(57)【要約】ＭＥＫ酵素であるＬＦ標的と相互作用する分子の立体配座エピトープもしくは領域を規定する、炭疽菌致死因子（ＬＦ）の一連の変異体が開示される。そのような変異体もしくは改変体、およびそれらをコードする核酸が開示される。そのような結合についての知識は、ＬＦのプロテアーゼ活性部位によるＭＥＫの認識とは別に、最終的なタンパク質分解および毒性に対して必要なこの追加形のＬＦ−ＭＥＫ結合のインヒビターを発見するための新規スクリーニングアッセイのための基礎として役立つ。非毒性ＬＦ変異体は、抗体および炭疽菌（Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染のＬＦ構成成分またはさもなければ炭疽菌致死毒素への曝露に対して特異的な免疫状態を発生させるための免疫原性組成物として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体もしくは改変体の炭疽菌致死因子（ＬＦ）ポリペプチドであって、該ＬＦの基質であるＭＥＫ−１またはＭＥＫ−２との相互作用のために重要であるドメインＩＩ内の１〜５個のアミノ酸残基は、該ポリペプチドが該ＭＥＫへの結合および該ＭＥＫとの相互作用において正常ＬＦと比較して阻害されるように置換、欠失、または化学的に誘導体化されており、該残基は、Ｌ２９３、Ｋ２９４、Ｒ４９１、Ｌ５１４およびＮ５１６からなる群から選択される、変異体もしくは改変体の炭疽菌致死因子ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体もしくは改変体のＬＦであって、ドメインＩＩ内の少なくとも２つのアミノ酸残基が、置換もしくは変異されており、該２つの残基は、Ｌ５１４／Ｌ２９３、Ｌ５１４／Ｋ２９４およびＬ５１４／Ｒ４９１からなる群から選択される、変異体もしくは改変体のＬＦ。
【請求項３】
前記１つ以上のアミノ酸残基が、ＡｌａまたはＧｌｙで置換されている、請求項１に記載の変異体もしくは改変体のＬＦ。
【請求項４】
前記少なくとも２つのアミノ酸残基が、ＡｌａまたはＧｌｙで置換されている、請求項２に記載の変異体もしくは改変体のＬＦ。
【請求項５】
Ｌ２９３Ａ、Ｋ２９４Ａ、Ｒ４９１Ａ、Ｌ５１４Ａ、Ｎ５１６Ａ、Ｌ５１４Ａ／Ｌ２９３Ａ、Ｌ５１４Ａ／Ｋ２９４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｒ４９１Ａからなる群から選択される、請求項３に記載の変異体もしくは改変体。
【請求項６】
前記ＬＦのドメインＩＩａまたはドメインＩＩｂに対応する、請求項１に記載の変異体もしくは改変体のＬＦのフラグメント、またはそれらの混合物。
【請求項７】
前記ドメインＩＩａまたはドメインＩＩｂが、配列番号４または配列番号６から本質的になる、請求項６に記載のフラグメントまたは混合物。
【請求項８】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の変異体もしくは改変体のＬＦポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項７または８に記載のフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解に対するいかなる効果とも無関係に、ＬＦおよびＭＥＫの結合相互作用を阻害する能力について試験される因子もしくは化合物を含む試験サンプルをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験サンプルをＬＦおよびＭＥＫタンパク質と接触させる工程；および
（ｂ）ＭＥＫに対するＬＦの結合についてアッセイする工程；
（ｃ）該試験サンプルの不在下における該結合を、ＬＦの結合と比較する工程；
を包含し、
工程（ａ）において測定された結合が工程（ｂ）において測定された結合よりも低い場合は、該因子もしくは化合物は、ＬＦ−ＭＥＫ結合のインヒビターである、
方法。
【請求項１１】
請求項１１に記載の方法であって、
工程（ｂ）における結合を、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載のＬＦの変異体、改変体もしくはフラグメントの、ＭＥＫへの結合と比較する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
前記サンプルがＭＥＫタンパク質分解を阻害する能力を試験する工程；
をさらに包含し、前記化合物が前記結合を阻害することにおいて陽性であり、かつ該タンパク質分解を阻害することにおいては陰性である場合に、該化合物は、結合インヒビターである、方法。
【請求項１３】
試験される因子もしくは化合物を含む１つのサンプルもしくは複数のサンプルを、（ｉ）ＬＦとＭＥＫとの結合相互作用を阻害する能力、および（ｉｉ）ＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解を阻害する能力について、スクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験サンプルをＬＦおよびＭＥＫタンパク質と接触させる工程；
（ｂ）ＭＥＫに対するＬＦの結合についてアッセイする工程；および
（ｃ）該結合を該試験サンプルの不在下でのＬＦの結合と比較する工程；
（ｄ）工程（ｂ）のアッセイとは無関係に、該１つまたは複数の試験サンプルの存在下でＬＦによるＭＥＫのタンパク質分解についてアッセイする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）におけるタンパク質分解を、該試験サンプルの不在下におけるＬＦによるＭＥＫのタンパク質分解と比較する工程；
を包含し、
工程（ａ）において測定された該結合が、工程（ｂ）において測定された結合よりも低い場合、および工程（ｄ）において測定された該タンパク質分解が、工程（ｅ）において測定された該タンパク質分解よりも低い場合は、該１つのサンプル中の因子もしくは化合物、または該複数のサンプル中の因子もしくは化合物は、ＬＦ−ＭＥＫ結合およびＬＦ媒介性ＭＥＫタンパク質分解のインヒビターである方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
工程（ｂ）における結合を、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載のＬＦの変異体、改変体もしくはフラグメントの、ＭＥＫへの結合と比較する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の変異体もしくは改変体のＬＦ；および
（ｂ）免疫学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤；
を含む、免疫原性組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項１６】
（ａ）請求項９に記載の核酸分子；および
（ｂ）免疫学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤；
を含む、免疫原性組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項１７】
被験体においてＬＦ特異的免疫を誘導する方法であって、
該被験体に対して、免疫学的有効量の請求項１５に記載の組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８】
被験体においてＬＦ特異的免疫を誘導する方法であって、
該被験体に対して、免疫学的有効量の請求項１６に記載の組成物を投与する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、生化学、遺伝学および医学の分野において、毒性に欠けるためにスクリーニング方法において、および炭疽菌に対する免疫原性組成物として有用である、炭疽菌致死因子（ＬＦ）の分子のドメインＩＩにおける変異体に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
炭疽菌毒素は、グラム陽性細菌である炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって生成された外毒素に由来する。この毒素は、３種のタンパク質である防御抗原（ＰＡ）、水腫因子（ＥＦ）、および致死因子（ＬＦ）から構成される。ＰＡ自体は毒性ではなく、むしろＥＦおよびＬＦを標的細胞の細胞質ゾルへ転位させる役割を果たす（Ｋｌｉｍｐｅｌ，  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０２７７−８１；Ｍｏｌｌｏｙ，  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：１６３９６−４０２；Ｓｉｎｇｈ，  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１１０９９−１１１０２；Ｐｅｔｏｓａ，  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８３３−８３８）。近年、ＰＡに対する２つの細胞表面レセプター（炭疽菌毒素レセプターもしくはＡＮＴＸＲ）が同定されている（Ｂｒａｄｌｅｙ，  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：２２５−９；Ｓｃｏｂｉｅ，  ＨＭ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：５１７０−４）。ＡＮＴＸＲへ結合した後、ＰＡは細胞表面結合フリン（ｆｕｒｉｎ）によって開裂され、２０ｋＤａのフラグメントが取り除かれ、ＡＮＴＸＲに結合した６３ｋＤａのフラグメント（ＰＡ６３）が残留する。この工程は、ＥＦもしくはＬＦに対する結合部位を露出させるため（Ｍｏｇｒｉｄｇｅ，  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１０７９−８２）ならびにＰＡのその後の七量体へのオリゴマー化にとっての立体障害を除去するため（Ｐｅｔｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｌｅｐｐｌａ，  ＳＨ，  Ｉｎ：  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ，  Ｆｒｅｅｒ，  Ａ，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１，  ｐｐ．２７７−３０２；Ｍｉｌｎｅ，  ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：２０６０７−１２）に不可欠である。ＥＦもしくはＬＦが七量体ＰＡ６３に結合した後、毒素複合体は、エンドソーム経路を介して内在化される（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，  ＡＭ  （１９８６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：７１２３−２６；Ｇｏｒｄｏｎ，  ＶＭ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｉｎｆｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ５６：１０６６−９；Ｌｅｐｐｌａ，  ＳＨ  （１９８２）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：３１６２−６）。エンドソームの酸性環境は、ＰＡ構造の立体配座変化を誘導し、おそらくＥＦもしくはＬＦがそれを通過して細胞質ゾル内へ移動する孔の形成を引き起こす。
【０００３】
ＥＦは、アデニル酸シクラーゼである（Ｌｅｐｐｌａ、上記）。ＥＦ＋ＰＡ（＝水腫毒素もしくはＥｄＴｘ）は、致死性ではないが、皮下注射（ｓ．ｃ．）されると水腫を引き起こす（Ｂｅａｌｌ，  ＦＡ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６２）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ８３：１２７４−８０；Ｓｔａｎｌｅｙ，  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６１）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：４９−６６）。
【０００４】
