(57)【要約】副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のアミノ酸残基２−１２、１−１２、２−１５および１−１５に対応するペプチド抗原、そのようなペプチド抗原に対する親和性を有する抗体、およびそのような抗体を作製する方法。本発明による抗原、抗体および抗体の作製方法は、血清、血漿、および／または細胞培地中の生理活性インタクトＰＴＨのレベルの決定に有用である。そのような抗体はさらに、高度に種交差反応性であるが、全体でないＰＴＨペプチド断片に対しては実質的に低減された交差反応性を有し、ＰＴＨの最初のアミノ酸残基の認識部位に対してほとんど反応性を有しない。
2008521824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中のインタクトなＰＴＨ（１−８４）レベルの決定に有用なＰＴＨ（１−８４）のＮ末端部分に対する抗体の作製方法であって、
ａ）ホスト動物において第１のペプチド抗原に対する抗体産生を誘導すべく、ホスト動物へ第１のペプチド抗原を投与する工程と、前記第１のペプチド抗原は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、（１−３４）ＰＴＨおよび（１−８４）ＰＴＨから成るグループから選択されることと、
ｂ）前記ホスト動物への前記少なくとも１つのペプチド抗原の投与により産生された抗体の力価をモニタする工程と、
ｃ）前記少なくとも１つのペプチド抗原の前記投与により前記ホスト動物で産生された血清を抽出する工程と、
ｄ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６から成るグループから選択された第２のペプチド抗原を用いてアフィニティクロマトグラフィにより工程ｃ）で抽出された前記血清から少なくとも１つの抗体を分離および選択する工程と、
ｅ）前記少なくとも１つの抗体が（４−３４）ＰＴＨ、（５−３４）ＰＴＨ、（４−８４）ＰＴＨ、および（５−８４）ＰＴＨから成るグループから選択されたペプチド抗原に対して特異的である程度まで、工程ｄ）で分離された前記少なくとも１つの抗体を除去する工程と、および
ｆ）前記抗体が（４−３４）ＰＴＨ、（５−３４）ＰＴＨ、（４−８４）ＰＴＨ、および（５−８４）ＰＴＨから成るグループから選択された前記抗原に対して特異的でない程度まで工程ｄ）および工程ｅ）で前記抗体を分離する工程と、を含む方法。
【請求項２】
工程ａ）で前記ホスト動物はマウスおよびウサギから成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）で前記ホスト動物は少なくとも１頭のヤギを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）で前記（１−３４）ＰＴＨはヒト、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、およびサルから成るグループから選択された種に由来するものである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）で前記第１のペプチド抗原にはキャリアタンパク質が結合されている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）で前記（１−８４）ＰＴＨはヒト、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、およびサルから成るグループから選択された種に由来するものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の方法により産生された抗体。
【請求項８】
請求項７の抗体を利用した、生理活性（１−８４）ＰＴＨを検出するためのテストキット。
【請求項９】
検出可能な部分をさらに有する請求項７に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生理活性インタクト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４に対する選択的結合特異性を有する抗体および同抗体を作製するためのペプチド抗原に関する。
【背景技術】
