(57)【要約】  本発明は、癌組織で特異的に発現する、ＡＩＭＰ２のエクソン２が欠損した変異体ＡＩＭＰ２ＤＸ２に関する。このＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質および遺伝子は、癌の診断および治療の発展にうまく活用できる。
2008521398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＩＭＰ２（ARS-interacting multi-functional protein 2）タンパク質のエクソン２領域が欠失したＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質。
【請求項３】
癌診断マーカーである、請求項１に記載のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質。
【請求項４】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子。
【請求項５】
配列番号１のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子を含む組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７の形質転換体を培養して請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を製造する方法。
【請求項９】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に特異的な抗体。
【請求項１０】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に特異的な抗体を含む癌診断キット。
【請求項１１】
（ａ）分析する試料を提供する段階と、
（ｂ）前記試料から、請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の発現を検出する段階とを含んで、癌診断マーカータンパク質ＡＩＭＰ２ＤＸ２を検出する方法。
【請求項１２】
段階（ｂ）において、請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に特異的な抗体と接触させて検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
段階（ｂ）において、増幅反応またはハイブリッド化反応によって検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
増幅反応が、ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２ＤＸ２のｍＲＮＡを区分するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction）により行われるか、或いは、ハイブリッド反応が、ＡＩＭＰ２とＡＩＭＰ２ＤＸ２のｍＲＮＡを区分するプローブを用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号５と６、配列番号７と８、または配列番号１６と６のヌクレオチド配列を有するプライマー、または配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列を有するプローブを用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列を有する核酸分子。
【請求項１７】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ核酸分子。
【請求項１８】
配列番号９と１０、配列番号１１と１２、または配列番号１３と１４のヌクレオチド配列でコーディングされるセンスとアンチセンスＲＮＡを含む、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ核酸分子。
【請求項１９】
請求項１７のｓｉＲＮＡ核酸分子を含む、癌を治療するための薬剤学的組成物。
【請求項２０】
請求項１７のｓｉＲＮＡ核酸分子を投与して癌を治療する方法。
【請求項２１】
請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相補的な配列を有するアンチセンス核酸分子。
【請求項２２】
請求項２１のアンチセンス核酸分子を含む、癌を治療するための薬剤学的組成物。
【請求項２３】
請求項２１のアンチセンス核酸分子を投与して癌を治療する方法。
【請求項２４】
（ａ）試験物質を、ＡＩＭＰ２タンパク質とＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を含む組成物と接触させる段階と、
（ｂ）試験物質がＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制するかを測定する段階とを含んで、請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制する抗癌剤をスクリーニングする方法。
【請求項２５】
イーストツーハイブリッド（yeast-two-hybrid）または試験管内プルダウンアッセイ（in vitro pull-down assay）によりスクリーニングする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）試験物質を、請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子を発現する細胞と接触させる段階と、
（ｂ）試験物質によるＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解促進を測定する段階とを含んで、請求項１のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現を抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解を促進する抗癌剤をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
ＲＴ−ＰＣＲまたはウエスタンブロットによりスクリーニングする、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ＡＩＭＰ２のエクソン２が欠損した変異体ＡＩＭＰ２ＤＸ２およびその利用に係り、具体的には、ＡＩＭＰ２ＤＸ２、その診断マーカーとしての用途およびその抑制剤を使用した抗癌用途に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
癌による死亡が世界的に増加しつつある。去る数年間、癌に対する集中的な研究が行われたにも拘わらず、癌は依然として全世界的な主要死亡原因である。
【０００３】
外科切除術、放射線療法、化学療法またはその他の公知の治療方法による適切な治療作用を容易にするためには、癌の初期診断のための迅速且つ簡単な方法が要求される。
【０００４】
癌特異的マーカーの開発は、癌の診断だけでなく、癌特異的な治療のためにも要求されている。細胞傷害性療法（cytotoxic therapies）は、最初に抗癌治療剤として使用されて以来、５０余年間癌の治療に広範囲に使われてきたが、癌細胞の他に、分裂速度が比較的速い他の臓器の細胞に非特異的に作用して強い毒性を示し、深刻な副作用を引き起こすという問題がある。このような既存抗癌剤の副作用および耐性を克服するために、正常細胞の癌化過程に現われる癌特異的マーカー（cancer specific marker）を用いて、腫瘍細胞特異的に作用する治療剤を開発しようとする研究が行われた。抗癌剤による毒性を最小化するための方案として台頭している癌ターゲッティング療法（cancer targeted therapy）の核心は、癌細胞特異的な遺伝子を探し出すことにある。
【０００５】
このような背景の下、本発明者は、ＡＩＭＰ２のエクソン２欠失変異体であるＡＩＭＰ２ＤＸ２をマーカーとして用いる場合、非常に高い信頼度で癌発生の有無を確認することができ、且つ、ＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現が癌誘発の直接的原因となるので、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に特異的な抗体、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡに対する特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を用いる場合、癌細胞特異的に癌を治療することができるということを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、ＡＩＭＰ２タンパク質のエクソン２の領域が欠失したＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子を提供することにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子を含む組み換えベクターを提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記形質転換体を培養してＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を製造する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に特異的な抗体を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に対する抗体を含む癌診断キットを提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、（ａ）分析する試料を提供する段階と、（ｂ）前記試料から、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の発現を検出する段階とを含んで、癌診断マーカータンパク質ＡＩＭＰ２ＤＸ２を検出する方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ核酸分子を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ核酸分子を含む癌治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ核酸分子を投与して癌を治療する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンス核酸を提供することにある。
【００１８】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンス核酸を含む癌治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相補的な配列を持つアンチセンス核酸を投与して癌を治療する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、ＡＩＭＰ２タンパク質のｍＲＮＡとＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡを区分するプライマーまたはプローブを用いて癌診断マーカータンパク質ＡＩＭＰ２ＤＸ２のｍＲＮＡを検出する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、（ａ）試験物質を、ＡＩＭＰ２タンパク質とＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を含む組成物と接触させる段階と、（ｂ）試験物質がＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制するかを測定する段階とを含んで、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制する抗癌剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、（ａ）試験物質を、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞と接触させる段階と、（ｂ）試験物質によるＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解促進を測定する段階とを含んで、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解を促進する抗癌剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【００２３】
〔図面の簡単な説明〕
図１ａ〜図１ｅは、ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す。ＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２−／−ＭＥＦｓにおいてＴＧＦ−βが細胞増殖（図１ａ）、コロニー形成（図１ｂ）、細胞周期の進行（図１ｃ）、並びにＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３の核移動（図１ｄ）に及ぼす効果を測定した。図１ａでは、０、２および４ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β濃度で６時間細胞を培養した。ＴＧＦ−β無処理細胞におけるチミジン挿入（thymidine incorporation）を１としたとき、数値は４つの独立的実験値の平均を示す。図１ｂでは、ＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２−／−ＭＥＦｓ（１４．５ｄ）をＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下に４時間培養し、ホルムアルデヒドで固定した後、Ｇｉｅｍｓａ染色によりコロニーを視覚化した。図１ｃでは、ＭＥＦｓをＴＧＦ−βで２４時間処理した後、Ｇ０／Ｇ１相細胞の占有程度をフローサイトメトリー（flow cytometry）で検査した。図１ｄでは、ＭＥＦＳをＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理した。Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３をその特異的抗体で反応させた後、ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（緑色）で視覚化した。核はＰＩ（赤色）で染色された。図１ｅでは、ＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３との相互作用を、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３に対する抗体を用いた共同免疫沈殿（coimmunoprecipitation）によって検査した。
【００２４】
