(57)【要約】本発明はＣＤ１１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とＩＦＮ−γの増大を誘発し、癌細胞の増殖を阻害することで癌を治療するためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体を薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物とその使用に関する。従って、副作用のない癌の予防又は治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の増大を誘発することで癌を治療又は予防するためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を有効成分として薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物。
【請求項２】
癌細胞増殖を相乗的に阻害する効果により癌を治療又は予防するための、ＨＢＢＫ４と抗ＣＴＬＡ−４抗体の混合物を有効成分として薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物。
【請求項３】
前記組成物がヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を組成物の総重量に対して０．１から５０重量％含有する、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項４】
前記ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.59のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項５】
前記ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.61のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項６】
前記ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.63のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項７】
前記ヒト化４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.60のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
前記ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.62のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
前記ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）がSEQ ID NO.64のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
それを必要とするヒトを含む哺乳類における癌の治療及び予防のための治療薬の調製のためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）の使用。
【請求項１１】
それを必要とするヒトを含む哺乳類における癌の治療及び予防のための治療薬の調製のためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）と抗ＣＴＬＡ−４抗体の混合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療又は予防するためのヒト化抗体ＨＢＢＫ４を含む医薬品組成物及びその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は特定のタンパク質についての過剰発現と突然変異の誘発から生じる癌細胞特異性抗原を発現し、これらは患者の自己免疫反応により排除される（Nagorsen D. et al., Clin. Cancer Res. 9, pp4296-4304, 2003; Yee C et al., J. Exp. Med. 192, pp1637-1644, 2000; Castelli C et al., J. Cell Physiol., 182, pp323-331, 2000）。癌細胞に対するこういった免疫反応は樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により代表され、通常の免疫反応と同じであり、癌細胞はＡＰＣによる適当なＴ細胞及びＢ細胞の活性化により除去される（Jay A. et al., J. Clin. Invest. 113, pp1515-1525, 2004）。癌細胞は様々なメカニズム、例えばＭＨＣ分子数の低下、共刺激分子発現の抑制、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０等の免疫抑制物質の誘発、癌組織へのＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞等の浸透を通して、アネルギー又は耐性を引き起こし、又、抗癌免疫反応から自己を守ろうとする（Smyth MJ et al., Nat. Immunol. 2, pp293-299, 2001; Dunn GP et al., Immunity 21, pp137-148, 2004）。
【０００３】
抗癌免疫反応は細胞性免疫に依存している。特にはＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）は癌細胞の除去に重要であり、免疫記憶を保持する（Maeurer MJ et al., Int. Rev. Immunol. 14, pp97-132, 1997）。
【０００４】
Ｔ細胞の活性化を誘発するには２種類の信号を必要とし（Mondino A et al., J. Leukoc. Biol. 55, pp805-815, 1994）、つまり抗原特異性信号である第一信号がＴＣＲにより運ばれ、第二信号が共刺激分子により運ばれる。Ｉｇ（免疫グロブリン）群及びＴＮＦＲ群は共刺激分子として良く知られている。これらの分子の免疫アゴニスト及びアンタゴニスト的役割は公知であることから、これを利用した多様な治療方法が現在まで試みられている。現在、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＬＩＧＨＴ、ＰＤ−１、ＣＤ２７等がこの中でも強力な抗癌活性を示すことが報告されている（Ye Z et al., Nat. Med. 8, pp343-348, 2002; Phan GQ et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, １００, pp8372-8377, 2003; Li Q et al., J. Immunother., 25, pp304-313, 2002; Yu P et al., Nat. Immunol.. 5, ppl41-149, 2004; Iwai Y et al., Int. Immunol. 17, ppl33-144, 2005; Arens R et al., J. Exp. Med.. 199, ppl595-1605, 2004）。
【０００５】
４−１BBがＣＴＬ及びＩＦＮ−γの発現を誘発することが報告されており、アゴニスト性抗４−１ＢＢｍＡｂによる癌の治療が多くの研究者によって試みられている（Shuford WW. et al, J. Exp. Med.. 186, pp47-55, 1997）
【０００６】
ＣＴＬＡ−４が免疫反応を制限し、活性化Ｔ細胞により発現したＣＴＬＡ−４信号伝達を阻害することでＴ細胞の最大活性化により癌細胞の増殖が防止されることが報告されている（Phan GQ et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100, pp8372-8377, 2003）。
【０００７】
本発明の発明者は、抗４−１ＢＢ抗体の機能を発見しようと試み、ついにアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体とアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用しての治療により癌細胞特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞が増大することを発見した。これによりＣＤ１１ｃ分子を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が誘発され、その他の共刺激分子とは異なる方法で腫瘍に浸透する。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体の投与による癌細胞増殖の阻害は腫瘍へのＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の十分な浸透と高度に発現したＩＦＮ−γにより引き起こされる。
【０００８】
従って、本発明はヒト化抗４−１ＢＢ抗体及び／又はアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の癌に対する治療有効性が、ＣＴＬ機能とＩＦＮ−γ発現の強化による強力な癌阻害効果へとつながる増大したＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞によるものであること、更にこの効果がＣＴＬＡ−４信号伝達の阻害により強化されることを確認することで完成した。
【０００９】
本発明のこれら及びその他の目的は以下に記載の本発明の詳細な開示により明らかとなる。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の一態様において、本発明はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞とＩＦＮ−γ発現増大の誘発を通して癌を治療又は予防するためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を有効成分として薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物を提供する。
【００１１】
本発明は哺乳類に有効量の有効成分としてのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を薬学的に許容されるその担体と共に投与することを含む、癌を治療又は予防するための免疫療法を提供する。
【００１２】
本発明は、それを必要とするヒトを含む哺乳類における癌の治療又は予防のための治療薬の調製のためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）の使用も提供する。
【００１３】
従って、本発明の目的はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞増大の誘発を通して癌を治療又は予防するためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（以下、ＨＢＢＫ４と称する）を有効成分として薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物を提供することである。
【００１４】
本発明の別の態様により、それを必要とするヒトを含む哺乳類における癌の治療又は予防のための治療薬の調製のためのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）の使用も提供する。
【００１５】
