(57)【要約】  本発明は、多様化のための鋳型として作用する配列の領域を含む核酸分子の使用による核酸配列の多様化に関する。従って、本発明は、多様化される核酸分子、ならびに鋳型領域（ＴＲ）として、および定方向の部位特異的多様化のためにＴＲと協調して作用する核酸分子を提供する。さらに、これらの核酸配列を調製する方法および使用する方法が提供される。
2008508879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の組換え核酸分子または核酸分子の対であって、
ドナー鋳型領域（ＴＲ）に作用可能に連結された可変領域（ＶＲ）を含み、
前記ＴＲは、逆転写酵素コード配列に作用可能に連結され、かつ前記ＶＲの部位特異的変異を指示する鋳型配列であり、かつ
前記単一の分子は、Ｂｖｇ＋指向性ファージ−１（ＢＰＰ−１）バクテリオファージの主要トロピズム決定（ｍｔｄ）遺伝子、ａｔｄ領域、および／またはｂｒｔコード配列の１又は複数の欠失変異のみを含む誘導体ではない、単一の組換え核酸分子または核酸分子の対。
【請求項２】
ＴＲの配列が、前記ＴＲの１又は複数のアデニンヌクレオチドの置換、またはＴＲ中のアデニンによるＶＲ中の１又は複数の非アデニンヌクレオチドの置換、またはＴＲ中の非アデニンヌクレオチドによるＶＲアデニンヌクレオチドの置換に起因する、前記ＶＲ中の配列の不完全な直接的反復である、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
ＶＲが標的分子の結合パートナーをコードする配列の全て又は一部である、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
結合パートナーをコードする配列のすべてをさらに含み、ＶＲが任意に前記結合パートナーをコードする前記配列の３’部分である、請求項３に記載の分子。
【請求項５】
結合パートナーが、細胞表面分子、ホルモン、成長因子もしくは分化因子、受容体、受容体のリガンド、細菌細胞壁分子、ウイルス粒子、免疫因子もしくは免疫寛容因子、またはＭＨＣ分子を結合する、請求項３または４に記載の分子。
【請求項６】
結合パートナーがバクテリオシンである、請求項３または４に記載の分子。
【請求項７】
ＴＲおよびＲＴコード配列が、異種プロモーター、例えばｆｈａプロモーターの制御下で転写される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子または分子の対。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子または分子の対を含む細胞。
【請求項９】
ＶＲを含む第１の核酸分子を、ＴＲがＶＲの部位特異的変異を指示する鋳型配列であるようなＴＲを含む第２の核酸分子に作用可能に連結する工程を含む、請求項１に記載の単一の分子を調製する方法。
【請求項１０】
ＴＲおよびＲＴコード配列を含む核酸分子に異種プロモーター配列を作用可能に連結する工程を含む、請求項７に記載の１つの分子または分子の対を調製する方法。
【請求項１１】
注目の核酸配列の部位特異的変異の方法であって、
請求項１に記載の核酸分子または分子の対を入手する工程、ここで、前記ＶＲは注目の核酸配列を含み、前記ＴＲは注目の配列の不完全または完全な反復であり、
前記ＴＲは配列の部位特異的変異を指示する注目の前記配列に作用可能に連結している鋳型配列であり、そして前記ＴＲは注目の前記配列中の非アデニンヌクレオチドの代わりの１又は複数のアデニンヌクレオチドの置換に起因する不完全な反復であり、またはその逆である、および
注目の前記配列の１又は複数のヌクレオチドの位置が異なるヌクレオチドによって置換されるように、前記核酸分子を細胞中で発現させる工程、
を含む方法。
【請求項１２】
注目の配列の１つより多くのヌクレオチドの位置が置換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
注目の配列が標的分子の結合パートナーの全て又は一部をコードする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
結合パートナーの結合特性が変化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＶＲが結合パートナーをコードする配列の３’部分である、請求項１３または１４または１５に記載の方法。
【請求項１６】
結合パートナーが、細胞表面分子、ホルモン、受容体、受容体のリガンド、細菌細胞壁分子、ウイルス粒子、またはＭＨＣ分子を結合する、請求項１３または１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合パートナーがバクテリオシンまたは細菌ファージ部分である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
ドナー鋳型領域（ＴＲ）および作用可能に連結されたＲＴコード配列を含み、Ｂｖｇ+指向性ファージ−１（ＢＰＰ−１）、Ｂｖｇ-指向性ファージ−１（ＢＭＰ−１）、またはＢｖｇ無差別ファージ−１（ＢＩＰ−１）バクテリオファージからではない、単離された核酸分子。
【請求項１９】
バクテリオファージ、細菌のプロファージ、細菌、またはスピロヘータから単離される、請求項１８に記載の分子。
【請求項２０】
請求項１に記載の核酸分子の複数またはライブラリー。
【請求項２１】
ＶＲがＴＲによって方向付けられる多様化を受けている、請求項２０に記載の複数またはライブラリー。
【請求項２２】
ＩＭＨ配列を同定する方法であって、
生物のゲノム中でＲＴコード配列を同定する工程；
ＲＴ  ＯＲＦの約５ｋｂ中にコード鎖を検索し、およびアデニン−欠損ＤＮＡの１８〜４８ヌクレオチドのストレッチを含むＩＭＨ様配列を同定する工程；ならびに
ａ）密接に関連する推定のＩＭＨのためにゲノムの広さを検索するために推定のＩＭＨ様配列を使用し、ならびにＩＭＨ様配列および推定のＩＭＨ配列に対して５’に位置するＤＮＡ配列を比較して、ＴＲ領域およびＶＲ領域をそれぞれ見い出す工程；または
ｂ）推定のＴＲを同定するためにＩＭＨ様配列に対して５’である１００〜３５０塩基対の長さに位置するＤＮＡの配列を使用し、ならびに推定のＶＲ配列およびＩＭＨ配列を一致させるためにゲノムの広さを検索して、このＴＲ配列およびＩＭＨ様配列の全て又は一部を使用する工程
を含む、方法。
【請求項２３】
ＲＴコード配列が、アミノ酸配列ＩＧＸＸＸＳＱまたはＬＧＸＸＸＳＱの一方または両方を検索することによって同定され、
ＩＭＨ様配列またはＩＭＨ配列が、ＴＣＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、またはＴＴＧＴから選択される保存配列を含み；または
同定されたＴＲ配列およびＶＲ配列が、約１００〜３５０塩基対長の間であり得、かつＴＲ中のアデニン塩基の位置にある違いの大部分と、約８０％より多く相同であるはずである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
注目の核酸配列の部位特異的変異の方法であって、
ドナー鋳型領域（ＴＲ）および可変領域（ＶＲ）を含む核酸分子を入手する工程を含み、前記ＴＲまたはＶＲまたは作用可能に連結される逆転写酵素コード領域は、ビブリオ  ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ＭＬファージ、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バクテロイデス  セタイオタオニクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｎｉｃｒｏｎ）、トレポネーマ  デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはラン藻の多様性生成レトロエレメント（ＤＧＲ）から単離される工程、ならびに
前記ＶＲの１又は複数のヌクレオチド位置が異なるヌクレオチドによって置換されるように、前記核酸分子を細胞で発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２５】
ＤＧＲが、トリコデスミウム  ユリスレウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１、トリコデスミウム  エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃２、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃１、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃２、またはノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）から単離される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
分子が異種結合タンパク質をコードし、かつ産物の結合特性が変化される、請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年８月３日に出願された米国仮特許出願第６０／５９８，６１７号からの優先権の利益を主張するものである（当該米国仮特許出願はその全体が完全に記載されているように本明細書に組み入れられる）。
【０００２】
連邦政府によって資金援助された研究開発の下でなされた発明に対する権利に対する言及
本発明は、両方ともＮＩＨによって与えられた補助金番号ＲＯｌ  ＡＩ３８４１７およびＡＩ０６１５９８、ならびにＵＳＤＡによって与えられた１９９９−０２２９８の米国政府の補助を用いてなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、多様化のための鋳型として作用する配列の領域を含む核酸分子の使用による核酸配列の多様化に関する。従って、本発明は、多様化される核酸分子、指示性の部位特異的多様化のため、および必要な酵素をコードするために鋳型領域（ＴＲ）として作用する核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を調製する方法および使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）バクテリオファージは、宿主細菌についての宿主トロピズムを特定する遺伝子の多様性を生成する。この適合は、転写、逆転写および部位特異的なアデニン特異的な変異誘発を用いる組み込みを合わせる遺伝因子によって産生される。このプロセスに必要なことは、２つの領域（１つはドナーの鋳型領域（ＴＲ）として働くもの、および他方は可変配列情報のレシピエント、可変領域（ＶＲ）として働くもの）の間の情報の逆転写酵素媒介性交換である。
【０００５】
ヒトを含む哺乳動物中で呼吸器感染を引き起こすボルデテラ種は、独特な多様性生成系をコードするバクテリオファージのファミリーのための宿主として働き、この独特な多様性生成系が、付着および引き続く感染のために細菌上で異なる受容体分子をバクテリオファージに使用させている（Ｌｉｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，２０９１−２０９４（２００２）およびＬｉｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｏｐｉｓｍ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６，１５０３−１７（２００４））。ボルデテラ細胞表面は、生物の感染サイクルを調節するＢｖｇＡＳホスホリレーによって媒介される遺伝子発現の複雑なプログラムの結果として高度に変動性である（Ａｃｋｅｒｌｅｙ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｏｔｔｅｒ  Ｐ．Ａ．，＆  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｒｅｇｕｌｏｎ  ａｌｔｅｒｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ−ｈｏｓｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ８０，６１１−６２０（１９９５）；Ｕｈｌ，Ｍ．Ａ．＆  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ａ  ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｔｈｅ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ＢｖｇＡＳ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １５，１０２８−１０３６（１９９６）；Ｃｏｔｔｅｒ，Ｐ．Ａ．＆  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ．Ｉｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｅ．Ｇｒｏｉｓｍａｎ，編  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．６１９−６７４（２０００）；およびＭａｔｔｏｏ，Ｓ．，Ｆｏｒｅｍａｎ−Ｗｙｋｅｒｔ，Ａ．Ｋ．，Ｃｏｔｔｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ６，Ｅ１６８−Ｅ１８６（２００１））。
【０００６】
