(57)【要約】  式Ｉの新規化合物が発明された。【化１０】2008517016.tif 000015
2008517016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド合成方法であって、
ａ．固相に結合されたペプチドを合成する工程であって、前記ペプチドは、少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基を具備し、前記システインは、その側鎖中においてＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基によって保護されている工程、
ｂ．３，３’−ジチオ−（１−カルボキシ−プロピル）−プロピオニル−ラジカルを有する更なるアミノ酸をＮ末端にカップリングさせるか、又は、そのＮ−末端アミノ酸のＮαを脱保護して、フリーのＮαと３，３’−ジチオ−プロピオン酸イミドとを反応させて対応するＮα−３，３’−ジチオ−（１−カルボキシ−プロピル）−プロピオンアミドを生成するか、そのＮ−末端アミノ酸のＮαを脱保護して、フリーのＮαと式IVの化合物とを反応させるかの何れかの工程であって、
Ｒ7−Ｓ−Ｓ−［ＣＨ2］2−ＣＯＯＨ      （IV）                              
ここで、Ｒ７はヘテロ核アリールを含めたアリール−、又はアラルキル−、アルキルアリール−又はアルキル−、さらにハロゲノ、アミド、エステル、カルボキシ又はエーテルによって置換されていてもよい工程、及び、
ｃ．ペプチドをＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル−保護基除去試薬と反応させる工程、及び、
ｄ．ジスルフィド結合形成によって前記ペプチドを環化する工程、好ましくは空気及び／又は酸素の存在下で前記ペプチドを環化する工程
を含んだ方法。
【請求項２】
前記システインは、前記ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基から、少なくとも３アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５アミノ酸残基離れていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相樹脂は２−クロロ−トリチル（ＣＴＣ）又はアミド生成樹脂から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドは、別々に保護された更なる複数のシステイン、ホモ−又はノル−システインを含んだ少なくとも１つの更なる側鎖保護基を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記システインは、最後のＣ−末端残基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも前記Ｓ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基の除去は、前記ペプチドをトリアルキルホスフィンと反応させることによって達成されることを特徴とする請求項１又は６に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは、極性非プロトン性溶媒中、弱塩基の存在下で環化されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドの前記固相への結合は、酸置換活性であり、好ましくは室温でジクロロメタン中の６０％ＴＦＡにおいて置換活性であることを特徴とする請求項１又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記樹脂はＳｉｅｂｅｒ樹脂であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドは、続く工程において、好ましくは包括的な脱保護によって、樹脂から切り離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ４，Ｒ５はＨ又はＡｒｇ−保護基、Ｒ２はカルボン酸保護基であり、Ｒ３はＴｒｐ−保護基であり、Ｒ１は前記ペプチド骨格と結合するチオエステル、エステル又はアミド結合中の固相である式Ｉのペプチド。
【化１】
2008517016.tif 000011
【請求項１２】
Ｒ４，Ｒ５はＨであり、Ｒ３はＮ−ベンジル−カルボニルであり、Ｒ２は３級ブチルである請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記固相は、結果として前記ペプチド骨格と結合するアミド結合となるＳｉｅｂｅｒ樹脂であることを特徴とする請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
好ましくは少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備し、Ｃ−末端残基又はアミノ酸側鎖を介して固相に結合されているペプチドであって、前記ペプチドは式IIの部位を具備した環状ペプチドであり、
【化２】
2008517016.tif 000012
ここで、ｎ，ｍは１乃至１０の範囲から独立に選択され、Ｎαは前記ペプチド骨格のＮ−末端窒素であり、そしてＣ＊は前記ペプチド骨格の１つのアミノ酸残基のＣαであり、また、Ｒ６はＮ−末端の前記Ｎαで終端している前記ペプチド骨格の環の半分であり、Ｒ５は前記固相に結合されるペプチド骨格のＣ−末端の半分であるが、Ｎ≠Ｎαという条件付きであり、好ましくは、Ｒ６は少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つの介在アミノ酸残基を含んでいることを特徴とするペプチド。
【請求項１５】
好ましくはシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備しているペプチドであって、そのペプチドはＣ−末端残基を介して固相に結合されており、そのペプチドはＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基によってその側鎖において保護された少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システインを具備し、そのＮαにおいてＮ−末端置換されて式IIIのアミド部位を構成し、
【化３】
2008517016.tif 000013
ここで、ｎ＝１乃至１０であり、好ましくはｎ＝２であることを特徴とするペプチド。
【請求項１６】
好ましくはシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備しているペプチドであって、そのペプチドはＣ−末端残基を介して固相に結合されており、そのペプチドは側鎖にフリーのチオール基を有している少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システインを具備し、そのＮαにおいてＮ−末端置換されて式IIIのアミド部位を構成し、
【化４】
2008517016.tif 000014