ＬＦは、数種の細胞有糸分裂活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ＝ＭＥＫ１、２、３、４、６および７を含むＭＥＫ）のＮＨ２末端を特異的に開裂するＺｎ２＋−金属プロテアーゼであり（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ，  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：７３４−７；Ｖｉｔａｌｅ，  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４８：１０６−１１；Ｐｅｌｌｉｚｚａｒｉ，  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４６２：１９９−２０４；Ｖｉｔａｌｅ，  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３５２  Ｐｔ  ３：７３９−４５）、結果としてそれらの不活化を生じさせる（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｃｈｏｐｒａ，  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：９４０２−６；Ｂａｒｄｗｅｌｌ，  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７８：５６９−７７）。ＬＦは、ＭＥＫ−５を開裂しない（Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。ＰＡ＋ＬＦ（＝致死毒素もしくは「ＬｅＴｘ」）の組み合わせは水腫を引き起こさないが、静脈内注射（ｉ．ｖ．）されると、死につながる低血圧性ショックを急激に誘導する。
【０００５】
成熟ＬＦは、大きな７７６アミノ酸（９０．２ｋＤａ）のタンパク質である（Ｂｒａｇｇ，  ＴＳ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８１：４５−５４）。存在するリーダー配列とともに以下に示す全長タンパク質は、８０９アミノ酸（配列番号２）を有する。ＬＦの結晶構造は、２．２Åの解像度まで解明されており（（Ｐａｎｎｉｆｅｒ，  ＡＤ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：２２９−３３）、図１に示されている。この構造は、４つのドメインから構成される。ドメインＩは、ＰＡに結合するＮＨ２末端部分を含んでいる。ドメインＩＩ（残基２６３〜２９７および３８５〜５５０）（より短い成熟ポリペプチドに基づく；配列番号１におけるドメインＩＩを規定する残基は、２９６〜３３０および４１８〜５８３である）。これらは、ＬＦタンパク質（配列番号２）のアミノ酸２９６〜３７５であるドメインＩＩａ（配列番号４）に一致する。ドメインＩＩｂのアミノ酸配列（配列番号６）は、ＬＦタンパク質のアミノ酸４１９〜５８３由来である。ドメインＩＩは、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のアデノシン二リン酸リボシル化毒素との構造類似性を示すが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド結合および触媒作用のために必要とされる残基が欠如している。ドメインＩＩＩはドメインＩＩ内に挿入されており、ドメインＩＩ内に存在するヘリックス・ターン要素の一連の４つのタンデム不完全リピートを含有する。以前の報告書は、第２不完全リピート（成熟タンパク質の残基３０８〜３２６または配列番号２の残基３４１〜３５９）の欠失がＬＦを非毒性にするので（Ａｒｏｒａ，  Ｎ  ＆  Ｌｅｐｐｌａ，  ＳＨ  （１９９３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：３３３４−４１）、ＬＦ活性にとってこの領域が重要であると提案している。ドメインＩＩＩ内の酸性残基は、ＭＥＫの塩基性ＮＨ２末端との特異的接点を形成する。ドメインＩＶは、サーモリシンとの限定された構造相同性を有し、触媒コアを含有する。このドメイン内の挿入変異（例、残基７２０でのＡｒｇ−Ｖａｌジペプチドの挿入）は、それがＰＡへ結合する能力を遮断せずにＬＦの毒性を排除できる（Ｑｕｉｎｎ，  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６６：２０１２４−３０）。ドメインＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの要素は一緒に、その中にＭＥＫのＮＨ２末端が適合して長い触媒溝を作り出し、活性部位複合体を形成する。
【０００６】
本発明者および同僚らは、Ｂ−Ｒａｆを含む他の調節分子がＭＥＫと相互作用するプロリンリッチ領域に隣接する、ＭＥＫ１のＣ末端領域内に位置するＬＦ相互作用領域（ＬＦＩＲ）の存在を証明した（Ｃｈｏｐｒａ，  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：９４０２−６）。この領域内に保存された残基の変異は、ＭＥＫのキナーゼ活性を変化させずにＭＥＫのＬＦタンパク質分解を防止した。ＬＦＩＲの精確な機能は判明していないが、ＬＦＩＲはＭＥＫがＬＦと結合するために必要であるという仮説が立てられた。
【０００７】
さらに、ＭＥＫは、ＭＡＰＫファミリーメンバーの上流活性化因子である。これらのメンバーは、例えばＭＡＰＫ１もしくはＭＡＰＫ２と同一であるＥＲＫ１もしくはＥＲＫ２などの、細胞有糸分裂活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）としても知られる細胞外信号調節キナーゼ（ＥＲＫ）を含んでいる。７種のＭＥＫ酵素が報告されている。ＭＥＫ１および２は、ｒａｓ経路による活性化に応答して、ＥＲＫ１および２（＝ＭＡＰＫ１および２）をリン酸化および活性化する。ＭＥＫ１および２は、細胞有糸分裂促進因子もしくは成長因子によって刺激される。細胞周期のＳ期への細胞の細胞有糸分裂促進因子誘発性進入は、アンチセンスＥＲＫ  ｍＲＮＡ（Ｐａｇｅｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０：８３１９−２３）、ドミナントネガティブＥＲＫ変異体（Ｔｒｏｐｐｍａｉｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９４，  ２６９：７０３０−５；Ｆｒｏｓｔ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９４，  ９１：３８４４−８）、およびＰＤ９８０５９（Ｄｕｄｌｅｙ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １９９５，  ９２：７６８６−７６８９）もしくはＰＤ１８４３５２（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  １９９９，  ５：８１０−６）などのＭＥＫ１／２の小分子インヒビターによって遮断される。ＭＥＫは、さらにまたプログラムされた細胞死においても役割を果たす（本発明者および同僚らによるＷＯ０２／０７６４９６、およびその中で言及された参考文献を参照されたい）。
【０００８】
ＭＥＫは、細胞有糸分裂促進因子ならびに環境上のストレスに対する細胞応答を調節する。これらのキナーゼの不適切な活性化は、腫瘍形成にの原因となる。活性化されたＭＡＰＫもしくは上昇したＭＡＰＫ発現は、乳がんおよび神経芽膠腫を含む様々なヒト腫瘍、ならびに腎臓、結腸、および肺組織に由来する原発性腫瘍細胞において検出されている（例えば、参照）。ＭＥＫ−ＥＲＫ信号伝達が、腫瘍転移および腫瘍血管新生（ＷＯ０２／０７６４９６、上記）において極めて重要な役割を果たすことも証明されている。
【０００９】
使用した略語；ＡＴＰ、アデノシン三リン酸；ＡＮＴＸＲ、炭疽菌毒素レセプター；ＣＯＯＨ、カルボキシ基；ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣；ｄｆ、自由度；ＥＣ５０、５０％有効濃度；ＥＦ、水腫因子；ＥＲＫ，細胞外調節キナーゼ；ＦＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィ；ｋＤａ、キロダルトン；ＬｅＴｘ、致死毒素；ＬＦ、致死因子；ＬＦＩＲ、ＬＦ相互作用領域；ＭＥＫ、細胞有糸分裂活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）；ＮＨ２、アミノ基；ｐ、確率；ＰＡ、防御抗原；ＳＤＳ、ラウリル硫酸ナトリウム。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明者は、ＬＦの多数の特異的変異体が、ＬＦ作用の基質であるＭＥＫ−１もしくはＭＥＫ−２へ結合する能力を消失している、または結合して生産的に相互作用する能力を減少していることを見いだした。これは、ＬＦがその毒性作用を発揮するＭＥＫのタンパク質分解によるものである。
【００１１】
そこで、本発明は、ＬＦの基質であるＭＥＫ−１もしくはＭＥＫ−２（ならびにＭＥＫ−３、４、６および７）との相互作用のために重要であるドメインＩＩ内の１〜５個のアミノ酸残基が、ポリペプチドが前記ＭＥＫへの結合および前記ＭＥＫとの相互作用に関して正常ＬＦと比較して阻害されるように置換、欠失、または化学的に誘導体化されている変異体もしくは改変体の炭疽菌致死因子（ＬＦ）ポリペプチドに向けられるが、前記残基はＬ２９３、Ｋ２９４、Ｒ４９１、Ｌ５１４およびＮ５１６からなる群から選択される。これらの位置は、配列番号２の残基Ｌ３２６、Ｋ３２７、Ｒ５２４、Ｌ５４７およびＮ５４９に一致する。
【００１２】
変異体もしくは改変体のＬＦの１つの実施形態では、ドメインＩＩ内の少なくとも２つのアミノ酸残基が置換もしくは変異しており、それら２つの残基は、Ｌ５１４／Ｌ２９３、Ｌ５１４／Ｋ２９４およびＬ５１４／Ｒ４９１からなる群から選択される。
【００１３】
好ましくは、上記の変異体もしくは改変体では、１つ以上のアミノ酸残基が、ＡｌａまたはＧｌｙと、最も好ましくはＡｌａと置換されている。
【００１４】
好ましい１群の変異体は、Ｌ２９３Ａ、Ｋ２９４Ａ、Ｒ４９１Ａ、Ｌ５１４Ａ、およびＮ５１６Ａ、ならびに二重変異体Ｌ５１４Ａ／Ｌ２９３Ａ、Ｌ５１４Ａ／Ｋ２９４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｒ４９１Ａである。
【００１５】
同様に、ＬＦのドメインＩＩａもしくはＩＩｂに一致する上記の変異体もしくは改変体のフラグメント、またはそのようなフラグメントの混合物もまた提供される。好ましくは、そのフラグメントの配列は、配列番号４または配列番号６である。
【００１６】
本発明は、上記の変異体もしくは改変体のＬＦポリペプチド、またはフラグメントをコードする単離された核酸分子に向けられる。これらの核酸は、ＬＦポリペプチドを生成するために、または当技術分野においてよく知られている方法および経路を使用した被験体への投与による免疫原性ＤＮＡワクチンとして使用できる。
【００１７】
ＬＦのドメインＩＩの特定立体配座エピトープは上記の位置における変異の結果としてＭＥＫへ結合不能または低結合性にさせられるという本発明者による認識の結果として、（本発明の前にはインヒビターを試験するための唯一の開示された基礎であったタンパク質分解の阻害に対して）結合の阻害にのみ基づいてＬＦ−ＭＥＫ結合の潜在的インヒビターの作用を試験するスクリーニングアッセイを設計することが可能になった。標識もしくは未標識構成成分（ＬＦ、ＭＥＫ）を用いると、当技術分野において知られている任意のタイプの結合アッセイを使用できる。このためによく知られている他のアッセイは、ＢｉａＣｏｒｅテクノロジーを用いるなどの標識を必要としないアッセイ、または等温比色アッセイ、または標識された反応物に基づくアッセイである「ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）」アッセイである。本明細書に例示するのは、Ｂ−Ｒａｆ結合の競合もしくはインビトロＭＥＫタンパク質分解を試験するアッセイである（後者は、単独では結合相をタンパク質分解相から識別せず、どちらか、または両方の相のインヒビターを同定するであろう）。
【００１８】
本発明は、ＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解に及ぼす任意の作用とは無関係に、試験対象の因子もしくは化合物を含む試験サンプルがＬＦおよびＭＥＫの結合相互作用を阻害する能力についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験サンプルをＬＦおよびＭＥＫタンパク質と接触させる工程；および
（ｂ）ＭＥＫに対するＬＦの結合についてアッセイする工程；
（ｃ）試験サンプルの不在下でこの結合をＬＦの結合と比較する工程とを含み、
工程（ａ）において測定された結合が工程（ｂ）において測定された結合より低い場合はその因子もしくは化合物がＬＦ−ＭＥＫ結合のインヒビターである方法を提供する。本方法は、工程（ｂ）における結合を本明細書に記載したＬＦの変異体、改変体もしくはフラグメントのＭＥＫへの結合と比較する工程をさらに含むことができる。
【００１９】
上述した特許請求の範囲の方法は、サンプルがＭＥＫタンパク質分解を阻害する能力を試験する工程をさらに含むことができるが、その化合物が結合を阻害することに陽性でタンパク質分解を阻害することに陰性である場合は、それは純粋な結合インヒビターである。
【００２０】
