(57)【要約】  L. acidophilus、L. crispatus、L. gasseri、L. helveticusおよびL. jensenii属の乳酸菌株を、泌尿生殖器および／または胃腸の病原体を殺すそれらの能力、ならびに泌尿生殖器および／または胃腸の病原体の、膣上皮細胞内への内部移行を阻止するそれらの能力について、ならびに膣および／または胃腸のレベルで体液性および／または細胞性免疫反応をモジュレートするそれらの能力、特に炎症性症候群ならびに感染症候群を阻止する能力について、選択した。女性の泌尿生殖器感染症を予防または治療するために有用な、治療上有効な量の前記菌株の少なくとも１つを適当な生薬担体と共に含む、医薬品組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性の泌尿生殖器感染症を予防または治療するための方法であって、L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219）から成る群より選ばれる治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
女性の泌尿生殖路における病原体の接着、コロニー化および／または増殖を、予防または阻止するための方法であって、L. crispatus KS 116.1(CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218）、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219) から成る群より選ばれる治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項３】
膣および／または胃腸レベルの体液性および／または細胞性免疫反応をモジュレートするための、特に炎症性症候群ならびに感染症候群を阻止するための方法であって、L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219) から成る群より選ばれる治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む、方法。
【請求項４】
乳酸菌株をＬＡＢ増殖因子と共に投与する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
適当な生薬担体を局所投与のために設計する、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
適当な生薬担体を経口投与のために設計する、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
女性の泌尿生殖器感染症の予防または治療のために有用な医薬品組成物であって、L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219) から成る群より選ばれる治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を適当な生薬担体と共に含む、医薬品組成物。
【請求項８】
膣および／または胃腸のレベルの体液性および／または免疫応答をモジュレートするために、特に炎症性症候群ならびに感染症候群を阻止するために有用な医薬品組成物であって、L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219)から成る群より選ばれる治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を、適当な生薬担体と共に含む、医薬品組成物。
【請求項９】
ＬＡＢ増殖因子をさらに含み、局所投与のために設計される、請求項７および８のいずれか一項記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
ＬＡＢ増殖因子をさらに含み、経口投与のために設計される、請求項７〜９のいずれか一項記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219)から成る群より選ばれる少なくとも１つの乳酸菌株の、請求項７〜１０のいずれか１項記載の組成物の調製のための使用。
【請求項１２】
L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)、L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)、L. crispatus 127.1 (CNCM I-3486)、L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)、L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)、L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)、L. gasseri KS 124.3 (CNCM I-3220)、L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)、L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)およびL. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219)から成る群より選ばれる乳酸菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける様々な病原体によって引き起こされる感染性疾患の治療、より具体的には女性における泌尿生殖器感染症の予防および／または治療に関する。
【０００２】
背景技術
いくつかの実験および臨床研究によって、ある乳酸桿菌の、細菌性膣炎、膣疾患、または尿路感染症などの一定の泌尿生殖器感染症の予防または治療における可能性が既に評価されており、また適切な療法が既に何十年間も適用されている。
【０００３】
泌尿生殖器感染症は、特に女性の集団において依然として一般的な疾病である。泌尿生殖器上皮への細菌の接着は、尿路感染症（ＵＴＩ）および特に腟感染症の開始および発病の重要な機作であると認められている。泌尿生殖器の病原体は、主に腸管起源であり、最初に尿道周辺領域にコロニー化し、膀胱へ上昇して症候性または無症候性の細菌性尿症を引き起こす。あるいは、これらの細菌は膣に侵入し、次にコロニー化して、そこに様々な型の症候性ならびに無症候性の腟感染症を引き起こす。その後、宿主因子および細菌の病原性因子に依存して、その生物体はさらに上昇し、それぞれ腎盂腎炎および女性生殖路の上行性感染症を引き起こす。泌尿生殖器の病原体は、通常は効率的な宿主側の防御機構に抵抗することを可能にする病原性特性を示す。
【０００４】
乳酸桿菌などの自然フローラ（autochthonous flora）の細菌の、泌尿生殖器病原体の泌尿生殖路へのコロニー化を排除するための使用は、何年間も比較的広範に研究され、確立している概念である（例えば、Cadieux et al. - Lactobacillus strains and vaginal ecology - Jama. 287:1940-41/2002; Butler BC, Beakley JW. Bacterial flora in vaginitis. Am J Obstet Gynaecol 1960;78:432-40, Eschenbach DA, Davick PR, Williams BL, Klebanoff SJ, Young- Smith K, Critchlow CM et al. Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. J Clin Microbiol 1989;27:251-6, Sobel JD, Cook RL, Redondo-Lopez V. Lactobacilli: a role in controlling the vaginal microflora? in Horowitz BJ, Mardh P-A, eds. Vaginitis and Vaginosis, pp 47-53. New York: Wiley-Liss, 1991, Lauritzen C, Graf F, Mucha M. Restoration of the physiological vaginal environment with Doederlein bacteria and estriol. Frauenarzt 1984; 4.を参照のこと）。