バクテリオファージ（「ファージ」）ＢＰＰ−１は、細菌の外膜上のファージ受容体、パータクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）（Ｐｒｎ）のディファレンシャルな発現に起因して、病原性のＢｖｇ＋ボルデテラ細菌に優先的に感染する（本明細書中の図１ａ、ならびにＥｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｉ．Ｇ．，Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ，Ｎ．Ｆ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｎ．Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｐ．６９  ｐｅｒｔａｃｔｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８１，９０−９２（１９９６）；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂ．Ｍ．，Ｂｅｅｋｈｕｉｚｅｎ，Ｈ．，Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｏｉ，Ｆ．Ｒ．，ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ，Ｒ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６７，１０５６−１０６２（１９９９）；ならびにＫｉｎｇ，ＡＪ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  １  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｒｔａｃｔｉｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４７，２８８５−２８９５（２００１）を参照のこと）。特徴的な頻度において、ＢＰＰ−１は指向性(tropic)変異体（ＢＭＰおよびＢＩＰ）が生じ、これらはそれぞれ、別個の表面受容体を認識して非病原性のＢｖｇ−細菌に優先的に感染するか、あるいはＢｖｇ状態とは無関係に感染する。このように、これらのウイルス寄生体は、その感染サイクルを横断する際に、それらの標的宿主によって示される動的な表面構造と歩調を合わせるように進化してきた。
【０００７】
上記の文献の引用は、前述のいずれかが関連のある先行技術であることの認可として意図されるのではない。これらの文献の内容に関する日付または提示に関するすべての言及は、出願人に利用可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さについてのいかなる認可も構成しない。
【０００８】
発明の説明
本発明は、特定の細菌に感染する能力を切り換えている素早い指向性切り換えが、ボルデテラバクテリオファージにおいて、ファージゲノム中にコードされている変動性生成カセットによって媒介されるという発見に部分的に基づく（本明細書中図１ｂを参照のこと）。このカセットは、ｍｔｄ遺伝子座の３’末端に存在する１３４ｂｐの可変領域（ＶＲ）中の２３個の部位においてヌクレオチド置換を導入するように機能する。推定上のテールタンパク質であるＭｔｄは、ファージ形態形成および感染性のために必要であり、そしてＭｔｄ中のＶＲの配列は、トロピズム（細菌宿主）特異性を決定する。ボルデテラ細胞表面へのＢＰＰ−１由来ＧＳＴ−Ｍｔｄ誘導タンパク質の結合は、細菌の外表面上のタンパク質パータクチン（Ｐｒｎ）の発現に依存し、親のファージの感染特性と相関する。したがって、図１ｂに示されるカセットは、ＶＲ配列の部位特異的変異、およびその多様化を介するリガンド−受容体相互作用における柔軟性を生成するように機能する。
【０００９】
従って、第１の局面において、本発明は、鋳型領域（ＴＲ）に作用可能に連結されている可変領域（ＶＲ）を含む核酸分子であって、上記ＴＲは上記ＶＲの部位特異的変異を指示する鋳型配列である、核酸分子を提供する。この核酸分子は、天然では一緒に見られない核酸配列、例えば合成（非天然）であり、そして／あるいは異種の供給源から分子生物学及び遺伝子操作の技術を使用することにより接合される配列を含んで成るという意味では組換えのものであってもよい。あるいは、核酸分子は、天然で見られる周囲の生物学的因子又は配列から単離された天然の配列を含んで成るという意味では、単離してもよい。
【００１０】
本発明の核酸分子のＶＲ領域とＴＲ領域の間の作用可能な連結とは、ＶＲ中の配列の、定方向(directional)の部位特異的変異または多様化のための鋳型として働くＴＲの能力をいう。従って、本発明の１つの可能な実施形態において、組換え核酸分子は、ＴＲが、ＶＲ中の部位特異的変異を指示する(direct)ための鋳型配列として働くように、シスで物理的に結合されているドナー鋳型領域（ＴＲ）および可変領域（ＶＲ）を含んでもよい。ＴＲ領域とＶＲ領域の間の分離は、これらは作用可能に連結されたままである限り、任意の距離であってもよい。別の実施形態において、ＴＲおよびＶＲはシスで連結されなくてもよいが、ＴＲはＶＲの部位特異的変異を指示する能力を保持している。従って、ＴＲ領域およびＶＲ領域は、各領域の配列が別々の核酸分子上に存在するように、トランスで作用可能に連結されてもよい。
【００１１】
従って、本発明はまた、核酸分子の対を提供し、この対の第１の分子は、この対の第２の分子上でＴＲに作用可能に連結されたＶＲを含む。本発明によって提供されるように、ＴＲは、上記ＶＲの部位特異的変異を指示する鋳型配列である。核酸分子は、これらが天然に一緒に見い出されない核酸配列、例えば、異種供給源から分子生物学および遺伝子操作技術の使用によって一緒にされる配列を含んで成ることがあるという意味においては任意に組換えである。当然ながら、一緒にされる配列は、合成の（天然には存在しない）配列、または天然に存在する配列由来であるが、天然にともに見い出される周囲の生物学的因子または配列から単離された配列であってもよい。
【００１２】
本発明の実施形態において、ＶＲおよびＴＲはトランスにあり、ＴＲは、以下に記載際されるように、逆転写酵素（ＲＴ）活性をコードする配列に作用可能に連結される。このようなものとして、ＶＲおよび逆転写酵素をコードする配列はまた、互いに対してトランスで存在する。ある実施形態において、ＴＲおよびＲＴ活性をコードする配列は、互いに対してシスであり、任意に、同じ生物から生じるＴＲおよびＲＴのコード配列を伴う。他の実施形態において、ＴＲおよびＲＴのコード配列は、ＴＲが作用可能に連結されたＶＲ中でＲＴ媒介性変化をなお指示するように作用可能に連結されたままでありながら、互いに対してトランスであってもよい。当然、ＴＲおよび／またはＲＴコード配列は、生物中の天然に存在するＴＲに対して、以下に記載されるように変化されてもよい。代替として、ＴＲおよびＲＴコード配列は、それらが異なる生物から生じるか、もしくは異なる生物から単離されるか、または一方もしくは他方もしくは両方が合成性（天然に存在するのではない）または合成される（単離されるのではない）という点で、互いに対して異種であってもよい。合成配列には、天然に存在する配列から誘導されるものが含まれる。
【００１３】
本発明はまた、ボルデテラバクテリオファージのＶＲの変動性の部位が、それ自体が指向性の切り換えのために不変かつ必須である、一般的な相同鋳型領域ＴＲ中のアデニン残基に一致するという発見に部分的に基づいている。本発明はまた、ＴＲの（翻訳的に）サイレントな（または「同義の」）置換が切り換えの間にＶＲに伝達され、ＴＲが変動性についての生の配列情報を供給するという発見に部分的に基づいている。
【００１４】
従って、本発明の組換え核酸分子は、ＴＲ中に存在するアデニン残基がＶＲ配列中の対応する位置の変異誘発または多様化を生じるように、ＴＲ領域がＶＲと同一である最初の分子を含む。別の言い方をすれば、本発明は、ＶＲ領域中の多様化に際して、ＴＲ中においてもまた見い出されるＶＲ中の１又は複数のアデニン残基が、ＴＲ配列中の変化を伴わずに、シトシン、チミンまたはグアニンである別のヌクレオチドに変異されるように、上記ＴＲの配列が上記ＶＲ中の配列の完全な直接的反復である組換え核酸分子を提供する。
【００１５】
あるいは、本発明は、ＴＲ領域がＶＲの多様化を指示するように、ＴＲ領域およびＶＲ領域が同一ではない組換え核酸分子を提供する。このような多様化は、ＴＲ中の対応するアデニン残基の存在に基づいて、ＶＲ中のヌクレオチド残基の変異誘発を含んでもよい。
【００１６】
理論によって束縛されることなく、および本発明の理解を改善するために提示するが、この能力は、ＴＲ  ＲＮＡ転写物のアデニン残基の反対側に組み込まれたヌクレオチドが得られる一本鎖ｃＤＮＡ中でランダム化される間に、ＴＲ転写物が逆転写のための鋳型として働く、逆転写に基づくメカニズムによって媒介される可能性がある。次いで、ＴＲ由来の変異誘発されたｃＤＮＡ配列は、「変異原性ホーミング」と呼ばれるプロセスにおいてＶＲの全て又は一部を置換するために使用される。このメカニズムについての裏付けは、ボルデテラバクテリオファージ中で、逆転写酵素（ＲＴ）をコードするｂｒｔ遺伝子座が、多様性の生成のために必須であるという発見によって提供される。さらなる裏付けは、変異誘発が、ＴＲにおけるアデニンによって占められる部位において独占的に起こるという発見によって提供される。別のヌクレオチドとのＴＲ中のアデニンの人工的置換は、ＶＲ中の対応する位置でのバリエーションを消滅するのに対して、異所性のアデニンの導入は、続いて、ＶＲ中の不均一な新規な部位を産生する。
【００１７】
従って、さらなる局面において、本発明は、ＶＲに作用可能に連結されたＴＲ中のアデニン残基の存在を介してＶＲ配列の多様化を提供する。本発明は、ＴＲ中に存在するアデニン残基がＶＲ配列中の対応する位置の変異誘発または多様化を生じるように、ＴＲ領域が、ＶＲ中に見い出されない１又は複数のアデニン残基を含む核酸分子を提供する。別の言い方をすれば、本発明は、上記ＶＲ中の１又は複数の非アデニン残基の代わりの１又は複数のアデニンの置換に起因して、上記ＴＲの配列が上記ＶＲ中の配列の不完全な直接反復である組換え核酸分子を提供する。これは、アデニン媒介多様化と称されることがある。
【００１８】
あるいは、ＶＲと比較して、ＴＲは、正確な読み枠を維持するために、さらなるヌクレオチドの挿入を任意に伴う、アデニンの１又は複数の挿入を含む。非限定的な例として、３つのヌクレオチド群（１又は複数のアデニンを含む）が、ＶＲへの変動性コドンの挿入を指示するために、ＴＲにインフレームで挿入されてもよい。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、ＶＲに作用可能に連結されたＴＲ中の他のヌクレオチド残基の変化を介してＶＲ配列の多様化を提供する。非限定的な例として、本発明は、作用可能に連結されたＶＲからの対応するするコドンの欠失を指示するため使用される１又は複数のコドンの欠失を含むＴＲを提供する。別の例として、ＴＲは、作用可能に連結されたＶＲへの挿入されるコドンの挿入を指示するために１又は複数のコドンの挿入を含む。本発明のＴＲはまた、ＴＲが、ＶＲの読み枠を変化させるために、作用可能に連結されたＶＲと比較して、１又は複数のヌクレオチドの欠失または挿入を含むものを含む。作用可能に連結されたＶＲ中での欠失または挿入を指示するＴＲ中のヌクレオチドの欠失または挿入が同時に使用されてもよく、例えば、ＴＲの１つの部分がヌクレオチドの欠失を指示するために使用されるのに対して、ＴＲの別の部分はヌクレオチドの挿入を指示するために使用される。これは、欠失／挿入媒介多様化と呼ばれてもよい。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、ＴＲ中の残基の非アデニン置換に基づく多様化を提供する。従って、ＴＲ中のヌクレオチドは、置換が作用可能に連結されたＶＲ中の対応する位置に移動されるように、非アデニン残基で置換されてもよい。非限定的な例として、ＴＲ中のシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換は、作用可能に連結されたＶＲ中の同じＣからＧへの置換を生じるために使用することができる。これは、置換媒介多様化と呼ばれてもよい。
【００２１】
本発明はまた、ＶＲの配列を変化させるために、任意の組み合わせにおけるアデニン媒介、欠失／挿入媒介、および／または置換媒介多様化の使用を提供する。
【００２２】
本発明のある核酸分子において、ＲＴコード領域、および／またはａｔｄ領域（もしくはｂｂｐ７領域）はまた、ＴＲの５’末端の近傍において存在してもよい。これらの領域は、ＴＲ領域に関してシスで存在してもよい。従って、ＶＲおよびＴＲが違いにトランスである本発明の実施形態において、ａｔｄ領域は、ＶＲに対してトランスであってもよい。他の実施形態において、ａｔｄ領域は存在せず、または機能的に類似した配列の領域、例えば、ＴＲ領域および作用可能に連結されたＲＴコード配列の発現を調節または指示するプロモーター配列によって置換される。
【００２３】
上記に説明したように、本発明の多様性生成系の１つの特性は、変異誘発に付随する配列情報の定方向の移動である。従って、１つのＴＲは、１又は複数の作用可能に連結されたＶＲ中の配列の変化を指示することが可能である。ＶＲは高度に変動性であるが、作用可能に連結されたＴＲは、ＶＲにコードされたタンパク質分子の基本的な構造的な完全性を保持するための情報を含む配列情報の破損していない供給源として維持される。本発明はさらに、配列情報のＴＲからＶＲへの移動の方向を決定する際に機能する、核酸配列設計ＩＭＨ（変異原性ホーミングの開始）の同定に基づく。
【００２４】
本発明のある実施形態において、ＩＭＨ配列は、ボルデテラバクテリオファージ中の各領域の３’末端に位置し、かつＧ残基およびＣ残基からなる１４ｂｐセグメント、続いて２１ｂｐ配列を含むものである。ＶＲの３’末端におけるＩＭＨ配列は、対応するＴＲ領域中の配列から５位で異なる（本明細書中図１ｃを参照のこと）。本発明はまた、これらの多型がホーミングの方向性を決定するシス作用性部位の一部を形成することの実証に部分的に基づく。この実証は、ＴＲの３’末端と結合した対応するＩＭＨ様配列（ＢＰＰ−３’ＴＲ）で２１ｂｐ  ＶＲ  ＩＭＨ配列を置換することによって作製された。結果は指向性切り換えの除去であった。ＶＲ  ＩＭＨ配列についての対応するＴＲ  ＩＭＨ様配列の逆置換は、切り換えに影響を与えなかった。その代わりに、ＶＲとＴＲの両方の３’末端におけるＶＲ  ＩＭＨ配列の配置は、驚くべきことに、ＶＲにおけるのと同様に、ＴＲにおけるアデニン依存性変動性の生成を生じ（本明細書中図１ｄを参照のこと）、この事象は以前には野生型ファージにおいては観察されなかった。変動性は、親のＴＲ中のアデニン残基によって占められる位置で単独で起こり続け、このことは、基本的な変異誘発のメカニズムが保持されたことを示した。さらに、異なるＢＰＰ−３’ＶＲファージ中で観察される変異のパターンは、ＴＲがＴＲとＶＲの両方の変動性の唯一の供給源であったことを示した（本明細書中図１ｄを参照のこと）。
【００２５】
これらの観察は、ＩＭＨと称される配列が、ＴＲからＶＲへの配列情報の移動の方向を決定することを補助することを実証する。これらはまた、ＴＲの破損を妨害するためにＴＲの３’末端において対応するＴＲ  ＩＭＨ様配列の使用を支持するのに対し、ＩＭＨは、ＶＲへの変動性を指示する。さらに、検出分析は、ＶＲ中、情報移動の５’境界が、ＶＲとＴＲの間の相同性の程度によって確立されることを示した。
【００２６】
従って、本発明の組換え核酸分子は、ＶＲの３’末端に位置するＩＭＨ配列およびＴＲの末端にＩＭＨ様配列を含んでもよい。あるいは、この分子は、ＴＲの配列がまた「超多様性」生成系を生じるように変化され得るように、ＶＲとＴＲの両方の末端でＩＭＨ配列を含んでもよい。