さらに、試験対象の因子もしくは化合物を含む１つのサンプルもしくは複数のサンプルを、（ｉ）ＬＦおよびＭＥＫの結合相互作用を阻害する能力、および（ｉｉ）ＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解を阻害する能力についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験サンプルをＬＦおよびＭＥＫタンパク質と接触させる工程；
（ｂ）ＭＥＫに対するＬＦの結合についてアッセイする工程；および
（ｃ）この結合を試験サンプルの不在下でのＬＦの結合と比較する工程；
（ｄ）工程（ｂ）のアッセイとは無関係に、１つ以上の試験サンプルの存在下でＬＦによるＭＥＫのタンパク質分解についてアッセイする工程；および
（ｅ）工程（ｄ）におけるこのタンパク質分解を試験サンプルの不在下でのＬＦによるＭＥＫのタンパク質分解と比較する工程；を含み、
工程（ａ）において測定された結合が工程（ｂ）において測定された結合より低い場合、および工程（ｄ）において測定されたタンパク質分解が工程（ｅ）におけるタンパク質分解測定値より低い場合は、１つのサンプル中の因子もしくは化合物、または複数のサンプル中の因子もしくは化合物がＬＦ−ＭＥＫ結合およびＬＦ媒介性ＭＥＫタンパク質分解のインヒビターである方法が提供される。本方法は、工程（ｂ）における結合を本明細書に記載したＬＦの変異体、改変体もしくはフラグメントのＭＥＫへの結合と比較する工程をさらに含むことができる。
【００２１】
本発明は、（ａ）上記の変異体もしくは改変体のＬＦ、および（ｂ）免疫学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含む免疫原性組成物もしくはワクチン組成物を含んでいる。さらに、（ａ）改変体ＬＦの変異体をコードする上述した核酸分子、および（ｂ）免疫学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤を含む、当技術分野においてよく知られているＤＮＡワクチンもまた含まれる。
【００２２】
本発明は、被験体におけるＬＦ特異的免疫を誘導する方法であって、前記被験体に免疫学的有効量の上記のポリペプチドもしくは核酸免疫原性組成物を投与する工程を含む方法にさらに向けられる。本方法は、貯蔵もしくは単離などができる、および受動免疫に使用できるＬＦ特異的抗体を生成するために使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（好ましい実施形態の説明）
ＬＦおよびＭＥＫは活性部位複合体の外側で相互作用するという結論（Ｃｈｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．、上記）に基づいて、本発明者らは、ＬＦは重要な残基での変異の導入が毒性を崩壊させる対応する領域を有しているに違いないと考え付いた。本発明は、ＬＦ媒介性毒性において重要な役割を果たすＬＦのドメインＩＩにおける１群の残基を同定する。部位特異的変異誘発は、そのような同定を達成するための好ましいアプローチであった。そのような１つ以上の部位の存在が明らかになり、そしてＬＦのＭＥＫへの個別結合が存在することにより、タンパク質分解機能とは別個の、この相互作用のインヒビターに焦点をあてる新規のスクリーニング法の開発への道が開かれた。これは、結合および認識機能全部がそこで酵素の触媒／活性部位を介して発生する大多数のプロテアーゼとそれらの標的との相互作用とは相違する。
【００２４】
このクラスター内の残基のＡｌａ置換は、実質的にＬＦ毒性を減少させ、細胞中でのＭＥＫのタンパク質分解を遮断した。これらの残基が一次配列中では連続しておらず、むしろＬＦタンパク質の三次構造内では「感受性」位置であることは注目に値する。つまり、分子の重要な領域は、直鎖状エピトープに対して「立体配座」エピトープのように行動する。
【００２５】
これらの変異の機能試験は、毒性の消失が、ＬＦがＰＡに結合する、膜を越えて転位する、またはインビトロでＭＥＫを開裂する能力の妨害によって引き起こされるのではないことを指摘した。毒性の消失は、むしろＬＦがＭＥＫと相互作用する能力の減少に関連していた。
【００２６】
この残基のクラスターを含有する領域は、ＬＦ−ＭＥＫ結合を崩壊させ、それによってＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解を遮断し、細胞に対するＬＦ毒性の阻害を生じさせるであろう小分子インヒビターの発見および開発にとっての有用な治療標的である。この方法で見いだされた薬物は、天然もしくは兵器化されたＢ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌による感染症、または単離された炭素菌致死毒素分子との接触が及ぼす影響を治療するために使用できよう。
【００２７】
また別の実施形態では、本明細書に記載した変異体ＬＦ分子は、分子の様々な保護エピトープへの免疫を誘導するための被験体へのそれらの投与にはＬＦの毒性作用が付随しないであろうから、ワクチン免疫原として有用である。
【００２８】
以下には、ＬＦの完全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列は配列番号１であり、アミノ酸配列は配列番号２である。この配列は、ドメインＩＩ（これは、２つの領域であるドメインＩＩａおよびＩＩｂから作られている）の２つのセグメントに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示すために下線を引くことによって注記されている。（ＩＩａとＩＩｂの間の配列は、ドメインＩＩＩと呼ばれており、タンパク質レベルでは、一緒に別個の領域を形成すると考えられるドメインＩＩにおいて見いだされるモチーフの一連の不完全リピートを含んでいる）。そこでドメインＩＩは：
（ａ）ドメインＩＩａのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号４）配列
（ｂ）ドメインＩＩｂのヌクレオチド（配列番号５）およびアミノ酸（配列番号６）配列、を含んでいる。
【００２９】
ドメインＩＩａコーディング配列（配列番号３）は、ＬＦ  ＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド８８５〜１１２５由来である。
【００３０】
ドメインＩＩｂコーディング配列（配列番号５）は、ＬＦ  ＤＮＡ（配列番号１）のヌクレオチド１１５７〜１７４９由来である。
【００３１】
ドメインＩＩａアミノ酸配列（配列番号４）は、ＬＦタンパク質（配列番号２）のアミノ酸２９６〜３７５由来である。
【００３２】
ドメインＩＩｂアミノ酸配列（配列番号６）は、ＬＦタンパク質（配列番号２）のアミノ酸４１９〜５８３由来である。
コドンおよびアミノ酸残基はドメインＩＩ（
【００３３】
【化１】
2008515404.tif 000002
2008515404.tif 000003
においてボールド体およびイタリック体で記載されている。ＬＦの別個のアミノ酸配列（配列番号２）は、以下に別個に示されており、以下のように注記されている：
【００３４】
【化２】
2008515404.tif 000004
以下では、ドメインＩＩａおよびＩＩｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、上記の全長ＬＦ配列から「取り除いて」示されている（本発明にとって特に重要なコドン／アミノ酸の注記はボールド体およびイタリック体で記載されている）。
【００３５】
（１）ドメインＩＩａポリペプチド（配列番号４）：
【００３６】
【化３】
2008515404.tif 000005
（２）ドメインＩＩｂポリペプチド（配列番号６）：
【００３７】
【化４】
2008515404.tif 000006
（３）ドメインＩＩａコーディング配列（配列番号３）：
【００３８】
【化５】
2008515404.tif 000007
（４）ドメインＩＩｂコーディング配列（配列番号５）：
【００３９】
【化６】
2008515404.tif 000008
以下のセクションでは、変異させるべき位置は、それらがポリペプチドのリーダー配列（上記の二重下線を引いて示した）を表わすので配列番号２の最初の３３残基がナンバリングから除外されている、上記とはいくらか修飾されたナンバリングシステムを用いて記載した。そこで、以下のリストは、等価（同一）アミノ酸残基を示している
【００４０】
【表１００】
2008515404.tif 000009
そこで、本出願における、特に実施例におけるＬ２９３、Ｋ２９４、Ｒ４９１、Ｌ５１４もしくはＮ５１６およびそれらの部位での変異についてのすべての言及は、配列番号２の位置Ｌ３２６、Ｋ３２７、Ｒ５２４、Ｌ５４７およびＮ５４９各々に関する。当然ながら、および配列番号１のそれらのコーディング配列）。
【００４１】
好ましい変異体はＬ２９３、Ｋ２９４、Ｒ４９１、Ｎ５１６でのアミノ酸置換改変体である。それらの任意の組み合わせもまた意図されており、Ｌ５１４／Ｌ２９３、Ｌ５１４／Ｋ２９４およびＬ５１４／４９１が好ましい。好ましい置換は、ＡｌａもしくはＧｌｙとの置換である。その他の置換は、本発明によって作製できる。同様に、これらの残基の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、または全５つの欠失もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００４２】
本明細書に記載した方法を用いてそのような置換もしくは欠失を作製してそれらを試験する、所望の特性を有するポリペプチド、つまりこれらのＬＦ変異体が減少している、もしくは毒性を有していないようにＭＥＫと生産的に相互作用する能力が減少した、もしくは能力を有していないＬＦ分子を生じさせることを決定することはルーチン試験の問題であろう。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、本明細書に記載したドメインＩＩ変異を含む全長ＬＦ分子だけではなく、それら自体が本明細書に記載した１つ以上の変異を含むドメインＩＩペプチドなどの短い分子もまた含んでいる。好ましい実施例は、以下に記載するスクリーニングアッセイ（結合の阻害についての）において、全長ＬＦ分子の代わりに、単独で、または組み合わせて使用できる配列番号４および配列番号６の変異形である。
【００４４】
（炭疽菌ＬＦの化学誘導体）
本明細書に記載した変異体もしくは改変体に加えて、本発明は、化学修飾もしくは誘導体化されているＬＦポリペプチドを含んでいる。
【００４５】
ＬＦポリペプチドの共有結合修飾は、標的化アミノ酸残基を選択された側鎖もしくは末端残基と反応させることのできる有機誘導体化剤と反応させる工程によって導入することができる。好ましい誘導体は、ＬＦ化学誘導体が結合して、ＭＥＫと生産的に相互作用してＭＥＫタンパク質分解を生じさせる能力を阻害する工程によって変異を模倣する誘導体である。
【００４６】
例えば、リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸もしくは他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの因子との誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる。α−アミノ含有残基を誘導体化するために適切な他の試薬には、メチルピコリニミデートなどのイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピロドキサル；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４ペンタンジオン；およびグリオキシル酸塩とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【００４７】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む１つまたは数種の従来型試薬との反応によって修飾される。そのような誘導体化は、グアニジン官能基の高ｐＫａのために反応がアルカリ条件下で実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リシン基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応することができる。
【００４８】
また別のタイプの化学誘導体は、ワクチン組成物と使用した場合にその免疫原性を改良するために本発明の変異体ＬＦがさらに誘導体化されている誘導体である。そのような誘導体化は、ポリペプチドを（当技術分野において知られている改良された免疫原性特性を備えるコンジュゲートを作製するために）それ自体へ、または様々な水に不溶性の支持体マトリックスもしくは他の高分子キャリアへ架橋結合させるために使用される。カルボキシル側鎖（アスパルチルもしくはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドもしくは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。一般に使用される架橋剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−アジドサリチル酸を備えるエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオン酸塩）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能マレイミドが含まれる。
