(57)【要約】  本発明は、新形成の診断、新形成治療の有効性の評価、新形成罹患対象者の予後評価のための方法を提供する。本発明はまた、新形成の検出で使用されるキットを提供する。本発明はさらに、細胞内でMdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化させる方法、及び細胞内でp53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節する方法を提供する。さらにまた、本発明は、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子を同定する方法を提供する。さらにまた本方法で同定された調節因子、前記調節因子を含む医薬組成物、および新形成を治療する方法での前記調節因子の使用が提供される。本発明はさらに、Mdm2と反応する作用因子及びHAUSPと反応する作用因子を同定する方法を提供する。さらにまた、これらの方法によって同定された作用因子が提供される。最後に、本発明はMdm2及びHAUSPを含む複合体を提供する。
2008505307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の診断サンプルをMdm2発現及びHAUSP発現についてアッセイすることを含む、対象者が新形成を有するか否かを決定する方法であって、前記診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が検出されることが前記対象者における新形成の診断指標となる、前記方法。
【請求項２】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫又は混合型新形成である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
新形成がMdm2-又はHAUSP-関連新形成である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
新形成がp53-関連新形成である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が、前記診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって検出される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
診断サンプルが、Mdm2と反応する作用因子及びHAUSPと反応する作用因子を用いてアッセイされる、請求項1の方法。
【請求項７】
少なくとも1つの作用因子が検出可能なマーカーで標識されている、請求項6記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの作用因子が抗体である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
診断サンプルが、Mdm2をコードする核酸とハイブリダイズする核酸プローブ及びHAUSPをコードする核酸とハイブリダイズする核酸プローブを用いてアッセイされる、請求項1の方法。
【請求項１０】
各核酸プローブがDNA又はRNAである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つの核酸プローブが検出可能なマーカーで標識されている、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
新形成について治療を受けた又は治療を受けている対象者において、新形成治療のための療法の有効性を評価する方法であって、Mdm2発現及びHAUSP発現について対象者の診断サンプルをアッセイすることを含み、前記診断サンプルにおける正常なMdm2発現及び正常なHAUSP発現が検出されることが新形成治療のための療法の成功の指標となり、前記診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは新形成治療のための療法の継続の必要性の指標となる、前記有効性を評価する方法。
【請求項１３】
診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が、前記診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって検出される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
新形成を有する対象者の予後を評価する方法であって、前記方法が、Mdm2発現及びHAUSP発現について前記対象者の診断サンプルをアッセイすることを含み、前記診断サンプルにおけるMdm2発現の低下及びHAUSP発現の低下が検出されれば前記対象者の予後は改善されており、前記診断サンプルにおけるMdm2発現の増加及びHAUSP発現の増加が検出されれば前記対象者の予後は悪化しているとする、前記予後を評価する方法。
【請求項１５】
Mdm2発現及びHAUSP発現が、診断サンプルにおけるMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって前記診断サンプルにおいて検出される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下を含む、新形成の検出に使用するキット：
（a）Mdm2と反応する少なくとも1つの作用因子；
（b）HAUSPと反応する少なくとも1つの作用因子；及び
（c）Mdm2の発現及びHAUSPの発現を検出するために適切な試薬。
【請求項１７】
少なくとも1つの作用因子が検出可能なマーカーで標識されている、請求項16記載のキット。
【請求項１８】
対象者におけるp53の活性を増加させることを含む、対象者において新形成を治療する方法であって、前記対象者においてMdm2-HAUSP相互作用を調節することによって前記対象者におけるp53の活性を増加させる、前記新形成を治療する方法。
【請求項１９】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫又は混合型新形成である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
新形成がMdm2-又はHAUSP-関連新形成である、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
新形成がp53-関連新形成である、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
Mdm2-HAUSP相互作用が、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子を対象者に投与することによって前記対象者において調節される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
調節因子が対象者の皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
細胞内のMdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化させる方法であって、Mdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化させるために有効な量のHAUSPと細胞を接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
接触がin vitroで実施される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
接触が対象者においてin vivoで実施される、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
接触が対象者にHAUSPを投与することにより、対象者においてin vivoで実施される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
HAUSPが対象者に対し経口的に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に投与される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
対象者がヒトである、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
ヒトが新形成を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫又は混合型新形成である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
新形成がMdm2-又はHAUSP-関連新形成である、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
新形成がp53-関連新形成である、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
HAUSPが対象者の新形成を治療する、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
p53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を細胞内で調節する方法であって、p53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節するために有効な量のMdm2-HAUSP相互作用の調節因子と細胞とを接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
細胞内でp53の脱ユビキチン化が増加し、p53の安定性が増加する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
p21がp53によって細胞内で誘導される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
接触がin vitroで行われる、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
接触が対象者においてin vivoで行われる、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
接触が対象者に調節因子を投与することにより、対象者においてin vivoで行われる、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
対象者がヒトである、請求項39記載の方法。
【請求項４２】
ヒトが新形成を有する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
新形成が癌腫、リンパ性白血病、骨髄性白血病、悪性リンパ腫、悪性メラノーマ、骨髄増殖性疾患、肉腫又は混合型新形成である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
新形成がMdm2-又はHAUSP-関連新形成である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
新形成がp53-関連新形成である、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子が対象者の新形成を治療する、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
以下の工程を含む、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子を同定する方法：
（a）Mdm2及びHAUSPを含むin vitro系を入手又は作成する工程；
（b）前記in vitro系を候補調節因子と接触させる工程；及び
（c）前記候補調節因子が前記in vitro系でMdm2-HAUSP相互作用を調節するか否かを決定する工程。
【請求項４８】
工程（c）の決定が、工程（b）のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用を、Mdm2及びHAUSPを含む第二のin vitro系における候補調節因子の非存在下におけるMdm2-HAUSP相互作用と比較することによって達成される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
工程（c）の決定が、工程（b）のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用をMdm2、HAUSP、候補調節因子、及び抗Mdm2若しくは抗HAUSP抗体又はアンタゴニストを含む第二のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用と比較することによって達成される、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
請求項47記載の方法によって同定される調節因子。
【請求項５１】
Mdm2-、HAUSP-又はp53関連症状を対象者で治療する方法であって、Mdm2-、HAUSP-又はp53関連症状を対象者で治療するために有効な量の請求項50記載の調節因子を対象者に投与する工程を含む、前記治療方法。
【請求項５２】
新形成を治療する方法におけるMdm2-HAUSP相互作用調節因子の使用。
【請求項５３】
有効量のMdm2-HAUSP相互作用調節因子及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項５４】
以下の工程を含む、Mdm2と反応する作用因子を同定する方法：
（a）HAUSPの存在下でMdm2と候補作用因子を接触させる工程；及び
（b）候補作用因子のMdm2-HAUSP相互作用を阻害する能力を評価する工程。
【請求項５５】
さらに以下の工程を含む、請求項54記載の方法；
（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と前記候補作用因子を接触させる工程；及び
（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞における1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対して影響を有するか否かを決定する工程。
【請求項５６】
請求項54記載の方法によって同定される作用因子。
【請求項５７】
以下の工程を含む、HAUSPと反応する作用因子を同定する方法：
（a）Mdm2の存在下でHAUSPと候補作用因子を接触させる工程；及び
（b）前記候補作用因子のHAUSP-Mdm2相互作用を阻害する能力を評価する工程。
【請求項５８】
さらに以下の工程を含む、請求項57記載の方法；
（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と前記候補作用因子を接触させる工程；及び
（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞における1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。
【請求項５９】
請求項57記載の方法によって同定される作用因子。
【請求項６０】
Mdm2及びHAUSPを含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願：本出願は、米国特許出願第10/113,732号（2002年3月30日出願）の権利を主張する米国部分継続出願10/813,177（2004年3月29日出願）の権利を主張する。前記出願の内容は参照により本明細書に含まれる。
政府の権利に関する記載：本発明は、NIHグラント番号RO1-CA85533により政府の援助を受けて達成された。したがって、合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、新形成の診断、新形成を治療する方法の有効性の評価、新形成を有する対象者の予後評価のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新形成は、新生物として知られる異常な細胞の増殖を特徴とする疾患である。新生物は白血病又は腫瘍の形で出現し、良性又は悪性でありうる。特に悪性新生物は、生命を脅かす重篤な症状をもたらしうる。多大な研究努力及び方策が、新形成罹患患者の治療に有効な化学療法剤を含む、新形成に対抗する処置の解明に向けられてきた。有効な抗新形成薬剤には、新生物に付随する細胞の急速な分裂を阻害又は制御する薬剤、新生物の退縮又は緩解に有効な薬剤、及び新形成罹患患者の生存を全般的に延長する薬剤が含まれる。悪性新形成又は癌治療の成功は、全ての悪性細胞（それらが原発部位で見つかるか、又は末梢／局所領域に広がっているか、又は身体の他の領域に転移しているかにかかわらず）の除去を必要とする。新形成の主要な治療方法は外科手術及び放射線療法（末梢性及び局所性新形成）並びに化学療法（全身的部位のため）である（Beers and Berkow (eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed. (Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories, 1999), 973-74, 976, 986, 988, 991）。
【０００３】
癌の様々な検出方法、診断及び治療方法にもかかわらず、前記疾患はなお社会のあらゆる階層に蔓延し、しばしば致命的である。検出（初期段階で新形成を同定することができるマーカーの開発を含めて）及び治療のためのまた別の方策が、癌患者の生存を改善するために必要なことは明瞭である。特に、腫瘍抑制作用因子及び腫瘍抑制経路の更なる理解は、新規な検出、診断及び治療方法の開発の基礎を提供するであろう。
p53腫瘍抑制因子は、種々のタイプのストレスに応答して、抗分裂作用（増殖の停止を含む）、アポトーシス及び細胞の老化を発現させる（A.J. Levine, p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 88:323-31, 1997；Giaccia and Kastan, The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev., 12:2973-83, 1998；Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999；M. Oren, Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol. Chem., 274:36031-034, 1999；Vogelstein et al., Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000；Michael and Oren, The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system. Semin. Cancer Biol., 13:49-58, 2003）。p53はヒトの癌腫でもっとも変異しやすい遺伝子であり、50％を超える腫瘍がp53に何らかの変化を示している（Hollstein et al. Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell lines. Nucleic Acids Res., 22:3551-55, 1994；Hollstein et al., New approaches to understanding p53 gene tumor mutation spectra. Mutat. Res., 431:199-209, 1999）。
【０００４】
野生型p53はゲノムの管理者と呼ばれてきた。なぜならば、野生型p53は、損傷修復のためにG1期に細胞を拘束するか又は損傷細胞を完全に排除するアポトーシス経路のいずれかによって、DNA損傷又はチェックポイント不履行に応答するからである（D.P. Lane, Nature, 358:15-16, 1992；A.J. Levine, p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, 88:323-31, 1997）。p53はまたゲノムの安定性に必須であり、異常な倍数性、遺伝子増幅、組換えの増加及び中心体の調節異常はいずれも機能的なp53を欠く細胞で観察された（Donehower et al. Nature, 356:215-21, 1992）。これらの観察は、p53機能の停止は癌の腫瘍形成に重大であることを提唱している。さらにまた、多数の研究が、p53経路の不活化は、ヒトの全種類（乳癌を含む）の腫瘍形成に中心的事象であることを指摘している（Vogelstein et al. Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000）。積重ねられつつある証拠はまた、野生型p53を保持する細胞では、p53経路における他の欠陥は腫瘍形成で重要な役割を果たすことを指摘している（Prives and Hall, p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999；M. Oren, Regulation of p53 tumor suppressor protein. J. Biol. Chem., 274:36031-034, 1999）。
【０００５】
p53は短命のタンパク質であり、その活性は正常細胞では低レベルに維持される。腫瘍抑制に必要なp53の分子的機能は、内在性遺伝子発現の調節で転写因子として機能するp53の能力を必要とする。細胞増殖の停止又はアポトーシスのどちらかで決定的に必要とされる多数の遺伝子がp53の直接的標的として同定された。前記にはp21CIP1/WAF1、Mdm2（ネズミダブルミニッツ2）、GADD45、サイクリンG、14-3-3-σ、Noxa、p53AIP1及びPUMAが含まれる（Kastan et al. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telangiectasia. Cell, 71:587-97, 1992；el-Deiry et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 75:817-825, 1993；Wu et al. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop. Genes Dev., 7:1126-32, 1993；Barak et al. mdm2 expression is induced by wild type p53 activity. EMBO J. 12:461-68, 1993；Okamoto and Beach, Cyclin G is a transcriptional target of the p53 tumor suppressor protein. Embo J. 13:4816-22, 1994；Oda et al. Noxa, a BH3-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science, 288:1053-58, 2000a；Oda et al. p53AIP1, a potential mediator of p53-dependent apoptosis and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53. Cell, 102:849-62, 2000b；Nakano and Vousden, PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Molecular cell, 7:683-94, 2001；Yu et al. PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Molecular Cell, 7:673-82, 2001）。さらにまた、p53そのものの厳密な制御は、腫瘍形成および正常な細胞増殖の維持に対するその作用に極めて重要である。
【０００６】
多くの実験が、p53の安定化に必要とされる多数の経路の存在を暗示している（Shieh et al. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997；Ashcroft et al. Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol. Cell Biol., 19:1751-58, 1999；Blattner et al. DNA damage induced p53 stabilization: no indication for an involvement of p53 phosphorylation. Oncogene, 18:1723-32, 1999；Dumaz and Meek, Serine15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2. EMBO J., 18:7002-10, 1999；Ashcroft et al. Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol. Cell Biol., 20:3224-33, 2000；Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol. Biol. (Paris), 48:227-45, 2000）。p53がそのような多数の調節経路によって活性化される正確なメカニズムは完全には理解されていない。しかしながら、一般的には、それらはp53の翻訳後修飾を必要とすると考えられている。前記翻訳後修飾にはユビキチン化、リン酸化及びアセチル化が含まれる（Giaccia and Kastan, The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev., 12:2973-83, 1998；Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol. Biol.(Paris), 48:227-45, 2000；Brooks and Gu, Ubiquitination, phosphorylation and acetylation: the molecular basis for p53 regulation. Curr. Opin. Cell Biol., 15:164-71, 2003）。例えば、DNA損傷に応答して、p53は多くの部位でリン酸化される。これらのリン酸化事象は、Mdm2との結合を妨げることによってp53の安定化を促進し、それによってp53をMdm2-媒介分解に対してより耐性にする（Shieh et al. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997；Appella and Anderson, Signaling to p53: breaking the posttranslational modification code. Pathol. Biol. (Paris), 48:227-45, 2000）。
【０００７】
タンパク質ユビキチン化は特定の細胞性タンパク質分解のためのシグナルとして機能することによって（例えばモノ-ユビキチン化、ポリユビキチン化）、多くの細胞プロセスの生理学的な調節において決定的な役割を果たす（Laney and Hochstrasser, Substrate targeting in the ubiquitin system. Cell, 97:427-30, 1999；Kornitzer and Ciechanover, Modes of regulation of ubiquitin-mediated protein degradation. J. Cell. Phys., 182:1-11, 2000；Hershko et al. The ubiquitin system. Nat. Med., 6:1073-81, 2000；C.M. Pickart, Back to the future with ubiquitin. Cell, 116:181-90, 2004）。ポリユビキチン化は主としてプロテアソーム依存性分解のためのシグナルとして機能するが、モノ-ユビキチン化の機能的帰結はしばしばタンパク質トラフィッキング及び他の分解非依存性プロセスと結びついている（Hicke and Dunn, Regulation of membrane protein transport by ubiquitin and ubiquitin-binding proteins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19:141-72, 2003）。ユビキチンで修飾されたタンパク質からユビキチン部分を除去する脱ユビキチン化はまた重要な制御工程として認識されている（K.D. Wilkinson, Signal transduction: aspirin, ubiquitin and cancer. Nature, 424:738-39, 2003；D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 33:337-52, 1998）。
【０００８】
