(57)【要約】複雑な混合物中における植物材料を検出する及び同定するための、普遍的プライマー及びその使用。本発明は、植物種を検出する及び同定するための、植物材料の葉緑体遺伝子ｔｒｎＬのイントロンの可変領域に近接するポリヌクレオチドおよびプライマーに関する。また、本発明は、複合体又は劣化した混合物中の植物種を検出する及び同定するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３で表されるタバコのｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは配列番号６８の配列にハイブリダイズすることと、第２オリゴヌクレオチドは配列番号６９の配列にハイブリダイズすることとを特徴とするペアのオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２４〜６７で表される植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは配列番号６８の配列にハイブリダイズすることと、第２オリゴヌクレオチドは配列番号６９の配列にハイブリダイズすることとを特徴とするペアのオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペアのオリゴヌクレオチドであって、ハイブリダイゼーションが、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含んでいる増幅緩衝液において５５゜Ｃで生じることを特徴とするペアのオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のペアのオリゴヌクレオチドであって、第１オリゴヌクレオチドが配列番号１、４〜１５を含んでいる群から選択されることと、第２オリゴヌクレオチドが配列番号２、１６〜２３を含んでいる群から選択されることとを特徴とするペアのオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１、配列番号２、配列番号４〜１５、配列番号１６〜２３を含んでいる群から選択される配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項７】
固体の支持体上に固定化されたことを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のペアのオリゴヌクレオチド、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
植物の葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するための方法であって、以下の工程を備えることを特徴とする方法：
ａ）植物のゲノムＤＮＡを含んでいるサンプルを提供すること；
ｂ）葉緑体ＤＮＡの可変領域を、請求項１〜４および７の何れか１項に記載のペアのオリゴヌクレオチドで又は請求項５に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで増幅すること。
【請求項９】
請求項８に記載の植物の葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するための方法であって、工程ｂ）で、増幅された葉緑体ＤＮＡの可変領域が配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
サンプル中の植物種を検出するための方法であって、以下の工程を備えることを特徴とする方法：
ａ）植物種を含有していることが疑われるサンプルを提供すること；
ｂ）増幅反応を、請求項１〜４および７の何れか１項に記載のペアのオリゴヌクレオチドで又は請求項５に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで実施すること。
ｃ）前記サンプル中に植物種の存在を検証する増幅産物が取得されるかどうかを検出すること。
【請求項１１】
請求項１０に記載のサンプル中の植物種を検出するための方法であって、工程ｃ）で、前記増幅産物が配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
サンプル中の植物種を同定するための方法であって、以下の工程を備えることを特徴とする方法：
ａ）植物種を含有していることが疑われるサンプルを提供すること；
ｂ）増幅反応を、請求項１〜４および７の何れか１項に記載のペアのオリゴヌクレオチドで又は請求項５に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで実施すること。
ｃ）このように取得された増幅産物を分析して、前記サンプル中に含有される植物種を同定すること。
【請求項１３】
請求項１２に記載のサンプル中の植物種を同定するための方法であって、工程ｃ）で、前記増幅産物が配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のサンプル中の植物種を同定するための方法であって、工程ｃ）で、前記増幅産物の配列が前記サンプル中に含有される植物種を同定するために決定される方法。
【請求項１５】
請求項１２または１３に記載のサンプル中の植物種を同定するための方法であって、工程ｃ）で、前記増幅産物が前記サンプル中に含有される植物種を同定するために少なくとも１つの参照植物配列とハイブリダイズされる方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のサンプル中の植物種を同定するための方法であって、前記参照配列が配列番号３および２４〜６７を含んでいる群から選択される方法。
【請求項１７】
請求項１２または１３に記載のサンプル中の植物種を同定するための方法であって、工程ｃ）で、前記増幅産物が前記サンプル中に含有される植物種を同定するために電気泳動で分析される方法。
【請求項１８】
タバコの葉緑体ＤＮＡのポジション４９４２５〜４９４６６に対応する植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の、植物種を検出するため及び同定するための使用。
【請求項１９】
請求項１８に記載の使用であって、植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、特に複雑な又は劣化した基質中の植物種を検出する及び同定するための、オリゴヌクレオチドに及び普遍的なプライマーとしてのその使用に関する。
【０００２】
ゲノムの分析に基づいて植物を同定するための様々な方法が知られているが、現在のところ劣化した及び／又は複雑な基質で作用することが可能なものは存在しない。
【０００３】
