(57)【要約】  本発明は、微生物由来の抗生物質である、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の発酵によって産生される任意に命名された抗生物質１０７８９１、薬学的に許容されるその塩及び組成物、並びに感受性微生物に対する抑制活性を有する抗菌剤としてのその使用に関する。Ａ１及びＡ２因子と命名された２つの因子を含む複合体である抗生物質１０７８９１は、ランチビオティックスグループの抗生物質の典型的な特徴であるランチオニン及びメチルランチオニンを成分として含有するペプチド構造を有する。抗生物質１０７８９１及びそのＡ１及びＡ２因子は、メチシリン耐性及びバンコマイシン耐性株を含めたグラム陽性細菌に対する良好な抗菌活性を示し、且つ、モラクセラカタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ナイセリア種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）などのグラム陰性細菌に対しても活性である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物
【化１】
2008528581.tif 000017
［式中、Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５は、独立に、Ｓ、Ｓ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、及びアリールからなる群から選択される］。
【請求項２】
ＸがＣｌであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＸがＣｌであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳであり、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８がＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項４に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｙ１がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｙ２がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｙ３がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｙ４がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｙ５がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４がＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
次式の化合物。
【化２】
2008528581.tif 000018
【請求項１７】
次式の化合物。
【化３】
2008528581.tif 000019
【請求項１８】
Ａ１因子及びＡ２因子を含む抗生物質１０７８９１複合体であって、次の特徴、即ち
（Ａ）次のエレクトロスプレイ条件、即ちスプレイ電圧：４．７ｋＶ、キャピラリー温度：２２０℃、キャピラリー電圧：３Ｖ、注入モード  １０μｌ／分を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ較正ミックスを使用して、エレクトロスプレイ源を取り付けたＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｄｅｃａ装置上で、トリフルオロ酢酸０．１％を含むメタノール：水  ８０／２０（ｖ／ｖ）中の０．２ｍｇ／ｍｌ溶液から記録された、Ａ１及びＡ２因子の最も低い同位体組成にそれぞれ対応するｍ／ｚ１１２４及びｍ／ｚ１１１６に２つの二重プロトン化イオンを示す質量スペクトルと、
（Ｂ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ４８型を用いてＫＢｒ中で記録され、３２６３、２９２９、１６６１、１５３３、１４０２、１１１４、１０２６（ｃｍ−１）に吸収極大を示す赤外スペクトルと、
（Ｃ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール：Ｈ２Ｏ  ８０：２０（ｖ／ｖ）中で実施され、２２６と２６７ｎｍにおいて２つの肩を示す紫外スペクトルと、
（Ｄ）内部標準として３．３１ｐｐｍにおけるメタノール−ｄ４残留シグナルを用いて、水抑制シーケンスを適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計で４０℃においてメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中で６００ＭＨｚにおいて記録された、次のシグナル［δ＝ｐｐｍ  多重度（帰属）］、即ち、０．９３ｄ（ＣＨ３）、０．９８ｄ（ＣＨ３）、１．０７ｔ（重複ＣＨ３）、１．１８ｔ（重複ＣＨ３）、１．２６ｓ（ＣＨ３）、１．３０ｔ（重複ＣＨ３）、１．６２〜１．７４ｍ（ＣＨ２）、１．７８ｄ（ＣＨ３）、１．８０ｄ（ＣＨ３）、２．０３ｍ（ＣＨ２）、２．２４ｍ（ＣＨ）、２．３６ｍ（ＣＨ２）、２．７２〜３．８ｍ（ペプチド性アルファＣＨ）、３．８〜５．２ｍ（ペプチド性アルファＣＨ）、５．５３〜６．０８ｓ（ＣＨ２）、５．６２ｄ（ＣＨ二重結合）、６．４２ｍ（ＣＨ）、６．９２ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．５５ｍ（芳香族ＣＨ）、７．６２〜１０．４ｄ及びｍ（芳香族及びペプチド性ＮＨ）を示す１Ｈ−ＮＭＲスペクトルと、
（Ｅ）内部標準として４９．１５ｐｐｍにおけるメタノール−ｄ４の残留シグナルを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計で４０℃においてメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中で記録された、次のシグナル［δ＝ｐｐｍ、（帰属）］、即ち、１３．６〜２３．２（脂肪族ＣＨ３）、２６．１６〜７３（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性アルファＣＨ）、１０５〜１３６（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６４．３〜１７６．３（ペプチド性カルボニル）を示す１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと、
（Ｆ）６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートでの誘電体化後に、他の同定されていないピークと共に次のアミノ酸、即ち、ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（アスパラギンの加水分解生成物）、フェニルアラニン及びロイシンの存在を示す６Ｎ  ＨＣｌ中（１０５℃、２４時間）の酸加水分解物と、
（Ｇ）５−クロロトリプトファンの存在を示す、０．２％（ｗ／ｖ）３−（２−アミノエチル）インドールを触媒として含む４Ｎ  メタンスルホン酸中（１１５℃、１６時間）の酸加水分解物と、
（Ｈ）過剰モルの０．０１Ｎ  塩酸を含む２−メトキシエタノール（ＭＣＳ）：Ｈ２Ｏ  １２：３（ｖ／ｖ）中で０．０１Ｎ  水酸化カリウムを用いて実施される酸／塩基滴定で検知される塩基性イオン性基と
を有する白色粉末である複合体。
【請求項１９】
抗生物質１０７８９１のＡ１因子であって、次の特徴、即ち、
（Ａ）次のエレクトロスプレイ条件、即ち、スプレイ電圧：４．７ｋＶ、キャピラリー温度：２５０℃、キャピラリー電圧：８Ｖ、注入モード１０μｌ／分を用いる、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ較正ミックスを使用する、エレクトロスプレイ源を取り付けたＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｄｅｃａ装置上で、酢酸０．５％を含むアセトニトリル：水  ５０：５０（ｖ／ｖ）中の０．１ｍｇ／ｍｌ溶液から記録された質量スペクトル中の最も低い同位体組成に対応するｍ／ｚ１１２４における二重プロトン化イオンと、
（Ｂ）エレクトロスプレイ源を取り付けたＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＡＰＥＸ  ＩＩ，４．７Ｔｅｓｌａ分光計を用いて決定された、ｍ／ｚ  １１２４．３６１２４（精度３０ｐｐｍ）における［Ｍ＋２Ｈ］２＋から算出されたモノアイソトピック質量である、２２４６．７１±０．０６の分子量に相当する抗生物質の正確な質量と、
（Ｃ）ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された場合に、６００ＭＨｚにおける、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．９４ｐｐｍ）として使用する［δ＝ｐｐｍ、多重度（帰属）］、次のシグナルのグループ（ｐｐｍで）、即ち、０．８４ｄ（ＣＨ３）、０．８９ｄ（ＣＨ３）、０．９４ｔ（重複したＣＨ３）、１．１ｄ（ＣＨ３）、１．１３ｄ（ＣＨ３）、１．１５ｔ（重複したＣＨ３）、１４９ｍ（ＣＨ２）、１．６９ｄ（ＣＨ３）、１．７５ｍ（ＣＨ２）、２．１１ｍ（ＣＨ）、２．２６ｍ（ＣＨ）、２．５ｍ（ＣＨ２）、２．６８〜３．８ｍ（ペプチド性ＣＨβ）、３．８〜５．０ｍ（ペプチド性ＣＨα）、５．４５〜６．１７ｓ（ＣＨ２）、５．５８ｄ（ＣＨ二重結合）、６．３６ｍ（ＣＨ）、６．８６ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．４５ｍ（芳香族ＣＨ）を示す１Ｈ  ＮＭＲスペクトルと、
（Ｄ）ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された場合に、６００ＭＨｚにおける、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．３９ｐｐｍ）として使用する［δ＝ｐｐｍ、（帰属）］、次のシグナル（ｐｐｍで）、即ち、１３．６〜２３．０３（脂肪族ＣＨ３）、２５．６９〜７７．９（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性ＣＨα）、１０５〜１３７．３（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６５．６〜１７６．６（ペプチド性カルボニル）を示す１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルと、
（Ｅ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ４８型を用いてＫＢｒ中で記録された、３２９４、３０５９、２９２６、１６６１、１５２９、１４３３、１４０７、１２８７、１１１４、１０２１（ｃｍ−１）に吸収極大を示す赤外スペクトルと、
（Ｆ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール：Ｈ２Ｏ（８０：２０の比で）中で記録された、２２６及び２６７ｎｍにおいて２つの肩を示す紫外スペクトルと、
（Ｇ）６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートでの誘電体化後に、他の同定されていないピークと共に次のアミノ酸、即ち、ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（アスパラギンの加水分解生成物）、フェニルアラニン及びロイシンの存在を示す６Ｎ  ＨＣｌ（１０５℃、２４時間）中の酸加水分解物と、
（Ｈ）５−クロロトリプトファンの存在を示す、０．２％（ｗ／ｖ）３−（２−アミノエチル）インドールを触媒として含む４Ｎ  メタンスルホン酸中（１１５℃、１６時間）の酸加水分解物と
を有する白色粉末であるＡ１因子。
【請求項２０】
抗生物質１０７８９１のＡ２因子であって、次の特徴、即ち、
（Ａ）次のエレクトロスプレイ条件、即ち、スプレイ電圧：４．７ｋＶ、キャピラリー温度：２５０℃、キャピラリー電圧：８Ｖ、注入モード１０μｌ／分を用いる、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ較正ミックスを使用する、エレクトロスプレイ源を取り付けたＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｄｅｃａ装置上で、酢酸０．５％を含むアセトニトリル：水  ５０：５０（ｖ／ｖ）中の０．１ｍｇ／ｍｌ溶液から記録された質量スペクトル中の最も低い同位体組成に対応するｍ／ｚ１１１６における二重プロトン化イオンと、
（Ｂ）エレクトロスプレイ源を取り付けたＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＡＰＥＸ  ＩＩ，４．７Ｔｅｓｌａ分光計を用いて決定された、ｍ／ｚ  １１１６．３６２６０（精度３０ｐｐｍ）における［Ｍ＋２Ｈ］２＋から算出されたモノアイソトピック質量である、２２３０．７１±０．０６の分子量に相当する正確な質量と、
（Ｃ）ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された場合に、６００ＭＨｚにおける、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．９４ｐｐｍ）として使用する［δ＝ｐｐｍ、多重度（帰属）］、次のシグナル（ｐｐｍで）、即ち、０．８４ｄ（ＣＨ３）、０．８８ｄ（ＣＨ３）、０．９４ｄ（ＣＨ３）、１．０６ｄ（ＣＨ３）、１．１４ｄ（ＣＨ３）、１４８ｍ（ＣＨ２）、１．６５〜１．７５ｍ（ＣＨ２）、１．６７ｄ（ＣＨ３）、２．１５ｍ（ＣＨ）、２．２５ｍ（ＣＨ）、２．５ｍ（ＣＨ２）、２．７７〜３．８ｍ（ペプチド性ＣＨβ）、３．８〜４．９ｍ（ペプチド性ＣＨα）、５．４５〜６．１４ｓ（ＣＨ２）、５．５９ｄ（ＣＨ二重結合）、６．３４ｍ（ＣＨ）、６．８４ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．４２ｍ（芳香族ＣＨ）を示す１Ｈ  ＮＭＲスペクトルと、
（Ｄ）ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された場合に、６００ＭＨｚにおける、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．３９ｐｐｍ）として使用する［δ＝ｐｐｍ、（帰属）］、次のシグナル（ｐｐｍで）、即ち、１３．６〜２２．９（脂肪族ＣＨ３）、２５．６５〜７３（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性ＣＨα）、１０５〜１３７．３（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６５．７〜１７６．１（ペプチド性カルボニル）を示す１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルと、
（Ｅ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ４８型を用いてＫＢｒ中で記録された、３２９６、３０６０、２９２８、１６６１、１５２９、１４３３、１４０７、１２８８、１１１６（ｃｍ−１）に吸収極大を示す赤外スペクトルと、
（Ｆ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール：Ｈ２Ｏ（８０：２０の比で）中で記録された、２２６及び２６７ｎｍにおいて２つの肩を示す紫外スペクトルと、
（Ｇ）６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートでの誘電体化後に、他の同定されていないピークと共に次のアミノ酸、即ち、ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（アスパラギンの加水分解生成物）、フェニルアラニン及びロイシンの存在を示す６Ｎ  ＨＣｌ（１０５℃、２４時間）中の酸加水分解物と、及び
（Ｈ）５−クロロトリプトファンの存在を示す、０．２％（ｗ／ｖ）３−（２−アミノエチル）インドールを触媒として含む４Ｎ  メタンスルホン酸中（１１５℃、１６時間）の酸加水分解物と
を有する白色粉末である抗生物質１０７８９１のＡ２因子。
【請求項２１】
抗生物質１０７８９１、そのＡ１若しくはＡ２因子、又は酸とのそれらの塩を産生する方法であって、
炭素、窒素及び無機塩の同化できる供給源を含有する水性栄養培地中において、好気条件下で、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４或いは前記抗生物質を産生する能力を保持するその変種又は突然変異体を培養するステップと、
得られた抗生物質を、菌糸体及び／又はろ過された発酵ブロスから単離するステップと、
単離された抗生物質１０７８９１を精製するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
菌株のＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４或いは抗生物質１０７８９１産生性のその変種又は突然変異体が前培養される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗生物質１０７８９１の単離が、発酵ブロスのろ過によって実施され、当該抗生物質が、ろ過された発酵ブロスから、水非混和性溶媒による抽出、非溶剤の添加による又は溶液のｐＨ変化による析出、吸収クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィー、及び前記技術の２つ以上の組合せからなる群から選択される技術によって回収される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
抗生物質１０７８９１の単離が、発酵ブロスの上澄みから菌糸体を分離することによって実施され、該菌糸体が水混和性溶媒で抽出され、使用済み菌糸体の除去後に、粗抗生物質を含む水混和性溶液が得られ、該溶液を、ろ過された発酵ブロスと別々に又は合わせて、溶媒による抽出、非溶剤の添加又は溶液のｐＨ変化によっての析出、吸収クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び分子排除クロマトグラフィー、並びに前記技術の２つ以上の組合せからなる群から選択される技術を用いて処理して抗生物質１０７８９１を回収することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
