(57)【要約】乳癌患者におけるＷｎｔ−５ａタンパク質発現の消失は、無再発生存がより短くなること、および哺乳動物細胞株における運動性の増大と関連している。Ｗｎｔ−５ａの配列分析に基づいて、１３のペプチドフラグメントを同定して、それらが、哺乳動物細胞接着および運動性に対するＷｎｔ−５ａタンパク質の効果を模倣する能力について検討した。新規なホルミル−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕペプチドリガンドは、Ｗｎｔ−５ａの内因性の発現が減少したヒト乳癌の５０％未満において抗転移処置のためのリード物質として機能し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列によってコードされる１つ以上のアミノ酸：
【化１】
2008542368.tif 000013
またはそのホルミル化誘導体。
【請求項２】
以下を含む請求項１に記載の１つ以上のアミノ酸：
【化２】
2008542368.tif 000014
またはそのホルミル化誘導体。
【請求項３】
以下の配列によってコードされる１つ以上のアミノ酸：
【化３】
2008542368.tif 000015
またはそのホルミル化誘導体の、薬学的組成物の製造における使用であって、該薬学的組成物がガン細胞の運動性を障害することによってガンの処置において用いられる、使用。
【請求項４】
請求項３に記載の使用であって、前記アミノ酸が以下の群：
【化４】
2008542368.tif 000016
またはそのホルミル化誘導体から選択される、使用。
【請求項５】
治療上活性な量の１つ以上のガン細胞運動性の阻害活性ペプチド配列であって、以下からなる群より選択されるペプチド配列：
【化５】
2008542368.tif 000017
またはそのホルミル化誘導体を、必要に応じて不活性なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項６】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記活性ペプチドが、以下：
【化６】
2008542368.tif 000018
またはそのホルミル化誘導体からなる群より選択される、薬学的組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の薬学的組成物であって、前記活性ペプチドが、
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
またはそのホルミル化誘導体である、薬学的組成物。
【請求項８】
ヒトにおける、詳細には、乳癌に罹患しているヒトにおけるガン細胞運動性を障害するための方法であって、以下からなる群より選択される１つ以上のペプチド配列：
【化７】
2008542368.tif 000019
またはそのホルミル化誘導体の治療上有効な量を投与することによる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（説明）
（技術分野）
本発明は、新規なペプチドリガンド、すなわち、詳細には乳癌および結腸癌におけるガン細胞の遊走を障害するために、そして甲状腺癌および神経癌腫における腫瘍抑制因子として機能するために用いられるべきペプチドリガンドに関する。詳細には、本発明は、ヘキサペプチドリガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
（序）
Ｗｎｔタンパク質は、自己分泌経路またはパラ分泌経路を介して発生および腫瘍発生に関与する３９〜４６ｋＤａの分子量を有する分泌型糖タンパク質のファミリーである（概説については、（１−３）を参照のこと）。分泌されたＷｎｔタンパク質は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｒｚ）ファミリーのＧ−タンパク質−カップリングレセプターに結合して、これを活性化する（４，５）。このＬＤＬレセプター関連タンパク質ＬＲＰ５またはＬＲＰ６は、この文脈では共同レセプター（ｃｏ−レセプター）として機能すると推測される（６，７）。マウス乳腺上皮細胞を形質転換するための種々のＷｎｔタンパク質の能力に基づいて、それらは、３つの異なるクラスに分けることができる。Ｗｎｔ−１、−３ａおよび−７ａは、最大の形質転換能力を有する；Ｗｎｔ−２、−５ｂおよび−７ｂは、中程度の形質転換能力を有する；そしてＷｎｔ−４、−５ａおよび−６は、非形質転換性である（８）。
【０００３】
原発性の浸潤性乳癌における低レベルのＷｎｔ−５ａタンパク質発現は、より高度の組織学的な段階（分化が低い）に、そして遠位の転移のより急速な発達に起因する無再発生存の短縮に関連していることが以前に報告されている（９）。この関連は、増殖に対するＷｎｔ−５ａの効果には起因しない。なぜなら、Ｗｎｔ−５ａタンパク質発現の消失と増殖性マーカーＫｉ６７との間に相関は検出されていないからである（９）。Ｗｎｔ−５ａの存在が、侵潤乳癌の転移能をどのように低下し得るかについての現在利用可能な唯一の説明は、それが、おそらく、コラーゲン活性化ジスコイジンドメインレセプター１（ＤＤＲ１）を介して、接着を増大し得る能力であるが、まだ不明確な機構も、腫瘍の進行に対するＷｎｔ−５ａの記載された臨床効果に寄与し得るという可能性がある。それにもかかわらず、ＤＤＲ１のＷｎｔ−５ａ−依存性活性は、運動性および乳癌上皮癌細胞の浸潤能の低下を生じる（１０）。正常には固着性である乳房の上皮細胞では、Ｗｎｔ−５ａの発現は減少し、従って、接着の減少は、それらの運動性を増大する。従って、Ｗｎｔ−５ａの内因性の発現が低いＭＣＦ−７乳ガン細胞株へＷｎｔ−５ａ発現ベクターを安定に導入することは、接着レセプターＤＤＲ１のコラーゲン誘導性活性化に必要であったということが観察されている（１０）。従って、Ｗｎｔ−５ａまたはアンチセンスＷｎｔ−５ａで安定にトランスフェクトされた正常なヒト乳腺上皮細胞株ＨＢ２（１１）のトランスフェクションはそれぞれ、コラーゲンＩに対するこれらの細胞の増大または減少した接着を生じた（１２）。ヒト乳腺細胞では、Ｗｎｔ−５ａがその効果を媒介する種々のＦｒｚ−レセプターのうちいずれを介するかはまだ確立されていない。しかし、線維芽様滑膜細胞および悪性黒色腫細胞の両方において、Ｗｎｔ−５ａ誘導性の効果を担うレセプターがＦｒｚ−５であることが特定のブロッキングＡｂを用いて明確に示されている（１３，１４）。
【０００４】
Ｗｎｔ−５ａの機能的な役割に基づく乳癌転移に特異的な処置を開発するためには、この上皮の腫瘍に対するその効果を担う細胞および分子の事象を理解することが重要である。ガン転移における重要かつ最初の事象の１つは、この形質転換された細胞がお互いから、そして規定膜のＥＣＭ成分からも離脱する能力である（１５）。Ｗｎｔ−５ａの存在下で、接着レセプターであるＤＤＲ１レセプターは、乳房上皮細胞におけるコラーゲンによって活性化され得、従って、コラーゲンに対するこれらの細胞のＷＮｔ−５ａ誘導性の増大した接着を媒介し得る可能性の高い候補物である。乳癌を欠くＷｎｔ−５ａで見られる転移活性の増大についての可能性のある説明は、これらの腫瘍細胞における接着の減少および運動活性の引き続く増大であり得る。従って、Ｗｎｔ−５ａタンパク質発現を欠く乳癌において転移活性を減じるための１アプローチは、Ｗｎｔ−５ａタンパク質発現の消失を担う転写欠損を克服する方法を見出すこと（１６）、それとは別に細胞のＷｎｔ−５ａ誘導性活性を再構成することであり得る。実験的に、分化した甲状腺癌への組み換えＷｎｔ−５ａの添加は、腫瘍抑制活性を有することが示されている（１７）。しかし、おそらく長期間にわたって患者に対して大型の４３ｋＤａのＷｎｔ−５ａタンパク質を与えることは、極めて魅力的なアプローチとはみられていない。
【０００５】
Ａｎｄｅｒｓｅｎおよび共同研究者による血小板での以前の研究（１８）によって、それぞれ、Ｇタンパク質カップリングプロテアーゼ活性化レセプターＰＡＲ１およびＰＡＲ４を特異的に活性化し得る２つの異なるヘキサペプチドフラグメントを特定した。高い能力を有する哺乳動物細胞上で、Ｇタンパク質カップリングレセプターに特異的に結合してこれを活性化し得る他の十分研究された小型のペプチドは、白血球上で走化性ペプチドレセプターに結合してこれを活性化する、細菌由来のホルミル化ペプチドである（１９）。この状況では、このホルミル基は、レセプターに対するペプチドについての結合親和性を顕著に増大し、結果としてまた細胞の活性化を増幅することが示されている（１９）。十分興味深いが、これらのペプチドは炎症部位で遭遇されるような低いｐＨでさえ機能的に活性である。炎症部位でのｐＨは、固形腫瘍で評価されたｐＨよりもかなり低い可能性が高い（２０、２１）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規なペプチドリガンド、詳細には、ガン細胞に対する運動性減少および接着の増大を示し、それによって、ガン細胞遊走を阻害するＷｎｔ−５ａのヘキサペプチドリガンド誘導体に関する。本研究では、１４個のペプチドフラグメントが、Ｗｎｔ−５ａの配列分析に基づいて、それが哺乳動物細胞接着および移動運動に対するＷｎｔ−５ａタンパク質の効果を模倣する能力について、Ｗｎｔ−５ａの内因性発現が減少している乳癌および結腸癌の抗転移性処置の可能性のある物質を特定するために同定されており、そして検討されている。このペプチドリガンドは、甲状腺癌および神経の癌における腫瘍抑制因子としても作用し、詳細には、本発明はヘキサペプチドリガンドに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、下の技術的な説明ならびに行われた試験を詳細に示す添付の図面およびグラフを参照して以下に考察および解明される。
【０００８】
本発明は、以下のアミノ酸配列：
【０００９】
【化８】
2008542368.tif 000002
を有する新規なペプチド構造、またはそのホルミル化誘導体に関する。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９〜配列番号１５のペプチド構造、またはそのホルミル化誘導体に関する。
【００１１】
詳細には、本発明は、配列番号１５またはそのホルミル化誘導体に関する。
【００１２】
本発明のさらなる局面では、本発明は、以下の配列によってコードされる１つ以上のアミノ酸：
【００１３】
【化９】
2008542368.tif 000003
またはそのホルミル化誘導体の使用であって、ガン細胞の運動性を障害することによってガンの処置において用いられる薬学的組成物の製造における、使用に関し、詳細にはこのアミノ酸は、以下の群：
【００１４】
【化１０】
2008542368.tif 000004
またはそのホルミル化誘導体から選択される。
【００１５】
本発明のなおさらなる局面では、本発明は、治療上有効な量の１つ以上のガン細胞運動性の阻害活性ペプチド配列であって、以下からなる群より選択されるペプチド配列：
【００１６】
【化１１】
2008542368.tif 000005
またはそのホルミル化誘導体を、必要に応じて不活性なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物に関し、