遺伝的なフィンガープリント法は、完全なゲノムの分析に基づいている。これらの方法の課題は、各々の個体に特異的な遺伝的なフィンガープリントを提供することである（個々の同定であり、種の同定ではない）。しかしながら、この事項は初期の課題ではなく、それらによってある程度まで種を同定することが可能である。しかしながら、これらの方法は、ＤＮＡが良質（劣化していない）で、外来ＤＮＡ（他の生物に由来する）と混合されないで取得されることを必要とする。結果的に、劣化した又は複雑な基質中の植物を同定するために、これらのアプローチを使用することは不可能である。
【０００４】
遺伝的なフィンガープリント法を例示することによって、ＡＦＬＰおよびＤＡｒＴ法に関する言及がなされる。
【０００５】
ＡＦＬＰ「増幅断片長多型（Amplified Fragment Length Polymorphism）」法は、集団遺伝学及び遺伝的マッピングの双方において、現在非常に広く使用されている〔Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23, 4407-4414; US patent No. 6,045,994〕。この方法は、ゲノムＤＮＡの消化/ライゲーションと、引続いて電気泳動法で分析可能とするために、ゲノムを単純化する目的での特異的なＰＣＲプライマーを用いる２つの連続的な増幅とに基づいている。この方法は、非常に良質で、十分な量のＤＮＡ（一般的に、数百ナノグラムのＤＮＡ）を必要とする。このアプローチを、劣化した及び複雑な基質の分析のために関連する様式で使用することは絶対的に不可能である。
【０００６】
ＤＡｒＴ「多様性アレイ技術（Diversity Array Technology）」法は、非常に類似するアプローチ（消化/ライゲーション それから増幅）に基づいているが、分析の方法（ハイブリダイゼーション）により異なっている〔Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, Kilian A (2001) Diversity arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research, 29, e25;米国特許第６,７１３,２５８号〕。このアプローチを、劣化した及び複雑な基質に使用することも不可能である。
【０００７】
他の方法は、増幅およびシークエンシングに基づいている。理論的な観点から、十分に長い(数百塩基対)相同領域のシークエンシングは、植物の種の同定を許容する潜在性を有している。係る領域は、普遍的なプライマーを増幅のために設計することを認容せしめる、非常に保存されたゾーンによって枠組み（framed）されていなければならない。核のＤＮＡは適切ではない。というのも、劣化した基質のケースにおいて、核へのアクセスは非常に困難であるか又は寧ろ不可能であるからである。しかしながら、核のＤＮＡに関して、ＩＴＳｓ〔リボソームＤＮＡ内部転写スペーサー（ribosomal DNA Internal Transcripted Spacers）〕が、植物を検出する及び同定するために使用されている。普遍的なプライマーは、真菌で発見されており、植物においても機能することが見出されている〔White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics in: PCR protocols, a guide to methods and applications (eds. Innis MA, Gelfand DH, Sninski JJ, White TJ), pp. 315-322. Academic Press, San Diego, California〕。結果として、数百塩基対の本領域が、植物での近縁種間の系統を決定するために〔Baldwin BG (1992) Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the Compositae. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1, 3-16; Gielly L, Yuan Y-M, Kupfer P, Taberlet P (1996) Phylogenetic use of noncoding regions in the genus Gentiana L.: chloroplast trnL (UAA) intron versus nuclear ribosomal internal transcribed spacer sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 6, 460-466〕、また種を同定するため〔例えば、Linder C, Moore L, Jackson R (2000) A universal molecular method for identifying underground plant parts to species. Molecular Ecology, 9, 1549-1559 or the website of the company "Bioprofiles"： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅｓ．ｃｏ．ｕｋ／を参照されたい〕に使用されてきた。しかしながら、本領域は、欠点を有する。第一に、高度に劣化した基質のケースに使用するには長すぎること；加えて、明らかに反復している核配列が関与するが、葉緑体ＤＮＡに存在するものよりも程度が低いことである。第二に、前記プライマーは、同種内の幾つかのタイプの配列を増幅することができる。最後に、前記プライマーは、現実には普遍的ではなく、特定の種で増幅を得ることは困難である可能性がある。
【０００８】
他方で、ミトコンドリアＤＮＡおよび葉緑体ＤＮＡは、各細胞中で高度に反復した様式で存在する（数百コピー）。このことは、彼等が、劣化した基質のケースにおいてより接触可能（accessible）である増幅に関する標的を呈示することを意味する。しかしながら、ミトコンドリアＤＮＡは、植物において十分に可変性ではない。
【０００９】
