(57)【要約】  本発明はポリエン特異的なシトクロムP450水酸化酵素検出に使うプライマー序列と、これを利用したポリエン生産菌株選別方法に関する。より詳しくは、本発明はポリエン特異的CYP(シトクロムP450水酸化酵素)暗号化序列；(I)：5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'、（II)：5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'に存在する保存領域に対して相補的な、序列(I)の正方向縮退性プライマー及び序列(II)の逆方向縮退性プライマーに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエン特異的なCYP(シトクロムP450水酸化酵素)暗号化序列の保存領域に相補的な、次の序列（I）の正方向縮退性プライマーと次の（II）の逆方向縮退性プライマー；
（I）5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'
（II）5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'
前記序列で、Sはグアニン又はシトシンを示し、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを示し、Yはチミン又はシトシンを示し、Wはチミン又はアデニンを示す。
【請求項２】
i)ポリエン特異的なCYP暗号化序列の保存領域に相補的な縮退性プライマー、四種類のデオキシヌクレオチド、及び、DNA重合酵素を菌の遺伝体に加える段階；そしてii)前記保存領域の複製を確認する段階を含む、ポリエン系化合物を生産する菌の検索方法。
【請求項３】
前記i)段階の縮退性プライマーが、次の序列（I）の正方向縮退性プライマーと次の序列（II）の逆方向縮退性プライマーであることを特徴とする、請求項２に記載の方法：
（I）5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'
（II）5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'
前記序列で、Sはグアニン又はシトシンを示し、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを示し、Yはチミン又はシトシンを示し、Wはチミン又はアデニンを示す。
【請求項４】
前記ii)段階が電気泳動の方法で遂行されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ii)段階が蛍光物質に標識されたデオキシヌクレトチドが利用されたPCR方法を通じて遂行されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］  本発明はポリエン特異的なシトクロムP450水酸化酵素検出に使うプライマー序列と、これを利用したポリエン生産菌株選別方法に関する。より詳しくは、本発明はポリエン特異的CYP(シトクロムP450水酸化酵素)暗号化序列；（I）：5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'、（II）：5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'に存在する保存領域に対して相補的な、序列（I）の正方向縮退性プライマー及び序列（II）の逆方向縮退性プライマーに関する。
【０００２】
前記序列で、Sはグアニン又はシトシンを示し、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを示し、Yはチミン又はシトシンを示し、Wはチミン又はアデニンを示す。
［背景技術］
本発明でポリエンというのは多数の二重結合を有する有機化合物の総称である。一般的にポリエン系列の抗生物質はポリエンマクロライドとも言う。すなわち、大きい環状のラクトン構造を有したマクロライド抗生物質の中で、3個以上の共役二重結合(conjugated double bond)を有した抗生物質を言う。
【０００３】
