(57)【要約】  患者のリンパ腫の存在を判定するための方法を開示する。患者から採取した骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、リンパ液および／または又はリンパ球のサンプルは、CDK9および／またはCYCLIN T1の発現を測定するためにアッセイされる。CDK9及び/又はCYCLIN T1の存在によって、患者における、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫以外のリンパ腫を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫のいずれでもないリンパ腫の存在を判定するための方法であって、該方法は、CDK9タンパク質又はCYCLIN T1タンパク質の発現を測定するために被験体のリンパ系から採取したサンプルのアッセイを含み、サンプル中のCDK9タンパク質又はCYCLIN T1タンパク質の存在は、被験体における該リンパ腫の存在を示す、前記方法。
【請求項２】
前記サンプルが、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、リンパ液又はリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リンパ腫が、前駆T細胞、前駆B細胞、胚中心細胞、活性化T細胞又はリード・シュテルンベルク（Reed-Sternberg）細胞におけるCDK9及びCYCLIN T1の発現から生じるリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫のいずれでもないリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リンパ腫が前駆B細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リンパ腫が前駆T細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ腫が濾胞性リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リンパ腫がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リンパ腫がバーキットリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンパ腫が古典的ホジキンリンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンパ腫が未分化大細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンパ腫が末梢T細胞リンパ腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、1つ以上の選択された抗体を用いたサンプルの免疫表現型検査、免疫ブロット、免疫組織化学又は免疫蛍光顕微鏡検査を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト患者中のリンパ腫の存在を判定するための方法であって、該方法は、CDK9及びCYCLIN T1のmRNAレベルを測定するためにヒト患者のリンパ系から採取したサンプルをアッセイすることを含み、CYCLIN T1と比較して増大したレベルのCDK9を伴うCDK9/CYCLIN T1 mRNA比の不均衡はリンパ腫を示す、前記方法。
【請求項１５】
前記リンパ腫が、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、リンパ液又はリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンパ腫が、前駆T細胞、前駆B細胞、胚中心細胞、活性化T細胞又はリード・シュテルンベルク細胞におけるCDK9及びCYCLIN T1の発現から生じるリンパ腫である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性リンパ球又はリンパ腫におけるCDK9及びCYCLIN T1の発現パターン、並びにCDK9及びCYCLIN T1の発現に基づく、リンパ腫の診断方法又は自己骨髄における潜在性腫瘍混入の同定方法、並びにリンパ腫の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ系は、リンパ液と呼ばれる水様の透明な体液を循環器系と相互作用して全身に輸送する、臓器及び結節の網状組織である。リンパ液は、リンパ球と呼ばれる細胞を含む。リンパ球には大きく分けてB細胞とT細胞の2種類がある。B細胞は骨髄中の幹細胞から生じ、骨髄中でその構造的成長（分化）及び成熟を完了する。T細胞も骨髄より生じるが、胸腺で分化及び成熟する。B細胞及びT細胞のリンパ球は、血流によりこれらの臓器から出る。その後リンパ球は体の異なる部分へ移動し、各段階で固有の機能を果たす。
【０００３】
リンパ腫は、リンパ球が悪性化する場合に生じる、関連している癌の一群である。細胞が悪性化すると、その成熟段階は停止し、リンパ球が悪性化すると、その発生段階がリンパ腫の特定の種類を決定する。異なるサブタイプ及び異なる成熟段階のリンパ球が存在するため、異なる種類のリンパ腫が存在する。リンパ腫は通常、2つのグループ：古典的ホジキンリンパ腫（ホジキン病）と非ホジキンリンパ腫とに細分される。正常細胞と同様に、悪性リンパ球は身体の多くの部分に移動することができる。
