(57)【要約】ヘモペキシンに融合された第1タンパク質を含んでいる融合タンパク質が提供される。前記融合タンパク質は、循環時間の増加を呈する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HpxまたはHpxバリアントへと、自由選択でリンカーを介して、融合された第1タンパク質を含んでいる融合タンパク質。
【請求項２】
前記第1タンパク質と比較して増加した循環時間を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第1タンパク質は、治療上のタンパク質である、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記HpxバリアントがHpx1-nであり、nが整数360〜438である融合タンパク質。
【請求項５】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記HpxバリアントがHpxm-439であり、mが整数2〜100である融合タンパク質。
【請求項６】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記HpxバリアントがHpxq-pであり、qが整数2〜50であり、pが整数389〜438である融合タンパク質。
【請求項７】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記Hpxバリアントが、Hpxから50アミノ酸までを付加、欠失および／または置換させることによって得られる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記Hpxバリアントが、Hpxと少なくとも80%配列同一性を有する融合タンパク質。
【請求項９】
65kDaを超える分子量を有する、請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項1〜3の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記Hpxバリアントが、Hpx配列における１以上のHis213およびHis270を欠失および／または置換させることによって得られる融合タンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーが存在しない、請求項1〜10の何れか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記リンカーが存在する、請求項1〜10の何れか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項1に記載の融合タンパク質であって、前記第1タンパク質のＮ末端が、自由選択でリンカーを介して、HpxのＣ末端と融合される融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項1に記載の融合タンパク質であって、前記第1タンパク質のＣ末端が、自由選択でリンカーを介して、HpxのＮ末端と融合される融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項1〜14の何れか１項に記載の融合タンパク質であって、前記第1タンパク質が、成長ホルモン、成長ホルモン化合物、またはヒト成長ホルモンである融合タンパク質。
【請求項１６】
Hpx-hGH(配列番号5);hGH-Hpx(配列番号6);Hpx(H213A)-hGH(配列番号7);hGH-Hpx(H213A)(配列番号8);His6-D4K-Hpx-hGH;(配列番号9)およびHis8-PTERP-D4K-hGH-Hpx(配列番号10)からなるリストから選択される、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
Hpx1-nであり、nが整数360〜438である、Hpxバリアント。
【請求項１８】
Hpxm-439であり、mが整数2〜100である、Hpxバリアント。
【請求項１９】
Hpxq-pであり、qが整数2〜50であり、pが整数389〜438である、Hpxバリアント。
【請求項２０】
Hpxから50アミノ酸までを付加、欠失および／または置換させることによって得られるHpxバリアント。
【請求項２１】
Hpxと少なくとも80%配列同一性を有するHpxバリアント。
【請求項２２】
Hpx配列における１以上のHis213およびHis270を欠失および／または置換させることによって得られるHpxバリアント。
【請求項２３】
第1タンパク質の循環時間を増加させる方法であって、前記第1タンパク質をHpxまたはHpxバリアントへと、自由選択でリンカーを介して融合して、融合タンパク質を取得することを備える方法。
【請求項２４】
請求項23記載の方法であって、前記リンカーが存在しない方法。
【請求項２５】
請求項23に記載の方法であって、前記リンカーが存在する方法。
【請求項２６】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記HpxバリアントがHpx1-nであり、nが整数360〜438である方法。
【請求項２７】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記HpxバリアントがHpxm-439であり、mが整数2〜100である方法。
【請求項２８】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記HpxバリアントがHpxq-pであり、qが整数2〜50であり、pが整数389〜438である方法。
【請求項２９】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記Hpxバリアントが、Hpxから50アミノ酸までを付加、欠失および／または置換させることによって得られる方法。
【請求項３０】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記Hpxバリアントが、Hpxと少なくとも80%配列同一性を有する方法。
【請求項３１】
請求項23〜25の何れか１項に記載の方法であって、前記Hpxバリアントが、Hpx配列における１以上のHis213およびHis270を欠失および／または置換させることによって得られる方法。
【請求項３２】
請求項23〜31の何れか１項に記載の方法であって、前記方法において得られた融合タンパク質が、影響される循環時間における変化を評価するため適切なアッセイでアッセイされる工程を備える方法。
【請求項３３】
請求項23〜31の何れか１項に記載の方法であって、前記融合タンパク質を、7を超えるpHの水性の非洗浄剤のスルホベタインおよび尿素中で希釈リフォールディングによってリフォールディングさせることを備える方法。
【請求項３４】
請求項33に記載の方法であって、前記リフォールディングが、約1MのNDSB201、約1Mの尿素において約pH9.0で実施される方法。
【請求項３５】
請求項1〜22の何れか１項に記載のタンパク質をコード化している核酸配列を含んでいる核酸構築物。
【請求項３６】
請求項35に記載の核酸構築物を含んでいるベクター。
【請求項３７】
請求項36に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項３８】
請求項1〜16の何れか１項に記載の融合タンパク質の、療法における使用。
【請求項３９】
請求項1〜16の何れか１項に記載の融合タンパク質を含んでいる薬学的組成物。
【請求項４０】
成長ホルモン欠乏、ターナー症候群、プラーダーヴィリ症候群、慢性腎不全、AIDS消耗症、または加齢を治療する方法であって、請求項15〜16の何れか１項に記載の融合タンパク質の効果的な量を、それを必要とする患者に投与することを備える方法。
【請求項４１】
請求項40に記載の方法であって、週に１回又はより長いインターバルでの非経口投与を備える方法。
【請求項４２】
請求項15〜16の何れか１項に記載のHpx融合タンパク質の、成長ホルモン欠乏、ターナー症候群、プラーダーヴィリ症候群、慢性腎不全、AIDS消耗症、および加齢から選択される疾患を治療するための医薬の製造における使用。
【請求項４３】
請求項42に記載の使用であって、前記医薬が週に１回又はより長いインターバルでの投与を意図する使用。
【請求項４４】
請求項1〜16の何れか１項に記載のHpx融合タンパク質に特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ヘモペキシン(Hpx)融合タンパク質に関する。また、本発明は、タンパク質の循環時間を、前記タンパク質をHpxまたはHpxバリアントに融合させることによって増加させる方法に、及びHpx融合タンパク質をそれを必要とする患者に投与することを備える治療方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ヘモペキシン(Hpx)は、アルブミン、免疫グロブリン、および血漿プロテアーゼに次いで高い量で血漿中に存在する、60kDaのタンパク質である。また、ヘモペキシンは、しばしばベータ-1B-糖タンパク質とも称されえる。ヘモペキシンは、ヘムに対して高い親和性を有し（KD<10-12M）、そして、Hpxの生物学的な役割がヘムの運搬に関するので、ヘム誘導性の酸化的ダメージおよびヘム結合性鉄欠乏（heme bound iron loss）が阻止されることが信じられている。ヘモペキシンは遊離ヘムを血漿から隔離し、これによって構造変化が誘導され、ヘム-Hpx複合体は肝臓中（ここでレセプター媒介性のエンドサイトーシスによって飲み込まれる）のレセプターに対する親和性の増加を得る；そしてヘムは、低いｐＨでエンドソームに放出される。その後、Hpxは、循環に戻り、更なるラウンドの運搬を経験することができる。
【０００３】
ヘモペキシンは、２つの相同性ドメインに折りたたまれ、各々は約２００アミノ酸であり、２０アミノ酸残基のリンカーによって連結される。２つのドメイン間に~25%配列同一性が存在する。２つのヒスチジンがヘム鉄を統合する。すなわち、リンカーペプチドからのHis213とＣ末端ドメインのループからのHis270とであり、これによって安定なbis-ヒスチジル  Fe(III)複合体が提供される。ナンバリングは、成熟タンパク質についてなされる。文献〔Clin. Chim. Acta, 312, 2001, 13-23 and DNA Cell Biol., 21, 2002, 297-304〕によって、最近のHpx化学の総説が提供される。
【０００４】
多くの試みが、タンパク質（特に治療的に関連するタンパク質の）の循環時間を増加させるためになされている。伝統的には、タンパク質は、例えば、アルブミンに結合すると信じられている脂肪酸に、又は腎臓クリアランスを減少させるために分子サイズを増加させるPEGなどの大きな分子に結合されている〔J.Pharm.Sci., 86, 1365-1368, 1997; US 4,179,337〕。別のアプローチは、所望のタンパク質を別のタンパク質（例えば、アルブミン）に融合させることである〔US5,045,312;WO97/24445;WO01/79271〕。
【０００５】
興味深い生物学的な又は治療上の活性を有する既知のタンパク質の数は、とりわけヒトゲノム計画の結果急速に多くなっている。しかしながら、これらの新規のタンパク質と同様に「古く」、よく研究されたタンパク質の治療上の可能性は、循環における非常に短い半減期によってしばしば限定される。それ故、循環におけるタンパク質の半減期を増加させる方法が必要とされる。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、HpxまたはHpxバリアントへと（自由選択で、リンカーを介して）融合された第1タンパク質を含んでいる、Hpx融合タンパク質に関する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、第1タンパク質の循環時間を増加させる方法に関し、該方法は前記第1タンパク質をHpxまたはHpxバリアントへと（自由選択で、リンカーを介して）融合することを備える。
【０００８】
別の態様において、本発明は、Hpxのバリアントに関する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、本発明のHpx融合タンパク質またはHpxバリアントをコード化している核酸構築物に、前記構築物を含んでいるベクターに、前記ベクターで形質転換された宿主細胞に、及び前記構築物、ベクター、または宿主細胞を用いて本発明のHpx融合タンパク質またはHpxバリアントを作出する方法に関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、本発明のHpx融合タンパク質またはHpxバリアントに対して産生された特異的な抗体に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、療法（therapy）における本発明のHpx融合タンパク質の使用に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、本発明のHpx融合タンパク質を含んでいる薬学的組成物に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、治療上効果的な量の本発明のHpx融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを備える治療方法に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、医薬の製造における本発明のHpx融合タンパク質の使用に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、改変されて、本発明の核酸構築物を含み、本発明のHpx融合タンパク質またはHpxバリアントを発現するトランスジェニック生物に関する。
【００１６】
［定  義］
本発明において、「Hpx」はヒトHpxを指摘することを意図しており、その配列はTakahashi〔Takahashi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82(1), 73-77, 1985〕などから利用可能である。
【００１７】
本発明において、「a」は、「1以上の（one or more）」を指摘することを意図している。
【００１８】
本発明において、「Hpx融合タンパク質（Hpx fusion protein）」は、第1タンパク質（例えば、治療上のタンパク質）をHpxまたはHpxバリアントである第2タンパク質と融合させることによって形成されるタンパク質を指摘することを意図している。前記第2タンパク質は、前記融合タンパク質の「Hpx部分（Hpx part）」を意味する。前記融合は、次の意味で直接的であってもよいことが理解されるべきである；つまり、HpxまたはHpxバリアントのN末端またはC末端が、前記第1タンパク質のN末端またはC末端へと直接的に結合するとの意味である。また、前記融合はリンカーを経由していてもよい；該リンカーは、一端でHpxまたはHpxバリアントと結合され、別端で上記第1タンパク質と結合される。前記第1タンパク質における及び前記HpxまたはHpxバリアントにおける付着点は、該タンパク質を構成しているアミノ酸残基の何れかで、即ち、Ｃ末端で、Ｎ末端で又は中間のアミノ酸残基の何れかであってもよい。
【００１９】
本発明において、「リンカー（linker）」は、融合タンパク質の２つの部分（即ち、Hpx部分および第1タンパク質）を連結するために貢献する部分（moiety）である。１つの態様において、前記リンカーは、直鎖又は分枝状鎖のC1-50-アルカン、直鎖又は分枝状鎖のC2-50-アルケン、直鎖又は分枝状鎖のC2-50-アルキン、炭素および少なくとも１つのN, O又はS原子を含んでいる1〜50員の直鎖又は分枝状鎖、C3-8シクロアルカン、炭素および少なくとも１つのN, O又はS原子を含んでいる3〜8員環（芳香族又は非芳香族環）、ベンゼン、ナフタレン、或いは、アミノ酸、1以上の次の基、即ち:ヒドロキシ, フェニル, フェノキシ, ベンジル, チエニル, オキソ, アミノ, C1-4-アルキル, -CONH2 , -CSNH2, C1-4 モノアルキルアミノ, C1-4 ジアルキルアミノ, アシルアミノ, スルホニル, カルボキシル, カルボキサミド(carboxamido) , ハロゲン, C1-6 アルコキシ, C1-6 アルキルチオ（alkylthio）, アルコキシルトリフルオロ（trifluoroalkoxy）, アルコキシルカルボニル（alkoxycarbonyl）, およびハロアルキルで任意に置換される構造、に由来するビラジカルである。別の態様において、前記リンカーは、50アミノ酸残基まで（例えば、40, 30, 20 または10アミノ酸残基まで）を含んでいるタンパク質ジラジカル（protein diradical）を表す。Hpx融合タンパク質を、ある点で切断することが望ましい；この場合において、切断部位（例えば、酵素的加水分解に関する）が前記リンカーに含まれてもよい。
【００２０】
本発明において、「タンパク質（protein）」の用語は、ペプチド結合で結合された一連の2以上のアミノ酸を指摘することを意図している。好ましくは、タンパク質は、20を超えるアミノ酸残基（例えば、40を超える、例えば、50を超える）を含み、前記アミノ酸は天然の又は非天然のものである。また、前記用語は、親油性又はPEG基を付着させることなどによって、更に誘導体化されているタンパク質を含むことを意図している。一態様において、タンパク質は、治療上のタンパク質を指摘することを意図している。
【００２１】
本明細書中に使用される化合物の「治療上効果的な量（therapeutically effective amount）」は、特定の疾患及びその合併症の臨床上の症状を、治癒（cure）、軽減（alleviate）、または部分的に抑止（arrest）するために十分な量を意味する。これを達成するのに十分な量は、「治療上効果的な量」と規定される。それぞれの目的のために有効な量は、疾患または傷害の重症度、並びに治療される被検者の重量、性別、年齢、達成されるべき効果、および一般的な状態（state）などに依存する。適切な用量の決定は、値からマトリックス（a matrix）を構築すること、および前記マトリックスの異なる点を試験することなどによるルーチン試験を使用して取得しえることが理解されるだろう；この事項は、全て訓練された医師または獣医の通常の知識の範囲内である。
【００２２】
