(57)【要約】  本明細書中に開示されるのは、配列5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3'を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む化合物、ISIS 2302の直腸投与を含む、潰瘍性大腸炎の改善の維持及び／または治療のための方法である。その方法は、組成物の投与の集結の後、延長した期間（90日より長い）の間、潰瘍性大腸炎の指標の減少の結果をもたらす。組成物は十分に耐容性があり、そして、全身性の暴露は最小限である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO 2を含む配列を有するオリゴヌクレオチド及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む組成物で、オリゴヌクレオチドの全身性暴露を最小限にさせる組成物の、直腸投与の薬剤の調製における使用。
【請求項２】
最小限の全身性暴露が、直腸へ投与された用量の約5％よりも少ない、全身への利用率を含む、請求項1の使用。
【請求項３】
薬剤が、潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標を改善させる、請求項1の使用。
【請求項４】
薬剤が、粘膜脆弱性、排便頻度、直腸出血、または疾患活動性指数の少なくとも1つを改善させる、請求項1の使用。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項1の使用。
【請求項６】
薬剤が粘膜治癒を維持させる、請求項1の使用。
【請求項７】
粘膜治癒の維持が少なくとも約90日間持続する、請求項6の使用。
【請求項８】
粘膜治癒の維持が少なくとも約120日間持続する、請求項6の使用。
【請求項９】
薬剤が疾患を改善する活性を有する、請求項1の使用。
【請求項１０】
潰瘍性大腸炎が中程度から重度の潰瘍性大腸炎である、請求項2の使用。
【請求項１１】
個体において潰瘍性大腸炎の指標の少なくとも1つの改善を維持するための以下を含む方法：
オリゴヌクレオチドがSEQ ID No: 1の2114から2133のヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、長さが約15から30の核酸塩基単位のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物の治療投与量の個体への直腸投与、及び
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善について個体をモニターすること。
【請求項１２】
潰瘍性大腸炎の指標が粘膜脆弱性を含む、請求項11の方法。
【請求項１３】
潰瘍性大腸炎の指標が排便頻度を含む、請求項11の方法。
【請求項１４】
潰瘍性大腸炎の指標が直腸出血を含む、請求項11の方法。
【請求項１５】
潰瘍性大腸炎の指標が疾患活動性指数を含む、請求項11の方法。
【請求項１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項11の方法。
【請求項１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド結合を含む、請求項16の方法。
【請求項１８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがもっぱらホスホロチオエートヌクレオチド結合を含む、請求項16の方法。
【請求項１９】
潰瘍性大腸炎の改善の維持とは、個体へ組成物を投与する処置期間終了後、少なくとも60日間の、潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善を含む、請求項11の方法。
【請求項２０】
潰瘍性大腸炎の改善の維持とは、個体へ組成物を投与する処置期間終了後、少なくとも90日間の、潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善を含む、請求項11の方法。
【請求項２１】
直腸に投与される組成物が注腸剤である、請求項11の方法。
【請求項２２】
治療投与量が、少なくとも一日あたり約240 mgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項11の方法。
【請求項２３】
組成物の全身性暴露が投与された用量の5％より少ない、請求項11の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドの長さが約18から22核酸塩基単位である、請求項11の方法。
【請求項２５】
個体の潰瘍性大腸炎の指標の少なくとも1つの改善を維持するための以下を含む方法：
SEQ ID 2を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物の治療投与量の直腸投与、及び
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善について個体をモニターすること。
【請求項２６】
潰瘍性大腸炎の指標が粘膜脆弱性を含む、請求項25の方法。
【請求項２７】
潰瘍性大腸炎の指標が排便頻度を含む、請求項25の方法。
【請求項２８】
潰瘍性大腸炎の指標が直腸出血を含む、請求項25の方法。
【請求項２９】
潰瘍性大腸炎の指標が疾患活動性指数を含む、請求項25の方法。
【請求項３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが修飾されている、請求項25の方法。
【請求項３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド結合を含む、請求項30の方法。
【請求項３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがもっぱらホスホロチオエートヌクレオチド結合を含む、請求項30の方法。
【請求項３３】
潰瘍性大腸炎の改善の維持が、個体へ組成物を投与する処置期間終了後、少なくとも60日間の、潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善を含む、請求項25の方法。
【請求項３４】
潰瘍性大腸炎の改善の維持が、個体へ組成物を投与する処置期間終了後、少なくとも90日間の、潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標の改善を含む、請求項25の方法。
【請求項３５】
直腸に投与される組成物が注腸剤である、請求項25の方法。
【請求項３６】
治療投与量が、少なくとも一日あたり約240 mgのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項25の方法。
【請求項３７】
組成物の全身性暴露が投与された用量の5％より少ない、請求項25の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願
本出願は、2004年12月2日に出願された60/632,826、及び、2005年9月12日に出願された60/716,355の2つのアメリカ合衆国仮出願に関連し、また、優先権を主張する。その両方は、その全体について本明細書中で援用される。
【０００２】
配列表
配列表は本出願とともに37 CFR 1.821に基づいて出願され、また、本明細書中で参照として援用される。
【０００３】
発明の属する分野
本発明は、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び回腸嚢炎を含む、炎症性腸疾患の改善及び／または治療を目的とする、細胞間接着分子-1（ICAM-1）の発現を調節する、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療用化合物に関連する。
【０００４】
発明の背景
免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーの構成員であるICAM-1は、血管内皮細胞上、及び、白血球の部分集合上に、低いレベルで恒常的に発現する、誘導型膜貫通糖タンパク質である（Dustin ら、J. Immunol.、137:245-54、1986; Rothlein ら、J. Immunol.、137:1270-4, 1986; Simmonsら、Nature、 331:624-7、1988）。ICAM-1が結合する主要なリガンドは、β2インテグリンであるLFA-1及びMac-1であり、それら両方は白血球上に発現している（Marlin及びSpringer、Cell、51:813-9、1987; Diamondら、J. Cell Biol.、 111:3129-39、1990）。ICAM-1は炎症過程の伝播において多様な機能を果たし、最も特徴的なものは、炎症部位における、血管内コンパートメントから血管外の空間への白血球の遊走の促進である（Butcher、Cell、67:1033-6、1991; Furieら、Blood、78:2089-97、1991; Oppenheimer-Marksら、J. Immunol.、147:2913-21、1991）。加えて、ICAM-1はまた、抗原提示の際に、重要な二番目のシグナルをT-リンパ球に提供することも明らかになっている（Altmannら、Nature、338:5l2-4、1989; Van Seventerら、J. Immunol.、144:4579-86、1990; Kuhlmanら、J. Immunol.、146: 1773-82、1991）。それはまた、細胞傷害性T細胞（Makgobaら、Eur. J. Immunol.、18:637-40、1988）、ナチュラルキラー細胞（Allavenaら、Blood、84:2261-8、1994）、及び好中球（Dingら、J. Immunol.、163:5029-38、1999）を介する標的細胞の損傷においても、重要な促進的役割を果たす。
