(57)【要約】  平面状脂質一重層若しくは平面状脂質二重層、球状脂質ベシクル、ミセル、又はエマルションエンベロープ一重層などの脂質集合体に、脂質連結部分を挿入する方法が記載される。本方法においては、脂質集合体と脂質連結部分とをマイクロ波照射下で接触させて、脂質連結部分を脂質集合体と会合可能にする。一実施形態では、脂質集合体はリポソームであり、脂質連結部分は脂質ポリマーである。前記方法に従って調製される、脂質層と脂質連結部分とを含む組成物もまた記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法であって、
脂質集合体と脂質連結部分とを、前記脂質連結部分が前記脂質集合体と会合するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で接触させること
を含む方法。
【請求項２】
前記脂質集合体が合成脂質集合体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質集合体がミセルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質集合体が脂質二重層を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質集合体が脂質一重層を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質集合体がエマルションである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質集合体がリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質集合体がベシクル形成脂質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ベシクル形成脂質の相転移温度が約５０℃を上回る請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂質集合体が、封入された治療剤を含有するリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
脂質層と脂質連結部分とを含む脂質集合体であって、前記脂質層と前記脂質連結部分とをマイクロ波エネルギーの存在下でインキュベートする工程によって得られる脂質集合体。
【請求項２３】
前記脂質連結部分が脂質ポリマーである請求項２２に記載の脂質集合体。
【請求項２４】
前記脂質連結部分が脂質ポリマー−リガンドである請求項２２に記載の脂質集合体。
【請求項２５】
一重層を含む請求項２２に記載の脂質集合体。
【請求項２６】
前記脂質連結部分が脂質二重層を含む請求項２２に記載の脂質集合体。
【請求項２７】
脂質連結部分がリポソームの二重層と会合しているリポソームを含んでいるリポソーム組成物の調製方法であって、
脂質連結部分とリポソームとの会合を達成するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で、前記リポソームの懸濁液と、前記脂質連結部分のミセル懸濁液とを接触させること
を含む方法。
【請求項２８】
前記リポソームが、封入された治療剤を有している請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載される主題は、脂質の外側表面に脂質ポリマー（ｌｉｐｏｐｏｌｙｍｅｒ）が挿入されている脂質構造体の調製方法に関する。脂質ポリマーは、脂質構造体が形成された後に、脂質ポリマーのポリマー部分が脂質表面から延びるような方法で脂質構造体に組み込まれる。幾つかの実施形態では、脂質ポリマーは、共有結合させた診断用、治療用又はターゲッティング用リガンドを含む。より詳しくは、本明細書に記載される主題は、共有結合させた診断用、治療用又はターゲッティング用リガンドと共に又はそれら無しに脂質二重層に脂質ポリマーが組み込まれている、ミセル及びリポソームなどの脂質構造体を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質二重層は、閉じた球状ベシクル状、平面シート状、平たいディスク状、小球状、チューブ状及びらせん状などの様々な異なる構造体を形成する、疎水的相互作用によってまとまっている脂質の集塊である（Ｋｕｎｉｔａｋｅ，Ｔ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３１：７０９（１９９２））。このような脂質二重層集合体は、種々の脂質から自然に生成するものであり、様々な技術分野での用途がある。例えば、平面状脂質二重層の集合体は、ターゲット分析対象物を検出するための光学センサーとして（米国特許第５，６１６，７９０号）、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド用のユニークな分離材料、すなわち固定化した人工膜として（Ｐｉｄｇｅｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７６：３６（１９８９））、バイオセンサーとして（Ｈ．Ｔ．Ｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ：Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｅｒｓ”、ｅｄ．Ｆ．Ｔ．Ｈｏｎｇ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）２５９−２６８ページ参照）、また脂質−水界面におけるリガンド−受容体相互作用を調べるための平面二重層膜として（国際公開第９８／２３９４８；国際公開第０１／２６８００；米国特許第５，９２２，５９４号）使用される。リポソームなどの球状の二重層脂質微粒子も、医薬又は診断剤の担体としての用途がある。
【０００３】
多くの場合、脂質二重層に、試験材料又は反応成分を結合する又は固定することが望ましい。例えば、多くの種類の分析化学手法は、１つ以上の反応の成分を固定することによって行うことができる。イムノアッセイ手法は、通常、成分の１つを脂質表面に固定することを必然的に含む。検定試料を脂質表面全面にわたって洗い流すと、固定された成分に対して結合親和性を有する検定試料中の成分が、検出用に捕捉される。
【０００４】
ミセル及びリポソームなどの閉じた球状脂質ベシクルの場合、様々な目的で、分子をベシクルの外側表面に結合させることが多い。例えば、結合させた分子は治療剤であってよいが、そのような薬剤を脂質二重層に結合させることは、その薬剤の薬物動態を変える役割をする（例えば、米国特許第６，３２６，３５３号参照）。結合させた分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏに投与した後、そのベシクルを所望の部位に導く又は「標的にする」役割をするターゲッティング部分であってよい（例えば、Ａｌｌｅｎ．Ｔ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２３７：９９−１０８（１９９５）；Ｂｌｕｍｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１４９：１８０−１８４（１９９３）；米国特許第６，３１６，０２４号、米国特許第６，２１４，３８８号参照）。通常、リガンドは、リンカーを介して、多くの場合ポリマー鎖を介してリポソーム表面に結合される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
通常、結合したリガンドを有する脂質ベシクルは、幾つかの手法のうちの１つによって調製される。１つのアプローチは、末端機能化脂質−ポリマー誘導体、すなわち遊離ポリマー末端が反応性である又は「活性化されている」脂質−ポリマーコンジュゲートを含む脂質ベシクルを調製することを必然的に含む（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：２９６（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３５３：７１（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、３９：１６３（１９９６）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８（２）：１１１（１９９７）参照）。脂質−活性化ポリマーコンジュゲートは、リポソームが形成されている間の脂質混合物に含まれている。リポソームが形成された後は、活性化されたポリマーの末端は所望のリガンドと反応する（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，４：２９６（１９９３））。このアプローチの欠点は、活性化された末端全てをリガンドと反応させることが困難であることである。また、このアプローチでは、リポソーム組成物から未反応のリガンドを分離する工程が引き続き必要となる。
【０００６】
別のアプローチでは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは調製され、リポソーム形成時に脂質組成物中に含まれる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８（２）：１１１（１９９７））。このアプローチは、貴重なリガンドの一部がリポソーム内側の水性の小区画の方を向き、意図する標的との相互作用に利用できないという欠点がある。
【０００７】