ここで、ｎ＝１乃至１０であり、好ましくはｎ＝２であることを特徴とするペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）におけるジスルフィド結合形成の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの種類の保護基、例えば、トリチル、アセトアミドメチル−、ｔ−ブチル、トリメチルアセトアミドメチル、２，４，６−トリメトキシベンジル、メトキシトリチル、ｔ−ブチルスルフェニルが、システイン残基の保護のために用いられうる。
【０００３】
最も一般的には、トリチル基がペプチド合成中の標準的なシステイン側鎖保護に用いられる。後でシスチンへと環化されるシステインの保護のためには、ヨウ素酸化を伴ったアセトアミドメチル（ａｃｍ）保護基が、最も広く用いられている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ヨウ素以外の多数の酸化剤が、液相環化におけるシスチン生成を可能にするとして記載されている（非特許文献３中のAlbericio et al.からの例：水性緩衝液中のグルタチオン、ＤＭＳＯ、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬 ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、アルキルトリクロロシランスルホキシド、強酸性媒質中でのトリフルオロメタンスルホン酸銀−ＤＭＳＯを介した酸化）。
【０００５】
通常、それら全ての方法は、望ましくない複数の副生成物を生じさせ、最適な収率のためには１０乃至２０時間の範囲の延長された反応時間を必要とする。
【０００６】
Volkmer-Engertら（非特許文献４）は、水性溶媒中に溶解された酸素を用いることによるジスルフィド結合のチャコール触媒酸化的生成を記述している。注意深い制御は、水性媒質中に物理的に溶解された酸素のプールが、酸化のためにチャコールに酸素を担持させるのに必要且つ十分であることを証明すると述べられた。チャコールの使用は、触媒を用いない伝統的なエアースパージングと比べて、反応速度を劇的に加速した。
【０００７】
けれども、チャコールの使用は、このような反応を樹脂上ではなく均一溶液中で行うことを必然的に要求する；続く脱保護の反応工程は、ペプチド樹脂固相から取り除くことのできないチャコールが続けて存在していることを許容しないであろう。
【０００８】
特許文献１は、トリプトファンを含んだペプチドを、固相から放出した後で溶液中において環化することを記述している。そのペプチドは、側鎖のチオール官能が保護されていないＣ−末端システイニル−カルボキシアミドを有し、さらにそのＮ−末端は、３−スルフヒドリル−プロピオンアミド又は３，３’−ジチオ−（１−カルボキシ−プロピル）プロピオンアミド部位の何れかにより誘導体化されている。システインのアミド側鎖の保護及び／又は脱保護は、上記システイン側鎖のチオエステル結合を介した樹脂上へのペプチドの側鎖アンカリングによって不必要とされる。Ｎ−末端のジチオ−プロピオナトによる誘導体化は、樹脂からの切り離しの前に起こる。環化は、樹脂からの切り離しの後、したがって溶液中において、システインとチオプロピオンアミド部位との間のジスルフィド結合生成によって起こる。環化の前における固体支持体からの切り離しと、チオプロピオニル官能以外の包括的な（global）脱保護とは、このスキームにおいて必須である。
【０００９】
不利な点として、切り離し及び包括的な脱保護の間にチオプロピオンアミド部位を保持することを考慮して、最大限の注意が払われねばならない。Athertonら（非特許文献５）は、スカベンジャー及び樹脂からの切り離し用の酸分解促進剤の両者としての二重の機能を有しているチオアニソールの一般的な使用も、ａｃｍ、ｔｅｒｔ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチルスルフェニルにより保護されたシステインの部分的な早期の脱保護をもたらすことを報告した。−全体の合成経路は入り組んでおり、この方法で得られうる収率に否定的に影響する多くの工程が含まれている。環化は、二量化を避けるため、高度に希釈された溶液中で行われなければならない。得られた収率は、この記載においては全く明示されていない。
【特許文献１】国際公開第０３／０９３３０２号パンフレット
【非特許文献１】Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta 63, 899-915
【非特許文献２】Rietman et al., 1994, Int. J. Peptide Protein Res. 44, 199-206
【非特許文献３】Chan and White, eds. ‘FMOC Solid-phase Peptide Synthesis’, Oxford university Press 2000, p. 91 to 114
【非特許文献４】J. Peptide Res. 51, 1998, 365-369
【非特許文献５】J. Chem. Perkin Trans. I., 1985, 2065
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、固相合成によってジスルフィド結合された環状ペプチドを合成するための、よりシンプルで直接的な、異なった又は改善された方法を編み出すことにある。この目的は、本発明によると、以下の工程を具備したペプチド合成方法によって解決される：
ａ．固相に結合されたペプチドであって、そのペプチドは、少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基を具備し、そのシステインは側鎖においてＳ−ｔｅｒｔ−ブチル−スルフェニル基によって保護されているペプチドを合成する工程、
ｂ．Ｎ−末端で３，３’−ジチオ−（１−カルボキシ−プロピル）−プロピオニル−ラジカルを有している更なるアミノ酸とそのＮα上でカップリングさせるか、任意に、Ｎ−末端アミノ酸のＮαを脱保護し、そしてフリーのＮαを３，３’−ジチオ−プロピオン酸イミドと反応させて対応するＮα−３，３’−ジチオ−（１−カルボキシ−プロピル）−プロピオンアミドを生成するか、又は、Ｎ−末端アミノ酸のＮαを脱保護し、フリーのＮαを式ＩＶの化合物、
Ｒ7−Ｓ−Ｓ−［ＣＨ2］2−ＣＯＯＨ      （IV）                              
ここでＲ７はアリール−、ヘテロ核アリールを含んだアリール−、又はアラルキル−、アルキルアリール−又はアルキル−であり、ハロゲノ、アミド、エステル及び／又はエーテルによってさらに置換されていてもよい、と反応させるかの何れかの工程、
ｃ．ペプチドをさらにＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル保護基除去試薬と、好ましくは、ペプチドを置換又は非置換トリスフェニルホスフィン又はトリスアルキルホスフィンと反応させる工程、
ｄ．空気及び／又は酸素の存在下、形式的にはシステインとＮα上の３−チオ−プロピオンアミド部位との間のジスルフィド結合の形成によってペプチドを環化する工程。
【００１１】
本発明に係るペプチドは、例えば、ホモシステイン、ホモアルギニン、Ｄ−シクロヘキシル−アラニン、ペニシリンアミド（Ｐｅｎ）又はオルニシン（Ｏｒｎ）などの、天然又は非天然のアミノ酸を含んだどのようなペプチドであってもよい。ペプチド骨格又は主鎖、側鎖及び接頭辞‘ノル−’‘ホモ−’の用語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ定義（Joint IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature ‘Nomenclature and symbolism for amino acids and Peptides’, Pure Appl. Chem., 56, 595-624 (1984) ）に従って、本文脈において解釈される。そのより狭く好ましい意味では、‘ホモ−’は、側鎖部分におけるちょうど１つの余分なメチレン架橋基を意味する。