【０００５】
腫瘍壊死因子-α(TNF-α)(Toら、Arthritis Rheum.、39:467-77、1996; Beutler、Arthritis Rheum.、26:16-21、1999)を含む前炎症性刺激因子に応答して、多くの細胞型でその表面上のICAM-1の発現が調節される。ICAM-1を含む細胞接着分子は、白血球及び内皮細胞の浸潤に必要とされる。多数の研究により、炎症性腸疾患（IBD）（Jonesら、Gut、36:724-30、1995）、関節リウマチ（Toら、Arthritis Rheum.、39:467-77、1996）、セリアック病（Sturgessら、Clin. Exp. Immunol. 82 :489-92、1990）、IgAニューロパシー（Nguyenら、Am. J. Nephrol. 19:495-9、1999）、全身性狼蒼（Papaら、Lupus、8 :423-9、1999; Egererら、Lupus、9 :614-21、2000）、炎症性皮膚炎（Ackermannら、Arch Dermatol Res.、290:353-9、1998）、及び、多発性硬化症（Boら、J. Neuropathol. Exp. Neurol.、55:1060-72、1996）を含む、広範囲の炎症性疾患を罹患している患者の関連組織内でのICAM-1の発現上昇が、証明されている。
【０００６】
抗ICAM-1モノクローナル抗体は、肺炎及び喘息（Bartonら、J. Immunol. 143:1278-82、1989; Wegenerら、Science、247:456-9、1990）、同種移植拒絶（Cosimiら。J. Immunol.、144:4604-12、1990; Isobeら、Science、255:1125-7、1993）、腎炎（Harningら、Clin. Immunol. Immunopath.、64:129-34、1992; Kawasakiら、J. Immunol.、150:1074-83、1993）、虚血性傷害（Maら、Circulation、86:937-46、1992; Kellyら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 91:812-6、1994）、炎症性関節炎（Iigoら、J. Immunol.、147:4167-71、1991）、接触皮膚炎（Scheyniusら、J. Immunol. 150:655-63、1993）、及び大腸炎（Hamamotoら、Clin. Exp. Immunol.、117:462-8、1999）を含む疾患の様々な動物モデルにおいて、有益な効果が証明されている。これらの動物モデルは、ヒト疾患でのICAM-1の機能あるいは発現のどちらかの阻害剤の、試験を支持した。
【０００７】
炎症性腸疾患（IBD）の期間のICAM-1の発現は証明されている。硫酸デキストランにより誘導される大腸炎のモデルマウスでは、ICAM-1の発現は結腸粘膜下及び血管筋層の内皮で、増加する（Bennett、J. Pharm. Exp. Ther.、280:988-1000、1997）。クローン病におけるヒトICAM-1の発現は粘膜固有層微小血管系（結腸と空腸の両方）（Sousaら、Gut、45:856-63、1999）、腸管単核細胞（Bernsteinら、Clin. Immunopathol.、86:147-60、1998）、及び結腸上皮の管腔側部分（Vanierら、Am. J. Surg. Pathol.、24:1115-24、2000）において、増加している。ICAM-1の組織発現は、疾患活動性と相関している（Vanierら、Clin. Exp. Immunol.、121:242-7、2000）。
【０００８】
炎症性腸疾患（IBD）とは、クローン病及び潰瘍性大腸炎の両方を含む、疾患群をいう。その2つの疾患は、その類似した病因及び臨床的症状発現のため、しばしば一緒に分類される。侵襲的な画像検査をせずに、2つの疾患を判別することは不可能であり、それらは多くの出版物及び研究において、しばしば単一の病気とみなされる。それぞれの疾患の確定的な診断には、白血球値の上昇を検出する全血球算定、赤血球沈降速度、及び、血清アルブミン濃度、を含む臨床検査と組み合わせて、内視鏡検査法（S状結腸検査法または結腸鏡検査法のどちらか）、二重造影バリウム注腸、及び、コンピュータ連動断層撮影（CT）スキャンといった画像検査が必要である。
【０００９】
両者の疾患とも、慢性で、再発性／寛解型である消化管（GI）の炎症性疾患である。クローン病に最も頻繁に冒されるGI管の領域は、小腸及び大腸であり、結腸とも呼ばれ、直腸をも含む。しかしながら、クローン病は口から肛門までのGI管全体を冒しうる。1つもしくは複数の斑状の炎症がみられることがある。潰瘍性大腸炎は、大腸のみを冒す。潰瘍性大腸炎の炎症及び潰瘍は、大腸の4層のうちの最も内側の2層である、粘膜及び粘膜下層に限られる。クローン病の炎症及び潰瘍は、小腸及び大腸の両方の腸管壁のすべての層に広がり得る。疾患に共通の症状は、下痢、腹痛、直腸出血、及び、体重減少を含む。クローン病の合併症は、腸膿瘍（intestinal abscess）、液体または分泌物が通過できる腸の一部分から他の部分への異常な導管であるフィステル、及び、腸閉塞を含む。主として、両者の疾患の経過は、間欠性であり、病気の悪化に続いて寛解の期間がある。しかしながら、潰瘍性大腸炎は、単発に起こることもあり、もしくは、厳しい症状が続くこともある。
【００１０】
病理及び臨床的な症状発現における重複に基づくと、クローン病と潰瘍性大腸炎に利用可能な治療法がおおむね重複することは驚くことではない。顕著な違いは、疾患領域が直腸に近いことによる、潰瘍性大腸炎の処置における注腸剤の使用の可能性である。これは、治療薬の局所投与を可能にする。クローン病は主に小腸の関与を含むので、全身性の処置が主に必要とされる。IBDの治療的介入には多数の選択肢があるが、多くは望ましくない副作用を有し、そのことがクローン病の処置においてそれらを理想以下のものにする。
【００１１】
軽度の潰瘍性大腸炎においては、経口または局所的な（すなわち注腸）アミノサリチル酸の送達が主として治療の第一線である。アミノサリチル酸類は、IBDに用いられる最も古い抗炎症性化合物の1つである、5-アミノサリチル酸（5-ASA）を含む薬剤からなる。例えば、5-ASAスルファサラジンは1930年代に関節リウマチの処置のために開発され、そして、IBDの処置に対するその有用性は、1970年代に確立された（Anthonisenら、Scan. J. Gastroenterol.、9:549-554、1974）。高投与量で使用すると、急性の発病において5-ASAは寛解を引き起こし得る。一般的には維持療法に用いられるが、5-ASAは寛解の維持に効果的であることは証明されていない。
【００１２】
一般に使用される5-ASA製剤は、スルファサラジン、経口及び局所メサラミン、オルサラジン、及びバルサラジドを含む。目的とする部位（例えば小腸または大腸）に利用可能な活性薬剤を提供するため、様々な製剤が改良されている。副作用は5-ASAにおいて、まれなものではない。スルファサラジンは、サルファ基（sulfa group）に付随して、頭痛、吐き気、消化不良、及び、食欲不振を含む、比較的高い毒性を有する（患者の約3分の1）。一般的でない副作用は、熱、発疹、関節痛、溶血、好中球減少、大腸炎の悪化、過敏性反応、及び、腎毒性を含む。サルファ基（sulfa group）を含まないメサラミン、オルサラジン、及びバルサラジドは、実質的により少ない副作用をもたらすが、依然として発疹、頭痛、及び、熱は引き起こしうる。他のより重篤な副作用もまた、報告されている。
【００１３】
メサラミン注腸は、さしこみ、急性腹部痛、及び出血性の下痢、時により頭痛、熱及び発疹により特徴付けられる、急性不耐症候群の産生に関与している。メサラミン型注腸を使用した際、何人かの患者が全大腸型の大腸炎（pancolitis）を引き起こした。しかしながら、頻度はプラセボ処置群より低かった。注腸からのメサラミン吸収の程度は保持時間に大きく依存し、そのため変化する。全身性暴露は、経口投与と比較すると注腸投与では、おおむね減少する。しかしながら、一日の投与量の10から30％は24時間の尿採取により回収されることから、全身性暴露は微弱ではないことが示される。臨床条件下、投与後10〜12時間において、患者の血漿値は2μg/mlであり、その約3分の2はN-アセチル代謝物であることが証明される。（Physicians Desk Reference、53rd Edition.1999. Medical Economics Data、Montvale、 NJ、pp 3126-7）。
