(57)【要約】本発明は、酵素およびプロセスに関する。詳細には、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼ、またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを記載している。細菌のフィターゼ酵素または改変型をコードする核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、および食物または動物の飼料中におけるこのようなフィターゼまたは改変型の使用も記載される。
2008515401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼ、またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、もしくはその機能的なフラグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、もしくはその機能的なフラグメントを有する単離されたポリペプチド。
【請求項４】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１２４７として寄託されたＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２株由来であるという点で特徴付けられるフィターゼ。
【請求項５】
フィターゼまたはその機能的な等価物であって、該フィターゼが少なくとも１１００Ｕ／ｍｇという比活性を有し、該比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該フィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる、フィターゼまたはその機能的な等価物。
【請求項６】
フィターゼまたはその機能的な等価物であって、該フィターゼがｐＨ３およびｐＨ４〜４．５の周囲で２つの最大活性を有し、該活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中で該フィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる、フィターゼまたはその機能的な等価物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼであって、以下の位置（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）：
【化１】
2008515401.tif 000015
において１つ以上の変異を含む、単離されたポリペプチドまたはフィターゼ。
【請求項８】
請求項７に記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼであって、該フィターゼが、以下の変異：
【化２】
2008515401.tif 000016
の１つ以上を含む、単離されたポリペプチドまたはフィターゼ。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼであって、以下：
Ｐ２２９Ｓ；Ｄ１１２Ｖ；Ｑ８２Ｒ；Ｑ２７４Ｈ；Ｄ１１２Ｙ；Ｆ８８Ｙ；Ｋ４６Ｅ；Ｓ２３３Ｃ；Ｒ２８８Ｍ；Ｉ３８４Ｌ；Ｑ３８５Ｒ；Ｑ２７４Ｌ；Ｅ３０７Ｙ；Ｔ１９９Ｉ；Ｑ８２ＫおよびＴ２０３Ｉ、
からなる群より選択される１つの変異を含む、単離されたポリペプチドまたはフィターゼ。
【請求項１０】
請求項７または請求項８に記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼであって、以下：
【化３−１】
2008515401.tif 000017
【化３−２】
2008515401.tif 000018
からなる群より選択される変異の組み合わせを含む、単離されたポリペプチドまたはフィターゼ。
【請求項１１】
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼという酵素、またはそのホモログをコードする単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、またはその有効なフラグメントを含む、ポリペプチドをコードする、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、配列番号２の任意の配列と同じであるか、もしくはそれに相補的であるか、もしくは配列番号２の任意の配列の任意の適切なコドン置換を含むか、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはフィターゼをコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
配列番号２に示される配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載される単離されたポリペプチドもしくはフィターゼまたはそのホモログもしくは誘導体を含むプラスミドまたはベクター系。
【請求項１７】
請求項１１〜１５のいずれかに記載の核酸配列を含む、請求項１６に記載のプラスミドまたはベクター系。
【請求項１８】
配列番号２に示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％相同性である配列もしくはその有効なフラグメントを含む、請求項１６に記載のプラスミドまたはベクター系。
【請求項１９】
前記プラスミドまたはベクター系が、宿主細胞または微生物中において、それぞれのフィターゼ酵素またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントの発現のための発現ベクターである、請求項１６〜１８のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
フィターゼを含む請求項２０に記載の宿主細胞であって、該フィターゼが、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同である配列、または請求項７〜１０のいずれかに記載のその改変体を含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の宿主細胞であって、前記宿主細胞が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌を含む微生物、および、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母を含む真菌由来である、宿主細胞。
【請求項２３】
前記微生物が原核生物細菌細胞、そして好ましくはＥ．ｃｏｌｉである請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４１２４７として寄託された、細菌細胞株Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２。
【請求項２５】
フィターゼを産生する方法であって、該方法は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の相同性を有する配列、またはその改変型もしくは改変体もしくは有効なフラグメントを宿主細胞中で発現する工程と、該宿主細胞培養培地から該フィターゼを分離する工程とを包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載されるフィターゼを含む食物または動物飼料組成物。
【請求項２７】
食物または動物の飼料中における請求項１〜１０のいずれかに記載のフィターゼの使用。
【請求項２８】
食物または動物飼料に対して請求項１〜１０のいずれかに記載のフィターゼを液体形態で噴霧する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項２９】
請求項１〜１０のいずれかに記載のフィターゼを乾燥生成物として、前記食物または動物飼料とを混合する工程を包含する、食物または動物飼料の生成のための方法。
【請求項３０】
フィターゼ酵素改変体を調製するための方法であって、該方法は：
ａ）親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、該親のフィターゼ酵素が：
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）該親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも１つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）該親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および／または
ｄ）フィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３１】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法であって、該方法が：
ａ）親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発に供する工程であって、該親のフィターゼ酵素が
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）工程（Ａ）において得られた変異されたＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
ｃ）該親フィターゼ酵素に比較して：
ｉｖ．より高い熱安定性および／または
ｖ．より高い比活性＊および／または
ｖｉ．より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および／または
ｅ）該宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィターゼ、フィターゼのヌクレオチド配列、フィターゼの産生方法、およびそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、飼料への添加のための分野に関する。さらに詳細には、本発明は、食物および動物の飼料におけるリン酸塩消化を増強するために用いられ得るフィターゼに関する。
【背景技術】
【０００３】
（技術的な背景および先行技術）
フィターゼは、穀類およびマメ類におけるリンの主要な貯蔵形態である。しかし、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物は、フィターゼ（またはフィチン酸）を代謝も吸収もできず、従ってこれが排出されて、集中的な家畜生産の地方ではリン汚染がもたらされる。さらに、フィチン酸はまた、カルシウム、銅および亜鉛のような金属因子をキレートすることによって、単胃動物における抗栄養剤として機能する。
【０００４】
これらの動物の成長および健康のために十分なリン酸塩を提供するためには、無機リン酸塩がそれらの食餌に添加される。このような添加は、費用がかさみ、そして汚染の問題をさらに拡大し得る。
【０００５】
フィチン酸塩は、フィターゼによって変換されるが、フィターゼとは一般に、フィチン酸塩の低級なイノシトール−リン酸塩および無機リン酸塩への加水分解を触媒する。フィターゼは動物の食餌への添加物として有用であり、ここでそれらはその動物に対する有機リンのアベイラビリティーを改善し、環境のリン酸塩汚染を低減する（非特許文献１）。
【０００６】
真菌起源の（非特許文献２〜４）および細菌起源の（非特許文献５〜１０）多数のフィターゼが文献に記載されている。
【０００７】
しかし、今日まで、これらのフィターゼで、動物飼料の補充物としての有効な使用のために必要な特性を示すものはない。詳細には、真菌のフィターゼは、タンパク質分解性に不安定である傾向であり（非特許文献１１）、従って、変性の影響を受け易いが、ほとんどの細菌のフィターゼは、フィチン酸塩のみに狭い基質特異性を有し、そしてイノシトールリン酸塩の分解が中間程度のリン酸化というように劣っている（非特許文献５、１２）。
【非特許文献１】Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ  ＲＪ，Ｕｌｌａｈ  ＡＨ．，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６年，第４２巻，ｐ．２６３−３０２
【非特許文献２】Ｗｙｓｓ  Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第６５巻，第２号，ｐ．３６７−３７３
【非特許文献３】Ｂｅｒｋａ  Ｒ．Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４巻，第１１号，ｐ．４４２３−４４２７
【非特許文献４】Ｌａｓｓｅｎ  Ｓ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１年，第６７巻，第１０号，ｐ．４７０１−４７０７
【非特許文献５】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９３年，第３０３巻，第１号，ｐ．１０７−１１３
【非特許文献６】Ｋｅｒｏｖｕｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４巻，第６号，ｐ．２７０９−２０８５
【非特許文献７】Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第２５巻，ｐ．１２３１−１２３４
【非特許文献８】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９７年，第３４１巻，第２号，ｐ．２０１−２０６
【非特許文献９】Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｊ．ら，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６年，第１８巻，ｐ．４４９−４５４
【非特許文献１０】Ｚｉｎｉｎ  Ｎ．Ｖ．ら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４年，第２３６巻，ｐ．２８３−２９０
【非特許文献１１】Ｉｇｂａｓａｎ  Ｆ．Ａ．ら，ＡＲｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．，２０００年，第５３巻，ｐ．３５３−３７３
【非特許文献１２】Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２０００年，第３５２巻，ｐ．６２３−６２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、改良されたフィターゼが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
広範な局面において、本発明は、細菌由来のフィターゼおよびその改変型に関する。詳細には、本発明は、細菌であるＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来の野性型フィターゼに、そして野性型酵素に比較して改善された特徴を示すそれらの改変体型／修飾型に関する。
【００１０】
本発明は、新規なフィターゼであって、飼料用酵素として特に有用にかつ効果的にする特性を有するフィターゼを提供するので有利である。詳細には、本発明は、本明細書に記載のような単離されるか、および／もしくは精製された新規なフィターゼポリペプチド、またはその機能的なフラグメントもしくは改変体型もしくは修飾型に関する。本発明はまた、このようなフィターゼをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供する。
【００１１】
食物および動物の飼料に対する酵素添加物として有効であるように、フィターゼは多数の異なる特性を組み合わせなければならない。動物の胃の酸性環境においてフィチン酸を分解できるためには、これは低いｐＨにおいて、好ましくは広範なｐＨの値にまたがって活性でなければらない。さらに、好ましくは飼料ペレットのような飼料の調製に通常使用される高温に対してタンパク質が耐え得るように高い比活性および高い熱安定性を有さなければならない。
【００１２】
酵素が広範な基質特異性を有しており、フィターゼを加水分解するだけでなく、イノシトール五リン酸、四リン酸および三リン酸のようなフィターゼ分解の中間産物も分解することを可能にすることがまた重要である。ブタでのフィターゼ分解の研究によって、これらのイノシトール五リン酸は、そうでなければ小腸および大腸においてかなり不溶性のままであり、従って、動物および腸のミクロフローラによって生成されるアルカリホスファターゼに対して近づきがたいことが示される（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ  Ｕら、Ａｒｃｈ．Ａｎｉｍ．Ｎｕｔｒ．５５，２５５〜２８０（２００１））。異なる酵素の基質特異性プロフィールにおける変動は同定されている。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のフィターゼによって生成されたイノシトール−三リン酸は、この酵素によるさらなる加水分解に対して本質的に耐性である（Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００３５２，６２３〜６２８）。
【００１３】
本発明の別の局面では、本明細書に記載される新規なフィターゼまたはその改変型を含むプラスミド、またはベクター系、または形質転換された生物体もしくはトランスジェニック生物体が提供される。
【００１４】
別の局面では、本発明は、本明細書に記載されるような新規なフィターゼまたはその改変型を発現するように改変され、従って、フィターゼを産生し得るトランスジェニック生物体に関する。本発明はさらに、フィターゼの生物技術学的な産生および食餌補充物としてのそれらの使用のための手段および方法を提供する。
【００１５】
本発明の局面は、請求項に、そして以下の注釈に提示されている。
【００１６】
参照を容易にするために、本発明のこれらおよびさらなる局面をここで、適切な見出しのもとで考察する。しかし、各々のセクションにおける教示は必ずしも、各々の特定のセクションには限定されない。
【００１７】
本発明に対する言及として用いる場合、「生成する、産生する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」、「生成すること、産生すること（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「生成された、産生された（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）」、「生成可能な（ｐｒｏｄｕｃｅａｂｌｅ）」、「生成、産生（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、それぞれの用語「調製する（ｐｒｅｐａｒｅ）」、「調製すること、調製する工程（ｐｒｅｐａｒｉｎｇ）」、「調製された（ｐｒｅｐａｒｅｄ）」、「調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、「生成された（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）」、「生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」および「調製可能な（ｐｒｅｐａｒａｂｌｅ）」と同義である。
【００１８】
本発明の言及で用いる場合、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」、「ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ（発現された）」、および「発現可能な（ｅｘｐｒｅｓｓａｂｌｅ）」という用語は、それぞれ「転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）」、「転写する（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｓ）」、「転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）」および「転写可能な（ｔｒａｎｓｃｒｉｂａｂｌｅ）」という用語と同義である。
【００１９】
本発明に対する言及で用いる場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、宿主、宿主細胞、組織または器官への核酸配列の導入の方法をいう。
【００２０】
本発明において用いられ得るヌクレオチド配列に関与する他の局面は以下を含む：本発明の配列を含む構築物；本発明における使用のための配列を含むベクター；本発明における使用のための配列を含むプラスミド；本発明における使用のための配列を含む形質転換された細胞；本発明における使用のための配列を含む形質転換された組織；本発明における使用のための配列を含む形質転換された器官；本発明における使用のための配列を含む形質転換された宿主；本発明における使用のための配列を含む形質転換された生物体。本発明はまた、宿主細胞における発現のような、これらを用いる本発明における使用のためのヌクレオチド配列を発現する方法を包含する；これには、これらを移入するための方法を包含する。本発明は、宿主細胞からの単離のような、ヌクレオチド配列を単離する方法をさらに包含する。
【００２１】
本発明における使用のためのアミノ酸配列に関する他の局面は以下を包含する：本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードする構築物；本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードするベクター；本発明における使用のためのアミノ酸配列をコードするプラスミド；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された細胞；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された組織；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された器官；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された宿主；本発明における使用のためのアミノ酸配列を発現する形質転換された生物体。本発明はまた、宿主細胞における発現のように、これらを用いて本発明における使用のためのアミノ酸配列を精製する方法を包含し、この方法は、これらを移入し、次いでこの配列を精製する方法を包含する。
【００２２】
配列番号１は、細菌株の同定のために得た配列を列挙する。
【００２３】
配列番号２は、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来のフィターゼ遺伝子を含む配列を列挙する。
【００２４】
配列番号３は、フィターゼ遺伝子Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２のアミノ酸配列を列挙する。
【００２５】
（発明の詳細な開示）
本発明は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼまたはその改変型、改変体、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントに相当するアミノ酸配列を含む酵素を特徴とする。
