(57)【要約】  新規の保護されたＧＬＰ−１化合物およびその治療学的な使用【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化されたGLP-1類似体であって、前記GLP-1類似体が、配列GLP-1(7−37)(配列番号１)に関連する７位および８位における少なくとも１のアミノ酸残基の修飾によりDPP-IVに対して安定化している、並びに前記アシル化が前記GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基に対して直接的に結合している二酸である類似体。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、前記二酸が、前記 GLP-1類似体のリジン残基のイプシロンアミノ基に対して結合している化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体が延長されたC末端を有する、即ち、当該類似体が当該配列GLP-1(7−37)(配列番号１)に関連する３８位におけるアミノ酸残基を含む化合物。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の化合物であって、前記二酸が前記GLP-1類似体のLys38に対して結合している化合物。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の化合物であって、前記二酸が、ジカルボン酸である化合物。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の化合物であって、前記アシル化基が直鎖または分岐したアルカンα,ω-ジカルボン酸である化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、当該アシル化基が構造HOOC-(CH2)nCO-を有する化合物、ここでｎは１２〜２０である化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、当該アシル基がHOOC-(CH2)14CO-, HOOC-(CH2)15CO-, HOOC-(CH2)16CO-, HOOC-(CH2)17CO-, およびHOOC-(CH2)18CO-から選択される構造を有する化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、当該アシル基が構造HOOC-(CH2)16CO-を有する化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体が当該GLP-１(7-37)配列の７位におけるN末端L-ヒスチジンの修飾を有する化合物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物であって、前記GLP-１類似体がイミダゾプロピオニル７、α-ヒドロキシ-ヒスチジン７またはN-メチル-ヒスチジン７を含む化合物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体が、D-ヒスチジン７、デスアミノ-ヒスチジン７、２-アミノ-ヒスチジン７、β-ヒドロキシ-ヒスチジン７、ホモヒスチジン７、Nα-アセチル-ヒスチジン７、α-フルオロメチル-ヒスチジン７、α-メチル-ヒスチジン７、３-ピリジルアラニン７、２-ピリジルアラニン７または４-ピリジルアラニン７を含む化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体が当該GLP-1配列の８位のL-アラニンの他のアミノ酸残基への置換を含む化合物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体がAib８, Gly８, Val８, Ile８, Leu８, Ser８ または Thr８を含む化合物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体がGLP-1(7-37)配列の８位における当該L-アラニンが(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロへプチル)カルボン酸または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸への置換を含む化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５の何れか１項に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体がGLP-1(7-37)
(配列番号１)と比較して置換、付加または欠失された１５以下のアミノ酸残基、またはGLP-1(7-37)(配列番号１)と比較して置換、付加または欠失された１０以下のアミノ酸残基を含む化合物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体がGLP-1(7-37)(配列番号１)と比較して置換、付加または欠失された６以下のアミノ酸残基を含む化合物。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体が遺伝コードによりコード化されていない４以下のアミノ酸残基を含む化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１８の何れか１項に記載の化合物であって、前記GLP-1類似体がただ１つのリジン残基を含む化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れか１項に記載の化合物であって、
[Aib8,Arg26,34] GLP-1(7-37)Lys{17-カルボキシヘプタデカノイル}-OH
【化１】
2008515856.tif 000012
または
[Gly8,Arg26,34,36]GLP-1 (7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-OH
【化２】
2008515856.tif 000013
または
[アルファヒドロキシデスアミノHis7,Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-OH
【化３】
2008515856.tif 000014
または
[Gly8, Glu22,23,30, Arg 18,26,34]GLP1 (7-37) Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-NH2
【化４】
2008515856.tif 000015
または
[Gly8,Arg26,34]GLP-1 (7-37)Lys(19-カルボキシノナデカノイル)-OH
【化５】
2008515856.tif 000016
である化合物。
【請求項２１】
患者におけるGLP-1類似体の活性の時間を増大するための方法であって、前記GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基において直接的に二酸で前記GLP-1類似体をアシル化することを特徴する方法。
【請求項２２】
患者におけるGLP-1類似体の活性の時間を約40時間よりも長く増大するための方法であって、GLP-1(7-37)ペプチドまたはその類似体の７位および８位におけるアミノ酸残基の少なくとも１が修飾されていること、および当該GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基が二酸で直接的にアシル化されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の医薬組成物であって、非経口投与に適切な医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の化合物の医薬を製造するための使用。
【請求項２６】
高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、Ｘ症候群、異脂肪血症、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈疾患および他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸症候群、消化不良および胃潰瘍を治療または予防するための医薬を製造するための請求項１〜２０の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２７】
２型糖尿病における疾病進行を遅らせるまたは予防するための医薬を製造するための請求項１〜２７の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
食物摂取の減少、β細胞アポトーシスの減少、β細胞機能およびβ細胞量の増大および／またはβ細胞に対するグルコース感受性の回復のための医薬を製造するための請求項１〜２０の何れか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療に役立つペプチド、即ち、新規遅延性GLP-1化合物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
連なる異なるアプローチがグルカゴン様ペプチド１（GLP-1）化合物の構造を修飾するために使用され、それによりインビボにおける活性のより長い持続が提供されてきている。WO 96/29342は、ペプチドホルモン誘導体であり、ここで、当該親ペプチドホルモンはC末端アミノ酸残基またはN末端アミノ酸残基において親油性置換基が導入されることにより修飾されているペプチドホルモン誘導体を開示されている。
【０００３】
WO 98/08871は、GLP-1誘導体であって、その親ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が、結合された親油性置換基を有する誘導体を開示する。
【０００４】
WO 99/43708は、そのC末端アミノ酸残基に結合された親油性置換基を有するGLP-1(7-35)およびGLP-1(7-36)誘導体を開示する。
【０００５】
WO 00/34331はアシル化されたGLP-1類似体を開示する。
【０００６】
WO 00/69911は、患者に対して注入されるべき活性化されたインスリン分泌性ペプチドであり、それらは血液成分と反応してコンジュゲートを形成し、それによって、伝えられるところでは、インビボでより長い活性の維持が提供されるインスリン分泌性ペプチドを開示する。
【０００７】
WO 02/46227は、インビボでの半減期を延長するためにヒト血清アルブミンに融合されたGLP-1およびエクセンジン(exendine)４類似体を開示する。
【０００８】
多くの糖尿病患者は、取り分け、２型糖尿病区分の患者は、所謂、「針恐怖症」、即ち、彼ら自身に注射をすることに実質的な恐れを持っている。２型糖尿病区分において、多くの患者は経口低血糖性薬剤で治療されており、また、GLP-1化合物が、投与されるだろうこれらの患者に第一に注射可能な製品であることが予期されていることから、注射の恐怖は、臨床上大いに有望なGLP-1化合物の広い使用にとって重大な障害になるかもしれない。このように、一日一回未満、例えば、二〜三日に一回、好ましくは一週間に一回で投与され、同時に許容される臨床プロフィールを維持している新規のGLP-1化合物の開発が必要である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、二酸でアシル化されDPP-IV安定化GLP-1類似体を提供する。本発明はまた、アシル化されたGLP-1類似体であって、前記GLP-1類似体が、配列GLP-1(7-37)(配列番号１)に関連して７位および８位における少なくとも１のアミノ酸が修飾されることによってDPP-IVに対して安定化されており、前記アシル化が前記GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基に対して直接に結合された二酸であるアシル化GLP-1類似体が提供される。本発明は、また、DPP-IV安定化GLP-1類似体であって、前記GLP-1類似体がN末端での修飾、例えば、天然のHis7またはAla8の修飾などを含むDPP-IV安定化GLP-1類似体が提供される。
【００１０】
