(57)【要約】  本発明は、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストを用いて、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）活性を阻害することにより、ヒトまたは動物患者における向上した創傷治癒の方法に関する。本発明はまた、ミオスタチンアンタゴニストを投与することを含む、線維症または障害を処置する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストの有効量を、それを必要とするヒトまたはヒト以外の患者に投与する工程を含む、向上した組織創傷治癒の方法。
【請求項２】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、
−抗−ミオスタチン抗体；
−免疫応答を惹起し、そしてミオスタチン活性を阻害することができる、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチン多量体またはミオスタチン免疫コンジュゲート；
−切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチン、または前記蛋白質阻害物質の機能性断片から選択される、ミオスタチンの蛋白質阻害物質；
−ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質；
−ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５番目のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される、優性阻害性のミオスタチン；
−アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンに結合して阻害することができる、小ペプチド；
−ミオスタチンのスプライス変異体；
−ミオスタチン経路の調節因子；および
−ミオスタチンの遺伝子発現を阻害することにより、ミオスタチン活性を阻害することができる、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗−ミオスタチンリボザイム、
よりなる群から選択されるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチンであるところの、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、アミノ酸３３５または３５０にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドであるところの、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：８〜１４で示されるポリペプチドから選択されるミオスタチンのスプライス変異体、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列であるところの、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：１６もしくは配列番号：１８で示される「マイティー」ペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路の調節因子であるところの、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
切り傷および擦り傷を含む、表皮の創傷；外科的切開を含む皮膚から筋肉に及ぶ、深い傷；スポーツ損傷もしくは外傷により生じる筋肉および腱に対する創傷、打撲傷および血腫を含む、内傷；ならびに火傷、の治癒向上のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
さらに創傷治癒を向上させるため、糖質コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＴＮＦ−アルファ・アンタゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物を、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストと、別々に、連続してあるいは同時に併用するところの、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、局所もしくは全身投与のために処方されているところの、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所性、鼻腔内、肺内、筋肉内または腹腔内投与のために処方されているところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
それを必要とするヒトまたはヒト以外の患者における組織の創傷治癒向上のための医薬の製造における、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストの使用。
【請求項１２】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、
−抗−ミオスタチン抗体；
−免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を阻害することができる、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチン多量体またはミオスタチン免疫コンジュゲート；
−切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチン、または前記蛋白質阻害物質の機能性断片から選択される、ミオスタチンの蛋白質阻害物質；
−ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質；
−ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチン；
−アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンに結合して阻害することができる、小ペプチド；
−ミオスタチンのスプライス変異体；
−ミオスタチン経路の調節因子；および
−ミオスタチンの遺伝子発現を阻害することにより、ミオスタチン活性を阻害することができる、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗−ミオスタチンリボザイム、
よりなる群から選択されるところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチンであるところの、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、アミノ酸３３または３５０にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドであるとこの、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：８〜１４で示されるポリペプチドから選択されるミオスタチンのスプライス変異体、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列であるところの、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：１６または配列番号：１８で示される「マイティー」ペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路の調節因子であるところの、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
切り傷および擦り傷を含む、表皮の創傷；外科的切開を含む皮膚から筋肉に及ぶ、深い傷；スポーツ損傷もしくは外傷により生じる筋肉および腱に対する創傷、打撲傷および血腫を含む、内傷；および火傷、の治癒向上のための、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
医薬が、糖質コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＴＮＦ−アルファ・アンタゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物をさらに含み、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストおよび付加的な化合物との、別々、連続もしくは同時投与のために処方されているところの、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
医薬が局所または全身投与のために処方されているところの、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
医薬が、経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所性、鼻腔内、肺内、筋肉内または腹腔内投与のために処方されているところの、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
それを必要とするヒトもしくはヒト以外の患者における改善された創傷治癒の方法に使用するための、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストおよび医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、
−抗−ミオスタチン抗体；
−免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を阻害することができる、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチン多量体またはミオスタチン免疫コンジュゲート；
−切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチン、または前記蛋白質阻害物質の機能性断片から選択される、ミオスタチンの蛋白質阻害物質；
−ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質；
−ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチン；
−アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンに結合して阻害することができる、小ペプチド；
−ミオスタチンのスプライス変異体；
−ミオスタチン経路の調節因子；および
−ミオスタチンの遺伝子発現を阻害することにより、ミオスタチン活性を阻害することができる、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗−ミオスタチンリボザイム、
よりなる群から選択されるところの、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチンであるところの、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、アミノ酸３３５または３５０にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドであるところの、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：８〜１４で示されるポリペプチドから選択されるミオスタチンのスプライス変異体、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列であるところの、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストが、配列番号：１６または配列番号：１８で示される「マイティー」ペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路の調節因子であるところの、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
