(57)【要約】本発明は細胞および組織の培養の分野に関する。特に、本発明は、器官型培養用の新規な装置を提供する。該装置は、１つの開口端と、多孔質膜によって閉鎖された１つの末端とを有し、該閉鎖末端はその全体にわたって融着された該多孔質膜により閉鎖されている培地導管、および該培地導管を実質的に鉛直方向に保持する枠体を備え、前記多孔質膜の表面に接触し、それにより、該多孔質膜上で成長しうる細胞に栄養分を供給するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により該培地導管中に保持することができるように、該培地導管が適合している。該装置は、１つの開口端と、前記培地導管に封着した前記多孔質膜の表面とは反対側の前記多孔質膜の表面によって閉鎖された１つの末端とを有する細胞懸濁液導管を更に備えてもよく、前記枠体は該培地導管と該細胞懸濁液導管とを実質的に鉛直方向に保持する。【選択図】図２
2008543302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官型培養用装置であって、該装置は
１つの開口端と、多孔質膜によって閉鎖された１つの末端とを有し、該閉鎖末端はその全体にわたって融着された該多孔質膜により閉鎖されている培地導管、および
該培地導管を実質的に鉛直方向に保持する枠体
を備え、
前記多孔質膜の表面に接触し、それにより、該多孔質膜上で成長しうる細胞に栄養分を供給するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により該培地導管中に保持することができるように、該培地導管が適合している該装置。
【請求項２】
１つの開口端と、前記培地導管に封着した前記多孔質膜の表面とは反対側の前記多孔質膜の表面によって閉鎖された１つの末端とを有する細胞懸濁液導管を更に備え、前記枠体は該培地導管と該細胞懸濁液導管とを実質的に鉛直方向に保持する請求項１に係る装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に係る装置であって、該装置が直立または倒立位置にあるときに、前記導管のおのおのが、該導管中の前記多孔質膜の表面と接触するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により保持することができるように適合している該装置。
【請求項４】
前記培地導管が円筒である請求項１〜３のいずれか１項に係る装置。
【請求項５】
前記細胞懸濁液導管が円筒である請求項２または請求項３に係る装置。
【請求項６】
前記培地導管が円筒であり、前記細胞懸濁液導管が円筒である請求項２または請求項３に係る装置。
【請求項７】
前記培地導管が0.5cm以下の半径を有する円筒である請求項４または６に係る装置。
【請求項８】
前記多孔質膜が、前記培地導管の一端の全体にわたって、接着により、ヒートシールにより、または超音波シールにより融着している先行するいずれかの請求項に係る装置。
【請求項９】
前記細胞懸濁液導管が、重力場により前記多孔質膜に対して加圧された縁により該多孔質膜に封着している請求項２〜８のいずれか１項に係る装置。
【請求項１０】
前記細胞懸濁液導管がネオプレンシールにより前記多孔質膜に封着している請求項２〜９のいずれか１項に係る装置。
【請求項１１】
前記細胞懸濁液導管がシリコーンシールにより前記多孔質膜に封着している請求項２〜９のいずれか１項に係る装置。
【請求項１２】
請求項２〜１１のいずれか１項に係る装置であって、前記細胞懸濁液導管は細胞培養の前に該装置から取り除くことができる装置。
【請求項１３】
前記細胞懸濁液導管が接着により、ヒートシールにより、または超音波シールにより前記多孔質膜に封着している請求項２〜１１のいずれか１項に係る装置。
【請求項１４】
前記細胞懸濁液導管がシリコーンで構成されている請求項２〜１３のいずれか１項に係る装置。
【請求項１５】
前記細胞懸濁液導管の内側の断面積が前記培地導管の内側の断面積より小さい請求項２〜１４のいずれか１項に係る装置。
【請求項１６】
前記多孔質膜が光学的に透明である先行するいずれかの請求項に係る装置。
【請求項１７】
前記多孔質膜が親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で構成されている請求項１６に係る装置。
【請求項１８】
前記枠体が前記導管を、該導管の、前記膜によって閉鎖された末端および該導管の開口端がいかなる表面にも接触しないように、実質的に鉛直方向に保持する請求項１〜１７のいずれか１項に係る装置。
【請求項１９】
前記枠体が前記導管を、前記細胞懸濁液導管の、前記膜と接触する末端が該膜に対する損傷を防止する該枠体により重力場において支持されるように、実質的に鉛直方向に保持する請求項２〜１８のいずれか１項に係る装置。
【請求項２０】
前記培地導管の開口端を囲むチャンバーを更に備える請求項１〜１９のいずれか１項に係る装置。
【請求項２１】
前記チャンバーが、前記培地を替えることができる開口部を備える請求項２０に係る装置。
【請求項２２】
前記液体培地とは反対側の前記多孔質膜の表面を覆うふたを備える請求項１〜２１のいずれか１項に係る装置。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に係る複数の装置を有する高処理量器官型培養のための装置。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に係る装置を96個, 384個, 1536個またはそれよりも多く有する請求項２３に係る高処理量器官型培養のための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞および組織の培養の分野に関する。特に、本発明は、器官型培養（organotypic culture）用の新規な装置を提供する。
【０００２】
組織培養とは、動物または植物有機体の器官または組織由来の細胞を生体外で（ex vivo）維持させることである。組織培養の方法は何十年にもわたって開発および改良されてきた。
【０００３】