【０００４】
リンパ腫は診断するのが困難であり、現在は、単独の検査でリンパ腫の診断を確立するのは不十分である。それどころか現在の臨床診療では、病理学者が正常なリンパ節の構造及び細胞特性における変化を探すことに携わっている。リンパ腫を評価するのに用いられる他の方法としては、血液検査、X線、コンピュータ断層撮影（CTスキャン）、磁気共鳴映像法(MRI)及び骨髄生検が挙げられる。
【０００５】
リンパ腫を含む多くの癌は、様々な悪性細胞における特定分子の固有の分子特性又は不適切な発現(例えば、濾胞性リンパ腫に見られるbcl-2遺伝子の再配列)によって特徴付けされる。そのため、これらの分子は特定の癌又はリンパ腫のマーカーとしての役割を果たす。使用する方法に関係なく、特定のリンパ腫の存在を正確に判定する能力は、リンパ腫の正確な診断及び安全で有効な治療のために極めて有用である。リンパ細胞の分化又は活性化の特定の段階で発現する分子の同定は、様々なリンパ腫の診断及び治療において、有用なマーカーとしての役割を果たすことができる。
【非特許文献１】Granaら、1994, Proc Natl Acad Sci U S A,  91:3834-3838
【非特許文献２】Fuら, 1999, J Biol Chem, 274:34527-34530
【非特許文献３】Pengら, 1998, Genes Dev, 12:755-762
【非特許文献４】Herrmannら, 1998, J Virol, 72:9881-9888
【非特許文献５】Simoneら, 2002, Oncogene, 21:4137-4148
【非特許文献６】De Falcoら, 2002, Cancer Biol Ther, 1:342-347
【非特許文献７】Herrmannら, 1998, J Virol, 72:9881-9888
【非特許文献８】MacLachlanら, 1998, J Cell Biochem, 71:467-478
【非特許文献９】Sanoら, 2002, Nat Med, 8:1310-1317
【非特許文献１０】Napolitanoら, 2002, J Cell Physiol, 192:209-215
【非特許文献１１】Herrmannら, 2001, J Cell Sci, 114(Pt8): 1491-1503
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、様々な悪性リンパ球及びリンパ腫において、CDK9及びCYCLIN T1の両方が発現していることを開示する。1つの態様において、本発明は、前駆B細胞及び前駆T細胞においてCDK9タンパク質及びCYCLIN T1タンパク質の両方が発現していることを開示する。末梢リンパ組織においては、濾胞間領域中の胚中心細胞並びに散在性B細胞芽球及び散在性T細胞芽球はCDK9/CYCLIN T1を発現するが、マントル細胞、プラズマ細胞及び小休止Tリンパ球はいずれの分子の発現も示さない。従って本発明は、CDK9/CYCLIN T1発現がリンパの分化/活性化の特定の段階にこのように関連していることを開示する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、悪性リンパ腫におけるCDK9とCYCLIN T1との複合体が、前駆B細胞及び前駆T細胞、濾胞性リンパ腫などの胚中心細胞、活性化T細胞(すなわち、未分化大細胞リンパ腫)、並びに古典的ホジキンリンパ腫のホジキン細胞及びリード・シュテルンベルク（Reed-Strnberg）細胞から生じるリンパ腫において高発現していることを開示する。びまん性大細胞型B細胞、バーキットリンパ腫及び末梢T細胞リンパ腫(T細胞リンパ増殖障害)は広範な値を示した。マントル細胞及び辺縁帯リンパ腫ではCDK9/CYCLIN T1の発現は見られない。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は、CDK9/CYCLIN T1 mRNA比の不均衡を特定のリンパ腫の診断に用いることができることを開示する。この不均衡は、CYCLIN T1のmRNAと比べてCDK9のmRNAが過剰発現していることに起因する。具体的には、反応性リンパ節との比較において、RNAレベルでのCDK9/CYCLIN T1比の不均衡は、濾胞性リンパ腫、胚中心の表現型を有するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫、並びに古典的ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫及び未分化大細胞リンパ腫の細胞株に見られる。
【０００９】
従って、本発明の実施形態において、ヒト患者中の、マントル細胞リンパ腫又は辺縁帯リンパ腫のいずれでもないリンパ腫の存在を判定するための方法が提供される。この判定方法は、CDK9タンパク質及び/又はCYCLIN T1タンパク質の発現を測定するために患者のリンパ系から採取したサンプル（例えば骨髄、胸腺、脾臓、リンパ節、リンパ液又はリンパ球）をアッセイすることを要とする。サンプル中のCDK9タンパク質及び/又はCYCLIN T1タンパク質の存在は、患者中のリンパ腫の存在を示唆する。リンパ腫は、前駆T細胞、前駆B細胞、胚中心細胞、活性化T細胞又はリード・シュテルンベルク細胞（極めて大型の異常B細胞）におけるCDK9及びCYCLIN T1の発現に起因するリンパ腫である。