本発明のその他の態様により、哺乳類に有効量の有効成分としてのヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を薬学的に許容されるその担体と共に投与することを含む、癌を治療又は予防するための免疫療法も提供する。
【００１６】
本発明のその他の態様により、癌細胞増殖を相乗的に阻害することにより癌を治療又は予防するための、ヒト化抗４−１ＢＢ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せを有効成分として薬学的に許容される担体と共に含む医薬品組成物も提供する。
【００１７】
本発明の別の態様により、それを必要とするヒトを含む哺乳類における癌の治療及び予防のための治療薬の調製のための、ヒト化抗４−１ＢＢ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との混合物の使用も提供する。
【００１８】
本発明のその他の態様により、哺乳類に有効量の有効成分としてのヒト化抗４−１ＢＢ抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体の混合物を薬学的に許容されるその担体と共に投与することを含む、癌を治療又は予防するための免疫療法も提供する。
【００１９】
本発明の癌を治療又は予防するための医薬品組成物は本発明の上記記載のヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）を組成物の総重量に対して約０．０１〜８０ｗ／ｗ％、好ましくは０．１〜５０ｗ／ｗ％含有する。
【００２０】
本願で開示の用語「ヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）」はヌクレオチド配列SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 61又はSEQ ID NO. 63を含み、またアミノ酸配列SEQ ID NO. 60、SEQ ID NO. 62又はSEQ ID NO. 64を含む。
【００２１】
本願で開示の用語「癌」には、肺癌、砒素細胞肺癌、結腸癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、胃癌、肛門周囲癌、結腸癌、乳癌、子宮内膜症、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、平滑組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性又は急性白血病、リンパ球腫、嚢胞癌、腎臓又は水尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、ＣＮＳ腫瘍、原発性中枢神経系悪性リンパ腫、脊髄髄質腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫症等を含む。
【００２２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明に関し、本願で開示のヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）は以下の手順で調製可能である。
【００２４】
例えば、本発明のＨＢＢＫ４はアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体（ＢＢＫ４）を第一工程でハイブリドーマ細胞株を用いて調製し；第二工程でＢＢＫ４遺伝子をクローニングし；ＢＢＫ４のＶＨ及びＶＬを第三工程でヒト化し；最終工程でヒト化ＢＢＫ４（ＨＢＢＫ４）クローンをヒト化ＢＢＫ４（ＨＢＢＫ４）ＳｃＦＶの機能分析を通して選択し、本発明のＨＢＢＫ４を得る工程を含む手順によって調製可能である。
【００２５】
従って、上記の方法で調製した本発明のＨＢＢＫ４は癌の予防と治療のための医薬品組成物の調製において有効成分として使用可能である。
【００２６】
更に、上記の方法で調製したＨＢＢＫ４と抗ＣＴＬＡ−４の混合物は癌の予防と治療のための医薬品組成物の調製において有効成分として使用可能である。
【００２７】
本発明の組成物は、追加として当該分野で慣用に使用されている適切な担体、アジュバント又は希釈剤を含んでいてもよい。適切な担体、アジュバント又は希釈剤は特定の材料に限定されず、用法及び適用方法に応じて選択可能である。適当な希釈剤は文献：Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Co., Easton PA)に記載されている。
【００２８】
本発明のＨＢＢＫ４抗体は独立して、又はタクソール、シクロホスファミド、ドキソルビシン等の周知の抗癌剤と組み合わせて使用可能である。
【００２９】
以下において、以下の製剤法及び賦形剤は単に例示的なものにすぎず、本発明をいかなる場合も限定するものではない。
【００３０】
本発明の組成物は薬学的に許容される担体、アジュバント又は希釈剤、例えば乳糖、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油を含有する医薬品組成物として調製可能である。処方には更に充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、着香料、乳化剤、保存料等を含有していてもよい。本発明の組成物は、当該分野で周知のいずれの手順でもって、患者に投与した後、有効成分が迅速、徐放性又は遅延放出されるように処方を設計することができる。
【００３１】
例えば、本発明の組成物は注射剤を製造する際に一般的に使用される油類、プロピレングリコール又はその他の溶媒に溶解可能である。適切な担体の例には生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性油、ミリスチン酸イソプロピル等が含まれるが、これらに限定されるものではない。局所的投与の場合、本発明の組成物を軟膏やクリームの形態で処方可能である。
【００３２】
本発明の組成物を含有する医薬品製剤は、経口投薬形状（粉末、錠剤、カプセル、ソフトカプセル、水薬、シロップ、エリキシル剤、丸薬、粉末、サシェ剤、顆粒）、又は局所用調合物（クリーム、軟膏、ローション、ゲル、バーム、パッチ、ペースト、散布剤、エアロゾル等）、又は注射剤（水溶液、懸濁液、エマルジョン）等のいずれの形状で調製してもよい。
【００３３】
薬剤投与形態での本発明の組成物は、その薬学的に許容される塩として使用してもよく、又、その他の薬学的に活性な化合物と組み合わせての使用はもちろん、単体で使用しても適当なものと組み合わせての使用であってもよい。
【００３４】
本発明の組成物の望ましい投与量は、患者の状態や対象の体重、疾患の重症度、剤形、投与経路、投与期間によって異なり、当業者が選択してもよい。しかしながら、望ましい効果を得るためには、本発明の抽出物又は組成物を体重/日あたり、１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１から１０００ｍｇ／ｋｇ投与することが一般的に勧められる。一日一回投与しても、何回かにわけて投与してもよい。
【００３５】
組成に関しては、本発明の組成物の含有量は組成物の全重量に対して０．０１から８０重量％、好ましくは０．５から５０重量％であるべきである。
【００３６】
本発明の医薬品組成物は、哺乳類（ラット、マウス、家畜又は人間）等の被験動物に様々な経路で投与可能である。全ての投与方式が考えられるが、例えば、経口投与、直腸投与、静脈内投与、筋肉投与、皮下投与、皮内投与、鞘内投与、硬膜外投与、又は脳室内投与が挙げられる。
【００３７】
本発明の精神又は範囲から外れることなく、本発明の組成物、その使用及び調製に様々な改良や変更を加えうることは当業者には自明である。
【００３８】
本発明を以下の図面及び実施例を用いてより詳細に説明するが、当然ながら、いかなる方法によっても本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００３９】
本発明の独創的なＨＢＢＫ４抗体はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＩＦＮ−γ発現の増大による、癌細胞増殖の阻害効果を示した。従って、癌の予防又は治療に有用であり、副作用を伴わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の精神と範囲から外れることなく様々な改変及び変更を本発明の組成物、その使用、及び調製に加えうることは当業者に明白である。
【００４１】
本発明は以下の実施例によりより具体的に説明されるが、当然のことながら、いかなる場合でも本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００４２】
以下の実施例及び実験例は、範囲を制限することなく本発明を説明することを意図するものである。
【実施例１】
【００４３】
アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ（ＢＢＫ４）の調製
１−１  ヒト４−１BBタンパク質の調製
ヒト４−１ＢＢ分子コードｃＤＮＡとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の結合部位をコードするＤＮＡ（Pharmacia LKB Biotechnology社）とを組み合わせることでｐＧＥＸ３発現ベクターを調製した。
【００４４】
大腸菌を上記ベクターで形質転換した後、適切な条件下で培養して４−１ＢＢ−ＧＳＴ融合タンパク質の発現を誘発させ、次にグルタチオンセファロース−４Ｂカラム（Pharmacia LKB Biotechnology社）により更に分離と精製を行うことで４−１ＢＢ−ＧＳＴ融合タンパク質を得た。  
【００４５】
１−２  免疫力
２０μｇの４−１ＢＢ−ＧＳＴ及び０．１ｍｌのフロインド完全アジュバントを混合し、生後４〜８週間のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に投与し、最小限の免疫反応を誘発させた。２０μｇの４−１ＢＢ−ＧＳＴ及びフロインド不完全アジュバントの混合物をＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に３週間間隔で２回投与し、免疫を誘発させた。
【００４６】
免疫誘発終了３日後、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に沿って少量の血液サンプルを尾部から採取することで抗体価を求め、免疫値が特定のレベルに達した際、取り出した脾臓の脾臓細胞を用いて細胞融合を行った。
【００４７】
１−３  細胞融合
免疫を与えられたマウスから得た脾臓細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８１）と混合比１：２で混合し、ポリエチレングリコール４０００（Gibco社）により融合させた。以下の実験は文献（Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular mmunology. W. H. Freeman Company, 1980）に開示の手順により行った。
【００４８】
ハイブリドーマ細胞を選択するために、融合細胞混合物をＨＡＴ培地、つまり１５％ウシ胎仔血清、０．１ｍＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリジン及び１６μＭチミジンを添加したＲＰＭＩ培地に懸濁させ、濃度３ｘ１０７細胞／ｍｌで９６ウェルミクロ培養トレイに注入し、５％ＣＯ２ガスを供給して３７℃で細胞培養物を培養した。骨髄腫細胞及びその他の非融合脾臓細胞は共にＨＡＴ培地では成長しなかったため、すでに融合した細胞のみをHAT培地で成長したと見なした。６、７、８日後にそれぞれ、培地の半分を新しい培地と入れ替えた。逆相顕微鏡で観察し細胞が十分成長した時点で抗体を含有する上清液を９６ウェルミクロ培養プレートから回収し、ＥＬＩＳＡ法を行った。
【００４９】
１−４  ハイブリドーマ細胞株の選択