【００２６】
「フィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）」という用語は、フィチン酸塩を含むリン酸のエステルの加水分解を触媒し得、かつ無機のリン酸塩を遊離し得るタンパク質またはポリペプチドを意味する。フィターゼは、フィチン酸塩に加えて、中程度のリン酸化の少なくともいくつかのイノシトールリン酸塩を加水分解し得る。
【００２７】
「Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼに相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ｐｈｙｔａｓｅ）」という用語は、この酵素がＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉの供給源から得られている必要はないことを意味する。そうではなく、この酵素は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼのものと本質的に同じ機能的な特徴または配列を有さなければならない。
【００２８】
「その機能的な等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｈｒｅｏｆ）」という用語は、この酵素が野性型のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼのものと本質的に同じ機能的な特徴を有さなければならないことを意味する。「改変型、修飾型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｏｒｍ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、この酵素が、そのもとの形態から改変されているが、野性型のＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼのものと本質的に同じ酵素的な機能の特徴を保持していることを意味する。詳細には、「改変体」または「修飾型、改変型」という用語は、親／野性型のフィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有し、かつ、まとめて変異と呼ばれる、１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を有するフィターゼ酵素を包含する。改変型または改変体は、親の酵素と比較して酵素特徴が変更され得る。好ましくは、改変型または改変体は、向上した熱安定性、ペプシン安定性の増大、非活性の増大、より広範な基質特異性または酵素の適用のために有利である他の改変を有する。この「機能的な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」または「有効な（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」フラグメントという用語は、本質的に同じ酵素の機能または効果を保持するＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼのフラグメントまたは部分を意味する。
【００２９】
好ましくは本発明のこの局面の酵素は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼのものと同じ配列または少なくとも７５％同一（相同）である配列を有する。
【００３０】
適切には、この酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％同一性（相同性）を有する配列、またはその機能的なフラグメントを含む、好ましい実施形態では、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％同一性（相同性）を有する配列、またはその有効なフラグメントを有する、単離および／または精製されたポリペプチドを提供する。
【００３１】
別の実施形態では、このフィターゼは、アクセッション番号ＮＣＩＭＢとして寄託されたＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２株由来であるという点で特徴付けられる。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の第一の局面の任意の実施形態によるフィターゼであって、以下の位置（配列番号３におけるナンバリングに従って番号付けしている）において１つ以上の変異を含む、フィターゼに関する：
２２、２３、２４、２８、４６、５３、５７、６７、７４、７５、７７、７８、７９、８２、８８、９５、９６、９７、９８、１０１、１０２、１０３、１０５、１０９、１１２、１２２、１２６、１３６、１４０、１４２、１４３、１４８、１５１、１５２、１５４、１５６、１６０、１６１、１６４、１６８、１７０、１７６、１７７、１９５、１９９、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２１５、２２４、２２５、２２９、２３３、２３５、２７４、２７９、２８８、３０１、３０７、３０８、３２２、３４３、３５８、３６０、３６２、３６５、３６６、３６７、３７０、３８３、３８４、３８５、３８６、３９１、３９３、３９５、３９７、４０８、および４１４。
【００３３】
これらの位置は、これらの位置での酵素の突然変異誘発が、所望の酵素特徴において改善をもたらすという点で特徴付けられる。
【００３４】
好ましい変異としては以下が挙げられる：
Ａ２２Ｔ、Ｅ２３Ｋ、Ｅ２３Ｑ、Ｅ２４Ｄ、Ｍ２８Ｌ、Ｋ４６Ｅ、Ｋ４６Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｎ、Ｄ５７Ｙ、Ｇ６７Ｒ、Ｇ７４Ｒ、Ｅ７５Ｋ、Ｅ７５Ｖ、Ｖ７７Ｉ、Ｓ７８Ｔ、Ｅ７９Ｖ、Ｑ８２Ｈ、Ｑ８２Ｋ、Ｑ８２Ｒ、Ｆ８８Ｙ、Ｎ９５Ｄ、Ｎ９５Ｐ、Ｎ９６Ｐ、Ｎ９６Ｓ、Ｎ９６Ｙ、Ｑ９７Ｔ、Ｔ９８Ｇ、Ｔ９８Ｐ、Ｓ１０１Ｆ，Ｐ１０２Ｌ、Ｇ１０３Ｅ、Ｖ１０５Ｉ、Ａ１０９Ｔ、Ｄ１１２Ｖ、Ｄ１１２Ｙ、Ｆ１２２Ｙ、Ｌ１２６Ｉ、Ｙ１３６Ｎ、Ｅ１４０Ｖ、Ｋ１４２Ｒ、Ｔ１４３Ｉ、Ｔ１４３Ｐ、Ｎ１４８Ｄ、Ｋ１５１Ｇ、Ｍ１５２Ｋ、Ｍ１５２Ｖ、Ｔ１５４Ｉ、Ｓ１５６Ｔ、Ｌ１６０Ｆ、Ｋ１６１Ｎ、Ｎ１６４Ｄ、Ｅ１６８Ｄ，Ａ１７０Ｔ、Ｌ１７６Ｑ、Ｌ１７６Ｖ、Ｙ１７７Ｅ、Ｓ１９５Ｔ、Ｔ１９９Ｉ、Ｔ２０３Ｉ、Ｔ２０３Ｌ、Ｔ２０３Ｓ、Ｔ２０３Ｗ、Ｅ２０４Ａ、Ｅ２０４Ｇ、Ｅ２０４Ｈ、Ｅ２０４Ｉ、Ｅ２０４Ｎ、Ｅ２０４Ｒ、Ｅ２０４Ｖ、Ｋ２０５Ｐ、Ｋ２０５Ｒ、Ｓ２０６Ｒ、Ｓ２０６Ｔ、Ｔ２０７Ａ、Ｔ２０７Ｓ，Ｌ２１５Ｆ、Ｄ２２４Ｈ、Ｎ２２５Ｄ，Ｎ２２５Ｅ、Ｐ２２９Ｓ、Ｓ２３３Ｃ、Ｓ２３５Ａ、Ｑ２７４Ｈ、Ｑ２７４Ｌ、Ｑ２７９Ｅ，Ｒ２８８Ｍ、Ｌ３０１Ｓ、Ｅ３０７Ｙ、Ｎ３０８Ｄ，Ｎ３０８Ｔ、Ａ３２２Ｖ、Ｇ３４３Ａ、Ｋ３５８Ｒ、Ｋ３６０Ｎ、Ｔ３６２Ａ、Ｔ３６２Ｉ、Ｎ３６５Ｄ、Ｔ３６６Ｓ、Ｄ３６７Ｎ、Ｑ３７０Ｈ、Ｄ３８３Ｖ、Ｉ３８４Ｆ、Ｉ３８４Ｌ，Ｉ３８４Ｍ、Ｑ３８５Ｒ、Ｐ３８６Ｑ，Ｋ３９１Ｎ、Ａ３９３Ｐ、Ｋ３９５Ｔ、Ｄ３９７Ｎ、Ｓ４０８ＩおよびＬ４１４Ｉまたは各々の位置での保存的変異。
【００３５】
「保存的変異（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」とは、示されたアミノ酸残基に比べてアミノ酸の特徴に関して保存的であるアミノ酸残基に対する変異を意味する。アミノ酸の特徴としては、当該分野で公知であり、そして詳細には以下に記載される、残基のサイズ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値、および他のアミノ酸特徴が挙げられる。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、この変異は、以下の位置の１つ以上である：
２３、４６、５３、７５、８２、８８、９５、９６、９８、１１２、１４３、１５２、１７６、１７７、１９９、２０３、２０４、２０５、２２５、２２９、２３３、２７４、２８８、３０７、３０８、３６２、３７０、３８４および３８５。
【００３７】
これらの特定の位置での好ましい変異としては以下が挙げられる：
Ｅ２３Ｋ、Ｅ２３Ｑ、Ｋ４６Ｅ、Ｋ４６Ｒ、Ｄ５３Ｋ、Ｄ５３Ｎ、Ｅ７５Ｋ、Ｅ７５Ｖ、Ｑ８２Ｈ、Ｑ８２Ｋ、Ｑ８２Ｒ、Ｆ８８Ｙ、Ｎ９５Ｄ、Ｎ９５Ｐ、Ｎ９６Ｐ、Ｎ９６Ｓ、Ｎ９６Ｙ、Ｔ９８Ｇ、Ｄ１１２Ｖ、Ｄ１１２Ｙ、Ｔ１４３Ｉ、Ｔ１４３Ｐ、Ｍ１５２Ｋ、Ｍ１５２Ｖ、Ｌ１７６Ｑ、Ｌ１７６Ｖ、Ｙ１７７Ｆ、Ｔ１９９Ｉ、Ｔ２０３Ｉ、Ｔ２０３Ｌ、Ｔ２０３Ｓ、Ｔ２０３Ｗ、Ｅ２０４Ａ、Ｅ２０４Ｇ、Ｅ２０４Ｈ、Ｅ２０４Ｉ、Ｅ２０４Ｎ、Ｅ２０４Ｒ、Ｅ２０４Ｖ、Ｋ２０５Ｐ、Ｋ２０５Ｒ、Ｎ２２５Ｄ、Ｎ２２５Ｅ、Ｐ２２９Ｓ、Ｓ２３３Ｃ、Ｑ２７４Ｈ、Ｑ２７４Ｌ、Ｒ２８８Ｍ、Ｅ３０７Ｙ、Ｎ３０８Ｄ、Ｎ３０８Ｔ、Ｔ３６２Ａ、Ｔ３６２Ｉ、Ｑ３７０Ｈ、Ｉ３８４Ｆ、Ｉ３８４Ｌ，Ｉ３８４Ｍ、およびＱ３８５Ｒまたは各々の位置での保存的変異。
【００３８】
１実施形態では、以下からなる群より選択される１つの変異を含む、フィターゼが提供される：
Ｐ２２９Ｓ；Ｄ１１２Ｖ；Ｑ８２Ｒ；Ｑ２７４Ｈ；Ｄ１１２Ｙ；Ｆ８８Ｙ；Ｋ４６Ｅ；Ｓ２３３Ｃ；Ｒ２８８Ｍ；Ｉ３８４Ｌ；Ｑ３８５Ｒ；Ｑ２７４Ｌ；Ｅ３０７Ｙ；Ｔ１９９Ｉ；Ｑ８２ＫおよびＴ２０３Ｉ。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態では、以下からなる群より選択される変異の組み合わせを含むフィターゼが提供される：
【００４０】
【化４−１】
2008515401.tif 000003
【００４１】
【化４−２】
2008515401.tif 000004
さらに好ましい実施形態では、以下からなる群より選択される変異の組み合わせを含むフィターゼが提供される：
【００４２】
【化５】
2008515401.tif 000005
従って、本発明に従う好ましいフィターゼは、配列番号３として列挙されたアミノ酸配列からなり、かつ上記で列挙された１つ以上のアミノ酸変異または上記で列挙された変異の組み合わせの１つを有する改変体である。
【００４３】
これらの実施形態では、この命名法は、配列番号３におけるアミノ酸の位置を参照することによって示される変異を有する、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むフィターゼを示す。この命名法は、下に詳細に記載される。
【００４４】
適切には、これらの改変体は、以下の任意の１つに関して改善された特徴を示す：温度安定性、ｐＨ範囲、ペプシン安定性、比活性、基質特異性。これらの特徴を決定するための適切な方法は本明細書に開示される。
【００４５】
詳細には、フィターゼの特徴における改善は、飼料補充物としての使用に特に適切である改善された改変体を作製する、食物および飼料の処理条件下での酵素安定性に、胃の通過の間の酵素安定性に、そしてヒトまたは動物の胃および／または腸管における酵素活性および安定性に関する。従って、このような改善は、パラメーターのなかでもとりわけ、上昇した温度、好ましくは６５℃を上回る温度での安定性の増大、タンパク質分解性の消化、好ましくは腸管のプロテアーゼに対する安定性の増大、低いｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満での触媒活性の増大、およびフィターゼからのフィターゼからの遊離リン酸基の一般的な有効性を含む。
【００４６】
適切には、１実施形態では、本発明のフィターゼまたは機能的な等価物は、このフィターゼが１０００Ｕ／ｍｇ以上の比活性をし、この比活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられる。別の実施形態では、本発明のフィターゼまたはその機能的な等価物はまた適切には、このフィターゼがｐＨ３およびｐＨ４〜４．５の周囲で２つの最大活性を有し、この活性が、２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に含有される、２ｍＭのフィターゼ、０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含有する溶液中でこのフィターゼをインキュベートすることによって決定されるという点で特徴付けられ得る。
【００４７】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
ａ）親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が：
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも１つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および／または
ｄ）フィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
【００４８】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を調製する方法を提供し、この方法は以下を包含する：
ａ）親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発に供する工程であって、この親のフィターゼ酵素が
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）工程（Ａ）において得られた変異されたＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉｖ．より高い熱安定性および／または
ｖ．より高い比活性＊および／または
ｖｉ．より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および／または
この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と。
【００４９】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する、本発明の上記実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、より高い熱安定性についてスクリーニングされる。
【００５０】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する、本発明の上記実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、より高い熱安定性およびより高いタンパク質分解安定性についてスクリーニングされる。
【００５１】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法に関する、本発明の上記実施形態では、このフィターゼ酵素改変体は好ましくは、より高い熱安定性およびより高いタンパク質分解安定性およびより高い比活性についてスクリーニングされる。
【００５２】
親のフィターゼ酵素は好ましくは、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来、より好ましくはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来である。
【００５３】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法であって、親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を突然変異誘発に供する工程を含む方法においては、親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を、好ましくはランダム変異導入法に、さらに好ましくはエラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲに、それよりさらに好ましくはエラー限界値（ｅｒｒｏｒ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）ＰＣＲに供する。
【００５４】
親フィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の突然変異誘発の好ましい方法はエラープローンＰＣＲ、より好ましくはエラー限界値ＰＣＲであり、突然変異誘発の他の方法は、エラープローン／限界値ＰＣＲの代わりに、またはエラープローン／限界値ＰＣＲと組み合わせて用いられ得る。適切なエラープローンＰＣＲおよびエラー限界値ＰＣＲ方法についての参照を提供する実施例１２を参照のこと。他の方法は、下で開示される。
【００５５】
「フィターゼ酵素改変体を調製する方法」をいう、この実施形態の文脈で用いられる場合、「宿主細胞での発現」という用語は、好ましくは、本明細書に規定されるような生きている生物体、器官または細胞におけるフィターゼ酵素改変体の産生として規定される。しかし、選択の目的のために、フィターゼ酵素改変体はまた、１つ以上の生存している生物体から単離された１つ以上の細胞から単離された転写物および翻訳機構を利用するインビトロの方法を介して生成されてもよいとみなされる。本発明の改変体フィターゼのこのようなインビトロ産生はまた、好ましい改変体フィターゼを選択するために用いられ得る。インビトロ発現は適切には、標準的な技術を用いて行われ得る。参照については、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃから入手可能な「インビトロ発現ガイド（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ）」を参照のこと（Ｐａｒｔ＃ＢＲ０５３）。
【００５６】
（改変体の表現型の定義）
より高い熱安定性（熱安定性相違）を有する改変体は好ましくは、実施例１２に開示される方法を用いて決定される。
【００５７】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法によって調製される改変体フィターゼ酵素は好ましくは、少なくとも１．５、より好ましくは２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、最も好ましくは少なくとも１０の熱安定性の相違を有する。
【００５８】
より高いタンパク質分解安定性を有する改変体は好ましくは、実施例１２に開示される方法によって決定される。
【００５９】
好ましくは、本発明のフィターゼ酵素改変体は、少なくとも４５％、好ましくは５０％、５５％、より好ましくは、少なくとも６０％のタンパク質分解性の安定性を有する。
【００６０】
（さらなる改変体実施形態）
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供する。
ａ）親のフィターゼ酵素を選択する工程であって、この親のフィターゼ酵素が：
ｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｉ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）この親のフィターゼ酵素におけるアミノ酸残基の挿入、欠失または置換である少なくとも１つの変更を作製して、フィターゼ酵素改変体を得る工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｉ．より高い熱安定性および／または
ｉｉ．比活性および／または
ｉｉｉ．タンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体をスクリーニングする工程と、および／または
ｄ）フィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
ｅ）調製されたこのフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程。
【００６１】
さらなる実施形態では、本発明は、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料の調製のための方法を提供する。
ａ）親のフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を、突然変異誘発に供する工程であって、この親のフィターゼ酵素が
ｉｉｉ．配列番号３に対して少なくとも７５％の相同性である親のフィターゼ酵素
ｉｖ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．由来の親のフィターゼ酵素
から選択される工程と、
ｂ）工程（Ａ）において得られた変異されたＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させる工程と、
ｃ）この親フィターゼ酵素に比較して：
ｖｉｉ．より高い熱安定性および／または
ｖｉｉｉ．より高い比活性＊および／または
ｉｘ．より高いタンパク質分解安定性
を有するフィターゼ酵素改変体を発現する宿主細胞をスクリーニングする工程と、
および／または
ｄ）この宿主細胞によって発現されるフィターゼ酵素改変体を調製する工程と、
ｆ）この調製されたフィターゼ酵素改変体を動物飼料に添加する工程。
【００６２】
フィターゼ酵素改変体を調製する方法の好ましい局面はまた、フィターゼ酵素改変体を含む動物飼料を調製する上記の方法にあてはまる。
【００６３】
別の局面では、本発明は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼ、またはそのホモログに相当するアミノ酸配列を含む酵素をコードする、単離されるか、および／または精製された核酸分子またはヌクレオチド配列を提供する。適切には、この単離されるか、および／または精製された核酸分子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列、もしくはその有効なフラグメントを含む、ポリペプチドをコードする。１実施形態では、この核酸分子は、配列番号３を含むポリペプチドをコードし、本明細書に列挙される好ましい位置での変異体を、または本明細書に列挙される任意の特定の変異体もしくは変異体の組み合わせを含む。別の実施形態では、本発明は、配列番号２の任意の配列と同じであるか、もしくはそれに相補的であるか、もしくは配列番号２の任意の配列の任意の適切なコドン置換を含むヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、ヌクレオチド配列を含む、単離されるかおよび／または精製された核酸分子を提供する。
【００６４】
なおさらなる局面では、本発明は、以下のように示されるヌクレオチド配列に、そしてヌクレオチド配列の使用に関する：
（ａ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントであるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体であるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントに対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の相補体であるヌクレオチド配列；
（ｉ）配列番号２に示されるヌクレオチド配列の相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列；
