(57)【要約】  ゲノム試料中の核酸配列を検出する方法は、２重鎖核酸の標的核酸配列を含有するゲノム試料を用意すること、プローブ核酸配列を含有するプローブを用意すること、ゲノム試料、プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含有するハイブリダイゼーション混合物を用意すること、ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートすること、標識の少なくとも一部を刺激してエネルギーを発生させるのに有効な放射線を、インキュベートされた混合物に照射すること、ならびにプローブが標的核酸配列と完全一致するかどうかを蛍光シグナルから検出することを含み、ここで、検出はハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に完了し、方法は、２重鎖核酸を変性せずに、かつ２重鎖核酸をＰＣＲ増幅せずに行われる。本方法を実施するためのキットは、プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含む。【配列表】
2008514197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム試料中の核酸配列を検出する方法であって、
２重鎖核酸の標的核酸配列を含むゲノム試料を用意すること、
プローブ核酸配列を含むプローブを用意すること、
前記ゲノム試料、前記プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含むハイブリダイゼーション混合物を用意すること、
前記ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートして前記標的核酸配列、前記プローブ、および前記標識の複合体を含むインキュベートされた混合物を用意すること、
前記標識の少なくとも一部を刺激してエネルギーを発生させるのに有効な放射線を、前記インキュベートされた混合物に照射すること、および
前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを蛍光シグナルから検出することにより、前記核酸配列が前記ゲノム試料中に存在するかどうか検出することを含み、
前記検出が前記ハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に完了し、前記方法が前記２重鎖核酸を変性せずに、かつ前記２重鎖核酸をＰＣＲ増幅せずに行われる方法。
【請求項２】
単一ヌクレオチド多型または多ヌクレオチド多型が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つよりも多い前記核酸配列が１つよりも多い前記プローブによってゲノム試料から検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ハプロタイプが検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム試料が得られる生物または細胞の形態状態が検出され、前記形態状態が発達段階に関する情報および疾患状態に関する情報のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノム試料が７００コピー未満の前記標的核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲノム試料が約１５０から約３００コピーの前記標的核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム試料が単一細胞の内容物から本質的になる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記検出が生物細胞において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノム試料が長さ５ｋｂよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノム試料が前記方法の全体を通して消化されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸配列が、前記ゲノム試料が得られる生物または細胞中に存在するかまたは以前に存在した病原体に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
単一ならば、前記プローブが１５から３０塩基長の１本鎖核酸または核酸アナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハイブリダイゼーション促進剤がインターカレート標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記インターカレート標識が２量体性シアニン色素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インターカレート標識がＹＯＹＯ−１からなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識が、前記ハイブリダイゼーション促進剤も構成するインターカレートフルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハイブリダイゼーション促進剤がコスモトロープである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ハイブリダイゼーション促進剤が、（ＣＨ3）4ＮＣｌ、（ＣＨ3）3Ｎ・ＨＣｌ、ＮａＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、および（ＮＨ4）2ＳＯ4からなる群から選択される化
合物の陽イオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が非インターカレートフルオロフォアである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記インキュベーションの時間が１から１０分間であり、前記方法が１５分間未満で完全に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハイブリダイゼーション混合物が前記インキュベーションの時間を通して２０から４０℃の温度で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複合体が３重鎖であるように、前記プローブの少なくとも１つの塩基が、ワトソン−クリック型相補的塩基相互作用および／または相同的塩基相互作用によって前記標的の塩基または塩基対に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複合体が４重鎖であるように、前記プローブの少なくとも１つの塩基が、ワトソン−クリック型相補的塩基相互作用および／または相同的塩基相互作用によって前記標的の塩基または塩基対に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プローブおよび前記標的核酸配列が、単にワトソン−クリック型塩基対形成則に従う逆平行鎖として一緒に結合していない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記放射線がパワー密度約８４Ｗ／ｃｍ２／ｓを有するレーザビームである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光シグナルが参照蛍光シグナルと比較されて、前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致であるかどうかが決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出が、経時的に前記蛍光シグナルの変化をモニタリングして、前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを決定することからなり、経時的な前記蛍光シグナルの増加が完全一致を示し、経時的な前記蛍光シグナルの減少が完全一致の欠如を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブが前記ハイブリダイゼーション混合物中に、標的濃度よりも高いプローブ濃度である標的飽和量で用意され、前記標識が複合体飽和量で前記ハイブリダイゼーション混合物中に用意され、前記複合体飽和量は、前記複合体飽和量を超えると、標識濃度が変化する第２速度よりも小さい第１速度で前記シグナルとバックグラウンドシグナルとの識別が変化する標識濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブがエネルギー移動または移行を最適にするのに有効な長さを有する、請求項
１に記載の方法。
【請求項３１】
前記蛍光シグナルとバックグラウンドシグナルとの識別が、標的内にインターカレートされた標識とプローブ−標的にインターカレートされた標識との間のエネルギー移動またはエネルギー移行によって最大になる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブが２０〜３０塩基長または塩基対長である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブの長さが、前記蛍光シグナルの強度を最大にするように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブが標的飽和量で前記ハイブリダイゼーション混合物中に用意され、前記標識が複合体飽和量で前記ハイブリダイゼーション混合物中に用意され、かつ前記プローブがエネルギー移動または移行を最適にするのに有効な長さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
緩衝液および水を含む予備混合物が、前記方法の感度を高めるのに有効な電荷の印加に供され、前記予備混合物の少なくとも一部が続いて前記ハイブリダイゼーション混合物に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ゲノム試料が、前記プローブ、前記ハイブリダイゼーション促進剤、および前記標識の後に前記ハイブリダイゼーション混合物に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ハイブリダイゼーション促進剤または前記標識が前記ハイブリダイゼーション混合物に最後に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ゲノム試料が精製、半精製、未精製、または希釈されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
ゲノム試料中の遺伝子産物の発現レベルが検出されるか、または少なくとも２つのゲノム試料の遺伝子産物の発現が比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ハイブリダイゼーション混合物が、前記標的核酸配列に隣接する前記ゲノム試料の配列に結合する複数のプローブをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブが、発光消光物質および少なくとも１つの前記標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記プローブが少なくとも１つの連結した部分により修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識が、ＦＥＴ、ＦＲＥＴ、エネルギー移行、または酸化還元セットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記標識が量子ドットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
核酸配列の反復、挿入、または欠失が検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出が様々な条件の前記ハイブリダイゼーション混合物で反復される、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ゲノム試料が得られた生物もしくは細胞の癌状態もしくは疾患状態が検出されるか、または前記生物の妊娠が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノム試料が、組織、頬細胞、血液、体液、喀痰、尿、または便のヒト試料から得られ、前記ゲノム試料の起源を同定するのに適合した分子同定タグで標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記プローブが、ビーズ、プレート、膜、フィルム、マイクロウェル、電極、カラム、および毛細管からなる群から選択される支持体上に用意される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記プローブが銀製の島状フィルム上に用意される、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブと、前記ハイブリダイゼーション促進剤と、前記標識とを備える、請求項１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項５２】
前記ハイブリダイゼーション混合物が中に入れられた容器をさらに備える、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記容器が喀痰の収集に適合されているか、または前記キットが喀痰収集装置をさらに備える、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記容器が、前記ゲノム試料の起源の同定に適合した分子同定タグを備える、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
前記プローブが、ビーズ、プレート、膜、フィルム、マイクロウェル、電極、カラム、および毛細管からなる群から選択される支持体上に用意される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
前記支持体が銀製の島状フィルムである、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記プローブが１本鎖でヘアピンを含むか、または２本鎖である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５８】
前記標識が２量体性シアニン色素を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５９】
前記標識および前記ハイブリダイゼーション促進剤がＹＯＹＯ−１からなる、請求項５１に記載のキット。
【請求項６０】
前記ハイブリダイゼーション促進剤が、（ＣＨ3）4ＮＣｌ、（ＣＨ3）3Ｎ・ＨＣｌ、ＮａＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、および（ＮＨ4）2ＳＯ4からなる群から選択される少
なくとも１つの化合物である、請求項５１に記載のキット。
【請求項６１】
ゲノム試料中の核酸配列を検出する方法であって、
１本鎖または２本鎖核酸の標的核酸配列を含むゲノム試料を用意すること、
プローブ核酸配列を含むプローブを用意すること、
前記ゲノム試料、前記プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含むハイブリダイゼーション混合物を用意すること、
前記ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートして、前記標的核酸配列、前記プローブ、および前記標識の複合体を含むインキュベートされた混合物を用意すること、
前記ハイブリダイゼーション混合物からシグナルを発生するのに有効なエネルギーを前記インキュベートされた混合物に加えること、および
前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを前記シグナルから検出することにより、前記核酸配列が前記ゲノム試料中に存在するかどうかを検出することを含み、
前記検出が前記ハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に完了し、前記方法が前記２重鎖核酸を変性させずに、かつ前記２重鎖核酸をＰＣＲ増幅せずに行われる方法。
【請求項６２】
前記インキュベートする工程に続いて、かつ前記エネルギーを適用する工程の前に、前記プローブが前記標的核酸配列から解離する条件で前記インキュベートされた混合物がさらにインキュベートされ、前記検出する工程が、前記プローブが前記標的核酸配列から解離するかどうか、およびインキュベーションの前記条件を前記シグナルから決定することにより、前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを決定することからなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記インキュベートする工程に続いて、かつ前記エネルギーを適用する工程の前に、前記プローブが前記標的核酸配列から解離する条件で前記インキュベートされた混合物がさらにインキュベートされ、前記検出する工程が、前記プローブが前記標的核酸配列から解離するかどうか、およびインキュベーションの前記条件を前記シグナルから決定することにより、前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを決定することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記プローブが１つまたは複数の部分を含み、前記部分の少なくとも１つが５から３０塩基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記照射する工程の前に、分離する工程が行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも１つの遮断プローブを用意して、前記ゲノム試料の非標的配列への前記プローブの結合を抑制する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
前記複合体が、光子エネルギーを収集してシグナル発生標識にエネルギーを移動させるための光子構造として作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法の工程が１回よりも多く繰り返されて、１つよりも多いハイブリダイゼーション混合物および１つよりも多い蛍光シグナルがもたらされ、但し、各ハイブリダイゼーション混合物が、前記ゲノム試料、前記プローブ、前記ハイブリダイゼーション促進剤、および前記標識を異なる順序で組み合わせることによって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
前記検出が、経時的に前記蛍光シグナルの蛍光異方性の変化をモニタリングして、前記プローブが前記標的核酸配列と完全一致するかどうかを決定することからなる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム材料のアッセイに関し、より詳細には核酸の２重鎖、３重鎖、および／または４重鎖ハイブリダイゼーションを検出するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願発明者は、例えば特許文献１および２に、特異的に結合したワトソン−クリック型４重鎖ならびにその他の特異的に結合した非標準４重鎖、３重鎖、および２重鎖を以前に開示した。これらの公報は、相同的モチーフまたはワトソン−クリック型モチーフで結合している平行または逆平行の２重鎖、３重鎖、または４重鎖を含むその公報に開示された様々な多重鎖のうち任意のものを得るための適切なハイブリダイゼーション条件の選択に関する、豊富な指針を提供している。エリクソン（Ｅｒｉｋｓｏｎ）らに付与された特許文献３、ダクシスら（Ｄａｋｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された特許文献４、および２００４年９月１６日に公表された同時係属の特許文献５も参照されたい。
【特許文献１】米国特許第６６５６６９２号
【特許文献２】米国特許第６９２７０２７号
【特許文献３】米国特許第６４２０１１５号
【特許文献４】米国特許第６４０３３１３号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／０１８０３４５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前述の成果にもかかわらず、核酸をアッセイするための、高感度、頑健、かつ信頼性の高い追加の手段を提供することが望ましい。ゲノム試料の核酸配列をアッセイするための方法およびキットを提供することが特に望ましい。核酸配列を増幅せずにゲノム試料中の核酸配列を直接検出するための手段を提供することがさらに望ましい。感度を向上させて、対象となる結合反応により発生するシグナルをさらに正確に高い信頼性で同定することがなおさらに望ましい。
【０００４】
本明細書に引用された全ての参照は、その全体を本願明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、ゲノム試料中の核酸配列を検出する方法を提供し、方法は、
２重鎖核酸の標的核酸配列を含むゲノム試料を用意すること、
プローブ核酸配列を含むプローブを用意すること、
ゲノム試料、プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含むハイブリダイゼーション混合物を用意すること、
ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートして、標的核酸配列、プローブ、および標識の複合体を含むインキュベートされた混合物を用意すること、
標識の少なくとも一部を刺激してエネルギーを発生させるのに有効な放射線を、インキュベートされた混合物に照射すること、および
プローブが標的核酸配列と完全一致するかどうかを蛍光シグナルから検出することにより、核酸配列がゲノム試料中に存在するかどうかを検出すること