【０００５】
この文脈中で用いられる乳酸桿菌は、乳酸、バクテリオシンのような拮抗物質およびＨ2Ｏ2の生産などの種々の機作により、泌尿生殖器のミクロフローラの制御に寄与すると信じられている。
【０００６】
生物治療薬による治療の主要な目標は、正常なミクロフローラを再建することができるときまで、病原体の過増殖を防止することである。さらに細菌療法は、「自然で」、従来の薬品治療と対照的に副作用がないと考えられる。
【０００７】
最近、乳酸菌（ＬＡＢ）株、それらの特性および薬学領域におけるそれらの将来的な使用についての詳細な知識に関して既に得られた進歩にもかかわらず、より便利でより効率的なＬＡＢ菌株を医学界に提示する必要性が、依然として残っている。
【０００８】
本発明の目的は、様々な病原体によって引き起こされる感染症（すなわち女性の泌尿生殖路の感染症）の治療において、あるいは例えば抗生物質で行なわれるような過酷な薬物療法後の平衡のとれた健康な泌尿生殖器生物相の回復において特に有効な、新しくて有用なＬＡＢ菌株を提供することである。本発明はさらにまた、特別に選択されたＬＡＢ菌株を含む、そのような感染の予防的または治療的な新しい治療法を提供する。
【０００９】
発明の開示
第１の目的として、本発明は、泌尿生殖器のおよび／または胃腸の病原体を殺す能力、ならびに泌尿生殖器のおよび／または胃腸の病原体の膣上皮細胞内への内部移行を阻害する能力について選ばれた、L. acidophilus、L. crispatus、L. gasseri、L. helveticus、L. jensenii属の乳酸菌（ＬＡＢ）株を提供することにする。
【００１０】
前記細菌はさらに、泌尿生殖器および／または胃腸の粘膜細胞の体液性および／または細胞性免疫反応をモジュレートする能力ならびに前記粘膜細胞内の炎症性症候群を阻止する能力について選択される。
【００１１】
別の目的として、本発明は、女性の一生にわたる健康な泌尿生殖器のフローラを確立し、維持し、または回復するための方法であって、治療上有効な量の少なくとも１つの選択されたＬＡＢ菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む方法、を提供する。
【００１２】
本発明はさらに、治療上有効な量の少なくとも１つの前記ＬＡＢ菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む、女性の泌尿生殖器感染症を予防または治療するための方法に関する。
【００１３】
本発明はさらにまた、女性の泌尿生殖路における病原体の接着、コロニー化および／または増殖を予防もしくは阻止するための方法であって、治療上有効な量の少なくとも１つの前記ＬＡＢ菌株を適当な生薬担体と共に含む医薬品製剤を投与する工程を含む方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、組成物、特に治療上有効な量の少なくとも１つの乳酸菌株を適当な生薬担体と共に含む、上記機構において有用な医薬品組成物に関する。
【００１５】
結局、本発明は組成物、より特別にはここで上述した医薬品組成物、の調製における前記ＬＡＢ菌株の１つの使用に関する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明のＬＡＢ菌株を、モデルとして選ばれた子宮頚部ＨｅＬａまたはＣａｃｏ−２などの上皮細胞に接着する能力に関して最初に選択した。細胞接着は、前記ＬＡＢが上皮組織（例えば泌尿生殖路の）へコロニー化し、そこで病原体のその特定位置への接着と競合し、阻止し、または除去する能力を規定するのであるから、確かに必須の選択用の機能である。
【００１７】
前記ＬＡＢ菌株をさらに、病原体（即ち上皮細胞からの泌尿生殖器および胃腸の病原体）の接着、増殖、およびさらに生存までを阻止する追加の能力に関して選択した。以下に挙げるようなグラム陰性ならびにグラム陽性病原体が、本発明のＬＡＢ菌株によって、接着、増殖、または病原活性に関して、有意に影響される病原体の代表である：S. enterica serovar TyphimuriumのようなSalmonella種、E.coli、例えばS. agalactiaeなどのStreptococcus種、S. aureusのようなStaphylococcus種、例えばG. vaginalisのようなGardnerella種、例えばP. biviaなどのPrevotella種；この列挙はもちろん網羅的ではない。
【００１８】
本発明のＬＡＢ菌株は、泌尿生殖器および／または胃腸の病原体、特に上述したような泌尿生殖器または胃腸のグラム陰性もしくはグラム陽性病原体を、殺す能力および／または膣上皮細胞内への内部移行を阻止する能力も有する。その枠組内の最も効率的なＬＡＢは、大量の過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）および乳酸の両方をインサイチューで発現し、そこで両因子が相乗的に作用する。後者は確かに、例えばGardnerellaおよび Prevotella種のような嫌気性泌尿生殖器病原体に対して極めて効果的であることが証明されている。
【００１９】
本発明のＬＡＢ菌株は、結果的にさらに重要な機能、即ち免疫担当細胞（すなわち胃腸または泌尿生殖器の粘膜細胞ならびに上皮細胞）の免疫応答をモジュレートする能力、言いかえれば、上述したようなグラム陰性またはグラム陽性病原体に、特に泌尿生殖器病原性E.coliに感染したときに、前記細胞の免疫応答を開始させ、刺激し、または強化する能力を示す。したがって前記ＬＡＢ菌株は、それらの特異的な機能により、病原体汚染にさらされたときに、胃腸もしくは泌尿生殖器の粘膜または膣上皮細胞の炎症性症候群を阻止する能力を有する。
【００２０】
極めて興味深いことに、その特異的な機能は、２つの別個のルートを用いて、即ちそれぞれＩＬ１０、ＩＬ１２、ＴＮＦまたはＩＦＮのような親炎症性または抗炎症性のサイトカインの誘導によって、上に述べた免疫応答のモジュレーションを行なう。本発明のいくつかのＬＡＢ菌株、即ち L. crispatus KS 116.1およびL. gasseri KS 124.3が、高いＩＦＮγ誘導能力を示すことがさらに観察され、これはそれらの菌株の抗感染症剤としての使用に適した機能である。
【００２１】
この菌株特異性は従って、問題となっている医学的治療を行なうために最も適切な菌株または菌株の組合せを選択する可能性を当業者に提供する。
【００２２】
これらの特性を示すＬＡＢ菌株の中で、本発明による好ましい種を以下に列挙する：L. jensenii KS 109、L. gasseri KS 114.1、L. crispatus KS 116.1、L. jensenii KS 119.1、L. crispatus KS 119.4、L. gasseri KS 120.1、L. jensenii KS 121.1、L. jensenii KS 122.1、L. gasseri KS 123.1、L. gasseri 124.3、L. gasseri KS 126.2、L. crispatus 127.1、L. jensenii KS 129.1、L. jensenii KS 130.1、L. helveticus KS 300、およびL. acidophilus KS 400。これらの菌株の大部分は健康なヒト膣のミクロフローラの代表である。
【００２３】
特に好ましい種として、次の菌株を挙げることができる：
【００２４】
L. gasseri KS 114.1 (CNCM I-3482)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生１０．５g/L−Ｈ２Ｏ２産生１０mg/L
【００２５】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、およびＧＥＮに陽性。
【００２６】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００２７】
L. crispatus KS 116.1 (CNCM I-3483)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陽性−乳酸産生９．６g/L−Ｈ２Ｏ２産生２mg/L。
