(57)【要約】  少なくとも1つの可溶性BTNL2分子、好ましくは2つの可溶性BTNL2分子を含むポリペプチドダイマーが記載される。さらに、該分子を含む医薬組成物およびT細胞媒介炎症障害を阻害する該分子の種々の医学使用が記載される。
2008541695.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの可溶性BTNL2分子を含むポリペプチドダイマー。
【請求項２】
2つの可溶性BTNL2分子を含む請求項１記載のポリペプチドダイマー。
【請求項３】
2つの可溶性BTNL2分子の少なくとも１つがBTNL2の全細胞外ドメインである、請求項２記載のポリペプチドダイマー。
【請求項４】
2つのBTNL2分子が単純な共有結合を介して互いに結合される、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチドダイマー。
【請求項５】
2つのBTNL2分子が可変型ペプチドリンカーを介して互いに結合される、請求項１〜３いずれか記載のポリペプチドダイマー。
【請求項６】
2つのBTNL2分子のそれぞれがIgGタンパク質のFcドメインに融合される、請求項１〜５いずれか記載のポリペプチドダイマー。
【請求項７】
ジスルフィド結合ホモダイマーとして発現される請求項６記載のポリペプチドダイマー。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチドダイマーまたは該ダイマーのモノマーをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の宿主細胞を培養する工程および該宿主細胞または培養培地からポリペプチドモノマーまたはポリペプチドダイマーを回収する工程を含む、請求項１〜７いずれか記載のポリペプチドダイマーを作製する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７いずれか記載のポリペプチドダイマー、請求項８記載のポリヌクレオチドまたは請求項９記載の発現ベクターを含む医薬組成物。
【請求項１３】
活性化Ｔ細胞によって媒介される炎症疾患の処置または予防のための医薬組成物の調製のための、請求項１〜７いずれか記載のポリペプチドダイマー、請求項８記載のポリヌクレオチドまたは請求項９記載の発現ベクターの使用。
【請求項１４】
該疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、心筋炎、関節炎、甲状腺炎、重症筋無力症、糖尿病、エリテマトーデス、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、重症筋無力症、対宿主性移植片病（GvHD）、癌、リンパ腫、セリアック病または乾癬である、請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも1つの可溶性BTNL2分子、好ましくは2つの可溶性BTNL2分子を含むポリペプチドダイマーに関する。本発明はまた、該分子を含む医薬組成物およびT細胞媒介炎症障害を阻害する該分子の種々の医学使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
T細胞および抗原提示細胞(APC)の間での共刺激は有効な免疫応答に必要である。T細胞レセプター(TCR)および主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の相互作用を介して送達される一次シグナルは、特定の細胞表面糖タンパク質、例えばCD28/B7分子(CD80およびCD86)、CD40/CD40リガンド(CD40L、CD154)、ならびにLFA-1(CD18)/ICAM-1(CD54)を介した共シグナル伝達によって調節され得る。これらの機能に依存して、これらの分子はT細胞活性の共刺激物質および共インヒビターにさらに分類される。最も特徴付けられる共シグナル伝達系の1つは、T細胞上のCD28および細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)を介したシグナルを送達するAPC上のB7-1およびB7-2によって示される。T細胞応答はCD28によって増大されるが、これらはCTLA-4によって阻害される(図１)(Bluestone, Clin Transplant, 1996, 10:104; Czitrom, Clin Orthop, 1996, 11; Harrisら, Immunol Cell Biol, 1999, 77:304)。CD80遺伝子のIgCドメインの欠失は、マウスプラスミドワクチン化モデルにおいて実質的な前炎症効果を有し、定常様ドメインが共刺激の間に免疫制御に重要であることを示唆する。
【０００３】