【０００２】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および血中カルシウムイオン濃度の調節におけるその重要はよく知られている。これに関し、このホルモンは上皮小体により生産され、他の因子と組み合わされて、血中カルシウムイオンレベルが細胞内と周囲の流体内との両方で安定した濃度に維持されるように血中カルシウムイオンレベルを調節するように機能する。本質的に、血清カルシウムレベルが減少すると、ＰＴＨは身体に貯蔵されたカルシウムを放出するように機能する。他方、そのような分泌は血清カルシウム濃度が増加する程度に抑えられる。
【０００３】
ＰＴＨは、その完全型の場合、８４個のアミノ酸で構成された固有のペプチドを有する。ＰＴＨの特定のシーケンス、複数の種（すなわちヒト、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、およびサル）に対して規定されているＰＴＨの特異的配列は図１に示されており、その変異型が図２であり、このような同定された種の間でＰＴＨホルモンが比較的一貫した構造を有することが示されている。
【０００４】
ヒトだけでなく様々な種のカルシウム代謝におけるその重要性を考慮すると、ＰＴＨの正確な測定はこれまでも現在も臨床上非常に重要である。血清ＰＴＨレベルが特に高カルシウム血症、原発性上皮小体機能亢進症および骨粗鬆症等の疾病を有する患者のための重要なパラメータとして機能することが文書により実証されている。ＰＴＨは同様に、ＰＴＨ異常のために腎臓骨ジストロフィーをきたし得る慢性腎不全患者においても臨床上非常に重要である。
【０００５】
代謝および臨床上の重要性におけるその重要な役割にもかかわらず、循環中の生理活性ＰＴＨレベルの決定には本質的な困難さがこれまでも今も存在し続けている。第一に、ＰＴＨは非常に低レベル（通常１０ｐｇ／ｍｌから６５ｐｇ／ｍｌの間）で通常存在することはよく知られている。さらに、ＰＴＨペプチドが様々な循環するＰＴＨ断片の形で存在し得ることがよく知られている。特に、クロマトグラフィで（７−８４）ＰＴＨ分子と共に移動するように見える大きな非（１−８４）循環ＰＴＨ断片は、従来のＰＴＨ測定法（アッセイ）に著しく干渉することが知られている、実際、この大きな非ＰＴＨ（１−８４）断片は多数の現在の測定法により測定されるＰＴＨの約半分（１／２）を表わし得る。ＰＴＨの正確な測定に関する現在の欠点は、特許文献１や非特許文献１に記載されており、これらの教示は引用により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
上記の欠点に対応するために、ＰＴＨレベルを検出するための新しい測定法がカリフォルニア州サンティ市（Santee）のスキャンチボディ研究所（Scantibodies Laboratory）
で導入された。この測定法は、ヒトＰＴＨのＮ末端の最端の部分、詳細にはヒトＰＴＨのＮ末端の最初の６個のアミノ酸残基に対する結合特異性を有するトレーサー抗体を組込んでいる。ここで理解されるように、そのような測定法は大きな非（１−８４）ＰＴＨ断片との交差反応性を最小限にするように見えるが、そのような抗体を得るには抗体の作製に大きな努力と費用が要求される。さらに、そのようなトレーサー抗体は、ＰＴＨの最初すなわち１番目のアミノ酸残基だけに対して最大の認識部位を有するのであって、後続の残基に対する特異性が大きく減少され、１番目のアミノ酸が異なる他のいくつかの種に対す
る使用が排除される。この欠点は非特許文献２に記載されており、この教示は引用により本明細書に組み込まれる。
【特許文献１】特許協力条約国際出願出願番号ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／００８５５、公開番号ＷＯ／００／４２４３７、発明の名称「Methods for Differentiating and Monitoring Parathyroid and Bone Status Related Diseases, and Lepage, Raymond」
【非特許文献１】A Non-(l-84) Circulating Parathyroid Hormone (PTH) Fragment Interferes With Intact PTH Commercial Assay Measurement In Uremic Samples, Clinical Chemistry 44:4, 1998 pages 805-809