また別のアプローチでは、リポソームの懸濁液を脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートのミセル懸濁液と共にインキュベートして、リポソームの二重層に前記コンジュゲートが挿入される（例えば、Ｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８６：２４３（１９９６）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，８（２）：１１１（１９９７）；米国特許第５，８９１，４６８号、米国特許第６，３１６，０２４号参照）。このアプローチでは、もしインキュベーションの条件が好適であり十分時間をかけることができるならば、コンジュゲートの挿入はうまく行われる。ある場合には、長時間のインキュベーション又は挿入達成に必要な温度によって、リガンドの不活性化及び／又はリポソーム成分の放出に至ることがある。
【０００８】
このように、当技術分野においては、予備形成した脂質集合体に所望のリガンドを結合させる方法が必要とされている。
【０００９】
上述の関連技術例及びそれら技術例に関連する限界は、説明のためのものであってそれらに限定しようとするものではない。それら関連技術が有するその他の限界については、本明細書を読み、添付の図面を検討すれば、当業者には明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下に記載の本発明の態様及びその実施形態は、例示及び説明を意図したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１１】
一態様では、予備形成した脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法が提供される。
【００１２】
別の態様では、脂質二重層集合体に脂質−ポリマーを挿入する方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、分析手法を実施するに十分な時間又は所望の終点を達成するに十分な時間、脂質連結部分を脂質二重層集合体に固定する方法が提供される。
【００１４】
別の態様では、脂質二重層集合体に脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを挿入する方法が提供される。
【００１５】
さらに具体的には、一態様では、脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法が記載される。その方法は、脂質集合体と脂質連結部分とを、その脂質連結部分が脂質集合体と会合可能となるに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で接触させることを含む。前記脂質集合体は、合成脂質集合体であっても又は生体脂質集合体であってもよいが、天然又は合成脂質から調製される合成脂質集合体であることが好ましい。
【００１６】
様々な実施形態において、前記脂質集合体はミセル、エマルションエンベロープ一重層、脂質二重層、脂質一重層、リポソーム等である。
【００１７】
一実施形態では、前記脂質集合体はベシクル形成脂質で構成される。一実施形態では、ベシクル形成脂質は、その相転移温度が約５０℃を上回りうる。
【００１８】
別の実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリマー化合物である。より好ましい実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリエチレングリコール化合物である。他のより好ましい実施形態では、脂質連結部分は、脂質−薬物部分又は脂質−生物学的リガンド部分である。典型的な生物学的リガンドは、抗体又は抗体断片などのペプチド又はタンパク質、また、これに限定されないが、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、断片を含む核酸分子、等である。一実施形態では、生物学的リガンドは、細胞表面受容体、血液中病原体などの結合相手に対する結合親和性を有する。
【００１９】
別の実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ペプチド模倣部分である。
【００２０】
別の実施形態では、脂質集合体は、封入された治療剤を含有するリポソームである。この実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリマー、脂質−生物学的リガンド化合物、又は脂質−ポリマー−生物学的リガンドコンジュゲートの形態をとることが好ましい。細胞表面受容体に対して結合親和性を有する生物学的リガンドは代表的な例である。
【００２１】
別の実施形態では、その外側表面から脂質連結部分が延びているリポソームを含むリポソーム組成物を調製する方法が記載される。この方法は、リポソームの懸濁液と脂質連結部分のミセル懸濁液とを、前記脂質連結部分がリポソームと会合可能となるに効果的なマイクロ波エネルギー源の存在下で接触させることを含む。
【００２２】
一実施形態では、前記マイクロ波エネルギー源は、約５００〜５０，０００ジュールの範囲のエネルギー、より好ましくは約１０，０００〜４０，０００ジュールの範囲のエネルギーを提供する。
【００２３】
別の実施形態では、前記リポソームは、封入された治療剤を有している。
【００２４】
また別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−ポリエチレングリコール部分などの脂質−ポリマー部分である。別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−薬物部分である。別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−生物学的リガンド部分又は脂質−ポリマー−生物学的リガンドコンジュゲートである。
【００２５】
また本発明の別の態様では、脂質層と脂質連結部分とを含む脂質集合体が開示される。前記脂質連結部分は、マイクロ波エネルギー源照射によって、前記脂質層と安定して会合している。様々な実施形態において、前記脂質連結部分は、脂質ポリマー又は脂質ポリマー−リガンドである。一実施形態では、脂質集合体はリポソームを含まない。
【００２６】
先に記載した態様及び実施形態の例に加え、更なる態様及び実施形態が、添付の図面を参照し、以下の説明を検討することによって明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１．定義
「マイクロ波」とは、周波数約３００ＭＨｚから３００ＧＨｚ、波長約１メートル（ｍ）〜１ミリメートル（ｍｍ）の範囲の電磁スペクトルを意図している。好ましい実施形態では、マイクロ波は、周波数約８００ＭＨｚから３００ＧＨｚ、波長約３７．５センチメートル（ｃｍ）〜１ミリメートル（ｍｍ）の範囲の電磁スペクトルを意図している。
【００２８】
「マイクロ波オーブン照射」とは、これに限定されないが、食物又は飲料を加熱又は調理するために使用されるマイクロ波オーブンに代表されるようなマイクロ波オーブンでの照射を意図している。このようなオーブンは、通常、約２．４５ＧＨｚで作動し、その波長は１ｍｍから３０ｃｍの範囲である。
【００２９】
「生体関連リガンド」とは、受容体又は病原体などの結合相手と特異的に結合する能力のある分子のことを言う。リガンドの細胞受容体への結合は、一般に、高い結合親和性、すなわちＫｍ＞１０５を特徴としており、例えば、受容体の機能の変化（例えば、イオンチャンネルの開口）によって、又は受容体近傍の環境の変化（例えば、表面プラズモン共鳴による結合の検出）として検出することができる。脂質二重層に組み込むためのリガンドは、化学的に合成するか、組換えによって生成するか、細胞から精製するか、又はその他の手段によって得ることができる。
【００３０】
「受容体」とは、生体関連リガンドと特異的に相互作用する能力のある分子を意図している。細胞において、受容体は通常、細胞の脂質二重層膜と会合している。本明細書に記載した各種手法を使用して脂質二重層に組み込むための受容体は、化学的に合成する、組換えによって生成する、細胞から精製するなどによって得ることができる。
【００３１】
結合が、あるタンパク質が別のタンパク質に「非特異的に」くっつくことに起因しているのではなく、受容体の結合部位とリガンドとの間の分子の相互作用に起因している場合、その結合は「特異的」である。
【００３２】
「脂質ポリマー」とは、「脂質−ポリマー」と交換可能に使用され、親水性ポリマー鎖に共有結合している疎水性部分を意図している。幾つかの好ましい例では、前記疎水性部分は、２つの炭化水素鎖を有する脂質である。「脂質−ポリマー−コンジュゲート」又は「脂質ポリマー−コンジュゲート」とは、結合した又は会合したリガンドを有する脂質ポリマーのことを言う。前記リガンドは、例えば、生体関連リガンド、診断用リガンド、反応性部分、治療用化合物などであってよい。
【００３３】
ＩＩ．調製方法
脂質連結部分が組み込まれた脂質集合体の調製方法が提供される。前記脂質集合体は、通常、ひとまとめにして脂質「層」と呼ばれる脂質一重層又は脂質二重層を有する集合体である。脂質連結部分は、脂質連結部分の疎水性部分、一般には脂質が集合体の脂質層に挿入され、そして、脂質連結部分の反対の部分が集合体の表面から、例えば外部の媒体の中へ延びるような方法で、集合体の脂質層に組み込まれる。脂質連結部分の種々の例については、以下に検討する。用語「脂質連結」における「脂質」とは、脂質で代表されるようないかなる疎水性部分をも包含するものとする。前記疎水性部分は、１つ、２つ若しくはそれ以上の炭化水素鎖を有する脂質であってよく、又はコレステロール若しくはそのアナログなどの炭化水素鎖を欠く疎水性部分であってもよい。実質的には、脂質集合体に組み込むのに好適な疎水性部分はいずれも好適であり、また企図されるものである。疎水性の「脂質」は、選択された部分、例えば、これらに限定されないが、薬物、ポリマー、親水性ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖、二本鎖）、炭水化物などに好適な化学的結合を介して結合される。本発明を限定しない具体的な例を以下に挙げる。
【００３４】