を含み、ここで、検出は、ハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に完了し、方法は、２重鎖核酸を変性させずに、かつ２重鎖核酸をＰＣＲ増幅せずに行われる。
【０００６】
ゲノム試料中の核酸配列を検出する方法がさらに提供され、方法は、
１本鎖または２本鎖核酸の標的核酸配列を含むゲノム試料を用意すること、
プローブ核酸配列を含むプローブを用意すること、
ゲノム試料、プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を含むハイブリダイゼーション混合物を用意すること、
ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートして、標的核酸配列、プローブ、および標識の複合体を含むインキュベートされた混合物を用意すること、
ハイブリダイゼーション混合物からシグナルを発するのに有効なエネルギーを、インキュベートされた混合物に加えること、および
プローブが標的核酸配列と完全一致するかどうかをシグナルから検出することにより、核酸配列がゲノム試料中に存在するかどうかを検出すること
を含み、ここで、検出は、ハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に完了し、方法は、２重鎖核酸を変性させずに、かつ２重鎖核酸をＰＣＲ増幅せずに行われる。
【０００７】
本発明の方法を実施するためのキットも提供される。
同じ参照符号が同じ要素を表す以下の図面と共に本発明を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本願発明者は、２重鎖核酸に対するヘテロポリマー鎖の特異的結合および他の２重鎖核酸に対する２重鎖核酸の特異的結合を以前に開示した。その開示は、天然２本鎖中の塩基配列が、その２本鎖において安定な対形成を維持しながら第３鎖中の塩基配列と特異的に反応されうる手段を提供する。これは、以前に認識されていない最も重要な事実である。例えば、米国特許第６６５６６９２号および米国特許第６９２７０２７号を参照されたい。本願発明者は、ヘテロポリマー核酸（および／またはそれらのアナログ）が、相同的塩基結合およびワトソン−クリック型塩基相互作用によって互いに特異的に結合することができ、その塩基結合は互いに逆平行方向を有する鎖に限定されないことも開示した（前掲）。このように、ヘテロポリマー核酸（および／またはそれらのアナログ）は、平行または逆平行方向で互いに特異的に結合することができ、ここで、それらの塩基は相同的塩基結合および／またはワトソン−クリック型塩基結合則により結合している。核酸結合モチーフの選好の開示も同様に以前は認識されておらず、同じく最も重要である。前述の特異的複合体はすべて容易に再現でき、容易に利用できる機器および温和で許容性の条件で使用された試薬を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出された。
【０００９】
本願発明者は、プローブとプローブインキュベーション剤との予備インキュベーションおよび／または標的と標的インキュベーション剤との予備インキュベーションが、（ａ）完全一致した標的およびプローブの結合親和性もしくはシグナル強度を増加させること、および／または（ｂ）不一致の標的およびプローブの結合親和性もしくはシグナル強度を減少させることによって、検出すべきシグナルとバックグラウンドシグナル（すなわち、干渉またはバックグラウンドノイズ）との識別性を増大することができることを以前に開示した。米国特許出願公開第２００４／０１８０３４５号を参照されたい。
【００１０】
今回、本願発明者は、プローブ長、プローブ濃度、標的濃度、および標識濃度を含めたいくつかの他のパラメータを開示する。それらのパラメータの調整により、予想外の有益な効果を実現することができる。
【００１１】
したがって、本発明は、核酸の結合をアッセイするための方法を提供し、ここで、前述のパラメータの少なくとも１つは有益な効果のために調整される。
さらに、今回、本願発明者は、標的を増幅せずにヒトｄｓＤＮＡなどのゲノム標的からヌクレオチド多型を検出できるようにする方法を開示する。公知の他の任意の方法とは異なり、本方法は非変性温度で６０分未満、好ましくは１５分未満で行うことができる。
【００１２】
本発明は、核酸の新規な２重鎖、３重鎖、および／または４重鎖複合体（および／またはそのアナログ）の使用および／または形成を包含する。
核酸鎖は固有の方向を有する。従来の知見によれば、逆方向の鎖、すなわち互いに対して方向が逆平行である鎖がそれぞれの塩基のワトソン−クリック型相補的結合を介して２重鎖を形成すると考えられている。したがって、ワトソン−クリック型塩基対形成則に従う単に２本の逆平行鎖としてプローブおよび標的核酸配列が一緒になった結合は、本発明のある実施形態から除外される。
【００１３】
他方で、本発明によるある２重鎖は、特異的結合が相同的塩基対形成またはワトソン−クリック型塩基対形成のいずれかによる、互いに平行な関係でハイブリダイズした２本の核酸鎖（および／または核酸アナログ）からなる。従来の知見によれば、そのような２重鎖は存在しないか、または例えば、平行な塩基結合のコンホメーションの要求により必要になる主鎖不規則性が原因で、少なくとも極度に不安定であろうと考えられている。
【００１４】
適切なハイブリダイゼーション条件で好ましくはＹＯＹＯ−１によって促進されシグナルが発せられる相同的結合が、ワトソン−クリック型相補的逆平行２重鎖に匹敵する特異性および安定性を示すという本願発明者の発見は、なおさらに意外である。
【００１５】
本発明は、特異的結合が相同的塩基対形成による、互いに逆平行な関係でハイブリダイズした２本の核酸鎖（および／または核酸アナログ）を含む２重鎖も包含する。
本明細書に使用する用語「ワトソン−クリック型塩基対形成」、「相補的塩基対形成」などは、一致した塩基（例えば、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃ、および／またはＡ：Ｕ）を介する核酸および／または核酸アナログ鎖の対向または隣接する対の間の特異的会合を定義することを意図する。平行２重鎖、平行および逆平行３重鎖、ならびに平行および逆平行４重鎖を含めた、本明細書に記載した非標準複合体に関連して、「ワトソン−クリック型塩基結合」および「相補的塩基結合」などの用語は、ＡとＴと、ＡとＵと、および／またはＧとＣとの間の結合を意味することを意図するが、必ずしもワトソンおよびクリックにより最初に記載された端と端を接して対向する平面コンホメーションである必要はない。ワトソンおよびクリックにより最初に提唱された従来型結合モチーフ（「Ｗ−Ｃモチーフ」）ならびにワトソン−クリック型塩基結合の前述の定義に包含されるそのコンホメーション変異体以外に、本発明は相同的塩基結合によって形成される複合体を包含する。相同的塩基結合では、塩基は相補的塩基よりもむしろ同一の塩基と特異的に結合する。したがって、「相同的モチーフ」では、相同的塩基対はＡ：Ａ、Ｇ：Ｇ、Ｃ：Ｃ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、およびＴ：Ｕを含む。
【００１６】
核酸鎖の塩基による結合は、多数の因子、特にＷ−Ｃモチーフまたは相同的モチーフのいずれかに従う鎖の結合ポテンシャルおよびイオン条件（例えば、塩濃度および／または塩の種類）に影響されるか、または左右される。塩を含む条件は、相同的結合よりもワトソン−クリック型結合の形成に有利になる傾向にある。相同的モチーフの４重鎖は同一の緩衝液条件でＷ−Ｃ型モチーフの４重鎖よりも有利である。
【００１７】
本発明の複合体中の各鎖は、任意の配列の核塩基および／または核塩基アナログを含むことができるが、但し、それらの核塩基は、Ｗ−Ｃ型モチーフまたは相同的モチーフのいずれかにより特異的に結合しようとする核塩基に関係する。従来技術のある教示とは逆に、標的およびプローブは、３重鎖または４重鎖を形成する場合でさえも、結合を実現するためにホモポリマー性である必要はない。このように、ある実施形態では、プローブ核塩基は、散在したプリンおよびピリミジンのヘテロポリマープローブ配列になって配置し、標的核塩基は、プローブ配列に少なくとも部分的に相補的であるかまたは部分的に相同的な標的配列になって配置している。例えば、プローブ配列は任意の順序で２５％から７５
％のプリン塩基および７５％から２５％のピリミジン塩基を含有することができる。本発明の複合体は、ヘテロポリマー配列から形成することができ、ヘテロポリマー配列は、本明細書に定義されたように少なくとも１つのプリン核塩基またはプリンアナログと、少なくとも１つのピリミジン核塩基またはピリミジンアナログとを少なくともそれらのハイブリダイズしているセグメントに含有する配列を意味する。ヘテロポリマー配列は、５塩基長よりも大きいホモポリマー断片を好ましくは欠如する。例えば、他の塩基に対して特異的ワトソン−クリック型および／または相同的結合親和性を有する、天然塩基合成アナログなどの他の核塩基もまた、本発明での使用に適する。
【００１８】
２重鎖以外に、本発明の複合体は３重鎖および４重鎖も含み、ここで、対向するヘテロポリマー鎖はワトソン−クリック型相補的塩基または相同的塩基によって連結し、結合した配列の相対方向は互いに平行または逆平行である。
【００１９】
プローブ鎖は、２重鎖標的の主溝または副溝に特異的に結合することができる。さらに、１本鎖プローブの塩基は、２重鎖標的の一方または両方の鎖上の塩基と特異的に相互作用することができる。同様に、２本鎖プローブの各鎖の塩基は、本発明の４重鎖複合体における２本鎖標的の一方または両方の鎖上の塩基と特異的に相互作用することができる。したがって、本発明のある３重鎖の実施形態では、プローブの少なくとも１つの塩基は、ワトソン−クリック型相補的塩基相互作用および／または相同的塩基相互作用によって標的の少なくとも１つの塩基または塩基対と結合することにより、複合体は３重鎖になり、本発明のある４重鎖の実施形態では、プローブの少なくとも１つの塩基は、ワトソン−クリック型相補的塩基相互作用および／または相同的塩基相互作用によって標的の少なくとも１つの塩基または塩基対と結合することにより、複合体は４重鎖になる。
【００２０】
ある３重鎖および４重鎖の実施形態では、各核酸塩基は１つまたは２つの他の核酸塩基と結合する。このように、上記の伝統的な２重鎖ワトソン−クリック型塩基対および２重鎖の相同的塩基対以外に、かかる実施形態には以下のワトソン−クリック型塩基結合トリプレット、すなわちＡ：Ｔ：Ａ、Ｔ：Ａ：Ｔ、Ｕ：Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ：Ｕ、Ａ：Ｕ：Ａ、Ｕ：Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ：Ｇ、および／もしくはＣ：Ｇ：Ｃ（Ｃ＋：Ｇ：Ｃ、および／もしくは塩基の他の任意のイオン化種を含む）、ならびに／または以下の相同的塩基トリプレット、すなわちＡ：Ａ：Ｔ、Ｔ：Ｔ：Ａ、Ｕ：Ｕ：Ａ、Ｔ：Ｕ：Ａ、Ａ：Ａ：Ｕ、Ｕ：Ｔ：Ａ、Ｇ：Ｇ：Ｃ、および／もしくはＣ：Ｃ：Ｇ（Ｃ：Ｃ＋：Ｇ、および／もしくは塩基の他の任意のイオン化種を含む）が挙げられる。
【００２１】
このように、プローブがワトソン−クリック型塩基対形成によって会合した第１および第２逆平行鎖の２重鎖として定義され、標的が第３および第４鎖の類似構造２重鎖として定義されるある４重鎖の実施形態では、（ａ）第１鎖および第２鎖の対向する塩基の間の結合、（ｂ）第３鎖および第４鎖の対向する塩基の間の結合、ならびに（ｃ）第２鎖および第４鎖の対向する塩基の間の結合に加えて、第１鎖および第３鎖の塩基も互いに結合すると考えられる。
【００２２】
本発明の３重鎖および４重鎖構造のある実施形態では、どの塩基の結合配列も別の塩基の結合配列に隣接していない。すなわち、少なくとも３本の別々の鎖が存在する。フォールディングしたコンホメーションなど（例えばヘアピンターンなど）は、本発明の範囲内に含まれる（特に非限定的にＲＮＡ干渉の実施形態。この実施形態では、ヘアピン設計がＲＮＡ標的の従来のワトソン−クリック型２重鎖結合に基づく干渉を引き起こすために有利であることが見出された。ヘマンら（Ｈｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ａｎ  ｅｐｉ−ａｌｌｅｌｉｃ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｐ５３  ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡｉ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｕｍｏｒ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００３年３月；３３
（３）：３９６〜４００）」参照）が、１重鎖のフォールディングした部分は、最低３本の別々の鎖に対し、その鎖を１回よりも多く数えさせることはない。
【００２３】
本発明の複合体は、複合体構造の維持のためにHoogsteen型結合（逆Hoogsteen型結合を含む）にもＧ−カルテットにも好ましくは頼らないが、Hoogsteen型結合（逆Hoogsteen型結合を含む）および／またはＧ−カルテットが存在することがある。すなわち、本発明の複合体は、好ましくはHoogsteen型結合（逆Hoogsteen型結合を含む）を実質的に有さず、Ｇ−カルテットを実質的に有さない。
【００２４】
複合体の各鎖は、デオキシリボースリン酸またはリボースリン酸の主鎖を有する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡ）または核酸主鎖もしくは塩基アナログを独立して含む。好ましい核酸アナログは、非荷電または部分的に荷電した主鎖（すなわち、天然ＤＮＡ主鎖ほどは陰性ではない電荷を有する主鎖）を含み、核酸アナログには、例えばＰＮＡおよびＬＮＡが挙げられる。ある実施形態は、ＰＮＡを有さない。安定性の増大のために、プローブをホスホトリエステル形態で用意して、使用中の分解を阻害することができる。
【００２５】
特にＰＮＡに関連するある複合体とは異なり、本発明の３重鎖は鎖の介入機構に依存しない。
複合体の少なくとも一部は、単離されたもの、精製されたもの、人工のもの、または合成されたものである。
【００２６】
ある実施形態では、複合体の一部はＰＣＲ増幅産物である。しかし、本発明の好ましい実施形態はＰＣＲ増幅をせず、その産物を有さない。
本発明の複合体は、溶液中、固体支持体上、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで存在し得る。固体支持体は、電気伝導性（例えば電極）または非伝導性であってよい。ある実施形態では、固体支持体は、アスランら（Ａｓｌａｎ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｍｅｔａｌ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５、１６：５５〜６２によって教示されたように、感度を高めるためにフルオロフォア−金属相互作用を利用した銀製の島状フィルムまたは他の材料である。さらに、複合体は、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）に付与された米国特許第６１４７１９８号および第５７２０９２８号に教示されたように、伸長後に光学的に位置付けまたは配列決定することができる。
【００２７】
核酸間の特異的結合は、温度、塩濃度、静電強度、緩衝液の組成、および核酸の相対モル濃度に変化を有する多様な条件で生じる。これらの条件およびこれらの条件を適用する方法の例は、当技術分野において公知である。
【００２８】
本願発明者は、核酸分析およびその他に関連して、一意かつ特異的な複合体を提供するのに特に適した条件を以前に開示した。例えば、米国特許第６６５６６９２号および米国特許第６９２７０２７号を参照されたい。本願発明者は、上記条件に関して以前の教示を今回さらに詳述する。
【００２９】
約７．６を超えるｐＨレベルで不安定であるかまたは存在しない多くのHoogsteen型複
合体とは異なり、本発明の複合体は広範囲のｐＨレベルで、好ましくは約ｐＨ５から約ｐＨ９で安定である。
【００３０】
下記の実施例に示すように、本願発明者は、取り扱うゲノム標的材料の節約を、アッセイシグナルに相応する犠牲を払わずに実現することができることを予想外に見出した。こ
のように、驚くべきことに、アッセイの特異性または感度を比例して減少させずに、本発明のアッセイにおけるゲノム標的材料の量を低減することが可能である。場合によると、ゲノム材料の量の低減は、アッセイの特異性および／または感度を増大するように見える。同様に、ある条件では、ハイブリダイゼーションプロモーター量または標識量の低減の結果として、シグナル発生の増強が生じる。
【００３１】
任意の理論に結びつけられることは望まないが、本願発明者には、この現象について考えられる説明がある。複合体にインターカレートされた標識の最適数を規定する少なくとも２つの相反する制約が存在すると考える。複合体によって発生する蛍光の強度は、その中にインターカレートされた標識数と共に増加する。しかし、複合体１個あたりの標識数は、標識に利用できる部位数により限定され、おそらくさらに重要なことには、隣接する標識の間で互いに電荷が反発することにより限定される。このように、飽和した標識対複合体（または標的）比に達したならば、その系に追加の標識を添加すると、飽和点よりも下にその比が低減すると予想されよう。そのとき、各複合体は最大数未満の標識を含み、その結果として複合体１個あたり低減した蛍光が生じるであろう。複合体１個あたりの蛍光が低減する結果として、（各複合体の蛍光低減が蛍光複合体数の増加よりも勝る場合）蛍光に全般的な低減または（蛍光複合体数の増加が各複合体の蛍光低減よりも勝る場合）複合体数の増加に比例したものよりも少ない蛍光増加を生じうる。本願発明者は、２重鎖ＤＮＡは、２重鎖の副溝にインターカレートされた標識と第３の鎖または２重鎖プローブ近くにクラスターを形成した標識との間の電荷の反発を幾分遮蔽するように作用して、複合体中に標識濃度が過密になる機会を生み出しているとさらに考える。次に、これらの標識は、近接していることから、放射を受けたときにドナー−ドナーエネルギー移行モデルに基づき相互作用すると考えられる。ドナー−ドナーエネルギー移動系に関する追加の情報については、例えば米国特許第６９１１３１０号を参照されたい。
【００３２】
本願発明者は、インターカレーター（intercalator）ＹＯＹＯ−１などの一部の標識が、それらが挿入される複合体の構造に応じて様々な強度の発光を行うことができることも観察した。これは、それらの標識が水和によって消光されることが原因でありうる。３本鎖構造が形成されると、結合して３重鎖を形成する第３の鎖が接近する前にインターカレーターが２重鎖の内部にあるときに存在する環境よりも、３本鎖構造は、インターカレートされた標識にとって脱水が高まった環境を提供するということでありうる。インターカレートされた標識によって安定化された３重鎖の形成が局所ＤＮＡの折り畳みを引き起こし、それが、今度は標識のなお大きな脱水およびそれらの標識からのなお大きい発光に貢献するということでもありうる。
【００３３】
以下の用語は、本発明の前述の理解に基づいて本明細書において使用される。
標識の複合体飽和量は、一定核酸濃度で標識濃度に対する蛍光強度のグラフで最大を実現するのに少なくとも十分な標識濃度である。
【００３４】
プローブの標的飽和量は、ハイブリダイゼーション培地中の全ての標的に結合するのに少なくとも十分なプローブ濃度である。この理論値は、実験データに基づき調整することができる（例えば、一定標的濃度のハイブリダイゼーション混合物中でプローブを滴定すること）。実際には、プローブの自己結合、基質との非特異的結合などの要因が原因で、理論値は経験的に得られる値と同一ではない場合がある。本明細書に使用する表現「標的飽和量」は、他に述べない限り経験的に得られた量を指す。
【００３５】
プローブの標的飽和量は、プローブ対標的比としても表現することができる。この比は、好ましくは約１：１から約１０１２：１である。
ハイブリダイゼーション混合物中のプローブおよび標識の絶対濃度は、混合物中の可能性のある標的濃度に基づき一般に選択される。本発明のアッセイは極めて高感度であるこ
とにより、標的のＰＣＲ増幅を行う必要をなくす。例えば、約１９ヨクトモルのヒトゲノム標的および約３．２ｐｍｏｌのプローブを含有する、約８０マイクロリットルの体積を有する被験試料をアッセイすることが可能である。本発明の実施形態は、２．４×１０−１８Ｍの濃度で、好ましくは２．４×１０−１９Ｍを超えない濃度でヒトゲノム標的をアッセイするのに十分な高感度である。本発明の実施形態は、４×１０−７Ｍの濃度の、好ましくは４×１０−８Ｍを超えない濃度のプローブを使用するのに十分な高感度である。前述の値は、本発明の方法がより高濃度もしくは低濃度の標的を検出できないか、またはプローブ濃度がより高値もしくは低値になることができないことを示唆することを意図しないことは、明白である。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、増幅されていないゲノム標的をそれらの天然濃度で検出することができる。本発明のアッセイは、４ｎｇから７５ｐｇの重量であり、約６０４コピーから１１コピー（ハイブリダイゼーション混合物８０μｌ中に１．３×１０−１７Ｍから２．４×１０−１９Ｍ）の核酸標的配列を含むヒトゲノム試料中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および／または多ヌクレオチド多型を検出するのに十分な高感度である。このように、ある実施形態では、反応混合物８０μｌ中で実行されるならば、アッセイは、標的核酸配列７００コピー未満、好ましくは標的核酸配列（以下「標的」と呼ぶときもある）約１５０から約３００コピーを含むゲノム試料で実施される。同様に、反応混合物８０μｌから、Bacillus globigii標的核酸５コピー中に存在する特徴的な配列を検出した
。
【００３７】
そのような感度を実現するために標的を部分的または完全に精製する必要はない。好ましい実施形態では、生物学的検体は生物または細胞から得られ、ゲノム試料は、ヒストンなどの非核酸材料の少なくとも一部（および最も好ましくは実質的に全て）をＤＮＡから溶解または消化または除去することにより、検体から調製される。本発明に使用するためのゲノム材料の適切な供給源には、真核生物、植物、動物、脊椎動物、魚類、哺乳動物、ヒト、微生物、およびウイルスが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【００３８】
場合により、ゲノム試料中のゲノムＤＮＡを、好ましくはディーンら（Ｄｅａｎ  ｅｔ