植物または動物の器官または組織から直接得られた細胞を培養することは初代培養と呼ばれる。初代培養の一方法によれば、器官の外植片は、該外植片の縁から細胞が成長するように、適当な組成からなる無菌の雰囲気が供給された適当な培養容器に入った適当な無菌培地中に置かれる。初代培養への別のアプローチは、酵素的および／または機械的処理により器官または組織の細胞を解離させ、解離細胞を上記の適切な環境中で培養することである。
【０００４】
動物細胞の初代培養の不都合な点は、該細胞が限定された寿命しか持たないということである。初代培養における細胞は細胞分裂することはできるが、通常、そのようなことをするのは、セネッセンスと呼ばれる細胞死の形態を経る前の限られた回数のみである。外植片に基づく動物細胞初代培養の別の不都合な点は、生体内における供給源の器官中の細胞に典型的な特徴の喪失を妨げるために特別の方策を講じない限り、培養した細胞が、通常、その特徴の多くを失うということである。外植片に基づくまたは解離細胞に基づく初代培養の間に生体内における特徴が失われ、不死の細胞系が出現することは、生物学的および医学的研究ならびに製品開発に関して重大な意味合いを有している。なぜならば、このことは、このような初代細胞培養（primary cell cultures）は生体内での応答を正確に予測するためには用いることができないことを意味しているからである。結果として、候補薬物の安全性と有効性を評価する多くの生物学的試験は丸ごとの動物（whole animals）の生体内で行わなくてはならない。丸ごとの動物内でのこのような試験は、費用がかかって、より高い医療費へとつながり、そして、動物の福祉を危うくする場合がある。したがって、何年もの間、より正確に生体内応答を予測する生体外試験の開発に駆り立てる少なからぬ推進力が存在してきた。
【０００５】
器官培養とは、動物の器官の全部または一部を生体外で、該器官の生存および機能を一定期間維持する条件下、維持させることである。例えば、肝臓（Wicks W., 1968）、心臓（Wildenthal K., 1971）および腸（Corradino R., 1973）を培養する手順が確立されている。器官培養は、該器官の生理学的特性の大部分あるいはすべてが維持される点において、外植片に基づく初代細胞培養および細胞系に対して大きな利点を有している。しかしながら、器官培養の処理量は、器官を外科的にホストから取り除き、培養システムを組み立てるために必要な操作によって制限される。さらに、ドナー動物（donor animal）毎にたった１つ、２つあるいは少数の培養物しか得ることができない。これらの限界のせいで、器官培養は、生物学的研究における他の多くの応用と共に、薬物スクリーニングおよび薬物標的スクリーニングのためには、あまりにも遅くて高価なものとなっている。
【０００６】
組織培養の分野における主要な前進は、器官および組織切片のための器官型培養方法の導入である。動物の器官の薄い（５０〜５００μｍ）切片を、該切片が供給源の器官の細胞組成、形態および生理学的特性を維持する条件下で培養する。器官切片を培養する条件は、器官型培養を達成するのに重要である。器官切片は、完全には浸らないが培地の薄膜でのみ覆われるように、多孔質膜の上側表面の上で培養され、該多孔質膜の下側表面から栄養分を供給される（Stoppini L. et al, 1991）。
【０００７】
酸素の取り込みおよび二酸化炭素の除去のための切片へのガスの移動は、外植片培養の方法に従って培地中に切片を完全に浸す場合よりもはるかに効率的である。加えて、器官型切片培養（organotypic slice culture）は、上で論じた外植片に基づくまたは解離細胞に基づく初代培養に関連する不都合な点による被害を受けない。同じ原理に基づいて他の組織の切片の器官型培養を行った例が多く存在する。
【０００８】
器官型切片培養は器官培養よりも際立って速く柔軟であるが、薬物発見のために必要な大規模なスクリーニングのためにはまだあまりにも遅く高価である。動物由来の器官を分析したり手術後のヒト由来の物質（material）を処理したりするために使われる手順は大きな労働力を要し、たいていの研究室では並行して数十の培養を実行できるのみである。薬物スクリーニングのためには、並列して数千個、数万個あるいは数十万個の培養物が供給されれば、はるかに有用であろう。よって、器官型培養のための理想的な方法は、特定の器官由来の解離細胞または細胞小凝集体（small aggregates of cells）に基づいてはいるが、適切に器官型培養を行うことができる方法である。
【０００９】
驚くべきことに、解離細胞または細胞小凝集体（微小外植片（microexplants）または外植片）を圧縮することにより、これらのものから膜上で器官型培養物（organotypic culture）を生産できることが分かっている。前記膜の反対側には、Stoppini L. et al, 1991の教示に従い、栄養分が供給される。解離細胞または微小外植片を用いて器官型培養物を生産する方法は、「方法」と題した本出願人の同時係属出願（２００５年６月１５日に英国で出願され(GB0512214.8)、２００６年６月１５日に国際的に出願された。本文書中に参考文献として含まれる。）に記載されている。
【００１０】
器官型切片培養および解離細胞または微小外植片に基づく器官型培養両方の１つの特徴は、該切片または圧縮細胞を多孔質膜上に載せ、該組織または細胞培養物が気液界面に位置するように該多孔質膜の反対側から液体栄養培地を供給することである。現在、このような要求を満たす装置が利用可能である。例えば、Millipore Corporation製のバイオポア（Biopore）膜付きMillicell-CMインサートは、ポリスチレンホルダーに封着した（sealed）多孔質膜からなる。前記膜の下側表面が液体培地と接触し、器官切片が前記多孔質膜の上側表面に載るように、前記膜を載せた前記ポリスチレンホルダーを液体培地入りペトリ皿の中に置く(Millipore Technical Note 062を参照せよ)。
【００１１】