炭酸塩緩衝液（ｐH９．６）で希釈することで４−１ＢＢ−ＧＳＴ濃度を２００ｎｇ／０．１ｍｌに調節し、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。完全にコーティングしたプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ含有１％ＦＢＳアルブミンを添加して、１時間放置した。プレートをＰＢＳで数回洗浄し、実施例１−３で調製した上清液を１時間に亘って培養した。培養後、プレートをＰＢＳで数回洗浄し、０．１ｍｌの希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（x1000、Southern Biotech社）を添加した。一時間後、プレートをＰＢＳで数回洗浄し、ｐ−ニトロフェニル一リン酸ナトリウムを炭酸塩緩衝液に１ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ９．６）で溶解することで調製した０．１ｍｌの基質液を添加して、室温で１０分間保存した。オートマイクロプレートレコーダーを用いて反応を求めることで、４−１ＢＢ特異性結合抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択した。以下、ＢＢＫ−４とする。
【００５０】
１−５  ハイブリドーマ細胞株を用いた抗体の調製
実施例１−４で調製したＢＢＫ−４細胞株（１ｘ１０７）を培地で増殖させ、０．５ｍｌのプリスタン（2,6,10,14-tetramethylpentadecane、シグマ社）で前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔投与し、腹水を採取した。腹水をプロテインＧセファロースカラム（Pharmacia社）での親和カラムクロマトグラフィに供し、本発明のモノクローナル抗体を単離した。その抗体産生速度は１ｍｇ／ｍｌ腹水である。
【００５１】
抗体分析キットによる分析結果により、本発明の抗体はカッパ軽鎖のアイソタイプを有するＩｇＧ１であると確定された。
【実施例２】
【００５２】
アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ（ＢＢＫ４）の遺伝子クローニング
２−１  ＢＢＫ−４クローンのｍＲＮＡ
完全長ＲＮＡを２ｘ１０８細胞数のＢＢＫ−４クローンから抽出した。細胞ペレットをＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（TriPure Isolation Reagent、Sigma社）で処理し、フェノール／クロロホルムでの一回の抽出に供した。上清をイソプロパノールで処理してＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡを７５％エタノールで二回洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に溶解させ、完全長ＲＮＡを得た。ｍＲＮＡの抽出はダイナルビーズｍＲＮＡ精製キット（Dynalbeads mRNA purification kit、DYNAＬ社）で行った。
【００５３】
２−２  ＢＢＫ−４クローンのｃＤＮＡライブラリの作製
ＺＡＰ−ｃＤＡＮ合成キット及びＺＡＰ−ｃＤＮＡギガパックIIIゴールドクローニング（STRATAGENE社）を用いてＢＢＫ−４のｃＤＮＡライブラリを作製した。
【００５４】
２−２−１  ファーストストランド合成
実施例２−１で調製した抽出ｍＲＮＡを用いてＢＢＫ４のファーストストランドを合成した。５μｇのｍＲＮＡ、リンカープライマー、リボヌクレアーゼＨリバーストランスクリプターゼ、メチルヌクレオチド混合液、及びリボヌクレアーゼ阻害剤の混合物を１時間に亘って３７℃で反応させた。リンカープライマーはＸｈｏＩサイトとSEQ ID NO. 1の配列を有していた。
【００５５】
２−２−２  セカンドストランド合成
リボヌクレアーゼＨ及びＤＮＡポリメラーゼIを用いてセカンドストランドを合成し、混合物を１６℃で２．５時間に亘って反応させた。反応後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出に供し、エタノールを用いて濃縮した。濃縮物を７０％エタノールで洗浄し、水に溶解させ、タンパク質をウルトラフリー・プロバインド・フィルタ（Utrafree-probind filter、Sigma社）で除去した。
【００５６】
２−２−３  ｃＤＮＡ末端の平滑化
ｃＤＮＡの３'末端及び５'末端の双方をクレノウ断片とｄＮＴＰを用いて平滑化した。タンパク質はウルトラフリー・プロバインドフィルタ（Sigma社）で除去した。
【００５７】
２−２−４  ＥｃｏＲＩアダプタのライゲーション
ｒＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼの双方を添加した。溶液を４℃で１２時間に亘って反応させ、７０℃で３０分に亘って加熱することで酵素を不活性化させた。
【００５８】
２−２−５  ＥｃｏＲＩ末端のキナーゼ化
ｒＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの双方を添加した。溶液を３７℃で３０分に亘って反応させ、７０℃で３０分に亘って加熱することで酵素を不活性化させた。
【００５９】
２−２−６  ＸｈｏＩ消化
消化はＸｈｏＩを用いて行われ、タンパク質はウルトラフリー・プロバインド・フィルタ（Sigma社）により除去された。
【００６０】
２−２−７  ｃＤＮＡのＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターアームへのライゲーション
調製したｃＤＮＡの量をエチジウムブロマイドを用いて測定した。１００ｎｇのｃＤＮＡ及び１２５μｇのＵｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクターの混合物を、ｒＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃で１２時間に亘って反応させた。
【００６１】
２−２−８  パッケージング
−８０℃で保存されたパッケージング抽出物の融解開始時に、２μｇのライゲートしたＤＮＡを泡を生じさせないようにピペットで慎重に添加し、混合した。溶液を２時間に亘って反応させ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１%のゼラチン及び２０μｌのクロロホルムを含有する５００μｇのＳＭ緩衝液と混合した。溶液を遠心分離し、上清を別のチューブに移した。
【００６２】
２−２−９  ライブラリの力価測定
ＸＬ−１ブルーＭＲＦ’をホスト細胞として用い、ＬＢ／テトラサイクリンプレート（６０μｇ／ｍｌ）上に接種することで得た単一コロニーを１０ｍＭのＭｇＳＯ４と０．２％のマルトースを含有するＬＢ培地に接種した。３７℃でＯＤ６００１．０を越えないようにコロニーを速度２００ｒｐｍの振動を与えながら培養した。培養物を速度５００ｘｇで１０分間に亘って遠心分離に供することで培地を分離し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２ＯをＯＤ６００が０．５になるまで細胞ペレットに添加した。調製したホスト細胞を４℃で保存し、４８時間に亘って生存させた。１μｌの１／１０まで希釈したパッケージング反応物を２００μｌのホスト細胞に添加し、ホスト細胞に３７℃、１５分で取り付けた。３ｍｌの４８℃の冷却した上層寒天部を添加し、ボルテックスに供し、予熱したＬＢ寒天プレートに注いだ。細胞を３７℃で１０時間に亘って成長させ、プラークの数をカウントすることで細胞数を計算した（ｐｆｕ／ｍｌ）。最終的にカウントされた細胞数が１．９ｘ１０６ｐｆｕであることが確認された。
【００６３】
２−３  重鎖遺伝子及びカッパ鎖遺伝子のスクリーニング
上記の細胞をプレーティングに供し、１００ｍｍあたり約２００から３００のプラークを形成し、ナイロン膜に移してＵＶ架橋した。膜を用いてハイブリダイゼーションを行った。ＰＣＲによりクローニングされた完成した各断片を重鎖とカッパ鎖のスクリーニング用のプローブとして使用した。ＥＣＬ直接核酸標識・検出キットを用いてハイブリダイゼーションを行った。クローンはＥｘａｓｓｉｔ／ＳＯＬＲを用いた生体内除去システムを通してプラスミドに形質転換され、配列を配列決定法により求めた。
【実施例３】
【００６４】
アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ抗体（ＢＢＫ４）のＶＨ及びＶＬヒト化
３−１  ＢＢＫ−４クローンのヒトホモログＶＨ及びＶＬの選択
クローンＢＢＫ−４コードマウスタンパク質のＶ領域配列に似たヒト抗体遺伝子をデータベースサーチシステムを通して選択した。ＢＢＫ−４と似た配列を用いてコンビナトリアル抗体ライブラリを構築するに必要なＰＣＲテンプレートとプライマーを調製した。
【００６５】
３−２  ＢＢＫ−４遺伝子のヒト化設計
ＢＢＫ−４の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ及びＦＲ部領域を見つけ出し、表１に開示のルールに準拠して、領域がヒトアミノ酸残基に変化したか否かを求めるスタンダードに従った。
【００６６】
ＣＤＲ領域、つまりＨ及びＬ鎖の多数の部分配列中で抗原と直接的に連結する領域をマウス配列に用い、カノニカル領域をマウス配列に用いた。ＦＲ領域に存在するものの、ＨとL鎖とのインターフェースに位置された配列をマウス配列に使用し、特定の配列をヒト配列に用いた。溶媒に露出した残基をマウス配列に用い、ヒト化ヌクレオチド配列をプロトコールに基づいて決定した（図１を参照のこと）。
【００６７】
【表１】
2008542261.tif 000003
【００６８】
３−３  コンビナトリアル抗体ライブラリを作製するためのプライマー調製
コンビナトリアル抗体ライブラリ作製に向けインサートを調製するために、ＢＢＫ−４クローンの重鎖と軽鎖配列とヒト・テンプレートの比較により得られたアミノ酸配列に基づいて、コンビナトリアル・プライマーを調製した。プライマー配列は表２においてSEQ ID NO.2からSEQ ID NO.18で示されている。
【００６９】
【表２】
2008542261.tif 000004
【００７０】
ＳｃＦｖ領域増幅のためのＰＣＲを表２に従って調製したプライマーを用いて行った。ＰＣＲは以下のように行った。９４℃での５分間に亘る予備変性と、９４℃での３０秒間の変性、５９℃での１分に亘るアニーリング、７２℃での３０秒に亘る伸長から成る１サイクルとを３５回繰り返し、後伸長を７２℃で７分に亘って行った。得られたＰＣＲ生成物をＱＩＡＧＥＮゲル抽出キットで単離した。
【００７１】
３−４  ライゲーションＳｃＦｖへの制限酵素サイトの追加
制限酵素サイトが表３にSQ.ID NO.19からSEQ.ID NO.20として示されている。
【００７２】
【表３】
2008542261.tif 000005
【００７３】
酵素サイトはＨＢＢＫ−４ＳｆｉＩ−Ｕ及びＨＢＢＫ４ＮｏｔＩ−Ｄを用いてＰＣＲ法を通してＳｃＦｖの５'−及び３'末端に追加され、得られたＰＣＲ生成物はＱＩＡＧＥＮゲル抽出キットにより単離された。
【００７４】
３−５  インサートの消化および精製
ＳｆｉＩ消化反応を行うために、８．５μｌの１０ｘの緩衝液（Roche社）、２μｌのＳｆｉＩ（１０Ｕ／μｌ、Roche社）、適当な体積の精製ＳｃＦｖ生成物（１μｇ）及び蒸留水を含有する８５μｌの混合液を８５μｌの鉱物油に添加し、共に５０℃で４時間に亘って反応させた。
【００７５】
ＮｏｔＩ消化反応を行うために、３．６μｌの３ＭのＮａＣｌ、１．５μｌの１０ｘの緩衝液（Roche社）、４μｌのＮｏｔＩ（１０Ｕ／μｌ、Roche社）、適当な体積の蒸留水を含有する１５μｌの混合液を完全に混合し３７℃で４時間に亘って反応させた。反応溶液をフェノール／クロロホルム抽出とスピンカラム精製法での単離に供した。
【００７６】
３−６  ＳｃＦｖの定量化とｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターへのライゲーション
ＳｃＦｖの量を電気泳動により測定した。２５ｎｇの単離したＳｃＦｖを１２．５ｎｇと２５ｎｇのＳｃＦｖマーカー双方と共に電気泳動に供し、幅０．７５ｃｍの１％アガロースゲル上で展開し、比較した。
【００７７】
更なるライゲーション処理でインサートを用い、５μｌの１０ｘのＯＰＡ緩衝液、５μｌのｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（５０ｎｇ／μｌ）、５μｌの１０ｍＭのＡＴＰ、２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ／μｌ）、５０μｌの蒸留水、及び適当な体積のＢＢＫ−４ＳｃＦｖ遺伝子断片（１５０ｎｇ）を含む５０μｌのライゲーション混合物を共に１６℃で１時間に亘って反応させた。次に溶液を７０℃で１０分間に亘り反応させて、リガーゼを不活性化し、５分間に亘って氷冷した。
【００７８】
３−７  形質転換とライブラリのサイズの確認
上記記載のライゲーション反応物において調製された生成物を１ｍｌの適切なＴＧ１細胞に添加し、氷中に４５分間に亘って放置した。混合物を４２℃で２分に亘って培養し、氷冷した。９００μｌのＬＢＧを１００μｌの冷却液に添加し、速度２５０ｒｐｍでの懸濁培養に供した。これらの形質転換細胞を希釈とプレーティングに供し、６ｘ１０６ｃｆｕの細胞ライブラリを得た。
【００７９】
３−８  ＢＢＫ−４組み換えファージ抗体ライブラリへの形質転換
上記記載の工程で調製した９００μｌの細胞ライブラリを９．１ｍｌの２ｘのＹＴ−Ｇ培地に添加し、速度２５０ｒｐｍ、温度３７℃での１時間に亘る懸濁培養に供した。速度１０００ｘｇ、１０分間に亘る遠心分離により上清を除去し、細胞を沈殿させた。１０ｍｌの２ｘのＹＴ−ＡＫ培地を沈殿した細胞に添加し、速度２５０ｒｐｍ、温度３７℃で一晩、懸濁培養した。懸濁物を速度１０００ｘｇで２０分に亘り遠心分離し、細胞を再度沈殿させた。上清を０．４５μｍの濾紙で濾過し、５０ｍｌの滅菌コニカルチューブに移し、パニングに供するまで４℃で保存した。
【００８０】
３−９  組み換えファージのＰＥＧ沈殿
２ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌをＢＢＫ−４組み換えファージ抗体ライブラリに添加し、完全に混合し、氷中で６０分に亘って培養した。懸濁物を速度１０００ｘｇ、温度４℃での遠心分離に２０分間に亘って供し、細胞を沈殿させ、上清を除去した。１６ｍｌの２ｘのＹＴ培地を沈殿物に添加し、混合した。上清を０．４５μｍの濾紙で濾過してパニングに供した。
【００８１】
３−１０  抗体陽性組み換えファージ抗体を選択するためのパニング
４−１ＢＢを０．０５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて１０μｇ／ｍｌに希釈し、溶液を室温で１又は２時間に亘って２５個のフラスコにコーティングした。フラスコをＰＢＳ溶液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液を充填し、室温で１時間に亘って保存し、ＰＢＳで再度、３回洗浄した。ＰＥＧで沈殿した組み換えファージ１６ｍｌを０．０１%のアジ化ナトリウムを含有する１４ｍｌのブロッキング緩衝液で希釈し、室温で１５分に亘って反応させた。２０ｍｌの希釈組み換えファージをフラスコに注ぎ、３７℃で２時間に亘って反応させた。フラスコを５０ｍｌのＰＢＳ溶液で２０回洗浄し、再度、５０ｍｌの０．１％ＰＢＳ−Ｔ溶液で２０回洗浄した。
【００８２】
１０ｍｌの成長段階ＴＧ１細胞をフラスコに注ぎ、３７℃で１時間に亘って培養した。１００μｌの培養物を様々な濃度、つまり１：１０、１：１００、１：１０００に希釈し、プレートあたり１００μｌでＳＯＢＡＧプレートにプレーティングした。フラスコを３０℃で一晩の培養に供し、各プレートのｃｆｕを概算した。ライブラリサイズは９ｘ１０４ｃｆｕと確認された。
【００８３】
３−１１  スクリーニング用のモノクローン選択
パニング後に得られた８８０個のコロニーを２００μｌの２ＸのＹＴ−ＡＧ培地を含有する９６ウェルプレートに接種し、速度２５０ｒｐｍ、温度３０℃で一晩培養した。Ｍ１３Ｋ０７（２．５ｘ１０１０ｐｆｕ）を含有する５０ｍｌの２ｘのＹＴ−ＡＧを別の９６ウェルプレートに２００μｌ／ウェルプレートで分配した。一晩培養したものをプレートに４０μｌ／プレートで接種した。接種したプレートを速度２５０ｒｐｍ、温度３７℃での懸濁培養と速度１５００ｘｇの２０分間に亘る遠心分離に供した。上清を更にＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。
【００８４】
３−１２  ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
４−１ＢＢを０．０５Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌまで希釈し、室温で１から２時間に亘って１００μｌ／プレートでＥＬＩＳＡプレート上にコートした。プレートを０．０１％を含有するＰＢＳで３回洗浄した。それぞれ２００μｌのブロッキング緩衝液を各ウェルに加え、室温で1時間に亘って反応させ、プレートをＰＢＳ−Ｔ緩衝液で３回洗浄した。１００μｌの組み換えファージ抗体の上清を準備したプレートに加え、同量のブロッキング緩衝液を混合し、室温で３０分に亘って反応させた。２００μｌの希釈したファージ抗体の上清を抗原をコートしたウェルに加え、室温で１時間に亘って反応させた。反応後、プレートを０．０１%ＰＢＳ−Ｔ溶液で５回洗浄し、ＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル複合体（HRP/anti-M13 monoclonal conjugate）をブロッキング緩衝液で１：５０００に２００μｌ／ウェルで希釈し、室温で1時間に亘って反応させた。プレートを０．０１%ＰＢＳ−Ｔ溶液で６回洗浄し、１ＸのＡＢＴＳ溶液を各ウェルに２００μｌ／ウェルで添加し、室温で２０分に亘って反応させた。０．５より高い吸光度を示すクローンは４０５ｎｍでの吸光度測定テストを通して陽性クローンとみなした。
【００８５】
スクリーニングの結果、１６２個の陽性クローンが得られ、各クローンのヌクレオチド配列は配列解析により同定された。配列中の重複した配列を調べることで、配列を異なる配列を有する５４のグループに分割した。
【実施例４】
【００８６】
ヒト化ＢＢＫ４(ＨＢＢＫ４)ＳｃＦｖの機能解析によるＨＢＢＫ４クローンの選択
【００８７】
４−１  ＢＢＫ４ＳｃＦｖの精製
各ＳｃＦｖを抗Ｅ−Ｔａｑセファロースカラムを用いて精製し、結果を図3に示した。
【００８８】
４−２  ＨＢＢＫ４ＳｃＦｖを用いたフローサイトメトリ
ＥＬＩＳＡスクリーニングにより求められたＨＢＢＫ４ＳｃＦｖクローン後、クローンをヒト４−１ＢＢを発現するＪｕｒｋａｔ８−１で処理しフローサイトメトリを分析しＨＢＢＫ４のヒト４−１ＢＢとの結合親和性を特定した。２μｇのＨＢＢＫ４を２ｘ１０５のＪｕｒｋａｔ８−１細胞に添加し、４℃で３０分間に亘り保存し、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを二次抗体で処理し、ＨＢＢＫ４を検出した。染色した細胞をフローサイトメトリ分析装置（FACScan、BD Bioscience社）で分析した。図４はＨＢＢＫ４クローン中の一部のクローンがマウスＢＢＫに似たヒト４−１ＢＢを認識することを示す。
【００８９】
４−３  競合ＥＬＩＳＡ
各クローンがマウスＢＢＫ４等の元のエピトープを有することを同定するために以下の競合ＥＬＩＳＡは抗原として４−１ＢＢ−ＧＳＴを選択し、ヒト化前の濃度の向上したマウスＢＢＫ４抗体とのＨＢＢＫ４ＳｃＦｖ結合親和性の比率の低下は以下の数式１によって表される阻害％によって示される。
【００９０】
（数１）
阻害比率（％）＝１００ｘ（非競合ＯＤ４０５−競合ＯＤ４０５）／非競合ＯＤ４０５
【００９１】
図５に示されるように、阻害比率（％）はマウスＢＢＫ４の濃度と共に用量依存的に上昇することから、ＨＢＢＫ４ＳｃＦＶが元来の抗原と似たエピトープを有することが証明され、これはＨＢＢＫ４ＳｃＦｖがマウスＢＢＫ４のそれと同様の生物学的効果を有することを強く示唆している。
【００９２】
４−４  ヒト化ＳｃＦｖの定常領域への連結
ＨＢＢＫ４ＳｃＦｖは連結されたＶＨ、リンカー及びＶＬ領域を有する。ＨＢＢＫ４ＳｃＦｖを抗体の元の構造、つまりＨ２Ｌ２構造に再構成するために、リーダー配列をＢＢＫ４のＶＨ領域に連結し、ヒトＩｇＧ１又ＩｇＧ４の定常領域をそれにそれぞれ連結した。リーダー配列及びヒト・カッパ鎖配列は共にカッパ鎖に連結され、各断片の連結はＰＣＲ法により行った。
【００９３】
４−５  Ｈ２Ｌ２を用いたＥＬＩＳＡ
定常領域へ続く完全にヒト化された配列は真核生物発現ベクターであるｐｃＤＮＡにサブクローンされ、２９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトされ、連続分析、つまりＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティング分析を細胞培地を用いて行った。４−１ＢＢ−ＧＳＴをＥＬＩＳＡについて抗原として用い、各５０個のトランスフェクタント培地を用いた。表４のＥＬＩＳＡ法の結果から見て取れるように、ネガティブコントロールのそれよりも約１５倍高い発現率を示した５０個のクローン中、クローン７５が最も高い発現率を示したことが確認された。
【００９４】
【表４】
2008542261.tif 000006
【００９５】
選択したクローン７５により産生した抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、完全にヒト化された抗体ＨＢＢＫ４−７５クローンが、図６に示されるように、ヒト４−１ＢＢと強力な親和性を示すことが確認された。
【実施例５】
【００９６】
アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ（ＢＢＫ４）のヒト化
アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体を用いて人体に癌治療法を適用するためには、抗体それ自体の負の活性を最小限とするヒト化抗体が必要である。マウスＢＢＫ４クローンの重鎖／軽鎖アミノ酸配列にかなり似たヒト抗体、すなわちアゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ抗体がスクリーニングされ、ヒト化のために比較された。最終的に選択したヒト化アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４）は２種類の定常領域、つまりヒトＩｇＧ又はＩｇＧ４と融合され、ＨＢＢＫ−４−７５Ｇ１とＨＢＢＫ４−７５Ｇ４とそれぞれ称した。最終的に合成されたＨＢＢＫ４抗体のヌクレオチド配列とアミノ酸配列が図７から図１２のSEQ.ID NO.59からSEQ.ID NO.64に図示されている。
【参考例１】
【００９７】
アゴニスト性抗マウス４−１ＢＢ抗体を用いた動物モデル試験
１−１  抗体
アゴニスト性抗ラット４−１ＢＢ及びアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の双方をプロテインＧカラムを用いてラットの腹水から単離した。ポジティブコントロールとして用いたラットＩｇＧはSigma社から購入し、サイトメトリ解析で使用したその他の抗体、つまり抗ＣＤ８−ＰＥ（５３−６．７）、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ（５３−６．７）、抗ＩＦＮ−γ−ＰＥ（ＸＭＧ１．２）、抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥ（ＨＬ３）、抗ＮＫ１．１−ＰＥ（ＰＫ１３６）はBD PharMingen社から購入した。
【００９８】
１−２  動物モデル及び抗体治療