詳細にはこの活性ペプチドは、以下からなる群：
【００１７】
【化１２】
2008542368.tif 000006
またはそのホルミル化誘導体より選択され、さらに詳細には、この活性ペプチドは、
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
またはそのホルミル化誘導体である。
【００１８】
本発明のさらなる局面では、本発明は、ヒトにおける、詳細には、乳癌に罹患しているヒトにおけるガン細胞運動性を障害するための方法であって、以下からなる群より選択される１つ以上のペプチド配列：
【００１９】
【化１３】
2008542368.tif 000007
【００２０】
【化１４】
2008542368.tif 000008
またはそのホルミル化誘導体の治療上有効な量を投与することによる、方法に関する。
【００２１】
以下のいくつかの略号が用いられており、それらは、以下である、
ＣＭ、Ｗｎｔ−５ａ−馴化培地；
ＤＤＲ１、ジスコイジンドメインレセプター１；
Ｆ−アクチン、糸状アクチン；
Ｆｒｚ、フリズルド（縮れた）（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）；
ＭＴＳ、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；
ＰＰ１、４−アミノ−５−（４−メチル−フェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ−Ｄ−３，４−ピリミジン。
【００２２】
（結果）
Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞の接着および遊走に対するペプチド誘導性の影響。表１は、Ｗｎｔ−５ａ配列から誘導されて、乳腺細胞の接着および運動性に対するＷｎｔ−５ａタンパク質の影響を模倣する能力について検討された最初の１４のペプチドフラグメントを列挙している。前の研究では、Ｗｎｔ−５ａタンパク質の存在が、接着レセプターＤＤＲ１のコラーゲン誘導性の活性化に、そしてコラーゲンに対する乳腺細胞の最大接着について必要であることが示されている（１２）。従って、ＤＤＲ１のリン酸化および接着を、種々のペプチドがＷｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞におけるＷｎｔ−５ａ媒介性効果を模倣する能力についてのスクリーニングパラメーターとして用いた。これらの細胞を選択した。なぜなら、それらの極めて低レベルのＷｎｔ−５ａによって、このペプチドのＷｎｔ−５ａ依存性の効果がより簡単に確認されるようになるからである。代表的なブロットおよび蓄積された濃度測定分析から示されるとおり、ペプチド番号１６８、１６９、１７０および１７５（１００μＭ）は、有意なＤＤＲ１のリン酸化を生じた。これらのペプチドの純度は、最初のスクリーニングで（図１および２）、ＨＰＬＣ分析によって決定されるとおり約６５％であった（データ示さず）。４つのペプチド（１６８、１６９、１７０および１７５）の存在下で、コラーゲンＩへ接着する細胞の割合を次に決定し、ここで図１で、ＤＤＲ１のリン酸化反応が可能であった。ペプチド１７１を陰性コントロールとして、そしてＷｎｔ−５馴化培地（ＣＭ）を陽性コントロールとして含んだ。その結果、ペプチド１６８は、接着になんら効果を有さなかったが、推定される陰性コントロールペプチドは、接着に有意な影響を有したことが示される（図２Ａ）。ペプチド１７１の存在下でＤＤＲ１のリン酸化が観察されなかったという事実によって（図１Ａ）、ペプチド１７１が接着に影響する機構はＤＤＲ１に非依存性であるという疑いが論理的になる。なぜならＤＤＲ１の活性化は、β１−インテグリン非依存性であり（２２）、Ｗｎｔ−５ａ−依存性哺乳動物細胞接着が、抗β１インテグリンＡｂとのプレインキュベーションに非感受性であるので（１２）、懸濁されたＨＢ２細胞を、３７℃で４５分間、ブロッキングモノクローナル抗β１インテグリンＡｂとともに前処理した。この結果、コントロールペプチド１７１によって生じた接着の増大は、β１インテグリン依存性である可能性が高いことが明らかになった（図２Ｂ）。これらの効果を、ペプチド１７５の効果と比較した（図２Ｂ）。この文脈では、これらの６５％純粋なペプチドのどれも、ＨＢ２細胞接着をＣＭの程度まで増大しなかったことが指摘されるべきである（図２Ａ）。図２のＣＭの効果がＷｎｔ−５ａによって媒介されたことを確認するために、ＣＭをＷｎｔ−５ａおよびタンパク質Ａで前処理し、そしてＷｎｔ−５ａを欠く方法によって、実験を行なった。これらのコントロール実験によって、Ｗｎｔ−５ａを欠くＣＭは、接着に影響を有さなかったことが明らかである（図２Ｃ）。
【００２３】
【化１５】
2008542368.tif 000009
ＡＷｎｔ−５ａ配列における３つのシステインを、ペプチド中のアラニン（Ａ）に交換した
Ｂペプチド１７５に基づいて伸長した配列
内因性のＷｎｔ−５ａ発現が低いＨＢ２細胞の接着を増大する能力を有するＷｎｔ−５ａタンパク質由来の４つのペプチドフラグメントを同定しており（図２Ａ）、次にこれらのペプチドの濃度依存性分析を行ったが、ここではより高純度であった（ＨＰＬＣによって決定した場合９５％）。明らかに、１７５のペプチドが、コラーゲン１に対するＨＢ２細胞接着を増大するのに最も有効であった（図３Ａ〜３Ｄ）。ペプチド１６９の効果は、より高純度で試験した場合増大したが、ペプチド１７０および１７１の効果は、この高純度では、失われたかまたは確実性が劣った。９５％純度のペプチド１６９および１７５の同時の添加では、ペプチド１７５単独と比較してＨＢ２細胞の接着をさらに増大はしなかった（データ示さず）。理論的な理由付けに基づいて、Ｗｎｔ−５ｂ分子の活性部分が２０アミノ酸長であるということが以前に示唆されている。十分興味深い事に、本発明のペプチド１７５は、Ｗｎｔ−５ａ分子内の対応するドメイン内に含まれる。従って、細胞接着に対するＷｎｔ−５ａタンパク質の前に示唆された活性部位に完全に対応するペプチドとするために、８アミノ酸をさらに失っているペプチド１７５の有効性が改善され得るか否かという考えを検討した。明らかに、２０アミノ酸長のペプチド１７４（表１）は、コラーゲンＩに対するＨＢ２細胞の接着を増大するのにおいて、より短いペプチド１７５ほど有効ではなかった（図３Ｅ）。
【００２４】
ＨＢ２細胞においてＷｎｔ−５ａタンパク質を増大することは、おそらく、コラーゲンへの接着の増大に起因して、コラーゲンゲルでのＨＧＦ誘導性の遊走を阻害することが示されている（１０）。細胞接着に対するペプチド１６９および１７５の以前に観察された効果に起因して、Ｗｎｔ−５ａの低いＨＢ２細胞の遊走に対するこれらのペプチド（９５％純度）の効果を次に検討した。方法の節に記載されるとおり、この細胞を、９５％純度のペプチド１６９または１７５（１００μＭ）の有無において１８時間、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバ中で遊走させた。それぞれ陽性および陰性のコントロールとして、精製された組み換えＷｎｔ−５ａ（０．４μｇ／ｍｌ）または９５％純度のペプチド１７１（１００μＭ）を添加した。ペプチド１６９および１７５の両方、ならびに組み換えＷｎｔ−５ａは、Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞の遊走を効率的に低下させた（図３Ｆ）。コントロールのペプチド１７１は、遊走に影響を有さなかった（図３Ｆ）。
【００２５】
Ｗｎｔ−５ａ欠損ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞の接着および遊走に対するペプチド誘導性の影響。
乳癌細胞においてＷｎｔ−５ａシグナル伝達を再構成し、それによってその転移能力を潜在的に障害する目的に基づいて、純粋なペプチド１６９、１７５およびコントロールペプチド１７１の効果を次に、Ｗｎｔ−５ａを欠くヒトＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞のコラーゲンＩに対する接着に対して検討した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＷｎｔ−５ａタンパク質発現のレベルは、Ｗｎｔ−５ａアンチセンスおよびＨＡ−Ｗｎｔ−５ａ過剰発現ＨＢ２細胞の両方に関して最初に分析した。図４Ａに示されるとおり、Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の両方が、低タンパク質レベルのＷｎｔ−５ａを有するが、Ｗｎｔ−５ａでトランスフェクトされた細胞は、極めて高レベルのＷｎｔ−５ａタンパク質を発現する。Ｗｎｔ−５ａの発現は、培養条件に依存し、そしてまたこの細胞が分析の時点でどの程度コンフルエントであるかにも依存することが公知である（２３）。結果として、図４Ａにおいて分析された細胞を、後の実験と同じ条件下で、すなわち８０〜９０％コンフルエンスで、そして他に言及しない限り、各々の実験の前に１６時間、無血清培地で処理した後に回収した。
【００２６】
コラーゲンＩに対するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の接着は、ペプチド１６９および１７５の存在下で、そしてＷｎｔ−５ａ含有ＣＭによって有意に増大されたが、コントロールペプチド１７１によっては増大されなかった（図４Ｂ）。１つ以上の遊離システインを含むペプチド、例えば、ペプチド１７５は、異なるタンパク質／ペプチドとのシステイン−システイン相互作用を形成することによって非特異的な影響を有し得る。細胞接着に対するペプチド１７５の影響が、そのシステイン残基に関連するか否かを検討するために、システイン含有ペプチド１７５の影響を、システインがアラニン残基で置換されていること以外は１７５ペプチドと同一のペプチドの影響と比較した。アラニン含有１７５は、接着を増大するのにおいて、システイン含有１７５と同じ程度に有効であって、システイン含有１７５ペプチドとアラニン含有１７５ペプチドとの間で統計的に有意な相違が観察されなかったことが見出された（図４Ｃ）。