切り傷および擦り傷を含む、表皮の創傷；外科的切開を含む皮膚から筋肉に及ぶ、深い傷；スポーツ損傷もしくは外傷により生じる筋肉および腱に対する創傷、打撲傷および血腫を含む、内傷；ならびに火傷、の治癒向上のための、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
糖質コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＴＮＦ−アルファ・アンタゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物をさらに含み、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストとの、別々、連続もしくは同時投与のために処方されているところの、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
局所もしくは全身投与のために処方されている、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所性、鼻腔内、肺内、筋肉内または腹腔内投与のために処方されている、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
改善された創傷治癒方法を必要とするヒトもしくはヒト以外の患者において、該方法に使用するための少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３２】
−抗−ミオスタチン抗体；
−免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を阻害することができる、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチン多量体またはミオスタチン免疫コンジュゲート；
−切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチン、または前記蛋白質阻害物質の機能性断片から選択される、ミオスタチンの蛋白質阻害物質；
−ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質；
−ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチン；
−アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含み、ミオスタチンに結合して阻害することができる、小ペプチド；
−ミオスタチンのスプライス変異体；
−ミオスタチン経路の調節因子；および
−ミオスタチンの遺伝子発現を阻害することにより、ミオスタチン活性を阻害することができる、アンチセンスポリヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡまたは抗−ミオスタチンリボザイム、
よりなる群から選択される、請求項３１に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３３】
ピエドモンテーゼ・アレルおよびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドから選択される優性阻害性のミオスタチンを含む、請求項３２に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３４】
アミノ酸３３５または３５０にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを含む、請求項３３に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３５】
配列番号：８〜１４で示されるポリペプチドから選択されるミオスタチンのスプライス変異体、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３２に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３６】
配列番号：１６または配列番号：１８で示される「マイティー」ペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％もしくは７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路の調節因子を含む、請求項３２に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３７】
切り傷および擦り傷を含む、表皮の創傷；外科的切開を含む皮膚から筋肉に及ぶ、深い傷；スポーツ損傷もしくは外傷により生じる筋肉および腱に対する創傷、打撲傷および血腫を含む、内傷；および火傷、の治癒向上のための、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３８】
さらに創傷治癒を向上させるため、糖質コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、およびＴＮＦ−アルファ・アンタゴニストよりなる群から選択される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物と、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストとの、別々、連続あるいは同時投与のための組み合わせにおける、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項３９】
局所もしくは全身投与のために処方される、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項４０】
経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所性、鼻腔内、肺内、筋肉内または腹腔内投与のために処方される、請求項３４に記載の、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニスト。
【請求項４１】
線維症疾患もしくは障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に治療上有効量のミオスタチンアンタゴニストを投与することを含む、方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒向上のための、特に、自然な創傷治癒過程の間に、障害組織に生じ得る瘢痕形成を防ぎ、かくして機能消失を防ぐための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷は、典型的には生物学的物質の消失に伴う組織完全性の破壊である。単純な創傷には、皮膚までの切り傷や擦り傷が含まれ、一方、筋組織、骨格系または内部の臓器にまで達する深い損傷は、複雑な創傷１と定義される。
【０００３】
創傷の形態や組織損傷の程度に拠らず、いずれの創傷も全て同様の修復過程を受ける１、２、３。創傷治癒には３つの異なる時期が認められる。第一段階は、痛んだ組織の剥離のための、および傷を洗浄するための炎症期または滲出期；第二段階は、肉芽組織の成長のための増殖期；そして、第三段階は、成熟および瘢痕形成のための分化期または再生期である１。
【０００４】
炎症期は、うっ血と炎症により特徴付けられる。組織に傷が生じた後、創傷形成により損傷を受けた細胞膜は、トロンボキサンＡ２およびプロスタグラジン２−アルファ、強力な血管収縮物質を放出する。この初期応答は、出血を制限するのを助ける。次いで、毛細血管の血管拡張が起こり、炎症細胞（血小板、好中球、白血球、マクロファージおよびＴリンパ球）が創傷部に遊走する。特に、好中性顆粒球は、食作用を介した創傷洗浄の中心的な役割を果たす。続いて創傷に存在する細胞は、白血球とマクロファージである。特にマクロファージは、創傷治癒に重要である。創傷を鮮創するコラゲネース；繊維芽細胞を刺激し（コラーゲン産生のために）、血管形成を促進するインターロイキンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；およびケラチン生成細胞を刺激する形質転換成長因子（ＴＧＦ）を含む、多くの酵素およびサイトカインがマクロファージから分泌される２。この段階は、組織の再構成過程、すなわち増殖期に移行する指標である。
【０００５】
増殖期は、上皮形成、血管形成、肉芽組織形成、およびコラーゲン沈着により特徴付けられる。ＴＮＦアルファにより刺激される血管形成は、創傷部内および周辺に栄養を送達するのに最も重要であり、そして効率的な創傷治癒に必須である。肉芽組織形成は、白血球、組織球、形質細胞、マスト細胞、および特にコラーゲン産生を通じて組織増殖を促進する繊維芽細胞が関係する複雑な事象である。増殖期の正確な工程および制御機序は分かっていない。関与する幾つかのサイトカインには、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）が挙げられる。これらは全て、コラーゲン形成に必要である２。
【０００６】
創傷治癒の最後の段階は、分化期である。創傷は、収縮し、肉芽組織はますます体液および血管を消耗し、強度が増しはじめ、そして瘢痕組織を形成するリモデリングを受ける。創傷が皮膚に対する損傷を含む場合、創傷治癒の最後の段階は、上皮細胞が露出部分を再び覆うために遊走する上皮形成である。創傷が骨格筋に対する損傷を含む場合、新たな筋細胞は衛星細胞を介して固定され（増殖期の肉芽組織に加えて）、分化して筋芽細胞を形成する４。創傷治癒の最後の段階では、筋芽細胞が分化し、成熟して筋肉繊維の一部となる筋管を形成する。この過程は、創傷部での筋機能を幾分か増加させる結果となるが、筋創傷は常に筋肉組織の喪失、瘢痕化および当初の筋機能を失うこととなる。
【０００７】
現在の組織創傷の治療法には、治癒時間を改善するため、血液循環を改善し、かくして創傷部に酵素および栄養を送達する方法が含まれる。これは、機械的に、例えば磁気および電気刺激（ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）、気泡治療（ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）および酸素療法を用いて実施することができる。しかしながら、これらの治療法は創傷の治癒過程を刺激し、さらに増進するのには効果的であるが、なおも創傷部での機能および／または美容上の損失をもたらすこととなる５。
【０００８】
サイトカインや、ＴＧＦ−ベータ、ＥＧＦおよびＩＧＦ−１などの成長因子を用いる新たな治療法が現在研究されている。また、ＴＮＦアゴニストおよびアンタゴニストは血管形成を改変するのにも有効であり、従って治癒過程を直接改善する非常に大きな可能性を提供し得る。しかしながら、これまで成長因子は、臨床診療での役割は限定的であった。現在唯一利用できる商業的な製品はＰＤＧＦであり、これは治癒期間を短縮することが示されたが、創傷治癒の美容もしくは機能的側面を改善することに成功していない２。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、機能もしくは美容を損なわずに、損傷を受けた組織を新たな組織に置き換えられるよう、創傷の治癒過程を制御することができる新たな創傷治癒療法を提供する必要性がある。
【００１０】
本発明の目的は、この必要性を満たす助けとなること、および／または有用な選択肢を公衆に提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要約）
驚いたことに、成長因子ＴＧＦ−ベータファミリーの一員である成長因子ミオスタチンが、創傷の治癒過程に関係することが初めて示された。ミオスタチン活性の阻害が、創傷治癒過程を著しく改善することが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
