(57)【要約】  本発明は、筋肉の健康を保持または回復するための式（１）に従う化合物を含んでなる組成物の使用について説明する：式（１）［式中：ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得、ここで：ｎは１、２もしくは３であり、Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３または式（２）であり、ここで、ｍは１、２もしくは３であり、但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］。本発明は、さらに、筋肉の健康を保持または回復し、それによって、例えば、運動による筋損傷を防止および／または処置するための組成物の製造における式（１）に従う化合物の使用に関する。より具体的には、そのような組成物は、食物、飲料、補助食品および飼料を含む。2008520219.tif 000015【選択図】  なし
2008520219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋肉の健康を保持または回復するための式（Ｉ）：
【化１】
2008520219.tif 000007
［式中：
ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；
Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得
ここで：ｎは１、２もしくは３であり、
Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３であるか、または
【化２】
2008520219.tif 000008
であり、
ここで、ｍは１、２もしくは３であり、
但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］
に従う化合物を含んでなる組成物の使用。
【請求項２】
筋肉の健康を保持または回復するための組成物の製造のための式（Ｉ）：
【化３】
2008520219.tif 000009
［式中：
ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；
Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得
ここで：ｎは１、２もしくは３であり、
Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３であるか、または
【化４】
2008520219.tif 000010
であり、
ここで、ｍは１、２もしくは３であり、
但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］
に従う化合物の使用。
【請求項３】
前記化合物は、ヒドロキシチロソール、その酢酸塩またはその前駆体である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物は、別の抗酸化剤をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記さらなる抗酸化剤はビタミンＣである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物は、飲料、栄養補助食品、食物または飼料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
組成物がそれらに添加されることを特徴とする、飲料、栄養補助食品、食物または飼料を調製するための方法であって、前記組成物は、筋肉の健康を保持または回復するための式（１）：
【化５】
2008520219.tif 000011
［式中：
ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；
Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得
ここで：ｎは１、２もしくは３であり、
Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３であるか、または
【化６】
2008520219.tif 000012
であり、
ここで、ｍは１、２もしくは３であり、
但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］
に従う化合物を含んでなる、方法。
【請求項８】
前記食物、飼料または飲料は、式（１）に従う前記化合物の１回摂取量あたり少なくとも１ｍｇを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
式（１）：
【化７】
2008520219.tif 000013
［式中：
ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；
Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得
ここで：ｎは１、２もしくは３であり、
Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３であるか、または
【化８】
2008520219.tif 000014
であり、
ここで、ｍは１、２もしくは３であり、
但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］
に従う化合物
ならびにビタミンＣまたはその前駆体
を含んでなる組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物を含んでなる食物、飲料、栄養補助食品または飼料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、筋肉の健康を保持または回復するための抗酸化化合物の使用に関する。これらの化合物は、筋肉の健康を保持または回復し、それによって、例えば、運動による筋損傷を防止および／または処置するための組成物の製造において使用することができる。より具体的には、そのような組成物は、食物、飲料、補助食品および飼料を含む。
【０００２】
運動選手は、定期的な強度および／または長期の筋肉運動を行う。研究は、精力的な運動中、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生が、組織の抗酸化防御システムを圧倒するレベルにまで上昇することを示唆する。結果は、酸化ストレスであり、組織、例えば、筋肉組織への損傷を引き起こし得る。一般に、良好な筋肉の条件は、それらの性能、特に、骨格筋に絶対的に重要である。それ故、運動は、筋肉の健康を損ない得、例えば、疲労、より低い耐久性、機能の消失を生じる。抗酸化補助食品の使用は、そのような損傷を防止することが提唱されている（Ｄｉｅｔａｒｙ  ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｅｘｅｒｃｉｓｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００４年、２２，８１−９４、パワー（Ｐｏｗｅｒｓ）ら）。
【０００３】
しかし、すべての抗酸化剤が筋肉損傷を回復するのに適切であるというわけではない。研究は、いくつかの抗酸化剤がほとんど効果を付与しないことを示している。これはいくらかの理由を有し得る。第１に、抗酸化剤のバイオアベイラビリティが低くあり得る。次いで、腸による抗酸化剤の取り込みが比較的低く、有効になるための大量の抗酸化剤の必要性が生じる。第２に、すべての抗酸化剤が筋細胞の膜を通過できるわけではない。さらに、いくつかの抗酸化剤は、使用時には減損しており、また、効果を認めるために比較的大量の抗酸化剤摂取を必要とする。これは、健康の観点（身体における多くの代謝物）からだけでなく、費用の観点から所望されることではない。
【０００４】
いくつかの抗酸化剤は、いわゆる抗酸化ネットワークにおいて再生されることが公知であり、例えば、ビタミンＣによるビタミンＥの再生がある。しかし、ビタミンＥに関するインビボ研究では、抗酸化剤のマーカーに対する有意な効果が示されていない。
【０００５】
本発明の目的は、良好なバイオアベイラビリティを有する抗酸化ネットワークに参加することができる筋回復に適切な成分を提供することである。
【０００６】
驚くべきことに、式（１）
【化１】
2008520219.tif 000003
［式中：
ＲはＨ、ＯＨまたはＣＨ３Ｏであり得；
Ｒ１はＨ、（ＣＨ２）ｎＯＲ２であり得
ここで：ｎは１、２もしくは３であり、
Ｒ２はＨ、ＣＯＣＨ３であるか、または
【化２】
2008520219.tif 000004
であり、
ここで、ｍは１、２もしくは３であり、
但し、ＲおよびＲ１は同時にＨではない］
に従う可食の化合物を使用して、筋肉の健康を保持または回復することができることを見出した。
【０００７】
式（１）に従う適切な化合物の例には、ヒドロキシチロソールおよびその酢酸塩、オレウロペイン、チロソールおよびその酢酸塩、ホモバニリンアルコール（ｈｏｍｏｖａｎｉｌｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ）、および／またはカテコールがある。また、これらの化合物の混合物を使用することもできる。
【０００８】
驚くべきことに、この化合物は、ビタミンＣの使用によって再生することができることを見出した。これは、式（１）に従う化合物を、酸化ストレスによる筋損傷を防止または処置するための組成物の製造において使用するのに適切とする。
【０００９】
好ましくは、ＲはＯＨである。より好ましくは、少なくともヒドロキシチロソールまたはその酢酸塩は、組成物において使用される。ヒドロキシチロソールは、それが両親媒性であるというさらなる利点を有する。それは、水性および脂肪性組成物の両方、例えば、細胞内および細胞外液ならびに膜において溶解され得る。