菌糸体抽出物中の水混和性溶媒の濃度を低下させた後に、菌糸体抽出物が、抗生物質をそれから回収するために処理される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ろ過された発酵ブロスを吸収樹脂に接触させ、前記樹脂を、極性の水混和性溶媒又はその水との混合物で溶離し、それにより粗抗生物質１０７９８１を含む溶液を得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記吸収樹脂が、ポリスチレン、混合ポリスチレン−ジビニルベンゼン、及びポリアミド樹脂からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
菌糸体を、Ｃ１〜Ｃ３アルカノールで抽出し、その菌糸体抽出物を、吸収樹脂と接触させ、極性水混和性溶媒又はその水との混合物を用いてそれから溶離し、それにより粗抗生物質１０７８９１を含む溶液を得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
粗抗生物質１０７８９１を含む溶液が合わされ前記抗生物質１０７８９１の更なる精製のために処理される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
粗抗生物質１０７９８１を含む溶液が濃縮され次いで凍結乾燥されて粗抗生物質１０７８９１固体生成物が得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
吸収された抗生物質を含む吸収樹脂が合わされ、その混合物が極性の水混和性溶媒又はその水との混合物で溶離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
抗生物質１０７９８１が、クロマトグラフ法を用いて、好ましくは分取ＨＰＬＣ又は中圧クロマトグラフィーによって精製される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
Ａ１因子又はＡ２因子が、精製された抗生物質１０７８９１から分取ＨＰＬＣによって分離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
抗生物質１０７８９１、抗生物質１０７８９１Ａ１因子、抗生物質１０７８９１Ａ２因子、及び前記因子の任意の比率の混合物、又は酸との薬学的に許容されるその塩から選択される抗生物質を含む医薬組成物。
【請求項３５】
薬学的に許容される担体を更に含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
薬剤としての使用のための、抗生物質１０７８９１、そのＡ１因子、そのＡ２因子、又は前記因子の任意の比率の混合物、又は酸との薬学的に許容されるその塩。
【請求項３７】
細菌性感染症の治療又は予防用の薬剤の製造のための、抗生物質１０７８９１、そのＡ１因子、そのＡ２因子、又は前記因子の任意の比率の混合物、又は酸との薬学的に許容されるその塩の使用。
【請求項３８】
動物成長促進剤としての、抗生物質１０７８９１、そのＡ１因子、そのＡ２因子、又は前記因子の任意の比率の混合物、又は酸とのその無毒性塩の使用。
【請求項３９】
菌株Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４、又は炭素、窒素及び無機塩の同化できる供給源の存在下で液内の好気条件下で培養された場合に、抗生物質１０７８９１を産生する能力を保持するその変種若しくは突然変異体の、生物学的に純粋な培養物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００３年７月１８日に出願されたＥＰ出願第０３０１６３０６．７号の優先権を主張する２００４年７月１２日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２００４／００７６５８の米国特許法第３７１条に基づく国内出願である２００５年１月１１日に出願された米国特許出願第１０／５２１，３３６号の一部係属出願である２００５年１月１２日に出願された米国特許出願第１１／０３５，２９６号の一部係属出願である２００５年１月２６日に出願された米国特許出願第［代理人整理番号８９２，２８０−５００］に基づく国際出願であり、これらの出願の全ては参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、Ａ１因子とＡ２因子を含む複合体である、微生物起源の抗生物質である、任意に命名された抗生物質１０７８９１、薬学的に許容されるその塩、その医薬組成物、及び抗菌剤としてのその使用に関する。
【０００３】
本発明の別の目的は、抗生物質１０７８９１の調製方法であり、該方法はＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．１０７８９１（以下Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４と識別される）或いは前記抗生物質を産生する能力を保持しているその変種又は突然変異体を培養すること、菌糸体から及び／又は発酵ブロスから本発明の抗生物質を回収すること、クロマトグラフ手段で純物質を単離すること、並びにＡ１及びＡ２因子を分離することを含む。
【背景技術】
【０００４】
抗生物質１０７８９１は、成分としてランチオニン及びメチルランチオンを含有する、ペプチド構造を有する新規の抗菌剤である。これらは、ランチビオティックスの、とりわけ細胞壁生合成に主に作用するサブグループの代表的な特徴である。
【０００５】
ランチビオティックスは、チオエーテルアミノ酸ランチオニン及びいくつかの他の修飾されたアミノ酸を含むペプチドである（Ｈ．Ｇ．Ｓａｈｌ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｉｅｒｂａｕｍ，（１９９８）“Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：４１−７９）。いくらかのものは異なる薬理学的標的に活性であると報告されているが、公知のランチビオティックスの大部分は抗菌作用を有する。抗菌性のランチビオティックスは、それらの構造を基に２つの群に広く分けることができ、タイプＡランチビオティックスは一般的に細長い、両親媒性のペプチドであるが、タイプＢランチビオティックスは小型で球形である（Ｏ．ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ，Ｒ．Ｐ．Ｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｈｉｌｌ，（２００１）：“Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ”，．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｒｅｖ．２５：２８５−３０８）。ナイシンはタイプＡランチビオティックの典型であるが、アクタガルジン［ガルジマイシン（ｇａｒｄｉｍｙｃｉｎ）］及びメルサシジンはタイプＢランチビオティックのサブクラスに属する。ナイシンタイプとメルサシジンタイプランチビオティックスの２つのクラスは細菌の増殖プロセスでそれらが引き起こす効果において異なるが、両方とも膜結合ペプチドグリカン前駆体脂質ＩＩと相互に作用する。ナイシンタイプランチビオティックスは、主に細胞膜の透過化によって細菌を死滅させるが（Ｈ．Ｂｒｏｔｚ，Ｍ．Ｊｏｓｔｅｎ，Ｉ．Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ，Ｕ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｆ．Ｇｏｔｚ，Ｇ．Ｂｉｅｒｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｓａｈｌ，（１９９８）：“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ−ｂｏｕｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｒｅｓ  ｂｙ  ｎｉｓｉｎ，ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：３１７−２７）、メルサシジンタイプランチビオティックスは、主に細胞壁生合成を阻害することによって細菌細胞を死滅させる（Ｈ．Ｂｒｏｔｚ，Ｇ．Ｂｉｅｒｂａｕｍ，Ｋ．Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｐ．Ｅ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｓａｈｌ，（１９９８）：“Ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ  ＩＩ”，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：１５４−６０）。
【０００６】
それぞれ抗生物質ＭＦ−ＢＡ−１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１と識別された、ミクロビスポラコラリナ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）株ＮＲＲＬＬ３０４２０によって産生された２種の抗生物質は、米国特許第６５５１５９１Ｂ１号に記載されている。上記に明らかにされた特許に報告された物理化学的データ（例えば質量分析データ、分子量、アミノ酸含量）及びＬＣ−ＭＳ実験解析の保持時間の比較は、抗生物質１０７８９１複合体とその成分Ａ１因子及びＡ２因子は、抗生物質ＭＦ−ＢＡ１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１と異なる化学物質であることを明らかに示している。
【０００７】
欧州特許出願公開第０５９２８３５Ａ２号は、抗腫瘍抗生物質ＢＵ−４８０３ＴＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２及びＤを記載している。抗生物質ＢＵ−４８０３ＴＡ１、Ａ２及びＢは、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ＡＴＣＣ  ５５３２７（ＡＡ  ９９６６）の発酵ブロスから回収されるが、抗生物質ＢＵ４８０３ＴＣ１、Ｃ２及びＤは、それぞれ抗生物質ＢＵ  ４８０３ＴＡ１、Ａ２及びＢの変換の産生物であり、これらの産生物はジメチルスルホキシド中に貯蔵される。上記抗生物質について欧州特許出願公開第０５９２８３５Ａ号に報告された物理化学的データ（例えば、外観、Ｕ．Ｖ．吸収、分子量、抗腫瘍活性）は、それらは抗生物質１０７８９１複合体とそのＡ１及びＡ２因子と異なる化学物質であることを明らかに示している。
【発明の開示】
【０００８】
菌株及び発酵
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．１０７８９１は、環境中で単離されて、２００３年２月２７日にブダペスト条約の規定の下で米国２０１１０−２２０９、バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ市、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、１０８０１、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託された。該菌株は寄託番号ＰＴＡ−５０２４が与えられた。
【０００９】
抗生物質１０７８９１の産生は、それを産生することが可能なＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．株、即ちＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４、或いは前記抗生物質を産生する能力を保持しているその変種又は突然変異体を培養すること、得られる抗生物質を全培養ブロスから、及び／又は分離された菌糸体から、及び／又はろ過された発酵ブロスから単離すること、並びに単離された抗生物質をクロマトグラフィー手段によって精製することによって達成される。いずれの場合でも、抗生物質１０７８９１を好気条件下で容易に同化できる炭素、窒素、及び無機塩の供給源を含有する水性栄養培地中において産生することが好ましい。発酵の分野で通常使用される栄養培地の多くが使用することができるが、特定の培地が好ましい。
【００１０】
好ましい炭素源は、スクロース、フルクトース、グルコース、キシロースなどである。好ましい窒素源は、大豆かす、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、トリプトン、アミノ酸、加水分解カゼインなどである。培地に混合することができる無機塩のなかに、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、コバルト、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、クロリド、カーボネート、スルフェート、ホスフェート、ナイトレートなどのイオンを生ずることが可能な通例の可溶性塩がある。
【００１１】
好ましくは、抗生物質１０７８９１を産生する菌株は、発酵管中で又は振盪フラスコ中で前培養され、次いでこの培養物を使用してかなりの量の物質の産生用のジャーファーメンターに入れる。前培養用に使用される培地は、より多量の発酵用に使用されるものと同じであってよいが、他の培地も使用することができる。抗生物質１０７８９１を産生する菌株は、１７℃から３７℃の温度で、最適温度としては約２８〜３０℃で増殖することができる。
【００１２】
発酵中に、抗生物質１０７８９１の産生は、感受性微生物のバイオアッセイによって、及び／又はＨＰＬＣ分析によって監視することができる。抗生物質１０７８９１の最大の産生は、一般的に発酵の約９０時間後で２００時間前に生ずる。
【００１３】
抗生物質１０７８９１は、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  ５０２４、或いは抗生物質１０７８９１を産生することが可能なその変種又は突然変異体を培養することによって産生され、それは培養ブロス中に、及び／又は菌糸体中に見出される。
【００１４】
本明細書及び特許請求の範囲においては、「抗生物質１０７８９１」という用語は、特別の定めのない限り、Ａ１及びＡ２因子を含む抗生物質１０７８９１複合体を意味する。
【００１５】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の形態学的特徴
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４は、種々の標準の固体培地でよく増殖する。微細な寸法は、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液（チアミン塩酸塩２５ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム２５０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸２５０ｍｇ／ｌ、ビオチン０．５ｍｇ／ｌ、リボフラビン１．２５ｇ／ｌ、シアノコバラミン６．２５ｍｇ／ｌ、パラアミノ安息香酸２５ｍｇ／ｌ、葉酸５００ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキサール５００ｍｇ／ｌ）が添加されたフミン酸−Ｔｒａｃｅ  Ｓａｌｔｓ  Ａｇａｒ（ｇ／ｌでの組成：フミン酸０．５、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．００１、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００１、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  ０．００１、ＭＯＰＳ  ２、寒天２０）上で増殖された培養物を用いて測定された。
【００１６】
液体培養（Ｖ６培地、ｇ／ｌでの組成：デキストロース２２、肉エキス５、酵母エキス５、カゼイン３、ＮａＣｌ  １．５）においては、菌糸体の断片化は２８℃での培養の６日後に観察されない。フミン酸−Ｔｒａｃｅ  Ｓａｌｔｓ  Ａｇａｒ（２８℃でのインキュベーションの２１日後）の顕微鏡検査は、分岐した、断片化されていない基質菌糸体、及び単軸分岐した気中菌糸体を明らかにし、多くの長い真直ぐな分岐の少ない気中菌糸も目に見える。特徴的な縦の胞子の組は、枝から又は直接主要な気中菌糸から側面に立ち上がっている短い担胞子体によって支持されている。胞子は球形で非運動性である。胞子嚢様体又は他の特異な構造は観察されない。
【００１７】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の培養特徴
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４を、ＡＦ／ＭＳ液体培地（実施例１を参照されたい）で２８℃及び２００ｒｐｍにおいて６日間増殖し、次いで新しいＡＦ／ＭＳ液体培地に移し（５％接種材料）、更に６日間培養して、最終的に１００ｍｌのＶ６液体培地（実施例１を参照されたい）中に接種した（７％接種材料）。２８℃及び２００ｒｐｍでの培養の６日後に、菌糸体を遠心分離で回収し、無菌食塩水で３度洗浄し、次いで希釈して適切な接種材料を得た。懸濁液のアリコットを、Ｓｈｉｒｌｉｎｇ及びＧｏｔｔｌｉｅｂ（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，（１９６６）：“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６：３１３−３４０）によって推奨された種々の培地、及びＳ．Ａ．Ｗａｋｓｍａｎ（１９６１）：“Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”，Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．Ｖｏｌ．２：３２８−３３４によって推奨された培地にクロスハッチング式に（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）すじをつけて（ｓｔｒｅａｋ）接種した。
【００１８】
種々の炭水化物を炭素及びエネルギー源として使用する能力が、基礎培地としての上記に記載された１ｍｌ／ｌのビタミン溶液が添加された、デンプンを含まないＩＳＰ４培地を用いて決定され；各炭素源が１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で添加された。
【００１９】
