(57)【要約】本発明は、新たな腫瘍関連抗原、その抗原と特異的に結合する結合分子、結合分子をエンコードする核酸分子、結合分子を含む組成物及び結合分子を同定又は製造する方法を提供する。新たな腫瘍関連抗原は癌細胞上に発現し、その抗原と特異的に結合することができる結合分子を、癌の診断、予防及び／又は治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬ細胞に存在する抗原と結合できる結合分子において、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有する、少なくとも重鎖ＣＤＲ３領域を含むことを特徴とする結合分子。
【請求項２】
請求項１に記載の結合分子において、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域を含むことを特徴とする結合分子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の結合分子において、前記結合分子がヒトのものであることを特徴とする結合分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合分子において、前記抗原が、白血球抗原関連の受容体タンパク質チロシンホスファターゼ又は配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする結合分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子及びタグを含む免疫複合体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子をエンコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを少なくとも一つ含むホスト。
【請求項９】
請求項８に記載のホストにおいて、ヒト細胞由来の細胞であることを特徴とするホスト。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子又は請求項５に記載の免疫複合体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物。
【請求項１１】
ＡＭＬの診断過程において、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子、請求項５に記載の免疫複合体又は請求項１０に記載の医薬品組成物を使用する方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子、請求項５に記載の免疫複合体又は請求項１０に記載の医薬品組成物を、薬物として使用する方法。
【請求項１３】
癌の予防又は治療のための薬物を調製する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子、請求項５に記載の免疫複合体又は請求項１０に記載の医薬品組成物とを用いた方法。
【請求項１４】
ＡＭＬの予防、治療又はその組合せにおいて薬物を調製する方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の結合分子、請求項５に記載の免疫複合体又は請求項１０に記載の医薬品組成物とを用いた方法。
【請求項１５】
白血球抗原関連の受容体タンパク質チロシンホスファターゼと特異的に結合することができるヒトの結合分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載のヒトの結合分子において、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３領域を少なくとも含むことを特徴とする結合分子。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のヒトの結合分子において、ＡＭＬ亜型Ｍ０、Ｍ１／２及びＭ３に、特異的な免疫反応性を有することを特徴とする結合分子。
【請求項１８】
薬物として使用するための、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のヒトの結合分子。
【請求項１９】
ＡＭＬの検出、予防、治療又はその組合せのための薬物を調製するために、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のヒトの結合分子を使用する方法。
【請求項２０】
ＡＭＬ亜型のＭ０、Ｍ１／２及びＭ３の検出、予防、治療又はその組合せのための薬物を調製するために、請求項１７に記載のヒトの結合分子を使用する方法。
【請求項２１】
配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬品組成物。
【請求項２２】
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合することができる結合分子。
【請求項２３】
薬物として使用するための、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項２１に記載の医薬品組成物、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをエンコードする核酸分子又は請求項２２に記載の結合分子。
【請求項２４】
癌の検出、予防、治療又はその組合せのための薬物を調製するために、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項２１に記載の医薬品組成物、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをエンコードする核酸分子又は請求項２２に記載の結合分子を使用する方法。
【請求項２５】
ＡＭＬの検出、予防、治療又はその組合せの薬物を調製するために、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、請求項２１に記載の医薬品組成物、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをエンコードする核酸分子又は請求項２２に記載の結合分子を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学の分野に関するものである。特に、本発明は、癌関連抗原と特異的に結合できる結合分子に関するものである。その結合分子は、癌の予防、治療及び検出に役立つ。
【背景技術】
【０００２】
癌は、異常細胞の制御できない増殖によって特徴づけられる疾患の種類である。それは、冠状動脈疾患についで、二番目のヒトの死亡原因である。世界的にも、毎年、何百万人もの人が癌で死亡する。米国のみにおいて、癌は、毎年おそらく５０万人以上の死亡原因となり、一年当たりで新たにおよそ１４０万の患者が診断される。
【０００３】
アメリカ合衆国の全ての癌の約３％を占める、癌の１つの種類は白血病である。この難病は、末梢血液及び／又は骨髄中に検出できる白血球の異常な増殖によって特徴付けられる。白血病は、概して急性及び慢性白血病に分類することができる。細胞形態及び細胞化学を含むさまざまな方法で、急性白血病は、骨髄系及びリンパ系の白血病に亜分類することができる。
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、もっとも一般的な型の白血病であり、成人が関係している全ての白血病の患者の約５０％及び、全ての急性白血病患者の実に８５％を占める。ＡＭＬに対する標準の治療法は化学治療であり、しばしばアントラサイクリンを含む。これは、ＡＭＬ患者において７０％の完全寛解率（ＣＲ）という結果となる。しかしながら、アントラサイクリンの治療は、骨髄抑制、用量により限定される心臓毒性を含む重症の副作用のみならず、深刻な発生率の再発を伴う。２０％未満のＣＲ患者は、長期的に生存する。再発性のＡＭＬ疾患は多数の薬物耐性（ＭＤＲ）を示すので、薬物を含む種々の化学療法薬により更に治療をしても、再発性の疾患はしばしば難治性となる。
【０００５】
その観点より、ＡＭＬの新規な治療法は開発された。ＣＤ３３又はＣＤ４５のようなＡＭＬ関連の抗原と結合することができる抗体が、いくつかの治療では使用される（国際公開２００４／０４３３４４号公報参照）。ＡＭＬ関連の抗原は記載されているけれども、抗体及び他の生物学的治療法に役立つ新規なＡＭＬ抗原には大きな必要性がある。更に、抗体に基いた診断及びイメージング方法のための標識として有用なＡＭＬ関連の抗原にも対応する必要性があり、願わくば、より早期の診断及びより高い予測予測の開発をもたらす。
【０００６】
本発明は、腫瘍、特にＡＭＬの予防、治療及び診断に役立つ新規な抗原を提供することによって、この必要性に対応する。更に、本発明は、これらの抗原に対する新規な抗体を提供する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明において、抗体に基づいた予防及び治療のための新たな腫瘍標的抗原を提供する。特に、ＡＭＬと関連する抗原を提供する。更にまた、腫瘍関連抗原と結合することができるいくつかの結合分子が、ファージディスプレイ技術を用いることにより同定され、得られた。更にまた、これらの結合分子を生成する方法及び腫瘍性の障害及び疾患、特にＡＭＬの診断、予防若しくは治療における結合分子の使用を記載する。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は、ＡＭＬ細胞のような腫瘍細胞上に存在する抗原と結合することができる結合分子を含む。本願明細書で、「急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）」は、骨髄性前駆細胞、骨髄単核前駆細胞及び未成熟の巨核芽球細胞を含むが、これらに限らず、骨髄由来の前駆細胞の抑制されない増殖によって特徴づけられる。ＦＡＢ分類によるＡＭＬの亜型は、ＦＡＢ−Ｍ０、ＦＡＢ−Ｍ１、ＦＡＢ−Ｍ２、ＦＡＢ−Ｍ３、ＦＡＢ−Ｍ４、ＦＡＢ−Ｍ５、ＦＡＢ−Ｍ６及びＦＡＢ−Ｍ７を含む。
【０００９】
本発明の結合分子は、ヒトの結合分子が好ましい。それらは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体のような無傷の免疫グロブリン分子であり、特にヒトモノクローナル抗体である。又は、結合分子は、抗原結合性フラグメントであってもよく、それは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖抗体、二量体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三量体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）及び四量体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、及びポリペプチドへの特異的な結合を与えるのに十分なイムノグロブリンのフラグメントを少なくとも含む前記ポリペプチドを含んでもよいが、これらに限られない。また、本願明細書で使用する「結合分子」は、本技術分野で知られている免疫グロブリンのクラス及びサブクラスを含む。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列により、無傷の抗体の５つの主要な分類に、結合分子を分けることができる。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ並びにＩｇＭであり、これらのいくつかは、例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の、サブクラス（イソタイプ）に更に分けることができる。抗体の生成方法は既知の技術であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ，  Ｌａｎｅ  （１９８８），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されており、本願明細書に援用したものとする。本発明の結合分子は、単離されてない型又は単離された型で用いることができる。更に、本発明の結合分子は、単独で又は少なくとも一つの結合分子（又はその変異型若しくはフラグメント）を含む混合物で使用することができる。言い換えると、結合分子を、例えば２つ以上の結合分子又はそのフラグメントを含む医薬品組成物として、組み合わせて用いることができる。例えば、好ましい治療又は診断効果を達成するために、相違しているが相補的な活性を有する結合分子を、単独療法に組み込むことができる。あるいは、望ましい治療又は診断効果を達成するために、同一の活性を有する結合分子も、単独療法に組み込むことができる。混合物は、少なくとも一つの他の治療薬を更に含むことができる。概して、本発明の結合分子は、それらの結合パートナと結合することができる。すなわち、本発明のＡＭＬ関連の抗原において、親和定数（Ｋｄ値）は、０．２×１０−４Ｍ、１．０×１０−５Ｍ、１．０×１０−６Ｍ、１．０×１０−７Ｍより低く、好ましくは１．０×１０−８Ｍより低く、より好ましくは１．０×１０−９Ｍ、より好ましくは１．０×１０−１０Ｍより低く、更により好ましくは１．０×１０−１１Ｍより低く、特に、１．０×１０−１２Ｍより低い。親和定数は、抗体イソタイプで変化することができる。例えば、ＩｇＭイソタイプに結合する親和性は、少なくとも約１．０×１０−７Ｍの結合親和性を示す。例えばＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用���て、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムに生物特有の相互作用の分析できる光学現象である、表面プラスモン共鳴を用いて、親和定数を測定することができる。
