(57)【要約】  本発明は、次のモノマー型ａ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーでない、２０℃で少なくとも１の水溶性を有するビニル重合可能なモノマー５〜４０質量％、ｂ）リガンドの求核基との反応で共有結合しうる、付加的な官能基を有するビニル重合可能なモノマー５〜５０質量％、ｃ）２個以上のエチレン系不飽和の重合可能な基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％からラジカル重合された、１０〜１０００μｍの平均粒径を有するマクロ孔質プラスチックパール材料に関し、このマクロ孔質プラスチックパール材料は、付加的にｄ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマー１〜２０質量％がポリマーのために使用されていることによって特徴付けられている。更に、本発明は、マクロ孔質プラスチックパール材料をモノマー相の逆懸濁重合によって製造する方法ならびに該マクロ孔質プラスチックパール材料の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のモノマー型
ａ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーでない、２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合可能なモノマー５〜４０質量％、
ｂ）リガンドの求核基との反応で共有結合しうる、付加的な官能基を有するビニル重合可能なモノマー５〜５０質量％、
ｃ）２個以上のエチレン系不飽和の重合可能な基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％からラジカル重合された、１０〜１０００μｍの平均粒径を有するマクロ孔質プラスチックパール材料において、付加的に
ｄ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマー１〜２０質量％をポリマーのために使用することを特徴とする、マクロ孔質プラスチックパール材料。
【請求項２】
モノマーｄ）がアルキル基中に第四アミノ基を有するアルキル（メタ）アクリレート、殊にトリメチルアンモニウムメチルメタクリレートまたはトリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリドである、請求項１記載のマクロ孔質プラスチックパール材料。
【請求項３】
マクロ孔質プラスチックパール材料が、１．５を上廻り２．５までの水中での膨潤数を有し、最大で０．１［モル／ｌ］の塩濃度の存在下でペニシリンアミダーゼ１５３０単位（Units）と担体ポリマー材料１ｇとの反応により生じる、少なくとも２００［Ｕ／ｇ湿分］のＥ．ｃｏｌｉからのペニシリンアミダーゼのための結合能力を有する、請求項１または２記載のマクロ孔質プラスチックパール材料。
【請求項４】
マクロ孔質プラスチックパール材料が次のモノマー：
ａ）アクリルアミドおよび／またはメタクリルアミド、
ｂ）グリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテル、
ｃ）Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドまたはＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミド、
ｄ）トリメチルアンモニウムメチルメタクリレートもしくは／またはトリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリドからなるコポリマーである、請求項１から３までのいずれか１項に記載のマクロ孔質プラスチックパール材料。
【請求項５】
マクロ孔質プラスチックパール材料が次のモノマー：
ａ）メタクリルアミド６〜１０質量％、
ｂ）グリシジルメタクリレート１６〜２０質量％およびアリルグリシジルエーテル１６〜２０質量％、
ｃ）Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミド４６〜５０質量％、
ｄ）トリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリド８〜１２質量％からなるポリマーであり、この場合成分は、１００質量％になるまで添加される、請求項４記載のマクロ孔質プラスチックパール材料。
【請求項６】
求核基を有するリガンドに対して結合活性を有する、パール状の架橋された親水性コポリマーを、モノマーおよび希釈剤からなるモノマー相の逆パール重合によって製造する方法において、モノマーとして、
