(57)【要約】本発明は、同一または異なる配列および長さの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドは、配列３’Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−１Ｎｉ．．．Ｎｊ５’（ここで、−３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’は、生細胞に存在するターゲット核酸配列に相補的な配列の、二本鎖１９−２８ｍｅｒオリゴヌクレオチドの半分であり、−３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴマー化を可能にする配列の３−５０ｍｅｒのオーバーハング）を有するものに関する。前記オリゴヌクレオチド組成物を含むトランスフェクションの組成物およびそれらの治療適用方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一または異なる配列および／または長さの二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドは、配列３’Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−１Ｎｉ．．．Ｎｊ５’
（ここで、
−  ３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’は、生細胞に存在するターゲット核酸配列に相補的な配列の、二本鎖１９−２８ｍｅｒオリゴヌクレオチドの半分であり、
−  ３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴマー化を可能にする配列の３−５０ｍｅｒのオーバーハングである）
を有する、組成物。
【請求項２】
配列３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’は、１９−２１ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項３】
５〜８ヌクレオチドを含む配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項４】
配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’は、安定化群（group）を含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項５】
前記安定化群は、プリンヌクレオチド、改変類似体、例えば、デオキシヌクレオチドによって置換されるピリミジンヌクレオチド、および／または、改変ヌクレオチド類似体、例えば、糖−または骨格改変リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む群において選択される、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項６】
一方または両方の５’端において５’ホスファートまたはヒドロキシル基を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項７】
配列３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む群において選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド組成物と、トランスフェクション剤または配合とを含むトランスフェクション組成物。
【請求項９】
トランスフェクション剤は、非ウイルスベクターである、請求項８に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項１０】
前記トランスフェクション剤は、カチオン脂質およびカチオンポリマーを含む群において選択される、請求項９に記載のトランスフェクション組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドの組成物を調製する方法であって、
化学的または酵素的な方法によって、請求項１〜７のいずれか１つにおいて規定された配列３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’および３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’を有するオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程と、
得られた合成オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と、
を包含する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の前記オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程の後にリンカー（単数種または複数種）加える工程であって、該リンカー（単数種または複数種）は、配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’に相補的なヌクレオチド配列端を有する、工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リンカー（単数種または複数種）は、オリゴヌクレオチド、ヘアピン様構造、３’または５’オーバーハングを有する短二本鎖核酸、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む群において選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
リンカーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体を含む群において選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