【００１０】
本発明の結合分子は、可溶型で、本発明のＡＭＬ関連の抗原と結合することができる。又は、マイクロタイタープレート、膜及びビーズ等の担体若しくは基質に、本発明のＡＭＬ関連の抗原を結合又は付着させることができる。担体又は基質は、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース又はテフロン(登録商標）等で製造してもよい。このような支持体の表面は、非多孔性（ｓｏｌｉｄ）又は多孔性であり、任意の都合のよい形状であってもよい。更にまた、結合分子は、精製された型又は精製されてない型及び／又は単離された型又は単離されてない型でＡＭＬ関連の抗原と結合することができる。好ましくは、本発明の結合分子は、それが抗原について陽性なヒトの細胞などの細胞と会合しているときに、抗原と結合することができ、そのような細胞には例えば、ＡＭＬ細胞若しくは本発明のＡＭＬ関連抗原によってトランスフェクトされた細胞、又はＡＭＬ関連抗原若しくはそのフラグメント（例えば、その抗原の細胞外部分など）を含んでいるそれらの細胞の部分又は一部などがある。同じ組織タイプの通常の細胞と比較して、本発明のＡＭＬ関連の抗原は腫瘍細胞において過剰発現しているので、本発明の結合分子は腫瘍細胞を選択的に標的化するのに用いることができる。特に、通常の血液細胞と比較して、本発明のＡＭＬ関連の抗原は、ＡＭＬ細胞に過剰発現している。
【００１１】
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）の可能なエフェクター機能を補充するために、ＡＭＬ細胞のような標的細胞の表面上に存在する抗原と結合し、表面に結合したままである本発明の結合分子は、裸の結合分子の状態で用いることができる。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを識別するアッセイは、当業者によく知られている。本発明の裸の抗体も、ＡＤＣＣ又はＣＤＣによる以外の他の方法で標的細胞のアポトーシスを誘導することができる。あるいは、それらは、本発明のＡＭＬ関連の抗原と結合して内在化することができる。結合分子の内在化は、当業者の既知の技術によって評価することができる。
【００１２】
好ましい実施態様において、本発明の結合分子は、少なくともＣＤＲ３領域を、好ましくは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む。
【００１３】
他の実施態様では、本発明の結合分子は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域を含む。
【００１４】
また、更なる実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は配列番号４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、本願明細書で規定される結合分子の機能を有する変異型又はそのフラグメントを含む。変異型は、本発明のＡＭＬ関連抗原との特異的な結合について親結合分子と競合することができる場合、分子は本発明による結合分子の機能を有する変異型であると見なされる。言い換えると、機能を有する変異型が更に、ＡＭＬ関連抗原又はその部分と結合できるときである。機能を有する変異型には、一次構造配列が実質的に同じ誘導体であるが、親結合分子中には見出されない、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの化学的及び／又は生化学的修飾を含んでいるものも含まれるが、これに限定されるものではない。この種の修飾は、当業者にとってよく知られている。
【００１６】
あるいは、機能を有する変異型は、親結合分子のアミノ酸配列と比較して一つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失又はその組合せを含むアミノ酸配列を有する本発明に規定する結合分子である。更にまた、機能を有する変異型は、アミノ末端又はカルボキシ末端のいずれか又は両方でアミノ酸配列の切断部を有することができる。本発明による機能を有する変異型は、親結合分子と比較して、同一若しくは異なった又は、より高いか若しくはより低い結合親和性を有するが、なお本発明によるＡＭＬ関連抗原と結合できる。例えば、親結合分子と比較して、本発明の機能を有する変異型は、本発明のＡＭＬ関連抗原の結合親和性を増減できる。好ましくは、可変領域のアミノ酸配列は修飾されており、フレームワーク領域、超可変領域、特にＣＤＲ３領域を含むがこれに限らない。本発明の範囲にあることを意図される機能を有する変異型は、本願明細書で規定される親結合分子と、少なくとも約５０％〜約９９％、好ましくは少なくとも約６０％〜約９９％、より好ましくは少なくとも約７０％〜約９９％、更により好ましくは少なくとも約８０％〜約９９％、最も好ましくは少なくとも約９０％〜約９９％、特に少なくとも約９５％〜約９９％、特に少なくとも約９７％〜約９９％のアミノ酸配列ホモロジを有する。なかでも当業者にとって既知のＧａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔのようなコンピュータアルゴリズムを、比較されるべきアミノ酸配列を最適に配列し、類似又は同一のアミノ酸残基を規定するために用いることができる。変異性ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）及び部位特異的変異誘発のような既知の技術の一般の分子生物学的方法によって、親結合分子又はその一部を変換することによって、機能を有する変異型を取得することができるが、これに限定されるものでない。
【００１７】
１つの実施態様において、ＡＭＬ関連抗原は、白血球抗原関連受容体のタンパク質チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ  ＰＴＰ）である。ＬＡＲ  ＰＴＰは、その細胞外領域が３つのＩｇ及びいくつかのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｓｔｒｅｕｌｉ等  １９８８）から構成されている、膜貫通型ホスファターゼのファミリーのプロトタイプである。上皮性細胞、平滑筋細胞及び心筋細胞を含む多くの異なる系統の細胞で、ＬＡＲ  ＰＴＰが発現し、ＬＡＲ  ＰＴＰ発現レベルの増加と、異なったパターンの細胞外の選択的スプライシングが、乳がん細胞株及び褐色細胞腫腫瘍組織で検出される。
【００１８】
本発明の別の態様では、ＬＡＲ  ＰＴＰ又はその細胞外の部分に特異的に結合することができる、本願明細書で規定されたヒトの結合分子と関連する。ＬＡＲ  ＰＴＰのアミノ酸配列は、配列番号４０で示す。タンパク質の細胞外の部分は、アミノ酸１―１２５９からなる（Ｓｔｒｅｕｌｉ等  １９８８）。好ましい実施態様において、ＬＡＲ  ＰＴＰに特異的に結合するヒトの結合分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ３領域を少なくとも含む。ＬＡＲ  ＰＴＰに特異的に結合することができる結合分子は病気の目安として用いることができ、ＬＡＲ  ＰＴＰは、とりわけ肥満、ＩＩ型糖尿病及び腫瘍のような役割を果たしていると示唆されている。ＬＡＲ  ＰＴＰがＡＭＬ細胞内で過剰発現するとき、ＡＭＬの検出、予防及び／又は治療において、ＬＡＲ  ＰＴＰに特異的に結合することができる結合分子を、薬物として用いることができる。本発明の結合分子は、ＡＭＬ亜型Ｍ０、Ｍ１／２及びＭ３と特有の免疫反応性を有し、これらの特有のＡＭＬ亜型の検出、予防及び／又は治療において、薬物として有利に用いることができる。
【００１９】
他の実施態様において、ＡＭＬ関連の抗原は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。このタンパク質は、ＡＴＡＤ３Ａと呼ばれる。それは、アミノ酸３４７−４６７から潜在的なＡＴＰアーゼ領域を含み、ＡＴＰアーゼのＡＡＡ−スーパファミリに潜在的に属する。一般に、ＡＴＰアーゼは、膜融合、蛋白質分解及びＤＮＡ複製を含む多種多様な細胞活性と関連している。更に、本発明は、そのポリペプチドが腫瘍、特にＡＭＬで過剰発現していることを提供する。そのポリペプチドは、全てのＡＭＬ亜型で発現する。
【００２０】
本発明の１態様は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをエンコードする核酸分子に関するものである。特定の態様において、その核酸分子は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそのポリペプチドをエンコードする核酸分子を含む医薬品組成物に関するものである。更に、医薬品組成物は、薬学的に許容できる担体を含む。このような組成物は、ワクチンとして用いることができる。
【００２２】
更にもう一つの実施態様において、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合することができる、本願明細書で規定する結合分子を提供する。配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、このポリペプチドを含む医薬品組成物、このポリペプチドをエンコードする核酸分子又は、このポリペプチドと特異的に結合する結合分子は、とりわけ、検出、予防及び／又は癌の治療、特にＡＭＬの検出、予防及び／又は治療のための薬物として用いることができる。
【００２３】
本発明のＡＭＬ関連抗原の、天然に発生する切断型、分泌型、天然に発生する変異型（例えば選択的スプライシングされた型）及び天然に発生する対立遺伝子変異体も、本発明の一部である。また、本発明の結合分子は、修飾が、抗原への結合分子の結合を止めない限り、これらの抗原の非天然的に発生する変異型又は類似物と特異的に結合することができる。
【００２４】
上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子は、配列番号６のアミノ酸配列を好ましくは含み、配列番号５に示すようなヌクレオチド配列を好ましくは含む。ワクチンとして又はワクチンを生成するために、核酸分子を用いることができる。
【００２５】
更なる態様において、本発明は、少なくとも一つの上記結合分子と、少なくとも一つのタグを更に含む分子である免疫複合体を含み、そのタグは、細胞の機能を抑制若しくは防止及び／又は細胞の破壊が生じる治療的な成分などである。また、本発明の免疫複合体の混合物又は、少なくとも一つの本発明の免疫複合体及び治療薬若しくは診断薬、他の結合分子又は免疫複合体のような他の分子の混合物も、本発明において意図している。さらなる態様において、本発明の免疫複合体は、複数のタグを含むことができる。これらのタグは、互いに同一でも相違していてもよく、結合分子と非共有結合で結合／複合してもよい。また、タグは、共有結合により結合分子と、直接結合／複合してもよい。あるいは、標識は、一つ以上の結合化合物によって、結合分子と結合／複合してもよい。結合分子と標識を結合する技術は、よく知られている（Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｐ．２４３−２５６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９８５），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ．  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ｐ．６２３−６５３  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８７），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．；Ｔｈｏｒｐｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，  ｐ．４７５−５０６  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４  ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （１９８５），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ｐ．  ３０３−３１６  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （１９８５），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．）
【００２６】