Ｈａｒｔにより最初に報告されたＢ１６黒色腫突然変異であるＢ１６−Ｆ１０黒色腫癌細胞株の抗原性は低い（Francia G et al., Cancer Res. 56, 3855-3858, 1996）。４ｘ１０５のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞をマウスの背中に皮下注射し、腫瘍を起こさせた。２００μｇの各アゴニスト性抗４−１ＢＢ（３Ｈ３クローン）及びアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４−抗体（９Ｈ１０クローン）を腹腔内への癌細胞株投与と共に４日ごとに５回、同時又はそれぞれでラットに注入した。腫瘍のサイズを以下の数式２に沿って４日ごとに求め、腫瘍形成マウスの生存率を毎日観察した。
【００９９】
（数２）
腫瘍サイズ＝（幅ｘ長さｘ高さ）ｘ（π／６）
【０１００】
１−３  浸透した免疫細胞の腫瘍組織からの単離
腫瘍組織をアゴニスト性抗４−１ＢＢ、アンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４又はラットＩｇＧ治療マウスから治療１８日後に単離した。単離した腫瘍組織をＨＢＳＳと混合し単一の細胞懸濁液を形成し、６３％／３６％のパーコール勾配の上層上に載せることによる、速度５００ｘｇ、４５分間の遠心分離に供した。遠心分離後、６３％と３６％パーコールの間の白色の免疫細胞が回収され、ＲＰＭＩ１６４０で２度洗浄し、以下の実験で使用した。
【０１０１】
１−４  フローサイトメトリのための細胞染色
１μｇの２．４Ｇ２Ｆｃブロッカーを流入領域リンパ節又は腫瘍組織から単離した免疫細胞に添加し、４℃で１０分間保存した。細胞を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ８−ＰＥ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥで染色し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（BD Bioscience社）で分析した。細胞を抗ＣＤ８−ＦＩＴＣで３０分間表面染色し、５００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｐｅｒｍ（BD PharMingen社）を用いて室温で２０分間、固定、透過処理し、サポニンを含有するパームウォッシュ緩衝液（Perm Wash buffer、BD PharMingen社）で洗浄した。上記の細胞を抗ＩＦＮ−γ−ＰＥで３０分間に亘り細胞内染色し、ＦＡＣＳｃａｎ（BD Bioscience社）を用いて分析した。
【０１０２】
１−５  腫瘍組織中の浸透したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞数のカウント
上述したように、腫瘍組織中の浸透した免疫細胞をパーコールを用いて単離し、細胞数を血球測定器を用いてカウントした。腫瘍組織に浸透したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数は以下の数式３により計算した。
【０１０３】
（数３）
腫瘍組織中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数＝（腫瘍細胞中に浸透した総免疫細胞数）ｘＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の比率（％）／１００
【０１０４】
１−６  ＣＤ８ｃ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｔ細胞の単離
ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をアゴニスト性抗４−１ＢＢ又はラットＩｇＧでそれぞれ治療した関節炎誘発マウスから取り出した流入領域リンパ節から単離し、細胞はＭＡＣＳ磁気分離システムにより単離した。細胞を適切なマイクロビーズ複合抗体と培養し、ＣＤ４＋、Ｆ４／８０＋、ＣＤ４０＋、Ｂ２２０＋、及びＤＸ５＋を除去し、更にＣＤ８−マイクロビーズと培養してＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。単離したＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ１１ｃ−マイクロビーズで処理し、ＣＤ８＋ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ８＋ＣＤ１１ｃ−の双方をＬＳ単離カラム（Miltenyi Biotech社）を用いて更に単離した。単離した各細胞は９６〜９８％の高い純度を示した。
【０１０５】
１−７  マイクロアレイ及びＲＴ−ＰＣＲ
ＣＤ８＋Ｔ、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ、及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、腫瘍注入から１５日後にＢ１６−Ｆ１０腫瘍モデルのリンパ節から単離し、完全長ＲＮＡを各細胞から抽出した。
【０１０６】
試験管内で、逆転写酵素を用いて抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、各０．５μＭプライマーについて０．５μｌのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。各遺伝子の発現レベルを表５に開示の遺伝子特異型プライマーとSEQ.ID 21からSEQ.ID 58を用いて比較した。
【０１０７】
【表５】
2008542261.tif 000007
【実験例１】
【０１０８】
ヒト化アゴニスト性抗ヒト４−１ＢＢ（ＨＢＢＫ４）の特性
ＨＢＢＫ４抗体の特性を明らかにするため、Ｔ細胞をヒト末梢血から単離した。単離した細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂ（ＯＫＴ３）で処理し、Ｔ細胞活性化とヒト化抗４−１ＢＢ抗体（ＨＢＢＫ４−７５）を用量依存的に誘発し、細胞の増殖速度を求めた。ＯＫＴ３により誘発されたＴ細胞の活性は用量依存的に増大したが、ＨＢＢＫ４−７５又は抗ＣＤ２８抗体で処理したグループのみがＴ細胞活性を誘発しなかった（図７）。
【０１０９】
従って、最終的に調製されたヒト化抗ヒト４−１ＢＢ抗体、ＨＢＢＫ４−７５はアゴニスト性抗体としてヒト４−１ＢＢを共刺激するのみならず認識することが確認された。
【実験例２】
【０１１０】
アゴニスト性抗４−１ＢＢ及びアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いた併用癌療法
臨床研究におけるアゴニスト性ＨＢＢＫ４の治療活性を予測するために、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍細胞注入動物モデルを用いた動物モデル試験を、ラットアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体を、強力な抗癌作用を示し、その治療有効性を最大化し、Ｔ細胞反応を強化すると周知のアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体と共に用いて行った。
【０１１１】
アゴニスト性抗４−１ＢＢ及び／又はアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の各自及び複合的な抗癌治療活性を求めるために、４ｘ１０５のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を各抗体を２００μｇで生後６週間のＣ５７ＢＬ／６マウスに４日ごとに５回皮下注射し、ラットＩｇＧ抗体をコントロールグループとして処理した。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体だけの治療グループにおける腫瘍サイズはコントロールグループよりかなり小さく、アンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体だけの治療グループにおける腫瘍サイズはコントロールグループのものと同様であった。それとは逆に、この両方で治療したグループの試験後２０日目までの癌成長速度は緩慢であり、腫瘍サイズはその後、緩やかに縮小していった（図１４）。腫瘍細胞注入３５日目で、各グループの生存率はアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体による治療グループで８０％、アンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体による治療グループで４０％、この双方での治療で１００％を示し、一方、コントロールグループの死亡率は３０日目で１００％を示した（図１５）。
【実験例３】
【０１１２】
４−１ＢＢの刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞増大及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞産生
アゴニスト性抗４−１ＢＢ及びアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の複合的な治療活性を分析するために鼠径リンパ節、つまり流入領域リンパ節を各グループのマウスから切除して各細胞集団の割合を調査した。アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体を処置した場合、腫瘍細胞を除去するのに必要なＣＤ８＋Ｔ細胞の比率は２倍に増大し、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ発現率は５倍を越えて増大した（図１６及び１７）。アンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体を処置した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率及びＩＦＮ−γ発現率にコントロールグループとの有意差は見られなかったが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は双方共に増加傾向を示した（図１６及び図１７）。両者で治療した治療グループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数は抗４−１ＢＢでの治療グループにおけるものと同様に増大したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ発現率は総ＣＤ８＋Ｔ細胞の約３０％がＩＦＮ−γを発現するほどに急激に増大した（図１６及び１７）。
【０１１３】
アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体の投与がマウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を治療及び阻害し得ることが報告されており、その活性はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される（Seo SK et al., Nat. Med., 10, pp1088-1094, 2004）。これらの結果に基づき、本発明者はアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体による癌細胞治療が同一の細胞集団を産生するか否かを確認するために研究し、ついに蛍光複合抗ＣＤ１１ｃ及び抗ＣＤ８抗体で染色した流入領域リンパ節から単離した細胞によりＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を確認した。同一細胞グループは、抗４−１ＢＢ抗体を動物腫瘍モデル内に投与した場合に形成され、３６％のＣＤ８＋細胞がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であった。同一細胞グループの比率は、併用治療の場合、５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＤ１１ｃを発現するまでに更に増大した（図１８）。
