(57)【要約】  大規模で、活性化されたＰＥＧリンカーのカラムクロマトグラフィーによる精製を行わずに不純物を除去し、分岐鎖ＰＥＧ−ポリペプチドなどのポリマー複合体を効率的に調製する方法について開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）活性化可能なポリマー残基を、離脱基を提供する能力のある活性化剤と反応させ、活性化されたポリマー残基および活性化可能なポリマー残基を含む第１反応混合物を提供し、
ｂ）前記第１反応混合物を、前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性の保護基を有する多官能性の結合部分と、前記第１反応混合物の前記活性化されたポリマー残基が、前記多官能性の結合部分に対して過剰に存在する条件下で反応させ、前記第１反応混合物、および、前記活性化されたポリマー残基と前記多官能性の結合部分との前記反応により得られる前記保護基を有する中間体ポリマーを含有する第２反応混合物を生成し；
ｃ）前記第２反応混合物を十分な量の第１クエンチ剤でクエンチ処理して、前記活性化されたポリマー残基を不活性化し、前記中間体ポリマーを含む第３反応混合物を生成し、
ｄ）十分な量の第２クエンチ剤を前記第３反応混合物に加えて、前記活性化可能なポリマー残基を不活性化し、前記中間体ポリマーを含む第４反応混合物を生成し；
ｅ）前記保護基を前記中間体ポリマーから除去し、前記第４反応混合物を中和して第５反応混合物を生成し;
ｆ）前記第５反応混合物と、生物活性部分と結合させるための前記中間体ポリマーを活性化する能力のある化合物を反応させ、活性化されたポリマーを含有する第６反応混合物を生成する；
各工程を有してなる、活性化されたポリマーを調製する方法。
【請求項２】
前記第６反応混合物を、生物活性のある化合物、ターゲット部分または診断用薬と反応させ、ポリマー複合体を生成する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリマー複合体を単離する工程をさらに包含することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記単離が、膜分離法もしくはサイズ排除クロマトグラフィーによって行われることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ポリマー複合体が、下記構造式： 
（Ｒ）ｎ−Ｌ−Ｄ
であることを特徴とする請求項２記載の方法。
ここで：
Ｒがポリマー残基であり；
Ｌが多官能性の脂肪族結合部分であり；
Ｄが、生物活性部分、ターゲット部分および診断用薬からなる群より選択される構成要素であり；および
ｎが正の整数である。
【請求項６】
前記Ｒが、ポリアルキレンオキサイドであることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ポリアルキレンオキサイドが、ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールが、約２００〜約１２０，０００の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約８０，０００の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリエチレングリコールが、約１０，０００〜約４０，０００の重量平均分子量を持つことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化可能なポリマー残基が、ｍＰＥＧ−ＯＨ、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ、ｍＰＥＧ−ＳＯ２、およびｍＰＥＧ−ハロゲンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化可能なポリマー残基が、ｍＰＥＧ−ＯＨであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化されたポリマー残基が：
【化１】
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からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記活性化されたポリマー残基が、ＳＣ−ＰＥＧ：
【化２】
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であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも１つの官能基を有する前記多官能性の結合部分が、置換アルキルジアミン、トリアミン、天然および非天然アミノ酸誘導体およびマロン酸エステル誘導体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも１つの官能基を有する前記多官能性の結合部分が、リジン、ジアミノアルキル、ジヒドロキシアルキル、およびジチオアルキルから選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性である少なくとも１つの官能基を有する前記多官能性の脂肪族結合部分が、リジン、リジンエステル、またはリジンエチルエステルであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記第１クエンチ剤が、遊離アミン、遊離チオールまたは遊離ヒドロキシル基を含有する化合物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記第１クエンチ剤が、システイン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、Ｃ−末端保護化アミノ酸およびそれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記第２クエンチ剤がシリル基または酸塩化物を含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記第２クエンチ剤が、ＴＢＤＭＳｉＣｌ、ＴＭＳｉＣｌ、ＭｅＩ、ＭｅＳＯ４、ＣＦ３ＳＯ３Ｍｅ、およびＭｅ３ＯＢＦ４からなる群より選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記第２クエンチ剤が、ＴＢＤＭＳｉＣｌであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記中間体ポリマー複合体を活性化させる能力のある前記化合物が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記生物活性のある化合物が、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、単鎖結合抗原（ＳＣＡ）、抗体、抗体フラグメント、および天然または合成の医薬品から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質がインターフェロンであることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記インターフェロンが、α、βまたはγインターフェロンであることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリマー複合体が、下記の構造式：