本明細書中に使用される「治療（treatment）」および「治療すること（treating）」の用語は、コンディション（例えば、疾患または障害）に対処するための、患者の管理（management）と世話（care）とを意味する。前記用語は、患者が罹患する、特定のコンディションに関する全てのスペクトルの治療を含み、例えば、徴候または合併症を軽減するための、疾患、障害、またはコンディションの進行を遅延させるための、徴候および合併症を軽減または解放（relief）するための、および／または、疾患、障害、またはコンディションを治癒または排除（eliminate）するための、同様に、コンディションを予防（prevent）するための活性化合物の投与である。ここで予防は、疾患、コンディション、または障害に対処するための、患者の管理および世話と理解され、そして徴候または合併症の開始を予防するための活性化合物の投与を含む。しかしながら、治療および予防は、本発明の別個の態様である。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳類、特にヒトであるが、動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、およびブタ）をも含む。
【００２３】
「治療上のタンパク質（therapeutic protein）」の用語は、インビボで1以上の治療上の及び／又は生物学的活性を有しているタンパク質を指摘することを意図している。治療上のタンパク質は、疾患、コンディション、または障害を治療する又は寛解するために有用である。最終的には治療上のタンパク質の活性はインビボで作用するが、治療上の活性を測定することができる当業者に既知の多くのインビトロアッセイが存在する。
【００２４】
［発明の記載］
一態様において、本発明はHpx融合タンパク質に関し、該融合タンパク質はHpxまたはHpxバリアントと融合された第1タンパク質（任意でリンカーを介して）を具備し、該融合タンパク質は前記第1タンパク質と比較して、増加した循環時間を有する。特に、増加した循環時間は、人間（man）における増加した循環時間を指摘することを意図している。
【００２５】
一態様において、前記第1タンパク質は、治療上のタンパク質である。
【００２６】
一態様において、前記第1タンパク質は、少なくとも30アミノ酸残基を含む。
【００２７】
本発明において、「Hpxバリアント（Hpx variant）」は、第1タンパク質に融合された場合に、前記第1タンパク質の循環時間が延長するバリアントと理解すべきである。一般的に、タンパク質の「バリアント」は、１以上のアミノ酸残基を、別の天然（natural）または非天然（unnatural）のアミノ酸で置換すること；１以上の天然または非天然のアミノ酸で付加させること；および／または１以上の天然または非天然のアミノ酸を、前記タンパク質から欠失させること；任意で、１以上のアミノ酸残基を更に誘導体化することで取得される。特定の態様において、４０まで（例えば３０まで、例えば２０まで、例えば１０まで、例えば５まで）のアミノ酸残基が、置換され、付加され、および／または、欠失される。特に、係る置換は、１つのアミノ酸残基が、同じグループの別のアミノ酸残基によって（即ち、類似する特性を有する別のアミノ酸残基によって）置換されるという意味において保存的なものである。アミノ酸は、特性によって次の群に分けることができる、つまり：塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン, チロシン, リジン, ヒスチジン), 酸性アミノ酸(例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸), 極性アミノ酸(例えば、グルタミンおよびアスパラギン), 疎水性アミノ酸(例えば、ロイシン, イソロイシン, バリン), 芳香族アミノ酸(例えば、フェニルアラニン, トリプトファン, チロシン)および小さいアミノ酸(例えば、グリシン, アラニン, セリン, スレオニン, メチオニン)である。
【００２８】
ヒトヘモペキシンは439のアミノ酸残基からなる。また、Hpxバリアントには、完全長HpxのＮ末端からの欠失によって得られるタンパク質が含まれる。Ｎ末端欠失によって得られるヘモペキシンバリアントは、Hpx1-nとして記載されえる（ここで、ｎは339〜438の整数である）。この命名法において、「Hpx1-400」は、アミノ酸残基1〜400（即ち、アミノ酸残基401〜439が欠失されている）からなるHpxバリアントを指摘することを意図している。特に、ｎは、360〜438の整数であり、例えば400〜438、例えば420〜438である。ヘモペキシンバリアントには、完全長HpxのＣ末端からの欠失によって取得されるタンパク質も含まれる。Ｃ末端欠失によって取得されるヘモペキシンバリアントは、Hpxm-439として記載されえる（ここで、mは2〜100の整数である）。この命名法において、「Hpx50-439」は、アミノ酸残基50〜439（即ち、アミノ酸残基1〜49が欠失されている）からなるHpxバリアントを指摘することを意図している。特に、mは、2〜20、2〜50、または2〜80の整数である。ヘモペキシンバリアントには、Ｃ末端およびＮ末端の欠失の組合せも含まれる。これは上記の命名法によって、Hpxq-pと記載することができる（ここで、qは2〜50の整数であり、pは389〜438の整数である）。特に、qは2〜10、2〜20、または2〜30の整数であり、これと組合わせてpは389〜438、410〜438、または420〜438の整数の何れかである。
【００２９】
別の態様において、本発明のHpxバリアントは、Hpxと少なくとも80%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の同一性を有している。
【００３０】
当該技術分野において既知の「同一性（identity）」の用語は、配列を比較することによって決定される、２以上のタンパク質の配列間の類縁関係を意味する。また、当該技術において、「同一性」は、2以上のアミノ酸残基のストリング（strings）間の適合（matches）の数により決定される、タンパク質間の配列関連性（sequence relatedness）の程度を意味する。「同一性」は、２以上の配列のより小さいものの間の同一性適合のパーセントを測定する〔特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって提出されるギャップアラインメントを伴う（もし必要であれば）〕。関連するタンパク質の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。係る方法には、次の文献に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない〔Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)〕。
【００３１】
同一性を決定するための好適な方法が設計され、試験された配列間の最大適合（largest match）が算出される。同一性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好適なコンピュータプログラム法には、例えばGCGプログラムパッケージ(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)が含まれ、これにはGAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))が含まれる。BLAST  Xプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI；National Center for Biotechnology Information）および他の供給元から公に利用可能である(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。
【００３２】
例えば、コンピュータアルゴリズム  GAP（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）を用いて、パーセント配列同一性が決定されるべき２つのタンパク質が彼等の個々のアミノ酸の至適なマッチング（matching）に関して整列される（前記アルゴリズムによって決定された、「適合したスパン（matched span）」）。gapオープニングペナルティー〔これは、３を平均対角に乗じて計算される；「平均対角（average diagonal）」は使用されている比較マトリックスの対角の平均である；「対角（diagonal）」は、特定の比較マトリックスによる各完全アミノ酸マッチに設定されたスコアまたは数である〕およびgapエクステンションペナルティー〔通常これは、｛分数（1/10）｝をgapオープニングペナルティーに乗じたものである〕、同様に比較マトリックス（例えば、PAM  250またはBLOSUM  62）が、前記アルゴリズムと共同して使用される。標準の比較マトリックス〔PAM250比較マトリックスに関して、Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978)；BLOSUM62比較マトリックスに関して、Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992)を参照されたい〕も、前記アルゴリズムにより使用される。
【００３３】
タンパク質配列比較のための好適なパラメータは、以下に記載するものを含む、即ち：
アルゴリズム：Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)；  比較マトリックス：Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992)からのBLOSSUM62；  Gapペナルティー（Gap Penalty）：12；  およびGap長ペナルティー（Gap Length Penalty）：4、類似性閾値（Threshold of Similarity）：0である。
【００３４】
前記GAPプログラムは、上記パラメータで有用である。上述のパラメータは、GAPアルゴリズムを用いる、タンパク質比較に関する初期設定パラメータ(エンドギャップに対してペナルティーなしの基準に従う）である。
【００３５】
上記で議論したとおり、ヘムのHpxへの結合によって、肝臓中のレセプターに対する親和性が増大するコンホメーション変化が生じる。次の事項が、信じられている；その事項とは、ヘム結合能力が減少している又は寧ろ欠失しているHpxバリアントを含んでいるHpx融合タンパク質が、循環時間の更なる増加を呈することであり、というのも肝臓レセプターへの親和性が失われているからである。ヘムの結合は、His213およびHis270（成熟タンパク質に関するナンバリング）で生じる。これらの部位での点突然変異はHpxのヘム結合親和性を除去し、そのため肝臓レセプター親和性が除去される。態様において、Hpxバリアントには、His213およびHis270の１つ若しくは双方が欠失するか又は別のアミノ酸で置換され、Hpxのヘム結合能力が少なくとも20%（例えば少なくとも50%、例えば少なくとも80%）まで減少したHpxが含まれる。係る他のアミノ酸には、AlaおよびCysが含まれる。
【００３６】
タンパク質を循環から排除するための１つの機構である腎クリアランスは、排除されるべき分子のサイズによって主に決定される。また、分子のサイズは、その分子量に大きく依存する。腎臓のカットオフ値は、約70kDaであるが、これは分子の荷電に依存する。すなわち、腎臓は、荷電した分子よりも非荷電の分子に関して高いカットオフ値を有する。一態様において、本発明は、60kDaを超える（例えば70kDa以上、例えば80kDa以上）分子量を有するHpx融合タンパク質に関する。
【００３７】
一態様において、30のアミノ酸残基までからなるリンカーが、前記第1タンパク質とHpx部分との間に挿入される。特に、このリンカーは、25アミノ酸残基、例えば20アミノ酸残基まで、例えば15アミノ酸残基まで、例えば10アミノ酸残基まで、例えば5アミノ酸残基まで、例えば1、2、3または4アミノ酸残基からなっていてもよい。
【００３８】
一態様において、本発明は、上記のHpxバリアントに関する。
【００３９】
一態様において、本発明は、第1タンパク質の循環時間（特に、人間における循環時間）を増加させる方法を提供し、該方法は前記第1タンパク質をHpxまたはHpxバリアントと融合することを備える。特に、係る方法は、影響される循環時間における変化を評価するため、適切なアッセイで前記融合タンパク質がアッセイされる工程を更に備えてもよい。特に、係る方法は、Hpx融合タンパク質が薬学的組成物に処方される工程をさらに備えていてもよい。
【００４０】
循環時間における増加は、クリアランス(CL；clearance)における減少として又は平均滞留時間（MRT；mean residence time）における増加として定量化しえる。適切なアッセイにおいて決定される、ＣＬが第1タンパク質のＣＬの50%以下へと減少される本発明の融合タンパク質は、増加した循環時間を有するといえる。適切なアッセイにおいて第1タンパク質のＭＲＴの150%以上にまでＭＲＴが増加される本発明の融合タンパク質は、増加した循環時間を有するといえる。クリアランスおよび平均滞留時間は、適切な試験動物を用いた標準の薬物動態学的試験で評価することができる。所与の融合タンパク質に関して適切な試験動物を選ぶことは、当業者の能力の範囲内である。ヒト（human）における試験は、もちろん最大限の試験を代表するものである。
【００４１】
例えば、前記融合タンパク質が成長ホルモンを含む場合、適切な試験動物の例には、通常のSprague-Dawley雄性ラット、マウスおよびカニクイザルサルが含まれる。典型的には、マウスおよびラットは、単一の皮下への大量瞬時投与（bolus）で注射され、サルには単一の皮下への大量瞬時投与で又は単一のiv用量で注射されえる。注射される量は、試験動物に依存する。引き続いて、血液サンプルが、CLおよびMRTの評価のために必要に応じて、１から５日の期間で採取される。血液サンプルは、ELISA技術で分析すると便利である。
【００４２】
一態様において、本発明の融合タンパク質は、以下のものから選択される、
Hpx-hGH(配列番号5)；
hGH-Hpx(配列番号6)；
Hpx(H213A)-hGH(配列番号7)；
hGH-Hpx(H213A)(配列番号8)；
His6-D4K-Hpx-hGH;(配列番号9)および
His8-PTERP-D4K-hGH-Hpx(配列番号10)。
【００４３】
メチオニンは、開始コドンによってコードされ、そのため翻訳の直後にタンパク質のＮ末端に存在する。しかしながら、Ｎ末端メチオニンは、翻訳後修飾（例えば、近接しているアミノ酸残基に依存するもの）において除去されてもよい。結果的に生じるタンパク質がＮ末端メチオニンを有するかどうかを予測することは困難であろう；しばしば、これをＮ末端シークエンシングによって決定しなければならない。結果的に、本発明は、付加的なＮ末端メチオニンを有する、上記で言及したタンパク質(配列番号5〜10)にも関する。
【００４４】
本発明のヘモペキシン融合タンパク質およびHpxバリアントは、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を産生させるために使用することができる。本発明において、「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、及びその抗原結合断片、例えば、F(ab')2およびFab断片（遺伝的に操作された抗体を含む）が含まれる。抗体は、本発明のペプチドに107M-1を超える又は同等のＫａで結合する場合に特異的であるといえる。抗体を調製するための方法は、例えば、文献〔Hurrell J.G.R. (Ed.) Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1982およびSambrok, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York, 1989〕に開示されている。本発明のペプチドに対して産生された抗体は、例えば、診断アッセイにおいて及びアフィニティー精製に関して使用されてもよい。
【００４５】
一態様において、本発明は、本発明のタンパク質をコード化している核酸構築物を提供する。
【００４６】
本発明の融合タンパク質は、幾つかの異なる様式で調製されてもよい。彼等は、当該技術分野における当業者に周知の、タンパク質合成法を用いて合成されてもよい。第1タンパク質およびHpx部分を適切な宿主中で別々に発現させ、引続いて２つのタンパク質を（任意でリンカーを介して）融合させることも可能である。しかしながら、特定の態様において、Hpx融合タンパク質は、適切な核酸構築物を宿主へと導入した後に宿主中で発現される。
【００４７】
本明細書中に使用される「核酸構築物（nucleic acid construct）」の用語は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはRNA起源の任意の核酸分子を指摘することを意図している。「構築物（construct）」の用語は、核酸セグメントを示すことを意図する用語であり、これは１本または２本鎖であってもよく、また、所望のタンパク質をコード化している、完全な又は部分的なヌクレオチド配列に基づいたものであってもよい。構築物は、任意に他の核酸セグメントを含有していてもよい。
【００４８】
本発明のタンパク質をコード化している本発明の核酸構築物は、適切なゲノム又はcDNA起源のものでよく、例えば、ゲノム又はcDNAライブラリを調製すること、および前記タンパク質の全部または部分をコード化しているＤＮＡ配列を、合成オリゴヌクレオチド  プローブを用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることにより取得される、これらは標準の技術(cf. Sambrook et al., supra)にしたがって実施される。本発明の課題に関して、前記タンパク質をコード化しているDNA配列は、好ましくはヒト起源のものである（すなわち、ヒトのゲノムDNAまたはcDNAライブラリに由来する）。特に、DNA配列は、ヒト起源のものであってもよい（例えば、特定のヒトの器官または細胞タイプからのcDNA又はヒトのゲノムDNAに由来する遺伝子）。
【００４９】
また、前記タンパク質をコード化している本発明の核酸構築物は、確立された標準方法、例えば、文献〔Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869〕に記載された亜リン酸アミダイト法（phosphoamidite method）、または文献〔Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805〕に記載された方法により合成的に調製してもよい。亜リン酸アミダイト法にしたがって、オリゴヌクレオチドが合成され（例えば、自動のDNA合成機において）、精製され、アニールされ（annealed）、連結させ（ligated）、そして適切なベクターにクローン化される。
