(57)【要約】本発明は、拡張機能障害あるいは拡張機能障害に関連する疾患、障害または状態を処置するための方法、心不全を処置するための方法、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節するための方法、筋細胞弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を増強するための方法、ならびに心室肥大を処置するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
拡張性障害あるいは拡張性障害に関連する疾患、障害または状態を処置する方法であって、
（ｉ）拡張性障害または拡張性障害に関連する疾患、障害、または状態に対する処置を必要とする対象を同定すること；および、
（ｉｉ）有効量のニトロキシルドナーを対象へと投与すること：
を含む前記方法。
【請求項２】
ニトロキシルドナーがＳ−ニトロソチオール化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニトロキシルドナーがチオ硝酸塩化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ニトロキシルドナーがヒドロキサム酸またはその薬学的に受容可能な塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ニトロキシルドナーがスルホヒドロキサム酸またはその薬学的に受容可能な塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ニトロキシルドナーがピローティ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ニトロキシルドナーがイソプロピルアミンジアゼニウムジオラート（ＩＰＡ／ＮＯ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ニトロキシルドナーがアンジェリ塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象がβアドレナリン受容体拮抗薬療法を受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
疾患、障害または状態が拡張期心不全である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象が高血圧性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象が糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
対象がメタボリック症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
対象が虚血性心疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
対象が高齢者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
対象が女性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
心不全を処置する方法であって、
（ｉ）障害性のＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを経験しているまたは生じやすい、および心不全の治療が必要である対象を同定すること；ならびに
（ｉｉ）有効量のニトロキシルドナーを対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節する方法であって、有効量のニトロキシルドナーを、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節する必要性のある対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
筋細胞の弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化する方法であって、有効量のニトロキシルドナーを、筋細胞の弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化する必要のある対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
前負荷が拡張終期容積（ＥＤＶ）または拡張終期圧（ＥＤＰ）で測定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
心室肥大を処置する方法であって、有効量のニトロキシルドナーを、心室肥大の処置を必要とする対象へ投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、拡張性障害または拡張性障害に関連する疾患、障害、または状態を処置するための方法、心不全を処置するための方法、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節するための方法、筋細胞の弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化するための方法、および心室肥大を処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素（ＮＯ）の１つの電子が減少した形態である、ニトロキシル（ＨＮＯ）は、一酸化窒素と比較して、独特な生化学的および機能的特性を有する活性窒素種である。Fukuto, J.M. et al., Chem. Res. Toxicol. 18, 790-801 (2005)；Wink, D. A. et al., Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 285, H2264-H2276 (2003)。無損傷の生体内の心臓において、典型のＨＮＯドナーであるアンジェリ塩（ＡＳ）は、β−アドレナリン作用遮断または刺激から独立して、およびｃＧＭＰの変化を伴わずに、心機能を強化する。Paolocci, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 10463-10468 (2001)；Paolocci, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5537- 5542 (2003)。多くの収縮性の刺激と異なり、ＨＮＯドナーは正常な心臓および心不全において同じように有効である。上記文献。静脈圧の低下において心機能を強化する、その組み合わせの能力により、新規の心不全処置としての潜在的な有用性が示唆される。
【０００３】
ＨＮＯの心臓硬化の根底を為す機構は、未知のままである。近年の研究により、それがＮＭＤＡ受容体（Kim, W.K. et al., Neuron. 24, 461-469 (1999)；Colton, CA. et al., J. Neurochem. 78, 1126-1134 (2001)）または骨格筋リアノジン受容体（Cheong, E. et al., Cell Calcium 37, 87- 96 (2005)）などのイオンチャンネルを刺激できるということが示唆された。一酸化窒素の心血管作用は時にｃＧＭＰと関連する一方、生体内でのＨＮＯ作用は循環ｃＧＭＰレベルの変化を伴わない。Paolocci, N. et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 98, 10463-10468 (2001)。しかしながら、ＨＮＯはチオール上に認識された反応性を有し（Fukuto, J.M. et al., Chem. Res. Toxicol. 18, 790-801 (2005)）、タンパク質におけるシステイン残基として広く分布し、ホスホランバン（ＰＬＢ）のＳＲ  Ｃａ２＋放出チャンネル、ＳＲ  Ｃａ２＋ポンプ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、およびＳＲ膜貫通領域などのＣａ２＋循環と関連する（MacLennan, D.H. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 566-577 (2003)）。
【発明の開示】
【０００４】
図面の簡単な説明
図１は、単離された心室筋細胞において、ＨＮＯが収縮および弛緩を増加させることを集合的にに示す、一連のグラフである。図１Ａは、ＨＮＯドナーであるＡＳの、単離マウス心室筋細胞におけるサルコメア短縮に対する効果を示す。図１Ｂは、ＡＳおよびＮＯドナーであるナトリウム２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−ジアゼノレート−２−オキシド（ＤＥＡ／ＮＯ）の、心室筋細胞におけるサルコメア短縮に対する、用量−反応効果を示す。＊：ｐ＜０．００１  対  対照群；
【数１】
2008543947.tif 000002
＊＊：ｐ＜０．００００５  対  対照群。図１Ｃは、ＡＳの筋細胞弛緩に対する効果を示す（５０％再延長までの時間）。＊：ｐ＜０．０５  対  対照群。図１Ｄは、タイロード溶液（ｐＨ  ７．４、室温）におけるＡＳ分解の動態、およびＡＳ／ＨＮＯと比較した、異なる用量の亜硝酸塩（ＮａＮＯ２）のマウス筋細胞のサルコメア短縮に対する効果を示す。図１Ｅは、ＡＳにより生産された硝酸塩がサルコメア短縮に対して効果を有しないことを示す。
【０００５】
図２は、筋細胞機能に対するＡＳ／ＨＮＯ作用がｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ独立性であるが、細胞内チオール内容により調節されることを集合的に示す、一連のグラフである。図２Ａは、ＡＳ（１ｍＭ）、次いでノルエピネフリン（ＮＥ）（１０μＭ）および広域ホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（１００μＭ）で負荷した、単一の生存新生ラット心筋細胞（ｉｎｓｅｔ）において記録されたｃＡＭＰ−ＦＲＥＴの動態を示し、および全体の細胞に対するＦＲＥＴの平均を描く。概要のデータを右に示す。＊：ｐ＜１０−６  対  対照群。図２Ｂは、１００μＭのＲｐ−ＣＰＴ−ｃＡＭＰでのＰＫＡ阻害により、イソプロテレノール（ＩＳＯ）変力作用を鈍化させるが、ＨＮＯ変力作用を鈍化させないということを示す。図３Ｃは、ｃＧＭＰ（ＯＤＱ）またはＰＫＧ（Ｒｐ−８Ｂｒ−ｃＧＭＰｓ）阻害によりＮＯ効果を鈍化させるが、ＨＮＯ効果を鈍化させないことを示す。図２Ｄは、ＮＯは付随するβ−アドレナリン作用刺激収縮性に対する負の効果を有する一方、ＨＮＯ効果は付加的であることを示す。図２Ｅは、細胞浸透性ＧＳＨでの前処置により、ＡＳ／ＨＮＯによりサルコメア短縮の増強が低下することを示す。
【数２】
2008543947.tif 000003
【０００６】
図３は、単離されたネズミおよびラット筋細胞におけるＡＳによるＣａ２＋透過の増加を集合的に示す、一連のイメージおよびグラフである。図３Ａは、対照群およびＡＳ（０．５ｍＭ）処置マウス心筋細胞におけるＣａ２＋透過のライン走査共焦点イメージを示す。細胞はＣａ２＋のインジケーターであるｆｌｕｏ−４（２０μＭ、２０分間）を担荷した。Ｃａ２＋透過をかかる走査より評価した。図３Ｂは、Ｃａ２＋透過振幅（ΔＦ／Ｆ０）の平均の結果を示す。図３Ｃは、立ち上がり時間（ピークまでの時間）の平均の結果を示す。図３Ｄは、ピークから５０％弛緩までの時間（Ｔ５０）の平均の結果を示す。図３Ｅは、基礎蛍光(basal fluorescence)を示す。それぞれのデータポイントに対し、ｎ＝２７〜２８細胞数、３つの心臓より。＊：ｐ＜０．０５  対  対照群。＃：ｐ＜０．０１  対  対照群。