【化３】
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からなる群より選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
ここで、
Ｒ１−２が、同一または異なるポリマー残基であり；
Ｙ１−６が、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ１０であり、ここでＲ１０は、Ｈ，Ｃ１−６アルキル、および置換アルキル、Ｃ３−６分岐鎖アルキルおよび置換分岐鎖アルキルおよびＣ４−８シクロアルキルからなる群より選択される；
Ｊが、二官能性結合部分であり；および
Ｄが、生物活性のある化合物、ターゲット部分、または診断用薬である。
【請求項２８】
活性化可能なポリマー残基がｍＰＥＧ−ＯＨであり；
離脱基を提供する能力のある活性化剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルであり；
前記活性化されたポリマー残基がｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートであり；
前記第１クエンチ剤がベンジルアミンであり；
前記第２クエンチ剤がＴＢＭＳｉＣｌであり；および、
生物活性部分と結合するための前記中間体ポリマー複合体を活性化させる能力のある前記化合物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化中間体ポリマー複合体が、さらに生物活性のある化合物と反応することを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ａ）活性化可能なポリマー残基を、離脱基を提供する能力のある活性化剤と反応させて、活性化されたポリマー残基および活性化可能なポリマー残基を含む第１反応混合物を提供し；
ｂ）前記第１反応混合物を、前記活性化されたポリマー残基に対して非反応性の保護基を有する多官能性の結合部分と、前記第１反応混合物の前記活性化されたポリマー残基が前記多官能性結合部分に対して過剰に存在する条件下で反応させて、前記第１反応混合物および前記活性化ポリマー残基と前記多官能性結合部分との前記反応で得られた前記保護基を含有する中間体ポリマーを含む第２反応混合物を生成し;
ｃ）前記第２反応混合物を十分な量の第１クエンチ剤でクエンチ処理して、前記活性化可能なポリマー残基を不活性化させ、前記中間体ポリマーを含む第３反応混合物を生成し；
ｄ）十分な量の第２クエンチ剤を前記第３反応混合物に加え、前記活性化されたポリマー残基を不活性化させ、前記中間体ポリマーを含む第４反応混合物を生成し；
ｅ）前記保護基を前記中間体ポリマーから除去し、前記第４反応混合物を中和して第５反応混合物を生成し；
ｆ）前記第５反応混合物を、生物活性部分と結合するための前記中間体ポリマーを活性化させる能力のある化合物と反応させ、活性化されたポリマーを含む第６反応混合物を生成する；
各工程を有してなる活性化されたポリマーを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー複合体の調製のための改良方法に関する。特に、本発明は、タンパク質などの生物活性部分のポリマー複合体を調製及び精製するための改良方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマー複合体を、タンパク質、ポリペプチド、または小分子などの生物活性部分に結合させることは、有効性を高める手段として、年々人気が高まっており、その上、多くの場合は、これら部分の１つまたはそれ以上のマイナスの側面を低減している。特に、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）、もしくは、さらに具体的に言うと、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、を用いたポリマーの結合は、治療に用いる半毒性または免疫原性の医薬品の効果的な誘導体の設計に、広く受け入れられている。
【０００３】
２、３の例を挙げると、特許文献１〜３には、非抗原性のポリマー、それらの調製およびそれらと生物活性部分との結合方法について記載されている。ここに引用することによって、前述のそれぞれの内容を本明細書中に援用する。これらの特許は、酵素、タンパク質および他のペプチド、ならびにポリペプチドなどの生物活性部分の利用を改善する有用な方法を提供しているが、結合方法の改善の必要性が、なお存在している。
【０００４】
例えば、前述の特許文献１には、分岐鎖ＰＥＧ誘導体の製法およびそれらを用いて生成されたタンパク質複合体について記載されている。そこに記載されている方法のひとつは、リジンエチルエステルなどの三官能性分子を過剰に用いて、スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）−ｍＰＥＧなどの活性化ｍＰＥＧ誘導体と結合させることを包含する。この方法によって、所望の活性化された分岐鎖ポリマーを提供し、結合がもたらされる一方で、さらに経済的に、より高純度で所望の複合体を提供することが望まれるであろう、ある特定の状況が存在することは明らかである。以前は、カラムクロマトグラフィーを用いて、未反応の出発材料または副生成物を除去することを提案する者もいた。例えば、特許文献４を参照のこと。
【特許文献１】米国特許第５，６４３，５７５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９１９，４５５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６０５，９７６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９３２，４６２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらの技術は費用が嵩み、大規模の製造には不都合であり、収率を大幅に損なう可能性がある。最終生成物を作る前に、所望の分岐鎖ポリマーの治療用複合体の生成と競合する可能性のある、残留出発材料または副生成物を除去するかあるいは不活性化させることが非常に望まれるであろう。言い換えれば、これにより、収率の損失が回復されるであろう。よって、特に、商業生産する場合に、代替物が模索されており、それには、生物活性部分の損失を最小限にすることが非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、活性化されたＰＥＧリンカーの調製のための新しい改良方法、および、それにより生じる生物活性部分との結合を提供する。本発明は、また、満たされていない必要性に対し、改良された純度および先行技術よりも優れた収率を有する、経済効率の良い結合方法を提供する役割をする。
【０００７】
