(57)【要約】  組成および方法が、硬骨、軟骨あるいは他の結合組織の成長、発達および修復を調整するために提供される。デバイスおよび刺激波形が、生体外あるいは生体内適用のための増殖、分化、基質形成あるいは石灰化を増進するように骨芽細胞、軟骨細胞および他の結合組織細胞の挙動を区別して調整するために提供される。電荷均衡信号による細胞の連続モードおよびパルスバーストモード刺激を使用することができる。硬骨、軟骨および他の結合組織成長が、部分的に電気刺激による一酸化窒素放出によって促進されて、ＮＯドナーおよびＮＯ合成酵素抑制薬の共投与によって調整されることができる。硬骨、軟骨および他の結合組織成長が、部分的に細胞の分化を増進するために電気刺激に反応したＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７の放出によって促進される。記載される方法およびデバイスは、骨折の修復、軟骨および結合組織修復を増進する際に、同じく移植のための組織をエンジニアリングするのに有用である。【選択図】図６
2008541938.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬骨、軟骨あるいは他の結合組織の発達あるいは修復を調整するための方法であって、発達中のあるいは再生中の組織を電気信号によって刺激するステップを含み、前記電気信号が、
前記組織の前記発達あるいは修復を調整するのに十分な時間の間、
Ａ−タイプ、Ｂ−タイプ、Ｃ−タイプあるいはＤ−タイプ信号を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、さらに、第２の電気信号によって発達を刺激するステップを含み、前記第２の電気信号が、Ａ−タイプ、Ｂ−タイプ、Ｃ−タイプあるいはＤ−タイプ信号を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記Ａ−タイプ信号が、β長さを有する長い成分およびα長さを有する短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、前記Ａ−タイプ信号が、持続期間で約６０μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項２の方法であって、前記Ｂ−タイプ信号が、γ長さを有する長い成分およびα長さを有する短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２の方法であって、前記Ｂ−タイプ信号が、持続期間で約２００μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２の方法であって、前記２つの電気信号が、前記組織内の細胞の増殖、分化あるいは基質生成を促進するために、同時にあるいは順番に投与される、ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１の方法であって、前記組織が、前駆細胞を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、前記前駆細胞が、幹細胞、方向づけられていない前駆体、方向付けされた前駆体、多分化能の前駆細胞、あるいは多能性の前駆細胞から選択される、ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１の方法であって、前記電気刺激が、ＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−７の生成を増加させる、ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１の方法であって、前記電気刺激が、一酸化窒素の生成を調整する、ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
硬骨、軟骨あるいは結合組織を生成するかあるいは修復するための方法であって、発達中のあるいは再生中の組織を電気信号によって刺激するステップを含み、前記電気信号が、Ａ−タイプ、Ｂ−タイプ、Ｃ−タイプあるいはＤ−タイプ信号を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、さらに、前記電気信号と組み合わせて機械荷重を加えるステップを含む方法。
【請求項１４】
請求項１２の方法であって、前記電気刺激が、容量結合された電極を使用して遂行される、ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
硬骨、軟骨あるいは他の結合組織を生成するかあるいは修復するための方法であって、組織形成細胞の増殖、分化あるいは基質生成を刺激するために第１の電気信号によって前記組織を刺激し、その後に前記組織形成細胞の前記増殖、分化あるいは基質／無機質生成を刺激するために第２の電気信号によって前記発達中の組織を刺激することが続くステップを含む、ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、前記第１の電気信号がＡ−タイプ信号を備え、そして、前記第２の電気信号がＢ−タイプ信号を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５の方法であって、前記Ａ−タイプ信号が、β長さを有する長い成分およびα長さを有する短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５の方法であって、前記Ａ−タイプ信号が、持続期間で約６０μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５の方法であって、前記Ｂ−タイプ信号が、γ長さを有する長い成分およびα長さを有する短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５の方法であって、前記Ｂ−タイプ信号が、持続期間で約２００μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
陽極酸化された金属でできている電極を備えた容量結合されたブリッジ電極。
【請求項２２】
請求項２１の電極であって、前記陽極酸化された金属が、ニオブ、タンタル、チタン、ジルコニウム、モリブデン、タングステン、バナジウム、アルミニウムあるいはステンレス鋼である、ことを特徴とする電極。
【請求項２３】
細胞とＡ−タイプ信号あるいはＢ−タイプ信号を前記細胞に供給する電気刺激装置とを備えたシステム。
【請求項２４】
請求項２３のシステムであって、さらに、前記細胞の機械荷重のための手段、を備えるシステム。
【請求項２５】
請求項２３のシステムであって、前記Ａ−タイプ信号が、持続期間で約２０μｓｅｃと１００μｓｅｃとの間の長い成分および持続期間で約５μｓｅｃと９５μｓｅｃとの間の短い成分を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２６】
請求項２３のシステムであって、前記Ａ−タイプ信号が、持続期間で約６０μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２７】
請求項２３のシステムであって、前記Ｂ−タイプ信号が、持続期間で約１００μｓｅｃと１０００μｓｅｃとの間の長い成分および持続期間で約５μｓｅｃと７５μｓｅｃとの間の短い成分を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２８】
請求項２３のシステムであって、前記Ｂ−タイプ信号が、持続期間で約２００μｓｅｃの長い成分および持続期間で約２８μｓｅｃの短い成分を備える、ことを特徴とするシステム。
【請求項２９】
請求項２３のシステムであって、前記細胞が、幹細胞、方向づけられていない前駆体、方向付けされた前駆細胞、多分化能の前駆体、多能性の前駆体、あるいは分化の他の時期の細胞から選択される、ことを特徴とするシステム。
【請求項３０】
請求項２３の培養システムであって、さらに、陽極酸化された金属でできている容量結合されたブリッジ電極、を備えるシステム。
【請求項３１】
移植に適している組織を準備するためのキットであって、細胞と電気刺激波形を与える電気刺激装置とを備え、前記電気刺激波形が、Ａ−タイプ、Ｂ−タイプ、Ｃ−タイプあるいはＤ−タイプ信号を備え、前記波形が、移植に適している組織への前記細胞の増殖、分化あるいは基質生成を促進する、ことを特徴とするキット。
【請求項３２】
請求項３１のキットであって、さらに、生体分解性あるいは生物学的安定性骨格形成材、を備えるキット。
【請求項３３】
請求項３２のキットであって、前記骨格形成材が、天然あるいは合成重合体から選択される材料から作られる、ことを特徴とするキット。
【請求項３４】
請求項３２のキットであって、前記骨格形成材が、成長促進あるいは付着力促進分子に関連している、ことを特徴とするキット。
【請求項３５】
請求項３１のキットであって、さらに、前記細胞の機械荷重のための手段、を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年６月３日に出願された米国仮出願第６０／６８７，４３０号、２００５年６月２３日に出願された米国仮出願第６０／６９３，４９０号、２００６年３月１５日に出願された米国仮出願第６０／７８２，４６２号及び２００６年４月７日に出願された米国仮出願第６０／７９０，１２８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
硬骨および軟骨と関連する疾患および負傷は、人々に多大な影響を有する。およそ５００万の骨折が、毎年米国内単独で起こる。これらの約１０％は治癒が遅れ、および、これらの中で、１５０，０００ないし２００，０００の癒着不能骨折が、生産性および自立の損失を伴って起こる。軟骨の場合、重症で慢性形態の膝関節軟骨損傷が、関節軟骨のより大きな悪化に至る可能性があり、最終的には全膝関節交換に至る場合がある。およそ２００，０００の全膝交換手術が毎年実施され、および、人工関節は一般に１０ないし１５年の間だけもち、生産性および自立の類似した損失に至る。
【０００３】
さらに、骨折の発生率はまた、概算４４００万人のアメリカ人に対する主要な公衆衛生脅威として骨粗鬆症の発生率を鑑みて高くとどまると思われる。現在アメリカにおいて、１０００万人がすでにこの疾患を有すると推定され、そして、更にほぼ３４００万が低骨質量を有すると推定され、彼らを骨粗鬆症に対する高まったリスクにおく。年齢５０才をこえる２人の女性に１人および４人の男性に１人が、彼らの残りの人生において骨粗鬆症関連の骨折をする。骨粗鬆症は、３００，０００の股関節部骨折、７００，０００の脊椎骨折、２５０，０００の手首骨折、および、他の部位での３００，０００の骨折を含めて、毎年１５００万を超える骨折の原因となる。骨粗鬆症性股関節部骨折に対する推定された全国的な直接の出費（病院および老人ホーム）は、２００２年に１８０億ドルであった（全米骨粗鬆症財団年次報告、２００２年）。
【０００４】
いくつかの治療、たとえば、内部および外部の固定、脱鉱化骨基質、血小板抽出物および骨基質蛋白質を含む移植骨片あるいは移植代替物、そして、生物物理学的刺激、例えば外部の固定装置を通して印加される機械的応力あるいは超音波および電磁場など、が扱いにくい骨折を治療するために現在利用可能である。
【０００５】
同様に、外傷および症状のひどさに従い、軟骨負傷に対する典型的な治療が残りであり、および他の保存的治療、傷害性軟骨領域の表面を洗浄して滑らかにするための軽微な関節鏡手術、そして、他の手術、例えば微小破壊、穿孔および剥離などがある。これらの全てが症状の軽減を提供するかもしれないが、特にその人の負傷前の活動水準が維持される場合、恩恵は通常一時的なだけである。
【０００６】
硬骨および他の組織、例えば軟骨は、生理的に有用な方法で電気信号に反応する。癒着不能および遷延治癒に適用される生物電気刺激デバイスは、１９６０年代に開始され、現在硬骨および軟骨に適用されている（ＣｉｏｍｂｏｒおよびＡａｒｏｎ、Ｆｏｏｔ  Ａｎｋｌｅ  Ｃｌｉｎ．  ２００５、（４）：５７９−９３）。現在、医療におけるそれらの役割の市場および一般的な容認は、確立された。生物電気刺激に帰する、より周知でない結果は、正の硬骨密度変化（Ｔａｂｒａｈ、１９９０年）および骨粗鬆症の予防（Ｃｈａｎｇ、２００３年）である。最近の報告は、パルス制御された電磁場（ＰＥＭＦ）による刺激が、伸延骨形成中に硬骨が形成されるのをかなり促進するという付属の証拠を示した（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ、２００３年）。
【０００７】
現在、硬骨修復のための電気療法の臨床用途は、修復部位の中に直接挿入される電極または非侵襲性容量あるいは誘導結合から成る。直流（ＤＣ）が、硬骨修復の部位の組織標的内に配置される１つの電極（陰極）および軟組織内に配置される陽極を通して印加される。５−１００μＡのＤＣ電流が、骨形成を促進するのに十分である。容量性結合技術は、骨折部位の両側に配置される外皮電極を使用する。２０−２００Ｈｚの正弦波が、一般的に修復部位に１−１００ｍＶ／ｃｍの電界を誘導するために使用される。
【０００８】
誘導結合（ＰＥＭＦ）技術は、１、２の電気コイルを通して時間変化する磁場を印加することによって修復部位に時間変化する電界を誘導する。誘導された電界は、多くの増殖因子によって媒介される硬骨修復の分子的調整の正規過程を調整する引金機構として働く。Ｂａｓｓｅｔｔ他は、ＰＥＭＦ信号が犬歯において１５０％硬骨修復を促進することができたと報告した最初のものであった。硬骨修復の実験的モデルは、ＤＣ電流による増強された細胞増殖、石灰化および増加した機械強度を示す。この種のアプローチは軟骨損傷に対する可能性も保持する。
【０００９】
傷ついた組織は、正常組織に対してある電位を有する。損傷部位で測定される電気信号は、「損傷電位」あるいは「損傷電流」と呼ばれ、ＤＣ（直流）だけであり、時間とともにゆっくり変化する。骨折修復および神経再成長潜在力は、一般的に負極の近傍において普通より速いが、正極の近くで遅く、そこでは場合によっては、組織萎縮症あるいは壊死が起こるかもしれない。このために、ごく最近の研究は、しばしば正味のＤＣ成分のない高周波数のより複雑な信号に集中した。
【００１０】