増殖のＮａＣｌ許容範囲、ｐＨ領域、及び異なる温度での増殖能力が、ＩＳＰ２培地上で決定された。全ての培地は２８℃で３週間インキュベートされ；説明は定めのない限り２１日による。色は自然の昼光でＭａｅｒｚ及びＰａｕｌのカラーアトラス（Ａ．Ｍａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｍ．Ｒ．Ｐａｕｌ，１９５０−Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｕｒ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて評価された。ナイトレートをナイトライトに還元する能力は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ他（Ｓ．Ｔ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｇ．Ａｌｄｅｒｓｏｎ、Ｅ．Ｍ．Ｈ．Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｐ．Ｈ．Ａ．Ｓｎｅａｔｈ及びＭ．Ｊ．Ｓａｃｋｉｎ、１９８３−Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｒａ−Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２９，１７４３−１８１３）によって記載された手順に従ってスロッピイなナイトレート培地中で評価された。
【００２０】
菌株Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４についての増殖、コロニー出現、基質及び気中菌糸体の色、並びに色素産生が表Ｉに記録されている。栄養増殖は、使用された培地のいくらかにしか現れない気中菌糸体と異なり、その大部分で現れる。明らかな色素沈着は使用されたいずれの培地にも見られない。菌株の生理的特徴は表ＩＩに示されている。増殖及び気中菌糸体の産生は１７℃で現れるが、４３℃では現れない。ＩＳＰ２上の気中菌糸体の産生は、６を超えたｐＨにおいて現れるが、１％ＮａＣｌの存在下では現れない。
【００２１】
種々の炭水化物を増殖に使用する能力は表ＩＩＩに示されている。
【００２２】
【表１】
2008528581.tif 000002
【００２３】
【表２】
2008528581.tif 000003
【００２４】
【表３】
2008528581.tif 000004
【００２５】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の化学分類学的特徴
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４を、ＧＹＭ培地（グルコース４ｇ／ｌ、酵母エキス４ｇ／ｌ、麦芽エキス１０ｇ／ｌ）中２８℃において回転式振盪機で増殖し、菌糸体を回収し、無菌蒸留水で２度洗浄し次いで凍結乾燥した。アミノ酸の分析が、Ｓｔａｎｅｃｋ及びＲｏｂｅｒｔｓ（Ｊ．Ｌ．Ｓｔａｎｅｃｋ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，（１９７４）：“Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｂｙ  ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２２６−２３１）の方法に従って実施された。メナキノン及び極性脂質が、Ｍｉｎｎｉｋｉｎ他（Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，Ａ．Ｇ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ．，Ｇ．Ａｌｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ａｔｈａｌｙｅ，Ａ．Ｓｃｈａａｌ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｌｅｔｔ，（１９８４）：“Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  ｑｕｉｎｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ”，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２：２３３−２４１）の手順に従って抽出された。極性脂質が、薄層クロマトグラフィーによって分析され（Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，Ｖ．Ｐａｔｅｌ，Ｌ．Ａｌｓｈａｍａｏｎｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，（１９７７）：“Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２７：１０４−１１７）、メナキノンが、ＨＰＬＣによって分析され（Ｒ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，（１９８２）：“Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅｓ  ｂｙ  ＨＰＬＣ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＲＰ１８  ａｎｄ  ａ  ｓｉｌｖｅｒ  ｌｏａｄｅｄ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ａｓ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ”，Ｊ．Ｌｉｑｕｉｄ．Ｃｈｒｏｍａｔ．５：２３５９−２３６７；Ｒ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，（１９８５）：“Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”，ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．Ｎｏ２０  ＳＡＢ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｐｐ．１７３−１９９，Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、脂肪酸メチルエステルが、ガス液体クロマトグラフィーによってそれぞれ分析された（Ｌ．Ｔ．Ｍｉｌｌｅｒ，（１９８２）：“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｘｙ  ａｃｉｄｓ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：５８４−５８６；Ｍ．Ｓａｓｓｅｒ，（１９９０）：“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｂｙ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”，ＵＳＦＣＣ  Ｎｅｗｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０：１−６）。ミコール酸の存在は、Ｍｉｎｎｉｋｉｎ他（Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，Ｌ．Ａｌｓｈａｍａｏｎｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，（１９７５）：“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔａｘａ  ｂｙ  ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｙｚａｔｅｓ”，．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８８：２００−２０４）の方法によって確かめられた。
【００２６】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の菌株の全細胞加水分解物は、ペプチドグリカンのジアミノ酸としてのメソ−ジアミノピメリン酸を含む。主要なメナキノンは、ＭＫ−９（ＩＩＩ、ＶＩＩＩ−Ｈ４）、ＭＫ−９（Ｈ２）及びＭＫ−９（Ｈ０）である。極性脂質の型は、ホスファチジルエタノールアミン、メチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールマンノシド、及びリン脂質を含有するＮ−アセチルグルコサミン、即ちＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ他（Ｈ．Ａ．Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｃ．Ｄｅ  Ｂｒｉｅｖｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，（１９７７）：“Ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓｔ．Ｅｃｏｌ．５：２４６−２６０）によるリン脂質ＩＶ型の存在によって特徴づけられる。脂肪酸型の主要な成分は、アンテイソ１５：０、イソ１６：０、ｎ−１６：０、アンテイソ１７：０、及び１０−メチルヘプタデカノイック（１０−Ｍｅ−１７：０）、即ち、３ｃセンスクロッペンシュテッド（３ｃ  ｓｅｎｓｕ  Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ）である（Ｒ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，（１９８５）：“Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”，ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ．Ｎｏ２０  ＳＡＢ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｐｐ．１７３−１９９．Ｍ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。ミコール酸は検知されない。
【００２７】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の１６Ｓ  ｒＤＮＡシーケンシング
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４株の全ｒＲＮＡの９５％に相当する、１６  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の部分配列、即ち１４４３ヌクレオチドは、公開された手順に従って達成された（Ｐ．Ｍａｚｚａ，Ｐ．Ｍｏｎｃｉａｒｄｉｎｉ，Ｌ．Ｃａｖａｌｅｔｔｉ，Ｍ．Ｓｏｓｉｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｏｎａｄｉｏ，（２００３）：“Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｒａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｉｔａｌｉａｎ  ｓｏｉｌ”，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌ．５：３６２−３７２）。それは配列番号１に報告された。この配列は、米国特許第６５５１５９１Ｂ１号に報告されたように菌株Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  ＮＲＲＬ  ３０４２０（ＭＦ−ＢＡ−１７６８）の配列と比較された。これら２つの配列は整列され、差異は１４５６整列位置のうちの３１で見出され、全体で２．１３％の配列相違があった。９７．５％未満の配列同一性を共有する任意の２つの菌株は、一般的に異なる種に属する（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ，Ｅ．ａｎｄ  Ｅｍｂｌｅｙ，Ｍ．Ｔ．（２０００）“Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｎｃｕｌｔｅｒｅｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”．Ｉｎ：Ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｒ．Ｒ．Ｃｏｌｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｇｒｉｍｅｓ（ｅｄｓ）．ＡＳＭ，Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，ｐｐ．５７−７５）。従って、配列相違の２％レベルは、極めて高く（Ｒｏｓｓｅｌｌｏ−Ｍｏｒａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｍａｎｎ，Ｒ．（２００１）．“Ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ”．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２５：３９−６７）、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４とＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  ＮＲＲＬ  ３０４２０（ＭＦ−ＢＡ−１７６８）は異なる菌株であることを示している。
【００２８】
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の同一性
抗生物質１０７８９１を産生する菌株は、次の化学分類学的及び形態学的特徴によりストレプトスポランギアセアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ）科、ミクロビスポラ（Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）属に割り当てられる。
・細胞壁中のメソ−ジアミノピメリン酸の存在、
・多量のＭＫ−９（ＩＩＩ、ＶＩＩＩ−Ｈ４）、及びＬｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ他（Ｈ．Ａ．Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｃ．Ｄｅ  Ｂｒｉｅｖｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ，（１９７７）：“Ｃｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ：ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓｔ．Ｅｃｏｌ．５：２４６−２６０）によるリン脂質ＩＶ型、
・３ｃセンスクロッペンシュテッド（Ｒ．Ｍ．Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，（１９９２）：“Ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ”，ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｉｏｔｅｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，，ｐｐ．１１３９−１１５６，Ａ．Ｂａｌｏｗｓ，Ｈ．Ｔｒｕｐｅｒ，Ｍ．Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｗ．Ｈａｒｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ  ｅｄｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）の脂肪酸プロフィール、
・ミコール酸の欠如、
・気中菌糸から側面に分岐する短い担胞子体の先端の特徴的な縦の胞子の組の形成。非運動性胞子、
・記載されたＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．からの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に対して＞９７％の同一性を示す、配列番号１に報告された、全ｒＲＮＡの９５％に相当する、１６  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の部分配列、即ち１４４３ヌクレオチド。
【００２９】
他の微生物と同様に、抗生物質１０７８９１を産生する菌株の特徴は変わる場合がある。例えば、菌株の人工的な変種及び突然変異体は、紫外線、並びに亜硝酸、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン及び他多数の物質などの化学物質などの種々の知られている突然変異原での処理によって得ることができる。抗生物質１０７８９１を産生することが可能な、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４株の全ての天然及び人工的な変種及び突然変異体は、本発明の目的についてＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４株と同等であるとみなされ、従って発明の範囲内とみなされる。
【００３０】
抗生物質１０７８９１の抽出及び精製
上記の通り、抗生物質１０７８９１は、菌糸体中と発酵ブロスのろ過画分中の両方に殆ど等しく配分されていることが見出される。
回収されたブロスは、発酵ブロスの上澄みから菌糸体を分離するよう処理することができ、菌糸体は、水混和性溶媒で抽出して、使用済み菌糸体の除去後に１０７８９１抗生物質を含む溶液を得ることができる。この菌糸体エキスは、次いで、上澄み画分についてこれから先に報告される手順に従って上澄みと別に、又は一緒に処理することができる。水混和性溶媒が菌糸体エキスから抗生物質を回収する操作に支障をもたらしうる場合、水混和性溶媒は蒸留によって除去することができ、又は支障のない濃度に水で希釈することができる。
【００３１】
本出願で使用される「水混和性溶媒」は、この用語の技術分野で現在与えられる意味を有するよう意図されており、使用の状態において、合理的に広い濃度範囲で水に混和できる溶媒を意味する。本発明の化合物の抽出に使用できる水混和性有機溶媒の例は、低級アルカノール、例えばメタノール、エタノール、及びプロパノールなどの（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノール；ベンジルアルコールなどのフェニル（Ｃ１〜Ｃ３）アルカノール、低級ケトン、例えばアセトン及びエチルメチルケトンなどの（Ｃ３〜Ｃ４）ケトン；ジオキサン及びテトラヒドロフランなどの環状エーテル；エチレングリコール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールモノメチルエーテルなどのグリコール及びそれらの部分エーテル化の生成物；ジメチルホルムアミド及びジエチルホルムアミドなどの低級アミド；酢酸、ジメチルスルホキシド並びにアセトニトリルである。
【００３２】