本発明はまた、二酸でアシル化されたDPP-IV安定化GLP-1類似体であって、前記二酸が前記GLP-1類似体のリジン残基のイプシロンアミノ酸基に対して結合しているDPP-IV安定化GLP-1類似体を提供する。
【００１１】
本発明はまた、二酸でアシル化されたDPP-IV安定化GLP-1類似体であって、アシル化が前記GLP-1類似体のLys38における二酸でアシル化されたDPP-IV安定化GLP-1類似体を提供する。
【００１２】
本発明はまた、約４０時間よりも長い時間まで患者におけるGLP-1類似体の活性の時間を増大する方法であって、GLP-1(7-37)ペプチドまたはその類似体の７位および８位における少なくとも１アミノ酸残基を修飾すること、および当該GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基を直接にアシル化することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、本発明に従う化合物を含む医薬組成物および、疾病を治療するため医薬を製造するための本発明に従う化合物の使用を提供する。
【００１４】
定義
本明細書において、以下の用語は指示される意味を有する：
ここで使用される用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、ペプチド結合により結合された少なくとも５つの成分アミノ酸で構成される化合物を意味する。当該成分アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸のグループに基づいてよく、それらは遺伝コードによりコードされない天然アミノ酸であっても、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝コードによりコードされない天然アミノ酸は、例えば、ヒドロキシプロリン、Y-カルボシキグルタメート、オミシン(omithine)、ホスフォセリン、D-アラニンおよびD-グルタミンなどである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されるアミノ酸を含み、即ち、遺伝コードによりコードされるアミノ酸のD-異性体、例えば、D-アラニンおよびD-ロイシン、Aib(α-アミノイソ酪酸)、Abu(α-アミノ酪酸)、Tle(tert-ブチルグリシン)、β-アラニン、3-アミノメチル安息香酸、アントラニル酸などを含む。
【００１５】
ここで使用される「類似体」の用語は、修飾されたペプチドを意味するポリペプチドを呼び、ここで、前記ポリペプチドの１以上のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基により置換されている、および／または１以上のアミノ酸残基が前記ポリペプチドから欠失している、および／または１以上のアミノ酸算残基が前記ポリペプチドから欠失しているまたは１以上のアミノ酸残基が当該ペプチドに付加されている。アミノ酸残基のそのような付加または欠失は、当該ペプチドのN末端および／または当該ペプチドのC末端で起こる。
【００１６】
ここでペプチドに関連して使用される当該用語「誘導体」は、化学的に修飾されたペプチドまたはその類似体を意味し、ここで、少なくとも１の置換基が未修飾のペプチドまたはその類似体には存在しない、即ち、共有結合性に修飾されたペプチドである。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステルなどである。GLP-1(7-37)の誘導体の例は、Arg34, Ｌｙｓ26(Nε−(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
【００１７】
ここで使用される用語「GLP-1」は、GLP-1(7-37)(配列番号１)、GLP-1(7-37)の類似体、GLP-1(7-37)誘導体、GLP-1(7-37)類似体の誘導体またはGLP-1(7-37)またはGLP-1(7-37)類似体又は誘導体を含む融合タンパク質を意味する。一態様において、GLP-1はインスリン分泌性薬剤である。
【００１８】
ここで使用される用語「インスリン分泌性薬剤」は、ヒトGLP-1受容体のアゴニストである化合物、即ち、当該ヒトGLP-1受容体を含む適切な培地中でのcAMPの形成を刺激する化合物を意味する。インスリン分泌性薬剤の効力は、以下に記載するようにな用量反応曲線からEC50を計算することにより決定される。
【００１９】
安定なトランスフェクト細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)、ヒトGLP-1受容体を発現する細胞系から精製された形質膜をGLP-1およびペプチド類似体で刺激し、cAMP産生能をパーキンエルマーライフサイエンスからのAlphaScreen(登録商標)cAMPアッセイキットを使用して測定した。
【００２０】
安定なトランスフェクト細胞系を製作し、高発現クローンをスクリーニングのために選択した。当該細胞は5％CO2でDMEM(5％FCS、1％Pen/Strepおよび0.5mg/ｍL G418)中で培養した。
【００２１】
約80％のコンフルエントで細胞をPBSで二度洗浄し、バーセン(Versene)で収集し、5分間、1000rpmで遠心し、上清を除いた。更なる工程は全て氷上にて行った。当該細胞ペレットをウルトラチューラックス(Ultrathurax)によりホモジナイズを20〜30秒間、10mLのバッファー１(20mM Na-HEPES、10mM EDTA、pH=7.4)中で行ない、15分間、20.000rpmで遠心し、そのペレットを10mLのバッファー２(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA、pH=7.4)中で再懸濁した。当該懸濁液を20〜30秒間ホモジナイズし、15分間、20.000rpmで遠心した。バッファー２中の懸濁、ホモジナイズおよび遠心を一度繰り返し、当該膜をバッファー２に懸濁し、更なる分析のために準備するか、または-80℃で保存した。
【００２２】
機能的な受容体アッセイは当該ペプチド誘導性cAMP産生をザ・アルファスクリーン・テクノロジー(The AlphaScreen Technology)により測定することにより実施した。ザ・アルファスクリーン・テクノロジーの基本的な原理は、内因性cAMPと外因性に加えられたビオチンcAMPとの間の競合である。cAMPの捕獲は、アクセプタービーズに対して結合している特異的抗体を使用して達成される。形成されたcAMPはアルファ・フュージョン・マイクロプレート・アナライザー(AlphaFusion Microplate Analyzer)でカウントおよび測定された。EC50値はグラフパッド・プリズム・ソフトウェア(Graph-Pad Prisme software)を使用して計算した。
【００２３】
ここでポリペプチドに関して使用される「DPP-IV保護」の語は、化学的に修飾され、それによって当該化学的に未修飾なペプチドよりも血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-4(DPP-IV)に対してより耐性が前記化合物に与えられたポリペプチドを意味する。血漿中の当該DPP-IV酵素は、いろいろなペプチドホルモン、例えば、GLP-1、GLP-2などの分解に関与していることが知られている。ジペプチジルアミノペプチダーゼIVによる分解に対するペプチドの耐性は、以下の分解アッセイにより測定可能である：
アリコートのペプチドを、37℃で、アリコートの精製ジペプチジルアミノペプチダーゼIVと共に4〜22時間、適切なバッファー中、pH7〜8(バッファーはアルブミンではない)でインキュベートする。酵素反応をトリフルオロ酢酸の添加により終了させ、当該ペプチド分解産物をHPLCまたはLC-MS分析を用いて分離し、定量する。この分析を実施するための一つの方法は：当該混合物をゾルバックス(Zorbax) 300SB-C18(30nmポア、5μm粒子)150ｘ2.1nmカラムに加え、流速0.5mL/minで、トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルのリニアグラジエント(30分間で0％〜100％のアセトニトリル)で溶出した。ペプチドおよびそれらの分解産物は214nm(ペプチド結合)または280nm(芳香族アミノ酸)でのそれらの吸光度によりモニターし、それらのピーク面積の積分により定量する。分解パターンは、当該分離されたピークのMSスペクトラが測定されるLC-MSを使用して決定可能である。問題となる時間での分解ペプチド当たりのインタクトペプチドのパーセンテージは、ペプチドのDPPIV安定性の評価のために使用される。
【００２４】
一つの態様において、ペプチドは、問題となる時間でインタクト化合物のパーセンテージを基づき、当該天然ペプチドよりも10倍安定な場合に、DPPIV安定性であると示す。従って、DPPIV安定性のGLP-1化合物は、GLP-1(7-37)よりも少なくとも10倍、より安定である。
【００２５】
発明の詳細な説明
一側面において、本発明は二酸でアシル化されたDPP-IV安定性GLP-1類似体に関する。
【００２６】
一側面において、本発明はアシル化されたGLP-1類似体であって、前記GLP-1類似体がDPP-IVに対して、当該配列GLP-1(7-37)(配列番号１)に関して7位および8位の少なくとも１つのアミノ酸残基を修飾することによって安定化される、並びに前記アシル化が前記GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基に対して直接に結合された二酸であるアシル化されたGLP-1類似体に関する。
【００２７】
本発明の一態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のリジン残基のイプシロンアミノ基に対して結合される。
【００２８】
本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、延長されたC末端を有する、例えば、当該類似体は、配列GLP-1(7-37)(配列番号１)に関して38位にアミノ酸残基を含む。そのような類似体は、更に、39位、40位、41位などにアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００２９】
本発明のもう一つの態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のLys38に対して結合している。
【００３０】
本発明のもう一つの態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のLys39に対して結合している。
【００３１】
本発明のもう一つの態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のLys40に対して結合している。
【００３２】
本発明のもう一つの態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のLys41に対して結合している。
【００３３】
本発明のもう一つの態様において、前記二酸は、前記GLP-1類似体のLys37に対して結合している。
【００３４】
本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、N末端での修飾、例えば、天然His7またはAla8の修飾などを含む。
【００３５】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、7位類似体、ここで、天然His7がイミダゾプロピニル７、α-ヒドロキシ-ヒスチジン７またはN-メチル-ヒスチジンにより置換されている類似体であってもよい。
【００３６】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、7位類似体、ここで、天然His7がD-ヒスチジン７、デスアミノヒスチジン７、2-アミノ-ヒスチジン７、β-ヒドロキシヒスチジン７、ホモヒスチジン７、Nα-アセチルヒスチジン７、α-フルオロメチルヒスチジン７、α-メチルヒスチジン７、3-ピリジルアラニン７、2-ピリジルアラニン７または4-ピリジルアラニン７によって置換されている類似体であってもよい。