【００４９】
メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光線の存在下で架橋結合を形成できる光活性化可能な中間体を産生する。または、臭化シアン活性化炭水化物ならびに米国特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４，１９５，１２８号；第４，２４７，６４２号；第４，２２９，５３７号；および第４，３３０，４４０号に記載された反応性基質などの反応性非水溶性マトリックスがタンパク質固定化のために使用される。
【００５０】
（ＬＦ／ＭＥＫ相互作用のインヒビターについてのスクリーニング方法）
これらのクラスター化残基は、ＬＦ毒性のために必要とされるドメインＩＩにおけるＬＦの表面エピトープを規定する。そこでこの部位を閉塞させる小分子は、ＬＦインヒビターとして機能することができ、被験体における炭疽菌感染の作用または炭疽菌致死毒素の他の作用を治療するための薬物として使用できる。そこで、本発明の１つの実施形態は、ＬＦ−ＭＥＫ結合／相互作用のそのようなインヒビターを同定するための方法である。本方法は、試験もしくは候補分子もしくは因子をＬＦおよびＭＥＫとともにインキュベートする工程；任意の結合アッセイを用いて候補分子／因子がＭＥＫの結合を防止する能力を測定する工程を含んでいる。または、ＭＥＫの開裂の阻害についてアッセイし、スクリーニングアッセイの組み合わせ方法に依存して、結合のみ、タンパク質分解のみ、またはその両方を阻害するインヒビターを見いだすことができるように、ＬＦ媒介性タンパク質分解の阻害について独立してアッセイすることが可能である。
【００５１】
以下の実施例および本明細書で言及した参考文献に記載した方法は、そのような測定を使用するための所定の適切な技術を提供する。これらの技術は、当技術分野において従来型で日常的と考えられており、本明細書においてこれ以上詳述する必要はない。その他の方法は、当技術分野においてよく知られている。Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，４８５，９２５号は、因子がＭＥＫのＬＦタンパク質分解を阻害する能力について評価するための方法について記載している。しかし、本発明を作製する以前には、タンパク質分解工程の前の段階でＬＦ／ＭＥＫ相互作用を阻害する化合物の能力を評価するための根拠はなかった。
【００５２】
（薬学的組成物および免疫原性組成物）
本発明はそこで、記載したようなＬＦのドメインＩＩ変異体、または化学誘導体、アナログ、もしくはそれらのミメティックを含む「医薬」組成物もしくは「免疫原性」組成物を医薬上もしくは免疫学的に受容可能な賦形剤と一緒に含んでいる。そこで、用語「治療組成物」には、ＬＦ変異体ポリペプチド、誘導体、アナログ、もしくはミメティック（またはＤＮＡワクチン組成物を使用しなければならない場合は核酸）および治療上容認できるキャリアもしくは賦形剤を含んでいる免疫原性組成物もしくはワクチン組成物ならびに任意の他の医薬品が含まれる。免疫原性組成物もしくはワクチン組成物を調製するための一般的方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ペンシルベニア州イーストン）（最新版）の中に記載されている。
【００５３】
本発明は、抗体反応および任意の他の付随する炭疽菌ＬＦもしくは致死毒素に対する免疫反応性の保護形を誘導するために、被験体、好ましくはヒトを免疫もしくはワクチン接種する工程によって治療する方法を提供する。
【００５４】
免疫原性因子は、ラテックスもしくは金ビーズ、ＩＳＣＯＭなどのビーズに吸着もしくは共役結合させることができる。免疫原性組成物は、免疫原性成分の免疫刺激特性を増強するために免疫原もしくはワクチン調製物に添加できる基質アジュバントを含むことができる。リポソームは、アジュバントであるとも考えられる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｅｓ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９）。タンパク質性免疫原の有効性に加えることができるアジュバントもしくは因子の実施例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルジョン、および水中油型エマルジョンが含まれる。好ましいタイプのアジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および様々のＭＤＰ誘導体および調製物、例えばＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−（β１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＧＭＤＰ）（Ｈｏｒｎｕｎｇ，  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  ２：７−１４）もしくはＩＳＡＦ−１（０．４ｍｇのトレオニル−ムラミルジペプチドを備えるリン酸緩衝液中の５％スクアレン、２．５％のプルロニックＬ１２１、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０；例えば、Ｋｗａｋ，  ＬＷ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ３２７：１２０９−３８を参照）である。
【００５５】
その他の有用なアジュバントは、細菌内毒素、脂質Ｘ、細菌である挫瘡プロピオンバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）もしくは百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の全微生物もしくは細胞以下分画、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニンおよび病院で現在使用されているＱＳ２１（Ｈｅｌｌｉｎｇ，  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５：２７８３−８８；Ｄａｖｉｓ，  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｌｏｏｄ，  ９０：５０９）などのサポニン誘導体（Ｗｈｉｔｅ，  Ａ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ，  ３０３：２０７−２１０）である、またはそれらに基づいている。ＱＳ２１は、南米産の樹木であるキラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のトリテルペングリコシドである（Ｓｏｌｔｙｓｉｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６９０：３９２−５）。その他のアジュバントには、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントが含まれる。多数の他のアジュバントは、例えば、
（ａ）Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ローウェー）
（ｂ）Ｆｒｅｕｎｄの完全もしくは不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト），
（ｃ）Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）−知られている最も古く、ヒトのために承認されているアジュバントの１つである水酸化アルミニウムゲル
（ｄ）Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標ではなくてもよい）および例えば、「ＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）が油、通常は軽液体パラフィン中に溶解させられた脱油レシチンからなる」ことを言及している米国特許第５，０８４，２６９号をさらに言及している米国特許公開第２００５００５８６６７号（２００５年３月１７日）により詳細に規定された水中油型調製物。Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ワールドワイドウエブで「ｖｐｍａｇ．ｃｏ．ｕｋ／ｎｅｗｓ／ａｒｔｉｃｌｅ．ｐｈｐ？ａｒｔｉｃｌｅ＝１４８３０２０７３６．ｈｔｍｌ」のＵＲＬにて）は、それがレシチンで被覆された油ミセルからなると述べている；または
（ｅ）ＡｍｐｈｉｇｅｎおよびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の混合物、のような様々な起源から市販で入手できる。
【００５６】
本治療を必要とする被験体、好ましくはヒトを治療するための好ましい有効量は、体重１ｋｇにつき約１００ｍｇまでの活性化合物の量である。ペプチド、キメラタンパク質もしくはペプチドミメティックの典型的な単回用量は、約１ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、および好ましくは約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。静脈内投与のためには、約０．１ｍｇ〜約７ｇの範囲内の全１日量が好ましい。受動免疫のために有用な抗体の用量は、１０〜１００ｍｇ／ｋｇである。これらの用量は、本発明の開示および最新技術と結び付けて経験的に決定できる。
【００５７】
しかし上記の範囲は、個々の治療レジメンにおける変量の数は大きく、これらの好ましい数値からの相当に大きな偏位が予想されるので、示唆的である。当業者には明白であるように、免疫原性組成物の用量は、治療するために使用される化合物の用量より高い可能性がある。有効量だけではなく有効投与頻度もまた意図される使用によって決定され、当業者であれば過度の実験を行わずに確立できる。各治療のために必要とされる総用量は、複数回投与によって、または単回投与で投与することができる。
【００５８】
塩基性基を含有する本発明の所定の化合物の薬学的に受容可能な酸付加塩は、適切な場合は、当技術分野において知られている方法によって強度もしくは中強度の非毒性、有機もしくは無機酸を用いて形成される。本発明に含まれる酸付加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩および硝酸塩である。酸性基を含有する本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基付加塩は、知られている方法によって有機および無機塩基から調製され、例えば、水酸化カルシウム、ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムなどの非毒性のアルカリ金属およびアルカリ土類塩基、ならびにトリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジン、およびトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどの非毒性有機塩基を含んでいる。
【００５９】
本発明の化合物、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩は、カプセル剤、含浸ウエハース、錠剤などの便宜的剤形または好ましくは注射用調製物中に組み込むことができる。固形もしくは液状の薬学的に受容可能なキャリアを使用できる。
【００６０】
好ましくは、本発明の化合物は、例えば注射もしくは注入によって全身性で投与される。投与は、任意の知られている経路、好ましくは静脈内、皮下、筋肉内、クモ膜下、脳室内、もしくは腹腔内によってでよい。（その他の経路を以下で言及する）。注射剤は、液剤もしくは懸濁剤、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液にするために適合する固体形、またはエマルジョンとしてのいずれかの従来型形態で調製できる。
【００６１】
送達もしくは免疫原性活性を強化するために、本化合物は、当技術分野において知られている方法および化合物を用いて、リポソーム内に組み込むことができる。
【００６２】
ＤＮＡ免疫原は、遺伝子銃を介して、または当技術分野においてよく知られているように筋肉内もしくは皮下注射によって投与される。
【００６３】