【００１２】
更なる側鎖の保護、特にペプチド配列中に含まれた更なるシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基であって、環化反応の間は保護されたままで、環化反応に関与しないことを意図されているものを指すときには、特別の注意が払われなければならない。好ましくは、このような更なるスルフヒドリル部位を具備した残基は、トリアルキルホスフィンの影響を受けない保護基によって保護され、より好ましくは、そのような非感受性スルフヒドリル保護基は、トリチル−、ｔｅｒｔ．ブチル−、アセトアミドメチル−、アルキル化アセトアミドメチル−、アルキル化トリチル−保護基からなる群より選択される。一般的なレベルでは、当技術で通常用いられる側鎖の保護基（例えば、Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesisを参照、下記参照）が、保護をしないとカップリング及び脱保護のサイクルにおいて変換されうる感受性の側鎖を保護することに使用されてもよい。感受性の側鎖を有しているアミノ酸の例は、Ｃｙｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｓｅｒ，Ａｒｇ，Ｈｏｍｏ−Ａｒｇ（Ｈａｒ），Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ｌｙｓ，Ｏｒｎ，Ｐｅｎ，Ｔｒｐ，Ａｓｎ及びＧｌｎである。あるいは、所望の側鎖を生成するために、ペプチドアミドの固相合成後の化学修飾が行われうる。例えば、別の文献（欧州特許第３０１８５０号明細書；Yajima et al., 1978, J. Chem. Cos. Chem. Commun., p.482；Nishimura et al., 1976, Chem. Pharm. Bull. 24:1568）に詳細に述べられているように、ホモアルギニンはペプチド鎖中に含まれたリシン残基のグアニデーションによって調製されるか、又は、アルギニンは、ペプチド鎖中に含まれたオルニシン残基のグアニデーションによって調製されうるが、これは、より好ましくなくより困難な選択肢に過ぎない。著しくは、例えばＨａｒのカップリングは、延長されたカップリング時間及びカップリング試薬の補充を要する。本発明によると、Ａｒｇ又はＨａｒを、好ましくはそれぞれＦＭＯＣ−Ａｒｇ及びＦＭＯＣ−Ｈａｒとして使用されるときに、側鎖の保護基を使用しないでカップリングさせることは１つの好ましい態様である。これは、個々のＡｒｇ又はＨａｒ残基のカップリングの後に、グアニジン部位が、あらゆる更なるカップリング反応に先立って定量的にプロトン化され、そして有機溶媒中のプロトンドナーと安定なイオン対を形成することを確実にすることによって達成されてもよい。これは、以下の実験項中において１つの好ましい態様としてより詳細に記載されるように、樹脂に結合したペプチドアミドを過剰の酸性カップリング補助剤ＢｔＯＨ又はその類似物で処理することによって、好ましくは達成される。グアニジニウム基の電荷をスカベンジする他の例は、米国特許第４９５４６１６号明細書に述べられているように、Ｆｍｏｃで保護されたＨａｒのテトラフェニルボロン酸塩を合成のために使用することである。
【００１３】
本発明に係るペプチドの好ましい態様の中で見出される個々のアミノ酸側鎖のための好適な保護基の例は：
好ましくは、アルギニン側鎖は、合成中に、例えばトシル、ベンジルオキシカルボニル、ペンタメチレンクロマンスルホニル（Ｐｍｃ）、ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル（Ｐｂｆ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）及びその４−ｔｂｕ−２，３，５，６−テトラメチル同族体（ｔａｒｔ）、アダマンチルオキシカルボニル又はＢｏｃを用いて付加的に共有結合的に保護されてもよい。Ｐｍｃ，Ｐｂｆ，Ｍｔｒ又はＴａｒｔはＡｒｇの保護のために強く推奨され、最も好ましくは、それはＰｂｆである。
【００１４】
Ｔｒｐは、合成中、好ましくはＢｏｃを用いて保護される。任意に、それは、ホルミル又はｓｙｍ−メシチレン−スルホニルによってＮ−保護されてもよい。
【００１５】
好適なカルボン酸側鎖の保護基は、側鎖のカルボキシ基のエステル化により、例えばアダマンチル、ｔｅｒｔ．ブチル、アリル、ベンジル（Ｚ）であり、好ましくは、カルボキシ基はｔｅｒｔ．ブチルエステルへの変換によって保護される。よく知られているように（Bodansky, M. 参照、下記）、上記の保護基の除去には、異なった脱保護の化学を必要とするかもしれないことは述べるまでもない。
【００１６】
固相支持体又は樹脂は、固相合成での使用に適した当技術において知られているあらゆる支持体でありうる。固相のこの定義は、ペプチドが機能的リンカー又はハンドル基を介して上記の固相又は樹脂に結合又はリンクされることを含んでおり、本文脈で「固相」と言うときにはこのようなリンカーが含意される。固相の例は、例えば、ポリスチレン支持体（例えばｐ−メチルベンジル−ヒドリルアミンによってさらに機能化されてもよい）、又は、珪藻土封入ポリジメチルアクリルアミド（ペプシンＫ）、シリカ又は微細孔性ガラスなどの剛直な機能化支持体である。固相の樹脂マトリクスは、両親媒性のポリスチレン−ＰＥＧ樹脂（例えばＴｅｎｔａｇｅｌ、米国特許第４９０８４０５号明細書参照）又はＰＥＧ−ポリアミド又はＰＥＧ−ポリエステル樹脂（例えば、Kempe et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7083 参照；米国特許第５９１０５５４号明細書、米国特許出願公開第２００３／０７８３７２号明細書）によって構成されてもよい。このような混合ＰＥＧ樹脂上で得られた生成物の純度は、伝統的な樹脂上よりも優れているが、樹脂ローディングは、通常、より効率が悪く、及び／又は、特に酸性媒質中での化学的安定性は、しばしば充分でない。ポリスチレン−ＰＥＧ樹脂はより高いローディングに達しているが、ＰＥＧの含有量が減少しているため、より低い両親媒性しか得られない。
【００１７】
好ましくは、固体支持体は、ポリスチレン、例えば、特には両親媒性ＰＳ−ＰＥＧなどのＰＥＧ又はポリジメチルアクリルアミド高分子マトリクス又は樹脂系である。
【００１８】
