(57)【要約】本発明は、タバコの煙に含まれている発癌物質として公知の４−(methylnitrosamino)−１−(３−pyridyl)−１−butanone(ＮＮＫ)により引き起こされる肺癌に対する、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の予防、阻害（抑制）及び治療用途に関する。本発明は、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）が、タバコの煙に含まれている肺癌誘発物質であるＮＮＫによって増加された肺内の腫瘍細胞増殖の指標である増殖性細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen：ＰＣＮＡ）の発現を抑制し、肺癌誘発物質であるＮＮＫによって発生する肺腫瘍の生成を抑制する効果を有することを確認し、この種の長生ドラジの抽出物（ＣＫ）を有効成分として含み、タバコが原因で発生する肺癌の予防、抑制及び治療用として活用できるようにした長生ドラジ抽出物の用途に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長生ドラジ抽出物を有効成分として含む、タバコによる肺癌の予防、抑制及び治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の用途に係り、さらに詳しくは、タバコの煙に含まれている発癌物質としての既知の４−(methylnitrosamino)−１−(３−pyridyl)−１−butanone（ＮＮＫ）により引き起こされる肺癌に対する、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の予防、阻害（抑制）及び治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キキョウ（桔梗：Platycodon grandiflorum Ａ．ＤＣ）はキキョウ科(Campanulaceae)の多年生草本であって、主根が凡そ１０〜１５ｃｍであり、直径は１〜３ｃｍであり、上部には不規則的な茎の痕跡があり、灰褐ないし乳白色を帯び、縦向きにシワが深く、横向きには皮目とシワがある。硬質であるが、非繊維性であるために破折し易く、やや匂いがし、味はひりっと辛い（ユク・チャンスら、現代生薬学、ソウル、学生社、４６０−４６１，１９９３）。
【０００３】
この種のキキョウの主な薬理成分はトリテルピン系のサポニン(platycodin Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｄ２，Ｄ３)であって、根の約３％を占めている。この薬理成分は、既に動物実験を通じて、鎮咳、去痰作用、中枢神経抑制作用（鎮静、鎮痛、解熱効果）、急慢性炎症に対する抗炎症作用、抗潰瘍及び胃液分泌の抑制作用、血管を拡張して血圧を下げる抗コリン作用、血糖降下作用、コレステロール代謝改善作用などがあることが判明されている(Chem. Pharm. Bull., ２０，１９５２（１９７２）, Chem. Pharm. Bull., ２３，２９６５（１９７５）, J. Chem. Soc., Perkin trans I, ６６１（１９８４）,  Sogoigaku, ３，１（１９５１）, J. Pharm. Soc. Kor., １９，１６４（１９７５）)。また、α−スピナステロール、スチグマスト−７−エノール、α−スピナステロールグルコシドなどのステロイド系の化合物とイヌリン、ベチュリンなどの多糖類もキキョウの薬理成分であって、単離されている。
【０００４】
長生ドラジは２０年根以上のキキョウの根のことである。これまでは、キキョウの様々な薬理作用にも拘わらず、長期に亘っての栽培が困難とされていたが、近年、キキョウ２０年以上の根としての長生ドラジを栽培可能な技術が開発され（李聖鎬（イ・ソンホ） 、「多年生キキョウの栽培法」大韓民国特許第０４５７３１号）、量産可能になっている。この長生ドラジは、寿命が２〜４年である一般的なキキョウに比べて薬理作用と生理活性効能が抜群である。
【０００５】
これまでの長生ドラジに関する研究としては、抗糖尿効果に関する実験（J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., ２５，９８６（１９９６））、高脂血症に関する実験（J. Pharmaceutical Society of Japan ９３（１９７３）１１８８−１１９４）などが挙げられるが、これらに留まらず、肝臓損傷の抑制及び保護に関する研究なども絶え間無く行われている。
【０００６】
肺癌は４０〜７０歳に頻繁に発生し、稀ではあるが４０歳以前に発生することもある。男女の発生比率は、１９６０年代には男女７:１であったが、これに比べ、１９８０年代以来女性の方の比率が高くなっている。これは、女性喫煙率の増加に起因したものであると分析されている。原因は不明であるが、多くの力学的・実験的研究を行ったところ、喫煙・石綿・ラドン・クロム・ニッケル、芳香族炭化水素、ヒ素化合物、放射線などの職業的露出が危険要因として作用していることが明らかになった。そのうち、喫煙が最もな要因として作用していると言われている。
