plasmid DNA:Purification of DNA for human clinical trials.,Human Gene Therapy,6巻,565〜573頁)。例えば、裸のＤＮＡ分子の形態で筋肉組織又は肝臓組織中に注射されたトランスジーンの構築物は、筋肉及び肝臓の組織によって取り込まれ、発現され得ることが報告されていた(Herweijer,H.,及びWolff,J.A.,(2003年),Progress and prospects:naked DNA gene transfer and therapy.,Gene Ther.,10巻,453〜458頁)。裸のＤＮＡの遺伝子導入系は、様々な真核生物の調節エレメントの転写の制御下で、治療用の遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドから構成されている(Hartikka,J.,Sawdey,M.,Cornefert-Jensen,F.,Margalith,M.,Barnart,Nolasco,M.ら,(1996年),An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle.,Human Gene Therapy,7巻,1205〜1217頁;Lui,V.W.,Falo,L.D.,Jr.,及びHuang,L.,Systemic production of IL-12 by naked DNA mediated gene transfer:toxicity and attenuation of transgene expression in vivo.,The Journal Of Gene Medicine,7巻,384〜393頁)。
【００９７】
裸のＤＮＡの分解は、肝臓等の体内の器官で効果的な遺伝子の導入を誘発する、大容量の注射を用いて回避することができる(Christianson,S.W.,Shultz,L.D.,及びLeiter,E.H.,(1993年),Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice.Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-la donors.,Diabetes,42巻,44〜55頁)。大容量のプラスミド含有溶液によりもたらされる物理的圧力により、ｐＤＮＡが細胞中に直接送達され、標的細胞におけるトランスジーンの発現をもたらす(Schultz,J.,Pavlovic,J.,Strack,B.,Nawrath,M.,及びMoelling,K.,(1999年),Long-lasting anti-metastatic efficiency of interleukin 12-encoding plasmid DNA.,Human Gene Therapy,10巻,407〜417頁;Blezinger,P.,Wang,J.,Gondo,M.,Quezada,A.,Mehrens,D.,French,M.ら,(1999年),Systemic inhibition of tumor growth and tumor metastases by intramuscular administration of the endostatin gene.,Nature Biotechnology,17巻,343〜348頁)。
【００９８】
インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含む、ベクター又は核酸を送達するための一様式として、エレクトロトランスファーも用いることができる。簡潔には、ｐＤＮＡを、高容量の生理学的溶液で筋肉内注射し、対流による組織を介してＤＮＡを分布させる。次いで、一般的には外部の電極を用いて、電気パルスを適用する。ｉｎ ｖｉｖｏのｐＤＮＡのエレクトロトランスファーのパラメーターは、当技術分野では公知であり、本発明の方法における使用に応用できる。
【００９９】
さらに、ＤＮＡを含む溶液のジェット注射も、遺伝子を、皮膚、筋肉、脂肪及び哺乳動物の組織に導入するのに用いることができる。いくつかの噴射式注射が開発されており、空気推進系を用いてコルチコステロイド及び麻酔の溶液をヒトの皮膚中に送達するのに一般に用いられている。
【０１００】
他の遺伝子送達様式には、超音波が含まれる。治療用の超音波は、裸のｐＤＮＡの、骨格筋及び他の組織中への形質移入の効率を増大するために、細胞膜の透過化を誘発する。例えば、超音波造影剤である、Ｏｐｔｉｓｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）は、ガスを充填したヒトアルブミン微粒子を含んでおり、これをプラスミドと混合することによりＤＮＡで充填することができる。Ｏｐｔｉｓｏｎは、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで裸のｐＤＮＡの形質移入の有効性を増強することができる(T Taniyama,Y.,Tachibana,K.,Hiraoka,K.,Aoki,M.,Yamamoto,S.,Matsumoto K.ら,(2002年),Development of safe and efficient novel nonviral gene transfer using ultrasound:Enhancement of transfection efficiency of naked plasmid DNA in skeltal muscle.,Gene Therapy,9巻,372〜380頁)。さらに、微小気泡で増強した超音波と組み合わせた、裸のＤＮＡの子宮内注射は、マウス胎児における高レベルのタンパク質の発現をもたらすことが示されている(Endoh,M.,Koibuchi,N.,Sato,M.,Morishita,R.,Kanzaki,T.,Murata,Y.ら,(2002年),Fetal Gene Transfer by Intrauterine Injection with Microbubble-Enhanced Ultrasound.,Molecular Therapy,5巻,501〜508頁)。超音波造影剤の微小気泡は、部位特異的なリガンドの組合せにより特定の組織への遺伝子のターゲティングを増幅することができる。さらに、リポソーム等の遺伝子を持ったビヒクルを、微小気泡と同時注射することによりペイロード容積を増大することが可能である(Price,R.J.及びKaul,S.,(2002年),Contrast ultrasound targeted drug and gene delivery:An update on a new therapeutic modality.,Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics,7巻,171〜180頁)。
【０１０１】
ｐＤＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子の導入は、全身投与した場合、分解から守るために、リポソーム又は陽イオンのポリマー等の送達系を使用することができる。ポリカチオンを添加すると、ｐＤＮＡ分子の陰イオンの電荷の静電気的に中和となり、ポリヌクレオチド構造が凝縮され、したがってヌクレアーゼの消化から保護される。ｐＤＮＡ及び陽イオンの両親媒性物質は、様々な比率で配合して、多様なサイズ及び表面電荷の性質の複合体を生成することができる。さらに、正味の正の電荷を帯びている複合体は、負の電荷の細胞膜に対する結合を増強し、細胞の取り込みが増大する(Rolland,A.P.,(1998年),From genes to gene medicines:recent advances in nonviral gene delivery.,Critical Reviews In Therapeutic Drug Carrier Systems,,15巻,143〜198頁)。
【０１０２】
ＤＮＡ−陽イオン性−リポソーム複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｘ）を用いた遺伝子導入を、治療用遺伝子を送達するための方法として用いたところ、成功した。陽イオン性のｌｉｐｏｐｌｅｘｅｘは、生成するのが日常的に容易であり、安価である。これは、非毒性で非免疫原性の材料でできており、大型のポリヌクレオチドを体細胞中に送達することができる。さらに、これらの試薬を、実験室で容易に操作して新規な生物学的機能を組み入れるか、又はｉｎ ｖｉｖｏの活性に対してスクリーニングすることができる新規な製剤を生成する。さらに、リポソームが媒介する遺伝子導入は、いかなる抗ウイルス性の免疫反応も生成せず、送達された遺伝子の組込み頻度は低く、一般的に形質導入された細胞では複製しないので、腫瘍原性の突然変異を生成する危険性はほとんどない。粒子又はリポソームの安定化により、一般的に生体適合性は増大し、免疫反応は低減し、ｉｎ ｖｉｖｏの安定性は増大し、循環からの消失は遅くなる。
【０１０３】
コラーゲン、乳酸若しくはグリコール酸又はポリ無水物を用いたポリマーベース系は、治療用の遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで送達するための他の態様である。第１に、ポリマー内のｐＤＮＡ分子は、それらが標的細胞中に放出されるまで、循環系における分解に対して保護され得る。第２に、特定の細胞型又は組織を標的にするために、身体中へのポリマーの注射又は埋め込みを容易に操作することができる。例えば、Ｔ細胞に対する抗ＣＤ３及び抗ＣＤ５抗体等の細胞ターゲティングリガンド又はいくつかの癌細胞に対するトランスフェリンを用いて、遺伝子の担体を修飾することにより遺伝子導入のターゲティングを達成することができる(Gijsens,A.,Derycke,A.,Missiaen,L.,De Vos,D.,Huwyler,J.,Eberle,A.ら,(2002年),Targeting of the photocytotoxic compound APIcS4 to Hela cells by transferring conjugated PEG-liposomes.,International Journal of Cancer,101巻,78〜85頁;Hofland,H.E.J.,Masson,C.,Iginla,S.,Ostetinsky,J.,Reddy,J.A.,Leamon,C.P.ら,(2002年),Folate-Targeted Gene Transfer in Vivo.,Molecular Therapy,5巻,739〜744頁;Bohl,K.E.,Bergstrand,N.,Carlsson,J.,Edwards,K.,Johnson,M.,Sjoberg,S.ら,(2002年),Development of EGF-conjugated liposomes for targeted delivery of boronated DNA-binding agents.,Bioconjug.Chem.,13巻,737〜743頁)。さらに、葉酸と複合した陽イオン−リポソームベースの形質移入複合体は、葉酸−受容体−発現性細胞及び腫瘍に特異的に形質移入することが示されており、これは腹腔内の癌に対する潜在的な治療法であることを示唆している(Reddy,J.A.,Abburi,C.,Hofland,H.,Howard,S.J.,Vlahov,I.,Wils,P.ら,(2002年),Folate-targeted,cationic liposome-mediated gene transfer into disseminated peritoneal tumors.,Gene Therapy,9巻,1542〜1550頁)。
【０１０４】
形質導入のターゲティングは、治療用の遺伝子置換療法のためにｉｎ ｖｉｖｏで用いることができる送達の一態様である。例えば、ウイルスのベクターを用いて組織又は細胞型を特異的に標的にすることができるか、又はウイルスのベクターを用いて、用いられるウイルス及びその宿主細胞の特異性に応じて、遺伝子を広範囲の細胞型中に幅広く導入することができる。この点に関しては、組換えのＡＡＶベクターは、広範囲の標的細胞中にトランスジーンを導入できるようにするので、遺伝子治療の適用において有益である。特定の細胞集団に対するウイルスのベクターの効率及び特異性が増大すれば、投与すべきウイルス負荷量が低減されることにより、遺伝子治療の安全性が増強する。組織のターゲティング（形質導入のターゲティング）を達成するために細胞の向性を決定する上で重要な役割を果たしている、ベクターのカプシドの修飾も本発明の方法に適用できる。シュードタイピング、特定の受容体結合性の性質のある分子アダプターとカプシドの複合及び遺伝子の向性のターゲティング等、遺伝子移入ベクターの細胞の向性を修飾する方法がいくつかある。