（ｊ）配列番号２として示されるヌクレオチド配列の改変体、ホモログ、誘導体またはフラグメントの相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列。
【００６５】
本発明のヌクレオチド配列は、配列番号３またはその改変体、改変型、ホモログもしくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。
【００６６】
詳細には、本発明は、本明細書に記載されるようなフィターゼ、またはそのホモログもしくは誘導体を含むプラスミドまたはベクター系を提供する。好ましくはこのプラスミドまたはベクター系は、配列番号２に示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％相同性である配列もしくはその有効なフラグメントを含む。適切には、このプラスミドまたはベクター系は、配列番号２に示される核酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％相同性（同一）である配列によってコードされる任意の酵素の微生物中での発現のための発現ベクターである。さらに、本発明は、任意の改変された酵素または本明細書に記載される改変体の発現のためのプラスミドまたはベクター系を提供する。適切な発現ベクターは本明細書に記載される。
【００６７】
本発明の別の局面では、本明細書において上記されるようなフィターゼをコードする核酸で形質転換されるか、またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。
【００６８】
適切には、本発明のこの局面に従う宿主細胞は、フィターゼを含み、このフィターゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列もしくはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同である配列を含む。
【００６９】
好ましい実施形態では、この宿主細胞は、フィターゼを生成する。
【００７０】
本発明の更なる局面では、本発明に従うフィターゼをコードする核酸で形質転換されるか、またはトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。好ましくは、このフィターゼは、本明細書において記載されるようなＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼ、またはそのホモログもしくは誘導体である。適切には、このフィターゼ酵素は、配列番号３のいずれかに示されるアミノ酸配列またはその機能的なフラグメント、またはそれに対して少なくとも７５％相同（同一）である配列を含む。好ましくは、この宿主細胞は、フィターゼを生成する。
【００７１】
１実施形態では、本発明において用いられ得るヌクレオチド配列は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉから得ることができる（ただし実際にそれが得られる必要は無い）が、等価な株から単離されるか、および／または精製された酵素は等しく用いられ得ることが理解される。
【００７２】
適切には、宿主細胞は、細菌を含む微生物および酵母を含む真菌由来である。特に好ましい実施形態では、この宿主細胞は、原核生物細菌細胞である。適切な細菌宿主細胞としては、プロテオバクテリアを含む種々の原核生物分類群由来の細菌が挙げられ、これには、α、β、γ、δ、およびεの亜門のグラム陽性の細菌のメンバー、例えば、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、フィルミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）および関連のもの、フラボバクテリウム、シアノバクテリア、緑色イオウ細菌、緑色非イオウ細菌および古細菌が挙げられる。特に好ましいのは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、γ亜門に属するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉプロテオバクテリア、および低ＧＣ−グラム陽性細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓである。
【００７３】
適切な真菌宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、ＨａｎｓｅｎｕｌａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含むアナモルフィックな（ａｎａｍｏｒｐｈｉｃ）Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａからなる群より選択される酵母が挙げられる。
【００７４】
他の適切な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞、例えばＳＦ９、ＳＦ２１、ＴｒｙｃｈｐｌｕｓｉａｎｉおよびＭ１２１細胞が挙げられる。例えば、本発明によるポリペプチドは、昆虫細胞系において有利に発現され得る。培養中での昆虫細胞における発現と同様に、フィターゼ遺伝子は、昆虫の生物体丸ごとにおいて発現され得る。バキュロウイルスのようなウイルスベクターは、昆虫全体へ感染し得る。大型の昆虫、例えば、カイコは、高い収率の異種タンパク質を供給する。このタンパク質は、従来の抽出技術に従って昆虫から抽出され得る。本発明における使用のために適切な発現ベクターとしては、昆虫細胞株において外来のタンパク質を発現可能である全てのベクターが挙げられる。
【００７５】
他の宿主細胞としては、プロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、胚珠、接合子などからなる群より選択された植物細胞が挙げられる。本発明はまた、形質転換されておりかつ本発明の組み換えＤＮＡを含む植物丸ごとを提供する。
【００７６】
「植物（ｐｌａｎｔ）」という用語は一般に、真核性藻類、有胚植物を含み、これには、コケ植物、シダ植物および種子植物、例えば、裸子植物および被子植物が挙げられる。
【００７７】
好ましくは、このような宿主細胞は微生物である。好ましい微生物としては、原核生物の細菌細胞、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ属の他の種、酵母、好ましくは、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅが挙げられる。
【００７８】
本発明の別の局面では、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｓｏｋｅｒｉｔｅｈｔａａｎｔｉｅ  ２０，ＦＩＮ−０２４６０  Ｋａｎｔｖｉｋ、Ｆｉｎｌａｎｄにアクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４７として寄託された細菌細胞の株Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２が提供される。このような細胞は、飼料に直接組み込まれてもよい。
【００７９】
別の局面では、本発明に従う発現ベクターまたはプラスミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトする工程と、この宿主細胞をフィターゼの発現のための条件下で培養する工程と、このフィターゼを宿主細胞培養培地から抽出する工程とを包含する、フィターゼの産生のための方法が提供される。
【００８０】
適切には、この方法は、配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の相同性を有する配列、またはその有効なフラグメントを宿主細胞中で発現する工程と、この宿主細胞培養培地から分泌されたタンパク質を抽出する工程とを包含する、フィターゼの産生のための方法である。
【００８１】
本発明の別の局面は、本発明に従うフィターゼを含む飼料組成物を提供する。好ましくは、この飼料組成物は、飼料１ｋｇあたり１０〜１００００Ｕ、好ましくは２００〜２０００Ｕ、さらに好ましくは５００〜１０００Ｕの濃度でフィターゼを含む。
【００８２】
１実施形態では、この飼料組成物は、本発明に従う宿主細胞を含む。
【００８３】
さらなる局面では、食料または動物飼料における本発明に従うフィターゼの使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
（好ましい局面）
好ましい局面は、添付の特許請求の範囲に、そして以下の詳細な説明および実施例のセクションに示される。
【００８５】
（さらなる利点）
本発明は、動物飼料に対する添加物としてフィターゼを特に有用にさせる、多数の特性を有するフィターゼを提供するので有利である。
【００８６】
詳細には、本発明のフィターゼは、低いｐＨで、そして好ましくは、ｐＨ２〜５．５の範囲で、活性でありｐＨ３および４．５の周囲で活性が最大である。適切には、本発明のフィターゼは、胃の環境の低いｐＨで活性である。
【００８７】
さらに、本発明のフィターゼは、天然の宿主において、そして異種発現の間に効率的に分泌され、これによって、飼料への添加のための、より効率的な産生および単離がもたらされる。
【００８８】
さらに、本発明のフィターゼは、五−、四−、三−、および二−リン酸塩基質を含む、広範な基質特異性を有し、それによって動物にとって利用可能な総リン酸塩が増大する。本発明のフィターゼはまた、１０００Ｕ／ｍｇ＋／−約１０％という領域で高い非活性を有する。
【００８９】
本発明の生成物は、食料および飼料に対する添加物／補充物として用いられ得る。この生成物はまた、種々のイノシトール−リン酸塩の商業的な産生において有用であり得る。
【００９０】
（フィチン酸塩／フィチン酸／フィターゼ）
フィチン酸（ｍｙｏ−イノシトール六リン酸エステル）は、穀類、マメ科植物および脂肪種子の作物における重要な構成物である。塩型であるフィチン酸塩は、これらの植物におけるリンの主要な貯蔵形態である。
【００９１】
フィターゼは、段階的な形態のｍｙｏ−イノシトールの五−、四−、三−、二−および一リン酸エステルの形成、ならびに無機リン酸塩の遊離を生じるフィチン酸のリン酸モノエステル加水分解を触媒する。
【００９２】
本発明において用いられる場合、「野性型フィターゼ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「野性型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」という用語は、天然に見出されるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素をいう。
【００９３】
「フィターゼ改変体（ｐｈｙｔａｓｅ  ｖａｒｉａｎｔ）」または「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「改変型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｏｒｍ）」という用語は、まとめて「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」と呼ばれる、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する親のフィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素を指す。
【００９４】
「親のフィターゼ（ｐａｒｅｎｔ  ｐｈｙｔａｓｅ）」または「親の酵素（ｐａｒｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、フィターゼ改変体が由来するフィターゼ酵素をいう。親のフィターゼは、野性型フィターゼまたは別のフィターゼ改変体であってもよい。詳細には、本発明においては、「親のフィターゼ」は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来であってもよい。適切には、「親のフィターゼ」は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を好ましくは有する、本明細書に記載のようなＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ株Ｐ３−４２由来である。
【００９５】
（単離された）
１局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、単離型である。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、この配列が、この配列が天然には通常会合している、そして天然には見出されるような、少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【００９６】
（精製された）
１局面では、好ましくはヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、精製型である。「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、この配列が比較的純粋な状態である−例えば、少なくとも約９０％純粋、または少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【００９７】
（ヌクレオチド配列）
本発明の範囲は、本明細書に記載のような特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９８】
本明細書において用いる場合、用語「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、オリゴヌクレオチド配列、核酸またはポリヌクレオチド配列、ならびにその改変体、ホモログ、フラグメントおよび誘導体（例えば、その一部）をいう。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来または合成由来または組み換え由来であってもよく、これはセンス鎖を示そうとまたはアンチセンス鎖を示そうと、二本鎖であっても、または一本鎖であってもよい。
【００９９】
「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、本発明に関しては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。好ましくは、これは、本発明をコードするＤＮＡを、より好ましくはｃＤＮＡ配列意味する。
【０１００】
好ましい実施形態では、このヌクレオチド配列は、本発明の範囲に関連する場合、そして本発明の範囲自体によって包含される場合、本発明に従って天然のヌクレオチド配列を、その天然の環境にある場合、そして天然に関連する配列（単数または複数）であってその天然の環境にある配列に関連する場合は、含まない。言及を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を、「天然でないヌクレオチド配列（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」と呼ぶものとする。これに関しては、この「天然のヌクレオチド配列（ｎａｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、その天然の環境にあり、そして天然に関連するプロモーター全体に作動可能に連結され、このプロモーターがまたその天然の環境にある場合、ヌクレオチド配列全体を意味する。しかし、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物体におけるヌクレオチド配列の発現後に単離および／または精製され得る。しかし、好ましくは、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然の生物体におけるヌクレオチド配列であって、ただしその生物体が天然に関連しているプロモーターの制御下ではないヌクレオチド配列によって発現されてもよい。
【０１０１】
（ヌクレオチド配列の調製）
代表的には、本発明の範囲によって包含されるヌクレオチド配列または本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術（すなわち、組み換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかし、本発明の別の実施形態では、このヌクレオチド配列は、当該分野で周知の化学的方法を用いて、全体としてまたは部分的に合成されてもよい（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３およびＨｏｒｎ  Ｔら（１９８０）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２を参照のこと）。
【０１０２】
本明細書に規定されるような特異的な特性を有する酵素、または改変に適切である酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列を、このような酵素を産生する任意の細胞または生物体から同定および／または単離および／または精製してもよい。ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製のためには、種々の方法が当該分野で周知である。例えば、より多くの配列を調製するためにＰＣＲ増幅技術を一旦用いて、適切な配列を同定および／または単離および／または精製してもよい。
【０１０３】
さらなる例としては、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーが、この酵素を産生する生物体から、染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いて構築され得る。酵素のアミノ酸配列または酵素のアミノ酸配列の一部が既知である場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、用いて、この生物体から調製されたゲノムライブラリーから酵素をコードするクローンを同定してもよい。あるいは、別の公知の酵素と相同な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、酵素コードクローンを同定してもよい。後者の場合、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いる。
【０１０４】
あるいは、酵素をコードするクローンは、プラスミドのような発現ベクターにゲノムＤＮＡのフラグメントを挿入すること、得られたゲノムＤＮＡライブラリーで酵素陰性の細菌を形質転換すること、次いでこの形質転換された細菌をこの酵素の基質（例えば、ガラクトシダーゼ（マルターゼ）産生酵素についてはマルトース）を含む寒天プレート上にプレートすることによって同定されてもよく、これによってこの酵素を発現するクローンを同定することが可能になる。
【０１０５】
なおさらなる実施形態では、この酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，ｐ１８５９〜１８６９によって記載されるホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３，ｐ８０１〜８０５によって記載される方法によって合成的に調製されてもよい。ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザー中で合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクターにクローニングされる。
【０１０６】
ヌクレオチド配列は、混合されたゲノム由来および合成由来の配列であっても、混合された合成由来およびｃＤＮＡ由来であっても、または混合されたゲノム由来およびｃＤＮＡ由来であってもよく、標準的な技術に従って合成、ゲノムもしくはｃＤＮＡ由来（必要に応じて）のフラグメントを連結することによって調製されてもよい。各の連結されたフラグメントは、全体的なヌクレオチド配列の種々の部分に相当する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号に、またはＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７〜４９１）に記載のような、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製されてもよい。
【０１０７】
遺伝子コードの縮重に起因して、ヌクレオチド配列は容易に生成され得、ここでは、もとのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸のいくつかまたは全てについて三つ組みのコドン用法が変化されており、それによって、もとのヌクレオチド配列に対しては相同性が低いが、もとのヌクレオチド配列によってコードされるのと同じ、または改変体、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が生成される。例えば、ほとんどのアミノ酸について、遺伝子コードの縮重性は三つ組みコドンにおける三番目の位置（ゆらぎ位置）であり（参照については、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌｕｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−７１６７−１９２０−７を参照のこと）、従って、全ての三つ組みのコドンが三番目の位置で「ゆらいでいる（ｗｏｂｂｌｅｄ）」ヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列に対しては約６６％の同一性であるが、変更されたヌクレオチド配列は、もとのヌクレオチド配列と同じ、または改変体の一次アミノ酸配列をコードする。
【０１０８】
従って、本発明はさらに、三つ組みコドンをコードする少なくとも１つのアミノ酸の別の三つ組みコドン用法を有するが、もとのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列と同じ、または改変体、ポリペプチド配列をコードする、任意のヌクレオチド配列に関する。
【０１０９】
さらに、特定の生物体は代表的には、三つ組みコドンがアミノ酸をコードするために用いられるのに応じてバイアスを有する。好ましいコドン用法の表は、広範に利用可能であり、そしてコドン最適化遺伝子を調製するために用いられ得る。このようなコドン最適化技術は、異種の宿主における導入遺伝子の発現を最適化するために慣用的に用いられる。
【０１１０】
（分子進化）
一旦、酵素をコードするヌクレオチド配列が単離されるか、および／もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、選択されたヌクレオチド配列を改変することが所望され得る。例えば、配列を変異させて、本発明に従う改善された安定特徴を有する酵素を調製することが所望され得る。
【０１１１】
変異は、合成のオリゴヌクレオチドを用いて導入されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に開示される。酵素コードヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ１４７〜１５１）に記載される。
【０１１３】