ａ）室温で少なくとも１０％の水溶液を形成し、第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーでない、ビニル基を有するラジカル重合可能な親水性モノマー５〜４０質量％、
ｂ）リガンドの求核基との重合類似の反応で共有結合しうる、付加的な官能基およびビニル基を有するラジカル重合可能なモノマー５〜５０質量％、
ｃ）２個以上のエチレン系不飽和重合可能な基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％ならびに
ｄ）アルキル基中に第四アミノ基を有するアルキルメタクリレート−モノマー１〜２０質量％がコポリマーのために含有されており、
但し、この場合ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、１００質量％になるまで添加され、モノマーと希釈剤との比は、１：１．５〜１：２．５であり、希釈剤として１：１．０〜１：４．０の比のメタノールと水との混合物を使用し、
モノマー相を、５〜７個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素からなる有機溶剤からの連続相中に分配し、小液滴に変え、この場合モノマー相と連続相との比は、１：１．５〜１：４．０であり、この形で重合開始剤および保護コロイドの存在下でラジカル重合することを特徴とする、求核基を有するリガンドに対して結合活性を有する、パール状の架橋された親水性コポリマーを、モノマーおよび希釈剤からなるモノマー相の逆パール重合によって製造する方法。
【請求項７】
モノマーとして
ａ）アクリルアミドおよび／またはメタクリルアミド、
ｂ）グリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテル、
ｃ）Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドまたはＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミド、
ｄ）トリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリドを使用する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
有機溶剤としてシクロヘキサンを使用する、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
タンパク質を結合するための請求項１から５までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【請求項１０】
クロマトグラフィーにおける請求項１から５までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【請求項１１】
医薬品を合成するための請求項１から５までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【請求項１２】
エナンチオマー純粋の物質を取得する立体特異的合成のための請求項１から５までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【請求項１３】
酵素を結合するための請求項１から６までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【請求項１４】
抗体を結合するための請求項１から５までのいずれか１項に記載のプラスチックパール材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロ孔質プラスチックパール材料に関する。このプラスチックパール材料は、親水性の重合可能なビニル系モノマーからなる架橋されたコポリマーであり、求核基を有するリガンドに対して結合活性を有する。更に、本発明は、マクロ孔質プラスチックパール材料をモノマー相の逆懸濁重合によって製造する方法ならびに該マクロ孔質プラスチックパール材料の使用に関する。
【０００２】
背景技術
タンパク質、殊に酵素のための多孔質ポリマーの担持材料は、十分に公知である。使用分野は、例えばペニシリン−アシラーゼ（ペニシリンアミダーゼ）による６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）へのβ−ラクタム抗生物質、例えばペニシリンＧの酵素分解で医学的範囲にある。重要な開発目的は、特にできるだけ高い負荷容量にあるが、しかし、低い膨潤可能性ならびにできるだけ僅かな残留溶剤含量でもある。ハロゲン化された溶剤は、製造の際に原則的に避けられるべきである。
【０００３】