【数３】
2008543947.tif 000004
図３Ｆは、非処置ラット筋細胞（Ｃｏｎ）およびＡＳ前処置ラット筋細胞（ＡＳ）におけるＣａ２＋透過の描写記録を示す。図３Ｇおよび図３Ｈは、Ｃａ２＋透過の振幅およびＣａ２＋減少のτの平均結果を示す（ｎ＝３０〜３１細胞数、４つの心臓より）。図３Ｉ、図３Ｊおよび図３Ｋは、１０ｍＭカフェインの急速適用を介して測定されたＳＲ  Ｃａ２＋担荷（ｎ＝１１〜１４細胞数、６つの心臓より）を示す。図３Ｉは、カフェイン振幅に由来する、％で表現する、痙攣振幅を示す（分画ＳＲ  Ｃａ２＋放出）。図３Ｊは、式１／τｔｗｉｔｃｈ＝１／τＮＣＸ＋１／τＳＲによるＣａ２＋除去フラックスを示す。τＮＣＸは、カフェイン存在下のＣａ２＋減少のτである。ＳＲの相対的な寄与は、Ｃｏｎにおける８７．６％からＡＳ前処置細胞における９１．３％へと増加し、ＮＣＸの相対的な寄与は、それぞれ１２．４％から８．７％へと減少した。図３Ｋは、総ＳＲ担荷は変化しなかったことを示す。全てのデータは平均±ＳＥＭであり；＊ｐ＜０．０５  対  Ｃｏｎ。
【０００７】
図４は、ＡＳ／ＨＮＯがチオール感受性の方式でＲｙＲ２機能を増加させることおよびネズミ筋小胞体（ＳＲ）小胞においてＡＴＰ依存性Ｃａ２＋取り込みを増加させることを集合的に示す、一連のグラフである。図４Ａは、対照の状態およびＡＳ／ＨＮＯの上昇濃度へと暴露したあとの、無損傷のネズミ筋細胞におけるＣａ２＋スパークのライン走査の像を示す。図４Ｂは、Ｃａ２＋スパーク周波数に対するＡＳ／ＨＮＯの用量依存性効果（左のパネル）（＊  ｐ＜０．００１  対  対照群）、およびＣａ２＋スパーク周波数に対して増加した濃度での、ＮＯドナーであるＤＥＡ／ＮＯの中和効果（右のパネル）を示す。図４Ｃは、ＧＳＨでの前処置により、Ｃａ２＋スパーク周波数におけるＡＳ誘導性の増加が無駄になることを示す。図４Ｄは、ネズミ筋細胞からのＲｙＲ２における単一チャンネル記録の描写的なオリジナルの軌跡を示す。心臓性ＲｙＲ２チャンネルは平面脂質二重層へと再構成され、３μＭ（ｃｉｓ）細胞質性Ｃａ２＋で活性化された。いちばん上よりいちばん下まで、対照状態および暴露後のＡＳ／ＨＮＯの上昇濃度におけるＲｙＲ２の単一の記録は、ＡＳ／ＨＮＯの用量を増加させる、ＰＯにおける用量依存性の増加を示す。一番下の軌跡において、ＲｙＲ２開放確率におけるＡＳ誘導性の増加は、チオール還元剤であるＤＴＴの細胞質側への添加によりほぼ完全に逆転した。図４Ｅは、６５０ｎｍ（Ｃａ−アルセナゾＩＩＩ複合体）および６９３ｎｍ（等吸収波長）信号の減算により得られた、Ｃａ２＋取り込みの描写的なストップフロー軌跡を示す。軌跡をＣａ２＋なしの、ＡＳの存在下（０．２５ｎＭ：下の軌跡）または欠如下（上の軌跡）で記録した。実線は、ストップフローデータへ残余項を足した単一指数の最良適合を表す。図４Ｆは、ＡＳがＣａ２＋取り込みの速度定数を顕著に増加させる（左のパネル）が、全体の（平衡の）ＳＲ  Ｃａ２＋担荷には影響しない（右のパネル）ことを示す。
【０００８】
図５は、拡張気圧−容量関係（ＥＤＰＶＲ）の評価方法を示すグラフである。
【０００９】
図６は、ＮＯドナーであるニトログリセリンのＥＤＶＰＲに対する効果を示すグラフである。
【００１０】
図７は、ＨＮＯ／ＮＯドナーであるイソプロピルアミンジアゼニウムジオラート（ＩＰ  Ａ／ＮＯ）のＥＤＰＶＲに対する効果を示す、一連のグラフである。図７Ａは、ＩＰ  Ａ／ＮＯにより付与されたＨＮＯが慢性心不全（ＣＨＦ）標本において下方シフトを起こすことを示す。図７Ｂは、高充填体積において、拡張期圧は、非処置ＣＨＦ心臓に対してＩＰ  Ａ／ＮＯで処置したＣＨＦ心臓においてより少ないことを示す。
【００１１】
図８は、特定のＬＶ用量における拡張終期圧（ΔＰｅｄ）の平均変化を示すグラフである。
【００１２】
定義
「拡張期」は、１つまたは２つ以上の以下の期を包含する：等容性弛緩、急速充満期（または早期拡張期）、低速充満期（または心拍静止期）、および心房収縮。「拡張性障害」は、かかる期の任意の１つまたは２つ以上が延長、低速化、不完全または欠如するときに起こるかもしれない。拡張性障害の非制限の例は、限定せずに、Kass, D. A. et al., Cir. Res. 94, 1533-42 (2004)；Zile M.R. et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 47(5), 314-319 (2005)；Yturralde F.R. et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 47(5), 314-319 (2005)；Owan, T.E. et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 47(5), 320-332 (2005)；Franklin, K.M. et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 47(5), 333-339 (2005)；Quinones, M.A., Prog. Cardiovasc. Dis., 47(5), 340-355 (2005)で記載される状態を含む。いくつかの態様において、拡張性障害は、遅延化した力（または圧力）の減衰および細胞再拡張速度、増加した（または減少した）早期充填速度および減速度、上昇したまたは急な拡張期圧用量（ＰＶ）関係、および／または上昇した充填速度依存性圧である。
【００１３】
「拡張期障害に関連する疾患、障害または状態」は、拡張性障害が病因学、疫学、予防および／または処置と関わりがある、任意の疾患、障害または状態を言及する。非限定の例は、うっ血性心不全、虚血性心筋症および梗塞、拡張期心不全、肺うっ血、肺水腫、心筋繊維化、心臓弁膜症、心膜疾患、循環うっ血性状態、末梢浮腫、腹水、シャーガス病、高血圧症、ならびに心室肥大を含む。
【００１４】
「ニトロキシルドナー」は、ニトロキシル（ＨＮＯ）および／またはニトロキシルアニオン（ＮＯ−）を提供する化合物をいう。非限定の例は、米国特許第6,936,639号、米国公開第2004/0039063号、国際公開第2005/074598号、および２００６年３月１７日出願米国仮出願第U.S. 60/783,556号に開示される化合物を含む。いくつかの態様において、かかるニトロキシルドナーは一酸化窒素（ＮＯ）を産生しない。
【００１５】
「ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込み」は、筋小胞体（ＳＲ）からのカルシウムの放出および／または筋小胞体への取り込みをいう。
【００１６】
「前負荷」は、収縮の開始に先立つ、拡張期における、腔の心筋細胞の伸張をいう。それゆえ、前負荷はサルコメア長に関する。サルコメア長は無損傷の心臓においては決定できないため、他の前負荷の指数、例えば心室拡張終期容積または圧など、を用いる。
【００１７】
「心室肥大」は左心室肥大および右心室肥大を含む。いくつかの態様において、心室肥大は左心室肥大である。
【００１８】
「有効量」は、所望の効果、例えば、拡張性障害を処置する、拡張性障害に関連する疾患、障害または状態を処置する、心不全を処置する、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節する、筋細胞弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化する、または心肥大を処置するなど、をもたらすに必要な量をいう。
【００１９】
「薬学的に受容可能な搬送体」は、対象化合物を１つの器官、または体の部分から、もう１つの器官または体の部位へと対象化合物を搬送するまたは輸送すること関係する、薬学的に受容可能な原料、組成物またはビヒクル、例えば原料をカプセル化する液体または固体の充てん剤、希釈剤、賦形剤または溶媒など、をいう。それぞれの搬送体は、処方物の他の材料と相溶性があり、患者での使用に好適であるという意味で、「受容可能」である。薬学的に受容可能な搬送体としての役割を果たすことのできる原料の例は、限定せずに：（１）乳糖、ブドウ糖およびショ糖などの糖類；（２）とうもろこしでんぷんおよびジャガイモでんぷんなどのでんぷん類；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐薬ワックスなどの賦形剤（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質のない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液類；（２１）ポリエステル類、ポリカーボネート類および／またはポリ無水物類；および（２２）薬学的処方物で採用される他の非毒性相溶性物質、を含む。
【００２０】
「薬学的に受容可能な塩」は本発明の化合物の酸性塩または塩基性塩をいい、その塩は所望の薬学的活性を有し、そうでなければヒトを含む動物への投与に好ましくなくはないものである。かかる塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、  酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ流酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、  臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタン−スルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩を限定せずに含む酸とともに形成することができる。塩基性塩の例は、限定せずに、アンモニウム塩類、アルカリ金属塩類、例えばナトリウムおよびカリウム塩類など、アルカリ土類金属塩類、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩類、有機塩基、ジシクロヘキシルアミン塩類などの有機塩基との塩類、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、およびアルギニンおよびリジンなどのアミノ酸との塩類を含む。いくつかの態様において、かかる塩基含有基を、ハロゲン化低級アルキル類、例えば塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチル；硫酸ジアルキル類、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミルなど；長鎖のハロゲン化物、例えば塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル；およびハロゲン化アラルキル、例えば臭化フェネチルなど、を含む薬剤で四級化できる。
【００２１】
「異性体」は、同じ番号および種類の原子を有し、それゆえ同じ分子量を有するが、原子の配置および構造に関しては異なる化合物をいう。
【００２２】
「光学異性体」は、立体異性体、ジアステレオ異性体および鏡像異性体を含む。
「立体異性体」は、空間における原子の配置においてのみ異なる異性体をいう。
【００２３】