特定の時点でのこれらの分子の特定の発現はプライミング、増殖、分化およびT細胞応答の機能性成熟を正および負に制御する。CD28はT細胞に構成的に発現され、一方でCTLA-4はネイティブT細胞に低濃度で見出されるだけであるが、T細胞活性化後に急速に誘導される(Chambersら, Annu Rev Immunol, 2001, 19:565)。B7-1およびB7-2のほかに、B7ファミリーは、ICOSリガンド、PD-L1(B7-H1)、PD-L2(B7-DC)、B7-H3、およびB7-H4(B7x/B7-S1)等のさらなる新規メンバーを含む(Chen, Nat Rev Immunol, 2004, 4:336)。
【０００４】
共刺激はT細胞の活性化およびT細胞媒介免疫応答に重要な役割を果たすことが過去に明らかになっている。これらの高い感受性共刺激系の異常調節はしばしば、損なわれたT細胞活性化による自己免疫疾患の発現となる。B7-2の有意な上方調節およびICAM-1(CD54)の同時下方調節が、インシュリン依存性真性糖尿病を有する患者で観察された(Spatzら,Cell Immunol, 2003, 221:15)。
【０００５】
増大されたレベルのB7-1およびB7-2が、クローン病または潰瘍性大腸炎患者のいずれか由来の腸マクロファージに観察されている（Roglerら, Eur J Gastroenterol Hepatol, 1999, 11:1105）。
【０００６】
CTLA-4遺伝子内の単一ヌクレオチド多形（SNP）は、タンパク質の発現または阻害機能のいずれかに影響を及ぼし、種々の自己免疫疾患と関連していることが示されている(Ligersら, Genes Immun, 2001, 2:145)。CTLA-4遺伝子のエキソン1のSNPは多発性硬化症（MS）の発現と関連していることが示された(Ligersら, J Neuroimmunol, 1999, 97:182)。
【０００７】
CTLA-4の変異は、I型糖尿病、自己免疫甲状腺機能低下症およびグレーヴズ病のような他の自己免疫障害について重篤な危険因子としても同定されている（Uedaら, Nature, 2003, 423:506）。
【０００８】
いくつかの動物実験はCD28/B7共刺激の阻害が病因の重篤性を低減し得、いくつかの場合、疾患を完全に予防し得ることを示している。例えば、抗B7抗体またはCTLA-4融合タンパク質によるCD28/B7の阻害は、多発性硬化症(Karandikarら, J Neuroimmunol, 1998, 89:10; Andersonら, Curr Opin Immunol, 1999, 11:677)、心筋炎(Bachmaierら, J Immunol, 1996, 157:1752)、関節炎(Tadaら, J Immunol, 1999, 162:203)、甲状腺炎(Petersonら, J Immunol, 1999, 162:1859)、重症筋無力症(Shiら, Eur J Immunol, 1998, 28:3587)、またはエリテマトーデス(Finckら, Science, 1994, 265:1225; Kinoshitaら, J Immunol, 2000, 164:6064) のマウスモデルにおいて疾患の重篤性を低減した。
【０００９】
移植において、長い間移植片の寛容の深い誘導は移植片生存を延長することが考えられていた。移植時にCTLA-4Igを用いた処置はマウスにおいてヒト島（Lenschowら,Science, 1992, 257:789）およびラットにおいて心臓同種異系移植片（Turkaら, Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:11102）の長期の許容を誘導した。移植の間のCD40/CD40LまたはCD28/B7の阻害は同種異系反応性T細胞増殖の減少またはアポトーシスの増加を誘導した（Liら, Nat Med, 1999, 5:1298; Zhengら,Transplant Proc, 1999, 31:627; Iwakoshiら, J Immunol, 2000, 164:512）。
【００１０】
臨床研究において、CTLA-4Igは尋常性乾癬を有する43人の患者を処置するために用いられた。4回の注入後に、およそ50％の患者は用量依存的な様式で臨床疾患活性の持続した改善を達成した（Abramsら, J Clin Invest, 1999, 103:1243）。別の例において、対宿主性移植片病（GVHD）は骨髄同種異系移植で減少された。この目的のために、同種異系抗原特異的なアレルギーが、CD28/B7を阻害するCTLA-4Igの存在下でドナー由来の骨髄を宿主からの末梢リンパ球との36時間の共培養によって誘導された（Guinanら, N Engl J Med, 1999, 340:1704）。
【００１１】
慢性関節リウマチ（RA）を有する339人の患者における研究は、メトトレキサートおよびキログラムあたり2（n=105）または10mg(n=115)のCTLA-4Igのいずれかを用いた組み合わせ治療がACR関節炎指標の有意な減少となることを示した(Kremerら, N Engl J Med, 2003, 349:1907)。ACR50およびACR70応答の有意でより高い速度がプラシーボコントロール（n=119）と比較して両方の真（verum）の群で見られた。この研究はCTLA-4IgがRA薬物療法のための見込みのある新しい薬物であることを示す。