【非特許文献２】John, M.R.et al., A Novel Immunoradiometric Assay Detects Full-Length Human PTH but not Amino-Terminally Truncated Fragments: Implications for PTH Measurements in Renal Failure, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol. 84, No. 11, 1999, p. 4287-4290
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＰＴＨペプチド断片に対する交差反応性を低減させてＰＴＨレベルを決定することが可能な、生理活性のあるインタクトＰＴＨに対して特異的な測定法結合パートナーおよび同パートナーを生成する方法が当該技術分野においてこれまでも現在も長い間必要とされている。同様に、よりコスト効率の良い方法でＰＴＨレベルを測定することができ、免疫測定キットおよびその等価物に容易に組み入れ可能なＰＴＨに対するより大きな親和性を有する改良された結合ＰＴＨ結合パートナーが当該技術分野において必要とされている。さらには、ＰＴＨに対して特異的で、広範な種に対するＰＴＨレベルの検出に利用することができる結合認識部位を有する結合パートナーすなわち抗体が必要とされている。最後に、最小減の精製しか必要とせずに従来の機構を使用して容易に得られ、その結果インタクトなＰＴＨに対する大きな結合認識があり、大きな非（１−８４）ＰＴＨ断片に対する交差反応性が最小限で、従来の結合パートナーよりも大きな抗体収率を得る方法を用いて得られる、ＰＴＨに対して高い結合親和性を有する改良された結合パートナーが当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は当該技術分野における上述の問題について取り組み、これを軽減する。これに関し、本発明は、特定の抗原、抗体ならびに血清、血漿または細胞培地等の試料流体中の生理活性インタクトＰＴＨのレベルの決定に有用な抗体を作製する方法を対象とする。本発明の抗体および方法は、ＰＴＨに対する親和性がより大きいという特定の利点を有し、詳細には１番目のＮ末端のＰＴＨ残基から延びるが好ましくはＰＴＨの４番目のアミノ酸残基を越えない最初の数個のアミノ酸残基に対する新規な認識部位を有するように設計される。最も好ましい実施形態では、抗体はＰＴＨのＮ末端の最初の３つのアミノ酸残基に対する特異性を有する。抗体はさらに、ＰＴＨの大きな非（１−８４）分子型との交差反応性も有しない。さらに、本発明による抗原、抗体および同抗体を生産する方法は、広範の種との交差反応性を有し、ヒトだけでなく、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、およびサルにおけるＰＴＨレベルをも検出するために利用可能である。
【０００９】
好ましい実施形態によれば、抗原は以下の式を有する：
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
ここでＸはＬＥＵ［配列番号１］およびＰＨＥ［配列番号２］から成るグループから選択される。この実施形態に関して、このような抗原ペプチドはＰＴＨのアミノ酸残基２−１２を表し、その６番目のアミノ酸残基はＬＥＵとＰＨＥの間で選択され、ＬＥＵはヒト、ラット、マウスおよびブタのＰＴＨに存在し、ＰＨＥはウシおよびイヌのＰＴＨに存在する。より好ましい実施形態では、抗原は以下の式を有するペプチドを含む：
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
ここでＸは上述したようにＬＥＵとＰＨＥの間で選択されたアミノ酸残基であり、ＹはＳＥＲまたはＡＬＡのいずれかから成るアミノ酸残基である［それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６］。ＳＥＲはヒト、イヌおよびブタに存在するアミノ酸を反映し、ＡＬＡはラット、マウスおよびウシのＰＴＨに存在する。
【００１０】
さらなる好ましい実施形態では、抗原は以下の式を有する：
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
ここでＸはＬＥＵ［配列番号７］またはＰＨＥ［配列番号８］から成るグループから選択される。このような抗原ペプチドはＰＴＨの２−１５のアミノ酸残基を表し、その６番目のアミノ酸残基はＬＥＵまたはＰＨＥのいずれかであり、上記に特定した適切な種で生じる対応のアミノ酸残基を反映する。別の実施形態では、抗原ペプチドはＰＴＨの１−１５のアミノ酸残基を表わし、以下の式を有する。
【００１１】