【００１０】
式１に従う化合物は、筋損傷を処置または防止するための組成物の製造に使用することができる。好ましくは、この組成物は、サリドロサイドを含まない。
【００１１】
本発明のもう１つの態様は、本発明に従う使用であって、ここで、筋回復に適切な成分は、ヒト消費に適切な栄養製品に使用される。任意の栄養製品は、例えば、食物、飲料または栄養補助食品に適切であり得る。好ましくは、栄養製品はチューインガムではない。
【００１２】
好ましくは、式（１）に従う抗酸化化合物は、運動選手による摂取のためのスポーツ栄養製品に存在する。運動選手は、一般集団に推奨される食事ガイドラインを超える特定の食物または食物成分から利益を得ることができる。用語「スポーツ栄養製品」は、本明細書において、特に、運動選手に適応される任意の食物または飲料を示すために使用される。
【００１３】
本発明の目的に適切ないくらかのタイプのスポーツ栄養食品、例えば、特定の栄養補助食品、スポーツ飲料またはスポーツ食品がある。
【００１４】
スポーツ飲料は低張性、高張性または等張性であることができる。スポーツ飲料は、液体の形態で、濃縮物としてまたは粉末（例えば、水のような液体に溶解される）として利用可能であり得る。スポーツ食品は、棒、錠剤およびゲルの形態であり得る。栄養補助食品は、ピルまたはカプセルの形態であり得る。
【００１５】
栄養物は、通常の添加物、例えば、甘味料、風味付け、糖、脂肪、ｅｍｕｌｇａｔｏｒｓ、保存剤をさらに含んでなることができる。栄養物はまた、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載の（加水分解された）タンパク質のような他の活性成分を含んでなることができる。また、他の抗酸化剤も、栄養物、例えば、フラボノイド類、カロテノイド類、ユビキノン類、ルチン、リポ酸、カタラーゼ、グルタチオン（ＧＳＨ）および例えば、ＣおよびＥのようなビタミン類またはそれらの前駆体に存在し得る。式１に従う化合物およびビタミンＣまたはその前駆体の組み合わせは、相乗効果を示している。好ましくは、ヒドロキシチロソールまたはその酢酸塩がビタミンＣと組み合わされる。式１に従う化合物およびビタミンＣを含んでなる組成物は新規であり、本発明のもう１つの態様である。
【００１６】
式１に従う化合物は、有効量で存在する必要がある。一般的に、１ｍｇ〜３グラムの間の化合物が、効果を類別するために１回摂取量あたり必要とされ、好ましくは、１回摂取量あたり１０ｍｇ〜１グラムである。これは、体重、年齢、食習慣および運動強度のような多くの因子に依存する。抗酸化剤の効果は、所定のマーカーを介して測定することができる。筋肉運動では、脂質酸化およびタンパク質酸化の両方が生じる。脂質酸化の量を測定すべき適切なマーカーは、例えば、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）およびイソプロタン類（ｉｓｏｐｒｏｔａｎｅｓ）である。タンパク質酸化の量のための適切なマーカーは、例えば、タンパク質カルボニルである。
【００１７】
式（１）に従う化合物を含んでなる栄養物は、運動の前、中または後に食することができる。それが運動前に使用される場合、それは、好ましくは、約１時間前に食される。それが運動後に使用される場合、それは、好ましくは、その後１時間以内、より好ましくは、運動直後に食される。
【００１８】
ヒトの消費に適切な栄養製品に加えて、式（１）に従う化合物を、ペットフードを含む動物の飼料において使用することもまた可能である。次いで、それは、それらの筋力のために用いられる動物、例えば、（競争）馬またはイヌ（即ち、競走犬もしくはそり犬）に特に適切である。
【００１９】
以後、本発明について、以下の非制限的実施例により説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１：器官槽実験
雄性Ｌｅｗｉｓラット（１２〜１４週齢の間）を使用した。断頭後、横隔膜を迅速に摘出し、小さなストリップ（幅約２ｍｍおよび長さ１ｃｍ）を切り取り、続いて、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２の混合物を通気したＫｒｅｂｓ緩衝液、ｐＨ７．４を含有するサーモスタット付き器官槽にマウントした。各横隔膜ストリップをアイソメトリック・トランスデューサーに垂直に接続した。Ｋｒｅｂｓ緩衝液の組成は、（ｍＭ）：ＮａＣｌ（１１７．５）、ＫＣＩ（５．６）、ＭｇＳＯ４（１．１８）、ＣａＣｌ２（２．５）、ＮａＨＰＯ４（１．２８）、ＮａＨＣＯ３（２５）およびグルコース（５．５）であった。実験中、１５分間ごとに緩衝液を変えた。白金電極により、各筋肉ストリップの長さ全体に沿って、フィールド刺激を作製した。
【００２１】
実験の開始時に、ストリップを、４５分間、室温で洗浄し、温度依存的劣化を最小限にした。その後、水浴を３７℃で稼動させた（実験開始の１５分前）。各ストリップを、単収縮（１Ｈｚ）を使用して、最初にその至適長さ（Ｌｏ）に調整した。パルス幅は常に１０ｍｓであった。