ポリエン系列の抗生物質は20個ないし40個の炭素からなる巨大なマクロラクトン(macrolactone)リング構造を有し、分子内に約4ないし7個の共役二重結合(conjugated double bond)を含む。また、ポリエン系列の抗生物質は、抗真菌活性を有する。これらは共役二重結合のため、特定波長のUVを吸収し、共役二重結合の数によって、テトラエン、ペンタエン(pentaen)、ヘキサエン、ヘプタエンなどに分類される。カンディダを含んだ酵母、かび及びトリコモナスなどは、ポリエン系列の抗生物質として有効であり、アムホテリシンB(amphotericin B)、ピマリシン(pimaricin)、ペンタマイシン(pentamycin) などが既に臨床的に使われている。
【０００４】
現在まで報告された大部分のポリエン系列の抗生物質は主に放線菌(actinomycetes)によって生合成されると知られている。放線菌は胞子を形成して、フィラメント形態の菌糸体を成し、周りの環境変化に従って独特の形態的分化を起こすグラム陽性土壌微生物として、抗生剤または抗癌剤のような多様な種類の有用な生理活性物質を生産する菌株である。
【０００５】
ポリエン系化合物は真菌類の細胞膜に存在するステロール(sterol)と結合してチャンネル(channel)を形成し、K+、Mg2+などの細胞内成分を細胞外へ漏出させる代謝障害を起こすことで、かび及び酵母のような真菌類に対する優秀な抗真菌活性を有すると知られている。したがって、ポリエン系化合物はステロール(sterol)のない細菌には作用しない。
【０００６】
ポリエン化合物はこれらが有する強い毒性副作用によって、医薬品としての使用が限定的であるが、卓越な抗真菌活性によって、新規及び改良されたポリエンマクロライド(polyene macrolide)抗生物質の開発が要求されている。
【０００７】
現在ナイスタチン(nystatin)、アムホテリシン(amphotericin)、ピマリシン(pimaricin)、カンジシジン(candicidin)などの代表的なポリエン系列化合物を合成する放線菌に対する研究が活発に進行されているし、最近これら生産菌株からポリエン生合成に関与する遺伝子群(gene cluster)に対する遺伝情報塩基序列が完全に解読された。
【０００８】
このように糾明された遺伝情報にて、ポリエン(polyene)生合成に共通的に要求されるポリケタイドシンターゼ(PKS, polyketide synthase)、トランスポート(transport)、レギュレーター(regulator)、ポリケタイド形成後変化(post-polyketide modification)を主とする遺伝子らが遺伝自群に含まれていることが明かされた。
【０００９】
一般的にポリエン系列の化合物が生合成されるためには、反復的な炭素重合反応であるポリケタイド生合成(polyketide biosynthesis)が先行され、続いてポリケタイド合成後変化(post-polyketide modification)が行われる。特にこれらの過程で、シトクロムP450系列の特定水酸化酵素であるシトクロムP450水酸化酵素(CYP)による位置特異的なヒドロキシ化が起きればこそ、ポリエン本来の活性を有した化合物になることが知られている。
【００１０】
シトクロムP450水酸化酵素(CYP)は、酸素結合部位(oxygen binding site)とヘムリガンドポケット(heme legand pocket)の保存領域を含んでおり、これら蛋白質は多様な前駆抗生物質の活性化と難分解性物質の解毒作用に関与する。またCYPは、ポリケタイド、脂肪酸、ステロイドを含めた多くの種類の化合物を基質にして、さまざまな酸化反応を触媒する酵素である。
【００１１】
ポリエンに特異的に作用するCYPの遺伝子は、一般的なCYP系列の水酸化酵素遺伝子らが有する酸素結合部位とヘムリガンドポケットの保存された序列以外にも追加的に保存領域(conserved region)を有する。このような追加的な保存領域塩基序列を図2に示した。
【００１２】
このような新規のポリエンマクロライドの開発のために、ポリエンを生産する能力のある菌株を検索する効果的な方法の開発が要求されている。
このようなポリエン生合成遺伝子らに対する分子遺伝学的研究が続けられる一方、既存の伝統的な菌株選別法を通じるポリエン生合成菌株発掘ではなく、菌株の遺伝子でポリエン生合成に必須的に要求される特定遺伝子の存在有無を検索して新規ポリエン生産菌株を選別することができる、いわゆる遺伝体研究に基づくインシリコ新薬開発(genomics-based in silico drug development)戦略が試みられている。
【００１３】