【００１０】
別の実施形態において、リンパ腫に罹患している患者の臨床成績(化学療法後及び/又は放射線療法後）の評価方法が提供される。この方法は、患者から得た臨床検体の細胞におけるCDK9及び/又はCYCLIN T1発現レベルの計測、並びにその発現レベルを一連の参照発現レベル(例えば、正常な、非悪性リンパ球の発現レベル又は健常人の扁桃腺細胞における発現レベル)に対して比較することを含み、ここでCDK9及び/又はCYCLIN T1の発現レベルの増減は患者の臨床成績を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、リンパ組織におけるCDK9とCYCLIN T1の発現を解析することによる癌の存在を判定するための方法に関する。
【００１２】
CDK9は、CDC2様キナーゼファミリーのメンバーである。PITALREとも呼ばれるこのキナーゼは、他のCDC2関連キナーゼ中に保存されている配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRによりクローン化された(Granaら、1994, Proc Natl Acad Sci U S A,  91:3834-3838)。このキナーゼファミリーのメンバーは全て、このタンパク質のアミノ末端の近傍のPSTAIRE又はPSTAIRE様アミノ酸配列により特徴付けられる。CDK9は、様々なメンバーのサイクリンTファミリー(T1、T2a及びT2b)並びにCYCLIN Kと複合体を形成することが可能であり(Fuら, 1999, J Biol Chem, 274:34527-34530;Pengら, 1998, Genes Dev, 12:755-762)、一方、CYCLIN T1はCDK9活性の調節において最も重要な役割を果たす。CYCLIN T1発現の誘導は転写後の機構を通じて生じると考えられ(Herrmannら, 1998, J Virol, 72:9881-9888)CYCLIN T1が上記複合体の制限要素であることを示唆している。
【００１３】
CDK9/CYCLIN T1複合体は、数種の細胞型の分化過程に必要であると考えられる。CDK9/CYCLIN T2複合体の過剰産生はMyoD機能を高め、筋分化を促進するが、ドミナントネガティブ型によるCDK9キナーゼ活性の阻害は、筋原性プログラムの活性化を妨げる(Simoneら, 2002, Oncogene, 21:4137-4148)。CDK9及びCYCLIN T1の発現は、神経細胞でも分化の間に増大するが、これらの発現レベルの変動は星状細胞の成熟の間には見られず、このことは、CDK9の分化への関与が、細胞型によって変化し得ること、また異なった刺激に依存する可能性があることを示唆している(De Falcoら, 2002, Cancer Biol Ther, 1:342-347)。
【００１４】
下記の具体的な実施例の記載において、CDK9とCYCLIN T1の分子がリンパ細胞の活性化及び分化に関与していることを決定するために、リンパ組織におけるCDK9とCYCLIN T1の発現の評価を提供する。実施例は、CDK9とCYCLIN T1の発現レベルが悪性形質転換と相関することを示すために、B細胞リンパ腫及びT細胞リンパ腫におけるCDK9とCYCLIN T1の発現の解析も提供する。特定のリンパ腫について用いた略語は以下のとおりである：B-LBL:前駆B細胞リンパ腫;T-LBL:前駆T細胞リンパ腫;MCL:マントル細胞リンパ腫;MZL:辺縁帯リンパ腫;FL:濾胞性リンパ腫;DLBCL:びまん性大細胞型B細胞リンパ腫;BL:バーキットリンパ腫;cHL:古典的ホジキンリンパ腫;ALCL:未分化大細胞リンパ腫;PTCL:末梢T細胞リンパ腫。
【００１５】
本明細書の記載において用いられている用語及び表現は、説明のための用語として用いられ、限定するものではなく、このような用語及び表現の使用には、示されている特徴及び記載されている特徴、又はこれらの一部の任意の均等物を除外することを意図しない。
【実施例】
【００１６】
症例の選択及び従来の組織学：
反応性リンパ節の20の症例、正常胸腺の3つの症例、正常骨髄の4つの症例及びリンパ腫の163の症例（表1）は、Department of Human Pathology and Oncology, University of Siena (Italy)、the Department of Pathology, “G. Cotugno” Hospital, Naples (Italy)及びthe Department of Haematology “L.A. Seragnoli”, Bologna (Italy)から入手した。
【００１７】
定性的組織学的評価に用いた染色法としては、ヘマトキシリン及びエオシン染色法、ギムザ染色法、PAS染色法並びにゴモリ鍍銀染色法が挙げられる。この免疫組織化学的検査の結果を用いて、2人の病理学者が上記症例を別々に評価し、WHO分類に基づく診断上のコンセンサスを確立した。患者の年齢及び性別並びに生検部位について情報を入手することができた。分子解析用の凍結組織は、反応性リンパ節の5つの症例、MCLの5つの症例、FLの6つの症例及びDLBCLの8つの症例について入手することができた。
【００１８】
免疫組織化学法:
パラフィン切片による免疫表現型検査は、抗体の大型パネル(表2)とULTRAVISION/AP法(Bioptica, Milan, Italy)とを用いて行った。抗原回復は、1mM EDTA(pH 8.0)中で、以前の経験により、また使用した抗体に応じて、切片をプレッシャークッカー又は電子レンジのいずれかの中で加熱することによって行った。
【００１９】
リンパ腫免疫表現型検査用の抗体は表2に報告したものであり、製造者に推奨される希釈度で用いた。モノクローナル抗CDK9(sc-13130)とポリクローナル抗CYCLIN T1(sc-8127)はSantaCruz, CAから入手し、1:50の希釈度で用いた。全切片について、所与の抗体に対して陽性の免疫染色を示していた細胞を、リンパ組織の無作為に選択した高倍率視野(HPF)中で計数し、その結果を、これらの領域内の全腫瘍細胞のパーセントで表した。観測者自身及び観測者間の、計数の再現性は約95%であった。
【００２０】
陰性対照は、使用した抗体に応じて、一次抗体を正常マウス血清/正常ヤギ血清と換えることによって得た。正常ヒト扁桃腺は、陽性対照としての役割を果たした。
【００２１】
二重染色法：
CDK9及びCYCLIN T1と組み合わせたCD3、CD20、CD79a、CD34及びCD68の二重染色法は、反応性リンパ節と骨髄の、選択した試料で行った。反応性リンパ節のパラフィン切片は通常の方法で脱パラし、再水和した。切片は全て、電子レンジ(750W)で、pH 9のTris EDTAバッファー中で2分間インキュベートし、TBS中に5分間置いた。内因性ペルオキシダーゼは、Peroxidase Blocking Reagent (DAKO, UK)を用いて20分間ブロッキングした。その後、上記の切片は、抗CDK9抗体及びCYCLIN T1抗体（両方とも1:50希釈）と共に、インキュベートした。TBS中で洗浄した後、このスライドは抗マウスEnVisionTM HRP試薬(DAKO, UK)と共にインキュベートした。このスライドは、EnVisionTM System kitで提供されるDAB基質を用いて発色させた。
【００２２】
その後、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD79a抗体、抗CD34抗体及び抗CD68抗体(表2参照)を適切な希釈度で切片に加えた。TBS中で洗浄した後、これらの抗体を抗マウスEnVisionTM AP試薬(DAKO, UK)により検出した。スライドは、Vector Blue Substrate Kit (Vector Labs, UK)を用いて発色させた。切片は水道水で洗浄し、Aquamount (Merck, Germany)でマウントした。一次抗体及び二次抗体のインキュベーションは全て、室温で30分間続けた。
【００２３】
全組織からのRNA単離：
MCLの5つの症例及びDLBCLの8つの症例から得られた切片は、滅菌ブレードを用いて作製し、その後Tri試薬中でホモジナイズした。全RNAは、製造者の使用説明書(Invitrogen, CA)に従って抽出した。
【００２４】
レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとRNA抽出：
5つの反応性リンパ節から得られた胚中心及びマントル帯領域、並びにFLの6つの症例から得られた腫瘍細胞領域は、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色した切片に基づいて同定し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)(Arcturus PixCell IITM, MWG-BIOTECH, Florence, Italy)を用いて単離した。
【００２５】
切片作製前に、クリオスタットは交差汚染を避けるために100%エタノールで拭き、各症例について未使用の使い捨てブレードを用いた。5〜6μmの厚さの切片を、室温で、Silane Prep Slides (Sigma, Saint Louis, MO, USA)上に置き;残りの切片の切断が完了するまでドライアイス上のスライドボックスに保存した。HistogeneTM 染色キット(Arcturus PixCell IITM MWG-BIOTECH, Florence, Italy)は、組織をLCM用に調製するために製造者の推奨に従って用いた。
【００２６】
顕微解剖した細胞は、PicoPureTM RNA単離キット(Arcturus, MWG Biotech, Florence, Italy)を用いて速やかに処理した。簡単に言えば、CapsureTMトランスファーフィルムキャリアーを、10μlの抽出バッファーが入っている標準的な微小遠心管に直接置いた。その後この遠心管を、抽出バッファーが遠心管のキャップ上で組織と接触するように42℃で30分間逆さに置き；残りの抽出手順は製造者の使用説明書に従って行った。
【００２７】
細胞株：
BL、cHL及びALCLについては新鮮なリンパ腫組織を入手することができなかったので、細胞株をRNA抽出用に用いることにした。ALCLの3つの細胞株(Fe-PD, OHNE OMNE, 299)、BLの1つの細胞株(Daudi)及びcHLの2つの細胞株(L1236, L428)は、Institut fur Pathologie Universitatsklinikum, Benjamin Franklin Freie Universitat, Berlin, Germanyから得た。RNAはDNase処理に供してその後RT-PCRに用いた。