従って、本発明は、少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストの有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、向上した組織の創傷治癒方法を提供する。本発明は、動物とヒトの双方の創傷治癒に有用であり得る。
【００１３】
創傷治癒は、１つまたはそれ以上の下記の機序：
（ａ）創傷回復期間の短縮；
（ｂ）炎症応答の促進および増強；および
（ｃ）瘢痕組織形成の減少もしくは抑制、を介してヒトまたは動物患者で改善され、それにより、処置組織の機能および美的外観が改善されることとなる。
【００１４】
ミオスタチンアンタゴニストは、いずれか１つまたはそれ以上の既知ミオスタチン阻害物質から選択されてもよい。例えば、米国特許第６０９６５０６号明細書および米国特許第６４６８５３５号明細書は、抗−ミオスタチン抗体を開示する。米国特許第６３６９２０１号明細書および国際公開第０１／０５８２０号パンフレットは、免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を阻害することができるミオスタチンペプチド免疫原、およびミオスタチン多量体およびミオスタチン免疫コンジュゲートを教示する。切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメインおよびフォリスタチンを含む、ミオスタチンの蛋白質阻害物質は、国際公開第０２／０８５３０６号パンフレットに開示される。ミオスタチンペプチドから誘導される他のミオスタチン阻害物質が知られており、例えば、ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質（国際公開第００／４３７８１号パンフレット）；ピエドモンテーゼアレル（Ｐｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅ  ａｌｌｅｌｅ）（３１３番目のシステインがチロシンに置換されている）およびアミノ酸３３５〜３７５のある部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを含む優性阻害性のミオスタチン（国際公開第０１／５３３５０号パンフレット）が含まれる。米国特許第２００４／０１８１０３３号明細書もまた、ミオスタチンに結合し阻害することができる、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含む小ペプチドを教示する。
【００１５】
好ましくは、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストは、アミノ酸３３５番目に、３５０番目に、もしくはその間のある部位にＣ末端切断を有するミオスタチンペプチド、およびピエドモンテーゼアレルからなる群より選択される、１つまたはそれ以上の優性阻害性物質を含む。
【００１６】
また、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストは、配列番号：８〜１４のいずれか１つに記載のポリペプチド、またはその機能断片もしくは変異体、あるいはそれらと９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチンスプライス変異体を含み得る。
【００１７】
また、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストは、配列番号：１６または配列番号：１８に記載のポリペプチド、またはその機能性断片もしくは変異体、あるいはそれらと少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％または７０％の配列同一性を有する配列を含む、ミオスタチン経路に関係する調節因子を含み得る。
【００１８】
また、ミオスタチンアンタゴニストには、ミオスタチンの遺伝子発現を阻害することによりミオスタチン活性を阻害するであろう、アンチセンスポリヌクレオチド、干渉ＲＮＡ分子、例えばＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡ、または抗−ミオスタチンリボザイムが含まれ得る。
【００１９】
１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストが抗体を含む場合、該抗体は、哺乳類もしくは哺乳類以外から誘導された抗体、例えばサメから誘導されたＩｇＮＡＲ抗体を含んでいてもよく、あるいは該抗体はヒト化抗体であってもよいし、または抗体から誘導された機能性断片を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明はまた、それを必要とする患者における向上した創傷治癒のための医薬の製造における、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストの使用も提供する。
【００２１】
１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストは、これまでに開示した一群のミオスタチンアンタゴニストから選択することができる。
【００２２】
医薬は、局所もしくは全身投与のために処方されていてよく、例えば外部創傷部への局所塗布のために処方されていてよく、あるいは内部創傷部への注入のために処方されていてもよい。
【００２３】
本発明は、さらにそれを必要とする患者における向上した創傷治癒の方法に使用するための、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストと共に医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、さらにそれを必要とする患者における向上した創傷治癒の方法に使用するための、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストを提供する。
【００２５】
（定義）
明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる「創傷」は、１つまたはそれ以上の組織に対する損傷を意味し、開放創、例えば、切り傷、擦り傷、外科的切開およびそれに類するものに限定されるものではないが、内傷、例えば、打撲傷、血腫およびそれに類するもの、並びに火傷もまた含む。
【００２６】
明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる「阻害物質」または「アンタゴニスト」は、蛋白質の活性を、完全もしくは部分的のいずれかで低下させるために作用するいずれかの化合物を意味する。これには、結合して、直接蛋白質の活性を阻害するか、あるいは、蛋白質の産生を減少させるかもしくはその産生を増加させ、そうして存在する蛋白質量に影響を及ぼし、それによりその活性を低下させる化合物が含まれる。
【００２７】
明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる「遺伝子発現」は、転写の開始、ある区間のＤＮＡからｍＲＮＡになる転写、およびｍＲＮＡからポリペプチドになる翻訳を意味する。
【００２８】
明細書および特許請求の範囲を通じて用いられる「含む」は、「少なくとも部分的に有する」こと、すなわち、この用語を含む独立した請求項を解釈する場合、各請求項において、この用語より前にある特徴はすべて有する必要があるが、他の特徴もまた有していてもよい。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、はじめて、ミオスタチンが創傷の治癒過程に関与することを示す。特に、ミオスタチンは、創傷治癒の３つの特徴的な段階、すなわち炎症期、増殖期および分化期の全ての負の調節因子のようである。
【００３０】
例えば、ミオスタチンが存在しない場合、例えばミオスタチンヌルマウスにおいて、あるいは阻害されている場合、例えばミオスタチンアンタゴニストを用いる場合、マクロファージの数が増加し、創傷部へのマクロファージの早期の遊走が生じ（炎症期）、コラーゲンがほとんど沈着せず（増殖期）、そして瘢痕組織形成が顕著に低下する（分化期）。
【００３１】
従って、ミオスタチンは、創傷治癒過程の強力な調節因子のようであり、自然な創傷治癒過程の間に損傷組織おいて通常生じる、瘢痕形成およびその結果生じる機能の喪失を防ぐために処理することができる。瘢痕化をなくすことは、美容目的のためにも重要であり、特に創傷が、容易に見られる体の表面部分、例えば顔、首、手などに生じた場合に重要である。
【００３２】
このように、本発明は、有効量の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストを、それを必要とする患者に投与する工程を含む、向上した組織の創傷治癒方法に関する。患者は、好ましくはヒト患者であるが、本発明の方法はまた、ヒト以外の動物における創傷治癒を改善するために用いてもよい。
【００３３】
創傷治癒は、１つまたはそれ以上の下記の機序：
（ａ）創傷回復期間の短縮：
（ｂ）炎症応答の増進および増強：および
（ｃ）瘢痕組織形成の減少または抑制、を介して、ヒトまたは動物患者で改善され、それにより、処置組織の改善された機能および美的外観をもたらす結果となる。
【００３４】
ミオスタチンアンタゴニストは、ミオスタチンの活性を完全にもしくは部分的に抑制できる、１つまたはそれ以上の分子から選択されてもよい。
【００３５】
特に、ミオスタチンアンタゴニストは、いずれか１つまたはそれ以上の既知のミオスタチン阻害物質から選択されてもよい。例えば、米国特許第６０９６５０６号明細書および米国特許第６４６８５３５号明細書は、抗−ミオスタチン抗体を開示する。米国特許第６３６９２０１号明細書および国際公開第０１／０５８２０号パンフレットは、免疫応答を惹起し、ミオスタチン活性を阻害することができる、ミオスタチンペプチド免疫原、ミオスタチン多量体およびミオスタチン免疫コンジュゲートを教示する。ミオスタチンの蛋白質阻害物質は、国際公開第０２／０８５３０６号パフレットにて開示され、それは、切断型アクチビンＩＩ型受容体、ミオスタチンプロドメイン、およびフォリスタチンを含む。ミオスタチンペプチドから誘導された他のミオスタチン阻害物質が知られており、例えば、ミオスタチンを過剰発現する細胞から培地中に放出されるミオスタチン阻害物質（国際公開第００／４３７８１号パンフレット）；ピエドモンテーゼ・アレル（３１３番目のシステインがチロシンで置換されている）、および３３５番目に、３７５番目に、もしくはその間のいずれかの部位にＣ末端切断を有する成熟ミオスタチンペプチドを含む優性阻害性のミオスタチン（国際公開第０１／５３３５０号パンフレット）が挙げられる。米国特許第２００４／０１８１０３３号明細書はまた、ミオスタチンに結合し阻害することができる、アミノ酸配列ＷＭＣＰＰを含む小ペプチドを教示する。
【００３６】
好ましくは、ミオスタチンアンタゴニストは優性阻害性のペプチドである。これらは、親蛋白質の生物活性に作用して阻害する、親蛋白質から誘導されたペプチドである。上記のように、ミオスタチンの優性阻害性のペプチドは既知であり、アミノ酸３３５番目に、３５０番目に、もしくはその間でＣ末端切断されている成熟ミオスタチンペプチド、およびピエドモンテーゼ・アレル（３１３番目のシステインがチロシンで置換されている）が挙げられる。
【００３７】
ミオスタチンは、筋形成に関係することが知られており、筋肉増殖の負の調節因子である６、７。ミオスタチンは、はじめは、そのＮ末端に分泌シグナル配列を有する３７５個のアミノ酸の前駆分子として産生され、それが開裂されて不活性型の前駆型（ｐｒｏ−ｆｏｒｍ）を放出する。ミオスタチンは、Ａｒｇ２６６でのフリン（ｆｕｒｉｎ）エンドプロテアーゼ開裂により活性化され、Ｎ−末端プロドメイン（または潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）ドメイン）および成熟ミオスタチンドメインを放出する。しかしながら、開裂後でも、そのプロドメインは、成熟ドメインに結合し不活性な複合体の状態でいることができる８。従って、このプロドメイン、またはその断片もまた、創傷治癒を向上させるためのミオスタチンアンタゴニストとして、本発明にて用いることができる。
【００３８】