部位特異的突然変異誘発の代わりに、上記のように、例えば、市販のキット、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ突然変異誘発キット、またはＣｌｏｎｔｅｃｈのＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲランダム変異突然変異誘発キットを用いて、変異をランダムに導入してもよい。
【０１１４】
新規な配列を得るための第三の方法は、多数の制限酵素（単数または複数）、例えば、Ｄｎａｓｅ  Ｉを用いることによって、同一でないヌクレオチド配列を断片化すること、および機能的なタンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再構築することである。あるいは、この全長ヌクレオチド配列の再構築の間に、１つまたは複数の同一でないヌクレオチド配列を用いて、変異を導入してもよい。
【０１１５】
これによって、ヌクレオチド配列に多数の部位特異的なまたはランダムな変異を、インビボまたはインビトロのいずれかで、生成すること、そして種々の手段によってこのコードされたポリペプチドの機能の改善について引き続きスクリーニングすることが可能である。
【０１１６】
非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の変異体または天然の改変体を、野性型または他の変異体または天然の改変体と組み換えて、新規な改変体を生成してもよい。このような新規な改変体はまた、コードされたポリペプチドの改善された機能についてスクリーニングされ得る。新規な好ましい改変体の生成は、当該分野で十分確立された種々の方法、例えば、エラー限界値突然変異誘発（Ｅｒｒｏｒ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＷＯ９２／１８６４５）、オリゴヌクレオチド媒介性ランダム突然変異誘発（米国特許第５，７２３，３２３号）、ＤＮＡシャッフリング（米国特許第５，６０５，７９３号）、エキソ媒介性遺伝子アセンブリ（ｅｘｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（ＷＯ００５８５１７）またはＰＣＲ（登録商標）Ｒｅｃｏｍｎｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（欧州特許１２３０３９０号および米国特許第６，８２１，７５８号）によって達成され得る。他の適切な方法は、例えば、ＷＯ０１３４８３５、ＷＯ０２／０９７１３０、ＷＯ０３／０１２１００、ＷＯ０３／０５７２４７、ＷＯ２００４／０１８６７４、米国特許第６，３０３，３４４号および米国特許第６，１３２，９７０号に記載される。
【０１１７】
上述の出願および類似の分子進化方法によって、タンパク質の構造または機能の先行技術の知識なしに、好ましい特徴を有する、本発明の酵素の改変体の同定および選択が可能になり、そして予測不能だが有益な変異または改変体の生成が可能になる。酵素活性の最適化または変更のためには当該分野において分子進化の適用の多数の例があり、このような例としては、限定はしないが、以下の１つ以上が挙げられる：宿主細胞における、またはインビトロにおける、最適化発現および／または活性、酵素活性の増大、基質および／または生成物特異性の変更、酵素のまたは構造の安定性の増大または減少、好ましい環境条件、例えば、温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変更。
【０１１８】
（アミノ酸配列）
本発明の範囲はまた、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列を包含する。
【０１１９】
本明細書において用いる場合、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「ポリペプチド」という用語および／または「タンパク質」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語と同義である。ある場合には、「アミノ酸配列（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、「酵素（ｅｎｚｙｍｅ）」と同義である。
【０１２０】
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製／単離されてもよいし、または合成的に作製されてもよいし、または組み換えＤＮＡ技術の使用によって調製されてもよい。
【０１２１】
本発明に包含される酵素は、他の酵素と組み合わせて用いられてもよい。従って、本発明はまた、酵素の組み合わせを包含し、この組み合わせは本発明の酵素および本発明に従う別の酵素であってもよい別の酵素を含む。この局面は後ろのセクションで考察される。
【０１２２】
好ましくは、本発明の範囲に関連している場合、および本発明の範囲自体によって包含される場合、このアミノ酸配列は、天然の酵素ではない。これに関して、「天然の酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、その天然の環境にあり、かつその天然のヌクレオチド配列によって発現されている場合、酵素全体を意味する。
【０１２３】
（改変体／ホモログ／誘導体）
本発明はまた、酵素の任意のアミノ酸配列の、またはこのような酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の改変体、ホモログおよび誘導体の使用を包含する。
【０１２４】
ここで、「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」という用語は、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」という用語は、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と同等であり得る。適切には、「ホモログ」とは、この状況では、下にさらに詳細に記載されるとおり、アラインメントアルゴリズムを用いてそれらの配列を整列させた後の２つの酵素の間の配列同一性の割合をいう。
【０１２５】
本発明の状況では、相同なアミノ酸配列は、この配列に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％の同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％の同一であり得るアミノ酸配列を含むものとする。代表的には、ホモログは、例えば、本発明のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮してもよいが、本発明の状況では、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１２６】
「機能的なフラグメント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、そのポリペプチドの特徴的な特性を保持するポリペプチドのフラグメントを意味する。本発明の状況では、フィターゼ酵素の機能的なフラグメントとは、タンパク質丸ごとのカロテノイド切断能力を保持するフラグメントである。
【０１２７】
本発明の状況では、相同なヌクレオチド配列とは、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（本発明の配列）に対して少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％同一である、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとする。代表的には、ホモログは、活性部位をコードする、本発明の配列と同じ配列などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮してもよいが、本発明の状況では、配列同一性の観点で相同性を表現することが好ましい。
【０１２８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列については、相同性比較は、肉眼で、またはさらに一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助によって行われてもよい。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列の間の相同性％を計算し得る。
【０１２９】
相同性％は、連続的な配列にまたがって算出され得、すなわち、１つの配列が他の配列と整列され、そして１つの配列における各々のアミノ酸が直接、他の配列における対応するアミノ酸、１残基とある時点で比較される。これは、「非ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。代表的には、このような非ギャップアラインメントは、比較的短い数の残基にまたがってのみ行われる。
【０１３０】
これは極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一対の配列において、１つの挿入または欠失は、次のアミノ酸残基がアラインメントから出されるようにさせ、これによって、可能性としては、全体的なアラインメントが行われる場合に相同性％の大きな低下を生じ得るということを考慮できない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に損なうことなく、可能な挿入および欠失を考慮する最適アラインメントを生成するように設計される。これは、局所相同性を最大化するように試みるために配列アラインメントにおいて「ギャップ（ｇａｐｓ）」を挿入することによって達成される。
【０１３１】
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントを生じる各々のギャップに対して「ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当て、その結果、同数の同一のアミノ酸について、できるだけギャップの少ない配列アラインメント（２つの比較配列の間の関連性がより高いことを反映する）は、多くのギャップで１よりも高いスコアを達成する。ギャップの存在について比較的高いコストおよびギャップにおける各々の引き続く残基についてより小さいペナルティーをチャージする、「アフィンギャップコスト（ａｆｉｉｎｅ  ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ）」が代表的には用いられる。これが、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然ながら、よりギャップの少ない最適化アラインメントを生じる。ほとんどのアラインメントプログラムによって、ギャップペナルティーが改変されることが可能になる。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウェアを用いる場合、デフォールト値を用いることが好ましい、例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列についてのデフォールトギャップペナルティは、ギャップについて−１２、そして各々の伸展について−４である。
【０１３２】
従って、最大相同性％の算出は最初に、ギャップペナルティーを考慮する最適アラインメントの生成を要する。このようなアラインメントを行う適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）。配列比較を行ない得る他のソフトウェアの例としては、限定はしないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方とも、オフラインおよびオンラインの検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。
【０１３３】
しかし、いくつかの適用については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる新規なツールもまた、タンパク質およびヌクレオチドの配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：１８７〜８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０１３４】
最終の相同性％が、同一性に関して測定され得るが、アラインメントプロセス自体は代表的には、オール・オア・ナッシングの対の比較には基づかない。代わりに、化学的な類似性または進化距離に基づいて各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、計測された類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。一般に用いられるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（プログラムのＢＬＡＳＴスイーツについてのデフォールトマトリックス）。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは一般に、供給された場合、公的なデフォールト値またはカスタム記号比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。いくつかの適用については、ＧＣＧパッケージについての公的なデフォールト値を、または他のソフトウェアの場合には、デフォールトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を用いることが好ましい。
【０１３５】
あるいは、相同性パーセントは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ  ７３（１），２３７〜２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において複数のアラインメント特徴を用いて算出され得る。
【０１３６】
一旦ソフトウェアが最適アラインメントを生成すれば、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することが好ましい。このソフトウェアは代表的には、これを配列比較の一部として行い、計算結果を得る。
【０１３７】
この配列はまた、サイレント変化を生じ、かつ機能的に等価な物質を生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有してもよい。意図的なアミノ酸置換は、アミノ酸特性（例えば、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質）の類似性に基づいてなされ得、従って、官能基においてアミノ酸をまとめてグループ分けするために有用である。アミノ酸は、それらの側鎖単独の特性に基づいて、まとめてグループ分けされてもよい。しかし、同様に変異データを含むことがさらに有用である。このように誘導されたアミノ酸のセットは、構造的な理由のために保存的であると考えられる。これらのセットは、Ｖｅｎｎダイアグラムの形態で記載され得る（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．およびＢａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５〜７５６（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）「Ｔｈｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５〜２１８）。保存的置換基は、例えば、アミノ酸の一般に受容されるＶｅｎｎダイアグラムグループ分けを記載する以下の表に従って行われてもよい。
【０１３８】
【化６】
2008515401.tif 000006
本発明はまた、保存的なまたは相同な置換基または変異を包含する（置換および置き換えは両方とも、既存のアミノ酸残基の別の残基での交換を意味するとして本明細書において用いられる）これは、すなわち、同種対同種の置換を生じ得る。従って、「保存的変異（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」という用語は、当業者が第一の変異に対して保存的であるとみなすアミノ酸変異をいう。この文脈における「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」とは、アミノ酸の特徴に関して保存的または不変であることを意味する。例えば、変異が、芳香族アミノ酸残基（例えば、Ｔｙｒ）の脂肪族のアミノ酸残基（例えば、Ｌｅｕ）での置換を特定の位置でもたらすならば、異なる脂肪族アミノ酸（例えば、ＩｌｅまたはＶａｌ）での同じ位置における置換は、保存的変異と呼ばれる。さらなるアミノ酸の特徴としては、当該分野で公知の残基のサイズ、疎水性、極性、電荷、ｐＫ値および他のアミノ酸特徴が挙げられる。従って、保存的変異としては、塩基と塩基、酸と酸、極性と極性などのような置換を挙げることができる。
【０１３９】
非保存的置換が生じてもよい、すなわち、１クラスの残基から、別のあるいは天然ではないアミノ酸、例えば、オルニチン（本明細書において以降ではＺと呼ばれる）、ジアミノ酪酸オルニチン（本明細書において以降ではＢと呼ばれる）、ノルロイシンオルニチン（本明細書において以降ではＯと呼ばれる）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンへの置換を含む。
【０１４０】
置き換えはまた、天然ではないアミノ酸によって行われてもよい。
【０１４１】
改変体アミノ酸配列は、グリシンまたはβアラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチルまたはプロピル基のようなアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含んでもよい。変動のさらなる形態は、１つ以上のアミノ酸残基のペプトイド型での存在に関与し、当業者によって良好に理解される。疑いを避けるために、「ペプトイド型（ｐｅｐｔｏｉｄ  ｆｏｒｍ）」とは、改変体アミノ酸残基をいうために用いられ、このα炭素置換基は、α炭素ではなく残基の窒素原子上にある。ペプトイド型でペプチドを調製するためのプロセスは、当該分野で公知である。例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０）、９３６７〜９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２〜１３４。
【０１４２】
（命名法）
本発明においては、アミノ酸残基についての従来の１文字および３文字コードを用いる。参照の容易さのために、酵素改変体における変異は、以下の命名法の使用によって記載する：親の酵素におけるアミノ酸残基；位置；置換アミノ酸残基（単数または複数）。この命名法に従って、例えば、２０位置でのアラニン残基のグリシン残基での置換は、Ａｌａ２０ＧｌｙまたはＡ２０Ｇと示される。同じ位置でのアラニンの欠失は、Ａｌａ２０＊またはＡ２０＊として示される。さらなるアミノ酸残基（例えば、グリシン）の挿入は、Ａｌａ２０ＡｌａＧｌｙまたはＡ２０ＡＧとして示される。アミノ酸残基の連続的ストレッチの欠失（例えば、位置２０のアラニンと位置２１のグリシンとの間）は、Δ（Ａｌａ２０−Ｇｌｙ２１）またはΔ（Ａ２０−Ｇ２１）と示される。親の酵素配列が、ナンバリングに用いられる酵素配列に比べて欠失を含む場合、このような位置での挿入（例えば、欠失位置２０でのアラニン）は、＊２０Ａｌａまたは＊２０Ａとして示される。複数の変異はプラスの記号またはスラッシュによって隔てられる。例えば、アラニンおよびグルタミン酸をグリシンおよびセリンで置換する位置２０および２１における２つの変異は、それぞれ、Ａ２０Ｇ＋Ｅ２１ＳまたはＡ２０Ｇ／Ｅ２１Ｓとして示される。所定の位置のアミノ酸残基が、２つ以上の別のアミノ酸残基で置換される場合、これらの残基は、コンマまたはスラッシュで隔てられる。例えば、グリシンまたはグルタミン酸のいずれかでの位置３０のアラニンの置換は、Ａ２０Ｇ，ＥまたはＡ２０Ｇ／Ｅ、またはＡ２０Ｇ、Ａ２０Ｅとして示される。改変に適切な位置が、示唆されている任意の特定の改変なしに本明細書において同定される場合、任意のアミノ酸残基が、この位置に存在するアミノ酸残基で置換され得ることが理解されるべきである。従って、例えば、位置２０におけるアラニンの改変を言及するが特定されない場合、アラニンは、欠失されても、または任意の他のアミノ酸残基（すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖのいずれか１つ）で置換されてもよいことが理解されるべきである。
【０１４３】
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、それらの中に合成または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらとしては、メチルホスホン酸塩およびホスホロチオエート骨格および／またはその分子の３’および／または５’末端の位置でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的については、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変されてもよいことが理解されるべきである。このような改変は、本発明のヌクレオチド配列のインビボの活性または寿命を増強するために、行われ得る。
【０１４４】
本発明はまた、本明細書に示される配列に相補的であるヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは誘導体の使用を包含する。この配列が、そのフラグメントに相補的であるならば、その配列は、他の生物体などにおいて類似のコード配列を同定するためのプローブとして用いられ得る。
【０１４５】
本発明の配列に対して１００％相同ではないが本発明の範囲内におさまるポリヌクレオチドは、多数の方法で得ることができる。本明細書に記載される配列の他の改変体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、種々の集団由来の個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のホモログ（相同体）を得ることが可能であり、そしてこのようなホモログおよびそのフラグメントは、一般に、本明細書に列挙される配列に示される配列に対して選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他の種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたは他の種由来のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすること、そしてこのようなライブラリーを、中度〜高いストリンジェンシーの条件下で添付の配列表における任意の１つの配列の全てまたは一部を含むプローブを用いてプローブすることによって、得ることができる。同様の検討を、得られた種ホモログおよび本発明のポリペプチドまたはヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体に加える。
【０１４６】