産生している微生物の発酵ブロスの上澄みからの化合物の回収は、それ自体公知の技術に従って行われ、該技術は、溶媒による抽出、非溶媒の添加による又は溶液のｐＨ変化による析出、分配クロマトグラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーなどによる抽出、或いは前記技術の２つ以上の組合せを含む。ろ過された発酵ブロスからの本発明の化合物の回収の手順は、水非混和性有機溶媒による抗生物質１０７８９１の抽出、それに続いての場合によっての析出剤の添加による濃縮された抽出物からの析出を含む。
【００３３】
この場合もまた、本出願で使用される「水非混和性溶媒」という用語は、前記用語に当技術分野で現在与えられる意味を有することが意図されており、使用の状態において、目的の用途に適した合理的に広い濃度範囲で水にわずかに混和する又は実質的に混和しない溶媒を意味する。
【００３４】
発酵ブロスからの本発明の化合物の抽出に使用できる水非混和性有機溶媒の例は、
ｎ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、４−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、２，２−ジメチル−３−ペンタノール、２，４−ジメチル−３−ペンタノール、４，４−ジメチル−２−ペンタノール、５−メチル−２−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、２−エチル−１−ヘキサノール、２−メチル−３−ヘキサノール、１−オクタノール、２−オクタノール、シクロペンタノール、２−シクロペンチルエタノール、３−シクロペンチル−１−プロパノール、シクロヘキサノール、シクロヘプタノール、シクロオクタノール、２，３−ジメチル−シクロヘキサノール、４−エチルシクロヘキサノール、シクロオクチルメタノール、６−メチル−５−ヘプテン−２−オル、１−ノナノール、２−ノナノール、１−デカノール、２−デカノール、及び３−デカノールなどの直鎖、分枝又は環状であってよい少なくとも４個の炭素原子のアルカノール；メチルイソプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｎ−アミルケトン、メチルイソアミルケトンなどの少なくとも５個の炭素原子のケトン、並びにそれらの混合物である。
【００３５】
当技術分野で知られているように、ろ過された発酵ブロスからの産生物抽出は、ｐＨを適切な数値に調節すること、及び／又は抽出溶媒に可溶性である、抗生物質とイオン対を形成する適切な有機塩を添加することによって改良することができる。
【００３６】
当技術分野で知られているように、相分離は水性相に加塩することによって改良することができる。
抽出に続いて、相当量の水を含む有機相が回収される場合、それより水を共沸的に蒸発することが便利であるかもしれない。一般的に、このことは、最小の水との共沸混合物を形成することが可能な溶媒の添加、及びそれに続く必要ならば所望の産成物を析出させるための析出剤の添加を必要とする。最小の水との共沸混合物を形成することが可能な有機溶媒の代表例は、ｎ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ブチルエーテル、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、２，５−ジメチルフラン、ヘキサン、及びｍ−キシレンであり、好ましい溶媒はｎ−ブタノールである。
【００３７】
析出剤の例は、石油エーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、及びブチルエーテルなどの低級アルキルエーテル、並びにアセトンなどの低級アルキルケトンである。
抗生物質１０７８９１を回収するための好ましい一手順によれば、ろ過された発酵ブロスは、吸着マトリックスと接触させ、次いで極性の水混和性溶媒又はその混合物で溶離し、減圧下で油状の残渣に濃縮し、前述のタイプの析出剤で析出させることができる。
【００３８】
本発明の化合物の回収に好都合に使用できる吸着マトリックスの例は、ポリスチレン又は混合ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（例えばＭ１１２又はＳ１１２、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ２又はＸＡＤ４、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ；Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ  ２０、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）、アクリル樹脂（例えばＸＡＤ７又はＸＡＤ８、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ）、ポリカプロラクタム、ナイロン及び架橋ポリビニルピロリドンなどのポリアミド（例えばＰｏｌｙａｍｉｄｅ−ＣＣ  ６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ−ＳＣ  ６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ−ＣＣ  ６．６、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ−ＣＣ  ６ＡＣ及びＰｏｌｙａｍｉｄｅ−ＳＣ  ６ＡＣ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ＆  Ｃｏ．、ドイツ；ＰＡ  ４００、Ｍ．Ｗｏｅｌｍ  ＡＧ、ドイツ）、及びポリビニルピロリドン樹脂ＰＶＰ−ＣＬ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．，ＫＧ、ドイツ）、並びに細孔制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ）架橋デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ−２０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＡＢ）である。好ましくは、ポリスチレン樹脂が使用され、とりわけ好ましいのはＤｉａｉｏｎ  ＨＰ  ２０樹脂である。
【００３９】
ポリスチレン樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリアミド樹脂又はアクリル樹脂の場合においては、好ましい溶離液は、水混和性溶媒又はその水性混合物である。水性混合物は、適切なｐＨ値の緩衝液を含有することができる。
【００４０】
この場合においてまた、本説明及び特許請求の範囲に使用される「水混和性溶媒」という用語は、上記に記載された前記用語に当技術分野で現在与えられる意味を有することが意図されている。
【００４１】
抗生物質の単離及び精製の連続的な手順は、ブロスの上澄みからと菌糸体からの合わせた抽出物について行うことができる。例えば、ろ過された発酵ブロス又は上澄みに含まれた抗生物質産生物の部分が、吸収樹脂上の吸収によって回収され、菌糸体に含まれた抗生物質産生物の部分が、水混和性溶媒でそれから抽出され次いで吸収樹脂上で吸着される場合、２組の吸収樹脂のそれぞれからの溶離画分は、場合によっては濃縮後に混合して、次いで更に単一の群として処理することができる。別法として、別々の抽出段階に利用された２組の吸収樹脂が同一のタイプであり、同一の機能的特徴を有する場合、それらを一緒にすることができ、この混合物は、例えば、水混和性溶媒又は水とその混合物を用いた単一の溶離ステップを受けることができる。
【００４２】
いずれの場合でも、粗抗生物質１０７８９１を回収するために採用された手順が何であっても、連続的な精製ステップが、通常、別々の抽出段階に由来する産生物の組合せから得られた粗材料の混合物について実施される。
【００４３】
粗抗生物質１０７８９１の精製は、それ自体公知の技術のいずれかによって達成することができるが、好ましくはクロマトグラフ法を用いて実施される。これらのクロマトグラフ法の例は、回収ステップに関して報告されたものであり、様々な機能的誘導体化、及び水混和性溶媒又は上記の種類の水混和性溶媒の水性混合物を用いての溶離を有する、シリカゲル、アルミナ、活性ケイ酸マグネシウムなどの固定相上のクロマトグラフィー、又はシラン処理シリカゲル上の逆相クロマトグラフィーも含む。
【００４４】
例えば、固定相としてＲＰ−８又はＲＰ−１８、及び溶離系としてＨＣＯＯＮＨ４  緩衝液：ＣＨ３ＣＮの混合物を用いる、分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用することができる。
【００４５】
精製ステップで回収された活性画分を一緒にし、真空下で濃縮し、上記の種類の析出剤の添加によって析出し、１回又は反復して乾燥又は凍結乾燥する。産生物がギ酸アンモニウム又は他の緩衝塩の残量を含む場合においては、これらを固相抽出カラム、例えばＳＰＥ  Ｓｕｐｅｒｃｌｅａｎ  ＬＣＰ１８  Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ  ＰＡ、米国）などの逆相樹脂カラム上の抗生物質１０７８９１の吸収、続いての蒸留水での洗浄及び適切な水性溶媒混合物、例えばエタノール：水を用いた溶離によって除去することができる。抗生物質を次いで溶離溶媒を除去することによって回収する。
【００４６】
その結果、精製された抗生物質１０７８９１複合体乾燥製剤が白色粉末として得られる。この技術分野で常のごとく、産生、並びに回収及び精製ステップは、感受性微生物に対する阻害アッセイ、及びＨＰＬＣ又は質量分析と組み合わせたＨＰＬＣを用いた分析管理を含めた種々の分析的な手順によって監視することができる。
【００４７】
好ましい一分析的ＨＰＬＣ技術が、流速１ｍｌ／分で溶離されるカラムＷａｔｅｒｓ  Ｓｉｍｍｅｔｒｙ−ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８、５μ（２５０×４．６ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｈｏｇｒａｐｈｙ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で温度５０℃において実施される。
【００４８】
溶離は多段階プログラム、即ち、時間＝０（３０％Ｂ相）、時間＝８分（３０％Ｂ相）、時間＝２８分（Ｂ相の４０％）を伴った。相Ａはアセトニトリル：１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ：５．０）５：９５（ｖ／ｖ）であり、相Ｂはアセトニトリルであった。ＵＶ検知器は２８２ｎｍであった。
【００４９】
カラムからの溶出液は５：９５の比に分割し、大部分（約９５０μｌ／分）はフォトダイオードアレイ検出器に回された。残りの５０  μｌ／分はＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）のＥＳＩインターフェースに回された。
【００５０】
質量分光分析が次の条件下で実施された。
試料注入口条件：
シートガス（Ｎ２）  ６０ｐｓｉ（約４１３６８５Ｐａ）、
補助ガス（Ｎ２）  ５ｐｓｉ（約３４４７４Ｐａ）、
キャピラリー加熱器  ２５０℃
試料注入口電圧設定：
陽極性及び陰極性の両方、
イオンスプレイ電圧  ＋／−５ｋＶ、
キャピラリー電圧  ＋／−１９Ｖ
走査条件：最大イオン時間  ２００ｍｓ、
イオン時間  ５ｍｓ、
フルミクロスキャン  ３、
セグメント：持続時間  ３０ｍｉｎ、スキャンイベントポジティブ（１５０〜２０００ｍ／ｚ）及びネガティブ（１５０〜２０００ｍ／ｚ）
【００５１】
これらの分析的ＨＰＬＣ条件においては、抗生物質１０７８９１のＡ１及びＡ２因子は、それぞれ１３．２分及び１３．９分の保持時間を示した。同じＨＰＬＣ系においては、ラモプラニンＡ２因子（Ｌ．Ｇａｓｔａｌｄｏ，Ｒ．Ｃｉａｂａｔｔｉ，Ｆ．Ａｓｓｉ，Ｅ．Ｒｅｓｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｋ．Ｋｅｔｔｅｎｒｉｎｇ，Ｌ．Ｆ．Ｚｅｒｉｌｌｉ，Ｇ．Ｒｏｍａｎｏ，Ｍ．Ｄｅｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｂ．Ｃａｖａｌｌｅｒｉ，（１９９２）：“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａ−１６６８６  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａ’１，Ａ’２  ａｎｄ  Ａ’３  ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：１３−１８）は７．５分の保持時間で溶離された。
【００５２】
抗生物質１０７８９１のＡ１及びＡ２因子は、抗生物質１０７８９１複合体の精製された試料から分取ＨＰＬＣを用いて分離することができる。
Ａ１因子は、ＤＭＳＯ：ギ酸  ９５：５（ｖ／ｖ）中に溶解された精製された抗生物質１０７８９１複合体から、流速３．５ｍｌにおける３０％から４５％のＢ相の２５分線形勾配溶離を用いて、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ．Ｃ１８カラム上で分離され精製された。
【００５３】
Ｂ相はアセトニトリルであった。Ａ相は、２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５：アセトニトリル  ９５：５（ｖ／ｖ）であった。純粋な抗生物質１０７８９１Ａ１因子を含む溶離された画分は、集められ真空下で濃縮された。残留溶液は、凍結乾燥されて純粋なＡ１因子が白色粉末として得られた。
【００５４】
Ａ２因子は、酢酸：アセトニトリル：１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４）５０：１２０：８０（ｖ／ｖ）の混合物中に溶解された精製された抗生物質１０７８９１複合体の試料からＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ．Ｃ１８カラム上の定組成溶離によって分離され精製された。定組成溶離は、１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４：アセトニトリルの８２．５：１７．５（ｖ／ｖ）の比率の混合物を用いて流速７ｍｌで実施された。純粋な抗生物質１０７８９１Ａ２因子を含む溶離された画分は、集められ真空下で濃縮された。残留溶液は、凍結乾燥されて純粋なＡ２因子が白色粉末として得られた。
【００５５】
抗生物質１０７８９１並びにそのＡ１及びＡ２因子は、２−メトキシエタノール（ＭＣＳ）：Ｈ２Ｏ  １２：３（ｖ／ｖ）中の酸／塩基滴定によって示されたように、塩基性官能基を含むので、それらは通常の手順によって適切な酸と塩を形成することができ、それらは遊離塩基の形態でも存在することができる。
【００５６】
抗生物質１０７８９１及びそのＡ１及びＡ２因子は、遊離塩基の形態で得られた場合、酸で対応する塩に変換することができ、それらの塩は無毒性の薬学的に許容される塩を含む。適切な塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、パルミチン酸、コール酸、パモ酸、粘液酸、グルタミン酸、樟脳酸、グルタル酸、グリコール酸、フタル酸、酒石酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、桂皮酸などの有機酸及び無機酸の両方との標準の反応によって形成される塩を含む。抗生物質１０７８９１並びにそのＡ１及びＡ２因子の酸との付加塩は、一般的に用いられる通常の手順に従って調製することができる。一例として、抗生物質１０７８９１又はそのＡ１因子又はそのＡ２因子は、遊離塩基の形態で、最小量の適切な溶媒、一般的に低級アルカノール、又は低級アルカノール／水の混合物に溶解され、化学量論的量の適切な選択された酸が、得られた溶液に徐々に添加され、得られた塩は非溶媒の添加によって析出する。形成する付加塩は、次いでろ過又は溶媒の蒸発によって回収される。
【００５７】
別法として、これらの塩は、凍結乾燥による実質的に無水の形態で調製することができ、この場合、揮発性酸との抗生物質１０７８９１又はそのＡ１因子又はそのＡ２因子の塩が、適切な量の不揮発性酸を用いて溶解される。この溶液は、次いでいずれかの不溶性物質からろ過され、１回又は反復して凍結乾燥される。
【００５８】
特定の付加塩は、所望の塩が適切なアニオンの付加によって析出する場合に、抗生物質１０７８９１又はそのＡ１因子又はそのＡ２因子の別の塩の形態の溶液からも得ることができる。
【００５９】
本発明の非塩化合物（ｎｏｎ  ｓａｌｔｓ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の対応する付加塩への変換、及びその逆、即ち本発明の化合物の付加塩の非塩形態への変換は、通常の技術的手腕の範囲内であり、本発明によって包含される。
【００６０】
抗生物質１０７８９１並びにそのＡ１及びＡ２因子の塩の形成は、前記抗生物質１０７８９１並びにそのＡ１及びＡ２因子の分離、精製、及び治療薬又は動物成長促進剤としてのそれらの使用を含めたいくつかの目的に役立ちうる。治療目的用には、薬学的に許容される塩が通常用いられる。
【００６１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、温血動物の治療に利用できる無毒性の塩を意味する。
抗生物質１０７８９１複合体、そのＡ１及びＡ２因子、並びに前記因子の任意の比率の混合物は、そのまま又は薬学的に許容される担体と混合して投与することができ、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド及びグリコペプチドなどの他の抗菌剤と併せて投与することもできる。
【００６２】
併用療法（Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、従って、最初に投与されたものの治療効果がそれに続くものが投与されるときに完全には消滅していないような、活性化合物の逐次的な、同時の及び別々の投与を含む。
【００６３】
本発明の化合物、又はその薬学的に許容される付加塩は、非経口の、経口の又は局所の投与に適した形態に製剤することができる。抗生物質に感受性の微生物を含む任意の感染症の治療における静脈内投与用の非経口製剤は、例えば、ポリプロピレングリコール又はジメチルアセトアミドなどの適切な可溶化剤、及び界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート又はポリエトキシル化ヒマシ油）、或いは注射用の滅菌水中のシクロデキストリン又はリン脂質ベースの製剤と共に水に溶解される。注射製剤もまた、適切なシクロデキストリンを用いて得ることができる。
【００６４】
抗生物質１０７８９１複合体、そのＡ１及びＡ２因子、並びに前記因子の任意の比率の混合物はまた、経口投与用のカプセル、錠剤又は水性懸濁液などの適切な医薬形態に、或いは局所適用のための従来のクリーム又はゼリーと共に使用することができる。ヒト及び獣医用の治療における薬剤としてのそれらの使用の他に、本発明の化合物はまた、動物の成長促進剤として使用することができる。この目的のためには、本発明の化合物は適切な飼料中に経口で投与される。使用される正確な濃度は、通常の量の飼料が消費される場合に成長促進に有効な量の活性剤を供給するのに必要な濃度である。