残念なことに、現在利用可能なほとんどの電気療法的デバイスが、電極あるいは電子パッケージ全体の直接の体内移植に、または時間変化する磁場を生成するコイルを使用して皮膚を通しての誘導結合に依存し、それによって組織への信号を非効率的に供給する身体組織内に弱い渦電流を誘導し、したがって、大きなコイルに加えて、比較的に大きい信号発生器およびバッテリパックを必要とする。１つの場合に手術および医用素材の必要性およびその他に過剰な回路複雑性および入力パワーの必要性は、ほとんどのこの種の装置の価格を比較的高く保ち、また、この種のデバイスの適用を高度に訓練された人員に制限してきた。適切な発達および治癒を増進するために骨軟骨性組織の成長を区別して調整するように生物電気刺激を与えるために使用されることができる汎用的な費用効率が高い装置に対する必要性は、したがって、残る。
【特許文献１】米国特許公開第２００４／０２６７３３３号
【特許文献２】米国特許第５，２７３，０３３号
【非特許文献１】ＣｉｏｍｂｏｒおよびＡａｒｏｎ、Ｆｏｏｔ  Ａｎｋｌｅ  Ｃｌｉｎ．  ２００５、（４）：５７９−９３
【非特許文献２】Ｂｏｗｌｅｒ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、１９９８、３：ｄ７６９−７８０
【非特許文献３】Ｂａｒｉｂａｕｌｔ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００６、２６（２）：７０９−７１７
【非特許文献４】Ｓｅｅｈｅｒｍａｎ、サイトカイン増殖因子Ｒｅｖ．  ２００５  Ｊｕｎ；１６（３）：３２９−４５
【発明の開示】
【００１１】
その主要態様に従って、および、概括的に述べて、本発明は、発病しているか損傷を受けた硬骨あるいは軟骨組織に電気信号を与えることによって、例えば硬骨組織あるいは軟骨の成長あるいは修復を調整する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、促進されてより永続的な治癒に結びつく自然身体信号の選択された特徴に対応するように最適化された生物電気信号の供給を可能にすることによって、従来技術デバイスおよび方法の欠点を克服する。本願明細書に記載される信号は自然信号の選択された特徴に適合し、および、従って、本発明に従う電気刺激にさらされる組織は最小の生理ストレスを受ける。加えて、本発明は非侵入性で費用効率が高く、それを人的なおよび個別的な使用に対する複数適用にとって望ましくする。さらに、本方法は電気信号が自然身体信号の選択された特性に精密に似ている電気刺激を提供する。刺激された組織はしたがって、最小の応力にさらされ、そして、成長および修復は大いに容易にされる。
【００１３】
神経系の疼痛衝撃を遮断することを目的とする従来のＴＥＮＳ−タイプデバイスとは対照的に、本方法によって使用される装置は、痛覚の通常の人間の閾値レベルを下回る刺激レベルで作動し、そして、そのようなものとして、ほとんどのユーザーは硬骨を修復するかあるいはその成長を増進するための治療の間、いかなる感覚も経験しない。
【００１４】
本願明細書において記載される技術は、ある種類の波形を使用し、その幾つかは新奇であり、およびその他は、誘導コイルを通して印加される場合、組織上に正の生体影響を有することは知られているが、電極を通しての正の生体影響を有することは、これまで実証されていなかった。
【００１５】
市販の生物電気デバイスは、骨粗鬆症療法に対して現在認可されていないとはいえ、本発明は有望な候補を提供する。本願明細書において実証されるように、独特のパルス制御された電磁場（ＰＥＭＦ）波パターンは、有利には、肉眼的レベル（すなわち一般の骨折）、同じく顕微鏡的レベル（すなわち骨芽細胞発達）の双方で印加されることができる。本発明の特定の実施態様は、所望のＰＥＭＦ波形の有用性および適用を最大化する：例えば、脊骨、股関節部および／または手首は骨粗鬆症性骨折の最も一般によくある部位であり、この種のタイプの骨折に対して本発明者は、電気療法的供給手段として単純自動接着性皮膚接触電極パッドを提供する。この種の電極パッドの使用は、この種の鍵となる解剖学的部位における骨質量の改善に結びつく。顕微鏡的レベルにおいて、本発明の発明者は骨芽細胞発達を最適化する特定のＰＥＭＦ波形および周波数を同定した。実施例（実施例１を参照）により詳細に記載されるように、本発明者は、ＰＥＭＦ信号が骨芽細胞石灰化および基質生成を高め、そして、この信号が同様に構造上の特徴を与える、ことを実証する。本発明者はまた、他のＰＥＭＦ信号が細胞増殖および骨形成蛋白質（ＢＭＰ）における付随する増加を強化したことも示す。パルスバーストおよび連続電気信号の双方が本発明において使用されることができるとはいえ、パルスバーストよりむしろ連続信号の投与が、増殖および石灰化に関してより顕著な効果を与えた。
【００１６】
本発明の電気信号は、構造上の組織、例えば硬骨および軟骨の修復および成長を増進するために使用されることができる。しかし、単離された細胞あるいは組織培養もまた、電気療法的波形に影響を受けることができるので、この種のシステム及び方法は、無処置生体とともに使用することに限定される必要はない（適切な電気刺激は、細胞代謝、分泌作用および増殖の速度を変更することが観察された）。電気信号は、一般に他の結合組織、例えば皮膚、靱帯、腱、などに印加可能である。ここに記載される電気信号は、移植目的のために、他の組織を刺激して、組織の修復を増強し、組織の成長を促進するために使用されることができる。単離された皮膚細胞は、例えば、細胞増殖および組織培養された、自原性の皮膚移植物質の準備の分別を強化するために、適切な増殖培地の中で本発明のデバイスおよび波形によって治療されるだろう。同様な方法で、これらの生体電気信号は治癒を高めるために傷ついたかあるいは疾患皮膚組織に直接印加されることができる。
【００１７】
骨折への生物電気信号および前駆細胞、例えば骨髄間質細胞ＢＭＳＣの外生的な供給は、扱いにくい骨折の高められた治癒および修復に至ることができる。これらの要因（生体電気および細胞補充）の両方ともが、実際、自然治癒過程の一部である。これらの用途に対して、本願明細書に記載される波形を使用する電気刺激は、電気療法システムによって損傷の直後に印加されることができる。この電気療法システムは、軽量、小型および携帯可能とすることができる。電気刺激および汎用細胞ベースの療法の双方が、損傷の後で２、３日以内に印加されることができる。自己由来の細胞が、損傷の更に後の時間に追加されることができる。本発明はまた、瘢痕組織よりむしろ自然組織を再生させる硬骨修復あるいは発達を引き起こすための方法を提供する。
【００１８】
したがって、本発明の一目的は、骨組織に新奇な電気信号を与えることによって、硬骨修復および発達の促進のために骨組織の増殖および分化を調整するための方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、骨組織エンジニアリングのためのＰＥＭＦの使用を含む新奇な培養システムを提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、電気刺激とあわせて前駆細胞の新奇な培養システムを提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、その必要とする受容者への移植のために、自己由来かつ同種の組織の成長のためのキットを提供することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、増殖あるいは分化を引き起こすために、生体外（in vitro）あるいは生体内（in vivo）の方向づけられていない前駆細胞を電気的に刺激するための方法を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、軟骨、硬骨あるいは他の結合組織の成長を調整するための方法を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、硬骨形態形成蛋白質の形質発現および放出を調整するための方法を提供することである。
【００２５】
本発明のこれらの、そしてまた他の、目的、特徴および利点は、開示された実施態様および添付の特許請求の範囲の以下の詳細な記述の再検討の後で明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下の記述は、本発明を実施する最良の目下意図されたモードを含む。この記述は、本発明の一般的な原理を例示するためになされ、かつ限定的にとられるべきでない。米国仮出願第６０／６８７，４３０号、第６０／６９３，４９０号、第６０／７８２，４６２号及び第６０／７９０，１２８号を含む、本願明細書において言及される参考文献の原文は参照によってそれらの全体においてここに組み込まれる。
【００２７】
本願明細書において記載される本発明の現在の生体外の適用はまた、生体内の適用、療法などに対して外挿されることができることは理解されるべきである。当業者は、縮小された準備および生体外モデルを使用して開発された技術が生体内の適用のために最終的に使用されることができる、ことを理解するであろう。生体内の電気刺激のための実効値および範囲は、生体外のあるいは動物モデル試験システムから導き出される用量反応曲線から外挿されることができる。
【００２８】
本発明は、促進され、かつより永続的な治癒に結びつく自然身体信号の選択された特性に対応するように最適化された生物電気信号の供給を可能にする。ここに記載される信号は自然信号の選択された特徴に一意的に適合し、および、従って、本発明に従う電気刺激にさらされる組織は最小の生理ストレスを受ける。加えて、本発明は非侵入性で費用効率が高く、それを人的なおよび個別的な使用に対する複数適用にとって望ましくする。
【００２９】
骨再形成
硬骨は、人体の最も堅い組織のうちの１つである。人間の骨格の主成分として、それは筋肉の構造を支持するだけでなく、また、頭部のおよび胸部の窩洞内の生体の器官の保護もする。骨は、細胞間の石灰化された材料（骨細胞外基質）および異なる細胞種：骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞から成る。細胞外基質は、有機および無機成分から成る。有機成分は、細胞、コラーゲン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸および他の蛋白質、リン脂質および増殖因子を含む。硬骨の剛性は、主にヒドロキシアパタイトＣａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の形式で結晶化されるカルシウムおよびリンである石灰化された無機成分に由来する。コラーゲンおよびヒドロキシアパタイトの組合せは、硬骨の硬度および剛性特性を与える。
【００３０】
骨芽細胞は、間葉性起源の前駆細胞に由来し、かつ新生の骨基質の隣の表面に局所化されて、並んで配置される。骨芽細胞の主要機能は、骨基質の同化および発達であり、そして、基質石灰化の役割を果たすことである。骨基質の小孔に埋め込まれる場合、骨芽細胞は骨細胞と呼ばれ、そして、わずかに異なる形態を採用しかつ他の骨細胞との接触を保持する。破骨細胞は、カルシトニンおよびインテグリンに対する受容体および他の分化した構造上の特徴を含むより大きい多核細胞である。破骨細胞の主要機能は、石灰化された骨基質の無機および有機成分の双方を再吸収することである。
【００３１】
骨再形成は、石灰化された基質の再生による正確に均衡のとれた骨格の質量に結びつく骨組織の再吸収および形成の基本のかつ高度に統合された過程である。この再生可能な過程は、硬骨の全体的解剖学的構造を損なわずに達成される。内部代謝回転のこの連続過程は、硬骨が応力に応答して連続的な微小破壊の修復および変質作用によって真の再生および硬骨完全性の維持の能力を持続する、ことを確実にする。成人の骨格の構造および組成は、永続的に動的な平衡にある。再形成はまた、恒常性の要求に応答してカルシウムの放出のための手段を提供する。骨再形成に影響する状態は、機械刺激、例えば固定化あるいは無重量感、電流あるいは電磁場、例えば容量結合された電界あるいはパルス制御された電磁場、ホルモンの変化、または、特定の炎症性疾患に反応した状態を含む。
【００３２】
骨再形成は、活性化、再吸収、逆転、形成および休止ステップを含む活動の編成されたサイクルを通して起こる。活性化は、内層細胞の薄層の存在によって特徴づけられる。次いで、造血系統の単核細胞を循環させることは、活性化部位に移動して、共に融合し始め、破骨細胞を形成する。活性化の後に、活性の破骨細胞が骨の表面を掘削する再吸収が続く。このステップは、一般的に約２−４週間、持続する。逆転は、再吸収に続いて起こって、不活性前骨芽細胞が再吸収凹部に存在するこの時間中に、９日の期間の間続く。次のステップが形成であって、約３−４ヵ月がかかる。この時期の間、活性骨芽細胞は、陥凹部位を再び満たす。骨再形成の最後の段階は、再形成活動が次の再形成サイクルの始まりまで起こらない休止である。理想的には、硬骨充填の量は骨質量の無損失で再吸収される量に匹敵しなければならない。
【００３３】
波形
本発明は、生物組織上の特異作用を可能にする電気信号および波形を提供する。この種の波形は、生体内および生体外の印加に対して効果的である。骨軟骨性組織は、著しく異なる周波数および波形に対して異なって反応するように本願明細書において示される。
【００３４】
特定の関心事は、反対極性および等しくない長さを有する交互の矩形あるいは準矩形パルスを備え、それによって矩形の非対称パルス列を形成する信号である。特定の長さのパルスが、特定の細胞生化学的機構、特に細胞膜上の受容体へのカルシウムあるいは他の小さい、移動性の、荷電化学種の束縛、または、それらの（通常より遅い）解放を活性化すると理論付けられてきた。反対極性を有するこの種の列の部分は、実質的に正味ゼロ電荷を与えるように均衡を保つことができ、そして、この列は連続的であるかあるいは実質的にゼロ信号の間隔によって区切られるパルスバーストに分割されることができる。パルスバーストモードで与えられる刺激は、連続的な列として与えられるそれらに類似した作用を有するが、それらの作用はゼロ信号期間の間、受容体から解放する荷電化学種の機能（理論的に）に起因して詳細で異なるかもしれず、そして、必要な投与スケジュールもまた、異なる可能性がある。
【００３５】