【００２８】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＭＡＬ、およびＳＡＣに陽性。
【００２９】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００３０】
L. jensenii KS 119.1 (CNCM I-3217)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生７．４g/L−Ｈ２Ｏ２産生２０mg/L。
【００３１】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＭＥＬ、ＳＡＣ、ＧＥＮ、およびＴＡＧに陽性−ＲＩＢに対しては変動。
【００３２】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＲＢ、ＬＡＣ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００３３】
L. crispatus KS 119.4 (CNCM I-3484)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陽性−乳酸産生１０．３g/L−Ｈ２Ｏ２産生陰性。
【００３４】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、およびＡＭＤに陽性。ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００３５】
L. gasseri KS 120.1 (CNCM I-3218)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生１０．６g/L−Ｈ２Ｏ２産生１mg/L。
【００３６】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、およびＡＭＤに陽性。
【００３７】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＲＩＢ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＮＡＧ、ＡＲＢ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００３８】
L. jensenii KS 121.1 (CNCM I-3219)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生１０．６g/L−Ｈ２Ｏ２産生１mg/L。
【００３９】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、およびＡＭＤに陽性−ＲＩＢ、ＮＡＧ、ＬＡＣ、ＲＡＦ、およびＬＦＵＣに対しては変動。
【００４０】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００４１】
L. gasseri KS 123.1 (CNCM I-3485)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生８．５g/L−Ｈ２Ｏ２産生１０mg/L。
【００４２】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＬＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＭＡＬ、およびＳＡＣに陽性−ＲＩＢおよび５ＫＧに対しては変動。
【００４３】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＧＡＬ、ＦＲＵ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＴＲＥ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＧＥＮ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、および２ＫＧに陰性。
【００４４】
L. gasseri KS 124.3 (CNCMＩ-3220)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陰性−乳酸産生１７．０g/L−Ｈ２Ｏ２産生２０mg/L。
【００４５】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＮＡＧ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＭＡＬ、ＳＡＣ、およびＴＲＥに陽性−ＲＴＢ、ＡＭＤ、ＧＥＮ、および５ＫＧに対しては変動。
【００４６】
ＫＯＮ、ＧＬＹ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＤＸＹＬ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＣＥＬ、ＬＡＣ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＧＬＹＧ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＴＡＧ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、ＧＮＴ、および２ＫＧに陰性。
【００４７】
L. crispatus KS 127.1 (CNCMＩ-3486)：グラム陽性−カタラーゼ陰性−オキシダーゼ陽性−乳酸産生１６．７g/L−Ｈ２Ｏ２産生 陰性。
【００４８】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＲＢ、ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＭＡＮ、ＳＯＲ、ＮＡＧ、ＡＭＹ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、ＭＬＺ、ＡＭＤ、ＧＬＹＧ、ＧＥＮ、ＴＡＧ、およびＧＮＴに陽性−ＧＬＹおよびＤＸＹＬに対しては変動。
【００４９】
ＫＯＮ、ＥＲＹ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＡＲＢ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＭＬＺ、ＲＡＦ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００５０】
L. helveticus KS 300 (CNCM I-3360)：グラム陽性−乳酸産生１０．４５g/kg−Ｈ2Ｏ2産生１mg/L。
【００５１】
ＡＰＩ ５０ ＣＨＩテスト：ＧＡＬ、ＧＬＵ、ＦＲＵ、ＭＮＥ、ＡＭＹ、ＡＲＢ、ＥＳＣ、ＳＡＬ、ＣＥＬ、ＭＡＬ、ＬＡＣ、ＳＡＣ、ＴＲＥ、およびＡＭＤに陽性。
【００５２】
ＲＩＢ、ＭＡＮ、ＧＬＹ、ＳＯＲ、ＫＯＮ、ＥＲＹ、ＭＬＺ、ＤＡＲＡ、ＬＡＲＡ、ＬＸＹＬ、ＡＤＯ、ＭＤＸ、ＳＢＥ、ＲＨＡ、ＤＵＬ、ＩＮＯ、ＭＤＭ、ＭＤＧ、ＭＥＬ、ＩＮＵ、ＲＡＦ、ＴＡＧ、ＧＮＴ、ＸＬＴ、ＴＵＲ、ＬＹＸ、ＤＦＵＣ、ＬＦＵＣ、ＤＡＲＬ、ＬＡＲＬ、２ＫＧ、および５ＫＧに陰性。
【００５３】
これらの菌株を、ブダペスト条約に従い正式にパスツール研究所、パリ（フランス）に登録した。
【００５４】
本発明によれば、ＬＡＢ菌株を、それらの特異的な抗病原体活性により、女性の泌尿生殖器の感染症の予防または治療のために、ならびに女性の泌尿生殖路の病原体のコロニー化および／または増殖を予防または阻止するために、即ち前記ＬＡＢ菌株が極めて効率的であると証明された状況下で、有利に用いることができる。
【００５５】
さらに、前記ＬＡＢ菌株を、女性の健康な泌尿生殖器の生物相を一生にわたって維持しまたは回復するために、より詳細には妊娠前、妊娠中、および妊娠後に女性の健康な泌尿生殖器の生物相を確立し、維持し、回復するために、あるいは抗生物質で行なわれるような過酷な薬物療法の後に平衡のとれた健康な生物相を回復するために、極めて効率的に用いることができる。
【００５６】
対応する治療的または予防的処置を、適当な生薬賦形剤、支持剤、または担体と組合せた治療上有効な量の本発明のＬＡＢ菌株を含む医薬品製剤を、経口でまたは局所的に投与することにより行なう。
【００５７】