改変体および株／種ホモログ（相同体）はまた縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲを用いて得られてもよく、このＰＣＲは、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の配列を標的するように設計されたプライマーを用いる。保存された配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログ由来のアミノ酸配列を整列させることによって、予測され得る。配列アラインメントは、当該分野で公知のコンピューターソフトウェアを用いて行われてもよい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広範に用いられる。
【０１４７】
縮重（ｄｅｇｅｎｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲにおいて用いられるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして公知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために用いられる条件よりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【０１４８】
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列の部位特異的な突然変異誘発によって得ることができる。このことは、例えば、このポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞についてコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン配列変化が必要である場合に有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するためには、または、このポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するためには、他の配列変化が所望され得る。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、別の増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性標識もしくは非放射性標識を用いる従来の手段によって顕在化標識で標識されたプローブを生成するために用いられてもよく、またはこのポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされてもよい。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０もしくは４０ヌクレオチド長であり、そしてまた本明細書において用いられる場合、本発明のポリヌクレオチドという用語によって包含される。
【０１５０】
本発明によるポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブは、組み換え的に、合成的にまたは当業者に利用可能な任意の方法によって生成されてもよい。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされてもよい。
【０１５１】
一般には、プライマーは、合成方法によって生成される。この手段は、ある時点での１ヌクレオチドでの所望の核酸配列の段階的な製造を包含する。自動的な技術を用いてこれを達成するための技術は、当該分野で容易に利用可能である。
【０１５２】
より長いポリヌクレオチドは一般に、組み換え方法を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成される。このプライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローニングされ得るように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【０１５３】
（生物学的に活性）
好ましくは、この改変体配列などは、本明細書に提示される配列と少なくとも同じ程度に生物学的に活性である。
【０１５４】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」とは、天然に存在する配列の類似の構造的機能（ただし同じ程度である必要はない）、および／または類似の調節機能（ただし、同じ程度である必要はない）、および／または類似の生物学的機能（ただし、同じ程度である必要はない）を有する配列をいう。
【０１５５】
詳細には、改変体配列またはその改変型は、本明細書において同定されたフィターゼのプロフィールに類似の酵素的なプロフィールを有する。このプロフィールとしては、分泌タンパク質であること、ｐＨ２〜５．５、好ましくは３．０〜３．５の範囲でｐＨ最適条件を有すること、ｐＨ範囲２．０〜５．５にまたがって最大活性の少なくとも５０％を保持すること、および／または１０００Ｕ／ｍｇを超える比活性を有することなどの特徴が挙げられる。
【０１５６】
（ハイブリダイゼーション）
本発明はまた、本発明の核酸配列に対して相補的である配列、または本発明の配列に対してもしくはそれに対して相補的である配列のいずれかに対してハイブリダイズし得る配列を包含する。
【０１５７】
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）」という用語は、「核酸の鎖が塩基対を通じて、相補的な鎖と結合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅のプロセスを包含する。
【０１５８】
本発明はまた、本明細書に提示される配列に対して相補的である配列に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは誘導体の使用を包含する。
【０１５９】
「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語はまた、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得る配列に相補的である配列を包含する。
【０１６０】
好ましくは、「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸・Ｎａ３  ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に対して相補的である配列を包含する。
【０１６１】
さらに好ましくは、「改変体」という用語は、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対して高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸・Ｎａ３  ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に対して相補的である配列を包含する。
【０１６２】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列に関する。
【０１６３】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるヌクレオチド配列の相補的な配列を含む）に対してハイブリダイズし得る配列に対して相補的であるヌクレオチド配列に関する
また、中度から最大のストリンジェンシーの条件下で、本明細書に提示されるヌクレオチド配列に対してハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０１６４】
好ましい局面では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ）下で、本発明のヌクレオチド配列、またはその相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。
【０１６５】
さらに好ましい局面では、本発明は、高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）下で、本発明のヌクレオチド配列、またはその相補体に対してハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を包含する。
【０１６６】
（部位特異的な突然変異誘発）
一旦、酵素コードヌクレオチド配列が単離および／もしくは精製されるか、または推定の酵素コードヌクレオチド配列が同定されれば、本発明の酵素を調製するために配列を変異させることが所望され得る。
【０１６７】
変異は、合成のオリゴヌクレオチドを用いて導入されてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０１６８】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に開示される。酵素コードヌクレオチド配列へ変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９），１８０、ｐ１４７〜１５１）に記載される。さらなる方法は、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９０），８、ｐ４０４〜４０７−「Ｔｈｅ  ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」）に記載される。
【０１６９】
（組み換え体）
１局面では、本発明における使用のための配列は、組み換え配列（すなわち、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製されている配列）である。
【０１７０】
これらの組み換えＤＮＡ技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｂｏｏｋｓ１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに説明される。
【０１７１】
（合成）
１局面では、本発明における使用のための配列は、合成配列−すなわち、インビトロの化学的または酵素的な合成によって調製されている配列−である。これには、限定はしないが、宿主生物体−例えば、メチロトローフ酵母ＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａについて最適コドン用法で作製された配列が挙げられる。
【０１７２】
（酵素の発現）
本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、組み換え複製可能ベクターに組み込まれてもよい。ベクターは、ヌクレオチド配列を酵素の形態で、適合性の宿主細胞においておよび／またはその宿主細胞から、複製および発現するために用いられ得る。
【０１７３】
発現は、制御配列、例えば、調節性配列を用いて制御され得る。
【０１７４】
ヌクレオチド配列の発現により宿主組み換え細胞によって生成される酵素は、分泌されてもよいし、または用いられる配列および／もしくはベクターに依存して細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核生物または真核生物の細胞膜を通じて物質コード配列の直接分泌を増強するシグナル配列で設計され得る。
【０１７５】
有利には、本発明の酵素は分泌される。
【０１７６】
（発現ベクター）
「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」、「ベクター系（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）」または「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、インビボまたはインビトロで発現し得る構築物を意味する。本発明の状況では、これらの構築物は、宿主細胞へ酵素をコードする遺伝子を導入するために用いられ得る。適切には、発現が誘導される遺伝子は、「発現可能導入遺伝子（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）」と呼ばれてもよい。
【０１７７】
好ましくは、この発現ベクターは、適切な宿主生物体のゲノムに導入される。「組み込まれた（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」という用語は好ましくは、ゲノムへの適切な組み込みを包含する。
【０１７８】
本発明のヌクレオチド配列を含む、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、ベクターに存在してもよく、このベクターでは、このヌクレオチド配列は、適切な宿主生物体によってヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節性配列に対して作動可能に連結される。
【０１７９】
本発明における使用のためのベクターは、本発明のポリペプチドの発現を提供するために、下に記載されるような適切な宿主細胞中に形質転換されてもよい。
【０１８０】
ベクター、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージベクターの選択はしばしば、導入されるべき宿主細胞に依存する。
【０１８１】
本発明における使用のためのベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子−例えば、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラマイシン耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。あるいは、選択は、同時形質転換によって達成され得る（ＷＯ９１／１７２４３に記載されるとおり）。
【０１８２】
ベクターは、インビトロで、例えば、ＲＮＡの産生のために用いられてもよく、または宿主細胞をトランスフェクト、形質転換、形質導入または感染させるために用いられてもよい。
【０１８３】
従って、さらなる実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を複製ベクターへ導入すること、このベクターを適切な宿主細胞へ導入すること、およびベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０１８４】
ベクターはさらに、該当の宿主細胞中でベクターを複製させ得るヌクレオチド配列を含んでもよい。このような配列の例は、プラスミドであるｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２およびｐＥＴ１１の複製起点である。
【０１８５】
（調節性配列）
いくつかの適用では、本発明における使用のためのヌクレオチド配列は、選り抜きの宿主細胞などによる、ヌクレオチド配列の発現を提供し得る、調節性配列に対して作動可能に連結される。一例として、本発明は、このような調節性配列に対して作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、発現ベクターであるベクターを包含する。
【０１８６】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、近接であって、記載された成分が意図される方式で機能することを可能にさせる関係にある近接を意味する。コード配列に対して「作動可能に連結された」調節性配列は、このコード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方式で連結される。
【０１８７】
「制御配列、調節性配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」という用語は、プロモーター、およびエンハンサー、および他の発現調節シグナルを包含する。
【０１８８】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）」という用語は、当該分野の正常な意味で用いられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１８９】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の増強された発現はまた、異種の調節性領域、例えば、プロモーター、分泌リーダーおよびターミネーター領域の選択によって達成され得る。
【０１９０】
好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列は、少なくともあるプロモーターに対して作動可能に連結される。
【０１９１】
細菌、真菌または酵母宿主におけるヌクレオチド配列の転写を指向するために適切なプロモーターの例は、当該分野で周知である。
【０１９２】
（構築物）
「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」という用語は、「結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」および「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」などの用語と同義であって、プロモーターに対して直接または間接的に結合された本発明による使用のためのヌクレオチド配列を包含する。
【０１９３】
間接的な結合の例は、本発明のプロモーターおよびヌクレオチド配列を仲介する、適切なスペーサー基、例えば、イントロン配列、例えば、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンの供給である。同じことは、直接または間接的な結合を含む、本発明に関する「融合された（ｆｕｓｅｄ）」という用語にあてはまる。ある場合には、この用語は、野性型遺伝子プロモーターと通常会合している、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせは、それらが両方ともその天然の環境にある場合、包含しない。
【０１９４】
この構築物は、その遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーを含んでもよいし、発現してもよい。
【０１９５】
いくつかの適用については、好ましくは本発明の構築物は、プロモーターに作動可能に連結された本発明の少なくともヌクレオチド配列を含む。
【０１９６】
（宿主細胞）
「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」という用語は、本発明に関しては、上記のようなヌクレオチド配列または発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞であって、本明細書に規定されるような特定の特性を有する酵素の組み換え産生において、または本発明の方法において用いられる任意の細胞を包含する。
【０１９７】
従って、本発明のさらなる実施形態は、本発明に記載される酵素を発現するヌクレオチド配列で形質転換されるかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。この細胞は、このベクターと適合するように選択され、そして例えば、原核生物（例えば、細菌）、真菌、酵母または植物細胞であってもよい。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞ではない。
【０１９８】
適切な細菌宿主生物体の例は、グラム陽性またはグラム陰性の細菌種である。
【０１９９】
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質および／または発現されたタンパク質のさらなる処理についての望ましさに依存して、真核生物宿主、例えば、酵母または他の真菌が好ましいかもしれない。一般には、酵母細胞は、真菌細胞よりも好ましい。なぜなら、それらは、操作することがより容易であるからである。しかし、いくつかのタンパク質は、酵母細胞からはあまり分泌されないか、またはある場合には、適切にはプロセシングされない（例えば、酵母では高グリコシル化）。これらの場合には、種々の真菌宿主生物体が選択されなければならない。
【０２００】
適切な宿主細胞（例えば、酵母、真菌および植物宿主細胞）の使用によって、翻訳後改変（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）およびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を、本発明の組み換え発現産物に対して最適の生物学的活性を付与するために必要であり得る場合、提供し得る。
【０２０１】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損であっても、またはプロテアーゼマイナス株であってもよい。
【０２０２】
宿主細胞の遺伝子型は、発現を改善するために改変され得る。
【０２０３】
宿主細胞改変の例としては、プロテアーゼ欠損、まれなｔＲＮＡの補充、およびジスルフィド結合形成を増強するための細胞質における還元電位の改変が挙げられる。
【０２０４】
例えば、宿主細胞Ｅ．ｃｏｌｉは、まれなｔＲＮＡを過剰発現して、Ｋａｎｅに例示／記載されたように（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５），６，４９４〜５０００「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｎ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ」）、異種タンパク質の発現を改善し得る。宿主細胞は、多数の還元酵素が欠失されてもよく、これによって、Ｂｅｓｓｅｔｔｅに例示／記載されたように（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９９），９６，１３７０３〜１３７０８「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ」）適切なジスルフィド結合の形成を支持する。
【０２０５】
１実施形態では、本発明の状況における宿主細胞としては、動物飼料に直接添加され得る細胞が挙げられる。
【０２０６】
（生物体）
「生物体（ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、本発明に関しては、本発明に記載されるような酵素をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物、および／または本発明によるヌクレオチド配列の発現をこの生物体に存在する場合に可能にし得るプロモーターを含む任意の生物体を包含する。
【０２０７】
適切な生物体としては、原核生物、真菌、酵母または植物を挙げることができる。
【０２０８】
「トランスジェニック生物体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、本発明に関しては、本発明に記載されるような酵素をコードするヌクレオチド配列および／またはそれから得られる産物、および／または本発明によるヌクレオチド配列の発現をこの生物体内で可能にし得るプロモーターを含む任意の生物体を包含する。好ましくは、このヌクレオチド配列は、この生物体のゲノムに組み込まれる。
【０２０９】
「トランスジェニック生物体」という用語は、それらの天然の環境において天然のヌクレオチドコード配列を、これもその天然の環境にあるそれらの天然のプロモーターの制御下である場合は、包含しない。
【０２１０】