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
ここでＸはアミノ酸残基ＬＥＵまたはＰＨＥを含み、ＹはＳＥＲまたはＡＬＡのいずれかから成るアミノ酸残基である［それぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２］。Ｙは上述の特定の種に対応するよう選択される。
【００１２】
本発明による抗体および同抗体を作製する方法に関して、それらは上述の抗原に対する親和性および特異性を有する抗体を対象とする。好ましくは、抗体は、ＰＴＨのアミノ酸残基２−１２、１−１２、２−１５および１−１５にそれぞれ特異的である。最も好ましい実施形態では、抗体はＰＴＨの最初の３つのアミノ酸残基だけに特異的である。ペプチド抗原に対する抗体産生を生じさせるために、そのような抗体は、ホスト動物（好ましくはヤギを含む）に、上述の種類のペプチド抗原を単独でまたはキャリアタンパク質と組み合わせて投与し、ペプチド抗原に対する抗体を生産することにより好ましくは作製される。別の好ましい実施形態では、抗体産生は、ＰＴＨのより大きなペプチド断片の投与によって引き起こされる。好ましくは、そのようなＰＴＨ断片は（１−３４）ＰＴＨを含み、これにはインタクトな（１−８４）ＰＴＨに対する抗原性を増加させるためにキャリアタンパク質が共有結合または融合されてもよい。ヒトでＰＴＨを検出するために抗体の取得が求められる程度で、インタクトな（１−８４）ＰＴＨ分子は好ましくはインタクトなラットＰＴＨであるか、またはより少ない程度で、ヒトＰＴＨを含む。その後、ホスト動物への抗原の投与により生産された抗体の力価がモニタされる。その後、ホスト動物中で生産された抗血清が分離され、ＰＴＨの所望の抗原領域（すなわちＰＴＨのアミノ酸残基２−１２、１−１２、２−１５および１−１５のそれぞれ）に対する特異性を有するよう、抗血清中の抗体がアフィニティクロマトグラフィにより選択される。追加の工程で、分離された抗体をさらに精製し、（４−３４）ＰＴＨおよび（４−８４）ＰＴＨの少なくとも一方、または（５−３４）ＰＴＨおよび（５−８４）ＰＴＨの少なくとも一方に対応する、望ましくない抗体を保持するが（１−３）または（１−４）ＰＴＨに特異的な抗体の通過は許容する結合抗原を用いることにより、４番目または５番目のＮ末端ＰＴＨアミノ酸残基を超えて延びるアミノ酸残基に対する親和性を有する抗体を除去する。その後抗体は、標識を付けてもよいし、ヒト対象であれ、任意の様々な種対象であれ、ＰＴＨの検出に使用される様々な従来の測定法に組み入れてもよい。
【００１３】
当業者には容易に理解されるように、本発明の抗原、抗体および方法は、ＰＴＨのアミノ酸残基２−１２、１−１２、２−１５および１−１５のそれぞれに注目することにより、Ｎ末端の生理活性を有するＰＴＨ分子の同部分に焦点を当て、したがって同ＰＴＨ分子の検出を最大にする。さらに、より好ましい実施形態では、抗原、抗体、およびＮ末端の生理活性部位を越えて延びる他のアミノ酸残基（すなわちＰＴＨの１２番目および１５番目のアミノ酸残基以下）を包含する同抗体の作製方法を提供することにより、そのような抗体の特異性および親和性が大いに改善され、測定法よびその等価物に組み入れられた時
に、抗体による先行技術の受容体より大きな特異性および親和性でのＰＴＨレベルの検出が可能となる。最も好ましい実施形態では、抗体は、上述したように除去または「スクラブ」工程により達成されるＰＴＨの最初の３つのアミノ酸残基以下に対する特異性を有し、それにより本発明の抗原の使用により生産された抗体は、そのような抗体がすべて（４−３４）ＰＴＨまたは（４−８４）ＰＴＨに対する親和性を有する程度に選択的に除去される。結果として、本発明により生産された抗体は、（その目的の達成のために本明細書に開示された方法およびペプチド抗原と同様に）、より大きな非（１−８４）ＰＴＨペプチド断片に対する実質的な交差反応性がなく、ＰＴＨの１番目のアミノ酸残基のみに対する最大の認識部位を有さず、本発明の方法から生成される抗体の収率が先行技術方法より大きい範囲で、コスト効率の良い方法で容易に得られる。
【００１４】