インビトロおよびインビボの遺伝子発現阻害方法であって、請求項１〜７のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド組成物または請求項８〜１０のいずれか１つに記載のトランスフェクション組成物の使用を含む、方法。
【請求項１６】
癌またはウイルス感染の治療等の治療用途のための請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ干渉に有用な新規な二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＮ）に関する。本発明はまた、生物学的または治療用途のための培養中または動物中の真核生物細胞へのオリゴヌクレオチドの送達のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、現在、初期の遺伝子機能レベルであるｍＲＮＡにおける遺伝子サイレンシングのための技術である（Fire et al．，1999；Tuschl et al．，1999）。この技術は、配列特異的ｍＲＮＡ分解およびタンパク質産生の阻害を提供する（Yang et al，2000、Zamore et al，2000、Hammond et al，2000、Parrish et al，2000）。ＲＮＡｉは、短ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；small interfering ＲＮＡ）の活性な配列の予測可能な設計およびｍＲＮＡのターゲッティングに起因して非常に有効である。ベクターを用いたトランスフェクションによってｓｉＲＮＡ二本鎖体が導入され細胞質に送達される場合、ＲＮＡｉは、種々の哺乳類細胞において外因性および内因性の遺伝子を有効にサイレンシングすることが示された（Elbashir et al，2001）。
【０００３】
ＲＮＡｉをメディエートするために必要とされる従来のｄｓＲＮＡ分子の構造的な特徴により、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド（特許文献１〜３を参照）、特には１９〜２３ヌクレオチドの長さを有する短ｄｓＲＮＡは、哺乳類細胞培養系においてＲＮＡｉ活性を有することが証明される（Parrish et. al．，2000；Elbashir et al．，2001；Tuschl，2001）。塩基対を形成した時に対にならない３’オーバーハング端を有する短１９〜２５ヌクレオチドは、配列特異的ｍＲＮＡ分解のためのガイドとしての機能を果たす。両端部がきっぱりとしている時（０ヌクレオチドのオーバーハング）または１つの鎖がきっぱりと終わる時にＲＮＡｉを観察することが可能である。ｓｉＲＮＡの不対のオーバーハングの配列がターゲットＲＮＡ切断にとって重大でないとしても、３’オーバーハングの存在は、最適化されたＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡの安定性にとって重大であるようである。少なくとも１つの鎖は、好ましくは１〜５ヌクレオチド、特には１〜３ヌクレオチドの３’−オーバーハングを有する。ＲＮＡ鎖は、好ましくは、３’−ヒドロキシル基を有し、好ましくは、５’末端にホスファート基を含み、５’−オーバーハングを有しない。最も有効な短ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの両端部上に１〜３、特定的には２のヌクレオチド３’−オーバーハングが存在するように対になっている２つの２１ヌクレオチド鎖からなる（Elbashir et al．，2001）。ＲＮＡ二本鎖体の長さは、２７〜２８ｍｅｒに延長可能であり（Siolas et al．，2005；Kim et al．，2005）、種々の化学的改変および／または骨格改変に耐えることが示された（Kurreck，2003）。
【特許文献１】国際公開第０２／４４３２１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０７５１６４号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第２００１０９８５８３３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＲＮＡｉの成功は、ｄｓＲＮＡの長さ、配列および化学的構造と、細胞送達のためのベクターとの両方によって決まる。アンチセンスまたはリボザイム技術と比べると、ターゲットｍＲＮＡの二次構造は、ｓｉＲＮＡによるサイレンシングの強い制限因子ではない。ｓｉＲＮＡの多くの配列は、所与のｍＲＮＡターゲットに有効であり得る。それ故に、ｓｉＲＮＡ二本鎖体の安定性および生体利用率並びに細胞に送達されるｄｓＲＮＡの量は、ｓｉＲＮＡによるターゲットの利用可能性よりはむしろ有効なサイレンシングの律速因子のままである。
【０００５】
本発明者らにより、互いに貼り付くことを可能にする特定の構造特徴を有するｄｓＯＮは、真核細胞において高いＲＮＡ干渉活性を有し、かつ、同一の送達系として導入された場合に従来の短ｄｓＲＮＡを用いて得られるものより高い遺伝子サイレンシングの有効性を提供することが見出された。従来の短ｄｓＲＮＡより長いオリゴヌクレオチドは、分解に対するそれらのより良好な抵抗性に起因してより高い安定性を示す。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、哺乳動物細胞に導入された場合に配列特異的なＲＮＡｉメディエータであるｄｓＯＮを含む新規な組成物を提供することである。本発明は、それ故に、１または多くのターゲット遺伝子の配列特異的ＲＮＡ干渉をメディエートする短ｄｓＯＮの多くのコピーを含有するｄｓＯＮの遺伝子サイレンシングについての利点を記載する。
【０００７】
本発明はまた、合成キャリアーに基づく種々のトランスフェクション送達システムおよび生物学的適用におけるそれらの使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の組成物は、同一または異なる配列または長さの二本鎖オリゴヌクレオチドであって、配列３’Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−１Ｎｉ．．．Ｎｊ５’を有するオリゴヌクレオチドを有するものである。