ドイツ連邦共和国特許出願公開第２２３７３１６号明細書には、パール状の架橋されたコポリマーを、ラジカル形成開始剤を含有し、生物学的物質に対して結合活性を有するモノマー、架橋性コモノマーおよび少なくとも1つの他のコモノマーを含有するモノマー混合物をラジカル重合させることによって製造する方法が記載されており、この場合このモノマー混合物は、非極性の有機液体中に懸濁され、小液滴に変わり、重合される。非極性の有機液体として、殊に脂肪族炭化水素、なかんずく６個以上のＣ原子を有する脂肪族炭化水素が適している。実施例においては、ｎ−ヘプタンとペルクロロエチレンとの混合物が使用される。モノマー相と連続的有機相との比は、１：１〜１：１０であるが、しかし、１：１．５〜１：４の比が好ましい。
【０００４】
ドイツ連邦共和国特許出願公開第３１０６４５６号明細書には、ドイツ連邦共和国特許出願公開第２２３７３１６号明細書と比較してポリマーパールの結合能力に関連して改善された方法が記載されている。担体ポリマーが架橋性モノマーの高い含量を有する場合およびモノマーと架橋剤とから形成されたモノマー相が溶剤混合物を希釈剤として含有する場合には、タンパク質、殊に酵素ペニシリン−アシラーゼ（ペニシリンアミダーゼ）のための特に高い結合能力が得られる。適した混合物は、例えば水／メタノールまたはホルムアミド／メタノールであることができる。モノマーおよび希釈剤は、例えば１：２．６の比で存在する。連続的有機相のためには、ｎ−ヘキサンとペルクロロエチレンとの混合物が使用される。モノマー相と連続的有機相との比は、実施例では約１：２．８である。モノマー混合物中で５０質量％の架橋剤含量および希釈剤としての水／メタノールの使用の場合には、１２５Ｕ／ｇまでのペニシリン−アシラーゼ活性として計算された結合能力を有する担体ポリマーを得ることができる。
【０００５】
ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０４０２１号明細書Ａ１には、本発明とは異なり事後にエポキシ基が導入されるようなマクロ孔質パールポリマーが記載されている。特に記載される、ペニシリン−アシラーゼでの負荷量は、本発明による方法と比較可能である。吸引漏斗湿潤材料に対する比較的高い結合能力が達成される。乾燥質量に対してそれぞれ同様に記載される値を考慮した場合には、間接的に膨潤数が算出される（Ｕ／ｇ湿分／Ｕ／ｇ乾燥分）。この場合に得られた値は、約３．０の範囲にある。ドイツ連邦共和国特許第１９８０４５１８号明細書には、アクリレートをベースとするパール状コポリマーの製造法、この方法により製造された担体ポリマー材料および該材料の使用が記載されている。この担体ポリマー材料は、なかんずく少なくとも２２０［Ｕ／ｇ湿分］のペニシリン−アシラーゼのための結合能力および同時に最大で１．５の低い膨潤数を示す。
【０００６】
欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書Ａ１には、酵素の不動態化のためにエポキシ基を含有する結合活性の担持材料が記載されている。記載された担持材料は、酵素が既に低いイオン強度の際に共有結合されていてよいという利点を提供する。官能性は、エポキシ基を有する担体パール材料の場合に表面上でエポキシ基の一部分が事後に種々の試薬と反応されるような方法において達成される。こうして付加的なアミノ基が生じ、このアミノ基は、酵素の結合を低いイオン強度の際に環境媒体中で有利にする。
【０００７】
課題および解決手段
ドイツ連邦共和国特許第１９８０４５１８号明細書Ｃ２には、アクリレートをベースとするパール状コポリマーの製造法およびこの方法により製造された、優れた性質、殊にペニシリンアミダーゼのための高い結合能力および同時に低い膨潤数を有する担体ポリマー材料が記載されている。この担体ポリマー材料の欠点は、バイオマクロ分子を比較的高いイオン強度で共有結合しなければならないことにある。
【０００８】
この欠点は、なかんずくこの場合に生じる排水が高い塩含量のために環境汚染をまねくことにある。また、不動態化すべきバイオマクロ分子は、部分的に高い塩含量によって巻き添えにされうるかまたは変性されうる。
【０００９】
欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書Ａ１には、表面上にエポキシ基を有する担体ポリマー材料から出発してエポキシ基の一部分を事後に種々の試薬と反応させることにより、前記問題を解決することが提案されている。こうして付加的なアミノ基が生じ、このアミノ基は、酵素の結合を低いイオン強度の際に環境媒体中で有利にする。この方法は、費用がかかり、それによって担体ポリマー材料の製造価格を上昇させるという欠点を有する。
【００１０】
ドイツ連邦共和国特許第１９８０４５１８号明細書の記載から出発して、比較的低いイオン強度の際にバイオマクロ分子の共有結合を可能にするマクロ孔質プラスチックパール材料が提供される。この場合、欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書Ａ１中に記載されているような費用のかかる事後の変性は、回避されるべきであった。同時に、膨潤数は、２．５以下のなお受け入れ可能な値を有するべきである。
