(57)【要約】本発明は、フラグメントの会合を駆動するために融合された相互作用ポリペプチドを必要とし、さらに、可溶性かつ安定であり、そしてそれらが融合されるポリペプチドの安定性を変えない蛍光タンパク質および発色団タンパク質に基づく、タンパク質の標識化および相互作用検出のシステムを提供する。１つの実施形態では、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１０、アミノ酸１９８〜２１４）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。第２の試験タンパク質Ｙは、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１１、アミノ酸２１５〜２３０）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。ＸとＹとが相互作用する場合、それらは、そのＧＦＰ鎖を接近させ、そしてＧＦＰアミノ酸１〜１９８（鎖１〜９）からなる第３のＧＦＰフラグメントとの補完によって検出される。
2008521447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのタンパク質ＸとＹとの相互作用を検出するためのアッセイであって、
（ａ）タンパク質Ｘのコード配列と融合した蛍光タンパク質の可溶性の第１マイクロドメインタグフラグメントのコード配列を含む第１のポリヌクレオチド構築物を適切な細胞において発現させる工程；
（ｂ）タンパク質Ｙのコード配列と融合した蛍光タンパク質の可溶性の第２マイクロドメインタグフラグメントのコード配列を含む第２のポリヌクレオチド構築物を該細胞において発現させる工程、または該コード配列によってコードされる融合タンパク質Ｙ−マイクロドメインタグを該細胞に導入する工程；
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のマイクロドメインタグフラグメントに補完的な可溶性アッセイフラグメントのコード配列を含む第３のポリヌクレオチド構築物を該細胞において発現させる工程、または該アッセイフラグメントを該細胞に導入する工程；
（ｄ）該細胞において蛍光を検出し、それによってタンパク質ＸとＹとの相互作用を検出する工程；
を包含し、選択された該２つのマイクロドメインタグフラグメントが、それに融合される相互作用タンパク質の非存在下において、該アッセイフラグメントと自己補完性でない、アッセイ。
【請求項２】
前記第１の可溶性マイクロドメインタグフラグメントは、単一β鎖ＧＦＰもしくはＧＦＰ様蛍光タンパク質またはその円順列変異体に対応し、前記第２の可溶性マイクロドメインタグは、該同じ蛍光タンパク質の隣接するβ鎖に対応し、そして前記アッセイフラグメントは、該同じ蛍光タンパク質の残りの９個のβ鎖に対応する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記第１の可溶性マイクロドメインタグフラグメントは、ＧＦＰのβ鎖ｓ１０もしくはＧＦＰ様蛍光タンパク質またはその円順列変異体に対応し、前記第２の可溶性マイクロドメインタグは、該同じ蛍光タンパク質のβ鎖ｓ１１に対応し、そして前記アッセイフラグメントは、該同じ蛍光タンパク質のβ鎖ｓ１−９に対応する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
タンパク質ＸおよびＹは、前記マイクロドメインタグフラグメントのＮ末端に融合される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記タンパク質ＸおよびＹは、リンカーポリペプチドを介して前記マイクロドメインタグフラグメントのＮ末端に融合される、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
タンパク質ＸおよびＹは、エフェクター分子の存在下においてのみ相互作用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記アッセイフラグメントは、化学的トランスフェクションによって前記細胞に導入される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記融合タンパク質Ｙ−マイクロドメインタグは、化学的トランスフェクションによって前記細胞に導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府によって支援された研究または開発の下でなされた発明に対する権利の陳述）
本発明は、米国エネルギー省によってＴｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに授与された、契約番号第Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６の下で政府援助によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＧＦＰおよびその多くの関連する蛍光タンパク質は、現在、薬剤をタグ化するタンパク質として広範に使用される（概説については、非特許文献１を参照のこと）。さらに、ＧＦＰは、末端に融合された試験タンパク質の可溶性レポーターとして用いられている（非特許文献２；「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」と題する特許文献１）。ＧＦＰ様タンパク質は、相同な、保存された１１のβ鎖「バレル」構造を共有する２５〜３０ｋＤａのポリペプチドの広範なファミリーである。このＧＦＰ様タンパク質ファミリーは、現在、種々のＡｎｔｈｏｚｏａ種およびＨｙｄｒｏｚｏａ種からクローニングされた約１００のメンバーを含み、そして赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質ならびに種々の非蛍光色素タンパク質を含む（Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、前述）。広範な種類の蛍光タンパク質標識アッセイおよび蛍光タンパク質標識キットが市販され利用可能であり、広範なスペクトルのＧＦＰのスペクトル的改変体、およびＤｓＲｅｄおよびその他の赤色蛍光タンパク質（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＧＦＰ様蛍光タンパク質を含む。
【０００３】
ＧＦＰフラグメント再構成システムがタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために主に説明されているが、いずれも、支援されない自己アセンブリを正しく折り畳まれた可溶性でありかつ蛍光性の再構成されたＧＦＰにすることができず、そして一般的なスプリットＧＦＰ折り畳みレポーターシステムは、これらのアプローチから出現していない。例えば、Ｇｈｏｓｈら、２０００は、ＧＦＰ構造のアミノ酸１〜１５７および１５８〜２３８に対応する２つのＧＦＰフラグメントが、個々のフラグメントが逆平行ロイシンジッパーを形成し得るコイルドコイル配列に融合されたとき、インビトロまたはＥ．ｃｏｌｉ中の同時発現により蛍光産物を生じ得たことを報告した（非特許文献３）。同様に、特許文献２は、逆平行ロイシンジッパーを形成し得、ＧＦＰ分子のスプリットフラグメントを接続し得る螺旋コイルの使用を記載している。この特許の明細書は、再構成が、ＧＦＰフラグメントに付着された補完性螺旋コイルの非存在下では生じないことを確立している。特に、この明細書は、ロイシンジッパー対を有さないＧＦＰフラグメントが「任意の緑色コロニーを示さず、従って、インビボおよびインビトロにおけるＧＦＰアセンブリを仲介するためのＮＺジッパーおよびＣＺロイシンジッパーの両方の存在の必要性を強調する」コントロール実験を記載している。
【０００４】
同様に、Ｈｕら、２００２は、相互作用タンパク質ｂＺＩＰおよびＲｅｌが、ＧＦＰの２つのフラグメントに融合されるとき、それらの相互作用によってＧＦＰ再構築を仲介し得ることを示した（非特許文献４）。Ｎａｇａｉら、２００１は、カルモジュリンおよびＭ１３に融合された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のフラグメントがカルシウムの存在下でＹＦＰの再構成を仲介し得たことを示した（非特許文献５）。このアプローチの改変例で、Ｏｚａｗａらは、カルモジュリンおよびＭ１３を、自己スプライシングインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）ポリペプチド配列を経由して２つのＧＦＰフラグメントに融合し、それによってカルシウムの存在下でＧＦＰフラグメントの共有結合再構成を仲介した（非特許文献６；非特許文献７）。これらの研究者の一人は、次いで、このスプライシングを基礎にしたＧＦＰ再構成システムの培養された哺乳動物細胞への適用を報告した（非特許文献８）。さらに最近、Ｚｈａｎｇら、２００４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで同時発現されるとき、Ｇｈｏｓｈら、２０００、前述の螺旋コイルスプリットＧＦＰシステムを用いてＧＦＰ（ならびにＹＦＰおよびＣＦＰ）蛍光を再構成し得たことを示し、そしてインビボにおける同時発現を確認することで、このシステムの有用性を示した（非特許文献９）。
【０００５】
前述のＧＦＰ再構成システムは、２つのスペクトル的に異なる蛍光タンパク質タグの使用よりも利点を提供するが、それらは、フラグメントのサイズ、および対応して乏しい折り畳み特徴（Ｇｈｏｓｈら、Ｈｕら、前述）、化学的連結工程の必要性（Ｏｚａｗａら、２００１、２００２、前出）、および検出可能であり、折り畳まれ、かつ蛍光性のＧＦＰ（Ｇｈｏｓｈら、２０００；Ｈｕら、２００１、Ｚｈａｎｇら、２００４、前出）を生成するための同時発現または同時折り畳みによって制限されている。乏しい折り畳み特徴は、フラグメントが同時に発現されるか、または一緒に同時に再折り畳みされる適用にこれらのフラグメントの使用を制限する。このようなフラグメントは、補完の前に個々のフラグメントの長期間の安定性および可溶性を必要とするインビトロアッセイには有用ではない。このようなスプリットタンパク質フラグメントが有用ではないような適用の例は、スプリットタンパク質対のメンバーでタグ化されたポリペプチドの相互作用の定量的分析、そして次いで補完フラグメントの添加によって検出されるポリペプチドの定量であろう。別の例は、タグ化ポリペプチドが同時に発現されないか、または相互作用が低分子エフェクター（例えば、薬物）の添加によって発現後に誘導される場合の、タンパク質相互作用の検出である。
【０００６】
理想的なタンパク質相互作用検出システムは、遺伝子によりコードされ、インビボおよびインビトロの両方で働き、高感度の分析信号を提供し、そして外部の化学的試薬または基質を必要としないであろう。特許文献３において、Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、２００２年８月６日は、検出されたタンパク質−タンパク質相互作用についての種々のスプリットタンパク質補完アッセイを記載する。しかし、指定されたスプリットタンパク質は、折り畳みが乏しく、そして主として不溶性である（ｇｅｌｓ  ｏｆ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、非特許文献３を参照のこと）。その出願において、指定されたＧＦＰのフラグメントもまた、折り畳みが乏しい。特許文献３において、Ｍｉｃｈｎｉｃｋは、スプリットタンパク質のフラグメントの折り畳みを改良するアプローチを記載し、そのスプリットタンパク質は、既知の相互作用ドメインに融合され、そしてそのスプリットタンパク質は、変異され、そしてライブラリーは、細胞内で同時発現し、かつ再構成されたスプリットタンパク質に関連した機能について選択される。ＤＨＦＲは、例示的な場合について使用される。しかし、特許請求の範囲の実施形態において使用される指定のＤＨＦＲフラグメントが、融合されたコイルドコイルを使用して再構築される場合に補完および酵素活性が可能であるにもかかわらず、別個に発現されるときに主として不溶性であるという事実は、補完フラグメントの同時発現に基づくこの指向性進化アプローチが可溶性かつ安定なフラグメントについて選択するために、十分にストリンジェントではないことを論じる。さらに、共有に係る同時係属中である米国特許出願第１０／９７３，６９３号（２００４年１０月２５日出願、Ｗａｌｄｏら）は、不溶性スプリット−ＧＦＰフラグメントの同時発現が補完をもたらし得るが、補完は、そのフラグメントが別個に発現される場合には生じないことを示す。係属中の米国特許出願第１０／９７３，６９３号において、Ｗａｌｄｏらは、スプリットタンパク質のフラグメントの逐次的な発現を使用する指向性進化が、スプリットタンパク質フラグメントのより可溶性で、安定なバージョンを選択するために使用され得ることをさらに示す。この逐次的な発現は、特許文献３（Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、２００２年８月６日）によって指定された同時発現に対して著しく異なる。最近、会合する前に凝集せず、かつタグ化ポリペプチドの可溶性を変化させないスプリット蛍光タンパク質タグ化システムが、記載されている（非特許文献１０）。しかし、そのフラグメントは、融合された相互作用タンパク質ドメインの必要性なくして自然に自己会合し得る。会合前に可溶性のままであり、そして融合された標的タンパク質の可溶性を変えず、そしてまた補完のための融合された相互作用ドメインに依存するスプリットＧＦＰフラグメントが必要であり、そして本発明によって取り扱われる。
【特許文献１】米国特許第６，４４８，０８７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７８０，５９９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４２８，９５１号明細書
【非特許文献１】Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、「ＧＦＰ−ｌｉｋｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｅｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ」、Ｋｅｒａｌａ、Ｉｎｄｉａ、２００３年、第１８章、ｐｐ．４０５−４３９
【非特許文献２】Ｗａｌｄｏら  １９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１７巻、ｐ．６９１〜６９５
【非特許文献３】Ｇｈｏｓｈら、「Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」、２０００年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２２巻、ｐ．５６５８〜５６５９
【非特許文献４】Ｈｕら、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｂＺＩＰ  ａｎｄ  Ｒｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２年、第９巻、ｐ．７８９〜７９８
【非特許文献５】Ｎａｇａｉら、「Ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｓｅｎｓｅ  Ｃａ２＋．」、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９８巻、ｐ．３１９７〜３２０２
【非特許文献６】Ｏｚａｗａら、「Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．」、２００１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻、ｐ．５１５１〜５１５７
【非特許文献７】Ｏｚａｗａら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ．」、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７３巻、ｐ．５８６６〜５８７４
【非特許文献８】Ｕｍｅｚａｗａ、２００３年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．、第３巻、ｐ．２２〜２８
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍａｒｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、２００４年、Ｃｅｌｌ、第１１９巻、ｐ．１３７〜１４４
【非特許文献１０】Ｃａｂａｎｔｏｕｓら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００４年、ＤＯＩ  １０．１０３８／Ｎｂｔ１０４４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、フラグメントの会合を駆動するために融合された相互作用ポリペプチドを必要とし、さらに、可溶性かつ安定であり、そしてそれらが融合されるポリペプチドの安定性を変えない蛍光タンパク質および発色団タンパク質に基づく、タンパク質の標識化および相互作用検出のシステムを提供する。本発明のシステムは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）由来のフラグメントの種々の組み合わせで例示され、これらは、インビトロおよびインビボの両方で複数のアッセイフォーマットでタンパク質相互作用を検出および定量するために用いられる。
【０００８】
１つの詳細な実施形態では、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１０、アミノ酸１９８〜２１４）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。第２の試験タンパク質Ｙは、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１１、アミノ酸２１５〜２３０）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。ＸとＹとが相互作用する場合、それらは、そのＧＦＰ鎖を接近させ、そしてＧＦＰアミノ酸１〜１９８（鎖１〜９）からなる第３のＧＦＰフラグメントとの補完によって検出される。ＧＦＰ鎖１０および１１がタンパク質ＸおよびＹの相互作用によって１つに保たれる場合、ＧＦＰ鎖１〜９との自発的な会合は、構造的補完、折り畳み、および付随するＧＦＰ蛍光を生じる。
【０００９】
このスプリット−ＧＦＰシステムは非常に単純で、外部試薬を必要とせず、相互作用するタグ化タンパク質の量に比例する高感度分析信号を提供し、融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、そしてインビボおよびインビトロの両方で働く。これらの能力を併せ持った他の現存するタンパク質タグ化および検出システムは存在しない。実施例、後述、に詳細に記載されるように、このスプリット−ＧＦＰシステムを用いて、マルチウェルプレートでタンパク質相互作用を定量し、そして生きている細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞）中でタンパク質発現および可溶性をモニタリングし得る。
【００１０】
本発明のこのスプリットＧＦＰシステムは、タンパク質を定量するため、タンパク質相互作用をアッセイするため、および特定の相互作用するポリペプチドまたはタンパク質の折り畳みおよび可溶性を改良することを狙う指向性進化ストラテジーの成功をモニタリングするためのレポーターアッセイとして特に有用であり、そして結合リガンドおよび標的を含むタンパク質−タンパク質相互作用の強度を操作するために特に有用である。さらに、本発明のこれらシステムは、特に高スループット薬物開発フォーマットにおいて、タンパク質の相互作用を阻害および／または促進する因子をアッセイするために用いられ得る。
【００１１】
折り畳みおよび再構成のために相互作用ドメインを必要とし、かつ可溶性でもあるレポータータンパク質のフラグメントを生成する方法がまた、提供される。これらの方法は、ＧＦＰの操作されたフラグメントの生成によって例示され、そして会合および折り畳みのために融合された相互作用ドメインを必要とする他のＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光タンパク質の可溶性フラグメントを生成するために用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
他であることが規定されなければ、本明細書で用いられる当該技術分野のすべての用語、表記およびその他の科学的用語法は、本発明が関係する当業者によって共通に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、共通して理解される意味をもつ用語は、本明細書中で明瞭さのため、および／または容易な参照のために定義され、そしてこのような定義を含めることは、当該技術分野で一般に理解されるものに対して実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中で説明され、または参照される技法および手順は、当業者によって従来の方法を用いて一般に良好に理解され、かつ共通に採用され、これには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．２００１）に記載された広く利用される分子クローニング方法などがある。認識されるように、市販され利用可能なキットおよび試薬の使用を含む手順は、他であることが注記されなければ、一般に、製造業者の規定したプロトコルおよび／またはパラメーターに従って実施される。
【００１３】
本明細書で用いられるとき、「蛍光タンパク質」は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの構造的改変体（すなわ  ち、円順列変異体（ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）、モノマーバージョン）、ＧＦＰの折り畳み改変体（すなわち、より可溶性のバージョン、超折り畳みバージョン）、ＧＦＰのスペクトル的改変体（すなわち、ＹＦＰ、ＣＦＰ）、およびＧＦＰ−様蛍光タンパク質（すなわち、ＤｓＲｅｄ）である。用語「ＧＦＰ−様蛍光タンパク質」は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａ蛍光タンパク質のメンバー、ならびにその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。用語「ＧＦＰ−様非蛍光タンパク質」および「ＧＦＰ−様発色団タンパク質」（または、単に、「発色団タンパク質」または「色素タンパク質」）は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａ発色団タンパク質およびＨｙｄｒｏｚｏａ発色団タンパク質、およびその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。ＧＦＰ−様タンパク質はすべて、共通の構造的および機能的特徴を共有し、制限されずに、分子状酸素以外に、アクセサリーコファクター、外部酵素触媒または基質を必要とすることなく、内部発色団を形成する能力を含む。
【００１４】
蛍光タンパク質の「改変体」は、「親」蛍光タンパク質に由来し、そして上記１１β−鎖バレル構造および内因性蛍光を保持し、そしてこのタンパク質の新規または改変された性質（すなわち、より大きな安定性、改良された可溶性、改良された折り畳み、放射または励起スペクトルにおけるシフト、マルチマーを形成する減少したまたは無くした能力など）を与え得るアミノ酸置換、欠失または挿入をもつ構造、ならびに改変されたＮ末端およびＣ末端を有する構造（すなわち、円順列変異体）を含むことが意図される。
【００１５】
レポーターポリペプチドを参照して用いられるとき、用語「補完性フラグメント」、または「補完フラグメント」は、個々には不活性であり（すなわち、レポーター表現型を発現しない）、ここで、補完フラグメントの結合が、レポーター活性を回復するポリペプチドのフラグメントをいう。２つ以上の蛍光（または発色団）タンパク質フラグメントを記載するために用いられるとき、用語「自己補完性」、「自己組織化」、および「自然に会合する」は、これらフラグメントが、これら個々のフラグメントが可溶性であるとき、インタクトな、蛍光（または発色団）タンパク質に再構成し得ることを意味する。
【００１６】
本明細書で用いられるとき、「ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２構造」は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）、ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ  Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢ  Ｃｌａｓｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質中、Ｏｒｍｏ＆Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎにより、ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２で開示されるＧＦＰ構造をいう。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）参照は、Ｉｄ  ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ著者：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢクラス：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質である（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質の結晶構造」、Ｓｉｅｃｎｃｅ  １９９６年９月６日；２７３（５２８０）：１３９２〜５；Ｙａｎｇら、「緑色蛍光タンパク質の分子構造」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６  １０月、１４（１０）：１２４６〜５１を参照のこと）。
【００１７】
「根２乗平均偏差（「ＲＭＳＤ」）」は、根２乗平均重ね合わせ残基をオングストロームでいう。この数は、２つの構造の最適重ね合わせ後、相当するＣ−α−原子間の２乗平均距離の平方根として算出される。
【００１８】
核酸の部分を参照して用いられるとき、用語「異質」は、核酸が本来互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、代表的には、新規な機能的核酸を作製するために整列される非関連遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からの蛍光タンパク質をコードする核酸、および別の供給源からのペプチド配列をコードする核酸を有して組換えにより発現される。同様に、異質タンパク質は、タンパク質が、元来、互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００１９】
用語「同一」または「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈においては、ＢＬＡＳＴ配列比較アルゴリズムもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに使用して測定するかまたは手作業による並置および視認によって測定するように、比較ウィンドウすなわち指定領域の全体にわたって最大の一致について比較および並置した場合に、特定の領域全体にわたって同じである２つ以上の配列もしくは部分配列を指すか、あるいは特定の領域全体にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドに関して特定の割合（すなわち、約７０％同一性、好ましくは、７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、または９５％同一性）を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。それゆえ、そのような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義はまた、試験配列の補完性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を指す。好ましくは、この同一性は、長さが少なくとも約２２アミノ酸もしくは少なくとも約２２ヌクレオチドである領域にわたって存在するか、またはより好ましくは、長さが３０アミノ酸、４０アミノ酸、もしくは５０アミノ酸〜１００アミノ酸または３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００２０】
配列比較に関して、代表的には、１つの配列が、参照配列の役割を果たし、この参照配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列が、コンピューター中に入力され、部分配列座標が、必要な場合には指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが、指定される。デフォルトプログラムパラメーターが、使用され得るか、または代替的パラメーターが、指定され得る。その後、その配列比較アルゴリズムは、上記プログラムパラメーターに基づいて、上記参照配列に対する上記試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００２１】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０から選択される連続位置数のうちのいずれか１つである部分に対する言及を包含し、その部分において、配列は、同じ連続位置数の参照配列に対して、それら２つの配列が最適に並置された後に比較され得る。比較のための配列の並置方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な並置は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）によって、または手作業による並置および視認（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）を参照のこと）によって、実施され得る。
【００２２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。これらのアルゴリズムは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、代表的には、本明細書中に記載されるデフォルトを用いて使用されて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントが決定される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開された状態で利用可  能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードと並置された場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近接（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）ワードスコアの閾値Ｔと呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致した一対の残基についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基についてのペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスが、上記累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、達成した最大値から量Ｘ減少した場合；１つ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速さを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００２３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似すると考えられる。
【００２４】
参照配列番号に言及する文脈における用語「最大一致によって決定される場合」とは、配列が、デフォルトパラメーターに設定されたＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、参照配列の長さ全体にわたって参照配列番号と最大限に並置されることを意味する。
【００２５】
用語「連結（する）」とは、本明細書中で使用される場合、物理的結合ならびに生物学的粒子（例えば、ファージ、細菌、酵母、または他の真核生物細胞）と共存することによって生じる結合を指す。
【００２６】
「物理的結合」とは、２つの分子を機能的に接続する（これは、「物理的に結合された」と呼ばれる）ための当該分野で公知の任意の方法を指し、これには、介在ドメインを含む組換え融合または介在ドメインを含まない組換え融合、インテイン媒介性融合、非共有結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合および共有結合）、水素結合；静電結合；ならびに高次構造結合（例えば、抗体−抗原結合、およびビオチン−アビジン結合）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「融合した」とは、共有結合による結合を指す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「リンカー」または「スペーサー」とは、２つの分子（蛍光結合リガンド、およびディスプレイタンパク質もしくはディスプレイ核酸）を接続してそれらの２つの分子を好ましい構成に配置する、分子または分子群を指す。
【００２９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物である、アミノ酸ポリマー；ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー；および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３０】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにその天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに、後に改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのようなアナログは、改変型Ｒ基を有する（例えば、ノルロイシン）かまたは改変型ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能する、化合物を指す。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書中では、その一般的に公知である３文字記号によってか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃａｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって、言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられている１文字記号によって言及され得る。
【００３２】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む核酸を包含する。そうではないと示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ以上（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；およびＣａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換可能に使用される。
【００３３】
「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のアミノ酸配列もしくは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指し、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一である配列を指す。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、所定の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、コドンＧＣＣ、コドンＧＣＧ、およびコドンＧＣＵは、すべて、アミノ酸であるアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるどの位置でも、その子ドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載される対応するコドンのうちのいずれかに変更され得る。そのような核酸バリエーション（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、「サイレントバリエーション」であり、これは、保存的に改変された改変形のうちの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、その核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションを記載する。当業者は、核酸中の各コドン（本来メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧと、本来トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一である分子を生じるように改変され得ることを、認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが、記載される各々の配列において暗示される。
【００３４】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における１つのアミノ酸または少数のアミノ酸を変化、付加、もしくは欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個別の置換、欠失、もしくは付加は、その変化が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えて存在し、これらの本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を排除しない。
【００３５】
以下の８つのグループの各々は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ），；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３６】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、種々の組織化レベルに関して記載され得る。この組織化の一般的考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチドにおける局所的に秩序立った３次元構造を指す。これらの構造は、一般的にはドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの部分であり、この部分は、そのポリペプチドの小型単位（ｃｏｍｐａｃｔ  ｕｎｉｔ）を形成する。ドメインは、代表的には、２５アミノ酸長〜約５００アミノ酸長である。代表的なドメインは、組織化の程度が少ない部分（例えば、一連のβ−シートおよびα−へリックス）から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成される三次元構造を指す。異方性項（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｔｅｒｍｓ）はまた、エネルギー項（ｅｎｅｒｇｙ  ｔｅｒｍ）としても公知である。
【００３７】
用語「単離された」および「精製された」とは、その天然状態において見出されるような通常付随する成分を実質的にも本質的にも含まない物質を指す。しかし、用語「単離された」とは、電気泳動ゲルまたは他の分離媒体において存在する成分を指すことは、意図されない。単離された成分は、そのような分離媒体、および別の適用における使用準備ができているかまたは新たな適用／環境において既に使用中である形態を、含まない。
【００３８】
（スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系）
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイは、スプリット−蛍光タンパク質系およびスプリット−発色団タンパク質系を利用し、それらは、一般に、共有に係る同時係属中である米国特許出願第１０／９７３，６９３号（２００４年１０月２５日出願、その全体が本明細書によって参考として援用される）に記載される。
【００３９】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントは、それらのフラグメントが使用されるべき特定のアッセイの環境において折り畳まれ得かつ可溶性であり得る。好ましい実施形態において、個々のフラグメントの折り畳み／溶解度が、試験され、そして代表的には、可溶性「タグ」フラグメントと可溶性「アッセイ」フラグメントを分離するために進化される。好ましい溶解度アッセイ適用において、上記タグフラグメントは、１個と３個との間の個数のβ鎖であり、最も好ましい適用  において、そのタグは、一本のβ鎖である。試験タンパク質が、このタグフラグメントに融合される。このタグフラグメントは、好ましくは、融合した試験タンパク質に対して実質的に変動性ではない。換言すると、その試験タンパク質単独の溶解度および折り畳みは、上記タグと融合した場合の試験タンパク質の溶解度および折り畳みと類似する。
【００４０】
スプリットＧＦＰ系を使用する実験結果（実施例２を参照のこと）に基づいて、溶解度アッセイにおける最適性能は、比較的大きなアッセイフラグメント（例えば、約８個〜約１０個連続するβ鎖）と、試験タンパク質が融合される比較的小さなタグフラグメント（例えば、約１個〜約３個連続するβ鎖）とを使用することによって、達成される。そのアッセイフラグメントは、可溶性であり、そしてタグフラグメント−試験タンパク質融合物にとって補完のために利用可能であり、そのタグフラグメントは、試験タンパク質の溶解度に対して非変動性である。理想的には、ほとんどの適用について、上記試験タンパク質単独の溶解度と、タグフラグメントと融合した状態の試験タンパク質の溶解度とは、ほぼ同じである。そのアッセイフラグメントは、理想的にはモノマーであり、そして自然に凝集することも誤折り畳みされることもない。
【００４１】
多くの適用において、非変動性タグフラグメントの使用が好ましいが、それにも関わらず、タグフラグメントは、蛍光と溶解度との間の実質的な比例性が存在する（しかし、必ずしも、正比例しない）限りには、試験タンパク質の溶解度に対して変動性であり得、そして溶解度スクリーニングアッセイにおいて有用なままである。いくつかの実施形態において、非変動性タグフラグメント（下記のサンドイッチ形式アッセイの説明を参照のこと）（例えば、目的は、高可溶性タンパク質をスクリーニングすることである）を使用することが、実際には、望ましくあり得る。この場合、非変動性タグフラグメントの使用は、すべてではないがほとんどの可溶性タンパク質またはタンパク質のバージョンに対して有効に選択され得る。また、そのような適用におけるアッセイフラグメントは、可溶性であるべきである。なぜなら、不溶性バージョンは、可溶性試験タンパク質−タグフラグメント融合物に対する補完のために利用可能ではないからである。
【００４２】
（タンパク質−タンパク質相互作用検出システム）
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用検出システムは、２以上の相互作用タンパク質または２以上の潜在的な相互作用タンパク質をタグ化する、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）のマイクロドメインを利用する。一般に、上記マイクロドメインは、上記蛍光タンパク質構造のうちの１以上の隣接するβ鎖に対応する。したがって、例えば、２つの既知の相互作用タンパク質（ＸおよびＹ）は、タグ化ポリペプチドのセットｓ１０−Ｘおよびｓ１１−Ｙ、Ｘ−ｓ１０およびＹ−ｓ１１などを産生するために、β鎖１０および１１に対応するＧＦＰマイクロドメインタグに融合され得る。上記融合ポリペプチドは、代表的に、ＤＮＡレベルで構築され、そしてそれらの融合ポリペプチドは、当業者によって一般に理解されるように、同時発現されても、別々に発現されてもよい。好ましい実施形態において、各マイクロドメインタグは、単一β鎖に実質的に対応する。
【００４３】
本発明の一般概念を示すために、以下は、ＧＦＰ  ｓ１−９に対応するアッセイフラグメントと一緒に、ｓ１０およびｓ１１に対応するＧＦＰマイクロドメインタグを利用する、単純な２タンパク質相互作用検出システムの記載である。これらの「タグ」マイクロドメインは、融合された相互作用タンパク質が相互作用する限り、そのマイクロドメインが補完アッセイフラグメント（ＧＦＰ  ｓ１−９）と自発的に自己補完しないように選択される。この単純な場合において、タンパク質ＸおよびＹは、相互作用することが公知である。タンパク質ＸおよびＹは、それぞれ、細胞中でｓ１０タグとの融合物およびｓ１１タグとの融合物として発現される。上記アッセイフラグメントは、細胞において発現されるか、または細胞にトランスフェクトされる。ＸとＹとの相互作用は、上記タグフラグメントを接近させ、このことは、上記アッセイフラグメントとの同時の相互作用に有利であり、この相互作用は、３つのＧＦＰフラグメントの間の自己補完をもたらし、上記ＧＦＰ分子を再構成し、次いで、そのＧＦＰ分子は、タンパク質ＸおよびＹが上記細胞中で相互作用したことを示すその特徴的な蛍光を提示する（図２６）。
【００４４】
この単純なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイは、特定の環境、異なる細胞、異なる物理的条件下、および他のタンパク質因子、薬剤、薬物などの存在下において、タンパク質ＸとＹとの相互作用を評価するために使用され得る。このようなアッセイは、ＸとＹとの間の相互作用をモジュレートする候補薬剤を単離することを目的とした高スループットスクリーニングの試みに、容易に適合可能である。例えば、上記システムは、タンパク質ＸとＹとの間の相互作用を妨げる薬剤についてのスクリーニングのために使用され得る。１つの特定のインビトロアッセイ実施形態において、種々の試験薬剤は、タグ化Ｘタンパク質およびタグ化Ｙタンパク質を発現する細胞に添加され得る。次いで上記細胞は、溶解されて、上記アッセイフラグメントと反応され得る。あるいは、上記アッセイフラグメントは、上記細胞内で発現され得るか、または当該分野において周知であるタンパク質トランスフェクション試薬（Ｃｈａｒｉｏｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して引き入れられ得る。ＸおよびＹが相互作用する場合、エントロピーは、アッセイフラグメントとの補完に有利であり、そして蛍光が、提示される。上記ＸとＹとの間の相互作用を妨げる薬剤は、このようなベースラインの蛍光と比較して減少した蛍光または検出可能な蛍光が無いことによって同定され得る。このようなアッセイは、高スループットスクリーニングに容易に適合可能であり、多数のウェルは、上記タグ化タンパク質を発現するように操作された細胞を含み、そして多くの異なる試験薬剤が、個々のウェルに添加され得る。
【００４５】
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの種々の実施形態が、想起され、それらのうちの数種は、以下で、実施例によって記載される。
【００４６】
本発明の別の局面は、他のタンパク質と相互作用するタンパク質を同定および単離するためのタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの使用に関する。種々の実施形態が、想起され、それらとしては、既知のタンパク質Ｙと相互作用する未知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイ、未知のタンパク質Ｙと相互作用する未知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイ、既知のタンパク質Ｙと相互作用する既知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイが挙げられるが、これらに限定されない（それらの相互作用は、既知ではなかった）。
【００４７】
本発明の別の局面は、改良された特性または規定された特性（例えば、他のタンパク質に対する、より高い親和性の結合）を有する既知の相互作用タンパク質の対の１つの改変体についてスクリーニングするために、タンパク質−タンパク質相互作用検出システムを利用する。例示の通り、タンパク質Ｙに結合する抗体Ｘは、結合の特異性または親和性を改良することを目的とした指向性進化ストラテジーに供され得る。簡単にいうと、その抗体の単鎖が、変異体のライブラリーとして発現され得、そして結合特性（例えば、結合親和性）について評価され得る。したがって、変異タンパク質Ｘのライブラリーは、ＧＦＰマイクロドメイン融合物（すなわち、Ｘ’−ｓ１０）として発現され、そしてそのライブラリーは、補完アッセイフラグメントｓ１−９の存在下において融合物Ｙ−ｓ１１と反応し得る。野生型Ｘ−ｓ１０が発現され、そして上記アッセイフラグメントの存在下においてＹ−ｓ１１と反応し得る場合に生成されるものと比較してより強い蛍光は、Ｘ’がＹに対してＸより強い親和性を有するという示唆を提供する。
【００４８】
関連した実施形態において、Ｘ’−ｓ１０は、野生型融合物Ｘ−ｓ１０と同時発現されても、野生型融合物Ｘ−ｓ１０の存在下において発現されてもよく、それらの両方は、アッセイフラグメントＧＦＰ  ｓ１−９の存在下においてＹ−ｓ１１との相互作用に関して競合し得る。色シフト変異体が、Ｘの変異体およびＸ’の変異体を区別するために使用され得、それらの変異体は、Ｙとの相互作用に関して他方に勝って競合する。例えば、ＧＦＰにおいて、鎖１０は、黄色シフトＧＦＰ改変体を産生するために、残基Ｔ２０３Ｙで変異され得る。したがって、例えば、タンパク質Ｘは、ＧＦＰ  ｓ１０  Ｔ２０３Ｙによってタグ化され得、そして変異タンパク質Ｘ’は、「緑色」ｓ１０  Ｔ２０３によってタグ化され得る。上記相互作用タンパク質は、ｓ１１によってタグ化される。上記３つのフラグメントは、１つの実施形態において、同じ細胞において同時発現され得る。ＸまたはＸ’のいずれもが、Ｙとの相互作用において、より効率的であり、それは、上記アッセイフラグメントとの補完複合体の一部を形成し、そうして再構成された蛍光タンパク質の色を決定する。したがって、この例示において、緑色蛍光は、Ｘ’がＹとの結合に関してＸに勝って競合するという示唆を提供するのに対して、黄色蛍光は、野生型Ｘがより良好な結合因子であったという示唆を提供する。このような競合結合アッセイは、より高い結合親和性を有するタンパク質の改変体（すなわち、抗体改変体、アンキリンドメイン融合物に基づく結合因子（Ｂｉｎｚら、２００４  Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５７５−５８２）など）についてのスクリーニングに生産的に使用され得る。
【００４９】
（３フラグメントのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイシステム）
本発明の１つの局面は、３フラグメント補完システムを利用するタンパク質−タンパク質相互作用アッセイシステムに関する。簡単にいうと、３フラグメントシステムにおいて、２つの相互作用タンパク質が、２つのＧＦＰフラグメントの各々との融合物として発現され、各ＧＦＰフラグメントは、１以上の隣接するβ鎖に対応する（すなわち、Ｘ−ｓ１０およびＹ−ｓ１１、ＸおよびＹは、相互作用タンパク質または潜在的な相互作用タンパク質である）。添加されるか、または発現される、Ｘ−ｓ１０構築物およびＹ−ｓ１１構築物において示されない上記蛍光タンパク質のβ鎖に対応するアッセイフラグメントの存在下での、宿主細胞における上記２つの融合物の同時発現は、上記３つのフラグメントの間に補完の機会を提供し、ＸおよびＹは、相互作用する。ＸとＹとの間の相互作用の非存在下において、上記３つのフラグメントは、補完しない。補完は、蛍光によって可視化される。したがって、このシステムは、Ｘと相互作用する未知のタンパク質Ｙを同定するために使用され得る。
【００５０】
上記システムはまた、タンパク質Ｘに対する改良された親和性を有するＹの操作された改変体をスクリーニングするために使用され得る。
【００５１】
上記システムはまた、ＸとＹとの間の相互作用を妨げる化学物質についてスクリーニングするために使用され得る。
【００５２】
反対に、上記システムは、ＸとＹとの間の相互作用に対する化学物質の妨害効果を回避し得るタンパク質Ｙについてスクリーニングするために使用され得る。
【００５３】
レポーター蛍光タンパク質およびレポーター発色団タンパク質は、自己補完して再構成型レポータータンパク質を形成可能な３つ（またはそれ以上の）個々のフラグメントへと分割され得る。サンドイッチ形式タンパク質検出アッセイの一実施形態において、その蛍光タンパク質または発色団タンパク質の２つのタグフラグメントは、試験タンパク質に融合される。これらのフラグメントは、一緒になって、第三フラグメントによって補完されて蛍光表現型または発色団表現型を再構成することが可能である。例えば、試験タンパク質は、ＧＦＰの２つの連続するβ鎖の間に挿入され得る（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１）。可溶性タンパク質の検出は、ＧＦＰ１−９による検出可能な補完によって達成される。この実施形態において、その３つのフラグメントの補完は、試験タンパク質を可溶性かつ全長であると同定し、これは、ｘに融合されたＧＦＰの２つのフラグメントが、ｘによって機能的に連結されることを示す。特に指向性進化ストラテジーの状況において、このアプローチは、試験タンパク質ｘが実際に全長でありかつインタクトであることを確実にし（一方、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１は、ＧＦＰ１−１０のみを補完し、ＧＦＰ１−９は補完しない）、試験タンパク質の短縮形または初期リボソーム結合部位を組み込んだバージョンまたはタンパク質分解したバージョンの出現を防ぐという利点を提供する。
【００５４】
より厳密な関連する溶解度アッセイ実施形態は、試験タンパク質に融合した２つのタグフラグメントを利用し、それらのフラグメントの各々は、独立した識別可能な第三補完アッセイフラグメントを用いて機能的に再構成することによって、独立して検出され得る。より具体的には、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１という融合物において、鎖１０は、円順列ＧＦＰ  １１−９Δ１０（円順列１１−１−２−３−４−５−６−７−８−９（１１と１とが連結されており、１０を欠いている。数字は、鎖を指す。図３を参照のこと））によって検出可能である。一方、鎖１１は、１−１０Δ１１（１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０（１１を欠いている））によって検出可能である。上記２つのタグを独立して同時に検出することは、１つの補完対または両方の補完対の色シフト改変体を利用することによって容易になり得る（すなわち、ＧＦＰ１１−９Δ１０が、シアン色改変体（Ｙ６６Ｗ）であり得、ＧＦＰ１−１０Δ１１が、黄色改変体（Ｔ２０３Ｙ）であり得る）。あるいは、それらのタグフラグメントは、別個のアミノ酸配列を有する複数の蛍光タンパク質から誘導され得、そして対応する適切なアッセイフラグメントを用いて検出され得る。例えば、ＧＦＰ由来の鎖１１は、試験タンパク質ＸのＮ末端をタグ化するために使用され得、ＧＦＰの鎖１−１０を用いて検出され得る。一方、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）由来の鎖１１は、同じ試験タンパク質ＸのＣ末端への融合物として同時に使用され得、そしてＤｓＲｅｄの鎖１−１０を用いて検出され得る。
【００５５】
代替的な実施形態は、試験タンパク質によって連結された２つの再構成されたＧＦＰの間で示されるＦＲＥＴを利用する。例えば、ＣＦＰ１１−９Δ１０：：１０−Ｘ−１１：：ＹＦＰ１−１０が、使用され得る。そのような構築物は、ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰに対して機能的に等価である。ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰは、ｘがインタクトである限りはＣＦＰドナーからＹＦＰアクセプターへのＦＲＥＴを示し、ｘが切断された場合にはＦＲＥＴを失い、近接状態からＣＦＰおよびＹＦＰを遊離させ、ＦＲＥＴの効率は、（１／ｒ６）（ｒは、ドナーとアクセプターとの間の距離である）に依存することが、以前に示されている。
【００５６】
（原核生物細胞培養物における適用および真核生物細胞培養物における適用）
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系が、事実上すべての細胞型（細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない）におけるアッセイに適用され得る。１つの限定事項は、ＧＦＰタンパク質およびＧＦＰ様タンパク質の発現は、高酸性環境（すなわち、ｐＨ＝４．０以下）では弱められることである。同様に、補完率は、一般的には、ｐＨ６．５以下の条件下では非効率的である（下記の実施例８を参照のこと）。
【００５７】
当業者によって認識されるように、タグフラグメントおよび／またはアッセイフラグメントを発現するために使用されるベクターは、そのベクターが存在する宿主細胞と適合性でなければならない。同様に、種々のプロモーター系が、利用可能であり、細胞型、株などとの適合性について選択されるべきである。コドン最適化技術が、周知であるような他の細胞において使用するために配列を適合するために使用され得る。
【００５８】
本発明の保管アッセイのために哺乳動物細胞を使用する場合、コドン最適化のための代替法は、化学的トランスフェクション試薬（例えば、最近記載された「チャリオット（ｃｈａｒｉｏｔ）」系（Ｍｏｒｒｉｓら、２００１、Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３〜１１７６））の使用である。そのＣｈａｒｉｏｔＴＭ試薬は、哺乳動物細胞の細胞質中にタンパク質を直接トランスフェクトするために使用され得る。従って、このアプローチは、インビボタンパク質検出アッセイのために有用である。このアッセイにおいて、そのアッセイフラグメントは、細胞によって遺伝子によりコードされる試験タンパク質−タグフラグメント融合物が発現する前または後のいずれかに、細胞中に導入され得る。
【００５９】
（改良されたタンパク質改変体を単離するための方法）
上記のタンパク質相互作用アッセイは、進化していない親タンパク質と比較して改善された特性を有するタンパク質改変体を単離することを目的とする指向性進化ストラテジーと組み合わせて、使用され得る。
【００６０】