図１は、硬骨および軟骨組織を刺激するために効果的なベース波形２０の模式図を示し、ここで、線２２は波形を連続モードで表し、そして、線２４は同一波形をパルスバーストモードでより長い時間的尺度で表し、レベル２６および２８は、電圧あるいは電流の２つの異なる固有値を表し、そして、間隔３０、３２、３４および３６は特定の遷移間のタイミングを表す。レベル２６および２８は必要に応じて正味正のあるいは正味負のＤ．Ｃ．成分に結びつくように選択されることができるが、レベル２６および２８は通常、波形の全サイクルを通じて平均される場合、正味直流電流（Ｄ．Ｃ．）成分がないように選択される。現実の適用において、例えば波形２０は、好ましくは間隔３４より長い減衰時間定数で、全ての電圧あるいは電流がレベル２６と２８との間のどこか中間レベルの方へ指数的に減衰するという点で、一般的に変更される。この結果は、線３８によって表される。ここで一般に記載される波形は、２つの信号成分：互いに対して、間隔３０として示されるより長い成分および間隔３２として示されるより短い成分、を有する。
【００３６】
短いおよび長い信号成分長さの変動は、刺激された組織の特定の効果を与える。本発明で関心を引くパルス幅は、次の通りに規定されることができ、増加する長さの順に：
長さα：持続期間で５と７５μｓｅｃとの間の、好ましくは持続期間で１０と５０μｓｅｃとの間の、より好ましくは、持続期間で２０と３５μｓｅｃとの間の、そして最も好ましくは持続期間で約２８μｓｅｃ。
長さβ：持続期間で２０と１００μｓｅｃとの間の、好ましくは持続期間で４０と８０μｓｅｃとの間の、より好ましくは持続期間で５０と７０μｓｅｃとの間の、そして最も好ましくは持続期間で約６０μｓｅｃ。
長さγ：持続期間で１００と１０００μｓｅｃとの間の、好ましくは持続期間で１５０と８００μｓｅｃとの間の、より好ましくは持続期間で１８０と５００μｓｅｃとの間の、そして最も好ましくは持続期間で約２００μｓｅｃ。
長さδ：持続期間で１ミリ秒を超える、好ましくは持続期間で５と１００ミリ秒との間の、より好ましくは、持続期間で１０と２０ミリ秒との間の、そして、最も好ましくは持続期間で約１３ミリ秒。
【００３７】
第１の実施態様において、電気信号は長さαのより短い成分および長さβのより長い成分を有し、したがって、各タイプ（それぞれ２８μｓｅｃおよび６０μｓｅｃ）の最も好ましいパルス幅で、約１１．４ｋＨｚの周波数を有する。長さαおよび長さβの交互パルスから成る信号は、本願明細書において「タイプＡ」信号と、そして、それらの波形は「タイプＡ」波形と称される。連続的なパルス列として与えられる具体例「タイプＡ」信号が、図２Ａに示される。これのような信号は、様々な生物学的あるいは治療的応用のための組織サンプルあるいは培養の増殖を促進するのに有用である。
【００３８】
パルスバーストモードにおいて、「タイプＡ」波形は約０．５ないし５００ミリ秒、好ましくは約５０ミリ秒のバーストでオンにされ、０．１−１０Ｈｚで、あるいは好ましくは約１Ｈｚで繰り返されるバーストを有するであろう。この種の波形の具体例は、図２Ｂに示される。
【００３９】
第２の実施態様において、電気信号は長さαのより短い成分、しかし、長さγのより長い成分を有し、したがって、各タイプ（それぞれ２８μｓｅｃおよび２００μｓｅｃ）の最も好ましいパルス幅で、約４．４ｋＨｚの周波数を有する。長さαおよび長さγの交互パルスから成る信号は、本願明細書において「タイプＢ」信号と、そして、それらの波形は「タイプＢ」波形と称される。この種の波形は、以前に米国特許出願１０／８７５，８０１番（米国特許公開第２００４／０２６７３３３号）に記載された。連続的なパルス列として与えられる「タイプＢ」信号の具体例は、図３Ａに示される。これのような信号は、疼痛寛解に、そして、硬骨治癒を促進する際に有用で、更に生体外の骨芽細胞培養の海綿骨の様な構造の発達を刺激し、外科的硬骨修復および移植材料の分野への適用を伴う。
【００４０】
パルスバーストモードにおいて、「タイプＢ」波形は約１ないし５０ミリ秒、好ましくは約５ミリ秒のバーストでオンにされ、５−１００Ｈｚで、あるいは好ましくは約１５Ｈｚで繰り返されるバーストを有する。この種の波形の具体例は、図３Ｂに示される。この波形は、偽関節硬骨刺激生成物、例えばＥＢＩ  ＭＥＤＩＣＡ社（登録商標）（Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）およびＯＲＴＨＯＦＩＸ社（登録商標）（マッキニー、ＴＸ）において、概して使用される典型的な誘導（コイル）電磁気装置によって供給される実効電流に、形状および振幅において類似している。
【００４１】
第３の実施態様において、電気信号は長さβのより短い成分、しかし、長さγのより長い成分を有し、したがって、各タイプ（それぞれ６０μｓｅｃおよび２００μｓｅｃ）の最も好ましいパルス幅で、約３．８ｋＨｚの周波数を有する。長さβおよび長さγの交互パルスから成る信号は、本願明細書において「タイプＣ」信号と、そして、それらの波形は「タイプＣ」波形と称される。これのような信号は、硬骨再生、熟成および石灰化を促進する際に有用である。
【００４２】
パルスバーストモードにおいて、「タイプＣ」波形は約１ないし５０ミリ秒、好ましくは約５ミリ秒のバーストでオンにされ、５−１００Ｈｚで、あるいは好ましくは約１５Ｈｚで繰り返されるバーストを有し、「タイプＢ」とほとんど同じである。この波形は、偽関節硬骨刺激生成物、例えば脊椎固定の治癒を促進するように設計されているＯＲＴＨＯＦＩＸ社（登録商標）（マッキニー、ＴＸ）ＰｈｙｓｉｏＳｔｉｍ  Ｌｉｔｅ（登録商標）において、概して使用される他の典型的な誘導（コイル）電磁気装置によって供給される実効電流に、形状および振幅において類似している。
【００４３】
第４の実施態様において、電気信号は長さγのより短い成分および長さδのより長い成分を有し、したがって、各タイプ（それぞれ２００μｓｅｃおよび１３ｍｓｅｃ）の最も好ましいパルス幅で、約７５Ｈｚの周波数を有する。長さγおよび長さδの交互パルスから成る信号は、本願明細書において「タイプＤ」信号と、そして、それらの波形は「タイプＤ」波形と称される。これのような信号は、特に軟骨治癒および硬骨石灰化を促進する際に、そして、骨粗鬆症および変形性関節症を治療するかあるいは後退させる際に有用である。参照によってここにて組み込まれる、米国特許第５，２７３，０３３号の図３に示すように、ＢＩＯＮＩＣＡＲＥ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社（登録商標）ＢＩＯ−１０００（商標）によって電極を通して供給されるそれに概括的に類似するとはいえ、「タイプＤ」信号は、実質的に波の形状（それは、指数関数的よりむしろ矩形である）において、および、それが好ましくは電荷均衡である事実において異なる。
【００４４】
パルスバーストモードにおいて、「タイプＤ」波形は少なくとも１００ミリ秒、好ましくは約１秒のバーストでオンにされ、１秒以上の間隔で繰り返されるバーストを有する。
【００４５】
信号の強さは、また、変化する可能性があり、実際に、より強力な信号はしばしばより弱いものと同様、恩恵を与えず、そして、時にはより劣っている。典型的な信号（図１の信号のような）に対して、ピーク有効性は一般的に平方センチメートルあたり１と１０マイクロアンペア（μＡ／ｃｍ２）との間のどこかに位置し、そして、交差点はこの値の約１００倍である。この点を越えると、この信号が治癒を減速する、あるいはそれ自体更なる損傷を引き起こすかもしれない。
【００４６】
バーストモードの代わりに連続モードで動作する電気信号あるいは波形は、本発明の方法に特に関連がある。（例えば図２Ａあるいは３Ａ）。連続動作信号は、パルスバースト信号のそれらに類似した効果を有するが、しかし、類似した結果を達成するために異なる供給スケジュールを必要とするかもしれない。
【００４７】
本発明の方法によって使用される波形に対して、典型的な印加平均値電流密度は、平方センチメートルにつき０．１と１０００マイクロアンペアとの間、好ましくは平方センチメートルにつき０．３と３００マイクロアンペアとの間、より好ましくは平方センチメートルにつき１と１００マイクロアンペアとの間、そして、最も好ましくは平方センチメートルにつき約１０マイクロアンペアであり、それぞれ典型的な身体組織において、センチメートルにつき０．０１と１０００、０．０３と３００、０．１と１００および１と１０マイクロアンペアとの間で変動する電圧傾度に結びつく。個々のほぼ正方形波信号は、長い正セグメントおよび短い負セグメントと非同期であり、あるいはその逆も同じである。正および負の部分は、ゼロ総電荷を与えるために釣り合い、あるいは、選択的に、全体としてこの波形を通じてゼロ正味荷電平衡を提供するパルスの端における等化パルスと電荷不均衡とすることができる。皮膚電極によって供給されるこれらの波形は、正弦波あるいは強く指数的に減衰する波形よりむしろ連続的な矩形あるいはおよそ矩形の波形を使用する。本発明の方法において有用な他の波形は、発表された米国特許出願１０／８７５，８０１番（公開番号２００４／０２６７３３３）において開示され、全体として本願明細書に引用したものとする。
【００４８】
上記した電気信号は、細胞、生物組織あるいは間欠的な治療間隔で、または連続的に一日の全体にわたる治療を必要とする個人に与えられることができる。治療間隔は本願明細書において、波形がパルスあるいは連続モードで与えられる時間的間隔として規定される。治療間隔は、持続期間で約１０分ないし約４時間、持続期間で約３０分ないし約２．５時間、あるいは持続期間で約１時間とすることができる。治療間隔は、１日約１回と１００回との間で生じることができる。治療間隔の持続期間および頻度は、細胞増殖、細胞分化、骨成長、発達あるいは修復を促進するために有効量の電気刺激を得るように、各場合に対して調整されることができる。パラメータは、最も効果的治療パラメータを決定するために調整される。
【００４９】
２４時間投与が必要に応じて使用されることができるとはいえ、信号が必ずしも治療間隔に長い時間の持続期間を必要とするというわけではない。一般的に、３０分（数回／日繰り返される）は生物学的効果のために必要とされる。生体外の細胞増殖は、体細胞数、核酸あるいは蛋白合成の増加のような標準の手段で測定されることができる。基質蛋白質のアップレギュレーションあるいはダウンレギュレーション（コラーゲン型Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ）、同じく、増殖因子およびサイトカイン（ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＳＬＰＩ、ＦＮ、ＭＭＰｓのような）もまた、測定されることができる（ｍＲＮＡおよび蛋白合成）。生体内の効果は、損傷の治癒の割合あるいは骨質量密度を測定することによって決定されることができる。骨組織の増殖、分化あるいは石灰化に対する他の診断法は、当業者に直ちに明らかである。
【００５０】
一実施態様において、増殖促進および分化促進信号が順番に使用される。波形のこの組合せは、細胞数を増加させて、そして次に、細胞の分化を促進するために使用される。一例として、増殖および分化信号の連続した使用は、骨芽細胞の増殖を、そして次に、硬骨の石灰化を促進する無機生成骨細胞への骨芽細胞の分化を、あるいはその逆に、促進するために使用されることができる。例えば、治療範例は、増殖促進Ａタイプ信号が、最初に、数時間、数日あるいは数週の間、生体外あるいはエキソビボ（ex vivo）の細胞集団に与えられ、そして次に、増殖促進信号が、硬骨石灰化がもたらされるまで、数時間、数日あるいは数週の間、石灰化促進Ｂタイプ信号によって置換される、ところで使用されることができる。形成された組織は、次いで患者の恩恵のために移植されることができる。両方の信号は、また、増殖も、分化も石灰化も同時に促進するために同時に印加されることができる。
【００５１】
この電気信号は、皮膚電極あるいは電気化学的結合によって供給されることができる。皮膚電極は、それぞれ、脊骨、股関節部および腕への適用に役立つことができる１  １／２Ｘ１２、２Ｘ３  １／２および２×２インチといった大きさで、商業的に入手可能である。これらの再使用可能な電極は、それらがラテックスを含まず、顕著な皮層刺激を示していないので、好都合である。再使用可能な電極は、複数回使用されることができ、患者に対するコストもまた減少する。この種の電極は、電極＃２１４（１／５”ｘ１３”）、＃２２０（２”ｘ２”）および＃２３０（２”ｘ３／５”）（ＫＯＡＬＡＴＹ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ（登録商標）、Ｔａｍｐａ、ＦＬ）、あるいは電極＃Ｔ２０２０（２”ｘ２”）および＃Ｔ２０３０（２”ｘ３．５”）（ＶＥＲＭＥＤ社（登録商標）、Ｂｅｌｌｏｗｓ  Ｆａｌｌｓ、ＶＴ）を含むことができる。
【００５２】
電磁コイルの代わりに皮膚電極を使用する複数の利点が、ある。第１に、皮膚電極は、より効率的である。電極については、実際のところ身体の中に送信される信号だけが、生成されなければならない。コイルについては、組織との貧弱な電磁結合のため、入力される信号は組織内で要求されるものより何倍も何倍も強くなければならない。これは、動作させるのに非常により少ない電力を必要とすると共に、電極に必要な発生回路を、コイルに対してと比べて潜在的に非常に簡単にする。第２に、皮膚電極は、ユーザーによりやさしい。皮膚電極は最高でも体重の２、３のパーセントを有するのに、大きなコイルが、同等の信号レベルを供給するのに必要であった。同様に、より良い結合効率の理由で、電極を駆動する信号発生器は、コイルに対するものより非常に小さくて軽くされることができる。短い時間の後、着用者はほとんどそれらがあると気がつかない。第３に、皮膚電極は、より経済的である。１個につき数百から数千ドルかかるコイルとは異なり、電極は、一般的に１ドル未満のコストの「捨てる」品目である。また、より大きな効率および簡単さのため、それらを駆動する信号発生器および電池は、コイルに対するものと比較して小さくなることができ、かつ製造するのに安価とすることができる。４番目に、皮膚電極はこのデバイスを使用する容易さおよび患者適応性を助長するより単純な電池構造およびより長い電池寿命を可能にする。最後に、皮膚電極は、電磁コイルより汎用的である。コイルは、それらが印加される部位の幾何学的特性に適合させるように作成されなければならず、そして、各々が治療されるべき部分を取り囲むかあるいは封入するために十分に大きくなければならない。これは、身体を「覆う」ことを意味し、非常に多くの異なるコイル寸法および形状がなければならず、それらの一部はきわめて大きい。電極については、他方、電流分布は電極配置だけによって決定され、そして、間の容積を通して容易に予測可能であり、それで、身体はほんの２、３の電極タイプさらに精選された配置のリストで「カバーされる」ことができる。
