(57)【要約】本発明は、植物抽出物と、マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択された一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼを阻害することができる、一つあるいはそれ以上の植物抽出物を含む皮膚用製剤とを提供する。本発明は、本発明の前記皮膚用製剤に組み入れるべき適切な上記活性を有する植物抽出物を同定するために、当該植物抽出物をスクリーニングするための迅速な方法をさらに提供する。本発明は、皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケアに加え、皮膚のシワまたはたるみ、放射線照射された皮膚および／または毛髪損傷、皮膚線の深化、皮膚弾性の変化を含む様々な皮膚病変の治療または予防に適切な皮膚用剤としての前記植物抽出物の使用法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的に許容可能な担体と細胞外プロテアーゼ阻害活性を有する効果的な量の一つあるいはそれ以上の植物抽出物とを含む皮膚用製剤であって、前記植物抽出物は溶媒抽出法により表1、2、3、4、および5に記載されている植物のいずれかから得られ、前記細胞外プロテアーゼはマトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択され、前記抽出物は皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす、皮膚用製剤。
【請求項２】
皮膚細胞における前記一つあるいはそれ以上の細胞活性が、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチンの破壊を弱めること；内皮細胞の移動を弱めること；コラーゲン産出を増加させること；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性を弱めること；および、線維芽細胞により生成された牽引力を弱めることから成る群より選択される、請求項1に記載の皮膚用製剤。
【請求項３】
前記溶媒が、水性溶媒、アルコール溶媒、あるいはそれらの組み合わせである、請求項1あるいは2に記載の皮膚用製剤。
【請求項４】
細胞外プロテアーゼ阻害活性を有する植物抽出物であって、溶媒抽出法によってAconitum napellus、Acorus calamus、Alchemilla mollis、Allium cepa、Allium sativum、Allium tuberosum、Ambrosia artemisiifolia、Anethum graveolens、Anthemis tinctoria、Aronia melanocarpa (Michx.) Ell.、Arctostaphylos uva-ursi、Aronia x prunifolia、Artemisia dracunculus、Avena sativa、Beta vulgaris、Beta vulgaris L. subsp. Vulgaris、Borago officinalis、Brassica napus、Brassica oleracea、Brassica oleracea L. var. italica Plenck、Brassica rapa、Bromus inermis、Capsicum annuum L. var. annuum、Cerastium tomentosum、Chaerophyllum bulbosum、Chenopodium quinoa、Chenopodium quinoa subsp. Quinoa、Chenopodium quinoa Willd.、Chichorium endivia、Chichorium endivia subsp. Endivia、Circium arvense、Citrullus lanatus、Cornus canadensis、Cornus sericea、Cynara cardunculus subsp. Cardunculus、Daucus carota、Daucus carota subsp carota L.、Dolichos lablab、Euphorbia amygdaloides、Fagopyrum tataricum、Foeniculum vulgare、Frangula alnus、Galinsoga quadriradiata、Gentiana lutea、Geranium sanguineum、Geranium x cantabrigiense、Glycyrrhiza glabra、Hamamelis virginiana、Helianthus strumosus、Heliotropium arborescens、Hordeum vulgare subsp. Vulgare、Hypomyces lactifluorum、Juniperus communis L.、Lentinus edodes、Lotus corniculatus、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Melilotus alba Medik.、Melissa officinalis、Mentha x piperita、Oenothera biennis、Pastinaca sativa L.、Petroselinum crispum、Phaseolus vulgaris、Physalis philadelphica、Phytolacca decandra、Phytolacca decandra syn. P. americana、Pimpinella anisum、Pisum sativum、Potentilla anserina L.、Potentilla fruticosa、Poterium sanguisorba、Pyrus communis、Raphanus raphanistrum、Rheum x hybridum、Rhus typhina L.、Ribes nigrum L.、Ribes sylvestre、Rodgersia spp.、Rosmarinus officinalis、Rubus occidentalis、Rubus thibetanus、Rumex crispus、Rumex scutatus、Ruta graveolens、Salvia officinalis、Sambucus canadensis L.、Setaria italica、Solanum melongena L.、Sorghum dochna bicolor gr technicum、Stellaria media、Tanacetum cinerariifolium、Taraxacum officinale、Teucrium chamaedrys、Thymus fragantissimus、Thymus x citriodorus、Trifolium incarnatum、Triticosecale spp.、Tropaeolum majus L.、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Vaccinium angustifolium Ait.、Vitia sp.、x Triticosecale spp.、Zea mays L.、およびZingiber officinaleから成る群より選択された植物から得られ、前記細胞外プロテアーゼはマトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される、植物抽出物。
【請求項５】
前記植物が、Beta vulgaris L.、Brassica oleracea L.、Capsicum annuum L、Chenopodium quinoa、Daucus carota L.、Geranium x cantabrigiense、Juniperus communis L.、Melilotus alba、Pastinaca sativa L.、Potentilla anserina L.、Rhus typhina L.、Solanum melongena L.、Tropaeolum majus L.、Vaccinium angustifolium、x Triticosecale spp.、およびZea mays L.から成る群より選択される、請求項3に記載の植物抽出物。
【請求項６】
前記溶媒抽出法は、アルコール、水、水性緩衝液、あるいはそれらの組み合わせを溶媒として用いる、請求項4あるいは5に記載の植物抽出物。
【請求項７】
前記アルコールがエタノールまたはグリコールである、請求項6に記載の植物抽出物。
【請求項８】
前記植物が前記溶媒抽出法の前に一つあるいはそれ以上のストレスに供される、請求項4、5、6、あるいは7のいずれかに記載された植物抽出物。
【請求項９】
皮膚用製剤の調製における、請求項4、5、6、7、あるいは8のいずれかに記載された植物抽出物の使用法。
【請求項１０】
皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケアのための、請求項1、2、あるいは3のいずれかに記載された皮膚用製剤の使用法。
【請求項１１】
前記皮膚、毛髪、および／または爪の健康および／または外観を改善するための、請求項1、2、あるいは3のいずれかに記載された皮膚用製剤の使用法。
【請求項１２】
皮膚病変の治療または予防における、請求項1、2、あるいは3のいずれかに記載された皮膚用製剤の使用法。
【請求項１３】
皮膚老化を弱める、または防止するための、請求項1、2、あるいは3のいずれかに記載された皮膚用製剤の使用法。
【請求項１４】
前記皮膚、毛髪、および／または爪の前記日常ケアのための、請求項4、5、6、7、あるいは8のいずれかに記載された植物抽出物の使用法。
【請求項１５】
前記皮膚、毛髪、および／または爪の前記健康および／または外観を改善するための、請求項4、5、6、7、あるいは8のいずれかに記載された植物抽出物の使用法。
【請求項１６】
皮膚病変の前記治療または予防における、請求項4、5、6、7、あるいは8のいずれかに記載された植物抽出物の使用法。
【請求項１７】
皮膚老化を弱める、または防止するための、請求項4、5、6、7、あるいは8のいずれかに記載された植物抽出物の使用法。
【請求項１８】
皮膚用製剤の調製に適切な植物抽出物を同定するための過程であって：
(a)植物材料の溶媒抽出法によって複数の可能性のある抽出物を作製する段階と；
(b)マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される、一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼを阻害するための、それぞれの前記可能性のある植物抽出物の能力を分析する段階と；
(c)抽出物群を提供するために、前記細胞外プロテアーゼのうち少なくとも一つの前記活性を阻害することができる、それらの可能性のある植物を選択する段階と；
(d)コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチンの破壊を弱めること；内皮細胞の移動を弱めること；コラーゲン産出を増加させること；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性を弱めること；および、線維芽細胞により生成された牽引力を弱めることから成る群より選択される、皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす能力を調べるために、前記抽出物群の各抽出物を分析する段階と；
(e)皮膚用製剤の調製に適切な植物抽出物を提供するために、前記細胞活性のうち一つあるいはそれ以上に影響を及ぼすことができる抽出物を選択する段階と；
を含む過程。
【請求項１９】
前記複数の可能性のある抽出物が、単一植物源の植物材料から作製される、請求項18に記載の過程。
【請求項２０】
前記複数の可能性のある抽出物が、植物群を選択し；前記選択された植物群内の各植物から植物材料を収穫し；前記複数の可能性のある植物を提供するために、各植物からの前記植物材料を溶媒抽出過程に供することによって作製される、請求項18に記載の過程。
【請求項２１】
前記溶媒抽出過程が、アルコール、水、水性緩衝液、あるいはそれらの組み合わせを溶媒として用いる、請求項18、19、あるいは20のいずれかに記載された過程。
【請求項２２】
段階（c）において選択された前記抽出物群は、前記細胞外プロテアーゼのうち少なくとも一つの活性を少なくとも20％阻害することができる、請求項18、19、20、あるいは21のいずれかに記載された過程。
【請求項２３】
前記抽出群内の各植物抽出物を、少なくとも一つの細胞毒性、生物学的利用率または安定性テストに供する段階と、生理的に許容可能な細胞毒性、生物学的利用率、および／または安定性を示すそれらの抽出物を選択する段階とをさらに含む、請求項18、19、20、21、あるいは22のいずれかに記載された過程。
【請求項２４】
前記植物材料が、一つあるいはそれ以上のストレスに供された植物または植物群から作製される、請求項18、19、20、21、22、あるいは23のいずれかに記載された過程。
【請求項２５】
生理的に許容可能な担体と、トウガラシ[Capsicum Annuum L]の抽出物；キノア［Chenopodium quinoa Willd］の抽出物；ゼラニウム・カンタブルギエンセ［Geranium x cantabrigiense］の抽出物；セイヨウネズ［Juniperus communis L］の抽出物；シロバナシナガワハギ［Melilotus alba Medic］の抽出物；アメリカボウフウ［Pastinaca sativa L.］の抽出物；エゾツルキンバイ［Potentilla anserina L］の抽出物；ルスティファナ［Rhus typhina L］の抽出物；ライコムギ［X Triticosecale spp］の抽出物；キンレンカ［Tropaeolum majus L.］の抽出物；およびトウモロコシ［Zea mays L］の抽出物；から成る群より選択された効果的な量の一つあるいはそれ以上の植物抽出物とを含む、皮膚用製剤。
【請求項２６】
前記一つあるいはそれ以上の植物抽出物が、アルコール、水、水性緩衝液、あるいはそれらの組み合わせを溶媒として用いる溶媒抽出法により得られる、請求項25に記載の皮膚用製剤。
【請求項２７】
前記アルコールがエタノールまたはグリコールである、請求項26に記載の皮膚用製剤。
【請求項２８】
前記トウガラシ[Capsicum Annuum L]の抽出物が前記植物の葉に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項２９】
キノア［Chenopodium quinoa Willd］の前記抽出物が前記植物の種子に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３０】
ゼラニウム・カンタブルギエンセ［Geranium x cantabrigiense］の前記抽出物が前記植物の葉に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３１】
セイヨウネズ［Juniperus communis L］の前記抽出物が前記植物の地上部に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３２】
シロバナシナガワハギ［Melilotus alba Medik］の前記抽出物が前記植物の地上部に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３３】
アメリカボウフウ［Pastinaca sativa L.］の前記抽出物が前記植物の根に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３４】
エゾツルキンバイ［Potentilla anserina L］の前記抽出物が前記植物の地上部に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３５】
ルスティファナ［Rhus typhina L］の前記抽出物が前記植物の葉に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３６】
ライコムギ［X Triticosecale spp］の前記抽出物が前記植物の種子に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３７】
キンレンカ［Tropaeolum majus L.］の前記抽出物が前記植物の地上部に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３８】
トウモロコシ［Zea mays L］の前記抽出物が前記植物の葉に由来する、請求項25、26、あるいは27のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項３９】
前記皮膚、毛髪、および／または爪の前記日常ケアにおいて使用するための、請求項25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、あるいは37のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項４０】
記皮膚、毛髪、および／または爪の健康および／または外観を改善するのに使用するための、請求項25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、あるいは37のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項４１】
皮膚病変の治療または予防が必要な被検体における、皮膚病変の治療または予防に使用するための、請求項25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、あるいは37のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項４２】
皮膚老化を弱める、または防止するのに使用するための、請求項25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、あるいは37のいずれかに記載された皮膚用製剤。
【請求項４３】
前記製剤は、皮膚のシワ、肌弾力の喪失、発赤、または炎症のうち一つあるいはそれ以上を弱める、または防止する、請求項42に記載の皮膚用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚科学の分野、具体的には植物抽出物を含む皮膚用薬剤の分野内に関する。
【発明の背景】
【０００２】
皮膚は、哺乳類、特にヒトにおいて、最も環境ストレスを受けやすい器官である。皮膚は、病原菌、有毒化学物質、および不良環境に供されるだけでなく、紫外線（UV）を直接浴びる唯一の器官である。また、この器官の生命力は遺伝子プロセスの結果であり、経時的に皮膚の機能性の低下につながる。従って、継続的な内因子（例えば、加齢による老化、疾病およびアレルギー）および／または数多くの外因子（感染症、外傷、放射線、毒素およびステロイド使用等）への暴露の結果として、多様な皮膚病変が発生し得る。
【０００３】
皮膚は、二つの主要部から成る、高度に組織化された構造体である。外側のより薄い部分、表皮または外皮は、その位置に応じて四つから五つの細胞層に組織化される。これらの層は、角質層、透明層（通常、皮膚が肥厚性である場合のみ存在している）、顆粒層、有棘層、および基底層である。皮膚の内側のより厚い部分、真皮は、上側の乳頭層および下側の網状層で構成される。真皮は、血管、神経、毛嚢、および汗腺も含む。真皮の下の層である皮下組織は、主に疎性結合組織と脂肪細胞とを含み、表皮／真皮を下層の骨および筋肉に固定するように機能するという点において、皮膚の一部であると考えられ得る。皮下組織は、真皮への血管および神経の供給も行う。
【０００４】
皮膚の細胞は概して、多くの組織と同様に、構成細胞間および隣接組織間にある組織内の空間を占める、大きな細胞外高分子のネットワークと接触している。この細胞外マトリクス（ECM）は、細胞および組織が支持され、接触している細胞の相互作用の調節に積極的に関与する足場として機能する。ECMの主要な高分子は、コラーゲン（体内で最も豊富なタンパク質）およびグリコサミノグリカン（通常タンパク質に結合されており、そのためプロテオグリカンと呼ばれる複合多糖）を含む。ECM内で見られ得る付加的なタンパク質は、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンを含む。皮膚の皮層は、大部分が、中に細胞が埋め込まれた高割合のコラーゲンおよびエラスチンを含有するECM（または「結合組織」）で構成されている。
【０００５】
ECMの構成要素は、細胞によって局所的に分泌される細胞外タンパク質分解酵素によって分解される。細胞外プロテアーゼ、特にマトリクス・メタロプロテアーゼ（MMP）は、数多くの皮膚病変、例えば、細胞外プロテアーゼを伴う加齢による老化および光老化過程のどちらにも関係している（例えば、米国特許出願番号200100513347を参照せよ）。皮膚内のMMP、特にMMP-1、-2、および-9のレベルの、加齢に伴う増加が実証されている（米国特許出願番号200100513347を参照せよ）。皮膚内のMMP-1、-2、-3および-9のレベルおよび／または活性における類似した増加も、UV暴露等の外因子を受けて発生すると報告されている（米国特許番号5,837,224を参照せよ）。老化過程（加齢および光誘導いずれも）は、皮膚内のECMの様々な構成要素、とりわけコラーゲン、エラスチン、およびフィブロネクチンの破壊の増加を伴う。コラゲナーゼ（MMP-1）およびストロメライシン-1（MMP-3）の発現を向上することは、皮膚内の結合組織破壊において中心的役割を果たすものとして説明されてきた（Brenneisen, et al., （2002）Ann. N.Y. Acad. Sci., 973:31-43）。同様に、加齢および光老化の無毛ネズミモデルにおいてセリンエラスターゼの発現を増加させることにより、フィブロネクチン分解が増加することが報告された（Labat-Robert, et al., （2000）J. Photochem. Photobiol. B., 57:113-118）。
【０００６】
弾性繊維は、フィブリンリッチな微小繊維のマントルで取り囲まれたエラスチン芯を含む、必須の細胞外マトリクス高分子である。これらの繊維は、血管、肺、および皮膚等の結合組織に、弾性および回復力といった決定的特性を与えるものである（review of elastic fibers by Kielty CM et al: J Cell Sci（2002）115:2817-2828を参照せよ）。日光への暴露は、「弾性線維症」として知られる皮膚内のエラスチンの崩壊を引き起こすことが知られており、これも皮膚老化の顕著な特徴である。好中球エラスターゼは弾性線維症に関係しており、例えば正常なネズミと比較した場合、好中球エラスターゼが不足しているネズミはUVBへの暴露による影響を受けない。また、慢性的なUVB照射の後、皮膚内にはエラスターゼ活性の増加が観察されている（Tsukahara K et al Biol Pharm Bull 2001;24(9):998-1003）。線維芽細胞エラスターゼの合成阻害因子およびワレモコウ[Sanguisorba officinalis L.]の抽出物のいずれも、シワ形成を阻害し、ラットの皮膚弾性を維持した（Tsukahara K et al Biol Pharm Bull 2001;24(9):998-1003）。
【０００７】
MMPは、皮膚内の弾性繊維の損失における役割も果たす。老化中の組織損失および年齢依存性病状は、エラスターゼ型エンドペプチダーゼ、特にMMP-2および-9が過剰に活性化される、タンパク質分解活性の調節障害の結果である（Isnard N et al: Biomed Pharmacother. 2002 Jul;56(5):258-64）。また、ゼラチナーゼB（MMP-9）は、ヒト皮膚組織切片においてフィブリリンを分解することが報告されている（Berton A et al, Matrix Biol 2000;19(2):139-148）。
【０００８】
莫大な数の皮膚障害を改善するための一環として、局所療法（クリーム、オイル、ローション、ゲル、およびスプレー）から経口療法、美容整形、注射、および紫外線療法にわたる治療法が開発されてきた。例えば、予測できない環境の変化からの皮膚の防御を補助するための局所皮膚塗布が当業界で既知である。従来の皮膚保護は一般的に、皮膚をUV光から保護しようと試みる（米国特許番号5,141,741を参照せよ）、または、遊離基を中和することができる添加剤を提供しようと試みる（米国特許番号6,764,693）ものである。MMPを阻害する化合物と組み合わせたUV遮断化合物の塗布によって、皮膚の加齢による老化または光老化を阻害する方法も報告されている（米国特許番号5,837,224、6,130,254、および6,365,630、ならびに米国特許出願番号20010053347）。MMPの活性を阻害するメルカプトケトンおよびメルカプトアルコール化合物、ならびに、関節症、皮膚病変、骨吸収、炎症性疾患、および腫瘍浸潤等の病態の治療または制御におけるそれらの使用法についても説明されている（米国特許番号6,307,101）。
【０００９】
皮膚障害を治療するための、ローション、クリーム、およびゲル等の薬剤に対するある植物抽出物またはフィト化合物の添加についても報告されている。これらの化粧品組成物は、皮膚をUV光から防御する働きをし（米国特許番号4,857,325、5,141,741、および6,342,208）、遊離基の中和において抗酸化剤として作用する（米国特許番号4,923,697）。遊離基を中和することができるいくつかの果実抽出物含有皮膚用剤は、付加的に保湿し、皮膚の水和を促進する（米国特許番号6,800,292を参照せよ）。
【００１０】
皮膚化粧品において有用なその他の植物抽出物が説明されている（米国特許番号6,682,763、5,824,320、および6,406,720を参照せよ）。ここでは、美肌効果、特に皮膚のシワおよびたるみの防止および解消に関する老化防止効果を有するものとして、オリーブ植物由来の外部物質が報告されている（米国特許番号6,682,763）。さらに、暗色皮膚、肝斑、雀卵斑、および皮膚の黒ずみまたはくすみを緩和（米国特許番号5,073,545）または防止することができる美白効果が報告されている（米国特許番号6,682,763）。皮膚に加えて、粘膜または外骨格に塗布するための、植物抽出物を含有する皮膚化粧品も考慮されており（米国特許番号6,406,720）；これらの化粧品の有効成分は、モンビン[Spondias mombin]、Maprounea guianensis、コバンバノキ[Waltheria indica]、Gouania blanchetiana、Cordia schomburgkii、Randia armata、または ハイビスカス・ヤンギヌアス[Hibiscus furcellatus]由来のものである。湿疹および／または乾癬（米国特許番号6,676,975および4,855,131）、痔核（米国特許番号5,627,216）の治療において、ならびに、一般的なスキンケアを維持するため（米国特許番号6,193,975）に有用な植物抽出物が説明されている。
【００１１】
数多くの特許および出版物が、植物から抽出された化合物により、一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼが阻害されたことを報告している。例えば、Sun et al.,（1996）Phytotherapy Res., 10: 194-197は、Doliocarpus verruculosisから抽出したベツリン酸により、ストロメライシン（MMP-3）およびコラゲナーゼがin vitro阻害されたことを報告している。Sazuka et al,（1997）Biosci. Biotechnol. Biochem., 61: 1504-1506は、緑茶および紅茶から単離された化合物により、ゼラチナーゼ（MMP-2およびMMP-9）および転移が阻害されたことを報告している。Kumagai et al, JP 08104628 A2, April 1, 1996（CA 125: 67741）は、コラゲナーゼを阻害する目的で、コガネバナ[Scutellaris baicanlensis]の根から単離したフラボンおよびアントシアニンを使用したことを報告している。Gervasi et al.,（1996）Biochem. Biophys. Res. Comm., 228: 530-538は、ある植物レクチンおよびその他の糖類によるMMP-2の調節について報告している。Dubois et al.,（1998）FEBS Lett., 427: 275-278は、ある植物レクチンにより、有毒性のゼラチナーゼB（MMP-9）の分泌が増加したと報告している。Nagase et al.,（1998）Planta Med., 64: 216-219は、ソラナム・メロンゲーナ（ナス）[Solanum melongena]から単離したフラボノイドであるディルフィニジンにより、コラゲナーゼが弱く阻害されたことを報告している。
【００１２】
その他の報告として、雷公藤［Tripterygium wilfordii Hook F］抽出物を使用したTNF-α産出の阻害について説明したAsano et al. （（1998） Immunopharmacology, 39: 117-126）；関節炎の治療におけるアボカド／大豆非鹸化性抽出物の使用法を報告したMaheu et al. （（1998）Arthritis Rheumatol., 41: 81-91）；コラゲナーゼをin vitroで阻害するための緑茶抽出物の使用法を報告したMakimura et al. （（1993）J. Periodontol., 64: 630-636）；ならびに、ユーカリおよびニワトコからの植物抽出物によるヒト線維芽細胞および好中球エラスターゼからのコラゲナーゼI（MMP-1）の阻害を報告したObayashi et al. （（1998）Nippon Keshonin Gijutsusha Kaishi, 32: 272-279（CA 130: 92196））が挙げられる。トウガラシ[Capsicum Annuum L]（米国特許番号6,432,456）およびキャベツ類[Brassica olearacea]（米国特許番号6,177,122）由来の植物抽出物についても説明されている。
【００１３】
薬草からのメタノール抽出物のエラスターゼ活性に対する効果は、LeeおよびKimによって報告されている（Inter. J. of Cosmetic Sci. 21:71-82（1999））。ビンロウ［A. catechu］、シナニッケイ［C. cassia］、ニクズク［M. fragrans］、ウコン［C. longa］、A. katsumadiaおよびD. cassirrhizomaのメタノール抽出物だけをスクリーニングした約150の抽出物が、優れたエラスターゼ活性阻害を示している。同様に、シロバナルーピン［L. albus］（PCT/FR00/01007, 公開番号WO 00/62789）のペプチド含有抽出物はMMP-1、MMP-2、およびMMP-9を含む細胞外プロテアーゼの活性を阻害することが、線維芽細胞モデルを使用して示されている。
【００１４】
様々な細胞外プロテアーゼを阻害することができる植物抽出物を得るための過程が国際特許出願PCT/CA02/00285（公開番号WO 02/06992）に説明されており、この過程において、抽出物は、in vitroアッセイで細胞外プロテアーゼを阻害する能力に基づきスクリーニングされる。しかしながら、in vivoで細胞外プロテアーゼを阻害する、またはそのようなプロテアーゼの活性に関連する過程を阻害するこれらの抽出物の能力は、説明または示唆されていなかった。
【００１５】
この背景情報は、本発明に関連性があると出願人が考える情報を知らせる目的で、提供されている。先に記載した情報が本発明に反する従来の技術の一部をなすということは、故意に意図されておらず、あるいはそのように解釈されるべきでない。
【発明の要約】
【００１６】
本発明の一つの目的は、植物抽出物およびその皮膚科使用法を提供することである。本発明の一局面と一致して、生理的に許容可能な担体と細胞外プロテアーゼ阻害活性を有する効果的な量の一つあるいはそれ以上の植物抽出物とを含む皮膚用製剤であって、前記植物抽出物は溶媒抽出法により表1、2、3、4、および5に記載されている植物のいずれかから得られ、前記細胞外プロテアーゼはマトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択され、前記抽出物は皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす皮膚用製剤が提供されている。
【００１７】
本発明の別の局面と一致して、細胞外プロテアーゼ阻害活性を有する植物抽出物であって、溶媒抽出法により、Aconitum napellus、Acorus calamus、Alchemilla mollis、Allium cepa、Allium sativum、Allium tuberosum、Ambrosia artemisiifolia、Anethum graveolens、Anthemis tinctoria、Aronia melanocarpa (Michx.) Ell.、Arctostaphylos uva-ursi、Aronia x prunifolia、Artemisia dracunculus、Avena sativa、Beta vulgaris、Beta vulgaris L. subsp. Vulgaris、Borago officinalis、Brassica napus、Brassica oleracea、Brassica oleracea L. var. italica Plenck、Brassica rapa、Bromus inermis、Capsicum annuum L. var. annuum、Cerastium tomentosum、Chaerophyllum bulbosum、Chenopodium quinoa、Chenopodium quinoa subsp. Quinoa、Chenopodium quinoa Willd.、Chichorium endivia、Chichorium endivia subsp. Endivia、Circium arvense、Citrullus lanatus、Cornus canadensis、Cornus sericea、Cynara cardunculus subsp. Cardunculus、Daucus carota、Daucus carota subsp carota L.、Dolichos lablab、Euphorbia amygdaloides、Fagopyrum tataricum、Foeniculum vulgare、Frangula alnus、Galinsoga quadriradiata、Gentiana lutea、Geranium sanguineum、Geranium x cantabrigiense、Glycyrrhiza glabra、Hamamelis virginiana、Helianthus strumosus、Heliotropium arborescens、Hordeum vulgare subsp. Vulgare、Hypomyces lactifluorum、Juniperus communis L.、Lentinus edodes、Lotus corniculatus、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Melilotus alba Medik.、Melissa officinalis、Mentha x piperita、Oenothera biennis、Pastinaca sativa L.、Petroselinum crispum、Phaseolus vulgaris、Physalis philadelphica、Phytolacca decandra、Phytolacca decandra syn. P. americana、Pimpinella anisum、Pisum sativum、Potentilla anserina L.、Potentilla fruticosa、Poterium sanguisorba、Pyrus communis、Raphanus raphanistrum、Rheum x hybridum、Rhus typhina L.、Ribes nigrum L.、Ribes sylvestre、Rodgersia spp.、Rosmarinus officinalis、Rubus occidentalis、Rubus thibetanus、Rumex crispus、Rumex scutatus、Ruta graveolens、Salvia officinalis、Sambucus canadensis L.、Setaria italica、Solanum melongena L.、Sorghum dochna bicolor gr technicum、Stellaria media、Tanacetum cinerariifolium、Taraxacum officinale、Teucrium chamaedrys、Thymus fragantissimus、Thymus x citriodorus、Trifolium incarnatum、Triticosecale spp.、Tropaeolum majus L.、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Vaccinium angustifolium Ait.、Vitia sp.、x Triticosecale spp.、Zea mays L.、およびZingiber officinaleから成る群より選択された植物から得られ、前記細胞外プロテアーゼはマトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される植物抽出物が提供されている。