【０１０５】
特異的なウイルス受容体の相互作用の事前の知識をほとんど必要としない、形質導入のリターゲティングの一形態は、シュードタイピングである。シュードタイピングは、あるウイルスの血清型からのカプシドを、他のウイルスの血清型由来のもので置換することを含む。シュードタイピングは、選択的なレトロウイルス及び選択的なキメラのアデノウイルスベクターを生成するのに用いられている(Somia,N.及びVerma,J.M.、(2000年)、Gene therapy:trials and tribulations.、Nat.Rev.Genet.、1巻、91〜99頁)。さらに、ＡＡＶ２の逆方向末端反復が隣接しているＡＡＶベクターのゲノムも、様々な血清型のカプシドに上首尾にクロスパッケージングされ、様々な特異性のシュードタイプのポートフォリオを作製している(Rabinowitz,J.E.,Rolling,F.,Li,C.,Conrath,H.,Xiao,W.,Xiao,X.ら,(2002年),Cross-packaging of a single adeno-associated virus(AAV)type2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.,J.Virol.,76巻,791〜801頁;Grimm,D.,及びKay,M.A.,(2003年),From virus evolution to vector revolution:use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus(AAV) as novel vectors for human gene therapy.,Curr.GeneTher.,3巻,281〜304頁;Gao,G.P.,Alvira,M.R.,Wang,L.,Calcedo,R.,Johnston,J.,及びWilson,J.M.,(2002年),Novel adeno-associated viruses from rhesus monkey as vectors for human gene therapy.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,99巻,11854〜11859頁)。
【０１０６】
特定の受容体結合性の特徴がある分子アダプターとウイルスのカプシドの複合をやはり用いて、インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを含むベクターを送達することができる。別々の細胞の集団にベクターのカプシドをターゲティングするための第２の方法は、特定の受容体結合性の特徴を含む分子アダプターとカプシドを複合することであった。この取組みを用いて、アデノウイルス(Douglas,J.T.,Miller,C.R.,Kim,M.,Dmitriev,J.,Mikneeva,G.,Krasnykh,V.ら,(1999年),A system for the propagation of adenoviral vectors with genetically modified receptor specificities.,Nat.Biotechnol.,17巻,470〜475頁),レトロウイルス(Snitkovsky,S.,及びYoung,J.A.,(2002年),Targeting retroviral vector infection to cells that express heregulin receptors using a TVA-heregulin bridge protein.,Virology,292巻,150〜155頁)及びＡＡＶベクター(Ponnazhagan,S.,Mahendra,G.,Kumar,S.,Thompson,J.A.,及びCastilas,M.,Jr.,(2002年),Conjugate-based targeting of recombinant adeno-associated virus type2 vectors by using avidin-linked ligands.,J.Virol.,76巻,12900〜12907頁)を用いた様々な培養した細胞型の形質導入を増強している。
【０１０７】
インシュリンをコードする核酸に作動的に連結している本発明のプロモーターを投与するための第３の取組みは、組換えのベクターの通常の受容体の結合能力をなくすか又はカプシド構造中に代替の受容体を結合するための小型のペプチドリガンドを組み入れるようにカプシド遺伝子を遺伝子操作することである。形質導入のリターゲティングのためのこの遺伝的な取組みは、いくつかの試験においてアデノウイルスベクターの指向性を校正する点で成功している(Hidaka,C.,Milano,E.,Leopold,P.L.,Bergelson,J.M.,Hackett,N.R.,Finberg.R.W.ら,(1999年),CAR-dependent and CAR-independet pathways of adenovirus vector-mediated gene transfer and expression in human fibroblasts.,J.Clin.Invest,103巻,579〜587頁)。
【０１０８】
転写のターゲティングは、治療用の遺伝子を選択的に送達するための他の態様である。本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターは、肝臓に対する発現の転写のターゲティングを例示する。
【０１０９】
本明細書に記載したような、強力な真核細胞のプロモーターの使用を、例えば、強力なウイルスのプロモーターの使用に比べて、ｉｎ ｖｉｖｏで長期間発現させるために用いることができる(Verma,M.,(2003年),Viral genes and methylation.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,983巻,170〜180頁)。細胞選択的な真核細胞のプロモーターを用いると、トランスジーンの特異的な発現の他の利点がもたらされる。
【０１１０】
プロモーターの構造及びデザインの考察に関する手引きは、さらに下記に記載されており、例えば、コアプロモーター構造、転写因子及びプロモーターの合理的なデザインが含まれる。この手引きは、デザイン及び本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターの使用に応用できる。
【０１１１】
簡潔には、真核細胞の遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）の活性及び全ての真核細胞の遺伝子に見出されるコアプロモーターエレメントに補強される基本的な転写因子により、概ね制御されている(Orphanides,G.,及びReinberg,D.,(2002年),A unified theory of gene expression.,Cell,108巻,439〜451頁)。ＲＮＡＰＩＩ並びにＴＦＩＩＢ及びＴＦＩＩＤ等の基本的な転写因子は、転写開始部位に対して−３５から＋３５ｂｐの領域に及ぶコアプロモーターで、いくつかの調節エレメント上に組み立てられる(Roeder,R.G.,(1996年),The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II.,TransBiochem.Sci.,21巻,327〜335頁)。調節エレメントとしては、ＴＡＴＡボックス含有プロモーターにおけるＴＡＴＡボックス及びＴＦＩＩＢ認識エレメント（ＢＲＥ）を含むが、イニシエーター及び下流の結合性エレメント（ＤＢＥ）はＴＡＴＡレスプロモーターに位置する。
【０１１２】
ＴＡＴＡボックスは、一般的に、真核生物の遺伝子の多くの調節領域における、−２５ｂｐに位置するが、多くのハウスキーピング遺伝子のプロモーターには特に存在しない(Smale,S.T.,(1997年),Transcription initiation from TATA-less promoters within eukaryotic protein-coding genes.,Biochim.Biophys.Acta.,1351巻,73〜88頁)。イニシエーター（Ｉｎｒ）は、一般的に、−３から＋５ｂｐにおける転写開始部位上に位置しており、ＴＡＴＡボックスの非存在下で転写を支援することができるか、又は共に存在する場合はそれと相乗作用をする(Martinez,E.,Zhou,Q.,L'Etoile,N.D.,Oelgeschlager,T.,Berk,A.J.,及びRoeder R.G.,(1995年),Core promoter-specific fuction of a mutant transcription factor TFIID defective in TATA-box binding.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92巻,11864〜11868頁)。ＤＰＥは約＋３０ｂｐにも見出され、ＴＡＴＡレスプロモーターにおいてＴＡＴＡボックスに対する代替として働くと考えられる。プロモーター結合したＴＦＩＩＤとＲＮＡＰＩＩとの間の架橋をもたらす上で役割を果たすＢＲＥは、ＴＡＴＡボックスの上流に位置する(Littlefield,O.,Korkhin,Y.,及びSigler,P.B.,(1999年),The structural basis for the oriented assembly of a TBP/TFB/promoter complex.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96巻,13668〜13673頁)。
【０１１３】
これらのモチーフによりＲＮＡＰＩＩをプロモーターを増強し、それゆえ開始部位で転写を開始するための前開始複合体（ＰＩＣ）を形成するのに、転写に関与する多くの基本的な転写因子を用いる(Cornetta,K.,Morgan,R.A.,Gillio,A.,Sturm,S.,Baltrcki,L.,O'Reily,R.ら,(1991年),No retroviremia or pathology in long-term follow-up of monkeys exposed to a murine amphotropic retrovirus.,Hum.GeneTher.,2巻,215〜219頁)。ＰＩＣにおける転写因子には、基本的な転写機構における細胞型特異的な成分が含まれる(Albright,S.R.,及びTjian,R.,(2000年),TAFs revisited:more data reveal new twists and confirm old ideas.,Gene,242巻,1〜13頁;Freiman,R.N.,Albright,S.R.,Zheng,S.,Sha,W.C.,Hammer,R.E.,及びTjian,R.,(2001年),Requirement of tissue-selective TBP-associated factor TAFII105 in ovarian development.,Science,293巻,2084〜2087頁)。さらに、組換えの転写因子／基本的な因子の相互作用により組織特異性をさらに増大するために、組織特異的な基本的な成分も用いることができる(Holmes,M.C.,及びTjian,R.,(2000年),Promoter-selective properties of the TBP-related factor TRF1.,Science,288巻,867〜870頁;Rabenstein,M.D.,Zhou,S.,Lis,J.T.,及びTjian,R.,(1999年),TATA box-binding protein(TBP)-related factor2(TRF2),a third member of the TBP family.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96巻,4791〜4796頁;Yamit-Hezi,A.,及びDikstein,R.,(1998年),TAFII105 mediates activation of antiapoptotic genes by NF-kappaB.,EMBO J.,17巻,5161〜5169頁)。