【０００９】
ここで、
−  ３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’は、生細胞に存在するターゲット核酸配列に相補的な配列の、二本鎖１９−２８ｍｅｒオリゴヌクレオチドの半分であり；
−  ３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’は、前記二本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴマー化を可能にする配列の３−５０ｍｅｒのオーバーハングである。
【００１０】
前記組成物の好ましいｄｓＯＮは、有利には、１９−２１ヌクレオチドの配列３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’および／または５〜８ヌクレオチドを含む配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’を有する。
【００１１】
実施例において立証されるように、短ｄｓＯＮは、不対３’オーバーハング端部と塩基対にされ、かつ、長ｄｓＯＮにオリゴマー化される場合、配列特異的ｍＲＮＡ分解のガイドとして機能する。
【００１２】
本発明の実施形態によると、配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’は、重大な活性の喪失なく、例えばヌクレアーゼによる分解に抗して安定化され得る。適切な安定化群は、プリンヌクレオチド、改変類似体（デオキシヌクレオチド等）によって置換されたピリミジンヌクレオチド、および／または、改変ヌクレオチド類似体（糖または骨格改変リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド等）を含む群において選択される。
【００１３】
別の実施形態では、場合によっては、前述の特徴のいずれか１つと組み合わされて、本発明の組成物は、５’端の一方または両方に５’ホスファートまたはヒドロキシル基を有する少なくとも１種のｄｓＯＮを含む。
【００１４】
本発明による組成物のｄｓＯＮにおいて、オリゴヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体（Verma and Eckstein，1998）、例えば、メチルホスホナート（Miller，1991）、モルホリノ・ホスホロジアミダート、ホスホロチオアート（Zon and Geiser，1991）、ＰＮＡ（Jepson and Wengel，2004）、ＬＮＡ、２’アルキルヌクレオチド類似体（Kurreck，2003）等を含有する。
【００１５】
強いウイルス性または非ウイルス性のベクターがオリゴヌクレオチドを細胞内に導入するために有用である。ウイルス送達システムは、依然として、それらの免疫原性および臨床的症状における潜在的なリスクに悩まされる。対照的に、合成システムによる核酸のトランスフェクションは、柔軟性を示し免疫原生のない用途の広い方法である。非ウイルス性ベクターによるオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、細胞質内のｄｓＯＮの送達に有用である。現在、非ウイルス性ベクターは、主として、カチオン脂質媒介トランスフェクション、例えば、Oligofectamin、TRANSIT-TKO、LipofectAmine2000、SiGuide、RNAiFectまたはjetSiに基づくか、または、カチオンポリマー媒介トランスフェクション、例えば、Superfect、jetPEIまたはX-TREMGeneに基づく。
【００１６】
本発明は、それ故に、上記に規定されたような少なくとも１種のオリゴヌクレオチド組成物およびを含むトランスフェクション組成物およびトランスフェクション剤または配合（formulation）にも関する。トランスフェクション剤または配合は、より特定的には、生細胞内にｄｓＯＮを導入し、かつ、細胞内にＲＮＡｉをメディエートするｄｓＯＮを遊離させるのに適した非ウイルス性送達システムである。
【００１７】
非ウイルス性ベクターシステムは、有利には、カチオン脂質またはポリマーまたはペプチドベースの送達試薬を含む。非ウイルス性ベクターシステムは、少なくとも１種の送達試薬、および配合を安定化させるか、細胞、組織または臓器をターゲットにするか、または、トランスフェクションの有効性を増大させる他の成分を含む配合である。
【００１８】
細胞に導入する前にトランスフェクション試薬と複合体（complex）が形成される場合、短ｄｓＯＮのオリゴマー化は、３’−オーバーハング−３’−オーバーハング相互作用に起因する分子間相互作用によってまたはｄｓＯＮの３’オーバーハングと相互作用するリンカーを用いることによって促進される。ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＯＮの３’−オーバーハングに対して相補的なヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチド等の多くのリンカーが用いられ得る。他のリンカーは、i）ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＯＮの３’オーバーハングを認識する末端オリゴマー化ドメインを有するヘアピン様構造、ii）ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＯＮの３’−オーバーハングを認識する５’−または３’−オーバーハングを各鎖端に有する短二本鎖核酸であり得る。リンカーはまた、配列特異的ＲＮＡｉをメディエートする、または、ＲＮＡｉによる遺伝子サイレンシングをメディエートするｄｓＯＮの３’−オーバーハングと相互作用するオーバーハングを含まない、１または複数のｄｓＯＮ（または多くのｄｓＯＮ）であり得る。
【００１９】
本発明はまた、上記に規定されたようなオリゴヌクレオチドの組成物を調製する方法であって、