【００３７】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、8位類似体、ここで、天然Ala8がAib8、Gly8、Val8、Ile8、Leu8、Ser8またはThr8により置換されている類似体であってもよい。
【００３８】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)配列の8位におけるL-アラニンの(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロへプチル)カルボン酸または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸への置換を含んでもよい。
【００３９】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は22位の天然GlyのGlu残基への置換を含んでもよい。
【００４０】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は16位の天然ValのLeu残基への置換を含んでもよい。
【００４１】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は30位の天然のAlaのGlu 残基への置換を含んでもよい。
【００４２】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記二酸がジカルボン酸であってもよい。
【００４３】
更に、本発明のもう一つの態様において、当該アシル化基が直鎖または分岐したアルカンα,ω-ジカルボン酸であってもよい。
【００４４】
更に、本発明のもう一つの態様において、当該アシル化基が構造HOOC-(CH2)nCO-を有してよく、ここでnは12〜20である。
【００４５】
更に、本発明のもう一つの態様において、当該アシル化基がHOOC-(CH2)14CO-, HOOC-(CH2)15CO-, HOOC-(CH2)16CO-, HOOC-(CH2)17CO-, and HOOC-(CH2)18CO-から選択される構造を有してもよい。
【００４６】
更に、本発明のもう一つの態様において、当該アシル化基が構造HOOC-(CH2)16CO-を有してもよい。
【００４７】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号１)に比較して、置換、付加または欠失している15以下アミノ酸残基、またはGLP-1(7-37)(配列番号１)に比較して、置換、付加または欠失されている10以下のアミノ酸残基を有してもよい。
【００４８】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号１)に比較して置換、付加または欠失されている6以下のアミノ酸残基を有してもよい。
【００４９】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は遺伝コードによりコードされない6以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５０】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、遺伝コードによりコードされない5以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５１】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、遺伝コードによりコードされない4以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５２】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、遺伝コードによりコードされない3以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５３】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、遺伝コードによりコードされない2以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５４】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は、遺伝コードによりコードされない1以下のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５５】
更に、本発明のもう一つの態様において、前記GLP-1類似体は1つのリジン残基のみを含んでもよい。
【００５６】
更に、本発明のもう一つの態様において、そのC末端アミノ酸残基において直接的に二酸でアシル化されている前記DPP-IV安定化GLP-1類似体は、
[Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{17-カルボキシヘプタデカノイル}-OH
【化６】
2008515856.tif 000002
【００５７】
または
[Gly8,Arg26,34,36]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-OH
【化７】
2008515856.tif 000003
【００５８】
または
[アルファヒドロキシデスアミノ-His7,Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-OH
【化８】
2008515856.tif 000004
【００５９】
または
[Gly8,Glu22,23,30,Arg18,26,34]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-NH2
【化９】
2008515856.tif 000005
【００６０】
または
[Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(19-カルボキシノナデカノイル)-OH
【化１０】
2008515856.tif 000006
【００６１】
であってよい。
【００６２】
もう一つの側面において、本発明は、GLP-1類似体の患者における作用時間を増加する方法であって、前記GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基において直接的に二酸で前記GLP-1類似体をアシル化することを特徴とする方法に関する。
【００６３】
もう一つの側面において、本発明は、GLP-1類似体の患者における作用時間を約40時間よりも長くまで増加する方法であって、GLP-1(7-37)ペプチドまたはその類似体の7位および8位における少なくとも1つのアミノ酸残基を修飾する、および当該GLP-1類似体のC末端アミノ酸残基を二酸で直接にアシル化することを特徴とする方法に関する。
【００６４】
当該GLP-1類似体は、古典的なペプチド合成、例えば、t-BocまたはF-Mocケミストリーを使用する固相ペプチド合成、または他の十分に確立された技術、例えば、例を参照したり、例えば、ホーウェン-ヴァイル、メソッド・オブ・オーガニック・ケミストリー(Houben-Wey, Methods of organic Chemistry)、E 22a巻, E22b 巻およびE 22C巻；グリーンおよびウーツ、「有機合成における保護基」、ジョン・ワイリー＆サンズ(Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", Jogn Wiley & Sons)、1999などを参照されたい。
【００６５】
治療に役立つポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするDNAを含み、且つ当該ポリペプチドが発現可能なホスト細胞を適切な栄養性培地中で当該ペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、その後得られたペプチドを当該培養物から回収することを含む方法により産生することが可能である。
【００６６】
当該細胞を培養するために使用される当該培地は、当該ホスト細胞の増殖のために適切な何れかの慣習的な培地であればよく、例えば、適切なサプリメントを含む最少培地またはコンプレックス培地などであればよい。適切な培地は、商業的な供給者から入手することが可能であり、または公表されている処方に従って調製してもよい(例えば、the American Type Culture Collection中など)。当該細胞において産生された当該ペプチドは、その培地から慣習的な手順により回収されてよく、例えば、そのような手段は、遠心または濾過により当該培地からホスト細胞を分離すること、その上清のタンパク質の成分を沈殿すること、または塩、例えば、硫酸アンモニウムなどを用いて濾過すること、種々のクロマトグラフィ手順、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどにより、問題のペプチドの種類に応じた手順により精製することなどを含んでもよい。
【００６７】
治療に役立つポリペプチドをコードするDNA配列は、適切にゲノムまたはcDNA起源であってもよく、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリーを調製することおよび当該ポリペプチドの全て若しくは一部分をコードするDNA配列を合成オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることなど、標準的な技術に従って、得てもよい(例えば、以下を参照されたい; Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989)。当該ポリペプチドをコードするDNA配列はまた、合成的に確立された標準的な方法、例えば以下の文献に記載されるホスホアミダイト方法(phoxphoamidite method)などにより調製されてもよい; Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869, or the method described by Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805。当該DNA配列はまた、特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応法、例えば、以下に記載されるような方法により調製されてもよい；US 4,683,202 または Saiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491。
【００６８】
当該DNA配列は、何れかのベクターに挿入されてもよく、それが都合よく組換えDNA手順に供されてもよく、またベクターの選択は多くの場合、導入されるべきホスト細胞に従うであろう。従って、当該ベクターは、自律的複製ベクター、即ち、染色体外の存在として存在するベクターであっても、その複製が染色体性の複製とは無関係であるベクターであっても、例えば、プラスミドであってもよい。或いは、当該ベクターはホスト細胞に導入された際に、当該ホスト細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。
【００６９】
当該ベクターは、好ましくは、発現ベクターであり、そこにおいて、当該ペプチドをコードするDNA配列は当該DNAの転写のために必要な更なる部分、例えば、プロモーターなどに機能可能に連結される。当該プロモーターは、選択されたホスト細胞において転写活性を示す何れのDNA配列であってもよく、当該ホスト細胞と同族または異種の何れのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。多様なホスト細胞において、本発明の当該ペプチドをコードするDNAの転写を方向付ける適切なプロモーターの例は、当該分野において周知であり、例えば、前掲のサンブロック(Sambrock)らの文献などに記載される。
【００７０】
当該ペプチドをコードするDNA配列はまた、必要であれば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写性のエンハンサー配列および翻訳性のエンハンサー配列に機能可能に連結されてもよい。本発明の当該組換えベクターは更に、問題のホスト細胞において当該ベクターの複製を可能にするDNA配列を含んでもよい。