【０００７】
タバコの煙に含まれる発癌物質のうち４−(methylnitrosamino)−１−(３−pyridyl)−１−butanone(以下、「ＮＮＫ」という)は、最も特異な物質であって、多くの動物実験を通じて肺癌を引き起こすことが明らかになっている（Ｍ．Ｋ．Ｋ．Shivji Cell., ６９, ３６７−３７４（１９９２）。また、ＮＮＫは、タバコに含まれる最も強い発癌性物質のニトロソアミン（nitrosamine）である。このような事実から、ＮＮＫが喫煙者にとって肺癌発生の最大の要因物質であることがわかる。
【０００８】
ＮＮＫによって発現が増加する増殖性細胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen、以下「ＰＣＮＡ」という）は、発癌段階で発生する腫瘍細胞増殖の指標といえ、ＤＮＡポリメラーゼ （polymerase）の共同因子としてＤＮＡ複製などに関与する（H.Kohno et al. Cancer Letters １７４.,１４１−１５０（２００１））。ＰＣＮＡは、発癌が進む多様な段階で損傷を受けるＤＮＡの復旧と癌細胞の増殖のためのＤＮＡ複製のために細胞内で増加する。
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、タバコの煙に含まれている肺癌誘発物質であるＮＮＫによる肺癌の発生を効果的に予防及び抑制し、回復させて肺を保護し、しかも無毒性の肺疾患治療及び予防用製剤に対する研究を重ねた結果、長生ドラジの抽出物が、ＮＮＫによって誘導される肺癌の発生に対する予防及び抑制効果を有していることを知見し、本発明を完成するに至った。そこで、本発明は、喫煙やタバコの煙の吸入などによって発生する肺癌に対する予防及び抑制効果を有する、安全且つ無毒性の天産物である長生ドラジ抽出物を有効成分として含む薬剤学的組成物を提供することを目的とする。
【００１０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１１】
本発明による長生ドラジ抽出物は、タバコによる肺癌を予防、抑制及び治療する用途を有するということを特徴とする。すなわち、本発明による長生ドラジ抽出物は、タバコの煙に含まれている肺癌誘発物質のＮＮＫによる肺癌発生を効果的に予防及び抑制し、回復させて肺を保護する用途として利用できるということを特徴とする。
【００１２】
本発明による長生ドラジ抽出物は、当該分野における周知の方法で調製される。長生ドラジ抽出物としては、通常熱水抽出物または有機溶媒抽出物が挙げられ、このような長生ドラジ抽出物は単独または許容可能な生薬材を添加して調製でき、ここに薬剤学的に許容される担体を含んで調製できる。
【００１３】
一般に、長生ドラジ粉末としては、水分含有量５％以下になるように長生ドラジを乾燥してそれを粉砕した後、粒径０.６ｍｍ以下のものを選別して用いる。熱水抽出物としては、長生ドラジ粉末に約５〜１０倍の水を添加し、９０〜１００°Ｃで４〜６時間２回抽出して得られたろ過液をそのまま用いるか、許容可能な生薬材または生薬材抽出物を選択的に添加したものを用いる。有機溶媒抽出物としては、長生ドラジ粉末に約３倍の有機溶媒を添加し、室温で２回抽出して得られた濾過液を減圧濃縮したものを用いる。有機溶媒としては、好ましくはエタノールを用いる。
【００１４】
本発明による長生ドラジ抽出物は、通常的な方法にて薬学的剤形を製造することができる。剤形を製造するに当たり、活性成分である長生ドラジ抽出物を担体と一緒に混合または希釈するか、あるいは容器形の担体内に封入させることが望ましい。希釈剤として用いられる担体としては、活性成分に対するビヒクル(Vehicle)、賦形剤またはミディアム(Medium)として作用する固形、半固形または液状の物質が挙げられる。このため、剤形は、精製、丸剤、粉剤、サシェ(sachet)、 エリキシル剤(elixir)、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール剤、軟質または硬質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射剤、滅菌粉剤などの形が挙げられる。適合な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニールピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び及び鉱油が挙げられる。剤形 は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明による薬剤学的組成物は、哺乳動物に投与された後活性成分の迅速、持続または遅延放出を与えるように当業界の公知の方法を用いて 剤形化することができる。
【００１５】