【００２７】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞での観察の増大は、定常的であるが、ＤＤＲ１の中度のリン酸化レベルが基礎的な状況でさえ見られ、Ｗｎｔ−５ａもペプチドも存在しない（図４Ｄ）。さらに、純粋なペプチドも、ＣＭも組み換えＷｎｔ−５ａもＭＤＡ−ＭＢ  ４６８細胞においてＤＤＲ１のリン酸化のレベルをさらに増大できなかった（図４Ｄ）。ＭＣＦ−７およびＨＢ２細胞におけるＤＤＲ１のＷｎｔ−５ａ−依存性コラーゲン誘導性リン酸化は、Ｓｒｃキナーゼを介して媒介されることが以前に示されている（１２）。結果として、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、１０μＭのＳｒｃインヒビター４−アミノ−５−（４−メチル−フェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピロゾロ−Ｄ−３，４−ピリミジン（ＰＰ１）を用いて３０分間処理した。明らかに、この処理は、ＤＤＲ１の基礎的なリン酸化を廃した（図５Ａ）。この観察は、血清の存在とは独立しているがＰＰ１によって廃されることがここで確認されそして示されている、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８における以前に報告された高いＳＲｃキナーゼ活性と申し分なく相関している（図５Ｂ）。これらの細胞におけるＳｒｃ活性の上昇は、ＥＧＦレセプターの過剰発現および機能亢進に起因することが示唆されている（２５）。これと一致して、ＥＧＦレポーターは、豊富に発現され、そして１６時間の血清枯渇後でさえＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において高度にリン酸化される（図５Ｃ）。可能性として、このＥＧＦレセプターの機能亢進および得られた高Ｓｒｃ活性は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞において観察された定常的なＤＤＲ１のリン酸化の背後にある原因である。これらの知見は、Ｗｎｔ−５ａ模倣ペプチドを特定する現在の労力には直接関係していないが、それらによって、ｉ／  ＤＤＲの活性化が、Ｗｎｔ−５ａが乳腺細胞接着および運動に影響する唯一の手段ではないということ、そしてｉｉ／  Ｗｎｔ−５ａシグナル伝達とは離れた他の機構は、Ｓｒｃ活性化を介してコラーゲン誘導性ＤＤＲ１活性化をし得るということが明らかになる。
【００２８】
遊走は、ガンの浸潤および転移の必要条件であること、そしてＢｏｙｄｅｎチャンバシステムにおける細胞遊走の増大が、インビボにおける腫瘍細胞の浸潤特性の増大と相関しているということが公知である。従って、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞運動性に対する、純粋なペプチド１７１（コントロール）、１６９および１７５の効果を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイにおいて検討した。ペプチド１６９および１７５の両方が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の遊走を有意に減少させたが、コントロールペプチド１７１は、統計学的に有意な影響を有さなかった（図６Ａ）。実験の開始前に、ウェルおよびメンブレンを、コラーゲンＩ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１時間コーティングした場合に同じ結果が得られた（データ示さず）。ついでに、ペプチド１７５に曝されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ（登録商標）４８８ファロイジンで染色することによってここで可視化された、未処理の細胞に比較して、糸状アクチン（Ｆ−アクチン）の有意に高い細胞含量を有したことが観察された（図６Ｂ）。増大されたＤＤＲ１活性化の非存在下で、このＦ−アクチンの増大は、接着におけるペプチド誘導性の増大、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の運動性の障害をよく説明し得る。なぜなら、Ｆ−アクチン含量の増大は、細胞をより強固にし、従って運動性を低くすることが公知であるからである。
【００２９】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞の接着および遊走に対する１７５ペプチド誘導性の影響に対するアミノ酸の連続的欠失およびホルミル化の影響。
依然として接着性の効果および抗運動性効果を有する可能性のある最短のペプチドを特定するために、１７５ペプチドである２つの同定された活性なペプチドの短い方のＮ末端側から２つのアミノ酸の連続的な欠失を行った。腫瘍細胞接着に対する影響は、ある時点で２つのアミノ酸がペプチド１７５から除去された場合、徐々に失われ、そして６アミノ酸のみが残った場合、影響は検出不能であった（図７Ａ）。細菌由来のＮホルミル化ペプチドリガンドが、これらの細胞上のＧタンパク質カップリングレセプターに対する結合によって白血球を強力に活性化し得るということは周知である。この文脈では、ホルミル基は、このリガンド効果を３または４倍の大きさまで増大する。十分興味深いことに、このような細菌ペプチドおよびＷｎｔ−５ａは、Ｇタンパク質結合レセプターに結合し、そしてこれらの細菌ペプチドおよび本発明者らのヘキサペプチドのいくつかは、それらのＮ末端でメチオニン残基を有する。従って、本発明者らは、細胞接着に対する本発明者らのヘキサペプチドのホルミル化改変体の影響を試験した。このヘキサペプチドのＮ末端メチオニンのホルミル化は、接着に対するその影響を修復して、可能性としては増強さえした（図７Ａ）。コントロール実験によって、白血球を活性化することが公知のホルミル化トリペプチドｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（１９）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞接着に影響しなかった（コントロール１５．３±３．６、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ  １５．７±４．５；ｎ＝６）ことが明らかになった。これによって、ホルミル化ヘキサペプチドの影響を媒介するのにおけるＷｎｔ−５ａヘキサペプチド配列の特定の役割が示される。細胞接着に対するホルミル化ヘキサペプチドおよびペプチド１７５の影響に従って、１０μＭ程度の低濃度で、両方のペプチドともＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の運動性を有意に障害したことがまた示され得る（図７Ｂおよび図７Ｃ）。
【００３０】
滑膜細胞および悪性黒色腫細胞において以前に示されているとおり、ホルミル化ヘキサペプチドおよび組み換えＷｎｔ−５ａが、乳腺細胞におけるＦｒｚ−５レセプターに対して結合する実際にリガンドであることを確認するために、Ｆｒｚ−５レセプターについて前に記載されたブロッキングＡｂが生成されて、コントロールＡｂが、Ｆｒｚ−２レセプターの外部ドメインにおける同じ配列に対して上昇された。図８Ａにおけるブロットで、これらの２つのアフィニティー精製されたＡｂが、それぞれＦｒｚ−２およびＦｒｚ−５レセプターの分子量に完全にマッチするタンパク質のバンドを特異的に認識することが示される。Ａｂを抗原ペプチドであってそれに対して上昇される抗原ペプチドとプレインキュベートする（１：１０モル比）ペプチドブロッキング実験も行なった。引き続くウエスタンブロット分析では、Ｆｒｚ−２およびＦｒｚ−５レセプターの検出は、フィルムが重度に過剰露光された場合でさえ検出不能であった（図８Ａ、それぞれレーン２および４）。悪性黒色腫由来の前のデータと一致して（１４）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞遊走におけるＷｎｔ−５ａ誘導性の減少は、Ｆｒｚ−５レセプターを介して媒介されることが示され得るが、コントロールの抗Ｆｒｚ−２Ａｂは、影響を有さなかった（図８Ｂ）。十分興味深い事に、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞遊走に対するホルミル化ヘキサペプチドの影響は、Ｆｒｚ−５レセプターを介して媒介されることも実証され得る（図８Ｂ）。インビボでの腫瘍細胞遊走を阻害する文脈では、当業者は、乳房腫瘍組織において遭遇されるｐＨがほぼ６．７であるということを思い出さねばならない。結果として興味深い事に、ホルミル化ヘキサペプチドは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞遊走を阻害することにおいて、ｐＨ６．７でｐＨ７，４と同様に有効であるということが観察された（図８Ｃ）。
【００３１】
本発明の検討では、Ｗｎｔ−５ａタンパク質配列由来の種々のペプチドを生成して、乳癌細胞運動性の阻害に関してＷｎｔ−５ａ模倣能力を有するこれらのうち２つを特定した。Ｗｎｔ−５ａは、多くの他のタンパク質リガンドと同様、その表面で少なくとも１つの溶媒露出されたループを通じてそのレセプターと相互作用相する可能性が高いことが判定された。Ｗｎｔ−５ａの実験的な三次元構造は未知であるので、相同性モデリング方法は、適切なテンプレートがないせいで適用され得ない。従って、Ｗｎｔ−５ａのどのセグメントが溶媒露出されたループを形成し得るかを推測するために、ＰＨＤで二次／溶媒アクセス可能な表面予測を行った。この結果（表１に報告される）本発明者らは最初に、わずか８〜１５アミノ酸長のペプチドの研究に集中することが可能になった。
【００３２】
以前にいくつかのペプチドリガンドであって、それらのうちで、インテグリンレセプターリガンドとして機能する十分確立されたトリペプチドであるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、ならびにＧタンパク質カップリングプロテアーゼ活性化レセプター１および４を特異的に活性化し得る２つのヘキサペプチドが首尾よく同定されている（１８）。別の例だが、この時点では拮抗作用を有するのは、Ｇタンパク質結合トロンビンに結合するセプタペプチドである（３０）。この研究では、哺乳動物細胞接着に対するペプチド誘導性の効果を、一次スクリーニングアプローチとして用いた。この時点まで、戦術的な２つのペプチドが同定されており、これは高純度（９５％）で、非ガン性のＨＢ２細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ガン細胞（Ｗｎｔ−５ａタンパク質の内因性レベルが極めて低い細胞株）の両方で濃度依存性の様式でコラーゲンＩに対する接着を増大した。Ｗｎｔ−５ａの効果と同様の抗運動性効果を依然として有する可能性のある最短のペプチドを特定するために、これらの２つのペプチドのうち短い方（１２アミノ酸長）のＮ末端から２つのアミノ酸の順次の欠失を行った。オクタペプチドは、依然として接着増大効果を有するが、ヘキサペプチドは有さないことが見出された。しかし、このヘキサペプチド上のＮ末端アミノ酸がメチオニンであったというのが事実であり、これによって、細菌由来のｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−ＰｈｅペプチドのＮ末端メチオニンのホルミル基によって発揮される強力な促進効果が思い起こされた（１９、３１〜３３）。Ｎ−ホルミル化メチオニンは、全ての細菌タンパク質の合成における開始アミノ酸である。感染の間、多数の細菌を種々の理由で分解して、このプロセスの間、細菌から短いＮホルミル化ペプチドの放出がある。これらのペプチドは、これらの細胞上のＧタンパク質カップリングホルミルペプチドレセプターに対するそれらの高い親和性結合によって、白血球の極めて強力な活性化因子である（３１、３３）。
【００３３】