【００７１】
当該ベクターはまた、選択可能なマーカーを含んでもよく、例えば、その産生物が当該ホスト細胞における欠損を補う遺伝子、または薬物に対する耐性を与える遺伝子などであってよく、またそのような薬物は例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートなどであってよい。
【００７２】
本発明の親ペプチドを当該ホスト細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌シグナル配列(また、リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている)が当該組換えベクターに提供されてもよい。当該分泌シグナル配列は、当該ペプチドをコードするDNA配列に対して正しいリーディングフレームで連結される。分泌シグナル配列は、一般に当該ペプチドをコードするDNA配列より5'に配置される。当該分泌シグナル配列は、通常当該ペプチドと関連するものであってもよく、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に基づいてもよい。
【００７３】
当該ペプチドをコードするDNA配列、当該プロモーターおよび任意に当該ターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結するため、並びにそれらを複製のために必要な情報を含む適切なベクターに対して挿入するための手順は、当業者には周知である(例えば、サンブロックらの前掲の文献を参照されたい)。
【００７４】
当該DNA配列または組換えベクターを導入するホスト細胞は、当該ペプチドを産生することが可能な何れの細胞であってもよく、それらは細菌、酵母、真菌および高等真核生物細胞を含む。適切なホスト細胞の例は周知であり、当該技術分野において使用されるものは、これに限定するものではないが、E.coli、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)または哺乳類のBHKまたはDHO細胞系などである。
【００７５】
本発明に従うGLP-1部分として有用な化合物の例は、国際特許出願No.WO 87/06941(The General Hospital Corporation)に記載されるものであり、この文献はGLP-1(7-37)およびその誘導体を含むペプチドフラグメント並びにインスリン分泌性薬剤としてのその使用に関する。
【００７６】
更にGLP-1類似体は、国際特許出願No.90/11296(The General Hospital Corporation)に記載されており、この文献は、GLP-1(7-36)およびその機能的な誘導体を含む、GLP-1(1-36)またはGLP-1(1-37)を上回るインスリン分泌活性を有するペプチドフラグメント並びにそれらのインスリン分泌性薬剤としての使用に関する。
【００７７】
国際特許出願No,91/11457(Buckleyら)は、活性なGLP-1ペプチド7-34、7-35、7-36および7-37の類似体を開示するものであり、これらは、本発明に従うGLP-1部分として有用でもある。
【００７８】
医薬組成物
本発明に従う化合物を含む医薬組成物は、慣習的な技術により製造されてよく、例えば、以下の文献に記載される通りに製造されてもよい；Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 または Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995。
【００７９】
本発明の1つの目的は、本発明に従う化合物を約0.1mg/mL〜約25mg/mLの濃度で含む医薬製剤を提供することであり、ここにおいて、前記製剤はpH2.0〜10.0であってもよい。当該医薬製剤は、本発明に従う化合物を0.1mg/mL〜約50mg/mLの濃度で含んでもよく、ここにおいて前記製剤がpH2.0〜10.0であってもよい。当該製剤は、更に、バッファー系、保存剤、等張剤、キレート剤、安定化剤および界面活性剤を含んでもよい。本発明の一つの態様において、当該医薬製剤は水性製剤、即ち、水を含む製剤である。そのような製剤は典型的に溶液または懸濁液である。更なる本発明の態様において、当該医薬製剤は、水性溶液である。用語「水性製剤」は、少なくとも水中で50重量パーセント(50％w/w water)で含む製剤として定義される。同様に、用語「水性溶液」は、少なくとも水中で50重量パーセント(50％w/w water)で含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は少なくとも水中で50重量パーセント(50％w/w water)で含む懸濁液として定義される。
【００８０】
もう一つの態様において、当該医薬製剤は凍結乾燥製剤であり、それに対して、医師または患者が使用に先駆けて溶媒および／または希釈液を添加するものである。
【００８１】
もう一つの態様において、当該医薬製剤は、溶解以前に何れの調製も不要であるように使用のために準備ができた乾燥製剤(例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥)である。
【００８２】
更なる側面において、本発明は、本発明に従う化合物の水溶液およびバッファーを含む医薬製剤であって、前記化合物が0.1mg/mLまたはそれ以上の濃度で存在し、前記製剤がpH約2.0〜約10.0である医薬製剤に関する。
【００８３】
更なる側面において、本発明は、本発明に従う化合物の水溶液およびバッファーを含む医薬製剤であって、前記化合物が0.1mg/mLまたはそれ以上の濃度で存在し、前記製剤がpH約7.0〜約8.5である医薬製剤に関する。
【００８４】
本発明のもう一つの態様において、当該製剤のpH値は、2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, および 10.0からなるリストから選択される。好ましくは、当該製剤のpHは、本発明に従う化合物の等電点から少なくとも1pH単位にあるpHであり、なおより好ましくは本発明に従う化合物の等電点から少なくとも2pH単位にあるpHである。
【００８５】
本発明の更なる態様において、当該バッファーは以下の群から選択される；酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸一ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ヘペス(hepes)、バイシン(bicine)、トリシン(tricine)、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはそれらの混合物。これらの明示されたバッファーのそれぞれが、本発明の代替的な態様を構成する。
【００８６】
本発明の更なる態様において、当該製剤は、更に薬学的に許容される保存剤を含む。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、以下の群から選択される；フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、エタノール、クロロブタノール、およびチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミドウレア(imidurea)、クロロヘキシジン、ソディウム  デハイドロアセテート(sodium dehydroacetate)、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェニシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)またはそれらの混合物。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、0.1mg/mL〜30mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、0.1mg/mL〜20mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、0.1mg/mL〜5mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、5mg/mL〜10mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該保存剤は、10mg/mL〜20mg/mLの濃度で存在する。これらの明示された保存剤の各々が本発明の代替的な態様を構成する。医薬組成物における保存剤の使用は当業者に周知である。例えば、便利な参考文献はRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995である。
【００８７】
本発明の更なる態様において、当該製剤は更に等張剤を含む。本発明の更なる態様において、当該等張剤は、以下からなる群から選択される；塩(例えば、塩化ナトリウムなど)、糖または糖アルコール、アミノ酸(例えば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンなど)、アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、またはそれらの混合物。何れの糖、例えば、モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、または水可溶性グルカンなど、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可能性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース-Naなどを含むが、これらが使用されてもよい。糖アルコールは、少なくとも一つの-OH基を有するC4-C8炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラシチトール(galacititol)、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールなどを含む。一つの態様において、糖アルコール添加物はマンニトールである。上で言及された糖または糖アルコールは、個々に使用されても、組み合わせて使用されてもよい。使用される量は、糖または糖アルコールが当該液体製剤に可能である限り、また本発明の方法を使用して達成される安定化された効果に不利な効果がない限り、固定された制限はない。一つの態様において、糖または糖アルコールの濃度は、約1mg/mL〜約150mg/mLである。本発明の更なる態様において、当該等張剤は1mg/mL〜50mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該等張剤は1mg/mL〜7mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該等張剤は8mg/mL〜24mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該等張剤は25mg/mL〜50mg/mLの濃度で存在する。これら明示した等張剤のそれぞれが本発明の代替的な態様を構成する。医薬組成物における等張剤の使用は当業者
に周知である。便利な参考文献に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995がある。
【００８８】
本発明の更なる態様において、当該製剤は更にキレート剤を含む。本発明の更なる態様において、当該キレート剤は以下から選択される；エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、クエン酸およびアスパラギン酸、並びにその混合物。本発明の更なる態様において、当該キレートは、0.1mg/mL〜5mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該キレート剤は、0.1mg/mL〜2mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、当該キレート剤は2mg/mL〜5mg/mLの濃度で存在する。これらの明示されたキレート剤の各々が本発明の代替的な態様を構成する。医薬組成物におけるキレート剤の使用は当業者に周知である。便利な参考文献に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995がある。