従って、本発明のトランスジェニック生物体は、本発明に記載される酵素をコードするヌクレオチド配列、本発明による構築物、本発明によるベクター、本発明によるプラスミド、本発明による細胞、本発明による組織、またはそれらの生成物のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせを含む生物体を包含する。
【０２１１】
例えば、トランスジェニック生物体はまた、異種プロモーターの制御下で本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０２１２】
（宿主細胞／生物体の形質転換）
以前に示されるように、宿主生物体は、原核生物または真核生物生物体であってもよい。適切な原核生物宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。
【０２１３】
原核生物宿主の形質転換に対する教示は、当該分野でよく実証されている、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。他の適切な方法は、本明細書における実施例に示される。原核生物宿主を用いるならば、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって、形質転換の前に適切に改変される必要があるかもしれない。
【０２１４】
糸状の真菌細胞は、当該分野で公知の種々の方法、例えば、プロロプラスト形成およびプロトプラストの形質転換に続く、公知の方式における細胞壁の再生を含むプロセスを用いて形質転換され得る。宿主微生物としてのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの使用は、欧州特許０２３８０２３に記載される。
【０２１５】
別の宿主生物体は植物であり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５〜２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏｎ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７〜２７）による文献に見出され得る。植物の形質転換に対するさらなる技術は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出され得る。
【０２１６】
真菌、酵母および植物の形質転換に対する一般的な技術は、以下の節に示される。
【０２１７】
（形質転換された真菌）
宿主生物体は、真菌、例えば、糸状の真菌であってもよい。適切なこのような宿主の例としては、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、パンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの属に属する任意のメンバーが挙げられる。
【０２１８】
糸状の真菌の形質転換に対する教示は、ＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されており、これは、糸状真菌の形質転換および真菌の培養についての標準的な技術が当該分野で周知であるということを述べている。Ｎ．Ｃｒａｓｓａに適用されるような技術の広範な概説は、例えば、Ｄａｖｉｓおよびｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１）１７Ａ：７９〜１４３に見出される。
【０２１９】
糸状の真菌を形質転換するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７に概説される。
【０２２０】
１局面では、宿主生物体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒであってもよい。
【０２２１】
本発明によるトランスジェニックのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓはまた、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｇ．１９９４（Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  Ｓ．Ｄ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  Ｊ．Ｒ．（編者）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：５０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ  ２９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９９４．ｐｐ．６４１〜６６６）の教示に従って調製されてもよい。
【０２２２】
糸状真菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔら（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２  Ｍａｙ；２０（５）：２００〜６，Ａｒｃｈｅｒ  ＆  Ｐｅｂｅｒｄｙ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）１７（４）：２７３〜３０６に概説されている。
【０２２３】
（形質転換された酵母）
別の実施形態では、トランスジェニックの生物体は酵母であってもよい。
【０２２４】
酵母における異種遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９５），４９：３４１〜５４、およびＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７）Ｏｃｔ；８（５）５５４〜６０に提供される。
【０２２５】
これに関して、例えば、種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（２０００  ２４（１）：４５〜６６を参照のこと）が、異種遺伝子発現のビヒクルとして用いられ得る。
【０２２６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙ（１９９３，「Ｙｅａｓｔ  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」、Ｙｅａｓｔｓ，第５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ  ＲｏｓｅおよびＪ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）によって与えられる。
【０２２７】
酵母の形質転換については、いくつかの形質転換のプロトコールが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｈｉｎｎｅｎらの教示（１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ  ７５，１９２９）；Ｂｅｇｇｓ，Ｊ  Ｄ（１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２７５，１０４）；およびＩｔｏ，Ｈら（１９８３，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３，１６３〜１６８）に従って調製されてもよい。
【０２２８】
この形質転換された酵母細胞は、種々の選択性マーカー、例えば、栄養要求性のマーカー優性な抗生物質耐性マーカーを用いて選択されてもよい。
【０２２９】
（形質転換された植物／植物細胞）
本発明に適切な宿主生物体は植物であってもよい。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１］４２：２０５〜２２５）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９４  １７〜２７）による文献に見出され得る。
【０２３０】
（培養および生成）
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされた酵素の産生をもたらし、そして細胞および／または培養培地からの酵素の回収を容易にする条件下で培養され得る。
【０２３１】
細胞を培養するために用いられる培地は、該当の宿主細胞を増殖すること、およびこの酵素の発現を得ることのために適切な任意の従来の培地であってもよい。
【０２３２】
組み換え細胞によって生成されるタンパク質は、細胞の表面上に提示され得る。
【０２３３】
この酵素は、宿主細胞から分泌されてもよく、そして周知の手順を用いて培養培地から都合よく回収されてもよい。
【０２３４】
（分泌）
発現宿主から培養培地へ酵素が分泌されて、それから酵素がより容易に回収され得ることが所望され得る。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択され得る。ハイブリッドシグナル配列も、本発明の状況で用いられてもよい。
【０２３５】
異種分泌リーダー配列の代表的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−両方とも、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の１８および２４アミノ酸のバージョン）、α因子遺伝子（酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）またはαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来する配列である。
【０２３６】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質の分泌は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：１３２〜４３に概説される。
【０２３７】
（検出）
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための種々のプロトコールは当該分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０２３８】
広範な種々の標識および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて用いられ得る。
【０２３９】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のような多数の会社が、これらの手順のための市販のキットおよびプロトコールを供給している。
【０２４０】
適切なレポーター分子または標識としては、それらの放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または色素生産剤、ならびに基質、補因子、インヒビター、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７；ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２；ＵＳ−Ａ−３，９９３９，３５０；ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５；ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７；ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９およびＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０２４１】
また、組み換え免疫グロブリンは、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されるように生成されてもよい。
【０２４２】
フィターゼ活性を検出するための他の適切なアッセイは、当該分野で公知であり、かつ本明細書に例示される。
【０２４３】
（融合タンパク質）
本発明に従う使用のためのアミノ酸配列は、例えば、抽出および精製を補助するための融合タンパク質として生成され得る。融合タンパク質のパートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）および（β−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質のパートナーと目的のタンパク質の配列との間にタンパク質分解性の切断部位を含んで、融合タンパク質配列の除去を可能にすることも好都合であり得る。
【０２４４】
好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を邪魔しない。
【０２４５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子融合発現系は、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５）６（５）：５０１〜６に概説されている。
【０２４６】
本発明の別の実施形態では、アミノ酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、物質の活性に影響し得る因子のペプチドライブラリーをスクリーニングするためには、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用であり得る。
【０２４７】
（さらなる配列）
本発明による使用のための配列はまた、１つ以上のさらなる目的のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＰＯＩ）または目的のヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＮＯＩｓ）と組み合わせて用いられ得る。
【０２４８】
ＰＯＩｓの非限定的な例としては以下が挙げられる：キシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）、リパーゼ、酸性ホスファターゼおよび／またはその他。これらとしては、例えば、飼料の粘度を調節する酵素が挙げられる。ＮＯＩは、任意のこれらの配列についてのアンチセンス配列であってさえよい。
【０２４９】
ＰＯＩは、例えば、抽出および精製を補助するか、またはインビボのフィチン酸塩代謝を増強する、融合タンパク質であってさえもよい。
【０２５０】
ＰＯＩは、分泌配列に融合されてさえよい。
【０２５１】
他の配列はまた、分泌を容易にするか、または分泌されたＰＯＩの収率を増大させ得る。このような配列は、例えば、英国特許出願９８２１１９８．０に記載のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｃｙｐ  Ｂ遺伝子の生成のようにシャペロンタンパク質をコードしてもよい。
【０２５２】
ＰＯＩをコードするＮＯＩは、限定はしないが、その発現産物のプロセシングおよび／または発現を改変する変更を含む、多数の理由のためにその活性を変更するように操作されてもよい。さらなる例としては、ＮＯＩはまた、特定の宿主細胞において発現を最適化するように改変されてもよい。制限酵素認識部位を導入するために他の配列変化が所望され得る。
【０２５３】
ＰＯＩをコードするＮＯＩはその中に、メチルホスホン酸塩およびホスホロチオエート骨格のような合成または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
【０２５４】
ＰＯＩをコードするＮＯＩは、細胞内の安定性および半減期を増大するように改変されてもよい。可能性のある改変としては、限定はしないが、その分子の５’および／もしくは３’末端の隣接配列の付加、またはこの分子の骨格内のホスホジエステラーゼ結合以外のホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【０２５５】
（抗体）
本発明の１局面は、配列番号３のアミノ酸と免疫学的に反応性であるアミノ酸に関する。
【０２５６】
抗体は、標準的な技術によって、例えば、本発明の物質での免疫によって、またはファージディスプレイライブラリーを用いることによって、生成され得る。
【０２５７】
本発明の目的に関しては、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、反対に特定しない限り、限定はしないが、ポリクローナル抗体、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成したフラグメント、ならびにその模倣物を包含する。このようなフラグメントとしては、標的物質についてのその結合活性を保持する抗体全体のフラグメント、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および他の合成タンパク質であって、抗体の抗原結合部位を含むタンパク質が挙げられる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、ヒト化抗体であってもよい。中和抗体、すなわち、物質としてのポリペプチドの生物学的活性を阻害する抗体が、特に診断および治療のために好ましい。
【０２５８】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、本発明の配列（またはその免疫学的なエピトープを含む配列）で免疫される。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増大してもよい。
【０２５９】
免疫された動物由来の血清を収集して、公知の手順に従って処理する。本発明の配列（またはその免疫学的エピトープを含む配列）に対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合、このポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生および処理するための技術は当該分野で公知である。このような抗体が作製され得るためには、本発明はまた、動物またはヒトにおける免疫原としての使用のために、本発明のポリペプチドまたは別のポリペプチドに対してハプテン化されたそのフラグメントを提供する。
【０２６０】
本発明の配列に関するモノクローナル抗体（またはその免疫学的なエピトープを含む配列）はまた、当業者によって容易に生成され得、これには限定はしないが、ハイブリドーマ技術（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｔｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：２０２６〜２０３０）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒｉｃｋｍａｎ  Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，ｐｐ７７〜９６）が挙げられる。
【０２６１】
さらに、ヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングによって、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るという、「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」の産生のために開発された技術が用いられてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜４５４）。
【０２６２】
あるいは、単鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７９号）は、物質特異的な単鎖抗体を生成するために適合されてもよい。
【０２６３】
この物質に特定の結合部位を含む抗体フラグメントも生成され得る。例えば、このようなフラグメントとしては、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構築されてもよい（Ｈｕｓｅ  ＷＤら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１２７５〜１２８１）。
【０２６４】
（大規模適用）
本発明の１つの好ましい実施形態では、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のフィターゼをコードするアミノ酸配列または本発明の方法を大規模な適用のために用いる。詳細には、本発明の方法は、食料または飼料の組成物への添加物／補充物としての産業上の用途のためのフィターゼの大規模生成に用いられ得る。
【０２６５】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり５ｇ〜約１０ｇの量で生成される。
【０２６６】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり１００ｍｇ〜約９０ｍｇの量で生成される。
【０２６７】
好ましくは、このアミノ酸配列は、宿主生物体の培養後、総細胞培養容積１リットルあたり２５０ｍｇ〜約５００ｍｇの量で生成される。
【０２６８】
（フィターゼの使用）
上記で述べるとおり、本発明はまた、本明細書に記載のようなフィターゼの生成に関する。
【０２６９】
詳細には、本発明はまた、有機および無機のリン酸化合物の生成において本明細書に開示されるようなアミノ酸配列の使用に関する。
【０２７０】
従って、本発明はさらに、フィターゼの発現のための発現ベクターまたは発現系を生成するのにおけるフィターゼをコードするヌクレオチド配列の使用に関する。
【０２７１】
さらに、本発明はフィターゼを発現する宿主細胞の生成におけるこのような発現ベクターまたは発現系の使用に関する。
【０２７２】
本発明はさらに、有機および無機のリン酸化合物の前駆体の生成における、または特定の有機リン酸塩化合物の生成における、改変宿主細胞の使用に関する。
【０２７３】
適切な有機および無機のリン酸塩化合物としては、ミオ−イノシトール五リン酸塩、四リン酸塩、三リン酸塩、二リン酸塩および一リン酸塩が挙げられる。
【０２７４】
従って、適切には、本発明は、有機リン酸化合物を生成する方法を提供し、この方法は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のフィターゼを用いてフィチン酸塩を処理する工程を包含する。好ましくは、この方法は、酵素が配列番号３に示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７５％の同一性（相同性）を有する配列またはその有効なフラグメント、または改変型を含むという点で特徴付けられる。適切には、有機リン酸塩は、ｍｙｏ−イノシトール二リン酸、三リン酸、四リン酸および五リン酸のフィチン酸塩または全ての可能な立体異性体である。他の適切な有機リン酸塩としては、イノシトール−四リン酸塩およびイノシトールオリゴリン酸塩が挙げられる。好ましい実施形態では、この方法はインビボのバイオテクノロジープロセスである。
【０２７５】
有機リン酸化合物を生成するためのこのような方法は適切には以下の工程を包含し得る：
ａ）Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼを含む発現可能な導入遺伝子を含む宿主細胞を提供する工程と；
ｂ）導入遺伝子の発現のために適切な条件下でトランスジェニック生物体を培養する工程と；