【００１８】
本発明の別の局面と一致して、植物抽出物は、Beta vulgaris L.、Brassica oleracea L.、Capsicum annuum L、Chenopodium quinoa、Daucus carota L.、Geranium x cantabrigiense、Juniperus communis L.、Melilotus alba、Pastinaca sativa L.、Potentilla anserina L.、Rhus typhina L.、Solanum melongena L.、Tropaeolum majus L.、Vaccinium angustifolium、x Triticosecale spp.、および Zea mays Lから成る群より選択される植物に由来する。
【００１９】
本発明の別の局面と一致して、植物抽出物は、アルコール、水、水性緩衝液、あるいはそれらの組み合わせを溶媒として用いる抽出法によって、植物材料から得られる。
【００２０】
別の局面と一致して、皮膚用製剤の調製における、本発明の植物抽出物の使用法が提供されている。
【００２１】
別の局面と一致して、皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケアのための、本発明の皮膚用製剤の使用法が提供されている。
【００２２】
別の局面と一致して、皮膚、毛髪、爪の健康および／または外観を改善するための、本発明の皮膚用製剤の使用法が提供されている。
【００２３】
別の局面と一致して、皮膚病変の治療または予防における、本発明の皮膚用製剤の使用法が提供されている。
【００２４】
別の局面と一致して、皮膚老化を弱める、または防止するための、本発明の皮膚用製剤の使用法が提供されている。
【００２５】
別の局面と一致して、皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケアのための、本発明の植物抽出物の使用法が提供されている。
【００２６】
別の局面と一致して、皮膚、毛髪、爪の健康および／または外観を改善するための、本発明の植物抽出物の使用法が提供されている。
【００２７】
別の局面と一致して、皮膚病変の前記治療または予防における、本発明の植物抽出物の使用法が提供されている。
【００２８】
別の局面と一致して、皮膚老化を弱める、または防止するための、本発明の植物抽出物の使用法が提供されている。
【００２９】
本発明の別の局面と一致して、皮膚用製剤の調製に適切な植物抽出物を同定するための過程であって、（a）植物材料の溶媒抽出法によって複数の可能性のある抽出物を作製する段階と；（b）前記可能性のある植物抽出物のそれぞれの、マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される、一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼを阻害する能力を分析する段階と；（c）抽出物群を提供するために、前記細胞外プロテアーゼのうち少なくとも一つの当該能力を阻害することができる、それらの可能性のある植物を選択する段階と；（d）コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチンの破壊を弱めること；内皮細胞の移動を弱めること；コラーゲン産出を増加させること；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性を弱めること；および、線維芽細胞により生成された牽引力を弱めることから成る群より選択される皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす能力を調べるために、前記抽出物群の各抽出物を分析する段階と；（e）皮膚用製剤の調製に適切な植物抽出物を提供するために、前記細胞活性のうち一つあるいはそれ以上に影響を及ぼすことができる抽出物を選択する段階とを含む過程が提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図1は、それぞれ固体植物材料に由来する植物抽出物を作製するために、本発明の一つの実施例により従うことができる手続きの概要を表している。
【００３１】
【図２】図2は、図1に示した手続きを詳細に説明している。
【００３２】
【図３】図3は、植物抽出物を調製するために、図1に示した手続きに基づき従うことができる商業的手続きの概要を表している。
【００３３】
【図４】図4は、ショクヨウダイオウ［Rheum rhabarbarum］由来の本発明の植物抽出物のコード形成における効果を示す：（a）処置を施さない細胞；（b）陽性対照で処置した細胞；（c）本発明の抽出物（1X濃度）で処置した細胞；および、（d）本発明の抽出物（2X濃度）で処置した細胞。
【００３４】
【図５】図5は、それぞれ固体植物材料に由来する植物抽出物を作製するために、本発明の別の実施例において従うことができる手続きの概要を表している。
【００３５】
【図６】図6は、図5に示した手続きを詳細に説明している。
【００３６】
【図７】図7は、ヒトケラチノサイトおよび線維芽細胞の生存率に対する本発明の植物抽出物の効果を表している。
【００３７】
【図８】図8は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲンの産出に対する本発明の植物抽出物の効果を表している。
【００３８】
【図９】図9は、ヒト皮膚ケラチノサイトからのIL-8の放出に対する本発明の植物抽出物の効果を表している。
【発明の詳細なる説明】
【００３９】
本発明は、少なくとも一つの皮膚細胞外プロテアーゼ（EP）を阻害することができる一つあるいはそれ以上の植物抽出物を含む皮膚用製剤を提供する。本発明の文脈では、「皮膚細胞外プロテアーゼ」および「皮膚EP」という語は、細胞外プロテアーゼ：マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）を意味する。本発明は、本発明の皮膚用製剤に組み入れるべき適切な上記活性を有する植物抽出物を同定するために、当該植物抽出物をスクリーニングするための迅速な方法をさらに提供する。本発明は、皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケア用および皮膚、毛髪、爪の健康および／または外観を改善するために加え、皮膚のシワまたはたるみ、放射線照射された皮膚および／または毛髪損傷、皮膚線の深化、皮膚弾性の変化等を含む様々な皮膚病変の治療または予防に適切な皮膚用剤としての、上記活性を有する植物抽出物の使用法も提供する。
【００４０】
本発明はさらに、本書において説明する、一つあるいはそれ以上の皮膚細胞外プロテアーゼを阻害する方法によって同定される新規植物抽出物を提供し、当該植物抽出物は、皮膚用剤として使用するのに適切である。本発明の植物抽出物から単離された、準精製された／精製された有効成分（すなわち、分子または化合物）、および、これらの有効成分の、単独あるいは抽出物と組み合わせた、皮膚溶剤としての使用法も考慮されている。
【００４１】
哺乳類の外皮系は、外胚葉およびその下の中胚葉由来の構成要素（皮膚、毛髪、および爪）によって構成される。哺乳類の皮膚は、細胞外マトリクス（ECM）に埋め込まれた細胞の数多くの層で構成され、皮膚に構造を提供し、コラーゲン、エラスチン、およびフィブロネクチンを含む数多くの重合構造成分を含む。線維芽細胞および免疫細胞を含む様々なタイプの細胞がECM内に分散されており、これらがECMにEPを分泌する。皮膚のECMは、流動しつつ一定の状態にある、つまり代謝回転しており、この代謝回転は厳密に調節され、分泌されたEPによって一部媒介され、これによってECMの構造成分を分解することができる。この代謝回転におけるコラーゲンまたはエラスチン等の一つあるいはそれ以上のECM構造成分の破壊速度増大へのシフトは、ECMの分解の増加および皮膚自体の望ましくない構造変化につながる。ECMの構造における変化は、栄養を皮膚に依存している毛髪および爪にも影響を及ぼす場合がある。ECM代謝回転のバランスにおけるシフトは、皮膚の疾患状態または有害要素（UV照射等）への暴露の結果として発生する場合があり、または、当然ながら、例えば、老化過程の一部として発生する場合がある。
【００４２】
従って、皮膚EPの阻害により、それに関連する皮膚および構造変化における望ましくないEP媒介ECM分解を弱めることができる。本発明の一つの実施例は、それに関連する皮膚および構造変化における望ましくないEP媒介ECM分解を弱めることができる植物抽出物を提供する。EP媒介ECM分解は、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブリリン、および／またはフィブロネクチンを含む、哺乳類の皮膚の細胞を取り囲んでいるECMの一つあるいはそれ以上の構成要素の破壊を意味する。望ましくない皮膚構造変化には、例えば、皮膚のシワおよび／またはたるみ、弾性の喪失、発赤、炎症、病斑の形成、上皮の菲薄化、皮膚内における細胞の異常移動（血管形成または炎症中に発生するもの等）、または、それらの様々な組み合わせが含まれる。
【定義】
【００４３】
別途定義しない限りは、本書で使用している全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００４４】
「可能性のある植物」という語は、本書で使用されているように、植物界の全ての種を含むように意図されており、それには陸生、水生、あるいはその他の植物が含まれ、それらはさらに、緑色植物門[Division Chlorophyta]、紅色植物門[Division Rhodophora might be a mistake for Division Rhodophyta]、褐藻植物門[Division Paeophyta]、コケ(苔)植物門[Division Bryophyta]、および維管束植物門[Division Tracheophyta]；ヒカゲノカズラ亜門[Subdivision Lycopsida]、トクサ亜門[Subdivision Sphenopsida]、シダ類亜門[Subdivision Pteropsida]、およびSubdivision Spermopsida；裸子植物綱[Class Gymnospermae]、被子植物綱[Class Angiospermae]、双子葉植物亜綱[Subclass Dicotyledonidae]、およびSubclass Monocotyledonidaeが含まれる。
【００４５】
「植物材料」という語は、本書で使用されているように、個々であるいは群で使用されている一つの植物のいかなる部分あるいは複数の部分をも意味する。その例には、植物の葉、花、根、種子、鞘、茎、果実、種皮、芽、およびその他の部分が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００４６】
「可能性のある抽出物」という語は、本書に記載されている手続きに続いて、植物材料に溶媒を接触させることにより調製された成分を意味し、当該成分は、一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼに対する阻害活性を有するとまだ判断されていない。可能性のある抽出物は、任意で一つあるいはそれ以上の分離段階および／または精製段階に供されてよい。
【００４７】
「本発明の抽出物」という語は、本書で使用されているように、本書に記載されている手続きに続いて、植物材料に溶媒を接触させることにより調製された成分を意味し、当該成分は、マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼに対する阻害活性を示す。植物抽出物は、一次抽出物であってもよいし、または、実質的に純粋な抽出物であってもよい。
【００４８】
「実質的に精製された」あるいは「実質的に純粋である」という語は、本発明の植物抽出物について使用される場合には、植物材料の第一の溶媒抽出の後に、少なくとも一つの付加的な処置に供された抽出物を意味する。従って、本発明は、任意でろ過または遠心分離段階が続く、植物材料の「一段階」溶媒抽出によって生じる一次抽出物と、初期抽出過程に続いて、液液抽出法、固液抽出法、クロマトグラフィー、蒸留、蒸発、ろ過等、一つあるいはそれ以上の付加的段階に供された実質的に純粋な植物抽出物とを提供する。「本発明の植物抽出物」という語によって、一次抽出物および実質的に純粋な抽出物の双方が包含される。
【００４９】
「ストレッサー」という語は、本書で使用されているように、物理的因子、化学化合物、あるいは生物剤など、植物における防御反応を活性化させ、それにより細胞外プロテアーゼ阻害剤を含む様々な化学物質の産出を誘発するために使用される因子を意味する。誘発因子および誘導因子もまた、ストレッサーと考えられる。
【００５０】
「単離された」という語は、分子または化合物等の有効成分について使用される場合には、それが得られた植物組織から分離された有効成分の形態を意味する。一般的に、単離された有効成分は、当該成分が植物において天然状態で関連性を持つタンパク質、核酸、脂質、炭水化物あるいはその他の物質を比較的含まない。単離された有効成分は、本書で説明しているようなルーチンあるいは既知の方法群を用いて、さらに精製することができる。そのようなものとして、本発明の単離された有効成分は、試料の少なくとも約1パーセント乃至数パーセント、例えば、少なくとも約5パーセントを構成してよい。一つの実施例では、単離された有効成分は、試料の少なくとも約20パーセントを構成する。別の実施例では、単離された有効成分はさらに精製され、試料の少なくとも約50パーセントを構成する。その他の実施例では、単離された有効成分はさらに精製され、試料の少なくとも約80パーセント、少なくとも約90パーセント、および少なくとも約95パーセントあるいはそれ以上を構成することができる。
【００５１】
「皮膚細胞」という語は、本書で使用されているように、通常、哺乳類の皮膚内に存在している細胞を意味する。「皮膚」は、表皮（基底層、有棘層、顆粒層、透明層、および角質層を含む）、真皮（真皮乳頭層および真皮網状層を含む）、および皮下組織を意味する。従って、「皮膚細胞」という語は、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞（血管内皮細胞を含む）、基底細胞、顆粒細胞、メルケル細胞、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、白血球、マスト細胞、神経細胞、脂肪細胞およびマクロファージを含むがそれらに限定されるものではない。
【００５２】
「弱める」という語は、本書で使用されているように、遅くする、阻害する、あるいは防ぐという意味である。
【００５３】
「細胞移動」という語は、本書で使用されているように、単一の細胞あるいは複数の細胞群の、一つの遺伝子座から別の遺伝子座への移動（一般的に、異常な移動）を意味する。細胞移動の例には、血管形成中に細胞群がECMあるいは基底板を通して移動することが含まれる。
【００５４】
「皮膚用剤」という語は、本書で使用されているように、外皮系の日常ケア用の、外皮系の健康および／または外観を改善するための、または、皮膚病変の治療または予防用の、抽出物、化合物、組成物、または製剤を意味する。
【００５５】
「皮膚病変」という語は、本書で使用されているように、被検体の外皮系の構成要素、すなわち、皮膚、毛髪、または爪の一つあるいはそれ以上に存在する、老化または内因子もしくは外因子による病変を意味する。
【００５６】
「治療」という語は、本書で使用されているように、治療を受けている個体の状態を改善する意図を以って行われる介入を意味する。改善は、主観的あるいは客観的であってよく、治療されている病気に関連した症状の改善、それらの発症の予防、あるいはそれらの病状を改善することに関連する。このように、治療という語は、広範な意味で使用されており、多様な病期にある病気の防止（予防）、緩和、減少、および治癒が含まれる。治療を受けている個体の状態が悪化することを防ぐことも、この語に含められる。治療を必要としている対象には、既に病気に罹患している個体、病気を発症する傾向があるかあるいはリスクがある個体、および、病気を予防する必要がある個体が含まれる。
【００５７】
「改善する」あるいは「改善」という語は、一時的および長期的な、治療されている病気の、一つあるいはそれ以上の症状、兆候、および特徴における、停止、予防、減少、あるいは改善を意味する。
【００５８】
「被験体」あるいは「患者」という語は、本書で使用されているように、治療を必要としている哺乳類、または、本発明の皮膚用製剤の使用により利益を享受するであろう個体を意味する。
【００５９】
本書で使用されているように、「約」という語は、記載された値から+/-10％の変動を意味する。そのような変動は、特に言及されるか否かに関わらず、本書に記載されている所与の値に常に含まれていると理解されたい。
【００６０】
本書で使用している化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（ed. Parker, S., 1985, McGraw-Hill, San Francisco）に例示されているような、当業界における慣行用法に従って、使用されている。
【００６１】
植物抽出物
本発明は、皮膚用剤としての使用に適切な植物抽出物を提供する。本発明によると、植物抽出物は、マトリクス・メタロプロテアーゼ-1（MMP-1）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-2（MMP-2）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-3（MMP-3）、マトリクス・メタロプロテアーゼ-9（MMP-9）、およびヒト白血球エラスターゼ（HLE）から成る群より選択される一つあるいはそれ以上の皮膚細胞外プロテアーゼを阻害することができる。
【００６２】
一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼを阻害するいくつかの植物抽出物がこれまでに同定されているが、様々な皮膚科的用途において効果的なこの特定のプロテアーゼ群のうちいずれかを、植物抽出物が阻害する可能性はまだ確立されていない。大型植物ライブラリ内の植物からこの特定のプロテアーゼ群のうち一つあるいはそれ以上を阻害する抽出物を同定するための、当該ライブラリの系統的評価、および、本書において説明しているように、その次の細胞モデル中における抽出物の評価により、この可能性を認識することができた。従って、皮膚用剤として使用するのに適切な本発明の植物抽出物は、上記に記載されている皮膚EPの少なくとも一つを阻害する。本発明は、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち、二つあるいはそれ以上、三つあるいはそれ以上、四つあるいはそれ以上、または五つすべてを阻害する植物抽出物も考慮している。
【００６３】
本発明の一つの実施例では、植物抽出物は少なくともMMP-1を阻害することができる。別の実施例では、植物抽出物は少なくともMMP-2を阻害することができる。さらなる実施例では、植物抽出物は少なくともMMP-3を阻害することができる。別の実施例では、植物抽出物は少なくともMMP-9を阻害することができる。別の実施例では、植物抽出物は少なくともHLEを阻害することができる。
【００６４】
ある代替の実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち少なくとも二つを阻害することができる。さらなる実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち少なくとも三つを阻害することができる。
【００６５】
植物抽出物は、当業界で既知である抽出物から選択されてよく、続いてMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、および／またはHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害する能力を調べるためにテストされてもよいし、または、本書において説明されているような過程を使用して同定されてもよい。本発明の一つの実施例では、植物抽出物は、表1から5に記載されている植物の一つに由来する。別の実施例では、植物抽出物は、表6に記載されている植物の一つに由来する。
【００６６】
別の実施例では、植物抽出物は、Aconitum napellus、Acorus calamus、Alchemilla mollis、Allium cepa、Allium sativum、Allium tuberosum、Ambrosia artemisiifolia、Anethum graveolens、Anthemis tinctoria、Aronia melanocarpa (Michx.) Ell.、Arctostaphylos uva-ursi、Aronia x prunifolia、Artemisia dracunculus、Avena sativa、Beta vulgaris、Beta vulgaris L. subsp. Vulgaris、Borago officinalis、Brassica napus、Brassica oleracea、Brassica oleracea L. var. italica Plenck、Brassica rapa、Bromus inermis、Capsicum annuum L. var. annuum、Cerastium tomentosum、Chaerophyllum bulbosum、Chenopodium quinoa、Chenopodium quinoa subsp. Quinoa、Chenopodium quinoa Willd.、Chichorium endivia、Chichorium endivia subsp. Endivia、Circium arvense、Citrullus lanatus、Cornus canadensis、Cornus sericea、Cynara cardunculus subsp. Cardunculus、Daucus carota、Daucus carota subsp carota L.、Dolichos lablab、Euphorbia amygdaloides、Fagopyrum tataricum、Foeniculum vulgare、Frangula alnus、Galinsoga quadriradiata、Gentiana lutea、Geranium sanguineum、Geranium x cantabrigiense、Glycyrrhiza glabra、Hamamelis virginiana、Helianthus strumosus、Heliotropium arborescens、Hordeum vulgare subsp. Vulgare、Hypomyces lactifluorum、Juniperus communis L.、Lentinus edodes、Lotus corniculatus、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Melilotus alba Medik.、Melissa officinalis、Mentha x piperita、Oenothera biennis、Pastinaca sativa L.、Petroselinum crispum、Phaseolus vulgaris、Physalis philadelphica、Phytolacca decandra、Phytolacca decandra syn. P. americana、Pimpinella anisum、Pisum sativum、Potentilla anserina L.、Potentilla fruticosa、Poterium sanguisorba、Pyrus communis、Raphanus raphanistrum、Rheum x hybridum、Rhus typhina L.、Ribes nigrum L.、Ribes sylvestre、Rodgersia spp.、Rosmarinus officinalis、Rubus occidentalis、Rubus thibetanus、Rumex crispus、Rumex scutatus、Ruta graveolens、Salvia officinalis、Sambucus canadensis L.、Setaria italica、Solanum melongena L.、Sorghum dochna bicolor gr technicum、Stellaria media、Tanacetum cinerariifolium、Taraxacum officinale、Teucrium chamaedrys、Thymus fragantissimus、Thymus x citriodorus、Trifolium incarnatum、Triticosecale spp.、Tropaeolum majus L.、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Vaccinium angustifolium Ait.、Vitia sp.、x Triticosecale spp.、Zea mays L.、およびZingiber officinaleから成る群より選択された植物に由来する。
【００６７】
別の実施例では、植物抽出物は、Allium cepa、Allium sativum、Ambrosia artemisiifolia、Ambrosia artemisiifolia、Arctostaphylos uva-ursi、Aronia x prunifolia、Artemisia dracunculus、Avena sativa、Beta vulgaris、Beta vulgaris L. subsp. Vulgaris、Brassica napus、Brassica oleracea、Brassica oleracea L. var. italica Plenck、Brassica rapa、Bromus inermis、Capsicum annuum L. var. annuum、Chenopodium quinoa、Chenopodium quinoa subsp. Quinoa、Chenopodium quinoa Willd.、Chichorium endivia、Chichorium endivia subsp. Endivia、Citrullus lanatus、Cornus sericea、Daucus carota、Daucus carota subsp carota L.、Dolichos lablab、Euphorbia amygdaloides、Foeniculum vulgare、Galinsoga quadriradiata、Gentiana lutea、Geranium sanguineum、Geranium x cantabrigiense、Glycyrrhiza glabra、Helianthus strumosus、Hypomyces lactifluorum、Juniperus communis L.、Lentinus edodes、Lotus corniculatus、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Melilotus alba Medik.、Melissa officinalis、Oenothera biennis、Pastinaca sativa L.、Phaseolus vulgaris、Physalis philadelphica、Pimpinella anisum、Pisum sativum、Potentilla anserina L.、Potentilla fruticosa、Raphanus raphanistrum、Rheum x hybridum、Rhus typhina L.、Ribes sylvestre、Rodgersia spp.、Rubus occidentalis、Rubus thibetanus、Rumex crispus、Rumex scutatus、Setaria italica、Solanum melongena L.、Sorghum dochna bicolor gr technicum、Stellaria media、Tanacetum cinerariifolium、Taraxacum officinale、Thymus fragantissimus、Thymus x citriodorus、Trifolium incarnatum、Triticosecale spp.、Tropaeolum majus L.、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Vaccinium angustifolium Ait.、Vitia sp.、x Triticosecale spp.、Zea mays L.、およびZingiber officinaleから成る群より選択された植物に由来する。
【００６８】
本発明の別の実施例では、植物抽出物は、Beta vulgaris L.、Brassica oleracea L.、Capsicum annuum L、Chenopodium quinoa、Daucus carota L.、Geranium x cantabrigiense、Juniperus communis L.、Melilotus alba、Pastinaca sativa L.、Potentilla anserina L.、Rhus typhina L.、Solanum melongena L.、Triticosecale spp.、Tropaeolum majus L.、Vaccinium angustifolium、およびZea mays L.から成る群より選択された植物に由来する。
【００６９】
本発明によると、植物抽出物は、選択された植物から溶媒抽出法によって得られた溶媒ベースの抽出物である。溶媒は、水性溶媒（水または緩衝液等）もしくは液体有機化合物であるか、または、水性溶媒と液体有機化合物との組み合わせであってよい。本発明の一つの実施例では、植物抽出物は、水性、アルコール性、または水性アルコール性の抽出物である。別の実施例では、植物抽出物は、水性、エタノール性、グリコール性、水性エタノール性、または水性グリコール性の抽出物である。さらなる実施例では、グリコールは、ブチレングリコールである。
【００７０】
植物抽出物の調製
植物抽出物は、植物材料の溶媒抽出により、選択された植物から得られる。実際の抽出過程は本発明にとって絶対不可欠なものではないが、一般的に、水性溶媒（緩衝液の水等）、液体有機化合物、あるいはそれらの組み合わせを溶媒として用いる。抽出過程において植物抽出物を調製するための溶媒として使用できる例示的液体有機化合物は、メチルアルコール（メタノール）、エチルアルコール（エタノール）、1-プロパノール、および1-ブタノール等の第一級アルコール；2-プロパノールおよび2-ブタノール等の第二級アルコール；2-メチル-2-プロパノール等の第三級アルコール；グリセリンおよびグリコール等の液状多価アルコール；ならびに、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、1,4-ジオキサン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド、酢酸、ジエチルエーテル、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、および酢酸エチル等、その他の既知の有機溶媒を含むがそれらに限定されるものではない。適切なグリコールは、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、および1,3-ブチレングリコールを含む。
【００７１】
水性溶媒と液体有機化合物との混合物を含む溶媒を使用して抽出過程が行われる場合、液体有機化合物の含有量は容量で約5％から約95％の範囲である。一つの実施例では、溶媒中の液体有機化合物の含有量は容量で約10％から約90％の範囲である。別の実施例では、溶媒中の液体有機化合物の含有量は容量で約20％から約90％の範囲である。さらなる実施例では、溶媒中の液体有機化合物の含有量は容量で約20％から約85％の範囲である。別の実施例では、溶媒中の液体有機化合物の含有量は容量で約20％から約50％の範囲である。代替の実施例では、溶媒中の液体有機化合物の含有量は容量で約50％から約85％の範囲である。
【００７２】
植物抽出物が局所使用のために製剤化される皮膚科的用途には、哺乳類の皮膚に適合する溶媒を選択することができる。そのような溶媒の例は、水、水性緩衝液、水／緩衝液と低級アルコールまたは無水低級アルコールとの組み合わせを含むがそれらに限定されるものではない。本発明の文脈では、低級アルコールは、第一級、第二級、第三級、または液状多価アルコール等、1から4個の炭素原子を有するアルコールを意味する。従って、本発明の一つの実施例では、溶媒は、水、低級アルコール、あるいはそれらの組み合わせから選択される。別の実施例では、低級アルコールは、メチルアルコール（メタノール）、エチルアルコール（エタノール）、1-プロパノール、1-ブタノール、2-プロパノール、2-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、2-メチル-2-プロパノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、および1,3-ブチレングリコールから成る群より選択される。
【００７３】
抽出で水性溶媒と低級アルコールとの組み合わせを溶媒として使用する場合、溶媒の低級アルコール含有量は一般的に、容量で約10％から約95％の範囲である。本発明の一つの実施例では、溶媒の低級アルコール含有量は容量で約10％から約90％の範囲である。別の実施例では、溶媒の低級アルコール含有量は容量で約15％から約90％である。さらなる実施例では、溶媒の低級アルコール含有量は容量で約15％から約50％の範囲である。別の実施例では、溶媒の低級アルコール含有量は容量で約50％から90％の範囲である。代替の実施例では、溶媒は水性溶媒と低級アルコールとの組み合わせを含み、低級アルコール含有量は容量で20％以上である。