p53のユビキチン化は、最初にパピローマウイルス感染細胞で発見された。前記細胞では、p53分解はウイルスのE6タンパク質によって媒介された（Scheffner et al. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as an ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell, 75:495-505, 1993）。正常細胞では、p53分解の制御は主としてMdm2によって支配される（Mdm2はp53のN-末端と物理的に相互作用し、それによってp53の腫瘍抑制活性を妨害するする癌タンパク質である）（Haupt et al. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature, 387:296-99, 1997；Kubbutat et al. Regulation of p53 stability by Mdm2. Nature, 387:299-303, 1997；Honda et al. Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53. FEBS Lette., 420:25-27, 1997）。p53特異的E3リガーゼとして作用することによって、Mdm2はp53の分解に必須であり、さらにまたp53をモノ-ユビキチン化することによって核外搬出を誘導する（Freedman et al. Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol. Life Sci., 55:96-107, 1999）。
興味深いことに、Mdm2遺伝子の転写はp53によって活性化され、したがって、Mdm2産生の増加は多様な細胞ストレスに応答するp53誘導を制限するという自己調節ループが存在する（Asccroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999）。p53制御におけるMdm2の決定的役割はマウスで実施された実験によって極めて明瞭に示される。前記実験では、p53の不活化は、Mdm2機能の低下によって惹起される胚の致死性を完全にレスキューすることが示された（Jones et al. Rescue of embryonic lethality in Mdm2-deficient mice by absence of p53. Nature, 378:206-08, 1995; Montes de Oca Luna et al. Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature, 378:203-06, 1995）。
【０００９】
癌遺伝子シグナリングに応答して生じるp53の安定化は、p14ARFの誘導によりもたらされると考えられる（p14ARFはMdm2と複合体を形成し、それによってp53及びMdm2の両者をin vitroで安定化することができる腫瘍抑制タンパク質である（Lowe and Sherr, Tumor suppression by Ink4a-Arf: progress and puzzles. Curr. Opin. Genet. Dev., 13:77-83, 2003）。p53経路におけるp14ARFの重要性は、p14ARF欠損マウスの腫瘍感受性増加によって強調される（Kamijo et al. Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated by the alternative reading frame product p19ARF. Cell, 91:649-59, 1997；C.J. Sherr, The INK4a/ARF network in tumor suppression. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2:731-37, 2001）。MdmX（Mdm2ファミリーメンバー）は、p53機能のもう1つの重要な制御因子として最近浮上してきた。Mdm2とは対照的に、MdmX単独ではp53をユビキチン化することはできないが、p53とMdm2の両者を安定化する（Stad et al. MdmX stabilizes p53 and Mdm2 via two distinct mechanisms. EMBO Rep., 2:1029-34, 2001）。このことから、MdmX及びMdm2はp53の安定性に対して反対の作用を有すると提唱された。Mdmx-ヌルマウスは胚致死性であり、前記致死性はp53-ヌルバックグラウンドでレスキューされうる（Mdm2欠損マウスを思い出させる態様である）（Parant et al. Rescue of embryonic lethality in Mdm4-null mice by loss of Trp53 suggests a non-overlapping pathway with MDM2 to regulate p53. Nat. Genet., 29:92-95, 2001；Finch et al. Mdmx is a negative regulator of p53 activity in vivo. Cancer Res., 62:3221-225, 2002；Migliorini et al. Mdm4 (Mdmx) regulates p53-induced growth arrest and neuronal cell death during early embryonic mouse development. Mol. Cell Biol.,22:5527-38, 2002）。MdmXの正確な機能はさらに解明されねばならないが（de Graaf et al. Mdmx protein stability is regulated by the ubiquitin ligase activity of Mdm2. J. Biol. Chem., 278:38315-324, 2003；Kawai et al. DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2. J. Biol. Chem., 278:45946-953, 2003；Pan and Chen, MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX. Mol. Cell Biol., 23：5113-21, 2003）、これらの結果はp53経路におけるMdmXの重大な役割を示唆している。
【００１０】
上記で指摘したように、野生型のp53を保持する細胞では、p53経路の他の欠損が腫瘍形成に重要な役割を果たすことが示唆されている。今日までに、p53経路を標的とすることによる少なくとも1つの癌の治療方法が開発された。この治療は、Mdm2-媒介脱ユビキチン化を阻害することによってp53を安定化させることを必要とする。全ての腫瘍例の15−30％がMdm2の過剰発現を示すと概算される。しかしながら、この酵素は、阻害することが困難なことは周知である。最近の実験ではまた、Mdm2-媒介ユビキチン化経路が無傷であるときでさえ機能する可能性があるp53安定化のためのまた別のメカニズムの存在が暗示された（Ashcroft et al. Regulation of p53 function and stability by phosphorylation. Mol. Cell Biol., 19:1751-58, 1999；Blattner et al. DNA damage induced p53 stabilization: no indication for an involvement of p53 phosphorylation. Oncogene, 18:1723-32, 1999；Dumaz and Meek, Serine15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2. EMBO J., 18:7002-10, 1999；Ashcroft et al. Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53. Mol. Cell Biol., 20:3224-33, 2000）。
上記の記載を基にすれば、p53経路の制御は極めて興味深いものであり、癌の診断及び治療の潜在的手段を提示している。それにもかかわらず、この経路並びにp53のユビキチン化及び脱ユビキチン化の制御のより深い理解は、それを基に新規な診断及び治療方法を開発しうる価値ある基礎を提供するであろう。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要旨
本発明は、p53のユビキチン化は可逆性であり、さらにユビキチンヒドロラーゼ（HAUSP）は直接p53と結合し、これを脱ユビキチン化するという発見を基にしている。この脱ユビキチン化は、細胞のp53を活性化及び安定化させ、それによって腫瘍抑制活性のためにp53を利用可能にする作用を有する。この発見は、新形成、特にp53関連癌腫の診断、モニター及び治療に広く関わりを有する。
本発明はさらに、RNAiによる内因性HAUSPレベルの部分的低下はp53を不安定化させるが、一方HAUSPの完全な除去はp53を安定化させ活性化するという発見を基にしている。本発明者らはこの現象は、HAUSPがp53非依存性態様でMdm2を安定化させるために生じており、それによってp53制御におけるフィードバックループが提供されていることを明らかにした。正常な細胞では、HAUSPはMdm2安定性のために必要であり、HAUSP消失細胞においては、自己ユビキチン化されたMdm2は極端に不安定となり、間接的なp53活性化をもたらす。このフィードバック調節はMdm2に特異的である。HeLa細胞（この細胞ではp53はもっぱらウイルスタンパク質E6依存性ユビキチン化によって分解される）では、HAUSPの枯渇はp53を活性化できない。したがって、本発明者らは、脱ユビキチン化酵素（HAUSP）によって直接制御されるユビキチンリガーゼ（Mdm2）の例を発見し、p53-Mdm2経路におけるHAUSPのダイナミックな役割を明らかにした。
【００１２】
したがって、本発明は、対象者が新形成を有するか否かを、対象者の診断サンプルをMdm2発現及びHAUSP発現についてアッセイすることによって決定する方法を提供する。本方法において、前記診断サンプルでの正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは、前記対象者における新形成の指標となる。ある実施態様では、正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現は、診断サンプルにおける正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって診断サンプルで検出される。
本発明はさらに、新形成について治療を受けた又は治療を受けている対象者において、新形成治療のための療法の有効性を、Mdm2発現及びHAUSP発現について前記対象者の診断サンプルをアッセイすることによって評価する方法を提供する。本方法において、前記診断サンプルにおいて正常なMdm2発現及び正常なHAUSP発現が検出されることは前記新形成治療のための療法の成功の指標であり、前記診断サンプルにおいて正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは、新形成治療のための療法の継続の必要性の指標である。ある実施態様では、正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現は、前記診断サンプルで正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって前記診断サンプルにおいて検出される。
本発明はまた、新形成を有する対象者の予後を、Mdm2発現及びHAUSP発現について対象者の診断サンプルをアッセイすることによって評価する方法を提供する。本方法において、前記診断サンプルにおけるMdm2発現低下及びHAUSP発現低下が検出されれば前記対象者の予後は改善されており、さらに前記診断サンプルにおけるMdm2発現増加及びHAUSP発現増加が検出されれば前記対象者の予後は悪化している。ある実施態様では、Mdm2発現及びHAUSP発現は、前記診断サンプルでMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって前記診断サンプルにおいて検出される。
【００１３】
さらにまた、本発明は、以下を含む、新形成の検出に使用されるキットを提供する：（a）Mdm2と反応する少なくとも1つの作用因子；（b）HAUSPと反応する少なくとも1つの作用因子；及び（c）Mdm2の発現及びHAUSPの発現を検出するために適切な試薬。
本発明はさらに、対象者でp53の活性を増加させることによって前記対象者の新形成を治療する方法を提供する。ここでp53の活性は、対象者におけるMdm2-HAUSP相互作用を調節することによって前記対象者で増加される。
本発明はまたMdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化させる方法を提供し、前記方法は、Mdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化させるために有効な量のHAUSPと細胞とを接触させることによる。
さらにまた、本発明は細胞内のp53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節する方法を提供し、前記方法は、p53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節するために有効な量のMdm2-HAUSP相互作用の調節因子と細胞とを接触させることによる。
本発明はさらに、以下の工程を含む、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子の同定方法を提供する：（a）Mdm2及びHAUSPを含むin vitro系を入手又は作成する工程；（b）前記in vitro系を候補調節因子と接触させる工程；及び（c）前記候補調節因子が前記in vitro系でMdm2-HAUSP相互作用を調節するか否かを決定する工程。ある実施態様では、工程（c）の決定は、Mdm2、HAUSP、候補調節因子、及び抗Mdm2若しくは抗HAUSP抗体又はアンタゴニストを含む第二のin vitro系でのMdm2-HAUSP相互作用と、工程（b）のin vitro系でのMdm2-HAUSP相互作用を比較することによって達成される。さらにまた、本方法によって同定される調節因子、及び前記調節因子を対象者に投与することによる、対象者のMdm2-、HAUSP-又はp53関連症状を治療する方法が提供される。
【００１４】
本発明はさらに、有効量のMdm2-HAUSP相互作用調節因子及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。さらに、新形成を治療する方法でのMdm2-HAUSP相互作用調節因子の使用が提供される。
さらにまた本発明は、以下の工程を含む、Mdm2と反応する作用因子を同定する方法を提供する：（a）HAUSPの存在下でMdm2と候補作用因子を接触させる工程；及び（b）候補作用因子のMdm2-HAUSP相互作用を阻害する能力を評価する工程。場合によって、前記方法はさらに以下の工程を含む；（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞における1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。さらに、本方法によって同定される作用因子が提供される。
本発明はさらに、以下の工程を含む、HAUSPと反応する作用因子を同定する方法を提供する：（a）Mdm2の存在下でHAUSPと候補作用因子を接触させる工程；及び（b）候補作用因子のHAUSP-Mdm2相互作用を阻害する能力を評価する工程。場合によって、前記方法はさらに以下の工程を含む；（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞における1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。さらに、本方法によって同定される作用因子が提供される。
最後に、本発明は、Mdm2及びHAUSPを含む複合体を提供する。
本発明の更なる特徴は下記の記載から明白となろう。
【００１５】
発明の詳細な説明
p53腫瘍抑制因子は短命なタンパク質であり、正常細胞では、Mdm2媒介ユビキチン化とそれに続くタンパク質分解によって低レベルで維持される。p53の安定化はその腫瘍抑制因子の機能のために重要である（Ashcroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999；M. Oren, Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol. Chem., 274:36031-034, 1999；Freedman et al., Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol. Life Sci., 55:96-107, 1999；Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999；Vogelstein et al., Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000）。しかしながら、ユビキチン化されたp53レベルがin vivoで制御される正確なメカニズムは完全には理解されていない。
アフィニティー精製したp53関連因子の質量分析によって、本発明者らは、p53相互作用タンパク質としてHAUSP（ヘルペスウイルス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ）を同定した（Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997）。HAUSPは、Mdm2（ネズミダブルミニッツ2）が過剰に存在するときでさえ強力にp53を安定化させ、p53依存性細胞増殖抑制及びアポトーシスを誘導する。重大なことには、HAUSPは、in vitro及びin vivoの両方で特異的にp53を脱ユビキチン化する固有の酵素活性を有する。対照的に、触媒として不活性なHAUSP点変異体の細胞内発現は、p53のユビキチン化レベルを増加させ、p53を不安定化させる。これらの発見によって、p53を直接的脱ユビキチン化によって安定化させ、さらにp53の安定化を介してin vivoで腫瘍抑制因子としてHAUSPが関与し得る重要なメカニズムが明らかにされた。
【００１６】
本明細書に開示する本発明者らのデータは、HAUSP媒介p53安定化は、固有の脱ユビキチン化酵素活性を介して機能することを示唆している。ユビキチン修飾タンパク質からユビキチン部分を除去する脱ユビキチン化は、今や重要な制御工程として認識されている（D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 35:337-52, 1998；Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:633-40, 1999；K.D. Wilkinson Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol., 11:141-48, 2000）。存在することが知られている多数のユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ（UBP）もまた、これらのタンパク質が特定の細胞性タンパク質と結合し、基質特異性をもつことを提唱している。哺乳動物細胞で同定されたUBPアナログの数は増加しつつあるが（D'Andrea and Pellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 35:337-52, 1998；Chung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266:633-40, 1999；K.D. Wilkinson Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol., 11:141-48, 2000）、そのいずれもin vivoで特定の基質の安定化に関与しているとは考えられていない。
【００１７】
HAUSPは、特定の細胞性因子（p53）を直接的に脱ユビキチン化しこれを安定化させることができる哺乳動物のタンパク質の最初の例であろう。したがって、本発明者らの発見は、HAUSPの潜在的な腫瘍抑制機能に関する重大な意味合いを有し、さらにまた多くの（HAUSPのような）UBPファミリータンパク質は、脱ユビキチン化とその後のタンパク質の安定化のために種々の基質とin vivoで相互作用しうることを予想させる。
以前の研究によって、HAUSPはヘルペスウイルスタンパク質（Vmw110）と相互作用し、HAUSPタンパク質サブセットがPMLの核小体とともに局在化させられることが示された（Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997）。さらにまた、いくつかのタイプの発癌ストレスによって誘導されるp53活性化のためにARFは不要であることを示す証拠が今や続出しつつある（Seavey et al. The E7 oncoprotein of human papillomavirus type 16 stabilizes p53 through a mechanism independent of p19（ARF）. J. Virol., 73:7590-98, 1999；Tolbert et al. p19ARF is dispensable for oncogenic stress-induced p53-mediated apoptosis and tumor suppression in vivo. Mol. Cell Biol., 22:370-77, 2002）。したがって、本発明者らの発見と総合すれば、これらの初期の研究はさらに、ウイルス感染、DNA損傷応答及び他のタイプのストレス応答におけるp53-HAUSP相互作用のための潜在的な制御を示唆する。
【００１８】
p53の安定化は、細胞増殖抑制及びアポトーシスに対するその作用のため、及びその腫瘍抑制機能のために非常に重要である。多くの研究によって、種々のタイプのストレスに対する応答でp53の安定化は、Mdm2-p53相互作用及び/又はMdm2媒介ユビキチンリガーゼの阻害を介して達成されうることが提唱されてきた（Ashcroft and Vousden, Regulation of p53 stability. Oncogene, 18:7637-43, 1999；Freedman et al. Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol. Life Sci., 55:96-107, 1999；M. Oren, Regulation of the p53 tumor suppressor protein. J. Biol. Chem., 274:36031-034, 1999；Prives and Hall, The p53 pathway. J. Pathol., 187:112-26, 1999；Vogelstein et al., Surfing the p53 network. Nature, 408:307-10, 2000；Sherr and Webbner, The ARF/p53 pathway. Curr. Opin. Genet. Dev., 10:94-99, 2000）。本発明者らの発見は、p53のユビキチン化はin vivoでのダイナミックなプロセスであり、ユビキチン化されたp53は直接的な脱ユビキチン化（図5D）を介してHAUSPによる分解から救済されうることを明らかにした。P53のMdm2媒介ユビキチン化とp53のHAUSP媒介脱ユビキチン化との間のバランスの変化はin vivoでのp53の安定化に重要であるということは極めてありそうなことである。
【００１９】
本明細書に記載した本発明者らの発見は、Mdm2安定性の制御におけるHAUSPユビキチンヒドロラーゼについての重大な役割を明確にした。本発明者らは、HAUSPは内在性Mdm2の安定性のために必要であることを発見した（Mdm2はin vivoで構成的に自己ユビキチン化され、分解される）。HAUSPの非存在下では、Mdm2は極端に不安定のようであり、p53を分解することができずHAUSP枯渇細胞ではp53の間接的活性化をもたらす。本実験は、ユビキチンリガーゼ（Mdm2）の安定性及び機能の維持に寄与する脱ユビキチン化酵素活性（HAUSP）の最初の例を提供する。本発明者らはまた、フィードバック媒介p53安定化はMdm2依存性であり、内在性HAUSPの枯渇はHeLa細胞でp53安定化を誘導することができないことを示した（HeLa細胞では、p53分解は主としてヒトパピローマウイルスタンパク質（E6）によって誘導される）。多くのE3ユビキチンリガーゼ（Mdm2を含む）は、それら自身の安定性を調節する手段として自己ユビキチン化を行う。
p53経路におけるHAUSPの役割は非常にユニークであるように思われる。一方では、HAUSPの過剰発現はp53とMdm2の両方を安定化させ、さらにより重要なことにはp53機能を活性化させ、これらはMdmX媒介作用とは異なっているが、p14ARF媒介作用と非常に類似する。他方、HAUSPの除去はMdm2を不安定化させp53を活性化させ、Mdm2ノックアウト細胞で観察される表現型と類似する表現型を生じる（Jones et al. Rescue of embryonic lethality in Mdm2-deficient mice by absence of p53. Nature, 378:206-08, 1995; Montes de Oca Luna et al. Rescue of early embryonic lethality in mdm2-deficient mice by deletion of p53. Nature, 378:203-06, 1995）。正常細胞でのHAUSP過剰発現の正味の結果がp53依存性転写の活性化及び細胞増殖抑制のために機能することを考慮すると、p53はin vivoでの優先的な標的であるかもしれない。この考えは、RNAiによる内在性HAUSPの部分的減少はp53不安定化を誘導するという観察によって支持される。
【００２０】
p53及びMdm2の両者の機能を調節することができるHAUSPのこの驚くべき能力はその生理学的な目的についての疑問を生じさせた。多数の研究によって、p53機能の調節で重要な役割を果たす、複雑なp53-Mdm2フィードバックネットワークの存在が明らかになった。p53及びMdm2が関与する中枢的なフィードバックループ（Freedman et al. Functions of the MDM2 oncoprotein. Cell Mol. Life Sci., 55:96-107, 1999）の他に、p53-Mdm2経路の制御はまた、類似するが別個のフィードバックメカニズムを介してp14ARF及びMdmXによって影響を受ける。例えば、p53及びMdm2はp14ARFによって安定化されうるが（Lowe and Sherr, Tumor suppression by Ink4a-Arf: progress and puzzles. Curr. Opin. Genet. Dev., 13:77-83, 2003）、一方、細胞内の14ARFレベルはp53の発現によってダウンレギュレートされる（Stott et al. The alternative product from the human CDKN2A locus, p14(ARF) participates in a regulatory feedback loop with p53 and MDM2. EMBO J., 17:5001-14, 1998）。
【００２１】
MdmXは最初p53を安定化することが見出された（Stad et al. MdmX stabilizes p53 and Mdm2 via two distinct mechanisms. EMBO Rep., 2:1029-34, 2001）。にもかかわらず、最近の研究によって、MdmXはまた明らかにp53の分解にも関与することが指摘され（Gu et al. Mutual dependence of MDM2 and MDMX in their functional inactivation of p53. J. Biol. Chem., 277:19251-254, 2002；Linares et al. Mdmx stimulates Mdm2-mediated ubiquitination and degradation of p53. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:12009-014, 2003）、さらにマウスでのMdmXのノックアウトはp53の活性化をもたらすことが示された（Parant et al. Rescue of embryonic lethality in Mdm4-null mice by loss of Trp53 suggests a non-overlapping pathway with MDM2 to regulate p53. Nat. Genet., 29:92-95, 2001；Finch et al. Mdmx is a negative regulator of p53 activity in vivo. Cancer Res., 62:3221-225, 2002；Migliorini et al. Mdm4 (Mdmx) regulates p53-induced growth arrest and neuronal cell death during early embryonic mouse development. Mol. Cell Biol., 22:5527-38, 2002）。さらにまた、Mdm2はMdmXの発現によって安定化させることができるが、MdmXはまたMdm2の基質でもあり、Mdm2媒介ユビキチン化によって分解される（de Graaf et al. Mdmx protein stability is regulated by the ubiquitin ligase activity of Mdm2. J. Biol. Chem., 278:38315-324, 2003；Kawai et al. DNA damage-induced MDMX degradation is mediated by MDM2. J. Biol. Chem., 278:45946-953, 2003；Pan and Chen, MDM2 promotes ubiquitination and degradation of MDMX. Mol. Cell Biol., 23：5113-21, 2003）。p53、p14ARF、Mdm2及びMdmX間での多次元的なやりとりによって、in vivoでp53は複数の経路によって活性化されるが、また厳密なコントロール下で維持されうるエレガントなフィードバックネットワークが提供された。本明細書に記載するHAUSP媒介機能は、明らかにこのp53-Mdm2ネットワークに興味深いフィードバック制御層を付け加える。