−  化学的または酵素的な方法によって上記に規定されたような配列３’Ｎｉ．．．Ｎｊ５’および３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’を有するオリゴヌクレオチド鎖を合成する工程と；
−  このようにして得られた合成オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と
を包含する方法に関する。
【００２０】
一実施形態によると、前記方法は、前記オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程の後にリンカー（単数または複数）を加える工程であって、前記リンカー（単数または複数）は、配列３’Ｎ１．．．Ｎｉ−１５’に相補的なヌクレオチド配列端を有する、工程をさらに包含する。
【００２１】
前記リンカー（単数または複数）は、有利には、オリゴヌクレオチド、単鎖オリゴヌクレオチド、ヘアピン様構造、３’または５’オーバーハングを有する短二本鎖核酸、２本鎖オリゴヌクレオチドを含む群において選択される。
【００２２】
リンカーは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体を含む群において選択される。
【００２３】
本発明はまた、インビトロおよびインビボの遺伝子発現阻害方法であって、上記に規定されたようなオリゴヌクレオチド組成物またはトランスフェクション組成物の使用を包含する方法に関する。
【００２４】
前記組成物および方法は、治療の適用、例えば、ガンの治療、例えば、膀胱（Urban-Klein et al．，2004）、前立腺（Pal et al．，2005）、白血病（Guan et al．，2005）の癌、または、ウイルス感染、例えば、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス感染（Ge et al．，2004）に特に有用である。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点は、以下に、図１〜７を参照しながら与えられることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（材料および方法）
（化学薬品およびオリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され、ＰＡＧＥは、Eurogentec（ベルギー）によって精製された。オリゴヌクレオチドは、１ｘアニーリングバッファ（５０ｍＭの酢酸カリウム（KAcetate）、５０ｍＭの酢酸マグネシウム（MgAcetate））（Eurogentec）中、２分間にわたり９５℃でアニーリングされ、続いて、２〜４時間室温でインキュベートされた。
【００２７】
jetSi-ENDO（登録商標）（ｓｉＲＮＡトランスフェクションのためのカチオン脂質試薬）およびjetPEI（登録商標）（核酸のトランスフェクションのためのカチオンポリマー（線状ポリエチレンイミン誘導体））は、Polyplus-Transfection（フランス）からであった。RNAiFectは、Qiagen（米国）からであった。
【００２８】
（細胞培養）
Ａ５４９（ヒト肺癌（human lung carcinoma），ATCC N°CCL-185）細胞は、ＧＬ３ルシフェラーゼ（ＳＶ４０成分（element）のコントロール下のフォチナス・フィラリス（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ）を安定的に発現するものであり、ｐＧＬ３Ｌｕｃプラスミド（Clontech）の安定なトランスフェクションの後に得られた。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞は、RPＭＩ（Eurobio，フランス）中で生育させられ、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Perbio，フランス）、２ｍＭのglutamax（Eurobio）、１００単位／ｍＬのペニシリン（Eurobio）、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Eurobio）および０．８μｇ／ｍＬのＧ４１８（Promega）が補給された。細胞は、５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃に維持された。
【００２９】
（トランスフェクション実験）
トランスフェクションの１日前に、２．５×１０４個の細胞が、１０％のＦＢＳを含有する１ｍＬの新鮮な完全培地中の２４ウェルの組織培養プレートに播種された。トランスフェクション前に、ｄｓＲＮＡ／トランスフェクション試薬の複合体が調製された。所望量のオリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ（オリゴヌクレオチドリンカーを伴うまたは伴わない）およびトランスフェクション試薬は、jetSi-ENDO（登録商標）については１５０μＬの無血清培地中に、jetPEI（登録商標）については１５０μＬのＮａＣｌ（１５０ｍＭ）に希釈された（３通りの実験のため）。ｄｓＯＮの重量（μｇ）当たりそれぞれ３および２μＬのjetSi-ENDO（登録商標）およびjetPEI（登録商標）が用いられた。溶液は、Vortex振とう器により１０秒間にわたり混合され、１０分間にわたり室温で放置された。トランスフェクション試薬がｄｓＲＮＡ溶液に加えられ、１０秒間にわたってVortex振とう器によりホモジナイズされ、３０分間にわたり室温で放置された。トランスフェクション複合体を加える前に、血清を有する完全培地が除去され、０．５ｍＬの無血清培地により置き換えられた。次いで、ウェル当たり１００μＬの複合体溶液が加えられ、プレートは、３７℃でインキュベートされた。２時間のインキュベーションの後、完全培地は除去され、１０％の血清を含有する１ｍＬの完全培地により置き換えられた。RNAifectについては、所望量のｄｓＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドリンカーが、３００μＬの無血清培地に希釈された（３通りの実験のため）。次いで、トランスフェクション試薬は、ｓｉＲＮＡ混合物に加えられた（ｄｓＯＮの重量（μｇ）当たりRNAifect  ３μＬ）。溶液は、Vortex振とう器により１０秒間にわたり混合され、１５分間にわたり室温で放置された。トランスフェクション複合体を加える前に、血清を有する完全培地は除去され、０．３ｍＬの有血清完全培地により置き換えられた。ウェル当たり１００μＬの複合体溶液が加えられ、プレートは３７℃でインキュベートされた。２４時間後、培養培地は除去され、１０％の血清を含有する完全培地  ０．５ｍＬによって置き換えられた。全てのトランスフェクションプロトコールについて、プレートは、さらに、３７℃で２４または４８時間にわたりインキュベー