本発明の一実施形態では、活性化されたポリマーおよびそれと共に作られるポリマー複合体を調製するための新しい方法が提供されている。本発明のこの態様における第一の工程では、ｍＰＥＧ−ＯＨなどの活性化可能なポリマー残基を、活性化可能なポリマー残基上に離脱基を提供する能力のある活性化剤と反応させ、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート（以下、ＳＣ−ＰＥＧ）などの、活性化されたポリマー残基、および、好ましくは微量の活性化可能なポリマー残基を含む、第１反応混合物を提供することを含む。本明細書中で用いる活性化剤の例としては、ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、または、ホスゲン（もしくはトリホスゲン）およびＮ−ヒドロキコハク酸イミド（以下、ＮＨＳ）の組合せが挙げられる。さらなる活性化剤／離脱基については、後述の詳細な説明の欄で論じる。
【０００８】
第２の工程では、第１反応混合物を、少なくともひとつの保護基、すなわち、リジンエチルエステルなどの、活性化されたポリマー残基と反応しない官能基を有する多官能性の結合部分と反応させることが必要である。この第２工程は、第１反応混合物の活性化されたポリマー残基が、多官能性の結合部分の活性基に対して過剰モルで存在している条件下で行われ、それによって第２反応混合物を生成する。この第２反応混合物は、第１反応混合物、および、活性化されたポリマー残基と多官能性の結合部分との反応に由来するよってもたらされる(ＰＥＧ)２Ｌｙｓエチルエステルなどの中間ポリマーを含む。
【０００９】
次の工程では、第２反応混合物を、フェネチルアミンまたはベンジルアミンなどの第１クエンチ剤でクエンチ処理を行い、活性化されたポリマー残基を不活性化し、とりわけ中間体ポリマー複合体を含む第３反応混合物を生成する。次に、ＴＢＤＭＳｉＣｌなどの第２のクエンチ剤を第３反応混合物に加え、それに含まれている活性化可能なポリマー残基を不活性化し、それによって、とりわけポリマー複合体中間物を含む第４反応混合物を生成する。第１および第２クエンチ剤は、両方を同時に加えさえしなければ、いずれの順番で加えることも可能である。しかしながら、第１クエンチ剤を最初に、および、第２クエンチ剤をその後に加えるのが好ましい。
【００１０】
第４反応混合物を、次に、エチルエステルを脱保護するためのＬｉＯＨのような強塩基、もしくは、ｔ−ブチルエステルを脱保護するためのＴＦＡなどの強酸などの脱保護剤で処理し、保護基を除去する。次に、中間体ポリマー、すなわち、ＰＥＧ化された多官能性の結合部分を中和して、第５反応混合物を生成する。
【００１１】
第５反応混合物を、次に、別の活性化剤またはＮＨＳなどの生物活性部分と結合させるために、混合物中の中間体ポリマーを活性化させる能力のある化合物と反応させ、第６反応混合物を生成する。次に、活性化されたポリマーを含む、この第６反応混合物を、生物活性部分と反応させて所望のポリマー複合体を生成する。
【００１２】
本発明の目的のための方法を、生物活性部分に関して述べる。しかしながら、この語句は、ターゲット薬または診断薬をも包含することが理解されよう。先行技術の方法とは異なり、この第６反応混合物は、生物活性部分と反応する中間体と競合することのない、所望の活性化されたポリマーを含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、所望のポリマー複合体を、膜分離、サイズ排除、イオン交換カラム、アフィニティー・カラム、または当業者に周知の他の技術を介して、最終反応混合物から単離する。単離技術の選択は、生成する個々の最終的な複合体によって決まり、このような選択は、不必要な実験をすることなく、行うことが可能である。
【００１４】
本発明の結果、熟練した技術者に、所望のポリマー複合体を効率的かつ高収率で提供する方法が提供される。費用が嵩み、また時間がかかるカラムクロマトグラフィーの工程を避けつつ、所望の活性化されたＰＥＧリンカーの単離を、大量に、または商業的規模の拡大に、容易に適用可能である。(ＰＥＧ)２Ｌｙｓ−ポリペプチド複合体を作る、１つの特に好ましい実施の態様では、好ましいクエンチ剤によってｍＰＥＧアミンカーバメートおよびシリル基でブロックされたｍＰＥＧを生成し、その両方がポリペプチドの結合に対して不活性であり、精製の間に、最終的なＰＥＧ−ポリペプチド複合体から容易に分離可能である。
【００１５】
他の、および、さらなる利点は、本明細書中に提供される説明から、不必要な実験をすることなく、当業者にとって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
Ａ．概観
本発明の工程は、様々なポリマー(ＰＥＧ)複合体の調製に有用である。本発明の過程で生成される反応混合物の多様な成分の選択には、かなりの自由裁量があるが、各工程での成分の特徴は、本方法を一般化して説明できるほど十分に類似している。図１には、後述する反応の概略が提供されているので参照されたい。
【００１７】
Ｂ．第１反応混合物
周知のポリマーまたはＰＥＧ活性化技術を用いて、第１反応混合物を生成する。これは、すなわち、結果的にＰＥＧ−ＯＨなどの活性化可能なポリマー残基、およびＳＣ−ＰＥＧなどの活性化されたポリマー残基を含む溶液となる。過剰の小分子剤は、再結晶などの既知の技術を用いて容易に除去可能である。
【００１８】
本発明の目的のための、活性化可能なポリマー残基は、既知の化合物のいずれかであって構わないが、本発明の好ましい態様では、ポリアルキレンオキサイド（ＰＯＡ）もしくはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を基礎とした化合物が用いられる。これら化合物の非限定的なリストには、ｍＰＥＧ−ＯＨ、ｍＰＥＧ−ＮＨ２、ｍＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ、ｍＰＥＧ−ＳＨ、およびＣｌなどのｍＰＥＧ−ハロゲンが含まれる。さらに好ましい実施の態様では、活性化可能なポリマー残基はｍＰＥＧ−ＯＨである。
【００１９】
本明細書中でポリマー複合体の合成に関して言及する場合、適切な離脱基としては、限定はしないが、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、ｐ−ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、チアゾリジニルチオン、または当業者にとって明らかな他の良好な離脱基などの部分が挙げられる。本発明の目的のための離脱基は、ＮＨ２、ＯＨ、ＳＨおよび多官能性の分子にみられる他の反応性のアミノ基（求核性）などの求核基によって置換される能力のある基であることが理解されるべきである。
【００２０】
ポリマー残基上の離脱基を提供する能力のある好ましい活性化剤の例としては、限定はしないが、ＳＣ−ＰＥＧの生成にはＤＳＣ／ピリジンまたはＮＨＳ／トリホスゲン、Ｔ−ＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ−２−メルカプトチオゾリジニルカーバメート(mercaptothiozolidinyl carbamate)）の生成には２−メルカプトチオゾリジン／ＥＤＣ／ＤＭＡＰ、ＢＳＣ−ＰＥＧ （すなわち、 ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシフタルアミジルカーボネートなど）の生成には Ｎ−ヒドロキシフタルアミジル／ＤＭＡＰが挙げられる。
【００２１】
本発明の方法に有用な好ましい活性化されたポリマー残基の例としては、ＰＥＧ化技術の分野における当業者に周知のものが含まれ挙げられる。多くは市販されており、例えば、ネクター(Nektar)社（アメリカ合衆国アラバマ州ハンツビル）からである。適切な活性化されたポリマー残基の非限定的なリストとしては、
