(57)【要約】  本発明は、感染に関与するか、または感染に関与することなく、病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質に関する。本発明はまた、感染に関与するか、または感染に関与することなく、病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質のモジュレーターに関する。
2008520191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ウイルス剤を同定する方法であって、
ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること；および
ｂ）該細胞遺伝子により生産される遺伝子産物のレベルおよび／または活性を検出すること（遺伝子産物および／または遺伝子産物活性の減少または消失が、抗ウイルス活性を有する化合物であることを示す。）
を含む、方法。
【請求項２】
抗ウイルス剤を同定する方法であって、
ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること；
ｂ）前記細胞をウイルスと接触させること；
ｃ）ウイルス感染レベルを検出すること；および
ｄ）ウイルス感染レベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係するウイルス感染の減少または消失が、該薬剤が抗ウイルス剤であることを示す。）
を含む、方法。
【請求項３】
抗ウイルス剤を同定する方法であって、
ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること；
ｂ）前記細胞をウイルスと接触させること；
ｃ）ウイルス感染レベルを検出すること；および
ｄ）ウイルス感染レベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係するウイルス感染の減少または消失が、該薬剤が抗ウイルス剤であることを示す。）
を含む、方法。
【請求項４】
表１に列記した１個以上の遺伝子の機能的欠失を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、病原菌による感染に対して減少した感受性を有する哺乳動物。
【請求項５】
前記病原菌がウイルスである、請求項４に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６】
前記病原菌が細菌である、請求項４に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７】
前記病原菌が真菌である、請求項４に記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８】
病原菌による感染に対して減少した感受性を有する、表１に列記した遺伝子の改変型または破壊型を含む細胞。
【請求項９】
前記病原菌がウイルスである、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記病原菌が細菌である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１１】
前記病原菌が真菌である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞が造血細胞である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１３】
病原菌による感染に対して減少した感受性を有する、表１に列記した遺伝子の改変型または破壊型を含む細胞集団。
【請求項１４】
表１に列記した遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を阻害することを含む、細胞における感染を阻害する方法。
【請求項１５】
前記感染がウイルス感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記感染が細菌感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記感染が真菌感染である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
表１に列記した遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を阻害する一定量の組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるウイルス感染を減少または阻害する方法。
【請求項１９】
前記感染がウイルス感染である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記感染が細菌感染である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記感染が真菌感染である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
表１に列記した１個以上の遺伝子の変異型を有する非ヒト動物集団であって、感染に対して感受性が少ない、集団。
【請求項２３】
前記非ヒト動物が鳥類である、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
前記集団が、ニワトリの一群である、請求項２３に記載の集団。
【請求項２５】
前記ニワトリの一群が、鳥インフルエンザに対して感受性が少ない、請求項２３に記載の集団。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法により同定された抗ウイルス剤。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法により同定された抗ウイルス剤。
【請求項２８】
表１に列記した遺伝子または遺伝子産物の発現または活性が、前記細胞を、化学物質、小分子化合物、タンパク質、ｃＤＮＡ、抗体、モルホリノ、三重らせん分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリゾザイムと接触させることにより阻害される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、化学物質、小分子化合物、タンパク質、ｃＤＮＡ、抗体、モルホリノ、三重らせん分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリゾザイムである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、参照によりその全体を本明細書中に包含される、２００４年１０月２７日出願の米国仮特許出願第６０／６２２，４８６号に優先権を主張する。
【０００２】
承認
本発明は、公衆衛生局（Public Health Service）による研究資金ＲＯ ｌ ＣＡ６８２８３の下に、政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、感染に関与するか、または感染に関与することなく、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫のような１種以上の病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質に関する。本発明はまた、感染に関与するか、または感染に関与することなく、病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質のモジュレーターに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ウイルス感染のための従来の処置には、ＨＩＶプロテアーゼまたは逆転写酵素のような特定のウイルス誘導タンパク質、またはインターフェロンのような組換え（クローン化）免疫モジュレーター（宿主由来）に向けた医薬が包含される。しかしながら、現在の方法は、抗ウイルス医薬を効果のない状態にするウイルスの高い突然変異率を含む、いくつかの限界および欠陥を有する。免疫モジュレーターに関する、限られた有効性、制限する副作用、特異性の欠如は全て、これらの薬剤の一般的適用可能性を制限する。また、現在の抗ウイルス剤および免疫モジュレーターでの成功率は低いままである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、一方または両方のアレルが崩壊したとき、細胞生存に必須ではないが、ウイルス複製に必要である遺伝子に注目する。これは、一方のアレルノックアウトが、細胞にウイルス耐性の表現型を与え得る用量効果で起こり得る。治療的介入の標的として、タンパク質、タンパク質の一部（グリコシル化を含むが、これらに限定されない修飾酵素、脂質修飾物質［ミリスチル化など］）、脂質、転写成分およびＲＮＡ調節分子を含む、これらの細胞遺伝子産物の阻害は、重度の毒性副作用をもたらす可能性を低くすることができ、ウイルス変異は、成功裏の複製の“阻止”を克服する可能性を低くする。
【０００６】
本発明は、ウイルス増殖に必要とされる細胞遺伝子を取り上げることにより、ウイルス感染に対して試みられた治療的介入のこれまでの方法を超える顕著な改善を提供する。故に、本発明はまた、ウイルス感染に必要な細胞遺伝子を阻害することによりウイルスを処理するための方法を提供することによりウイルス感染への介入に対する革新的治療的アプローチを提供する。これらの細胞遺伝子の阻害はまた、細菌、真菌および寄生虫のような他の病原菌による感染の処置にも有用であり得る。これらの遺伝子は、細胞の生存に必要でないため、これらの処置方法は、これまでの方法で見出されているような、対象に対する重大な悪影響なく対象に用いることができる。
【０００７】
発明の概要
本発明は、感染に関与するか、または感染に関与することなく、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫のような１種以上の病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質を提供する。本発明はまた、感染に関与するか、または感染に関与することなく、病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質のモジュレーターの同定方法を提供する。また、感染に関与するか、または感染に関与することなく、病原菌の生活環に関係する、核酸配列およびこれらの配列によりコードされる細胞タンパク質のモジュレーターを提供する。
【０００８】
図面の簡単な説明
図１は、クローン化ＲＩＥ−１細胞の、レオウイルス１型感染に対する耐性の表現型特性の特徴を示す。（Ａ）細胞を、既報［３］のレオウイルス抗原について染色した。ＰＩ細胞のみが、免疫組織化学によって検出されるレオウイルス抗原を含む（黒いウェル）。上側のウェルは、レオウイルス耐性に関して選択された２セットのＲＩＥ−１変異細胞系由来のクローン化ＲＩＥ−１細胞変異体である。下側のウェルは、ＰＩ ＲＩＥ−１（左）、および非感染性野生型ＲＩＥ−１（右）である。（Ｂ）１ｍｌの完全培地（completed medium）中で維持したレオウイルス感受性Ｌ−細胞単層を、変異細胞（上側の２個のウェル）、ＰＩ ＲＩＥ−１細胞（下側左）または非感染性親ＲＩＥ−１細胞（下側右）から得られた溶解物１００μｌ中のウイルスの存在を検出するために用いた。Ｌ−細胞単層のみを、暴露の一週間以内に溶解したＰＩ ＲＩＥ−１細胞由来の溶解物に暴露したことに留意すべきである（ゲンチアナ・バイオレット染色）。
【０００９】
図２は、ＲＩＥ−１変異細胞が、レオウイルスによる溶菌感染に耐性であることを示す。カラムは、非選択的なＲＩＥ−１細胞ライブラリー、ＲＩＥ−１ ４０℃、および代表的レオウイルス耐性変異細胞クローンを含む。レオウイルスの連続２倍希釈を、最上列の最も高いタイターがＭＯＩ＝１×１０４にて作製した。レオウイルス１型感染に対する耐性を、感染の３から７日後に変異細胞において観察した。最下列の細胞（“Ｃ”と示される）は感染させず、細胞生存および増殖に関しての対照とした。細胞を、感染の４日後に、ゲンチアナ・バイオレットを用いて染色した。透明なウェルは、ウイルス感染後の細胞死を示す。
【００１０】
図３は、レオウイルスの生活環モデル、および本明細書中、挿入変異により同定された細胞遺伝子の機能に基づき提案されたチェックポイントを示す。ウイルス生活環は、ウイルスの細胞表面受容体への結合により始まり（上、右回り）、初期エンドソーム中に取り込まれる。その後、これらのエンドソームは、アネキシン−ＩＩ（Ａｎａｘ２）と結合し［８５］、ゴルジ体から移動してきた新しく合成されたリソソーム酵素を含むアネキシン−ＩＩ−結合ビヒクルと融合し［８６］、それはさらに、リソソームと融合する。液胞Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは、リソソームを酸性化し、酸依存性プロテアーゼがウイルス粒子の外膜を消化してそれらを活性化するのを可能にする［８７］。その後、これらの活性化粒子は、リソソーム膜を通過し、ｍＲＮＡの転写を開始する。ゴルジタンパク質ｇｍ１３０（Ｇｏｌｇａ２）は、それらが、ゴルジ層板を介してそれらの新しく合成された物質（cargo）を運ぶように、ビヒクルの結合を仲介すると考えられている［８８、８９］。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍｇａｔｌ）は、細胞表面タンパク質（例えば、受容体）のグリコシル化を開始し、リソソーム酵素の正しい種類の維持に貢献する、同族（kinship）認識を介して多くの役割を果たし得る［９０−９４］。Ｉｇｆ２ｒシャトル酵素は、ゴルジ体由来のリソソームに結合し［９５］、該リソソームにカプサイシンを移す。Ｉｇｆ２の過剰発現は、ｉｇｆ２ｒ結合物質のリソソームへの送達を変え得る（Sheng J, Organ EL, Hao C, Wells, KS, Ruley HE, Rubin DH. 2004）。ＩＧＦ−ＩＩ経路における変異は、溶解性レオウイルス感染に対して耐性を与える（BMC Cell Biology, 5:32 (27 August 2004)）。カルサイクリンおよびα−トロポミオシンは、互いに特異的に結合し、カルサイクリンは、Ａｎｘａ２に結合することが公知である［１６、２０］。故に、それらは、エンドソーム融合に関与し得る。Ｅｉｆ３ｓ１０は、ウイルスメッセンジャーＲＮＡに特異的に結合し、その優先的翻訳を開始する。ＤｎａＪａｌタンパク質は、そのシャペロン機能を有するウイルスタンパク質の正しい折りたたみを容易にし得る［９６］。しかしながら、Ｄｎａｊａｌタンパク質およびＥｉｆ３は、ウイルス輸送またはアポトーシスのそれぞれにさらに役割を果たし得る。最終的に、形態形成は、クリスタリン様配列の新しいビリオンが形成され、細胞溶解が起こり、ウイルスが放出されるときに完了する。変異遺伝子によりコードされる細胞タンパク質の多くは、エンドソームの輸送またはリソソーム融合に直接的または間接的に役割を果たし、故に、初期の分解または転写活性なビリオンの適当な細胞領域への送達に役割を果たし得る。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の好ましい態様の下記の詳細な説明および本明細書中に包含される実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。
【００１２】
本発明の化合物、組成物、物質（article）、装置および／または方法が、開示および記載される前には、本発明は、特定の核酸、特定のポリペプチド、または特定の方法に限定されず、それ自体、もちろん変化してよいことが当然理解される。本明細書で用いられる用語は、特定の態様を記載する目的のみであって、限定することを意図するものではないことも、当然理解される。
【００１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”には、本文中他に異なる明確な記載がない限り、複数形を含む。用語“または”は、本文中他に異なる明確な記載がない限り、規定の代替的構成要素の単一構成要素または２個以上の構成要素の組み合わせを意味する。本明細書で用いる“含む”は、含むことを意味する。故に、“ＡまたはＢを含む”とは、さらなる構成要素を排除することなく、“Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む”ことを意味する。
【００１４】
範囲は、本明細書中、“約”１つの特定の値から、および／または“約”他の特定の値までを表し得る。そのような範囲が示されるとき、他の態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が、前に“約”を用いて近似値として表されるとき、特定の値が他の態様を形成することが理解され得る。範囲の各終点は、他方の終点と関係して、かつ他方の終点とは独立して重要であることが、さらに理解され得る。
【００１５】
“任意”または“所望により”は、その後ろに記載される事象または状況が、起こり得るかまたは起こり得ないこと、ならびにその記載が、該事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、用語“所望により処置前に得られた”は、処置前または処置後に得られたか、または全く得られなかったことを意味する。
【００１６】
本明細書中で用いる“対象”は、個体を意味する。好ましくは、対象は、霊長類のような哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。用語“対象”には、ネコ、イヌなどの飼われている動物、家畜類（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ（gerbil）、モルモットなど）および鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、キジ、ハト（pigeon）、ハト（dove）、オウム、オウム類（cockatoo）、ガチョウなど）が含まれる。本発明の対象はまた、魚類、両生類およびは虫類を含み得るが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の方法は、細胞中でのウイルス増殖に必要であるが、細胞の生存に必要ではないいくつかの細胞遺伝子を提供する。本明細書で用いる細胞遺伝子の“細胞生存に必要ではない”とは、一方または両方のアレルの崩壊が、結果として、ウイルス複製の細胞中での減少または阻害を可能にする少なくとも一定期間の間、細胞生存をもたらす遺伝子を意味する。そのような減少は、予防的もしくは治療的使用または研究における使用のために利用できる。遺伝子について“ウイルス増殖に必要”とは、この遺伝子の遺伝子産物、分泌されたかまたは分泌されないタンパク質またはＲＮＡのどちらかが、直接的または間接的に何らかの方法でウイルスの増殖に必要であり、それ故に、その遺伝子産物（すなわち、機能的に利用可能な遺伝子産物）の不存在において、ウイルスを含む少なくともいくつかの細胞が死ぬことを意味する。本明細書中で用いる通り、“遺伝子産物”は、遺伝子の発現により結果として生じるＲＮＡまたはタンパク質である。
【００１８】
ウイルス感染に関与するこれらの細胞遺伝子または宿主核酸配列は、遺伝子トラップ法を用いて同定された。これらの遺伝子トラップ法は、実施例、ならびに米国特許第６，４４８，０００号および同第６，７７７，１７７号に記載される。米国特許第６，４４８，０００号および同第６，７７７，１７７号は、両方とも、参照によりその全体を本明細書中に包含される。例えば、本明細書に記載の宿主核酸配列は、（ａ）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを細胞培養物中に導入し、（ｂ）前記マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、（ｃ）前記細胞培養物をウイルスで感染させ、そして（ｄ）その中にマーカー遺伝子が挿入されている細胞遺伝子を生存細胞から単離し、それにより細胞中のウイルス増殖に必要であって、細胞生存に必要ではない遺伝子を同定することを含む、細胞中のウイルス増殖に必要であり、細胞生存に必要ではない細胞遺伝子を同定する方法により同定され得る。宿主核酸配列はまた、（ａ）機能的プロモーターを欠く選択マーカー遺伝子をコードするベクターを、血清含有培地中で増殖する細胞培養物中に導入し、（ｂ）前記マーカー遺伝子を発現する細胞を選択し、（ｃ）培養培地から血清を除去し、（ｄ）前記細胞培養物をウイルスで感染させ、そして（ｅ）その中にマーカー遺伝子が挿入されている細胞遺伝子を生存細胞から単離し、それにより細胞中のウイルス増殖に必要であって、細胞生存に必要ではない遺伝子を同定することを含む、細胞中のウイルス増殖に必要であり、細胞生存に必要ではない細胞遺伝子を同定する方法により同定され得る。
【００１９】
これらの宿主配列およびそれらにコードされるタンパク質の同定は、調節（例えば、遺伝子発現および／または遺伝子産物の活性の低下、または遺伝子発現および／または遺伝子産物の活性の増大）、および／または治療的介入の標的となり得る配列の同定を可能にする。
【００２０】