【００２８】
RT-PCR:
RT-PCR解析用に、10μlの単離されたRNAを、15μlのcDNA合成用逆転写酵素マスターミックスと混合した。逆転写は、42℃で1時間、RNAsin(Promega)の存在下でAMV(Promega)を用いて行った。リアルタイムPCRは、Rocheが提供する装置(LightCycler)を用いて行った。DNAマスターSYBRグリーン1キット(Roche Diagnostics, Germany)は、製造者の使用説明書に従って用いた。CDK9とCYCLIN T1はG3PDHに対して正規化した(CDK9用のプライマー:フォワード、
5'-ACGGCCTCTACTACATCCACA-3'(配列番号1)及びリバース、
5'-GCTGCGGGTCCACATCTCTGC-3'(配列番号2)）;CYCLIN T1オリゴヌクレオチド配列:フォワード、5'-AAACCAGAGGAGATAAAAATG-3'(配列番号3)及びリバース、
5'-GAATGAGAGTGCTTGTGTGAG-3'(配列番号4)。G3PDH用のプライマー配列は以前に記載されている13。ハウスキーピング遺伝子G3PDHを増幅するため、各サンプルについて前述のRNAを用いた。実験は全て3重に行った。
【００２９】
ウエスタンブロット法：
MCLの5つの新鮮なサンプルをEBCバッファー(50mM Tris-HCl pH8.0、NaCl 120mM、0.5％ NP40及び新鮮なプロテアーゼ阻害剤)中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、Bradfordアッセイ(Biorad, CA)を用いて評価した。50μgのタンパク質抽出物を10％SDS-PAGEにロードして分離した。ウエスタンブロット法(WB)は、モノクローナル抗CDK9(sc-13330, Santa Cruz, CA)を1:500希釈で用いて、またポリクローナル抗CYCLIN T1(sc-8127, Santa Cruz, CA)を1:500希釈で用いて行った。Jurkatt細胞株は陽性対照として用いた。実験は全て3重に行った。
【００３０】
CDK9とCYCLIN T1の発現は、免疫組織化学を用いて測定し、核染色パターンによって示されるように両方ともリンパ細胞における発現を示した。CDK9とCYCLlN T1の発現は、胸腺の被膜下外皮質のリンパ球集団にて、さらに腫瘍性T細胞前駆体にて主に見られた。骨髄においては、CDK9とCYCLIN T1の発現は、リンパ球及び骨髄由来の、より未成熟な細胞に現われた。CDK9とCYCLIN T1の核染色は、CD34について陽性の細胞(幹細胞、プロB細胞)の大部分、プレB細胞を示すと考えられるCD20陽性細胞の小集団、CD68陽性骨髄芽球及び巨赤芽球で見られた。前駆B細胞由来の腫瘍も、CDK9とCYCLIN T1の両方について染色された核を有した。末梢リンパ組織において、胚中心細胞(GC)、特に胚中心芽細胞においてCDK9とCYCLIN T1の発現が見られた(図1a及び図1b)。マントル細胞は、試験した症例の全てにおいて常に陰性であった。濾胞間領域中の、散在性B細胞芽球及び散在性T細胞芽球も、CD20抗体とCD3抗体をそれぞれ用いた二重染色によって示されるように、CDK9とCYCLIN T1を発現した。休止期小型Bリンパ球と休止期小型Tリンパ球は陰性であった。髄洞中のマクロファージと成熟形質細胞は、CDK9抗体とCYCLIN T1抗体に対して全く反応を示さなかった。末梢Bリンパ細胞及び末梢Tリンパ細胞から生じたリンパ腫の中でも、FL(図1c)及びALCL(図1f)は、両方のタンパク質について陽性な腫瘍細胞の40％以上を示した。古典的ホジキンリンパ腫のホジキン細胞とリード・シュテンベルク細胞も、両方のタンパク質について強い核染色を示した(図1e)。DLBCL(図1d)、BL、及びPTCL(図示せず)は、0％〜100％にわたる大きな変動を示した。DLBCLは、CD10、BCL6及びMUM-1(表3)の免疫組織化学的発現に応じて、GC様と非GC様とにさらに分類される。興味深いことに、DLBCLにおいて、CDK9陽性細胞及びCYCLIN T1陽性細胞のパーセントと、胚芽中心マーカー（例えばBCL6(r=0.81;p<0.001)及びCD10(r=0.83;p<0.001)）の発現との間に相関関係が見られたが(データ示さず)、MUM1の発現との間には相関関係は見られなかった。MZL又はMCLにおいては、CDK9とCYCLIN T1の発現は検出されなかった。
【００３１】
悪性リンパ腫におけるCDK9発現の結果は図2にまとめた。CYCLIN T1について得られた結果は、CDK9について得られた結果と密接に関連していた(データ示さず)。
【００３２】
反応性リンパ節、悪性リンパ腫の幾つかのサンプル及び細胞株におけるCDK9とCYCLIN T1のmRNA発現は、RT-PCRによって解析した。この結果は図3(a、b及びc)にまとめた。
【００３３】
顕微解剖した反応性胚中心細胞及びマントル細胞において、CDK9とCYCLIN T1のmRNAが同程度、1:1の比で観察されたが、正常マントル細胞においては、いずれの分子の発現も、免疫組織化学を用いてもタンパク質レベルで検出することはできなかった。
【００３４】