本明細書においては、前記調製方法は、脂質連結部分として脂質ポリマーを使用する例で表される。以下に記載する一実施形態では、脂質ポリマーはさらにリガンドを含む。前記リガンドは、生体関連リガンド、診断用分子又は反応性部分であってよい。前記リガンドは一般に脂質ポリマーに共有結合しているが、静電的引力又はファンデルワールス引力などによって脂質ポリマーと「会合」している可能性もある。共有結合している場合のリガンドは、脂質ポリマーにおけるポリマーの遊離末端に結合していてよい。また、脂質ポリマーの脂質がリン脂質の場合、リガンドは、３価のホスホジエステル結合に結合していてもよい。前記リガンドは、治療活性を有するか又は治療活性は有しないがターゲッティングリガンド若しくは結合リガンドとして作用する、生体関連リガンドであってよい。前記リガンドはまた、蛍光タグから放射線増感剤にまでわたる診断用化合物であってもよい。前記リガンドは、有機薬物などの治療用化合物であってもよい。本発明は、リガンドが、脂質ポリマーが脂質構造体に組み込まれた後に反応可能な反応性部分であることも企図するものである。さらに付け加えられるリガンド例を以下に記載する。
【００３５】
脂質ポリマーがリガンド、特に生体関連リガンドを含んでいる実施形態では、好ましい配置は、リガンドが脂質ポリマーにおけるポリマーの遊離末端に結合している配置である。脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは、本明細書で後述する方法を使用して、コンジュゲートの脂質部分を脂質集合体の脂質層に挿入することによって脂質集合体に結合される。前記脂質層には複数の脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートが挿入されることが好ましいが、結合されたコンジュゲートの数又は密度は、後にさらに詳しく記載するように、コンジュゲートの脂質の、層の脂質に対する割合を選択することによって、制御し得ることは理解されよう。挿入された脂質ポリマーコンジュゲートは、アッセイを完了する又は所望のターゲットに結合するなどの最終的な結果を得るために十分な時間、脂質層集合体と会合した状態又は脂質層集合体の中に固定された状態にある。
【００３６】
脂質層は、様々な手法によって、また、種々の脂質及び脂質混合物から容易に形成される。平面状脂質二重層の調製については、例えば、Ｈａｎｋｅ，Ｗ．とＳｃｈｌｕｅ，Ｗ．Ｒ．、Ｐｌａｎａｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ、Ｄ．Ｂ．Ｓａｔｔｅｌｌｅ、Ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）及び国際公開第９８／２３９４８に記載されている。脂質ベシクルの調製については、例えば、Ｓｚｏｋａ  Ｆ．とＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７（１９８０）に記載されている。脂質層の脂質は、生物学的膜から精製した天然脂質及び／又は合成脂質を含むことができる。天然脂質の例としては、これらに限定されないが、市販の大豆由来脂質抽出物であるアゾレクチン（Ａｚｏｌｅｃｔｉｎ）（Ｓｉｇｍａ社製、セントルイス、ミズーリー州）、卵の黄身から精製されるホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。合成脂質は、頭部基及び炭化水素組成に不純物のない脂質、又は生体膜には通常存在しない脂質であってよい。好ましい脂質としては「ベシクル形成脂質」が挙げられる。ここでベシクル形成脂質とは、安定なミセル又はリポソーム組成物の一部を形成する能力があり且つ通常疎水性の炭化水素鎖を１つ若しくは２つ又はステロイド基を１つ含む任意の脂質のことを言い、それらはアミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールなどの化学的反応性を有する基をその極性頭部基に有していてよい。代表的な合成及び天然ベシクル形成脂質については、後に記載する。
【００３７】
本方法においては、脂質集合体、通常、脂質一重層又は脂質二重層が調製される。脂質集合体は、必要ならば脂質層を形成し支持するように処理された脂質層適合性の表面又は基板、例えば酸化シリコンウェハ又はフューズドシリカウェハに支持させることができる。或いはまた、脂質集合体は、ミセル又はリポソーム又はエマルションエンベロープ一重層などの、基板に支持されない自己支持型とすることができる。
【００３８】
１つの研究においては、実施例１に記載するように、ドキソルビシンを含有するリポソームを調製し、マイクロ波オーブンにてインキュベート時間を変えながらインキュベートした。マイクロ波エネルギーへの曝露後にリポソームから放出されたドキソルビシンの量を測定することによって、また、同曝露後にリポソーム中のドキソルビシンの量を測定することによって、このリポソームの安定性を評価した。さらに、マイクロ波エネルギー存在下でのインキュベーションの前後におけるリポソームの大きさを測定した。
【００３９】
測定結果から、マイクロ波照射下で３０秒、４５秒、６０秒及び９０秒間、ドキソルビシンを含有するリポソームをインキュベートしても、リポソームからの薬物の放出は誘発されないことが明らかとなった。また上記インキュベーションによって、リポソーム粒子の大きさにも変化は生じなかった。マイクロ波下でのインキュベーションの前後で、リポソーム中のドキソルビシン濃度は３．８ｍＭであり、リポソームの粒子径は９０ｎｍであった。このように、使用した出力レベル（５１０Ｗ：総エネルギー４５．９ｋＪ）においては、最長９０秒間までの時間長のマイクロ波照射によってリポソームは依然として完全であった。
【００４０】
実施例２は、予備形成したリポソームへの脂質−ポリマー−ターゲッティングリガンドコンジュゲートの挿入を促進するために、マイクロ波照射を使用した研究について記載するものである。リポソームは、実施例１Ａに記載の通りに調製したものであり、ＨＳＰＣ、コレステロール及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥから構成されたものである。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−リガンドを含む脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを実施例２Ａに記載の通りに調製した。リガンドはｃ−ｅｒｂＢ−２受容体エピトープに結合親和性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片（国際公開第９９／５５３６７）とした。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートのミセル懸濁液とリポソームの懸濁液とを、リン脂質１μモル当たりｓｃＦｖリガンド６μｇの固定濃度とし、全リン脂質の濃度を４７μモル／ｍＬとして混合した。混合物を、温度、溶媒（エタノール）、超音波照射、時間及びマイクロ波照射などを含めて様々な異なる条件下におき、コンジュゲートのリポソーム脂質二重層への挿入の度合いを分析した。インキュベーションの条件及び挿入の結果は、表１にまとめて示す。
【表１】
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【００４１】
表１は、室温及び３７℃では、最長７２時間のインキュベートでもリポソーム脂質二重層にＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦ５コンジュゲートが挿入されなかったことを示している。３７℃で２４時間インキュベートした試料を除き、エタノールを０．１％及び０．５％の濃度で添加してもコンジュゲートのリポソーム二重層への挿入は促進されなかった。ターゲッティングコンジュゲートをリポソームと共に６０℃で１時間インキュベートすると、コンジュゲートの７３％がリポソームの二重層に挿入された（コンジュゲートの２７％は遊離、未挿入の状態）。室温にて、超音波処理器でコンジュゲートとリポソームを１０分間及び２０分間インキュベーションしたが、コンジュゲートはリポソームに挿入されなかった（表１には示さず）。
【００４２】
引き続き表１を参照すると、マイクロ波照射しながら３０秒から９０秒の範囲でインキュベートすると挿入が高レベルで行われており、４５秒間超及び９０秒未満の間のマイクロ波照射後には、８０％を上回る遊離コンジュゲートが挿入され、採用したエネルギーレベルではコンジュゲートの減少も見られない。図１Ａは、マイクロ波照射下でインキュベートした試料に関する結果をプロットした図であり、遊離で未挿入のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖ脂質ポリマーコンジュゲートの量を、マイクロ波オーブンでマイクロ波照射に曝露した時間に対してプロットしたものである。図１Ｂは、関連のプロット図であり、インキュベーション媒体中の遊離で未挿入のＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートの全量を、マイクロ波インキュベーション時間の関数として示した図である。図１Ａは、マイクロ波源からの出力５１０Ｗに３０秒間曝露すると、脂質ポリマーコンジュゲートの７７％がリポソームに挿入され、脂質ポリマーコンジュゲートの減少もなかったことを示している（表１の最右の欄、図１Ｂ参照）。６０℃で１時間加熱した後も同程度の挿入が達成されている（表１参照）ことは、比較のポイントとして注目に値する。さらに、マイクロ波照射曝露時間を９０秒にまで増大すると、コンジュゲートの全量は全く損失せずに、脂質ポリマーコンジュゲートの８８％が挿入される。この出力レベルで３分間マイクロ波照射すると、脂質ポリマーコンジュゲートの全量は減少せずに、挿入量が低下（５０％）した。１０分間マイクロ波照射すると、脂質ポリマーコンジュゲートの５０％が分解した。この挿入プロファイルは、試験した全試料体積（２００〜１０００μＬ）に関して得られたものである。