以上のことから、幾つかの文献は、葉緑体ＤＮＡの様々な領域を標的とする普遍的なプライマーを記載している〔Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109; Demesure B, Sodzi N, Petit RJ (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochodrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4, 129-131; Dumolin-Lapegue S, Pemonge M-H, Petit RJ (1996) An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular Ecology, 5, 393-397;および Hamilton MB (1999) Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation. Molecular Ecology, 8, 521-523〕。彼等のうちの幾つかは、葉緑体ＤＮＡの様々な領域を増幅する及びシークエンシングするために広く使用されている。彼等は、主にcおよびdプライマー〔Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109〕であり、これらはロイシンに関する転移ＲＮＡ〔コドンＵＡＡ(ｔｒｎＬ  ＵＡＡ)〕の遺伝子のイントロンを増幅する。現在、本イントロンの数千の配列が、公共のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）中で利用可能である。ｔｒｎＬ遺伝子（ＵＡＡ）のイントロンは、非常に可変性であるが、それが二次構造を構成することができるとの事実に関連した保存された部分をも有している〔Simon D, Fewer D, Friedl T, Bhattacharya D (2003) Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-Leu group I intron. Journal of Molecular Evolution, 57, 710-720〕。しかしながら、これらのｃおよびｄプライマーは、劣化した基質に使用するには長すぎる領域を増幅する。
【００１０】
特異的な同定のための別の解決法が、Ｂｏｂｏｗｓｋｉ等〔Bobowski B, Hole D, Wolf P, Bryant L (1999) Identification of roots of woody species using polymerase chain reaction (PCR) and restricted fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Molecular Ecology, 8, 485-491〕によって提案されている、即ち：普遍的なプライマーを用いたｒｂｃＬ遺伝子の増幅、および増幅産物の酵素消化と続くゲル移動（gel migration）とによる特性決定（前記産物は、直接的なシークエンシングによっても特性決定できるだろう）。
【００１１】
しかしながら、全てのこれらのプライマーは、劣化した基質に使用するためには長すぎる領域を増幅する。このことは、他のプライマーが、より短い断片を増幅するためにＰｏｉｎａｒ等〔Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Paabo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281, 402-406〕によって同定された理由であり、「化石（fossil）」残留物の分析が適合する（このケースでは、絶滅したナマケモノの糞石）。これらの著者は、葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子におけるプライマーを設計した。増幅された断片によって辛うじて、ファミリーを同定することが可能である。そして、これらのプライマーは、現実には普遍的ではない。これにもかかわらず（代替法が存在しない）Ｗｉｌｌｅｒｓｌｅｖ等〔Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, Brand TB, Gilbert MTP, Shapiro B, Bunce M, Wiuf C, Gilichinsky DA, Cooper A (2003) Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science, 300, 791-795〕は、Ｐｏｉｎａｒ等〔Poinar HN, Hofreiter M, Spaulding WG, Martin PS, Stankiewicz BA, Bland H, Evershed RP, Possnert G, Paabo S (1998) Molecular coproscopy: Dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis. Science, 281, 402-406〕のプライマーを、永久凍土（凍結土）から抽出したＤＮＡの分析に使用した。彼等の課題は、土中にいまだ存在する植物ＤＮＡを特徴づけすることであった。この場合でも、ファミリーのみを同定することができた。
【００１２】
要約すると、一時提案された何れかのシステムは、劣化した基質の分析に効果的であるためには長すぎる配列に基づいている。或いは、短い断片の可変性の程度は、植物の同定に本当に有用であるために十分ではない。十分に短く十分に可変性の領域は稀であり、これまで特性付けされたことはない。
【００１３】
従来技術の欠点を修復するために、本発明は新規のオリゴヌクレオチドと普遍的なプライマーとして植物種を検出する及び同定するためのそれらの使用とを提案する。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドによって、葉緑体ＤＮＡのｔｒｎＬ（ＵＡＡ）遺伝子のイントロンの、非常に短いが非常に可変性の領域を増幅することが可能である。
【００１５】
本発明の第一の利点は、前記オリゴヌクレオチドおよび本発明の方法によって、形質転換（熱、凍結乾燥などによって）した基質などの複雑な又は劣化した基質中の植物を検出する及び同定することが可能となるとの利点である。というのも、増幅された領域は、短く非常に可変性であるからである。
【００１６】
本発明の別の利点は、次の事項である；つまり、増幅された領域は、植物種間で非常に可変性であるのみならず、様々な植物種中の所望の領域を、普遍的なプライマーを用いて増幅することを認容せしめる、非常に保存されたフランキング領域（flanking regions）をも有するとの利点である。
【００１７】
本発明の別の利点は、次の事項である；つまり、ｔｒｎＬ（ＵＡＡ）遺伝子イントロンが稀な葉緑体配列の１つであることであり、これに関して数千の配列がデータベース〔例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）〕において利用可能であるとの利点である。従って、普遍的なプライマーを用いて増幅された可変領域の分析によって、対応している植物種をデータベース中で利用可能な配列を参照することによって同定することが可能である。
【００１８】
複雑な又は劣化した基質中の植物を同定するための方法は、大きな価値を有するものである。例えば、農産食品産業（agrofoods industry）への適用に関してであり、ここでの観点はトレーサビリティ基準への忠実性などである。つまり、食物調製物中の植物種の詳細な組成を同定するための新規な分析方法の開発が意味される。
【００１９】
［発明の記載］