ａｌ．）に付与された米国特許第６６１７１３７Ｂ２号に開示されたＭＤＡ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によって増幅することができ、ここで、変性条件は回避される。
【００３９】
ある種の以前のアッセイ法は、標的核酸配列との接近を促進するためにゲノム試料のＤＮＡを消化することを必要とするが、本発明は、ゲノムＤＮＡを短い配列に分割する必要なしに、完全なゲノムの微小部分を構成する標的核酸配列を直接検出できるようにする。このように、ゲノム試料が、分画されていないかまたは部分的に分画されただけのゲノム標的を含む場合に、本発明は標的核酸配列を検出することができる。ある実施形態では、ゲノム試料は、完全なゲノムの少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは１００％を含む。ある実施形態では、ゲノム配列中の２ｋｂ長よりも大きい、好ましくは５ｋｂ長よりも大きい標的核酸配列が検出される。したがって、標的核酸配列を含むゲノム材料の長さはアッセイの制限因子ではない。好ましくは、標的核酸配列は、８ｂｐから３．３×１０９ｂｐ長の長さを有する１本鎖または２本鎖ゲノム材料である。
【００４０】
標的核酸配列の長さは好ましくは、標的核酸配列が試料中で一意であるのに足る長さであるべきである（もっとも、ゲノム内の複数の一意でない短い配列を標的にしてゲノムの性質を一意に同定することができる）。好ましい標的核酸配列は、８から２００塩基長、さらに好ましくは１５から３０塩基長である。標的核酸配列は、未増幅ゲノム材料、ゲノム材料から増幅されたもの、または合成のものとすることができる。標的核酸配列は、そのゲノム材料が抽出された生物もしくは細胞のゲノムの全てもしくは一部とすることがで
き、その生物もしくは細胞に存在する（または以前に存在した）病原体に属するものとすることができる。このように、本発明は遺伝的突然変異を診断するために適するだけではなく、宿主生物または細胞に感染する病原体の核酸を検出するためにも適する。
【００４１】
本発明のアッセイは、特にｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのｃＤＮＡなどの非ゲノム標的を検出するためにも適する。
本アッセイは、１つまたは複数のプローブを用いて１つまたは複数の標的の存在を検出することができる。複数の異なる標的を検出するための複数の異なるプローブの使用は、ハプロタイプを検出するために特に有用である。
【００４２】
本願発明者は、プローブは好ましくは２から２００塩基長であり、さらに好ましくは５から３０塩基長であり、１本鎖または２本鎖でありうることを以前に開示した。その後、本願発明者は、検出の感度および特異性を上げるためにプローブ長を調整できる方法を予想外に見出した。例えば、実施例に記載した系において、２５塩基長および３０塩基長のプローブは１５塩基長および２０塩基長のプローブよりも優れ、２５塩基長のプローブはＳＮＰの存在を検出することが目的の場合に最大の感度および特異性を時にもたらす。したがって、３重鎖を形成するプローブは、２５塩基長のときにＳＮＰ検出に最適な特異性であることがあり、３重鎖プローブは、長いよりも短いときにＳＮＰ検出に最適な特異性の、２重鎖を形成するプローブとは異なる。
【００４３】
任意の理論に結びつけることを意図しないが、本願発明者はこの現象について考えられる説明を行う。例えば、標識が１１塩基離れた部位でプローブ−標的複合体の副溝内に結合できると仮定すると、２５塩基長プローブ−標的複合体は、複合体１個あたり２つの副溝結合標識を有すると予想されるが、１５塩基長プローブ−標的複合体は、複合体１個あたり１つだけの副溝結合標識を有すると予想されよう。これにより、２５塩基長プローブが１５塩基長プローブよりもなぜ優れているかが説明できよう。３０塩基長プローブ−標的複合体は、２５塩基長プローブ−標的複合体と同数（標識２個）の副溝結合標識を有すると予想されるが、蛍光強度が結合親和性と相関し、かつ塩基の不一致が３０塩基長よりも２５塩基長の方を大きく不安定化すると思われることから、３０塩基長プローブはヌクレオチド多型に対して同様に高感度ではないはずである。
【００４４】
別の理論は、標識が距離の第１関数（Ｆ1）として互いに反発し、標識が距離の第２関
数（Ｆ2）として隣接標識の蛍光を増強でき（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移
動）またはＤＤＥＭ（ドナー−ドナーエネルギー移行）を介して）、Ｆ1はＦ2と反比例すると仮定している。プローブ：標的複合体の最大のインターカレーションおよび最大のＦＲＥＴ様発光またはＤＤＥＭを可能にする、荷電標識の濃度または濃度範囲が存在し得る。標的へのプローブの添加が標識に追加のインターカレーション部位をもたらすことができる可能性があるが、そのような部位の数および位置は標識間の相互の反発によって制約される。このように、ある長さを下回るプローブ（本願発明者が予想する長さは、プローブ、標的、標識、および環境の性質に応じて幾分変動するであろう）は、互いに反発する隣接標識電荷を十分に遮蔽しないおそれがあり、かつ／または副溝中の標識、もしくは標的の塩基間にインターカレートされた標識の間のＦＲＥＴ様もしくはＤＤＥＭ相互作用に好都合な部位をもたらさないおそれがある。
【００４５】
例えば、標識が２本鎖標的にわたり２０塩基毎にインターカレートでき、これらの標識間の距離がＦＲＥＴ様もしくはＤＤＥＭ相互作用を支援するには大きすぎると仮定する。ＦＲＥＴ様もしくはＤＤＥＭ相互作用が、標的にそのようにインターカレートされた標識と、（例えば、副溝中で結合すること、プローブと標的塩基との間でインターカレートすることなどにより）プローブに会合した標識との間で実際に起こるならば、プローブに会合した標識と標的に会合した標識との整列は、より長いプローブについて最も起こりそう
である。十分な長さのプローブ鎖は、十分な数の標識を互いに近接させることができ、それにより、標識間のエネルギー移動またはエネルギー移行はプローブ：標的複合体からの発光を高め、よって検出を高めることができる。
【００４６】
したがって、本発明のプローブは、好ましくは１５から３０塩基長の１本鎖核酸または核酸アナログであり、ここで、シグナルとバックグラウンドシグナルとの識別は、標的内にインターカレートされた標識およびプローブ−標的にインターカレートされた標識の間のエネルギー移動またはエネルギー移行によって最大になる。さらに好ましくは、プローブはエネルギー移動またはエネルギー移行に最適な長さを有する。好ましくは、その長さは１５塩基よりも大きい。なおさらに好ましくは、プローブは２０〜３０塩基長である。
【００４７】
本発明のアッセイに使用するのに適切なプローブには、例えばｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｓＰＮＡ、ＬＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ｄｓＰＮＡ、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ならびに他の１本鎖および２本鎖核酸、ならびに全体的に非荷電であるか、部分的に荷電した糖リン酸および／またはペプチド主鎖を全体的もしくは部分的に含むか、または塩基アナログを全体的もしくは部分的に含む核酸アナログが挙げられる。ある実施形態では、プローブの長さを標的の長さと一致するように選択することができる。
【００４８】
本発明のプローブは、好ましくは安全に使用でき、数年間安定である。したがって、プローブを大量に製造または注文して、保存することができる。
本発明のある実施形態では、標的核酸配列に結合することが意図されるプローブに追加して遮断プローブを使用することができる。例えば、米国特許第６１１０６７６号を参照されたい。
【００４９】
プローブおよび標的は、ハイブリダイゼーション促進剤（ＨＰＡ）の存在下でハイブリダイズされる。ＨＰＡは、一般に、アッセイを行うことができる特異性および／または素早さを改善することがわかっているイオンである。本願発明者は、プローブまたは標識を含む対照試料から発光した蛍光の強度を安定化するために、ＨＰＡを長時間アッセイに使用することができることも見出した。適切なＨＰＡには、（ＣＨ3）4ＮＣｌ、（ＣＨ3）3Ｎ・ＨＣｌ、ＮａＣｌ、Ｎａ2ＳＯ4、Ｎａ2ＨＰＯ4、および（ＮＨ4）2ＳＯ4の陽イオン
が挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましいＨＰＡには、フレスコら（Ｆｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第６７８３９３２Ｂ２号に開示された水構造作製物質（すなわちコスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）またはコスモトロープ剤）が挙げられる。
【００５０】
反応混合物に１つまたは複数のＨＰＡを使用する有益性および任意の選択されたアッセイ条件で使用するためのその最良の濃度は、本開示を指針書として使用して実験的に決定することができる。選択されたＨＰＡについての好ましい濃度には、５０から８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０から６０ｍＭ  Ｎａ2ＳＯ4、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１２５から２５０ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、３０ｍＭトリメチルアンモニウムクロリド（またはトリメチル
アミン塩酸塩）、３０から５２．５ｍＭテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡ−Ｃｌ）（それぞれ別々に添加）、または１０から２０ｍＭ  ＮａＣｌと組み合わせた５０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌが挙げられるが、それに限定されるわけではない。フレスコら（Ｆｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第６７８３９３２Ｂ２号は、ポリプリン配列に基づいて３重鎖を安定化するためにずっと高濃度のコスモトロープを使用することを教示している。そのような高濃度は本発明の範囲内に含まれるが、それらは、本発明の特異的なヘテロポリマー３重鎖および４重鎖を安定化するために必要ではない。
【００５１】
ある実施形態では、ＨＰＡは蛍光標識でもある。当該実施形態では、非ＨＰＡ標識また
は追加のＨＰＡ標識の使用は随意である。ＨＰＡ標識に追加したＨＰＡもまた随意である。ＨＰＡ標識は、好ましくはインターカレート標識であり、さらに好ましくは２量体性シアニン色素であり、なおさらに好ましくはＹＯＹＯ−１である。
【００５２】
本発明の標識は、（単にマーカーとして、単にＨＰＡとして、またはＨＰＡおよびマーカーとして機能するにせよしないにせよ）好ましくはインターカレートフルオロフォアである。好ましい標識は、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニン２量体、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニン単量体、エチジウムブロミド、エチジウムホモ２量体−１、エチジウムホモ２量体−２、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム−アクリジンヘテロ２量体、エチジウムモノアジド、プロピジウムヨージド、ＳＹＴＯ色素、ＳＹＢＲグリーン１、ＳＹＢＲ色素、ピコグリーン、ＳＹＴＯＸ色素、および７−アミノアクチノマイシンＤからなる群から選択されるメンバーである。最も好ましくは、標識は、米国特許第４８８３８６７号（リー（Ｌｅｅ））、第５５８２９７７号（ユエら（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．））、第５３２１１３０号（ユエら（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．））、および第５４１００３０号（ユエら（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．））に記載されたものなどの、核酸と会合したときに増強した蛍光を与えるシアニン色素またはシアニン色素のホモ２量体もしくはヘテロ２量体であり、ＴＯＴＯ、ＢＯＢＯ、ＰＯＰＯ、ＹＯＹＯ、ＴＯ−ＰＲＯ、ＢＯ−ＰＲＯ、ＰＯ−ＰＲＯ、およびＹＯ−ＰＲＯの商標でモレキュラープローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）米国オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）所在から商業的に入手できる核酸品種を含む。これらのうち、ＹＯＹＯ−１（本明細書において「ＹＯＹＯ」と呼ばれる場合がある）が最も好ましい。
【００５３】
非インターカレート標識も本発明での使用に適する。当該標識の好ましい例には、ビオチン、ローダミン、フルオレセイン、および励起エネルギーを照射された場合に標的／プローブ複合体となって結合するかどうかが蛍光によるか、または蛍光シグナルの不在による他の標識または標識対が挙げられる。
【００５４】
本発明は、非蛍光シグナルを発生する標識の使用をさらに包含する。そのような標識には、発光試薬、散乱光を検出できる粒子（例えばイグエラビデら（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ
ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第６２１４５６０号参照）、磁気標識（例えば、ケムラら（Ｃｈｅｍｌａ  ｅｔ  ａｌ．）「Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｎｏａｓｓａｙ」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７巻、１４２６８〜１４２７２（２０００）などが挙げられる。ある実施形態では、標識は、山本ら（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第５９３９２５６号に開示された標識である。標識は、複合体自体との反応または相互作用によって検出できる変化を引き起こすか、または多重鎖ヘリカル構造の存在下で相互作用性であることにより、検出できる変化を引き起こす。ある実施形態では、標識は、コールら（Ｃｏｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第６３６１９４２Ｂ１号に開示された２部分プローブの酸化還元セット（例えば、酸化還元対）である。ある実施形態では、標識は量子ドットである。
【００５５】
ウォーカーら（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第５５９３８６７号によって開示された、検出の蛍光異方性法に適合した標識を使用することも本発明の範囲内に含まれる。
【００５６】
ある実施形態では、標識は必要ない。例えば、エイクソンら（Ａｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａ
ｌ．）に付与された米国特許出願公開第２００３／００９９９５１Ａ１号に開示されたように、ナノポアを通過させてハイブリダイゼーション複合体を抜き取ること、電場を印加すること、および電流変化についてナノポアをモニタリングすることによってハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５７】
同様な複合体の融解プロファイルの間の差を検出して、複合体が同一かどうかを決定することも可能である。例えば、リプスキーら（Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許出願公開第２００３／０１５７５０７Ａ１を参照されたい。そのような実施形態では、副溝結合剤もまた使用して、プローブの融解温度を同じにすることにより、標的について匹敵する結合親和性および変性アッセイについて匹敵する変性プロファイルを示すようにすることができる。デンプシーら（Ｄｅｍｐｃｙ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許第６６８３１７３Ｂ２号を参照されたい。
【００５８】
標識、プローブ、標的、およびＨＰＡを組み合わせて、水、少なくとも１つの緩衝液などの任意の追加の構成要素に加えて、ハイブリダイゼーション混合物を用意する。ハイブリダイゼーション混合物に構成要素を添加する順序は必ずしも重大ではないが、反応混合物への添加の順序を変動させて、標識からの発光をモニタリングおよび比較すれば、標的について重大な情報が得られることがある。例えば、安定化させる多重鎖をすでに含む溶液に、ＨＰＡ（および／またはＨＰＡ−標識）を添加することができるし、また、１つまたは複数の鎖と共に添加することができる。さらに、ハイブリダイゼーション混合物の構成要素は、別個の化合物の形態または他の点では個別の構成要素の複合材料の形態のことがある。複合材料の例には、例えばＨＰＡ、ＨＰＡ−標識、ならびに／またはプローブおよび／もしくは標的と共有結合した、もしくはその内部にインターカレートされた標識が挙げられる。ある実施形態では、複合材料は、リードら（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許出願公開第２００４／００８１９５９Ａ９号に開示された種類の「オリゴヌクレオチド−消光物質−蛍光色素コンジュゲート」である。この実施形態は、リードら（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．）の副溝結合物質（ＭＧＢ）をさらに含むことがある。リードら（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．）のＭＧＢは、ハイブリダイゼーション混合物の別個の構成要素として添加するのにも適し、非特異的蛍光からのバックグラウンドノイズを増大せずに多重鎖形成を促進すると予想される。ヘグペスら（Ｈｅｇｐｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）に付与された米国特許出願公開第２００４／００５８３２２Ａ１号も参照されたい。
【００５９】
ハイブリダイゼーション混合物に構成要素を添加する順序は、ある実施形態では、重大でありうる。しかし、本願出願人は、任意の特定の添加順序で本方法を実施不可能にするほど重要であることが必要な添加順序を見出していない。むしろ、本願出願人は、添加順序を変更することであまり好ましくない添加順序に比べて結果の向上を生じる、好ましい添加順序を確認できることを見出した。例えば、本願出願人は、ハイブリダイゼーション混合物に（例えば、ゲノム試料中に含まれる）標的核酸配列を最後に添加することが特異性および感度の増大を生じうることを予想外に見出した。これは、ハイブリダイゼーション混合物に標識を最後に添加する方がある別の実施形態については好ましいことを考慮すると、特に意外である。
【００６０】
一部または全ての構成要素が、本願出願人の以前の米国特許出願公開第２００３／０１７０６５９号の教示に従い電気的に前処理されるときもまた、添加順序が重大なことがある。例えば、プローブを他の構成要素と組み合わせてハイブリダイゼーション混合物を形成させる前に、緩衝溶液を電気的に前処理することができよう。電気的前処理は、アッセイの感度および／または特異性を増大し得る。
【００６１】
ハイブリダイゼーション混合物をある時間インキュベートして、ハイブリダイゼーションを生じさせる。インキュベーションは６０分未満、好ましくは１５分未満、さらに好ま
しくは多くて１０分、なおさらに好ましくは約５分以下、最も好ましくは１分以下の時間にわたり行われる。インキュベーションは好ましくは非変性温度で行われ、より好ましくは２０から４０℃の範囲内の温度で行われる。本明細書に使用される用語「非変性温度」は、２本鎖標的核酸配列を変性させるのに不十分な温度を指し、４０℃以下の高さの温度を明示的に包含する。標的を変性するのに十分な温度は、本方法にコスト、遅れ、および不必要な複雑さを追加することから好ましくない。
【００６２】
ハイブリダイゼーション混合物は、インキュベーション後に好ましくは標識の最大励起波長またはその近辺のコヒーレント光を照射され、次にハイブリダイゼーション混合物がフルオロフォアを含有するならば蛍光についてモニタリングされる。ＹＯＹＯ（すなわちＹＯＹＯ−１）について、励起波長４８８ｎｍが好ましい。被験試料に照射している光のパワー密度が重要であり、標識がＹＯＹＯ−１の場合は約８４Ｗ／ｃｍ２／ｓの放射線が送達されるように好ましくは設定されるべきであることが見出された。レーザまたは明るい光源から送達されようとされまいと、過度に高いパワー密度は、アッセイを無効にしうるだけではなく、試薬を損傷することにより、適切なパワーを与えられた放射線を用いた被験試料のその後のアッセイを不可能にする。これは、適切に刺激されたならば、ＹＯＹＯ−１が光開裂剤として作用できるからである。レーザは最も好ましい線源である。パルス光または連続した明るい光を発生するキセノン電球などの「明るい光」源によってパワーを与えられた機器は、たとえその後フィルターをかけられても、ＹＯＹＯ−１を用いたアッセイを実施するのにあまり適さず、分かりにくい結果を一般に発生する。フィルターをかけられた「明るい光」は、レーザ刺激と等しくない。４ＡＡＡバッテリーによってパワーを与えられたターナーデザイン（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）「ＴＤ」ピコフロー機器に存在するような非常に低電力フォトダイオードを使用してアッセイを行い、ＹＯＹＯ−１蛍光発光を測定することができる。
【００６３】
標識を照射するのに、１つまたは複数の異なる光源を使用することができる。異なる波長の複数の光ビームを用いた標識の照射は、異なる励起特性を有する標識が使用される場合に特に有用である。例えば、４８８ｎｍのレーザ光を適用して、１つの標的配列の検出を目標とするＹＯＹＯ−１標識を励起する一方で、別の波長のレーザ光を適用して、存在する他の標識を励起させることができる。
【００６４】