変異型タンパク質改変体のライブラリーを作製するための当該分野で公知の任意の方法が、タグフラグメントとの融合物として発現され得る候補試験タンパク質を生成するために使用され得る。その標的タンパク質または標的ポリペプチドは、通常は、その核酸を変異させることによって変異される。変異させるための技術は、当該分野で周知である。これらの技術としては、エラープローンＰＣＲ、化学的変異誘発、およびカセット変異誘発などの技術が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、宿主細胞のミューテーター株が、変異頻度を増加するために使用され得る（ＧｒｅｅｎｅｒおよびＣａｌｌａｈａｎ（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２）。例えば、エラープローンＰＣＲ（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌを参照のこと）は、長い配列全体にわたってランダムに低レベルの点変異を導入するために、低忠実度ポリマー化条件を使用する。他の変異誘発方法としては、例えば、組換え（ＷＯ９８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３〜４６２（１９８５）；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（１９８７）における概説を参照のこと）；ホスホチオエート媒介性ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５〜８７８７（１９８５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３〜８１４（１９８８））；ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２（１９８５）およびＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）；ギャップ付き二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；ＫｒａｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８））；ならびにＦｒｉｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８））が挙げられる。さらなる方法としては、ポイントミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ  ３８：８７９〜８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用する変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３（１９８７））、欠失変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｎおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６））、制限選択および制限増幅（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５〜４２３（１９８６））、完全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９〜１３０１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１〜６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５）；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５）が挙げられる。変異誘発のためのキットが、市販されている（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。より最近のアプローチとしては、コドンベースの変異誘発が挙げられ、このアプローチにおいては、Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：７６〜８１に記載されるＲＩＤ方法によって例証されるように、コドン全体が置換され、それによって生じた変異体の多様性が増加する。
【００６１】
細胞ベースの発現系において、改変体を発現するクローンは、上記のインビボアッセイまたはインビトロアッセイを使用して、溶解度について迅速にスクリーニングされ得る。従って、インビボでの実施形態において、クローンのライブラリーが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製され、その各々のクローンは、第一独立誘導性プロモーターの制御下にタグフラグメントに融合した個々の改変体タンパク質をコードする発現可能構築物を保有する。その細胞は、第二の別個に誘導可能なプロモーターの制御下に、補完アッセイフラグメントをコードする発現可能な構築物を同時に保有するか、またはアッセイフラグメントポリペプチド自体を同時に保有する（上記のＭｏｒｒｉｓら（２００１）に記載されるようなタンパク質トランスフェクション方法によって導入される）。
【００６２】
あるインビボ実施形態において、細胞は、タグフラグメント−タンパク質改変体融合物を発現するように、そしてその後にその細胞において補完フラグメントを発現するように、誘導される。最も好ましい実施形態において、その融合物の発現は、不溶性融合物の凝集を可能にするために充分な時間の間（すなわち、１時間；下記の実施例４および実施例１０を参照のこと）抑制または停止され、その後、補完フラグメントの発現を誘導される。このアプローチのバリエーションにおいて、その細胞は、上記融合構築物のみを、好ましくは誘導性プロモーター／抑制性プロモーターの制御下に保有する。補完フラグメントは、タンパク質トランスフェクション方法論によって導入される。
【００６３】
種々のインビトロ実施形態が、可能である。一般的に、これらは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、改変体タンパク質−タグフラグメント融合物の発現と、その後の細胞溶解、および補完アッセイフラグメントポリペプチドとの反応を包含する。
【００６４】
（事前補完）
ＧＦＰフラグメントの補完の間の蛍光形成速度は、その発色団が、適切な発色団アミノ酸を保有するフラグメントにおいて予め形成されたＧＦＰのフラグメントを使用することによって、発色団の環化が全く生じていないフラグメントと比較して、大幅に増加され得る。簡単に述べると、発色団アミノ酸を保有する非蛍光性の事前補完されたＧＦＰフラグメントは、（１）そのフラグメントを、発色団アミノ酸を含まない補完フラグメントと混合すること；（２）補完反応および蛍光形成を完了させること；（３）それらのフラグメントを、例えば、化学的手段によって折り畳みを解いて、折り畳みを解かれた非蛍光ＧＦＰフラグメントを生成させること；（４）発色団アミノ酸を含むフラグメントを回収し、それを他のフラグメントから分離すること；（５）発色団アミノ酸を保有するフラグメントを再生することによって、形成され得る。このフラグメントは、たとえ環化発色団を含むが、実質的に非蛍光性のままである。なぜなら、このフラグメントは、非蛍光性であるように化学的手段または他の手段によって実質的に折り畳みを解かれており、補完フラグメントの非存在下では折り畳みを解かれたままであるからである。蛍光の迅速な回復は、発色団に関連する共有結合改変を生じる必要なく、単に、補完性の非発色団含有ＧＦＰフラグメントを再添加することによって得られる。このアプローチによると、遅い発色団環化反応が完了するので、補完の間の蛍光の形成は、補完フラグメントの結合速度と、折り畳まれたネイティブのβバレル構造の形成とによってのみ、制限される。
【００６５】
（スプリットタンパク質フラグメントの操作）
（可溶性自己補完性フラグメントを単離するための指向性進化ストラテジー）
本発明の別の局面は、フラグメントの指向性進化および連続誘導によって、理想的なスプリットタンパク質相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）を作製するための方法に関する。連続的な誘導の組み込みは、スプリットフラグメントの同時誘導を特定する既存の公開されたアプローチとは対照的である。簡単に述べると、連続誘導アプローチにおいて、フラグメント１が、一定に保たれ、そしてフラグメント２が、進化させられる。フラグメント１が一定に保たれてフラグメント２が進化させられる場合、フラグメント２は、まず発現され、その後、発現が停止される。そのフラグメントは、凝集させられるか、または可溶性のままであるようにされる。次に、フラグメント１が、発現される。両方のフラグメントが同時発現される場合、これは、擬陽性をもたらし得る。なぜなら、凝集の前に補完が生じ得るからである。連続発現は、真の陽性（すなわち、改変体）の選択をもたらす。最適なフラグメント２改変体の選択の後、この改変体は、一定に保たれ、その後、フラグメント１が進化させられる。このプロセスは、望ましいフラグメント溶解度が達成されるまで、さらなる連続誘導を使用して継続され得る。このアプローチを使用して、生じるフラグメントは、補完の前にそれ自体が可溶性であるように操作され得る。
【００６６】
（検出可能なタンパク質の溶解度変動の減弱）
可溶性フラグメントは、融合したパッセンジャードメイン（試験タンパク質）の溶解度に対するその変動効果を減少するようにさらに操作され得る。簡単に述べると、上記フラグメントに融合された場合には単独で発現された場合よりも溶解度が小さい試験タンパク質が、そのフラグメントを、融合物の溶解度と非融合物の溶解度とが同様であることによってその試験タンパク質の溶解度に対するそのフラグメントの効果を減少するように操作することを目的とする指向性進化アプローチにおいて、「おとり（ｂａｉｔ）」ドメインとして使用される。このストラテジーは、小さなＧＦＰフラグメントを最適化する際に使用され、融合されたパッセンジャータンパク質に対する変動効果が減弱した改変体を生じた（下記の実施例４を参照のこと）。このアプローチは、上記融合物の溶解度が単独で発現されたおとりタンパク質より低い適切なおとりタンパク質を使用して、同時かまたは連続してＧＦＰの１以上のフラグメントに適用され得る。
【００６７】
（キット）
本発明の別の局面は、上記の種々のアッセイを実施する際に有用なスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系を提供する。本発明のキットは、本発明のスプリット蛍光系およびスプリット発色団系の使用を容易にし得る。本発明のアッセイを実施するための種々の材料および試薬が、提供され得る。キットは、試薬を含み得、この試薬としては、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、細胞形質転換試薬および細胞トランスフェクション試薬、ポリペプチドを精製するための試薬および材料、タンパク質変性試薬およびタンパク質再折り畳み試薬、ならびに本発明のアッセイおよび他の方法を実行する際に有用な他の溶液または緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、コントロールサンプル；本発明のアッセイを較正する際に有用な材料；ならびにアッセイ反応が実施され得る容器、チューブ、マイクロタイタープレートなどを含み得る。キットは、容器中に包装され得、その容器は、そのキットの内容物を収容するための区画、そのアッセイを実施するための指示書などを含み得る。
【００６８】
例えば、キットは、本発明の１つ以上のスプリット蛍光タンパク質フラグメント、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドベクター、そのベクターを増殖するために適切な細菌細胞株、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする構築物で事前形質転換または安定にトランスフェクトされた細胞、ならびに発現された融合タンパク質の精製のための試薬を提供し得る。
【００６９】
本発明のタンパク質検出アッセイの実施を容易にするキットの一実施形態において、そのキットは、タグ蛍光タンパク質フラグメントまたはタグ発色団タンパク質フラグメント（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  Ｓ１０）のコード配列を含むレシピエント核酸ベクターを含み、これは、そのタグフラグメントコード配列のＮ末端にインフレームで試験タンパク質を挿入するためのマルチクローニング部位を含む。必要に応じて、この挿入部位の後には、下流タグ配列のコード配列とインフレームであるリンカーポリペプチドのコード配列が存在し得る。具体的な実施形態は、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドである。このプラスミドの操作は、実施例１において記載されており、このプラスミドは、図１において示されている。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの完全ヌクレオチド配列が、図１Ｂに示される。Ｘ−ｓ１０およびＹ−Ｓ１１は、別々に発現され得るか、または両方とも単一のポリシストロンから発現され得る。
【００７０】
これらのレシピエントまたは「タグベクター」は、適切な宿主細胞において試験タンパク質−タグ融合物を生成するために使用される。インビトロアッセイ実施形態において、このキットは、そのタグベクターによって発現される試験タンパク質−タグフラグメント融合物の相互作用を検出するために使用される、予め精製されたアッセイフラグメント（すなわち、ＧＦＰ１−９ポリペプチド）をさらに含む。インビボアッセイ実施形態において、このキットは、「アッセイベクター」をさらに含む。この「アッセイベクター」は、タグベクターと適合性であり、かつ独立して調節されるプロモーターの制御下にアッセイフラグメントをコードする。別のインビボアッセイ実施形態において、アッセイベクター（すなわち、誘導性プロモーターの制御下にＧＦＰ１−９をコードするベクター）を含む細胞が、適合性タグベクターとともにこのキットにおいて提供され、この適合性タグベクター中に試験タンパク質がクローン化され得る。この適合性タグベクターにおいて、発現は、別個に誘導可能なプロモーターによって制御される。このアッセイベクターを含む細胞は、タグベクターで形質転換され得、細胞蛍光が、モニタリングされ得る。
【００７１】
本発明のアッセイを較正するための材料が、提供され得る。一実施形態において、このキットは、融合タンパク質試薬として、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１に融合された精製された相互作用コイルドコイルを含む。別のキットにおいて、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢ  １２およびＦＲＢ（それらの相互作用がラパマイシンの添加によって誘導され得る２つのタンパク質）に融合される。
【００７２】
（蛍光タンパク質および発色団タンパク質）
本発明は、スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系の設計のための方法および原理を提供し、これは、本明細書において、タンパク質相互作用の検出およびタンパク質相互作用の定量化における使用のための最適なスプリットＧＦＰ系の作製および分子進化によって例証される。しかし、他のＧＦＰ様タンパク質が、本発明の実施において使用され得る。
【００７３】
ある蛍光タンパク質群は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびに多数のＧＦＰ改変体（例えば、シアン色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など（Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：９０６〜９１８））を包含する。代表的には、これらの改変体は、配列番号２（または配列番号８）と約８０％以上の配列同一性を共有する。これらの色シフトＧＦＰ改変体は、青色〜黄緑色の放出色、増加した明るさ、および光安定性を有する（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６７：５０９〜５４４）。そのような１つのＧＦＰ改変体（増強型黄色蛍光タンパク質と呼ばれる）は、５２９ｎｍにおいて発光極大を提示する。最近記載された別の改変体（金色改変体）は、トリプトファンの非天然改変体をシアン改変体に組み込むことによって作製された。これは、充分に赤色にシフトした５７４ｎｍの発光極大によって特徴付けられる（Ｂａｅら、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：１０７１〜１０８１）。
【００７４】
改変型励起スペクトルおよび発光スペクトルを有するさらにＧＦＰベースの改変体（Ｔｓｉｅｎら、米国特許出願第２００２０１２３１１３Ａ１号）、蛍光強度および温度許容性が増大したさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｔｈａｓｔｒｕｐら、米国特許出願第２００２０１０７３６Ａ１号；Ｂｊｏｒｎら、米国特許出願第２００２０１７７１８９Ａ１号）；および減少した酸素レベル下で発色団形成するさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｆｉｓｈｅｒ、米国特許第６，４１４，１１９号）もまた、記載されている。花虫綱のＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ  ｋｏｌｌｉｋｅｒｉ由来のＧＦＰもまた、記載されている（Ｗａｒｄら、米国特許出願第２００３００１３８４９号）。
【００７５】
さらに、花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）由来の１００種を超えるＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光色素タンパク質が、現在同定されている（概説について、Ｖｅｒｋｕｓｈａら、２００３、ＧＦＰ−ｌｉｋｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ．４０５〜４３９，Ｖ．Ｕｖｅｒｓｋｙ編，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｒｅａｌａ，Ｉｎｄｉａを参照のこと）。この群の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）タンパク質としては、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種のサンゴ由来の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）、および種々のＤｓＲｅｄ（例えば、ＤｅＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２）が挙げられる。ＤｓＲｅｄおよび他の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）蛍光タンパク質は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰに対してたった約２６％〜約３０％のアミノ酸配列同一性しか有さないが、主要なすべてのモチーフが保存されており、このことは、ＧＦＰの１１本鎖βバレル構造の形成を示す。ＤｓＲｅｄの結晶構造もまた、解明されており、この結晶構造は、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す。
【００７６】
長い波長の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの多数の改変体もまた、記載されている。例えば、発光スペクトルがさらに赤色にシフトしている最近記載されたＤｓＲｅｄ改変体が、本発明の実施において使用され得る（Ｗｉｅｈｌｅｒら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８７：３８４〜３８９；Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５８５〜１５８８；Ｂａｉｒｄら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１９８４〜１１９８９）。最近、ＤｓＲｅｄのモノマー改変体が、記載された（Ｃａｍｐｅｌｌら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：７８７７〜７８８２）。この改変体（「ｍＲＦＰ１」と呼ばれる）は、（３０時間かけて成熟する野生型ＤｓＲｅｄと比較して）急速に成熟し、残留緑色蛍光を有さず、他のＤｅＲｅｄ改変体よりも約２５ｎｍ長い励起波長および発光波長を有する。
【００７７】
多数の海洋生物由来の増加する多数の他の蛍光タンパク質が、最近記載されており、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋは、現在、多数のＧＦＰおよびＧＦＰ改変体の結晶構造、ならびに種々のＧＦＰアナログの結晶構造を列挙する。サンゴ、シーペン、ホヤ、およびイソギンチャクに由来する、ＧＦＰと類似すると推測される構造を有する関連蛍光タンパク質が、記載されており、それは、本発明のスプリット蛍光タンパク質系の生成において使用され得る（概説について、Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：３：９０６〜９１８を参照のこと）。
【００７８】
さらに、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｍａｊａｎｏ由来の蛍光タンパク質、Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、およびＣｌａｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質が、報告されている（Ｍａｔｚら、上記）。イシサンゴ種Ｔｒａｃｈｙｐｈｉｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉからクローニングされた蛍光タンパク質は、緑色光、黄色光、および青色光を発光すること、そしてＵＶ光に暴露されると緑色光発光を青色光発光へと変換することが、報告されている（Ａｎｄｏら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２６５１〜１２６５６）。イソギンチャク由来の最近記載された蛍光タンパク質としては、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた緑色蛍光タンパク質および橙色蛍光タンパク質（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１４０９１〜１４０９６）、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａの触手からクローニングされた天然の増強型緑色蛍光タンパク質（Ｈｏｎｇｂｉｎら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０１：８７９〜８８５）、およびＡｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた弱い赤色蛍光を示す概して非蛍光性の紫色色素タンパク質および近赤外シフト発光スペクトル（５９５ｎｍ）を示すその改変体（Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜２５８８２）が挙げられる。
【００７９】
イソギンチャクＥｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒから単離された最近記載された赤色蛍光タンパク質ＥｑＦＰ６１１は、独特の共平面トランス発色団を有する近赤外の非常に蛍光性のタンパク質である（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１６４６〜１１６５１）。ＥｑＦＰ６１１の結晶構造は、解明されており、これは、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｕｇｕｓｔ  ８，２００３；Ｍ３０７８９６２００）。
【００８０】
色素体特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質および蛍光特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質が、記載されている。そのような一群のサンゴ由来タンパク質（ポシロポリン）は、広範なスペクトル特徴および蛍光特徴を示す（ＤｏｖｅおよびＨｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，１９９９，ＰＣＴ出願ＷＯ００／４６２３３；Ｄｏｖｅら、２００１、Ｃｏｒａｌ  Ｒｅｅｆｓ  １９：１９７〜２０４）。最近、造礁サンゴＭｏｎｔｉｐｏｒａ  ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のポシロポリンＲｔｍｓ５の精製および結晶化が、記載されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、Ａｃａｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５９：５９７〜５９９）。Ｒｔｍｓ５は、色が深青色であるが、弱く蛍光する。しかし、Ｒｔｍｓ５ならびにＲｔｍｓ５に対して配列相同性を有する他の色素タンパク質は、単一アミノ酸置換を介して近赤外蛍光タンパク質へと相互変換され得ることが報告されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、上記；Ｂｕｌｉｎａら、２００２、ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：７；Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、上記）。
【００８１】
ポシロポリンに密接に関連する他の種々のサンゴ由来色素タンパク質もまた、公知である（例えば、Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜８２；Ｇｕｒｓｋａｙａら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０７：１６〜２０を参照のこと）。これらの色素タンパク質が、ＧＦＰおよび他の蛍光タンパク質の保存された１１本鎖βバレル構造を含む程度まで、これらの色素タンパク質は、本明細書中に記載されるように自己補完性フラグメントへと分割され得、そしてアッセイシステムにおいて使用され得る。
【００８２】
ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造から５オングストローム未満、しばしば３オングストローム未満または４オングストローム未満、好ましくは２オングストローム未満の根２乗平均偏差を有する構造を有する任意の蛍光タンパク質が、自己補完性フラグメントの開発において使用され得る。いくつかの場合において、蛍光タンパク質は、マルチマー形態で存在する。例えば、ＤｅＲｅｄは、テトラマーである（Ｃｏｔｌｅｔら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３９８０１４４０３）。当業者によって認識されるように、そのようなマルチマー蛍光タンパク質とＧＦＰ（モノマー）との間の構造偏差（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、その蛍光タンパク質の構造のモノマー単位に基づいて評価される。
【００８３】
当業者によって認識されるように、そのような蛍光タンパク質または色素タンパク質構造は、当該分野で周知の比較方法論を使用して同定され得る。そのタンパク質を同定する際に、ＭＭＤＢ  ＩＤ：５７４２構造に対する並置および比較における重要な特徴は、βバレル構造の保存（すなわち、代表的には、１１本のβ鎖を含むが、少なくとも１つの場合には、もっと少ないβ鎖を含む（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００（上記）を参照のこと）、ならびに二次構造エレメントの位相または結合順序（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｃｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｙａｎｇら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：５２８０，１３９２〜５；Ｙａｎｇら、１９９６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１２４６〜５１）である。代表的には、蛍光タンパク質とＧＦＰ構造との間の偏差のほとんどは、重要なβ鎖間の結合鎖またはリンカーの長さにある（例えば、Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４６２〜７中のｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＤｓＲｅｄ  ａｎｄ  ＧＦＰを参照のこと）。Ｙａｒｂｒｏｕｇｈらにおいて、ＧＦＰとＤｓＲｅｄとのアラインメントが、図示されている。立体図から、１１本鎖バレルが、この２つの構造の間で強く保存されていることが、明らかである。ｃ−α骨格が、１６９個のアミノ酸にわたって根２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）が１オングストローム以内に並置されるが、その配列同一性は、ＤｓＲｅｄとＧＦＰとを比較してたった２３％である。
【００８４】
構造比較において、比較される２つの構造は、当業者に周知のアルゴリズムを使用して、例えば、ＣＣＰ４プログラムソフトウェアパッケージ（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＡＬ  ＰＲＯＪＥＣＴ，ＮＵＭＢＥＲ  ４．１９９４，「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）を用いて並置される。このようなプログラムを使用するにあたって、ユーザーは、並置されるべき２つの構造のＰＤＢ座標ファイルを入力し、このプログラムは、２つの構造中の原子の位置における全体的な差異を最小にするために剛体変換（回転および並進）を用いて、並置された構造の原子の出力座標ファイルを生成する。各構造についての出力された並置座標は、別個に可視化されてもよいし、容易に入手可能な分子グラフィックプログラム（例えば、ＲＡＳＭＯＬ，ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＩＢＳ），Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，ｐ．３７４）またはＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ，Ｇｕｅｘ，ＮおよびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，１９９６  Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ａｎｄ  ＰＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  Ｑｕａｔｅｒｌｙ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ７７，ｐ．７７）による重ね合わせとして可視化されてもよい。
【００８５】
ＲＭＳＤを考慮する場合、このＲＭＳＤ値は、構造アラインメントの程度に応じて定められ、このサイズは、全体的な構造類似性の記述子としてＲＭＳＤを用いる場合に、考慮に入れられる。ＲＭＳＤのスケーリングの問題は、代表的には、特定の閾値内で並置されるアミノ酸ブロックを含めることによって処理される。特定の基準を満たす並置された配列の乱れていない（ｕｎｂｒｏｋｅｎ）ブロックが長いほど、その構造は、よりよく並置される。ＤｓＲｅｄの例において、ｃ−α炭素の１６４は、ＧＦＰの１Å内にあるように並置され得る。代表的には、当業者は、例えば、Ｄａｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９３，２３３，１２３−１３８に記載されるように、剛体変換に基づいて、２つの試験構造を並置し得るプログラムを選択し得る。ＤＡＬＩアルゴリズムの出力は、剛体変換を使用して、２つの構造間で重ね合わせられ得る配列ブロックである。閾値Ｚ＝２以上のＺスコアを有する領域は、類似していると報告される。このようなブロックの各々について、全体的なＲＭＳＤが報告される。
【００８６】
本発明において使用するための蛍光タンパク質または色素タンパク質のＲＭＳＤは、１１本のβ鎖内の配列の少なくとも８０％について５Å内である。好ましくは、ＲＭＳＤは、１１本のβ鎖（重ね合わせとして図示された２つの並置された構造の目視およびＤＡＬＩプログラム出力により報告された並置ブロックとの比較により決定されるβ鎖）内の配列の少なくとも９０％について２Å内である。当業者により認められるように、β鎖間のリンカーは、かなり変動し得、必ずしも構造間で重ね合わせできなくてもよい。
【００８７】
好ましい実施形態において、蛍光タンパク質または色素タンパク質は、このタンパク質と比較して折り畳み特性または溶解度が改善されている、このタンパク質の変異バージョン、またはこのタンパク質の改変体である。しばしば、このようなタンパク質は、例えば、ＷＯ０１２３６０２に記載されている方法および増大された折り畳みについて選択するための他の方法を用いて同定され得る。
【００８８】
例えば、増大した折り畳み特性を有する蛍光タンパク質を得るために、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる、「おとり」ペプチドまたは「ゲスト」ペプチドが、この蛍光タンパク質に連結され得る。このゲストペプチドは、挿入される場合に、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる任意のペプチドであり得る。変異蛍光タンパク質のライブラリーが作製される。このベイトペプチドは、蛍光タンパク質に挿入され、このタンパク質の蛍光の程度が、アッセイされる。おとりペプチドと親蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質と比較して増大した蛍光を示すクローンが、選択される（蛍光強度は、正確に折り畳まれた蛍光タンパク質の量を示す）。ゲストペプチドは、末端で蛍光タンパク質に連結されてもよいし、内部に挿入されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の実施において有用な、野生型蛍光タンパク質および変異蛍光タンパク質、ならびに野生型変異色素タンパク質および変異色素タンパク質は、極めて安定な「超折り畳み」改変体を生成するために、実験的に進化され得る。同時係属中の共有に係る米国特許出願第１０／４２３，６８８号（２００３年４月２４日出願、本明細書に参考として援用される）に記載される方法は、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、および任意の数の関連蛍光タンパク質ならびに色素タンパク質の指向性進化のために用いられ得る。このような超折り畳み改変体は、自己補完フラグメントに分割され得、このフラグメントをさらに進化させて、単独でまたは試験タンパク質に融合させた場合のこのフラグメントの溶解度特性を調節し得る。
【００９０】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントまたはスプリット色素タンパク質フラグメントの可溶性改変体および（試験タンパク質溶解度に対して）非変動性改変体の進化のための特定の方法は、小見出し「スプリットタンパク質フラグメント操作」（前出）にて提供される。
【実施例】
【００９１】
本発明の種々の局面が、さらに記載され、以下のいくつかの実施例により例示されるが、これらのうちのいずれも、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【００９２】
（実施例１：プラスミドｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲの構築）
市販のｔｅｔプロモーターＰＲＯ細菌発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、発現プラスミドとは別個の第２のプラスミド上に調節タンパク質ｔｅｔＲを有し、大規模なライブラリーの作製を非能率的にしている。この制限を克服するために、本発明者らは、標的タンパク質の発現を制御するｔｅｔプロモーターと、調節タンパク質ｔｅｔＲとを、テトラサイクリン誘導性プロモーターであるｔｅｔ、ｔｅｔプロモーター調節タンパク質ｔｅｔＲ、および選択可能な抗生物質マーカーであるＳｐｅｃＲを含む単一のプラスミド（抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を与える）上で組み合わせた。ＣｏｌＥ１複製起点は、このプラスミドが、ｐＴＥＴプラスミドを有する細胞内で、適合性の起点（例えば、ｐ１５起点）と共存することを可能にする。このことは、一方のタンパク質（例えば、ＧＦＰのフラグメントとタグ化されたタンパク質）がプラスミドから発現され、そして、もう一方のタンパク質（例えば、補完ＧＦＰアッセイフラグメント）が、第２のプラスミド（たとえば、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から発現されることを可能にする。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドは、図１Ａに図示され、このプラスミドの配列および遺伝的要素は、図１Ｂに示される。
【００９３】
ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドを、市販のｐＰＲＯＴｅｔ．６×ＨＮベクター、ｐＰＲＯＬＡＲベクター、およびＢＬ２１−ＰＲＯ株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により保有される自己複製プラスミドからの要素を組み合わせる、オーバーラップＰＣＲにより操作した。クロラムフェニコール耐性遺伝子を、ＢＬ２１−ＰＲＯ株により保有される自己複製プラスミドからクローニングしたスペクチノマイシン耐性マーカーで置き換え、ｐＰＲＯＬＡＲベクターのカナマイシン耐性マーカーのプロモーターの制御下においた。本発明者らは、ＢＬ２１−ＰＲＯ株から単離したスペクチノマイシン耐性の自己複製プラスミドに由来するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タンパク質を、Ｔ０転写終結配列の上流にクローニングした。翻訳されたｔｅｔＲの量は、ＳａｃＩの下流にある弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列により調節する。このＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、小さな縮重ライブラリーからＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏの改変体を選択して、無水テトラサイクリンの添加後の漏出を最小にし、そして誘導を最大にすることによって操作される（下記を参照のこと）。市販のバージョンに存在するＳｐｅＩ制限部位を機能しないようにした（ｓｉｌｅｎｃｅ）。この新しいプラスミド「ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ」を、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩの制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、ＧＦＰ  Ｓ１１スプリットＧＦＰクローニングカセットを得た。この得られたクローニング部位の構造は、Ｎｃｏ−１：：６ＨＩＳ：：トロンビン切断部位：：Ｎｄｅ−１：：フレームシフトスタッファー（ｆｒａｍｅ  ｓｈｉｆｔ  ｓｔｕｆｆｅｒ）：：ＢａｍＨＩ：（ＧＧＧＳ）：ＳｐｅＩ：：ＧＦＰ  Ｓ１１（ＴＡＡ終止）：：ＫｐｎＩである。クローニングカセットのセンス鎖は、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩに隣接している：
【００９４】
【化１】
2008521447.tif 000003
【００９５】
フレームシフトスタッファーは、再連結したベクターによるバックグラウンド発現を避けるために、好ましくは、ＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位の間に加える。
フレームシフトスタッファーの例１：ＦＳ０
【００９６】
【化２】
2008521447.tif 000004
【００９７】
フレームシフトスタッファーの例２：ＦＳ１
【００９８】
【化３】
2008521447.tif 000005
【００９９】
Ｃ末端スプリットタンパク質フラグメント（例えば、ＧＦＰ鎖１１またはＧＦＰ鎖１０〜１１）を、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、制限部位ＳｐｅＩとＫｐｎＩとの間にクローニングし、隣接制限部位および所望のフラグメントのコード配列を提供する。このフラグメントはまた、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ（当該分野で周知の方法）を使用して、鋳型ＤＮＡ供給源および組込んだ制限部位から増幅され得る。完成したＮｃｏＩ／ＫｐｎＩカセットが、目的のベクター内に、適切な制限部位を操作することによって、他の発現ベクターまたは発現システム（例えば、ｐＥＴベクター）に移され得ること、および、他の制限部位が採用され得ることは、当業者に明らかである。
【０１００】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から単離したプラスミドを使用して、ｔｅｔＲ遺伝子を増幅した。遺伝子全体の増幅は、この遺伝子の配列の５’特異的プライマーおよび３’特異的プライマーを使用することにより認識した。センスプライマーは、ＳａｃＩ制限部位、およびその後に続く、ｔｅｔプロモーターの制御下に組換えタンパク質の最適な抑制／誘導のために最適化されたＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含んだ（この実施例、下記を参照のこと）。下流のプライマーは、ＰＲＯＴｅｔプラスミドのＴ０転写終結配列に相同な領域を含んだ。得られたＰＣＲ産物を、Ｔ０終結アンプリコンと組み立てて、最終産物を、当該分野で周知の方法によるＰＣＲ媒介性部位指向変異誘発によって、共通の制限部位を機能しないようにすることによって予め改変された、ＰＲＯＴｅｔＴＭ６×ＨＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＳａｃＩ／ＳｐｅＩ制限部位を介してクローニングした。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、以下の遺伝子特異的なプライマーを使用して、ＢＬ２１  ＤＥ３  ＰＲＯから単離したプラスミドから増幅した：
【０１０１】
【化４】
2008521447.tif 000006
【０１０２】
Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーは、ｐＰＲＯＬａｒベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのカナマイシンプロモーターの配列を含み、Ｐ３プライマーおよびＰ４プライマーは、カナマイシン部位の末端とＳａｃＩとの間に接合部を含んだ。完成したカセットを、ＡａｔＩＩ／ＳａｃＩ制限部位を介して、新規ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドに移動させた。
【０１０３】
【化５】
2008521447.tif 000007
【０１０４】
を、重なるプライマーから操作し、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを介して、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドにクローニングして、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ１プラスミドおよびｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ２プラスミドを得た。ｔｅｔＲタンパク質の翻訳を制御するＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を、変異誘発および選択により最適化した。簡単に述べると、折り畳みレポーターＧＦＰ遺伝子を、ＤＨ１０Ｂ株に形質転換されたスタッファーｖ１  ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩにクローニングした。ｔｅｔＲ遺伝子を、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列の４つのヌクレオチドについての縮重プライマーを用いて増幅し、このカセットを、ＧＦＰ含有ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ受容ベクターのＳａｃＩ／ＳｐｅＩにクローニングした。得られたライブラリーを、ＢＬ２１  ＤＥ３株に形質転換した。最適な改変体を、誘導率（誘導後の細胞のＧＦＰ蛍光を、誘導前の細胞のＧＦＰ蛍光で割ったもの）を計算し、０．２５μｇ／ｍｌの無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を添加した際の最大誘導率を有する改変体を選択することによってスクリーニングした（表１）。最大の誘導率を示す最適なｔｅｔＲ配列のためのＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、ＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＧ［配列番号３２］である。
【０１０５】
【表１】
2008521447.tif 000008
【０１０６】
（実施例２：スプリットＧＦＰの実現可能な対の発見）
図２に概説されたスプリットＧＦＰタンパク質のタグ化および検出のスキームを達成するために、本発明者らは、まず、折り畳みレポーターＧＦＰ（変異Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａを有するもの（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、１９９６）、変異Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔを有するもの（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら、１９９７））、または、格別に安定な「超折り畳み」ＧＦＰ（折り畳みレポーターＧＦＰ変異、ならびにＳ３０Ｒ、Ｙ３９Ｎ、Ｎ１０５Ｔ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１ＶおよびＡ２０６Ｖを含む）のいずれかに由来するフラグメントのいくつかの対を試験した。本発明者らは、アミノ酸１−１４５＋１４５−２３８、１−１５５＋１５６−２３８、１−１７１＋１７１−２３８、１−１９５＋１９６−２３８、１−２１４＋２１４−２３８を含む、数種類のＧＦＰフラグメントの対を、Ｅ．ｃｏｌｉ中の適合性プラスミド上に別々に、共発現させた。接合点は、β鎖間のループまたはターンに対応する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８；Ｂａｉｒｄ，Ｚａｃｈａｒｉａｓら  １９９９）（図３を参照のこと）。超折り畳みレポーターＧＦＰからのフラグメント対は、一貫して、折り畳みレポーターＧＦＰからの同じ対よりもかなり明るいコロニーを生じた。例えば、１５６および１７２における超折り畳みＧＦＰフラグメントは、折り畳みレポーターＧＦＰに由来するフラグメントよりも明るかった（図４を参照のこと）。本発明者らの目的は、タンパク質タグとして使用するための１つのフラグメントのサイズを最小にすることであり、従って、本発明者らは、最小のフラグメント（１−２１４＋２１４−２３８）を有する実現可能な対に焦点を当てた。タグ化ドメインのサイズをさらに減らすために、本発明者らはまた、１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）を２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１）との補完性について試験し、小さなフラグメントから無秩序な残基２３１−２３８（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）を排除した。表２は、野生型および操作した変異体を含むＧＦＰ  Ｓ１１構築物の配列を示す。
【０１０７】
【表２】
2008521447.tif 000009
【０１０８】
適合性の起点を有するｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からの超折り畳みＧＦＰフラグメント１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）および２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１野生型）の共発現は、蛍光のＥｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを生じた（図５、挿入部分）。対応する折り畳みレポーターＧＦＰフラグメントでは、検出可能な補完は起こらなかった（図５、挿入部分）。超折り畳みＧＦＰ  １−１０は、不溶性であったが、再び折り畳まれた封入体（実施例９、下記を参照のこと）を、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍに由来する可溶性亜硫酸レダクターゼ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）と共にインキュベートすると、Ｃ末端が野生型ＧＦＰであるＳ１１野生型とタグ化して、融合タンパク質亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を生じ、時間依存的な蛍光の増加を生じた（図５、グラフ）。
【０１０９】
（実施例３：ＧＦＰアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０の操作）
本発明者らは、ＤＮＡシャッフリングにより超折り畳みＧＦＰ  １−１０を向上し（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）、その可溶性を向上させ、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１によるその補完を増加させた。超折り畳みＧＦＰ  １−１０のＰＣＲアンプリコンを、出版されたプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いる、ＤＮＡ断片化およびシャッフリングに供した。ＧＦＰ  １−１０  ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドを、ｐＰＲＯＴＥＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上に亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型タグ化タンパク質を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ発現株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に形質転換した。この発現ライブラリーを、１．０ＯＤ６００ｎｍの凍結した２０％グリセロール／Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ストックの２つの段階４００倍希釈を使用して、ニトロセルロース膜の上にプレーティングした。３７℃にて一晩増殖させた後、膜を、培地１ｍｌあたり５０μｇカナマイシンおよび３５μｇクロラムフェニコール、および５０μｇスペクチノマイシンを含有するＬＢ／Ａｇａｒプレートに移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを足して３７℃にて３時間おき、次いで、上記の抗体＋６００ｎｇ／ｍｌ無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を含有する新しいプレートの上に移動させた。最も迅速な蛍光の発色を示すクローンをピックアップし、−８０℃にて２０％のグリセロール凍結ストックとして凍結した。これらのクローンを、増殖させ、１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして、可溶性の溶解物を、過剰量の精製した亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合タンパク質を用いるインビトロアッセイ（下記の実施例９を参照のこと）において、補完効率についてスクリーニングした。最良の候補をプールし、もう一ラウンドの進化に供した。変異を、蛍光色素によるターミネーターＤＮＡ配列決定により確認した。シャッフリングおよび最も明るいクローンの選択の３回のラウンドの後、最良の改変体（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴと名付けた）の可溶性溶解物のインビトロ補完性は、同じ量の再び折り畳まれた超折り畳みＧＦＰ  １−１０と比べて８０倍向上した（図５、グラフ）。折り畳みレポーターＧＦＰ変異（上記を参照のこと）に加え、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、超折り畳みＧＦＰからのＳ３０Ｒ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１Ｖ、Ａ２０６Ｖ、および、７つの新しい変異（Ｎ３９Ｉ、Ｔ１０５Ｋ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｉ１６７Ｖ、Ｓ２０５Ｔ）を含み、そして、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３７℃で発現されると、約５０％が可溶性である。非蛍光ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の紫外−可視スペクトルには、レッドシフトしたＧＦＰ（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）の４８０ｎｍ吸収帯がなく、ＧＦＰ  １１の付加が、環化されたクロモフォアを作製するために必要とされる折り畳み工程を誘発することを示唆する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）。精製されたＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、超折り畳みＧＦＰ、および折り畳みレポーターＧＦＰを、各々、１０ｍｇ／ｍｌでロードされる分析用ゲル濾過により研究した。ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、６０％の二量体、３５％の単量体、および５％の高次凝集体として溶出したが、全長の折り畳みレポーターＧＦＰおよび超折り畳みＧＦＰは、ともに、９５％を超える単量体と、微量の二量体および高次凝集体として溶出した。
【０１１０】
（実施例４：ＧＦＰ  Ｓ１１の操作）
Ｃ末端野生型ＧＦＰ  Ｓ１１融合タグは、数個のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）試験タンパク質の可溶性を劇的に減少させた（表３）。３−ヘキスロース  ６−ホスファターゼシンターゼ（ＨＰＳ）は単独では、６０％が可溶性であったが、野生型のＧＦＰ  １１と融合させた場合、不溶性であった（図６、表３）。タンパク質の可溶性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および以前に記載されたゲルデンシトメトリー分析（Ｗａｌｄｏ，Ｓｔａｎｄｉｓｈら  １９９９；Ｗａｌｄｏ  ２００３）により決定した。簡単に述べると、ハイスループットのスクリーニングについて、１ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％ｖ：ｖグリセロールを含有する緩衝液（ＴＮＧ緩衝液）１１０μｌに再懸濁した。他の場合において、３ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、３００  １０μｌのＴＮＧ緩衝液に再懸濁した。超音波処理した後、サンプルを遠心分離して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを提供した。ペレットを、超音波処理した上清と等量のＴＮＧ中に再懸濁した。１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する２×ＳＤＳ変性緩衝液（１５μｌ）と混合し、１５分間１００℃にて加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して染色し、ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。較正走査装置（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｓｃａｎｎｅｒ）は、タンパク質スポットの合成光学密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）Ｄを提供した。全ての発現されたタンパク質含量を、可溶性フラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｓ）とペレットフラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｐ）とを足すことによって見積もり、可溶性を、Ｓ＝Ｄｓ／（Ｄｓ＋Ｄｐ）として規定した。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける指向性進化の図式において、ＨＰＳを「おとり」として使用して、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１融合物の可溶性が、ＨＰＳ非融合物の可溶性と一致したＧＦＰ  Ｓ１１の変異体を発見した。
【０１１１】
【表３】
2008521447.tif 000010
【０１１２】
ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１改変体およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのライブラリーを、それぞれ、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲベクター（実施例１、前出を参照のこと）およびｐＥＴ２８ベクターからの配列において発現させた。独立した誘導性の適合性プラスミドを用いるこの連続的な誘導プロトコルは、同時翻訳の折り畳みおよびＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の不溶性改変体とＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとの補完により生じる偽陽性を回避することに役立った。ヘキスロースリン酸シンターゼ−ＧＦＰ  １１（ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１）融合物を、ＰＣＲにより増幅し、刊行されたプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いてシャッフリングした。ＧＦＰ  Ｓ１１変異体ライブラリーを、ＡｎＴＥＴ誘導性ｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）を有するｐＴＥＴプラスミドから、Ｎ末端６−ＨＩＳタグを有するおとりタンパク質であるＨＰＳとのＣ末端融合物として発現させ（図１および実施例１、前出を参照のこと）、そして、ｐ１５複製起点を含む改変したｐＥＴベクターにおいてＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）株へと形質転換した。最適物を、以下のような連続誘導プロトコルを使用してスクリーニングした。３７℃において一晩増殖させた後、コロニーを有するニトロセルロース膜を、３００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有する、選択ＬＢ／寒天Ｂａｕｅｒプレート上に移し、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１ライブラリーを発現させ、これを、新しい「休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）」プレートに１時間移して、ＡｎＴｅｔをコロニーから拡散させ、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の発現を遮断し、そして、最終的に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＬＢ／寒天プレートに２時間移して、ｐＥＴプラスミドから補完ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの発現を誘導した。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型構築物は、完全に不溶性なので、連続発現プロトコルに従ってＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するコロニーは、わずかに蛍光を発するのみであった。より可溶性のＨＰＳ−ＧＦＰ  １１最適物に関連する、より明るいコロニーを、９６ウェル組織培養プレートの選択液体培地にとり、−８０℃の２０％グリセロールストックとして保存した。これらのコロニーを、１ｍｌの液体培地中で増殖させ、３００ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴで誘導した。可溶性フラクションを、過剰の精製ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（下記、実施例９を参照のこと）において、補完効果についてスクリーニングした。最速の補完速度を有するクローンを選択し、さらにもう一ラウンドの進化およびスクリーニングのためにプールした。２ラウンドの進化は、２つの別個のＧＦＰ  Ｓ１１変異体、Ｌ２２１ＨおよびＴ２２５Ｎを生じた。本発明者らは、まず、Ｌ２２１Ｈ改変体（ＧＦＰ  １１  Ｍ１と名付ける）に焦点を当てた。この変異は、インビボにおいて、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを効率的に補完し、そして、ＨＰＳ  ＧＦＰ  Ｓ１１野生型と比べて向上した可溶性を有したが、融合タンパク質の溶解度に対するＧＦＰ  Ｓ１１の有害な効果を完全には排除しなかった（図６および表３）。ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２を、Ｆ２２３Ｓ（異なるスプリットＧＦＰフラグメントの可溶性を実質的に増加した変異（実施例１１、下記を参照のこと））を、Ｔ２２５Ｎと合せることによって操作した（表３、前出を参照のこと）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２の可溶性は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１またはＨＰＳ−ＧＦＰ  １１野生型のいずれに対しても大きく向上した（図６、表３）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの補完率は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１と比べて約５倍減少した。これは、可溶性融合タンパク質に匹敵する量である（図７）。本発明者らは、二重のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのＣ末端残基であるＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２からＫ２１４を除去し、そして、縮重プライマーセット（当該分野で周知の方法）を使用してホットスポット位置２２３において６４倍縮重ライブラリーをスクリーニングし、そして、得られたＧＦＰ  １１  Ｍ２の改変体をＨＰＳとのＣ末端融合物としてクローニングして、より保存的な変異について検索した。約２００クローンの可溶性フラクションを、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（実施例９、下記を参照のこと）においてスクリーニングした。平衡化した最良のＧＦＰ  Ｓ１１構築物（Ｌ２２１Ｈ，Ｆ２２３Ｙ，Ｔ２２５Ｎ）（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３と称する：アミノ酸配列ＲＤＨＭＶＬＨＥＹＶＮＡＡＧＩＴ［配列番号１６］、表２（前出）を参照のこと）は、良好な補完性で（図７）、融合タンパク質の溶解度の揺れを減らした（図６、表２、前出）。本発明者らはまた、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２タグを補完標的として使用して、上記の実施例３において概説した方法に従う指向性進化により、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完を向上させることを試みた。これにより、ＧＦＰ  １−１０  Ａ４と呼ばれる改変体が生成され、この改変体は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、約５速いＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２の補完を示した。ＧＦＰ  １−１０  Ａ４は、超折り畳み変異、ならびにさらなる変異Ｒ８０Ｑ、Ｓ９９Ｙ、Ｔ１０５Ｎ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｅ１７２ＶおよびＳ２０５Ｔを含んだ。Ａ４改変体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて主に封入体として発現され、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、インビボアッセイにあまり有用ではない。しかし、改変体Ａ４は、インビトロアッセイにおいて有用である。なぜならば、改変体Ａ４は、単に新しいＴＮＧ緩衝液に尿素で可溶化したペレットを希釈することによって封入体から再び折り畳まれ得、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴよりも４倍速くＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２またはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を補完するからである。
【０１１３】
（実施例５：ＧＦＰ  １−１０の可溶性バージョンまたは不溶性バージョンを使用する、連続的な誘導または同時誘導の効果の比較）
同時誘導が、不溶性かつ凝集したＧＦＰ  １−１０の補完をもたらし得るという仮説を試験するために、本発明者らは、連続誘導プロトコルおよび同時誘導プロトコルを比較した。ＣｏｌＥ１起点を有するベクターｐＴＥＴ上の大きなＧＦＰ  １−１０フラグメント（折り畳みレポーターＧＦＰ  １−１０、超折り畳みＧＦＰ  １−１０またはＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ）、および、ｐ１５起点を有するｐＥＴプラスミド上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型で同時形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、栄養寒天プレート上のニトロセルロース膜に二連でプレーティングし、直径約１ｍｍまで一晩増殖させた。１つの膜を、連続誘導プロトコル（実施例４、前出を参照のこと）を使用して処理した。簡単に述べると、ＧＦＰ  １−１０を、まず、ＡｎＴＥＴを用いて発現させ、その後、新しいプレート上に置いて、ＡｎＴＥＴを除き、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する新しいプレート上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を発現させた。二連のプレートを、別々に同時誘導させた（ＡｎＴＥＴおよびＩＰＴＧの両方を含有するプレート）。蛍光コロニーを、ＩｌｌｕｍａＴｏｏｌ（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて４８８ｎｍの光で照射し、そして、Ｋｏｄａｋ  ＤＣ２９０デジタルカメラを使用して、５２０ｎｍロングパスフィルタを通して画像化した。超折り畳みＧＦＰ  １−１０を一過性に発現させ、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型の誘導前にインビボで凝集させると、細胞はぼんやりしている（図８）。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴおよび亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１構築物を発現する細胞は、予想通りに、同時発現であっても連続発現であっても、明るい（図８）。
【０１１４】
（実施例６：インビトロで行なったスプリットＧＦＰアッセイの感度）
本発明者らは、マイクロタイタープレートでの２００μｌの反応において、数個の異なる量の精製亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３の補完について、蛍光漸増曲線（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｃｕｒｖｅ）を測定した（図９）。本発明者らは、高濃度かつ大モル過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）を使用して補完を開始させることにより、潜在的なより高次の動力学的効果を避けた。これらの感度実験について、９６ウェルマイクロプレートを最初に、ＴＮＧ緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ：ｖグリセロール）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液で、１０分間ブロッキングした。Ｔａｌｏｎ樹脂で精製した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）６ＨＩＳ−亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質の２倍の段階希釈を、同じ緩衝液中で行なった。この希釈は、２０μｌのアリコートあたり、２００ｐｍｏｌ〜０．１ｐｍｏｌの範囲にわたり、このアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに添加し、次いで、１８０μｌのアリコートに添加された大過剰（８００ｐｍｏｌ）のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて実施した。その結果、大きなフラグメントの濃度は制限されなかった。粗製Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の、反応の感度に対する効果を、別個の実験で試験するために、サンプルをまた、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加前に、不適切な非タグ化タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解物（２０μｌ）を添加することによって、スパイクした。蛍光動力学（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｗｉｎｎｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いてモニタリングし、３分間隔で１５時間記録した。ブランクサンプル（２０μｌの不適切なタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ溶解物、１００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および１００μｌのＴＮＧ緩衝液中０．５％  ＢＳＡ）のバックグラウンド蛍光を、最終蛍光値から減算した。ブランクは、最も低い標的濃度（０．１ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３）から、３０％未満のシグナルであった。補完蛍光は、分析物濃度の線形関数であった（図９）。１０〜２００ｐｍｏｌ量の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加後１５分以内で正確に定量化され得（図９Ａ）、そして、０．１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌは、約１時間を要した（図９Ｂ）。広範な濃度範囲にわたる漸増曲線は、単純な線形スケーリングにより重ね合わされ得（図１０）、反応の動力学が、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの濃度により制限されなかったことを示す。図９に示される曲線にフィットする滑らかな線は、試験サンプルが、既知濃度のサンプルを測定する際に使用されるのと同じ条件下で測定される限りは、ＧＦＰタグ化ドメインでタグ化された試験サンプル中のタンパク質の量を決定するための較正曲線に歩み寄ることができる（例えば、この較正曲線は、同じアッセイ試薬濃度のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および同じ容量のサンプルを使用して、図９Ａの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を例示した）。従���て、図９Ａにおいて、蛍光（Ｙ）のｐｍｏｌへの線形フィットは、Ｙ＝２．４６×（ｐｍｏｌ）＋２２．８により与えられる。本発明者らが、較正曲線と同じ条件下でタグ化タンパク質の未知の濃度を測定すると仮定すると、２００単位の蛍光の測定が得られる。ｐｍｏｌについての解法（ｓｏｌｖｉｎｇ）は、（Ｙ−２２．８）／２．４６であり、Ｙを２００と置き換え、本発明者らは、ｐｍｏｌを、（２００−２２．８）／２．４６＝７２．０ｐｍｏｌを計算し得る。
【０１１５】
（実施例７：スプリットＧＦＰフラグメントの迅速な結合）
スプリットＧＦＰフラグメントの結合動力学と、クロモフォア形成の動力学との間を区別するために、本発明者らは、Ｔａｌｏｎ樹脂に結合させた６ＨＩＳ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの、Ｎ末端折り畳みレポーターＧＦＰにタグ化したＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３による補完を行なった。５０％ｖ／ｖスラリーのＴａｌｏｎ樹脂のアリコート（１００μｌ）を、Ｎ末端６ＨＩＳ親和性タグ（２ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）を有するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴで飽和させた。ビーズ（５０μｌのベッド容量）を、３００μｌのＴＮＧ緩衝液で３回洗浄して、未結合のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを除去し、残った緩衝液を吸引して破棄し、そして、蛍光を９６ウェルマイクロタイタープレートにて測定した（図１１、工程１）。過剰の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質（５ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）をビーズに添加し、１５秒間ピペッティングすることにより混合し、小さな０．２μスピン濾過カラムに迅速に移し、ＴＮＧの０．５ｍｌアリコートで３回洗浄して、未結合の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質を除去した。この手順は、約５分を要した。ビーズをマイクロタイタープレートの新しいウェルに移し（図１１、工程２）、そして、蛍光を、３分間隔で１２時間測定した（図１１、工程３）。ビーズの蛍光は、折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質が、迅速に６ＨＩＳ−ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに結合したことを示した（図１１、工程２）。洗浄したビーズは、溶液中で観察されたものに匹敵する速度でさらなる蛍光を得（図１１、工程３）、蛍光形成の動力学が、ＧＦＰフラグメントの会合速度により制限されないことを示した。
【０１１６】
（実施例８：補完アッセイの頑健性、ならびにアジュバントおよびｐＨの影響）
本発明者らは、補完反応に対する一般的な化学アジュバントおよびｐＨの影響を試験した。９Ｍの尿素の連続的な２倍段階希釈を、ＴＮＧを用いて行なった。１０の溶液の１００μｌアリコート（９Ｍ尿素から０．０１９Ｍ尿素までの濃度範囲）を、１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１  Ｍ３、１０μｌのアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および８０μｌのＴＮＧ緩衝液と合せた。蛍光データを、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で１２時間にわたって集めた。この反応を、２．０Ｍより上の尿素でクエンチした（図１２）。別の実験において、補完速度は、５ｍＭジチオスレイトールにより約３０％向上したが、０．１％ｗ／ｖ  ＳＤＳによりクエンチした。本発明者らは、次に、補完反応の効率に対する、異なるｐＨの溶液の影響を試験した。１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質、またはＳ１１野生型ペプチドの等モル溶液を、適切な緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ５〜６．５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５〜８．５）、ＢＩＣＩＮＥ（ｐＨ８．５〜９．０）を含有する、１８０μｌの０．１Ｍ溶液（０．５ｐＨ単位の間隔で、５．０〜９．０のｐＨ範囲にわたる）に添加した。補完を、１０μｌのＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって開始し、そして、補完の動力学を、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で一晩モニタリングした。補完は、ｐＨ６．５より下では非効率的であり、約ｐＨ７．３の見かけ上のｐＫａを有した（図１３）。補完後、蛍光ＧＦＰ部分は、５Ｍより大きな尿素において蛍光のゆっくりとした時間依存的な減少を示し（ｔ１／２＝２０時間）、約５．５のｐＫａは、「増強された」ＧＦＰと同様であった（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら  １９９７）。
【０１１７】
（実施例９：インビトロでのタンパク質の定量化）
スプリットＧＦＰシステムが、インビトロで正確に異なるタンパク質を定量化することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質を、Ｃ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグを有するｐＥＴベクター構築物として液体培養物中で発現させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスプリットＧＦＰ補完システムを使用して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析した（図１４）。１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質の可溶性フラクションを、ｐＥＴ発現タンパク質定量化試験についてアッセイするため、そして、ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−１０改変体の指向性進化の間に、最適物に対してアッセイを行なうために、細胞溶解物の標的タンパク質の可溶性フラクション（２０μｌ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中で、１８０μｌの０．３５ｍｇ／ｍｌ再折り畳みＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約６００ｐｍｏｌ）と混合した。不溶性のペレットをアッセイするために、５０μｌの再懸濁した不溶性フラクションの各々を遠心分離し、乾燥したペレットを、５０μｌの９Ｍ尿素の添加により溶解し、次いで、１０μｌの非折り畳みサンプルを、１９０μｌのＴＮＧ中０．３５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの迅速な添加によりアッセイした。ペレットアッセイの蛍光値を、２つの因子によりスケール化して可溶性アッセイと比べて低い容量を補償し、可溶性フラクションアッセイとの直接的な比較を可能にした。アッセイ中の尿素の最終濃度は、約０．４Ｍであった（実施例８、前出、および図１２を参照のこと）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、可溶性フラクションおよびペレットフラクションのサンプルを定量化するために、１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１５μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する）と混合し、１００℃にて１５分間加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。ゲル上のタンパク質スポットを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、画像化して、ＧＳ−８００較正スキャニングデンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、タンパク質スポットの光学密度を定量化した。クーマシー色素は染色効率のタンパク質依存性のバリエーションを示すものの（Ｔａｉ，Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら  １９８５）、補完および折り畳みの完了後（約６時間後）、測定される蛍光値と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したタンパク質の量との間には強い相関があった（図１４）。９Ｍ尿素中に溶解し（この実施例、前出を参照のこと）、過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを含有する緩衝液で２０倍希釈した不溶性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化された不溶性タンパク質の量と良好に相関する蛍光を生じた（図１４）。対照的に、可溶化されたペレットを、濃縮したＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのアリコートを���加する前に、新しい緩衝液で希釈した場合、十分に発現された不溶性タンパク質のいくつか（すなわち、ポリスルフィドレダクターゼおよびヌクレオチド二リン酸キナーゼ、表３および図１４）は、検出可能な補完を与えなかった。おそらく、これらのタンパク質は、希釈の際に折り畳みを誤り、凝集し、引き続くＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ部分の前に、ＧＦＰ  １１  Ｍ３タグをアクセス不能にしている。
【０１１８】
（実施例１０：スプリットＧＦＰアッセイシステムを使用する、インビボでの可溶性タンパク質および総タンパク質の推定）
実用的なスプリットタンパク質タグ化システムは、可溶性タンパク質または不溶性タンパク質のいずれかを標識および検出するために、インビボで使用され得る。本発明者らは、可溶性タンパク質が、まず、タグ化タンパク質を限られた時間だけ発現させ、次いで、この発現を停止して、同じ細胞区画において補完ＧＦＰフラグメントの引き続く発現の前に、タグ化タンパク質が、その固有の溶解表現型を現すことを可能にすることによって、生きているＥ．ｃｏｌｉ細胞においてアッセイされ得るという仮説を立てた。インビトロペレットアッセイ（実施例９、前出を参照のこと）における本発明者らの同時再折り畳みの結果から、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグ化タンパク質およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを同時発現させることによって、インビボでの試験タンパク質の凝集前の構造的な補完およびＧＦＰ蛍光の発色に対する確約をもたらし、発現される総タンパク質の見積もりを可能にすることが期待された。Ｎ末端６ＨＩＳを有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質と、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミド（図１、前出を参照のこと）に由来するＣ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグと、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとを同時に発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび７０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ中で飽和まで増殖させ、−８０℃のフリーザーストック用に、２０％グリセロール中に、ＯＤ６００ｎｍ＝１．０にて希釈した。細胞を、ＬＢ中２つの４００倍希釈で、段階希釈し、ニトロセルロース膜にプレートした。３２℃にて一晩増殖させた後、これらの細胞を、連続的（実施例４、ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、前出を参照のこと）、または同時に誘導した。連続的な誘導について、一晩のコロニーを有する膜上の細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有するプレート上で１．５時間、静止プレートで１時間、そして、１ｍＭ  ＩＰＴＧプレート上で最後に１時間インキュベートした（ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、実施例４に使用した時間と比べ、誘導時間が短いことに注意されたい）。同時誘導プロトコルについて、一晩のコロニーを有する膜を、６００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴＥＴおよび１ｍＭのＩＰＴＧの両方を含有するプレートに移し、３７℃にて４時間インキュベートして、ＧＦＰ  Ｓ１１融合物、および大きなＧＦＰフラグメント１−１０の両方を同時に発現させた。プレート上で誘導されたコロニーを、４８８ｎｍ励起フィルタを備えるＩｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて照射し、ＤＣ２９０デジタルカメラ（Ｋｏｄａｋ）を用いて、有色ガラスフィルタ（５２０ｎｍロングパス，ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を通して写真撮影した。蛍光のコロニーを、同時発現の後、または連続的な発現の後に画像化し、同じ構築物の可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、液体培養物中での連続的な誘導の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１５）。本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に���可溶性フラクションを過剰のＴａｌｏｎ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に結合することによって、有用な凝集していない６ＨＩＳタグ化タンパク質の量を評価した。簡単に述べると、インビボ全細胞プレート補完アッセイにおいて使用したものと同じクローンの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析するために、コロニーを、別個に、９６ウェル培養プレートの１ｍｌ中で、３７℃にて増殖させた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴを含む対数期に１時間誘導し、新しいＬＢで３回洗浄し、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧで１．５時間誘導した。誘導後、培養ペレットを、１１０μｌのＴＮＧ緩衝液で再懸濁し、超音波処理によりばらばらにした。溶解物を、遠心分離によりフラクションして、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを得た。連続的に誘導した液体培養物の４０μｌの可溶性抽出物を、ＴＮＧ緩衝液中５０％ｖ／ｖの金属親和性樹脂ビーズ（Ｔａｌｓｏｎ樹脂，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の等容量のスラリーと混合し、簡単に遠心分離した。未結合のフラクションを、ピペッティングにより除去し、ビーズを、過剰のＴＮＧ緩衝液で連続的に２回洗浄した。最後の遠心分離工程の後、緩衝液を捨てた。４０μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液を添加し、１００℃にて１５分間加熱した。不溶性フラクションを、記載されたように変性した（実施例４、前出を参照のこと）。Ｔａｌｏｎ結合し、かつ変性したサンプルを、各々、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、ＧＳ−８００較正デンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。同時誘導によるインビボコロニー蛍光は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致する総タンパク質を報告したが、その一方で、連続的な誘導によるコロニー蛍光は、Ｔａｌｏｎ結合した可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致した（図１５）。高度に可溶性のタンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されていようと、連続的に誘導されていようと（タンパク質２、４および５、図１５）、明るかった。不溶性タンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されたとき（タンパク質８、１１、１５、１６および１８、図１５）、かなり明るかった。タンパク質１、４、５、７、９、１２および１４は、各々、ｐＴＥＴプラスミド（図１５）のより弱いｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）から発現された場合よりも、ｐＥＴシステム（表３および図１４、前出）の非常に強力なＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら  １９９０）から発現されたときに、溶けにくかった。タンパク質の発現レベルおよび溶解度に対するプロモーターの強度の影響は、以前に注目されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ  １９９６；Ｂａｎｅｙｘ  １９９９；Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｅｄｗａｒｄｓら  ２００３；Ｙｏｋｏｙａｍａ  ２００３；Ｆａｈｎｅｒｔ，Ｌｉｌｉｅら  ２００４）。
【０１１９】
（実施例１１：ＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグフラグメントおよびＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントからなるスプリットＧＦＰ補完対の操作）
実施例２（前出）の方法に従って、本発明者らは、超折り畳みＧＦＰアミノ酸１９８−２３８から構成される実現可能なスプリットＧＦＰ対（ＧＦＰ  Ｓ１０−１１）、および超折り畳みＧＦＰアミノ酸１−１９８から構成される補完アッセイフラグメント（ＧＦＰ１−９）を同定した。これらは、２つのフラグメントがＥ．ｃｏｌｉにおいて同時に発現される場合に、蛍光細胞を産生した。ＧＦＰ  １−９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて単独で発現されると不溶性であった。単独で発現されたフラグメントはいずれも、蛍光ではなかった。実施例３（前出）の記述に従って、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１０−１１融合タンパク質を補完標的として使用して、本発明者らは、指向性進化によるＧＦＰ  １−９の折り畳みおよび溶解度を向上させて、新規改変体ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを生じ、これは、超折り畳みＧＦＰの変異（実施例２、前出を参照のこと）、およびさらなる変異Ｓ２Ｒ、Ｔ４３Ｓ、Ａ８７Ｖ、Ｆ１１４ＳおよびＫ１６６Ｔを含んだ。このフラグメントは、ｐＥＴ  ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からＥ．ｃｏｌｉにおいて３７℃にて発現されると、約５０％可溶性であった。次に、本発明者らは、実施例４（前出）の記述に従って、進化したＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完標的として使用して、ＧＦＰ  Ｓ１０−１１の溶解度を向上させ、そして、融合タンパク質の折り畳みおよび溶解度の揺れを減少させた。超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグは、以下の配列：
【０１２０】
【化６】
2008521447.tif 000011
【０１２１】
を有し、一方で、最適化されたＧＦＰ  Ｓ１０−１１は、以下の配列：
【０１２２】
【化７】
2008521447.tif 000012
【０１２３】
（変異Ｎ１９８Ｄ、Ｓ２０５Ｔ、Ｖ２０６Ｉ、Ｋ２１４Ｅ、Ｆ２２３Ｓ）を有する。これらのフラグメントを使用する、インビトロスプリットＧＦＰアッセイの感度を、実施例６、前出に従って試験したが、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴの量は制限された（２．５μＭのＧＦＰ  １−９  ＯＰＴ）。これらの条件下で、蛍光は、予測どおり、２．５μＭ以上のタグ化フラグメント濃度において、プラトーに達した（図１６）。
【０１２４】
（実施例１２：（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）サンドイッチタグ形式の操作、およびアッセイフラグメントＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いた検出）
標的タンパク質の両端が結合しているときを厳密に試験するため、そして、標的タンパク質の一端のみがタグ化された状態で結合している潜在的なアーチファクト（例えば、タンパク質分解または内部リボソーム結合部位により生じた短いフラグメント）を減らすために、本発明者らは、試験タンパク質が、ＧＦＰの二つの小さなドメイン間の融合物として発現されるサンドイッチ形式を操作し、これを次いで、ＧＦＰの第３のドメインで補完させる。この実施形態において、試験タンパク質Ｘは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）のようなＧＦＰ鎖１０とＧＦＰ鎖１１との間のサンドイッチとして発現される（図１７）。この種は、ＧＦＰの第３のドメインであるＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完して、インタクトなＧＦＰを生成する。本発明者らは、当該分野で周知の方法を使用して、超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグ中のＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との間に試験タンパク質を挿入することによって、構築物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を操作した。ここで、Ｌ１およびＬ２は、各々アミノ酸ＧＧＧＳから構成されるリンカーである（図１８Ａ）。本発明者らは、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−亜硫酸レダクターゼ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を首尾よく検出したが、補完は、Ｃ末端がＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３＋ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ形式と同じくらいの効率である、わずか約１／３０であった。本発明者らはまた、他の部分的に可溶性のタンパク質が、このサンドイッチ形式で発現されると不溶性になることを発見した。まず、本発明者らは、溶解度とは無関係に補完効率を改善した。本発明者らは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）から開始し、ここで、鎖ＧＦＰ  Ｓ１０および鎖ＧＦＰ  Ｓ１１は、超折り畳みＧＦＰに由来するものであり（図１８Ａ）、短いアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＳＧＧ［配列番号３７］が、２つのＧＦＰ鎖の間に柔軟なリンカーを提供する。これを、ＤＮＡシャッフリングにより変異させ、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完が向上した改変体のライブラリーを、ｐＴＥＴベクターからのライブラリーの連続的な誘導によりインビボでスクリーニングし、その後、（実施例４、前出に概説した方法に従って）プレート上のコロニーとして、Ｅ．ｃｏｌｉ内でｐＥＴベクターからＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを発現させた。６つの最も明るいコロニーを、３回の進化のラウンドの後に配列決定した（図１８Ａ）。本発明者らは、６つのセットのうちの５番目の変異体に焦点をあて、この構築物を、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）（ＳＭ５＝サンドイッチ変異体番号５）と名付けた。この最適物は、以下の配列：
【０１２５】
【化８】
2008521447.tif 000013
【０１２６】
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターまたは優先順位の低いベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。このようなアプローチは、当該分野で周知である。このカセットを、ｐＴＥＴベクターへのクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位により隣接させる。開始鎖構築物と比べ、Ｎｄｅ−１／ＢａｍＨ−１部位にクローニングされた可溶性亜硫酸レダクターゼは、補完速度が約２０倍増加したが、（実施例４、前出のように）部分的に可溶性のＨＰＳタンパク質を用いて試験した場合、タンパク質の溶解度に対する有害な効果がまた増加した。続いて、向上した補完、および融合タンパク質の溶解度の摂動の減少について同時に選択するために、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１の溶解度および補完を向上するために用いたものと同じおとりタンパク質であるリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）（実施例４、前出）を使用した。ＨＰＳは、ｐＴＥＴベクターから単独で発現されると、約６０％可溶性であった（図１５、タンパク質番号９）が、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−ＨＰＳ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）融合タンパク質として発現されると、不溶性であった。本発明者らは、シャッフリングおよびプライマードーピング変異誘発（１４の合成オリゴヌクレオチドプライマーのプール）を用いて、上流の（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）ドメインに焦点をあてた（図１８Ｂ）。各プライマーを、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５ドメインの１４のアミノ酸の１つに集中させた。中心の標的アミノ酸は、ＮＮＮがコードする縮重を含み、そして、クローニングベクターの前後関係において、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５に対する相同物（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）と隣接する（図１８Ｂおよび図１９に示される標的配列）。縮重プライマーのプールを、組立て反応（実施例４、前出において実施した再組立て）の間に、断片化したＤＮＡに添加した。このようなプライマードーピング変異誘発技術は、当該分野で周知である。本発明者らは、上流でＮｃｏＩ、そして下流でＢａｍＨＩに隣接されたドメインＮｃｏ１：（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をシャッフルして増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるフラグメントの再組立ての間に、縮重プライマーミックスを添加した。本発明者らは、ＰＣＲによって、再組立て��た変異型構築物に由来するドメインを再増幅し、次いで、変異型（ＧＦＰ  Ｓ１０）プールを含むＮｃｏ１／Ｎｄｅ−１フラグメントを消化して切り出し、標準的な技術を使用してゲル精製し、そして、Ｎｃｏ１／／Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）を含む受容ベクターにクローニングした。（この実施例、前出、および、この実施例中の中間体フラグメントを使用する、インビトロ補完アッセイについて、実施例４、前出に概説された方法に従う）ｐＴＥＴプラスミドおよびｐＥＴプラスミドからの連続的な誘導形式を使用する、３回の選択ラウンドの後、最良の８クローンの各々の配列を、蛍光色素ターミネーター配列決定により決定した（図１９）。最良のパフォーマンスを示すクローン（（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−Ｌ１−Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と名付ける）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させると、約４５％が可溶性であり、これは、不溶性での開始構築物に対して顕著な改善である。そして、補完シグナルは、ここで、サンドイッチ構築物（前出）においてＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５タグのみを検出するためにＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを使用した場合の補完シグナルの、約１／５〜１／４であった。次に、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（同一性および非融合物の溶解度については、表３、前出を参照のこと）を用いて、アッセイを試験した。可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、以前に記載したように（実施例９、前出）、本実施例の即時のフラグメントを用いてアッセイした。本発明者らは、参照物として（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）タグのみを特異的に検出するために、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いて、そしてまた、サンドイッチ形式でタグ化したタンパク質の（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）鎖および（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）鎖の両方の結合を必要とするＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、これらのサンドイッチ形式でタグ化したタンパク質をアッセイした。予想どおりに、補完は、一方の鎖のみが検出に必要とされる場合（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの場合）に、より効率的であり、そして、尿素可溶化ペレットを用いたペレットフラクションの検出は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの検出の場合に最も効率的であった（図２０）。それにもかかわらず、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いて検出されるサンドイッチについての可溶性フラクションの蛍光は、ＧＦＰ  １−１０での検出を用いたときのシグナルと十分に相関し、可溶性タンパク質が予想どおりであったことを記録した。同様に、インビボでの連続的な誘導は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物を用いた可溶性ｐＴＥＴの発現と相関した（図２０、また、実施例９（前出）および図１５も参照のこと）。好ましい最適物は、以下のアミノ酸配列：
【０１２７】
【化９】
2008521447.tif 000014
【０１２８】
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。カセットは、ｐＴＥＴベクターにクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位に隣接される。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。
【０１２９】
（実施例１３：スプリットＧＦＰフラグメントの再構成の同時発現を使用する、存在するタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの作用のモデル）
従来のスプリットＧＦＰシステムは、折り畳みが乏しく、そして主として不溶性である。フラグメントの多くは、凝集体に分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）する。少量は、シャペロンの活性によってレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）されるが、相互作用ドメインの非存在下において、レスキューされた一過性の可溶性フラグメントが凝集体に再分配する前に結合し得る確率は、低い（図２１ａ）。相互作用ドメインを付加する工程は、それらのフラグメントを係合（ｔｅｔｈｅｒ）し得、新しく再折り畳みされた一過性の可溶性フラグメントの相互作用の確率を上昇させる（図２１ｂ）。したがって、このシステムは、エントロピーの理由からではなく、むしろ安定性の欠如に起因して自発的に補完しないようである。
【０１３０】
（実施例１４：別々に発現されるスプリットＧＦＰフラグメントの再構成を使用する、存在するタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの作用のモデル）
融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ、従来のスプリットＧＦＰシステムは、（時間的か、または空間的に）別々に発現した場合に、効率的に補完することができない。上記フラグメントは、同時に発現されないので、新しく再折り畳みされた一過性の可溶性フラグメントの相互作用の確率は、非常に低い（図２２）。したがって、このシステムは、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ、エントロピーの理由からではなく、むしろ安定性の欠如に起因して自発的に補完しないようである。これは、融合された相互作用コイルドコイルを有するＧＦＰフラグメントは同時発現した場合にのみ補完が可能であるというＺｈａｎｇおよびＣｈａｌｆｉｅ、２００４、前出による観察と一致し、そしてＨｕら、２００３、前出は、封入体から再折り畳みしたか、または同時発現した場合にのみ、コイルドコイル融合ＧＦＰフラグメントの補完を観察した（Ｈｕ，ＣＤ．＆Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｔ．Ｋ．、２００３、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１、５３９−５４５）。
【０１３１】
（実施例１５：再構成のために相互作用ドメインをレスキューする、可溶性の、非変動性スプリット蛍光タンパク質フラグメントの操作）
先に記載されたスプリットＧＦＰフラグメントは、折り畳みが乏しく、凝集し、したがって効率的に補完しなかった（図２３ａ）。上記の実施例（実施例１〜１２）は、可溶性のままであり、かつ凝集しない可溶性の、安定なＧＦＰフラグメントを操作するための技術およびアプローチを示す（図２３ｂ）。これらのフラグメントは、同時か、または別々に発現され得、そして可溶性のままであり、かつ融合されたポリペプチドの可溶性および折り畳みを変動させない。これは、タンパク質フラグメントの再構成に基づく一般的に有用なタンパク質−タンパク質相互作用検出システムについての、重要な必要条件である。しかし、これらのフラグメントは、融合された相互作用ドメインに対する必要性を伴わずに自己会合する（図２３ｂ）。タンパク質−タンパク質相互作用検出因子として有用であるために、上記フラグメントは、必ず、再構成のための融合された相互作用ドメインを必要とする。１つのアプローチにおいて、可溶性の操作されたフラグメントＦ１を、一定に保ち、そしてそのフラグメントＦ１を、フラグメントＦ２の改変体のライブラリーをスクリーニングするためのアッセイフラグメントとして使用して、自発的な補完および蛍光の形成を排除または廃絶するＦ２の変異を同定する。広いライブラリーを、例えば、非蛍光性である多数の改変体（すなわち、＞１０５）を見出し、そして収集するためにフローサイトメトリーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてスクリーニングし得る（図２３ｃ）。これらの非蛍光改変体は、折り畳みの欠損を有する変異体、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ補完が不可能な変異体、不溶性である変異体などのような望ましくない改変体を含み得る。したがって、上記非蛍光改変体のライブラリーを、次いで、公知の相互作用タンパク質（例えば、コイルドコイル）を有する融合物として発現される変異体を生じるベクターにサブクローニングする（このようなコイルドコイルは、Ｈｕ、２００２、前出；Ｇｈｏｓｈら、２０００、前出に記載される）。また、上記ライブラリーを、相互作用タンパク質にのみ融合した場合に、そのまま補完する変異体を同定するために、フローサイトメトリーによってスクリーニングするか、プレート上でスクリーニングする。必要な場合、最適物の最終的なライブラリーを、そのまま、補完のための融合された相互作用ドメインに対する依存性を確かめるために、相互作用タンパク質を含まないベクターにサブクローンし得る。フラグメントの安定性および可溶性をさらに改良するための変異のさらなるラウンドを、必要とされる場合、実施例３および実施例４（上記）にあるように行ない得る。さらに、最適以下の凝集し易いＧＦＰフラグメントに融合した場合に、減少した可溶性を有するおとりタンパク質を、この本発明の実施例（実施例１５）の融合物に組み込んで、自発的な会合を排除する変異体についてスクリーニングする間の、可溶性についてのストリンジェントな選択を維持し得る。さらに、相互作用ＧＦＰフラグメントの間の界面に特異的に関与するアミノ酸を、当該分野において周知の方法であるプライマー特異的変異誘発（変質したオリゴドーピング）（定義、変異誘発の方法、前出を参照のこと）を使用し、全体として、骨格と比較して上昇したレベルの変異誘発の標的とし、それによってＧＦＰフラグメントの間の相互作用がそれらのＧＦＰフラグメントの折り畳みに悪影響を与えることなく減少し得る見込みを増大し得る。ＧＦＰの界面のアミノ酸を、三次元構造の検査（Ｙａｎｇ、１９９６、前出）によって容易に同定し得る（位相幾何図の図３も参照のこと）。
【０１３２】
（実施例１６：相互作用が低分子エフェクターによって誘導可能な誘導されたタンパク質ドメインを使用する、再構成のための相互作用ドメインをレスキューする可溶性の、非変動性スプリット蛍光タンパク質フラグメントの操作）
この実施例は、上記融合されたタンパク質ドメインの相互作用が、例えば、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢ  １２およびＦＲＢ（それらの相互作用がラパマイシンの添加によって誘導され得る２つのタンパク質）によって誘導可能であること除いて、実施例１５（上記）に類似する。したがって、図２４ｃにおいて、自発的な補完を排除するＦ２の変異体を、そのエフェクター（ラパマイシン、この実施例において）の非存在下においてスクリーニングし得、次いで相互作用ドメインに融合した場合に首尾よく補完するＦ２変異体を、図２４ｄにあるようなエフェクターを添加することによって同定し得る。
【０１３３】
（実施例１７：３体補完）
ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を、試験タンパク質Ｘに融合する。これらの種とアッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１−９とのＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖の補完をもたらし、それによってＸが可溶性であること、ならびにＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１をＸにおいて係合することを示す（図２５ａ）。ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を、図２５ｂにあるように、係合する場合、そのエントロピーを、ＧＦＰ  ｓ１−９との補完を可能にするには高すぎる。
【０１３４】
（実施例１８：２つのタンパク質の相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２６ａ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹが相互作用することを示す。ＸおよびＹが相互作用しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。相互作用タンパク質Ｘおよび相互作用タンパク質Ｙの例は、コイルドコイル、抗体およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）のペプチドまたはタンパク質抗原もしくは結合パートナー（ヘテロマルチマーを形成するタンパク質）を含む。
【０１３５】
（実施例１９：２つのタンパク質と第３のタンパク質との相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹは、自発的に相互作用しないか、または互いに結合しない。ＸおよびＹが、相互作用し、そしてそれらが、第３のタンパク質Ｚに結合する場合、Ｚを添加する工程は、ＸおよびＹの結合、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２６ｂ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹがＺと相互作用し、そしてＺが存在することを示す。ＸおよびＹがＺと相互作用しないか、またはＺが存在しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。Ｚと相互作用するタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの例は、ヘテロメリックかまたはホモメリックなトリブリッド（ｔｒｉｂｒｉｄ）のコイルドコイル、抗原（Ｚ）と結合する抗体の対（ＸおよびＹ）およびその同族のペプチドまたはタンパク質抗原もしくは結合パートナー（ヘテロマルチマーを形成するタンパク質）を含み得る。
【０１３６】
（実施例２０：２つのタンパク質とエフェクター低分子との相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹは、自発的に相互作用しないか、またはエフェクター低分子に結合する。ＸおよびＹが相互作用し、そしてそれらがエフェクター低分子に結合する場合、エフェクター低分子を添加する工程は、ＸおよびＹの結合、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２７ｂ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹが上記エフェクターと相互作用し、そしてそのエフェクターが存在することを示す。ＸおよびＹが上記エフェクターと相互作用しないか、またはそのエフェクターが存在しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない（図２７ｂ）。エフェクターと相互作用するタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの例は、例えば、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢＰおよびＦＲＢを含み得る。低分子を感知する種々の２成分システムもまた、使用し得る。
【０１３７】
（実施例２１．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用パートナーの同定）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  ｓ１０および融合されたＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１３８】
（実施例２２．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する折り畳みパートナーの同定）
Ｘは、ＸとＹとから構成される真正の折り畳みの対の部分であり、ここで同じ区画内でのＸおよびＹの同時発現は、Ｙとの接触およびＹとの同時折り畳みによって、Ｘの適切な折り畳みをもたらす。次いで、ＸおよびＹは、ＸおよびＹから構成される正しい折り畳みの可溶性ヘテロダイマーを形成する、ここでＸおよびＹは、互いと会合したままである。Ｙの非存在下において、Ｘは、折り畳みを誤り、そして凝集体を形成する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。タンパク質Ｘは、それだけで発現した場合、折り畳みが乏しく、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０を凝集体中に隔離させる。Ｘの折り畳みをレスキューする折り畳みパートナーＹを見出すために、Ｘとの潜在的な相互作用する折り畳みパートナーを含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、同時折り畳みを行い、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じる正しく折り畳まれた可溶性ヘテロダイマーを生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。次いで、これらの会合した融合種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、相互作用する会合した折り畳みパートナーを形成しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。上記融合タンパク質ＸおよびＹが、上記ｔｅｔプロモーターの制御下で発現され、例えば、そして上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが、独立誘導性プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター）の制御下で発現される場合、Ｘ、Ｙ、およびＧＦＰ  １−９の発現の順番は、独立して調節され得る。上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントがＸ融合タンパク質およびＹＬＩＢ融合タンパク質と同時に発現される場合、そのＸとＹとの間の相互作用は、ＸおよびＹの可溶性にかかわらずに検出され得る。上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが上記ＸおよびＹの後に発現される場合、会合した相互作用し、また可溶性であるＸタンパク質およびＹタンパク質のみが、検出される。連続誘導に依存するこの可溶性レポーターの局面は、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９、ならびにＧＦＰ  Ｓ１０−Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９を使用して、先に示されている。