本発明の第一の対象はペアのオリゴヌクレオチドであって、配列番号３で表されるタバコのｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは配列番号６８配列にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドは配列番号６９配列にハイブリダイズするペアのオリゴヌクレオチドである。
【００２０】
本発明の別の対象はペアのオリゴヌクレオチドであって、配列番号２４〜６７で表される植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは配列番号６８配列にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドは配列番号６９配列にハイブリダイズするペアのオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
典型的には、ハイブリダイゼーションは、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んでいる増幅緩衝液において５５゜Ｃで生じる。
【００２２】
本発明の好適な態様において、第１オリゴヌクレオチドは配列番号１、４〜１５を含んでいる群から選択され、第２オリゴヌクレオチドは配列番号２、１６〜２３を含んでいる群から選択される。
【００２３】
また、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４〜１５および配列番号１６〜２３を含んでいる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００２４】
また、本発明は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
本発明の有利な態様において、オリゴヌクレオチドのペア（本発明によるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）は、固体の支持体上に固定化される。
【００２６】
本発明の別の対象は、植物の葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するための方法であり、該方法は以下の工程を備える：
ａ）植物のゲノムＤＮＡを含んでいるサンプルを提供すること；
ｂ）葉緑体ＤＮＡの可変領域を、本発明によるオリゴヌクレオチドのペアで又は本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで増幅すること。
【００２７】
特定の態様において、工程ｂ）で、増幅された葉緑体ＤＮＡの可変領域は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００２８】
別の特定の態様において、本発明による植物の葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するための方法は、増幅工程ｂ）の前に、葉緑体ＤＮＡを抽出することからなる工程を備える。
【００２９】
好ましくは、葉緑体ＤＮＡの可変領域は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の手段で増幅される。
【００３０】
また、本発明は、サンプル中の植物種を検出するための方法に関し、該方法は以下の工程を備える：
ａ）植物種を含有していることが疑われるサンプルを提供すること；
ｂ）増幅反応を、本発明によるオリゴヌクレオチドのペアで又は本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで実施すること；
ｃ）前記サンプル中に植物種の存在を検証する増幅産物が取得されるかどうかを検出すること。
【００３１】
特定の態様において、増幅産物は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００３２】
別の特定の態様において、本発明によるサンプル中の植物種を検出するための方法は、増幅工程ｂ）の前に、前記ＤＮＡを抽出することからなる工程を備える。
【００３３】
好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）が実施される。
【００３４】
また、本発明は、サンプル中の植物種を同定するための方法に関し、該方法は以下の工程を備える：
ａ）植物種を含有していることが疑われるサンプルを提供すること；
ｂ）増幅反応を、本発明によるオリゴヌクレオチドのペアで又は本発明による少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで実施すること；
ｃ）このように取得された増幅産物を分析して、前記サンプル中に含有される植物種を同定すること。
【００３５】
特定の態様において、前記増幅産物は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００３６】
一態様において、工程ｃ）で、増幅産物の配列は、前記サンプル中に含有される植物種を同定するために決定される。
【００３７】
別の態様において、工程ｃ）で、増幅産物は、前記サンプル中に含有される植物種を同定するために、少なくとも１つの参照植物配列（reference plant sequence）とハイブリダイズされる。
【００３８】
好ましくは、前記参照植物配列は、配列番号３および２４〜６７を含んでいる群から選択される。
【００３９】
別の態様において、工程ｃ）で、増幅産物は、前記サンプル中に含有される植物種を同定するために電気泳動で分析される。
【００４０】
また、本発明は、タバコの葉緑体ＤＮＡのポジション４９４２５〜４９４６６に対応する植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の、植物種を検出するため及び同定するための使用に関する。
【００４１】
特定の態様において、植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域は、配列番号２４〜６７を含んでいる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドである。
【００４２】
本発明は、植物の葉緑体ＤＮＡの２つの非常に保存された領域に由来するポリヌクレオチドに関する。植物界（特に被子植物および裸子植物）を通じて非常に保存された配列を有する領域から由来する、これらのポリヌクレオチドは、植物の葉緑体ＤＮＡを増幅する又はシークエンシングするための普遍的プライマーとして使用することができる。
【００４３】
加えて、本発明のポリヌクレオチドが由来する保存された配列が、短く非常に可変性である葉緑体ＤＮＡの領域に隣接（flank）することが特に有利なこととして発見されている。従って、植物種間の本領域の可変性を、植物種を区別する（distinguishing）及び同定するために使用することができる。