「ジアステレオ異性体」は、互いに鏡像でない立体異性体をいう。ジアステレオ異性体は、２つまたは３つ以上の不斉炭素原子を有する化合物において発生する；それゆえ、かかる化合物は２ｎ個の光学異性体を有する、式中ｎは不斉炭素原子の数である。
【００２４】
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない立体異性体をいう。
「鏡像異性体が豊富な」は、１つの鏡像異性体が有意である混合物をいう。
【００２５】
「ラセミ化合物の」は、等量の個々の鏡像異性体を含有する混合物を言及する。
「非ラセミ化合物の」は、等量でない個々の鏡像異性体を含有する混合物を言及する。
【００２６】
「動物」は、感覚および随意運動の能力を有し、その生活のために酸素および自然食品を必要とする生体をいう。例は、限定することなく、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌおよびネコの種の類のメンバーを含む。いくつかの態様において、かかる動物は哺乳類、例えば温血脊椎動物である。他の態様において、かかる動物はヒトであり、明細書中において「患者」または「対象」と呼んでもよい。
【００２７】
ある疾患、障害または状態に対して「処置の必要にある」動物または対象は、ある疾患、障害または状態に罹患するおよび／または罹患しやすくなっている動物または対象をいう。
【００２８】
「処置する」は：（ｉ）疾患、障害または状態を、かかる疾患、障害および／または状態に罹患しやすくなっているかもしれないが、まだそれを有すると診断されていない動物において発生することを予防すること；（ｉｉ）疾患、障害または状態を阻害すること、例えば、その進展を引き止めること；（ｉｉｉ）疾患、障害または状態を和らげること、つまりかかる疾患、障害および／または状態の退化を引き起こすこと；（ｉｖ）徴候の重症度および／または頻度を軽減すること；（ｖ）徴候および／または根底にある原因を除去すること；および／または（ｖｉ）かかる徴候および／またはその根底にある原因の発生を防ぐこと、をいう。
【００２９】
文脈がほかに述べない限り、単数形の用語の定義を、本出願において見られる複数の同等物に適用すると推定してもよい；同様に、複数の用語の定義を、本出願において見られるその単数の同等物に適用すると推定してもよい。
【００３０】
本発明の方法
ニトロキシル（ＨＮＯ）は、無損傷の正常なおよび不全の哺乳類の心臓における、心臓収縮および弛緩の、新規の酸化還元感受性促進剤である。ＨＮＯは、正味の筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋担荷を変えることなく、または心臓拡張後のＣａ２＋レベルを上昇させることなく、細胞内Ｃａ２＋透過の振幅を増加させそして減衰を加速することにより、単離された心筋細胞における収縮および弛緩を刺激する。このことにより、リアノジン感受性Ｃａ２＋放出チャンネルの開確率、およびＳＲ  Ｃａ２＋輸送活性の直接の刺激によりかかるＳＲへの速いＣａ２＋再取り込みにおける付随した増加を生じる。これらの変化はｃＡＭＰ／ＰＬＡおおびｃＧＭＰ／ＰＫＧから独立するが、これらのタンパク質とのＨＮＯチオール相互作用と一貫する。かかる結果は、心不全、特に拡張期心不全の処置において利用可能性のある新規のＳＲ−Ｃａ２＋循環促進剤としてのＨＮＯを支持する。
【００３１】
従って、本発明の１つの側面は、以下を含む、拡張性障害または拡張性に関連する疾患、障害または状態を処置するための方法に関する：（ｉ）拡張性障害または拡張性障害に関連する疾患、障害または状態に対する処置の必要にある対象を同定すること；および（ｉｉ）有効量のニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、動物へ投与すること。
【００３２】
いくつかの態様において、かかる動物は哺乳類である。他の態様において、かかる動物は対象、つまりヒトである。さらに他の態様において、かかる対象は高齢者である。さらに他の態様において、かかる対象は女性である。さらに他の態様において、かかる対象はベータアドレナリン受容体拮抗薬療法を受けている。さらに他の態様において、かかる動物は高血圧性である。さらに他の態様において、かかる対象は糖尿病性である。さらに他の態様において、かかる対象はメタボリック症候群を有する。さらに他の態様において、かかる対象は虚血性心疾患を有する。
【００３３】
かかるニトロキシルドナーは、米国特許第6,936,639号、米国公開特許第2004/0039063号、国際公開第WO 2005/074598号、および２００６年３月１７日に出願された米国仮出願第U.S. 60/783,556号で開示される任意の化合物である。いくつかの態様において、かかるニトロキシルドナーは一酸化窒素（ＮＯ）を産生しない。他の態様において、かかるニトロキシルドナーはＳ−ニトロソチオール化合物である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはチオ硫酸塩化合物である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはヒドロキサム酸またはその薬学的に受容可能な塩である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはスルホヒドロキサム酸またはその薬学的に受容可能な塩である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはアルキルスルホヒドロキサム酸またはその薬学的に受容可能な塩である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはＮ−ヒドロキシスルホンアミドである。
【００３４】
さらに他の態様において、かかるＮ−ヒドロキシスルホンアミドは、２−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、２−クロロ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、２−ブロモ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、２−（トリフルオロメチル）−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、５−クロロチオフェン−２−スルホヒドロキサム酸、２，５−ジクロロチオフェン−３−スルホヒドロキサム酸、４−フルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、４−トリフルオロ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、４−シアノ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミド、または４−ニトロ−Ｎ−ヒドロキシベンゼンスルホンアミドである。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはピローティ酸である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはイソプロピルアミンジアゼニウムジオラート（ＩＰＡ／ＮＯ）である。さらに他の態様において、かかるニトロキシルドナーはアンジェリ塩である。いくつかのニトロキシルドナーは１つまたは２つ以上の不斉炭素中心を有してもよい。それ自体、それらは、光学異性体の形態で、またはラセミ化合物または非ラセミ化合物の混合物の一部として存在してもよい。いくつかの非ラセミ化合物の混合物において、Ｒ体を濃縮してもよく、一方他の非ラセミ化合物混合物において、Ｓ体を濃縮してもよい。
【００３５】
いくつかの態様において、かかる拡張性障害に関連する疾患、障害または状態は拡張期心不全である。他の態様において、かかる拡張性障害に関連する疾患、障害または状態はうっ血性心不全である。
【００３６】
本発明のもう１つの側面は、以下を含む、心不全を処置するための方法に関する：
（ｉ）障害のあるＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを罹患するおよび／または罹患しやすくなっている、ならびに心不全に対する処置の必要性にある動物を同定すること；および、
（ｉｉ）有効量のニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、動物へ投与すること。
【００３７】
本発明のさらにもう１つの側面は、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節するための方法であって、有効量のニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、ＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節する必要のある動物へ投与することを含む前記方法に関する。
【００３８】
本発明のさらにもう１つの側面は、筋細胞弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化するための方法であって、有効量のニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、筋細胞弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化する必要のある動物へ投与することを含む前記方法に関する。
【００３９】
いくつかの態様において、かかる前負荷は拡張終期容積（ＥＤＶ）により測定される。他の態様において、かかる前負荷は拡張終期圧（ＥＤＰ）により測定される。
【００４０】
本発明のさらにもう１つの側面は、心室肥大を処置するための方法であって、有効量のニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、心室肥大の処置を必要とする動物へ投与することを含む前記方法に関する。
【００４１】
かかるニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、当業者に公知の任意の手段により、例えば、経口、非経口、吸入噴霧、局所的、経直腸的、経鼻的、経口腔的、経膣的、または埋め込み容器を介して、投与してもよい。明細書で用いられる「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、および骨内注入ならびに注入技術を含む。
【００４２】
かかるニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、単回投与、複数回分離投与または連続注入で投与してもよい。ポンプ手段、特に皮下ポンプ手段は、連続注入に有用である。
【００４３】
約０．００１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ／ｄのオーダーの用量レベルが、本発明の方法に対して有用である場合がある。いくつかの態様において、かかる用量レベルは約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇ／ｄである。他の態様において、かかる用量レベルは約１ｍｇ／ｋｇ／ｄ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／ｄである。任意のある患者に対する適切な用量レベルおよび／または投与プロトコールは、採用する特別な化合物の活性および可能性のある毒性；患者の年齢、体重、総体的な健康、性および食餌；投与の時間；排泄速度；かかる化合物と組み合わせる単数または複数の他の治療剤；およびかかる疾患、障害および状態の重症度を含む、さまざまな要素に依存して異なるかもしれない。典型的には、in vitro用量−効果の結果により、患者投与に対する適切な用量に関する有用な指針が提供される。動物モデルにおける研究は、また、有益である。適切な用量レベルおよび投与プロトコールを決定するための考慮事項は、医療界における当業者に公知である。