【０１１４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写の基本的なレベルを生成するには基本的な機構が必要であるが、他のシス作用性の調節因子とのその相互作用により、他のレベルの制御がもたらされる。これらのシスエレメントは、状況に応じて、遺伝子発現のトランスアクチベーター又はトランスリプレッサーとして作用する遺伝子特異的、刺激特異的又は組織特異的な転写因子によって認識される。
【０１１５】
転写因子は、一般的に、基本的な因子と転写因子との間のメディエーターとして働く共調節因子により、基本的な機構の活性を制御する(Glass,C.K.,及びRosenfeld,M.G.,(2000年),The coregulator exhange in transcriptional functions of nuclear receptors.,Genes Dev.,14巻,121〜141頁;Lemon,B.,及びTjian,R.,(2000年),Orchestrated response:a symphony of transcription factors for gene control.,Genes Dev.,14巻,2551〜2569頁)。これらの共調節因子は、プロモーター特異的及び組織特異的な遺伝子の発現がおこる上で重要な機能を果たしており、本発明のプロモーターの組織特異性をさらに高めるのに用いることができる。これらは、それにより細胞が転写の包括的なネットワークに影響を及ぼし、様々な刺激に反応し、かつ発達の様々な段階で遺伝子の発現を調整することができる手段でもある(Lemon,B.,及びTjian,R.,(2000年),Orchestrated response:a symphony of transcription factors for gene control.,Genes Dev.,14巻,2551〜2569頁)。したがって、これらの因子に結合する短いシスエレメントは、グルコース反応性のエレメントの下で異種性のトランスジーンの発現を標的にし、制御するためのプロモーターの、ある範囲の選択及びデザインを提供し、特異的な標的又は反応を達成するために発現を修飾するのに特に有用である。転写因子の結合部位は、転写開始部位の上流又は下流のいずれかに位置する。これらのエレメントに結合している転写因子は、活性化されている間に介在性のＤＮＡのルーピングによりプロモーターと近接するようになる。
【０１１６】
転写のターゲティングのための合理的なデザインのプロモーターを使用して、本発明の組織特異的グルコース反応性プロモーターを生成することもまたできる。この点、ｄｅ ｎｏｖｏの合成プロモーターを生成するために、転写のメカニズムの総合的な理解は必要条件ではない。実施例Ｉに記載するようなプロモーター構築物の機能的なスクリーニングを用いて、望ましい活性を含む様々なエレメントの最適な組合せを同定することができ、これをランダムに短い長さで合成することができるか、又は様々なシスエレメントのランダムな組合せにより複合性のプロモーターに生成することができる(Edelman,G.M.,Meech,R.,Owens,G.C.,及びJones,F.S.,(2000年),Synthetic promoter elements obtained by nucleotide sequence variation and selection for activity.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97巻,3038〜3043頁;Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,及びDraghia-Akli,R.,(1999年),Synthetic muscle promoters:activities exceeding naturally occurrng regulatory sequences.,Nat.Biotechnol.,17巻,241〜245頁)。
【０１１７】
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も、本明細書で提供された本発明の定義内に含まれることが理解される。したがって、以下の実施例は、本発明を例示し、本発明を制限するものではないことを目的とする。
【実施例】
【０１１８】
１型糖尿病の治療のためのインシュリンの遺伝子治療
本実施例は、多部分に分かれているグルコース反応性プロモーターの生成及び選択、並びに、調節されたインシュリンレベルを糖尿病動物に送達するためのその使用を示す。
【０１１９】
最初にシスエレメントのモジュールを３コピー生成することにより、合成プロモーターのライブラリーを構築した。モジュールは、肝細胞核因子−１（ＨＮＦ−１）、ＣＡＡＴ／エンハンサー結合性タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）反応性エレメント及びグルコース反応性エレメント（ＧＲＥ）に対する転写因子結合性シスエレメントを、全ての可能な組合せで３コピー含んでいた。以下に記載するように、この組合せを、図１Ｂに示すような３つの制限酵素部位における各シスエレメントの配列の挿入により生成した。これらの３コピーのモジュールを、図２に示すように、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃを生成するためにｐＬＰＫ（−９６／＋１２）−Ｌｕｃプラスミドに移した。さらに、３コピーのモジュールを、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミド中に挿入することにより、６コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。
【０１２０】
簡潔には、プロモーターを内部に持つプラスミドを構築するために、ｐＧＬ３−エンハンサープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州、米国）のオリジナルのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を、配列にＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ部位を含む新しいＭＣＳで置換し、ｐＧＬ３Ｅ−Ｎｅｗプラスミドを生成した（図１Ａ）。ＰＣＲ増幅したＬＰＫプロモーター領域（転写開始部位に対して−３２００ｂｐ／＋１２ｂｐ）のＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、オンタリオ州、カナダ）中への直接挿入を用いて、ｐＬＰＫ−ＴＡプラスミドを構築した。２．５ｋｂｐのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＬＰＫプロモーターのフラグメントを、ｐＬＰＫ−ＴＡプラスミドから除去し、次いで、ｐＧＬ３−エンハンサーの同じ部位中にクローニングし、プロモーターアッセイで陽性対照として用いたｐＬＰＫ−ｌｕｃプラスミドを生成した。１０８ｂｐのＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＬＰＫプロモーターのフラグメント（転写開始部位に対して−９６ｂｐ／＋１２ｂｐ）をｐＬＰＫ−ＴＡから除去し、ｐＧＬ３Ｅ−ＮｅｗＭＣＳプラスミドの同じ部位中に挿入して、本試験で生成された全ての合成プロモーターの基本的なプロモーターとして用い、図１Ｂに示したｐＬＰＫ（−９６／＋１２）−ｌｕｃプラスミドを生成した。ｐＧＥ３−エンハンサーのＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌ部位におけるルシフェラーゼ遺伝子を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、オンタリオ州、カナダ）から購入したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏプラスミドの同じ部位に移すことにより、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。
【０１２１】
個々のシスエレメントのランダムの配列を生成するために、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃの２７個の異なるプラスミド全てを、１０μｇの量で混合した。さらに、３コピーのＳＰ−Ｄ３プラスミドから切り取った３コピーのモジュールを一緒に混合し、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃの同じ酵素で切断した混合物で連結し、６コピーのＳＰ−Ｌｕｃを生成した。６つのシスエレメントの可能な組合せの数（３）をカバーするために、我々は６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃ及びＳＰＸＮ−Ｌｕｃプラスミド両方から３００個を超えるクローンを単離した。
【０１２２】
合成プロモーターライブラリーを生成するために、各々のリン酸化した対照のエレメントに対して、２つの相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、アニールして短いＤＮＡフラグメントを生成した。オリゴヌクレオチド配列は以下のＨＮＦ−１（センス）５’−ＣＴＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴ−３’（配列番号１）；ＨＮＦ−１（アンチセンス）５’−ＣＴＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴ−３’（配列番号４）；Ｃ／ＥＢＰ（センス）５’−ＴＣＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＧ−３’（配列番号２）；Ｃ／ＥＢＰ（アンチセンス）５’−ＴＣＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＧ−３’（配列番号５）；グルコース反応性エレメント（センス）５’−ＧＧＧＣＧＣＡＣＧＧＧＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡ−３’（配列番号３）、グルコース反応性エレメント（アンチセンス）５’−ＴＡＣＡＣＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＧＴＧＣＧＣＣＣ−３’（配列番号６）であった。合成のフラグメントは全て、合成プロモーターのライブラリーを生成するために、オリゴヌクレオチドの両終端で、特異的な制限酵素付着末端で合成した。導入した制限酵素部位は以下のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩであった。
【０１２３】
２つの相補的なオリゴヌクレオチド（各１００ｐｍｏｌ）を、２０ｕｌのアニーリング溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で混合し、９０℃で５分間インキュベートし、室温までゆっくりと放冷した。アニールしたオリゴヌクレオチドのフラグメントを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB、Beverly、マサチューセッツ州、米国）を用いて５０ｕｌの反応混合液（７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ）で、３７℃で３０分間リン酸化し、その後、７０℃で１０分間、熱不活化した。アニール／リン酸化したＤＮＡフラグメントを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出により精製し、次いで、合成プロモーターライブラリーを生成するために用いた。