上記の治療を行なうために適した医薬品組成物または調製物は、さらに通常のＬＡＢ増殖因子を含むことができる。経口投与用に設計された場合は、前記組成物を、例えば食品サプリメントとして、好ましくは、凍結乾燥した微生物を含む摂取可能なカプセルの形で、または食用乳ベースの散剤、懸濁液または乳剤の形で、あるいは食用発酵乳製品、例えばヨーグルトの形で、提供することができる。
【００５８】
上述のような組成物は、本発明のＬＡＢ菌株の混合物、ならびにこれらの菌株の少なくとも１つと、１つまたはいくつかの従来技術の菌株の混合物を、同様に含むことができる。さらに、これらの組成物は、特異的に選択された化合物のような追加の薬学的有効成分を含んでもよい。
【００５９】
上述した組成物または調製物は、選択された微生物を、グラムまたは用量または単位当たり約１０６CFU（コロニー形成単位）〜約１０11CFU、好ましくは約１０８〜約１０11CFUの範囲であり得る量で、通常それらの生存度およびそれらの特異性を元のままに保つ脱水した形で、例えば凍結乾燥の形で含んでいればよい。前記組成物の最終的な詳細ならびにその用量は、結局、それらが意図する特異的な用途および標的器官、治療される患者もしくは人の年齢または健康状態、病原体汚染の性質に依存するであろう。すべての関連するパラメーターを調節することは、医学界の現在の技術および専門知識により可能である。
【００６０】
従来の既知の参考菌株と比較したとき（下記の実施例を参照のこと）、本発明のＬＡＢ菌株は、そのために選択された実験的モデルに依存して、同様のまたはより高い抗病原体活性を示した。
【００６１】
次の実施例は、本発明の実施態様のうちのいくつかのみの例示であり、したがって、そのいかなる限界または制限を構成することも意図するものではない。
【００６２】
実施例
【００６３】
【表１】
2008517014.tif 000002
【００６４】
対照の接着性乳酸桿菌株は、L. casei rhamnosus菌株GG (ATCC番号53103)、L. rhamnosus菌株GR-1 (ATCC番号55826)、およびL. fermentum菌株RC-14 (ATCC番号55845)である。
【００６５】
すべての乳酸桿菌株を、Ｄｅ Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ、Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地（Biokar Diagnostic, Beauvais, France）で、３７℃１８時間増殖させた。
【００６６】
病原菌
Salmonella enterica serovar Typhimurium菌株SL 1344は、B.A.D. Stocker（Stanford, California）から贈与された。細菌をＬｕｒｉａ培地（Difco Laboratories）中で３７℃、終夜１８時間増殖させた。
【００６７】
尿路病原性で散在して接着する Escherichia coli菌株IH11128および7372、ならびに下痢原性菌株C1845は、B. Nowicki（Texas University, Galvestone）およびS. Moseley（Seattle University）から寄贈された。菌株７３７２は、クラスII ｐａｐＧ対立遺伝子、ｈｌｙ遺伝子（溶血素）およびＤｒオペロンを保持する。菌株IH11128は、Ｄｒオペロンを保持する。菌株C1845は、Ｄａａオペロンを保持する。すべての細菌株をＬＢプレート上で維持し、また、感染に先立って、細菌を３７℃１８時間ＬＢ培地中で増殖させた。
【００６８】
菌株Streptococcus agalactiae DSM 2134、Gardnerella vaginalis DSM 4944、Prevotella bivia Cl-1 (DSM 20514)およびCandida albicans DSM 1386は、Medinova Ltd.(Zurich, Switzerland)から得た。Staphylococcus aureus菌株はPasteur culture collection (Paris) から得た。細菌を、３７℃で一晩ＴＳＡ培地（Difco Laboratories）中で増殖させた。Streptococcus agalactiae菌株を、３７℃で終夜ＢＨＩ培地（Difco Laboratories）中で増殖させた。
【００６９】
Candida albicans 菌株を、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地中で終夜３７℃で増殖させた。Gardnerella vaginalis および Prevotella biviaをBio Merieux Franceから購入したＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ寒天プレート上で増殖させた。
【００７０】
細菌を、緩衝塩化ナトリウムペプトン溶液ｐＨ７．０に約１０６コロニー形成単位（CFU/ml）で、懸濁させた。５００μlの調製した懸濁液を寒天プレートに塗り広げた。接種したプレートを無菌の層気流条件下で乾燥させた。次に寒天プレートを、密封した嫌気瓶（Becton Dickinson, USA）を用いた嫌気条件下３７℃で最大３６時間インキュベーションした。使用前に、Gardnerella vaginalis 菌株を、酵母抽出物、マルトース、およびウマ血清を補足したＢＨＩ中で、密封した嫌気瓶を用いた嫌気条件下で、３７℃で最大３６時間継代培養した。
【００７１】
使用前に、細菌培養物を５，５００×ｇ、５分間４℃で遠心した。培地を捨て、細菌をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で一回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【００７２】
細胞系統および培養
ヒト子宮頚部ＨｅＬａ細胞を、以前に記載されたように（１４）、３７℃で５％ＣＯ２−９５％空気雰囲気下、１０％の非働化（３０分、５６℃）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Boehringer, Mannheim, Germany）を補足したＬ−グルタミン入りＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で培養した。集密する前に、即ち培養５日後に、細胞を感染分析に用いた。
【００７３】
用いたヒト腸細胞系統は、親のＣａｃｏ−２細胞系統から確立されたＴＣ７クローン（Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７）であった。以前に記述されたように慣例通りに、細胞を、１５％非働化（３０分、５６℃）ウシ胎仔血清（Invitrogen、Cergy、France）および１％非必須アミノ酸（Invitrogen）で補足されたＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ最少必須培地（ＤＭＥＭ）（２５mMグルコース）(Invitrogen）中で増殖させた。維持の目的で細胞を、０．０２％トリプシンを用い、３mMＥＤＴＡを含むＣａ2+、Ｍｇ2+フリーのＰＢＳを用いて毎週継代した。細胞の実験および維持を、３７℃で１０％ＣＯ２／９０％空気雰囲気中で行なった。毎日培地を換えた。１５日間培養後細胞を集密させた後に（完全に分化した細胞）、S. enterica serovar Typhimuriumの感染アッセイに用いた。
【００７４】
接着分析
乳酸桿菌株の子宮頚部ＨｅＬａ細胞および腸Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞上への接着を、次の工程によって検査した：細胞単層を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。各接着分析について、０．５mlの乳酸桿菌懸濁液（使用済み培地上清を伴う細菌）をＤＭＥＭ（０．５ml）と混合し、次に組織培養プレート（２４ウェル）の各ウェルに加え、それを次に３７℃で１０％ＣＯ2／９０％空気中、インキュベーションした。検査した細菌の最終濃度は、１ml当たり１×１０８、２×１０８、１×１０９、および２×１０９細菌であった。１時間インキュベーションした後、単層を無菌ＰＢＳで５回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色で染色し、次に、油浸下で顕微鏡検査した。各接着分析を、３代継代培養の細胞で二重に行った。各分析について、２０の無作為な顕微鏡下の領域で接着した細菌数を測定した（接着スコア：０〜５）。さらに、生存可能な接着する乳酸桿菌のレベルを、感染細胞単層に結合している細菌の定量的測定により決定した。感染させた後に、細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄し、滅菌Ｈ2Ｏで溶解させた。適当な稀釈液を、トリプティックソイ寒天（ＴＳＡ）上にプレートし、細菌コロニー計数によって生存可能な細胞に結合した細菌数を決定した。