表１は、ウイルス感染に関与するか、またはその他のウイルスの生活環に関係する、宿主核酸配列を記載する。例えば、これらの核酸およびそれらにコードされるタンパク質は、ウイルスの細胞受容体への結合、ウイルス感染、ウイルスの侵入、内在化、ウイルスの分解、ウイルス複製、ウイルス配列のゲノム組み込み、ｍＲＮＡの翻訳、ウイルス粒子の集合、細胞溶解および細胞からのウイルスの放出を含むが、これらに限定されない、ウイルス生活環の全ての段階に関与し得る。
【００２１】
本明細書中で用いる通り、遺伝子とは、プロモーターまたはオペレーターのような調節配列（regulatory sequence）の制御下にポリペプチドをコードする核酸配列である。その遺伝子のコーディング配列は、適当な調節配列の制御下に位置するとき、（インビボ、インビトロまたはインサイチュウで）その一部を転写され、ポリペプチドに翻訳される。コーディング配列の範囲は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の停止コドンにより決定され得る。前記コーディング配列が、真核細胞中で発現されるものであるとき、ポリアデニル化シグナルおよび転写終了配列は、コーディング配列に３’末端の停止コドンを含み得る。
【００２２】
転写および翻訳制御配列には、宿主細胞における発現のようなコーディング配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターのようなＤＮＡ調節配列が含まれるが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルは、例えば真核生物の制御配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合、および下流の（３’方向）コーディング配列の転写開始が可能な調節領域である。さらに、遺伝子は、分泌されるか、または細胞表面に発現されるべきタンパク質のコーディング配列の始めにシグナル配列を含み得る。この配列は、宿主細胞においてポリペプチドの移動を導く、シグナルペプチドである成熟ポリペプチドのＮ末端をコードし得る。
【００２３】
表１（カラム２）はまた、表１に列記される遺伝子によりコードされるタンパク質を提供する。いくつかの例において、遺伝子トラップベクターを、２つの遺伝子に分裂された遺伝子の１つが、マイナス鎖に転写された遺伝子中に存在するようなベクターの位置であるため、その遺伝子をトラップするために利用した。そのような事象の例は、アプラタキシンをコードする遺伝子、およびＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）相同体、サブファミリーＡ、同じベクターによるメンバー１をコードする遺伝子の破壊がある。
【００２４】
表１はまた、ラットおよびヒトゲノム（それぞれ、カラム３およびカラム４）における遺伝子の染色体上の位置を提供する。故に、本発明は、ウイルス感染に関係する遺伝子のゲノム遺伝子座を同定する。ゲノムにおける遺伝子およびその位置を同定することにより、本発明は、遺伝子およびその産物（複数可）の両方を、一部の例として抗ウイルス治療、抗菌治療、抗真菌治療および駆虫治療のような治療の標的として提供する。
【００２５】
また、ラットｍＲＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号（カラム５）、ヒトｍＲＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号（カラム６）およびヒトタンパク質配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号（カラム７）を、表１に提供する。本明細書中に記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で提供される核酸配列およびタンパク質配列は、参照によりその全体を本明細書中に包含される。当業者は、本明細書中に記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で提供される核酸配列は、米国立医学図書館（National Library of Medicine）のNational Center for Biotechnology Information（http://www ncbi nlm nih.,gov/entrez/query.fcgi?db＝nucleotide）から容易に入手可能であることを知り得る。同様に、本明細書中に記載のタンパク質配列は、米国立医学図書館のNational Center for Biotechnology Information（http://www ncbi nlm.nih.gov/entrez/queLy.fcgi?db＝protein）から容易に入手可能である。本明細書中に記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で提供される核酸配列およびタンパク質配列は、参照によりその全体を本明細書中に包含される。
【００２６】
表１はまた、遺伝子トラップベクターの挿入により得られるラット遺伝子の一部の配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号を提供する（カラム９）。簡潔には、これらの遺伝子を、細胞をレトロウイルス遺伝子トラップベクターで感染させ、遺伝子トラップ事象が起こった（すなわち、ベクターは、プロモーター不含有マーカー遺伝子が、細胞プロモーターがマーカー遺伝子の転写を促進するように挿入された、すなわち機能性遺伝子に挿入されたように挿入されていた）細胞を選択することにより、遺伝子トラップライブラリーを作製することにより単離した。その後、その中にレトロウイルス遺伝子トラップベクターが挿入された遺伝子を、レトロウイルス遺伝子トラップベクターに特異的なプローブを用いてクローンから単離した。従って、この方法により単離された核酸は、単離された遺伝子の複数部分である。故に、これらの部分を、配列比較および他のバイオインフォマティクス法により各遺伝子の完全な配列を同定するために利用した。
【００２７】
さらに、ラット遺伝子およびヒト遺伝子についてのＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号を提供する（それぞれカラム１０および１１）。表１に列記されるＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号で提供される情報はまた、参照により全体的に本明細書中に包含される。当業者は、この情報を、米国立医学図書館のNational Center for Biotechnology Information（http://www ncbi nlm.nih.gov/entrez/guery.fcgi?db＝gene）から容易に入手可能である。Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号にアクセスすることにより、当業者は、遺伝子のゲノム上の位置、遺伝子によりコードされるタンパク質の性質の概要、遺伝子の相同性の情報ならびに各遺伝子についてのゲノム、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列のような多数の参照配列のような、表１に列記される遺伝子それぞれについてのさらなる情報を容易に入手可能である。故に、表１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号に記載した配列に加えて、当業者は、各遺伝子に提供されるＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号の下で利用可能なさらなる情報にアクセスすることにより、ゲノム、ｍＲＮＡおよびタンパク質配列のようなさらなる配列を容易に入手可能である。故に、本明細書に記載のＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号から容易に入手可能な情報の全てはまた、参照によりその全体を本明細書中に包含される。
【００２８】
表２は、表１に記載した多数の遺伝子の細胞内での役割に従い、それらの分類を提供する。調節配列のいくつかの例（例えば、転写因子）を、表２にて提供する（例えば、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｃｔｃｆ、ＥＭ、Ｇｔｆ２ｅ１、Ｈｎｒｐｌ、Ｈｏｘｃ１３、Ｈｐｌ−ｂｐ７４、Ｉｄ３、Ｚｎｆ２０７およびＺｆｐ７）。故に、これらの転写因子は、多数の遺伝子経路を制御する。いくつかの場合において、転写因子の破壊は、ウイルス増殖に直接的な影響を有する。他の場合において、転写因子の破壊は、その制御下にある遺伝子または複数の遺伝子の転写または翻訳に影響することによりウイルス増殖に影響を与える。故に、表１および２に記載の転写因子の制御下にある複数の遺伝子群はまた、本発明により、抗ウイルス治療、抗菌治療、駆虫治療および抗真菌治療のような治療のための標的として提供される。表２はまた、小胞輸送、ユビキチン化、アポトーシス、代謝などのような他の経路に関与する遺伝子の例を提供する。故に、表２におけるこれらの経路について記載した遺伝子の上流または下流のどちらかの、これらの経路における他の遺伝子はまた、治療的介入（治療）のための標的として本明細書中に提供される。例えば、ユビキチン化経路において上流または下流のどちらかでＵｂｅｌｃと相互作用する遺伝子産物を生産する遺伝子は、細胞内病原菌に対する治療のための標的であると見なされる。例えば、これは、Ｕｂｅｌｃの発現を調節する転写因子またはＵｂｅｌｃに結合する別のタンパク質であり得る。これらの例は、本明細書中に記載した全ての遺伝子およびそれらが関与する細胞経路へのこの適用の単なる例示である。
【００２９】
表１の遺伝子（複数可）に言及するとき、これには、表１に列記した遺伝子または核酸として機能し得る、何らかの生物由来の何らかの遺伝子、核酸、ｃＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。表１に列記したタンパク質（複数可）に言及するとき、これには、表１に列記したタンパク質として機能し得る、何らかの生物由来の何らかのタンパク質またはその断片が含まれる。例えば、用語ＡＮＸＡ１（アネキシン１）は、ＡＮＸＡ１遺伝子またはＡＮＸＡ１核酸として機能し得る何らかの生物由来の何らかのＡＮＸＡ１遺伝子、核酸、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む。用語ＡＮＸＡ１はまた、ＡＮＸＡ１タンパク質として機能し得る何らかの生物由来の何らかのタンパク質を含む。
【００３０】
本明細書で用いる用語“核酸”は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはその何らかの組み合わせであり得る一本鎖または複数鎖分子を示し、その核酸の修飾型を含む。核酸は、コーディング鎖もしくはその相補鎖、またはその何らかの組み合わせを示す。核酸は、本明細書に記載される部分のいずれかについて天然に存在する配列と同一順序であり得るか、または天然に存在する配列中に見出されるものと同じアミノ酸をコードする選択的コドンを含み得る。これらの核酸はまた、それらの典型的な構造から改変され得る。そのような修飾には、メチル化核酸、リン酸残基上の非架橋酸素の、硫黄（ホスホロチオエート・デオキシヌクレオチドを産する）、セレン（ホスホロセレノエート（phosphorselenoate）・デオキシヌクレオチドを産する）、またはメチル基（メチルホスホネート・デオキシヌクレオチドを産する）のいずれかでの置換、ＡＴに富む領域のＡＴ含量の減少、または発現系の好ましくないコドンの利用の、発現系の好ましいコドンの利用への置換が含まれるが、それらに限定されない。核酸は、適当なベクター中に直接クローニングされ得るか、または要すれば、その後のクローニング段階を促進するために修飾され得る。かかる修飾段階は慣習的であり、例えば、核酸の末端への制限酵素認識部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーの添加である。一般的方法は、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning−A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook)に記載される。
【００３１】
核酸配列が得られれば、その配列をコードする特定のアミノ酸を、当技術分野で公知の技術により、何らかの特定のアミノ酸部位にて修飾または変形することができる。例えば、ＰＣＲプライマーは、アミノ酸の位置（複数可）にわたり、いずれかのアミノ酸を他のアミノ酸に置換し得るように設計され得る。あるいは、当業者は、点変異に関する技術により、特定の核酸配列中のいずれかの点に特定の変異を導入し得る。一般的方法は、参照によりその方法についてその全体を本明細書中に包含されるＳmith, M. “In vitro mutagenesis”Ann. Rev. Gen., 19:423−462 (1985)、およびZoller, M.J. “New molecular biology methods for protein engineering”Curr. Opin. Struct. Biol., 1:605−610 (1991)に記載される。これらの技術は、コードされるアミノ酸配列を変化することなくコーディング配列を変えるために用いることができる。
【００３２】
本明細書において意図される配列には、ウイルス感染に関与する細胞核酸またはタンパク質として機能するための能力を有する全長の野生型（または天然）配列、ならびにアレル変異体、変異体、断片、相同体または融合配列が含まれる。ある例において、タンパク質または核酸配列は、表１に記載の天然配列と、少なくとも７０％の配列同一性を有し、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を有する。他の例において、ウイルス感染に関与する核酸配列は、表１に記載の配列とハイブリダイズする配列を有し、表１に記載の配列の活性を有する。例えば、表１に記載のＡＮＹＡ１核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０００７００に示す核酸配列セット）とハイブリダイズし、ＡＮＸＡ１活性を保持するタンパク質をコードする核酸は、本発明により意図される。そのような配列には、表１に記載の遺伝子のゲノム配列が含まれる。ＡＮＸＡ１についての上記の例は、単に説明するものであって、ＡＮＸＡ１を、表１に列記の全ての核酸およびタンパク質に適用され得るこれらの例に限定するものではない。
【００３３】
他に特に記載がなければ、核酸分子の全ての言及は、核酸の逆の相補鎖を含む。一本鎖であることが本明細書中で必要とされる場合（例えば、ｓｓＲＮＡ分子）を除き、記載される全ての核酸は、一本鎖だけでなく、対応する二本鎖核酸の両方の鎖を包含する。例えば、ｄｓＤＮＡのプラス鎖の記載にはまた、そのｄｓＤＮＡの相補的なマイナス鎖が包含される。さらに、特定のタンパク質、またはその断片をコードする核酸分子の言及は、センス鎖およびその逆の相補鎖の両方を含む。表１および本明細書中に記載の核酸の断片も意図される。これらの断片は、表１に記載の核酸または遺伝子のいずれかを増幅または検出するために、プライマーおよびプローブとして利用され得る。
【００３４】
特定のストリンジェンシーの程度をもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに依存して変化し得る。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度および（Ｎａ＋濃度のような）ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定し得る。特定のストリンジェンシーの程度を達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (chapters 9および11)に開示される。下記に、ハイブリダイゼーション条件の例を記載するが、それに限定されない：
【００３５】
非常に高いストリンジェンシー（９０％の同一性を共有する配列の検出）
ハイブリダイゼーション：５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、室温（ＲＴ）で１５分間
２回洗浄：それぞれ、０．５×ＳＳＣ、６５℃で２０分間
高ストリンジェンシー（８０％またはそれ以上の同一性を共有する配列の検出）
ハイブリダイゼーション：５×〜６×ＳＳＣ、６５℃−７０℃で１６−２０時間
２回洗浄：それぞれ、２×ＳＳＣ、ＲＴで５−２０分間
２回洗浄：それぞれ、ｌ×ＳＳＣ、５５℃−７０℃で３０分間
低ストリンジェンシー（５０％以上の同一性を共有する配列の検出）
ハイブリダイゼーション：６×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で１６−２０時間
少なくとも２回洗浄：それぞれ、２×〜３×ＳＳＣ、ＲＴから５５℃で２０−３０分間。
【００３６】
本発明の核酸を含むベクターもまた提供する。該ベクターは、本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドのいずれかのインビボまたはインビトロ合成を誘導し得る。ベクターは、挿入された核酸の転写を誘導および調節する、必須の機能的要素を有することが意図される。これらの機能的要素には、プロモーター、プロモーターの転写活性を調節し得るエンハンサーのようなプロモーターの上流または下流の領域、複製オリジン、プロモーターに隣接するインサートのクローニングを促進するための適当な制限酵素認識部位、抗生物質耐性遺伝子、またはベクターを含む細胞、もしくはインサート、ＲＮＡスプライス部位、転写末端部位もしくは挿入遺伝子またはハイブリッド遺伝子の発現を促進するために用いられ得る何らかの他の領域を含むベクターの選択に用いられ得る他のマーカー（一般的には、Sambrook et al.を参照のこと）が含まれるが、それらに限定されない。ベクターは、例えばプラスミドであり得る。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、アンピシリン耐性、ゲンタマイシン耐性、ネオマイシン耐性または選択可能マーカーとしての使用に適する他の遺伝子もしくは表現型、または遺伝子増幅のためのメトトレキサート耐性を付与する遺伝子を包含し得る。
【００３７】
当業者に公知の、多数の他の大腸菌（エシェリキア・コリ）発現ベクターが存在し、それは、核酸インサートの発現に有用である。使用に適する他の微生物宿主には、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス属、およびサルモネラ菌、セラチア菌および様々な緑膿菌種のような他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核宿主において、それは、典型的に宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば、複製オリジン）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージ由来のプロモーター系のような多数の様々な公知のプロモーターが存在し得る。プロモーターは、典型的に、所望によりオペレーター配列と共に発現を制御し得、例えば、転写および翻訳の開始および完了のためのリボソーム結合部位配列を有する。要すれば、アミノ末端メチオニンは、５’のＭｅｔコドンおよび下流に核酸インサートを有するインフレームの挿入により提供され得る。また、核酸インサートのカルボキシ末端伸張を、標準オリゴヌクレオチド変異導入法を用いて除くことができる。また、核酸修飾を、アミノ末端の均質性を高めるために作製することができる。
【００３８】
さらに、酵母発現を用いることができる。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であって、酵母細胞により発現され得る核酸を提供する。より特には、核酸は、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）または出芽酵母（S. cerevisiae）により発現され得る。例えば、出芽酵母およびメタノール資化酵母を含む酵母発現系にはいくつかの利点がある。第一に、正しいジスルフィド対形成を示すタンパク質が、酵母分泌系で産生されるという証拠が存在する。第二に、効率的な大規模生産を、酵母発現系を用いて行うことができる。出芽酵母ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファ接合因子リーダー部位（ＭＦα−１遺伝子にコードされる）を、酵母からのタンパク質分泌を誘導するために用いることができる（Brake, et al.）。ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファ接合因子のリーダー部位は、シグナルペプチド、およびＫＥＸ２遺伝子によりコードされる酵母プロテアーゼの認識配列を含むｐｒｏ−部分を含む：この酵素は、Ｌｙｓ−Ａｒｇジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側で前駆タンパク質を切断する。核酸コーディング配列は、ｐｒｅ−ｐｒｏ−アルファ接合因子リーダー部位にインフレームで融合し得る。この構築物を、アルコールデヒドロゲナーゼＩプロモーター、アルコールオキシダーゼＩプロモーター、解糖系プロモーター、またはガラクトース利用経路用のプロモーターのような強力な転写プロモーターの制御下に置くことができる。核酸コーディング配列は、その後に転写終了シグナルが続く翻訳終止コドンがその後に続く。あるいは、核酸コーディング配列は、親和性クロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にするために用いられるＳｊ２６またはベータ−ガラクトシダーゼのような二次タンパク質コーディング配列と融合させることができる。融合タンパク質の構成成分を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入は、酵母での発現に用いられる構築物に適用可能である。効率的な翻訳後グリコシル化および組換えタンパク質の発現は、バキュロウイルス系でも達成することができる。