【０１１４】
これらの結果は、アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体の治療によりＣＤ８＋Ｔ細胞の数及びＩＦＮ−γの発現が増大し、同様に抗ＣＴＬＡ−４抗体がこれらの活性をより最大限に引き出すことを示した。これに加え、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が抗４−１ＢＢ抗体を用いた癌治療に関係することを示唆した。
【実験例４】
【０１１５】
アゴニスト性抗４−１ＢＢによるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸透
ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の形成のみならずＣＤ８＋Ｔ細胞及びＩＦＮ−γの上昇が癌細胞の増殖に直接的に関わっているか否かを確認するために、各細胞グループの割合と特性を腫瘍から免疫細胞を単離することで分析した。Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を２００μｇの各抗体、つまりラットＩｇＧ、抗４−１ＢＢ、抗ＣＴＬＡ−４又は抗４−１ＢＢ＋抗ＣＴＬＡ−４と共にラットに４日ごとに皮下投与した。癌細胞の注入後１８日目に単離された腫瘍を３６％／６３％パーコールで遠心分離した。細胞中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の比を調べた後、ラットＩｇＧでのみ治療したコントロールグループにおけるＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞は５％未満だったのに対し、抗４−１ＢＢで治療した試験グループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の浸透率は６２％と１３％に上昇した。アンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体で治療した治療グループはコントロールグループと同様のレベルを示し、両者で治療した治療グループは抗４−１ＢＢ抗体で治療した治療グループと同等のレベルを示した（図１９）。流入領域リンパ節で見られたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍にも見られ、腫瘍に浸透したＣＤ８＋Ｔ細胞の９０％を越える割合がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であった（図２０）。ＮＫ細胞も癌細胞除去に関与していた。
【０１１６】
加えて、研究により腫瘍中のＮＫ細胞の比率を求め、これらの細胞グループがアゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体による癌阻害過程に関与しているのか否かを確認し、又、どの試験グループでもＮＫ細胞の増加は見られないことを発見した（図２１）。
【０１１７】
アゴニスト性４−１ＢＢ、及び両者で治療した治療グループにおける腫瘍に浸透した細胞の数はそれぞれ約２倍及び２．５倍に増加した（図２２）。抗４−１ＢＢ、及び両者で治療した治療グループにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、腫瘍中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の数をフローサイトメトリ解析で計算した場合、約１０倍と１５倍にそれぞれ増大した。抗４−１ＢＢでの治療グループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の数はどちらかといえば増大したもの、両者で処理した治療グループにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞は４倍に増大した（図２２）。
【０１１８】
これらの結果は、アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体での治療はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化と増殖につながり、細胞が腫瘍に浸透し、癌細胞の増殖を阻害したことを示唆する。抗ＣＴＬＡ−４抗体は抗４−１ＢＢ抗体の抗癌効果を最大限にひきだし、ＮＫ細胞はこれらの過程に関与しなかった。
【実験例５】
【０１１９】
ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の遺伝子発現分布
アゴニスト性抗４−１ＢＢ抗体により形成されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８の特性を分析し、どの遺伝子発現が癌細胞増殖に影響するかを確認するために、抗４−１ＢＢ又はラットＩｇＧ治療マウスのＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を比較した。アゴニスト性抗４−１ＢＢの治療により自己免疫疾患が阻害され、治療活性はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介されることが報告されている。従って、ＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎）モデルから単離した細胞、つまり抗４−１ＢＢ治療マウスにおけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と、ラットＩｇＧ治療マウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞を用いてＤＮＡアレイを行い、癌モデルで生成されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の発現をこういった結果に基づいて求めた。
【０１２０】
コラーゲンをマウスに投与し関節炎を誘発させ、それぞれ２００μｇのラットＩｇＧ又は抗４−１ＢＢ抗体を２日ごとに５回、同時に腹腔内注射した。抗体の最終投与から１４日目に、各マウスの流入領域リンパ節、つまり鼠径部及び腸骨リンパ節を取り出し、抗４−１ＢＢ抗体治療マウスにおけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びラットＩｇＧ治療マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＲＮＡをこういった細胞から抽出し、２つの細胞間での遺伝子発現差をアフィマトリックス・マイクロアレイシステムを用いて分析した。４−１ＢＢ刺激により生成されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は約２２０遺伝子で高い発現を示し、Ｔ細胞エフェクタ機能、アポトーシス、抗アポトーシス、及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞接着及び細胞移動に関連した遺伝子発現は表６に示されるように上昇した。
【０１２１】
コラーゲンをラットに投与し関節炎を誘発させ、それぞれ２００μｇのラットＩｇＧ又は抗４−１ＢＢ抗体を２日ごとに５回、同時に腹腔内注射した。コラーゲン免疫付与から１２日後、各ラットの流入領域リンパ節、つまり鼠径部及び腸骨リンパ節を取り出し、抗４−１ＢＢ抗体治療ラットにおけるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びラットＩｇＧ治療ラットのＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＲＮＡをこういった細胞から抽出し、２つの細胞間での遺伝子発現差をアフィマトリックス・マイクロアレイシステムを用いて分析した。Ｔ細胞エフェクタ機能、アポトーシス、抗アポトーシス、及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞接着及び細胞移動に関連した遺伝子発現の中で比較的高い遺伝子発現を示した遺伝子を表６に示した。
【０１２２】
【表６】
2008542261.tif 000008
2008542261.tif 000009
【０１２３】
Ｂ１６−Ｆ１６黒色腫細胞株の注入と同時に、２００μｇの抗４−１ＢＢ又はラットＩｇＧをマウスに２日ごとに５回注入し、各マウスの流入領域リンパ節、つまり鼠径部リンパ節を取り出してＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を抗体の最終投与から４日目に単離した。ＲＮＡを単離した細胞から抽出してｃＤＮＡを合成し、表６に図示の増大した遺伝子発現を分析した。Ｔｉｍ３、ＩＬ４ｉｇ１、ＩＬ−１ＲII、ＴＨＲＩ１３、ＬＡＧ３、プレクストリン、ＴＩＰ２、Ｋ１ｒｇ２−Ａ１、ＰＲＰ１、アネキシンＡ４、ＴＧＦ−β、Ｋ１ｒｇ１、ＣＤ６８Ａｇ、ＮＫＧ２、ＩＦＮ−γ、パーフォリン、グランザイムＢの遺伝子発現がＲＴ−ＰＣＲにより確定され、ＰＲＰ１及びパーフォリンを除く遺伝子発現の大半が増大することが判明した（図２３）。これらの結果は、抗４−１ＢＢ治療により形成されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に自己免疫疾患モデルと癌モデルの間で有意差が認められなかったことを示している。癌モデルから単離されたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は癌細胞の除去に必要なＩＦＮ−γ及びグランザイムＢに関して高レベルの遺伝子発現を示し、これはこれらの細胞グループが癌細胞除去に効果的であることを表している。Ｔ細胞増殖というよりもＣＴＬエフェクタ機能により強化された分化状態を示すＫ１ｒｇ１の発現はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において高いレベルを示し、Ｋ１ｒｇ１に加え、Ｔ細胞、ＣＤ２７及びＴＨＲＩ１３の抗アポトーシスに関与するアネキシンＡ４、Ｔ細胞機能の調節に関与したＴ細胞の共刺激分子、Ｔｉｍ−３遺伝子及びＬＡＧ−３遺伝子の発現が高く向上したことが判明した。これらの結果はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が単にＣＴＬ機能を示すだけでなく、免疫反応を制御し得る細胞ことを示している。
【０１２４】
以下に、製剤方法と賦形剤の種類とを説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製剤例は以下に記載のとおりである。
【０１２５】
注射剤の調製
ＨＢＢＫ４                １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム    ３．０ｍｇ
メチルパラベン            ０．８ｍｇ
プロピルパラベン          ０．１ｍｇ
注射用蒸留水              最適量
注射剤は、慣用の注射剤調製法により有効成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整し、２ｍｌのアンプルに全成分を充填して殺菌することで調製した。
【０１２６】
粉剤の調製
ＨＢＢＫ４        ５００ｍｇ
コーンスターチ    １００ｍｇ
乳糖              １００ｍｇ
タルク            １０ｍｇ
上記成分を混合して密封容器に充填することで粉剤を調製した。
【０１２７】
錠剤の調製
ＨＢＢＫ４                  ２００ｍｇ
コーンスターチ              １００ｍｇ
乳糖                        １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    最適量