【００１２】
多発性硬化症における髄鞘脱落の免疫病因は免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)への自己抗体応答を含む。結晶構造分析は、MOGの細胞外ドメインがリガンドCTLA4と結合するために共刺激分子B7-2によって用いられるものと類似の溝を有するIgV様折りたたみを取ることを示している(Breithauptら, Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:9446)。
【００１３】
サルコイドーシスは、肉芽腫形成に導くTリンパ球および単球食細胞(MNP)浸潤を特徴とする、未知の病因の全身性炎症疾患である。疾患の特徴は、疾患器官で乾酪化されない肉芽腫の存在である(Sharma, Dis Mon, 1990, 36:469; Kanathurら,South Med J, 2000, 93:631)。これらの肉芽腫は任意の器官系でさまざまな割合で生じ得るが、肺およびリンパ節で最も一般的に見出される。サルコイドーシスの報告された症例の30〜60％の範囲が無症候性であり、慣例の健康スクリーニング胸X線写真中に発見されている。患者について、最も一般的な問題は、乾性咳、呼吸困難または胸の痛みのような呼吸症状および全身性症状、例えば熱、寝汗、疲労または倦怠感を含む。
【００１４】
障害の臨床発現は広く変化し、2つの主な表現型：急性および慢性サルコイドーシスを有する。急性サルコイドーシスは2〜3年以内に消散し、しばしば自発的に消失し、残る影響を残さない。一部の急性患者はロフグレン症候群を示し、熱、左右対称門のリンパ節症、結節性紅斑およびしばしば足首の関節での関節炎の組み合わせを特徴とする(Johardら, Sarcoidosis, 1993, 10:125; Oshimaら,Intern Med, 2003, 42:534)。およそ4分の1のサルコイドーシス患者は傷跡による永続性肺損傷を有し、ある患者は慢性サルコイドーシスを患い得る。症例の約5％において、器官移植（肺、心臓および肝臓等）が死亡を回避するために必要とされる。
【００１５】
サルコイドーシスは、他の慢性炎症障害と顕著な重複を示す。ブラウ症候群およびクローン病は、関与する器官および免疫病態生理学の範囲においてサルコイドーシスと重複を示す複合障害である。疾患組織において単球活性化およびT細胞活性化ならびに肉芽腫形成と共にまだ未知の標的への増強された免疫応答はサルコイドーシスおよびクローン病の両方に特有な特徴である。炎症の原発部位は異なるが（サルコイドーシスの肺およびクローン病の腸）、皮膚、関節および他の器官の疾患は両方の障害で共通である。家族または1個体でさえにおけるサルコイドーシスおよびクローン病の同時発現は偶然だけで見込まれるよりもより一般的である。
【００１６】
サルコイドーシス罹病性遺伝子の位置を突き止めるために、いくつかの連鎖研究および多くの関連研究が異なる割合で実施されている。55のドイツのサルコイドーシス家族におけるMHC領域に渡る7つの多形の連鎖研究は、マーカー座位D6S1666で3.2の最大値を有する全MHC領域について2.5を超える推定最大NPLスコアを与えた。後に、225個のマイクロサテライトマーカーを用いた63のドイツのサルコイドーシス家族の詳細なゲノムワイド連鎖研究は、6つの染色体に局在した7つのピークの連鎖証拠を同定した。最も顕著なピークは2.99のNPLスコア(p=0.0001)を有するマイクロサテライトマーカーD6S1666で第6染色体になお局在されていた。染色体6p21について16.4Mbの体系的3段階単一ヌクレオチド多形（SNP）スキャンは、家族性および散発性サルコイドーシスの独立した947の症例までにおいて実施された。TDTおよび症例コントロール分析を用いて、BTNL2遺伝子の3'末端に局在した15kbセグメントはサルコイドーシスと非常に関連して同定され得た。主な疾患関連バリアントであるrs2076530は、以前に報告された、サルコイドーシスおよびBTNL2の約200kb内に局在したDRB1遺伝子の対立遺伝子の間での関連と全く独立する危険因子を示す。rs2076530のリスク対立遺伝子AはBTNL2転写物の選択的スプライシングをもたらし、早熟停止を誘導する。得られた切断型タンパク質はC末端IgCドメインおよび膜貫通へリックスを欠き、それによってこの分子の本来の共阻害機能を阻害する。しかしながら、BTNL2の正確な生物学的機能に関して、従ってさらなる（炎症）疾患の進行におけるありうる関係はまったく未知であった。
【００１７】
従って、本発明の基礎となる技術課題は、CD3/CD28を介した共刺激によるT細胞活性化が組換えBTNL2分子を用いた処置によって阻害され得るかどうかを決定することであった。
【００１８】
該技術課題に対する解決は請求の範囲を特徴とする態様を提供することによって達成される。本発明はBTNL2がT細胞のCD3/CD28媒介NF-κB活性化を阻害するという観察に基づいている。記載された変異によるBTNL2機能の損失は、BTNL2依存性T細胞制御に干渉し、T細胞媒介免疫応答を増大することを仮説とする。さらに、この異常制御T細胞活性は慢性炎症障害の発現をもたらし得る。