【００１１】
この課題は、次のモノマー型
ａ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーでない、２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合可能なモノマー５〜４０質量％、
ｂ）リガンドの求核基との反応で共有結合しうる、付加的な官能基を有するビニル重合可能なモノマー５〜５０質量％、
ｃ）２個以上のエチレン系不飽和の重合可能な基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％
からラジカル重合された、１０〜１０００μｍの平均粒径を有するマクロ孔質プラスチックパール材料によって解決され、このマクロ孔質プラスチックパール材料は、付加的に
ｄ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマー１〜２０質量％をポリマーのために使用することによって特徴付けられる。
【００１２】
発明の実施態様
モノマー
モノマー混合物の親水性を保証するために、このモノマー混合物の主要部分は、親水性モノマーから形成されていなければならない。親水性モノマーは、室温で少なくとも１０％の水溶液を形成し、特にイオン性基を含有しないかまたは酸または塩基の添加によってイオン化可能な基を含有するようなモノマーである。
【００１３】
モノマーａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、それぞれ添加されて１００質量％になる。
【００１４】
モノマーａ）
モノマーａ）は、室温で少なくとも１０％の水溶液を形成する、ビニル基を有する親水性のビニル重合可能なモノマー５〜４０質量％、有利に５〜２０質量％、殊に６〜１０質量％である。モノマーａ）は、第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーではない。従って、モノマーａ）は、モノマーｄ）とは常に異なる。
【００１５】
モノマーａ）としては、殊にアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミドが適しており、この場合には、メタクリルアミドが好ましい。他の例は、重合可能な不飽和カルボン酸のヒドロキシルアルキルエステル、例えばヒドロキシエチルアクリレートおよびヒドロキシエチルメタクリレートまたはＮ−ビニルピロリドンである。
【００１６】
モノマーｂ）
モノマーｂ）は、リガンドの求核基とのポリマー類似の反応で共有結合しうる、ビニル基および付加的な官能基、有利にオキシラン基（エポキシ基）を有するラジカル重合可能なモノマー５〜５０質量％、有利に３２〜４０質量％である。殊に、オキシラン基は、リガンドを生物活性の維持下に結合するのに適している。
【００１７】
好ましいモノマーｂ）は、グリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテルである。特に有利には、同時に２つのモノマーがほぼ同量で使用され、したがってこれら２つのモノマーは、一緒になって３０〜５０質量％、有利に３２〜４０質量％の含量を生じる。
【００１８】
モノマーｃ）
モノマーｃ）は、２個以上の重合可能なエチレン系不飽和基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％、殊に２５〜５５質量％、特に有利に４０〜５５質量％である。好ましいモノマーｃ）は、Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドまたはＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミドである。Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミドは、特に好ましい。場合によっては、２個以上の重合可能なエチレン系不飽和基を有する他のラジカル重合可能な架橋性モノマー０〜１０質量％が使用されてもよい。親水性のジ（メタ）アクリレート、例えばポリエチレンオキシド−ジ（メタ）アクリレートが適している。
【００１９】
モノマーｄ）
モノマーｄ）は、第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマー、有利にアルキル基中に第四アミノ基を有するアルキル（メタ）アクリレートモノマー１〜２０質量％、有利に５〜１５質量％、殊に８〜１２質量％である。モノマーｄ）は、有利にトリメチルアンモニウムメチルメタクリレートまたはトリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリドである。