【００８９】
本発明の更なる態様において、当該製剤は安定化剤を含む。医薬組成物における安定化剤の使用は当業者に周知である。便利な参考文献にRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995がある。
【００９０】
更に、とりわけ、本発明の組成物は、安定化された液体医薬組成物であり、その治療学的に活性な成分はポリペプチドを含み、これは、貯蔵中に液体医薬製剤において凝集形成を呈する可能性がある。「凝集形成」は、当該ポリペプチド分子間の物理的な相互作用を意図し、凝集形成により、可溶性のままであり得る、オリゴマー、または当該溶液から沈殿する大きな目に見える凝集が生じる。「貯蔵中」は、一旦調製された液体医薬組成物または製剤が、対象に対して直ぐには投与されないことを意図する。寧ろ、以下の製剤、それは、対象に対する投与するための液体形態または他の適切な形態に後に再構成するために、貯蔵のための液体形態、凍結状態、または乾燥形態の何れかにパッケージされる。「乾燥形態」は、液体医薬組成物または製剤であって、凍結乾燥(freeze drying)(即ち、凍結乾燥(lyophilization);例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照されたい)、噴霧乾燥(Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照されたい)、または空気乾燥(Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)の何れかにより乾燥される。液体医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成は、そのポリペプチドの生物学的活性に不利に影響する可能性があり、それにより当該医薬組成物の治療効果の損失を生じる可能性がある。更に、凝集形成は、他の問題、例えば、当該ポリペプチド含有医薬組成物が注入系を使用して投与される場合に、チューブ押出、膜、またはポンプを詰まらせるなどの問題の原因となる可能性がある。
【００９１】
本発明の医薬組成物は更に、十分な量のアミノ酸塩基を含み、組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成を減少してもよい。「アミノ酸塩基」は、アミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを意図し、何れかの問題のアミノ酸が、その遊離塩基形態またはその塩形態の何れかで存在することを意図する。アミノ酸の組み合わせで使用される場合、そのアミノ酸の全てが遊離塩基形態で存在してもよく、全てがそれらの塩形態で存在してもよく、或いは幾らかがそれらの遊離塩基の形態で存在すると同時に他がそれらの塩形態で存在してもよい。一つの態様において、本発明の組成物を製造するために使用されるアミノ酸は、荷電した側鎖を有するもの、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸などである。一つの態様において、本発明の組成物を製造するために使用されるアミノ酸はグリシンである。特定のアミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニンおよびその混合物)の何れかの立体異性体(即ち、LまたはD)、またはこれらの立体異性体の組み合わせも、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態またはその塩形態の何れかで存在する限り、本発明の医薬組成物において存在してもよい。一つの態様において、L-立体異性体が使用される。本発明の組成物はまた、これらのアミノ酸の類似体で製剤化されてもよい。「アミノ酸類似体」は、本発明の液体医薬組成物の貯蔵中のポリペプチドによる凝集形成を減少する望ましい効果などを生ずる天然に存在するアミノ酸の誘導体を意図する。適切なアルギニン類似体は、例えば、アミノグアニジン、オルニチンまたはN-モノエチルL-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体は、エチオニンおよびブチオニンを含み、適切なシステイン類似体は、S−メチル−L システインを含む。他のアミノ酸と一緒の場合でも、当該アミノ酸類似体は、それらの遊離塩基形態またはそれらの塩形態の何れかにおいても当該組成物に組み込まれてよい。本発明の更なる態様において、当該アミノ酸またはアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止するまたは遅らせるために十分な濃度で使用される。
【００９２】
本発明の更なる態様において、治療剤として作用するポリペプチドが、以下のような酸化を受けやすい少なくとも一つのメチオニン残基を含むポリペプチドである場合に、メチオニン(または他の硫黄を含むアミノ酸若しくはアミノ酸類似体)を添加して、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害してもよい。「阻害」は、メチオニン酸化型種を長時間に亘り最少な蓄積に留めることを意図する。メチオニンの酸化を阻害することにより、当該ポリペプチドをその適切な分子形態により長く維持させる。何れの立体異性体のメチオニン(L、Dまたはその混合物)であっても使用できる。追加されるべき量は、メチオニンスルホキシドの量が規制する機関に対して許容されるように、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量であるべきである。典型的には、これは、当該組成物が約10％〜約30％以下でメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般的には、これは、添加されるメチオニンの割合が約1:1〜約1000:1、例えば、10:1〜約100:1の範囲のメチオニン残基になるようにメチオニンを添加することによって達成される。
【００９３】
本発明の更なる態様において、当該製剤は更に高分子量ポリマーまたは低分子量化合物の群から選択される安定化剤を含む。本発明の更なる態様において、当該安定化剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG3350など)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-／ヒドロキシセルロースまたはその誘導体(例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LLおよびHPMCなど)、シクロデキストリン、硫黄含有物質、例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2−メチルチオエタノオール、他の塩(例えば、塩化ナトリウムなど)から選択される。これらの特定の安定化剤のそれぞれが本発明の代替の態様を構成する。
【００９４】
当該医薬組成物はまた、付加的な安定化剤であって、そこにおいて治療学的活性ポリペプチドの安定性を更に高める安定化剤を含んでもよい。本発明にとって特に重要な安定化剤は、これらに制限するものではないが、メチオニンおよびEDTAであり、これらは当該ポリペプチドをメチオニン酸化から保護するものであり、並びに非イオン性界面活性剤、これは当該ポリペプチドを凍結-解凍または機械的なシャーリングから保護するものである。
【００９５】
本発明の更なる態様において、当該製剤は更に界面活性剤を含む。本発明の更なる態様において、当該界面活性剤は、以下から選択される；洗浄剤(detergent)、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド(polyglycolyzed glyceruides)、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、ポロキサマー(poloxamers)、例えば、Pluronic(登録商標)F68、ポロキサマー188および407、トリトンX-100など)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スターシェイプPEO(starshaped PEO)、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体、例えばアルキル化およびアルコキシル化誘導体(tween、例えば、Tween-20、Tween-40、Tween-80およびBrij-35など)、ヒドロキシステアリン酸ポリオキシエチレン、モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリンなど)、リン脂質の誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸など)およびリゾリン脂質(例えば、パルミトイルリゾホスファチジルーL-セリンおよび1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスフェートエステルのエタノールアミン、コリン、セリンまたはトレオニン)およびアルキル、アルコキシ(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体のリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリン、例えば、ラウロイルおよびミリストイル誘導体のリゾホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、および極性の先基(polar head group)の修飾、即ち、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、トレオニン、グリセロール、イノシトール、および正荷電DODAC、COTMA、DCP、BISHOP、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルトレオニンおよびグリセロリン脂質(例えば、セファリン(cephalines))、グリセログリコリピッド(例えば、ガラクトピランソイド(galactopyransoide))、スフィンゴグリコリピッド(例えば、セラミド、ガングリオシド(gangliosides))、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えば、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウムなど)、長鎖脂肪酸およびその塩C6-C12(例えば、オレイン酸およびカプリル酸など)、アシルカルニチンおよび誘導体、Nα-アシル化誘導体のリジン、アルギニンまたはヒスチジン、または側鎖アシル化誘導体のリジンまたはアルギニン、リジン、アルギニンまたはヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の何れかの組み合わせを含むジペプチドのNα−アシル化誘導体、中性アミノ酸および二価負荷アミノ酸何れかの組み合わせを含むトリペプチドのNα-アシル化誘導体、DSS(ドキュセートナトリウム(docusate sodium)、(CAS登録番号[577-11-7])、ドキュセートカルシウム(CAS登録番号[128-49-4])、ドキュセートカリウム、CAS登録番号[749-09-0]）、SDS(ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム)、ソディウムキャピレート(sodium caprylate)、コール酸またはその誘導体、胆汁酸およびその塩およびグリシンまたはタウリン複合体、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、陰イオン性(アルキル-アリール-スルホネート)一価界面活性剤、双性イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチル-アンモニオ-1-プロパンスルホネート、3-コールアミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート)、陽イオン性界面活性剤(四級アンモニウム塩基)(例えば、セチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-グルコピラノシド)、ポロキサミン(例えば、テトロニックス(Tetronic's))、これはエチレンジアミンに対してプロピレンオキシドを連続して添加することに由来する四官能価ブロックコポリマーであり、当該界面活性剤は、イミダゾリン誘導体またはその混合物の群から選択されてよい。これらの特定の界面活性剤のそれぞれは本発明の代替の態様を構成する。