【００４３】
リポソーム懸濁媒体中の遊離脂質ポリマーコンジュゲートの濃度を１ヶ月間モニターすることによって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖ脂質ポリマーコンジュゲートをマイクロ波挿入することによって調製した免疫リポソームの安定性を評価した。定期的に試料を採取し、高圧液体クロマトグラフィーによって遊離脂質ポリマーコンジュゲートの存在を分析した。対照として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートのミセル懸濁液を、リポソーム非存在下で同等のマイクロ波照射条件（５８０Ｗ＝３４．８ｋＪで１分間照射）にさらした。結果を表２Ａ及び表２Ｂに示す。これらの表には、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートの全量（リポソーム結合及び遊離）、懸濁媒体中の遊離ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートの量、コンジュゲート全量に対する遊離ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートのパーセンテージ（表２Ａ）、並びにリポソームの非存在下で、単独でマイクロ波照射に曝露したＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートの全量（表２Ｂ）がまとめてある。
【表２】
2008515929.tif 000003
【表３】
2008515929.tif 000004
【００４４】
表２Ａは、マイクロ波照射への１分間の曝露によってリポソームに挿入されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートは安定であって、４℃に保持した場合、８〜１１日間は安定して挿入された状態にあったことを示している。この期間は、遊離コンジュゲート（リポソームの二重層と会合していない）の濃度が、全コンジュゲート量の約２０％であった。約１１日経過後、さらに４℃で保管すると、懸濁媒体中の遊離コンジュゲートは失われることなくそのレベルが増大した。表２Ｂは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは安定であって、１分間のマイクロ波照射では明らかに影響されていないことを示している。
【００４５】
別の研究では、マイクロ波照射法を使用して、予備形成したリポソームに脂質−ポリマー（「脂質ポリマー」）コンジュゲートを挿入した。ここで、脂質ポリマーコンジュゲートは、ＤＳＰＥのホスホジエステルの遊離価標に４−ヒドロキシクマリン（ＨＣ）が連結した状態のＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質ポリマーであった。図２Ａに示すコンジュゲートは、実施例３Ａに記載の、また、図２Ｂに示した反応スキームに従って調製した。水性溶液中では、脂質ポリマーコンジュゲート、ＤＳＰＥ−ＨＣ−ＰＥＧは、臨界ミセル濃度を下回る濃度（〜３μＭ）ではほとんど蛍光を発しないが、ミセル又はリポソームなどの脂質の環境に挿入された途端、その蛍光強度は挿入された脂質ポリマーコンジュゲートの量に比例して増大する。このように、脂質ポリマーコンジュゲートは、脂質の環境に化合物が挿入されたことを決定する診断用リガンド又はプローブとしての役目をする。
【００４６】
プラセボリポソームをＰＥＧ−ＨＣ−ＤＳＰＥの溶液と混合し、最大出力５１０Ｗで１５秒、３０秒、４５秒及び６０秒間それぞれ操作したマイクロ波オーブンにて、マイクロ波照射に曝露した（実施例３Ｂ）。この曝露時間の直後に、蛍光を測定した。また、マイクロ波照射への曝露後５時間まで１時間ごとに蛍光を測定し、さらに曝露２１時間後にも蛍光を測定した。結果を図３に示す。
【００４７】
図３から分かるように、脂質−ポリマーコンジュゲートのリポソームへの挿入は、マイクロ波照射への曝露時間が長くなるにつれて増大した。マイクロ波照射への曝露１時間後から５時間後までの１時間ごとの蛍光強度によって明白であるように、マイクロ波照射後の蛍光強度はほとんど変化しなかった。各インキュベーション時間ごとの蛍光の絶対値も、２１時間保管後も著しく変化していなかった。このことは、挿入された蛍光性コンジュゲートがリポソームの二重層に残留していたことを示唆するものである。
【００４８】
６０秒間マイクロ波照射に曝露した後の蛍光性ＰＥＧ−ＨＣ−ＤＳＰＥ脂質ポリマーコンジュゲートの挿入の程度を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して測定した結果、蛍光性脂質ポリマーコンジュゲート全量の８５％がリポソームに挿入されていると測定された。
【００４９】
より一般的には、先に示したように、マイクロ波照射法を使用して、脂質−ポリマー（「脂質ポリマー」）、すなわちいずれのリガンドも欠いている脂質ポリマーを、リポソームなどの予備形成した脂質構造体に挿入することもできる。この広い技術思想は、実施例４に記載される別の研究、すなわち卵黄ホスファチジルコリンの脂質二重層を有し蛍光標識を含んでいるリポソームを、脂質ポリマーＤＳＰＥ−ＰＥＧのミセル懸濁液と共にインキュベートした研究で説明する。リポソームの脂質二重層に組み込まれる図４Ａ〜４Ｂに示すような２つの異なる蛍光標識を使用して、２つの研究を行った。図４Ａは７−ヘプタデシル−４−ヒドロキシクマリン（Ｃ１７ＨＣ）の構造を示し、図４Ｂは１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ−ＨＣ）の構造を示す。これら蛍光性脂質標識の少量を、リポソーム形成の間に脂質に含ませた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ脂質ポリマーのミセルをリポソームに添加し、この混合物に９０秒間マイクロ波（５１０Ｗ）照射へ曝露し、次いで、挿入されたＤＳＰＥ−ＰＥＧの量を、ＨＣ部分の見かけのｐＫａの変化によって測定した。
【００５０】
Ｃ１７ＨＣで標識されたリポソームに関する結果を表３に示す。この研究では、比較評価の基準として、室温における（マイクロ波照射無しの）同様のリポソームへのＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ＭＷ２０００ドルトン）脂質ポリマーの挿入も測定した。
【表４】
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【００５１】
表３は、９０秒間のマイクロ波照射への曝露によっても、５時間の室温でのインキュベーションによっても、類似した程度にｐＫａ値が上昇することを示しており、このことは類似レベルでの挿入を示唆するものである。Ｃ１７ＨＣのｐＫａの上昇は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ脂質ポリマーがリポソーム二重層に挿入されていたこと、及びリポソーム表面がさらに負に荷電されたことを示している。Ｃ１７ＨＣの見かけのｐＫａ値をインキュベーション期間の４８時間後にも測定したが、リポソームの表面電位は著しくは変化していないことが分かった。このことは、挿入された脂質ポリマーがリポソームと会合したままの状態にあったことを示唆するものである。
【００５２】
ＤＯＰＥ−ＨＣで標識したリポソームに関しては、結果を表４に示す。ＤＯＰＥ−ＨＣ標識卵黄ＰＣリポソームを、マイクロ波照射下、９０秒間、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ＭＷ２０００ドルトン）コンジュゲートと共にインキュベートした。脂質ポリマーの挿入の程度を、実施例４に記載のように、見かけのｐＫａから算出した。
【表５】
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【００５３】
見かけのｐＫａの絶対値は小さくなっているが、その相対的変化は、Ｃ１７ＨＣで標識したリポソームについて実施した研究で測定された変化（表３）と質的に同じである。絶対値が小さくなっていることは、ＤＯＰＥ−ＨＣの蛍光物質がＣ１７ＨＣの場合と比べて（表面から）離れた位置にあることを示すものである。室温で４８時間保管後、リポソームの見かけのｐＫａ値に著しい変化はなかった（結果は示していない）。このことは脂質ポリマーがリポソーム二重層と会合したままの状態にあったことを示唆するものである。
【００５４】
またこの研究では、ＥＰＣリポソームの試料を遊離のポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量２０００ドルトン）と組み合わせ、マイクロ波オーブンにて、容量６０％（総容量８５０Ｗ）で９０秒間マイクロ波を照射した。リポソームへの遊離のＰＥＧ（すなわち、脂質部分又は疎水性部分を欠いているＰＥＧ）の挿入は認められなかった。
【００５５】
マイクロ波照射法は実質上いかなる脂質連結部分であっても予備形成した脂質集合体への挿入に使用できることは、当業者には明らかであろう。前記例は脂質連結部分をマイクロ波照射によって挿入することを説明するものであり、それら例においては、脂質連結部分は脂質−ポリマー又は脂質−ポリマー−リガンドである。脂質連結部分は脂質−リガンド部分であってもよい。脂質集合体は任意の脂質構造体であってよく、好ましくは、主として合成脂質を含み且つ脂質二重層を有する構造体である。しかし、脂質集合体は、天然又は生体の脂質を含むものであってもよく、脂質一重層であってもよい。
【００５６】
前述の例は、調製方法を例証するために脂質ポリマー又は脂質ポリマー−リガンドコンジュゲートを中心としたが、様々な脂質連結部分が企図されること、また、脂質ポリマーは単に代表例にすぎないことは十分理解されよう。例えば、治療薬（後に挙げるような）を疎水性部分に結合させ、次いで脂質構造体に挿入することができる。ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物なども疎水性部分に結合させ、次いで脂質構造体に挿入することができる。これら代表例として例示した部分を選択された脂質に結合させることは、化学者の通常の技量の範囲内で十分成し得ることである。