【００６５】
本発明の活性化合物の動物の飼料への添加は、好ましくは、有効量の活性化合物を含む適切な飼料プレミックスを調製してこのプレミックスを完全飼料に混合することによって達成される。別法として、活性成分を含む中間体濃縮物又は飼料添加物（ｆｅｅｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を飼料中にブレンドすることができる。このような飼料プレミックス及び完全飼料を調製し投与できる様式が参考文献（例えば“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  ＣＯ．，Ｓ．Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９６９  ｏｒ“Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｆｅｅｄｓ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄｉｎｇ”０  ａｎｄ  Ｂ  ｂｏｏｋｓ，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９７７）に記載されている。
【００６６】
抗生物質１０７８９１の物理化学的特徴
Ａ）質量分析：
Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ較正ミックス（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｍｉｘ）を用いた、エレクトロスプレイ源を備えたＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｄｅｃａ装置上のＭＳ実験においては、抗生物質１０７８９１は、２つの二重にプロトン化されたイオンを、複合体Ａ１因子とＡ２因子の最も低い同位体組成にそれぞれ対応するｍ／ｚ＝１１２４とｍ／ｚ＝１１１６において示す。エレクトロスプレイ条件は、スプレイ電圧４．７ｋＶ、キャピラリー温度２２０℃、キャピラリー電圧３Ｖ、注入モード  １０μｌ／分であった。スペクトルは、トリフルオロ酢酸０．１％を含むメタノール／水８０／２０（ｖ／ｖ）中の０．２ｍｇ／ｍｌ溶液から記録され、図１Ａ（完全走査低解像度スペクトル）及び１Ｂ（拡大高解像度スペクトル）に示される。
【００６７】
Ｂ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ４８型を用いてＫＢｒ中で記録された抗生物質１０７８９１の赤外線スペクトルは、３２６３、２９２９、１６６１、１５３３、１４０２、１１１４、１０２６（ｃｍ−１）に吸収極大を示す。赤外線スペクトルは図２に示されている。１６３１、１５９６及び１３４６における吸収帯は、ギ酸アンモニウムの残量に起因する。
Ｃ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール／Ｈ２Ｏ（８０：２０の比率）中で実施された抗生物質１０７８９１の紫外スペクトルは、２２６と２６７ｎｍにおいて２つの肩を示す。紫外スペクトルは図３に示されている。
Ｄ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが、水抑制シーケンス（ｗａｔｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｉｅｎｃｅ）を適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計でメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中４０℃において記録された。内部標準として、３．３１ｐｐｍにおけるメタノール−ｄ４の残留シグナルが考慮された。
【００６８】
抗生物質１０７８９１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが図４に示されている。
メタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（０．０１Ｎ  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）中に溶解された抗生物質１０７８９１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚにおいてＭｅＯＨ−ｄ４を内部標準（３．３１ｐｐｍ）として用いて次のシグナルのグループ（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ、多重度（帰属）］：０．９３ｄ（ＣＨ３）、０．９８ｄ（ＣＨ３）、１．０７ｔ（重複ＣＨ３）、１．１８ｔ（重複ＣＨ３）、１．２６ｓ（ＣＨ３）、１．３０ｔ（重複ＣＨ３）、１．６２〜１．７４ｍ（ＣＨ２）、１．７８ｄ（ＣＨ３）、１．８０ｄ（ＣＨ３）、２．０３ｍ（ＣＨ２）、２．２４ｍ（ＣＨ）、２．３６ｍ（ＣＨ２）、２．７２〜３．８ｍ（ペプチド性アルファＣＨ）、３．８〜５．２ｍ（ペプチド性アルファＣＨ）、５．５３〜６．０８ｓ（ＣＨ２）、５．６２ｄ（ＣＨ二重結合）、６．４２ｍ（ＣＨ）、６．９２ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．５５ｍ（芳香族ＣＨ）、７．６２〜１０．４ｄ及びｍ（芳香族及びペプチド性ＮＨ）。
Ｅ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが、内部標準として４９．１５ｐｐｍにおけるメタノール−ｄ４の残留シグナルを用いるＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計上でメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中４０℃において記録された。抗生物質１０７８９１のｂｂデッカプル（ｂｂ  ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが図５に示されている。
メタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（０．０１Ｎ  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）中に溶解された抗生物質１０７８９１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＭｅＯＨ−ｄ４を内部標準（４９．１５ｐｐｍ）として用いて６００ＭＨｚにおいて次のシグナルのグループ（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ、（帰属）］：１３．６〜２３．２（脂肪族ＣＨ３）、２６．１６〜７３（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性アルファＣＨ）、１０５〜１３６（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６４．３〜１７６．３（ペプチド性カルボニル）。
Ｆ）抗生物質１０７８９１複合体が、過剰モルの０．０１Ｍ塩酸を含む２−メトキシエタノール（ＭＣＳ）：Ｈ２Ｏ  １２：３（ｖ／ｖ）に溶解された。この溶液は、次いで、０．０１Ｎ水酸化カリウムの溶液で逆滴定された。得られた滴定曲線は、１つの塩基性イオン性官能基を示した。
【００６９】
抗生物質１０７８９１並びにそのＡ１及びＡ２因子のアミノ酸組成
Ａ）抗生物質１０７８９１複合体中の「耐酸性」アミノ酸の決定
抗生物質１０７８９１が完全な酸加水分解（ＨＣｌ  ６Ｎ、１０５℃、２４時間）にかけられ、酸処理に耐性がある抗生物質のアミノ酸成分が同定された。酸に不安定なアミノ酸はこの手法で検知できない。加水分解物は、適切な誘電体化の後に、同様に誘電体化された標準のアミノ酸の混合物と比較して、ＨＰＬＣ−ＭＳ及びＧＣ−ＭＳ分析によって研究された。ＨＰＬＣ分析については、加水分解された試料は、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡｃｃＱ−Ｔａｇ（商標）Ｆｌｕｏｒ試薬キット）で処理され、ＧＣ分析については、無水メタノール及びトリフルオロ酢酸無水物中の３Ｎ  ＨＣｌの混合物で処理された。
【００７０】
定性的ＨＰＬＣ分析が、同時のＤＡＤ及びＭＳ検知を用いる液体クロマトグラフィー系上で実施された。
【００７１】
ＨＰＬＣ法は次の条件を有した。
カラム：ＡｃｃＱ−Ｔａｇ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＮｏｖｏＰａｋ  ４μｍ  ３．９×１５０ｍｍ）
カラム温度：３７℃
流速：１ｍＬ／分
Ａ相：酢酸アンモニウム１４０ｍＭ  ｐＨ５（酢酸）
Ｂ相：水：アセトニトリル６０：４０（ｖ／ｖ）
【００７２】
【表４】
2008528581.tif 000005
【００７３】
ＵＶ検知：２５４ｎｍ
ＭＳ条件は次の通りである。
分光計：標準エレクトロスプレイ源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ
キャピラリー温度：２５０℃
供給源電圧：４．７０ＫＶ
供給源電流：８０μＡ
キャピラリー電圧：−１５Ｖ
定性的ＧＣ分析は、ＭＳ−ＥＩ検知が取り付けられたガスクロマトグラフ上で実施された。
【００７４】
ＧＣ法は、次の条件を有した。
カラム：Ｊ  ＆  Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＤＢ−５、３０ｍ×０．２５４ｍｍ  ＩＤ×０．２５μｍ  ＦＴ
キャリヤーガス：ヘリウム
注入モード：スプリットレス
注入温度：２００℃
トランスファーライン温度：３００℃
温度プログラム：２．５℃／分で５０℃から１００℃まで（１０分）、１０℃／分で１００℃から２５０℃まで（１５分）、２５０℃で１５分
注入量：１μｌ
【００７５】
ＭＳ条件は次の通りであった。
分光計：Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７００
イオン化モード：電子衝撃
電圧設定：
フィラメント電流：４００ｍＡ
電子マルチプライヤ：１４００Ｖ
電子エネルギー：７０ｅＶ
陽イオンモード
走査条件：
走査範囲：４０〜６５０ａｍｕ
走査時間：１秒
【００７６】
抗生物質１０７８９１の加水分解物で得られたＬＣ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳクロマトグラムにおいては、次のアミノ酸が他の同定されていないピークと共に同定された：ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（ＮＭＲ研究は、これは加水分解によってアスパラギン酸を生成するアルパラギンの変換産成物であることを示している）、フェニルアラニン及びロイシン。
【００７７】
抗生物質１０７８９１Ａ１及びＡ２因子が、複合体について報告された同じ条件（誘電体化及びＨＰＬＣ−ＭＳ）で完全な酸加水分解にかけられた。ＧＣ−ＭＳ分析は、ＰＴＶ注射器を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＧＣ−ＭＳ装置上で実施された。
【００７８】
ＧＣ法は次の条件を有した。
カラム：Ｒｅｓｔｅｋ  ＲＴＸ−５ＭＳ、１５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．２５μｍ  ＦＴ
キャリヤーガス：ヘリウム
インターフェース温度：２５０℃
温度プログラム：５０℃で１．５分、２０℃／分で５０℃から１００℃まで、１００℃で１分、２０℃／分で１００℃から１３５℃まで、１３５℃で１分、２０℃／分で１３５℃から２５０℃まで、２５０℃で１分
注入量：１μｌ
注射器：スプリットレスモード、基本温度５０°Ｃ、トランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）温度  ２８０°Ｃ、トランスファーレート  １４．５°Ｃ／ｍｉｎ
【００７９】
ＭＳ条件は次の通りであった。
イオン化モード：電子衝撃
電圧設定：
フィラメント電流：１４９μＡ
電子マルチプライヤ：２００Ｖ
電子エネルギー：７０ｅＶ
陽イオンモード：
走査条件：
走査範囲：３３〜５００ａｍｕ
走査時間：０．６秒
【００８０】
抗生物質１０７８９１のＡ１因子の加水分解物中において、ＨＰＬＣ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳクロマトグラムは、他の同定されていないピークと共に次のアミノ酸の存在を示した：ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（ＮＭＲ研究は、これは加水分解によってアスパラギン酸を生成するアルパラギンの変換産成物であることを示している）、フェニルアラニン及びロイシン。
【００８１】
Ａ２因子に実施された上記の手順は、他の同定されていないピークと共に次のアミノ酸の存在を明らかにした：ランチオニン、メチルランチオニン、グリシン、プロリン、バリン、アスパラギン酸（ＮＭＲ研究は、これは加水分解によってアスパラギン酸を生成するアルパラギンの変換産成物であることを示している）、フェニルアラニン及びロイシン。
【００８２】
Ｂ）抗生物質１０７８９１複合体中並びにそのＡ１因子及びＡ２因子中の５−クロロトリプトファンの決定
精製された１０７８９１複合体並びにその単一のＡ１及びＡ２因子の完全な加水分解が、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＲＪ，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＲ，Ｌｉｕ  ＴＹ，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ），Ａｐｒｉｌ  １０，１９７６，２５１（７），１９３６−４０によって記載された方法に従って実施された。
【００８３】
この加水分解手順は、鉱酸の消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）中は通常不安定であるアミノ酸の分解を防止し、従ってペプチドの加水分解物からの、トリプトファンを含むこれらのアミノ酸の決定を可能にする。５−クロロ−ＤＬ−トリプトファンの標準試料は、Ｂｉｏｓｙｎｔ  ＡＧ、Ｓｔａａｄ、スイスから購入され、その構造はＮＭＲ分析によって確認された；ＤＬ−トリプトファンは、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツから購入された。
【００８４】
Ａ１因子（１．５ｍｇ）が、０．２％（ｗ／ｖ）３−（２−アミノエチル）インドールを加水分解用の触媒として含む０．６ｍｌの４Ｎメタンスルホン酸中に懸濁された。加水分解が、１１５℃において１６時間実施された。加水分解物は次いで、５Ｎ  ＮａＯＨで中和され、同量の蒸留水で希釈された。この溶液の１００μｌが、ＬＣ−ＭＳによって分析された。分離がＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（５μｍ）３．９×２０ｍｍ前置カラムを備えたＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（５μｍ）４．６×２５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏ．Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ、米国）上で実施された。溶離が流速１ｍｌ／分においてＢ相の０％から５０％からの２５ｍｉｎ線形勾配を用いて実施された。Ａ相は２５ｍＭ  ＨＣＯＯＮＨ４緩衝液ｐＨ  ４．５：ＣＨ３ＣＮ  ９５：５（ｖ／ｖ）であり、Ｂ相はＣＨ３ＣＮであった。ＵＶ検知は２８０ｎｍにおいてであった。ＨＰＬＣ装置は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）と連結された。カラムからの５０μｌ／分の溶出液が、ＬＣＱ質量分析計のエレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）インターフェースに回された。ＭＳ分析が次の条件で実施された。試料注入口：シアーガス（ｓｈｅａｒ  ｇａｓ）（Ｎ２）６０ｐｓｉ（約４１３６８５Ｐａ）、キャピラリー加熱器  ２１０°Ｃ、試料注入口電圧極性：陽極及び陰極の両方、イオンスプレイ電圧＋／−４．５ＫＶ、キャピラリー電圧＋／−２１Ｖ、走査条件：最大イオン時間５０ｍｓ、フルミクロ（ｆｕｌｌ  ｍｉｃｒｏ）：スキャン（ｓｃａｎ）３。
【００８５】
トリプトファン及び５−クロロトリプトファンの標準は、それぞれｍ／ｚ  ２０５及び２３９のＭ＋Ｈ＋に対応する８．１分及び１１．５分の保持時間で溶離された。抗生物質１０７８９１Ａ１因子の加水分解物においては、２３８．９７のｍ／ｚを有する１１．５分におけるピークの存在は、５−クロロトリプトファンの存在を示した。
【００８６】
標準のトリプトファンは、０．３μｇ／ｍｌの検出限界で使用されたクロマトグラフ系で検出可能であった。この数値は、試験された抗生物質試料中の前記アミノ酸の存在を示したであろう数値に比べてより低い。トリプトファンは、抗生物質１０７８９１Ａ１因子の加水分解物のクロマトグラムの前記限界内で検出されなかった。同一の結果が、Ａ２因子の加水分解物及び抗生物質１０７８９１複合体の精製された試料の加水分解物のＬＣ−ＭＳ分析から得られた。
【００８７】
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子の質量分析
Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ較正ミックスを用いる、エレクトロスプレイ源を取り付けたＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ｄｅｃａ装置上のＭＳ実験で、最低の同位体組成に対応して、抗生物質１０７８９１Ａ１因子はｍ／ｚ＝１１２４において、Ａ２因子はｍ／ｚ１１１６において二重にプロトン化されたイオンを示す。エレクトロスプレイ条件は、スプレイ電圧：４．７ｋＶ、キャピラリー温度：２５０℃、キャピラリー電圧：８Ｖ、注入モード  １０μｌ／分であった。スペクトルは、酢酸０．５％を含むアセトニトリル：水  ５０：５０（ｖ／ｖ）中の０．１ｍｇ／ｍｌ溶液から記録され、図６Ａ（完全走査低解像度スペクトル）及び６Ｂ（拡大走査高解像度スペクトル）及び図７Ａ（完全走査低解像度スペクトル）及びＢ（拡大走査高解像度スペクトル）に報告されている。
【００８８】