【００３９】
哺乳動物細胞は、折りたたみおよびシステイン対形成、複合糖質構造の添加、および活性タンパク質の分泌のような重要な翻訳後修飾を有利にする環境でのタンパク質の発現を可能にする。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルの間へのタンパク質コーディング配列の挿入により特徴付けられる。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、ゲンチシン（genticin）およびＧ４１８耐性、または選択可能マーカーとしての使用に適する他の遺伝子もしくは表現型、または遺伝子増幅のためのメトトレキサート耐性を付与する遺伝子を含み得る。キメラタンパク質コーディング配列を、メトトレキサート耐性をコードするベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に導入するか、または適する選択マーカーを用いて他の細胞系に導入することができる。形質転換細胞中のベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット分析により確認することができる。インサート・コーディング配列に対応するＲＮＡの産生は、ノーザンブロット分析により確認することができる。無傷のヒトタンパク質を分泌し得る多くの他の適する宿主細胞系が、当技術分野で開発され、それにはＣＨＯ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、ジャーカット細胞などが含まれる。これらの細胞用の発現ベクターには、複製オリジン、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列のような必要な情報のプロセシング部位が含まれ得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。
【００４０】
本明細書に記載の発現ベクターはまた、テトラサイクリン誘導プロモーターまたはグルココルチコイド誘導プロモーターのような誘導プロモーターの制御下に本発明の核酸を含み得る。本発明の核酸はまた、組織特異的プロモーターの制御下に存在し、特定の細胞、組織または臓器において核酸の発現を促進し得る。当技術分野で多くの例が公知である、プロモーターメタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、および他の制御可能プロモーターのような何らかの制御可能プロモーターも意図される。さらに、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ誘導系、ならびにＦｌｐリコンビナーゼ誘導プロモーター系も用いることができ、両方とも当技術分野で公知である。
【００４１】
ヒトγ−インターフェロン、組織プラスミノゲン活性化因子、凝固因子ＶＩＩＩ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼＮｅｘｉｎｌ、および好酸球主要塩基性タンパク質の発現用に開発されたのと同様の、哺乳動物細胞における遺伝子または核酸の発現のための選択的ベクターを用いることができる。さらに、ベクターは、哺乳動物細胞（ＣＯＳ−７のような）における挿入核酸の発現に利用可能なＣＭＶプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００４２】
昆虫細胞もまた哺乳動物タンパク質の発現が可能である。バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞中で生産される組み換えタンパク質は、野生型タンパク質のそれと同じ翻訳後修飾を受ける。簡単には、昆虫細胞における活性タンパク質の発現に有用なバキュロウイルスベクターは、ポリヘドリンをコードする遺伝子のAutographica californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）プロモーターの下流のタンパク質コーディング配列（主要な封入タンパク質）の挿入により特徴付けられる。スポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）細胞系のような培養昆虫細胞を、ウイルスおよびプラスミドＤＮＡの混合物を用いてトランスフェクトし、子孫ウイルスを播く。ポリヘドリン遺伝子の欠失または挿入不活性化は、野生型の封入陽性ウイルスのプラークとは顕著に異なるプラークからの、封入陰性ウイルスの産生をもたらす。これらの独特のプラーク形態は、ＡｃＮＰＶ遺伝子を、選択したハイブリッド遺伝子で置換した組換えウイルスの視覚的スクリーニングを可能にする。
【００４３】
本発明はまた、宿主における核酸の発現に適する、意図した核酸を含むベクターを提供する。宿主細胞は、例えば、細菌細胞を含む原核細胞であり得る。より特には、細菌細胞は、大腸菌細胞であり得る。あるいは、細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＬＡ細胞、鳥類細胞、骨髄腫細胞、ピチア細胞、または昆虫細胞を含む、真核細胞であり得る。本明細書に記載のポリペプチドのいずれかのコーディング配列を、メトトレキサート耐性をコードするベクターを用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に導入するか、または適する選択マーカーを用いて他の細胞系に導入することができる。形質転換細胞中のベクターＤＮＡの存在は、サザンブロット分析により確認することができる。インサート・コーディング配列に対応するＲＮＡの生産は、ノーザンブロット分析により確認することができる。多くの他の適する宿主細胞系が開発され、それには骨髄腫細胞系、線維芽細胞系、および黒色腫細胞系のような様々な腫瘍細胞系が含まれる。これらの細胞用の発現ベクターには、複製オリジン、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列のような必要な情報のプロセシング部位が含まれ得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどから誘導されるプロモーターである。興味のある核酸部分を含むベクターを、細胞宿主のタイプによって異なる公知の方法により宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、塩化カルシウムを用いる形質転換を、通常、原核細胞用に利用し、一方、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクトアミン、またはリポフェクチンが仲介するトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは現在公知もしくは将来確認される何らかの方法を、他の真核細胞宿主に用いることができる。
【００４４】
ポリペプチド
本発明は、表１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号下に記載のポリペプチドまたはタンパク質配列を含む単離ポリペプチドを提供する。本発明はまた、これらのポリペプチドの断片、例えば、アネキシンＡｌタンパク質の断片、アネキシンＡ２タンパク質の断片、アネキシンＡ３タンパク質の断片などを提供する。これらの断片は、抗体の作製のための抗原ペプチドとして十分な長さであり得る。本発明はまた、タンパク質の少なくとも１種の活性、例えばウイルス感染に必要であるが、細胞の生存に必要ない活性を有する表１に記載のタンパク質の機能的断片を意図する。表１に記載のポリペプチドが他の性質を有することは、当業者に公知であり得る。例えば、ＡＢＣＡ４は、ＡＴＰ結合カセット輸送体のサブファミリーのメンバーである。故に、当業者は、ＡＢＣＡ４断片の、ＡＴＰ結合カセット輸送体として機能するその能力を評価することができた。ＡＴＰ結合カセット輸送体活性があるとき、当業者は、ＡＢＣＡ４が、ＡＢＣＡ４の機能的断片であることを知り得た。表１に列記したポリペプチドの断片および変異体は、そのそれぞれのＧｅｎＢａｎｋ受託番号下に列記したアミノ酸配列と比較して１個以上の保存アミノ酸残基を含み得る。
【００４５】
“単離ポリペプチド”または“精製ポリペプチド”とは、ポリペプチドが、通常、天然または培養下で結合する物質から実質的に遊離した形態であるポリペプチドを意味する。本発明のポリペプチドは、例えば、可能なときは、天然源（例えば、哺乳動物細胞）から抽出するか、ポリペプチドをコードする組換え核酸を発現させるか（例えば、細胞中または無細胞翻訳系で）、またはポリペプチドを化学的に合成することにより得ることができる。さらに、ポリペプチドを、全長ポリペプチドを切断することにより得ることができる。ポリペプチドが、天然に存在するポリペプチドより大きい断片であるとき、単離したポリペプチドが、より短く、全長を含まないとき、その天然に存在するポリペプチドは、断片である。
【００４６】
本発明のポリペプチドを、溶液法および固相法を含む、当技術分野で公知の多数のポリペプチド化学合成法のいずれかを用いて製造することができる。本発明のポリペプチドを作製する１つの方法は、タンパク質化学技術により２個以上のペプチドまたはポリペプチド結合させる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（butyloxycarbonoly））化学のどちらかを用いて現在利用可能な実験装置を用いて化学的に合成することができる（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。当業者は、本発明の抗体に相当するペプチドまたはポリペプチドを、例えば標準的化学反応により合成することができることを容易に理解する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドが合成され、その合成レジンから切断されないが、一方、抗体の他の断片が合成され、その後、レジンから切断され、それにより他の断片上で機能的に妨げられる末端基が露出する。ペプチド縮合反応により、これらの２個の断片は、そのカルボキシル末端およびアミノ末端それぞれにてペプチド結合により共有結合し、抗体、またはその断片を形成し得る（Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N −Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer−Verlag Inc., NY）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、上記に記載の通り、インビボで独立して合成する。一度単離すると、これらの独立ペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応により、抗体またはその断片を形成するために結合し得る。
【００４７】
例えば、クローン化または合成ペプチド断片の酵素的ライゲーションは、より長いペプチド断片、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を作製するために、比較的短いペプチド断片を結合させるのを可能とする（Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991））。あるいは、合成ペプチドの化学的ライゲーション法（native chemical ligation）を、より短いペプチド断片から長いペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築するために利用することができる。この方法は、２段階化学反応からなる（Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776−779 (1994)）。第一段階は、非保護合成ペプチド−α−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチド断片を化学選択的に反応させ、最初の共有結合産物としてチオエステル結合中間体を得る。反応条件を変えることなく、この中間体を、自発的な、急速な分子内反応に付し、ライゲーション部位に天然ペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成の、この天然化学ライゲーション法の適用は、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の製造により説明される（Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97−101; Clark−Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark−Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623−30 (1994)）。
【００４８】
あるいは、非保護ペプチド断片を、化学的ライゲーションの結果得られたペプチド断片間に形成された結合が、非天然（非ペプチド）結合であるとき、化学的に結合させる（Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992)）。この技術は、完全な生物活性を有するタンパク質ドメインならびに多量の比較的純粋なタンパク質の合成類似体に用いられている（deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257−267 (1992））。
【００４９】
本発明のポリペプチドはまた、例えば、組換え技術を含む他の手段により製造できる。適当なクローニングおよび配列決定技術の例、ならびに多くのクローニング法についての当業者に十分な指示は、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning−A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook）に見出される。
【００５０】
また、本発明は、表１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号下に記載のポリペプチド配列またはこれらのポリペプチド配列の断片と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００５１】
本明細書中で用いる用語“相同性”および“同一性”は、類似性と同じ意味であることが理解される。従って、例えば、用語「相同性」の使用が、２個の非天然配列に言及して用いられるとき、これは、これら２個の配列間の進化的関係を示す必要はなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性を見ていることが理解される。２個の進化的に関係した分子間の相同性を決定するための多くの方法が、常套的に、それらが、進化的に関係するかどうかに関わらず、配列類似性を測定することを目的として、いずれかの２個以上の核酸またはタンパク質に用いられる。
【００５２】
一般的に、本明細書中に開示の核酸およびポリペプチドの、何らかの公知の変異体および誘導体または生じ得るものを定義する一つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性の点からその変異体および誘導体を定義することであることが理解される。一般的に、本明細書中に開示される核酸およびポリペプチドの変異体は、典型的に、規定配列または天然配列と、少なくとも、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を有する。当業者は、２個のポリペプチドまたは核酸の相同性を決定するための方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルであるように２個の配列を整列後に、その相同性を測定することができる。
【００５３】
相同性を測定するための他の方法は、既報のアルゴリズムにより実行し得る。比較のための配列の最適な整列は、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムによるか、Needleman and Wunsch, J M61. Biol. 48: 443 (1970）の相同性整列アルゴリズムによるか、Pearson and Lipman, Proc. Nad. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988）の類似法の探索によるか、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA；National Center for Biotechnology Information（http://www ncbi nhn nih gov/blast/bl2seq/bl2.html)から利用可能なTatusova and Madden FEMS Microbiol. Lett. 174: 247−250 (1999)のＢＬＡＳＴアルゴリズム）のコンピューター上での実行によるか、または調査（inspection）により、行うことができる。
【００５４】
相同性の同じタイプを、例えば、核酸配列に少なくとも関係する物質について、参照により本明細書中に包含されるZuker, M. Science 244:48−52, 1989, Jaeger et al. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 86:7706−7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281−306, 1989に開示のアルゴリズムにより、核酸に関して得ることができる。その方法のいずれかを典型的に用いることができること、およびある例において、これらの様々な方法の結果が異なり得るが、当業者は、同一性がこれらの方法の少なくとも１つで発見されるとき、その配列は、規定の同一性を有すると言えることを理解することが、理解される。
【００５５】
例えば、本明細書で用いる通り、他の配列と特定の％の相同性を有するとして引用された配列は、上記の計算法のいずれか１個以上により計算されたように引用された相同性を有する配列を意味する。例えば、本明細書に記載の通り、たとえ第一の配列が、他のいずれかの計算法による計算で第二の配列と８０％の相同性を有しなくとも、第一の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算法を用いて第二の配列と８０％の相同性を有することが計算されたならば、第一の配列は、第二の配列と８０％の相同性を有する。他の例として、本明細書に記載の通り、たとえ第一の配列が、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ計算法、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ計算法、Ｊａｅｇｅｒ計算法、または他のいずれかの計算法による計算で第二の配列と８０％の相同性を有しなくとも、第一の配列が、Ｚｕｋｅｒ計算法およびＰｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ計算法の両方を用いて第二の配列と８０％の相同性を有することが計算されたならば、第一の配列は、第二の配列と８０％の相同性を有する。さらに他の例として、本明細書に記載の通り、第一の配列が、それぞれの計算法を用いて第二の配列と８０％の相同性を有することが計算されたならば、第一の配列は、第二の配列と８０％の相同性を有する（しかし、実際は、異なる計算法は、異なる計算された相同性％の結果となることもしばしばあり得る）。
【００５６】
また、本発明は、１個以上の保存的アミノ酸置換を有する表１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号下に記載のポリペプチドを提供する。これらの保存的置換は、天然に存在するアミノ酸が、同様の性質を有するものにより置換されるようなものである。そのような保存的置換は、ポリペプチドの機能を変化させない。例えば、保存的置換を、下記の表に従って作製することができる：
【００５７】