ヘキサペプチド配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕは、哺乳動物細胞におけるＷｎｔ−５タンパク質に固有であるが、それは細菌中の２つの異なるタンパク質に存在する。しかし、いずれの場合もＮ末端位置にヘキサペプチド配列を有することはなく、従って、ホルミル化状態では存在し得ない。結果として、現在記載されるＮホルミル化ヘキサペプチドは、細菌細胞にも哺乳動物細胞にも見出され得ない固有のペプチドである。この状況では、白血球を活性化する強力なトリペプチドであるＮ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞接着に影響を有さなかったと言わなければならず、このことによって、単なるホルミル化ではないペプチドがこれらの細胞上のＦｒｚ−５レセプターに結合して活性化することが示されている。
【００３４】
Ｗｎｔ−５ａ発現の損失は乳癌細胞接着の減少を、従って運動性の増大をもたらすということが以前に示されている。これらの結果を、細胞遊走の増大が、ガン転移の背景にある問題であるという知識と一緒にして、本発明者らは、乳癌細胞に対するホルミル化ヘキサペプチドの抗運動性効果を検討することが切望された。これらの実験は、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバで行なった。なぜなら、このようなアッセイでの腫瘍細胞の運動性活性は、それらのインビボでの浸潤性挙動とよく相関することが以前に示されているからである。ホルミル化ヘキサペプチドが、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞接着に有する影響とよく一致して、これもそれらの遊走を強力に阻害した。ＤＤＲ１が接着および遊走に対する影響を担うと考えられた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞がペプチド、ＣＭまたは組み換えＷｎｔ−５ａの有無において一定のＤＤＲ１リン酸化を示すという事実によって、Ｗｎｔ−５ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞遊走に影響するさらなる機構を通じて作用し得るということが示される。運動性の低下と平行したＦ−アクチンにおける有意なペプチド誘導性の増大の観察によって、細胞のＦ−アクチン媒介性の固着は、それらの強力な接着および運動性の低下についての別の説明であり得るということが示唆される。遊走に対して有意な影響を有したホルミル化ヘキサペプチドの最小濃度は、１０μＭであって、これは、Ａｎｄｅｒｓｅｎおよび共同研究者による知見とよく一致しており、彼らは、血小板中のそれらのヘキサペプチドの最低の機能的濃度は１０μＭであることを見出した。
【００３５】
本発明の知見の強力な臨床的な相違は明白である。哺乳動物腫瘍細胞における内因性Ｗｎｔ−５ａタンパク質発現の欠失は、より高度の組織学的段階およびこれらの患者の無病生存の減少と強力に相関するという事実（９）によって、このような腫瘍細胞においてＷｎｔ−５ａシグナル伝達を再構成し、それによって遠位転移の形成を遅延または阻害する方法の必要性が示される。さらに、Ｗｎｔ−５ａシグナル伝達の再構成はまた、他の腫瘍形態での将来の治療的アプローチであると考えられる。なぜなら、Ｗｎｔ−５ａは、甲状腺癌で腫瘍抑制活性を有することが示されており、そしてＷｎｔ−５ａ発現の損失は、高リスク神経芽細胞腫と関連するからである。
【００３６】
不十分な血管新生および乳酸塩産生の増大に起因して、固体腫瘍組織における細胞外ｐＨは正常な組織においてよりも低い。しかし、ヒト乳癌において、Ｎａ＋−Ｈ＋交換アイソフォーム１はまた、細胞外ｐＨおよび細胞内ｐＨの両方の調節に関与することが示唆されている。従って、腫瘍組織において遭遇される低いｐＨでも有効である潜在的な転移阻害物質が極めて重要である。インビボで固形腫瘍組織におけるｐＨを評価する試みによって、これがほぼ６．７５であると見積もった。十分興味深い事に、本発明のデータによって、同定されたホルミル化ヘキサペプチドが、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞運動性を、低いｐＨ（６．７）で正常なｐＨ（７．４）と同様に阻害するということが示される。
【００３７】
結果として、Ｗｎｔ−５ａリガンド由来の新規なホルミル−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕペプチドリガンドが、内因性Ｗｎｔ−５ａタンパク質発現の低いヒト乳癌細胞株のＦｒｚ−５レセプターに対する結合において、そして運動性能力を阻害するのにおいて、全長Ｗｎｔ−５ａ分子の影響を模倣する能力を有するということが確立されている。このペプチドリガンドは、Ｗｎｔ−５ａの内因性発現の低下を示す乳癌と診断されている患者（約５０％）のための革新的な抗転移処置の将来の開発のためのモデル物質として機能し得る。
【００３８】
（方法）
（細胞培養）
ＨＢ２乳腺上皮細胞株、ＭＴＳＶ−１．７細胞株のサブクローンであって、Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ（１１）の研究室に由来する細胞株を用いた。ＨＢ２細胞は、１０％のＦＢＳ、５Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、１０μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８を、１０％ＦＢＳ、５Ｕ／ｍｌペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ｐＨ実験は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．５％のＢＳＡ、５Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを補充したＭＥＭ中で行った。このｐＨ７．４の培地に４ｍＭの炭酸水素ナトリウムをさらに補充したが、ｐＨ６．７の培地には、補充しなかった。全ての細胞を３７℃で９５％空気および５％ＣＯ２中でインキュベートした。
【００３９】
（化合物および試薬）
Ａｂおよび化合物の供給源は以下のとおりであった：抗アクチンモノクローナルＡｂＣ４（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、抗−β１インテグリンモノクローナルＡｂ  Ｐ５Ｄ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、コラーゲン、ラット・テール由来のＩ型および抗−ＥＧＦ−レセプターＡｂ（活性型）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、抗−ＥＧＦ−レセプターＡｂ（全ての型）および抗−ホスホロチロシンモノクローナルＡｂ  ４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｉｎｃ．Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、ＰＰ１（Ｂｉｏｍｏｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）、組み換えマウスＷｎｔ−５ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、抗−Ｓｒｃ  Ａｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗−Ｓｒｃ［ｐＹ４１８］（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ試薬（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
【００４０】
（ペプチド合成）
ほとんどの場合、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）が、Ｗｎｔ−５ａ分子由来の種々のペプチドフラグメントを合成した。しかし、１２アミノ酸長の１７５ペプチド由来のより短いペプチドおよびホルミル化ペプチドは、Ｐｅｐｓｃａｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって合成された。全ての他の実験試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【００４１】
（レセプターブロッキング抗体）
ヒトＦｒｚ−５レセプターの外部ドメインにおけるアミノ酸２９８〜２１７に対応するペプチドＣＰＩＬＫＥＳＨＰＬＹＮＫＶＲＴＧＱＶＰＮを、Ｆｒｚ−５レセプターブロッキングＡｂを生成するために前に記載されたとおり用いた（１３）。ヒトＦｒｚ−２レセプターの外部ドメインにおけるアミノ酸２０２〜２２０に相当する、ペプチドＣＰＲＶＬＫＶＰＳＹＬＳＹＫＦＬＧＥＲＤを用いて、コントロールの抗Ｆｒｚ−２Ａｂを生成した。ペプチドの合成（イタリック体は、Ｆｒｚ−５およびＦｒｚ−２配列を示しており、システインはＡｂを上昇および精製するために添加された）ならびにウサギ抗−Ｆｒｚ−５および抗−Ｆｒｚ−２抗血清の産生を、ＡｇｒｉＳｅｒａ（Ｖａｅｎｎａｅｓ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｕｍｅａｅ動物倫理委員会（ａｎｉｍａｌ  ｅｔｈｉｃ  ｃｏｍｍｉｔｔｅ）からのＡ６９−０４を可能にする）によって管理した。この抗血清は、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに対してそれぞれのペプチド抗原を結合させ、次いでその上でそれぞれの抗血清を溶出させることによって実験室でアフィニティー精製した。
【００４２】
（免疫沈降およびウエスタンブロット）
ウエスタンブロットブロット分析を行って、ＨＢ２およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＷｎｔ−５ａ、ＥＧＦ−レセプター、ＳｒｃおよびＦｒｚ−２および５のタンパク質発現を評価した。明らかに、本発明の研究において用いたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のバッチは、低いＷｎｔ−５ａ発現レベルを有した。Ｗｎｔ−５ａ  Ａｂは、前に記載されたとおり（９、１０）、実験室で生成した。この細胞を、２倍濃縮したＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で溶解して煮沸させた。タンパク質含量を、各々のサンプル中で決定し、そして各々のレーンに確実に等量のタンパク質をロードするように調節し、次いで５０ｍＭ  ＤＴＴを添加して、その溶解物を、ＳＤＳゲル電気泳動による分離の前に、１０分間煮沸した。このタンパク質を引き続き、ＰＶＤＦメンブレンに移した。このメンブレンを３％のＢＳＡまたは５％の脱脂乳中で４５分間ブロックして、一次抗体とともに１時間（Ｗｎｔ−５ａについては１：２，０００、活性化ＥＧＦ−レセプター、総ＥＧＦ−レセプター、アクチン、活性なＳｒｃおよび総Ｓｒｃについては１：１，０００、そしてＦｒｚ−２およびＦｒｚ−５については１：５，０００）、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次Ａｂとともに１時間インキュベートした。このＡｂ−抗原複合体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の増感化学発光検出キットを用いて検出した。再プローブの場合、このメンブレンをＣｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）のＲｅｂｌｏｔ  Ｓｔｒｏｎｇ溶液で剥がした。