【００５０】
さらに、核酸構築物は、合成およびゲノムの混合性のもの、合成およびcDNAの混合性のもの又はゲノムおよびcDNA起源の混合性のものであってもよく、合成、ゲノム、またはcDNA起源のフラグメント(必要に応じて)、全体の核酸構築物（the entire nucleic acid construct）の様々な部分に対応するフラグメントを、標準技術に基づいて連結することにより調製される。
【００５１】
また、前記核酸構築物は、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法により調製し得る〔例えば、4,683,202またはSaiki et al., Science 239 (1988), 487 - 491に記載のように〕。
【００５２】
一態様において、前記核酸構築物はDNA構築物であり、該用語は以下で排他的（exclusively）に使用される。
【００５３】
一態様において、本発明は、本発明のDNA構築物を含んでいる組換え型のベクターに関する。本発明のDNA構築物が挿入されている組換えベクターは、組換えＤＮＡ処置に都合よく供されえる、任意のベクターでよい。また、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、前記ベクターは自律的に複製するベクター、即ち、染色体外の実体（extrachromosomal entity）として存在し、その複製が染色体複製に非依存性であるベクターであってもよい（例えば、プラスミド）。或いは、前記ベクターは次のようなベクター、即ち、宿主細胞に導入された際に、前記宿主細胞ゲノムに統合され、それが統合された染色体（ｓ）と共に複製されるベクターであってもよい。
【００５４】
前記ベクターは、好ましくは発現ベクター中の本発明のタンパク質をコード化しているDNA配列が、前記DNAの転写に必要とされる付加的なセグメントに動作可能に連結される、発現ベクターである。通常は、前記発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスのDNAに由来するものである、或いは両方のエレメントを含有していてもよい。「動作可能に連結（operably linked）」の用語は、前記セグメントが、それらがそれらの意図する目的に関して協調して機能するように配置されることを示す（例えば、転写は、プロモーターで開始され、タンパク質をコード化しているDNA配列を通して進行する）。
【００５５】
前記プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を呈する任意のDNA配列でよく、前記宿主細胞に対して相同的な（homologous）又は異種性の（heterologous）のタンパク質をコード化している遺伝子に由来するものであってもよい。
【００５６】
哺乳類細胞における本発明のタンパク質をコード化しているDNAの転写を方向付けるための適切なプロモーターの例は、SV40プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864)、MT-1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., Science 222 (1983), 809 - 814)、またはアデノウイルス2主要後期プロモーターである。
【００５７】
昆虫細胞における使用に関して適切なプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター(US 4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11)、P10プロモーター(J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776)、Autographa californica多核体病ウイルス塩基性タンパク質プロモーター(EP 397 485)、バキュロウイルス前初期遺伝子1プロモーター(US 5,155,037; US 5,162,222)、またはバキュロウイルス39K遅延性-初期遺伝子プロモーター(US 5,155,037; US 5,162,222)である。
【００５８】
酵母宿主細胞における使用に関して適切なプロモーターの例には、酵母の解糖遺伝子（glycolytic genes）からのプロモーター(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434)またはアルコール脱水素酵素遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, New York, 1982)、またはTPI1(US 4,599,311)またはADH2-4c (Russell et al., Nature 304 (1983), 652 - 654)プロモーターが含まれる。
【００５９】
糸状菌（filamentous fungus）宿主細胞における使用に関して適切なプロモーターの例は、例えば、ADH3プロモーター(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099)またはtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A.oryzae  TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性α-アミラーゼ（acid stable α-amylase）、A.niger、またはA.awamoriグルコアミラーゼ(gluA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、A.oryzaeアルカリ性プロテアーゼ、A.oryzae三炭糖リン酸塩イソメラーゼ、またはA.nidulansアセトアミダーゼをコード化している遺伝子に由来するものである。好適なものは、TAKA-アミラーゼおよびgluAプロモーターである。
【００６０】
細菌の宿主細胞における使用に適切なプロモータの例には、Bacillus stearothermophilusのマルトース産生性アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformisのアルファ-アミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciensのBANアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtilisのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はBacillus pumilus キシロシダーゼ遺伝子のプロモータ、或いはファージのLambda PRもしくはPLプロモータ又はE. coliのlac, trpもしくはtacプロモータが含まれる。
【００６１】
また、本発明のタンパク質をコード化しているDNA配列は、必要な場合には、適切なターミネーター〔例えば、細菌性のターミネーターT7、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または（真菌性の宿主に関して）TPI1(Alber and Kawasaki, op. cit.)またはADH3(McKnight et al., op. cit.)ターミネーター〕に動作可能に連結されてもよい。前記ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えば、SV40またはアデノウイルス5  Elb領域からの)、転写エンハンサー配列(例えば、SV40エンハンサー)および翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスVA  RNAsをコード化しているもの)などの因子を更に具備していてもよい。
【００６２】
本発明の組換え型ベクターは、前記ベクターを所望の宿主細胞中で複製させることを可能にするDNA配列を更に具備していてもよい。係る配列の例（宿主細胞が哺乳類細胞である場合）は、複製のSV40起点である。
【００６３】
宿主細胞が酵母細胞である場合、前記ベクターを複製可能にする適切な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製起点である。
【００６４】
宿主細胞が細菌細胞である場合、前記ベクターを複製可能にする配列は、ＤＮＡポリメラーゼIII複合体コード遺伝子および複製起点である。
【００６５】
また、前記ベクターは、その産物が宿主細胞における欠陥を相補する遺伝子などの選択マーカーを具備してもよい。これは、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードしている遺伝子またはSchizosaccharomyces pombeのTPI遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130によって記載）、又はアンピシリン, カナマイシン, テトラサイクリン, クロラムフェニコール, ネオマイシン, ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与するものなどである。糸状菌類に関する、選択可能なマーカーには、amdS, pyrG, argB, niaD および sCが含まれる。
【００６６】
本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌経路（secretory pathway）へと方向付ける（direct）ために、分泌性シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる)を組換えベクターに提供してもよい。分泌性シグナル配列は、正しい読み枠で、前記タンパク質をコード化しているDNA配列と連結される。分泌性シグナル配列は、前記タンパク質をコード化しているDNA配列に対して、5'に通常配置される。分泌性シグナル配列は、前記タンパク質と通常関連するものであってもよい又は別の分泌タンパク質をコード化している遺伝子からのものであってもよい。
【００６７】
酵母細胞からの分泌に関して、分泌性シグナル配列は、発現したタンパク質の前記細胞の分泌経路への効率的な方向付けを保証する任意のシグナルペプチドをコード化してもよい。前記シグナルペプチドは、天然で生じている（naturally occurring）シグナルペプチド、又はその機能的な部分であってもよい、又は合成ペプチドであってもよい。適切なシグナルペプチドは、α-因子シグナルペプチド(cf. US 4,870,008)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(cf. O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646)、修飾したカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(cf. L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897)、酵母BAR1シグナルペプチド(cf. WO 87/02670)、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチド(cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137)であることが見出されている。
【００６８】
酵母における効率的な分泌に関して、リーダーペプチドをコード化している配列が、シグナル配列の下流およびタンパク質をコード化しているDNA配列の上流に挿入されてもよい。リーダーペプチドの機能は、発現されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へと、更に培養培地への分泌に関連する分泌小胞（secretory vesicle）へと方向付けることを可能にすることである(即ち、タンパク質の、細胞壁を横切った輸送又は少なくとも細胞膜を介した酵母細胞の細胞膜周辺腔への輸送)。前記リーダーペプチドは、酵母α-因子リーダーであってもよい(その使用は、例えば、US 4,546,082, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544およびEP 163 529に記載されている)。或いは、前記リーダーペプチドは合成プロペプチドであってもよく、つまり自然界でみつけることができないリーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463またはWO 92/11378に記載されたように構築し得る。
【００６９】
糸状菌における使用に関して、前記シグナルペプチドは、コウジカビ属の種（Aspergillus sp）のアミラーゼまたはグルコアミラーゼをコード化している遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼまたはプロテアーゼまたはHumicola lanuginosaのリパーゼをコード化している遺伝子から由来するものであってもよい。前記シグナルペプチドは、好ましくはA.oryzae TAKAアミラーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼ、またはA.nigerグルコアミラーゼをコード化している遺伝子から由来するものである。
【００７０】
昆虫細胞における使用に関して、前記シグナルペプチドは、昆虫遺伝子(cf. WO 90/05783)、例えば、lepidopteran Manduca sextaの脂質動員ホルモン前駆物質シグナルペプチド(cf. US 5,023,328)から由来するものであってもよい。
【００７１】
それぞれ、タンパク質をコード化しているＤＮＡ配列、プロモーターおよび任意でターミネーター、および／または分泌性シグナル配列を連結するために及びそれらを適切なベクター（このベクターは複製に必要な情報を含有している）に挿入するために使用される処置は、当業者に周知である(cf.、例えば、Sambrook et al., op.cit.)。
【００７２】
本発明のDNA構築物または組換えベクターが導入された宿主細胞は、本発明のタンパク質を産生する能力を有する任意の細胞でありえ、該宿主細胞には、細菌、酵母、真菌、および高等真核細胞が含まれる。
【００７３】
培養に際して本発明のタンパク質を産生する能力がある細菌性の宿主細胞の例は、例えばBacillus（例えば、B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium またはB. thuringiensisの株）の株、又はStreptomyces（例えば、S. lividansまたはS. murinus）の株などのグラム陽性細菌、またはグラム陰性細菌（例えば、Echerichia coli）である。細菌の形質転換は、既知の様式のプロトプラスト形質転換により又はコンピテント細胞を用いることにより達成されてもよい（cf. Sambrook et al., supra）。
【００７４】
タンパク質を細菌（例えば、E. coli）中で発現させた場合、タンパク質は細胞質に保持されるか〔典型的には、不溶性の顆粒として（封入体として知られる）〕、又は細胞膜周辺腔へと細菌性の分泌配列によって方向付けられえる。前者のケースにおいて、細胞は溶解される。そして、顆粒が、回収され、変性され、タンパク質が変性剤を希釈することによってリフォールドされる。後者のケースにおいて、タンパク質は、細胞膜周辺腔から、細胞膜周辺腔の内容物を放出させるために細胞を破壊すること（例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって）、タンパク質を回収することによって回収されえる。
【００７５】
適切な哺乳類細胞株の例は、COS(ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10), CHL(ATCC CCL39)またはCHO(ATCC CCL 61)細胞株である。哺乳類細胞を形質移入する及び前記細胞に導入したＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えば、文献〔Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; およびNeumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845〕に記載されている
適切な酵母細胞の例には、Saccharomyces spp.またはSchizosaccharomyces spp.の細胞が、特にSaccharomyces cerevisiaeまたはSaccharomyces kluyveriの株が含まれる。酵母細胞を異種性のDNAで形質転換する及びそれからの異種性のタンパク質を産生させるための方法は、例えば、US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、5,037,743、および US 4,845,075に記載され、これら全ては参照によって援用される。形質転換された細胞は、選択可能なマーカー（一般に薬剤抵抗性または特定の栄養分（例えば、ロイシン）の非存在下で成長する能力）により決定される表現型により選択される。酵母における使用に関して好適なベクターは、US 4,931,373に開示されるPOT1ベクターである。本発明のタンパク質をコード化しているDNA配列は、シグナル配列および任意でリーダー配列（例えば、上記のような）により先行されていてもよい。適切な酵母細胞の更なる例は、Kluyveromyces（例えば、K.lactis）、hansenula（例えば、H.polymorpha、またはPichia（例えば、P.pastoris）の株である(cf. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; US 4,882,279)。