【表１】
2008520191.tif 000003
【００５８】
従って、望ましいとき、修飾および変形を、本発明のポリペプチドをコードする核酸および／または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において作製し、類似のまたは他の望ましい特徴を有するポリペプチドをまだ得ることができることが理解される。そのような変形は、天然の単離体に起こり得るか、または部位特異的変異導入法、当技術分野で公知のミスマッチポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような方法を用いて合成的に導入することができる。例えば、あるアミノ酸を、ポリペプチドにおいて、機能的活性の相当な消失なく他のアミノ酸に置換することができる。故に、様々な変形が、生物学的利用性または活性の相当な消失なく、そのような利用性または活性の増加を有する可能性のある、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（または、元の核酸配列）を作製可能であると考えられる。故に、本明細書に記載のポリペプチド配列中の天然に起こる変形、ならびに本明細書に記載のポリペプチド配列の遺伝子的に改変した変形が、本発明により意図されることは明確である。ウイルス感染に関与する遺伝子のゲノム上の位置を提供することにより、本発明はまた、これらの遺伝子の変形配列のいずれかのゲノム上の位置を提供する。故に、本明細書中に提供した情報を基に、本発明者らにより同定されたゲノム領域を同定および配列決定し、本明細書に記載の遺伝子の変形配列を同定することは、当業者にとって常套的に可能である。また、本明細書に記載の遺伝子の相同体であり、感染に必要であるが、細胞の生存に必要ではない他の種からの配列を同定するために比較ツールおよびバイオインフォマティクス技術を利用することは、当業者当業者にとって常套的に可能である。
【００５９】
抗体
本発明はまた、表１に記載の遺伝子産物、ポリペプチド、タンパク質およびその断片に特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明の抗体は、ポリペプチドに選択的に結合する。“選択的に結合する”または“特異的に結合する”とは、抗原の存在を決定する抗体結合反応を意味する（存在するとき、タンパク質および他の生物学的物質の不均一な集団のうち、表１に記載のポリペプチドまたはその抗原断片）。故に、指定の免疫測定条件下、特定の抗体は、特定のペプチドに特異的に結合し、試料中のかなりの量の他のタンパク質に結合しない。好ましくは、選択的結合には、分析バックグラウンドの約１．５倍またはそれ以上の結合が含まれ、有意な結合の不存在は、分析バックグラウンドの１．５倍未満である。
【００６０】
本発明はまた、天然の相互作用因子（interactor）またはリガンドに結合するために、表１に記載のタンパク質と競合する抗体を意図する。言い換えると、本発明は、表１に記載のタンパク質とそれらの結合パートナーとの相互作用を破壊する抗体を提供する。例えば、本発明の抗体は、細胞上の結合部位（例えば、受容体）に関してタンパク質と競合し得るか、または抗体は、他のタンパク質または表１に記載の転写因子の転写調節下にある核酸のような生体分子に結合するために、タンパク質と競合し得る。抗体は、所望により、抗原と比較して、アンタゴニスト機能またはアゴニスト機能のどちらかを有し得る。
【００６１】
好ましくは、抗体は、エクスビボまたはインビボでポリペプチドに結合する。所望により、本発明の抗体は、検出可能な部分で標識される。例えば、検出可能な部分は、蛍光部分、酵素結合部分、ビオチン部分および放射性標識部分からなる群から選択され得る。抗体を、診断、スクリーニング、または画像化のような技術または方法に用いることができる。抗イディオタイプ抗体および親和性成熟抗体はまた、本発明の一部であると見なされる。
【００６２】
本明細書で用いる用語“抗体またはその断片”には、二重もしくは多重抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびに、ハイブリッド断片を含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどのような断片が含まれる。故に、それらの特定の抗原に結合する能力を有する抗体の断片を提供する。そのような抗体および断片は、当技術分野で公知の技術により作製することができ、実施例に記載の方法に従い、および抗体を作製し、特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的方法で、特異性および活性についてスクリーニングすることができる（Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)を参照のこと）。
【００６３】
また、“抗体またはその断片”の意味には、例えば、参照によりその内容を本明細書中に包含される米国特許第４，７０４，６９２号に記載の抗体断片および抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）の複合体が包含される。
【００６４】
所望により、前記抗体を、他の種で作製し、ヒトに投与するために“ヒト化”する。本発明の１つの態様において、“ヒト化”抗体は、生殖細胞系変異動物により作製される抗体のヒトバージョンである。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列のような）その断片である。ヒト化抗体には、受容側のＣＤＲ由来の残基を、望ましい特異性、親和性および能力（capacity）を有する、マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（供与側抗体）のＣＤＲ由来の残基で置換されるヒト免疫グロブリン（受容側抗体）が含まれる。１つの態様において、本発明は、表１に記載のタンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の少なくとも１個、２個、３個、４個、または全てのＣＤＲまでを含む抗体のヒト化バージョンを提供する。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、受容側抗体にも、インポートＣＤＲ（imported CDR）またはフレームワーク配列中にも発見されない残基を含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全ての、または少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインを含み得、ここで、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列である。ヒト化抗体は、有利には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含み得る（Jones et al., Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323−327 (1988）；および、Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593−596 (1992)）。
【００６５】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当技術分野で公知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである起源由来の、それに導入された１個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、“インポート（import）”残基と称され、それらは、典型的に、“インポート”可変ドメインから取られる。ヒト化は、基本的にWinterおよび同僚の方法（Jones et al., Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323−327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534−1536 (1988)）に従い、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、行われ得る。従って、かかる“ヒト化”抗体は、キメラ抗体（米国特許番号第４，８１６，５６７号）であり、ここで、実質的に無傷ではないヒト可変ドメインは、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている。実際に、ヒト化抗体は、典型的に、ヒト抗体であり、ここで、いくつかのＣＤＲ残基および可能性のあるいくつかのＦＲ残基は、齧歯動物抗体の類似部位に由来する残基により置換される。
【００６６】
薬剤の同定
抗ウイルス剤を同定する方法は、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）細胞遺伝子により生産される遺伝子産物のレベルおよび／または活性を検出すること（遺伝子産物および／または遺伝子産物活性の減少または消失が、抗ウイルス活性を有する化合物であることを示す。）、を含む。
【００６７】
本発明はまた、抗ウイルス剤を同定する方法であって、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）前記細胞をウイルスと接触させること、ｃ）ウイルス感染のレベルを検出すること、そしてｄ）ウイルス感染のレベルと、表１の遺伝子の発現レベルまたは表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係するウイルス感染の減少または消失が、該薬剤が抗ウイルス剤であることを示す。）、を含む方法を提供する。例えば、前記薬剤は、遺伝子発現および／または該遺伝子のタンパク質またはポリペプチド産物の活性を妨げ得る。本発明の方法において、本発明の試験化合物または抗ウイルス剤は、細胞をウイルスと接触させる前または後、またはウイルスとの接触と同時に送達され得る。
【００６８】
上記の方法は、感染を減少させるか、感染を防止するか、または病原菌（複数可）で感染後の細胞生存を促進する活性を有する何らかの薬剤を同定するために利用可能である。それ故、本発明の方法において、細胞をウイルスと接触させる段階は、細胞を何らかの感染性病原菌と接触させる段階で置換され得る。感染には、非組換えウイルス、組換えウイルス、プラスミド、細菌、プリオン、真核微生物、または細胞培養中の細胞または対象の細胞のような宿主に感染し得る他の物質のような感染物質の導入が含まれる。かかる感染は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで可能である。
【００６９】
本明細書中に記載の方法に用いる試験化合物は、化学物質、小分子化合物、薬剤、タンパク質、ｃＤＮＡ、抗体、モルホリノ、三重らせん分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または本明細書中に記載の細胞遺伝子の発現および／または機能を妨げる、現在公知のもしくは将来同定される何らかの他の化合物であり得るが、それらに限定されない。試験化合物はまた、本明細書中に記載の細胞遺伝子の遺伝子産物の活性を調節し得る。
【００７０】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それにより遺伝子発現を減少またはさらに阻害し得る二本鎖ＲＮＡである。いくつかの例において、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも２１ヌクレオチドのような約１９−２３ヌクレオチド長、例えば少なくとも２３ヌクレオチド長である。一例にて、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡのような相同性ＲＮＡ分子の特異的分解を引き起こす。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は、３’突出末端と対形成するとき、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示する。ｄｓＲＮＡプロセシングの方向は、センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡが、生じたｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体により切断され得るかどうかを決定する。故に、ｓｉＲＮＡは、例えば、表１に記載の１個またはそれ以上の遺伝子のような遺伝子のサイレンシングにより、転写を調節するために用いることができる。ｓｉＲＮＡの効果は、ショウジョウバエ、線虫、昆虫、カエル、植物、真菌、マウスおよびヒトを含む、様々な生物由来の細胞で証明されている（例えば、ＷＯ０２／４４３２１；Gitlin et al., Nature 418:430−4, 2002; Caplen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9742−9747, 2001；および、Elbashir et al., Nature 411:494−8, 2001）。
【００７１】
ある例において、ｓｉＲＮＡを、同じ核酸配列に対して用いた遺伝子トラップ法の結果を確認するために、ある標的遺伝子に対して向ける。配列分析ツールの利用により、当業者は、遺伝子発現を減少させるために、表１に記載の何らかの遺伝子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡを設計し得る。表１に記載の何らかの遺伝子の遺伝子発現を阻害またはサイレンスするｓｉＲＮＡは、Ambion Inc. 2130 Woodward Austin, TX 78744−1832 USAから入手可能である。Ambion Inc.により合成されたｓｉＲＮＡは、両方とも表１のラットおよびヒトコーディング配列について提供される、コーディング配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号または遺伝子についてのＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号を提供することにより容易に得ることができる。
【００７２】
また、本明細書中、表１に列記した遺伝子の遺伝子発現を減少するのに利用可能な配列の例を提供する。特に、表３は、表１に列記した遺伝子についてのセンスＲＮＡ配列およびアンチセンスＲＮＡ配列を提供する。故に、表３に記載のセンスまたはアンチセンス配列のいずれかを、遺伝子発現を阻害するために、単独でまたは他の配列と組み合わせて用いることができる。これらの配列は、ｓｉＲＮＡ配列の効率の良いクローニングおよび発現を可能にする３’ＴＴ突出配列および／または付加配列を含み得る。これらの配列は、表３に列記した遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を分析することにより得られる。故に、表３は、分析した各遺伝子の名前、その遺伝子のｍＲＮＡについてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号、そのｍＲＮＡの長さ、そのｍＲＮＡのＯＲＦ領域および各遺伝子についての位置番号を提供する。各遺伝子についての位置番号は、表１に列記したＥｎｔｒｅｚ遺伝子番号に相当する。表３はまた、表３に記載のセンスＲＮＡ配列および／またはアンチセンスＲＮＡ配列の標的とされる遺伝子のオープンリーディングフレーム中に配列の開始部位を提供する。標的配列の開始部位を、名前カラムおよび開始カラムに示す。名前カラムはまた、各標的配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号識別子を提供する。故に、名前ＮＭ−０００３５０−ｓｉＲＮＡ−４５８を有する表３の列は、センスおよびアンチセンス配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０００３５０に対応し、標的配列の開始部位が４５８であることを示すことは、明確であろう。例えば、ＡＢＣＡ４遺伝子の標的配列は、４５８位から始まる。故に、配列番号１を含む配列および／または配列番号２を含む配列は、ＡＢＣＡ４を標的とし、ＡＢＣＡ４遺伝子発現を減少させるのに利用することができる２個の配列である。同様に、配列番号３を含む配列および／または配列番号４を含む配列は、ＡＢＣＡ４発現を標的とするために利用できる。これらの例は、制限することを意味せず、表３に記載のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ配列全てに関連する。本明細書中に記載のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ配列を含む配列を、何らかの細胞（真核または原核）、動物または何らかの他の生物において、遺伝子発現を阻害するのに利用することができる。これらの配列は、ベクター中にクローニングされ、インビトロ、エクスビボまたはインビボで遺伝子発現を減少させるために利用可能である。
【００７３】
ｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）は、ＲＮＡｉ干渉実験を目的として、ｓｉＲＮＡ（１９−２１ｎｔの二本鎖ＲＮＡ）を発現させるために発現ベクター中にクローニングされ得るＤＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、下記の構造的特徴：標的遺伝子から誘導された約１９−２９ヌクレオチドの範囲の短いヌクレオチド配列、次いで、約４−１５ヌクレオチドの短いスペーサー（すなわち、ループ状）、および最初の標的配列の逆相補体である約１９−２９ヌクレオチド配列、を有する。例えば、表３に記載の遺伝子のいずれかのセンスｓｉＲＮＡ配列を、ｓｈＲＮＡを設計するために利用することができる。例としては、Ｃ１０ｏｒｆ３のセンスＲＮＡ配列（配列番号２９２）を、典型的なリンカー配列（ＣＧＡＡ）を用いてｓｈＲＮＡを設計するために利用した。下記に示す通り、センス配列は、リンカー（ＣＧＡＡ）により、アンチセンス配列と結合し、トップ鎖（top strand）を形成する。トップ鎖およびボトム鎖（bottom strand）を、発現に適するベクター中にクローニングされ得る二本鎖オリゴヌクレオチドを作製するためにアニーリングする。二本鎖オリゴヌクレオチドは、下記のヌクレオチド突出を有し、クローニングを促進し得る。これらの配列は、ベクター中にクローニングされ、遺伝子発現を減少させるためにインビトロ、エスクビボまたはインビボで利用され得る。
【００７４】
【表２】
2008520191.tif 000004
【００７５】
故に、表３に記載のいずれかのセンス配列を、リンカーを用いてその対応するアンチセンス配列と結合させ、ｓｈＲＮＡ用のトップ鎖を作製することができる。ボトム鎖は、トップ鎖の逆相補体である。表３に記載の配列の“Ｕ”を、“Ｔ”と置換し、ＤＮＡ鎖を作製する。その後、トップ鎖およびボトム鎖をアニーリングし、二本鎖ｓｈＲＮＡを形成させる。上記の通り、トップ鎖およびボトム鎖は、突出または付加配列を有し、発現ベクター中へのクローニングを促進し得る。
【００７６】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的なハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレアーゼ的切断を伴う。ＲＮＡ発現を減少または阻害するためにリボザイムを用いる方法は、当技術分野で公知である（例えば、Kashani−Sabet, .T. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 7:76−78, 2002を参照のこと）。
【００７７】
一般的に、用語“アンチセンス”は、いくらかの配列相補性により、ＲＮＡ配列の一部（ｍＲＮＡのような）とハイブリダイズし得る核酸分子を示す。本明細書中で開示のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡまたはその修飾体または誘導体であるオリゴヌクレオチドであって、それを、細胞に直接投与することができるか（例えば、アンチセンス分子を対象に投与することにより）、または外来性の導入配列の転写により細胞内で産生することができる（例えば、プロモーターの制御下にアンチセンス分子を含むベクターを対象に投与することにより）。
【００７８】
アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、例えば６から１００ヌクレオチド長である、ポリヌクレオチド、例えば核酸分子である。しかしながら、アンチセンス分子はより長くてよい。特定の例において、ヌクレオチドは、１個またはそれ以上の塩基性部分、糖部分、またはリン酸骨格（または、その組み合わせ）にて修飾され、ペプチドのような他の付加基、または細胞膜（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86:6553−6; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84:648−52；ＷＯ８８／０９８１０）もしくは血液脳関門（ＷＯ８９／１０１３４）を通過する輸送を促進する物質、ハイブリダイゼーションを誘発する切断物質（Krol et al., BioTechniques 1988, 6:958−76）、または挿入物質（Zon, Pharm. Res. 5:539−49, 1985）を含み得る。