【００５７】
ＩＩＩ．実用性
本発明の挿入法は、多種多様な脂質ポリマー及び脂質ポリマー−リガンドコンジュゲートを脂質集合体に結合させる又は挿入するのに使用される。脂質集合体は閉じた球状ベシクル、平面シート、平べったいディスク、小球、チューブ、又はらせんの形態をしていてよい。好ましい実施形態では、脂質集合体は脂質ベシクル又は脂質平面シートである。
【００５８】
１．脂質二重層ベシクル
リポソームとも呼ばれる脂質二重層ベシクルは、水相を包み込むように同心的に配置された脂質二重層を含む球状粒子である。リポソームは、水相又は脂質二重層に含有される治療剤又は診断剤の送達ビヒクルとして使うことができる。薬物にもよるが、薬物をリポソームに封入された形態で送達することには、例えば、薬物毒性が減弱する、薬物動態が変わる、又は薬物の溶解性が向上するなどの様々な利点がある。親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含むように製剤化されたリポソーム、いわゆるステルス（Ｓｔｅａｌｔｈ（登録商標））リポソーム又は長期滞留性リポソーム又は立体安定化リポソームには、単核食細胞系によるリポソームの除去が減ることも一部寄与し、血中滞留期間が長いというさらなる利点がある（米国特許第５，０１３，５５６号）。長期の存続期間は、リポソームがその注入部位から所望のターゲット域又は細胞に到達するために必要であることが多い。
【００５９】
本明細書に記載の方法に従って、親水性ポリマー鎖の外側表面コーティングを有するリポソームを調製することができる。前記のように、脂質ポリマーは、マイクロ波照射に曝露している間に予備形成したリポソームに挿入される。脂質ポリマーは、その脂質部分がリポソームの脂質二重層に挿入されそのポリマー部分がリポソームの表面から離れて外部の媒体中へ延びるようにして、外側脂質二重層に組み込まれる。
【００６０】
ターゲッティング用、治療用、及び／又は診断用リガンドを有するリポソーム、いわゆる「免疫リポソーム」も、本明細書に記載の方法を使用して調製することができる。先に言及したように、結合したリガンドは、血中滞留期間が短い小分子などの治療剤、又はリポソーム及び封入されたペイロードを特定の組織又は細胞に誘導するターゲッティング用部分とすることができる。リガンドは、通常ポリマーの遊離末端に結合することによって、又は脂質がリン脂質である場合にはホスホジエステルの遊離価標に結合することによって、脂質−ポリマーと結合又は会合している。
【００６１】
本発明の方法で使用するのに好適なリポソームとしては、主としてベシクル形成脂質で構成されるリポソームが挙げられる。ベシクル形成脂質とは、ゲルから液晶相への相転移温度範囲を上回る温度で、自然発生的に脂質二重層を形成するような脂質のことを言う。一般に、そのような脂質は、疎水性部分及び親水性部分の断面積がほぼ同じであることによりラメラ相にぎっしり詰まることが可能となる、などの、自然発生的な二重層形成を可能にする幾つかの特徴を有している。コレステロール及びその種々のアナログなどの、脂質二重層に安定して組み込まれ得る脂質は、二重層が形成される間にその脂質二重層に組み込むことができる。ベシクル形成脂質は、２つの炭化水素鎖、通常アシル鎖と、極性又は非極性の頭部基とを有する脂質であることが好ましい。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含め、種々の合成及び天然に存在するベシクル形成脂質があるが、これらのベシクル形成脂質においては、２つの炭化水素鎖は、通常炭素原子約１４〜２２個の範囲の長さを有し、飽和又は様々な程度の不飽和度を有する。アシル鎖の飽和度が様々である前記脂質及びリン脂質は、購入することもできるし又は公開されている方法によって調製することもできる。その他の好適な脂質としてはリン脂質、スフィンゴ脂質、グリコ脂質、及びコレステロールなどのステロールが挙げられる。
【００６２】
陽イオン性脂質もまた使用することができるが、陽イオン性脂質は、リポソームを形成する、脂質混合物の主要でない成分として又は主要な若しくは唯一の成分として含まれていてよい。陽イオン性脂質は、通常、ステロール、アシル鎖又はジアシル鎖などの親油性成分を有し、その脂質は全体として正電荷を帯びている。脂質の頭部基が正電荷を帯びていることが好ましい。一価の陽イオン性脂質の代表例としては、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、３［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、及びジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）が挙げられる。
【００６３】
別の群は、それ自身でミセルを形成し、そして、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの他の脂質の存在下でリポソームを形成する、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳなどの多価の陽イオン性脂質である。その他の多価の陽イオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はポリリシンもしくは、その他のポリアミン、例えばスペルミン、などの多価の陽イオン性分子で誘導体化されたその他のリン脂質などの中性脂質であってよい。
【００６４】
ベシクル形成脂質を選択して、特定の程度の流動性又は強直性を達成すること、血清中でのリポソームの安定性を制御すること、後に説明するようにターゲッティング用コンジュゲートの挿入に効果的な条件を制御すること、及び／又はリポソーム内に捕捉された薬物の放出速度を制御することができる。より強直な脂質二重層又はゲル状（秩序だった固体）相の二重層を有するリポソームは、例えば長い飽和アシル鎖有する脂質、したがって比較的高い相転移温度範囲、例えば＞３７℃から最高６０℃までの温度範囲を有する脂質など、比較的強直な脂質を使うことによって達成される。このような脂質は、脂質二重層により優れた膜強直性を付与する一因となる。コレステロールなどのその他の脂質成分も、脂質二重層を液体秩序相に変換することによって脂質二重層構造体の膜強直性に寄与していることが知られている。
【００６５】
一方、高い脂質流動性は、比較的流動性の脂質、典型的な例では、液相から液晶相への相転移温度範囲が比較的低い、例えば３７℃又はそれより低い脂質相を有する脂質を組み込むことによって達成される。このような脂質は、主たる中鎖（Ｃ１４）、炭化水素鎖を２本有する脂質であるか、又は不飽和炭化水素鎖を１本若しくは２本する脂質であってよい。
【００６６】
リポソームは、ベシクル形成脂質ではない脂質ポリマーを形成するために親水性ポリマーで誘導体化されたベシクル形成脂質を含むことができる。例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に記載されているように、リポソーム組成物にこのような誘導体化された脂質が含まれると、リポソームの周りに親水性ポリマー鎖の表面コーティングが形成される。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、このようなコーティングを有していないリポソームに比べて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリポソームの血中滞留期間を長くする効果がある。
【００６７】
親水性ポリマーで誘導体化するのに好適なベシクル形成脂質としては、先に挙げた脂質のいずれも挙げられるが、特に、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのリン脂質類が挙げられる。
【００６８】
ベシクル形成脂質で誘導体化するのに好適な親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸アミド及び親水性ペプチド配列が挙げられる。このようなポリマーは、ホモポリマーとして又はブロック若しくはランダムコポリマーとして採用することができる。
【００６９】
好ましい親水性ポリマー鎖はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、好ましくは分子量が５００〜１０，０００ドルトンの範囲のＰＥＧ鎖、より好ましくは分子量が７５０〜１０，０００ドルトンの範囲のＰＥＧ鎖、さらに好ましくは分子量が７５０〜５，０００ドルトンの範囲のＰＥＧ鎖である。メトキシ又はエトキシでキャップされたＰＥＧのアナログもまた好ましい親水性ポリマーであり、例えば１２０〜２０，０００ドルトンの種々のポリマーサイズが市販されている。
【００７０】
親水性ポリマーを使用して誘導体化されるベシクル形成脂質の調製については、例えば米国特許第５，３９５，６１９号に記載されている。このような誘導体化された脂質を含むリポソームの調製についても記載があるが、記載されている調製においては、通常、このような誘導体化された脂質はリポソーム製剤に１〜２０モル％含まれる（米国特許第５，０１３，５５６号参照）。要約すると、リポソームは、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．Ｊｒ．，ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９：４６７（１９８０）に詳細に記載されているような種々の手法によって調製されるが、本発明を支持して調製されるリポソームの具体例は先に挙げた。一般に、リポソームは多重層ベシクル（ＭＬＶ）であって、簡単な脂質膜水和法によって形成することができる。この手法では、好適な有機溶媒に溶解した先に詳述したような種類のリポソーム形成脂質の混合物を容器内で蒸発させて薄膜を形成し、次いで、その薄膜を水性媒体で覆う。脂質膜水和によって、通常約０．１〜１０ミクロンの範囲のサイズのＭＬＶが形成される。