【００１４】
コルチコステロイドはIBD発病における寛解の誘導に最も効果的な薬剤の1つであり、また、5-ASA処置に効果がないときの、典型的な第二の治療選択である。化合物はまず、経口、または、直腸のどちらかから、5-ASAの投与に付随して、または、単独で送達される。経口送達が功を奏さない場合、その化合物は静脈内投与される。理想的には、コルチコステロイドは、短期間の処置にのみ用いられ、そして、疾患の寛解により次第に減らす。
【００１５】
IBD処置に一般に用いられるコルチコステロイドは、プレドニゾン、ブデゾニド、及び、ヒドロコルチゾンを含む。コルチコステロイドは、その使用に伴う、重度で深刻な副作用の数により使用が限定される。短期使用の一般的な副作用は、不眠症、寝汗、情緒変動、及び、糖代謝異常を含む。長期的な維持療法は、主に、重篤で難治性の症例のためのみに保持される。長期的な治療は、副腎萎縮をもたらす可能性があり、一方、突然の中断は、副腎不全、低血圧、及び死さえも引き起こし得る。他の副作用は、にきび、異常脂肪沈着、多毛症及び骨粗鬆症を含む。クローン病では、コルチコステロイドは疾患の状態を悪化させるフィステルの治癒を阻害し得る。
【００１６】
経口または直腸投与のコルチコステロイドに対する個体の応答は、しばしば5-ASAの維持投与量による。しかしながら、寛解期の間の薬理学的介入を提供しない医師もいる。静脈内コルチコステロイドの治療が必要な患者は、主に5-ASAと併せて、6-メルカプトプリン及び／またはアザチオプリンといった、免疫抑制剤を持続させる。非経口栄養法はそういった重篤な疾患において主に考慮される。患者が上記の治療に応答しない場合、腸の疾患部位を除去する手術を避けるための試みとして、免疫抑制剤シクロスポリンが投与されることがある。
【００１７】
免疫抑制剤の介入は、望ましくない副作用がないわけではない。6-メルカプトプリン及びアザチオプリンは、白血球減少、膵炎、重度の感染、及び、骨髄抑制を含む、より重篤な副作用とともに、熱、発疹、吐き気、及び頭痛、を引き起こす可能性がある。シクロスポリンは、感覚異常症（灼熱感やチクチクするような異常な感覚）、多毛症、高血圧、振せん、腎不全、頭痛、及び、日和見感染を含む、さらに重篤な副作用を有し得る。
【００１８】
抗生物質、主にシプロフロキサシン、または、メトロニダゾールは、特に、瘻管形成、または、結腸の疾患の患者の治療において、5-ASAまたはコルチコステロイドへの添加剤として、用いられる。すべての他の治療法と同様、抗生物質を用いた長期治療にも副作用がある。
【００１９】
インフリキシマブは、現在のところIBDの薬物療法の最終手段である。それは、ヒトタンパク質75％及びマウスタンパク質25％からなるキメラモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、強力な炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子-α（TNF-α）の阻害剤である。薬剤は可溶型及び膜結合型TNF-αの両方に結合することによりsinkとして機能する。炎症性カスケードの上流活性化因子を阻害することにより、多数の炎症性経路が阻害されうる。薬剤は、製品ラベルに示される通りに、初めに治療のため、そして続いて、維持薬剤として8週間ごとに、静脈内投与される。しかしながら、それは生物学的薬剤であるため、免疫応答が薬剤の有用性を制限する可能性がある。そのため、通常は免疫抑制剤をインフリキシマブ維持療法と併せて与える。IBDに対する他のすべての治療法と同様、インフリキシマブにも重大な副作用がある。TNF-αは、新生物細胞の根絶に重要な役割を果たし、そのため、その抑制は、特に長期戦略の場合、日和見感染、悪性疾患、及び、他の合併症へとつながる可能性がある（Brownら、Arthritis Rheum.、46:3151-8、2002;Leeら、Arthritis Rheum.、46:2565-70、2002;Naharら、Ann. Pharmacotherapy、37:1256-65、2003）。
【００２０】
外科的介入は、IBDの処置方法であり、治療ではない。IBDの慢性的な性質により、また、比較的低年齢で発症するため、薬理学的介入で応答しない患者は、生涯を通して複数の手術が必要となり得る。腸の短い部分の除去は、重大な副作用なしで可能である。しかしながら、腸のより大きい部分、または、複数の部分の除去は、栄養の吸収が出来ない短腸症候群をもたらす可能性がある。大腸部分の除去は、結腸瘻造設術、または、他のさらなる外科的手法の必要が生じ得る。よって、手術はIBDの処置の好ましい方法ではない。
【００２１】
IBD処置のための外科的介入は、さらなる疾患をもたらし得る。結腸を完全に除去した場合、外科医刃小腸から回腸嚢を構築することが可能で、永久的な人工肛門の必要性よりもむしろ便を肛門を介して除去させる。回腸嚢炎は、回腸嚢の非特異的炎症であり、再構築後初めの2年以内に主に起こる。症状は、失禁、出血、熱、及び／または、便意切迫を伴い得る、排便頻度の確かな増加を含む。潰瘍性大腸炎の患者の約20から30％が、少なくとも一つの症状の発現を経験する。抗生物質は回腸嚢炎の治療に十分であり得るが、しかしながら、IBDに使われるものと同様の、より挑戦的な他の治療法が必要とされる。
【００２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、先行技術のアプローチが直面する問題に対する理想的な解決を提供する。それらは、所定の核酸またはタンパク質の発現を選択的に阻害するように設計することが可能であり、そしてヌクレオチド配列に基づく核酸標的との相互作用により、作用の非特異的な機構を回避し、類似したタンパク質構造または活性をもつファミリーの、特異的なアイソフォームの阻害を可能にする。特異的な阻害剤の設計には、標的機構や高分子相互作用の完全な理解は必要ではない。
【００２３】
ヒトICAM-1は3.3-kb mRNA（SEQ ID NO 1）によりコードされ、55,219ダルトンのタンパク質の合成を生じる。ICAM-1は、N-結合型糖鎖付加部位を介して、高度に糖鎖付加を受けている。その成熟タンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定される、90 kDaの見かけ分子量を有する（Stauntonら、Cell、52:925-933、1988）。ICAM-1は免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーの構成員である。5つの免疫グロブリン様ドメインをN末に含み、膜貫通ドメイン、及び、細胞質ドメインが続く。LFA-1及びライノウイルスへの主要な結合部位は、第一の免疫グロブリン様ドメインに見いだされる。しかしながら、それらの結合部位は異なっているようである（Stauntonら、Cell、61:243-354、1990）。
【００２４】
ICAM-1は広範囲の組織および細胞に分布を示し、そして、白血球、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、及び、他の上皮細胞上にも見いだすことができる。ICAM-1の発現は、血管内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、アストロサイト、及び、いくつかの細胞株において、細菌性リポ多糖、及び、インターロイキン-1、腫瘍壊死因子、γ-インターフェロン及びリンフォトキシンといったサイトカインによる処理により、制御され得る（例えば、Frohmanら、J. Neuroimmunol.、23:117-124、1989を参照）。
【００２５】
in vitro及びin vivoの実験の両方を用いて、一連のオリゴヌクレオチドをヒトICAM-1（SEQ ID NO 1）の発現を阻害する能力について試験した（例えば、アメリカ合衆国特許5,514,788参照）。これらの実験より、ヒトICAM-1のヌクレオチド2114から2133を標的とするオリゴヌクレオチドISIS 2302（SEQ NO 2）がさらなる開発のため選択された。
【００２６】
ISIS 2302は、ヒトICAM-1 mRNAの3'-非翻訳領域の配列に特異的にハイブリダイズするように設計された20塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。ISIS 2302は、ICAM-1 mRNAへ特異的に結合し、RNaseHヌクレアーゼの遍在的なファミリーの1つであるRNaseH1酵素によってそのmRNAの切断をもたらすことによって機能することが、研究により強く示唆されている（Crooke、Biochim. Biophys. Acta.、1489:31-44、1999）。しかしながら、本発明の方法は、ISIS 2302の作用機構によって限定されない。
【００２７】
オリゴデオキシヌクレオチドのホスホロチオエート修飾では、各ホスホジエステル結合の非架橋酸素分子を硫黄分子に置換することにより、非修飾DNAと比較して有意にエキソヌクレアーゼ耐性が増加しており、そして、薬剤の半減期は延長する（Gearyら、Anti-Cancer Drug Design、12:383-94、1997）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは最小限の抗原性のみであり、細胞毒性はなく、かつ、耐容性がよく、また、その薬物動態及び薬力学的特性は十分に特徴づけられている（例えば、Butlerら、Lab. Invest.、77:379-88、1997; Mirabelliら、Anti-Cancer Drug Des.、6:647-61、1991参照）。