図２ａ〜図２ｆは、ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す。図２ａでは、Ａ５４９細胞をＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、所定の時間に収穫して抽出したタンパク質を抗−Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３抗体で免疫沈殿させ、共同沈殿したＡＩＭＰ２を抗−ＡＩＭＰ２抗体で測定した。ＷＣＬは全細胞溶解物（lysate）のタンパク質ウエスタンブロットを示す。図２ｂでは、ＴＧＦ−βのターゲット遺伝子、ｐ１５、ｐ２１およびＰＡＩ−１の発現を、対照区およびＡＩＭＰ２で形質転換されたＤＵ１４５でＲＴ−ＰＣＲによって検査した。図２ｃでは、ＡＩＭＰ２−／−ＭＥＦｓにおいてＳａｍｄ２のリン酸化に及ぼすＡＩＭＰ２の効果を示す。図２ｄでは、Ｓａｍｄ２の個別ドメイン（Ｍａｄ−相同ドメイン、ＭＨ１、ＭＨ２およびリンカー）をＬｅｘＡ融合タンパク質で発現させ、Ｂ４２融合ＡＩＭＰ２との相互作用をＸ−ｇａｌ含有酵母培地におけるブルーコロニー形成によって観察した。図２ｅでは、Ｓｍａｄ２とＴＧＦ−β受容体のＴＧＦ−β依存的相互作用を共同免疫沈殿で測定した。ＭＥＦｓを３７℃でＴＧＦ−βで処理し、免疫沈殿の前に８℃で培養した。ＴＧＦ−β受容体とＳｍａｄ２との結合を抗−ＴβＲＩ抗体で免疫ブロットして観察した。図２ｆでは、ＴＧＦ−β処理後のＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２−／−ＭＥＦｓにおける総Ｓｍａｄ２、リン酸化Ｓｍａｄ２（ｐ−Ｓｍａｄ２）およびＡＩＭＰ２水準の時間別推移を示す。
【００２５】
図３ａ〜図３ｆは、ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果である。様々な癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の水準をウエスタンブロット（図３ａ）、フローサイトメトリー（図３ｂ）で比較した。Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ４６０、−Ｈ３２２およびＨ２９０は肺癌細胞株であり、ＤＵ１４５およびＨＣＴ１１６はそれぞれ前立腺と大腸癌の細胞株である。図３ｂでは、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ」は２次抗体のみで処理したＤＵ１４５を示す。各細胞株の２０００細胞を分析した。図３ｃでは、ＡＩＭＰ２の転写水準を相異なるプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲによって比較した。エクソン３〜４および１〜３を貫通する転写物は、それぞれプライマー６／７および１／５（図８ｂ）を用いて生成された。ＧＡＰＤＨをローディング対照区として用いた。エクソン１〜３の転写物に相当するプライマー対を用いる場合、小さいＡＩＭＰ２転写物（smaller AIMP2 transcript）が生成された。このような小さい転写物はエクソン２が足りない、ＡＩＭＰ２の相異なるスプライシング型（ＡＩＭＰ２ＤＸ２）である。このような転写物は、プライマーＤＸ２−Ｆ、およびエクソン１と３間の接合配列に特異的なプライマーＤＸ２−８（図８ｂ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行うとき、低い−ＡＩＭＰ２水準を示す細胞株のみで生成された。図３ｄでは、ＡＩＭＰ２のＴＧＦ−β依存的誘導および核移動は、ＴＧＦ−βで２時間培養した後、免疫蛍光染色して調査した。図３ｅでは、表示された細胞の増殖に及ぶＴＧＦ−βの効果を［３Ｈ］チミジン挿入（ｎ＝４）によって比較した。図３ｆでは、目的遺伝子、ｐ２１およびＰＡＩ−１のＴＧＦ−β依存的誘導を、ＴＧＦ−βにより２時間処理した後でＲＴ−ＰＣＲによって比較した。
【００２６】
図４ａ〜図４ｈは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果である。図４ａでは、ＴＧＦ−βにより２時間処理または無処理されたＤＵ１４５細胞にＤＸ２をトランスフェクションした後、ＡＩＭＰ２水準をウエスタンブロットで測定した。ｃ−ｍｙｃ、ＤＸ２およびＧＡＰＤＨ（対照区）の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検査した。図４ｂでは、ＤＵ１４５をＤＸ２および空ベクターで形質転換した後、ＴＧＦ−β依存的細胞成長抑制に及ぶ効果をチミジン挿入によって検査した（ｎ＝４）。図４ｃでは、ＡＩＭＰ２−Ｆおよび−ＤＸ２間の相互作用をイーストツーハイブリッドアッセイ法（Rho et al, Pro Natl Acad Sci USA 96, 4488-93（1999））で測定した。図４ｄでは、ＡＩＭＰ２−Ｆおよび−ＤＸ２を［３５Ｓ］メチオニン存在の下にインビトロ翻訳で合成した後、ＧＳＴ−ＡＩＭＰ２−Ｆまたは−ＣＤＫ２（対照区）と混合し、その後グルタチオン−セファロースで沈殿させた。沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離し、オートラジオグラフィー法によって検出した。図４ｅでは、ＡＩＭＰ２−Ｆまたは−ＤＸ２とＦＵＳＥ−結合タンパク質（ＦＢＰ：FUSE-binding protein）（Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003））およびＳｍａｄ２との相互作用をイーストツーハイブリッドによって測定した。図４ｆでは、プロテアソーム抑制剤、ＡＬＬＮ（５０μＭ、４時間）がＡＩＭＰ２−Ｆおよび−ＤＸ２の水準に及ぼす効果をＤＸ２生成Ｈ３２２細胞において抗−ＡＩＭＰ２抗体を用いてウエスタンブロットで測定した。ＤＸ２形態はその試験管内合成されたカウンタパートとのゲル上の共同移動（co-migration）で確認した（資料なし）。図４ｇでは、ＡＬＬＮ（２０μＭ、２時間）で処理した後、ＡＩＭＰ２の増加を、Ｈ３２２細胞において抗−ＡＩＭＰ２抗体を用いて免疫蛍光染色により調べた。図４ｈでは、Ｍｙｃ−ｔａｇ付きＤＸ２でＡＬＬＮ処理ＤＵ１４５細胞を形質転換し、抗−ＡＩＭＰ２抗体を用いてＡＩＭＰ２を免疫沈殿させた後、ユビキチン化されたＡＩＭＰ２分子を抗−ユビキチン抗体（Ｕｂｉ）で免疫ブロットして観察した。
【００２７】
図５ａ〜図５ｈは、ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す。図５ａでは、ＤＸ２（または空ベクター）をＭＥＦｓにトランスフェクションした後、細胞成長に対する効果を観察した。細胞およびコロニ―をそれぞれ光學顯微鏡（上）およびGiemsa染色（下）で観察した。図５ｂでは、ＤＸ２特異的な３種のｓｉＲＮＡをコーディングするヌクレオチド配列を示す。図５ｃでは、３種のｓｉＲＮＡを発現するベクターをそれぞれ製造し、このベクターで癌細胞株としてのＨ３２２およびＨ４６０細胞株を形質転換した後、正常的ＡＩＭＰ２およびｓｍａｄ２のリン酸化に及ぶ影響を調査した。図５ｄでは、４番および５番のｓｉＲＮＡでＨ３２２細胞を形質転換したときのＴＧＦ−βによる細胞死滅の程度（左）と細胞周期の停止程度（右）を示した。図５ｅでは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２をターゲッティングする４番のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＸ２）を発現するベクターをＨ３２２に組み込み、ＤＸ２転写抑制に対する効果をＲＴ−ＰＣＲによって測定した（上）。ｓｉ−ＤＸ２は、エクソン３〜４に相当する転写物のＲＴ−ＰＣＲから分かるように、全長ＡＩＭＰ２（full-length AIMP2）転写には影響を及ぼさなかった。ｓｉ−ＤＸ２がＳｍａｄ２のリン酸化およびＡＩＭＰ２の発現に及ぼす効果をウエスタンブロットで測定した（下）。ＴＧＦ−βシグナル伝達の復旧に及ぶｓｉ−ＤＸ２の効果を、Ｈ３２２を用いてＳｍａｄ２の免疫蛍光（図５ｆ）、３ＴＰプロモータ下のＴＧＦ−β依存的レポーターアッセイ（図５ｇ）、成長停止（図５ｈ）で測定した。図５ｆでは、ｐ−Ｓｍａｄ２および核をＴＧＦ−β処理３０分の後にＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体（緑色）およびＰＩ（赤色）で３０分間染色した。ｓｉ−ＤＸ２の形質転換によってｐ−Ｓｍａｄ２が増加し、核に位置する。
【００２８】
図６ａ〜図６ｆは、肺癌の形成とＡＩＭＰ２との関連性を観察した結果である。図６ａでは、ＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２＋／−マウスにベンゾ−（α）−ピレン（benzo-（α）-pyrene）を腹腔内投与した後、時間間隔で肺腫瘍形成を観察した。「Ｎ」は犠牲されたマウスの数を示す。図６ｂでは、肺癌患者の正常および腫瘍部位から単離されたＲＮＡをＤＸ−２特異的プライマーでＲＴ−ＰＣＲした。図３ｃでは、患者の（コード番号で表示）正常および腫瘍組織を抗−ＡＩＭＰ２抗体を用いてＲＴ−ＰＣＲした。
【００２９】
図７は、ＡＩＭＰ２との相互作用に関連したＳｍａｄ２ドメインを測定した結果である。ＡＩＭＰ２またはＣＤＫ２をコードするｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ４Ｔ−１のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位と結合させ、ＧＳＴ融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた後、製造者の説明に従って融合タンパク質を単離した。相異なるＳｍａｄ２欠失断片は、ＴＮＴカップリングされた転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて［３５Ｓ］メチオニンの存在下に試験管内転写（in vitro translation）で合成した。グルタチオンセファロースビードに結合したＧＳＴ融合タンパク質は、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロライド（ＰＭＳＦ）、および１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の結合緩衝液で［３５Ｓ］メチオニンラベル付きＳｍａｄ断片と培養した。結合混合物を４℃で回転させながら一晩培養した後、０．５％トリトンＸ−１００を含む結合緩衝液で４回洗浄した。ＳＤＳサンプル緩衝液を添加した後、結合したタンパク質を加熱して溶出させ、ＳＤＳゲル電気泳動によって単離した。Ｓｍａｄ２断片の存在はオートラジオグラフィー法（autoradiography）によって確認した。
【００３０】
図８ａおよび図８ｂは、ＡＩＭＰ２遺伝子のエクソン配列およびＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡにおけるプライマーの位置を示す。図８ａでは、ＡＩＭＰ２遺伝子は表示された大きさのポリペプチドをコーディングする４つのエクソン（青色で表示）から構成されている。図８ｂは、ＡＩＭＰ２の相異なる領域を貫通するｃＤＮＡの生成に使用されるプライマーの位置および配列を示す図式図である。
【００３１】
図９ａ〜図９ｄは、癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現減少およびＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を観察した結果である。図９ａでは、ＤＸ２−ポジティブおよび−ネガティブ細胞間のＡＩＭＰ２水準を比較するために、一つのディッシュにＤＵ１４５およびＨ４６０細胞を培養し、抗−ＡＩＭＰ２抗体（緑色）で免疫蛍光染色を行った。ＤＵ１４５細胞は突然変異のため高い水準でｐ５３を発現するが、Ｈ４６０細胞は野生型のｐ５３を持つため低い水準を保つ。よって、２つの細胞株をｐ５３免疫蛍光染色（赤色）で区分した。細胞をＴＧＦ−βで２時間処理し、メタノールで固定した。図９ｂでは、ＡＩＭＰ２の発現にＡＩＭＰ２ＤＸ２が及ぼす効果を検討するために、ＡＩＭＰ２水準をフローサイトメトリーで検査した。２μｇ／ｍｌの空ベクターまたはＤＸ２でＤＵ１４５細胞を形質転換し、２４時間培養した。細胞を７０％のエタノールで固定した後、抗−ＡＩＭＰ２抗体で反応させ、次いでＦＩＴＣコンジュゲート２次抗体で反応させた。図９ｃでは、ＴＧＦ−β依存的細胞の周期停止に及ぶＡＩＭＰ２ＤＸ２の効果をフローサイトメトリーで比較した。空ベクターで形質転換されたＤＵ１４５細胞におけるＧ０／Ｇ１相細胞の割合は増加するに比べて、ＤＸ２で形質転換された細胞ではそうではなかった。黒色線と青色線は、それぞれＴＧＦ−βで無処理および処理された細胞を表示する。図９ｄでは、１０μＭのＡＬＬＮで２時間無処理（対照区）または処理されたＨ４６０細胞におけるＡＩＭＰ２水準を比較した。「ネガティブ」は、ＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体のみで培養された細胞を示す。
【００３２】
図１０ａおよび図１０ｂは、肺癌組織におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成およびＡＩＭＰ２の抑制を示す。ベンゾピレンで注射されたＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２＋／−マウスから肺を単離した後、ＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成をＲＴ−ＰＣＲで測定するために、各肺からＲＮＡを単離した。ＤＸ２を生成する全ての肺は、腫瘍が生成された（＋で表示）。
【００３３】
図１１ａおよび図１１ｂは、様々な組織と細胞におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２が発現することを示す。図１１ａでは、ヒト組織における肝癌とＡＩＭＰ２ＤＸ２の形成をＲＴ−ＰＣＲで検査した。図１１ｂでは、多様な癌細胞株におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現を示す結果である。
【００３４】
図１２は、ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウト（ＡＩＭＰ２＋／−）させたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２の発現が正常的な野性型マウスと比較して示す。図１２ａでは、ＡＩＭＰ２突然変異マウスの特徴をサザンブロットとＰＣＲ分析で確認した。マウスＡＩＭＰ２遺伝子のイントロンＩ領域からプライマーｆ３とｒ２を用いて１２２３ｂｐ ＰＣＲ断片を生成し、これをマウスゲノムＤＮＡのＳａｃＩ断片のハイブリッド化のためのプローブとして使用した。ｆ６、ｒ６およびｐＫＯｆ２プライマーの混合物をＰＣＲ分析に使用した。野性型および突然変異された形質は、それぞれ約１．２および１．９ｋｂ ＰＣＲ産物を生成した。ＡＩＭＰ２の発現に及ぶ突然変異効果を、ＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット、および単離されたヒトＡＩＭＰ２に対して生成された多クローンウサギ抗体を用いたウエスタンブロットで測定した。ノーザンブロットの各レーンから同量のアクチンが検出された（資料なし）。＋／＋、＋／−および−／−は、野性型、異型接合および同型接合の突然変異マウスを示す。また、ｇｅｎｅ ｔｒａｐの挿入位置を突然変異された形質のゲノムＤＮＡのシーケンシングで測定した。図１２ｂは、ＡＩＭＰ２＋／−と野性型マウスの癌発生比率を示す。図１２ｃは、ＡＩＭＰ２＋／−と野性型マウスの形成された腫瘍の平均数を示す。図１２ｄは、ＡＩＭＰ２＋／−と野性型マウスの肉腫形成を示す。
【００３５】
図１３は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２発現ベクターを示す。
【００３６】
〔発明を実施するための最良の様態〕