【０１３９】
（実施例２３．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用パートナーの同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４０】
（実施例２４．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する折り畳みパートナーの同定）
Ｘは、ＸとＹとから構成される真正の折り畳みの対の部分であり、ここで同じ区画内でのＸおよびＹの同時発現は、Ｙとの接触およびＹとの同時折り畳みによって、Ｘの適切な折り畳みをもたらす。次いで、ＸおよびＹは、ＸおよびＹから構成される正しい折り畳みの可溶性ヘテロダイマーを形成する、ここでＸおよびＹは、互いと会合したままである。Ｙの非存在下において、Ｘは、折り畳みを誤り、そして凝集体を形成する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。タンパク質Ｘは、それだけで発現した場合、折り畳みが乏しく、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０を凝集体中に隔離させる。Ｘの折り畳みをレスキューする折り畳みパートナーＹを見出すために、Ｘとの潜在的な相互作用する折り畳みパートナーを含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、同時折り畳みを行い、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じる正しく折り畳まれた可溶性ヘテロダイマーを生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。次いで、これらの会合した融合種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、相互作用する会合した折り畳みパートナーを形成しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。上記融合タンパク質ＸおよびＹが、上記ｔｅｔプロモーターの制御下で発現され、例えば、そして上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが、独立誘導性プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター）の制御下で発現される場合、Ｘ、Ｙ、およびＧＦＰ  １−９の発現の順番は、独立して調節され得る。上記ＧＦＰ  １−９  アッセイフラグメントがＸ融合タンパク質およびＹＬＩＢ融合タンパク質と同時に発現される場合、そのＸとＹとの間の相互作用は、ＸおよびＹの可溶性にかかわらずに検出され得る。上記ＧＦＰ  １−９  アッセイフラグメントが上記ＸおよびＹの後に発現される場合、会合した相互作用し、また可溶性であるＸタンパク質およびＹタンパク質のみが、検出される。連続誘導に依存するこの可溶性レポーターの局面は、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９、ならびにＧＦＰ  Ｓ１０−Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９を使用して、先に示されている。
【０１４１】
（実施例２５．エフェクターの存在下におけるタンパク質相互作用のモニタリング）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９および記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。そのエフェクター分子Ｅは、低分子（例えば、薬物、ホルモン、またはペプチド）、または大きい分子（例えば、タンパク質または高分子複合体）であり得る。次にそのエフェクター分子Ｅを、上記融合タンパク質に接触させ、そしてその融合タンパク質のドメインＸとドメインＹとの相互作用の効率を、ＧＦＰ  １−９との補完を使用して評価する。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光より明るい。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光よりぼんやりしている。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光と同じである。
【０１４２】
（実施例２６．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、タンパク質相互作用に作用し得る潜在的なエフェクタータンパク質の同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９および記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。この実施例において、上記エフェクター分子Ｅは、遺伝子によりコードされるペプチド、タンパク質または高分子複合体である。上記ＸとＹとの間の相互作用の潜在的なエフェクターを含むランダムライブラリーＥＬＩＢを、Ｘ融合タンパク質およびＹ融合タンパク質として、同じ区画内で発現させる。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現さ得、そしてその融合タンパク質を、ＥＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＥＬＩＢｉ）を上記Ｘ融合タンパク質およびＹ融合タンパク質と接触させるように、互いに接触させる。上記融合タンパク質におけるＸとＹとの間の相互作用の強度を測定するために、これらの種を、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９に接触させる。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０ドメインと融合されたＧＦＰ  Ｓ１１ドメインとの係合は、増大し、そして上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光よりも明るく、それによって、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用を増強することを示す。一方で、ＥＬＩＢｉが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光よりもぼんやりとしており、それによって、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用を低下させることを示す。ＥＬＩＢｉが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光と同じであり、このことは、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用に対して効果を有さないことを示す。
【０１４３】
（実施例２７．細胞小器官特異的なタンパク質相互作用を検出するための細胞小器官の着色（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｐａｉｎｔｉｎｇ））
これは、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９が、局在タグを使用して特定の細胞区画を指向することを除いて、実施例１８および実施例２１（前出）に類似する。したがって、特定の区画内で生じる相互作用を、ＧＦＰ  １−９をその区画に送ることによって、特異的に検出する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）をＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。上記相互作用が特定の区画Ｃ内で生じるか否かを決定するために、ＧＦＰ  １−９を、区画ＣへのＴ−ＧＦＰ  １−９またはＧＦＰ  １−９−Ｔの局在を指揮する局在タグＴと融合する。ＸおよびＹが、区画Ｃにおいて相互作用する場合、Ｔ−ＧＦＰ  １−９  またはＧＦＰ  １−９−Ｔが区画Ｃを指向するときに、区画Ｃは、ＸとＹとの融合種と、上記アッセイ鎖Ｔ−ＧＦＰ  １−９またはＧＦＰ  １−９−Ｔとを接触させ、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖と、ＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成することで蛍光になる。このことは、ＸおよびＹＬＩＢｉが区画Ｃにおいて相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、区画Ｃにおいて相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、区画Ｃ内で係合されず、Ｔ−ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントまたはＧＦＰ  １−９−Ｔアッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、区画Ｃにおいて弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。複数の区画を、異なる色のＧＦＰ  １−９によってタグ化し得、１つより多い区画がＧＦＰ  Ｓ−１０およびＧＦＰ  Ｓ−１１と融合された潜在的な相互作用タンパク質ＸおよびＹについてモニタリングされるようにする。例えば、Ｙ６６Ｗシアン変異体を含むＧＦＰ  １−９のシアン改変体は、公知のゴルジ体標的性融合シグナルを使用して、ゴルジ体を標的とし得る。同時に、Ｙ６６を含むＧＦＰ  １−９の緑色バージョンは、融合するミトコンドリア標的性ドメインを使用して、ミトコンドリアを標的とし得る。シアン蛍光の量および緑色蛍光の量のモニタリングは、それぞれ、ゴルジ体およびミトコンドリア内で生じる、タンパク質ＸとＹとの間の相互作用の量を報告する。
【０１４４】
（実施例２８．エフェクター媒介性の細胞小器官特異的なタンパク質相互作用を検出するための、細胞小器官の着色）
これは、実施例２０および実施例２５（上記）に関し、ここでＧＦＰ  １−９のスペクトル的に異なる改変体は、局在タグを使用して１つ以上の特定の細胞区画を指向する。特定の区画内で生じる、ＧＦＰ−Ｓ１０およびＧＦＰ−Ｓ１１によって各々標識したタンパク質ＸとＹとの間の相互作用を、その区画を指向するＧＦＰ  １−９のスペクトル特徴によって、特異的に検出する。各区画内の上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９、およびＧＦＰ  １−９の各スペクトル改変体について記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。そのエフェクター分子Ｅは、低分子（例えば、薬物、ホルモン、またはペプチド）、または大きい分子（例えば、タンパク質または高分子複合体）であり得る。次にそのエフェクター分子Ｅを、そのアッセイを実施する細胞または区画に接触させ、そして上記融合タンパク質のドメインＸとドメインＹとの相互作用の効率を、その細胞区画を標的とするＧＦＰ  １−９のスペクトル的に異なるバージョンの各々について評価する。Ｅが、指定された細胞区画内で上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光より明るい。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光よりぼんやりしている。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光と同じである。標的とされた各区画内での補完の効率を、その区画を標的とするＧＦＰ  １−９改変体の蛍光特徴をモニタリングすることによって評価する。例えば、ＸおよびＹは、ゴルジ体およびミトコンドリア内で相互作用することが公知のタンパク質であり得る。シアンＧＦＰ  １−９は、ゴルジ体を標的とし得、そして緑色ＧＦＰ  １−９は、ミトコンドリアを標的とし得る。種々のエフェクター薬物を、ミトコンドリアと比較して、ゴルジ体内でのＸおよびＹの補完を増加させる薬物について試験し得る。したがって、所望の効果を有する薬物は、ゴルジ体において補完を増加させ、効果を有さなかった薬物、またはミトコンドリアと比較して、ゴルジ体内でのＸおよびＹの補完を低下させた薬物と比較して、シアン蛍光  対  緑色蛍光の増大した比をもたらす。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。
【０１４５】
（実施例２９．結合リガンド−抗原相互作用の操作）
この実施例は、実施例１８および実施例１９と機能的に類似する。ＧＦＰ  １０を、融合構築物ＧＦＰ  Ｓ１０−ＢまたはＢ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、結合リガンドＢ（例えば、抗体）に融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質抗原Ａに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ａ、Ａ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｂ、Ｂ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることが、明らかである。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。抗体または結合リガンドＢ、および抗原Ａが相互作用し、そしてそれらが、互いと結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、このことは、ＢおよびＡが相互作用することを示す。ＢおよびＡが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４６】
（実施例３０．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する結合リガンドの同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、遺伝子によりコードされる抗原Ａに融合する。Ａとの潜在的な結合リガンドを含むランダムライブラリーＢＬＩＢを、ＢＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−ＢＬＩＢ、ＢＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ａ、Ａ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてそのタンパク質を、ＢＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉ）をＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いと結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、このことは、ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４７】
（実施例３１．競合性結合リガンドを使用する、結合リガンド選択のストリンジェンシーの増大）
この実施例は、実施例２９の延長である。この実施例において、競合的結合リガンドＢｃを、区画内で同時発現させる。Ｂｃは、抗原Ａに対する結合に関してＢＬＩＢと競合する。Ｂｃを、ＧＦＰフラグメントタグと融合せず、したがってＢｃによるＡの結合は、ＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのメンバーによるＡの結合を妨げる。したがってＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０におけるＡと、Ｂｃとの相互作用がＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉの置換をもたらすので、Ｂｃは、蛍光補完を低下させ、係合されないＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１を生じ、ＧＦＰ  １−９との補完を非効率的にする。Ｂｃより強力にＡに結合するＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのメンバーのみが、Ｂｃを置換し得、ＡとＢＬＩＢｉとの相互作用をもたらし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０ドメインと融合されたＧＦＰ  Ｓ１１ドメインとを係合し、このことは、ＧＦＰ  １−９との増大した蛍光補完をもたらす。Ｂｃが、例えば、無水テトラサイクリン誘導性ｔｅｔプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０およびＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのように同じプロモーターエレメントから発現され得る一方で、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターのような別個の誘導性プロモーターエレメントから発現され得る。ｔｅｔプロモーター構築物を逐次的に発現し、次いで無水テトラサイクリンを除去し、次いでＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントのその後の発現を行なうことは、Ｂｃ−抗原相互作用より厳密であり、かつ可溶性でもある結合リガンド−抗原相互作用因子を検出する。
（実施例３３：再構成のための相互作用ドメインを必要とする可溶性の非変動性酵素レポータータンパク質の操作）
先に記載されたスプリットＤＨＦＲフラグメントは、折り畳みが乏しく、凝集し、したがって不溶性の凝集体をする（ＵＳＰＴＯ番号６，４２８，９５１を参照のこと）。その中で、Ｍｉｃｈｎｉｃｋらは、相互作用ドメインに融合したＤＨＦＲのフラグメントの操作、およびＤＨＦＲのより良好な折り畳みのバージョンを示す増加した抗生物質耐性についての選択によって、ＤＨＦＲのより良好な折り畳みのフラグメントを選択するストラテジーを記載する。このアプローチは、上記フラグメンが可溶性であることを保証しない。なぜなら上記フラグメントは、継続した細胞生存を与えるために同時発現されなければならないからである。融合された相互作用ドメインにも依存するＤＨＦＲの非変動性の可溶性フラグメントを選択するために、ＤＨＦＲ活性に特異的なアッセイを使用することを除き、特に、上記フラグメントが、安定な可溶性改変体について選択するために別々に発現される連続誘導様式を使用して、上記の実施例１５および実施例１６において使用した同じアプローチに従う。さらに、マルチウェル培養プレートにおいて、各々がＤＨＦＲの改変体を含む小さい培養物を、増殖させる。ＤＨＦＲ活性に対する色素形成基質を使用する種々の活性アッセイは、当該分野において周知であり、そしてこれらは、補完が生じている場合を決定するために使用される。第１の工程において、ＤＨＦＲの自己補完性フラグメントを、インビボの細胞生存のための融合された相互作用ドメインを有さないＤＨＦＲフラグメント変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって選択し得る。上記フラグメントを、ＤＨＦＲの凝集し易い改変体に融合した場合に低下した可溶性を示すタンパク質（凝集おとりドメイン）に融合し得、それによってＤＨＦＲフラグメントの可溶性改変体を選択するストリンジェンシーを増大させる。所望される場合、上記ＤＨＦＲフラグメントの１つ以上（融合されたおとりドメインを有するか、またはそれを有さない）をまた、ＧＦＰマイクロドメインに融合し得、そしてＤＨＦＲフラグメント変異体の可溶性を、連続誘導プロトコルを用いたＧＦＰアッセイフラグメントを使用するインビトロの高スループット様式においてアッセイし、ＤＨＦＲフラグメントを、実施例９および実施例１０にあるようなＧＦＰスプリット補完レポーターシステムを使用して増加した可溶性について進化させるための標的タンパク質として処理する。一旦可溶性の候補を見出すと、それらを、細胞生存のための同時発現を行なうか、またはインビトロで別々に発現した候補の可溶性の進化したＤＨＦＲフラグメントを混合し、そして再構成され、最適化された可溶性ＤＨＦＲフラグメントが、補完後に依然として酵素的に活性なＤＨＦＲを提供することを確認するために、当該分野において周知であるインビトロＤＨＦＲ酵素活性アッセイを使用することによってスクリーニングし得る。これらのフラグメントは、同時かまたは別々に発現され得、可溶性のままであり、そして融合されたポリペプチドの可溶性および折り畳みを変動させない。これは、タンパク質フラグメントの再構成に基づく一般的に有用なタンパク質−タンパク質相互作用検出システムについての、重要な必要条件である。しかし、これらのフラグメントは、融合された相互作用ドメインに対する必要性を伴わずに自己会合する。タンパク質−タンパク質相互作用検出因子として有用であるために、上記フラグメントは、必ず、再構成のための融合された相互作用ドメインを必要とする。１つのアプローチでは、融合された相互作用ドメインの非存在下において、可溶性の操作されたフラグメントＤＨＦＲ  Ｆ１を、一定に保ち、そしてそのフラグメントＤＨＦＲ  Ｆ１を、フラグメントＤＨＦＲ  Ｆ２の改変体のライブラリーをスクリーニングするためのアッセイフラグメントとして使用して、自発的な補完およびＤＨＦＲ活性の形成を排除または廃絶するＦ２の変異を同定する。同様に、一定の変異していないＤＨＦＲ  Ｆ１を、ＧＦＰ  ｓ−１０に融合し得、変異したライブラリーＤＨＦＲ  Ｆ２を、ＧＦＰ  ｓ１１に融合し得、そしてその変異したライブラリーＤＨＦＲ  Ｆ２を、アッセイフラグメントＧＦＰ  ｓ１−９の補完の低下によって例示される、ＤＨＦＲフラグメントの自発的な会合を廃絶するＤＨＦＲ  Ｆ２における変異を同定するためにＧＦＰ  ｓ１−９を使用してスクリーニングした。広いライブラリーを、例えば、非蛍光性である多数の改変体（すなわち、＞１０５）を見出し、そして収集するためにフローサイトメトリーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてスクリーニングし得る。これらの非相互作用ＤＨＦＲ改変体は、折り畳みの欠損を有する変異体、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ補完が不可能な変異体、不溶性である変異体などのような望ましくない改変体を含み得る。ＤＨＦＲ  Ｆ２  ＧＦＰ  ｓ−１１融合物を、それらが依然として可溶性であることを確認するために、ＧＦＰ  ｓ１−１０アッセイフラグメントを使用してインボビでスクリーニングし得、したがってＤＨＦＲ  Ｆ１と自発的に集合することもできない可溶性ＤＨＦＲ  Ｆ２変異体を、同定する。次いで、自発的に会合しない可溶性ＤＨＦＲ  Ｆ２改変体のライブラリーを、公知の相互作用タンパク質（例えば、コイルドコイル）を有する融合物として発現される変異体を生じるベクターにサブクローニングする（このようなコイルドコイルは、Ｈｕ、２００２、前出；Ｇｈｏｓｈら、２０００、前出に記載される）。また、上記ライブラリーを、相互作用タンパク質にのみ融合した場合に、そのまま補完する変異体を同定するために、フローサイトメトリーによってスクリーニングするか、プレート上でスクリーニングする。次いで二次的なＤＨＦＲ酵素活性スクリーニングを、上記可溶性ＤＨＦＲフラグメントがまた、相互作用タンパク質に融合した場合に酵素活性を保持することを決定するために、インビトロで適用し得る。必要な場合、最適物の最終的なライブラリーを、そのまま、補完のための融合された相互作用ドメインに対する依存性を確かめるために、相互作用タンパク質を含まないベクターにサブクローンし得る。フラグメントの安定性および可溶性をさらに改良するための変異のさらなるラウンドを、必要とされる場合、実施例３および実施例４（上記）にあるように行ない得る。さらに、最適以下の凝集し易いＤＨＦＲフラグメントに融合した場合に、減少した可溶性を有するおとりタンパク質を、この本発明の実施例（実施例３３）の融合物に組み込んで、自発的な会合を排除する変異体についてスクリーニングする間の、可溶性についてのストリンジェントな選択を維持し得る。さらに、相互作用ＤＨＦＲフラグメントの間の界面に特異的に関与するアミノ酸を、当該分野において周知の方法であるプライマー特異的変異誘発（変質したオリゴドーピング）（定義、変異誘発の方法、前出を参照のこと）を使用し、全体として、骨格と比較して上昇したレベルの変異誘発の標的とし、それによってＤＨＦＲフラグメントの間の相互作用がそれらのＤＨＦＲフラグメントの折り畳みに悪影響を与えることなく減少し得る見込みを増大し得る。ＤＨＦＲの界面のアミノ酸を、三次元構造の検査（Ｆｉｌｍａｎ、１９８２、Ｏｅｆｎｅｒ、１９８８、Ｂｙｓｔｒｏｆｆ、１９９１）によって容易に同定し得る。上記のアプローチを、補完のための融合された相互作用ドメインにも依存する可溶性フラグメント改変体を同定するために、他の酵素タンパク質（例えば、スプリットβ−ラクタマーゼまたはスプリットβ−ガラクトシダーゼ）に適用し得ることは、当業者にとって明らかである。
【０１４８】
（実施例３４：インビトロ相互作用アッセイ）
（マイクロＧＦＰタグ化タンパク質の発現）
１０−ＦＲＢタンパク質融合物およびＦｋｂｐ１２−１１タンパク質融合物を、それぞれ、Ｃ−６ＨＩＳ  ｐＥＴ  ２８ベクターおよびＮ−６ｈｉｓ  ｐＥＴ  ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）から発現させた。各構築物を発現するＢＬ２１（ＤＥ３）の５０ｍｌ培養物を、ＯＤ６００  約０．５まで増殖させ、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧと一緒に２７℃にて５時間インキュベートした。その培養ペレットを、１ｍｌ  ＴＮＧ中に再懸濁し、そして超音波処理した。１０−ＦＲＢの封入体を、０．５ｍｌの９Ｍ尿素中で変性し、そして５ｍｌのＴＮＧ緩衝液中で再折り畳みした。１０−ＦＲＢの乏しい可溶性は、予想された。なぜなら、同様の条件下で発現したＦＲＢ−ＧＦＰ融合物が主として不溶性であり、そして単独で発現したＦＲＢが著しく不溶性であるからである。可溶性Ｆｋｂｐ１２＿１１融合物を、さらに精製することなく使用した。ｐＴｅｔベクターに由来するバイシストロニック構築物を使用して、１０−ＦＲＢおよびＦｋｂｐ１２−１１をそれぞれ、独立したリボソーム結合部位から同時発現させた。代替的なトポロジー１０−Ｆｋｂｐ１２＋ＦＲＢ−１１を、同様に構築した。構築物を、上記と同じ条件を使用したが、誘導剤として３００ｎｇ／ｍｌ無水テトラサイクリンを使用して誘導した。可溶性フラクションを、補完アッセイのために使用した。
【０１４９】
（補完アッセイおよびラパマイシンを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の誘導）
異なる構築物を、大フラグメント１−９ｏｐｔの存在下で、１００ｎＭラパマイシンを添加したか、またはそれを添加せずに、補完について試験した。２０μｌの同時発現した１０−ＦＲＢおよびＦｋｂｐ１２−１１可溶性フラクション（図２８、行１）、または２０μｌの同時発現した１０−Ｆｋｂｐ１２およびＦＲＢ−１１（図２８、行２）を、８０μｌの１−９ｏｐｔと混合した。個別に発現したタンパク質（図２８、行３）については、２０μｌの再折り畳みした１０−ＦＲＢおよび１０μｌの可溶性Ｆｋｂｐ１２＿１１を、７０μｌの１−９ｏｐｔと混合した。１つの例において、ラパマイシンを、添加しなかった（図２８、「−」を付した第１の列）。別の例において、１００ｎＭのラパマイシンを、添加した（ＤＭＳＯに希釈した１０μｌの１μＭストック溶液、図２８、「＋」を付した第２の列）。一晩インキュベートした後、そのプレートを、写真撮影（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）した（図２８）。最終的な蛍光値を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）と一緒に（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を使用して、一晩インキュベートした後に測定した（図２９）。
【０１５０】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参考として援用されることが示されたかのように、本明細書中に参考として援用される。
【０１５１】
本発明は、本明細書中に開示された実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、それらの実施形態は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価であるあらゆる実施形態は、本発明の範囲内である。本発明の方式および方法に対する種々の改変は、本明細書中に記載されるものに加えて、上述の記載および教示から当業者に明らかとなり、そしてそれらの改変は、同様に、本発明の範囲内に含まれることが、意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。
【０１５２】
（引用した文献）
【０１５３】
【化１０】
2008521447.tif 000015
【０１５４】
【化１１】
2008521447.tif 000016
【０１５５】
【化１２】
2008521447.tif 000017
【０１５６】
（配列表）
【０１５７】
【化１３】
2008521447.tif 000018
【０１５８】
【化１４】
2008521447.tif 000019
【０１５９】
【化１５】
2008521447.tif 000020
【０１６０】
【化１６】
2008521447.tif 000021
【０１６１】
【化１７】
2008521447.tif 000022
【０１６２】
【化１８】
2008521447.tif 000023
【０１６３】
【化１９】
2008521447.tif 000024
【０１６４】
【化２０】
2008521447.tif 000025
【０１６５】
【化２１】
2008521447.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの概略図を示し、これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能なｐＰＲＯＴｅｔ．６ｘＨＮベクターの改変バージョンである。クロラムフェニコール耐性遺伝子が、ｐＰＲＯｌａｒ耐性マーカーのカナマイシンプロモーターの制御下のスペクチノマイシン耐性マーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡからのｐＰＲＯｌａｒプラスミド）によって置換された。同一シストロン上に、Ｔ０転写終結配列の上流のテトラサイクリンリプレッサーがコードされている。翻訳されるリプレーサーの量は、ＳａｃＩの下流の弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列によって調節される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、操作されたｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの異なる要素を示す。太字＝ＮｃｏＩ  ＣＣＡＴＧＧ、およびＫｐｎＩ  ＧＧＴＡＣＣによって隣接される、ｔｅｔプロモーター下の発現遺伝子のためのｖ１クローニングカセット。ボックス１＝ＳｐｅｃＲ−ｔｅｔＲシストロンのためのＴ０転写ターミネーター；ボックス２＝ｔｅｒＲリプレッサー遺伝子；ボックス３＝ｔｅｔＲ翻訳を制御するＲＢＳ；ボックス４＝スペクチノマイシン（ｓｐｅｃＲ）遺伝子；ボックス５＝ＰＲＯＬＡＲベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からのカナマイシンプロモーター要素。
【図２】図２は、スプリットＧＦＰ補完の原理を示す。目的のタンパク質（Ｘ）が、柔軟なリンカー（Ｌ）を経由して小ＧＦＰフラグメント（β鎖１１、残基２１５〜２３０）に融合される。補完ＧＦＰフラグメント（β鎖１〜１０、残基１〜２１４）は別個に発現される。単独で蛍光を発するフラグメントはない。混合されるとき、小ＧＦＰフラグメントおよび大ＧＦＰフラグメントは自然に会合し、ＧＦＰ折り畳みおよび蛍光発色団の形成を得る。誤折り畳みまたは凝集のような、小ＧＦＰタグを接近させないプロセスは、補完を防ぎ得る。
【図３】図３は、１１のβ鎖のＧＦＰファミリーメンバーのトポロジー的二次構造図を示す。（Ａ）アミノ酸の鎖および番号付け。丸で囲った番号は、鎖間の曲がりの指標（およびこのタンパク質を分離するために好ましい部位）に対応する。塗りつぶしの丸は、折り畳みレポーター変異であり、そして白丸は超折り畳みＧＦＰ変異である。（Ｂ）は、１１のβ鎖の番号付けの慣例を示す。（Ｃ）は、短い柔軟性のリンカーによってＮ末端およびＣ末端を連結することにより作製され、そしてアミノ酸１７３における新たな開始コドン、およびアミノ酸１７２の後の停止コドンを提供する、円順列変異体ＧＦＰを示す。
【図４】図４は、スプリット位置１５７または１７２における示されたＧＦＰフラグメント（すなわち、１〜１５６＋１５７〜２３８および１〜１７１＋１７２〜２３８）による、プレート上のＥ．ｃｏｌｉコロニー中の適合プラスミドから同時発現された、インビボ補完の蛍光イメージを示す。左のカラムは、折り畳みレポーターＧＦＰ由来のフラグメントを、右のカラムは、超折り畳みＧＦＰ由来の同じフラグメントを示す。予期されるように、この超折り畳みフラグメントは、確かに働き、そしてより明るいコロニーを与え、超折り畳みＧＦＰ  対  折り畳みレポーターＧＦＰの改良された折り畳みと一致する。
【図５】図５は、ＧＦＰ１−１０改変体のインビトロ補完効率を示す。野生型ＧＦＰ１１に融合された１ｍｇ／ｍｌの可溶性亜硫酸レダクターゼを含む１８０μｌの緩衝液の添加後の、１ｍｇ／ｍｌの再折り畳みされた超折り畳みＧＦＰ１−１０の２０μｌ（下のトレース）、または等量の可溶性最適化ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴフラグメント（上のトレース）の補完についての蛍光進行曲線。挿入画は、ＧＦＰ１−１０改変体のインビボ補完を示す。野生型ＧＦＰ  Ｓ１１と融合された亜硫酸レダクターゼとともに、超折り畳みＧＦＰ（上）、または折り畳みレポーターＧＦＰ（下）からの同時発現するＧＦＰ１−１０ニトロセルロースメンブレン上のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーの蛍光イメージ。
【図６】図６は、単独もしくはＧＦＰ  Ｓ１１野生型（ＷＴ）へのＮ末端融合としてタンパク質ヘクスロースホスフェートシンターゼ（ＨＰＳ）、または３つのＧＦＰ  Ｓ１１最適物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）に融合されたＨＰＳを発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の可溶性フラクション（Ｓ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物は不溶性であり、その一方、ＨＰＳ単独は、約６０％可溶性であることに注目のこと。
【図７】図７は、組織培養プレート中、インビロで過剰のＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）の添加後の、亜硫酸レダクターゼ（５０ｐｍｏｌ）に融合された３つのＧＦＰ  Ｓ１１変異体Ｍ１、Ｍ２およびＭ３の蛍光補完動力学的トレースを示す。各アッセイの最終容量は２００μｌであった。
【図８】図８は、３つの異なるＧＦＰ１−１０構築物を用いる逐次的（左カラム）または同時誘導プロトコル（右カラム）の効果を示す。ＧＦＰ１−１０構築物を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンの３つの行の蛍光イメージは、漸次良好な性能および可溶性を有し：折り畳みレポーター（ＦＲ、第１の行）、超折り畳み（ＳＦ、第２の行）、または最適化ＧＦＰ１−１０改変体（ＯＰＴ、第３の行）である。超折り畳みＧＦＰ１−１０は、単独で発現されるとき不溶性である。第１のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１融合物の発現が続くＧＦＰ１−１０の一時的発現。第２のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１野生型とのＧＦＰ１−１０の同時発現。超折り畳みＧＦＰ１−１０は不溶性であり、そして細胞は、一時的誘導プロトコル後、かすかに蛍光を発し、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１−１０が、亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物の発現の前に凝集し得、補完効率を減少するからである。同時発現は、明るい細胞を与え、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１−１０と亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１との間の結合および補完が迅速に起こり、ＧＦＰ１−１０を誤折り畳み、および凝集からレスキューするためである。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを発現する細胞は、これら構築物が逐次的に発現されるか、または同時発現されるか否かにかかわらず明るい。
【図９Ａ】図９は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグフラグメントおよびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。０．１〜２００ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、８００ｐｍｏｌのＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１５分後、各溶液について測定された蛍光。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１時間後、各溶液について測定された蛍光。
【図９Ｂ】図９は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグフラグメントおよびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。０．１〜２００ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、８００ｐｍｏｌのＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１５分後、各溶液について測定された蛍光。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１時間後、各溶液について測定された蛍光。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に融合された亜硫酸レダクターゼの５０ｐｍｏｌ、２５ｐｍｏｌ、１２．５ｐｍｏｌ、６．２５ｐｍｏｌ、３．１３ｐｍｏｌ、および１．５６ｐｍｏｌの補完の進行曲線を示す。これらデータは、小定数を引き、そしてＥＸＣＥＬデータ分析ツールＳｏｌｖｅｒ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）を用いて非線形最小自乗法によって算出された、スケーリング因子を適用することにより５０ｐｍｏｌの進行曲線に適合された。優れた重ね合わせは、この進行曲線の形状が、タグ化タンパク質の濃度、または非結合ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴフラグメントのプールの枯渇に依存しないことを示す。
【図１１】図１１は、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３でタグ化されたレポーターＧＦＰを折り畳みすることによる、Ｔａｌｏｎ樹脂−結合６ＨＩＳ  ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴへの結合およびその補完を示す。（１）結合した６ＨＩＳ  ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴをもつＴａｌｏｎ樹脂、（２）融合したＣ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を経由する折り畳みレポーターＧＦＰの結合によるビーズ−結合蛍光における迅速な増加、（３）補完に起因するゆっくりとした蛍光形成。
【図１２】図１２は、補完反応に対する尿素濃度の影響を示す。反応は、２Ｍ以上の尿素で停止される。
【図１３】図１３は、補完反応に対するｐＨの影響を示す。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加６時間後の亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に対  する最終蛍光のｐＨ依存性。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加６時間後の合成ペプチドＧＦＰ  Ｓ１１の最終蛍光のｐＨ依存性。蛍光補完は、ｐＨ６．５未満で非効率的に見える。
【図１４】図１４の棒グラフは、スプリットＧＦＰシステムを用いる、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグをもつ１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質のインビトロタンパク質定量を示す（前述、表３を参照のこと）。ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを用いる可溶性（黒い棒）および非折り畳みペレットフラクション（灰色の棒）のＧＦＰフラグメント補完アッセイ蛍光。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、対応する可溶性（Ｓ）、およびペレットフラクション（Ｐ）を示す。タンパク質番号８、酒石酸デヒドロゲナーゼ−βサブユニットは、約１３ｋＤの第２のより低いバンドを示すことに注目のこと。
【図１５】図１５は、スプリットＧＦＰアッセイシステムを用いるインビボ可溶性および発現スクリーニングを示す。ｔｅｔ−プロモータープラスミドからのＮ−末端６ＨＩＳタグおよびＣ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグとともに発現された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（表３、前述を参照のこと）は、ＧＦＰ−１−１０  ＯＰＴを発現するｐＥＴプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）株中にクローン化された。タグ化構築物およびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（上）の同時誘導後、またはタグ化構築物、次いでＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（逐次的誘導、中央）の発現が続くタグ化構築物の一時的発現のプレート上のコロニーの蛍光イメージ。液体培養中で逐次的に誘導された細胞からのＴａｌｏｎ樹脂ビーズ−結合可溶性（Ｂ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下）。付随的に結合されたＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（見かけの分子量約２９ｋＤ）は矢印によって示される。ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（タンパク質番号７）は部分的に可溶性であることに注目のこと（Ｔａｌｏｎ樹脂−結合フラクション中のＧＦＰ１−１０に対応するバンドの僅かに下のバンドを参照のこと）。ポリスルフィドレダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物（表３、前述を参照のこと）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、そしてこのタンパク質の良好な発現にもかかわらず同時発現の間に総細胞蛍光を減少する強い赤色のコロニーを生成した。
【図１６】図１６は、ＧＦＰ  Ｓ１０−１１  ＯＰＴタグフラグメントおよびＧＦＰ１−９  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０−１１  ＯＰＴ融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、２５０μＭのＧＦＰ１−９  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。蛍光は、ＧＦＰ１−１０の添加６時間後、各溶液について測定された。ＧＦＰ１−９  ＯＰＴの濃度は制限的であるので、蛍光は、約２５０μＭを超える亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０−１１でプラトーになる。
【図１７】図１７は、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの２つのドメイン（鎖１０および鎖１１）の間の融合物として発現され、そしてＧＦＰの第３のドメインによって検出されるサンドイッチタグフォーマットの原理を示す。（ａ）補完は、これらタグ鎖がインタクトな標的タンパク質Ｘによって両者連結されるとき、効率的に起こる。（ｂ）補完は、これらタグ鎖が分離されると非効率的であり得る。
【図１８Ａ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１−９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。
【図１８Ｂ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１−９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。
【図１９】図１９は、参照配列（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）、図１８Ａからの最適配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）、および８つの最適物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の配列を示す。開始配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の可溶性を改良する標的鎖ＧＦＰ  Ｓ１０中の変異は、赤色の強調表示で示される。８つの最適物配列の各々は、ＨＰＳコード配列を通って続き、そしてＢａｍＨＩ部位で再開し、柔軟なリンカー配列およびＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５が続く（リスト中の第２の配列の端部を参照のこと）。
【図２０】図２０は、（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−ＧＧＧＳ−ＮｅｄＩ−Ｘ−ＢａｍＨＩ−ＧＧＧＳ−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をもつｐＴＥＴベクターのＮｅｄＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位中にクローン化され、そしてｐ１５オリジンをもつｐＥＴ２８ベクター上にＧＦＰ１−９  ＯＰＴを含むＢＬ２１（ＤＥ３）株中に形質転換された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍコントロールタンパク質Ｘのインビトロおよびインビボ補完アッセイを示す。インビトロアッセイには、液体培養がＡｎＴＥＴでのみ誘導された。（ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴでアッセイされた２０μｌの可溶性アリコート（ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート（ｃ）ＧＦＰ１−９  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート。（ｅ）ＡｎＴＥＴ試薬を用いるｐＴＥＴからのサンドイッチタグ構築物の一時的誘導、次いでＩＰＴＧを用いるＧＦＰ１−９の誘導後のＥ．ｃｏｌｉの蛍光イメージ。
【図２１】図２１は、従来の乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントを使用する、ＧＦＰフラグメントの同時発現の間の、２体スプリットＧＦＰ補完を示す。タンパク質のほとんどは、凝集され（Ａｇｇ．経路）、そして少量の誤折り畳みのタンパク質は、レスキューされ、そしてシャペロンによって一過性に可溶性にされる（Ｃｈａｐ．経路）。（ａ）において、相互作用タンパク質ドメインは存在せず、したがって非常に少ないそのタンパク質は、シャペロン媒介経路によって補完し得る。なぜならそのフラグメントが相互作用ドメインによって１つに保たれず（所与のフラグメントがシャペロンによって可溶化された後に）、それが第２の直近に再折り畳みされたフラグメントと相互作用しないようであるからである。その係合されていないフラグメントは、それらが生産的に相互作用し得る前にシャペロンから放出された後、再凝集するようである。（ｂ）において、相互作用ドメインを付加する工程は、それらのフラグメントを、それらがシャペロンによって再折り畳みされる間に近くに保ち、シャペロンによって一過性に可溶化される間にそれらのフラグメントが互いに到達する確率を上昇させることによって、補完されたタンパク質の量を増加させ得る。したがって、存在する乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントは、そのタンパク質のほとんどが、誤折り畳みされ、そして凝集しても、蛍光の形成のために相互作用ドメインを必要とするようである。
【図２２】図２２は、従来の乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントを使用する、ＧＦＰフラグメントの連続的な発現または異なる分離した区画における発現の間の、２体（ｔｗｏ−ｂｏｄｙ）スプリットＧＦＰ補完を示す。図２１にあるように、タンパク質のほとんどは、凝集され（Ａｇｇ．経路）、そして少量の誤折り畳みのタンパク質は、レスキューされ、そしてシャペロンによって一過性に可溶性にされる（Ｃｈａｐ．経路）。（ａ）において、相互作用タンパク質ドメインは存在せず、したがって非常に少ないそのタンパク質は、シャペロン媒介経路によって補完し得る。なぜならそのフラグメントが相互作用ドメインによって１つに保たれず（所与のフラグメントがシャペロンによって可溶化された後に）、それが第２の直近に再折り畳みされたフラグメントと相互作用しないようであるからである。その係合されていないフラグメントは、それらが生産的に相互作用し得る前にシャペロンから放出された後、再凝集するようである。（ｂ）において、相互作用ドメインを付加する工程が、補完されたタンパク質の量を増加させることができなくても、そのフラグメントは、同時に発現されないか、または異なる区画において発現されるので、相互作用ドメインを有する場合でさえ、シャペロンによって一過性に可溶化される間にそれらのフラグメントが互いに到達する確率を劇的に減少させる。したがって、存在する乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントは、相互作用ドメインと融合される場合でさえ、同時に発現されるか、または同時に折り畳まれるときに補完し損なう。
【図２３】図２３は、可溶性の、非変動性ＧＦＰフラグメントを見出すためのストラテジーを示し、そのＧＦＰフラグメントはまた、再構成および折り畳みに相互作用ドメインを必要とする。（ａ）存在するＧＦＰフラグメントＦ１およびＦ２は、乏しい折り畳みであり、そして補完し損なう。（ｂ）Ｆ１およびＦ２は指向性進化によって操作されて、可溶性のままであり、凝集せず、そして融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、したがって、自発的な会合が可能である良好な折り畳みのバージョンを見出す。これらの変異は、白色の点に示される。（ｃ）において、自発的な会合を減少させるか、またはそれを排除するさらなる変異が、見出される（黒色の点）。もはや蛍光性ではない改変体の大プールが、フローサイトメトリーまたはプレートに対するスクリーニングによって細胞から単離される。（ｄ）これらの改変体は、ベクターにサブクローニングされ、そしてベクターは、相互作用ドメインに融合される場合にのみ、結合し、そして折り畳まれ蛍光性になる非蛍光変異体のサブセットを見出すために使用され得る融合された公知の相互作用タンパク質ドメイン（例えば、コイルドコイル）と一緒に発現される。これは、融合されたドメインの存在下においてさえ、誤折り畳みされるかまたは補完が不可能な、工程（ｃ）における偽陰性を排除する。
【図２４】図２４は、可溶性の、非変動性ＧＦＰフラグメントを見出すための代替的なストラテジーを示し、そのＧＦＰフラグメントはまた、再構成および折り畳みに相互作用ドメインを必要とする。（ａ）存在するＧＦＰフラグメントＦ１およびＦ２は、乏しい折り畳みであり、そして補完し損なう。（ｂ）Ｆ１およびＦ２は指向性進化によって操作されて、可溶性のままであり、凝集せず、そして融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、したがって、自発的な会合が可能である良好な折り畳みのバージョンを見出す。これらの変異は、白色の点に示される。（ｃ）において、自発的な会合を減少させるか、またはそれを排除するさらなる変異が、見出される（黒色の点）。その改変体は、小エフェクターの存在下において相互作用するドメインに融合される。そのエフェクターの非存在下で蛍光性ではない改変体の大プールが、フローサイトメトリーまたはプレートに対するスクリーニングによって細胞から単離される。（ｄ）これらの改変体は、次いで、そのエフェクターに曝され、そしてそのエフェクターの存在下において蛍光性になる改変体が、単離される。これらは、結合し、そして折り畳まれて、相互作用ドメインに融合される場合にのみ蛍光性になる。これは、融合されたドメインの存在下においてさえ、誤折り畳みされるかまたは補完が不可能な、工程（ｃ）における偽陰性を排除し、そしてその変異体が工程ｃと工程ｄとの間に新しいベクターにサブクローニングされる必要がないという利点を有する。
【図２５】図２５は、３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１１およびＧＦＰ  ｓ１０が、ドメインＸにおいて係合される場合、それらは、自発的に結合し、そしてＧＦＰ  ｓ１−９と補完し得る。（ｂ）において、ＧＦＰ  ｓ１１およびＧＦＰ  ｓ１０は、係合されず、そしてエントロピーは、効率的な補完には高すぎる。
【図２６】図２６は、タンパク質相互作用を検出するために使用される３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、相互作用タンパク質ＸおよびＹに融合される。ＸとＹとの相互作用の際に、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合され、そしてエントロピーは十分に低められて、蛍光ＧＦＰを産生するための、ＧＦＰ  ｓ１−９との結合および折り畳みを可能にする。（ｂ）において、ＸおよびＹは、第３のタンパク質または標的Ｚと相互作用し、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の係合を引き起こし、そしてそのエントロピーを十分に減少させて、ＧＦＰ  ｓ１−９との効率的な補完および折り畳まれた蛍光ＧＦＰの形成を可能にする。
【図２７】図２７は、エフェクター−誘導タンパク質相互作用を検出するために使用される３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、エフェクターの存在下で相互作用するタンパク質ＸおよびＹに融合される。そのエフェクターの非存在下において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合されず、そしてそのエントロピーは、ＧＦＰ  ｓ１−９との効率的な補完には高すぎる。（ｂ）において、そのエフェクター分子の添加は、ＸおよびＹの結合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を係合し、そしてそのエントロピーは十分に低められて、蛍光ＧＦＰを産生するための、ＧＦＰ  ｓ１−９との結合および折り畳みを可能にする。
【図２８】（記載無し）
【図２９】（記載無し）
【図１Ａ】
2008521447.tif 000027
【図１Ｂ】
2008521447.tif 000028
【図２】
2008521447.tif 000029
【図３】
2008521447.tif 000030
【図３】
2008521447.tif 000031
【図３】
2008521447.tif 000032
【図４】
2008521447.tif 000033
【図５】
2008521447.tif 000034
【図６】
2008521447.tif 000035
【図７】
2008521447.tif 000036
【図８】
2008521447.tif 000037
【図９Ａ】
2008521447.tif 000038
【図９Ｂ】
2008521447.tif 000039
【図１０】
2008521447.tif 000040
【図１１】
2008521447.tif 000041
【図１２】
2008521447.tif 000042
【図１３】
2008521447.tif 000043
【図１４】
2008521447.tif 000044
【図１５】
2008521447.tif 000045
【図１６】
2008521447.tif 000046
【図１７】
2008521447.tif 000047
【図１８Ａ】
2008521447.tif 000048
【図１８Ｂ】
2008521447.tif 000049
【図１９】
2008521447.tif 000050
【図２０】
2008521447.tif 000051
【図２１】
2008521447.tif 000052
【図２２】
2008521447.tif 000053
【図２３】
2008521447.tif 000054
【図２４】
2008521447.tif 000055
【図２５】
2008521447.tif 000056
【図２６】
2008521447.tif 000057
【図２７】
2008521447.tif 000058
【図２８】
2008521447.tif 000059
【図２９】
2008521447.tif 000060
【配列表】
2008521447000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】蛍光タンパク質マイクロドメインを使用するタンパク質−タンパク質相互作用検出システム
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府によって支援された研究または開発の下でなされた発明に対する権利の陳述）