代わりに、そのような除去または「スクラブ」工程は、（５−３４）ＰＴＨまたは（５−８４）ＰＴＨに対する親和性を有する抗体を選択的に除去するために利用される。そうすることによって、分離された抗体は最終的には、Ｎ末端ＰＴＨの最初の４つのアミノ酸残基以下に対する親和性を有する。したがって、本発明の目的は、１）抗体の生産および分離のための選択抗原；２）抗体；および３）大きな非（１−８４）ＰＴＨペプチド断片に対して低減された交差反応性を有するＰＴＨに対する結合親和性および特異性を有する抗体を生産する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、１）抗体の生産のための選択抗原；２）抗体；および３）本発明の抗原、抗体、および抗体の作製方法が様々な種におけるＰＴＨの検出に容易に利用できるよう先行技術の結合パートナーよりもＰＴＨに対して大きな親和性および特異性を有すると共に、種間ＰＴＨで高い交差反応性を有する抗体を生産する方法を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、１）抗体の生産および分離のための選択抗原；２）抗体；および３）ＰＴＨの生理活性のあるＮ末端の部分のより多くの部分に対する結合親和性および特異性を有し、従って対象の先行技術の結合パートナーよりも有効かつ正確にインタクトＰＴＨレベルを決定する同抗体の作製方法を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、１）抗体の生産および分離のための選択抗原；２）抗体；および３）ＰＴＨの１番目のＮ末端アミノ酸配列のみに対しては最大の結合親和性および特異性を有しない抗体を作製する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、１）抗体の生産および分離のための選択抗原；２）抗体；および３）ＰＴＨのＮ末端に対する結合親和性および特異性を有する抗体を作製する従来の方法よりも安価に高収率の抗体が生成される抗体の作製方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、１）抗体の生産および分離のための選択抗原；２）抗体；および３）様々な市販の測定法に容易に組み込み可能な上、様々な免疫測定法の用途に望ましいように修正（例えば標識等）できる抗体を容易に取得する抗体の作製方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の上記および他の特徴は、図面を参照すればより明白になる。
以下に述べる詳細な説明は、本発明の現時点で好ましい実施形態の説明として意図されるものであって、本発明が構成または利用され得る唯一の形式を表わすことは意図されない。以下の説明では本発明の構成および実施のための機能および工程の順序を述べるが、異なる実施形態によっても同じ機能および順序は達成され得るのであって、そのような異なる実施形態も本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００２１】
本発明は、抗原、抗体、およびＰＴＨのＮ末端領域に位置するＰＴＨの抗原領域、より正確には図１−３に１０として描かれたＮ末端から延びる最初の１５個のアミノ酸残基に向けられた抗体を作製する方法を包含する。最も好ましい実施形態では、抗体はＰＴＨの最初の３個のアミノ酸残基のみに特異的である。周知のように、ＰＴＨのＮ末端領域はＰＴＨ／ＰＴＨｒｐ受容体結合に必要であると認識されており、血清、血漿または細胞培地のような生物流体試料に見出され得る生理活性インタクトＰＴＨのレベルを測定するための最も望ましいエピトープであるものとして認識されている。ＰＴＨに関連する現状の技術水準およびＰＴＨの生産方法は、特許文献１や非特許文献１に記載されており、これらの教示は引用により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の抗原ペプチドは図１−３では包括的に１２として識別されるＰＴＨのアミノ酸残基２−１２に対応するアミノ酸残基を有する。詳細には、同抗原ペプチドは以下の式を有する：
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
ここでＸはＬＥＵ［配列番号１］またはＰＨＥ［配列番号２］から選択される。当業者には理解されるように、このＰＴＨペプチド抗原の６番目のアミノ酸残基は列挙されている種間で異なり、そのためヒト、ラット、マウスおよびブタではＬＥＵを有し、ウシおよびイヌではＰＨＥを有する。当業者には理解されるように、一つのアミノ酸残基の違いにも拘わらず、同抗原ペプチドは列挙された種間で変わらず、以下により詳細に論じるように、交差反応性で様々なそのような種でのＰＴＨレベルの検出に有効な抗体を調製および究極的には利用することが可能である。
【００２３】
より好ましい実施形態では、ペプチド抗原は１４として識別されるＰＴＨの最初の１２個のアミノ酸残基を反映し、以下の式を有する：
