(57)【要約】  ヒトを含む、脊椎動物で骨形成を刺激するための能力を有するオリゴヌクレオチドが開示される。これらの骨形成ヌクレオチドは骨又は歯周の欠損を置換又は回復するために又はプロテーゼの成功した移植と骨の延展手法を容易にするために臨床手法の幅広い範囲で使用され得る。骨格組織が欠損している動物の領域での骨の発生のための方法が提供される。それらは薬学的に許容される担体中で、動物への骨形成オリゴヌクレオチドの１個又はそれより多いものから成る組成物の局所的又は全身の投与にある。組成物は骨部位で骨形成を誘導するために効果のある量で投与される。
2008520545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成を誘導する薬剤の製造のための約14〜100個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの使用であって、前記オリゴヌクレオチドは次の組成: PyNTTTTNT又はPyNTTTTGT(PyはC又はTでありNは任意のデオキシリボヌクレオチドである)を有する少なくとも1種のサブ配列を有することを特徴とする、使用。
【請求項２】
骨形成機能障害の治療用の薬剤の製造のための請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３】
骨粗鬆症の治療用の薬剤の製造のための請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
骨格の欠損(deficiency)又は変性(alteration)の治療用の薬剤の製造のための請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが14〜40ヌクレオチドから成ることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが天然(ホスホジエステル)ホスフェート骨格の任意の種類の改変(modification)を有することを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが5′ヌクレオチド間結合でのホスフェート骨格改変を有することを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが3′ヌクレオチド間結合でのホスフェート骨格改変を有することを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ヌクレオチド間結合の少なくとも1種がホスホロチオアート結合であることを特徴とする請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドが以下から成る群から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用:
TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No2);
TCCTCCTTTTGTCCTTTTGTCCTT (SEQ  ID  No3);
TCTTCTTTTTGTCTTTTTGTCTTT (SEQ  ID  No4);
TTGTTGTTTTGTTGTTTTGTTGTT (SEQ  ID  No7);
TCATTTTTTTGTTTTTTTGTCATT (SEQ  ID  No10);
TCATTGTTTTGTTGTTTTGTCATT (SEQ  ID  No11);
TCATTCTTTTGTTCTTTTGTCATT (SEQ  ID  No12);
TCATTATTTTGTTATTTTGTCATT (SEQ  ID  No15);
TCATCCTTTTGTCCTTTTGTCATT (SEQ  ID  No17); 
TCATCTTTTTGTCTTTTTGTCATT (SEQ  ID  No18);
CATTTTGTTTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No 20);
TTCATTTTGTTTTTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No21); 
TTTTCATTTTGTTTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No22); 
TTTTTTCATTTTGTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No23); 
TTTTTTTTCATTTTGTTTTTTTTT (SEQ  ID  No24); 
TTTTTTTTTTCATTTTGTTTTTTT (SEQ  ID  No25); 
TTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTT (SEQ  ID  No26); 
TTTTTTTTTTTTTTCATTTTGTTT (SEQ  ID  No27);
TTTTTTTTTTTTTTTTCATTTTGT (SEQ  ID  No 28);
TTTTCATTTTGTCATTTTGTTTTT (SEQ  ID  No29);
TCATCAATTTGTCAATTTGTCATT (SEQ  ID  No30);
ACATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No46);
CCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No47);
GCATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No48);
TAATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No49); 
TTATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No50);
TGATCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No51);
TCCTCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No52);
TCTTCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No53);
TCAACATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No55);
TCACCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No56);
TCAGCATTTTGTCATTTTGTCATT (SEQ  ID  No57);
TCATCATTTTGTCATTTTGTAATT (SEQ  ID  No58);
TCATCATTTTGTCATTTTGTTATT (SEQ  ID  No59);
TCATCATTTTGTCATTTTGTGATT (SEQ  ID  No60);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCCTT (SEQ  ID  No61);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCTTT (SEQ  ID  No62);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCAAT (SEQ  ID  No64);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCACT (SEQ  ID  No65);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCAGT (SEQ  ID  No66);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCATA (SEQ  ID  No67);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCATC (SEQ  ID  No68);
TCATCATTTTGTCATTTTGTCATG (SEQ  ID  No69);
TCATCAATTGGTCAATTGGTCATT (SEQ  ID  No75);
TCATCAACTGGTCAACTGGTCATT (SEQ  ID  No77);
TCATCATTGTGTCATTGTGTCATT (SEQ  ID  No84);
TCATCATTTGGTCATTTGGTCATT (SEQ  ID  No87);
TGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT  (SEQ  ID  No91);
TCATCATCTTGTCATCTTGTCATT (SEQ  ID  No95);
TCATCATGTTGTCATGTTGTCATT (SEQ  ID  No96);
GGGGGTCTTTTTTTCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No107)
TTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTGGG (SEQ  ID  No108)
AAAAATCTTTTTTTCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No109)
TGCTGCTTTTATGCTTTTATGCTT (SEQ  ID  No110)
TCATCATTCTGTCATTCTGTCATT (SEQ  ID  No111)
TTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No112)
TGCTGCTTTTCTGCTTTTCTGCTT (SEQ  ID  No113)
TTTTTTCTTTTCTTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No114)
TTTTTCCTTTTTTCCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No115)
CCCCCTCTTTTTTTCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No116)
TTTTTTCTTTTTCTTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No117)
TTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTCCC (SEQ  ID  No118)
TTTTTTCTTTTTCTCTTTTTCTCT (SEQ  ID  No119)
TTTTTGCTTTTTTGCTTTTTTTTT (SEQ  ID  No120)
TTTTTACTTTTTTACTTTTTTTTT (SEQ  ID  No121)
TCATAATTTTGTAATTTTGTCATT (SEQ  ID  No122)
TTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTAAA (SEQ  ID  No123)
TTTTTTCTTTTTTCTTTTTTTTTT (SEQ  ID  No124)
TTTTTTTTTTTTCATTTTGTGGGG  (SEQ  ID  No125)
TTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTG  (SEQ  ID  No126)
GGGTTTTTTTTTCATTTTGTTTTT (SEQ ID  No127)
GTTTTTTTTTTTCATTTTGTTTTG  (SEQ  ID  No128)
【請求項１１】
前記薬剤がヒトに投与されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドが徐放送達ビヒクル(slow release delivery vehicle)に封入されていることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが薬学的に許容される担体に含まれることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドが徐放送達ビヒクルに封入されていることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチド、骨形成オリゴヌクレオチドが骨格の欠損又は変性の治療を促進することが意図されたデバイスと併用されて被験体に投与されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記デバイスが成形(molded)インプラント、プロセティック・デバイス(prosthetic device)、カプセル、チタン合金、又はセラミックブロックであることを特徴とする請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
前記デバイスが重量で0-100 %ヒドロキシルアパタイトと残りの100-0%がリン酸三カルシウムを含むセラミックブロックであることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬剤が製剤(preparation)を保持するためにデバイスになされた穴または溝に吸着、浸透又は包含することによってデバイスと組み合わされることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
骨原生細胞の供給源の付加を伴う請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが１用量あたり1 μgから100mgの量で存在することを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記薬剤が液体、ゲル及び凍結乾燥された製剤からなる群から選択されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
前記薬剤が皮内、筋肉内又は静脈内注射によって投与されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
前記薬剤が経口、鼻腔内、肛門、膣、又は経皮経路によって投与されることを特徴とする上記の請求項のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はインビボでの骨成長を誘導するための骨形成オリゴヌクレオチドと医薬組成物両方の使用に関する。さらに詳細には、それはヒトを含む動物での骨形成を刺激する能力を持つ約14から100ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
参考文献
米国特許文献
1)米国特許 5,409,896 April 25, 1995
2)米国特許 5,422,340 June 6, 1995
3)米国特許 5,604,204 February 18, 1997
4)米国特許 5,854,207 December 29, 1998
5)米国特許 5,885,964 March 23, 1999
6)米国特許 5,948,428 September 7, 1999
7)米国特許 5,972,703 October 26, 1999
8)米国特許 6,028,207 February 22, 2000
9)米国特許 6,355,672 March 12, 2002
10)米国特許 6,426,222 July 30, 2002
11)米国特許 6,531,604 March 11, 2003
12)米国特許 6,569,204 May 27, 2003
13)米国特許 6,649,072 November 18, 2003
非米国特許文献
1)WO 98/08517 March  05, 1998
2)WO 98/30234 July  16, 1998
3)WO 98/33515 August  06, 1998
4)WO 00/78351 December  28, 2000
5)WO 01/10463 February  15, 2001
6)WO 01/89521 November  29, 2001
7)WO 02/080955 October  17, 2002
8)WO 2004/030683 April  15, 2004
その他の参考文献
1) Hughes FJ, McCulloch CA. Stimulation of the differentiation of osteogenic rat bone marrow stromal cells
by osteoblast cultures. Lab Invest. 1991 May;64(5):617-22. 