ＡＩＭＰ２（ARS-interacting multi-functional protein 2）は、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素複合体（Aminoacyl-tRNA synthetase：ＡＲＳｓ）の形成に関連したタンパク質の一つであって、ｐ３８／ＪＴＶ−１またはｐ３８と呼ばれる。
【００３７】
本発明者は、ＡＩＭＰ２タンパク質の新規機能によって、先行研究においてＡＩＭＰ２の遺伝的崩壊がｃ−ｍｙｃの過発現を誘導し、これにより肺胞上皮細胞（alveolar epithelial cell）が過増殖しながら新生マウスの致死（neonatal lethality）が誘導されることを明らかにし、且つ、ＡＩＭＰ２がＴＧＦ−βによって誘導され、核に移動してｃ−ｍｙｃの発現を抑制することを分子および細胞学的分析によって解明したことがある（Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336（2003））。
【００３８】
前述した研究に続き、本発明者は、ＡＩＭＰ２が、新規の癌抑制子（tumor suppressor）であって、Ｓｍａｄ２／３との直接相互作用によってＴＧＦ−βのシグナル伝達を強化させる機能をすることを解明した。また、癌細胞株および組織において、ＡＩＭＰ２エクソン２欠損型の変異体であるＡＩＭＰ２ＤＸ２が特異的に発現することを確認した：エクソン２が欠損したＡＩＭＰ２変異体であるＡＩＭＰ２ＤＸ２の存在を、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＡＩＭＰ２−特異的プライマーの組み合わせによってベンドが異なることから確認した。エクソン３と４を含むＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡに由来したプライマー対をＲＴ−ＰＣＲに使用したときは、ウエスタンブロットにおいて低いＡＩＭＰ２水準を示す細胞からＡＩＭＰ２転写減少が観察されなかったが、エクソン１〜３を含む転写物に由来したプライマーをもってＲＴ−ＰＣＲを行ったとき、予想サイズの転写物と共に小さい転写物も現われた。小さいバンドの形で現われる転写物をシーケンシングした結果、ＡＩＭＰ２のエクソン２に相当する６９アミノ酸が全て欠損したＡＩＭＰ２の変異体であった。エクソン１とエクソン３との接合配列に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ったとき、低いＡＩＭＰ２水準を示しながら標準のＡＩＭＰ２転写物の他にも、小さい転写物を生成する細胞株のみからＰＣＲ産物が生成されることを確認し、もう一度ＡＩＭＰ２変異体の存在を証明した。
【００３９】
また、本発明者は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２で形質転換された細胞では、ＴＧＦ−βと関係なくＡＩＭＰ２水準が極力減少することから、ＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成がＡＩＭＰ２活性の喪失をもたらすことを確認した。実際、細胞内にＡＩＭＰ２ＤＸ２をトランスフェクションさせた結果、ｃ−ｍｙｃの発現を増加させ、ＡＩＭＰ２の核移動を防ぎ、細胞成長を停止させるなどのＴＧＦ−βシグナルの異常機能が招かれた。ＡＩＭＰ２ＤＸ２はＡＩＭＰ２と不活性型のヘテロダイマーを形成し、これは癌の形成と進行に密接に連関されていることを立証した。このようなＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成は肺癌、肝癌、皮膚癌、乳癌、腎臓癌、骨肉腫などの様々な癌から観測された。
【００４０】
一つの様態として、本発明は、エクソン２が欠失したＡＩＭＰ２変異体であるＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を提供する。
【００４１】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質配列のうちエクソン２の領域が欠失した変異体であって、ＡＩＭＰ２タンパク質の配列（３１２ａａ ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＡＣ５０３９１．１またはＧＩ：１２１５６６９；３２０ａａ ｖｅｒｓｉｏｎ：ＡＡＨ１３６３０１．１、ＧＩ：１５４８９０２３、ＢＣ０１３６３０．１）は文献（312aa version: Nicolaides, N.C., Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. Analysis of the 5’ region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 （2）, 329-334（1995）; 320 aa version: Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99（26）, 16899-16903（2002））に記述されており、この中でも、エクソン２に相当する領域が欠失したタンパク質である。本発明者によって出願された韓国特許出願１０−２００３−００１８４２４はＡＩＭＰ２タンパク質の癌治療効果について記述している。この特許文献に記述されたＡＩＭＰ２タンパク質に関する説明が本願に引用される。
【００４２】
前述したＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、全配列のＡＩＭＰ２のエクソン２領域が欠失したタンパク質を含み、ＡＩＭＰ２等価物（アミノ酸配列の置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによる変形体であって、ＡＩＭＰ２と実質的に同等な活性を持つ機能的等価物、または物理化学的性質を増加または減少させる変形を持つが、ＡＩＭＰ２と実質的に同等な活性を持つ機能的誘導体）のエクソン２領域が欠失したタンパク質を含む。
【００４３】
本発明において、ＡＩＭＰ２タンパク質配列のうち「エクソン２の領域が欠失」したというのは、ＡＩＭＰ２タンパク質においてエクソン２領域のアミノ酸配列（アミノ酸４６番〜１１４番）が部分的または全体的に欠失して生じた変異体がＡＩＭＰ２タンパク質とヘテロダイマーを形成してＡＩＭＰ２の正常的な機能を妨害することを意味する。したがって、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質のエクソン２のアミノ酸配列が全て欠失し、或いはこの領域のアミノ酸配列を含んでエクソン１、エクソン３、エクソン４またはこれらの領域の全てにおいてこれらの領域の一部も欠失し、或いはエクソン２のアミノ酸配列の一部のみが欠失したタンパク質を含む。好ましくは、本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、ＡＩＭＰ２タンパク質のエクソン２のアミノ酸配列が全て欠失したタンパク質である。より好ましくは、本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を持つタンパク質である。
【００４４】
また、本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、この天然型アミノ酸配列を持つタンパク質だけでなく、そのアミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれる。ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の変異体とは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２の天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を持つタンパク質を意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知になっている（H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も通常的に発生する交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００４５】
場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）などで修飾（modification）できる。
【００４６】
前記ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質またはその変異体は、天然から抽出し、または合成（Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc.. 85:2149-2156（1963））またはＤＮＡ配列を基本とする組み合わせ方法によって製造できる（Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2d Ed., （1989））。遺伝子組み換え技術を用いる場合、ＡＩＭＰ２ＤＸ２をコードする核酸を適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターで形質転換された形質転換体においてＡＩＭＰ２ＤＸ２が発現するように宿主細胞を培養した後、形質転換体からＡＩＭＰ２ＤＸ２を回収する過程によって得られる。
【００４７】
前述したように、本発明者は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質が肺癌、肝癌、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、骨肉腫などの癌組織で特異的に発現することを見出し、このようなタンパク質の検出が癌の診断に利用でき、ＡＩＭＰ２ＤＸ２は癌の診断マーカーとして使用できる。
【００４８】
他の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子を提供する。
【００４９】
上述したようなＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸配列は、これと同等な活性を持つタンパク質をコーディングする限りは、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異できる。前記配列番号２のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列を持つ核酸分子によってコーディングされる。このような核酸分子の配列は、単鎖または二重鎖であり、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であり得る。
【００５０】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸配列は、天然から単離されるか、人為的に合成または遺伝的組み換え方法によって製造できる。本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸配列を、これを発現することが可能なベクターに作動的に連結させることにより、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を提供することができる。
【００５１】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする核酸分子を含む組み換えベクターを提供する。
【００５２】
本発明において、用語「組み換えベクター」とは、適当な宿主細胞において目的タンパク質または目的ＲＮＡを発現することが可能なベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子作製物をいう。
【００５３】
本発明において、用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、一般的機能を行うように、核酸発現調節配列と、目的のタンパク質またはＲＮＡをコーディングする核酸配列とが機能的に連結（functional linkage）されていることをいう。例えば、プロモータとタンパク質またはＲＮＡをコーディングする核酸配列が作動可能に連結され、コーディングする核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる。組み換えベクターとの作動的連結は当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて行い、部位特異的ＤＮＡの切断および連結は当該技術分野で一般に知られている酵素などを用いて行う。
【００５４】
本発明のベクターは、プラスミドベクター、コスミッドベクター、バクテリオファージベクターおよびウィルスベクターなどを含むが、これらに限定されるものではない。適切な発現ベクターは、プロモータ、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造できる。ベクターのプロモータは構成的または誘導性であり得る。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。
【００５５】
シグナル配列には、宿主がエシェリキア属菌の場合にはＰｈｏＡシグナル配列やＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバシラス属菌の場合にはα−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母の場合にはＭＦαシグナル配列やＳＵＣ２シグナル配列などが、宿主が動物細胞の場合にはインシュリンシグナル配列やα−インタフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが用いられるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００５７】
形質転換は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含む。当該分野に公知になっているように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法にはエレクトロポレーション法（electroporation）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリア媒介形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクタミンなどを含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
宿主細胞によってタンパク質の発現量と修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。宿主細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、プロテウスミラビリス（Proteus mirabilis）、スタヒロコッカス（Staphylococcus）などの原核宿主細胞があるが、これらに限定されるものではない。また、真菌（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、酵母（例えば、ピキア酵母（Pichia pastoris）、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、アカバンカビ（Neurospora crassa））などの下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞として使用することができる。
【００５９】