抗生物質Ａ１因子及びＡ２因子の正確な質量は、エレクトロスプレイ源を取り付けたＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ＡＰＥＸ  ＩＩ，４．７  Ｔｅｓｌａ分光計を用いて決定された。これらのデータに基づいて、Ａ１因子は、高解像度ＥＳＩ−ＦＴＭＳによって決定された、ｍ／ｚ  １１２４．３６１２４（精度３０ｐｐｍ）における［Ｍ＋２Ｈ］２＋から算出されたモノアイソトピック質量である、２２４６．７１±０．０６の分子量が与えられる。Ａ２因子は、高解像度ＥＳＩ−ＦＴＭＳによって決定された、ｍ／ｚ  １１１６．３６２６０（精度３０ｐｐｍ）における［Ｍ＋２Ｈ］２＋から算出されたモノアイソトピック質量である、２２３０．７１±０．０６の分子量が与えられる。
【００８９】
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子と抗生物質ＭＦ−ＢＡ−１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１の比較
Ａ）米国特許第６５５１５９１Ｂ１号に記載されたＭｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ  ＮＮＲＬ  ３０４２０（ＭＦ−ＢＡ−１７６８）は、ＮＮＲＬコレクションから得られた。予備的な実験においては、Ｍ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ  ＮＮＲＬ  ３０４２０（ＭＦ−ＢＡ−１７６８）株を米国特許第６５５１５９１Ｂ１号に記載された条件で三角フラスコ中で発酵した。回収されたブロスは、メタノールでの希釈によって抽出された。菌糸体の遠心分離後、上澄みをＨＰ２０ポリスチレン吸収樹脂に載せ、メタノール：水  ７０：３０の混合物で溶離し、その溶離液を小容量にし、次いで凍結乾燥した。
【００９０】
クロマトグラムにおいて、２つのピークが、それぞれＭＦ−ＢＡ−１７６８β１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８α１について米国特許第６５５１５８１Ｂ１号に報告された［Ｍ＋２Ｈ］２＋に相当する１０９１及び１１０８［Ｍ＋２Ｈ］２＋シグナルを示した。上記の抽出物は次いで、抗生物質１０７８９１Ａ１及びＡ２因子で加え（ｓｐｉｋｅ）、その混合物はＬＣ−ＭＳで分析された。抗生物質ＭＦ−ＢＡ−１７６８β１とＭＦ−ＢＡ−１７６８α１の、並びに抗生物質１０７８９１Ａ１とＡ２因子のピークは、異なる保持時間及び異なる［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ＭＳ断片を有することが見出された。
Ｂ）更なる一実験においては、Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．株ＮＲＲＬ  ３０４２０  （ＭＦ−ＢＡ−１７６８）の３０ｌ槽発酵が実施され、回収されたブロスが米国特許第６５５１５９１Ｂ１号の記載に従って処理された。ＨＰ２０ポリスチレン樹脂及びポリアミドＣＣ  ６  ０．１〜０．３ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）樹脂上で逐次行われた精製ステップの後、２７ｍｌ／分の流速で溶離された、次の多段階プログラム、即ち時間＝０分（Ｂ相の３２％）、時間＝８分（Ｂ相の３２％）、時間＝２０分（Ｂ相の３６％）、時間＝３２分（Ｂ相の９０％）を用いた、μ１０粒子サイズＣ１８  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡ、ＵＳＡ）Ｌｕｎａ（２５０×１２．２ｍｍ）カラム上の分取ＨＰＬＣによって２つの個別の物質が純粋な形態で得られた。Ａ相は水中の０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、Ｂ相はＣＨ３ＣＮであった。
【００９１】
これらの物質は、表ＩＶに示されたようにブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）及び腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）に対して抗菌作用を示した。ＬＣ−ＭＳ実験において、２つの物質は、米国特許第６５５１５９１Ｂ１号に記載されたように、抗生物質ＭＦ−ＢＡ−１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１に相当する［Ｍ＋２Ｈ］＋＋二重プロトン化イオンシグナルを示した。
【００９２】
【表５】
2008528581.tif 000006
【００９３】
抗菌試験の実験条件は、以下の表ＶＩに報告された試験に利用したものと同一であった。
単離された抗生物質ＭＦ−ＢＡ−１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１のＬＣ−ＭＳ分析が、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（５：ｍ）３．９×２０ｍｍ前置カラムを備えたＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８（５：ｍ）４．６×２５０ｍｍ．カラム（Ｗａｔｅｒｓ；Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ、ＵＳＡ）上（両方とも温度５０℃でオーブン中に保たれた）で実施された。溶離は、次の多段階溶離プログラム、即ち時間＝０分（Ｂ相３０％）、時間＝８分（Ｂ相３０％）、時間＝２０分（Ｂ相４５％）、時間＝２４分（Ｂ相９０％）、及び時間＝２８分（Ｂ相９０％）を用いて流速１ｍｌ／分で実施された。Ａ相は、２５ｍＭ  ＨＣＯＯＮＨ４緩衝液ｐＨ４．５：ＣＨ３ＣＮ  ９５：５（ｖ／ｖ）であり、Ｂ相はＣＨ３ＣＮであった。ＨＰＬＣ装置は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ、ＵＳＡ）と連結された。カラムからの１００μｌ／分の溶離液は、ＬＣＱ質量分析計のＥＳＩインターフェースに回された。ＭＳ分析が次の条件、即ち、試料注入口：シートガスフロー（Ｎ２）２５ｐｓｉ（約１７２３６９Ｐａ）、補助ガスフロー５ｐｓｉ（約３４４７４Ｐａ）、キャピラリー加熱器：２１０°Ｃ、試料注入口電圧極性  陽極及び陰極の両方、イオンスプレイ電圧：＋／−４．７５ＫＶ、キャピラリー電圧：＋／−１２Ｖ、走査条件：最大イオン時間５０ｍｓ、フルミクロ：スキャン３で実施された。
【００９４】
個別の抗生物質因子ＭＦ−ＢＡ−１７６８α１及びＭＦ−ＢＡ−１７６８β１と抗生物質１０７８９１Ａ１及びＡ２因子が個別に及び混合物で分析された。結果が次の表Ｖに要約されている。
【００９５】
【表６】
2008528581.tif 000007
【００９６】
同じクロマトグラフ系においては、ラモプラニンＡ２因子（Ｌ．Ｇａｓｔａｌｄｏ，Ｒ．Ｃｉａｂａｔｔｉ，Ｆ．Ａｓｓｉ，Ｅ．Ｒｅｓｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｋ．Ｋｅｔｔｅｎｒｉｎｇ，Ｌ．Ｆ．Ｚｅｒｉｌｌｉ，Ｇ．Ｒｏｍａｎｏ，Ｍ．Ｄｅｎａｒｏ  ａｎｄ  Ｂ．Ｃａｖａｌｌｅｒｉ，（１９９２）：“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａ−１６６８６  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａ’１，Ａ’２  ａｎｄ  Ａ’３  ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：１３−１８）が１１．００分の保持時間で溶離された。
【００９７】
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子のＮＭＲスペクトロスコピー
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが、水抑制シーケンスを適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中２９８Ｋにおいて記録された。内部標準として１．９４ｐｐｍにおけるアセトニトリル−ｄ３の残留シグナルが考えられた。
Ａ）抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが図８に報告されている。
【００９８】
ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）中に溶解された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚにおいてＣＤ３ＣＮを内部標準（１．９４ｐｐｍ）として用いて次のシグナル群（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ、多重度；（帰属）］：０．８４ｄ（ＣＨ３）、０．８９ｄ（ＣＨ３）、０．９４ｔ（重複したＣＨ３）、１．１ｄ（ＣＨ３）、１．１３ｄ（ＣＨ３）、１．１５ｔ（重複したＣＨ３）、１４９ｍ（ＣＨ２）、１．６９ｄ（ＣＨ３）、１．７５ｍ（ＣＨ２）、２．１１ｍ（ＣＨ）、２．２６ｍ（ＣＨ）、２．５ｍ（ＣＨ２）、２．６８〜３．８ｍ（ペプチド性ＣＨβ）、３．８〜５．０ｍ（ペプチド性ＣＨα）、５．４５〜６．１７ｓ（ＣＨ２）、５．５８ｄ（ＣＨ二重結合）、６．３６ｍ（ＣＨ）、６．８６ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．４５ｍ（芳香族ＣＨ）。不純物として、ジメチルスルホキシドのシグナルが２．５８ｐｐｍに存在し、ホルメートのシグナルがまた８．３３ｐｐｍに存在する。
Ｂ）抗生物質１０７８９１Ａ２因子のｂｂデカップル１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが図９に報告されている。
【００９９】
ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）中に溶解された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、６００ＭＨｚにおいてＣＤ３ＣＮを内部標準（１．９４ｐｐｍ）として用いて次のシグナル群（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ、多重度；（帰属）］：０．８４ｄ（ＣＨ３）、０．８８ｄ（ＣＨ３）、０．９４ｄ（ＣＨ３）、１．０６ｄ（ＣＨ３）、１．１４ｄ（ＣＨ３）、１４８ｍ（ＣＨ２）、１．６５〜１．７５ｍ（ＣＨ２）、１．６７ｄ（ＣＨ３）、２．１５ｍ（ＣＨ）、２．２５ｍ（ＣＨ）、２．５ｍ（ＣＨ２）、２．７７〜３．８ｍ（ペプチド性ＣＨβ）、３．８〜４．９ｍ（ペプチド性ＣＨα）、５．４５〜６．１４ｓ（ＣＨ２）、５．５９ｄ（ＣＨ二重結合）、６．３４ｍ（ＣＨ）、６．８４ｄ（ＣＨ二重結合）、７．０〜７．４２ｍ（芳香族ＣＨ）。不純物として、ジメチルスルホキシドのシグナルが２．５８ｐｐｍに存在し、ホルメートのシグナルがまた８．３２ｐｐｍに存在する。
【０１００】
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが、１．３９ｐｐｍにおけるアセトニトリル−ｄ３の残留シグナルを内部標準として使用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ  ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中で２９８Ｋにおいて記録された。
Ｃ）抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが図１０に示されている。ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．３９ｐｐｍ）として使用して６００ＭＨｚにおいて次のシグナル群（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ；（帰属）］：１３．６〜２３．０３（脂肪族ＣＨ３）、２５．６９〜７７．９（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性ＣＨα）、１０５〜１３７．３（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６５．６〜１７６．６（ペプチド性カルボニル）。
Ｄ）抗生物質１０７８９１Ａ２因子のｂｂデカップル１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが図１１に示されている。
【０１０１】
ＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）に溶解された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＤ３ＣＮを内部標準（１．３９ｐｐｍ）として使用して６００ＭＨｚにおいて次のシグナル群（ｐｐｍで）を示す［δ＝ｐｐｍ；（帰属）］：１３．６〜２２．９（脂肪族ＣＨ３）、２５．６５〜７３（脂肪族ＣＨ２及びペプチド性ＣＨα）、１０５〜１３７．３（芳香族及び二重結合ＣＨ及び四級炭素）、１６５．７〜１７６．１（ペプチド性カルボニル）。
【０１０２】
抗生物質１０７８９１Ａ１因子及びＡ２因子の紫外及び赤外スペクトル
Ａ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ  ４８型でＫＢｒ中で記録された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の赤外スペクトルは、３２９４；３０５９；２９２６；１６６１；１５２９；１４３３；１４０７；１２８７；１１１４；１０２１に（ｃｍ−１）において吸収極大を示した。赤外スペクトルは図１２に報告されている。
Ｂ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール：Ｈ２Ｏ  ８０：２０（ｖ／ｖ）中で記録された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の紫外スペクトルは、２２６と２６７ｎｍに２つの肩を示す。紫外スペクトルは図１３に報告されている。
Ｃ）Ｂｒｕｋｅｒフーリエ変換赤外分光光度計ＩＦＳ  ４８型を用いてＫＢｒ中で記録された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の赤外スペクトルは、３２９６；３０６０；２９２８；１６６１；１５２９；１４３３；１４０７；１２８８；１１１６に（ｃｍ−１）において吸収極大を示す。赤外スペクトルは図１４に報告されている。
Ｄ）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光光度計λ１６を用いてメタノール：Ｈ２Ｏ  ８０：２０（ｖ／ｖ）中で記録された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の紫外スペクトルは、２２６と２６７ｎｍに２つの肩を示す。紫外スペクトルは図１５に報告されている。
【０１０３】
上記に報告された物理化学的データに基づき、次の構造式を抗生物質１０７８９１に与えることができ、
【０１０４】
【化１】
2008528581.tif 000008
【０１０５】
式中、ＸはＨ又はハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）であり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５は独立にＳ、Ｓ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏであってよく、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は独立にＨ、ＯＨ、アルキル（分枝若しくは非分枝の、置換若しくは非置換の）、又はアリール（置換若しくは非置換の）であってよい。
【０１０６】
別の一実施形態においては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はＨ又はＯＨであってよい。従って、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の可能な組合せは次のものを含む。
【０１０７】
【表７】
2008528581.tif 000009
【０１０８】
同様に、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８はＨ又はＯＨであってよい。従って、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の可能な組合せは次のものを含む。
【０１０９】
【表８】
2008528581.tif 000010
【０１１０】
更に、上記に報告された物理化学的データに基づき、次の構造式を抗生物質１０７８９１Ａ１因子に与えることができ、式中、ＸはＣｌであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５はＳであり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８はＨであり、この構造式は、薬学的に許容されるその塩と共に本発明の好ましい一実施形態である。
【０１１１】
【化２】
2008528581.tif 000011
【０１１２】
更に、上記に報告された物理化学的データに基づき、次の構造式を抗生物質１０７８９１Ａ２因子に与えることができ、式中、ＸはＣｌであり、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５はＳであり、Ｒ１はＯＨであり、Ｒ２はＯＨであり、Ｒ３はＨであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８はＨであり、この構造式は、薬学的に許容されるその塩と共に本発明の好ましい一実施形態である。
【０１１３】
【化３】
2008528581.tif 000012
【０１１４】
抗生物質１０７８９１のインビトロ生物活性
抗生物質１０７８９１の抗菌活性が、米国臨床研究所規格委員会の提案（ＮＣＣＬＳ、文書Ｍ７−Ａ５）によるブロス微量希釈法によって測定された。
【０１１５】
使用された菌株は、臨床分離株、又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）からの菌株であった。試験の結果は表ＶＩと表ＶＩＩに報告されている。