2) Lee SC, Shea M, Battle MA, Kozitza K, Ron E, Turek T, Schaub RG, Hayes WC. 
Healing of large segmental defects in rat femurs is aided by RhBMP-2 in PLGA matrix. J Biomed Mater Res. 1994 Oct;28(10):1149-56. 
3)  Asahina I, Sampath TK, Hauschka PV. Human osteogenic protein-1 induces chondroblastic, osteoblastic, and/or
adipocytic differentiation of clonal murine target cells. Exp Cell Res. 1996 Jan 10;222(1):38-47. 
4) Maliakal JC, Asahina I, Hauschka PV, Sampath TK. Osteogenic protein-1 (BMP-7) inhibits cell proliferation and stimulates the expression of markers characteristic of osteoblast phenotype in rat osteosarcoma (17/2.8) cells. Growth Factors. 1994;11(3):227-34. 
5) Asahina I, Sampath TK, Nishimura I, Hauschka PV. Human osteogenic protein-1 induces both chondroblastic and osteoblastic
differentiation of osteoprogenitor cells derived from newborn rat calvaria. J Cell Biol. 1993 Nov;123(4):921-33. 
6) Akiyama H, Fukumoto A, Shigeno C, Ito H, Mukai S, Hoshino T, Makino H,
Nakamura T. TAK-778, a novel synthetic 3-benzothiepin derivative, promotes chondrogenesis in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Jul 22;261(1):131-8.
7) Notoya K, Nagai H, Oda T, Gotoh M, Hoshino T, Muranishi H, Taketomi S, Sohda T, Makino H. Enhancement of osteogenesis in vitro and in vivo by a novel osteoblast differentiation promoting compound, TAK-778. J Pharmacol Exp Ther. 1999 Sep;290(3):1054-64. 
8) Oda T, Notoya K, Gotoh M, Taketomi S, Fujisawa Y, Makino H, Sohda T. Synthesis of novel 2-benzothiopyran and 3-benzothiepin derivatives and their stimulatory effect on bone formation. J Med Chem. 1999 Feb 25;42(4):751-60. 
9) Sigurdsson TJ, Nygaard L, Tatakis DN, Fu E, Turek TJ, Jin L, Wozney JM,
Wikesjo UM. Periodontal repair in dogs: evaluation of rhBMP-2 carriers. Int J Periodontics Restorative Dent. 1996 Dec;16(6):524-37.
10) Hanada K, Dennis JE, Caplan AI. Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic
protein-2 on osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Bone Miner Res. 1997 Oct;12(10):1606-14. 
11) King GN, King N, Cruchley AT, Wozney JM, Hughes FJ. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes wound healing in rat periodontal fenestration defects. J Dent Res. 1997 Aug;76(8):1460-70. 
12) Kimura M, Zhao M, Zellin G, Linde A. Bone-inductive efficacy of recombinant human bone morphogenetic protein-2
expressed in Escherichia coli: an experimental study in rat mandibular defects. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg. 2000 Dec;34(4):289-99.
13) Zellin G, Linde A. Effects of recombinant human fibroblast growth factor-2 on osteogenic cell
populations during orthopic osteogenesis in vivo. Bone. 2000 Feb;26(2):161-8.
14) Zellin G, Linde A. Treatment of segmental defects in long bones using osteopromotive membranes and
recombinant human bone morphogenetic protein-2. An experimental study in rabbits. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg. 1997 Jun;31(2):97-104.
15) Zellin G, Linde A. Importance of delivery systems for growth-stimulatory factors in combination
with osteopromotive membranes. An experimental study using rhBMP-2 in rat mandibular defects. J Biomed Mater Res. 1997 May;35(2):181-90. 
16) Wikesjo UM, Guglielmoni P, Promsudthi A, Cho KS, Trombelli L, Selvig KA, Jin L, Wozney JM. Periodontal repair in dogs: effect of rhBMP-2 concentration on regeneration of alveolar bone and periodontal attachment. J Clin Periodontol. 1999 Jun;26(6):392-400. 
17) Barboza E, Caula A, Machado F. Potential of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in bone regeneration.
Implant Dent. 1999;8(4):360-7. Review.
18) Murata M, Huang BZ, Shibata T, Imai S, Nagai N, Arisue M. Bone augmentation by recombinant human BMP-2 and collagen on adult rat parietal bone. Int J Oral Maxillofac Surg. 1999 Jun;28(3):232-7.
19) Cochran DL, Schenk R, Buser D, Wozney JM, Jones AA. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulation of bone formation around endosseous dental implants. J Periodontol. 1999 Feb;70(2):139-50. 
20) Isobe M, Yamazaki Y, Mori M, Ishihara K, Nakabayashi N, Amagasa T. The role of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in PLGA capsules at an extraskeletal site of the rat. J Biomed Mater Res. 1999 Apr;45(1):36-41. 
21) Mori M, Isobe M, Yamazaki Y, Ishihara K, Nakabayashi N. Restoration of segmental bone defects in rabbit radius by biodegradable capsules containing recombinant human bone morphogenetic protein-2. J Biomed Mater Res. 2000 May;50(2):191-8.