別の実施形態では、非特異的シグナルを発生するおそれがあるハイブリダイゼーション培地中の任意の２重鎖を消化することによって、アッセイの特異性を向上することができる。２重鎖は、ランバーグ（Ｒａｍｂｅｒｇ）に付与された米国特許第６４５８５４０Ｂ１号によって教示されたように、３重鎖中の２重鎖標的は、消化から保護される。トルンら（Ｔｏｌｕｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「Ａ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＤＮａｓｅ  ａｓｓａｙ
（ＲｅＤＡ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３：９月１５日；３１（１８）：ｅ１１１は、２重鎖中のインターカレーターは消化を停止する必要がないが、３重鎖ＤＮＡのインターカレーションおよび安定化はその必要がありうることを示している。
【００６５】
本発明のある実施形態では、ハイブリダイゼーション培地から発生したシグナルを検出する前に分離工程が行われる。この工程では、プローブ−標的複合体から未結合のプローブを分離する。好ましくは、分離工程は、米国特許第５５９９６６７号に教示されたようなポリ陽イオン性固体支持体の使用を含む。
【００６６】
１回または複数回照射された後で、標識の発光についてハイブリダイゼーション混合物を１回または複数回モニタリングすることができる。測定されるシグナルは、好ましくはハイブリダイゼーション混合物から発光された蛍光強度である。そのような実施形態では、標識がシグナル消光またはシグナル発光によりハイブリダイゼーションのシグナルを発
するかどうかに応じて、プローブと標的との間の結合親和性はその強度と直接相関または逆相関することがある。このように、インターカレート剤によって発生する蛍光強度は、プローブ−標的結合親和性と直接相関するが、一方でプローブに共有結合した非インターカレートフルオロフォアを使用している実施形態の蛍光強度は、プローブ−標的結合親和性と逆相関するおそれがある。ある実施形態では、蛍光強度は、好ましくは両端の数字を含んで０〜２個の不一致および／または欠失の範囲にわたり、さらに好ましくは両端の数字を含んで０〜３個の不一致および／または欠失の範囲にわたり、プローブと標的との間の一致度と共に増加（または非インターカレーターについては減少）する。
【００６７】
本発明の実施形態は、参照シグナルに対して測定されたシグナルをキャリブレーションしてプローブが標的核酸配列について完全一致であるかどうかを決定することからなる。測定シグナルの大きさ（例えば蛍光強度）が標的核酸配列とプローブとの間の結合親和性の関数であるキャリブレーション曲線が作成される。標的核酸配列とプローブとの間の結合親和性は、不一致の塩基数、不一致の性質（Ａ−Ｇ対Ａ−Ｃ対Ｔ−Ｇ対Ｔ−Ｃなど）、ハイブリダイゼーション複合体内の不一致の位置などと共に変動することから、本発明の方法を使用して、プローブおよび標的核酸配列が完全一致または不一致であるかどうかを検出して、最終的に標的核酸配列を決定することができる。
【００６８】
発生シグナルを連続的に収集して、時間の関数として即座に評価することができる。例えば、時間に関して蛍光シグナルの変化をモニタリングして、インターカレート標識を含むハイブリダイゼーション混合物中の標的核酸配列にプローブが完全一致するかどうかをよりよく決定することができる。ここで、時間に関する蛍光シグナルの増加（「漸増」）は完全一致を示し、時間に関する蛍光シグナルの減少（「漸減」）は完全一致の欠如を示す。同様に、非インターカレート標識を含むハイブリダイゼーション混合物により発生した漸増および漸減シグナルも、不完全一致および完全一致をそれぞれ示し得る。ある状況では、完全一致を欠如した混合物のシグナル強度は経時的に減少しないが、不一致混合物により発生するシグナルが一致混合物のシグナルよりも低速で変化する場合や、不一致混合物により発生するシグナルが不連続変化および復帰の証拠を示す場合には、完全一致と不一致とを識別することが依然として可能である。
【００６９】
本発明は、前述のシグナル測定およびデータ解析プロトコルのうち１つまたは複数の使用を包含する。１つよりも多くのプロトコルを使用すれば、アッセイの信頼性が高まることがある。アッセイの他のパラメータ（例えば、ハイブリダイゼーション混合物への添加順序、プローブ長など）も、アッセイの信頼性を高めるために多数のプロトコルにわたり一貫性をチェックするために変動することがある。
【００７０】
蛍光シグナルの検出は、ハイブリダイゼーション混合物を用意してから６０分以内に、より好ましくは１５分未満に、なおさらに好ましくは約１０分以内に、いっそうさらに好ましくは約５分以内に好ましくは完了する。全体的な方法は、好ましくは６０分未満で、さらに好ましくは１５分未満で、なおさらに好ましくは１０分未満で、なおさらに好ましくは約５分以下で、非変性温度で行われる。
【００７１】
本発明の信頼性は、プローブおよび標的のどちらのグアニンおよびシトシン含量にも依存しない。伝統的なＷ−Ｃモチーフでは、Ｇ：Ｃ塩基対が３つの水素結合を形成するが、Ａ：Ｔ塩基対は２つの水素結合しか形成せず、より高いＧまたはＣ含量を有する標的およびプローブ配列の方が高い融解温度を有して安定である。結果として、完全一致したハイブリッドに存在する含量を超えて、ハイブリダイズしたプローブおよび標的領域のＧＣ含量を増加させる塩基対不一致は、不一致プローブに関連する結合の脆弱さを補うことができる。
【００７２】
本発明の方法は、前例のない速度と信頼性の組合せを有し、ＳＮＰを含めた遺伝子突然変異を検出するために有用である。核酸配列の反復、挿入、および／または欠失も検出することができる。本方法は、ゲノム試料が得られる生物または細胞の形態状態を検出するためにも有用である。その形態状態は、好ましくは、（ａ）発達段階、（ｂ）高次構造、（ｃ）結合事象、および／または（ｄ）疾患状態に関する情報を含む。
【００７３】
本方法を生物細胞内で行うことができる。
本発明は、前述の方法に加えてそれらの方法を実施するためのキットを含む。そのキットは、ゲノム試料を収集するための試料収集手段、プローブ、ハイブリダイゼーション促進剤、および標識を好ましくは備える。
【００７４】
適切な試料収集手段には、シリンジ、コップ、バイアル、スポンジ、綿棒、スティック、毛細管、吸収シート、膜、フィルム、マイクロウェル、カラム、ビーズ、チップなどが挙げられるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、試料収集手段は、組織、頬細胞、血液、体液、喀痰、尿および／または便の収集に適合している。
【００７５】
ある実施形態では、分子同定タグが試料に添加され、その履歴を追跡して最終的な監査証跡を提供するために生物学的試料をマークするキットおよび方法を提供する。そのタグは、少なくとも１つの検出できる分子である。好ましくは、そのタグは、少なくとも１つの検出できる標識（好ましくはスピン標識または量子ドット）と、場合により少なくとも１つの架橋剤とで機能付与された核酸または核酸アナログ配列である。本方法およびキットに使用される試料収集手段は、好ましくは（例えば支持体表面に架橋した）タグを含み、どのタグがその試料と一意に関連しているかを同定するためのバーコードまたは他の手段を有する。例えば、ＰＣＲ系アッセイのための同定タグを開示している米国特許第６１５３３８９号を参照されたい。
【００７６】
ある実施形態では、プローブは、ビーズ、プレート、膜、フィルム、マイウロウェル、電極、カラム、または毛細管からなる群から選択される支持体上に用意される。
キットのプローブ、標識、およびＨＰＡは、本方法に関するものと本質的に同一である。
【００７７】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに詳細に例示するが、本発明はそれに限定されるわけではない。
【実施例１】
【００７８】
本実施例は、２重鎖アンプリコン標的をアッセイするために、１５塩基長または２５塩基長の１本鎖オリゴヌクレオチドプローブを使用したときに発生する３重鎖アッセイシグナルを比較する。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ精製キット（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）、カナダ国ミシソーガ（Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ）所在）を製造業者の説明書通りに使用して、ゲノムｄｓＤＮＡをヒト血液試料から抽出した。嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０の臨床的に重大な領域に対応する４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ断片（配列番号１）［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０、２１４〜２２８（１９９１）］をＰＣＲ増幅した。２０塩基長の上流プライマーおよび２０塩基長の下流プライマーをＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、パーセプティブバイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて合成し、カートリッジ精製し、ｄｄＨ2Ｏに溶解した。２０塩基長の上流プ
ライマーの配列は、５’−ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡ−３’（配列番号２）であった。２０塩基長の下流プライマーの配列は、５’−ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＣＡ−３’（配列番号３）であった。Ｔａｑ  ＰＣＲマスターミックスキット（キアゲン、カナダ国ミシソーガ所在）を用いてＰＣＲ反応混合物１００μｌ中で各プライマー１００ｐｍｏｌｅをゲノムｄｓＤＮＡ１μｇと混合し
た。以下のＰＣＲサイクルパラメータを使用した：９４℃×５分を１サイクル、（９３℃×３０秒、４８℃×３０秒、７２℃×４５秒）を２５サイクル、７２℃×７分を１サイクル。ＰＣＲ断片のサイズをゲル電気泳動によって確認した。微量の残留したプライマーまたはゲノムＤＮＡを除去するための試料の精製は行わなかった。残留したプライマーおよびゲノムＤＮＡを有するＰＣＲ増幅された４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ標的の濃度をＵＶ分光法により決定し、１ｐｍｏｌｅ／μｌの原液を調製した。
【００７９】
ヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０由来の１５塩基長または２５塩基長アンチセンスｓｓＤＮＡプローブ配列を、ＤＮＡ合成装置（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９、パーセプティブバイオシステムズ）を用いて合成し、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解した。
【００８０】
プローブＣＦ０１−１５（配列番号４）は、アミノ酸位置５０５から５１０に重複する、ＰＣＲ増幅された野生型４９１ｂｐ  ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的であるように設計された１５塩基長ｓｓＤＮＡプローブであった［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０、２１４〜２２８（１９９１）］。
【００８１】
プローブＣＦ０１−１５（配列番号４）の配列は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
プローブＣＦ１０−１５およびＣＦ０９−１５は、１塩基突然変異（下線部）を除き野生型プローブＣＦ０１−１５と配列が同一の１５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【００８２】
プローブＣＦ１０−１５（配列番号５）の配列は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
プローブＣＦ０９−１５（配列番号６）の配列は、５’−ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ−３’であった。
【００８３】
プローブＣＦ０１−２５（配列番号７）は、アミノ酸位置５０４から５１２に重複する、ＰＣＲ増幅された４９１ｂｐの野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに完全に相補的であるように設計された２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブであった［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０、２１４〜２２８（１９９１）］。
【００８４】
プローブＣＦ０１−２５（配列番号７）の配列は、５’−ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  Ｔ−３’であった。
プローブＣＦ１０−２５およびＣＦ０９−２５は、１塩基突然変異（下線部）を除き野生型プローブＣＦ０１−２５と配列が同一の２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【００８５】
プローブＣＦ１０−２５（配列番号８）の配列は、５’−ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  Ｔ−３’であった。
プローブＣＦ０９−２５（配列番号９）の配列は、５’−ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  Ｔ−３’であった。
【００８６】
ＹＯＹＯ−１などの蛍光インターカレーターによってシグナルが発生する３重鎖アッセイを、Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ  ５０ｍＷアルゴンイオンレーザ、モデル５３２−ＡＰ；２５ｍＷイオンレーザテクノロジー（Ｉｏｎ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）アルゴンイオンレーザ、モデル５４９０ＡＣＭ−００；２０ｍＷコヒーレント固体レーザ、モデルＳａｐｐｈｉｒｅ４８８−２０ＯＥＭ；メレスグリオ（Ｍｅｌｌｅｓ  Ｇｒｉｏｔ）１５ｍＷアルゴンイオンレーザ、モデル３５−ＩＭＡ−４１５−１２０を含むＧｅｎｅ
ｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；および２０ｍＷコヒーレント固体レーザ、モデルＳａｐｐｈｉｒｅ４８８−２０ＯＥＭを含むＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを含めたいくつかのレーザからの刺激放射線を用いて行った。これらレーザの全ては、波長４８８ｎｍで８０〜８４Ｗ／ｃｍ２／ｓの放射線を送達するように設計された。
【００８７】
反応混合物（８０μｌ）は、０．０５ｐｍｏｌｅのＰＣＲ増幅された４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ標的、１．２５ｐｍｏｌｅの１５塩基長または２５塩基長のｓｓＤＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥ、および１５０ｎＭのＤＮＡインターカレーターＹＯＹＯ−１（モレキュラープローブズ、米国オレゴン州ユージーン所在）を含有していた。本実施例および他の全ての実施例で言及する反応混合物は、終体積８０μｌであり、別に述べない限り室温でインキュベートされた。室温（２４℃）で５分間インキュベートした後で、その反応混合物をコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）Ｎｏ  Ｂｉｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ３８４ウェルプレート（黒色で底が透明）に入れ、波長４８８ｎｍを有するＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒの１５ｍＷアルゴンイオンレーザを照射した。１０ｍＷのレーザ光は、各ウェルの底から試料を照射する。照射は、２０ヘルツ、３２％ＰＭＴ、および感度１０μＡ／Ｖの設定で６０ミクロンのサンプリング間隔で生じた。蛍光発光をモニタリングし、さらに１０分間インキュベートした後で照射したときにもう一度モニタリングした。他に述べない限り、このＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを全ての付随の実施例に使用した。
【００８８】
対照として、ＹＯＹＯ−１と共にインキュベートしたときのｓｓＤＮＡプローブは、ＹＯＹＯ−１と共にインキュベートしたｄｓＤＮＡ標的対照の蛍光に比べて比較的高レベルの蛍光を生成した。各対照中には、関連する反応混合物中と同量のＹＯＹＯ−１が存在した。ｓｓＤＮＡプローブ対照からの高レベルの蛍光は、ＹＯＹＯ−１によって安定化されシグナルを発生する複合体が形成したためであった。２５塩基長のプローブ対照は、１５塩基長のプローブ対照に比べてずっと高レベルの蛍光を生成した（表１）。
【００８９】
１５０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で形成した、４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ（配列番号１）および１５塩基長のプローブＣＦ０１−１５からなる完全一致のＤＮＡ３重鎖（試料４）は、５分間および１５分間のインキュベーションのどちらの後にも非常に強い蛍光発光を生成した（表１）。ｓｓＤＮＡプローブ対照の発光における変動に関して基準化したとき、１ｂｐのＡ−Ｃが不一致のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ１５塩基長３重鎖（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋プローブＣＦ１０−１５）（試料６）からの発光は、５分間および１５分間のインキュベーション後に、完全一致の１５塩基長３重鎖（試料４）に比べてそれぞれ９６．２％および９５．４％低かった。ｓｓＤＮＡプローブ対照の発光における変動に関して基準化したとき、１ｂｐのＴ−Ｃが不一致のｄｓＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ１５塩基長３重鎖（４９１ｂｐ  ｄｓＤＮＡ＋プローブＣＦ０９−１５）（試料８）からの発光は、５分間および１５分間のインキュベーション後に、完全一致の１５塩基長３重鎖（試料４）に比べてそれぞれ９８．２％および９８．８％低かった。
【００９０】
１５０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で形成された、４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ（配列番号１）およびプローブＣＦ０１−２５からなる完全一致の２５塩基長ＤＮＡ３重鎖（試料１０）は、５分間および１５分間のインキュベーション後に強い蛍光発光を生成した（表１）。一致した２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブとのｄｓＤＮＡ標的の複合体化の結果として、一致した１５塩基長ｓｓＤＮＡプローブとのｄｓＤＮＡ標的の結合時に生じる発光に比べて、大きく増強した発光が生じた。したがって、２５塩基長プローブを使用する結果として、１５塩基長プローブの使用に比べて高感度の２重鎖標的の３重鎖アッセイが得られた。１ｂｐのＡ−Ｃ不一致または１ｂｐのＴ−Ｃ不一致を含む、不完全に相補的なプローブと標的との複合体（それぞれ４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋プローブＣＦ１０−２５（試料１２）および４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋プローブＣＦ０９−２５（試料１４））は、ｓｓＤＮＡプローブ対照の発光における変動に関して基準化したとき、５分間のインキュベー
ション後にそれぞれ９８．０％または１００％低く、１５分間のインキュベーション後にそれぞれ９８．５％または１００％低い発光強度を生成した（表１）。これらのデータは、２重鎖標的中のＳＮＰの検出に２５塩基長プローブの方が１５塩基長プローブに比べて特異性でありうるという意外な結論を支持している。２５塩基長３重鎖中の１ｂｐの不一致が１５塩基３重鎖中の１ｂｐの不一致に比べて不安定化しうることは注目すべきであり、予想外であり、非常に有用である。この直感に反した事実をさらに詳述するために、上記の条件で２重鎖標的と１５、２０、２５、２７、３０、または３５塩基長オリゴプローブとを用いて形成した完全一致の３重鎖を比較した。２５塩基長プローブがその反応条件で最も特異的であると経験的に決定された。したがって、長い３重鎖形成プローブの方が、短い３重鎖形成プローブに比べて特異的でありうる。
【００９１】
２５塩基長プローブがＹＯＹＯ−１存在下で２重鎖標的と複合体化したときに形成した不一致の３重鎖が、プローブの対照発光に比べて小さい発光を生み出すことが起こりうる（試料１３および１４を比較）（表１）。ＹＯＹＯ−１はプローブの自己会合を促進して、照射時に発光を起こすことができるが、自己会合およびＹＯＹＯ−１との複合体は２重鎖標的の導入時に分散すると思われ、２重鎖標的の副溝に、および形成した任意の不一致の３重鎖により作り出された新しい溝にＹＯＹＯ−１がインターカレートすることによる蛍光に十分に大きい相殺的増加を有さない。不一致の３重鎖からのアッセイ発光が、関連するプローブ対照発光からの発光に比べて低いと、溶液中ＳＮＰアッセイにおいて均一性が得られるという非常に理想的な特徴がもたらされる。この場合、本方法は、ゲノムｄｓＤＮＡ標的に存在するＳＮＰについてバイナリーアッセイシグナルを生じる。
【実施例２】
【００９２】
本実施例は、反応混合物に添加する前に、１５塩基長または２５塩基長ｄｓＤＮＡプローブが様々な温度でＹＯＹＯ−１と共に予備インキュベートされたときに発生した４重鎖アッセイシグナルを比較する。
【００９３】
ＤＮＡ合成装置で合成したヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０由来の相補性センスおよびアンチセンスの１５塩基長または２５塩基長配列から、２重鎖プローブを作製し、これをカートリッジ精製し、次に１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でｄｄＨ2Ｏに溶解した。当モ