【００７１】
リポソームは、リポソーム表面上に親水性ポリマー鎖の表面コーティングを形成するために、親水性ポリマーで誘導体化したベシクル形成脂質を含み得る。リポソーム形成時に、脂質混合物に対して、約１〜２０モル％範囲の脂質−ポリマーコンジュゲートを添加すると、ポリマー鎖がリポソームの脂質二重層の内側及び外側両表面から延びるようになる。ポリマーで誘導体化された脂質の調製法及びポリマーでコーティングされたリポソームの形成法については、米国特許第５，０１３，５５６号、米国特許第５，６３１，０１８号及び米国特許第５，３９５，６１９号に記載されているが、それらを参照によって本明細書に組み込む。親水性ポリマーを脂質に安定に結合させてもよいこと、又は不安定な連結を介して脂質に結合させることによって、ポリマーでコーティングされたリポソームが、血流にのって循環しながら又は刺激に反応してポリマー鎖のコーティングを放出することを可能にしてもよいことは理解されよう。
【００７２】
リポソームは治療剤又は診断剤を含むこともできるが、そのような薬物の例は後に記載する。選択された薬物は、（ｉ）脂質膜を薬物の水溶液と水和させることによって水溶性化合物を受動的に捕捉する、（ｉｉ）薬物を含有する脂質膜を水和させることによって親油性化合物を受動的に捕捉する、及び（ｉｉｉ）リポソームの内側／外側ｐＨ勾配に逆らってイオン化性の薬剤を添加するなどの方法を含めた、標準的な方法でリポソームに組み込まれる。逆相蒸発法などのその他の方法も好適である。
【００７３】
リポソームを形成した後、リポソームを小型化することによって、実質的に均質なサイズ範囲を有するリポソーム群、一般に約０．０１〜０．５ミクロンの範囲、より好ましくは０．０３〜０．４０ミクロンの範囲のリポソーム群を得ることができる。ＲＥＶ及びＭＬＶを分粒するための１つの効果的な方法は、リポソームの水性懸濁液を、エタノールと共に又はエタノール無しで、０．０３〜０．２ミクロン範囲の選択された均一な孔径を有する、通常は０．０５ミクロン、０．０８ミクロン、０．１ミクロン又は０．２ミクロンの均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通して排出することである。膜の孔径は、特に同じ膜で２回以上の排出を行って調製される場合には、その膜を使った排出により生成されるリポソームの最大サイズにほぼ一致する。多くの場合、排出は、孔径が大きいフィルターから始めて、段階的に行われる。均質化法もまた、リポソームを１００ｎｍ以下のサイズに小型化するのに有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．、ＳＰＥＣＩＡＬＩＺＥＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ−ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、Ｐ．Ｔｙｌｅ、Ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６７〜３１６（１９９０））。
【００７４】
リポソームを形成した後、本明細書に記載するマイクロ波照射法を使用して、脂質二重層に脂質連結部分を組み込む。通常、脂質二重層には、同じ又は異なる複数の脂質連結部分が組み込まれる。予備形成しておいたリポソームと脂質連結部分を混合し、次いでマイクロ波を照射して、リポソームの二重層の外側一重層への脂質連結部分の挿入を達成する。脂質連結部分を挿入すると、脂質連結部分（すなわち「部分」）の脂質部と正反対の部分が脂質表面から外側に向かうような状態で、脂質集合体の脂質二重層に脂質部分が固定されることになり、このようにして「部分」の外側表面コーティングが得られる。脂質ポリマー−リガンドコンジュゲート又は脂質−薬物−リガンドコンジュゲートの場合のように、脂質連結部分にリガンドを結合させる実施形態では、リガンドはやはり脂質の表面から外側に向かう状態となり、それによってそのコンジュゲートの受容体又は結合相手と相互作用が可能になる。
【００７５】
所望の挿入率、所与の部分がその結合作用又は治療作用などに悪影響を受けることなく安全に加熱されるような温度、並びに脂質及び脂質組成物の相転移温度を低くする程度などを含めた幾つかの変数に基づいて、脂質構造体への脂質連結部分の挿入を達成するのに効果的な照射条件が決定されることは理解されよう。
【００７６】
先に言及したように、リガンドは、細胞受容体、血中を循環する病原体などに結合親和性を有する分子とすることができる。リガンドはまた、治療用又は診断用分子、特に、遊離型で投与された場合の血中滞留期間が短い分子とすることができる。
【００７７】
一実施形態では、リガンドは生物学的リガンドであり、好ましくは、細胞受容体に結合親和性を有する生物学的リガンドである。生物学的リガンドの代表例としては、ＣＤ４、葉酸、インスリン、ＬＤＬ、ビタミン類、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク、Ｅ、Ｌ及びＰセレクチンなどのセレクチン類、Ｆｌｋ−１，２、ＦＧＦ、ＥＧＦ、インテグリン、特にα４β１、αＶβ３、αＶβ１、αＶβ５、αＶβ６インテグリン、ＨＥＲ２並びにその他の各種受容体に対する結合親和性を有する分子が挙げられる。好ましいリガンドとしては、抗体及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどの抗体断片（重鎖及び軽鎖の可変領域からなる断片）並びにｓｃＦｖ（ペプチドリンカーによって重鎖及び軽鎖の可変領域が連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子）などを含めた、タンパク質及びペプチドが挙げられる。リガンドは、小分子のペプチド模倣分子であってもよい。
【００７８】
細胞表面受容体又はその断片もリガンドとして使うことができることは、理解されよう。
【００７９】
リガンドは、文献（米国特許第６，１８０，１３４号、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５３：７１（１９９４）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：２９６（１９９３）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．、３９：１５３（１９９６）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、８（２）：１１１（１９９７））に公開されている合成反応スキームを使用して、容易に脂質又はポリマーで誘導体化した脂質に結合される。リガンドとポリマー又は脂質との間の連結は、安定な共有結合或いはｐＨの変化又は還元剤及び／若しくはＳＨ部分含有分子の存在などの刺激に反応して分解する解除可能な結合である。
【００８０】
リポソームはまた、捕捉された状態の治療剤又は診断剤を含んでいてよい。捕捉されたとは、薬剤がリポソームの水性の核及び水性の空間に封入されていること、薬剤が並びにリポソームの脂質二重層に捕捉されていることを含む。本発明の組成物に使用することを企図した薬物は多岐にわたるが、治療用及び診断用に好適な本発明を限定しない薬物の例としては、ステロイド、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、非ステロイド系抗喘息薬、非ステロイド系抗炎症薬、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、細胞毒性薬、抗ウイルス薬、遺伝子治療薬、放射線治療薬、及び造影剤などが挙げられる。
【００８１】
一実施形態では、捕捉された治療薬は細胞毒性薬剤である。このような細胞毒性薬剤は、これらに限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン及びイダルビシン、並びにそれらの塩及びアナログを含めたアンスラサイクリン系の抗生物質とすることができる。このような細胞毒性薬は、シスプラチンン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、（（−）−（Ｒ）−２−アミノメチルピロリジン（１，１−シクロブタンジカルボキシラート）プラチナ）、（ＳＰ−４−３（Ｒ）−１，１−シクロブタン−ジカルボキシラート（２−）−（２−メチル−１，４−ブタンジアミン−Ｎ，Ｎ’）プラチナ）、ネダプラチン、及び（ビス−アセタート−アミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−プラチナ（ＩＶ））などのプラチナ化合物であってもよい。細胞毒性薬は、これらに限定されないが、トポテカン、イリノテカン、（７−（４−メチルピペラジノ−メチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）カンプトテシン）、７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシン、９−アミノカンプトテシン及び９−ニトロカンプトテシンなどを含めた、トポイソメラーゼ１阻害剤であってもよい。細胞毒性薬はまた、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、ビンロジシン、ビノレルビン及びビンデシンなどのビンカアルカロイドであってもよい。捕捉された治療剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン及びＴＮＦαなどの血管新生阻害剤とすることもできる。
【００８２】
２．平面状脂質二重層