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY
ここでＸはＬＥＵまたはＰＨＥから選択されたアミノ酸残基であり、ＹはＳＥＲまたはＡＬＡからアミノ酸残基である［それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６］。１番目のアミノ酸残基のバリエーション（変異）に関して、かかるアミノ酸はヒト、イヌおよびブタに見出されるＳＥＲであるか、ラット、マウスおよびウシに見出されるＡＬＡである。これについて、本発明で、詳細には本発明のより好ましい実施形態で抗原ペプチドに与えられるバリエーションは、そのようなペプチド抗原から最終的に得られる抗体が所与の種でのＰＴＨの検出に望ましい高い結合親和性を有するような余地を与える。
【００２４】
本発明のより高度に洗練された実施形態では、抗原ペプチドはＰＴＨのアミノ酸残基２−１５および１−１５のそれぞれに対応する配列を有する。前者に関しては図１−３に１６として識別され、そのような抗原ペプチドは以下の式を有する：
VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
ＸはＬＥＵ［配列番号７］またはＰＨＥ［配列番号８］から選択される。１０として識別されるＰＴＨのアミノ酸残基１−１５に対応する後者に関して、そのような抗原ペプチドは以下の式を有する：
Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU
ここでＸはアミノ酸残基ＬＥＵまたはＰＨＥから選択されるアミノ酸残基であり、ＹはＳＥＲまたはＡＬＡから選択されるアミノ酸残基である［それぞれ配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２］。米国施行規則１．８２１−１．８２５の要件を満たすコンピュータ読取り可能な形式の配列番号１−１２（本明細書で提供された記述した配列リストと同一である）を提供するコンパクトディスクを、法定の要件を遵守するために提出した。
【００２５】
上述のペプチドの上述の式にもかかわらず、それらは同ペプチドのすべての機能的誘導体にも及ぶ。機能的誘導体とは、図１−３の配列に反映されるＰＴＨの同じ部分から得られ、特異的抗ＰＴＨ抗体、詳細にはＰＴＨのＮ末端アミノ酸残基に特異的な抗体を得る同様の能力を有する機能的に匹敵するペプチドを含む。これに関し、そのような機能的誘導体は、上に論じられると共に図１−３に反映された配列から得られ、アミノ酸の置換、付加または削除（このような誘導はＰTＨに反応性の抗原を引き起こすというペプチド抗原
の能力を変更しない）を有する同様に位置決定されたペプチドであり得る。
【００２６】
本発明のペプチド抗原は、図１−３で上述したペプチドの上流または下流の数個のアミノ酸がシフトされ得るペプチドや、アミノ酸の置換、付加または除去もしくは変更がＰＴＨの最初の１２個のアミノ酸残基またはその任意の下位配列に対する高い親和性および特異性を備えた抗体を引き起こすというペプチド抗原の能力を著しく達成しないような保存されたアミノ酸変化を有するペプチドを含むこともさらに認識されるべきである。
【００２７】
抗体産生に関して、図４に抗体を生成する方法（２０）が示される。最初に、所与の種のＰＴＨの最初の１２個から１５個のアミノ酸残基の全部または一部に対応する前述のバリエーションであるペプチドを提供する（２２）。しかしながら、より好ましい実施形態では、抗体産生を生成するために使用される抗原ペプチドはより大きなＰＴＨ断片を含み、これには（１−３４）ＰＴＨおよび完全なインタクト（１−８４）ＰＴＨペプチドが含まれるがこれらに限定されるわけではない。この流れに沿うと、少なくとも抗原を提供する最初の工程（２２）と、続く以下に論じる工程（２４）による抗原を投与する工程とに関して、最終的に生産される抗体は、本発明の方法の前述の抗原ペプチド（すなわちＰＴＨのアミノ酸配列２−１２、１−１２、２−１５および／または１−１５）に対応するアミノ酸残基に対する特異性を有するが、完全ＰＴＨペプチドおよびそのＮ末端断片が、ＰＴＨのＮ末端のＰＴＨの生理活性部分に対して理想的な結合親和性および特異性を最終的に有する抗体の産生を引き起こすのに適切な抗原ペプチドとして好ましく役立ち得る。最も好ましい実施形態では、提供され投与される抗原ペプチドはＰＴＨのアミノ酸残基１−３４に対応するＰＴＨ断片を含み、これはキャリアタンパク質に任意選択で結合され得る。このペプチド断片は、代わりに全長（１−８４）ＰＴＨとして投与されてもよく、同ＰＴＨは図１および図２で識別される種のいずれの形式をとってもよい。好ましくは、ヒトＰＴＨに特異的な抗体の開発に関しては、（１−３４）ラットＰＴＨまたは全長（１−８４）ラットＰＴＨの使用が好まれる。