【００７４】
植物抽出物を調製するために、当業界で既知である数多くの標準抽出技術を用いることができる。一般的に、抽出過程は、固体植物材料を溶媒に接触させることを必然的に伴い、接触は、適切な配合の溶媒を用い、および当該固体植物材料が当該溶媒に適切に晒され当該植物材料に存在する阻害活性が当該溶媒により引き出されるように十分な長さの時間で行う。
【００７５】
抽出過程で用いる植物材料は、植物全体であってもよいが、例えば葉、花、根、種子、鞘、茎、果実、種皮、芽、あるいはそれらの組み合わせなどから得られた一つあるいはそれ以上の独特の植物組織であってもよい。植物材料は、新鮮であっても、乾燥してあっても、あるいは凍結してあってもよい。植物材料は、収穫した直後に使用しても、あるいは抽出過程に供する前にある期間保存してもよい。植物材料を保存する場合、保存する前に、例えば、乾燥、凍結、乾燥凍結、あるいはそれらのなんらかの組み合わせにより、処理してもよい。保存期間は長さが異なっていてよく、例えば、数日から数年の間であってよい。一般的に、保存期間は1週間未満から約1年の期間の範囲である。
【００７６】
必要に応じて、植物材料は、収穫ストレス処理に供した植物に由来するものであってよい。ストレス処理は、植物または植物由来の材料を、一つあるいはそれ以上の化学物質の増強産出を誘導あるいは誘発することを目的とする一つあるいはそれ以上のストレッサーと接触させるかそれらを用いて処理することを含む。ストレッサーは、化学化合物または物理処理であってよい。科学的ストレッサーの例は、脂肪酸類を含む有機酸類および無機酸類、グリセライド類、リン脂質類、糖脂質類、有機溶媒類、アミノ酸類、ペプチド類、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、リポ多糖類、フェノール類、アルカロイド類、テルペン類、テルペノイド類、抗生物質類、洗剤類、ポリアミン類、過酸化物類、イオノフォア類等を含むがそれらに限定されるものではない。物理的ストレス処理の例は、紫外線放射、サンドブラスト、低温および高温ストレス、塩あるいは糖類により誘導される浸透ストレスを含むがそれらに限定されるものではない。栄養ストレスは、一つあるいはそれ以上の化学物質の増強産出を誘導あるいは誘発するために、必須の栄養素（窒素、リン、あるいはカリウム）を植物から奪うことと定義される。一つあるいはそれ以上のストレッサー（すなわち、化学化合物、物理処理、あるいはそれらの組み合わせ）を、継続してあるいは断続的に、植物材料に適用してよい。抽出物調製の前に植物にストレスを負荷するための多様なストレッサーおよび手続きは先に説明してあり（国際特許出願WO 02/06992を参照せよ）、それらは本発明で使用するのに適切である。
【００７７】
本発明の一つの実施例では、植物抽出物はストレス処理に供された植物から調製される。別の実施例では、抽出物は、一つあるいはそれ以上の化学的ストレッサーに供された植物から調製される。さらなる実施例では、抽出物は、γ-リノレン酸、γ-リノレン酸低級アルキルエステル、アラキドン酸、およびアラキドン酸低級アルキルエステルから成る群より選択された、一つあるいはそれ以上の化学的ストレッサーに供された植物から調製される。さらなる実施例では、抽出物は、一つあるいはそれ以上の物理的ストレスに供された植物から調製される。さらに別の実施例では、抽出物はストレスを負荷していない植物に由来する。
【００７８】
必要に応じて、抽出過程を促進する目的で、抽出過程の前に植物材料を処理してよい。一般的にそのような処置は、より広い面積を溶媒に晒すように、植物材料をなんらかの手段により断片化するものである。例えば、粉砕機あるいはその他の装置を用いて植物材料を機械的に潰すかあるいはスライスし、植物材料を小片あるいは粒子に断片化するか、あるいは液体窒素を用いて植物材料を凍結させ、その後潰すか断片化し、小片としてもよい。
【００７９】
抽出に使用する溶媒の量は、固体植物材料の約1Xから約100X（質量／質量）の範囲であってよい。本発明の一つの実施例では、抽出過程で使用する溶媒の量は、固体植物材料の約1Xから約50X（質量／質量）の範囲であってよい。
【００８０】
抽出過程には多様な条件を用いることができる。一般的に、抽出手続きは、約10分から約24時間の時間で、約4℃から約50℃の温度で、行われる。しかしながら、約4℃から約90℃、例えば約4℃から約70℃の温度を用いてよい。同様に、抽出時間はその他の抽出条件によって異なってよく、例えば、抽出時間は数分から数時間の範囲であってよい。
【００８１】
溶媒を植物材料と適切に接触させるには、懸濁液を振るのがよい。あるいは、抽出効率を改善し得る、例えば攪拌機を装備した抽出器具を用いてよい。抽出は、常圧で、加圧下で、または、例えば吸引により確立された減圧下で行うことができる。当業者は、産出設備および収量等の産出条件を考慮して、適切な抽出条件を容易に判断および選択することができる。
【００８２】
抽出過程に続いて、液体分画（一次植物抽出物）を固体（不溶）分から分離してよい。液体分画と固体分画の分離は、様々な遠心分離またはろ過過程等、当業者に既知である一つあるいはそれ以上の標準分離過程により、実現することができる。
【００８３】
必要に応じて、一次抽出物をさらに精製するために、当該抽出物を一つあるいはそれ以上の付加的段階に供してよい。例えば、一次抽出物は、実質的に純粋な抽出物を産出するために、固液抽出法、液液抽出法、固相抽出法(SPE)、メンブレンろ過、限外ろ過、透析法、電気泳動法、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴ったあるいは伴わない液体あるいはガスクロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含む）、凍結乾燥、蒸発、多様な「担体」（PVPP、炭素、抗体等）を用いた沈殿、超臨界流体（CO2等）の使用、またはそれらの組み合わせに供されてよい。
植物抽出物テスト
【００８４】
細胞外プロテアーゼ阻害活性の判断
抽出過程に続いて、植物抽出物を、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEから成る群より選択された一つあるいはそれ以上の皮膚EPを阻害するその能力について、当業界で既知である多様なテクニックを用いて、テストすることができ、それらのテクニックは本書に記載したものを含むがそれらに限定されるものではない。本発明の文脈では、EPの活性を少なくとも20％減少させる植物抽出物は、そのプロテアーゼの活性を阻害する能力を有すると考える。本発明の一つの実施例では、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも20％阻害する植物抽出物は、本発明の抽出物であると考える。別の実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも30％阻害する。別の実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも40％阻害する。さらなる実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも45％阻害する。別の実施例では、植物抽出物はMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも50％阻害する。
【００８５】
抽出物が皮膚EPを阻害するか否かを判断するために、当該抽出物を、個々の皮膚EPについて、または、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち二つあるいはそれ以上を含むパネルについてテストすることができる。
【００８６】
上記のように、皮膚EPの活性を阻害する抽出物の能力を質的にまたは量的に測定する多様な方法群およびテクニックが当業界において既知である。例えば、MMPおよびエラスターゼの活性を測定するアッセイがいくつかあり（これらの方法群を閲覧するには、Murphy and Crabbe, In Barrett (ed.) Methods in Enzymology. Proteolytic Enzymes: Aspartic Acid and Metallopeptidases, New York: Academic Press, 1995, 248: 470を参照せよ）、それらのアッセイには、ゼラチン分解アッセイ[gelatinolytic assay]（これは、放射能標識を付けたタイプΙコラーゲンの分解に基づく）、ザイモグラフィーアッセイ（これは、基質含浸SDSポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動をモニターする、負染色したバンドの存在に基づく）、およびPacmen et al.,(Biochem. Pharm.（1996）52:105-111)により開発されたマイクロタイタープレートアッセイがある。
【００８７】
その他の方法には、自動クエンチした蛍光基質を用いるものがある。多くの蛍光基質が、蛍光レベル変化測定を用いて、MMPおよびエラスターゼの活性を定量化できるようにデザインされている（Nagase and Fields (1996) Biopolymers 40: 399-416により、再調査された）。EP活性を測定する別の方法は、カナダ国特許番号2,189,486およびSt-Pierre et al.,（（1996）Cytometry 25: 374-380）に説明されている、蛍光活性化基質変換[fluorescent activated substrate conversion、FASC]アッセイを使用するものである。
【００８８】
アッセイにおいては、当業界で既知である多様なフォーマットを利用することができる。例えば、抽出物を、一つあるいはそれ以上のEPについて連続してテストすることもでき、あるいは複数の皮膚EPまたは皮膚EPのアレイについて同時にテストすることもできる。これらのアッセイを、複数の皮膚EPについての抽出物の同時テストを促進する目的で、当業界で既知であるような高スループットに適用することもできる。
【００８９】
これらのアッセイは、精製された、または準精製されたEPを使用して行うことができる。EPを単離または精製する方法は、当業界では既知である。また、EPは市販されている（例えば、ミズーリ州セントルイス市Sigma-Aldrich社およびカリフォルニア州サンディエゴ市Calbiochem社）。
【００９０】
あるいは、皮膚EPの活性を阻害する抽出物の能力は、一つあるいはそれ以上の皮膚EPを分泌する細胞の培養物を使用して評価することができる。この場合、細胞培養物は適切な量の抽出物と接触している。適切な時間の後、細胞を抽出して、遠心分離し、上澄み中のタンパク質分解活性を測定する。この方法は、特定の細胞ラインまたは細胞ラインの組み合わせによって分泌されたEPのセットを阻害する抽出物の能力を判断するのに有用である。例えば、ケラチノサイトまたは線維芽細胞等、哺乳類の皮膚に由来する細胞ラインを用いてアッセイを行うことができる。
【００９１】
皮膚モデルにおけるEP活性の阻害
上述した細胞培養アッセイの延長として、抽出物を、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害するそれらの能力について、適切な皮膚モデルにおいてテストすることができる。例えば、抽出物をテストするために、in vitroヒト皮膚モデルを用いてよい。そのようなモデルは一般的に、ヒト皮膚線維芽細胞およびコラーゲンを含むゲルをまず形成することにより、ヒト線維芽細胞およびケラチノサイトから構成される。細胞培養液を添加し、線維芽細胞増殖、ならびに、ゲルへのコラーゲンおよびプロテアーゼの合成および分泌を可能にするのに十分な日数、ゲルをインキュベートする。このインキュベーション時間の後、生体媒質中のドナーが一致したヒト表皮ケラチノサイトを、ゲル上にピペットでゆっくり分注し、その表面上にコンフルエントな層を確立させる。被験植物抽出物を添加し、適切なインキュベーション時間（例えば、6時間から24時間）を経た後、ゲルを抽出して、遠心分離し、上澄み中のタンパク質分解活性をアッセイする。
【００９２】
エラスターゼ酵素源を提供する目的で、上記の皮膚モデルに免疫細胞を添加してもよい。皮膚モデルのその他の例が当業界において提供されており、例えば、米国特許6,079,415およびその参考文献を参照されたい。
【００９３】
EPe阻害のin vivoテスト
あるいは、皮膚EP活性を阻害する抽出物の能力は、標準テクニックを用いてin vivoで評価することができる。例えば、プロテアーゼ活性を阻害する抽出物の能力は、動物モデルまたはヒトの志願者において判断できる。適切な動物モデルの例は、本発明の抽出物で処理した後、UV放射線を浴びたSKH-1マウスもしくはヌードマウス、またはラットであろう（Nishimori et al.（2001）J. Invest. Dernatol. 117:1458-1463を参照せよ）。UV放射線は、あるMMPの活性のレベルを増強することが知られている（例えば、米国特許番号6,130,254を参照せよ）。動物から皮膚生検を採取し、被験抽出物の阻害活性を示すような標準テクニックを使用して、生検試料中のEP活性の量を測定することができる。
【００９４】
皮膚におけるEP活性を阻害する抽出物の能力を評価するために、ヒト治験を使用してもよい。例えば、皮膚生検は、UV放射線を浴び、UV暴露前後に抽出物で処理した成人の志願者から採取してよい。生検試料のEP活性を評価し、適切な対照（例えば、対照化合物で処理した、または処理していない個体の皮膚生検）と比較することができる。あるいは、MMP-1、MMP-2、およびMMP-9の相対活性の、加齢に伴う増加が実証されており（例えば米国特許出願番号20010053347を参照せよ）、高齢な個体（例えば、80歳を超える個体）は、UV暴露の必要なく治験の志願者として使用することができる。
【００９５】
皮膚生検におけるプロテアーゼ活性を評価する目的で、一般的に試料を急速冷凍し、機械的に粉砕し、および／またはホモジナイズする。遠心分離後、上澄みを単離し、上記で概説したようなアッセイにおいてEP活性を評価するために使用する。
【００９６】
皮膚細胞におけるIn vitro細胞活性
皮膚科的用途において有用となるには、選択された植物抽出物は、皮膚細胞の一つあるいはそれ以上の細胞活性に有益な方式で影響を及ぼすことができる。皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす植物抽出物の能力は、当業界で既知である標準テクニックの一つ、または組み合わせを使用してin vitroで評価することができる。in vitroで評価できる皮膚細胞中の細胞活性は、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチン等のECMの構造成分の破壊；細胞の移動；コラーゲン産出；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性および線維芽細胞によって生成された牽引力；酸化的ストレスに対する応答、IL-8またはその他のサイトカインの放出の阻害、誘導アポトーシスに対する応答、創傷治癒を含むがそれらに限定されるものではない。
【００９７】
例えば、一つあるいはそれ以上のECM構成要素の破壊を弱める本発明の抽出物の能力は、上述したように皮膚モデルを使用してin vitroで評価することができる。植物抽出物でインキュベートした後、ゲルを抽出し、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、および／またはフィブリリン等、ECMの一つあるいはそれ以上の構造成分の損失をアッセイすることができる。あるいは、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、および／またはフィブリリンの断片の存在について、これらの構成要素の破壊を示すような標準テクニックを使用して、ゲルをアッセイしてもよい。
【００９８】
例えばエラスチンは、デスモシンとして生化学的に定量化する、または組織学的に可視化することができる（Starcher B and Conrad M: Ciba Found Symp. （1995）192:338-46）。あるいは、皮膚微小繊維ネットワークの可視化において、共焦点顕微鏡法を使用することができる（Watson RE et al: J Invest Dermatol.（1999）112（5）:782-7）。無傷エラスチンおよびエラスチン断片を、免疫ブロット法によって測定することもできる（Sakuraoka K et al: J Dermatol Sci （1996）12（3）:232-237）。
【００９９】
ゲル中のコラーゲン量の変化を評価するために、生化学的および／または免疫化学的方法を使用してよい。ゲル中のコラーゲン量の変化を評価するために、微細構造的方法を使用してもよい（Fligiel SE et al: J Invest Dermatol. （2003）120（5）:842-8）。皮膚病変内に沈殿する最も豊富な細胞外マトリクスタンパク質であるタイプIコラーゲンは、Allanore Y et al （J Rheumatol. (2003）30（1）:68-73）によって説明されている方法を使用して測定することができる。
【０１００】
皮膚弾性線維症、フィブリリン減少、およびタイプVIIコラーゲン発現の存在を判断するために、量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応分析を使用することができる（Bosset S et al: Br J Dermatol.（2003）148（4）:770-8）。
【０１０１】
より複雑な皮膚モデルによって、Roguet R（Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. （2002）15 Suppl 1:1-3）によって説明されているような、より高度なテスト手続きが可能になり、植物抽出物のテストにおいてこれを用いてもよい。
【０１０２】
一般的に、細胞の移動を阻害する抽出物の能力は、標準細胞移動アッセイを使用してin vitroで評価することができる。一般的に、そのようなアッセイは、適切なメンブレンで上部と底部のセクションに仕切られたマルチウェルプレートで行う。当該メンブレンは、適切な化合物で被覆されており、当該化合物の選択は評価対象の細胞の種類によって異なり、当業者は容易に当該化合物の選択を決定することができる。そのような例には、内皮細胞用のコラーゲン、ゼラチン、およびマトリゲルが含まれる。EGM-2、IL-8、αFGF、βFGF等の適切な化学誘引物質を、化学誘引物質として底部チェンバーに加える。被験細胞のアリコットを抽出物とともに上部チェンバーに加える。一般的に、抽出物の多様な希釈液をテストする。適切なインキュベーション時間を経た後、メンブレンを洗浄、固定、さらに染色する。メンブレンの上部にある細胞を拭き取り、メンブレンの下部にある無作為に選択した領域を計数する。
【０１０３】
細胞移動はまた、コード形成アッセイを用いて評価することができる。このアッセイでは、植物抽出物を含んだ、あるいは含んでいない内皮細胞をマトリゲルに植え、適切な条件下でインキュベートする。適切なインキュベーション時間（例えば、18時間から24時間）をおき、細胞がコードに形成されたか否かを外観検査により判断して、細胞の移動を評価する。
【０１０４】
細胞移動アッセイにおいて、多様な細胞ラインを使用することができる。適切な内皮細胞ラインには、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)、ヒト冠状動脈内皮細胞(HCAEC)、ウシ副腎毛細血管内皮細胞(BCE)、および血管平滑筋細胞が含まれるがそれらに限定されるものではない。HUVECは、標準方法を用いて臍帯から単離するか（例えば、Jaffe et al. （1973）J. Clin. Invest. 52: 2745を参照せよ）、あるいは、ATCCから入手することができ、またその他の適切な内皮細胞ラインが市販の入手源から入手できるように、多様な市販の入手源から入手できる。
【０１０５】
皮膚細胞内でのコラーゲンI産出における植物抽出物の効果は、例えば免疫化学的方法を使用して評価することができる。一つの例示的方法は、抽出物で処理される皮膚細胞内のプロコラーゲンタイプI Cペプチド（PIP）の放出を計測すること、および、これを、処理していない対照および／またはコラーゲン産出に影響を及ぼすことが知られている化合物で処理した対照によって放出されたPIPの量と比較することを伴う。PIPをアッセイするのに適切なELISAキットは、市販されている（例えば、ウィスコンシン州マディソン市Takara Mirus Bio社）。コラーゲン三重らせんの形成中にPIPがプロコラーゲン分子から開裂すると、皮膚細胞により放出されたこのペプチドの量は、合成されたコラーゲンの量に化学量論的に比例する。
【０１０６】
UV誘導細胞外プロテアーゼ活性は、皮膚細胞の培養物にUVA光を照射し、照射された細胞を抽出物で処理することによって評価することができる。あるいは、抽出物の予防効果を評価するため、照射前に抽出物を細胞に添加してもよい。適切な培地において適切なインキュベーション時間を経た後、細胞から上澄みを分離し、上述のようにタンパク質分解活性をアッセイすることができる。処理されていない細胞、および／または、UV誘導プロテアーゼ活性に影響を及ぼすことが知られている化合物で処理した細胞と、結果を比較することができる。
【０１０７】
上記アッセイにおいて使用するのに適切な皮膚細胞には、ヒト皮膚線維芽細胞と、ケラチノサイトと、メラノサイトと、ランゲルハンス細胞と、毛嚢の細胞と、白血球、マクロファージ、およびリンパ球を含む、プロテアーゼを産出する免疫系の細胞とが含まれる。
【０１０８】
当業界で既知であるように、MMPは細胞外マトリクスにおいて線維芽細胞の固定を延長するように作用し、それにより線維芽細胞牽引力を大きくすることができる。このようにして、線維芽細胞により生成された牽引力における植物抽出物の効果をアッセイすることができる。このアッセイでは、皮膚様環境を作成するためにコラーゲンマトリクスに埋め込まれた線維芽細胞を含むモデルを用いる。そのようなモデルは、培地中のコラーゲンIの溶液に線維芽細胞を添加し、そのコラーゲンを重合してゲルを形成させることによって調製することができる。適切なインキュベーション時間を経た後、皮膚様ゲルを抽出物で処理し、収縮の量をある期間、例えば数日にわたって測定する。収縮の量は、例えば、様々な時点においてゲルをデジタルで撮影し、適切なソフトウェアを使用してゲル領域を計算することによって、評価することができる。収縮の量を、処理されていない対照ゲル、および／または、線維芽細胞牽引力に影響を及ぼすことが知られている化合物で処理したゲルと比較することができる。
【０１０９】
付加的なテスト
必要に応じて、植物抽出物に付加的なテストを受けさせてよい。例えば、皮膚細胞の一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす植物抽出物の能力はin vivoで評価することができ、および／または、植物抽出物を、望ましい皮膚科学的効果を発揮するそれらの能力を評価するために、ヒトの志願者におけるテストに供することができる。ヒトの志願者におけるテストの前に、植物抽出物に、一つあるいはそれ以上の安全性、安定性、および／または生物学的利用率テストを受けさせてもよい。
【０１１０】
1． In vivoテスト
皮膚細胞の一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼす本発明の抽出物の能力は、多様な標準テクニックを使用してin vivoで評価することができる。例えば、適切な動物モデルおよび／またはヒトの志願者を使用する。
【０１１１】
特にコラーゲンおよび／またはエラスチンの破壊によるECMの変性は、皮膚生検において、例えば、抽出物による処理後の皮膚組織の組織学的検査によって評価することができる。ECMの一つあるいはそれ以上の構造成分の破壊を判断するための、上述した方法は、生検試料において使用することもできる。異常な細胞移動を判断するために、組織学を使用することもできる。
【０１１２】
シワおよび／またはたるみ、発赤、病斑の形成、色素異常等の皮膚変化は、外観検査によって評価することができる。例えば、皮膚における植物抽出物の効果は、皮膚への外用に適しており、続いてヒトの志願者のパネルを使用して製剤の官能検査を行うことができるような抽出物を、製剤化することによって評価できる。官能検査は、一般的に、数週間にわたる、一日に一度または二度等の定期的なパネリストの皮膚への製剤の塗布を伴う。皮膚における製剤の効果は、パネリストの皮膚を調べ、調べられている皮膚特性、例えば、皮膚の張りおよび艶や、シワ、たるみ、発赤、病斑および／または色素異常の減少を、視覚的に評価することによって評価できる。
【０１１３】
皮膚試料における紅斑は、例えば市販のクロマメーターを使用して計測することができる。皮膚における炎症を緩和する植物抽出物の能力を、ヒトの志願者において、外観検査を含む標準テクニックを使用して評価することもできる。
【０１１４】
内皮細胞の移動を阻害する植物抽出物の能力を、CAMアッセイ（Brooks et al., in Methods in Molecular Biology, Vol. 129, pp. 257-269（2000）, ed. A.R. Howlett, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Ausprunk et al.,（1975）Am. J. Pathol., 79:597-618; Ossonski et al.,（1980）Cancer Res., 40:2300-2309を参照せよ）、マトリゲルプラグアッセイ（例えば、Passaniti, et al.,（1992）Lab. Invest. 67:519-528を参照せよ）、または角膜マイクロポケットアッセイ（D'Amato, et al.,（1994）Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 91:4082-4085; Koch et al.,（1991）Agents Actions, 34:350-7; Kenyon, et al.,（1996）Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:1625-1632を参照せよ）等の標準テクニックを使用して、in vivoで評価することもできる。
【０１１５】
CAMアッセイは、全組織の血管新生を測定し、ニワトリ胚血管はCAM内に成長するか、あるいはCAMに移植した組織内に成長し、in vivo血管形成に使用可能なよく知られたアッセイモデルである。マトリゲルプラグアッセイは、抽出物を冷液体状のマトリゲルに導入することを伴い、これを適切な動物モデルに皮下注入すると、固相化し宿主細胞の穿通および新しい血管の形成を許容する。適切な期間をおいて、当該動物を屠殺し、マトリゲルプラグを回収し、ヘモグロビンを測定すること、または、組織学的薄片の選択領域を血管密度について点数化することによって、マトリゲルプラグにおける血管形成を評価する。このアッセイの改変もまた説明されている（例えば、Akhtar et al.,（2002）Angiogenesis 5:75-80; Kragh et al.,（2003）Int J Oncol. 22:305-11を参照せよ）。角膜マイクロポケットアッセイは、適切な量の抽出物を含有する滅菌済みのハイドロンポリマーからペレットを調製することを伴う。ペレットを、被検動物の外側角膜縁よりも内側の適切な距離の位置に作成した角膜間質性マイクロポケットに外科的に埋め込む。血管形成を、ペレット埋め込み後多様なタイミングで、実体顕微鏡を利用して定量化することができる。一般的に、四肢の血管リングから角膜の中心に向かって形成された新血管の長さと、当該新血管の幅を測定する。
【０１１６】
2． その他のテスト
上記のテストに加えて、本発明の植物抽出物を、安全性、細胞毒性、安定性、生物学的利用率等を評価するためのその他の標準テストに供することができる。抽出物の細胞毒性およびサイトカイン放出を誘導するそれらの可能性を判断するための例示的なテスト本書において記載している（実施例XおよびXIIIを参照せよ）。
【０１１７】
皮膚に浸透する抽出物の能力は、例えば、in vitro放出テスト（例えば、"Guidance for Industry. Nonsterile Semisolid Dosage Forms. Scale-up and postapproval changes: in vitro release testing and in vivo bioequivalence documentation"と題されたU.S. Center for Drug Evaluation and Research guidance documentを参照せよ）によって評価することができる。一般的に、そのようなテストは、適切なメンブレンが装着されたフランツセル等のオープンチャンバー拡散セルを使用して行われる。被検抽出物をメンブレンの上側に入れ、溶媒蒸発および組成変化を防止するため、閉塞したままに保つ。水性緩衝液または水性アルコール媒質等の受容液を、受容細胞中のメンブレンの反対側に入れる。受容液の実質的に回収された試料のアッセイによって、メンブレン全体への有効分の拡散をモニターする。本発明の抽出物については、アッセイは、例えばEP活性を阻害する回収された試料の能力のテストを含み得る。メンブレンは、合成メンブレン、例えば、ポリスルホン、酢酸または硝酸セルロース、ポリテトラフルオロエチレンであってもよいし、死体から採取した試料等の皮膚試料であってもよい。
【０１１８】
その他のテストも当業界において既知であり（例えば、U.S. Pharmacopoeia XXII（1990）を参照せよ）、抽出物の安定性および／または安全性をテストするのに適切である。
【０１１９】
当業者には容易に明らかとなるように、選択された抽出物は、ヒト使用のための法的要件を満たす目的で、ある種の判断基準を満たす必要がある場合がある。従って、上述したようなテストを行うことにより、ヒトに使用する抽出物の適合性を評価することができる。
【０１２０】
有効成分の単離
本発明は、本発明の植物抽出物から単離された有効成分も提供している。本発明の文脈では、「有効成分」は、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEから成る群より選択された皮膚EPを阻害することができる化合物または分子である。有効成分は、タンパク様であるか、あるいは非タンパク様であってよい。単離された有効成分を、上述した手続きを使用して、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害するそれらの能力についてテストすることができる。
【０１２１】
本発明の植物抽出物から有効成分を単離するために用いられ得る、混合物から有効分を単離するための、当業界で既知のテクニックが数多くある。これらのテクニックは、固液抽出法、液液抽出法、固相抽出法（SPE）、膜ろ過、限外ろ過、透析法、電気泳動法、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴ったあるいは伴わない液体あるいはガス相クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を含む）、凍結乾燥、蒸発、多様な「担体」（PVPP、炭素、抗体等）を用いた沈殿、あるいはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されるものではない。当業者は、対象の活性においてそれぞれの連続した分画を強める目的を以って、単離手続きを通して当該活性を追跡することにより、そのような選択肢を連続的にどのように使用するのかよく理解しているであろう。
【０１２２】
固液抽出法には、ソックスレー抽出溶媒、ボルテックスシェーカー、超音波、および抽出を高めるその他の手段、さらにろ過、遠心分離および文献（例えば、R. J. P. Cannell, Natural Products Isolation, Humana Press, 1998を参照せよ）、に記載されている関連方法群による回収法の使用が含まれる。使用可能な溶媒の例には、炭化水素溶媒、塩素化溶媒、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。超臨界溶媒の使用も考慮されており、これにはV. H. Bright（Supercritical Fluid Technology, ACS Symp. Ser. Vol. 488, ch. 22, 1999）で説明されているような修飾因子の使用が含まれる。
【０１２３】
液液抽出法には、超臨界条件下の溶媒を含む、当業界で既知である溶媒の多様な混合物の使用が含まれる。一般的な溶媒には、炭化水素溶媒、塩素化溶媒、有機エステル、有機エーテル、アルコール、水、多様な水溶液、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。液液抽出法は、手動で行うこともできるが、準自動化あるいは完全自動化することもでき、溶媒は当業界の標準テクニック（例えば、S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）を用いて除去あるいは濃縮することができる。
【０１２４】
固相抽出(SPE)テクニックには、カートリッジ、カラム、あるいは業界で既知のその他の装置の使用が含まれる。そのようなテクニックと併用することができる吸収剤には、シリカ・ゲル（順相）、逆相シリカ・ゲル（修飾シリカ・ゲル）、イオン交換樹脂、およびフルオリシル[fluorisil]が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明はまた、抽出物から有効成分およびその他の構成物質を選択的に分離するために、有機的あるいは無機的なマクロ分子剤に由来する固相支持体に付着させたスカベンジャー樹脂あるいはその他のトラップ剤の使用も含む。
【０１２５】
メンブレン、逆浸透および限外ろ過の手段には、当業界で既知の多種のメンブレンの使用、および圧力、真空、遠心力、および／またはメンブレンおよび限外ろ過の過程に使用することができるその他の手段が含まれる（例えば、S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）。
【０１２６】
透析法には、阻止分子量が約0.5KDa未満から約50KDaを超えるメンブレンが含まれる。本発明はまた、当業界で既知の多様な手段によって透析物あるいは濃縮水から得られた有効成分の回収をも網羅しており、そのような既知の手段には、蒸発、減圧蒸発、蒸留、真空蒸留、および凍結乾燥が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１２７】
クロマトグラフィー手段には、当業者に既知であり文献に説明されているクロマトグラフィーを行う多様な手段が含まれる（例えば、G. Sofer, L. Hagel, Handbook of Process Chromatography, Academic Press, 1997を参照せよ）。その例には、通常のカラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、中圧液体クロマトグラフィー（MPLC）、超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）、向流クロマトグラフィー（CCC）、移動層方式クロマトグラフィー、擬似移動層方式クロマトグラフィー、膨張層方式クロマトグラフィー、および平面クロマトグラフィーが含まれるがそれらに限定されるものではない。それぞれのクロマトグラフィー法について、使用可能な吸収剤には、シリカ・ゲル、アルミナ、フルオリシル[fluorisil]、セルロースおよび修飾セルロース、多様な修飾シリカ・ゲル、イオン交換樹脂、サイズ排除ゲルおよび当業界で既知のその他の吸収剤（例えば、T. Hanai, HPLC: A Practical Guide, RSC Press, UK 1999を参照せよ）が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明はまた、有効成分の分画段階、部分的精製段階、および／または精製段階をクロマトグラフィー手段により行うための、二つあるいはそれ以上の溶媒勾配をも含む。使用可能な溶媒の例には、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、石油エーテル、シクロヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert-ブタノール、水、ジクロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、テトラヒロドフラン、ジオキサン、tert-ブチルメチルエーテル、アセトン、および2-ブタノンが含まれるがそれらに限定されるものではない。水あるいは水相を使用した場合は、当該の水あるいは水相には多様な量の無機塩類あるいは有機塩類が含まれていてよく、および／または、分画および／または精製が向上されるように酸あるいは塩基を用いてpHを異なる値に調整してよい。