【００７５】
各細胞結合分析を、３代継代培養細胞によって、少なくとも３重に行った。結果を、細胞に結合した細菌のCFU/mlとして表した。
【００７６】
病原体の増殖に対する活性
ＭＲＳ（５ml）および特異的病原体培地（５ml）を含む培地に、０．１mlの培養した病原体および０．１mlの培養した乳酸桿菌株を接種した。対照は、ｐＨ４．５に調節された、０．１mlの培養した病原体および０．１mlの未培養ＭＲＳを接種した培地であった。指示した時点で、アリコートを取り出し、連続希釈してトリプティックソイ寒天上にプレートし、病原体の細菌コロニー計数を測定した。各分析を少なくとも３重に行った。結果を、CFU/mlとして表した。
【００７７】
病原体の生存度に対する活性。
１０８CFU/mlの病原体（０．５ml）を乳酸桿菌培養（１０８CFU/ml、０．５ml）と共に３７℃でインキュベーションすることにより、コロニー計数分析を行なった。対照は、ｐＨ４．５に調節された未培養ＭＲＳであった。最初に、および所定の時間間隔で、小部分を取り出し、連続的に薄めてトリプティックソイ寒天上にプレートし、病原体の細菌コロニー数を測定した。各分析を少なくとも３重に行った。結果をCFU/mlとして表した。
【００７８】
尿路病原性E.coliの上皮ＨｅＬａ細胞への接着の阻害
細胞単層感染のために、病原体を上述の適当な培地で３７℃１８時間培養した。感染に先立って、２４ウェルＴＰＰ組織培養プレート（ATGC, Paris, France）中で調製された細胞単層を２回ＰＢＳで洗浄した。感染させる細菌を培地に懸濁させ、０．５ml ＤＭＥＭ＋０．２５ml培養病原体（１×１０８CFU/ml）＋０．２５ml乳酸桿菌培養液（１．５×１０９CFU/ml）の全量を、組織培養プレートの各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１０％ＣＯ2／９０％空気中、示したような異なる感染時間の間インキュベーションし、次に無菌のＰＢＳで３回洗浄し、滅菌Ｈ2Ｏで溶解した。適当な稀釈液をトリプティックソイ寒天上にプレートし、細菌コロニー計数によって細胞に結合した生存可能な細菌の数を決定した。各分析を、ＨｅＬａ細胞の3代継代により３重に行った。
【００７９】
分析
結果を、平均±平均に対する標準誤差 として表す。統計的比較のために、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行なった。
【００８０】
結果
実施例１
１．L. jensenii KS 119.1およびKS 130.1、L. crispatus KS 116.1およびL. gasseri KS 124.3の、ＨｅＬａ細胞およびＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞への接着能力
【００８１】
上記の菌株の接着レベルを、細胞に４つの濃度（５×１０7；１×１０8；５×１０8；１×１０9CFU/ウェル）の乳酸桿菌を接種した後に、決定した。概して濃度依存性の接着が観察された。
【００８２】
子宮頚部ＨｅＬａ細胞では、観察された接着レベルは、テストした菌株がすべて接着していることを示す。L. jensenii KS 119.1およびKS 130.1菌株が、対照の接着する菌株、L. casei rhamnosus GGおよびL. rhamnosus GRl菌株と比較して、最良の接着する菌株（５×１０８CFU/ウェルで１０７.５CFU/ml）と思われた。
【００８３】
腸Ｃａｃｏ−２／ＴＣ７細胞では、観察した接着レベルが、すべての Medinova菌株が接着していることを示した。L. crispatus KS 116.1、L. jensenii 119.1、129.1、および KS 130.1、L.gasseri 124.3菌株が、対照の接着する菌株、L. casei rhamnosus GGおよびL. rhamnosus GRl菌株と比較して、最良の接着する菌株（５×１０８CFU/ウェルで１０７.５〜８CFU/ml）と思われた。
【００８４】
走査電子顕微鏡による観察によれば、すべての「本発明の乳酸桿菌株」が、ＨｅＬａおよびＣａｃｏ−２／ＴＣ７細胞と密着して接着しているように見えた。
【００８５】
それらの接着特性に基づいて、L. crispatus KS 116.1およびL. jensenii KS 119.1を、尿路膣および腸の病原体に対する抗菌活性に関する次の研究のために選択した。
【００８６】
２．泌尿生殖器および腸の病原体の増殖に対するKS 116.1および KS 119.1の活性
【００８７】
上述の菌株が、Staphylococcus aureus、Streptococcus agalactiae、尿路病原性および下痢原性E.coliおよび下痢原性Salmonella enterica serovar Typhimuriumの増殖に対する活性を有するかどうかを検査した。病原体の増殖を５、８、１８、および２４時間に測定した。
【００８８】
Staphylococcus aureusについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の増殖を阻害した。同様に、L. crispatus KS 116.1およびL. jensenii 119.1が、Staphylococcus aureusの増殖を阻害し、生細菌数の減少を示した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、L. jensenii 119.1が最も活性が強い菌株と思われた。
【００８９】
尿路病原性E.coli菌株IH11128および7372については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の増殖を阻害した。同様に、L. crispatus KS 116.1およびL. jensenii KS 119.1がE.coli.の増殖を阻害した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、L. jensenii 119.1が最も活性が強い菌株と思われた。
【００９０】
下痢原性E.coli菌株Cl845については、対照のL. rhamnosus strain GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が細菌の増殖を阻害した。同様に、L. crispatus KS 116.1およびL. jensenii KS 119.1が、E.coliの増殖を阻害した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、調査したすべての乳酸桿菌株について同一の活性が見出された。
【００９１】
下痢原性S. enterica serovar Typhimurium菌株 SLl344については、対照のL. rhamnosus strain GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の増殖を阻害した。同様に、L. jensenii 119.1がS. enterica serovar Typhimuriumの増殖を阻害した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、対照のL. rhamnosus菌株 GR-1およびL. fermentum菌株RC-14およびL. jensenii KS 119.1.について同一の活性が見出された。対照的に、L. crispatus KS 116がより低い活性を示した。
【００９２】