別の様態として、本発明は、前記形質転換体を培養してＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を製造する方法を提供する。
【００６０】
形質転換体の培養は、目的のタンパク質であるＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現を可能にする適切な条件の下で行い、このような条件は、当業者に公知になっている方法によって行うことができる。
【００６１】
形質転換体で発現させたタンパク質は、通常の方式で精製でき、例えば塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノールなどを用いたタンパク質分画沈殿）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相カラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、および限外濾過などの技法を単独でまたは組み合わせで適用させ、本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を精製することができる（Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.（1982）: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）; and Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods, Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA（1990））。
【００６２】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２に特異的な抗体を提供する。
【００６３】
本発明において、用語「抗体」とは、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体はＡＩＭＰ２と区分してＡＩＭＰ２ＤＸ２を特異的に認知する抗体を意味し、多クローン抗体および単クローン抗体を含む。
【００６４】
前述したようにＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質が究明されたので、これを用いて抗体を生成することは、当業界の公知技術を用いて容易に行うことができる。
【００６５】
多クローン抗体は、前述したＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血して、抗体を含む血清を得る当業界の公知方法によって生産することができる。このような多クローン抗体は、山羊、ウサギ、羊、猿、馬、豚、牛、犬などの任意の動物種宿主から製造可能である。
【００６６】
単クローン抗体は、当業界に広く知られている融合方法（fusion method）（Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519）、組み換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）またはファージ抗体ライブラリ（Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991; and Marks et al, J. Mol. Biol., 222, 58, 1-597, 1991）技術を用いて製造できる。
【００６７】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の検出に用いられる抗体は、２つの全長の軽鎖および２つの全長の重鎖を持つ完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【００６８】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２に特異的な抗体は、癌の診断に使用されるだけでなく、患者に投与することによりＡＩＭＰ２ＤＸ２の活性を抑制するので癌の治療にも使用できる。治療用抗体として用いられる場合、抗体は既存の治療剤と直接またはリンカーなどを介して間接にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。
【００６９】
抗体と結合できる治療剤には、放射性核種（radionuclide）、薬剤、リンフォカイン、毒素、異型機能性抗体などがあるが、これに限定されるものではない。放射性核種には、１３１Ｉ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６７Ｇａ、１２５Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎなどがある。薬剤にはメトトレキサート（methotrexate）、アドリアマイシン（adriamycin）などがあり、リンフォカインにはインターフェロンなどがある。毒素にはリシン、アブリン、ジフテリアなどがある。他の抗体と結合してその複合体が癌細胞と効能細胞（例えば、Ｔ細胞などのＫ細胞（killer cell））の両方ともに結合する抗体である異型機能性抗体（heterofunctional antibodies）がある。
【００７０】
抗体は、それ自体または抗体を含む組成物の形で投与できる。治療用組成物の場合、投与方式に応じて、許容可能な担体を含んで適切な製剤に製造される。投与方式に適した製剤は公知になっており、典型的に、膜を通過した移動を容易にする界面活性剤を含む。このような界面活性剤は、ステロイドから誘導されたもの、或いはＮ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）などの陽イオン性脂質、またはコレステロールヘミサクシネート、ホスファチジルグリセロールなどの各種化合物などがある。
【００７１】
本発明の抗体を含む組成物は、癌細胞またはそれらの転移を治療するために薬学的に効果的な量で投与できる。薬学的組成物は、単一または多重投与できる。抗体を含む組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および局部的免疫抑制治療のために必要であれば病変内投与を含む適切な方法によって投与される。非経口注入には筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましい投与方式および製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などである。製剤のｐＨは、抗体安定性（化学的および物理的安定性）の均衡を合わせて、投与される患者に適するようにするが、一般にｐＨ４とｐＨ８の範囲である。その他にも経皮投与および経口投与などの投与のための他の技術を適切に変形させて利用し、適切な製剤を考案することができる。典型的な投与量の水準は、標準臨床的技術を用いて最適化することができる。
【００７２】
また、本発明の抗体は、抗体を暗号化する核酸の形で投与されて細胞内で抗体が生成されるようにすることができる（ＷＯ９６／０７３２１）。
【００７３】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２に特異的な抗体を含む癌診断キットを提供する。
【００７４】
本発明の癌診断キットには、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を選択的に認知する抗体だけでなく、免疫学的分析に用いられる当分野で一般に用いられる道具や試薬などが含まれる。このような道具／試薬としては、適切な担体、検出可能なシグナルを生成することが可能な標識物質、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などを含むが、これらに限定されるものではない。標識物質が酵素の場合には、酵素活性を測定することが可能な基質および反応停止剤を含むことができる。適切な担体としては、これらに限定されるものではないが、可溶性担体、例えば、当分野に公知になっている、生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳ、不溶性担体、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子などの高分子、その他の紙、ガラス、金属、アガロースおよびこれらの組み合わせであり得る。
【００７５】
本発明の癌診断キットは、これに限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスチックデバイス、免疫クロマトグラフィー試験ストリップおよび放射分割免疫検定デバイス、およびフロースルー（flow-through）デバイスなどの形を持つことができる。
【００７６】
本発明において、用語「癌診断マーカー」とは、癌組織および細胞で発現し、その発現有無を確認することにより、癌の発病を確認することが可能な物質、好ましくは正常組織と癌組織において有意な差異を示すタンパク質またはｍＲＮＡなどの有機生体分子を意味する。本発明の目的上、癌診断マーカーは、様々な癌組織および細胞のみで特異的に発現するＡＩＭＰ２ＤＸ２であり、ＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現をｍＲＮＡの水準または／およびタンパク質の水準で確認することにより、癌を診断することができる。本発明の抗体は、癌、より具体的には肺癌、肝癌、 乳癌、皮膚癌、腎臓癌、骨肉腫癌などの診断に有用である。
【００７７】
別の様態として、本発明は、（ａ）分析する試料を提供する段階と、（ｂ）前記試料から、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の発現を検出する段階を含み、癌診断マーカータンパク質ＡＩＭＰ２ＤＸ２を検出する方法を提供する。
【００７８】
本発明において、用語「分析する治療」とは、癌の発生によってマーカータンパク質の発現量の差異が検出できる組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、精液、脳脊髄液または尿などの生物学的試料を意味し、当業界の公知方法で処理して準備する。
【００７９】
具体的に、分析試料においてＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列の発現は、タンパク質水準またはｍＲＮＡ水準で検出することができる。
【００８０】
ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の検出は、前記タンパク質に特異的に認知する抗体を試料に接触させ、その抗原−抗体複合体形成を測定して行われる。
【００８１】
本発明において、用語「抗原−抗体複合体」とは、生物学的試料中のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とこれを特異的に認知する抗体との結合物を意味する。抗原−抗体複合体の形成を観察する実験方法には、組織免疫染色、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット（Western Blotting）、免疫沈殿分析法（Immunoprecipitation Assay）、免疫拡散分析法（Immunodiffusion assay）、補体固定分析法（Complement Fixation Assay）、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ（protein chip）などがあり、これに限定されるものではない。
【００８２】
抗原−抗体複合体の形成を定性または定量的に測定可能にするラベルには、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、レドックス分子および放射線同位元素などがあり、必ずしもこれらに限定されるものではない。検出ラベルとして利用可能な酵素には、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼとＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼとルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ホスフェノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β−ラクタマーゼなどがあり、これらに限定されるものではない。蛍光物にはフルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタル酸アルデヒド（o-phthaldehyde）、フルオレサミンなどがあり、これに限定されるものではない。リガンドにはビオチン誘導体などがあり、これに限定されるものではない。発光物にはアクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがあり、これに限定されるものではない。微小粒子にはコロイド金、着色されたラテックスなどがあり、これらに限定されるものではない。レドックス分子にはフェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などがあり、これらに限定されるものではない。放射線同位元素には３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅなどがあり、これらに限定されるものではない。
【００８３】
ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡの検出は、当分野に知られている増幅反応またはハイブリッド化反応で行われる。増幅反応またはハイブリッド化反応は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡに特異的なプライマーまたはプローブを用いて行われる。
【００８４】
本発明において、用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸化基（free 3' hydroxyl group）を持つ核酸配列であって、相補的なテンプレートと塩基対を形成することができ、テンプレート鎖複写のための開始点として機能をする短い核酸配列を意味する。
【００８５】
本発明において、用語「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合をすることが可能な、短くは数塩基、長くは数百塩基に相当するＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリングされていて特定ｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）プローブ、単鎖ＤＮＡ（single stranded DNA）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（double stranded DNA）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形に製作でき、ビオチン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ＤＩＧなどで或いは放射線同位元素などで標識できる。例えば、配列番号８または配列番号１６のヌクレオチド配列をプローブとして使用することができる。
【００８６】