本発明のタグは、毒性物質、放射性物質、リポソーム、酵素、ポリヌクレオチド配列、プラスミド、蛋白質、ペプチド又はその組合せを含むが、これに限定されるものではない。毒性物質は、例えば小分子毒性剤、化学治療剤のような細胞毒性剤、又は細菌、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性な毒素、又はそのフラグメントを含むが、これに限定されるものではない。一般に、適切な化学治療剤は、下記に記載されている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９０），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８５），  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：  Ａ．Ｇ．  Ｇｉｌｍａｎ，  Ｌ．Ｓ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｔ．Ｗ．  Ｒａｉｌ  ａｎｄ  Ｆ．  Ｍｕｒａｄ．  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。まだ実験段階である適切な化学治療剤は、当業者にとって知られており、本発明で毒性物質として用いることができる。
【００２７】
酵素活性毒素をエンコードするヌクレオチド配列をフレーム単位で、結合分子にエンコードし、そして核酸分子を発現するヌクレオチド配列を含む核酸分子を、組換えで構成するような既知の技術の方法で、酵素活性毒素と本発明の免疫複合体の結合分子とを含む融合タンパク質を生成することができる。あるいは、直接又は間接的に、例えばリンカーにより、本願明細書で規定した結合分子を酵素活性毒素と化学的に結合することにより、融合タンパク質は生成することができる。酵素を含む免疫複合体は、抗体標的化酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）において有用である。
【００２８】
また、本発明では、放射性核種でラベルされた本発明の免疫複合体の結合分子を意図する。当業者は、適切な放射性核種を理解している。例えば治療される疾患の種類、治療される疾患の段階、治療される患者等の多くの要因に、放射性核種の選択は依存している。よく知られた技術の方法によって、直接又は間接的にキレート剤により、結合分子を放射性核種に付着させることができる。
【００２９】
他の実施態様において、いわゆる免疫リポソームを生成するために、本発明の免疫複合体の結合分子は、リポソームと結合することができる。リポソームは、一つ以上の結合分子と結合することができ、結合分子は同一であるか又は相違するかのいずれかである。これらの方法は本技術分野でよく知られた技術であり、音波処理、押出し、高圧／ホモジナイゼーション、マイクロ流動化、洗浄剤透析、小リポソーム小胞のカルシウム誘導融合及びエーテル注入法を含むが、これに限定されるものではない。リポソームは多層小胞でもよいが、好ましくは、リポソームは、小単層（２００−５００Å）又は大単層小胞（５００−５０００Å）のような単層小胞である。リポソームに入れることができる薬物は、上記の毒性物質を含むが、これに限定されるものではない。１種類の薬物が入れられた各々のリポソームであって、異なる薬物及び異なるリポソームが入れられたリポソームを、リポソームの別の態様として用いてもよく、これらの実施態様も、本発明において意図されている。リポソームの表面又は、例えば通常の化学結合技術を用いてリポソームの表面にグラフトされたポリエチレングリコールのようなポリマーの末端に、本発明の結合分子を付着することができる。
【００３０】
更に別の実施態様では、例えばヒドロキシプロピルメタクリルアミン（ＨＰＭＡ）のような、水溶性、生体分解性ポリマーと、本発明の結合分子は結合することができる。
【００３１】
他の態様において、本発明の結合分子を、一つ以上の抗原と結合／付着させることができる。好ましくは、これらの抗原は、結合分子−抗原結合体が投与される被験者の免疫系によって認識される抗原である。抗原は、同一であることができるが、相違することもできる。抗原と結合分子を付着させる結合方法は、本技術分野でよく知られた技術であり、架橋剤の使用を含むが、これに限定されるものではない。
【００３２】
あるいは、本発明に記載されている結合分子はタグと結合することができ、検出及び／又は分析及び／又は診断の目的で用いることができる。それらの目的のために、結合分子にラベルをつけた標識は、使用された特定の検出／分析／診断、技術及び／又は方法に依存し、それには、とりわけ組織サンプルの免疫組織化学的染色、流動細胞検出、スキャンレーザ流動細胞検出、蛍光免疫法、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、生物学的試験（例えば生育阻害アッセイ）、ウェスタンブロッティング法等がある。また、本発明の結合分子を、蛍光及び他の色素原又は染料のような光学活性剤又は染料と結合させることができ、そのようにして得られた免疫複合体を、光放射、光線療法又は光感作療法において用いることができる。
【００３３】
本発明の免疫複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏの診断用に用いられるとき、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤、超音波造影剤若しくはＸ線造影剤又は、放射線同位体標識に結合させても、結合分子の検出を可能とすることができる。
【００３４】
更に、本発明の結合分子又は免疫複合体を、固体支持体に付着させることができ、イムノアッセイ又は結合相手の精製において特に有益である。このような固体支持体は、多孔性又は非多孔性、平面又は非平面でもよい。また、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィのためのＮＨＳ−活性化セファロース又はＣＮＢｒ活性化セファロースのような濾過媒体へも、結合分子は有益に結合することができる。それらも、典型的にはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、正磁性マイクロスフェアに有用に付着することができる。マイクロスフェアを、ＡＭＬ関連抗原又はそのフラグメントを発現又は提示している細胞の単離に用いることができる。別の例として、本発明の結合分子は、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートの表面に、有益に付着することができる。それは、上記タグのいずれかが、本発明の新たな抗原に結合することができることも当業者にとって明確である。
【００３５】
本発明の別の態様は、本発明の結合分子をエンコードする、本願明細書で規定されるとおりの核酸分子に関するものである。更に他の態様では、本発明は、少なくとも上記ＡＭＬ関連の抗原と特異的に結合する結合分子をエンコードする核酸分子を提供する。好ましい態様において、核酸分子は、単離又は精製される。
【００３６】
当業者は、本発明の核酸分子の機能を有する変異型も、本発明の一部であることが意図されることを認識できる。機能を有する変異型は、直接翻訳される核酸配列であり、標準遺伝子コードを用いて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供する。好ましくは、その核酸分子はＣＤＲ３領域を、好ましくは配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む結合分子をエンコードする。更により好ましくは、その核酸分子は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む結合分子をエンコードする。更に別の実施態様において、その核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを有する結合分子をエンコードする。又は、それらは、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とをエンコードする。本発明の特定の実施態様において、本発明の結合分子をエンコードする核酸分子は、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
本発明の一つ以上の核酸分子を含む核酸構築物であるベクターを提供することは、本発明の別の態様である。ベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、植物ウイルス又は動物ウイルスから得ることができる。ベクターは、本発明の結合分子のクローニング及び／又は発現に用いることができ、遺伝子治療目的にさえ用いられる。一以上の発現調節核酸分子と機能を作動するように結合した本発明の核酸分子を一以上含むベクターも、本発明に含まれる。ベクターの選択は、次の組換え方法及び用いられるホストに依存する。宿主細胞へのベクターの導入は、とりわけリン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介されたトランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクト又はエレクトロポレーションによってもたらすことができる。ベクターは、独立して複製することができるか、又はそれらが組み込まれた染色体と共に複製することができる。好ましくは、ベクターは一つ以上の選択マーカーを含む。マーカーの選択は、宿主細胞の選択に依存することができるが、これは当業者にとって良く知られており、本発明において重要ではない。結合分子を単離するために用いることができる蛋白質又はペプチドをエンコードする一つ以上の核酸分子と機能を作動するように結合した、上記結合分子をエンコードする一つ以上の核酸分子を含むベクターも、本発明に含まれる。
【００３８】
上記ベクターの一つ以上の複製を含むホストは、本発明の付加的課題である。好ましくは、そのホストは、宿主細胞である。宿主細胞は、哺乳類、植物、昆虫、菌類又は細菌由来の細胞を含むが、これに限定されるものではない。細菌細胞は、バシラス属、ストレプトミセス属及びブドウ球菌属の数属のようなグラム陽性菌由来の細胞又は、エシェリヒア属及びシュードモナス属の数属のようなグラム陰性菌の細胞を含むが、これに限定されるものではない。菌類の細胞のグループにおいて、好ましくは、酵母細胞が用いられる。酵母の発現は、とりわけピチアパストリス、サッカロマイセスセレビシエ及びハンセヌラ  ポリモルファなどの酵母株を用いることにより達成することができる。更にまた、ショウジョウバエ及びＳｆ９由来の細胞のような昆虫細胞を、宿主細胞として用いることができる。それに加えて、宿主細胞は、植物細胞でもよい。形質転換した（トランスジェニック）植物又は植物細胞は、既知の方法によって生成される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞又はボーズメラノーマ細胞のような哺乳動物細胞を用いた発現システムが、本発明では好ましい。哺乳動物細胞は、哺乳類由来の天然分子と最も類似した翻訳後修飾で、タンパク質を発現する。本発明はヒトに投与しなければならないかもしれない分子を扱うので、完全なヒトの発現システムが特に好ましい。従って、更により好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。ヒト細胞の実施態様は、とりわけＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。好ましい実施態様において、ヒトの生成細胞は、少なくとも、発現可能な型でアデノウイルスＥｌ領域をエンコードする核酸配列の機能を有する部分を含む。なおより好ましい実施態様において、上記宿主細胞は、ヒトの網膜細胞であり、アデノウイルスＥｌ配列を含む核酸によって不死化されたものであり、例えば９１１細胞又はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、ＣＡＭＲ、ソールズベリー、ウィルトシャーＳＰ４  ＯＪＧ、グレートブリテン、９６０２２９４０番に１９９６年２月２９日に寄託され、商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の下で市販されている（ＰＥＲ．Ｃ６クルセルオランダＢ．Ｖ．の登録商標である）細胞株である。本出願の目的で、「ＰＥＲ．Ｃ６」は、９６０２２９４０の番号の下に寄託された細胞又は原細胞、上流継代、下流継代又は寄託された細胞の原細胞由来の子孫及び、前記いずれかの誘導体のことをいう。
【００３９】
宿主細胞における組換え蛋白質の生成は、本技術分野でよく知られた方法により実行することができる。関連する蛋白質の生産プラットホームとして商標ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）として市販された細胞を用いることは、国際公開００／６３４０３号公報に記載されており、全体を本願明細書に援用したものとする。
【００４０】
結合分子又はその機能を有する変異型、好ましくは本発明のヒト結合分子又はその機能を有する変異型を生成する方法を提供することは、本発明の別の態様である。本方法は、ａ）結合分子の発現をもたらす条件の下で上記ホストを培養するステップと、ｂ）必要に応じて発現された結合分子を回収するステップとを含む。発現された結合分子は、セル‐フリー抽出液から回収することができるが、好ましくは、それらを培地から回収する。セル‐フリー抽出液又は培地から結合分子のような蛋白質を回収する方法は、当業者にとってよく知られている。上記方法で入手できる結合分子も、本発明の一部である。
【００４１】