ミオスタチンのスプライス変異体が、ミオスタチンアンタゴニストとしても作用することが確認された（ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０号）。ミオスタチンスプライス変異体（ＭＳＶ）は、三番目のエクソンの大部分を除去する特別なスプライス事象の結果生じる。得られたＭＳＶポリペプチド、ヒツジ（ｏＭＳＶ；配列番号：８）およびウシＭＳＶ（ｂＭＳＶ；配列番号：１１）は、はじめの２５７個のアミノ酸を天然のミオスタチンプロペプチドと共有しているが、特有の６４個のアミノ酸Ｃ末端（ヒツジｏＭＳＶ６５、配列番号：９およびウシｂＭＳＶ６５、配列番号：１２）を有する。そのｍＲＮＡは、１９５個のヌクレオチドが異なっているが、ＭＳＶの２５７番目のバリン残基は、通常のミオスタチン配列と同じである。ベルジアン・ブルーウシのＭＳＶ（ｂＭＳＶｂｂ；配列番号：７）は、７ａａ小さい３１４ａａの蛋白質をコードするが（配列番号：１４）、その残りの蛋白質配列は、試験した２匹の繁殖体で完全な一致を示す。特有の６５ａａのＣ末端ペプチド（配列番号：１２）はｂＭＳＶｂｂで保存されている。
【００３９】
フリンエンドペプチダーゼを含むプロペプチド転換酵素（ＰＣ１−７）の（ＫＥＲＫ）開裂部位が、２７１番目〜２７４番目に存在することもまた見出された。２７４番目での開裂は、４７個のアミノ酸のＣ末端成熟ＭＳＶ断片（ヒツジｏＭＳＶ４７、配列番号：１０およびウシｂＭＳＶ４７、配列番号：１３）を放出する。
【００４０】
アミノ酸６５個のＭＳＶ断片（配列番号：１２）は、試験管内（インビトロ）でミオスタチンアンタゴニストとして作用することが示され（ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０号）、生体内（インビボ）でＭＳＶがミオスタチン活性を調節するために作用することが期待される。従って、本明細書で開示されるＭＳＶポリペプチドは、ミオスタチンを阻害し、その結果、本発明に関する創傷治癒を促進するために用いられ得る。
【００４１】
別のミオスタチンアンタゴニストには、ミオスタチンの遺伝子発現のモジュレーターがある。ミオスタチンの遺伝子発現は、転写および／または翻訳に干渉するポリヌクレオチドを導入することにより改変することができる。例えば、アンチ−センスポリヌクレオチドを導入することができ、それらは、アンチ−センス発現ベクター、アンチ−センスオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチ−センスホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド、アンチ−センスオリゴリボヌクレオチド、アンチ−センスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含んでいてよく、あるいは当分野で知られている他の方法のいずれか、それらは、アンチ−センスポリヌクレオチドの効率を増強する化学修飾の使用を含む。ミオスタチンのアンチセンス分子は、当分野で既知の方法９によりおよびミオスタチンの遺伝子配列６、７についての知見により作製することができる。
【００４２】
いずれのアンチ−センスポリペプチドも、問題とするポリヌクレオチドと１００％相補的である必要はないが、アンチ−センスポリヌクレオチドが他の遺伝子の発現を実質的に乱すことなく、その遺伝子の発現を乱すために、その遺伝子もしくはｍＲＮＡと結合することを可能とする実質的な同一性を有することが必要であることだけは認められよう。遺伝子と相補的な、５’端非翻訳領域を含むポリヌクレオチドもまた、ミオスタチン蛋白質の翻訳を乱すのに用いることができることも理解されるであろう。同様に、これら相補的なポリヌクレオチドは、１００％の相補性を有する必要はないが、他の遺伝子の翻訳を実施的に乱すことのなく、そのｍＲＮＡに結合し、翻訳を乱すのに十分である必要がある。
【００４３】
遺伝子発現のモジュレーションは、以下の既知技術１０により当業者であれば認められるように、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡ分子の使用も含み得る。
【００４４】
遺伝子発現のモジュレーションは、触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムの使用により達成することもできる。そのようなリボザイムは、特定の標的ＲＮＡ分子と対をなすよう設計できることは当分野で知られている。リボザイムは、標的のＲＮＡに結合し開裂させる１１。
【００４５】
遺伝子発現およびＲＮＡプロセッシングを調節する当分野で既知の他のいずれかの技術を、ミオスタチンの遺伝子発現の調節に用いることができる。
【００４６】
ミオスタチンのさらなるアンタゴニストは、ミオスタチン受容体から誘導されたペプチドである。そのような受容体誘導断片は、一般に、野生型のミオスタチンに結合して阻害する、ミオスタチン結合ドメインを有する。ミオスタチン受容体は、アクチビンＩＩＢ型があり、そのペプチド配列は既知である８。従って、当業者であれば、過度の実験を要することなく、そのような受容体アンタゴニストを産生することができよう。
【００４７】
他のミオスタチンアンタゴニストには、抗−ミオスタチン抗体が含まれる。ミオスタチンに対する抗体は、上述のように当分野で知られており、そのような抗体を産生する方法も知られている。抗体は、哺乳類の抗体であってもよいし、哺乳類以外の抗体、例えばサメ由来のＩｇＮＡＲクラスの抗体；または前記蛋白質のいずれかから誘導され、ミオスタチンに結合することができる断片もしくは誘導体であってもよい。
【００４８】
ミオスタチンシグナル伝達経路に関係する他の分子、特にミオスタチンに対して拮抗作用を示す分子が、本発明の使用に適していようことは認められよう。そのようなペプチドの１つに、「マイティー（ｍｉｇｈｔｙ）」が知られており、ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８号に開示され、筋肉増殖を促進するのに作用する。「マイティー」の発現は、ミオスタチンにより抑制され、従って、同じシグナル伝達経路に関係する。このように、直接ミオスタチンを阻害することに代えて、ミオスタチンのシグナル伝達作用を妨害するペプチド、例えば「マイティー」は創傷治癒を促進するのに用いることができよう。
【００４９】
「マイティー」の遺伝子をコードするポリヌクレオチド（ヒツジ；配列番号：１５およびウシ；配列番号：１７）が、「マイティー」の「恒常的」もしくは「一過性」発現のいずれかを用いて、創傷部での局所的な遺伝子治療に使用することができるし、あるいは、「マイティー」蛋白質（ヒツジ；配列番号：１６およびウシ；配列番号：１８）を直接用いることができることは認められる。遺伝コードの重複性のため、実質的に同じ活性を有する配列を作り出すことができ、それらは配列番号：１５〜１８に開示される配列と同一ではない。さらに、同じ本質的な機能を有する、非必須ドメインにおける変更を有するペプチドもまた作り出すことができる。変更には、挿入、欠失、またはあるアミノ酸残基から他のものへの変更が含まれ得る。そのような変種は、本発明の範囲内に包含される。
【００５０】
本発明は、ミオスタチンが創傷治癒を促進し、創傷の損害を改善することができるという知見に基づく。創傷治癒は、１つまたはそれ以上の下記の機序：
（ｇ）創傷回復時間の短縮；
（ｈ）炎症応答の増進および増強；および
（ｉ）瘢痕組織形成の軽減または抑制、を介してヒトまたは動物患者において改善され、それにより、処置組織の改善された機能および美的外観の結果をもたらす。従って、既知もしくは開発される、いずれかのミオスタチンアンタゴニストが、本発明の方法に使用するのに適している。これには、ミオスタチンに結合することができるいずれかの分子、例えば大腸菌からのＩＭＭ７免疫蛋白質、または当分野で既知の他の一連の結合蛋白質のいずれかが含まれる。ミオスタチンに結合し阻害することができる他のペプチド、例えばアミノ酸ＷＭＣＰＰを有するペプチドが知られている（米国特許第２００４／０１８１０３３号明細書）。ミオスタチンを阻害することができるいずれかの化合物が、本発明の方法および医薬に有用であろうことは認められよう。
【００５１】
ミオスタチンは、骨格筋で主に合成される分泌型の成長因子である。しかしながら、ミオスタチンは、心臓、乳腺、脂肪組織および脳を含む他の組織にも存在し、そしてミオスタチン受容体は偏在する。従って、ミオスタチンアンタゴニストは、ミオスタチンが存在するか、またはミオスタチン受容体が存在する組織における、または前記組織を含む器官、例えば皮膚における創傷治癒を促進するのに有効であろうことが期待される。
【００５２】
本発明の方法に有用なミオスタチンアンタゴニストは、以下に記載されるように創傷治癒の動物モデルで、または試験管内モデルで生物活性について試験することができ、そして適切な活性化合物を医薬組成物に処方することができる。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストに加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当分野で周知の他の物質を含んでいてもよい。そのような物質は、無毒であるべきであり、そして活性成分の効能を干渉しないものであるべきである。担体または他の物質の適格な性質は、医薬組成物の望ましい性質、および経口、静脈内、皮膚、皮下、皮内、局所性、鼻腔内、肺内、筋肉内または腹膜内などの投与経路に依存するであろう。
【００５３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、口内錠、カプセル剤、粉剤、顆粒剤または液剤であってよい。錠剤または他の固体の経口投与剤は、通常、固体担体、例えばゼラチン、デンプン、マンニトール、結晶セルロースまたは医薬製造で通常用いられる他の不活性な物質を含む。同様に、液体の医薬組成物、例えばシロップ剤、エマルジョン剤は、一般に、液体担体、例えば水、鉱油、動物性もしくは植物性の油、鉱物油もしくは合成油を含むであろう。
【００５４】
静脈内、皮膚、皮下、皮内または腹膜内注射について、活性成分は、発熱性の物質を含まず、適切なｐＨ、等浸透圧および安定性を有する非経口の水溶液の形態であろう。
局所投与について、活性成分は、適切な緩和剤中に溶解もしくは懸濁されるであろうし、クリーム剤、回転塗布剤、ローション剤、スティック剤、スプレー剤、軟膏、ペーストもしくはゲルの剤型に処方されていてよく、そして創傷部に直接適用されてもよいし、またはパッド、パッチまたはそのような介在物を介して適用されてもよい。
【００５５】
経鼻投与または経肺投与について、活性成分は、吸入に適した微粉、液体もしくは懸濁液の形態であろう。あるいは、活性成分は、鼻粘膜に直接塗布するのに適した形態、例えば軟膏またはクリーム、鼻腔用スプレー、鼻腔用点滴薬またはエアロゾルの形態であってもよい。
【００５６】
特に好ましい本明細書に記載のミオスタチンアンタゴニストの適用は、筋肉創傷の治癒における適用である。
筋肉創傷を処置する１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストの能力は、以前に記載された筋肉損傷のノテキシンモデルにおいて実証することができる１２。
【００５７】
本発明の他の好ましい適用は、皮膚創傷の処置における適用である。
表面もしくは深部の皮膚の創傷を処置する１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストの能力は、既知の方法に従って実証することができる１３。
本発明の他の好ましい適用は、火傷の処置における適用である。
火傷を処置する１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストの能力は、既知の動物モデルにおいて実証することができる。例えば、Ｙａｎｇら、１４に記載されるものがある。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、処置計画で付加的なもしくは相乗的な効果を与えるため、本発明の医薬組成物と同時に投与される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物の使用が考えられる。そのような免疫応答化合物は、一般には、免疫応答誘導性物質であろう。そのような物質の例には、糖質コルチコステロイド、例えばプレドニゾロンおよびメチルプレドニゾロン；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ならびに第一世代および第二世代の抗−ＴＮＦα剤が含まれる。そのような物質は、当業者により認められるように、処置されるべき創傷の形態に応じて、本明細書に記載の少なくとも１つのミオスタチンアンタゴニストと、別々に、連続して、もしくは同時のいずれかで投与され得る。