【００２２】
p53とMdm2は機能的に互いに拮抗するので、in vivoでp53又はMdm2を安定化する場合、HAUSPの制御は極めて重要になる。本発明者らは、p53-HAUSP相互作用は、DNA損傷に応答して増強される（これはin vivoでのp53の安定化と良好な相関性を有する）ことを示した。HAUSPは、最初ヘルペスウイルスユビキチンリガーゼICP0関連細胞因子として同定された（Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997）。より最近になって、エプスタイン・バーウイルス核内抗原-1（EBNA-1）はまたHAUSPと相互作用することができ、細胞内でHAUSPとの結合についてp53と競合しうることが報告された（Holowaty et al. Protein interaction domains of the ubiquitin-specific protease, USP7/HAUSP. J. Biol. Chem., 278:47753-761, 2003；Holowaty et al. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem., 278:29987-994, 2003）。本発明者らの実験によって、可逆的ユビキチン化は細胞性因子（ユビキチンリガーゼ自体を含む）の機能制御のための普遍的なメカニズムであることが提唱される。腫瘍細胞では、特定のHAUSP変異体がp53-HAUSP相互作用のみを停止させMdm2-HAUSP相互作用は停止させないということがあり得る。さらにまた、p53、HAUSP及びMdm2間の相互作用は、DNA損傷又はウイルス感染時にダイナミックに調節されるかもしれない。
【００２３】
上記のことから、本発明は対象者が新形成を有するか否かを決定する方法を提供する。本明細書で用いられる“対象者”とは哺乳動物であり、前記にはウシ、イヌ、ヒト、サル、マウス、ブタ又はラットが含まれるが、ただしこれらに限定されない。前記対象者は好ましくはヒトである。本発明者らは、正常な（非損傷）細胞と比較して、DNA損傷に付された細胞でHAUSP-p53相互作用の顕著な増強及びHAUSP発現の増強が検出されることを本明細書（図8A−8C参照）で示した。したがって、本発明の方法は、対象者の診断サンプルをHAUSPの発現についてアッセイすることを含み、前記アッセイにおいて正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは対象者における新形成の診断指標である。
本明細書で用いられる“HAUSP”には、HAUSP（ヘルペスウイルス関連ユビキチン特異的プロテアーゼ）及びHAUSPアナログが含まれる。特段の指摘がなければ、“タンパク質”にはタンパク質、タンパク質ドメイン、ポリペプチド又はペプチドが含まれる。本明細書でさらに用いられる、HAUSPタンパク質（USP7としてもまた知られている）は図6に示すアミノ酸配列を有する（配列番号:6、以下もまた参照されたい：Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997；GenBankアクセッション番号CAA96580）。
【００２４】
本明細書で用いられる“HAUSPアナログ”は、HAUSPの生物学的活性を有するHAUSPタンパク質の機能的変種であり、HAUSPタンパク質と60％以上の（好ましくは70％以上の）アミノ酸配列相同性を有する。HAUSP“アナログ”には、相同な三次元構造を有するHAUSPタンパク質の変種が含まれる。本明細書で用いられる“HAUSPの生物学的活性”という用語は、本明細書に記載されるように、p53腫瘍抑制タンパク質と物理的に結合する能力（すなわち陰性コントロールのバックグラウンド結合よりほぼ2倍、より好ましくはほぼ5倍の結合）を提示するタンパク質又はペプチドの活性を指すが、ただしアフィニティーはHAUSPのそれと異なりうる。HAUSP及びHAUSPアナログは、合成により又は組換えにより生成することができるが、また天然の細胞から単離することもできる。HAUSPは好ましくは、一般的技術及びHAUSPをコードするcDNA（配列番号:7、以下もまた参照されたい：Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997；GenBankアクセッション番号Z72499）を用いて組換えによって生成される。
本明細書で用いられる“保存的置換”は、置換アミノ酸残基が類似の極性又は立体配置を有するために、又はそれらが置換される残基と同じクラスに属するために（例えば疎水性、酸性又は塩基性）、置換されるアミノ酸残基と機能的に等価であるアミノ酸置換である。本明細書で用いられる“保存的置換”という用語には、特にp53の阻害作用因子の同定及び設計のため、分子置換分析のため、及び/又は相同性模型作成のために前記相互作用を使用することに関して、p53と相互作用するHAUSPの能力に対して重要ではない影響を有する置換が含まれる。
【００２５】
本発明の方法を用いて対象者が新形成を有するか否かを決定し、それによって対象者でそのような診断を下すことを可能にすることができる。本明細書で用いられる“新形成”は、正常細胞の増殖を引き起こさない又は増殖を停止させる条件下における、新生物（すなわち新形成細胞、例えば腫瘍細胞）の制御不能で進行性の細胞増殖である。新形成は“新生物”を生じる。新生物は、本明細書では一切の新規で異常な増殖、特に組織の新規な増殖（前記組織では細胞の増殖は制御不能であり進行性である）を意味すると定義される。したがって新形成は“癌腫”を含み、この語は、本明細書では、正常な制御の喪失という固有の特徴を有する新形成細胞の増殖を指し、調節不能の増殖、分化の欠如、局所の組織浸潤及び/又は転移をもたらす。
本明細書で用いられる新生物には、対象者の組織内の細胞の形態学的不規則性とともに、同じ組織の正常な増殖と比較して対象者の組織内の細胞の病的な増殖が含まれる（ただし前記に限定されない）。さらにまた、新生物には良性腫瘍及び侵襲性又は非侵襲性の悪性腫瘍（例えば乳癌）が含まれる。悪性新生物は、より強く退形成又は脱分化及び細胞の方向性の喪失を示し、侵襲及び転移の特性を有するという点で良性新生物と区別される。本明細書に開示した本発明にしたがって評価、検出、診断、モニター又は治療される新生物又は新形成の例には、癌腫、特に膀胱、乳房、子宮頸部、大腸、頭部、腎臓、肺臓、頸部、卵巣、前立腺及び胃の癌腫；リンパ性白血病、特に急性リンパ芽球性白血病及び慢性リンパ性白血病；骨髄性白血病、特に急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病及び慢性骨髄球性白血病；悪性リンパ腫、特にバーキットリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫；悪性メラノーマ；骨髄増殖性疾患；肉腫、特にユーイング肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、末梢神経上皮腫及び滑膜肉腫；並びに混合型新形成、特に癌肉腫及びホジキン病が含まれるが、ただしこれらに限定されない（Beers and Berkow (eds.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th ed.(Whitehouse Station, NJ: Merck Research Laboratories, 1999) 973-74, 976, 986, 988, 991）。
【００２６】
上記で指摘したように、全ての癌腫の60％を超える症例がp53の変異を伴っている。したがって、本発明のある実施態様では、本発明の方法及び組成物は、p53関連新形成（p53経路の欠損を伴う新形成を含む）の評価、検出、診断、モニター及び治療を目的とする。本発明のまた別の実施態様では、本発明の方法及び組成物は、乳癌、大腸癌、白血病、肺癌、悪性メラノーマ、卵巣癌又は前立腺癌の評価、検出、診断、モニター及び治療を目的とする。
本発明の方法にしたがえば、対象者の診断サンプルはin vitro又はin vivoでアッセイすることができる。アッセイをin vitroで実施する場合は、対象者の診断サンプルは標準的方法を用いて取り出すことができる。前記診断サンプルは組織（任意の骨、脳組織、乳房組織、大腸組織、筋肉組織、神経組織、卵巣組織、前立腺組織、皮膚組織、又は軟組織を含む）でありうる。これらの組織は標準的な生検によって取り出すことができる。さらにまた、前記診断サンプルは体液（脳脊髄液、心臓周囲液、腹腔液、唾液、血清及び尿を含む）でもよい。さらにまた、対象者又は患者から採取される診断サンプルは例えば、新生物を有することが判明している任意の組織、新生物を有すると疑われる任意の組織、又は新生物を有すると考えられる任意の組織でありうる。
タンパク質は、当業界で公知の標準的方法を用いて、本発明の診断サンプルから単離及び精製することができる。前記方法には、組織からの抽出（例えば前記タンパク質を可溶化する界面活性剤を用いる）が含まれ（ただし前記に限定されない）、必要な場合には続いてカラムでのアフィニティー精製、クロマトグラフィー（例えばFITC及びHPLC）、免疫沈降（例えばHAUSPに対する抗体を用いて）、及び沈殿（例えばイソプロパノール及びトリゾールのような試薬）が実施される。前記タンパク質の単離及び精製に続いて電気泳動（例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル上で）が実施される。核酸は、当業者に公知の標準的技術を用いて診断サンプルから単離することができる。
【００２７】
本発明の方法にしたがえば、対象者の新形成は、対象者の診断サンプルをHAUSPの発現についてアッセイすることによって診断することができる。この場合、正常より上昇したHAUSPの発現によって新形成と診断される。本明細書で用いられる“発現”は、遺伝子の少なくとも1つのmRNA転写物への転写、または少なくとも1つのmRNAのタンパク質への翻訳を意味する。例えば、“HAUSPの発現”は、上記に定義するように、HAUSP遺伝子の少なくとも1つのmRNA転写物への転写、または少なくとも1つのmRNAのHAUSPタンパク質への翻訳を意味する。したがって、診断サンプルは、HAUSPタンパク質、HAUSP cDNA又はHAUSP mRNAについてアッセイすることによってHAUSPの発現についてアッセイすることができる。HAUSPの適切な形態は本明細書で考察される具体的な技術を基準にして明白であろう。
さらにまた、対象者又は患者が新形成を有するか否かを決定するために、診断サンプルをHAUSPタンパク質の任意の形態又は全ての形態（前駆体、分子内タンパク分解的にプロセッシングされた形態及び翻訳後修飾から生じる他の形態を含む）の発現についてアッセイすることもできる。さらにまた、本明細書に開示するように、p53-HAUSP相互作用の増加を検出することによって、正常より上昇したHAUSPの発現について診断サンプルをアッセイすることもできる。したがって、本発明のある実施態様では、正常より上昇したHAUSP発現は正常より上昇したp53-HAUSP相互作用を検出することによって検出される。
【００２８】
本明細書で用いられる“正常より上昇した”という用語は、疾患をもたない同じ性別で同様な年齢の対象者又は患者から採取された同じタイプの診断サンプルに対して予想されるレベルよりも有意に高いレベルでの検出（例えばHAUSPの発現、p53-HAUSP相互作用などの検出）を指す。さらに本明細書で用いられる、“有意に高い”は、正常及び予想される（通常の）レベル（例えばHAUSP発現又はp53-HAUSP相互作用などのレベル）より上昇している、前記レベル間の相違が統計的に有意であることを意味する。
好ましくは、正常より上昇したHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）は、正常な場合に予想されるHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）レベルよりも少なくとも10％高いレベルのHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）である。HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）が個々の対象者又は患者から採取された個々の診断サンプルに存在しないと予想される場合、前記対象者又は患者についての正常なHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）レベルはゼロである。個々の対象者又は患者から採取された個々の診断サンプルが、低レベルの構成的HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）を有すると予想される場合、前記低レベルが、前記対象者又は患者についての正常なHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）レベルである。本明細書に開示されるように、p53-HAUSP相互作用及びHAUSP発現は、DNA損傷を含まない細胞内では一般的に低レベル存在する。
【００２９】
対象者又は患者から採取された個々の診断サンプルについて予想される、又は正常なHAUSP発現レベルは、疾患をもたない同じ性別で同様な年齢の対象者をアッセイすることによって容易に決定することができる。例えば、診断サンプルは、少なくとも30人の年齢が25から80歳の間の正常で健康な男性から入手され、男性におけるHAUSP発現の正常な量を決定することができる。同様な方法にしたがい、女性におけるHAUSP発現の正常な量を決定することができる。いったん必要な又は所望されるサンプルを入手したら、下記に記載されるように、定量のための標準的なアッセイ、例えばフローサイトメトリー、ウェスタンブロット分析又はタンパク質量を測定するためのELISAを用いて、男性及び女性におけるHAUSP発現の正常量を決定することができる。例えば、ELISAは各サンプルについてデュープリケートで実施し、HAUSP量の平均値及び標準偏差を決定することができる。必要な場合には、HAUSP発現の正常量を定量する前に、追加の対象者を募集することができる。同様なタイプの方法を用いて、対象者又は患者から採取した個々の診断サンプルについて予想される、又は正常なp53-HAUSP相互作用レベルを決定することができる。
【００３０】
本発明の方法にしたがい、対象者の診断サンプルをHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）についてアッセイすることができ、さらに、公知の技術（例えば免疫学的技術、ハイブリダイゼーション分析、蛍光画像化技術、及び/又は放射線検出など）から容易に決定されるアッセイ及び検出方法とともに本明細書に開示する任意のアッセイ及び検出方法（例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析など）を用いて、HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）を診断サンプルで検出することができる。例えば、対象者の診断サンプルは、HAUSPと反応する作用因子を用いてHAUSP発現についてアッセイすることができる。本明細書で用いられる“反応する”は、問題の標的（例えばHAUSP）に対して親和性を有するか、前記と結合するか、又は前記に対抗して誘導された作用因子を意味する。さらに本明細書で用いられる“作用因子”には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA又はRNAを含む）、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗生物質、薬剤及び前記の任意の組合せが含まれる。Fabフラグメントは抗体の一価の抗原結合フラグメントであり、パパイン消化によって生成される。F(ab')2フラグメントは抗体の二価の抗原結合フラグメントであり、ペプシン消化により生成される。好ましくは、本発明の作用因子は検出可能なマーカー又は標識により標識される。
本発明のある実施態様では、HAUSPと反応する作用因子は抗体である。本明細書で用いられる、本発明の抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。さらにまた、本発明の抗体は当業者に周知の技術によって作成することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製タンパク質（例えばHAUSP）でマウス、ウサギ又はラットを免疫することによって作成することができる。モノクローナル抗体は、次に免疫マウスから脾臓を取り出し、前記脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成することによって作成することができる。ハイブリドーマは培養物として増殖させたとき、モノクローナル抗体を産生するであろう。
【００３１】
本明細書で用いられる抗体は検出可能なマーカー又は標識により標識することができる。抗体の標識は、多様な標識技術の1つを用いて達成することができる。前記には当業界で公知のペルオキシダーゼ、化学発光標識及び放射能標識が含まれる。本発明の検出可能なマーカー又は標識は、例えば非放射能又は蛍光マーカー、例えばビオチン、フルオレセイン（FITC）、アクリジン、コレステロール又はカルボキシ-X-ローダミンでありうる。これらは、蛍光又は当業界で容易に知りうる他の画像化技術を用いて検出することができる。また別には、検出可能なマーカー又は標識は放射性マーカー（例えば放射性同位元素を含む）でもよい。前記放射性同位元素は、検出可能な放射線を放出する同位体、例えば35S、32P、125I、3H又は14Cでありうる。放射性同位元素によって放出される放射能は当業界で周知の技術によって検出することができる。例えば放射性同位元素のガンマ線放出はガンマ線画像化技術、特にシンチグラフ画像化を用いて検出できる。好ましくは、本発明の前記作用因子は、検出可能なマーカー又は標識で標識された高親和性抗体（例えばα-HAUSP）である。
本発明の前記作用因子がHAUSPと反応する抗体である場合、対象者から採取された診断サンプルは、固相（例えば、ビーズ、ゲル又はプレートの形態をもつ不溶性有機ポリマー）に結合したリガンドとしてHAUSP抗体（例えばα-HAUSP）を含むアフィニティーカラムを通過させることによって精製することができる。前記固相に結合させた抗体はカラムの形態で使用することができる。適切な固相の例には、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セファロース又は他の不溶性有機ポリマーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。HAUSP抗体（例えばα-HAUSP）は、所望の場合は、スペーサー分子を介してさらに固相に結合させることができる。前記作用因子及び抗体の結合を担保するための適切な結合条件（例えば温度、pH及び塩濃度）は、当業者により容易に決定することができる。好ましい実施態様では、HAUSP抗体（例えばα-HAUSP）はセファロースカラム、例えばセファロース4Bに結合させられる。
【００３２】
前記作用因子が抗体である場合、標準的な免疫学的検出技術とともに、HAUSPと免疫反応する1つ又は2つ以上の抗体を利用する結合実験を用いて、HAUSP発現について対象者の診断サンプルをアッセイすることができる。例えば、前記アフィニティーカラムから溶出させたHAUSPタンパク質はELISAアッセイ、ウェスタンブロット分析、フローサイトメトリー、又は抗原抗体反応を利用する他の任意の免疫染色方法に付すことができる。好ましくは、診断サンプルは、ウェスタンブロット分析を用いてHAUSP発現についてアッセイされる。
また別には、対象者の診断サンプルは、前記診断サンプルから抽出された核酸のハイブリダイゼーション分析を用いてHAUSP発現についてアッセイすることができる。本発明のこの方法にしたがえば、ハイブリダイゼーション分析はmRNAのノザンブロット分析を用いて実施できる。本方法はまた、HAUSPをコードする核酸とハイブリダイズする1つ又は2つ以上の核酸プローブを用い、DNAのサザンブロット分析を実施することによって達成することができる。前記核酸プローブは、当業者に公知の多様な技術によって調製することができる。前記技術は以下のとおりである（ただしこれらに限定されない）：HAUSP核酸の制限酵素消化；及びHAUSP核酸のヌクレオチド配列の選択部分に一致する配列を有するオリゴヌクレオチドの自動合成（市販のオリゴヌクレオチド合成装置（例えばアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル392 DNA/RNA合成装置）を使用する）。
【００３３】
本発明で用いられる核酸プローブはDNAでもRNAでもよく、長さはタンパク質コード（例えばHAUSPコード）核酸の約８ヌクレオチドから完全長まで変化しうる。前記プローブで用いられる核酸はいずれの哺乳動物（ヒトを含む）由来でもよい。ヒトHAUSPのヌクレオチド配列は公知である（例えば以下を参照されたい：Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997）。例えばこの配列をプローブとして用い、当業者は他の種から対応するHAUSP cDNAを容易にクローニングすることができる。さらにまた、本発明の核酸プローブを1つ又は2つ以上の検出可能なマーカー又は標識で標識することができる。核酸プローブの標識は、多様な標識（例えば放射性標識（例えば35S、32P又は3H）又は非放射性標識（例えばビオチン、フルオレセイン（FITC）、アクリジン、コレステロール又はカルボキシ-X-ローダミン（ROX））の1つとともに、当業界で公知の多数の方法のうちの1つ（例えばニックトランスレーション、末端標識、フィルイン末端標識、ポリヌクレオチドキナーゼ交換反応、ランダムプライミング、又はSP6ポリメラーゼ（リボプローブ調製用））を用いて達成することができる。HAUSP核酸の異なる又はオーバーラップする領域に対応して、2つ又は3つ以上の核酸プローブ（又はプライマー）をまた使用し、例えばPCR又はRT-PCRを用いてHAUSP発現のための診断サンプルをアッセイすることができる。
【００３４】
本発明の方法によるHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）の検出は、対象者の診断サンプルにおけるHAUSP発現の程度を測定又は定量するアッセイを伴うことができる。そのようなアッセイは当業者には周知であり、免疫組織化学／免疫細胞化学分析、フローサイトメトリー、質量分析、ウェスタンブロット分析又はHAUSPタンパク質の量を測定するELISAが含まれうる。例えば、免疫組織化学的アッセイを使用するために、組織学的（パラフィン包埋）組織切片をスライド上に静置し、続いてHAUSPに対する抗体とともにインキュベートすることができる。続いて前記スライドを第二の抗体（一次抗体に対する抗体）とインキュベートすることができる。前記第二の抗体には色素又は他の比色系（例えば蛍光発色団、放射性物質、又は高い電子スキャン能力を有する物質）が付加され、前記切片に存在するHAUSPの可視化を可能にする。
本発明の診断サンプルは、対象者又は患者によってではなく、その主治医によってでもなく、検査室の技師又は他の臨床医によってHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）についてしばしばアッセイされることが意図される。したがって、本発明の方法はさらに、対象者又は患者の診断サンプルのアッセイ時にHAUSP発現について得られた結果の報告書を前記対象者又は患者の主治医に提供することを含む。
【００３５】
同様に、本発明は、対象者の診断サンプルをMdm2発現及びHAUSP発現についてアッセイすることによって対象者が新形成を有するか否かを決定する方法を提供する。前記方法において、正常より上昇したMdm2（ネズミダブルミニッツ2）発現及び正常より上昇したHAUSP発現が前記診断サンプルにおいて検出されることは、対象者が新形成を有することの診断指標となる。上記で考察したように、癌腫にはp53経路の欠損（HAUSP、Mdm2及び/又はp53における欠損を含む）が付随していた。したがって、ある実施態様では、本発明の方法及び組成物は、p-53関連新形成の評価、検出、診断、モニター及び治療を目的とする。また別の実施態様では、本発明の方法及び組成物は、Mdm2又はHAUSP関連新形成の評価、検出、診断、モニター及び治療を目的とする。
本発明の方法にしたがえば、診断サンプルは、上記に記載したようにHAUSPタンパク質、HAUSP cDNA又はHAUSP mRNAについてアッセイすることによって、HAUSP発現についてアッセイすることができる。さらにまた、診断サンプルは、Mdm2タンパク質、Mdm2 cDNA又はMdm2 mRNAについてアッセイすることによって、Mdm2発現についてアッセイすることができる。Mdm2の適切な形態は、本明細書で考察する個々の技術を基にすれば明白であろう。対象者又は患者から採取される個々の診断サンプルについて、予想される又は正常なHAUSP発現レベルは、上記に記載した方法にしたがって決定することができる。対象者又は患者から採取される個々の診断サンプルについて、予想される又は正常なMdm2発現レベルは、HAUSPに関連して上記に記載したように、疾患をもたない同じ性別で同様な年齢の対象者をアッセイすることによって容易に決定することができる。
【００３６】
好ましくは、正常より上昇したMdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）とは、正常な場合に予想されるMdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）レベルよりも少なくとも10％高いレベルのMdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）である。Mdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）が個々の対象者又は患者から採取された個々の診断サンプルに存在しないと予想される場合、前記対象者又は患者についての正常なMdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）レベルはゼロである。個々の対象者又は患者から採取された個々の診断サンプルが、低レベルの構成的Mdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）を有すると予想される場合、前記低レベルが、前記対象者又は患者についての正常なMdm2発現（又はHAUSP発現又はMdm2-HAUSP相互作用）レベルである。
対象者又は患者が新形成を有するか否かを決定するために、診断サンプルをMdm2及びHAUSPタンパク質の任意の形態又は全ての形態（前駆体、分子内タンパク分解的にプロセッシングされた形態及び翻訳後修飾から生じる他の形態を含む）の発現についてアッセイすることもできる。さらにまた、Mdm2-HAUSP相互作用の増加を検出することによって、正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSPの発現について診断サンプルをアッセイすることもできる。したがって、本発明のある実施態様では、正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現は、診断サンプルで正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって診断サンプルで検出される。
【００３７】
対象者の診断サンプルは、本明細書に記載した方法にしたがってMdm2発現、HAUSP発現、及び/又はMdm2-HAUSP相互作用についてアッセイすることができる。Mdm2発現、HAUSP発現、及び/又はMdm2-HAUSP相互作用はまた、本明細書に開示した任意のアッセイ及び検出方法と同様に公知の技術から容易に決定できるアッセイ及び検出方法を用いて診断サンプルで検出することができる。
