(57)【要約】  本発明は既知の逆転写酵素阻害剤と異なる作用をもつ、特別のクラスのＨＩＶ逆転写酵素の阻害剤を識別する方法に関する。本発明は特に、ヌクレオシド三リン酸又はピロリン酸の存在下で、より高い阻害活性を有する阻害剤を識別する工程に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなる反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｂ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなるもう１つの反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）で得られるＲＴ活性を比較し、
ｄ）ｂ）で得られるＲＴ阻害活性がａ）で得られるＲＴ阻害活性を超える試験化合物を選択し、
ここで段階ａ）及びｅ）におけるＨＩＶのＲＴ阻害剤の量は同等であり、ＲＴ活性の増加は測定可能であるようなものである、
ことを含んでなるリボヌクレオチド又はピロリン酸感受性のＲＴ阻害剤の識別方法。
【請求項２】
ａ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなる反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｂ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
例えば、ＡＴＰ及びＧＴＰから選択される少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなるもう１つの反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）で得られるＲＴ活性を比較し、
ｄ）試験化合物を反応速度論的ＲＴ酵素アッセイにかけ、
ｅ）ｂ）で得られるＲＴ阻害活性がａ）で得られるＲＴ阻害活性を超え、そして更に段階ｄ）の反応速度論的酵素アッセイにおいて競合的である試験化合物を選択し、
ここで段階ａ）及びｅ）におけるＨＩＶのＲＴ阻害剤の量は同等であり、ＲＴ活性の増加は測定可能であるようなものである、
ことを含んでなる、ヌクレオチド競合的な、リボヌクレオチド又はピロリン酸感受性のＲＴ阻害剤の識別方法。
【請求項３】
段階ａ）及びｂ）を引き続いて実施する請求項１又は２の方法。
【請求項４】
段階ａ）及びｂ）を平行して実施する請求項１又は２の方法。
【請求項５】
段階ａ）及びｂ）を引き続いて実施し、次に段階ｄ）を実施する請求項２の方法。
【請求項６】
段階ａ）及びｂ）を平行して実施し、次に段階ｄ）を実施する請求項２の方法。
【請求項７】
段階ａ）及びｂ）において決定されるＲＴ活性が特定のパーセントの「阻害濃度」、特にＩＣ５０又はＩＣ９０値である請求項１〜６のいずれかの方法。
【請求項８】
ヌクレオシドリン酸がＡＴＰ及びＧＴＰから選択される請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
ＨＩＶのＲＴ酵素に対するテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及びヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含んでなる、ヌクレオチド競合的ＲＴ阻害剤を識別するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は既知の逆転写酵素阻害剤と異なって作用する特定のクラスのＨＩＶ逆転写酵素の阻害剤を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶウイルス感染症を治療するために現在市場で販売されている又は開発中の薬剤は、逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）及びより最近の融合阻害剤のようなクラスに属する。ＲＴＩは逆転写機序に介入することによりウイルスの複製を妨げ、他方、ＰＩはウイルスのアッセンブリーに介入する。ＲＴ阻害剤は、ウイルスの複製がブロックされるようにその機能を妨げる多数の方法でＲＴ酵素と相互反応する。ＰＩはウイルスのプロテアーゼ酵素の活性部位に結合し、それにより感染性ヴィロンの構造的及び酵素の成分を生成するために必要な前駆体のポリタンパク質の分解（ｃｌｅａｖａｇｅ）を妨げる。
【０００３】
「ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）」は、逆転写酵素による、伸長しているウイルスＤＮＡ中への取り込みのために天然のヌクレオシド三リン酸と競合する、ヌクレオシド三リン酸に細胞内で転化されるクラスのＲＴ阻害剤である。これらの化合物を天然のヌクレオシドから区別する化学的修飾物がＤＮＡのチェインターミネーション事象をもたらす。現在入手できるＮＲＴＩは、ジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄｌ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ラミブジン（３ＴＣ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エムトリシタビン（ＦＴＣ）及びテノフォビル及びテノフォビル・ジソプロキシルフマレート（ＴＤＦ）を包含し、後者はしばしば、「ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮｔＲＴＩ）」と呼ばれる。
【０００４】
逆転写酵素の機能はＨＩＶのＲＮＡをＤＮＡに転化させることである。この過程で、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）は増殖しているＤＮＡチェインに結合される。ＮＲＴＩのようなチェインストッパーが最初に細胞キナーゼにより三リン酸（ＴＰ）に転化される。例えば、識別された最初のＨＩＶのＲＴ阻害剤の１つであったＡＺＴはＡＺＴ−ＴＰに転化され、次にＨＩＶ−１のＲＴがウイルスのＤＮＡの構築における有効な代替基質としてＡＺＴ−ＴＰを使用することができる。しかし、ＡＺＴ−ＴＰは更なるＤＮＡ伸長に必要な３’ＯＨを欠き、それにより、取り込み後の増殖しているＤＮＡチェインのターミネーションを誘起する。逆の過程、すなわちチェインのヌクレオチドの除去又はＡＺＴのようなチェインターミネート残基の除去は、ピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸により仲介され、同様にしかしずっと低い程度に起る。この逆の過程はＨＩＶ突然変異体において促進され、それが野生型ＲＴよりずっと高い効力を伴ってチェインターミネート残基を除去する能力を増加している。この機序は例えば、非特許文献１中に記載のＡＺＴ又は他のいずれかのＮＲＴＩに対する突然変異ＨＩＶの耐性の原因と認められる（非特許文献１参照）。
【０００５】
この逆過程のために、インビトロのＲＴ試験モデルへのピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸の添加は、特に突然変異ＲＴが使用される時、試験されるＮＲＴＩの阻害活性の減少をもたらす。しかし、幾つかのＮＲＴＩはＲＴ活性の最少の減少を示すのみか、又は幾つかのＮＲＴＩによるＲＴ活性は同一レベルに留まることすらある。
【０００６】
現在入手できるＨＩＶ薬剤に対するＨＩＶウイルスの耐性は治療の失敗の主要な原因であり続ける。これが、通常、異なる活性プロファイルを有する２種以上の抗−ＨＩＶ剤の組み合わせ治療の導入をもたらした。ＨＡＡＲＴ治療（高度活性抗−レトロウイルス治療
）の導入により著しい進歩がもたらされ、それにより処置されるＨＩＶ患者集団における罹患率及び死亡率の著しい減少をもたらした。ＨＡＡＲＴはＮＲＴＩ、ＮＮＲＴＩ及びＰＩの種々の組み合わせを伴う。抗レトロウイルス治療に対する最近の指針は、初期の処置に、このような３種組み合わせ治療計画を推奨する。しかし、これらの多剤治療はＨＩＶを完全には排除せず、長期の処置は通常、多剤耐性をもたらす。特に、抗−ＨＩＶ組み合わせ治療を受けている患者の半数は、主として、使用される１種以上の薬剤に対するウイルスの耐性のために、処置に完全には応答しない。更に、耐性ウイルスは新規感染個体に継代され、それが、これらの薬剤に新規の患者に対して極めて限定される治療選択肢をもたらすことが示された。
【０００７】
その結果、ＨＩＶに対して有効な薬剤組み合わせ物中に使用のための、新タイプの有効成分の継続的需要が存在する。従って、化学構造及び活性プロファイルの異なる、新タイプの抗−ＨＩＶの有効な活性成分を提供することが、達成すべき、著しく望ましい目標である。逆転写酵素は興味深い標的であり続け、そしてこの酵素の阻害剤はＨＡＡＲＴ組み合わせ物の欠くべからざる部分である。新機序によりこの酵素の機能を阻害する物質を発見することは、近年使用されるＮＲＴＩ及びＮＮＲＴＩの代替物を提供することが期待される。特に後者は、このクラス全体にわたり交差耐性を引き起こす突然変異体に悩む。しかし程度は小さいが、ＮＲＴＩもまた、突然変異体による耐性に直面する。ＮＲＴＩが比較的弱い交差耐性を示す事実は、ポケット中に構造的変化を引き起こす突然変異がすべてのＮＮＲＴＩを無効にさせる、同様な結合ポケットと明らかにすべて反応するＮＮＲＴＩに比較した、ＲＴとの、より複雑な相互反応により説明される。