別の実施形態では、脂質二重層は、好適な基板上に支持されている平面状に広がる脂質二重層である。平面状脂質二重層は、当技術分野で知られている手法を使用して作られる。例えば、ガラス、石英、雲母などの基板を選び、リン脂質二重層を１回に一層ずつ空気−水の境界面から堆積させるか、又は予備形成しておいたリポソーム同士の融合によって堆積させる。（Ｇｒｏｖｅｓ，Ｊ．及びＤｕｓｔｉｎ，Ｍ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｔｄｓ、２７８：１９（２００３））。二重層は、基板上にパターン又はグリッド状に形成することができるが、この場合、基板上には、異なる二重層組成物及び／又は異なるリガンドがグリッドパターン状に配置される。基板上に二重層を形成したら、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲート又は脂質−リガンドコンジュゲートの形態をした選択されたリガンドを、マイクロ波照射下で平面二重層の表面又は特定の表面領域をコンジュゲートと接触させることによって、平面二重層に挿入する。
【００８３】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本明細書に記載の発明をさらに詳しく説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８４】
材料
脂質、すなわちジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、コレステロール、部分水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及びメトキシ（ポリエチレングリコール）−ジステアロイルホスファチジルコリン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．社（アラバマ州アラバスター）から入手した。
【００８５】
（実施例１）
マイクロ波照射の間の脂質粒子の安定性
Ａ．リポソームの調製
部分水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール及びメトキシ（ポリエチレングリコール）−ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（モル比５５：４０：５）から、脂質膜水和法によってリポソームを調製し、次いで膜排出した（Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８１（１９）：１４８４（１９８９））。丸底フラスコにて、脂質をクロロホルム／メタノール混合物に溶解した。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を除去し、脂質の薄膜を形成した。１００ｍＭ硫酸アンモニウムと１ｍＭデフェロキサミンの水溶液中で前記脂質膜を激しく振とうして多重層リポソームを形成した。続いて、高圧又は中圧押し出し機を使い、孔径０．２μｍから０．０５μｍのポリカーボネート膜を孔径の大きいものから通過させて段階的にリポソームを排出した。粒径７０〜１００ｎｍの範囲のベシクルが得られた。粒径は動的光散乱によって測定した。
【００８６】
リポソーム懸濁液をクロマトグラフィーのカラムで濾過することにより、捕捉されなかった硫酸アンモニウム及びデフェロキサミンを除去した。ドキソルビシンを生理食塩水に溶かし（４ｍｇ／ｍＬ）、濾過後のリポソーム懸濁液と混合した。リポソーム−ドキソルビシン混合物を６０℃で１時間インキュベートした。ドキソルビシンのリポソーム内への添加は、硫酸アンモニウムが作り出すプロトン濃度勾配の結果として生じた（Ｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ、１１５１（２）：２０１（１９９３））。インキュベーション期間の終わりに、リポソーム懸濁液をカチオン交換樹脂を通過させることによって、捕捉されなかったドキソルビシンを除去した。
【００８７】
Ｂ．マイクロ波照射
容量８５０ＷのＳｐｅｃｔｒａマイクロ波オーブン（Ｎ  ＫＯＲ−８０２Ｂ型、フランス製）にて、出力レベル５１０Ｗ（全容量の６０％）で、インキュベーション時間を変えながらリポソームをインキュベートした。マイクロ波照射に対するリポソームの安定性を評価するために、捕捉されているドキソルビシンの放出を測定した。具体的には、Ｄｏｗｅｘ×５０×４−４００カチオン交換樹脂の存在下及び非存在下で、リポソームから放出されるドキソルビシンの量とリポソーム内ドキソルビシンの量とをそれぞれ測定した（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．ＵＳＡ；Ｄｒｕｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、９８０：３８１（１９８９）；Ａｍｓｅｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．７９：１０４５（１９９０））。ＡＬＶ−５０００／ＥＰＰ複合デジタル相関器を備えたＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ  ＡＬＶ−ＮＩＢＳ／ＨＰＰＳ（ＡＬＶ−Ｌａｓｅｒ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ＧｍｂＨ社製、Ｌａｎｇｅｎ、独国）でサイズを測定することによって、インキュベーション前後のリポソームの完全性を評価した。結果を図１に示す。
【００８８】
（実施例２）
予備形成しておいたリポソームへの脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートの挿入
Ａ．コンジュゲートの調製
先に記載の手法（米国特許第６，１８０，１３４号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３５３：７１（１９９４））を使い、ｃ−ｅｒｂＢ−２受容体エピトープ  に結合親和性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０７３９５、世界特許機構特許９９／５５３６７として公開）を、反応性ＰＥＧ−ＤＳＰＥコンジュゲートと反応させて脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを調製した。つまり、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）と、ヘテロ二官能性ＰＥＧ誘導体、すなわちＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル−ＰＥＧ−マレイミドとを反応させて、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドコンジュゲートを生成する。遊離ＰＥＧ末端のマレイミド基は、タンパク質のチオール部分に対して反応性である。ｓｃＦｖ抗体断片を、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドと反応させてＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートを生成する。
【００８９】
Ｂ．コンジュゲートの挿入
リポソームを実施例１Ａに記載のように調製した。但し、これらリポソームはドキソルビシンを含んでいなかった。予備形成しておいたリポソームとＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｓｃＦｖコンジュゲートのミセルの懸濁液を、全リン脂質の濃度４７μモル／ｍＬ、ターゲッティング用リガンドの割合をリン脂質１μモル当たり６μｇとして、プラスチック製マイクロチューブ（試料体積１００μＬに対して１．７ｍＬ容量、ＭＣＴ−１７５−Ｃ、Ａｘｙｇｅｎ、米国；その他の全試料体積に対して１５ｍＬ容量、Ｍｉｎｉｐｌａｓｔ、イスラエル）の中で混合した。試料は、以下のインキュベーション条件のうちの１つに従って処理した。
１．６０℃で６０分間。
２．室温（約２５℃）で７２時間。
３．３７℃で７２時間。
４．０．１％又は０．５％エタノール存在下、室温（約２５℃）又は３７℃で時間を変えて。
５．室温（約２５℃）で超音波処理器（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．社製、Ｇ１１２ＳＰＩＴ型、６００Ｖ、８０ＫＣ、５ＡＭＰ）中、１０分又は２０分。
６．試料体積１００μＬ、３００μＬ、５００μＬ及び１０００μＬに関して、Ｓｐｅｃｔｒａマイクロ波オーブン中、５１０Ｗで３０秒、４５秒、１分、１．５分、３分及び１０分間インキュベート。
【００９０】
インキュベーションの後、予備形成しておいたリポソームへのコンジュゲート挿入の程度を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（カラム：ＴＳＫＧ４０００ＳＷｘｌ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、８μｍ；ガードカラム：ＴＳＫＧＥＬｘｌ、６ｍｍ×４ｃｍ；移動相：０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４と０．１％ＳＤＳ水溶液；流速：１．０ｍＬ／分；波長：２１５ｎｍ；注入体積：５０μＬ；分析時間：２０分）を使用して測定し、同時に懸濁媒体中のコンジュゲート（リポソームに挿入されていない）の量及び回収されたターゲッティング用リガンドの全量を分析した。結果を表１及び図１Ａ〜１Ｂで要約する。
【００９１】
（実施例３）
リポソームへの蛍光脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
Ａ．蛍光性脂質ポリマープローブの調製：ＤＳＰＥ−ＨＣ−ＰＥＧ