トされた。
【００３０】
（ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ）
ルシフェラーゼ遺伝子発現は、市販キット（Promega，フランス）を用いて測定された。完全培地を除去した後、１ｍＬのＰＢＳ溶液による３回の洗浄がなされた。次いで、ウェル当たり１００μＬの１ｘ溶解バッファが加えられ、プレートは、室温で３０分間にわたりインキュベートされた。溶解質は、集められ、５分間にわたり１４，０００ｇの遠心分離にかけられた。ルシフェラーゼアッセイは、１００μＬのルシフェラーゼ溶液の注入後に５μＬの溶解質により評価された。発光（ＲＬＵ）は、照度計（Berthold，フランス）を用いて１０秒にわたる積算によりモニタリングされた。結果は、ＢＣＡアッセイ（Pierce，フランス）を用いて細胞タンパク質の重量（ｍｇ）当たりの１０秒にわたり積算される光の単位（ＲＬＵ）として表される。
【００３１】
（結果）
内因性遺伝子のターゲットモデルとして、本発明者らは、ＧＬ３ルシフェラーゼ（ＳＶ４０成分のコントロール下のフォチナス・フィラリス・ルシフェラーゼ）を安定的に発現するＡ５４９細胞を用いた。ＧＬ３ルシフェラーゼｍＲＮＡに向けられた、明確に化学的に生じたｓｉＲＮＡは、典型的なカチオン脂質ベースの送達試薬（jetSi-ENDO（登録商標））および典型的なカチオンポリマーベースの送達試薬（jetPEI（登録商標））により、ナノモル濃度の範囲のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた。配列特異的な古典的ＧＬ３Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡは、ＧＬ３Ｌｕｃ  ｍＲＮＡに合致し、かつ、哺乳動物細胞においてＲＮＡｉをメディエートする好ましいｓｉＲＮＡの規定に従う２つのデオキシリボヌクレオチド（ｄＴ）の同一の（すなわち、非相補的な）３’−オーバーハングを含む１９ヌクレオチドの短ｄｓＲＮＡである（Elbashir et al．，2001）。図１に提示されるＧＬ３ルシフェラーゼのサイレンシングの有効性は、トランスフェクションがjetSi-ENDO（登録商標）により７５ｎＭのｓｉＲＮＡで行われた場合に、トランスフェクションの２４および４８時間後にそれぞれ７０％および８０％超に達した。無関係な配列として用いられるＧＬ２Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡの低いサイレンシングレベルは、配列特異的ＲＮＡｉを裏付けた。配列特異的なＧＬ３ルシフェラーゼのサイレンシングはまた、トランスフェクションがjetPEI（登録商標）により行われた場合に観察されたが、それは、カチオン脂質誘導体によるトランスフェクションより低い有効性および継続期間を有していた。
【００３２】
ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＲＮＡのサイレンシングの有効性を改善するために、本発明者らは、ＧＬ３  Ｌｕｃ  ｍＲＮＡに合致し、かつ、アンチセンス鎖の末端に５つのデオキシチミジンヌクレオチドを、センス鎖の末端に５つのデオキシグアノシンヌクレオチドを有する３’−オーバーハングを含む１９ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ（配列番号３）を用いた。これらの３’オーバーハングは、ｄｓＲＮＡのより長いｄｓＲＮＡへの分子間オリゴマー化につながる３’オーバーハング−３’オーバーハング相互作用を促進することができる。jetPEI（登録商標）と複合体を形成した（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）（図２）によるＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞のトランスフェクションの後、高いルシフェラーゼサイレンシングが観察される（５０−７５ｎＭのｄｓＲＮＡで＞８０％（トランスフェクション後２４および４８時間））。（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）は、jetSi-ENDO（登録商標）およびjetPEI（登録商標）試薬の両方によりトランスフェクトされた標準のｓｉＲＮＡより良好なルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングをメディエートした。（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）による遺伝子サイレンシングは、１０ｎＭ濃度においてトランスフェクションの４８時間後に特に有効であり、この場合、ＧＬ３Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡは、いずれかの用いられた送達試薬により導入された時にルシフェラーゼ発現をサイレンシングさせることができなかった（図２）。
【００３３】