【００２７】
多様化される注目の配列（または「所望のＶＲ」）が必要なＴＲ領域に作用可能に連結されない本発明の実施形態において、ＩＭＨ配列は、所望のＶＲの３’に作用可能に配置することができ、そのＩＭＨ様３’−領域を有する適切なＴＲへの作用可能な連結が続く。このような系の非限定的な例は、細胞のゲノム配列の全て又は一部である所望のＶＲの場合に見られ、適切なＩＭＨの挿入ならびに適切な対応するＩＭＨ様領域を有し、シス連結されたＲＴコード配列を任意に有するコンストラクトを含むＴＲの導入は、所望のＶＲを多様化するために使用される。ＴＲは、単に、多様化される所望のＶＲ配列の直接的な反復であってもよく、またはＴＲ中に存在するアデニンを介して変異誘発されてもよい。あるいは、ＴＲは、多様性が所望されるＶＲの特定の部位に対応する位置での異所性のアデニン、欠失／挿入、および／または置換を含んでもよい。ＴＲとＶＲの間の相同性の長さは、多様化される所望のＶＲを機能的に規定するために使用することができる。
【００２８】
本発明の所望のＶＲは、本発明の使用による変異誘発または多様化のための目的の任意の核酸配列であってもよい。ある実施形態において、配列は、標的分子の結合パートナーをコードする配列の全て又は一部である。標的分子は、本発明を実施する当業者に対して目的である任意の細胞因子またはその部分であってもよい。非限定的な例には、ポリペプチド、細胞表面分子、炭水化物、脂質、ホルモン、成長または分化因子、細胞受容体、受容体のリガンド、細菌タンパク質または表面成分、細胞壁分子、ウイルス粒子、免疫または免疫寛容因子、ＭＨＣ分子（例えば、クラスＩまたはＩＩ）、腫瘍細胞中または腫瘍細胞上で見い出される腫瘍抗原、ならびに当業者によって所望され、および／または本明細書に記載されるような他のものが含まれる。結合パートナー（所望のＶＲによって少なくとも部分的にコードされる）は、発現の際に、例えば、生理学的条件または実験室（インビボ、インビトロ、または培養中）条件下で、標的分子に結合する任意のポリペプチドであり得る。
【００２９】
本発明のある実施形態において、結合パートナーは、バクテリオシン（ビブリオシン、ピオシン、もしくはコリシンを含む）、バクテリオファージタンパク質（宿主特異性を決定するテール成分を含む）、キャプシドもしくは表面膜成分（生理学的、薬理学的、もしくは薬学的特性を決定するものを含む）、細胞表面因子もしくは同定された薬物もしくは診断的な標的分子のためのリガンド、または所望されおよび／もしくは本明細書に記載される他の分子である。
【００３０】
結合パートナーについてのコード領域の任意の部分、またはすべては、所望のＶＲとして使用することができる。しかし、本発明のある実施形態において、所望のＶＲは、上記結合パートナーをコードする上記配列の３’部分である。コード配列の３’部分は最後のコドンで終了する。本発明の他の実施形態において、所望のＶＲは、多様化されるコード配列の最後のコドンの約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、または３５０以上以内のコドンに配置される。別の言い方をすれば、所望のＶＲは、コード領域の最後のヌクレオチドから、約２０、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約９００、約９５０、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、または約３０００以上のヌクレオチドを含んでもよい。ある実施形態において、ＩＭＨは、ＶＲの翻訳された部分の一部ではなく、それ自体、任意にイントロンであり得る。別の言い方をすれば、本発明のある実施形態は、転写されるが翻訳はされず、または転写されないか翻訳されるＩＭＨを提供するのに対して、ＶＲおよびＶＲを含むより大きな配列が転写および翻訳され、ならびにポリペプチドをコードしてもよい。
【００３１】
さらなる実施形態において、結合パートナーは、それが別のポリペプチドを含むキメラタンパク質として産生されるように、融合タンパク質の一部であってもよい。融合タンパク質の他のポリペプチドメンバーは、結合パートナーに対して異種であってもよい。あるいは、これは、融合タンパク質が天然において見い出されない組換え分子であるように、同じ結合パートナーの別の部分であってもよい。
【００３２】
他の実施形態において、部位特異的変異のための所望のＶＲは、翻訳されない、および任意に転写されない調節領域である。本発明は、このような調節配列を多様化させてそれらの機能を修飾するために利用されてもよい。５’調節エレメントの場合において、非限定的な例として、本発明は、発現をより強力に（例えば、より強力なプロモーター）またはより強力でなく（例えば、より弱いプロモーター）指示する調節領域を誘導するために使用されてもよい。あるいは、調節領域は、調節に対してそれらの感受性を増加または減少するように（例えば、より密接にまたはより密接ではなく）誘導体化されてもよい。３’調節エレメントの場合において、本発明は、発現されたＲＮＡ分子の安定性を増加または減少する領域を誘導するために使用されてもよい。他の調節配列は、同様に多様化されてもよい。
【００３３】
上記のように、本発明はまた、天然に存在する配列から誘導される単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子は、ドナー鋳型領域（ＴＲ）および可変領域（ＶＲ）を含むように記載されてもよく、上記ＴＲは、上記ＶＲの部位特異的変異を指示するために上記ＶＲに作用可能に連結された鋳型配列である。これらの単離された核酸分子は、ＶＲおよびＴＲを含むコード配列、ならびに異種系中でのＶＲの部位特異的変異を指示するために必要である他の構成要素を含んでもよい。天然に存在する配列からのさらなる配列の非限定的な例は、ＲＴ活性をコードするもの、およびＴＲからＶＲへの配列情報の移動に対する方向性を提供するためにＩＭＨとして機能するもの、またはＴＲ配列中の変化を妨害もしくはその頻度を減少するためのＩＭＨ様配列である。これらの他の構成要素を有するこれらのＶＲおよびＴＲ領域を含む分子は、本発明の多様性生成レトロエレメント（ＤＧＲ）と呼ばれる。
【００３４】
これらの単離された核酸分子は、本発明の実施における使用のためのさらなるＩＭＨ配列、ＲＴコード領域、およびａｔｄ領域の供給源として働いてもよい。単離された核酸分子の非限定的な例には、本明細書の図２に示されるものが含まれる。これらには、ビブリオ  ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ＭＬファージ、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バクテロイデス  セタイオタオニクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｎｉｃｒｏｎ）、トレポネーマ  デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）から単離された分子、またはラン藻からのＤＧＲが含まれる。このようなラン藻の非限定的な例には、トリコデスミウム  エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１、トリコデスミウム  エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃２、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０  ＃１、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０  ＃２、またはノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）が含まれる。図２に図示される関連配列は、すべて公的に利用可能であり、かつ当業者には利用可能である。
【００３５】
ある実施形態において、本発明は、ドナー鋳型領域（ＴＲ）および作用可能に連結されたＲＴコード配列を含む単離された核酸分子を提供する。このような分子は、好ましくは、Ｂｖｇ＋指向性ファージ−１（ＢＰＰ−１）、Ｂｖｇ−指向性ファージ−１（ＢＭＰ−１）、またはＢｖｇ無差別(indiscriminate)ファージ−１（ＢＩＰ−１）バクテリオファージからではない。単離された分子は、バクテリオファージ、細菌のプロファージ、細菌、またはスピロヘータからであってもよい。
【００３６】
当然、本発明の核酸分子を含む細胞もまた提供される。このような細胞は、原核生物性または真核生物性であってもよく、本明細書に記載のように、部位特異的変異をサポートすることができる。このような変異誘発をサポートできない細胞は、本発明の核酸分子を複製するために、または引き続く使用のためのコードされたタンパク質分子を生成するためになおも使用されることがある。真核生物細胞の場合、本発明の核酸は、真核生物環境におけるそれらの使用のために修飾されてもよい。これらの修飾は、真核生物性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列の使用；ｂｒｔの翻訳のために核から細胞質までのＲＮＡ転写物の輸送を容易にするためのＴＲ−ｂｒｔ中でのイントロン配列の導入、ならびに、ＲＴポリペプチドが、真核生物の核へのその輸送、および／またはその中への保持を指示するためにＮＬＳを含むように、ＲＴコード配列の一部としての核局在化シグナル（ＮＬＳ）コード配列の存在を含む。ある実施形態において、ＮＬＳは、ＲＴポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に局在化される。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、本発明のＶＲに存在する注目の核酸配列の部位特異的変異の方法を提供する。このような方法は、ＶＲが注目の上記核酸配列を含み、かつＴＲがＶＲの直接的反復または注目の配列である、本明細書に記載されるような核酸分子の使用を含む。従って、変異誘発は、ＴＲ中に存在するアデニン残基に限定される。あるいは、同一でないＴＲ、例えば、異所性アデニン残基、挿入、欠失、または置換を含むＶＲまたは注目の配列の反復が使用されてもよい。この方法はさらに、ＶＲまたは注目の配列の１又は複数のヌクレオチドの位置が異なる残基によって置換されているように、細胞中のこのような核分子の発現を含む。
【００３８】
本発明のこのような方法は、ＶＲまたは注目の配列の１つより多くのヌクレオチドの位置が置換されることを可能にするように実施されてもよい。上述のように、ＶＲまたは注目の配列は、標的分子の結合パートナーの全て又は一部（例えば、３’位置）をコードしてもよい。本発明のこれらの方法は、当然、標的分子とのその相互作用が変化するように、結合パートナーの結合特性を変化させるために使用されてもよい。このような変化の非限定的な例には、結合パートナーの特異性または結合親和性を変化させることが含まれる。これらの方法は、結合パートナーが異なる標的分子を結合するように、特定の結合パートナーを修飾するために使用されてもよい。本発明のこの局面の非限定的な例は、ファージ指向性決定因子が注目の異種細菌表面構成要素を結合するような、ファージ指向性決定因子の修飾である。従って、このような誘導体を発現するために作製されるバクテリオファージは、異種細菌に感染性である。これは、前駆体の指向性決定因子を発現するファージによって通常は影響されない特定の細菌株に結合すること、これに感染すること、および／またはこれを殺傷すること（例えば、溶解または膜電位の散逸を介して）が可能であるファージまたはファージの部分を作製する手段として有利に使用されてもよい。本発明はまた、親のファージまたは任意のファージによって共通して結合されず、または感染されない標的分子、種、または株を含めるために、バクテリオファージの宿主範囲、またはその一部またはその部分の結合の範囲を拡大または拡張する手段として使用されてもよい。別の非限定的な例は、結合または酵素活性を回復または変化させるため、例えば、ホスホトランスフェラーゼ活性の回復のための配列の修飾である。
【００３９】
本明細書に記載のように、既知のバクテリオファージタンパク質の部位特異的変異はまた、本明細書に記載されるようなＶＲおよびＴＲの天然に存在する組み合わせを含む単離された核酸分子の使用によって実施されてもよい。このような分子の非限定的な例には、ビブリオ  ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ＭＬファージ、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バクテロイデス  セタイオタオニクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｎｉｃｒｏｎ）、トレポネーマ  デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはラン藻からのＤＧＲからのものが含まれる。このようなラン藻の非限定的な例には、トリコデスミウム  ユリスレウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１、トリコデスミウム  エリスラエウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃２、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃１、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃２、またはノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）が含まれる。
【００４０】
さらなる局面において、本明細書に記載のように、本発明は、上記ＴＲが上記ＶＲの部位特異的変異を指示する鋳型配列として作用するように、上記ＴＲを含む第２の核酸分子に、上記ＶＲを含む第１の核酸分子を作用可能に連結することによって、組換え核酸分子を調製する方法を提供する。ＶＲとＴＲの間でのシスでの連結の場合において、第１および第２の核酸分子は、本明細書に記載されるような操作方法で、一緒に共有結合的にライゲーションされる。トランスでの連結の場合において、第１および第２の核酸分子は、１つの操作方法において、同じ細胞環境または部位特異的変異のためのインビトロ反応混合物中に配置される。
【００４１】