【００４４】
タイミングおよび薬物送達の順番を制御するための当業者に周知の任意の投与計画を用いることができ、本発明の方法における処置を達成させるための必要に応じて繰り返される。例えば、かかる処方計画は追加の治療剤との前処置および／または同時投与を含んでもよい。いくつかの態様において、かかるニトロキシルドナーまたはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物を、単独で、または１つまたは２つ以上の追加の治療剤とともに、同時使用、分離した使用、または逐次使用のために、投与する。追加の単数または複数の薬剤は、１つまたは２つ以上のベータアドレナリン受容体拮抗薬および／または本発明の化合物を限定することなく含む、任意の治療剤であってよい。かかるニトロキシルドナー、またはニトロキシルドナーを含む薬学的組成物は、（ｉ）単一の処方物においてともに、または（ｉｉ）それぞれの活性薬剤の最適な放出速度のために設計された個々の処方物において分離して、のいずれかで、１つまたは２つ以上の治療剤とともに併用投与してもよい。
【００４５】
本発明の薬学的組成物
本発明のさらにもう１つの側面は、以下を含む薬学的組成物に関する：
（ｉ）有効量の本発明の化合物；および、
（ｉｉ）薬学的に受容可能な搬送体。
【００４６】
いくつかの実施態様において、かかる有効量は拡張性障害を処置するに必要な量である。他の実施態様において、かかる有効量は拡張性障害に関連する疾患、障害または状態を処置するために有効な量である。さらに他の実施態様において、かかる有効量はＳＲ  Ｃａ２＋放出および／または取り込みを調節するために必要な量である。さらに他の態様において、かかる有効量は筋細胞弛緩、前負荷またはＥ２Ｐ加水分解を強化するために必要な量である。さらに他の実施態様において、かかる有効量は心肥大を処置するに必要な量である。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、１つまたは２つ以上の湿潤剤、緩衝剤、懸濁化剤、平滑剤、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色剤、香味料、甘味料および追加の治療剤を限定することなく含む、１つまたは２つ以上の追加の薬学的に受容可能な材料を含んでもよい。
【００４８】
本発明の薬学的組成物を、以下のものに適合するものを含む、固体または液体形態での投与のために処方してもよい：（１）経口投与、例えば、ドレンチ（例えば、水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤（例えば、口腔内、舌下および体内吸収を対象とするもの）、ボーラス投与、粉末、顆粒、舌への投与のためのペースト、硬ゼラチンカプセル、やわらかいゼラチンのカプセル、口内スプレー、エマルジョンおよびマイクロエマルジョン；（２）非経口投与、例えば、無菌溶液または懸濁液としての皮下、筋内または硬膜外注射、あるいは徐放処方物；（３）局所投与、例えば、クリーム、軟膏、または制御放出パッチあるいは皮膚へと適用するスプレー；（４）膣内または直腸内、例えばペッサリー、クリームまたは泡として；（５）舌下；（６）眼球；（７）経皮；あるいは（８）経鼻。
【００４９】
本発明の特定の態様は、上述の側面の１つ、いくつかまたは全てを対象としてもよく、明細書中に示す態様、ならびに他の態様の１つ、いくつかまたは全てを包含してもよいことは、当業者には明らかであろう。
【００５０】
例
以下の例は本発明の説明するものであり、そこへの限定を意図するものではない。
【００５１】
ＨＮＯの心性の活性のメカニズムを決定するために、本発明者は心筋細胞カルシウムシグナル伝達およびＨＮＯドナーであるアンジェリ塩に対する機能的反応を評価し、ｃＡＭＰ／ＰＫＡまたはｃＧＭＰから独立するが、チオール修飾に関連する、正味のＳＲカルシウムサイクリングの新規な強化を見出した。
【００５２】
他に述べない限り、全てのデータを平均±ＳＥＭで表す。群の内部での比較はスチューデントｔ検定で行い、ｐ＜０．０５の値が統計学的有意性を示すとした。
【００５３】
例１：単離されたマウス心室筋細胞におけるＨＮＯの収縮性および弛緩に対するＨＮＯ／ＮＯ−効果
試薬
ＨＮＯはDr. J.M. Fukutoより提供されたＡＳ（Ｎａ２Ｎ２Ｏ３）より産生され、ＮＯはCalbiochem/EMD Biosciences (San Diego, CA, USA)より購入したジエチルアミン（ＤＥＡ）／ＮＯより産生された。インド１−ＡＭは、Molecular Probes Inc.-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)より購入した。全ての他の化合物をSigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA; Milan, Italy)より購入した。
【００５４】
単離されたマウス心室筋細胞における収縮および全体のＣａ２＋透過の測定
野生型２〜４月齢マウスを、腹腔内へのペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ／ｉｐ）で麻酔した。心臓を前述のように還流した。Mongillo, M. et al., Circ. Res., 98, 226-234 (2006)。サルコメア短縮に関して評価するために、細胞を倒立蛍光顕微鏡(Diaphot 200; Nikon, Inc)での領域刺激(Warner instruments)を用いてイメージ化した。サルコメア長をリアルタイムフーリエ変換(IonOptix MyoCam, CCCDlOOM)で測定し、細胞単収縮の振幅を休止細胞長のパーセンテージで表現した。短縮の動態を、ピークまでの時間短縮およびピークから５０％弛緩への時間を測定することにより定量化した。全体のカルシウム透過測定に対して、筋細胞をＣａ２＋インジケーターであるフルオ−４／ＡＭ（Molecular Probes, 20 μM、３０分間）で担荷し、Ｃａ２＋透過を共焦点レーザー顕微鏡(LSM510, Carl Zeiss)による還流液中の０．５Ｈｚでの領域刺激下で測定した。デジタル画像解析は、Interactive Data Language (IDL)でコード化されたカスタマーデザインのプログラムを用いた。
【００５５】
結果
ＡＳ（１０−６〜１０−３Ｍ）を新鮮な単離した成体ネズミ筋細胞（Ｃ５７／Ｂ１６）へ適用し、サルコメア短縮に用量依存性の増加を誘導した（図１Ａ、図１Ｂ）。筋細胞収縮性は≧１００μＭ  ＡＳへと上昇し、０．５および１ｍＭで〜１００％のピークとなった（ともにｐ＜０．００００５）。筋弛緩は、また、１０〜２０％加速した（図１Ｃ、ｐ＜０．０５）。かかる反応は〜１０〜１５分後にプラトーとなり、≦５００μＭでの中断ののち、同様の期間の後に完全に可逆性となった（図１Ａ）。ＨＮＯと対照的に、ＮＯドナーであるＤＥＡ／ＮＯ［ナトリウム  ２−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）−ジアゼノレート−２−オキシド］は低用量においてわずかな下降を、そして高用量において最小の変化を誘発した（図１Ｂ）。
【００５６】
生理学的なｐＨにおいて、ＡＳは分解し、ＨＮＯおよび亜硝酸塩を産出する。そのため、観察される反応において亜硝酸塩が役割を果たすかどうかを試験した。筋細胞研究に対して用いられた同一の媒体および温度におけるＡＳ分解（図１Ｄ）は、〜１０００秒（１６分）後に２５％の亜硝酸塩を産生するのみであることを明らかにした。同一の結果が０．１〜１ｍＭ  ＡＳに対して得られた。そのため、機能分析の時点において、２５〜２５０μＭのＮＯ２−が予測された；しかしながら、そのようなレベル（および、より高用量またはより低用量）はサルコメア短縮において影響を有しない（図１Ｅ）。
【００５７】
例２：単離されたラット心室筋細胞におけるＨＮＯ／ＮＯ作用へのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの影響
単離されたラット心室筋細胞における全体のＣａ２＋透過およびＳＲ  Ｃａ２＋担荷の測定
ラットからの心室筋細胞の単離を、前述のように実行した。Bassani, RA. et al., J. MoI. Cell. Cardiol., 26, 1335-1347 (1994)。組織解離のために用いられた酵素はLiberase Blendzyme３または４（１３〜２０Wuensch単位／心臓）であり、時に５〜１０単位のDispase IIで補充した（ともに、Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）。かかる心臓が弛緩状態となったとき、左心室の組織を小さな断片へと切り出し、酵素溶液中でさらに培養した（５〜１０分、３７℃）。かかる組織を分散し、ろ過し、そして実験での使用前に懸濁液を数回リンスした。単離したラット心筋細胞を、それから、天然マウスラミニン(Invitrogen, Carlsbad, CA)で処置したガラス底を有する、過還流チャンバー上へと撒いた。全ての実験で用いた標準のタイロード液は、以下を含有した（単位はｍＭ）：ＮａＣｌ  １４０、ＫＣｌ  ４、ＭｇＣｌ２  １、ブドウ糖  １０、ＨＥＰＥＳ  ５、およびＣａＣｌ２  １、ｐＨ  ７．４。筋細胞を６μＭインド−１／ＡＭで２５分間担荷し、次いで少なくとも３０分間還流し、染料を脱エステル化させた。いくつかの細胞を０．５ｍＭ  ＡＳで前処理し（いくつかのカフェイン実験において１ｍＭで）、洗浄し、そしてインド−１／ＡＭで担荷した。ＡＳ原液の濃度を、２５０ｎｍでの吸光度で検証した。全ての実験は室温（２３〜２５℃）において、領域刺激を用いて行った。Ｃａ２＋−透過をClampex 8.0で記録し、データをClampfitで解析した。
【００５８】
ＦＲＥＴイメージング
１〜３日齢Sprague Dawleyラット(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)からの心臓心室筋細胞の初代培養を記載のように調製した。Dostal, D.E. et al., Am. J. Physiol., 263, C851-C863 (1992)。細胞をＦＲＥＴに基づくセンサーでｃＡＭＰに対して形質導入し(Zaccolo, M. et al., Science, 295, 1711-1715 (2002))、形質導入後４８時間イメージ化した。実験の間、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝リンガー修飾溶液（１ｍｍｏｌ/Ｌ  ＣａＣｌ２）で室温で連続的に還流した。細胞を倒立OlympusＩＸ５０顕微鏡で４３０ｎｍの励起でイメージ化した。Mongillo, M. et al., Circ. Res., 98, 226-234 (2006)。イメージ解析はImageJ (Rasband, W.S., ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA)を用いて実行した。それぞれの時点において、ＦＲＥＴ価を４８０ｎｍ／５３５ｎｍ発光率強度（Ｒ）で測定し、０（ｓ）時点の４８０ｎｍ／５３５ｎｍ値へと標準化した（Ｒｏ）。