【００２０】
好ましいモノマー組成物
マクロ孔質プラスチックパール材料は、有利に次のモノマー：
ａ）アクリルアミドおよび／またはメタクリルアミド、
ｂ）グリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテル、
ｃ）Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドまたはＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミド、
ｄ）トリメチルアンモニウムメチルメタクリレートもしくは／またはトリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリドからなるコポリマーである。
【００２１】
特に好ましい組成物は、次のもの：
ａ）メタクリルアミド６〜１０質量％、
ｂ）グリシジルメタクリレート１６〜２０質量％およびアリルグリシジルエーテル１６〜２０質量％、
ｃ）Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミド４６〜５０質量％、
ｄ）トリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリド８〜１２質量％からなり、この場合モノマー型ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の５つの記載されたモノマーの含量は、１００質量％になるまで添加される。
【００２２】
コポリマーの製造法
本方法は、ドイツ連邦共和国特許第１９８０４５１８号明細書Ｃ２の記載に相当し、但し、この場合モノマーｄ）は、モノマー混合物の強制的に必要とされる成分である。
【００２３】
従って、本発明は、求核基を有するリガンドに対して結合活性を有する、パール状の架橋された親水性コポリマーを、モノマーおよび希釈剤からなるモノマー相の自体公知の逆パール重合によって製造する方法に関し、この場合モノマーとして、
ａ）室温で少なくとも１０％の水溶液を形成し、第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーでない、ビニル基を有するラジカル重合可能な親水性モノマー５〜４０質量％、
ｂ）リガンドの求核基との重合類似の反応で共有結合しうる、付加的な官能基およびビニル基を有するラジカル重合可能なモノマー５〜５０質量％、
ｃ）２個以上のエチレン系不飽和の重合可能な基を有する親水性で架橋性のラジカル重合可能なモノマー２０〜６０質量％ならびに
ｄ）第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマー１〜２０質量％がコポリマーのために含有されており、
但し、この場合ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、１００質量％になるまで添加され、モノマーと希釈剤との比は、１：１，５〜１：２．５、有利に１：１．７〜１：２．３であり、希釈剤としてメタノールと水との混合物は、１：１．０〜１：４．０の比で使用され、この場合モノマー相は、５〜７個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素からなる有機溶剤からの連続相中に分配され、小液滴に変わり、この場合モノマー相と連続相との比は、１：１．５〜１：４．０、有利に１：２．０〜１：３．０であり、この形で重合開始剤および保護コロイドの存在下でラジカル重合される。
【００２４】
希釈剤
モノマー相は、モノマーａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）からなり、該モノマーは、１：１．０〜１：４．０の比でのメタノールと水との混合物でなければならない希釈剤中に溶解されている。メタノールおよび水のための特に好ましい混合比は、１：１．２〜１：２．５、殊に１：１．３〜１：１．７である。
【００２５】
モノマーと希釈剤との比
モノマーと希釈剤との比は、特に重要である。この比は、１：１．５〜１：２．５の範囲内、有利に１：１．７〜１：２．３、特に有利に１．９〜２．１の範囲内でなければならない。
【００２６】
連続相
連続相として、４〜７個のＣ原子を有する脂肪族炭化水素である有機溶剤は、適している。好ましいのは、ｎ−ヘプタンであり、特に好ましいのは、シクロヘキサンである。
【００２７】
モノマー相／連続相の比
モノマー相と有機溶剤によって形成された連続相との比は、１：１．５〜１：４．０、有利に１：２．０〜１：３．０でなければならない。
【００２８】
他の処理条件