【０００８】
インビトロ試験モデルにピロリン酸又はヌクレオシド三リン酸を添加する時に、増加した活性を示すＲＴ阻害剤は、新クラスの抗−ＨＩＶ剤に属することが見いだされた。前記のように、これまでのところ、ＲＴ活性の減少又は同一レベルに留まることのみが認められている。その結果、このような活性増加を示す化合物は、ＲＴ酵素と異なって相互反応し、従って新クラスのＲＴ阻害剤に属すると考えられる。従って本発明はこの新規なクラスのＨＩＶ阻害剤に属する化合物を見いだすことを目的とする。
【０００９】
本発明は抗−ＨＩＶ治療に使用を見いだすことができ、そして特に抗−ＨＩＶ剤組み合わせ物に使用を見いだすことができる新タイプのＨＩＶのＲＴ阻害剤を識別する方法を目的とする。本発明は更に、新クラスのＨＩＶのＲＴ阻害剤に属するこれらの化合物を識別するための、化合物のスクリーニング法を提供する。
【非特許文献１】Ｇｏｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，ｐｐ．３５７９−３５８５
【発明の開示】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、
ａ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなる反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｂ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなるもう１つの反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）で得られるＲＴ活性を比較し、
ｄ）ｂ）で得られるＲＴ阻害活性がａ）で得られるＲＴ阻害活性を超える試験化合物を選択し、
ここで段階ａ）及びｅ）におけるＨＩＶのＲＴ阻害剤の量は同等であり、ＲＴ活性の増加は測定可能であるようなものである、
ことを含んでなる、リボヌクレオチド又はピロリン酸塩感受性のＲＴ阻害剤の識別方法を提供する。
【００１１】
本発明の方法の段階ａ）及びｂ）は引き続いて又は平行して実施することができる。引き続いて実施される時は、段階ａ）を最初に実施し、次にｂ）を実施するか、その逆も可能である。
【００１２】
１つの態様において、段階ａ）及びｂ）で決定されるＲＴ活性は特定のパーセントの「阻害濃度」である。好ましい態様において、段階ａ）及びｂ）で決定されるＲＴ活性はＩＣ５０又はＩＣ９０値である。
【００１３】
本発明はまた、ＨＩＶのＲＴ酵素に対するテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質、ＨＩＶのＲＴ酵素及び、例えばＡＴＰ及びＧＴＰから選択されるヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含んでなる、ヌクレオチド競合的ＲＴ阻害剤を識別するためのキットを提供する。
【００１４】
更なる面において、本発明は、
ａ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなる反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｂ）  ＨＩＶのＲＴ酵素に対する少なくとも１種のテンプレート、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種の検出可能なｄＮＴＰ基質、
少なくとも１種の試験化合物、
少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸、
少なくとも１種のＲＴ酵素、
を含んでなるもう１つの反応ウエルを準備し、
ここで該ＨＩＶのＲＴ酵素は検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込み、
そして
テンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量を測定することによりＲＴ活性を決定し、
ｃ）段階ａ）及び段階ｂ）で得られるＲＴ活性を比較し、
ｄ）試験化合物を反応速度論的ＲＴ酵素アッセイにかけ、
ｅ）ｂ）で得られたるＲＴ阻害活性がａ）で得られるＲＴ阻害活性を超え、そして更に段階ｄ）の反応速度論的酵素アッセイにおいて競合的である試験化合物を選択し、