しかし、先行技術の器官型培養用装置には多くの不都合があり、器官型培養のための最適条件は提供されない。例えば、現在利用可能な装置では、細胞集団（cell mass）を多孔質膜に添加した後で該細胞集団とは反対側の多孔質膜表面に培地を添加することはできず、培地を替えることもできない。各培養物に栄養を与える培地を個別に特定することができるのであれば、そして、培養物に対する培地交換の影響を評価するために各培地を独立して替えることができるのであれば有用である。このような培地交換は、多孔質膜表面上の器官型培養物を静水力学的圧力の有意な変化にさらすことなく行う必要がある。なぜなら、このような変化は、伸長および変形作用に対する応答を細胞培養物中に引き起こし、生物学的試験の結果を混乱させる場合があるからである。更に、現在利用可能な装置では、大量処理が可能ではない、すなわち、並行して複数の器官型培養物を生産し、維持し、スクリーニングするために用いることができない。
【００１２】
したがって、器官型培養物を調製し維持するための装置であって、器官型培養物を不必要な変形作用にさらさずに培地交換を行うことが容易となるように設計されており、かつ、器官型培養物を高処理量で生産しスクリーニングすることが容易となるように設計されている装置が必要とされている。
【００１３】
本発明の概要：
本発明の第一の様相によれば、器官型培養用装置であって、該装置は
１つの開口端と、多孔質膜によって閉鎖された１つの末端とを有し、該閉鎖末端はその全体にわたって融着された該多孔質膜により閉鎖されている培地導管、および
該導管を実質的に鉛直方向に保持する枠体（frame）
を備え、
前記多孔質膜の表面に接触し、それにより、該多孔質膜上で成長しうる細胞に栄養分を供給するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により該導管中に保持することができるように、該導管が適合している該装置が提供される。
【００１４】
器官型培養の間中、培養物は前記導管の１つの末端に配置した多孔質膜の表面上で維持される。本発明の方法の重要な一特徴は、器官型培養の間中、毛管力が細胞培養物とは反対側の多孔質膜表面、即ち、該導管中の膜の表面と、該培地との間の接触を維持するように該導管が設計されていることである。
【００１５】
毛管力を利用して培地を導管中に保持すれば、ピペット操作を行う工程により、培地を取り除くことおよび取り替えることが可能となる。培地を供給するとき、ピペットの先端は膜の表面に対し実行可能な限り近くに配置するのがよい。
【００１６】
該導管は、前記装置が直立（upright）位置または倒立（inverted）位置にあるときに、該導管中の多孔質膜の表面と液体培地との間の接触が維持されるのに十分な体積の該培地が毛管現象により保持されるように適合していることが好ましい。該導管を本文書中で培地導管という場合がある。
【００１７】
直立位置とは、装置の使用中に器官型培養物が多孔質膜の上側の表面で成長するように、該膜で封止された末端を最も高い位置に配置させて、枠体が実質的に鉛直方向に導管を保持することを意味する。倒立位置とは、装置の使用中に器官型培養物が多孔質膜の下側の表面にあるように、開口端を最も高い位置に配置させ、該膜で閉鎖された末端を最も低い位置に配置させて、枠体が実質的に鉛直方向に導管を保持することを意味する。このように、当業界で利用可能な装置とは対照的に、本発明の装置では、該装置を直立位置または倒立位置に配置して、器官型培養物をインキュベートし、器官型培養物のための培地を替えることができる。培養物および装置の方向がこのように柔軟であることは、上向きの対物レンズを有する顕微鏡または下向きの対物レンズを有する顕微鏡を培養物の研究のために交換可能に用いることができ、培地の添加または除去を行う液体取扱装置をどちらの方向でも使用できることを意味する。
【００１８】
導管は円筒であることが好ましい。導管は断面が長方形であって非対称であってもよい。導管の正確な寸法および構成は、器官型培養の間中、好ましくは装置が直立位置にあるか倒立位置にあるかどうかにかかわらず、導管中の多孔質膜の表面と培地との間の接触が維持されるのに十分な体積の液体培地が毛管現象により保持されるように選択される。保持される液体の体積は、使用中に、培地を不当に短い間隔で替えることを必要とせずに、十分な栄養分が器官型培養物に供給されるほど十分であるのがよい。
【００１９】
毛管現象は数個のパラメーターに依存する。毛管力は円筒管の直径または断面が長方形である導管の広さ、即ち、幅の逆関数である。水溶液に及ぶ毛管力は溶液の表面張力にも依存し、該溶液は、洗剤等の界面活性剤が溶液の状態で存在することにより弱められうるその力によって保持される。毛管現象は液体の分子と表面の分子との間の吸引力の度合いに影響される。水性液体の場合、毛管現象は導管表面の親水性の度合いに影響される。導管中に液体培地が保持されることに影響を与える別の要因は培地の体積である。したがって、本発明の装置が多孔質膜と接触する一定の体積の液体培地を毛管現象により確実に保持できるようにするために、これらの要因を考慮に入れる必要がある。
【００２０】
本発明の装置においては、２つの異なる毛管力が作用して、多孔質膜と接触する導管中に液体培地が保持される。液体培地と管との間の引力により発揮される毛管力が一方の力である。もう一方の力は、液体培地と膜の細孔中の壁との間の引力により発揮される。十分に強ければ、前者は重力に対抗して、直立であるか倒立であるかにかかわらず導管中に液体を保持し、後者は液体と膜との接触を保持する。ある境界で、培地に及ぶ重力が毛管力を超え、付加的な力（additional force）によって制止されない培地は導管から落下する。
【００２１】
導管が円筒である場合、該円筒中に収容される液体の質量、したがって、該液体を該円筒から除去するように作用する重力は、該円筒の半径の二乗に正比例するのに対し、該液体を該円筒中に保持するように作用する毛管力は該半径に反比例する。このように、所定の液体および円筒の長さについては、それを超えると所定の表面組成からなる円筒中の液体が重力に対抗して保持されることがなくなる最大の半径が存在するが、それを下回ると液体が重力に対抗して保持されることがなくなる最小の半径は存在しない。
【００２２】