本発明は、米国エネルギー省によってＴｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに授与された、契約番号第Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６の下で政府援助によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＧＦＰおよびその多くの関連する蛍光タンパク質は、現在、薬剤をタグ化するタンパク質として広範に使用される（概説については、非特許文献１を参照のこと）。さらに、ＧＦＰは、末端に融合された試験タンパク質の可溶性レポーターとして用いられている（非特許文献２；「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ」と題する特許文献１）。ＧＦＰ様タンパク質は、相同な、保存された１１のβ鎖「バレル」構造を共有する２５〜３０ｋＤａのポリペプチドの広範なファミリーである。このＧＦＰ様タンパク質ファミリーは、現在、種々のＡｎｔｈｏｚｏａ種およびＨｙｄｒｏｚｏａ種からクローニングされた約１００のメンバーを含み、そして赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質ならびに種々の非蛍光色素タンパク質を含む（Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、前述）。広範な種類の蛍光タンパク質標識アッセイおよび蛍光タンパク質標識キットが市販され利用可能であり、広範なスペクトルのＧＦＰのスペクトル的改変体、およびＤｓＲｅｄおよびその他の赤色蛍光タンパク質（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＧＦＰ様蛍光タンパク質を含む。
【０００３】
ＧＦＰフラグメント再構成システムがタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために主に説明されているが、いずれも、支援されない自己アセンブリを正しく折り畳まれた可溶性でありかつ蛍光性の再構成されたＧＦＰにすることができず、そして一般的なスプリットＧＦＰ折り畳みレポーターシステムは、これらのアプローチから出現していない。例えば、Ｇｈｏｓｈら、２０００は、ＧＦＰ構造のアミノ酸１〜１５７および１５８〜２３８に対応する２つのＧＦＰフラグメントが、個々のフラグメントが逆平行ロイシンジッパーを形成し得るコイルドコイル配列に融合されたとき、インビトロまたはＥ．ｃｏｌｉ中の同時発現により蛍光産物を生じ得たことを報告した（非特許文献３）。同様に、特許文献２は、逆平行ロイシンジッパーを形成し得、ＧＦＰ分子のスプリットフラグメントを接続し得る螺旋コイルの使用を記載している。この特許の明細書は、再構成が、ＧＦＰフラグメントに付着された補完性螺旋コイルの非存在下では生じないことを確立している。特に、この明細書は、ロイシンジッパー対を有さないＧＦＰフラグメントが「任意の緑色コロニーを示さず、従って、インビボおよびインビトロにおけるＧＦＰアセンブリを仲介するためのＮＺジッパーおよびＣＺロイシンジッパーの両方の存在の必要性を強調する」コントロール実験を記載している。
【０００４】
同様に、Ｈｕら、２００２は、相互作用タンパク質ｂＺＩＰおよびＲｅｌが、ＧＦＰの２つのフラグメントに融合されるとき、それらの相互作用によってＧＦＰ再構築を仲介し得ることを示した（非特許文献４）。Ｎａｇａｉら、２００１は、カルモジュリンおよびＭ１３に融合された黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のフラグメントがカルシウムの存在下でＹＦＰの再構成を仲介し得たことを示した（非特許文献５）。このアプローチの改変例で、Ｏｚａｗａらは、カルモジュリンおよびＭ１３を、自己スプライシングインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）ポリペプチド配列を経由して２つのＧＦＰフラグメントに融合し、それによってカルシウムの存在下でＧＦＰフラグメントの共有結合再構成を仲介した（非特許文献６；非特許文献７）。これらの研究者の一人は、次いで、このスプライシングを基礎にしたＧＦＰ再構成システムの培養された哺乳動物細胞への適用を報告した（非特許文献８）。さらに最近、Ｚｈａｎｇら、２００４は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで同時発現されるとき、Ｇｈｏｓｈら、２０００、前述の螺旋コイルスプリットＧＦＰシステムを用いてＧＦＰ（ならびにＹＦＰおよびＣＦＰ）蛍光を再構成し得たことを示し、そしてインビボにおける同時発現を確認することで、このシステムの有用性を示した（非特許文献９）。
【０００５】
前述のＧＦＰ再構成システムは、２つのスペクトル的に異なる蛍光タンパク質タグの使用よりも利点を提供するが、それらは、フラグメントのサイズ、および対応して乏しい折り畳み特徴（Ｇｈｏｓｈら、Ｈｕら、前述）、化学的連結工程の必要性（Ｏｚａｗａら、２００１、２００２、前出）、および検出可能であり、折り畳まれ、かつ蛍光性のＧＦＰ（Ｇｈｏｓｈら、２０００；Ｈｕら、２００１、Ｚｈａｎｇら、２００４、前出）を生成するための同時発現または同時折り畳みによって制限されている。乏しい折り畳み特徴は、フラグメントが同時に発現されるか、または一緒に同時に再折り畳みされる適用にこれらのフラグメントの使用を制限する。このようなフラグメントは、補完の前に個々のフラグメントの長期間の安定性および可溶性を必要とするインビトロアッセイには有用ではない。このようなスプリットタンパク質フラグメントが有用ではないような適用の例は、スプリットタンパク質対のメンバーでタグ化されたポリペプチドの相互作用の定量的分析、そして次いで補完フラグメントの添加によって検出されるポリペプチドの定量であろう。別の例は、タグ化ポリペプチドが同時に発現されないか、または相互作用が低分子エフェクター（例えば、薬物）の添加によって発現後に誘導される場合の、タンパク質相互作用の検出である。
【０００６】
理想的なタンパク質相互作用検出システムは、遺伝子によりコードされ、インビボおよびインビトロの両方で働き、高感度の分析信号を提供し、そして外部の化学的試薬または基質を必要としないであろう。特許文献３において、Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、２００２年８月６日は、検出されたタンパク質−タンパク質相互作用についての種々のスプリットタンパク質補完アッセイを記載する。しかし、指定されたスプリットタンパク質は、折り畳みが乏しく、そして主として不溶性である（ｇｅｌｓ  ｏｆ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、非特許文献３を参照のこと）。その出願において、指定されたＧＦＰのフラグメントもまた、折り畳みが乏しい。特許文献３において、Ｍｉｃｈｎｉｃｋは、スプリットタンパク質のフラグメントの折り畳みを改良するアプローチを記載し、そのスプリットタンパク質は、既知の相互作用ドメインに融合され、そしてそのスプリットタンパク質は、変異され、そしてライブラリーは、細胞内で同時発現し、かつ再構成されたスプリットタンパク質に関連した機能について選択される。ＤＨＦＲは、例示的な場合について使用される。しかし、特許請求の範囲の実施形態において使用される指定のＤＨＦＲフラグメントが、融合されたコイルドコイルを使用して再構築される場合に補完および酵素活性が可能であるにもかかわらず、別個に発現されるときに主として不溶性であるという事実は、補完フラグメントの同時発現に基づくこの指向性進化アプローチが可溶性かつ安定なフラグメントについて選択するために、十分にストリンジェントではないことを論じる。さらに、共有に係る同時係属中である米国特許出願第１０／９７３，６９３号（２００４年１０月２５日出願、Ｗａｌｄｏら）は、不溶性スプリット−ＧＦＰフラグメントの同時発現が補完をもたらし得るが、補完は、そのフラグメントが別個に発現される場合には生じないことを示す。係属中の米国特許出願第１０／９７３，６９３号において、Ｗａｌｄｏらは、スプリットタンパク質のフラグメントの逐次的な発現を使用する指向性進化が、スプリットタンパク質フラグメントのより可溶性で、安定なバージョンを選択するために使用され得ることをさらに示す。この逐次的な発現は、特許文献３（Ｍｉｃｈｎｉｃｋら、２００２年８月６日）によって指定された同時発現に対して著しく異なる。最近、会合する前に凝集せず、かつタグ化ポリペプチドの可溶性を変化させないスプリット蛍光タンパク質タグ化システムが、記載されている（非特許文献１０）。しかし、そのフラグメントは、融合された相互作用タンパク質ドメインの必要性なくして自然に自己会合し得る。会合前に可溶性のままであり、そして融合された標的タンパク質の可溶性を変えず、そしてまた補完のための融合された相互作用ドメインに依存するスプリットＧＦＰフラグメントが必要であり、そして本発明によって取り扱われる。
【特許文献１】米国特許第６，４４８，０８７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，７８０，５９９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４２８，９５１号明細書
【非特許文献１】Ｖｅｒｋｈｕｓｈａら、「ＧＦＰ−ｌｉｋｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｅｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ」、Ｋｅｒａｌａ、Ｉｎｄｉａ、２００３年、第１８章、ｐｐ．４０５−４３９
【非特許文献２】Ｗａｌｄｏら  １９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１７巻、ｐ．６９１〜６９５
【非特許文献３】Ｇｈｏｓｈら、「Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」、２０００年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２２巻、ｐ．５６５８〜５６５９
【非特許文献４】Ｈｕら、「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｂＺＩＰ  ａｎｄ  Ｒｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２年、第９巻、ｐ．７８９〜７９８
【非特許文献５】Ｎａｇａｉら、「Ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｓｅｎｓｅ  Ｃａ２＋．」、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９８巻、ｐ．３１９７〜３２０２
【非特許文献６】Ｏｚａｗａら、「Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．」、２００１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻、ｐ．５１５１〜５１５７
【非特許文献７】Ｏｚａｗａら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｉｍｅ．」、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７３巻、ｐ．５８６６〜５８７４
【非特許文献８】Ｕｍｅｚａｗａ、２００３年、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．、第３巻、ｐ．２２〜２８
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍａｒｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」、２００４年、Ｃｅｌｌ、第１１９巻、ｐ．１３７〜１４４
【非特許文献１０】Ｃａｂａｎｔｏｕｓら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００４年、ＤＯＩ  １０．１０３８／Ｎｂｔ１０４４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、フラグメントの会合を駆動するために融合された相互作用ポリペプチドを必要とし、さらに、可溶性かつ安定であり、そしてそれらが融合されるポリペプチドの安定性を変えない蛍光タンパク質および発色団タンパク質に基づく、タンパク質の標識化および相互作用検出のシステムを提供する。本発明のシステムは、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）由来のフラグメントの種々の組み合わせで例示され、これらは、インビトロおよびインビボの両方で複数のアッセイフォーマットでタンパク質相互作用を検出および定量するために用いられる。
【０００８】
１つの詳細な実施形態では、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１０、アミノ酸１９８〜２１４）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。第２の試験タンパク質Ｙは、ＧＦＰの１６アミノ酸のフラグメント（β鎖１１、アミノ酸２１５〜２３０）に融合され、融合タンパク質の可溶性を変動させないように操作される。ＸとＹとが相互作用する場合、それらは、そのＧＦＰ鎖を接近させ、そしてＧＦＰアミノ酸１〜１９８（鎖１〜９）からなる第３のＧＦＰフラグメントとの補完によって検出される。ＧＦＰ鎖１０および１１がタンパク質ＸおよびＹの相互作用によって１つに保たれる場合、ＧＦＰ鎖１〜９との自発的な会合は、構造的補完、折り畳み、および付随するＧＦＰ蛍光を生じる。
【０００９】
このスプリット−ＧＦＰシステムは非常に単純で、外部試薬を必要とせず、相互作用するタグ化タンパク質の量に比例する高感度分析信号を提供し、融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、そしてインビボおよびインビトロの両方で働く。これらの能力を併せ持った他の現存するタンパク質タグ化および検出システムは存在しない。実施例、後述、に詳細に記載されるように、このスプリット−ＧＦＰシステムを用いて、マルチウェルプレートでタンパク質相互作用を定量し、そして生きている細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞）中でタンパク質発現および可溶性をモニタリングし得る。
【００１０】
本発明のこのスプリットＧＦＰシステムは、タンパク質を定量するため、タンパク質相互作用をアッセイするため、および特定の相互作用するポリペプチドまたはタンパク質の折り畳みおよび可溶性を改良することを狙う指向性進化ストラテジーの成功をモニタリングするためのレポーターアッセイとして特に有用であり、そして結合リガンドおよび標的を含むタンパク質−タンパク質相互作用の強度を操作するために特に有用である。さらに、本発明のこれらシステムは、特に高スループット薬物開発フォーマットにおいて、タンパク質の相互作用を阻害および／または促進する因子をアッセイするために用いられ得る。
【００１１】
折り畳みおよび再構成のために相互作用ドメインを必要とし、かつ可溶性でもあるレポータータンパク質のフラグメントを生成する方法がまた、提供される。これらの方法は、ＧＦＰの操作されたフラグメントの生成によって例示され、そして会合および折り畳みのために融合された相互作用ドメインを必要とする他のＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光タンパク質の可溶性フラグメントを生成するために用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
（定義）
他であることが規定されなければ、本明細書で用いられる当該技術分野のすべての用語、表記およびその他の科学的用語法は、本発明が関係する当業者によって共通に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、共通して理解される意味をもつ用語は、本明細書中で明瞭さのため、および／または容易な参照のために定義され、そしてこのような定義を含めることは、当該技術分野で一般に理解されるものに対して実質的な差異を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中で説明され、または参照される技法および手順は、当業者によって従来の方法を用いて一般に良好に理解され、かつ共通に採用され、これには、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．２００１）に記載された広く利用される分子クローニング方法などがある。認識されるように、市販され利用可能なキットおよび試薬の使用を含む手順は、他であることが注記されなければ、一般に、製造業者の規定したプロトコルおよび／またはパラメーターに従って実施される。
【００１３】
本明細書で用いられるとき、「蛍光タンパク質」は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの構造的改変体（すなわ  ち、円順列変異体（ｐｅｒｍｕｔａｎｔ）、モノマーバージョン）、ＧＦＰの折り畳み改変体（すなわち、より可溶性のバージョン、超折り畳みバージョン）、ＧＦＰのスペクトル的改変体（すなわち、ＹＦＰ、ＣＦＰ）、およびＧＦＰ−様蛍光タンパク質（すなわち、ＤｓＲｅｄ）である。用語「ＧＦＰ−様蛍光タンパク質」は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａ蛍光タンパク質のメンバー、ならびにその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。用語「ＧＦＰ−様非蛍光タンパク質」および「ＧＦＰ−様発色団タンパク質」（または、単に、「発色団タンパク質」または「色素タンパク質」）は、ＧＦＰの１１−β鎖「バレル」構造を共有するＡｎｔｈｏｚｏａ発色団タンパク質およびＨｙｄｒｏｚｏａ発色団タンパク質、およびその構造的、折り畳みおよび構造的改変体をいうために用いられる。ＧＦＰ−様タンパク質はすべて、共通の構造的および機能的特徴を共有し、制限されずに、分子状酸素以外に、アクセサリーコファクター、外部酵素触媒または基質を必要とすることなく、内部発色団を形成する能力を含む。
【００１４】
蛍光タンパク質の「改変体」は、「親」蛍光タンパク質に由来し、そして上記１１β−鎖バレル構造および内因性蛍光を保持し、そしてこのタンパク質の新規または改変された性質（すなわち、より大きな安定性、改良された可溶性、改良された折り畳み、放射または励起スペクトルにおけるシフト、マルチマーを形成する減少したまたは無くした能力など）を与え得るアミノ酸置換、欠失または挿入をもつ構造、ならびに改変されたＮ末端およびＣ末端を有する構造（すなわち、円順列変異体）を含むことが意図される。
【００１５】
レポーターポリペプチドを参照して用いられるとき、用語「補完性フラグメント」、または「補完フラグメント」は、個々には不活性であり（すなわち、レポーター表現型を発現しない）、ここで、補完フラグメントの結合が、レポーター活性を回復するポリペプチドのフラグメントをいう。２つ以上の蛍光（または発色団）タンパク質フラグメントを記載するために用いられるとき、用語「自己補完性」、「自己組織化」、および「自然に会合する」は、これらフラグメントが、これら個々のフラグメントが可溶性であるとき、インタクトな、蛍光（または発色団）タンパク質に再構成し得ることを意味する。
【００１６】
本明細書で用いられるとき、「ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２構造」は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＭＤＢ）、ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ  Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢ  Ｃｌａｓｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質中、Ｏｒｍｏ＆Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎにより、ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２で開示されるＧＦＰ構造をいう。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）参照は、Ｉｄ  ＰＤＢ  Ｉｄ：１ＥＭＡ  ＰＤＢ著者：Ｍ．Ｏｒｍｏ＆Ｓ．Ｊ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ＰＤＢ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：１−Ａｕｇ−９６  ＰＤＢクラス：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＤＢタイトル：Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質である（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ緑色蛍光タンパク質の結晶構造」、Ｓｉｅｃｎｃｅ  １９９６年９月６日；２７３（５２８０）：１３９２〜５；Ｙａｎｇら、「緑色蛍光タンパク質の分子構造」Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６  １０月、１４（１０）：１２４６〜５１を参照のこと）。
【００１７】
「根２乗平均偏差（「ＲＭＳＤ」）」は、根２乗平均重ね合わせ残基をオングストロームでいう。この数は、２つの構造の最適重ね合わせ後、相当するＣ−α−原子間の２乗平均距離の平方根として算出される。
【００１８】
核酸の部分を参照して用いられるとき、用語「異質」は、核酸が本来互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。例えば、核酸は、代表的には、新規な機能的核酸を作製するために整列される非関連遺伝子からの２つ以上の配列、例えば、１つの供給源からの蛍光タンパク質をコードする核酸、および別の供給源からのペプチド配列をコードする核酸を有して組換えにより発現される。同様に、異質タンパク質は、タンパク質が、元来、互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００１９】
用語「同一」または「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈においては、ＢＬＡＳＴ配列比較アルゴリズムもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターとともに使用して測定するかまたは手作業による並置および視認によって測定するように、比較ウィンドウすなわち指定領域の全体にわたって最大の一致について比較および並置した場合に、特定の領域全体にわたって同じである２つ以上の配列もしくは部分配列を指すか、あるいは特定の領域全体にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドに関して特定の割合（すなわち、約７０％同一性、好ましくは、７５％同一性、８０％同一性、８５％同一性、９０％同一性、または９５％同一性）を有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。それゆえ、そのような配列は、「実質的に同一である」と言われる。この定義はまた、試験配列の補完性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を指す。好ましくは、この同一性は、長さが少なくとも約２２アミノ酸もしくは少なくとも約２２ヌクレオチドである領域にわたって存在するか、またはより好ましくは、長さが３０アミノ酸、４０アミノ酸、もしくは５０アミノ酸〜１００アミノ酸または３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００２０】
配列比較に関して、代表的には、１つの配列が、参照配列の役割を果たし、この参照配列に対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列が、コンピューター中に入力され、部分配列座標が、必要な場合には指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが、指定される。デフォルトプログラムパラメーターが、使用され得るか、または代替的パラメーターが、指定され得る。その後、その配列比較アルゴリズムは、上記プログラムパラメーターに基づいて、上記参照配列に対する上記試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００２１】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書中で使用される場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０から選択される連続位置数のうちのいずれか１つである部分に対する言及を包含し、その部分において、配列は、同じ連続位置数の参照配列に対して、それら２つの配列が最適に並置された後に比較され得る。比較のための配列の並置方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適な並置は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）によって、または手作業による並置および視認（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）を参照のこと）によって、実施され得る。
【００２２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。これらのアルゴリズムは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、代表的には、本明細書中に記載されるデフォルトを用いて使用されて、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一性パーセントが決定される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開された状態で利用可  能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードと並置された場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、近接（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）ワードスコアの閾値Ｔと呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期近接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一致した一対の残基についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基についてのペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスが、上記累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、達成した最大値から量Ｘ減少した場合；１つ以上の負のスコアの残基の整列の蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速さを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）、アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００２３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似すると考えられる。
【００２４】
参照配列番号に言及する文脈における用語「最大一致によって決定される場合」とは、配列が、デフォルトパラメーターに設定されたＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、参照配列の長さ全体にわたって参照配列番号と最大限に並置されることを意味する。
【００２５】
用語「連結（する）」とは、本明細書中で使用される場合、物理的結合ならびに生物学的粒子（例えば、ファージ、細菌、酵母、または他の真核生物細胞）と共存することによって生じる結合を指す。
【００２６】
「物理的結合」とは、２つの分子を機能的に接続する（これは、「物理的に結合された」と呼ばれる）ための当該分野で公知の任意の方法を指し、これには、介在ドメインを含む組換え融合または介在ドメインを含まない組換え融合、インテイン媒介性融合、非共有結合、共有結合（例えば、ジスルフィド結合および共有結合）、水素結合；静電結合；ならびに高次構造結合（例えば、抗体−抗原結合、およびビオチン−アビジン結合）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「融合した」とは、共有結合による結合を指す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「リンカー」または「スペーサー」とは、２つの分子（蛍光結合リガンド、およびディスプレイタンパク質もしくはディスプレイ核酸）を接続してそれらの２つの分子を好ましい構成に配置する、分子または分子群を指す。
【００２９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換可能に使用される。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物である、アミノ酸ポリマー；ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー；および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３０】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにその天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに、後に改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（すなわち、水素に結合しているα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのようなアナログは、改変型Ｒ基を有する（例えば、ノルロイシン）かまたは改変型ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似する様式で機能する、化合物を指す。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書中では、その一般的に公知である３文字記号によってか、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃａｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって、言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に受け入れられている１文字記号によって言及され得る。
【００３２】
用語「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかであるそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知アナログを含む核酸を包含する。そうではないと示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された１つ以上（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；およびＣａｓｓｏｌら、１９９２；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８）。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと互換可能に使用される。
【００３３】
「保存的に改変された改変体」とは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のアミノ酸配列もしくは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を指し、またはその核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一である配列を指す。遺伝コードの縮重が原因で、多数の機能的に同一な核酸が、所定の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、コドンＧＣＣ、コドンＧＣＧ、およびコドンＧＣＵは、すべて、アミノ酸であるアラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるどの位置でも、その子ドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載される対応するコドンのうちのいずれかに変更され得る。そのような核酸バリエーション（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、「サイレントバリエーション」であり、これは、保存的に改変された改変形のうちの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、その核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションを記載する。当業者は、核酸中の各コドン（本来メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧと、本来トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一である分子を生じるように改変され得ることを、認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが、記載される各々の配列において暗示される。
【００３４】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における１つのアミノ酸または少数のアミノ酸を変化、付加、もしくは欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個別の置換、欠失、もしくは付加は、その変化が、化学的に類似するアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に改変された改変体」であることを、当業者は認識する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えて存在し、これらの本発明の多型改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を排除しない。
【００３５】
以下の８つのグループの各々は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ），；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００３６】
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は、種々の組織化レベルに関して記載され得る。この組織化の一般的考察については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ
Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」とは、ポリペプチドにおける局所的に秩序立った３次元構造を指す。これらの構造は、一般的にはドメインとして公知である。ドメインは、ポリペプチドの部分であり、この部分は、そのポリペプチドの小型単位（ｃｏｍｐａｃｔ  ｕｎｉｔ）を形成する。ドメインは、代表的には、２５アミノ酸長〜約５００アミノ酸長である。代表的なドメインは、組織化の程度が少ない部分（例えば、一連のβ−シートおよびα−へリックス）から構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な３次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成される三次元構造を指す。異方性項（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｔｅｒｍｓ）はまた、エネルギー項（ｅｎｅｒｇｙ  ｔｅｒｍ）としても公知である。
【００３７】
用語「単離された」および「精製された」とは、その天然状態において見出されるような通常付随する成分を実質的にも本質的にも含まない物質を指す。しかし、用語「単離された」とは、電気泳動ゲルまたは他の分離媒体において存在する成分を指すことは、意図されない。単離された成分は、そのような分離媒体、および別の適用における使用準備ができているかまたは新たな適用／環境において既に使用中である形態を、含まない。
【００３８】
（スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系）
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイは、スプリット−蛍光タンパク質系およびスプリット−発色団タンパク質系を利用し、それらは、一般に、共有に係る同時係属中である米国特許出願第１０／９７３，６９３号（２００４年１０月２５日出願、その全体が本明細書によって参考として援用される）に記載される。
【００３９】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントは、それらのフラグメントが使用されるべき特定のアッセイの環境において折り畳まれ得かつ可溶性であり得る。好ましい実施形態において、個々のフラグメントの折り畳み／溶解度が、試験され、そして代表的には、可溶性「タグ」フラグメントと可溶性「アッセイ」フラグメントを分離するために進化される。好ましい溶解度アッセイ適用において、上記タグフラグメントは、１個と３個との間の個数のβ鎖であり、最も好ましい適用  において、そのタグは、一本のβ鎖である。試験タンパク質が、このタグフラグメントに融合される。このタグフラグメントは、好ましくは、融合した試験タンパク質に対して実質的に変動性ではない。換言すると、その試験タンパク質単独の溶解度および折り畳みは、上記タグと融合した場合の試験タンパク質の溶解度および折り畳みと類似する。
【００４０】
スプリットＧＦＰ系を使用する実験結果（実施例２を参照のこと）に基づいて、溶解度アッセイにおける最適性能は、比較的大きなアッセイフラグメント（例えば、約８個〜約１０個連続するβ鎖）と、試験タンパク質が融合される比較的小さなタグフラグメント（例えば、約１個〜約３個連続するβ鎖）とを使用することによって、達成される。そのアッセイフラグメントは、可溶性であり、そしてタグフラグメント−試験タンパク質融合物にとって補完のために利用可能であり、そのタグフラグメントは、試験タンパク質の溶解度に対して非変動性である。理想的には、ほとんどの適用について、上記試験タンパク質単独の溶解度と、タグフラグメントと融合した状態の試験タンパク質の溶解度とは、ほぼ同じである。そのアッセイフラグメントは、理想的にはモノマーであり、そして自然に凝集することも誤折り畳みされることもない。
【００４１】
多くの適用において、非変動性タグフラグメントの使用が好ましいが、それにも関わらず、タグフラグメントは、蛍光と溶解度との間の実質的な比例性が存在する（しかし、必ずしも、正比例しない）限りには、試験タンパク質の溶解度に対して変動性であり得、そして溶解度スクリーニングアッセイにおいて有用なままである。いくつかの実施形態において、非変動性タグフラグメント（下記のサンドイッチ形式アッセイの説明を参照のこと）（例えば、目的は、高可溶性タンパク質をスクリーニングすることである）を使用することが、実際には、望ましくあり得る。この場合、非変動性タグフラグメントの使用は、すべてではないがほとんどの可溶性タンパク質またはタンパク質のバージョンに対して有効に選択され得る。また、そのような適用におけるアッセイフラグメントは、可溶性であるべきである。なぜなら、不溶性バージョンは、可溶性試験タンパク質−タグフラグメント融合物に対する補完のために利用可能ではないからである。
【００４２】
（タンパク質−タンパク質相互作用検出システム）
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用検出システムは、２以上の相互作用タンパク質または２以上の潜在的な相互作用タンパク質をタグ化する、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）のマイクロドメインを利用する。一般に、上記マイクロドメインは、上記蛍光タンパク質構造のうちの１以上の隣接するβ鎖に対応する。したがって、例えば、２つの既知の相互作用タンパク質（ＸおよびＹ）は、タグ化ポリペプチドのセットｓ１０−Ｘおよびｓ１１−Ｙ、Ｘ−ｓ１０およびＹ−ｓ１１などを産生するために、β鎖１０および１１に対応するＧＦＰマイクロドメインタグに融合され得る。上記融合ポリペプチドは、代表的に、ＤＮＡレベルで構築され、そしてそれらの融合ポリペプチドは、当業者によって一般に理解されるように、同時発現されても、別々に発現されてもよい。好ましい実施形態において、各マイクロドメインタグは、単一β鎖に実質的に対応する。
【００４３】
本発明の一般概念を示すために、以下は、ＧＦＰ  ｓ１−９に対応するアッセイフラグメントと一緒に、ｓ１０およびｓ１１に対応するＧＦＰマイクロドメインタグを利用する、単純な２タンパク質相互作用検出システムの記載である。これらの「タグ」マイクロドメインは、融合された相互作用タンパク質が相互作用する限り、そのマイクロドメインが補完アッセイフラグメント（ＧＦＰ  ｓ１−９）と自発的に自己補完しないように選択される。この単純な場合において、タンパク質ＸおよびＹは、相互作用することが公知である。タンパク質ＸおよびＹは、それぞれ、細胞中でｓ１０タグとの融合物およびｓ１１タグとの融合物として発現される。上記アッセイフラグメントは、細胞において発現されるか、または細胞にトランスフェクトされる。ＸとＹとの相互作用は、上記タグフラグメントを接近させ、このことは、上記アッセイフラグメントとの同時の相互作用に有利であり、この相互作用は、３つのＧＦＰフラグメントの間の自己補完をもたらし、上記ＧＦＰ分子を再構成し、次いで、そのＧＦＰ分子は、タンパク質ＸおよびＹが上記細胞中で相互作用したことを示すその特徴的な蛍光を提示する（図２６）。
【００４４】
この単純なタンパク質−タンパク質相互作用アッセイは、特定の環境、異なる細胞、異なる物理的条件下、および他のタンパク質因子、薬剤、薬物などの存在下において、タンパク質ＸとＹとの相互作用を評価するために使用され得る。このようなアッセイは、ＸとＹとの間の相互作用をモジュレートする候補薬剤を単離することを目的とした高スループットスクリーニングの試みに、容易に適合可能である。例えば、上記システムは、タンパク質ＸとＹとの間の相互作用を妨げる薬剤についてのスクリーニングのために使用され得る。１つの特定のインビトロアッセイ実施形態において、種々の試験薬剤は、タグ化Ｘタンパク質およびタグ化Ｙタンパク質を発現する細胞に添加され得る。次いで上記細胞は、溶解されて、上記アッセイフラグメントと反応され得る。あるいは、上記アッセイフラグメントは、上記細胞内で発現され得るか、または当該分野において周知であるタンパク質トランスフェクション試薬（Ｃｈａｒｉｏｔ  ｒｅａｇｅｎｔ）を使用して引き入れられ得る。ＸおよびＹが相互作用する場合、エントロピーは、アッセイフラグメントとの補完に有利であり、そして蛍光が、提示される。上記ＸとＹとの間の相互作用を妨げる薬剤は、このようなベースラインの蛍光と比較して減少した蛍光または検出可能な蛍光が無いことによって同定され得る。このようなアッセイは、高スループットスクリーニングに容易に適合可能であり、多数のウェルは、上記タグ化タンパク質を発現するように操作された細胞を含み、そして多くの異なる試験薬剤が、個々のウェルに添加され得る。
【００４５】
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの種々の実施形態が、想起され、それらのうちの数種は、以下で、実施例によって記載される。
【００４６】
本発明の別の局面は、他のタンパク質と相互作用するタンパク質を同定および単離するためのタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの使用に関する。種々の実施形態が、想起され、それらとしては、既知のタンパク質Ｙと相互作用する未知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイ、未知のタンパク質Ｙと相互作用する未知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイ、既知のタンパク質Ｙと相互作用する既知のタンパク質Ｘを同定し得るアッセイが挙げられるが、これらに限定されない（それらの相互作用は、既知ではなかった）。
【００４７】
本発明の別の局面は、改良された特性または規定された特性（例えば、他のタンパク質に対する、より高い親和性の結合）を有する既知の相互作用タンパク質の対の１つの改変体についてスクリーニングするために、タンパク質−タンパク質相互作用検出システムを利用する。例示の通り、タンパク質Ｙに結合する抗体Ｘは、結合の特異性または親和性を改良することを目的とした指向性進化ストラテジーに供され得る。簡単にいうと、その抗体の単鎖が、変異体のライブラリーとして発現され得、そして結合特性（例えば、結合親和性）について評価され得る。したがって、変異タンパク質Ｘのライブラリーは、ＧＦＰマイクロドメイン融合物（すなわち、Ｘ’−ｓ１０）として発現され、そしてそのライブラリーは、補完アッセイフラグメントｓ１−９の存在下において融合物Ｙ−ｓ１１と反応し得る。野生型Ｘ−ｓ１０が発現され、そして上記アッセイフラグメントの存在下においてＹ−ｓ１１と反応し得る場合に生成されるものと比較してより強い蛍光は、Ｘ’がＹに対してＸより強い親和性を有するという示唆を提供する。
【００４８】
関連した実施形態において、Ｘ’−ｓ１０は、野生型融合物Ｘ−ｓ１０と同時発現されても、野生型融合物Ｘ−ｓ１０の存在下において発現されてもよく、それらの両方は、アッセイフラグメントＧＦＰ  ｓ１−９の存在下においてＹ−ｓ１１との相互作用に関して競合し得る。色シフト変異体が、Ｘの変異体およびＸ’の変異体を区別するために使用され得、それらの変異体は、Ｙとの相互作用に関して他方に勝って競合する。例えば、ＧＦＰにおいて、鎖１０は、黄色シフトＧＦＰ改変体を産生するために、残基Ｔ２０３Ｙで変異され得る。したがって、例えば、タンパク質Ｘは、ＧＦＰ  ｓ１０  Ｔ２０３Ｙによってタグ化され得、そして変異タンパク質Ｘ’は、「緑色」ｓ１０  Ｔ２０３によってタグ化され得る。上記相互作用タンパク質は、ｓ１１によってタグ化される。上記３つのフラグメントは、１つの実施形態において、同じ細胞において同時発現され得る。ＸまたはＸ’のいずれもが、Ｙとの相互作用において、より効率的であり、それは、上記アッセイフラグメントとの補完複合体の一部を形成し、そうして再構成された蛍光タンパク質の色を決定する。したがって、この例示において、緑色蛍光は、Ｘ’がＹとの結合に関してＸに勝って競合するという示唆を提供するのに対して、黄色蛍光は、野生型Ｘがより良好な結合因子であったという示唆を提供する。このような競合結合アッセイは、より高い結合親和性を有するタンパク質の改変体（すなわち、抗体改変体、アンキリンドメイン融合物に基づく結合因子（Ｂｉｎｚら、２００４  Ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２：５７５−５８２）など）についてのスクリーニングに生産的に使用され得る。
【００４９】
（３フラグメントのタンパク質−タンパク質相互作用アッセイシステム）
本発明の１つの局面は、３フラグメント補完システムを利用するタンパク質−タンパク質相互作用アッセイシステムに関する。簡単にいうと、３フラグメントシステムにおいて、２つの相互作用タンパク質が、２つのＧＦＰフラグメントの各々との融合物として発現され、各ＧＦＰフラグメントは、１以上の隣接するβ鎖に対応する（すなわち、Ｘ−ｓ１０およびＹ−ｓ１１、ＸおよびＹは、相互作用タンパク質または潜在的な相互作用タンパク質である）。添加されるか、または発現される、Ｘ−ｓ１０構築物およびＹ−ｓ１１構築物において示されない上記蛍光タンパク質のβ鎖に対応するアッセイフラグメントの存在下での、宿主細胞における上記２つの融合物の同時発現は、上記３つのフラグメントの間に補完の機会を提供し、ＸおよびＹは、相互作用する。ＸとＹとの間の相互作用の非存在下において、上記３つのフラグメントは、補完しない。補完は、蛍光によって可視化される。したがって、このシステムは、Ｘと相互作用する未知のタンパク質Ｙを同定するために使用され得る。
【００５０】
上記システムはまた、タンパク質Ｘに対する改良された親和性を有するＹの操作された改変体をスクリーニングするために使用され得る。
【００５１】
上記システムはまた、ＸとＹとの間の相互作用を妨げる化学物質についてスクリーニングするために使用され得る。
【００５２】
反対に、上記システムは、ＸとＹとの間の相互作用に対する化学物質の妨害効果を回避し得るタンパク質Ｙについてスクリーニングするために使用され得る。
【００５３】
レポーター蛍光タンパク質およびレポーター発色団タンパク質は、自己補完して再構成型レポータータンパク質を形成可能な３つ（またはそれ以上の）個々のフラグメントへと分割され得る。サンドイッチ形式タンパク質検出アッセイの一実施形態において、その蛍光タンパク質または発色団タンパク質の２つのタグフラグメントは、試験タンパク質に融合される。これらのフラグメントは、一緒になって、第三フラグメントによって補完されて蛍光表現型または発色団表現型を再構成することが可能である。例えば、試験タンパク質は、ＧＦＰの２つの連続するβ鎖の間に挿入され得る（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１）。可溶性タンパク質の検出は、ＧＦＰ１−９による検出可能な補完によって達成される。この実施形態において、その３つのフラグメントの補完は、試験タンパク質を可溶性かつ全長であると同定し、これは、ｘに融合されたＧＦＰの２つのフラグメントが、ｘによって機能的に連結されることを示す。特に指向性進化ストラテジーの状況において、このアプローチは、試験タンパク質ｘが実際に全長でありかつインタクトであることを確実にし（一方、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１は、ＧＦＰ１−１０のみを補完し、ＧＦＰ１−９は補完しない）、試験タンパク質の短縮形または初期リボソーム結合部位を組み込んだバージョンまたはタンパク質分解したバージョンの出現を防ぐという利点を提供する。
【００５４】
より厳密な関連する溶解度アッセイ実施形態は、試験タンパク質に融合した２つのタグフラグメントを利用し、それらのフラグメントの各々は、独立した識別可能な第三補完アッセイフラグメントを用いて機能的に再構成することによって、独立して検出され得る。より具体的には、ＧＦＰ  Ｓ１０−ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１という融合物において、鎖１０は、円順列ＧＦＰ  １１−９Δ１０（円順列１１−１−２−３−４−５−６−７−８−９（１１と１とが連結されており、１０を欠いている。数字は、鎖を指す。図３を参照のこと））によって検出可能である。一方、鎖１１は、１−１０Δ１１（１−２−３−４−５−６−７−８−９−１０（１１を欠いている））によって検出可能である。上記２つのタグを独立して同時に検出することは、１つの補完対または両方の補完対の色シフト改変体を利用することによって容易になり得る（すなわち、ＧＦＰ１１−９Δ１０が、シアン色改変体（Ｙ６６Ｗ）であり得、ＧＦＰ１−１０Δ１１が、黄色改変体（Ｔ２０３Ｙ）であり得る）。あるいは、それらのタグフラグメントは、別個のアミノ酸配列を有する複数の蛍光タンパク質から誘導され得、そして対応する適切なアッセイフラグメントを用いて検出され得る。例えば、ＧＦＰ由来の鎖１１は、試験タンパク質ＸのＮ末端をタグ化するために使用され得、ＧＦＰの鎖１−１０を用いて検出され得る。一方、赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）由来の鎖１１は、同じ試験タンパク質ＸのＣ末端への融合物として同時に使用され得、そしてＤｓＲｅｄの鎖１−１０を用いて検出され得る。
【００５５】
代替的な実施形態は、試験タンパク質によって連結された２つの再構成されたＧＦＰの間で示されるＦＲＥＴを利用する。例えば、ＣＦＰ１１−９Δ１０：：１０−Ｘ−１１：：ＹＦＰ１−１０が、使用され得る。そのような構築物は、ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰに対して機能的に等価である。ＣＦＰ−ｘ−ＹＦＰは、ｘがインタクトである限りはＣＦＰドナーからＹＦＰアクセプターへのＦＲＥＴを示し、ｘが切断された場合にはＦＲＥＴを失い、近接状態からＣＦＰおよびＹＦＰを遊離させ、ＦＲＥＴの効率は、（１／ｒ６）（ｒは、ドナーとアクセプターとの間の距離である）に依存することが、以前に示されている。
【００５６】
（原核生物細胞培養物における適用および真核生物細胞培養物における適用）
本発明のスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系が、事実上すべての細胞型（細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない）におけるアッセイに適用され得る。１つの限定事項は、ＧＦＰタンパク質およびＧＦＰ様タンパク質の発現は、高酸性環境（すなわち、ｐＨ＝４．０以下）では弱められることである。同様に、補完率は、一般的には、ｐＨ６．５以下の条件下では非効率的である（下記の実施例８を参照のこと）。
【００５７】
当業者によって認識されるように、タグフラグメントおよび／またはアッセイフラグメントを発現するために使用されるベクターは、そのベクターが存在する宿主細胞と適合性でなければならない。同様に、種々のプロモーター系が、利用可能であり、細胞型、株などとの適合性について選択されるべきである。コドン最適化技術が、周知であるような他の細胞において使用するために配列を適合するために使用され得る。
【００５８】
本発明の保管アッセイのために哺乳動物細胞を使用する場合、コドン最適化のための代替法は、化学的トランスフェクション試薬（例えば、最近記載された「チャリオット（ｃｈａｒｉｏｔ）」系（Ｍｏｒｒｉｓら、２００１、Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３〜１１７６））の使用である。そのＣｈａｒｉｏｔＴＭ試薬は、哺乳動物細胞の細胞質中にタンパク質を直接トランスフェクトするために使用され得る。従って、このアプローチは、インビボタンパク質検出アッセイのために有用である。このアッセイにおいて、そのアッセイフラグメントは、細胞によって遺伝子によりコードされる試験タンパク質−タグフラグメント融合物が発現する前または後のいずれかに、細胞中に導入され得る。
【００５９】
（改良されたタンパク質改変体を単離するための方法）
上記のタンパク質相互作用アッセイは、進化していない親タンパク質と比較して改善された特性を有するタンパク質改変体を単離することを目的とする指向性進化ストラテジーと組み合わせて、使用され得る。
【００６０】
変異型タンパク質改変体のライブラリーを作製するための当該分野で公知の任意の方法が、タグフラグメントとの融合物として発現され得る候補試験タンパク質を生成するために使用され得る。その標的タンパク質または標的ポリペプチドは、通常は、その核酸を変異させることによって変異される。変異させるための技術は、当該分野で周知である。これらの技術としては、エラープローンＰＣＲ、化学的変異誘発、およびカセット変異誘発などの技術が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、宿主細胞のミューテーター株が、変異頻度を増加するために使用され得る（ＧｒｅｅｎｅｒおよびＣａｌｌａｈａｎ（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２）。例えば、エラープローンＰＣＲ（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌを参照のこと）は、長い配列全体にわたってランダムに低レベルの点変異を導入するために、低忠実度ポリマー化条件を使用する。他の変異誘発方法としては、例えば、組換え（ＷＯ９８／４２７２７）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３〜４６２（１９８５）；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３〜１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１〜７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８〜５００（１９８３）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９〜３５０（１９８７）における概説を参照のこと）；ホスホチオエート媒介性ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９〜８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５〜８７８７（１９８５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：９６７９〜９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１〜８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３〜８１４（１９８８））；ウラシル含有テンプレートを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２（１９８５）およびＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）；ギャップ付き二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１〜９４５６（１９８４）；ＫｒａｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０〜３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８））；ならびにＦｒｉｔｚら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７〜６９９９（１９８８））が挙げられる。さらなる方法としては、ポイントミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ
３８：８７９〜８８７（１９８４））、修復欠損宿主株を使用する変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２〜４０３（１９８７））、欠失変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｎおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６））、制限選択および制限増幅（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５〜４２３（１９８６））、完全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９〜１３０１（１９８４）；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１〜６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５）；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５〜３３１６（１９８５）が挙げられる。変異誘発のためのキットが、市販されている（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。より最近のアプローチとしては、コドンベースの変異誘発が挙げられ、このアプローチにおいては、Ｍｕｒａｋａｍｉら、２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：７６〜８１に記載されるＲＩＤ方法によって例証されるように、コドン全体が置換され、それによって生じた変異体の多様性が増加する。
【００６１】