【化１】
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【００２２】
が挙げられ、その他については、当業者にとって明らかである。さらに好ましい態様では、活性化されたポリマー残基はＳＣ−ｍＰＥＧである。たとえ活性化されたポリマー残基が製造供給元から購入したものであったとしても、微量の不純物、すなわち、ｍＰＥＧ−ＯＨまたは反応の過程において生じるＰＥＧ−ＯＨのいずれかが存在していると思われる。よって、これらの化合物から生成された反応混合物には、ＰＥＧ−ＯＨまたは他の出発材料のクエンチ処理を行うべきである。
【００２３】
一般に、反応は、およそ室温で、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トルエン（ＴＯＬ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロフォルム（ＣＨＣｌ３）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはそれらの混合物などの不活性溶媒中で行う。
【００２４】
Ｃ．第２反応混合物
第１反応混合物を生成した後、それを、活性化されたポリマー残基と反応していない少なくとも１つの官能基を有する多官能性の結合部分と反応させる。反応は、第１反応混合物中にみられる活性化されたポリマー残基が、好ましくは多官能性の結合部分に対して過剰モルで存在する条件下で行う。
【００２５】
一般に、反応は、およそ室温で行われる。しかしながら、好ましいＳＣ−ＰＥＧを用いる場合には、第２反応混合物の生成は、約２０〜約５０℃の温度で行われることが好ましく、約２５〜約３５℃がさらに好ましい。
【００２６】
リジン、および、リジンエチルエステルなどのリジンエステルは、少なくとも１つの保護基、すなわち、活性化されたポリマー残基に対して非反応性の官能基を有する、さらに周知でかつ好ましい多官能性の結合部分のうちの２種類であるが、その一方で、当然ながら、当業者は、他の化合物もまた有用であることに気づくであろう。例えば、１，３−ジアミノ−２−プロパノール、ジエチレントリアミン、マロニルクロリド、およびその他が利用可能である。これら代替物の非限定的なリストには、一般に、置換されたアルキルジアミン、トリアミン、マロン酸エステル誘導体などの天然および非天然アミノ酸誘導体、および、ジヒドロキシアルキルもしくはジチオアルキルが含まれる。
【００２７】
結果として起こる反応により、第１反応混合物、および、活性化されたポリマー残基が多官能性の結合部分と反応することにより得られる、新しく生じた中間体ポリマー複合体を含む、第２反応混合物の生成がもたらされる。
【００２８】
Ｄ．第３および第４反応混合物
中間体ポリマー複合体が生じた後、第１および第２のクエンチ剤を第２反応混合物に別々に加え、それぞれ第３および第４の反応混合物を生成する。
【００２９】
具体的には、第３反応混合物は、第２反応混合物を第１クエンチ剤と反応させ、含まれている活性化されたポリマー残基を不活性化させることにより生成可能である。その後、第２クエンチ剤を第３反応混合物に加え、含まれている活性化可能なポリマー残基を不活性化させ、第４反応混合物を生成する。よって、第４反応混合物には、１）（その後の工程における）対象となるターゲットに結合するために活性化される中間体ポリマー、２）不活性化された出発材料、および３）生物活性のあるタンパク質、ポリペプチドなどがそれらと反応する場合に、他の方法では所望の活性化されたポリマーリンカーと競合したであろう副生成物、が含まれる。
【００３０】
本発明の別の実施の態様では、第３反応混合物は、含まれている活性化可能なポリマー残基がまず不活性化するように、第２反応混合物を第２クエンチ剤と反応させることによって生成される。次に、この別の第３反応混合物を、第１のクエンチ剤と反応させ、含まれる活性化されたポリマー残基を不活性化し、別の第４反応混合物を生成する。
【００３１】
用いられるクエンチ剤の量は、十分な量とする。本発明の目的のための、薬剤の「十分な」量とは、第１クエンチ剤にとっては、含まれる活性化されたポリマー残基を不活性化させる量であり、第２クエンチ剤にとっては、含まれる活性化可能なポリマー残基を不活性化させる量のことをいう。
【００３２】
適切な第１クエンチ剤は、システイン、ベンジルアミン、ｎ−ブチルアミン、フェニルエチルアミン、ブロックされたグリシン、または、ブロックされたアラニンなどのＣ−末端ブロック化アミノ酸、およびそれらの混合物などの、遊離アミン、遊離チオール、または遊離ヒドロキシル基を含む化合物である。
【００３３】
第１クエンチ剤の選択は、当然ながら、本方法で用いられる活性化されたポリマー残基（すなわち、ｍＰＥＧ−ＳＣなど）の性質によって決定されるであろう。適切な第２クエンチ剤としては、シリル基または酸塩化物を含み、また、その中に存在する活性化可能なポリマー残基と反応する能力のある化合物が挙げられる。
【００３４】
第２クエンチ剤の選択もやはり、本方法で用いられる活性化可能なポリマー残基（すなわちｍＰＥＧ−ＯＨ、ｍＰＥＧ−ＮＨ２など）の性質によって決定される。適切な薬剤の非限定的なリストとしては、テトラブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳｉＣｌ）、トリメチルシリルクロリド（ＴＭＳｉＣｌ）、ＭｅＩ、ＭｅＳＯ４、ＣＦ３ＳＯ３Ｍｅ、Ｍｅ３ＯＢＦ４が挙げられる。例えば、ｍＰＥＧ−ＯＨを用いる場合には、第２クエンチ剤はＴＢＤＭＳｉＣｌが好ましい。
【００３５】
Ｅ．第５反応混合物
第４反応混合物中の中間体ポリマーの保護基を、効果的な量の脱保護剤、すなわち、強酸もしくは強塩基を用いて脱保護する。適切な塩基としては、限定はしないが、水酸化リチウム、水酸化カリウム、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム、およびナトリウムアミドが挙げられる。適切な酸は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、硫酸、リン酸、および塩酸などから選択可能である。水酸化リチウムを加えて脱保護し、次に塩酸で中和するのが好ましい。その後、第４の混合物を中和して第５反応混合物を生成する。
【００３６】
第５反応混合物を次に適切な活性化剤と反応させる、すなわち、生物活性部分と結合させるために、含まれているポリマー複合体の中間体を活性化させる能力のある化合物と反応させることによって活性化させる。この工程により、活性化されたポリマーを含んでいる第６反応混合物を生成する。中間体を活性化させる能力のある適切な化合物の例としては、第１反応混合物の生成において述べた「活性化剤」が挙げられる。活性化されたポリマーをターゲットのアミノ基に付加させたい場合は、離脱基はＮＨＳが好ましい。
【００３７】
Ｆ．ポリマー複合体
第６反応混合物には２種類の不活性化されたポリマー残基、および、さらなる精製なしにターゲットとする生物活性化剤と反応させるのに適した１種類の活性化された分岐鎖ポリマーリンカーが含まれ、ポリマー複合体を生成する。これらの活性化された分岐鎖ポリマーについては、前述の、一般的には譲渡されている特許文献１、特許文献２および米国特許第第６，１１３，９０６号明細書に記載のものであって構わない。１つの特に好ましい活性化された分岐鎖ポリマーは：