あるいは、宿主細胞のようなホスト中での発現の次に、本発明の結合分子を、一般のペプチドシンセサイザ又は本発明のＤＮＡ分子から得られるＲＮＡを用いて、セルフリー翻訳システムで合成することができる。上記の合成による生成方法又はセルフリー翻訳システムによって入手できる結合分子も、本発明の一部である。更に、結合分子を生成する上記方法も、本発明のＡＭＬ関連抗原を生成するために用いることができる。
【００４２】
更に、別の実施態様において、本発明の結合分子は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物によって生成することができる。ヒト以外の哺乳動物を免疫するためのプロトコールは本技術分野でよく確立されている。Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｄ．  Ｌａｎｅ  （１９９８），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ  （２００１），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照とし、開示は、本願明細書に援用するものとする。
【００４３】
更なる態様において、本発明は、本発明による結合分子、好ましくはヒトのモノクローナル抗体又はそのフラグメントのようなヒトの結合分子又は本発明による核酸分子を同定する方法を提供する。本発明は、ａ）本発明のＡＭＬ関連抗原又はそのフラグメントを含む物質と、結合分子、好ましくはヒトの結合分子のファージライブラリを接触させるステップと、ｂ）本発明のＡＭＬ関連抗原又はそのフラグメントを含む物質と結合するファージを、少なくとも一回選択するステップと、ｃ）本発明のＡＭＬ関連抗原又はそのフラグメントを含む物質と結合するファージを、単離及び回収するステップとを含む。本発明の選択ステップは、本発明のＡＭＬ関連抗原の少なくとも一部、例えば、ＡＭＬ関連抗原の発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞の存在下で好適に実行され、ＡＭＬ関連抗原、その細胞外部分、それを含む融合タンパク質などが単離される。１実施態様において、選択ステップを、ＡＭＬ細胞の存在下で実行する。この選択ステップより前又は同時に、結合分子のファージライブラリを、通常の血液細胞及び／又は本発明のＡＭＬ関連抗原を発現している腫瘍細胞株と接触させることができる。抗体のような結合分子を同定及び取得するためのファージディスプレイ方法は、当業者に既知の今日では確立された方法である。それらは、例えば米国特許番号５，６９６，１０８号公報（バートンとバーバス（１９９４）、デクライフ等（１９９５ｂ）に記載されている。ファージディスプレイライブラリの構築のために、ヒトのモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のコレクションを、バクテリオファージ、好ましくは糸状のバクテリオファージ粒子の表面上に、例えば単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ型（デクライフ等１９９５ｂ参照）で発現させる。抗体フラグメント発現ファージのラージライブラリは、１．０×１０９より大きい抗体特異性を一般的に有し、免疫された個体又は免疫されていない個体のＢリンパ球中で発現される免疫グロブリンＶ領域から構成される。あるいは、ファージディスプレイライブラリは、ライブラリ（半合成ライブラリ）で付加的な抗体多様性を導入するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ある程度集められた免疫グロブリン可変領域から構築することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで集められた可変領域は、抗体特異性のために重要な分子の領域、例えばＣＤＲ領域において、合成で生成された、ランダム化又は部分的にランダム化されたＤＮＡの伸展（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）を含む。抗原特有のファージ抗体は、固相上で固定化標的抗原によって、ライブラリから選ぶことができ、その後固相結合した抗原に特有の抗体フラグメントを発現するファージの結合を可能にするために標的抗原をファージライブラリにさらす。結合してないファージは洗浄で取り除かれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリアの感染のために結合したファージを固相から溶出し、その後に増殖させる。選択及び増殖の複数ラウンドが、標的抗原に特異的に結合したファージを十分に濃縮するために通常必要である。蛋白質の複合混合物又は全細胞などの複合抗原との結合についても、ファージを選択することができ、その全細胞には、抗原発現プラスミドによってトランスフェクトされた細胞又は本発明のＡＭＬ関連抗原を天然に発現している細胞などがある。全細胞で抗体を選択することには、標的抗原がそれらの天然の形状で提示されているという利点があり、言い換えれば、抗原が固相に固定化された場合に導入される可能性がある構造変化によって、乱されることがない。抗原特異的なファージ抗体は、興味の対象である細胞集団をインキュベートすることによってライブラリから選ぶことができ、それらの表面上に既知及び未知の抗原を発現し、ファージ抗体ライブラリによって、例えば、ファージのｓｃＦｖ又はＦａｂ部分を細胞表面上の抗原と結合させる。結合していない若しくは緩く付着したファージを取り除くためにインキュベート及び数回の洗浄を行った後、興味の対象である細胞を、特異的なの蛍光ラベルをつけた抗体で染色し、蛍光活性セルソータ（ＦＡＣＳ）で単離する。それらのｓｃＦｖ又はＦａｂ部分によってこれらの細胞と結合させたファージを溶出し、大腸菌を感染させるのに使用し、新たな特異性の増幅を可能とする。通常、大過剰の非結合ファージから興味の対象であるファージを単離するために、一回以上の選択ラウンドを必要とする。モノクローナルファージの調製物について、それらの特異的な染色法パターンを分析することが可能であり、認識される抗原の同定を可能にすることができる（デクライフ等、１９９５ａ）。標的に類似しているが同一ではない、非標的分子の過剰量を添加することによって、スクリーニングの間の非関連結合剤を取り除くことにより、ファージディスプレイ方法を拡張及び改善することができ、そしてそれによって、関連した結合分子を検出する機会を強力に改良する。（このプロセスは、Ｍａｂｓｔｒａｃｔ（登録商標）プロセスと呼ぶ。Ｍａｂｓｔｒａｃｔ（登録商標）は、クルセルオランダＢ．Ｖ．の登録商標であり、米国特許番号２６５，１５０号公報を参照にし、本願明細書に援用したものとする。
【００４４】
更に、他の態様において、本発明は、本発明による結合分子又は核酸分子を取得する方法を提供する。この方法は、ａ）結合分子、好ましくは本発明によるヒトのモノクローナル抗体又はそのフラグメントのようなヒトの結合分子又は、本発明による核酸分子を同定する上記方法を実行するステップと、ｂ）ヒトの結合分子及び／又はヒトの結合分子をエンコードする核酸を回収されたファージから単離するステップとを含む。新たなモノクローナルファージ抗体が、結合分子又は結合分子をエンコードする核酸分子を同定する上記方法で一度確立又は同定されると、ｓｃＦｖ又はＦａｂをエンコードするＤＮＡを、バクテリア又はファージから単離することができ、標準的な分子生物学技術と結びついて、所望の特異性（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ）の二価ｓｃＦｖ又は完全なヒト免疫グロブリンをエンコードするコンストラクトを作製する。これらのコンストラクトを、適切な細胞株中へトランスフェクトすることができ、完全なヒトのモノクローナル抗体を生成することができる（ＨｕＩｓ等（１９９９）、Ｂｏｅｌ等（２０００）参照）。
【００４５】
更なる態様において、本発明は、少なくとも一つの結合分子、少なくとも一つの機能を有する変異型若しくはそのフラグメント、少なくとも一つの本発明による免疫複合体又はその組合せを含む組成物を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の新たなＡＭＬ関連抗原を含む組成物を提供する。更に、その組成物は、とりわけアルブミン若しくはポリエチレングリコールのような安定化分子又は塩類を含むことができる。必要に応じて、結合分子を機能させなくなる酸の作用又は他の天然若しくは非天然の状態からそれらを保護するために、本発明の結合分子又は抗原を物質内又は物質上にコートすることができる。
【００４６】
更に、他の態様において、本発明は、本発明に記載の少なくとも一つの核酸分子を含む組成物を提供する。その組成物は、塩類（例えばＮａＣｌ又は上記塩類）、洗浄剤（例えばＳＤＳ）及び／又は他の適切な構成要素を含む水溶液などの水溶液を含むことができる。
【００４７】
更にまた、本発明は、少なくとも一つの本発明による結合分子と、少なくとも一つの機能を有する変異型若しくはそのフラグメントと、少なくとも一つの本発明による免疫複合体と、少なくとも一つの本発明による組成物又はその組合せとを含む医薬品組成物に関するものである。また、本発明は、本発明のＡＭＬ関連抗原を含む医薬品組成物を提供する。本発明の医薬品組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容できる担体／医薬品添加物を更に含む。本発明の医薬品組成物は、少なくとも一つの他の治療、予防及び／又は診断薬を更に含むことができる。
【００４８】
一般的に、生成条件及び保存条件の下で、医薬品組成物は無菌であり且つ安定でなければならない。本発明の結合分子、その変異型若しくはフラグメント、免疫複合体、核酸分子、本発明の組成物又は抗原は、供給前又は供給時に適当な薬学的に許容できる医薬品添加物で再構成するために、粉末状態でもよい。滅菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥法）であり、前もって滅菌濾過されたその溶液から、有効成分の粉末に加えて任意の付加的所望成分を生成する。
【００４９】
あるいは、本発明の結合分子、その変異型若しくはフラグメント、免疫複合体、核酸分子又は組成物は、溶液でもよい。一単位投与量の注射可能な剤型を提供するために、適当な薬学的に許容できる医薬品添加物を、提供前又は提供時に、添加及び／又は混合することができる。好ましくは、本発明に用いられる薬学的に許容できる医薬品添加物は、高い薬物濃度に適しており、適当な流動性を維持し、必要に応じて、吸収を遅延させることができる。
【００５０】
医薬品組成物の投与の最適ルートの選択は、組成物中の活性分子の物理化学的性質を含むいくつかの要因、臨床状況の緊急性及び所望の治療的効果に対する活性分子の血漿濃度の関係に影響される。投与ルートは、２つの主要なカテゴリ、経口投与及び非経口投与に分けることができる。好ましい投与ルートは、静脈内投与である。
【００５１】
結合分子、好ましくは本発明によるヒトのモノクローナル抗体のようなヒトの結合分子、その変異型若しくはフラグメント、本発明による免疫複合体、本発明による核酸分子、本発明による組成物又は本発明による医薬品組成物は、薬物として用いることができる。それらは、癌の診断、予防、治療又はその組合せにおいてとりわけ用いることができる。好ましくは、癌はＡＭＬであるが、他の腫瘍、好ましくは本発明の新たな抗原が過剰発現する腫瘍も、予防、治療及び／又は診断することができる。本発明の結合分子は、癌で苦しんでいる未治療の患者、治療されたか又は治療中であるか及び寛解しているか又は寛解していない患者、再発性／難治性の癌患者の治療に適切である。本発明の結合分子は、癌の予防に用いることもできる。更に、上記を含む本発明の新しい抗原又は医薬品組成物は、癌の診断、予防、治療又はその組合せに用いることができる。好ましくは、癌はＡＭＬのような新しい抗原が過剰発現している腫瘍である。
【００５２】
上記分子又は組成物は、診断、予防及び／又は治療において役立つ他の分子と共に用いることできる。それらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで用いることができる。その分子は一般的には、予防、治療的又は診断の効果的な量で、本発明の組成物及び医薬品組成物に調製される。用法−用量を、最適な望ましい反応（例えば治療反応）を提供するように調製することができる。本発明による分子及び組成物は、好ましくは無菌である。これらの分子及び組成物を滅菌する方法は、本技術分野でよく知られている技術である。本発明の結合分子について提案されているように、診断、予防及び／又は治療において有益な他の分子は、類似の用法−用量で投与することができる。他の分子が別に投与される場合、それらを、癌を有している被験者へ、一つ以上の結合分子又は本発明の医薬品組成物の投与をする前に（例えば２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、４週間又は６週間前に）、同時に又は後に（例えば２分、５分、１０分、１５分、３０分、４５分、６０分、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、７日、２週間、４週間又は６週間後）投与する。ヒト患者の臨床試験の間に、投与療法を通常選別する。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏの診断又は治療剤としてヒトに投与するときに、ヒトの結合分子及びヒトの結合分子を含む医薬品組成物は、特に役立ち、好ましいことが多い。モノクローナルネズミ、キメラ又はヒト化した結合分子の投与でもたらされたものより、投与された抗体に対する受容体の免疫反応性は、実質的に少ないことが多いためである。