【０１２８】
平面クロマトグラフィーの場合には、本発明は、この種のクロマトグラフィーの多様な形態の使用を含み、その例には、1次元および2次元薄層クロマトグラフィー(1D-および2D-TLC)、高速薄層クロマトグラフィー(HPTLC)、および遠心薄層クロマトグラフィー(遠心TLC)が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１２９】
向流クロマトグラフィー(CCC)の場合には、本発明は、手動、準自動化、および自動化システムの使用、ならびに有効成分の分画段階および／または精製を行うために必要な、多様な溶媒および溶媒の組み合わせの使用を含む（例えば、W. D. Conway, R. J. Petroski, Modern Countercurrent Chromatography, ACS Symp. Ser. Vol. 593, 1995を参照せよ）。溶媒の除去および／または濃縮は、当業界で既知の多様な手段により行うことができ、そのような手段の例には、減圧蒸発、蒸発、減圧蒸留、蒸留、および凍結乾燥が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１３０】
本発明は、膨張層方式クロマトグラフィー、移動層方式クロマトグラフィー、擬似移動層方式クロマトグラフィー、および当業界で既知のその他の関連方法群による、有効成分の単離を含む（例えば、G. Sofer, L. Hagel, Handbook of Process Chromatography, Academic Press, 1997 and S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）。
【０１３１】
選択的沈殿手段には、多様な溶媒および溶媒の組み合わせの使用、温度変更の使用、沈殿剤および／または修飾因子の付加、および／または有効成分またはその他の構成物質の選択的沈殿を行うための塩基あるいは酸の添加によるpHの修飾を含む。
【０１３２】
本発明は、蒸気蒸留、水利用蒸留[hydrodistillation]、あるいは当業界で既知であるその他の関連蒸留方法群による、有効成分の単離も含む（例えば、L. M. Harwood, C. J. Moody, Experimental Organic Chemistry, Blackwell Scientific Publications, UK, 1989を参照せよ）。
【０１３３】
皮膚用製剤
本発明は、本発明の一つあるいはそれ以上の抽出物、一つあるいはそれ以上の有効成分、またはそれらの組み合わせを含む、皮膚科的用途に適切な製剤をさらに提供する。当該製剤は、任意でその他の治療剤または化粧剤を含んでよい。
【０１３４】
製剤は、許容可能な毒性および安定性を有するように標準テクニックによって調製される。また、製剤が局所以外の経路で（例えば、経口等の全身経路、または、腹腔内、静脈内、皮下、および筋肉注射を介して）投与される場合、抽出物および／または有効成分は、許容可能な肝毒性を示さなくてはならず、作用部位に到達できるために、分解に対する十分な耐性がなくてはならない。
【０１３５】
上記のパラメータのテストおよび適切な製剤の調製は、当業者によって容易に想到し得るものである。製剤の調製において考慮しなくてはならない判断基準は、当該製剤を構成する抽出物および／または有効成分の物理化学的および生化学的特性（生物学的利用率、毒性、安定性等）を含むがそれらに限定されるものではない。特に、製剤は、動物に有害とならずに、投与時における有効分の最大阻害活性を、可能な限り保存するように調製される。
【０１３６】
製剤は、抽出物（群）および／または有効成分を生理的に許容可能な担体とともに混合することによって調製される。製剤には、賦形剤、結合剤、希釈剤等が含まれてもよい。抽出物（群）および／または有効成分は、必要であれば単独で製剤化し、次に希釈剤等を使用して各製剤を組み合わせて投与してもよいし、同時にまたは時差をつけて、互いに独立して被検体投与してもよい。
【０１３７】
本発明による製剤は、固体、半固体、または液体の形態であってよく、経口（カプセル、錠剤、薬瓶、トローチ等）、非経口、直腸、吸入、または局所投与に適応していてよく、単位投薬形態であってよい。製剤は、当業界で既知であるように、in vivo徐放に適応していてよい。本発明の製剤は、液剤、シロップ、トローチ、ロゼンジ、水性あるいは油性の懸濁液、分散性の粉末あるいは顆粒、乳剤、ハードあるいはソフトカプセル、エリキシル剤、注射剤、錠剤、カプセル、坐薬、疎水性および親水性のクリームおよびローションを含むがそれらに限定されない、従来の形態で使用されてよい。非経口という語には、本書で使用されているように、皮下注射、静脈内、包膜内、筋肉内、胸骨内注入、または輸注テクニックを含む。
【０１３８】
当業界において既知である様々な生理的に許容可能な担体を、本発明の皮膚用製剤において使用することができる。適切な担体の例には、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン（トウモロコシ、ジャガイモ、米、小麦）、アルファ化デンプン、ゼラチン、スクロース、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、グァーガム、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、粉末セルロース、グルコース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、トラガカント、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、カオリン、マンニトール、タルク、酢酸フタル酸セルロース、ポリエチレンフタレート、セラック、二酸化チタン、カルナウバロウ、マイクロクリスタリンワックス、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒマシ油、鉱物オイル、軽鉱物油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、硬化植物オイル（例えば、ピーナツ、綿実、ヒマワリ、ゴマ、オリーブ、トウモロコシ、大豆）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、シリカ・ゲル、ヒマシ油、フタル酸ジエチル、グリセリン、モノ-およびジ-アセチル化モノグリセリド、プロピレングリコール、トリアセチン、アラミック酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、ベントナイトマグマ、カルボマー934、カルボキシメチルセルロースナトリウム12、カラギナン、ヒドロキシエチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ペクチン、ポリビニルアルコール、ポヴィディン、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンゴム、およびシリコーンが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１３９】
経口用の製剤は、当業界で既知である方法群に従って調製してよく、上品で口に合う薬剤を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤、および保存剤等、一つあるいはそれ以上の薬剤を含有してよい。錠剤は、錠剤の製造に適切である、毒性のない生理的に許容可能な賦形剤と混合した抽出物（群）および／または有効成分を含有している。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムあるいはリン酸ナトリウム等の不活性の希釈剤；コーンスターチあるいはアルギン酸等の顆粒化剤および分解剤；スターチ、ゼラチンあるいはアラビアゴムなどの結合剤；ならびに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸あるいはタルクなどの潤滑剤を含んでよい。錠剤は、被覆されていなくてもよく、あるいは、胃腸管での分解および吸収を遅延させ、それによって長時間にわたって持続作用を提供する目的で、既知のテクニックにより被覆されていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリン[glyceryl monostearate]、ジステアリン酸グリセリン[glyceryl distearate]などの時間的遅延を起こす材料を使用してよい。
【０１４０】
経口用の製剤はまた、ハードゼラチンカプセルあるいはソフトゼラチンカプセルとして調製してよく、ハードゼラチンカプセルの場合には、抽出物（群）および／または有効成分は不活性固相希釈剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、あるいはカオリンなど）と混合してよく、ソフトゼラチンカプセルの場合には、抽出物（群）および／または有効成分は水あるいは油性媒体（例えばピーナツオイル、液体パラフィン、あるいはオリーブオイルなど）と混合してよい。
【０１４１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤と混合した抽出物（群）および／または有効成分を含有している。そのような賦形剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁液；天然型リン脂質（例えば、レシチン）であってよい分散剤あるいは湿潤剤、脂肪酸を伴ったアルキレンオキシドの縮合物（例えば、polyoxyethyene stearate）、あるいは長鎖脂肪族アルコールを伴ったエチレンオキサイドの縮合物（例えば、hepta-decaethyleneoxycetanol）、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分的エステルを伴ったエチレンオキサイドの縮合物（例えば、polyoxyethylene sorbitol monooleate）、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分的エステルを伴ったエチレンオキサイドの縮合物（例えば、polyethylene sorbitan monooleate）である。当該の水性懸濁液はまた、一つあるいはそれ以上の保存剤（エチル、あるいはn-propyl p-hydroxy-benzoate）、一つあるいはそれ以上の着色剤、一つあるいはそれ以上の着香剤、一つあるいはそれ以上の甘味剤（スクロースあるいはサッカリン）を含有していてよい。
【０１４２】
油性懸濁液は、抽出物(群)および／または有効成分を、落花生オイル、オリーブオイル、セサミオイルあるいはココナツオイルなどの植物オイル、あるいは液体パラフィンなどの鉱物オイルで懸濁させることにより製剤化してよい。当該の油性懸濁液は、蜜蝋、ハードパラフィン、あるいはセチルアルコールなどの濃縮剤を含有していてよい。上記のような甘味剤および着香剤を加えて、口に合う経口用製剤を提供してよい。これらの製剤群は、アルコルビン酸などの抗酸化剤を加えることにより、保存することができる。
【０１４３】
水を加えることにより調製する水性懸濁液に適切である分散性の粉末あるいは顆粒は、分散剤あるいは湿潤剤、懸濁剤、および一つあるいはそれ以上の保存剤と混合した形態の抽出物（群）および／または有効成分を提供する。適切な分散剤あるいは湿潤剤および懸濁剤は、上述したものにより例示した。甘味剤、着香剤および着色剤などの付加的な賦形剤もまた存在してよい。
【０１４４】
本発明の製剤はまた、水‐油エマルションの形態であってもよい。油相は、オリーブオイルあるいは落花生オイルなどの植物オイルあるいは液体パラフィンなどの鉱物オイルであってよく、またこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、アラビアゴムあるいはトラガカントゴムなどの天然ゴム；大豆あるいはレシチンなどの天然型リン脂質；sorbitan monoleateなどの、脂肪酸およびヘキシトール、無水物に由来するエステルあるいは部分的エステル；およびpolyoxyethylene sorbitan monoleateなどの、エチレンオキサイドを伴った前記部分的エステルの縮合物であってよい。乳化剤はまた、甘味剤および着香剤を含有していてもよい。
【０１４５】
シロップおよびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースなどの甘味剤を含んで製剤化してよい。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、さらに着香剤および着色剤を含有していてよい。製剤は、滅菌済みの注入可能な水性あるいは油性の懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、既知の技術に従って、上記のような適切な分散剤あるいは湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化してよい。滅菌済注入可能製剤はまた、毒性のない注射剤として許容可能な希釈剤あるいは溶媒に溶解した、滅菌済注入可能溶液あるいは懸濁液であってよく、その例には、1,3-ブタンジオール中の溶液が挙げられる。使用可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌済みの固定オイルが、従来から溶媒あるいは懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセライドあるいは合成ジグリセライドなどの多様な無菌性固定オイルを用いてよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用してよい。
【０１４６】
本発明の一つの実施例では、皮膚用製剤は経口投与用のものである。そのような製剤は、例えば、カプセル、カシェ剤、錠剤、エアゾールスプレー、粉末、顆粒、クリーム、ぺースト、ゲル、軟膏として、または、水性液体、非水性液体、油‐水エマルション、もしくは油‐水エマルション液中の溶液または懸濁液として提供できる。
【０１４７】
本発明により考慮される製剤は、いわゆる薬草製剤および自然療法製剤を含む。植物（群）の固体部分を含む自然療法製剤については、当該植物（群）は食用植物でなくてはならない。抽出物（群）および／または有効成分、または植物部分は、これらの薬草療法および自然療法製剤において、溶液、精製溶液、または乾燥粉末として使用できる。
【０１４８】
本発明の別の実施例では、皮膚用製剤は局所投与用のものである。そのような製剤は、例えば、エアゾールスプレー、粉末、スティック、顆粒、クリーム、液体クリーム、ぺースト、ゲル、ローション、シロップ、軟膏として、スポンジまたは綿棒につけて、または、水性液体、非水性液体、水‐油エマルション、もしくは油‐水エマルション液中の溶液または懸濁液として提供できる。
【０１４９】
皮膚、毛髪、および／または爪への塗布用の局所製剤は、一つあるいはそれ以上の保湿剤、すなわち、皮膚からの水分の喪失を阻害または防止することによって皮膚の水和を促進し、空気から水分を吸収して皮膚を水和し、および／または、空気から直接的に水分を吸収する皮膚の能力を向上させる剤を含んでよい。保湿剤は概して、皮膚の乾燥および亀裂を最小化または防止する。モイスチャライザーは、使用時には一般的に、製剤の約0.01から20重量パーセントの量で存在する。
【０１５０】
適切な保湿剤には、酸性成分、疎水性物質、および親水性物質、またはそれらの組み合わせが含まれる。酸性成分である保湿剤の例には、2-ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）；2-ヒドロキシプロパン酸（乳酸）；2-メチル2-ヒドロキシプロパン酸；2-ヒドロキシブタン酸；フェニル2-ヒドロキシ酢酸；フェニル2-メチル2-ヒドロキシ酢酸；3-フェニル2-ヒドロキシ酢酸；2,3-ジヒドロキシプロパン酸；2,3,4-トリヒドロキシブタン酸；2,3,4,5,6-ペンタヒドロキシヘキサン酸；2-ヒドロキシドデカン酸；2,3,4,5-テトラヒドロキシペンタン酸；2,3,4,5,6,7-ヘキサヒドロキシヘプタン酸；ジフェニル2-ヒドロキシ酢酸；4-ヒドロキシマンデル酸；4-クロロマンデル酸；3-ヒドロキシブタン酸；4-ヒドロキシブタン酸；2-ヒドロキシヘキサン酸；5-ヒドロキシドデカン酸；12-ヒドロキシドデカン酸；10-ヒドロキシデカン酸；16-ヒドロキシヘキサデカン酸；2-ヒドロキシ-3-メチルブタン酸；2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸；3-ヒドロキシ-4-メトキシマンデル酸；4-ヒドロキシ-3-メトキシマンデル酸；2-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸；3-（2-ヒドロキシフェニル）乳酸；3-（4-ヒドロキシフェニル）乳酸；ヘキサヒドロマンデル酸；3-ヒドロキシ-3-メチルペンタン酸；4-ヒドロキシデカン酸；5-ヒドロキシデカン酸；アリューリット酸；2-ヒドロキシプロパン二酸；2-ヒドロキシブタン二酸；タンニン酸；サリチル酸；エリトラル酸；トレアル酸；アラビラル酸；リバル酸；キシラル酸；リキサル酸；グルカル酸；ガラクタル酸；マンナル酸；グラル酸；アラル酸；アルトラル酸；イダル酸；タタール酸；2-ヒドロキシ-2-メチルブタン二酸；クエン酸、イソクエン酸、アガリシン酸、キナ酸、グルコロン酸、グルコロノラクトン、ガラクトロン酸、ガラクトロノラクトン、ウロン酸、ウロノラクトン、アスコルビン酸、ジヒドロアスコルビン酸、ジヒドロキシ酒石酸、トロパ酸、リボノラクトン、グルコノラクトン、ガラクトノラクトン、グロノラクトン、マンノノラクトン、シトラマル酸；ピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸、ヒドロキシピルビン酸リン酸およびそのエステル；ピルビン酸メチル、ピルビン酸エチル、ピルビン酸プロピル、ピルビン酸イソプロピル；フェニルピルビン酸およびそのエステル；メチルフェニルピルビン酸塩、エチルフェニルピルビン酸塩、プロピルフェニルピルビン酸塩；ホルミルギ酸およびそのエステル；メチルホルミルギ酸塩、エチルホルミルギ酸塩、プロピルホルミルギ酸塩；ベンゾイルホルミル酸およびそのエステル；メチルベンゾイルホルミル酸塩、エチルベンゾイルホルミル酸塩およびプロピルベンゾイルホルミル酸塩；4-ヒドロキシベンゾイルホルミル酸およびそのエステル；4-ヒドロキシフェニルピルビン酸およびそのエステル；ならびに2-ヒドロキシフェニルピルビン酸およびそのエステルが含まれるがそれらに限定されるものではない。エステルもしくはラクトン、またはその医薬的に許容可能な塩等、上記の酸性成分の一つあるいはそれ以上の誘導体も使用し得ることを理解されたい。
【０１５１】
疎水性物質である保湿剤の例には、セラミド、ルリヂサオイル（リノール酸）、トコフェロールリノール酸塩、ジメチコーン、グリセリン、およびそれらの混合物が含まれるがそれらに限定されるものではない。親水性物質である保湿剤の例には、ヒアルロン酸、ペロキシリンカルボン酸ナトリウム（PCAナトリウム）、小麦タンパク質（ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解コムギタンパク等）、毛髪ケラチンアミノ酸、およびそれらの混合物が含まれるがそれらに限定されるものではない。例えば毛髪ケラチンアミノ酸がモイスチャライザーとして含まれる場合、塩化ナトリウムも存在し得る。製剤中に含まれ得るその他の保湿剤には、月見草オイルおよび亜麻オイルが含まれる。
【０１５２】
製剤は、任意で、システイン成分、マグネシウム成分、マンガン成分、セレニウム成分、および銅成分のうち一つあるいはそれ以上をさらに含む。これらの成分は、皮膚、毛髪、および／または爪に有益な効果を与えることが当業界では既知である。
【０１５３】
例えばシステイン成分は、真皮を厚くしてコラーゲンおよび弾性組織を補うことができ、それによってシワおよびその他の皮膚病変の減少につながり得る。適切なシステイン成分の例は、N-アセチルシステイン、またはその医薬的に許容可能な塩であり、これらは製剤中に約1から10重量パーセントの量で含まれることができる。銅成分は、エラスターゼ活性を阻害するのに貢献し得る。多様な銅成分またはその医薬的に許容可能な塩が、製剤中に含まれるのに適切である。例えば、セバシン酸銅は、製剤中に約5から20重量パーセントの量で含むことができる。
【０１５４】
任意のマンガン成分は、例えばアスコルビン酸マンガンまたはマンガンアスコルビン酸錯体等、多様なマンガン成分またはその医薬的に許容可能な塩のうちの一つであってよく、当該成分は、製剤中に約0.5から10重量パーセントの量で含むことができる。適切なマグネシウム成分は、アスコルビン酸マグネシウムまたはマグネシウムアスコルビン酸錯体を含む。マグネシウム成分は、製剤中に約1から10重量パーセントの量で含むことができる。適切なセレニウム成分は、例えばL-セレノメチオニン等、アミノ酸と錯体を形成したセレニウムを含む。セレニウム成分は、製剤中に約0.01から3重量パーセントの量で含むことができる。
【０１５５】
皮膚用製剤は、皮膚または隣接する体組織における炎症の阻害または抑制を促進し、それによって皮膚の発赤および腫れの減少を補助する、一つあるいはそれ以上の抗炎症成分を含んでよい。適切な抗炎症成分の例には、ビタミンEおよびその誘導体、亜鉛、アラントイン、グリシルレチン酸、アズレン、メフェナム酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ε-アミノカプロン酸、ヒドロコルチゾン、パンテノールおよびその誘導体および塩、酸化亜鉛、ならびにジクロフェナクナトリウムが含まれる。抗炎症成分は、使用時には、約0.001から約5重量パーセントの量で本発明の製剤に組み込むことができる。
【０１５６】
製剤は、遊離基を中和し、皮膚におけるそれらの効果を最小化するのを補助するために、任意で一つあるいはそれ以上の抗酸化物質を含んでもよい。抗酸化物質は、酵素型であっても非酵素型であってもよい。例には、酵素酸化物質：スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、カタラーゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼ、ならびに、非酵素酸化物質：ビタミンE（例えば、トコフェロール）およびその誘導体、ビタミンA（レチノール）、ビタミンC（アスコルビン酸）、カロテノイドおよびその誘導体、エキナコシド、カフェオイル誘導体、オリゴメリックプロアントシアニジン、またはプロアンタノール（ブドウ種子抽出物から得られたもの等）、緑茶ポリフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、タンニンならびに没食子酸およびエラグ酸等その誘導体、フラボン、カテキン、ケルセチン、およびロイコアントシアニジン等のフラボノイド類、ユビキノンおよびビタミンK等のキノン類、チアミン類およびその塩、リボフラビンおよび酢酸リボフラビン等のリボフラビン類、塩酸ピリドキシンおよびピリドキシンジオクタノエート等のピリドキシン類、ニコチン酸アミドおよびベンジルニコチン酸等のニコチン酸類、ビリルビン、マンニトール、トリプトファン、ヒスチジン、およびノルジヒドログアヤレト酸が含まれる。
【０１５７】
製剤中にビタミンCが含まれる場合、当該ビタミンCは、パルミチン酸アスコルビル、ジパルミテートL-アスコルビン酸、ナトリウムL-アスコルビン酸-2-硫酸、もしくはナトリウム、カリウム、およびカルシウム等のアスコルビン酸塩、またはそれらの混合物の形態であってよい。ビタミンCは、製剤中に約0.1から50重量パーセントの量で含むことができる。ビタミンAが含まれる場合、通常、ビタミンAパルミテートの形態である。ビタミンAは、局所製剤中に約0.5から15重量パーセントの量で含むことができる。適切なカロテノイドは、例えば、βカロテン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、リコピン、ルテイン、クロセチン、カプサンシン、およびそれらの混合物を含む。カロテノイドは、製剤中に約0.1から5重量パーセントの量で含むことができる。
【０１５８】
本発明の皮膚用製剤には、その他の皮膚に有益な成分を任意で含んでよい。皮膚に有益な成分の例には、サンスクリーンおよびサンブロック、必須脂肪酸類、レチノイド類、細胞活性化因子、血液循環プロモーター、なめし剤、αまたはβヒドロキシ酸類、タンパク質類、ペプチド類、および多糖類が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１５９】
サンスクリーンおよびサンブロックは、一般に紫外線を遮断するために用いられるそれらの材料を含む。適切なサンスクリーンおよびサンブロックの例には、二酸化チタン、酸化亜鉛、タルク、動物用赤色ワセリン、桂皮酸エステル（メトキシ桂皮酸オクチル等）、ベンゾン（オキシベンゾンまたは2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン等）、サリチル酸塩（ホモサリチル酸またはサリチル酸オクチル等）、安息香酸（パラアミノ安息香酸等）、およびベンゾフェノン（オキシベンゾフェノン等）が含まれるがそれらに限定されるものではない。メトキシ桂皮酸オクチルおよび2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）は、商標Parsol MCX(tm)およびBenzophenone-3(tm)でそれぞれ市販されている。製剤中に用いられるサンスクリーンの的確な量は、太陽のUV放射線からどの程度保護するのが望ましいかによって異なり、当業者には容易に判断できる。
【０１６０】
必須脂肪酸類（EFAs）は、すべての細胞の原形質膜形成に必須な脂肪酸類である。ケラチノサイトにおいて、EFA欠乏は細胞を過剰増殖させる。EFAsはまた、表皮における脂質生合成を向上させ、表皮による障壁形成において使用される脂質を提供する。製剤に含み得る必須脂肪酸類の例には、リノール酸、γ-oリノレン酸、ホモ-γ-リノレン酸、コルムビン酸、エイコサン-（n-6,9,13）-トリエン酸、アラキドン酸、γ-リノレン酸、ティムノドン酸、ヘキサエン酸、およびそれらの組み合わせが含まれる。
【０１６１】
任意で、クリンバゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、エコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、ブトコナゾール、スルコナゾール、リオナゾール、およびそれらの組み合わせ等のアゾール類を製剤中に含んでもよい。
【０１６２】
細胞活性化因子には、例えば、ローヤルゼリー、光線感作物質、コレステロールおよびその誘導体、ウシ胎仔血液抽出物、ビタミンA、レチノール類およびレチノイド類、クエン酸、乳酸、酒石酸、マル酸、グリコール酸、コハク酸、セリン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、テアニン、ピロリドンカルボン酸、酵母抽出物、ラクトバチルス属［Lactobacillus］抽出物、およびビフィドバクテリウムビフィダム［Bifidobacterium bifidum］抽出物が含まれる。細胞活性化因子は、製剤中に約0.001から5重量パーセントの量で組み込むことができる。
【０１６３】
血液循環プロモーターの例は、セファランチン、トコフェロールおよびその誘導体、ニコチン酸およびその誘導体、ノナン酸バニリルアミド、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、タンニン酸、α-ボルネオール、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、γ-オリザノール、ショウノウ、ヒノキチオール、ならびに、リパーゼおよびパパイン等の酵素類である。血液循環プロモーターは、製剤中に約0.01から20重量パーセントの量で組み込むことができる。
【０１６４】
本発明の製剤は、任意で一つあるいはそれ以上の増粘剤をさらに含んでよい。増粘剤は通常、製剤の0.1から20重量％の量で存在する。例示的な増粘剤は、商標Carbopol(tm)（B. F. Goodrich社）で入手可能な架橋ポリアクリル酸材料、キサンタンゴム、カラギナン、ゼラチン、カラヤゴム、ペクチン、およびローカストビーンガムである。ある種の状況下において、増粘機能は製剤のモイスチャライザー成分によって実現し得る。例えば、シリコーンゴムおよびステアリン酸グリセロール等のエステルは、二重機能性を有する。
【０１６５】
例えば着色剤、乳白剤、香料、および保存料（例えば、イミダゾリディニール尿素、ジメチルイミダゾリジノン、またはディアゾリディニール尿素）等、その他の付加的微量成分を任意で皮膚用製剤に組み込んでもよい。これらの材料の量は、製剤の0.001重量％から最大20重量％の範囲となり得る。
【０１６６】
局所投与用の皮膚用製剤は、粘度および使用目的に合わせて適切な容器に詰めることができる。例えば、ローションまたは液状クリームは、ボトルもしくはボール回転式アプリケータ、カプセル、高圧駆動のエアロゾル装置、または、指で操作するのに適切なポンプが装着された容器に詰めることができる。組成物がクリームまたはペーストである場合、当該組成物は単に、チューブまたは蓋付きジャー等、変形不可能なボトルまたはスクイーズ容器に保存すればよい。
【０１６７】
使用法
本発明の植物抽出物および／または当該抽出物由来の有効成分、ならびに当該抽出物および／または有効成分を含む製剤は、皮膚、毛髪、および／または爪の日常ケア用の、皮膚、毛髪、および／または爪の健康および／または外観を改善するための、ならびに、多様な皮膚病変の治療または予防における使用に適切である。
【０１６８】
本発明の文脈では、皮膚病変は、皮膚、毛髪、または爪等、被検体の外皮系の構成要素のうち一つあるいはそれ以上に存在し、老化または内因子もしくは外因子によって引き起こされる病変である。内因子は、例えば、皮膚、毛髪、または爪に望ましくない効果を引き起こす病的状態に加えて、個体の遺伝子構成を含む。外因子は、太陽光、放射線、大気汚染、風、冷気、湿気、熱、化学物質、煙、および喫煙を含むがそれらに限定されるものではない。
【０１６９】
従って、効果的な量の、本発明の一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分、または、効果的な量の、一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分を含む皮膚用製剤は、皮膚、毛髪、および／または爪の健康および／または外観を改善するため、または皮膚病変を治療もしくは予防するために、日常的な皮膚／毛髪／爪のメンテナンスの一部として、哺乳類に投与することができる。本発明の一つの実施例では、植物抽出物、有効成分、または製剤は、哺乳類に局所投与される。
【０１７０】
本発明で考慮される皮膚病変の例には、乾燥皮膚；フケ；ニキビ；角化症；乾癬；湿疹；掻痒；シミ；皮膚水分の減少；クモ状静脈；老人性紫斑病；黒子；肝斑；皮膚線の深化；斑点；シワ；欠陥のある皮膚；小結節；萎縮；酒さ；膿痂疹；皮革様の、粗く、ザラザラし、乾燥した、帯黄色の皮膚を特徴とする弾性線維の変化；毛細管拡張性皮膚；過度に色素沈着した皮膚；角化性皮膚；炎症性皮膚疾患；表皮水疱症等の「水疱性」疾患；切れ毛；脱毛；風化損傷；毛髪の菲薄化；脆弱爪；菲薄爪；剥離爪および隆起爪が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１７１】
皮膚、毛髪、および爪の健康および／または外観を改善することは、例えば、紫外線への暴露、ホルモンバランスおよび遺伝的プログラムの変化等の多様な原因により生成または形成された、暗色皮膚、肝斑または雀卵斑を解消または予防すること；皮膚のくすみを緩和すること；皮膚の艶および／または堅さを改善すること；皮膚老化現象の進行を阻害または防止すること；微小な欠陥を減少させること；フケを抑制すること；頭皮の発赤または炎症を減少すること等を含む。創傷治癒を推進するため、および／または瘢痕化のリスクを低減するために、本発明の皮膚用製剤を使用してもよい。
【０１７２】
別の実施例では、効果的な量の、本発明の一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分、または、効果的な量の、一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分を含む皮膚用製剤は、皮膚のシワおよび／またはたるみ、肌弾力の喪失、発赤、炎症、病斑の形成、上皮の菲薄化、皮膚内における細胞の異常移動（血管形成または炎症中に発生するもの等）、または、それらの多様な組み合わせ等、皮膚における一つあるいはそれ以上の望ましくない構造変化を弱めるために、哺乳類に投与される。
【０１７３】
本発明の一つの実施例は、効果的な量の、本発明の一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分、または、効果的な量の、一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分を含む皮膚用製剤の、スキンケア製品としての使用法を提供する。本発明の文脈では、「スキンケア製品」は、外観および機能の観点から、皮膚の健康の維持および最適化ならびに保護における使用を意図した製品を意味する。本発明の別の実施例では、スキンケア製品は老化防止製品である。老化防止製品は、内因子または外因子による皮膚老化を弱める、または防止するために使用することを意図した製品である。皮膚老化現象は、例えば、皮膚の菲薄化、細かいまたは粗い皮膚シワ、たるみ、弾力の喪失等を含む。従って、本発明は、老化防止効果を生むことを目的として、効果的な量の、本発明の一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分、または、効果的な量の、一つあるいはそれ以上の植物抽出物および／または有効成分を含む皮膚用製剤の、哺乳類への投与を提供する。
【０１７４】
「効果的な量」とは、皮膚病変の治療における有益な効果、または望ましい皮膚改善効果を提供する植物抽出物または有効成分の量という意味である。当業者は、この量が用途および個々の被検体によって異なり、当業者によって容易に判断可能であることを理解するはずである。
【０１７５】
植物抽出物（群）および／または有効成分を含む製剤の適切な投与量も、個々の患者の年齢、体重、および応答によって異なる。一般的に、1日当たりの総投与量範囲は、約1回から10回の投与または使用で投与される、約0.01mgから約2,000mgの植物抽出物（群）および／または有効成分である。
【０１７６】
本発明の植物抽出物を調製する商業的過程
本発明は、本発明の植物抽出物を大規模に調製することを考慮している。対象の抽出物の分析規模の抽出で用いられる抽出過程を使用することにより、当該抽出物を商業的規模で調製することができる。本発明のこの局面に関する一つの実施例を、図3に示す。この実施例では、小規模の抽出過程を簡単に規模拡大し、品質管理の付加段階を加え、再生可能な結果を確保している。同様に、図5に概要を示した過程は、商業目的で規模拡大するように構成されている。