本発明によると、ペプチドは、アミノ酸側鎖、典型的にはＣ−末端アミノ酸（このようなアミノ酸がまさに本発明に係るＳ−ｔＢｕ−スルフェニル保護されたシステイン残基でなければ）を介して、又はＣ−末端のα―カルボニル基を介して、エステル、チオエステル又はアミド結合によって、樹脂と結合されうる。その例は、例えば、アミノ−メチル、カルボキシル又はブロモメチル又はヨードメチルラジカルを有している固体支持体か、又は、その支持体が既知のリンカー若しくはハンドル、例えば、ワン（Ｗａｎｇ）、トリチル、２−クロロ−トリチル、４−メトキシトリチル、‘リンク（Ｒｉｎｋ）アミド’、４−（２’，４’−ジメトキシベンジル−アミノメチル）−フェノキシ−、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂 ９−アミノ−６−フェニルメトキシ−キサンテン−、４−ヒドロキシメチルフェノキシアセチル−又は４−ヒドロキシメチル安息香酸（後者は、感受性のアミノ酸、例えばＴｒｐ及び特にはシステイン、のラセミ化をもたらしうるｐ−ジメチルアミノピリジン触媒によるエステル化プロトコルによって第１のアミノ酸を結合させることを要する、Atherson, E. et al., 1981, J. Chem.Soc. Chem. Commun., p.336 ff.参照）リンカーにより誘導体化された支持体である。樹脂にチオエステル結合を提供する方法は、国際公開第０４／０５０６８６号パンフレットにおいて詳細に開示され、さらに参照付けられている。本発明の１つの好ましい態様では、ペプチド部位の固相への結合のためのチオエステル結合は、２０％ピペリジンに対して、さらにはトリフェニルホスフィンなどの求核剤を用いた処理に対して脆弱であるために放棄される。
【００１９】
リンクアミド、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（Tetrahedron Lett. 1987, 28, 2107-2110）、又は類似の９−アミノ−キサンテニル型樹脂、ＰＡＬ樹脂（Albericio et al., 1987, Int. J. Pept. Protein Research 30, 206-216）、又は、Meisenbach et al., 1997, Chem. Letters, p.1265 f.に従った特別に置換されたトリチルアミン誘導体は、樹脂又は固相からのペプチドの開裂に際してそこからＣα―カルボキシアミドが生成又は遊離されるリンカー又はハンドルの例である。このようなアミドリンカーの使用が、実施される固相合成のタイプ、即ち、伝統的なＢｏｃか、カップリングのために使用される、現在では習慣的な直交性Ｆｍｏｃ保護化学かどうかに当然に依存していることは述べるまでもない；例えばＢｏｃに特異的なアミド樹脂リンカーはＰＡＭである。従って、このようなリンカー基を具備している固相は、本文脈では、‘アミド生成固相’と称される。
【００２０】
好ましくは、ペプチドは、アミド結合かエステル結合かの何れかによって、Ｃ−末端を介して固相へとアンカーされる。より好ましくは、固相は、固相からのペプチジル部位の切断に関して酸−感受性又は酸−置換活性な固相であり、さらに好ましくは、アミドを生成する酸置換活性な固相である。このような酸置換活性な固相は、樹脂からの切断のために、極性非プロトン性溶媒中に、少なくとも０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、より好ましくは、少なくとも０．５％のＴＦＡを必要とする。最も好ましくは、固相は、弱酸性条件下で切断される酸感受性の固相であり、つまり、前記溶媒中０．１乃至１０％のＴＦＡが、室温における５時間以内のインキュベーションの際に少なくとも９０％の切断効率を達成するのに充分である。このような高度に酸置換活性な固相は、例えば、２−クロロトリチル樹脂、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂、ＰＡＬ樹脂又は４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）−酪酸（ＨＭＰＢ）樹脂であり、ＳｉｅｂｅｒとＲｉｎｋは、酸分解に際してＣ−末端がアミド化されたペプチドを生じさせる。これらの酸置換活性な固相は、側鎖の保護基に対する樹脂上での脱保護の化学に特に脆弱であり、それゆえこれらの場合には特別な注意が払われなければならない。
【００２１】
Ｃ−末端のシステイン残基を介した固体支持体のハンドル基への側鎖アンカリングの場合には、リンクさせる結合は、チオエーテル又はチオエステル結合でなければならない。側鎖アンカリングのためのさらに好適な残基は、酸性側鎖中のカルボキシ基、ヒドロキシ基、特にはリシンのε−アミノ基である。側鎖アンカリングの場合は、一般的にＣ−末端フリーのカルボキシ基は、例えば側鎖のアミノ官能の固相への結合反応のためにＦＭＯＣ−Ｌｙｓ−カルボキシアミドを使用することによって、第１のカップリング反応の実行に先立って、エステル化又はアミド化によって保護されねばならないことは述べるまでもない。
【００２２】
ある好ましい態様では、Ｓ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニルで保護されたシステインは、ペプチドのＣ−末端残基であり、そのカルボキシ末端を介してエステル結合又はアミド結合によって固相に結合されるが、前記リンク結合はベンジルエステル部位ではなく、好ましくは先に定義したような弱酸性反応条件下で切断される酸置換活性な樹脂であるという条件付きである。Ｃ−末端システインは、酸性条件においてラセミ化を特に受けやすい傾向がある。
【００２３】
３級ホスフィンとの反応を用いたＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル保護基のシステインからの除去は、例えばトリブチルホスフィン（Atherton et al., 1985, J. Chem. Soc., Perkin I. 2057）及びトリエチルホスフィン（Huang et al., 1997, Int. J. Pept. Protein Res. 48, 290）を使用することによって、記載されている。同様の脱保護工程が、本発明によると、Ｎα−３，３’−ジチオ−（１−カルボキシプロピル）−プロピオンアミド、異なった数のメチレン基を有しているその同族体、又は式ＩＶの化合物のジスルフィド結合を切断するために用いられる。ｔｅｒｔ−ブチルスルフェニル基は、最も多くの場合、例えばβ−メルカプト−エタノール又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は３級ホスフィン（Huang et al., 1997, Int. J. Pept. Protein. Res. 48, 290；Riemann et al., 1985, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 1141）などのチオール試薬を用いて除去される。好ましくは、３級ホスフィンは、トリフェニルホスフィンであるか、又は、例えばトリ−（ｐ−メトキシフェニル）−ホスフィンなどのアルキル化又はアルコキシ化されたトリフェニルホスフィンであるか、又は、さらにより好ましくは、トリアルキルホスフィンであって、そのアルキルは、同じであっても異なっていてもよいが、それぞれのアルキルはＣ１乃至Ｃ７アルキル、好ましくはＣ１乃至Ｃ４アルキルであり、分岐アルキル又は直鎖アルキルであってもよいトリアルキルホスフィンである。好ましくは、アルキルは直鎖である。その例は、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチルである。トリ−ｎ−ブチル−ホスフィン及びトリ−エチルホスフィンは特に好ましい。アルキルは、任意に、ハロゲノ、メトキシ若しくはエトキシによって、又は、溶媒系に耐えられる場合は、カルボキシによってさらに置換されていてもよいが、好ましくは無置換である。驚くべきことに、本発明によると、ホスフィンによるジスルフィド切断は、例えばＳｉｅｂｅｒ又は２−ＣＴＣ樹脂などの弱酸性条件において切断可能な非常に酸置換活性な樹脂にも使用されうること