細胞ベースの発現系において、改変体を発現するクローンは、上記のインビボアッセイまたはインビトロアッセイを使用して、溶解度について迅速にスクリーニングされ得る。従って、インビボでの実施形態において、クローンのライブラリーが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作製され、その各々のクローンは、第一独立誘導性プロモーターの制御下にタグフラグメントに融合した個々の改変体タンパク質をコードする発現可能構築物を保有する。その細胞は、第二の別個に誘導可能なプロモーターの制御下に、補完アッセイフラグメントをコードする発現可能な構築物を同時に保有するか、またはアッセイフラグメントポリペプチド自体を同時に保有する（上記のＭｏｒｒｉｓら（２００１）に記載されるようなタンパク質トランスフェクション方法によって導入される）。
【００６２】
あるインビボ実施形態において、細胞は、タグフラグメント−タンパク質改変体融合物を発現するように、そしてその後にその細胞において補完フラグメントを発現するように、誘導される。最も好ましい実施形態において、その融合物の発現は、不溶性融合物の凝集を可能にするために充分な時間の間（すなわち、１時間；下記の実施例４および実施例１０を参照のこと）抑制または停止され、その後、補完フラグメントの発現を誘導される。このアプローチのバリエーションにおいて、その細胞は、上記融合構築物のみを、好ましくは誘導性プロモーター／抑制性プロモーターの制御下に保有する。補完フラグメントは、タンパク質トランスフェクション方法論によって導入される。
【００６３】
種々のインビトロ実施形態が、可能である。一般的に、これらは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、改変体タンパク質−タグフラグメント融合物の発現と、その後の細胞溶解、および補完アッセイフラグメントポリペプチドとの反応を包含する。
【００６４】
（事前補完）
ＧＦＰフラグメントの補完の間の蛍光形成速度は、その発色団が、適切な発色団アミノ酸を保有するフラグメントにおいて予め形成されたＧＦＰのフラグメントを使用することによって、発色団の環化が全く生じていないフラグメントと比較して、大幅に増加され得る。簡単に述べると、発色団アミノ酸を保有する非蛍光性の事前補完されたＧＦＰフラグメントは、（１）そのフラグメントを、発色団アミノ酸を含まない補完フラグメントと混合すること；（２）補完反応および蛍光形成を完了させること；（３）それらのフラグメントを、例えば、化学的手段によって折り畳みを解いて、折り畳みを解かれた非蛍光ＧＦＰフラグメントを生成させること；（４）発色団アミノ酸を含むフラグメントを回収し、それを他のフラグメントから分離すること；（５）発色団アミノ酸を保有するフラグメントを再生することによって、形成され得る。このフラグメントは、たとえ環化発色団を含むが、実質的に非蛍光性のままである。なぜなら、このフラグメントは、非蛍光性であるように化学的手段または他の手段によって実質的に折り畳みを解かれており、補完フラグメントの非存在下では折り畳みを解かれたままであるからである。蛍光の迅速な回復は、発色団に関連する共有結合改変を生じる必要なく、単に、補完性の非発色団含有ＧＦＰフラグメントを再添加することによって得られる。このアプローチによると、遅い発色団環化反応が完了するので、補完の間の蛍光の形成は、補完フラグメントの結合速度と、折り畳まれたネイティブのβバレル構造の形成とによってのみ、制限される。
【００６５】
（スプリットタンパク質フラグメントの操作）
（可溶性自己補完性フラグメントを単離するための指向性進化ストラテジー）
本発明の別の局面は、フラグメントの指向性進化および連続誘導によって、理想的なスプリットタンパク質相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）を作製するための方法に関する。連続的な誘導の組み込みは、スプリットフラグメントの同時誘導を特定する既存の公開されたアプローチとは対照的である。簡単に述べると、連続誘導アプローチにおいて、フラグメント１が、一定に保たれ、そしてフラグメント２が、進化させられる。フラグメント１が一定に保たれてフラグメント２が進化させられる場合、フラグメント２は、まず発現され、その後、発現が停止される。そのフラグメントは、凝集させられるか、または可溶性のままであるようにされる。次に、フラグメント１が、発現される。両方のフラグメントが同時発現される場合、これは、擬陽性をもたらし得る。なぜなら、凝集の前に補完が生じ得るからである。連続発現は、真の陽性（すなわち、改変体）の選択をもたらす。最適なフラグメント２改変体の選択の後、この改変体は、一定に保たれ、その後、フラグメント１が進化させられる。このプロセスは、望ましいフラグメント溶解度が達成されるまで、さらなる連続誘導を使用して継続され得る。このアプローチを使用して、生じるフラグメントは、補完の前にそれ自体が可溶性であるように操作され得る。
【００６６】
（検出可能なタンパク質の溶解度変動の減弱）
可溶性フラグメントは、融合したパッセンジャードメイン（試験タンパク質）の溶解度に対するその変動効果を減少するようにさらに操作され得る。簡単に述べると、上記フラグメントに融合された場合には単独で発現された場合よりも溶解度が小さい試験タンパク質が、そのフラグメントを、融合物の溶解度と非融合物の溶解度とが同様であることによってその試験タンパク質の溶解度に対するそのフラグメントの効果を減少するように操作することを目的とする指向性進化アプローチにおいて、「おとり（ｂａｉｔ）」ドメインとして使用される。このストラテジーは、小さなＧＦＰフラグメントを最適化する際に使用され、融合されたパッセンジャータンパク質に対する変動効果が減弱した改変体を生じた（下記の実施例４を参照のこと）。このアプローチは、上記融合物の溶解度が単独で発現されたおとりタンパク質より低い適切なおとりタンパク質を使用して、同時かまたは連続してＧＦＰの１以上のフラグメントに適用され得る。
【００６７】
（キット）
本発明の別の局面は、上記の種々のアッセイを実施する際に有用なスプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系を提供する。本発明のキットは、本発明のスプリット蛍光系およびスプリット発色団系の使用を容易にし得る。本発明のアッセイを実施するための種々の材料および試薬が、提供され得る。キットは、試薬を含み得、この試薬としては、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、細胞形質転換試薬および細胞トランスフェクション試薬、ポリペプチドを精製するための試薬および材料、タンパク質変性試薬およびタンパク質再折り畳み試薬、ならびに本発明のアッセイおよび他の方法を実行する際に有用な他の溶液または緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。キットはまた、コントロールサンプル；本発明のアッセイを較正する際に有用な材料；ならびにアッセイ反応が実施され得る容器、チューブ、マイクロタイタープレートなどを含み得る。キットは、容器中に包装され得、その容器は、そのキットの内容物を収容するための区画、そのアッセイを実施するための指示書などを含み得る。
【００６８】
例えば、キットは、本発明の１つ以上のスプリット蛍光タンパク質フラグメント、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドベクター、そのベクターを増殖するために適切な細菌細胞株、１つ以上の蛍光タンパク質フラグメントをコードする構築物で事前形質転換または安定にトランスフェクトされた細胞、ならびに発現された融合タンパク質の精製のための試薬を提供し得る。
【００６９】
本発明のタンパク質検出アッセイの実施を容易にするキットの一実施形態において、そのキットは、タグ蛍光タンパク質フラグメントまたはタグ発色団タンパク質フラグメント（すなわち、ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  Ｓ１０）のコード配列を含むレシピエント核酸ベクターを含み、これは、そのタグフラグメントコード配列のＮ末端にインフレームで試験タンパク質を挿入するためのマルチクローニング部位を含む。必要に応じて、この挿入部位の後には、下流タグ配列のコード配列とインフレームであるリンカーポリペプチドのコード配列が存在し得る。具体的な実施形態は、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドである。このプラスミドの操作は、実施例１において記載されており、このプラスミドは、図１において示されている。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの完全ヌクレオチド配列が、図１Ｂに示される。Ｘ−ｓ１０およびＹ−Ｓ１１は、別々に発現され得るか、または両方とも単一のポリシストロンから発現され得る。
【００７０】
これらのレシピエントまたは「タグベクター」は、適切な宿主細胞において試験タンパク質−タグ融合物を生成するために使用される。インビトロアッセイ実施形態において、このキットは、そのタグベクターによって発現される試験タンパク質−タグフラグメント融合物の相互作用を検出するために使用される、予め精製されたアッセイフラグメント（すなわち、ＧＦＰ１−９ポリペプチド）をさらに含む。インビボアッセイ実施形態において、このキットは、「アッセイベクター」をさらに含む。この「アッセイベクター」は、タグベクターと適合性であり、かつ独立して調節されるプロモーターの制御下にアッセイフラグメントをコードする。別のインビボアッセイ実施形態において、アッセイベクター（すなわち、誘導性プロモーターの制御下にＧＦＰ１−９をコードするベクター）を含む細胞が、適合性タグベクターとともにこのキットにおいて提供され、この適合性タグベクター中に試験タンパク質がクローン化され得る。この適合性タグベクターにおいて、発現は、別個に誘導可能なプロモーターによって制御される。このアッセイベクターを含む細胞は、タグベクターで形質転換され得、細胞蛍光が、モニタリングされ得る。
【００７１】
本発明のアッセイを較正するための材料が、提供され得る。一実施形態において、このキットは、融合タンパク質試薬として、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１に融合された精製された相互作用コイルドコイルを含む。別のキットにおいて、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢ  １２およびＦＲＢ（それらの相互作用がラパマイシンの添加によって誘導され得る２つのタンパク質）に融合される。
【００７２】
（蛍光タンパク質および発色団タンパク質）
本発明は、スプリット蛍光タンパク質系およびスプリット発色団タンパク質系の設計のための方法および原理を提供し、これは、本明細書において、タンパク質相互作用の検出およびタンパク質相互作用の定量化における使用のための最適なスプリットＧＦＰ系の作製および分子進化によって例証される。しかし、他のＧＦＰ様タンパク質が、本発明の実施において使用され得る。
【００７３】
ある蛍光タンパク質群は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびに多数のＧＦＰ改変体（例えば、シアン色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など（Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：９０６〜９１８））を包含する。代表的には、これらの改変体は、配列番号２（または配列番号８）と約８０％以上の配列同一性を共有する。これらの色シフトＧＦＰ改変体は、青色〜黄緑色の放出色、増加した明るさ、および光安定性を有する（Ｔｓｉｅｎ，１９９８，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６７：５０９〜５４４）。そのような１つのＧＦＰ改変体（増強型黄色蛍光タンパク質と呼ばれる）は、５２９ｎｍにおいて発光極大を提示する。最近記載された別の改変体（金色改変体）は、トリプトファンの非天然改変体をシアン改変体に組み込むことによって作製された。これは、充分に赤色にシフトした５７４ｎｍの発光極大によって特徴付けられる（Ｂａｅら、２００３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：１０７１〜１０８１）。
【００７４】
改変型励起スペクトルおよび発光スペクトルを有するさらにＧＦＰベースの改変体（Ｔｓｉｅｎら、米国特許出願第２００２０１２３１１３Ａ１号）、蛍光強度および温度許容性が増大したさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｔｈａｓｔｒｕｐら、米国特許出願第２００２０１０７３６Ａ１号；Ｂｊｏｒｎら、米国特許出願第２００２０１７７１８９Ａ１号）；および減少した酸素レベル下で発色団形成するさらなるＧＦＰベースの改変体（Ｆｉｓｈｅｒ、米国特許第６，４１４，１１９号）もまた、記載されている。花虫綱のＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＲｅｎｉｌｌａ  ｋｏｌｌｉｋｅｒｉ由来のＧＦＰもまた、記載されている（Ｗａｒｄら、米国特許出願第２００３００１３８４９号）。
【００７５】
さらに、花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）由来の１００種を超えるＧＦＰ様蛍光タンパク質および非蛍光色素タンパク質が、現在同定されている（概説について、Ｖｅｒｋｕｓｈａら、２００３、ＧＦＰ−ｌｉｋｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ａｎｔｈｏｚｏａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ：Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ｐｐ．４０５〜４３９，Ｖ．Ｕｖｅｒｓｋｙ編，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｒｅａｌａ，Ｉｎｄｉａを参照のこと）。この群の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）タンパク質としては、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種のサンゴ由来の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９〜９７３）、および種々のＤｓＲｅｄ（例えば、ＤｅＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２）が挙げられる。ＤｓＲｅｄおよび他の花虫綱（Ａｎｔｈｏｚｏａ）蛍光タンパク質は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の野生型ＧＦＰに対してたった約２６％〜約３０％のアミノ酸配列同一性しか有さないが、主要なすべてのモチーフが保存されており、このことは、ＧＦＰの１１本鎖βバレル構造の形成を示す。ＤｓＲｅｄの結晶構造もまた、解明されており、この結晶構造は、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す。
【００７６】
長い波長の赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄの多数の改変体もまた、記載されている。例えば、発光スペクトルがさらに赤色にシフトしている最近記載されたＤｓＲｅｄ改変体が、本発明の実施において使用され得る（Ｗｉｅｈｌｅｒら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４８７：３８４〜３８９；Ｔｅｒｓｋｉｋｈら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１５８５〜１５８８；Ｂａｉｒｄら、２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１１９８４〜１１９８９）。最近、ＤｓＲｅｄのモノマー改変体が、記載された（Ｃａｍｐｅｌｌら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：７８７７〜７８８２）。この改変体（「ｍＲＦＰ１」と呼ばれる）は、（３０時間かけて成熟する野生型ＤｓＲｅｄと比較して）急速に成熟し、残留緑色蛍光を有さず、他のＤｅＲｅｄ改変体よりも約２５ｎｍ長い励起波長および発光波長を有する。
【００７７】
多数の海洋生物由来の増加する多数の他の蛍光タンパク質が、最近記載されており、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋは、現在、多数のＧＦＰおよびＧＦＰ改変体の結晶構造、ならびに種々のＧＦＰアナログの結晶構造を列挙する。サンゴ、シーペン、ホヤ、およびイソギンチャクに由来する、ＧＦＰと類似すると推測される構造を有する関連蛍光タンパク質が、記載されており、それは、本発明のスプリット蛍光タンパク質系の生成において使用され得る（概説について、Ｚｉｍｍｅｒ、２００２、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：７５９〜７８１；Ｚｈａｎｇら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：３：９０６〜９１８を参照のこと）。
【００７８】
さらに、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｍａｊａｎｏ由来の蛍光タンパク質、Ｚｏａｎｔｈｕｓ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｔｒｉａｔａ由来の蛍光タンパク質、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質、およびＣｌａｖｕｌａｒｉａ  ｓｐ．由来の蛍光タンパク質が、報告されている（Ｍａｔｚら、上記）。イシサンゴ種Ｔｒａｃｈｙｐｈｉｌｉａ  ｇｅｏｆｆｒｏｙｉからクローニングされた蛍光タンパク質は、緑色光、黄色光、および青色光を発光すること、そしてＵＶ光に暴露されると緑色光発光を青色光発光へと変換することが、報告されている（Ａｎｄｏら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２６５１〜１２６５６）。イソギンチャク由来の最近記載された蛍光タンパク質としては、Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた緑色蛍光タンパク質および橙色蛍光タンパク質（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１４０９１〜１４０９６）、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａの触手からクローニングされた天然の増強型緑色蛍光タンパク質（Ｈｏｎｇｂｉｎら、２００３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０１：８７９〜８８５）、およびＡｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａからクローニングされた弱い赤色蛍光を示す概して非蛍光性の紫色色素タンパク質および近赤外シフト発光スペクトル（５９５ｎｍ）を示すその改変体（Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜２５８８２）が挙げられる。
【００７９】
イソギンチャクＥｎｔａｃｍａｅａ  ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒから単離された最近記載された赤色蛍光タンパク質ＥｑＦＰ６１１は、独特の共平面トランス発色団を有する近赤外の非常に蛍光性のタンパク質である（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１６４６〜１１６５１）。ＥｑＦＰ６１１の結晶構造は、解明されており、これは、ＧＦＰ  ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造の保存を示す（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ａｕｇｕｓｔ  ８，２００３；Ｍ３０７８９６２００）。
【００８０】
色素体特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質および蛍光特性を有するなおさらなる種類のＧＦＰ様タンパク質が、記載されている。そのような一群のサンゴ由来タンパク質（ポシロポリン）は、広範なスペクトル特徴および蛍光特徴を示す（ＤｏｖｅおよびＨｏｅｇｈ−Ｇｕｌｄｂｅｒｇ，１９９９，ＰＣＴ出願ＷＯ００／４６２３３；Ｄｏｖｅら、２００１、Ｃｏｒａｌ  Ｒｅｅｆｓ  １９：１９７〜２０４）。最近、造礁サンゴＭｏｎｔｉｐｏｒａ  ｅｆｆｌｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のポシロポリンＲｔｍｓ５の精製および結晶化が、記載されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、Ａｃａｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５９：５９７〜５９９）。Ｒｔｍｓ５は、色が深青色であるが、弱く蛍光する。しかし、Ｒｔｍｓ５ならびにＲｔｍｓ５に対して配列相同性を有する他の色素タンパク質は、単一アミノ酸置換を介して近赤外蛍光タンパク質へと相互変換され得ることが報告されている（Ｂｅｄｄｏｅら、２００３、上記；Ｂｕｌｉｎａら、２００２、ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：７；Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、上記）。
【００８１】
ポシロポリンに密接に関連する他の種々のサンゴ由来色素タンパク質もまた、公知である（例えば、Ｌｕｋｙａｎｏｖら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５８７９〜８２；Ｇｕｒｓｋａｙａら、２００１、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５０７：１６〜２０を参照のこと）。これらの色素タンパク質が、ＧＦＰおよび他の蛍光タンパク質の保存された１１本鎖βバレル構造を含む程度まで、これらの色素タンパク質は、本明細書中に記載されるように自己補完性フラグメントへと分割され得、そしてアッセイシステムにおいて使用され得る。
【００８２】
ＭＭＤＢ  Ｉｄ：５７４２の１１本鎖βバレル構造から５オングストローム未満、しばしば３オングストローム未満または４オングストローム未満、好ましくは２オングストローム未満の根２乗平均偏差を有する構造を有する任意の蛍光タンパク質が、自己補完性フラグメントの開発において使用され得る。いくつかの場合において、蛍光タンパク質は、マルチマー形態で存在する。例えば、ＤｅＲｅｄは、テトラマーである（Ｃｏｔｌｅｔら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４３９８０１４４０３）。当業者によって認識されるように、そのようなマルチマー蛍光タンパク質とＧＦＰ（モノマー）との間の構造偏差（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は、その蛍光タンパク質の構造のモノマー単位に基づいて評価される。
【００８３】
当業者によって認識されるように、そのような蛍光タンパク質または色素タンパク質構造は、当該分野で周知の比較方法論を使用して同定され得る。そのタンパク質を同定する際に、ＭＭＤＢ  ＩＤ：５７４２構造に対する並置および比較における重要な特徴は、βバレル構造の保存（すなわち、代表的には、１１本のβ鎖を含むが、少なくとも１つの場合には、もっと少ないβ鎖を含む（Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎら、２０００（上記）を参照のこと）、ならびに二次構造エレメントの位相または結合順序（例えば、Ｏｒｍｏら、「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｃｕｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｙａｎｇら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：５２８０，１３９２〜５；Ｙａｎｇら、１９９６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１２４６〜５１）である。代表的には、蛍光タンパク質とＧＦＰ構造との間の偏差のほとんどは、重要なβ鎖間の結合鎖またはリンカーの長さにある（例えば、Ｙａｒｂｒｏｕｇｈら、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４６２〜７中のｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＤｓＲｅｄ  ａｎｄ  ＧＦＰを参照のこと）。Ｙａｒｂｒｏｕｇｈらにおいて、ＧＦＰとＤｓＲｅｄとのアラインメントが、図示されている。立体図から、１１本鎖バレルが、この２つの構造の間で強く保存されていることが、明らかである。ｃ−α骨格が、１６９個のアミノ酸にわたって根２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）が１オングストローム以内に並置されるが、その配列同一性は、ＤｓＲｅｄとＧＦＰとを比較してたった２３％である。
【００８４】
構造比較において、比較される２つの構造は、当業者に周知のアルゴリズムを使用して、例えば、ＣＣＰ４プログラムソフトウェアパッケージ（ＣＯＬＬＡＢＯＲＡＴＩＶＥ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＡＬ  ＰＲＯＪＥＣＴ，ＮＵＭＢＥＲ  ４．１９９４，「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）を用いて並置される。このようなプログラムを使用するにあたって、ユーザーは、並置されるべき２つの構造のＰＤＢ座標ファイルを入力し、このプログラムは、２つの構造中の原子の位置における全体的な差異を最小にするために剛体変換（回転および並進）を用いて、並置された構造の原子の出力座標ファイルを生成する。各構造についての出力された並置座標は、別個に可視化されてもよいし、容易に入手可能な分子グラフィックプログラム（例えば、ＲＡＳＭＯＬ，ＳａｙｌｅおよびＭｉｌｎｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＴＩＢＳ），Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．９，ｐ．３７４）またはＳｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ，Ｇｕｅｘ，ＮおよびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．，１９９６  Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ  ｆｏｒ
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ  ａｎｄ  ＰＣ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  Ｑｕａｔｅｒｌｙ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ  ７７，ｐ．７７）による重ね合わせとして可視化されてもよい。
【００８５】
ＲＭＳＤを考慮する場合、このＲＭＳＤ値は、構造アラインメントの程度に応じて定められ、このサイズは、全体的な構造類似性の記述子としてＲＭＳＤを用いる場合に、考慮に入れられる。ＲＭＳＤのスケーリングの問題は、代表的には、特定の閾値内で並置されるアミノ酸ブロックを含めることによって処理される。特定の基準を満たす並置された配列の乱れていない（ｕｎｂｒｏｋｅｎ）ブロックが長いほど、その構造は、よりよく並置される。ＤｓＲｅｄの例において、ｃ−α炭素の１６４は、ＧＦＰの１Å内にあるように並置され得る。代表的には、当業者は、例えば、Ｄａｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９３，２３３，１２３−１３８に記載されるように、剛体変換に基づいて、２つの試験構造を並置し得るプログラムを選択し得る。ＤＡＬＩアルゴリズムの出力は、剛体変換を使用して、２つの構造間で重ね合わせられ得る配列ブロックである。閾値Ｚ＝２以上のＺスコアを有する領域は、類似していると報告される。このようなブロックの各々について、全体的なＲＭＳＤが報告される。
【００８６】
本発明において使用するための蛍光タンパク質または色素タンパク質のＲＭＳＤは、１１本のβ鎖内の配列の少なくとも８０％について５Å内である。好ましくは、ＲＭＳＤは、１１本のβ鎖（重ね合わせとして図示された２つの並置された構造の目視およびＤＡＬＩプログラム出力により報告された並置ブロックとの比較により決定されるβ鎖）内の配列の少なくとも９０％について２Å内である。当業者により認められるように、β鎖間のリンカーは、かなり変動し得、必ずしも構造間で重ね合わせできなくてもよい。
【００８７】
好ましい実施形態において、蛍光タンパク質または色素タンパク質は、このタンパク質と比較して折り畳み特性または溶解度が改善されている、このタンパク質の変異バージョン、またはこのタンパク質の改変体である。しばしば、このようなタンパク質は、例えば、ＷＯ０１２３６０２に記載されている方法および増大された折り畳みについて選択するための他の方法を用いて同定され得る。
【００８８】
例えば、増大した折り畳み特性を有する蛍光タンパク質を得るために、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる、「おとり」ペプチドまたは「ゲスト」ペプチドが、この蛍光タンパク質に連結され得る。このゲストペプチドは、挿入される場合に、この蛍光タンパク質の折り畳み効率を減少させる任意のペプチドであり得る。変異蛍光タンパク質のライブラリーが作製される。このベイトペプチドは、蛍光タンパク質に挿入され、このタンパク質の蛍光の程度が、アッセイされる。おとりペプチドと親蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質と比較して増大した蛍光を示すクローンが、選択される（蛍光強度は、正確に折り畳まれた蛍光タンパク質の量を示す）。ゲストペプチドは、末端で蛍光タンパク質に連結されてもよいし、内部に挿入されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明の実施において有用な、野生型蛍光タンパク質および変異蛍光タンパク質、ならびに野生型変異色素タンパク質および変異色素タンパク質は、極めて安定な「超折り畳み」改変体を生成するために、実験的に進化され得る。同時係属中の共有に係る米国特許出願第１０／４２３，６８８号（２００３年４月２４日出願、本明細書に参考として援用される）に記載される方法は、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、および任意の数の関連蛍光タンパク質ならびに色素タンパク質の指向性進化のために用いられ得る。このような超折り畳み改変体は、自己補完フラグメントに分割され得、このフラグメントをさらに進化させて、単独でまたは試験タンパク質に融合させた場合のこのフラグメントの溶解度特性を調節し得る。
【００９０】
スプリット蛍光タンパク質フラグメントまたはスプリット色素タンパク質フラグメントの可溶性改変体および（試験タンパク質溶解度に対して）非変動性改変体の進化のための特定の方法は、小見出し「スプリットタンパク質フラグメント操作」（前出）にて提供される。
【実施例】
【００９１】
本発明の種々の局面が、さらに記載され、以下のいくつかの実施例により例示されるが、これらのうちのいずれも、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【００９２】
（実施例１：プラスミドｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲの構築）
市販のｔｅｔプロモーターＰＲＯ細菌発現システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）は、発現プラスミドとは別個の第２のプラスミド上に調節タンパク質ｔｅｔＲを有し、大規模なライブラリーの作製を非能率的にしている。この制限を克服するために、本発明者らは、標的タンパク質の発現を制御するｔｅｔプロモーターと、調節タンパク質ｔｅｔＲとを、テトラサイクリン誘導性プロモーターであるｔｅｔ、ｔｅｔプロモーター調節タンパク質ｔｅｔＲ、および選択可能な抗生物質マーカーであるＳｐｅｃＲを含む単一のプラスミド（抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を与える）上で組み合わせた。ＣｏｌＥ１複製起点は、このプラスミドが、ｐＴＥＴプラスミドを有する細胞内で、適合性の起点（例えば、ｐ１５起点）と共存することを可能にする。このことは、一方のタンパク質（例えば、ＧＦＰのフラグメントとタグ化されたタンパク質）がプラスミドから発現され、そして、もう一方のタンパク質（例えば、補完ＧＦＰアッセイフラグメント）が、第２のプラスミド（たとえば、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））から発現されることを可能にする。ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドは、図１Ａに図示され、このプラスミドの配列および遺伝的要素は、図１Ｂに示される。
【００９３】
ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドを、市販のｐＰＲＯＴｅｔ．６×ＨＮベクター、ｐＰＲＯＬＡＲベクター、およびＢＬ２１−ＰＲＯ株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により保有される自己複製プラスミドからの要素を組み合わせる、オーバーラップＰＣＲにより操作した。クロラムフェニコール耐性遺伝子を、ＢＬ２１−ＰＲＯ株により保有される自己複製プラスミドからクローニングしたスペクチノマイシン耐性マーカーで置き換え、ｐＰＲＯＬＡＲベクターのカナマイシン耐性マーカーのプロモーターの制御下においた。本発明者らは、ＢＬ２１−ＰＲＯ株から単離したスペクチノマイシン耐性の自己複製プラスミドに由来するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タンパク質を、Ｔ０転写終結配列の上流にクローニングした。翻訳されたｔｅｔＲの量は、ＳａｃＩの下流にある弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列により調節する。このＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、小さな縮重ライブラリーからＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏの改変体を選択して、無水テトラサイクリンの添加後の漏出を最小にし、そして誘導を最大にすることによって操作される（下記を参照のこと）。市販のバージョンに存在するＳｐｅＩ制限部位を機能しないようにした（ｓｉｌｅｎｃｅ）。この新しいプラスミド「ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ」を、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩの制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、ＧＦＰ  Ｓ１１スプリットＧＦＰクローニングカセットを得た。この得られたクローニング部位の構造は、Ｎｃｏ−１：：６ＨＩＳ：：トロンビン切断部位：：Ｎｄｅ−１：：フレームシフトスタッファー（ｆｒａｍｅ  ｓｈｉｆｔ  ｓｔｕｆｆｅｒ）：：ＢａｍＨＩ：（ＧＧＧＳ）：ＳｐｅＩ：：ＧＦＰ  Ｓ１１（ＴＡＡ終止）：：ＫｐｎＩである。クローニングカセットのセンス鎖は、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩに隣接している：
【００９４】
【化１】
2008521447.tif 000071
【００９５】
フレームシフトスタッファーは、再連結したベクターによるバックグラウンド発現を避けるために、好ましくは、ＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位の間に加える。
フレームシフトスタッファーの例１：ＦＳ０
【００９６】
【化２】
2008521447.tif 000072
【００９７】
フレームシフトスタッファーの例２：ＦＳ１
【００９８】
【化３】
2008521447.tif 000073
【００９９】
Ｃ末端スプリットタンパク質フラグメント（例えば、ＧＦＰ鎖１１またはＧＦＰ鎖１０〜１１）を、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、制限部位ＳｐｅＩとＫｐｎＩとの間にクローニングし、隣接制限部位および所望のフラグメントのコード配列を提供する。このフラグメントはまた、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲ（当該分野で周知の方法）を使用して、鋳型ＤＮＡ供給源および組込んだ制限部位から増幅され得る。完成したＮｃｏＩ／ＫｐｎＩカセットが、目的のベクター内に、適切な制限部位を操作することによって、他の発現ベクターまたは発現システム（例えば、ｐＥＴベクター）に移され得ること、および、他の制限部位が採用され得ることは、当業者に明らかである。
【０１００】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から単離したプラスミドを使用して、ｔｅｔＲ遺伝子を増幅した。遺伝子全体の増幅は、この遺伝子の配列の５’特異的プライマーおよび３’特異的プライマーを使用することにより認識した。センスプライマーは、ＳａｃＩ制限部位、およびその後に続く、ｔｅｔプロモーターの制御下に組換えタンパク質の最適な抑制／誘導のために最適化されたＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含んだ（この実施例、下記を参照のこと）。下流のプライマーは、ＰＲＯＴｅｔプラスミドのＴ０転写終結配列に相同な領域を含んだ。得られたＰＣＲ産物を、Ｔ０終結アンプリコンと組み立てて、最終産物を、当該分野で周知の方法によるＰＣＲ媒介性部位指向変異誘発によって、共通の制限部位を機能しないようにすることによって予め改変された、ＰＲＯＴｅｔＴＭ６×ＨＮベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＳａｃＩ／ＳｐｅＩ制限部位を介してクローニングした。スペクチノマイシン耐性遺伝子を、以下の遺伝子特異的なプライマーを使用して、ＢＬ２１  ＤＥ３  ＰＲＯから単離したプラスミドから増幅した：
【０１０１】
【化４】
2008521447.tif 000074
【０１０２】
Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーは、ｐＰＲＯＬａｒベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのカナマイシンプロモーターの配列を含み、Ｐ３プライマーおよびＰ４プライマーは、カナマイシン部位の末端とＳａｃＩとの間に接合部を含んだ。完成したカセットを、ＡａｔＩＩ／ＳａｃＩ制限部位を介して、新規ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドに移動させた。
【０１０３】
【化５】
2008521447.tif 000075
【０１０４】
を、重なるプライマーから操作し、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを介して、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドにクローニングして、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ１プラスミドおよびｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ  ｖ２プラスミドを得た。ｔｅｔＲタンパク質の翻訳を制御するＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を、変異誘発および選択により最適化した。簡単に述べると、折り畳みレポーターＧＦＰ遺伝子を、ＤＨ１０Ｂ株に形質転換されたスタッファーｖ１  ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩにクローニングした。ｔｅｔＲ遺伝子を、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列の４つのヌクレオチドについての縮重プライマーを用いて増幅し、このカセットを、ＧＦＰ含有ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲ受容ベクターのＳａｃＩ／ＳｐｅＩにクローニングした。得られたライブラリーを、ＢＬ２１  ＤＥ３株に形質転換した。最適な改変体を、誘導率（誘導後の細胞のＧＦＰ蛍光を、誘導前の細胞のＧＦＰ蛍光で割ったもの）を計算し、０．２５μｇ／ｍｌの無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を添加した際の最大誘導率を有する改変体を選択することによってスクリーニングした（表１）。最大の誘導率を示す最適なｔｅｔＲ配列のためのＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列は、ＡＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＧ［配列番号５４］である。
【０１０５】
【表１】
2008521447.tif 000076
【０１０６】
（実施例２：スプリットＧＦＰの実現可能な対の発見）
図２に概説されたスプリットＧＦＰタンパク質のタグ化および検出のスキームを達成するために、本発明者らは、まず、折り畳みレポーターＧＦＰ（変異Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａを有するもの（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、１９９６）、変異Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔを有するもの（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら、１９９７））、または、格別に安定な「超折り畳み」ＧＦＰ（折り畳みレポーターＧＦＰ変異、ならびにＳ３０Ｒ、Ｙ３９Ｎ、Ｎ１０５Ｔ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１ＶおよびＡ２０６Ｖを含む）のいずれかに由来するフラグメントのいくつかの対を試験した。本発明者らは、アミノ酸１−１４５＋１４５−２３８、１−１５５＋１５６−２３８、１−１７１＋１７１−２３８、１−１９５＋１９６−２３８、１−２１４＋２１４−２３８を含む、数種類のＧＦＰフラグメントの対を、Ｅ．ｃｏｌｉ中の適合性プラスミド上に別々に、共発現させた。接合点は、β鎖間のループまたはターンに対応する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８；Ｂａｉｒｄ，Ｚａｃｈａｒｉａｓら  １９９９）（図３を参照のこと）。超折り畳みレポーターＧＦＰからのフラグメント対は、一貫して、折り畳みレポーターＧＦＰからの同じ対よりもかなり明るいコロニーを生じた。例えば、１５６および１７２における超折り畳みＧＦＰフラグメントは、折り畳みレポーターＧＦＰに由来するフラグメントよりも明るかった（図４を参照のこと）。本発明者らの目的は、タンパク質タグとして使用するための１つのフラグメントのサイズを最小にすることであり、従って、本発明者らは、最小のフラグメント（１−２１４＋２１４−２３８）を有する実現可能な対に焦点を当てた。タグ化ドメインのサイズをさらに減らすために、本発明者らはまた、１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）を２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１）との補完性について試験し、小さなフラグメントから無秩序な残基２３１−２３８（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）を排除した。表２は、野生型および操作した変異体を含むＧＦＰ  Ｓ１１構築物の配列を示す。
【０１０７】
【表２】
2008521447.tif 000077
【０１０８】
適合性の起点を有するｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からの超折り畳みＧＦＰフラグメント１−２１４（ＧＦＰ  １−１０）および２１４−２３０（ＧＦＰ  Ｓ１１野生型）の共発現は、蛍光のＥｓｈｃｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを生じた（図５、挿入部分）。対応する折り畳みレポーターＧＦＰフラグメントでは、検出可能な補完は起こらなかった（図５、挿入部分）。超折り畳みＧＦＰ  １−１０は、不溶性であったが、再び折り畳まれた封入体（実施例９、下記を参照のこと）を、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍに由来する可溶性亜硫酸レダクターゼ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）と共にインキュベートすると、Ｃ末端が野生型ＧＦＰであるＳ１１野生型とタグ化して、融合タンパク質亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を生じ、時間依存的な蛍光の増加を生じた（図５、グラフ）。
【０１０９】
（実施例３：ＧＦＰアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０の操作）
本発明者らは、ＤＮＡシャッフリングにより超折り畳みＧＦＰ  １−１０を向上し（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）、その可溶性を向上させ、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１によるその補完を増加させた。超折り畳みＧＦＰ  １−１０のＰＣＲアンプリコンを、出版されたプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いる、ＤＮＡ断片化およびシャッフリングに供した。ＧＦＰ  １−１０  ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドを、ｐＰＲＯＴＥＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上に亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型タグ化タンパク質を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＯ発現株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）に形質転換した。この発現ライブラリーを、１．０ＯＤ６００ｎｍの凍結した２０％グリセロール／Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ストックの２つの段階４００倍希釈を使用して、ニトロセルロース膜の上にプレーティングした。３７℃にて一晩増殖させた後、膜を、培地１ｍｌあたり５０μｇカナマイシンおよび３５μｇクロラムフェニコール、および５０μｇスペクチノマイシンを含有するＬＢ／Ａｇａｒプレートに移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを足して３７℃にて３時間おき、次いで、上記の抗体＋６００ｎｇ／ｍｌ無水テトラサイクリン（ＡｎＴＥＴ）を含有する新しいプレートの上に移動させた。最も迅速な蛍光の発色を示すクローンをピックアップし、−８０℃にて２０％のグリセロール凍結ストックとして凍結した。これらのクローンを、増殖させ、１ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、そして、可溶性の溶解物を、過剰量の精製した亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合タンパク質を用いるインビトロアッセイ（下記の実施例９を参照のこと）において、補完効率についてスクリーニングした。最良の候補をプールし、もう一ラウンドの進化に供した。変異を、蛍光色素によるターミネーターＤＮＡ配列決定により確認した。シャッフリングおよび最も明るいクローンの選択の３回のラウンドの後、最良の改変体（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴと名付けた）の可溶性溶解物のインビトロ補完性は、同じ量の再び折り畳まれた超折り畳みＧＦＰ  １−１０と比べて８０倍向上した（図５、グラフ）。折り畳みレポーターＧＦＰ変異（上記を参照のこと）に加え、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、超折り畳みＧＦＰからのＳ３０Ｒ、Ｙ１４５Ｆ、Ｉ１７１Ｖ、Ａ２０６Ｖ、および、７つの新しい変異（Ｎ３９Ｉ、Ｔ１０５Ｋ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｉ１６７Ｖ、Ｓ２０５Ｔ）を含み、そして、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて３７℃で発現されると、約５０％が可溶性である。非蛍光ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の紫外−可視スペクトルには、レッドシフトしたＧＦＰ（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）の４８０ｎｍ吸収帯がなく、ＧＦＰ  １１の付加が、環化されたクロモフォアを作製するために必要とされる折り畳み工程を誘発することを示唆する（Ｔｓｉｅｎ  １９９８）。精製されたＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、超折り畳みＧＦＰ、および折り畳みレポーターＧＦＰを、各々、１０ｍｇ／ｍｌでロードされる分析用ゲル濾過により研究した。ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴは、６０％の二量体、３５％の単量体、および５％の高次凝集体として溶出したが、全長の折り畳みレポーターＧＦＰおよび超折り畳みＧＦＰは、ともに、９５％を超える単量体と、微量の二量体および高次凝集体として溶出した。
【０１１０】
（実施例４：ＧＦＰ  Ｓ１１の操作）
Ｃ末端野生型ＧＦＰ  Ｓ１１融合タグは、数個のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（Ｆｉｔｚ−Ｇｉｂｂｏｎ，Ｃｈｏｉら  １９９７）試験タンパク質の可溶性を劇的に減少させた（表３）。３−ヘキスロース  ６−ホスファターゼシンターゼ（ＨＰＳ）は単独では、６０％が可溶性であったが、野生型のＧＦＰ  １１と融合させた場合、不溶性であった（図６、表３）。タンパク質の可溶性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および以前に記載されたゲルデンシトメトリー分析（Ｗａｌｄｏ，Ｓｔａｎｄｉｓｈら  １９９９；Ｗａｌｄｏ  ２００３）により決定した。簡単に述べると、ハイスループットのスクリーニングについて、１ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０％ｖ：ｖグリセロールを含有する緩衝液（ＴＮＧ緩衝液）１１０μｌに再懸濁した。他の場合において、３ｍｌの細胞培養物を遠心分離によりペレット化し、３００  １０μｌのＴＮＧ緩衝液に再懸濁した。超音波処理した後、サンプルを遠心分離して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを提供した。ペレットを、超音波処理した上清と等量のＴＮＧ中に再懸濁した。１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する２×ＳＤＳ変性緩衝液（１５μｌ）と混合し、１５分間１００℃にて加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して染色し、ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。較正走査装置（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ｓｃａｎｎｅｒ）は、タンパク質スポットの合成光学密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）Ｄを提供した。全ての発現されたタンパク質含量を、可溶性フラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｓ）とペレットフラクションのタンパク質スポット光学密度（Ｄｐ）とを足すことによって見積もり、可溶性を、Ｓ＝Ｄｓ／（Ｄｓ＋Ｄｐ）として規定した。本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける指向性進化の図式において、ＨＰＳを「おとり」として使用して、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１融合物の可溶性が、ＨＰＳ非融合物の可溶性と一致したＧＦＰ  Ｓ１１の変異体を発見した。
【０１１１】
【表３】
2008521447.tif 000078
【０１１２】
ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１改変体およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのライブラリーを、それぞれ、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲベクター（実施例１、前出を参照のこと）およびｐＥＴ２８ベクターからの配列において発現させた。独立した誘導性の適合性プラスミドを用いるこの連続的な誘導プロトコルは、同時翻訳の折り畳みおよびＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の不溶性改変体とＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとの補完により生じる偽陽性を回避することに役立った。ヘキスロースリン酸シンターゼ−ＧＦＰ  １１（ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１）融合物を、ＰＣＲにより増幅し、刊行されたプロトコル（Ｓｔｅｍｍｅｒ  １９９４）を用いてシャッフリングした。ＧＦＰ  Ｓ１１変異体ライブラリーを、ＡｎＴＥＴ誘導性ｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）を有するｐＴＥＴプラスミドから、Ｎ末端６−ＨＩＳタグを有するおとりタンパク質であるＨＰＳとのＣ末端融合物として発現させ（図１および実施例１、前出を参照のこと）、そして、ｐ１５複製起点を含む改変したｐＥＴベクターにおいてＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）株へと形質転換した。最適物を、以下のような連続誘導プロトコルを使用してスクリーニングした。３７℃において一晩増殖させた後、コロニーを有するニトロセルロース膜を、３００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有する、選択ＬＢ／寒天Ｂａｕｅｒプレート上に移し、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１ライブラリーを発現させ、これを、新しい「休止（ｒｅｓｔｉｎｇ）」プレートに１時間移して、ＡｎＴｅｔをコロニーから拡散させ、ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１の発現を遮断し、そして、最終的に、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有するＬＢ／寒天プレートに２時間移して、ｐＥＴプラスミドから補完ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの発現を誘導した。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型構築物は、完全に不溶性なので、連続発現プロトコルに従ってＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを発現するコロニーは、わずかに蛍光を発するのみであった。より可溶性のＨＰＳ−ＧＦＰ  １１最適物に関連する、より明るいコロニーを、９６ウェル組織培養プレートの選択液体培地にとり、−８０℃の２０％グリセロールストックとして保存した。これらのコロニーを、１ｍｌの液体培地中で増殖させ、３００ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴで誘導した。可溶性フラクションを、過剰の精製ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（下記、実施例９を参照のこと）において、補完効果についてスクリーニングした。最速の補完速度を有するクローンを選択し、さらにもう一ラウンドの進化およびスクリーニングのためにプールした。２ラウンドの進化は、２つの別個のＧＦＰ  Ｓ１１変異体、Ｌ２２１ＨおよびＴ２２５Ｎを生じた。本発明者らは、まず、Ｌ２２１Ｈ改変体（ＧＦＰ  １１  Ｍ１と名付ける）に焦点を当てた。この変異は、インビボにおいて、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを効率的に補完し、そして、ＨＰＳ  ＧＦＰ  Ｓ１１野生型と比べて向上した可溶性を有したが、融合タンパク質の溶解度に対するＧＦＰ  Ｓ１１の有害な効果を完全には排除しなかった（図６および表３）。ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２を、Ｆ２２３Ｓ（異なるスプリットＧＦＰフラグメントの可溶性を実質的に増加した変異（実施例１１、下記を参照のこと））を、Ｔ２２５Ｎと合せることによって操作した（表３、前出を参照のこと）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２の可溶性は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１またはＨＰＳ−ＧＦＰ  １１野生型のいずれに対しても大きく向上した（図６、表３）。ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ２のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの補完率は、ＨＰＳ−ＧＦＰ  １１  Ｍ１と比べて約５倍減少した。これは、可溶性融合タンパク質に匹敵する量である（図７）。本発明者らは、二重のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのＣ末端残基であるＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２からＫ２１４を除去し、そして、縮重プライマーセット（当該分野で周知の方法）を使用してホットスポット位置２２３において６４倍縮重ライブラリーをスクリーニングし、そして、得られたＧＦＰ  １１  Ｍ２の改変体をＨＰＳとのＣ末端融合物としてクローニングして、より保存的な変異について検索した。約２００クローンの可溶性フラクションを、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いるインビトロアッセイ（実施例９、下記を参照のこと）においてスクリーニングした。平衡化した最良のＧＦＰ  Ｓ１１構築物（Ｌ２２１Ｈ，Ｆ２２３Ｙ，Ｔ２２５Ｎ）（ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３と称する：アミノ酸配列ＲＤＨＭＶＬＨＥＹＶＮＡＡＧＩＴ［配列番号１６］、表２（前出）を参照のこと）は、良好な補完性で（図７）、融合タンパク質の溶解度の揺れを減らした（図６、表２、前出）。本発明者らはまた、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２タグを補完標的として使用して、上記の実施例３において概説した方法に従う指向性進化により、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完を向上させることを試みた。これにより、ＧＦＰ  １−１０  Ａ４と呼ばれる改変体が生成され、この改変体は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、約５速いＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２の補完を示した。ＧＦＰ  １−１０  Ａ４は、超折り畳み変異、ならびにさらなる変異Ｒ８０Ｑ、Ｓ９９Ｙ、Ｔ１０５Ｎ、Ｅ１１１Ｖ、Ｉ１２８Ｔ、Ｋ１６６Ｔ、Ｅ１７２ＶおよびＳ２０５Ｔを含んだ。Ａ４改変体は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて主に封入体として発現され、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに比べ、インビボアッセイにあまり有用ではない。しかし、改変体Ａ４は、インビトロアッセイにおいて有用である。なぜならば、改変体Ａ４は、単に新しいＴＮＧ緩衝液に尿素で可溶化したペレットを希釈することによって封入体から再び折り畳まれ得、そして、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴよりも４倍速くＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ２またはＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を補完するからである。