プローブまたはプライマーを用いてＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡを検出することが可能な方法としては、ＤＮＡシーケンシング（DNA sequencing）、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー延長方法（Nikiforov et al, Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994）、オリゴヌクレオチド延長分析（ＯＬＡ）（Nickerson et al, Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927（1990））、対立形質特異的なＰＣＲ方法（Rust et al, Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993）、ＲＮａｓｅ不一致切断（RNase mismatch cleavage; Myers et al, Science, 230, 1242-1246, 1985）、単鎖形状多形成（single strand conformation lymorphism: SSCP; Orita et al, Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989）、ＳＳＣＰおよびヘテロデュプレックス同時分析法（Lee et al, Mol Cells, 5:668-672, 1995）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE; Cariello et al, Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988）、変性高圧液体クロマトグラフィー（denaturing high performance liquid chromatography: Ｄ−ＨＰＬＣ, Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997）などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
好ましくは、特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行って癌診断マーカーｍＲＮＡを検出する方法である。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｐ．Ｓｅｅｂｕｒｇ（１９８６）によってＲＮＡの分析に導入された方法であって、ｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅して分析する。この際、増幅段階では本発明の目的に合わせて製造されたプライマーを使用するようにする。本発明の目的上、プライマーは、それぞれ正常ＡＩＭＰ２ ｍＲＮＡと変異体ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡに相当する大きさの異なる２つのバンドで示すプライマーと、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相当するバンドのみで示すプライマーに製作することができる。大きさの異なる２つのバンドで示されるようにするためには、エクソン２に相当する部分が転写されるように２つのプライマーの位置を指定して製作すればよい。プライマーの種類は、特に限定されるものではないが、本発明では、配列番号５と配列番号６のヌクレオチド配列を持つプライマーを使用した。変異体に相当するバンドのみ示されるようにプライマーを製作するためには、一つのプライマーがエクソン１のＣ末端とエクソン３のＮ末端との連結地点の配列を持つように製作すればよい。本発明では、接合地点に相当する配列番号８のプライマーを配列番号７のプライマーと共に使用し、或いは接合地点に相当する配列番号１６のプライマーを配列番号６のプライマーと共に用いてＲＴ−ＰＣＲした。ＲＴ−ＰＣＲは、バンドパターンを確認することにより、診断マーカーＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡの発現有無を確認することができ且つ癌発生有無を診断することができる簡便な方法である。
【００８８】
対照区と検出試料中のＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現に有意的な差異があるかを絶対的（例えば：μｇ／ｍｌ）または相対的（例えば：シグナルの相対強度）の差異から確認することにより、癌、特に肺癌、肝癌、乳癌、皮膚癌、腎臓癌および骨肉腫癌を診断することができる。
【００８９】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）核酸分子を提供する。
【００９０】
本発明において、用語「ｓｉＲＮＡ」とは、特定のｍＲＮＡの切断（cleavage）によってＲＮＡｉ（RNA interference）現象を誘導することが可能な短い二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を持つセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を持つアンチセンスＲＮＡ鎖から構成される。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制することができるため、効率的な遺伝子ノックダウン方法または遺伝子治療（gene therapy）の方法によって提供される。
【００９１】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士が対を成す二重鎖ＲＮＡ部分が完全に対を成すことに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的ではない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などによって対を成さない部分が含まれ得る。全長は１０〜１００塩基、好ましくは１５〜８０塩基、さらに好ましくは２０〜７０塩基である。ｓｉＲＮＡ末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果によって抑制することが可能なものであれば、平滑（blunt）末端或いは粘着（cohesive）末端でもよい。粘着末端構造は、３末端側が突出した構造と５末端側が突出した構造の両方とも可能である。突出する塩基数は限定されない。例えば、塩基数としては１〜８塩基、好ましくは２〜６塩基とすることができる。本明細書において、ｓｉＲＮＡの全長は、中央の二重鎖部分の長さと、両末端の単鎖突出を構成する長さとの和で示した。また、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制効果を維持することが可能な範囲で、例えば一側末端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウィルスＲＮＡなどの天然のＲＮＡ分子または人工のＲＮＡ分子）を含むことができる。ｓｉＲＮＡ末端構造は、両側とも切断構造を持つ必要はなく、二重鎖ＲＮＡの一方の末端部位がリンカーＲＮＡによって接続されたステムループ型構造であり得る。リンカーの長さは、ステム部分の対を成すのに支障がない長さであれば特に限定されない。
【００９２】
本発明において、用語「特異的」または「特異的な」は、細胞内で他の遺伝子に影響を及ぼさず、目的遺伝子のみを抑制する能力を意味し、本発明ではＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的である。本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的に作動するように、ＡＩＭＰ２ＤＸ２のエクソン１とエクソン３との境界地点に相当するｍＲＮＡと相同の配列を含むセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を含むアンチセンスＲＮＡ鎖を持つ。
【００９３】
前記において、「遺伝子発現の減少（Inhibition of gene expression）」とは、目的遺伝子から生成されたｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の水準が除去または減少されたことを意味し、これはｍＲＮＡの切断によって起こるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：RNA interference）現象による。
【００９４】
ｓｉＲＮＡを製造する方法は、試験管内でｓｉＲＮＡを直接合成した後、トランスフェクション（transfection）過程を経て細胞内に導入させる方法と、ｓｉＲＮＡが細胞内で発現するように製造されたｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはＰＣＲ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞内にトランスフェクションまたは感染させる方法がある。ｓｉＲＮＡを製造し、細胞または動物に導入する方法の決定は、実験の目的および標的遺伝子産物の細胞生物学的機能によって異なる。
【００９５】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡを特異的に減少させることができれば、配列と長さは特に限定されず、本発明の具体的な実施では、３種のＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的なｓｉＲＮＡを発現するベクターを製作し、ｓｉＲＮＡが細胞内ＡＩＭＰ２ＤＸ２の細胞内水準を減少させ、ＡＩＭＰ２の機能とＴＧＦ−βシグナル伝達過程を回復することができることを確認した。
【００９６】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２に特異的なｓｉＲＮＡは、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡのエクソン１とエクソン３との連結部位に相当する配列を含む核酸である。好ましくは、それぞれ配列番号９と配列番号１０のヌクレオチド配列から発現するＲＮＡ配列を含む３番ｓｉＲＮＡ、配列番号１１と配列番号１２のヌクレオチド配列から発現するＲＮＡ配列を含む４番ｓｉＲＮＡ、または配列番号１３と配列番号１４のヌクレオチド配列から発現するＲＮＡ配列を含む５番ｓｉＲＮＡである。その中でも、配列番号１１と配列番号１２のヌクレオチド配列から発現するＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡが最も好ましい。単一または２種以上のｓｉＲＮＡを混合して使用することができる。
【００９７】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸配列を提供する。
【００９８】
本発明において、用語「アンチセンス核酸」とは、特定のｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡまたはＲＮＡまたはこれらの誘導体を意味し、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害する特徴がある。本発明のアンチセンス配列は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡに相補的であり、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡに結合できるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味し、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（translocation）、成熟（maturation）または他の全ての生物学的機能に対する必須的な活性を阻害することができる。アンチセンス核酸の長さは６〜１００塩基であり、好ましくは８〜６０塩基であり、より好ましくは１０〜４０塩基である。
【００９９】
前記アンチセンス核酸は、効能を増進させるために一つ以上の塩基、糖または骨格（backbone）の位置において変形できる（De Mesmaeker et al, Curr Opin Struct Biol., 5（3）:343-55, 1995）。核酸骨格は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル、シクロアルキル、単鎖へテロアトミック、複素環式糖間結合などで変形できる。また、アンチセンス核酸は、一つ以上の置換された糖成分（sugar moiety）を含むことができる。アンチセンス核酸は、変形された塩基を含むことができる。変形された塩基には、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−ｍｅピリミジン（特に５−メチルシトシン）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、ジェントビオシルＨＭＣ、２−アミノアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、２，６−ジアミノプリンなどがある。また、本発明のアンチセンス核酸は、前記アンチセンス核酸の活性および細胞吸着性を向上させる一つ以上の成分（moiety）またはコンジュゲート（conjugate）と化学的に結合できる。コレステロール成分、コレステリル成分、コール酸（colic acid）、チオエーテル、チオコレステロール、脂肪性鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル成分、オクタデシルアミン、ヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール成分などの脂溶性成分などがあり、これに限定されるものではない。脂溶性成分を含むオリゴヌクレオチドとその製造方法は、本発明の技術分野で既によく知られている（米国特許第５，１３８，０４５号、米国特許第５，２１８，１０５号および米国特許第５，４５９，２５５号）。前記変形された核酸は、ヌクレアーゼに対する安定性を増加させ、アンチセンス核酸と標的ｍＲＮＡとの結合親和力を増加させることができる。
【０１００】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２に特異的なアンチセンス核酸は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡのエクソン１とエクソン３とが連結される接合点部位の当該配列に相補的な配列を含むことが好ましい。
【０１０１】
アンチセンスＲＮＡの場合、通常の方法によって試験管で合成されて生体内に投与し、或いは生体内でアンチセンスＲＮＡが合成されるようにすることができる。試験管でアンチセンスＲＮＡを合成する一例は、ＲＮＡポリメラーゼＩを用いることである。生体内でアンチセンスＲＮＡが合成されるようにする一例は、認識部位（ＭＣＳ）の起源が反対方向にあるベクターを用いてアンチセンスＲＮＡが転写されるようにすることである。このようなアンチセンスＲＮＡは、配列内に翻訳中止コドンが存在するようにして、ペプチド配列に翻訳されないようにすることが好ましい。
【０１０２】
別の様態として、本発明は、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を含む癌を治療するための薬剤学的組成物、およびこれを投与して癌を治療する方法を提供する。
【０１０３】