なお別の局面において、本発明は、さらなるＲＴコード配列、ＩＭＨおよびＩＭＨ様配列、および対応するＴＲおよびＶＲ配列を同定する方法を提供する。この方法は、他の生物におけるさらなるＲＴコード配列を同定するために、本発明のＲＴ活性の同定された結合モチーフの使用に基づく。次いで、推定のさらなるＲＴコード配列の近傍の領域が、１）推定のＴＲ配列に連結され、または２）ＶＲ連結されたＩＭＨ配列を見い出すために使用される、すぐ近くのＩＭＨ型配列について検索される。
【００４２】
本発明の１又は複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００４３】
本発明を実施する特定の形態の詳細な説明
本発明は、ＴＲ中でアデニンによって占められる位置における注目の配列の多様化を指示する、ＶＲと相同反復（ＴＲ）との間の作用可能な連結において、全体でまたは部分的にＶＲである注目の配列の部位特異的変異における核酸分子およびそれらの使用のための方法を提供する。本発明によって生成することができる多様性の程度は、ＶＲにおいて置換を指示することが可能であるアデニンの位置の数と等しくはない。その代わりに、ＴＲ中の各アデニンは、ＶＲ中の３つの異なるヌクレオチド置換をその位置で生じることができ、その多くはＶＲによってコードされる対応する位置において置換されたアミノ酸を生じる。非限定的な例として、本発明の実施における２３個のアデニンヌクレオチドの存在は、１０12個を超える別個のポリペプチド配列を生成することが理論的に可能である。
【００４４】
従って、本発明は、対応するＶＲにおいて変異誘発を指示するための、本発明の所与のＴＲにおいて２３個までまたはそれ以上のアデニンヌクレオチドの存在を提供する。アデニン残基の存在は、ＴＲ中での天然の存在、または本明細書に記載されるようなＴＲへの意図的な挿入もしくは置換に起因し得る。ＴＲ中での天然に存在するアデニンヌクレオチドの場合において、変異誘発が起こることが許容されてもよく、または変異誘発は、コードされるアミノ酸を変化させることがない、アデニンヌクレオチドから非アデニンヌクレオチドへの置換（サイレント置換）によって回避されてもよい。意図的な挿入または置換の場合において、本発明は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個以上のアデニンヌクレオチドのＴＲへの導入を提供する。
【００４５】
本明細書に記載のように、本発明は、鋳型領域（ＴＲ）に作用可能に連結されている可変領域（ＶＲ）を含む、組換えおよび単離された核酸分子を提供し、ＶＲおよびＴＲ配列は同一分子中または別個の分子中にあり、上記ＴＲは、上記ＶＲの部位特異的変異を指示するために上記ＶＲに作用可能に連結されている鋳型配列である。しかし、好ましくは、この分子は、Ｂｖｇ＋指向性ファージ−１（ＢＰＰ−１）バクテリオファージの主要トロピズム決定（ｍｔｄ）遺伝子、ａｔｄ領域、および／またはｂｒｔコード配列の１又は複数の欠失変異のみを含む誘導体ではない。
【００４６】
ＶＲ領域およびＴＲ領域は、本明細書に記載のように、物理的に、かつシスで作用可能に連結され、またはトランスで作用可能に連結されてもよい。シスで連結される場合、２つの領域間の分離は、約１００塩基対以下から約１２００塩基対以上の範囲であり得る。シスまたはトランス配置で結合される場合、ＴＲおよび作用可能に連結されたＲＴコード配列の発現は、内因性または異種プロモーターの制御下であり得る。トランスで結合される場合、ＴＲおよび作用可能に連結されたＲＴコード配列の発現は、内因性または異種の、調節可能なプロモーターの制御下であり得る。
【００４７】
本発明の核酸分子はまた、ＴＲ領域とシスであるＲＴコード配列を含んでもよい。ＲＴコード配列の非限定的な例には、本明細書において提供されるような、ビブリオ  ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ）ＭＬファージ、ビフィドバクテリウム  ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バクテロイデス  セタイオタオニクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｎｉｃｒｏｎ）、トレポネーマ  デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）からのもの、またはラン藻、例えば、トリコデスミウム  ユリスリスム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｉｓｍ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属、またはノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）からのＤＧＲが含まれる。これらの供給源からの関連するＲＴコード配列は、すべて公的にアクセス可能であり、当業者に利用可能である。加えて、ある核酸分子は、ＴＲのすぐ５’にａｔｄ領域（またはｂｂｐ７領域）を含んでもよい。理論によって束縛されることはなく、かつ本発明の理解を改善するために提供されるが、ａｔｄ領域は、ＴＲの転写を調節する際に関与すると考えられており、したがって、異種プロモーターの使用によって増強されてもよい。
【００４８】
異種プロモーターの使用を含む本発明の実施形態において、このプロモーターは、使用される条件下でＴＲおよびＲＴコード配列を発現するために適切である任意のものであり得る。非限定的な例として、原核生物細胞がＶＲ領域およびＴＲ領域とともに使用される場合、プロモーターは、原核生物細胞中での使用のために適切な任意のものであり得る。非限定的な例には、線維状赤血球凝集素プロモーター（ｆｈａＰ）、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、およびａｒａＢＡＤプロモーターが含まれる。条件が真核生物細胞の条件である場合、プロモーターの非限定的な例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト伸長因子−１Ｅプロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター；および酵母については、Ｇａｌ  １１プロモーターおよびＧａｌ  １プロモーターが含まれる。当然、ＶＲは、存在する場合、内因性プロモーターの制御下に置かれたままであることもあり、または原核生物細胞が使用されるか、もしくは真核生物細胞が使用されるかに依存して、上記に列挙したものもしくは他のものから独立して選択される別の異種プロモーターの制御下にあってもよい。したがって、本発明の実施において無細胞系が使用されるならば、プロモーターは、使用されるＲＮＡポリメラーゼのような細胞の転写構成成分の供給源に基づいて選択される。
【００４９】
本発明の核酸はまた、ＩＭＨ配列またはその機能的アナログを含んでもよい。ＩＭＨの機能は上文に記載されており、本発明はさらに、天然に存在するか、または合成であるかに関わらず、さらなる機能的に類似の配列の同定、単離、および使用を提供する。天然に存在する機能的アナログの場合において、これらは、本発明の実施において、異種ＶＲおよびＴＲ配列とともに使用されてもよい。
【００５０】
本発明の実施における使用のためのＩＭＨおよびＩＭＨ様配列の非限定的な例には、以下の表において示されるものが含まれる。ＩＭＨまたはＩＭＨ様配列は、３’末端を通してＧＣリッチ領域を含んでもよい。
【００５１】
【表１】
2008508879.tif 000003
【００５２】
【表２】
2008508879.tif 000004
【００５３】
別の局面において、本発明は、さらなるＲＴコード配列、ＩＭＨおよびＩＭＨ様配列、ＴＲ配列、およびＶＲ配列を同定する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＩＧＸＸＸＳＱまたはＬＧＸＸＸＳＱを含む保存性ヌクレオチド結合部位モチーフの一方または両方の存在について配列を検索することによって関連するＲＴコード配列を同定する方法を提供し、「Ｘ」は任意の天然に存在するアミノ酸を表す。配列情報を検索するための任意の適切な方法論が使用されてもよい。非限定的な例には、ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いてタンパク質配列データベースを検索することを含む。
【００５４】
本発明はまた、ＩＭＨ配列を同定する方法を提供し、上記方法は、生物のゲノム中でＲＴコード配列を同定する工程、任意に、上記のように、ＲＴ  ＯＲＦの約５ｋｂ以内でコード鎖を検索する工程、およびアデニン欠損ＤＮＡの１８〜４８ヌクレオチドストレッチを含むＩＭＨ様配列を同定する工程、ならびに、
ａ）密接に関連する推定のＩＭＨのためにゲノムの広さを検索するために推定のＩＭＨ様配列を使用し、ならびにＩＭＨ様配列および推定のＩＭＨ配列に対して５’に位置するＤＮＡ配列を比較して、相同なＴＲ領域およびＶＲ領域をそれぞれ見い出す工程；または
ｂ）推定のＴＲを同定するためにＩＭＨ様配列に対して５’である１００〜３５０塩基対の長さに位置するＤＮＡの配列を使用し、ならびに推定のＶＲ配列およびＩＭＨ配列を一致させるためにゲノムの広さを検索して、このＴＲ配列およびＩＭＨ様配列の全て又は一部を使用する工程を含む。
【００５５】
潜在的なＶＲ領域は、コード配列または推定のコード配列中に存在する場合、さらなる分析のために任意に選択されてもよい。潜在的なＴＲは、ＲＴコード配列の近傍の遺伝子間領域中の位置に基づいて任意に選択されてもよい。当然、潜在的なＴＲ領域およびＶＲ領域の配列アラインメントはまた、特に配列の違いが主としてアデニンにおいて起こる場合に、それらの作動性連結を確認するために使用されてもよい。非限定的な例として、これらの配列は、ＴＲ中のアデニン塩基の位置において存在する差異の大部分と、約８０％より多く、約８５％より多く、約９０％より多く、または約９５％より多く相同である。さらなる任意選択として、ＴＲ配列またはＶＲ配列の同定は、約１００〜約３５０塩基対長またはそれ以上である配列の検索または同定を含んでもよい。
【００５６】
ＩＭＨ様またはＩＭＨ、配列を同定することに関して、可能なＴＲ領域およびＶＲ領域の３’末端におけるＴＣＧＧ、ＴＴＴＴＣＧ、またはＴＴＧＴから選択される保存性配列についての検索が使用されてもよい。図９は、ＴＲとＶＲの対の間で変動する最も３’のヌクレオチドの後のいくつかの保存性配列パターンを示す。
【００５７】
保存性配列パターンは、ＴＲとＶＲの対の間で変動する最も３’のヌクレオチドの後として同定されてきた。ＶＲ領域の後の領域（ＶＲ含有遺伝子の終止コドンの位置までまたはそこをわずかに過ぎて）の比較は、以下を含むいくつかの共通の特徴を明らかにした：１）領域の長さが約１８〜約４４ヌクレオチドの範囲（約３８の平均長）である；２）領域がアデニンヌクレオチドを全く含まないか、またはほとんど含まない；３）ほとんどすべて（１９／２３）がＴＣまたはＴＴで開始し、モノ−およびジ−ヌクレオチドが豊富なサブ領域のランが続く；４）すべてが３’末端の近傍に１又は複数のミスマッチを有する（９ヌクレオチドストレッチ中に５個までのミスマッチ）；および５）大部分（１３／２３）がＴＣＴＴモチーフを有し、その他（５／２３）は領域の３’末端の近傍に類似のモチーフを有する。従って、本発明のＩＭＨおよびＩＭＨ様配列は、これらの特徴の１つ以上を有するように設計されてもよい。
【００５８】
上記の方法は、ＤＧＲおよびＩＭＨを同定するためにバイオインフォマティクス的なアルゴリズムの型であり得る。当業者によって認識されるように、上記の方法は、コンピュータ読み取り可能な媒体（例えば、ソフトウェア）の型で埋め込まれてもよい。
【００５９】
１つの代替案として、ＢＰＰ１  ｂｒｔタンパク質配列は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用してタンパク質データベース中でホモログについて検索するために使用されてもよい。以前に同定された、推定のＤＧＲからのＢｒｔホモログは、第２の反復検索のために使用されてもよく、トップヒットは、ＲＴコード配列の近傍でＴＲ配列およびＩＭＨ様配列についてさらに試験されてもよい。ある実施形態において、密接に関連するＲＴ遺伝子を有する生物のゲノム中のＲＴコード配列からの約２０００〜５０００ｂｐ上流および下流のゲノム領域は、直接的反復、例えば、＞５０ｎｔ長の≦４回反復で検索されてもよい。潜在的なＴＲ領域およびＶＲ領域は、上流遺伝子の３’末端およびＲＴ遺伝子の上流の遺伝子間領域に反復が存在する場合に同定される可能性がある。推定のＴＲ領域およびＶＲ領域の配列アラインメントは、配列の違いが主としてアデニンにおいて存在する場合に、推定のＤＧＲを同定した。推定のＴＲ領域およびＶＲ領域の３’末端は、上記のように、保存性のＩＭＨおよびＩＭＨ様配列モチーフについて試験してもよい。
【００６０】
本発明はさらに、ＴＲおよびＶＲの変動しない３’末端のアラインメントから誘導された少なくとも２つのパターンのクラスを提供する。ラン藻の配列は高度に類似するサブグループを形成するのに対して、他のＴＲ／ＶＲ対は、類似しない内部配列を有する領域の末端の一方または両方で保存性配列モチーフを有する（図１５を参照のこと）。終止コドンは、各領域中の保存性配列モチーフから下流の変動する距離に配置された。
【００６１】
本発明に従う部位特異的変異のための配列の非限定的な例は、標的分子の結合パートナーの全て又は一部をコードするものである。結合パートナーの非限定的な例には以下が含まれる：アミリン、ＴＨＦ−γ２、アドレノメデュリン、インスリン、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、エキスタチン、ヒト成長ホルモン、ＭＭＰ、フィブロネクチン、インテグリン、カルモジュリン、セレクチン、ＨＢＶタンパク質、ＨＢＶ抗原、ＨＢＶコア抗原、トリプターゼ、プロテアーゼ、脂肪細胞プロテアーゼ、Ｓｒｃ、Ｌｙｎ、サイクリンＤ、サイクリンＤキナーゼ（Ｃｄｋ）、ｐ１６INK4、ＳＨ２／ＳＨ３ドメイン、ＳＨ３アンタゴニスト、ｒａｓエフェクタードメイン、ファルネシルトランスフェラーゼ、ｐ２１WAF1、Ｍｄｍ２、ビンキュリン、補体成分、Ｃ３ｂ、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦα受容体、抗体（Ａｂ）およびモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、ＣＴＬＡ４  ＭＡｂ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｌ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロン、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＣＳＦ、インターロイキン受容体、ＩＬ−１受容体、ｃ−ＭｐＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ受容体、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４受容体、Ｂ細胞受容体、ＣＤ３０−Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、レプチン、ＣＴＬＡ−４、ＰＦ−４、ＳＤＦ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ。