【化２】
2008530271.tif 000004
【００３８】
である。
【００３９】
本発明の方法によってもたらされた離脱基、生物活性のある化合物、ターゲット部分、または診断用薬を含むポリマー複合体は、一般に以下の構造式：
（Ｒ）ｎ−Ｌ−Ｄ 
である。
【００４０】
ここで：
Ｒはポリマー残基であり；
Ｌは、芳香族基を含有するか否かを問わず、リジン、ジアミノプロパノール、適切なアミノ酸などの多官能性の結合部分であり；
Ｄは、離脱基、生物活性部分、ターゲット部分および診断用薬からなる群の構成要素であり；および、
ｎは、正の整数であり、２であることが好ましい。
【００４１】
さらには、下記の構造式： 
【化３】
2008530271.tif 000005
【００４２】
の１つに対応する複合体であることが好ましい。
【００４３】
ここで：
Ｒ１−２は、同一もしくは異なるポリマー残基であり；
Ｙ１−６は、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ３であり、ここで、Ｒ３は、Ｈ（好ましい）、Ｃ１−６アルキルおよび置換アルキル、Ｃ３−６分岐鎖アルキルおよび置換分岐鎖アルキルおよびＣ４−８シクロアルキルの中から選択され；
Ｊは、二官能性の結合部分であり；および
Ｄは、離脱基、生物活性化合物、ターゲット部分または診断用薬である。この態様中では、Ｙ２およびＹ４はＯであることが好ましく、一方、Ｙ１、Ｙ３、Ｙ５およびＹ６はＯ、ＳまたはＮＨのいずれかである。
【００４４】
本発明のさらなるポリマー複合体には下記のものが含まれる：
【化４】
2008530271.tif 000006
【００４５】
ここで：
（ａ）は約１〜約５の整数であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ４、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ２であり；ここでＲ４はＨ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−８分岐鎖アルキル、Ｃ１−８置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり；
（ｍ）は、０または１であり；
（ｐ）は、正の整数であり、約１〜約６であることが好ましく、および
Ｄは、離脱基、生物活性化合物、ターゲット部分または診断用薬である。
【００４６】
ポリマー残基
上記のように、Ｒ、Ｒ１およびＲ２はポリマー残基である。それぞれが、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）などの実質的に非抗原性の水溶性ポリマー残基であることが好ましく、ポリエチレングリコールがさらに好ましい。説明の目的であって、限定はしないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)残基部分は以下の中から選択可能である：
【化５】
2008530271.tif 000007
【００４７】
ここで、
ｘは、重合度、すなわち、約１０〜約２，３００であり；
Ｒ５は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−１２分岐鎖アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ１−６置換アルキル、Ｃ２−６置換アルケニル、Ｃ２−６置換アルキニル、Ｃ３−８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１−６ヘテロアルキル、置換Ｃ１−６ヘテロアルキル、Ｃ１−６アルコキシアルキル、フェノキシアルキルおよびＣ１−６ヘテロアルコキシの中から選択され；および
Ｒ６は、キャップ基、すなわち、メチル、エチル、ベンジル、などである。
【００４８】
ある特に好ましい実施の態様では、Ｒは、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−およびＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−の中から選択され、ここでｘは、重量平均分子量の総重量が約２００〜約１２０，０００Ｄａ（ダルトン）になるように選択される正の整数である。重量平均分子量の総重量が約２，０００〜約８０，０００Ｄａであることが好ましく、約１０，０００〜約４０，０００Ｄａとなることがさらに好ましい。多くの態様では、複合体のポリマー部分の最も好ましい総分子量は、当業者の必要に応じて、約５，０００〜約４０，０００Ｄａである。
【００４９】
本明細書中に含まれるポリマー基質は、室温で水溶性であることが好ましい。これらポリマーの非限定的なリストにとしては、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキサイドホモポリマー、ポリオキシエチレン化されたポリオール、それらの共重合体、および、ブロック共重合体の水溶性が維持されている、それらのブロック共重合体が挙げられる。
【００５０】
二官能性の結合部分「Ｊ」
Ｊは、生物活性部分が脂肪族の連結基に付加する連結基のいずれかであって構わない。非限定的なリストには、以下のものが含まれる：
【化６】
2008530271.tif 000008
【００５１】
ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｒ６を定義したのと同一の群より選択され；
ｔは、正の整数であり、約１〜約１２であることが好ましい。
【００５２】
Ｇ．ポリマー複合体の分離
別の態様では、上記の方法は、さらに混合物７中の副生成物からポリマー複合体を分離または単離する工程を包含する。これは、成果を達成するのに適した技術的に受容可能な方法のいずれかを用いて行うことが可能である。用いられる方法は、効率的に大量生産するための設置に利用可能なものであることが好ましい。ほとんどの場合は、膜分離法またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、望まれる結果を達成していると考えられる。しかしながら、イオン交換、アフィニティー、および疎水性のカラムクロマトグラフィーもまた、当業者による個々の必要性に応じて利用可能である。例えば、反応混合物を水で希釈し、ＳＰセファロース（登録商標）ＦＦ樹脂を充填したカラムに通しても良い。次にカラムをＰＢＳ（リン酸塩）緩衝液などの適切な緩衝液で洗浄し、不活性なＰＥＧおよび反応の間に加水分解されたＰＥＧをすべて除去する。次に、付加された２以上の部位を有するポリマー複合体を、所望のポリマー複合体が、例えば、９０〜９５％の高純度で溶出する前に、異なる濃度勾配の緩衝液で洗い流す。
【００５３】
Ｈ．生物活性部分
Ｄが生物活性を有する化合物である構造式（Ｉ）の態様では、これらの適した化合物の非限定的なリストには、有機化合物、酵素、タンパク質、ポリペプチドなどの残基が含まれる。上記に加えて、生物活性を有する化合物は、また、酵素、タンパク質、ポリペプチド、モノクローナル抗体、オリゴヌクレオチド、ＳＳ１Ｐなどの免疫複合体、ＣＣ４９などの単鎖抗原結合蛋白（ＳＣＡ）の残基であってもよく、また、それらの断片も意図するものである。適切なタンパク質としては、限定はしないが、ポリペプチド、酵素、ペプチド、および、ポリマーに付加するための少なくとも１つの利用可能な基を有する同種のもの、例えば、ε−アミノ、シスチニルチオ、Ｎ−末端アミノなどが挙げられ、有機溶媒中で反応を触媒可能であると同時に、生理または薬理活性を有する材料も含まれる。