【００５３】
刺激システム
また、細胞と電気信号を細胞に供給するための刺激装置とを含む生物系が、本発明によって企図される。この種の細胞は、幹細胞、方向づけられていない前駆体、方向付けされた前駆細胞、多分化能の前駆体、多能性の前駆体のような前駆細胞、あるいは分化の他の段階における細胞、を含むことができるが、これに限定されるものではない。この種の細胞は、胚、胎児性、あるいは成体の細胞であることができ、そして、自己由来あるいは同種異系の源から獲得されあるいは単離されることができる。非増殖性の細胞もまた、本願明細書に記載される方法で使用されることができるとはいえ、一実施態様において、増殖性の細胞が使用される。この種の細胞は、生体外で、例えば組織培養で、あるいは、生体内で、組織エンジニアリングあるいは組織修復用途に対して組合わされることができる。移植された幹細胞は、損傷あるいは疾患の部位に選択的に引き寄せられることができ、次いで高められた治癒を与えるために電気的に刺激されることができる。
【００５４】
本発明の方法および目的に従う細胞培養の刺激は、また、培養過程を妨げることなく、あるいは汚染を生じさせることなく、多くの培養ウェルに同時に一様な波形を供給する実際的手段を必要とする。デバイスが、本願明細書において、信号投与のための特別に設計された容量結合され陽極酸化された電極システムを使用して、多ウェルシステムとして接続される６個の組織培養ウェルを好ましくは含む、培養の間、培養物を電気的に刺激するために提供される。リボンケーブルアタッチメントを用いて培養器の密封における漏れを最小限に抑え、培養のための制御されたＣＯ２環境を保持する。典型的な構成は、図４に部分的に模式的な形式で示される。
【００５５】
例えば図４に示される構成において、６個の組織培養ウェル１１０ａないし１１０ｆが相互接続され、そして、各ウェルは、Ｕ字型カーブでつながれ、ブリッジ１１２の中心部１４２に直角曲げで接続される、２本の１５ｍｍおよび１本の７．５ｍｍ直線セグメントのワイヤによって形成されるチャンバ端部に電極１４０を含む。７個のこの種のブリッジが図４に示される。電極１４０は、典型的な３ｍｍ充填深さで内部的に１８×４８ミリメートルと測定される、Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩスライドチャンバの端壁に適合するようにサイズ設定される。この種の電極のキャパシタンスは、約０．５６マイクロファラッドである。ブリッジ１１２ａおよび１１２ｇは、各々約１５ｃｍのワイヤを含有する端ウェル螺旋体１４４を有する点で異なる。ブリッジワイヤ１１２ａあるいは１１２ｇと対応する銀電極１０４との間に得られるキャパシタンスは、約２．３マイクロファラッドである。
【００５６】
固い、比較的不活性金属から形成されるブリッジ１１２ａ、１１２ｂなどは、端ウェル１０６ａと１０６ｂとの間に電気的に直列にチャンバ１１０ａ、１１０ｂなどを接続する。１１０ａないし１１０ｆの６個のチャンバおよび１１２ａないし１１２ｇの７個のブリッジがここで示されるとはいえ、その他の都合のいい数「ｎ」個のチャンバおよび「ｎ＋１」個のブリッジが使用されることができる。加えて、各々「ｎ」チャンバ、「ｎ＋１」ブリッジおよび２つの端ウェルから成る複数のこの種の直列接続したグループは、電子信号方式の技術で周知のように、グループの間で信号エネルギーを分けるために抵抗回路網のような信号分布手段を使用して、単一の信号源１００とともに使用されることができる。
【００５７】
記載されるように１２個のチャンバ電極端部、２個の端ウェル螺旋体電極１０６および６個のチャンバによる、示された構成の全電気インピーダンスは、主に０．０４５マイクロファラッドの容量成分プラス約１０，０００オームの電気抵抗成分である。信号源１００と端ウェル１０６ａとの間に接続される直列抵抗（図示せず）は、所望のレベルまで印加電流を調整することができて、更に直列リアクタンスの容量部を「圧倒する」ことができる。例えば、１−メグオーム抵抗によって、周波数応答は、５Ｈｚから３Ｍｈｚまで＋／−３ｄＢの範囲内で一様である。
【００５８】
必要に応じて、チャンバ内の信号エネルギー分布は、拡大されたチャンバ１１０ｂに示すようにプローブによって測定されることができる。任意の適度に非活性の金属、しかし、好ましくは電極１０４ａおよび１０４ｂのように９９．９％純銀でできており、それらの先端を除いて絶縁され、これらの先端が周知のかつ固定距離を引き離す、プローブ１２０は、培地１２２内に浸漬されて、一連の位置に移動し、好ましくは矩形の格子をマークする。各位置における差動電圧は、アナログ・デバイセズＡＤ５２２のような差動増幅回路１２４によって読み込まれ、そして、表示あるいは記録のための１２６によって一般に示されるオシロスコープあるいは他のデバイスに送信される。結果は、再び拡大されたチャンバ１１０ｂに対して図４の底部に示すように、全体的平均値に対する各点における信号の強さの比率を表す数の配列として都合よく表される。代替法として、色分けするかあるいは立体的なグラフで示すような他の手段が、使用されることができる。
【００５９】
結果は、再び拡大されたチャンバ１１０ｂに対して図４の底部に示すように、全体的平均値に対する各点における信号の強さの比率を表す数の配列として都合よく表される。代替法として、色分けするかあるいは立体的なグラフで示すような他の手段が、使用されることができる。
【００６０】
図４の格子によって示されているように、矩形のチャンバの狭端部に配置される電極による信号分布は、電極に直ちに隣接している小さい領域における以外は一般的に非常に均一である。培地内の、あるいは普通の生理食塩水内の、切断された、あるいは割られた酸化物が回復するにつれて、均一性も時間とともに改善される。図４の左下の平均以上である読取りは、例えば、カットワイヤ端で不完全に癒合された酸化物から生じることができた。
【００６１】
取り扱う際の便宜、最小培地気化および無菌性を維持する際の容易さのため、グループ内のチャンバ、ブリッジおよび端ウェルの全てが、硬性ガラス板あるいは他の滅菌可能なキャリア上で都合よく組立てられることができ、そして、一旦組立てられたより多くのこれらの板の一つは、次いで硬質プラスチックボックスのような外部の容器内に封入されることができる。
【００６２】
本発明はまた、骨成長あるいは修復を促進するために電気信号を供給するための新奇な刺激デバイスを提供する。具体的には、新奇な受動電極システムが電気信号を供給するために提供される。これらの電極システムは、生体外あるいは生体内の適用のための時間変化する電気信号を連結し、そして、容量結合を支持して誘導によるＰＥＭＦタイプ信号の供給のための従来の電解質ブリッジ技術を置換する。この電極システムは、ニオブ、タンタル、チタン、ジルコニウム、モリブデン、タングステンおよびバナジウムのような陽極酸化された金属などの材料でできていることができるが、しかし、それに限定されない。アルミニウムおよびステンレス鋼は、この特性を共有するが、それらが塩化物イオンを含む溶液によってゆっくり腐食されるので、非常により少ない程度に、である。一般的に約５Ｈｚと３ＭＨｚとの間の、そして、回路改善によって、約１Ｈｚより下から約３０ＭＨｚを超える使用可能な周波数で、ＤＣ電流通過は無視してよい。
【００６３】
ニオブは、自己不動態化し、それによって、酸素および湿度にさらされると、薄いがきわめて耐久性がある表面酸化物層を形成する、いくつかの金属のうちの１つである。この過程は、陽極酸化によって制御されることができる。一般に、自己不動態化は他の方法との信頼性が高い接続を困難にするが、しかし、現在の設計は電極内に電流を誘導するために容量結合を一意的に使用し、そしてそれによって、他の金属との電気的接続を形成する困難を回避する。この電極システムは、無視してよい電気分解を提供し、および生理的に有意な細胞毒性がなく、また、生体内の適用にも役立つ。
【００６４】
本発明の電極システムによって使用されるワイヤは、「自己保護」であり、湿度あるいは酸素にさらされると、薄いがきわめて耐久性がある、かつしっかりと接着する非反応性酸化物の表層を形成する。こうして形成される酸化物は高誘電率を有し、および、酸化物の厚さは実質的に一様で、精密に制御されることができる。保護酸化物コーティングによって、金属が交流電流（ゼロ総電荷あるいはＺＮＣ）電気信号を一様な分布および無視してよい電気分解を伴う培地に導入するための結合コンデンサとして作用することができる。
【００６５】
１００によって一般に示される、刺激装置あるいは他の信号源は、ワイヤ、クリップリード線を通してあるいはその他の都合のいい手段１０２によって、端ウェル１０６ａおよび１０６ｂ内の電気伝導流体内に浸漬される一対の比較的非活性の金属電極１０４ａおよび１０４ｂに接続される。これらは、それに対してそれが印加されるべき培養チャンバ１１０ａ、１１０ｂその他の組立体への信号に対する入口点を提供する。使用中に塩化銀の薄層が界面で生じ、かつ可逆的電気化学反応を通して電流の通過を容易にするので、純粋な（純度９９．９％）銀が電極１０４ａおよび１０４ｂに対して、および、生理食塩水（塩化ナトリウム溶液）が端ウェル１０６ａおよび１０６ｂ内の流体に対して好ましい。他の金属および流体も、しかしまた、使用されることができる。
【００６６】
それが細胞毒性でないと仮定するならば、ブリッジ１１２ａ、１１２ｂその他は任意の相対的に非活性の金属で形成されることができる。一般的に体液に対する不可侵電極として使用される金属は、銀、金、白金および他の白金族金属である。残念なことに、これらはきわめて高価であり、それらの表面で若干の電気化学反応を可能にするか、あるいはさらに触媒作用を起こすことさえでき（特に軽微な不純物がある場合）、そして、この種の反応の生成物は細胞毒性である可能性がある。
【００６７】
この理由のために、いわゆる「自己保護の」金属のグループは、水あるいは水溶液との接触で、金属表面を更なる流体接触から封止する薄くて、連続的で、高度に不溶解性で生物学的に非活性の表面酸化物層を形成し、本発明において好ましい。この酸化物は、電気信号送出システムと培地との間の唯一の接触を形成する。この種の金属は、ニオブ、タンタル、チタン、ジルコニウム、モリブデン、タングステンおよびバナジウムを含む。アルミニウムおよびステンレス鋼は、それらが塩化物イオンを含む溶液によって、（ほとんど全ての体液がそうするように）ゆっくり腐食されるので、この特性を共有するが非常により少ない程度に、である。
【００６８】
この種の金属上の酸化物形成は、増強されることができ、そして、酸化物厚さは陽極酸化を通して、精密に制御可能な方法で増大されることができる。一様な酸化物厚さは金属表面の単位面積あたり一様なキャパシタンスを与え、次に、流体内のその形状にほとんどかかわらず表面上に相対的に一様な信号の強さを生ずる。切断及び形成で生じた酸化物の小さい破損は、流体との更なる反応によって迅速に癒合する。
【００６９】
ニオブは、陽極酸化によって形成される表面酸化物（Ｎｂ２Ｏ５）内の光干渉によって作成される鮮明で安定な色のおかげで、それが宝石で普及しており、したがって都合のいい形態および様々な在庫の色で手頃なコストで入手可能であるので、特にこの用途に好適である。リオグランデ宝石商の供給物は、例えば、「紫」、「ピンク」、「濃青色」、「緑色がかった青」、「緑」および「金」に予備陽極酸化された２０−ゲージおよび２２−ゲージ円形ニオブワイヤの在庫があり、各々の色は異なる酸化物厚さを表す。ワイヤは、任意の所望の電極形状に容易に作られて、形成される。Ｎｂ２Ｏ５の屈折率（Ｎｄ＝２．３０）およびその誘電率（εＲ＝４１ε０）と仮定すると、酸化物厚さは光反射スペクトルから容易に測定されることができ、および、面積あるいはワイヤ長さの単位あたり得られるキャパシタンスが算出されることができる。「紫」ワイヤは、４２０ｎｍピーク反射率から４８ｎｍと測定される最も薄い酸化物を有し、およびしたがって、２２−ゲージ「紫」ワイヤ（．０６４４ｃｍの直径；リオグランデカタログ番号６３８−２４０）に対してキャパシタンスは、ワイヤ長さのセンチメータあたり０．１５４マイクロファラッドと算出された。直接測定は、酸化物破壊に起因して当初は非常により高い測定値を与えたが生理食塩水の中で２４時間の後、測定されたキャパシタンスは、予測値の近くの、センチメータあたり０．１５８マイクロファラッドで安定した。
【００７０】
ブリッジ１１２ａ、１１２ｂその他はしたがって、それらを通した流体あるいはイオン流の可能性がないことを除いて、従来の塩橋がするのとほとんど同じに、電気的に機能し、したがって、チャンバ間の、あるいは、チャンバと端ウェルとの間の起こりうる相互汚染を回避する。加えて、従来の塩橋によって直面された気化および起こりうる破損の問題および寒天培地あるいは他のゲル化剤と作用する不都合は、回避される。それらが電気的に容量性であるので、ブリッジは直流を遮断し、および、したがって、チャンバに到達する信号は相間で電荷均衡を保ち、直流電流成分は除去される。
【００７１】
増殖培地と接触する全てのブリッジ端は、好ましくは同じ概算の寸法を有し、およそ同じワイヤの長さを含み、それで全てがおよそ同等のキャパシタンスを有して、培養チャンバの狭端部に対して配置され、培養チャンバ自体は、図４内の拡大されたチャンバ１１０ｂに示すように、好ましくは矩形である。端ウェル（例えば、図４のブリッジ１１２ａおよび１１２ｇの左端）内の流体と接触するブリッジ端は、接触を強化し、キャパシタンスを減少させ、および／または、これらが培養チャンバとは異なる場合に端ウェルの寸法および形状をよりよく適合させるために、必要に応じて異なる形状を与えられることができる。例えば、円形端ウェルを使用する場合、それらの中に浸漬されるブリッジ端は、図４に示すように螺旋体１４４として都合よく形成されることができる。
【００７２】
要約するとしたがって、本発明によって意図される生物系は以下の要素を備える：電気シミュレータ、陽極酸化された金属電極および細胞。この種のシステムに用いられる適切なＰＥＭＦ信号は、例えば図２あるいは３に記載されるような波形を含む。この種の信号の実際的用途は、骨組織の増殖、分化あるいは石灰化を増強する、ＢＭＰ形質発現を増強する、あるいは一酸化窒素生成を増強することを含む。