【００１９】
アミノ酸およびドメイン構造の相同性に基づいて、BTNL2はB7-1タンパク質に非常に類似している（Valentonyteら, Nature Gentecics, 27 February 2005; doi:10.1038/ng1519）。BTNL2はまた、マウスNG9およびNG10遺伝子に対する相同性を示し、拡張されたB7ファミリーのメンバーであると系統学的に思われるジッパータンパク質、bg2、MOG、およびB-Gに対するホモログである。
【００２０】
従って、第一の態様において、本発明は少なくとも1つの可溶性BTNL2分子、好ましくは2つの可溶性BTNL2分子を含むポリペプチドダイマーに関する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「ポリペプチドダイマー」はまた、コンカテマーを形成する通常のペプチド結合（「頭-尾」）または「尾-尾」（図3B）を介して結合したモノマーを含む融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドダイマーは公知の方法を用いて設計され得る。利用されるBTNL2の可溶性ドメインは、BTNL2の全細胞外ドメインから構成され得るか、あるいは全細胞外ドメインの生物学的活性を実質的に維持する変異またはその断片から構成される。BTNL2の細胞外部分のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は図２に示される。BTNL2の細胞外ドメインはaa1（シグナルペプチドを含む）〜aa369である。
【００２２】
ポリペプチドダイマーの好ましい態様において2つの可溶性BTNL2分子の少なくとも1つはBTNL2の全細胞外ドメインである。
【００２３】
ダイマーのモノマーは直接的に結合され得、すなわち、ポリペプチド鎖のC末端が単純な共有結合を介して他のN末端（またはC末端）に結合されるか、あるいはこれらは、ヒトIgGのヒンジ領域のような可変型（flexible）リンカードメイン、または種々の長さおよび組み合わせでのグリシン、セリン、トレオニンもしくはアラニンのような低分子アミノ酸からなるポリペプチドリンカーを使用し得る。さらに、本発明のポリペプチドダイマーは例えば、金属キレートクロマトグラフィーによって迅速で単純な精製を可能にするHis6および／または例えばウエスタンブロット、免疫沈降等によって検出を可能にするように抗体が利用可能であるエピトープによって標識され得る。
【００２４】
さらなる好ましい態様において、本発明のポリペプチドダイマーにおいて、2つのBTNL2分子がIgGタンパク質のFcドメインに融合される(Aruffoら,Cell 67(1)(1991), 35-44を参照)。この例において、Fcドメインを保有するヘテロダイマー分子は好ましくは、ジスルフィド結合ダイマー（1つ以上のジスルフィド架橋を含む；図３A）として発現される。アミノ酸配列は図４に示される。
【００２５】
さらに、本発明はまた、遺伝子工学で改変された、例えば、結合に関して変更された特性を有する可溶性BTNL2の変異型に関する。
【００２６】
本発明はまた、本発明のダイマーまたは該ダイマーのモノマーをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドはDNAおよびRNA分子の両方であり得る。適切なポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムまたはcDNA分子である。BTNL2の可溶性部分の全てまたは部分をコードする全ての核酸分子はまた、これらが生物学的活性を有するポリペプチドをコードする限り、含まれることが理解されよう。本発明のポリヌクレオチドは天然供給源から単離され得るか、あるいは公知の方法によって合成され得る。
【００２８】
本発明はまた、アミノ酸配列が図２のBTNL2ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、85％、90％、95％または最も好ましい態様において98％の同一性を示すポリペプチドダイマーまたはモノマーをコードするポリヌクレオチドを提供する。かかるアミノ酸配列は図２に示されるアミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸残基の欠失、置換および／または挿入を特徴とするか、あるいは組換えの結果である。これらは、例えば他の生物からの配列である天然のバリアント、または天然に生じ得るかあるいは特定の突然変異生成によって導入される変異であり得る。これらはまた、例えば、細胞または組織から生成されたゲノムまたはcDNAライブラリーから単離され得る。本発明のかかるポリヌクレオチドを同定および単離するために、これらの分子の部分または逆補完物が、例えばハイブリダイゼーションの手段によって使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、例えばそれぞれ図２に記載されるヌクレオチド配列またはこれらの配列の部分を正確または基本的に有する核酸分子が使用され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして使用される断片は従来の合成方法の手段によって生成された合成断片または本発明のポリヌクレオチドの配列に基本的に対応する配列であり得る。