本発明の具体的な実施によれば、ＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的ｓｉＲＮＡを処理する場合、ＡＩＭＰＤＸ２の発現誘導によって発生したＡＩＭＰ２の機能的崩壊が復旧されることを、ＡＩＭＰ２の細胞内水準増加、Ｓｍａｄ２のリン酸化が誘導されることから確認することができた。すなわち、ＡＩＭＰ２ＤＸ２は、ＡＩＭＰ２の機能を崩壊して癌を誘発する直接的な原因として作用するが、ＡＩＭＰ２ＤＸ２のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を用いる場合、細胞内ＡＩＭＰ２の細胞内水準が増加しながら機能が復旧されるので、癌細胞特異的な癌治療に有用である。
【０１０４】
本発明のＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を用いてＡＩＭＰ２ＤＸ２発現誘導によって発生した全ての癌を治療することができる。このような癌は、肺癌、肝癌、乳癌、皮膚癌、腎臓癌、骨肉腫癌などを含む。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡまたはＡＩＭＰ２ＤＸ２アンチセンス核酸１種以上を含む薬学的組成物は、患者の癌細胞の増殖を阻害させる追加の物質を含むことができ、またｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸分子の導入を促進させる製剤、例えばリポソーム（米国特許第４，８９７，３５５号、第４，３９４，４４８号、第４，２３５，８７１号、第４，２３１，８７７号、第４，２２４，１７９号、第４，７５３，７８８号、第４，６７３，５６７号、第４，２４７，４１１号、第４，８１４，２７０号）を用いるか、コレステロール、コール酸塩よびデオキシコール酸を始めとした多数のステロール類のうち１種の新油性担体と共に配合することもできる。また、アンチセンス核酸は、細胞によって吸収されるペプチドに接合させることもできる。有用なペプチドの例としては、ペプチドホルモン、抗原または抗体およびペプチド毒素などがある（Haralambid et al, ＷＯ８９／０３８４９; Lebleu et al., ＥＰ０２６３７４０）。
【０１０６】
本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体と共に投与でき、経口投与の場合には結合剤、滑澤剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形に製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形に製造することができる。
【０１０７】
本発明の薬剤学的組成物に含有されるＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質のｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸の有効投与量の範囲は、性別、重症度、年齢、投与方法、標的細胞、発現水準などの様々な要因によって異なり、当分野の専門家によって容易に決定できる。
【０１０８】
本発明に係る薬剤学的組成物は、経口的に、または静脈内、皮下、鼻腔内または腹腔内などの非経口的にヒトと動物に投与される。非経口的投与は、皮下注射や筋肉内注射、静脈注射などの注射法および点滴法を含む。この他の本発明の薬剤学的組成物は、各種剤形の形で通用される技法によって製造することができる。
【０１０９】
別の様態として、本発明は、（a） 試験物質を、ＡＩＭＰ２タンパク質とＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質を含む組成物と接触させる段階、および（ｂ）試験物質がＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制するかを測定する段階を含み、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成を抑制する抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１０】
ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質とＡＩＭＰ２タンパク質間のヘテロダイマー形成は、実施例で証明したのと同様に、癌と関連している。したがって、ヘテロダイマー形成を抑制する基質は抗癌剤と判断される。
【０１１１】
ヘテロダイマー形成をスクリーニングすることが可能な方法には、例えば、イーストツーハイブリッド（yeast-two-hybrid）、試験管内プルダウンアッセイ（in vitro pull-down assay）などがある。
【０１１２】
イーストツーハイブリッドアッセイは、Ｆｉｅｌｄ＆Ｓｏｎｇ（１９８９）によって最初開発された方法であって、転写調節タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（DNA binding domain）と転写活性ドメイン（transcription activation domain）にそれぞれベイト（bait）とプレイ（prey）タンパク質を融合タンパク質の形で発現させ、転写調節タンパク質により調節される遺伝子の発現および栄養欠乏培地での酵母の成長を観察することにより、２つのタンパク質（プレイタンパク質、ベイトタンパク質）の相互作用有無を確認することができるスクリーニング方法である。試験管内プルダウンアッセイは、タンパク質間の相互作用をタグ付きタンパク質（ベイトタンパク質）を精製し、この際、ベイトタンパク質に結合するタンパク質結合パートナ（プレイタンパク質）のプルダウン有無を確認することにより、２タンパク質の結合有無を確認することができるスクリーニング方法である。これらのスクリーニング方法を行い、ＡＩＭＰ２ＤＸ２とＡＩＭＰ２のヘテロダイマー形成を阻害させる抑制剤を選別することができる。
【０１１３】
別の様態として、本発明は、（ａ）試験物質を、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子を発現する細胞と接触させる段階と、（ｂ）試験物質によるＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解促進を測定する段階とを含み、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質をコーディングする遺伝子の発現抑制またはＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の分解を促進する抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１４】
ＡＩＭＰ２ＤＸ２遺伝子の発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の水準で測定することができる。ＡＩＭＰ２ＤＸ２ ｍＲＮＡ発現を検出しようとする場合、好ましくは前述したようなＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって行うことができる。ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質の発現を検出しようとする場合、前述したようなＡＩＭＰ２ＤＸ２特異的な抗体を使用する様々な免疫アッセイ方法、例えばウエスタンブロットで行うことができる。
【０１１５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１６】
〔実施例〕
（細胞培養、化合物および細胞周期の分析）
本研究に使用された細胞株は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０で維持した。マウス胚児線維芽細胞（ＭＥＦＳ：Mouse embryonic fibroblasts）は、１２．５日〜１４．５日目の胚児から単離し、２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで培養した。ＴＧＦ−βが細胞周期に及ぼす影響を確認するために、細胞を無血清または１％ＦＢＳ含有培地で２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで処理して培養し、細胞を集めてＦＡＣＳ分析した。また、細胞増殖は［３Ｈ］チミジン挿入（thymidine incorporation）で測定した。細胞を、ＴＧＦ−βを処理または無処理した状態の無血清培地で２０時間培養した後、［３Ｈ］チミジン１μＣｉ／ｍｌの存在下に４時間培養した。挿入されたチミジンは、液体閃光計算器を用いて文献（Kim et al., Nat. Genet. 34, 330-336（2003））によって定量した。ＴＧＦ−βはＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入し、抗−Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ４抗体はＳｎａｔａ Ｃｒｕｚから購入した。抗−ＡＩＭＰ２抗体は実験室で製造した。単離したＡＩＭＰ２ンパク質５００μｇ（１ｍｇ／ｍｌ）をウサギ（ｍａｌｅ、ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ）にｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ）５００μｌと混ぜて皮下に注射した。７日後、ＡＩＭＰ２タンパク質５００μｇをｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ）５００μｌと混ぜてウサギの皮下に注射し、これを７日間隔で２回さらに行った。３日後、ウサギの血液から抗体を採取する工程によって抗−ＡＩＭＰ２抗体を製造した。
【０１１７】
（免疫沈殿とウエスタンブロットの分析）
細胞をＴＧＦ−βで一定の時間処理し、プロテアーゼ含有ＲＩＰＡ緩衝液を用いて細胞からタンパク質を抽出し、１０〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて単離した後、特異的抗体としてＥＣＬシステムを用いて免疫ブロットした。免疫沈殿のために、細胞溶解物をＩｇＧおよびアガロース−コンジュゲートされたタンパク質Ａで処理した。遠心分離の後に、上澄み液を特異的抗体およびアガロース−コンジュゲートされたＡで２時間培養した。冷たいＰＢＳで２回、ＲＩＰＡで１回洗浄した後、結合したタンパク質を特異的抗体で沈殿させ、溶出してウエスタンブロット分析を行った。
【０１１８】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡ（total-RNA）を製造社（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコールに従って単離した。新鮮に準備された組織（３×３×３ｍｍ）を小さい欠片に切り、３５０μｌの溶解緩衝液と混合し、ホモジナイザーまたは注射器で均質化させた。３５０μｌの７０％エタノールを添加した後、溶解物（lysate）を多数回上下に揺らしてカラムにロードし、１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。カラムを洗浄緩衝液で２回洗浄した後、ＲＮＡを４０μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＷで溶出した。逆転写のために、１μｇの単離されたＲＮＡをＡＩＭＰ２−特異的プライマー（図８ｂ）の鋳型として使用した。逆転写の後、ＤＷで３倍に希釈させ、１μｌを、０．５μｌ ｄＭＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μｌの表示されたプライマー（各１０ｐＭ）、１．５μｌ ＤＭＳＯおよび０．１μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含む３０μｌＰＣＲ反応に使用した。
【０１１９】
（ｓｉＲＮＡを用いたＡＩＭＰ２ＤＸ２の抑制）
ＡＩＭＰ２ＤＸ２の発現を抑制するために、ＡＩＭＰ２ＤＸ２に対するｓｉＲＮＡを製作した。ＡＩＭＰ２ＤＸ２に対するｓｉＲＮＡをコーディングする配列を製作し、ＩＭＧ−７００（Ｉｍｇｅｎｅｘ）ベクターのＳａｌＩおよびＸｂａＩ部位と連結させ、クローニングをＤＮＡシーケンシングで確認した。Ｈ３２２細胞を、ｓｉ−ＤＸ２発現するベクター２μｇで形質転換させた。１ｍｌの無血清培地で３時間ＤＮＡ−リポソーム複合体とインキュベーションした後、２０％ＦＢＳを含む１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０をＨ３２２細胞に投与した。さらに２０時間培養した後、無血清条件または指示された時間だけＴＧＦ−βを処理した。
【０１２０】
（イーストツーハイブリッドアッセイ）
ヒトＡＩＭＰ２およびＳｍａｄ２（およびその欠失断片）をコーディングするｃＤＮＡを、特異的プライマーを用いるＰＣＲによって獲得した。ＳｍａｄおよびＡＩＭＰ２のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断してそれぞれｐＥＧ２０２（ＬｅｘＡ）およびｐＪＧ４−５（Ｂ４２）のようなサイトに結合させた（Gyuris et al, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791-803, 1993）。Ｌｅｘ−Ｓｍａｄ２断片とＢ４２−ＡＩＭＰ２間の相互作用は、Ｘ−ｇａｌを含む酵母培地で生存する能力で分析した（Rho et al, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 4488-93, 1999）。
【０１２１】
（ＡＩＭＰ２ＤＸ２を安定的に生成する細胞の構築）
野生型ＭＥＦｓをｐｃＮＤＡ−ＡＩＭＰ２ＤＸ２またはｐｃＤＮＡで形質転換させ、形質転換体を、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ培地で選択した。形質転換されていない細胞を除去した後、形質転換体を、Ｇ４１８を含まない培地で３日間培養した後、２％ＰＦＡで固定させ、Ｇｉｅｍｓａで染色した。
【０１２２】
（免疫染色と組織学的分析）
冷凍した組織スライドを２％パラホルムアルデヒドで固定し、冷たいＰＢＳで３回洗浄した。０．２％トリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）および１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングおよび浸潤（permeablization）した後、スライドを抗−ＡＩＭＰ２抗体で２時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、抗−ウサギ山羊ＩｇＧ−ＦＩＴＣおよびプロピジウムヨウ化物（propidium iodide）（ＰＩ５０μｇ／ｍｌ）で１時間培養し、その後ＰＢＳで洗浄し、固定して共焦点顕微鏡（confocal microscopy）で観察した。
【０１２３】
（ＡＩＭＰ２ＤＸ２発現ベクターの製作）
ＡＩＭＰ２ＤＸ２を発現するプラスミドを構築するために、ＡＩＭＰ２ＤＸ２のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃにクローニングした。まず、ＡＩＭＰ２ＤＸ２をＨ３２２ ｃＤＮＡにおいてＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩリンカー付きプライマーを用いて増幅させた後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｐｃＤＮＡ３．１−ｍｙｃにクローニングした。ＡＩＭＰ２ＤＸを発現するｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ／ＡＩＭＰ２ＤＸ２ベクター（図１３）は、寄託名をＥｓｃｈｅｒｉｃｈａｉ  ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａ／ＡＩＭＰ２ＤＸ２として、２００４年１０月２５日付けで、ＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究院）に寄託番号ＫＣＴＣ １０７１０ＢＰで寄託した。