【００９６】
医薬組成物における界面活性剤の使用は当業者に周知である。便利な参考文献は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995である。
【００９７】
GLP-1化合物の非経口投与のための組成物は、例えば、WO 03/002136に開示されている通りに製造されてよい。
【００９８】
他の成分が本発明の当該ペプチド医薬製剤に存在することも可能である。そのような追加の成分は湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性溶媒、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質など)および双性イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなど)を含んでよい。そのような追加の成分は、もちろん、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に不利に影響すべきではない。
【００９９】
本発明の化合物を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に対して、様々な部位で、例えば、局所的部位で、例えば、皮膚および粘膜部位で、吸収をバイパスする部位で、例えば、動脈内、静脈内、心臓内への投与、および吸収に関連する部位、例えば、皮膚、皮下、筋肉内または腹部への投与など、に投与されてよい。
【０１００】
本発明に従う医薬組成物の投与は、種々の投与経路を介してもよく、例えば、舌、舌下、頬側、口腔内、経口、胃内および腸内、経鼻、肺、例えば、細気管支(bronchiole)および肺胞またはその組み合わせを介して、表皮、経皮、経皮的、膣、直腸、眼、例えば、結膜を介して、尿管および非経口的に、そのような必要な患者に対して行われてよい。
【０１０１】
本発明の組成物は、種々の投与形態、例えば、溶液、懸濁液、乳剤、ミクロエマルジョン、マルチプルエマルジョン形態、膏薬、プラスター、軟膏剤、錠剤、コーティング錠剤、すすぎ液、カプセル、例えば、硬ゼラチンカプセルおよび軟ゼラチンカプセル、坐薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアロゾル、吸入剤、点眼薬、眼軟膏、眼科用すすぎ液、膣坐薬、膣用すすぎ液、膣用軟膏、注射溶液、インサイチュー・トランスフォーミング溶液、例えば、インサイチューゲル化(in situ gelling)、インサイチュー・セッティング(in situ setting)、インサイチュー沈殿、インサイチュー結晶化、注入溶液およびインプラントなどで投与されてよい。
【０１０２】
本発明の組成物は、例えば、共有結合、疎水性および静電気的な相互作用を介して、薬物担体、薬物送達系、高度薬物送達系に、更に、配合されてもよく、または関連付けられてもよく、それにより、当該化合物の安定性が更に増強されたり、生物学的利用能が増大したり、溶解度が増加したり、有害な作用が減少したり、当業者に周知の時間療法が達成されたり、並びに        患者のコンプリアンスが上がったりまたはその何れかの組み合わせであったりする。担体、薬物送達系および高度薬物送達系の例は、これに制限するものではないが、ポリマー、例えば、セルロースおよび誘導体、ポリサッカリド、例えば、デキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アシル化およびメタアクリレートポリマー、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えば、アルブミン、ゲル、例えば、サーモゲリング(thermogelling)系、例えば、当業者に周知のブロックコ-ポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフェア、ナノパーティキュレート、液晶、およびその分散系、L2相およびその分散系、液体-水系における相行動は当業者に周知、ポリマー性ミセル、マルチエマルジョン、自己乳状化、自己マイクロエマルジョン化、シクロデキストリンおよびその誘導体、およびデンドライマー(dendrimer)を含む。
【０１０３】
本発明の組成物は、例えば、メータ・ドーズ・インヘラー(meterd dose inhaler)、ドライパウダーインヘラーおよびネブライザー(これらは全て当業者には周知の装置である)を使用する当該化合物の肺投与のための固体、半固体、パウダーおよび溶液の形態において有用である。
【０１０４】
本発明の組成物は、制御された、持続性の、遅延性の、遅延された、および緩徐放出薬物送達系の製剤において特に有用である。更にとりわけ、しかしながら、これらに制限するものではないが、組成物は、非経口制御性放出および持続性放出系(両系とも投与回数を何倍も減らすことが可能である)の形態において有用であり、これらの系は当業者に周知である。更により好ましくは、皮下で投与される制御性放出および持続性放出系である。本発明の範囲を制限するものではないが、有用な制御性放出系および組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフェア、ナノパーティクルを含む。
【０１０５】
本発明の組成物のために有用な制御性放出系を製造するための方法は、これらに制限するものではないが、結晶化、凝集、共結晶化(co-cystallization)、沈殿、共沈殿、乳状化、分散、高圧均質化(high pressure homogenization)、カプセル封入、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、マイクロスフェアを生じるための溶媒蒸発、押し出し形成、超臨界流体加工(supercritical fluid processes)を含む。一般的な参考文献は、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) and Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000)がある。
【０１０６】
非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内に、注射器、任意にはペン型注射器により実施されてもよい。或いは、非経口投与は、注入ポンプにより実施できる。更なる選択は、経鼻または肺用スプレーの形態にある本発明の化合物の投与のための溶液または懸濁液であってもよい組成物である。また更なる選択として、本発明の化合物を含む医薬組成物は、経皮的投与、例えば、無針注射またはパッチ、任意にはイオン注入用パッチ、または経粘膜、例えば、バッカル、投与に適応されてもよい。
【０１０７】
用語「安定化製剤」は、物理的な安定性が増大された、化学的な安定性が増大されたまたは物理学的および化学的安定性が増大された製剤をいう。
【０１０８】
ここで使用されるタンパク質製剤の用語「物理学的安定性」とは、生物学的に不活性なおよび／または不溶解性のタンパク質の凝集を形成する傾向をいい、これは、当該タンパク質が、タンパク質が熱-機械的ストレスおよび／または不安定化する境界面および表面、例えば、疎水性表面および境界性などとの相互作用に暴露された場合に結果として生じる。水性タンパク質製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えば、カートリッジまたはバイアル)に充填された当該製剤を、機械的／物理的ストレス(例えば、撹拌など)に対して異なる温度で種々の期間に亘って暴露した後に、視覚検査および／または濁り測定の手段により評価する。製剤の視覚検査は、暗背景で鋭く焦点を合わせたライト中で実施される。製剤の濁りは、例えば、スケール０〜３（濁りが見えない製剤は視覚スコア０に対応、および明所で見える濁りを示した製剤は視覚スコア３に対応）の程度に視覚スコアを等級付けすることにより特徴付けられる。それが明所における視覚的濁りを示すとき、その製剤は、タンパク質凝集に関して物理学的不安定に分類される。或いは、当該製剤の濁りは、当業者に周知の簡単な濁り測定によって測定される。当該水性タンパク質製剤の物理的安定は、また、当該タンパク質の構造状態のための分光学的薬剤またはプローブを使用することにより評価される。当該プローブは好ましくは、当該タンパク質構造の非天然構造に対して優先的に結合する小分子である。小分子の分光学的プローブの一つの例は、チオフラビンTデアル。チオフラビンTは、蛍光色素であり、広くアミロイド原繊維の検出のために使用されている。原繊維、恐らく同様に他のタンパク質組織の存在において、チオフラビンTは、新たに約450nmで最大の励起と原線維タンパク質形態に対して結合した際には約482nmでの増強された発光が生じる。未結合のチオフラビンTは、基本的にその波長では無蛍光である。
【０１０９】
他の小分子は、天然から非天然状態へのタンパク質構造の変化を示すプローブとして使用される。例えば、「疎水性パッチ」プローブは、優先的にタンパク質の暴露された疎水性パッチに結合する。当該疎水性パッチは、一般的には、その天然状態におけるタンパク質の三次構造においては埋没しているが、タンパク質が展開または変性されたときに露出するようになる。これらの小分子、分光学的プローブの例は、芳香族、疎水性色素であり、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナンチロリン(phenanthroline)などである。他の分光学的プローブは金属アミノ酸複合体、例えば、コバルトメタル複合体の疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなどである。
【０１１０】
ここで使用されるタンパク製剤の「化学的安定性」の用語は、当該タンパク質構造における化学的共有結合性の変化をいい、これは、当該天然タンパク質構造に比べて、生物学的効力のポテンシャルが少ないおよび／または免疫原性の性質のポテンシャルが高い化学的分解産物を導くものである。種々の化学的分解産物は、天然タンパク質の種類および性質、並びに当該タンパク質が暴露される環境に依存して形成される。化学的分解の排除は、非常に高い確率で、完全には避けることは不可能であり、当業者に周知のように、化学的分解産物の増加は、当該タンパク質製剤を貯蔵および使用している間に多くの場合に見られる。多くのタンパク質には、脱アミドの傾向があり、その過程は、グルタミニルまたはアスパラギニル基における側鎖アミド基が加水分解され、遊離カルボン酸を形成するものである。他の分解経路は、高分子量の変型産物の形成に関するものであり、そこにおいては、2以上のタンパク質分子が、アミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合したダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解産物が形成されるものである(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化(例えば、メチオニン残基の酸化など)は、別の種々の化学分解として言及される。タンパク質製剤の化学的安定性は、異なる環境状態に暴露した後に種々の時点で化学的分解産物の量を測定することにより評価することが可能である(分解産物の形成は多くの場合、例えば、温度の上昇などにより加速する)。各々個々の分解産物の量は、多くの場合、当該分解産物を分子サイズおよび／または電荷に依存して、種々のクロマトグラフィ技術(例えば、SEC-HPCLおよび／またはRP-HPLCなど)を使用して分離することにより決定される。