ホスホルアミドジエステルが連結した７−ヒドロキシクマリンとｍＰＥＧ−ＤＳＰＥのコンジュゲート（図２Ａ）を、図２Ｂに示す反応スキームに従って調製した。ジクロロメタンに溶解したｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを、塩化オキサリルと触媒量のＤＭＦで処理した。この溶液を蒸発乾固し、残渣を再度ジクロロメタンに溶解し、氷冷した後、トリエチルアミン、１−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパンで処理した。１５分後に、反応を完了した。この溶液を蒸発させ、Ｂｏｃ−アミノプロピルホスホラミデート生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール、９５：５）によって精製した。Ｂｏｃ基の除去を、４ＭＨＣｌのジオキサン溶液中１時間かけて達成した後、アミノプロピル官能基化ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを、ジクロロメタン中で過剰量の７−ヒドロキシクマリニルアセテートのスクシンイミジルエステルで処理した。３時間後、ｍＰＥＧ−７ＨＣ−ＤＳＰａｍ生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール、９５：５）によって精製した。総括収率は約５０％であった。この材料について、ＮＭＲ、ＭＳ及び分光蛍光分析によって特徴付けを行った。
【００９２】
Ｂ．リポソームへの脂質ポリマープローブの挿入
実施例１に記載の条件に従い、マイクロ波オーブンにて、実施例１Ａに記載のように調製したがドキソルビシンは含んでいないリポソームを、蛍光性脂質ポリマープローブＤＳＰＥ−ＨＣ−ＰＥＧと共に、１５秒、３０秒、４５秒又は６０秒間インキュベートした。インキュベーションの後、ＬＳ５５０Ｂルミネセンス分光装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、コネチカット州、Ｎｏｒｗａｌｋ）を使用して各試料の蛍光を測定した。その後５時間の間に１時間ごとに蛍光を測定し、さらに室温（２２℃）にて２１時間保管後の蛍光も測定した。結果を図３に示す。
【００９３】
（実施例４）
ホスファチジルコリンリポソームへの脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）で構成され、ｐＨ感受性プローブ、７−ヘプタデシル−４−ヒドロキシクマリン（Ｃ１７ＨＣ）（図４Ａ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ−ＨＣ）（図４Ｂ）、で標識されたリポソームを薄膜水和法によって調整し、次いで排出法を使用して小型化した。つまり、ＥＰＣと、前記ｐＨ感受性プローブのうちの１つを、丸底フラスコ中で有機溶媒に溶解した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、水性バッファと水和して多重層リポソームを形成している脂質薄膜を形成した。リポソーム懸濁液をポリカーボネート膜による膜排出によって分粒し、平均径１００ｎｍとした。
【００９４】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ＰＥＧ分子量２０００ドルトン）のコンジュゲートを購入した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧコンジュゲートのミセル懸濁液を前記標識したＥＰＣリポソームの懸濁液と混合し、出力６０％で作動させた従来のマイクロ波オーブン（Ｓｐｅｃｔｒａ、容量８５０Ｗ）にて、マイクロ波照射下で９０秒間インキュベートした。コンジュゲート挿入の程度を、ＨＣ部分の見かけのｐＫａの変化によって測定した。結果を表３に示す。
【００９５】
Ｃ１７ＨＣで標識したリポソームに関しては、Ｃ１７ＨＣの見かけのｐＫａを、バルクｐＨの関数としての、励起波長３８０／３３０（放出波長４５０ｎｍ）の割合の変化から算出した（Ｚｕｉｄａｍ  ａｎｄ  Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１３２９（２）：２１１〜２２（１９９７））。ＬＳ−５０Ｂルミネセンス分光装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、コネチカット州、Ｎｏｒｗａｌｋ）を使用して蛍光を測定した。比較評価の基準として、室温で同じリポソームにＤＳＰＥ−ＰＥＧを挿入し、その挿入の程度を測定した。結果を表４に示す。
【００９６】
ＤＯＰＥ−ＨＣで標識したリポソームに関しては、ＤＯＰＥ−ＨＣの見かけのｐＫａを、バルクｐＨの関数としての、励起波長３７０／４０８（放出波長４８０ｎｍ）の割合の変化から算出した。マイクロ波照射への曝露直後と曝露後４８時間後に、ＬＳ−５０Ｂルミネセンス分光装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、コネチカット州、Ｎｏｒｗａｌｋ）を使用して蛍光を測定した。結果を表４に示す。
【００９７】
多数の代表例としての態様及び実施形態について議論してきたが、当業者ならば、それらに施されるある程度の修正、変更、付加、及び部分的な組合せに思い至るであろう。したがって、以下に添付の特許請求の範囲及び本明細書で後に記載する特許請求の範囲は、それら修正、変更、付加、及び部分的な組合せを、それらがその真の精神及び範囲内にあるという理由から含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】脂質ポリマー−ターゲッティングリガンドコンジュゲートを予備形成したリポソームと共にマイクロ波照射下で時間を変えてインキュベートした後の、前記予備形成したリポソームの脂質二重層に挿入されていない、遊離の形態の前記コンジュゲートの割合を示すプロット図である。
【図１Ｂ】予備形成したリポソームと共にマイクロ波照射下で時間を変えてインキュベートした後に回収された、脂質ポリマー−ターゲッティングリガンドコンジュゲートの総割合を示すプロット図である。
【図２Ａ】蛍光脂質ポリマー、ＤＳＰＥ−ＨＣ−ＰＥＧ、の化学構造を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの蛍光脂質ポリマーを調製するための、合成反応スキーム図である。
【図３】ＤＳＰＥ−ＰＥＧのコンジュゲートと共にインキュベートした蛍光標識リポソームの懸濁液の蛍光強度を、秒で表したマイクロ波照射時間の関数として示すプロット図である。ここでは、リポソームが結合した蛍光物質が、電荷密度の変化に反応して蛍光を発する。
【図４Ａ】リポソームを標識するために使われるｐＨ感受性蛍光プローブ、７−ヘプタデシル−４−ヒドロキシクマリン（Ｃ１７ＨＣ）、の化学構造を示す図である。
【図４Ｂ】リポソームを標識するために使われるｐＨ感受性蛍光プローブ、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ−ＨＣ）、の化学構造を示す図である。
【図１Ａ】
2008515929.tif 000007
【図１Ｂ】
2008515929.tif 000008
【図２Ａ】
2008515929.tif 000009
【図２Ｂ】
2008515929.tif 000010
【図３】
2008515929.tif 000011
【図４Ａ】
2008515929.tif 000012
【図４Ｂ】
2008515929.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月10日(2006.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法であって、
脂質集合体と脂質連結部分とを、前記脂質連結部分が前記脂質集合体と会合するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で接触させること
を含む方法。
【請求項２】
前記脂質集合体が合成脂質集合体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質集合体がミセルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記脂質集合体が脂質二重層を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質集合体が脂質一重層を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質集合体がエマルションである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質集合体がリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質集合体がベシクル形成脂質を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ベシクル形成脂質の相転移温度が約５０℃を上回る請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記脂質集合体が、封入された治療剤を含有するリポソームである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法によって調製された脂質集合体。
【請求項２３】
脂質連結部分がリポソームの二重層と会合しているリポソームを含んでいるリポソーム組成物の調製方法であって、
脂質連結部分とリポソームとの会合を達成するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で、前記リポソームの懸濁液と、前記脂質連結部分のミセル懸濁液とを接触させること
を含む方法。
【請求項２４】
前記リポソームが、封入された治療剤を有している請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２３から３３までのいずれか一項に記載の方法によって調製されたリポソーム。
【国際調査報告】
2008515929.tif 000014
2008515929.tif 000015
2008515929.tif 000016