【００５４】
あるいは、本発明の結合分子を発現する遺伝子工学による細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで患者に投与される。このような細胞は、動物又は患者若しくはＭＨＣ適合性のドナーから得ることができ、線維芽細胞、骨髄細胞、血液細胞（例えばリンパ球）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞等を含むことができるが、これに限定されるものではない。細胞は、本発明の核酸分子を細胞に導入する組換えＤＮＡ技術を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子組換えを行う。好ましくは、結合分子は、細胞から分泌される。本願明細書で記載されているように、結合分子を発現するか及び好ましくは分泌する組換え細胞を、例えば全身に、例えば循環中に、又は腹膜内から、患者に導入することができる。他の実施態様において、細胞は、マトリックスに組込むか、又はカプセル化するか及び体に埋込むことができる。遺伝子治療の状況において、結合分子はホスト細胞を感染させることができるベクターの状態で投与することができ、本発明による結合分子をコードする。
【００５５】
他の態様においては、本発明は、結合分子、好ましくはヒトのモノクローナル抗体のようなヒトの結合分子、そのフラグメント若しくは変異型、本発明による免疫複合体、本発明による核酸分子、組成物又は本発明による薬物の調製における医薬品組成物を、ＡＭＬのような癌の診断、予防、治療又はその組合せへ使用する方法に関するものである。
【００５６】
少なくとも一つの結合分子、好ましくは本発明によるヒトのモノクローナル抗体のようなヒトの結合分子、少なくとも一つのその変異型若しくはフラグメント、少なくとも一つの本発明による免疫複合体、少なくとも一つの本発明による核酸分子、少なくとも一つの本発明による組成物、少なくとも一つの本発明による医薬品組成物、少なくとも一つの本発明によるベクター、少なくとも一つの本発明によるホスト又はその組合せを含むキットも、本発明の一部である。任意に、上記キットは、本発明のＡＭＬ関連抗原を含む。任意に、本発明のキットの上記構成要素は、適切な容器に包装され、表示された状況の治療及び／又は診断のためにラベルされる。上記構成要素を、単位の又は複数投与用のコンテナに保存することができる。そのキットは、薬学的に許容できるバッファを備えるより多くの容器を更に含むことができる。それは商業的及び使用者の立場から望ましい他の物質を更に含むことができ、それには、他のバッファ、希釈液、濾過器、ニードル、注射器、一つ以上の適切なホストのための培地を含むことができる。キットに付けて、治療用又は診断用の製品の商業的なパッケージ中に慣習的に含まれる指示書を含めることができ、それは、例えば上記治療用若しくは診断用の製品の使用に関する適用、使用、投与量、製造、投与、禁忌及び／又は警告事項に関する情報を含む。
【００５７】
更に、本発明は、本発明のＡＭＬ関連抗原若しくはそのフラグメントと同じエピトープに特異的に結合するための結合分子又はその機能を有する変異型若しくはフラグメントをスクリーニングする方法を対象とするものであり、エピトープが本発明による結合分子によって結合するとき、本方法は、（ａ）スクリーニングされるべき結合分子（又は機能を有するそのフラグメント若しくは変異型）と、本発明の結合分子（又は機能を有するそのフラグメント若しくは変異型）と、本発明のＡＭＬ関連抗原（又は抗原決定基を含むそのフラグメント）とを接触させるステップと、（ｂ）スクリーニングされるべき結合分子（又は機能を有するその変異型若しくはフラグメント）が、本発明のＡＭＬ関連抗原（又は抗原決定基を含むそのフラグメント）への特異的に結合について、本発明の結合分子と競合できるかどうかを評価するステップとを含む。これらの競合分析（「競合的結合分子」又は「交差反応性結合分子」）によって同定される結合分子には、抗体、抗体フラグメント、及びエピトープ又は参照結合分子が結合する結合部位に結合する他の結合剤、すなわち、本発明の結合分子のみならず、抗体、抗体フラグメント、及びエピトープ又は結合部位に結合する他の結合剤を含むが、これに限定されるものではなく、その結合部位は参照結合分子が結合するエピトープに十分に近く、選別されるべき結合分子と参照結合分子との間の競合的結合が起こる。
[実施例]
【００５８】
本発明を説明するために、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００５９】
ヒト急性骨髄性白血病細胞を特異的に認識する１本鎖Ｆｖフラグメントを持つファージの選別
米国特許番号６，２６５，１５０号と国際公開９８／１５８３３号公報に実質的に記載されているように、ファージディスプレイ抗体ライブラリや、一般的なファージディスプレイ技術、そしてＭａｂｓｔｒａｃｔ（登録商標）の技術を使用して、抗体フラグメントを選別した（両方とも参照として本願明細書に援用する）。更に、国際公開０２／１０３０１２号公報に記載されている方法とヘルパーファージを本発明で使用した（本願明細書に参照として援用する）。ＡＭＬ腫瘍細胞を認識するファージ抗体を同定するために、赤白血病細胞株Ｋ５６２もしくはＨＬ６０と呼ばれているＡＭＬ細胞株と、ＡＭＬの患者の骨髄吸引物から得られた初代ＡＭＬ腫瘍細胞を使用して、ファージ選別実験を行った。
【００６０】
ライブラリと２３０×１０６個の末梢血液白血球（ＰＢＬ）を含む１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地を混合することにより、ファージライブラリの一定分量（５００μＬ、約１０１３ｃｆｕ、増幅にはＣＴヘルパーファージを使用（国際公開０２／１０３０１２号公報参照））のブロック及び事前の差分除去を行った。得られた混合物を４℃で１．５時間遠心した。その後細胞は沈殿させ、ファージライブラリを含む上清を新しい２３０×１０６個のＰＢＬの沈殿を含むチューブに移した。ファージライブラリ上清中で細胞を再懸濁し、再度この混合物を４℃で１．５時間遠心した。この過程を再度繰り返し、最終的に３回ＰＢＬを差分除去したブロック後のファージライブラリを含む上清１０ｍＬを新しいチューブに移し、４℃で一晩置いた。翌日Ｋ５６２と呼ばれる赤白血病細胞株、又はＨＬ６０と呼ばれるＡＭＬ細胞株の４×１０６個の細胞を別々の１５ｍＬチューブ中で沈殿させ、１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地１ｍＬ中に再懸濁した。このチューブに、事前に差分除去したブロック後のファージライブラリ３．３ｍＬと、１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地５ｍＬを加え、この混合物を４℃で２時間遠心した。その後、得られた混合物を５０ｍＬチューブに移し、１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬで５回洗浄した。沈殿になった細胞に５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）０．８ｍＬを加え、よく混合し１０分間室温に置いて、付着したファージを溶出した。その後、中和のために１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）０．４ｍＬを加えた。そして細胞を再び沈殿させ、その上清を使用して、ＯＤ６００ｎｍで約０．３まで３７℃で培養したＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌培地５ｍＬに感染させた。ファージを３７℃で３０分間ＸＬ１−ｂｌｕｅ細菌に感染させた。次に、この混合物を室温において１０分間３２００ｇで遠心し、細菌の沈殿を２−トリプトン酵母抽出（２ＴＹ）培地１ｍＬ中に再懸濁した。得られた細菌懸濁液をテトラサイクリン、アンピシリン、グルコースを補充した２ＴＹアガープレート上で単離した。プレートを３７℃で一晩培養した後、実質的にＤｅｋｒｕｉｆ等（１９９５ａ）と国際公開０２／１０３０１２号公報で説明するように、コロニーをプレートから掻き取り濃縮ファージライブラリを作成するのに使用した。簡単に説明すると、掻き取った細菌をアンピシリン、テトラサイクリン、グルコースを含む２ＴＹ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００ｎｍが約０．３となるまで培養した。ＣＴヘルパーファージを加え細菌に感染させ、その後培地をアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンを含む２ＴＹ培地に交換した。培養を３０℃で一晩続けた。翌日、細菌を遠心によって２ＴＹ培地から取り除き、その後培地の中のファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００／ＮａＣｌを使用して沈殿させた。最後に、ファージを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）入りのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍＬに溶解し、濾過滅菌して次回の選別実験に使用した。この目的のため、Ｋ５６２由来の増幅したサブライブラリ、もしくはＨＬ６０由来の増幅したサブライブラリの５００μＬを１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地２ｍＬで３０分、４℃でブロックした。このブロックしたサブライブラリに、ＰＥ標識の抗ＣＤ３４抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）で事前に染色した５×１０６個の解凍した初代ＡＭＬ芽細胞（ＣＤ３３＋ＣＤ３４＋芽細胞が９０％、ＦＡＢ分類のＭ０）を加えた。得られた混合物を４℃で２．５時間遠心した。その後、この混合物を５０ｍＬチューブに移し、１０％ＦＢＳ入りの冷やしたＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍＬで３回洗浄した。次に、この混合物を７０ミクロンの細胞濾過器に通し、フローサイトメトリにかけた。細胞の選別はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅフローサイトメータ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行った。細胞のゲートは弱い側方散乱光（ＳＳＣ）とＣＤ３４−ＰＥ染色との組合せに基づいて行った。約９×１０５個の細胞を選別した。選別した細胞を遠沈し、上清は保存し、細胞を５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）８００μＬに再懸濁し室温で５分インキュベートすることで結合したファージを細胞から溶出した。取得した混合物を１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）４００μＬによって中和し、レスキューされた上清に加えた。溶出したファージを上記で説明したようにＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌に再感染するのに使用した。２回目の選別が終了した後、個々の大腸菌コロニーのモノクローナルファージ抗体を作成するのに使用した。実質的に、個々のコロニーを９６穴型プレート中で対数期まで増殖させ、ＣＴヘルパーファージを感染させて、その後ファージ抗体産生を一晩進行させた。生産されたファージ抗体をＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させ濾過滅菌して、（２回目の選別に使用した）初代ＡＭＬ芽細胞と、Ｋ５６２赤白血病細胞株又はＨＬ６０急性骨髄性白血病細胞株の両方への結合を、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して調べた。選別したファージ抗体のうち２つ、すなわちＳＣ０２−３６１とＳＣ０２−４０１が、初代ＡＭＬ腫瘍芽細胞とＫ５６２赤白血病細胞又はＨＬ６０細胞の両方によく結合し、これらの更に詳細な分析を行った（下記の実施例参照）。
【実施例２】
【００６１】
一本鎖ＦｖフラグメントＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の分析
当技術分野で既知の標準技術に従い、選別した一本鎖ＦｖクローンのＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１からプラスミドＤＮＡを取り出した。その後当業者に周知の標準技術に従って、一本鎖ＦｖクローンのＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の塩基配列を決定した。ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の塩基配列は表１に示してあり、それぞれ配列番号１１と配列番号１３となる。また同様に塩基配列のアミノ酸翻訳も表１に示す。それぞれ配列番号１２と配列番号１４となる。ＶＨとＶＬ遺伝子の実体、及び重鎖ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列も同様に表１に記載する。
【実施例３】
【００６２】
ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１によって認識される抗原の初代ＡＭＬサンプル、腫瘍細胞株、及び通常造血幹細胞上における発現
ファージ抗体ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１によって認識される標的抗原の分布を、初代ＡＭＬサンプル、腫瘍細胞株、及び末梢血液由来の通常造血幹細胞を使用し、フローサイトメトリによって分析した。フローサイトメトリ分析のために、様々な細胞を染色する前に、ファージ抗体を最初に等量の４ｗ／ｖ％牛乳蛋白入りのＰＢＳ（ＭＰＢＳ）の中で４℃で１５分間ブロックした。ファージ抗体の細胞への結合は、ビオチン標識抗Ｍ１３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用しその後ストレプトアビジン―アロフィコシアニン又はストレプトアビジン―フィコエリスリン（Ｃａｌｔａｇ）を加えることによって可視化した。ファージ抗体に加え、以下の抗体の組合せを使用した：ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ、ｍｙｃ−ビオチンとストレプトアビジン―ＰＥを用いたＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の間接標識、及びＣＤ３３−ＡＰＣ。細胞を１ｗ／ｖ％ＢＳＡ入りのＰＢＳで２回洗浄し、死細胞およびアポトーシス細胞を除外するために、アネクシンＶ−ＦＩＴＣを補充した標識アネクシンＶ用結合バッファ（Ｃａｌｔａｇ）に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）においてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。最終的な分析のために、弱い側方散乱光とＣＤ４５の発現に基づいて芽細胞のゲートを行った。（コントロール抗体であるＣＲ２４２８による染色と比べて）細胞の２０％以上が目的の抗原を発現していればサンプルは陽性とみなした。
【００６３】
種々の初代ＡＭＬ芽細胞（特にＦＡＢサブタイプ：ＦＡＢ−Ｍ０、ＦＡＢ−Ｍ１、ＦＡＢ−Ｍ２、ＦＡＢ−Ｍ３、ＦＡＢ−Ｍ４、及びＦＡＢ−Ｍ５）のうちＣＤ４５陽性の芽細胞群を、ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１ファージ抗体の結合に関して、ＣＤ３３の発現と直接比較して分析した。ファージ抗体ＳＣ０２−４０１はＦＡＢ−Ｍ０、ＦＡＢ−Ｍ１／２、ＦＡＢ−Ｍ３に対して強い結合を示し、ＦＡＢ−Ｍ５に対しても結合した。ＳＣ０２−４０１はＦＡＢ−Ｍ１、ＦＡＢ−Ｍ２、ＦＡＢ−Ｍ４、ＦＡＢ−Ｍ５ａ及びＦＡＢ−Ｍ５ｂ型の初代ＡＭＬ芽細胞に対してはコントロールファージ抗体ＣＲ２４２８と比較して顕著な結合を示さなかった（表２参照）。
【００６４】
ファージ抗体ＳＣ０２−３６１はＦＡＢ−Ｍ０、ＦＡＢ−Ｍ１、ＦＡＢ−Ｍ１／２、ＦＡＢ−Ｍ２、ＦＡＢ−Ｍ３、ＦＡＢ−Ｍ４、ＦＡＢ−Ｍ５、ＦＡＢ−Ｍ５ａ及びＦＡＢ−Ｍ５ｂ型に対して、コントロールファージ抗体ＣＲ２４２８と比較して強い結合を示した（表３参照）。
【００６５】
造血幹細胞及び非造血幹細胞の両方に由来する一連の腫瘍細胞株の分析により分かったのは、ＳＣ０２−４０１によって認識される抗原の発現は骨髄由来の腫瘍細胞株（ＨＬ６０とＮＢ４）の亜集団に限定したものではないということであり、これは他の腫瘍細胞株、すなわちＵ９３７、Ｋ５６２、２９３Ｔ、ＬＳ１７４Ｔ及びＨＥｐ−２（表４参照）においても発現が見られることによる。ＳＣ０２−３６１によって認識される抗原は骨髄由来の腫瘍細胞株、それに加え腫瘍細胞株Ｕ９３７、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＥｐ−２においても検出できた。
【００６６】
前方及び側方散乱光の特性に基づきリンパ球、単球及び顆粒球の亜集団を選別する（ｇａｔｉｎｇ）ことによりフローサイトメトリ分析を行った。ＡＰＣ標識抗ＣＤ１９抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）でサンプルを染色することにより、リンパ球を更にＢ細胞とＴ細胞に分割した。細胞表面抗原であるＣＤ１４（ＦＩＴＣ標識、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１６（ＦＩＴＣ標識、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３３（ＡＰＣ標識、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を認識する抗体による染色により、末梢血液中の白血球の上記の亜集団を分析した。末梢血液中ではファージ抗体ＳＣ０２−４０１は分析したどの亜集団にも顕著に結合しなかった（表５参照）。ＳＣ０２−３６１は単球と樹状細胞の亜集団を認識したが、顆粒球、Ｂ細胞及びＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、赤血球、血小板には顕著に結合しなかった（表５参照）。
【００６７】
図１と図２で示すのは、それぞれファージ抗体ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１のＡＭＬ細胞に対する結合強度は、健康なドナーの末梢血液の種々の細胞集団に対するファージ抗体の結合強度より極めて高いということであり、抗体によって認識される抗原のＡＭＬにおける過剰発現を示唆している。ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の平均蛍光輝度をＡＭＬと種々の細胞集団に関して計算した。更に言えば、コントロール抗体（ＳＣ０２−００６と呼び、サイログロブリンに結合）の平均蛍光輝度がＡＭＬと種々の細胞集団に関して計算され（データは示さず）、この値はＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の平均蛍光輝度から差し引かれた。
【００６８】
これらの発現データの組合せから、ＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１によって認識される抗原は悪性腫瘍、特にＡＭＬの診断、予防及び／又は治療の良い標的抗原であることが結論づけられる。
【実施例４】
【００６９】
ＣＲ２４０１とＣＲ２３６１のＩｇＧ１分子の産生
制限酵素サイト及び／又はＩｇＧ発現ベクターでの発現のための配列を付加するためのオリゴヌクレオチドを使用して、一本鎖ＦｖのＳＣ０２−４０１とＳＣ０２−３６１の重鎖と軽鎖の可変領域をＰＣＲで増幅した。ＶＬ鎖はオリゴヌクレオチド５Ｋ−Ｃ（配列番号１５）と３Ｋ−Ｃ（配列番号１６）を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに組み込み、塩基配列を当業者に既知の標準技術に従って確認した。ＶＨ遺伝子は５Ｈ−Ｂ（配列番号１７）とＳｙ３Ｈ−ａｒｅｖｅｒｓｅｄ（配列番号１８）を用いて増幅した。その後、ＰＣＲ産物をｐＳｙｎ−Ｃ０３−ＨＣｇｌベクターに組み込み、塩基配列を当業者に既知の標準技術に従って確認した。
【００７０】
５Ｈ−Ｂ
ａｃｃｔｇｔｃｔｔｇａａｔｔｃｔｃｃａｔｇｇｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇ
Ｓｙ３Ｈ−ａｒｅｖｅｒｓｅｄ
ｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃ
５Ｋ−Ｃ
ａｃｃｔｇｔｃｔｃｇａｇｔｔｔｔｃｃａｔｇｇｃｔｇａｃａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｃｃ
３Ｋ−Ｃ
ｃａａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｔａａｇｔｇｃａｃｔｔｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔａａｇｇａａａａ
【００７１】
重鎖と軽鎖の発現コンストラクトを２９３Ｔ細胞に一時的に発現させ、ＩｇＧ１抗体を含む上清を取得した。ＣＲ２４０１の重鎖の塩基配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示す。ＣＲ２４０１の軽鎖の塩基配列を配列番号２３に示し、アミノ酸配列を配列番号２４に示す。ＣＲ２３６１の重鎖の塩基配列を配列番号２１に示し、アミノ酸配列を配列番号２２に示す。ＣＲ２３６１の軽鎖の塩基配列を配列番号２５に示し、アミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【００７２】
抗体は免疫グロブリンに対して一般的に使用される精製方法（例えば国際公開００／６３４０３号公報参照）を用い、プロテインＡカラム及びサイズ排除カラムによって精製した。
【実施例５】
【００７３】
ＣＲ２４０１によって認識される膜抽出性抗原と、ＣＲ２３６１によって認識される膜抽出性抗原の免疫沈降
ＣＲ２４０１が膜抽出性抗原と反応したかどうかを確認するために、生理緩衝液（０．１２Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中にＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンが２ｍｇ含まれる最終濃度で、１０８個のＬＳ１７４Ｔ細胞の細胞表面を室温で１時間ビオチン化した。次に、１０ｍＭグリシン入りの生理緩衝液で、残りの遊離ビオチンを室温で３０分インキュベートしてブロックした。標識した後、細胞を冷やした生理緩衝液で洗浄し、ＴＸ−１００溶解バッファ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、プロテアーゼインヒビタ（Ｒｏｃｈｅ））中に細胞が３×１０７個／ｍＬという濃度で３０分氷上で可溶化した。非可溶性の物質を２０，０００ｇで４℃で３０分の遠心によって除去した。その後、ビオチン化され可溶化された溶解物を、４℃で２時間プロテインＡビーズによって前洗浄した。一方で、４μｇのＣＲ２４０１、コントロール抗体ＣＲ２４２８（ネガティブコントロール）、コントロール抗体ＣＲ２３００ＩｇＧ１（ポジティブコントロール；有核細胞すべてに存在するＣＤ４６に対する抗体）をプロテインＡビーズに室温で結合させた。次に、前洗浄したサンプルをビーズに結合したＩｇＧと４℃で２時間インキュベートした。プロテインＡビーズをＴＸ−１００溶解バッファ１ｍＬで５分間の洗浄を３回行い、サンプルローディングバッファを加えることで結合した複合体を溶出した。サンプルを非還元又は還元条件においてＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＰＶＤＦ膜上にブロッティングした後、ビオチン化された蛋白をストレプトアビジン―ＨＲＰ（Ａｍａｒｓｈａｍ）と強化化学発光（Ａｍａｒｓｈａｍ）によって検出した。
【００７４】
１０８個のＮＢ４細胞と、１ｖ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５ｗ／ｖ％デソキシコレート、０．１ｗ／ｖ％ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、プロテアーゼインヒビタ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ溶解バッファを免疫沈降の目的に使用したという条件で、ＣＲ２３６１が膜抽出性抗原と反応したかを確認するために上記と同様の過程を行った。
【００７５】
ＬＳ１７４Ｔ細胞溶解物のＣＲ２４０１免疫沈降物では、約１５０ｋＤａに１つの大きなバンドと約４５ｋＤａに１つの小さなバンドが検出された。これらのバンドのいずれもネガティブコントロールＩｇＧ１ＣＲ２４２８、又は抗ＣＤ４６ポジティブコントロールＩｇＧ１ＣＲ２３００を使用した免疫沈降物には存在しない（図３参照）。ＣＲ２４０１の免疫複合体の大規模精製のための洗浄と溶出の条件を確立するために、免疫沈降物を１５０ｍＭ−５００ｍＭの種々のＮａＣｌ濃度で洗浄し、また免疫複合体を低ｐＨ（ｐＨ２．７）又は高ｐＨ（ｐＨ１１）バッファを使用してプロテインＡビーズから溶出した。免疫複合体は５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した後も存在しており、一方でこれらはｐＨ１１では溶出されるようになった（データは示さず）。
【００７６】
ＮＢ４細胞溶解物のＣＲ２３６１免疫沈降物では、約３０、４０、７５、１５０ｋＤａに泳動する４つの明確に分かれたバンドが検出された。これらのバンドのいずれもネガティブコントロールＩｇＧ１ＣＲ２４２８、又は抗ＣＤ４６ポジティブコントロールＩｇＧ１ＣＲ２３００を使用した免疫沈降物には存在しない（図４参照）。ＣＲ２３６１の免疫複合体の大規模精製のための洗浄と溶出の条件を確立するために、免疫沈降物を１５０ｍＭ−５００ｍＭの種々のＮａＣｌ濃度で洗浄し、また免疫複合体を低ｐＨ（ｐＨ２．７）又は高ｐＨ（ｐＨ１１）バッファを使用してプロテインＡビーズから溶出した。免疫複合体は５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した後も存在しており、一方でこれらはｐＨ２．７では溶出されるようになった（データは示さず）。
【実施例６】
【００７７】
ＣＲ２４０１又はＣＲ２３６１に反応する免疫複合体の精製