が思いがけなくも発見された。−チオール試薬は、自らがジスルフィド生成物を形成することによって、ジスルフィドを還元、したがって切断してしまうことは、しばしば見過ごされる。ＤＴＴの場合は、分子内閉環が有利であるが、β−メルカプトエタノールの場合は、例えばジスルフィド交換反応による、あらゆる分子内反応生成物が可能である。さらには、新たに生成したジスルフィドでさえも、更なる交換反応を被ってもよい。チオール試薬の広範な使用は、３級ホスフィン試薬を用いるときの例えば樹脂からの漏出などの副反応のおそれを、明らかに負う。
【００２４】
ペプチド合成のためのカップリング試薬は、当技術においてよく知られている（Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993；そこでのカップリング添加剤又は補助剤の役割についての議論も参照）。カップリング試薬は、混合無水物（例えば、Ｔ３Ｐ：プロパンリン酸無水物）又は活性化エステル又はハロゲン化酸（例えば、ＩＣＢＦ、イソブチル−クロロホルミエート）のような他のアシル化剤であってもよく、又は、カルボジイミド（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）、活性化されたベンゾトリアジン誘導体（ＤＥＰＢＴ：３−（ジエトキシホスフォリルオキシ）−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン）又はベンゾトリアゾールのウロン酸若しくはリン酸塩であってもよい。
【００２５】
最良の収率、短い反応時間及び鎖伸長中のラセミ化に対する保護のためには、カップリング試薬が、フリーのカルボン酸官能の活性化が可能なベンゾトリアゾールのウロン酸塩及びリン酸塩からなる群より選択されるとともに、反応は塩基存在下で実施されることがより好ましい。このようなウロン酸又はリン酸カップリング塩の好適且つ同様に好ましい例は、例えば、ＨＢＴＵ（Ｏ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロン酸ヘキサフルオロリン酸塩、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＡＯＰ、ＨＣＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロン酸ヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＣＴＵ（Ｏ−１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロン酸テトラフルオロホウ酸塩）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロン酸ヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロン酸テトラフルオロホウ酸塩）、ＴＯＴＵ（Ｏ−［シアノ（エトキシカルボニル）メチレンアミノ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロン酸テトラフルオロホウ酸塩）、ＨＡＰｙＵ（Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）オキシビス−（ピロリジノ）−ウロン酸ヘキサフルオロリン酸塩）である。
【００２６】
ＤＥＰＢＴ又は類似物、ウロン酸又はリン酸塩試薬を使用するときには、好ましくは、カップリング工程を実施するために更なる即ち第２の弱塩基試薬が必要とされる。これには、ペプチド又はアミノ酸又はアミノ酸誘導体のα―アミノ官能を除いた、共役酸がｐＫａ７．５乃至１５の、より好ましくはｐＫａ７．５乃至１０のｐＫａ値を有している塩基が適合し、この塩基は、好ましくは、３級の立体的に嵩高いアミンである。このさらに好ましい例は、Ｈｕｎｉｇ塩基（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアニリン、２，４，６−トリアルキルピリジン又はＮ−アルキル−モルフォリンであって、アルキルは直鎖又は分岐鎖のＣ１乃至Ｃ４アルキルであり、より好ましくは、Ｎ−メチルモルフォリン又はコリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）であり、最も好ましくはコリジンである。Ｃ１乃至Ｃ４アルキルの例は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ．ブチル、イソブチルである。
【００２７】
カップリング添加剤、特にはベンゾトリアゾール型のカップリング添加剤の使用も知られている（Bodansky、上記参照）。それらの使用は、高活性な前述のウロン酸塩又はリン酸塩カップリング試薬を用いるときに特に好ましい。したがって、カップリング試薬添加剤は、活性化エステルを形成できる求核的なヒドロキシ化合物であることがさらに好ましく、より好ましくは、酸性で求核的なＮ−ヒドロキシ官能を有しており、ここでＮはイミド又はＮ−アシル又はＮ−アリール置換トリアゼノであり、最も好ましくは、カップリング添加剤は、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体（即ち１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール誘導体）又はＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体である。このようなカップリング添加剤Ｎ−ヒドロキシ化合物は、国際公開第９４／０７９１０号パンフレット及び欧州特許第４１０１８２号明細書において、大きく且つ広く記述されており、それらの各々の開示は、参照によってここに組み込まれる。例としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、及びＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアジン誘導体が特に好ましく、最も好ましい態様では、カップリング試薬添加剤は、ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンである。
【００２８】
カップリング添加剤のアンモニウム塩化合物は既知であり、それらのカップリング化学における使用は、例えば米国特許第４８０６６４１号明細書中に記載されている。
【００２９】
さらに特に好ましい態様では、ウロン酸又はリン酸カップリング試薬は、ウロン酸塩試薬であり、好ましくは、ＨＣＴＵ，ＴＣＴＵ又はＨＢＴＵであり、より好ましくは、ＨＣＴＵ又はＴＣＴＵであり、そして最も好ましくは、それはＮ−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン又はその塩とともに反応において使用される。この態様は、塩基置換活性なＮα保護基の除去後のペプチド合成における鎖伸長での使用に主には好ましいが、側鎖の環化中のラクタム化反応に使用されてもよい。
【００３０】