22) Hoshino T, Saito K, Muranishi H, Sohda T, Ogawa Y. Sustained-release microcapsules of a bone formation stimulant, TAK-778, for local injection into a fracture site. J Pharm Sci. 2001 Dec;90(12):2121-30. 
23) Hoshino T, Muranishi H, Saito K, Notoya K, Makino H, Nagai H, Sohda T, Ogawa Y. Enhancement of fracture repair in rats with streptozotocin-induced diabetes by a single injection of biodegradable microcapsules containing a bone formation
stimulant, TAK-778. J Biomed Mater Res. 2000 Sep 5;51(3):299-306. 
24) Kato H, Nishiguchi S, Furukawa T, Neo M, Kawanabe K, Saito K, Nakamura T. Bone bonding in sintered hydroxyapatite combined with a new synthesized agent, TAK-778. J Biomed Mater Res. 2001 Mar 15;54(4):619-29. 
25) Yudell RM, Block MS. Bone gap healing in the dog using recombinant human bone morphogenetic protein-2. J Oral Maxillofac Surg. 2000 Jul;58(7):761-6. 
26) Tatakis DN, Wikesjo UM, Razi SS, Sigurdsson TJ, Lee MB, Nguyen T, Ongpipattanakul B, Hardwick R. Periodontal repair in dogs: effect of transforming growth factor-beta 1 on alveolar bone and cementum regeneration. J Clin Periodontol. 2000 Sep;27(9):698-704. 
27) Danesh-Meyer MJ. Tissue engineering in periodontics and implantology using rhBMP-2. Ann R Australas Coll Dent Surg. 2000 Oct;15:144-9. 
28) Oldham JB, Lu L, Zhu X, Porter BD, Hefferan TE, Larson DR, Currier BL, Mikos AG, Yaszemski MJ. Biological activity of rhBMP-2 released from PLGA microspheres. J Biomech Eng. 2000 Jun;122(3):289-92.
29) Marukawa E, Asahina I, Oda M, Seto I, Alam MI, Enomoto S. Bone regeneration using recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) in alveolar defects of primate mandibles. Br J Oral Maxillofac Surg. 2001 Dec;39(6):452-9.
30) Seto I, Asahina I, Oda M, Enomoto S. Reconstruction of the primate mandible with a combination graft of recombinant
human bone morphogenetic protein-2 and bone marrow. J Oral Maxillofac Surg. 2001 Jan;59(1):53-61
31) Sykaras N, Triplett RG, Nunn ME, Iacopino AM, Opperman LA. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on bone regeneration and osseointegration of dental implants. Clin Oral Implants Res. 2001 Aug;12(4):339-49. 
32) Wikesjo UM, Sorensen RG, Wozney JM. Augmentation of alveolar bone and dental implant osseointegration: clinical
implications of studies with rhBMP-2. J Bone Joint Surg Am. 2001;83-A Suppl 1(Pt 2):S136-45.
33) Majumdar MK, Wang E, Morris EA. BMP-2 and BMP-9 promotes chondrogenic differentiation of human multipotential
mesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1. J Cell Physiol. 2001 Dec;189(3):275-84. 
34) Takayama S, Murakami S, Shimabukuro Y, Kitamura M, Okada H. Periodontal regeneration by FGF-2 (bFGF) in primate models.
J Dent Res. 2001 Dec;80(12):2075-9. 
35) Ripamonti U, Crooks J, Petit JC, Rueger DC. Periodontal tissue regeneration by combined applications of recombinant human
osteogenic protein-1 and bone morphogenetic protein-2. A pilot study in Chacma baboons (Papio ursinus). Eur J Oral Sci. 2001 Aug;109(4):241-8.
36) Hoshino T, Saito K, Muranishi H, Sohda T, Ogawa Y. Sustained-release microcapsules of a bone formation stimulant, TAK-778, forlocal injection into a fracture site. J Pharm Sci. 2001 Dec;90(12):2121-30.
37) Kato H, Neo M, Tamura J, Nakamura T. Bone bonding in bioactive glass ceramics combined with a new synthesized agent
TAK-778. J Biomed Mater Res. 2001 Nov;57(2):291-9.
38) Kato H, Nishiguchi S, Furukawa T, Neo M, Kawanabe K, Saito K, Nakamura T. Bone bonding in sintered hydroxyapatite combined with a new synthesized agent, TAK-778. J Biomed Mater Res. 2001 Mar 15;54(4):619-29. 
39) Gotoh M, Notoya K, Ienaga Y, Kawase M, Makino H. Enhancement of osteogenesis in vitro by a novel osteoblast
differentiation-promoting compound, TAK-778, partly through the expression of Msx2. Eur J Pharmacol. 2002 Sep 6;451(1):19-25.
40) Anusaksathien O, Giannobile WV. Growth factor delivery to re-engineer periodontal tissues.Curr Pharm Biotechnol. 2002 Jun;3(2):129-39. 
41) Lieberman JR, Daluiski A, Einhorn TA. The role of growth factors in the repair of bone. Biology and clinical
applications. J Bone Joint Surg Am. 2002 Jun;84-A(6):1032-44.
42) Saltzman WM, Olbricht WL. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 2002 Mar;1(3):177-86.
43) Li G, Bouxsein ML, Luppen C, Li XJ, Wood M, Seeherman HJ, Wozney JM, Simpson H. Bone consolidation is enhanced by rhBMP-2 in a rabbit model of distraction osteogenesis. J Orthop Res. 2002 Jul;20(4):779-88.
44) Weber FE, Eyrich G, Gratz KW, Maly FE, Sailer HF. Slow and continuous application of human recombinant bone morphogenetic protein via biodegradable poly(lactide-co-glycolide) foamspheres. Int J Oral Maxillofac Surg. 2002 Feb;31(1):60-5.
45) King GN, Cochran DL. Factors that modulate the effects of bone morphogenetic protein-induced
periodontal regeneration: a critical review. J Periodontol. 2002 Aug;73(8):925-36.
46) Schilephake H. Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. 2002 Oct;31(5):469-84. 
47) Ikeuchi M, Dohi Y, Horiuchi K, Ohgushi H, Noshi T, Yoshikawa T, Yamamoto K,
Sugimura M. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes osteogenesis within atelopeptide type I collagen solution by combination with rat cultured marrowcells. J Biomed Mater Res. 2002 Apr;60(1):61-9. 
48) Marukawa E, Asahina I, Oda M, Seto I, Alam M, Enomoto S. Functional reconstruction of the non-human primate mandible using recombinant human bone morphogenetic protein-2. Int J Oral Maxillofac Surg. 2002 Jun;31(3):287-95.
49) Selvig KA, Sorensen RG, Wozney JM, Wikesjo UM. Bone repair following recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulated periodontal regeneration. J Periodontol. 2002 Sep;73(9):1020-9. 
50) Rosa AL, Beloti MM. TAK-778 enhances osteoblast differentiation of human bone marrow cells. J Cell Biochem. 2003 Aug 15;89(6):1148-53.