例えば、対象者の診断サンプルは、前記診断サンプルから抽出された核酸のハイブリダイゼーション分析を用いてMdm2発現についてアッセイすることができる。この方法は、好ましくはMdm2をコードする核酸とハイブリダイズする核酸プローブを利用する。ある実施態様では、前記核酸プローブは検出可能なマーカー又は標識により標識される。また別には、対象者の診断サンプルは、Mdm2と反応する作用因子を用いてMdm2発現についてアッセイすることができる。本発明の作用因子は好ましくは検出可能なマーカー又は標識により標識される。本発明のある実施態様では、Mdm2と反応する前記作用因子は抗体（例えば抗Mdm2モノクローナル抗体、4b2）である。
本発明の前記作用因子がMdm2と反応する抗体であるときは、HAUSPの検出について上記に記載した技術にしたがって、対象者から採取された診断サンプルは、固相（例えば、ビーズ、ゲル又はプレートの形態をもつ不溶性有機ポリマー）に結合したリガンドとしてMdm2抗体を含むアフィニティーカラムを通過させることによって精製することができる。さらにまた、前記作用因子が抗Mdm2抗体である場合、HAUSPに関連して上記に記載したように、標準的な免疫学的検出技術とともに、Mdm2と免疫反応する1つ又は2つ以上の抗体を利用する結合実験を用いて、Mdm2発現について対象者の診断サンプルをアッセイすることができる。
【００３８】
本発明の方法におけるMdm2発現、HAUSP発現及び/又はMdm2-HAUSP相互作用の検出は、対象者の診断サンプルにおけるMdm2発現、HAUSP発現及び/又はMdm2-HAUSP相互作用の程度を測定又は定量するアッセイを伴うことができる。さらにまた、本発明の方法は、対象者又は患者の診断サンプルのアッセイ時にMdm2発現、HAUSP発現及び/又はMdm2-HAUSP相互作用について得られた結果の報告書を前記対象者又は患者の主治医に提供する工程を含むことができる。
本発明はさらに、新形成のための治療を受けた又は受けている対象者又は患者で新形成治療のための療法の有効性を評価する方法を提供する。本発明の方法は、対象者又は患者の診断サンプルをHAUSP発現についてアッセイすることを含む。前記アッセイにおいて、正常レベルのHAUSP発現が検出されることは新形成治療のための療法の成功の指標であり、正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは新形成治療のための療法の継続の必要性の指標である。本発明のある実施態様では、正常より上昇したHAUSP発現は、正常より上昇したp53-HAUSP相互作用を検出することによって検出される。前記新形成は上記に記載した新形成のいずれか（p53-関連新形成を含む）でありうる。前記診断サンプルは、上記に記載したように組織でも体液でもよく、in vitro又はin vivoでHAUSPの発現（又はp53-HAUSP相互作用）についてアッセイすることができる。さらにまた、前記診断サンプルは、上記に記載した多様なアッセイ及び検出方法の全てを用いてHAUSPの発現（又はp53-HAUSP相互作用）についてアッセイすることができる。本発明のこの方法は、対象者又は患者から採取された診断サンプルでのHAUSPの発現レベル（又はp53-HAUSP相互作用）の周期的評価を可能にすることによって、新形成治療のための療法の有効性をモニターする手段を提供する。
【００３９】
本発明の方法にしたがって、対象者又は患者の診断サンプルをアッセイし、新形成治療のための療法の開始後任意の時期にHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルについて評価することができる。例えば、対象者又は患者に新形成の治療を施しながら、HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルを評価することができる。対象者又は患者の被検診断サンプルで検出されたHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルが正常より上昇したままである場合、医師は前記新形成について対象者又は患者の治療の継続を選択することができる。対象者又は患者の被検診断サンプルにおいてHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルが継続する評価を通じて減少した場合、新形成に対する前記治療は機能したという表示であり、前記治療を縮小するか終わらせることすら可能であろう。対象者又は患者の被検診断サンプルにおいてHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルが継続する評価を通じて急速には減少していない場合、新形成に対する前記治療は機能していないという表示であり、前記治療を増強させることができる。対象者又は患者の被検診断サンプルにおいて、HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）がもはや検出されない場合、医師は、前記新形成について治療は成功であったと結論し、前記治療を終了させることができる。
【００４０】
前記新形成が対象者又は患者で再発したか否かを決定するために、対象者又は患者の新形成治療の完了後にHAUSP発現レベルを評価することは本発明の範囲内である。したがって、アッセイされる診断サンプルでのHAUSP発現レベルの評価は、新形成を有すると診断された患者の経過観察実施のために便利な方法を提供することができる。さらにまた、臨床的又は病理学的病期決定ツールとして、対象者又は患者の新形成の程度を決定する手段として、及び適切な治療選択肢の手段として、HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）の評価レベルを用いることは本発明の範囲内である。
本発明はまた、新形成について治療を受けた又は治療を受けている対象者において、新形成治療のための療法の有効性を、Mdm2発現及びHAUSP発現について前記対象者の診断サンプルをアッセイすることによって評価する方法を提供する。本方法において、前記診断サンプルでの正常なMdm2発現及び正常なHAUSP発現が検出されることは、前記新形成治療のための療法の成功の指標であり、前記診断サンプルでの正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現が検出されることは新形成治療のための療法の継続の必要性を指標である。本発明のある実施態様では、正常より上昇したMdm2発現及び正常より上昇したHAUSP発現は、前記診断サンプルで正常より上昇したMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって前記診断サンプルで検出される。前記新形成は、上記に記載した新形成（p53-関連新形成を含む）のいずれでもよい。本発明の方法で使用される適切な診断サンプル、アッセイ、並びに検出及び定量方法は既に記載した。
【００４１】
一般的には、癌罹患患者の腫瘍負荷と生存との間には相関性が存在する。したがって、本発明ではまた、対象者の診断サンプルをHAUSP発現についてアッセイすることは、新形成を有する対象者又は患者の予後に関する情報提供の有用な手段でありうると考えられる。したがって本発明はさらに、対象者の診断サンプルをHAUSP発現についてアッセイすることを含む、新形成を有する対象者の予後を評価する方法を提供する。前記方法において、前記診断サンプルにおけるHAUSP発現低下があれば前記対象者の予後は改善されており、前記診断サンプルにおけるHAUSP発現が増加していれば前記対象者の予後は悪化している。本発明のある実施態様では、正常より上昇したHAUSP発現は、正常より上昇したp53-HAUSP相互作用を検出することによって検出される。本発明の方法で使用される適切な診断サンプル、アッセイ、並びに検出及び定量方法は既に記載した。本発明のこの方法は、新形成を有すると診断された対象者又は患者の予後を決定するための手段を、前記対象者又は患者の被検診断サンプル中のHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルに基づいて提供する。
本発明の方法にしたがえば、対象者又は患者の新形成の診断時又は診断後の任意の時点で、前記対象者又は患者の診断サンプルをアッセイすることができ、HAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルを評価することができる。例えば、被検診断サンプル中のHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルは、対象者又は患者の最初の予後決定のために、前記対象者又は患者が新形成の治療を受ける前に評価することができる。さらにまた、被検診断サンプル中のHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルは、前記対象者又は患者の予後が治療過程を通じて多かれ少なかれ改善されたか否かを決定するために、対象者又は患者が新形成のための治療を受けている間に評価することができる。
【００４２】
例示すれば、対象者又は患者の被検診断サンプルで検出されたHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルが有意に高いか、又は高いままである場合、医師は対象者又は患者の予後は不良であると結論することができる。対象者又は患者の被検診断サンプルで検出されたHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）が、連続した評価を通して低下した場合、前記対象者又は患者の予後は改善しつつあるという指標でありうる。対象者又は患者の被検診断サンプルのHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）のレベルが、連続した評価を通して顕著に低下しない場合、前記対象者又は患者の予後は改善されていないという指標でありうる。最後に、対象者又は患者の被検診断サンプルでHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）が低いか、又は正常である場合、医師は、前記対象者又は患者の予後は良好であると結論することができる。
同様に、本発明は、対象者の診断サンプルをMdm2発現及びHAUSP発現についてアッセイすることによって、新形成を有する対象者の予後を評価する方法を提供する。前記方法で、前記診断サンプルにおけるMdm2発現の低下及びHAUSP発現低下が検出されれば前記対象者の予後は改善されており、前記診断サンプルにおけるMdm2発現の増加及びHAUSP発現の増加が検出されれば前記対象者の予後は悪化している。ある実施態様では、Mdm2発現及びHAUSP発現は、診断サンプルでMdm2-HAUSP相互作用を検出することによって前記診断サンプルで検出される。
【００４３】
HAUSPは新形成を示す細胞で検出することができるという発見は、新形成を有する患者を同定する手段を提供し、新形成診断用検査として商業的に利用するための潜在性を提示する。そのような検査の開発は、一般的なスクリーニング方法を提供しうるであろう。そのような方法は癌の早期発見及び診断に役立ち、正常より上昇したHAUSP発現（p53-HAUSP相互作用を含む）及びMdm2発現（Mdm2-HAUSP相互作用を含む）が検出された患者の経過観察のための方法を提供することができる。
したがって本発明はさらに、HAUSPと反応する作用因子及びHAUSP発現（又はp53-HAUSP相互作用）を検出する適切な試薬を含む、新形成のアッセイとして使用されるキットを提供する。本発明はまた、以下を含む、新形成の検出に使用されるキットを提供する：（a）Mdm2と反応する少なくとも1つの作用因子；（b）HAUSPと反応する少なくとも1つの作用因子；及び（c）Mdm2の発現及びHAUSPの発現を検出するために適切な試薬。前記作用因子は、上記に記載した作用因子のいずれでもよく、さらに、HAUSP発現、Mdm2発現、p53-HAUSP相互作用及びMdm2-HAUSP相互作用を検出又は定量するために上記に記載したアッセイ又は方法のいずれにおいても使用することができる。好ましくは、本発明の少なくとも1つの作用因子は検出可能なマーカー又は標識で標識される。
上記で指摘したように、全ての癌症例の60％を超える症例がp53の変異を伴う。したがって、p53は多くの癌治療のための手がかりであり、p53経路は特に重要な問題である。p53は一般的に不安定なタンパク質であり、ほぼ20分の半減期を有し、ユビキチン化（ユビキチンの結合）に続いてタンパク質分解経路においてプロテオソームによって非常に迅速に分解される。p53の安定化は、腫瘍抑制因子としての前記タンパク質の有効性のために重要であると考えられている。
【００４４】
本発明者らは、HAUSP（又はUSP7）は、p53からユビキチンを除去することによってp53腫瘍抑制因子を安定化させ、それによってp53をタンパク質分解からレスキューすることができると決定した。したがって、HAUSPは脱ユビキチン化酵素である。HAUSPはp53の半減期を顕著に増強し、前記を20分から90分に増加させる。興味深いことには、下記に記載するように、HAUSPはまた、その遺伝子が発現されたとき腫瘍抑制因子として機能するように思われる。HAUSPの腫瘍抑制因子機能は、p53に依存すると考えられる。酵母で脱ユビキチン化酵素が同定され、哺乳動物細胞にも存在することが知られているが、本明細書に記載の発見は、本発明者らが知るかぎり、ある特定のユビキチナーゼが基質特異性を有することを示した最初のものである。
p53経路に欠損を伴ういくつかの癌はp53の欠損から生じるのではなく、変異HAUSP（例えばコード領域の遺伝的変化から生じる変異）、及び/又は発現レベルでのHAUSP制御の欠損（例えばHAUSP遺伝子のプロモーター領域の遺伝的変化から生じる欠損）、及び/又は変異Mdm2、及び/又は発現レベルでのMdm2制御の欠損から生じると予想される。前述の記載を考慮すれば、細胞内のHAUSP、Mdm2及び/又はHAUSP-Mdm2のレベルの調節が、p53の腫瘍抑制機能の増強及び前記機能のHAUSP自身の腫瘍抑制機能による補強のための手段を提供することは明白である。したがって、本発明はさらに、対象者でHAUSPの活性を高めることを含む、新形成治療の必要がある対象者で前記新形成を治療する方法を提供する。前記新形成は上記に記載したもののいずれでもよいが、好ましくはp53関連新形成である。
【００４５】
本発明の方法にしたがえば、対象者のHAUSPの活性は直接HAUSPを標的とすることによって高めることができる。さらにまた、対象者のHAUSP活性は、対象者のHAUSPの機能又はレベルを制御又は調節する酵素又は他の内在性分子を標的とすることによって間接的に高めることができる。好ましくは、対象者のHAUSP活性は、本発明の方法で少なくとも10％増強される。より好ましくは、HAUSP活性は少なくとも20％増強される。
例えば、対象者のHAUSPの活性は、対象者でHAUSPの1つ又は2つ以上の機能を直接的又は間接的に活性化、促進又は刺激することによって（例えばHAUSPと相互作用するタンパク質の制御又は調節によって）高めることができる。本明細書で用いられる“活性化させる”という用語は、対象者でHAUSPの機能（特にp53の脱ユビキチン化及びその結果のp53の安定化）を刺激又は誘導することを意味する。本発明の方法では、対象者のHAUSPは、例えば、上記に規定したようにHAUSPを刺激するか又はHAUSPと反応する小分子又はタンパク質模倣体を対象者に投与することによって活性化することができる。
対象者のHAUSPの活性はまた、対象者の体内のHAUSP発現のアップレギュレーションを直接的又は間接的に惹起、誘導又は刺激することによって高めることができる。したがって、本発明のある実施態様では、HAUSPの活性は、HAUSP発現の調節因子を前記対象者における前記新形成の治療に有効な量で投与することによって対象者で高められる。本明細書で用いられる“発現の調節因子”は、特定のタンパク質の発現に対してアンタゴニスト（阻害性）又はアゴニスト（促進性）作用を有する任意の作用因子又は作用因子の組合せでありうる。したがって、発現の調節因子はアゴニスト又はアンタゴニストでありうる。本発明の調節因子には、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA又はRNAを含む）、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗生物質及び薬剤並びに問題のタンパク質（例えばHAUSP）と反応し前記タンパク質の発現を誘導又はアップレギュレートする物質が含まれる。
【００４６】
HAUSPの調節因子は簡単なスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。例えば、HAUSPの候補調節因子のスクリーニングのために、ヒト肺癌細胞（H1299）をマイクロタイタープレートに播種し、続いて薬剤ライブラリーと接触させることができる。核酸ハイブリダイゼーション及び/又は当業界で公知の免疫学液技術（ELISAを含む）を用いて、HAUSP発現の増加又はアップレギュレーションをもたらすものはいずれも検出することができる。HAUSP発現のさらに別の調節因子は、当業界で周知であるか、又は本明細書に開示するスクリーニング方法を用いて同定することができる。HAUSPの調節因子は、HAUSPの発現を誘導又はアップレギュレートする薬剤であろう。この態様では、候補調節因子はまた、新生物の増殖を阻害するそれらの能力について、新形成中の細胞の増殖又は細胞の生長が停止又はその速度が低下したことを示す指標としてHAUSP発現を用いてスクリーニングすることができる。
新形成の治療の有効性を高めるため、ターゲティングの有効性を高めるため、及び/又はp53脱ユビキチン化の有効性を高めるために、HAUSP発現の調節因子を別の作用因子と連結させるか、又は別の作用因子と併用投与することができるということも本発明の範囲内である（前記別の作用因子は例えば抗新形成薬剤又はリボザイムである）。HAUSP発現の調節因子と連結させることができる抗新形成薬剤の例には、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド及びビンブラスチンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４７】
対象者のHAUSP活性はまた、対象者の体内でin vivoでHAUSPレベルを直接的又は間接的に増加させることによって対象者で高めることができる。例示すれば、対象者のHAUSPレベルは、HAUSPタンパク質を対象者の新形成治療に有効な量で対象者に投与することによって高めることができる。同様に、対象者のHAUSPレベルは、HAUSPをコードする核酸配列を、対象者でHAUSP発現を許容する態様で、対象者の新形成治療に有効な量で対象者に投与することによって高めることができる。
本発明は、in vitroでのポリペプチドの合成（例えば化学的手段又はmRNAのin vitro翻訳による）によって生成されるタンパク質及びタンパク質アナログの使用を包含する。例えば、HAUSP及びMdm2は当業者に一般的に知られている方法によって合成することができる（Modern Techniques of Peptide and Amino Acid Analysis, New York, John Wiley & Sons, 1981；M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, New York: Springer-Verlag New York, Inc., 1984）。アミノ酸配列及びこれら配列のアナログの合成で用いることができる方法の例には、固相ペプチド合成、溶液系ペプチド合成及び市販のペプチド合成装置のいずれかを用いる合成が含まれる。本発明のアミノ酸配列はカップリング試薬及び保護基を含むことができる。カップリング試薬及び保護基はタンパク質配列の合成で用いられ、当業界では周知である。
本発明の方法にしたがえば、HAUSPタンパク質は、新形成を有する対象者に、単独で又は新形成治療に用いられる1つ又は2つ以上の抗新形成薬剤と併用して投与することができる。HAUSPタンパク質と併用することができる抗新形成薬剤の例には、カルボプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド及びビンブラスチンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４８】
本発明の方法では、HAUSP発現の調節因子、HAUSPタンパク質、又はHAUSPをコードする核酸配列が、対象者の新形成を治療するために有効な量で、新形成を有する対象者に投与される。本明細書で用いられる、“新形成を治療するために有効”という語句は、前記新形成からもたらされる臨床的障害又は症状を緩和又は最小にするために有効であることを意味する。例えば、新形成の臨床的障害又は症状は、対象者が被る一切の痛み又は不快を減ずることによって；対象者の生存をそのような治療がなければ予想されるものを超えて延長させることによって；新形成の発育又は拡散を阻害若しくは予防することによって；又は新生物中の細胞の成熟及び分裂を制限、一時停止又は制御することによって緩和又は最小限にすることができる。対象者で新形成を治療するために有効である、HAUSP発現の調節因子、HAUSPタンパク質、又はHAUSPをコードする核酸配列の量は、各症例の個々の因子に応じて変動するであろう。前記因子には、新形成のタイプ、新形成の病期、対象者の体重、対象者の症状の重篤度、及び投与方法が含まれる。これらの量は当業者には容易に決定することができる。
本発明の方法では、HAUSP発現の調節因子、HAUSPタンパク質、又はHAUSPをコードする核酸配列は、ヒト又は動物の対象者に公知の方法によって投与することができる。前記方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：経口投与、非経口投与（例えば筋膜上、(関節)包内、皮内、真皮内、筋肉内、眼窩内、腹腔内、脊髄内、胸骨内、血管内、静脈内、実質組織内、又は皮下投与）、経皮投与、及び浸透圧ポンプによる投与。好ましい投与方法の１つは、静脈注射又は皮下注射による非経口投与である。
【００４９】
経口投与のためには、カプセル、錠剤、散剤、顆粒又は懸濁液としてHAUSP調節因子、タンパク質又は核酸の製剤を調製することができる。前記製剤は通常の添加剤、例えばラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン又はジャガイモデンプンを含むことができる。前記製剤はまた、結合剤、例えば結晶質セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチンとともに供することができる。さらにまた、前記製剤は、崩壊剤例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムとともに供することができる。前記製剤はまた、二塩基性リン酸カルシウム無水物、グリコール酸ナトリウムデンプン（sodium starch glycolate）とともに供することができる。最後に、前記製剤は滑沢剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウムとともに供することができる。
非経口投与のためには、HAUSP調節因子、タンパク質又は核酸は無菌的水溶液と混合することができる。前記溶液は好ましくは対象者の血液と等張である。そのような製剤は、固体の活性成分を生理学的に適合しうる物質（例えば塩化ナトリウム、グリシンなど）を含み、生理学的条件に適合しうる緩衝されているpHを有する水に溶解して水溶液を生成し、続いて前記溶液を滅菌することによって調製することができる。前記製剤は単位投与用又は複数回投与用容器（例えば封入アンプル又はバイアル）で供することができる。前記製剤はまた、上記に記載したもののいずれかを含む、任意の注射態様によってデリバーすることができる。
【００５０】
経皮投与のためには、HAUSP調節因子、タンパク質又は核酸は、皮膚浸透増強剤、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、N-メチルピロリドンなどと混合することができる。これらの皮膚浸透増強剤は、調節因子、タンパク質又は核酸に対し皮膚の透過性を高めてこれらを皮膚から血流に浸透させる。前記増強剤及び調節因子、タンパク質又は核酸の組成物はまた、ポリマー物質（例えばエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニルアセテート、ポリビニルピロリドンなど）とさらに混合され、ゲル形態の組成物が提供される。これらを溶媒（例えばメチレンクロリド）に溶解させ、所望の粘度に蒸発させ、続いて裏張り材に塗布して膏薬を提供する。調節因子、タンパク質又は核酸は、対象者の新形成が局在している部位又は部位近くで経皮的に投与することができる。また別には、調節因子、タンパク質又は核酸は、全身的投与を達成するために患部領域以外の部位で経皮的に投与することができる。
本発明のHAUSP調節因子、タンパク質又は核酸はまた、浸透圧ミニポンプ又は他の経時放出装置から放出又はデリバーされうる。初歩的な浸透圧ミニポンプの放出速度は、放出口に配置された微小孔をもつ迅速応答ゲルにより調整することができる。浸透圧ミニポンプは、前記調節因子、タンパク質又は核酸の制御放出又はターゲティングデリバリーのために有用であろう。
HAUSP発現の調節因子がタンパク質である場合、又はHAUSPタンパク質が選択された療法である場合、本発明の方法にしたがえば、前記タンパク質は、対象者に前記タンパク質そのものを導入することによって、又は前記タンパク質をコードする核酸を前記タンパク質の発現を許容する態様で対象者に導入することによって対象者に投与することができる。したがって、本発明のある実施態様では、対象者のHAUSPの活性は、ある量のタンパク質（例えばHAUSP発現の調節因子又はHAUSPタンパク質そのもの）を対象者に投与することによって高めることができる。本発明のさらに別の実施態様では、対象者のHAUSP活性は、タンパク質（例えばHAUSP発現の調節因子又はHAUSPタンパク質そのもの）をコードする核酸配列を対象者に投与することによって高めることができる。
【００５１】
本発明のタンパク質は、タンパク質及び他の薬剤の導入に用いられる公知の技術（例えば注射及び輸液を含む）によって対象者に投与又は導入することができる。新生物が対象者の身体の特定の部分に局在する場合は、治療用タンパク質を前記領域に注射又は他の何らかの手段によって（例えば前記タンパク質を血液又は別の体液に導入することによって）直接導入することが所望されうる。使用されるタンパク質の量は、上記で規定したように対象者で新形成を治療するために有効な量であり、当業者には容易に決定できる。
HAUSP発現の調節因子がタンパク質である場合、又はHAUSPタンパク質が選択された療法である場合、本発明の方法では、前記タンパク質はまた、前記タンパク質をコードする核酸を対象者の十分な数の細胞に、対象者で前記タンパク質の発現を許容する態様で導入することによって対象者に投与又は導入することができる。前記治療用タンパク質をコードする核酸の量は、上記に規定したように、対象者で新形成を治療するために有効な量のタンパク質を生成する量である。この量は当業者には容易に決定できる。
HAUSP発現の調節因子又はHAUSPタンパク質をコードする核酸は、HAUSP発現の任意のヌクレオチド調節因子と同様に、いずれも通常の当業界で公知の方法を用いて対象者に導入することができる。前記方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：エレクトロポレーション、DEAEデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクチン、モノカチオンリポソーム融合、ポリカチオンリポソーム融合、プロトプラスト融合、in vivo電場の形成、DNA被覆微小弾丸ボンバードメント、複製欠損組換えウイルスの注入、相同組換え、in vivo遺伝子治療、ex vivo遺伝子治療、ウイルスベクター、及び裸のDNAの移入、又は前記の組合せ。遺伝子治療に適した組換えウイルスベクターには、レトロウイルス、HSV、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林ウイルス、サイトメガロウイルス及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノムに由来するベクターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５２】
細胞内で治療用タンパク質の発現を達成するために、HAUSP発現の調節因子をコードする核酸又はHAUSPタンパク質そのものをコードする核酸をin vitroで適切な細胞に導入することも本発明の範囲内である。続いて、HAUSP発現の調節因子又はHAUSPタンパク質を発現する細胞を対象者に導入し、in vivoで新形成を治療することができる。そのようなex vivo遺伝子治療によるアプローチでは、細胞は好ましくは対象者から取り出され、前記治療用タンパク質をコードする核酸を取り込ませるためのDNA技術に付され、続いて前記対象者に再び導入される。
HAUSP調節因子、タンパク質又は核酸を含む製剤を医薬的に許容できる担体とさらに結合させることも本発明の範囲内であり、それによって本発明は医薬組成物を含む。したがって本発明はさらに医薬組成物を提供し、前記組成物は、HAUSP発現の調節因子、又はHAUSPタンパク質、又はHAUSPをコードする核酸配列及び医薬的に許容できる担体を含む。前記医薬的に許容できる担体は、組成物の他の成分と適合できるという意味で“許容できる”ことが必要であり、さらに前記組成物の受容者にとっても有害であってはならない。許容できる医薬的担体の例には、とりわけカルボキシメチルセルロース、結晶質セルロース、グリセリン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、パウダー（powder）、食塩水、アルギン酸ナトリウム、シュクロース、デンプン、タルク及び水が含まれる。医薬組成物の製剤は便利なようにユニット剤形として供される。