上記成分を混合、錠剤状にすることで錠剤を調製した。
【０１２８】
カプセルの調製
ＨＢＢＫ４                  １００ｍｇ
乳糖                        ５０ｍｇ
コーンスターチ              ５０ｍｇ
タルク                      ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    最適量
錠剤は、慣用のゼラチン調製方法で上記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填することで調製した。
【０１２９】
液剤の調製
ＨＢＢＫ４          １０００ｍｇ
糖                  ２０ｇ
多糖                ２０ｇ
レモン風味着香料    ２０ｇ
液剤は、慣用の液剤調製法により有効成分を溶解し、次に全成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、殺菌することで調製した。
【０１３０】
本発明の記載より、様々な変更を加えうることは明白である。そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。また、当業者に自明なそういった改良は全て、以下に述べる請求項の範囲に含まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明に記載したように、本発明の独創的なＨＢＢＫ４抗体を含む組成物はＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞数とＩＦＮ−γ発現の増大により癌細胞増殖の阻害効果を示した。従って、本発明は癌の予防又は治療、及び副作用なく癌の免疫療法を行うのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
本発明の上記又はその他の目的、構成、及びその他の利点は、添付の図面と共に以下の詳細な記載からより明確に理解されるものである。
【図１】アゴニスト性抗４−１BB抗体のヒト化設計を示す。
【図２】BBK４のヒト化ＳｃＦｖを産生するためのプライマー設計を示す。
【図３】抗Ｅタグセファロースを用いてヒト化ＢＢＫ４（ＨＢＢＫ４）ＳｃＦｖを精製するための精製手順を示す。
【図４】ＨＢＢＫ４のフローサイトメトリ分析を示す。
【図５】競合ＥＬＩＳＡ法の結果を示す。
【図６】Ｈ２Ｌ２を用いたウェスタンブロット法の結果を示す（レーン１：ＨＢＢＫ４−７５／ｐｃＤＮＡトランスフェクタント、レーン２：ＨＢＢＫ−４−７５／ｐＤ１８トランスフェクタント、レーン３：２９３ＥＢＮＡ−ネガティブコントロール）。
【図７】ＨＢＢＫ４−７５Ｇ１のヌクレオチド配列を示す。
【図８】ＨＢＢＫ４−７５Ｇ１のアミノ酸配列を示す。
【図９】ＨＢＢＫ４−７５Ｇ４のヌクレオチド配列を示す。
【図１０】ＨＢＢＫ４−７５Ｇ４のアミノ酸配列を示す。
【図１１】ＨＢＢＫ４−７５Ｌのヌクレオチド配列を示す。
【図１２】ＨＢＢＫ４−７５Ｌのアミノ酸配列を示す。
【図１３】ＨＢＢＫのＴ細胞増殖に対する増加作用を示す。
【図１４】アゴニスト性抗４−１ＢＢとアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の混合物による黒色腫の多剤併用療法における腫瘍サイズの変化を示す。
【図１５】アゴニスト性抗４−１ＢＢ及びアンタゴニスト性抗ＣＴＬＡ−４抗体の混合物による黒色腫の多剤併用療法におけるラットの生存率の変化を示す。
【図１６】抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ８−ＰＥで染色したフローサイトメトリの分析を示す。
【図１７】ＣＤ８−ＦＩＴＣ＋抗ＩＦＮ−γ−ＰＥで染色したフローサイトメトリの分析を示す。
【図１８】抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥで染色したフローサイトメトリの分析を示す。
【図１９】アゴニスト性抗４−１ＢＢの投与によるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍組織への浸透を示し、細胞は抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ８＋ＰＥ染色される。
【図２０】アゴニスト性抗４−１ＢＢの投与によるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍組織への浸透を示し、細胞は抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ＋抗ＣＤ１１ｃ−ＰＥで染色される。
【図２１】アゴニスト性抗４−１ＢＢの投与によるＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍組織への浸透を示し、細胞は抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ＋抗ＮＫ１．１−ＰＥで染色される。
【図２２】フローサイトメトリ分析において各腫瘍組織から回収した細胞中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数の計算結果を示す。
【図２３】ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の遺伝子発現のレベルと分布を示す。
【０１３３】
（配列表）
SEQ. #1: 5'-CTCGAGTTTT TTTTTTTT-3' is Linker primer containing XhoI site, 
SEQ. #2:  5'-CTG CAG CAC GGT ATA GGT GA-3' is HBBK4-1U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #3: 5'-AGTAGCTGCT GAAGGTGTAG CCAGAAGCCT TGCAGGAAAS CTTCACTGAA GCCCCAGGCT TTWYTACTTC-3' is HBBK4-1D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #4: 5'-TACACCTTCA GCAGCTACTG GATGCACTGG GTGARGCAGG CACCTGGACA AGGCCTTGAG TGGATTGGA-3' is HBBK4-2U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #5: 5'-TGCTCTTGAA CTTCTCATTG TAGTTAGTAT GACCGTTGCC AGGATTAATC TCTCCAATCC ACTCAAGGCC-3' is HBBK4-2D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #6: 5'-AATGAGAAGT TCAAGAGCAR GGYAACTMTG ACTSKGGACA CCTCTACAAG CACAGYATAC ATGSAACTCA-3' is HBBK4-3U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #7: 5'-TAAAAGATCT TGCACAGTAA TAGACCGCGG WGTCCTCAGA CCGCAGGCTG CTGAGTTSCA TGTATRCTGT-3' is HBBK4-3D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #8: 5'-TACTGTGCAA GATCTTTTAC TACGGCACGG GCGTTTGCTT ACTGGGGCCA AGGGACCCTC GTGACCGTCT-3' is HBBK4-4U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #9: 5'-CTGAGCCGCC GCCGCCTGAG CCGCCGCCGC CTGAGCCGCC GCCGCCTGAG GAGACGGTCA CGAGGGTCCC-3' is HBBK4-4D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #10: 5'-TCAGGCGGCG GCGGCTCAGA CRTTGTGATG ACTCAGTCTC CAGCCTTCTT ATCTGTGACT CCAGGAGAG-3' is HBBK4-5U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #11: 5'-AGTGTAAGTA GTCGCTAATA GTCTGGCTGG CCCTGCAAGT AAKAGTCACT TTCTCTCCTG GAGTCACAGA-3' is HBBK4-5D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #12: 5'-ATTAGCGACT ACTTACACTG GTATCAACAA AAACCCGATC AAKCTCCCAA ACTTCTCATC AAATATGCTT-3' is HBBK4-6U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #13: 5'-TCCCTGATCC ACTGCCACTG AACCTGGAGG GAAYCCCAGA GATGGATTGG GAAGCATATT TGATGAGAAG-3' is HBBK4-6D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #14: 5'-AGTGGCAGTG GATCAGGGAC TGATTTCACT YTTASTATCT CGTCGSTCGA GGCAGAAGAT GYTGSGRYGT-3' is HBBK4-7U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #15: 5'-TAGTTCCTTG ACCGAAAGTT GGGGGAAAGC TGTGACCATC TTGACAGTAA TACRYCSCAR CATCTTCTGC-3' is HBBK4-7D which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #16: 5'-GAGTCATTCT CGACTTGCGG CCGCTTTGAT CTCGAGTTTA GTTCCTTGAC CGAAAGT-3' is HBBK4-8D which is BBK4 ScFv combinational primer, SEQ. #17: 5'-ACTGCGGCCC AGCCGGCCAT-3' is HBBK4 SfiI-U which is BBK4 ScFv combinational primer, 
SEQ. #18:  5'-TTAGTTCCTT GACCGAAAGT-3' is HBBK4 NotI-D which is BBK4 ScFv combinational primer, SEQ. #19: 5'-ACTGCGGCCC AGCCGGCCAT-3' is recognition site for resriction enzyme SfiI, SEQ. #20: 5'-TTAGTTCCTT GACCGAAAGT-3' recognition site for resriction enzyme NotI, 
SEQ. #21: 5'-AATCAACCAG ACATACCAGC-3' is forward primer for Annexin4, 
SEQ. #22: 5'-TCTTCAAAGC TTCCAGATGT-3' is reverse primer for Annexin4, 
SEQ. #23: 5'-CTTTGCAATG GTGGCTTT-3' is forward primer for Klrg1, 
SEQ. #24: 5'-CTCCAGCCAT CAATGTT-3' is reverse primer for Klrg1, 