ここで段階ａ）及びｂ）におけるＨＩＶのＲＴ阻害剤の量は同等であり、ＲＴ活性の増加は測定可能であるようなものである、
ことを含んでなるヌクレオチド競合的な、リボヌクレオチド又はピロリン酸感受性のＲＴ阻害剤の識別方法を提供する。
【００１５】
前者の方法において、段階ａ）、ｂ）及びｄ）は平行して又は引き続いて実施することができる。
【００１６】
本発明は更に、本明細書及び請求の範囲に開示されたいずれかの特徴の種々の組み合わせ及び準組み合わせに関する。
【００１７】
発明の詳細な記述
本発明の方法において、ヌクレオシドリン酸は、リボヌクレオシドリン酸、リボヌクレオシド二リン酸及びリボヌクレオシド一リン酸を包含し、そして更にデオキシリボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド二リン酸及びデオキシリボヌクレオシド一リン酸並びに、リボヌクレオシドチオ又はイミノ誘導体のホスフェートのようなそれらの誘導体を包含することができる。リボヌクレオシド三リン酸はＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰから選択することができ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰから選択することができる。リボヌクレオシド一又は二リン酸はＡＭＰ、ＡＤＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰから選択することができる。デオキシリボヌクレオシド一又は二リン酸はｄＡＭＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＭＰ、ｄＧＤＰ、ｄＵＭＰ、ｄＵＤＰ、ＴＤＰ、ＴＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＣＤＰから選択することができる。リボヌクレオシドチオ又はイミノ誘導体のホスフェートは例えば、ＡＴＰｂｇＮＨ（アデノシン５’（ベータ、ガンマ、イミド）三リン酸）、ＡＴＰｇＳ（アデノシン５’［ガンマ−チオ］三リン酸）を包含する。特に興味深いものは、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＡＴＰｂｇＮＨ、ＡＴＰｇＳ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰである。
【００１８】
ヌクレオシドリン酸がデオキシリボヌクレオシド三リン酸である場合、検出可能なｄＮＴＰ基質は好ましくは、もう１つの核酸から誘導される。本発明における使用に好ましいものはＡＴＰ又はＧＴＰであり、もっとも好ましいものはＡＴＰである。ピロリン酸又はＰＰｉはピロリン酸アルカリ金属、特にピロリン酸ナトリウムのようなピロリン酸塩であることができる。
【００１９】
本発明の方法において、段階ａ）及び段階ｂ）の成分はいずれかの一定の順序で試験ウェルに添加することができる。それらは１種ずつ又は混合物中に合わせたようなグループとして添加することができる。特に、ＲＴ酵素を最初に反応ウェルに添加することができ、次に他の成分を添加するか、又は他の成分を最初に添加することができ、その後ＲＴ酵素を反応ウェルに添加する。更に１種又は複数の成分を添加し、次にＲＴ酵素、次に残りの成分を添加することもできる。
【００２０】
このように、１つの態様において、アッセイは、ＨＩＶのＲＴ酵素に対するテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び試験化合物を含んでなる反応ウェルを提供
する。次にＨＩＶのＲＴ酵素を反応ウェルに添加し、そこでＨＩＶのＲＴ酵素が検出可能なｄＮＴＰ基質をテンプレートに取り込む。試験化合物のＲＴ阻害活性を測定する。試験化合物は、そこでＨＩＶのＲＴ酵素に対するテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質、試験化合物及び、ＡＴＰ及びＧＴＰのようなヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含んでなるもう１つの反応ウェルが提供される、もう１つの試験を受ける。次に野生型ＨＩＶのＲＴ酵素を反応ウェルに添加し、そこでＨＩＶのＲＴ酵素が検出可能なｄＮＴＰ基質をテンプレート中に取り込む。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下での試験化合物のＲＴ阻害活性を測定し、ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含まない試験で得られる結果と比較する。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下における試験化合物のＲＴ阻害活性が、ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を含まない試験で得られるＲＴ阻害活性を超える化合物が選択される。