導管は、0.5cm以下、好ましくは0.3cm以下、好ましくは 0.25cm, 0.2cm, 0.15cm以下の半径を有する円筒であることが好ましい。該円筒は、約0.3cm, 0.15cmまたは 0.075 cmの半径を有することが好ましい。0.5cm以下の半径を有する円筒形の導管は、装置が直立位置にあるか倒立位置にあるかどうかにかかわらず、ダルベッコ最小必須培地（Dulbecco's Minimum Essential Medium）などの標準の液体培地からなる1cmの円柱が導管中の多孔質膜の表面と接触するのを維持するように適合していることが分かっている。導管、好ましくは円筒は、液体からなる1cmの円柱を保持することができるように、長さが約1cmであることが好ましい。導管の長さは、1cmをわずかに超えることが好ましく、約1.1cmまたは1.2 cmであることが好ましい。
【００２３】
導管中に存在するときに液体培地に加わる毛管力が増加するように、導管は親水性材料、好ましくは親水性ポリマーでできていることが好ましい。親水性ポリマーは当業者には公知である。導管を作製するポリマーの親水性は、例えば、ポリエチレングリコール基を含有させることで更に上昇させてもよい。
【００２４】
本発明は0.5cm未満の半径を有する円筒に限定されない。なぜなら、該装置において用いてもよい他の導管の寸法を決定することは十分に当業者の能力の範囲内であるからである。具体的には、当業者は、異なる寸法の導管中に入った所定の体積の液体培地に加わる毛管力と重力とを計算することができ、よって、液体が導管中に保持されるように毛管力が重力を確実に超えるためには該装置においていかなる寸法の導管を用いるべきかを決定することができる。更に、培地を導管から取り除くように作用する重力に対する抵抗を増加させるために、導管中には狭窄部、踊り場（platforms）または他の障害物が含まれていてもよい。
【００２５】
ラプラス−ケルビン（Laplace-kelvin）方程式によれば、
毛管力 = 表面張力 / (R1-R2)
（式中、R1 = 管または細孔（この場合は導管）の半径（cm）および R2 = 該管または細孔の壁と接触するメニスカス層の厚さ）
である。
【００２６】
１ダインは１グラムを1cm秒-2で加速するのに要する力である。洗剤等の界面活性剤を含まない限り、水性培地の表面張力は約73ダイン cm-2である。培地に洗剤を含ませることは一般的な習慣ではないが、タンパク質は同様に表面張力に影響を与え、培地には特に血清の形で一般的に含まれている。一般に、液体培地の表面張力は50ダイン cm-2以上である。所定の体積の液体培地に作用する合計の重力は98 x（体積(cm3)）ダインである。本発明の目的のために毛管現象を評価する場合には、通常、メニスカス層の厚さ(R2)は考慮に入れる必要がない。R2が小さいときは毛管現象に与える影響を無視してよく、R2がR1に近づくにつれて毛管力は大きくなる。したがって、本発明の目的のために所定の導管および水性培地について最小の毛管力の要件が満たされるかどうかを決定することのみが必要であるときには、R2の測定は必要ない。しかし、毛管力をより正確に計算することが望ましい場合には、もちろんR2を測定してもよい。
【００２７】
したがって、長さ1cm、半径0.5cmの円筒について、倒立時に重力に対抗して、表面張力50ダイン cm-2の液体からなる1cmの円柱を毛管現象により該円筒中に保持するには、全体として少なくとも77ダインの毛管力が必要である。円筒表面の親水性が十分に高い場合は、毛管力は液体からなるこのような円柱に対して100ダインを超える力を加えることができる。
【００２８】
長さ1cm、半径0.3cmの円筒について、倒立時に重力に対抗して、表面張力50ダイン cm-2の液体からなる1cmの円柱を該円筒中に保持するには、全体として少なくとも28ダインの毛管力が必要である。円筒表面の親水性が十分に高い場合は、毛管力は液体からなるこのような円柱に対して170ダインを超える力を加えることができる。
【００２９】
装置が移動または振動しなければ、これらの毛管力は液体からなるこのような円柱を倒立時に保持するのに十分である。なぜなら、移動または振動により生じる加速度は液体からなる円柱の運動量を変化させ、抑制力（restraining force）に打ち勝ちうるからである。導管の寸法は、手動によるまたはロボットによる通常の操作で生じうるような相応の運動量変化によっては導管から液体が失われないようになっていることが好ましい。
【００３０】
好ましくは、導管の寸法は、所定の体積の液体培地を多孔質膜の表面に保持するように作用する毛管力が、該培地を解放するように作用する重力の少なくとも６倍となるように選択される。重力の６倍の毛管力は、培地が該培地の表面張力を弱めるタンパク質成分、例えば、血清中のものを含んでいるときでも、通常の操作下において液体培地を装置の導管中に確実に保持するのに十分であることが分かっている。
【００３１】
多孔質膜は、導管の一端の全体にわたって、接着により、ヒートシールにより、または超音波シールにより融着していることが好ましい。多孔質膜は、該膜中の細孔の半径および表面組成に依存しつつ、ラプラス−ケルビン方程式 (上記参照)に従って導管中の液体に毛管力を加える。膜により発揮されるこの毛管力は、該膜を湿らせ、該液体が該膜と接触するのを維持するのに十分なものであるのがよい。
【００３２】
本発明の装置中の多孔質膜は大きさ〜0.4μmの細孔を有することが好ましい。本発明の装置中で用いるのに適した膜には、光学的に透明なミリポア社（Millipore Corporation）製親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE、デュポンの商品名テフロン（登録商標）でも知られている)膜、ポリカーボネート製、PET (ポリエチレンテレフタレート)製, または AnoporeTM (無機酸化アルミニウム, Whatman Corpの商標)製の膜が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