51) Cook SD, Barrack RL, Patron LP, Salkeld SL. Osteoinductive agents in reconstructive hip surgery: a look forward.
Clin Orthop. 2003 Dec;(417):195-202. 
52) Puleo D. Biotherapeutics in orthopaedic medicine: accelerating the healing process? BioDrugs. 2003;17(5):301-14.
53) Tabata Y. Tissue regeneration based on growth factor release. Tissue Eng. 2003;9 Suppl 1:S5-15.
54) Wikesjo UM, Xiropaidis AV, Thomson RC, Cook AD, Selvig KA, Hardwick WR. Periodontal repair in dogs: rhBMP-2 significantly enhances bone formation under provisions for guided tissue regeneration. J Clin Periodontol. 2003 Aug;30(8):705-14. 
55) Matin K, Senpuku H, Hanada N, Ozawa H, Ejiri S. Bone regeneration by recombinant human bone morphogenetic protein-2 around
immediate implants: a pilot study in rats. Int J Oral Maxillofac Implants. 2003 Mar-Apr;18(2):211-7. 
56) Nakashima M, Reddi AH. The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering.
Nat Biotechnol. 2003 Sep;21(9):1025-32.
57) Camelo M, Nevins ML, Schenk RK, Lynch SE, Nevins M. Periodontal regeneration in human Class II furcations using purified
recombinant human platelet-derived growth factor-BB (rhPDGF-BB) with bone allograft. Int J Periodontics Restorative Dent. 2003 Jun;23(3):213-25. 
58) Sheehan JP, Sheehan JM, Seeherman H, Quigg M, Helm GA. The safety and utility of recombinant human bone morphogenetic protein-2 for cranial procedures in a nonhuman primate model. J Neurosurg. 2003 Jan;98(1):125-30.
59) Murakami S, Takayama S, Kitamura M, Shimabukuro Y, Yanagi K, Ikezawa K, Saho T, Nozaki T, Okada H. Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) stimulates periodontal regeneration in class II furcation defects created in beagle dogs.
J Periodontal Res. 2003 Feb;38(1):97-103. 
60) Rasubala L, Yoshikawa H, Nagata K, Iijima T, Ohishi M. Platelet-derived growth factor and bone morphogenetic protein in the healing of mandibular fractures in rats. Br J Oral Maxillofac Surg. 2003 Jun;41(3):173-8.
61) Clokie CM, Bell RC. Recombinant human transforming growth factor beta-1 and its effects on osseointegration. J Craniofac Surg. 2003 May;14(3):268-77.
62) Lee YM, Nam SH, Seol YJ, Kim TI, Lee SJ, Ku Y, Rhyu IC, Chung CP, Han SB, Choi SM. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. J Periodontol. 2003 Jun;74(6):865-72. 
63) Sykaras N, Opperman LA. Bone morphogenetic proteins (BMPs): how do they function and what can they
offer the clinician? J Oral Sci. 2003 Jun;45(2):57-73.
64) Sykaras N, Opperman LA. Bone morphogenetic proteins (BMPs): how do they function and what can they offer the clinician? J Oral Sci. 2003 Jun;45(2):57-73.
65) Schmidmaier G, Wildemann B, Gabelein T, Heeger J, Kandziora F, Haas NP, Raschke M. Synergistic effect of IGF-I and TGF-beta1 on fracture healing in rats: single versus combined application of IGF-I and TGF-beta1. Acta Orthop Scand. 2003 Oct;74(5):604-10. 
66) Cheng H, Jiang W, Phillips FM, Haydon RC, Peng Y, Zhou L, Luu HH, An N, Breyer B, Vanichakarn P, Szatkowski JP, Park JY, He TC. Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenetic proteins (BMPs). J Bone Joint Surg Am. 2003 Aug;85-A(8):1544-52.
67) van den Dolder J, de Ruijter AJ, Spauwen PH, Jansen JA. Observations on the effect of BMP-2 on rat bone marrow cells cultured on titanium substrates of different roughness. Biomaterials. 2003 May;24(11):1853-60. 
68) Matin K, Senpuku H, Hanada N, Ozawa H, Ejiri S. Bone regeneration by recombinant human bone morphogenetic protein-2 around
immediate implants: a pilot study in rats. Int J Oral Maxillofac Implants. 2003 Mar-Apr;18(2):211-7. 
69) Wikesjo UM, Qahash M, Thomson RC, Cook AD, Rohrer MD, Wozney JM, Hardwick WR. Space-providing expanded polytetrafluoroethylene devices define alveolar augmentation at dental implants induced by recombinant human bone morphogenetic protein 2 in an absorbable collagen sponge carrier. Clin Implant Dent Relat Res. 2003;5(2):112-23.
70) Wikesjo UM, Qahash M, Thomson RC, Cook AD, Rohrer MD, Wozney JM, Hardwick WR. rhBMP-2 significantly enhances guided bone regeneration. Clin Oral Implants Res. 2004 Apr;15(2):194-204.
71) Benghuzzi H, Tucci M, Tsao A, Russell G, England B, Ragab A. Stimulation of osteogenesis by means of sustained delivery of various natural androgenic hormones. Biomed Sci Instrum. 2004;40:99-104. 
72) Rosa AL, Beloti MM. TAK-778 enhances osteoblast differentiation of human bone marrow cells via an
estrogen-receptor-dependent pathway. J Cell Biochem. 2004 Mar 1;91(4):749-55.
73) Roldan JC, Jepsen S, Miller J, Freitag S, Rueger DC, Acil Y, Terheyden H. Bone formation in the presence of platelet-rich plasma vs. bone morphogenetic protein-7. Bone. 2004 Jan;34(1):80-90.
74) Ashinoff RL, Cetrulo CL Jr, Galiano RD, Dobryansky M, Bhatt KA, Ceradini DJ, Michaels J 5th, McCarthy JG, Gurtner GC. 
Bone morphogenic protein-2 gene therapy for mandibular distraction osteogenesis. Ann Plast Surg. 2004 Jun;52(6):585-90.
75) Osyczka AM, Diefenderfer DL, Bhargave G, Leboy PS. Different effects of BMP-2 on marrow stromal cells from human and rat bone. Cells Tissues Organs. 2004;176(1-3):109-19.