配列特異的（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）における単一のヌクレオチド置換が９位に導入されて（アンチセンス鎖においてＡ対Ｇ）、ＧＬ３Ｌｕｃ  ｍＲＮＡターゲットの特定の認識が完全に破壊された。この単一の突然変異配列である（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  Ｍｕｔ  ｄｓＲＮＡ（配列番号４）は、jetPEI（登録商標）によりＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞に導入された。それは、トランスフェクションの４８時間後に５〜５０ｎＭの濃度範囲においてルシフェラーゼ発現をサイレンシングさせることができなかった（図３）。選択性の他のコントロールとして、（ｄＡ）５−ＧＬ２Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）（無関係なＧＬ２ルシフェラーゼに合致する）がトランスフェクトされ、これも、ルシフェラーゼ発現をサイレンシングさせることができなかった（図３）。
【００３４】
オリゴマー化可能なｄｓＲＮＡの３’オーバーハングの長さは、二本鎖体の３’−突出部（protusion）における５または８ヌクレオチドを用いて研究された。（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）および（ｄＡ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８（配列番号７）の両方が、jetPEI（登録商標）によりＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞に導入される時にトランスフェクションの４８時間後にサイレンシングの有効かつ比較され得るレベルを示した（図４）。コントロールとして、（ｄＴ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号６）および（ｄＴ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号８）（これらは、それらのオリゴマー化を促進することができない）は、オリゴマー化可能なｄｓＲＮＡである配列番号３および７により得られた結果と比較してルシフェラーゼ発現をサイレンシングさせるのにはるかに有効性に欠けていた（図４）。サイレンシング選択性のコントロールは、二本鎖体の各鎖の３’端に５または８ヌクレオチドを有するが、ＧＬ２配列と合致するオリゴマー化可能なｄｓＲＮＡにより行われた。（ｄＡ）５−ＧＬ２Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号５）および（ｄＡ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号９）の両方が、内因性発現されたＧＬ３ルシフェラーゼをサイレンシングさせるのに有効でなかった（図５）。
【００３５】
ＲＮＡｉをメディエートする短ｄｓＯＮのオリゴマー化は、塩基対形成によるｄｓＯＮ二本鎖体の３’−オーバーハングと塩基対を形成することにより認識するオリゴヌクレオチドリンカーによって促進され得る。モデルとして、（ｄＴ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号６）および（ｄＴ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号８）が、Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞にjetPEI（登録商標）により、ポリ（ｄＡ）ヌクレオチドの存在下または不存在下に導入された。長さにおいて１５（配列番号１２）および２４（配列番号１３）ヌクレオチドを含むポリ（ｄＡ）が、それぞれ配列番号６および８の二本鎖体のオリゴマー化を促進するために用いられた。ポリ（ｄＡ）リンカーが存在した場合、ルシフェラーゼサイレンシングは、ポリ（ｄＡ）リンカーの不存在下に得られるサイレンシングの有効性と比較して両方のｄｓＲＮＡ二本鎖体に非常に有効であった（図６）。５ヌクレオチドの長さを有する３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、この例において（ｄＡ）１５リンカーの存在下に最良のサイレンシング能を示した（図６）。オリゴヌクレオチドリンカーによる、ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＲＮＡのオリゴマー化は、それ故に、その有効性を増加させた。
【００３６】
ｄｓＯＮ二本鎖体の３’−オーバーハングと塩基対を形成することによって認識するオリゴヌクレオチドリンカーによってオリゴマー化され、かつ、カチオン脂質をベースとするトランスフェクション試薬、例えば、jetSi-ENDO（登録商標）またはRNAiFect送達試薬により細胞に送達されたｄｓＯＮを含む組成物は、Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞において特定のＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングをメディエートする。ポリ（ｄＡ）が、長さにおいて１５（配列番号１２）および２４（配列番号１３）ヌクレオチドを含むリンカーとして用いられて、それぞれ配列番号６および８の二本鎖体のオリゴマー化が促進された。ポリ（ｄＡ）リンカーが存在した場合、ルシフェラーゼサイレンシングは、典型的なＧＬ３Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号１）により得られるサイレンシング有効性と比較してナノモルレベルにおいて両方のｄｓＲＮＡ二本鎖体について非常に有効であった（図７）。オリゴヌクレオチドリンカーによる、ＲＮＡｉをメディエートするｄｓＲＮＡのオリゴマー化は、カチオン脂質ベースの送達システムにより細胞に導入される場合に、ｓｉＲＮＡを用いる従来の方策と比較して遺伝子サイレンシング有効性を増加させた。
【００３７】
【化１】
2008541745.tif 000002
【００３８】
【化２】
2008541745.tif 000003
【００３９】
（書誌参照）
Elbashir, SM et al. (2001 ) Duplexes of 21 -nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature 411 : 494-498. 