【００７６】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、コウジカビ属 spp.（Aspergillus spp.）、パンカビ属 spp.（Neurospora spp.）、フザリウム spp.（Fusarium spp.）、またはトリコデルマ属 spp.（Trichoderma spp.）の細胞、特にA.oryzae、A.nidulans、またはA.nigerの株である。コウジカビ属 spp.のタンパク質の発現に関する使用は、例えば、EP272277およびEP230023に記載されている。F.oxysporumの形質転換は、例えば、文献（Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156）に記載のとおり実施し得る。
【００７７】
糸状菌が宿主細胞として使用される場合、それを本発明のDNA構築物で、前記DNA構築物を宿主染色体に統合させて組換え宿主細胞（recombinant host cell）を得ることにより形質転換し得る。この統合は一般的には有利であると考えられる、というのも前記DNA配列が前記細胞において安定的に維持される可能性が高いからである。前記DNA配列の宿主染色体への統合は、従来の方法（例えば、相同的な又は異種性の組換えによる）にしたがって実施し得る。
【００７８】
昆虫細胞の形質転換及びその中での異種性のタンパク質の産生は、US 4,745,051；US 4,879,236；US 5,155,037；5,162,222；EP 397,485に記載のとおり実施し得る（これらの文献の全ては本明細書中に参照によって援用される）。宿主として使用される昆虫株化細胞は、鱗翅目株化細胞（例えば、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia ni細胞）であってもよい(cf. US 5,077,214)。培養条件は、例えば、WO 89/01029またはWO 89/01028に、または上述の文献の何れかに記載されたとおりであってもよい。
【００７９】
上記の形質転換された又は形質移入した宿主細胞は、次に適切な栄養培地中で、本発明のタンパク質の発現を許容する条件下で培養され、その後、生じたペプチドは培養物から回収される。
【００８０】
前記細胞を培養するために使用される培地は、前記宿主細胞を成長させるために適切な任意の従来培地、例えば、適切なサプリメントを含有する最小の又は複合的（complex）な培地であってもよい。適切な培地は、商業上の提供者から購入される又は公開されたレシピ(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ中の）にしたがって調製し得る。前記細胞により産生されたタンパク質は、次に培養培地から従来の処理により回収される〔この処理には宿主細胞を培地から遠心分離または濾過により分離すること、上清もしくは濾過物のタンパク性成分を塩（例えば、アンモニウム硫酸塩）で沈殿させ、様々なクロマトグラフィー処理（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）により精製すること、等が含まれる〕、この処理は問題のタンパク質のタイプに依存して行われる。
【００８１】
本発明のタンパク質を産生するためのトランスジェニック動物技術を実施することも、本発明の範囲内である。トランスジェニック動物は、そのゲノム中に異種性のＤＮＡ配列が導入されている動物である。特に、本発明のタンパク質は、非ヒト雌性哺乳類の乳腺中に発現されえる（特に、大量のミルクを産生することが知られているもの）。好適な哺乳類の例は家畜動物（例えば、ヤギ、ヒツジおよびウシ）であるが、小さい哺乳類（例えば、マウス、ウサギまたはラット）も使用しえる。
【００８２】
本発明のタンパク質をコード化しているＤＮＡ配列を、動物へと、この目的に関して前に記載された方法の何れか１つによって導入しえる。例えば、乳腺における発現を得るため、ミルクタンパク質遺伝子からの転写プロモーターが使用される。ミルクタンパク質遺伝子は、カゼイン(cf. U.S.  5,304,489)、ベータ-ラクトグロブリン、アルファ-ラクトアルブミン、および乳清酸性タンパク質をコード化している遺伝子を含む。現行の好適なプロモーターは、β-ラクトグロブリンプロモーター(cf. Whitelaw et al., Biochem J. 286, 1992, pp. 31-39)である。
【００８３】
イントロンを欠損しているＤＮＡ配列が、イントロンを含有しているものと比較して、トランスジェニック動物中で不十分に発現することは当該技術において一般的に認識されている（cf. Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, pp. 836-840; Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, pp. 478-482; Whitelaw et al., Transgenic Res. 1, 1991, pp. 3-13; WO 89/01343; WO 91/02318）。トランスジェニック動物中での発現に関して、可能ならいつでも（whenever possible）、全ての又は幾つかの、所望のタンパク質をコード化している遺伝子の本来のイントロンを含んでいるゲノム配列を使用することが好ましい。β-ラクトグロブリン遺伝子などからの、少なくとも幾つかのイントロンを含むことも好ましいだろう。係る領域の１つは、ヒツジのベータ-ラクトグロブリン遺伝子の3'非翻訳領域からイントロンスプライシングおよびRNAポリアデニル化に関して提供されるDNAセグメントである。遺伝子の本来の3'非コード領域配列に対して置換される場合、このセグメントは、所望のタンパク質の発現レベルを増強及び安定化しえる。所望のタンパク質の開始コドンを囲んでいる（surrounding）領域を、ミルクタンパク質遺伝子の対応する配列で置換することも可能だろう。係る置換により、推定上の組織特異的な開始環境が提供されて、発現が増強される。
【００８４】
本発明のタンパク質のトランスジェニック動物における発現に関して、前記タンパク質をコード化しているヌクレオチド配列は、その発現に要求される付加的なDNA配列に動作可能に連結されて、発現ユニットを産生する。係る付加的な配列は、前述のプロモーター、同様に転写の終結およびmRNAのポリアデニル化に要求される配列を含む。前記発現ユニットは、前記タンパク質をコード化している配列に動作可能に連結された分泌性シグナル配列をコード化しているDNA配列を更に含む。分泌性シグナル配列は、タンパク質の本来のものであってもよく又は別のタンパク質のもの〔例えば、ミルクタンパク質(cf. von Heijne et al., Nucl. Acids Res. 14, 1986, pp. 4683-4690;およびUS 4,873,316)〕であってもよい。
【００８５】
トランスジェニック動物で使用するための発現ユニットの構築は、本発明のタンパク質をコード化しているDNA配列を、付加的なDNA配列を含んでいるベクターへと挿入することにより都合よく実施されえるが、前記発現ユニットは基本的に連結物（ligations）の何れかの配列により構築され得る。ミルクタンパク質をコード化しているDNA配列を含んでいるベクターを提供すること及びミルクタンパク質に関するコード領域を本発明のタンパク質をコード化しているDNA配列で置換することは、特に都合がよく；これによってミルクタンパク質遺伝子の発現制御配列（expression control sequences）を含む融合体が作出される。
【００８６】
発現ユニットは、次に選択された宿主種の受精卵または早期段階の胚へと導入される。異種性DNAの導入は、マイクロインジェクション(cf. US 4,873,191)、レトロウイルス感染(cf. Jaenisch, Science 240, 1988, pp. 1468-1474)、または胚性幹細胞を用いた部位特異的統合（site-directed integration）(Bradley et al., Bio/Technology 10, 1992, pp. 534-539により論評されている)を含む、いくつかの様式で実施しえる。前記卵は、次に偽妊娠メスの卵管（oviducts）または子宮に移植され、期間（term）まで発生させる。生殖系列において導入されたDNAを保持している子孫は、前記DNAを彼らの後代（progeny）へと伝達することができ、トランスジェニック群（transgenic herds）の発生が可能となる。
【００８７】
トランスジェニック動物を生産するための一般的な処置は、当該技術分野において知られている〔cf. 例えば, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6, 1988, pp. 179-183; Wall et al., Biol. Reprod. 32, 1985, pp. 645-651; Buhler et al., Bio/Technology 8, 1990, pp. 140-143; Ebert et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988; Krimpenfort et al., Bio/Tecnology 9: 844-847, 1991, Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992; US 4,873,191, US 4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188; WO 92/11757 およびGB 87/00458〕。異種性のＤＮＡ配列を哺乳類及び彼らの胚細胞へと導入するための技術は、最初にマウスにおいて開発された。例えば、「Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980, Gordon and Ruddle, Science 214: 1244-1246, 1981; Palmiter and Brinster, Cell 41: 343-345, 1985; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985; およびHogan et al. (ibid.)」を参照されたい。これらの技術は、引き続いて、大型の動物（家畜種を含む）での使用に関して適用された(例えば、WO 88/00239, WO 90/01588 およびWO 92/11757; およびSimons et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988を参照されたい）。要約す
ると、トランスジェニックマウスまたは家畜の産生においてこれまで使用された最も効率的な経路において、所望のDNAの数百の直鎖状分子が、当該技術において標準的となった技術にしたがって、受精卵の前核（pro-nuclei）の１つに注射される。接合体（zygote）の細胞質へのDNAの注射も使用できる。
【００８８】
別の態様において、第1タンパク質およびHpx部分は、別々に発現される。第1タンパク質は次に２機能性リンカー(活性化)と反応してもよく、これによって前記リンカーは第1官能基を介して第1タンパク質に結合される。活性化タンパク質は引き続いてHpx部分と反応されて、それによって前記Hpx部分は第2官能基を介して前記リンカーに結合される。前記リンカーを最初に前記Hpx部分と反応させ、次に第1タンパク質と反応させるように、反応順（reaction order）を逆にしえることは当業者には明らかである。
【００８９】
多数の官能基が、タンパク質およびリンカー間の結合を形成するために利用させる文献に開示されている。関連性のある文献は、例えば、WO03/044056およびBiomaterials, 22, 405-417, 2001である。典型的には、有用な付着点であるタンパク質中の基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、アルデヒド、およびケトンであり、これらは本来のタンパク質中に存在してもよい又は酸化などによって作出してもよい。第1タンパク質およびHpx部分がリンカーを介して融合される場合、前記リンカーは原則的に第1タンパク質中の任意のアミノ酸残基に及びHpx部分の任意のアミノ酸残基に付着されてもよい。
【００９０】
第1タンパク質は、例えば、特性をさらに修飾するために親油性またはPEG基を付着させることによってさらに誘導体化してもよい。また、HpxまたはHpxバリアントとの融合に際して、結果的に生じた融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の特性をさらに修飾するために親油性またはPEG基を付着させることによってさらに誘導体化してもよい。
【００９１】
任意のタンパク質を、本発明によるHpxまたはHpxバリアントに原則的に融合しえる。係るタンパク質には、酵素, ペプチドホルモン, 成長因子, 抗体, サイトカイン, レセプター, リンフォカインおよびワクチン抗原が含まれ、特別の言及は治療タンパク質, 例えば、インシュリン, グルカゴン様ペプチド１ (GLP-1), グルカゴン様-ペプチド2 (GLP-2), 成長ホルモン, サイトカイン, トレフォイル因子ペプチド（trefoil factor peptides）(TTF), ペプチドメラノコルチン レセプターモディファイヤー（peptide melanocortin receptor modifiers）およびVII因子化合物に関してなされる。一態様において、本発明は、HpxまたはHpxバリアントの融合に加えて、Hpx融合タンパク質の特性の更なる修飾をえるために、親油性基またはPEGなどで誘導体化されたHpx融合タンパク質に関する。
【００９２】
具体的に適用可能なインシュリンは、ヒトインシュリンである。本発明において「ヒトインシュリン（human insulin）」の用語は、天然で産生されたインシュリンまたは組換え技術で産生されたインシュリンを意味する。組換え型のヒトインシュリンは、任意の適切な宿主細胞において産生でき、例えば、前記宿主細胞は細菌性、真菌性 (酵母を含む)、昆虫、動物または植物細胞であってもよい。多くのインシュリン化合物は文献中に開示されており、それらも本発明の方法に特に有用である。「インシュリン化合物」（および関連する表現）は、1以上のアミノ酸が、他のアミノ酸（天然または非天然）によって欠失および／または置換されたヒトインシュリン、および／または付加的なアミノ酸（天然または非天然）（即ち、51アミノ酸を超える）を具備しているヒトインシュリン、および／または少なくとも１つの有機置換基が1以上のアミノ酸に結合されたヒトインシュリンを意味する。
【００９３】
本発明に関連するGLP-1の例には、ヒトGLP-1およびGLP-1化合物が含まれる。ヒトGLP-1は、37アミノ酸残基のペプチドであり、プレプログルカゴン（i.a.  遠位の回腸のＬ細胞、膵臓および脳で合成される）に由来する。GLP-1は、糖代謝と胃腸の分泌および代謝とにおける調節機能を有する重要な胃腸ホルモンである。プレプログルカゴンのプロセッシング〔GLP-1(7-36)アミド、GLP-1(7-37)およびGLP-2を生じる〕は、主にL細胞で生じる。断片  GLP-1(7-36)-アミドおよびGLP-1(7-37)は、双方グルコース依存的なインシュリン分泌性因子である。過去数十年間において、GLP-1の幾つかの構造類似物（structural analogues）が、ヒーラモンスタートカゲ（Gila monster lizards）(Heloderma suspectum および Heloderma horridum)の毒から単離された。Exendin-4は、Heloderma horridumの毒液から単離された39アミノ酸残基のペプチドであり、このペプチドは、GLP-1と52%の相同性を共有している。Exendin-4は、強力なGLP-1レセプターアゴニストであり、イヌに注射されたときに、インシュリン放出を刺激し、血中グルコースレベルの低下を確実（ensuring）にすることが示されている。GLP-1(1-37)およびexendin-4(1-39)および特定の断片、アナログ、及びその誘導体のグループ（本明細書中でGLP-1化合物と指定される）は、強力なインシュリン分泌性因子であり、彼らの全ては本発明の方法に適用可能である。GLP-1(1-37)のインシュリン分泌性断片は、全体配列がGLP-1(1-37)の配列中に見出せ、そこで少なくとも１つの末端アミノ酸が削除されているインシュリン分泌性ペプチドである。GLP-1(1-37)のインシュリン分泌性断片の例は、GLP-1(1-37)のポジション1-6におけるアミノ酸残基が削除されたGLP-1(7-37)およびGLP-1(1-37)のポジション1-6および37におけるアミノ酸残基が削除されたGLP-1(7-36)である。exendin-4(1-39)のインシュリン分泌性断片の例は、exendin-4(1-38)およびexendin-4(1-31)である。化合物のインシュリン分泌性特性は、当該技術分野において周知のインビボまたはインビトロアッセイで決定されえる。一例を挙げると、前記化合物は、動物に投与され、インシュリン濃度の時間経過がモニタされる。GLP-1(1-37)およびexendin-4(1-39)のインシュリン分泌性アナログ（Insulinotropic analogs）はそれぞれ、その分子において１以上のアミノ酸残基が天然または非天然の他のアミノ酸残基で交換（exchanged）されている及び／又はその分子から１以上のアミノ酸残基が欠失（deleted）されている及び／又はその分子から天然または非天然の１以上のアミノ酸残基が付加（added）されている分子を意味する（但し、前記アナログは、インシュリン分泌性であるか又はインシュリン分泌性化合物のプロドラックである）。
【００９４】
GLP-2およびGLP-2化合物も、本発明によって修飾されえる。本発明において、GLP-2化合物は、GLP-2レセプターと、好ましくは1μM以下（例えば、100nM以下）の親和性の定数 (KD)または作用強度(EC50)で結合する。「GLP-2化合物」の用語は、１以上のアミノ酸残基が削除された及び／又は別のアミノ酸残基（天然または非天然）で置換されたヒトGLP-2を、及び／又は付加的なアミノ酸残基を具備しているヒトGLP-2を、及び／又は少なくとも１つの有機置換基が１以上のアミノ酸残基と結合しているヒトGLP-2を指摘することを意図している。特に、次のペプチドが考慮される、それはアミノ酸配列がヒトGLP-2のアミノ酸配列の60%を超える33連続アミノ酸（33 consecutive amino acids）の任意の配列で提示されるものである。また、次のペプチドが考慮される；それはアミノ酸配列が、前記アミノ酸配列から4アミノ酸までが削除された場合、ヒトGLP-2のアミノ酸配列の60%を超える37連続アミノ酸の任意の配列で提示されるものである。また、次のペプチドが考慮される；それはアミノ酸配列が、2アミノ酸までがそれらのアミノ酸に付加された場合、GLP-2のアミノ酸配列の60%を超える31連続アミノ酸の任意の配列で提示されるものである。また、「GLP化合物」の用語には、１つの個体から別の個体へ存在（exist）し、発生（occur）しえる対立遺伝子バリエーション（allelic variations）が含まれる。また、糖鎖形成または他の翻訳後修飾の程度および位置は、選ばれた宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して異なってもよい。本発明にしたがって使用しえる候補GLP-2化合物には、WO 96/32414, WO 97/39031, WO 98/03547, WO 96/29342, WO 97/31943, WO 98/08872（該文献は、全て本明細書中に参照によって援用される）に記載されたGLP-2化合物が含まれる。