【００２１】
本発明のもう１つの態様において、アッセイはＨＩＶのＲＴ酵素が反応ウェル中に存在し、そしてテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質、ＨＩＶのＲＴ阻害剤及び、アッセイの第２の部分においてはヌクレオシドリン酸又はピロリン酸がＨＩＶのＲＴ酵素に添加されるように実施される。
【００２２】
反応速度論的ＲＴ酵素アッセイを包含する方法において、段階ａ）、ｂ）及びｄ）は平行して又は引き続いて実施することができ、これは、平行又は連続のどんな組み合わせの実験をも実施することができることを意味する。例えば、３段階すべてを平行して実施することも又は３段階すべてをどんな与えられる順序でも連続して、例えば、ａ）、ｂ）及びｄ）を連続的に、又はｄ）、ｂ）及びａ）を連続的に等で実施することができる。２段階を平行して実施することができるが、残りはこれらの段階に先行するか又は後に来る、例えば、ａ）及びｂ）を平行し、次にｄ）を実施する。
【００２３】
本発明の方法は特定の試験化合物に対するＲＴ酵素活性の感受性の変化に基づく。感受性は概括的にＡＴＰ又はＧＴＰのようなヌクレオシドリン酸あるいはピロリン酸の存在下及び不在下におけるＲＴ酵素活性のＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率として表わすことができる。他のＩＣ百分率の比率も可能である。感受性は概括的にＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率として表わされる。
【００２４】
ＩＣ５０又はＩＣ９０値はそれぞれ５０％又は９０％の酵素活性が阻害される試験化合物濃度である。これらの値は標準法を使用して決定される。
【００２５】
例えばＡＴＰ及びＧＴＰから選択されるヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下で測定されるＲＴ酵素活性のＩＣ値に対する、ヌクレオシドリン酸、例えばＡＴＰ及びＧＴＰ、又はピロリン酸の存在下で測定されるＲＴ酵素活性のＩＣ値の比率は１より大きくなければならず、好ましくは該比率は３より大きくなければならず、より好ましくはそれは５より大きくなければならない。特に、該比率はＩＣ５０又はＩＣ９０値の比率である。
【００２６】
段階ｄ）における反応速度論的ＲＴ酵素アッセイは、試験化合物が競合的ＲＴ阻害剤であるか否かを決定するために使用される。それは、ＨＩＶのＲＴ阻害剤の阻害機序が野生型ＨＩＶのＲＴ又は突然変異ＲＴタンパク質を使用する反応速度論から決定される、酵素の反応速度論的アッセイである。例えば、ミカエリス定数（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）、Ｋｍ、酵素阻害剤複合物の解離定数、Ｋｉ及び阻害の機序は、基質、ＲＴ阻害剤及び／又は他の試薬の種々の濃度におけるデータを、ミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の競合阻害方程式、ミカエリス−メンテンの非競合（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）阻害方程式及びミカエリス−メンテンの反競合（ｕｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）阻害方程式に当てはめることにより決定することができる。ミカエリス−メンテンの競合阻害方程式を使用して最良の適合が得られる場合は、該阻害剤はヌクレオチド競合ＲＴ阻害剤である。考えられる適用に応じて、当該技術分野で知られた他のいずれかの反応速度論的分析を本発明の方法とともに使用することができる。
【００２７】
本発明は新しいクラスに属するＨＩＶのＲＴ阻害剤を検出するためのインビトロの、迅速なそして安価な方法を提供する。
【００２８】