【００２２】
最初に、Ｐｔ（１Ｈｚの刺激での単収縮張力）およびＰｏ（１００Ｈｚの刺激、２５０ｍｓ幅での最大固有張力）を決定した。その後、増加する刺激周波数に対する横隔膜筋ストリップの応答を、２５０ｍｓ連続で適用される１０、２０、３３、５０および１００Ｈｚパルスの適用により、Ｌｏで評価した。収縮の間に、２分間の回復期間を使用した。力−収縮頻度プロトコルの終了時に、疲労プロトコルを適用した。ストリップを６分間、５Ｈｚで刺激した。この刺激プロトコル後、ヒドロキシチロソール（ＨＴ）またはコントロール（ビヒクル、エタノール）を、５分間、インキュベートした。続いて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）またはコントロール（ＭｉｌｌｉＱ）を、１０分間、インキュベートした。その後、再度：Ｐｔ、Ｐｏ、力−収縮頻度および疲労を決定した。
【００２３】
ヒドロキシチロソールは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、米国から購入した。過酸化水素は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国から入手した。他のすべての化学物質は、分析用純度のものであった。
【００２４】
図１は、筋力に対するＨ２Ｏ２の影響を示す。Ｈ２Ｏ２は、コントロールと比較して、適用されたすべての刺激周波数において、用量依存的に力を減少する。データを、少なくとも２重の測定値に基づく平均として表す。
【００２５】
図２は、Ｈ２Ｏ２仲介筋損傷に対するＨＴの保護効果を示す。ＨＴは、すべての刺激周波数（１０、２０、３３、５０および１００Ｈｚ）において、Ｈ２Ｏ２仲介筋損傷を保護する。Ｈ２Ｏ２インキュベーションを伴わない３００μＭ  ＨＴでも筋機能を保存した。データを、少なくとも２重の測定値に基づく平均として表す。
【００２６】
図３は、Ｈ２Ｏ２仲介筋損傷に対するＨＴの保護効果を示す。ＨＴは、Ｈ２Ｏ２によって誘導された力の低下に対して用量依存的に保護する。刺激周波数は５０Ｈｚであり、Ｈ２Ｏ２の濃度は１ｍＭであった。データを、少なくとも２つの２重の測定値に基づく平均として表す。
【００２７】
実施例２：スカベンジング実験およびリポ酸との比較
材料
ヒドロキシチロソールは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、米国から入手した。チロソールおよびＫＯ２は、Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ、瑞国から購入した。ホモバニリンアルコール、２−メトキシフェノール、フェノール、およびジヒドロローダミン−１２３（ＤＨＲ−１２３）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国から入手した。カテコールは、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｃｈｉｍｉｃａ，Ｇｅｅｌ、白国から入手した。リポ酸は、Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａｃ  ＡＧ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、独国から購入した。一酸化窒素は、ＡＧＡ，Ｈａｍｂｕｒｇ、独国から購入した。他のすべての化学物質は、分析用純度のものであった。
【００２８】
ＯＮＯＯＨスカベンジング
化合物のＯＮＯＯＨ誘導性ＤＨＲ−１２３酸化に対する保護は、クーイ（Ｋｏｏｙ）ら（Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｈｙｄｒｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，１６；１４９−５６）により記載されるように測定した。簡単に説明すると、５μＭ  ＤＨＲ−１２３および多様な濃度のスカベンジャーを、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で、インキュベートした。続いて、１０μｌのアリコートを迅速にボルテックスしながら試験管にピペッティングすることによって、ＯＮＯＯＨを添加し、０．７μＭの最終濃度に到達させた。それぞれ５００および５３６ｎｍの励起および蛍光波長で、蛍光測定を実施した。効果を、ＤＨＲ−１２３（ＩＣ５０）の酸化の５０％阻害を付与するスカベンジャーの濃度として表す。
【００２９】
Ｏ２・−スカベンジング