【００６２】
本発明のある実施形態において、結合パートナーは、バクテリオシン（ビブリオシン、ピオシン、またはコリシンを含む）、バクテリオファージタンパク質（宿主特異性を決定するテール成分を含む）、キャプシドまたは表面膜成分、細胞表面因子についてのリガンド、または同定された薬物もしくは診断用標的分子である。
【００６３】
さらなる実施形態において、結合パートナーは、それが別のポリペプチドを含むキメラタンパク質として産生されるように、融合タンパク質の一部であってもよい。融合タンパク質の他のポリペプチドメンバーは、以下の非限定的なリストから選択されてもよい：バクテリオファージテールファイバー、毒素、神経毒、抗体、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、神経成長因子。
【００６４】
さらなる実施形態において、結合パートナーは、核酸、核酸分子の一部、またはアプタマーであってもよい。
【００６５】
上記のように、本発明はまた、天然に存在する配列から誘導された単離された核酸分子を提供する。このような単離された核酸分子は、ドナー鋳型領域（ＴＲ）および可変領域（ＶＲ）を含むとして記載されてもよく、上記ＴＲは、上記ＶＲの部位特異的変異を指示するために上記ＶＲに作用可能に連結される鋳型配列である。好ましくは、この分子はバクテリオファージからであるが、Ｂｖｇ＋指向性ファージ−１（ＢＰＰ−１）、Ｂｖｇ-指向性ファージ−１（ＢＭＰ−１）、またはＢｖｇ無差別ファージ−１からではない。
【００６６】
本発明の核酸分子は、ＶＲの部位特異的変異を可能にし、および／または分子の複製を補助する、細胞に導入されるベクターまたはベクターの対の一部であってもよい。ベクターの非限定的な例には、プラスミドおよびウイルスベースのベクターが含まれ、これには、多様化されたＶＲ配列を発現するために使用されてもよいファージディスプレイのためのベクターが含まれる。他の非限定的な実施形態は、診断用、予後診断用、または治療用製品として含む使用のために、さらなる多様化を伴わずに多量のＶＲコードタンパク質を産生するようにＴＲの発現を妨害することを含む、本発明の方法に供せられ、次いで作用可能に連結されたＴＲから除去されるＶＲ配列を含むベクターである。
【００６７】
本発明はまた、それ自体で、またはベクターの状況で１つより多くのＶＲ配列の「多様化コレクション」を提供し、少なくとも２つのＶＲ配列は互いに配列が異なる。ある実施形態において、配列の差異は、ＶＲ配列によって異なるポリペプチドのコード化を生じるが、しかし、この差異はまた、サイレントまたは同義（同じアミノ酸をコードする異なるコドン）であってもよく、コドンの最適化がコードされたポリペプチドの発現を改善するために必要とされる場合において任意に使用される。「多様性コレクション」はまた、それ自体またはベクターの状況で、ライブラリーまたは複数のＶＲ配列と呼ばれてもよい。従って、本発明はまた、本明細書に記載されるような複数の核酸分子または核酸分子のライブラリーを提供する。複数の核酸分子または核酸分子のライブラリーには、ＶＲが作用可能に連結されたＴＲによって方向付けられる多様化を受けているものが含まれてもよい。
【００６８】
本発明の核酸を含む細胞の非限定的な例には、本明細書に記載されるようなバクテリオファージの部位特異的変異を補助する細菌細胞、または組換えの変異誘発されたタンパク質の変異誘発および／または産生もしくはプロセシングを補助する、任意の種起源の真核生物細胞が含まれる。ある実施形態において、酵母細胞または真菌細胞が使用されてもよい。他の実施形態において、より高等真核生物細胞が使用されてもよい。
【００６９】
ここで、本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、例示の目的で提供され、かつ特定されない限りは、本発明の限定であることが意図されない、以下の実施例を参照することを通して、より容易に理解される。
【実施例】
【００７０】
実施例１：材料および方法
細菌株、ファージおよびプラスミド
Ｂ．ブロンキセプチカ（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）株は、配列決定されたＲＢ５０株に由来し（Ｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＰａｒｋｈｉｌｌ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３５，３２−４０（２００３））およびＢＰＰ−１は、Ｂ．ブロンキセプチカのウサギ単離物から誘導した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＢＭＰ−１は指向性切り換えアッセイ（以下を参照のこと）を使用してＢＰＰ−１から単離した。プレート溶解物は軟寒天重層法を使用して調製し（Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｈ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９５９）、指向性切り換えアッセイは、以前に記載されたように実施した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。細菌およびファージコンストラクトは、対立遺伝子交換を使用して生成した（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｒ．Ａ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉ，，Ｄ．Ｍ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｔｏ  ａｎａｌｙｚｅ  ９８７Ｐ  ｆｉｍｂｒｉａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  ２０７，１４９−１５７（１９９８）ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｓｋｉ，Ｄ．Ｈ．＆  Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｉｇｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＲＫ２  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ａ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｉｎ  ｔｒａｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６，１６４８−１６５２（１９７９））。
【００７１】
複数置換コンストラクト
ＢＰＰ−ＭＳ１およびＢＭＰ−ＭＳ１（図３ａおよび３ｂ）は、それぞれ、ＴＲ中で以下の同義置換：Ｔ７−Ａ（ＰｓｔＩ）、Ｇ３７−Ｔ（ＢｓｔＸＩ）、Ｃ５５−Ａ（ＸｈｏＩ）、Ｃ７９−Ｇ（ＡｐａＩ）およびＧ１００−Ｃ（ＮｌａＩＩＩ）を含む、ＢＰＰ−１およびＢＭＰ−１誘導体である。各置換は、示されるような独特な制限部位を生成する。３７位および１００位における置換は、それぞれ、ＡｆｌＩＩＩおよびＭｂｏＩＩ制限部位を除去し、変動性についてのインビトロ選択を可能にする（図３ｂ）。ファージＭＳ２（図３ｃ）は、ＴＲにおける１０６位において１ｂｐ欠失および置換：Ｔ７−Ａ、Ｇ３７−Ｔ、Ｃ５５−Ａ、Ｃ−７９Ｇを含むＢｐｐ−１誘導体である。ファージＭＳ３（図２ｃ）は、ＴＲにおける９位に１ｂｐ欠失および置換：Ｇ３７−Ｔ、Ｃ−５５Ａ、Ｃ７９−ＧおよびＧ１００−Ｃを含むＢＭＰ−１誘導体である。
【００７２】
インビトロ変動性アッセイ
インビトロ変動性アッセイは、制限酵素切断に対する耐性を付与する単一ヌクレオチド置換の、ＴＲからＶＲへの移動のために選択する。溶原は、マイトマイシンＣを用いて誘導し、ＶＲ配列は、ＰＣＲによって増幅し、適切な制限酵素を用いて消化した。増幅−制限サイクルは、さらなる切断が観察されず、産物が配列決定のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングされたときまで、ネスト化プライマーを用いて反復した。「自己ホーミング」に起因するＴＲ中の変動性（図１ｃ、ＢＰＰ−３’ＶＲ）は、親のＴＲを切断するが耐性を付与するアデニン修飾を有するＴＲ配列を切断しない、ＢｓｒＩを使用してアッセイした。図３ｂにおける複数置換実験のために、増幅産物は、精製し、そしてＢＭＰ−ＭＳ１ファージのためにはＡｆｌＩＩＩで、またはＢＰＰ−ＭＳ１ファージのためにはＭｂｏＩＩで消化した。両方の場合において、親のＶＲ配列は切断に供せられるのに対し、制限酵素切断部位を除去する特異的な同義置換がＴＲから移されているファージは耐性である。
【００７３】
バイオインフォマティクス
注釈を付けたＢＰＰ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０２９１８５の下で利用可能である。保存性逆転写酵素触媒ドメインを含むデータベースエントリー（Ｐｆａｍ  ０００７８  ｒｖｔ）は、コンパイルし、系統発生プロフィールを、ＰＨＹＬＩＰソフトウェアパッケージ（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌにおいて）を使用して構築した。Ｂｒｔと一緒にグループ化されたエントリーを、ＲＥＰｕｔｅｒプログラム（Ｋｕｒｔｚ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＲＥＰｕｔｅｒ：ｔｈｅ  ｍａｎｉｆｏｌｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｃａｌｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９，４６３３−２６４２（２００１））を使用して、ＲＴに対して近位である直接反復の存在について検索した。Ａｒｔｅｍｉｓソフトウェアを使用して、データを収集し、かつ注釈付けを容易にした（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｍｉｓ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：９４４−９４５（２０００））。
【００７４】
実施例２：複数同義置換
配列変異体を生じる事象を追跡するための遺伝子ストラテジーは、ＴＲ中の保存性ヌクレオチド置換が、指向性を切り換えたファージのＶＲに組み込まれるという観察に基づいて設計した。ＴＲに沿って配置される複数の同義置換を導入することによって切り換え事象の間に移動されたＴＲの部分は、ＶＲ中に現れる置換のパターンを記録することによって決定することができる。次いで、指向性切り換えの根底にある機構的事象は、得られる「ハプロタイプ」プロフィールから再構築することができる。
【００７５】
情報は、均等にＶＲを横切って移動されているのではないと観察された。図３ａは、ＢＰＰ−−＞ＢＭＰ／ＢＩＰまたはＢＭＰ−−＞ＢＰＰ指向性切り換えに付随する伝達のパターンを示す。両方の場合において、３’マーカーは１００％効率で伝達されたのに対して、５’マーカーは５０％に近づく頻度で伝達された。アデニンの変動性は近位の置換の移動と相関したのに対して、変動性の欠如は、それらの非存在と相関した。いくつかの場合において、変動性の、ＴＲ誘導性配列のストレッチが、不変のＶＲ−誘導性配列によって中断された、モザイクパターンを観察した（黒点、図３ａ）。一緒に、これらの結果は、転位反応において一般的に観察されるような単純なカットアンドペーストメカニズムに反論する（Ｐｅｎａ，Ｃ．Ｅ．，Ｋａｈｌｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｔｆｕｌｌ，Ｇ．Ｅ．Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．ＰＮＡＳ  ９７，７７６０−５（２０００）およびＨａｌｌｅｔｔ  Ｂ．，Ｓｈｅｒｒａｔｔ，Ｄ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ａｄａｐｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｃｕｔ−ａｎｄ  ｐａｓｔｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ａ  ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１，１５７−７８）。
【００７６】
受容体特異性を支配する配列決定因子は不明であるので、核指向性切り換えアッセイは、強力な、なお乏しく規定されている一連の選択圧によって固有に偏向される。したがって、置換パターンは、指向性切り換えまたはファージ感染性について選択せずに、単一の正確に規定された位置での変動性を選択するＰＣＲベースのインビトロアッセイを使用して記録した。これらのアッセイは、ＴＲにおける同義置換の伝達から生じる親のＶＲ配列中の制限部位の損失に基づく。
【００７７】
図３ｂに示すように、インビトロ変動性アッセイは、ＡｆｌＩＩＩ選択クローンが、選択部位（３７位）を含むＴＲの中間部分を優先的に移動し、移動の頻度がいずれの方向にも急激に下落した、選択特異的なマーカー移動のパターンを明らかにした。ＭｂｏＩＩ選択クローンは、選択部位（１００位）を含むＴＲの３’末端を移動したが、５’末端では配列のバリエーションに偏りはなかった。両方の場合において、マーカー移動の最大頻度は選択の正確な点に移動した。事象の大部分は、中断された伝達のパターンまたは不変の配列によって隣接された伝達のパッチのいずれかを示した（黒丸、図３ｂ）。
【００７８】
変異誘発についての選択の欠如にも関わらず、図３ｂにおけるＶＲ配列のすべてがアデニン置換を含む。柔軟性の程度をさらに探索するために、ＴＲの３’または５’境界の移動に対する強力なネガティブ選択を課した。これは、移動されると、非生存性のファージを産生するフレームシフト変異の導入によって達成した。
【００７９】