【００２９】
一般に、従来の分子生物学的プロセスによって、本発明のポリヌクレオチドに異なる変異を導入することが可能である。その結果、もしかすると変更された生物学的特性を有する可溶性BTNL2ポリペプチドが合成される。１つの可能性は、核酸分子がコードDNA配列の5'-または3'-末端からの連続欠失によって生成され、したがって短くなったポリペプチドの合成をもたらす欠失変異型の生成である。別の可能性は、アミノ酸配列の修飾が例えば、結合特性に影響する位置における単一変異の導入である。
【００３０】
遺伝子操作による原核生物細胞における操作のため、本発明のポリヌクレオチドまたはこれらの分子の部分は、プラスミド内に導入され得、変異誘発またはDNA配列の組換えによる配列の修飾が可能となり得る。従来の方法によって塩基が交換され得、天然または合成配列が付加され得る。DNA断片を互いに連結するために、アダプターまたはリンカーを断片に付加し得る。さらに、適当な切断部位を提供する操作または余分なDNAまたは切断部位を除去する操作が行なわれ得る。挿入、欠失または置換が可能な場合、インビトロ変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションが行なわれ得る。解析方法としては通常、配列解析、制限解析および他の生化学的または分子生物学的方法が使用される。
【００３１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターに関する。好ましくは、これらは、遺伝子操作の分野で通常使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび他のベクターである。本発明での使用に適したベクターとしては、限定されないが、哺乳動物細胞での発現のためのT7系発現ベクターおよび昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルス由来ベクターが挙げられる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳され得る原核生物および／または真核生物細胞内でのmRNAの転写および合成を保証する本発明の組換えベクター内の調節エレメントに作動可能に連結される。転写されるヌクレオチド配列は、T7、メタロチオネインIまたはポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され得る。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、一過的にまたは安定的に本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、インビトロで組換えDNAを取り込むことができ、可能である場合、本発明のポリヌクレオチドにコードされるBTNL2ポリペプチドを合成することができる生物体であることを理解されたい。好ましくは、これらの細胞は原核生物細胞または真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞または酵母細胞である。
【００３３】
本発明はまた、本発明のポリペプチドダイマーまたは前記ダイマーのモノマーの組換え作製のための方法であって、本発明の宿主細胞を、ポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養し、続いて該ポリペプチドを培養細胞および／または培養培地から単離する方法に関する。組換えにより作製されたポリペプチドの単離および精製は、分取用クロマトグラフィーならびに、例えば抗BTNL2抗体を使用する親和性および免疫学的分離を含む従来の手段によって行なわれ得るか、または例えば、Smith and Johnson, Gene 67; 31-40 (1988)に記載の１工程方法によって実質的に精製され得る。
【００３４】
本発明はまた、本発明によるポリペプチドダイマー、ポリヌクレオチドまたは組換えベクターおよび薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。
【００３５】