ル量の相補性オリゴヌクレオチドを９５℃で１０分間加熱し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で、温度を１．５時間かけて２１℃に下げながらゆっくりとアニーリングさせた。ｄｓＤＮＡオリゴを濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解した。
【００９４】
ｄｓプローブＣＦ０１−１５（配列番号１０）は、アミノ酸位置５０５から５１０に重複する、ＰＣＲ増幅された４９１ｂｐの野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）の１５ヌクレオチドセグメントに相同的であるように設計された１５塩基長ｄｓＤＮＡプローブを含んだ［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０、２１４〜２２８（１９９１）］。
【００９５】
ｄｓプローブＣＦ０１−１５のセンス鎖の配列（配列番号１０）は、５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
ｄｓプローブＣＦ１０−１５およびｄｓプローブＣＦ０９−１５は、１ｂｐの突然変異（下線部）を除いて、野生型ｄｓプローブＣＦ０１−１５と配列が同一の１５塩基長突然変異ｄｓＤＮＡプローブを含んだ。
【００９６】
ｄｓプローブＣＦ１０−１５のセンス鎖の配列（配列番号１１）は、５’−ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
ｄｓプローブＣＦ０９−１５のセンス鎖の配列（配列番号１２）は、５’−ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ−３’であった。
【００９７】
ｄｓプローブＣＦ０１−２５（配列番号１３）は、アミノ酸部分５０４から５１２に重複する、ＰＣＲ増幅された４９１ｂｐの野生型ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）の２５ヌクレオチドセグメントに相同的であるように設計された２５塩基長ｄｓＤＮＡプローブであった［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０、２１４〜２２８（１９９１）］。
【００９８】
ｄｓプローブＣＦ０１−２５のセンス鎖の配列（配列番号１３）は、５’−ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  Ａ−３’であった。
ｄｓプローブＣＦ１０−２５およびｄｓプローブＣＦ０９−２５は、１ｂｐの突然変異（下線部）を除いて、野生型ｄｓプローブＣＦ０１−２５と配列が同一の２５塩基長突然変異ｄｓＤＮＡプローブであった。
【００９９】
ｄｓプローブＣＦ１０−２５のセンス鎖の配列（配列番号１４）は、５’−ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  Ａ−３’であった。
ｄｓプローブＣＦ０９−２５のセンス鎖の配列（配列番号１５）は、５’−ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  Ａ−３’であった。
【０１００】
本願出願人は例えば、米国特許第６６５６６９２号および米国特許出願公開第２００３／０１１３７１６号に、２重鎖標的に相同な２重鎖プローブが２重鎖標的に特異的および検出可能に結合するものであると以前に開示した。２重鎖プローブおよび２重鎖標的は、複合体中の近位塩基の間にワトソン−クリック型対応が存在するときにもまた特異的および検出可能に結合することができる。そのような「入れ子相補的」結合は、しかしながら相同的４重鎖結合ほどには頻繁に起こらない。
【０１０１】
１．２５ｐｍｏｌｅの野生型または突然変異ｄｓＤＮＡプローブを、３０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共に室温（２４℃）または３０℃（ホットプレート上）で１時間、０．５×ＴＢＥ緩衝液中で予備インキュベートしてから、ＰＣＲ増幅された４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ標的（配列番号１）０．０５ｐｍｏｌｅおよび７０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を添加した。次に、反応混合物８０μｌを室温または３０℃のいずれかで５分間インキュベートし、水晶キュベットに入れ、波長４８８ｎｍを有するコヒーレント固体レーザを照射し、蛍光発光を直ちにモニタリングした。レーザ照射時間は７０ｍｓｅｃで、８０Ｗ／ｃｍ２の放射線を送達した。発光をオーシャンオプティクス（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）製ＣＣＤで収集し、オーシャンオプティクスのソフトウェアにより記録した。
【０１０２】
３０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共にｄｓＤＮＡプローブ対照を３０℃で１時間予備インキュベートすると、各ｄｓＤＮＡプローブ対照の発光強度が大きく低減した。前述の予備インキュベートされたプローブを反応混合物に添加したとき、完全一致の平行相同的２重鎖（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ０１−１５および４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ０１−２５）からなるｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ４重鎖によって最高の発光強度が生成した。さらに、３０℃での反応混合物をインキュベーションした結果として、一致した１５塩基長または２５塩基長相同的４重鎖を含む試料からの発光は、室温でインキュベートされた同じ複合体に比べて増強した。完全一致の相同的４重鎖の発光増加は、２５塩基長ｄｓＤＮＡプローブが、３０℃でインキュベートされた反応に使用されたときに最も明らかであった（データ非図示）。ＹＯＹＯ−１が促進しシグナルを発生したＳＮＰアッセイの感度および特異性は、反応混合物への添加前にプローブを予備インキュベートすることによって、および室温よりも高い非変性温度で反応混合物をインキュベートすることによっても、高めることができた。
【０１０３】
１ｂｐのＡ−Ｃが不一致の複合体（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ１０−１５）または１ｂｐのＴ−Ｃが不一致の複合体（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブ
ＣＦ０９−１５）を生じている不完全に相同なプローブと標的との組合せは、室温で５分間のインキュベーション後に、完全一致の平行相同的４重鎖から室温で発光した蛍光強度に比べて、それぞれ６１．３％または６７．８％低い４重鎖関連蛍光発光強度を生じた。１ｂｐのＡ−Ｃが不一致の４重鎖（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ１０−２５）または１ｂｐのＴ−Ｃが不一致の４重鎖（４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ０９−２５）は、室温で５分間のインキュベーション後に、完全一致の４重鎖から室温で発光した蛍光強度に比べて、共に１００％低い４重鎖関連蛍光発光強度を生成した。ｄｓＤＮＡ標的が２５塩基長相同的ｄｓＤＮＡプローブと複合体化したとき、ｄｓＤＮＡ標的に相同な１５塩基長ｄｓＤＮＡプローブと複合体化したときに比べて、高い特異性が観察された。したがって、長い２重鎖プローブは短い２重鎖プローブに比べて特異的でありうる。ＳＮＰについては、２５塩基長２重鎖プローブをアッセイすることが好ましい。
【０１０４】
１５塩基長プローブと、または２５塩基長プローブと形成した、１ｂｐのＡ−Ｃが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ４重鎖（それぞれ４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ１０−１５および４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ１０−２５）から発光した４重鎖関連蛍光強度は、３０℃で５分間のインキュベーション後に、完全一致の４重鎖から３０℃で発光した蛍光強度に比べてそれぞれ４１．５％および８５．２％低かった。１５塩基長プローブと、または２５塩基長プローブと形成した、１ｂｐのＴ−Ｃが不一致のｄｓＤＮＡ：ｄｓＤＮＡ４重鎖（それぞれ４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ０９−１５および４９１ｂｐのｄｓＤＮＡ＋ｄｓプローブＣＦ０９−２５）から発光した４重鎖関連蛍光強度は、３０℃で５分間のインキュベーション後に、完全一致の４重鎖から３０℃で発光した蛍光強度に比べて共に１００％低かった。
【０１０５】
２５塩基長ｄｓＤＮＡプローブを３０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共に３０℃で１時間予備インキュベートしてから３０℃で４量体を形成させた結果、２５塩基長２重鎖プローブを３０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共に室温で１時間予備インキュベーション後に実現されたものよりも、または１５塩基長ｄｓＤＮＡプローブを３０ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共に３０℃で１時間を予備インキュベーション後に実現されたものよりも、高い感度および特異性が生じた。反応混合物を室温の代わりに３０℃でインキュベートしたとき、１５塩基長ｄｓＤＮＡプローブまたは２５塩基長ｄｓＤＮＡプローブのいずれかと共に形成した完全一致の４重鎖について、ＹＯＹＯ−１発光の有意な強度増加が観察された。２５塩基長ｄｓＤＮＡ平行相同的プローブが使用されたときにその増加が最も著しかった。したがって、２５塩基長ｄｓプローブは匹敵する１５塩基長ｄｓプローブよりも感度および特異性が高いことがある。
【実施例３】
【０１０６】
本実施例は、ＹＯＹＯ−１の存在下で１５塩基長、２０塩基長、２５塩基長、または３０塩基長ｓｓＤＮＡプローブと室温で反応させた精製されたヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的の３重鎖形成について記載する。
【０１０７】
ヒトゲノムｄｓＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ精製キット（キアゲン、カナダ国ミシソーガ所在）を製造業者の説明書通りに使用して、血液試料から抽出した。ゲノムｄｓＤＮＡの濃度をＵＶ分光法によって決定した。
【０１０８】
ヒト嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）遺伝子エキソン１０由来配列を有するアンチセンス１５塩基長、２０塩基長、または２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブをＤＮＡ合成装置で合成し、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解した。
【０１０９】
デルタＦ５０８−ＷＴ１５Ｃプローブ（配列番号４）は、プローブＣＦ０１−１５と配列が同一の１５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
デルタＦ５０８−ＭＵＴ１５Ｃプローブ（配列番号１６）は、アミノ酸位置５０７および５０８で連続する３つの塩基が欠失している以外はヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０のセンス鎖の１５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された１５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであり、野生型アンチセンス配列ＡＡＧを欠失している。
【０１１０】
デルタＦ５０８−ＭＵＴ１５Ｃプローブの配列（配列番号１６）は、５’−ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＴ−３’であった。
デルタＦ５０８−ＷＴ２０Ｃプローブ（配列番号１７）は、アミノ酸位置５０６から５１２に重複する、ヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０のセンス鎖の２０ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２０塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１１１】
デルタＦ５０８−ＷＴ２０Ｃプローブの配列（配列番号１７）は、５’−ＴＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴ−３’であった。
デルタＦ５０８−ＭＵＴ２０Ｃプローブ（配列番号１８）は、アミノ酸位置５０７および５０８で連続する３つの塩基が欠失している以外はヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０のセンス鎖の２０ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２０塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであり、野生型アンチセンス配列ＡＡＧを欠失している。
【０１１２】
デルタＦ５０８−ＭＵＴ２０Ｃプローブの配列（配列番号１８）は、５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴ−３’であった。
デルタＦ５０８−ＷＴ２５Ｃプローブ（配列番号７）は、プローブＣＦ０１−２５と配列が同一の２５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１１３】
デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブ（配列番号１９）は、アミノ酸位置５０７および５０８で連続する３つの塩基が欠失している以外はヒト嚢胞性線維症遺伝子エキソン１０のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであり、野生型アンチセンス配列ＡＡＧを欠失している。
【０１１４】
デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブの配列（配列番号１９）は、５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＴＴ  ＴＴＣ  Ｔ−３’であった。
反応混合物（８０μｌ）は、５００ｐｇ  ヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的（約７５コピー）、３．２ｐｍｏｌｅ  １５塩基長、２０塩基長、または２５塩基長いずれかのｓｓＤＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥ、および６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。５、１５、３０、４５、および６０分間インキュベーションした後で反応混合物からの蛍光発光を、１５ｍＷアルゴンイオンレーザおよび３４％のＰＭＴ設定を備えるＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて検出した。
【０１１５】
ｓｓＤＮＡプローブ対照は、６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で、同様に６００ｎＭ
ＹＯＹＯ−１を含むゲノムｄｓＤＮＡ標的対照から発光した蛍光発光に比べて高レベルの蛍光発光を生成した。２５塩基長プローブ対照は、匹敵する２０塩基長または１５塩基長プローブ対照に比べて高レベルの蛍光を示した（表２）。反応混合物からの蛍光発光値を基準化して、関連する反応混合物の発光から適切なプローブ対照の発光を引くことによって３重鎖関連シグナルを同定した。それら両方を経時的にモニタリングした。
【０１１６】
ゲノムｄｓＤＮＡおよび２５塩基長デルタＦ５０８−ＷＴ２５Ｃプローブからなるヘテロポリマー完全一致ＤＮＡ３重鎖（試料５）が形成され、その３重鎖は、６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間という短いインキュベーション後に検出された（表２）。完全一致の３重鎖関連発光がゲノムｄｓＤＮＡ標的対照およびプローブ対照の合計発光に比べて有意に大きくなりうることは全く注目に値する。ある条件で、これらの完全一致のＤ
ＮＡ３重鎖（試料５）の発光レベルが、最初の５分間のインキュベーションおよび最初のレーザ測定後に最長５５分目までの様々な時点で本質的に安定であったことも注目に値する（表２およびデータ非図示）。最初の５分間に形成した検出された３重鎖複合体が６０分間を通して安定に検出されたという観察は、ゲノム標的および他の試薬の平衡が、室温でわずか５分間のインキュベーション後に実質的に実現されたことを強く示唆している。前述の観察は、核酸結合の「ランダム衝突」モデルに対抗する証拠を構成している。手で取り扱う工程により課された時間的制約により、５分間未満のインキュベーションの間にゲノム標的との３重鎖形成をモニタリングすることはできなかった。
【０１１７】
３ｂｐの不一致を含むｇＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ３重鎖（ゲノムｄｓＤＮＡ＋デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブ）（試料６）によって生成した３重鎖関連蛍光発光強度は、５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後に、完全一致の３重鎖（試料５）によって発光した蛍光発光に比べてそれぞれ９０．１％、９２．９％、９２．５％、および９１．６％低かった（表２）。これらの結果は、未標識オリゴｓｓＤＮＡプローブおよびＹＯＹＯ−１を用いて、室温で５分間という短いインキュベーション後に溶液中でヒトゲノムｄｓＤＮＡを均一にアッセイできることを明らかに実証している。そのようなヘテロポリマー３重鎖を形成させて、ヒトゲノム試料中のＳＮＰ、ヒトゲノム試料中の配列、またはヒトゲノムｄｓＤＮＡも含有する試料中の別の生物もしくは病原体の存在もしくは遺伝子型を検出することができる。本アッセイは、３重鎖複合体に関係するシグナルの直接検出を提供する。その複合体を、ときにインジェネウス３重鎖（ＩＮＧＥＮＥＵＳ  ＴＲＩＰＬＥＸ）と称し、本発明に開示されたアッセイ能力をゲノムアッセイと称する。
【０１１８】
ゲノムｄｓＤＮＡおよび２０塩基長デルタＦ５０８−ＷＴ２０Ｃプローブからなる完全一致のヘテロポリマーＤＮＡ３重鎖（試料１０）も形成し、それを６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーション後に検出した（表２）。ＹＯＹＯ−１と共に５分間のインキュベーション後に完全一致の３重鎖が形成する効率は、蛍光発光レベルから証明されるように、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブに比べて２０塩基長ｓｓＤＮＡプローブが使用されたときの方が有意に低いと思われた。
【０１１９】
３ｂｐの不一致を含む２０塩基長３重鎖（ゲノムｄｓＤＮＡ＋デルタＦ５０８−ＭＵＴ２０Ｃプローブ）（試料１１）についての３重鎖関連蛍光強度は、５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後に、匹敵する完全一致の２０塩基長３重鎖（試料１０）により発光した蛍光強度に比べてそれぞれ４３．０％、７７．６％、８５．９％、および９５．５％低かった（表２）。完全一致の２０塩基長３重鎖と、ゲノムｄｓＤＮＡおよび２０塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる３ｂｐが不一致の３重鎖との間の識別レベルは、５分間のインキュベーション後に、ゲノムｄｓＤＮＡおよび２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる３重鎖について観察されたレベルに比べて顕著に低かったが、最長４５分間のインキュベーションは、一致した２０塩基長３重鎖と不一致の２０塩基長３重鎖の間の識別レベルに漸増を生じた（表２）。これは、不一致の２０塩基長３重鎖形成の漸減と一致して、経時的に完全一致の２０塩基長３重鎖の形成が着実に増加したことが原因とされた。このパターンは持続し、４５および６０分間のインキュベーション時間にモニタリングされた（データ非図示）。４５分間のインキュベーション後に、ゲノムｄｓＤＮＡおよび２０塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる、一致および不一致の３重鎖の間の識別レベルは、ゲノムｄｓＤＮＡおよび２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる、一致および不一致の３重鎖の間の識別レベルと等しかったが、より低い３重鎖関連蛍光発光シグナルを有した。
【０１２０】
ゲノムｄｓＤＮＡおよびデルタＦ５０８−ＷＴ１５Ｃプローブ（試料１５）が６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間インキュベートされたとき、１５塩基長完全一致３重鎖からの有意に低レベルの蛍光発光が観察された（表２）。ゲノムｄｓＤＮＡおよびデル
タＦ５０８−ＭＵＴ１５Ｃプローブからなる、３ｂｐが不一致の１５塩基長３重鎖（試料１６）から観察された蛍光発光は、短時間のインキュベーション後に、完全一致の１５塩基長３重鎖（試料１５）の蛍光発光に比べて高かった。しかし、６００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で４５分間のインキュベーション後に、不一致の１５塩基長３重鎖関連蛍光は十分に減少し、３ｂｐが不一致の１５塩基長３重鎖（試料１６）からの３重鎖関連蛍光発光は、完全一致の１５塩基長３重鎖（試料１５）の蛍光発光に比べて８３．１％低かった（表２）。この識別は６０分間のインキュベーション後も維持された（データ非図示）。