ｃ）培養物から有機リン酸化合物を回収する工程と；
この化合物は、フィターゼの特徴付けのためのアッセイを含む多数の適用のために用いられ得る。いくつかのイノシトールリン酸塩は、細胞内の調節におけるシグナル分子として含まれており、研究の化合物として用いられ得る。
【０２７６】
別の局面では、食品または動物の飼料の産生のための方法が提供される。動物飼料は代表的には、飼料粉砕機において生成され、ここでは原料が最初に適切な粒子サイズに挽かれ、ついで適切な添加物と混合される。次いでこの飼料は、マッシュまたはペレットとして生成されてもよい；後者は代表的には、温度が標的レベルまで上昇され、次いで飼料が金型を通過されて特定のサイズのペレットが生じる方法を包含する。引き続き、液体添加物、例えば、脂肪および酵素を添加してもよい。このペレットは輸送の前に冷却される。動物飼料の生成はまた、ペレット化の前の押し出し成形または膨張を含むさらなる工程を包含してもよい。
【０２７７】
従って、本発明はさらに、食物または飼料生成物の製造における使用のためのフィターゼを生成するための、フィターゼをコードするアミノ酸配列またはフィターゼを発現する宿主細胞の使用を提供する。１局面では、食物または飼料生成物の製造における本明細書に記載のようなアミノ酸配列の使用が提供される。別の局面では、食物または飼料生成物の製造における本発明に従う、宿主細胞の使用が提供される。別の局面では、食物または飼料生成物の製造における本発明に従う発現ベクターまたは発現システムの使用が提供される。
【０２７８】
本発明はまた、動物に対して送達するための他の成分と組み合わせた飼料の成分として酵素を用いる工程を包含する。
【０２７９】
（他の成分との組み合わせ）
本発明の酵素は、他の成分またはキャリアと組み合わせて用いられてもよい。
【０２８０】
飼料酵素のために適切なキャリアとしては、コムギ（荒挽き）が挙げられる。さらに、植物ゴムなどを添加している、脂肪／ワックス被膜に基づくカプセルを含む、多数のカプセル化技術がある。
【０２８１】
他の成分の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、結合剤、結晶調整剤（ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、甘味料（人工甘味料を含む）、流動性調整剤（ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、安定剤、抗酸化剤、色素、酵素、キャリア、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、香味料、着色物、懸濁剤、崩壊剤、顆粒結合剤など。これらの他の成分は天然であってもよい。これらの他の成分は、化学的および／または酵素的な技術の使用によって調製され得る。
【０２８２】
本明細書において用いる場合、「増粘剤またはゲル化剤（ｔｈｉｃｋｎｅｒ  ｏｒ  ｇｅｌｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、粒子、不混和性の液体の液滴、空気または不溶性の固体の移動を遅らせるかまたは防止することによって分離を妨げる生成物をいう。
【０２８３】
本明細書において用いる場合、「安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒ）」とは、経時的な変化から生成物（例えば、食品）を保持する成分または成分の組み合わせとして規定される。
【０２８４】
本明細書において用いる場合、「乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）」という用語は、エマルジョンの分離を妨げる成分（例えば、食物成分）をいう。
【０２８５】
本明細書において用いる場合、「結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）」という用語は、物理的または化学的な反応を通じて生成物を一緒に結合させる成分（例えば、食品成分）をいう。
【０２８６】
本明細書において用いる場合、「結晶調節剤（ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）」という用語は、脂肪または水の結晶化に影響する成分（例えば、食品成分）をいう。
【０２８７】
「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒｓ）」または「ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）」とは、化合物投与のために適切な物質を意味し、そして、非毒性であり、有害な様式でその組成物の任意の成分と相互作用しない、当該分野で公知の任意のこのような物質、例えば、任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などが挙げられる。
【０２８８】
栄養的に受容可能なキャリアの例としては、例えば、穀物、水、塩溶液、アルコール、シリコン、ワックス、ワセリン、植物油などが挙げられる。
【０２８９】
賦形剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：微結晶性セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖および高分子量ポリエチレングリコール。
【０２９０】
崩壊剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：デンプン（好ましくは、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、またはタピオカデンプン）、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複雑なケイ酸塩。
【０２９１】
顆粒結合剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチンおよびアカシア。
【０２９２】
潤滑剤の例としては以下の１つ以上が挙げられる：ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリル・ベヘネートおよび滑石。
【０２９３】
希釈剤の例としては、以下の１つ以上が挙げられる：水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、およびそれらの組み合わせ。
【０２９４】
他の成分は、同時に用いられても（例えば、それらが一緒に混合される場合、またはそれらが異なる経路によって送達される場合でさえ）、または連続して用いられてもよい（例えば、それらは、種々の経路によって送達され得る）。
【０２９５】
本明細書において用いる場合、「動物またはヒトの消費に適切な成分」という用語は、栄養面での恩恵であり得る、補充物としての本発明の組成物であるか、またはそれに添加され得る化合物、線維代用物、または消費者に一般に有益な効果を有する化合物を意味する。
【０２９６】
１例として、この成分は、プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、例えば、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、インスリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ラクトスクロース、ダイズオリゴ糖、パラチノーゼ、イソマルト−オリゴ糖、グルコ−オリゴ糖およびキシロ−オリゴ糖であってもよい。
【０２９７】
（食物または飼料物質）
この化合物は、食品または飼料物質として、またはその調製において用いられ得る。ここで、「食物（ｆｏｏｄ）」という用語は、広義に用いられ、そしてヒトのための食物および食品を、そして動物用の食品（すなわち、飼料）を包含する。「飼料（ｆｅｅｄ）」という用語を用いて、家畜の飼育において動物に給餌される生成物をいう。好ましい局面ではこの食物または飼料は、ブタ、家禽および魚類のような単胃動物による消費のためである。
【０２９８】
この食物または飼料は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の様式に依存して、溶液の形態で用いられても、または固体として用いられてもよい。
【０２９９】
（食物および飼料成分および補充物）
この化合物は、食物または飼料成分として用いられ得る。
【０３００】
本明細書において用いる場合、「食物または飼料成分（ｆｏｏｄ  ｏｒ  ｆｅｅｄ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、処方物を含み、これは、食物または食料品であってもそれに添加されてもよく、そして広範な種々の生成物に低レベルで用いられ得る処方物を含む。
【０３０１】
食品成分は、適用の用途および／または様式、ならびに投与の方式次第で、溶液の形態であってもまたは固体であってもよい。
【０３０２】
この化合物は、食物補充物であっても、または食物補充物に添加されてもよい。
【０３０３】
（食物および飼料組成物）
単胃動物のための飼料組成物は代表的には、フィチン酸塩を含む植物生成物を含む組成物を含む。このような組成物としては、コーンミール、ダイズミール、菜種かす、綿実粕、トウモロコシ、コムギ、オオムギおよびソルガムベースの飼料が挙げられる。
【０３０４】
本明細書に記載されるフィターゼは、食物または飼料組成物であっても、またはそれに添加されてもよい。
【０３０５】
本発明はまた、食物または飼料成分または補充物を調製する方法を提供し、この方法は、本発明のプロセスによって生成されるフィターゼまたは本発明に従う組成物と別の食物成分とを混合させる工程を包含する。調製方法または食物成分はまた、本発明の別の局面である。動物飼料を調製するための方法は、上記されている。この酵素は、固体処方物の形態で添加されてもよいし、または事前混合物のような飼料添加物として添加されてもよい。固体型は代表的には、混合工程の前または間に添加される；そして液体型は代表的には、ペレット化工程の後に添加される。
【０３０６】
（薬剤）
本発明のフィターゼはまた、いくつかの薬学的な効果を得るために、薬学的調製物においてまたは食品への組み合わせのために用いられ得る。例えば、欧州特許第１，３８９，９１５号は、ヒトの食品または飲料のカルシウム、鉄および／または亜鉛のアベイラビリティーを増大するための食物または飲料におけるフィターゼの使用を記載している。
【０３０７】
さらに、欧州特許第１，３９２，３５３号は、生体元素、例えば、カルシウムおよび鉄のバイオアベイラビリティを増大させるため、ならびに欠乏性の疾患と戦うために有用である、フィターゼを含む医薬または栄養補充物を記載している。
【０３０８】
ここでは、「薬剤の（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」という用語は、広義の意味で用いられる−そして、ヒトの薬剤および／または栄養補助剤、ならびに動物のための薬剤および／または栄養補助剤（すなわち、獣医の適用）を包含する。好ましい局面では、薬剤はヒトの使用のため、および／または畜産業のためである。
【０３０９】
薬剤は、治療目的のためであってもよく、これは実際には、治療的であっても、または緩和（対症）的であっても、または予防的であってもよい。薬剤は、診断目的であってさえよい。
【０３１０】
薬剤として、または薬剤の調製において用いる場合、本発明の生成物および／または化合物は、以下の１つ以上と組み合わせて用いられ得る：薬学的に受容可能なキャリア、薬学的に受容可能な希釈剤、薬学的に受容可能な賦形剤、薬学的に受容可能なアジュバント、薬学的に活性な成分。
【０３１１】
薬剤は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の様式に依存して、溶液の形態であっても、または固体であってもよい。
【０３１２】
（薬学的な成分）
本発明の生成物および／または化合物は、薬学的成分として用いられ得る。ここで本発明の生成物および／または組成物は、単独の活性成分であってもよいし、または活性成分の少なくとも１つのメンバー（すなわち、２つ以上）であってもよい。
【０３１３】
薬学的な成分は、適用の用途および／もしくは方式、ならびに／または投与の方式に依存して、溶液の形態であっても、または固体であってもよい。
【０３１４】
薬学的な成分は、薬剤の溶解特性を改善するために発泡性生成物の形態であってもよい。
【０３１５】
（形態）
本発明の生成物および／または化合物は、単独の場合であろうと、組成物中に存在する場合であろうと、任意の適切な形態で用いられ得る。同様に、本発明に従って生成されたフィターゼ（すなわち、成分−例えば、食物成分、機能的食品成分、または薬学的な成分）は、任意の適切な形態で用いられてもよい。
【０３１６】
形態の適切な例としては、即時放出、遅延放出、改変放出、持続放出、パルス放出または制御放出の適用のための、以下：錠剤、丸剤、カプセル、胚珠、溶液または懸濁液の１つ以上が挙げられ、これは、香味料または着色剤を含んでもよい。
【０３１７】
１例として、生成物および／または組成物が、機能的な成分としての使用のためなどの錠剤型で用いられる場合、この錠剤は、以下：賦形剤、崩壊剤、顆粒結合剤または潤滑剤のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０３１８】
この形態を調製するのにおける使用のための栄養的に受容可能なキャリアの例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコン、ワックス、ワセリンなどが挙げられる。
【０３１９】
この形態のための好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３２０】
水性の懸濁液および／またはエリキシルについては、カロチノイド切断化合物を、種々の甘味料または香味量、着色料または色素と、乳化剤および／または懸濁剤と、そして希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにそれらの組み合わせと合わせてもよい。
【０３２１】
この形態はまた、ゼラチンカプセル；ファイバーカプセル、ファイバー錠剤などを含んでもよい。
【０３２２】
（一般的な組み換えＤＮＡ方法論技術）
本発明は、他に示さない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、この文献に例示される。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｂｏｏｋｓ１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５）および定期補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々が本明細書において参照によって援用される。
【実施例】
【０３２３】
本発明はここで、以下の非限定的な実施例においてさらに例示される。
【０３２４】
（実施例１．フィターゼ活性アッセイ）
フィターゼアッセイは、マイクロタイタープレートで行った。反応混合物（１００μｌ９は以下を含んだ：２ｍＭのフィチン酸塩および０．８ｍＭのＣａＣｌ２が含有される２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５。この反応物は、３７℃で１時間処理させて、その後に、放出されたリン酸塩を公知の手順の変法によって測定した（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ  Ｊ．Ｋ．，Ｌａｈｔｉ  Ｒ．Ｊ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３（２），３１３〜３１７（１９８１））。要するに、２００μｌの新鮮に調製したＡＭＭ溶液（７．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、１５ｍＭのモリブデン酸アンモニウムおよびアセトン  −  １：１：２）を、各々のマイクロタイタープレートウェル中で１００μｌの反応混合物に添加した。３９０ｎｍでの吸光度は、ＡＭＭ試薬の添加後、１０分より後でかつ３０分より前に測定した。リン酸塩の量は、濃度が既知のリン酸塩溶液を用いて検量線を作成することによって決定した。異なるｐＨ値でフィターゼ活性を評価するためには、以下の（全てが２００ｍＭ）緩衝液を用いた：グリシン／ＨＣｌｐＨ２．０〜３．０、酢酸ナトリウム／酢酸、ｐＨ３．５〜５．５、Ｔｒｉｓ／マレイン酸ｐＨ６．０〜７．５．
（実施例２．フィターゼ産生株Ｐ３−４２）
細菌株Ｐ３−４２はもともと、フィンランド南部の湿潤な森林において採集された腐敗しているカバノキの葉の塊から単離された。この株は多くの単純な培養培地、例えばＬＢ（１％ペプトン、０．５％酵母抽出物、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）または低リン酸塩培地ＰＰ１（１％ペプトン、１％ウシ抽出物、０．５％、酵母抽出物、ＣａＣｌ２−０．２Ｍ）上において、３０℃で好気的に培養され得る。この培地を、ＮａＯＨでｐＨ１１に調製して、１０分間煮沸する。この沈殿物を、濾過によって除去し、ｐＨを、５．５に再調節して、その培地は１２１℃で１５分間のオートクレーブによって滅菌する。
【０３２５】
液体ＰＰ１培地中での増殖後、その株は、ｐＨ３．５および５．５の両方でフィターゼ活性を示すことが見出された（実施例１に記載のようにアッセイした）。３．５および５．５での活性の比は約１．５であった。その活性はまた、Ｐ３−４２の細胞および細胞上清中で別々に測定した。これらの測定によれば、全てのフィターゼ活性のうち約９０％が上清に見出された。この株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４７として２００４年９月２２日にＮＣＩＭＢに寄託された。
【０３２６】
（実施例３．株Ｐ３−４２からの染色体ＤＮＡの単離）
染色体ＤＮＡは本質的に、標準的な手順によって調製した（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）。ＬＢ培地中において３０℃で一晩増殖した２５０ｍｌの培養物を、１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離して、２０ｍｌの５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８中で洗浄し、そして１０ｍｌの冷ＴＥＳ（５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５％グルコースｐＨ８）中に再懸濁した。リゾチームを１０ｍｇ／ｍｌに添加して、その細胞懸濁液を、溶解が生じるまで３７℃で３０〜６０分間インキュベートして、１００μｌの反応混合物の１ｍｌの０．１％ＳＤＳへの希釈および「ネバネバの（ｓｌｉｍｙ）」流動性についてチェックすることによって確認した。この時点で、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ（ＳＩｇｍａ）を、それぞれ１％および０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。この反応混合物を、５６℃で３０分間インキュベートし、続いて２ｍＭの５Ｍ  ＮａＣｌの添加および１．４ｍｌの１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ）の添加を行った。このインキュベーションは、６５℃で１５分間継続した。その溶液をクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を用いて１回、フェノール／クロロホルムを用いて１回抽出した。抽出後、その水相を０．６容積のイソプロパノールと混合して、ＤＮＡ沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分）によって収集し、７０％エタノールで洗浄し、減圧乾燥して、２ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８、５μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅに再懸濁した。
【０３２７】
（実施例４．細菌株Ｐ３−４２の分類学的同定）
株Ｐ３−４２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のフラグメントを、プライマー；５３６ｆ（ＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＷＣ）および１３９２ｒ（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＲＣ）（Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，Ｓｔａｃｋｂｒａｎｄｔ，Ｅ、およびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｍ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ｐｐ１１５〜１１７（１９９１））を用いて、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。以下のプログラムを用いた：１）９５℃５分の初回ＤＮＡ変性工程；２）９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分の３０サイクル；３）７０℃の最終伸長工程１０分間。約９００塩基対のサイズのＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル中における電気泳動によって精製し、製造業者の指示に従ってＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから抽出した。精製されたＰＣＲ生成物は、Ｍｅｄｐｒｏｂｅ（Ｎｏｒｗａｙ）によって商業的に配列決定させた。この配列決定された領域を配列番号１に列挙する。この配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）におけるＤＮＡ配列と比較した。最高のマッチング（８２４ヌクレオチドのうち８２３、９９．９％）は、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＤＳＭ  ３００３９由来の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子の配列と見出された。従って、株Ｐ３−４２は分類学的に、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉとして分類され得る。
【０３２８】
（実施例５．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来のフィターゼ遺伝子のクローニング）