【００５４】
対象となるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、限定はしないが、ヘモグロビン、第 ＶＩＩ、第ＶＩＩＩ、および第ＩＸ因子を含む血液因子などの血清タンパク質、免疫グロブリン、インターロイキン、すなわちＩＬ−１〜ＩＬ−１３などのサイトカイン、α、βおよびγ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子およびホスホリパーゼ活性化蛋白（ＰＬＡＰ）、さらにはチモシンα１およびセクレチンが挙げられる。一般的な生物学的または治療上の対象となる他のタンパク質としては、インスリン、レクチンおよびリシンなどの植物性タンパク質、腫瘍壊死因子、ＴＧＦαまたはＴＧＦβなどの形質転換成長因子等の成長因子、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ウイルス蛋白ケモカイン、および上皮細胞増殖因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポエチン、色素性ホルモン(pigmentary hormones)、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子などが挙げられる。対象となる免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの断片が含まれる。
【００５５】
インターロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子などの一部のタンパク質もまた、通常、組み換え技術の結果として、非グリコシル化型で存在する。非グリコシル化型のものもまた、本発明にかかるタンパク質に含まれる。
【００５６】
対象となる酵素としては、炭水化物−特異的酵素、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、転位酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素およびリガーゼが挙げられる。特定の酵素に限定されるわけではないが、対象となる酵素の例としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ(endotoxinase)、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシン・ジホスファターゼ、チロシナーゼおよびビリルビン・オキシダーゼが挙げられる。対象となる炭水化物−特異的酵素としては、ブドウ糖酸化酵素、グルコダーゼ(glucodase)、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ(glucouronidase)などが挙げられる。
【００５７】
また、生体内での活性を実証する生体高分子のいずれかの部分もまた、本明細書中に含まれる。これには、アミノ酸配列、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体フラグメント、例えば、その開示を引用することによって本明細書中に援用する、米国特許第４，９４６，７７８号明細書中に開示される単鎖結合タンパク質、抗体または断片の融合を含む結合分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および触媒抗体が含まれる。
【００５８】
タンパク質またはそれらの一部分を、組織培養、動物材料からの抽出、または、組み換えＤＮＡの手法によってなど、当技術分野における当業者に既知の技術を用いて調製もしくは単離可能である。タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列などの遺伝子組み換え材料もまた、意図するものである。これらの材料は、乳汁、血液、または組織でタンパク質を発現する、トランスジェニック動物、すなわち、ネズミ、豚、牛などから入手する。トランスジェニック昆虫およびバキュロ・ウイルスの発現系もまた、材料として意図している。さらには、突然変異型インターフェロンなどのタンパク質の突然変異もまた、本発明の範囲内である。
【００５９】
対象とする他のタンパク質は、ブタクサ、抗体Ｅ５ミツバチ毒、ダニアレルゲンなどのアレルゲン・タンパク質である。上記のものは、本発明に適したタンパク質の実例である。本明細書中で定義されるタンパク質としては、特に言及はしないが、利用可能なアミノ基を有しているタンパク質もまた対象としており、本発明の範囲に含まれることが理解されよう。
【００６０】
本発明の好ましい態様では、アミノ基またはヒドロキシル基含有化合物は、治療を必要とする状態にある、例えば、ヒトを含めた哺乳類などの動物の治療における、医薬のまたは診断上の利用に適した生物活性のある化合物である。前述のリストは、例示を意図するものであり、変更可能な化合物に限定されるわけではない。当業者は、他のこういった化合物／組成物も、不必要な実験を行わずに、同様に変更可能であることを理解するであろう。特に言及はしないが、適切な付加基を持つ、生物活性のある材料についてもまた、意図するものであり、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【００６１】
診断用薬
Ｄが診断用薬である構造式（Ｉ）の態様では、適切な薬剤の非限定的なリストとしては、染料、キレート剤、および同位体で標識された化合物ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの他の標識された化合物が挙げられる。
【００６２】
ターゲット部分
Ｄがターゲット部分である構造式（Ｉ）の態様では、適切な薬剤の非限定的なリストとしては、ＴＡＴペプチドおよびＵ−７ペプチドなどのペプチド、ＣＣ４９などの単鎖抗体、例えばタウリンおよびビオチンなどの小分子が挙げられる。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、生物活性のある化合物は、治療を必要とする状態にある、例えば、ヒトを含めた哺乳類などの動物の治療における、医薬のまたは診断上の利用に適した生物活性のある化合物である。前述のリストは、例示を意図するものであり、変更可能な化合物に限定されるわけではない。当業者は、他のこういった化合物／組成物も、不必要な実験を行わずに、同様に変更可能であることを理解するであろう。特に言及はしないが、適切な付加基を持つ、生物活性のある材料についてもまた、意図するものであり、本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【００６４】
Ｉ．生体内診断
本発明の別の態様では、診断用薬は、診断または画像化を目的として選択されるタグである。よって、例えばアミノ酸残基などの適切な部分を、標準技術である放射性同位体、放射線不透性ラベル、磁気共鳴ラベル、もしくは磁気共鳴画像法に適する他の非放射性の同位体ラベル、蛍光型のラベル、可視色を示す、および／または紫外線、赤外線もしくは電気化学的刺激下で蛍光を発する能力のあるラベルのいずれかと結合させることによって適切なタグを調製し、外科的処置などの間に、腫瘍組織を画像化可能にする。状況に応じて、診断用のタグは結合する治療部分に取り込まれ、および／またはそれと結合し、動物またはヒトである患者の体内で治療的生物活性のある材料の分布をモニタ可能にする。