１つの態様において、ヌクレオシド三リン酸である化合物は廃棄される。これらは天然のヌクレオシドの三リン酸又は、ＮＲＴＩ三リン酸のようなそれらの誘導体のいずれかを含んでなり、特にこれらは逆転写酵素による、伸長しているウイルスＤＮＡ中への取り込みのための天然のヌクレオシド三リン酸と競合するいずれかの三リン酸を含んでなる。特定の態様において、天然のヌクレオシド又は、一、二又は三リン酸を包含するそれらの誘導体、のいずれかのヌクレオシドリン酸（ヌクレオチド）は排除される。
【００２９】
本発明の方法は特に、高い処理量の試験又は評価装置に適用できる。しかし、各反応物が相互から隔離されたままで留まるようなサンプルラック又は多数の反応ウェルから形成された固形支持体を作製することは本発明の実施の範疇内にある。次に、反応ウェルへの１種又は複数の試薬の同時の移動は高い処理量の分析技術分野で使用される多数の技術の１つにより実施することができる。
【００３０】
各反応ウェルの、１種又は複数の内容物は変更することができる。例えば、１つの態様において、各反応ウェルはＨＩＶのＲＴ阻害剤のためのテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び、野生型ＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素であることができるＨＩＶのＲＴ酵素を含有する。例えば、ＡＴＰ又はＧＴＰから選択されるヌクレオシドリン酸又はピロリン酸は各反応ウェルに添加されるか又は添加されない。反応ウェルはアレーを形成しても、又は各コンパートメントを識別又は処理するもう１つの手段を使用してもよい。次に各反応ウェルのＲＴ活性を各反応ウェルのテンプレート中に取り込まれる検出可能なｄＮＴＰ基質の量から自動的に決定し、記録することができる。他の態様は、それらに限定はされないが、１種又は複数の成分の濃度、ＲＴ酵素を変更すること、及びヌクレオシドリン酸又はピロリン酸を変更することを包含する。
【００３１】
高い処理量を処理する、すなわち比較的短期間に多数のサンプルを分析する多数の方法が存在する。利用できるあらゆる高処理量のいずれの分析法をも本発明の方法に適用することができる。例は、それらに限定はされないが、「官能ピペットサンプルを有する分析装置」と題するＳａｋａｚｕｍｅ等の米国特許第５，９８５，２１５号明細書、「微量規模の流動装置中の高処理スクリーニングアッセイシステム」と題するＰａｒｃｅ等の米国特許第６，０４６，０５６号明細書、「検体の迅速なスクリーニングの方法」と題するＰａｕｗｅｌｓ等の国際公開第００／１４５４０号パンフレット、「連続フォーマット高処理スクリーニング」と題するＢｅｕｔｅｌ等の国際公開第９９／３０１５４号パンフレット及び「細胞に基づくスクリーニングアッセイを実施するための高処理法、システム及び装置」と題するＷａｄａ等の国際公開第９９／６７６３９号パンフレットを包含する。
【００３２】
本発明の実施において、ＨＩＶのＲＴ酵素に対して有効なテンプレートとして役立つと考えられるいずれのテンプレートをも使用することができる。テンプレートは反応ウェルに結合してもしなくてもよいが、好ましい態様においては、反応ウェルに結合される。更なる好ましい態様において、テンプレートはポリ−ｒＡ又はヘテロポリマーＲＮＡ又はＤＮＡから選択される。選択されるテンプレートに相補的ないずれのプライマーをも使用することができる。１つの態様において、プライマーはオリゴ−ｄＴ又は、ヘテロポリマーテンプレートに相補的なプライマーから選択される。
【００３３】
本発明の実施に有用な検出可能なｄＮＴＰ基質は任意のｄＮＴＰ基質、そして好ましい
態様においてはテンプレート中への取り込み前そして／又はその後に検出可能な、任意のｄＴＴＰ基質（デオキシチミジン三リン酸）を包含する。検出可能なｄＮＴＰ基質は、それらに限定はされないが、放射性標識ｄＴＴＰ又は任意の放射性標識ｄＮＴＰ及び、蛍光、発光又は吸収分光分析により検出可能なｄＮＴＰ基質を包含する。検出可能なｄＮＴＰ基質はそれ自体で検出可能であるか又は、次に検出することができるトレーサーに結合させることができる。トレーサーは蛍光、発光又は吸収分光分析により検出することができるトレーサーのような光学的トレーサーであるか、あるいはトレーサーが放射性標識トレーサーであることができる。１つの態様において、検出可能なｄＮＴＰ基質はブロモ−デオキシウリジン−三リン酸であり、そして光学的トレーサーはｄＮＴＰ基質に結合するアルカリホスファターゼに共役結合された抗体、又はモノクローナル抗−ＢｒｄＵ抗体のようなモノクローナル抗体である。
【００３４】
本発明の方法に使用のための試験化合物は任意の天然の、天然に誘導された又は人工の物質であることができる。本範疇内に使用される用語「試験化合物」は、単一の化合物又は化合物の混合物を表わす。
【００３５】