【００５３】
本発明の製剤は製薬業界で周知の方法によって調製することができる。例えば、HAUSP調節因子、タンパク質又は核酸を懸濁液又は溶液として担体又は希釈剤と一緒にすることができる。場合によって、1つ又は2つ以上の付属成分（例えば緩衝剤、香料、表面活性剤など）もまた添加することができる。担体の選択は投与経路に左右されるであろう。前記医薬組成物は、新形成を治療するために本発明のHAUSP調節因子、タンパク質又は核酸を対象者に投与するために有用であろう。前記HAUSP調節因子、タンパク質又は核酸は、前記医薬組成物を投与される対象者の新形成を治療するために有効な量で提供される。前記の量は、上記に記載したように、当業者には容易に決定することができる。
本発明はさらに、対象者においてp53の活性を増加又は増強することによって新形成を治療する方法を提供する。この方法では、p53の活性は、Mdm2-HAUSP相互作用を対象者において調節することによって増加又は増強される。好ましくは、対象者のp53の活性は本発明の方法で少なくとも10％増加又は増強される。より具体的には、p53の活性は少なくとも20％増加又は増強される。前記新形成は上記に記載した新形成のいずれでもよいが、好ましくはMdm2-、HAUSP-又はp53-関連新形成である。
Mdm2-HAUSP相互作用は、対象者にMdm2-HAUSP相互作用の調節因子を投与することによって対象者において調節することができる。本明細書で用いられる、“Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子”は、Mdm2-HAUSP相互作用に対してアンタゴニスト（阻害性）作用又はアゴニスト（促進性）作用を有する任意の作用因子又は作用因子の組合せでありうる。したがって、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子はアゴニストでもアンタゴニストでもよい。例えば、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子は、Mdm2タンパク質、Mdm2をコードする核酸配列、Mdm2発現の調節因子、HAUSPタンパク質、HAUSPをコードする核酸、HAUSP発現の調節因子、Mdm2-HAUSP複合体と反応する作用因子、及びMdm2-HAUSP相互作用を直接調節する作用因子でありうる。Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子（現在公知の一切のもの又は後に発見されるものを含む）はまた天然でも合成でもよい。
【００５４】
例示すれば、Mdm2-HAUSP相互作用は、対象者の体内でin vivoでMdm2及びHAUSPのレベルを直接又は間接的に増加させることによって調節することができる。対象者のMdm2又はHAUSPのレベルは、Mdm2タンパク質又はHAUSPタンパク質をそれぞれ対象者に投与することによって増加させることができる。同様に、対象者のMdm2（又はHAUSP）のレベルは、Mdm2（又はHAUSP）をコードする核酸配列を、Mdm2（又はHAUSP）の発現を許容する態様で対象者に投与することによって増強することができる。
Mdm2-HAUSP相互作用はまた、対象者でMdm2又はHAUSPの1つ又は2つ以上の機能を直接又は間接的に活性化、促進又は刺激することによって（例えばMdm2又はHAUSPと相互作用するタンパク質の制御又は調節によって）対象者において調節することができる。対象者のMdm2（又はHAUSP）は、例えばMdm2（又はHAUSP）を刺激するか、又はMdm2（又はHAUSP）と反応する小分子又はタンパク質模倣体を対象者に投与することによって活性化させることができる。さらにまた、Mdm2-HAUSP相互作用は、対象者の体内でMdm2（又はHAUSP）発現のアップレギュレーションを直接又は間接的に惹起し又は誘導し又は刺激することによって対象者において調節することができる。したがって、本発明のある実施態様では、Mdm2-HAUSP相互作用は、Mdm2（又はHAUSP）発現の調節因子を対象者に投与することによって対象者において調節することができる。
【００５５】
さらにまた、Mdm2-HAUSP相互作用は、Mdm2-HAUSP複合体と反応するか又はそうでなければMdm2-HAUSP相互作用を調節するタンパク質を直接又は間接的に活性化、促進、制御、調節又は刺激することによって対象者において調節することができる。したがって、また別の実施態様では、対象者におけるMdm2-HAUSP相互作用は、Mdm2-HAUSP複合体と反応する作用因子及びMdm2-HAUSP相互作用を直接調節する作用因子を対象者に投与することによって調節される。
本発明の方法で使用される調節因子には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA又はRNAを含む）、抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、分子、化合物、抗体、薬剤、HAUSP発現を誘導又はアップレギュレートするHAUSPと反応する作用因子、Mdm2発現を誘導又はアップレギュレートするMdm2と反応する作用因子、及びMdm2-HAUSP複合体と反応する作用因子が含まれるが、ただし前記に限定されない。Mdm2の調節因子は簡単なスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。例えば、Mdm2の候補調節因子をスクリーニングするために、細胞（例えばMdm2ヌル細胞又はMdm2を含む細胞）をマイクロタイタープレートに播種し、続いて薬剤ライブラリーと接触させることができる。Mdm2発現の増加又はアップレギュレートを生じるいずれの作用因子も、核酸ハイブリダイゼーション及び/又は当業界で公知の免疫学的技術（ELISAを含む）用いて検出することができる。Mdm2の調節因子は、Mdm2の発現を誘導又はアップレギュレートする薬剤であろう。さらに別のMdm2発現の調節因子は、Mdm2-HAUSP複合体と反応する作用因子及びMdm2-HAUSP相互作用を直接調節する作用因子と同様、当業界で周知であるか又は本明細書で開示したスクリーニング方法を用いて同定することができる。
【００５６】
本発明の方法では、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子は、公知の方法（本明細書に記載の方法を含む）によって新形成を有する対象者に投与される（単独で又は1つ又は2つ以上の抗新形成薬剤と併用して）。選択された調節因子は、対象者のp53の活性を高めるために有効な量で提供され、それによって対象者の新形成を治療する。この量は、各症例の個々の因子（新形成のタイプ、新形成の病期、対象者の体重、対象者の症状の重篤度、及び投与方法を含む）に応じて変動するが、当業者には容易に決定することができる。
本明細書に開示するように、本発明者らは、アフィニティー精製p53関連因子の質量分析を用いて、HAUSPはp53と相互作用すると決定した。HAUSPは、過剰なMdm2の存在下でさえも強力にp53を安定化させ、p53依存細胞増殖抑制及びアポトーシスを誘導する。重大なことには、HAUSPは、in vitro及びin vivoの両方で特異的にp53を脱ユビキチン化する固有の酵素活性を有する。対照的に、触媒的に不活性なHAUSP点変異体の細胞内での発現はp53のユビキチン化レベルを増加させ、p53を不安定化させる。これらの発見は、p53を直接的な脱ユビキチン化によって安定化させることができる重要なメカニズムを明らかにした。前述の記載を考慮して、本発明はさらに、p53を含む細胞でp53を脱ユビキチン化及び/又は安定化させる方法を提供する。前記方法は、細胞をp53の脱ユビキチン化及び/又は安定化のために有効な量のHAUSPと接触させることを含む。本明細書で用いられる、単数形の“a”、“an”及び“the”は、文脈が明白にそうでないことを示さないかぎり複数の意味を含む。例えば、“a cell”は、複数のそのような細胞及び当業者に公知のその等価物を含む。
【００５７】
本発明の方法を用いて、in vitroで又は対象者においてin vivoでp53を脱ユビキチン化する、すなわちp53からユビキチンを除去することができる。p53の脱ユビキチン化は、本明細書に開示する任意の方法、分子的方法及びアッセイを含む公知の方法によって検出することができる。p53の脱ユビキチン化を調節するHAUSPの能力は、上記に記載したように新形成（特にp53関連新形成）の治療のためにHAUSPを有用にさせる。したがって、本発明のある実施態様では、対象者は新形成を有するヒトであり、HAUSPは前記新形成を治療する。
HAUSPは、細胞にHAUSPタンパク質を導入することによって、又は細胞にHAUSPをコードする核酸配列をHAUSPの発現を許容する態様で導入することによって、in vitroで又は対象者においてin vivoでp53を含む細胞と接触させることができる。前記細胞は対象者の組織中に含まれていてよく、公知の技術から容易に決定される標準的な検出方法によって対象者の組織において検出することができる。前記検出方法の例には、免疫学的技術（例えば免疫組織化学的染色）、蛍光画像化技術及び顕微鏡技術が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明のある実施態様では、前記接触は、HAUSPを対象者に投与することによって対象者にin vivoで実施される。タンパク質及び核酸配列を対象者に導入又は投与するための方法及び組成物は既に記載した。
【００５８】
さらにまた、本発明は、Mdm2を含む細胞においてMdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化する方法を提供する。前記方法は、Mdm2を脱ユビキチン化及び/又は安定化するために有効な量のHAUSPと細胞を接触させることを含む。本発明の方法を用いて、in vitro又は対象者においてin vivoでMdm2を脱ユビキチン化する、すなわちMdm2からユビキチンを除去することができる。Mdm2の脱ユビキチン化は、本明細書に記載した方法、分子的方法及びアッセイのいずれかを含む公知の方法によって検出される。Mdm2の脱ユビキチン化を調節するHAUSPの能力は、新形成（特にMdm2-、HAUSP-及びp53関連新形成）の治療のためにHAUSPを有用にさせる。したがって、本発明のある実施態様では、対象者は新形成を有するヒトであり、HAUSPは前記新形成を治療する。HAUSPと対象者の少なくとも1つの細胞との間で接触を達成するために、HAUSPは、本明細書に記載した任意の投与態様を含むいずれかの態様によって対象者に投与することができる。
本発明者らはまた、細胞内でのp53の安定化及び脱ユビキチン化はMdm2とHAUSPとの間の相互作用によって影響されうることを本明細書で開示した。例えば、本発明者らは、HAUSPは正常細胞でのMdm2安定化のために必要であり、HAUSP-消失細胞では自己ユビキチン化Mdm2は極めて不安定になり間接的なp53安定化をもたらすことを示した。本発明者らはまた、Mdm2媒介p53分解は強力にHAUSP発現によって救済され、それによってMdm2は安定化されることを示した。したがって、本発明はさらに、p53を含む細胞においてp53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節する方法を提供する。前記方法は、p53の脱ユビキチン化及び/又は安定性を調節するために有効な量のMdm2-HAUSP相互作用の調節因子と細胞とを接触させることを含む。
【００５９】
本発明の方法を用いて、in vitroで又は対象者においてin vivoでp53の脱ユビキチン化を調節することができる（すなわちp53からユビキチンを取り除くか、又はp53にユビキチンを付加することによって）。本明細書に開示したように、p53の脱ユビキチン化が増強される場合はp53の安定性もまた高められるであろう。続いてp53の脱ユビキチン化はp21の誘導をもたらすであろう。したがって、本発明のある実施態様では、p53の脱ユビキチン化が細胞内で増強され、p53の安定性が細胞内で高められ、さらにp21が細胞内で誘導される。P53のユビキチン化及び脱ユビキチン化は、本明細書に開示した方法、分子的方法及びアッセイのいずれかを含む公知の方法によって検出することができる。
p53の脱ユビキチン化を調節するMdm2-HAUSP相互作用の能力は、新形成（特にMdm2-、HAUSP-及びp53関連新形成）の治療のためにMdm2-HAUSP相互作用の調節因子を有用にさせる。したがって、本発明のある実施態様では、対象者は新形成を有するヒトであり、Mdm2-HAUSP相互作用の治療物質は前記新形成を治療する。
Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子は、タンパク質調節因子を細胞に導入することによって、又は前記調節因子をコードする核酸を前記調節因子の発現を許容する態様で細胞に導入することによって、in vitro又は対象者でin vivoで細胞と接触させることができる。前記細胞は対象者の組織中に含まれ、上記に記載したように公知の技術から容易に決定される標準的な検出方法によって対象者の組織で検出することができる。本発明のある実施態様では、前記接触は、Mdm2-HAUSP相互作用の調節因子を対象者に投与することによって対象者にin vivoで実施される。タンパク質及び核酸配列を対象者に導入又は投与するための方法及び組成物は既に記載した。
【００６０】
本発明はまた、p53と反応する作用因子を同定する方法を提供し、前記方法はHAUSP-p53相互作用を阻害する候補作用因子の能力を評価することによって実施される。特段に示さない限り、“p53”はp53タンパク質（GenBankアクセッション番号CAA38095）（その保存的置換を含む）及びp53アナログの両者を含む。“p53”アナログは、p53の生物学的活性を有するp53タンパク質の機能的変種であり、p53タンパク質と60％以上の（好ましくは70％以上の）アミノ酸配列相同性を有する。さらに本明細書で用いられる“p53生物学的活性”という用語は、本明細書に記載したアッセイ条件下でHAUSPと検出可能な結合（すなわち陰性コントロールのバックグラウンド結合よりほぼ2倍の結合、より好ましくはほぼ5倍の結合）を示すタンパク質又はペプチドの活性を指す（アフィニティーはp53のそれと異なってもよい）。
本発明の方法は以下の工程を含む：（a）HAUSPの存在下でp53と候補作用因子を接触させる工程；及び（b）候補作用因子のHAUSP-p53相互作用を阻害する能力を評価する工程。本明細書で用いられる“作用因子”は上記に提供した定義を有し、上記に記載した作用因子の任意の例を含むであろう。p53と結合する作用因子は天然でも合成でもよい。p53と反応する作用因子は、本明細書に開示されているように、HAUSPの代わりにp53と結合し、それによってHAUSPとp53の相互作用を阻害することによってHAUSP-p53相互作用を阻害する能力を有するであろう。p53と結合する能力を有する候補作用因子は、この結合の結果として立体障害によりp53の活性を妨げるか、又はHAUSPによるp53の脱ユビキチン化においてHAUSPを模倣し、それによってHAUSPの安定化能力を補強するであろう。
【００６１】
本発明の方法にしたがえば、p53と反応する作用因子はin vitroアッセイ（例えば直接結合アッセイ、競合結合アッセイなど）を用いて同定することができる。例えば、直接結合アッセイでは、候補作用因子とp53又はそのペプチドフラグメントとの結合は直接的に測定することができる。候補作用因子は例えばペプチドライブラリーによって供給することができる。
また別には、競合結合アッセイにおいて、標準的な方法を用いて、HAUSPとp53との結合でHAUSPを放逐するか又はHAUSPに取って代り、それによってHAUSPとp53の相互作用を阻害する候補作用因子の能力を評価することができる。そのような競合結合アッセイでは、候補作用因子はp53との結合についてHAUSPと競合し、いったんp53と結合すると、HAUSPとp53との結合を立体的に妨害してそれによってHAUSPによるp53の脱ユビキチン化を妨げるか、或いはp53の脱ユビキチン化又は他の方法によるp53安定化においてHAUSPとして機能する。競合結合アッセイは、p53及びHAUSPを含む粗抽出物の使用を可能にするので、HAUSP-p53相互反応の阻害を評価する簡便な方法である。
競合的結合アッセイは、候補作用因子及び標識HAUSP（両者は既知濃度で混合物に存在する）を含む混合物に、p53又はp53活性（上記に定義したとおり）を含む抽出物を添加することによって実施することができる。インキュベーションの後で、p53／作用因子複合体を未結合標識HAUSP及び非標識候補作用因子から分離し、これを計測することができる。標識HAUSPとp53との結合の50％阻害に必要な候補作用因子の濃度（IS）を続いて計算することができる。
【００６２】
本明細書に記載する結合アッセイの様式は標識したアッセイ成分を用いる。HAUSP又はp53の標識は、上記に記載した任意の標識を含む、当業界で公知の多様な種々の化学発光標識及び放射能標識の１つを用いて実施することができる。オートラジオグラフィープレートの競合結合アッセイによって定性的な結果を得ることができる。また別には、スキャチャードプロット（Scatchard plots）を用いて定量的結果を作成することができる。本発明の標識は、当業界で周知の方法にしたがって所望のアッセイ成分に直接又は間接的に結合させることができる。標識の選択は多数の関連する因子に左右され、前記因子には、要求される感度、標識されるべき化合物との結合の容易さ、安定性の要件及び利用可能な装置が含まれる。
直接結合アッセイ及び競合結合アッセイのいずれのアッセイも多様な種々の形態で用いることができる。ある競合結合アッセイでは、候補作用因子は、固体の土台（例えばカラムクロマトグラフィーマトリックス又は管）に結合させたp53（捕捉作用因子）の特定の結合部位について、標識したHAUSP（標識分析物）と競合することができる。また別には、前記候補作用因子は、固体の土台に結合させた野生型HAUSP又はそのフラグメント（捕捉作用因子）に対して、標識p53（標識分析物）の特定の結合部位について競合することができる。捕捉作用因子は、未結合標識分析物から結合した標識分析物の分離を実施するために、固体の土台に結合される。いずれのタイプの競合結合アッセイでも、捕捉作用因子と結合する標識分析物の濃度は、結合アッセイで競合する候補作用因子の濃度に反比例する。候補作用因子による標識分析物の阻害の量は、結合アッセイの条件並びに使用される候補作用因子、標識分析物及び捕捉作用因子の濃度に依存する。
【００６３】
また別の競合結合アッセイは液相で実施することができる。このタイプのアッセイでは、当業界で公知の多様な技術のいずれかを用いて、未結合標識分析物から結合標識分析物（HAUSP又はp53のどちらでもよい）を分離することができる。そのような分離に続いて、結合した標識分析物の量を決定することができる。分離したサンプル中に存在する未結合標識分析物の量は、結合した標識分析物の量に反比例する。
また別には、分離工程が不要の均質結合アッセイを実施してもよい。このタイプの結合アッセイでは、標識分析物（HAUSP又はp53のいずれでもよい）の標識は、前記分析物と捕捉作用因子との結合によって変化する。標識分析物におけるこの変化は、前記標識から放出されるシグナルの減少又は増加をもたらし、その結果、結合アッセイ終了時の標識の測定によって分析物の検出又は定量が可能になる。
標識分析物と捕捉作用因子との結合量が50％（好ましくは90％）以上減少したならば、特定のアッセイ条件下で、候補作用因子は、HAUSPとp53との結合を競合結合アッセイにおいて阻害することができると考えられる。直接結合アッセイの形態が用いられる場合は、測定されるシグナルがバックグラウンドレベルの2倍又はそれより高いときに、候補作用因子はp53と結合すると考えられる。さらにまた、HAUSP競合結合アッセイを用いて同定された候補作用因子の特異性の証拠として、結合競合はまた洗浄リボソームの存在下で精製p53を用いて実施することができる。
【００６４】
p53腫瘍抑制因子は、アポトーシス、細胞周期の拘束又は老化を誘導する多数のストレス因子によって活性化される。本明細書に記載したようにp53は強力な腫瘍抑制因子機能を有するので、p53媒介生物学的活性はしばしば研究の焦点となる。それにもかかわらず、p53はまた他の生物学的事象でも関与が示された。例えば、p53遺伝子の最初の6つのエクソンに欠失変異（不活化p53ではなく活性化p53と一致する表現型を付与する変異）をもつマウスでは、偶発的腫瘍に対する耐性の強化は、加齢に付随する表現型の早期開始（寿命の短縮、骨粗しょう症、全身的器官萎縮及びストレス抵抗性の低下を含む）を伴うことが示された。これらのデータは、p53は生物における加齢の調節に役割を有していることを提唱している（Tyner et al. p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotype. Nature, 415:45-53, 2002）。
さらにまた、p53は化学療法剤の使用に関連する副作用の発生に役割を果たしていることが示唆された。抗癌剤は毛包（HF）のアポトーシスを刺激し、脱毛を引き起こす（これは化学療法のもっとも一般的な副作用である）。化学療法誘導脱毛のためのあるマウスモデルでは、p53はこのプロセスに必須であることが示された。特に、野生株のマウスとは対照的に、p53欠損マウスは、シクロホスファミド処置後に活性な分裂を維持したHFケラチノサイトで脱毛もアポトーシスも示さなかった。これらの観察は、p53の局所薬理学的阻害は、化学療法関連脱毛の防止に有用でありうることを示している（Botchkarev et al. p53 is essential for chemotherapy-induced hair loss. Cancer Res., 60:5002-20, 2000）。
【００６５】
前述の記載を考慮すれば、HAUSPの構造に基づいて又は前記に類似するように設計した治療薬は、多数のp53関連症状（新形成、加齢及び化学療法剤誘導又は薬剤誘導副作用を含む）の治療に有用でありうることは明らかである。したがって、いったん本発明の候補作用因子がスクリーニングされ、p53との適切な結合親和性を有する（すなわちp53と反応する）と決定されたら、p53が関与する生物学的事象又はプロセス（新形成、加齢、並びに医薬及び他の化学療法剤に使用に付随する副作用を含む）に対して影響を有するか否かを確認するために、前記候補作用因子を評価することができる。特に、候補作用因子は、細胞分裂の阻害剤として作用するその能力又は他の方法による適切な腫瘍抑制因子として機能するその能力について評価することができる。本発明の候補作用因子は、新形成（本明細書に開示したものを含む）の治療に有用であると期待される。候補作用因子はまた、加齢に関連する負の作用又は対象者への化学療法剤の投与に付随する副作用を緩和するその能力について評価することができる。
したがって、本発明はさらに以下の工程を含む：（c）p53を含む1つ又は2つ以上の細胞と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞で1つ又は2つ以上のp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。本明細書で用いられる“p53関連の生物学的事象”には、p53活性が示唆された生化学的又は生理学的プロセスが含まれる。本明細書で開示されるように、p53関連の生物学的事象の例には、p53関連新形成、加齢のプロセスに付随する負の作用（例えばストレスに対する抵抗性の低下、全身的な器官の萎縮、骨粗しょう症及び寿命の短縮）、及び医薬及び他の化学療法剤の投与又は使用に付随する副作用（例えば脱毛又は抜け毛及び悪心）が含まれる。
【００６６】
本発明のある実施態様では、例えば前記方法はさらに以下の工程を含む：（c）新生物の1つ又は2つ以上の細胞（新形成細胞）と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記新形成細胞の分裂に対し影響を有するか否かを決定する工程。本明細書で用いられる“増殖”には新形成細胞の分裂、生長及び増加が含まれるが、ただし前記に限定されない。候補作用因子と接触させることができる新形成細胞の例にはヒト肺癌細胞（H1299）及びp53を含む他の任意の新形成細胞が含まれる。さらに本明細書で用いられる“p53を含む”細胞は、p53又はその誘導体若しくはホモログが天然に発現されるか又は天然に存在する細胞である。本発明のこの方法にしたがえば、候補作用因子は新形成細胞とin vitroで接触させることができる。例えば、候補作用因子を含む調製物とともに新形成細胞の培養をインキュベートすることができる。続いて、前記新形成細胞の増殖に対する候補作用因子の影響を当業界で公知の任意の生物学的アッセイ又は方法（組織学的分析を含む）によって評価することができる。
本発明はさらに、Mdm2と反応する作用因子を同定する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）HAUSPの存在下でMdm2と候補作用因子を接触させる工程；及び（b）候補作用因子のMdm2-HAUSP相互作用を阻害する能力（例えばMdm2の脱ユビキチン化を阻害する能力）を評価する工程。特段に示さない限り、“Mdm2”にはMdm2（ネズミダブルマイニュート2；murine double minute 2）タンパク質及びMdm2アナログの両者が含まれる。さらに本明細書で用いられる“Mdm2アナログ”は、Mdm2の生物学的活性を有するMdm2タンパク質の機能的変種であり、Mdm2タンパク質と60％以上（好ましくは70％以上）のアミノ酸配列相同性を有する。Mdm2“アナログ”には相同な三次元立体配置を有するMdm2タンパク質の変種が含まれる。本明細書で用いられる“Mdm2の生物学的活性”という用語は、本明細書に記載したように、p53をユビキチン化する能力を示すタンパク質又はペプチドの活性を指す。Mdm2及びMdm2アナログは合成によって又は組換えによって製造するか、又は天然の細胞から単離することができる。Mdm2は好ましくは、通常の技術及びMdm2をコードするcDNAを用いて組換えによって製造される。
【００６７】
Mdm2と結合するか又は反応する作用因子は天然のものでも合成でもよい、Mdm2と反応する作用因子は、立体障害によりMdm2活性及び/又はMdm2-HAUSP相互作用を妨げることによってMdm2-HAUSP相互作用を阻害することができ、さらにHAUSPの構造と類似する構造を有することができる。Mdm2と反応する作用因子はまた、Mdm2の脱ユビキチン化においてHAUSPを模倣することができる。本発明の方法にしたがえば、Mdm2と反応する作用因子は、当業界で公知の技術及び/又は本明細書に開示する技術にしたがって、in vitroアッセイ（例えば直接結合アッセイ、競合結合アッセイ、均質結合アッセイなど）を用いて同定することができる。
HAUSPの構造に基づいて又は前記に類似するように設計した治療薬は、新形成を含むMdm2関連症状の治療に有用でありうる。さらにまた、上記で考察したように、HAUSPの構造に基づいて又は前記に類似するように設計した治療薬もまた、p53関連症状（新形成、加齢及び化学療法剤誘導又は薬剤誘導副作用を含む）の治療に有用でありうる。したがって、いったん本発明の候補作用因子がスクリーニングされ、Mdm2と適切な結合親和性を有する（すなわちMdm2と反応する）と決定されたら、Mdm2、HAUSP及びp53が示唆された生物学的事象又はプロセス（新形成、加齢、並びに医薬及び他の化学療法剤の使用に付随する副作用を含む）に対して影響を有するか否かを確認するために評価することができる。特に、候補作用因子は、細胞分裂の阻害剤として作用するその能力又はそうでなければ適切な腫瘍抑制因子として機能するその能力について評価することができる。本発明の候補作用因子は、新形成（本明細書に開示したものを含む）の治療に有用であると期待される。候補作用因子はまた、加齢に関連する負の作用又は対象者への化学療法剤の投与に付随する副作用を緩和するその能力について評価することができる。
【００６８】
したがって、本発明はさらに以下の工程を含む：（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞で1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。本明細書で用いられる“Mdm2関連の生物学的事象”には、Mdm2活性が示唆された生化学的又は生理学的プロセス（例えば新形成）が含まれ、“HAUSP関連の生物学的事象”には、HAUSP活性が示唆された生化学的又は生理学的プロセス（例えば新形成）が含まれる。本発明のある実施態様では、例えば、前記方法はさらに以下の工程を含むことができる：（c）新生物の1つ又は2つ以上の細胞（新形成細胞）と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記新形成細胞の増殖に対し影響を有するか否かを決定する工程。本明細書でさらに用いられる“Mdm2又はHAUSPを含む”細胞は、Mdm2又はHAUSP、又はその誘導体若しくはホモローグが天然に発現されるか又は天然に存在する細胞である。
同様に、本発明はHAUSPと反応する作用因子を同定する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）Mdm2の存在下でHAUSPと候補作用因子を接触させる工程；及び（b）候補作用因子のHAUSP-Mdm2相互作用を阻害する能力を評価する工程。HAUSPと結合又は反応する作用因子は天然のものでも合成でもよい。HAUSPと反応する作用因子は、立体障害によりHAUSP活性及び/又はHAUSP-Mdm2相互作用を妨げることによってHAUSP-Mdm2相互作用を阻害することができ、さらにMdm2の構造と類似する構造を有することができる。本発明の方法にしたがえば、HAUSPと反応する作用因子は、当業界で公知の技術及び/又は本明細書に開示する技術にしたがって、in vitroアッセイ（例えば直接結合アッセイ、競合結合アッセイ、均質結合アッセイなど）を用いて同定することができる。