適当な薬学的担体などの例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油/水 エマルジョンなどのエマルジョン、種々の型の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。かかる担体は従来の方法によって製剤化され得、被験体に適当な用量で投与され得る。適当な組成物の投与は、異なる方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって行なわれ得る。投与経路は、もちろん、疾患の性質、その局在および医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投薬計画は、担当医師および他の臨床要素によって決定される。医薬分野では周知のように、任意のひとりの患者に対する投薬は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される具体的な化合物、投与時間および投与経路、疾患(例えば、腫瘍)の種類および段階、一般健康状態ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドの送達は、直接適用または、好ましくは、これらの化合物を含有するキメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド状分散系の使用によって達成され得る。標的部位に対する直接適用は、例えば、コロイド状分散系としてバリスティック(ballistic)送達によって、または動脈内の部位へのカテーテルによって行なわれ得る。上記のポリヌクレオチドの送達に使用され得るコロイド状分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズならびに水中油型エマルジョン(混合)、ミセル、リポソームおよびリポプレックスを含む脂質系が挙げられる。好ましいコロイド状系はリポソームである。リポソームの組成物は、通常、リン脂質およびステロイド、特にコレステロールの組合せである。当業者は、所望のポリヌクレオチドの送達に適したかかるリポソームを選択する立場にある。臓器特異的または細胞特異的リポソームは、所望の組織のみへの送達を達成するために使用され得る。リポソームの標的化は、当業者によって一般的な公知の方法を適用することにより行なわれ得る。この標的化としては、受動標的化(洞様毛細血管を含む臓器内のRESの細胞に分布するリポソームの天然傾向を利用する)または能動標的化(例えば、周知の方法によってリポソームを特異的リガンド、例えば、抗体、受容体、糖、糖脂質、タンパク質などにカップリングさせることによって)が挙げられる。
【００３７】
遺伝子療法に有用な好ましい組換えベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたは、より好ましくは、レトロウイルスなどのRNAウイルスである。さらにより好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルス由来のものである。本発明において使用され得るかかるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイ(Harvey)マウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺癌ウイルス(MuMTV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV)である。最も好ましくは、マウスベクターと比べてより広範な宿主範囲を提供するテナガザル白血病ウイルス(GaLV)などの、非ヒト霊長類レトロウイルスベクターが使用される。組換えレトロウイルスは不完全であるため、感染性の粒子を作製するために補助が必要とされる。かかる補助は、例えば、レトロウイルスのすべての構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株をLTR内の調節配列の制御下で使用することにより提供され得る。適当なヘルパー細胞株は当業者に周知である。前記ベクターは、形質導入された細胞が同定され得るように選択可能なマーカーをコードする遺伝子をさらに含み得る。さらに、レトロウイルスベクターは、標的特異的となるように修飾され得る。これは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質、好ましくは、抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより達成され得る。当業者は、標的特異的ベクターを作製するためのさらなる方法を知っている。インビトロまたはインビボ遺伝子療法のためのさらなる適当なベクターおよび方法は、文献に記載されており、当業者に知られている;例えば、WO 94/29469またはWO 97/00957を参照のこと。
【００３８】
本発明はまた、活性化されたT-細胞によって媒介される炎症性疾患、好ましくは、多発性硬化症(MS)、心筋炎、関節炎、甲状腺炎、重症筋無力症、糖尿病、エリテマトーデス、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、重症筋無力症、対宿主性移植片病(GvHD)、癌、リンパ腫、セリアック病または乾癬の処置または予防のための医薬組成物の調製のための、本発明の上記の化合物(タンパク質ダイマー、ポリヌクレオチド、ベクターなど)の使用に関する。
【実施例】
【００３９】
実施例1:  BTNL2タンパク質の発現
(A)  材料