【００４３】
ＤＤＲ１のリン酸化状態は、以下の改変を伴い前に記載のとおり（１２）分析した。１６時間の血清枯渇後、細胞をＶｅｒｓｅｎｅで剥がし、次いで、３７℃で６０分（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）または９０分（ＨＢ２）間、コラーゲンＩに接着させた。この実験は、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．４、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２．５ｍＭのベンザミジン、１ｍＭのペファブロック（ｐｅｆａｂｌｏｃ）、１μｇ／ｍｌのロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）および１ｍＭのＮａ３ＶＯ４）を用いた接着および非接着細胞の両方を溶解することによって終わらせた。免疫ブロットのために、抗−ＤＤＲ１ウサギポリクローナルＡｂ、ｓｃ−５３２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、１：１０，０００の希釈で用いた。このＡｂは、乳房上皮細胞におけるＤＤＲ１のｂまたはｃアイソフォームのリン酸化をコラーゲンのみが誘導するので必須であるＤＤＲ１ｂ／ｃを認識する（１０）。
【００４４】
（接着アッセイ）
接着アッセイは、前に記載されたとおり（１２）に行った。要するに、細胞を１６時間血清枯渇させて、Ｖｅｒｓｅｎｅで剥がし、そして３７℃で６０分（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）または９０分（ＨＢ２）間、コラーゲンＩに対して単一の細胞として接着させた。非接着細胞を、ＰＢＳで洗浄することによって取り出した。この接着細胞を、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムとともにインキュベートして、内部塩（ＭＴＳ）色素還元アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）および吸光度を、ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＦｌｕｏｓｔａｒマイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍで測定した。各々の実験において、単一の値を、プラスチック単独への接着を差引きした後に、６つの別々のウェルからの接着の平均に基づいて算出した。接着アッセイにおけるコントロールとして用いたＣＭは、Ｗｎｔ−５ａを過剰発現するベクターで安定にトランスフェクトされた、コンフルエントなＷｎｔ−５ａ過剰発現ＨＢ２細胞（Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞での実験について）またはＷｎｔ−５ａ過剰発現ＭＣＦ−７細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞について）から得た。
【００４５】
（ＣＭのコントロール）
ＣＭの特異性を制御するために、ＣＭをＷｎｔ−５ａまたはコントロールのＡｂのいずれかとともに３７℃で４５分間インキュベートした。引き続き、１０μｌのプロテインＡセファロースを、３０分間添加して、その後、プロテインＡ結合した抗体を、遠心分離によって収集して、残りの上清を実験のために用いた。
【００４６】
（細胞遊走アッセイ）
細胞遊走分析は、２つのチャンバ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）；Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を隔てる、ポリカーボネートメンブレン（１０μｍの厚みであって８．０μｍの小孔直径である）を備える改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバ中で行なった。いくつかの実験で示されるとおり、このメンブレンを、上部チャンバに０．２５％の酢酸に希釈したコラーゲン−Ｉ（１０μｇ／ｍｌ）を添加することによって、コラーゲンで３７℃において１時間コーティングして、その後に、これをＰＢＳで３回洗浄した。各々の実験を、３７℃で１０〜２０分間Ｖｅｒｓｅｎｅ処理によって細胞を剥がすことによって開始し、洗浄して、０．５％ＢＳＡを補充した無血清ＤＭＥＭ培地中において単細胞懸濁液として再懸濁した。示したアゴニストと一緒に、０．２ｍｌの細胞懸濁液（２５，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−４６８または５０，０００個のＨＢ２細胞を含む）を次に、トランスウェルの上部チャンバに添加した。下部チャンバを、０．６ｍｌの無血清だがＢＳＡを含有するＤＭＥＭ培地であって、１ｎｇ／ｍｌの化学誘引物質ＩＧＦ−Ｉを補充した培地で充填した。コントロールとして、ＩＧＦ−Ｉは、各々の別個の実験でいくつかのウェルでは除いた。この細胞を、９５％空気および５％ＣＯ２の加湿雰囲気中において３７℃で１８時間Ｂｏｙｄｅｎチャンバ中で遊走させた。この実験は、メンブレンの上部表面から綿棒で非遊走性細胞を除去することによって終わらせた。このメンブレンを通じて遊走した下部表面上の残りの細胞を、２０％メタノール／８０％水中に希釈した０．５％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。このメンブレンを洗浄した後、１つのメンブレンおよびウェルあたりの染色細胞の数を、倒立顕微鏡でカウントした。各々の別の実験からの値は、３つの個々のウェルの中央値を示す。
【００４７】
（蛍光顕微鏡）
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、３７℃で１０分間のＶｅｒｓｅｎｅとのインキュベーションによって組織培養ディッシュから剥がし、洗浄し、ペプチド１７５（１００μＭ）の有無において０．５％ＢＳＡを補充した無血清ＤＭＥＭ培地中で単独細胞として再懸濁し、そして細胞培養ディツシュ中で、１０μｇ／ｍｌのコラーゲン−Ｉでプレコーティングしたカバーガラス上にプレートした。これらの実験は、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で１０分間、細胞を固定することによって１８時間後に終わらせた。次いで、この細胞を、０．５％のＴｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００とともに５分間インキュベーションすることによって透過化処理し、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を補充した３％のＢＳＡ溶液と４５分間インキュベーションすることによってブロックした。細胞の染色を、４０分間、ＡｌｅｘａＦＩｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と、１：５００の希釈で１％のＢＳＡの存在下で、４０分間インキュベーションすることによって暗野で行った。その後に、この細胞を徹底的に洗浄して、最終的に、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ蛍光マウンティング培地を用いてマウントした。このサンプルを試験して、６０×の油浸対物レンズを用いてＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８００顕微鏡で写真を撮った。
【００４８】
（薬学的処方物）
薬剤として使用する場合、本発明の化合物は通常、薬学的組成物の形態で投与される。これらの化合物は、経口および直腸を含む種々の経路によって投与され得る。これらの化合物は、経口組成物として有効である。このような組成物は、製薬の当該分野で周知の様式で調製されて、少なくとも１つの活性化合物を含む。
【００４９】
本発明はまた、薬学的組成物を含み、これは、活性成分として、薬学的に受容可能なキャリアに会合した、本明細書に記載される１つ以上の化合物を含む。本発明の組成物を作製するのには、活性成分を通常、賦形剤と混合するか、賦形剤によって希釈するか、またはこのようなキャリア内に包含し、これはカプセル、子袋（ｓａｃｈｅｔ）、紙または他の容器の形態であってもよい。賦形剤が希釈剤として機能する場合、これは、固体、半固体または液体の物質であってもよく、これは、活性成分のためのビヒクル、キャリアまたは培地として機能する。従って、この組成物は、錠剤、丸剤、粉末、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、子袋（ｓａｃｈｅｔｓ）、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔｓ）、エリキシル、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、軟性および硬性のゼラチンカプセル、坐剤およびパッケージされた粉末の形態であってもよい。
【００５０】
処方物を調製するには、他の成分と組み合わせる前に、適切な粒子サイズを得るために活性化合物を粉砕することが必要であり得る。活性化合物が実質的に不溶性である場合通常、２００メッシュ未満の粒子サイズまで粉砕される。この活性化合物が実質的に水溶性である場合、この粒子サイズは通常、粉砕することによって調節されて、処方物中で実質的に均一な分布、例えば、約４０メッシュが得られる。
【００５１】
適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム（ｇｕｍ  ａｃａｃｉａ）、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。この処方物としては、さらに以下を挙げることができる：潤滑剤、例えば、滑石、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；防腐剤、例えば、メチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエート；甘味料；および香味量。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによって、患者への投与後、活性成分の急速、徐放性または遅延性の放出を得るように処方され得る。
【００５２】