【００５９】
本発明の医薬組成物の投与は、「予防上有効な量」または「治療上有効な量」であることが好ましく、それは個人に利益を表すのに十分な量である。投与される実際の投与量、および頻度および時間間隔は、処置される創傷形態の性質および重傷度に依存するであろう。処置計画、例えば投薬量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、輸送部位、投与方法および開業医に既知の他の要素が考慮される。上記の技術およびプロトコルの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．（編集）、１９８０において確認することができる。
【００６０】
本発明はまた、それを必要とする患者における向上した創傷治癒のための医薬の製造での、１つまたはそれ以上のミオスタチン阻害物質の使用に関する。１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストは、上記のミオスタチンアンタゴニストの群から選択することができる。
【００６１】
本医薬は、局所もしくは全身投与のために処方されていてよく、例えば本医薬は表面の創傷部もしくは開放創部に局所適用するために処方されていてよく、または内部もしくは深部の傷に注入するために処方されていてもよい。
【００６２】
本医薬は、さらに創傷治癒に付加的なもしくは相乗的な効果を与えるため、上記の免疫応答化合物の群から選択される１つまたはそれ以上の付加的な免疫応答化合物をさらに含んでいてもよい。本医薬は、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストと、１つまたはそれ以上の免疫反応化合物との、別々、連続もしくは同時投与のために処方されていてもよい。
【００６３】
理論に拘泥されることなく、ミオスタチンアンタゴニストは、創傷治癒の確認された３つの段階、すなわち上記した炎症期、増殖期および分化期の全てに作用することにより、創傷治癒を向上させるのに効果的であると考えられる。
【００６４】
例えば、ミオスタチン活性の阻害は、最初、マクロファージ動員に直接効果を発揮することで示された。特に、ミオスタチンが存在しない場合（ミオスタチンヌルマウスにおいて）、またはミオスタチンアンタゴニストを用いて阻害する場合のいずれでも、マクロファージの数および創傷部への遊走時間の両方が増強される。このように、創傷治癒の第一段階、炎症期が顕著に改善され、これにより、より早いそしてより効果的な創傷洗浄および血管形成の結果がもたらされることが期待される。
【００６５】
加えて、ミオスタチン活性の阻害はまた、増殖期に沈着するコラーゲンがほとんど生じなくなるという結果を示した。ミオスタチンは、本明細書で初めて、繊維芽細胞に対する化学誘引物質であることが示された。このように、ミオスタチン活性の阻害は、創傷部への繊維芽細胞の動員をほとんどなくし、かくして、減少した繊維芽細胞集団によりコラーゲン産生がほぼなくなる結果をもたらすと考えられる。
【００６６】
ミオスタチンは、さらに、創傷の分化期の瘢痕組織形成に関係することが初めて示された。具体的には、ミオスタチン活性の阻害は、回復した創傷組織における瘢痕組織形成の顕著な低下をもたらす結果を示した。加えて、機能的な組織の喪失もまた顕著に低下し、すなわち、ミオスタチンの阻害により、回復した組織が瘢痕化することなく置き換わり、かくして、機能をほとんど損なわず、もしくは美容上の損失もほとんど受けないよう、向上した組織回復の結果となる。このことは、美容手術において、または明らかに見える体の部分、例えば顔、首、手などの創傷を治癒するにあたって、特に利益があろう。
【００６７】
本発明は、筋肉創傷モデルにおいてのみ実例を示すが、本発明は、その他の創傷形態、例えば皮膚の切り傷および擦り傷、皮膚から筋肉に達する深い傷（外科的切開を含む）、ならびに内傷（例えば、スポーツ損傷もしくは外傷により生じる筋肉および腱に対する創傷）、打撲傷、血腫および火傷にも同じく作用することが期待される。
【００６８】
本発明は、概して本出願の明細書に個別にもしくは全体的に参照されもしくは示された部分、要素および特徴、ならびに該部分、要素または特徴のいずれか２つまたはそれ以上のいずれかもしくは全ての組み合わせに存すると言うこともできるし、特定の完成品が本明細書中で言及された場合は、本発明に関連する分野で既知の均等物が含まれ、そのような既知の均等物は、個別に記載されたように、本明細書の一部とされると考えられる。
【実施例】
【００６９】
本発明は前述したものに存し、また、以下の構成は単なる実例を提供するものであると考える。
実施例１：ミオスタチンアンタゴニストは、筋肉創傷治癒に関係する細胞の炎症応答および走化性を増大する
創傷治癒は、高度に秩序だった過程である；筋肉組織の創傷は、迅速な炎症応答をもたらし、次いで筋原性の前駆衛星細胞が走化性の遊走をすることとなる。ここで、我々は、ミオスタチンが実際に炎症応答および筋原細胞の創傷部への走化性の遊走を抑制することを示した。従って、ミオスタチンの喪失またはミオスタチンアンタゴニストの、創傷治癒における速さと質に有益な効果が明らかにされた。
【００７０】
材料および方法
３５０の発現および精製
ウシ・ミオスタチンの２６７番〜３５０番のアミノ酸（以降、「３５０」もしくは「３５０プロテイン」と称する）に対応するｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅して、ｐＥＴ１６Ｂベクターにクローニングした。３５０プロテインの発現および精製は、製造業者（キアゲン）の天然条件下のプロトコルに従って行った。
【００７１】
ノテキシン創傷モデル
６〜８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／１０およびＭｓｔｎ−／−マウス（１群あたりｎ＝２７）に、２５％ヒプノルム（Ｈｙｐｎｏｒｍ）（クエン酸フェンタニル０．３１５ｍｇ／ｍｌおよびフルアニソン１０ｍｇ／ｍｌ）および１０％ヒプノベル（Ｈｙｐｎｏｖｅｌ）（５ｍｇ／ｍｌのミダゾラム）の混合物を、０．１ｍｌ／１０ｇ体重で用いて麻酔をかけた。右肢の前脛骨筋を、１００μｌの注射器（ＳＧＥ、オーストラリア）を用いて、１０μｌの１０μｇ／ｍｌノテキシンを筋肉内注射した。前脛骨筋は、０日目（対照）に、および１日、２日、３日、５日、７日、１０日、１４日または２８日目（１日あたりｎ＝３）に安楽死させたマウスから取り出した。前脛骨筋をＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃに乗せ、液体窒素中で冷却されたイソペンタン中で凍結させた。３５０の創傷を試みるため、１年齢の野生型マウスに、上記のように左の前脛骨（ＴＡ）筋中にノテキシンを注入した。傷つけたマウスに、ミオスタチンアンタゴニスト３５０を体重１ｇあたり６μｇまたは等量の食塩水（対照マウス）のいずれかを用いて、１日、３日、５日および７日目に皮下注射した。筋肉治癒における３５０の効果を評価するため、マウスをノテキシン注射の１日、３日、７日、１０日および２８日後に安楽死させ、そしてＴＡ筋を切り出し、蛋白質分離または組織切片法にかけた。凍結された筋肉試料は−８０℃で保存した。７μｍの横断切片を３段階で１００μｍごとに切断した（ｎ＝３）。次いで、切片をヘマトキシリンおよびエオシンまたはワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ）染色した。次いで、切片を検査して、ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  ＤＣ−３３０カラー・カメラ（ＤＡＧＥ−ＭＴＩ社）を備えたオリンパス社ＢＸ５０顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、ドイツ）を用いて撮影した。
【００７２】
免疫組織化学
凍結させた筋肉切片（７μｍ厚）を、２％パラホルムアルデヒド中で素早く固定化し、次いでＰＢＳ中の０．３％（ｖ／ｖ）トライトンＸ−１００にて透過処理し、そして１０％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清−トリス緩衝生理食塩水（ＮＧＳ−ＴＢＳ）を用いて１時間室温にてブロッキングした。その切片を、５％ＮＧＳ−ＴＢＳ中に希釈された抗体と共に、一晩４℃でインキュベートした。用いた抗体は、マウス抗−ＭｙｏＤの１：２５希釈液（５５４１３０；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で、活性型筋芽細胞に対する特異マーカーであり（Ｃｏｏｐｅｒら、１９９９；Ｋｏｉｓｈｉら、１９９５）；ヤギ抗−Ｍａｃ−１の１：４００希釈液（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｍ−１９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で、浸潤型末梢マクロファージ１５に特異的な抗体であり；マウス抗−ビメンチン抗体の１：３００希釈液で、繊維芽細胞に対するマーカーである。切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、続いてロバ抗マウスＣｙ３結合体の１：４００希釈液（７１５−１６５−１５０；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）か、またはビオチン化ロバ抗−ヒツジ／ヤギＩｇＧ抗体の１：４００希釈液（ＲＰＮ  １０２５；Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかと共にインキュベートした。二次抗体のインキュベーションに続いて、フルオロセインと結合したストレプトアビジンを、５％ＮＧＳ−ＴＢＳ中１：４００に希釈した希釈液（Ｓ−８６９；モレキュラー・プローブ）と共に３０分間室温でインキュベートした。切片をＰＢＳで３回すすぎ、ＤＡＰＩを用いて対比染色し、Ｄａｋｏ（登録商標）蛍光封入剤を用いて封入した。前脛骨筋切片は、落射蛍光顕微鏡により観察した。代表的な顕微鏡写真を、ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  ＤＣ−３３０  カラー・カメラ（ＤＡＧＥ−ＭＴＩ  Ｉｎｃ．ＩＮ、ＵＳＡ）を備えたオリンパスＢＸ５０顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社、ドイツ）にて撮影した。筋肉領域の平均は、免疫組織化学にあらかじめ用いたＭｓｔｎ−／−および野生型マウスの５つの無作為に選ばれた筋肉切片を用いて、サイオン・イメージング・プログラム（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ＮＩＨ）を用いて測定した。
【００７３】
走化性アッセイ