他の成分として、懸濁されたモノマー相は、自体公知の重合開始剤中に含有され、好ましくは、硫黄不含の開始剤であり、特に好ましくは、４，４′−アゾビス−（４−吉草酸）、ならびに保護コロイド（乳化剤）、例えば３００００〜８００００の分子量（質量平均）を有する、ｎ−ブチルメタクリレート９５部と２−トリメチルアンモニウムエチルメタクリレート−クロリド５部とのコポリマーである。
【００２９】
パール重合（懸濁重合とも呼称される）は、いずれにせよ、公知方法で、例えば連続相に保護コロイドを装入し、開始剤も存在するモノマー相を攪拌しながら、例えば４０〜６０℃で有機相中に分配し、引続き６０〜７０℃に加熱することにより実施される。水／メタノール混合物は、例えば６時間に亘って殆んど完全に共沸的に遠心分離されうる。このバッチ量を約３〜５時間、終結するまで反応させ、引続き室温に冷却する。生じたパールは、吸引され、例えば１２時間、真空中で乾燥される。そのために選択的に、パールポリマーは、濾別されてもよく、水で洗浄されてもよく、次に水湿潤状態で使用されてもよいし、乾燥されてもよい。好ましくは、乾燥は、渦動層乾燥器中で行なわれ、それというのも、こうして溶剤残基は、特に効果的に除去させることができるからである。得られたポリマーパール（＝担体ポリマー材料）は、５０〜５００μｍ、殊に１２０〜２５０μｍの範囲内の寸法を有する。
【００３０】
結合能力
本発明による担体ポリマー材料の重要な使用分野は、Ｅ．ｃｏｌｉからの結合されたペニシリンアミダーゼを用いての６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）へのペニシリンＧの分解である。
【００３１】
結合能力は、一定の酵素を用いての担体ポリマー材料の最大の負荷で達成されるような酵素活性である。結合能力は、担体ポリマーパール１ｇ当たりの単位でペニシリンアミダーゼ活性として表現される［Ｕ／ｇ湿分］。本発明による担体ポリマーパールの結合能力は、この測定法の場合に少なくとも２００［Ｕ／ｇ湿分］である。
【００３２】
本発明によるマクロ孔質プラスチックパール材料は、最大で０．１［モル／ｌ］、有利に最大で０．０５［モル／ｌ］の塩濃度の存在下でペニシリンアミダーゼ１５３０単位（Units）と担体ポリマー材料１ｇとの反応により生じる、少なくとも２００［Ｕ／ｇ湿分］のＥ．ｃｏｌｉからのペニシリンアミダーゼのための結合能力を有する。塩濃度は、場合によっては酵素溶液中に存在する塩および不動態化に添加される、不動態化混合物中の塩または緩衝塩から計算により測定される。
【００３３】
方法
種々の塩濃度の際のペニシリンアミダーゼのための結合能力の測定
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＣ 3.5.1.11）からのペニシリンアミダーゼ（＝ペニシリンＧ−アシラーゼ）のための結合能力の測定
ａ）担体ポリマー材料へのペニシリンアミダーゼの共有結合
担体ポリマー材料１ｇは、滅菌された燐酸カリウム緩衝液５ｍｌ  ｐＨ値７．５中のペニシリンアミダーゼ１５３０単位に添加され、２３℃で４８時間、恒温保持される。
【００３４】
引続き、ポリマーパールは、焼結されたガラス（多孔性２または３）からなるフリット上に置かれ、２回脱塩水および引続き２回エチル−４−ヒドロキシベンゾエート０．０５％を含有する０．１Ｍの燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５でフリット上での吸引により洗浄される。得られた、ペニシリンアミダーゼで負荷されたパールの湿分含量は、測定される。
【００３５】
ｂ）結合能力の測定
ペニシリンアミダーゼと結合された湿った担体ポリマー材料４００〜７００ｍｇ（ポリマーパール）は、エチル−４−ヒドロキシベンゾエート０．０５％を含有する、０．０５Ｍの燐酸カリウム緩衝液ｐＨ値７．５中の２％のペニシリンＧ溶液３０ｍｌ中に３７℃で添加される。
【００３６】
均一に攪拌しながら、遊離されたフェニル酢酸は、０．５ＭのＮａＯＨで７．８の一定のｐＨ値で４分間滴定され、この場合ＮａＯＨの使用量が記録される。
【００３７】
引続き、ポリマーパールは、ａ）項の記載と同様にガラスフリット上で脱イオン水２０ｍｌが吸収されることにより取得される。
【００３８】
ｃ）結合能力の計算
測定曲線（通常、１〜３分間の範囲）の線状範囲は、計算に基づくものである。結合能力は、湿潤した担体ポリマー材料１ｇ当たりのペニシリンアミダーゼの単位（Ｕ／ｇ湿分）として記載される。１つの単位は、１分間当たりの加水分解されたペニシリンＧ  μｍｏｌに相当し（μｍｏｌ／分）；
この場合、０．５ＭのＮａＯＨ  １ｌは、加水分解されたペニシリンＧ５００μｍｏｌと等価である。（担体ポリマー材料の含水量は、ほぼ一定であり、したがって無視されてよい。）
［％］でのペニシリンアミダーゼ結合収率の測定
ペニシリンアミダーゼ（ＰｃＡ）結合収率の計算は、次式により行なわれる：
ＰｃＡ結合収率［％］＝Ａ［Ｕ／ｇ］×Ｆ［ｇ］×１００／ＰｃＡ［Ｕ］