【００７３】
組織エンジニアリング
本発明の方法は、また、組織エンジニアリング用途に使用されることができる。細胞は、生体外であるいはエキソビボで機能組織を生成するために、生物学的適合性骨格形成材と組み合わせて本発明の方法および培養システムを使用して培養されることができるか、あるいは生体内で機能組織を形成するために移植されることができる。移植されるあるいは被移植の体幹細胞は、選択的にまた、損傷あるいは疾患の部位に移植されてあるいは引き寄せられ、次いで高められた治癒あるいは回復を提供するために本願明細書において記載される電気信号によって刺激される。組織骨格形成材は、生物学的適合性の天然高分子、合成高分子あるいはその組合せから、実質的に開放構造を有する不織開放性細胞を持つ基質内に、形成されることができ、それは、培養内にあるいは生体内で充分な空間を細胞浸潤に提供する一方、受容者内の標的部位の中への骨格形成材の組込み中に、骨格形成材内で成長する細胞によって発揮される収縮、圧縮、あるいは張力の外力に耐えるのに充分な機械強度を維持する。組織骨格形成材は規定された形状を有する中実の三次元構造を生成するための剛構造とすることができ、あるいは、代わりとして骨格形成材は可撓性の組織を生成するための半個体の基質とすることができる。
【００７４】
本発明の方法および培養システムは、重合体単独、共重合体あるいはその混合物から作られる骨格形成材使用を含む。この重合体は、生体分解性、生物学的安定性、あるいはその組合せであることができる。ここで使用しているように、「生体分解性の」材料は、化学結合の酵素による切断あるいは加水分解の切断を含む、生理学的条件の下で切断されることができる結合を含むものである。
【００７５】
適切な天然高分子は、アルギン酸塩、セルロース、デキストラン、プラン（ｐｕｌｌａｎｅ）、ポリヒアルロン酸、キチン質、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）、ポリ（３−ヒドロキシオクタン酸）およびポリ（３−オキシ脂肪酸）のような多糖類を含むが、これに限定されるものではない。また、アルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化、同じく当業者によく知られている他の修飾のような化学基の置換および／または追加を含む前記天然高分子の化学誘導体が、本発明の範囲内で考察される。天然高分子は、また、コラーゲン、ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテンおよび血清アルブミンのような蛋白質から選択されることができる。適切な合成高分子は、ポリホスファゼン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリ（アミノ酸）（ポリアンヒドリド）ポリカーボネート、ポリアクリラート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレン酸化物、ポリアルキレンテレフタル酸塩、ポリオルトエステル、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリエステル、ポリ乳酸、ポリグリクソライド（ｐｏｌｙｇｌｙｘｏｌｉｄｅ）、ポリシーロキサン、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシブタレート、ポリウレタン、スチレンイソブチルスチレンブロック重合体（ＳＩＢＳ）および共重合体、および、その組合せ、を含むが、これに限定されるものではない。
【００７６】
生体分解性の合成高分子が好まれ、および、ポリＬ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびその共重合体（すなわちポリＤ，Ｌ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ））などのポリα−ヒドロキシ酸、そして、ヒアルロン酸を含むが、これに限定されるものではない。ポリα−ヒドロキシ酸は、人間の臨床用途に対してＦＤＡに認可されている。多糖類およびヒアルロン酸を含む、特定の重合体は水溶性であることに留意する必要がある。水溶性の重合体を使用する場合、例えば架橋剤を用いて、これらの重合体を化学修飾によって部分的に不溶解性の水にすることが重要である。
【００７７】
生体分解性の高分子基質の利点のうちの１つは、血管由来のおよび他の生理活性化合物は基質が生体内で分解するにつれてそれらがゆっくり放出されるように、直接基質内に組み込まれることができることである。細胞−重合体構造が血管新生化され、および、構造が分解するにつれて、細胞はそれらの固有の特性に従って分化する。栄養素、増殖因子、分化あるいは退行分化（すなわち、分化細胞に、分化の特性を失わせ、増殖およびより一般的な機能といった特性を獲得させる）の誘発因子、を含む因子、分泌の生成物、免疫調節薬、炎症の抑制薬、症候の緩解因子、リンパの網目あるいは神経線維の内植を強化するかまたは可能にする生物学的に活性の化合物、ヒアルロン酸、そして、当業者にとって公知であり、かつ有効量を構成することについて使用法とともに、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のような供給業者から商業的に入手可能な薬剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦのような血管増殖因子が、基質内に組み込まれることができるかあるいは基質とともに提供されることができる。同様に、結合ペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のようなペプチドを含有する重合体が、基質を形成するために、合成されることができる。
【００７８】
キット
キットもまた、電気刺激装置を細胞の成長および一体化された組織への組込みを支持する生物学的適合性骨格形成材と組み合わせる本発明において、提供される。内蔵の電極を備えた容器がこのキットを備えることができ、および、電極は自己不動態化材料、あるいは、他の従来の電極材でできていることができる。これらのキットは、骨格形成材との細胞の統合を促進するために任意に成長媒体のような試薬および増殖因子を含むことができる。キット内に含まれる骨格形成材は、それらの表面に固定する生育促進および接着分子を有するように設計されていることができる。この種のキットは、任意選択で適正使用および最適化に関する使用法と共にパッケージされる。
【００７９】
細胞が適切な組織を形成するためにキットの他の要素と結合されるこの種の時間まで、細胞は保護剤によって保たれた形態のキットを備えていることができる。一実施態様において、液体窒素内に低温保存される、あるいは、トレハロースのような化合物の存在で脱水させられる細胞が提供される。細胞は、幹細胞を含む未分化の前駆細胞、多能性の幹細胞、多分化能の幹細胞あるいは、方向付けされた前駆体、であることができる。代替法として、最終分化細胞がまた、これらのキットとともに使用されることができる。この種のキットは、硬骨、軟骨、筋肉、腎臓、肝臓、神経系、肺、心臓、血管系などの任意の器官系に用いられる交換組織を形成するように設計されることができるが、これに限定されない。
【００８０】
細胞は、また、治療を必要とする患者から、患者の自身の組織から技術者交換組織に取り入れられることができる。患者の自身の組織の使用は、組織拒絶反応に伴う合併症の減少した移植組織を形成する方法を提供する。
【００８１】
純粋に電気刺激に加えて、生体外の電気および機械刺激の組合せがいくつかの目的のために有利であると見いだされることができる。機械刺激は、引張荷重、圧縮荷重あるいは剪断荷重から成ることができる。典型的な構成が、図８ａないし８ｅの断面図に示される。
【００８２】
荷重の各々の場合において、試験構成は、従来技術においてよく知られている任意の種類の培養ウェルあるいはチャンバ２００のまわりに作成され、培地２０２および培養ウェルの硬性機械底部２０８の一部であるかどうかの下部シートまたは膜２０６に一般的に取り付けられる細胞の層２０４を含む。とりわけ記載されるように任意の使うことができる金属の、しかし好ましくは自己防衛の金属の、そして、より好ましくは、陽極処理されたニオブの、電極２１０は、培地２０２の全体にわたって相対的に一様な電流分布を形成するような方法で、チャンバ２００内に配置される。
【００８３】
引張荷重に対して、膜２０６は図８ａに示すように培養ウェルあるいはチャンバ２００の追加的なあるいは「疑似の」底部を形成する。膜２０６は、プラズマエッチングされたシリコーンゴムのような、細胞が付着する任意の適切に可撓性で弾性の材料から、作られることができる。チューブ２１２は、膜２０６と硬性チャンバ底部２０８との間の空間２１４を、外部ポンプまたは安定した、あるいは変動する圧力あるいは真空の他の供給源２１６と接続する。圧力源あるいは真空源２１６の間欠運転は、膜２０６を上下に屈曲させ、膜内に、およびしたがって、それに結合される細胞層２０４内に間欠的な張力を生成する。代替法として、供給源２１６は拡張期間の間膜２０６全体にほとんど圧力を印加しないことができ、細胞２０４にその未延伸状態で膜にコロニーを作らせ、次いで、異なる圧力を印加し、それによって例えば細胞２０４がまさに集密状態に到達して、ギャップ結合接触を確立した培養成長の点で、膜２０６を引き伸ばす。
【００８４】
圧縮荷重に対して、培養ウェルあるいはチャンバ２００はその代わりにカバー２２０で封止され、そして、図８ｂに示すように直接圧力源２１６に接続される。供給源２１６は、したがって、細胞層２０４に直接印加される培地２０２の、安定したかあるいは変動する静水圧を形成する。
【００８５】
圧縮荷重に対する代替手段として、チューブ２１２および圧力源２１６が除去され、そして、チャンバカバー２２０は、図８ｃに示すように、安定したあるいは変動する圧力がそれを通して直接培地２０２に、およびしたがって細胞２０４に、印加されることができる可動ピストンの形状をとる。
【００８６】
剪断荷重に対して、培養ウェル２００はその代わりに、図８ｄに示すように、培地２０２が循環される２本のチューブ２１２ａおよび２１２ｂ経由で、圧力源２１６に接続される。この流れは、単一の方向に一定である、間欠的である、あるいは振動することができる。各チューブは、概ね、矢印２２２によって示されるように、より一様な流れを達成するために、好ましくはバッフル２２０を備える。バッフル２２０は、示すように電極２１０から分離したようにされることができ、あるいは、代わりとして、電極は穿孔されることができるか、あるいはさもなければ、バッフルを形成するように非連続的にされることができる。培地２０２の運動および細胞層２０４に対するその摩擦が、所望の剪断荷重を生成する。
【００８７】
剪断荷重を提供するための代替手段として、概ね、矢印２３２によって示されるように、培地２０２を細胞層２０４に対して動いているように維持する可動インペラ２３０によって、チューブ２１２ａおよび２１２ｂおよび圧力源２１６が置換される。インペラ２３０は、いくつかの形状のいずれかをとることができるが、しかし、図８ｅに示すように有利には円筒形の形状とすることができ、チャンバ２００の硬性底部２０８が同じ形状に近似して、インペラ表面から比較的一様な隙間を維持する。培地２０２は、それによって単に一定の速度での回転にインペラ２３０を維持することによって連続的に、そして、細胞２０４の上で安定した速度で掃引される。代替法として、インペラ２３０の速度を変えることは、流速およびしたがって、剪断荷重のレベルを変える。それらがこの配置において様々な位置をとることができるので、電極２１０は示されない。好ましくは、しかし、硬性細胞床２０８およびインペラ２３０は適切な電極金属で、より好ましくは、自己保護の金属で、そして、最も好ましくは陽極酸化されたニオブできており、および電極として機能する。
【００８８】
骨成長の分化調整
上記の通りの本発明の波形は、また、生体内で骨組織の成長および修復を促進するための方法において役立つ。上記の通りに、Ａタイプ波形による刺激は細胞増殖を促進する。Ａタイプ波形はまた、分化を促進する硬骨形態形成蛋白質の増加に結びつく。一実施態様において、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７生成の増加はＡタイプ、あるいは、より少ない程度にＢタイプ電気信号を使用して遂行される。この効果は高度に有益であり、および生体内で適切な組織治癒のための、あるいは組織移植片を形成するために、充分な組織の生成を強化するための方法を提供する。この信号は、また、充分な細胞集団を組織エンジニアリング目的の重合体骨格形成材内への浸潤を提供するのに有益である。別の実施態様において、生体外の試験によって実証されるように、生体内での刺激は石灰化のための骨芽細胞の数を増加させるために骨芽細胞の増殖および分化を提供する。この種の細胞の数の増加は、電気刺激を通して硬骨を発達するかあるいは再生させる際の間隙あるいは穴を埋めるための方法を提供する。Ａタイプ波形によって誘導される増殖を通して生成される細胞は直ちに使用されることができ、あるいは、将来の必要が生じるまで、従来の細胞保存方法を使用して保たれることができる。
【００８９】
Ｂタイプ波形による刺激は、少ない程度に増殖を促進して、Ａタイプ波形とは異なる作用を有する。Ｂタイプ波形によって促進される作用は、石灰化、細胞外の蛋白質生成および基質構築を含むが、これに限定されるものではない。Ｂタイプ波形の作用もまた有益で、石灰化ステップおよび新しい骨組織の骨形成を増強する方法を提供する。一実施態様において、骨組織を発達させるかあるいは再生させることが、石灰化の速度を高めるためにＢタイプ波形によって刺激される。Ｂタイプ波形はカルシウム／カルモジュリン経路を介して、更に、骨細胞上のＧＴＰ結合蛋白質結合受容体あるいは機械受容器の刺激によって作用することができることが提案された（Ｂｏｗｌｅｒ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ、１９９８、３：ｄ７６９−７８０、Ｂａｒｉｂａｕｌｔ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００６、２６（２）：７０９−７１７）。そのようなものとして、また、電気刺激を使用して、カルシウム／カルモジュリン介在された作用の活動、同じくＧＴＰ結合蛋白質結合受容体および機械受容器を調整するための方法が提供される。これらの細胞経路および受容体の調整は、生体外あるいは生体内の骨組織の成長および修復を促進するために有益である。