本発明による薬剤学的組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む複数の経路を介して投与できる。ヒトの場合、通常１日投与量は１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重とし、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、実際投与量は、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、健康状態及び疾患の重度などの多くの関連因子に基づいて決定する必要がある。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するためのものに過ぎないもので、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
［実施例１］長生ドラジ熱水抽出物の調製
長生ドラジを水分含有量５重量％以下に乾燥させて粉砕した後、粒径０.６ｍｍ以下になるように選別して粉末状の長生ドラジを調製した。長生ドラジ粉末０.２ｋｇに蒸溜水２ｌを加え、９０〜９５°Ｃで５時間に２回抽出した後ろ過し、それを凍結乾燥させて長生ドラジ抽出物（ＣＫ）１００ｇを得た。
【００１８】
［実験例１］実験動物及び実験方法
１．試薬
試薬は、次の物を購入して使用した。
ＰＣＮＡに対する抗体はCell signaling社から、トリスベース(Tris-base)とウシ血清アルブミン(Bovine serum albumin:ＢＳＡ)はＵＳＢ社から、ツイン２０(Tween-20)とＮ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン(N,N,N',N'-tetramethyl-ethylenediamine：ＴＥＭＥＤ) はSigma社から、ＰＶＤＦ膜(PVDF membrane)はPall corporationから、 キシレン(Xylene)はDuksanから、メチルアルコール(Methyl alcohol)とエチルアルコール(Ethyl alcohol)はHaymanから、ＮＮＫはToronto Research Chemicalsからそれぞれ購入した。
【００１９】
２.動物
実験動物としては、生後６週齢の２０〜２５ｇの実験用マウス（Ａ／Ｊ mouse）をSamtako Biokorea Co., Koreaから購入して用い、飼料(purina korea)と水を自由摂取させ、飼育場の温度は２１〜２４°Ｃ、相対湿度は４０〜８０％を維持した。また、１２時間毎に昼と夜が繰り返されるように飼育場内の光を調整した。
【００２０】
３.ＮＮＫによる肺癌誘発と長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の処理
実験動物を、１群１５匹に無処理の正常群(control)と、ＮＮＫを腹腔注射した群（ＮＮＫ１００ｍｇ／ｋｇ）と、ＮＮＫを腹腔注射後に長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与した群（ＮＮＫ３ｍｇ／ｋｇ＋ＣＫ１０ｍｇ／ｋｇ、ＮＮＫ３ｍｇ／ｋｇ＋ＣＫ１００ｍｇ／ｋｇ）とに分けた。ＮＮＫは、実験開始時に１００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射し、１週後にさらに１００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射した。長生ドラジ抽出物（ＣＫ）は、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを１週間に３回ずつ２３週間口腔投与した。
【００２１】
４.統計学的分析
統計学的有意性の検定は、one−way ＡＮＯＶＡ with t−test方法を用い、Ｐ値が０.０５よりも小さい場合を有意であると判定した。
【００２２】
［実施例２］肺癌誘発物質ＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）による体重と肺重量の変化
肺癌誘発物質ＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）による実験動物の体重変化と肺重量の変化とを調査するために、ＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の処理前に体重を測定し、ＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の処理２３週後に再び体重を測定した。また、肺重量を測定してＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）による肺重量変化を調べてみた 。
【００２３】
実験動物としてのマウスに肺癌誘発物質ＮＮＫを注射した群と、ＮＮＫ注射後に長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与した群とにおける、ＮＮＫ処理前の最初の体重とＮＮＫ処理２３週後の体重とを比較し、その結果を表１に示す。
【００２４】
＜表１＞実験用マウスの体重変化
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【００２５】