【００５９】
二光子レーザー走査顕微鏡のための蛍光プローブおよびイメージ獲得
カチオン性電位差滴定蛍光染料であるテトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）を用いて、ΔΨｍにおける変化を前記のようにモニターした。Cortassa, S. et al., Biophys. J., 87, 2060-2073 (2004)。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼにより触媒される、細胞浸透性モノクロロビマン（ＭＣＢ）の低下したグルタチオン（ＧＳＨ）との反応からの蛍光グルタチオン付加物であるＧＳＢの産生を用いて、前記のように細胞内グルタチオンレベルを測定した。Cortassa, S. et al., Biophys. J, 87, 2060-2073 (2004)。実験記録は、心筋細胞を実験タイロード液へと暴露してから開始した。心筋細胞を含有するディッシュをNikon E600FN正立顕微鏡のステージ上、３７℃で、大気中酸素に制限することなく接触させ、平衡化した。かかる状態下で、細胞を１００ｎＭ  ＴＭＲＭおよび５０μＭ  ＭＣＢとともに、少なくとも２０分間担荷した。細胞内ＧＳＨプールでのＡＳの効果を、フローチャンバー内で実行した動態実験において調査した。心筋細胞を３分間０．５ｍＭ  ＡＳへと手短に暴露し、その間連続イメージングを行った（イメージあたり３．５ｓ）。７４０ｎｍでの励起で、二光子レーザー走査顕微鏡(Bio-Rad MRC-1024MP)を用いて、イメージを記録した(Tsunami Ti:Sa laser, Spectra-Physics)。ＴＲＭＥの赤色発光を６０５±２５ｎｍで収集し、ＧＳＢの青色発光をその最大発光（４８０ｎｍ）で収集した。イメージをオフラインでImageJソフトウェア(Wayne Rasband, National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/)を用いて解析した。３ｍＭのＧＳＨの非存在または存在での細胞間の差異の統計学的有意性を、ｔ検定で評価した（小標本、両側ｐ値での対応のないｔ−検定）。データの正規性を、Kolmogorov-Srnirnov試験でテストした。
【００６０】
結果
増加したサルコメア短縮へと共役した、ピークＣａ２＋透過性を増加させる薬剤は、細胞内ｃＡＭＰにおける増加および引き続くタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化を介してそれを行う。Prestle, J. et al., Curr. Med. Chem., 10, 967-981 (2003)。これがＡＳに適用されるかどうかを試験するために、形質導入された新生ラット心筋細胞におけるｃＡＭＰのリアルタイムイメージングを、ｃＡＭＰ  ＦＲＥＴプローブを用いて実行した。Zaccolo, M. et al., Science, 295, 1711-1715 (2002)。１ｍＭ  ＡＳへの暴露に際し、かかるＦＲＥＴ信号は変化しなかったが（０．３％±０．１％、ｎ＝２３、ｐ＝ＮＳ）、一方引き続くノルエピネフリン（１０μＭ）またはホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸ（１００μＭ）の適用により、ともにそれを１２％増加させた（ｐ＜１０−６）（図２Ａ）。ＰＫＡ阻害剤Ｒｐ−ＣＰＴ−ｃＡＭＰでの成体マウス筋細胞の前処置（１００μＭ、図２Ｂ）により、ＡＳ強化サルコメア短縮は変化しなかった。
【００６１】
ＡＳ刺激収縮性は、また、ｃＧＭＰ／ＰＫＧから独立していた。溶解性グアニルサンシクラーゼ阻害剤ＯＤＱ（１０μＭ×３０分）での前培養により、ＤＥＡ／ＮＯ誘発の負の変力作用を阻害したが、ＡＳの正の変力作用には影響を及ぼさなかった。ＰＫＡ阻害剤(Rp-8Br-cGMPs、10 μM)での前処置によりＤＥＡ／ＮＯの負の変力作用は、適度な正の作用へと転換されたが、ＡＳ変力作用に影響を及ぼさなかった（図２Ｃ）。
【００６２】
ＮＯドナーは、in vitroおよびin vivoでのβアドレナリン刺激に対して負の効果しか発揮しない；しかしながら、無損傷の心臓において、ＨＮＯドナーに対しては反対のことが見受けられた。Paolocci, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 100, 5537-5542 (2003)。ＨＮＯドナーのβアドレナリン刺激に対する効果を、心筋細胞において試験した。イソプロテレノール（ＩＳＯ、２．５ｎＭ）で負荷した細胞は、サルコメア短縮において１００±２７％の増加を有した（ｐ＝０．００２、ｎ＝３０）。これは、０．２５ｍＭのＤＥＡ／ＮＯの共注入により顕著に鈍化したが、一方、０．５ｍＭのＡＳの共投与により、ＩＳＯ単独よりも短縮を倍加させた（図２Ｄ）。それゆえ、ＡＳ（ＨＮＯ）はβアドレナリン刺激経路と平行して作用する。
【００６３】
ＨＮＯは選択されたタンパク質においてチオール基を標的とする。Fukuto, J.M. et al., Chem. Res. Toxicol., 18, 790-801 (2005)。そのような相互作用が全体の細胞収縮性効果の根底にあるかどうかを試験するために、ＧＳＨの細胞浸透性エステル誘導体を用いて、筋細胞のチオール同等物がはじめに強化されるかどうかの研究を実行した（タイロード液中のＧＳＨエチルエステル、４ｍＭ、３時間）。細胞内チオール内容を豊富にすることにより、興奮収縮共役に関する決定的なチオール残基を標的とする前の、ＨＮＯ補足の確率を強化するであろうという仮説が立てられた。ＧＳＨでの前処置により、二光子顕微鏡検査を用いたグルタチオン  Ｓ−ｂｉｍａｎｅ産生の蛍光アッセイにより決定されるように、細胞内チオール同等物を強化した（＋６±１．５％  蛍光ａ．ｕ．中  対対照群、ｎ＝４０、ｐ＜０．０５）。前処置した細胞をそれからＡＳ（０．５ｍＭ）へと暴露し、かかる収縮性反応は実質的に鈍化した（＋５７±１９％；ｐ＝０．０２  対ベース；ｐ＝０．０５  対ＡＳ単独）（図２Ｅ）。このことにより、ＨＮＯのＳＨ基に対する標的化によりその心臓刺激作用を発揮することが支持された。
【００６４】
例３：単離された成体マウスおよびラット心筋細胞におけるＨＮＯ／ＮＯ−のＣａ２＋透過性への効果
可能性のあるＨＮＯ標的を検索するために、成体マウスおよびラット心筋細胞におけるカルシウム循環を試験した。細胞をまずＡＳへと５〜１０分間暴露し、それから、洗浄し、Ｉｎｄｏ−１またはＦｌｕｏ−４で２０分間担荷した。かかる薬物はＣａ２＋インジケーター（Ｆｌｕｏ−４およびＩｎｄｏ−１の両方）と反応し、その蛍光特性を変えるため、ＡＳでの前処置を実行した。マウスにおいて、焦点ライン走査イメージングで評価したカルシウム透過振幅は、０．５ｍＭ  ＡＳでの基線より〜４０％、（ｎ＝２７、ｐ＜０．００１）（図３Ａおよび図３Ｂ）増加し、ピーク透過までの時間は延長し（図３Ｃ）、一方減衰時間は短縮した（図３Ｄ）。基礎蛍光（Ｆ０）はＡＳ前処置で変化しなかった（図３Ｅ）。類似の結果がラット筋細胞（Ｉｎｄｏ−１を使用）のＣａ２＋透過振幅（図３Ｆおよび図３Ｇ）および減衰時間（図３Ｈ）に対して得られた。振幅における増加は、心臓拡張Ｃａ２＋レベルにおける増加に伴わなかった（速度４０５／４８５＝０．２３９＋０．００６（Ｃｏｎ）対０．２４３＋０．００８（ＡＳ）；ｎ．ｓ．；図３Ａ、図３Ｅおよび図３Ｆもまた参照のこと）。急速な持続カフェイン（１０ｍＭ）投与により、全てのＳＲ  Ｃａ２＋を放出し、次いで［Ｃａ２＋］ｉ低下が、主にＮａ／Ｃａ交換を介して媒介された。カフェイン誘発性Ｃａ２＋の振幅および低下により、ＨＮＬはＳＲ  Ｃａ２＋（図３Ｋ）またはＮａ／Ｃａ交換機能（τ＝２．０±０．４対２．２±０．３ｓ、図３Ｊ）を変化させなかった。これらの結果により、ＨＮＯ強化［Ｃａ２＋］ｉの低下は増加したＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ機能によるものであり、そしてＨＮＯ強化Ｃａ２＋透過振幅は、不変ＳＲ  Ｃａ２＋内容との、強化された分画ＳＲ  Ｃａ２＋放出によるものであった（図３Ｉ）。
【００６５】
ネズミ筋網状（ＳＲ）小胞体における、ＲｙＲ２機能およびＡＴＰ依存性Ｃａ２＋取り込みへのＨＮＯ／ＮＯ−の効果
全体のＳＲ  Ｃａ２＋内容における正味の増加のない、強化されたＳＲカルシウム再取り込みおよび放出に対する証明を得るために、リアノジン感受性放出チャンネル（ＲｙＲ２）におけるＨＮＯ／ＮＯの調節の効果を試験した。プールしたＣ５７／ＢＬ６マウス心臓から単離されたＳＲ膜小胞体におけるＨＮＯ／ＮＯの効果をまた研究し、ＨＮＯが直接ＳＲ  Ｃａ２＋取り込みを強化するかどうかを試験した。
【００６６】
自発的Ｃａ２＋スパークの視覚化およびスパーク周波数の測定
新鮮な単離されたマウス心筋細胞をＣａ２＋インジケーターｆｌｕｏ−４／ＡＭとともに担荷した（Molecular Probes, 20μＭ、３０分間）。共焦点像を、共焦点レーザー顕微鏡(LSM510, Carl Zeiss)を用いて、Zeiss Plan-Neofluor ４０×油浸対象で得た（ＮＡ＝１．３）。Ｆｌｕｏ−４／ＡＭはアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）で励起し、蛍光は＞５０５ｎｍで測定された。像をライン走査モードで、筋細胞の長軸に平行な走査ラインで得た。それぞれの像は１．９２ｍｓ間隔で得られた５１２のライン層から成り、それぞれ０．１０μｍ距離間隔での５１２ピクセルを含んでいた。デジタル画像解析には、Interactive Data language (IDL)でコード化されたカスタマーデザインのプログラムおよび修飾したスパーク同定アルゴリズムを用いた。Cheng, H. etal, Biophys. J., 76, 606-617 (1999)。
【００６７】
平面脂質二重層におけるＲｙＲ２単一チャンネル記録
脂質二重層における単一ＲｙＲ２の記録を、前述のように実施した。Jiang, M.T. et al., Circ. Res., 91, 1015-1022 (2002)。簡潔に、ＰＥ：ＰＳ（１：１  ｎ−デカン中に溶解、２０ｍｇ／ｍｌ）のリン脂質二重層を、デルリンカップ中で〜３００μｍ径の開口で形成した。シスチャンバー（９００μｌ）は２００ＡAxopatch増幅のヘッドステージへと側面接続された電圧対照であり、一方トランスチャンバー（８００μｌ）は仮想接地へ備え付けた。両方のチャンバーははじめは５０ｍＭのメタンスルホン酸セシウムおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ／Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２で満たした。二重層の形成ののち、メタンスルホン酸セシウムはシス側において３００ｍＭへと上昇し、１００〜２００μｇのマウス心性ＳＲ小胞体を添加した。チャンネル開口の検出後、トランスチャンバー中のＣｓ＋は３００ｍＭへと上昇し、化学勾配を崩壊させた。単一チャンネルデータを一定の電圧（−３０ｍＶ）で２〜５分間収集した。チャンネル活性を、１６ビットＶＣＲに基づく１０ｋＨｚサンプリングレートでの獲得および貯蔵システムで記録した。８ポールBesselフィルターで、１．５〜２ｋＨｚのサンプリング周波数でフィルタリングしたのち、信号を解析した。データの獲得および解析をAxon Instrumentsのソフトウェアおよびハードウェア(pClamp v8.0、Digidata 200 AD/DA interface)で行った。