【０１７７】
工業的レベルの抽出物生産へ向かって規模を拡大する途中に必要となる可能性がある、小規模手続きの改変もまた、本発明で考慮している。そのような改変には、例えば、規模拡大の途上に起こる変化を補正し、全体の手続きを工業規模生産に向かって体質改善しコスト効果を高める目的の、使用中の溶媒についての改変あるいは使用中の抽出手続きについての改変が含まれる。この種の改変は、業界の標準であり、当業者には明らかであろう。
付加的な植物抽出物を同定する過程
【０１７８】
本発明は、本発明の皮膚用製剤に組み入れるべき適切な、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害することができる植物抽出物を同定するために、当該植物抽出物をスクリーニングするための迅速法をさらに提供する。
【０１７９】
当該過程は、以下の一般的段階を含む：（a）溶媒抽出法によって植物材料から複数の抽出物を作製する段階；（d）MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害するために、各植物抽出物の活性を分析する段階；および、記載されたEPのうち少なくとも一つの活性を阻害することができるそれらの抽出物を選択する段階。続いて、阻害活性を呈する抽出物を、ECMの構造成分（すなわち、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチン）の破壊を弱めること；内皮細胞の移動を弱めること；コラーゲン産出を増加させること；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性を弱めること；および、線維芽細胞により生成された牽引力を弱めること等、皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼすそれらの能力を調べるために、スクリーニングする。細胞スクリーニングにおいて効果的であるそれらの抽出物は、適切な安定性および毒性プロフィールを呈していれば、提供される皮膚用製剤に含むべき適切な候補であると考えられる。
【０１８０】
複数の抽出物は、上記の段階（a）において、異なる溶媒を使用して単一植物源の植物材料から作製できる、または、複数の抽出物は、まず対象の植物の群を選択し、当該群の各植物から植物材料を収穫し、続いて溶媒または溶媒群を用いて植物材料を抽出し、複数の抽出物を作製することにより、作製できる。
【０１８１】
スクリーニングすべき抽出物は、対象の植物、すなわち「可能性のある植物」由来の植物材料から調製される。可能性のある植物は、本書で使用されているように、植物界の全ての種を含み、それには陸生、水生、あるいは、上記に記載されている皮膚EPのうち少なくとも一つを阻害するその能力をテストできる抽出物を作製することを目的として、本書において説明している手法に供することができる、その他の植物が含まれる。
【０１８２】
可能性のある植物の例は、以下の分類を含むが、それらに限定されるものではない：種子植物上門［Superdivision Spermatophyta-Seed plants］；針葉樹類門［Division Coniferophyta-Conifers］；マツ綱［Class Pinopsida］；マツ目［Order Pinales］；南洋杉科［Family Araucariaceae-Araucaria family］；イヌガヤ科［Family Cephalotaxaceae-plum yew family］；ヒノキ科［Family Cupressaceae-Cypress family］；マツ科［Family Pinaceae-Pine family］；球果植物目 ［Family Podocarpaceae-Podocarpus family］；スギ科［Family Taxodiaceae-Redwood family］；イチイ目［Order Taxales］；イチイ科［Family Taxaceae-Yew family］；ソテツ門［Division Cycadophyta-Cycads］、ソテツ綱［Class Cycadopsida］、ソテツ目［Order Cycadales］、ソテツ科［Family Cycadaceae-Cycad family］；ザミア科［Family Zamiaceae-Sago-palm family］；イチョウ門 ［Division Ginkgophyta-Ginkgo］、イチョウ綱［Class Ginkgoopsida］、イチョウ目 ［Order Ginkgoales］、イチョウ科［Family Ginkgoaceae-Ginkgo family］；マオウ植物門［Division Gnetophyta- Mormon tea and other gnetophytes］、グネツム綱［Class Gnetopsida］、マオウ目［Order Ephedrales］、マオウ科［Family Ephedraceae-Mormon-tea family］；グネツム目［Order Gnetales］、グネツム科［Family Gnetaceae-Gnetum family］；被子植物門［Division Magnoliophyta-Flowering plants］、単子葉植物綱［Class Liliopsida-Monocotyledons］、オモダカ亜綱［Subclass Alismatidae］、オモダカ目［Order Alismatales］、オモダカ科［Family Alismataceae-Water-plantain family］、ハナイ科［Family Butomaceae-Flowering Rush family］、黄花面高科［Family Limnocharitaceae -Water-poppy family］；トチカガミ目［Order Hydrocharitales］、トチカガミ科［Family Hydrocharitaceae-Tape-grass family］；イバラモ目［Order Najadales］、水▲よう▼科［Family Aponogetonaceae-Cape-pondweed family］、シオニラ科［Family Cymodoceaceae-Manatee-grass family］、シバナ科［Family Juncaginaceae-Arrow-grass family］、イバラモ科［Family Najadaceae - Water-nymph family］、ポシドニア科［Family Posidoniaceae - Posidonia family］、ヒルムシロ科［Family Potamogetonaceae - Pondweed family］、カワツルモ科［Family Ruppiaceae - Ditch-grass family］、ホロムイソウ科［Family Scheuchzeriaceae - Scheuchzeria family］、イトクズモ科［Family Zannichelliaceae-Horned pondweed family］、アマモ（甘藻）科［Family Zosteraceae - Eel-grass family］；ヤシ亜綱［Subclass Arecidae］、サトイモ目［Order Arales］、ショウブ（菖蒲）科［Family Acoraceae - Calamus family］、サトイモ科［Family Araceae - Arum family］、ウキクサ科［Family Lemnaceae - Duckweed family］；ヤシ目［Order Arecales］ヤシ科［Family Arecaceae - Palm family］；パナマソウ目［Order Cyclanthales］、パナマソウ科［Family Cyclanthaceae - Panama Hat family］；タコノキ目［Order Pandanales］、タコノキ（蛸木）科［Family Pandanaceae - Screw-pine family］；ツユクサ亜綱［Subclass Commelinidae］、ツユクサ目［Order Commelinales］、ツユクサ科［Family Commelinaceae - Spiderwort family］、マヤカ科［Family Mayacaceae - Mayaca family］、トウエンソウ科［Family Xyridaceae - Yellow-eyed Grass family］；カヤツリグサ目［Order Cyperales］、カヤツリグサ科［Family Cyperaceae - Sedge family］、イネ科［Family Poaceae - Grass family］；ホシクサ目［Order Eriocaulales］、ホシクサ（星草）科［Family Eriocaulaceae - Pipewort family］；［Order Juncales］、イグサ科［Family Juncaceae - Rush family］；サンアソウ目［Order Restionales］、ヨインウィレア科［Family Joinvilleaceae - Joinvillea family］；ガマ目［Order Typhales］、ミクリ科［Family Sparganiaceae - Bur-reed family］、ガマ科［Family Typhaceae - Cat-tail family］；ユリ亜綱［Subclass Liliidae］、百合目［Order Liliales］、リュウゼツラン科［Family Agavaceae - Century-plant family］、アロエ科［Family Aloeaceae - Aloe family］、ヤマノイモ科［Family Dioscoreaceae - Yam family］、ハゼリソウ科［Family Haemodoraceae - Bloodwort family］、ハングアナ科［Family Hanguanaceae - Hanguana family］、アヤメ科［Family Iridaceae - Iris family］、ユリ科［Family Liliaceae - Lily family］、タヌキアヤメ科［Family Philydraceae - Philydraceae family］、ミズアオイ科［Family Pontederiaceae - Water-Hyacinth family］、サルトリイバラ科［Family Smilacaceae - Catbrier family］、ビャクブ（百部）科［Family Stemonaceae - Stemona family］、タシロイモ［Family Taccaceae - Tacca family］；ラン目［Order Orchidales］、ヒナノシャクジョウ科［Family Burmanniaceae - Burmannia family］、ラン科［Family Orchidaceae - Orchid family］； ショウガ亜綱［Subclass Zingiberidae］、パイナップル目［Order Bromeliales］、パイナップル科［Family Bromeliaceae - Bromeliad family］；ショウガ目［Order Zingiberales］、カンナ科［Family Cannaceae - Canna family］、オオホザキアヤメ科［Family Costaceae - Costus family］、オウムバナ科［Family Heliconiaceae - Heliconia family］、クズウコン科［Family Marantaceae - Prayer-Plant family］、バショウ科［Family Musaceae - Banana family］、ショウガ科［Family Zingiberaceae - Ginger family］；モクレン綱［Class Magnoliopsida - Dicotyledons］、キク亜綱［Subclass Asteridae］、キク目［Order Asterales］、キク科［Family Asteraceae - Aster family］；アワゴケ目［Order Callitrichales］、アワゴケ科［Family Callitrichaceae - Water-starwort family］、スギナモ科［Family Hippuridaceae - Mare's-tail family］；カリケラ目［Order Calycerales］、カリケラ科［Family Calyceraceae - Calycera family］；キキョウ目［Order Campanulales］、キキョウ科［Family Campanulaceae - Bellflower family］、クサトベラ科［Family Goodeniaceae - Goodenia family］、ナガボノウルシ科［Family Sphenocleaceae - Spenoclea family］；マツムシソウ目［Order Dipsacales］、レンプクソウ科［Family Adoxaceae - Moschatel family］、スイカズラ科［Family Caprifoliaceae - Honeysuckle family］、マツムシソウ科［Family Dipsacaceae - Teasel family］、オミナエシ科［Family Valerianaceae - Valerian family］；リンドウ目［Order Gentianales］、キョウチクトウ科［Family Apocynaceae - Dogbane family］、ガガイモ科［Family Asclepiadaceae - Milkweed family］、リンドウ科［Family Gentianaceae - Gentian family］、マチン科［Family Loganiaceae - Logania family］；シソ目［Order Lamiales］、ムラサキ科［Family Boraginaceae - Borage family］、シソ科［Family Lamiaceae - Mint family］、レンノア科［Family Lennoaceae - Lennoa family］、クマツヅラ科［Family Verbenaceae - Verbena family］；オオバコ目［Order Plantaginales］、オオバコ科［Family Plantaginaceae - Plantain family］；アカネ目［Order Rubiales］、アカネ科［Family Rubiaceae - Madder family］；ゴマノハグサ目［Order Scrophulariales］、キツネノマゴ科［Family Acanthaceae - Acanthus family］、ノウゼンカズラ科［Family Bignoniaceae - Trumpet-creeper family］、フジウツギ科［Family Buddlejaceae - Butterfly-bush family］、イワタバコ科［Family Gesneriaceae - Gesneriad family］、タヌキモ科［Family Lentibulariaceae - Bladderwort family］、ハマジンチョウ科［Family Myoporaceae - Myoporum family］、モクセイ科［Family Oleaceae - Olive family］、ハマウツボ科［Family Orobanchaceae - Broom-rape family］、ゴマ科［Family Pedaliaceae - Sesame family］、ゴマノハグサ科［Family Scrophulariaceae - Figwort family］；ナス目［Order Solanales］、ヒルガオ科［Family Convolvulaceae - Morning-glory family］、ネナシカズラ科［Family Cuscutaceae - Dodder family］、フォウクィエリア科［Family Fouquieriaceae - Ocotillo family］、ハゼリソウ科［Family Hydrophyllaceae - Waterleaf family］、ミツガシワ科［Family Menyanthaceae - Buckbean family］、ハナシノブ科［Family Polemoniaceae - Phlox family］、茄子科［Family Solanaceae - Potato family］；ナデシコ亜綱［Subclass Caryophyllidae］、ナデシコ目［Order Caryophyllales］、アカトカルプス科［Family Achatocarpaceae - Achatocarpus family］、ハマミズナ科［Family Aizoaceae - Fig-marigold family］、ヒユ科［Family Amaranthaceae - Amaranth family］、ツルムラサキ科［Family Basellaceae - Basella family］、サボテン科［Family Cactaceae - Cactus family］、ナデシコ科［Family Caryophyllaceae - Pink family］、アカザ科［Family Chenopodiaceae - Goosefoot family］、ザクロソウ科［Family Molluginaceae - Carpet-weed family］、オシロイバナ科［Family Nyctaginaceae - Four o'clock family］、ヤマゴボウ科［Family Phytolaccaceae - Pokeweed family］、スベリヒユ科［Family Portulacaceae - Purslane family］；イソマツ目［Order Plumbaginales］、イソマツ科［Family Plumbaginaceae - Leadwort family］；タデ目［Order Polygonales］、タデ科［Family Polygonaceae - Buckwheat family］；ビワモドキ亜綱［Subclass Dilleniidae］、バティス目［Order Batales］、バティス科［Family Bataceae - Saltwort family］；フウチョウソウ目［Order Capparales］、アブラナ科［Family Brassicaceae - Mustard family］、フウチョウソウ科［Family Capparaceae - Caper family］、ワサビノキ科［Family Moringaceae - Horse-radish tree family］、モクセイソウ科［Family Resedaceae - Mignonette family］；イワウメ目［Order Diapensiales］、イワウメ科［Family Diapensiaceae - Diapensia family］；ビワモドキ目［Order Dilleniales］、ビワモドキ科［Family Dilleniaceae - Dillenia family］、ボタン科［Family Paeoniaceae - Peony family］；カキノキ目［Order Ebenales］、カキノキ科［Family Ebenaceae - Ebony family］、アカテツ科［Family Sapotaceae - Sapodilla family］、エゴノキ科［Family Styracaceae - Storax family］、ハイノキ科［Family Symplocaceae - Sweetleaf family］；ツツジ目［Order Ericales］、リョウブ科［Family Clethraceae - Clethra family］、キリラ科［Family Cyrillaceae - Cyrilla family］、ガンコウラン科［Family Empetraceae - Crowberry family］、エパクリス科［Family Epacridaceae - Epacris family］、ツツジ科［Family Ericaceae - Heath family］、シャクジョウソウ科［Family Monotropaceae - Indian Pipe family］、イチヤクソウ科［Family Pyrolaceae - Shinleaf family］；サガリバナ目［Order Lecythidales］、サガリバナ科［Family Lecythidaceae - Brazil-nut family］；アオイ目［Order Malvales］、パンヤ科［Family Bombacaceae - Kapok-tree family］、ホルトノキ科［Family Elaeocarpaceae - Elaeocarpus family］、アオイ科［Family Malvaceae - Mallow family］、アオギリ科［Family Sterculiaceae - Cacao family］、シナノキ科［Family Tiliaceae - Linden family］；ウツボカズラ目［Order Nepenthales］、モウセンゴケ科［Family Droseraceae - Sundew family］、ウツボカズラ科［Family Nepenthaceae - East Indian Pitcher-plant family］、サラセニア科［Family Sarraceniaceae - Pitcher-plant family］；サクラソウ目［Order Primulales］、ヤブコウジ科［Family Myrsinaceae - Myrsine family］、サクラソウ科［Family Primulaceae - Primrose family］、テオフラスタ科［Family Theophrastaceae - Theophrasta family］；ヤナギ目［O
rder Salicales］、ヤナギ科［Family Salicaceae - Willow family］；ツバキ目［Order Theales］、マタタビ科［Family Actinidiaceae - Chinese Gooseberry family］、バターナット科［Family Caryocaraceae - Souari family］、テリハボク科［Family Clusiaceae - Mangosteen family］、フタバガキ亜科［Family Dipterocarpaceae - Meranti family］、ミゾハコベ科［Family Elatinaceae - Waterwort family］、マルクグラウィア科［Family Marcgraviaceae - Shingle Plant family］、オクナ科［Family Ochnaceae - Ochna family］、ツバキ科［Family Theaceae - Tea family］；スミレ目［Order Violales］、シュウカイドウ科［Family Begoniaceae - Begonia family］、ベニノキ科［Family Bixaceae - Lipstick-tree family］、パパイア科［Family Caricaceae - Papaya family］、ハンニチバナ科［Family Cistaceae - Rock-rose family］、ウリ科［Family Cucurbitaceae - Cucumber family］、ダティスカ科［Family Datiscaceae - Datisca family］、イイギリ科［Family Flacourtiaceae - Flacourtia family］、フランケニア科［Family Frankeniaceae - Frankenia family］、シレンゲ科［Family Loasaceae - Loasa family］、トケイソウ科［Family Passifloraceae - Passion-flower family］、ギョリュウ科［Family Tamaricaceae - Tamarix family］、トゥルネラ科［Family Turneraceae - Turnera family］、スミレ科［Family Violaceae - Violet family］；マンサク亜綱［Subclass Hamamelidae］、モクマオウ目［Order Casuarinales］、モクマオウ科［Family Casuarinaceae - She-oak family］；ブナ目［Order Fagales］、カバノキ科［Family Betulaceae - Birch family］、ブナ科［Family Fagaceae - Beech family］；マンサク目［Order Hamamelidales］、カツラ科［Family Cercidiphyllaceae - Katsura-tree family］、マンサク科［Family Hamamelidaceae - Witch-hazel family］、スズカケノキ科［Family Platanaceae - Plane-tree family］； クルミ目［Order Juglandales］、クルミ科［Family Juglandaceae - Walnut family］；レイトネリア目［Order Leitneriales］、レイトネリア科［Family Leitneriaceae - Corkwood family］；ヤマモモ目［Order Myricales］、ヤマモモ科［Family Myricaceae - Bayberry family］；イラクサ目［Order Urticales］、アサ科［Family Cannabaceae - Hemp family］、ケクロピア科［Family Cecropiaceae - Cecropia family］、クワ科［Family Moraceae - Mulberry family］、ニレ科［Family Ulmaceae - Elm family］、イラクサ科［Family Urticaceae - Nettle family］；モクレン亜綱［Subclass Magnoliidae］、ウマノスズクサ目［Order Aristolochiales］、ウマノスズクサ科［Family Aristolochiaceae - Birthwort family］；シキミ目［Order Illiciales］、シキミ科［Family Illiciaceae - Star-anise family］、マツブサ科［Family Schisandraceae - Schisandra family］；クスノキ目［Order Laurales］、ロウバイ科［Family Calycanthaceae - Strawberry-shrub family］、ハスノハギリ科［Family Hernandiaceae - Hernandia family］、クスノキ科［Family Lauraceae - Laurel family］、モニミア科［Family Monimiaceae - Monimia family］；モクレン目［Order Magnoliales］、バンレイシ科［Family Annonaceae - Custard-apple family］、カネラ科［Family Canellaceae - Canella family］、モクレン科［Family Magnoliaceae - Magnolia family］、ニクズク科［Family Myristicaceae - Nutmeg family］、ハマザクロ科［Family Sonneratiaceae - Sonneratia family］、シキミモドキ科［Family Winteraceae - Wintera family］；スイレン目［Order Nymphaeales］、ハゴロモモ科［Family Cabombaceae - Water-shield family］、マツモ科［Family Ceratophyllaceae - Hornwort family］、ハス科［Family Nelumbonaceae - Lotus-lily family］［Family Nymphaeaceae - Water-lily family］；ケシ目［Order Papaverales］、ケマンソウ科［Family Fumariaceae - Fumitory family］、ケシ科［Family Papaveraceae - Poppy family］；胡���目［Order Piperales］、センリョウ科［Family Chloranthaceae - Chloranthus 
2008520588.tif 000002
Saururaceae - Lizard's-tail family］；キンポウゲ目［Order Ranunculales］、メギ科［Family Berberidaceae - Barberry family］、アケビ科［Family Lardizabalaceae - Lardizabala family］、ツヅラフジ科［Family Menispermaceae - Moonseed family］、キンポウゲ科［Family Ranunculaceae - Buttercup family］、アワブキ科［Family Sabiaceae - Sabia family］；バラ亜綱［Subclass Rosidae］、セリ目［Order Apiales］、セリ科［Family Apiaceae - Carrot family］、ウマノスズクサ科［Family Araliaceae - Ginseng family］；ニシキギ目［Order Celastrales］、モチノキ科［Family Aquifoliaceae - Holly family］、ニシキギ科［Family Celastraceae - Bittersweet family］、コリノカルプス科［Family Corynocarpaceae - Karaka family］、デチンムル科［Family Hippocrateaceae - Hippocratea family］、クロタキカズラ科［Family Icacinaceae - Icacina family］、スタックホウシア科［Family Stackhousiaceae - Stackhousia family］；ミズキ目［Order Cornales］、ミズキ科［Family Cornaceae - Dogwood family］、ガリヤ科［Family Garryaceae - Silk Tassel family］、ヌマミズキ科［Family Nyssaceae - Sour Gum family；トウダイグサ目［Order Euphorbiales］、ツゲ科［Family Buxaceae - Boxwood family］、トウダイグサ科［Family Euphorbiaceae - Spurge family］、シムモンドシア科［Family Simmondsiaceae - Jojoba family］；マメ目［Order Fabales］、マメ科［Family Fabaceae - Pea family］；フウロソウ目［Order Geraniales］、ツリフネソウ科［Family Balsaminaceae - Touch-me-not family］、フウロソウ科［Family Geraniaceae - Geranium family］、リムナンテス［Family Limnanthaceae - Meadow-Foam family］、カタバミ科［Family Oxalidaceae - Wood-Sorrel family］、ノウゼンハレン科［Family Tropaeolaceae - Nasturtium family］；アリノトウグサ目［Order Haloragales］、グンネラ科［Family Gunneraceae - Gunnera family］、アリノトウグサ科［Family Haloragaceae - Water Milfoil family］；アマ目［Order Linales］、コカノキ科［Family Erythroxylaceae - Coca family］、アマ科［Family Linaceae - Flax family］；フトモモ目［Order Myrtales］、シクンシ科［Family Combretaceae - Indian Almond family］、ミソハギ科［Family Lythraceae - Loosestrife family］、ノボタン科［Family Melastomataceae - Melastome family］、フトモモ科［Family Myrtaceae - Myrtle family］、アカバナ科［Family Onagraceae - Evening Primrose family］、ザクロ科［Family Punicaceae - Pomegranate family］、ジンチョウゲ科［Family Thymelaeaceae - Mezereum family］、ヒシ（菱）科［Family Trapaceae - Water Chestnut family］；カワゴケソウ目［Order Podostemales］、カワゴケソウ科［Family Podostemaceae - River-weed family］；ヒメハギ目［Order Polygalales］、クラメリア科［Family Krameriaceae - Krameria family］、キントラノオ科［Family Malpighiaceae - Barbados Cherry family］、ヒメハギ科［Family Polygalaceae - Milkwort family］；ヤマモガシ目［Order Proteales］、ヤマモガシ科［Family Proteaceae - Protea family］；ラフレシア目［Order Rafflesiales］、ラフレシア科［Family Rafflesiaceae - Rafflesia family］；クロウメモドキ目［Order Rhamnales］、グミ科［Family Elaeagnaceae - Oleaster family］、クロウメモドキ科［Family Rhamnaceae - Buckthorn family］、ブドウ科［Family Vitaceae - Grape family］；ヒルギ目［Order Rhizophorales］、ヒルギ科［Family Rhizophoraceae - Red Mangrove family］；バラ目［Order Rosales］、ブルネリア科［Family Brunelliaceae - Brunellia family］、クリソバラヌス科［Family Chrysobalanaceae - Cocoa-plum family］、マメモドキ科［Family Connaraceae - Cannarus family］、ベンケイソウ科［Family Crassulaceae - Stonecrop family］、クロッソソマ科［Family Crossosomataceae - Crossosoma family］、クノニア科［Family Cunoniaceae - Cunonia family］、スグリ科［Family Grossulariaceae - Currant family］、アジサイ科［Family Hydrangeaceae - Hydrangea family］、トベラ科［Family Pittosporaceae - Pittosporum family］、バラ科［Family Rosaceae - Rose family］、ユキノシタ科［Family Saxifragaceae - Saxifrage family］、スリアナ科［Family Surianaceae - Suriana family］；ビャクダン目［Order Santalales］、ツチトリモチ科［Family Balanophoraceae - Balanophora family］、エレモレピス科［Family Eremolepidaceae - Catkin-mistletoe family］、オオバヤドリギ科［Family Loranthaceae - Showy Mistletoe family］、ボロボロノキ科［Family Olacaceae - Olax family］、ビャクダン科［Family Santalaceae - Sandalwood family］、ヤドリギ科［Family Viscaceae - Christmas Mistletoe family］；ムクロジ目［Order Sapindales］、カエデ科［Family Aceraceae - Maple family］、ウルシ科［Family Anacardiaceae - Sumac family］、カンラン科［Family Burseraceae - Frankincense family］、トチノキ科［Family Hippocastanaceae - Horse-chestnut family］、センダン科［Family Meliaceae - Mahogany family］、ミカン科［Family Rutaceae - Rue family］、ムクロジ科［Family Sapindaceae - Soapberry family］、ニガキ科［Family Simaroubaceae - Quassia family］、ミツバウツギ科［Family Staphyleaceae - Bladdernut family］、ハマビシ科［Family Zygophyllaceae - Creosote-bush family］。