【００９０】
Ｃタイプ波形による刺激は、硬骨再生、熟成および石灰化を促進する。これらの波形もまた有益で、新しい骨組織の石灰化ステップおよび骨形成を増強する方法を提供する。
【００９１】
Ｄタイプ波形を使用した刺激は、軟骨発達および治癒および硬骨石灰化を促進して、骨粗鬆症および変形性関節症を治療するかあるいは後退させるのに役立つ。これらの波形の適用は、損傷を受けた軟骨を修復すること、骨粗鬆症患者の硬骨密度を増やすことのような生体内での適用、同じく例えば軟骨の組織エンジニアリングに関する生体外の適用を含む。
【００９２】
また、骨軟骨性組織を発達させあるいは再生させることに関する、特定の生物学的成果を達成するための治療療法の開発のために本願明細書において記載される波形の組合せあるいは連続した使用のための方法も、提供される。
【００９３】
一実施態様において、硬骨疾患患者の骨折は骨折を治癒して、そして次に、硬骨を強化する信号によって治療されることができる。この実施態様の限定しない具体例として、骨折を伴う骨粗鬆症性患者が、まず増殖因子の増殖および放出を促進する、Ａタイプ信号によって、そして次に、修復の部位で硬骨密度の増加を促進して、骨質量密度を増やし、再骨折を防ぐＢタイプ波形によって、刺激することによって治療されることができる。
【００９４】
別の実施態様において、本願明細書において記載される２つ以上の種類の波形を組み合わせることが、骨軟骨性組織の連続した増殖、分化および石灰化を促進するために使用されることができる。この実施態様の限定しない具体例として、骨芽細胞の培養が、高分子基質と結合してあるいは結合の前にＡタイプ信号の影響の下で育てられることができる。高分子基質に接種したあと、Ｂタイプ信号は、次いで移植骨片として役立つ構築物の石灰化を促進するために細胞基質構築物に与えられる。
【００９５】
第３の実施態様において、２つ以上の信号が生体内であるいは生体外で骨軟骨性組織の共働の増殖、分化および石灰化を促進するために同時に与えられることができる。種々の信号が、また、各々の信号を単独で供給するより、より大きな効果を生ずるために骨軟骨性組織に順番に印加されることができる。この逐次過程は、必要に応じて、所望の生体効果を得るために、二段階過程を通して十分に何回も循環することによって付加組織（硬骨のような）を生成するために繰り返されることができる。具体的な限定しない具体例として、Ａタイプ信号が、増殖によってより多くの骨細胞を生成するために最初に印加されることができ、そして次に、Ｂタイプ信号が、より多数の骨細胞を誘発してより多くの骨組織（基質、無機質および組織）を生成するために印加されることができ、次いで必要に応じて繰り返されることができる。連続した刺激プロトコルの反復を使用して生成される硬骨の量は、各々の信号単独であるいは組み合わせで生成される量より大きいであろう。
【００９６】
前駆体細胞刺激
本願明細書において記載される方法および波形は、方向付けされた系統への増殖および／または分化を促進するために未分化の前駆細胞に適用されることができる。この種の前駆細胞は、幹細胞、方向づけられていない前駆体、方向付けされた前駆細胞、多分化能の前駆体、多能性の前駆体あるいは分化の他の段階の細胞、を含むことができるが、これに限定されるものではない。また、特に骨芽細胞および軟骨芽細胞が、含まれる。一実施態様において、多分化能の成体幹細胞（間葉性幹細胞あるいは骨髄幹細胞）が、硬骨、結合組織、脂肪などのような特定の経路への多分化能の成体幹細胞の増殖および分化を生体外で促進するためにＡタイプ信号によって刺激される。両方の信号の組合せあるいは連続した投与が、また、前述したように前駆体細胞刺激のために企図される。
【００９７】
代替法として、ここに記載される波形および方法はまた、生体内でＡタイプ信号によって細胞を刺激して、硬骨、結合組織、脂肪などのような特定の経路への多分化能の成体幹細胞の増殖および分化を促進するために、多分化能の成体幹細胞（間葉性幹細胞あるいは骨髄幹細胞）に適用されることができる。両方の信号の組合せあるいは連続した投与が、また、企図される。
【００９８】
前駆細胞の電気刺激は、また、前駆細胞の増殖または分化を促進することが公知の増殖および分化因子によって伴われることができる。増殖因子は、細胞上の分裂促進性の作用を備えた任意の化合物を含む。この種の増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、顆粒白血球−コロニー形成刺激因子、ＩＧＦ−Ｉ、などを含むことができるが、これに限定されるものではない。分化因子は、細胞の分化作用を備えた任意の化合物を含む。この種の分化因子は、レチノイン酸、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７などを含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００９９】
ここに記載される電気波形は、生体外であるいは生体内で骨軟骨性組織の成長および発達上の分化および組合せ調整を提供する。石灰化の前にＡタイプ信号によって細胞増殖を増加することは、骨細胞の数を増加し、したがって、Ｂタイプ信号による刺激によって遂行されるその後の石灰化の増加を提供する。本発明の波形はまた、一酸化窒素および硬骨形態形成蛋白質の放出による前駆細胞の増殖および分化を促進する。
【０１００】
容量結合
金属間の電気的接続を得ることは困難であるので、生体外および生体内の準備の刺激は自己不動態化金属によってしばしば困難である。本発明は、堅固な電気的接続を得ることに伴う問題なく自己不動態化金属電極を使用する利点を得る方法を提供する。これらの電極の容量結合は、電気的接続に対する必要性を回避する自己不動態化金属電極を通して直流を誘導する方法を提供する。この方法において、ニオブ、タンタル、チタン、ジルコニウム、モリブデン、タングステンおよびバナジウム、アルミニウムおよびステンレス鋼のような自己不動態化金属から作られる電極は殺菌され、かつ刺激されるべき細胞の集団に間近の付近に配置される。回路ワイヤが、食塩水のような導電媒質内の金属電極に間近の付近内に配置され、そして、電気信号が回路ワイヤを介して送信され、電流がこのワイヤから生理食塩水および酸化物層を通して自己不動態化金属電極に容量結合され、それによって細胞集団を刺激する。一実施態様において、容量結合刺激は、細胞培養のような生体外適用に使用されるが、しかし、これに限定されない。１枚の培養皿がこの方法を使用して刺激されることができ、あるいは、いくつかの培養皿あるいはウェルが一様な電気刺激のために共に結合されることができる。
【０１０１】
別の実施態様において、容量結合刺激は、無菌の陽極処理された金属電極が治療を必要とする患者内に挿入される生体内の適用のために使用され、そして、回路ワイヤが組織の修復または成長を促進するために有効量の時間の間、挿入された金属電極内に電流を誘導するために皮膚と接触して患者の外側に配置される。例えば、電極の外端部は皮膚のすぐ下に平坦なコイルを形成することができ、そして、信号が、このコイルを通じて直接皮膚上に配置される従来の皮膚接触電極を使用してそれの中に接続されることができる。組織に対する緊密な容量結合が望ましくない容量結合された電極の部分は、挿入された回路に用いられる適切な任意の絶縁材料でおおわれることができ、周知のように、したがって、信号損失および治療されない組織の望ましくない刺激を最小限に抑えることができる。硬骨修復のような具体例において、自己不動態化金属から作られる無菌の陽極酸化された金属電極が治療を必要とする患者内に挿入されて、刺激される。硬骨の修復のための充分な期間の後、電極は患者から除去されることができる。
【０１０２】
ＢＭＰ形質発現増強
本発明は、刺激された細胞から硬骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）の形質発現および放出を促進するためにＡタイプおよびＢタイプ波形を使用する方法および装置を更に含む。ここに記載される電気信号は、この信号にさらされる組織に利点を引き起こすのに十分なレベルで、ＢＭＰの放出を生じさせるために使用されることができる。利点は、信号に直接さらされない組織で生じることができる。
【０１０３】
ＢＭＰは、骨誘導に関係するポリペプチドである。それらは、ＢＭＰ−１を除く腫瘍増殖因子−β超科のメンバである。少なくとも２０のＢＭＰが現在まで識別されて、研究されたが、しかし、ＢＭＰ２、４および７だけが、生体外で幹細胞分化の全ての過程を刺激して造骨細胞成熟細胞にすることが可能だった。現在の研究は、整形外科的組織再生のためにＢＭＰを供給する方法を開発しようと試みている。（Ｓｅｅｈｅｒｍａｎ、サイトカイン増殖因子Ｒｅｖ．  ２００５  Ｊｕｎ；１６（３）：３２９−４５）。技術的に厳しくて高価な供給方法での外因性ＢＭＰの供給を通しての代わりに電気刺激を通して整形外科的組織再生のために生体外のあるいは生体内のＢＭＰの放出を誘導するための方法がここで提供される。
【０１０４】
一実施態様において、Ａタイプおよびより少ない程度にＢタイプ波形が内因性ＢＭＰの形質発現および放出を引き起こすために使用される。内因性ＢＭＰの放出は、標的組織の発達および分化を促進する。刺激電極の配置は、ＢＭＰ形質発現の増加を必要とする生体外の準備のあるいは患者内の生体内で局所化された領域へのＢＭＰ形質発現を目標とする方法を提供する。一実施態様において、ＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−７あるいはその組合せが、標的組織の分化および発達を遂行するために内因的に放出される。特定の実施態様において、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７の一方または両方の放出が、硬骨あるいは軟骨組織の分化、石灰化、蛋白質生成および基質構築を促進する。
【０１０５】
一酸化窒素による硬骨、軟骨あるいは他の結合組織細胞の刺激
ここに記載される方法および電気信号は、また、硬骨、軟骨あるいは他の結合組織の修復および成長を促進するために使用されることができる。一実施態様において、Ｂタイプ波形が一酸化窒素（ＮＯ）の放出を通して細胞成長を増強する。この波形は、この信号にさらされる組織に利点を引き起こすのに十分なレベルで、一酸化窒素の放出を生じさせることができる。利点は、直接信号にさらされない組織で生じることができる。硬骨、軟骨あるいは他の結合組織細胞増殖は、電気刺激と組み合わせたＮＯドナーの共投与によって更に増強されることができる。ＮＯドナーは、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、ＳＩＮ−Ｉ、ＳＮＡＰ、ＤＥＡ／ＮＯおよびＳＰＥＲＴＮＯを含むが、これに限定されるものではない。硬骨、軟骨あるいは他の結合組織細胞増殖は、電気刺激と組み合わせてＮＯ合成酵素阻害剤を共投与することによって減少することができる。この種のＮＯ合成酵素阻害剤は、Ｎ（Ｇ）−ニトロ−ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）および７−ニトロインダゾール（７−ＮＩ）を含むが、これに限定されるものではない。これらの方法を使用して、硬骨、軟骨あるいは他の結合組織細胞増殖は特定の必要性に従い調整されることができる。
【０１０６】
本発明の装置および方法の適用
ここで記載されるように、本発明の装置および方法を用いて、この装置および方法は骨軟骨性組織の成長、分化、発達および石灰化を促進する際に効果的である。
【０１０７】
この装置は、さまざまな生理学的条件に対する細胞の反応に関係するサイトカインのような化学因子の放出を強化することによって治療部位で直接動作すると信じられる。これは、増加した血流に結びつき、そして、治療部位の更なる炎症を抑制し、それによって身体の固有の治癒過程を強化する。
【０１０８】
本発明は、手術中に鋸で切られたかあるいは折れた硬骨を含むが、これに限らず単純な、あるいは複雑な（複数のあるいは粉砕された）骨折の治癒を促進する際に特に使用される。本発明は脊椎固定手術の後で脊柱の癒合を促進するために使用することができる。
【０１０９】
本発明は、癒着不能骨折を治療し、骨粗鬆症を治療し、防ぎ、あるいは、後退させ、骨減少症を治療し、防ぎ、あるいは、後退させ、骨壊死を治療し、防ぎ、あるいは、後退させ、網状骨（仮骨、骨棘）の形成を遅延させ、あるいは、後退させ、長期にわたる床上安静における骨カルシウム損失を遅延させ、あるいは、後退させ、微重力状態における骨カルシウム損失を遅延させ、あるいは、後退させる、ために使用されることができる。加えて、本発明は局所的血液循環を増加させ、外傷の領域に対する血流を増加し、慢性皮膚潰瘍の領域に対する血流を増加し、そして、血液凝固を調整する、ために使用されることができる。
【０１１０】
本発明がまた、使用されることができる領域のうちの１つは、損傷を受けたかあるいは裂けている軟骨の治癒を促進することである。また、本発明は皮膚損傷あるいは潰瘍の治癒（上皮化）を促進するために使用されることができる。
【０１１１】
本発明は培養細胞あるいは組織の成長を促進して、細胞増殖を調整して、細胞分化を調整して、細胞周期進行を調整して、腫瘍増殖因子の形質発現を調整して、骨形成蛋白質の形質発現を調整して、軟骨増殖因子の形質発現を調整して、インスリン様成長因子の形質発現を調整して、線維芽細胞成長因子の形質発現を調整して、腫瘍壊死因子の形質発現を調整して、インターロイキンの形質発現を調整して、サイトカインの形質発現を調整する、ために更に使用されることができる。
【０１１２】
本発明の方法および装置は、以下の限定されない具体例によって更に例示される。手段は、さまざまな他の実施態様、変更およびその等価物に対して有されることができ、それは、本願明細書において記述を読み込んだ後に、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲の目的から逸脱することなく、当業者に示唆することができる。
【０１１３】
［実施例］
［実施例１］
一次骨芽細胞培養における石灰化および形態に関するＰＥＭＦ信号構成の効果
【０１１４】