【００２８】
このような抗原ペプチドは、固相化学合成のような従来の方法や組換え技術による合成を含む当該技術分野の種々の周知の方法により作製可能である。さらに理解されるように、合成ペプチドは、任意選択でキャリアタンパク質と結合されてもよいし、代わりに抗原性を増加させる融合タンパク質として組換えペプチドが生成されてもよい。当業者にはさらに理解されるように、そのような抗原ペプチドは抗ＰＴＨ抗体を得る同ペプチドの能力に基づいてスクリーニングされ得る。そのようなスクリーニング技術には免疫沈降法または免疫測定法が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００２９】
一旦得られると、そのようなペプチド抗原は従来の技術を使用して本発明の抗体を作製するために利用可能となる。これに関し、ペプチド抗原、好ましくは免疫賦活剤（アジュバント）と組み合わされたペプチド抗原は、好ましくはヤギを含むホスト動物２４に投与される。しかしながら、ウサギ、マウス、ヒツジ、ニワトリ等の他の種がホスト動物としてさらに利用され得る。これに関し、抗原の投与は、皮下注射または筋内注射を含むがこれらに限定されない様々な方法で遂行され得る。投与されるペプチド抗原の投与量は使用される特定のペプチドおよび動物ホストに応じて変化する。しかしながら、所与の種に対して最も高い親和性および特異性を有する抗体を得るためには、各々の種に由来する適切な対応ペプチドに対する抗体が個別に生成されるべきである。
【００３０】
一旦投与されると、ホスト動物中で生じた抗体力価の結果がモニタされる（２６）が、これは慣例の採血等の当該技術分野で周知の種々の技術により行うことが可能である。（遠心分離等で）抗血清が分離されると、抗血清に対する結合親和性を有する抗ペプチド抗体の存在を調べるために工程（２８）でスクリーニングが行われる。本発明の抗体を得る上述の従来の免疫学的方法を仮定すると、そのような抗体は本来的にモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。従来の慣例と一致して、抗血清は複数のホスト動物に由来するものであることが好まれる。
【００３１】
本発明用の抗体を得るために、ホスト動物から得た抗血清はアフィニティ精製される。当該技術分野において周知のように、抗血清は、固相（例えばビーズ等）に結合されたＰＴＨのアミノ酸残基配列２−１２、１−１２、２−１５および１−１５に対応する前述の抗原ペプチドを備えた分離カラムへの導入のような、従来の技術により精製され得る。その後、抗血清は洗浄され、１または複数の抗原ペプチドに対する特異性を有しない抗体が除去され、残りの同１または複数の抗原ペプチドに対して特異的な結合抗体は最終的に分離カラムから溶出される。その後抗体は当業者に周知の慣例に従って保存され得る。
【００３２】
追加の工程（２９）で、上記のような分離および精製プロセスによって得られた抗体はさらなる精製プロセスを受け、それにより（４−３４）または（５−３４）ＰＴＨならびに／もしくは（４−８４）または（５−８４）ＰＴＨに対して親和性を有する抗血清中に存在する抗体はすべて選択的に除去または「スクラブ」される。このため、抗血清が工程（２８）で分離されると、抗血清は分離カラムまたは他の従来の技術の使用により本明細書で詳述した種のいずれかの（４−３４）または（５−３４）ＰＴＨならびに／もしくは（４−８４）または（５−８４）ＰＴＨに対して特異性を有する抗体を除去するために精製されることが想定され、そのためにアミノ酸配列（４−３４）または（５−３４）ＰＴＨもしくは（４−８４）（５−８４）ＰＴＨのいずれかに対応する抗原ペプチドが精製が求められる抗血清が晒される固相に結合される。（４−３４）または（５−３４）ＰＴＨならびに／もしくは（４−８４）または（５−８４）ＰＴＨペプチドに対する特異性を有する抗体は結合されたままとなり、（４−３４）または（５−３４）ＰＴＨもしくは（４−８４）または（５−８４）ＰＴＨペプチドのいずれに対しても特異性を有しない残りの抗体は特異性を有する抗体から区別される。有利には、そのようなプロセスは、ＰＴＨの最初の３個または４個以下のアミノ残基に対する親和性を有する抗体のみを分離するため、ＰＴＨのＮ末端の５番目のアミノ酸残基やそれを超える任意のアミノ酸残基に対する結合親和性を全く有しない。そのようなプロセスにより、最終的に分離された抗体がすべて、ＰＴＨの（１−８４）Ｎ−最端に実際に特異的で、少なくともＰＴＨの最初の３つまたは４つのＮ末端アミノ酸残基を含まない任意のタイプのＰＴＨ断片に結合しないことが保証される。