前記表１から明らかなように、ＮＮＫと長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の処理前の体重と２３週処理後の体重とを比較するとき、肺癌誘発物質ＮＮＫのみを注射した群の体重は若干減少した。ＮＮＫ注射後に長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を飲ませた群は、ＮＮＫのみを注射した群に見られた体重減少が回復され、無処理の正常群と比較するとき、ほとんど変化しないことがわかった。
【００２６】
［実施例３］長生ドラジ抽出物（ＣＫ）のＮＮＫによって増加された癌細胞増殖の指標であるＰＣＮＡ発現に対する抑制効果
発癌物質として公知のＮＮＫによるＤＮＡ損傷とこれによる癌細胞増殖のためのＤＮＡ複製に関与するＰＣＮＡの発現に対する長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の影響を調査するために、実験動物用マウスにＮＮＫを注射し、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与してから３０日後に肺の一部を摘出し、そこに緩衝液を入れ、ホモジナイザー(homogenizer)を用いて組職を均質化し、遠心分離機を用いて上澄み液を回収し、それに含まれているＰＣＮＡタンパク質の発現量をウエスタンブロット(Western blot)法により測定した。
【００２７】
図１は、ＰＣＮＡタンパク質の発現量を示す図であって、同図から、発癌物質として公知のＮＮＫによって増加された細胞増殖の指標であるＰＣＮＡのタンパク質発現量が、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与によって有意に減少することが確認された。
【００２８】
［実施例４］長生ドラジ抽出物（ＣＫ）による、肺癌誘発物質ＮＮＫによって引き起こされる肺組職における腫瘍形成の抑制効果
実験動物の肺組職に対して、肺癌誘発物質ＮＮＫを注射した群と、ＮＮＫ注射後に長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与した群とにおける、肺に形成された腫瘍の数をそれぞれ計測して比較し、さらに、ヘマトキシリン・エオジン染色法(hematoxylin-eosin stain)を用いて、無処理の正常群の肺と、ＮＮＫを腹腔注射した群の肺と、ＮＮＫを腹腔注射した後に長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与した群の肺とを比較し、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）による肺腫瘍形成の抑制効果を調べてみた。
【００２９】
図２は、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与可否による実験動物の肺の変化を示す写真であって、同図から、ＮＮＫによって発生した肺腫瘍が、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与することで抑制されることがわかった。図３は、肺腫瘍の数を測定した結果を示すグラフであって、同図から、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）が肺腫瘍の生成を抑制する効果を有することが確認された。図４は、肺組織をヘマトキシリン・エオジン染色法による結果の変化を示す写真であって、同図から、ＮＮＫによって引き起こされた肺腫瘍が、長生ドラジ抽出物（ＣＫ）を投与することで抑制されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
上述したように、本発明による長生ドラジ抽出物含有組成物は、タバコの煙に含まれている強力な肺癌誘発物質であるＮＮＫによって引き起こされる肺腫瘍生成に対して予防及び抑制効果を発揮することにより、喫煙とタバコの煙などの原因から生じる肺癌の予防及び治療剤として有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与可否による、ウエスタンブロット (Western blot)法によるＰＣＮＡタンパク質の発現量の変化を示す図である。
【図２】長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与可否による、実験動物の肺の変化を示す写真である。
【図３】長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与可否による、肺胞の外部に生成された腫瘍の数の変化を示すグラフである。
【図４】長生ドラジ抽出物（ＣＫ）の投与可否による、ヘマトキシリン・エオジン染色法(hematoxylin-eosin stain)による肺組織の変化を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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