多孔質膜は光学的に透明であることが好ましい。この特徴により、試験培養物を顕微鏡検査や生物学的アッセイのためのサンプリングに常に利用しやすくなる。励起に使用される、通常、400-750nmの範囲内の波長において多孔質膜が生成するバックグラウンド蛍光は低いことが好ましい。好ましくは、多孔質膜は親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜から構成される。
【００３４】
枠体は、導管の、膜により閉鎖された末端および導管の開口端のどちらもがいかなる表面にも接触しないように、導管を鉛直方向に保持することが好ましい。本装置は、枠体が確実に導管との堅い接触を保持するようにする密閉リング（sealing ring）を更に備えることが好ましい。該装置はこのような密閉リングを２つ備えることが好ましい。該装置は、倒立時に導管が外れないよう枠体が確実に導管との堅い接触を保持するようにする付加的な手段を更に備えてもよい。このような付加的な手段には、例えば、枠体と導管との間のバネなどの摩擦手段（friction means）が含まれていてもよい。
【００３５】
該装置は、導管の開口端を囲むチャンバーを更に備えていてもよい。該チャンバーは、導管を鉛直方向に保持する枠体の一部を形成してもよい。装置の使用時、該チャンバーは、培地中の最適な酸性度および酸素レベルを維持するために、導管中の培地と接触する適当なガス組成の雰囲気を含む。該チャンバーは、使用中に液体培地が外部の雰囲気にさらされないことを確実にするために、密閉されていることが好ましい。該チャンバーは、該チャンバー中の雰囲気の条件をコントロールできるようにするためのガス出入口を更に備えてもよい。
【００３６】
シールされたチャンバーは、培地を替えることができる開口部を更に備えることが好ましい。開口部は、培地を替えるときに培地が雰囲気にさらされるのを最小限にするように設計することが好ましい。開口部は、通常はシールされているが培地を取り出し新しい培地を導入するためにピペットの先端で突き通してもよい隔膜または弁によりシールされていてもよい。隔膜はゴム製またはネオプレン製であってもよい。開口部は、培地を完全に替えるためではなく、既存の培地に増殖因子または抗体または毒素などの特定の成分を導入するために用いてもよい。ピペット操作は、培地が静水力学的力の有意な変化を受けることなく行うことが好ましい。
【００３７】
導管から液体を取り出すためには導管内の液体を保持する圧力よりも大きい陰圧をかけなければならないことは、手動によるまたはロボットによるピペットの構成（pipette construction）に関する当業者には明らかである。ピペットの先端による多孔質膜への損傷を回避することは重要であり、このためピペットの先端は前進しても該膜とは接触しない。したがって、全ての液体培地を導管から単一のピペット操作で除去することができない場合がある。液体は導管中でピペットの先端が最大限に移動する点と膜との間の導管の領域にとどまる場合がある。液体が毛管力によって導管中にこのようにとどまることは、非常に小さい円筒の半径について最も当てはまりそうに思われるが、ピペットの先端および液体の正確な特性にも依存する。液体がとどまっても、たいていの場合、培養物の健康状態には影響しない。
【００３８】
しかし、ある状況では、例えば、培養物の毒性物質への暴露を試験する場合には、液体がとどまることにより潜在的に実験データに影響が及びうる。この場合、液体の除去および新しい液体との交換からなるピペット操作は、毒性物質を希釈により除去するのに必要なだけ多く繰り返してもよい。例えば、円筒が1cmの長さで、ピペットの先端が膜から0.1cm以内の地点まで支障なく進むことができる場合、せいぜい10%の体積が円筒中にとどまる可能性がある。1cmの長さいっぱいに新しい液体を添加すれば、毒素は元の濃度の10%に希釈される。この工程を繰り返せば、毒素は元の濃度の1%に希釈される。ピペット操作を行う工程の時間プログラミングを行う場合には、希釈による除去の効率を最大化するために毒素を平衡化する必要があることが考慮される。
【００３９】
該装置は、重力場による圧縮の前および間中、細胞を収容する１つ以上の導管、好ましくは除去可能な導管を更に備えることが好ましい。このような導管または除去可能な導管は、培地を収容する導管に対して膜の反対側に配置される。この実施形態の装置により、遠心分離による細胞の圧縮と該細胞の表面への移動とを同時に行うことができる。該導管は、重力場による圧縮のための表面に対して適切な方向に細胞懸濁液を保持するように装備される。最適の方向は、重力場の強さが最小となる点から、該表面が細胞懸濁液よりも遠くなる方向である。遠心分離機中で生成される重力場の場合、該表面は、細胞懸濁液と比べて、遠心分離機ローターの回転軸よりも遠くに配置される。導管と表面との接点で、該表面と該表面に隣接する該導管の縁との間にシールを設けて、細胞が効率よく該表面に移動し、該導管からは失われないことを確実にすることが好ましい。遠心分離による細胞の圧縮後、液体培地は、細胞懸濁液を収容するように装備された導管に対して多孔質膜の反対側で培地を収容するように装備された導管に移される。その後、細胞は毛管現象により更に圧縮される。細胞懸濁液を収容する導管を本文書中では細胞懸濁液導管と呼び、液体培地を収容する導管を培地導管と呼ぶ。圧縮の前および間中、１つを超える細胞懸濁液導管を使用することにより、各培地導管と接触する膜の領域内の異なる場所に１つを超える培養物を構築することができる。細胞懸濁液導管が除去可能でない場合、それらは接着により、またはヒートシールにより、または超音波シールにより永久的に（permanently）多孔質膜に封着していてもよい。細胞懸濁液導管が除去可能である場合、それらは非永久的に（non-permanently）多孔質膜に封着する。非永久的なシールの例としては、圧力を集中させる成形縁部（shaped edges）や、導管の全部または導管のシール縁部（sealing edge）を構成してもよいシリコーンまたは他の圧縮可能な物質が挙げられる。遠心分離に精通している者は、遠心分離機ローターの回転軸に対して多孔質膜よりも近い位置にある導管を備える装置に重力を加えることにより、導管のシール縁部が多孔質膜に対して押し付けられると理解する。除去可能な導管の場合、これによりシール縁部のシール特性が強化される。また、重力場中で使用するための装置のデザインに関する当業者は、負荷に耐える表面は不具合を回避するのに十分な強度の構造により支持されていなければならないと理解する。例えば、本発明の多孔質膜は、弱い重力場中でさえも多孔質膜への損傷無しに導管を支持するのに十分な強度を有していない。したがって、本発明の導管が装置の枠体内の十分な強度の構造により支持されることを確実にする措置が取られている。圧縮可能なシールが導管と多孔質膜との間で使用される場合、重力場の影響下における圧縮の度合いは、全ての場合において、導管を装置の枠体内の十分な強度の構造と接触させることにより制限される。これらの考慮事項は、重力場中で使用するための装置のデザインの当業者とって自明である。