【００６９】
Mdm2-HAUSP相互作用を阻害するように設計した治療薬は、新形成を含むMdm2関連症状の治療に有用でありうる。さらにまた、Mdm2の構造に基づいて又は前記に類似するように設計した治療薬はまた、多数のp53関連症状（新形成、加齢及び化学療法剤誘導又は薬剤誘導副作用を含む）の治療に有用でありうる。したがって、いったん本発明の候補作用因子がスクリーニングされ、HAUSPと適切な結合親和性を有する（すなわちHAUSPと反応する）と決定されたら、Mdm2、HAUSP及びp53が示唆された生物学的事象又はプロセス（新形成、加齢、並びに医薬及び他の化学療法剤の使用に付随する副作用を含む）に対して影響を有するか否かを確認するために評価することができる。特に、前記候補作用因子は、細胞分裂の阻害剤として作用するその能力又は他の方法による適切な腫瘍抑制作用因子として機能するその能力について評価することができる。本発明の候補作用因子は、新形成（本明細書に開示したものを含む）の治療に有用であると期待される。前記候補作用因子はまた、加齢に関連する負の作用又は対象者への化学療法剤の投与に付随する副作用を緩和するその能力について評価することができる。したがって、本発明はさらに以下の工程を含む：（c）Mdm2、HAUSP又はp53を含む1つ又は2つ以上の細胞と候補作用因子を接触させる工程；及び（d）前記作用因子が、前記1つ又は2つ以上の細胞で1つ又は2つ以上のMdm2-、HAUSP-又はp53-関連の生物学的事象に対し影響を有するか否かを決定する工程。
本発明はまた、Mdm2-HAUSP相互作用に影響を与える（すなわち前記相互作用を増加又は低下させる）その能力を評価することによって、Mdm2-HAUSPの調節因子を同定する方法を提供する。本発明のこの方法は以下の工程を含む：（a）Mdm2及びHAUSPを含むin vitro系を入手又は作成する工程；（b）前記in vitro系を候補調節因子と接触させる工程；及び（c）前記候補調節因子が前記in vitro系でMdm2-HAUSP相互作用を調節するか否かを決定する工程。例示すれば、本発明の前記in vitro系は細胞（例えば培養細胞）の収集物でありうる。しかしながら好ましくは、前記in vitro系は無細胞系、例えば精製タンパク質の混合物（例えばMdm2及びHAUSP）、細胞溶解物（例えばさらに抗Mdm2又は抗HAUSP抗体を含む）、再構築した細胞溶解物、又は細胞溶解物の混合物である。
【００７０】
当業者は、個々の候補作用因子のいずれがMdm2-HAUSP相互作用の調節因子であるか否かをいくつかの周知の方法（未処置コントロールとの比較及び本明細書に開示した任意のアッセイを含む）のいずれかによって決定することができる。例示すれば、工程（c）の決定は、Mdm2及びHAUSPを含み、候補調節因子を含まない第二のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用と工程（b）のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用を比較することによって達成することができる。また別には、前記in vitro系が細胞の収集物である場合、HAUSP又はMdm2に特異的なアンタゴニストを工程（b）のin vitro系に添加し、さらに工程（c）の決定は、Mdm2、HAUSP及び候補調節因子を含み、選択したアンタゴニストを含まない第二のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用と工程（b）のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用を比較することによって達成することができる。さらにまた別には、前記in vitro系が無細胞系である場合、抗HAUSP抗体又は抗Mdm2抗体を工程（b）のin vitro系に添加し、さらに工程（c）の決定は、Mdm2、HAUSP及び候補調節因子を含み、選択した抗体を含まない第二のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用と工程（b）のin vitro系におけるMdm2-HAUSP相互作用を比較することによって達成することができる。例えば、前記抗体が抗HAUSPモノクローナル抗体である場合、Mdm2の活性レベルを第一及び第二のin vitro系で評価することができる。候補調節因子が第二の系でMdm2レベル及び/又は活性に対して影響を示すが第一の系では示さないならば、前記候補調節因子は、HAUSPを介してその調節作用を示し、したがってMdm2-HAUSP相互作用の調節因子であると結論することができる。
【００７１】
Mdm2-HAUSP相互作用を調節するように設計した治療薬は、新形成を含むMdm2-HAUSPの関連症状の治療に有用でありうる。さらにまた、そのような治療薬はまた、多数のp53関連症状（新形成、加齢及び化学療法剤誘導又は薬剤誘導副作用を含む）の治療に有用でありうる。したがって、いったん本発明の候補作用因子がスクリーニングされ、Mdm2-HAUSP相互作用に対し適切な調節作用を有すると決定されたら、Mdm2、HAUSP及びp53が示唆された生物学的事象又はプロセス（新形成、加齢、並びに医薬及び他の化学療法剤の使用に付随する副作用を含む）に対して影響を有するか否かを確認するために前記を評価することができる。特に、候補調節因子は、細胞分裂の阻害剤として作用するその能力又は他の方法による適切な腫瘍抑制作用因子として機能するその能力について評価することができる。本発明の候補調節因子は、新形成（本明細書に開示したものを含む）の治療に有用であると期待される。前記候補調節因子はまた、加齢に関連する負の作用又は対象者への化学療法剤の投与に付随する副作用を緩和するその能力について評価することができる。
【００７２】
本発明はさらに、上記に記載した同定方法によって同定した作用因子及び調節因子に関する。そのような作用因子及び調節因子は、Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状の治療に有用でありうる。本明細書で用いられる、“Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状”は、Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53活性が関係している症状、疾患又は異常であり、以下が含まれる：治療の必要がある対象者のMdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連新形成、治療の必要がある対象者の加齢に付随する負の作用、及び対象者での医薬又は化学療法剤の使用に付随する副作用。Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状は、対象者のMdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状を治療するために有効な量の本発明の作用因子又は調節因子を対象者に投与することによって、対象者で治療することができる。前記の量は当業者には容易に決定することができる。したがって、本発明はさらに、対象者のMdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状を治療する方法を提供する。前記方法は、対象者においてMdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状を治療するために有効な量の本発明の作用因子又は調節因子（例えばMdm2-HAUSP相互作用の調節因子）を対象者に投与することを含む。さらにまた、新形成の治療方法における本発明の作用因子又は調節因子（例えばMdm2-HAUSP相互作用の調節因子）の使用が提供される。
本発明はまた、上記に記載した同定方法の１つによって同定した作用因子又は調節因子及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。適切な医薬的に許容できる担体、並びに医薬製剤及び組成物の調製方法の例は上記に記載されている。本発明の医薬組成物は、Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状を治療することを目的として、本発明の作用因子又は調節因子を対象者に投与するために有用であろう。そのような事例では、前記医薬組成物は、Mdm2-、HAUSP-及び/又はp53-関連症状の治療に有効な量で対象者に投与される。
【００７３】
本発明はまたHAUSP及びp53を含む複合体を提供する。そのようなHAUSP-p53複合体では、HAUSPのp53結合部位のアミノ酸残基は、p53のアミノ酸残基と直接的ファンデルワール結合及び/又は水素結合及び/又は塩橋接触状態にある。本発明の複合体は、p53の完全なアミノ酸配列と複合体を形成したHAUSPの完全なアミノ酸配列を含むことができる。また別の実施態様では、本発明の複合体は、HAUSPの少なくともN-末端ドメイン（HAUSPのp53-結合部位を含む）を含む。
本明細書で用いられる、“HAUSPのN-末端ドメイン”は、HAUSPの残基1−248及びそのアナログを意味する。さらにまた本明細書で用いられる、“結合部位”は、分子又は分子複合体の領域であって、その形状及び荷電電位の結果として別の分子（タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA又はRNAを含む）、分子、化合物、抗生物質又は薬剤を含むが、ただしこれらに限定されない）と種々の共有結合及び/又は非共有結合力を介して積極的に相互作用又は結合する領域を指す。したがって、本発明で意図されるように、“HAUSPのp53結合部位”はHAUSP上の結合部位であって、その形状、反応性、荷電、電位、及び/又は他の特徴の結果として別の分子（タンパク質（例えばp53）、ポリペプチド、ペプチド、核酸（DNA又はRNA）、分子、化合物、抗生物質又は薬剤を含むが、ただしこれらに限定されない）と有利に相互作用又は結合する部位である。
種々のHAUSPアイソフォーム又は本発明に包含されるHAUSPアナログにおける全てのアミノ酸残基のナンバリングは本明細書に示されたものとは異なる可能性があり、又は、本明細書に記載した結合活性と同じp53結合活性を生じるある種の保存的アミノ酸置換を含みうることは、当業者には明白であろう。他のアイソフォーム又はアナログにおける対応するアミノ酸及び保存的置換は、関連するアミノ酸配列の目視精査によって、又は市販の相同性ソフトウェアプログラムを用いることによって容易に同定される。
【００７４】
HAUSPのp53結合部位は、HAUSP上の実際のp53結合部位を含むことができる。p53結合部位はまたHAUSP上の付属的結合部位を含むことができる。この付属的結合部位は、前記実際のp53結合部位に隣接するか又はその近くにあり、それにもかかわらず、実際のp53結合部位との直接的干渉によって、又はHAUSP分子の立体的配置若しくは荷電電位に間接的に影響を与えることによって、p53の実際の結合部位におけるp53とHAUSPとの結合を阻止又は低下させて、特定の作用因子との相互作用又は結合時にHAUSP又はp53-HAUSP活性に影響を与えることができる。
分子又は分子複合体の結合部位の同定は重要である。なぜならば、分子又は分子複合体の生物学的活性はしばしば、作用因子／リガンドと前記分子又は分子複合体の1つ又は2つ以上の結合部位との間の相互作用から生じるからである。したがって、HAUSPのp53-結合部位の位置の決定は、HAUSP又はHAUSP-p53の活性に影響を与える阻害因子を同定するためのもっとも適切なツールを提供する。HAUSPのp53-結合部位の位置決定は又、HAUSPまたはHAUSPアナログのp53-結合部位と積極的に結合または相互作用することができる化学物質の設計及び合成を目的とする多様な分子設計及び分析技術の使用を可能にする（前記化学物質は潜在的にHAUSP又はHAUSP-p53活性の阻害因子として作用する）。前述の事柄を考慮すれば、本発明のHAUSP-p53相互作用及びHAUSP-p53複合体は、薬剤スクリーニングの合理的設計及び開発のツールとして、阻害因子又は調節因子として作用することができる小分子阻害因子のための標的として、さらにペプチド模倣体のための土台として用いることができる。
【００７５】
本発明はまたMdm2及びHAUSPを含む複合体を提供する。そのようなMdm2-HAUSP複合体では、Mdm2のアミノ酸残基はHAUSPのアミノ酸残基と物理的な接触（例えば直接的ファンデルワール接触、水素結合による接触、塩橋による接触など）状態にある。本発明の複合体は、HAUSPの完全なアミノ酸配列と複合体を形成したMdm2の完全なアミノ酸配列を含むことができる。また別には、本発明の複合体はHAUSPの少なくとも一部分を含み、前記部分はMdm2との相互作用又は物理的結合の少なくとも1つの部位を含む。
本発明はさらにHAUSPタンパク質の点変異体（HAUSP-cs）を提供する。前記変異タンパク質では、コアドメインの高度に保存されたCys残基がSerに置き換えられている。より具体的には、前記点変異タンパク質は図6に示すアミノ酸配列（配列番号:6）を含み、前記配列ではアミノ酸残基223のCysはSerに置換されている。この変異タンパク質は、in vitroでのp53とのその強力な結合を保持する。さらに又、本明細書に開示するように、細胞内でのHAUSP-csの発現はp53ユビキチン化のレベルを増加させ、このことは、HAUSP-csは、p53の内在性HAUSP媒介脱ユビキチン化に干渉することによりドミナントネガティブ変異体として機能することができることを示している。さらにまた本明細書で提供されるものは、本発明のHAUSP点変異タンパク質をコードする核酸配列及び前記核酸配列をトランスフェクションされた細胞である。
【００７６】
本発明はさらに非ヒトトランスジェニック動物を提供する。前記トランスジェニック動物は、低下した又は変異したHAUSP遺伝子生成物を発現するか、又はHAUSP遺伝子生成物を全く発現せず、又はヒトHAUSP遺伝子生成物のみを発現する。特に、本発明は、HAUSPが選択的に不活化された非ヒトトランスジェニック動物を提供する。より具体的には、本発明は、そのゲノムがHAUSP遺伝子内に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供し、この場合、前記トランスジェニック動物は、野生型と比較して機能的なHAUSPタンパク質レベルの低下を示す。前記非ヒト動物は任意の適切な動物でありうるが（例えばネコ、ウシ、イヌ、ウマ、ヤギ、げっ歯類及びヒツジ）、好ましくはげっ歯類である。より好ましくは、前記非ヒト動物はラット又はマウスである。
特段に示さない限り、本明細書では“HAUSP遺伝子”という用語は、HAUSPタンパク質をコードする核酸配列及びその任意の対立遺伝子変種を指す。遺伝暗号の縮退のために、本発明のHAUSP遺伝子は多数の核酸置換を含み、前記もまたHAUSPタンパク質をコードする。“内在性”HAUSP遺伝子は、生物の体内から生じるか又は天然に生じる遺伝子である。“HAUSPタンパク質”、“HAUSPアナログ”及び“HAUSPタンパク質の生物学的活性”という用語は上記で定義した。
【００７７】
本明細書で用いられる、“非ヒトトランスジェニック動物”という用語は、実験的な操作によって作成され、そのゲノムはトランスジーンの導入によって変異している遺伝的に操作された非ヒト動物を指す、。さらに本明細書で用いられる“トランスジーン”という用語は、実験的操作によって動物のゲノムに導入された核酸（例えばDNA又は遺伝子）を指し、導入される遺伝子は前記動物にとって内在性ではないか、又は前記動物にとって内在性である遺伝子の改変型又は変異型である。前記内在性遺伝子の改変又は変異型はヒトへの介入（例えば点変異の導入、フレームシフト変異の導入、内在性遺伝子の一部分又はフラグメントの欠失、選別可能マーカー遺伝子の挿入、終止コドンの挿入などによる）を介して作成することができる。非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトへの介入を必要とするいくつかの方法によって作成することができる。前記方法には、非ヒト動物の胚性幹細胞、新規受精卵又は初期胚へのトランスジーンの導入；体細胞及び/又は生殖細胞染色体へのトランスジーンの組込み；及び本明細書に記載した任意の方法が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００７８】
本発明のトランスジェニック動物は、HAUSP遺伝子が選択的に不活化され、その結果内在性HAUSP遺伝子が破壊されたゲノムを有する。本明細書で用いられる、“破壊”は、機能的なHAUSPタンパク質の正常な発現を妨げる（例えば変異HAUSPタンパク質の発現をもたらすか、正常な量のHAUSPタンパク質の発現を妨げるか、又はHAUSPタンパク質の発現を妨げる）HAUSP遺伝子内の変異（すなわち永続的で伝達可能な遺伝物質における変化）を指す。破壊の例には、点変異、フレームシフト変異の導入、内在性遺伝子の一部分又はフラグメントの欠失、選別可能マーカー遺伝子の挿入、終止コドンの挿入が含まれるが、ただしこれらに限定されない。本明細書で用いられる、“変異”という用語は、野生型遺伝子（又はその遺伝子生成物）と比較したとき、その配列（又はその機能的特性）内に少なくとも1つの改変を示す遺伝子（又はその遺伝子生成物）を指す。反対に、“野生型”という用語は、その天然の供給源（例えば自然集団）でもっとも頻繁に見出される、個々の遺伝子について特徴的な遺伝型（又は表現型）を指す。野生型動物は例えば機能可能なHAUSPを発現する。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物における選択的不活化は多様な方法によって達成することができ、ヘテロ接合体性破壊（この場合HAUSP遺伝子の一方の対立遺伝子が破壊され、その結果、得られたトランスジェニック動物は前記変異についてヘテロ接合体である）又はホモ接合体性破壊（この場合HAUSP遺伝子の両方の対立遺伝子が破壊され、その結果、得られたトランスジェニック動物は前記変異についてホモ接合体である）を生じることができる。本発明のある実施態様では、前記トランスジェニック動物の内在性HAUSP遺伝子は、HAUSP遺伝子生成物にとって共通の領域をコードする核酸配列による相同組換えを介して破壊される。例示すれば、相同組換えによる破壊は、HAUSP遺伝子のノックアウト変異、特に少なくとも1つの欠失がHAUSP遺伝子の少なくとも1つのエクソン（例えばエクソン1）に導入されているノックアウト変異を生じることができる。
【００７９】
さらにまた、本発明の方法にしたがえば、HAUSP遺伝子の破壊は、異種選別可能マーカーの内在性HAUSP遺伝子への挿入により達成することができる。本明細書で用いられる、“選別可能なマーカー遺伝子”という用語は、前記遺伝子が発現される細胞又は生物に、薬剤又は抗生物質に対する耐性を付与し、その結果、前記マーカーの発現又は活性について（例えば正のマーカー、例えばneo遺伝子）、又は前記マーカーの発現又は活性に反して（例えば負のマーカー、例えばdt遺伝子）選別することができる酵素をコードする遺伝子を指す。さらに本明細書で用いられる、“異種選別可能マーカー遺伝子”という用語は、前記遺伝子が通常では見出されない動物のゲノムに実験的操作により挿入された選別可能なマーカー遺伝子を指す。そのような異種選別可能マーカー遺伝子は、HAUSP遺伝子の任意のコードエクソンに挿入することができる。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、同じ種の対応する野生型非ヒト動物と比較して機能可能なHAUSPタンパク質の発現低下を示す。本明細書で用いられる、“機能可能なHAUSPタンパク質の発現低下を示す”という語句は、そのゲノムが野生型のHAUSP遺伝子を含む同じ種の対応する動物で検出される機能可能なHAUSPの量よりも少ない機能可能なHAUSP量が検出されるトランスジェニック動物を指す。好ましくは、前記トランスジェニック動物は、対応する野生型動物よりも少なくとも50％少ない機能可能なHAUSPを含む。より好ましくは、前記トランスジェニック動物は、対応する野生型動物よりも少なくとも75％少ない機能可能なHAUSPを含む。さらに好ましくは、前記トランスジェニック動物は、対応する野生型動物よりも少なくとも90％少ない機能可能なHAUSPを含む。HAUSP活性と同様に、動物のHAUSPレベルは、標準的なアッセイ（例えば当業界で公知のもの）を用いて検出することができる。
【００８０】
したがって、本発明のトランスジェニック動物が、野生型に比して機能可能なHAUSPタンパク質の発現低下を示す場合、トランスジェニック動物の機能可能なHAUSPタンパク質レベルは、天然に見出されるレベルよりも低い。本発明のある実施態様では、トランスジェニック動物は、（量には関係なく）変異HAUSPを発現する。本発明のまた別の実施態様では、トランスジェニック動物はHAUSP（野生型又は変異体）を全く発現しない。本発明のさらに別の実施態様では、トランスジェニック動物は野生型HAUSPタンパク質を発現するが、同じ種の対応する野生型動物と比較して発現レベルは低い。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物、又は野生型と比較して低い機能可能なHAUSPタンパク質の発現を示す任意の非ヒトトランスジェニック動物は、トランスジェニック動物を遺伝的に操作するための多様な技術によって作成することができる。例えば、同じ種の対応する野生型動物と比較して機能可能なHAUSPタンパク質の発現低下を示す非ヒトトランスジェニック動物を作成するために、当業界で周知の技術を用いて、先ず初めにHAUSPターゲティングベクターを作成することができる。
本明細書で用いられる、用語“HAUSPターゲティングベクター”は、HAUSP遺伝子の一部分又は全てを含み、さらに前記ターゲティングベクターに受容細胞内の内在性HAUSP遺伝子の少なくとも一方の対立遺伝子と相同性組換えを達成させるために十分であるオリゴヌクレオチド配列を指す。本発明のある実施態様では、前記ターゲティングベクターはさらに正又は負の異種選別マーカー遺伝子（例えば正の選別遺伝子、neo）を含む。さらにまた、ターゲティングベクターは置換ベクター（すなわち選別可能なマーカー遺伝子が内在性の標的遺伝子と置き換えられる）であってもよい。例えば、本発明の置換ベクターは、異種選別可能マーカー遺伝子をHAUSP遺伝子に挿入し、機能可能なHAUSPタンパク質が発現されないようにHAUSP遺伝子の破壊をもたらすことができる。本明細書ではそのような破壊は、“ヌル”又は“ノックアウト”変異と称される。さらにまた、ターゲティングベクターが挿入ベクターであるものも本発明の範囲内でありうる。例示すれば、本発明のHAUSPターゲティングベクターは、非ヒトHAUSP遺伝子の少なくとも一部分を含むオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つのエクソン（例えばHAUSPのエクソン1）中に少なくとも1つの欠損が存在するオリゴヌクレオチドでありうる。
【００８１】
本発明の方法では、作成したHAUSPターゲティングベクターを非ヒト動物の受容細胞（野生型HAUSP遺伝子を含む）に導入し、処置された受容細胞を得ることができる。この導入は、受容細胞のゲノム中の少なくとも1つの野生型HAUSP遺伝子とベクターとの相同性組換えに適した条件下で実施することができる。前記受容細胞は、例えば胚性幹細胞又は卵母細胞若しくは接合体の細胞でありうる。
本発明のHAUSPターゲティングベクターは、遺伝子伝達に適した任意のin vivo又はex vivoでの手段によって受容細胞に導入することができる。前記方法には、エレクトロポレーション、DEAEデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクチン、モノカチオンリポソーム融合、ポリカチオンリポソーム融合、プロトプラスト融合、in vivo電場の形成、DNA被覆微小弾丸ボンバードメント、複製欠損組換えウイルスの注入、相同性組換え、ウイルスベクター、及び裸のDNAの導入、又は前記の組合せが含まれるが、ただしこれらに限定されない。遺伝子伝達に適した組換えウイルスベクターには、例えばレトロウイルス、HSV、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林ウイルス、サイトメガロウイルス及びワクシニアウイルスのようなウイルスのゲノムに由来するベクターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００８２】
本発明の方法にしたがえば、続いて前記処置された受容細胞を、同じ種の非ヒト動物の胚盤胞に導入して（例えば胞胚腔に注入又はマイクロインジェクションを実施することによって）、処置された胚盤胞を得ることができる。その後で、発現とそれに続く生殖細胞系列の子孫への伝達のために、前記処置した胚盤胞を同じ種の偽妊娠非ヒト動物に導入することができる。例えば、前記処置した胚盤胞を分娩予定日まで発育させ、それによって前記偽妊娠動物に相同組換えベクターを含む子孫を分娩させることができる。この場合、前記子孫は、同じ種の対応する野生型動物と比較してHAUSPの発現低下を示すことができる。続いて、そのゲノムがその内在HAUSP遺伝子に破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を同定することは可能であろう。続いて同定したトランスジェニック動物を、他の始祖（founder）トランスジェニック動物と交配して、同じ種の対応する野生型動物と比較して機能可能なHAUSPの発現低下を示すヘテロ接合又はホモ接合非ヒト動物を作成することができる。本発明はさらに、上記の方法によって作成されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００８３】
上記で考察したように、今日までの研究は、大半（全部ではないとしても）の癌症例においてp53経路は機能不全であり、p53それ自体も全ての癌のほぼ60％で変異していることを示唆している。野生型p53が検出される癌症例では、p53経路の別の酵素又は生化学反応に欠陥があるので（例えばHAUSP）、p53は活性化又は安定化されえないと考えられる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物（野生型に比して機能可能なHAUSPタンパク質の発現低下を示すか、又は野生型HAUSP遺伝子を欠く）での研究は、腫瘍形成、特にp53関連新形成におけるHAUSPの生理学的役割の理解を促進することができる。例えば、前記非ヒトトランスジェニック動物を用いて、HAUSPの低下が新形成の発育に影響を与えるか否かを調べることができる。ヒトHAUSPを発現するように遺伝的に操作した非ヒトトランスジェニック動物はまた、HAUSPリード化合物をin vivoで試験するための有益な被検物であろう。さらにまた、本発明者らの非ヒトトランスジェニック動物は、p53との相互反応でHAUSPの代用となりうるp53活性の調節因子のスクリーニングのために重要な固有の有用な被検物を提供する。
本発明は以下の実施例で詳述されるが、これらの実施例は本発明の理解を容易にするために提示されるものであり、請求の範囲に規定される本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。
【００８４】
実施例１−プラスミドおよび抗体
実施例２−３で使用したプラスミドおよび抗体は以下のように調製した。HAUSPおよびUSP11発現ベクターを構築するため、完全長タンパク質に対応するDNA配列（Everett et al. A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1997；Chhung and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266: 633-40, 1999）をMarathon-Ready Hela cDNA（Clontech）からPCRによって増幅し、pcDNA3-Topoベクター（Invitrogen）に、または、Flag-タグを付加してバクテリアにおける発現用にｐET-11ベクターへ若しくは哺乳動物細胞における発現用にpBabeベクターへサブクローニングした（Luo et al., Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408:377-81, 2000; Luo et al., Negative control of p53 by Sir2α promotes cell survival under stress. Cell, 107:137-48, 2001）。種々の欠失変異構築物については、種々の領域に対応するDNA配列をPCRにより上記構築物から増幅し、それぞれの発現ベクターにサブクローニングした。HAUSP抗体を調製するため、本発明者らは組換えHAUSP完全長タンパク質に対するポリクローナル抗体を作製した。完全長タンパク質に対応するDNA配列をpET-15-Hisベクター（Novagene）にサブクローニングした。精製His-HAUSPタンパク質（Covance）に対してα-HAUSP抗血清をウサギに生じさせ、更にプロテイン-Aカラムでアフィニティー精製した。
【００８５】
実施例２−P53-結合タンパク質としてのHAUSPの検出