初代筋芽細胞を、公開されたプロトコル１６、１７に従って、４〜６週齢のマウスの後肢筋肉から培養した。簡単には、筋肉を細かく切り刻み、０．２％コラゲネース１Ａ型中で９０分間消化した。培養液を、３時間、被覆していないプレート上にあらかじめ撒くことにより筋芽細胞で豊富化させた。筋芽細胞培養物は、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０％ＨＳおよび１％ＣＥＥを含む成長培地（ＧＭ）中、１０％マトリゲル被覆されたプレートにて３７℃／５％ＣＯ２で維持された。培地の精製度は、培養物中４８時間後のＭｙｏＤ発現についてフローサイトメトリー分析することにより評価した。細胞を、トリプシンを用いて集め、１０６細胞／２００μｌの濃度に懸濁し、５ｍｌの７０％エタノール中、−２０℃で一晩かけて固定化した。染色は、ラビットポリクローナル抗−ＭｙｏＤの１：２００（サンタクルーズ）を用い、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗−ラビットコンジュゲートの１：５００（モレキュラープローブ）を用いて室温で３０分かけて行った。分析は、各アッセイで集められた１０４細胞事象を用いて２回行った。残骸は、前方および側面のスキャッタープロフィールで開閉させることにより取り除いた。細胞は、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・デッキンソン）により分析した。マクロファージを、腹腔洗浄技術により単離した。ザイモン−活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）を、公開されたプロトコルに従って調製した（ＣｏｌｄｉｔｚおよびＭｏｖａｔ、１９８４）。走化性実験は、直径７ｍｍのウェルの単純盲検−ウェルＢｏｙｄｅｎ型チャンバーにおいて実施した（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ、ＭＤ  ＵＳＡ）。８μｍの穴を有する標準的なポリカーボネート濾紙（ニューロプローブ；穴＝表面積の６％）に通じて洗浄し、筋芽細胞アッセイのために、濾紙をＤＭＥＭ中の１％マトリゲルで３０分間処理した。次いで、濾紙を乾燥させ、チャンバーの上部と底部の間に置いた。
【００７４】
筋芽細胞の走化性アッセイのために、５％トリ胚抽出物（ＣＥＥ）を含むＤＭＥＭと透析緩衝液を、陽性対照として用いた。組換えミオスタチン（２．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌミオスタチン）および３５０プロテイン（ミオスタチン濃度の５倍、すなわち１２．５μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌ）を、陽性対照培地に加えた。通常のＤＭＥＭを陰性対照として用いた。２４ウェルプレートにて、ウェルの底部を、被検体または対照培地で満たした。７５，０００細胞をウェルの上部に加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて７時間インキュベートした。膜の上面を予め濡らした綿棒で洗浄し、遊走しなかった細胞を取り除いた。次いで、膜を固定化し、ジルのヘマトキシリンで染色し、スライドに濡れた状態で乗せた。遊走した細胞は、膜あたり４つの代表的な領域で計数し、その平均数をプロットした。
【００７５】
マクロファージの走化性アッセイに関して、３３％ザイモサン活性化マウス血清（ＺＡＭＳ）を含むＤＭＥＭと透析緩衝液を、陽性対照として用いた。組換えミオスタチン（５μｇ／ｍｌ  ミオスタチン）および３５０プロテイン（ミオスタチン濃度の２倍および５倍、すなわち１０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌ）を、陽性培地または通常のＤＭＥＭに加えた。２４ウェルプレートにて、ウェルの底部を、被検体または対照培地で満たした。７５，０００細胞を、テレフタル酸ポリエチレン（ＰＥＴ）０．８μｍの膜を含むウェル上部に加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。膜の上面を予め濡らした綿棒で洗浄し、遊走しなかった細胞を取り除いた。次いで、膜を固定化し、ジルのヘマトキシリンで染色し、スライドに濡れた状態で乗せた。遊走した細胞は、膜あたり４つの代表的な領域で計数し、その平均数をプロットした。
【００７６】
初代繊維芽細胞を、肢の皮膚の移植片から得た。１０ｐｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−βを含むＤＭＥＭを陽性対照として用いた。組換えミオスタチン（５μｇ／ｍｌ  ミオスタチン）を、陽性培地に加えた。２４ウェルプレートにて、ウェルの底部を、被検体または対照培地で満たした。８５，０００細胞を、テレフタル酸ポリエチレン（ＰＥＴ）０．８μｍの膜を含むウェル上部に加えた。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて４時間インキュベートした。膜の上面を予め濡らした綿棒で洗浄し、遊走しなかった細胞を取り除いた。次いで、膜を固定化し、ジルのヘマトキシリンで染色し、スライドに濡れた状態で乗せた。遊走した細胞は、膜あたり４つの代表的な領域で計数し、その平均数をプロットした。
【００７７】
遺伝子発現についてのＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、トリゾル（インビトロジェン）を用い、製造元のプロトコルに従って単離した。逆転写反応は、スーパースクリプト・プレアンプリフィケーション・キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（インビトロジェン）を用いて実施した。ＰＣＲは１μｌの逆転写反応液を用いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間にて実施した。各遺伝子に関し、指数関数的増幅に要求されるサイクル数は、種々のサイクル数を用いて決定した。単位複数配列は、アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写した。ＰＣＲ産物はサザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。各データポイントは、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの存在量により標準化した。
【００７８】
結果
ミオスタチンは、筋芽細胞、マクロファージおよび繊維芽細胞の走化性に影響を及ぼす
好酸球の存在および筋芽細胞の遊走で示されるように、筋肉創傷に対する炎症応答が、ノテキシン創傷後２４時間以内に野生型およびＭｓｔｎ−／−マウスの両方で見られた（図１Ｃ）。２日目には、野生型とＭｓｔｎ−／−との間に炎症応答の応答および衛星細胞遊走の差が認められ、Ｍｓｔｎ−／−筋肉切片の創傷部では核増大の顕著な増加を伴った（図１Ｄ、矢印）。観察される核の数の増加は、増加した数のマクロファージおよび筋芽細胞に拠るものである。最も高い核密度は、特にＭｓｔｎ−／−切片の壊死した筋原細胞の縁に沿って見られた（図１Ｄ、矢頭）。３日目には、再生した野生型の筋肉切片でも核数の増加が見られたが、Ｍｓｔｎ−／−マウスから集められた対応する組織において見られる増加よりもまだはるかに少ない（図１Ｅ）。無毒な創傷後に生じる単核球の増大は、野生型およびＭｓｔｎ−／−の筋肉切片両方で５日目に最大となった（図１Ｆ）。記載した重要な効果は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉切片における増進されたマクロファージおよび筋芽細胞の創傷部への遊走である。
【００７９】
筋肉創傷に対する応答では、炎症細胞および衛星細胞が創傷部に遊走する１８。ミオスタチンの喪失が、活性化された衛星細胞または炎症細胞のいずれの遊走を増進するかどうかを決定するため、創傷部での炎症細胞および筋芽細胞の割合を定量した。免疫組織化学を用いて、筋芽細胞についての特異マーカーＭｙｏＤ１９、および浸潤性末梢マクロファージについてのＭａｃ−１２０を検出した。対照である未処理の筋肉切片は、ＭｙｏＤ免疫染色に関して陰性であることが認められた。筋肉切片をＤＡＰＩで染色し、核の総数を計数した。定量の結果、回復したＭｓｔｎ−／−筋肉での筋原細胞（ＭｙｏＤ陽性）（図２Ａ）およびマクロファージ（Ｍａｃ−１陽性）（図２Ｂ）の数は、２日目の創傷治癒部位で、野生型の切片と比べて２倍存在することが明らかとなった。創傷治癒の２日から５日にかけて、Ｍｓｔｎ−／−筋肉切片では、野生型筋肉よりも多くの筋芽細胞が存在した（図２Ａ）。ＭｙｏＤ陽性細胞のように、創傷に対する応答で、創傷部への増加したマクロファージ浸潤が、Ｍｓｔｎ−／−筋肉でより早い時期（２日目）に見られた（図２Ｂ）。加えて、炎症細胞の数は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉でより早く減少したが、これは炎症細胞応答の全ての過程がＭｓｔｎ−／−マウスで増進されたことを示している（図２Ｂ）。
【００８０】
Ｇｒｏｕｎｄｓら２１は、ＭｙｏＤおよびミオゲニンの遺伝子発現が、筋肉創傷治癒の間に遊走した筋芽細胞を、より初期に検出するためのマーカーとして用いることができることを明らかにした。従って、ＭｙｏＤおよびミオゲニンの発現を、回復組織で決定した。定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、筋肉調節因子ｍｙｏＤおよびミオゲニンの発現は、野生型の筋肉と比較してＭｓｔｎ−／−筋肉ではより初期に発現されていたことが確認された。高レベルのＭｙｏＤ  ｍＲＮＡが、Ｍｓｔｎ−／−筋肉の創傷後１２時間以内に検出された。しかしながら、野生型の筋肉では、ＭｙｏＤ発現は創傷の１日後までには検出されなかった（図２Ｃ）。同様に、高レベルのミオゲニンｍＲＮＡもまた、再生したＭｓｔｎ−／−筋肉では創傷後１２時間以内のごく初期に検出された。しかしながら、野生型の再生筋肉では、ミオゲニンｍＲＮＡは筋肉創傷の１日後まで検出されなかった（図２Ｃ）。このように、免疫組織化学および遺伝子発現分析の結果は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉の創傷部に筋原細胞の増加および増進された遊走が起こることと一致する。
【００８１】
筋芽細胞に加えて、繊維芽細胞もまた創傷部に遊走し集まる。筋肉創傷治癒の間の繊維芽細胞遊走の動態におけるミオスタチンの効果も調べられた。図３に示されるように、ビメンチン抗体（繊維芽細胞に特異的なマーカー）を用いた染色により、野生型マウスの筋肉と比較して、Ｍｓｔｎ−／−マウスのＴＡ筋肉における繊維芽細胞の増大は実質的に見られないことを示す。この結果は、以下の繊維芽細胞についての遊走アッセイのデータと組み合わせて、明らかにミオスタチンが繊維芽細胞に対する化学誘引物質として作用することを示す。
【００８２】
増強された炎症応答における、３５０によるミオスタチン活性阻害の有用な効果を実証するため、ノテキシン損傷後の創傷治癒を受けているマウスを、３５０プロテインで処理し、炎症応答を決定した。３５０を用いて処理した２日目の損傷筋肉に、Ｍａｃ１陽性マクロファージのより大きな百分率が見られた（図４）。３日目までに、３５０処理した筋肉の百分率は、食塩水処理した３日目の筋肉の値よりも低くなり、７日および１０日目の筋肉ではさらに低い値を示した。この結果は、２日目までの３５０処理した筋肉におけるマクロファージの早いもしくはより十分な動員を示し、続いて７日および１０日までの減少した動員を示す。この結果は、３５０処置による増進された創傷治癒過程を実証する。
【００８３】
ミオスタチンによる筋芽細胞およびマクロファージの走化性抑制、ならびに３５０によるその回復
熱により傷ついた組織（火傷）において、その創傷後２４時間でミオスタチンレベルが３倍増加することが明らかにされた１４。同様に、ノテキシンにより傷つけられた筋肉組織において、ミオスタチンレベルの顕著な増加が、創傷の２４時間後に筋肉組織で測定された１２。
【００８４】
以上で示した結果は、Ｍｓｔｎ−／−筋肉では、創傷領域へのマクロファージの増大されたおよび増進された浸潤、および筋芽細胞の遊走となることを示す。その両方の細胞型が、化学走化性因子により影響を受け、その遊走を方向づけられることが知られていたため２２、２３、筋芽細胞およびマクロファージから派生した衛星細胞の遊走能におけるミオスタチンの効果を研究した。ミオスタチンが走化性信号に干渉するかどうかを試験するため、盲検−ウェル走化性チャンバーを用いた。単離された筋芽細胞またはマクロファージを、化学誘引物質（筋芽細胞についてはＣＥＥ、そしてマクロファージについてはＺＡＭＳ活性化血清）の方に濾紙を通り抜けて遊走するそれらの能力について評価した。単離された筋芽細胞は、フローサイトメトリーにより評価することで、９０％が筋原性（ＭｙｏＤ陽性）であることが分かった。図５に示されるように、ＺＡＭＳ培地に５μｇ／ｍｌのミオスタチンを加えることで、マクロファージの遊走は完全になくなる。３５０プロテインを５μｇ／ｍｌのミオスタチンを含む培地に加えた場合、マクロファージにおけるミオスタチンの化学抑制効果の有意な回復が観察される（２０倍増加）。この結果は、ミオスタチン阻害物質、例えば３５０の投与は、ミオスタチンによるマクロファージ遊走の抑制を低下させ、それにより、創傷治癒を増進することができることを裏付けるものである。