Ａ＝不動態化された活性ＰｃＡ／ｇ湿潤された不動態化物、
Ｆ＝湿潤収率＝ポリマー担体１ｇの湿潤質量−乾燥物質、
ＰｃＡ＝ポリマー担体１ｇ当たりのＰｃＡの使用された単位−乾燥物質。
【００３９】
膨潤数
水中のポリマーパールの膨潤性は、膨潤数によって表わされる［ｍｌ湿分／ｍｌ乾燥分］。本発明によるマクロ孔質プラスチックパール材料は、１．５を上廻り２．５まで、有利に１．７ないし２．３の水中での膨潤数を有する。
【００４０】
従って、膨潤数は、ドイツ連邦共和国特許第１９８０４５１８号明細書Ｃ２に記載のプラスチックパール材料（１．５未満）より高く、ドイツ連邦共和国特許出願公開第３４０４０２１号明細書Ａ１に記載のプラスチックパール材料（約３．０）より低い。
【００４１】
膨潤数の測定［ｍｌ湿分／ｍｌ乾燥分］
ポリマー担体乾燥材料１ｇは、測定シリンダー２５ｍｌ中に計量供給される。ｍｌでの充填高さは、測定される（＝乾燥容量）。引続き、この測定シリンダーは、０．０１％ポリソルバート（Polysorbat）８０水溶液で２／３に充填される。この測定シリンダーは、６回１０分間間隔で振盪される。壁に懸吊されているパールをポリソルバート（Polysorbat）８０水溶液で後方から濯ぐ。３時間後、測定シリンダーの底面に沈殿したポリマー担体湿潤材料の湿潤容積をｍｌで読取る。湿潤容積／乾燥容積からの商から膨潤数が判明する。
【００４２】
使用
本発明による担体ポリマー材料は、存在するオキシラン基を用いて攪拌型反応器または貫流型反応器中でリガンドの共有結合のために使用されることができる。これは、例えばタンパク質、殊に酵素を濃厚な溶液から共有結合を介して生物学的活性を維持しながら付着させることによって行なうことができる。更に、ペプチド、アミノ酸、β−ラクタム抗生物質、脂質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子量求核性化合物または金属有機化合物は、担体パールのオキシラン基と反応されてもよい。
【００４３】
リガンドで負荷されたポリマーパールは、自体公知の方法でキラル物質、例えばアミノ酸（Ｄ−フェニルアラニン、ｐ−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−ｔ−ロイシン）または医薬品、例えばイブプロフェン（Ibuprofen）の立体特異的合成に使用されてよい。同様に、前記ポリマーパールは、担体として６−アミノペニシリナン酸（６−ＡＰＡ）へのペニシリンＧの酵素分解、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）へのセファロスポリンＧの酵素分解または７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）へのセファロスポリンＣの酵素分解に使用される。この方法は、ＤＥＣＨＥＭＡ１９９６年議事録−要約、第１巻、DECHEMA e.V.社刊中に記載されている。
【００４４】
更に、使用分野は、アモキシリンおよびアンピシリンへの基質、例えば上記分解生成物の特殊な酵素合成である。
【００４５】
もう１つの使用分野は、ファインケミカルズまたは化学合成（例えば、リンゴ酸、マレート）のための基本生成物の合成である。他の使用は、担体固定されたβ−ガラクトシダーゼでのラクトースの加水分解および担体固定されたカタラーゼでの過酸化水素の分解である。前記ポリマーパールは、吸着クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーのための分離技術に使用されてもよい。特殊な吸着のために、ポリマーパールは、抗血清からの免疫グロブリン画分またはモノクロナール抗体で負荷されることができる。他の使用分野として、病原性物質または毒性物質が全血から除去される体外治療における、酵素または抗体が負荷された、吸着剤としての担体ポリマー材料の使用を挙げることができる。
【００４６】
本発明によるマクロ孔質プラスチックパール材料は、殊に次のものに使用されることができる：
タンパク質の結合のため、
クロマトグラフィーにおいて、
医薬品の合成のため、
エナンチオマー純粋の物質を取得するための立体特異的合成のため、
酵素の結合のため、
抗体の結合のため。
【００４７】
本発明の有利な作用
本発明によるマクロ孔質プラスチックパール材料は、第四アミノ基を有するビニル重合可能なモノマーに基づいてリガンド、例えば酵素の物理的吸着を不動態化混合物のｐＨ値とは無関係にイオン交換作用により可能にする。欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書Ａ１とは異なり、プラスチックパール材料の製造は、ポリマーの後処理なしに一工程で可能である。しかし、リガンドは、欧州特許出願公開第１３５２９５７号明細書Ａ１の材料の場合と同様に既に極めて低い塩含量で良好な収率で共有結合されていることができる。第四アミノ基を有するビニル重合可能な親水性モノマーの導入にも拘わらず、プラスチックパール材料の膨潤数は、受け入れ可能な範囲内にある。