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）におけるキサンチン（１５０μＭ）およびキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）（５．５ｍＵ／ｍｌ）の反応によって、Ｏ２・−を発生させた。Ｏ２・−ラジカルを、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、５０μＭ）によって検出した。ＮＢＴは、Ｏ２・−によるそのホルマザンへの還元を経験する。この還元速度を、２分間の間に、５６０ｎｍで分光光学によりモニターした。多様な濃度のスカベンジャーを添加し、３７℃でインキュベートした。反応は、ＸＯの添加によって開始した。Ｏ２・−スカベンジング能を、ＮＢＴ（ＩＣ５０）の還元の５０％減少を付与するスカベンジャーの濃度として表す。ＸＯの活性に対するスカベンジャーの可能な阻害効果を調整するために、最も高い濃度のスカベンジャーを、３７℃でインキュベートし、続いて、２分間の間に、尿酸塩形成の速度を、２９３ｎｍで測定した。
【００３０】
スカベンジング試験の結果を以下の表１に示す。
【００３１】
【表１】
2008520219.tif 000005
【００３２】
実施例３：アスコルビン酸によるヒドロキシチロソール（ＨＴ）の再生
３７℃、５０μＭ  ＨＴおよび５Ｕ／ｍｌチロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）を含有する１４５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４において、ＨＴ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、米国）の酸化を実施した。チロシナーゼおよびＨＴのインキュベーションは、キノン（ＨＴＱ）の形成をもたらす。反応は、分光光学および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、モニターした。２４０ｎｍ／ｍｉｎのスキャンスピードで、スペクトルを記録した。インキュベーション混合物のＨＰＬＣ分析を、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ３１８カラムを使用して実施した。カラムを、０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸および５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含有する蒸留水で、１分間あたり１ｍｌの流速で溶出させた。２８０ｎｍでのダイオードアレイ検出（ＤＡＤ）を使用した。アスコルビン酸がＨＴＱと反応する能力を、以下のとおりに決定した。最初に、ＨＴＱを、２分半の間に形成させた。続いて、１５０μＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）をＨＴＱに添加し、混合物を、直ちに手動でＨＰＬＣ中へ３分間で注入した。
【００３３】
図４は、ＨＴのみ（コントロール）のＨＰＬＣ測定の結果を示す。
【００３４】
図５は、チロキナーゼのＨＴへの添加の効果を示し、それによって、そのキノン（コントロール）の形成を示す。
【００３５】
図６は、ＨＴおよびチロキナーゼの混合物へのアスコルビン酸の添加の効果を示す。
【００３６】
これは、ＨＴが再度形成され、３分後にはもはやＨＴＱが存在しないことを示す。
【００３７】
アスコルビン酸によるＨＴの再生が生じていた（例）。
【００３８】
実施例４：ヒドロキシチロソールを含んでなるクッキーのレシピ
【００３９】
【表２】
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【００４０】
混合下ですべての成分を緩徐に添加し、スイート・ショート・ペストリーを形成した。その後、ペストリーを約５ｍｍの厚さに平らにする前に、少なくとも２時間、ペストリーを保冷（４℃）する。片を切り出し、焼き上げ前に、表面にブラシで卵黄を塗る。焼き上げは、１５分間、ファンオーブン中、１８０℃で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】筋力に対するＨ２Ｏ２の影響を示す。
【図２】Ｈ２Ｏ２仲介筋損傷に対するＨＴの保護効果を示す。
【図３】Ｈ２Ｏ２仲介筋損傷に対するＨＴの保護効果を示す。
【図４】ＨＴのみ（コントロール）のＨＰＬＣ測定の結果を示す。
【図５】チロキナーゼのＨＴへの添加の効果を示し、それによって、そのキノン（コントロール）の形成を示す。
【図６】ＨＴおよびチロキナーゼの混合物へのアスコルビン酸の添加の効果を示す。
【図１】
2008520219.tif 000016
【図２】
2008520219.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008520219.tif 000021
【国際調査報告】
2008520219.tif 000022
2008520219.tif 000023
2008520219.tif 000024
2008520219.tif 000025