本発明の方法に使用のための反応ウェルは、例えばＡＴＰ及びＧＴＰから選択される少なくとも１種のヌクレオシドリン酸又は少なくとも１種のピロリン酸を含有してもしなくてもよい。リボヌクレオチド又はピロリン酸の濃度は考慮される適用に応じて変動することができる。例えば、インビボのピロリン酸（ＡＴＰと一緒の）の影響は明らかに細胞内濃度に左右される。好ましい態様において、ＡＴＰに対しては３．２±１．５ｍＭ、ＧＴＰに対しては０．５±０．２ｍＭ、そしてピロリン酸に対しては１３０μＭにおいて、十分に確立されている細胞内濃度が使用される。
【００３６】
本発明の方法は野生型ＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素を使用して実施することができる。テンプレート中に検出可能なｄＮＴＰ基質を取り込むことができるいずれのＲＴ酵素又は突然変異体ＲＴ酵素も本発明の実施に有用であることができる。
【００３７】
本発明はまた、キットを提供する。キットは本明細書に記載のいずれかの方法に使用することができ、キットは特に、ヌクレオチド競合ＲＴ阻害剤を選択するために使用することができる。本発明のキットはＨＩＶのＲＴ酵素に対するテンプレート、プライマー、検出可能なｄＮＴＰ基質及び、例えば、ＡＴＰ及びＧＴＰから選択されるリボヌクレオシド三リン酸又はピロリン酸を含んでなることができる。キットは更に突然変異体ＲＴ酵素及び／又は野生型ＲＴ酵素を含んでなることができる。
【００３８】
本発明に従う方法は、新クラスに属するＲＴ阻害剤、すなわちヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下で増加したＲＴ阻害活性を示すＲＴ阻害剤である化合物の検出を許す。この新クラスのＲＴ阻害剤は既存のＲＴ阻害剤と異なる、すなわちこのクラスの化合物はＮＲＴＩのクラスにもＮＮＲＴＩにも属さない。後者は、通常は、ＲＴ酵素中のいわゆるＮＮＲＴＩ「ポケット」と相互反応する化合物を含んでなることを意味する、「非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤」として当該技術分野で表わされる化合物のクラスである。以下の説に限定されることは望まないが、ヌクレオシドリン酸（ＡＴＰのような）又はピロリン酸はまた、酵素の機能が阻害されるようにＲＴ酵素に結合するが、本発明の方法により検出される化合物は、ＮＲＴＩと同様なＲＴ酵素中の位置で相互反応することが推定される。これが酵素の二重のブロックをもたらすので、本発明の方法により検出される化合物はＨＩＶのＲＴ酵素の非常に有効なブロッカーであると考えられる。ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の同時投与を伴わない場合ですら、ＡＴＰのようなヌクレオシドリン酸は細胞血漿（ｃｅｌｌ  ｐｌａｓｍａ）中に存在するので、この効果は役割を果たすことができる。
【００３９】
ＮＲＴＩの当該技術分野で知られたクラスに属する化合物もＮＮＲＴＩのいずれも、本発明の方法を使用して識別することができる新しいクラスのＲＴ阻害剤におけるようにＲＴ阻害活性の増加を示さない。従って、本発明の方法により検出される化合物は独特な作用機序によりＲＴ酵素と相互反応して、ＮＲＴＩ又はＮＮＲＴＩの単独又は組み合わせ治療を逃れるＨＩＶ突然変異体に対して活性であろう。従ってこのような化合物はＮＲＴＩ及び／又はＮＮＲＴＩ又は組み合わせ治療で前処置されていた患者の処置に使用することができる。
【００４０】
特定の態様において、本発明に従う方法はまた、ヌクレオシドリン酸又はピロリン酸の存在下で増加したＲＴ阻害活性を示すＲＴ阻害剤であり、そして更に天然のヌクレオシド三リン酸と競合する化合物の検出を許す。このような方法はＮＲＴＩ様動態を有すが化学的に異なる化合物の発見を許し、それは交差耐性に感受性の低い、そして異なる変異体を選択する薬剤をもたらすことが期待される。このような化合物は薬剤カクテル中のＮＮＲＴＩ及び／又はＮＲＴＩの代用物として使用できるかも知れない。新しいクラスに属する、ＲＴ阻害剤であるこの種の化合物は「ヌクレオチド競合的ＲＴ阻害剤（ＮＣＲＴＩ）」と呼ぶことができる。
【００４１】
本明細書に引用されるすべての参考文献、特許及び特許出願はそれら全体を引用することにより取り込まれている。
【００４２】
［実施例］
以下の実施例は具体的表示により提供され、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００４３】
ＡＴＰの存在下及び不在下におけるＨＩＶ逆転写酵素のインビトロの阻害