【００４４】
本発明による、「ポリヌクレオチド」の用語は、単一鎖のヌクレオチド鎖又はそれに相補的な鎖、又は二重鎖のヌクレオチド鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ型であってもよい）を意味することを意図している。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡ型（特に、二重鎖のＤＮＡ）である。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」の用語は、修飾されているオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドも意味する。典型的には、修飾されたポリヌクレオチドには、修飾されたヌクレオチドが含まれえる。或いは、これらの修飾されたポリヌクレオチドは、結合試薬（例えば、ビオチン）に又は標識試薬（例えば、蛍光標識）に結合させたポリヌクレオチドである。慣習的に、ポリヌクレオチドに結合させた標識試薬に対する結合試薬によって、これらのポリヌクレオチドの精製または検出が促進される。
【００４６】
本発明による、「オリゴヌクレオチド」の用語は、短配列（short sequence）のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを意味することを意図しており、その数は１から数十の範囲であるが、一般に１００塩基未満である。従って、「ポリヌクレオチド」の用語は、オリゴヌクレオチドも意味する。
【００４７】
「プライマー（primer）」の用語は、核酸鋳型とハイブリダイズされる場合に、ポリメラーゼに新しいＤＮＡ鎖の合成を開始させることを許容させる短いオリゴヌクレオチド配列を意味することを意図している。プライマーから産生される鎖は、鋳型として使用される鎖に相補的なものである。
【００４８】
有利なことに、本発明のポリヌクレオチドは、固体の支持体上に固定化させることができる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの固定化〔特に、ＤＮＡチップの製作（fabrication）に〕に適切な固体の支持体が、知られている。ＤＮＡチップの多くのバラエティーが存在し、これらは使用される支持体の型、性質、密度および支持体上にヌクレオチド配列を付着させる又は合成する方法、及び読み取り条件（reading conditions）により異なっている。これらの技術は、当業者に知られている。「固体の支持体（solid support）」の用語は、微粒子型の支持体〔例えば、ＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）社のＦＬＥＸＭＡＰ TMおよびＱＩＡＧＥＮ（登録商標）社のＬＩＱＵＩＤＣＨＩＰ TM〕を意味することをも意図している。
【００４９】
通常は、本発明のポリヌクレオチドは、彼等の天然の環境から単離または精製されたものである。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)により記載された従来の分子生物学技術によって又は化学合成によって調製することができる。
【００５０】
「植物種（plant species）」の用語は、植物界の一部である任意の生きた生物体を意味する。
【００５１】
また、本発明は、ペアのオリゴヌクレオチドであって、植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは葉緑体ＤＮＡの第１の非常に保存された領域にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドは葉緑体ＤＮＡの第２の非常に保存された領域にハイブリダイズするペアのオリゴヌクレオチドに関する。前記第１の保存された領域の配列は、プライマーｇの配列(配列番号１)及びそれに相補的な配列(配列番号６８)に対応する。前記第２の保存された領域の配列は、プライマーｈの配列(配列番号２)及びそれに相補的な配列(配列番号６９)に対応する。
【００５２】
参照の植物種として使用することができるタバコにおいて、本発明のオリゴヌクレオチドのペアは、配列番号３で表される配列を有するタバコのｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅を許容する。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドのペアの配列は、植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の選択的な増幅に十分に厳密な条件下で、第１オリゴヌクレオチドは配列番号６８にハイブリダイズし、第２オリゴヌクレオチドは配列番号６９配列にハイブリダイズする様式で選択される。
【００５４】
当業者は、選択的な増幅のためのＤＮＡ増幅反応および厳密な条件（特に、ハイブリダイゼーション温度条件およびハイブリダイゼーション緩衝剤組成条件）を知っている。
【００５５】
従って、当業者は、日常的な技術を用いて、プライマーｇ(配列番号１)およびh(配列番号２)の異なるバリアントを容易に規定しえる。これらのバリアントは、参照配列とハイブリダイズし、所望の葉緑体ＤＮＡの可変領域の選択的な増幅を許容する。プライマーｇの特定のありうるバリアントは、配列番号４〜１５に表される。また、プライマーｈの特定のありうるバリアントは、配列番号１６〜２３に表される。通常、配列バリエーションは、増幅反応を損なわせ（compromise）ないように、オリゴヌクレオチドの５’末端に導入される。慣習的には、例えば、付加的なヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの５’末端に導入することが可能である。
【００５６】
本発明による、「ハイブリダイズ」の用語は、バックグラウンドノイズよりも有意に大きなレベルで参照配列とハイブリダイズする配列を意味することを意図している。選択的にハイブリダイズする能力のある配列と参照配列との間の相互作用によって産生されるシグナルのレベルは、バックグラウンドノイズを生じる他のＤＮＡ配列の相互作用のものよりも、一般に１０倍、好ましくは１００倍より強烈である。選択的なハイブリダイゼーションのための厳密なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。通常は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は、所与のｐＨおよび所与のイオン強度で、参照配列のＴｍより少なくとも５゜Ｃ低い温度である。典型的には、ハイブリダイゼーション温度は、１５〜５０ヌクレオチドのポリヌクレオチドに対して少なくとも３０゜Ｃであり、５０ヌクレオチドを超えるポリヌクレオチドに対して少なくとも６０゜Ｃである。