本発明の文脈では、ＨＣＴＵ及びＴＣＴＵは、これらの化合物及びその可能な類似体は、ウロン酸部位よりむしろイソニトロソ部位を含有することが結晶構造解析によって示されており（O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio “HCTU and TCTU: New Coupling Reagents: Development and Industrial Applications”, Poster, Presentation Gordon Conference February 2002）、代わりにヘテロ環コア上のＮ−アミジノ置換基はグアジニウム構造をもたらすにもかかわらず、「ウロン酸塩試薬」という用語によって包含されると定義されていることは注意されるべきである。本文脈では、このような部類の化合物は、本発明に係るウロン酸塩試薬の「グアジニウム型サブクラス」と称される。
【００３１】
塩基置換活性なＮαの脱保護は、当技術でルーチン的にされているように、例えばＦｍｏｃ化学の場合にはＮ−メチルモルフォリン中の２０％ピペリジンを用いて実施されてもよい。最も広範には、Ｎ−末端に対するＦｍｏｃ又はＢｏｃ保護化学が固相合成においてルーチン的に適用されているが、更なる任意のＮα保護化学が当技術において知られており、樹脂共役ペプチドのジスルフィド含有ペプチド環化を案出する本発明に干渉しないときには、それらが適用されうる。
【００３２】
前記カップリング化学は、先に定義した式IVの化合物、Ｒ7−Ｓ−Ｓ−［ＣＨ2］2−ＣＯＯＨのカップリングにも用いられうる。この化合物は、例えば、各々の対称カルボン酸イミドを、例えばアルカノール又はアルキルアミンと反応させることにより、容易に製造されうる。
【００３３】
環化は、本発明に従って、極性非プロトン性有機溶媒中、第１の弱塩基存在下で実施される。環化を媒介する酸化剤は、Chan and White, eds., ‘FMOC Solid-phase Peptide Synthesis’ Oxford university Press 2000, p. 91 to 114 で言及されているどのようなものであってもよい：水性緩衝液中のグルタチオン、ＤＭＳＯ、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬 ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、アルキルトリクロロシランスルホキシド、強酸性媒質中でのトリフルオロメタンスルホン酸銀−ＤＭＳＯを介した酸化、ここで強酸性媒質は、チャコールを介した酸化がそうであるように、保護されたペプチドを溶媒和するための更なる有機溶媒系中で、樹脂上環化において使用することに全く非実用的というわけではない。別の一般的な方法は、ジスルフィド結合形成のための塩化カルボエトキシスルフェニルの使用である（Le-Nguyen, D., 1986, Int. J. Peptide Protein Res. 27, 285-292）。溶媒系の理由のために、１つの好ましい態様では、環化は、例えば米国特許第５１４４００６号明細書においてより詳細に記載されているように、ＤＭＳＯを酸化剤及び下記の溶媒に加えた混和性共溶媒として、結局は少量の水の存在下で、ＤＭＳＯを介した酸化によって実施される。ＤＭＳＯは、許容できるほどに速い反応速度を提供し、変性させる共溶媒であり、ペプチド基質を溶解させるのを助ける。そのメチオニン側鎖への酸化効果を考慮すれば、アミノ酸側鎖の脱保護に先立った樹脂上環化におけるその使用は、溶液中での脱保護されたペプチドとの通常の使用よりも、ずっと便利である。
【００３４】
最も好ましい態様では、前記環化は空気及び／又は酸素の存在中で、しかし特には、ジスルフィド結合を形成するためのチオール基の酸化を達成するための不均一系反応速度加速触媒無しで実施される。好ましくは、環化は、実質上触媒フリーで、即ち触媒的に有効な又は充分な量の不均一系触媒なしで、実施される。
【００３５】
本発明によると、そして特には酸化剤としての空気及び／又は酸素とともに、より好ましくは、前記の不均一系つまり固相触媒なしで空気／酸素とともに実施されるときには、本発明に係る環化の工程は著しく効率的であり、０．５乃至２時間の反応時間しか要さず、非常に穏和な反応条件（典型的には周囲温度、適切な温度範囲は１０℃乃至８０℃であるが、もちろん、溶媒の還流温度も考慮に入れられなければならない）下で、抽出物から所望の生成物への文字通り定量的で完全な変換が可能となる。先例のないことに、それでもまだ、変換は完全である。これは際立った達成であり、ジスルフィド結合方式のペプチド環化においては未だ達成されていないし、このようなシンプルで穏和で高速な環化反応の条件は以前には発明されていない。不均一系触媒のための厄介な混合及び分離の問題は決して起こらない。それでもなお、反応速度は、従来技術における触媒有りでの反応の速度に匹敵する。まっすぐな反応経路のために、副生成物の生成はほぼ完全に避けられる。
【００３６】
好適な極性非プロトン性溶媒は、例えば、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、Ｎ−メチルピロリドン、テトラヒドロフランである。このような溶媒は、水とは対照的に、以前に水性触媒系について記述されてきたように、通常は、ジスルフィド結合の酸化的生成をもたらすために妥当な量の酸素を物理的に溶解させないかもしれない。
【００３７】
従って、空気、空気／酸素又は純酸素の供給には、注意が払われなければならない。空気／酸素は、徹底的な攪拌、ボルテックシング、攪拌のために使用されるプロペラの特別な設計、液体中へのガススパージングによって供給されてもよい。ガスは、空気か純酸素か酸素富化された空気かであってもよい。１つの特に好ましい態様では、反応容器の底面及び／又は壁面の大きな表面領域に、徹底的な攪拌下でガスを液体中にスパージングするために孔があけられる。
【００３８】
本発明のあるペプチドに対して、システインのための異なった保護形式が使用されることも可能である。例えば、ペプチド鎖中の更なるシステインは、樹脂からの除去の後に及び本発明に係る樹脂上での最初のジスルフィド結合が生じた後に、溶液中での標準的なヨウ素酸化による内部システインの間の更なる位置特異的なジスルフィド結合を供給するために、伝統的にａｃｍ保護基によって、保護されても良い。
【００３９】
第１の弱塩基は、その共役酸がｐＫａ７．５乃至１５、より好ましくはｐＫａ８乃至１０のｐＫａを有しており、好ましくは３級の立体的に嵩高いアミンである。このような及びさらに好ましい例は、Ｈｕｎｉｇ塩基（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアニリン、２，４，６−トリアルキルピリジン又はＮ−アルキル−モルフォリンであり、アルキルはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチルなどの直鎖又は分岐鎖のＣ１乃至Ｃ４アルキルであり、最も好ましくは、Ｎ−メチルモルフォリン、コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン）又はＨｕｎｉｇ塩基である。
【００４０】
好ましくは、ジスルフィド保護基の事前の除去、とりわけＳ−ｔｅｒｔ．ブチルスルフェニル基の除去は、少しの酸分解による樹脂からの漏出のあらゆるリスクを回避するための第１の弱塩基試薬の存在下で、つまり７．５乃至１２の、より好ましくは８乃至１１のｐＨにおいて実施される。任意に、ＴＨＦやアセトニトリルなどの水と自由に混和する極性非プロトン性溶媒を使用することによって、例えば水溶液中の酢酸ナトリウムなどの塩基性塩がその目的のために使用されてもよい。この態様は、前記のジスルフィド基の切断又は除去の工程のために３級ホスフィンが使用されるとき特に好ましい。このようなジスルフィド保護基の除去に付随して適当な酸素供給を組み合わせることによって、本発明の別の態様において、例えば極性非プロトン性有機溶媒と酸素供給とを３級アミンの存在中に使用するとき、及び、酸素に対して不活性な３級ホスフィンを脱保護のために使用するときには、ジスルフィドの脱保護及び環化を、ワンポッド反応でだけでなく単一の反応工程として実行することが可能かもしれない。