【００４０】
したがって、本発明は、１つの開口端と、前記培地導管に封着した前記多孔質膜の表面とは反対側の前記多孔質膜の表面によって閉鎖された１つの末端とを有する細胞懸濁液導管を備えることが好ましい。更に、前記枠体は該培地導管と該細胞懸濁液導管とを実質的に鉛直方向に保持することが好ましい。
【００４１】
本装置は、導管の外側の多孔質膜の表面を覆うふたを更に備えることが好ましい。該ふたは、装置の使用時に培養物が位置する多孔質膜の表面を覆う。装置がふたを備える場合、チャンバーおよび枠体は、該チャンバーと膜の上の該ふたにより囲まれる空間との間でガスが流れるようにする付加的な出入口を備えることが好ましく、数週間以上にわたって、培養物を囲む雰囲気をコントロールすることできるようになる。
【００４２】
本発明の第一の様相の装置は、複数の器官型培養物を同時に調製し維持することを含む高処理量（high-throughput）方法での使用に適合していることが好ましい。したがって、本発明の第二の様相によれば、本発明の第一の様相による装置を複数有する高処理量器官型培養のための装置が提供される。高処理量器官型培養のための装置は、本発明の第一の様相による装置を96個, 384個, 1536個またはそれよりも多く有することが好ましい。
【００４３】
よって、本発明の第二の様相の装置は数千の培地導管、および、ある実施形態では数千の細胞懸濁液導管を備えていてよく、各々の培地導管には培地を独立に供給することができ、培地を独立に交換することができる。培地の交換は上記のとおりマルチチャンネルピペット（multichannel pipette）またはロボットにより行うことが好ましい。
【００４４】
高処理量装置は、該装置内の個々の導管全てを覆う単一のふたを備えることが好ましい。
【００４５】
高処理量装置中の各々の培地導管の開口端を囲むチャンバーは開口部により接続しており、装置内のチャンバー全てへのガスの流れが高処理量装置中の単一のガス流出入口によりコントロールされるように、チャンバーの間にガスを流すことが好ましい。
【００４６】
高処理量装置中の複数の装置は単一のユニットとして組み立ててもよい。あるいは、高処理量装置は、おのおの単一の培地導管、および、ある実施形態では１以上の永久的または除去可能な細胞懸濁液導管を有し、所望の数の導管を有する高処理量装置に使用者が組立てることができる、本発明の第一の様相による個々の装置として供給してもよい。高処理量装置は、所望の数の導管を有する高処理量装置に―場合により、使用者が―組立てることができる、本発明の第一の様相による個々の装置複数からなる連なり（strips）として、例えば、2, 4, 8,または12個からなるグループとして供給してもよい。所定の数のウェル（well）を有する連なりを備える高処理量装置は、細胞培養の技術においては公知だが、器官型培養については公知ではない。このタイプのマルチウェル（multiwell）装置はDynatechによりThorne A. (1979)中で米国特許4,154,795として記載されている。
【００４７】
好ましくは、高処理量装置については、装置の全体のサイズおよび装置内の個々の導管の位置が標準のマイクロタイタープレートのサイズに合っており、該装置を標準のマイクロタイタープレート用に設計されたロボットとともに使用できるのがよい。例えば、本発明の第一の様相による96個の装置から構成される高処理量装置においては、該装置は、標準の96ウェルマイクロタイタープレートに似せて、8×12個の装置のアレイとして配置することが好ましい。高処理量装置を構成する96個の装置中の導管は円筒であることが好ましい。培地導管を構成する各円筒は、標準の96ウェルマイクロタイタープレート中のウェルの半径である約0.3cmの半径を有することが好ましい。このような円筒中で作用する毛管力および重力ついては上記した。細胞懸濁液導管の寸法は、重力に対抗して毛管力によって液体を保持するという必要性によっては制限されない。なぜなら、常にそれらは重力場の強さが最大となる点で多孔質膜とともに使用されるからである。細胞懸濁液導管を構成する各円筒は、標準のマイクロタイタープレート用に設計されたピペット装置によって容易に満たすことおよび吸引することができることが好ましい。例えば、本装置が各培地導管につき細胞懸濁液導管を１本備え、培地導管が９６本ある場合、各細胞懸濁液導管の軸は、多孔質膜の反対側で直接向かい合って配置されている培地導管の軸と同一線上にあることが最適である。本装置が９６本の培地導管のおのおのにつき細胞懸濁液導管を４本備える場合、細胞懸濁液導管の間隔は384ウェルマイクロタイタープレートのウェルと等しいことが望ましい。本装置が９６本の培地導管のおのおのにつき細胞懸濁液導管を１６本備える場合、細胞懸濁液導管の間隔は１５３６ウェルマイクロタイタープレートのウェルと等しいことが望ましい。各細胞懸濁液導管の半径は、差し支えなくピペット操作ができるように、適当なピペットの先端またはピペットニードル（pipette needle）の半径よりも十分に大きいことが望ましい。
【００４８】