【００６５】
本発明のさらに別の態様では、本発明にかかるタグ化された複合体は、従来技術によって、例えば、放射性同位元素などを含む適切なラベルのいずれかによって、容易に調製される。単なる例証ではあるが、これらには、１３１ヨウ素、１２５ヨウ素、９９ｍテクネチウム、および／または１１１インジウムが含まれ、生体内で腫瘍細胞に選択的に取り込まれる放射性免疫シンチグラフ用の薬剤(radioimmunoscintigraｐＨic agents)を生成する。例えば、ペプチドをＴｃ−９９ｍと結合させる、数多くの公知技術として知られている方法が存在し、単なる例証としてではあるが、引用することにより本明細書に援用する、米国特許第５，３２８，６７９号、同第５，８８８，４７４号、同第５，９９７，８４４号および同第５，９９７，８４５号の各明細書に示されるものが挙げられる。１４Ｃ、１５Ｎなどの他の放射性同位元素もまた利用可能である。
【００６６】
概して、患者における腫瘍組織の解剖学的局在のための複合体タグは、腫瘍を持つ疑いのある患者または動物に投与される。ラベル化された免疫グロブリンが腫瘍部位に集中的に局在するのに十分な時間の経過後、例えば、視覚的に、Ｘ線ラジオグラフィー、コンピュータ断層撮影、ＭＲＩによって、また、蛍光タグの装置検出によって、γカメラなどのフォトスキャン装置によって、もしくは選択されるタグの性質に適した他の方法または機器によって、ラベルにより生じるシグナルを検出する。
【００６７】
検出されたシグナルは、つぎに、画像または解剖学的および／または腫瘍部位の生物学的決定に変換される。画像は、生体内の腫瘍の位置の発見、および、適切な治療方針の考案を可能にする。タグ化された部分自身が治療薬となるこれらの実施の態様では、検出されるシグナルは処置の間の解剖学的局在の証拠を提供し、また、続いて行う診断および治療的介入のための基準を提供する。
【実施例】
【００６８】
下記の実施例は、本発明をさらに正しく認識するためのものであり、本発明の有効な範囲を限定することを意図するものでは決してない。太字で示された参照番号は、図２〜３に示す化合物に対応している。
【００６９】
ＰＥＧ２合成
実施例１
第１反応混合物：
化合物１  ２０ｋのｍＰＥＧ−ＯＨ（１２５ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）をトルエン（１．８８ｌ）と共に窒素雰囲気下で２時間共沸し、３７５ｍｍｏｌの溶媒を除去した。この溶液を５０℃に冷却した。トリホスゲン（１．２４ｇ、４．１８ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９９ｇ、１２．４７ｍｍｏｌ）を加え、反応溶液を５０℃で３時間攪拌した。Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１．７９ｇ、１５．５９ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．２３ｇ、１５．５９ｍｍｏｌ）を次に加えた。反応溶液を５０℃で２０時間攪拌し、続いて濾過して、ピリジン塩を除去した。４０℃、真空下でトルエン溶媒を完全に除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン（４００ｍｌ）に溶解した。エチルエーテル（２．５０ｌ）を溶液にゆっくりと加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル（８７５ｍｌ）に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール（３．７５ｌ）をゆっくりと加え、白色の固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、４０℃で乾燥し、化合物１および２を含む第１反応混合物を得た（１１２ｇ、５．５５ｍｍｏｌ、８９％）。
【００７０】
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ25.0, 58.6, 67.9-71.4 (ＰＥＧ), 151, 168.1
実施例２
第２および第３反応混合物：
化合物１および２の第１反応混合物（５．０ｇ、０．２５mmol）を、窒素雰囲気下で無水クロロフォルム（５０ｍｌ）に溶解した。１−リジンエチルエステル二塩酸塩（２６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４２ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を３０℃に加熱し、３０℃で２０時間攪拌し、化合物１、２および４を含む第２反応混合物を得た。この第２反応混合物を室温まで冷却し、ベンジルアミン（５３．２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えて、第１反応混合物中の過剰な活性化ＰＥＧをクエンチした。この反応溶液を室温で２０時間攪拌した。溶媒を３０℃、真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解した。エチルエーテル（１００ｍｌ）をゆっくりと溶液に加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル（１０ｍｌ）に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール（１５０ｍｌ）をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、４０℃で乾燥し、化合物１、４および５の第３反応混合物を得た（４．５ｇ、９０重量％）。
【００７１】
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ13.84, 21.91, 29.06, 31.70, 40.06, 44.38 （ベンジルアミン）, 53.27, 58.55, 60.85, 63.26, 63.71, 68.97-71.41(ＰＥＧ), 126.88-127.95 (ベンジルアミン), 155.32, 155.88, 171.60
実施例３
第４反応混合物：
化合物１、４および５を含む第３反応混合物（４．２３ｇ）を無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、続いて塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温で、窒素雰囲気下、２０時間攪拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解した。エチルエーテル（１００ｍｌ）を溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル（１０ｍｌ）に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール（１２５ｍｌ）をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、４０℃で乾燥し、化合物４、５および６の第４反応混合物を得た（３．８ｇ、９３重量％）。