抗生物質１０７８９１をＤＭＳＯ中に溶解して、１０００μｇ／ｍｌの原液を得、次いで水に希釈して使用液を得た。使用された培地は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、モラキサラカタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ及びリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）用の陽イオン調整したＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロス（ＣＡＭＨＢ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）用のＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔブロス（ＴＨＢ）；ナイセリア  ｓｐｐ．（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．）用のＧＣ培地＋１％  Ｉｓｏｖｉｔａｌｅｘ＋１％  ヘミン（ｈａｅｍｉｎｅ）；インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）用のＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔｈ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ＋１％  Ｃサプリメント（Ｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）；乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）用の乳酸菌ブロス；スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）用のＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ＯＡＤＣ濃縮を含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９；カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）用のＲＰＭＩ  １６４０培地；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）用のＷｉｌｋｉｎｓ  Ｃｈａｌｇｒｅｎブロス＋オキシラーゼ（ｏｘｙｒａｓｅ）（１：２５ｖ／ｖ）；プロピオン酸菌属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）用のシステイン（ｃｉｓｔｅｉｎｅ）（０．５ｇ／Ｌ）を含むＢｒｕｃｅｌｌａブロスであった。バクテリアの接種原は１０５ＣＦＵ／ｍｌであった。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの接種原は１Ｘ１０４ＣＦＵ／ｍｌであった。全ての試験は、０．０２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下で実施された。培養物は、嫌気性雰囲気を必要とするＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ及びＰｒｏｐｉｏｎｉｏｂａｃｔｅｒｉａ菌株以外は空気中３５℃でインキュベートされた。１８〜２４時間後、視覚による記録が行われ、ＭＩＣが測定された。ＭＩＣは目に見える増殖がない抗生物質のより低い濃度として定義された。
【０１１６】
【表９】
2008528581.tif 000013
【０１１７】
【表１０】
2008528581.tif 000014
【０１１８】
抗生物質１０７８９１は、グラム陽性細菌に対する良好な抗菌活性を示す。
メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）及びグリコペプチド中間体（ＧＩＳＡ）耐性株を含めたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣ範囲は、＝０．１３〜４μｇ／ｍｌであり、最近の臨床分離株である、バンコマイシン耐性菌（ＶＲＥ）を含めたＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対するＭＩＣ範囲は、０．５〜４μｇ／ｍｌである。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．に対しては、ＭＩＣは≦０．１３μｇ／ｍｌである。
【０１１９】
抗生物質１０７８９１はまた、嫌気性グラム陽性株に対して活性であり、ＭＩＣはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａに対して≦０．１３μｇ／ｍｌであり、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａに対して≦０．００４〜４μｇ／ｍｌである。抗菌活性が、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＭＩＣ  ０．１２５μｇ／ｍｌ）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株（ＭＩＣ範囲≦０．１３−４μｇ／ｍｌ）に対して示された。いくらかのグラム陰性細菌は抗生物質１０７８９１の影響を受けやすく、ＭＩＣはＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対して１〜０．２５μｇ／ｍｌ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．に対して０．５〜０．２５μｇ／ｍｌ、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対して３２μｇ／ｍｌである。
【０１２０】
抗生物質１０７８９１は、試験された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株に対して活性ではない。
タイムキル（ｔｉｍｅ−ｋｉｌｌ）実験においては、抗生物質１０７８９１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＧＩＳＡ及びＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＶａｎＡ株に対して殺菌活性を示し、２４時において殺菌濃度はＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロス中でＭＩＣ値である。
【０１２１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、生死にかかわる感染を引き起こす恐れがあり、ＭＲＳＡは特に臨床的に重要である。というのは、それが全てのペニシリン及びセファロスポリンに、また多数の他の抗生物質に耐性があり、更にそれが患者から患者へ容易に伝染して、保健施設に対する重要な影響を伴って感染の大発生を引き起こすためである（Ｗ．Ｗｉｔｔｅ，（１９９９）：“Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４４：１−９）。疾病管理センター（ＣＤＣ）米国院内感染監視制度（ＮＮＩＳ）は、米国病院のＳ．ａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性が１９７５年の２．４％から１９９１年の２９％に、集中治療室でのより高い程度の耐性を伴って増加したことを報告した（Ｌ．Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｌ．Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｄ．Ｍｏｎｎｅｔ，Ｊ．Ｅ．Ｊｒ  Ｍｃ  Ｇｏｗａｎ，Ｆ．Ｔｅｎｏｖｅｒ，Ｒ．Ｇａｙｎｅｓ，（１９９７）：“Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ｃａｒｅ  ｕｎｉｔ”，Ｃｌｉｎｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２４：２１１−５）。院内のブドウ球菌感染は、多数の罹患率及び死亡率と係わり合いを持ち、在留期間を引き延ばし入院費用を増加させる。ＭＲＳＡ菌株の大多数は、マクロライド、アミノグリコシド、及びセファロスポリンの最新世代を含めた現在使用中のβ−ラクタム系抗生物質を含めた最も一般に使用される抗菌剤のいくつかに耐性がある。
【０１２２】
感染に関与するバンコマイシン耐性院内感染性（心内膜炎、髄膜炎及び敗血症などの）の病原菌は、増大する治療上の難問をもたらしている（Ｙ．Ｃｅｔｉｎｋａｙａ，Ｐ．Ｆａｌｋ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｍａｙｈａｌｌ，（２０００）：“Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ”，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３：６８６−７０７；Ｌ．Ｂ．Ｒｉｃｅ，（２００１）：“Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ”，．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．７：１８３−７）。
【０１２３】
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは、広く認められている重要なヒトの病原菌である。それらは、呼吸器感染、特に子供の中耳炎及び高齢者の下部呼吸器感染の共通する原因である。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、近年、最も一般的な気道の病原として認められている（Ｍ．Ｃ．Ｅｎｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈ．ＭｃＫｅｎｚｙ，（１９９７）：“Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  （Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：３６０−７１）。
【０１２４】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、様々な疾患、即ちガス壊疽及び関連創傷感染、破傷風、ボツリヌス中毒、抗生物質による下痢（ＣＤＡＤ）及び偽膜性大腸炎に関与する。これらの微生物の多くが、疾患の病因で重要な役割を果たす外毒素を産生する。クロストリジウムディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、ＣＤＡＤの症例の２５％に、また偽膜性大腸炎のほぼ全ての症例に関与する原因物質である。最近数年にわたって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの同時感染の発生が、バンコマイシン耐性腸球菌感染症又はコロニー形成を有する患者に生じた（Ｊ．Ｇ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，（１９９２）：“Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉａｒｒｈｅａ”，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５：５７３−５８１）。
【０１２５】
抗生物質１０７８９１Ａ１及びＡ２因子のインビトロ生物活性
表ＶＩＩＩは、抗生物質１０７８９１のＡ１及びＡ２因子の個々の抗菌活性を報告している。ＭＩＣは、上記に記載された微量ブロス希釈法によって測定された。
【０１２６】
【表１１】
2008528581.tif 000015
【０１２７】
抗生物質１０７８９１のインビボ生物活性
２３〜２５ｇの体重の雌性ＩＣＲマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｉｔａｌｉａ  ＳｐＡ−Ｓ．Ｐｉｅｔｒｏ  ａｌ  Ｎａｔｉｓｏｎｅ、イタリア）が、免疫応答性又は好中球減少性マウスの急性致死性感染症の実験に使用された。好中球減少症が、４日及び１日でそれぞれ２００及び１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドの２種の腹腔内投与によって誘発された後、マウスが感染された。
【０１２８】
メチシリン耐性ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の臨床分離株（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ  ＳＡ３８１７）又は標準のメチシリン感受性菌株（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ  Ｓｍｉｔｈ  ＡＴＣＣ１９６３６）のいずれかの細菌浮遊液を免疫応答性マウス（８動物／用量／処置群）の腹腔内に接種することによって、或いは好中球減少性マウスにグリコペプチド耐性ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの臨床分離株（Ｅｎｔ．ｆａｅｃａｌｉｓ  Ａ５３３）を接種することによって感染症が誘発された。０．５ｍＬの５％バクテリアをムチン（Ｄｉｆｃｏ）中に懸濁して、細菌のチャレンジ（約１０６細胞／マウス）が行われた。未処置動物は、感染後２４〜７２時間以内に死んだ。抗生物質処置は、チャレンジ後１０〜１５分以内に始まった。抗生物質１０７８９１は、異なる水性製剤で静脈内に又は皮下に１回投与された。５０％有効量（ＥＤ５０）及び９５％信頼限界が、７日において生き残っている動物の百分率からＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｄ．Ｊ．Ｆｉｎｎｅｙ，（１９５２）：“Ｔｈｅ  Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ”，ｉｎ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓａｙ．ｐｐ．５２４−５３０，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ）によって算出された。結果は次の表ＩＸに報告されている。
【０１２９】
抗生物質１０７８９１は、２００ｍｇ／ｋｇの最大試験用量まで毒性ではない。
【０１３０】
【表１２】
2008528581.tif 000016
【実施例】
【０１３１】
実施例１  Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の発酵方法
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４株が、オートミール寒天斜面上に２〜３週間２８℃で維持された。一斜面の微生物含有量が、５ｍｌ滅菌水でかき取られ、デキストロース２０、酵母エキス２、大豆かす８、ＮａＣｌ１、及び炭酸カルシウム４（ｇ／ｌ）から構成される１００ｍｌの種培地（ＡＦ／ＭＳ）を収容する５００ｍｌ三角フラスコ中に接種された。培地は、蒸留水中で調製され、１２１℃での２０分間の殺菌の前に、ｐＨが７．３に調節された。接種されたフラスコは、２８℃において２００ｒｐｍで作動する回転式振とう機上で培養された。４〜６日後、この培養物の５％が、同じ発酵培地を収容する第二シリーズのフラスコ中に接種された。７２時間のインキュベーションの後、２００ｍｌが３Ｌの同じ栄養培地を収容する４Ｌバイオリアクター中に移された。
【０１３２】
発酵が３０℃において７００ｒｐｍでの撹拌及び０．５ｖｖｍのエアレーションを行いながら実施された。７２時間後、培養物（１．５Ｌ）が１５Ｌの同じ栄養培地を収容する２０Ｌバイオリアクター中に移された。発酵が４８時間３０℃において５００ｒｐｍでの撹拌及び０．５ｖｖｍのエアレーションを行いながら実施され、次いで産生槽に移された。抗生物質１０７８９１の産生が、ｇ／ｌでデンプン２０、グルコース１０、酵母エキス２、加水分解カゼイン４、肉エキス２及び炭酸カルシウム３から構成される２００Ｌの産生培地Ｍ８を収容する３００Ｌ発酵槽中で実施された。培地は脱イオン水中で調製され１２１℃において２５分間殺菌される前にｐＨが７．２に調節された。冷却後、発酵槽は、約１４Ｌ（７％）の前培養物で接種された。発酵槽は、２９℃において１８０ｒｐｍでの撹拌及び０．５ｖｖｍのエアレーションを行いながら３６０００Ｐａ（０．３６ｂａｒ）の頭部圧力で運転された。発酵槽は９８時間の発酵の後に回収された。
【０１３３】
抗生物質１０７８９１の産生は、全培養ブロスの同量のメタノールでの抽出の後に、前述のようにＨＰＬＣによって監視された。抽出は室温で１時間撹拌しながら実施した。
【０１３４】
実施例２  Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４の別の発酵方法
Ｍｉｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５０２４が、グルコース１０、マルトース１０、ダイズ油１０、ダイズ粉８、酵母エキス２及び炭酸カルシウム４ｇ／ｌから構成される１００ｍｌの培養培地（Ｇ１）を収容する５００ｍｌ三角フラスコ中に接種された。培地は脱イオン水中で調製され、ｐＨ調節することなく１２０℃×２０分殺菌された。接種されたフラスコは、１２０〜１６８時間２８℃において２００ｒｐｍで撹拌しながら良好な増殖が観察されるまでインキュベートされた。このフラスコは次いで、実施例１に記載の通り構成された３Ｌの種培地ＡＦ／ＭＳを収容する４Ｌバイオリアクターを接種（３％）するのに使用された。７００ｒｐｍでの撹拌及び０．５ｖｖｍエアレーションを行いながらの３０℃における１２０時間の発酵の後、１．５Ｌの培養物が、１５Ｌの同じ栄養培地を収容する２０Ｌバイオリアクターに移された。発酵は３０℃において６００ｒｐｍでの撹拌及び０．５ｖｖｍエアレーションを行いながら９６時間実施され、次いで産生槽に移された。
【０１３５】
抗生物質の産生が、デキストロース２０、酵母エキス５、肉エキス５、加水分解カゼイン３、ペプトン５及びＮａＣｌ１．５（ｇ／ｌ）から構成される２００Ｌの生産培地（Ｖ６）を収容する３００Ｌ発酵槽中で得られた。培地が脱イオン水中で調製されｐＨが７．５にＮａＯＨで調節され、１２１℃において２０分間殺菌された。
【０１３６】
発酵槽が１４Ｌの種培地（７％）で接種され、発酵が２９℃において１８０ｒｐｍで撹拌し毎分１００Ｌの標準の空気（０．５  ｖｖｍ）で通気しながら実施された。抗生物質１０７８９１の産生が、前述のようにＨＰＬＣによって監視された。発酵物は約１６０時間後に回収された。
【０１３７】
実施例３  抗生物質１０７８９１の回収
実施例１に記載された発酵ブロスを、接線ろ過システム（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）（０．１μｍ細孔サイズ膜、Ｋｏｃｈ  Ｃａｒｂｏ−Ｃｏｒ、Ｋｏｃｈ  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、米国）によってろ過して１７０Ｌの上澄み及び３０Ｌの濃縮された菌糸体を得た。抗生物質１０７８９１複合体が、ろ液（Ａ）中及び菌糸体（Ｂ）中の両方で見出された。
（Ａ）ろ過されたブロスは、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂（４Ｌ）の存在下で室温において終夜撹拌された。樹脂は次いで回収され、１０Ｌのメタノール：水  ４：６（ｖ／ｖ）で洗浄され、バッチ式に最初に１０Ｌのメタノール：水  ９：１（ｖ／ｖ）で、次いで１０Ｌのメタノール：ブタノール：水  ９：１：１（ｖ／ｖ）で溶離された。合わされた抗生物質１０７８９１を含む溶離された画分は、回転式蒸発器で小容量に濃縮され、次いで凍結乾燥され、３２ｇの粗材料が得られた。この粗材料がｎ−ブタノール（１Ｌ）中に溶解され、次いで８００ｍｌの水で逐次的に３回抽出された。有機相が減圧下で濃縮されて油状残留物になり、その油状残留物がメタノール中に溶解された。石油エーテルが添加されると、５ｇの粗抗生物質製剤が析出によって得られた。