【００４１】
本方法は樹脂上での環化を可能とするので、さらに、分子間環化よりも分子内環化を有利にするために従来技術で記載されているほとんどの方法で以前は必要であった、面倒であり且つ収率を減少させるペプチドの高度希釈を必要としない。
【００４２】
本発明の樹脂上での操作方式は、二量化の機会を全く与えず、高速且つ効率的な分子内環化のみを可能とする。
【００４３】
さらに好ましい態様では、ペプチドは式Ｉのペプチドである。保護基という用語は、所定の側鎖の官能性のための保護基か、又は、保護基が標準的なｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成で使用される特定の側鎖のための保護基であると解釈されるべきである。このような保護基及び特定の側鎖の官能性のために特定の保護基を使用することは、当技術においてよく知られており、またルーチンである（上記 Chan et al., ed.；上記 Bodansky et al. 参照）。
【００４４】
１つのさらに可能な態様では、ペプチドは、任意に、固相へのペプチジル部位の永続的で共有結合的な接着によってではなく、たんぱく質の精製に用いられる確立されたヘキサ−Ｈｉｓタグ技術に類似した、安定な金属キレート錯体による固相への非共有的で可逆な接着（Lonza AG, Basel,スイスとAplaGen GmbH, Baesweiler,ドイツとの共同による製品ニュース、２００４年１０月）によって合成されてもよい。このような非共有的固相結合又は類似の未来の態様は、本発明によって同様に包含され、上記及び下記の本発明の好ましい実施形態は、この態様についても同様に適用される。
【００４５】
適切な固相に共役され有利に環化された先に記載のペプチド、及び、それらの上記及び下記に引用された好ましい態様との組み合わせは、本発明の更なる目的である。
【００４６】
第１の目的は、式Ｉのペプチドである。
【化５】
2008517016.tif 000003
【００４７】
ここで、Ｒ４，Ｒ５はＨ又はＡｒｇ−保護基であり、Ｒ２はカルボン酸保護基であり、Ｒ３はＴｒｐ保護基であり、そしてＲ１はペプチド骨格へのチオエステル、エステル又はアミド結合中の固相である。
【００４８】
好ましくは、このようなペプチドにおいて、Ｒ４，Ｒ５はＨであり、Ｒ３はＮ−ベンジルオキシカルボニルであり、Ｒ２は３級ブチルである。
【００４９】
好ましくは、前記固相は、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂、又は、アミド生成リンカー又はハンドルを具備し、結果的にペプチド骨格とアミド結合接続する他の樹脂である。
【００５０】
第２の目的は、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備したペプチドであって、そのペプチドはＣ−末端残基又はアミノ酸側鎖を介して固相に結合され、そのペプチドは式IIの部位を具備した環状ペプチドであることを特徴とする。
【化６】
2008517016.tif 000004
【００５１】
ここで、ｎ，ｍは１乃至１０の範囲から独立に選択され、好ましくはｎ＝２及びｍ＝１（システイニル部位を与える）であり、Ｎαはペプチド骨格のＮ−末端窒素、そしてＣ＊はペプチド骨格のアミノ酸残基のＣαであり、また、Ｒ６はＮ−末端であり、前記Ｎα及びＲ５で終端しているペプチド骨格の環の半分は固相に結合されるペプチド骨格のＣ−末端の半分であるが、Ｎ≠Ｎαという条件付きであり、好ましくは、Ｒ６は少なくとも３つの、より好ましくは少なくとも４つの介在するアミノ酸残基を含む。はっきりさせるためには、Ｒ５は、Ｃ＊Ｈ（−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’）又はＣ＊Ｈ（−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’）又は最後にはＣ＊Ｈ（−ＣＯ−Ｓ−Ｒ’）を意味すると解釈されるべきであり、ここでＲ’は、リンカー又はハンドル、Ｒ５、及び、任意に前記固相に結合された幾つかのアミノ酸残基を含みうる固相を具備している。好ましくは、Ｒ５及びＲ６は、２００個までの、より好ましくは１００個までの、最も好ましくは５０個までのアミノ酸残基を具備している。
【００５２】
更なる目的は、好ましくはシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備しているペプチドであって、そのペプチドはＣ−末端残基を介して固相に結合されており、そのペプチドはＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基によって側鎖において保護された少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システインを具備していることを特徴とし、ＮαにおいてＮ−末端置換されて式IIIのアミド部位を構成するペプチドである。
【化７】
2008517016.tif 000005
【００５３】
ここで、ｎ＝１乃至１０、好ましくはｎ＝２である。
【００５４】
重ねて、更なる目的は、好ましくはシステイン、ホモ−又はノル−システイン残基上にＳ−ｔｅｒｔ．ブチル−スルフェニル基以外の少なくとも１つのアミノ酸側鎖保護基を具備しているペプチドであって、そのペプチドはＣ−末端残基を介して固相に結合されており、そのペプチドは側鎖にフリーのチオール基を有している少なくとも１つのシステイン、ホモ−又はノル−システインを具備していることを特徴とし、ＮαにおいてＮ−末端置換されて式IIIのアミド部位を構成するペプチドである。
【化８】
2008517016.tif 000006
【００５５】
ここで、ｎ＝１乃至１０、好ましくはｎ＝２である。
【００５６】
同様に、本発明の最後の及び最後から２番目の目的のペプチドは、再び、好ましくは２００個までの、より好ましくは１００個までの、最も好ましくは５０個までのアミノ酸残基を具備している。たとえ１００アミノ酸残基又はそれ以上のペプチドを合成するための必須条件ではないにせよ、非常に長いペプチドを合成するときには、樹脂の選択も得られる収率に影響することは述べるまでもない。例えばＰＥＧ樹脂は、通常、このために良い選択であるかもしれない。さらに、ペプチドの個々のアミノ酸配列は、所定のペプチドで得られうる最長の鎖長及びカップリング効率に影響するかもしれないことは述べるまでもない；広く知られた例は、ベータシート形成及び鎖間結合による、線状合成中のペプチドスレッドの好ましくない鎖間凝集である。
【００５７】
実験
本発明の新規で改善された方法を案出することを目指して、樹脂上での環化のための保護されたモデルペプチドとして、Eptifibatideが選択された；eptifibatideのための固相合成法は、すでに米国特許第５３１８８９９号明細書に記載されている。
【００５８】
全体の合成戦略は、下の表１に示される：
【表１】
2008517016.tif 000007
【００５９】