この系は、驚くべきことに、これらを、むしろ極端な選択に適合した。両方の変異体ファージは、本質的に鏡像である伝達ヒストグラムを生成する、フレームシフト変異の伝達を回避しながら、指向性を切り換えることができた（図３ｃおよび図８）。
【００８０】
実施例３：遺伝子変換
インビトロ制限酵素に基づくアッセイによって課せられるような、単一位置における選択は、選択の点の周囲に集中したより短い変動性配列を単離する傾向がある。新規な受容体特異性のためにより複雑な選択は、移動された変異誘発された配列のより大きなセグメントについて選択する（図４ａ）。
【００８１】
これらの条件は、ＩＭＨにおいて開始された部位特異的ホーミングが、組換えまたは修復に起因してランダムな遺伝子変換に続くメカニズムによって満足され得る。このモデルによると、ヘテロ二重鎖は、変動性生成プロセスの間にＶＲにて形成される（図４ｂ）。Ｍｏｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．およびＷａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。ヘテロ二重鎖は、ＴＲ誘導体化ｃＤＮＡとのＶＲのハイブリダイゼーションから生じる高密度のミスマッチ塩基対によって特徴付けられる。ミスマッチ修復、または類似のプロセスは、配列バリエーションの「パッチ」を含むキメラＶＲを生じる。
【００８２】
多様性生成メカニズムの結果は、変動性が、高度に標的化された様式でｍｔｄ遺伝子座に導入されることである。多様化は、独占的に、変動性反復の境界内で起こり、これは、ＴＲ中のアデニン残基に対して対応する位置においてのみ起こり、およびこれは、選択に供される塩基のサブセットに対して限定され得る。この変動性の「フォーカシング」は、不必要なまたは有害な置換の蓄積を最小化しながら、選択圧に有効に応答するための手段を提供するので高順応性である可能性を有する。修復工程は、必須の所定のの高い割合のアデニン変異誘発であってもよく、およびこれは、選択の反復ラウンドを通して受容体の特異性の最適化を可能にする（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｎ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，４５８−６４（１９９６）およびＦａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１７７５４−１７７６４（１９９８））。
【００８３】
実施例４：他の生物における関連する遺伝子多様化系
リガンド−受容体相互作用に関与するタンパク質ドメインを多様化する能力は、極度に広い有用性を有する。従って、本発明は、天然で他の供給源から発見されるような、ボルデテラファージレトロエレメントに対して相同であるエレメントを提供する。関連する配列を同定するために、保存性ＲＴドメインを含む細菌起源のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコンパイルした。サブセットは、Ｂｒｔと系統発生的にクラスター化した（図２ａ）。隣接配列を調べ、すべての場合において、候補ＴＲおよびＶＲ反復を、ＯＲＦの３’末端に位置するＶＲとともに同定した。
【００８４】
さらなる注釈付けはカセットのアレイを明らかにし、本発明者らは、ここでこれを、推定の多様性生成レトロエレメント（ＤＧＲ）と名付けた。ＲＴドメインは高度に関連しており、かつＤＧＲは構造的な特徴の全体の保存性を共有しているが（図４ｂ）、これらの関連するカセットの他の成分間での配列類似性は、もしあっても、少ししか存在しない。
【００８５】
あらゆる場合において、ＶＲアナログは、それらの同族のＴＲと、アデニンに対応する位置においてほぼ独占的に異なる（図９）。この観察は、類似の様式で多様性を生成するそれらの機能に基づき、これらのカセットの使用を支持する。
【００８６】
同族のＶＲおよびＴＲの３’末端の比較はまた、ボルデテラファージＩＭＨ部位に類似の配列の存在を示唆する（図９）。図２ｂに示すように、ＤＧＲは、多様な細菌種の染色体中で見い出され、かつこれらは、共通のテーマ上のバリエーションを示す。例えば、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）およびトリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）種は、単一のＴＲが配列変動性を有する２つの異なるＶＲを明白に供給するカセットを含む。このような場合において、ＶＲは、９０％を超える配列同一性を有するパラロガスＯＲＦの一部であり、かつＴＲ中のアデニンに対応する塩基を除いて同一である。
【００８７】
加えて、いくつかのラン藻種は、相同ではなく、およびしたがって、独立して獲得された複数のＤＧＲを含む。ボルデテラおよびＶ．ハーベイ（ｈａｒｖｅｙｉ）のカセットはプロファージゲノム上に存在するが、残りの配列についてのファージの関連性の証拠は存在しない。図２におけるデータに基づいて、ＤＧＲは、多様な生物における無数の機能を実行するように進化してきたことが提案される。
【００８８】
グループＩＩイントロンのようなレトロエレメント（Ｂｏｎｅｎ，Ｌ．＆  Ｖｏｇｅｌ，Ｊ．Ｔｈｅ  ｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  ｉｎｔｒｏｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １７，３２２−３３１（２００１））、レトロトランスポゾン（Ｂｕｓｈｍａｎ，Ｆ．Ｄ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＬＴＲ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ  Ｃｅｌｌ  １１５，１３５−１３８（２００３））、レトロウイルス（Ｇｉｆｆｏｒｄ，Ｒ．＆  Ｔｒｉｓｔｅｍ，Ｍ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２６，２９１−３１５（２００３））、およびヒトＬＩＮＥ（Ｋａｚａｚｉａｎ，Ｈ．Ｈ．Ｊｒ．＆  Ｇｏｏｄｉｅｒ，Ｊ．Ｌ．ＬＩＮＥ  ｄｒｉｖｅ：ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｅｌｌ  １１０，２７７−２８０（２００２））は、関連した特徴を共有している。
【００８９】
実施例５：シスおよびトランスで作用するＤＧＲのエレメント
ボルデテラ株６１−１１（ＲＢ５０  ＢＰＰ−１  Δｂｒｔ、図１０を参照のこと）を、ＤＧＲのシスおよびトランス作用エレメントを特徴付けするために使用した。この株は、ファージがその指向性を切り換えることを不可能にする、プロファージＲＴ遺伝子（ｂｒｔ）中の欠失を有する。
【００９０】
ＤＧＲの種々の成分を含むＤＮＡフラグメントを、インタクトなＲＢ５０  ＢＰＰ−１溶原からＰＣＲによって増幅し、制限酵素を用いて消化し、そしてｆｈａプロモーターを有するベクターｐＢＢＲｍｃｓＦにクローニングした。２つのプラスミド、ｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔおよびｐｆｈａＰ−ＴＲ−ｂｒｔを表１に示し、および図１０に図解的に示す。ｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔにおいて、ｐｆｈａＰ配列とａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ配列の間にはターミネーターは存在しない。ｐｆｈａＰ−ＴＲ−ｂｒｔにおいては、ｆｈａプロモーターとＴＲ配列の間にターミネーターは存在しない。
【００９１】
得られるコンストラクトを表２に列挙する。
【００９２】
【表３】
2008508879.tif 000005
【００９３】
６１−１１株へのプラスミドの形質転換後、指向性の切り換えを、マイトマイシンＣを用いて溶原細胞を誘導すること、およびファージ溶解物をＲＢ５３（Ｂｖｇ＋株）またはＲＢ５４（Ｂｖｇ−株）上に直接的にプレーティングすることによってアッセイし、プラーク形成を観察した（ｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔを用いる使用については図１１を参照のこと）。
【００９４】
ｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔを保有する細胞からの誘導された溶解物を、ＲＢ５３（Ｂｖｇ＋）またはＲＢ５４（Ｂｖｇ−）に直接的にプレーティングした。ＲＢ５３プレートからの１８個のプラークを単離し、そしてＰＣＲ増幅後、それらのＶＲ領域を配列決定し、ＴＲ中のアデニンに対応する位置において変化があることを見い出した。１００μｌの溶解物から、平均で１５個のプラークを、ＲＢ５４上に直接的にプレーティングすることによって見い出した（ＲＢ５３上にプレーティングすることに対して比較した効率は約１０-3である）。
【００９５】
並行して、ｐｆｈａＰ−ＴＲ−ｂｒｔを保有する細胞からの誘導された溶解物を、ＲＢ５３（Ｂｖｇ＋）またはＲＢ５４（Ｂｖｇ−）に直接的にプレーティングした。ＲＢ５３プレートからの１０個のプラークからのファージを単離し、それらのＶＲ領域をＰＣＲによって増幅し、そして配列決定した。すべてがＴＲ中のアデニンに対応するＶＲ領域の変化を有した。１００μｌの溶解物から、平均で１５個のプラークを、ＲＢ５４上に直接的にプレーティングすることによって見い出した（ＲＢ５３上にプレーティングすることに対して比較した効率は約１０-3である）。
【００９６】
ファージのすべてのＶＲ領域は、指向性を切り換えなかったものでさえ、ＴＲ中のアデニン残基に対応するヌクレオチドの変化を含んだので、変異誘発の頻度は、強力な異種プロモーターの使用を伴って、効率よく１００％であった。
【００９７】
ｐｆｈａＰ−ｂｒｔおよびｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲを用いる類似の実験は、指向性切り換えを示さなかった。
【００９８】
結果は、指向性を切り換える能力を回復させる、ｂｒｔ欠失の相補のために必要とされる最小限の単位が、ＴＲ−ｂｒｔ領域であることを示し、ここで
（ｉ）ＴＲはｂｒｔとシスで作用し
（ｉｉ）ＴＲはＶＲとトランスで作用する。
【００９９】
結果はさらに、トランス作用性コンストラクトが、ファージＶＲ配列のプロウイルスコピーの変異誘発を指示することができたことをさらに示唆する。
【０１００】
実施例６：誘導されていないプロファージのトランスでの変異誘発
（染色体）プロファージのＶＲ配列を変化するＴＲ−ｂｒｔのトランス発現の能力を、ファージ誘導の非存在下で決定した。プラスミドｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔを保有する誘導されていない溶原６１−１１において、ＰＣＲ増幅を一晩培養物に対して実施し、ＤＮＡ産物を配列決定ベクターにクローニングした。
【０１０１】
１つの実験において、１つのコロニーを拾い上げ、ＬＢ培地中で３７℃で一晩培養物によって増殖させた。５μｌの一晩培養物のＶＲ領域をＰＣＲ増幅し、配列決定ベクター（ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔＩＩ）にクローニングした。２０個のプラスミドを配列決定し、２つ（従って１０％）が、ＴＲ中のアデニンに対応するＶＲ中の変化を有した。別の実験において、５個のコロニーを拾い上げ、ＬＢ培地中で３７℃での一晩培養を介して個々に増殖させた。各一晩培養物の５μｌのＶＲ領域をＰＣＲ増幅し、配列決定ベクター（ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔＩＩ）にクローニングした。各プレートから３個のプラスミドを配列決定し、１５個の内の５個（従って３０％）が、ＴＲ中のアデニンに対応するＶＲ中の変化を有した。
【０１０２】
従って、ＴＲ−ｂｒｔ領域のｆｈａプロモーターによって方向付けられる転写は、ＶＲ変異誘発の上昇レベルを生じ、以下を実証する：
（ｉ）ＴＲ−ｂｒｔは異種プロモーターの制御下に置くことができ、ａｔｄエレメントについての必要性を置き換える（以下を参照のこと）
（ｉｉ）ＴＲ−ｂｒｔ転写の制御は、ＶＲ変異誘発のレベルに影響を与える
（ｉｉｉ）ＴＲ−ｂｒｔ領域は、細菌染色体中の同族のＶＲ上でトランスで作用することができる。
【０１０３】
実施例７：加えられた部位の変異誘発の導入
部位特異的変異を使用して、３つのアデニンを、ＴＲ領域のヌクレオチド５９〜６１の代わりに置換した。対応するＶＲヌクレオチドは、非変動性Ｍｔｄ残基Ａ３５６をコードした。相同組換えを使用して、置換された３つのアデニンを有するＴＲを６４０５株（ＲＢ５４  ＢＭＰ−１溶原）に導入した。６４０５  ＴＲの修飾の成功は、配列決定および制限消化によって確認し、６４０５ＡＡＡ株を生成した（以下を参照のこと）。
ＴＲ−６４０５株
【化１】
2008508879.tif 000006
ＴＲ−６４０５ＡＡＡ株
【化２】
2008508879.tif 000007
【０１０４】
６４０５ＡＡＡ株を誘導し、得られるファージ混合物のＶＲ領域をＰＣＲ増幅し、親のＶＲ配列をＡＡＡ置換に対して３’で切断する制限酵素（ＭｂｏＩＩ）で消化した。インビトロ選択は、コードされたポリペプチドに対するその効果を評価することなく、親のＭｂｏＩＩ認識配列の多様化のためであった。ＭｂｏＩＩによって消化されなかったＶＲ配列の再増幅、続いてクローニングおよび配列決定は、新規に導入されたＴＲアデニン残基がＶＲに移され、かつ多様化されたことを実証した。
【０１０５】
実施例８：ａｔｄはホーミング変異誘発のために必要とはされない
ａｔｄへの終止コドンの配置は、変異誘発を排除しない。このことは、ａｔｄが変異誘発のために必要とされるタンパク質をコードしていないことを表す。
【０１０６】
部位特異的変異を使用して、終止コドンで、仮定の補助トロピズム決定因子（ａｔｄ）ＯＲＦの９番目のアミノ酸の代わりに置換した。相同組換えを使用して、終止コドンを有するａｔｄは、溶原株６４０５に導入した。６４０５の修飾の成功は、配列決定によって確証した。
【０１０７】
誘導およびさらなるラウンドの増殖後、ＢＶＧ＋またはＢＶＧ−のいずれかのボルデテラ  ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）上でプラーク形成が可能であるファージを単離した。したがって、ファージは、指向性を切り換える能力を維持していた。さらに、ファージの一次誘導は変異体を生じる。これは、制限酵素／ＰＣＲ選択法において、制限消化に対する変化した感受性を使用して初代溶解物中の変異体について選択することによって示された。