Elbashir, SM et al. (2001 ) RNA interference is mediated by 21 and 22 nt RNAs. Genes &Dev. 15: 188-200.
Fire. A. (1999) RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363.
Ge. Q et al. (2004) Inhibition of influenza virus production in virus infected mice by RNA interference. PNAS 101 , 8676-8681. 
Guan. H. (2005) A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor inhibits Ewing's sarcoma growth in a xenograft mouse model, Clin Cancer Res 7, 2662-2669.
Hammond, SM et al. (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 363-366.
Jepsen JS, Wengel J. (2004) LNA-antisense rivals siRNA for gene silencing. Curr Opin Drug 15 Discov Devel. 7(2): 188-94.
Kim, DH et al. (2005) Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy.Nature Biotech. 23, 222-226.
Kurreck J. (2003) Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biυchem. 270(8): 1628-44.
Miller PS. (1991) Oligonucleoside methylphosphonates as antisense reagents. Biotechnology  (N Y) 9(4): 358-62.
Pal, A. et al. (2005) Systemic delivery if RafsiRNA using cationic cardiolipin liposomes silences Raf-1 expression and inhibits tumor growth in xenograft model of human prostate cancel- Ant J Oncol, 26, 1087-91 
Parrish, S. et al. (2000) Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strand in RNA interference. MoI Cell. 6, 1077-1087.
Siolas, D et al. (2005) Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers. Nature biotech. 23, 227-231.
Tuschl, T. (2001) RNA interference and small interfering RNAs. Chembiochem. 2,239-245.
Tuschl, T. et al. (1999) Targeted niRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes & Dev. 13, 3191-3197.
Urban-Klein, B. et al. (2004) RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Therapy 23, 1-6
Verma S, Eckstein F. ( 1998) Modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users. Annu Rev Biochem. 67:99-134.
Vester B, Wengel J. (2004)LNA (locked nucleic acid): high-affinity targeting of complementary RNA and DNA. Biochemistry. 43(42): 13233-41.
Yang, D, et al. (2000) Evidence that processed small dsRNAs may mediate sequence-specific mRNA degradation during RNAi in Drosophila embryos. Curr Biol. 10, 1191-1200.
Zamore, PD et al. (2000) RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotides intervals. Cell 101, 25-33.
Zon G, Geiser TG. (1991 ) Phosphorothioate oligonucleotides: chemistry, purification, analysis, scale-up and future directions. Anticancer Drug Des.6(6):539-68. 