【００７９】
修飾塩基部分の例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンオシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−Ｓ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが含まれるが、それらに限定されない。
【００８０】
修飾糖部分の例には、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシロース、およびヘキソース、またはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホトアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、またはホルムアセタールもしくはその類似体のようなリン酸骨格の修飾成分が含まれるが、それらに限定されない。
【００８１】
特定の例において、アンチセンス分子は、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡの特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは対照的に、その鎖は互いに平行である（Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625−41, 1987）。オリゴヌクレオチドは、ペプチド、ハイブリダイゼーションを誘導する架橋物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーションを誘導する切断物質のような他の分子と結合し得る。オリゴヌクレオチドは、宿主細胞による分子の取り込みを増強する標的部分を含み得る。前記標的部分は、宿主細胞の表面に存在する分子を認識する抗体またはその断片のような特異的結合分子であり得る。
【００８２】
特定の例において、本明細書中で記載の核酸を認識するアンチセンス分子には、触媒ＲＮＡまたはリボソームが含まれる（例えば、ＷＯ９０／１１３６４；ＷＯ９５／０６７６４；および、Sarver et al., Science 247:1222−5, 1990を参照のこと）。アンチセンスと、ｍＲＮＡ加水分解を仲介し得るテルピリジルＣｕ（ＩＩ）のような金属混合物との複合体が、Bashkin et al. （Appl. Biochem Biotechnol. 54:43−56, 1995）に記載される。一例において、アンチセンスヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131−48, 1987）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（1noue et al., FEBS Lett. 215:327−30, 1987）である。
【００８３】
これらの方法を利用して同定される抗ウイルス剤を、インビトロ、エクスビボまたはインビボのいずれかで、細胞におけるウイルス感染を阻害するために用いることができる。
本発明の方法において、ウイルス、または細菌、寄生虫もしくは真菌のような他の病原菌で感染することができる全ての細胞を利用することができる。その細胞は、昆虫、魚類、甲殻類、哺乳動物、鳥類、は虫類、酵母または大腸菌のような細菌類由来の細胞のような、原核または真核であり得る。細胞は、生物の一部、または哺乳動物細胞の培養物もしくは細菌培養物のような細胞培養の一部であり得る。
【００８４】
本発明のウイルスには、全てのＲＮＡウイルス（マイナス鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスを含む）、およびＤＮＡウイルスが含まれる。ウイルスの例には、ＨＩＶ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む）、パルボウイルス、パピローマウイルス、麻疹ウイルス、フィロウイルス（例えば、マルブルグ（Marburg））、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、ハンタウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ、ＢおよびＣウイルス）、肝炎ウイルスＡ〜Ｇ、カルシウイルス、アストロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器系コロナウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス（例えば、帯状疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス、およびヒトサイトメガロウイルスを含むＩ３ＳＶ−１−９）、口蹄疫ウイルス、ヒトアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、天然痘ウイルス（variola）、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ウイルス髄膜炎およびハンタウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
動物に関して、ウイルスには、上記に列記したいずれかのヒトウイルスの動物対応物、鳥インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２株）、およびサル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、およびビスナウイルスのような動物のレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の方法はまた、細菌感染を評価し、抗菌剤を同定するために用いることができる。特に、同じ方法を、細胞をウイルスと接触させる代わりに用い、細胞を細菌と接触させるのに用いる。故に、本発明は、抗菌剤を同定する方法であって、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）細胞遺伝子により生産される遺伝子産物のレベルおよび／または活性を検出すること（遺伝子産物および／または遺伝子産物活性の減少または消失が、抗菌活性を有する化合物であることを示す。）、を含む方法を提供する。
【００８７】
本発明はまた、抗菌剤を同定する方法であって、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）その細胞を細菌と接触させること、ｃ）細菌感染のレベルを検出すること、およびｄ）細菌感染のレベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係のある細菌感染の減少または消失が、該薬剤が抗菌剤であることを示す。）、を含む方法を提供する。
【００８８】
細菌の例には、リステリア（種）、ヒト型結核菌、リッケチア（全てのタイプ）、エールリヒア属、クラミジアが含まれるが、これらに限定されない。本方法により標的化され得る細菌のさらなる例には、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ株、ＢＣＧ株、トリ型結核菌、イントラセルラーレ結核菌、アフリカ型結核菌、カンサシイ型結核菌（M. kansasii）、マリーヌム型結核菌（M. marinum）、ウルセランス型結核菌（M. ulcerans）、トリ型結核菌亜種パラ結核菌、ノカルジア菌（Nocardia asteroide）、他のノカルジア種、レジオネラニューモフィラ（Legionella pneumophila）、他のレジオネラ種、サルモネラチフス菌、他のサルモネラ種、シゲラ種、ペスト菌（Yersinia pestis）、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・マルトシダ、他のパスツレラ種、アクチノバラス・ニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イバノビ、ブルセラ・アボルツス、他のブルセラ種、コウドリア・ルミナンティウム（Cowdria ruminantium）、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）、コクシエラバーネティー（Coxiella burnetti）、他のリッケチア種、エーリキア種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ピヨゲネス、ストレプトコッカス アガラクティー、炭疽菌、大腸菌、ビブリオ菌、カンピロバクター種、髄膜炎菌（Neiserria meningitidis）、淋菌（Neiserria gonorrhea）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、他のシュードモナス種、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ジュクレイ（Hemophilus ducreyi）、他のヘモフィルス種、クロストリジウム・テタニ、他のクロストリジウム種、エルシニア・エンテロコリチカ、および他のエルシニア種が含まれる。
【００８９】
１種の細菌に有効であることが発見された抗菌剤はまた、他の細菌、特に同属の細菌にも有効であり得る。故に、１種の細菌で同定された抗菌剤は、他の細菌に対する抗菌活性を、本発明の方法を用いて試すことができる。
【００９０】
本発明の方法はまた、寄生虫感染を評価し、駆虫剤を同定するために用いることができる。特に、同様の方法を、細胞とウイルスを接触させる代わりに、細胞を寄生虫と接触させるのに用いる。故に、本発明は、駆虫剤を同定する方法であって、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）細胞遺伝子により生産される遺伝子産物のレベルおよび／または活性を検出すること（遺伝子産物および／または遺伝子産物活性の減少または消失が、駆虫活性を有する化合物であることを示す。）、を含む方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、駆虫剤を同定する方法であって、ａ）表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞に薬剤を投与すること、ｂ）その細胞を寄生虫と接触させること、ｃ）寄生虫感染のレベルを検出すること、およびｄ）寄生虫感染のレベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係のある寄生虫感染の減少または消失が、該薬剤が駆虫剤であることを示す。）、を含む方法を提供する。
【００９２】
寄生虫の例には、クリプトスポリジウム、プラスモジウム（全ての種）、アメリカトリパノソーマ（T. cruzi）が含まれるが、それらに限定されない。さらに、本方法の範囲内に意図される原生動物および真菌種の例には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、他のマラリア原虫種、トキソプラズマ・ゴンディ、ニュウモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クルーズトリパノソーマ、他のトリパノソーマ種、ドノヴァン・リーシュマニア（Leishmania donovani）、他のリーシュマニア種、タイレリア・アヌラタ（Theileria annulata）、他のタイレリア種、アイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、他のアイメリ種、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ブラストミセス・デルマティティジス、コクシジオイデス・イミチス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス、ペニシリウム・マルネッフェイ、およびカンジダ種が含まれるが、それらに限定されない。
【００９３】
１種の寄生虫に有効であることが発見された駆虫剤はまた、他の寄生虫、特に同属の寄生虫にも有効であり得る。故に、１種の寄生虫で同定された駆虫剤は、他の寄生虫に対する駆虫活性を、本発明の方法を用いて試すことができる。
【００９４】
本明細書中に記載の方法において、表１に列記した細胞遺伝子を含む細胞を一旦薬剤と接触させると、感染のレベルを、遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係する感染の減少または消失が、前記薬剤が病原菌に対して有効であることを示すように、遺伝子発現および／または活性のレベルと関連付け得る。これらの方法は、一部の例として、細菌感染、抗ウイルス感染、抗菌感染、抗寄生虫感染に対する薬剤の効果を評価するために利用することができる。例えば、ウイルス感染のレベルを、表１に記載の遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡの投与後、細胞において測定することができる。ウイルス感染の減少があれば、該ｓｉＲＮＡは、効果的な抗ウイルス剤である。ウイルス感染のレベルを、特定のウイルス感染と関係する抗原または他の産物を測定することにより評価することができる（例えば、ＨＩＶ感染に関してｐ２４）。表１に記載の遺伝子に向けたｓｉＲＮＡの投与後、ｐ２４レベルが減少すれば、その遺伝子を標的とする該ｓｉＲＮＡは、ＨＩＶに対して効果的な抗ウイルス剤である。ウイルス感染のレベルを、リアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によっても測定することができる（例えば、Payungporn et al. “Single step multiplex real−time RT−PCR for H5N1 influenza A virus detection.” J Virol Methods. Sep 22, 2005; Landolt et la. “Use of real−time reverse transcriptase polymerase chain reaction assay and cell culture methods for detection of swine influenza A viruses” Am J Vet Res. 2005 Jan;66(1):119−24を参照のこと）。
【００９５】
同様に、ウイルス感染のレベルを、上記の方法および当技術分野で公知の方法を用いて、化学物質、小分子化合物、薬剤、タンパク質、ｃＤＮＡ、抗体、モルホリノ、アンチセンスＲＮＡ、リボゾームまたは何らかの他の化合物の投与後、細胞中で測定することができる。ウイルス感染が減少すれば、該化学物質、小分子、薬剤、タンパク質、ｃＤＮＡ、抗体、モルホリノ、アンチセンスＲＮＡ、リボゾームまたは何らかの他の化合物は、効果的な抗ウイルス剤である。同様の方法を、細菌感染、菌感染および寄生虫感染のような他のタイプの感染レベルを測定するために利用することができる。
【００９６】
１種のウイルスに有効であることが発見された抗ウイルス剤はまた、他のウイルス、特に同属のウイルスにも有効であり得る。しかしながら、ＨＩＶに対して有効であることが発見されている薬剤が、インフルエンザまたはトリインフルエンザまたは何らかの他のウイルスに対しても有効であり得ることも意図される。それ故に、１種のウイルスに関して同定された抗ウイルス剤を、他のウイルスに対する抗ウイルス活性について、本発明の方法を用いて試験することができる。遺伝子産物のレベルを、何らかの標準方法、例えばタンパク質に特異的な抗体を用いて検出することにより測定することができる。本明細書に記載の核酸およびその断片を、標準的増幅方法により、表１に記載の遺伝子の１つの遺伝子転写物のような核酸配列の増幅のためにプライマーとして用いることができる。例えば、遺伝子転写物の発現を、細胞から単離されたＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲにより定量することができる。様々なＰＣＲ法が、当業者によく知られている。ＰＣＲ法のレビューについては、増幅法について、参照によりその全体を本明細書中に包含されるWhite (1997)の表題“PCR Methods and Applications”なる文献（1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press）を参照のこと。これらのＰＣＲ法それぞれにおいて、増幅すべき核酸配列の両側のＰＣＲプライマーを、適当に調製した核酸試料に、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼのような熱安定性のポリメラーゼと共に添加した。試料中核酸を変性させ、該ＰＣＲプライマーを、試料中の相補的核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライマーを伸張させる。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸張の別のサイクルを開始する。そのサイクルを多数回繰り返し、プライマー部位間に核酸配列を含む増幅断片を作製する。ＰＣＲはさらに、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，９６５，１８８号を含むいくつかの特許に記載されている。これらの刊行物はそれぞれ、ＰＣＲ法について、参照によりその全体を本明細書中に包含される。当業者は、表１に記載の核酸配列またはその断片のいずれかを増幅するプライマーを設計および合成する方法を知っているだろう。
【００９７】
検出可能標識を、増幅反応に含んでいてよい。適する標識には、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトロン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどが含まれる。該標識は、増幅したＤＮＡを、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特定の抗体などを有するビオチン、ハプテンなどと結合させ、結合パートナーを、検出可能標識と結合させる、２段階システムであってよい。標識を、一方または両方のプライマーと結合させてよい。あるいは、増幅産物中に標識を挿入するために、増幅に用いるヌクレオチドプールを標識する。
【００９８】
試料核酸、例えば増幅した断片を、当技術分野で公知の多数の方法のうち１つにより分析することができる。該核酸を、ジデオキシ法または他の方法により配列決定することができる。該配列とのハイブリダイゼーションはまた、サザンブロット、ドットブロットなどにより、その存在を決定するために用いることができる。
【００９９】
本発明の遺伝子および核酸はまた、ポリヌクレオチドアレイに用いることができる。ポリヌクレオチドアレイは、単一試料中、多数のポリヌクレオチド配列を分析できるハイスループット技術を提供する。この技術は、例えば、対照試料と比較して、表１に記載の核酸の減少した発現を有する試料を同定するために用いることができる。この技術はまた、表１に記載の核酸の減少した発現の効果を決定するために利用することができる。本方法において、当業者は、表１に記載の核酸の発現の減少により上方制御または下方制御される遺伝子を同定することができる。同様に、当業者は、表１に記載の核酸の増加した発現により上方制御または下方制御される遺伝子を同定することができる。本方法において、他の遺伝子を、抗ウイルス療法、抗菌療法、抗寄生虫療法または抗真菌療法のような治療の標的として同定することができる。
【０１００】
アレイを作製するために、一本鎖ポリヌクレオチドプローブを、二次元マトリックスまたはアレイにおいて基板上にスポットすることができる。各一本鎖ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０またはそれ以上の、表１のＧｅｎＢａｎｋ受託番号下に記載のヌクレオチド配列から選択される隣接ヌクレオチドを含み得る。
【０１０１】
そのアレイはまた、表１に記載の１個またはそれ以上の遺伝子の異なる多形アレルに対するプローブを含むマイクロアレイでもあり得る。２個以上の形態の核酸配列が対象集団内に存在するとき、多形が存在する。例えば、多形核酸は、最も一般的なアレルが、９９％以下の発生頻度を有するとき、１つであり得る。異なるアレルは、核酸配列の相違により同定することができ、（多形を定義した一般的に許容される頻度である）集団の１％以上で起こる遺伝的変異は、ある適応症のための有用な多形である。
【０１０２】