僅かな修飾を伴い、製造業者の指示に従いキット  ＴＲＫ  １０２２ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してアッセイを実施した。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中に１／４に次第に希釈し、次に培地Ａ（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％コウシ胎仔血清、２０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン）中に１／５０に希釈した。
【００４４】
各実験において、３種の条件を試験した：２５μｌの前記の化合物溶液を満たしたウェル、２５μｌの培地Ａ中２％ＤＭＳＯで満たしたウェル（Ｒ０）及び培地Ａ中１００μｌの停止溶液及び２５μｌのＤＭＳＯを満たしたウェル（Ｒ１）。各ウェルに２５．５μＬのマスターミックッス（５μＬのプライマー／テンプレートビード、１０μｌのアッセイバッファー、０．５μｌのトレーサー（５０μＭ［３Ｈ］−ｄＴＴＰ）、５μＬのＨＩＶのＲＴ酵素溶液（１５ｍＵ／μｌ）、５μｌ培地Ａ）を添加した。プレートをシールし、３７℃で４時間インキュベートした。次に１００μｌの停止溶液を各ウェル（Ｒ１を除く）に添加した。放射能をＴｏｐＣｏｕｎｔＴＭ中で計測した。
【００４５】
ＡＴＰの存在下における試験化合物阻害に対し、前記と同様なプロトコールを使用したがマスターミックス中の培地Ａを３２０ｍＭのＡＴＰを含有する培地Ａと置き換えた。
【００４６】
前記のアッセイを使用してＡＴＰ不在下の化合物１のＩＣ５０は０．３μＭであり、他方ＡＴＰ存在下の化合物１のＩＣ５０は０．０１６μＭである。
【００４７】
化合物１は国際公開第０４／０４６１４３号パンフレットに記載され、構造
【００４８】
【化１】
2008528046.tif 000002
を有する化合物である。
【実施例２】
【００４９】
実施例１の方法を繰り返したが、ＡＴＰを多数の他のヌクレオシドリン酸により変更した。以下の表は試験されたヌクレオシドリン酸及び関与したヌクレオシドリン酸の存在下で得られた化合物１のμＭのＩＣ５０値を示す。
【００５０】
ＡＴＰｇＳはアデノシン５’［ガンマ−チオ］三リン酸［ＣＡＳ  ９３８３９−８９−５］であり、そしてＡＴＰｂｇＮＨはアデノシン５’［ベータ、ガンマ、イミド］三リン酸［ＣＡＳ  ７２９５７−４２−７］である。
【００５１】
【表１】
2008528046.tif 000003
【実施例３】
【００５２】
酵素の反応速度論的研究
酵素の反応速度論的研究を、４０〜３μＭの範囲のｄＴＴＰ及び２〜０μＭの範囲の化合物１に対する、種々の基質及び阻害剤濃度の４×５のマトリックスを伴うプロトコールを使用して実施した。
【００５３】
反応混合物（５０μｌ）は更に５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭのジジチオスレイトール、３００ｍＭのグルタチオン、５００μＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭのテンプレート／プライマー・ポリ（ｒＡ）オリゴ（ｄＴ）及び０．０６％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有した。反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、その時点で１００μｌのコウシ胸腺ＤＮＡ（１５０ｐｇ／ｍｌ）、２ｍｌのＮａ４Ｐ２Ｏ７（１ＭのＨＣｌ中０．１Ｍ）及び２ｍｌのトリクロロ酢酸（１０％ｖ／ｖ）を添加した。溶液を氷上で３０分間維持し、その後、酸不溶性物質を洗浄し、放射能を分析した。反応速度の逆数（１／ｖ）を異なる濃度の化合物１の存在下で基質濃度の逆数（１／［ｄＴＴＰ］）に対してプロットすると、グラフ（図１参照）を得た。
【００５４】
すべての線がＹ−軸との交点で交差するので、本化合物がＨＩＶのＲＴ阻害の競合モードを有することは明白である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、反応速度の逆数（１／ｖ）を異なる濃度の化合物１の存在下で基質濃度の逆数（１／［ｄＴＴＰ］）に対してプロットしたグラフである。
【図１】
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【国際調査報告】
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