【０１１３】
（実施例５：ＧＦＰ  １−１０の可溶性バージョンまたは不溶性バージョンを使用する、連続的な誘導または同時誘導の効果の比較）
同時誘導が、不溶性かつ凝集したＧＦＰ  １−１０の補完をもたらし得るという仮説を試験するために、本発明者らは、連続誘導プロトコルおよび同時誘導プロトコルを比較した。ＣｏｌＥ１起点を有するベクターｐＴＥＴ上の大きなＧＦＰ  １−１０フラグメント（折り畳みレポーターＧＦＰ  １−１０、超折り畳みＧＦＰ  １−１０またはＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ）、および、ｐ１５起点を有するｐＥＴプラスミド上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型で同時形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、栄養寒天プレート上のニトロセルロース膜に二連でプレーティングし、直径約１ｍｍまで一晩増殖させた。１つの膜を、連続誘導プロトコル（実施例４、前出を参照のこと）を使用して処理した。簡単に述べると、ＧＦＰ  １−１０を、まず、ＡｎＴＥＴを用いて発現させ、その後、新しいプレート上に置いて、ＡｎＴＥＴを除き、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する新しいプレート上の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型を発現させた。二連のプレートを、別々に同時誘導させた（ＡｎＴＥＴおよびＩＰＴＧの両方を含有するプレート）。蛍光コロニーを、ＩｌｌｕｍａＴｏｏｌ（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて４８８ｎｍの光で照射し、そして、Ｋｏｄａｋ  ＤＣ２９０デジタルカメラを使用して、５２０ｎｍロングパスフィルタを通して画像化した。超折り畳みＧＦＰ  １−１０を一過性に発現させ、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型の誘導前にインビボで凝集させると、細胞はぼんやりしている（図８）。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴおよび亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１構築物を発現する細胞は、予想通りに、同時発現であっても連続発現であっても、明るい（図８）。
【０１１４】
（実施例６：インビトロで行なったスプリットＧＦＰアッセイの感度）
本発明者らは、マイクロタイタープレートでの２００μｌの反応において、数個の異なる量の精製亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３の補完について、蛍光漸増曲線（ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｃｕｒｖｅ）を測定した（図９）。本発明者らは、高濃度かつ大モル過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）を使用して補完を開始させることにより、潜在的なより高次の動力学的効果を避けた。これらの感度実験について、９６ウェルマイクロプレートを最初に、ＴＮＧ緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｖ：ｖグリセロール）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液で、１０分間ブロッキングした。Ｔａｌｏｎ樹脂で精製した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）６ＨＩＳ−亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質の２倍の段階希釈を、同じ緩衝液中で行なった。この希釈は、２０μｌのアリコートあたり、２００ｐｍｏｌ〜０．１ｐｍｏｌの範囲にわたり、このアリコートを、９６ウェルプレートのウェルに添加し、次いで、１８０μｌのアリコートに添加された大過剰（８００ｐｍｏｌ）のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて実施した。その結果、大きなフラグメントの濃度は制限されなかった。粗製Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の、反応の感度に対する効果を、別個の実験で試験するために、サンプルをまた、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加前に、不適切な非タグ化タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の溶解物（２０μｌ）を添加することによって、スパイクした。蛍光動力学（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５３０ｎｍ）を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ，Ｗｉｎｎｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いてモニタリングし、３分間隔で１５時間記録した。ブランクサンプル（２０μｌの不適切なタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ溶解物、１００μｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および１００μｌのＴＮＧ緩衝液中０．５％  ＢＳＡ）のバックグラウンド蛍光を、最終蛍光値から減算した。ブランクは、最も低い標的濃度（０．１ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３）から、３０％未満のシグナルであった。補完蛍光は、分析物濃度の線形関数であった（図９）。１０〜２００ｐｍｏｌ量の亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの添加後１５分以内で正確に定量化され得（図９Ａ）、そして、０．１ｐｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌは、約１時間を要した（図９Ｂ）。広範な濃度範囲にわたる漸増曲線は、単純な線形スケーリングにより重ね合わされ得（図１０）、反応の動力学が、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの濃度により制限されなかったことを示す。図９に示される曲線にフィットする滑らかな線は、試験サンプルが、既知濃度のサンプルを測定する際に使用されるのと同じ条件下で測定される限りは、ＧＦＰタグ化ドメインでタグ化された試験サンプル中のタンパク質の量を決定するための較正曲線に歩み寄ることができる（例えば、この較正曲線は、同じアッセイ試薬濃度のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および同じ容量のサンプルを使用して、図９Ａの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を例示した）。従���て、図９Ａにおいて、蛍光（Ｙ）のｐｍｏｌへの線形フィットは、Ｙ＝２．４６×（ｐｍｏｌ）＋２２．８により与えられる。本発明者らが、較正曲線と同じ条件下でタグ化タンパク質の未知の濃度を測定すると仮定すると、２００単位の蛍光の測定が得られる。ｐｍｏｌについての解法（ｓｏｌｖｉｎｇ）は、（Ｙ−２２．８）／２．４６であり、Ｙを２００と置き換え、本発明者らは、ｐｍｏｌを、（２００−２２．８）／２．４６＝７２．０ｐｍｏｌを計算し得る。
【０１１５】
（実施例７：スプリットＧＦＰフラグメントの迅速な結合）
スプリットＧＦＰフラグメントの結合動力学と、クロモフォア形成の動力学との間を区別するために、本発明者らは、Ｔａｌｏｎ樹脂に結合させた６ＨＩＳ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの、Ｎ末端折り畳みレポーターＧＦＰにタグ化したＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３による補完を行なった。５０％ｖ／ｖスラリーのＴａｌｏｎ樹脂のアリコート（１００μｌ）を、Ｎ末端６ＨＩＳ親和性タグ（２ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）を有するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴで飽和させた。ビーズ（５０μｌのベッド容量）を、３００μｌのＴＮＧ緩衝液で３回洗浄して、未結合のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを除去し、残った緩衝液を吸引して破棄し、そして、蛍光を９６ウェルマイクロタイタープレートにて測定した（図１１、工程１）。過剰の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質（５ｍｇ／ｍｌタンパク質を２００μｌ）をビーズに添加し、１５秒間ピペッティングすることにより混合し、小さな０．２μスピン濾過カラムに迅速に移し、ＴＮＧの０．５ｍｌアリコートで３回洗浄して、未結合の折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質を除去した。この手順は、約５分を要した。ビーズをマイクロタイタープレートの新しいウェルに移し（図１１、工程２）、そして、蛍光を、３分間隔で１２時間測定した（図１１、工程３）。ビーズの蛍光は、折り畳みレポーターＧＦＰ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タンパク質が、迅速に６ＨＩＳ−ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴに結合したことを示した（図１１、工程２）。洗浄したビーズは、溶液中で観察されたものに匹敵する速度でさらなる蛍光を得（図１１、工程３）、蛍光形成の動力学が、ＧＦＰフラグメントの会合速度により制限されないことを示した。
【０１１６】
（実施例８：補完アッセイの頑健性、ならびにアジュバントおよびｐＨの影響）
本発明者らは、補完反応に対する一般的な化学アジュバントおよびｐＨの影響を試験した。９Ｍの尿素の連続的な２倍段階希釈を、ＴＮＧを用いて行なった。１０の溶液の１００μｌアリコート（９Ｍ尿素から０．０１９Ｍ尿素までの濃度範囲）を、１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  １１  Ｍ３、１０μｌのアッセイフラグメントＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ、および８０μｌのＴＮＧ緩衝液と合せた。蛍光データを、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で１２時間にわたって集めた。この反応を、２．０Ｍより上の尿素でクエンチした（図１２）。別の実験において、補完速度は、５ｍＭジチオスレイトールにより約３０％向上したが、０．１％ｗ／ｖ  ＳＤＳによりクエンチした。本発明者らは、次に、補完反応の効率に対する、異なるｐＨの溶液の影響を試験した。１０μｌの亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質、またはＳ１１野生型ペプチドの等モル溶液を、適切な緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ５〜６．５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５〜７．５）、ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５〜８．５）、ＢＩＣＩＮＥ（ｐＨ８．５〜９．０）を含有する、１８０μｌの０．１Ｍ溶液（０．５ｐＨ単位の間隔で、５．０〜９．０のｐＨ範囲にわたる）に添加した。補完を、１０μｌのＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって開始し、そして、補完の動力学を、ＦＬ−６００プレートリーダー（ＢＩＯＴＥＫ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、３分間隔で一晩モニタリングした。補完は、ｐＨ６．５より下では非効率的であり、約ｐＨ７．３の見かけ上のｐＫａを有した（図１３）。補完後、蛍光ＧＦＰ部分は、５Ｍより大きな尿素において蛍光のゆっくりとした時間依存的な減少を示し（ｔ１／２＝２０時間）、約５．５のｐＫａは、「増強された」ＧＦＰと同様であった（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｋｎｏｂｅｌら  １９９７）。
【０１１７】
（実施例９：インビトロでのタンパク質の定量化）
スプリットＧＦＰシステムが、インビトロで正確に異なるタンパク質を定量化することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質を、Ｃ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグを有するｐＥＴベクター構築物として液体培養物中で発現させ、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスプリットＧＦＰ補完システムを使用して、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析した（図１４）。１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍタンパク質の可溶性フラクションを、ｐＥＴ発現タンパク質定量化試験についてアッセイするため、そして、ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−１０改変体の指向性進化の間に、最適物に対してアッセイを行なうために、細胞溶解物の標的タンパク質の可溶性フラクション（２０μｌ）を、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中で、１８０μｌの０．３５ｍｇ／ｍｌ再折り畳みＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ（約６００ｐｍｏｌ）と混合した。不溶性のペレットをアッセイするために、５０μｌの再懸濁した不溶性フラクションの各々を遠心分離し、乾燥したペレットを、５０μｌの９Ｍ尿素の添加により溶解し、次いで、１０μｌの非折り畳みサンプルを、１９０μｌのＴＮＧ中０．３５ｍｇ／ｍｌ  ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの迅速な添加によりアッセイした。ペレットアッセイの蛍光値を、２つの因子によりスケール化して可溶性アッセイと比べて低い容量を補償し、可溶性フラクションアッセイとの直接的な比較を可能にした。アッセイ中の尿素の最終濃度は、約０．４Ｍであった（実施例８、前出、および図１２を参照のこと）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、可溶性フラクションおよびペレットフラクションのサンプルを定量化するために、１５μｌの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、１５μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液（１００ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭジチオスレイトール、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、および２０％グリセロールを含有する）と混合し、１００℃にて１５分間加熱した。変性したサンプルを、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。ゲル上のタンパク質スポットを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、画像化して、ＧＳ−８００較正スキャニングデンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、タンパク質スポットの光学密度を定量化した。クーマシー色素は染色効率のタンパク質依存性のバリエーションを示すものの（Ｔａｉ，Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎら  １９８５）、補完および折り畳みの完了後（約６時間後）、測定される蛍光値と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化したタンパク質の量との間には強い相関があった（図１４）。９Ｍ尿素中に溶解し（この実施例、前出を参照のこと）、過剰のＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを含有する緩衝液で２０倍希釈した不溶性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化された不溶性タンパク質の量と良好に相関する蛍光を生じた（図１４）。対照的に、可溶化されたペレットを、濃縮したＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴのアリコートを���加する前に、新しい緩衝液で希釈した場合、十分に発現された不溶性タンパク質のいくつか（すなわち、ポリスルフィドレダクターゼおよびヌクレオチド二リン酸キナーゼ、表３および図１４）は、検出可能な補完を与えなかった。おそらく、これらのタンパク質は、希釈の際に折り畳みを誤り、凝集し、引き続くＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ部分の前に、ＧＦＰ  １１  Ｍ３タグをアクセス不能にしている。
【０１１８】
（実施例１０：スプリットＧＦＰアッセイシステムを使用する、インビボでの可溶性タンパク質および総タンパク質の推定）
実用的なスプリットタンパク質タグ化システムは、可溶性タンパク質または不溶性タンパク質のいずれかを標識および検出するために、インビボで使用され得る。本発明者らは、可溶性タンパク質が、まず、タグ化タンパク質を限られた時間だけ発現させ、次いで、この発現を停止して、同じ細胞区画において補完ＧＦＰフラグメントの引き続く発現の前に、タグ化タンパク質が、その固有の溶解表現型を現すことを可能にすることによって、生きているＥ．ｃｏｌｉ細胞においてアッセイされ得るという仮説を立てた。インビトロペレットアッセイ（実施例９、前出を参照のこと）における本発明者らの同時再折り畳みの結果から、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグ化タンパク質およびＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを同時発現させることによって、インビボでの試験タンパク質の凝集前の構造的な補完およびＧＦＰ蛍光の発色に対する確約をもたらし、発現される総タンパク質の見積もりを可能にすることが期待された。Ｎ末端６ＨＩＳを有するＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質と、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミド（図１、前出を参照のこと）に由来するＣ末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグと、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来するＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴとを同時に発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび７０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ中で飽和まで増殖させ、−８０℃のフリーザーストック用に、２０％グリセロール中に、ＯＤ６００ｎｍ＝１．０にて希釈した。細胞を、ＬＢ中２つの４００倍希釈で、段階希釈し、ニトロセルロース膜にプレートした。３２℃にて一晩増殖させた後、これらの細胞を、連続的（実施例４、ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、前出を参照のこと）、または同時に誘導した。連続的な誘導について、一晩のコロニーを有する膜上の細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌのＡｎＴｅｔを含有するプレート上で１．５時間、静止プレートで１時間、そして、１ｍＭ  ＩＰＴＧプレート上で最後に１時間インキュベートした（ＧＦＰ  Ｓ１１の操作、実施例４に使用した時間と比べ、誘導時間が短いことに注意されたい）。同時誘導プロトコルについて、一晩のコロニーを有する膜を、６００ｎｇ／ｍｌのＡｎＴＥＴおよび１ｍＭのＩＰＴＧの両方を含有するプレートに移し、３７℃にて４時間インキュベートして、ＧＦＰ  Ｓ１１融合物、および大きなＧＦＰフラグメント１−１０の両方を同時に発現させた。プレート上で誘導されたコロニーを、４８８ｎｍ励起フィルタを備えるＩｌｌｕｍａｔｏｏｌ  Ｌｉｇｈｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて照射し、ＤＣ２９０デジタルカメラ（Ｋｏｄａｋ）を用いて、有色ガラスフィルタ（５２０ｎｍロングパス，ＬｉｇｈｔＴｏｏｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を通して写真撮影した。蛍光のコロニーを、同時発現の後、または連続的な発現の後に画像化し、同じ構築物の可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、液体培養物中での連続的な誘導の後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１５）。本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に���可溶性フラクションを過剰のＴａｌｏｎ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に結合することによって、有用な凝集していない６ＨＩＳタグ化タンパク質の量を評価した。簡単に述べると、インビボ全細胞プレート補完アッセイにおいて使用したものと同じクローンの可溶性フラクションおよびペレットフラクションを分析するために、コロニーを、別個に、９６ウェル培養プレートの１ｍｌ中で、３７℃にて増殖させた。細胞を、２５０ｎｇ／ｍｌ  ＡｎＴＥＴを含む対数期に１時間誘導し、新しいＬＢで３回洗浄し、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧで１．５時間誘導した。誘導後、培養ペレットを、１１０μｌのＴＮＧ緩衝液で再懸濁し、超音波処理によりばらばらにした。溶解物を、遠心分離によりフラクションして、可溶性フラクションおよびペレットフラクションを得た。連続的に誘導した液体培養物の４０μｌの可溶性抽出物を、ＴＮＧ緩衝液中５０％ｖ／ｖの金属親和性樹脂ビーズ（Ｔａｌｓｏｎ樹脂，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の等容量のスラリーと混合し、簡単に遠心分離した。未結合のフラクションを、ピペッティングにより除去し、ビーズを、過剰のＴＮＧ緩衝液で連続的に２回洗浄した。最後の遠心分離工程の後、緩衝液を捨てた。４０μｌの２×ＳＤＳ変性緩衝液を添加し、１００℃にて１５分間加熱した。不溶性フラクションを、記載されたように変性した（実施例４、前出を参照のこと）。Ｔａｌｏｎ結合し、かつ変性したサンプルを、各々、４〜２０％勾配のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で分離した。タンパク質サンプルを、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて染色し、ＧＳ−８００較正デンシトメーター（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて画像化した。同時誘導によるインビボコロニー蛍光は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致する総タンパク質を報告したが、その一方で、連続的な誘導によるコロニー蛍光は、Ｔａｌｏｎ結合した可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥと一致した（図１５）。高度に可溶性のタンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されていようと、連続的に誘導されていようと（タンパク質２、４および５、図１５）、明るかった。不溶性タンパク質を発現するコロニーは、ＧＦＰ  １−１０が同時に誘導されたとき（タンパク質８、１１、１５、１６および１８、図１５）、かなり明るかった。タンパク質１、４、５、７、９、１２および１４は、各々、ｐＴＥＴプラスミド（図１５）のより弱いｔｅｔプロモーター（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ  １９９７）から発現された場合よりも、ｐＥＴシステム（表３および図１４、前出）の非常に強力なＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら  １９９０）から発現されたときに、溶けにくかった。タンパク質の発現レベルおよび溶解度に対するプロモーターの強度の影響は、以前に注目されている（Ｍａｋｒｉｄｅｓ  １９９６；Ｂａｎｅｙｘ  １９９９；Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｅｄｗａｒｄｓら  ２００３；Ｙｏｋｏｙａｍａ  ２００３；Ｆａｈｎｅｒｔ，Ｌｉｌｉｅら  ２００４）。
【０１１９】
（実施例１１：ＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグフラグメントおよびＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントからなるスプリットＧＦＰ補完対の操作）
実施例２（前出）の方法に従って、本発明者らは、超折り畳みＧＦＰアミノ酸１９８−２３８から構成される実現可能なスプリットＧＦＰ対（ＧＦＰ  Ｓ１０−１１）、および超折り畳みＧＦＰアミノ酸１−１９８から構成される補完アッセイフラグメント（ＧＦＰ１−９）を同定した。これらは、２つのフラグメントがＥ．ｃｏｌｉにおいて同時に発現される場合に、蛍光細胞を産生した。ＧＦＰ  １−９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて単独で発現されると不溶性であった。単独で発現されたフラグメントはいずれも、蛍光ではなかった。実施例３（前出）の記述に従って、そして、亜硫酸レダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１０−１１融合タンパク質を補完標的として使用して、本発明者らは、指向性進化によるＧＦＰ  １−９の折り畳みおよび溶解度を向上させて、新規改変体ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを生じ、これは、超折り畳みＧＦＰの変異（実施例２、前出を参照のこと）、およびさらなる変異Ｓ２Ｒ、Ｔ４３Ｓ、Ａ８７Ｖ、Ｆ１１４ＳおよびＫ１６６Ｔを含んだ。このフラグメントは、ｐＥＴ  ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からＥ．ｃｏｌｉにおいて３７℃にて発現されると、約５０％可溶性であった。次に、本発明者らは、実施例４（前出）の記述に従って、進化したＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完標的として使用して、ＧＦＰ  Ｓ１０−１１の溶解度を向上させ、そして、融合タンパク質の折り畳みおよび溶解度の揺れを減少させた。超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグは、以下の配列：
【０１２０】
【化６】
2008521447.tif 000079
【０１２１】
を有し、一方で、最適化されたＧＦＰ  Ｓ１０−１１は、以下の配列：
【０１２２】
【化７】
2008521447.tif 000080
【０１２３】
（変異Ｎ１９８Ｄ、Ｓ２０５Ｔ、Ｖ２０６Ｉ、Ｋ２１４Ｅ、Ｆ２２３Ｓ）を有する。これらのフラグメントを使用する、インビトロスプリットＧＦＰアッセイの感度を、実施例６、前出に従って試験したが、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴの量は制限された（２．５μＭのＧＦＰ  １−９  ＯＰＴ）。これらの条件下で、蛍光は、予測どおり、２．５μＭ以上のタグ化フラグメント濃度において、プラトーに達した（図１６）。
【０１２４】
（実施例１２：（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）サンドイッチタグ形式の操作、およびアッセイフラグメントＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いた検出）
標的タンパク質の両端が結合しているときを厳密に試験するため、そして、標的タンパク質の一端のみがタグ化された状態で結合している潜在的なアーチファクト（例えば、タンパク質分解または内部リボソーム結合部位により生じた短いフラグメント）を減らすために、本発明者らは、試験タンパク質が、ＧＦＰの二つの小さなドメイン間の融合物として発現されるサンドイッチ形式を操作し、これを次いで、ＧＦＰの第３のドメインで補完させる。この実施形態において、試験タンパク質Ｘは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｘ−（ＧＦＰ  Ｓ１１）のようなＧＦＰ鎖１０とＧＦＰ鎖１１との間のサンドイッチとして発現される（図１７）。この種は、ＧＦＰの第３のドメインであるＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを補完して、インタクトなＧＦＰを生成する。本発明者らは、当該分野で周知の方法を使用して、超折り畳みＧＦＰ  Ｓ１０−１１タグ中のＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との間に試験タンパク質を挿入することによって、構築物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を操作した。ここで、Ｌ１およびＬ２は、各々アミノ酸ＧＧＧＳ［配列番号４４］から構成されるリンカーである（図１８Ａ）。本発明者らは、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−亜硫酸レダクターゼ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）を首尾よく検出したが、補完は、Ｃ末端がＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３＋ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴ形式と同じくらいの効率である、わずか約１／３０であった。本発明者らはまた、他の部分的に可溶性のタンパク質が、このサンドイッチ形式で発現されると不溶性になることを発見した。まず、本発明者らは、溶解度とは無関係に補完効率を改善した。本発明者らは、（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）から開始し、ここで、鎖ＧＦＰ  Ｓ１０および鎖ＧＦＰ  Ｓ１１は、超折り畳みＧＦＰに由来するものであり（図１８Ａ）、短いアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＳＧＧ［配列番号５４］が、２つのＧＦＰ鎖の間に柔軟なリンカーを提供する。これを、ＤＮＡシャッフリングにより変異させ、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの補完が向上した改変体のライブラリーを、ｐＴＥＴベクターからのライブラリーの連続的な誘導によりインビボでスクリーニングし、その後、（実施例４、前出に概説した方法に従って）プレート上のコロニーとして、Ｅ．ｃｏｌｉ内でｐＥＴベクターからＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを発現させた。６つの最も明るいコロニーを、３回の進化のラウンドの後に配列決定した（図１８Ａ）。本発明者らは、６つのセットのうちの５番目の変異体に焦点をあて、この構築物を、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｘ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）（ＳＭ５＝サンドイッチ変異体番号５）と名付けた。この最適物は、以下の配列：
【０１２５】
【化８】
2008521447.tif 000081
【０１２６】
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターまたは優先順位の低いベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。このようなアプローチは、当該分野で周知である。このカセットを、ｐＴＥＴベクターへのクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位により隣接させる。開始鎖構築物と比べ、Ｎｄｅ−１／ＢａｍＨ−１部位にクローニングされた可溶性亜硫酸レダクターゼは、補完速度が約２０倍増加したが、（実施例４、前出のように）部分的に可溶性のＨＰＳタンパク質を用いて試験した場合、タンパク質の溶解度に対する有害な効果がまた増加した。続いて、向上した補完、および融合タンパク質の溶解度の摂動の減少について同時に選択するために、本発明者らは、ＧＦＰ  Ｓ１１の溶解度および補完を向上するために用いたものと同じおとりタンパク質であるリン酸シンターゼ（ＨＰＳ）（実施例４、前出）を使用した。ＨＰＳは、ｐＴＥＴベクターから単独で発現されると、約６０％可溶性であった（図１５、タンパク質番号９）が、（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−ＨＰＳ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）融合タンパク質として発現されると、不溶性であった。本発明者らは、シャッフリングおよびプライマードーピング変異誘発（１４の合成オリゴヌクレオチドプライマーのプール）を用いて、上流の（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）ドメインに焦点をあてた（図１８Ｂ）。各プライマーを、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５ドメインの１４のアミノ酸の１つに集中させた。中心の標的アミノ酸は、ＮＮＮがコードする縮重を含み、そして、クローニングベクターの前後関係において、ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５に対する相同物（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）と隣接する（図１８Ｂおよび図１９に示される標的配列）。縮重プライマーのプールを、組立て反応（実施例４、前出において実施した再組立て）の間に、断片化したＤＮＡに添加した。このようなプライマードーピング変異誘発技術は、当該分野で周知である。本発明者らは、上流でＮｃｏＩ、そして下流でＢａｍＨＩに隣接されたドメインＮｃｏ１：（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をシャッフルして増幅し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるフラグメントの再組立ての間に、縮重プライマーミックスを添加した。本発明者らは、ＰＣＲによって、再組立て��た変異型構築物に由来するドメインを再増幅し、次いで、変異型（ＧＦＰ  Ｓ１０）プールを含むＮｃｏ１／Ｎｄｅ−１フラグメントを消化して切り出し、標準的な技術を使用してゲル精製し、そして、Ｎｃｏ１／／Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）を含む受容ベクターにクローニングした。（この実施例、前出、および、この実施例中の中間体フラグメントを使用する、インビトロ補完アッセイについて、実施例４、前出に概説された方法に従う）ｐＴＥＴプラスミドおよびｐＥＴプラスミドからの連続的な誘導形式を使用する、３回の選択ラウンドの後、最良の８クローンの各々の配列を、蛍光色素ターミネーター配列決定により決定した（図１９）。最良のパフォーマンスを示すクローン（（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−Ｌ１−Ｎｄｅ１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と名付ける）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させると、約４５％が可溶性であり、これは、不溶性での開始構築物に対して顕著な改善である。そして、補完シグナルは、ここで、サンドイッチ構築物（前出）においてＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５タグのみを検出するためにＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを使用した場合の補完シグナルの、約１／５〜１／４であった。次に、本発明者らは、１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（同一性および非融合物の溶解度については、表３、前出を参照のこと）を用いて、アッセイを試験した。可溶性フラクションおよびペレットフラクションを、以前に記載したように（実施例９、前出）、本実施例の即時のフラグメントを用いてアッセイした。本発明者らは、参照物として（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）タグのみを特異的に検出するために、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴを用いて、そしてまた、サンドイッチ形式でタグ化したタンパク質の（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）鎖および（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）鎖の両方の結合を必要とするＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを使用して、これらのサンドイッチ形式でタグ化したタンパク質をアッセイした。予想どおりに、補完は、一方の鎖のみが検出に必要とされる場合（ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴの場合）に、より効率的であり、そして、尿素可溶化ペレットを用いたペレットフラクションの検出は、ＧＦＰ  １−１０  ＯＰＴでの検出の場合に最も効率的であった（図２０）。それにもかかわらず、ＧＦＰ  １−９  ＯＰＴを用いて検出されるサンドイッチについての可溶性フラクションの蛍光は、ＧＦＰ  １−１０での検出を用いたときのシグナルと十分に相関し、可溶性タンパク質が予想どおりであったことを記録した。同様に、インビボでの連続的な誘導は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物を用いた可溶性ｐＴＥＴの発現と相関した（図２０、また、実施例９（前出）および図１５も参照のこと）。好ましい最適物は、以下のアミノ酸配列：
【０１２７】
【化９】
2008521447.tif 000082
【０１２８】
を有し、ここで、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖には下線を付し、アスタリスクは終止コドンである。最初の斜体の配列は、ＮｄｅＩクローニング部位ＣＡＴＡＴＧに由来するものであり、アミノ酸ＨＭをコードする。第２の斜体の配列は、ＢａｍＨＩ制限部位ＧＧＡＴＣＣに由来するものであり、アミノ酸ＧＳをコードする。ＮｄｅＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位をインフレームで有する試験タンパク質を、当該分野で周知の方法を使用して、ＮｄｅＩ制限酵素およびＢａｍＨＩ制限酵素で前もって消化した構築物を含むベクターにクローニングする。カセットは、ｐＴＥＴベクターにクローニングするために、ＮｃｏＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位に隣接される。代表的に、この構築物を含むクローニングカセット中のＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間のインフレームの領域は、フレームシフトスタッファーにより終止コドンで置き換えられ、消化されていないベクターにより生じる偽陽性を防ぐ（代表的なフレームシフトスタッファー配列については、実施例１、前出を参照のこと）。
【０１２９】
（実施例１３：スプリットＧＦＰフラグメントの再構成の同時発現を使用する、存在するタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの作用のモデル）
従来のスプリットＧＦＰシステムは、折り畳みが乏しく、そして主として不溶性である。フラグメントの多くは、凝集体に分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）する。少量は、シャペロンの活性によってレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）されるが、相互作用ドメインの非存在下において、レスキューされた一過性の可溶性フラグメントが凝集体に再分配する前に結合し得る確率は、低い（図２１ａ）。相互作用ドメインを付加する工程は、それらのフラグメントを係合（ｔｅｔｈｅｒ）し得、新しく再折り畳みされた一過性の可溶性フラグメントの相互作用の確率を上昇させる（図２１ｂ）。したがって、このシステムは、エントロピーの理由からではなく、むしろ安定性の欠如に起因して自発的に補完しないようである。
【０１３０】
（実施例１４：別々に発現されるスプリットＧＦＰフラグメントの再構成を使用する、存在するタンパク質−タンパク質相互作用検出システムの作用のモデル）
融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ、従来のスプリットＧＦＰシステムは、（時間的か、または空間的に）別々に発現した場合に、効率的に補完することができない。上記フラグメントは、同時に発現されないので、新しく再折り畳みされた一過性の可溶性フラグメントの相互作用の確率は、非常に低い（図２２）。したがって、このシステムは、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ、エントロピーの理由からではなく、むしろ安定性の欠如に起因して自発的に補完しないようである。これは、融合された相互作用コイルドコイルを有するＧＦＰフラグメントは同時発現した場合にのみ補完が可能であるというＺｈａｎｇおよびＣｈａｌｆｉｅ、２００４、前出による観察と一致し、そしてＨｕら、２００３、前出は、封入体から再折り畳みしたか、または同時発現した場合にのみ、コイルドコイル融合ＧＦＰフラグメントの補完を観察した（Ｈｕ，ＣＤ．＆Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｔ．Ｋ．、２００３、Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１、５３９−５４５）。
【０１３１】
（実施例１５：再構成のために相互作用ドメインをレスキューする、可溶性の、非変動性スプリット蛍光タンパク質フラグメントの操作）
先に記載されたスプリットＧＦＰフラグメントは、折り畳みが乏しく、凝集し、したがって効率的に補完しなかった（図２３ａ）。上記の実施例（実施例１〜１２）は、可溶性のままであり、かつ凝集しない可溶性の、安定なＧＦＰフラグメントを操作するための技術およびアプローチを示す（図２３ｂ）。これらのフラグメントは、同時か、または別々に発現され得、そして可溶性のままであり、かつ融合されたポリペプチドの可溶性および折り畳みを変動させない。これは、タンパク質フラグメントの再構成に基づく一般的に有用なタンパク質−タンパク質相互作用検出システムについての、重要な必要条件である。しかし、これらのフラグメントは、融合された相互作用ドメインに対する必要性を伴わずに自己会合する（図２３ｂ）。タンパク質−タンパク質相互作用検出因子として有用であるために、上記フラグメントは、必ず、再構成のための融合された相互作用ドメインを必要とする。１つのアプローチにおいて、可溶性の操作されたフラグメントＦ１を、一定に保ち、そしてそのフラグメントＦ１を、フラグメントＦ２の改変体のライブラリーをスクリーニングするためのアッセイフラグメントとして使用して、自発的な補完および蛍光の形成を排除または廃絶するＦ２の変異を同定する。広いライブラリーを、例えば、非蛍光性である多数の改変体（すなわち、＞１０５）を見出し、そして収集するためにフローサイトメトリーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてスクリーニングし得る（図２３ｃ）。これらの非蛍光改変体は、折り畳みの欠損を有する変異体、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ補完が不可能な変異体、不溶性である変異体などのような望ましくない改変体を含み得る。したがって、上記非蛍光改変体のライブラリーを、次いで、公知の相互作用タンパク質（例えば、コイルドコイル）を有する融合物として発現される変異体を生じるベクターにサブクローニングする（このようなコイルドコイルは、Ｈｕ、２００２、前出；Ｇｈｏｓｈら、２０００、前出に記載される）。また、上記ライブラリーを、相互作用タンパク質にのみ融合した場合に、そのまま補完する変異体を同定するために、フローサイトメトリーによってスクリーニングするか、プレート上でスクリーニングする。必要な場合、最適物の最終的なライブラリーを、そのまま、補完のための融合された相互作用ドメインに対する依存性を確かめるために、相互作用タンパク質を含まないベクターにサブクローンし得る。フラグメントの安定性および可溶性をさらに改良するための変異のさらなるラウンドを、必要とされる場合、実施例３および実施例４（上記）にあるように行ない得る。さらに、最適以下の凝集し易いＧＦＰフラグメントに融合した場合に、減少した可溶性を有するおとりタンパク質を、この本発明の実施例（実施例１５）の融合物に組み込んで、自発的な会合を排除する変異体についてスクリーニングする間の、可溶性についてのストリンジェントな選択を維持し得る。さらに、相互作用ＧＦＰフラグメントの間の界面に特異的に関与するアミノ酸を、当該分野において周知の方法であるプライマー特異的変異誘発（変質したオリゴドーピング）（定義、変異誘発の方法、前出を参照のこと）を使用し、全体として、骨格と比較して上昇したレベルの変異誘発の標的とし、それによってＧＦＰフラグメントの間の相互作用がそれらのＧＦＰフラグメントの折り畳みに悪影響を与えることなく減少し得る見込みを増大し得る。ＧＦＰの界面のアミノ酸を、三次元構造の検査（Ｙａｎｇ、１９９６、前出）によって容易に同定し得る（位相幾何図の図３も参照のこと）。
【０１３２】
（実施例１６：相互作用が低分子エフェクターによって誘導可能な誘導されたタンパク質ドメインを使用する、再構成のための相互作用ドメインをレスキューする可溶性の、非変動性スプリット蛍光タンパク質フラグメントの操作）
この実施例は、上記融合されたタンパク質ドメインの相互作用が、例えば、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢ  １２およびＦＲＢ（それらの相互作用がラパマイシンの添加によって誘導され得る２つのタンパク質）によって誘導可能であること除いて、実施例１５（上記）に類似する。したがって、図２４ｃにおいて、自発的な補完を排除するＦ２の変異体を、そのエフェクター（ラパマイシン、この実施例において）の非存在下においてスクリーニングし得、次いで相互作用ドメインに融合した場合に首尾よく補完するＦ２変異体を、図２４ｄにあるようなエフェクターを添加することによって同定し得る。
【０１３３】
（実施例１７：３体補完）
ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を、試験タンパク質Ｘに融合する。これらの種とアッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１−９とのＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖の補完をもたらし、それによってＸが可溶性であること、ならびにＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１をＸにおいて係合することを示す（図２５ａ）。ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を、図２５ｂにあるように、係合する場合、そのエントロピーを、ＧＦＰ  ｓ１−９との補完を可能にするには高すぎる。
【０１３４】
（実施例１８：２つのタンパク質の相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２６ａ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹが相互作用することを示す。ＸおよびＹが相互作用しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。相互作用タンパク質Ｘおよび相互作用タンパク質Ｙの例は、コイルドコイル、抗体およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）のペプチドまたはタンパク質抗原もしくは結合パートナー（ヘテロマルチマーを形成するタンパク質）を含む。
【０１３５】
（実施例１９：２つのタンパク質と第３のタンパク質との相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹは、自発的に相互作用しないか、または互いに結合しない。ＸおよびＹが、相互作用し、そしてそれらが、第３のタンパク質Ｚに結合する場合、Ｚを添加する工程は、ＸおよびＹの結合、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２６ｂ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹがＺと相互作用し、そしてＺが存在することを示す。ＸおよびＹがＺと相互作用しないか、またはＺが存在しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。Ｚと相互作用するタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの例は、ヘテロメリックかまたはホモメリックなトリブリッド（ｔｒｉｂｒｉｄ）のコイルドコイル、抗原（Ｚ）と結合する抗体の対（ＸおよびＹ）およびその同族のペプチドまたはタンパク質抗原もしくは結合パートナー（ヘテロマルチマーを形成するタンパク質）を含み得る。
【０１３６】
（実施例２０：２つのタンパク質とエフェクター低分子との相互作用の検出）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  ｓ１１を、ＧＦＰ  ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。代替的な構造ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１を、使用し得る。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。ＸおよびＹは、自発的に相互作用しないか、またはエフェクター低分子に結合する。ＸおよびＹが相互作用し、そしてそれらがエフェクター低分子に結合する場合、エフェクター低分子を添加する工程は、ＸおよびＹの結合、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる（図２７ｂ）。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹが上記エフェクターと相互作用し、そしてそのエフェクターが存在することを示す。ＸおよびＹが上記エフェクターと相互作用しないか、またはそのエフェクターが存在しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない（図２７ｂ）。エフェクターと相互作用するタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの例は、例えば、Ｍｏｏｔｚ  ＆  Ｍｕｉｒ、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０４４−９０４５、Ｓｔａｎｄａｅｒｔら、１９９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＫＢＰ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１−６７４；Ｃｈｅｎら、１９９５、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  １１−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ２８９−ｋＤａ  ＦＫＢＰ１２−ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９２：４９４７−４９５１にあるような、ＦＫＢＰおよびＦＲＢを含み得る。低分子を感知する種々の２成分システムもまた、使用し得る。
【０１３７】
（実施例２１．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用パートナーの同定）
ＧＦＰ  ｓ１０を、ＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  ｓ１０またはＧＦＰ  ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  ｓ１０とＧＦＰ  ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  ｓ１０および融合されたＧＦＰ  ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  ｓ１−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  ｓ１０鎖およびＧＦＰ  ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  ｓ１−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１３８】
（実施例２２．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する折り畳みパートナーの同定）
Ｘは、ＸとＹとから構成される真正の折り畳みの対の部分であり、ここで同じ区画内でのＸおよびＹの同時発現は、Ｙとの接触およびＹとの同時折り畳みによって、Ｘの適切な折り畳みをもたらす。次いで、ＸおよびＹは、ＸおよびＹから構成される正しい折り畳みの可溶性ヘテロダイマーを形成する、ここでＸおよびＹは、互いと会合したままである。Ｙの非存在下において、Ｘは、折り畳みを誤り、そして凝集体を形成する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。タンパク質Ｘは、それだけで発現した場合、折り畳みが乏しく、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０を凝集体中に隔離させる。Ｘの折り畳みをレスキューする折り畳みパートナーＹを見出すために、Ｘとの潜在的な相互作用する折り畳みパートナーを含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、同時折り畳みを行い、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じる正しく折り畳まれた可溶性ヘテロダイマーを生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。次いで、これらの会合した融合種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、相互作用する会合した折り畳みパートナーを形成しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。上記融合タンパク質ＸおよびＹが、上記ｔｅｔプロモーターの制御下で発現され、例えば、そして上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが、独立誘導性プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター）の制御下で発現される場合、Ｘ、Ｙ、およびＧＦＰ  １−９の発現の順番は、独立して調節され得る。上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントがＸ融合タンパク質およびＹＬＩＢ融合タンパク質と同時に発現される場合、そのＸとＹとの間の相互作用は、ＸおよびＹの可溶性にかかわらずに検出され得る。上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが上記ＸおよびＹの後に発現される場合、会合した相互作用し、また可溶性であるＸタンパク質およびＹタンパク質のみが、検出される。連続誘導に依存するこの可溶性レポーターの局面は、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９、ならびにＧＦＰ  Ｓ１０−Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９を使用して、先に示されている。