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】２つの主要な分類のトランスフェクション剤の典型、すなわち、カチオン脂質ベースおよびポリマーベースのトランスフェクション試薬（jetSi-ENDO（登録商標）およびjetPEI（登録商標））と複合体を形成した従来のｓｉＲＮＡ二本鎖体によるＲＮＡ干渉。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞（安定的にＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子を発現する）には、jetSi-ENDO（登録商標）およびjetPEI（登録商標）と複合体を形成したＧＬ３Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号１）がトランスフェクトされ、トランスフェクション試薬の効能が評価された。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、（ａ）２４時間および（ｂ）４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。細胞溶解質（lysate）は、市販のキット（Promega）を用いて蛍ルシフェラーゼ発現について評価された。非特異的なコントロールとして、ＧＬ２ルシフェラーゼ配列に合致するｓｉＲＮＡ（配列番号２）が、同一条件下にトランスフェクトされる。実験は３通りなされ、ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図２】カチオンポリマー送達試薬であるjetPEI（登録商標）と複合体を形成した（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）二本鎖体によるＲＮＡ干渉。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞がトランスフェクトされ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、（ａ）２４時間および（ｂ）４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。標準ＧＬ３Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（配列番号１）が比較のために用いられた。実験は、３通りなされ、ルシフェラーゼのサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図３】（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）二本鎖体によるＲＮＡ干渉は、配列特異的ＲＮＡ干渉をメディエートする。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞には、jetPEI（登録商標）と複合体を形成した、（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）、９位に突然変異が生じた配列（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  Ｍｕｔ  ｄｓＲＮＡ（配列番号４）および（ｄＡ）５−ＧＬ２Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号５）二本鎖体がトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。実験は３通りなされ、ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図４】jetPEI（登録商標）と複合体を形成する場合に細胞間オリゴマー化を誘導する３’−オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡは、高いＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングをメディエートする。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞には、jetPEI（登録商標）と複合体を形成した（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）および（ｄＡ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号７）二本鎖体がトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。３’オーバーハングによって分子間のオリゴマー化を促進することができないｄｓＲＮＡとして、（ｄＴ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号６）および（ｄＴ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号８）二本鎖体が、同一条件下にjetPEI（登録商標）によりトランスフェクトされた。実験は３通りなされ、ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図５】jetPEI（登録商標）と複合体を形成する場合に細胞間オリゴマー化を誘導する３’−オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡは、配列特異的ＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングをメディエートする。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞には、jetPEI（登録商標）と複合体を形成した、（ｄＡ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号３）および（ｄＡ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号７）二本鎖体がトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。非特異的コントロールとして、（ｄＡ）５−ＧＬ２Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号５）および（ｄＡ）８−ＧＬ２Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号９）が、同一条件下にjetPEI（登録商標）によりトランスフェクトされた。実験は３通りなされ、ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図６】ｄｓＲＮＡ二本鎖体の対称性３’オーバーハングと相互作用するリンカーを用いる細胞間相互作用によって促進されたｄｓＲＮＡのオリゴマー化は、jetPEI（登録商標）と複合体を形成する場合に有効なＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングをメディエートする。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞には、それぞれjetPEI（登録商標）と複合体を形成し、かつ、（ｄＡ）１５リンカー（配列番号１２）を有する、または、有しない、（ｄＴ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号６）および（ｄＡ）２５リンカー（配列番号１３）を有するまたは有しない、（ｄＴ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号８）二本鎖体がトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。実験は３通りなされ、ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図７】ｄｓＲＮＡ二本鎖体の対称性３’オーバーハングと相互作用するリンカーを用いる分子間相互作用によって促進されたｄｓＲＮＡのオリゴマー化は、カチオン脂質配合、例えばjetSi-ENDO（登録商標）またはRNAiFectと複合体を形成する場合に有効なＧＬ３ルシフェラーゼサイレンシングをメディエートする。Ａ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞には、（ａ）jetSi-ENDO（登録商標）および（ｂ）RNAiFectと複合体を形成する、（ｄＴ）２−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）２  ｓｉＲＮＡ（配列番号１）、（ｄＴ）５−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）５  ｄｓＲＮＡ（配列番号６）および（ｄＴ）８−ＧＬ３Ｌｕｃ−（ｄＴ）８  ｄｓＲＮＡ（配列番号８）二本鎖体（配列番号６および８については、それぞれ、（ｄＡ）１５リンカー（配列番号１２）および（ｄＡ）２５リンカー（配列番号１３）を有する）がトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、４８時間のインキュベーション期間の後に測定された。実験は３通りなされ、ルシフェラーゼサイレンシングの有効性は、細胞溶解質中のタンパク質の含有量によって規格化された非トランスフェクトＡ５４９−ＧＬ３Ｌｕｃ細胞の内因性ルシフェラーゼレベルから算出された。
【図１】
2008541745.tif 000004
【図２】
2008541745.tif 000005
【図３】
2008541745.tif 000006
【図４】
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【図５】
2008541745.tif 000008
【図６】
2008541745.tif 000009
【図７】
2008541745.tif 000010
【国際調査報告】
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2008541745.tif 000012
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