遺伝体基盤のインシリコ新薬開発戦略というのは、新薬を開発する場合において微生物を分離し、分離された微生物から該当の遺伝子を捜し出す従来の方法の代わりに、有用微生物の遺伝体情報から抗生剤や有用物質を合成することができる能力を持った有用微生物を捜し出すことを言う。即ち、このように得られた遺伝体情報から該当微生物が遺伝体上に抗生剤や有用物質を合成することができる能力を持っているが、さまざまな条件が最適化されなくて有用物質を合成することができなかった微生物までも、新薬開発に応用することができるようにするための戦略を指している。
【００１４】
したがって、当業界ではポリエン特異的なCYP遺伝子情報を確保し、これを微量試料から増幅検出して、抗真菌及び抗ウイルス活性を有したポリエン生産菌株を検索する遺伝体基盤のインシリコ技術の開発が切実に要求されてきた。
［発明の開示］
［技術的課題］
従って、本発明の基本的な目的は、ポリエン特異的CYP(シトクロムP450水酸化酵素)暗号化遺伝子序列の保存領域に相補的で、前記保存領域の増幅のために効果的に使われることができる、次の序列（I）の正方向縮退性プライマーと次の（II）の逆方向縮退性プライマーを提供することである：（I）：5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'、（II）：5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'。
【００１５】
前記序列で、Sはグアニン又はシトシンを示し、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを示し、Yはチミン又はシトシンを示し、Wはチミン又はアデニンを示す。
本発明の縮退性プライマーは、検索対象菌株の遺伝子に存在するCYP遺伝子の特定部分を選択的に増幅して検出する。このプライマーは、ポリエン特異的CYP遺伝子の特定保存領域に結合し、それゆえに、ポリエン生合成機能を有する菌株の検索のためのPCR反応用プライマーとして用いられる。
【００１６】
本発明の他の目的は、i)ポリエン特異的CYP暗号化序列の保存領域に相補的な縮退性プライマー、四種類のデオキシヌクレオチド、及び、DNA重合酵素を菌株の遺伝体に加える段階；そしてii)DNA複製可否を確認して前記菌株がポリエンを生産することができるかの可否を確認する段階を含む、ポリエン生産菌株の検索方法を提供することである。
［技術的解決方法］
前述の本発明の目的は、ポリエン特異的CYP(シトクロムP450水酸化酵素)暗号化序列の保存領域に相補的な、次の(I)の正方向縮退性プライマーと次の(II)の逆方向縮退性プライマー：(I)5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'；そして(II)5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'を提供することで達成される。
【００１７】
前記序列で、Sはグアニン又はシトシンを示し、Vはアデニン、グアニン又はシトシンを示し、Yはチミン又はシトシンを示してWはチミン又はアデニンを示す。
縮退性プライマーというのは、一部塩基位置が一つ以上の可能な塩基を含むDNA断片である。この縮退性プライマーは、多くの類似した序列を増幅するために用いることができる。
【００１８】
本発明の縮退性PCR正方向プライマーPEH-1(degenerate PCR forward primer PEH-1)は、5'-TGGATCGGCGACGACCGSVYCGT-3'であり、ここでSはGまたはCを、VはAまたはGまたはCを示し、YはTまたはCを示す。本発明の縮退性PCR逆方向プライマーPEH-2(degenerate PCR reverse primer PEH-2)は、5'-CCGWASAGSAYSCCGTCGTACTT-3'であり、ここでWはTまたはAを示し、SはGまたはCを示し、YはTまたはCを示す。
【００１９】
ポリエン特異的なCYP遺伝子クローニングのための縮退性PCRプライマー(degenerate PCR primer)を製作するために既存に明かされたポリエン生合成に関与するCYP遺伝子の塩基序列は、比較分析されるべきである。ポリエン生合成と関わるCYP遺伝子の序列を図2に示した。
【００２０】