CDK9とCYCLIN T1のmRNA発現レベルは、リンパ腫の種類に応じて、解析対象の腫瘍サンプル間で異なっていた。MCLにおいては、CDK9とCYCLIN T1のmRNAは正常なマントル細胞と同じレベルで発現していた(図3a)。対照的に、FLにおいては、CDK9のmRNAは反応性胚中心と比べて過剰発現していたが、CYCLIN T1発現については、反応性胚中心と腫瘍性胚中心との間で差異は観察されなかった。
【００３５】
DLBCLにおいて不均一な状態が見られた：
全症例中のCDK9とCYCLIN T1の発現の平均値は、CDK9のmRNAレベルのわずかな増大を示した。しかし、GC様の表現型を有するDLBCLは、CDK9/CYCLIN T1比の著しい不均衡を示し、これはFLで観察された状態と似ていた(図3b)。
【００３６】
解析したcHL、BL、及びALCLの細胞株中で、CDK9の過剰発現も観察されたが、CYCLIN T1の発現は低く、やはりCDK9/CYCLIN T1比の不均衡をもたらしていた(図3c)。
【００３７】
正常マントル細胞と腫瘍性マントル細胞が、免疫組織化学的タンパク質発現を伴わず、胚中心細胞と同様のCDK9及びCYCLIN T1のmRNA発現を示したため、凍結組織を入手することができたMCLの5つの症例のウエスタンブロット解析を行った。MCLの全症例において、JurkatT細胞株におけるタンパク質発現と比べて、ウエスタンブロット法を用いてもCDK9とCYCLIN T1の発現はほとんど検出することができなかった。(図4a及び図4b)。
【００３８】
本発明において、CDK9/CYCLIN T1はBリンパ球とTリンパ球の分化/活性化プログラムに関与することが示されている。CDK9とCYCLIN T1のタンパク質発現は、リンパ細胞の種類によって著しく異なる。このタンパク質発現は、前駆B細胞及び前駆T細胞には存在するが、末梢リンパ組織における上記発現は、形質B細胞又は記憶B細胞へ分化する前の、抗原チャレンジした胚中心B細胞(胚中心芽細胞)において常に最高レベルで検出することができた。さらに、濾胞間領域中の散在性B細胞芽球と散在性T細胞芽球もCDK9とCYCLIN T1を発現していたが、マントル細胞と小型休止期Tリンパ球は、いずれの分子の発現も示さなかった。これらの結果は、CDK9/CYCLIN T1が、リンパ細胞の分化/活性化プログラムの特定の段階において当該細胞において発現されることを示す。さらに、これらのタンパク質の発現は、増殖している細胞（例えば、前駆B細胞及び前駆T細胞、胚中心細胞並びに免疫芽細胞）で主に見られるため、本明細書では細胞周期と関連するものとして示す。この知見は、末梢血リンパ球がPMA及びPHAによる活性化の後、細胞周期に入って、細胞周期を進め、CDK9/CYCLIN T1の発現が同時に著しくアップレギュレートされるという実験上の証拠と一致する(Herrmannら, 1998, J Virol, 72:9881-9888)。しかし、CDK9/CYCLIN T1の発現は、他の細胞型では増殖及び/又は細胞周期と関連していない。骨格筋及び神経細胞株の両方において、CDK9キナーゼ活性は、非同調的増殖の間より分化の終末で高いが、少なくともC2C12細胞においては、活性のレベルは終末分化が達成される前が最も高いと考えられる(MacLachlanら, 1998, J Cell Biochem, 71:467-478;Sanoら, 2002, Nat Med, 8:1310-1317;Napolitanoら, 2002, J Cell Physiol, 192:209-215)。
【００３９】
CDK9とCYCLIN T1の複合体の、悪性リンパ腫における免疫組織化学的発現は、この複合体が、前駆T細胞及び前駆B細胞、胚中心細胞(FL)及び活性化T細胞(すなわちALCL)から生じたリンパ腫において高発現しているため、その細胞起源を反映すると考えられる。古典的ホジキンリンパ腫のホジキン細胞及びリード・シュテルンベルク細胞におけるCDK9とCYCLIN T1の発現の知見も、これらがGC細胞又はポストGC細胞から生じたことと一致する。T細胞リンパ増殖障害の中でも、DLBCL、BL及びPTCLは広範囲の値を示したが、おそらくこれは細胞起源の不均一性を反映しているだろう。対照的に、免疫組織化学を用いても、MZL又はMCLにおいてCDK9とCYCLIN T1の発現は検出されなかった。結果的に、CDK9及びCYCLIN T1が構成的に高発現している段階から生じたリンパ系腫瘍形成の同定には免疫染色が適している。
【００４０】
意外にも、CDK9とCYCLIN T1のmRNA発現パターンは、免疫組織化学で検出されるタンパク質発現プロファイルと完全に一致しているわけではない。正常マントル細胞及び腫瘍マントル細胞におけるCDK9とCYCLIN T1のmRNAのレベルは反応性GC細胞と比べると類似しているが、いずれの分子についてもマントル細胞ではタンパク質の発現を検出することはできなかった。CDK9とCYCLIN T1が転写される細胞においてタンパク質発現が検出できないことは、転写後レベルの遮断、又はこれらのタンパク質の機能を要しない分化の特定の段階ある細胞におけるタンパク質の迅速なターンオーバーを示唆する。また、CDK9はFLの腫瘍性GC細胞において強く過剰発現していたが、CYCLIN T1は影響を受けていなかった。GC様の表現型を有するDLBCLにおけるCDK9とCYCLIN T1との比は、FLにおけるこれらの比と類似していた。