【０１８３】
一つの実施例では、可能性のある植物は、以下を含む：Abelmoschus esculentus、Abies balsamea、Abies cephalonica、Abies firma、Abies lasiocarpa、Acer campestre、Acer mandshurica、Acer palmaturn "burgundy"、Acer tataricum、Acer truncatum、Achillea millefolium、Achillea ptarmica、Achillea tomentosa、Acolypha hispida、Aconitum napellus、Aconitum spp.、Acorus calamus、Actaea racemosa、Actinidi colonicta、Actinidia arguta、Actinidia chinensis、Actinidia colomicta、Adansonia digitata、Adianthum radiatum、Adianthum trapezieformis、Adiantum pedatum、Adiantum tenerum、Aechmea luddemoniana、Aesculus hypocastanum、Aesculus waertilensis、Aesculus woerlitzenis、Aessopteria crasifolia、Aframomum melegueta、Agaricus bisporus、Agastache foeniculum、Agastache mexuicana、Agatis robusta、Ageratum conizoides、Aglaonema commutatus、Agrimonia eupatora、Agropyron cristatum、Agropyron repens、Agrostis alba、Agrostis stolonifera、Ailantus altissima、Ajuga reptans、Alcea rosea、Alchemilla mollis、Alchemilla sp.、Alium cernum、Alkanna tinctoria、Allium ampeloprasum、Allium cepa、Allium fistulosum、Allium grande、Allium nutans、Allium porrum、Allium sativum、Allium schoenoprasum、Allium sp.、Allium tuberosum、Allium victorialis、Aloe vera、Alpinia officinarum、Althaea officinalis、Alum japonica、Amaranthus caudatus、Amaranthus retroflexus、Amaranthus tricolor、Ambrosia artemisiifolia、Amelanchier alnifolia、Amelanchier canadensis、Amelanchier sanguinea、Amelanchier sanguinea x A. laevis、Amelanchier spicata、Amigdalus nana、Amsonia tabernaemontana、Ananas comosus、Anaphalis margaritacea、Anemona japonica、Anethum graveolens、Angelica archangelica、Angelica dahurica、Angelica sinensis、Antericum ramosum、Anthemis tinctoria、Anthoxanthum odoratum、Anthriscus cerefolium、Anthurium altersianum、Anthurium andreanum、Anthurium elegans、Anthurium guildingii、Anthurium hookeri、Anthurium magnificurn、Anthyrium filis-femina、Anthyrium nopponicum、Apium graveolens、Apocynum cannabinum、Arachis hypogaea、Aralia cordata、Aralia nudicaulis、Aralis mandshurica、Archirantus bidentata、Arctium lappa、Arctium minus、Arctostaphylos uva-ursi、Armoracea rusticana、Armoraica ristica、Aronia melanocarpa、Aronia x prunifolia、Arrhenatherum elatius、Artemisia abrotanum、Artemisia absinthium、Artemisia dracunculus、Artemisia ludoviciana、Artemisia vulgaris、Asarum europaeum、Asclepias incarnata、Asclepias tuberosa、Asimina triloba、Asorum canadensis、Asparagus officinalis、Asplenium australasicum、Aster spp、Aster-Nova anglicae、Astilbe chinensis、Astilbe x arendsii、Astilboides tabularis、Astragulus sinicus、Athyrium asperum、Atriplex hortensis、Atropa belladonna、Austolachia australis、Avena sativa、Averrhoa carambola、Bactisia australis、Baptisia tinctoria、Barbaric sp.、Beckmannia eruciformis、Begonia convolvulacea、Begonia eminii、Begonia glabra、Begonia mannii、Begonia polygonoides、Bellis perennis、Berberis thungergi、Berberis vulgaris、Bergenia crassifolia、Bergenia x schmidtii、Beta vulgaris、Betula alba、Betula alleghaniensis、Betula daurica、Betula glandulosa、Betula nigra、Betula pendula、Bocconia cordata、Boechimeria boloba、Boesenbergia rotunda、Boletus edulis、Borago officinalis、Boxus sempervirens、Brassica cepticepa、Brassica chinensis、Brassica juncea、Brassica napa、Brassica napus、Brassica nigra、Brassica oleracea、Brassica rapa、Bromelia balansae、Bromus inermis、Brugmansi graveolens (ralf)、Brugmansia suaveolens、Brugmansia suaveolens、Buddleja davidii、Bupleurum falcatum、Butomus umbellatus、Buxus microphilla "japonica"、Buxus microphylla、Cachris alpina、Cactus officinalis、Caladium spp.、Calamagrostis arundiflora、Calamintha nepeta、Calathea zebrina、Calendula officinalis、Calicatus floridus、Camellia sinensis、Campanula carpatica、Campanula rapunculus、Canna indica、Cantharellus cibarius、Capparis spinosa inemis、Capsella bursa-pastoris、Capsicum annuum、Capsicum frutescens、Carex morrowii、Carica papaya、Carlina acaulis、Carpinus caroliniana、Carthamus tinctorius、Carum capsicum、Carum carvi、Carya cordiformis、Caryota ureus、Casia hebecarpa、Castanea sativa、Castanea spp.、Celosia cristata、Celtis occidentalis、Centaurea dealbata、Centaurea solstitialis、Centauria maculata、Cerastium tomentosum、Cerasus japonica、Cerasus maghabab、Ceratoramia mexicana、Chaenomeles x superba、Chaernomelis superba、Chaerophyllum bulbosum、Chamaemelum nobile、Charnaechrista fasciculata、Charnaeciparis pisifera、Chelidonium majus、Chenopodium album、Chenopodium bonus-henricus、Chenopodium quinoa、Chrysanthemum coronarium、Cicer arietinum、Cichorium endivia subsp. endivia、Cichorium intybus、Cinnamomum verum、Cirsium arvense、Cissus discolor、Cistus incanus、Citinis coggriaria、Citrullus colocynthis、Citrullus lanatus、Citrus limettoides、Citrus limon、Citrus reticulata、Citrus sinensis、Citrus x paradisi、Clematis alpina、Clematis armandii、Clematis chiisanensis、Clematis rectae、Clerodendrurn speciossicum、Cobiaeum varilarturn、Coccoloba caracasana、Cocculus laurifolius、Cocos nucifera、Coix lacryma-jobi、Colocasia spp.、Comus mass、Convalaria majalis、Conyza canadensis、Corchorus olitorius、Coreopsis verticillata、Coriandrum sativum、Cornus alba、Cornus canadensis、Cornus mas、Cornus sericea、Coronolla varia、Coryllus avelana、Corylus maxima、Cosmos sulphureus、Cotinus coggygria、Cotoneaster fangianus、Cotoneaster horisontalis、Cotynus cogygria、Crambe cordifolia、Cramble cardifolia、Crataegus praegophyrum、Crataegus sanguinea、Crataegus spp.、Crataegus submollis、Crategus macrophyllum、Crithmum maritimum、Cryptotaenia canadensis、Crytomium fortunei、Cucumis anguria、Cucumis melo、Cucumis metuliferus、Cucumis sativus、Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo、Cullen corylifolium、Cuminum cyminum、Cupress lusitanica、Cupressus sempervirens、Curcuma longa、Curcuma zedoaria、Cycas cirinalis、Cydonia oblonga、Cymbopogon citratus、Cymbopogon martinii、Cynara cardunculus subsp. cardunculus、Cynnamonum zeylonicum、Cyperus alternifolius、Cyperus esculentus、Dactylis glomerata、Dahlia spp.、Darura stramonium、Datisca cannabina、Datura metel、Datura stramonium、Daucus carota、Deutria scabra、Dieffenbachia leopoldii、Dieffenbachia segiunae、Digitalis lutea、Digitalis purpurea、Dimocarpus longan、Diopiros kaka、Dioscorea batatas、Diospyros kaki、Dipsacus sativus、Dirca palustris、Dolichos lablab、Dracaena fragrans、Dracaena sp.、Dryopteris filis-max、Dryopteris filix-mas、Echinacea purpurea、Echinochloa frumentacea、Echinops sphae、Eleagnus angustifolia、Eleagnus cemutata、Eleusine coracana、Encephalaris horridum、Epilobium augustifolium、Equisetum hyemale、Equisetum variegatum、Erigeron speciosus、Eriobotria japonica、Eriobotrya japonica、Eruca vesicaria、Erungium campestre、Erysimum perofskianum、Erythrinia caffra、Erythrinia crista、Erythrinia glabeliferus、Eschscholzia californica、Eucaliptus rudis、Eucomia ulurifolia、Euonimus elata、Euonomus europea、Euonomus verrucosa、Euphorbia amygdaloides、Fagopyrum esculentum、Fagopyrum suffruticosum、Fagopyrum tataricum、Fagus silvatica、Fautenousus qualiqualia、Festuca rubra、Feucrium hamedris、Ficus benjaminii、Ficus elastica、Ficus purnila、Ficus religiosa、Ficus sp.、Ficus triangularis、Filipendula rubra、Filipendula ulmaria、Filipendula vulgaris、Foeniculum vulgare、Foenix zeulonica、Forsithsia suspensa、Forsitsia europea、Forsythia x intermedia、Fortunella spp.、Fragaria x ananassa、Frangula alnus、Fraxinus exelsior、Fuchsia magellanica、Fuchsia spp.、Fucus vesiculosus、Fumaria officinalis、Galinsoga quadriradiata、Galium aparine、Galium odoratum、Gallium sporium、Gardenia jasminoides、Gaultheria hispidula、Gaultheria procumbens、Genista multibracteata、Gentiana cruciata、Gentiana littorala、Gentiana lutea、Gentiana macrophylla、Gentiana tibetica、Geranium maculata、Geranium phaeum、Geranium pratense、Geranium sanguineum、Geranium x cantabrigiense、Geum fanieri、Geum macrophyllum、Geum rivale、Gingko biloba、Glaux maritima、Glechoma hederacea、Glyceria maxima、Glycine max、Glycyrrhiza glabra、Gnetum guemon、Gossypium herbaceum、Gratiola officinalis、Gravilea robusta、Guizotia abyssinica、Haemanthus katharina、Hamamelis mollis、Hamamelis virginiana、Haser trilobum、Hedeoma pulegioides、Hedychium coronarium、Hedychium spp.、Helenium spp.、Helianthus annus、Helianthus strumosus、Helianthus tuberosus、Helichrysum angustifolium、Helichrysum thianschanicum、Heliotropium arborescens、Helleborus niger、Heraclelum pubescens、Herba schizonepetae、Hernerocalis spp.、Hibiscus cannabinus、Hissopus zeraucharicus、Hiuga reptans、Hordeum hexastichon、Hordeum vulgare、Hordeum vulgare subsp. vulgare、Hosta fortuna、Hosta fortunaea、Hosta lancefolia、Hosta sieboldiana、Hosta zibalda、Houttuynia cordata、Humulus lupulus、Hydrangea quercifolia、Hydrastis canadensis、Hydrocotile asiatica、Hylotelephium spp.、Hymenoxys hoopesii、Hyoscyamus niger、 Hypericum henryi、Hypericum perforatum、Hypericum spp.、Hypomyces lactifluorum、Hyppoach rhamnoides、Hyssopus officinalis、Iberis amara、Iberis sempervirens、Ilex agnifolium、Ilex cornuta、Inula helenium、Ipomea tricolor、Ipomoea aquatica、Ipomoea batatas、Iris alida、Iris pseudocarpus、Iris versicolor、Isatis tinctoria、Jacobinia sp.、Jasminum frutocarus、Jeffersonia diphylla、Juca sp.、Juglands regia、Juglans nigra、Juniperus "blue pacific"、Juniperus communis、Keyleiteria paniculata、Kochia scoparia、Koeleria glauca、Kolkwitzia amabilis、Korria japonica、Krameria lappacea、Lactuca sativa、Lactuca serriola、Lal lab purpurea、Lamiastrum galeobdolon、Lapia dulcis、Laportea canadensis、Larix dedidua、Laserpitium latifolium、Lathyrus sativus、Lathyrus sylvestris、Laurus nobilis、Lavandula angustifolia、Lavandula latifolia、Lavandula officinalis、Ledum groenlandicum、Lens culinaris subsp. culinaris、Lentinus edodes、Leontopodium alpinum、Leonurus cardiaca、Lepidium sativum、Leucanthemum vulgare、Levisticum officinale、Liatris spinata、Liclum barbatum、Ligularia dentata、Ligustrum vulgare、Linaria vulgaris、Lindera benzoin、Linium hirsutum、Linum usitatissimum、Lippa dulcis、Litchi chinensis、Livistona fragrans、Lobelia siphitica、Lolium multiflorum、Lolium perenne、Lonicera ramosissima、Lonicera
syringantha、Lotus corniculatus、Lotus tetragonolobus、Luglands nigra、Lunaria annua、Lupinus luteaus、Lupinus polyphyllus、Luzula sylvatica、Lychnis chalcedonica、Lycodium japonicum、Lycopersicon esculentum、Lycopersicon pimpinellifolium、Lysimachia clethroides、Lythrum salicaria、Madia sativa、Magnolia agrifolia、Magnolia cobus、Magnolia loebheril、Magnolia stellata、Magnolia x loebneri、Malus hupehensis、Malus prunifolia、Malus spp.、Malva moschata、Malva sylvestris、Malva verticillata、Mangifera indica、Manihot esculenta、Marrubium vulgare、Matricaria recutita、Matricaria spp.、Matteuccia pensylvanica、Matteucia strutioptoris、Medicago sativa、Melaleuca alternifolia、Melilotus albus、Melilotus officinalis、Melissa officinalis、Mentha arvensis、Mentha pulegium、Mentha spicata、Mentha suaveolens、Mentha x piperita、Menyanthes trifoliata、Mespilus germanica、Metasequoia glyptotrobioldes、Metrosideros excelsa、Microbiata decussata、Microlepia platphylla、Microlepia platyphylla、Microsorium punctatum、Minispermum dauricum、Mirica certifera、Miscanthus sacchariflorus、Miscanthus sinensis、Momordica charantia、Monarda didyma、Monarda fistulosa、Monarda spp.、Monstera deliciosa、Monstera pertusa、Montia perfoliata、Morus alba、Murraya exotica、Musa textilis、Musa x paradisiaca、Myrica pensylvanica、Myrthus communis、Nasturtium officinale、Nepeta cataria、Nicodemia diversifolia、Nicotiana rustica、Nicotiana tabacum、Nigella sativa、Ocimum Basilicum、Ocimum tenuiflorum、Oenothera biennis、Oenothera fruticosa subsp fruticosa、Olea europaea、Olea olcaster、Onobrychis viciifolia、Onoclea sensibilis、Ophiopogon japonicus、Opuntia spp.、Oreopanax capitata、Origanum majorana、Origanum vulgare、Oryza sativa、Osmanthus spp.、Osmunda regalis、Osmundastrum claytonionum、Ostrea carpinifolia、Ostrea connote、Oxalis deppei、Oxobachus nictogenea、Oxyria digyna、Pachyra affinis、Paeonia daurica、Paeonia lactiflora、Paeonia rubra、Paeonia spp.、Paeonia suffructicisa、Panax quinquefolius、Panicum miliaceum、Parrotia persica、Parthenosicus tricuspidata、Passiflora caerulea、Passiflora spp.、Pastinaca sativa、Pegamun hamalis、Pelargonium zonale、Pennisetum alopecuroides、Penstemon digitalis、Pentaphylloides fruticosa、Perilla frutescens、Persea americana、Petasites japonicus、Petroselinum crispum、Peucedanum cervaria、Peucedanum oreaselinum、Pfaffia paniculata、Phacelia tanacetifolia、Phalaris arundinacea、Phalaris canariensis、Phaseolus acutifolius、Phaseolus coccineus、Phaseolus vulgaris、Phebodium aureum、Philadelphus coronarius、Philodendron amurense、Phleum pratense、Phlox paniculata、Phoenix dactylifera、Phylidendron speciosus、Phyllanthus grandifolium、Phyllitis scolopendrium、Phymatosorus scolopendria、Physalis alkekengi、Physalis creticola、Physalis grisea、Physalis philadelphica、Physalis spp.、Physostegia virginiana、Phytolacca americana、Picea schrenkiana、Pieras japonica、Pigelia pennata、Pimpinella anisum、Pinus bungiana、Pinus cembra、Pinus mugo、Pinus pinea、Pinus pumila、Pinus salinifolia、Pinus silvestris、Pinus sirtrobus、Pinus strobus、Piper chaba、Piper nigrum、Pisum sativum、Pithecelobium unguis、Pittisporum tibica、Plantago coronopus、Plantago major、Plantago minor、Platanus acidentalis、Platicada grandiflora、Plectranthus fruticosus、Plectranthus spp.、Pleurotus spp.、Plumbago zeylanica、Poa compressa、Poa pratensis、Podocarpus spinulosus、Podophyllum amodii、Podophyllum peltatum、Poligonum aviculare、Poligornun latifolia、Polygonium odoratum、Polygonum aviculare、Polygonum chinense、Polygonum cuspidatum、Polygonum pensylvanicum、Polygonum persicaria、Polymonium ceruleum、Polyschium braunii、Pongamia pinnata、Pontederia cordata、Populus incrassata、Populus tremula、Populus x petrowskyana、Portulaca oleacea、Potentilla alba、Potentilla anserina、Potentilla fruticosa、Poterium sangiusorba、Primula veris、Princepia sp.、Prunella vulgaris、Prunus armeniaca、Prunus cerasifera、Prunus cerasus、Prunus persica、Prunus serotica、Prunus spp.、Prunus tomentosa、Prunus xocanEPathyrostachys juncea、Pseudotsuga menzisia、Psidium guajava、Psidium spp.、Psychotria metbacteriodomasica、Psychotria nigropunctata、Pteridium aquilinum、Pterigota alata、Puansetia sp.、Pulmonaria molissima、Pulmonaria officinalis、Pulmonaria saccharata、Punica granatum、Pyrus communis、Pyrus pyrifolia、Quercus castanufolia、Quercus imbricaria、Quercus nigra、Quercus robur "fastigiata"、Quercus rubra、Quercus trojana、Raphanus raphanistrum、Raphanus sativus、Ratibiunda columnus-Fera、Rauwolfia tetraphylla、Rehmannia glutinosa、Reseda luteola、Reseda odorata、Rheum officinale、Rheum palmatum、Rheum x hybridum、Rhododendron spp.、Rhus aromatica、Rhus toxicodenta、Rhus trilobata、Ribes americanum、Ribes grossularia、Ribes nigrum、Ribes sylvestre、Ribes uva-crispa、Ribes x nidigrolaria、Ricinus communis、Rimula japonica、Rodgersia podophylla、Rodgersia spp.、Rosa cocanica、Rosa multiflora、Rosa rugosa、Rosmarinus officinalis、Rubus allegheniensis、Rubus arcticus、Rubus canadensis、Rubus idaeus、Rubus occidentalis、Rubus phoenicolasius、Rubus pubescens、Rubus thibetanus、Rudbeckia maxima、Rumex acetosa、Rumex acetosella、Rumex crispus、Rumex patientia、Rumex scutatus、Ruschia indurata、Ruta graveolens、Saccharum officinarum、Salis babilonics、Salix purpurea、Salix tamarisifolia、Salvia elegans、Salvia officinalis、Salvia sclarea、Salvia sylvestris、Sambucus canadensis、Sambucus ebulus、Sambucus nigra、Sanchezia nobilis、Sanguisorba minor、Sanguisorba officinalis、Santolina chamaecyparissus、Saponaria officinalis、Satureja hortensis、Satureja montana、Satureja repandra、Schisandra chinensis、Scolymus hispanicus、Scorzonera hispanica、Scotch pine、Scrophularia nodosa、Scutellaria certicola、Scutellaria lateriflora、Scutellarian altissima、Secale cereale、Sechium edule、Sedum album、Sedum telchium、Sempervivum tectorum、Senecio platifilla、Senecio vulgaris、Senseviera sp.、Serenoa repens、Seringa josiceae、Serratula tinctoria、Seruginea suffruticisa、Sesamum indicum、Sesbania exaltata、Sesbania speciosa、Setaria italica、Sibirea altaiensis、Sidalcea spp.、Silene vulgaris、Silybum marianum、Sinapis alba subsp. alba、Siringa vulgaris、Sium sisarum、Sluffera sp.