【００３３】
上記の抗体はＰＴＨのアミノ酸残基配列２−１２および２−１５のそれぞれに対応する抗原ペプチドを使用して分離されるため、従来技術の方法によって得られた抗体で問題であることがわかっているＰＴＨの１番目のアミノ酸残基に対する結合親和性を必ずしも有さず、いわんや最大結合親和性を有しない単離抗体が存在する。上記に習って、ＰＴＨの１−１２および１−１５にそれぞれ対応するペプチド配列が最終的に得られる抗体が使用される種に由来するのとは違なる１番目のアミノ酸残基を有する種から選択されるとすれば、ＰＴＨの１番目のアミノ酸残基に対する親和性を有する抗体の除去または実質的な抑制が、かかるペプチド配列の利用により同様に達成されるだろう。
【００３４】
例えば、ヒトＰＴＨの１番目のアミノ酸残基に対する特異性を欠いた、ヒトでのＰＴＨレベルを検出するのに適した抗体を得るために、ホスト動物に由来する抗ラットＰＴＨ血清がヒトＰＴＨのアミノ酸残基配列１−１２および１−１５に対応するペプチドに対して
精製される。理解されるように、ラットＰＴＨの１番目のＮ末端のアミノ酸残基はヒトで見出されるＳＥＲとは異なりＡＬＡを含むため、最終的に分離された抗体はすべて、必ずそのような１番目のアミノ酸残基配列を越えて延びるアミノ酸残基に対する結合親和性を有するだろう。
【００３５】
一旦工程（３０）で得られると、上記の抗体は、所与の試料（例えば血清または血漿）に見出されるように、生理活性インタクトＰＴＨの存在と相関させるために、免疫学的技術に使用され得る。これに関し、本発明の抗体は、大きな非（１−８４）ＰＴＨ断片との交差反応は有利に避けて生理活性インタクトＰＴＨの存在を決定すべく所与試料をスクリーニングするために、単独または組み合わせて使用され得る。例として、そのような抗体は免疫学的測定キットに組み込まれ得る。そのような用途の例には、血清、血漿または細胞培地中の生理活性インタクトＰＴＨのレベルの定量的決定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を提供するカリフォルニア州サンクレメント（San Crement）のＩ
ｍｍｕｔｏｐｉｃｓ社により作製されたヒト生理活性ＰＴＨおよびラットのインタクト名生理活性ＰＴＨのＥＬＩＳＡキットが含まれる。この点に関して、様々な種のＰＴＨに対して特異的な抗体を得るために上述の応用例が与えられれば、Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ社により提供されるような免疫学的測定は、そのような抗体の親和性および特異性を広範な種に応用するように特別に設計され得るか、または代わりにキットが所与の種向けにより狭くあつらえられるように所与の種の適当な対応ペプチドに対して作製され得る。
【００３６】
本発明のさらなる改変および改良も、当業者には明白であり得る。したがって、本明細書で説明し図示した部分の特定の組み合わせは、本発明の特定の実施形態を表わすにすぎず、本発明の精神および範囲内の代わりの装置の限定として機能するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】様々な種、すなわちヒト、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ネコ、およびサルに対するＰＴＨのアミノ酸配列と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２として本明細書で識別したアミノ酸配列とを示す。
【図２】図１の種のＰＴＨの１−８４アミノ酸配列のバリエーションを示す図１の別例。配列番号１−１２のアミノ酸配列が比較的一定であるＰＴＨの保存されたＮ末端をも示す。
【図３】ヒトＰＴＨのＮ末端部分の図。
【図４】本発明の好ましい実施形態により抗体を生産する工程を示すフローチャート。
【図１】
2008521824.tif 000003
【図２】
2008521824.tif 000004
【図３】
2008521824.tif 000005
【図４】
2008521824.tif 000006
【配列表】
2008521824000001.app
【国際調査報告】
2008521824.tif 000007