同様に、cHL、BL、及びALCLの細胞株は、高レベルのCDK9 mRNAの存在下で低いCYCLIN T1 mRNAを示した。これらの知見は、リンパ組織における腫瘍性形質転換がCDK9/CYCLIN T1比の不均衡と関連する可能性があることを示す。転写及び分化においてCDK9/CYCLIN T1複合体は重要であるため、この不均衡は、未同定の転写因子が媒介して活性化された転写の脱制御に関与する可能性がある。CDK9とCYCLIN T1の配分パターンは、転写阻害剤で処理した細胞において変化することが見出されている。CYCLIN T1欠損変異体の一過的発現は、転写におけるCYCLIN T1の重要な役割を示した(Herrmannら, 2001, J Cell Sci, 114(Pt8): 1491-1503)。
【００４１】
上記の実施例は、可能性のある癌指標としての、CDK9又はCYCLIN T1のタンパク質またはRNAの発現の測定方法を記載する。上記のとおり、これらの遺伝子は悪性リンパ球において発現し、当業者がこれらの遺伝子を、例えばリンパ腫のアッセイに利用することを可能とする。
【００４２】
患者（ヒト患者）から得られた、適宜利用可能な組織又は液体サンプルは全て遺伝子発現レベルの測定に用いることができる。特定の実施形態において、解析対象のサンプルは骨髄、胸腺組織サンプル、脾臓組織サンプル、リンパ節、リンパ液及び/又はリンパ球である。サンプルは生検から得られる。1つの実施形態において、サンプルは侵襲が最小である方法によって迅速且つ容易に入手可能であるサンプルである。遺伝子発現解析用サンプルの調製方法は当技術分野において周知であり、市販のキットを用いて行うことができる。
【００４３】
本発明の方法において用いられる遺伝子発現レベルは、現在公知の方法、又は測定対象のレベルに関する定量的情報を提供し得る将来考案される方法の全てによって測定することができる。これらの方法は、好ましくは高感度な方法であり、再現可能な結果を提供する。1つの実施形態において、核酸増幅技術に基づく方法が用いられる。特に、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)及び関連の増幅技術（例えばNASBA）に基づく方法ならびに他の等温増幅技術を用いることができる。特に、CDK9遺伝子又はCYCLIN T1遺伝子のmRNAの逆転写を行い、その後、得られたcDNAの増幅を行うことによる、いわゆるRT-PCR法が考えられる。
【００４４】
発現の測定は、例えば、CDK9及び/又はCYCLIN T1遺伝子の転写産物を核酸ハイブリダイゼーションによって測定することによっても行うことができる。好適な実施形態において、実験者は、サンプルを、CDK9又はCYCLIN T1遺伝子の転写産物と特異的にハイブリダイズする核酸分子と接触させることにより、この転写産物の存在を判定する。標的に対する核酸分子のハイブリダイゼーションは、CDK9遺伝子又はCYCLIN T1遺伝子の発現及び癌の可能性を示唆する。好ましくは、この判定は、ポリメラーゼ連鎖反応と同様に2つのプライマー分子を用いて行われる。これらアッセイとの関連において、CDK9遺伝子又はCYCLIN T1遺伝子の発現の測定も本発明の一部である。
【００４５】
代替アッセイも本発明の一部である。代替アッセイとしては、電気泳動法、又は1つ以上の選択された抗体を用いる、サンプルの免疫表現型検査法、免疫ブロット法、免疫組織化学法若しくは免疫蛍光顕微鏡検査法が挙げられる。
【００４６】
このようなアッセイは、実験者が抗体を測定する任意の標準的な方法、例えばサンプルを、抗体が結合するか否かを判定するために要する量のタンパク質および任意の追加試薬と接触させることにより判定する方法、また任意の付加的試薬と接触させることによって行うことができる。1つの方法は固定化タンパク質の使用を含み、ここで当該タンパク質は当技術分野において公知の標準的な方法のいずれかによって、固定化し、続いてサンプルと接触させ、その後例えば抗IgG抗体、抗Fc抗体等と接触させる。反対に、CDK9及び/又はCYCLIN T1タンパク質の存在は、上記アッセイのタンパク質の代わりに抗体を用いて判定することもできる。
【００４７】
CDK9発現又はCYCLIN T1発現と特定のリンパ腫との相関関係に加えて、異常なCDK9発現又はCYCLIN T1発現に関連した症状の治療に有用な様々な治療法及び治療組成物も、本発明の一部である。これに関連して、「異常なCDK9発現又は異常なCYCLIN T1発現」は、発現自体、又は正常な個体中の発現レベルとは異なる発現レベルを意味し得る。すなわち、異常なCDK9又はCYCLIN T1の発現レベルとは、正常な個体より低い発現レベル又は高い発現レベルであり得る。
【００４８】
本発明は、例えば悪性リンパ球におけるCDK9又はCYCLIN T1の発現を阻害又は遮断するためにアンチセンス分子を使用するような、治療法を想定する。これらのアンチセンス分子は、核酸分子にハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、これらのアンチセンス分子の長さは17〜50ヌクレオチドである。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはカチオン性リポソームなどの好適な担体と組み合わせて投与される。
【００４９】