SEQ. #25: 5'-GCATATCTGT TTTGAATCC-3' is forward primer for CD68 Ag, 
SEQ. #26: 5'-CCTTAGAGAG AGCAGGTCA-3' is reverse primer for CD68 Ag, 
SEQ. #27: 5'-GTGATGACCA CCGTACTCTT-3' is forward primer for THRI13, 
SEQ. #28: 5'-GCATTGACTA CTCGGATAGC-3' is reverse primer for THRI13, 
SEQ. #29: 5'-CGATTCACCC TTAACACATT-3' is forward primer for NKG2, 
SEQ. #30: 5'-GCTGGAATTT TGAGACAAAC-3' is reverse primer for NKG2, 
SEQ. #31:  5'-TTGACGTCAC TGGAGTTGTA-3' is forward primer for TGF-BETA1, 
SEQ. #32:  5'-AATAGTTGGT ATCCAGGGCT-3' is reverse primer for TGF-BETA1, 
SEQ. #33: 5'-CAGCATTACC ACAAGAATGA-3' is forward primer for PRP1, 
SEQ. #34: 5'-CCCACATTCC AGAAGATTTA-3' is reverse primer for PRP1, 
SEQ. #35:  5'-CGATGCAGGC TATTACAGA-3' is forward primer for IL-1R II, 
SEQ. #36: 5'-ATCAAAAATC AGCGACACT-3' is reverse primer for IL-1R II, 
SEQ. #37:  5'-CCCAGGCGCA ATGCTAA-3' is forward primer for GRANZYME B, 
SEQ. #38: 5'-CCAGGATAAG AAACTCG-3' is reverse primer for GRANZYME B, 
SEQ. #39: 5'-GAACGGGAAG CTTGTCA-3' is forward primer for GAPDH, 
SEQ. #40: 5'-CTAAGCAGTT GGTGGTGC-3' is reverse primer for GAPDH, 
SEQ. #41: 5'-ATCCAGCAGA TACCAGCTA-3' is forward primer for TIM-3, 
SEQ. #42: 5'-TCCATTGTTA TTATGGAGG-3' is reverse primer for TIM-3, 
SEQ. #43: 5'-GTATCTTCAC TTTCCGGGA-3' is forward primer for IL-4 IG 1, 
SEQ. #44: 5'-GAGGTAGAAG AAGCCCTC-3' is reverse primer for IL-4 IG 1, 
SEQ. #45: 5'-ACTGAATCTG GAGAAGGAC-3' is forward primer for PLECKSTRIN, 
SEQ. #46: 5'-TTCAGTAAAC ATCCCTGCT-3' is reverse primer for PLECKSTRIN, 
SEQ. #47: 5'-AAAGCAAAGC AAATGAAGA-3' is forward primer for TIP2, 
SEQ. #48: 5'-TCAGTGGAGG AATGGTAAT-3' is reverse primer for TIP2, 
SEQ. #49: 5'-GTCTCCATCA CGTACAACC-3' is forward primer for LAG3, 
SEQ. #50: 5'-CACAAATCTT TCCTTTCCA-3' is reverse primer for LAG3, 
SEQ. #51: 5'-TCCTCCAGAG AAACTCATT-3' is forward primer for KLRG2-A1, 
SEQ. #52: 5'-TACAGTTTTT GGAAATGCA-3' is reverse primer for KLRG2-A1, 
SEQ. #53: 5'-GCTGAATCTC ACAGTTCCT-3' is forward primer for CD27, 
SEQ. #54: 5'-CCAGTGTCAC CTGGATAT-3' is reverse primer for CD27, SEQ. #55: 5'-GTCACGTCGA AGTACTT-3' is forward primer for PERFORIN, 
SEQ. #56: 5'-ATGGCTGATA GCCTGTC-3' is reverse primer for PERFORIN, 
SEQ. #57: 5'-AACGCTACAC ACTGCAT-3' is forward primer for IFN-GAMMA, 
SEQ. #58: 5'-GCCGTGGCAG TAACAGC-3' is reverse primer for IFN-GAMMA, 
SEQ. #59: 5'-gatctcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgtc cactcccagg tgcagctgca gcagtctggg gctgaagtaa taaagcctgg ggcttcagtg aagctttcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgagg caggcacctg gacaaggcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact aactacaatg agaagttcaa gagcagggca actctgactg gggacacctc tacaagcaca gtatacatgg aactcagcag cctgcggtct gaggacaccg cggtctatta ctgtgcaaga tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggaccctcgt gaccgtctcc tcagcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa aagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa aaaaagtttg agtcccaaat cttgtgacaa aactcatact tgcccgccgt gcccggctcc ggaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacattgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaatga-3' is base sequence of HBBK4-75G1, 
SEQ. #60: 5'-DLTMGWSCII LFLVATATGV HSQVQLQQSG AEVIKPGASV KLSCKASGYT FSSYWMHWVR QAPGQGLEWI GEINPGNGHT NYNEKFKSRA TLTGDTSTST VYMELSSLRS EDTAVYYCAR SFTTARAFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKSL SPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK-3' is amino acid sequence of HBBK4-75G1, 
SEQ. #61: 5'-gatctcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgtc cactcccagg tgcagctgca gcagtctggg gctgaagtaa taaagcctgg ggcttcagtg aagctttcct gcaaggcttc tggctacacc ttcagcagct actggatgca ctgggtgagg caggcacctg gacaaggcct tgagtggatt ggagagatta atcctggcaa cggtcatact aactacaatg agaagttcaa gagcagggca actctgactg gggacacctc tacaagcaca gtatacatgg aactcagcag cctgcggtct gaggacaccg cggtctatta ctgtgcaaga tcttttacta cggcacgggc gtttgcttac tggggccaag ggaccctcgt gaccgtctcc tcagcttcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc acaggtgtac accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg taaatga-3' is base sequence of HBBK4-75G4, 
SEQ. #62: 5'-MGWSCIILFL VATATGVHSQ VQLQQSGAEV IKPGASVKLS CKASGYTFSS YWMHWVRQAP GQGLEWIGEI NPGNGHTNYN EKFKSRATLT GDTSTSTVYM ELSSLRSEDT AVYYCARSFT TARAFAYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPSCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK-3' is amino acid sequence of HBBK4-75G4, 
SEQ. #63: 5'-gcctggacat gatgaggttc tctgctcagt tccttggtct cctgttgctc tgttttcaag gtaccagatg tgacattgtg atgactcagt ctccagcctt cttatctgtg actccaggag agaaagtgac tattacttgc agggccagcc agactattag cgactactta cactggtatc aacaaaaacc cgatcaagct cccaaacttc tcatcaaata tgcttcccaa tccatctctg ggattccctc caggttcagt ggcagtggat cagggactga tttcactttt actatctcgt cgctcgaggc agaagatgct gcgacgtatt actgtcaaga tggtcacagc tttcccccaa ctttcggtca aggaactaaa ctcgagatca aaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagttcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tag-3' is base sequence of HBBK4-75L, 
SEQ. #64: 5'-LDMMRFSAQF LGLLLLCFQG TRCDIVMTQS PAFLSVTPGE KVTITCRASQ TISDYLHWYQ QKPDQAPKLL IKYASQSISG IPSRFSGSGS GTDFTFTISS LEAEDAATYY CQDGHSFPPT FGQGTKLEIK TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC-3' is amino acid sequence of HBBK4-75L.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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