【００４８】
実施例
方法
種々の塩濃度の際のペニシリンアミダーゼのための結合能力の測定
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＣ 3.5.1.11）からのペニシリンアミダーゼ（＝ペニシリンＧ−アシラーゼ）のための結合能力の測定
ａ）担体ポリマー材料へのペニシリンアミダーゼの共有結合
担体ポリマー材料１ｇは、滅菌された燐酸カリウム緩衝液５ｍｌ  ｐＨ値７．５中のペニシリンアミダーゼ１５３０単位に添加され、２３℃で４８時間、恒温保持される。
【００４９】
引続き、ポリマーパールは、焼結されたガラス（多孔性２または３）からなるフリット上に置かれ、２回脱塩水および引続き２回エチル−４−ヒドロキシベンゾエート０．０５％を含有する０．１Ｍの燐酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５でフリット上での吸引により洗浄される。得られた、ペニシリンアミダーゼで負荷されたパールの湿分含量は、測定される。
【００５０】
ｂ）結合能力の測定
ペニシリンアミダーゼと結合された湿った担体ポリマー材料４００〜７００ｍｇ（ポリマーパール）は、エチル−４−ヒドロキシベンゾエート０．０５％を含有する、０．０５Ｍの燐酸カリウム緩衝液ｐＨ値７．５中の２％のペニシリンＧ溶液３０ｍｌ中に３７℃で添加される。
【００５１】
均一に攪拌しながら、遊離されたフェニル酢酸は、０．５ＭのＮａＯＨで７．８の一定のｐＨ値で４分間滴定され、この場合ＮａＯＨの使用量が記録される。
【００５２】
引続き、ポリマーパールは、ａ）項の記載と同様にガラスフリット上で脱イオン水２０ｍｌが吸収されることにより取得される。
【００５３】
ｃ）結合能力の計算
測定曲線（通常、１〜３分間の範囲）の線状範囲は、計算に基づくものである。結合能力は、湿潤した担体ポリマー材料１ｇ当たりのペニシリンアミダーゼの単位（Ｕ／ｇ湿分）として記載される。１つの単位は、１分間当たりの加水分解されたペニシリンＧ  μｍｏｌに相当し（μｍｏｌ／分）；
この場合、０．５ＭのＮａＯＨ  １ｌは、加水分解されたペニシリンＧ５００μｍｏｌと等価である。（担体ポリマー材料の含水量は、ほぼ一定であり、したがって無視されてよい。）
［％］でのペニシリンアミダーゼ結合収率の測定
ペニシリンアミダーゼ（ＰｃＡ）結合収率の計算は、次式により行なわれる：
ＰｃＡ結合収率［％］＝Ａ［Ｕ／ｇ］×Ｆ［ｇ］×１００／ＰｃＡ［Ｕ］
Ａ＝不動態化された活性ＰｃＡ／ｇ湿潤された不動態化物、
Ｆ＝湿潤収率＝ポリマー担体１ｇの湿潤質量−乾燥物質、
ＰｃＡ＝ポリマー担体１ｇ当たりのＰｃＡの使用された単位−乾燥物質。
【００５４】
膨潤数の測定［ｍｌ湿分／ｍｌ乾燥分］
ポリマー担体乾燥材料１ｇは、測定シリンダー２５ｍｌ中に計量供給される。ｍｌでの充填高さは、測定される（＝乾燥容量）。引続き、この測定シリンダーは、０．０１％Polysorbat 80水溶液で２／３に充填される。この測定シリンダーは、６回１０分間間隔で振盪される。壁に懸吊されているパールをポリソルバート（Polysorbat）８０水溶液で後方から濯ぐ。３時間後、測定シリンダーの底面に沈殿したポリマー担体湿潤材料の湿潤容積をｍｌで読取る。湿潤容積／乾燥容積からの商から膨潤数が判明する。
【００５５】
実施例１〜３
実施例１〜３で一致する試験条件：
温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた２  ｌの攪拌型フラスコ中に、有機溶剤およびｎ−ブチルメタクリレート９５部と保護コロイドとしての２−トリメチルアンモニウムメチルメタクリレート−クロリド５部とのコポリマー３ｇを装入する。
【００５６】
攪拌しながら窒素の貫流下に５０℃で希釈剤と第１表中に記載されたモノマー混合物１００ｇと４，４′−アゾビス−４−シアノ吉草酸２ｇ（重合開始剤として）とからなるモノマー相を有機相中に分配し、引続き６５〜７０℃で沸騰加熱する。このバッチ量を約６時間攪拌し、引続き室温に冷却する。生じたポリマーパールを吸引し、洗浄し、かつ渦動層乾燥器中で乾燥する。引続き、ペニシリンアミダーゼのための結合能力［Ｕ／ｇ湿分］を種々の塩濃度の際に測定し、結合収率および膨潤数［ｍｌ湿分／ｍｌ乾燥分］を測定する。結果は、第２表中に記載されている。
【００５７】
【表１】
2008530280.tif 000002
【００５８】
【表２】
2008530280.tif 000003
【国際調査報告】
2008530280.tif 000004
2008530280.tif 000005
2008530280.tif 000006
2008530280.tif 000007