この組成物は好ましくは、単位剤形で処方される。「単位剤形（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ）」という用語は、ヒト被験体および他の哺乳動物のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位であって、各々の単位が、適切な薬学的賦形剤と関連して、所望の治療効果を得るために計算された、予め決定された量の活性物質を含む単位をいう。好ましくは、上記の式（Ｉ）の化合物を、薬学的組成物の約２０重量パーセント以下で、より好ましくは、約１５重量％以下で使用し、このときのバランスは、薬学的に不活性なキャリア（単数または複数）である。
【００５３】
この活性化合物は、広範な投薬範囲にわたって有効であり、一般には薬学的に有効な量で投与される。例えば、薬物が、経口経路を介して投与される場合、各々の投薬量は、活性成分の約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約２ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、さらに好ましくは約５ｍｇ〜約６０ｍｇを含む。しかし、現実に投与される化合物の量は、処置される状態、投与の選択経路、投与される実際の化合物およびその相対的な活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重篤度などを含む、関連の状況に照らして、医師によって決定されることが理解される。原則的な観点から、この処方物は、食物摂取と同時に投与されなければならず、次いで、脂質の十分な阻害を提供する量で投与されなければならない。従って、身体は、栄養的な観点からある程度の脂質を必要とし得、次いでこれは、投与される本発明の化合物を阻害する量に影響し得る。本発明の化合物の影響は、小腸に起こり、従って、その化合物の潜在的な代謝物のではないが、それ自体で得られるさらなる影響はない。
【００５４】
固体組成物、例えば錠剤を調製するために、主な活性成分を薬学的賦形剤と混合して、本発明の化合物の均一な混合物を含む固体の前処方組成物を形成する。これらの前処方組成物が均一であるという場合、この活性成分は、この組成物全体に均一に分散されており、その結果この組成物が、錠剤、丸剤およびカプセルのような等しく有効な単位剤形に容易に分割され得るということを意味する。次いで、この固体の前処方物を、本発明の活性成分を含有する上記のタイプの単位剤形に分割する。
【００５５】
本発明の錠剤、丸剤、顆粒をコーティングするか、またはそうでなければ、配合して、長期間作用という利点を与える剤形を得てもよい。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与および外部投与の成分を含んでもよく、この後者は前者を覆うエンベロープの形態である。この２成分は、腸溶性層によって隔てられ得、この層は、胃での分解に抵抗するように機能し、そして内部成分が十二指腸にまるごと通過するか、または放出が遅れることを可能にする。種々の物質を、このような腸溶性層またはコーティングのために用いてもよく、このような物質としては、多数のポリマー酸およびポリマー酸とセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような物質との混合物が挙げられる。
【００５６】
本発明の錠剤、丸剤または顆粒は、膵臓リパーゼが腸へ解放される、膵臓で遊離し得る徐放性コーティングでコーティングされてもよい。従って、このような徐放性コーティングは、もしあれば胃でのわずかな放出を可能にするが、小腸の上部での完全な放出を可能にする。
【００５７】
例えば、錠剤は、圧縮または成型によって調製されてもよい。圧縮された錠剤は、適切な機械中で、本発明の組成物を、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤および／または表面活性剤もしくは分散剤と必要に応じて混合された、自由流動型、例えば、粉末または顆粒に圧縮することによって調製されてもよい。成型された錠剤は、適切な機械中で、不活性な液体希釈物と湿らせた粉末化化合物との混合物を成型することによって作製されてもよい。
【００５８】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤とは、結合剤、充填剤、またはそれらの混合物である。適切な賦形剤としては、潤滑剤、崩壊剤およびそれらの混合物が挙げられる。好ましい賦形剤としては、限定はしないが、ラクトース、クロスカルメロース、微結晶性セルロース、アルファ化デンプンおよびステアリン酸マグネシウムが挙げられる。
【００５９】
本発明の薬学的組成物の投薬処方物を調製するために適切な結合剤としては、限定はしないが、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたは他のデンプン、ゼラチン、天然および合成のガム、例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末化トラガカント、グアーガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチル・セルロース・カルシウム、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（例えば、Ｎｏ．２２０８、２９０６、２９１０）、微結晶性セルロースおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
微結晶性セルロースの適切な形態としては、例えば、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３およびＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５（Ｍａｒｃｕｓ  Ｈｏｏｋ，Ｐａ．のＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｉｓｃｏｓｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手可能）として販売される物質が挙げられる。特に適切な結合剤は、微結晶性セルロースおよびＦＭＣ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによりＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１として販売されるカルボキシルメチル・セルロース・ナトリウムの混合物である。
【００６１】
本発明の化合物の剤形としての使用に適切な充填剤の例としては、限定はしないが、滑石、炭酸カスリウム（例えば、顆粒または粉末）、微結晶性セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、サリチル酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプンおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００６２】
代表的には、本発明の固体剤形の約５０〜約９９重量％が結合剤および／または充填剤である。
【００６３】
崩壊剤を用いて、水性の環境に曝されたとき錠剤を分解させる。錠剤を生成するのに崩壊剤が多すぎれば、錠剤は大気中の湿度に起因してボトル中で崩壊し得る；少な過ぎれば、崩壊が生じるのに不十分であり得、従って、この剤形からの本発明の化合物の放出の速度および程度が変更され得る。従って、薬物の放出を悪く変更するのに少なすぎることも多すぎることもない十分な量の崩壊剤を用いて、本発明の固体剤形を形成しなければならない。用いられる崩壊剤の量は、処方物のタイプおよび投与形式に基づいて変化し、そして当業者には容易に認識可能である。代表的には、約０．５〜約１５重量％の崩壊剤、好ましくは約１〜約５重量％の崩壊剤が、薬学的組成物において用いられ得る。
【００６４】
固体剤形を形成するために用いられ得る適切な崩壊剤としては、限定はしないが、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン（ｃｒｏｓｐｏｖｉｄｏｎｅ）、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ジャガイモまたはタピオカのデンプン、他のデンプン、アルファ化デンプン、他のデンプン、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ガムおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００６５】
固体剤形での使用に適切な潤滑剤としては、限定はしないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレン・グリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、滑石、硬化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天およびそれらの混合物が挙げられる。さらなる潤滑剤としては、例えば、サイロイドシリカゲル（ｓｙｌｏｉｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ）（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．のＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．が製造したＡＥＲＯＳＩＬ２００）、合成シリカの凝固エアロゾル（Ｐｉａｎｏ，Ｔｅｘ．のＤｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．が製造した）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．のＣａｂｏｔ  Ｃｏ．によって販売される発熱性二酸化ケイ素生成物）およびその混合物が挙げられる。潤滑剤が必要に応じて、薬学的組成物の約１重量％未満の量で添加されてもよい。
【００６６】
好ましくは、各々の固体剤形は、本発明の化合物の約５ｍｇ〜約３０００ｍｇを含む。好ましくは、各々の固体剤形は、本発明の化合物の約５ｍｇ、約２５ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇまたは約５００ｍｇを含む。経口投与に適切な固体剤形は好ましくは、本発明の化合物の約５ｍｇ〜約２００ｍｇを含む。
【００６７】
液体型であって、本発明の新規な組成物が、経口的に投与のために組み込まれてもよい剤形としては、水溶液、適切に香味付けされたシロップ、水性および香味付けされたエマルジョンであって、食用油、例えば、コーン油、綿実油、ゴマ油、ココナツ油、またはピーナツ油とのエマルジョン、ならびにエリキシルおよび同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００６８】