【００６８】
ネズミ心筋からの（ＳＲ）小胞体の単離およびネズミ心性ＳＲ小胞体によるＡＴＰ依存性Ｃａ２＋の取り込みの測定
断片化した筋小胞体（ＳＲ）を含有する粗心臓ミクロソーム小胞体を、ラット心臓に関して、前述のように調製した。Froehlich, J.P. et al., J. MoI. Cell. Cardiol., 10, 427-438 (1978)。頸椎脱臼で殺処分したＣ５７成体オスマウスからのプールした心臓を、氷上の０．９％生理食塩水に配置し、心房および結合組織を取り除き、秤量した。細かくミンチした心筋をPolytronミキサーを用いて１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中でホモジェナイズし、８，５００および４５，０００×ｇでの分画遠心法で筋フィラメント、ミトコンドリアおよび角膜から分離した。０．２５Ｍショ糖＋１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０中に懸濁したＳＲ小胞体を冷凍し、使用に先立って液体窒素中に貯蔵した。Ｃａ２＋取り込みを測定する２０分前に、心性ＳＲ小胞体（貯蔵バッファ中１ｍｇ／ｍｌ）を、新たに調製した１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に溶解させた１０ｍＭのＡＳ（Ｎａ２Ｎ２Ｏ３）の原液から由来する２５０μＭ  ＡＳで培養した。Ｃａ２＋取り込みバッファー中のＳＲ膜を希釈したのち、ＡＳへの暴露から生じる動態における変化が〜１５分の遅延で見られ、実験の期間にわたって効果が持続した（４５〜６０分）。
【００６９】
貯蔵ＡＳ溶液の経時により、刺激活性が完全に損失され、ＨＮＯが分解され生化学的に不活性の産生物、例えば亜硝酸塩へと分解されることを反映した。ストップフローミキシングを用いて、Ｃａ２＋インジケーター染料であるアルセナゾＩＩＩを用いたネズミ心性ＳＲ小胞体によるＣａ２＋蓄積の初期の経時変化を測定した。１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭアルセナゾＩＩＩ、５ｍＭアジ化ナトリウム、および２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４を含有する媒体中に懸濁した膜小胞体（０．４ｍｇ／ｍｌ）を、手動操作式ストップフロー装置(Applied Photophysics, Ltd.)中、２４℃で、１ｍＭ  Ｎａ２ＡＴＰ含有の等量の同一の媒体とともに混合した。混合キュベット中の［Ｃａ２＋］における変化を、６５０ｎｍに設定した単色光分光器とともに、単一ビームＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（ＡＶＩＳ、モデル１４ＤＳ）を用いて、モニターした。取り込み媒体における全体［Ｃａ２＋］は０．５μＭであり、０．２μＭのＣａ−アルセナゾＩＩＩ複合体と平行である、遊離［Ｃａ２＋］を産生した（ＫＡ＝３．３×１０４Ｍ−１）。心性Ｃａ２＋取り込みを阻害する１０μＭのタプシガルギンの存在下で、異なるＣａ２＋濃度（０〜３０μＭ）で行ったアルセナゾＩＩＩのスペクトル操作により、６５０ｎｍでのＣａ２＋に対する吸収ピークおよびタンパク質の欠失において得られた値（６８５ｎｍ）から赤方シフトした６９３ｎｍでの等吸収点を明らかにした。培養媒体へと２５０μＭ  ＡＳを追加しても、アルセナゾＩＩＩのスペクトル特性またはＣａ２＋に対するその反応へと影響を及ぼさなかった。
【００７０】
ＳＲ小胞体によるＣａ２＋取り込みを反映する、６５０ｎｍでの吸収における時間依存性の変化を、３０〜６０ｓ、０．１ｓ間隔でモニターした。Ｃａ２＋−アルセナゾＩＩＩ複合体からのＣａ２＋解離は、染料によるレート限定を除外し、これらの実験において測定されるＣａ２＋蓄積のレートよりも＞１００倍速かった（〜６０ｓ−１）。小胞体光操作による信号変化を、６９３ｎｍの等吸収波長と同一の状態下で実施した分離測定から評価した。Ｃａ２＋取り込みの経時変化の評価のために、６９３ｎｍでの描写的な軌跡を同一の状態下で得られた６５０ｎｍでの個別の軌跡のそれぞれから減じた。Ｃａ２＋取り込みに対する動態的なおよび熱力学のパラメーターを、停止フロー信号を１つまたは２つの指数崩壊関数に非線形回帰を用いた残りの項を加えて近似させることにより、評価した(Prism, Version 3.03)。近似曲線とデータ点の間の差異の残差プロットを用いて、近似における偏りを評価し、最良適合の選択に用いる残差２乗和を計算した。
【００７１】
結果
無損傷の筋細胞において、ライン走査焦点顕微鏡検査（図４Ａ）で評価された増加した周波数のＣａ２＋スパークで明らかなように、ＡＳは、用量依存性の様式で、ＲｙＲ２開確率を強化した（図４Ｂ左パネル；１ｍＭ  ＡＳでのスパーク周波数のおいて１８倍の上昇、ｎ＝１０〜２４、ｐ＜０．００１）。対照的に、ＤＥＡ／ＮＯはスパーク産生に影響をおよぼさなかった（図４Ｂ、右パネル）。個々のスパーク振幅、上昇時間、および空間広さは、ＡＳにより変化せず、ＲｙＲ２活性化への初期の効果を示した。タプシガルギン（１０μＭ、３０分）またはリアノジン暴露（１０μＭ）によるＳＲ  Ｃａ２＋の枯渇により、対照群およびＡＳ（０．５ｍＭ、データは図示せず）におけるＣａ２＋スパークを無効にした。Ｃａ２＋へのＡＳの影響は、チオール感受性であった。ＡＳ暴露に先立って低下したグルタチオン（３ｍＭ、４時間）で前培養した細胞は、増加したスパーク周波数を阻害し（図４Ｃ）、増加した細胞内チオール内容が効果的にＨＮＯシグナル伝達／作用を停止したことを示した。
【００７２】
ＨＮＯがＲｙＲ２タンパク質とともに相互作用し開確率を増加させるかどうかをさらに試験するために、精製再構成ＲｙＲ２を平面脂質二重層で発現させ、定常状態活性をＡＳとともにまたはＡＳなしで記録した。ｃｉｓ（細胞質性）溶液は１０μＭの活性化Ｃａ２＋を含有し、正の３０ｍＶ保持電圧で記録した。ＡＳ（０．１〜１ｍＭ）は周波数において用量依存性の急速な増加および単一のチャンネルコンダクタンスを変えない開イベントの平均時間を発生した（図４Ｄ）。チャンネルが開いている確率（Ｐ０）は、ＡＳなしで平均０．１６±０．０３からチャンネルの細胞質側へと０．３ｍＭ  ＡＳを添加して０．４６±０．０７へと増加した（ｎ＝４）。これは、２ｍＭ  ＤＴＴ（０．１１±０．０４）の添加に際し可逆性であった。これらの所見により、直接のＨＮＯ−ＲｙＲ２相互作用はタンパク質中のチオール基との可逆性反応を介するであろうことが支持される。
【００７３】
ＨＮＯが直接ＳＲ  Ｃａ２＋取り込みを強化するかどうか試験するために、プールしたＣ５７／Ｂ１６マウス心臓から単離されたＳＲ膜小胞体への効果を研究した。２４℃でのストップトフローミキシングでＡＴＰ依存Ｃａ２＋取り込みを測定するに先立って、粗ＳＲミクロソーム小胞体を２５０μＭ  ＡＳで培養した。中程度のＣａ２＋インジケーターである、アルセナゾＩＩＩを用いて、小胞外の区画からのＣａ２＋除去をモニターし、遊離［Ｃａ２＋］をＣａ２＋ポンプの半飽和を発生するレベルで緩衝した（〜０．２μＭ）。６９３ｎｍ（等吸収波長）の吸光度における時間依存性の変化を６５０ｎｍで記録された変化、Ｃａ２＋−アルセナゾＩＩＩ複合体に対する吸収極大、から減じた。Ｃａ２＋蓄積は、はじめの２０ｓ以内に起こる、＞９０％の取り込みの、単相経時変化を呈した（図４Ｅ、上のパネル）。取り込みは１０μＭタプシガルギンで無効となり、一方Ａ２３１８７（５μｇイオノフォア／ｍｇＳＲタンパク質）は、総Ｃａ２＋取り込みを＞５０％減少させ、搬送勾配の部分的な崩壊を反映した（データ非公開）。
【００７４】
ＡＳ／ＨＮＯ暴露により、Ｃａ２＋取り込みに対する速度定数は、６５０〜６９３ｎｍ信号の指数関数解析に基づき１０４％増加させた（０．１５６３ｓ−１対０．３２０４ｓ−１；ｐ＜０．０００５；ｎ＝６）（図４Ｅ下パネルおよび図４Ｆ）。平衡における総Ｃａ２＋取り込みにおける相違はなく（０．００２５７±０．０００３〜０．００２０２±０．０００μＭ、ＡＳ暴露前および後、各々；ｎ＝６；ｐ＝ＮＳ）、ＨＮＯにより活性化により熱力学効率を変化させることなくＣａ２＋ポンプの触媒効率を増加させることを示した。完全に産生物、例えば亜硝酸塩まで崩壊したＡＳの試験溶液への暴露後は、ＳＲ  Ｃａ２＋取り込み活性の刺激を得なかった（データ非公開）。これらの小胞体実験における強化されたＳＥＲＣＡ２ａ機能、および不変の正味のＳＲ  Ｃａ２＋取り込みは、無損傷の筋細胞におけるＡＳ誘発性のＳＲ依存性［Ｃａ２＋］ｉ崩壊およびＳＲ  Ｃａ２＋リークと一貫している（図３Ｈ〜Ｋおよび４Ａ〜Ｄ）。
【００７５】
生理学的設定において、心収縮力および力の減衰速度は、筋フィラメントを刺激する活性化因子Ｃａ２＋を誘発するｃＡＭＰ／ＰＫＡ共役機構を介して典型的には強化される。ＨＮＯは非常に異なり、ｃＡＭＰ／ＰＫＡから独立して心性収縮および弛緩を増加させ、ＳＲ  Ｃａ２＋取り込みおよび放出の直接の強化によりＣａ２＋の透過を調節する。これらの２つの対抗効果は、心臓拡張における正味の上昇またはＳＲ  Ｃａ２＋担荷物における変化がないかを説明しそうである。不変の総ＳＲ  Ｃａ２＋内容での増加したＳＲ  Ｃａ２＋放出は、ＡＳが増加する内部ＳＲ  Ｃａ２＋貯蔵に引き続くリークの減少よりむしろ、ＲｙＲ２機能への効果を有する。Kubalova, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 14104-14109 (2005)。さらに、この直接の効果は、酸化還元感受性および可逆性である。
【００７６】
ＲｙＲ２におけるＨＮＯの作用は、ＮＯドナー、β作動薬およびカフェインにより発揮されるものと非常に異なる。ＮＯドナーはＲｙＲ２を強化する(Stoyanovsky, D. et al., Science, 279, 234-237 (1998))または阻害する(Zahradnikova, A. et al., Cell Calcium, 22, 447-454 (1997))と報告されてきており、そして、基礎Ｃａ２＋スパーク周波数を増加させないと報告される(Ziolo, M.T. et al., Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol., 281, H2295-H2303 (2001))。βアドレナリン性作動薬はＰＫＡ媒介リン酸化反応を介してＲｙＲ２開確率を刺激する。Hain, J. et al., J. Biol. Chem., 270, 2074-2081 (1995)。そのため、いかなる理論を限定することなく、休止Ｃａ２＋スパーク周波数は、βアドレナリン刺激の間に、ＲｙＲ２（Ｐ０確率を増加させる）およびＰＬＢ（ＳＲ  Ｃａ２＋担荷を増加させる）の両方のＰＫＡ媒介リン酸化反応により増加する。Zhou, Y.Y. et al., J. Physiol., 52, 351-361 (1999)。
【００７７】