薬学的調製物は、製薬化学の従来型技術にしたがって作製される。薬学的組成物は、極めてわずかな量の湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助因子をさらに含有することができる。ペプチドは、注射による投与のために従来型の薬学的に受容可能な非経口ビヒクルを使用して調製される。これらのビヒクルは非毒性および治療的であり、多数の調製物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （１９９０））に陳述されている。賦形剤の非限定的例は、水、食塩液、リンガー液、デキストロース液およびハンクス（Ｈａｎｋ’ｓ）平衡食塩液である。本発明による調製物は、等張性、生理的ｐＨ、および安定性を維持する因子などの少量の添加物をさらに含有することができる。さらに、適切な油性注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与することができる。適切な親油性溶媒もしくはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる因子を含有することができる。任意で、懸濁液は安定剤を含有することができる。
【００６４】
本発明のポリペプチド、核酸およびその他の有用な組成物は、好ましくは凝集物およびその他のタンパク質因子を、好ましくは１．０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、実質的に含んでいない精製形で調製される。
【００６５】
これまでは本発明を一般に説明してきたが、本発明は、例示することによって提供されており、他に特別に規定しない限り本発明を限定することが意図されていない以下の実施例を参照することでより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【００６６】
（実施例Ｉ）
（方法および材料）
（細胞系、培養および試薬）
マウスマクロファージ由来Ｊ７７４Ａ．１およびチャイニーズハムスター卵巣上皮（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞系は、ＡＴＣＣ（バージニア州、マナッサス）から入手した。Ｊ７７４Ａ．１細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％のＦＢＳ、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したハム（Ｈａｍ）のＦ−１２培地中で培養した。両方の細胞系を、３７℃の加湿した５％のＣＯ２インキュベータ内で維持した。
【００６７】
（部位特異的変異誘発）
ＬＦ中のアラニン置換は、プライマー伸長反応を１８分間持続させ、さらにＬＦの高デオキシアデニレートおよびデオキシチミジレート含量（７０％）を遺伝子に反映させるためにデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）ストックを修飾したこと（Ｂｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、上記）を除いて、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用いて製造業者の取扱説明書にしたがって炭疽菌ＬＦ発現ベクターｐＳＪ１１５（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記）内へ変異を導入する工程によって生成した。
【００６８】
部位特異的変異誘発のために使用されたプライマーは、以下の表１に列挙した：
【００６９】
【表１】
2008515404.tif 000010
2008515404.tif 000011
変異は、変異を含有する領域のＤＮＡシーケンシングによって確証した。さらに、所望の変異しか存在しなかったことを確証するために、減少した毒性を証明した全ＬＦをコードする遺伝子を全体としてシーケンシングした。
【００７０】
（タンパク質の発現および精製）
変異誘発したタンパク質は、非メチル化プラスミドＤＮＡを入手するために大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｄｃｍ−１ｄａｍ−菌株ＳＣＳ１１０内へ最初に形質転換させ、その後に炭疽菌ＢＨ４４５の非毒素産生性芽胞形成欠陥性菌株に形質転換させた（Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記によって記載されたように、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【００７１】
分泌されたタンパク質の粗調製物を調製するために、単一コロニーの形質転換細胞を使用して５ｍＬのＦＡ培地に接種した（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。培養は、３７℃で１４〜１６時間にわたり増殖させた。培養上清（２ｍＬ）は、遠心フィルタ（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００Ｋ  ＭＷＣＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、タンパク質を４０μＬのバッファ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＮａＣｌ）中で回収した。各タンパク質の濃度は、１０〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での分離後にクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色ＢＳＡ標準因子（０．５および２．０ｍｇ／ｍＬ）との直接比較によって推定した。
【００７２】
ＬＦおよびＰＡの高純度調製物を作製するために、５０ｍＬの培養を使用して３７℃、ｐＨ７．４でＢｉｏＦｌｏ  １００発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中の５ＬのＦＡ培地へ接種し、他方では３Ｌ／分で空気を噴霧し、ｄＯ２のレベルが５０％未満に低下するにつれて１００ｒｐｍから４００ｒｐｍへ増加するように設定して攪拌した。１７〜１８時間にわたり増殖させた後、遠心（３５００ｇ、３０分間、４℃）によって細胞を除去し、上清を無菌濾過し、１ｆｔ２の３０ＫＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホン膜を備えるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｐｒｅｐ／ｓｃａｌｅ−ＴＦＦカートリッジを用いるタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮し、１ｂａｒの逆圧下で約５０ｍＬ／分で濾液を収集した。
【００７３】
発現したタンパク質は、上記のＰａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．の方法にしたがって、硫酸アンモニウム分画化ならびにフェニルセファロースおよびＱ−セファロースカラムを用いる高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって精製した。各タンパク質の濃度は、ビシンコニン酸法（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、上記）を用いて、およびクマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルのデンシトメトリ分析によって推定した。
【００７４】
組換えヒトＭＥＫ１タンパク質は、ｐＶＬ１３９３ベクター主鎖（ｐＫＭ６３６）内へライゲートされたヒトＭＥＫ１を含有するバキュロウイルスに感染させられていたスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ：Ｓｆ９）細胞中で発現させた。タンパク質は溶解細胞の上清から単離し、２０ｍＬのＱ−セファロースカラムから０〜５００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配で１０カラム容量にわたり溶出させた。ＭＥＫタンパク質を含有するピーク分画をプールし、１０ｍＬのＮｉ−ＮＴＡカラム上へ直接装填した。３０ｍＭのイミダゾールでカラムを洗浄した後、１００ｍＭのイミダゾールを用いてＭＥＫを溶出させた。この時点で、溶出液を３μＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｎＣｌ２、および２ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）へ調整し、さらに２５単位のプロテインホスファターゼ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州ベバリー）を反応液に添加し、これを３０℃で４時間にわたりインキュベートした。次にサンプルを濃縮し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴおよび１０％グリセロールのバッファ中の３２０ｍＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ２００カラムに適用した。
【００７５】
ＥＲＫ２タンパク質を大腸菌中で発現させ、以前に記載されたように（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｃｈｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．、上記）ＦＰＬＣによって精製した。Ａｃｔｉｖｅ  Ｂ−Ｒａｆ（Δ１−４１５）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃから購入した。
【００７６】
（細胞毒性アッセイ）
細胞は９６ウエルマイクロプレート内で７０％のコンフルエンスへ増殖させた。溶解を誘導するために、細胞はＬｅＴｘ［ＰＡ（０．１μｇ／ｍＬ）＋ＬＦ（０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ）］を含有する培養培地で処理し、３７℃で３時間にわたりインキュベートした。実験の終了時に、細胞の生存をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイ（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ワイオミング州マディソン）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して決定した。５７０ｎｍの吸光度で５０％最大減少を引き起こすために必要としたＬＦの濃度（ＥＣ５０）は、線形回帰によって決定した。
【００７７】
（ＰＡ結合および転位アッセイ）
ＰＡ結合および転位アッセイは、Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．（上記）によって記載されたように実施し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ  ３１００ＴＲ液体シンチレーションカウンタを用いて定量した。
【００７８】
（ＭＥＫタンパク質分解およびＢ−Ｒａｆキナーゼアッセイ）
細胞中でのＭＥＫ開裂をアッセイするために、本発明者らは、０．１μｇ／ｍＬのＰＡおよび０．０１μｇ／ｍＬのＬＦもしくはＬＦ変異体とともに２時間にわたりインキュベートしたＪ７７４Ａ．１マクロファージの溶解物を作製した。溶解物は、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＭＥＫ２のＮＨ２もしくはＣＯＯＨ末端に対して立てられた抗体（Ｎ−２０およびＣ−１６、１：１０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いて免疫ブロッティングした。インビトロＭＥＫ開裂アッセイは、以前に記載されたように（Ｃｈｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．、上記）ＭＥＫに対して立てられた抗体（抗ＭＥＫ１／２、１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いる免疫ブロッティングを使用して実施した。または、ＭＥＫ−開裂は、ＬＦ活性についての読み出しとしてＭＥＫ活性（すなわち、ＥＲＫリン酸化）を用いて、一定濃度のＭＫＥを様々な量のＬＦと反応させる工程によって間接的にアッセイした。手短には、０．３５μｇのＭＥＫ１を、様々な量のＬＦもしくは変異体ＬＦ（０．００２μｇ〜１０μｇ）の存在下および総量１０μＬ中で３μＬの開裂バッファ（２０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ｐＨ７．２）、２５ｍＭのβ−グリセロリン酸、５ｍＭのエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、および１ｍＭのジチオトレイトール）へ添加した。これらの開裂反応は、３０℃で１０分間インキュベートした。氷上で２分間冷却した後、１０μＬのキナーゼバッファ（［γ３２Ｐ］ＡＴＰを用いて９：１に希釈した０．５ｍＭのＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社；１０ｍＣｉ／ｍＬ、３，０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ））、７５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．４μｇのＥＲＫ２］を添加し、サンプルを３０℃で１０分間インキュベートした。氷上で２分間冷却した後、１容量の２×ＳＤＳ−バッファを添加し、サンプルを沸騰水浴中で３分間インキュベートした。次に１０％ゲル上でのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法によりタンパク質を分離し、Ｆｕｊｉ  ＦＬＡ−５０００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用してＥＲＫ２リン酸化を定量した。