【０１０８】
上記の実施例５の結果と合わせて、ａｔｄコードポリペプチドは、指向性切り換えのためには必要ではなく、ａｔｄ配列は異種プロモーターによって完全に置換することができると結論することができる。
ａｔｄ−野生型
【化３】
2008508879.tif 000008
ａｔｄ−終止コドンあり
【化４】
2008508879.tif 000009
【０１０９】
実施例９：異種ポリペプチドの多様化
それ自体のプロモーターとともにアミノグリコシド−３’−ホスホトランスフェラーゼ−ＩＩ（ＡＰＨ（３’）−ＩＩａ）をコードするカナマイシン耐性遺伝子を、制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩを使用してプラスミドｐＺＳ２４*ｌｕｃから単離し、プラスミドｐＢＢＳｍｃｓにクローニングした（図１２）。この新規なプラスミドｐＢＢＲ−Ｋａｎを保有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を、カナマイシンとクロラムフェニコールの両方の存在下で増殖させた。
【０１１０】
ＡＰＨ（３’）−ＩＩａのアミノ酸配列は２６４残基長であり、以下の通りである：
【化５】
2008508879.tif 000010
２４３位のＬｅｕ残基を強調して示す。
【０１１１】
終止コドン（ｔａａ）は、部位特異的変異を使用することによって２４３位に導入した。この変異は、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋａｎを保有する宿主中でカナマイシン耐性を除去した。プラスミドｐＺＳ２４*ｌｕｃは、Ｌｕｔｚ，Ｒ．＆  Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，１２０３−１２１０からである。
【０１１２】
カナマイシン耐性遺伝子は、ＰＣＲ増幅し、制限酵素（ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を用いて消化した。ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐｆｈａＰ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ中のａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ領域に対して５’で配置した。得られるプラスミドは、ｐＫａｎ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔであり、これは、ａｔｄの上流の転写ターミネーター構造の欠失を有する（図１３を参照のこと）。
【０１１３】
カナマイシン耐性遺伝子のために設計されたＶＲ領域（ＡＰＨ（３’）−ＩＩａ）は、遺伝子の最後の７５ｂｐ（Ｐｈｅで終了する２５残基をコードする）続いて終止コドンｔｇａおよび遺伝子ｍｔｄの最後からの５５ｂｐを含む（図１４を参照のこと）。仮定のコードされるペプチド配列を用いて示される５５ｂｐ  ｍｔｄ領域は、１４ｂｐのＧＣリッチ領域（図１４における下線部）、続いてＩＭＨ配列を含む。ｍｔｄ領域は、プラスミドｐＫａｎ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ中で５’末端で挿入位置の各々の側に相補的である隣接領域を有するオリゴを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＫａｎ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ上での修飾した部位特異的変異のためのプライマーとして使用した。得られるプラスミドは、ｐＫａｎ−ＩＭＨ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔである（図１３）。
【０１１４】
カナマイシン耐性遺伝子のために設計されたＴＲ’領域は、その同族のＶＲ領域とのアラインメント中で以下に示される。ＶＲに対応する１３０ｂｐ領域は、大文字で示すＬｅｕ２４３に対応するコドンとともに示される。最後の５５ｂｐは、ＢＰＰ−１  ＤＧＲ領域のＴＲ領域と同じであり、強調のために大文字で示す。
【化６】
2008508879.tif 000011
【０１１５】
プラスミドｐＫａｎ−ＩＭＨ−ａｔｄ−ＴＲ−ｂｒｔ中のカナマイシン耐性遺伝子についてのＴＲ’領域は、改変した部位特異的変異によって作製した。最終的なプラスミドは、ｐＫａｎ−ＩＭＨ−ａｔｄ−ＴＲ’−ｂｒｔ（図１３）またはｐＫａｎ−ＴＲ’である。アンバー終止コドンは、部位特異的変異によって、２４３位のカナマイシン耐性遺伝子に導入され、ｐＫａｎ２４３ａｍ−ＩＭＨ−ａｔｄ−ＴＲ’−ｂｒｔ（ｐＫａｎ２４３−ＴＲ’とも呼ばれる）を生じた。
【０１１６】
プラスミドは、溶原６１−１１に形質転換した。プラスミドｐＫａｎ−ＴＲ’を有する溶原は、カナマイシンの存在下で正常に増殖した。
【０１１７】
ｐＫａｎ２４３−ＴＲ’を用いるカナマイシン耐性の選択は以下の通りであった。プラスミドｐＫａｎ２４３−ＴＲ’を有する溶原６１−１１の培養物を一晩増殖させ、続いて段階希釈を行った。この希釈は、ＬＢプレート上で、４０μｇ／ｍｌカナマイシンを用いてプレーティングした。アデニン特異的変異誘発によってアンバー終止コドンを「修復」した、カナマイシン耐性プラスミドを保有する６１−１１宿主は、カナマイシンの存在下でコロニーを形成することが予測される。ｐＫａｎ２４３−ＴＲ’を保有する宿主のプレートからの２つの強固なコロニー、２４３ｒｅｓｉｓ１ＶＲおよび２４３ｒｅｓｉｓ２ＶＲを単離し、それらのＶＲ領域を増幅し、そして配列決定した。
【０１１８】
結果はすぐ上のボックスに示す通りであり、ここで、２４３ｒｅｓｉｓ１ＶＲは、ｔａａからｔａｃ（ｔｙｃ）への変化を含んだ；ｔａｃはＴＲ’におけるものと同じコドン配列である。このことは、ＴＲ’配列がＶＲ配列の代わりに置換するために使用されたことを示す。別の言い方をすれば、変化は、ＴＲ’からＶＲへの配列の置換の結果であった。
【０１１９】
２４３ｒｅｓｉｓ２ＶＲにおいて、ｔａａはｔｔｃ（Ｐｈｅ）に変化し、同じコドンの２つの変異の結果であった。２つの変異誘発事象の１つは、ＡからＴへの変化であり、ＴＲ’中の対応するＡの多様化を生じるのに対して、ＡからＣへの変化は、２４３ｒｅｓｉｓ１ＶＲについて見られるようなＴＲ’鋳型からの置換（またはホーミング）であった。ＰｈｅおよびＴｙｒは非常に類似したアミノ酸構造を有し、かつ両方とも疎水性であり、結果は、ネイティブ配列ではＬｅｕ（これもまた疎水性である）である２４３位におけるＴｙｒまたはＰｈｅは、カナマイシン耐性を回復することが可能であった。このことは、２４３位が、ホスホトランスフェラーゼ機能の維持または回復のために、ＬｅｕからＴｙｒまたはＰｈｅへの置換を許容することを示唆する。
【０１２０】
Ｎｕｒｉｚｚｏ  ａｌ．（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，３２７：４９１−５０６，２００３）によって示されているように、カナマイシン耐性タンパク質のＣ末端ドメインは、カナマイシン分子の結合に関与する。それらの公開された結晶構造に従って、Ｌ２４３からアンバー変異までは、αへリックス７および８の前でタンパク質を切断する。これは、カナマイシン結合ポケットの一部を形成するＣ末端残基２６０〜２６４の喪失に導く。従って、配列は、終止コドンから２４３ｒｅｓｉｓ１ＶＲのコドンに変化し、２４３ｒｅｓｉｓ２ＶＲは、ホスホトランスフェラーゼのカナマイシン結合ドメインの回復を反映する。
【０１２１】
上記の結果はまた、ＩＭＨが上記のカナマイシンホスホトランスフェラーゼコンストラクト中のｔｇａ終止コドンに従うため、ＩＭＨは、変異誘発のために翻訳されることが起こる必要がないことを示す。上記の結果はまた、第２の分子上の別々のプロモーターの制御下でＴＲおよびＲＴコード配列を提供する、トランスコンストラクトを用いて実施されてもよい。
【０１２２】
実施例１０：Ｔ．デンチコーラからのＤＧＲの同定
トレポネーマ  デンチコーラは、ヒト口腔でコロニー形成し、歯周病と関連している運動性の嫌気性スピロヘータである。オープンリーディングフレームＴＤＥ２２６９の３’末端に位置する、１３４塩基対の同定された可変領域（ＶＲ）が存在する。対応する鋳型領域（ＴＲ）は、ＶＲの１９９塩基対下流、およびボルデテラファージ逆転写酵素（ｂｒｔ）に対する相同性（６ｅ−３９）を有する逆転写酵素コード配列の５７３塩基対上流に位置する。ＶＲおよびＴＲは、２６個の位置で異なり、ＶＲ中に存在するこれらの違いのうちの２３個が、ＴＲ中のアデニンに対応する位置にある。アデニンに対応しない３つの位置のうちの２つがＩＭＨシグナルの一部であり得る。なぜなら、これらは、最も３’の位置の変動性であるからである（以下を参照のこと）。また、ＴＤＥ２２６９は、リポタンパク質シグナル配列を有し（以下の下線部）、このことは、このタンパク質が外膜に搬出され得ることを示す。ＶＲは、以下の太字のテキストに示される。
ＴＤＥ２２６９−３２９アミノ酸
【化７】
2008508879.tif 000012
【０１２３】
ＴＲ中のアデニンに対応するＶＲ中のバリエーションを確証するために、制限酵素ＨｉｎＣＩＩを変動性アッセイにおいて使用し、２５個のヌクレオチド位置において配列決定されたＶＲとは異なるＴ．デンチコーラＶＲを同定した。２５個の違いのうちの２１個が、ＴＲ中のアデニンに対応する位置に存在し、４つの違いのうちの残りの１つが、以下に示されるようなＴＲからの直接的なヌクレオチドの移動（またはホーミング）であるようである。
【０１２４】
ＨｉｎＣＩＩ認識部位は、ＧＴＹＲＡＣであり、ここで、ＹはＣまたはＴ；ＲはＡまたはＧである。ＴＲ鎖は鋳型領域を意味し；ＶＲ鎖は可変領域を意味し；そしてＩＶは、可変領域の同定された変異体を意味する。ＴＲおよびＶＲの推定のＩＭＨ様配列およびＩＭＨ配列の部分は、それぞれ、太字で示す。
【化８】
2008508879.tif 000013
【０１２５】
本明細書に引用されたすべての参考文献は、先に具体的に組み込まれるか否かに関わらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）および「いくつかの」（「ａｎｙ」）という用語は、各々が単数形と複数形の両方を含むことが意図される。
【０１２６】
本発明を十分に説明してきたが、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、および過度の実験を伴うことなく、広い範囲内の等価なパラメーター、濃度、および条件で実施することができることが当業者によって認識される。本発明は、その特定の実施形態とともに説明されてきたが、さらなる改変が可能であることが理解される。本出願は、一般的に、本発明の原理に従って、ならびに本発明が属する技術分野の公知のまたは慣例的な実務の中に入るような、および本明細書上記に示した本質的な特徴に適用してもよいような、本開示からの逸脱を含む、本発明の任意のバリエーション、使用、または適合を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１ａ〜１ｄはボルデテラバクテリオファージによって切り換えられる指向性を示す。図１ａにおいて、特異性および指向性切り換え頻度は、Ｂ．ブロンキセプチカ（ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ＢｖｇＡＳ−媒介相転移の上に示される。ＢＰＰ、ＢＭＰおよびＢＩＰは、Ｂｖｇ＋相、Ｂｖｇ-相またはいずれかの相について、それぞれ指向性である。図１ｂは、変動性生成カセットの成分を示す。ｍｔｄの３’部分は拡大され、１３４ｂｐ  ＶＲ配列に下線を付す。変動性塩基（赤）は、ＴＲ中のアデニン残基に対応する。図１ｃは野生型（ｗｔ）ＢＰＰ−１におけるものを示し、情報はＴＲからＶＲに一方向的に移され、これにはアデニン依存性変異誘発が付随する。ＢＰＰ−３’ＴＲは指向性を切り換えることに失敗するのに対して、ＢＰＰ−３’ＶＲは野生型の頻度で指向性を切り換え、ＶＲと同様にＴＲにおいて変動性を生成する。図１ｄにおいて、ＴＲアデニンが一番上に示され、続いて親のＶＲにおける対応するヌクレオチドが示される。ＴＲ１〜９は、ファージＢＰＰ−３’ＶＲ上で実施されるインビトロ変動性アッセイから誘導されたＴＲ配列である。赤いヌクレオチドは、変化される位置を示す。変動性の部位は、親のＴＲ中のアデニン残基とともに整列される。
【図２】図２ａおよび２ｂは、細菌およびバクテリオファージゲノム中での多様性生成レトロエレメント（ＤＧＲ）を示す。図２ａは、レトロエレメントの他のクラスに関連する、ＤＧＲの系統樹を示す。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を示す。ＤＧＲ、多様性生成レトロエレメント（赤線）；Ｇ２、グループＩＩイントロン；Ｒｐｌ、ミトコンドリアレトロプラスミド；Ｒｔｎ、レトロン；ＮＬＴＲ、非ＬＴＲエレメント；ＬＴＲ、ＬＴＲレトロエレメント；Ｔｅｌｏ、テロメラーゼ；ＰＬＥ、ペネロープ（Ｐｅｎｅｌｏｐｅ）様エレメント。ＲＴドメインは、パーセントとして表現される、１０００個のブートストラップサンプリングを用いて、ＰＨＹＬＩＰ  ３．６ｂの隣接結合アルゴリズムを使用して分析した。ＤＧＲは、９２％ブートストラップサポートを有する十分に規定された分岐を形成する（赤線；ピンクで丸で囲んであるＢｒｔ）。グループＩＩイントロンは、それらの最も密接した関連物であるが、非常に弱いサポート（５５％）を有すると予測される。図２ｂは、ボルデテラファージＤＧＲに対して比較して、９個の推定のＤＧＲを示す。すべてのＤＧＲは、Ｃ末端に位置する１０３〜１９０ｂｐ  ＶＲ（灰色矢印）を含むＯＲＦ（１９１〜８８８ａａ）、ある場合にはａｔｄまでの類似のサイズの小さなオープンリーディングフレームを含む１３６〜１，２２０ｂｐのスペーサー領域、およびＲＴ（２８３〜４１５ａａ）に対して密接した近接にある（２２〜３３９ｂｐ）ＶＲに等しい長さのＴＲ（黒矢印）を含む。２つのＶＲを含むトリコデスミウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ）およびノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）エレメントについては、ＶＲ１およびＶＲ２は、同じＴＲから生じる異なる変異原性ホーミング事象から得られたようである。ＲＴについてのＥ値は、Ｂｒｔと比較して、１Ｅ−１１から４Ｅ−３７までの範囲である。