、Solanum dulcamara、Solanum melongena、Solanum scabrum、Solanum tuberosum、Soleirolia soleirolii、Solidago caesia、Solidago canadensis、Solidago spp.、Solidago virgaurea、Solidago x hybrida、Sonchus oleraceus、Sorbocotoneaster sp.、Sorbus aucuparia、Sorbus cominicta、Sorghum bicolor、Sorghum x drummondii、Spartina potentiflora、Spathiphyllum cochlearispaturn、Spathiphyllum grandiflorum、Spinacia oleracea、Stachis lanata、Stachys affinis、Stachys byzantina、Stachys macrantha、Staphylea trifolia、Stellaria graminea、Stellaria media、Stephanandra incisa、Stepochlaena tenuifolia、Sterulia elata、Stevartia coreana、Stewartia pseudocamellia、Stipa capillata、Strelitzia reginae、Sulda sanganea、Sundapsis spp.、Symphitium officinalis、Symphoricarpos albus、Symphoricarpos orbiculatus、Symphytum officinale、Syngoniurn aurutum、Syngoniurn podophyllum、Taccus bacata、Tagetes minuta、Talictrum minus、Talictrum sp.、Tamarindus india、Tamarindus indica、Tanacetum balsamita、Tanacetum balsamita subsp. balsamita、Tanacetum cinerariifolium、Tanacetum parthenium、Tanacetum vulgare、Tapeinochilos spectabilis、Taraxacum officinale、Taraxacum officinalis、Taxodium dixticum、Taxus cuspidata、Taxus hiksii、Taxus media、Taxus x media、Tetraclinis articulata hinensis、Tetradenia riparia、Teucrium chamaedrys、Thalictrum aquilegiifolium、Thalictum flavum、Thlaspi arvense、Thuja occidentalis、Thymus camosus、Thymus cretaceus、Thymus cytridorus "aureus、Thymus fragantissimus、Thymus herba-barona、Thymus lemabarona、Thymus portugalense、Thymus praecox、Thymus praecox subsp. arcticus、Thymus pseudolamginosus、Thymus pseudolanuginosus、Thymus puleglodes "lemons"、Thymus puliglodes、Thymus serphylum、Thymus speciosa、Thymus thrasicus、Thymus vulgaris、Thymus vulgaris "argenteus," Thymus vulgaris "oregano," Thymus wooly、Thymus x citriodorus、Tiarella cordifolia、Tiarella spp.、Tragopogon porrifolius、Tragopogon spp.、Trambe pontica、Trevesia sungaica、Trichosanthes kirilowii、Trifolium hybridum、Trifolium incarnatum、Trifolium pannonicum、Trifolium pratense、Trifolium repens、Trigonella foenum-graecum、Triticum aestivum、Triticum aestivum subsp. spelta、Triticum turgidum、Trollius x cultorum、Tropaeolum majus、Tsuga canadensis、Tsuga canadensis "penola"、Tsuga diversifolia、Tsuga mertensiana、Tuja orientalis "eligantissima"、Tula ocidentalis "columbia," Tulip tree、Turnera ulmifolia、Tussilago farfara、Typha latifolia、Ulmus americana、Ulmus pumila、Urtica dioica、Uschusa sp.、Uvularia perfoliata、Vaccinium angustifolium、Vaccinium corymbosum、Vaccinium macrocarpon、Valeriana officinalis、Valerianella locusta、Veratrum nigrum、Veratrum viride、Verbascum thapsus、Verbena officinalis、Verium oleander、Vernonia gigantea、Veronica austriaca ssp teucrium、Veronica beccabunga、Veronica officinalis、Viburnum opulus、Viburnum plicatum、Vicia faba、Vicia sativa、Vicia villosa、Vigna angularis、Vigna mungo、Vigna unguiculata、Vinca minor、Vincetocsicum officinalis、Vitis labrissa、Vitis spp.、Weigela coraeensis、Weigela hortensis、Withania somnifera、x Triticosecale spp.、Xanthium sibiricum、Xanthium strumarium、Xanthosoma sagittifolium、Xeupressocyparis deylandii、Yucca elephantipes、Yucca filamentosa、Zea mays、Zelcova、Zingiber officinalis、およびZingiber officinale。
【０１８４】
可能性のある植物の群は、原産地域に基づいて選択され得る。例えば、可能性のある植物の一つの群は、乾燥地域原産の植物、例えば、北緯35度と南緯35度の間に存在する植物を含み得る。従って、本発明の別の実施例と一致して、可能性のある植物は以下を含む：Yucca elata、Y. breviflora、Agave deserti、A. chrysantha、およびDasylirion wheeleriを含むリュウゼツラン科［agave, Agavaceae, family］；Eriogonum fasciculatumを含むタデ科［buckwheat, Polygonaceae, family］；Delphinium scaposum、Anemone tuberosa、およびD. parishiiを含むキンポウゲ科［crowfoot, Ranunculaceae, family］；Platystemon califomicu、Argemone pleiacantha、Corydalis aurea、Eschschoizia californica、およびAr. Corymbosa を含むケシ科［poppy, Papaveraceae, family］；Dithyrea californica、Streptanthus carinatus、およびLesquerella gordoniを含むアブラナ科［mustard, Cruciferae, family］；Acacia greggii、Prosopis velutina、A. constrica、Senna covesii、Cercidium floridum、C. microphyllum、Lotus huminstratus、Krameria parvifolia、Parkinsonia aculeata、Calliendia eriophylla、Lupinus arizonicus、Olyneya tesota、Astragalus lentiginosus、Psorothamunus spinosus、およびLupinus sparsiflorusを含むマメ科［legume, Leguminosae, family］；Mentzelia involucrata、M. pumila、およびMohavea Confertifloraを含むシレンゲ科［loasa family, Loasacea］；Carnegiea gigantia、Opuntia leptocaulis、Ferocactus wislizenii、O. bigelovii、O. pheacantha、O. versicolor、O. fulgida、Echinocereus engelmannii、Mammillaria microcarpa、O. basilaris、Stenocereins thurberi、O. violacea、M. tetrancistra、O. ramosissima、O. acanthocarpa、E. pectinatins、およびO. arbusculaを含むサボテン科［cactus, Cactaceae, family； Oenothera deltoides、Camissonia claviformis、およびOe. Primiverisを含むアカバナ科［evening primrose, Onagraceae］；Asclepias erosa、A. sublata、およびSarcostemma cynanchoidesを含むガガイモ科［milkweed, Asclepiadaceae, family］；Cryptantha augusti foliaおよびAmsinckia intermediaを含むムラサキ科［borage, Boraginaceae, family］；Baccharis sarothroides、Monoptiilon belloides、Erieron divergens、Zinnia acerosa、Melampodium leucanthan、Chaenactis fremontii、Calycoseris wrightii、Malacothrix californica、Helianthus annus、H. niveus、Geraea canescens、Hymenothrix wislizenii、Encelia farinosa、Psilostrophe cooperi、Baileya multiradiata、Bebbia juncea、Senecio douglasii、Trixis californica、Machaeranthera tephrodes、Xylorhiza tortifolia、Cirsiinm neomexicanum、Antennaria parvifloraおよびCh. Douglasiiを含むキク科［sunflower, Compositae, family］；Larrea tridentataおよびKallstroemia grandifloraを含むハマビシ科［caltrop, Zygophyllaceae, family；Hibiscus coulteri、H. denudatus、およびSphaeralcea ambiguaを含むアオイ科［mallow, Malvaceae, family］；Luanthus aureusを含むハナシノブ科［phlox, Polemoniaceae, family］；［Proboscidiea altheaefolia］を含むツノゴマ科［unicorn plant, Martyniaceae, family］；Cucurbita digitataを含むウリ科［gourd, Cucurbitaceae, family］；Calochortus kennedyi、Dichelostemma pulchellum、Allium macropetalum、およびHesperocallis indulataを含むバイケイソウ［lily, Lilaceae, family］；Fouquieria splendensを含むフォウクィエリア科［ocotillo, Fouquieriaceae, family］；Castilleja sp.、Penstemon parryi、およびOrthocarpus purpurascensを含むゴマノハグサ科［figwort, Scrophulariaceae, family］；Anisacanthus thurberi、Justicia califomica、およびRuellia nudifloraを含むキツネノマゴ科［acanthus, Acanthaceae, family］；Allionia incarnata、Abronia villosa、およびMirabilis multifloraを含むオシロイバナ科［four o'clock, Nyctaginaceae, family］；Erodium cicutariumを含むフウロソウ科［geranium, Geraniaceae, family］；Nama demissum、Phacelia bombycinおよびPh. Distans］を含むフウロソウ科［waterleaf, Hydrophyllaceae, family］；Chilopsis linearisを含むノウゼンカズラ科［bignonia, Bignoniaceae, family］；Glandularia gooddugiiおよび［Verbena neomexicanaを含むクマツヅラ科［vervain, Verbenaceae, family］；Hyptis emoryiおよびSalvia columbariaeを含むシソ科［mint, Labiatae, family］；Orobanche cooperiを含むハマウツボ科［broomrape, Orobanchaceae, family］；Talinum auriantiacumを含むスベリヒユ科［portulaca, Portulaceae, family］；Sesuvium verrucosumを含むハマミズナ科［carpet-weed, Aizoaceae, family］；Linum lewisiiを含むアマ科［flax, Linaceae, family］；Nicotiana trigonophyllaおよびPhysalis lobataを含む茄子科［potato, Solanaceae, family］；およびAmoreuxia palmatifidaを含むワタモドキ科［cochlospermum, Cochlospermaceae, family］。
【０１８５】
必要に応じて、可能性のある植物（群）を収穫ストレス処理に供してもよい。ストレス処理は、可能性のある植物（群）または当該可能性のある植物（群）由来の材料を、一つあるいはそれ以上のストレッサーと接触させるかそれらを用いて処理することを含む。ストレッサーは、化学化合物または物理処理であってよい。適切なストレッサーの例を上記した。当業者には明らかであるように、多様なストレッサーおよび処理計画の組み合わせを用いてもよい。
【０１８６】
植物材料は、収穫した直後に使用しても、あるいは抽出手続き（群）を実行する前にある期間保存してもよい。必要であれば、保存する前に、例えば、乾燥、凍結、乾燥凍結、あるいはそれらのなんらかの組み合わせにより、植物材料を処理してもよい。植物材料を保存用に調製する処理に続いて、抽出物の調製前に、植物材料をある期間保存してもよい。保存期間は長さが異なっていてよく、例えば、数日から数年の間であってよい。本発明の一つの実施例では、植物抽出物は、1週間未満の期間保存されている。別の実施例では、植物材料は、1週間から1ヶ月の期間保存されている。さらなる実施例では、植物材料は、1ヶ月から6ヶ月の期間保存されている。その他の実施例では、植物材料は、4ヶ月から1年の期間、および1年を超える期間保存されている。
【０１８７】
抽出過程
多様な抽出過程が当業界で既知であり、それらを本発明の過程において用いることができる（例えば、国際特許出願WO 02/06992を参照せよ）。
【０１８８】
本発明の一つの実施例では、植物材料を、図1に示したような抽出過程に供している。この実施例によると、可能性のある抽出物A、B、およびCを作製するため、三つの基本的抽出過程が順番に行われている。
【０１８９】
本発明のその他の実施例では、抽出過程の数が多いものあるいは少ないものが考慮されている。例えば、代替の実施例では、植物材料を、図5に示したような抽出過程に供している。この実施例によると、植物材料を、二つの別個の抽出過程に供し、同時に二つの別個の、可能性のある抽出物Aを得ている。
【０１９０】
抽出過程の数に関わらず、各抽出過程の手続きは、固体植物材料を溶媒に接触させることを必然的に伴い、接触は、適切な配合の溶媒を用い、および当該固体植物材料が当該溶媒に適切に晒され当該植物材料に存在する阻害活性が当該溶媒により引き出されるように十分な長さの時間で行う。一般的に、抽出手続きは、約10分から約24時間の時間で、約4℃から約50℃の温度で、行われる。上述したように、抽出過程においてその他の時間および温度を用いてもよい。溶媒を植物材料と適切に接触させるには、懸濁液を振るのがよい。その後、液体分画を固体（不溶）分から分離し、二つの分画を作製する：液体分画（これが可能性のある抽出物である）と固体分画。液体分画と固体分画の分離は、当業者に既知である一つあるいはそれ以上の標準過程により、行うことができる。
【０１９１】
次いで、図1に示した実施例に従って、第二および第三の溶媒を用いて抽出過程を繰り返す。図1の溶媒A、BおよびCは、一般的に、別個のクラスの溶媒（例えば、水性、アルコール系および有機系）を表している。溶媒群は、例えば、極性から非極性の順序あるいは非極性から極性の順序のような、特定の順序で適用することができる。あるいはまた、溶媒群は、無作為の順序で適用することもできる。しかし、全ての場合において、後続の溶媒と接触させる前に、固体分は乾燥していなければならない。
【０１９２】
抽出過程で用いる植物材料は、植物全体であってもよいが、その葉、種子、根、茎、花、あるいはそれらの組み合わせ等から得られた一つあるいはそれ以上の独特の植物組織であってもよい。植物材料は、新鮮であっても、乾燥してあっても、あるいは凍結してあってもよい。必要であれば、抽出過程を促進する目的で、抽出過程の前に植物材料を処理してよい。一般的にそのような処置は、より広い面積を溶媒に晒すように、植物材料をなんらかの手段により断片化するものである。例えば、粉砕機あるいはその他の装置を用いて植物材料を機械的に潰すかあるいはスライスし、植物材料を小片あるいは粒子に断片化するか、あるいは液体窒素を用いて植物材料を凍結させ、その後潰すか断片化し、小片としてもよい。
【０１９３】
それぞれの抽出過程で使用する溶媒は、水性、アルコール系、または有機系、あるいはそれらの組み合わせであってよい。本発明の一つの実施例では、ある水性溶媒を用いて植物材料を抽出している。別の実施例では、pHが6から8である水性緩衝液を含む水性溶媒を抽出に使用しており、その抽出条件は、時間が30分から8時間、および温度が約4℃から約50℃である。
【０１９４】
本発明の代替の実施例では、エタノール、メタノール、1-プロパノール、1-ブタノール、2-プロパノール、2-ブタノール、2-メチル-1-プロパノール、2-メチル-2-プロパノール、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、もしくは1,3-ブチレングリコール等のアルコール溶媒、またはアルコール溶媒の組み合わせを用いて植物材料を抽出している。一つの実施例では、エタノールとメタノールとの組み合わせをアルコール溶媒として使用しており、この場合エタノール：メタノールの範囲は、約50：50から約85：15の間である。別の実施例では、グリコールをアルコール溶媒として使用している。さらなる実施例では、約10分から1時間の間、約4℃から約25℃の温度で、植物材料をアルコール溶媒と接触させている。
【０１９５】
代替の実施例では、一つのアルコール溶媒を一つの共溶媒（水性あるいは有機系であってよい）と組み合わせて使用し、植物材料を抽出している。一つの実施例では、エタノールと水との組み合わせを溶媒として使用しており、この場合エタノール：水の範囲は、約50：50および約85：15の間である。別の実施例では、グリコールと水の組み合わせを溶媒として使用しており、この場合グリコール：水の範囲は約95：5および約50：50の間である。
【０１９６】
代替の実施例では、ジエチルエーテル、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、または酢酸エチル等の有機溶媒を用いて、植物材料を抽出している。一つの実施例では、ジクロロメタンを溶媒として用い、当該溶媒を用いて1時間から24時間に渡り、植物材料を振動させた。
【０１９７】
可能性のある抽出物群が単離されたら、単離された抽出物群を、皮膚EP活性を阻害するその能力について、直接テストしてよく（適切な溶媒に溶解あるいは分散させた後）、あるいは、下記に説明し図2および図6にその概要を示した、さらなる手続きに供してもよい。例えば、可能性のある抽出物群を、プロテアーゼ活性を妨害する可能性のある脂肪酸類あるいはクロロフィル分を取り除く手続き、あるいはその他のアッセイに供してもよい。当業界で既知である多様な手続きを用いることができる。一つの実施例では、ヘキサン、ヘプタン、あるいは酢酸エチルなどの有機溶媒を使用する、一つあるいはそれ以上の付加的な分割段階が含まれている。必要に応じて、一つあるいはそれ以上の分割段階の前に、液体状である、可能性のある抽出物を濃縮し、適切な溶媒に溶解してもよい。
【０１９８】
本発明は、既知の大規模、中規模、小規模の抽出物調製方法群を含む、多様な規模を用いて、抽出過程を行うことができるということを考慮している。
【０１９９】
皮膚細胞外プロテアーゼ阻害活性の判断
抽出過程に続いて、可能性のある抽出物を、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEから成る群より選択された一つあるいはそれ以上の皮膚EPを阻害するその能力について、当業界で既知である多様なテクニックを用いてテストすることができ、それらのテクニックは本書に記載したものを含むがそれらに限定されるものではない。少なくとも一つの皮膚EPの活性を少なくとも20％減少させるそれらの植物抽出物を、さらにテストするために選択する。本発明の一つの実施例では、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも30％阻害する植物抽出物を選択する。別の実施例では、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも40％阻害する植物抽出物を選択する。別の実施例では、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち一つあるいはそれ以上の活性を少なくとも50％阻害する植物抽出物を選択する。
【０２００】
可能性のある抽出物が皮膚EPを阻害するか否かを判断するために、当該抽出物を、個々の皮膚EPについて、または、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびHLEのうち二つあるいはそれ以上を含むパネルについてテストすることができる。同様に、当該抽出物を個別にテストすることができ、または、当業界で既知であるような高スループットアッセイを使用して、複数の抽出物を同時にテストすることができる。複数の抽出物の同時テストにより、一定期間にテストできる抽出物の数が最大となり、従ってスクリーニング過程にかかる総時間が減少する。
【０２０１】
抽出物の細胞スクリーニング
続いて、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9およびHLEのうち一つあるいはそれ以上を阻害することができると同定されたそれらの抽出物を、皮膚細胞における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼすそれらの能力を調べるためにスクリーニングする。そのような細胞活性は、例えば、ECMの構造成分（すなわち、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、および／またはエラスチン）の破壊を弱めること；内皮細胞の移動を弱めること；コラーゲン産出を増加させること；UV誘導細胞外プロテアーゼ活性を弱めること；および／または線維芽細胞により生成された牽引力を弱めることを含む。上述したような標準方法を使用して、当該抽出物をテストしてもよい。
【０２０２】
さらなるテスト
本発明の皮膚用製剤に含むことに対する適合性を判断するために、上記過程によって同定された抽出物を、細胞毒性テスト、安定性テスト、生物学的利用率テスト等、その他の標準テストに供してもよい。例示的なテストを上述している。
【０２０３】
本書で説明している発明をよりよく理解させるため、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示目的のみであることを理解されたい。従って、これらの実施例は、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
【実施例】
【０２０４】
実施例1：ストレスを負荷した植物抽出物およびストレスを負荷していない植物抽出物（方法A）
任意の収穫前処理：生きている植物の地上部に、ガンマリノレン酸（6,9,12-オクタデカトリエン酸、Sigma L-2378）（ストレスG）あるいはアラキドン酸（5,8,11,14-エルカ酸、Sigma A-3925）（ストレスA）（0.125％（v/v）トリトンX-100を含む水を用いてM400μとした）を噴霧し、葉を完全に覆った。ストレス負荷後20時間から24時間後に、植物を収穫した。
【０２０５】
固相S1の収穫および任意の保存処理：ストレスを負荷した植物、またはストレスを負荷していない植物から、4グラムを超える葉、茎、果実、花、種子、あるいはその他の部分を収穫し、ドライアイスで即座に冷凍し、-20℃の冷凍庫にできるだけ早く移し、使用するまで保存した。植物材料は、-20℃で、阻害活性を失わせずに一年超保存することができる。一定状態を確保するため、温度をモニターした。
【０２０６】
ストレスを負荷した植物およびストレスを負荷していない植物を湿潤試料として回収し、-20℃で多様な期間保存し、三つの亜分画：水性、エタノール性、および有機性の分画を生成する過程に供した。継続サイクルで、以下の段階を用いて、完全な抽出過程を行った。植物試料の最初の5gを、攪拌器を用いて液体窒素中でホモジナイズした。得られた粉末を計量した。
【０２０７】
抽出過程1-水抽出：植物粉末の4.5グラム毎に、100 mM Tris、pH7.0の冷たい溶液12mlを加えた。得られた混合物を、ボルテックスミキサーで2分間完全に攪拌した。当該混合物を、氷上に30分間置き、10分毎にボルテックスミキサーで攪拌した。試料をCorex(tm) 30 ml遠心管内で、5分間4500rpmで遠心分離した。得られた上澄みを、Miracloth(tm)フィルターでろ過した後、15 ml試験管内で、デカンテーションに供した。この抽出物が、図1の可能性のある抽出物Aを表している。ペレット（固相S2と呼ぶ）を、エタノール抽出のため保存した。
【０２０８】
水性抽出物（可能性のある抽出物A）をさらに、そのEP阻害活性を判断するため精製した。当該の可能性のある抽出物Aを、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、当該水性抽出物を較正したSephadex G-25カラム（1×10cm）上で20mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.5緩衝液を溶離液として使用しクロマトグラフィー処理した。1500ダルトン（D）未満の分子量（MW）を有すると思われる化合物に対応する分画をプールし、精製水抽出物を構成した。
【０２０９】
実施例IIで説明したような、水性抽出物の阻害活性についての分析に先立って、非特異的な酵素リガンドを除去するために、当該抽出物を10％ゼラチン-セファロース（スウェーデン国ウプサラ市Pharmacia Biotech社）で処理した。1mLの抽出物に対し、ゼラチン-セファロース樹脂100μLをマイクロアレイチューブに加え、チューブ内の溶液を混合し、氷上に30分間置き、その後5,000rpmで5分間遠心分離した。上澄みを取り除き、直接アッセイに使用した。
【０２１０】
抽出過程II-アルコール抽出：先の水抽出から回収したペレット、固相S2に、冷エタノール：メタノール（85：15）12mlを加え、得られた混合物をボルテックスで2分間よく攪拌する。得られた混合物を氷上で30分冷やし、10分毎にボルテックスで攪拌する。当該試料をCorex(tm) 30 ml遠心管内で4,500rpmで5分間遠心分離した。得られた上澄みを、Miracloth(tm)フィルターでろ過した後、15 ml試験管内で、デカンテーションに供した。得られたペレット（固相S3と呼ぶ）を、後続の有機抽出のため保存した。この抽出物を、可能性のある抽出物Bとする。
【０２１１】
エタノール抽出物である、可能性のある抽出物Bを、酵素アッセイに先立って液液抽出法により精製した。この目的のため、エタノール抽出物1mlを真空下で蒸発させ、ジメチルスルホキシド（DMSO）150μlに溶解し、トリス緩衝液を含む1.5mlの最終量とした（最終濃度：Tris-HCl 20mM；pH7.5）。ヘキサン4mlをガラス試験管内のトリス相に加え、当該試験管をボルテックスで完全に混合し、その後二相性の液体を形成させる。有機相を除去し、抽出物を再び液液抽出法に供する。水相を除去し、10％ゼラチン-セファロース（スウェーデン国ウプサラ市Pharmacia Biotech社）で処理し、後続のアッセイを行う前に非特異的な酵素リガンドを除去した。抽出物1mlに、マイクロアレイ試験管内でゼラチン-セファロース樹脂100μLを加え、当該試験管を混合し、氷上に30分間置き、その後5,000rpmで5分間遠心分離した。実施例IIで説明しているように、上澄みを取り除き、直接アッセイに使用した。
【０２１２】
抽出過程III-有機抽出：先のエタノール抽出から回収したペレット、固相S3に、冷ジクロロメタン12mlを加え、得られた混合物をボルテックスで2分間よく攪拌する。得られた混合物を氷上で30分冷やし、10分毎にボルテックスで攪拌する。当該試料をCorex(tm) 30ml遠心管内で4,500rpmで5分間遠心分離した。得られた上澄みを、Miracloth(tm)フィルターでろ過した後、15mlガラス試験管内で、デカンテーションに供した。最終ペレットを廃棄した。有機溶媒を真空下で蒸発させ、当該相をジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解させた。この抽出物を、可能性のある抽出物Cとし、それを酵素アッセイによる分析に先立ちさらに固相抽出で精製した。
【０２１３】
可能性のある抽出物Cをアッセイに供するために、有機抽出物をDMSO：メタノール：トリス（20mM, pH 7.5）（10 :50 :40）の溶液（溶液A）で1：10に希釈した（すなわち、220μlの抽出物を、2.0mlの溶液Aに加えた）。ボルテックスで10秒間激しく攪拌した後、当該混合物に10秒間超音波処理を施した。溶解抽出物を、次に、固相の抽出プレート（ミズーリ州セントルイス市Sigma Chemical Co製Discovery SPE-96）に適用した。1mlのメタノールを用いてカラムを条件付けた後、溶液Aを用いてカラムを平衡化し、抽出試料をカラムに置いた。溶液Aを用いて溶出を完了させ（最終量2ml）、この分画を実施例IIで説明しているように直接アッセイに使用した。
【０２１４】
実施例II：In vitro酵素阻害アッセイ
ヒトMMP-1、ヒトMMP-2、ヒトMMP-3、ヒトMMP-9、および／またはヒト白血球エラスターゼ（HLE）に対する試料成分群の阻害活性を、蛍光基質またはFASCアッセイのいずれかを使用して判断した。
【０２１５】
蛍光ペプチド基質を用いたヒトMMP-1、-2、-3および -9活性の測定
MMP-1、-2、-9を、文献に説明されているように、I.M. Clark著"Matrix metalloproteinases protocols"（Humana Press版、2001）に記載されているプロトコルに基づいて、天然源（ヒト不死化細胞ライン：MMP-1については8505C（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、MMP-2についてはHT-1080（ヴァージニア州マナサス市ATCC社）、および、MMP-9についてはTHP-1（ヴァージニア州マナサス市ATCC社））から精製した。大腸菌［E. coli ］において組換えヒトMMP-3を過剰発現させ、Windsor LJ, Steele DL (2001), Methods Mol Biol 151:191-205に従って精製した。これらのプロテアーゼのタンパク質分解活性を、自動消光したペプチド基質の開裂に基づくアッセイによって評価した：（MMP-1、-2、および-9についてはMCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 TFA［Dpa=N-3-（2,4-ジニトロフェニル）-L-2,3-ジアミノプロピニル］）；および、MMP-3についてはMCA-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Lys（DNP）-NH2（DNP=2,4--ジニトロフェニル；Nva=L-ノルバリン）（カリフォルニア州サンディエゴ市Calbiochem社）。インタクトペプチドにおいて、DpaあるいはDNPがMCA蛍光を消光する。ペプチドの開裂により、蛍光MCA基が放出され、その後放出された蛍光MCA基を蛍光光度計（カリフォルニア州サニーベール市Molecular Devices社製Gemini XS）で定量した。アッセイを、ヒト精製プロテアーゼ（I.M. Clark: Matrix metalloproteinases protocols, Humana Press（2001））を含んだTNCZアッセイ緩衝液（20mM Tris-HCl；NaCl 150mM；CaCL2 5mM；ZnCl2 0.5mM；pH 7.5）を用いて行った。最初にDMSOに溶解した基質を、次にアッセイを行うためTNCZ緩衝液に再溶解させる。典型的なアッセイでは、10μlの精製酵素（1-50ng）と、5μlの溶解基質（最終濃度10μM）を混合し、75μlの最終量（TNCZを用いて完了させる）を得た。全てのアッセイを、96穴プレートで行い、基質を加えることにより反応を開始した。アッセイを20分間、40分間、および60分間測定した（励起325nm、放出392nm）。
【０２１６】
FASCアッセイを用いた、ヒトMMP-9またはヒト白血球エラスターゼ（HEL）活性の測定
ヒト白血球エラスターゼを、Calbiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ市）より入手した。ヒトMMP-9を、先に説明したように精製した。アッセイは、カナダ国特許番号2,189,486（1996）およびSt-Pierre et al., （Cytometry （1996）25:374-380に説明されている方法に基づいた。アッセイには、一般的に、5μlの精製酵素（1-100ng）、5μlの濃縮緩衝液（20mM Tris-HCl；NaCl 150mM；CaCL2 5mM；ZnCl2 0.5mM；pH 7.5）、および5μlのゼラチン-FITCビーズを用い、最終量100μlを得た。反応混合物を37℃で90分間インキュベートすることにより、アッセイを行った。混合物を0.5mlの20mM Tris、150mM NaCl；pH9.5緩衝液に移すことにより、反応を停止させた。この試験管を、カナダ国特許番号2,189,486に説明されているように、フローサイトメーター（オンタリオ州ミシソーガ市Beckman Coulter社Epics MCL）内で分析した。