アレル頻度（特定のタイプの集団内の全てのアレル核酸の割合）を、集団内のアレルの数およびタイプを直接計数または概算することにより決定することができる。多形およびアレル頻度の決定方法は、Hard, D.L. and Clark, A.G., Principles of Population Genetics, Third Edition (Sinauer Associates, Inc., Sunderland Massachusetts, 1997）、特にchapter １および２に開示される。
【０１０３】
これらのマイクロアレイを、対象由来の試料において多形アレルを検出するために利用することができる。かかるアレルは、ウイルス感染により感受性であるか、またはウイルス感染に感受性の少ないことを示し得る。例えば、本発明は、表１に記載の遺伝子のいずれかにおける破壊が、減少したウイルス感染をもたらすことを示すことから、そのようなマイクロアレイを、ウイルス感染に感受性の少ない対象を同定するために、減少した遺伝子発現および／または遺伝子産物の減少した活性をもたらす表１に記載の遺伝子の多形型を検出するのに利用することができる。
【０１０４】
前記基板は、ポリヌクレオチドプローブを結合し得る何らかの基板であり得、ガラス、ニトロセルロース、シリコン、およびナイロンが含まれるが、それらに限定されない。ポリヌクレオチドプローブは、共有結合または疎水性結合のような非特異的結合のどちらかにより基質と結合し得る。アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを用いる方法は、欧州番号第０７９９８９７号；ＰＣＴ番号第ＷＯ９７／２９２１２号；ＰＣＴ番号第ＷＯ９７／２７３１７号；欧州番号第０７８５２８０号；ＰＣＴ番号第ＷＯ９７／０２３５７号；米国特許第５，５９３，８３９号；同第５，５７８，８３２号；欧州番号第０７２８５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；欧州番号第０７２１０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；ＰＣＴ番号第ＷＯ９５／２２０５８；および、米国特許第５，６３１，７３４号に記載される。商業的に利用可能な、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ．（商標）のようなポリヌクレオチドアレイを用いることもできる。遺伝子発現を検出するための前記ＧｅｎｅＣｈｉｐ．（商標）の使用は、例えば、Lockhart et al., Nature Biotechnology 14:1675 (1996); Chee et al., Science 274:610 (1996); Hacia et al., Nature Genetics 14:441, 1996;および、Kozal et al., Nature Medicine 2:753, 1996に記載される。
【０１０５】
遺伝子産物のレベルを、化合物と接触させていない対照細胞における遺伝子産物のレベルと比較することができる。遺伝子産物のレベルを、化合物の添加前の同じ細胞における遺伝子産物のレベルと比較することができる。活性または機能を、何らかの標準方法、例えば、基質から産物への変換を測定する酵素的分析またはタンパク質と核酸の結合を測定する結合分析により、測定することができる。
【０１０６】
さらに、遺伝子の調節領域は、レポーター遺伝子と機能的に結合することができ、化合物を、レポーター遺伝子の阻害についてスクリーニングすることができる。かかる調節領域は、ゲノム配列から単離することができ、種の調節領域に特徴的であることが観察された何らかの特徴により、かつ遺伝子のコーディング領域のための開始コドンとそれらの関係により、同定することができる。本明細書で用いる通り、レポーター遺伝子は、レポータータンパク質をコードする。レポータータンパク質は、発現されたとき特異的に検出され得る何らかのタンパク質である。レポータータンパク質は、発現配列からの発現を検出または定量するのに有用である。多くのレポータータンパク質が、当技術分野で公知である。これらには、特異的に検出される産物を生産するβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれるが、それらに限定されない。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のような蛍光レポータータンパク質を、用いることもできる。
【０１０７】
ウイルス感染はまた、細胞に基づいた分析により測定することもできる。簡単には、細胞（２０，０００から２，５００，０００）を所望の病原菌で感染させ、３−７日間インキュベーションを継続する。抗ウイルス剤を、病原菌での感染前、感染中、または感染後に細胞に適用することができる。ウイルスの量および投与した薬剤は、当業者により決定することができる。いくつかの例において、最適な用量範囲を同定するために、可能性のある治療剤のいくつかの異なる用量を投与することができる。トランスフェクション後、分析を、様々な物質による感染に対する細胞の耐性を決定するために行う。
【０１０８】
例えば、ウイルス感染を分析するとき、ウイルス抗原の存在を、ウイルスタンパク質に特異的な抗体を用いて、その抗体を検出することにより決定することができる。一例において、ウイルスタンパク質に特異的に結合する抗体を、例えばフルオロフォアのような検出可能マーカーを用いて標識する。他の例において、抗体を、標識を含む二次抗体を用いて検出する。その後、結合抗体の存在を、例えば顕微鏡、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを用いて検出する。
【０１０９】
あるいは、またはさらに、生存ウイルス感染に対する細胞の能力を、例えば、トリパンブルー排除のような細胞生存分析を行うことにより決定する。
表１に列記したタンパク質の細胞中の量を、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、免疫沈降法、免疫蛍光法（例えば、ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、免疫細胞化学などのような細胞中のタンパク質を定量するための当技術分野における標準方法、ならびに細胞中のもしくは細胞により産生されたタンパク質を定量するために現在公知かまたは今後開発される何らかの他の方法、により決定することができる。
【０１１０】
表１に列記した核酸の細胞中の量を、インサイチュウ・ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ分析、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＰＯＴ、ドットブロッティングなどのような細胞中の核酸を定量するための当技術分野における標準方法、ならびに細胞中の核酸量を定量するために現在公知かまたは今後開発される何らかの他の方法、により決定することができる。
【０１１１】
一部の例として、ＨＩＶ、エボラ、インフルエンザＡ、ＳＡＲＳ、天然痘のようなウイルスによる感染を防止または減少する抗ウイルス剤の能力を、動物モデルにおいて評価することができる。いくつかのウイルス感染動物モデルが、当技術分野で公知である。例えば、マウスＨＩＶモデルは、Sutton et al.（Res. Initiat Treat. Action, 8:22−4, 2003）およびPincus et al.（AIDS Res. Mum. Retroviruses 19:901−8, 2003）に記載されており；エボラ感染のモルモットモデルは、Parren et al.（J Yirol. 76:6408−12, 2002）およびXu et al.（Nat. Med. 4:37−42, 1998）に記載されており；そして、インフルエンザ感染のカニクイザル（Macaca fascicularis）モデルは、Kuiken et al.（Yet. Pathol. 40:304−10, 2003）に記載されている。このような動物モデルはまた、ウイルス感染と関係する症状を改善する能力について薬剤を試験するために用いることができる。さらに、そのような動物モデルは、動物対象におけるＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために用いることができ、かかるデータは、可能性のある薬剤のインビボ効果を決定するために用いることができる。動物モデルはまた、抗菌剤、抗真菌剤および駆虫薬を評価するために用いることができる。
【０１１２】
鳥類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ（micro−pig）、ヤギ、および非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーを含むが、それらに限定されない全ての種の動物を、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染または必要であれば寄生虫感染の動物モデルを作製するために用いることができる。
【０１１３】
例えば、ウイルス感染のモデルについて、適当な動物は、抗ウイルス剤の存在下または不存在下で、所望のウイルスを接種される。ウイルスの量および投与する薬剤は、当業者により決定され得る。いくつかの例において、可能性のある治療剤（例えば、抗ウイルス剤）のいくつかの異なる用量が、最適用量範囲を同定するために、異なる試験対象に投与され得る。その治療剤を、ウイルスで感染させる前、感染中、感染後に投与することができる。処置後、動物を、適当なウイルス感染の発生およびそれと関係する症状について観察する。薬剤の存在下での、適当なウイルス感染の発生、またはそれと関係する症状の減少は、前記薬剤が、対象におけるウイルス感染の減少または阻害にさえ用い得る治療剤であるという証拠を提供する。
【０１１４】
本発明はまた、感染を減少させる化合物を作製する方法であって、ａ）化合物を合成すること、ｂ）該化合物を表１に記載の細胞遺伝子を含む細胞に投与すること、ｃ）該細胞と感染性病原菌を接触させること、ｃ）感染レベルを検出すること、ｄ）前記感染レベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係する感染の減少または消失が、感染の成立を減少させる化合物であることを示す。）、を含む方法を提供する。
【０１１５】
また、感染を減少させる化合物を作製する方法であって、ａ）化合物を、表１に記載の細胞遺伝子を含む細胞に投与すること、ｂ）該細胞と感染性病原菌を接触させること、ｃ）感染レベルを検出すること、ｄ）前記感染レベルと、表１の遺伝子の発現レベル、または表１の遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を関連付けること（遺伝子発現および／または活性の減少または消失と関係する感染の減少または消失が、該化合物が感染を減少する化合物であることを示す。）、およびｅ）薬学的に許容される担体中に該化合物を入れること、を含む方法を提供する。感染を減少させる化合物は、抗ウイルス化合物、抗菌化合物、抗真菌化合物もしくは駆虫化合物、または病原菌による感染を減少させる何らかの化合物であり得る。
【０１１６】
形質転換細胞および非ヒト動物
組換えおよびノックアウト動物を含む形質転換動物モデルを、本明細書に記載の宿主核酸から作製することができる。例示的形質転換非ヒト動物には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、ウシおよびブタが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、表１に列記した１個またはそれ以上の遺伝子のノックアウトを有し、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫のような病原菌による感染に減少した感受性を有する、形質転換非ヒト動物を提供する。そのようなノックアウト動物は、動物からヒトへのウイルスの伝染を低減するために有用である。本発明の形質転換動物において、表１に記載の１個以上の遺伝子の一方または両方のアレルをノックアウトすることができる。
【０１１７】
“減少した感受性”とは、表１の遺伝子の一方または両方のアレルのノックアウトまたは機能的欠失を有しない動物と比較して、病原菌による感染にあまり影響を受けないか、減少した感染を経験することを意味する。該動物は、病原菌に対して必ずしも十分な耐性を有する必要はない。例えば、動物は、表１に記載の遺伝子の機能的欠失を有しない動物と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または病原菌による感染にあまり影響を受けない範囲の何らかの％であり得る。さらに、感染の減少または感染に対する感受性の減少には、細胞または対象へのウイルスまたは他の病原菌の、侵入、複製、病原性、挿入、溶解もしくは複製ストラテジーの他の段階、またはそれらの組み合わせを減少することが含まれる。
【０１１８】
故に、本発明は、表１に列記した１個またはそれ以上の遺伝子の機能的欠失を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物であって、ウイルス、細菌、寄生虫または真菌のような病原菌による感染に減少した感受性を有する動物を提供する。機能的欠失とは、遺伝子産物の産生を阻害するか、または完全に機能がないかもしくは非機能的である遺伝子産物を提供する遺伝子配列を作製する、変異、部分的または完全な欠失、挿入、または他の変異である。
【０１１９】
ノックアウトまたは機能的欠失に用いる配列の発現により、所望の遺伝子を、適当なプロモーター配列により調節することができる。例えば、構成的プロモーターを、機能的に欠失した遺伝子が、動物により発現されないことを確実にするために用いることができる。対照的に、誘導プロモーターを、該形質転換動物が、興味のある遺伝子を発現するかまたは発現しないとき、対照として用いることができる。例示的誘導プロモーターには、組織特異的プロモーターまたは特定の刺激（例えば、光、酸素、化学物質濃度など）に反応性または非反応性のプロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター）が含まれる。
【０１２０】
例えば、表１に列記した遺伝子の破壊形を含む形質転換マウスまたは他の形質転換動物を、様々な病原菌に暴露中に調査し得る。比較データは、病原菌の生活環に関する見識を提供し得る。さらに、別の感染（例えば、インフルエンザ）に感受性のノックアウト動物（例えば、ブタ）を、遺伝子の破壊により与えられた、感染に耐性とし得る。形質転換動物における遺伝子の破壊が、結果として感染に対する耐性の増加となるとき、これらの形質転換動物を、感染にあまり感受性のない一群（flock）または群れ（herd）の確立のために繁殖させることができる。
【０１２１】
形質転換動物の作製および使用方法を含む、形質転換動物は、様々な特許および刊行物、例えばＷＯ０１／４３５４０；ＷＯ０２／１９８１１；米国特許公開番号第２００１−００４４９３７号および同第２００２−００６６１１７号；および、米国特許第５，８５９，３０８号；同第６，２８１，４０８号；および同第６，３７６，７４３号に記載され、それらは参照により本明細書中に包含される。
【０１２２】
本発明の形質転換動物にはまた、例えば、特定の遺伝子ノックダウン用のｓｉＲＮＡ、組織特異的発現用のＣｒｅ−ｌｏｘＰおよび誘導発現用のテトラサイクリン−オンを組み合わせるＳＩＲＩＵＳ−Ｃｒｅ系を利用することにより作製された条件遺伝子ノックダウン動物が含まれる。これらの動物は、テトラサイクリン制御下に、興味のある遺伝子の特異的ｓｉＲＮＡおよび組織特異的リコンビナーゼを含む、２個の親系列を交配することにより作製することができる。参照によりその全体を本明細書中に包含される、条件遺伝子ノックダウン動物の作製についてのChang et al. “Using siRNA Technique to Generate Transgenic Animals with Spatiotemporal and Conditional Gene Knockdown.” American Journal of Pathology 165: 1535−1541 (2004)を参照のこと。
【０１２３】
本発明はまた、病原菌による感染に耐性である、表１に列記した遺伝子の変異形または破壊形を含む細胞を提供する。これらの細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボ細胞であり得、変異した一方または両方のアレルを有し得る。故に、かかる細胞には、ＨＩＶ感染、エボラ感染、トリインフルエンザ感染、インフルエンザＡまたは細菌、寄生虫、真菌を含む、本明細書に記載の他の病原菌のいずれかに対して減少した感受性を有する細胞が含まれる。
【０１２４】
感染に対する耐性のスクリーニング
また、本明細書中、宿主核酸のヌクレオチド配列または宿主ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、表１に示すもの）を特徴付けることにより感染への耐性について宿主対象をスクリーニングする方法を提供する。例えば、ＡＮＸＡ１なる対象の核酸を、単離、配列決定、およびＡＮＸＡ１の野生型配列との比較をすることができる。対象のＡＮＸＡ１核酸と野生型ＡＮＸＡＩ配列との類似性が高いほど、個人の感染に対する感受性が増すが、一方、対象のＡＮＸＡ１核酸と野生型ＡＮＸＡ１配列との類似性が低いほど、対象の感染の可能性への耐性が増す。そのようなスクリーニングを、いずれかの種において、表１に記載のいずれかの宿主核酸または宿主ポリペプチドのアミノ酸配列について行うことができる。
【０１２５】
集団の遺伝的特徴を評価することは、その集団のウイルス感染に対する感受性または耐性についての情報提供を可能にする。例えば、特定のヒト集団、例えば特定の市または地理的領域におけるアレルの多型分析は、その集団が感染に対してどの程度感受性かを示し得る。表１に列記した野生型配列とアレルの実質的類似性の高い割合は、その集団が、感染により感受性であることを示すが、一方、表１に列記した野生型配列よりも実質的に異なる多数の多型アレルは、集団が感染に対してより耐性であることを示す。かかる情報を、感染しやすい集団に予防接種を行うことについての公衆衛生決定に当たって、用いることができる。
【０１２６】
本発明はまた、表１に列記した遺伝子の変異形について細胞をスクリーニングする方法を提供する。該変異形は、遺伝子産物の量または活性を変化させるように、遺伝子中に機能的欠失、変異または変化を有する遺伝子であり得る。表１に列記した遺伝子の変異形を含むこれらの細胞を、表１に列記した遺伝子の天然に生じる変異を含む細胞が、感染に対するそれらの耐性の点で異なるかどうかを決定するために、病原菌と接触させることができる。例えば、動物、例えばニワトリ由来の細胞を、表１に列記した遺伝子の変異形についてスクリーニングすることができる。天然に生じる変異が発見され、それらのゲノム中に遺伝子の変異形を有するニワトリが、感染にあまり感受性でないとき、これらのニワトリを、感染に耐性である一群を確立するために選択的に繁殖させることができる。これらの方法を利用することにより、トリインフルエンザに耐性であるニワトリの一群を確立することができる。同様に、他の動物を、表１に列記した遺伝子の変異形についてスクリーニングし得る。天然に生じる変異が発見され、それらのゲノム中に変異形を有する動物が、感染にあまり感受性でないとき、これらの動物を、感染に耐性である集団を確立するために選択的に繁殖させることができる。これらの動物には、ネコ、イヌ、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ（gerbil）、モルモットなど）および鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、七面鳥、アヒル、キジ、ハト、ハト（pigeon）、ハト（dove）の一群など）が含まれるが、それらに限定されない。故に、本発明は、結果として、ウイルス感染に対して減少した感受性となり、それによりウイルス感染にあまり感受性でない動物集団を提供する、表１に列記した遺伝子の天然に生じる変異を含む動物集団を提供する。同様に、天然に生じる変異が発見され、それらのゲノム中に遺伝子の変異形を有する動物が、細菌感染、寄生虫感染または真菌感染にあまり感受性でないとき、これらの動物を、細菌感染、寄生虫感染または真菌感染に耐性である集団を確立するために選択的に繁殖させることができる。
【０１２７】
感染の阻害方法
また、本発明は、表１に列記した遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を阻害することを含む、細胞における感染の阻害方法を提供する。本明細書中に記載の通り、感染とは、一部の例として、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染または寄生虫感染であり得る。阻害は、細胞において、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで起こり得る。表１の１個以上の遺伝子の発現を阻害することができる。同様に、表１に列記した１個以上の遺伝子産物の活性を阻害することができる。発現の阻害または減少は、このことが、発現のわずかな減少から発現の除去を完全にするまでの範囲であり得るようにされなければならないわけではない。例えば、発現は、表１に列記した遺伝子の発現が阻害されない対照細胞と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはいずれかの間の％で阻害され得る。同様に、遺伝子産物の活性の阻害または減少は、このことが、遺伝子産物のわずかな減少から除去を完全にするまでの範囲であり得るようにされなければならないわけではない。例えば、遺伝子産物の活性は、表１に列記した遺伝子産物の活性が阻害されない対照細胞と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％またはいずれかの間の％で阻害され得る。