発明の背景
骨は最初にそれを分解して(破骨細胞性再吸収)、それからそれを再構築する(骨芽細胞性形成)細胞の現象によって成人の生涯の間に継続的に再構築される複雑な、高度に組織化された、結合組織である。この再構築過程は骨格の至る所の別々の位置で起こっている。骨は線維性瘢痕の介入無しで完全な修復が可能な唯一の組織である(Hult. A. 1989. Current concepts of fracture healing. Clin. Orthop. Relat. Res. 249:265-384.)。しかしながら、整形および顎顔面手術のような骨の機能の急速な回復を確保するために治癒の促進を必要とする臨床の状況が存在する。一方で、加齢、血液の供給不足及び糖尿病を含むいくつかの現象は骨折の治癒の妨害に導き得る(J.A. Buckwalter, T.A. Einhorn, M.E. Bolander and R.L. Cruess , Healing of the musculoskeletal tissues. In: C.A. Rockwood, D.P. Green, R.W. Bucholz and J.D. Heckman, Editors, Fracture in Adults, Lippincott-Raven, New York (1996), pp. 261-304.)。骨粗鬆症の骨折の回復はまた、骨折位置の力学的な力が仮骨と石灰化の不十分な量のために減少しているので遅れる(L.J. Melton, III , Epidemiology of fractures. In: B.L. Riggs and L.J. Melton, III, Editors, Osteoporosis: Etiology, Diagnosis, and Management, Lippincott-Raven, Philadelphia (1995), pp. 225-247. ; W.R. Walsh, P. Sherman, C.R. Howlett, D.H. Sonnabend and M.G. Ehrlich, Fracture healing in a rat osteopenia model. Clin. Orthop. Relat. Res. 342 (1997), pp. 213-227)。このように、骨形成を増強するための薬剤の開発は、骨折の治癒と骨の治療を含む手術方法の両方を促進する点、骨形成機能障害を患う患者の骨折を防ぐ点で重要な薬理学の進歩があるだろう。
【０００３】
多くの成長因子とサイトカインが骨折位置に高レベルで存在し、これらのタンパク質の多くは骨の回復を促進することに重要な役割を演じている(M.E. Bolander, Regulation of fracture repairs by growth factors. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 200 (1992), pp. 165-170.)。骨形成タンパク質(BMPs)、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、インスリン様成長因子(IGFs)、繊維芽細胞成長因子(FGFs)及び血小板由来成長因子(PDGF)のような様々な成長因子を用いた薬剤治療は、これらの分子の局所的な適用が動物モデルで骨の再生を誘導することが示されているので有用であるかもしれない(Lind M (1996) Growth factors: Possible new clinical tools. Acta Orthop. Scand. 67: 407-417)。
【０００４】
これらの発見はこれらの成長因子の臨床での使用が骨折の治癒を増すための可能な新しい治療になり得ることを示している。しかしながら、これらの成長因子の安全性と費用効率は考慮されなければならない。それゆえ、安全に骨の形成を促進し、骨折の修復を容易にする化合物を開発することに重要な関心がある。そのような化合物の一つの例が、“インビトロ”及び“インビボ”で骨形成活性を有するイプリフラボン(7-イソプロポキシ-イソフラボン)の誘導体であるTAK-778である(: Notoya K, Nagai H, Oda T, Gotoh M, Hoshino T, Muranishi H, Taketomi S, Sohda T, Makino H (1999). Enhancement of osteogenesis in vitro and in vivo by a novel osteoblast differentiation promoting compound, TAK-778.J Pharmacol Exp Ther. 290:1054-64)。ヒトでの使用のためのこの化合物の有効性は臨床試験で証明されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
我々は今約14から100ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが強力な骨形成活性を持つ化合物であることを開示する。
【０００６】
成熟した形態的に通常の骨をそれが必要とされる場所で生み出すために骨格(骨性)組織欠損(deficiency)を有する動物にこの発明の骨形成オリゴヌクレオチドの1個またはそれより多くのものを供給することが本発明の目的である。
【０００７】
この目的は当業者にとって明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
上記の目的は骨格組織が欠損している動物の部位での骨の再生のための方法、及び組成物が該部位で骨の成長を誘導するために有効な量で投与されるように薬学的に許容される担体中で、各場合に必要とされるように該部位で局所的に又は全身に、動物にこの発明の骨形成オリゴヌクレオチドの1種または２種以上を含む該組成物の有効量の投与にある方法を提供することによって達成される。
【０００９】
本発明のこの態様は必要とされる全身又は局所的に骨格の通常の成熟した骨の形成を可能にする。以下に記載されているこの発明の骨形成性ODNのいくつかを実施例として使用した前臨床結果はラットの骨欠損で新しい骨の形成と霊長類の骨欠損で新しい骨の形成を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
好ましい実施例の説明
"骨成長を誘導すること"は置換されることを必要とする骨の欠損がある部位でだけ形態的に通常の成熟した骨の形成を促進することを意味する。成熟した骨とは新生児モデルで形成されるであろう未熟又は軟骨性の骨とは反対の石灰化された、皮質又は小柱のいずれかの、任意のタイプの骨である。形態的に通常の骨とは組織学的に通常(すなわち、軟骨内または膜型の層板骨からなり、破骨細胞と造骨細胞を有する髄腔を含んでいる)として認められる骨である。これは、例えば骨折の治癒の初期段階に見られるような線維性マトリックスを有する仮骨構造とは対照である。このように、ここでの骨の誘導は骨折のような、骨の再生の促進だけでなく、通常の形態の状態に戻らされる骨の形成の刺激として考えられる。
【００１１】
"骨格組織欠損"は外科的処置または骨折のどちらかの結果として生じた任意の位置の骨の欠損、及び骨を回復することが要求される場所での骨の欠損を意味する。
【００１２】
“骨形成”によって骨が発生する過程が意味される。
【００１３】
“骨原生細胞”によって増殖し、骨芽細胞と骨細胞に分化できる細胞が意味される。
【００１４】
“骨芽細胞”によって骨細胞外組織成分の合成と分泌に関わる成熟骨細胞が意味される。
【００１５】
“骨細胞”によってそれらが分泌する生成物によって囲まれる本質的に骨芽細胞である細胞が意味される。
【００１６】
"動物"によって脊椎構造を持つ任意の動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトが意味される。
【００１７】
“被験体(subject)”はヒトを含む霊長目の動物を指す。
【００１８】
ここで使用されているように、用語"オリゴヌクレオチド"又は"オリゴ"は複数のヌクレオチド(すなわち、リン酸基と、置換ピリミジン(例えばシステイン(C)、チミン(T)又はウラシル(U))又は置換プリン(例えばアデニン(A)又はグアニン(G))のどちらかである交換可能な有機塩基に結合した、例えばリボース又はデオキシリボースのような糖を含む分子)を意味する。ここで使用されている用語"オリゴヌクレオチド"はオリゴリボヌクレオチド(ORNs)とオリゴデオキシリボヌクレオチド(ODNs)の両方を指す。用語"オリゴヌクレオチド"はまた、ポリマーを含むオリゴヌクレオシド(すなわち、オリゴヌクレオチドからリン酸を引いたもの)と任意の他の有機塩基を含む。オリゴヌクレオチドは既存の核酸源(例えば、ゲノム又はcDNA)から得られ得るが、好ましくは合成のもの(例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生産される)である。