本発明の第一の様相による384個の装置から構成される高処理量装置においては、各装置中の培地導管は円筒であることが好ましく、円筒の半径は約0.15cm、即ち、標準の384ウェルマイクロタイタープレートにおけるウェルの半径であることが好ましい。同じ1cmの長さのこの円筒中の液体の重量は、0.3cmの円筒の半径に対応する重量のわずか25%であるが、毛管力は上記のより大きい円筒と比較して２倍である。本発明の第一の様相による1536個の装置から構成される高処理量装置においては、各装置中の培地導管は円筒であることが好ましく、円筒の半径は約0.075cm、即ち、標準の1536ウェルマイクロタイタープレートにおけるウェルの半径であることが好ましい。この場合、同じ1cmの長さの円筒中の液体の重量は、0.3cmの円筒の半径に対応する重量のわずか6.25%であるが、毛管力は４倍高い。96, 384または1536本の培地導管から構成される高処理量装置においては、各培地導管につき１本以上の細胞懸濁液導管が存在しうる。該細胞懸濁液導管の数および配置は、高処理量のピペット操作に適した器具を用いることができるかどうかによってのみ制限される。このように、本発明に従って標準のマイクロタイタープレートの全体のサイズに合わせて作製した96, 384または1536本の培地導管からなる装置は全て、倒立位置にある培地導管中に液体を保持し、いずれも永久的または除去可能な細胞懸濁液導管を備えることができる。
【００４９】
本発明の種々の様相および実施形態をより詳細に例を用いて説明する。細部の変更は本発明の範囲から離れることなくなしうると理解される。
【００５０】
例：
図１に示すとおり、本発明の好ましい装置は、培地導管としての円筒および該円筒の一端に接着またはヒートシールまたは超音波シールした多孔質膜、および該円筒を鉛直に保持し該円筒の開口端を囲むチャンバーを作り出す枠体を備える。
【００５１】
該円筒は、毛管現象により円筒中に保持される一定の体積の液体培地を、それが多孔質膜の下側表面と接触するように収容する。その体積の液体培地の液体メニスカスを示す。
【００５２】
図２に示すとおり、本発明の別の好ましい装置は、培地導管としての円筒および該培地導管の一端に接着またはヒートシールまたは超音波シールした多孔質膜、および該培地導管に対して該多孔質膜の反対側に封着した細胞懸濁液導管としての別の円筒、および両円筒を鉛直に保持し該培地導管の円筒の開口端を囲むチャンバーを作り出す枠体を備える。
【００５３】
細胞懸濁液導管の円筒は遠心分離による圧縮の前および間中、細胞懸濁液を収容する。遠心分離後に得られた細胞集団を示す。遠心分離後に、培地導管の円筒は、多孔質膜の下側表面と接触するように毛管力により該円筒中に保持される一定の体積の液体培地を収容する。その体積の液体培地の液体メニスカスを示す。
【００５４】
図１および２の装置は、膜でシールされた、導管の末端を囲むふたを更に備え、ガス交換は可能であるが微生物汚染は防止する点において、器官型培養物を囲む雰囲気の制御手段を与える。
【００５５】
高処理量のための装置の組立品の場合、ふたは組立品全体を覆うことが好ましい。該ふたは、ガスが拡散できるようにゆるく取り付けられ、空気の乱流がわずかに存在するときに汚染を最小化するために、該皿または該組立品の縁と重なるスカートを有してもよい。空気の乱流を最小化すべきことは組織培養の専門家には周知である。あるいは、該ふたは堅く取り付けられてもよく、その場合、ガスがチャンバーとふた・膜間の空間との間で循環できるように出入口が枠体中に装備されていてもよい。
【００５６】
チャンバーは、チャンバーを培地導管の円筒の基部の周りに堅固に配置する２つの密閉リングを組み込んだ組み立て済みの柔軟な形状（pre-fabricated plastic shape）を有することが好ましい。また、細胞懸濁液導管の円筒が存在する場合、２つの密閉リングは、該組み立て済みの柔軟な形状内に該細胞懸濁液導管の円筒を配置するために用いられる。シールはネオプレンで作られた密閉リングであることが好ましい。細胞懸濁液導管の円筒は、遠心分離の間中、多孔質膜に対するシールが確実に行われるように、半硬質材料であるシリコーンで作られていることが好ましい。
【００５７】
チャンバーの基部は、培地を周囲の環境にさらすことなくチャンバー中の培地の交換を容易にするために、ピペットで突き通すことができる隔膜を更に備える。
【００５８】
チャンバーの内部へはガスの拡散または潅流のために到達しやすいことが好ましく、チャンバーは、雰囲気の条件をコントロールするためにガス流用の２つの孔または出入口を備える。チャンバーと枠体は、チャンバーとふたにより覆われる膜の上の空間との間でガスが流れるようにする付加的な出入口を備えることが好ましい。
【００５９】
図３に示すとおり、本発明による複数の器官型培養物のための高処理量装置は、図１に示す単一の器官型培養物のための装置を複数有する。高処理量装置中の培地導管の円筒おのおのは、毛管現象により膜との接触が保持される液体培地を独自に供給する。図４に示すとおり、本発明による複数の器官型培養物のための別の高処理量装置は、図２に示す器官型培養物のための装置を複数有する。該高処理量装置中の培地導管の円筒おのおのは、毛管現象により膜との接触が保持される液体培地を独自に供給する。遠心分離の前および間中、細胞懸濁液を収容する１本以上の細胞懸濁液導管の円筒が、培地導管の円筒おのおのに対応して存在する。図４に示す例では、細胞懸濁液導管の円筒が４本存在し、よって、培地導管の円筒おのおのにつき４個の器官型培養物が存在する。
【００６０】
図３および４における培地導管の円筒の基部にあるチャンバーは連通しており、チャンバーの間でガスは流れることができ、これにより、装置のどちらか一方の端にあるガス流出入口を通して全チャンバーの雰囲気の条件をコントロールすることができる。更に、ふたと培養物との間の空間は枠体中の出入口によりチャンバーと連続的になり、これにより、膜上の培養物を囲む雰囲気の条件をコントロールすることができる。
【００６１】
図５に示すとおり、図１および２の装置は、枠体に対して所定の位置に導管を保持する要素、例えば、導管と枠体との間のバネを更に備えてもよい。
【００６２】
参考文献：
Corradino R., 1973, J. Cell Biol., Vol 58, pp64-78, Embryonic chick intestine in organ culture. A unique system for the study of the intestinal calcium absorptive mechanism.