【０１２４】
最初に、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩの付着末端を含む３つのシスエレメント各々を、同じ酵素で消化したｐｃＤＮＡ３−ＮｅｗＭＣＳプラスミド中にクローニングし、１コピーのＳＰ−Ｄ３プラスミドを生成し、ここで他の３つのシスエレメントのフラグメントを、配列におけるＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ部位中にクローニングして３コピーのＳＰ−Ｄ３プラスミドを生成した（図１）。合成プロモーター−レポータープラスミドを生成するために、３コピーのＳＰ−Ｄ３プラスミドからのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡフラグメント（３コピーのモジュール）をｐＧＬ３Ｅ−ＮｅｗＭＣＳの同じ部位中にサブクローニングし、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成した（図２Ｂ）。
【０１２５】
６コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成するために、３コピーのＳＰ−Ｄ３の各々１０ｕｇを混合し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ又はＸｈｏＩ／ＮｈｅＩのいずれかで消化し、その後３コピーのモジュールをゲル抽出した。同時に、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミド全てを同じ方法で混合し、同じ酵素のセットで消化した。溶出した３コピーのモジュールを、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ又はＸｈｏＩ／ＮｈｅＩで消化した３コピーのＳＰ−Ｌｕｃのプール中にサブクローニングし、先に挿入した３コピーのモジュールと同方向（６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃ）又は反対方向（６コピーのＸＰＸＥ−Ｌｕｃ）における合成プロモーターのライブラリーを６コピー生成した（図２Ｂ）。６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃ又は６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃプラスミドを含む形質転換体を培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Quiagen、Missisauga、オンタリオ州、カナダ）を用いてプラスミドを調製するために回収した。転写活性の高い合成プロモーターのためのスクリーニングをした後、３コピーのＳＰ−Ｄ３からの他の３コピーの合成プロモーターのフラグメントを、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ部位の部位で選択された６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃ中に挿入して、９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。
【０１２６】
合成プロモーターのライブラリーのスクリーニングを、以下に記載するように行った。最初に、高い転写活性についてスクリーニングされるべき多数のクローンに、代表的な数の様々なプロモーターの組合せを評価するために、実際的な目標を設定した。この問題を解決するために、時間及び労力を要する精製工程を必要とする高品質のプラスミドの代わりに低品質のプラスミドを用いた。低品質のプラスミドの転写効率は、高品質のプラスミドの約１０％であったが、低品質及び高品質両方のプラスミドのプロモーター活性は類似することが見出され、低品質プラスミドの結果は、高品質のプラスミドの結果を示すことを示した。その後、転写実験は全て、低品質のプラスミドを用いた。
【０１２７】
合成プロモーターを最初にスクリーニングするための形質移入実験で用いたプラスミドは全て、製造元の指示にしたがってＱｉａｇｅｎからのｍｉｎｉｐｒｅｐキットを用いて調製した。Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Qiagen、Missisauga、オンタリオ州、カナダ）を用いて、ｍｉｎｉｐｒｅｐキットからの低品質のプラスミドでの転写効率を比較するためのプラスミドを単離した。Ｈ４ＩＩＥ細胞を、以下に記載するように培養した。形質移入１日前に、細胞を９６ウェルのプレート中に、５０００細胞／ウェルの数で接種した。細胞に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｐｌｕｓ試薬（Invitrogen、Burlington、オンタリオ州、カナダ）を用いて、製造元の指示にしたがい１５０ｎｇプラスミド／ウェルで形質移入し、形質移入２４時間後に回収した。Ｇｌｏ Ｌｙｓｉｓバッファー（Promega、Madison、ウィスコンシン州、米国）で細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ系（Promega、Madison、ウィスコンシン州、米国）を用いて測定した。アッセイは、少なくとも２つの異なるラウンドの形質移入で４回行った。
【０１２８】
３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの転写活性を、ラット肝細胞腫細胞系を用いた合成プロモーターのスクリーニングの最初の工程として試験した。結果を図３Ａに示す。コントロールとして、標的遺伝子の強力な偏在性の発現を駆動するＣＭＶプロモーターを用いた。さらに、天然に存在する肝臓に特異的なグルコース反応性のプロモーターであるＬＰＫプロモーターを、天然に存在するプロモーターに対するコントロールとして用いた。ほとんどの３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの活性は、ＣＭＶプロモーターの活性の２〜５％で、ＬＰＫプロモーターの活性に匹敵した。多量体化した単一のエレメントのみからなるプロモーターの活性はＬＰＫプロモーターよりも低く（図３Ａ）、これは以前の報告と一致する(Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,及びDraghia-Akli,R.,(1999年),Synthetic muscle promoters:activities exceeding naturally occurrng regulatory sequences.,Nat.Biotechnol.,17巻,241〜245頁)。
【０１２９】
６コピーのＳＰ−Ｌｕｃの転写活性及びエレメントの配向の効果を調べるために、他の３コピーのモジュールを先に構築した３コピーのモジュールと同じ又は反対の方向で３コピーのＳＰ−Ｌｕｃ中に組み入れた（図２Ｂ）。ＸＥ及びＸＮからの３００を超えるクローンを、その転写活性について試験した。図５Ａ及びＢに示すように、両グループからの転写活性の分布に著しい相違は見出されなかった。これらの結果は、合成プロモーターにおける転写活性に関して、エレメントの組合せにおける方向はあまり重要でないことを示している。両グループでは、ほとんどの転写活性は、ＣＭＶプロモーター活性の６％未満であった。しかし、両グループからの同じ合成プロモーターは、ＬＰＫプロモーターの活性よりも２倍を超える活性を、また、ＣＭＶプロモーター活性の８％を超える活性を示した。強力な転写活性に対して何らかのパターンが存在するか否かを決定するために、６コピーのＳＰ（ＸＥ）−ＬｕｃグループからのＣＭＶプロモーター活性の８％を超えて示した、選択された６コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの配列を決定した。結果を図４Ａに示し、結果は、個々の合成プロモーター間のエレメントの順番に類似性はなく、シスエレメントの組成に共通のパターンを見出すことができなかったことを示している。
【０１３０】
３コピーのモジュールを加えることによる、合成プロモーターの転写活性の増強も試験した。他のモジュールを、選択された６コピーのＳＰＸＥ−ＬｕｃプラスミドのＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ部位に挿入した。ＣＭＶプロモーター活性の８％を超える、６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃプラスミドからの全部で１７個の合成プロモーターを、シスエレメントをさらに伸長するために選択し、図４Ｂに示すように９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。他の３コピーのモジュールの付加に起因する可能な組合せ全てをカバーするために、９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの４０個を超えるクローンを、個々の６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃプラスミドから生成した。
【０１３１】
９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの転写活性の分布を図５に示す。９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの全体の活性は、オリジナルの６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃプラスミドよりも相対的に高かった。これらの活性の大部分は、ＣＭＶプロモーター活性の１２％未満であった（図５Ｃ）。しかし、かなりの数のクローンが、６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃプラスミドを超える、ＣＭＶプロモーター活性の１２％を超えて示したことは注目に値し、シスエレメントの数が増加すると転写活性に正の効果があったことを示していた。さらに、同じクローンが、ＬＰＫプロモーター活性を７倍超えるに等しい、ＣＭＶプロモーター活性の２５％を超えて示した。これら合成プロモーターにおけるシスエレメントの組成を試験し、図４Ｂに示した。合成プロモーター間でシスエレメントの順番に、類似性は観察されなかった。
【０１３２】
ｉｎ ｖｉｖｏで合成プロモーターの活性を調査するために、選択された９コピーの合成プロモーターの制御下でインシュリン遺伝子を発現する組換えのアデノウイルスを生成した。我々は、ＣＭＶプロモーター活性の３０％を超えて示したＳＰ２３１３７、ＳＰ２３１４２及び７３２５を選択した。これらの実験では、偏在性かつ強力なウイルスのプロモーターのコントロールとしてＣＭＶの調節領域を用いた。標的器官は肝臓であったため、合成後に成熟インシュリンにプロセシングされ得る、フューリン切断可能なプロインシュリンを用いた。
【０１３３】
簡潔には、製造元の指示にしたがってＴｒａｎｓｐｏｓｅ−ＡＤ（登録商標）アデノウイルスベクター系（Qbiogene、Carlsbad、カリフォルニア州）を用いて、組換えのアデノウイルスを構築した。フューリン切断可能なラットインシュリンのｃＤＮＡ（ｒＩＮＳｆｕｒ）を、ラットインシュリン遺伝子を、Ｂ鎖及びＣペプチド接合部にフューリン切断可能な部位と共に含むＶＲ３５０３プラスミドから得た(Abai,A.M.,Hobart,P.M.,及びBarnhart,K.M.,(1999年),Insulin delivery with plasmid DNA.,Hum.GeneTher.,10巻,2637〜2649頁)。ｒＩＮＳｆｕｒのＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ部位で消化し、ｐＣＲ２７６アデノウイルスの導入プラスミド中にクローニングし、合成プロモーターを含むアデノウイルスのベクターをさらに構築するためのバックボーンとして用いるｐＣＲ２７６−ｒＩＮＳｆｕｒを生成した。トランスジーンの発現を駆動するためのＣＭＶプロモーターがあるｐＣＲ２５９アデノウイルスの導入ベクター中にｐＣＲ２７６−ｒＩＮＳｆｕｒからのｒＩＮＳｆｕｒ領域を挿入することにより、ｐＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒを生成した。