【００９５】
本発明に関連するVII因子化合物は、野生型VII因子(即ち、米国特許第4,784,950号に開示されたアミノ酸配列を有しているタンパク質)、同様に、野生型VII因子、VII因子関連ポリペプチド同様にVII因子誘導体およびVII因子結合体（Factor VII conjugates）と比較して、実質的に同じ、減少した、又は改善された生物活性を呈しているVII因子のバリアントを包含する。「VII因子化合物（Factor VII compounds）」の用語は、VII因子ポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク質分解性にプロセスされてこれらのそれぞれの生理活性の形態に産生された、VIIa因子と指定されるものを含むことが意図される。典型的には、VII因子は、残基152および153の間で切断されてVIIa因子を産出する。VII因子の係るバリアントは、ヒトVII因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変更された比活性などを含む異なる特性を示してもよい。
【００９６】
本明細書中に使用される、「VII因子関連ポリペプチド（Factor VII-related polypeptides）」は、野生型VIIa因子と比較して、実質的に修飾または減少されたVIIa因子生物活性を有するバリアントを含む、ポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、特定のアミノ酸配列の変更を導入して、ポリペプチドの生理活性を修飾または崩壊（disrupt）させた、VII因子またはVIIa因子が限定されることなく含まれる。
【００９７】
本明細書中に使用される「VII因子誘導体（Factor VII derivative）」の用語は、野生型VII因子およびVII因子関連ポリペプチドと比較して、実質的に同じか又は改善された生物活性を呈している野生型VII因子、VII因子のバリアントを指定することを意図しており、ここで親ペプチドの1以上のアミノ酸は、例えば、アルキル化、PEG化（PEGylation）、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学的に修飾されている。これにはPEG化ヒトVIIa因子、システイン―PEG化ヒトVIIa因子及びそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
「PEG化ヒトVIIa因子（PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに結合されたPEG分子を有しているヒトVIIa因子を意味する。前記PEG分子は、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含む、VIIa因子ポリペプチドの任意の部分に付着しえることが理解される。「システイン―PEG化ヒトVIIa因子（cysteine-PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に結合させたPEG分子を有しているVIIa因子を意味する。
【００９９】
血液凝固におけるVIIa因子の生物活性は、これが（i）組織因子（TF）に結合する能力、および（ii）IX因子またはX因子のタンパク質分解性の切断を触媒して活性化されたIX因子またはX因子（それぞれIXa因子またはXa因子）を産生する能力に由来する。本発明の目的のために、VIIa因子の生物活性は、たとえば米国特許第5,997,864号に記載されているとおり、VII因子が欠乏した血漿およびトロンボプラスチンを用いて、調製物が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量してもよい。このアッセイ法において、生物活性は、コントロールサンプルと比較した凝固時間の減少として表され、１単位／mlのVII因子活性を含むプールされたヒト血清標準と比べることにより「VII因子単位（Factor VII units）」に換算される。代わりに、VIIa因子の生物活性は、(i)脂質膜およびX因子に包埋（embedded）されたTFを含む系において、VIIa因子がXa因子を産生する能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii)水性系におけるX因子の加水分解を測定すること；(iii)表面プラスモン共鳴に基づいた機器を使用して、そのTFに対する物理的な結合を測定すること；および(iv)合成基質（synthetic substrate）の加水分解を測定することによって定量してもよい。
【０１００】
野生型VIIa因子と比較して実質的に同じ又は改善された生物活性を有するVII因子バリアント（Factor VII variants）は、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生されたVIIa因子の比活性（specific activity）の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、および最も好ましくは少なくとも約90％を示すものを包含する。VII因子バリアントは、野生型VIIa因子と比較して実質的に減少した生物活性を有し、上記の通りに凝固アッセイ法、タンパク質分解アッセイ法、またはTF結合実験の１つまたは複数において試験したときに、同じ細胞タイプにおいて産生された野生型VIIa因子の比活性の約25％未満、好ましくは約10％未満、より好ましくは約5％未満、および最も好ましくは約1％未満を示すものである。野生型VII因子と比較して実質的に修飾された生物活性を有するVII因子バリアントは、TF非依存性のX因子タンパク分解活性を示すVII因子バリアント、およびTFに結合するが、X因子を切断しないものを含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
VII因子のバリアントは、実質的に野生型VII因子と同じ若しくは優れた生理活性を示すか、または代わりに、野生型VII因子と比較して実質的に修飾され、もしくは減少した生理活性を示すかどうかにかかわらず、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によって野生型VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０１０２】
本明細書中に使用される、「VII因子バリアント（Factor VII variant）」または「VII因子バリアント（Factor VII variants）」の用語は、野生型VII因子の配列を有しているVII因子であって、親タンパク質（parent protein）の１以上のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、および／または親タンパク質の１以上のアミノ酸が欠失している、および／または１以上のアミノ酸がタンパク質中に挿入されている、および／または１以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されているものを指定（designate）することを意図している。係る付加は、親タンパク質のN末端終端（N-terminal end）またはC末端終端の何れかで又は両方で生じてもよい。本定義内の「バリアント（variant）」または「バリアント（variants）」は、その活性型においてなおもFVII活性を有する。一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と70%同一である。一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と80 %同一である。別の態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と90%同一である。更なる一態様において、バリアントは、野生型VII因子の配列と95 %同一である。
【０１０３】
本発明に関連する成長ホルモンには、その配列および特性が文献（Hormone Drugs, Gueriguian, U.S.P. Covention, Rockvill, 1982）などに記載されたヒト成長ホルモン(hGH)および成長ホルモン化合物が含まれる。「成長ホルモン化合物（growth hormone compound）」の用語は、１以上のアミノ酸残基が削除された及び／又は別のアミノ酸残基（天然または非天然）で置換されたヒト成長ホルモン(hGH)を、及び／又は付加的なアミノ酸残基を具備しているhGHを、及び／又は少なくとも１つの有機置換基が１以上の有機置換基と結合しているhGHを指摘することを意図している。特別の言及が191の本来（native）のアミノ酸配列(ソマトロピン)および192アミノ酸Ｎ末端メチオニン種(ソマトレム)に関してなされる。
【０１０４】
本発明により修飾できるサイトカインの例には、エリスロポエチン (EPO), トロンボポエチン, INF-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, インターロイキン-1β (IL-1-β), IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 IL-24, 顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF), GM-CSF, およびケモカイン、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質-1(MIP-1)ガンマインターフェロン誘導性タンパク質およびIFNγで誘導されるモノカイン(MIG)が含まれる。
【０１０５】
本発明に関連するIL-19の具体的な例には、WO98/08870(Human Genome Science)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。
【０１０６】
IL-20に適用可能なIL-19の具体的な例には、WO99/27103 (Zymogenetics)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。本発明において、IL-20は、IL-20それ自身及びその断片、同様に、IL-20又はその断片と少なくとも90%同一であるポリペプチドを指摘することを意図している。
【０１０７】
本発明に関連するIL-21の例には、WO 00/53761(Zymogenetics)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。
【０１０８】
TTFは、本発明に関連するタンパク質の別のグループである。TTFペプチドは、胃腸管と主に関連するペプチドのファミリーである。特別の言及は、ヒト, マウス, およびラットから知られている乳癌関連pS2ペプチド(TFF-1)、ヒト, ブタ, ラット, およびマウスから知られている鎮痙ポリペプチド(TFF-2)、並びにヒト, ラット およびマウスから知られている腸トレフォイルファクター(TFF-3)に関してなされる。
【０１０９】
本発明に関連するTFFファミリーの他のペプチドには、WO02/46226(Novo Nordisk)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたものが含まれる。TFFファミリーの他のタンパク質には、WO96/06861(Novo Nordisk)（該文献は本明細書中に参照によって援用される）に開示されたTFF-1およびTFF-3ダイマーが含まれる。
【０１１０】
幾つかのメラノコルチンレセプターが知られており、本発明の方法に適用可能なペプチドの特別の言及が、ペプチド性（peptidic）のメラノコルチン-4レセプターアゴニスト（これは食欲抑制性の効果を有することが知れている）に関してなされる。特別の言及が次に記す特許文献に開示されたペプチドまたはタンパク質に関してなされる（該文献は、全て本明細書中に参照によって援用される）：US 6,054,556 (Hruby), WO 00/05263 (William Harvey Research), WO 00/35952 (Melacure), WO 00/35952 (Melacure), WO 00/58361 (Procter & Gamble), WO 01/52880 (Merck), WO 02/26774 (Procter & Gamble), WO 03/06620 (Palatin), WO 98/27113 (Rudolf Magnus Institute) およびWO 99/21571 (Trega)。
【０１１１】
本発明に関連する他のクラスのペプチドまたはタンパク質には、酵素が含まれる。多くの酵素が様々な産業目的で使用されており、特別の言及はヒドロラーゼ(プロテアーゼ, リパーゼ, セルラーゼ, エステラーゼ), オキシドレダクターゼ(ラッカーゼ, ペルオキシダーゼ, カタラーゼ, スーパーオキシドジスムターゼ, リポキシゲナーゼ), トランスフェラーゼおよびイソメラーゼに関してなされる。
【０１１２】
本発明に関連する他のペプチドまたはタンパク質には、副腎皮質刺激ホルモン, コルチコトロピン-放出因子, アンギオテンシン, カルシトニン, インシュリン及びその断片およびアナログ, グルカゴン, IGF-1, IGF-2, エンテロガストリン（enterogastrin）, ガストリン, テトラガストリン, ペンタガストリン, ウロガストリン（urogastrin）, 上皮成長因子, , セクレチン, 神経成長因子, 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン, ソマトスタチン, 成長ホルモン放出ホルモン, ソマトメジン, 副甲状腺ホルモン, トロンボポエチン, エリスロポエチン, 視床下部の 放出因子, プロラクチン, 甲状腺刺激ホルモン, エンドルフィン, エンケファリン, バソプレッシン, オキシトシン, オピオイド及びそのアナログ, アスパラギナーゼ, アルギナーゼ, アルギニンデアミナーゼ, アデノシンデアミナーゼおよびリボヌクレアーゼが含まれる。
【０１１３】
インシュリンを使用して、糖尿病が治療または予防される。そして、一態様において、本発明は、１型または２型の糖尿病を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療上効果的な量の本発明によるインシュリンまたはインシュリン化合物を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明によるインシュリンまたはインシュリン化合物を含んでいるHpx融合タンパク質の、１型または２型の糖尿病の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０１１４】
GLP-1は、高血糖、２型糖尿病、耐糖能障害（impaired glucose tolerance）、１型糖尿病、肥満、高血圧症、Ｘ症候群、異脂肪血症、β-細胞アポトーシス、β-細胞欠乏、炎症性の腸症候群（inflammatory bowel syndrome）、消化不良、認知障害（cognitive disorders）、例えば、認知増強（cognitive enhancing）、神経保護、アテローム性動脈硬化症、冠性心疾患および他の心臓血管障害の治療に使用しえる。従って、一態様において本発明は、前記疾患を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療上効果的な量の本発明によるGLP-1またはGLP-1化合物を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明によるGLP-1またはGLP-1化合物を含んでいるHpx融合タンパク質の、上記で言及した疾患の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０１１５】
GLP-2は、腸における栄養の吸収不良へと至る腸不全（intestinal failure）の治療に使用しえる。また、特にGLP-2は、小腸症候群（small bowel syndrome）, 炎症性腸症候群（Inflammatory bowel syndrome）, クローン病, コラーゲン大腸炎（collagen colitis）を含む大腸炎, 放射線大腸炎, 照射後萎縮症（post radiation atrophy）, 非熱帯性(グルテン不耐性)および熱帯性スプルー, 血管閉塞または外傷の後の組織の傷害, 旅行者の下痢, 脱水, 菌血症, 敗血症, 神経性食欲不振症, 化学療法後の組織傷害, 未熟児, 強皮症（schleroderma）, 萎縮性胃炎を含む胃炎, 幽門洞切除後の萎縮性胃炎（postantrectomy atrophic gastritis）およびピロリ菌胃炎, 潰瘍, 腸炎, 盲腸（cul-de-sac）, リンパ閉塞（lymphatic obstruction）, 血管疾患（vascular disease）および移植片対宿主病, 外科的な処置後のヒーリング（healing）, 放射線照射後の萎縮症および化学療法,および 骨粗鬆症の治療に使用しえる。従って、一態様において本発明は、上記疾患を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療上効果的な量の本発明によるGLP-2またはGLP-2化合物を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明によるGLP-2またはGLP-2結合体を含んでいるHpx融合タンパク質の、上記で言及した疾患の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０１１６】