例として、ハイブリダイゼーションは、次の緩衝液中で実施される：つまり、６ｘＳＳＣ, ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ(ｐＨ７.５), １ｍＭ  ＥＤＴＡ, ０.０２％ PVP, ０.０２％フィコール, ０.０２％ ＢＳＡ, ５００μg／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡである。洗浄は、２ｘ ＳＳＣ, ０,１％ＳＤＳ緩衝剤中での低度の厳密性で、０.５ｘ ＳＳＣ, ０１％ＳＤＳ緩衝剤中での中等度の厳密性で、および０.１ｘ ＳＳＣ, ０.１％ＳＤＳ緩衝剤中での高度の厳密性などの条件で連続的に実施される。ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の他の通常の方法（特に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989を参照されたい）にしたがって実施することができる。
【００５７】
好ましくは、参照ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、参照配列の機能を保存しているものである。本発明において、前記ポリヌクレオチドの機能は、葉緑体ＤＮＡの可変領域の増幅である。
【００５８】
「厳密（stringency）」の用語は、分子のハイブリダイゼーションが生じる操作条件（特に、温度およびイオン強度）の厳格性（strictness）を意味することが意図される。
【００５９】
「増幅（amplification）」の用語は、規定されたＤＮＡ配列の任意のインビトロ酵素増幅を意味することが意図される。
【００６０】
通常、増幅は、連続的な増幅サイクル(一般に２０〜４０)を備える。増幅サイクルは、３つのフェーズから構成される、即ち：ＤＮＡ変性工程（二重螺旋の２つの鎖の分離）の後、それに相補的な配列の反対のプライマー(特異的に選択された短いオリゴヌクレオチド配列)の位置決め、及びこれらの標的への結合であり、方法の第二フェーズを構成する(ハイブリダイゼーション)。伸張フェーズには、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）が関与する。この酵素は、プライマーから鋳型として作用するものに相補的な鎖を合成する。このサイクルの反復によって、ＤＮＡ断片の指数関数的な増幅が得られる。
【００６１】
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドのペアを用いての、植物の葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するための方法に関する。
【００６２】
ＤＮＡ配列を増幅するための方法は、当業者に周知であり、文献に広範に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に関して言及がなされるが、任意のタイプの増幅反応を本発明の方法に使用することができる。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドの配列が植物界全体で高度に保存されている場合、これらのポリヌクレオチドを植物種の検出に使用することができる。
【００６４】
「検出（detection）」の用語は、サンプル中に植物種が存在することを意味するが、サンプル中の植物種の測定および定量をも意味することが意図される。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドを用いることによって、葉緑体ＤＮＡの非常に可変性の領域を増幅することが可能となった。本領域の配列は、１つの植物種と他の種とで異なっており、各配列は種に特異的である又は少数の非常に近縁の種に特異的である。一度、可変領域が増幅されると、その配列は植物種を同定するために分析される。当業者に周知の様々な方法によって、分析を実施することができる。それは完全な又は部分的なシークエンシングと、引き続く既知の配列との比較であってもよい。或いは、ハイブリダイゼーション技術などを用いた、既知の配列（参照配列）との相同性の度合の決定が含まれてもよい。別の可能性は、電気泳動法による分析、そして参照配列との比較である。以上のように、本発明の方法によって、サンプルに存在する植物種の同一性を決定することが可能である。
【００６６】
分析手順中の「サンプル（sample）」の用語は、測定される物質（substance）を意味することが意図される。本発明において、サンプルは、通常では植物種を含有していることが疑われる有機物を含む。有利なことに、本発明の方法によって、加温, 凍結乾燥もしくは凍結によって又はＤＮＡのデグラデーションを生じる任意の他の処理によって分解した又は劣化（degraded）した物質からなるサンプルの分析が許容される。以上のように、本発明の方法によって、形質転換した食物（transformed foods）などの中の植物種の検出が許容される。本発明の方法の別の適用は、凍結した土壌（永久凍土）に由来する基質中の又は化石化した残留物中の植物種の検出である。
【００６７】
サンプルは、本発明のポリヌクレオチドを用いた増幅反応が実施される前に、処理を受けてもよい。典型的には、その処理は当業者に周知の日常的な技術によるＤＮＡ抽出工程であってもよい。
【００６８】
「抽出（extraction）」の用語は、物質を媒体から溶媒などを用いて又は任意の他の物理化学的な方法によって抽出することからなるプロセスを意味することが意図される。
【００６９】
また、本発明は、タバコの葉緑体ＤＮＡのポジション４９４２５〜４９４６６に対応する植物のｔｒｎＬ葉緑体遺伝子のイントロンの可変領域の、植物種を検出するため及び同定するための使用に関する。
【００７０】
タバコの参照配列(Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147)及び本参照配列上の可変領域のポジションに基づいて、当業者は日常的な技術を用いて他の植物種における対応する配列を同定することができる。
【００７１】
［配列表の記載］
配列番号１:  プライマー  ｇ。
【００７２】
配列番号２:  プライマー  ｈ。
【００７３】
配列番号３:  タバコ（Nicotiana tabacum）の増幅された可変性の配列。
【００７４】
配列番号４〜１５:  プライマー  ｇのバリアント。
【００７５】
配列番号１６〜２３:  プライマー  ｈのバリアント。
【００７６】
配列番号２４〜６７:  様々な植物種の増幅された可変性の配列。
【００７７】
配列番号６８:  プライマー  ｇに相補的な領域の配列。
【００７８】
配列番号６９:  プライマー  ｈに相補的な領域の配列。
【００７９】
直接的なシークエンシングによる分析に関して、電気泳動での検出に使用されるＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