p53に対する真の結合パートナーをアフィニティークロマトグラフィーアッセイにおいて成功裡に同定するためには非特異的なタンパク質結合を排除することが非常に重要である（Guら、Synergistic activation of transcription by CBP and p53. Nature, 387:819-23, 1997; Luo ら、Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408: 377-81, 2000）。この点について、溶出されるタンパク質の種類を制限するために、結合および溶出条件の間の塩濃度範囲を従前に記載された方法（Guら、Synergistic activation of transcription by CPB and p53. Nature, 387: 819-23, 1997; Luoら、Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408: 377-81, 2000）に比較して改変した(例えば、結合のためには200mM NaCl、溶出のためには500mM NaCl)。さらに核抽出物をGSTカラムで広範に前精製してからGST-p53アフィニティーカラムに装荷した。可能性のある一切の非特異的結合を明らかにするために、同じ核抽出物を装荷したGSTカラムおよびブランクバッファーを装荷したGST-p53カラムで同時に偽精製を行った。
【００８６】
簡単に言えば、示したGST-融合-タンパク質共役ビーズ40μlを含むカラムをBC500（25mM Tris、500mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、10％グリセロール、0.2％ NP40、１％Triton X-100、0.1％DOC、pH7.8）で十分に洗浄し、次に、装荷のためBC200（25mM Tris、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、10％グリセロール、0.2％ NP40、pH7.8）で平衡化した。ヒト肺がん細胞（H1299）をDMEM培地で増殖させ、核抽出物を本質的に従前に記載されたように（Guら、Synergistic activation of transcription by CPB and p53. Nature, 387: 819-23, 1997; Luoら、Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408: 377-81, 2000）調製した。核抽出物を200mM NaClおよび0.2％NP40に調整し、少なくとも３回GSTカラムを通して予備精製した。予備精製した800μlの核抽出物をGSTミニカラムまたはGST-p53ミニカラム上に装荷した。1mlのBC200バッファーで５回洗浄後、結合しているタンパク質を40μlのBC500でカラムから溶出した。約10ｘ109個の細胞由来の核抽出物を大量調製に使用した。
【００８７】
実施例３−p53の安定化およびp53のユビキチン化レベルの検出
p53-ヌル H1299細胞を0.1〜２mgのCMV-Flag-p53、２mgのCMV-Mdm2、１mgのCMV-GFPおよび５〜16mgのCMV-HAUSPまたは示したHAUSP変異体または他のタンパク質の発現ベクターでトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後にウェスタンブロット解析のために細胞をFlag-溶解バッファー（50ｍM Tris、137ｍM NaCl、10mM NaF、1mM EDTA、１％Triton X-100、0.2％サルコシル、1mM DTT、10％グリセロール、pH7.8；および新鮮なプロテイナーゼ阻害剤）で溶解した。GFPのレベルを抗GFPモノクローナル抗体、JL-8（Clontech）で、トランスフェクション効率コントロールとして検出した。p53のユビキチン化レベルは本質的に従前に記載されたように（Rodriguezら、Multiple C-terminal lysine residues target p53 for ubiquitin-proteasome-mediated degradation. Mol. Cell. Biol., 20: 8458-67, 2000）検出した。細胞を50mMのプロテアソーム阻害剤LLNL（Sigma）で４時間処理してから集め、その細胞を前記Flag-溶解バッファー中で緩やかに音波処理しながら溶解した。細胞抽出物をFlagモノクローナル抗体（M2）で免疫沈降させ、つづいて８％または4-20％SDS-PAGEゲル（Novex）で分離し、α-p53（DO-1）を用いてウェスタンブロットにより解析した。
【００８８】
in vitro脱ユビキチンアッセイ用に大量のユビキチン化p53を調製するため、H1299細胞(5X107)をFlag-p53およびMdm2発現ベクターで同時トランスフェクションした。上記と同じ処理後、ユビキチン化p53をM2-アフィニティーカラム上で前記Flag-溶解バッファーを用いて精製した。Flag-溶解バッファーで充分洗浄後、タンパク質をBC100バッファー（25mM Tris、100mM NaCl、pH7.8）中にFlag-ペプチド（Sigma）とともに溶出した。組換えFlag-HAUSPおよび変異型（HAUSP-cs）をBL21細胞にて発現させ、M2カラム上で精製した。in vitro脱ユビキチンアッセイ反応については、ユビキチン化p53タンパク質を組換えHAUSP(100ng)または同じ量の他の示したタンパク質と脱ユビキチンバッファー（50mM Tris-HCl、pH8.0；50mM NaCl、1mM EDTA、10mM DTT、５％グリセロール）中で37℃にて２時間インキュベーションした。
【００８９】
以下に上記実施例１〜３の事件と関連した本発明によって得られた結果をまとめる。
GST-p53アフィニティークロマトグラフィー（Guら、Synergistic activation of transcription by CPB and p53. Nature, 387: 819-23, 1997; Luoら、Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature, 408: 377-81, 2000）による生化学的精製を用いて、本発明者らはp53-結合タンパク質をヒト肺がん細胞（H1299）の抽出物から同定した。図１Aに示したように、GST-p53アフィニティーカラムおよび他のカラムから溶出した画分中に多数のタンパク質が存在する。驚いたことに、ただ一つのタンパク質p153（相対分子質量〜135,000；Mr:135K）がGST-p53カラムから得られた結合因子中に特異的に存在したが、このタンパク質はGSTカラムまたはコントロールカラムから得られた因子中には存在しなかった（レーン３ 対 レーン１，２）。大量調製により、質量分光分析用にp153バンドの十分な材料が得られ、合計で５つのペプチド配列が得られた（配列番号：１〜５）。全ての５つのペプチドはHAUSPまたはヒトUSP7として知られる（Everettら、A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1977）ヘルペスウイルスタンパク質Vmw110-関連細胞性因子由来の配列であった。
【００９０】
HAUSPは脱ユビキチン化酵素（DUB）のユビキチン-(Ub)-特異的プロセッシングプロテアーゼ（UBP）ファミリーであり、特徴的なCysおよびHisモチーフをコア酵素ドメインに含む（Everettら、A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1977）。興味深いことに、HAUSPのアミノ末端およびカルボキシル末端伸長は他のUBPのメンバーと有意な相同性が無く、基質特異性に非常に重要であると考えられており、in vitroでp53に直接結合する（Everettら、A novel ubiquitin-specific protease is dynamically associated with the PML nuclear domain and binds to a herpesvirus regulatory protein. EMBO J., 16:566-77, 1977；D'AndreaとPellman, Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 35:337-52, 1998; Chumg and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266: 633-40, 1999; Wilkinson, K.D., Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol., 11:141-48, 2000）。しかしながら、図９に示されたようにin vitro翻訳された35S-標識HAUSPはGST-p53に強く結合したがGST単独には結合しなかった（レーン２対 レーン３）。さらに、p53はHAUSPのN-末端伸長[HASUP(NT)]に強く結合し（レーン２、図９B）、そのカルボキシル末端伸長[HASUP(CT)]に弱く結合したが（レーン８、図９B）、コア触媒ドメイン[HASUP(M)]には結合しなかった（レーン５、図９B）。
【００９１】
共免疫沈降解析によってin vivoで相互作用を評価するため、p53-ヌル細胞（H1299）をp53およびFlag-タグ付加HAUSP発現ベクターでトランスフェクションした。図１Bに示されたようにp53はFlag-HAUSPとp53とで同時トランスフェクションされた細胞から容易に免疫沈降したが（レーン４）、p53のみでトランスフェクションされた細胞から沈降しなかった（レーン２）。
HAUSP-特異的抗体を用いることによって、本発明者らは内在性p53とHAUSPタンパク質との相互作用も調べた。ウェスタンブロット解析によりp53はヒト肺がん細胞(H460)の細胞抽出物からのα-HAUSP免疫沈降物中に存在するが、免疫前血清から得たコントロール免疫沈降物中には存在しないことが示された（図１C）。興味深いことに、この相互作用は遺伝毒性ストレスにさらされた細胞中で強く検出されたが（レーン２対レーン３，図１C）、プロテアソーム阻害剤LLNLで処理した細胞中には僅かな増強が検出されただけだった（レーン４、図１C。これらの結果はp53がin vivoでHAUSPと相互作用することを示しており、HAUSPによるp53の潜在的制御はDNA損傷応答の際に細胞中でなお有効であろうことを示している。
【００９２】
p53-HAUSP相互作用の機能的結果を決定するために、本発明者らはHAUSPがp53の安定化に影響を与えるかどうかを調べた。図２Aに示されたように、HAUSP発現はp53の定常細胞レベルを有意に増加させた。これに対して、HAUSPは、ユビキチン化経路によってその安定性が制御されている別の短命な腫瘍抑制タンパク質であるp27（SlingerlandとPagano、Regulation of the cdk inhibitor p27 and its deregulation in cancer. J. Cell Physi., 183: 10-17, 2000）のレベルに対しては明瞭な影響を全く与えなかった（図２B）。さらに、図２Cに示されたように、HAUSPはMdm2-媒介分解からp53を効果的に救済する。従って、Mdm2の過剰発現はp53分解を有意に誘導するが（レーン３対レーン１，図２C）、p53の分解はHAUSPを発現させると用量依存的に阻害された（レーン４〜６、図２C）。
【００９３】
本発明者らはHAUSP発現の内在性p53の安定化に対する影響をさらに調べた。正常なヒト線維芽細胞IMR-90をpBabeレトロウイルス空ベクターまたはHASUPを含むpBabeレトロウイルスで感染させた。本発明者らはまず内在性p53のタンパク質レベルをウェスタンブロット解析によって調べた。有意に高いp53タンパク質レベルがpBabe-HAUSP-感染細胞において検出された（レーン２対レーン１，図２D）。興味深いことに、内在性p21の発現も誘導されたが（レーン２対レーン１，図２D）、これは一過性トランスフェクションの結果と矛盾無く、従って、HAUSPはp53-依存性転写を活性化することも示される。対照的に、内在性p27のレベルは同じに維持され、HAUSPがin vivoでp53を安定化させるがp27は安定化させないという考えが支持される。特に、pBabe-HAUSP感染細胞におけるp53の半減期はHAUSP発現によって著しく増加した（約20分間から約90分間）が、偽-感染細胞におけるp53の半減期は30分間未満であった（図２E）。これらの結果を確証するため、本発明者らはpBabe-HAUSP感染細胞におけるp53のユビキチン化レベルが偽-感染細胞におけるレベルに比較して低下していることを見いだした（図２F）。従って、これらのデータはHAUSPがin vivoでp53を特異的に安定化することを明らかにしている。
【００９４】
HAUSPの生物学的役割を調べるために、本発明者らはコロニー形成アッセイにおいて細胞増殖に対するHAUSPの効果を調べた。1対のヒト肺がん細胞（H1299とH460）を空のpBabe-puroコントロールレトロウイルスまたはHAUSPをコードするpBabe-puroに感染させ、生理学的選択下で2週間培養した。驚くべきことに、HAUSPは野生型p53を発現するH460細胞の細胞増殖を強く阻害したが、p53-ヌル H1299細胞には何ら有意な効果を与えなかった（図３A）。HAUSPによる同様な細胞増殖抑制はMEF p53(+/+)細胞でも観察されたがMEF p53(-/-)細胞では観察されず、HAUSPによる細胞増殖抑制はp53依存性であることが示唆された。
本発明者らはHAUSPがp53依存性アポトーシスに直接影響を与えるかどうかも調べた。H1299細胞をp53単独でトランスフェクションまたはp53とMdm2で、またはp53、Mdm2およびHAUSPで同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を固定し、p53について染色し、DNA含量に従ってアポトーシス細胞（SubG1）を解析した（Luoら、Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis. Nature 408: 377-81, 2000）。図３Bに示したように、p53単独の過剰発現はアポトーシスを有意に誘導したが（31.0％）、Mdm2はp53依存性アポトーシスレベルを強く低下させた(11.2％)。しかしながら、HAUSPの発現はMdm2のp53依存性アポトーシスに対する阻害効果を効果的に減弱させた（28.5％対11.2％、図３B）。これらのデータは、HAUSPはp53依存性アポトーシスの制御および細胞増殖阻害に重要な関係があることを示している。
【００９５】
HAUSPがp53を安定化させる分子機構を明らかにするために、本発明者らはHAUSPがp53ユビキチン化レベルをin vivoで直接制御するのかどうかを調べた。図４Aに示されたように、Mdm2で同時トランスフェクションした細胞において高レベルのユビキチン化p53が見られたが、p53ユビキチン化はHAUSP発現によって有意に抑制された（レーン３ 対 レーン２）。対照的に、HAUSPはユビキチン化p27のレベルには全く影響を与えなかった（データ提示せず）。特に、p53結合しない無関係のヒトUBPファミリーのメンバー（ヒトUSP11）（Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 35:337-52, 1998; Chumg and Baek, Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 266: 633-40, 1999; Wilkinson, K.D.,Signal transduction: aspirin, ubiquitin and cancer. Nature, 424: 738-39, 2003）はp53ユビキチン化のレベルに明らかな影響を全く与えず（レーン５、図4A）p53安定化にも影響を与えなかった（レーン５、図４B）。重要なことに、コアドメインに短い欠失を有するHAUSP変異体はp53を安定化する能力を失うか（レーン４、図４B）p53ユビキチン化レベルを低下させ（レーン４、図４A）、このことはHAUSPによるp53の安定化には脱ユビキチン酵素活性が必要であることを示している。
【００９６】
p53に対するHAUSPのこの特異的脱ユビキチン活性を更に確認するため、本発明者らは、HAUSPが精製系においてp53を直接に脱ユビキチンし得るかどうかを調べた。HAUSPタンパク質をバクテリアで発現させ均一に近くまで精製した。次に、Flag-タグ付加p53発現ベクターでトランスフェクションした細胞から、M2アフィニティーカラムでp53のユビキチン化型を高ストリンジェンシー条件下で精製した。阻害性因子（例えばp14ARF）またはp53のユビキチン化に関与するなんらかの酵素のあり得る混入を避けるため、高度に精製したin vitro系をこのアッセイでは用いた。図４Cに示されたように、精製された組換えHAUSPとインキュベーションするとp53は効率的に脱ユビキチンされた（レーン２）。このように、前述の結果はHAUSPがin vitroおよびin vivoのいずれにおいてもp53を特異的に脱ユビキチン化できることを明らかにしている。
【００９７】
興味深いことに、コアドメインの高度に保存されたCys残基がSerに置換されたHAUSP点変異タンパク質（HAUSP-cs）はp53に対する強い結合性を維持していた。しかし、この変異体はin vitro におけるp53脱ユビキチンについて機能的に欠損していた（レーン３、図４）。重要なことに、HAUSPの野生型によって生じた効果と対照的に、細胞内のHAUSP-cs発現はp53ユビキチン化のレベルを上昇させたが（レーン４対レーン２、図５A）、このことはHAUSP-csがp53の内在性HAUSP-媒介脱ユビキチン化と干渉することによってドミナントネガティブ変異体として機能するかもしれないことを示している。
【００９８】
これらの結果を確証するため、本発明者らはHAUSP-cs発現が細胞内でp53タンパク質のレベルに影響を与えるかどうかもテストした。図５Bに示されるように、HAUSP-csとp53の同時発現はp53タンパク質のレベルを僅かに、しかし有意に低下させた（レーン１、３対レーン２，４）。さらにHAUSPが内在性p53を制御することを明らかにするため、本発明者らは正常なヒト細胞に点変異(HAUSP-cs)を導入した。IMR-90細胞をpBabeレトロウイルス空ベクターまたはHAUSP-csを含むpBabeレトロウイルスに感染させた。図５Cに示されたように偽-感染細胞におけるp53タンパク質のレベルはDNA損傷により強く誘導された（レーン１，３、５）。しかし、HAUSP-cs発現は正常条件およびDNA損傷条件のいずれにおいてもp53安定化の有意な減弱を引き起こした（レーン２、４、６）。これらをまとめると、これらの結果はHAUSPが生理学的条件下でp53の脱ユビキチン化および安定化に重要に関与することを示唆している。
【００９９】
実施例４−共免疫沈降解析
共免疫沈降解析によってin vivo相互作用を更に評価するため、p53-ヌル細胞（H1299）をp53およびFlag-タグ付加HAUSP発現ベクターでトランスフェクションした。図８Aに示されたようにp53はFlag-HAUSPおよびp53の両方でトランスフェクションした細胞からは容易に免疫沈降したが（レーン４）、p53単独単独でトランスフェクションした細胞からは沈降しなかった（レーン２）。HAUSP-特異的抗体を用いることにより、本発明者らは内在性p53とHAUSPタンパク質との相互作用も調べた。ウェスタンブロット解析により、p53は野生型p53を発現するヒト肺がん細胞（H460）の細胞抽出物からのα-HAUSP免疫沈降物中には存在するが（レーン４、図８B）免疫前血清で得られたコントロール免疫沈降物中には存在しないことが示された（レーン２、図８B）。興味深いことに、この相互作用は遺伝毒性ストレスに晒された細胞においては非常に強いことが示され（レーン３対レーン４、図８B）、一方、プロテアソーム阻害剤、LLNLで処理した細胞においては僅かな増強しか検出されなかった（レーン５、図８B）。さらに、p53-HAUSP相互作用の増強はDNA損傷のわずか２〜４時間という早期に観察され（図７C）、このことはDNA損傷応答の際におけるp53安定化の制御にHAUSPが重要な役割を果たすことを強く示唆している。従って、Mdm2-p53相互作用のDNA損傷による抑制（Shiehら、DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition MDM2. Cell, 91:325-34, 1997）と対照的に、これらの結果はp53がin vivoでHAUSPと相互作用し、この相互作用がDNA損傷後に細胞内で増強されることを示しており、これは内在性HAUSPがp53安定化に重要な役割を果たすという示唆と矛盾しない。
【０１００】
実施例５−更なる別のプラスミドおよび抗体
実施例６〜７で使用したプラスミドおよび抗体は以下のように調製した。p53、Mdm2、HAUSPおよびユビキチン発現ベクターを構築するため、完全長タンパク質に対応するcDNA配列をMarathon-Ready HeLa cDNA（Clontech）または他の鋳型からPCRによって増幅し、バクテリアにおける発現のためにｐGEX(GST)またはpET-11（His6）ベクターへ、または哺乳動物細胞における発現のためにpcDNA3へサブクローニングした。FLAGエピトープタグはPCRによって導入した。変異体構築物を調製するため、種々の領域に対応するcDNA配列を上記構築物からPCRによって増幅し、Gene Editシステム（Promega）で部位特的変異導入するためにサブクローニングした。p53に対するモノクローナル抗体（DO-1）(Santa  Cruz)、p21に対するモノクローナル抗体(Santa  Cruz)、GFPに対するモノクローナル抗体（Clontech）、マウスユビキチンに対するモノクローナル抗体(Calbiochem)、c-Mycに対するモノクローナル抗体(Santa Cruz)およびp27に対するモノクローナル抗体(Calbiochem)はそれぞれ示した会社から購入した。MdmXおよびMdm2(4B2)モノクローナル抗体はそれぞれJ.Chen研究室およびA.Levine研究室からの供与物である。MdmX抗体はIBL社（Fujioka,JP）から入手することもできる。Mdm2(4B2)抗体についてはChenら、（Mapping of the p53 and mdm-2 interaction domains. Mol. Cell. Biol., 13: 4107-14, 1993）を参照されたし。
Mdm2およびHAUSPポリクローナル抗体用に、それぞれ精製されたGST-Mdm2(1-110)およびGST-HAUSP(1-98)タンパク質断片に対する抗血清をウサギに生じさせた。
【０１０１】
実施例６−RNAiおよびshRNAによる内在性HAUSPの抑制
U2OS細胞におけるHAUSPレベルの効率的な低下のため2段階処理を利用した。初めに、本発明者らは、本質的に従前に記載されたように（Hermannら、An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo. Nat. Genet., 33:396-400, 2003）HAUSP短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を発現する安定な細胞株を樹立した。簡単に言えば、以下に対応する3'オリゴヌクレオチドを作製した：U6プロモーターの相同物、HAUSPの28nt領域（nt133-161）、８ntスペーサー、HAUSP配列のアンチセンス、およびpol III終結部位。5'オリゴヌクレオチドはU6プロモーターの5'末端のSP6部位に対応する。U6プロモーターを含むpGEMベクターをPCR反応の鋳型として用いた。生成物をpGlow-TOPOベクター（Invitrogen）へサブクローニングし、続いてG418耐性（Gibco）による安定株のクローン選別のためにU2OS細胞へトランスフェクションした。この方法はHAUSPレベルを安定に半分に低下させ、同様な効果を有する１０以上の細胞株が得られた。
【０１０２】
更なる低下のため、前記U2OS-HAUSP shRNA安定株をHAUSP mRNAに特異的な3' dTdTオーバーハングを含む、21nt siRNA二重鎖、HAUSP#1（AAUGUGGCCCUGAGUGAUGGA:配列番号８またはHAUSP#2（AAGUCUUUGUACAGGCGGAUG：配列番号９）（Dharmacon）でトランスフェクションした。２個のヌクレオチドが変更された同じ配列（HAUSP#1-変異体）（AAUGUGGGCCUGAGAGAUGGA:配列番号１０）をコントロールとして用いた。RNAiトランスフェクションはオリゴフェクタミンを用いて行った。トランスフェクションの前におよそ100万個の細胞を10cmディッシュに入れた。すべてのトランスフェクションは業者（Invitrogen）のプロトコルに従った。その他については、内在性HAUSPのRNAi-媒介抑制はHAUSP  21-ヌクレオチドsiRNA二重鎖を用いて、上述したように行った。次にこれらの細胞を記載のアッセイに使用した。
【０１０３】
実施例７−In vitro脱ユビキチンアッセイ
基質としてユビキチン化Mdm2を調製するため、3ngのバクテリア産生GST-Mdm2を、10ngのE1、20-100ngのE2（UbcH5a）および５μgのHis-ユビキチンを含む他の精製成分と200μlの反応バッファー（40mM Tris、５mM MgCl2、2mM ATP、および2mM DTT、pH7.6）中で混合した。37℃にて60分後、各反応を８M尿素洗浄バッファー（バッファーA）を添加することによって停止させ、続いてNi2+-NTA-アガロースビーズと４時間室温にてインキュベーションした。次にビーズを５分間それぞれ以下のバッファーで洗浄した：バッファーA（８M尿素、0.1M Na2PO4/NaH2PO4、0.01M Tris/HCl(pH8.0)、10mM β-メルカプトエタノール、0.2％Triton X-100）およびバッファーB（８M尿素、0.1M Na2PO4/NaH2PO4、0.01M Tris/HCl(pH6.3)、10mM β-メルカプトエタノール、0.2％Triton X-100）。His6-タグ付きユビキチン化タンパク質を溶出バッファー（100mM NaCl、20％グリセロール、20mM Tris-HCl(pH7.9)、200mMイミダゾール、1mM DTT）で4℃にて60分間溶出した。
【０１０４】
ユビキチン化Flag-c-MycおよびFlag-p53基質の調製のため、293細胞およびHeLa細胞を10μgのｐCIN4-Flag-Mycおよび５μgのPCIN4-Flag-p53でそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクション24時間後、細胞を25μMのプロテアソーム阻害剤、MG132およびLLNL（Sigma）で各６時間処理し、つぎに、Flag-溶解バッファー中で溶解した。細胞抽出物をFlagモノクローナル抗体（M2）で免疫沈降させた。脱ユビキチン化アッセイのため、溶出物を100ngの、バクテリアで発現させた精製したGST-HAUSP、GSTHAUSP-cs、またはGST-UBP11と60分間インキュベーションし、続いて4-12％グラジエントゲル上でウェスタンブロット解析用に分離した。
以下に上記実施例５−７の実験と関連して本発明者が得た結果をまとめる。
【０１０５】
内在性HAUSPのRNAi-媒介低下によるp53レベルに対する示差的効果
HAUSPのin vivoの役割を明らかにするため、本発明者らは内在性HAUSPのRNAi-媒介低下の機能的結果を調べた。この目的のため、HAUSPおよび野生型p53の両方を発現する正常なヒト線維芽細胞（NHF-1およびIMR90）をHAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチド(RNAi/HAUSP#1)またはコントロールGFP-特異的RNAオリゴヌクレオチド(RNAi/コントロール)でトランスフェクションした。図10Aに示されたように、HASUPはかなり安定なタンパク質なので、内在性HAUSPポリペプチドのレベルは１回のオリゴヌクレオチドトランスフェクション後には部分的にしか低下しなかった（上段：レーン２および４対レーン１とレーン３）。これらの条件下では、内在性p53タンパク質のレベルも中程度に低下しており、細胞内p53の安定化におけるHAUSPの正の役割を支持する。
【０１０６】
興味深いことに、HAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチドによる連続３回のトランスフェクション後には、内在性HAUSPのレベルはほぼ完全に枯渇した（図１０B、上段、レーン２対レーン１）。しかしながら、驚くべきことに、HAUSP発現の著しい低下はp53の安定化を誘導した（中段、レーン２対レーン１）。この現象を確認するため、本発明者らはHAUSP消失の効果を別の細胞型で異なるアプローチを用いて調べた。
ヒト骨肉腫細胞U2OSにおけるHAUSPの効果的な低減のため、2段階方法を用いた。初めに、本発明者らは本質的に従前に記載されたようにして（Hemannら、An epi-allelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo. Nat. Genet., 33: 396-400,2003）HAUSP短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を発現する安定な細胞株を樹立した。その後、U2OS-HAUSP shRNA安定株において更にHAUSPレベルを低下させるため、HAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチドで１回のトランスフェクションを行った。図１０Gに示されるように、内在性HAUSPタンパク質はほとんど検出できなかった；しかしながら、ここでも内在性p53レベルは有意に増加した。これらをまとめると、これらの結果はRNAiによる内在性HAUSPレベルの部分的低下は確かに内在性p53を不安定化させることを示している。しかしながら、HASUP発現の著しい低下は逆にp53を安定化させることを示している。