さらに、本発明の１つ以上の化合物（単数または複数）を含む薬学的組成物は、任意の他の適切な薬物と組み合わせて、例えば、胃腸障害の処置のために投与されてもよい。併用療法を使用する場合、本発明の化合物（単数または複数）および第二の薬物を含む薬学的組成物は、同時に、連続してまたは別々に投与されてもよい。併用療法で用いられる各々の成分は、その意図される目的に十分な量で使用される。例えば、二次薬物を、インビボで該当の症状の軽減を果たすのに十分な量で使用する。
【００６９】
好ましくは、本発明の化合物のための投薬範囲は、１用量あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは約２ｍｇ〜約５００ｍｇ、それよりさらに好ましくは約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、そしてなおさらに好ましくは約５ｍｇ〜約６０ｍｇである。ここでも、用いられる特定の用量は、患者（年齢、体重など）および疾患の重篤度（軽度、中度、重度）に依存する。最後に、２つの活性な成分を含む薬学的組成物がまた、薬物を同時に投与するために調製されてもよい。
【００７０】
本発明の薬物（単数または複数）の投与は正常には、リパーゼ−コリパーゼが消化に起因して解放され、そして最適阻害が十二指腸下で得られる場合、食物摂取と組み合わせて行われる。
【実施例】
【００７１】
以下の調製物および実施例は、当業者が本発明をさらに明確に理解し、そして実施することを可能にするために示される。それらは、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではなく、単にその例示および代表と解釈されるべきである。
【００７２】
（処方物の実施例）
（実施例１）
以下の成分を含む硬性のゼラチンカプセルを調製する：
量
成分                            （ｍｇ／カプセル）
活性成分                            ３０．０
デンプン                          ３０５．０
ステアリン酸マグネシウム              ５．０
上記の成分を混合して硬性のゼラチンカプセル中に、３４０ｍｇの量で充填する。
【００７３】
（実施例２）
錠剤処方物を以下の成分を用いて調製する：
量
成分                            （ｍｇ／錠剤）
活性成分                            ２５．０
セルロース、微結晶性              ２００．０
コロイド状二酸化ケイ素              １０．０
ステアリン酸                          ５．０
この成分を混合して、圧縮し、錠剤を形成して、各々２４０ｍｇ秤量する。
【００７４】
（実施例３）
３０ｍｇの活性成分を各々が含む錠剤を以下のとおり調製する：
量
成分                            （ｍｇ／錠剤）
活性成分                            ３０．０ｍｇ
デンプン                            ４５．０ｍｇ
微結晶性セルロース                  ３５．０ｍｇ
ポリビニルピロリドン                  ４．０ｍｇ
（無菌水に含まれる１０％溶液として）
デンプングリコール酸ナトリウム        ４．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ０．５ｍｇ
滑石                                  １．０ｍｇ
総量                              １２０．０ｍｇ
活性成分、デンプンおよびセルロースを、Ｎｏ．２０メッシュＵ．Ｓ．シーブを通過させ、そして徹底的に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を、得られた粉末と混合し、次いでこれを１６メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させる。このように生成された顆粒を５０〜６０℃で乾燥させて、１６メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させる。Ｎｏ．３０のメッシュのＵ．Ｓ．シーブを前に通過させたデンプングリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよび滑石を次に、この顆粒に添加して、これを混合後に、錠剤機械で圧縮して、各々１２０ｍｇと秤量して錠剤を生成する。
【００７５】
（実施例４）
４０ｍｇの医薬を各々が含有するカプセルを以下のように作成する：
量
成分                            （ｍｇ／錠剤）
活性成分                            ４０．０ｍｇ
デンプン                          １０９．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              １．０ｍｇ
総量                              １５０．０ｍｇ
この活性成分、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを混合して、Ｎｏ．２０メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させ、そして硬性ゼラチンカプセル中に１５０ｍｇの量で充填する。
【００７６】
（実施例５）
２５ｍｇ活性成分を各々が含む坐剤を以下のように作成する：
成分                                    量
活性成分                              ２５ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリドを            ２，０００ｍｇまで
この活性成分を、Ｎｏ．６０メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させ、そして必要な最小の熱を用いて前に融解してある飽和脂肪酸グリセリド中で懸濁する。次いで、この混合物を名目上２．０ｇの容量の成型坐薬中に入れて、冷却させた。
【００７７】
（実施例６）
５．０ｍｌの用量あたり５０ｍｇの医薬を各々が含む懸濁液をいかのように作成する：
成分                                    量
活性成分                                    ５０．０ｍｇ
キサンタン・ガム                              ４．０ｍｇ
カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム（１１％）
微結晶性セルロース（８９％）                ５０．０ｍｇ
スクロース                                  １．７５ｇ
安息香酸ナトリウム                          １０．０ｍｇ
香料および着色料                            適量
精製水を５．０ｍｌまで
この活性成分、スクロースおよびキサンタン・ガムを混合して、Ｎｏ．１０メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させ、次いで、微結晶性セルロースおよびカルボキシ・メチルセルロース・ナトリウムを含有する前に作成された水溶液と混合する。この安息香酸ナトリウム、香料および着色料を、ある程度の水で希釈して撹拌しながら添加する。次いで、十分な水を添加して、必要な容積にする。
【００７８】
（実施例７）
処方物は以下のように調製してもよい：
量
成分                            （ｍｇ／錠剤）
活性成分                            １５．０ｍｇ
デンプン                          ４０７．０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム              ３．０ｍｇ
総量                              ４２５．０ｍｇ
この活性成分、デンプンおよびステアリン酸マグネシウムを混合して、Ｎｏ．２０メッシュのＵ．Ｓ．シーブを通過させ、そして硬性ゼラチンカプセル中に４２５．０ｍｇの量で充填する。
【００７９】
本発明における使用のための他の適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，第１８版，１９９０）に見出され得る。
【００８０】
【化１６】
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【００８１】
【化１７】
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【００８２】
【化１８】
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞におけるコラーゲン誘導性ＤＤＲ１リン酸化に対する粗ペプチドの効果。単一の細胞を、示した粗ペプチドの存在下で、コラーゲンＩコーティングプレートに接着させた（１００μＭ）。（Ａ）ペプチド１６７〜１７３の存在下で実験を行なった。（Ｂ）ペプチド１７５から８０の存在下で実験を行なった。９０分後、細胞を溶解して、ＤＤＲ１を免疫沈降させた。引き続き、この免疫沈降を、抗ホスホチロシンＡｂでの、次いでストリッピング後に、抗ＤＤＲ１Ａｂを用いるウエスタンブロット分析に供して等しいロードを確実にした。示したブロットは、３つの実験の代表である。この図は、コントロールのパーセントとして表される、ＤＤＲ１リン酸化の濃度測定分析を示す。