Candida albicansについては、対照のL. rhamnosus strain GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. crispatus KS 116.1およびL. jensenii KS 119.1には活性が見出されなかった。
【００９３】
３．泌尿生殖器および腸の病原体に対する、KS 116.1およびKS 119.1の死滅活性。
【００９４】
前記乳酸桿菌が、Staphylococcus aureus、Streptococcus agalactiae、尿路病原性および下痢原性E.coli、および下痢原性Salmonella enterica serovar Typhimuriumの生存度に対して活性を有するかどうかを検査した。病原体の生存度に対する影響を、２、３、および４時間に測定した。
【００９５】
Staphylococcus aureusについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. jensenii 119.1が、細菌の生存度を２桁減少させた。対照的に、L. crispatus KS 116.1は活性を示さなかった。
【００９６】
Streptococcus agalactiaeについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. jensenii 119.1およびL. crispatus KS 116.1は活性を示さなかった。
【００９７】
尿路病原性E.coli菌株IH11128および 7372については、対照のL. rhamnosus菌株GR- 1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の生存度の４桁の減少を示した。L. crispatus KS 116.1およびL. jensenii 119.1は活性がなく、細菌の生存度の1桁のみの減少を示した。
【００９８】
下痢原性E.coli菌株C1845については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14の両方が、ならびにL. crispatus KS 116.1およびL. jensenii 119.1が、C1845細菌の生存度に対して低い活性を示した（２桁の減少）。
【００９９】
下痢原性S. enterica serovar Typhimurium菌株SL1344については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14の両方が、ならびにL. crispatus KS 116.1およびL. jensenii 119.1が高い活性を示し、SL1344細菌の生存度を減少させた（５桁の減少）。
【０１００】
Gardnerella vaginalisについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. fermentum菌株RC-14およびL. jensenii 119.1が、Gardnerellaの生存度を２桁減少させた。対照的に、L.crispatus KS 116.1は活性を示さなかった。
【０１０１】
Candida albicansについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. crispatus KS 116.1およびL. jensenii KS 119.1は活性が見られなかった。
【０１０２】
４．KS 116.1およびKS 119.1による、尿路病原性E.coli菌株IH11128のＨｅＬａ細胞への接着の阻害
【０１０３】
前記乳酸桿菌が、尿路病原性E.coli菌株IH11128のＨｅＬａ細胞への接着を阻害することができるかどうかを検査した。対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. jensenii 119.1およびL. crispatus KS 116.1の影響を、３つの濃度：ウェル当たりの細菌１×１０８、５×１０８および１×１０９で測定した。
【０１０４】
３０〜４０％のIH11128接着阻害が、ウェル当たり細菌１×１０８の濃度で、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14について見出された。この濃度では、L. jensenii KS 119.1およびL. crispatus KS 116.1は不活性であった。IH11128の接着が、ウェル当たり細菌５×１０８の濃度で、L. jensenii 119.1およびL. crispatus KS 116.1によって有効に阻害され、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14で得られたものと同様の阻害が観察された。同様のIH11128接着の高い阻害レベルを、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. jensenii 119.1およびL. crispatus KS 116.1で、ウェル当たり細菌１×１０９の濃度で観察した。
【０１０５】
実施例２
１．L. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300およびL. acidophilus KS 400の、泌尿生殖器および腸の病原体の増殖に対する活性。
【０１０６】
上述した菌株が、Staphylococcus aureus、Streptococcus agalactiae、Candida albicansおよび尿路病原性ならびに下痢原性E.coli菌株IH11128および7372の増殖に対して活性を有するかどうかを検査した。病原体の増殖を５、８、１８、および２４時間に測定した。
【０１０７】
L. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300およびL. acidophilus KS 400、ならびに対照の菌株GR-1およびRC-14は、Streptococcus agalactiaeおよびCandida albicansに対する活性をあらわさなかった。
【０１０８】
Staphylococcus aureusについては、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の増殖を阻害した。同様に、L. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300およびL. acidophilus KS 400が、Staphylococcus aureusの増殖を阻害し、生細菌数の減少を示した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、L. helveticus KS 300が最も活性が高い菌株と思われた。
【０１０９】
尿路病原性E.coli菌株IH11128については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14が、細菌の増殖を効果的に阻害した。同様に、L. helveticus KS 300がE.coli.の増殖を効果的に阻害した。乳酸桿菌株の活性を比較したとき、L. gasseri KS 124.3およびL. acidophilus KS 400にはより低い活性が現れた。
【０１１０】
尿路病原性E.coli菌株7372については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14の両方が、細菌の増殖を阻害した。同様にL. helveticus KS 300がE.coliの増殖を阻害した、しかし一方で、L. acidophilus KS 400は２５時間の時だけ活性があった。
【０１１１】
２．泌尿生殖器および腸の病原体に対する、KS 124.3、KS 300、およびKS 400の死滅活性。
【０１１２】
前記乳酸桿菌が、Staphylococcus aureus、Streptococcus agalactiae、Candida albicans、尿路病原性E.coli IH11128および7372、下痢原性E.coli C1845ならびにGardnerella vaginalisの生存度に対して活性を有するかどうかを検査した。病原体の生存度に対する影響を、２、３、および４時間目に測定した。
【０１１３】