【０１２１】
上記結果は、好ましくはＹＯＹＯ−１および２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブを使用するときの、非変性、非増幅、ヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的中のＳＮＰ不一致を検出するヘテロポリマー３重鎖アッセイの驚異的な効率を明らかに実証している。ゲノムｄｓＤＮＡ標的のヘテロポリマー３重鎖アッセイの感度は、ゲノムｄｓＤＮＡ５００ｐｇ、約７５コピーが終体積８０μｌの反応混合物中で均一にアッセイされたことを考慮すると驚異的である。重量２ｎｇから１００ｐｇ、約３０２コピーから１５コピーのヒトゲノム標的中のＳＮＰは、様々なＹＯＹＯ−１濃度を用いて溶液中で同様にアッセイされた。
【０１２２】
ヒトのメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）遺伝子エキソン４由来配列を有する２０塩基長、２５塩基長、または３０塩基長アンチセンスｓｓＤＮＡプローブを、ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解させた。
【０１２３】
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２０Ｃ（配列番号２０）は、ヒトＭＴＨＥＲ遺伝子エキソン４のセンス鎖の２０ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２０塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７、１９５〜２００（１９９４）。
【０１２４】
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２０Ｃの配列（配列番号２０）は、５’−ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＣ−３’であった。
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２０Ｃ（配列番号２１）は、１塩基突然変異（下線部）を除き、野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２０Ｃと配列が同一の２０塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。ＭＴＨＦＲ６７７多型は、ＭＴＨＥＲ遺伝子のセンス鎖におけるシトシンからチミンへの置換であり、その置換の結果としてＭＴＨＦＲ酵素にアラニンからバリンへの置換が生じる。
【０１２５】
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２０Ｃの配列（配列番号２１）は、５’−ＴＧＡ  ＴＧＡ
ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＣＣ−３’であった。
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃ（配列番号２２）は、ヒトＭＴＨＦＲ遺伝子エキソン４のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１２６】
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号２２）は、５’−ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  Ａ−３’であった。
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃ（配列番号２３）は、１塩基突然変異（下線部）を除き、野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃと配列が同一の２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１２７】
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃの配列（配列番号２３）は、５’−ＴＧＡ  ＴＧＡ
ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  Ａ−３’であった。
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ３０Ｃ（配列番号２４）は、ヒトＭＴＨＦＲ遺伝子エキソン４のセンス鎖の３０ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された３０塩基長
野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１２８】
プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ３０Ｃ（配列番号２４）の配列は、５’−ＧＣＧ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ−３’であった。
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ３０Ｃ（配列番号２５）は、１塩基突然変異（下線部）を除き、野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ３０Ｃと配列が同一の３０塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１２９】
プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ３０Ｃの配列（配列番号２５）は、５’−ＧＣＧ  ＴＧＡ
ＴＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ−３’であった。
反応混合物（８０μｌ）はヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的１ｎｇまたは２ｎｇ（それぞれ約１５１コピーまたは３０２コピー）、２０塩基長、２５塩基長、または３０塩基長いずれかのｓｓＤＮＡプローブ３．２ｐｍｏｌｅ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。反応混合物の蛍光発光を、実施例１に記載したように５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に３０％ＰＭＴの設定でＧｅｎｅｘｎｓ分析装置の１５ｍＷアルゴンイオンレーザを用いてモニタリングした。
【０１３０】
これらの条件でＹＯＹＯ−１の存在下で各プローブ配列の自己ハイブリダイゼーション特性レベルにおける差が原因で、野生型および突然変異ｓｓＤＮＡプローブ対照について非常に異なる蛍光発光レベルが観察された（表３）。３０塩基長のプローブは、２５塩基長または２０塩基長のプローブに比べて高レベルの蛍光を示した。反応混合物からの蛍光発光を基準化して、関連する反応混合物の発光から適切なプローブ対照の発光を引くことによって３重鎖関連シグナルを同定した。それら両方を経時的にモニタリングした。
【０１３１】
ゲノムｄｓＤＮＡと、プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ３０ＣまたはプローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃのいずれかとからなる完全一致のヘテロポリマー性３０塩基長および２５塩基長３重鎖（それぞれ表３の試料５および１０）は、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーションの間に形成した。完全一致の３０塩基長および２５塩基長３重鎖関連シグナルレベルは両方とも、５分間だけのインキュベーション後に、標的ゲノムｄｓＤＮＡ対照および関連するプローブ対照を合計した蛍光シグナルに比べて両方とも有意に大きかった。５分間のインキュベーション後に３０塩基長および２５塩基長の３重鎖複合体が形成して直接検出されたこと、ならびに続く５５分間を通して検出シグナルが安定であったこと（表３）は、わずか５分間のインキュベーション後に平衡が実質的に達成されたことを示唆している。ゲノム３重鎖アッセイに半量のゲノムｄｓＤＮＡ標的、すなわち２ｎｇの代わりに１ｎｇを使用しても、意外にも形成した完全一致の３０塩基長または２５塩基長３重鎖複合体から発生した３重鎖関連シグナルは、それに比例して減少しなかった（データ非図示）。匹敵するレベルの反応混合物蛍光発光によって証明されるように、完全一致の２５塩基長３重鎖が類似の効率で形成した（データ非図示）。３重鎖関連蛍光発光のレベルに基づくと、完全一致の２５塩基長３重鎖は、試験された反応条件で完全一致の３０塩基長３重鎖に比べて効率的に形成した（表３の試料１０および５を比較）。
【０１３２】
ゲノムｄｓＤＮＡ２ｎｇおよびプローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ３０Ｃからなる、反応混合物中の１ｂｐのＣ−Ａが不一致の３０塩基長３重鎖（試料６）からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後に、完全一致の３０塩基長３重鎖（試料５）を含有する反応混合物から発光した蛍光発光に比べてそれぞれ９０．４％、９２．６％、９２．４％、および９３．３％低かった。これらの発光をそれぞれ匹敵するインキュベーション後に評価した（表３）。同様に、ゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇがプローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ３０Ｃと反応して、１ｂｐのＣ−Ａが不一致の３０塩基長３重鎖を形成したとき、この不一致の３重鎖からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後に、完全一致の３０塩基長３重鎖を含有する反応
混合物から発光した蛍光発光に比べてそれぞれ８０．２％、８４．９％、８６％、および８７．３％低かった。これらの発光をそれぞれ匹敵するインキュベーション後に評価した（データ非図示）。これらの結果は、３０塩基長ｓｓＤＮＡプローブを用いてインジェネウス３重鎖により発光するシグナルが、ヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的のＳＮＰ不一致を検出する効率を明らかに実証している。３０塩基長インジェネウス３重鎖における１ｂｐの不一致が非常に不安定化することができるので、ＹＯＹＯ−１およびヒトゲノムＤＮＡ試料の存在下で完全一致の３０塩基長３重鎖と不一致の３０塩基長３重鎖との間のそのような高レベルの識別を可能にすることは注目すべきである。
【０１３３】
ゲノムｄｓＤＮＡ２ｎｇをプローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃと反応させて１ｂｐのＣ−Ａが不一致の２５塩基長３重鎖（試料１１、表３）が形成されたとき、この不一致の３重鎖を含有する反応混合物からの３重鎖関連蛍光発光は、完全一致の２５塩基長３重鎖（試料１０）を含有する反応混合物によって発光した蛍光発光に比べて５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後にそれぞれ９８．１％、９９．０％、９９．３％、および９９．４％低かった。ゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇおよびプローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃからなる１ｂｐのＣ−Ａが不一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物からの蛍光発光は、５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後に、完全一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物により発光した蛍光発光に比べてそれぞれ９１．４％、９３．７％、９４．４％、および９５．２％低かった（データ非図示）。まとめると、これらの結果は、３０塩基長または２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブのいずれかとＹＯＹＯ−１とを用いて実施してヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的中のＳＮＰ不一致を検出したとき、ヘテロポリマー３重鎖アッセイの特異性のレベルが高いことを実証している。
【０１３４】
２ｎｇまたは１ｎｇいずれかのゲノムｄｓＤＮＡおよびプローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２０Ｃ（それぞれ表３の試料１５および示していないデータ）を含有する反応混合物中に完全一致のヘテロポリマー性２０塩基長３重鎖が形成する効率は、匹敵する２５塩基長または３０塩基長プローブを用いて形成した効率よりも有意に低かった。ゲノムｄｓＤＮＡおよび２０塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる完全一致の２０塩基長３重鎖（試料１５）と、１ｂｐが不一致の３重鎖（試料１６）との間の識別レベルは、ゲノムｄｓＤＮＡおよび２５塩基長または３０塩基長ｓｓＤＮＡプローブからなる３重鎖について観察されたレベルに比べて５分間のインキュベーション後に著しく低かったが、最長４５分間のインキュベーションは、一致および不一致の２０塩基長３重鎖の間で識別レベルに漸増を生じた（表３）。
【０１３５】
上記結果は、ヒトゲノムＤＮＡを含有する試料のヘテロポリマー性３重鎖アッセイについて２５塩基長または３０塩基長ｓｓＤＮＡプローブが、１５または２０塩基長の長さの短いプローブよりも明らかに好ましいことを実証している。
【実施例４】
【０１３６】
実施例４は、ｓｓＤＮＡプローブ、ＹＯＹＯ−１、およびヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的の間のその後のヘテロポリマー性３重鎖形成に及ぼす試験培地の電気前処理の効果を実証している。以前に本願出願人らは、ヒトゲノムｄｓＤＮＡよりも複雑でない標的を含有する反応混合物に添加する前に、培地の電気前処理を行う利点を開示した。米国特許出願公開第２００３／０１７０６５９号を参照されたい。
【０１３７】
１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中に０．７×ＴＢＥを含む試験培地を、使用前に処理しないかまたは電気的に前処理を行った。試験培地中に２ｍｍ離間して液浸した２つの白金／イリジウム電極により、試験培地を電気的に前処理した。１０秒間隔とした９ボルトＤＣ電流の５００ｍｓｅｃパルス４０回を、０．７×ＴＢＥからなる試験培地５６μｌに適用した。ＤＣ電流の最終パルスの直後に、ヘテロポリマー２５塩基長ｓｓＤＮＡプロー
ブ（配列番号７または配列番号１９）３．２ｐｍｏｌｅ、ヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的５００ｐｇ（約７５コピー）、およびＹＯＹＯ−１を、未処理の試験培地および電気的に前処理した試験培地に添加して、終体積８０μｌを有する反応混合物を生成した。緩衝液の終濃度は０．５×ＴＢＥであり、ＹＯＹＯ−１の終濃度は６００ｎＭであった。５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に３０％に設定したＰＭＴで蛍光発光をモニタリングした。
【０１３８】
完全一致のＤＮＡ３重鎖（ゲノムｄｓＤＮＡ＋デルタＦ５０８−ＷＴ２５Ｃプローブ）を含有する反応混合物が最高の蛍光強度を発光したが、３ｂｐの不一致を有する不完全に相補性の３重鎖（ゲノムｄｓＤＮＡ＋デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブ）を含有する反応混合物は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、匹敵するインキュベーション後の未処理培地中の完全一致の３重鎖により発光した蛍光発光に比べてそれぞれ５４．７％、７９．９％、８４．７％、９８．６％、および９０．５％低い３重鎖関連蛍光発光を生成した（データ非図示）。
【０１３９】
試験構成要素を添加する前に試験培地に９Ｖパルスを４０回適用した結果、未処理試験培地中の同じ対照で観察された蛍光発光に比べて、ｓｓＤＮＡプローブ対照の蛍光発光レベルは約２分の１に減少した。しかし、試験培地の電気的前処理の結果として、ゲノムｄｓＤＮＡ対照との蛍光発光に差が生じなかった。記載した試験培地の電気的前処理は、完全一致のヘテロポリマー２５塩基長３重鎖形成を含む反応混合物から発生したシグナルを、未処理試験培地で形成した同じ完全一致の３重鎖で観察されたシグナルに比べて、この場合９２５０％増加の程度まで劇的に高めた（データ非図示）。３ｂｐが不一致の３重鎖形成（ゲノムｄｓＤＮＡ＋デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブ）から発生したシグナルも、試験培地に９Ｖのパルスを４０回適用することにより有意に増加し、その結果、前処理された培地中に３ｂｐが不一致の複合体を含有する反応混合物からの３重鎖関連発光は、５分間のインキュベーション後に、完全一致の複合体により得られた蛍光発光に比べてわずか１７．４％だけ低かった（データ非図示）。一致および不一致のヘテロポリマー２５塩基長ＤＮＡ３重鎖両方の異常に高レベルの蛍光発光は、経時的に持続したばかりでなく、モニタリングされた６０分間のインキュベーション時間を通してわずかに増加した。
【０１４０】
発光した３重鎖関連シグナルにおけるこの劇的な増加は、分析物および試薬の添加前に試験培地の電気的前処理を実施することにより、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブおよびＹＯＹＯ−１を用いた３重鎖アッセイの感度を劇的に増加できることを実証している。このような感度増加によって、ヒトゲノムのバックグラウンドの存在下でさえも、終体積８０μｌを有する反応混合物中に存在する対象となる７５コピーの配列よりもずっと少ないコピー数の検出を可能になるであろう。
【実施例５】
【０１４１】
本実施例は、インジェネウス３重鎖が、ＹＯＹＯ−１の存在下で２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブと反応した一連の標的濃度にわたり血液または唾液から精製されたヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的上で特異的に形成する能力を実証している。
【０１４２】
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ精製キット（キアゲン、カナダ国ミシソーガ所在）を用いてヒト血液試料から、またはオラジーン（Ｏｒａｇｅｎｅ）ＤＮＡ収集キット（ＤＮＡジェノテック（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ）カナダ国オタワ（Ｏｔｔａｗａ）所在）を製造業者の説明書通りに使用して、ヒト唾液からヒトゲノムｄｓＤＮＡを抽出した。ゲノムｄｓＤＮＡの濃度をＵＶ分光法によって決定した。
【０１４３】
ヒト第Ｖ因子遺伝子エキソン１０由来配列またはヒト嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）遺伝子
のイントロン１４ｂ由来配列を有するアンチセンス２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブをＤＮＡ合成装置で合成して、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶
解した。
【０１４４】
プローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃ（配列番号２６）は、ヒト第Ｖ因子遺伝子エキソン１０のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１４５】
プローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号２６）は、５’−ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  Ｇ−３’であった。
プローブＦＶＬ−ＭＵＴ２５Ｃ（配列番号２７）は、第Ｖ因子ライデン（ＦＶＬ）突然変異Ｇ１６９１Ａに対応する１塩基突然変異（下線部）を除き野生型プローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃと配列が同一の２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった［Ｎａｔｕｒｅ
３６９、６４〜６７（１９９４）］。この突然変異の結果として、血液凝固第Ｖ因子タンパク質のアミノ酸配列の位置５０６でアルギニンの代わりにグルタミンへの置換が生じる。
【０１４６】
プローブＦＶＬ−ＭＵＴ２５Ｃの配列（配列番号２７）は、５’−ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  Ｇ−３’であった。
プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃ（配列番号２８）は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子エキソン１４ｂおよびイントロン１４ｂのセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１４７】
プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号２８）は、５’−ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  Ｃ−３’であった。
プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＭＵＴ２５Ｃ（配列番号２９）は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１４ｂにおける２７８９＋５Ｇ→Ａ突然変異に対応する１塩基突然変異（下線部）を除き、野生型プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃと配列が同一の２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１４８】
プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＭＵＴ２５Ｃの配列（配列番号２９）は、５’−ＡＡＴ
ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＴＩＴ  Ｃ−３’であった。
反応混合物（８０μｌ）は７５ｐｇから４ｎｇの量のヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的（約１１コピーから６０４コピー）、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブ３．２ｐｍｏｌｅ、０．５×ＴＢＥおよび５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に３０％のＰＭＴ設定で反応混合物からの蛍光発光をモニタリングした。
【０１４９】
野生型および突然変異ｓｓＤＮＡプローブ対照について異なる蛍光発光レベルが観察された。反応混合物からの蛍光発光値を基準化して、適切なプローブ対照発光値を引くことによって、３重鎖関連シグナルを同定した。それら両方を経時的にモニタリングした。
【０１５０】
（血液から精製された）２ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、または２００ｐｇのいずれかのゲノムｄｓＤＮＡと、プローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃ（それぞれ表４の試料５、８、１１、および１４）とからなる完全一致のヘテロポリマー２５塩基長３重鎖が、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーション中に形成した。完全一致の２５塩基長３重鎖シグナルレベルは、わずか５分間のインキュベーション後に標的ゲノムｄｓＤＮＡ対照および野生型プローブ対照の合計蛍光シグナルに比べて全て有意に大きかった。ゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇが反応混合物中に存在したとき、６０分間のインキュベーション時間を通して完全一致の２５塩基長３重鎖蛍光発光の漸増が存在した（試料８、表４）。漸
減する濃度のゲノムｄｓＤＮＡ対照は漸減する蛍光発光を生成したが、反応混合物中のゲノムｄｓＤＮＡ濃度が漸減しても、形成した完全一致の２５塩基長３重鎖からの３重鎖関連発光はそれに比例して減少しなかった（表４）。
【０１５１】
１ｂｐのＧ−Ｔが不一致の２５塩基長３重鎖と、２ｎｇから２００ｐｇの間の重量のゲノム標的と、プローブＦＶＬ−ＭＵＴ２５Ｃとを含有する反応混合物（表４の試料６、９、１２、および１５）からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、完全一致の２５塩基長３重鎖と、匹敵する量のゲノムｄｓＤＮＡと、プローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃとを含有する反応混合物（表４のそれぞれ試料５、８、１１、および１４）により発光する蛍光発光に比べて全て１００％低かった。実施例１に論じたように、ＹＯＹＯ−１が促進したプローブの自己会合は、ゲノム２重鎖標的の導入に応じて大きく減少すると思われ、ＹＯＹＯ−１発光の減少を生じ、２重鎖標的へのインターカレーションおよび任意の不一致の３重鎖形成による蛍光に十分に大きな相殺的増加を有さなかった。この結果として、匹敵するプローブ対照からの発光に比べて低い、不一致のゲノムＤＮＡ３重鎖を含有する反応混合物からの蛍光発光が生じうる。
【０１５２】
完全一致のヘテロポリマー２５塩基長３重鎖は、（血液から精製された）４ｎｇ、２ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、２００ｐｇ、１００ｐｇ、または７５ｐｇのいずれかのゲノムｄｓＤＮＡと、３．２ｐｍｏｌｅのプローブＣＦＴＲ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃとを含有する反応混合物中で５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーション後に、ゲノムｄｓＤＮＡとプローブＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃとからなる完全一致の２５塩基長３重鎖（表４に示す）に類似した効率で形成した（データ非図示）。ＣＦＴＲの完全一致の２５塩基長３重鎖関連発光は、標的ゲノムｄｓＤＮＡ対照の蛍光発光および関係するプローブ対照の発光を合計したものに比べて全て有意に大きかった。使用されたアッセイ条件で通例であるように、反応混合物からの３重鎖関連発光は６０分間のインキュベーション時間にわたり安定であった（データ非図示）。
【０１５３】
４ｎｇから７５ｐｇの間のゲノムｄｓＤＮＡと、プローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＭＵＴ２５Ｃからなる、１ｂｐのＴ−Ｇが不一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に関連するプローブ対照値に基準化した後で、匹敵する量のゲノム標的ＤＮＡを含む完全一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物によって発光した蛍光発光に比べて全て１００％低かった（データ非図示）。
【０１５４】
上記結果は、ゲノムアッセイが広範囲のゲノムｄｓＤＮＡ濃度にわたり非変性、非増幅、ヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的中の様々な遺伝子の様々な不一致を直接検出できるようにする、インジェネウス３重鎖の驚くべき効率および感度をはっきりと実証している。前記アッセイの能力は、検出感度について最適化されていないか、または８０μｌ未満の終体積で作業するための研究者に利用できる装置で、わずか７５ｐｇのゲノムｄｓＤＮＡ、約１１コピーをＳＮＰについてアッセイできるようにすることから、いっそう驚異的である。
【０１５５】
本実施例で記載された本質的に同じアッセイプロトコルを用いたゲノムアッセイを用いて、数多くのＳＮＰがうまくアッセイされた。ときどき、試薬濃度またはプロトコルに変化を加えた。アッセイされたＳＮＰには、第Ｖ因子ライデンＧ１６９１Ａ、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔ、ＣＦＴＲデルタＦ５０８、ＣＦＴＲデルタ１５０７、ＣＦＴＲ２７８９＋５Ｇ→Ａ、ＣＦＴＲ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ、ＣＦＴＲ３６５９ｄｅｌＣ、ＣＦＴＲ  Ｇ５５１Ｄ、ＣＦＴＲ６２１＋１Ｇ→Ｔ、ＣＦＴＲ  Ｒ１１６２Ｘ、ＣＦＴＲ１７１７−１Ｇ→Ａ、ＣＦＴＲ  Ａ４５５Ｅ、ＣＦＴＲ  Ｇ５４２Ｘ、ＣＦＴＲ  Ｎ１３０３Ｋ、ＣＦＴＲ  Ｒ５６０Ｔ、およびＣＦＴＲ  Ｗ１２８２Ｘが挙げられる。上記ゲノムアッセイでアッセイされた２重鎖標的中の標的配列の７５％は、４または５個のプリンおよびピリミ
ジン塩基が交互になったものの１つまたは複数の領域を含み、それは温和な条件でＺ  ＤＮＡの領域を形成することができる。このＺ  ＤＮＡポテンシャルは、ゲノムアッセイを行う上でアッセイの困難を生じなかった。
【０１５６】
これらの場合全てにおいて、血液から精製されたヒトゲノムｄｓＤＮＡ試料をアッセイした。５０℃で３０分間インキュベーション後に室温で１週間保存された唾液試料から精製したゲノムｄｓＤＮＡを使用してＣＦＴＲ２７８９＋５Ｇ→Ａ突然変異についてもゲノム３重鎖アッセイを行った。室温で唾液試料を長期保存できるようにするためにオラジーンキットの製造業者によって５０℃のインキュベーションが勧められている。
【０１５７】
表５は、唾液から精製されたヒトゲノムｄｓＤＮＡから得られたアッセイ結果を、血液から精製されたヒトゲノムｄｓＤＮＡの結果と比較したものである。ヒトゲノムｄｓＤＮＡの４ｎｇまたは２ｎｇのいずれかを、３．２ｐｍｏｌｅのプローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃを用いてアッセイした（表５の試料５および８）。反応混合物からの発光は、一致した３重鎖が５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーション後に同等の効率で形成したことを示した（表５の試料５および８ならびに示していないデータ）。３重鎖関連発光は、モニタリングした４５分間を通して安定であった。
【０１５８】
ゲノムｄｓＤＮＡ４ｎｇおよびプローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＭＵＴ２５Ｃからなる１ｂｐのＴ−Ｇが不一致の２５塩基長３重鎖（試料６、表５）を含有する反応混合物からの３重鎖関連蛍光発光は、完全一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物により発光した蛍光発光に比べて５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後にそれぞれ９４．９％、９３．１％、９４．１％、および９３．８％低かった。同様に、ゲノムｄｓＤＮＡ２ｎｇを同じプローブと反応させて１ｂｐのＴ−Ｇが不一致の２５塩基長３重鎖（試料９、表５）を形成させたとき、３重鎖関連蛍光発光は、完全一致の２５塩基長３重鎖を含有する反応混合物によって発光した蛍光発光に比べて５、１５、３０、および４５分間のインキュベーション後にそれぞれ１００％、９７．７％、１００％、および１００％低かった（試料８、表５）。
【０１５９】
上記結果は、唾液から精製されたヒトゲノムＤＮＡのゲノムアッセイが、ヒトゲノムＤＮＡが血液から精製されたアッセイと同様に効率的および特異的でありうることを実証している。したがって、キアゲンキットを用いたときに起こるゲノムＤＮＡの大規模な精製は、ヒトゲノムｄｓＤＮＡを含有する試料の３重鎖アッセイに必要ではないことがある。唾液からのアッセイ用ヒトゲノムＤＮＡの獲得は、血液からの獲得に比べて取扱い、保存、および輸送に明らかな利点を提供する。並列した比較において、キアゲンキットによって精製された末梢血１ｍｌから、反応１回あたり３ｎｇをアッセイしたとして、これらの実施例で記載された３重鎖アッセイを９０００回を超えて実施するのに十分なヒトゲノムＤＮＡを得た。オラジーンキットを用いて半精製された典型的な喀痰試料は、７０００回を超える３重鎖アッセイを実施するのに十分なヒトゲノムＤＮＡを生成した。
【０１６０】
これらの実施例における全てのデータは、３重鎖核酸と複合体を形成したＹＯＹＯ−１分子が、２重鎖核酸と複合体を形成したときに比べて大きい光を発光するという結論と一致することが観察される。
【実施例６】
【０１６１】
本実施例は、発光の漸増および／または漸減が経時的にモニタリングされ評価された、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブと共に反応したヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的のＳＮＰアッセイを記載する。
【０１６２】
ヒト血液試料からヒトゲノムｄｓＤＮＡを抽出し、実施例３に記載されたように定量し
た。ヒトＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１９由来の配列を有するアンチセンス２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブをＤＮＡ合成装置で合成し、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解した。
【０１６３】
プローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＷＴ２５Ｃ（配列番号３０）は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１９のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的であるように設計された２５塩基長野生型ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１６４】
プローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号３０）は、５’−ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  Ｔ−３’であった。
プローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃ（配列番号３１）は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のイントロン１９における３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ突然変異に対応する１塩基突然変異（下線部）を除き、野生型プローブ３８４９＋１０ｋｂ→Ｔ−ＷＴ２５Ｃと配列が同一の２５塩基長突然変異ｓｓＤＮＡプローブであった。
【０１６５】
プローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃの配列（配列番号３１）は、５’−ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＴＡＣ  Ｔ−３’であった。
【０１６６】
反応混合物（８０μｌ）はヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的２ｎｇ（約３０２コピー）、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブ３．２ｐｍｏｌｅ、０．５×ＴＢＥ、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１、および４０ｍＭまたは４５ｍＭいずれかのコスモトロピック陽イオン性テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡ−Ｃｌ）を含有した。各実験において反応混合物を２回の繰り返しで形成させ、一方には反応混合物にＹＯＹＯ−１を最後に添加した。もう一方の反応混合物では反応混合物の全ての構成要素を混合してから、ゲノムＤＮＡを添加した。全ての場合で、反応混合物を５分間インキュベートして照射した。反応混合物の蛍光発光を、実施例１に記載されたように５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に３２％ＰＭＴの設定でＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒの１５ｍＷアルゴンイオンレーザを用いてモニタリングした。
【０１６７】
４５ｍＭまたは４０ｍＭのＴＭＡ−Ｃｌの存在下で、アッセイされた各ＳＮＰについて野生型および突然変異ｓｓＤＮＡプローブ対照からの蛍光発光は、５分間のインキュベーション後に同様であり（表６、７および示していないデータ）、さらに５５分の経過時間にわたり定常を維持した。反応混合物の１５から６０分間のインキュベーション後に得られた３重鎖関連発光値だけを表６および７に示す。
【０１６８】
４５ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌおよび５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で１５分間のインキュベーション後にモニタリングされた、ゲノムＤＮＡおよびプローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＷＴ２５Ｃからなる、反応混合物中の２回繰り返しの完全一致の２５塩基長３重鎖（試料５および９、表６）からの３重鎖関連発光は、ＹＯＹＯ−１またはｇＤＮＡのどちらが反応混合物に最後に添加されたかどうかにかかわらず同様であった。６０分間にわたりモニタリングされたとき、両方の３重鎖アッセイプロトコルで、完全一致の３重鎖関連発光が劇的に増加した（表６、図１および２）。
【０１６９】
４５ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌおよび５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で１５分間のインキュベーション後にモニタリングされた、ゲノムＤＮＡおよびプローブ２７８９＋５Ｇ→Ａ−ＭＵＴ２５Ｃからなる、反応混合物中の２回の繰り返しの不一致の２５塩基長３重鎖（試料６および１０、表６）からの３重鎖関連発光は、ＹＯＹＯ−１またはｇＤＮＡのどちらが反応混合物に最後に添加されたかどうかにかかわらず同様であり、完全一致の３重鎖を含有する反応混合物に比べて５５％または５４％低い発光を生成した（それぞれ試料５
および９、表６）。６０分間にわたりモニタリングされたとき、ＹＯＹＯ−１が最後に添加された反応混合物中で形成した不一致の３重鎖からの３重鎖関連発光は比較的一定のままであった（試料６、表６、および図１）。対応する完全一致の３重鎖関連発光は、モニタリングした期間にわたり有意に増加したことから、完全一致の３重鎖シグナルと１ｂｐが不一致のシグナルとの間の識別レベルは、ＹＯＹＯ−１が最後に添加された反応混合物では５５％から６５％に増加した。ｇＤＮＡが最後に添加された反応混合物中で形成した不一致の３重鎖からの３重鎖関連発光は、経時的にやや増加した（試料１０、表６、および図２）。しかし、これら反応混合物中の不一致の３重鎖についての３重鎖関連発光の増加速度は、匹敵する完全一致の３重鎖を含有する反応混合物からの速度に比べてずっと小さいことにより、完全一致の３重鎖関連シグナルと１ｂｐが不一致の３重鎖関連シグナルとの間の識別レベルは、その時間にわたりモニタリングされたときに５４％から６０％に増加した。
【０１７０】
４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌおよび５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下で１５分間のインキュベーション後にモニタリングされたゲノムＤＮＡおよびプローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＷＴ２５Ｃからなる反応混合物中の完全一致の２５塩基長３重鎖（試料５および９、表７）からの３重鎖関連発光は、ＹＯＹＯ−１またはｇＤＮＡのどちらが最後に反応混合物に添加されたかどうかにかかわらず同様であった。６０分目の時点までモニタリングしたとき、両方の３重鎖アッセイプロトコルで、完全一致の３重鎖関連発光は増加した（表７、図３、および４）。
【０１７１】
ＹＯＹＯ−１が最後に添加された、４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌを含有する反応混合物では、ゲノムＤＮＡおよびプローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃからなる不一致の２５塩基長３重鎖（試料６、表７）からの３重鎖関連発光は、５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分間のインキュベーション後に、完全一致の２５塩基長３重鎖（試料５、表７）を含有する同様にモニタリングされた反応混合物からの発光よりもそれぞれ７０％、８４％、９０％、９４％、９９％、９８％、１００％、１００％、１００％、１００％、および１００％低かった。ｇＤＮＡが最後に添加された、４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌを含有する反応混合物では、ゲノムＤＮＡおよびプローブ３８４９＋１０ｋｂＣ→Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃからなる不一致の２５塩基長３重鎖（試料１０、表７）からの３重鎖関連発光は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、および６０分間のインキュベーション後に、完全一致の２５塩基長３重鎖（試料９、表７）を含有する同様にモニタリングされた反応混合物からの発光に比べてそれぞれ４９％、５５％、６２％、６６％、６９％、７２％、７３％、７６％、８５％、および８８％低かった。
【０１７２】
したがって、アッセイ反応混合物と別々または組み合わせて添加された、特異的濃度のＴＭＡ−Ｃｌまたは１つもしくは複数のコスモトロピック陽イオンの添加は、完全一致の結合が起こっているならばシグナル発光に漸増を生じることがある一方で、不一致結合は、アッセイ反応混合物からのシグナル発光に漸減を生じることがある（表７、図３、および４、ならびに示していないデータ）。このように、完全一致の結合および不一致の結合の間の識別レベルの増加を経時的にモニタリングできる反応混合物を選択することができる。同様に、反応混合物から高レベル、一定レベル、または漸増するレベルの結合関連シグナルを観察するようにモニタリングを向けることもできる。それらのレベルより下では、不一致の結合シグナルは低い。結果として、シグナルを得るために様々なプロトコルまたは試薬を使用して２回の繰り返しでアッセイを実施することが有利である。そのシグナルのいくつかの特徴は試料の評点を確認する。一致または不一致の結合をひとまとめにして検出するこれらの方法を「漸増および漸減（ｗａｘｉｎｇ  ａｎｄ  ｗａｎｉｎｇ）」法と称する。発光強度における相対的増加に単に依存するだけではなく、経時的に重大な発光の変化の速度および方向も使用できる蛍光シグナルゲノムアッセイを作製することは
非常に有用である。
【０１７３】