成長ホルモンは、成長ホルモン欠乏, ターナー症候群, プラーダーヴィリ症候群, 慢性腎不全, AIDS消耗症（AIDS wasting）および加齢の治療に使用しえる。従って、本発明は、これらの疾患または状態を治療するための方法を提供し、該方法は、必要とする患者に治療上効果的な量の本発明による成長ホルモンまたは成長ホルモン化合物を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、成長ホルモンまたは成長ホルモン化合物を含んでいるHpx融合タンパク質の、成長ホルモン欠乏, ターナー症候群, プラーダーヴィリ症候群, 慢性腎不全, AIDS消耗症または加齢の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０１１７】
サイトカインは、免疫系に関連する疾患のホストの病因（etiology）に関係する。特に、IL-20が乾癬（psoriasis）に関与し、その治療にも関与すること、I-21が癌に関与し、本疾患の治療処置を構成するだろうことが言及される。一態様において、本発明は、乾癬を治療する方法を提供し、該方法は、治療的に効果的な量の本発明によるIL-20結合体を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明のIL-20結合体を含んでいるHpx融合タンパク質の、乾癬の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、癌を治療する方法に関し、該方法は治療的に効果的な量の本発明のIL-21結合体を含んでいるHpx融合タンパク質を、それを必要とする被験者に投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明のIL-21結合体を含んでいるHpx融合タンパク質の、癌の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０１１９】
TTFペプチドを使用して、被験者における粘膜層の粘性を増加させること、唾液の分泌（例えば、唾液分泌の増加が放射線療法、抗コリン作用性またはシェーグレン症候群の治療で生じる）を減少させること、アレルギー性鼻炎、外傷に対して二次的なストレス誘発性胃潰瘍、ショック（shock）、大きな手術（large operations）、腎臓または肝臓の疾患、NSAID（例えば、アスピリン）、ステロイドまたはアルコールでの処置を治療することが可能である。また、TTFペプチドを使用して、クローン病、潰瘍性大腸炎、角膜結膜炎、慢性 膀胱感染症、腸管性膀胱炎（intestinal cystitis）、乳頭腫および膀胱癌を治療しえる。従って、一態様において本発明は、上記で言及した疾患または状態を治療する方法に関し、該方法は、必要とする被験患者に治療上効果的な量の本発明によるTTFを含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明のTTFを含んでいるHpx融合タンパク質の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０１２０】
メラノコルチンレセプターモディファイヤー（Melanocortin receptor modifiers）と、特にメラノコルチン4レセプターアゴニストとは、肥満および関連する疾患の治療および予防に関与している。一態様において、本発明は、糖耐性障害(IGT；impaired glucose tolerance)のインシュリン非要求性２型糖尿病への進行を予防する又は遅延させるための、インシュリン非要求性２型糖尿病のインシュリン要求性糖尿病への進行を予防する又は遅延させるための、肥満（obesity）を治療するための、および食欲（appetite）を制御するための方法を提供する。また、メラノコルチン4レセプターアゴニストは、アテローム性動脈硬化症, 高血圧症, 糖尿病, ２型糖尿病, 糖耐性障害(IGT), 異脂肪血症, 冠性心疾患, 胆嚢 疾患, 胆石, 骨関節炎, 癌, 性的不能および早発死のリスク（the risk of premature death）から選択される疾患の治療に関与している。従って、一態様において本発明は、上記の疾患または状態を治療する方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療上効果的な量の本発明によるメラノコルチン4レセプターアゴニストを含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。なお別の態様において、本発明は、本発明のメラノコルチン4レセプターアゴニストを含んでいるHpx融合タンパク質の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用に関する。
【０１２１】
VII因子化合物は、凝固に関連する疾患の治療に関与している。また、生物学的に活性なVII因子化合物は、特に血友病, VIIIおよびIX因子に対するインヒビターを伴う血友病, 血小板減少症を伴う患者, 血小板病（thrombocytopathies）を伴う患者、例えば、グランツマン血小板無力症血小板放出欠陥および貯蔵プール欠陥（Glanzmann's thrombastenia platelet release defect and strorage pool defects）, フォンウィルブランド病を伴う患者, 肝疾患および外傷または外科に関連する出血問題を伴う患者の治療に関与している。生物学的に不活性なVII因子化合物は、過剰凝固状態（hypercoagluable states）、例えば、敗血症を伴う患者, 深部静脈血栓症（deep-vein thrombosis）, 心筋感染症（myocardial infections）または血栓発作（thrombotic stroke）の危険がある患者, 肺塞栓症, 急性の冠血管症候群を伴う患者, 冠血管心臓疾患（coronary cardiac）を経験している患者, 血管形成術を受けている患者に対する心臓イベント（cardiac events）および再狭窄の予防, 末梢性の脈管性疾患を伴う患者, および急性の呼吸困難症候群（acute respiratory distress syndrome）の治療に関与している。従って、一態様において本発明は、上記で言及した疾患または状態を治療するための方法を提供し、該方法は、必要とする被験者に治療上効果的な量の本発明によるVII因子化合物を含んでいるHpx融合タンパク質を投与することを備える。別の態様において、本発明は、本発明によるVII因子化合物を含んでいるHpx融合タンパク質の、上記で言及した疾患または状態の治療に使用される医薬の製造における使用を提供する。
【０１２２】
多くの疾患は、治療において１を超える医薬を用いて、同時に投与されるか又は連続的に投与されて治療される。従って、本発明のペプチド結合体を、上記で言及した疾患の１つを治療するための治療方法に、該疾患の治療に通常使用される1以上の他の治療的に活性な化合物と組み合わせて使用することは本発明の範囲内である。同様に、本発明のペプチド結合体を、上記で言及した疾患の１つの治療に通常使用される他の治療的に活性な化合物と組み合わせて、該疾患のための医薬の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【０１２３】
前記治療方法は、任意の適切な経路、例えば、口, 直腸, 鼻, 肺, 局所（topical）(頬および舌下を含む), 経皮（transdermal）, 嚢内（intracisternal）, 腹腔内, 膣 および非経口(皮下, 筋肉内, クモ膜下腔内, 静脈内および皮内を含む)経路（非経口経路が好適である）を介した投与を備えうる。
【０１２４】
典型的な非経口による用量は、10-9 mg/kg〜約100 mg/kg体重/投与の範囲である。典型的な投与の用量は、約 0.0000001〜約 10 mg/kg体重/投与である。正確な用量は、投与の指示、医薬、頻度、およびモード（mode）、性別、年齢、および治療される対象の一般的なコンディション、治療される疾患またはコンディションの重症度、治療の望まれる効果、並びに当業者に明らかな他の因子に依存する。
【０１２５】
典型的な投薬の頻度は、１日に２回、１日に１回、２日毎（bi-daily）、週に２回、週に１回、又はより長い投薬インターバルである。本発明の融合タンパク質は半減期が長期にわたるので、長い投薬インターバルの投薬措置（a dosing regime）、例えば、週に２回、週に１回、又はより長い投薬インターバルは、本発明の特定の態様である。
【０１２６】
薬学的組成物
本発明の別の課題はHpx融合タンパク質を含んでいる薬学的製剤（pharmaceutical formulation）を提供することであり、これは10-15 mg/ml〜200 mg/ml（例えば、10-10 mg/ml〜5 mg/ml）の濃度で存在し、前記製剤は2.0〜10.0のpHを有する。前記製剤は、さらに緩衝系、保存剤、張性剤（tonicity agent）、キレート剤、安定化剤（stabilizer）および界面活性剤を具備してもよい。本発明の一態様において、薬学的製剤は水性製剤（即ち、水を含む製剤）である。係る製剤は、典型的には溶液または懸濁物である。本発明の更なる態様において、前記薬学的製剤は、水溶液である。「水性製剤（aqueous formulation）」の用語は、少なくとも50% w/wの水を具備している製剤と規定される。同様に、「水溶液（aqueous solution）」の用語は、少なくとも50%w/wの水を具備している溶液と規定される。また「水性懸濁物（aqueous suspension）」の用語は、少なくとも50%w/wの水を具備している懸濁物と規定される。
【０１２７】
別の態様において、前記薬学的製剤は、医師または患者によって使用前に溶媒および／または希釈剤が添加されるフリーズドライ製剤（freeze-dried formulation）である。
【０１２８】
別の態様において、前記薬学的製剤は、事前に溶解することなく使える状態の乾燥製剤（例えば、フリーズドライまたはスプレードライ）である。
【０１２９】
更なる側面において、本発明は、Hpx融合タンパク質および緩衝剤の水溶液を含んでいる薬学的製剤に関し、該Hpxタンパク質は0.1〜100mg/ml以上の濃度で存在し、該製剤は約2.0〜約10.0のpHを有する。
【０１３０】
本発明の別の態様において、前記製剤のpHは、2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, および 10.0からなるリストから選択される。
【０１３１】
本発明の更なる態様において、前記緩衝剤は、酢酸ナトリウム, 炭酸ナトリウム, シトレート, グリシルグリシン, ヒスチジン, グリシン, リジン, アルギニン, リン酸二水素ナトリウム（sodium dihydrogen phosphate）, リン酸水素二ナトリウム（disodium hydrogen phosphate）, リン酸ナトリウム, およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン, ビシン, トリシン, リンゴ酸, スクシナート, マレイン酸, フマル酸, 酒石酸, アスパラギン酸又はその混合物からなる群から選択される。これらの特定の緩衝剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０１３２】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、さらに薬学的に許容される保存剤を含む。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、フェノール, o-クレゾール, m-クレゾール, p-クレゾール, メチル p-ヒドロキシルベンゾアート, プロピル p-ヒドロキシルベンゾアート, 2-フェノキシエタノール, ブチル p-ヒドロキシルベンゾアート, 2-フェニルエタノール, ベンジルアルコール, クロロブタノール, およびチメロサール（thiomerosal）, ブロノポール, 安息香酸, イミド尿素（imidurea）, クロロヘキシジン（chlorohexidine）, デヒドロ酢酸ナトリウム, クロロクレゾール, エチル p-ヒドロキシルベンゾアート, 塩化ベンゼトニウム, クロルフェネシン(3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール)又はその混合物からなる群から選択される。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、0.1 mg/ml〜5 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、5 mg/ml〜10 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記保存剤は、10 mg/ml〜20 mg/mlの濃度で存在する。これらの特定の保存剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０１３３】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、さらに等張化剤（isotonic agent）を含む。本発明の更なる態様において、前記等張化剤は、塩(例えば、塩化ナトリウム), 糖または糖アルコール, アミノ酸(例えば、L-グリシン, L-ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファン, スレオニン), アルジトール(例えば、グリセロール(グリセリン), 1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール), 1,3-プロパンジオール, 1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えば、PEG400)、又はその混合物からなる群から選択される。任意の糖を使用してもよく、これは例えば次のものである；モノ-、ジ-、またはポリサッカライド、または水溶性のグルカン、例えば次のものが含まれる、果糖、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性のデンプン、ヒドロキシエチルスターチおよびカルボキシメチルセルロース-Na。一態様において、糖添加物は、スクロースである。糖アルコールは、少なくとも1つの-OH基を有しているC4-C8炭化水素と規定され、これには、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクティトール、ズルシトール（dulcitol）、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。一態様において、糖アルコール添加物は、マンニトールである。上記の糖または糖アルコールは、個々に（individually）又は組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を用いて得られた安定化効果に不利に影響しないかぎり、使用される量に定められた限度はない。一態様において、糖または糖アルコール濃度は、約 1 mg/mlおよび約 150 mg/mlの間である。本発明の更なる態様において、等張化剤は、1 mg/ml〜50 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、1 mg/ml〜7 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、8 mg/ml〜24 mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、等張化剤は、25 mg/ml〜50 mg/m
lの濃度で存在する。これらの特定の等張化剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物における等張化剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０１３４】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、さらにキレート剤を含む。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、並びにその混合物から選択される。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、0.1mg/ml〜2mg/mlの濃度で存在する。本発明の更なる態様において、前記キレート剤は、2mg/ml〜5mg/mlの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。薬学的組成物におけるキレート剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０１３５】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、さらに安定化剤（stabilizer）を含む。薬学的組成物における安定化剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０１３６】
より具体的には、本発明の組成物は、安定化された液体薬学的組成物（liquid pharmaceutical compositions）であって、治療的に活性な成分が液体薬学的製剤での貯蔵の間に凝集物形成を呈する可能性のあるタンパク質を含む安定化された液体薬学的組成物である。「凝集物形成（aggregate formation）」は、オリゴマー（可溶性が残存しえる）、または溶液から沈殿した大きな可視の凝集物の形成を生じるタンパク質分子間の物理的な相互作用を意図している。「貯蔵される間（during storage）」は、一度調製された液体薬学的組成物または製剤が被験者に即座に投与されないことを意図している。むしろ、調製に引続いて、それは被験者への投与に適切な、後の液体形態または他の形態への再構成のために、液体形態、凍結状態、又は乾燥形態への何れかでの貯蔵のためにパッケージされる。「乾燥形態（dried form）」は、液体薬学的組成物または製剤が、フリーズドライ（即ち、凍結乾燥;例えば、Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59を参照されたい)、スプレードライ（Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; およびMumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照されたい）、又は空気乾燥（Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; およびRoser (1991) Biopharm. 4:47-53）の何れかにより乾燥されることを意図している。液体薬学的組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成は、そのタンパク質の生物活性に不利に影響しえるものであり、前記薬学的組成物の治療上の有効性の欠損を生じる。さらにまた、凝集物形成は、タンパク質含有薬学的組成物が輸液システムを用いて投与されるときのチュービング（tubing）、膜、又はポンプの閉塞（blockage）などの他の問題の原因となりえる。