１．１  線状ペプチド Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−Ｓｉｅｂｅｒ のＦＭＯＣ ＳＰＰＳ
ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＯＨの合成は、既に記載されている（Rietman et al., 1994, Synth. Commun.v24, p. 1323 f）。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂は、Novabiochemの製品であり、Calbiochem-Novabiochem（EMD Biosciences、カリフォルニア／米国に属する）から購入された。ＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−ＯＨ（cat. No. B-1530）を含めた全てのＦＭＯＣアミノ酸は、Bachem AG（Bubendorf，スイス）から購入された。
【００６０】
樹脂のロ−ディングは０．５２ｍｍｏｌ／ｇであり、全量では１０ｇのＳｉｅｂｅｒ樹脂であった。ローディングのためのカップリング時間は、標準的なカップリング時間の２倍、即ち全体で６０分であった。カップリングは、各々２当量の各アミノ酸を用いて、各々１当量の６−クロロ−ＨＯＢｔ、ＴＣＴＵ、Ｈｕｎｉｇ塩基（ジイソプロピルアミン）の存在下、ジクロロメタン中で行われた。洗浄は、Ｎ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）によって行った。
【００６１】
ＦＭＯＣの脱保護は、ピペリジンの１０％Ｎ−メチル−ピロリドン溶液に１５分間の３サイクルで行われた；切断の効率及び合成の完了は、それぞれニンヒドリン反応及び逆相ＨＰＬＣによって分析された。
【００６２】
１．２  １．１からＨａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−Ｓｉｅｂｅｒへのペプチドの伸長
ＦＭＯＣ−Ｈａｒ残基（Bachem, Burgendorf, スイス）のカップリングは、アミノ酸１当量に対して１当量のＨＯＢｔの存在下で（グアニジノ基をプロトン化されたままにするために）行われた；ＦＭＯＣアミノ酸は、ＨＯＢｔ及びＮＭＰ中の１当量のジイソプロピルカルボジイミドとともに事前にインキュベートされ、その後樹脂と混合された。Ｈａｒカップリングは、１８０分を要し（他のアミノ酸：３０分）、その後、補充された試薬を用いて、約６０分間、第２サイクルが続いた。このようにして、他の残基に対してのように、標準的な９９．８％のカップリング効率がかなえられた。
【００６３】
ＦＭＯＣの除去は、前のように行われた。特に、ＦＭＯＣの除去及びその次のＮＭＰ洗浄の後、樹脂の更なる膨潤を妨げるため、ＨＯＢｔによって何度も洗浄された。
【００６４】
注意：ＴＣＴＵを用いた延長されたカップリングは、上記のＨＯＢｔとのイオン対生成以外には保護基を用いないＡｒｇカップリングに対して可能である。ＨＯＢｔとの更なるイオン対生成は、脱保護の間の副反応に関して問題を含むかもしれない例えばＰｂｆなどのＡｒｇのための共有的に結合された保護化学を用いる場合と比べて、好ましい態様である。
【００６５】
１．３  １．２から（Ｍｐａ）2−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｓ−ｔＢｕ）−Ｓｉｅｂｅｒへのペプチド樹脂の誘導体化
氷浴中で１０℃より低くまで冷却されたＤＭＦ中で、３，３’−ジチオプロピオンイミド（Novabiochem）との反応が行われた。１当量のジイソプロピル−カルボジイミドが、１０分間に亘って、攪拌しながら、温度が１５乃至２０℃以下に留まるように制御しつつ、反応混合物中に添加された。その後、反応混合物は、１．２節からの脱保護され樹脂に結合したペプチド生成物中に添加された。カップリングは、周囲温度で６時間進行させられた。
【００６６】
反応生成物の一定分量は、６０％ＴＦＡによって樹脂から切断され、ＬＣ−（エレクトロスプレー）ＭＳによって分析された。２つの主生成物ピークが検出された（＜２５％の副生成物：ジペプチド）ものの、変換は定量的であった。故に、この工程の収率は＞７５％であった。
【００６７】
１．４  Ｂｕ3Ｐによる脱保護
樹脂は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で３回、懸濁及び洗浄された。反応は、室温で１時間、１９％（ｖ／ｖ）ＰＢｕ３／７７％（ｖ／ｖ）ＴＨＦ／４％（ｖ／ｖ）酢酸ナトリウム飽和水溶液として調製された５０当量のトリブチルホスフィンを用いて行われ、沈殿した塩は使用前に濾過された。反応は一様に進行し、１つの主要な生成物ピークを与えた。収率は逆相ＨＰＬＣにより決定され、９８．９％の純粋な生成物に達することが分かった。
【００６８】
１．５
【化９】
2008517016.tif 000008
【００６９】
を生成するための環化
１．４からのペプチド−樹脂共役は洗浄で膨潤させられ、そして、ＮＭＰ中で３回洗浄された。環化は、樹脂を１時間、室温でＮＭＰ中の６％ＤＩＥＡ（Ｈｕｎｉｇ塩基）とともにインキュベートすることによりなされた；反応は、水平に二分する封入されたＧ３（１６乃至４０μｍ）ガラスフリットを下方部分に具備した鉛直ガラス容器中で行われた。ガラスフリット又はフリット板は下方からの空気によって孔あけされ、フリット上方の溶媒で覆われた反応物空間の断面全体を横切る空気バブリングを可能とし、そこでは、下方からのバブリング空気によって樹脂が浮かんでいた。厳密に純粋で均一な生成物が得られ、はっきりとした又は断片的な副生成物が、この反応工程後に現れることはなかった。逆相ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより独立に決定された生成物への変換は１００％であった。ＲＰ−ＨＰＬＣは、Hypersil-KeystoneTM Betabasic（Thermo Electron Corp., Waltham Mass./U.S.A.）C18 150x4.6 mm カラム上で、３５℃のカラム温度において、１５μｌの注入体積及び２６２ｎｍでの検出によって行われた。勾配ランは、
【表２】
2008517016.tif 000009
【００７０】
１．６  包括的な脱保護
包括的な脱保護は、樹脂をジクロロメタン（ＤＣＭ）中で３回膨潤させることにより調製された。切断反応相混合物は、以下から成るようにして調製された。
【表３】
2008517016.tif 000010
【００７１】
反応は、ゆっくりと回転するオービタル振動装置上で２時間、１５℃において行われた。樹脂を濾過した後、ｔｅｒｔ．ブチル酸メチスエステルの滴下によって、反応は停止され、生成物は沈殿された。−生成物は、均一なピークであり；主要な副生成物は検出されえなかった。−上の包括的な脱保護の条件は、対照について試験され、ペプチド中の前もって形成されたジスルフィド結合に影響しないことが分かった。この最終工程の変換は、上の１．５で詳しく述べたようにしてＲＰ−ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳにより決定したところ、＞９９％であった。
【国際調査報告】
2008517016.tif 000016
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2008517016.tif 000018