【００７９】
Ｂ−Ｒａｆキナーゼアッセイは、以前に記載されたように（Ｃｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．、上記）実施し、Ｆｕｊｉ  ＦＬＡ−５０００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量した。結果は、ＬＦの不在下でリン酸化へ標準化し、対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した。
【００８０】
（実施例ＩＩ）
（クラスター化脂肪族残基の部位特異的変異誘発）
ＬＦＩＲ内の多数の保存された残基は長鎖脂肪族残基であるので、本発明者らは、ＬＦ上の相補領域はクラスター化脂肪族残基を含有しており、その中にＭＥＫのＮＨ２末端が適合する溝の近くに位置するであろうと考えた。ＬＦの表面プロットは、この要件を満たす脂肪族残基の３つの別個のクラスターを示している。第１は、ドメインＩＩ内に存在する脂肪族残基（Ｉ２９８、Ｉ３００、Ｉ４８５、Ｌ４９４、およびＬ５１４）から構成され、触媒溝の一端に存在する。第２（残基Ｉ３２２、Ｉ３４３、Ｌ３４９、Ｌ３５７、およびＶ３６２）は、ドメインＩＩＩ内の第２、第３、および第４不完全リピートの要素から構成され、触媒溝の反対側の末端に存在する。ドメインＩＶ内に存在する第３クラスター（Ｌ４５０、Ｉ４６７、Ｌ６７７、Ｌ７２５、およびＬ７４３）は、ＭＥＫのＮＨ２末端を受け入れる触媒溝に隣接して存在する。
【００８１】
これを試験するために、部位特異的変異誘発を使用してアラニンをこれらの残基の各々と置換させ、次にマクロファージ毒性アッセイ（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ、上記）を用いてこれらの変異がＬＦ活性に及ぼす作用を評価した。吸光度／細胞生育性における５０％最大減少（ＥＣ５０）を引き起こすために必要とされる野生型ＬＦの粗調製物の平均濃度は、１５．６±１６．７ｎＭであった。試験した脂肪族残基の大多数の変異は、毒性の５分の１未満の減少を引き起こし（１２．９ｎＭ≦ＥＣ５０≦８４．３ｎＭ；図２ａ）、毒性における中立的もしくは境界的役割を有すると判定された。これとは対照的に、Ｌ５１４のアラニン置換は、毒性の５０分の１を超える減少を引き起こした（ＥＣ５０＝８１６±１３７ｎＭ；図２ａ）。
【００８２】
ＬＦのこの領域内の他の残基がＬＦ毒性において役割を果たすかどうかを決定するために、Ｌ５１４の近位に存在した表面露出残基でアラニン置換を作製した。これらのうち、Ｌ２８５、Ｒ２９０、Ｑ２９７、Ｅ５１５、およびＫ５１８は、毒性における中立的もしくは境界的役割を有すると判定された（４０ｎＭ≦ＥＣ５０≦６５ｎＭ；図２ｂ）。これとは対照的に、Ｌ２９３、Ｋ２９４、Ｒ４９１、もしくはＮ５１６でのアラニン置換は、毒性の１０分の１を超える減少を引き起こした（１４１ｎＭ≦ＥＣ５０≦４１９ｎＭ；図２ｂ）。興味深いことに、Ｌ５１４とＬ２９３、Ｋ２９４、もしくはＲ４９１のいずれかとの対の変異は完全にＬＦの毒性を排除したが（図２ｃ）、その代わりにＬ５１４およびＮ５１６の対の変異はＮ５１６Ａ単独に匹敵する毒性を生じさせた（ＥＣ５０＝Ｌ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａについての２００±９８ｎＭ対Ｎ５１６Ａについての１６４±１３ｎＭ；図２ｃ）。これらの結果は、これらの残基のアラニン置換によって引き起こされたドメインＩＩの表面組成のかすかな動揺は、ＬＦ毒性に実質的な影響を及ぼす可能性があることを示している。
【００８３】
（実施例ＩＩＩ）
ドメインＩＩにおける点変異は、ＰＡに対するＬＦの親和性およびＬＦが血漿膜を越えて転位する能力を減少させない。
【００８４】
ＬＦは、細胞有糸分裂活性化タンパク質キナーゼキナーゼのＮＨ２末端を特異的に開裂させるＺｎ２＋−金属プロテアーゼである。ドメインＩＩ内のクラスター化残基がＬＦタンパク質分解活性のために必要とされるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＡ（０．１μｇ／ｍＬ）＋野生型ＬＦまたはこの領域内にアラニン変異を含有するＬＦ（０．０１μｇ／ｍＬ）を用いて２時間にわたり処理されていたＪ７７４Ａ．１マクロファージ内で免疫ブロッティングすることによってＭＥＫ２の開裂についてアッセイした。試験したタンパク質中では、ＭＥＫ２のＮＨ２末端を開裂することができたのは野生型ＬＦおよび毒性に中立的もしくは限界的作用を有していたアラニン変異を含有するＬＦだけであった（図３ａ）。これとは対照的に、Ｌ２９３Ａ、Ｋ２９４Ａ、Ｒ４９１Ａ、Ｌ５１４Ａ、およびＮ５１６Ａならびに二重変異体Ｌ２９３Ａ／Ｌ５１４Ａ、Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４Ａ、Ｒ４９１Ａ／Ｌ５１４Ａ、およびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６ＡはＭＥＫ２開裂を全く引き起こさなかった、または減少させた。これらの結果は、ドメインＩＩのこれらの残基しかＬＦ毒性において重要な役割を果たさないという本発明者らの観察と一致している。しかし、先行するアッセイはセルベースであり、ＬＦがＰＡに結合する、エンドソーム膜を越えて転位する、またはＭＥＫを開裂する能力の減少によって引き起こされる減少した毒性間を識別しない。それによりこれらの変異が毒性を妨害するという機序を解明するために、その後の分析を実施した。
【００８５】
本発明者らの変異体ＬＦがＰＡに結合して膜を越えて転位できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］−Ｍｅｔ−標識ＬＦを用いて結合および転位アッセイを実施した。これらのアッセイではＬＦおよびＰＡ６３をその温度ではエンドサイトーシスが発生しない４℃でＣＨＯ−Ｋ１細胞上のＡＮＴＸＲに結合させた。ＬＦ（Ｙ２３６Ａ）でアラニン置換を含有するＬＦは陰性コントロールであった。ＬＦは、以前にＰＡに結合できないことが証明されていた。
【００８６】
非結合タンパク質を洗い流した後、細胞は低ｐＨもしくは中性ｐＨバッファを用いて処理した。低ｐＨバッファはエンドソーム環境を模倣しており、ＰＡ６３孔形成およびＬＦの細胞質ゾルへのその後の転位を誘発する。この後、任意の表面結合標識を取り除くために細胞をプロナーゼにさらし、洗浄し、溶解させ、３５Ｓ含量についてアッセイした。図３ｂおよび３ｃに示したように、野生型および変異体ＬＦは、同等にＰＡ６３へ結合し、血漿膜を越えて転位することができた。公表された報告書（Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．、上記）と一致して、ＬＦ（Ｙ２３６Ａ）は、同一アッセイにおいてＰＡ６３に感知できるほどには結合しなかった。野生型および変異体ＬＦがＰＡに結合する能力は、ＬＦおよびトリプシンでニックされたＰＡ（ＰＡ６３）を用いる非変性ゲルシフトアッセイによって独立して確証した（図示していないが、図５参照）。これらの結果は、変異体ＬＦにおける毒性の消失は、ＰＡに結合する能力の消失によっても細胞膜を越えて転位する不能力によっても説明できないことを示している。
【００８７】
（実施例ＩＶ）
（ドメインＩＩ内の点変異はＬＦタンパク質分解活性を変化させない）
先行するアッセイはタンパク質の相対的粗調製物を用いて実施されたが、本発明者らが観察した結果は変異体ＬＦ上の不純物の作用によって引き起こされたもので、野生型ＬＦ活性によって引き起こされたのではない可能性が残った。これを試験するために、本発明者らは、野生型ＬＦおよび選択されたＬＦ二重変異体をＦＰＬＣによって精製し、マクロファージ細胞毒性アッセイを用いてこれらの調製物の毒性を再評価した。野生型ＬＦのＥＣ５０は１０．９±５．９ｎＭ（図４ａ）であったが、ＦＰＬＣ精製Ｌ５１４Ａは低毒性であることが証明された（ＥＣ５０＞１，０００ｎＭ）。タンパク質の粗調製物について言及したように、Ｌ５１４ＡにおけるＮ５１６についての第２アラニン残基の置換は、この変異体の毒性を部分的に回復させた（ＥＣ５０＝４２７±７４ｎＭ）。ＦＰＬＣ精製Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４ＡおよびＲ４９１／Ｌ５１４Ａは、非毒性であった（ＥＣ５０＞＞１０，０００ｎＭ）。ＦＰＬＣ精製ＬＦおよびＬＦ変異体は、同一タンパク質の粗調製物の毒性に類似する毒性を有しているので、それらの減少した毒性が不純物の存在に寄与することはありそうもない。
【００８８】
現時点で、分析は、ドメインＩＩのクラスター化残基での点変異がＬＦのタンパク質分解活性を減少させることを指摘した。これを直接的に試験するために、ＦＰＬＣ精製野生型および変異体ＬＦのタンパク質分解活性を免疫ブロッティングによってインビトロで試験した。コントロールは、以前に非毒性である（Ｋｌｉｍｐｅｌ，  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３：１０９３−１１００）およびタンパク質分解的に不活性である（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８、上記））と特徴付けられているＺｎ２＋結合ドメイン（Ｅ６８７Ｃ）内で点変異を含んでいるＬＦのＦＰＬＣ精製調製物であった。０．２μｇの野生型ＬＦと０．２μｇのＮＨ２末端Ｈｉｓ６−タグ付けＭＥＫ１とのインキュベーションは、以前に記載したようにＮＨ２末端タンパク質分解と一致して、ＭＥＫ１の電気泳動度を増加させたが、Ｅ６８７Ｃは増加させなかった。予想外にも、変異体ＬＦはいずれもＭＥＫに対する減少したタンパク質分解活性を示さなかった（図４ｂ）。しかし、この開裂アッセイの分類は、本質的に定性的であり、タンパク質分解活性の部分的減少を解明することはできない。
【００８９】
変法開裂アッセイは、一定量のＭＥＫの存在下でＬＦの濃度を変化させながら実施し、ＥＲＫに対するＭＥＫのキナーゼ活性をタンパク質分解の間接的な、しかし定量可能な尺度として使用した。野生型ＬＦは、ＭＥＫ活性の強固な阻害を引き起こし、０．５±０．３のモル比（ＬＦ：ＭＥＫ）でＥＲＫリン酸化の５０％抑制を生じさせた（図４ｂ）。これとは対照的に、コントロールＥ６８７Ｃは、ＭＥＫ活性に影響を及ぼさなかった（過剰に存在する場合を除く）。これらの変異体の観察された毒性と一致して、Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４ＡおよびＲ４９１Ａ／Ｌ５１４Ａは顕著に減少したタンパク質分解活性を示し、各々１．９±１．１および１．６±０．４のモル比でＥＲＫリン酸化の５０％抑制を示した。予想外にも、Ｌ５１４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａは、各々０．９±０．１および０．８±０．３のモル比でＥＲＫリン酸化の５０％抑制を引き起こし、野生型活性に匹敵するタンパク質分解活性を有していた。そこで、ドメインＩＩのクラスター化点変異はＬＦ毒性を減少させるが、この消失は全体として減少したタンパク質分解活性に帰することはできない。
【００９０】
上記の観察についてのまた別の説明は、減少したＬＦ毒性はタンパク質分解活性とは無関係の基質親和性の消失によって引き起こされる可能性があるというものである。ＭＥＫへのＬＦ結合についての直接アッセイの代わりに、本発明者らは以前に、ＬＦがＭＥＫのＢ−Ｒａｆリン酸化を競合的に阻害できること、そしてこの阻害がそのタンパク質分解活性とは無関係であることを証明した。これらの結果の解釈は、ＬＦおよびＢ−ＲａｆがＭＥＫ上の隣接もしくは重複エピトープに結合したことであった。ドメインＩＩのクラスター化残基での点変異がＭＥＫに対するＬＦの親和性を減少させたかどうかを決定するために、インビトロＢ−Ｒａｆ媒介性ＭＥＫリン酸化をＬＦもしくはＬＦ変異体の存在下でアッセイした。以前に報告したように、ＬＦはＢ−ＲａｆによるＭＥＫリン酸化の約３５％阻害を引き起こしたが、Ｅ６８７ＣがＢ−ＲａｆによるＭＥＫリン酸化も阻害したので、この作用はＬＦタンパク質分解活性とは無関係であった（図４ｃ）。興味深いことに、Ｌ５１４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａは、ＭＥＫリン酸化への野生型ＬＦが及ぼす作用に類似する作用を有していたが、Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４ＡおよびＲ４９１Ａ／Ｌ５１４Ａは有意に減少した阻害を示し、Ｒａｆ媒介性ＭＥＫリン酸化を各々１０±７％（ｐ＝０．０１４、ｄｆ＝６）および２±５％（ｐ＝０．００２６、ｄｆ＝６）しか遮断しなかった（図４ｃ）。これらの結果は、ドメインＩＩのクラスター化残基における点変異の結果として生じた減少したＬＦ毒性が、一部にはＭＥＫと相互作用する減少した能力に起因する可能性があることを示していた。