【０１２４】
（ノックアウト（knock-out）マウスの製作）
マウスゲノムＤＮＡ上の突然変異は、方法によるｇｅｎｅ ｔｒａｐ方法に従った（Zambrowicz et al, Nature, 9, 608-611, 1998）。ｇｅｎｅ ｔｒａｐベクターは、１２９／ＳｖＥｖＢｒｄマウスに由来した胚児幹細胞の無作為的突然変異ライブラリ（OmniBank library, Lexicon Genetics, USA）の生成に使用された。ライブラリにおいて、ＡＩＭＰ２遺伝子が破壊されたＯＳＴ７９９４クローンを同定した。前記クローンを用いて、Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の標準プロトコールに従ってＣ５７／ＢＬ６異型接合のマウスを生成した。同型接合の突然変異マウスを得るために、異型接合のマウスを交配させた。単離された１３．５日目のマウスの腹をｒａｚｏｒ ｂｌａｄｅで切り、トリプシン酵素処理してペトリ皿に培養のためのプレーティングを行った。マウス胚児線維細胞（embryonic fibroblast cells）から単離されたゲノムＤＮＡを用いてサザンブロットおよびＰＣＲ分析して突然変異を確認した。ＡＩＭＰ２発現をノーザンブロットおよびウエスタンブロットで確認した。ｇｅｎｅ ｔｒａｐの挿入位置をゲノムＤＮＡシーケンシングで確認した。サザンブロットのために、マウス尻からゲノムＤＮＡを単離し、ＳａｃＩで分解した。切断されたＤＮＡ断片を変性ゲル電気泳動（denaturing gel electrophoresis）で単離し、放射学的にラベルされたＡＩＭＰ２遺伝子の１．２ｋｂ ＰＣＲ産物を配列番号１７と１８のプライマーでハイブリッドさせた。ハイブリッドされたバンドを蛍光イメージ分析器（phosphorimage analyzer）を用いて検出した。単離されたゲノムＤＮＡを配列番号１９と２１、配列番号２０と２１の特異的プライマーでＰＣＲ分析に使用した。
【０１２５】
ノーザンブロット分析のために、マウス胚児線維細胞から全細胞ＲＮＡを製造社の指示に従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて準備した。単離されたＲＮＡ（３０μｇ）を１．２％アガロース／２．２Ｍホルムアルデヒドゲルから電気泳動によって単離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移動させ、ＵＶ照射によって膜に固定した。膜上のＲＮＡをＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡのＰＣＲによって生成された特異的プローブでＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてハイブリッドさせた。マウス胚児線維細胞からタンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、文献（Park et al, 274, 16673-16676, 1999; Kim et al, J Biol Chem, 275, 21768-21772, 2000）に記述した抗−ＡＩＭＰ２多クローン抗体でウエスタンブロットを行った。
【０１２６】
（肺癌形成）
ＡＩＭＰ２＋／−マウス３２匹と（雄１９匹と雌１３匹）ＡＩＭＰ２＋／＋マウス２５匹（雄１４匹および雌１１匹）を実験に使用した。マウス腹腔内にベンゾピレン（１００ｍｇ／ｋｇ）を単一注射した。対照区として、ＡＩＭＰ２＋／＋マウス３匹（雄２匹および雌１匹）およびＡＩＭＰ２＋／−マウス５匹（雄４匹および雌１匹）をバイカル溶液（生理食塩水に１０％ＤＭＳＯおよび３５％ＰＥＧ４０が溶けた溶液）で注射した。
【０１２７】
（ノックアウトマウスにおける皮膚癌の発癌モデル）
前記で製作したＡＩＭＰ２ノックアウト（ＫＯ）型と野生型（ＷＴ）マウス総３３匹をＷＴ雄対照区（３匹）、ＷＴ雄処理区（６匹）、ＷＴ雌対照区（２匹）、ＷＴ雌処理区（６匹）、ＫＯ雄対照区（２匹）、ＫＯ雄処理区（６匹）、ＫＯ雌対照区（３匹）、ＫＯ雌処理区（５匹）に分類した。
【０１２８】
ＤＭＢＡ（7,12-dimethylbenz[a]anthracene）を０．２μｍｏｌ／０．２ｍｌアセトンの濃度で処理区マウスの剃り済み背に局部的に適用した。この際、対照区に属するマウスはアセトンのみで処理した。１週間後、ＤＭＢＡ誘導マウスを１０ｎｍｏｌ／０．２ｍｌアセトン濃度のＴＰＡ（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）で１週に２回ずつ２１週間処理した。この際、対照区はアセトンのみで処理した。促進剤処理の後、１週から直径１ｍｍ以上の腫瘍の数を毎週計算した。２１週にマウスを犠牲させて生化学的分析のための腫瘍試料を収集した。
【０１２９】
（実施例１：ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要さと作用方式）
ＴＧＦ−βシグナル伝達においてＡＩＭＰ２が重要に作用することを考察するために、ＴＧＦ−βで誘導された細胞成長停止、Ｓｍａｄ２／３の核移動およびＳｍａｄ２／３とＡＩＭＰ２との相互作用に対するＡＩＭＰ２＋／＿＋およびＡＩＭＰ２−／−ＭＥＦｓの反応を調べた。チミジン挿入、コロニー形成およびフローサイトメトリーで確認した結果、正常細胞の成長はＴＧＦ−βに抑制されるのに比べ、ＡＩＭＰ２欠乏細胞はこのようなシグナルに反応を示さなかった（各図１ａ、ｂおよびｃ）。ＭＥＦｓをＴＧＦ−βで処理したとき、正常細胞ではＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３が核に移動したが、ＡＩＭＰ２−／−細胞ではそうではなかった（図１ｄ）。このような全ての結果は、Ｓｍａｄ２および３を経由するＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性を示す。
【０１３０】
ＡＩＭＰ２のＳｍａｄ２および３との可能な相互作用を共同免疫沈澱によって調査した。ＡＩＭＰ２はＳｍａｄ２／３との相互作用を示した。これはＴＧＦ−βによって強化された（図１ｅ）。ＡＩＭＰ２と２つのＲ−Ｓｍａｄ間の直接的相互作用をイーストツーハイブリッドおよび試験管内プルダウンアッセイで確認した（図２、図７）。Ｓｍａｄ２／３に結合するＡＩＭＰ２の量は、ＴＧＦ−βによってＡＩＭＰ２が誘導されるにつれて増加した（図２ａ）。形質転換によってＡＩＭＰ２水準が増加するとき、ＴＧＦ−βターゲット遺伝子の発現は強化された。これはＴＧＦ−βシグナル伝達においてＡＩＭＰ２の刺激的な役割を意味する（図２ｂ）。ＡＩＭＰ２はＳｍａｄ２および３に結合するため、このような２つのＲ−Ｓｍａｄは同様の方式で作動すると予測することができた。よって、ＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２との相互作用に焦点を合わせてより詳しく考察した。ＴＧＦ−β依存的Ｓｍａｄ２のリン酸化は、ＡＩＭＰ２欠乏ＭＥＦｓで抑制されたが、ＡＩＭＰ２がＡＩＭＰ２−／−細胞に導入されると復旧された（図２ｃ）。ＡＩＭＰ２との相互作用に関連したＳｍａｄ２のドメインをイーストツーハイブリッド（図２ｄ）および試験管内プルダウンアッセイ（in vitro pull-down assay）（図７）で確認した。２つの実験によって、Ｓｍａｄ２のＭＨ２ドメインが相互作用に関連していることが明らかになった。
【０１３１】
ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作用方式を考察するために、正常およびＡＩＭＰ２欠乏細胞においてＳｍａｄ２とＴＧＦ−β受容体とのＴＧＦ−βで誘導された結合を観察した。細胞をＴＧＦ−βで処理し、Ｓｍａｄ２と受容体との結合をＳｍａｄ２とタイプＩ受容体の共同免疫沈澱によって時間間隔を置いてモニタリングした。野生型細胞では、ＴＧＦ−βで誘導されたＳｍａｄ２のＴＧＦ−β受容体との結合が初期時点で観察され減少されたが、ＡＩＭＰ２欠乏細胞では、Ｓｍａｄ２に結合した受容体がＴＧＦ−β処理後の後期段階で蓄積された（図２ｅ）。ＴＧＦ−βで誘導されたＳｍａｄ２のリン酸化において、野生型細胞ではリン酸化されたＳｍａｄ２は益々増加したが、ＡＩＭＰ２−／−細胞では深刻に抑制された（図２ｆ）。このような結果は、ＡＩＭＰ２が、Ｒ−Ｓｍａｄ２との直接的相互作用によって、ＴＧＦ−βで誘導されたＲ−Ｓｍａｄのリン酸化に決定的役割を果たすことを意味する。
【０１３２】
（実施例２：癌細胞におけるＡＩＭＰ２の抑制とＡＩＭＰ２の欠失型の生成）
癌形成とＡＩＭＰ２との関連性を調査するために、相異なる各種癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現程度を観察した。観察した６つの細胞株のうち３つはウエスタンブロット（図３ａ）およびＦＡＣＳ分析（図３ｂ）において低いＡＩＭＰ２水準を示した。低いＡＩＭＰ２水準を示す細胞株全てはＴＧＦ−βタイプＩＩ受容体が正常水準で発現し、キナーゼ活性も保有しているという事実は、低いＡＩＭＰ２水準が受容体の機能異常による結果ではないことを意味する。ＡＩＭＰ２水準差が転写差異によるものかを確認するために、他の組み合わせのＡＩＭＰ２特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＡＩＭＰ２遺伝子は４つのエクソンから構成されている（図８ａ）。エクソン３および４を貫通するＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡを生成させる配列番号３と４のプライマーを使用したとき、減少したＡＩＭＰ２水準を示す細胞からＡＩＭＰ２転写の減少は観察されなかった（図３ｃ、第１行）。これは低いＡＩＭＰ２水準の低い転写の結果ではないことを意味する。エクソン１から３までの転写物を生成させる配列番号５と６のプライマーを使用したとき、予想した大きさの転写物だけでなく、小さい大きさの転写物も得ることができた（図３ｃ、第２行）。小さい大きさの転写物の配列分析結果、ＡＩＭＰ２の６９個のアミノ酸をコーディングするエクソン２が欠損していることが分かった（図８ｂ）。この小さい大きさの転写物の生成を再確認するために、エクソン２欠損によって生成されるエクソン１およびエクソン３の接合配列をターゲッティングする配列番号８のプライマー（図８ｂ、プライマーＤＸ−Ｂ）を製作し、配列番号７プライマーを共に用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。低い水準のＡＩＭＰ２を発生する細胞株は、小さい大きさの転写物（ＤＸ２と命名し、図３ｃ、第２行および第３行）を生成した。
【０１３３】
抗−ＡＩＭＰ２抗体でウエスタンブロット分析すると、一般に、全長ＡＩＭＰ２のみが検出されＤＸ２は検出されないので（図２ａ）、タンパク質水準におけるＤＸ２は非常に不安定であることを意味する。また、Ｈ４６０、Ｈ３２２およびＨ２９０における低いＡＩＭＰ２水準が免疫蛍光染色で証明された（図３ｄ）。染色差異が発生する可能性を排除するために、Ｈ４６０およびＤＵ１４５細胞を同じプレートに共同培養し、ＡＩＭＰ２を染色した。Ｈ４６０におけるＡＩＭＰ２の染色強度は、ＤＵ１４５より多く弱かった（図９ａ）。低いＡＩＭＰ２水準を示す細胞からＴＧＦ−β依存的なＡＩＭＰ２の核移動が観察されなかった（図３ｄ、下行）。ＡＩＭＰ２とＴＧＦ−β機能間の関連性を検討するために、前記細胞株におけるＴＧＦ−βによる成長抑制を測定した。Ａ５４９およびＤＵ１４５細胞はその成長がＴＧＦ−βによって抑制されるのに反し、低いＡＩＭＰ２水準を示す細胞はＴＧＦ−βに反応しなかった（図３ｅ）。このような結果は、Ａ５４９細胞はＴＧＦ−βに敏感であり、Ｈ４６０細胞はＴＧＦ−βに鈍感であるという先行の研究と一致するものである（Osada et al. Cancer Res. 61, 8331-8339, 2001; Kim et al., Lung Cancer 31, 181-191, 2001）。また、ターゲット遺伝子はＡ５４９およびＤＵ１４５細胞においてＴＧＦ−βによって誘導されたが、低いＡＩＭＰ２水準を示すＨ３２２および他の２つの細胞株では誘導されなかった（図３ｆ）。
【０１３４】
（実施例３：機能性のＡＩＭＰ２と不活性の欠失突然変異体のヘテロダイマー形成）
ＤＸ２生成とＡＩＭＰ２抑制との一般な関連性を理解するために、ＤＸ２でＤＵ１４５細胞を形質転換した後、ＡＩＭＰ２水準の変化を調査した。ウエスタンブロット（図４ａ、第１行）およびＦＡＣＳ分析（図９ｂ）の結果、ＤＸ２で形質転換された細胞においてＡＩＭＰ２は減少した。また、ＡＩＭＰ２のターゲットであるｃ−ｍｙｃの発現がＤＸ２の導入によって増加した（図４ａ、第３行）。ＤＸ２はＴＧＦ−βによる成長停止を軽減させた（図４ｂ、図９ｃ）。
【０１３５】
ＤＸ２が機能的ＡＩＭＰ２（ＡＩＭＰ２−Ｆ）にどのように影響を及ぼすかを調べた。ＡＩＭＰ２はホモダイマーを形成することができるので（Quevillon et al, J. Mol. Biol. 285, 183-195, 1999; Kim et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916, 2002）、ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２−Ｆと相互作用するかをイーストツーハイブリッドアッセイで検査した。ＡＩＭＰ２ＤＸ２はＡＩＭＰ２−Ｆと相互作用したが、ＡＩＭＰ２−ＤＸ同士は相互作用しなかった（図４ｃ）。試験管内プルダウンアッセイにおいて、放射線的に合成されたＡＩＭＰ２−Ｆおよび−ＤＸ２は、ＧＳＴ−ＡＩＭＰ２−Ｆと共同精製された（図４ｄ）。これはＡＩＭＰ２−Ｆと−ＤＸ２間の直接的相互作用があることを証明するものである。ＤＸ２がＴＧＦ−βシグナル伝達に活性を示すかを調べるために、イーストツーハイブリッドアッセイでＳｍａｄ２との相互作用を検査した。ＡＩＭＰ２はＡＩＭＰ２のターゲットとして知られているＦＢＰだけでなく、Ｓｍａｄ２とも相互作用するが（Kim et al, Nat. Genet. 34, 330-336, 2003）、ＤＸ２はこのようなタンパク質と全く結合していない。これはＤＸ２の機能的不活性を意味する（図４ｅ）。
【０１３６】
ヘテロダイマー形成がどのようにＡＩＭＰ２を抑制するかを調べるために、ＡＩＭＰ２水準がプロテアソーム依存的分解過程によって調節されるかをチェックした。ＤＸ２生産Ｈ３２２細胞をプロテアソーム抑制剤ＡＬＬＮ（Zhou et al, J. Biol. Chem. 271, 24769-24775, 1996）で処理し、ＡＩＭＰ２水準がプロテアソーム遮断によって増加するかを観察した。ウエスタンブロット（図４ｆ）、免疫蛍光染色（図４ｇ）およびフローサトメトリー（図９ｄ）から分かるように、ＡＩＭＰ２はＡＬＬＮ処理によって著しく増加した。これは、細胞内のＡＩＭＰ２水準がプロテアソーム媒介分解により調節されることを示す。また、ＡＩＭＰ２ＤＸ２型もプロテアソーム抑制によって検出された（図４ｆ）。ＡＩＭＰ２ＤＸ２の低い強度は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって証明したように、正常ＡＩＭＰ２と比較して低い発現（図３ｃ）および／または抗−ＡＩＭＰ２抗体による不十分な認知のためである。ＡＩＭＰ２分解はプロテアソームによって媒介されるため、ユビキチン化がＤＸ２によって促進されるかを観察した。ＡＬＬＮで処理された、対照区およびＤＸ２で形質転換された細胞からＡＩＭＰ２を免疫沈澱させ、抗−ユビキチン抗体でブロットしたとき、対照区細胞と比較して多い量のユビキチン化ＡＩＭＰ２が、ＤＸ２で形質転換された細胞から観察された（図４ｈ）。以上より、ＤＸ２はＡＩＭＰ２に結合して不活性のヘテロダイマーを形成するドミナントネガティブ突然変異（dominant negative mutant）として作用するものと思われる。