ヒトβ２Ａｒｓを過剰発現したトランスジェニックマウスにおいて、対照群に類似した休止細胞質性Ｃａ２＋およびＣａ２＋担荷を有するにもかかわらず、Ｃａ２＋スパークは非トランスジェニック細胞よりも大きく、周波数が高い。同文献。このことにより、β媒介ｃＡＭＰ−ＰＫＡ活性化がＣａ２＋に対するＲｙＲ２感度だけでなく、活性化におけるＣａ２＋放出連鎖ＲｙＲ２を変え(Sham, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15096-15101 (1998))、潜在的にＳＲ安定性を変えることを示す。全く対照的に、ＨＮＯは個々のスパーク特性を変えずにスパーク周波数を増加させ、Ｃａ２＋安定性に悪影響を及ぼさない。ＲｙＲ２に対するＨＮＯ作用はカフェインのものとは異なる。単離されたマウス筋細胞において、カフェインは自発的Ｃａ２＋放出イベント（Ｃａ２＋波）を増加させ、薬物の中断後でさえも維持させ(Balasubramaniam, R. et al., Am. J. Physiol.,289, H1584-H 1593 (2005))、そしてＳＲ  Ｃａ２＋カウントを顕著に低下させる。
【００７８】
ＨＮＯのＲｙＲ２への独自の作用は、ＨＮＯの親硫黄性(thiophilic)化学により説明してもよい。ＲｙＲ２に対するＨＮＯの効果は、即座に還元同等物により逆転化され、ＲｙＲ２における遊離チオールおよび決定構造チオール残基の間のＨＮＯに対するリアルタイム競合を示している。これは、細胞内ＧＳＨにおける６％の増加がサルコメア短縮へのＨＮＯの効果の５７％を鈍化させるという、全体の筋細胞でのデータと合っており、より一般化されたチオール関与よりむしろチオラート（−Ｓ−）残基のＨＮＯ「選択的」標的化を示す。これらの特別な標的の同定がシステイン修飾のサブプロテオーム解析を待望しており、部位突然変異は特別な標的の機能的重要性を同定する。
【００７９】
心性変力作用を強化しそして維持するために、弛緩のあいだのＣａ２＋再取り込みの速度は理想的には増加し(Diaz, M.E. et al., Cell Calcium, 38, 391-396 (2005))、ＨＮＯはまたこの効果を達成すると示されてきた。速度は増加する一方、総Ｃａ２＋取り込みは変化せず、Ｃａ２＋ポンプの熱力学効率はＨＮＯにより不変であることが示唆された。このことはＨＮＯがポンプの触媒効率を増加させることにより作用するということを示すが、これを起こさせる機構は現在のところ分かっていない。ＳＥＲＣＡ２ａの強化された取り込み活性がより大きなＣａ２＋放出を相殺する、および後者を阻害することにより（例えば、ルテニウムレッドとともに）正味のＣａ２＋取り込みを増加させるであろうという可能性もある。ＡＳ／ＨＮＯで強化されたＣａ２＋取り込み活性は、ホスホランバンの欠如においてＳＥＲＣ  Ａ２ａを発現したＳｆ２１細胞からのＥＲミクロソームにおいて観察される刺激に結び付くものであり(Mahaney, J.E. et al., Biochemistry, 44, 7713-7724 (2005))、ＡＳ／ＨＮＯはまたＰＬＢを標的にし、ＳＥＲＣＡ２ａのその阻害を和らげる。これらの機構を明確化するために、努力がなされている。
【００８０】
本所見は、過去の無損傷動物のデータを強く支持するに至り(Paolocci, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 10463-10468 (2001); Paolocci, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5537-5542 (2003))、βアドレナリン作動薬に加えて、β−アドレナリン作用遮断から独立した無損傷の心不全における心機能を改善するＡＳの能力を示した。可逆性、チオール依存性、ＳＲ  Ｃａ２＋取り込みおよび放出の強化である、その機構は、新規であり、そして、ＨＮＯに特有であるかもしれない。ＨＮＯの親硫黄性の性質の証明により、それが実際in vivoシグナル伝達分子であるかもしれないということを示唆するが(Schmidt, H.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14492-14497 (1996); Adak, S. et al., J. Biol. Chem., 275, 33554-33561 (2000))、この仮説を試験する方法は現在利用できない。ＨＮＯの生物学的活性の調査はその初期におけるものであるが、本所見により、心不全処置に対する潜在性のある有用性ならびに基礎および作動薬機能に対する細胞内Ｃａ２＋循環に重度に依存する他の細胞系への可能性のある影響を有する、心臓への新規のシグナル伝達効果が示される。
【００８１】
例５：正常および不全イヌ心筋に対するＨＮＯ／ＮＯ−の効果
Ｃａ−ＡＴＰアーゼ部分反応およびＶｍａｘに対するＡＳの効果を、正常（Ｎ）および不全（Ｆ）（急速ペーシング誘発）イヌ心臓から単離された、封入心筋小胞体（ＣＳＲ）膜小胞において測定した。５ｍＭ  ＥＧＴＡでのリン酸化ＳＥＲＣＡ２ａの追跡により測定された自発的Ｅ２Ｐ加水分解により、ＮおよびＦ  ＣＳＲ小胞体における単相動態（１２ｓ−１対１１ｓ−１）が示されたが、０．２５ｍＭのＡＳへの暴露後は有意に増加した（７６ｓ−１対１１１ｓ−１）。０．２５ｍＭのシュウ酸塩（Ｃａ２＋負荷条件）の存在下での、ＮおよびＦ ＣＳＲ（対照群と比較して４％対９％）における０．２５ｍＭ ＡＳ刺激最大Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ活性。Ｖｍａｘ刺激はシュウ酸塩なしで増加し（Ｎ  ＣＳＲにおいて２７％）、Ｃａ２＋電解層、Ａ２３１８７により破壊された。その結果により、ＨＮＯ／ＮＯは、Ｅ２Ｐにおける内腔搬送へのＣａ２＋結合と競合する、Ｅ２Ｐ加水分解を活性化するＮおよびＦ  ＣＳＲにおけるＳＥＲＣＡ２ａを活性化することを示唆する。これにより、Ｃａ２＋によるＳＥＲＣＡ２ａ阻害を和らげ、Ｖｍａｘを増加させる。これらのＨＮＯ／ＮＯ効果は、ホスホランバン（ＰＬＢ）阻害解放後のＳＥＲＣＡ２ａ活性における変化に類似しており、それらはＰＬＢ、ＳＥＲＣＡ２ａ、または両方の共有結合修飾に起因する。
【００８２】
その結果により、ＡＳにより産生されるＨＮＯ／ＮＯは、心筋小胞体（ＣＳＲ）Ｃａ２＋ポンプ（ＳＥＲＣＡ２ａ）の活性化と関係がある、正常および不全イヌ心筋における新機能に対し正の収縮および拡張効果を有することが示す。
【００８３】
例６：チオールおよびグアニルサンシクラーゼ阻害のＡＳ変力作用に対する効果
ニトロキシル（ＨＮＯ）は、in vivoにおいて正の変力作用を付与する。ここにおいて、リアノジン受容体（ＲｙＲ２）からの強化されたＣａ２＋放出に関与する、ＨＮＯ作用が筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋循環に対する直接の影響から生じるかどうかが決定される。筋細胞をＳＴマウスより単離し、タイロード液（１ｍＭ  Ｃａ２＋）中に懸濁し、そしてフィールド刺激した。サルコメア短縮（ＳＳ）をリアルタイムイメージ解析で評価し、Ｃａ２＋透過をＩｎｄｏ−１蛍光から評価した。ＲｙＲ２活性を、単一のＣａ２＋放出単位からのＣａ２＋の光学イメージングにより決定した。ＨＮＯドナーであるアンジェリ塩（ＡＳ）は、用量依存性の変力作用を誘発した（０．５ｍＭにおいてＳＳ：７３±３１％；１ｍＭにおいて１３１±３１％；全てｎ＝１５、ｐ＜．０５対ベース；＜０．１ｍＭ：効果なし）。対照的に、ＮＯドナーであるＤＥＡ／ＮＯは、ＳＳを５〜５０μＭで５５〜６５％低下させ（ともにｐ＜．０５対ベース）、より高い用量において効果はなかった。グアニル酸シクラーゼの阻害により（ＯＤＱ、１０μ、３０’）、ＤＥＡ／ＮＯの負の変力採用を完全に阻止したが、ＡＳ作用への効果はなかった（１５７±４０％；ｎ＝１５、Ｐ＝ＮＳ対ＡＳ  １ｍＭ）。
【００８４】
しかしながら、チオール寄与化合物であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、３ｍＭ）との共注入により、ＡＳ変力作用を無効にさせた。カフェインの急速注入により、ＳＲ  Ｃａ２＋貯蔵が１ｍＭ  ＡＳで低下することが示された（％［Ｃａ２＋］Ｉ：１３８±１７対２２３±３４、ｎ＝８；ｐ＝．０５対カフェイン単独）。それゆえ、ＡＳ／ニトロキシルは、カルシウムスパークの周波数を増加させた（ＣＳＦ、単一のＳＲ放出）；０．５ｍＭにおいてＡＳ、ＣＳＦは対照群よりもほぼ７倍高かった（それぞれ２６±３対４±１スパーク／１００μｍ／ｓ、ｐ＜．０１）。ＤＳＨで前処理した（ｗ．５ｍＭ、３時間）筋細胞は、ＣＳＦにおけるＡＳ誘発の増加を無効にした。等モル用量のＤＥＡ／ＮＯはＣＳＦを顕著には影響しなかった。さらに、ＳＲ  Ｃａ２＋取り込み遮断薬タプシガルギン（３μＭ）はＡＳ変力作用を鈍化させた（５２±１４％、ｐ＜．０５対ＡＳ、ｎ＝１６）。ＨＮＯのin vitro変力作用は、ｃＧＭＰ依存性であり、カルシウムを放出するＲｙＲ２の活性化によるものである。増加した細胞内チオール濃度により、ＲｙＲ２に位置するチオール残基との競合によるかのように、ＨＮＯ効果を防止する。
【００８５】
かかる結果により、ニトロキシルは、リアノジン受容体からのカルシウム放出を、チオール感受性であるがｃＧＭＰ独立性の様式で、増加させる。
【００８６】
例７：ＳＥＲＣＡ２ａ機能へのＨＮＯ／ＮＯ作用および単離されたネズミ心筋細胞における細胞内チオール内容への感度
ニトロキシル（ＨＮＯ）ドナーはin vivoにおいて酸化還元感受性の正の変力物質であるが、作用の機構は不明確のままである。ここで、かかる結果により、ＨＮＯは筋小胞体（ＳＲ）Ｃａ２＋放出および取り込みを、同等物を低下させる細胞内レベルに感受性のある様式で直接刺激することが示される。単離されたネズミ心筋細胞において、ＨＮＯドナーであるアンジェリ塩（ＡＳ）は、サルコメア短縮をＣａ２＋透過を変化させずに増加させ（ＳＳ、例えば１．０ｍＭにおいて１１７±２５％、ｎ＝２１；ｐ＜．０１対ベース）、等モルのＮＯにより再現されない効果がＤＥＡ／ＮＯにより付与された。グアニリルシクラーゼまたはＰＫＧの阻害により、ＨＮＯ応答を変化させなかった。細胞内チオール内容に対するＨＮＯ感度を確認するために、筋細胞チオール定量を二光子顕微鏡検査で実施した。低下したグルタチオン（ＧＳＨ、４ｍＭ、３時間）での前培養により、細胞内チオール内容を増加させ（＋６％、ｐ＜．０５、ｎ＝４０）、ＨＮＯ応答は半分にカットされた：ＳＳ：５８±１９％、ｎ＝１４、ｐ＝．０５％対１ｍＭ  ＡＳ単独）。心リアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＨＮＯの作用に対して評価するために、Ｃａ２＋スパークを光学イメージングにより解析し、ＲｙＲ２を平面脂質二重層に再構成し、単一チャンネル記録を実施した。ＨＮＯはカルシウムスパークの周波数を用量依存性の様式で増加させた：０．５ｍＭ  ＡＳにおいて７倍の増加（２６±３対４±１スパーク／１００μｍ／ｓ、ｐ＜．０１）。
【００８７】
ＧＳＨでの前処置は、ＣＳＦにおける増加を無効にした。再構成したＲｙＲ２において、ＨＮＯは、単位コンダクタンスを変えずに、開放ベント(open vent)の周波数／平均時間を急速に増加させた。チャンネルの開確率（Ｐ０）は、０．１、０．３および１．０ｍＭのＡＳを添加したのち、０．１６±０．０３（対照群）から０．２５±０．０５、０．４６±０．０７および０．６９±０．１１へと、チャンネルの細胞質（ｃｉｓ）側へ増加させた。ＡＳ活性化チャンネルのＰ０は、２ｍＭのスルヒドリル還元剤であるＤＴＴの添加後、シス側への、対照群へと戻った（０．１１±０．０４）。最終的に、ＨＮＯがＳＥＲＣＡ２ａ機能に影響するかどうかを試験するために、ＡＳ（２５０μＭ）を単離された心性マウスＳＲ小胞体へと添加した。ＨＮＯは初期のＣａ２＋取り込みの速度を強化した。そして、それぞれＲｙＲ２の潜在的な活性化を通して、およびＣａ２＋  ＳＲ取り込み動態に対し、、ＨＮＯは筋細胞収縮性（正の変力作用）を増加させ、そして弛緩（正の拡張作用）を加速させた。これらの特性は、心不全におけるＨＮＯ放出化合物の有益な作用に寄与するかもしれない。