【００９１】
（実施例Ｉ〜ＩＶについての考察）
ＬＦは、炭疽菌毒素の主要ビルレンス因子である（Ｃａｔａｌｄｉ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４：１１１１−１７；Ｐｅｚａｒｄ，  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｉｎｆｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ５９：３４７２−７７；Ｐｅｚａｒｄ，  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７３９：２４５９−６３）。現在までに、その唯一同定された基質は、タンパク質キナーゼのＭＥＫファミリーのメンバーである。結果として、ＬＦとＭＥＫとの間の相互作用は、炭疽菌の病因を理解するため、ならびに標的とする治療因子の設計における重要な問題である。上記に記載したこの試験は、ＭＥＫとの相互作用のために必要とされるＬＦの領域を同定するために実施された。出発点として、本発明者らは、ＬＦＩＲ内の多数の保存された残基は長鎖脂肪族残基であるので、それが結合しているＬＦの任意の領域は、（ｉ）表面露出脂肪族残基のクラスターを含有し、そして（ｉｉ）そこで活性部位複合体が形成するであろう触媒溝に隣接して存在するであろうと推論した。これらの推定の生理学的重要性とは無関係に、この仮説の試験は、アラニン残基と置換されると、ＬＦ毒性における実質的な減少を生じさせたドメインＩＩにおける単一残基（Ｌ５１４）の同定をもたらした。Ｌ５１４の近位でのまた別のアラニン置換は、同様にＬＦ毒性において役割を果たす４つの追加の残基を同定した。一次配列内では離れているが、ＬＦの三次構造はドメインＩＩＩとＩＶとの間に形成される溝の一方の端に存在して活性部位を含有する集束領域内でこれらの５つの残基を並ばせている。
【００９２】
この領域はＬＦ毒性においてどのような役割を果たすのであろうか？  １つの重要な観察は、変異体ＬＦ（すなわち、Ｌ５１４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａ）はセルベースアッセイにおいてＭＥＫを開裂できなかったが、それらはインビトロでは開裂したことである。これは、これらの変異体が基質であるＭＥＫに遭遇する状況に感受性であることを示している。細胞中では、ＭＥＫの空間分布および接近性はＭＰ１（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９Ｓ）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１６６８−１６７１）およびＪＩＰ−ｌ（Ｗｈｉｔｍａｒｓｈ，  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６７１−７４）などのスカフォールディングタンパク質によって影響を受ける。さらに、細胞ＭＥＫは翻訳後に（例えばリン酸化によって）修飾することができ、それらの同族ＭＡＰＫ並びにＢ−Ｒａｆなどの他の調節分子と結合することができる。これらの因子のいずれかは、細胞中のＭＥＫに結合して開裂させる変異体ＬＦの能力を制限することができる。実際に、ＭＥＫ１スカフォールディングタンパク質であるＭＰ１はインビトロでは組換えＭＥＫ１およびＭＥＫ２の両方に結合できるが、細胞中ではＭＥＫ１にしか結合できない（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。本発明は潜在的機序によって結び付けられることは意図していないが、本観察の最も単純な解釈は、本明細書で同定した領域が、ＬＦがＭＥＫとの生産的複合体へ結合するために必要な部位を規定することにある。いくつかの観察所見は、この概念を支持している：（ｉ）変異の作用は特異的であった；この領域内の変異だけがＬＦ毒性を減少させ、クラスターＩＩもしくはＩＩＩ内の変異はＬＦ毒性を減少させなかった。（ｉｉ）減少した毒性には、細胞内のＭＥＫ２の減少したタンパク質分解が付随した、（ｉｉｉ）この領域内の変異は「他の」機能、すなわち、ＰＡへの結合または細胞膜を越えるＬＦの転位を変化させなかった、（ｉｖ）ＬＦ変異体であるＬ５１４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａは、野生型ＬＦに匹敵するインビトロタンパク質分解活性を有していた、（ｖ）ＬＦ変異体Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４ＡおよびＲ４９１Ａ／Ｌ５１４Ａは、ＭＥＫのＢ−Ｒａｆリン酸化を競合的に阻害する減少した能力を提示する、および（ｖｉ）ドメインＩＩ上で同定された領域は活性部位とは空間的に別個であるので、基質タンパク質分解に直接的に関与する可能性はないと思われる。変異体ＬＦはＰＡに結合して細胞内へ内在化する能力を維持しただけではなく、さらに（Ｌ５１４ＡおよびＬ５１４Ａ／Ｎ５１６Ａの場合は）野生型レベルのタンパク質分解活性を有していたので、説明は、変異が非特異的作用を備えるＬＦにおける大きな構造的変化を誘導するということである。
【００９３】
この領域がＭＥＫとの生産的複合体内へのＬＦの結合を促進することに果たす正確な役割について理解するためには、詳細な研究が必要とされる。この領域は、ＬＦを細胞内のＭＥＫへ方向付けるために必要となることがある。この場合には、ドメインＩＩの領域内の変異は、ＬＦがＭＥＫと共局在化するタンパク質と結合する能力を減少させるであろう。または、この領域はＭＥＫに結合する際に直接的な役割を果たす可能性がある。後者の可能性は、ＬＦ変異体Ｋ２９４Ａ／Ｌ５１４ＡおよびＲ４９１Ａ／Ｌ５１４Ａが、ＭＥＫのＢ−Ｒａｆリン酸化を競合的に阻害する減少した能力を提示するという観察によって支持されている。さらに、間接的な証拠は、ＬＦおよびＭＥＫが活性部位の外側の部位で相互作用するという結論の見解を支持している。ＬＦの結合パートナーを同定するために酵母ツーハイブリッド分析を使用して、Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記）は、ＮＨ２末端開裂部位が欠如するＭＥＫ２をコードするｃＤＮＡを単離した。さらに、本発明者および同僚らは以前に、ＭＥＫのＬＦ媒介性タンパク質分解のために必要とされるＭＥＫ１のＣ末端に位置する保存された領域の存在を証明した（Ｃｈｏｐｒａ，  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３、上記）。
【００９４】
最近の出版物は、ＬＦ活性の小分子インヒビターとして使用するために適合する主要化合物を同定している（Ｄｅｌｌ’Ａｉｃａ，  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ５：４１８−２２；Ｍｉｎ，  ＤＨ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：７１７−２３；Ｔｕｒｋ，  ＢＥ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１：６０−６；Ｔｏｎｅｌｌｏ，  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８６）。これらの分子は、ＭＥＫ上のＮＨ２末端開裂部位を模倣する最適化ペプチド基質を使用するＬＦ開裂（タンパク質分解）アッセイによって最初に同定された。しかし、本明細書で示したように、ＭＥＫの効率的なタンパク質分解のためにはＬＦおよびＭＥＫの両方の上の活性部位複合体外の部位が必要とされる。
【００９５】
そこで、本発明によると、新規でより効果的な炭疽菌治療薬は、これらの残基によって規定されたＬＦの領域を標的とする、そして単独で、またはＬＦの活性部位を標的とする同定された分子と組み合わせてのどちらかで使用される分子である。
【００９６】
上記に言及した参考文献は、特別に組み込まれていてもいなくても、本明細書における言及によってすべてが組み込まれる。
【００９７】
これまで本発明を十分に記載してきたが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、および過度の実験を行なわずに広範囲の同等パラメータ、濃度、および条件内で同一のことを実施できることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】脂肪族残基を強調している炭疽菌ＬＦの表面プロット図。ＬＦの空間充填プロット図はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（著作権）フリーウエアを用いて作製した。脂肪族残基が同定され、これらが触媒溝に隣接する３つのクラスター（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩと表示）に分類されることが見いだされた。残基は、ロイシンについては緑色、イソロイシンについては青色、およびバリンについてはピンクにカラー表示されている。ＭＥＫのＮＨ２末端は、黒色で表示されている。
【図２Ａ】変異したＬＦの毒性。変異ＬＦの毒性は、マクロファージ溶解アッセイを用いて測定した。細胞生育性における５０％の最大減少（ＥＣ５０）を誘発するために必要とされる（ａ）クラスターＩ〜ＩＩＩにおける脂肪族残基のアラニン変異、および（ｂ）Ｌ５１４の近くに位置する残基のアラニン変異を含有するＬＦタンパク質の濃度は、内挿法によって決定し、各々独立して精製したタンパク質のバッチを用いて実施した少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。二重変異体の毒性もまた、マクロファージ溶解アッセイ（ｃ）を用いて測定し、独立して精製したタンパク質のバッチを用いた少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。
【図２Ｂ】変異したＬＦの毒性。変異ＬＦの毒性は、マクロファージ溶解アッセイを用いて測定した。細胞生育性における５０％の最大減少（ＥＣ５０）を誘発するために必要とされる（ａ）クラスターＩ〜ＩＩＩにおける脂肪族残基のアラニン変異、および（ｂ）Ｌ５１４の近くに位置する残基のアラニン変異を含有するＬＦタンパク質の濃度は、内挿法によって決定し、各々独立して精製したタンパク質のバッチを用いて実施した少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。二重変異体の毒性もまた、マクロファージ溶解アッセイ（ｃ）を用いて測定し、独立して精製したタンパク質のバッチを用いた少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。
【図２Ｃ】変異したＬＦの毒性。変異ＬＦの毒性は、マクロファージ溶解アッセイを用いて測定した。細胞生育性における５０％の最大減少（ＥＣ５０）を誘発するために必要とされる（ａ）クラスターＩ〜ＩＩＩにおける脂肪族残基のアラニン変異、および（ｂ）Ｌ５１４の近くに位置する残基のアラニン変異を含有するＬＦタンパク質の濃度は、内挿法によって決定し、各々独立して精製したタンパク質のバッチを用いて実施した少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。二重変異体の毒性もまた、マクロファージ溶解アッセイ（ｃ）を用いて測定し、独立して精製したタンパク質のバッチを用いた少なくとも３回の実験の平均値±バッチ間の標準偏差として提示した。