本発明の他の目的は i)ポリエン特異的CYP暗号化序列の保存領域に相補的な縮退性プライマー、四種類のデオキシヌクレオチド；デオキシアデノシン-三リン酸(2'-Deoxyadenosine 5'-triphosphate, dATP)、デオキシシチジン-三リン酸(2'-Deoxycytidine 5'-triphosphate, dCTP)、デオキシグアノシン-三リン酸(2'-Deoxyguanosine 5'-triphosphate, dGTP)、デオキシチミジン-三リン酸(2'-Deoxythymidine 5'-triphosphate, dTTP)、及び、DNA重合酵素を、菌株の遺伝子に加える段階；そしてii)DNA複製可否を確認して前記菌株がポリエンを生産することができるかの可否を確認する段階を含む、ポリエン生産菌検索方法を提供することで達成される。
【００２１】
本発明のプライマーを用いてポリエン特異的なCYP暗号化遺伝子の保存領域を増幅することができる。またこれを電気泳動してポリエン特異的なCYP暗号化遺伝子が菌株に存在するか否かを知ることができるようになる。
【００２２】
本発明者らは本発明の縮退性プライマーを利用してPCRを遂行し、ポリエン特異的なCYPとポリエン生合成遺伝子を有する放線菌を検索した。前記PCR遂行の後に、ポリエン生合成遺伝子を持っている菌株より得たPCR産物から約350bpで増幅された遺伝子断片が確認された。しかし、ポリエン生合成遺伝子を持っていない菌株より得たPCR産物からは、約350bpで増幅された遺伝子断片は確認されなかった。
［有利な効果］
以上説明したように、ポリエン特異的なCYP遺伝子検出のためのPCRを遂行すると、既存の伝統的な菌株を利用して新規ポリエン化合物の検出法でポリエン生産可否が確認されなかったシュードノカルジアオートトロフィカ(P. autotrophica)遺伝体とセベキアベニハナ(S. benihana)遺伝体で、新規ポリエン特異的なCYP遺伝子を検出することができる。
［発明の実施のための最善の形態］
以下、本発明を下記の実施例を通じて、より具体的に説明するが、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲をこれら実施例だけで限定しようとするのではない。
〔実施例１〕
＜縮退性プライマー(degenerate primer)製作＞
放線菌類のCYPsは互いに類似したアミノ酸序列を有し、特に酸素結合部位とヘムリガンドポケットでの塩基序列の類似性が非常に高い。しかし、このような二つの序列外にポリエン生合成にのみ特異的に関与するCYP蛋白質には互いに類似した保存領域が存在する。
【００２３】
本発明ではポリエン特異的なCYPを検出するためにポリエン生合成にのみ特異的に関与するCYP蛋白質の保存領域のアミノ酸序列を利用して縮退性プライマーを製作した。本発明の縮退性プライマー製作に利用された保存領域は図2に実線で表示した。
〔実施例２〕
＜ポリエン特異的なCYP検出法及び菌株培養方法＞
ポリエン特異的なCYP検索に使われた菌株としては、ポリエン生合成遺伝子を持たない放線菌3種ストレプトマイセスコエリコロルM145(Streptomyces coelicolorM145)、ストレプトマイセスエバーミチリス(Streptomyces avermitilis, ATCC31267)、ストレプトマイセスプセチウス(Streptomyces peucetius, ATCC29050)と、ポリエン生産菌株2種ストレプトマイセスノドサス(Streptomyces nodosus, KCTC9035)、ストレプトマイセスヌールゼイ(Streptomyces noursei, KCTC1083)、そしてポリエン生合成可否が糾明されない稀少放線菌2種シュードノカルジアオートトロフィカ(Pseudonocardia autotrophica, KCTC9441)、セベキアベニハナ(Sebekia benihana, KCTC9660)を含む、合計7種が使われた。
【００２４】
それぞれの菌株はR2YE液体培地で菌糸体(mycelium)状態で成長させた後、20%グリセロールストックで−20℃に冷凍保管して使用した。またそれぞれの遺伝体DNA群(genomic DNA)分離に使われる菌体を得るために、YEME(スクロース 340g, イースト・エキス, 3g, Bacto-peptone 5g, マルト・エキス 3g, グルコース 10g, D.W. 1L)液体培地にストックを充分に接種した。28℃で5日間培養した後、遠心分離機(8000rpm)を利用して菌体を収穫した。
〔実施例３〕
＜重合酵素連鎖反応(PCR)遂行＞