【００２８】
ホスホロチオエート骨格の修飾に加え、多数の他の可能性のある骨格修飾、糖修飾、及び、他の修飾が当業者によく知られており、また、本出願が基づいている、親出願において議論されている。
【００２９】
ICAMを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、炎症性腸疾患のマウス及びラットのモデルで、皮下または腹腔内注射により全身性に投与された際に、効果があることが示された（例えばそれぞれ、Bennett、USP 5,514,788、実施例20;及びUSP 6,096,722、実施例29）。これらのデータは、ヒトのクローン病、回腸嚢炎、及び、潰瘍性大腸炎の処置に向けた臨床試験の開発の基盤となった。クローン病の試験では、ISIS 2302（Alicaforsen）はプラセボ対照試験において、個体へ全身に投与された。第二相試験では、患者のいくつかの下部集団においてISIS 2302の静脈内投与の有効性が示された（Yacshynら、Gut、51:30-36、2002; Yacyshynら、Aliment. Pharmacol. Ther.、16: 1761-70、2002）。続く2回の第三相試験では、静脈内投与されたISIS 2302は、臨床的寛解および疾患活動性指標スコアに基づいた中程度から重度のクローン病患者の治療において、効果がないことが見いだされた（Cheyら、Gastroenterology、128:A-112、abst 724、2002）。
【００３０】
回腸嚢炎治療の臨床試験には、ISIS 2302の注腸製剤が用いられた（アメリカ合衆国特許公報20040162259、実施例17参照、Minerら、Alimnet. Pharmacol. Ther.、19:281-6、2004）。慢性の寛解しない回腸嚢炎で、かつ、回腸嚢炎疾患活動性指数（PDAI）が少なくとも7である、患者12人が試験に登録された。PDAIは排便頻度、直腸出血、便意切迫、腹部疝痛、100°Fより高い熱、内視鏡的スコア、及び、組織学的スコアを含む因子の組み合わせに基づいた臨床的スコアである。伝統的に、活動性の回腸嚢炎は、PDAIスコアを少なくとも7有すると確定されている。患者は、ISIS 2302を240 mg含むヒドロキシプロピルメチルセルロース注腸の毎晩の投与を6週間受けた。評価は、ベースラインにおいて、また、3、6、及び、10週において、行なわれた。内視鏡検査、及び、症状のスコアは早くも3週において有意な減少がみられ、さらに6週まで継続し、それぞれの内視鏡検査の構成要素は10週間まで、改善がみられ、主要評価項目である、PDAIの6週での減少が達せられた（p=0.001）。臨床症状スコアもまた、基準から6週へ減少した。注腸は、耐容性が良好であり、そして、研究においては深刻な有害事象はなかった。10週を越えた長期の追跡評価は行われなかった。
【００３１】
軽度から中程度の潰瘍性大腸炎の治療のための、ISIS 2302直腸投与の小規模無作為化、対照化、二重盲検での段階的投与量増加試験（SJH van Deventerら、Gut、53:1646-51）。患者にISIS 2302の4段階の1日あたり投与量（6、30、120、及び240 mg）の1つを28日間処置し、そして、1、3、及び6か月後、処置の安全性及び有効性を、疾患活動性指数（DAI）の改善についてモニターした。DAIは、排便頻度、直腸出血、内視鏡による外見、及び、調査者の包括的な評価に基づく、臨床的スコアである。6ヶ月の試験の間、ベースラインを越えたさらなる外科的または内科的介入を必要とした患者は、プラセボ群では50％であったのと比較して、240 mg/1日群ではいなかった。結果は、急性及び長期の有望な利点を示唆した。しかしながら、その結果を決定的にするには、より大規模な臨床試験における立証が必要とされた。
【００３２】
IBD処置において可能な介入が多数あるにも関わらず、そのどれもが、制限された有効性、望ましくない副作用、または、その両方のため、完全に満足するものではない。IBDの効果的な治療にはまだ満たされていない必要性が明らかに残っており、その疾患の慢性的特徴のため、効果の維持を生み出す治療が望ましい。  発明の概要
個体への、好ましくはヒドロキシルプロピルメチルセルロース中で製剤された、8から80核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む治療的投与量の組成物の直腸投与を含む、潰瘍性大腸炎の持続的改善、または治療の方法が、開示され、そのオリゴヌクレオチドは、SEQ ID 1の2114から2133のヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする少なくとも8核酸塩基部分を含み、そして、疾患の改善について個体をモニターする。さらに、組成物の投与を含む、粘膜治癒及び持続的な応答を促進する方法を開示する。さらに、組成物の投与を含む、疾患を改善する結果を生み出すための方法を開示する。これらの方法は、組成物の活性成分の最小限の全身暴露を伴い、また実質的な副作用はなく、治療的評価項目を達成する。好ましい態様において、その方法は中程度から重度の潰瘍性大腸炎をもつ個体に用いられる。
【００３３】
ヒドロキシプロピルメチルセルロース中に、配列（SEQ ID 2）:
5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3'
を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む、治療的投与量の組成物の直腸投与を含む、潰瘍性大腸炎の改善の維持または治療のための方法が開示され、そのオリゴヌクレオチドはICAM-1タンパク質の発現を阻害し、そして、疾患の改善について個体をモニターする。さらに、組成物の投与を含む、粘膜治癒及び持続的な応答を促進する方法を開示する。さらに、組成物の投与を含む、疾患を改善する結果を生み出すための方法を開示する。これらの方法は、組成物の活性成分に対する最小限の全身暴露を伴い、また実質的な副作用はなく、その治療的評価項目を達成する。好ましい態様において、その方法は中程度から重度の潰瘍性大腸炎をもつ個体に対して用いられる。
【００３４】
潰瘍性大腸炎を患う個体において、個体への直腸投与により粘膜治癒及び持続的な応答を促進する薬剤の調製を目的とする、SEQ ID NO 1のヌクレオチド2114から2133に特異的にハイブリダイズする、少なくとも8核酸塩基部分を含むオリゴヌクレオチドである、8から80核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む組成物の使用を開示する。薬剤としてのさらなる用途は、疾患を改善する結果を生み出すことである。これらの用途は、組成物の活性成分の最小限の全身暴露を伴い、そして、実質的な、望ましくない副作用がないことで、達成され得る。オリゴヌクレオチドがSEQ ID NO 2の配列を有することができ、そして、直腸投与用の薬剤がヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて調製され得ることをさらに開示する。好ましい態様において、組成物は中程度から重度の潰瘍性大腸炎を有する個体の処置のための薬剤の製造に使用される。
【００３５】
発明および好ましい態様の詳細な説明
アンチセンスオリゴヌクレオチドは多くのヒト疾患の治療を目的とする治療薬として素晴らしい見込みをもっている。オリゴヌクレオチドは、ワトソン-クリック塩基対により定義された通り、mRNA前駆体または、成熟mRNAの相補的な配列に特異的に結合し、DNAからタンパク質への遺伝情報の流れを阻害する。その標的配列によってそれ自身を特異的なものにするという、アンチセンスオリゴヌクレオチドの特徴はまた、それらの用途を非常に広くしている。なぜなら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは4つの単一的な単位の長い鎖であるため、それらは、どのような標的RNA配列に対しても容易に合成され得るためである。
【００３６】
本発明の薬剤組成物（たとえばオリゴヌクレオチド）などの薬剤組成物を輸送する方法は良く知られている。本発明では、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中にオリゴヌクレオチドを含む注腸製剤において、オリゴヌクレオチドを直腸投与により輸送する。投与の経路に関する詳細は、以下の実施例、及び、本明細書中で参照として援用される親特許出願において、提供される。
【００３７】
薬剤組成物を輸送するための製剤は、当業者によく知られている。具体的な製剤の選択は、投与の経路、投与される組成物の可溶性、及び、投与される化合物の質を含む（限定しない）、当業者に良く知られている検討事項に基づいている。製剤の詳細は実施例、及び、両方とも本明細書中で参照として援用される、アメリカ合衆国特許6,096,722及び6,747,014において示される。
【００３８】