【０１３４】
合成プロモーター、フューリン切断可能なラットインシュリンのｃＤＮＡ、ポリ−Ａ領域及びＳＶ４０エンハンサーを含むＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒのＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化したフラグメントを、ＰＣＲ２７６導入ベクターの同じ部位でクローニングし、ＰＣＲ２７６−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミドを生成した。得られたプラスミドを、化学的にコンピテントなＨｉｇｈ−Ｑ Ｔｒａｎｓｐｏｓｅ−ＡＤ（登録商標）２９４細胞に形質転換し、そこで組換えのアデノウイルスからのトランスジーンの転位がベクターをＴｒａｎｓｐｏｓｅ−２９４プラスミドに導入し、ｐＡＤ−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミドを生成した。ｐＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミドを、同じ方法でｐＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒから生成した。アデノウイルスの導入ベクターからｐＡＤ−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミドを分離し、増幅するために、遺伝子転位で生じた白色コロニーから抽出したＤＮＡを、化学的にコンピテントなＨｉｇｈＡ−１ＴＭ細胞中に再形質転換する。分離したｐＡＤ−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミドを、次いで、ＨＥＫ２９３細胞中に精製して入れ、合成プロモーターの制御下でインシュリン遺伝子を発現する組換えのアデノウイルス（ｒＡｄ−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒ）を生成した。ｒＡＤ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、同じ方法で生成した。組換えのウイルスをＨＥＫ２９３細胞で大規模に増幅し、二重のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により精製し、アデノウイルス希釈バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０，２ｍＭ ＭｇＣｌ2、４％ショ糖）に対して透析した。透析したウイルスを、貯蔵のため−８０℃に維持した。ウイルスの力価を、２６０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定することにより決定した。
【０１３５】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、クエン酸バッファーｐＨ４．０中１４０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で腹腔内注射によりストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与し、引き続きウイルス投与を行った。血中グルコースを４００ｍｇ／ｄＬまで上昇させ、連続３日間継続した後、組換えのアデノウイルスを尾静脈から静脈投与した。尾静脈血及びＯｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  Ｐｒｏｆｉｌｅポータブル血中グルコースモニター（Lifescan、Milpitas、カリフォルニア州）を用いて、グルコースオキシダーゼ法により血中グルコースを測定した。
【０１３６】
ＣＭＶプロモーターを用いてインシュリン遺伝子の発現を誘導する制御されない強力なプロモーターの効果を最初に試験した。ＣＭＶプロモーター（ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ）の制御下でインシュリンタンパク質を生成することができる組換えのアデノウイルスを上記のように生成した。このウイルスを、５×１０10（ｎ＝５）、１０10（ｎ＝６）、５×１０9（ｎ＝４）及び１０9（ｎ＝４）個のウイルス粒子の力価で、ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス中に尾静脈から静脈投与した。図６に示すように、最高力価のｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒで治療した動物は、治療後２日以内に死亡した。より力価が低いウイルスで治療したマウスは、より力価の高いウイルスで治療したマウスよりも長く生存したが、最終的には全てのマウスが血中グルコースレベルの低下により死亡した。図６に示すように全動物が死亡前に重症の低血糖症に罹患し、血中グルコースレベルは２０ｍｇ／ｄｌ未満に低下していた。
【０１３７】
ラット肝細胞腫細胞系を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのプロモーターアッセイから選択した９コピーの合成プロモーターのｉｎ ｖｉｖｏの活性も試験した。合成プロモーターの投与量効果を、ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒを、５×１０10（ｎ＝５）、１０10（ｎ＝６）及び５×１０9（ｎ＝６）個のウイルス粒子の様々な投与量で投与することにより試験した。最高の投与量で治療した動物は、数日以内に血中グルコースレベルが正常範囲まで非常に速やかに低下したが、１０10個のウイルス粒子で治療した動物は、血中グルコース濃度が比較的ゆっくりと低下した（図７）。血中グルコースレベルが正常範囲に到達した後、１０10個のウイルス粒子で治療したマウスでは正常血糖が最高１ヶ月維持され、５×１０10個のウイルス粒子で治療したマウスでは１ヶ月以上維持された。５×１０9個のウイルス粒子のｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒで治療した動物は、より高投与量のウイルスで治療したマウスに比べて血中グルコースレベルは中程度の低減を示し、この力価のウイルスからのインシュリンの量は、高い血中グルコースレベルを正常範囲までに低下させるのに十分ではなかったことを示していた。図７に示すように、ｒＡＤ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物は、ｒＡＤ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒで治療した動物とは対照的に、有害な低血糖症状も何も示さなかった。５×１０10個のウイルス粒子で治療したマウスでは血中グルコースレベルが早期に比較的低いことが観察されたが、動物は死ななかった。
【０１３８】
最初の６コピーのモジュールに対しては同じシスエレメントがあり、後の３コピーのモジュールでは異なるエレメントがある、図４Ｂに示す、選択された合成プロモーターであるＳＰ２３１３７とＳＰ２３１４２の転写活性の相違も試験した。インシュリン遺伝子の発現に対してＳＰ２３１３７を含む組換えのアデノウイルスを生成し、ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス中に１０個のウイルス粒子の力価で尾静脈から静脈投与した。図８に示すように、治療した動物は１週間以内に正常の血中グルコースレベルを示し、ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒ治療した動物同様、最高一ヶ月正常血糖を保った。ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒ治療した動物と、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療した動物に、著しい相違はなかった。
【０１３９】
ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕ又はｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒのいずれかで治療した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス全てが、ウイルス治療１ヶ月後に高血糖の再発を示した。この結果は、ＥＩＡ遺伝子のみ欠損する第１世代のアデノウイルスからの一過性の遺伝子発現の出現により説明することができる。そこで、アデノウイルスのゲノムの存在を、ウイルス投与１０、２５及び５０日後に試験した。肝臓を、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕ治療したＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスから得、ゲノムのＤＮＡを単離し、アデノウイルスゲノムにおけるラットインシュリン遺伝子に特異的なプライマーでＰＣＲ増幅を行った。
【０１４０】
簡潔には、ウイルス投与１０、２５及び５０日後にｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療したＮＯＤ−ｓｉｃｄマウスの肝臓から、製造元の指示にしたがってＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（Qiagen、Missisauga、オンタリオ州、カナダ）で、ＤＮＡを精製した。陽性対照として、ｒＡＤ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ及びｐＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ（ラットインシュリン遺伝子を含むアデノウイルスの導入ベクター）治療動物の肝臓からのＤＮＡを用いた。ラットインシュリン遺伝子に特異的なプライマーで、上記したのと同じ条件で、１００ｎｇの各ＤＮＡでＰＣＲを行った。用いた上流及び下流のプライマーは以下のセンス、ＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧ（配列番号１７）：アンチセンス、ＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号１８）であった。増幅後、生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色により検出した。
【０１４１】
１０日目及び２５日目に明確なバンドが観察され、一方、動物が高血糖状態の再発を示した５０日目に非常にかすかなバンドが肝臓に示された。この結果は、治療の後期に回復した高血糖状態は、肝臓の細胞でインシュリン遺伝子を発現するアデノウイルスのゲノムの数の低減に起因することを示していた。
【０１４２】
合成プロモーターのグルコース反応性も評価した。図６に示すように、インシュリン遺伝子が制御されない構成的発現は、治療した実験動物に致死的な影響をもたらし、インシュリンの遺伝子治療における転写の調節エレメントのグルコース反応性の重要性を示した。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒで治療した動物は、正常範囲内で血中グルコースレベルの制御に効果的であると思われたが、合成プロモーターのグルコース反応性を同定することは有益であった。グルコースの変化に反応するその機能を決定するために、正常の対照動物、糖尿病の対照動物及びｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物で糖負荷試験を行った。動物を１６時間絶食させた後、２００ｍＭのグルコース溶液を２ｇ／ｋｇ体重の投与量で絶食動物中に腹腔内注射した。グルコース注射前、グルコース負荷後最初の１時間の間に１５分間隔で、９０分、１２０分及び２４０分後に、マウスの尾部の尖端の小さな切り傷から血液サンプルを回収した。
【０１４３】