［例］
１）直接的なシークエンシング
直接的なシークエンシングによる分析に関して、電気泳動での検出に使用されるＰＣＲ条件は、以下のとおりである：
ａ）蛍光色素で標識されたプライマーｇでの検出のための増幅条件：
（ｉ）最終的な容量:  ２５μｌ
（ｉｉ）ＭｇＣｌ２:  ２ｍＭ
（ｉｉｉ）ｄＮＴＰ:  各０.２ｍＭ
（ｉｖ）プライマー:  各１μＭ
（ｖ）Ｔａｑポリメラーゼ(Amplitaq Gold, Perkin Elmer)：  １ユニット
（ｖｉ）ＢＳＡ  :  ０.２μｌ／チュウブ
（ｖｉｉ）使用されたＤＮＡ抽出物の容量:  ２.５μｌ
（ｖｉｉｉ）１０ｍｎ、９５゜Ｃでの最初の変性
（ｉｘ）サイクル数:  ３５（抽出物に依存して調整される）
（ｘ）変性：  ３０ｓ、９５゜Ｃ，  ハイブリダイゼーション:  ３０ｓ、５５゜Ｃ，  伸長工程なし。
【００８０】
これらの条件は、結果の解釈を妨げる「＋Ａ」のアーチファクトを減少させることを目的としている。
【００８１】
ｂ）蛍光色素で標識されたプライマーｈでの検出のための増幅条件：
（ｉ）最終的な容量:  ２５μｌ
（ｉｉ）ＭｇＣｌ２：  ２ｍＭ
（ｉｉｉ）ｄＮＴＰ：  各０．２ｍＭ
（ｉｖ）プライマー:  各１μＭ
（ｖ）Ｔａｑポリメラーゼ(Amplitaq Gold, Perkin Elmer)：  １ユニット
（ｖｉ）ＢＳＡ  :  ０.２μｌ／チュウブ
（ｖｉｉ）使用されたＤＮＡ抽出物の容量:  ２．５μｌ
（ｖｉｉｉ）１０ｍｎ、９５゜Ｃでの最初の変性
（ｉｘ）サイクル数:  ３５（抽出物に依存して調整される）
（ｘ）変性：３０ｓ、９５゜Ｃ，  ハイブリダイゼーション:３０ｓ、５５゜Ｃ，  伸長:６０s、７２゜Ｃ。
【００８２】
（ｘｉ）最終的な伸長：９０分間、７２゜Ｃ。
【００８３】
これらの条件は、結果の解釈を促すために、「＋Ａ」のアーチファクトを促進することを目的としている。
【００８４】
２）普遍的プライマー
表１は、葉緑体ＤＮＡの可変領域を増幅するために使用された普遍的プライマーの配列を示しており、これは劣化した基質から抽出および増幅した後に、植物を同定するためのものである。タバコの参照配列に基づく３’塩基のポジションが、表で指摘されている〔Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147〕。
【表１】
2008515416.tif 000002
【００８５】
これら２つのフランキング領域のアライメントによって（表１および２）、高等植物における普遍的なプライマーを規定することが可能であることが示されている（被子植物および裸子植物）。数百のｔｒｎＬ（ＵＡＡ）イントロン配列を整列させた後に、ゾーン（ここで我々は前記プライマーを規定した）中で観察された幾つかの配列バリエーションによって、後者が実際に普遍的であることが実証された（表２を参照されたい）。実際に、プライマーの配列と共に観察された差異は、プライマーの３’側の最後の３塩基に影響しない多くとも単一のミスマッチが関与している。結果として、プライマーｇおよびｈが普遍的であることを予測することは確かに可能である。
【００８６】
３）増幅された領域の可変性
表２は、食物の組成の一部である様々な植物に関して、プライマーｇおよびｈによって増幅されるゾーン（zone）のバリエーションを示している（表３をも参照されたい）。これらの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ(公共のＤＮＡ配列データベース)から取得するか又は我々の研究室で作出した。
【００８７】
２つの非常に保存された領域は、約２０〜１００塩基対の長さの非常に可変性の部分を形成する（図１）。従って、係る領域は、劣化した基質から植物を同定するための理想的な標的を代表する（これらの条件下では、１２０塩基対以上の長さの増幅断片を得ることはしばしば困難である）。我々は、これらの基準に合致する他の領域を発見していなかった。従って、我々が提案しているシステムはユニークであると思われる。
【００８８】
表２は、第一に普遍的なプライマーによって規定されるゾーン、第二に増幅された領域の可変性を示している配列アライメントを示す。前記プライマーに対応している領域中の下線をひいたヌクレオチドは、普遍的なプライマーｇおよびｈとのミスマッチを指摘している。増幅された領域に関して、下線は同一の配列を指摘している。
【表２−１】
2008515416.tif 000003
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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増幅された領域は、様々な種の間でサイズのバリエーションを示すのみならず、配列バリエーションをも示す。次の事項が、興味深いことが注意される；その事項とは、可変性の程度によって、消費される種の圧倒的多数を同定することが可能なことである。しかしながら、近い種は、特定のケースにおいて、識別可能ではないだろう。これは、コムギとライ麦との間およびキャベツとカブラとの間での我々の例である。
【００８９】
表３は、表２の食物の配列の共通の名称および起源を示している。ＬＥＣＡ＝発明者によって産生された配列
【表３−１】
2008515416.tif 000007
【表３−２】
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４）劣化した基質への適用の例
本出願で提案されたアプローチの有効性を明確に実証する、幾つかの実験を我々は実施した。
【００９０】
幾つかの複合体および／または形質転換した基質のＤＮＡを、慣用されている抽出キットを用いて、製造者（Dneasy Plant Mini Kit, Qiagen）の説明書にしたがって、抽出した。試験された基質は、以下のものである： 
（ｉ）サトウキビ
(ii)調理されたジャガイモ
(iii)調理されたパスタ
(iv)凍結乾燥したパケットスープ（packet soup）
固形の食物に関して、ＤＮＡを５０ｍｇの乾燥重量から抽出した。ＤＮＡ抽出物の最終容量を、２００μｌに回収した。
【００９１】
増幅を、プライマーｇおよびh(表１)並びに以下の増幅条件で実施した：
（ｉ）最終的な容量：  ２５μｌ
（ｉｉ）ＭｇＣｌ２:  ２mM
（ｉｉｉ）ｄＮＴＰ:  各０.２ｍＭ
（ｉｖ）プライマー:  各１μＭ
（ｖ）Ｔａｑポリメラーゼ(Amplitaq Gold, Perkin Elmer):  １ユニット
(vi)ＢＳＡ  :  ０.２μｌ／チュウブ
（ｖｉｉ）使用されたＤＮＡ抽出物の容量:  ２.５μｌ（抽出物の１/８０）
（ｖｉｉｉ）１０ｍｎ、９５゜Ｃでの最初の変性
（ｉｘ）サイクル数:３５（サトウキビは除く：  ５０）
（ｘ）変性：３０s、９５゜Ｃ，  ハイブリダイゼーション:３０ｓ、５５゜Ｃ，  伸長：６０ｓ、７２゜Ｃ。
【００９２】