以下の実施例において議論される試験は、潰瘍性大腸炎の改善及び処置における、ISIS 2302の有効性及び安全性を証明する。ISIS 2302は、治療の標準であるメサラミンよりも持続的で、耐久的な応答を生み出す。この応答の持続性は、疾病を患う個人の生活の質に大きな影響をもつ、潰瘍性大腸炎のような疾患において、重要である。再発の頻度を減少させることにより、患者の生活の質は改善される。さらに、ISIS 2302は、潰瘍性大腸炎の以前のどんな治療にも見いだされなかった、疾患改善活性をもつことが示されている。
【００３９】
オリゴヌクレオチドは本明細書中で開示される試験において、完全にホスホロチオエート修飾されたバックボーンを持つことが試された。同一の配列で、他の可能性のあるバックボーン、修飾された糖、または他の型が、本発明において使用され得る。
【００４０】
定義
本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という言葉は、リボ核酸または、デオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを言う。この言葉は、天然に存在する塩基、糖、及び糖の間（バックボーン）の結合とからなるオリゴマーだけでなく、天然には存在しない部分をもち同様に機能するオリゴマーも含む。このような修飾された、または、置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞への取り込みの増強や、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増加、及び、ハイブリダイゼーションの親和性の上昇といった性質から、しばしば、天然の型よりも好ましい。混合、または、キメラオリゴマーを含む、オリゴヌクレオチドのバックボーン及び糖の可能性のある修飾に関する詳細は、特許および非特許の両方の発行物においいて広く議論され、そして、当業者に良く知られている。ペプチド核酸（PNA）及び、ロック化核酸（LNA）といった、オリゴヌクレオチドのその標的への親和性を上昇させ、また、標的配列へのミスマッチへの耐性を提供する、擬似オリゴマーの使用は、当業者に良く知られている。非修飾及び修飾オリゴヌクレオチドの合成の方法もまた、提供される。本発明の好ましい方法において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合を含み、ホスホロチオエート結合が最も好ましい。
【００４１】
本発明に従って、オリゴヌクレオチドは好ましくは、約8から約80核酸塩基単位を含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、約12から50の核酸塩基単位を含むのが好ましく、さらにより好ましくは、約15から30の核酸塩基単位を有し、そして、最も好ましくは、約18から22核酸塩基単位を有する。正しく認識されるであろう通り、1つの核酸塩基単位とは、隣接した核酸塩基単位と、ホスホジエステルまたは他の結合を介して、適切に結合した1つの塩基-糖の組み合わせである。当業者は、約8から約80の核酸塩基単位が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、または80核酸塩基単位を含むことを、理解するだろう。
【００４２】
発明のオリゴヌクレオチド化合物は、SEQ ID NO 1の2114から2133のヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、好ましくは少なくとも8核酸塩基部分、より好ましくは、12核酸塩基部分、さらに15核酸塩基部分、さらに18核酸塩基部分、最も好ましくは20核酸塩基部分を含む。
【００４３】
発明の文脈における“炎症性腸疾患”（IBD）とは、腸管に刺激及び潰瘍を引き起こす疾患を意味し、最も一般的なIBDの型は、クローン病及び潰瘍性大腸炎である。他の炎症性腸疾患は、回腸嚢炎、過敏性腸症候群、限局性腸炎、及び、限局性回腸炎を含むが限定するものではない。
【００４４】
“メッセンジャーRNA”は、そのDNAからそれらが転写される、DNAのオープンリーディングフレーム（ORF）であり、DNAのORF からの情報のみならず、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、及び、介在配列として知られる付随するリボヌクレオチドを含むことが、当業者により理解される。このように、オリゴヌクレオチドは、本発明に従って、これらの付随リボヌクレオチドと情報を提供するリボヌクレオチドの全体または一部を標的として、製剤化され得る。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは3'非翻訳領域の配列、特に SEQ ID NO 1のヌクレオチド2114から2133に特異的にハイブリダイズする。
【００４５】
本発明の文脈において“ハイブリダイゼーション”は、通常、逆の核酸ストランドまたは1つの核酸ストランドの2つの領域上にある、相補的な塩基の間の、ワトソン-クリック、フーグスティーン、または、逆フーグスティーン水素結合であり得る、水素結合を意味する。グアニン及びシトシンは、それらの間に3つの水素結合を形成することが知られている、相補的な塩基の例である。アデニン及びチミンは、それらの間に2つの水素結合を形成する、相補的な塩基の例である。
【００４６】
“特異的にハイブリダイズ可能な”及び“相補的な”は、DNAまたはRNA標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定で特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性を示すために使用される言葉である。オリゴヌクレオチドと標的との結合が標的分子の正常な機能を阻害し、活性を失わせ、また、例えば、in vivoアッセイまたは治療的処理の場合の生理的条件下、または、in vitroアッセイの場合のそのアッセイが行われる条件下、といった、特異的な結合が望ましい条件下で、オリゴヌクレオチドと非標的核酸配列との非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００４７】
“薬剤組成物”とは、薬理学的に活性をもつ薬剤を含む組成物であり、さらに、その組成物の動物、好ましくはヒトへの投与に適するように薬剤を運搬する賦形剤を含んでも善い。ビヒクルは、生理食塩水、または、経口で投与される薬剤の場合に組成物の味をよくする薬剤などの、不活性のものであり得る。あるいはビヒクルは、薬理学的に活性をもつ薬剤のバイオアベイラビリティを上昇、または、改善させる活性を持つ薬剤であってもよい。前記の活性をもつビヒクルは、浸透増強剤、または、薬理学的に活性な薬剤が腸管で吸収されることが可能なように胃の中で薬理学的な活性を保護するための化合物を含む。前記の活性をもつビヒクルは当業者には既知である。
【００４８】
“治療的投与量”とは、その組成物により治療される疾患の、改善または治療の提供に必要とされる、組成物の量である。疾患をモニターする方法は、当業者にはよく知られている。実施例において、治療的投与量に関するガイダンス、及び、疾患、特にIBDの重篤性をモニターする方法が提供される。
【００４９】
“持続的（sustained）”は、標準的治療またはプラセボと比較して、他の薬理学的または外科的な介入を用いる治療の増大の必要なく、本明細書中に開示される組成物の投与終了後、潰瘍性大腸炎の臨床的な徴候の実質的な減少及び／または粘膜治癒レベルの維持が、より長期の状態である。持続的というのは、疾患または粘膜治癒レベルの指標の減少が、本明細書中で開示される組成物の最後の投与を過ぎて、少なくとも約60日、好ましくは、少なくとも約90日間、さらにもう少し好ましくは、約120日、もっとも好ましくは約180日であると定義される。臨床的な徴候における減少の持続とは、介入により持続的な応答を示している。
【００５０】
本明細書中で使用される“疾患を改善する活性”を有する薬物とは、標準的な疾患のモニター基準（例えばDAI）により定義される疾患の進行の割合を遅延させる能力、及び／または、薬物のクリアランス後の延長された期間、効果を有する能力、をもつ組成物を意味する。
【００５１】
“潰瘍性大腸炎の徴候”とは、潰瘍性大腸炎の疾患の存在に付随する症状または状態である。徴候は、客観的（例えば、排便頻度、直腸出血、粘膜脆弱性）、主観的（例えば医師の評価）、または、多数の所見の複合（例えば、DAIまたは臨床活動性指数）である。
【００５２】
潰瘍性大腸炎の“疾患活動性指数（DAI）”はSchroederら（1987、N. Engl. J. Med. 317:1625-9）により定義され、そして、排便頻度、直腸出血、内視鏡での外見、及び、患者の症状、S字結腸鏡検査及び理学的検査の所見、臨床検査及び患者の全体的な状態を含む調査者の全体的な評価、に基づく総合スコアである。4つの観点それぞれの指数は、最も重篤でない状態を0で最も重篤な状態を3とする、0-3で評価される。
【００５３】
本明細書中で使用される“処置期間”とは、組成物を少なくとも毎週という比較的頻繁な基準で投与している期間を意味する。処置期間は好ましくは1週間に2回、より好ましくは1日おき、最も好ましくは毎日であり、少なくとも約二週間、好ましくは少なくとも約3週間、より好ましくは少なくとも約4週間である。
【００５４】