Stoppini L. et al, 1991, Neurosci. Methods, Vol 37 pp173-82, A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.
Wicks W., 1968, J. Biol. Chem., Vol 243, pp900-6, Induction of tyrosine-alpha-ketoglutarate transaminase in fetal rat liver.
Wildenthal K., 1971, J. Appl. Physiol., Vol 30, pp153-7, Long-term maintenance of spontaneously beating mouse hearts in organ culture. 
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の第一の様相による細胞懸濁液導管を備えない装置の断面図。
【図２】本発明の第一の様相による細胞懸濁液導管を備える装置の断面図。
【図３】本発明の第二の様相による器官型培養のための細胞懸濁液導管を備えない高処理量装置の断面図。
【図４】高処理量装置の断面図ならびに圧縮の前および間中、細胞を収容するための導管をウェル当たり４本含む高処理量装置用の除去可能な導管。
【図５】導管を所定の位置に保持する付加的な部品を有する本発明の第一の様相による改造された器官型培養用装置の断面図。
【図１】
2008543302.tif 000003
【図２】
2008543302.tif 000004
【図３】
2008543302.tif 000005
【図４】
2008543302.tif 000006
【図５】
2008543302.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月14日(2007.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
器官型培養用装置であって、該装置は
１つの開口端と、多孔質膜によって閉鎖された１つの末端とを有し、該閉鎖末端はその全体にわたって融着された該多孔質膜により閉鎖されている培地導管、および
該培地導管を実質的に鉛直方向に保持する枠体
を備え、
前記多孔質膜の表面に接触し、それにより、該多孔質膜上で成長しうる細胞に栄養分を供給するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により該培地導管中に保持することができるように、該培地導管が適合しており、
該装置は
１つの開口端と、前記培地導管に封着した前記多孔質膜の表面とは反対側の前記多孔質膜の表面によって閉鎖された１つの末端とを有する細胞懸濁液導管
を更に備え、
前記枠体は該培地導管と該細胞懸濁液導管とを実質的に鉛直方向に保持する該装置。
【請求項２】
請求項１に係る装置であって、該装置が直立または倒立位置にあるときに、前記培地導管が、該導管中の前記多孔質膜の表面と接触するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により保持することができるように適合している該装置。
【請求項３】
前記培地導管が円筒である請求項１または請求項２に係る装置。
【請求項４】
前記細胞懸濁液導管が円筒である請求項１〜３のいずれか１項に係る装置。
【請求項５】
前記培地導管が0.5cm以下の半径を有する円筒である請求項１〜４のいずれか１項に係る装置。
【請求項６】
前記多孔質膜が、前記培地導管の一端の全体にわたって、接着により、ヒートシールにより、または超音波シールにより融着している先行するいずれかの請求項に係る装置。
【請求項７】
前記細胞懸濁液導管が、重力場により前記多孔質膜に対して加圧された縁により該多孔質膜に封着している請求項１〜６のいずれか１項に係る装置。
【請求項８】
前記細胞懸濁液導管がネオプレンシールにより前記多孔質膜に封着している請求項１〜８のいずれか１項に係る装置。
【請求項９】
前記細胞懸濁液導管がシリコーンシールにより前記多孔質膜に封着している請求項１〜８のいずれか１項に係る装置。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に係る装置であって、前記細胞懸濁液導管は細胞培養の前に該装置から取り除くことができる装置。
【請求項１１】
前記細胞懸濁液導管が接着により、ヒートシールにより、または超音波シールにより前記多孔質膜に封着している請求項１〜１０のいずれか１項に係る装置。
【請求項１２】
前記細胞懸濁液導管がシリコーンで構成されている請求項１〜１１のいずれか１項に係る装置。
【請求項１３】
前記細胞懸濁液導管の内側の断面積が前記培地導管の内側の断面積より小さい請求項１〜１２のいずれか１項に係る装置。
【請求項１４】
前記多孔質膜が光学的に透明である先行するいずれかの請求項に係る装置。
【請求項１５】
前記多孔質膜が親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)で構成されている請求項１４に係る装置。
【請求項１６】
前記枠体が前記導管を、該導管の、前記膜によって閉鎖された末端および該導管の開口端がいかなる表面にも接触しないように、実質的に鉛直方向に保持する請求項１〜１５のいずれか１項に係る装置。
【請求項１７】
前記枠体が前記導管を、前記細胞懸濁液導管の、前記膜と接触する末端が該膜に対する損傷を防止する該枠体により重力場において支持されるように、実質的に鉛直方向に保持する請求項１〜１６のいずれか１項に係る装置。
【請求項１８】
前記培地導管の開口端を囲むチャンバーを更に備える請求項１〜１７のいずれか１項に係る装置。
【請求項１９】
前記チャンバーが、前記培地を替えることができる開口部を備える請求項１８に係る装置。
【請求項２０】
前記液体培地とは反対側の前記多孔質膜の表面を覆うふたを備える請求項１〜１９のいずれか１項に係る装置。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に係る複数の装置を有する高処理量器官型培養のための装置。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に係る96個, 384個, 1536個またはそれよりも多く有する請求項２０に係る高処理量器官型培養のための装置。
【請求項２３】
器官型培養用装置であって、該装置は
１つの開口端と、多孔質膜によって閉鎖された１つの末端とを有し、該閉鎖末端はその全体にわたって融着された該多孔質膜により閉鎖されている培地導管、および
該培地導管を実質的に鉛直方向に保持する枠体
を備え、
前記多孔質膜の表面に接触し、それにより、該多孔質膜上で成長しうる細胞に栄養分を供給するのに十分な体積の液体培地を毛管現象により該培地導管中に保持することができるように、狭窄部の存在により、該培地導管が適合している該装置。
【国際調査報告】
2008543302.tif 000008
2008543302.tif 000009
2008543302.tif 000010