【０２１７】
蛍光タンパク基質を用いた、HLE活性の測定
HLEを、Calbiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ市）から入手した。HLEの活性を、Alexa-488染料（オレゴン州ユージン市Molecular Probes社）で強く標識化したタンパク基質（ベータ-カゼイン）の蛍光の増加に基づいたアッセイにより測定した。当該基質は、染料で強く標識化した場合に、染料蛍光をほとんど消光する。基質の開裂の結果、蛍光が増加する。この蛍光の増加は蛍光分光光度計で測定することができるが、プロテアーゼ活性に比例していた。一般的に、10 μlの精製HLE（10-50ng）および10μLのベータ-カゼイン-Alexa488（100ng）をアッセイに供し、最終量を20mM TNCZ緩衝液を用いて75μlに調整した。蛍光を励起488nm／放出525nm波長で読み取った以外は、先に既に説明したように反応を行った。
【０２１８】
植物抽出物の阻害アッセイ
一般的アッセイに先立ち、実施例Iで説明したように調製した水性抽出物を、1：10のゼラチン-セファロース4B(tm)を用いて30分間プリインキュベーションに供し、蛍光消光を除去した。エタノール抽出物については、最初のヘキサン抽出を行い、試料を1：10のゼラチン-セファロース4B(tm)で処理し、消光を除去した。
【０２１９】
一般的な蛍光アッセイでは、酵素アッセイについて先に述べた濃度の10μlの精製酵素、5μlの溶解蛍光ペプチド基質あるいは10μlの溶解蛍光タンパク基質（最終濃度10μM）、およびテスト用の40μLの水性抽出物、エタノール抽出物、あるいは有機抽出物を混合し、75μlの最終量を得た（蛍光ペプチド基質アッセイについてはTNCZで完了させ、蛍光タンパク基質アッセイについては20mMクエン酸pH 3.3緩衝液で完了させた）。全てのアッセイを、96穴プレートで行い、反応は基質を加えることにより開始させた。アッセイを20分間、40分間、および60分間測定した（ペプチドについては、励起325nm、放出392nm；タンパク質については、励起488nm、放出525nm）。活性および阻害の値を、蛍光の増加から定量した。
【０２２０】
FASCアッセイを行うには、実施例Iに説明したように調製した処理済抽出物35 μl、先に説明したように調製した精製酵素5μl、濃縮緩衝溶液（TNCZ）5μl、およびゼラチン-FITCビーズ5μlを、一般的に用いた。アッセイの最初の段階で、阻害剤を酵素に結合させるため、ビーズを除いた反応を氷上で30分間インキュベートした。蛍光ビーズを加え、反応を37℃で90分間インキュベートした。0.5mlの20mM Tris、150mM NaCl；pH9.5緩衝液に混合物を移すことにより、反応を停止させた。この試験管を、カナダ国特許番号2,189,486（1996）に説明されているように、フローサイトメーター（オンタリオ州ミシソーガ市Beckman Coulter社Epics MCL）内で分析した。
【０２２１】
例示的なストレスを負荷した植物源（A：アラキドン酸およびG：ガンマリノレン酸）およびストレスを負荷していない（T）植物源からの水性抽出物（O）、アルコール性抽出物（R）および有機抽出物（S）について、阻害調査の結果を表1から5に示す。阻害は、当該抽出物不在時の基質分解と比較した、基質分解の阻害の百分率（％）として報告する。阻害百分率は、以下の式に従って計算した：
阻害百分率（％）=［EA-EB/EA］×100
式中、EAは植物抽出物不在時におけるプロテアーゼ活性であり、EBは当該抽出物の存在時におけるプロテアーゼ活性である。
【０２２２】
表1：植物抽出物によるMMP-1の阻害
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【０２２３】
表2：植物抽出物によるMMP-2の阻害
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【０２２４】
表3：植物抽出物によるMMP-3の阻害
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【０２２５】
表4：植物抽出物によるMMP-9の阻害
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【０２２６】
表5：植物抽出物によるHLEの阻害
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【０２２７】
実施例III：ある抽出物に発見された阻害活性の例示的精製
Agilent 1100システム（カリフォルニア州サンフェルナンド市）を用いて、HPLCにより抽出物を分離した。簡単に言えば、実施例Iで説明したように調製した粗抽出物100μLを、C18逆相カラム上に適用した（カリフォルニア州サンフェルナンド市Agilent社、Purospher RP-18 5μm、4.0x125mm（HP））。化合物の溶出を、10％から85％のアセトニトリルの線形勾配を用いて達成した。分画を回収し、蒸発させ、水性緩衝液中で再懸濁させ、既に説明したように特定の酵素に対するその阻害活性を再分析した。対象の分画（生物学的活性を示している）をさらなる分析および特徴付けのために、より大きな規模で再単離した。
【０２２８】
実施例IV：植物抽出物の調製（方法Ｂ）
方法Bの一般的な面について、図5に要約する。当該方法は、予備的な分析規模の抽出および第二のより大きな規模の抽出過程に従って、二つの主たる部分に分けることができる。
【０２２９】
1．分析規模の抽出―植物・抽出物の選択
商業的サプライャーの専用の温室栽培（物理的・化学的ストレスを伴ったあるいは伴わない）により、あるいは非栽培の天然源から採集することにより、処理済みの植物材料（葉、根、種子等）を得た。分析規模、あるいは大規模の抽出のいずれかにおいて使用するそれぞれの植物について、適切に同定し、標識を付けた試料を実験室に保存した。
【０２３０】
予備的分析規模および大規模の抽出の双方に関する抽出プロトコルを、概して図6に示す。
【０２３１】
回収した乾燥植物材料（2gから10g）をまず固液抽出法に供し、粗抽出物A(ミリグラム規模)を作製した。二つの異なる溶媒をテストした（エタノール・メタノール混合物、あるいはエタノール・水混合物）。次にヘキサンを用いて抽出物を脱脂し、ヒドロアルコール性あるいはアルコール性の抽出物Bおよびヘキサン抽出物Cを得た。抽出物Bを水で希釈した後、酢酸エチルを用いて分割し、水性抽出物Eおよび有機的抽出物Fを得た。
【０２３２】
得られた抽出物を採集し、一つあるいはそれ以上の標的プロテアーゼを阻害するそれらの能力、および、皮膚における一つあるいはそれ以上の細胞活性に影響を及ぼすそれらの能力について、以下に説明した方法を使用して評価した。
【０２３３】
結果の分析により、大規模抽出に用いる植物材料を選択することができる。選択過程には、純粋な活性化合物の単離に十分な量の抽出物を得るために必要な、植物の部分および乾燥材料の量に関する決定が含まれる。当該過程の選択にはまた、さらなる作業において使用される溶媒系（水性対アルコール性）および活性抽出物（B、E、あるいはF）の選択も含まれる。
【０２３４】
それぞれの段階において行われる分割により達成される濃度の上昇を評価し、虚偽の陽性結果を生む可能性のある材料（脂肪酸、クロロフィル）を除去し、さらなる抽出においてどの分画段階を使用すべきかを示すために、天然産物の古典的化学基（テルペン、アルカロイド、フェノール酸、ポリフェノール）に特異である異なった試薬を用いて、薄層クロマトグラフィー（TLC）により抽出物を分析する。
【０２３５】
2．大規模抽出―単離
大規模抽出過程を開始する前に、それぞれの新しい試料について、反復分析規模抽出を行い、生物学的活性を確認する。
【０２３６】
第一の段階は、分析規模調製で得られた結果に基づいて選択された汎用溶媒混合物を用いて、乾燥および粉末材料に由来する二次的代謝物を放出させることである。これは、ほとんどの天然化合物を同時に溶解させる同じ溶媒を用いて、連続した解離・ろ過操作により行うことができる。その後、セルロースのような不活性且つ不溶性の材料のほとんどを、ろ過により取り除く。乾燥および粉砕の条件を管理する（乾燥温度は45℃未満、粒子サイズ）。
【０２３７】
第二の段階は、対象のすべての天然産物を含有する複数グラムの混合物を得ることを目的とし、さらに望ましくない材料のほとんどを除去することを目的として、異なった極性の溶媒を用いて一連の液液低分解能抽出において望ましくない材料の部分を除去することである。
【０２３８】
抽出プロトコルを図6に示しているが、これは、分析調製で用いた手続きと本質的に同じである。乾燥および粉状の材料（大規模抽出では2kgから3kg）を、分析規模の結果（抽出の収量）に基づいて、エタノール・メタノール［85：15］v/v（a）あるいはエタノール・水［85：15］v/v（b）の混合物（3ｘ5 - 10L）を用い、2ｘ24時間から48時間にわたって室温で、繰り返し（解離・ろ過）抽出する。
【０２３９】
アルコール抽出物（a）の場合、組み合わせたアルコール抽出物（A）を減圧下で濃縮し、水（10％-15％）により希釈し、ヘキサン（あるいはヘプタン）により抽出し、ヘキサン抽出物（C）およびヒドロアルコール分画（B）を得る。その後、得られたものを濃縮し、エタノール（20％）により希釈し、酢酸エチルにより抽出し、水（E）および酢酸エチル（F）の抽出物を得る。
【０２４０】
ヒドロアルコール抽出物（b）の場合、組み合わせたアルコール抽出物（A）をヘキサンにより抽出し、ヘキサン抽出物（C）およびヒドロアルコール分画（B）を得る。その後、後者を残留水により濃縮し、エタノール（20％）により希釈し、酢酸エチルにより抽出し、水（E）および酢酸エチル（F）の抽出物を得る。
【０２４１】
すべての抽出物（A-F）を試料として採取し、処理回収およびアリコットを生物学的な評価（選択的酵素阻害）に供する。得られた結果を、分析規模セクションより得られた結果と比較し、その後選択した陽性抽出物を減圧下で乾燥するまで濃縮する。
【０２４２】
すべての抽出物をTLCにより分析し、分析規模抽出物と比較する。
【０２４３】
実施例V：ヒト皮膚モデルにおける、植物抽出物によるプロテアーゼ阻害
皮膚の細胞モデルを使用し、実施例Iで説明したように調製した水性およびエタノール性植物抽出物の、皮膚における潜在的阻害効果を判断した。ヒト皮膚線維芽細胞（Cascade Biologics社製、5ｘ104/ウェル）、タイプIコラーゲン（3mg/ml、Sigma）、および細胞培養液を12または24穴未処理Falconプレートにピペットで分注し、37℃で1時間インキュベートし、ゲル形成させた。続いて、ウェルに細胞培養液を加え、ゲルを5％CO2人工空気中において、37℃で一晩インキュベートした。ゲルを5日間インキュベートし、2日目と4日目に培地を交換し、ゲル中にコラーゲンおよびプロテアーゼを合成・分泌させて線維芽細胞を増殖させた。5日目、培地を取り除き、生体媒質中のドナーが一致したヒト表皮ケラチノサイト（Cascade Biologics社製、105細胞／ウェル）を、ゲル上にピペットでゆっくり分注した。7日目に培地を交換してさらに3日間インキュベートし、ゲルの表面上にケラチノサイトのコンフルエントな層を確立させた。8日目、培地を取り除き、被検植物抽出物を含有する細胞培養液をウェルに加え、5％CO2人工空気中において、37℃で6時間から24時間インキュベートした。続いてウェルからゲルを取り除き、PBSを用いて凍結融解サイクル3回で抽出し、遠心分離を行った。上述したような（実施例II）蛍光アッセイによって、上澄み中のタンパク質分解活性をアッセイした。
【０２４４】
結果を表6に示す。
【０２４５】
表6：ヒト皮膚モデルにおけるプロテアーゼの阻害
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【０２４６】
実施例VI：細胞移動に対する植物抽出物の効果
MMP-9、MMP-2、またはMMP-1を阻害する水性およびアルコール性の植物抽出物を、実施例Iに説明したように調製し、製品開発に適切であるような安定且つ非細胞毒性の分子を含有していることをさらにテストした。生理的条件を含む多様な条件下において、プロテアーゼ阻害の回復により、経時的に安定性を確認する。細胞毒性は、以下に示す細胞タイプを含む種々の細胞タイプで、抽出物をインキュベートすることにより確認する。
【０２４７】
細胞移動に対する有効なプロテアーゼ阻害剤である様々な植物抽出物の効果をテストするために、内皮細胞を使用するコード形成アッセイと併用して、細胞移動アッセイを行った。実験の詳細を以下に示す。植物抽出物の濃度を、プロテアーゼ阻害について定量したIC50濃度の関数で表し、それを1Xとする。従って、当該抽出物は、本書で説明しているアッセイの一つに従って測定した場合に、少なくとも一つの細胞外プロテアーゼの活性を少なくとも50％減少させることができる。この1X濃度は、当該抽出物の調製において使用した植物および溶媒によって異なり得る。1X水性抽出物の平均濃度は約1.6mg/mlであり、一方、1Xアルコール性抽出物の平均濃度は約4mg/mlである。以下で説明するアッセイ群でテストするそれぞれの抽出物につき、4つの異なる濃度（0.31X、0.62X、1.25X、および2.5X）を正副二通りに使用した。
【０２４８】
細胞移動アッセイ
PETメンブレン（穴サイズ8μm）により上部および底部セクションに区切られているマルチウェルシステム（Falcon 1185、24穴フォーマット）を用いて、移動を評価した。対象アッセイで使用している細胞に応じて、メンブレンを10μg/mlラット尾由来のコラーゲンで被覆し、乾燥させた。上部セクションで使用した溶液は全て、DMEM-0.1％BSA中で調製したが、底部セクションで使用した溶液は全て、10％ウシ胎児血清を含有するその他の媒体中で調製した。
【０２４９】
底部チェンバーにケモアトラクタント［chemo-attractant］としてEGM-2（700μl）を加えた。HUVECs（100μlの106細胞/ml）および適切な希釈率で植物抽出物を含有する緩衝液を、上部チェンバーに加えた（それぞれの植物抽出物のウェルをそれぞれの希釈率で正副用意した）。5％CO2雰囲気において、37℃で5時間インキュベートした後、メンブレンをPBSで洗浄し、固定染色した。メンブレンの上部を拭き取り、底部の無作為に選択した三つの領域を計数した。
【０２５０】
移動阻害百分率を、以下のように計算する：
[(A-B)/A]×100
式中、Aは対照ウェル内のフィールド当たりの平均細胞数であり、Bは処理ウェル内のフィールド当たりの平均細胞数である。
【０２５１】
コード形成アッセイ
マトリゲル（60μlの10mg/ml）を、96穴プレートの平面底部プレート（Costar 3096）に加え、5％CO2雰囲気において、37℃で30分間インキュベートした。HUVECおよび植物抽出物の混合物、あるいは陽性対照（フマギリンおよびGM6001）を、それぞれのウェルに加えた。EGM-2を用いてHUVECをml当たり2.5ｘ105 個の細胞を含む懸濁液として調製し、その後得られたHUVEC調製物500μlを、望ましい希釈度（2X）の植物抽出物あるいは対照薬剤500μlと混合し、200μlをそれぞれのウェルに加えた。それぞれの抽出物につき4種類の濃度を、正副でテストした。5％CO2雰囲気において、37℃で18時間から24時間インキュベートした後、当該細胞は移動し、コードを形成した（Rheum rhabarbaramからの抽出物を使用した結果を示す図4を参照せよ）。
【０２５２】
三つの無作為に選択した領域における細胞間結合の数を計数し、コード形成の阻害を以下のように計算する：
[(A-B)/A]×100
式中、Aは対照ウェル内のフィールド当たりの平均細胞間結合数であり、Bは処理ウェル内のフィールド当たりの平均細胞間結合数である。
上記テストの結果を表7に示す。
【０２５３】
表7：内皮細胞移動に対する例示的植物抽出物の効果
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【０２５４】
実施例VII：ヒト白血球エラスターゼ（HLE）を阻害する植物抽出物
植物抽出物を、実施例Iにおいて説明したように調製し、HLEを阻害するその能力を、実施例IIにおいて説明したようにテストした。
結果を表8に示す。
【０２５５】
表8：HLEの阻害
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【０２５６】
実施例VIII：植物抽出物の調製（方法C）
以下のプロトコルを用いて、以下の実施例（IXからXIV）においてテストする植物抽出物を調製した。
【０２５７】
それぞれの植物について、抽出を行う5グラムの乾燥植物材料をビーカーに入れ、十分な量の溶媒を加えて攪拌子で適度にかき混ぜた。この実施例において使用した溶媒は：ブチレングリコール（100％）、ブチレングリコール／水（50/50、v/v）、ブチレングリコール／水（20/80、v/v）；エタノール（100％）、エタノール／水（85/15、v/v）、エタノール／水（50/50、v/v）；水（100％）であった。
【０２５８】
それぞれの溶媒について、いくつかの異なる抽出時間を用い、室温で1時間、2時間、3時間、または4時間混合した後、懸濁液を遠心分離し、0.45ミクロンペーパーフィルターでろ過した。遠心分離し、ろ過したブチレングリコール混合物については、続いて120℃で溶媒を蒸発させ、残留物質を計量して各時点における抽出の収量を定量した。遠心分離し、ろ過したエタノール混合物については、各時点における抽出の収量を定量する目的で、減圧下、45℃未満の温度で溶媒を取り除いた。
【０２５９】
抽出物の酵素特性および生体特性を計測するために、4時間のブチレングリコールまたはエタノール混合物を、さらに処理することなくアッセイした。
【０２６０】
上記のプロトコルは、皮膚用製剤において用いられる抽出物を調製するのに適切である。ブチレングリコール抽出物は、例えば、局所塗布用の製剤に直接的に含むことができる。エタノール抽出物は、実施例XVにおいて説明するように、局所塗布用の製剤に組み込む前に一つあるいはそれ以上の付加的段階を経る場合がある。
【０２６１】
実施例IX：方法Cにより調製された植物抽出物のプロテアーゼ阻害 
実施例VIIIにおいて説明したように調製した植物抽出物を、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、および／またはHLEを阻害するそれらの能力について、上述したアッセイ（実施例II）を使用してテストした。
結果を表9に示す。
【０２６２】
表9：方法Cによって調製された植物抽出物による、プロテアーゼの阻害
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【０２６３】
実施例X：植物抽出物の細胞毒性テスト 
この実施例は、植物抽出物をその細胞毒性についてテストする方法を説明し、さらなる効用調査に適切な、非細胞毒性の濃度の抽出物の選択を可能にするものである。植物抽出物は、実施例VIIIにおいて説明したように調製した。
【０２６４】
本発明の抽出物の、考えられる増殖抑制効果を評価するために、正常なヒト皮膚線維芽細胞およびケラチノサイト（オレゴン州ポートランド市Cascade Biologics社）をテストした。後者のテストは、抽出物のある濃度に細胞を暴露することが、さらなる細胞アッセイに望ましくない効果をもたらさないことを確認するために行ったものである。本反応は96穴プレートにおいて測定した。線維芽細胞については5X103細胞/100μl/ウェル、ケラチノサイトについては8X103細胞/100μl/ウェルで、細胞を培地（Cascade Biologics社製、線維芽細胞はM106+LSGS、ケラチノサイトはM154+HKGS）に植えた。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で24時間インキュベートした。抽出物を得て、双方の培地において濃度2mg/ml（最終濃度2X）に希釈した。各細胞ラインについて4つの希釈液をテストした。各アッセイには、細胞の最大成長および生存率を反映させるための100μlの培地、ならびに、80％細胞毒性効果を得るための100ng/mlのダウノルビシンという対照を含めた。すべてのウェルを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で72時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルにAlamar Blue色素を加え1、Spectrafluor Plus（ノースカロライナ州ダラム市Tecan社）で蛍光性を読み取った。すべてのアッセイを正副四通りに行った。
【０２６５】
結果を表10に示す。図7は、シロバナシナガワハギ［Melilotus alba］およびセイヨウネズ［Juniperus communis］からの抽出物についての結果を表している。結果は、四通りの測定の平均を表したものである。
【０２６６】
表10：代表的な植物抽出物の細胞毒性
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【０２６７】
実施例XI：コラーゲン産出における植物抽出物の効果
この次の実施例は、例示的植物抽出物の、ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲンI産出を刺激する能力を実証するものである。アッセイにはヒト皮膚線維芽細胞（オレゴン州ポートランド市Cascade Biologics社）を用い、プロコラーゲンタイプI C-ペプチド（PIP）の放出を評価するTakara Biomedicals ELISAキット（ウィスコンシン州マディソン市Takara Mirus Bio社）を使用して、コラーゲン産出を刺激する当該植物抽出物の能力を測定した。PIPペプチドはコラーゲン三重らせんの形成中にプロコラーゲン分子から開裂するため、この遊離プロペプチドは、合成されたコラーゲン分子の数を化学量論的基準で示す。植物抽出物は実施例VIIIにおいて説明したように調製した。
【０２６８】
まず、完全M106（Cascade Biologics社M106+LSGS）を使用して、線維芽細胞を96穴プレートで成長させた。この培地を対照としても使用した。GM6001（カリフォルニア州テメクラ市Chemicon社）を、50μMの濃度で陽性対照として使用した。すべての抽出物および対照を、完全M106中で希釈した。植物抽出物は、表10に示すように、線維芽細胞の100％生存率を提供する濃度で使用した。完全M106培地中において、5X103 細胞／ウェルの濃度で細胞を96穴プレートに植えた。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で72時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を取り除き、200μlの試料をウェルに加えた（すべて正副二通り）。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で48時間インキュベートした。
【０２６９】
製造元（Takara Biomedicals社）が推奨するプロトコルに従って、ELISA（酵素免疫測定）を実行した。各ウェルから20μlの上澄みを使用した。標準緩衝液および停止液を新たに調製した。100μlの抗体-POD複合体を、プレコートした96穴プレートのウェルに加え、続いて20μlの標準液および試料を適切なウェルに加えた。プレートをゆっくり混合し、密閉して（蒸発を制限するため）、37℃で3時間インキュベートした。
【０２７０】
インキュベーション後、各ウェルをPBS緩衝液で4回洗浄した。過酸化水素およびテトラメチルベンジジン（TMBZ）を含有する100μlの基質溶液を各ウェルに加え、プレートを15分間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの1N H2SO4（停止液）を各ウェルに加えた。続いてプレートをゆっくり混合し、Spectrafluor Plusプレートリーダー（Tecan社）において450nmで吸収度を読み取った。読み取りは、停止液を追加して15分以内に行った。PBSおよび停止液を除き、使用したすべての溶液はキットに含まれていた。
【０２７１】
結果を表11に示す。図8は、様々な抽出物（A：50：50 v/v ブチレングリコール：水を溶媒として使用する抽出物；B：20：80 v/vブチレングリコール：水を溶媒として使用する抽出物）について、結果の抜粋を表している。対照（偽BU：H2Oおよび細胞単独）は、50μMの陽性対照GM6001と比較して最も低いコラーゲンI産出を示した。
【０２７２】
表11：代表的な植物抽出物によって刺激されたPIP産出の増加
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【０２７３】
実施例XII：植物抽出物による、皮膚収縮の阻害
以下の実施例は、実施例VIIIで説明したように調製した例示的な抽出物の、in vitro皮膚モデルにおいて皮膚収縮を阻害する能力を実証するものである。皮膚モデルは、コラーゲンIマトリクスに埋め込まれたヒト皮膚線維芽細胞を含み、線維芽細胞により生成された牽引力により生じる皮膚収縮のin vitro表現を提供する。部分的または永続的な皮膚収縮は、シワの形成においてその役割を果たすことができる。従って、このタイプの収縮を阻害することができる抽出物は、皮膚において皮膚非収縮老化防止効果を提供する可能性を有する。これらの抽出物は、過収縮により病的瘢痕化が観測される場合の、創傷治癒における潜在的用途も有する。
【０２７４】
ヒト皮膚線維芽細胞（オレゴン州ポートランド市Cascade Biologics社）において、皮膚収縮を阻害する例示的な植物抽出物の能力を評価した。細胞をコラーゲンIマトリクスに埋め込み、皮膚様環境を作成した。線維芽細胞を、80％コンフルエンスになるまで完全M106中で成長させた。浮遊性線維芽細胞密集コラーゲンゲルを24穴プレートにおいて調製した。500μlのゲル中に、2.5mg/mlのコラーゲンI（ラット尾由来、マサチューセッツ州ベッドフォード市BD Biosciences社）、M106 5X、NaOH 0.7N；1X105細胞、および、20％のウシ胎仔血清（FBS）（カナダ、ケベック州サンブリュノ市Wisent社）を含有する。混合物を、分配するまで氷上に置いた。皮膚様ゲルを、加湿5％CO2雰囲気において、37℃で1時間、重合させた。インキュベーション後、ゲルをウェルから剥離した。培地106を陰性対照として使用し、GM6001（カリフォルニア州テメクラ市Chemicon社）を50μMの濃度で陽性対照として使用した。完全培地106中において、すべての抽出物を非細胞毒性の濃度（すなわち、表10に示すような、線維芽細胞の100％生存率を提供する濃度）で調製した。最終濃度10％のFBSを各ウェルに加えた。プレートを、加湿5％CO2雰囲気において、37℃で最大7日間インキュベートした。すべてのアッセイを、正副二通りに行った。3日目から収縮の測定を開始した。収縮ゲルをデジタルで撮影し、ImageProソフトウェアを使用してゲル領域を計算した。
【０２７５】
結果を表12に示す。培地のみで処理した対照ゲルは、最も小さい領域を有し、対照の収縮を表す。GM6001は、完全ではないが、収縮の阻害を制限した。
【０２７６】
表12：代表的な植物抽出物による皮膚収縮の阻害
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【０２７７】
実施例XIII：サイトカイン放出に対する植物抽出物の効果
以下の実施例は、実施例VIIIにおいて説明したように調製した本発明の代表的な植物抽出物の、非刺激性挙動を実証するものである。ケラチノサイトを植物抽出物に暴露した後に放出されたインターロイキン-8（IL-8）の量は、以下で説明するように、当該抽出物に対して起こり得る、あらゆる刺激応答を定量化するために使用することができる。
【０２７８】
ヒト皮膚ケラチノサイト（オレゴン州ポートランド市Cascade Biologics社）において、Quantikine hIL-8 ELISAキット（ミネソタ州ミネアポリス市R&D Systems社）を使用してIL-8放出を評価した。まず、完全M154（Cascade Biologics社M154+HKGS）を使用して、ケラチノサイトを96穴プレートで成長させた。この培地を対照としても使用した。ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸（PMA）（オンタリオ州オークビル市Sigma-Aldrich Canada社）を、2.5μMの濃度で陽性対照として使用した。すべての被検植物抽出物および対照を、完全M154中で非細胞毒性の濃度（すなわち、表10に示すような、ケラチノサイトの100％生存率を提供する濃度）に希釈した。完全M154培地において、8ｘ103細胞/ウェルの濃度で、細胞を96穴プレートに植えた。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で48時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を取り除き、200μlの試料をウェルに加えた（すべて正副二通り）。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で48時間インキュベートした。
【０２７９】
製造元（R&D Systems社）が推奨するプロトコルに従って、ELISAを実行した。各ウェルの上澄み25μlを、25μlのR5DP 1X希釈緩衝液と混合した。R5DP 1X中で標準液を新たに調製した。100μlのアッセイ希釈液RD1-8を96穴プレートの各ウェルに加え、続いて50μlの標準液および試料を適切なウェルに加えた。プレートをゆっくり混合し、密閉して（蒸発を制限するため）、室温（RT°）で2時間インキュベートした。
【０２８０】
インキュベーション後、各ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。100μlの複合溶液を加え、RT°で1時間インキュベートした。このインキュベーションの後、各ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄した。過酸化水素およびテトラメチルベンジジン（TMBZ）を含有する200μlの基質溶液を各ウェルに加え、プレートを15分間インキュベートした。インキュベーション後、50μlの2N H2SO4（停止液）を各ウェルに加えた。続いてプレートをゆっくり混合し、Spectrafluor Plusプレートリーダー（Tecan社）において450nmで吸収度を読み取った。読み取りは、停止液を追加して15分以内に行った。用いたすべての溶液は、キットにおいて提供されたものである。
【０２８１】
上述のELISAは、IL-8の放出を評価するものである。IL-8の強い放出を引き起こす植物抽出物は、被検濃度において皮膚に刺激をもたらし得る。結果を表13に示す。図9は、様々な抽出物（A：50：50 v/vブチレングリコール：水を溶媒として使用する抽出物；B：20：80 v/vブチレングリコール：水を溶媒として使用する抽出物；C：100％水を溶媒として使用する抽出物；D：100％エタノールを溶媒として使用する抽出物）についての結果を表している。陰性対照（M154培地）が最も低いIL-8放出を示し、これが最小IL-8放出を表すと考えられる。PMAが強い炎症反応を誘導し、これが最高レベルのIL-8放出を表すと考えられる。被検抽出物のうちいくつかはIL-8放出を増加させたが、その増加はPMAにより誘導されたものと比較して小さかった。IL-8放出をわずかに増加させるそれらの抽出物は、より低濃度でアッセイすることができ、これにより、IL-8放出の量が相対的に減少すると思われる。上述したようなサイトカイン放出の評価により、さらなるin vivo調査用の植物抽出物の最大濃度を設定することが可能になる。
【０２８２】
表13：IL-8放出に対する代表的な植物抽出物の効果
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【０２８３】
実施例XIV：UV誘導タンパク質分解活性の阻害
以下の実施例は、例示的な植物抽出物の、日光暴露後のタンパク質分解損傷から皮膚を保護する可能性を実証するものである。植物抽出物は、実施例VIIIで説明したように調製した。
【０２８４】
まず、完全M154（Cascade Biologics社M154+HKGS）を2.5X104細胞/500μl/ウェルの濃度で使用して、ケラチノサイトを24穴プレートで成長させた。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で48時間インキュベートした。培地を取り除き、細胞をHBSSで2回洗浄した。液体を完全に取り除いた後、細胞に25J/cm2のUVA光を照射した。照射後、被検試料を500μl/ウェルで加えた。培地を陰性対照として使用した。50μM濃度のGM6001を陽性対照として使用した。すべての抽出物および対照を、完全M154中で非細胞毒性の濃度（すなわち、表10に示すような、ケラチノサイトの100％生存率を提供する濃度）に希釈した。プレートを、37℃、加湿5％CO2雰囲気で24時間インキュベートした。各ウェルの上澄みをアッセイ、または、使用するまで-80℃で保存した。MMP2/7内部消光ペプチド（Calbiochem社）を使用して、その全体的なタンパク質分解活性を調べるために、上澄み（60μl）をアッセイした。対照について正副四通りに行った以外は、すべてのアッセイを正副二通りに行った。
【０２８５】
結果を表14に示す。
【０２８６】
表14：代表的な植物抽出物による、UV誘導プロテアーゼ活性の阻害 
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【０２８７】
実施例XV：局所製剤用のエタノール性植物抽出物の調製
エタノールは化粧用製剤における溶媒として一般的に使用されるものではないため、実施例VIIIで説明したようにエタノール抽出によって調製された植物抽出物をさらに処理し、局所製剤に組み込むために調製する場合がある。例えば、エタノール抽出物は、標準プロトコルに従い、活性炭で処理して脱色することができる。エタノールを抽出物から取り除いてもよいし、または、脱色した抽出物および減少した抽出材料を、固相支持体上に、または、化粧用製剤により許容可能な液体溶媒中に、再懸濁してもよい。従って、抽出物、または脱色された抽出物は、溶媒のエタノール成分の一部、または全部を取り除くために、蒸発手続き（例えば、ロータリーエバポレーターまたはソックスレーを使用して）に供することができる。グリコール等の皮膚科学的に適切なアルコールを加え、結果として生じる溶液を、局所塗布に適切な担体に組み込んでもよい。抽出物の活性は、この付加的な手続きにおいて、一つあるいはいくつかの点で検証され得る。
【０２８８】
本明細書に参考として組み入れられている全ての特許、出版物（出版された特許出願を含む）、およびデータベースは、そのような特許、出版物、およびデータベースが具体的に個別に参考として組み入れられていると記載されたと同程度に、そのまま参考として組み入れられているものである。
【０２８９】
本発明はこのように説明されているが、同じものが多様に変更されてよいということは明白である。そのような変化は本発明の精神および範囲からの逸脱とみなされるべきでなく、そのような改変の全てが、以下の請求項の範囲内に含まれると意図されていることは、当業者には明白である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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