【図３】図３ａ〜３ｃは、複数置換実験の結果を示す。図３ａにおいて、ファージＭＳ１のＴＲは、黒線で印を付けた同義置換を含む（本明細書の実施例１を参照のこと）；ＴＲアデニンは、一本線によって表される隣接部位とともに赤線で印を付けられる。紫色または青色で囲んだデータは、９個の独立した指向性変異体のＶＲ配列を図解的に表す。紫色のボックス、ＢＰＰ−ＭＳ１−−＞ＢＭＰまたはＢＩＰ；青色のボックス、ＢＭＰ−ＭＳ１＞ＢＰＰ。黒線は置換がＴＲから獲得されたことを示す；赤線は位置が親のＶＲに関して変化したことを示す。同義置換の移動の頻度（伝達ヒストグラム）は下端に示す。紫色のバー、ＢＰＰ−ＭＳ１−−＞ＢＭＰ／ＢＩＰ；青色のバー、ＢＭＰ−ＭＳ１−−＞ＢＰＰ。図３ｂは、ＭｂｏＩＩ（１００位、紫で囲んだ）またはＡｆｌＩＩＩ（３７位、青色で囲んだ）に対する耐性を付与するＴＲからＶＲへの同義置換の移動についての選択後の、インビトロ変動性アッセイの結果を示す（以下の実施例１を参照のこと）。ＭｂｏＩＩ選択（紫色のバー）またはＡｆｌＩＩＩ選択（青色のバー）に対応する伝達ヒストグラムは、制限酵素切断（矢印）の位置とともに下端に示す。図３ｃは、ファージＭＳ２のＴＲが、ＶＲに移動された場合にｍｔｄおよび非感染性ファージにおけるフレームシフト変異を生じる、１０６位における１ｂｐ欠失を含むことを示す（方法を参照のこと）。紫で囲ったデータは、ＢＰＰ−ＭＳ２−−＞ＢＭＰ／ＢＩＰ指向性変異体のＶＲ配列を示す。ファージＭＳ３のＴＲは、ＶＲに移動された場合に非感染性ファージを生じる、９位における１ｂｐ欠失を含む。青色で囲ったデータは、ＢＭＰ−ＭＳ３−−＞指向性変異体を示す。伝達ヒストグラムは、ＢＰＰ−ＭＳ２−−＞ＢＭＰ／ＢＩＰ（紫色のバー）またはＢＭＰ−ＭＳ３−−＞ＢＰＰ（青色のバー）の反応に対応する。星印は、ネガティブ選択に供されるフレームシフト変異の移動の欠如を示す。
【図４】図４ａおよび４ｂは、変異原性ホーミングからのＶＲ配列の結果を示す。図４ａにおいて、異なる選択条件下で移動されたＴＲの平均長はヒストグラムを用いて示され、移動した配列の長さの分布は、泡を用いて示す（サイズは所与の長さのクローンの相対的な数を表す）。複合選択、例えば、指向性切り換え（ＢＰＰ−−＞ＢＭＰ；ＢＭＰ−−＞ＢＰＰ）を必要とするものは、移動した配列のより長いストレッチを有する比較的珍しい単離物を選択する。制限酵素耐性を生じる単一ヌクレオチド置換の移動（ＡｆｌＩＩＩｓ−−＞ＡｆｌＩＩＩｒ；ＭｂｏＩＩｓ−−＞ＭｂｏＩＩｒ）についてのより単純な選択は、選択の点に関わらず、移動した配列のより短いストレッチを含む、より豊富なクローンについて選択する。図４ｂは、可変長のＴＲのランダムな部分を含むＶＲ配列の生成を示す。本発明を用いて提案されるモデルにおいて、逆転写に続いて、変異原生ホーミングを行い、ここで、ＴＲ誘導体化逆転写物は、ＶＲホーミングヘテロ二重鎖にいて相同性依存性様式で組み込む。この事象は、ＩＭＨ部位において開始することができ、グループＩＩイントロンについて提案されたような標的開始逆転写（ｔａｒｇｅｔ−ｐｒｉｍｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＴＰＲＴ）に類似のメカニズムによって起こる（Ｍｏｒｒｉｓｈ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＬＩＮＥ−Ｉ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３１，１５９−１６５（２００２）およびＷａｎｋ，Ｈ．，ＳａｎＦｉｌｉｐｐｏ，Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｎ．，Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｍ．，Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ，Ａ．Ｍ．Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ／ｍａｔｕｒａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｔ  ｉｔｓ  ｏｗｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  Ｉｎｔｒｏｎ  ＲＮＡ．ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  ４，２３９−２５０（１９９９））。得られるヘテロ二重鎖は、アデニン特異的変異誘発に起因して、高密度のミスマッチ塩基対（赤色の星印）を含む。次いで、このヘテロ二重鎖は、ミスマッチ修復、および／または組換えを介して、親のＶＲ配列に部分的に変換される。ＤＮＡ複製は、ＴＲ由来の可変配列のパッチによってモザイクＶＲを生じる。
【図５】ＢＰＰ−１多様性生成カセットの境界を規定するためのインフレーム欠失の使用を示す。内部のインフレーム欠失は、ｂｒｔ−ｍｔｄ領域に隣接するファージ遺伝子に導入した。指向性切り換え領域を含むＢＰＰ−１ゲノムセグメントのマップを、インフレーム欠失から得られる表現型とともに示す。生存度は、マイトマイシンＣを用いる溶原の誘導後の感染性のファージ粒子の産生として定義する。変動性は、インビトロ変動性アッセイを用いる検出を使用する溶原の誘導後の、アデニン変異誘発したＶＲ配列を含むファージＤＮＡの産生として定義する。ファージ遺伝子ｂｂｐ１、ｂｂｐ２、ｂｂｐ３、およびｂｂｐ４は、すべてＢＰＰ−１生存度のために必須であるが、ＶＲ変動性のためには必要ではない。ファージ遺伝子ｂｒｔ、ａｔｄ、およびｍｔｄは、すべてこれらのコンストラクト中でＶＲ変動性について必要である。これらの３つの変動性カセット遺伝子の中で、ｍｔｄのみがＢＰＰ−１変動性のために必須である。ファージ遺伝子ｂｂｐ９およびｂｂｐ１０は、変動性または生存度のために必要ではない。今日までに同定されたすべての変動性決定因子は、ファージゲノムの規定された連続する領域中に存在し、変動性生成遺伝子座がカセットとして機能するという考えを支持する。
【図６】図６ａ〜ｃは、ＴＲのアデニン依存性変異誘発の結果を示す。ａ：上端の配列は、２３個の天然に存在するアデニン（太字）、および部位特異的変異、その後の対立遺伝子交換（５５位、赤色の太字）によって新規な部位に導入されたさらなる異所性アデニン残基を有するＴＲを示す。ＶＲ１〜ＶＲ５は、異所性アデニンが変化することが観察された、独立して単離された指向性変異体からのＶＲ配列を示す。異所性アデニンにおける変動性の実際の頻度はｃに示す。これらのデータは、ＴＲ中のアデニン残基の異所性付加が、ＶＲ中で変動性の新規な部位を作製することを実証する。ｂ：上端の配列は、２３〜２４位の天然に存在するアデニン対がＧＣ（赤色の太字）で置換されているＴＲを示す。残りの２１個の天然に存在するアデニンを太字で示す。２０個の単離された指向性変異体から、その代表的な５つを示し（ＶＲ１〜ＶＲ５）、２３〜２４位において変動性は観察されなかった。指向性切り換えの間に、２３〜２４位において天然に存在するアデニン対の変化の頻度は約９５％であるので、ＴＲ中のアデニン残基の除去は、ＶＲにおける対応する位置での変動性を除去する。ｃ：移動されたアデニンにおける変異誘発の頻度は、インビトロ変動性アッセイを使用して計算した。いずれかの位置（ＡＡ−＞ＮＡ／ＮＮ；ＡＡ−＞ＡＮ／ＮＮ）または両方の位置（ＡＡ−＞ＮＮ）において置換を生じる移動されたアデニンの対における変異誘発の頻度を示す（ｎ＝２０）。３５位における単一の内因性アデニンの変異誘発頻度（内因性Ａ−＞Ｎ、ｎ＝５０）、または５５位における異所性アデニンの変異誘発頻度（異所性Ａ−＞、ｎ＝５０）もまた示す。観察されるように、および本発明の範囲内で提供されるように、対の一部であるアデニンは、単一のアデニンであるよりは変化する可能性がはるかに高く、５５位における異所性アデニン（上記のａを参照のこと）の変動性の頻度は、３５位の内因性アデニンについての頻度とほぼ同一である。
【図７】図７ａおよびｂは、内部欠失実験の結果を示す。ａ：配列のストレッチはＴＲから欠失され、線図（縮尺として使用する）の上に示されるようなＢＰＰ−１のＶＲおよび得られる株を、インビトロ変動性アッセイを使用してＶＲにおけるバリエーションについて試験した。ＶＲにおけるバリエーションを右側のカラムにおいて「＋」によって示すのに対して、バリエーションの欠如は「−」によって示す。非常に大きな欠失（Ｄ１１８）を除いて、この系は、異なるサイズおよび位置（Δ１８、Δ３９、Δ６１）の欠失に適合することができた。最も意味深いことに、ＶＲの５’部分の大きな欠失（Δ６１）がなお、バリエーションを示した。このことは、ＩＭＨに類似する５’シス作用性部位が存在しないこと、およびこの系におけるホーミングは、部分的に相同性に基づくことを示す。ｂ：Δ６１ファージから誘導された変異体ＶＲ（ＶＲ１〜４）の配列をＴＲおよびＶＲ（上記）に対して整列させる。欠失とＧ／Ｃストレッチの間の配列を示す。ＴＲ中のアデニン（太字）に対応する残基における変異誘発（赤色）とともに、選択のＭｂｏＩＩ部位もまた示す（下線部）。
【図８】図８ａおよび８ｂは、ＴＲ中の複数置換を有するファージの頻度を切り換える指向性を示す。株の略号は図３と同じである。ＭＳ１は、５つの同義置換を有するのに対して、ＭＳ２およびＭＳ３は、同義置換に加えて１ｂｐ欠失を有する（図３におけるマップを参照のこと）。ａ：ＢＭＰ−１バックグラウンド（ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３）または野生型ＢＭＰ−１における複数置換コンストラクトは、ＢＰＰ指向性に切り換えるために選択された。溶原から誘導されたファージは、Ｂｖｇ-細菌上で増殖され、Ｂｖｇ＋上でプラークを形成することが可能であるファージの画分を測定した。ｂ：ＢＰＰ−１バックグラウンドまたは野生型ＢＰＰ−１中の複数置換コンストラクトは、ＢＭＰまたはＢＩＰ指向性に切り換えるために選択した。溶原から誘導されたファージはＢｖｇ＋宿主上で増殖され、Ｂｖｇ-宿主上でプラークを形成することが可能であるファージの画分を測定した。ａおよびｂにおいて、ＭＳ２およびＭＳ３ファージへの指向性切り換えの頻度は、野生型よりも低く、これは、ファージの画分がネガティブ選択によって除去されたことを示す。しかし、両方の場合において、これらの変異型ファージは、フレームシフト変異の伝達を回避しながら、指向性を切り換えすることが可能であった（図３ｃ）。
【図９−１】異なるＤＧＲからのＶＲおよびＴＲのヌクレオチド配列アラインメントを示す。ＴＲは、下端のＶＲ配列とともに上端に示される。終止コドンは小文字で示す。ＴＲ中のアデニンは、太字で示すのに対して、ＶＲ中の対応する塩基は、ＴＲとは異なる場合にのみ、太字体で示される。違いは、非アデニン置換に反対するように、ＴＲアデニンにのみ大部分限定され、このことは、変異誘発の基本メカニズムがＤＧＲを横切って保存されていることを示すことに注目のこと。３’末端におけるミスマッチは、ボルデテラファージにおけるＩＭＨと同様に、色で示す（緑色、ＶＲ；青色、ＴＲ）。加えて、その機能的重要性が不明である、よく保存されているＴＣＴＴモチーフに下線を付す。これらの類似性は、異なるエレメント間の配列同一性の欠如に関わらず、メカニズムの特徴の保存の可能性を証明する。
【図９−２】異なるＤＧＲからのＶＲおよびＴＲのヌクレオチド配列アラインメントを示す。ＴＲは、下端のＶＲ配列とともに上端に示される。終止コドンは小文字で示す。ＴＲ中のアデニンは、太字で示すのに対して、ＶＲ中の対応する塩基は、ＴＲとは異なる場合にのみ、太字体で示される。違いは、非アデニン置換に反対するように、ＴＲアデニンにのみ大部分限定され、このことは、変異誘発の基本メカニズムがＤＧＲを横切って保存されていることを示すことに注目のこと。３’末端におけるミスマッチは、ボルデテラファージにおけるＩＭＨと同様に、色で示す（緑色、ＶＲ；青色、ＴＲ）。加えて、その機能的重要性が不明である、よく保存されているＴＣＴＴモチーフに下線を付す。これらの類似性は、異なるエレメント間の配列同一性の欠如に関わらず、メカニズムの特徴の保存の可能性を証明する。
【図１０】本発明のコンストラクトの模式図を示す。第１のコンストラクトにおいて、ａｔｄ領域は、示されたターミネーターの３’末端とＴＲ領域の開始との間に存在する。第２のコンストラクトにおいて、ａｔｄ領域は、プロモーターと示されたＴＲ領域との間に存在する。第３のコンストラクトにおいて、コンストラクト中に、ａｔｄまたはＴＲ領域は存在しない。
【図１１】誘導されたプロファージ上でのＶＲの変異誘発を示す。
【図１２】新規なＴＲおよびＩＭＨを有する異種配列を変異誘発するための設計の図解を示す。
【図１３】ホスホトランスフェラーゼコード配列を変異誘発するために使用されるコンストラクトの図解を示す。
【図１４】非ボルデテラ  ＡＰＨ（３’）−ＩＩａコード配列の変異誘発において使用されるＶＲアミノ酸配列を示す。大きな「Ｌ」は、カナマイシン結合の除去およびカナマイシン耐性の不活性化のための２４３位におけるアンバーコドンの挿入の位置を描写する。
【図１５−１】本発明の種々のＤＧＲ（ラン藻ＤＧＲ、ならびにノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃１および＃２、トリコデスミウム  ユリスレウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  Ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１および＃２、ならびにその他からのものを含む）からの配列のアラインメントを示す。
【図１５−２】本発明の種々のＤＧＲ（ラン藻ＤＧＲ、ならびにノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃１および＃２、トリコデスミウム  ユリスレウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  Ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１および＃２、ならびにその他からのものを含む）からの配列のアラインメントを示す。
【図１５−３】本発明の種々のＤＧＲ（ラン藻ＤＧＲ、ならびにノストック  パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＰＣ種７１２０＃１および＃２、トリコデスミウム  ユリスレウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  Ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ）＃１および＃２、ならびにその他からのものを含む）からの配列のアラインメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【国際調査報告】
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