【００１９】
"オリゴヌクレオチド"はホスホジエステル結合によって結合された複数のヌクレオチドを指す。
【００２０】
"免疫賦活性オリゴヌクレオチド"は統計的に有意な様式で免疫系の細胞(すなわち、リンパ球又はマクロファージ)を刺激する(すなわち、分裂促進効果を有し、サイトカインの発現を誘導、増加または減少させる)オリゴヌクレオチドを指す。
【００２１】
“CpG”はシトシン-グアニン ジヌクレオチドを指す。
【００２２】
"CpGオリゴヌクレオチド"は免疫系の細胞を刺激し、免疫賦活活性が配列中の少なくとも1個のCpGの存在に重大に依存しているオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２３】
"非CpGオリゴヌクレオチド"は免疫系の細胞を刺激し、免疫賦活活性は配列中のCpGの存在に重大に依存しないオリゴヌクレオチドを指す。
【００２４】
発明を実施するための形態
本発明は、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドの1種または２種以上を適切な薬学的担体と混合することによる、及び骨の損傷で通常の成人の骨の形成を誘導するために動物に必要とされるように局所的に又は全身に結果組成物を投与することによる1つの態様で実施される。骨原生細胞とそれらの前駆細胞は一つ又は複数の損傷部位に存在すべきである。もし一個又は複数の損傷部位が天然に存在している骨原生細胞の供給源を有していないのなら、医薬組成物はまた骨成長を誘導するために十分な量で骨原生細胞の供給源を含んでいてもよい。
【００２５】
一個又は複数の骨格部位での骨修復の促進が重要である部位の表示の例は以下のものを含んでいる: 根槽(root socket)治癒が損なわれている場所(歯槽部位)での歯周病、(ハイリスクの骨折の初期治療と定着された非癒合骨折(non-union fractures)の骨移植または骨代用物での付随治療を含む)非癒合骨折、外傷又は手術によって引き起こされる大きな骨の欠損[例えば、ガンのための部分的な下顎骨の切除、大きな頭蓋の欠損、脊髄(椎骨)の融解、(ボディーキャスト(body cast)のために通常必要とされる6ヶ月の期間を短縮するために)ハリングトン バーを使用して本来の位置で維持される手術の位置合わせによる重症の脊柱側弯症の矯正、及び(固定期間を大きく減少させるために)観血的整復法(open reduction)を使用した脊髄骨折]、及び人工プロテーゼ(artificial prostheses)とスペーサーバー、オーラルジョイント、及び骨置換の急速な安定化と高められた定着化。
【００２６】
後者の例は、形成及び再建手術、下顎骨への永久義歯の固定化、(急速な緩みと不安定性のために受け入れられないプロテーゼ(prostheses)の受容に導く)受け入れられる関節プロテーゼ、例えば股関節、膝関節、肩甲関節の高められた定着化、及び悪性腫瘍と通常関連している救肢手順(limb salvage procedures)(骨シャフトが取り除かれるかもしれないが、関節面が本来の場所に残されスペースバーによって繋がれる; 急速な高められた定着化が成功のために必要とされる。)を含んでいる。その部位が歯周部位、すなわち歯、歯ぐき、及び歯槽を含むものを構成するなら、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドは外因性で加えられる骨原生細胞の供給源と組み合わされて投与され得る。
【００２７】
一つの好ましい実施態様では、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドはこの発明の１種または２種以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物でデバイスをコーティングすることによって、そしてその欠損部位で動物にデバイスを移植することによって投与される。該組成物はまた骨原生細胞源を、該部位がそのような細胞を欠損しているときに含み得る。デバイスは成形(molded)インプラント、プラグ、プロセティック・デバイス(prosthetic device)、カプセル、チタン合金、スポンジ、又はセラミックブロックを含む、移植のために適した任意のデバイスであり得る。デバイスとして有用な好適な送達ビヒクル(delivery vehicles)の例は、Nade et al., Clin. Orthop. Rel. Res., 181: 255-263 (1982); Uchida et al., J. Biomed. Mat. Res., 21: 1-10 (1987); Friedenstein et al., Exp. Hematol., 10: 217-227 (1982); Deporter et al., Calcif. Tissue Int., 42: 321-325 (1988); McDavid et al., J. Dent. Res., 58: 478-483 (1979); Ohgushi et al., J. Orthopaedic Res., 7: 568-578 (1989), Aprahamian et al., J. Biomed. Mat. Res., 21: 965-977 (1986) 及び  Emmanual et al., Stain. Tech., 62: 401-409 (1987)によって開示されているものである。
【００２８】
ドライソケット又は非癒合骨折のような隙間を含む骨の欠損にとって、プラグは隙間を埋めるために使われ得る。プラグは例えば、この発明の１種以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物が吸着したヒドロキシルアパタイト又はコラーゲンから構成されてもよい。例えば、外傷、または潰瘍又は股関節プロテーゼ(hip prosthesis)の周辺での骨格再建に由来するより大きな骨の欠損のために、デバイスは好ましくは寸法に合わせて作ったセラミックブロックである。より好ましくは、セラミックブロックは重量で0-100%ヒドロキシルアパタイトと残りは100-0%リン酸三カルシウムから、最も好ましくは60%ヒドロキシルアパタイトと40%リン酸三カルシウムを含む。
【００２９】
下顎インプラントのための特異的な実施態様で、炭酸カルシウム成形(moldable)材料またはインターポア.TM.成形(molding)デバイスが、手術の前に下顎の三次元X線を使用して下顎に合うように成形される。成形された(molded)材料はこの発明のオリゴヌクレオチドの1種以上を含む組成物で浸透される。それから、動物のもう一つの部位から(例えば、股関節から)分取された骨髄がモールドに浸透され、そのモールドが最終的な移植のために下顎に置かれる。
【００３０】
好ましくは、デバイスは吸着を可能にするための十分な時間の間、この発明の１種以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物(例えば、溶液又はゲル)で処理される。溶液又はゲル中のこの発明のオリゴヌクレオチドの濃度とさらされる時間は欠損の容量やそれが適用される部位の性質を含む多くの因子に依存し、それに応じて調整されるべきである。欠損の大きさが増加するにつれ、又は部位が骨の部位以外であるとき、オリゴヌクレオチドの濃度と浸けおきする時間は増加する。処置は、移植前に、上で述べられている因子に依存して、少なくとも約0.5時間(さらに好ましくは少なくとも約1時間、そして最も好ましくは1-2時間)であるべきである。上の考慮にまた依存して、組成物のオリゴヌクレオチドの濃度は好ましくは少なくとも約0.1 mg/ml(さらに好ましくは少なくとも約0.5-10で、100 mg/mlまで)であるべきである。処置は、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドと必要なら骨原生細胞源を効果的に送達するためのデバイスに組成物が適用されるいずれの態様からなってもよい。そのような処置は、適応症の性質に一部依存して、例えば吸着又は浸透を含む。
【００３１】