グルコースチャレンジ前の血中グルコースレベルは９９±２１ｍｇ／ｄｌ（正常対照マウス）、８０±２１ｍｇ／ｄｌ（ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療マウス）及び３６８±４８ｍｇ／ｄｌ（糖尿病対照マウス）であった（図９）。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒで治療した動物は、正常対照マウスよりも比較的低い血中グルコースレベルを示したが、健康であり、絶食期間後に低血糖を示さなかった。糖尿病対照マウスは、依然として血中グルコースレベルが高い状態に罹患していた。グルコースチャレンジ後、血中グルコースレベルは、３０分以内にそれぞれ、２８５±４７ｍｇ／ｄｌ（ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療マウス）、２５２±３６ｍｇ／ｄｌ（正常対照マウス）及び６２０±４８ｍｇ／ｄｌ（糖尿病対照）に上昇した。
【０１４４】
正常対照マウスでは上昇した血中グルコースレベルは、６０分以内に速やかに正常範囲内に低下したが、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物は、正常対照に比べて相対的に遅い速度で血中グルコースが低下した。治療した動物の血中グルコースレベルは、正常対照マウスよりも比較的低かったが、正常対照又はｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物では低血糖は観察されなかった。
【０１４５】
合成プロモーターによる肝臓特異的な遺伝子の発現をまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで決定した。この点に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成プロモーターの組織特異性を、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを様々な種及び組織に由来するいくつかの細胞系中に感染させることにより決定した。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを対照として用いた。個々の細胞系の供給源は以下のマウス胎児性線維芽細胞からの３Ｔ３−Ｌ１細胞系、ヒト子宮頚部からのＨｅＬａ細胞系、ラット骨格筋からのＬ６細胞系、マウス皮下結合組織からのＬ−９２９細胞系、ラット腎臓からのＮＲＫ細胞系及びラット肝臓からのＨ４ＩＩＥ細胞系であった。
【０１４６】
以下の手順を用いて、細胞系の免疫学的染色を行った。簡潔には、本試験で用いた細胞は全て、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン（２００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２／９５％湿潤空気の雰囲気で培養した。用いた細胞は以下のＬ６(Dutheil,N.,Shi,F.,Dupressoir,T.,及びLinden,R.M.,(2000年),Adeno-associated virus site-specifically integrates into a muscle-specific DNA region.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97巻,4862〜4866頁)、Ｌ９２９（マウス皮下結合組織細胞系）、３Ｔ３Ｌ１（マウス線維芽細胞細胞系）、Ｈ４ＩＩＥ（ラット肝臓腫瘍細胞系）、ＨｅＬａ（ヒト上皮細胞系）及びＮＲＫ（ラット腎臓細胞系）細胞であった。細胞を、２×１０4個／ウェルの数で、特異的にデザインされたスライド（Labtek、Nalge Nucc、Naperville、イリノイ州、米国）上に接種し、１日培養し、引き続き他の１日ウイルス感染させた。感染後、細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を用いて室温で１５分間固定し、１％トリトンＸ−１００のＰＢＳ溶液で透過処理した。非特異的な抗体の結合を、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液）を用いて１時間ブロックした。１次抗体（モルモット抗ラットインシュリン（DAKO、Carpiteria、カリフォルニア州、米国））をブロッキングバッファーで希釈し（１／２００）、１時間細胞に適用した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。２次抗体（ビオチン化抗モルモット抗体）をブロッキングバッファーで希釈し（１／３００）、細胞に１時間加えた。３回洗浄後、ＨＲＰ複合したストレプトアビジンをブロッキングバッファーで希釈し（１／３００）、細胞に１時間加え、引き続き、製造元の指示にしたがってＶｅｃｔｏｒ  ＶＩＰ（Vector laboratory）を用いて発色させた。
【０１４７】
ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスに感染させた細胞系全てでインシュリンの発現が観察された。結果を図１０に示し、ＣＭＶプロモーターの偏在的な転写活性を示しているが、ＳＰ２３１３７はＨ４ＩＩＥ細胞のみでインシュリン遺伝子の発現を誘発したことを示している（図１０Ａ）。
【０１４８】
合成プロモーターによる組織特異的な標的の遺伝子の発現も、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスモデルで試験した。ｉｎ ｖｉｖｏの活性を評価するために、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス中に投与した。偏在性の対照として、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを用いた。正常血糖に到達した時点で治療動物を屠殺した。腎臓、脾臓、肝臓、肺及び心臓等のいくつかの器官を、全ＲＮＡ抽出用に回収した。
【０１４９】
簡潔には、動物のいくつかの器官（肝臓、脾臓、肺、心臓及び腎臓）を、１０容量のＲＮＡｌａｔｅｒ ＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Qiagen、Missisauga、オンタリオ州、カナダ）に配置して−８０℃で貯蔵した。全ＲＮＡを、製造元の指示にしたがってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen、Missisauga、オンタリオ州、カナダ）を用いて単離し、−８０℃で貯蔵した。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Invitrogen、Burlington、オンタリオ州、カナダ）及びオリゴ（ｄＴ）１２〜１８（Invitrogen、Burlington、オンタリオ州、カナダ）を用い、５ｕｇの全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。ラットのインシュリンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。マウスヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を、内部標準として用いた。用いた上流及び下流のプライマーは以下のラットインシュリン、センスＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧ（配列番号１９）；ラットインシュリン、アンチセンス、ＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧ（配列番号２０）；マウスＨＰＲＴ、センスＧＴＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＣ（配列番号２１）；マウスＨＰＲＴ、アンチセンスＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＡ（配列番号２２）であった。ＰＣＲ条件を各セットのプライマーに対して最適化した。ＰＣＲ混合物(Chalkley,G.E.,及びVerrijzer,C.P.,(1999年),DNA binding site selection by RNA polymerase II TAFs:a TAF(II)250-TAF(II)150 complex recognizes the initiator.,EMBO J.,18巻,4835〜4845頁)は、各デオキシヌクレオチド三リン酸０．２ｍＭ、各々の特異的なプライマー１ｕＭ、ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ又は２ｍＭ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０及びＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）２．５Ｕを含んでいた。増幅後、生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色により検出した。
【０１５０】
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１１に示す。ラットインシュリン遺伝子の発現を、その偏在的な転写活性により、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ治療ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスからの全器官で観察することができ、それは我々のｉｎ ｖｉｔｒｏの結果と一致していた。インシュリンのｍＲＮＡはｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物からの肝臓でのみ検出することができ、合成プロモーターであるＳＰ２３１３７は肝臓特異的な転写活性があることを示していた。
【０１５１】
組織学的分析により、ｉｎ ｖｉｖｏの組織特異的な発現も評価した。血中グルコースレベルが１５０ｍｇ／ｄＬ未満に低下したとき、ウイルス治療したＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスから、肝臓、腎臓、脾臓及び膵臓を除去した。組織を除去する２時間前に、グルコース（２ｇ／ｋｇ体重）を負荷して、インシュリンの発現を増大させた。サンプルを、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、４．５μｍの切片にし、スライドガラス上に搭載した。サンプルをキシレンで処理し、１００％、９０％、８０％及び７０％のエタノールで順番に治療し、水道水で洗浄した。非特異的な抗体の結合を、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ溶液）を用いて、１時間ブロックした。１次抗体（モルモット抗ラットインシュリン（DAKO、Carpiteria、カリフォルニア州、米国））をブロッキングバッファーで希釈し（１／２００）、１時間細胞に適用した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。２次抗体（ビオチン化抗モルモット抗体）をブロッキングバッファーで希釈し（１／３００）、１時間細胞に加えた。３回洗浄後、ＨＲＰ複合したストレプトアビジンをブロッキングバッファーで希釈し（１／３００）、さらに１時間細胞に加え、引き続き、製造元の指示にしたがってＶｅｃｔｏｒ ＶＩＰ（Vector laboratory、Burlingame、カリフォルニア州、米国）を用いて発色させた。水道水で洗浄後、サンプルをＭｅｙｅｒのヘマトキシリン溶液で対比染色した。得られた結果は、合成プロモーターの転写活性は肝臓に限定されており、他の器官では観察されなかったことを示した。
【０１５２】