（Ｂ）２５Ｌのメタノールの添加後、菌糸体を含む残存部分が１時間撹拌され、ろ過されて４５Ｌの菌糸体エキスが得られた。この溶液が次いで水（２０Ｌ）で希釈され室温でＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂（１Ｌ）と共に室温で終夜撹拌された。樹脂が次いで回収され、２Ｌのメタノール：水  ４０：６０（ｖ／ｖ）で洗浄されてバッチ式に逐次的に３Ｌのメタノール：水  ８５：１５（ｖ／ｖ）で、及び次いで２Ｌのメタノール：水  ９０：１０（ｖ／ｖ）で溶離された。溶離された画分は、抗生物質１０７８９１の存在が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓについての寒天拡散アッセイによって、また先に報告された分析的ＨＰＬＣ法によって監視された。
【０１３８】
抗生物質１０７８９１を含む溶離された画分が合わされ、減圧下で濃縮されて凍結乾燥され、８．１グラムの粗抗生物質１０７８９１が得られた。
【０１３９】
実施例４  抗生物質１０７８９１の別の回収法
実施例２に記載された２００Ｌ槽発酵から回収されたブロスがｐＨ６．８にされ、このブロスが接線ろ過（０．１μｍ細孔サイズ膜、Ｋｏｃｈ  Ｃａｒｂｏ−Ｃｏｒ）によってろ過された。透過水（１８０Ｌ）がバッチ式に終夜室温で２ＬのＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０樹脂（三菱化学）と一緒に撹拌され、樹脂が次いで回収された。
【０１４０】
メタノール（２５Ｌ）が、接線ろ過装置（約２０Ｌ）中の、濃縮された菌糸体を含む残存部分に添加された。この懸濁液が約１時間撹拌され、次いで精密ろ過システムでろ過されて約２０Ｌの残渣残存部になった。更なるメタノール（２５Ｌ）が次いで添加され、上記プロセスが逐次的に合計５サイクル繰り返された。合わされたメタノール抽出物（約１２５Ｌ）が１６０Ｌの脱塩水で希釈されバッチ式に終夜室温で３ＬのＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０樹脂と一緒に撹拌された。樹脂が次いで回収され、上記の記載されたプロセスに従ってブロス透過水を抽出するのに使用されたＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０樹脂と合わされた。合わされた樹脂が、２０Ｌの水：メタノール  ６：４（ｖ／ｖ）でクロマトグラフカラム中に洗いこまれた。抗生物質１０７８９１が、２３Ｌのメタノール：５０ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ３．５：ｎ−ブタノール  ９：１：１（ｖ／ｖ）で溶離された。この溶離液が、次いで真空下で濃縮されて３Ｌの最終体積となった。濃縮された溶液が、次いでｐＨ４．５において、水：メタノール  ７：３（ｖ／ｖ）で調整された２．５ＬのポリアミドＣＣ６  ０．１〜０．３ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）カラムに装入された。カラムが、水：メタノール  ７：３（ｖ／ｖ）で、次いで２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ３．５：メタノール  ７：３（ｖ／ｖ）で洗浄された。抗生物質が、水：メタノール  ３：７（ｖ／ｖ）で、次いで１：９（ｖ／ｖ）混合物で溶離された。溶離は、１：９（ｖ／ｖ）の比の２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ２．８：メタノールで完了した。抗生物質１０７８９１を含む溶離液が合わされ、真空下で濃縮されて１Ｌの最終体積になった。濃縮された溶液のｐＨを７Ｍ水酸化アンモニウムを用いて４から５．７にし、次いでこの混合物が遠心分離されて析出物が回収された。この固体が、水に懸濁され凍結乾燥され、６．９６ｇの抗生物質１０７８９１製剤が得られた。
【０１４１】
実施例５  抗生物質１０７８９１の精製
実施例３に記載の通りに調製された粗抗生物質１０７８９１（３．６ｇ）は、Ｂ−６８７グラジェントフォーマー（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒｍｅｒ）、Ｂ−６８４フラクションコレクター（ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）、Ｂ−６８５ガラスカラム７０×４６０ｍｍを備えたＢｕｃｈｉ  Ｂ−６８０中圧クロマトグラフィーシステム（Ｂｕｃｈｉ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｓ−ｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、Ｆｌａｗｉｌ、スイス）を使用することによって、１００ｇの逆相Ｃ８（ＥＣ）４０〜７０μｍ粒子サイズ、６０Ａ細孔サイズ、ＩＳＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｄ−Ｇｌａｍｏｒｇａｎ、英国）上の中圧クロマトグラフィーによって精製された。樹脂は、Ａ相：Ｂ相  ８：２（ｖ／ｖ）で先に調整され、次いで、６０分でＢ相の２０％から６０％の６０分線形勾配で２５ｍｌ／分で溶離された。
【０１４２】
Ａ相は、アセトニトリル：２０ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．６）１０：９０（ｖ／ｖ）であり、Ｂ相は、アセトニトリル：２０ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ：６．６）９０：１０（ｖ／ｖ）であった。
【０１４３】
抗生物質１０７８９１を含む画分が合わされ、真空下で濃縮されて水から２回凍結乾燥され、４３０ｍｇの精製された抗生物質１０７８９１が得られた。
【０１４４】
実施例６  分取ＨＰＬＣによる抗生物質１０７８９１の精製
抗生物質１０７８９１が、更に、Ｂ相の３０％から４５％の２５分線形勾配溶離を用いて流速３０ｍｌ／分でＨｉｂａｒ  ｐｒｅｐａｃｋｅｄ  ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ８（７：ｍ  粒子サイズ）カラムＲＴ２５０〜２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ上の分取ＨＰＬＣによって精製された。Ａ相は、２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５：アセトニトリル  ９５：５（ｖ／ｖ）であり、Ｂ相は、アセトニトリルであった。
【０１４５】
実施例５からの抗生物質１０７８９１のサンプル（３００ｍｇ）が、ＤＭＳＯ：ギ酸  ９５：５（ｖ／ｖ）の１，５ｍｌ  ３５０：ｌ中に溶解され、３００μｌがクロマトグラフ処理された。抗生物質１０７８９１は、典型的には１５〜１６分で溶離された。抗生物質１０７８９１を含む５つのクロマトグラフ処理の溶離画分が合わされ、真空下で濃縮された。残った溶液が、逐次的に３回水から凍結乾燥され、３１ｍｇの抗生物質１０７８９１が白色粉末として得られた。
【０１４６】
実施例７  抗生物質１０７８９１のＡ１及びＡ２因子の個々の分離と精製
Ａ１及びＡ２因子が、２つの異なる溶離プログラムを使用して、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８（７μｍ粒子サイズ）カラム７．８×３００ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｄｆｏｌｄ、米国）上の分取ＨＰＬＣによって実施例５の抗生物質１０７８９１複合体から分離され精製された。
Ａ）Ａ１因子は、流速３．５ｍｌでＢ相の３０％から４５％の２５分線形勾配溶離によって精製された。Ａ相は、２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４．５：アセトニトリル  ９５：５（ｖ／ｖ）であり、Ｂ相は、アセトニトリルであった。精製された抗生物質１０７８９１複合体（１５ｍｇ）が、３５０μｌのＤＭＳＯ：ギ酸  ９５：５（ｖ／ｖ）に溶解され、クロマトグラフ処理された。Ａ１及びＡ２因子は、典型的には１１〜１３分の時間枠中に溶離された。溶離された画分が、次いで、上記に記載された分析的条件下でＨＰＬＣによって分析された。純粋な抗生物質１０７８９１Ａ１因子を含む１４のクロマトグラフ処理の画分が合わされ、真空下で濃縮された。残った溶液が、逐次的に３回水から凍結乾燥されて、１５ｍｇの純粋なＡ１因子が白色粉末として得られた。
Ｂ）Ａ２因子が、流速７ｍｌで１００ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４：アセトニトリル  ８２．５：１７．５（ｖ／ｖ）で定組成溶離によって精製された。精製された抗生物質１０７８９１複合体（５ｍｇ）が、２５０μｌの酢酸：アセトニトリル：１００ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液ｐＨ４  ５０：１２０：８０（ｖ／ｖ）混合物中に溶解され、クロマトグラフ処理された。Ａ１及びＡ２因子は、典型的には９〜１０分時間枠中に溶離された。溶離された画分が、次いで、上記に記載された分析的条件下でＨＰＬＣによって分析された。純粋な抗生物質１０７８９１Ａ２因子を含む２０のクロマトグラフ処理の画分が合わされ、真空下で濃縮された。残った溶液が、水から２回凍結乾燥され、８ｍｇの純粋なＡ２因子が白色粉末として得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１Ａ】ｍ／ｚ１１２４及びｍ／ｚ１１１６に二重プロトン化イオンを示している抗生物質１０７８９１の質量スペクトル（完全走査低解像度スペクトル）を表す図である。
【図１Ｂ】ｍ／ｚ１１２４及びｍ／ｚ１１１６に二重プロトン化イオンを示している抗生物質１０７８９１の質量スペクトル（拡大走査高解像度スペクトル）を表す図である。
【図２】ＫＢｒ中に分散した抗生物質１０７８９１の赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図３】メタノール：Ｈ２Ｏ中に溶解した抗生物質１０７８９１の紫外スペクトルを表す図である。
【図４】水抑制シーケンスを適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中４０℃で記録された１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図５】Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でメタノール−ｄ４：Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．３  ＨＣｌ）４０：１０（ｖ／ｖ）の混合物中４０℃で記録された１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図６Ａ】ｍ／ｚ１１２４に二重プロトン化イオン［Ｍ＋２Ｈ］２＋を示している抗生物質１０７８９１Ａ１因子の質量スペクトル（完全走査低解像度スペクトル）を表す図である。
【図６Ｂ】ｍ／ｚ１１２４に二重プロトン化イオン［Ｍ＋２Ｈ］２＋を示している抗生物質１０７８９１Ａ１因子の質量スペクトル（拡大走査高解像度スペクトル）を表す図である。
【図７Ａ】ｍ／ｚ１１１６に二重プロトン化イオン［Ｍ＋２Ｈ］２＋を示している抗生物質１０７８９１Ａ２因子の質量スペクトル（完全走査低解像度スペクトル）を表す図である。
【図７Ｂ】ｍ／ｚ１１１６に二重プロトン化イオン［Ｍ＋２Ｈ］２＋を示している抗生物質１０７８９１Ａ２因子の質量スペクトル（拡大走査高解像度スペクトル）を表す図である。
【図８】水抑制シーケンスを適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中２９８Ｋで記録された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図９】水抑制シーケンスを適用するＢｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中２９８Ｋで記録された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図１０】Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中２９８Ｋで記録された抗生物質１０７８９１Ａ１因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図１１】Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＭＸ６００分光計上でＣＤ３ＣＮ：Ｄ２Ｏ（１：１）の混合物中２９８Ｋで記録された抗生物質１０７８９１Ａ２因子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す図である。
【図１２】ＫＢｒ中に分散した抗生物質１０７８９１Ａ１因子の赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図１３】メタノール：Ｈ２Ｏ中に溶解した抗生物質１０７８９１Ａ１因子の紫外スペクトルを表す図である。
【図１４】ＫＢｒ中に分散した抗生物質１０７８９１Ａ２因子の赤外吸収スペクトルを表す図である。
【図１５】メタノール：Ｈ２Ｏ中に溶解した抗生物質１０７８９１Ａ２因子の紫外スペクトルを表す図である。
【図１Ａ】
2008528581.tif 000020
【図１Ｂ】
2008528581.tif 000021
【図２】
2008528581.tif 000022
【図３】
2008528581.tif 000023
【図４】
2008528581.tif 000024
【図５】
2008528581.tif 000025
【図６Ａ】
2008528581.tif 000026
【図６Ｂ】
2008528581.tif 000027
【図７Ａ】
2008528581.tif 000028
【図７Ｂ】
2008528581.tif 000029
【図８】
2008528581.tif 000030
【図９】
2008528581.tif 000031
【図１０】
2008528581.tif 000032
【図１１】
2008528581.tif 000033
【図１２】
2008528581.tif 000034
【図１３】
2008528581.tif 000035
【図１４】
2008528581.tif 000036
【図１５】
2008528581.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月15日(2008.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物
【化１】
2008528581.tif 000038
［式中、Ｘは、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５は、独立に、Ｓ、Ｓ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立に、Ｈ、ＯＨ、アルキル、及びアリールからなる群から選択される
（但し、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４及びＹ５の内、１つ以上がＳでない）］、
又は薬学的に許容可能なその塩。
【請求項２】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８がＨである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項３】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項４】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項５】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項６】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＯＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項７】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項８】
Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＨであり、Ｒ３がＯＨである、請求項２に記載の化合物又は塩。
【請求項９】
Ｙ１がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項１０】
Ｙ２がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項１１】
Ｙ３がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項１２】
Ｙ４がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ５がＳである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項１３】
Ｙ５がＳ−Ｏ−、Ｓ＝Ｏ、Ｏ−−Ｓ＝Ｏ、及びＯ＝Ｓ＝Ｏからなる群から選択され、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、及びＹ４がＳである、請求項１に記載の化合物又は塩。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物又は塩、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
薬剤としての使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物又は塩。
【請求項１６】
細菌性感染症の治療又は予防のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
動物成長促進剤として使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表９】
2008528581.tif 000039
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
【表１０】
2008528581.tif 000040
【国際調査報告】
2008528581.tif 000041
2008528581.tif 000042
2008528581.tif 000043