BTNL2遺伝子(ヌクレオチド1〜1107)の細胞外部分をコードするDNA断片を、単球RNA由来のプライマーBTNL2-s (5'-GTCTCGAGATGGTGGATTTTCCAGGC-3')およびBTNL2-a(5'-CTGAATTCTGTTTTCCACAAAAATGTCATCCT-3')(コード配列に結合する部分に下線を付している)を用いてRT-PCRによって増幅し、標準的な技術に従って単離し、精製した。精製断片を、異なる標識を有するBTNL2を作製するために種々のプラスミド内に: BTNL2-GFPを作製するためにはpEGFP-N1、BTNL2-Hisを作製するためにはpcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)、BTNL2-Fcを作製するためにはIgG-Fc断片を含有するpcDNA3.1内にクローニングした。得られた構築物をさらなる使用の前にDNA配列決定によって確認した。
【００４０】
(B)  細胞培養および細胞トランスフェクション
CHO細胞は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany)から購入した。細胞はすべてRPMI＋10%ウシ胎児血清(FCS)中で培養した。トランスフェクションの１日前、細胞を6ウェルプレートに5×105細胞/2mlの密度で播種した。トランスフェクションは、上記の1μgのそれぞれのBTNL2発現プラスミドを使用することにより、製造業者のマニュアルに従ってFugeneTM(Roche, Germany)を用いて行なった。トランスフェクションの24〜48時間後、細胞を収集し、さらにタンパク質またはRNA単離のために使用した。どの単一のトランスフェクション実験も3重に行ない、少なくとも2回繰返した。
【００４１】
(C)  BTNL2-Fcは、非還元条件下でホモダイマーを形成する
BTNL2-GFPまたはBTNL2-His発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトしたCHO細胞由来の上澄みを、48時間後に収集し、各々25μlのアリコートを非還元SDS-PAGE上で分離した。BTNL2-GFPを、標準的な技術に従って、1:5000の希釈度のGFP特異的モノクローナル抗体(BD Bioscience Clontech, Palo Alto,m CA, USA) を用いて検出した(A)。BTNL2-Hisを抗V5-His抗体(Invitrogen)と平行して検出した(B)。両方の実験において、挿入物のないそれぞれのベクターを陰性対照として使用した。図5は、BTNL2-GFPおよびBTNL2-Hisは、モノマーおよびダイマーとして検出され得、BTNL2は自発的に可溶性ダイマーを形成することを示す。
【００４２】
実施例2:  BTNL2-FcによるCD3/CD28媒介性T細胞活性化の阻害
(A)  細胞および材料
ジャーカット細胞はGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany) から得た。10%ウシ胎児血清、0.5μM 2-メルカプトエタノール、2 mM グルタミン、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI 1640培地中で、細胞を培養した。抗CD3抗体(クローンOKT3)および抗CD28抗体をeBioscience (San Diego, USA) から購入した(クローン37-51)。NF-κB-LucレポータープラスミドおよびDual-Luciferase Reportergen (DLR)アッセイは、Promega (Mannheim, Germany) から購入した。BTNL2-Fcを、pcDNA3.1-BTNL2-FcをトランスフェクトしたCHO細胞の上澄みから調製した。タンパク質をプロテインAカラム(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK) 上でのクロマトグラフィーおよび続くゲル濾過(Sephacryl S-300 HR, Amersham)によって精製した。
【００４３】
(B)  T細胞の活性化およびELISAによるサイトカイン検出
マイクロタイタープレートを抗CD3抗体(2μg/ml)で一晩4℃でコーティングした。ジャーカット細胞 (5×104細胞/ウェル)を、これらのプレートにおいて200μlの培地中、異なる量のBTNL2-Fcの非存在下および存在下、20時間37℃でインキュベートした。平行して、非特異的IgG1抗体をBTNL2-Fcの代わりに陰性対照として使用した。続いて、細胞を2μg/mlの抗CD28抗体とともにさらに36時間インキュベートした。IL-2およびIFN-γ分泌を上澄み中において、標準的な技術によるELISAによって測定した。各実験は3重に行ない、少なくとも2回繰返した。結果を図6に示す。
【００４４】
(C)  BTNL2-FcによるT細胞におけるNF-κB 活性化の阻害