治療で使用されるこの発明の骨形成オリゴヌクレオチドを含む組成物は、処置される骨格組織欠損の性質、ホストの種類、個々の患者の医学的状況、組成物中の他のいずれかの薬の存在、薬剤の送達部位、投薬方法、投薬スケジュール、及び開業医に知られている他の因子を考慮している優良医療基準(good medical practice)と一致した様式で投薬される。ホスト反応での相違のために、重要な部位対部位、患者対患者の多様性が存在する。ここでの目的のために、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドの"治療的有効量"は骨格組織欠損の部位で、上で定義されているように、骨の成長を誘導するために有効な量である。
【００３２】
一般的な提案として、この発明の骨形成オリゴヌクレオチドは、部位に約0.1 mg/mlに等しい又はそれ以上のオリゴヌクレオチドのレベルを達成できる用量で処方され、標的部位に送達される。典型的に、オリゴヌクレオチド濃度は約0.1 mg/ml〜12 mg/ml、好ましくは1〜4 mg /mlの範囲である。これらの組織内濃度は好ましくは局所的な適用及び/又は徐放(sustained release)によって維持される。
【００３３】
上で示されているように、オリゴヌクレオチドのこれらの提案された量は多くの治療的判断を受ける。適切な用量とスケジュールを選択するキーとなる因子は得られた結果である。終点を決定するための臨床パラメーターは、骨の形状と質量、Ｘ線撮影で(radiographically)検出できる骨の高さの増加を含む。そのような測定は当分野の通常の知識を有する臨床医及び薬理学者によく知られている。
【００３４】
オリゴヌクレオチド組成物は、局所的、連続的に放出する薬剤を含むいずれかの適切な方法によって部位局所的に、または必要なら全身に投与される。オリゴヌクレオチドは一般的に、生理学的に受け入れられる担体、例えば使用される量と濃度で患者に非毒性である担体と周囲温度、適切なpH、及び所望の純度で組み合わされる。担体は投与のための所望の製剤の形態に依存して幅広い種類の形態を取ってもよい。
【００３５】
デバイスの浸透に適切な液体組成物の調製のために、担体は適切なバッファー、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、(グルコース又はデキストランを含む)炭水化物、EDTAのようなキレート剤、セルロース、又は他の賦形剤である。加えて、オリゴヌクレオチド組成物は好ましくは滅菌のものである。滅菌は0.2ミクロン膜を通した滅菌濾過により容易に達成される。再構成するために凍結乾燥した処方は受け入れられるけれども、オリゴヌクレオチドは通常は水性溶液として保存されるであろう。
【００３６】
一般的に、骨疾患がそれを可能にする場所で、部位特異的送達のためのオリゴヌクレオチドを処方し、投薬されるべきであり、そこでオリゴヌクレオチドは所望の部位への局所的な適用に適した滅菌徐放組成物に配合される。
【００３７】
オリゴヌクレオチド組成物の局所的適用のために、例えば、ひびである骨欠損、例えば癒合骨折(union fracture)の場合に; 担体はこの目的のために効果的ないずれかのビヒクルであってもよい。ゲル配合物を得るために、液体組成物は典型的には局所的に適用されるために適切な粘度のゲルを形成するために水溶性多糖、ポリエチレングリコール、またはポリビニルピロリドンのような合成ポリマーの効果的な量と混合される。多糖は一般的にゲルの重量で1-90%、より好ましくは1-20%の範囲でゲル配合物中に存在する。使用されてもよい多糖は、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースを含むエーテル化されたセルロース誘導体のようなセルロース誘導体; デンプン及び分別されたデンプン、寒天; アルギン酸およびアルギナート、アラビアガム、プルラン、アガロース、カラギーナン、デキストラン、デキストリン、フルクタン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラビナン、キトサン、グリコーゲン、グルカン、および合成バイオポリマー、加えてキサンタンガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、トラガカントガム、およびカラヤガムのようなガム、並びにそれらの誘導体と混合物も含む。ここで好ましいゲル化剤は生物系に不活性、非毒性、調製するのが容易、流れすぎず又は粘性がありすぎないものであり、その中で保持されたオリゴヌクレオチドを脱安定化しないであろうものである。好ましくは多糖はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくはよく規定され、精製され、そしてUSPに列挙されているもの、例えばメチルセルロース及び、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいものはメチルセルロースである。
【００３８】
ゲル化に有効なポリエチレングリコールは典型的には適切な粘度を得るために低および高分子量のポリエチレングリコールの混合物である。例えば、400-600ダルトンの分子量のポリエチレングリコールと1500の分子量のものの混合物は、ペーストを得るための適切な割合で混合された時この目的のために効果的であろう。多糖とポリエチレングリコールに適用される用語"水溶性"はコロイド溶液及び分散液を含むことを意味される。一般的に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換度によって決定され、ここでの有用な安定化誘導体は誘導体を水溶性にするためにセルロース鎖中の無水グルコース単位当たりのそのようなエーテル基の十分な量を有するべきである。無水グルコース単位当たり少なくとも0.35エーテル基のエーテル置換度は一般的に十分である。付加的に、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばLi, Na, K, 又はCs塩の形態であってもよい。
【００３９】
好ましい実施態様において、ゲルは重量で約2-5%メチルセルロースを含み、オリゴヌクレオチドはゲルのml当たり約10-1000 μgの量で存在する。より好ましくは、ゲルは重量で約3%のメチルセルロース、pH 5.0までの乳酸、ml当たりオリゴヌクレオチドの20-200 μgからなる。
【００４０】
徐放性製剤の調製のために、オリゴヌクレオチドは好適に生分解性マトリックスまたはマイクロカプセル粒子に組み込まれる。ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブタン酸(EP 133,988A)のようなポリ(.アルファ.-ヒドロキシカルボン酸)の他のポリマーは使用され得るけれども、この目的のために適切な材料はポリラクチドである。追加の生分解性ポリマーは、ポリ(ラクトン)、ポリ(アセタール)、ポリ(オルトエステル)又はポリ(オルトカーボネート)を含む。オリゴヌクレオチドはまた、徐放特性を有する担体マトリックスを形成するためにコラーゲン、アテロコラーゲン、又はゼラチンのような生分解性タンパク質担体と好適に混合される; 結果の混合物はそれから乾燥され、乾燥した材料はU.S. Pat. No. 4,774,091に記載されているように適切な形に形成される。
【００４１】
ここでの最初の考慮は担体それ自身、又はその分解産物がターゲットの骨部位で非毒性であり状況をさらに悪化させないであろうことでなければならない。これはターゲットの骨疾患の動物モデル又は、もしそのようなモデルが利用できないなら、普通の動物でのルーチンスクリーニングによって測定され得る。徐放組成物の例は、U.S. Pat. No. 3,773,919, EP 58,481A, U.S. Pat. No. 3,887,699, EP 158,277A, Canadian Patent No. 1176565, U. Sidman et al., Biopolymers, 22:547 (1983), and R. Langer et al., Chem. Tech., 12:98 (1982)を参照。
【００４２】
1つの部位へのオリゴヌクレオチドの制御された送達はまた該部位に置かれたオリゴヌクレオチドを有する透過性の中空セルロースアセテートファイバーを使用して適切に達成され、24時間後に除去されるか又はより長い時間の間置いておかれる(U.S. Pat. No. 4,175,326)。また、アクリル樹脂片又はキャストフィルムはオリゴヌクレオチドで浸透され得、作用される部位に適用される。加えて、細い透析チューブはオリゴヌクレオチド溶液で満たすことができ、そして適切な部位にそれを運搬するように置かれる。
【００４３】