【００７２】
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ13.79, 21.85, 28.98, 31.59, 39.99, 44.38 (ベンジルアミン), 53.20, 58.49, 60.76, 63.20, 63.64, 68.91-71.37 (ＰＥＧ), 126.84-127.89 (ベンジルアミン), 155.29, 155.84, 171.54
実施例４
第５反応混合物：
化合物４、５および６の第４反応混合物（３．４６ｇ）を水（２０ｍｌ）に完全に溶解した。水酸化リチウム一水和物（５．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応溶液を室温で２０時間攪拌した。溶液のｐＨを２〜２．５に調整し、続いてジクロロメタン（１００ｍｌ）で２回抽出した。混合有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン（１５ｍｌ）に溶解した。エチルエーテル（１００ｍｌ）をこの溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。固体を濾過し、エーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、４０℃で乾燥し、化合物５、６および７の第５反応混合物を得た（３．０ｇ、８７重量％）。
【００７３】
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ21.8, 28.98, 31.62, 40.06, 44.50 (ベンジルアミン), 52.88, 58.55, 63.23, 63.63, 65.29-72.27(ＰＥＧ), 126.87-127.95 (ベンジルアミン), 155.29, 155.84, 172.40
実施例５
第６反応混合物：
化合物５、６および７の第５反応混合物（２．２２ｇ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（３８ｍｇ、０．３３ｍｇ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタンおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合溶媒に、窒素雰囲気下で溶解した。溶液を０℃まで氷浴で冷却し、１−[３−（ジメチルアミン）プロピル]−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を加えた。反応溶液を０℃〜室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣を乾燥ジクロロメタン（７ｍｌ）に溶解した。エチルエーテル（５０ｍｌ）を溶液にゆっくり加え、生成物を沈殿させた。この粗生成物をアセトニトリル（４．５ｍｌ）に再度溶解し、続いてイソプロピルアルコール（７０ｍｌ）をゆっくりと加え、白色固体を沈殿させた。固体を濾過し、イソプロピルアルコールおよびエーテルで洗浄した。単離した固体を真空下、４０℃で乾燥し、化合物５、６および８の第６反応混合物を得た（２．０７ｇ、９３重量％）。
【００７４】
13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) δ21.46, 25.17, 28.80, 31.38, 39.74, 44.44 (ベンジルアミン), 51.72, 58.55, 63.34, 64.03, 69.12-71.41 (ＰＥＧ), 126.93-127.95 (ベンジルアミン), 155.07, 155.97, 167.51, 168.19
実施例６
ＰＥＧ２−ＩＦＮβ−１ｂ（モノＰＥＧ化されたＰＥＧ２インターフェロンβ−１ｂ）
純粋なＩＦＮβ−１ｂ（０．４５ｍｇ／ｍｌで５ｍｌ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％両性界面活性剤３−１４、ｐＨ＝７．９の条件下で、化合物５、６および８を含む第６反応混合物（３８ｍｇ）と反応させることにより、ＰＥＧ化されたＩＦＮβ−１ｂ（モノＰＥＧ化されたＰＥＧ２インターフェロンβ−１ｂ）を合成した。反応混合物を１．５時間、２５℃で攪拌した。ＰＥＧ化反応を、グリシン（１Ｍグリシン溶液で９．５μｌ）を加えてクエンチ処理し、次に、２Ｎ酢酸でｐＨを６．５に下げた。モノＰＥＧ化複合体化合物９（分岐鎖ＰＥＧ化タンパク質）を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより収率３９％で得た（表１参照）。直鎖ＰＥＧ化（１／２ＰＥＧ）ＩＦＮβ−１ｂは得られなかった。後述の工程を用いて純粋なモノＰＥＧ化ＩＦＮβ−１ｂ化合物９を単離した。
【００７５】
クエンチ処理した反応混合物を水で希釈して、伝導度が約５ミリ秒になるように調整し、次に、あらかじめ、２０ｍＭリン酸ナトリウムで、流速５ｍｌ／分、ｐＨ６．５の平衡状態にした、ＳＰ「セファロース」ＦＦ樹脂を充填したカラムに入れた。カラムを平衡化緩衝液で洗浄し、反応の間に第６反応混合物によりもたらされる不活性なＰＥＧおよび反応の間に加水分解されたＰＥＧをすべて除去した。ＰＥＧ２−ＩＦＮβ−１ｂオリゴマー（ＨｉＰＥＧ）を、７５ｍＭの塩化ナトリウムのカラム１０本分の体積の平衡化緩衝液で洗い流した。所望のモノＰＥＧ化されたＰＥＧ２−ＩＦＮβ−１ｂ化合物９を、次に、２２５ｍＭの塩化ナトリウムのカラム１０本分の体積の平衡化緩衝液で溶出させた。ＩＦＮ−βに対する最終的な単離収率は、約３０％であった。
【表１】
2008530271.tif 000009
【００７６】
実施例７
比較用のＰＥＧ化されたＩＦＮβ−１ｂを、分岐鎖活性化ＰＥＧ８および実施例６で用いた第６反応混合物の代わりに、同一の分子量を持つ、ネクター社のＰＥＧ２−ＮＨＳを用いて、同一の結合条件下で調製した。この比較用のＰＥＧ２−ＮＨＳを、インターフェロンと反応させる前に、カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。ＰＥＧ化後、やはりＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。結果を以下の表２に示す。
【表２】
2008530271.tif 000010
【００７７】
上記結果は、本発明の方法が、先行技術の方法と比較した場合、インターフェロンとの反応前に、付加的コストが必要とされるＰＥＧ２−ＮＨＳのカラム精製を行わずに、好ましい結果を提供することを実証している。本発明の方法により提供されるＨｉ−ＰＥＧ（多ＰＥＧ化）部分は、商業化されているＰＥＧ２−ＮＨＳよりもずっと少なかった。Ｈｉ−ＰＥＧの収率パーセントは、新しい方法では、約半分に低減した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】明細書中に記載された反応工程の概略図。
【図２】実施例に記載された反応スキームの概略図。
【図３】実施例に記載された反応スキームの概略図。
【図１】
2008530271.tif 000014
【図２】
2008530271.tif 000015
【図３】
2008530271.tif 000016
【国際調査報告】
2008530271.tif 000017