図２は、増幅結果を示している。増幅産物は、ＡＢＩ３１００キャピラリー自動シークエンサーでの直接的なシークエンシングによって配列決定された。サトウキビ、調理したジャガイモおよび調理したパスタに関して取得された配列は、それぞれサトウキビ(Saccharum officinarum), ジャガイモ(Solanum tuberosum)およびコムギ(Triticum aestivum)の配列に対して同一である。他方で、凍結乾燥したパケットスープに関する直接的なシークエンシングによって取得された配列は解読不可能であり、これが混合物であることを指摘している。従って、我々は、様々な分子を分離するために、凍結乾燥したパケットスープからＰＣＲ産物をクローン化した。シークエンスした２３クローンから、我々は、リーキの配列を含んでいる１９クローンを、ジャガイモの配列を含んでいる３クローンを、及びタマネギの配列を含んでいる１クローンを取得した。
【００９３】
表４は、凍結乾燥したパケットスープから取得した増幅産物のクローニングの結果を示している（シークエンスした２３クローン）。得られた結果は、前記パケットで指摘された組成と対応している。
【表４】
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【００９４】
５）劣化した基質におけるプライマーｇ，  ｈおよびｃ，  ｄでの比較例
本実験の課題は、本発明と１９９１年に公開されたアプローチ〔Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109〕とを比較することであった。
【００９５】
ゲノムＤＮＡを、１００ｍｇのパン粉から抽出キット（Dneasy Plant Mini Kit, Qiagen）を用い、製造者の説明書にしたがって抽出した。ＤＮＡ抽出物の最終的な容量を、１００μｌに回収した。
【００９６】
増幅を、最初にプライマーｇおよびｈを、第二にプライマーｃおよびｄを用いて実施した〔Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109〕。次の増幅条件を適用した：
最終的な容量：  ２５μｌ
ＭｇＣｌ２：  ２ｍＭ
ｄＮＴＰ:  各０.２ｍＭ
プライマー:  各１μＭ
Ｔａｑポリメラーゼ(Amplitaq Gold, Perkin Elmer)：１ユニット
ＢＳＡ  :  ０.２μｌ／チュウブ
使用されたＤＮＡ抽出物の容量:  ２.５μｌ（抽出物の１/８０）
１０mn、９５゜Ｃでの最初の変性
サイクル数：  ２５
変性：３０s、９５゜Ｃ, ハイブリダイゼーション:３０s、５５゜Ｃ, 伸長:６０s、７２゜Ｃ。
【００９７】
図３は、得られた結果を示している。増幅産物は、プライマーｃおよびｄでは明らかとならなかった。他方で、増幅産物は、プライマーｇおよびｈで得られた。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、タバコ葉緑体ＤＮＡ配列における、試験されたゾーンの及び普遍的プライマーの位置を示す図である〔Shinozaki K, Ohme M, Tanaka M, Wakasugi T, Hayashida N, Matsubayashi T, Zaita N, Chunwongse J, Obokata J, Yamaguchi-Sinozaki K, Ohto C, Torazawa K, Ment B, Sugita M, Deno H, Kamogashira T, Yamada K, Kusuda J, Takaiwa F, Kato A, Tohdoh N, Shimada H (1986) The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome. Plant Molecular Biology Reporter, 4, 110-147〕；ｃおよびｄは、Ｔａｂｅｒｌｅｔ等によって規定されたプライマーを示している〔Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J (1991) Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology, 17, 1105-1109〕；ｇおよびｈは、本特許出願にしたがって規定された普遍的プライマーを示している。
【図２】図２は、劣化した基質に由来するＤＮＡの抽出物を用いて、プライマーｇおよびｈで得られた増幅物の例を示す図である。１，  調理されたジャガイモ；２，  調理されたパスタ；３および４，  凍結乾燥したパケットスープ；５，  抽出のネガティブコントロール(基質なしの増幅を用いた増幅反応)；６，  増幅のネガティブコントロール(ＤＮＡ抽出物なしの増幅反応)；７，  ポジティブコントロール(Cyclamen DNＡ）；Ｍ，  分子量マーカー。調理されたジャガイモに対応する断片(７９ｂｐ)が、調理されたパスタに対応する（従って、小麦に対応する）もの（９２ｂｐ）よりも短いことが注目される。
【図３】図３は、劣化した基質(パン粉)から抽出されたＤＮＡを増幅するために、プライマーｃ〜ｄ(レーン１〜４)およびｇ〜ｈ(レーン５〜８)の有効性を比較した実験を示す図である。Ｍ，  分子量マーカー。１および５，  パン粉から抽出されたＤＮＡ。２および６，  抽出のコントロール。３および７，  増幅のコントロール。４および８，  ポジティブコントロール。
【図４】図４は、本発明の特定の態様を用いて植物を同定するために適用されるだろう一般的なアプローチを、模式的に示す図である。第１の工程は、ＤＮＡを基質から抽出することからなる。第２の工程は、抽出物のＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応法)法を用いた増幅である。増幅産物の分析は、第３の工程を構成する。４つの代替的な解決法を示す。第１の分析可能性（analytical possibility）は、単純な基質のみ（単一の植物種のみが存在する）に関連し、増幅産物を慣用されている方法で直接的にシークエンスすることからなる。第２および第３の可能性が、植物の混合物を含有している複雑な基質に関して、確保されている。増幅産物をクローニングし、次に幾つかのクローンをシークエンスした後に（結果の例に関して、表４を参照されたい）、又は支持体上で潜在的な標的配列とハイブリダイゼーションさせた後に、分析が実施される（説明されない方法、これには存在するだろう種の従来の知識が関与する）。最終的な分析可能性は、増幅産物を電気泳動（変性、又はＳＳＣＰタイプの未変性）で特性決定することから構成される。後者の可能性は、単純な基質(存在する単一の植物種)に関して又は混合物を含有している基質に関して均等（equally）に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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