【０１３７】
本発明の薬学的組成物は、前記組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成を減少させるために十分なアミノ酸塩基の量をさらに具備してもよい。「アミノ酸塩基（amino acid base）」は、任意の所与のアミノ酸が、その遊離塩基の形態（its free base form）又はその塩の形態（its salt form）の何れかで存在する、アミノ酸又はアミノ酸の組合わせを意図している。アミノ酸の組合わせが使用される場合、全てのアミノ酸は、それらの遊離塩基の形態で存在してもよい、全てがそれらの塩の形態で存在してもよい、又は幾つかがそれらの遊離塩基の形態で存在し、他方で他はそれらの塩の形態で存在してもよい。一態様において、本発明の組成物を調製することに使用するアミノ酸は、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸などの荷電側鎖を保持しているものである。特定のアミノ酸(メチオニン, ヒスチジン, アルギニン, リジン, イソロイシン, アスパラギン酸, トリプトファン, スレオニン及びその混合物)の任意の立体異性体（即ち、L、D、又はその混合物）又はこれらの立体異性体の組合わせ又はグリシン又は有機塩基（例えば、イミダゾールであるが、限定されない）が、特定のアミノ酸または有機塩基がその遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在するかぎり、本発明の薬学的組成物に存在してもよい。一態様において、アミノ酸のL-立体異性体が使用される。一態様において、L-立体異性体が使用される。また、本発明の組成物は、これらのアミノ酸のアナログと処方されてもよい。「アミノ酸アナログ（amino acid analogue）」は、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵間のタンパク質による凝集物形成を減少させる所望の効果を生じせしめる天然アミノ酸の誘導体（derivative）を意図している。適切なアルギニンアナログには、例えば、アミノグアニジン（aminoguanidine）、オルニチンおよびN-モノエチルL-アルギニンが含まれる、適切なメチオニンアナログには、エチオニンおよびブチオニン（buthionine）が含まれる、並びに適切なシステインアナログには、S-メチル-Lシステインが含まれる。他のアミノ酸と同様に、アミノ酸アナログは、それらの遊離塩基の形態又はそれらの塩の形態の何れかで前記組成物に導入される。本発明の更なる態様において、前記アミノ酸またはアミノ酸アナログは、前記タンパク質の凝集を阻止する又は遅延（delay）させるのに十分な濃度で使用される。
【０１３８】
本発明の更なる態様において、メチオニン(または他の硫黄性アミノ酸またはアミノ酸アナログ)は、治療薬として作用する前記タンパク質が次の酸化に感受性の少なくとも１つのメチオニン残基を具備しているタンパク質である場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されてもよい。「阻害（inhibit）」は、メチオニン酸化型種の、時間経過に対する蓄積が最小であることを意図している。メチオニン酸化を阻害することによって、前記タンパク質を、その適切な分子形態によりよく保持することとなる。メチオニン(LまたはD異性体)の任意の立体異性体又はその任意の組合わせを使用することができる。添加すべき量は、メチオニン残基の酸化を阻害するために十分な量にすべきであり、メチオニンスルホキシドの量が管理機関（regulatory agencies）に認可されるような量にすべきである。典型的には、この事項は、前記組成物が約10%〜約30%のメチオニンスルホキシド以下を含有することを意味している。一般に、この事項は、メチオニンのメチオニン残基に添加される比率が約1:1〜約1000:1（例えば、10:1〜約100:1）の範囲であるようにメチオニンを添加することで達成することができる。
【０１３９】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物からなる群から選択される安定化剤を更に含む。本発明の更なる態様において、前記安定化剤は、ポリエチレングリコール(例えば、PEG 3350)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン、カルボキシル-/ヒドロキシセルロース（hydroxycellulose）又はその誘導体(例えば、HPC, HPC-SL, HPC-LおよびHPMC)、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールのようなイオウ含有物質、並びに異なる塩(例えば、塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定化剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０１４０】
また、薬学的組成物は、そのなかの治療的に活性なタンパク質の安定性をさらに増強する付加的な安定化剤を具備する。本発明に特に重要な安定化剤には、メチオニンおよびEDTA（メチオニン酸化に対して前記タンパク質を防御する）、および非イオン性界面活性剤（凍結融解または機械的剪断に関連する凝集に対して前記タンパク質を防御する）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
本発明の更なる態様において、前記製剤は、さらに界面活性剤（surfactant）を含む。本発明の更なる態様において、前記界面活性剤は、洗剤（detergent）, エトキシル化ヒマシ油（ethoxylated castor oil）, ポリグリコール化グリセリド（polyglycolyzed glycerides）, アセチル化モノグリセリド, ソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー(例えば、ポロキサマー、例えば、Pluronic(登録商標) F68, ポロキサマー 188 および407, トリトン X-100), ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル, ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体（例えば、アルキル化およびアルコキシル化誘導体(tweens, 例えば、 Tween-20, Tween-40, Tween-80 およびBrij-35), モノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体, ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体, アルコール, グリセロール, レクチンおよびリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン, ホスファチジルコリン, ホスファチジルエタノールアミン, ホスファチジルイノシトール, ジホスファチジルグリセロールおよびスフィンゴミエリン), リン脂質の誘導体(例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸)およびリゾリン脂質の誘導体(例えば、パルミトイルリゾホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン, コリン, セリンまたはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-リン酸エステル)およびリゾホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル, アルコキシル (アルキルエステル), アルコキシ (アルキルエーテル)-誘導体、例えば、リゾホスファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体, ジパルミトイルホスファチジルコリン, および, 極性の頭部基（head group）の修飾体, 該頭部基はコリン, エタノールアミン, ホスファチジン酸, セリン, スレオニン, グリセロール, イノシトール, および陽性荷電のDODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルスレオニン, およびグリセロリン脂質(例えば、セファリン), グリセロ糖脂質 (例えば、ガラクトピラノシド), スフィンゴ糖脂質 (例えば、セラミド, ガングリオシド), ドデシルホスホコリン, ニワトリ卵リゾレシチン, フシジン酸誘導体-(例えば、タウロ-フシジン酸ナトリウムなど), 長鎖脂肪酸及びその塩, C6-C12 (例えば、オレイン酸およびカプリル酸), アシルカルニチンおよび誘導体, リジン, アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体, またはリジンまたはアルギニンの側鎖アシル化誘導体（side-chain acylated derivatives）, リジン, アルギニンまたはヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の何れかの組合わせを具備しているジペプチドのNα-アシル化誘導体, 中性アミノ酸および２荷電化アミノ酸（two charged amino acids）の何れかの組合わせを具備しているトリペプチドのNα-アシル化誘導体, DSS (ドキュセートナトリウム, CAS登録番号[577-11-7]), ドキュセートカルシウム, CAS登録番号[128-49-4]), ドキュセートカリウム, CAS登録番号[7491-09-0]), SDS (ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム), カプリル酸ナトリウム, コール酸又はその誘導体, 胆汁酸及びその塩およびグリシンまたはタウリン結合体, ウルソデオキシコール酸, コール酸ナトリウム, デオキシコール酸ナトリウム, タウロコール酸ナトリウム, グリココール酸ナトリウム, N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナート, 陰イオン性(アルキル-アリール-スルホナート)一価  界面活性剤, 双性イオン性界面活性剤(例えば、N-アルキル-N,N-ジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート, 3-コラミド（cholamido）-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホナート, 陽イオン性界面活性剤(四級アンモニウム塩基)(例えば、セチル-トリメチルアンモニウム  ブロミド, 塩化セチルピリジニウム), 非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド), ポロキサミン(例えば、Tetronic's), これはプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次付加することから派生する四官能性ブロック  コポリマー（tetrafunctional block copolymers）である, 又はイミダゾリン誘導体, 又はその混合物からなる群から選択されえる界面活性剤、から選択される。これらの特定の界面活性剤の各々は、本発明の代替的な態様を構成する。
【０１４２】
薬学的組成物における界面活性剤の使用は、当業者に周知である。便宜のため、文献（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 2000）を参照されたい。
【０１４３】
他の構成成分が本発明の薬学的製剤中に存在することが可能である。係る付加的な構成成分は、湿潤剤, 乳化剤, 抗酸化剤, バルキング剤（bulking agents）, 張性修飾剤（tonicity modifiers）, キレート剤, 金属イオン, 油性ビヒクル（oleaginous vehicles）, タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン, ゼラチンまたはタンパク質)および双性イオン(例えば、アミノ酸、例えば、ベタイン, タウリン, アルギニン, グリシン, リジン および ヒスチジン)を含んでもよい。係る付加的な構成成分は、もちろん、本発明の薬学的製剤の全体の安定性に不利に影響すべきではない。
【０１４４】
本発明によるHpx融合タンパク質を含有している薬学的組成物は、係る治療を幾つかの部位、例えば、局所的部位（例えば、皮膚および粘膜部位）、吸収をバイパスする部位（例えば、動脈における、静脈における、心臓における投与）、吸収が関与する部位（例えば、皮膚における、皮膚下における、筋肉における又は腹部における投与）で必要としている患者に投与しえる。
【０１４５】
本発明による薬学的組成物の投与は、係る治療を必要とする患者に、舌（lingual）, 舌下（sublingual）, 頬, 口内（in the mouth）, 経口（oral）, 胃および腸中（in the stomach and intestine）, 経鼻（nasal）, 肺（例えば, 細気管支および肺胞又はその組み合わせを介して）, 上皮（epidermal）, 真皮（dermal）, 経皮（transdermal）, 膣（vaginal）, 直腸, 眼球（例えば, 結膜を介して）, 尿管（uretal）, および非経口などの幾つかの投与経路を介するものであってもよい。
【０１４６】
当該発明の組成物は、溶液, 懸濁物, エマルジョン剤, マイクロエマルジョン剤, 複合エマルジョン, 泡剤（foams）, 軟膏剤（salves）, ペースト剤（pastes）, プラスター, 軟膏（ointments）, 錠剤, 被覆錠剤, リンス剤（rinses）, カプセル, 例えば, 硬いゼラチンカプセルおよび柔らかいゼラチンカプセル, 坐剤, 直腸カプセル, ドロップ剤（drops）, ゲル, スプレー, 粉末剤, エアロゾル, 吸入剤（inhalants）, 点眼液, 眼軟膏, 眼のリンス剤（ophthalmic rinses）, 膣のペッサリー, 膣のリング, 膣軟膏, 注射溶液, インサイチュー転換溶液（in situ transforming solutions）、例えば、インサイチューゲル化剤, インサイチュー硬化剤（in situ setting）, インサイチュー沈殿剤, インサイチュー結晶化剤, 輸液溶液, およびインプラントなどの幾つかの剤形で投与しえる。
【０１４７】
本発明の組成物は、例えば、共有結合性、疎水性及び静電気的な相互作用を介して、薬担体、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムに、Hpx融合タンパク質の安定性をさらに増強させるため、バイオアベイラビリティーを増加させるため、溶解度を増加させるため、有害な作用を減少させるため、当業者に周知の時間療法（chronotherapy）を達成するため、および患者のコンプライアンスを増加させるため、又はその任意の組み合わせのために、さらに配合され（compounded）又は付属（attached）されてもよい。担体（carriers）、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムの例には、ポリマー, 例えば、セルロースおよび誘導体, ポリサッカライド, 例えば、デキストランおよび誘導体, デンプンおよび誘導体, ポリ(ビニルアルコール), アクリラートおよびメタクリレートポリマー, ポリ乳酸およびポリグリコール酸及びそのブロックコポリマー, ポリエチレングリコール, 担体タンパク質, 例えば、アルブミン, ゲル, 例えば、サーモジェリング（thermogelling）システム, 例えば、当業者に周知のブロックコポリマーシステム, ミセル, リポソーム, ミクロスフェア, ナノ微粒子（nanoparticulates）, 液体結晶（liquid crystals）及びその分散剤, 脂質-水システムにおける相行動（phase behaviour）の当業者に周知のL2相及びその分散剤, ポリマー性ミセル, 複合エマルジョン剤, 自己乳化（self-emulsifying）, 自己ミクロ乳化, シクロデキストリン及びその誘導体, およびデンドリマー（dendrimers）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
当該発明の組成物は、定量吸入器（a metered dose inhaler）、乾燥粉末吸入器（dry powder inhaler）およびネブライザー（全て当業者に周知の装置である）などを用いて、Hpx融合タンパク質を肺投与するための、固体、半固体（semisolids）、粉末および溶液の製剤に有用である。
【０１４９】
現行の発明の組成物は、制御性（controlled）、持続性（sustained）、遅延性（protracting）、遅滞性（retarded）、および緩徐性（slow）に放出させる薬物送達系に特に有用である。より具体的な限定されない、組成物は、当業者に周知の、非経口の制御性放出および持続性放出システム（双方のシステムは幾つかの投与における何倍もの減少に至る）の製剤に有用である。なおより好ましいものは、皮下に投与される制御性放出および持続性放出システムである。本発明の範囲は限定されないが、有用な制御性放出システムおよび組成物の例は、ヒドロゲル、油性の（oleaginous）ゲル、液体結晶（liquid crystals）、重合体ミセル（polymeric micelles）、ミクロスフェア、ナノ粒子（nanoparticles）である。