【図３Ａ】点変異がＬＦ機能に及ぼす作用。（ａ）点変異がマクロファージ中のＬＦのタンパク質分解活性に及ぼす作用は、ＭＥＫ２のＮＨ２末端［ＭＥＫ（ＮＴ）］に向けられた抗体を用いて、毒素処理した（０．１μｇ／ｍＬのＰＡ、０．０１μｇ／ｍＬのＬＦを用いて２時間）Ｊ７７４Ａ．１細胞の溶解液を免疫ブロッティングすることによって評価した。装填および一様なタンパク質発現について制御するために、これらのブロットは、ＭＥＫ２のＣＯＯＨ末端［ＭＥＫ２（ＣＴ）］に向けられた抗体を用いてストリッピングおよび再精査した。ＭＥＫ２を開裂することができたのは、野生型ＬＦおよび毒性に中立的もしくは限界的作用を有していたアラニン変異を含有するＬＦだけであった。表示した結果は、３回の実験を代表している。（ｂ）本発明者らの変異体ＬＦがＰＡに結合できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、結合３５Ｓは液体シンチレーションカウンタを用いて定量した。ＰＡに結合できないことが以前に証明されているＬＦ（Ｙ２３６Ａ）（Ｌａｃｙ，  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３００６−１０）を陰性コントロールとして使用した。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、細胞に結合した野生型ＬＦに対する百分率±標準偏差として提示した。（ｃ）本発明者らの変異体ＬＦが膜を越えて移動できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］メチオニン標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、細胞は低ｐＨもしくは中性ｐＨバッファを用いて処理した。低ｐＨバッファはエンドソーム環境を模倣しており、ＰＡ６３孔形成およびＬＦの細胞質ゾルへのその後の転位を誘発する。この後、細胞は任意の表面結合標識を取り除くためにプロナーゼを用いて、または用いずに処理し、洗浄し、溶解させ、３５Ｓ含量についてアッセイした。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、プロナーゼを用いて処理されていなかった細胞内に組み込まれた標識に対する百分率±標準偏差として提示した。
【図３Ｂ】点変異がＬＦ機能に及ぼす作用。（ａ）点変異がマクロファージ中のＬＦのタンパク質分解活性に及ぼす作用は、ＭＥＫ２のＮＨ２末端［ＭＥＫ（ＮＴ）］に向けられた抗体を用いて、毒素処理した（０．１μｇ／ｍＬのＰＡ、０．０１μｇ／ｍＬのＬＦを用いて２時間）Ｊ７７４Ａ．１細胞の溶解液を免疫ブロッティングすることによって評価した。装填および一様なタンパク質発現について制御するために、これらのブロットは、ＭＥＫ２のＣＯＯＨ末端［ＭＥＫ２（ＣＴ）］に向けられた抗体を用いてストリッピングおよび再精査した。ＭＥＫ２を開裂することができたのは、野生型ＬＦおよび毒性に中立的もしくは限界的作用を有していたアラニン変異を含有するＬＦだけであった。表示した結果は、３回の実験を代表している。（ｂ）本発明者らの変異体ＬＦがＰＡに結合できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、結合３５Ｓは液体シンチレーションカウンタを用いて定量した。ＰＡに結合できないことが以前に証明されているＬＦ（Ｙ２３６Ａ）（Ｌａｃｙ，  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３００６−１０）を陰性コントロールとして使用した。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、細胞に結合した野生型ＬＦに対する百分率±標準偏差として提示した。（ｃ）本発明者らの変異体ＬＦが膜を越えて移動できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］メチオニン標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、細胞は低ｐＨもしくは中性ｐＨバッファを用いて処理した。低ｐＨバッファはエンドソーム環境を模倣しており、ＰＡ６３孔形成およびＬＦの細胞質ゾルへのその後の転位を誘発する。この後、細胞は任意の表面結合標識を取り除くためにプロナーゼを用いて、または用いずに処理し、洗浄し、溶解させ、３５Ｓ含量についてアッセイした。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、プロナーゼを用いて処理されていなかった細胞内に組み込まれた標識に対する百分率±標準偏差として提示した。
【図３Ｃ】点変異がＬＦ機能に及ぼす作用。（ａ）点変異がマクロファージ中のＬＦのタンパク質分解活性に及ぼす作用は、ＭＥＫ２のＮＨ２末端［ＭＥＫ（ＮＴ）］に向けられた抗体を用いて、毒素処理した（０．１μｇ／ｍＬのＰＡ、０．０１μｇ／ｍＬのＬＦを用いて２時間）Ｊ７７４Ａ．１細胞の溶解液を免疫ブロッティングすることによって評価した。装填および一様なタンパク質発現について制御するために、これらのブロットは、ＭＥＫ２のＣＯＯＨ末端［ＭＥＫ２（ＣＴ）］に向けられた抗体を用いてストリッピングおよび再精査した。ＭＥＫ２を開裂することができたのは、野生型ＬＦおよび毒性に中立的もしくは限界的作用を有していたアラニン変異を含有するＬＦだけであった。表示した結果は、３回の実験を代表している。（ｂ）本発明者らの変異体ＬＦがＰＡに結合できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］Ｍｅｔ標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、結合３５Ｓは液体シンチレーションカウンタを用いて定量した。ＰＡに結合できないことが以前に証明されているＬＦ（Ｙ２３６Ａ）（Ｌａｃｙ，  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３００６−１０）を陰性コントロールとして使用した。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、細胞に結合した野生型ＬＦに対する百分率±標準偏差として提示した。（ｃ）本発明者らの変異体ＬＦが膜を越えて移動できるかどうかを試験するために、［３５Ｓ］メチオニン標識ＬＦおよびＬＦ変異体を４℃、ｐＨ７．０でＣＨＯ細胞とインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、細胞は低ｐＨもしくは中性ｐＨバッファを用いて処理した。低ｐＨバッファはエンドソーム環境を模倣しており、ＰＡ６３孔形成およびＬＦの細胞質ゾルへのその後の転位を誘発する。この後、細胞は任意の表面結合標識を取り除くためにプロナーゼを用いて、または用いずに処理し、洗浄し、溶解させ、３５Ｓ含量についてアッセイした。表示した結果は、少なくとも３回の実験の平均値であり、プロナーゼを用いて処理されていなかった細胞内に組み込まれた標識に対する百分率±標準偏差として提示した。
【図４Ａ】精製ＬＦおよびＬＦ二重変異体の毒性およびタンパク質分解活性。（図４ａ）  野生型ＬＦおよび選択されたＬＦ二重変異体が高速液体クロマトグラフィによって精製され、それらの毒性がマクロファージ−細胞毒性アッセイを用いて再評価されたことを記載している。Ｊ７７４Ａ．１細胞は、方法のセクションに記載したように、ＰＡに様々な濃度の野生型ＬＦ（ｘ）およびＬＦ（Ｌ５１４Ａ）ならびにＬ５１４およびＮ５１６、Ｌ５１４およびＫ２９４、またはＬ５１４およびＲ４９１の対のアラニン変異を含有するＬＦを加えたもので処理した。細胞生育性は、３時間の処理後にＡＱアッセイによって評価され、５回の実験の平均値±標準偏差として提示した。
【図４Ｂ】精製ＬＦおよびＬＦ二重変異体の毒性およびタンパク質分解活性。（図４ｂ）  Ｈｉｓ６−タグ付け野生型ＭＥＫ１（０．２μｇ）が３０℃で１もしくは５分間にわたり野生型ＬＦもしくはＬＦ変異体（０．２μｇ）とともにインキュベートされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質が分離され、ヒトＭＥＫ１の残基２１６〜２３３に対して立てられた抗体を用いて免疫ブロッティングされた結果を示している。ＬＦ（コントロール）と反応しない、または不活性ＬＦ（Ｅ６８７Ｃ）と反応するＭＥＫ１は、陰性コントロールとして含まれている。ＭＥＫ１の開裂は、Ｈｉｓ６−タグならびにＭＥＫ１のＮＨ２末端のタンパク質分解性除去後の増加した電気泳動移動度によって指示される。
【図４Ｃ】精製ＬＦおよびＬＦ二重変異体の毒性およびタンパク質分解活性。（図４ｃ）  ＬＦ活性についての読み出しとしてＭＥＫ活性（すなわち、ＥＲＫリン酸化）を用いて、ＬＦの量を変化させながら（０．００２〜１０μｇ）一定濃度のＭＥＫ（０．３５μｇ）の存在下で実施されたインビトロＭＥＫタンパク質分解アッセイの結果を示した図である。ＥＲＫリン酸化は、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量した。縦座標；各実験においてＬＦの不在下で入手された数値を制御するために標準化したＥＲＫリン酸化。横座標；ＭＥＫ１に対する野生型ＬＦ、ＬＦ（Ｅ６８７Ｃ）、およびＬＦ（Ｌ５１４Ａ）ならびにＬ５１４およびＮ５１６、Ｌ５１４およびＫ２９４、またはＬ５１４およびＲ４９１についての対のアラニン置換を含有するＬＦのモル比。これらの結果は、少なくとも３回の実験の平均値±標準偏差として提示した。
【図４Ｄ】精製ＬＦおよびＬＦ二重変異体の毒性およびタンパク質分解活性。（図４ｄ）  インビトロでアッセイしたＦＰＬＣ精製ＬＦおよびＬＦ変異体の存在下でのＭＥＫのＢ−Ｒａｆリン酸化の試験を示した図である。ＭＥＫリン酸化は、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて定量し、ＬＦの不在下でＭＥＫリン酸化へ標準化した。これらの結果は、４回の実験の平均値±標準偏差として提示した。
【図５】非変性ＰＡ：ＬＦゲルシフトアッセイの結果を示した図である。変異体ＬＦがＰＡに結合する能力を維持しているかどうかを試験するために、本発明者らは、ＬＦおよびトリプシンでニッキングされたＰＡ（ＰＡ６３）を用いて非変性ゲルシフトアッセイを実施した。ＰＡ６３は、１０μＬのＰＡ（７．３ｍｇ／ｍＬ）を１μＬのトリプシン（５０ｎｇ／μＬ）および６２μＬの１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）とともに室温で１５分間にわたりインキュベートすることによって作製した。トリプシンは、０．５μＬのトリプシンインヒビター（５μｇ／ｍＬ、ウシ膵臓由来１Ｐ型、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の添加によって不活化した。ＬＦおよびＬＦ変異体タンパク質（５μｇ）はＰＡ６３（５μｇ）とともに室温で１５分間にわたりインキュベートした。サンプルは、等量の非変性サンプルバッファ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、０．００２５％のブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ）、ｐＨ８．６）を添加した後にＴｒｉｓ−グリシン非変性ランニングバッファ（２５ｍＭのＴｒｉｓベース、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３）を使用して４〜１２％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上で分離した。陰性コントロールとして、本発明者らは、ＰＡへ結合できないことが以前に証明されていたチロシン残基２３６（Ｙ２３６Ａ）（Ｐａｒｋ，  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ７５：２９３−３０２）のためのアラニン置換を含有するＬＦを使用した。他方、野生型ＬＦならびに全変異体ＬＦは、ＰＡ６３の存在下でスーパーシフト複合体を形成したが、ＬＦ（Ｙ２３６Ａ）は形成しなかった。
【図６】変異した残基を強調している炭疽菌ＬＦの表面プロット図である。ＬＦの空間充填プロット図はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（著作権）フリーウエアを用いて作成した。ＬＦ活性について臨界的であると同定された残基は、黄色（Ｋ２９４）、緑色（Ｌ２９３）、赤色（Ｌ５１４）、紫色（Ｎ５１６）、および橙色（Ｒ４９１）にカラー表示されている。ＬＦ活性において中立的もしくは限界的役割を果たすことが見いだされた残基は、白色で表示されている。ＭＥＫのＮＨ２末端は、黒色で指示されている。この領域の拡大画像は、臨界的残基が、触媒溝の一方の端に存在する集束バンド（ＫＬＬＮＲ）内に並行して組織化されていることを示している。
【図１】
2008515404.tif 000012
【図２Ａ】
2008515404.tif 000013
【図２Ｂ】
2008515404.tif 000014
【図２Ｃ】
2008515404.tif 000015
【図３Ａ】
2008515404.tif 000016
【図３Ｂ】
2008515404.tif 000017
【図３Ｃ】
2008515404.tif 000018
【図４Ａ】
2008515404.tif 000019
【図４Ｂ】
2008515404.tif 000020
【図４Ｃ】
2008515404.tif 000021
【図４Ｄ】
2008515404.tif 000022
【図５】
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【図６】
2008515404.tif 000024
【国際調査報告】
2008515404.tif 000025
2008515404.tif 000026
2008515404.tif 000027
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