糖尿病動物モデルにおけるｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒの治療効果も評価した。ＳＰ２３１３７のＮＯＤマウスにおける転写活性を試験するために、３×１０10個のウイルス粒子の力価のｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、糖尿病ＮＯＤマウス中に投与した。動物は、ウイルス投与前は、５５４±４５ｍｇ／ｄｌの高い血中グルコースレベルに罹患していた。図１２に見られるように、血中グルコースレベルは、２〜３日で正常範囲に速やかに低減した。これらの結果は、ｒＡＤ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒは、免疫適格性である自己免疫の１型動物モデル及び免疫不全である化学的に誘発した糖尿病の動物モデルに治療効果があることを示す。しかし、ｒＡｄ−２３１３７治療したＮＯＤマウスにおける正常血糖は１０日間維持され、次いで高血糖が再発した。高血糖の再発は、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスで血中グルコースレベルが正常化した１ヵ月後に観察された。この、ＮＯＤマウスにおける高血糖の早期再発は、アデノウイルスのベクターに対する宿主のより強力な免疫反応に起因する可能性がある。
【０１５３】
上記の試験の結果より、３エレメントのコピーを有する合成プロモーターのほとんどには、天然のＬＰＫプロモーターに匹敵する転写活性があったが、多量体化された単一のエレメントの活性は比較的低く、これは以前の報告と一致していたことが明らかになった(Li,X.,Eastman,E.M.,Schwartz,R.J.,及びDraghia-Akli,R.,(1999年),Synthetic muscle promoters:activities exceeding naturally occurrng regulatory sequences.,Nat.Biotechnol.,17巻,241〜245頁)。しかし、最近では、構築物内に他の転写因子結合性エレメントを含むことで遺伝子の発現を増強することができることも示されている(Walters,M.C.,Fiering,S.,Eidemiler,J.,Magis,W.,Groudine,M.,及びMartin,D.J.,(1995年),Enhancers increase the probability but not the level of gene expression.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92巻,7125〜7129頁;Sutherland,H.G.,Martin,D.,及びWhitelaw,E.,(1997年),A globin enhancer acts by increasing the proportion of erythrocytes expressing a linked trans gene.,Mol.CellBiol.,17巻,1607〜1614頁)。したがって、３コピーの合成プロモーターの転写活性の増強を、構築物における他の３コピーのモジュールの導入により調べた。
【０１５４】
配向効果を調べるために、３コピーのモジュールを、予め存在するモジュールと同じ又は反対の方向で挿入した。これらの構築物の転写活性の分布は、その大多数の転写活性は、３コピーの合成プロモーターに比べて同じ又は劣ったことを示していた（図５Ａ及び５Ｂ）。しかし、プロモーターのコピー数が同じか又はより高い場合は、はるかに高い活性を示した（図３Ｂ）。３コピーのモジュールの同じ又は反対方向の構築物の間では、転写活性の分布に著しい相違はなかった。これら全体の観察は、シスエレメントのいくつかの組合せは、プロモーター活性に対して相乗効果があり得ることを示している。しかし、６又は９コピーのモジュールのいずれにも、８％を超えるＣＭＶプロモーター活性を示した合成プロモーターにおける共通のパターンがあることは観察されなかった。９コピーの合成プロモーターにおける転写活性の分布は、そのほとんどの活性は同じ又は劣るが、いくつかはその親の構築物に比べて活性が高かったことを示していた。活性の高い９コピーの合成プロモーターに個々のエレメントの配列順序に類似性は見出されなかった。
【０１５５】
合成プロモーターの転写活性は、天然のＬＰＫプロモーターに比べて増強されたが、インシュリンの遺伝子治療を調節する機能に対する、グルコース反応性も評価した。図６に示すように、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物ではＣＭＶプロモーターによるインシュリンの調節機構が発現されず低血糖により死亡した。それとは対照的に、合成プロモーターによるインシュリンの発現は、ＳＴＺ誘発した糖尿病モデルにおけるグルコースの変化に反応して好適に制御された。５×１０10個のウイルス粒子で治療した動物に重症の低血糖が見出されなかったことは注目に値する。第１世代のアデノウイルスのウイルスの毒性を避けるために、ベクターの投与量はこれ以上増大しなかった。さらに、ｒＡｄ−ＳＰ−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物における空腹時血中グルコースレベルは、正常の健常動物におけるものに匹敵し、インシュリンの発現が血中グルコースレベルに反応して調節されていることを示していた。これらの結果は、本発明の合成プロモーターは、グルコースレベルの変化に反応してインシュリン生成を調節し、糖尿病動物において正常血糖を維持する機能があることを示している。
【０１５６】
さらに、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物における糖負荷試験の結果は、インシュリンの発現に対してグルコース変化に反応する合成プロモーターの機能を支持している。グルコースチャレンジから１５及び３０分後のピークの後、血中グルコースレベルは、対照同様に正常範囲まで低下した。しかし、対照の動物は６０分以内に正常グルコースを示したが、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ治療動物では、グルコース負荷１２０分後にも同じレベルを示した。さらに、グルコースチャレンジ後１８０と２４０分の間の正常対照の動物に比べて治療動物での血中グルコースレベルは相対的に低いことが観察され、これは、２７０分の正常対照動物と同様の範囲に戻った。これらの結果は、本発明の合成プロモーターは、特にネガティブフィードバックに関して、さらに最適化することができることを示している。しかし、合成プロモーターは、以前に報告されたプロモーターよりもはるかに効率的であり、治療動物における非絶食時グルコースレベルの高さは中程度であった。合成プロモーターの負の調節は、インシュリンの存在下でプロモーターの活性を抑制することが示されているインシュリン反応性エレメントの導入により達成することができる(O'brien,R.M.,Streeper,R.S.,Ayala,J.E.,Stadelmaier,B.T.,及びHornbuckle,L.A.,(2001年),Insulin-regulated gene expresion.,Biochem.Soc.Trans.,29巻,552〜558頁)。さらに、インシュリン誘発性の低血糖の潜在的な危険性がインシュリンｍＲＮＡの相対的な安定性に大幅に依存しているので(Dong,H.,及びWoo,S.L.,(2001年),Hepatic insulin production for type 1 diabetes.,TrendsEndocrinol.Metab.,12巻,441〜446頁)、特異的なエレメントを、速やかな分解をもたらすその配列中に組み入れることにより、トランスジェニックインシュリンｍＲＮＡの半減期を制御することもできる。
【０１５７】
本出願を通して、様々な出版物が括弧内に記載されている。これら出版物のその全文の公開は、本発明の最新技術をより完全に記載するために、本出願において本明細書に参照として組み入れられる。
【０１５８】
本発明を開示した実施形態に関して記載したが、当業者であれば、上記に詳細に記載した特定の実施例及び試験は本発明を例示するにすぎないことを容易に理解するであろう。本発明の精神から逸脱することなしに、様々な修飾を行うことができることを理解すべきである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】合成プロモーターのライブラリーを構築するための３コピーのモジュールのシス調節性のエレメントの生成を示す図である。（Ａ）オリジナルのマルチクローニング部位を（ＭＣＳ）ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて新しいＭＣＳで置換し、ｐｃＤＮＡ３−ＮｅｗＭＣＳを生成した。（Ｂ）３コピーのモジュールを構築するために用いた３つの異なるシス調節エレメントの可能な組合せ。グルコース反応性エレメント（Ｇ）、Ｃ／ＥＢＰ結合エレメント（Ｃ）及びＨＮＦ−１結合性エレメント（Ｈ）を混合し、ｐｃＤＮＡ３−ＮｅｗＭＣＳにおけるＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩの部位中に順番に連結し、３コピーのＳＰ−Ｄ３を生成した。
【図２】合成プロモーターライブラリーの生成を示す図である。（Ａ）ｐＧＬ３−エンハンサーベクターにおいて、新しいＭＣＳでオリジナルのＭＣＳを置換し、ｐＧＬ３Ｅ−ＮｅｗＭＣＳを生成した。（Ｂ）３、６及び９コピーのシス調節エレメントを含む合成プロモーターの模式図。ＬＰＫプロモーターの近接部位（転写開始部位に対して−９６／＋１２）を合成プロモーター−レポーター構築物を生成するための基本のプロモーターとして用いた。３コピーのＳＰ−Ｄ３からの３コピーの分子を、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位におけるｐＬＰＫ（−９６／＋１２）−Ｌｕｃに移し、３コピーのＳＰ−Ｌｕｃプロモータープラスミドを生成した。他の３コピーのモジュールを、同方向（ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ）又は反対方向（ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ）のいずれかで３コピーのＳＰ−Ｌｕｃに挿入し、６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃ及び６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ部位における６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃにおいて、他の３コピーのモジュールを導入することにより、９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドを生成した。矢印は、３コピーのモジュールの配向を示す。３つのシスエレメントのあるボックスは、単一のエレメントを含む３コピーのモジュールの単一の位置を表す。
【図３】ＣＭＶプロモーターと比べた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成プロモーターのルシフェラーゼの活性比較を示す図である。（Ａ）３コピーの合成プロモーターのルシフェラーゼ活性。（Ｂ）ＣＭＶプロモーター活性が８％を超える６コピーの合成プロモーターのルシフェラーゼ活性。各々の合成プロモーター−ルシフェラーゼ構築物をＨ４ＩＩＥ細胞中に形質移入し、ルシフェラーゼ活性を形質移入１日後に測定した。合成プロモーター構築物のルシフェラーゼ活性を、ＣＭＶプロモーター活性のパーセント値として計算した。ＬＰＫはｐＬＰＫ−Ｌｕｃプラスミドを示す。ルシフェラーゼアッセイを、形質移入の少なくとも２つの異なるラウンドで４回行った。値は全て平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図４Ａ】合成プロモーター構築物におけるシス調節エレメントの組成を示す図である。ＣＭＶプロモーター活性が８％を超えて示されるた６コピーのＳＰＸＩ−Ｌｕｃプラスミドである。３００クローンを超える、６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃ及び６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃを、それらの転写活性について調べた。その中で、ＣＭＶプロモーターの活性が８％を超える活性を示した１７のプラスミドを、３つの他のコピーのシスエレメントを挿入することによる９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの生成に選択した。選択した９コピーの合成プロモーターを、そのｉｎ ｖｉｖｏの効果を決定するためのアデノウイルスの生成に用いた。６コピーのＳＰＸＮの組成は示していない。