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２株由来の染色体ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで部分的に消化して、その消化物を１％のアガロースゲル上で分画した。３〜５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから単離して、ＢａｍＨＩ消化した脱リン酸化λ―ＺＡＰアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と連結させた。ライブラリー構築のための引き続く工程は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ／Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔの指示に従った。ライブラリーのファージ型は、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって記載されたとおりの「マス切除（ｍａｓｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）」手順によってプラスミド型に変換された。プラスミドライブラリーのスクリーニングは、ペトリプレートでのフィターゼ活性の検出のための初期の公開された方法と類似の方法によって行った（ＨｏｗｓｏｎおよびＤａｖｉｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５，３７７〜３８２（１９８３）；Ｃｈｅｎ  Ｊ．Ｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（１０）７５１〜７６１（１９９８）；Ｒｉｃｃｉｏ  Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８２，１７７〜１８５（１９９７））。いくつかのフィターゼ陽性クローンを単離して、サブクローニングによって精製した。これらの単離物は、液体培養物（ＬＢ培地で３０℃かつ２００ｒｐｍで約２４時間）中で増殖させて、そしてフィターゼ活性を、得られた細胞懸濁液中で測定した（実施例１）。最高のフィターゼ活性を有した１つのクローン（約５Ｕ／ｍｌ、ｐＨ３．５）を引き続く特徴づけのために選択した。プラスミドＤＮＡは、ｐＢＫ（Ｐ３−４２）と命名されたこのクローンから単離して、挿入ＤＮＡの部分的ＤＮＡ配列決定によって特徴付けた（配列決定サービスは、Ｍｅｄｐｒｏｂｅ（Ｎｏｒｗａｙ）から得た）。フィターゼ遺伝子を含むこの配列は、配列番号２として列挙する。Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼの、この推定アミノ酸配列は、配列番号３として列挙される。ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）によって提供されるＢＬＡＳＴサービスを用いるＧｅｎＢａｎｋにおける配列との配列番号３の比較によって、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のフィターゼは、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼの最も緊密な公知のホモログとして同定される。しかし、相同性レベルは低く、両方のタンパク質で同一であるのはアミノ酸残基のほぼ６２％しかない。
【０３２９】
（実施例６．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来のフィターゼ遺伝子の増幅および発現）
フィターゼ遺伝子は、ＰＣＲによって増幅された。Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２株の染色体ＤＮＡを、テンプレートとして、そしてオリゴヌクレオチドｏ４２−５（ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＧ）およびｏ４２−３（ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＧＴＡＡＣＴＧＣＡＣＡＣ）をプライマーとして用いた。その増幅は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。以下のプログラムを用いた：１）９４℃で３分間の初回のＤＮＡ変性；２）９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、６８℃で１分、７２℃で１分、７４℃で１分の３５サイクル；３）７２℃で１０分の最終伸長工程。得られたＰＣＲ産物を、０．８％アガロースゲル中での電気泳動、その後のＧｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるゲルからのＤＮＡ抽出によって精製した。この精製されたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化して、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって反応混合物から単離した。ベクタープラスミドｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化して、エビのアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて脱リン酸して、０．８％アガロースゲル中における電気泳動によって精製した。この直線化したプラスミドＤＮＡのバンドをゲルから切り出して、Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。この２つの精製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて連結した。この連結反応物を７０％エタノールで沈殿させて、エタノールで洗浄し、そして５０μｌのエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞中に直接再懸濁した。この懸濁物を０．１ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移して、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）セットを用いて、１８００Ｖ、２５μＦおよび２００Ωで電気泳動させた。電気泳動の直後に、１ｍｌのＬＢ培地を添加して、細胞懸濁液を１５ｍｌのプラスチックチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移して、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上にプレートして、３７℃で一晩インキュベートした。２４個の形質転換体を液体培地中で増殖させて、その培養物を、フィターゼ活性をアッセイすることおよびプラスミドＤＮＡの単離のために用いた。最高のフィターゼ活性を生成し、かつプラスミドＤＮＡの予想される認識パターンを生成する１クローンを選択した。ｐＥＴ１１（Ｐ３−４２）と命名されたこのクローンによって含まれるプラスミドを用いて、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。この形質転換された細胞懸濁物を、２％グルコースを含有するＬＢ中において３７℃で１時間振盪し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびグルコース（２％）を含有する５０ｍｌのＬＢに接種して、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させた。得られた培養物のＯ��は、６００ｎｍで測定して、その培養物を用いて、０．０４のＯＤ６００になるまで１ｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に接種した。増殖は、３０℃で一晩継続した。このような培養物におけるフィターゼ活性は代表的には、５０〜６０Ｕ／ｍｌ（ｐＨ３．５で測定した）であった。ほぼ全てのフィターゼが培養培地中に分泌された。Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼが、その天然の宿主において、かつＥ．ｃｏｌｉにおける異種発現の間においてその両方で効率的に分泌される酵素であるという事実は、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ由来のフィターゼの細胞内性質とは対照的である（Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，１２３１〜１２３４（２００３））。同じ条件下で増殖されたｐＥＴ１１で形質転換されたコントロールの株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの培養物における活性は０．０５Ｕ／ｍｌ未満であった。
【０３３０】
（実施例７．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２からの組み換えフィターゼの精製）
ｐＥＴ１１（Ｐ３−４２）で形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの培養物を遠心分離して、細菌細胞を除去して、ロータリーエバポレーターを用いて約１／１０のもとの容積まで濃縮して、溶液の伝導率が２５０μＳ／ｃｍ未満に低下するまで水に対して透析した。溶液のｐＨは、ｔｒｉｓ塩基を用いて８．０に調節し、そしてこれを、２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のカラム（３×２０ｃｍ）に加えた。そのカラムを、平衡化緩衝液を３ｍｌ／分の流速で３０分間用い、続いて、３つの連続的勾配のＮａＣｌが含有される２５ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０：０〜５０ｍＭ、５０〜１５０ｍＭおよび１５０〜５００ｍＭを用いて、洗浄した。各々の３つの勾配は、３ｍｌ／分の一定流速を用いて１時間プログラムした。９ｍｌの画分を収集して、フィターゼ活性についてアッセイした。活性の１つの強力なピークが検出された。ピーク画分中のタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮して、１２％のゲルおよび標準的なＬａｅｍｍｌｉ緩衝液システムを用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。この分析の結果、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅによって得られた組み換えＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２フィターゼの調製物が単一の突出したタンパク質成分を含むことが示された。ゲルのデジタル画像を走査することに基づく半定量的な分析（図１）によって約６０〜７９％という純度が示される。
【０３３１】
（実施例８．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来の組み換え体フィターゼのｐＨプロフィール）
（実施例７に従って精製された）Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２フィターゼの活性のｐＨ依存性を、緩衝液中において、そして実施例１に記載の条件下で研究した。この酵素は、広範なｐＨ領域（２〜５．５）で活性であり、ｐＨ３および４〜４．５の周囲で２つの活性最大値を有していた（図２）。
【０３３２】
（実施例９．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来の組み換えフィターゼの基質特異性）
１つのイノシトール残基あたり３、４または５つのリン酸基を含むイノシトールリン酸塩の画分を真菌フィターゼ（Ｎａｔｕｐｈｏｓ）で処理したフィチン酸の部分的加水分解物からイオン交換クロマトグラフィーによって単離した。これらの調製物の産生および精製は、ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ（Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，Ｒｕｓｓｉａ）の商業的サービスであった。種々の程度のリン酸化を有するイノシトール−リン酸塩による各々の画分の混入は、ＨＰＬＣによって５％未満であると判定された（Ｓａｎｄｂｅｒｇ  Ａ．Ｓ．，Ａｈｄｅｒｉｎｎｅ  Ｒ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５１（３），５４７〜５５０）。市販のフルクトース１，６−二リン酸塩およびフルクトース６−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）を、二および一リン酸塩基質に向かうＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２フィターゼの特異性を評価するために用いたモデル基質として用いた。異なる基質での実施例７によって精製されたＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼの活性を、最終反応混合物中において２ｍＭ濃度の基質を用いて、ｐＨ３．５で標準的なアッセイ（実施例１）によって測定した。この結果（図３）によって、この酵素は、イノシトール五リン酸塩で最大活性を有することが示されている。イノシトール三リン酸および四リン酸塩、ならびにフィチン酸での活性は、ある程度類似していたが、フルクトース１，６−二リン酸塩は、むしろ劣った基質であった。フルクトース６−リン酸塩の加水分解は、信頼できる検出限界未満であった。
【０３３３】
（実施例１０．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来の組み換えフィターゼの比活性）
Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼの比活性は、実施例７に従って精製された調製物を用いて評価した。フィターゼ活性は、実施例１に従ってｐＨ３．５で測定した。フィターゼ濃度は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて総タンパク質濃度を測定すること、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって評価されるフィターゼ含量（実施例７）によってこれを補正することによって算出した。これらの測定によれば、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来の組み換えフィターゼの比活性は約１１００Ｕ／ｍｇである。
【０３３４】
（実施例１１．Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２フィターゼとＣ．ｂｒａｋｉｉ  ＹＨ−１５由来のフィターゼとの比較）
初期に記載されたＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒファミリーに属する細菌由来の唯一のフィターゼは、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ  ＹＨ−１５由来の細胞内フィターゼである（Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，１２３１〜１２３４（２００３））。この酵素は、本発明のＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉの分泌フィターゼといくつかの特性を共有し、両方の酵素とも高い比活性の酸性フィターゼである。２つの酵素のアミノ酸配列の直接比較は、不可能である。なぜなら、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ酵素に関する配列情報は、１０アミノ酸残基のストレッチに限定される。Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼの推定アミノ酸配列は、Ｃ．ｂｒａｋｉｉ酵素由来の配列と１０残基のうち９残基を共有するフラグメントを含む。しかし、配列のこのような短いフラグメントの比較では、２つの酵素の全体的な相同性について結論を得ることはできない。２つの酵素の間の最も顕著な相違は、細胞位置である：Ｃ．ｂｒａｋｉｉ由来の酵素は、細胞内であるが、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのフィターゼは明らかに分泌された酵素である。この酵素は、天然の宿主において分泌され、その推定のアミノ酸配列は、シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐアルゴリズム：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／によって予想）を含み、その酵素はまた、その天然のシグナルペプチド下でＥ．ｃｏｌｉから極めて効率的に分泌される。それに加えて、２つの酵素の生化学的な特性には多数の有意な相違が存在する（表１）。表１
（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来のフィターゼとＣ．ｂｒａｋｉｉ  ＹＨ−１４由来のフィターゼとの比較）
【０３３５】
【化７】
2008515401.tif 000007
（＊）Ｋｉｍら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５，１２３１〜１２３４（２００３））によって記載される条件下で測定した：熱処理は１００ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４、６０℃中において３０分で、その後は３７℃の標準アッセイである。
【０３３６】
（実施例１２．フィターゼ改変体の生成および特徴づけ）
フィターゼ改変体は、上記で列挙されるような突然変異誘発方法、例えば、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２，ｐ６４６〜６４９）に、またはＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ１４７〜１５１）に開示される方法、またはＷＯ９２／１８６４５に記載のエラー限界値突然変異誘発プロトコールを用いて、配列番号２の突然変異誘発によって構築した。
【０３３７】
フィターゼ酵素改変体は、以下の発現宿主の１つ以上における異種発現後に特徴付けられた：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【０３３８】
（１．熱安定性）
改変体の熱安定性は、酵素の不活性化温度によって特徴付けた。この不活性化温度は、種々の温度での１０分間のインキュベーションおよび引き続く室温への冷却後、実施例１に記載されるような酵素アッセイにおいて、酵素の残留活性を測定することによって決定した。この不活性化温度とは、この残留活性が、室温で同じ条件下で同じ期間にわたるインキュベーション後の残留活性に比較して５０％である温度である。必要に応じて、測定された活性データからの適切な補間および外挿を行って、５０％残留活性に相当する温度を決定する。熱安定性の相違の℃は、２つの酵素の不活性温度をお互いから差引きすることによって計算した。すなわち、熱安定性の相違（Ｔ．Ｄ．）を、親のフィターゼと比較する（＝不活性化温度（改変体）−不活性化温度（親））。
【０３３９】
表２は、種々の改変体についての熱安定性の相違を列挙する：
表２：配列番号３に示される配列を有する親のフィターゼＰ３−４２由来の改変体の熱安定性の相違
【０３４０】
【化８−１】
2008515401.tif 000008
【０３４１】
【化８−２】
2008515401.tif 000009
【０３４２】
【化８−３】
2008515401.tif 000010
２．他の特徴
他の特徴も改善された。
【０３４３】
選択された改変体の熱安定性、比活性およびペプシン安定性を、上記のアッセイを用いて比較した。このような改変体のペプシン安定性は、コントロール条件と比較して、ペプシンインキュベーション後、ｐＨ３．５、３７℃で測定した残留活性によって特徴付けられた（残留活性＝ペプシンインキュベーション後の活性／コントロール条件下でのインキュベーション後の活性）。ペプシンインキュベーションは、３７℃で、ｐＨ２．０、０．２５ｍｇ／ｍｌ、ペプシン、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで２時間行った。コントロールの条件はｐＨ５．０で１ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで３７℃で２時間であった。
【０３４４】
表３は、選択された改変体の特性を示す（配列番号３に従う、フィターゼ由来および重量に比較して）
【０３４５】
【化９】
2008515401.tif 000011
（配列情報）
【０３４６】
【化１０−１】
2008515401.tif 000012
【０３４７】
【化１０−２】
2008515401.tif 000013
【０３４８】
【化１０−３】
2008515401.tif 000014
上記の明細書に言及された全ての刊行物、およびこのような刊行物に引用された参考文献は、参照によって本明細書に援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変および変形は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者に明白である。本発明は、特定の好ましい実施例と関連して記載されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、分子生物学または関連の領域における当業者に明白である、本発明を行うための記載された方式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３４９】
【図１】図１は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって精製したＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来の組み換えフィターゼのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。この図は、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉフィターゼのサンプルを含むレーンのデジタル写真画像の走査トレースを示す
【図２】図２は、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉのＰ３−４２由来のフィターゼのｐＨプロフィールを示す。
【図３】図３は、Ｃ．ｆｒｅｎｄｉｉのＰ３−４２由来の精製された組み換えフィターゼと、種々の程度のリン酸化およびモデル基質のイノシトールリン酸塩画分との基質特異性を示す。略号：ＩＰ６−フィチン酸、ＩＰ５、ＩＰ４およびＩＰ３−それぞれ、異性体のイノシトール５−、４−および３−リン酸塩の混合物。Ｆｒｕ  Ｐ２−フルクトース１，６−二リン酸塩、Ｆｒｕ  Ｐ１−フルクトース６−リン酸塩。
【図１】
2008515401.tif 000019
【図２】
2008515401.tif 000020
【図３】
2008515401.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月13日(2007.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008515401000001.app
【国際調査報告】
2008515401.tif 000022
2008515401.tif 000023
2008515401.tif 000024