他の治療法としては、CDK9タンパク質又はCYCLIN T1タンパク質自体、これらに由来する1つ以上の抗原ペプチド、およびいわゆるポリトピック型ワクチン、又はCDK9タンパク質若しくはCYCLIN T1タンパク質の阻害剤、の投与が挙げられる。ポリトピック型ワクチンは複数の抗原ペプチドを含み、これらのペプチドは、好ましくはリンカー配列により互いに結合してはいない。得られたペプチドは、MHCクラスI分子又はMHCクラスII分子のいずれかに結合することができる。これらのタンパク質、ペプチド、又はポリトピック型ワクチンは、適切なアジュバントと組み合わせて投与することができる。これらは上記のタンパク質、ペプチド、ポリトピック構造等の発現が可能であるように設計された遺伝子構築物の形態で投与することもできる。
【００５０】
本明細書に記載の治療組成物及び治療法は処方することができる。投与する薬剤の量及び投与法は、治療する症状及び個人によって異なるであろう。標準的な投与形式（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、直腸投与、及び経皮投与）を用いることができる。製剤に関しては、タンパク質及び/又はペプチドをアジュバント及び/又は担体と組み合わせることができる。本発明の他の態様は当業者には明らかであり、本明細書においてあらためて述べる必要はない。
【００５１】
核酸法を用いる場合、多様なベクター（例えばワクシニア、レトロウイルス又はアデノウイルスベースのベクター）を用いることができる。真核生物のトランスフェクション（例えばヒト細胞のトランスフェクション）に有用な任意のベクターを用いることができる。これらのベクターは、例えば、その表面に関連ペプチド/MHC複合体を提示する樹状細胞などの細胞を作製するために用いることができる。その後これらの細胞は、標準的な方法を用いて投与前に非増殖性とすることができる。
【００５２】
本発明は、リンパ腫治療後の残存腫瘍細胞の分子検出も意図する。リンパ腫を患う患者は、化学療法により臨床的完全寛解を達成し得ることが多いが、それでも再発は生じる。残存腫瘍細胞が治療中生き残り、その後の病気再発の原因となるのであろう。その後、これら残存腫瘍細胞は続いて起こる病気再発の原因となり得る。自己幹細胞レスキューを伴う高用量化学療法を受けた患者は、所与の自己幹細胞又は骨髄中への潜在性腫瘍混入の結果として、リンパ腫を再発する可能性もある。本発明の方法は、移植前に行う場合、骨髄パージングの有効性を評価するために用いることもできる。
【００５３】
本明細書中で引用される全ての刊行物及び参考文献は、特許出願を含むがこれに限定されるものではなく、個々の刊行物又は参考文献の各々が、明確且つ個別に示され、十分に記載され本明細書中に参考として援用されるように、その全てが参考として本明細書中に援用される。この発明は特定の実施形態に関して記載されているが、これらの方法及び組成物を変更したものを用いることができること、並びに本発明は本明細書中に具体的に記載されている方法とは別の方法で実施し得ることが意図されることは、当業者には自明である。従って本発明は、請求項に記載される本発明の精神及び範囲に包含される全ての変更物を含む。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】(a)及び(b)反応性リンパ節；(c)濾胞性リンパ腫(FL);(d)びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);(e)古典的ホジキンリンパ腫(cHL);(f)未分化大細胞リンパ腫(ALCL)におけるCDK9発現の免疫組織化学解析を示す。(元の倍率(a)100X；(b及びc)200X、(d、e及びf) 400X)。
【図２】様々なリンパ腫の種類の、CDK9陽性細胞のパーセントを示す。
【図３】反応性リンパ節、悪性リンパ腫及びその細胞株におけるCDK9とCYCLIN T1のmRNA発現を示す。(a)マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)において観察されるmRNAレベルと比較した、反応性胚中心細胞及び反応性マントル細胞におけるCDK9とCYCLIN T1のmRNAレベル；(b)びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)の2つの異なるグループにおけるCDK9とCYCLIN T1のmRNAレベル。グループ1：胚中心様(GC様)表現型を有するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);グループ2:非GC様表現型を有するびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)(CD10-、Bcl-6-の表現により定義される);(c)古典的ホジキンリンパ腫(cHL)、バーキットリンパ腫(BL)及び未分化大細胞リンパ腫(ALCL)の細胞株におけるCDK9とCYCLIN T1のmRNAレベル。
【図４】マントル細胞リンパ腫(MCL)の2つのサンプル(レーン1及びレーン2)(a)：CDK9及び(b)：CYCLIN Tのウエスタンブロット解析を示す。JurkatT細胞:陽性対照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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