【０１３７】
（実施例４：ＡＩＭＰ２ＤＸ２によるＴＧＦ−βシグナル伝達不活性化および細胞成長促進）
ＤＸ２をＭＥＦｓにトランスフェクションした後、ＤＸ２が細胞成長に及ぼす効果を顕微鏡分析およびコロニー形成によって観察した。細胞成長は、ＤＸ２導入によって著しく増加した（図５ａ）。また、ＤＸ２に特異的に結合できる３種のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＸ２）を（図５ｂ）発現するそれぞれのベクターを製造し、ＤＸ２を発現するＨ３２２およびＨ４６０細胞を形質転換した後、正常的ＡＩＭＰ２およびｓｍａｄ２のリン酸化に及ぼす影響を観察した（図５ｃ）。４番または５番ｓｉＲＮＡを発現するベクターをＨ３２２細胞にトランスフェクションしたとき、ＴＧＦ−βによる細胞死滅が増加し（左）、細胞周期の停止（右）が起こることをフローサイトメトリーで観察することができた（図５ｄ）。ＤＸ２を発現するＨ３２２細胞に、ＤＸ２の転写を特異的に抑制する４番ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＤＸ２）を発現するベクターを組み込み、ｓｉＲＮＡによってＡＩＭＰ２の正常的水準およびＴＧＦ−ベータシグナル伝達が復旧されるかをチェックした。ｓｉ−ＤＸ２はＤＸ２転写物を除去させ（図５ｅの上）、ＡＩＭＰ２の正常水準およびＴＧＦ−βにより誘導されたＳｍａｄ２のリン酸化（図５ｅの下および図５ｆ）、Ｓｍａｄ２の核移動（図５ｆ）、ＴＧＦ−β依存的レポーターの発現（図５ｇ）、および成長停止（図５ｈ）を復旧させた。前記全ての結果は、ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節に及ぶＤＸ２の崩壊的な効果を証明することである。
【０１３８】
（実施例５：ＡＩＭＰ２欠失変異体とヒト肺癌との関連性）
ＡＩＭＰ２の減少は様々な癌細胞株からよく発見され（図３ａ、ｂおよびｄ）、ＡＩＭＰ２の損失は肺細胞の過増殖をもたらすため（Kim et al., Nat. Genet. 34, 330-336, 2003）、本発明者はＡＩＭＰ２の異常が肺癌形成と関連しているかを調べた。このような可能性を検討するために、化学的発癌物質、ＢＰ（benzo-（α）-pyrene）（Wang et al, Cancer Res. 63, 4389-4395, 2003）をＡＩＭＰ２＋／＋およびＡＩＭＰ２＋／−マウス腹腔内に投与して肺腫瘍を誘導した後、肺における腫瘍形成を観察した。ＢＰ投与後６週から、ＡＩＭＰ２＋／−マウスでは５０〜７０％の頻度で、正常マウスでは約３０％の頻度で肺腫瘍が観察された（図６ａ）。これは、異型接合マウス（heterozygous mice）が、ＢＰにより誘導された腫瘍形成にさらに敏感であることを意味する。ＢＰ注射マウスの肺におけるＤＸ２生成有無を調査した。３匹のＡＩＭＰ２＋／＋マウスのうち１匹のみが腫瘍を発生させるのに比べ、ＡＩＭＰ２＋／−マウスから単離した４つの肺のうち３つから腫瘍が生成された。全てのこのような腫瘍はＤＸ−２を生成させた（図１０）。これは、肺癌形成とＤＸ２との関連性があることを意味する。
【０１３９】
ヒト肺の非腫瘍の炎症性組織（the inflammatory but non-tumor）と腫瘍組織におけるＡＩＭＰ２水準を比較した。ＤＸ２は腫瘍組織のみで生成された（図６ｂ）。相異なる個体によってＡＩＭＰ２水準とＤＸ２形成が異なる可能性を排除するために、同じ患者から単離した正常および腫瘍組織においてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＡＩＭＰ２の癌特異的減少とＤＸ２の生成とは連関していた（図６ｃ）。癌部位における正常的ＡＩＭＰ２水準を示す一つの事例からＤＸ２が観察されなかった（図６ｃ、患者２２８７２）。
【０１４０】
（実施例６：癌発生とＡＩＭＰ２、ＡＩＭＰ２ＤＸ２との連関性）
癌発生とＡＩＭＰ２、ＡＩＭＰ２ＤＸ２との連関性を多様な組織および癌細胞株におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２発現で検査した。
２つの肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）試料から、正常と癌組織におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成有無をＲＴ−ＰＣＲで観察した。癌組織からＡＩＭＰ２ＤＸ２の形成が観察された（図１１ａ）。その他の多様な癌細胞株におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を調べた。細胞株を６ウェルプレートに１×１０５ずつシードし、２４時間後に細胞を収穫した。収穫した細胞を、１％β−メルカプトエタノールを含むＧＳＳ溶液を用いて溶解させ、酸性フェノール（ｐＨ４．３）とクロロホルムを含む４％イソアミルアルコールを入れて混合した。これを遠心分離し、上澄み液をイソプロパノールで沈殿させ、再び遠心分離してペレットを得た。ペレットをエタノールで洗浄し、ＤＷに溶かしてＲＮＡを得た。ＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４２℃で１時間逆転写させ、配列番号１６のプライマーと配列番号６のプライマーを用いて、９５℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分を１サイクルとした条件で３８サイクルのＰＣＲを行った。その結果、肺癌細胞株（Ｈ２２６、Ｈ４６０、Ｈ３２２およびＨ２９０）、胚児腎臓癌細胞株（２９３）、骨肉腫細胞株（ＳａＯＳ２）、皮膚癌細胞株（ＨａＣＡＴ）、乳癌細胞株（ＭＣＦ７）からＡＩＭＰ２ＤＸ２が発現した（図１１ｂ）。
【０１４１】
（実施例７：ＡＩＭＰ２ノックアウトマウスを用いた発癌研究）
ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウトさせたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２発現が正常な野生型マウスと比較してみた。その結果、ＡＩＭＰ２ノックアウトマウスにおいて、皮膚腫瘍が発生するマウス数とマウスの腫瘍の数が確然に増加することが分かった。具体的に、マウスにＤＭＢＡにより癌を誘発し、ＴＰＡで癌の誘発を促進させる場合、ＡＩＭＰ２ノックアウト雌マウスは雌対照区マウスに比べて腫瘍発生率が約１．３倍増加し、ＡＩＭＰ２ノックアウト雄マウスは雄対照区マウスに比べて腫瘍発生率が約２倍増加した（図１２ｂ）。また、腫瘍発生マウスに発生した腫瘍の数も、ＡＩＭＰ２ノックアウト雌マウスは雌対照区マウスに比べて約４倍増加し、ＡＩＭＰ２ノックアウト雄マウスは雄対照区マウスに比べて約２倍増加した（図１２ｃおよび図１２ｄ）。
【０１４２】
〔産業上の利用可能性〕
本発明の癌に特異的に発現するＡＩＭＰ２ＤＸ２（タンパク質、ｍＲＮＡ）を癌診断マーカーとして用いて癌を正確且つ容易に診断することができ、ＡＩＭＰ２ＤＸ２タンパク質に対する抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸などのＡＩＭＰ２ＤＸ２の抑制剤を用いて癌を効果的に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１ａ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す図である。
【図１ｂ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す図である。
【図１ｃ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す図である。
【図１ｄ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す図である。
【図１ｅ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の機能的重要性およびＡＩＭＰ２とＳｍａｄ２／３との相互作用を示す図である。
【図２ａ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図２ｂ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図２ｃ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図２ｄ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図２ｅ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図２ｆ】ＴＧＦ−βシグナル伝達におけるＡＩＭＰ２の作動メカニズムを示す図である。
【図３ａ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図３ｂ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図３ｃ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図３ｄ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図３ｅ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図３ｆ】ＡＩＭＰ２の差別的発現とＡＩＭＰ２のエクソン２欠失型の生成を観察した結果を示す図である。
【図４ａ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｂ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｃ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｄ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｅ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｆ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｇ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図４ｈ】ＡＩＭＰ２ＤＸ２がＡＩＭＰ２の細胞内安定性に及ぼす効果を確認した結果を示す図である。
【図５ａ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｂ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｃ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｄ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｅ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｆ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｇ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図５ｈ】ＴＧＦ−βシグナル伝達および細胞成長調節におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の崩壊的効果を示す図である。
【図６ａ】肺癌の形成とＡＩＭＰ２との関連性を観察した結果を示す図である。
【図６ｂ】肺癌の形成とＡＩＭＰ２との関連性を観察した結果を示す図である。
【図６ｃ】肺癌の形成とＡＩＭＰ２との関連性を観察した結果を示す図である。
【図７】ＡＩＭＰ２との相互作用に関連したＳｍａｄ２ドメインを測定した結果を示す図である。
【図８ａ】ＡＩＭＰ２遺伝子のエクソン配列およびＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡにおけるプライマーの位置を示す図である。
【図８ｂ】ＡＩＭＰ２遺伝子のエクソン配列およびＡＩＭＰ２ ｃＤＮＡにおけるプライマーの位置を示す図である。
【図９ａ】癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現減少およびＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を観察した結果を示す図である。
【図９ｂ】癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現減少およびＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を観察した結果を示す図である。
【図９ｃ】癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現減少およびＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を観察した結果を示す図である。
【図９ｄ】癌細胞株におけるＡＩＭＰ２の発現減少およびＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成を観察した結果を示す図である。
【図１０】肺癌組織におけるＡＩＭＰ２ＤＸ２の生成およびＡＩＭＰ２の抑制を示す図である。
【図１１ａ】様々な組織と細胞とにおいてＡＩＭＰ２ＤＸ２が発現することを示す図である。
【図１１ｂ】様々な組織と細胞とにおいてＡＩＭＰ２ＤＸ２が発現することを示す図である。
【図１２ａ】ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウト（ＡＩＭＰ２＋／−）させたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２の発現が正常的な野性型マウスと比較して示す図である。
【図１２ｂ】ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウト（ＡＩＭＰ２＋／−）させたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２の発現が正常的な野性型マウスと比較して示す図である。
【図１２ｃ】ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウト（ＡＩＭＰ２＋／−）させたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２の発現が正常的な野性型マウスと比較して示す図である。
【図１２ｄ】ＡＩＭＰ２遺伝子をノックアウト（ＡＩＭＰ２＋／−）させたマウスにおける発癌程度を、ＡＩＭＰ２の発現が正常的な野性型マウスと比較して示す図である。
【図１３】ＡＩＭＰ２ＤＸ２発現ベクターを示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図５ｈ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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