この研究の目的は、一次骨細胞培養における生化学的および形態的な変異を評価することによって容量性カップリングによって供給される２つのＰＥＭＦ波形構成を比較することであった。
【０１１５】
方法
骨芽細胞培養：一次人骨芽細胞（ＣＡＭＢＲＥＸ（登録商標）、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）は、７５％集密状態に拡大されて、以前に記載されたＬＡＢ−ＴＥＫ（商標）チャンバ（ＮＡＬＧＥ  ＮＵＮＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（商標）、ロチェスター、ＮＹ）に直接５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で平板培養された。培養は、分化因子のない塩基性の骨芽細胞媒体によって当初は支持された。培養液がチャンバの内部で７０％集密状態に到達した時、媒体はヒドロコルチゾン−２１−ヘミこはく酸（２０ＯｍＭ終末濃度）、β−グリセロリン酸（１ＯｍＭ終末濃度）およびアスコルビン酸で補充された。骨芽細胞は、最高２１日の間、３７℃、５％  ＣＯ２、９５％空気で加湿された空気の中で培養された。媒体は実験の経過の間、２日ごとに変えられ、各チャンバを４ｍｌ補充した。
【０１１６】
電気刺激：培養液は、３０分間あるいは２時間のいずれかの間、１日につき二回刺激された。２つの電気信号療法が、細胞に選択的に適用され、１つが、「信号Ａ」（μｓｅｃで６０／２８正／負信号持続期間）として示される連続的な波形、そして、もう一方が「信号Ｂ」（μｓｅｃで２００／２８正／負信号持続期間）として示される連続的な波形であった。２．４ｍＶ／ｃｍ（ピーク対ピーク）強度がサンプル実行で測定された。刺激されない骨芽細胞（ＮＣ）が、同様の方法で（対照として）同一の密度で平板培養された。以下が、詳細な方法の手順を使用して測定された：アルカリ性ホスファターゼ、カルシウム、オステオカルシンおよび組織構造。以下のグラフの各々は、「Ａ」信号、「Ｂ」信号、「１」として３０分持続期間、「２」として２時間持続期間および電流がないとしてＮＣ（または合流点）を示す（すなわち、Ａ１はＡ信号−３０分であり；Ｂ２は、Ｂ−２時間である）。
【０１１７】
本願明細書において用いられる電気デバイスは連続的な波形の印加、複数の外植体に対する電気刺激を同時に可能にする。各実験に対して、６対の外植体が、４ｍｌの培地内の個々のウェル内に入れられた。対照標本が類似した状態で培養され、唯一の差異が供給された信号の欠如である。現在の試験構成は、ニオブワイヤのコイル状にされた部分経由で直列に接続される６個の検査培養ウェル（１７×４２ｍｍ）から成った。
【０１１８】
人間の骨芽細胞が、各々約１０ｃｍ２の表面領域を有する、ＬＡＢ−ＴＥＫ（商標）ＩＩスライドウェル（ＮＡＬＧＥ  ＮＵＮＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ（商標）、ロチェスター、ＮＹ）内に定着された。信号が、一対のキャパシタンスとして作用したニオブワイヤ経由で直列に、それらを接続することによって同時にいくつかのチャンバに印加された。刺激は、信号Ｂと示された（標準臨床硬骨治癒信号に類似した）９ｍＶ／ｃｍを供給する、１５／ｓｅｃで繰り返す、２００／２８μｓｅｃ双極性矩形パルスの９ミリ秒のバースト、あるいは信号Ａと示された４ｍＶ／ｃｍを供給する６０／２８μｓｅｃの実質的に単極性パルスの４８ミリ秒のバーストのどちらかであった。培養液は、１日２回３０分あるいは２時間刺激を受けた。サンプルが、媒体からとられて、アルカリ性ホスファターゼ、オステオカルシン、基質カルシウムおよび組織構造に対して７、１４、２１日時点で分析された。石灰化付随形態が、フォンコッサ染料によって確認された。全ての生化学的分析は、従来の分析評価技術によって実行された。
【０１１９】
結果
ＰＧＥ２、生成は市販のＥＬＩＳＡキットを使用して評価された（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ（商標）、ミネアポリス、ＭＮ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社（商標）、カールズバッド、ＣＡ）。結果は、２４時間につき、組織のｐｇ／ｍｇ（μＭ／ｇ／２４ｈｒｓ）として表現される。
【０１２０】
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）：研究設計に示す時点で、細胞が溶解され（Ｍａｍｍａｌｉａｎ−ＰＥ、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、セントルイス、ＭＯ）、そして、上澄み液が集められた。アルカリ性ホスファターゼは、マグネシウムの存在下で塩基性の状態の下でニトロフェニル（ＰＮＰ）へのパラ−ニトロフェニル燐酸塩（ＰＮＰＰ）の開裂で測定された。最終産物ＰＮＰは、４０５ナノメートルの吸収ピークによる比色である。塩基性の状態は、ｐＨ１０．３で０．５Ｍの炭酸塩緩衝液を使用して達成された。培養基は、ＡＬＰ活動に対して直接検査された。細胞層ＡＬＰは、トリトンＸ−１００の溶液およびＡＬＰ活動に対して測定されるアリクォットによって抽出された。アルカリ性ホスファターゼは、溶解緩衝液抽出に続いて上澄み液の中で、および、膜の中での双方で測定された（図５）。他の研究（Ｌｏｈｍａｎ、２００３年）から予想通りに、アルカリ性ホスファターゼ形質発現は、膜の中で、ほとんど７日で最高に達した。「Ｂ」刺激の下で培養された細胞において、しかし、培養基は測定できるＡＰの増加を実証し続けた。
【０１２１】
オステオカルシン：オステオカルシン（５８００ダルトン）は、骨芽細胞の特定の生成物である。少量のオステオカルシンが、循環流動内に直接放出され、それは、主として骨基質の中に沈着される。研究は、オステオカルシンが無処置（１−４９）蛋白質として、そして、Ｎ末端断片として循環することを示している。主要Ｎ末端断片は、ペプチド（１−４３）である。ミッドタクトオステオカルシンエリサキットが、その高い特異性のために選択された。分析評価は、大いに高感度（０．５ｎｇ／ｍｌ）で、わずか２５マイクロリットルのサンプルが必要とされるだけである。我々の実験群と同時に実行される標準物質は、ＢＴＩ製造業者（ＢＴＩ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ）によって提供される期待値に強い相関を示した。培養液を急冷することに続いて測定され、かつ基質成分から決定される、オステオカルシン沈着は、「Ｂ」刺激に続いてより顕著で、そして、２１日で最高であった（図６）。
【０１２２】
ＤＮＡ含量：細胞層は、０．１Ｎ水酸化ナトリウムおよびＣｙＱｕａｎｔ分析評価キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社（商標）、カールズバッド、ＣＡ．）を使用してＤＮＡ含量に対して検査されるアリクォットによって抽出された。トリトンＸ−１００によってＡＬＰ含量に対して抽出される細胞サンプルに対して抽出物は、１Ｎ水酸化ナトリウムを使用して０．１Ｎ水酸化ナトリウムに合うよう調節された。標準曲線は、マッチング緩衝液を含む。また、タンパク含有量を必要とするサンプルに対してアリクォットが、染料結合法（ブラッドフォード）を使用して蛋白質に対して測定された。
【０１２３】
カルシウム：カルシウムは、青紫色の色のついた複合体を形成するｏ‐クレゾールフタレインコンプレクソンとともにシュワルツェンバッハ方法論によって測定された。２ｍｌの０．５Ｍ酢酸を夜通し加えることによって、カルシウムは溶解され、そして、含量は５５２ｎｍにおける比色分析評価によって標準物質に対して定量化された（ＣＯＲＥ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＳＵＰＰＬＩＥＳ（商標）、カントン、ＭＩ）。
【０１２４】
培養液内のカルシウム分布は、また、組織構造によって評価された。細胞は２％グルタルアルデヒドで固定され、カコジラート緩衝液によって洗浄されて、ＰＢＳによって洗浄され、次いで示されたように、染色のために水和された。各時間は、協調して実行され、代表する形態が、２１日の間提示され、「Ｂ」信号と、「Ａ」信号を比較し、そして、両方の信号を対照と比較する（図６）。信号Ｂに対して、最も著明な観察結果が、我々が「擬似海綿状の」硬骨として解釈した明らかな優先配列とともにカルシウムの分布内にあった。信号Ａに対して、定性的に信号Ｂより多くの細胞増殖およびより少ない基質生成があるように見えた（しかし、信号Ａは、明らかに対照によるより多くの基質を有した）。
【０１２５】
骨計測解析が開発され、クラウチャーの方法論から修正された。この二次元のチャンバシステムにおいて、サンプルをとられた格子の総面積に対して平均の小柱の面積が、調査された。各々の強度で２チャンバから最低限２０領域を使用して、調査は骨生成、類骨幅および細胞数を検討した。ランダムな特定の格子が、直接の比較のために、そして、バイアスを除去するために開発された。加えて、刺激および対照チャンバの双方内の骨芽細胞培養が、組織構造を調査し、培養内のカルシウムの分布を制限するために、ＶｏｎＫｏｓｓａ法（マロリー、１９６１）によって、直接染色された。
【０１２６】
結論
アルカリ性ホスファターゼは、１０−１４日レベル近くでピークまで上昇して、次いで徐々に沈下し、信号Ｂによって刺激される上澄み液の中で増加した。オステオカルシン沈着は、培養液を急冷することに続いて測定され、かつ基質成分から決定され、「Ｂ」信号だけに続いてより顕著で、そして、２１日でその最高点まで増加した。ｍｇ／ｄｌで測定された基質カルシウム、および組織培養板の面積の関数としての基質カルシウムは、信号Ｂだけによって最も大きかった。無機質分布は、組織構造およびフォンコッサ染色法によって分かるように、分析評価から生化学データを実証した。Ｂ刺激は、より大きな量の無機質を与えて、さらに三次元小柱配列において予想されるように、類似した張力動態を与えることができる網状の２次元パターンを示唆した。細胞増殖が、信号Ａ対対照で定性的により高く見えた、一方、かなり増加した石灰化およびパターンが信号Ｂで２１日においてはっきりした。
【０１２７】
２信号構成が、きわめて異なる効果を生じたことは、Ｃａ／ＣａＭ標的を想定して、信号Ｂの検出感度が信号Ａより１Ｏ倍高いことを示した信号対雑音比（ＳＮＲ）解析によって、容易に説明可能である。この調査は、ＰＥＭＦが組織形態との構造変更共鳴性をもたらす潜在性を有することを初めて実証する。２１日の培養で明らかな幾何学的パターンは、海綿骨に調和する小柱細網化を反映させ、そして、評価された全ての時点で信号Ａにさらされる対照および培養の双方における細胞のランダム配向を明確に対比した。この種の結果は、好ましい信号構成が、以前は組織レベル観察に限定された構造上の階層をもたらすことができることを示唆する。
【０１２８】
［実施例２］
生体外のＰＥＭＦ刺激のためのニオブ「塩」橋の使用
導入
陽極酸化されたニオブワイヤを使用した受動電極システムが、培養チャンバ内に時間変化する電気信号を接続するために開発された。設計の意図は、細胞、組織調査のために、生体外で誘導的によりむしろ容量的に、ＥＢＩ反復性パルスバースト骨成長刺激装置によって組織内に誘導されるもののような、ＰＥＭＦタイプ信号の供給のための従来の電解質ブリッジ技術を置換することによって、複雑性を減少させ、再現性を向上させることであった。陽極酸化されたニオブワイヤは、容易に入手可能で、電極ブリッジを形成するために単純な手工具だけを必要とする。使用できる周波数で、一般的に５Ｈｚと３ＭＨｚとの間で、ＤＣ電流通過は、無視してよい。
【０１２９】
背景
容量結合された電界が、限定された周波数応答を有し、かつ長期の露出時間の間汚染のリスクなしで使用するのが困難な、従来の電解質塩橋によって、一般的に培地に導入された。ニオブ（コロンビウム）は、酸素あるいは湿気にさらされると、自己不動態化し、薄いがきわめて耐久性がある表面酸化物層を形成するいくつかの金属のうちの１つである。他のものは、タンタル、チタン、そして、非常により少ない程度に、ステンレス鋼である。この過程は、促進されることができて、陽極酸化によって制御されることができる。自己不動態化に関する課題は、それが他の金属との信頼性が高い接続を困難にすることである。本設計は、その困難を回避する。
材料および方法。
【０１３０】
酸化ニオブ、Ｎｂ２Ｏ５は、硬くて、透明で、電気絶縁で、広いｐＨ範囲にわたって水、一般の試薬および体液に対して不活性である。ニオブを陽極酸化すると、Ｎｂ２Ｏ５を一様な厚さで形成し、染料が加えられていないので、宝石として高く評価されるさまざまな鮮明な光干渉色を示し、安定かつ再現可能なキャパシタンスを生じる。宝石商のニオブは、各々異なる酸化物厚さを表す標準の色彩で販売される。Ｎｂ２Ｏ５の誘電率が著しく高く（εＲ＝４１ε０）、そして、層が薄い（４８−７０ｎｍ）ので、それらのキャパシタンスは驚くほど大きい。「紫」ニオブは、最も薄い酸化物および最も高い測定キャパシタンスを有する：２２−ゲージワイヤ（リオグランデ＃６３８−２４０）に対して０．１５８μＦ／ｃｍで、４８ｎｍ酸化物に対する計算値（４２０ｎｍピーク反射率）に近い。水あるいは生食水の中で、カットワイヤ端および曲げで形成される小さい傷は、再陽極酸化の必要なしで、酸化物とすばやく癒合する。
【０１３１】
ニオブブリッジ：
本用途において、酸化ニオブは培地との唯一の電気的接点を形成し、そして、ＰＥＭＦタイプ信号は容量的にそれを通過する。数ミリアンペアを下回る信号レベルで、アーチファクトを生じさせる無視してよい電解あるいはｐＨ変化がある。複数のチャンバが直列に接続されることができ、各々が同一の信号を受け取る。各ニオブブリッジは、０．５６μＦの典型的なキャパシタンスとともに、各先端でシートのような電極を形成して曲げられる。矩形のチャンバの端部に電極ブリッジを配置することは、培地の全体にわたってほぼ一様な電流分布および電圧傾度を生成する。以前に図４に示されて、付随するテキストに記載されたように、培養入替え装置、電極およびＰＥＭＦタイプ信号の典型的な構成で測定される勾配は、主に電極の近くで、あるいは培地が深さでかなり変化するところで±３％の平均変動を示す。一つのチャンバあるいはいくつかの直列に接続されたチャンバが、特別なニオブ端ブリッジによって付勢され、各々が、生理食塩水を介して、接続末端を形成する銀の帯状電極に容量的に接続されるその外端部を有する。これは、ニオブをそれ自体にあるいはその他の金属に接続するいかなる必要性も取り除く。電流は、直列制限抵抗Ｒｌｉｍによって制御される。得られるバンドパス（標準値±３ｄＢ）は、幾分Ｒｌｉｍによって変化するが、検査構成において、しかし、５Ｈｚから３ＭＨｚ、試みられた最も高い周波数、まで動作した。ＰＥＭＦタイプ信号は、したがって、容量結合経由で、生体外で歪められずに供給されることができる。