ＣＲ２４０１とＣＲ２３６１の標的抗原を精製するために、当業者に既知の標準技術に従って１．５ｍｇのＣＲ２４０１又はＣＲ２３６１をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂビーズ１ｍＬに結合させ、アフィニティーカラムを作成した。事前にＩｇＧ１を１００ｋＤａ超遠心装置にかけ、不完全なＩｇＧ小フラグメントを除去した。
【００７８】
実施例５で説明した方法に従い、５×１０９個のＬＳ１７４Ｔ細胞の細胞溶解液をＴＸ−１００溶解バッファで生成した。次に、細胞溶解液を０．２２μｍフィルタに通して凝集塊を取り除いた。ブロック後のＣＮＢｒ活性化セファロースＣＬ−４Ｂビーズ６０ｍＬを用いて細胞溶解液を４℃で４時間前洗浄し、次にヒトコントロールＩｇＧ１を結合したＣＮＢｒ活性ビーズ（１ｍｇ  ＩｇＧ１／ｍＬ、Ｃａｐｐｅｌ）５ｍＬを用いて４℃で４時間前洗浄して、細胞溶解液からＩｇＧと非特異的に相互作用する蛋白を取り除いた。次に溶解液を０．２２μｍフィルタに通し不溶性の物質を取り除いた。次にネガティブコントロール抗体ＣＲ２４２８のアフィニティーカラムをＣＲ２４０１に関して説明したように作成し、抗体ＣＲ２４０１のアフィニティーカラムとＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ９００に順次連結した。このシステムをＴＸ−１００バッファ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、プロテアーゼインヒビタ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて平衡化した。細胞溶解液を１ｍＬ／毎分でカラムにかけ、カラムをカラム体積の５倍のＴＸ−１００バッファで洗浄した。その後１５０ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌまでの塩濃度勾配バッファを加え、カラム体積の５倍のＴＸ−１００バッファで洗浄し、カラム体積の５倍のリジン溶液（ｐＨ１１）で溶出した。その時カラム体積の１倍の溶出バッファを加えた後、液流を１０分間停止させて、免疫複合体の放出を促進した。次に、カラムをカラム体積の５倍のＴＸ−１００バッファで再度洗浄した。溶出分画の０．５ｍＬを０．１Ｍクエン酸溶液５０μＬで中和し、サンプル２０μＬを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルで泳動し、当業者に既知の標準技術に従って銀染色を行った。ＣＲ２４０１カラムから溶出した蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によると、１５０ｋＤａの蛋白（矢印で示す）は分画８−１０に特異的にカラムから放出された（図５参照）。分画８はそれに加え１５０ｋＤａよりやや小さい２つの蛋白のバンドを含んだ（アスタリスクで示す）。その後、分画８をＹＭフィルタを使用して５倍に濃縮し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに入れた。１５０ｋＤａのバンドを鋭利な剃刀でゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ又はｎａｎｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔａｎｄｅｍＭＳ（ｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ）によって質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、１２のペプチドを同定した。すなわちＦＥＶＩＥＦＤＤＧＡＧＳＶＬＲ（配列番号２７）、ＡＡＧＴＥＧＰＦＱＥＶＤＧＶＡＴＴＲＹＳＩＧＧＬＳＰＦＳＥＹＡＦＲ（配列番号２８）、ＴＧＥＱＡＰＳＳＰＰＲ（配列番号２９）、ＩＱＬＳＷＬＬＰＰＱＥＲ（配列番号３０）、ＶＳＷＶＰＰＰＡＤＳＲ（配列番号３１）、ＡＨＴＤＶＧＰＧＰＥＳＳＰＶＬＶＲ（配列番号３２）、ＩＩＳＹＴＷＦＲ（配列番号３３）、ＶＡＡＡＭＫＴＳＶＬＬＳＷＥＶＰＤＳＹＫ（配列番号３４）、ＧＳＳＡＧＧＬＱＨＬＶＳＩＲ（配列番号３５）、ＷＦＹＩＶＷＰＩＤＲ（配列番号３６）、ＹＡＮＶＩＡＹＤＨＳＲ（配列番号３７）、及びＴＧＣＦＩＶＩＤＡＭＬＥＲＭＫＨＥＫＴＶＤＩＹＧＨＶＴＣＭＲ（配列番号３８）��あった。１つのペプチド、すなわちＮＶＬＥＬＳＮＷＲ（配列番号３９）をｎａｎｏＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳによって同定した。Ｂｌａｓｔ分析により、これらのペプチドはヒト蛋白ＬＡＲ  ＰＴＰの一部であることを同定した（ＮＩＨ  ＢＬＡＳＴデータベース上のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ４５０６３１１参照）。ヒトＬＡＲ  ＰＴＰのアミノ酸配列も配列番号４０に記載した。
【００７９】
ＣＲ２４０１によって認識される標的抗原としてＬＡＲ  ＰＴＰの同定を固定するために、精製した分画８、ネガティブコントロール分画、ポジティブコントロールの細胞溶解液、及びＣＲ２４２８、ＣＲ２３００、ＣＲ２４０１の免疫沈降溶解物を、ＬＡＲ  ＰＴＰ特異的なマウスモノクローナル抗体を使用して、ＬＡＲ  ＰＴＰの存在について分析した。５５と２５ｋＤａ付近に泳動する免疫グロブリンのバンドとの交差反応を防ぐため、サンプルを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＰＶＤＦ膜上にブロットした後、膜を４％非脂肪ミルク粉末を含むＴＢＳＴバッファに浸し、１μｇ／ｍＬの抗ＬＡＲ  ＰＴＰマウスモノクローナル抗体（ＢＤ）（含ミルクＴＢＳＴ中）と室温で１時間インキュベートし、その後ＴＢＳＴで５分間の洗浄を３回行った。次に、膜をＨＲＰ標識抗マウスウサギ抗体（ＤＡＫＯ）（含ミルクＴＢＳＴ中に１μｇ／ｍＬ）と室温で１時間インキュベートした。最後に、膜を更にＴＢＳＴで洗浄した後ＰＢＳでの洗浄過程を経て、反応性蛋白を化学発光検出システム（ＥＣＬ）によって検出した。図６に示すように、ＬＡＲ  ＰＴＰはＣＲ２４０１の免疫沈降物で検出され、一方でネガティブコントロール（ＣＲ２４２８）とポジティブコントロール（ＣＲ２３００）の免疫沈降物からは反応性のバンドは検出されなかった。更には、ＬＡＲ  ＰＴＰは細胞溶解液と溶出分画には存在したが、コントロール分画には存在しなかった。溶出分画のうち更に２つの分子量のやや低いバンドが同様に抗ＬＡＲ  ＰＴＰマウス抗体と反応した。これらのバンドは上の図５のアスタリスクで示したように、溶出分画の銀染色のゲル上で同様に観察された、ＬＡＲ  ＰＴＰの分解産物と見込まれるものである可能性がある。
【００８０】
ＣＲ２３６１の標的抗原を精製するために、ＣＲ２４０１に関して上記で説明したようにアフィニティーカラムを作成した。実施例５で説明した方法に従い、４×１０９個のＮＢ４細胞の細胞溶解物をＲＩＰＡバッファで作成した。細胞溶解物を実質的に上記で説明したように処理し、ＣＲ２３６１アフィニティーカラムとＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ９００に順次連結したネガティブコントロールのアフィニティーカラムにかけた。このシステムをＲＩＰＡバッファで平衡化した。細胞溶解物を１ｍＬ／分でカラムにかけ、カラム体積の５倍のＲＩＰＡバッファで洗浄した。その後１５０ｍＭから５００ｍＭまでの塩濃度勾配バッファを加え、カラム体積の５倍のＴＸ−１００バッファ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、プロテアーゼインヒビタ（Ｒｏｃｈｅ））で洗浄し、カラム体積の５倍のグリシン溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。その時カラム体積の１倍の溶出バッファを加えた後液流を１０分間停止させて、免疫複合体の放出を促進した。次に、カラムをカラム体積の５倍のＴＸ−１００バッファで洗浄した。溶出分画の０．５ｍＬを２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２０μＬで中和し、サンプル２０μＬを非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルで泳動し、当業者に既知の標準技術に従って銀染色を行った。ＣＲ２３６１カラムから溶出した蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によると、分子量が３０、４０、７５及び１５０ｋＤａの蛋白（図７において矢印と記号Ｅ，Ｆ、Ｇ、Ｈで示す）がカラムから放出された。４つのバンドを鋭利な剃刀で切り出し、脱染色し、ゲル中でトリプシンで分解した。使用した条件はＰａｐｐｉｎ等に従った。簡単に説明すると、脱染色は３０ｍＭフェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）と１００ｍＭチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）の新しく調製した１：１の混合液を使用して行った。ゲルのバンドを、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３を含む３０％アセトニトリル溶液で３回洗浄し、次に純粋アセトニトリル中に置き乾燥させた。トリプシン分解を３７℃で一晩行った（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）４．２μＬ中にトリプシン７５ｎｇ）。分解後、６０％アセトニトリル／１％ＴＦＡ溶液でペプチドを溶出した。製造者の説明書に従い、Ｃ１８−Ｚｉｐ  Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してサンプルを脱塩した。溶出したペプチドを１：１でＭＡＬＤＩマトリックス（２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）：２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸＝９：１）と混合し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。結果として生じるペプチド質量を用い、Ｐｒｏ  Ｆｏｕｎｄソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して、ＮＣＢ  Ｉｎｒデータベースについてデータベース検索を行った。
【００８１】
３０、４０、７５ｋＤａの蛋白から数個のペプチドを同定した。１５０ｋＤａ蛋白からはペプチドが同定されなかった。３０ｋＤａバンドから同定されたペプチドはＭＳＷＬＦＧＩＮＫ（配列番号４１）、ＴＬＳＥＥＴＲ（配列番号４２）、ＱＴＶＬＥＳＩＲＴＡＧＴＬＦＧＥＧＦＲ（配列番号４３）、及びＬＧＫＰＳＬＶＲ（配列番号４４）であった。４０ｋＤａバンドから同定されたペプチドはＷＳＮＦＤＰＴＧＬＥＲ（配列番号４５）、ＩＴＶＬＥＡＬＲ（配列番号４６）、及びＣＳＥＶＡＲＬＴＥＧＭＳＧＲ（配列番号４７）であった。７５ｋＤａバンドから同定されたペプチドはＡＡＲＥＬＥＨＳＲ（配列番号４８）、ＱＲＹＥＤＱＬＫ（配列番号４９）、ＤＩＡＩＡＴＲ（配列番号５０）、ＡＴＬＮＡＦＬＹＲ（配列番号５１）、ＭＹＦＤＫＹＶＬＫＰＡＴＥＧＫ（配列番号５２）、ＬＡＱＦＤＹＧＲ（配列番号５３）、及びＶＱＤＡＶＱＱＨＱＱＫＭＣＷＬＫＡＥＧＰＧＲ（配列番号５４）であった。３０ｋＤａバンドと４０ｋＤａバンドから同定されたペプチドはＧＬＧＤＲＰＡＰＫ（配列番号５５）、ＡＴＶＥＲＥＭＥＬＲ（配列番号５６）、ＡＥＲＥＮＡＤＩＩＲ（配列番号５７）、ＮＡＴＬＶＡＧＲ（配列番号５８）、及びＮＩＬＭＹＧＰＰＧＴＧＫ（配列番号５９）であった。最後に、３０、４０及び７５ｋＤａバンドから同定されたペプチドはＧＥＧＡＧＰＰＰＰＬＰＰＡＱＰＧＡＥＧＧＧＤＲ（配列番号６０）及びＱＱＱＬＬＮＥＥＮＬＲ（配列番号６１）であった。Ｂｌａｓｔ分析により、これらのペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を持つヒト蛋白の一部であることを同定した（ＮＩＨ  ＢＬＡＳＴデータベース上のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＨ６３６０７参照）。この蛋白にはＡＴＡＤ３Ａという名称が付けられているが、この蛋白については何の機能も割り当てられていない。ＡＴＡＤ３Ａの塩基配列は配列番号５の塩基配列を有する。
【００８２】