【００８８】
かかる結果により、ＨＮＯ／ＮＯ−はネズミ心筋細胞においてＳＲＣａ２＋放出および取り込みを強化することが示される。
【００８９】
例８：ネズミ筋細胞における収縮性へのＨＮＯ／ＮＯ−の効果
ニトロキシルアニオン（ＨＮＯ／ＮＯ−）ドナーは、ＮＯ／硝酸塩ドナーを産出しないin vivo正常心および心不全において、類似した正の変力／拡張効果を発揮すると示されてきた。in vivoのＨＮＯ注入により共役化され、カルシトニン産生関連ペプチド（ＣＧＰＲ）が全身的に放出されるようである。しかしながら、ＨＮＯと異なり、ＣＧＰＲの正の変力作用は、β−遮断感受性であり、ＣＨＦ心において重篤に鈍化させるかもしれない。ＨＮＯ／ＮＯドナーであるアンジェリ塩（ＡＳ）は、肥大および心不全の確立されたモデルと同様に、Ｇαｑ過剰発現マウスにおいて、筋細胞収縮性に直接の正の変力効果を有すると仮定される。
【００９０】
心筋細胞をＷＴおよびＧαｑ過剰発現２〜６月齢ＦＶＢ／Ｎマウスより単離し、タイロード液（１ｍＭカルシウム）へ懸濁し、そして０．５Ｈｚ、２３℃でフィールド刺激した。サルコメア短縮（ＳＳ）をリアルタイムイメージ解析で評価した；データを定常状態で提示する（１０分薬物注入）。
【００９１】
Ｇαｑ過剰発現マウスからの心筋細胞は、イソプロテレノール（ＩＳＯ）に対して抑制された効果を呈した。特に、２．５および１０ｎＭにおいて、ＩＳＯはいかなる収縮性反応をも誘発しなかったが、一方、ＷＴ細胞において同じＩＳＯ濃度においてＳＳを７４±２４％および２５０±７５％、それぞれ強化した（ともにｐ＜．０５対基線、ｎ＝６）。全く対照的に、Ｇαｑ筋細胞はホルスコリン（ＦＳＫ）の注入を介したアデニリルシクラーゼの直接の刺激に対して、用量依存性の方式で、なお感受性であった。ＳＳは２５ｎＭ  ＦＳＫで８５±９％、および１００ｎＭ  ＦＳＫで１５８±６２％増加し（ともにｐ＜．０５対基線、ｎ＝６）、対照細胞である、完全なβ−アドレナリン性脱感作に対して相違はなかった。興味深いことに、Ｇαｑ筋細胞において、ＡＳ注入により、ＷＴ細胞とは顕著に異なる正の変力効果が示された。２５０μＭにおいて、ＡＳは２２±１１％のＳＳにおける増加を引き起こす一方、５００μＭにおいてかかる増加は４０±１１％であった（ともにｐ＜．０５対基線、ｎ＝１０）。
【００９２】
Ｇαｑ過剰発現マウスからの心筋細胞は、完全なβ−アドレナリン性脱感作を呈する。一方、ニトロキシルは正の変力効果を発揮し、βアドレナリン性シグナル伝達経路と独立しているようである。それゆえ、ニトロキシル作用は心不全の処置において治療的方策として臨床的に意義があるかもしれない。それゆえ、かかる結果により、心収縮性血管のネズミモデルにおいて筋細胞レベルでの収縮性を増加させることが示される。
【００９３】
例９：収縮終期および拡張終期圧−次元評価
成体オス雑種犬（２２〜２５ｋｇ）を、前述のように、圧次元解析に関し慢性的に測定した。Paolocci et al., "Positive Inotropic and Lusitropic Effects of HNO/NO- in Failing Hearts: Independence from Beta- Adrenergic Signaling," Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 5537-5542 (2003); およびSenzaki et al., Circulation, 101, 1040-1048 (2000)を参照のこと。動物をナトリウムチオペンタール（１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）での誘導後、１〜２％のハロタンで麻酔した。外科的／実験的動物プロトコールは、Johns Hopkins大学動物管理使用委員会により承認された。外科的処置は、ＬＶマイクロマノメーター（Ｐ２２；Komgsberg Instruments, Pasadena, CA）、腹背のＬＶ次元を測定するソノマイクロメーター、心前負荷を変化させる下大静脈周囲閉塞、大動脈圧カテーテル、超音波冠血流プローブ（近位回旋動脈）、および心房ペーシングのための心外膜ペーシング電極の設置を含んだ。記載されるように、心不全を３週間の急速心室ペーシングにより誘発した。Paolocci et al., supra、およびSenzaki et al., supraを参照のこと。
【００９４】
血流力学データを２５０Ｈｚでデジタル化した。定常状態パラメーターを１０〜２０連続拍動から平均化したデータから測定する一方、透過過大静脈閉塞の間に収集したデータを用いて圧−次元相関を決定した。これらのデータは、以前立証したように、正常心および心不全における圧−容量からの結果と強く相関した。心血管機能を、ストローク次元、分画短縮（ストローク次元／心臓拡張終期次元［ＥＤＤ］）、推定心拍出量（ストローク次元×ＨＲ）、圧上昇のピーク速度（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）、収縮終期エラスタンス（Ｅｅｓ、収縮終期圧次元相関の勾配［ＥＳＰＤＲ］）、ｄＰ／ｄｔｍａｘ−ＥＤＤ相関（ＤＥＤＤ）（Little, Circ Res., 56:808-815 (1985)を参照のこと）、収縮終期エラスタンス（Ｅｅｓ、収縮終期圧次元相関の勾配［ＥＳＰＤＲ］）、ｄＰ／ｄｔｍａｘ−ＥＤＤ相関の勾配（ＤＥＤＤ）（Little, Circ Res., 56:808-815 (1985)を参照のこと）、前動員１回仕事量(pre-recruitable stroke work)（ＰＲＳＷ）、（次元データに基づく）、推定動脈エラスタンス（Ｅａ、収縮終期圧／ストローク次元）および推定全抵抗値（ＲＴ、ストローク次元×ＨＲ／大動脈圧）により評価した。Ｅｅｓ、ＤＥＤＤおよびＰＲＳＷにより担荷の強烈な収縮性の測定がもたらされた。
【００９５】
拡張終期圧−容量相関（ＥＤＰＶＲ）を、Kass, Cardiol Clin., 18, 571-86 (2000)(Review)に記載のように、拡張収縮期圧および容量点（それぞれ、ＰｅｄおよびＶｅｄ）に非線形回帰解析を適用して決定した。これらのデータは以下の２つの等式、Ｐｅｄ＝Ｐ０＋ｂｅａＶｅｄおよびＰｅｄ＝ｂｅａＶｅｄに適合した（２つめの式はＰ０の項を単に除去した）。前者の等式は、ゼロ圧力減衰漸近線を推定しないため、好ましい。
【００９６】
ＥＤＰＶＲに対するそれぞれの薬理学的介入の効果を評価するために、１０、１２．５、１５、１７．５および２０ｍｍＨｇＥＤＰ（それぞれ、Ｆ１０、Ｆ１５、Ｆ２０）の基線拡張終期圧を提供する用量における基線（ΔＰｅｄ）からの拡張終期圧における変化を決定した（図５）。
【００９７】
ＨＮＯ、ＮＯおよび硝酸塩ドナーのＥＤＰＶＲへの効果
３０％〜５０％の心不全患者が収縮期左心室（ＬＶ）機能を温存することが推定され、しばしば拡張期心不全（ＤＨＦ）と呼ばれる。これは、高齢者、高血圧性、女性である、および高血圧症を有する患者においてより顕著に起こるようである。これらの患者において死亡率は高く、病的状態および入院率は収縮期心不全の患者のものと類似する（Kass et al., "What Mechanisms Underlie Diastolic Dysfunction in Heart Failure?" Circ. Res., 94(12): 1533-42 (June 25, 2004)を参照のこと）。拡張期心不全の患者の管理は、本質的に経験的、限定的および失望的である。処置の選択肢に基づく、新規の薬物、デバイス、および遺伝子療法が、現在調査中である。Feld et al., 8(1), 13-20 (2006)を参照のこと。
【００９８】
一酸化窒素ドナーが心臓拡張機能を改善するかもしれないということが報告されてきた（Paulus et al., Heart Fail. Rev., 7(4), 371-83 (Oct. 2000)を参照のこと）。しかしながら、ニトログリセリンで図６で示されるように、そのような改善はＥＤＰＶＲ相関の平行下方シフトで構成され（Matter et al., Circulation, 99(18), 2396-401, (1999)を参照のこと）、心臓におけるＮＯ／硝酸塩ドナーにより発揮される除荷効果を反映するようである。対照的に、左心室コンプライアンス（膨張性）が実際に影響される場合、平行シフトと異なる、ＥＤＰＶ相関の勾配における変化が、予期されるであろう（特に最高拡張終期容積／圧において）。
【００９９】
先の研究により、ＨＮＯドナーはＣＨＦを意識する調製物における心筋弛緩ならびに拡張期圧を改善するかもしれないということが示された（Paolocci et al., supraを参照のこと）。だが、ＥＤＰＶＲ解析は未だに実施されていない。
【０１００】
図７で示されるように、かかる結果はＩＰＡ／ＮＯにより付与されるＨＮＯはＣＨＦ調製物においてＥＤＰＶＲの下方シフトを作り出すことができるということを実証し、心臓における除荷効果だけでなく、より重要にもＥＤＰＶＲの勾配における変化も示す。矢印は最高容量充填拡張期圧が、ＩＰＡ／ＮＯで処置した心臓において、非処置ＣＨＦ心臓に対して少ないことを示す。
【０１０１】
図８は、特定の容量におけるΔＰｅｄの平均変化を示す。全体的に、これらの変化は相対的に小さい。だが、ＨＮＯドナー、ＩＰＡ／ＮＯおよびＡＳの両方の場合（データ非公開）、ＥＤＰＶＲは基線曲線適合から顕著に低下し、左心室のコンプライアンスにおける改善を示すようであった。対照的に、（ＤＥＡ／ＮＯからの）ＮＯ、（ＮＴＧからの）硝酸塩のいずれも、ＬＶコンプライアンスを顕著には改善しないが、むしろ、心室の担荷における変化により、図６においてＮＴＧに対して描かれているように、ＥＤＰＶＲの平行下方シフトを誘発する。
【０１０２】
上で特定する全ての出版物、特許および／または特許出願は、明細書中に引例として組み入れる。
【０１０３】
本発明はそのように記載され、同様のことが多くの方法で、本発明の精神および範疇より開始することなく変化してもよいことは明らかであろう。かかる変化形は主張される本発明の範疇内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】単離された心室筋細胞において、ＨＮＯが収縮および弛緩を増加させることを集合的にに示す、一連のグラフである。
【図２】筋細胞機能に対するＡＳ／ＨＮＯ作用がｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ独立性であるが、細胞内チオール内容により調節されることを集合的に示す、一連のグラフである。
【図３】単離されたネズミおよびラット筋細胞におけるＡＳによるＣａ２＋透過の増加を集合的に示す、一連のイメージおよびグラフである。
【図４】ＡＳ／ＨＮＯがチオール感受性の方式でＲｙＲ２機能を増加させることおよびネズミ筋小胞体（ＳＲ）小胞においてＡＴＰ依存性Ｃａ２＋取り込みを増加させることを集合的に示す、一連のグラフである。
【０１０５】
【図５】拡張気圧−容量関係（ＥＤＰＶＲ）の評価方法を示すグラフである。
【図６】ＮＯドナーであるニトログリセリンのＥＤＶＰＲに対する効果を示すグラフである。
【図７】ＨＮＯ／ＮＯドナーであるイソプロピルアミンジアゼニウムジオラート（ＩＰ  Ａ／ＮＯ）のＥＤＰＶＲに対する効果を示す、一連のグラフである。
【図８】特定のＬＶ用量における拡張終期圧（ΔＰｅｄ）の平均変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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