４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌおよび５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有する反応混合物中でゲノムＤＮＡ２ｎｇを２５塩基長デルタＦ５０８−ＷＴ２５Ｃプローブまたは２５塩基長デルタＦ５０８−ＭＵＴ２５Ｃプローブのいずれかと反応させ、ＹＯＹＯ−１またはｇＤＮＡのいずれかを最後に反応混合物に添加したとき、完全一致の３重鎖関連発光および不一致の３重鎖関連発光の漸増および漸減が、６０分間のインキュベーション時間にわたり観察された（データ非図示）。この場合、３重鎖関連発光は反応混合物の２４時間のインキュベーション後にもモニタリングされた。漸増および漸減発光パターンは、２４時間のインキュベーション後に明らかであった（データ非図示）。
【０１７４】
５０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有する反応混合物中でゲノムＤＮＡ２ｎｇを２５塩基長ＦＶＬ−ＷＴ２５Ｃプローブまたは２５塩基長ＦＶＬ−ＭＵＴ２５Ｃプローブのいずれかと反応させ、ＹＯＹＯ−１またはｇＤＮＡのいずれかを反応混合物に最後に添加した場合、反応混合物を２４時間かけてモニタリングしたときに漸増および漸減発光パターンが観察された（データ非図示）。
【０１７５】
多数のコスモトロピック陽イオンが、ゲノムアッセイの特異性を向上するために、および３重鎖関連発光の漸増および漸減も高めるために、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１と共に使用された。これらには、５０から８０ｍＭのＮａＣｌ、１０から６０ｍＭのＮａ2ＳＯ4、５０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１２５から２５０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、３０ｍＭのＴｒｉ
ＭＡ−Ｃｌ、それぞれ別々に添加された３０から５２．５ｍＭのＴＭＡ−Ｃｌ、または１０から２０ｍＭのＮａＣｌと組み合わせた５０ｍＭのＴＭＡ−Ｃｌが挙げられる。反応混合物中に１つまたは複数のコスモトロピック陽イオンを使用する有益性および任意の選択されたアッセイ条件で使用する最良の濃度を、実験的に決定することができる。
【０１７６】
したがって、計算された２つ以上のプロトコルに従って集めた２つ以上の反応混合物中にインジェネウス３重鎖を形成させて、経時的にモニタリングされる３重鎖関連発光を生み出すことによって、ゲノムアッセイを行うことができるのは明白であり、その発光は多数の発光特性を観察して評価することを可能にし、より正確にアッセイを行うことができる。
【実施例７】
【０１７７】
本実施例は、ＹＯＹＯ−１および過剰のヒトゲノムｄｓＤＮＡの存在下で２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブと反応させた病原体ゲノムｄｓＤＮＡ標的に対してインジェネウス３重鎖を特異的に形成する能力を実証している。
【０１７８】
Bacillus globigii（ＢＧ）栄養細胞懸濁液は、ダイコールテクノロジーズ社（Ｄｙｃ
ｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）（カナダ国アルバータ州エドモントン（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ）所在）によって供給された。５０００×ｇ（７５００ｒｐｍ）で５分間遠心分離することによってＢＧ１ｍｌをペレットにし、細菌細胞放出剤（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ）（ニーホライゾンズ（Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ）、米国メリーランド州コロンバス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）所在）２０μｌに再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。次に、溶解した細菌を緩衝液ＡＬ（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｍｉｎｉ精製キット（キアゲン、カナダ国ミシソーガ所在）に供給されている）１６０μｌに再懸濁し、２０μｌのプロテイナーゼＫと共に５６℃で３０分間インキュベートした。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ精製キットを製造業者の説明書通りに使用して、ＢＧゲノムｄｓＤＮＡの単離を完了した。ＢＧゲノムｄｓＤＮＡの濃度をＵＶ分光法により決定した。ヒト血液試料からヒトゲノムｄｓＤＮＡを抽出し、実施例３に記載されたように定量した。
【０１７９】
Ｂ．globigii由来ＢｇｌＩ制限エンドヌクレアーゼ（ｂｇｌＩＲ）遺伝子または胞子形成特異的ＳＡＳＰタンパク質（ｃｓｇＡ）遺伝子のセンス鎖の２５ヌクレオチドセグメントに相補的な配列を有するアンチセンス２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブを、ＤＮＡ合成装置で合成し、カートリッジ精製し、濃度１ｐｍｏｌｅ／μｌでｄｄＨ2Ｏに溶解した。
【０１８０】
プローブｂｇｌＩＲ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号３２）は、５’−ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  Ｔ−３’であった。
プローブｃｓｇＡ−ＷＴ２５Ｃの配列（配列番号３３）は、５’−ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  Ｔ−３’であった。
【０１８１】
反応混合物（８０μｌ）はＢＧゲノムｄｓＤＮＡ０．４６ｐｇ（１００コピー）、２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブ３２ｐｍｏｌｅ、０．５×ＴＢＥ、４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌ、５００から３００ｎＭのＹＯＹＯ−１、およびヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的２ｎｇ（約３０２コピー）の存在または不在のいずれかを含有した。全ての場合で、反応混合物にＹＯＹＯ−１を最後に添加し、それを５分間インキュベートして照射した。実施例１に記載されたように、５、１５、２５、３５、４５、５５、および６５分間のインキュベーション後に３２％ＰＭＴの設定でＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ１５ｍＷアルゴンイオンレーザを用いて反応混合物の蛍光発光をモニタリングした。
【０１８２】
４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌの存在下で、ｂｇｌＩＲ−ＷＴ２５ＣおよびｃｓｇＡ−ＷＴ２５ＣのｓｓＤＮＡプローブ対照の両方についての蛍光発光レベルは、反応混合物中のＹＯＹＯ−１濃度が増加すると共に増加した（表８および示していないデータ）。これは、種々のＹＯＹＯ−１濃度でのプローブの自己ハイブリダイゼーションレベルを示している。各プローブ対照の蛍光発光レベルは６５分間のインキュベーション時間を通して一定のままであった。予想通り、ヒトゲノムＤＮＡ対照の蛍光発光レベルは、ＹＯＹＯ−１濃度が減少するのに伴いわずかに減少し、６５分のインキュベーション時間を通して比較的一定のままであった（表８）。ＰＭＴ設定３２％（表８）または３４％（データ非図示）でモニタリングされたＢＧのゲノムＤＮＡ対照について蛍光シグナルは観察されなかった。これは、非常に低コピー数のＢＧのｇＤＮＡがアッセイされたことを反映している。３６％ＰＭＴ設定で、ＢＧのｇＤＮＡ対照は、アッセイされた各ＹＯＹＯ−１濃度でＹＯＹＯ−１対照の発光値をわずかに超える蛍光発光値を与えた（データ非図示）。反応混合物からの蛍光発光値を基準化して、適切なプローブ対照発光値を引くことによって３重鎖関連シグナルを同定した。それら両方を経時的にモニタリングした。
【０１８３】
ＢＧゲノムｄｓＤＮＡ１００コピーおよびプローブｇｂｌＩＲ−ＷＴ２５Ｃからなる完全一致のヘテロポリマー性２５塩基長３重鎖は、５００、４００、または３００ｎＭのＹＯＹＯ−１の存在下で５分間のインキュベーション後に形成した（それぞれ表８の試料５、１０、１５）。完全一致の反応混合物シグナル発光レベルは、標的ＢＧゲノムｄｓＤＮＡ対照またはプローブ対照の蛍光シグナルを合計したものに比べて全て有意に大きかった。１００コピーのＢＧゲノムＤＮＡを含有する反応混合物中のＹＯＹＯ−１濃度が５００ｎＭから３００ｎＭに減少したときに、３重鎖形成の効率が向上した。反応混合物中に３００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１が存在したとき、最初の３５分間のインキュベーションを通して完全一致の２５塩基長３重鎖蛍光発光（試料１５、表８）が漸増し、その後、蛍光発光のプラトーが観察された。２００コピーのＢＧゲノムＤＮＡがｂｇｌＩＲ−ＷＴ２Ｃプローブを用いてアッセイされたときにも、５分間のインキュベーション後に５００〜３００ｎＭのＹＯＹＯ−１の存在下で効率的な３重鎖形成が観察され、反応混合物８０μｌ中で４００ｎＭおよび５００ｎＭが好ましいＹＯＹＯ−１濃度であった（データ非図示）。８０μｌあたり１０００コピーから３０コピーの濃度範囲のＢＧゲノムＤＮＡも、ｃｓｇＡ−ＷＴ２５Ｃプローブを用いてうまくアッセイされた（データ非図示）。反応体積８０μｌ
中わずか１０コピーのＢＧゲノムＤＮＡが、３００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下でｂｇｌＩＲ−ＷＴＣプローブを用いて再現的にアッセイされ、これは病原体を検出するためのインジェネウス３重鎖アッセイの顕著な感度を明らかに実証している（データ非図示）。
【０１８４】
なおさらに注目すべきであるのは、インジェネウス３重鎖が莫大なヒトゲノムＤＮＡバックグラウンドの中の細菌ゲノムＤＮＡ１００コピーを特異的にアッセイできることである。ＢＧゲノムｄｓＤＮＡ１００コピーおよびプローブｇｂｌＩＲ−ＷＴ２５Ｃの間で形成された完全一致のヘテロポリマー３重鎖は、３００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１、４０ｍＭ  ＴＭＡ−Ｃｌ、および３０２コピーのヒトゲノムＤＮＡの存在下で５分間のインキュベーション中に形成された（表８の試料１７）。さらに、６５分間のインキュベーションを通してＢＧ３重鎖蛍光発光が漸増した。表８に示された反応混合物の蛍光発光も２４時間のインキュベーション後にモニタリングされた。バックグラウンドヒトゲノムＤＮＡの不在下で観察されたＢＧ３重鎖関連蛍光は２４時間のインキュベーション後にわずかに減少したが、過剰なヒトゲノムＤＮＡの存在下で観察されたＢＧ３重鎖関連蛍光は、２４時間のインキュベーションを通して増加を続けた。存在するヒトゲノムＤＮＡの各コピーについて０．３３コピーの細菌ゲノムＤＮＡを均一にアッセイできることは、わずか５分で病原体を検出するためのインジェネウス３重鎖アッセイの顕著な感度を実証している。
【実施例８】
【０１８５】
本実施例は、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔ突然変異について野生型ホモ接合性、突然変異ヘテロ接合性、または突然変異ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ試料をアッセイする能力を実証している。
【０１８６】
ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔに関して野生型ホモ接合性、突然変異ヘテロ接合性、または突然変異ホモ接合性のいずれかであったヒトゲノムｄｓＤＮＡを、患者の血液試料から抽出し、実施例３に記載されたように定量した。ヒトＭＴＨＦＲ遺伝子エキソン４由来配列を有するアンチセンス２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブを、実施例３に記載されたように調製した。
【０１８７】
反応混合物（８０μｌ）は、１ｎｇまたは２ｎｇのヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的（それぞれ約１５１コピーまたは３０２コピー）、３．２ｐｍｏｌｅの野生型もしくは突然変異いずれかの２５塩基長ｓｓＤＮＡプローブ、０．５×ＴＢＥ、および５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１を含有した。実施例１に記載されたように５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、３０％ＰＭＴに設定したＧｅｎｅｘｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒの１５ｍＷアルゴンイオンレーザで反応混合物の蛍光発光をモニタリングした。
【０１８８】
ＹＯＹＯ−１の存在下で各プローブ配列の特徴である自己ハイブリダイゼーションレベルの差が原因で、野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃ対照（配列番号２２）および突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃ（配列番号２３）対照について異なる蛍光発光レベルが観察された（データ非図示）。反応混合物からの蛍光発光値を基準化して、関連する反応混合物発光から適切なプローブ対照発光を引くことによって３重鎖関連シグナルを同定した。それら両方を同じインキュベーション時間の後に測定した。
【０１８９】
野生型ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡおよび野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃ、または突然変異ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡおよび突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃのいずれかからなる、反応混合物中の完全一致のヘテロポリマー性ＤＮＡ３重鎖は効率的に形成し、５００ｎＭ  ＹＯＹＯ−１の存在下でちょうど５分間のインキュベーション後に検出された（それぞれ図５の試料１および４）。３重鎖関連蛍光の出現によってシグナルを発生した、一致した３重鎖の形成効率は、突然変異ホモ接合性ゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇおよび突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃ  １ｎｇからなる反
応混合物（試料４、図５）中で、野生型ホモ接合性ゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇおよび野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃからなる反応混合物（試料１、図５）の効率に比べて、５分間のインキュベーション後にわずかに大きかった。一致した３重鎖（試料４、図５）の３重鎖関連蛍光発光は、モニタリングされた６０分間のインキュベーション時間にわたりわずかに減少したが、一致した３重鎖（試料１、図５）の３重鎖関連蛍光発光は経時的に比較的一定のままであった。２つの完全一致の３重鎖のいずれかを含む反応混合物から観察された３重鎖関連蛍光発光強度は、１ｎｇではなく２ｎｇのゲノムｄｓＤＮＡが反応混合物中に存在した場合の方が同様であった（データ非図示）。
【０１９０】
突然変異ヘテロ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇを突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃ（試料３、図５）と反応させたとき、３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、それぞれ匹敵するインキュベーション時間後に評価された野生型ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ  １ｎｇおよび野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃ  １ｎｇからなる完全一致の３重鎖（試料１、図５）を含有する反応混合物から発光した蛍光発光に比べてそれぞれ７７％、８０％、８５％、８８％、および９０％低かった。
【０１９１】
１ｎｇ  野生型ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ  および１ｎｇ  突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃからなる、反応混合物中の１ｂｐのＣ−Ａが不一致の３重鎖（試料２、図５）からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、それぞれ匹敵するインキュベーション時間後に評価された１ｎｇ
野生型ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ  および１ｎｇ  野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃからなる完全一致の３重鎖（試料１、図５）を含有する反応混合物から発光した蛍光発光に比べて、それぞれ９２％、９５％、９８％、９８％、および９８％低かった。１ｎｇ  突然変異ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡおよび１ｎｇ  野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃからなる、反応混合物中の１ｂｐのＣ−Ａが不一致の３重鎖（試料５、図５）からの３重鎖関連蛍光発光は、５、１５、３０、４５、および６０分間のインキュベーション後に、それぞれ匹敵するインキュベーション時間後に評価された、１ｎｇ  突然変異ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡおよび１ｎｇ  突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃからなる完全一致の３重鎖（試料４、図５）を含有する反応混合物から発光した蛍光発光に比べて全て１００％低かった。
【０１９２】
上記結果は、野生型ホモ接合性、突然変異ヘテロ接合性、または突然変異ホモ接合性ヒトゲノムｄｓＤＮＡ試料をアッセイする方法の高い効率および特異性を実証している。これらの結果は、ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔについての野生型および突然変異のアンチセンス２５塩基長プローブを用いて得られた。ＭＴＨＦＲ  Ｃ６７７Ｔについての野生型および突然変異のセンス２５塩基長プローブを用いて類似の反応を行ったときに、匹敵する結果が観察された（データ非図示）。重量２ｎｇから２００ｐｇの範囲でヒトゲノムｄｓＤＮＡ標的が終反応体積８０μｌで野生型プローブＣ６７７Ｔ−ＷＴ２５Ｃおよび突然変異プローブＣ６７７Ｔ−ＭＵＴ２５Ｃを用いてうまくアッセイされたとき、本アッセイの感度もさらに実証された（データ非図示）。
【０１９３】
本発明を詳細に特定の実施例を参照して記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに本発明に様々な変更および修飾を加えることができることは当業者に明らかであろう。
【０１９４】
【表１】
2008514197.tif 000003
【０１９５】
【表２】
2008514197.tif 000004
【０１９６】
2008514197.tif 000005
【０１９７】
【表３】
2008514197.tif 000006
【０１９８】
2008514197.tif 000007
【０１９９】
【表４】
2008514197.tif 000008
【０２００】
2008514197.tif 000009
【０２０１】
2008514197.tif 000010
【０２０２】
【表５】
2008514197.tif 000011
【０２０３】
【表６】
2008514197.tif 000012
【０２０４】
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【０２０５】
【表７】
2008514197.tif 000014
【０２０６】
2008514197.tif 000015
【０２０７】
【表８】
2008514197.tif 000016
【０２０８】
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【０２０９】
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【０２１０】
2008514197.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】経時的な蛍光強度の漸増および／または漸減を示している、インキュベーション時間に対する蛍光強度のグラフ。
【図２】経時的な蛍光強度の漸増および／または漸減を示している、インキュベーション時間に対する蛍光強度のグラフ。
【図３】経時的な蛍光強度の漸増および／または漸減を示している、インキュベーション時間に対する蛍光強度のグラフ。
【図４】経時的な蛍光強度の漸増および／または漸減を示している、インキュベーション時間に対する蛍光強度のグラフ。
【図５】経時的な蛍光強度の漸増および／または漸減を示している、インキュベーション時間に対する蛍光強度のグラフ。
【図１】
2008514197.tif 000020
【図２】
2008514197.tif 000021
【図３】
2008514197.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2008514197000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月25日(2007.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008514197000001.app
【国際調査報告】
2008514197.tif 000031
2008514197.tif 000032
2008514197.tif 000033