Staphylococcus aureusについては、対照菌株L. rhamnosus GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300およびL. acidophilus KS 400が、細菌の生存度を２〜３桁減少させた。
【０１１４】
Streptococcus agalactiaeおよびCandida albicansについては、２つの対照菌株ならびにL. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300およびL. acidophilus KS 400は活性を示さなかった。
【０１１５】
尿路病原性E.coli菌株IH11128については、対照菌株L. rhamnosus GR-1およびL. fermentum菌株RC-14、ならびにL. helveticus KSが同様に、３桁の細菌生存度の減少を示した。L. acidophilus KS 400およびL. gasseri KS 124.3は活性がなかった。
【０１１６】
尿路病原性E.coli菌株7372については、対照菌株が、２桁の細菌生存度の減少を示した。L. helveticus KS 300は３桁の減少を示したが、一方でL. acidophilus KS 400およびL. gasseri KS 124.3は、同じ条件で活性がなかった。
【０１１７】
Gardnerella vaginalisについては、両方の対照菌株、L. acidophilus KS 400およびL. gasseri KS 124.3が、細菌の生存度を３桁減少させた。L. helveticus KS 300 に対しては、上記の対照菌株について見出されたよりも高い、迅速で効果的な活性が観察された。
【０１１８】
下痢原性E.coli菌株C1845 については、対照のL. rhamnosus菌株GR-1およびL. fermentum菌株RC-14の両方が、C1845細菌を殺し、その生存度の３桁の減少を示した。同様の活性がL. gasseri KS 124.3について観察された。しかしL. acidophilus KS 400に関しては、活性が検出されなかった。L. helveticus KS 300は、上記の対照菌株について観察されたよりも明確に高い死滅活性を示す。
【０１１９】
実施例３
１．L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1、L. gasseri KS 120.1ならびにL. helveticus KS 300の泌尿生殖器および腸の病原体に対する死滅活性
【０１２０】
前記乳酸桿菌株が、Streptococcus agalactiae、Candida albicans、尿路病原性E.coli IH11128、Gardnerella vaginalis、Prevotella bivia、およびSalmonella enterica Typhimuriumの生存度に対して活性を有するかどうかを検査した。接触４時間で病原体の生存度に対する影響を測定した。
【０１２１】
Streptococcus agalactiaeおよび Candida albicansの両方については、テストした乳酸桿菌のいずれも活性を示さなかった。
【０１２２】
尿路病原性E.coli菌株IH11128については、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1が活性を示さなかった、しかし対照的に、L. gasseri KS 120.1は、振盪しない条件の大腸菌の生存度を効果的に（４桁）減少させた。L. helveticus KS 300およびL. fermentum RC-1対照菌株は、振盪しない条件のE.coliの生存度を２桁減少させた。
【０１２３】
Gardnerella vaginalisについては、L. jensenii KS 121.1および KS 122.1の両方が活性を示さなかった。対照的に、L. gasseri KS 120.1は、振盪しない条件のGardnerella vaginalisの生存度を効果的に（６桁）減少させた；L. helveticus KS 300もまた、振盪しない条件で同様の効率（４桁の減少）を示した、しかし対照菌株は、３桁の減少のみを示した。
【０１２４】
Prevotella biviaについては、L. gasseri KS 120.1、L. jensenii 122.1、L. helveticus KS 300、および対照菌株L. fermentum RC-14が、細菌の生存度を振盪しない条件で２桁減少させた。振盪しない条件でPrevotella biviaに対して高い活性を有したL. jensenii KS 121.1は、振盪した条件でテストしたときはその活性を失っていた。
【０１２５】
Salmonella Typhimuriumに関しては、L. gasseri KS 120.1(3桁)、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1、L. helveticus KS 300ならびに対照菌株L. fermentum RC-14が、振盪しない条件で強い活性を有した（６桁の減少）。L. gasseri KS 120.1は、振盪した条件でさえ、活性なままであった。
【０１２６】
２．KS 120、KS 121.1、KS 122.1、およびKS 300の、Gardnerella vaginalisおよびPrevotella biviaの増殖に対する活性
【０１２７】
テストを、振盪した条件および振盪しない条件で行なった。
【０１２８】
振盪しない条件で、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1は、Gardnerella vaginalisの増殖を阻害した、しかしL. gasseri 120.1、L. helveticusおよび対照菌株L. fermentum RC-14は、さらにより高程度に前記活性を阻害した。
【０１２９】
振盪した条件では、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1、ならびにL. helveticusもまた、それらの活性を失った。しかしL. gasseri 120.1は、Gardnerella vaginalisに対しては活性を有したままである（２桁の減少）。
【０１３０】
振盪した条件および振盪しない条件の両方で、L. gasseri KS 120.1、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1、L. helveticus KS 300、ならびに対照菌株が、高程度にPrevotella biviaの増殖を阻害した。
【０１３１】
３．Gardnerella vaginalisおよびPrevotella biviaのＨｅＬａ細胞への接着の、KS 120.1、KS 121.1、およびKS 300による阻害
【０１３２】
L. gasseri KS 120.1、L. helveticus KS 300、および対照菌株L. fermentum RC-14ならびにL. casei rhamnosus GGの影響を、ウェル当たり１×１０９細菌濃度で測定した。
【０１３３】
対照のL. fermentum RC-14菌株、およびL. jensenii KS 121.1が、テストした細胞へのGardnerella vaginalisの接着のレベルを２桁減少させた。L. gasseri KS 120.1およびL. helveticus KS 300は、前記接着を４桁減少させた。
【０１３４】
L. jensenii KS 121.1はPrevotella biviaの接着を１桁のみ減少させた、しかしL. gasseri KS 120.1、L. helveticus KS 300ならびに対照菌株RC-14は、前記接着を２桁減少させた。
【０１３５】
４．尿路病原性E.coli菌株IH11128のＨｅＬａ細胞への接着および内部移行の、KS 120.1、KS 121.1およびKS 300による阻害
【０１３６】
E.coliのような腸管外病原体によってしばしば用いられる、宿主の防御機構を回避するための戦略は、上皮細胞内に局所的貯蔵所を構築することであり（M. A. Muvlea in Escherichia coli. Cell. Microbiol. 4, 257-271, 2002）、IH11128菌株による細胞侵入は、これらの病原体の尿路中における長期に亘る存続を促進するための有効な機構であるように見える。