【０１２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ分子を、発現を妨げ、そして／または遺伝子産物の活性を減少するために利用することができる。小分子化合物、薬剤、抗体、タンパク質および化学物質を、遺伝子産物の発現および／または活性を阻害するためにも利用できる。遺伝子の発現および／または表１に記載の遺伝子産物の活性を減少するために、現在公知であるかまたは将来同定されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、小分子、化学物質、抗体、タンパク質、ｃＤＮＡ、および何らかの他の化合物は、単独で、または抗ウイルス化合物、抗菌剤、抗真菌剤、駆虫剤、抗炎症剤、抗癌剤などのような他の治療剤と併用して用いることができる。
【０１２９】
抗ウイルス化合物の例には、インフルエンザおよびその関連症状の処置用のアマンタジン、リマンタジン、ザナマビル（zanamavir）およびオセルタマビル（oseltamavir）（タミフル）が含まれるが、それらに限定されない。ＨＩＶ処置に有用な抗ウイルス化合物には、コンビビル（登録商標）（ラミブジン−ジドブジン）、クリキシバン（登録商標）（インジナビル）、エムトリバ（登録商標）（エムトリシタビン）、エピビルＤ（登録商標）（ラミブジン）、フォートベース（登録商標）（サキナビル−ｓｇ）、ハイビッド（登録商標）（ザルシタビン）、インビラーゼ（登録商標）（サキナビル−ｈｇ）、カレトラ（登録商標）（ロピナビル−リトビナル）、レクシヴァＴＭ（ホスアンプレナビル）、ノービア（登録商標）（リトナビル）、レトロビル（登録商標）（ジドブジン）、サスティバ（登録商標）（エファビレンツ）、ビデックスＥＣ（登録商標）（ジダノシン）、ビデックス（登録商標）（ジダノシン）、ビラセプト（登録商標）（ネルフィナビル）、ビラミューン（登録商標）（ネビラピン）、ゼリット（登録商標）（スタブジン）、ザイアジェン（登録商標）（アバカビル）、フューゼオン（登録商標）（エンフュービルタイド）、レスクリプター（登録商標）（デラビルジン）、レイアタッツ（登録商標）（アタザナビル）、トリジビル（登録商標）（アバカビル−ラミブジン−ジドブジン）、ビリアード（登録商標）（フマル酸テノホビルジソプロキシル）およびアジェネラーゼ（登録商標）（アンプレナビル）が含まれる。エボラおよび他のフィロウイルスの処置に有用な他の抗ウイルス化合物には、リバビリンおよびシアノビリン−Ｎ（ＣＶ−Ｎ）が含まれる。ヘルペスウイルスの処置について、ゾビラックス（登録商標）（アシクロビル）が利用可能である。抗菌剤には、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびアンピシリン）、サルファ剤および葉酸類似体、β−ラクタム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、マクロライド、リンコサミド、ストレプトグラミン、フルオロキノロン、リファンピン、ムピロシン、シクロセリン、アミノシクリトールおよびオキサゾリジノンが含まれるが、それらに限定されない。
【０１３０】
抗真菌剤には、アンフォテリシン、ナイスタチン、テルビナフィン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ケトコナゾール、グリセルフルビン（griselfulvin）が含まれるが、それらに限定されない。
駆虫剤には、駆虫薬（anthelmintic）、殺線虫薬（antinematodal Agent）、抗扁虫薬（antiplatyhelmintic agent）、抗原虫薬（antiprotozoal agent）、殺アメーバ薬（amebicide）、抗マラリア薬、抗トリコモナス薬（antitrichornonal agentｓ）、アオシジオスタット（aoccidiostat）および抗トリパノソーマ薬が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３１】
本発明は、対象に表１の遺伝子または遺伝子産物の発現または活性を阻害する組成物の一定量を投与することを含む、対象において、感染を減少または阻害する方法を提供する。本明細書に記載の通り、感染は、何らかの病原菌、例えばウイルス、細菌、真菌または寄生虫から可能である。感染の減少または阻害は、これが、感染のわずかな減少から、感染の消失までの範囲であり得るようにされなければならないわけではない。例えば、本明細書に記載の方法において、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％またはいずれかの間の％の感染の減少があり得る。該減少は、感染と関係する症状の改善をもたらし、感染の改善達成し得る。しかしながら、感染の完全な改善は、感染と関係する症状の低減に効果があるか、または対象を感染にあまり感受性ではなくするのに効果がある、対象における感染の減少または阻害に必ずしも必要ではない。
【０１３２】
本明細書で用いる通り、感染の予防とは、感染の発生を阻害することを意味する。処置について言及するとき、これは、ウイルス感染を阻害または減少させるような感染に関係する疾患または病理的状態の徴候または症状を改善し、必ずしも完全な症状の改善または感染の改善を必要としない方法を意味する。
【０１３３】
本発明はまた、対象由来の選択細胞にてエクスビボで、表１に列記した遺伝子を、遺伝子の機能的遺伝子産物を産生し得ない変異遺伝子、または遺伝子の機能的遺伝子産物の減少量を産生する変異遺伝子に変異させ、対象において細胞を置換し、それにより対象における細胞感染を減少させることを含む、対象における感染を減少または阻害する方法を提供する。
【０１３４】
ウイルスまたは細菌、真菌もしくは寄生虫のような他の病原菌で感染され得る何らかの細胞が、本明細書中で意図される。宿主細胞は、昆虫類、甲殻類、哺乳動物、鳥類、は虫類、酵母由来の細胞のような原核または真核、または大腸菌のような細菌であり得る。例示的宿主細胞には、哺乳動物Ｂリンパ球細胞、造血細胞、胚性幹細胞、胚性生殖系細胞、多能性幹細胞および全能性幹細胞が含まれるが、それらに限定されない。
【０１３５】
例えば、感染に感受性のまたは感染を有する対象を、治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイムまたはｓｉＲＮＡ分子（または、それらの組み合わせ）で処置することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子、リボザイムまたはｓｉＲＮＡ分子が、効果を発揮した（ウイルス感染レベルの減少が観察されるか、またはウイルス感染と関係する症状が減少する）後、例えば２４−４８時間後、対象をウイルス感染と関係する症状に関して観察することができる。
【０１３６】
同様に、抗体、ポリペプチド、小分子化合物または表１の宿主タンパク質と相互作用する他の薬剤のような他の薬剤を、ウイルス感染の減少にも用いることができる。この相互作用は、宿主タンパク質との結合のような直接的結合、または表１の宿主タンパク質と相互作用するタンパク質と結合するかそれを調節するような間接的結合であり得る。抗体、ポリペプチド、小分子または他の薬剤が、効果を発揮した（感染レベルの減少が観察されるか、または感染と関係する症状が減少する）後、例えば２４−４８時間後、対象を感染と関係する症状について観察することができる。ペプチドおよび有機または無機分子のような他の物質もまた、治療的有効量で対象に投与することができる。
【０１３７】
本明細書に記載の処置はまた、予防的に、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染または寄生虫感染のような感染の阻害または予防に用いることができる。かかる投与は、その処置が、疾患の処置または予防に有用性を有することを示すとき指示される。予防的使用は、感染と関係する疾患の進行について公知または予期される状態で指示される。
【０１３８】
ある例において、本発明の方法のレトロウイルス挿入により破壊されたとき、いくつかの遺伝子は、結果として遺伝子産物の過剰発現となり、この過剰発現がウイルス複製を阻害した。例えば、ＣＴＣＦ配列を含むゲノム領域の破壊により、結果として減少したウイルス複製をもたらすＩＧＦ２の過剰発現となる。故に、本発明は、減少したウイルス複製をもたらす遺伝子の過剰発現によりウイルス複製を減少または阻害する方法を提供する。本発明はまた、その過剰発現が遺伝子を破壊することによりウイルス複製を減少する方法、または、結果としてその過剰発現がウイルス複製を減少する遺伝子の増加した発現をもたらす遺伝子の遺伝子産物を阻害する方法を提供する。例えば、１つには、ＩＧＦ２の発現を増加するためにＣＴＣＦを阻害し得る。これは、別の遺伝子の発現を増加させ、結果として減少したウイルス複製をもたらすことが発見された何らかの遺伝子と同じであり得る。
【０１３９】
遺伝子が、破壊により別の遺伝子の過剰発現をもたらすことが発見されると、過剰発現される遺伝子は、直接的に、すなわち過剰発現した遺伝子により、または間接的に、すなわち本来破壊された遺伝子（またはその遺伝子産物）によるか、または過剰発現した遺伝子と関係する別の遺伝子（またはその遺伝子産物）により、調節され得る。
【０１４０】
故に、本発明は、細胞と前記物質を接触させ、遺伝子発現の増加および／または遺伝子産物の活性を測定することを含む、遺伝子の発現および／または遺伝子産物の活性を増加する物質を同定する方法を提供する。
【０１４１】
本発明はまた、感染の減少を伴う遺伝子発現の増加および／または遺伝子産物の活性が、その物質が、遺伝子の過剰発現および／または遺伝子産物の活性の増加により病原菌による感染を阻害することを示すように、前記物質を細胞に投与し、その細胞と病原菌を接触させ、遺伝子発現の増加および／または遺伝子産物の活性と、感染レベルを関係づけることを含む、遺伝子の過剰発現および／または遺伝子産物の活性の増加により感染を減少または阻害する物質を同定する方法を提供する。
【０１４２】
例えば、当業者は、ＩＧＦ２の過剰発現をもたらす化合物を投与することができる。この化合物は、ＩＧＦ２遺伝子、ＩＧＦ２ｍＲＮＡ、ＩＧＦ２タンパク質またはその断片と結合し得る。ヒトＩＧＦ２遺伝子およびその関係配列についての情報は、Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子番号３４８１にて発見し得る。前記化合物はまた、ＣＴＣＦ遺伝子、ＣＴＣＦｍＲＮＡ、ＣＴＣＦタンパク質またはそれらの断片と相互作用し、ＩＧＦ２発現を増加し得る。前記化合物はまた、ＩＧＦ２経路に関係する他の遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質と相互作用し、結果としてＩＧＦ２発現を増加させる。
【０１４３】
故に、遺伝子Ｘの破壊が、結果として遺伝子Ｙの過剰発現をもたらすとき、過剰発現した遺伝子（Ｙ）は、直接的に、すなわち過剰発現した遺伝子（Ｙ）によるか、または間接的、すなわち元の破壊された遺伝子（Ｘ）（または、その遺伝子産物）または過剰発現した遺伝子（Ｙ）と関係する別の遺伝子（またはその遺伝子産物）により調節され得る。例えば、当業者は、結果としてＹの過剰発現をもたらす化合物を投与することができる。この化合物は、Ｙ遺伝子、ＹｍＲＮＡまたはＹタンパク質と相互作用し得る。この化合物はまた、Ｘ遺伝子、ＸｍＲＮＡまたはＸタンパク質と相互作用し、Ｙ発現を増加し得る。この化合物はまた、他の遺伝子と相互作用し、ｍＲＮＡまたはタンパク質を、遺伝子Ｙ経路（すなわち、遺伝子Ｙが関係する細胞経路）に関与し、結果として増加したＹ発現をもたらす。
【０１４４】
医薬組成物および投与方法
本明細書に記載の治療薬を投与するための様々な送達系は、公知であり、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体が仲介するエンドサイトーシス（Wu and Wu, J Biol. Chem. 1987, 262:4429−32）、ならびにレトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療的核酸の構築が包含される。導入方法には、粘膜、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、膣内、直腸内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口投与が含まれるが、それらに限定されない。化合物を、何らかの常套方法により、例えば注射またはボーラス注入により、上皮層または皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、膣粘膜および腸粘膜など）を介する吸収により、投与することができ、他の生物学的活性剤物質と共に投与することができる。投与は、全身的または局所的であり得る。医薬組成物を、例えば局所適用または局所注入により、処置の必要な領域に局所的に送達することができる。
【０１４５】
治療的有効量の、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、分子、薬剤、タンパク質、抗体または他の治療剤を、単独で、または薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物が開示される。さらに、前記医薬組成物または処置方法は、他の抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤および駆虫剤のような他の治療的処置剤と併用して（例えば、投与前、投与中または投与後に）投与され得る。
【０１４６】
送達系
本明細書中有用な薬学的に許容される担体は、常套的である。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、本明細書に記載の治療剤の医薬送達に適する組成物および剤形を記載する。一般的に、担体の性質は、用いられる投与方法に依存して変化し得る。例えば、非経腸的剤形には通常、薬学的および生理学的に許容される、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、ブドウ糖水溶液、ゴマ油、グリセロール、エタノール、それらの組み合わせなどのような液体を、ビヒクルとして含む注射溶液が含まれる。担体および組成物を滅菌することができ、剤形を投与方法に合わせる。生物学的に中性の担体に加え、投与すべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートのような微量の非毒性補助剤を含み得る。
【０１４７】
組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、持続放出性製剤または粉末であり得る。固形組成物（例えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態）に関して、常套的な非毒性固形担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのような担体と共に、坐剤として製剤され得る。
【０１４８】
医薬を含む開示の態様は、当業者に公知であり得る通り、常套的な薬学的に許容される担体、アジュバントおよび対イオン（counterion）と共に製造され得る。
【０１４９】
感染を減少するか阻害するのに有効な治療剤の量は、病原菌の性質およびその関係する疾患または状態に依存し、標準的臨床技術により決定され得る。故に、これらの量は、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫または他の病原菌の対応に依存して変化し得る。さらに、インビトロ分析を、最適な投与量範囲を同定するために用いることができる。製剤に用いるべき正確な用量は、投与経路、および疾患または状態の重症度にも依存し、担当医の判断およびそれぞれの対象の周囲環境に従い決定されるべきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系から導かれる用量応答曲線から推定することができる。
【０１５０】
本発明の開示はまた、１個以上の医薬組成物の構成成分で満たされた１個以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。所望によりかかる容器（複数可）に関連付けられているのは、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を調整する政府機関の規定した形態での通知、ヒト投与のための製造、使用または販売の政府機関による承認を示す通知であり得る。組成物の使用のための指示書も含まれ得る。
【０１５１】
アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子のような核酸が、感染、例えばウイルス感染を減少するために用いられる例において、その核酸を、細胞内に（例えば、核酸ベクターからの発現、または受容体が仲介する機構により）、または例えばレトロウイルスベクターの使用により、細胞内に至るように投与される適当な核酸発現ベクターにより（米国特許番号第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注入により、または微粒子銃法（microparticle bombardment）の使用により（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でのコーティングにより、または核を入れることが知られているホメオボックス様ペプチドと結合させて投与することにより（例えば、Joliot et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 1991, 88:1864−8）、送達することができる。本発明の開示には、ゲノム内に組み込まれるか、または組み込まれない、合成オリゴ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドおよびウイルス送達を含む核酸送達の全ての形態が包含される。
【０１５２】
上述の通り、ベクター送達は、組換えレトロイルスゲノムをパッケージングし得るレトロウイルスベクター系のようなウイルス系により可能である（例えば、Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Z.S.A. 85:4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986を参照のこと）。その後、前記組換えレトロウイルスを感染に用いることができ、それにより感染細胞に核酸、例えばアンチセンス分子またはｓｉＲＮＡを送達することができる。哺乳動物細胞中に変異した核酸を導入する正確な方法はもちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941−948, 1994）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（Goodman et al., Blood 84:1492−1500, 1994）、レンチウイルスベクター（Naidini et al., Science 272:263−267, 1996）、および偽型レトロウイルスベクター（Agrawal et al., Exper. Flematol. 24:738−747, 1996）の使用を含む他の技術が、本方法に広く利用可能である。泡沫状ウイルスベクターのような他の非病原菌性ベクター系はまた、利用可能である（Park et al. “Inhibition of simian immunodeficiency virus by foamy virus vectors expressing siRNAs.” Virology. 2005 Sep 20）。遺伝子発現を阻害するためにベクター送達系により短いヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を送達することも可能である（Pichler et al. “In vivo RNA interference−mediated ablation of MDR1 P−glycoprotein.” Clin Cancer Res. 2005 Jun 15;11(12):4487−94; Lee et al. “Specific inhibition of HIV−1 replication by short hairpin RNAs targeting human cyclin T1 without inducing apoptosis.” FEBS Lett. 2005 Jun 6;579(14):3100−6．を参照のこと）。
【０１５３】