【図２】コラーゲンに対するＷｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞の接着に対する粗ペプチドの効果。（Ａ）単一の細胞を、示された粗ペプチド（１００μＭ）の有無において９０分間接着させた。接着性細胞の量を、この方法に記載されたとおりに分析して、その結果を、７つの別の実験の平均±ＳＥＭとして示す。（Ｂ）コラーゲンに対するＷｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞の接着は、抗−□１−インテグリンＡｂとともにこの細胞を４５分間事前処理した後に分析し、その後に、ペプチド１７１もしくは１７５（１００μＭ）またはＣＭの有無において９０分間それらを接着させる。接着細胞の量を、この方法に記載されたとおりに分析して、その結果を６つの別の実験の平均±ＳＥＭとして示す。（Ｃ）このダイアグラムは、現在用いられるＣＭのコントロールを概説する。その細胞を、正常なＣＭまたはＷｎｔ−５ａ枯渇ＣＭの有無において、コラーゲンＩコーティングウェルに接着させた。接着性細胞の量を、この方法に記載のとおり分析して、その結果は、６つの別の実験の平均±ＳＥＭとして示す。Ｎｓ＝有意差なし（ｎｏｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０５、そして＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図３】Ｗｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２細胞が接着および遊走する能力に対する、選択されたペプチドおよび純粋なペプチドの効果。（Ａ〜Ｅ）コラーゲンＩ型コーティングウェルにこの細胞が接着する能力を、種々の濃度の示したペプチドの有無において、図２に以前に記載されるとおり分析した。（Ｆ）トランスウェル遊走アッセイにおけるＷｎｔ−５ａアンチセンスＨＢ２の遊走に対する示したペプチドの効果。この細胞を、１００μＭのペプチドまたは０．４μｇ／ｍｌの組み換えＷｎｔ−５ａの有無において、１８時間遊走させた。このデータは、各々三連で行った６〜７の別々の実験の平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞における接着およびＤＤＲ１リン酸化に対するペプチド誘導性の効果。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞と比較した、Ｗｎｔ−５ａアンチセンスおよびＷｎｔ−５ａ過剰発現ＨＢ２細胞におけるＷｎｔ−５ａタンパク質発現のウエスタンブロット分析。このブロットは、９つの別の実験の代表である。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞接着に対するペプチド誘導性の効果。この細胞を、１００μＭの示したペプチドまたはＣＭの有無において、コラーゲンＩ型コーティングウェルに対して６０分間接着させた。接着細胞の量は、この方法に記載されたとおり分析して、その結果は、８つの別の実験の平均±ＳＥＭとして示す。（Ｃ）ペプチド１７５またはアラニンでのシステインの置換以外は同じアミノ酸配列を有するペプチド（１７５Ａｌａ）またはＣＭの有無における、コラーゲンＩコーティングウェルに対するＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の接着。接着細胞の量は、パネルＡにおいてのとおり評価して、６つの別個の実験の平均±ＳＥＭとして表した。ｎｓ＝有意差なし、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）単一のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、示されたペプチド（１００μＭ）、ＣＭまたは組み替えＷｎｔ−５ａ（０．８□ｇ／ｍｌ）の有無において６０分間、コラーゲンＩコーティングプレートに接着させた。ＤＤＲ１免疫沈降を、第一の抗ホスホリトシンＡｂを用いて、次いでストリッピング後に抗ＤＤＲ１  Ａｂを用いてウエスタンブロットした。示されるブロットは、６つの別の実験の代表である。右のダイアグラムは、コントロールのパーセントとして表される、ＤＤＲ１リン酸化データの濃度測定分析を示す。
【図５】（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞における接着誘導性ＤＤＲ１リン酸化に対するＳｒｃ−インヒビターＰＰ１（１０μＭ）での事前処理（３０分）の効果。示されるブロットは、３つの別個の実験の代表である。（Ｂ）ＰＰ１および／または血清の有無におけるＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＳｒｃ活性。細胞を血清で１６時間枯渇させるか、させず、次いで、このインキュベーション期間の最後の３０分間、１０μＭのＰＰ１で処理するかまたは処理しなかった。示されるブロットは、６つの別個の実験の代表である。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞における、そしてＷｎｔ−５ａアンチセンスまたは過剰発現ＨＢ２細胞における、ＥＧＦレセプター活性および発現レベル。示されるブロットは、５つの別個の実験の代表である。
【図６】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞遊走およびそれらのＦ−アクチンの含量に対するペプチド誘導性の効果。（Ａ）この細胞を、示したペプチド（１００μＭ）の有無において１８時間遊走させた。パネルＡのデータは、各々三連で行った、８つの別個の実験の平均±ＳＥＭとして表す。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）この細胞を、ペプチド１７５（１００μＭ）の有無において、コラーゲンＩコーティングしたカバーガラスに接着させた。次いで、この細胞を、方法の節に記載されたとおりＡｌｅｘａ４８８−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色した。図示された顕微鏡写真は、５つの別個の実験の代表である。
【図７】ペプチド１７５の改変であって、それがＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍細胞接着および遊走を誘導する能力に対するペプチド１７５改変の効果。（Ａ）この細胞を、ペプチド１７５、ペプチド１７５の三段階のＮ末端欠失改変体、またはペプチド１７５由来の試験ヘキサペプチドのホルミル化バージョンの有無において、コラーゲンＩコーティングウェルに対して６０分間接着させた。接着細胞の量は、方法に記載されたとおりに分析して、その結果を、６つの別個の実験の平均±ＳＥＭとして表す。（ＢおよびＣ）この細胞を、ペプチド１７５（Ｂ）またはホルミル化ヘキサペプチド（Ｃ）の１または１０μＭの有無において、１８時間遊走させた。このデータは、各々三連で行った、６つの別個の実験の平均±ＳＥＭとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図８】腫瘍細胞遊走を阻害するホルミル化ヘキサペプチドおよびＷｎｔ−５ａの能力に対するＦｒｚ−５レセプターブロッキングおよび低下したｐＨの効果。（Ａ）抗Ｆｒｚ−２および抗Ｆｒｚ−５ＡｂでのＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞溶解物のウエスタンブロット分析。ペプチド（抗原）−ブロッキング実験によって、フィルムの過剰露光後でさえ検出可能なタンパク質バンドは明らかでなかった。このブロットは、３つの別個の実験の代表である。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞遊走に対する抗Ｆｒｚ−２および抗Ｆｒｚ−５Ａｂの効果。この細胞を、それぞれ灰色および白のバーである、抗Ｆｒｚ−２または抗Ｆｒｚ−５のＡｂ（５μｇ／ｍｌ）の有無において１８時間遊走させた。示されるとおり、ホルミル化ヘキサペプチド（１００μＭ）または組み換えＷｎｔ−５ａ（０．４μｇ／ｍｌ）を、それらの遊走の全体的な期間の間、細胞に添加した。そのデータは各々三連で行った７つの別個の実験の平均±ＳＥＭとして示す。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、７．４（灰色のバー）または６．７（白色のバー）というｐＨを有する培地中でホルミル化ヘキサペプチド（１０μＭ）の有無において１８時間遊走させた。このデータは、各々三連で行った、４つの別個の実験の平均±ＳＤとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１】
2008542368.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
2008542368.tif 000023
【図５】
2008542368.tif 000024
【図６】
2008542368.tif 000025
【図７】
2008542368.tif 000026
【図８】
2008542368.tif 000027
【配列表】
2008542368000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月30日(2008.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
【化１】
2008542368.tif 000028
によってコードされる１つ以上のアミノ酸。
【請求項２】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項１に記載のアミノ酸。
【請求項３】
以下：
【化２】
2008542368.tif 000029
を含む請求項１に記載の１つ以上のアミノ酸。
【請求項４】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項３に記載のアミノ酸。
【請求項５】
以下の配列：
【化３】
2008542368.tif 000030
によってコードされる１つ以上のアミノ酸の、薬学的組成物の製造における使用であって、該薬学的組成物はガン細胞の運動性を障害することによってガンの処置において用いられる、使用。
【請求項６】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
請求項５に記載の使用であって、前記アミノ酸が以下の群：
【化４】
2008542368.tif 000031
から選択される、使用。
【請求項８】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
治療上活性な量の１つ以上のガン細胞運動性の阻害活性ペプチド配列であって、以下：
【化５】
2008542368.tif 000032
からなる群より選択されるペプチド配列を、必要に応じて不活性なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の薬学的組成物であって、前記活性ペプチドが、以下：
【化６】
2008542368.tif 000033
からなる群より選択される、薬学的組成物。
【請求項１２】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の薬学的組成物であって、前記活性ペプチドが、
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
のホルミル化誘導体である、薬学的組成物。
【請求項１４】
ヒトにおける、詳細には、乳癌に罹患しているヒトにおけるガン細胞運動性を障害するための組成物であって、該組成物は、以下：
【化７】
2008542368.tif 000034
からなる群より選択される１つ以上のペプチド配列の治療上有効な量を含む、組成物。
【請求項１５】
前記アミノ酸が、それらのホルミル化誘導体である、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008542368.tif 000035
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