本明細書中で使用される“最小限の全身性暴露”とは、全身に利用可能な用量が、投与された用量の約5％より少ない、好ましくは約4％より少ない、より好ましくは約3％より少ない、そして最も好ましくは約1％より少ないことを意味する。
【実施例】
【００５５】
実施例1
製剤の空腸内、及び、直腸投与後の、ISIS 2302のバイオアベイラビリティの分析
ISIS 2302の絶対的バイオアベイラビリティは、いくつかの製剤で、空腸内への点滴注入に続いて算定された。バイオアベイラビリティパーセントは結果として得られたデータから、以下の式に従って計算された：
％バイオアベイラビリティー＝(AUCpo/Do)/(AUCiv/Do)×100 ％
式中、AUCpoは、経口投与された、製剤されたオリゴヌクレオチド錠剤の血漿濃度曲線の下の面積、AUCivはi.v.溶液（対照）として投与されたオリゴヌクレオチドの血漿濃度曲線の下の面積、そして、Doはこれらの2つの投与方法のそれぞれの投与量である。
【００５６】
オリゴヌクレオチド薬物製剤のバイオアベイラビリティを決定するため、2つの異なる投与形態が試験された。オリゴヌクレオチドを以下のように調製された油中水乳剤中に製剤した。初めに、二相を調製した。水相は、ISIS 2302溶液2 ml（100 mg/ml）と2 mlの水を混ぜることにより調製した。油相は、1 gのGrill 3（モノステアリン酸ソルビタン）（Croda, US）、3 mlのCaptex 355（Abotec Corp., Jenesville, Wis.）、及び、3 mlのLabrasol（Gattefosse, France）を穏やかに約70℃に加熱して調製した。水溶液をゆっくりと油相に、激しく攪拌しながら注ぎ入れた。
【００５７】
空腸内点滴投与には、250-300 g体重のSprague-Dawleyラットを使用した。一晩絶食の後、ラットに5％ペントバルビタール（50 mg/kg）の腹腔内注射により、麻酔をした。腹部正中切開を行なった後、小腸を引き出し、そして注射部位（トライツ靭帯の2 cm下）を見いだした。1.0 mlの一定分量の薬物製剤を次に27ゲージ針を用いて注射した。次に筋肉を外科的に閉じ、そして、注射後に皮膚をクリップで留めた。
【００５８】
直腸投与では、試験ラットは、はじめに一晩の絶食期間の後、洗腸剤を投与し、そして次に試験製剤の試料を投与した。注腸製剤は、カテーテルを介して投与し、1時間の間、その状態を保った。
【００５９】
オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを評価するため、試料を処理し、オリゴヌクレオチドの存在量を、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）及びHPLC分析により評価した。
【００６０】
ISIS 2302の絶対的バイオアベイラビリティは、5匹のSprague-Daley ラットの空腸内点滴投与に従って及び、7匹のラットの直腸投与に従って、決定された。空腸内投与されたISIS 2302では、絶対的バイオアベイラビリティは20.3％であった（n=5）。直腸投与されたISIS 2302では、絶対的バイオアベリラビリティは24.5％であった（n=7）。
【００６１】
実施例2
オリゴヌクレオチドの組織への取り込みの分析のための注腸製剤の調製
オリゴヌクレオチドの直腸送達に続く結腸への送達及び粘膜浸透を評価するため、以下の製剤を調製した（表1）。ISIS 2302の溶液及び乳化製剤を調製した。製剤に使用される添加剤は、食塩水、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、カラギーナン、ビタミンE a-トコフェロールポリエチレングリコール1000コハク酸エステル（TPGS）、Tween 80、及びソルビトールを含んだ。
【００６２】
製剤 1a：ISIS 2302溶液は、滅菌食塩水中、望ましい濃度で調製し、そして、in vivoの評価で使用した。
製剤 1b：ISIS 2302溶液及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）を、ISIS 2302の最終濃度が製剤 2aと同一であり、そして、HPMC濃度が1.5％となるように調製した。
【００６３】
製剤1c：ISIS 2302溶液を製剤2aと同様に、1.0％カラギーナン、及び、ビタミンE TPGSを含み調製した。
製剤1d：ISIS 2302の油中水乳剤を上記実施例中の一般的な方法に従って調製した。
【００６４】
製剤1e：この製剤はISIS 2302、Tween 80及びHPMCを、混合物が望ましい濃度のISIS 2302、0.5％のTween 80、及び0.75 ％のHPMCとなるように、適当な量で混合して調製した。
製剤1f：この製剤はISIS 2302、ソルビトール、及び、HPMCを、混合物が望ましい濃度のISIS 2302、0.5％のTween 80、及び0.75 ％のHPMCとなるように、適当な量で混合して調製した。
【００６５】
【表１】
2008521927.tif 000002
【００６６】
オリゴヌクレオチド製剤を、研究用ビーグル犬へ注腸剤として直腸投与し、評価した。一晩の絶食期間の後、試験犬ははじめに洗腸剤を投与され、そして次に試験製剤の試料を投与された。注腸製剤はフォーリーカテーテルを介して投与され、1時間その状態で保たれた。結腸組織へのオリゴヌクレオチドの運搬及び吸収を評価するため、投与の3時間、及び、24時間後、結腸組織の生検を試験動物で行った。組織試料を処理し、そして組織中に存在するオリゴヌクレオチド量をキャピラリーゲル電気泳動（CGE）及び免疫組織化学的（IHC）分析により評価した。
【００６７】
先の実施例で調製された（製剤2a-2f）ISIS 2302の6つの製剤を、犬に直腸注腸剤で投与し、結腸組織でのISIS 2302の局所分布を投与の3時間、及び、24時間後に、CGE及びIHCにより決定した。結果は表2に示した。ヒドロキシプロピルメチルセルロース（1b）が、上記実施例1の方法により調製された油中水乳剤より高い組織への取り込みをする結果となったことは、注目に値する。
【００６８】
【表２】
2008521927.tif 000003
【００６９】
実施例3
臨床試験第一相において、ヒトに静脈内投与されたISIS 2302の毒性及び薬物動態の分析
ISIS 2302を用いた第一の臨床試験は、標的疾患状態への治療試験の開始の前に、健康な被験者において抗ICAM-1アンチセンスオリゴヌクレオチドの静脈内投与の安全性及び薬物動態を評価するためのものであった。これは二重盲検、プラセボ対照、無作為抽出（3:1、薬物：プラセボ）の試験だった。4人の健常男性ボランティアを、7つの単回投与（0.06、0.12、0.24、0.5、1.0、1.5、及び2.0 mg/kg）及び複数回投与群（0.2、0.5、1.0、及び2.0 mg/kgを一日おきに4回投与）のそれぞれに登録した。投与量が増えていく順番で群を試験し、そして多数回投与群は初めの5つの単回投与群が試験を完了した後に開始した。ISIS 2302（またはプラセボとしての滅菌生理食塩水）は、80 mlの容量中、二時間かけて、静脈内注入により投与した。被験者は横になったままで、各注入の開始後4時間、連続的なECGモニタリングを行った。各注入の前、及び、各注入後の合間で、臥位血圧と脈、aPTTを含む凝固検査、トロンビン時間、プロトロンビン時間、血清補体分解産物C3aとC5a、好中球数、尿の微小タンパク質、及び、標準的な臨床安全検査（血液学、血液生化学及び尿分析）が計測された。最終注入から14及び21日後に、複数回投与群から血清試料を回収し、ISIS 2302に対する抗体の存在を分析した。血液試料はISIS 2302の血漿濃度の計測のために、注入前及び、注入開始後24時間まで、取られた。
【００７０】
補体分解産物は、商業的に入手可能なC3 及びC5aアッセイキット（Amersham）により、計測した。血漿は抗ISIS 2302抗体の存在を、先に記述されたELISA法を改善したものを用いて試験した（Lacy及びVoss、J. Immunol. Methods、116:87-98、1989）。ISIS 2302を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株からの培地を陽性対照として用いた。ISIS 2302がマウスで免疫原性を表さないように、キーホールリンペットヘモシアニンと結合させたISIS 2302でマウスを免疫することにより、細胞株を産生した。
【００７１】
Leedsらにより記述される通り、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）により薬物分析を行った（Anal. Biochem.、235:36-43、1996）。27チミジンヌクレオチド（T27）からなる、ホスホロチオエート標準オリゴヌクレオチドを血清及び尿に加え、内部標準とした。この方法を使用して、血漿中の検出可能な直線範囲のオリゴヌクレオチドの濃度は、10 nMから20 μM（約0.07から140 μg/ml）であった。
【００７２】