【０１３９】
（実施例２３．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用パートナーの同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４０】
（実施例２４．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する折り畳みパートナーの同定）
Ｘは、ＸとＹとから構成される真正の折り畳みの対の部分であり、ここで同じ区画内でのＸおよびＹの同時発現は、Ｙとの接触およびＹとの同時折り畳みによって、Ｘの適切な折り畳みをもたらす。次いで、ＸおよびＹは、ＸおよびＹから構成される正しい折り畳みの可溶性ヘテロダイマーを形成する、ここでＸおよびＹは、互いと会合したままである。Ｙの非存在下において、Ｘは、折り畳みを誤り、そして凝集体を形成する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。タンパク質Ｘは、それだけで発現した場合、折り畳みが乏しく、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０を凝集体中に隔離させる。Ｘの折り畳みをレスキューする折り畳みパートナーＹを見出すために、Ｘとの潜在的な相互作用する折り畳みパートナーを含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）にＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、同時折り畳みを行い、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じる正しく折り畳まれた可溶性ヘテロダイマーを生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。次いで、これらの会合した融合種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、相互作用する会合した折り畳みパートナーを形成しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。上記融合タンパク質ＸおよびＹが、上記ｔｅｔプロモーターの制御下で発現され、例えば、そして上記ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントが、独立誘導性プロモーター（例えば、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター）の制御下で発現される場合、Ｘ、Ｙ、およびＧＦＰ  １−９の発現の順番は、独立して調節され得る。上記ＧＦＰ  １−９  アッセイフラグメントがＸ融合タンパク質およびＹＬＩＢ融合タンパク質と同時に発現される場合、そのＸとＹとの間の相互作用は、ＸおよびＹの可溶性にかかわらずに検出され得る。上記ＧＦＰ  １−９  アッセイフラグメントが上記ＸおよびＹの後に発現される場合、会合した相互作用し、また可溶性であるＸタンパク質およびＹタンパク質のみが、検出される。連続誘導に依存するこの可溶性レポーターの局面は、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９、ならびにＧＦＰ  Ｓ１０−Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１およびＧＦＰ  １−９を使用して、先に示されている。
【０１４１】
（実施例２５．エフェクターの存在下におけるタンパク質相互作用のモニタリング）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９および記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。そのエフェクター分子Ｅは、低分子（例えば、薬物、ホルモン、またはペプチド）、または大きい分子（例えば、タンパク質または高分子複合体）であり得る。次にそのエフェクター分子Ｅを、上記融合タンパク質に接触させ、そしてその融合タンパク質のドメインＸとドメインＹとの相互作用の効率を、ＧＦＰ  １−９との補完を使用して評価する。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光より明るい。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光よりぼんやりしている。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、上記蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光と同じである。
【０１４２】
（実施例２６．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、タンパク質相互作用に作用し得る潜在的なエフェクタータンパク質の同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＹまたはＹ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質Ｙに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９および記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。この実施例において、上記エフェクター分子Ｅは、遺伝子によりコードされるペプチド、タンパク質または高分子複合体である。上記ＸとＹとの間の相互作用の潜在的なエフェクターを含むランダムライブラリーＥＬＩＢを、Ｘ融合タンパク質およびＹ融合タンパク質として、同じ区画内で発現させる。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現さ得、そしてその融合タンパク質を、ＥＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＥＬＩＢｉ）を上記Ｘ融合タンパク質およびＹ融合タンパク質と接触させるように、互いに接触させる。上記融合タンパク質におけるＸとＹとの間の相互作用の強度を測定するために、これらの種を、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９に接触させる。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０ドメインと融合されたＧＦＰ  Ｓ１１ドメインとの係合は、増大し、そして上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光よりも明るく、それによって、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用を増強することを示す。一方で、ＥＬＩＢｉが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光よりもぼんやりとしており、それによって、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用を低下させることを示す。ＥＬＩＢｉが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、上記蛍光は、ＥＬＩＢｉの非存在下における蛍光と同じであり、このことは、ＥＬＩＢｉがそのＸとＹとの間の相互作用に対して効果を有さないことを示す。
【０１４３】
（実施例２７．細胞小器官特異的なタンパク質相互作用を検出するための細胞小器官の着色（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｐａｉｎｔｉｎｇ））
これは、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９が、局在タグを使用して特定の細胞区画を指向することを除いて、実施例１８および実施例２１（前出）に類似する。したがって、特定の区画内で生じる相互作用を、ＧＦＰ  １−９をその区画に送ることによって、特異的に検出する。ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、試験タンパク質Ｘに融合する。Ｘとの潜在的な相互作用因子を含むランダムライブラリーＹＬＩＢを、ＹＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＹＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてその融合タンパク質を、ＹＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＹＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  ｓ１１−ＹＬＩＢｉ）をＧＦＰ  Ｓ１０−ＸまたはＸ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＸおよびＹＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いに結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。上記相互作用が特定の区画Ｃ内で生じるか否かを決定するために、ＧＦＰ  １−９を、区画ＣへのＴ−ＧＦＰ  １−９またはＧＦＰ  １−９−Ｔの局在を指揮する局在タグＴと融合する。ＸおよびＹが、区画Ｃにおいて相互作用する場合、Ｔ−ＧＦＰ  １−９  またはＧＦＰ  １−９−Ｔが区画Ｃを指向するときに、区画Ｃは、ＸとＹとの融合種と、上記アッセイ鎖Ｔ−ＧＦＰ  １−９またはＧＦＰ  １−９−Ｔとを接触させ、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖と、ＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成することで蛍光になる。このことは、ＸおよびＹＬＩＢｉが区画Ｃにおいて相互作用することを示す。ＸおよびＹＬＩＢｉが、区画Ｃにおいて相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、区画Ｃ内で係合されず、Ｔ−ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントまたはＧＦＰ  １−９−Ｔアッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、区画Ｃにおいて弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。複数の区画を、異なる色のＧＦＰ  １−９によってタグ化し得、１つより多い区画がＧＦＰ  Ｓ−１０およびＧＦＰ  Ｓ−１１と融合された潜在的な相互作用タンパク質ＸおよびＹについてモニタリングされるようにする。例えば、Ｙ６６Ｗシアン変異体を含むＧＦＰ  １−９のシアン改変体は、公知のゴルジ体標的性融合シグナルを使用して、ゴルジ体を標的とし得る。同時に、Ｙ６６を含むＧＦＰ  １−９の緑色バージョンは、融合するミトコンドリア標的性ドメインを使用して、ミトコンドリアを標的とし得る。シアン蛍光の量および緑色蛍光の量のモニタリングは、それぞれ、ゴルジ体およびミトコンドリア内で生じる、タンパク質ＸとＹとの間の相互作用の量を報告する。
【０１４４】
（実施例２８．エフェクター媒介性の細胞小器官特異的なタンパク質相互作用を検出するための、細胞小器官の着色）
これは、実施例２０および実施例２５（上記）に関し、ここでＧＦＰ  １−９のスペクトル的に異なる改変体は、局在タグを使用して１つ以上の特定の細胞区画を指向する。特定の区画内で生じる、ＧＦＰ−Ｓ１０およびＧＦＰ−Ｓ１１によって各々標識したタンパク質ＸとＹとの間の相互作用を、その区画を指向するＧＦＰ  １−９のスペクトル特徴によって、特異的に検出する。各区画内の上記融合タンパク質のＸドメインとＹドメインとの相互作用効率を、最初に、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９、およびＧＦＰ  １−９の各スペクトル改変体について記録された蛍光を使用して、エフェクター分子Ｅの非存在下において評価した。そのエフェクター分子Ｅは、低分子（例えば、薬物、ホルモン、またはペプチド）、または大きい分子（例えば、タンパク質または高分子複合体）であり得る。次にそのエフェクター分子Ｅを、そのアッセイを実施する細胞または区画に接触させ、そして上記融合タンパク質のドメインＸとドメインＹとの相互作用の効率を、その細胞区画を標的とするＧＦＰ  １−９のスペクトル的に異なるバージョンの各々について評価する。Ｅが、指定された細胞区画内で上記ＸとＹとの間の相互作用を増大させる場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光より明るい。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用を低下させる場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光よりぼんやりしている。Ｅが、上記ＸとＹとの間の相互作用に対して、中立であるかまたは効果を有さない場合、その区画の蛍光は、Ｅの非存在下における蛍光と同じである。標的とされた各区画内での補完の効率を、その区画を標的とするＧＦＰ  １−９改変体の蛍光特徴をモニタリングすることによって評価する。例えば、ＸおよびＹは、ゴルジ体およびミトコンドリア内で相互作用することが公知のタンパク質であり得る。シアンＧＦＰ  １−９は、ゴルジ体を標的とし得、そして緑色ＧＦＰ  １−９は、ミトコンドリアを標的とし得る。種々のエフェクター薬物を、ミトコンドリアと比較して、ゴルジ体内でのＸおよびＹの補完を増加させる薬物について試験し得る。したがって、所望の効果を有する薬物は、ゴルジ体において補完を増加させ、効果を有さなかった薬物、またはミトコンドリアと比較して、ゴルジ体内でのＸおよびＹの補完を低下させた薬物と比較して、シアン蛍光  対  緑色蛍光の増大した比をもたらす。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ｙ、Ｙ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｘ、Ｘ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を、使用し得る。
【０１４５】
（実施例２９．結合リガンド−抗原相互作用の操作）
この実施例は、実施例１８および実施例１９と機能的に類似する。ＧＦＰ  １０を、融合構築物ＧＦＰ  Ｓ１０−ＢまたはＢ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、結合リガンドＢ（例えば、抗体）に融合する。ＧＦＰ  １１を、ＧＦＰ  Ｓ１１−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１１のように、試験タンパク質抗原Ａに融合する。ＧＦＰ  Ｓ１０−Ａ、Ａ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ｂ、Ｂ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることが、明らかである。上記融合タンパク質を、細胞内、細胞区画内、またはインビトロで発現させ、そしてその融合タンパク質を、互いに接触させる。抗体または結合リガンドＢ、および抗原Ａが相互作用し、そしてそれらが、互いと結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を引き起こし、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、このことは、ＢおよびＡが相互作用することを示す。ＢおよびＡが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完は非効率的であり、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４６】
（実施例３０．ランダムな遺伝的スクリーニングを使用する、相互作用する結合リガンドの同定）
ＧＦＰ  １０を、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０のように、遺伝子によりコードされる抗原Ａに融合する。Ａとの潜在的な結合リガンドを含むランダムライブラリーＢＬＩＢを、ＢＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢのように、ＧＦＰ  Ｓ１１との融合物として発現させる。ＧＦＰ  Ｓ１０−ＢＬＩＢ、ＢＬＩＢ−ＧＦＰ  Ｓ１０またはＧＦＰ  Ｓ１１−Ａ、Ａ−ＧＦＰ  Ｓ１１からなる代替的な構造を使用し得ることは、明らかである。上記タンパク質を、細胞区画内、細胞内または細胞を含まない抽出物内で発現させ、そしてそのタンパク質を、ＢＬＩＢの単一のメンバーｉ（すなわち、ＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉ）をＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０と相互作用させるように、互いに接触させる。ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用し、そしてそれらが互いと結合する場合、それらは、ＧＦＰ  Ｓ１０とＧＦＰ  Ｓ１１との係合を生じ、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０および融合されたＧＦＰ  Ｓ１１の構造エントロピーを減少させる。これらの種と上記アッセイ鎖ＧＦＰ  １−９とを接触させる工程は、ＧＦＰ  Ｓ１０鎖およびＧＦＰ  Ｓ１１鎖とＧＦＰ  １−９との補完を生じ、それによって蛍光発色団を形成し、このことは、ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用することを示す。ＡおよびＢＬＩＢｉが相互作用しない場合、ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、係合されず、ＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントの補完を非効率的にし、このことは、弱い蛍光補完を生じるか、または蛍光補完を生じない。
【０１４７】
（実施例３１．競合性結合リガンドを使用する、結合リガンド選択のストリンジェンシーの増大）
この実施例は、実施例２９の延長である。この実施例において、競合的結合リガンドＢｃを、区画内で同時発現させる。Ｂｃは、抗原Ａに対する結合に関してＢＬＩＢと競合する。Ｂｃを、ＧＦＰフラグメントタグと融合せず、したがってＢｃによるＡの結合は、ＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのメンバーによるＡの結合を妨げる。したがってＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０におけるＡと、Ｂｃとの相互作用がＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉの置換をもたらすので、Ｂｃは、蛍光補完を低下させ、係合されないＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ
Ｓ１１を生じ、ＧＦＰ  １−９との補完を非効率的にする。Ｂｃより強力にＡに結合するＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのメンバーのみが、Ｂｃを置換し得、ＡとＢＬＩＢｉとの相互作用をもたらし、融合されたＧＦＰ  Ｓ１０ドメインと融合されたＧＦＰ  Ｓ１１ドメインとを係合し、このことは、ＧＦＰ  １−９との増大した蛍光補完をもたらす。Ｂｃが、例えば、無水テトラサイクリン誘導性ｔｅｔプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＧＦＰ  Ｓ１０−ＡまたはＡ−ＧＦＰ  Ｓ１０およびＢＬＩＢｉ−ＧＦＰ  Ｓ１１またはＧＦＰ  Ｓ１１−ＢＬＩＢｉのように同じプロモーターエレメントから発現され得る一方で、上記アッセイフラグメントＧＦＰ  １−９は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターのような別個の誘導性プロモーターエレメントから発現され得る。ｔｅｔプロモーター構築物を逐次的に発現し、次いで無水テトラサイクリンを除去し、次いでＧＦＰ  １−９アッセイフラグメントのその後の発現を行なうことは、Ｂｃ−抗原相互作用より厳密であり、かつ可溶性でもある結合リガンド−抗原相互作用因子を検出する。
（実施例３３：再構成のための相互作用ドメインを必要とする可溶性の非変動性酵素レポータータンパク質の操作）
先に記載されたスプリットＤＨＦＲフラグメントは、折り畳みが乏しく、凝集し、したがって不溶性の凝集体をする（ＵＳＰＴＯ番号６，４２８，９５１を参照のこと）。その中で、Ｍｉｃｈｎｉｃｋらは、相互作用ドメインに融合したＤＨＦＲのフラグメントの操作、およびＤＨＦＲのより良好な折り畳みのバージョンを示す増加した抗生物質耐性についての選択によって、ＤＨＦＲのより良好な折り畳みのフラグメントを選択するストラテジーを記載する。このアプローチは、上記フラグメンが可溶性であることを保証しない。なぜなら上記フラグメントは、継続した細胞生存を与えるために同時発現されなければならないからである。融合された相互作用ドメインにも依存するＤＨＦＲの非変動性の可溶性フラグメントを選択するために、ＤＨＦＲ活性に特異的なアッセイを使用することを除き、特に、上記フラグメントが、安定な可溶性改変体について選択するために別々に発現される連続誘導様式を使用して、上記の実施例１５および実施例１６において使用した同じアプローチに従う。さらに、マルチウェル培養プレートにおいて、各々がＤＨＦＲの改変体を含む小さい培養物を、増殖させる。ＤＨＦＲ活性に対する色素形成基質を使用する種々の活性アッセイは、当該分野において周知であり、そしてこれらは、補完が生じている場合を決定するために使用される。第１の工程において、ＤＨＦＲの自己補完性フラグメントを、インビボの細胞生存のための融合された相互作用ドメインを有さないＤＨＦＲフラグメント変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって選択し得る。上記フラグメントを、ＤＨＦＲの凝集し易い改変体に融合した場合に低下した可溶性を示すタンパク質（凝集おとりドメイン）に融合し得、それによってＤＨＦＲフラグメントの可溶性改変体を選択するストリンジェンシーを増大させる。所望される場合、上記ＤＨＦＲフラグメントの１つ以上（融合されたおとりドメインを有するか、またはそれを有さない）をまた、ＧＦＰマイクロドメインに融合し得、そしてＤＨＦＲフラグメント変異体の可溶性を、連続誘導プロトコルを用いたＧＦＰアッセイフラグメントを使用するインビトロの高スループット様式においてアッセイし、ＤＨＦＲフラグメントを、実施例９および実施例１０にあるようなＧＦＰスプリット補完レポーターシステムを使用して増加した可溶性について進化させるための標的タンパク質として処理する。一旦可溶性の候補を見出すと、それらを、細胞生存のための同時発現を行なうか、またはインビトロで別々に発現した候補の可溶性の進化したＤＨＦＲフラグメントを混合し、そして再構成され、最適化された可溶性ＤＨＦＲフラグメントが、補完後に依然として酵素的に活性なＤＨＦＲを提供することを確認するために、当該分野において周知であるインビトロＤＨＦＲ酵素活性アッセイを使用することによってスクリーニングし得る。これらのフラグメントは、同時かまたは別々に発現され得、可溶性のままであり、そして融合されたポリペプチドの可溶性および折り畳みを変動させない。これは、タンパク質フラグメントの再構成に基づく一般的に有用なタンパク質−タンパク質相互作用検出システムについての、重要な必要条件である。しかし、これらのフラグメントは、融合された相互作用ドメインに対する必要性を伴わずに自己会合する。タンパク質−タンパク質相互作用検出因子として有用であるために、上記フラグメントは、必ず、再構成のための融合された相互作用ドメインを必要とする。１つのアプローチでは、融合された相互作用ドメインの非存在下において、可溶性の操作されたフラグメントＤＨＦＲ  Ｆ１を、一定に保ち、そしてそのフラグメントＤＨＦＲ  Ｆ１を、フラグメントＤＨＦＲ  Ｆ２の改変体のライブラリーをスクリーニングするためのアッセイフラグメントとして使用して、自発的な補完およびＤＨＦＲ活性の形成を排除または廃絶するＦ２の変異を同定する。同様に、一定の変異していないＤＨＦＲ  Ｆ１を、ＧＦＰ  ｓ−１０に融合し得、変異したライブラリーＤＨＦＲ  Ｆ２を、ＧＦＰ  ｓ１１に融合し得、そしてその変異したライブラリーＤＨＦＲ  Ｆ２を、アッセイフラグメントＧＦＰ  ｓ１−９の補完の低下によって例示される、ＤＨＦＲフラグメントの自発的な会合を廃絶するＤＨＦＲ  Ｆ２における変異を同定するためにＧＦＰ  ｓ１−９を使用してスクリーニングした。広いライブラリーを、例えば、非蛍光性である多数の改変体（すなわち、＞１０５）を見出し、そして収集するためにフローサイトメトリーを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてスクリーニングし得る。これらの非相互作用ＤＨＦＲ改変体は、折り畳みの欠損を有する変異体、融合された相互作用ドメインを有する場合でさえ補完が不可能な変異体、不溶性である変異体などのような望ましくない改変体を含み得る。ＤＨＦＲ  Ｆ２  ＧＦＰ  ｓ−１１融合物を、それらが依然として可溶性であることを確認するために、ＧＦＰ  ｓ１−１０アッセイフラグメントを使用してインボビでスクリーニングし得、したがってＤＨＦＲ  Ｆ１と自発的に集合することもできない可溶性ＤＨＦＲ  Ｆ２変異体を、同定する。次いで、自発的に会合しない可溶性ＤＨＦＲ  Ｆ２改変体のライブラリーを、公知の相互作用タンパク質（例えば、コイルドコイル）を有する融合物として発現される変異体を生じるベクターにサブクローニングする（このようなコイルドコイルは、Ｈｕ、２００２、前出；Ｇｈｏｓｈら、２０００、前出に記載される）。また、上記ライブラリーを、相互作用タンパク質にのみ融合した場合に、そのまま補完する変異体を同定するために、フローサイトメトリーによってスクリーニングするか、プレート上でスクリーニングする。次いで二次的なＤＨＦＲ酵素活性スクリーニングを、上記可溶性ＤＨＦＲフラグメントがまた、相互作用タンパク質に融合した場合に酵素活性を保持することを決定するために、インビトロで適用し得る。必要な場合、最適物の最終的なライブラリーを、そのまま、補完のための融合された相互作用ドメインに対する依存性を確かめるために、相互作用タンパク質を含まないベクターにサブクローンし得る。フラグメントの安定性および可溶性をさらに改良するための変異のさらなるラウンドを、必要とされる場合、実施例３および実施例４（上記）にあるように行ない得る。さらに、最適以下の凝集し易いＤＨＦＲフラグメントに融合した場合に、減少した可溶性を有するおとりタンパク質を、この本発明の実施例（実施例３３）の融合物に組み込んで、自発的な会合を排除する変異体についてスクリーニングする間の、可溶性についてのストリンジェントな選択を維持し得る。さらに、相互作用ＤＨＦＲフラグメントの間の界面に特異的に関与するアミノ酸を、当該分野において周知の方法であるプライマー特異的変異誘発（変質したオリゴドーピング）（定義、変異誘発の方法、前出を参照のこと）を使用し、全体として、骨格と比較して上昇したレベルの変異誘発の標的とし、それによってＤＨＦＲフラグメントの間の相互作用がそれらのＤＨＦＲフラグメントの折り畳みに悪影響を与えることなく減少し得る見込みを増大し得る。ＤＨＦＲの界面のアミノ酸を、三次元構造の検査（Ｆｉｌｍａｎ、１９８２、Ｏｅｆｎｅｒ、１９８８、Ｂｙｓｔｒｏｆｆ、１９９１）によって容易に同定し得る。上記のアプローチを、補完のための融合された相互作用ドメインにも依存する可溶性フラグメント改変体を同定するために、他の酵素タンパク質（例えば、スプリットβ−ラクタマーゼまたはスプリットβ−ガラクトシダーゼ）に適用し得ることは、当業者にとって明らかである。
【０１４８】
（実施例３４：インビトロ相互作用アッセイ）
（マイクロＧＦＰタグ化タンパク質の発現）
１０−ＦＲＢタンパク質融合物およびＦｋｂｐ１２−１１タンパク質融合物を、それぞれ、Ｃ−６ＨＩＳ  ｐＥＴ  ２８ベクターおよびＮ−６ｈｉｓ  ｐＥＴ  ２８ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）から発現させた。各構築物を発現するＢＬ２１（ＤＥ３）の５０ｍｌ培養物を、ＯＤ６００  約０．５まで増殖させ、そして１ｍＭ  ＩＰＴＧと一緒に２７℃にて５時間インキュベートした。その培養ペレットを、１ｍｌ  ＴＮＧ中に再懸濁し、そして超音波処理した。１０−ＦＲＢの封入体を、０．５ｍｌの９Ｍ尿素中で変性し、そして５ｍｌのＴＮＧ緩衝液中で再折り畳みした。１０−ＦＲＢの乏しい可溶性は、予想された。なぜなら、同様の条件下で発現したＦＲＢ−ＧＦＰ融合物が主として不溶性であり、そして単独で発現したＦＲＢが著しく不溶性であるからである。可溶性Ｆｋｂｐ１２＿１１融合物を、さらに精製することなく使用した。ｐＴｅｔベクターに由来するバイシストロニック構築物を使用して、１０−ＦＲＢおよびＦｋｂｐ１２−１１をそれぞれ、独立したリボソーム結合部位から同時発現させた。代替的なトポロジー１０−Ｆｋｂｐ１２＋ＦＲＢ−１１を、同様に構築した。構築物を、上記と同じ条件を使用したが、誘導剤として３００ｎｇ／ｍｌ無水テトラサイクリンを使用して誘導した。可溶性フラクションを、補完アッセイのために使用した。
【０１４９】
（補完アッセイおよびラパマイシンを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の誘導）
異なる構築物を、大フラグメント１−９ｏｐｔの存在下で、１００ｎＭラパマイシンを添加したか、またはそれを添加せずに、補完について試験した。２０μｌの同時発現した１０−ＦＲＢおよびＦｋｂｐ１２−１１可溶性フラクション（図２８、行１）、または２０μｌの同時発現した１０−Ｆｋｂｐ１２およびＦＲＢ−１１（図２８、行２）を、８０μｌの１−９ｏｐｔと混合した。個別に発現したタンパク質（図２８、行３）については、２０μｌの再折り畳みした１０−ＦＲＢおよび１０μｌの可溶性Ｆｋｂｐ１２＿１１を、７０μｌの１−９ｏｐｔと混合した。１つの例において、ラパマイシンを、添加しなかった（図２８、「−」を付した第１の列）。別の例において、１００ｎＭのラパマイシンを、添加した（ＤＭＳＯに希釈した１０μｌの１μＭストック溶液、図２８、「＋」を付した第２の列）。一晩インキュベートした後、そのプレートを、写真撮影（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）した（図２８）。最終的な蛍光値を、ＦＬ６００マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）と一緒に（λｅｘｃ＝４８８ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）を使用して、一晩インキュベートした後に測定した（図２９）。
【０１５０】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれ個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参考として援用されることが示されたかのように、本明細書中に参考として援用される。
【０１５１】
本発明は、本明細書中に開示された実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、それらの実施形態は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図され、そして機能的に等価であるあらゆる実施形態は、本発明の範囲内である。本発明の方式および方法に対する種々の改変は、本明細書中に記載されるものに加えて、上述の記載および教示から当業者に明らかとなり、そしてそれらの改変は、同様に、本発明の範囲内に含まれることが、意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。
【０１５２】
（引用した文献）
【０１５３】
【化１０】
2008521447.tif 000083
【０１５４】
【化１１】
2008521447.tif 000084
【０１５５】
【化１２】
2008521447.tif 000085
【０１５６】
（配列表）
【０１５７】
【化１３】
2008521447.tif 000086
【０１５８】
【化１４】
2008521447.tif 000087
【０１５９】
【化１５】
2008521447.tif 000088
【０１６０】
【化１６】
2008521447.tif 000089
【０１６１】
【化１７】
2008521447.tif 000090
【０１６２】
【化１８】
2008521447.tif 000091
【化１９】
2008521447.tif 000092
【化２０】
2008521447.tif 000093
【化２１】
2008521447.tif 000094
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１Ａ】図１Ａは、ｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの概略図を示し、これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能なｐＰＲＯＴｅｔ．６ｘＨＮベクターの改変バージョンである。クロラムフェニコール耐性遺伝子が、ｐＰＲＯｌａｒ耐性マーカーのカナマイシンプロモーターの制御下のスペクチノマイシン耐性マーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡからのｐＰＲＯｌａｒプラスミド）によって置換された。同一シストロン上に、Ｔ０転写終結配列の上流のテトラサイクリンリプレッサーがコードされている。翻訳されるリプレーサーの量は、ＳａｃＩの下流の弱いＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列によって調節される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、操作されたｐＴＥＴ−ＳｐｅｃＲプラスミドの異なる要素を示す。太字＝ＮｃｏＩ  ＣＣＡＴＧＧ、およびＫｐｎＩ  ＧＧＴＡＣＣによって隣接される、ｔｅｔプロモーター下の発現遺伝子のためのｖ１クローニングカセット。ボックス１＝ＳｐｅｃＲ−ｔｅｔＲシストロンのためのＴ０転写ターミネーター；ボックス２＝ｔｅｒＲリプレッサー遺伝子；ボックス３＝ｔｅｔＲ翻訳を制御するＲＢＳ；ボックス４＝スペクチノマイシン（ｓｐｅｃＲ）遺伝子；ボックス５＝ＰＲＯＬＡＲベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からのカナマイシンプロモーター要素。
【図２】図２は、スプリットＧＦＰ補完の原理を示す。目的のタンパク質（Ｘ）が、柔軟なリンカー（Ｌ）を経由して小ＧＦＰフラグメント（β鎖１１、残基２１５〜２３０）に融合される。補完ＧＦＰフラグメント（β鎖１〜１０、残基１〜２１４）は別個に発現される。単独で蛍光を発するフラグメントはない。混合されるとき、小ＧＦＰフラグメントおよび大ＧＦＰフラグメントは自然に会合し、ＧＦＰ折り畳みおよび蛍光発色団の形成を得る。誤折り畳みまたは凝集のような、小ＧＦＰタグを接近させないプロセスは、補完を防ぎ得る。
【図３】図３は、１１のβ鎖のＧＦＰファミリーメンバーのトポロジー的二次構造図を示す。（Ａ）アミノ酸の鎖および番号付け。丸で囲った番号は、鎖間の曲がりの指標（およびこのタンパク質を分離するために好ましい部位）に対応する。塗りつぶしの丸は、折り畳みレポーター変異であり、そして白丸は超折り畳みＧＦＰ変異である。（Ｂ）は、１１のβ鎖の番号付けの慣例を示す。（Ｃ）は、短い柔軟性のリンカーによってＮ末端およびＣ末端を連結することにより作製され、そしてアミノ酸１７３における新たな開始コドン、およびアミノ酸１７２の後の停止コドンを提供する、円順列変異体ＧＦＰを示す。
【図４】図４は、スプリット位置１５７または１７２における示されたＧＦＰフラグメント（すなわち、１〜１５６＋１５７〜２３８および１〜１７１＋１７２〜２３８）による、プレート上のＥ．ｃｏｌｉコロニー中の適合プラスミドから同時発現された、インビボ補完の蛍光イメージを示す。左のカラムは、折り畳みレポーターＧＦＰ由来のフラグメントを、右のカラムは、超折り畳みＧＦＰ由来の同じフラグメントを示す。予期されるように、この超折り畳みフラグメントは、確かに働き、そしてより明るいコロニーを与え、超折り畳みＧＦＰ  対  折り畳みレポーターＧＦＰの改良された折り畳みと一致する。
【図５】図５は、ＧＦＰ１−１０改変体のインビトロ補完効率を示す。野生型ＧＦＰ１１に融合された１ｍｇ／ｍｌの可溶性亜硫酸レダクターゼを含む１８０μｌの緩衝液の添加後の、１ｍｇ／ｍｌの再折り畳みされた超折り畳みＧＦＰ１−１０の２０μｌ（下のトレース）、または等量の可溶性最適化ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴフラグメント（上のトレース）の補完についての蛍光進行曲線。挿入画は、ＧＦＰ１−１０改変体のインビボ補完を示す。野生型ＧＦＰ  Ｓ１１と融合された亜硫酸レダクターゼとともに、超折り畳みＧＦＰ（上）、または折り畳みレポーターＧＦＰ（下）からの同時発現するＧＦＰ１−１０ニトロセルロースメンブレン上のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コロニーの蛍光イメージ。
【図６】図６は、単独もしくはＧＦＰ  Ｓ１１野生型（ＷＴ）へのＮ末端融合としてタンパク質ヘクスロースホスフェートシンターゼ（ＨＰＳ）、または３つのＧＦＰ  Ｓ１１最適物（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）に融合されたＨＰＳを発現するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の可溶性フラクション（Ｓ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＨＰＳ−ＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物は不溶性であり、その一方、ＨＰＳ単独は、約６０％可溶性であることに注目のこと。
【図７】図７は、組織培養プレート中、インビロで過剰のＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（８００ｐｍｏｌ）の添加後の、亜硫酸レダクターゼ（５０ｐｍｏｌ）に融合された３つのＧＦＰ  Ｓ１１変異体Ｍ１、Ｍ２およびＭ３の蛍光補完動力学的トレースを示す。各アッセイの最終容量は２００μｌであった。
【図８】図８は、３つの異なるＧＦＰ１−１０構築物を用いる逐次的（左カラム）または同時誘導プロトコル（右カラム）の効果を示す。ＧＦＰ１−１０構築物を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンの３つの行の蛍光イメージは、漸次良好な性能および可溶性を有し：折り畳みレポーター（ＦＲ、第１の行）、超折り畳み（ＳＦ、第２の行）、または最適化ＧＦＰ１−１０改変体（ＯＰＴ、第３の行）である。超折り畳みＧＦＰ１−１０は、単独で発現されるとき不溶性である。第１のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１融合物の発現が続くＧＦＰ１−１０の一時的発現。第２のカラム：亜硫酸レダクターゼＧＦＰ
Ｓ１１野生型とのＧＦＰ１−１０の同時発現。超折り畳みＧＦＰ１−１０は不溶性であり、そして細胞は、一時的誘導プロトコル後、かすかに蛍光を発し、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１−１０が、亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１野生型融合物の発現の前に凝集し得、補完効率を減少するからである。同時発現は、明るい細胞を与え、おそらく、超折り畳みＧＦＰ１−１０と亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１との間の結合および補完が迅速に起こり、ＧＦＰ１−１０を誤折り畳み、および凝集からレスキューするためである。対照的に、部分的に可溶性のＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを発現する細胞は、これら構築物が逐次的に発現されるか、または同時発現されるか否かにかかわらず明るい。
【図９Ａ】図９は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグフラグメントおよびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。０．１〜２００ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、８００ｐｍｏｌのＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１５分後、各溶液について測定された蛍光。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１時間後、各溶液について測定された蛍光。
【図９Ｂ】図９は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグフラグメントおよびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。０．１〜２００ｐｍｏｌの亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、８００ｐｍｏｌのＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１５分後、各溶液について測定された蛍光。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加１時間後、各溶液について測定された蛍光。
【図１０】図１０は、ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に融合された亜硫酸レダクターゼの５０ｐｍｏｌ、２５ｐｍｏｌ、１２．５ｐｍｏｌ、６．２５ｐｍｏｌ、３．１３ｐｍｏｌ、および１．５６ｐｍｏｌの補完の進行曲線を示す。これらデータは、小定数を引き、そしてＥＸＣＥＬデータ分析ツールＳｏｌｖｅｒ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）を用いて非線形最小自乗法によって算出された、スケーリング因子を適用することにより５０ｐｍｏｌの進行曲線に適合された。優れた重ね合わせは、この進行曲線の形状が、タグ化タンパク質の濃度、または非結合ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴフラグメントのプールの枯渇に依存しないことを示す。
【図１１】図１１は、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３でタグ化されたレポーターＧＦＰを折り畳みすることによる、Ｔａｌｏｎ樹脂−結合６ＨＩＳ  ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴへの結合およびその補完を示す。（１）結合した６ＨＩＳ  ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴをもつＴａｌｏｎ樹脂、（２）融合したＣ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３を経由する折り畳みレポーターＧＦＰの結合によるビーズ−結合蛍光における迅速な増加、（３）補完に起因するゆっくりとした蛍光形成。
【図１２】図１２は、補完反応に対する尿素濃度の影響を示す。反応は、２Ｍ以上の尿素で停止される。
【図１３】図１３は、補完反応に対するｐＨの影響を示す。（Ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加６時間後の亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３に対  する最終蛍光のｐＨ依存性。（Ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴの添加６時間後の合成ペプチドＧＦＰ  Ｓ１１の最終蛍光のｐＨ依存性。蛍光補完は、ｐＨ６．５未満で非効率的に見える。
【図１４】図１４の棒グラフは、スプリットＧＦＰシステムを用いる、Ｃ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグをもつ１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質のインビトロタンパク質定量を示す（前述、表３を参照のこと）。ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴを用いる可溶性（黒い棒）および非折り畳みペレットフラクション（灰色の棒）のＧＦＰフラグメント補完アッセイ蛍光。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、対応する可溶性（Ｓ）、およびペレットフラクション（Ｐ）を示す。タンパク質番号８、酒石酸デヒドロゲナーゼ−βサブユニットは、約１３ｋＤの第２のより低いバンドを示すことに注目のこと。
【図１５】図１５は、スプリットＧＦＰアッセイシステムを用いるインビボ可溶性および発現スクリーニングを示す。ｔｅｔ−プロモータープラスミドからのＮ−末端６ＨＩＳタグおよびＣ−末端ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３タグとともに発現された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ試験タンパク質（表３、前述を参照のこと）は、ＧＦＰ−１−１０  ＯＰＴを発現するｐＥＴプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ）株中にクローン化された。タグ化構築物およびＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（上）の同時誘導後、またはタグ化構築物、次いでＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（逐次的誘導、中央）の発現が続くタグ化構築物の一時的発現のプレート上のコロニーの蛍光イメージ。液体培養中で逐次的に誘導された細胞からのＴａｌｏｎ樹脂ビーズ−結合可溶性（Ｂ）およびペレットフラクション（Ｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下）。付随的に結合されたＧＦＰ１−１０  ＯＰＴ（見かけの分子量約２９ｋＤ）は矢印によって示される。ヌクレオシドジホスフェートキナーゼ（タンパク質番号７）は部分的に可溶性であることに注目のこと（Ｔａｌｏｎ樹脂−結合フラクション中のＧＦＰ１−１０に対応するバンドの僅かに下のバンドを参照のこと）。ポリスルフィドレダクターゼ−ＧＦＰ  Ｓ１１  Ｍ３融合物（表３、前述を参照のこと）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、そしてこのタンパク質の良好な発現にもかかわらず同時発現の間に総細胞蛍光を減少する強い赤色のコロニーを生成した。
【図１６】図１６は、ＧＦＰ  Ｓ１０−１１  ＯＰＴタグフラグメントおよびＧＦＰ１−９  ＯＰＴアッセイフラグメントを用いるスプリットＧＦＰ補完の感受性を示す。亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０−１１  ＯＰＴ融合タンパク質を含む２０μｌのアリコートを、２５０μＭのＧＦＰ１−９  ＯＰＴを含む１８０μｌのアリコートと混合し、補完を開始した。蛍光は、ＧＦＰ１−１０の添加６時間後、各溶液について測定された。ＧＦＰ１−９  ＯＰＴの濃度は制限的であるので、蛍光は、約２５０μＭを超える亜硫酸レダクターゼＧＦＰ  Ｓ１０−１１でプラトーになる。
【図１７】図１７は、試験タンパク質Ｘが、ＧＦＰの２つのドメイン（鎖１０および鎖１１）の間の融合物として発現され、そしてＧＦＰの第３のドメインによって検出されるサンドイッチタグフォーマットの原理を示す。（ａ）補完は、これらタグ鎖がインタクトな標的タンパク質Ｘによって両者連結されるとき、効率的に起こる。（ｂ）補完は、これらタグ鎖が分離されると非効率的であり得る。
【図１８Ａ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１−９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。ＧＧＧＳＧＳＧＧ  リンカー［配列番号４３］。
【図１８Ｂ】（Ａ）は、開始配列（下の配列）が続く、補完標的としてＧＦＰ１−９  ＯＰＴを用いる（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）の進化からの６つの最適物の配列を示す。ＧＦＰ  Ｓ１０およびＧＦＰ  Ｓ１１は、下線および青の強調表示で示される。開始配列に対する６つの最適物中の変異は黄色の強調表示で示される。第５の最適物が好ましく、そして（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）と称され、ここで、Ｘは目的の標的タンパク質である。（Ｂ）は、ＧＦＰ  Ｓ１０の標的部位に変異を導入するために用いられた１４の変異誘発縮重プライマーを示す。ＧＧＧＳＧＳＧＧ  リンカー［配列番号４３］。
【図１９】図１９は、参照配列（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−ＮｄｅＩ：：ＧＧＧＳＧＳＧＧ：：ＢａｍＨＩ−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１）、図１８Ａからの最適配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｄｅ−１：：Ｘ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）、および８つの最適物（ＧＦＰ  Ｓ１０）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の配列を示す。開始配列（ＧＦＰ  Ｓ１０  ＳＭ５）−Ｌ１−Ｎｅｄ−１：：ＨＰＳ：：ＢａｍＨ１−Ｌ２−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）の可溶性を改良する標的鎖ＧＦＰ  Ｓ１０中の変異は、赤色の強調表示で示される。８つの最適物配列の各々は、ＨＰＳコード配列を通って続き、そしてＢａｍＨＩ部位で再開し、柔軟なリンカー配列およびＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５が続く（リスト中の第２の配列の端部を参照のこと）。
【図２０】図２０は、（ＧＦＰ  Ｓ１０  Ａ１０）−ＧＧＧＳ−ＮｅｄＩ−Ｘ−ＢａｍＨＩ−ＧＧＧＳ−（ＧＦＰ  Ｓ１１  ＳＭ５）をもつｐＴＥＴベクターのＮｅｄＩ／ＢａｍＨＩクローニング部位中にクローン化され、そしてｐ１５オリジンをもつｐＥＴ２８ベクター上にＧＦＰ１−９  ＯＰＴを含むＢＬ２１（ＤＥ３）株中に形質転換された１８のＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍコントロールタンパク質Ｘのインビトロおよびインビボ補完アッセイを示す。インビトロアッセイには、液体培養がＡｎＴＥＴでのみ誘導された。（ａ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴでアッセイされた２０μｌの可溶性アリコート（ｂ）ＧＦＰ１−１０  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート（ｃ）ＧＦＰ１−９  ＯＰＴでアッセイされた１０μｌの尿素可溶化ペレットのアリコート。（ｅ）ＡｎＴＥＴ試薬を用いるｐＴＥＴからのサンドイッチタグ構築物の一時的誘導、次いでＩＰＴＧを用いるＧＦＰ１−９の誘導後のＥ．ｃｏｌｉの蛍光イメージ。ＧＧＧＳ  リンカー［配列番号４４］
【図２１】図２１は、従来の乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントを使用する、ＧＦＰフラグメントの同時発現の間の、２体スプリットＧＦＰ補完を示す。タンパク質のほとんどは、凝集され（Ａｇｇ．経路）、そして少量の誤折り畳みのタンパク質は、レスキューされ、そしてシャペロンによって一過性に可溶性にされる（Ｃｈａｐ．経路）。（ａ）において、相互作用タンパク質ドメインは存在せず、したがって非常に少ないそのタンパク質は、シャペロン媒介経路によって補完し得る。なぜならそのフラグメントが相互作用ドメインによって１つに保たれず（所与のフラグメントがシャペロンによって可溶化された後に）、それが第２の直近に再折り畳みされたフラグメントと相互作用しないようであるからである。その係合されていないフラグメントは、それらが生産的に相互作用し得る前にシャペロンから放出された後、再凝集するようである。（ｂ）において、相互作用ドメインを付加する工程は、それらのフラグメントを、それらがシャペロンによって再折り畳みされる間に近くに保ち、シャペロンによって一過性に可溶化される間にそれらのフラグメントが互いに到達する確率を上昇させることによって、補完されたタンパク質の量を増加させ得る。したがって、存在する乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントは、そのタンパク質のほとんどが、誤折り畳みされ、そして凝集しても、蛍光の形成のために相互作用ドメインを必要とするようである。
【図２２】図２２は、従来の乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントを使用する、ＧＦＰフラグメントの連続的な発現または異なる分離した区画における発現の間の、２体（ｔｗｏ−ｂｏｄｙ）スプリットＧＦＰ補完を示す。図２１にあるように、タンパク質のほとんどは、凝集され（Ａｇｇ．経路）、そして少量の誤折り畳みのタンパク質は、レスキューされ、そしてシャペロンによって一過性に可溶性にされる（Ｃｈａｐ．経路）。（ａ）において、相互作用タンパク質ドメインは存在せず、したがって非常に少ないそのタンパク質は、シャペロン媒介経路によって補完し得る。なぜならそのフラグメントが相互作用ドメインによって１つに保たれず（所与のフラグメントがシャペロンによって可溶化された後に）、それが第２の直近に再折り畳みされたフラグメントと相互作用しないようであるからである。その係合されていないフラグメントは、それらが生産的に相互作用し得る前にシャペロンから放出された後、再凝集するようである。（ｂ）において、相互作用ドメインを付加する工程が、補完されたタンパク質の量を増加させることができなくても、そのフラグメントは、同時に発現されないか、または異なる区画において発現されるので、相互作用ドメインを有する場合でさえ、シャペロンによって一過性に可溶化される間にそれらのフラグメントが互いに到達する確率を劇的に減少させる。したがって、存在する乏しい折り畳みのＧＦＰフラグメントは、相互作用ドメインと融合される場合でさえ、同時に発現されるか、または同時に折り畳まれるときに補完し損なう。
【図２３】図２３は、可溶性の、非変動性ＧＦＰフラグメントを見出すためのストラテジーを示し、そのＧＦＰフラグメントはまた、再構成および折り畳みに相互作用ドメインを必要とする。（ａ）存在するＧＦＰフラグメントＦ１およびＦ２は、乏しい折り畳みであり、そして補完し損なう。（ｂ）Ｆ１およびＦ２は指向性進化によって操作されて、可溶性のままであり、凝集せず、そして融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、したがって、自発的な会合が可能である良好な折り畳みのバージョンを見出す。これらの変異は、白色の点に示される。（ｃ）において、自発的な会合を減少させるか、またはそれを排除するさらなる変異が、見出される（黒色の点）。もはや蛍光性ではない改変体の大プールが、フローサイトメトリーまたはプレートに対するスクリーニングによって細胞から単離される。（ｄ）これらの改変体は、ベクターにサブクローニングされ、そしてベクターは、相互作用ドメインに融合される場合にのみ、結合し、そして折り畳まれ蛍光性になる非蛍光変異体のサブセットを見出すために使用され得る融合された公知の相互作用タンパク質ドメイン（例えば、コイルドコイル）と一緒に発現される。これは、融合されたドメインの存在下においてさえ、誤折り畳みされるかまたは補完が不可能な、工程（ｃ）における偽陰性を排除する。
【図２４】図２４は、可溶性の、非変動性ＧＦＰフラグメントを見出すための代替的なストラテジーを示し、そのＧＦＰフラグメントはまた、再構成および折り畳みに相互作用ドメインを必要とする。（ａ）存在するＧＦＰフラグメントＦ１およびＦ２は、乏しい折り畳みであり、そして補完し損なう。（ｂ）Ｆ１およびＦ２は指向性進化によって操作されて、可溶性のままであり、凝集せず、そして融合タンパク質の折り畳みおよび可溶性を変動させず、したがって、自発的な会合が可能である良好な折り畳みのバージョンを見出す。これらの変異は、白色の点に示される。（ｃ）において、自発的な会合を減少させるか、またはそれを排除するさらなる変異が、見出される（黒色の点）。その改変体は、小エフェクターの存在下において相互作用するドメインに融合される。そのエフェクターの非存在下で蛍光性ではない改変体の大プールが、フローサイトメトリーまたはプレートに対するスクリーニングによって細胞から単離される。（ｄ）これらの改変体は、次いで、そのエフェクターに曝され、そしてそのエフェクターの存在下において蛍光性になる改変体が、単離される。これらは、結合し、そして折り畳まれて、相互作用ドメインに融合される場合にのみ蛍光性になる。これは、融合されたドメインの存在下においてさえ、誤折り畳みされるかまたは補完が不可能な、工程（ｃ）における偽陰性を排除し、そしてその変異体が工程ｃと工程ｄとの間に新しいベクターにサブクローニングされる必要がないという利点を有する。
【図２５】図２５は、３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１１およびＧＦＰ  ｓ１０が、ドメインＸにおいて係合される場合、それらは、自発的に結合し、そしてＧＦＰ  ｓ１−９と補完し得る。（ｂ）において、ＧＦＰ  ｓ１１およびＧＦＰ  ｓ１０は、係合されず、そしてエントロピーは、効率的な補完には高すぎる。
【図２６】図２６は、タンパク質相互作用を検出するために使用される３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、相互作用タンパク質ＸおよびＹに融合される。ＸとＹとの相互作用の際に、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合され、そしてエントロピーは十分に低められて、蛍光ＧＦＰを産生するための、ＧＦＰ  ｓ１−９との結合および折り畳みを可能にする。（ｂ）において、ＸおよびＹは、第３のタンパク質または標的Ｚと相互作用し、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１の係合を引き起こし、そしてそのエントロピーを十分に減少させて、ＧＦＰ  ｓ１−９との効率的な補完および折り畳まれた蛍光ＧＦＰの形成を可能にする。
【図２７】図２７は、エフェクター−誘導タンパク質相互作用を検出するために使用される３体補完ストラテジーを示す。（ａ）において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、エフェクターの存在下で相互作用するタンパク質ＸおよびＹに融合される。そのエフェクターの非存在下において、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１は、係合されず、そしてそのエントロピーは、ＧＦＰ  ｓ１−９との効率的な補完には高すぎる。（ｂ）において、そのエフェクター分子の添加は、ＸおよびＹの結合を引き起こし、ＧＦＰ  ｓ１０およびＧＦＰ  ｓ１１を係合し、そしてそのエントロピーは十分に低められて、蛍光ＧＦＰを産生するための、ＧＦＰ  ｓ１−９との結合および折り畳みを可能にする。
【図２８】（記載無し）
【図２９】（記載無し）
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008521447000001.app
【国際調査報告】
2008521447.tif 000095