【０１３７】
L. gasseri KS 120.1、L. helveticus KS 300の、ならびに対照菌株RC-14およびGGの効果を、上記の尿路病原性E.coliについて検査した：L. jensenii 121.1が、生存可能な内部移行されたE.coliのレベルを２桁減少させた。しかしL. gasseri 120.1、L. helveticus、および両方の対照菌株は、内部移行されたE.coliの４桁の減少を示した。
【０１３８】
実施例４
免疫応答のモジュレーション（ヒトＰＭＢＣを用いるインビボのテスト）
【０１３９】
次の菌株を、以下に設定する条件で、それらの免疫応答を引き起こすまたはモジュレートするあるいは影響する能力に関して、具体的には、サイトカインその他の分泌を引き起こすそれらの能力に関してテストした：L. crispatus KS 116.1、L. jensenii 119.1、L. jensenii KS 121.1およびKS 122.1、L. gasseri KS 120.1、L. gasseri KS 124.3、L. helveticus KS 300ならびにL. acidophilus KS 400。
【０１４０】
サイトカインの誘導の検出を、単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をインビトロで刺激にするテストによって、行った。これらのテストの間に誘起されたサイトカインには、インターロイキン１０および１２（ＩＬ１０およびＩＬ１２）、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）がある。
【０１４１】
実験手順
【０１４２】
ＰＭＢＣの調製：
健康な被験者（４人の提供者）から得られた新鮮なヒト血液を、ＰＢＳ−Ｃａ（GIBCO）により１：２の比率で薄め、フィコール勾配（GIBCO）で精製した。４００×ｇ３０分間２０℃で遠心分離した後に、末梢血単核球細胞（ＰＭＢＣ）が、血清中で中間のリング層を形成した。ＰＭＢＣを注意深く吸引し、ＰＢＤ−Ｃａを用いて最終体積５０mlに懸濁させ、同じ緩衝液で、３５０×ｇ１０分２０℃の遠心分離工程により３回洗浄した。
【０１４３】
ＰＭＢＣを、続いて１０％w/vのＬ−グルタミン（GIBCO）およびゲンタマイシン（１５０μg/ml）（GIBCO）を補った、完全ＲＰＭＩ培地（GIBCOP）を用いて再懸濁した。顕微鏡下でＰＢＭＣを計数し、２×１０6細胞/mlの濃度に調節し、２４ウェルの組織培養プレート（Corning, Inc.）に分注した（１mlに小分けして）。
【０１４４】
細菌の調製：
ＬＡＢの終夜培養物をＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．２で２回洗浄し、２×１０9CFU/mlの濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１４５】
ＰＭＢＣとのインキュベーション：
これらの懸濁液から、１０μlをＰＭＢＣプレートのウェルへ移し、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気中３７℃でインキュベーションした。２４時間のインキュベーション後、上清を吸引し、２０００rpmで遠心し、上清を取り出して−２０℃で保存した。対照は細菌を含まない緩衝液であった。
【０１４６】
サイトカインの定量：
サイトカインの発現レベルをＥＬＩＳＡテスト（“酵素結合免疫吸着検定法”）によって決定した。抗サイトカイン抗体でＥＬＩＳＡプレートをコートし（終夜の手続）、ＰＢＳ／ＢＳＡ１％で抗体をブロックする。１５．６２〜２０００pg/mlの検出範囲をカバーする適当な標準を、既知の濃度のサイトカインで調製した（一晩インキュベーションして）。
【０１４７】
抗サイトカイン性の検出および定量を、基質（ＴＭＢ Phamingen）に対するストレプトアビジンの反応によって行なった。Phamingenの市販キットをメーカーの記載に従って用いた。４つのサイトカイン：親炎症性／Ｔｈ１サイトカインＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、および抗炎症性／Ｔｈ２サイトカインＩＬ１０を測定した。
【０１４８】
【表２】
2008517014.tif 000003
【０１４９】
観察
−  すべてのテストしたＬＡＢ菌株について、高レベルのＴＮＦα誘導
−  L. jensenii KS 121.1についての比較的低レベルのＩＮＦγ
−  L. crispatus KS 116.1およびKS 400について最高のＩＬ１０誘導能力
−  ２つのL. jensenii菌株とは対照的に、２つのL. gasseri菌株は、同様のプロフィールを示した。特にＩＬｌ０／ＩＬ１２およびＴＮＦα／ＩＮＦγの比率を考慮した場合はそうであった。
【０１５０】
上記のテストの枠組み内では、サイトカイン誘導プロフィールは菌株特異的であることが明らかである。
【０１５１】
実施例５
抗炎症性活性の測定（動物モデルを用いるインビボのテスト）
【０１５２】
マウスの急性モデルは、Camoglio et al.（Eur. J. Immunol. 2000参照）から改変されたものである。動物に、−５日〜＋２日の間、選択された乳酸菌株を１日当たり１匹のマウス当たり１０８細菌の率で給餌した。次に、急性大腸炎を引き起こすために、１２０mg/kgマウスの率でＴＮＢＳを０日に注入し、＋２日で動物を殺し、最終的に、肉眼的（Ｗａｌｌａｃｅスコア−表Ｉ）および組織学的採点（Ａｍｅｈｏスコア−表II）を行った。
【０１５３】
これらの表は明白に、参考菌株と比較した時、選択された乳酸菌株が有意な抗炎症性効果を発揮することを示す。
【０１５４】
実施例６
６．１  局所投与用組成物（膣カプセル剤）
本発明のＬＡＢ菌株試料（上記参照）を最短で２４時間、上述と同様の条件で培養した。培養した菌株を個々に、単離し、洗浄し、および凍結乾燥して、個々にラクトース／ＭＳＫ粉末混合液に懸濁し、結局各々が約１０８〜１０９CFU（コロニー形成単位）を含む単位投与量に分割した。
【０１５５】
前記単位投与量を次に、ゼラチン膣カプセルへ注ぎ込み、それら各々が本発明の選ばれたＬＡＢ菌株約１０８〜１０９CFUを含むようにした。
【０１５６】
６．２  局所投与用組成物（腟坐剤）
【０１５７】
次の成分を用いて、柔らかい腟坐剤を調製した：
−  緩衝乳酸溶液
−  ラクトース
−  ＰＥＧ４０００
−  ＰＥＧ６００
【０１５８】
次に、適切な量の本発明の選択された凍結乾燥ＬＡＢ菌株を単位投与量に加えて、各々約１０８〜１０９CFUを含む腟坐剤を作製した。
【０１５９】
実施例７
７．１  経口投与用組成物（食用カプセル剤）
【０１６０】
各々が本発明の選択されたＬＡＢ菌株約１０８〜１０９CFUを含む食用セルロースカプセル（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）を、次の成分を含む充填剤を用いて作製した：
−  脱水ヨーグルト粉末
−  無水ブドウ糖
−  ジャガイモでんぷん
−  微結晶セルロース
−  選択された凍結乾燥ＬＡＢ菌株。
【０１６１】
７．２  経口投与用組成物（ヨーグルト）
【０１６２】
次のプロセスを用いて、所謂「Ｎａｔｕｒｅ Ｌｉｇｈｔヨーグルト」の小分けを調製した：１バッチ分の標準化１．５％脂肪ミルクに３％脱脂粉乳（ＭＳＫ）を加え、次に９０℃で３０分間全体を低温殺菌した。１％体積の市販のL. bulgaricusおよびS. thermophilusの開始用培養物を低温殺菌牛乳に加え； 次に、室温で全体を穏やかに撹拌し、１００mlの容器に分配し、結局全体を４時間程度の間４０℃でインキュベーションして所望のｐＨとした。
【０１６３】
次に、ヨーグルト缶当たり約１０８〜１０９CFUとなる量の本発明の選択された凍結乾燥ＬＡＢ菌株の小分けをヨーグルト缶に加え、ｐＨ約４．５〜４．７になるまで約３０分間さらにインキュベーションを行った。これらのヨーグルトの小分けは、消費するまで４℃で貯蔵することができる。
【０１６４】
【表３】
2008517014.tif 000004
【０１６５】
【表４】
2008517014.tif 000005
【国際調査報告】
2008517014.tif 000006
2008517014.tif 000007
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