【０１０７】
HAUSP発現はまたMdm2を安定化する
HAUSPによるp53レベルの示差的制御に関与する分子機構を理解するため、本発明者らは、p53に加えて他の細胞性因子もHAUSPによって制御されておりHAUSP-枯渇細胞においてp53の間接的な安定化を生じさせているかもしれないと考えた。そこで、本発明者らは、p53経路における他のキー制御因子に対するHAUSPの効果を調べた。興味深いことに、H1299細胞（p53-ヌル、ヒト肺がん細胞株）をp53、Mdm2、およびHAUSPをコードする発現ベクターでトランスフェクションすると、本発明者らはMdm2のレベルが上昇することを見いだした。従って、図１０Dに示されたように、Mdm2-媒介p53分解はHAUSP発現によって確かに強力に救済されるが、またMdm2のレベルも有意に増強される。同様な結果はヒトU2OS細胞においても見いだされ（図１４、上段パネル）、HASUPはMdm2を安定化させることもできることを示している。対照的に、本発明者らはHAUSP発現によるMdmXに対する有意な影響はなんら検出できなかった（図１０E）。
【０１０８】
HAUSPはp53非存在下でMdm2と相互作用する
Mdm2のHASUP-媒介安定化が直接の効果であるのかどうかを決定するため、本発明者らはHAUSPがp53非存在下でMdm2に結合し得るかどうかをまず調べた。図１１Aに示されたようにin vitro-翻訳した35S-標識HAUSPは固定化GST-Mdm2ポリペプチドに強く結合したがGST単独には結合しなかった（レーン３対レーン２）。次に、本発明者らはH1299（p53-欠損細胞株）においてMdm2とHAUSPの間のp53依存性相互作用について調べた。Mdm2の内在レベルはH1299細胞においては非常に低いので、本発明者らはFlag-タグ付加野生型ヒトMdm2を安定に発現する誘導体細胞株を作製した。図１１Bに示されるように、Flag-特異的M2抗体を用いたFlag-Mdm2の免疫沈降によりこれらの細胞から内在性HAUSPが容易に回収された（レーン４）。HAUSP特異的抗体を用いて、本発明者らはまたU2OS細胞における内在性HAUSPとMdm2タンパク質との相互作用を確認した。ウェスタンブロット解析によりMdm2はU2OS細胞の細胞抽出物からの抗HAUSP免疫沈降物中に存在しているが、コントロール免疫沈降物中には存在しないことが示された（図１１C、レーン３対レーン２）。これらの結果は、HAUSPとMdm2との間のp53に依存しない物理的相互作用を明らかにしている。
【０１０９】
Mdm2はHAUSP-媒介脱ユビキチン化の基質である
本発明者らは、さらにHAUSPがMdm2安定化において酵素的役割を有しているかどうかを決定しようとした。in vitro脱ユビキチン化アッセイを行った。このアッセイでは、ユビキチン化Mdm2を組換えHAUSPまたは酵素的欠損変異体HAUSP-csと共インキュベーションした。図１１Dに示されたように、Mdm2はHAUSP存在下では有意に脱ユビキチンされたが、HAUSP-cs存在下ではされなかった。特に、HAUSPはユビキチン化c-Mycタンパク質をin vitroで脱ユビキチンできなかった。無関係のヒト脱ユビキチン化酵素UBP11は非特異的基質を脱ユビキチン化できたが、同様なアッセイでMdm2を脱ユビキチンできなかった（図１４（中段および下段のパネル）および図１５（上段パネル））。このことはHAUSP-媒介Mdm2脱ユビキチン化の特異性を確認するものである。
本発明者らは、次に、p53-ヌル細胞をMdm2および野生型または変異型HAUSPで同時トランスフェクションすることによって、HAUSPがp53非存在下でMdm2を安定化する能力を調べた。図１１Eに示されたように、Mdm2は細胞中で短命なタンパク質であるが（最上段パネル）、Mdm2は野生型HAUSPの存在下で強力に安定化され（中段パネル）、この安定化は触媒変異型HAUSP-csによって重度に低下した（下段パネル）。これらのデータは、HAUSPはp53非存在下でMdm2を脱ユビキチン化することによりMdm2安定化を直接に制御し得ることを示している。
【０１１０】
Mdm2はHAUSP-消失細胞中では極度に不安定であり、p53の間接的な活性化を生じさせる
HAUSP RNAiによって誘導される特異的な効果を更に確認するため、本発明者らは他のHAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチド、RNAi/HAUSP#2（HASUP mRNAの異なる領域を認識する）を用いて類似のアッセイを行った。３回の連続するトランスフェクション後、内在性HAUSPタンパク質のレベルはほとんど消失し（図１２A、上段パネル、レーン３対レーン４）、ここでもp53のレベルはHAUSP枯渇によって上昇した（図１２A）。これらの結果は図１０に示した結果と一致する。
本発明者らは、HAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチドの点変異体を用いてコントロール実験も行った。図１２Aに示されたように、HAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチド＃１（RNAi/HAUSP#1）による内在性HAUSPの著しい枯渇はU2OS細胞においてp53安定化を生じさせたが、HAUSP特異的RNAオリゴヌクレオチド＃１点変異体（RNAi/HAUSP#1-mut）で処理した細胞においては有意な効果は見られなかった。さらに、c-Mycやp27のような他の短命なタンパク質に対してもHAUSP枯渇による有意な効果は見られなかった（図１５、中段パネル）。特に、HAUSP枯渇はp21（p53の主要な転写標的）の誘導ももたらした（図１２B）。これらの結果は、p53がHAUSP枯渇細胞において安定化され活性化されたことを示している。
【０１１１】
本発明者らは、更にHAUSP枯渇による内在性Mdm2に対する効果を調べた。Mdm2のmRNAレベルは上昇したが、これはMdm2もp53の転写標的であるからである（図１５、下段パネル）。しかしながら、内在性Mdm2の半減期はHAUSPのRNAi媒介枯渇により非常に短くなった（図１２C）。従って、HAUSP過剰発現はMdm2とp53のどちらも安定化させるが（図１０D）、HAUSP枯渇の正味の結果はp53の安定化および機能的活性化である。なぜなら、Mdm2は細胞内でp53を分解するには明らかにあまりに不安定だからである。このことはまた、HAUSP消失細胞において、Mdm2を脱ユビキチンできないことが（この結果Mdm2活性が低下し、p53が間接的に活性化される）HAUSP-媒介p53脱ユビキチン化欠損による予想されるp53の不安定化を無効化することも示唆する。
【０１１２】
p53のHAUSP-媒介フィードバック制御はMdm2に特異的である
p53-Mdm2制御におけるHAUSPの特異的役割を明らかにするため、本発明者らはHAUSP枯渇によるp53安定化という効果がMdm2-依存性であるかどうかを調べた。野生型p53を発現する正常細胞はMdm2の欠損により生存することができないので、この問題を直接扱うのは明らかに困難である。HeLa細胞においては、p53のユビキチン化および分解はヒトパピローマウイルス（HPV）タンパク質E6と細胞性E6APユビキチンリガーゼとの組合せにより制御されている（Hengstermannら、Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1218-23, 2001; Munger and Howley, Human papillomavirus immortalization and transformation functions. Virus Res., 89: 213-28, 2002）。従って、本発明者らは初めにHAUSPがE6-媒介p53分解も阻害するかどうかを調べた。図１３Aに示されるように、HAUSPの過剰発現はp53のE6-媒介分解を効果的に救済した（レーン４，５対レーン２，３）。さらに、HeLa細胞から精製したユビキチン化p53タンパク質は組換えHAUSPによって容易に脱ユビキチンされたが（図１３B、レーン２対レーン１）、脱ユビキチン-欠損変異体HAUSP-csによってはされなかった（レーン３）。
【０１１３】
p53ユビキチン化のMdm2-依存性経路はHeLa細胞においては不活性であるので（Hengstermannら、Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 1218-23, 2001）HAUSP過剰発現のp53のE6-媒介分解救済に対する直接的効果がこれらの細胞では曝露される。この解釈を確認するため、本発明者らは、HeLa細胞におけるHAUSP発現の枯渇がp53に対して異なる効果を生じさせるかどうか調べた。図１３Cに示されたように、HeLa細胞におけるHAUSP枯渇は、U2OS細胞における効果と対照的に、内在性p53のレベルを低下させp21を活性化できなかった。従って、HAUSP-媒介脱ユビキチン化の消失はHeLa細胞においてはp53の分解を更に容易にする。これらのデータは、p53のHAUSP-媒介フィードバック制御Mdm2に特異的であることを示唆しており、さらにHAUSPのin vivo p53安定化における正の役割を確認するものである。
上記発明を明確化および理解のために詳細に記載してきたが、本開示により当業者は態様および細部の種々の変更は請求項に記載の本発明の範囲を逸脱することなく行い得ることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図1A−1Cは、HAUSPの精製及びp53とHAUSPとの間の相互作用を示す。（A）HAUSPは、表示したカラムの溶出液を含むSDS-PAGEゲルの銀染色分析を用いて、p53結合タンパク質として同定された。以下のペプチド配列（p135タンパク質バンドに由来する）が質量分析から得られた：YDAGEHGLQEAEK（配列番号:1）；DFEPQPGNMSHPR（配列番号:2）；KLYYQQLK（配列番号:3）；FMYDPQTDQNIK（配列番号:4）；及びIQDYDVSLDK（配列番号:5）。（B）全細胞抽出（WCE）又はトランスフェクション細胞の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）による免疫沈降物（IP/M2）を用いて、p53はHAUSPと細胞内で相互作用すると決定された。（C）未処理細胞（レーン3、上段）若しくはDNA損傷試薬（エトプシド）処理細胞（レーン2、上段）若しくはプロテアソーム阻害因子（LLNL）処理H460細胞（レーン4、上段）の免疫前血清によるコントロール免疫沈降物のウェスタンブロット分析（レーン1、上段）、又は抗HAUSP抗体（IP/α-HAUSP）による免疫沈降物のウェスタンブロット分析、又は抗p53（中段パネル）若しくは抗アクチンモノクローナル抗体（下段パネル）によって免疫沈降させたこれら種々の核抽出物（NE）のウェスタンブロット分析を用いて内在性p53とHAUSPタンパク質との間の相互作用が解明された。
【図２】図2A−2Fは、HAUSPはin vivoでp53と相互作用し、これを安定化させることを示す。p53単独（レーン1、3）をトランスフェクションするか、又はp53及びHAUSP（レーン2、4）を同時トランスフェクションしたH1299細胞から得た細胞抽出物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析によれば、HAUSPは定常レベルのp53を増強するが（A）、p27は増強しない（B）。（A）p27単独（レーン1、3）をトランスフェクションするか、又はp27及びHAUSP（レーン2、4）を同時トランスフェクションしたH1299細胞由来の細胞抽出物の抗p27モノクローナル抗体（B）によるウェスタンブロット分析。（C）p53（レーン1）をトランスフェクションするか、又はp53及びHAUSP（レーン2）を同時トランスフェクションするか、又はp53及びMdm2（レーン3）を同時トランスフェクションするか、又は種々の量のHAUSPと組み合わせて（レーン4−6）トランスフェクションした細胞由来抽出物の、抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析を用いて、HAUSPによってMdm2-媒介分解からp53が保護されることを示した。（D）偽感染及びpBabe-HAUSP感染IMR-90細胞由来の細胞抽出物で示されるように（ウェスタンブロット分析によって各タンパク質の発現レベルについて分析された）、HAUSPは内在性タンパク質の発現レベルを制御する。（E）内在性p53の半減期のHAUSPによる制御。偽感染及びpBabe-HAUSP感染IMR-90細胞由来の細胞抽出物（シクロヘキサミド（CHX）で前処理した後種々の時点で採集）を、抗p53モノクローナル抗体（DO-1）を用いてウェスタンブロットによってp53タンパク質レベルについて分析した。（F）内在性p53のユビキチン化レベルのHAUSPによる制御。偽感染細胞及びLLNLで4時間、前処理したpBabe-HAUSP感染IMR-90細胞由来の細胞抽出物を最初に抗p53ポリクローナル抗体で免疫沈降させ、続いて抗p53モノクローナル抗体（DO-1）を用いてウェスタンブロットによってユビキチン化レベルについて分析した。
【図３】図3A−3Bは、p53媒介細胞増殖の抑制（A）及びアポトーシス（B）に対するHAUSPの影響を示す。（A）一対のヒト肺癌細胞（H1299及びH460）並びに一対のマウス胚線維芽細胞（MEF p53(+/+)及びMEF p53(-/-)）をpBabe-ベクター又はpBabe-HAUSPで感染させた。感染後24時間で、細胞を分割し、ピューロマイシン含有培地で維持し、生存コロニーを2週間後に数えた。（B）表示のように、H1299細胞にp53のみ若しくはHAUSPのみをトランスフェクションするか、又はp53及びMdm2を同時トランスフェクションするか、又はp53、Mdm2及びHAUSPを同時トランスフェクションした。トランスフェクション後に細胞を固定し、FITC結合α-p53抗体によりp53を染色し、さらにDNA含有量にしたがって（PI染色）アポトーシス細胞（サブG1）について分析した。
【図４】図4A−4Cは、in vivo及びin vitroの両者におけるHAUSPによるp53の脱ユビキチン化を示す。（A）in vivoにおけるp53の脱ユビキチン化レベルの調節。Flag-p53（レーン１）をトランスフェクション、又はFlag-p53及びMdm2（レーン2）を同時トランスフェクション、又は表示のように種々の発現ベクターと組み合わせて（レーン3−5）トランスフェクションした細胞のM2/Flag抗体による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。（B）HAUSP変異体によるp53安定性の調節。p53（レーン1）をトランスフェクション、又はp53およびMdm2（レーン2）を同時トランスフェクション、又は表示のように種々の発現ベクターと組み合わせて（レーン3−5）トランスフェクションした細胞由来のH1299細胞抽出物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。トランスフェクション効率管理のために各トランスフェクションにCMV-GFP発現ベクターを含め、GFPレベルを抗GFPモノクローナル抗体（JL-8；Clontech）で検出した。（C）HAUSPによるp53のin vitro脱ユビキチン化。精製脱ユビキチン化p53タンパク質をHAUSP（レーン2）又はHAUSP-cs（レーン3）のどちらかの精製した組換えタンパク質とともにインキュベートした。
【図５】図5A−5Dはヒト細胞におけるHAUSP-csのドミナントネガティブ効果を示す。（A）Flag-p53（レーン１）をトランスフェクション、又はFlag-p53及びMdm2（レーン2）を同時トランスフェクション、又は表示のようにHAUSP及びHAUSP-csと組み合わせて（レーン3、4）トランスフェクションした細胞のM2/Flag抗体による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。全ての細胞を採集の4時間前にLLNL（50mM）で処理した。（B）Flag-p53（レーン2、4）の発現ベクターをトランスフェクションするか、又はHAUSP-csとともにFlag-p53（レーン1、3）の発現ベクターを同時トランスフェクションしたヒトSJSA細胞のM2/Flag抗体による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。トランスフェクション効率コントロール用にCMV-GFP発現ベクターを各トランスフェクションに含め、GFPレベルを抗GFPモノクローナル抗体（JL-8；Clontech）で検出した。（C）偽感染及びpBabe-HAUSP-cs感染IMR90細胞由来の細胞抽出物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。細胞は未処理（レーン1、2）のままか、又は表示のように1時間若しくは2時間、表示のように20mMのエトプシド（レーン3−6）で処理した。（D）Mdm2、HAUSP及びARFによるp53安定性調節のためのモデル。p53はMdm2によってユビキチン化され、続いて26Sプロテアソームによって分解され、一方、ARF腫瘍抑制因子は、Mdm2により媒介されるユビキチンリガーゼ活性の阻害を介してp53安定化を誘導する。HAUSPはp53を直接脱ユビキチン化し、ユビキチン化p53を分解からレスキューすることができる。
【図６】図6はヒトHAUSPのアミノ酸配列（配列番号:6）を示す。
【図７】図7はヒトHAUSPのcDNA配列（配列番号:7）を示す。
【図８】図8A−8CはP53とHAUSPとのin vivoにおける相互作用を示す。（A）p53は細胞内でHAUSPと相互作用する。表示の全細胞抽出物（WCE）（レーン1、3）、又はF-HAUSP及びp53同時トランスフェクションH1299細胞（レーン3、4）若しくはp53単独トランスフェクション細胞（レーン1、2）から調製したM2抗体（IP/M2）（レーン2、4）による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。（B）内在性p53とHAUSPタンパク質との間の相互作用。表示の核抽出物（NE）（レーン1）、又は免疫前血清によるコントロール免疫沈降物、又は未処理（レーン4）、DNA損傷処理、若しくはLLNL処理H460細胞の細胞抽出物の抗HAUSP抗体による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体によるウェスタンブロット分析。（C）DNA損傷応答の際のp53とHAUSPとの相互作用。H460核抽出物（NE）（レーン6）、又はDNA損傷処理後に表示の時点で採集したH460細胞の抗HAUSP抗体（IP/α-HAUSP）（レーン1−5）による免疫沈降物の抗p53モノクローナル抗体（DO-1）によるウェスタンブロット分析。
【図９】図9A−9Bはp53とHAUSPのin vitroでの相互作用を示す。（A）in vitro翻訳35S-標識完全長HAUSP（FL）（レーン1−3）、又はHAUSPのN-末端伸長物（1-248）（レーン4−6）、又はHAUSPのコアドメイン（245-644）（M）（レーン7−9）、又はHAUSPのC-末端伸長物(637-1102)を用いたGSTプルダウンアッセイにおいてGST及びGST-p53融合タンパク質を用いた。（B）p53とHAUSP-cs、HAUSP(Δ207-564)及びUSP11とのin vitro相互作用。in vitro翻訳35S-標識HAUSP-cs（レーン1−3）、HAUSP(Δ207-564)（レーン4−6）又はUSP11（レーン7−9）を用いたGSTプルダウンアッセイでGST及びGST-p53融合タンパク質を用いた。
【図１０】図10A−10Eは、p53及びMdm2のHAUSPによる安定化を示す。（A）NHF-1細胞及びIMR90細胞におけるHAUSP#1-RNAi １回処理後の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析。HAUSP#1はAAUGUGGCCCUGAGUGAUGGA（配列番号:8）である。（B）HAUSP#1-RNAi三回処理後のIMR90全細胞抽出物のウェスタンブロット分析。（C）HAUSP#1-RNAiの一回処理により、U2OS-HAUSP shRNA安定株を一過性にトランスフェクションした。抗HAUSP、抗p53（DO-1）及び抗アクチン（AC-15）抗体を用いて前記ブロットをプロービングした。（D）Flag-p53単独（レーン1）、Flag-p53及びMdm2（レーン2）、又はFlag-p53、Mdm2及びHAUSP（レーン3）をトランスフェクションしたH1299細胞の全細胞抽出物の、抗p53（DO-1）、抗Mdm2、抗HAUSP及び抗GFP抗体によるウェスタンブロット分析。（E）Mdm2X単独（レーン1）、MdmX及びMdm2（レーン2）、MdmX、Mdm2及びHAUSP（レーン3）又はMdmX及びHAUSP（レーン4）をトランスフェクションしたH1299細胞の全細胞抽出物のウェスタンブロット分析。ブロットは抗MdmX及び抗GFPモノクローナル抗体を用いてプロービングした。
【図１１】図11A−11Eは、HAUSPはp53の非存在下でMdm2と相互作用し、これを安定化させることを示す。（A）HAUSPとMdm2とのin vitro相互作用。in vitro翻訳した35S-標識完全長HAUSPを用いたGSTプルダウンアッセイにおいてGST（レーン2）及びGST-Mdm2（レーン3）融合タンパク質を用いた。（B）コントロールH1299細胞（レーン3）及びFlag-Mdm2 wtを安定的に発現する細胞（レーン4）由来のインプット及び免疫抽出物の抗HAUSP抗体によるウェスタンブロットで示されるように、HAUSPはp53ヌル細胞でMdm2と相互作用する。（C）IgGコントロールによるコントロール免疫沈降物（レーン2）又は抗HAUSP抗体による免疫沈降物（レーン3）のウェスタンブロット分析。（D）HAUSPによるMdm2のin vitro脱ユビキチン化。精製したin vitro脱ユビキチン化Mdm2タンパク質（レーン2）をHAUSP(レーン3)又はHAUSP-cs（レーン4）のどちらかの精製組換えタンパク質とともにインキュベートした。（E）HAUSPによるMdm2の半減期の制御。H1299細胞にMdm2、Mdm2及びHAUSP、又はMdm2及びHAUSP-csをトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後に細胞を1：4に分けた。トランスフェクションの48時間後にシクロヘキサミドで前処理後、表示した種々の時点で細胞を採取し、それぞれ抗Mdm2及び抗アクチン（AC-15）抗体を用いてMdm2及びアクチンタンパク質レベルをウェスタンブロットによって分析した。
【図１２】図12A−12Cは、HAUSP枯渇細胞においてp53は安定化及び活性化されるが、Mdm2は極端に不安定であることを示す。（A）種々のHAUSP RNAiオリゴヌクレオチドの影響。RNAi/HAUSP#1-変異体（レーン1）、RNAi/HAUSP#1（レーン2）、RNAi/HAUSP#2（レーン3）又はRNAi/コントロール（GFP）（レーン4）による三回処理を実施したU2OS細胞由来の細胞抽出物のウェスタンブロット分析。HAUSP#2はAAGUCUUUGUACAGGCGGAUG（配列番号:9）である。ブロットは抗HAUSP、抗p53（DO-1）及び抗アクチン（AC-15）抗体でプロービングした。（B）HAUSPの除去はp21発現を活性化させる。コントロールRNAi（レーン1）又はHAUSP#1-RNAi（レーン2）のどちらかで処理したU2OS細胞の全細胞抽出物について、抗p21、抗HAUSP及び抗アクチン（AC-15）抗体でイムノブロットを実施した。（C）HAUSPによる内在性Mdm2及びp53の半減期の制御。シクロヘキサミドで前処理した後、表示のように種々の時点で採集したHAUSP#1-RNAi（右パネル）及びコントロールRNAi（左パネル）U2OS細胞由来の細胞抽出物を、p53及びMdm2タンパク質レベルについて、それぞれ抗p53（DO-1）及び抗Mdm2抗体を用いてウェスタンブロットによって分析した。
【図１３】図13A−13Cは、p53のHAUSP媒介フィードバック制御はMdm2に特異的であることを示す。（A）HAUSP非存在下でFlag-p53及び漸増するE6をトランスフェクションしたH1299細胞（レーン2及び3）、又はHAUSP存在下でFlag-p53及び漸増するE6をトランスフェクションしたH1299細胞（レーン4及び5）の全細胞抽出物の、抗p53（OD-1）抗体によるウェスタンブロット分析。（B）HAUSPによるp53のin vitro脱ユビキチン化。HeLa細胞由来の精製ユビキチン化Flag-p53タンパク質（レーン1）を、HAUSP（レーン2）又はHAUSP-cs（レーン3）の精製組換えタンパク質とともにインキュベートした。（C）コントロールRNAi（レーン1）又はHAUSP#1-RNAi（レーン2）のどちらかで処理したHeLa細胞の全細胞抽出物について、抗p53（DO-1）、抗HAUSP、抗アクチン（AC-15）及び抗p21抗体を用いてイムノブロットを実施した。
【図１４】図14は、HAUSPはU2OS細胞においてp53及びMdm2の両方を安定化させ（上パネル）、さらにMdm2はHAUSPによってin vitroで特異的に脱ユビキチン化されるが、UBP11では脱ユビキチン化されない（中及び下パネル）ことを示す。（上パネル）：Flag-p53単独（レーン1）、Flag-p53及びMdm2（レーン2）、又はFlag-p53、Mdm2及びHAUSP（レーン3）をトランスフェクションしたU2OS細胞由来の全細胞抽出物の、抗p53（DO-1）、抗Mdm2及び抗GFP抗体によるウェスタンブロット分析。（中パネル）：精製したin vitroユビキチン化Mdm2タンパク質（レーン1）をGST-UBP11（レーン2）又はGST-HAUSP（レーン3）の精製組換えタンパク質とともにインキュベートし、抗Mdm2抗体を用いてイムノブロットを実施した。（下パネル）：UBP11はin vitroで活性を有する脱ユビキチン化酵素である。ポリ-ユビキチン鎖（UB2-7）（Affiniti）をGST（レーン2）又はGST-UBP11（レーン1）とともにインキュベートし、マウス抗ユビキチン抗体を用いてイムノブロットを実施した。
【図１５】図15は、HAUSPはMdm2に対して特異的な脱ユビキチン化酵素であるがc-Mycに対してはそうではない（上パネル）こと、HAUSP枯渇は他の不安定なタンパク質（例えばc-Myc及びp27）に対しては影響を与えないこと（中パネル）、及びHAUSP枯渇によってMdm2のmRNAレベルは上昇するがp53のmRNAレベルは等しく維持されること（下パネル）を示す。（上パネル）：Flag-Myc及びHA-Ub構築物をトランスフェクションした293細胞を抗Flag（M2）免疫精製に付した。続いてユビキチン化Flag-Mycタンパク質をin vitroで組換えGST-HAUSPタンパク質とともにインキュベートした。ブロットは、抗HA（レーン1及び2）又は抗Myc（C33）（レーン3及び4）抗体のどちらかを用いてプロービングした。（中パネル）：U2OS-HAUSP shRNA安定株にHAUSP#1-RNAiを三回処理により一過性にトランスフェクションした。ブロットは、抗HAUSP、抗Myc（C33）、抗p53（DO-1）、抗アクチン（AC-15）及び抗p27抗体を用いてプロービングした。（下パネル）：コントロール-RNAi又はHAUSP#1-RNAi安定株（それぞれコントロール-RNAi又はHAUSP#1-RNAiの追加の一回処理を行った）に対して、Mdm2、p53及びアクチンに特異的なプライマーを用いてRT-PCRを実施した。
【図１６】図16A−16Bは、p53の過剰発現が内在性Mdm2発現を誘導することを示す。（上パネル）：U2OS細胞に5μgのFlag-p53（レーン2）、10μgのFlag-p53（レーン3）又は15μgのFlag-p53（レーン4）をトランスフェクションした。ブロットを抗Mdm2、抗p53（DO-1）及び抗GFP抗体でプロービングした。（下パネル）：H1299細胞に5μgのp53（レーン2）、10μgのp53（レーン3）又は15μgのp53（レーン4）をトランスフェクションした。ブロットを抗Mdm2、抗p53（DO-1）及び抗GFP抗体でプロービングした。
【図１７】図17A−17Bは、HAUSPとヒトMdm2との間のin vitro相互作用を示す。（上パネル）：in vitro翻訳した35S-標識完全長HAUSPを用いたGSTプルダウンアッセイにおいてGST（レーン2）及びGST-Mdm2（レーン3）融合タンパク質を用いた。GST-Mdm2のN-末端（1-110）（レーン4）、GST-Mdm2の伸長N-末端（1-220）（レーン5）、GST-Mdm2（110-220）（レーン6）及びGST-Mdm2（110-280）（レーン7）とともにインキュベートしたin vitro翻訳した35S-標識完全長HAUSPを用いて、Mdm2相互作用ドメインの更なる性状決定を実施した。（下パネル）：ここに記載したアッセイで用いたMdm2 wtタンパク質及びフラグメントの模式図である。タンパク質結合ドメイン及びMdm2保存領域が示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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