【図４Ｂ】合成プロモーター構築物におけるシス調節エレメントの組成を示す図である。ＣＭＶプロモーター活性が２５％を超えて示されるた９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの状況におけるシスエレメントの配列。３００クローンを超える、６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃ及び６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃを、それらの転写活性について調べた。その中で、ＣＭＶプロモーターの活性が８％を超える活性を示した１７のプラスミドを、３つの他のコピーのシスエレメントを挿入することによる９コピーのＳＰ−Ｌｕｃプラスミドの生成に選択した。選択した９コピーの合成プロモーターを、そのｉｎ ｖｉｖｏの効果を決定するためのアデノウイルスの生成に用いた。６コピーのＳＰＸＮの組成は示していない。
【図５Ａ】（Ａ）６コピーのＳＰＸＥ−Ｌｕｃ及び（Ｂ）６コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃの転写活性の分布パターンを示す図である。６コピーのＳＰＸＥ、６コピーのＳＰＸＮ及び９コピーのＳＰ  Ｌｕｃからの各ＤＮＡを、Ｈ４ＩＩＥ細胞中に形質移入し、次いでルシフェラーゼアッセイを行った。合成プロモーター構築物のルシフェラーゼ活性を、ＣＭＶプロモーター活性の％により計算した。ルシフェラーゼ活性の％を示した構築物の数を示す。
【図５Ｂ】（Ｃ）９コピーのＳＰＸＮ−Ｌｕｃの転写活性の分布パターンを示す図である。６コピーのＳＰＸＥ、６コピーのＳＰＸＮ及び９コピーのＳＰ  Ｌｕｃからの各ＤＮＡを、Ｈ４ＩＩＥ細胞中に形質移入し、次いでルシフェラーゼアッセイを行った。合成プロモーター構築物のルシフェラーゼ活性を、ＣＭＶプロモーター活性の％により計算した。ルシフェラーゼ活性の％を示した構築物の数を示す。
【図６】ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスで、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒが血中グルコースレベルを低下させる効果を示す図である。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、様々な投与量で（５×１０10、１０×１０10、５×１０9及び１０×１０9個のウイルス粒子）糖尿病動物中に投与した。各投与量グループからの代表的なデータを示す。＃は、その日に治療した動物の死亡を示す。●５×１０10ウイルス粒子；○１０10ウイルス粒子；▼５×１０9個ウイルス粒子；△１０9個ウイルス粒子。
【図７】ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスで、ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒが血中グルコースレベルを低下させる効果を示す図である。ｒＡｄ−２３１４２−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、（Ａ）５×１０10（ｎ＝４）、（Ｂ）１０×１０10（ｎ＝７）及び（Ｃ）５×１０9（ｎ＝６）個のウイルス粒子の様々な投与量で糖尿病マウス中に投与した。値は全て平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図８】ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスで、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒが血中グルコースレベルを低下させる効果を示す図である。（Ａ）糖尿病動物における、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒが血中グルコースレベルを低下させる効果。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ及びｒＡＤ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスをＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス中に投与し、血中グルコースレベルをモニターした。陰性対照として、ウイルスで処置しなかった糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスを用いた。●ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ（ｎ＝７）；○糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス（ｎ＝４）；▼ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ（ｎ＝８）。値は全て平均値±Ｓ．Ｄ．である。（Ｂ）処置動物の肝臓における組換えのアデノウイルスのゲノムの存在。ウイルス投与後様々な時間に、ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ（５×１０9）又はｒＡＤ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルス（１０10個のウイルス粒子）で処置したマウスから肝臓を得た。ＰＣＲの肝臓から全ＤＮＡを抽出し、ラットインシュリン遺伝子に対するプライマーを用いてアデノウイルスのゲノムの検出を行った。レーン１、５日目のｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ；レーン２、１０日目のｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ；レーン３、２５日目のｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ；レーン４、５０日目のｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ；レーン５、陽性対照としてのｐＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒプラスミド。
【図９】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおける糖負荷試験を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒで処置後の正常血糖の動物を１６時間絶食させ、グルコース（体重１ｋｇあたり２ｇ）を腹腔内注射により投与した。血中グルコースレベルを、グルコースチャレンジ、１、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２４０及び２７０分後に測定した。●ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス；○正常対照マウス；▼糖尿病対照マウス。値は全て平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図１０Ａ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを（Ａ）Ｈ４ＩＩＥ（ラット肝細胞腫細胞系）感染させた。細胞を、ラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１０Ｂ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスをＬ９２９（マウス線維芽細胞細胞系）に感染させた。細胞をラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１０Ｃ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスをＬ６（マウス筋肉細胞系）に感染させた。細胞をラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１０Ｄ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスをＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌細胞系）に感染させた。細胞をラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１０Ｅ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、ＮＲＫ（正常ラット腎臓細胞系）に感染させた。細胞をラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１０Ｆ】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置細胞系における肝細胞特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ又はｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞細胞系）に感染させた。細胞をラットインシュリンに対する特異的な抗体を用いて染色した。ウイルス感染しない細胞を陰性対照として用いた。
【図１１】ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ処置ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおける肝臓特異的なインシュリン遺伝子の発現を示す図である。ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ及びｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルスを、ＳＴＺ誘発した糖尿病ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウス中に投与した。処置動物が正常グルコースレベルを示した後、動物を屠殺し、腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）、肝臓（Ｌ）、肺（Ｌｕ）及び心臓（Ｈ）を含む様々な器官を除去した。全ＲＮＡを単離し、ラットインシュリン又はＨＰＲＴに対するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。（Ａ）ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ、ＨＰＲＴ、（Ｂ）ｒＡｄ−ＣＭＶ−ｒＩＮＳｆｕｒ、ラットインシュリン、（Ｃ）ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ、ＨＰＲＴ及び（Ｄ）ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒ、ラットインシュリン。
【図１２】自然発症の糖尿病ＮＯＤマウスにおける、ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒが血中グルコースレベルを低下させる効果を示す図である。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒウイルス（３×１０10個のウイルス粒子、ｎ＝４）を、糖尿病ＮＯＤマウス中に尾静脈から静脈投与した。ｒＡｄ−２３１３７−ｒＩＮＳｆｕｒで処置した動物は、投与数日後に血中グルコースレベルの正常化を示し、正常化した血中グルコースレベルを最高１０日間維持した。値は全て平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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