【０１５０】
当該発明の組成物に有用な制御性放出システムを産生する方法には、結晶化, 凝縮, 共結晶化（co-crystallization）, 沈殿, 共沈殿, 乳化, 分散剤, 高圧均質化（high pressure homogenisation）, カプセル化（encapsulation）, スプレードライ, マイクロカプセル化（microencapsulating）, コアセルベーション, 相分離（phase separation）, 溶媒蒸発によるミクロスフェアの産生, 押出し成形（extrusion）および超臨界流体プロセス（supercritical fluid processes）が含まれるが、これらに限定されない。一般的に、薬学的な制御放出のハンドブック〔Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000〕および〔Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000〕を参照されたい。
【０１５１】
非経口投与は、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内の注射で、注射器（自由選択で、ペン様の注射器）の手段によって実施し得る。或いは、非経口投与は、輸液ポンプの手段で実施することができる。さらなるオプションは、Hpx融合タンパク質を、経鼻または肺スプレー（nasal or pulmonal spray）の形態で投与するための溶液剤または懸濁剤である組成物である。なお更なるオプションとして、Hpx融合タンパク質を含有している薬学的組成物は、経皮投与〔例えば、針なし注射（needle-free injection）による又はパッチ、任意でイオントフォレーシス性パッチ（iontophoretic patch）から〕、又は経粘膜（例えば、頬投与）に適用することもできる。
【０１５２】
「安定化製剤（stabilized formulation）」の用語は、増加した物理的な安定性、増加した化学的な安定性または増加した物理的および化学的な安定性を有する製剤を意味する。
【０１５３】
本明細書中に使用されるタンパク質製剤の「物理的な安定性（physical stability）」の用語は、タンパク質の熱機械的ストレス（thermo-mechanical stresses）への暴露の及び／又は不安定な界面（interfaces）および表面（例えば、疎水性の表面および界面）との相互作用の結果として、タンパク質の生物学的に不活性および／または不溶性の凝集物を形成するタンパク質の傾向を意味する。水性のタンパク質製剤の物理的な安定性は、適切なコンテナ(例えば、カートリッジまたはバイアル)に充填した前記製剤を、機械的／物理的なストレス(例えば、撹拌)に異なる温度で様々な時間で暴露した後で、視覚的な点検および／または濁度測定の手段によって評価される。前記製剤の視覚的な点検（Visual inspection）は、暗い背景で焦点を絞った光源（a sharp focused light）において行われる。前記製剤の濁度は、濁度の度合を、例えば、0から3のスケール（濁りを呈していない製剤は視覚スコア0に対応し、昼光中で視覚的な濁りを呈している製剤は視覚スコア3に対応する）で、視覚的にスコアをつけることによって特徴づけられる。製剤が昼光中で視覚的な濁度を呈した場合、タンパク質凝集に関して物理的に不安定であると分類される。或いは、製剤の濁度は、当業者に周知の単純な濁度測定によって評価することができる。また、水性のタンパク質製剤の物理的な安定性は、タンパク質のコンホメーション状態の分光学的な薬剤またはプローブを用いることによって評価することができる。前記プローブは、好ましくは、タンパク質の非天然コンフォーマー（non-native conformer）へと優先的に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子の分光学的なプローブの一例は、チオフラビンTである。チオフラビンTは、アミロイドフィブリルの検出に広く使用されている蛍光色素である。フィブリルの存在下（おそらく他のタンパク質配置も同様）で、チオフラビンTは、フィブリルタンパク質形態に結合した場合に、新たな最大励起を約 450 nmで及び増強した発光を約 482 nmで発生する。非結合型のチオフラビンTは、前記波長で基本的に非蛍光性（non-fluorescent）である。
【０１５４】
他の小分子は、タンパク質構造における天然から非天然の状態への変化のプローブとして使用することができる。一例を挙げると、「疎水性パッチ（hydrophobic patch）」プローブは、タンパク質の暴露した疎水性パッチに優先的に結合する。一般的に、疎水性パッチは、天然の状態においてタンパク質の三次構造内で埋没しているが、タンパク質がアンフォールドする又は変性しはじめると暴露される。これらの小分子、分光学的なプローブの例は、芳香族の、疎水性色素、例えば、アントラセン（antrhacene）、アクリジン、フェナントロリンなどである。他の分光学的なプローブは、金属アミノ酸複合体（metal-amino acid complexes）、例えば、疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンなど）のコバルト金属複合体である。
【０１５５】
本明細書中に使用されるタンパク質製剤の「化学的な安定性（chemical stability）」の用語は、タンパク質構造における化学的な共有結合性の変化であって、天然のタンパク質構造と比較して、潜在的に低い生物学的な作用強度および／または潜在的に増加した免疫原性の特性を有する化学的なデグラデーション産物の形成に至る変化を意味する。様々な化学的なデグラデーション産物は、天然タンパク質のタイプおよび性質に並びに前記タンパク質が暴露される環境に依存して形成されえる。化学的なデグラデーションの除去は、完全に避けることは多分不可能である。そして、化学的なデグラデーション産物の量の増加は、当業者に周知のように、タンパク質製剤の貯蔵および使用の間にしばしば認められる。大抵のタンパク質は、脱アミド（グルタミニルまたはアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成するプロセス）する傾向がある。他のデグラデーション経路には、高分子量転換産物（high molecular weight transformation products）の形成が関与する。ここでは２以上のタンパク質分子がアミド基転移および／またはジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合で結合されて、共有結合性のダイマー、オリゴマーおよびポリマーのデグラデーション産物の形成に至る(Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。酸化（一例を挙げると、メチオニン残基の）を、化学的なデグラデーションの別のバリアントとして言及することができる。タンパク質製剤の化学的な安定性は、異なる環境条件(デグラデーション産物の形成は、一例を挙げると、温度を増加させることによってしばしば促進させることができる)に暴露後に、化学的なデグラデーション産物の量を様々な時点で測定することによって評価することができる。各々の個々のデグラデーション産物の量は、分子サイズおよび／または電荷に依存した様々なクロマトグラフィー技術(例えば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC)を用いて、デグラデーション産物を分離することによって度々決定される。
【０１５６】
以上、上記で概説したとおり「安定化製剤（stabilized formulation）」は、増加した物理的な安定性、増加した化学的な安定性または増加した物理的および化学的な安定性を有する製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に達するまでの、使用および貯蔵（推奨される使用および貯蔵条件に応じて）の間に安定でなければならない。
【０１５７】
本発明の一態様において、Hpx融合タンパク質を含んでいる薬学的製剤は、6週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【０１５８】
本発明の別の態様において、Hpx融合タンパク質を含んでいる薬学的製剤は、4週以上の使用の間に及び3年以上の貯蔵の間に安定である。
【０１５９】
本発明の更なる態様において、Hpx融合タンパク質を含んでいる薬学的製剤は、4週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【０１６０】
本発明のなお更なる態様において、Hpx融合タンパク質を含んでいる薬学的製剤は、2週以上の使用の間に及び2年以上の貯蔵の間に安定である。
【０１６１】
［例］
略語
NDSB:  非-洗浄剤スルホベタイン（Non-detergent sulfo betaine）
NDSB201:  3-(1-ピリジノ)-1-プロパンスルホナート
DTT:  ジチオスレイトール
IPTG:  イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
例1  ヘモペキシンのクローニング
４つのヘモペキシンタンパク質配列を、NCBIタンパク質データベース(gi: 1708182; 2144904; 226337; 386789)中に見出した。これらを整列し、ベクターNTIソフトウェアを用いて同一であることが見出された。直線mRNA(gi:11321560)を呈示する対応するcDNA配列を、プライマー設計の鋳型として使用した。前記プライマーを、設計して、シグナルペプチドを排除した（以下を参照されたい）。ネステッドプライマーでのＰＣＲ戦略を、オリゴ(dT)プライム化２本鎖ヒト肝臓cDNA(BD Bioscience)からHpxを増幅するための短いHpx特異的プライマーセット、及び付加的な精製タグ（Ｈｉｓ６）、エンテロキナーゼ切断部位（Ｄ４Ｋ）、短いｈＧＨリンカー配列、同様に、既にｈＧＨ遺伝子を含んでいる細菌発現ベクター（pNNC19）へのクローニングのためのNde1およびSal1制限酵素部位を含んでいる長いプライマーセットを用いて行った（図１を参照されたい）。高い忠実度ＤＮＡポリメラーゼを、短いプライマーセットでの２５ＰＣＲサイクルに使用した。そして、単位複製配列（amplicon）の同一性は、ゲル電気泳動（単位複製配列サイズ  1317bp）およびHpxにおけるKpn1部位の制限酵素消化で確認された。この後、精製された単位複製配列は、長いプライマーセットを用いた別の１０サイクルに供試された。単位複製配列サイズは、1394bpであった。
【０１６２】
ヘモペキシン  短いプライマーセット:
5'-acccctcttcctccgactagtgccca-3'(配列番号1)および
5'-gtgagtgcagcccaggagactggtca-3'（配列番号2）。
【０１６３】
ヘモペキシン  長いプライマーセット(精製タグ、Nde1およびSal1制限部位を含んでいる):
5'agatatacatatgcaccatcaccatcatcacgacgatgacgacaagacccctcttcctccgactagtgccca-3'(配列番号3)および
5'caaaaagtcgactcagcgggatggtcgggaagtgagtgcagcccaggagactggt-3'(配列番号4)。
【０１６４】
例2  Hpx-hGHクローニング
例１で取得された単位複製配列の末端を、Nde1およびSal1で切断し、断片をpNNC19にクローン化した。陽性クローンを、制限酵素分析を用い選択し、融合タンパク質の配列をＤＮＡシークエンシングで確認した。生じた発現ベクターは、Met-His6-D4K-Hpx-hGHを含んでいる融合タンパク質をコード化している（図１を参照されたい）。
【０１６５】
例3  His6-D4K-Hpx-hGHの発現および単離
発現
発現を、異なる温度およびIPTGの濃度を用いた標準条件で行った。簡単に説明すると、大腸菌を、0.6のOD600nmまで成長させた。そして、発現を、IPTGで約４時間誘導した。細菌ペレットを、収穫した。そして、タンパク質含量を、SDS PAGEを用いて組換え型融合タンパク質の存在に関して調査した（図２）。Hpx融合タンパク質は、試験した全ての条件下で封入体中に主に見出された。
【０１６６】
リフォールディングおよび精製
His6-D4K-Hpx-hGH封入体の可溶化後（8M Urea、20mM DTT、20mM Tris pH9.0中で）、タンパク質を1M NDSB201、1M Urea、および20mM Tris pH9.0中で５０倍の希釈リフォールディング（dilution refolding）で一晩リフォールディングさせた。融合タンパク質のヘモペキシン部分の正しいリフォールディングは、そのヘミンへの結合能力によって示された。ヘミン結合は、ヒスチジン213および270が安定なbis-ヒスチジルFe(III)複合体を形成しているヘム鉄へ協調的に結合することに依存する（ヘモペキシンがその天然のコンホメーションにフォールドされる場合にのみ達成することができる）。さらにまた、遊離ヘミンは、bis-ヒスチジルFe(III)複合体においてヘモペキシンと結合する場合に、390nmおよび405nmで吸収する〔Morgan WT and Muller-Eberhard U (1972), J. Biol. Chem., 247:7181-7187およびHeide K et al. (1964) Clin. Chim. Acta., 10:460-469を参照されたい〕。タンパク質は、一般的に280nmで吸収する。従って、ヘミン/Hpx-hGH複合体は、精製の間にUV  280/390nmをモニターすることによって特異的に追跡することができる。
【０１６７】
リフォールドされたHpx-hGHの精製の間に、ヘミンをモル過剰に添加し、390nmでの吸収がフロースルー（flow through）において及び溶出ピークにおいて認められた。しかしながら、図3aおよびbにおけるＵＶスキャンによって明らかなとおり、吸収プロファイルはフロースルーから溶出へ変化し、このことは次の事項を指摘している。その事項とは、遊離ヘミンがフロースルー（390nmでピーク）で見つけられ、結合したヘミンが溶出（405nmでピーク）に見つけられることである。hGHドメインの生物活性は、hGHの生物活性を評価するために適切なアッセイにおいて試験することができる。この一例は、BAF3アッセイである〔Wada M et al. (1997), Mol Endocrinol 12:146-156〕。
【０１６８】
加えて、タンパク質のリフォールディング後に、ジスルフィドブリッジマッピングをゲル内トリプシン消化、続いてトリプシン断片のＤＴＴ処理前後でのMALDI分析を実施した。Hpx-hGHは、６つのジスルフィドブリッジをHpx部分(Cys27-Cys208, Cys126-Cys131, Cys165-Cys177, Cys234-Cys437, Cys343-Cys385, Cys395-Cys412)に及び２つのジスルフィドブリッジを前記タンパク質のhGH部分(Cys53-Cys165, Cys182-Cys189)において含む。融合タンパク質中の８つのジスルフィドブリッジのうち４つの形成が同定できた；２つはHpx部分(Cys165-Cys177およびCys395-Cys412)および２つはhGH部分(Cys53-Cys165およびCys182-Cys189)であり、これによってHpxドメインがジスルフィドブリッジを正しく形成していることが示唆され、hGHドメインがジスルフィドブリッジを正しく形成していることが証明された。全てのジスルフィドブリッジがMALDI分析において検出できるわけではないことが一般的である。以上より、Hpx-hGHにおけるHpxドメインのヘミンに結合する能力、および６つのジスルフィドブリッジのうちの２つが陽性に同定されたことは、Hpxドメインが正しくフォールドされていることを強く指摘するものである。加えて、hGHドメインにおけるジスルフィドブリッジの双方が陽性に同定されたことは、このドメインが正しくフォールドされていることを暗示（imply）する。従って、機能的なドメインが無傷（intact）のHpx-hGH融合タンパク質が、首尾よく得られたと思われる。
【０１６９】
本発明の融合タンパク質はHis精製タグを含んでいるので、ニッケル親和性カラムで都合よく精製しえる。リフォールドされたHis6-D4K-Hpx-hGHを、Ni-NTAアガロース(Qiagen)に適用した。しかしながら、Ｎｉイオンは精製の間にマトリックスから除かれ、これはHpxへのＮｉ結合によって生じると考えられる。前記カラムは異なる緩衝液を用いて何回か使用されたが、前記カラムからのニッケル除去は阻止されなかった。
【０１７０】
代替的な戦略として、融合タンパク質は、イオン交換カラム（例えば、QセファロースFF）で精製しえる。この場合、ヒスチジン精製タグは、余分（redundant）である。
【０１７１】
ヒスチジンタグを含有しているエンテロキナーゼを有する融合タンパク質の処理は、Hpx-hGH融合タンパク質(配列番号5)を生じる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ベクター(pNNC19)が、AMP抵抗性およびT7駆動性でIPTG誘導性のhGH遺伝子を含むことを示す図である。Nde1/Sal1セグメントがNde1/Sal1含有ヘモペキシンＰＣＲ単位複製配列で置換されることによって、His6-D4K-ヘモペキシン-hGH (pNCC36)を含んでいる発現ベクターが得られる。
【図２】大腸菌におけるHis6-D4K-Hpx-hGHの発現を示す図である。レーン１  ＭＷマーカー：97, 66, 45, 30, 14.4 kDa；レーン２  pNNC19  hGHコントロール(24.65kDa)；レーン３  pNNC36  未誘導；レーン４  IPTG誘導；レーン５  超音波処理前；レーン６  超音波処理後；レーン７  可能性タンパク質；およびレーン８  封入体。
【図３】His6-D4K-Hpx-hGHの精製のフロースルー（a）および溶出物（ｂ）のＵＶスキャンを示す図である。
【図１】
2008515389.tif 000002
【図２】
2008515389.tif 000003
【図３】
2008515389.tif 000004
【国際調査報告】
2008515389.tif 000005
2008515389.tif 000006
2008515389.tif 000007
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