最近、細胞内シグナル伝達分子NF-κBは、CD3/CD28共刺激によって活性化されると記載された(Schmitz, et al., Faseb J, 2003, 17:2187)。トランスフェクションの１日前、ジャーカット細胞を6ウェルプレートに5×105細胞/2mlの密度で播種した。トランスフェクションは、1.8μgのNF-κB-Lucレポータープラスミド(BD Biosciences)および0.2μgのpRL-TK参照プラスミド(Promega, CA, USA)を使用することにより、製造業者のマニュアルに従ってPolyfectTM(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて行なった。次いで、細胞を抗CD3コーティング6ウェルプレートに移し((B)参照)、2.5μg/ml BTNL2-Fcの存在下、20時間37℃でインキュベートした。2μg/mlの抗CD28抗体を添加し、細胞を48時間まで37℃でインキュベートした。細胞の一部分を表示された時点で収集し(図7)、受動溶解バッファー(PLB)で溶解し、ルシフェラーゼ活性を製造業者のプロトコルに従って測定し、レニラ(renilla)ルシフェラーゼの結果に対して標準化した。
【００４５】
要約すると、共刺激T-細胞によるIL-2およびIFN-7などの前炎症性サイトカインの発現は、BTNL2-Fcでの細胞の処理によって用量依存的に下方調節され得る。サイトカイン発現のこの下方調節は、ほとんどの場合、図6に示されるように、NFκB活性の特異的阻害によって媒介される。結果は、BTNL2-Fc処理が、T細胞活性および前炎症性メディエーターの下方調節によるT細胞媒介性疾患の処置のための治療的潜在性を有し得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図1は、T細胞活性化中の共刺激の概念である。MHC-Ag提示後の最適免疫学的T細胞応答は、TCR媒介性第１シグナルがT細胞発現CD28へのAPC上に発現されたB7-1/2の結合に付随(escort)する場合のみに得られる(C)。B7-1/2の存在がないことは、T細胞アネルギーをもたらし(A)、CD28単独へのB7-1/2の結合は生物学的効果をもたない(B)。CD28と組合せたB7-1/2の刺激性の役割に加え、CTLA-4に対する結合は、Ag-MHC誘導性T細胞活性化を阻害する(D)。同様の阻害機構がBTNL2に対して仮定される(E)。
【図２】図2は、ヒトBTNL2の細胞外ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【図３】図3は推定BTNL2ダイマーの概要である。(A)IgG-Fc分子を介して連結されたBTNL2の２つの細胞外ドメインを含む融合タンパク質。(B、C)そのC末端の種々の長さのポリペプチドを介して(B)または「頭-尾」配向を介して(C)のいずれかで連結されたBTNL2ダイマー。また、ダイマーは、種々の位置で標識化(TAG)され得る。標識は、例えば、Hisn、c-myc、Strep、FLAG、ポリ-アルギニン、カルモジュリン結合ペプチド(CBP)、キチン結合ドメイン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)などであり得る。
【図４Ａ】図4Aは、融合タンパク質BTNL2-Fcのヌクレオチド配列である。該タンパク質は、BTNL2の細胞外ドメイン、リンカー配列(下線を付している)およびIgG-Fc分子を含む。
【図４Ｂ】図4Bは、融合タンパク質BTNL2-Fcのアミノ酸配列である。該タンパク質は、BTNL2の細胞外ドメイン、リンカー配列(下線を付している)およびIgG-Fc分子を含む。
【図５】図5はBTNL2の発現である。(A)緑色蛍光タンパク質(GFP)またはV5-His(B)による標識。それぞれの抗体でのタンパク質の染色は、BTNL2が、GFP mock対照(A)によって示されるように標識と独立してタンパク質ダイマーを構築することを示す。
【図６】図6は、抗CD3および／または抗CD28抗体ならびに増加量の融合タンパク質BTNL2-Fcでの刺激後のジャーカット細胞によるIFN-γ(A)およびIL-2(B)の分泌である。各グラフは、少なくとも2つの独立した実験 (各々、3回の同一の反復を含む)(* p＜0.05; ** p＜0.01)の平均の結果を示す。
【図７】図7は、BTNL2-Fcによるジャーカット細胞におけるCD3/CD28媒介性NF-κB活性化の阻害である。
【図１】
2008541695.tif 000003
【図２】
2008541695.tif 000004
【図３】
2008541695.tif 000005
【図４Ａ】
2008541695.tif 000006
【図４Ｂ】
2008541695.tif 000007
【図５】
2008541695.tif 000008
【図６】
2008541695.tif 000009
【図７】
2008541695.tif 000010
【配列表】
2008541695000001.app
【国際調査報告】
2008541695.tif 000011
2008541695.tif 000012
2008541695.tif 000013