リポソーム送達および受容体が仲介する機構および他のエンドサイトーシス機構のような物理的形質導入技術もまた、一部の例として使用可能である（例えば、Schwartzenberger et al., Blood 87:472−478, 1996を参照のこと）。本発明を、これらのまたは他の通常使用される遺伝子導入方法のいずれかと併用して用いることができる。
【０１５４】
本明細書中、様々な刊行物が参照される。これらの文献の開示内容全体は、本発明が関係する技術の水準をより完全に記載するために、参照により本明細書中に包含される。
【０１５５】
本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明において様々な修飾および変更を行うことができることは、当業者に明らかであろう。本発明の他の態様は、本明細書に記載の発明の説明および実施例を考慮することにより当業者に明らかになるだろう。本明細書および実施例は、例示のみであると見なされ、特許請求の範囲により示される本発明の正確な範囲または精神が包含されることが意図される。
【実施例】
【０１５６】
ウイルスは、宿主細胞をその生活環の異なる段階に置く偏性細胞内寄生虫である。ウイルス感染および／または殺細胞に必要な細胞遺伝子の特徴付けは、ウイルス生活環を理解するために必須であり、新しい抗ウイルス療法の細胞標的を提供し得る。
【０１５７】
溶解性レオウイルス感染に必要な候補遺伝子は、標識配列変異法、遺伝子エントラップ法により破壊された遺伝子の迅速な同定が可能となる方法により同定された。１５１個のレオウイルス耐性クローンを、２×１０５個の独立して破壊された遺伝子を含む細胞ライブラリーから選択され、その内１１１個が、既に特徴付けられた遺伝子および機能不明の転写単位に変異を含んでいた。まとめると、レオウイルス耐性と関係する遺伝子は、公知の変異多発領域であることが示され、多数の変異がＩＧＦ−ＩＩ発現／シグナリング、小胞輸送／細胞骨格輸送およびアポトーシスを含む特定の細胞過程の周辺に集まるように見えたという点で、無作為化遺伝子エントラップ法により標的とされる遺伝子とは異なっていた。
【０１５８】
標識配列変異法は、ウイルス感染に必要な候補細胞遺伝子を同定するための、迅速な全ゲノムストラテジーを提供する。
【０１５９】
細胞遺伝子は、細胞受容体への結合、内在化、分解、ｍＲＮＡの翻訳、会合および細胞からの放出を含むウイルス生活環の全ての段階に関与する［１］。ウイルス感染に対する感受性は、異なる細胞タイプ間で大きく異なり、ウイルス耐性細胞がしばしば、感染後に出現する［２−４］。このことは、宿主細胞に影響を与え得る遺伝的決定が、ウイルス生活環に貢献することを示唆する。ウイルス感染に影響する哺乳動物遺伝子の例にかかわらず、そのような遺伝子の同定は、培養細胞における遺伝子分析のための実践的方法を使用しないことにより妨げられた。本発明の実験において、マウス胚性幹細胞において遺伝子の変異に広く用いられる標識配列変異−遺伝子エントラップストラテジーが［５−１０］、レオウイルスによる溶解感染に必要な候補細胞遺伝子を同定するために用いることができるかどうか、細胞質中で複製する小さい細胞溶解ＲＮＡウイルスを試験した。哺乳動物レオウイルスは、増殖性の未分化細胞において選択的に複製されるそれらの能力のために、ウイルス−宿主細胞の相互作用のモデルとして有用である［３］。
【０１６０】
遺伝子トラップは、胚性幹細胞にもともと導入される変異のマウスにおける実験により評価された効果的な変異誘発である。体細胞において、前記方法は、遺伝子エントラップによって導入された機能喪失変異が、遺伝子量効果（例えば、ハプロ不全）、既存のヘテロ接合またはヘテロ接合の消失の結果となるレオウイルス耐性を与え得ることを仮定する。Ｕ３ＮｅｏＳＶＬレトロウイルス遺伝子トラップシャトルベクターでの感染後、変異したラット腸上皮（ＲＩＥ）−１細胞クローンのライブラリーを単離し、その各クローンは、プロウイルス組み込みにより破壊された単一遺伝子を含んでいた［６］。レオウイルス１型で感染させたエントラップメントライブラリーおよびウイルス耐性クローンを、細胞変異の不存在下でウイルス耐性を発現し得る持続的に感染した細胞（ＰＩ）の出現に対しても選択される条件下で選択した［４］。１５１個のレオウイルス耐性細胞全てにおいて破壊された遺伝子を、エントラップメントベクターに隣接したゲノムＤＮＡの領域を配列決定することにより同定することができる［６］；これらのうち、１１１個は、既に特徴付けられた遺伝子および特徴不明の転写単位における変異を含む。
【０１６１】
レオウイルス耐性クローンは、非変異細胞からよりもエントラップメントライブラリーから高頻度で選択され、レオウイルス耐性表現型が、遺伝子トラップ変異により誘発されたことを示唆する。しかしながら、何らかの遺伝子スクリーニングにおいて、選択された表現型を有するクローンが自然突然変異に起因する可能性があり、その結果、個々の遺伝子がレオウイルス耐性表現型に実際に貢献する遺伝子エントラップメントにより破壊されたことを証明するために、さらなる実験が必要である。例えば、Ｃｔｃｆ、インスリン増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の転写リプレッサーにおける変異は、ＩＧＦ−ＩＩ発現および／またはシグナリングに影響を与えるレオウイルス耐性と関係する４個の変異のうちの１個であった。その後の実験が、強制的ＩＧＦ−ＩＩ発現が、高レベルのレオウイルス耐性を与えるのに十分であることを証明した［４］。簡潔には、レオウイルス耐性クローン群における標識配列変異により共同で同定された遺伝子は、ウイルス生活環に関与する細胞過程の機構研究のための候補を提供する。破壊された遺伝子が、細胞生存に悪影響を及ぼさないため、該遺伝子によりコードされるタンパク質を阻害する薬剤は、細胞に明らかに毒性であると予期されない。故に、候補遺伝子にはまた、新規の抗ウイルス療法のための標的が含まれる。
【０１６２】
ＲＩＥ−１、Ｌ−細胞およびウイルス：
Bernard N. Fields. Virusから最初に入手されたレオウイルス１型、ラング株（strain Lang）を、Ｌ−細胞中で継代し、３回継代したストックを、既報の通りＣｓＣＩ勾配で精製し、これらの実験のために用いた［５９］。ＰＩ細胞系の開発のため、ＲＩＥ−１細胞を、５感染多重度（ＭＯＩ）でレオウイルス１型を用いて感染させ、生存細胞を、ダルベッコ修飾イーグルス最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA）中で維持した。前初期遺伝子として、レポーター遺伝子であるｌａｃＺを発現するヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）−１クローン、ＨＳＶ−１ ＫＯＳｔｋ１２［４６］は、寛大にPatricia Spear, Northwestern University, USAから贈られた。ＲＩＥ−１およびＬ−細胞に関しては、培地には、１０％ウシ胎仔血清（２ｍＭ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（１００μ単位／ｍｌ）、ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA）が添加された［完全培地］。いくつかの実験において、血清を培地から除いた。レオウイルスまたはＨＳＶ−１での感染後の細胞単層の維持は、ゲンチアナ・バイオレットで染色することにより決定された。
【０１６３】
標識配列変異およびレオウイルス耐性の選択：
ＲＩＥ−１細胞のＵ３ｎｅｏＳＶ１ベクター（０．１ＭＯＩ）での感染後、変異した細胞を、Ｇ４１８硫酸塩１ｍｇ／ｍｌを含む培地中でのネオマイシン耐性について選択した（Clontech, Palo Alto, CA, USA）［６］。変異ＲＩＥ−１細胞の２０個のライブラリーおよびＡ５４９ヒト腺癌細胞の１個のライブラリー（それぞれ、１０４の遺伝子エントラップメント事象からなる）を、各変異クローンを表示するおよそ１０３個の同種細胞まで増殖させた。これらの細胞を、サブコンフルエント密度で播き、それらが静止状態になるまで血清不含有培地中で３日間インキュベートし、３５ＭＯＩ、プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞にてレオウイルス血清型１型で感染させた。感染の１８時間後、細胞をトリプシンで剥がし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地中に播いた（Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah, USA）。６時間後、培地を除き、細胞を血清不含有培地中で、フラスコに結合して残った細胞がほんのわずかになるまで維持した。平均して、１から１０個のクローンが、６桁の選択細胞の濃縮物として、１０７個の変異細胞からなるライブラリーから回収された。その選択で残った細胞を、１０％ＦＢＳを含む培地の細胞培養プレートに移し、細胞をＤＮＡ抽出用に分け冷凍保存した。
【０１６４】
ＨＳＶ−１前初期遺伝子レポーターの転写および翻訳：
ＨＳＶ−１前初期遺伝子レポーター遺伝子であるｌａｃＺの転写および翻訳を、それぞれ標準的ノーザンブロット技術およびβ−ガラクトシダーゼ分析により決定した。
【０１６５】
変異したＲＩＥ−１細胞のライブラリーの作製：
変異した細胞のライブラリーを、溶解感染に耐性のクローンを選択するため、レオウイルス血清型１型、ラング株で感染させた。ウイルス耐性クローンの選択を、持続的感染（ＰＩ）細胞の出現を抑制するために、血清不含有培地中で行った［４］。これは、ＰＩ細胞が、ウイルスおよび細胞ゲノムの両方において適応変異を伴う過程で生じ［６０］、ＲＩＥ−１細胞が、細胞変異の不存在下でのウイルス耐性に必要である手段を提供するため、重要である。非感染ＲＩＥ−１細胞は増殖を停止するが、一方、ＰＩ ＲＩＥ−１細胞は、血清不含有培地中で死滅する。
【０１６６】
ＤＮＡ配列分析：
１３０細胞系のそれぞれに挿入されたプロウイルスの５’末端に直ぐ隣接するゲノムＤＮＡを、プラスミドレスキューによりクローン化した［６］。この隣接ＤＮＡの約３００から６００塩基対を配列決定し、重複のない（non−redundant）（ｎｒ）および発現配列タグ（ｄｂＥＳＴ）核酸データベースと比較した［６１］。データベースのオーソロガス配列との一致確率は、種間変化、隣接ＤＮＡ中のエクソン量（隣接ＤＮＡがｃＤＮＡ配列と一致する場合）、選択的スプライシングおよび配列決定の誤りのために異なる。データベースの配列との一致は、確率スコアが、＜１０−５であり、配列が非反復性であるとき、有意な可能性があると見なされた。多くの場合に、一致遺伝子は、プロウイルスと同じ転写方向であった。さらに、ｃＤＮＡ配列の一致は、隣接ゲノムＤＮＡに存在する同一鎖上にわたるエクソンであって、スプライス部位で外れた。記載する通り、同定された遺伝子のほとんど全てが、マウス、ラット、またはヒト遺伝子配列とｐ＜１０−１０の一致を有していた。
【０１６７】
標識配列変異およびレオウイルス耐性クローンの選択
２０個の変異ＲＩＥ−１細胞ライブラリー（それぞれ、およそ１０４の独立遺伝子トラップ事象を示す）を、Ｕ３ＮｅｏＳＶ１遺伝子トラップレトロウイルスでの感染後に単離した。Ｕ３ＮｅｏＳＶ１は、ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域にネオマイシン耐性遺伝子のコーディング配列を含む。ネオマイシン耐性についての選択は、積極的に転写される遺伝子内に挿入されたプロウイルスを有するクローンを生じる。各エントラップメントライブラリーから集めされた細胞を、３５感染多重度にてレオウイルス１型でそれぞれ感染させ、レオウイルス耐性クローンを、持続的感染（ＰＩ）細胞の出現を抑制する血清不含有培地中で選択した（ｒｅｆ）。全体で１５１個のレオウイルス耐性クローンを単離した（１０３遺伝子トラップクローン当たり約１分または１０７レオウイルス感染細胞当たり１変異）。比較のため、遺伝子エントラップメントによって変異しないＲＩＥ−１細胞からの耐性クローンの回復頻度は、１０−８未満であった。これは、レオウイルス耐性表現型が、遺伝子トラップ変異により誘導されたことを示唆する。
【０１６８】
血清不含有培地中で選択されたレオウイルス耐性細胞は、ウイルス抗原を発現せず（図１）、プラーク分析により評価される感染性ウイルスを産生しない。ほとんどのクローンが、高力価レオウイルスによる感染に耐性であり、さらに分析された（図２）。レオウイルス耐性は、最初は、持続的感染の確立の結果ではないが、多くのクローンが、その後の継代で持続的に感染するようになり、これは、ウイルス耐性を示す変異細胞が、選択に用いた残りのウイルスからの、ＰＩ状態［２］の確立に感受性でありためであると考えられる。
【０１６９】
レオウイルス耐性クローンにおいて破壊された遺伝子の同定
Ｕ３ＮｅｏＳＶ１遺伝子トラップベクターは、プラスミドの複製オリジンおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む；故に、標的ベクターに隣接するゲノムＤＮＡの領域は、プラスミドレスキューおよび配列決定により容易にクローン化された［６］。隣接配列を、遺伝子エントラップメントにより変化したとき、レオウイルスによる溶解感染に耐性を与える候補細胞遺伝子を同定するため、核酸データベースと比較した。全体で、１５１個のクローン化された隣接配列が、公開されたＤＮＡ配列データベース［重複のない（ｎｒ）、ハイスループットゲノム配列（ｈｔｇ）、ならびにヒト、マウス、およびラットゲノム配列］の１１１個の注釈付き遺伝子（annotated gene）および転写単位と一致した［６］。４０個の隣接配列は、それらが、いずれの注釈付き転写単位とも関係しない反復エレメントまたはゲノムＤＮＡ領域と一致したため、参考にならなかった。
【０１７０】
表１は、いくつかの機能的情報が利用可能な、レオウイルス耐性クローンにおいて破壊された遺伝子を列記する。表はまた、物理的相互作用することが知られているタンパク質をコードする遺伝子を含む。特に代謝またはシグナル経路と関係する遺伝子が、表２に示される。これらには、ウイルス複製の全ての局面：侵入、分解、転写、翻訳、および再構築（表１、２、図３）に潜在的に役割を果たし得る遺伝子産物が含まれる。カルサイクリン、インスリン増殖因子結合タンパク質５プロテアーゼ（ｐｒｓｓｌ１）、Ｃ型様レクチンタンパク質（Ｃｌｒ）−ｆおよび−Ｃ、Ｄｎａｊａｌ−／アプラタキシン＋（Ａｐｒｘ）、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（Ｇａｔａ４）、Ｂｃｌ２様−１（Ｂｃｌ２ｌ１）；ならびに、１０番染色体オープンリーディングフレーム３（ＣｈｒｌＯｏｒｆ３）およびｍｙｏｆｅｒｌｉｎ、ｆｅｒ−１様タンパク質３（Ｆｅｒｌ１３）、Ｓ１００ａ６（コード化カルサイクリン）、ならびに２個の機能的に不明なｃＤＮＡをコードする１１個の遺伝子は、別個の細胞ライブラリー中で独立して変異されていた（表１）。これらの独立した変異クローン中プロウイルスは、互いに、７個以内から１５００ヌクレオチド以上に位置した。
【０１７１】
ＨＳＶ−１に対する耐性
実験を、遺伝子が、ＨＳＶ−１感染に耐性であるかどうかを決定するために行った。これらの実験は、１ａｃＺレポーターを前初期遺伝子として発現するＨＳＶ−１（ＫＯＳ）ｔｋｌ２、感染性ウイルスを用いた［４６］。Ｅｉｆ３ｓ１０、ＡｎｘａＩ、ＭｇａｔｌおよびＩｇｆ２ｒ遺伝子に変異を有する４個のクローンが、ＨＳＶ−Ｉ感染に耐性であり、前初期ｌａｃＺレポーター遺伝子を発現する能力が減少していた。Ｅｉｆ３ｓ１０、ＭｇａｔｌおよびＩｇｆ２ｒに変異を有するクローンもまた、ウイルスｍＲＮＡの転写および翻訳ならびに細胞死の減少を示す。Ｉｇｆ２ｒの変異は、ＨＳＶ複製に影響することが知られている［１５、５４、５８］；一方、ＨＳＶ複製とＥｉｆ３ｓ１０、ＡｎｘａｌおよびＭｇａｔｌによりコードされるタンパク質の関係は、新規である。これらのデータは、レオウイルス感染で生存するクローンにおいて発見されるいくつかの候補遺伝子が、他のウイルスにより用いられる通常の細胞過程に影響し得ることを示す。
【０１７２】
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【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
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【表７６】
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【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】図１は、クローン化ＲＩＥ−１細胞の、レオウイルス１型感染に対する耐性の表現型特性の特徴を示す。（Ａ）細胞を、既報［３］のレオウイルス抗原について染色した。ＰＩ細胞のみが、免疫組織化学によって検出されるレオウイルス抗原を含む（黒いウェル）。上側のウェルは、レオウイルス耐性に関して選択された２セットのＲＩＥ−１変異細胞系由来のクローン化ＲＩＥ−１細胞変異体である。下側のウェルは、ＰＩ ＲＩＥ−１（左）、および非感染性野生型ＲＩＥ−１（右）である。（Ｂ）１ｍｌの完全培地（completed medium）中で維持したレオウイルス感受性Ｌ−細胞単層を、変異細胞（上側の２個のウェル）、ＰＩ ＲＩＥ−１細胞（下側左）または非感染性親ＲＩＥ−１細胞（下側右）から得られた溶解物１００μｌ中のウイルスの存在を検出するために用いた。Ｌ−細胞単層のみを、暴露の一週間以内に溶解したＰＩ ＲＩＥ−１細胞由来の溶解物に暴露したことに留意すべきである（ゲンチアナ・バイオレット染色）。
【図２】図２は、ＲＩＥ−１変異細胞が、レオウイルスによる溶菌感染に耐性であることを示す。カラムは、非選択的なＲＩＥ−１細胞ライブラリー、ＲＩＥ−１ ４０℃、および代表的レオウイルス耐性変異細胞クローンを含む。レオウイルスの連続２倍希釈を、最上列の最も高いタイターがＭＯＩ＝１×１０４で作製した。レオウイルス１型感染に対する耐性を、感染の３から７日後に変異細胞において観察した。最下列の細胞（“Ｃ”と示される）は感染させず、細胞生存および増殖に関しての対照とした。細胞を、感染の４日後に、ゲンチアナ・バイオレットを用いて染色した。透明なウェルは、ウイルス感染後の細胞死を示す。
【図３】図３は、レオウイルスの生活環モデル、および本明細書中、挿入変異により同定された細胞遺伝子の機能に基づき提案されたチェックポイントを示す。ウイルス生活環は、ウイルスの細胞表面受容体への結合により始まり（上、右回り）、初期エンドソーム中に取り込まれる。その後、これらのエンドソームは、アネキシン−ＩＩ（Ａｎａｘ２）と結合し［８５］、ゴルジ体から移動してきた新しく合成されたリソソーム酵素を含むアネキシン−ＩＩ−結合ビヒクルと融合する［８６］、それはさらに、リソソームと融合する。液胞Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅは、リソソームを酸性化し、酸依存性プロテアーゼがウイルス粒子の外膜を消化してそれらを活性化するのを可能にする［８７］。その後、これらの活性化粒子は、リソソーム膜を通過し、ｍＲＮＡの転写を開始する。ゴルジタンパク質ｇｍ１３０（Ｇｏｌｇａ２）は、それらが、ゴルジ層板を介してそれらの新しく合成された物質（cargo）を運ぶように、ビヒクルの結合を仲介すると考えられている［８８、８９］。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（Ｍｇａｔｌ）は、細胞表面タンパク質（例えば、受容体）のグリコシル化を開始し、リソソーム酵素の正しい種類の維持に貢献する、同族（kinship）認識を介して多くの役割を果たし得る［９０−９４］。Ｉｇｆ２ｒシャトル酵素は、ゴルジ体由来のリソソームに結合し［９５］、該リソソームにカプサイシンを移す。Ｉｇｆ２の過剰発現は、ｉｇｆ２ｒ結合物質のリソソームへの送達を変え得る（Sheng J, Organ EL, Hao C, Wells, KS, Ruley HE, Rubin DH. 2004）。ＩＧＦ−ＩＩ経路における変異は、溶解性レオウイルス感染に対して耐性を与える（BMC Cell Biology, 5:32 (27 August 2004)）。カルサイクリンおよびα−トロポミオシンは、互いに特異的に結合し、カルサイクリンは、Ａｎｘａ２に結合することが公知である［１６、２０］。故に、それらは、エンドソーム融合に関与し得る。Ｅｉｆ３ｓ１０は、ウイルスメッセンジャーＲＮＡに特異的に結合し、その優先的翻訳を開始する。ＤｎａＪａｌタンパク質は、そのシャペロン機能を有するウイルスタンパク質の正しい折りたたみを容易にし得る［９６］。しかしながら、Ｄｎａｊａｌタンパク質およびＥｉｆ３は、ウイルス輸送またはアポトーシスのそれぞれにさらに役割を果たし得る。最終的に、形態形成は、クリスタリン様配列の新しいビリオンが形成され、細胞溶解が起こり、ウイルスが放出されるときに完了する。変異遺伝子によりコードされる細胞タンパク質の多くは、エンドソームの輸送またはリソソーム融合に直接的または間接的に役割を果たし、故に、初期の分解または転写活性なビリオンの適当な細胞領域への送達に役割を果たし得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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