ISIS 2302の2時間の単回注入の間、合成されたもとの薬剤のn-1、n-2、n-3を短縮形と共移動する代謝物が、血漿中に速やかに現れ、注入30分後には全体のオリゴヌクレオチドの20％を占めた。興味深いことに、全長の薬剤、n-1、n-2、及びn-3型によりなる全オリゴヌクレオチドの相対比率は、注入の2時間の間、及び、代謝物を計測することが出来た注入後さらに4時間の間、比較的一定であった。そのため、もとの薬物は、薬物や代謝物が検出可能な全ての時間において、存在するオリゴヌクレオチドの大多数を構成した。
【００７３】
1.0及び2.0 mg/kg複数回投与群からの尿試料を、もとの薬物及び代謝物について分析した。非常に低い濃度の薬物または代謝物が尿中に排せつされたが（投与されたすべての薬物の0.5％より少ない量が初めの6時間に排泄された）、もとの薬物、及び、n-1、n-2、及びn-3型を計測することができ、また、短い型の量は電気泳動により推定された。注入開始後の初めの6時間をかけて排泄されたもとの薬物の量は、投与した用量の平均約0.05％であり、また、親薬物及び代謝物のこの時間での推測される全排泄量は、全体の投与量の0.5％より少なかった。
【００７４】
実施例4
臨床試験第一相において、ヒトに皮下投与されたISIS 2302の毒性及び薬物動態の分析
皮下に投与されるISIS 2302の第1相試験は、健常者ボランティアにより行われた。試験の第一相において、濃度範囲50-200 mg/mlにおけるISIS 2302の1 ml単回皮下注射の耐容性と薬物動態は、二重盲検、プラセボ対照、無作為抽出（3：1、試験薬：プラセボ）という様式で、4人の被験者による集団に対して投与された。全ての濃度において軽度の注射部位の紅斑、浮腫、及び硬化を産生し、それは、数日間継続した。これは、患者の苦情というよりは臨床所見であり、全ての投与量において十分に耐容性があることがわかった。予備的分析により、血漿バイオアベイラビリティが約50％であり、最大濃度の時間は1-3時間であることが示された。補体活性は非常に低い段階であり（C3aのみでC5aではない）、また、上に記述した軽度の注射部位の反応に加えて、低い段階のリンパ節症という根拠から、1 mg/kgを一日おきに4回、または、毎週で4週間という治療プログラムはわずかに耐容性があった。2 mg/kgの多量の治療プログラムは、耐容性をよく示さなかった。
【００７５】
実施例5
非盲検試験での軽度から中程度の潰瘍性大腸炎の治療における、ISIS 2302注腸剤の相対的吸収及び薬理学的活性の分析
（CS-28）ISIS 2302の相対的吸収（局所及び全身性薬物動態）及び、薬理学的活性を、非盲検試験により評価した。
【００７６】
粘膜脆弱性を有する軽度から中程度の活性の左側の潰瘍性大腸炎（DIA 3-10）の15患者による集団を試験した。
患者に240 mgのISIS 2302注腸剤を、6週間の間、毎日与えた。内視鏡の粘膜生検試料を、ベースライン及び、治療の終了時に取った。集中的な24時間血漿薬物動態（PK）試料採取を、定量的な薬物分析のために、初めと最後の注腸剤投与後、全ての患者で行った。治療の最後に、結腸組織生検思量を、下行結腸からの局所定量PK評価のために回収した。結腸組織生検及び時間ごとの血漿試料を、感度が高く、選択的なハイブリダイゼーションELISA生物学的分析方法を用いて、薬物濃度について分析した。
【００７７】
初めの12患者のPK及び臨床データを分析した。最大血漿濃度（Cmax）は2.2 ng/mLから38 ng/mLの範囲で、最大血漿濃度に対する平均時間は初めの注腸後1.8時間であった。AUCの平均値は0.124 μg*hr/mLであり、投与された用量の1％より少ない量が全身性に利用可能であることを示した。血漿PK値は、試験の最後において、単回投与の後と安定状態の投与と比較して差がなかった。対照的に、もとのオリゴヌクレオチドの結腸粘膜組織での濃度は平均4300 ng/g湿組織であった。局所組織の暴露は、血漿で認められた最大薬物濃度よりも100倍高かった。腸管の炎症、脆弱性、及び潜在的自発性出血を伴う集団において、この全身性暴露の低さは驚くべきことだった。治療すべき特異的な領域への薬物の限定は、その化合物の安全性及び効果を増加させる可能性を秘めている。
【００７８】
疾患活動性指数（DAI）は、ベースラインから6週まで12人の患者のうち9人で著しく改善された。試験を行ったすべての患者は、ベースラインにおいて中程度から重度の粘膜疾患を有していた（DAIの内視鏡的外見の構成要素である、改善Mayoスコアがベースラインにおいて2かそれ以上）。12人の患者のうちの7人において、粘膜治癒が証明され、そして、試験の完了時には、脆弱性が解決した（改善Mayoスコアが0か1）。これは、予想されたよりも実質的に高かった。粘膜薬物濃度と臨床応答との相関関係は証明できていないが、臨床応答は盲検試験での効果と対応している。
【００７９】
ISIS 2302注腸剤の、安定状態及び単回投与での全身性利用能は、活動性結腸炎症を有する患者で最小である。alicaforsenの効果的な組織において濃度が達せられた。Alicaforsenの粘膜組織濃度と臨床応答との関係は、この小さい患者集団においては、確立できなかった。
【００８０】
実施例6
軽度から中程度の潰瘍性大腸炎の治療における、ISIS 2302注腸剤の安定性及び効率の分析
ISIS 2302注腸剤の4つの異なる投与プログラムでの安全性及び効率を、プラセボ対照、二重盲検第二相試験において分析した潰瘍性大腸炎の治療において評価した。
【００８１】
ベースライン前の30日間の安定した経口メサラミンのバックグラウンド投与、及び／または、ベースライン前の60日間の安定した6-メルカプトプリンのバックグラウンド投与をし、ベースライン前90日間に、TNF-α阻害剤、メトトレキサート、シクロスポリン、または、サリドマイドを投与していない、軽度から中程度に活性な遠位の潰瘍性大腸炎（DIA 4-10）の112人の患者の集団を同定した。ベースラインでの患者の特徴は、以下の通りであった：平均年齢47.1歳、性別男性/女性:67/45、平均疾患期間7.5年、平均ベースラインDAI 6.9。ベースラインでの特徴は試験群間で類似していた。患者は平等に無作為化されて5つの試験集団のうちの一つに入れられた。
【００８２】
1．6週間毎晩、240 mg ISIS 2302；
2．連続した10夜240 mg ISIS 2302に続いて、残りの32夜の間、一晩おきに240 mg ISIS 2302；
3．6週間の間、一晩おきに240 mg ISIS 2302；
4．連続した10夜120 mg ISIS 2302に続いて、残りの32夜の間、一晩おきに120 mg ISIS 2302；
5．6週間の間、プラセボ注腸剤を毎晩。
【００８３】
全ての患者は、プラセボ注腸剤またはISIS 2302注腸剤を6週間、毎晩受けた。集団2、及び、4の患者は、ISIS 2302を一日おきに投与されている時、一晩おきにプラセボ注腸剤を受けた。
【００８４】
一次応答の終点は、6週でのDAIの減少であり、二次応答は、急性の応答、改善、粘膜治癒、寛解、及び、再発であった。
再発、新たな内科的または外科的介入、または、投薬試験の中止が起こらない限り、30週までの間、安全性及び有効性について患者を追跡調査し、投薬試験が中止された場合は、最後の投薬から30日間、患者を安全性についてモニターした。
【００８５】
ISIS 2302（Alicafosen）240 mgの毎晩の投与は、プラセボに比べ、18週及び30週において有意に良好な応答率を示した（p=0.04及び0.03）。Alicafosenの3つの低い投与群はプラセボ以上の統計的な改善を示すことはできなかった。中程度の患者群（DAI 8-10）または、“真の”左側の疾患（15-40 cm）をもつ被験者のみを含む下部集団分析が行われた場合、特異的な差がより強調され、また、他の時点においては有意でさえあった（実施例8参照）。
【００８６】
DAIの各構成要素についてもまた、分析した。排便頻度、及び、直腸出血の持続的な減少が、ISIS 2302を用いた治療への応答としてみとめられた。
治療への応答の持続性は十分にあった。6週間の治療の後、初めに寛解に達した被験者のうち、プラセボ群では9人に4人だったのに対し、ISIS 2302 240 mg 群の13被験者のうち10人が、30週（試験の終了）において寛解のままであった（p=0.12）。このように、ISIS 2302 240 mg群の応答の持続性の平均は、有意に延長された（≧6ヶ月治療群対＜3ヶ月プラセボ群）。
【００８７】
ISIS 2302 240 mgを6週間毎晩投与は、統計的に有意な応答の活性および持続性、疾患改善活性、及び、非常に一般的によく耐容性をもつこと示された。
実施例7
軽度から中程度の潰瘍性大腸炎の治療における、ISIS 2302注腸剤の安全性及び有効性の分析
ヒドロキシプロピルメチルセルロース製剤中のISIS 2302の安全性及び有効性を、軽度の活性から中程度の活性の潰瘍性大腸炎、左側大腸炎または左側に疾患再発（flare）をもつ結腸炎を有する患者の治療のため、複数の医療機関にまたがった、無作為化、二重盲検、プラセボ対照の、投与量決定第二相試験において評価した。
【００８８】