【００８５】
マクロファージ遊走における効果に加え、我々はまた、ミオスタチンアンタゴニスト、例えば３５０が、筋芽細胞の走化性遊走におけるミオスタチンの負の効果を低下させることができることも明らかにする。２．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの組換えミオスタチンの陽性対照培地への添加は、筋芽細胞の遊走をそれぞれ５５％および８２％抑制することとなる。３５０プロテインを、組換えミオスタチンを含む培地に添加した場合、筋芽細胞におけるミオスタチンの化学抑制効果は、陽性対照で観察された時と同様のレベルまで回復し、かくしてミオスタチンアンタゴニスト、例えば３５０が筋芽細胞遊走を増強することにより創傷治癒を効果的に増進することができることを明らかにした。
【００８６】
ミオスタチンは繊維芽細胞に対して化学誘引物質として作用する
マクロファージおよび筋芽細胞と対照的に、ミオスタチンは、繊維芽細胞の遊走に関しては化学誘引物質として作用する。このことは、ミオスタチンヌルマウスにおける創傷部への繊維芽細胞の低下した遊走の観察により支持される（図６）。繊維芽細胞におけるミオスタチンの走化性効果を直接明らかにするため、遊走アッセイを組換えミオスタチンを用いて試験管内で行った。図６で示されるように、ミオスタチンの添加は、緩衝液対照と比較して、繊維芽細胞の走化性の遊走を増加させた。
【００８７】
実施例２：ミオスタチン拮抗の結果、軽減された線維症および増強された筋肉治癒をもたらす。
方法
切創モデル
３ｍｍの横切開を、それぞれのマウス（野生型およびミオスタチンヌル）の左の前脛骨筋（ＴＡ）に施した。創傷の０日、３日、５日および７日後に、野生型のＴＡの創傷部に（ＴＡ筋肉内に）、２μｇ／体重ｇの３５０プロテイン（総量８５μｇ／マウス）、または食塩水のいずれかを注射した。傷つけていない右のＴＡを対照として用いた。損傷および対照筋肉を、創傷の２日、４日、７日、１０日および２１日後に回収し、その重量を決定した。治癒中および治癒した切創でのコラーゲン沈着の範囲もまた、ワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｓｏｎ）染色により測定した。
【００８８】
ＳＥ顕微鏡検査
筋肉試料は脂質の洗浄が行われ、２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを含む１０ｍｌの０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、４８時間穏やかに揺らしながら固定化した。グルタルアルデヒドをＰＢＳで１時間洗い流した後、５０ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌに移し、定温２５℃で５日間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで洗浄し、５０ｍｌの滅菌蒸留水に移した。筋肉は定温２５℃でさらに４日間維持した。最初の３６時間は、水を１２時間毎に交換し、次いで、その後２４時間ごとに交換した。次に、筋肉を１％タンニン酸（ｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）中に、２時間移し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。筋肉を、１％ＯｓＯ４で２時間処理し、続いてエタノールの上昇勾配（５０％〜１００％）中でそれぞれ１５分間３回浸透して脱水した。筋肉試料を、二酸化炭素を用いて乾燥させ、金で被覆した。標本を調査し、１０ｋＶの加速電圧を備えた走査型電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ  ４１００、日本）を用いて撮影した。
コラーゲンの蓄積は、実施例１に記載したように、２１日目の、野生型に対するヌルの切創ＴＡで評価した。
【００８９】
結果
ミオスタチン欠損は、向上した筋肉治癒および軽減された線維症をもたらす
骨格筋において、線維症の発症は、ノテキシン創傷の２週間後に始まり、長期間持続する２４。線維症におけるミオスタチンの役割を評価するため、両方の筋肉の遺伝型の組織学をノテキシン創傷後に比較した（実施例１の方法の章を参照のこと）。２８日目、瘢痕組織が、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した創傷野生型マウスの切片において観察されたが、Ｍｓｔｎ−／−の創傷切片ではほとんど見られなかった（図７）。結合組織の存在が、ワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ）染色によりさらに確認された（図７）。２８日目の野生型の筋肉切片は、大きなコラーゲン領域が存在し、その結果、Ｍｓｔｎ−／−筋肉と比較して創傷した野生型組織でより多くの瘢痕組織が認められた。この結果をさらに確認するため、再生した筋肉を、走査型電子顕微鏡を用いて分析した。０日（対照）および２４日目の再生した筋肉の走査型電子顕微鏡により、ひとたび筋原繊維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）により占領されると、その空間を取り囲む結合組織の枠が見られた（図７）。野生型またはＭｓｔｎ−／−筋肉のいずれも、対照（創傷しなかった）試料における繊維空間周辺の肥厚結合組織は見られなかった。しかしながら、創傷治癒の２４日までに、野生型の筋肉では結合組織の密集した束状構造が観察されたが（図７）、Ｍｓｔｎ−／−筋肉では観察されなかった。同様に、切創モデルにおいて、野生型マウスに対してミオスタチンヌルマウスを比較すると、２８日目の修復された創傷部でのコラーゲン蓄積の程度は、ミオスタチンヌルマウスで有意に減少した（データは示さない）。これらの結果は、ミオスタチンの欠損が、創傷後の瘢痕組織を軽減することとなることを裏付ける。
【００９０】
３５０処理は、筋肉創傷治癒を増強し、線維症を軽減する
創傷治癒の増強において、ミオスタチンアンタゴニスト、例えば３５０の効果を研究するため、１年齢の野生型マウス（Ｃ５７黒）に、ノテキシンを用いて創傷し、そして３５０を注射した（実施例１の方法を参照のこと）。典型的には、ノテキシン型の創傷後には、筋肉重量は、その結果として生じる浮腫のために当初は増加し、次いで、損傷部位から除去されることとなる、損傷を受けた筋肉繊維の壊死のために減少する。これ以降、筋肉重量は、新たな繊維の成長のために再び増加し始める。試行の結果は、７日および１０日に、３５０処理した筋肉は、対照の食塩水注射された筋肉と同じようには重量が減少しないことが示された（図８）。これは、おそらく損傷を受けた筋肉のより迅速な修復によるものであろう。３５０処理したマウスで、増進されたおよび増強されたマクロファージ遊走と、創傷治癒におけるミオスタチンアンタゴニストの使用に関係するという以前に議論された他の増強された創傷治癒過程との組み合わせのため、より早く損傷筋肉が治癒するという仮説を、提示された分子データ（図４）は、実際に支持する。
【００９１】
組織学分析は、食塩水および３５０処理した筋肉間の多様性を裏付ける。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、食塩水処理した筋肉と比較して３５０で処理した筋肉では、より早い初期の筋繊維形成および壊死領域のより早い減少を示した（図９）。この結果は、３５０処置されたマウスにおける増進されたおよび増強された筋肉創傷治癒を裏付ける。図９で示された組織学的データは、筋肉全体を横断面の視野領域中の治癒された領域と治癒していない領域の両方を分析して、定量化した。筋肉切片は、各筋肉の中央の膨らんだ領域から常に採取した。図１０で示した分析は、食塩水で処理した対照マウスにおいて７日間に、３５０処理したマウスと比較して治癒していない領域が増加していることを示す。結果として、７日目に３５０処理したマウスと比較すると、相対的に大きく筋肉組織の喪失がある。同じ効果は、１０日目にも見られる。これらの結果は、３５０プロテインを用いた処理が、創傷損傷から回復した筋肉で筋肉組織の喪失がほとんど生じないことを裏付ける。このことは、治癒した筋肉の改善された機能性をもたらすことが期待されるであろう。
【００９２】
加えて、コラーゲンを検出するワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ）染色は、ノテキシン投与の１０日後および２８日後に、食塩水処理した筋肉と比較して、３５０処理した筋肉でコラーゲン沈着の低下したレベルを示し、このことは、３５０処理が創傷治癒過程の間、線維症を軽減することを示す（図１１）。この結果は、ミオスタチンアンタゴニスト、例えば３５０が、創傷治癒の間の瘢痕組織形成（線維症）を軽減することを裏付ける。さらに、ほぼ生じない瘢痕組織および増加した筋肉組織は、対照と比較して３５０で処理され治癒した筋肉の機能を顕著に増加させるであろう。
【００９３】
ワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ）染色画像を用いて、無作為に選択された再生した繊維領域を測定し、ノテキシン投与の２８日後に繊維の大きさを評価した（図１２）。この分析から得られた結果は、３５０処理された筋肉から回復した筋繊維は、食塩水処理した筋肉から回復した筋繊維よりも顕著に大きかった。この増加した回復筋繊維の大きさは、３５０によるミオスタチン機能の抑制のため、筋細胞に過栄養を誘導することを裏付ける。
【００９４】
３５０処理されたマウスにおける増大された創傷治癒が、増大された衛星細胞の活性に部分的に拠るものであることをさらに確認するため、我々は、Ｐａｘ７およびＭｙｏＤ蛋白質の発現について分子分析を行った。Ｐａｘ７蛋白質は、衛星細胞に対するのマーカーであり、ＭｙｏＤの発現は、衛星細胞の活性化を表す。蛋白質分析により、増大したレベルの衛星細胞および活性化が確認された（図１３）。Ｐａｘ７レベル（図１３Ａ）は、３日目、７日目、１０日目および２８日目の３５０処理により大きくなっており、このことは、食塩水処理した筋肉と比較して衛星細胞の活性化における増加を示す。加えて、３５０処理された筋肉では７日から１０日の間にＰａｘ７レベルは増加したが、それとは対照的に食塩水処理された筋肉では減少が観察された。このことは、１０日目あたりで３５０処理された筋肉での衛星細胞の活性の増大を示すであろう。ＭｙｏＤレベル（図１３Ｂ）もまた、３日、７日および１０日目に３５０処理体で大きくなっており、これは、食塩水処理された筋肉と比較して増大した筋形成を示す。これらを考慮すれば、３５０処理された組織における高いＰａｘ７およびＭｙｏＤレベルは、衛星細胞の活性化、そしてその結果生じる筋形成が増大するという観察結果を支持する。この結果により、３５０を用いた処置が、創傷治癒を増進および増大させることが確認される。
【００９５】
３５０の局所適用は、増進された創傷治癒を引き起こす。
創傷部への３５０の直接的な適用の、創傷治癒の増進についての有効性を評価するため、３５０プロテインを、切創した後再生したＴＡ筋肉に適用した。損傷させていない右のＴＡは、対照として用いた。損傷させた筋肉および対照の筋肉を、創傷後２日、４日、７日、１０日および２１日目に回収し、その重量を決定した。炎症性の浸潤のため、創傷の２日および４日後の当初は、筋肉重量の増加が３５０注射および食塩水注射されたＴＡの両方で観察された（図１４）。創傷後７日〜１０日目に、３５０注射および食塩水注射されたＴＡの両方で、それらの筋肉は正常な重量を回復した。しかしながら、創傷後２１日目に、３５０注射されたＴＡは、食塩水処理された筋肉と比較して、筋肉重量に反映されるように、筋肉の大きさに顕著な増加を示した。
【００９６】
議論