【０１３２】
実験：
ニオブ電極ブリッジの有用性は、前述したようにＢタイプ波形を使用して骨芽細胞および軟骨細胞培養上で試験された。存在する細胞なしでＯＧＭ（登録商標）骨芽細胞培地（ＣＡＭＢＲＥＸ（登録商標）、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、Ｍｄ）に印加されるこの信号によって、２４時間後に測定されたｐＨは無印加対照の８．２７と比較して８．２９であり、無視してよい電気分解を示唆した。生理的に有意な細胞毒性の不在が、ＡタイプおよびＢタイプ波形の双方を使用してＯＧＭ（登録商標）内の２１日にわたる骨芽細胞の強い増殖、海綿骨状構造の分化および発達によって示された。培養内の波形に対する２１日の間の３０分および２時間露出の後、細胞および基質はエネルギー分散Ｘ線（ＥＤＸ）によって分析された。ニオブは、検出されることができなかった。他の調査において、Ｂタイプ信号が９６時間の間１％ウシ胎児血清を含む培地の中で人間の軟骨細胞（ＨＣＣ）に印加された。細胞層のＤＮＡ含量で測定されたように、Ｂタイプ信号は細胞数の１５４％増加を生じさせ、再び、有意な細胞毒性を示さなかった。各々が４日の間毎日３０分供給された、容量結合された信号と他の点では同一の、しかし、電磁気で結合された信号との間の直接の比較において、ＤＮＡによる骨芽細胞数の測定された増加は、しかし、互いにではなく、対照とはかなり異なった（ニオブに対して１５７％、連結されたＥＭに対して１６４％）。
結論。
【０１３３】
新奇なニオブ電極ブリッジが、培養内の細胞／組織に容量結合されたＰＥＭＦタイプ信号を印加するために開発された。ニオブブリッジのバンドパスは５Ｈｚから３ＭＨｚまであるので、硬骨および傷の修復のために臨床的に使用されるもののようなＰＥＭＦタイプ信号は歪なしで通過する。標準電解質ブリッジ構成とは異なり、ニオブブリッジは培養皿内に一様な電流密度を形成する。長期のＰＥＭＦ露出に対する適用は、電気分解あるいは生理的に有意な細胞毒性を示さない。
［実施例３］
容量結合されたＰＥＭＦ信号を使用した軟骨細胞の刺激
導入
硬骨修復のために臨床的に使用されるものに類似したＰＥＭＦ信号は、関節炎患者の関節の痛みを減少するためにその機能を現在試験されている。関心を引くことは、この疼痛寛解信号が、また、障害のある軟骨の基本的な問題を改善することができるどうかである。
【０１３４】
背景
薬物療法および生物学と比較して、ＰＥＭＦベースの治療は使いやすくて、非侵入性で、潜在的な副作用を伴う異質の薬剤を含まず、ゼロクリアランス時間を有する治療を提供する。ＰＥＭＦ治療に関する問題は感応性の細胞を識別し、細胞上の物理的形質導入部位を解明して、細胞反応に結びつく生物学的作用機構を決定することを含む。この調査の目的は、現在疼痛寛解（ＭＥＤＲＥＬＩＥＦ（登録商標）、Ｈｅａｌｔｈｏｎｉｃｓ社、ＧＡ）用に試験されている特定のＰＥＭＦ信号が生体外で軟骨細胞を刺激することができるかどうか、そして、生物学的作用機構が解明されることができるかどうか判定することであった。
【０１３５】
方法
通常の人間の軟骨細胞（ＨＣＣ；ＣＡＭＢＲＥＸ（登録商標）、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）が、単層の矩形の細胞チャンバの中で平板培養された。時間変化する電流が一様にチャンバの中を流れることができたニオブ電極ブリッジシステムを通して、ＰＥＭＦ印加は容量結合された。ここに記載されるパルスバーストＢタイプ信号は、１５Ｈｚで繰り返される幅２００／２８マイクロ秒の非対称矩形パルスの１０ミリ秒のバーストから成る。ＰＥＭＦ信号は、治療につき３０分間印加された。細胞増殖は、細胞層のＤＮＡ含量によって評価された。一酸化窒素（ＮＯ）培地の含量は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社（登録商標）（カールズバッド、ＣＡ）の、分析評価キットを使用してグリース反応によって評価された。結果は、細胞層のＤＮＡ含量によって評価されるように、細胞数あたりＮＯのマイクロモルとして表現される。
【０１３６】
結果
４００マイクロアンペア、ピーク対ピークで、１％ウシ胎児血清を含有する培地の中で成長されるＨＣＣ細胞に、９６時間の期間にわたって１２時間ごとに印加されたＰＥＭＦ信号は、１５３±２２％、ｐ＜０．００１の増加した細胞増殖に結びついた。関心を引くのは、最初のＰＥＭＦ治療の２４時間後に集められた調整された培地が示すこと、そして、９６時間で重要でないレベルに落ちた１９６±１４％、ｐ＜０．００１のＮＯの増加であった。ＳＮＰ（ＮＯドナーニトロプルシドナトリウム）が３マイクログラム／ｍｌの終末濃度に追加された場合と類似した状態の下で、また、２４時間でのＮＯの増加（１７４±２６％、ｐ＜０．００１）、そして、未処理の対照と比較して９６時間での細胞数の増加（１６８±２２％、ｐ＜０．００１）があった。以降の実験において血清濃度は、０．１％に減少し、ＰＥＭＦは、２４時間ごとに１回４０マイクロアンペアで印加され、そして、測定が７２時間後にされた。ＰＥＭＦ治療は、調節された培地のＮＯ含量を１５４±３０％（＜０．０１）に増大した。図７に示すように、ＰＥＭＦ治療は細胞数を増やし、そして、この細胞反応はＬ−ＮＡＭＥ（一酸化窒素シンターゼ阻害剤）によって減らされた。
【０１３７】
結論
これらの結果は、関節炎による関節痛を減少するために現在試験されているＰＥＭＦ信号がまた、軟骨に対する利点を提供することができることを示唆する。データは、人間の軟骨細胞が増加した細胞増殖によってこの信号に反応することができることを示す。さらに、ＰＥＭＦ刺激された軟骨細胞成長に対する作用の可能な生物学的機構は、ＮＯの放出を通してである。ＮＯドナーに対する軟骨細胞の類似した反応は、この仮定を支持する。決定的でないとはいえ、このデータは、ＰＥＭＦ治療後の増加した細胞増殖がＮＯによって媒介されるか、あるいは、ＮＯは増加した細胞増殖をもたらすＰＥＭＦに対する機構の必須のステップであるかどちらかであることを示唆する。
［実施例４］
一次骨芽細胞培養内のＢＭＰ生成のＰＥＭＦ刺激：
信号構成および露出持続期間上の依存性。
【０１３８】
導入
脊椎固定の手術に対する補助的手段としてあるいは長骨の扱いにくい偽関節の治療に対して、ＰＥＭＦは非外科的療法として有効と証明された。試行研究は、骨芽細胞が信号構成および持続期間の双方に異なって反応することを実証した。１つの鍵となる差異は、細胞増殖の代わりに基質を沈着するための傾向を含んだ。脊椎固定における、および、偽関節におけるＢＭＰの証明された有効性に基づいて、そして、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４が、ＰＥＭＦによって刺激されることを実証する努力（Ｂｏｄａｍｙａｌｉ、１９９８）に基づいて、我々の研究は、以前の細胞反応が、ＢＭＰ調整に関連づけられることができるかどうかのより良い理解に集中した。
【０１３９】
目的
この研究は容量結合によって供給される２つのＰＥＭＦ波形構成を比較し、ＢＭＰ調整と一次骨細胞培養の生化学的および形態的な変異とを関連づけた。
【０１４０】
方法論
正常な人間の骨芽細胞が、１０ｃｍ２の個々の培養チャンバ内に定着された。信号が、結合キャパシタンスとして作用したニオブワイヤ経由で直列に、それらを接続することによって同時にいくつかのチャンバに印加された。刺激は、「信号Ａ」として示される６０／２８マイクロ秒の矩形の双極性パルス、あるいは、信号Ｂとして示される２００／２８マイクロ秒の矩形の双極性パルスのどちらかの連続的な列から成り、１．２ｍＶ／ｃｍ（Ａ内）あるいは２．４ｍＶ／ｃｍの（Ｂ内）ピークツーピーク電界を培養に一様に印加した。培養は、１日２回、（１）３０分あるいは（２）２時間の間露出され、比較のためのグループＡ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２を生じた。膜蛋白定量のために以前に使用されたアリクォットが、ＥＬＩＳＡ分析評価によってＢＭＰ蛋白質に対して分析され、そして、カルシウムを測定して、形態を解釈するために以前に使用された基質は、その後、（１８ｓ  ＲＮＡ）ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７に対して周知で入手可能なシーケンスプライマを使用して、二段階逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析されたＲＮＡを単離するために使用された。増殖を刺激した信号および基質沈着を刺激した信号の双方が、ＢＭＰ調整および蛋白質転移に対して分析された。７日、１４日および２１日時点からのサンプルが、分析評価に対する同一の比較を確実にするために使用された。
【０１４１】
結果
この実験の主要な結果は、６つの部分からなった。１）ＢＭＰ蛋白質およびＢＭＰに対するｍＲＮＡは、両方の刺激、特に「Ａ」信号のそれに反応して高められた。２）１日につき二回供給された３０分刺激は、２時間治療と比較して、２１日でＢＭＰ−２形質発現のほぼ４０倍の増加を提供し、１４−２１日間の期間中に大部分の増加が達成された。３）「Ａ」信号の３０分刺激は、１４日解析と２１日解析との間に再びほぼ完全に注目される、ＢＭＰ−７形質発現の１５倍の増加を提供した。４）ＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−７のどちらかの中程度だけの増加が、「Ｂ」信号に関して見られた。５）この研究は、ＢＭＰ−７形質発現がＰＥＭＦ刺激によって促進される最初の証拠を提供し、そして、６）増殖評価が定性的だったとはいえＢＭＰ沈着の分裂促進の性質は以前に発表された研究と一致している。短い期間の間の形質転換細胞系上のＰＥＭＦを評価する研究は、ＢＭＰ−３もＢＭＰ−６も刺激されないことを示唆する（ヤジマ、１９９６）。我々は、これらの増殖因子に関して我々のモデルを評価しなかった。
【０１４２】
結論
ＢＭＰ−２が形態形成および分裂促進の特性を有することを示した研究の主要部を前提として、「Ａ」信号に反応した細胞の増殖は驚くべきでない。２信号構成が、きわめて異なる効果を生じたことは、Ｃａ／ＣａＭ形質導入経路を前提として、信号「Ｂ」の適用量が信号「Ａ」より１０倍高いことができることを示唆するＳＮＲ解析によって、潜在的に説明可能である。おそらくより予想外だったのは、「Ｂ」信号によってもたらされた誇張された基質沈着にもかかわらず正常化されたＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７レベルであった。骨生成は、増殖因子と表面の微解剖図との均衡に鋭敏に依存しており−実際、円滑な表面の存在は、ＢＭＰ−２に対する細胞反応に優先して、ジストロフィの石灰化を目立たせる。「Ｂ」信号に反応して見られる高程度の基質構築および沈着を仮定すると、それ自体内の、そして、そのＢＭＰ形質導入は、増殖性の骨生成のために不十分に見え、および分離したターゲッティング機構によって生じることができる。
【０１４３】
［実施例５］
ケーススタディ：ＰＥＭＦ刺激による骨粗鬆症の治療
１人の骨粗鬆症性人物（女性、年齢５０、開始におけるＴ＝−３．０９２）が、週に４−５日、毎日３−５時間の間信号Ｂ（２００／３０）を使用する電気刺激を使用した。この患者は１年期間の間、同じ薬物投与、補助剤および活動にとどまった。６ヵ月および１２ヵ月の進度管理硬骨密度調査で、骨質量密度の１６％および２９％増加が認められた。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】硬骨骨折治癒を促進する際に使用される波形の模式図である。
【図２】図２Ａ：誘導コイル波形に基づき、かつ硬骨の石灰化を促進するための皮膚印加のために適応されるパルスモードの有効電気信号波形を示す例証を提供する。図２Ｂ：硬骨の石灰化を促進するための連続モードの有効電気信号波形を示す例証を提供する。
【図３】図３Ａ：骨細胞の増殖を促進するためのパルスモードの有効電気信号波形を示す例証を提供する。図３Ｂ：骨細胞の増殖を促進するための連続モードの有効電気信号波形を示す例証を提供する。
【図４】電流を供給するための実験的ラボチャンバを示す例証を提供する。
【図５】上澄み液（左）内の、および、膜（右）内のアルカリ性ホスファターゼの変化を示す棒グラフを提供する。
【図６】信号「Ｂ」によるオステオカルシンおよびカルシウム沈着物の変化を示す棒グラフを提供する。
【図７】Ｌ−ＮＡＭＥの存在および不在におけるＰＥＭＦ信号波形に対する対照±標準偏差のパーセンテージとしてＤＮＡで測定される細胞数の増加を示す棒グラフを提供する。Ｌ−ＮＡＭＥ単独は、実験的対照として示される。
【図８】生体外の適用のための機械および電気刺激の組合せを使用するための構成の模式図を提供する。
【符号の説明】
【０１４５】
２０ベース波形
２２連続モード波形
２４パルスバーストモード波形
２６、２８電圧あるいは電流の２つの異なる固有値
３０、３２、３４、３６特定の遷移間のタイミング
１００信号源
１０２手段
１０４電極
１０６端ウェル
１１０ａないし１１０ｆ組織培養ウェル
１１２ブリッジ
１２０プローブ
１２２培地
１２４差動増幅回路
１２６オシロスコープ
１４０電極
１４２ブリッジの中心部
１４４螺旋体
２００培養ウェル
２０２培地
２０４細胞層
２０６膜
２０８機械底部
２１０電極
２１２チューブ
２１４空間
２１６供給源
２２０チャンバカバー、バッフル
２２２矢印
２３０可動インペラ
２３２矢印
【図１】
2008541938.tif 000003
【図２】
2008541938.tif 000004
【図３】
2008541938.tif 000005
【図４】
2008541938.tif 000006
【図５】
2008541938.tif 000007
【図６】
2008541938.tif 000008
【図７】
2008541938.tif 000009
【図８】
2008541938.tif 000010
【国際調査報告】
2008541938.tif 000011