【０１１１】
従って、上に概説したように、「安定化製剤」は、高い物理的安定、高い化学的安定および高い物理および化学的安定を有する製剤をいう。一般的に、製剤は、(推奨される使用及び貯蔵条件に従う)使用および貯蔵中において使用期限日に到達するまでは安定していなくてはならない。
【０１１２】
本発明の一つの態様において、本発明に従う化合物を含む医薬製剤は、６週間より長い使用および３年よりも長い貯蔵において安定である。
【０１１３】
本発明の更なる態様において、本発明に従う化合物を含む医薬製剤は、４週間より長い使用および３年よりも長い貯蔵において安定である。
【０１１４】
本発明の更なる態様において、本発明に従う化合物を含む医薬製剤は、４週間より長い使用および２年よりも長い貯蔵において安定である。
【０１１５】
更に、本発明の更なる態様において、当該化合物を含む医薬製剤は、２週間より長い使用および２年よりも長い貯蔵において安定である。
【０１１６】
本発明に従うGLLP-1誘導体を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする患者に対して非経口的に投与されてよい。非経口的投与は、注射器、任意にペン型注射器により皮下、筋肉内または静脈内に注入されてよい。或いは、非経口投与は、注入ポンプにより実行されてよい。更なる選択は、経鼻または肺用スプレーの形態にあるGLP-1誘導体の投与のためのパウダーまたは液体であってもよい組成物である。更なる選択として、本発明のGLP-1誘導体は、また、経皮的に、例えば、パッチ、任意にイオン導入パッチまたは経粘膜的に、例えば、バッカルにより投与されてもよい。
【０１１７】
従って、本発明のGLP-1誘導体の注射可能な組成物は、製薬産業の慣習的な技術を使用して製造され、それには、所望の最終産物を得るために適切な通りの成分を溶解することおよび混合することを含む。
【０１１８】
一つの手順に従うと、当該GLP-1誘導体は製造されるべき組成物の最終容量よりもやや少ない量の水に溶解される。等張剤、保存剤およびバッファーを必要に応じて添加し、その溶液のpH値を、必要であれば、酸、例えば、塩酸など、または塩基、例えば、水酸化ナトリウム水などで必要に応じて調整する。最後に、当該溶液の容量を水で調整して、所望の濃度の成分にする。
【０１１９】
上述の成分に更に付け加えると、本発明に従うGLP-1誘導体を含む溶液は、また、界面活性剤を含み、溶解性および／またはGLP-１誘導体の安定性を改善してもよい。
【０１２０】
あるペプチドの経鼻投与のための組成物は、例えば、欧州特許No. 272097 (to Novo Nordisk A/S)またはWO 93/18785に記載される通りに製造してよい。
【０１２１】
本発明の一つの好ましい態様に従うと、当該GLP-1誘導体は、注射による投与に適切な組成物の形態で提供される。そのような組成物は、使用のために容易な注射可能な溶液であってもよく、またはある量の固体組成物、例えば、凍結乾燥製品などであり、注射に使用される前に溶媒に溶解するべき形態であってもよい。注射可能な溶液は好ましくは約2mg/mL以上、好ましくは約5mg/mL以上、より好ましくは約10mg/mL以上のGLP-1誘導体を含み、好ましくは約100mg/mL以下のGLP-1誘導体を含む。
【０１２２】
本発明のGLP-1誘導体は、種々の疾患の治療において使用される。ある特定のGLP-1誘導体が使用され、何れかの患者に対する最適の用量レベルは、治療されるべき疾患および使用される特定のペプチド誘導体の効力、年齢、体重、物理的活性、当該患者の食餌を含む種々の因子、可能な他の薬物との組み合わせ、およびそのケースの重症度などに依存するであろう。本発明のGLP-1誘導体の用量は各個々の患者に対して当業者により決定されることが推奨される。
【０１２３】
特に、当該GLP-1誘導体は、非インスリン依存性糖尿病の治療および／または肥満の治療のために遅延性の活性プロフィールを有する医薬を製造するために使用されるであろうと考えられる。
【０１２４】
もう一つの側面において、本発明は、本発明に従う化合物の医薬の製造のための使用に関する。
【０１２５】
一つの態様において、本発明は、高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、肥満、高血圧、Ｘ症候群、異脂肪血症、β細胞アポトーシス、β細胞欠損、心筋梗塞、炎症性症候群、消化不良、認知症、例えば、認知亢進、ニューロプロテクション(neuroprotection)、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心臓疾患および他の心血管障害の治療のための医薬の製造のために使用することに関する。
【０１２６】
もう一つの態様において、本発明は、本発明に従う化合物の小腸症候群、炎症性腸症候群、クローン病を治療するための医薬を製造するための使用に関する。
【０１２７】
もう一つの態様において、本発明は、高血糖、１型糖尿病、２型糖尿病またはβ細胞欠損の治療のための医薬の製造のための本発明に従う化合物の使用に関する。
【０１２８】
本発明に従う化合物での治療は、また、第二のまたは更なる薬理活性物質、例えば、以下から選択される物質と組み合わされてもよい；例えば、抗糖尿病薬、抗肥満薬、食欲調節薬、抗高血圧薬、糖尿病の結果または糖尿病に関連の合併症を治療および／または予防するための薬剤、並びに、肥満の結果または肥満に関連の合併症および障害を治療および／または予防するための薬剤。本明細書における表現「抗糖尿病薬」は、インスリン抵抗性およびインスリン抵抗性が病態生理学的機序である疾病の治療および／または予防のための化合物も含む。
【０１２９】
これらの薬理活性物質の例は次の通りである；インスリン、GLP-1アゴニスト、スルホニルウレア(例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリピザイド(glipizide)およびグリクラザイド(gliclazide))、ビグアニド、例えば、メトホルミン、メグリチニド、グルコシダーゼインヒビター(例えば、アコルボース)、グルカゴンアンタゴニスト、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼIV)インヒビター、ガストリン、糖新生および／またはグリコゲノライシス(glycogenolysis)の刺激に関連する肝臓酵素の阻害剤、グルコース取り込み調節剤、チアゾリジンジオン、例えば、トログリタゾンおよびシグリタゾン(ciglitazone)、脂質代謝を修飾する化合物、例えば、抗高脂血症剤、例えば、HMG CoA阻害剤(スタチン類)、     食物摂取を低下する化合物、RXRアゴニストおよびβ細胞のATP依存性カリウムチャネルにおいて作用する薬剤、例えば、グリベンクラミド、グリピザイド、グリクラザイドおよびレパグリニド(repaglinide)；コレスチラミン、コレスチポール、クロフィブレート、ゲンフィブロジル(gemfibrozil)、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、プロブコール、デキストロチロキシン(dextrothyroxine)、ネテグリニド(neteglinide)、レパグリニド(repaglinide)；βブロッカー、例えば、アルプレノロール(alprenolol)、アテノロール(atenolol)、チモロール(timolol)、ピンドロール、プロプラノロールおよびメトプロロール(metoprolol)、ACE(アンジオテンシン変換酵素)阻害剤、例えば、ベナゼプリル(benazepril)、カプトプリル、エナラプリル(enalapril)、ホシノプリル(fosinopril)、リシノプリル(lisinopril)、アラトリオプリル(alatriopril)、キナプリル(quinapril)およびラミプリル(ramipril)、カルシウムチャネルブロッカー、例えば、ニフェジピン、フェロジピン(felodipine)、ニカルジピン、イソラジピン、ニモヂピン、ジルチアゼムおよびベラパミル、およびα-ブロッカー、例えば、ドキサゾシン(doxazosin)、ウラピジル、プラゾシンおよびテラゾシン；CART(コカインアンフェタミン調節転写)アゴニスト、NPY(ニューロペプチドY)アンタゴニスト、MC4(メラノコルチン４)アゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、TNF(腫瘍壊死因子)アゴニスト、CRF(コルチコトロピン放出因子)アゴニスト、CRF BP(コルチコトロピン放出因子結合タンパク質)アンタゴニスト、ウロコルチンアゴニスト、β３アゴニスト、MSH(メラノサイト刺激ホルモン)アンタゴニスト、MCH(メラノサイト凝集ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取り込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(チレオトロピン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(アンカップリングタンパク質２または３)調節剤、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリピチン、ドプレキシン)、リパーゼ／アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)調節剤、TRβアゴニスト；ヒスタミンH3アンタゴニスト、ガストリンおよびガストリン類似体。
【０１３０】
上述の一以上の化合物を伴う本発明に従う化合物と、任意の一以上の更なる薬理活性物質との何れの適切な組み合わせも本発明の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１３１】
本発明は更に、以下の例により更に説明されるが、しかしながら、この例は権利範囲を制限すると解釈されるものではない。先の記述および以下の例において開示される特徴は、個々に、またはその何れかの組み合わせにおいて、その多様な形態にある本発明を理解するための材料であってよい。
【０１３２】
例
用いられる略語：
r.t  室温
DIEA  ジイソプロピルエチルアミン
H2O  水
CH3CN  アセトニトリル
DMF  NNジメチルホルムアミド
HBTU  2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート
Fmoc  9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル
Boc  tertブチルオキシカルボニル
OtBu  tertブチルエステル
tBu  tertブチル
Trt  トリフェニルメチル
Pmc  2,2,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル
Dde  1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DCM  ジクロロメタン
TIS  トリイソプロピルシラン
TFA  トリフルオロ酢酸
Et2O  ジエチルエーテル
NMP  1-メチル-ピロリジン-2-オン。
【０１３３】
ペプチドは、Applied Biosystems 433A ペプチド合成器でFmoc ストラテジーを用い、0.25mmolスケールで、当該製造者が供給するFastMoc UV プロトコルを用い、Fmoc保護化Rink アミド樹脂(Novabiochem)またはクロロトリチル樹脂上で合成された。該プロトコルは、N-メチルピロリドン(N-メチルピロリドン)中のHBTU(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3 テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート)媒介カップリング、及びFmoc 保護基の脱保護のUVモニタリングを用いる。用いられた保護化アミノ酸誘導体は、Fmoc-Aib-OH(Fmoc-アミノイソブチル酸)のような非天然のアミノ酸をのぞく標準的なFmoc-アミノ酸(Anaspec)であり、ABI433A合成器に適切な、予め坪量された（preweighed）カートリッジで供給された。
【０１３４】