ここでの組成物はまた好適にIGF-I、IGF-beta 1、及びPDGFのような他の骨形成因子を含んでも良い。そのような骨形成因子は、意図された目的のため、すなわち骨の形成を促進するために有効な量で適切に存在する。
【００４４】
本発明は次の実施例への参照によってより良く理解されるであろう。それらは、しかしながら、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。すべての文献の引用は参考として援用される。
【実施例】
【００４５】
実施例1
材料と方法
次の材料と方法は一般的に実施例中で使用された。
1)オリゴヌクレオチド
ホスホロチオアートのヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドが購入され、Operon Technologies(Alameda, California)又はAnnovis(Aston, Pennsylvania)又はOligos Etc(Bethel, Maine)が提供している高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製された。ODNsは脱パイロジェン化された水に懸濁され、リムルス試験を使用してLPS汚染を分析されて使用されるまで-20℃で保存された。純度はHPLCおよびPAGEアッセイにより評価された。ODN調製物はLPSレベルが検出不能であるなら使用された。
2)動物実験
約350 gの体重の若い(8-12週齢)成体オスのスプラーグドーリー(Sprague Dawley)ラットが使用された。動物はケタミン(50 mg/kg)とキシラシン(xilacine)(5 mg/kg)の混合物の腹腔内注射(i.p.)によって麻酔された。その後、後肢を覆っている皮膚が剃られ、滅菌された。1.5 cmの縦の切開が脛骨の先頭帯において行われた。骨の欠損を発生させるために、骨切り術が生理食塩水の洗浄下で球形ダイヤモンドソーに取り付けられた低速度歯科用ドリルを使用して行われた。骨切り術のために、筋肉付着が無い部位が足関節より下15 mmで選択された。創傷は十分深いので骨髄まで届くことができた。メチルセルロース1%の3 μl中のODNの(各実験で述べられている)一回用量が右脛骨に作られた欠損部に導入された。コントロールとして、ビヒクルの同じ量(3 μl)が左脛骨に作られた欠損に導入された。骨折の仮骨形成は0、21及び28日に放射線撮影で(radiographically)評価された。28日目に動物はエーテル雰囲気下で安楽死させられ、脛骨は取り除かれて撮影された。この後、脛骨は10%ホルモール溶液で固定され、10%EDTA溶液中で脱灰され、パラフィンに埋め込まれた。各脛骨の縦の切片が切られ、ヘマトキシン/エオシンで染色され、光学顕微鏡下で検査された。
【００４６】
実施例2
オリゴヌクレオチドによる骨形成刺激
ラット大腿脛骨モデルは実施例1に記載されているように使用された。最初に、オリゴヌクレオチドの60 μgの欠損当たりの全用量が使用された。これらの実験で使用されたオリゴヌクレオチドはIMT504であった。このオリゴヌクレオチドは24ヌクレオチド長であり、そのヌクレオチド配列は5’-TCATCATTTTGTCATTTTGTCATT-3’であり、すべてのDNA(天然の)ホスホジエステル結合はそれを酵素分解から保護するためにホスホロチオアート結合で置き換えられている。実施例として、図1は実験ラットの両方の脛骨に対応するＸ線写真(radiographs)を示す。右脛骨で骨欠損がIMT504を加えたビヒクルで満たされている場所(were)では、該欠損を満たしている放射線高密度の(radiodense)物質が処置の開始後早くも3週間後に観察され得る。この処置された右脛骨では、該欠損は処置の開始後5週でもはや見えなくなる。一方で、未処置(コントロール)の左脛骨では欠損は5週まではっきり見ることができる。図2は、実験の骨切り術が実施された部位での右(IMT504で処置されたもの)と左(未処置)の脛骨の写真を示している。観察され得るように、処置された脛骨での欠損は明らかに通常の骨(bond)で完全に埋められているように見える一方、コントロールの脛骨の欠損は不完全な骨化に相当する多孔性物質で満たされている。相当する組織学的な証拠資料は図3で見られ得る。この図で処置された脛骨は骨切り術が実施された部位で十分に形成された骨組織を示す。反対に、未処置の脛骨では欠損はまだ見ることができる。
【００４７】
実施例3
骨形成誘導におけるODN濃度の影響(Efect)
急速な骨化を得るために必要なIMT504の最小量を評価するめに、ラット大腿脛骨モデルが実施例1に記載されているように使用された。表1は幾らかの活性が0.06 mg/mlと同じくらい低い濃度で観察されたけれども、IMT504の少なくとも0.4 mg/mlを含むゲルで骨切除部を満たすことが急速な骨化を得るために必要であることを示す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
実施例4
異なる組成を有するODNによる骨形成の誘導
免疫系の構成成分の数種は骨形成過程の調節で役割を演じる(Shinoda K, Sugiyama E, Taki H, Harada S, Mino T, Maruyama M, Kobayashi M. Resting T cells negatively regulate osteoclast generation from peripheral blood monocytes. Bone. 2003 Oct;33(4):711-20.; Evans DB, Bunning RA, Russell RG. The effects of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF) on human osteoblast-like cells. Biochem Biophys Res Commun. 1989 Apr 28;160(2):588-95; Fujikawa Y, Sabokbar A, Neale SD, Itonaga I, Torisu T, Athanasou NA. The effect of macrophage-colony stimulating factor and other humoral factors (interleukin-1, -3, -6, and -11, tumor necrosis factor-alpha, and granulocyte macrophage-colony stimulating factor) on human osteoclast formation from circulating cells. Bone. 2001 Mar;28(3):261-7.)。それゆえ、我々は骨形成過程における免疫賦活性ODNの異なる種類の影響を調査した。表2は骨形成の最良の刺激はPyNTTTTGTクラスの免疫賦活性ODNを使用して得られたことを示す(Elias F, Flo J, Lopez RA, Zorzopulos J, Montaner A, Rodriguez JM. Strong cytosine-guanosine-independent immunostimulation in humans and other primates by synthetic oligodeoxynucleotides with PyNTTTTGT motifs. J Immunol. 2003 Oct 1;171(7)3697-704.)。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
これらの結果は、強い免疫賦活活性を有するODNsは必ずしも骨形成の強い刺激物ではないことを示す。しかしながら、骨形成の最も活性のあるODNは強く免疫賦活性である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図1はプラセボ(A, B及びC)とIMT504処理(D, E及びF)骨の両方での、手術の7、21および35日後の、骨切り術部位でのラットの脛骨のＸ線撮影分析(X-ray radiographic analysis)を示す。
【図２】図2はプラセボ(A)及びIMT504処理(B)骨の両方で手術の35日後、骨切り術部位でのラットの脛骨の写真を示す。
【図３】図3はプラセボ(A)及びIMT504処理(B)骨の両方で手術の35日後、骨切り術部位でのラットの脛骨の顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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