本発明の実施例１で製作した縮退性プライマー双とTaq重合酵素(polymerase)、デオキシアデノシン-三リン酸(2'-Deoxyadenosine 5'-triphosphate, dATP)、デオキシシチジン-三リン酸(2'-Deoxycytidine 5'-triphosphate, dCTP)、デオキシグアノシン-三リン酸(2'-Deoxyguanosine 5'-triphosphate, dGTP)、デオキシチミジン-三リン酸(2'-Deoxythymidine 5'-triphosphate, dTTP)を、実施例２で培養した各種放線菌の遺伝体に加えてラピッド・サーマルサイクラー(Idaho technology, USA)を利用して96℃で30秒間変性(denature)させて、40℃で30秒間プライマー付着(annealing)させた後、72℃ で35秒間延長(extention)させた。これを30回繰り返してPCRを遂行した。
［発明の実施のための形態］
〔実施例４〕
＜ポリエン特異的なCYP検出法結果＞
ポリエン特異的なCYP遺伝子分離のためのPCR遂行をした後、電気泳動をした結果、既存にポリエン生産菌株として報告されたストレプトマイセスノドサス(S.  nodosus)とストレプトマイセスヌールゼイ(S. noursei)では予想した大きさである約350bpで増幅された遺伝子断片を確認することができた。しかし、ポリエン生合成遺伝子を持っていないストレプトマイセスコエリコロル(S. coelicolor)、ストレプトマイセスエバーミチリス(S. avermitilis)、そしてストレプトマイセスプセチウス(S. peucetius)では予想された大きさの増幅されたDNA断片が検索されなかった。
【００２５】
このような結果は、大部分の放線菌に数十種類の類似したCYPが存在するにもかかわらず、本研究で使った縮退性プライマーを利用してポリエン特異的なCYP遺伝子を選択的に検出することができることを表している。
【００２６】
特にポリエン特異的な縮退性プライマーを利用してポリエン生産可否が確認されない稀少放線菌シュードノカルジオートトロフィカ遺伝体から、ポリエン特異的なCYPに推定される約350bpの遺伝子断片が増幅された。
〔実施例５〕
＜シュードノカルジアオートトロフィカ遺伝体のポリエン特異的なCYPに推定される塩基序列分析＞
シュードノカルジアオートトロフィカのポリエン特異的なCYPに推定される約350bpのPCR断片をpGEMT-easy vector(Promega, USA)にクローニングして塩基序列を分析した結果、増幅された遺伝子断片は、既存に報告されたポリエン特異的なCYP遺伝子と高い類似性を見せる新規ポリエン特異的なCYP遺伝子であることが判明した。
［産業上の利用可能性］
従来の技術によると、ポリエン系化合物生産可否が知られていない菌株がポリエン系化合物を生産するか否かを確認するためには当該菌株を直接培養してポリエン系化合物が生成されるのかの可否を確認しなければならないので多くの時間と努力が必要だった。特に、培養条件が複雑で難しい稀少菌らからポリエン系化合物の生産可否を判断するには、より多くの時間と努力が要求された。
【００２７】
本発明の縮退性プライマーと本発明の方法を使って、多様な種類の菌株らのポリエン系化合物生産能力を、より迅速且つ容易に判断することができる。
［序列目録テキスト］
添付ファイルHSPA0403.APP
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗真菌及び抗ウイルス活性を有するポリエン系列の抗生物質を示す化学式である。
【図２】ポリエン特異的なCYPアミノ酸序列の保存領域を示した図である。
【図３】CYP遺伝子分離のためのPCR結果物を電気泳動した写真である。
【図４】シュードノカルジアオートトロフィカ(P. autotrophica)のポリエンに特異的に作用するCYPに推定される約350bpのPCR断片をpGEMT-easy vector(Promega，USA)にクローニングして塩基序列を分析した結果を示した遺伝子序列である。
【図１】
2008515424.tif 000002
【図２】
2008515424.tif 000003
【図３】
2008515424.tif 000004
【図４】
2008515424.tif 000005
【配列表】
2008515424000001.app
【国際調査報告】
2008515424.tif 000006
2008515424.tif 000007
2008515424.tif 000008