ミオスタチンは、筋形成の強力な負の調節因子である。驚いたことに、今回の結果は、ミオスタチンもまた炎症応答を調節するのに関係し、それにより、筋肉の治癒過程および瘢痕組織形成を制御していることを示した。正常な創傷治癒過程の一環として、マクロファージが創傷の直後に創傷部に浸潤し、ケモカイン放出により、上皮形成、組織リモデリング、そして皮膚２５および他の組織での血管形成の調節など、治癒における重要な過程に寄与する。
【００９７】
組織学的データは、野生型マウスと比較して、Ｍｓｔｎ−／−マウスの前脛骨筋の創傷領域への増大されたおよび増進されたマクロファージおよび筋芽細胞の浸潤の存在を明らかに示す（図１）。第２に、Ｍｓｔｎ−／−マウスでは、失われる大部分の筋肉繊維は、新たな筋肉繊維に置き換わるが、結合組織の蓄積量は減少する（図７）。傷つけられた筋肉では、損傷を受けた筋原線維は壊死することとなる。創傷治癒の間、壊死領域には、微小血管、単核球および活性化マクロファージが押し寄せる。これらの活性型リンパ球は、走化性および後の創傷治癒過程に重要な、種々のサイトカインおよび増殖因子を同時に分泌する。より重要なことに、損傷部での増殖因子の放出はまた、筋芽細胞の遊走、増殖および分化を調節し、筋肉の創傷治癒および回復を促進する２６。本明細書において、ミオスタチンアンタゴニストは、増進した治癒を引き起こすこととなる筋原細胞の早期の蓄積を増大させることにより、組織修復を増強することを示した。
【００９８】
ミオスタチンが多くの創傷型で創傷直後に創傷部に存在することは、これまでに示された。本明細書では、走化性実験において、ミオスタチンがマクロファージおよび筋芽細胞の遊走を抑制することを示した。重要なことに、ミオスタチンアンタゴニスト、例えば３５０は、筋芽細胞およびマクロファージ両方の遊走におけるミオスタチンの負の効果に打ち勝つことに成功した。従って、創傷組織をミオスタチンアンタゴニストで処理した場合、創傷部への増進されたおよび増強されたマクロファージおよび筋芽細胞の遊走の結果、改善された創傷治癒をもたらす。我々の結果は、効果のあるミオスタチンアンタゴニスト３５０を、創傷治癒を受けているマウスに注射した場合、向上された創傷治癒の結果をもたらすことを示す。
【００９９】
線維症は創傷治癒過程の一部であるが、過剰な線維症は瘢痕および低下された組織機能をもたらす。繊維芽細胞は、コラーゲンの沈着、かくして創傷での瘢痕形成に大きな役割を果たす。研究は、これまでに、繊維芽細胞蓄積の範囲と皮膚の火傷における瘢痕とを関係づけた。本明細書中で我々は、ミオスタチンが繊維芽細胞の強力な化学誘引物質であることを示したが、これまでにミオスタチンは創傷直後に傷つけられた組織に増大されたレベルで蓄積されることは示されていた。ミオスタチンヌルマウスにおいて、切創部で繊維芽細胞の減少した蓄積が起こり、次に治癒された傷での瘢痕が減少した。重要なことに、本明細書で示されたデータは、アンタゴニストの局所および全身投与により、そのミオスタチンを中和させる能力が、創傷治癒を受けている組織で減少したコラーゲン沈着および瘢痕化の結果をもたらすことを示す。コラーゲンは、多くの線維症疾患における主要な病理所見であると認められている２７。従って、他の病状、例えば濾胞性線維症、膵臓の濾胞性線維症、ムコビシドーシス、膵臓線維症、骨髄線維症、持発性肺線維症、肝線維症、強皮症、骨形成不全症、または過剰なコラーゲン沈着および線維症組織により特徴付けられる他のいずれかの線維症状態は、ミオスタチン阻害物質の投与により処置され得ることが期待される。
【０１００】
結論
全身および局所に適用されるミオスタチン阻害物質は、本明細書で、様々な重要な過程の増進および増強により、創傷治癒速度を増加させることが示された。また、ミオスタチン阻害物質の適用は、減少したコラーゲンの沈着をもたらし、そのことは、瘢痕形成による組織機能の喪失または美容上の損失を予防する結果となることが示された。
【０１０１】
上記の実施例にのみ、本発明の範囲が制限されることを意図するものではない。当業者であれば認められるであろうが、多くの変更が、（添付する特許請求の範囲に記載されるように）本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１０２】
参考文献
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【０１０４】
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【０１０５】
引用された特許文献
米国特許第６０９６５０６号明細書、米国特許第６４６８５３５号明細書、米国特許第６３６９２０１号明細書、米国特許第２００４／０１８１０３３号明細書、国際公開第０１／０５８２０号パンフレット、国際公開第０２／０８５３０６号パンフレット、国際公開第００／４３７８１号パンフレット、国際公開第０１／５３３５０号パンフレット、ＰＣＴ／ＮＺ２００５／０００２５０号およびＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００３０８号。
すべての参考文献および引用された特許文献は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、１つまたはそれ以上のミオスタチンアンタゴニストを全身もしくは局所のいずれかで投与することによる、創傷治癒向上のための方法を提供する。本方法は、改善された創傷治癒時間ならびに低下した瘢痕組織形成、そして軽減された組織機能喪失を提供する。本方法は、特に、美容上の処置に有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１Ａは、野生型マウスおよびミオスタチンヌルマウスの、対照の無傷の筋肉切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色を示す；図１Ｂは、ノテキシンを用いた創傷後１日目（Ｄ１）の低出力像を示す；図１Ｃは、好酸性（ｅ）細胞質および細胞内空間の増加を伴う筋原線維の明白な細胞内の空砲形成（ｖ）を示すために染色し、筋原線維破壊に印（矢印）を付けた、（Ｂ）と同じ切片の高出力像を示す；図１Ｄは、ミオスタチンヌルマウスの筋肉における核の数の増加が見られる（矢印）、２日目（Ｄ２）の筋肉切片を示す。矢頭は、壊死した筋原線維の縁に沿った筋肉の核（ｍｙｏｎｕｃｌｅｉ）を表す；図１Ｅは、野生型マウスおよびミオスタチンヌルマウスの両方で浸潤単核細胞を含むが、ミオスタチンヌル切片では多数存在する、３日目（Ｄ３）の筋肉切片を示す。尺度は１０μｍである；図１Ｆは、ミオスタチンヌル筋肉切片の創傷部内に増加した数の核を有する、５日目の切片（Ｄ５）を示す；
【図２】図２Ａは、野生型（Ｍｓｔｎ＋／＋）およびミオスタチンヌル（Ｍｓｔｎ−／−）の再生した筋肉におけるＭｙｏＤ陽性の筋原性前駆細胞の百分率を示す；図２Ｂは、野生型（Ｍｓｔｎ＋／＋）およびミオスタチンヌル（Ｍｓｔｎ−／−）の再生した筋肉におけるＭａｃ−１陽性細胞の百分率を示す；図２Ｃは、無傷の対照筋肉（Ｃ）およびノテキシンを用いて創傷した後最大２８日までの再生した野生型（ｗｔ）およびミオスタチンヌル（Ｍｓｔｎヌル）の筋肉におけるＭｙｏＤおよびミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）遺伝子の発現プロフィールを示す。ＧＡＰＤＨは、用いた等量のＲＮＡを示すために対照として用いた；
【図３】図３は、損傷後１４日、２１日および２８日目のミオスタチン・ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスから得た組織切片の免疫蛍光。ＷＴ組織は、強い染色強度、すなわちＫＯ組織と比較した場合に、より高濃度のビメンチン陽性細胞を示す；
【図４】図４は、食塩水処理したマウスおよびミオスタチンアンタゴニスト３５０処理したマウス（３５０番目のアミノ酸でＣ末端切断された優性阻害性のミオスタチンペプチド）にノテキシンを用いて創傷した後２日、３日、７日および１０日後に再生した筋肉における、Ｍａｃ１陽性細胞の平均数を示す；
【図５】図５は、ミオスタチンアンタゴニスト（３５０番目のアミノ酸でＣ末端切断された優性阻害性のミオスタチンペプチド）を用いた、マクロファージ遊走におけるミオスタチンの化学抑制効果および回復を示す；
【図６】図６Ａは、ヒツジ初代繊維芽細胞におけるミオスタチンの化学誘引効果を示す；図６Ｂは、ミオスタチンアンタゴニスト（３５０番目のアミノ酸でＣ末端切断された優性阻害性のミオスタチンペプチド）を用いた、ヒツジ初代筋芽細胞におけるミオスタチンの化学抑制効果および回復を示す；
【図７】図７は、２８日目（Ｄ２８）の野生型およびミオスタチンヌル筋肉切片の低出力像（ｉ）および高出力像（ｉｉ）のヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）およびワン・ギーソン（Ｖａｎ  Ｇｅｉｓｅｎ）（ｉｉｉ）染色の顕微鏡写真を示す。密集した結合組織（矢印）は、野生型の筋肉切片で見られる（ｉｉ）；コラーゲン（矢印）は野生型の筋肉切片で見られる（ｉｉｉ）；尺度は１０μｍである；野生型およびミオスタチンヌルの筋肉の走査電子顕微鏡写真は、再生の２４日後（ｉｖ）を示す；尺度は、１２０μｍである；
【図８】図８は、ノテキシンを用いた筋肉創傷から回復したマウスにおける、ミオスタチンアンタゴニスト（３５０番目のアミノ酸でＣ末端切断された優性阻害性のミオスタチンペプチド）の筋肉重量における効果を示す；
【図９】図９Ａ〜Ｄは、ノテキシンを用いた筋肉創傷から回復したマウスの７日目（Ａ−塩水処理；Ｂ−ミオスタチンアンタゴニスト３５０処理）および１０日目（Ｃ−塩水処理；Ｄ−ミオスタチンアンタゴニスト３５０処理）の筋肉切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色したものを示す；
【図１０】図１０は、図９の筋肉切片中の回復しなかった領域
【化１】
2008530003.tif 000002
と回復した領域
【化２】
2008530003.tif 000003
の百分率を示す；
【図１１】図１１は、塩水処理したマウスおよびミオスタチンアンタゴニスト３５０処理したマウスにおける、ノテキシンを用いて創傷した１０日および２８日後の再生した筋肉中のコラーゲン形成の百分率を示す；
【図１２】図１２は、塩水処理したマウスおよびミオスタチンアンタゴニスト３５０処理したマウスにおける、ノテキシンを用いて創傷した２８日後の再生した筋肉繊維の平均の繊維領域を示す；
【図１３】図１３は、塩水（ｓａｌ）およびミオスタチンアンタゴニスト３５０処理したＴＡ筋肉における、ノテキシンを用いて創傷した１日、３日、７日、１０日および２８日後のＧｅｎｅ  Ｐａｘ７（Ａ）およびＭｙｏＤ（Ｂ）蛋白質レベル（ウェスタンブロッティングにより検出した）である；
【図１４】図１４は、創傷の２日および４日後の創傷した筋肉での増加した炎症反応、および回復した筋肉（２１日目）における増量した筋肉量を示す；ならびに
【図１５】図１５は、骨格筋治癒におけるミオスタチンの役割に関する概略モデルを示す。
【図１】
2008530003.tif 000004
【図２】
2008530003.tif 000005
【図３】
2008530003.tif 000006
【図４】
2008530003.tif 000007
【図５】
2008530003.tif 000008
【図６】
2008530003.tif 000009
【図７】
2008530003.tif 000010
【図８】
2008530003.tif 000011
【図９】
2008530003.tif 000012
【図１０】
2008530003.tif 000013
【図１１】
2008530003.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
2008530003.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
2008530003000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月9日(2007.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008530003.tif 000031
2008530003.tif 000032
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