ベースライン前の30日間の安定した経口メサラミンのバックグラウンド投与、及び／または、ベースライン前の60日間の安定した6-メルカプトプリンのバックグラウンド投与をし、ベースライン前90日間に、TNF-α阻害剤、メトトレキサート、シクロスポリン、または、サリドマイドを投与していない、活性で遠位の潰瘍性大腸炎、または、左側に疾患再発（flare）をもつ結腸炎でDAIスコアは4-10である患者191人の集団を同定した。ベースラインでの患者の特徴は、以下の通りであった：平均年齢45.3歳、性別男性/女性:86/73、平均疾患期間9.3年、平均ベースラインDAI 7.3。ベースラインでの特徴は試験群間で類似していた。患者は平等に無作為化され、ISIS 2302 120 mg、ISIS 2302 240 mg、または、軽度から中程度の潰瘍性大腸炎の一般的な治療であるメサラミン4.0 gを注腸剤で投与、の3つの治療群のうちの一つに入れられた。製剤は6週間、毎晩投与された。
【００８９】
ISIS 2302投与量は、初めの第二相投与量範囲試験において、統計的有意に有効性を示したため選択した。投与量は動物試験に基づいて、炎症性腸疾患の薬理学的動物モデルにおいて効果を示した組織局所濃度を得られるように予測した。一次応答の終点はDAIの6週での減少であり、二次応答は急性の応答、改善／粘膜治癒、寛解、及び、再発であった。
【００９０】
再発、新たな内科的または外科的介入、または、投薬試験の中止が起こらない限り、30週の間、安全性及び有効性について患者を追跡調査し、投薬試験が中止された場合は、最後の投薬から30日間、患者を安全性についてモニターした。30週まで、さらなる、もしくは、代わりの薬物または外科的介入を必要としない患者は、安全性及び有効性について24週まで追跡調査した。血漿中の薬物濃度測定のために取られる血液試料を、初めの注腸投与の後、24時間に設定された間隔で、また、3週及び6週に、治療群あたり10患者の下部集団において採取した。
【００９１】
ISIS 2302 240 mgとメサラミン注腸剤との間の臨床応答率は試験を通して類似しており、どちらもISIS 2302 120 mg注腸よりは優れていた。表3にみることができるように、ISIS 2302とメサラミンに対する急性の応答は類似しているが、ISIS 2302に対する応答は、DAIの減少の百分率、医師の評価、臨床的寛解の維持及び粘膜治癒により決定される通り、実質的にはより持続性で維持されている。
【００９２】
【表３】
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【００９３】
6週間の投与の後、初めに応答した被験者で、ISIS 2302 240 mgへの応答の持続の平均は、メサラミン注腸剤では＜3ヶ月であるのに対し、6ヶ月に達した（p=0.20）。ISIS 2302 240 mg群で18週での臨床的寛解の比率は、メサラミン治療群の5.6％に対し、20％であった（p=0.03）。この傾向は、試験を通して、他のすべての時点においても明らかだった。どの試験群においても治療に関連する重篤な有害事象は報告されなかった。SAE及びAEは試験群間で、類似していた。
【００９４】
急性の左側UCにおいて、ISIS 2302 240 mg注腸は、メサラミン注腸と同様の活性を示した。しかしながら、ISIS 2302 240 mg処理された被験者は、メサラミンより、高い寛解率及びより長い寛解の持続に向かう傾向があった。ISIS 2302は、非常に一般的によく耐容性があった。
【００９５】
実施例8
中程度から重度の潰瘍性大腸炎の治療における、ISIS 2302注腸剤の安全性及び有効性の分析
中程度から重度の疾患を有する試験集団（n=26）の下部集団の分析を行った。中程度から重度の疾患は、DAI判定基準を用いた以下のスコアを有する患者として定義された：ベースライン排便頻度≧2、直腸出血≧2、内視鏡≧2、及び調査者の評価≧1。この下部集団は、いくつかの治療群における、ベースライン及びプラセボと比較して、実質的なDAIの減少を示した。ISIS 2302を毎晩受けた個体は、試験の18週までにDAIが有意に（p≦0.05）減少し、試験の残りの期間を通して、DAIが減少する強い傾向（p≦0.09）を有した。同様に、ISIS 2302を一晩おきに受けた個体は、試験の6週までにDAIの有意な（p≦0.05）減少を示し、また、18週から30週の間、DAIが減少する強い傾向（p≦0.11）を示した。この下部集団分析は、中程度から重度の潰瘍性大腸炎の治療における、ISIS 2302の有効性を示す。その分析はまた、より重篤な疾患をもつ個体の臨床的寛解の維持を促進することによる、ISIS 2302の疾患改善活性を示す。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月29日(2008.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標を改善させるための、SEQ ID NO: 2の配列を有するオリゴヌクレオチドおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、医薬組成物であって、直腸投与用のものであり、そしてその投与の結果オリゴヌクレオチドに対する全身性暴露を最小限にさせる、前記医薬組成物。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが約15〜30核酸塩基単位の長さのものである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、20核酸塩基単位の長さのものである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項５】
最小限の全身性暴露が、直腸へ投与された用量の約5％よりも少ない全身への利用率を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項６】
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標が、粘膜脆弱性、排便頻度、直腸出血、または疾患活動性指数から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬組成物の投与により結果として持続的な粘膜治癒がもたらされる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項８】
粘膜治癒の維持が少なくとも約90日間持続する、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項９】
粘膜治癒の維持が少なくとも約120日間持続する、請求項7に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
医薬組成物の投与が疾患を改善する活性をもたらす、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
潰瘍性大腸炎が中程度から重度の潰瘍性大腸炎である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
1日おきに1回までの頻度で投与される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
1日おきに1回投与される、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標を持続的に改善させるための、SEQ ID NO: 2の配列を有するオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、直腸投与用のものであり、そして1日おきに1回までの頻度で投与される場合に、その投与により、オリゴヌクレオチドのクリアランスの後、長期間にわたり効果をもたらされる、前記医薬組成物。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチドが約15〜30核酸塩基単位の長さのものである、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが、20核酸塩基単位の長さのものである、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
潰瘍性大腸炎の少なくとも1つの指標が、粘膜脆弱性、排便頻度、直腸出血、または疾患活動性指数から選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
医薬組成物の投与により結果として持続的な粘膜治癒がもたらされる、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
粘膜治癒の維持が少なくとも約90日間持続する、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
粘膜治癒の維持が少なくとも約120日間持続する、請求項19に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
潰瘍性大腸炎が中程度から重度の潰瘍性大腸炎である、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドへの全身性暴露が、直腸へ投与された用量の約5％よりも少ない、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
1日おきに1回投与される、請求項14に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2008521927.tif 000007