ＣＲ２３６１によって認識される標的抗原としてＡＴＡＤ３Ａの同定を確認するために、製造者より供給されるプロトコールに従いｎｕｃｌｅｏｔｒａｐ  ｍＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してｍＲＮＡを２×１０７個のＮＢ４細胞から抽出した。その後、単離したｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲのために、以下のプライマを設計した：順方向プライマ５’−ＧＴＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧＴＧＧＣ−３’（配列番号６２）と逆方向プライマ５’−ＧＧＡＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＧＧ−３’（配列番号６３）。５％ＤＭＳＯ存在下でＰｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰＣＲを行い、１８００塩基の産物を得た。結果として生じたフラグメントをｐＣＲ４ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に組み込み、ＤＨ５α細胞に形質転換した。結果として生じたプラスミドのクローンをシーケンシング分析で確認し、データベース上に存在する配列とアラインメントした。この蛋白コンストラクトを次にＥｃｏＲＩで切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏの対応する場所に組み込み、ＡＴＡＤ３ＡｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏコンストラクトを作成した。次のトランスフェクション実験において蛋白の検出を簡便化するために、ＰＣＲを手段として（コンストラクトを鋳型として）この蛋白を５’末端もしくは３’末端でｍｙｃタグと融合させた。５’ｍｙｃコンストラクトのために以下のプライマを設計した：順方向プライマ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧ−３’（配列番号６４）と、逆方向プライマ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号６５）。３’ｍｙｃコンストラクトのために、ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＡ上のｍｙｃタグと蛋白のフレームが一致するようプライマを設計した。この場合、順方向プライマが５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧＴＧＧＣ−３’（配列番号６６）で、逆方向プライマが５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号６７）であった。Ｐｆｕポリメラーゼを使用してＰＣＲを行い、結果として生じる５’ｍｙｃタグのフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに組み込みｍｙｃＡＴＡＤ３Ａコンストラクトを作成し、一方結果として生じる３’ｍｙｃタグのフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１／ｈｉｓｍｙｃＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩサイトに組み込みＡＴＡＤ３Ａｍｙｃコンストラクトを作成した。これらのコンストラクトをシーケンシングで確認した。全ての組み込み過程を当業者には既知の標準的な分子技術に従って行った。上記の発現コンストラクト、つまりＡＴＡＤ３Ａ、ｍｙｃＡＴＡＤ３Ａ、ＡＴＡＤ３Ａｍｙｃ、そして細胞表面受容体ＣＤ３８を発現するポジティブコントロールコンストラクトにより、製造者から供給されるプロトコールに従い、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて２×１０７個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後��、細胞を回収し、ＦＡＣＳ分析のために上記の実施例３で説明したようにファージ抗体ＳＣ０２−３６１で染色した。染色した細胞をフローサイトメトリで分析したが、ＳＣ０２−３６１はトランスフェクションした細胞のいずれも染色せず、蛋白が細胞表面には発現していないことを示唆している。しかし、当業者に既知の過程に従った抗ｍｙｃ抗体を使用したトランスフェクションした細胞の細胞溶解物のウェスタンブロッティング分析では、おそらく細胞の内側で蛋白が発現されていることが判明した。次に、ＡＴＡＤ３Ａ、ｍｙｃＡＴＡＤ３Ａ、ＡＴＡＤ３ＡｍｙｃによりトランスフェクションされたＨＥＫ９３Ｔ細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００バッファに溶解し、その後上記で説明したように、胞溶解物をビオチン化してＣＲ２３６１とコントロール抗体ＣＲ２３００及びＣＲ２４２８で免疫沈降を行った。抗ｍｙｃ抗体によって行った免疫ブロッティングでは、３’又は５’ｍｙｃ標識されて細胞質分画に存在する蛋白が、ＣＲ２３６１によって免疫沈降され、コントロール抗体では免疫沈降されないことが分かった（図８参照）。ＮＢ４細胞又はトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のビオチン化された全細胞溶解液の免疫沈降では、クローニングした蛋白の分子量は７５ｋＤａに存在するバンドに相当することが分かった（図９参照）。
【００８３】
【表１】
2008515449.tif 000002
【００８４】
【表２】
2008515449.tif 000003
【００８５】
【表３】
2008515449.tif 000004
【００８６】
【表４】
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【００８７】
【表５】
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【００８８】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、健康なドナーの末梢血液で、異なる細胞集団へのファージ抗体の結合強度に関して、ファージ抗体ＳＣ０２−４０１のＡＭＬへの結合強度（平均蛍光で表す）を示す図である。
【図２】図２は、健康なドナーの末梢血液で、異なる細胞集団へのファージ抗体の結合強度に関して、ファージ抗体ＳＣ０２−３６１のＡＭＬへの結合強度（平均蛍光で表す）を示す図である。
【図３】図３は、ネガティブコントロールＩｇＧ１（ＣＲ２４２８；左のレーン）、ＣＤ４６に対するポジティブコントロールＩｇＧ１（ＣＲ２３００；中間のレーン）又はＩｇＧｌ  ＣＲ２４０１（右側のレーン）によって免疫沈降するＬＳ１７４Ｔ細胞溶解物の免疫ブロットを示す図である。ブロットの左側に、分子量マーカーを示す。
【図４】図４は、ネガティブコントロールＩｇＧ１（ＣＲ２４２８；左のレーン）、ＣＤ４６に対するポジティブコントロールＩｇＧ１（ＣＲ２３００；中間のレーン）又はＩｇＧ１  ＣＲ２３６１（右側のレーン）によって免疫沈降するＮＢ４細胞溶解物の免疫ブロットを示す図である。ブロットの左側に、分子量マーカーを示す。
【図５】図５は、ＣＲ２４０１の親和性カラムから溶出した蛋白質の銀染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、分画８−１０でカラムから特に放出される興味の対象であるタンパク質（１５０ｋＤａ）を示す。アスタリスクは、１５０ｋＤａより若干小さい２つのタンパク質のバンドを示す。ブロットの左側に、分子量マーカーを示す。
【図６】図６は、ネズミ抗ＬＡＲ  ＰＴＰ抗体を用いた免疫ブロットを示す図である。左側に、分子量マーカーを示す。左から右に、ネガティブコントロール抗体ＣＲ２４２８の免疫沈降物、抗体ＣＲ２４０１の免疫沈降物、ポジティブコントロール抗体ＣＲ２３００の免疫沈降物、精製分画、精製したコントロール分画及び完全なＬＳ１７４Ｔ細胞溶解物を示す。
【図７】図７は、ＣＲ２３６１の親和性カラムから溶出した蛋白質の銀染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、分画９−１２でカラムから、特に放出される興味の対象であるタンパク質を示す（３０、４０、７５及び１５０ｋＤａはそれぞれＥ、Ｆ、Ｇ及びＨ）。左側に、分子量マーカーを示す。
【図８】図８は、ＡＴＡＤ３Ａ、ｍｙｃＡＴＡＤ３Ａ及びＡＴＡＤ３Ａｍｙｃコンストラクト（それぞれ、ブロットの右側、左側及び真中部分）によってトランスフェクトされたＨＥＫ９３Ｔ細胞の免疫ブロットを示す図である。細胞は溶解され、得られた細胞溶解液はビオチン化され、ネガティブコントロール抗体ＣＲ２４２８、ポジティブコントロール抗体ＣＲ２３００及び抗体ＣＲ２３６１によって免疫沈降された。免疫ブロットを抗ｍｙｃにより発色させた。左側に、分子量マーカーを示す。
【図９】図９は、細胞表面をビオチン化したＮＢ４細胞溶解物のＣＲ２３６１による免疫沈降物（左のレーン）と、ＡＴＡＤ３ＡｍｙｃによってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の完全な細胞溶解物（右側のレーン）の免疫ブロットを示す図である。ブロットの左側に、分子量マーカーを示す。
【図３】
2008515449.tif 000007
【図４】
2008515449.tif 000008
【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＬの診断過程において、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、前記ポリペプチドをエンコードする核酸分子、前記ポリペプチドに結合することができる結合分子、少なくとも前記結合分子を含む免疫複合体、または少なくとも前記ポリペプチド、核酸分子若しくは結合分子を含む医薬品組成物を用いる方法。
【請求項２】
ＡＭＬの検出、予防、処置またはその組合せに対する薬物の調製のために、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、前記ポリペプチドをエンコードする核酸分子、前記ポリペプチドに結合することができる結合分子、少なくとも前記結合分子を含む免疫複合体、または少なくとも前記ポリペプチド、前記核酸分子若しくは前記結合分子を含む医薬品組成物を用いる方法。
【請求項３】
ＡＭＬの診断過程において、白血球抗原関連受容体チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ  ＰＴＰ）、前記ＬＡＲ  ＰＴＰをエンコードする核酸分子、前記ＬＡＲ  ＰＴＰに結合することができる結合分子、少なくとも前記結合分子を含む免疫複合体、または少なくとも前記ＬＡＲ  ＰＴＰ、核酸分子若しくは結合分子を含む医薬品組成物を用いる方法。
【請求項４】
ＡＭＬの検出、予防、処置またはその組合せに対する薬物の調製のために、白血球抗原関連受容体チロシンホスファターゼ（ＬＡＲ  ＰＴＰ）、前記ＬＡＲ  ＰＴＰをエンコードする核酸分子、前記ＬＡＲ  ＰＴＰに結合することができる結合分子、少なくとも前記結合分子を含む免疫複合体、または少なくとも前記ＬＡＲ  ＰＴＰ、前記核酸分子若しくは前記結合分子を含む医薬品組成物を用いる方法。
【請求項５】
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、特異的に結合することができる結合分子。
【請求項６】
請求項５に記載の結合分子において、前記結合分子が、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子。
【請求項７】
白血球抗原関連受容体チロシンホスファターゼに特異的に結合することができる結合分子であって、前記結合分子は配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む結合分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の結合分子において、前記結合分子がヒトのものであることを特徴とする結合分子。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の結合分子とタグとを含む免疫複合体。
【請求項１０】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の結合分子をエンコードする核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の少なくとも一つの核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の少なくとも一つのベクターを含むホスト。
【請求項１３】
請求項１２に記載のホストにおいて、前記ホストがヒト細胞から由来の細胞であることを特徴とするホスト。
【請求項１４】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の結合分子又は請求項９に記載の免疫複合体と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬品組成物。
【請求項１５】
薬物として使用するために、請求項５〜８のいずれか１項に記載の結合分子、請求項９に記載の免疫複合体または請求項１４に記載の医薬品組成物を使用する方法。
【請求項１６】
癌の検出、予防、処置またはその組合せに対する薬物の調製のために、請求項５〜８のいずれか１項に記載の結合分子、請求項９に記載の免疫複合体または請求項１４に記載の医薬品組成物を使用する方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記癌がＡＭＬであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号５のヌクレオチド配列を含む核酸分子と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬品組成物。
【国際調査報告】
2008515449.tif 000016
2008515449.tif 000017
2008515449.tif 000018