側鎖及びリンカーの、粗製の樹脂結合保護化(protected)ペプチド上の特定のリジン残基への結合(attachment)は、Fmoc-Lys(Dde)-OHの組み込みにより特定の部位で行われ、この間ヒドラジンを用いた選択的な脱保護が後続する合成が自動的に行われた。
【０１３５】
Dde保護の除去手順
樹脂(0.25mmol)を手動の振盪／濾過装置に配し、N-メチルピロリドン中の2％ヒドラジンを用いて処理して(20mL, 2x12分)、DDE基を除去し、N-メチルピロリドンで洗浄した(4x20mL)。
【０１３６】
側鎖のリジン残基への結合手順
アミノ酸(樹脂に比例して４モル等量)を、N-メチルピロリドン／塩化メチレン (1:1, 10mL)中に溶解させた。ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(樹脂に比例して４モル等量)及びジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に比例して４モル等量)を添加し、溶液を15分撹拌した。該溶液を上記樹脂に添加し、ジイソプロピルエチルアミン(樹脂に比例して４モル等量)を添加した。樹脂を24時間室温で振盪した。樹脂をN-メチルピロリドン(2x20mL)、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1)(2x20mL)及び塩化メチレン(2x20mL) で洗浄した。
【０１３７】
Fmoc-保護の除去手順：
上記樹脂(0.25mmol)を、手動の振盪装置におけるフィルターフラスコ内に配し、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1)(2x20mL)及びN-メチルピロリドン(1x20mL)、N-メチルピロリドン中の20％ピペリジンの溶液 (3x20mL, 各10分)を用いて処理した。樹脂をN-メチルピロリドン(2x20mL), N-メチルピロリドン/塩化メチレン(1:1)(2x20mL) 及び塩化メチレン(2x20mL) で洗浄した。
【０１３８】
樹脂からのペプチドの切断手順：
トリフルオロ酢酸、水、及びトリイソプロピルシラン(95：2.5：2.5)の混合物とともに180分室温で撹拌することにより、ペプチドを樹脂から切断した。切断混合物(cleavage mixture)を濾過し、濾液を窒素流により濃縮して油状物にした。この油状物から45mL ジエチルエーテルを用いて粗製ペプチドを沈殿させ、45mL ジエチルエーテルで３回洗浄した。
【０１３９】
精製：
粗製ペプチドを、7μ C-18シリカが充填された20mm x 250mmカラム上の準分取用(semipreparative)HPLCにより精製した。ペプチドにより、２つ、１つまたは２つの(two one or two)精製系が用いられた。
【０１４０】
ＴＦＡ：乾燥させた後、粗製ペプチドを5mL 50％酢酸H2O中に溶解させ、H2Oで希釈して20mLとし、上記カラムに注入した後、0.1％TFA中の40-60％ CH3CN の勾配を用いて10mL/分で50分にわたり40℃で溶出した。画分を含んだペプチドが回収された。溶出液を水で希釈したのち、精製されたペプチドを凍結乾燥させた。
【０１４１】
硫酸アンモニウム：
上記カラムを、0.05M(NH4)2SO4中の40％ CH3CNで平衡化させ、濃縮したH2SO4でpH 2.5に調整した。乾燥後、粗製ペプチドを5mL 50％酢酸 H2O 中に溶解させ、H2Oで希釈して20mL とし、上記カラムに注入して、
0.05M(NH4)2SO4中の40-60％ CH3CN の勾配を用いて、pH 2.5で、10mL/分で50分にわたり40℃で溶出した。画分を含んだペプチドを回収し、３体積のH2Oで希釈し、Sep-Pak（登録商標）C18カートリッジ(Waters part. ＃:51910)を通過させたのち、0.1％ TFAで平衡化させた。ついで0.1％ TFA を含んだ70％ CH3CNを用いて溶出させ、溶液を水で希釈した後に、精製されたペプチドを、凍結乾燥させることにより分離した。
【０１４２】
得られた最終生成物は、分析RP-HPLC(保持時間)及びLCMSにより特徴づけられた。RP-HPLC分析は、214nmでのUV検出、及び1mL/分で42℃で溶出するVydac 218TP54 4.6mm x 250mm 5μC-18シリカカラム(The Separations Group, Hesperia, USA)を用いて行われた。以下の異なる溶出条件が用いられた：
Ａ１：0.1M(NH4)2SO4を含んだ緩衝液を用いてカラムを平衡化，濃縮されたH2SO4を用いてpH 2.5に調整され、同じ緩衝液中の0％〜60％ CH3CNの勾配により50分にわたり溶出。
【０１４３】
Ｂ１：0.1％TFA／H2Oを用いでカラムを平衡化，0％CH3CN／0.1％TFA／H2O〜60％CH3CN／0.1％TFA／H2Oの勾配により50分にわたり溶出。
【０１４４】
Ｂ６：0.1％TFA／H2Oを用いてカラムを平衡化，0％CH3CN／0.1％TFA／H2O〜90％CH3CN／0.1％TFA／H2Oの勾配により50分にわたり溶出。
【０１４５】
LCMSは、Hewlett Packardシリーズ1100 G1312A ビンポンプ、Hewlett Packardシリーズ1100カラムコンパートメント、Hewlett Packardシリーズ1100 G1315A DADダイオードアレイ検出器、Hewlett Packardシリーズ1100 MSD 、及びSedere 75 蒸発型光散乱式検出器からなる設備をHP Chemstation ソフトウェアにより制御して行われた。HPLCポンプは、以下を含んだ２つの溶出リザーバに連結される：
Ａ：水中の10mM NH4OH
Ｂ：90％アセトニトリル中の10mM NH4OH。
【０１４６】
分析を、適切な体積の試料(好ましくは20μL)を、Ａ及びＢの勾配を用いて溶出するカラムに注入することにより、23℃で行った。
【０１４７】
用いるHPLC 条件、検出器の設定、及び質量分析器の設定を以下の表に示す：
カラム  Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5μm
勾配  5％〜100％ アセトニトリル  リニア  6.5分間  1.5mL/分で。
【０１４８】
検出  210nm(DADからのアナログ出力)
ELS(ELSからのアナログ出力)
MSイオン化モードAPI-ES。走査100-1000amu  ステップ0.1amu。
【０１４９】
例１  [Aib8,Arg26,34] GLP-1(7-37)Lys{17-カルボキシヘプタデカノイル}-OH
【化１１】
2008515856.tif 000007
ABI433A機器上で製造者の指針にしたがい、樹脂(Rink アミド, 0.68mmol/g Novabiochem 0.25mmole)を用いて主要な配列（primary sequence）を生成した。保護基は全て、部位37で用いた残基 (FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem)を除き、他のいずれのリジンよりむしろこのリジンの特定の脱保護を可能にする酸不安定(acid labile)であった。
【０１５０】
手順
樹脂(0.25mmole)を手動の振盪／濾過装置に配し、N-メチルピロリドン中の2％ヒドラジンを用いて処理し(2x12分  2x20mL)、Dde基を除去した。樹脂をN-メチルピロリドンで洗浄した(4x20mL)。Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(Neosystem FA03202)(樹脂に比例して４モル等量)を、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1, 20mL)中に溶解させた。ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(樹脂に比例して４モル等量)及びジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に比例して４モル等量)を添加し、該溶液を15分撹拌した。この溶液を樹脂に添加し、ジイソプロピルエチルアミン(樹脂に比例して４モル等量)を添加した。樹脂を24時間室温で振盪した。樹脂をN-メチルピロリドンで洗浄した(4x20mL)。N-メチルピロリドン中の20％ ピペリジンの溶液(3x20mL, 各10分)を、撹拌しながら樹脂に添加した。樹脂をN-メチルピロリドンで洗浄した(4x20mL)。ドデカン酸 (樹脂に比例して４モル等量)をN-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1, 20mL)中に溶解させた。ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBt；H2O)(樹脂に比例して４モル等量)及びジイソプロピルカルボジイミド(樹脂に比例して４モル等量)を添加し、該溶液を15分撹拌した。溶液に樹脂を添加し、ジイソプロピルエチルアミン(樹脂に比例して４モル等量)を添加した。樹脂を24時間室温で振とうした。樹脂をN-メチルピロリドン(2x20mL)、N-メチルピロリドン／塩化メチレン(1:1)(2x20mL)及び塩化メチレン(2x20mL) で洗浄した。トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5  15mL)の混合物とともに180分室温で撹拌することにより、ペプチドを樹脂から開裂させた。切断混合物(cleavage mixture)を濾過し、濾液を真空中で濃縮して油状物にした。この油状物から45mL ジエチルエーテルを用いて粗製ペプチドを沈殿させ、45mL ジエチルエーテルで３回洗浄した。粗製ペプチドを、7μ C-18 シリカが充填された20 mm x 250 mm カラム上の分取用HPLC により精製した。粗製ペプチドを水中の50％酢酸  5mL中に溶解させ、H2Oで希釈して20mLとし、前記カラムに注入し、ついで40-60％(水中のCH3CN 及び0.1％ TFA)の勾配を用いて10mL/分で50分にわたり40℃で溶出した。画分を含んだペプチドを回収した。溶出液を水で希釈した後、精製されたペプチドを凍結乾燥させた。
【０１５１】
HPLC(方法A1)：RT＝43.82分。LCMS：m/z＝1284.8(M+3H)3+  計算値(M+H)+＝3850.8。
【０１５２】
例２  [Gly8,Arg26,34,36]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-OH
【化１２】
2008515856.tif 000008
例１と同様に「合成方法」に従い調製。
【０１５３】
HPLC(方法A1)：RT＝43.6分。LCMS：m/z＝1275.6(M+3H)3+  計算値(M+H)+＝3822.1。
【０１５４】
例３  [アルファヒドロキシデスアミノHis7, Gly8, Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-OH
【化１３】
2008515856.tif 000009
例１と同様に「合成方法」に従い調製。
【０１５５】
HPLC(方法A1)：RT＝33.6分。LCMS：m/z＝1275.7(M+3H)3+  計算値(M+H)+＝3823.3。
【０１５６】
例４  [Gly8, Glu22,23,30, Arg 18,26,34]GLP1(7-37) Lys(17-カルボキシヘプタデカノイル)-NH2
【化１４】
2008515856.tif 000010
例１と同様に「合成方法」に従い調製。
【０１５７】
LCMS：m/z＝1342.1(M+3H)3+  計算値(M+H)+＝4021.6。
【０１５８】
例５  [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(19-カルボキシナノデカノイル)-OH
【化１５】
2008515856.tif 000011
例１と同様に「合成方法」に従い調製。
【０１５９】
HPLC(方法A1)：RT＝46.6分。LCMS：m/z＝1284.7(M+3H)3+  計算値(M+H)+＝3850.4。
【配列表】
2008515856000001.app
【国際調査報告】
2008515856.tif 000017
2008515856.tif 000018
2008515856.tif 000019