(57)【要約】  本発明は、抗原結合分子（ABMs）に関する。特定の態様において、本発明は、ヒトMCSPに特異的な、キメラ、霊長類化、及びヒト化抗体を含めた組み換えモノクローナル抗体に関する。加えて、本発明は、そのようなABMsをコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、本発明のABMsの製造方法、及び疾患の治療におけるこれらのABMsの使用方法に関する。加えて、本発明は、増強されたFc受容体結合と増強されたエフェクター機能を有する抗体を含めた改善された治療特性を有する、修飾されたグリコシル化を伴うABMsに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
a.  配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；及び配列番号75から成る群から選択される配列；
b.  配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；及び配列番号93から成る群から選択される配列；並びに
c.  配列番号95、
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の：
a.  配列番号97；配列番号99；及び配列番号101から成る群から選択される配列；
b.  配列番号103又は配列番号105；並びに
c.  配列番号107、
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
融合ポリペプチドをコードする、請求項1又は2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の：配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号23を含む、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号5を含む、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号3を含む、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の：配列番号29、配列番号31、及び配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；配列番号51から成る群から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号45を含む、請求項8に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記単離されたポリヌクレオチドが、融合ポリペプチドをコードする、請求項4又は8に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
以下の：
a）  配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに
b）  配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、及び配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号44；配列番号46；配列番号48；配列番号50；配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列、
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１３】
以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１４】
以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１５】
以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも85%の同一性を有する配列を含む、請求項13に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１６】
以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項14に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１７】
以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項15に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１８】
以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項16に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１９】
以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも95%の同一性を有する配列を含む、請求項17に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項２０】
以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項２１】
以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項19に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項２２】
以下の：
a）  配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに
b）  マウス種以外の種からの抗体のFc領域、又はそのフラグメントの配列を持つポリペプチドをコードする配列、
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
以下の：
a）  配列番号28、配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；及び配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに
b）  マウス以外の種からの抗体軽鎖の定常ドメイン、又はそのフラグメントの配列を持つポリペプチドをコードする配列、
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
以下の：配列番号4；配列番号：6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
以下の：配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；及び配列番号52から成る群から選択されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項1〜25のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２７】
前記ベクターが、少なくとも抗体の軽鎖又は重鎖をコードする、請求項26に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ベクターが、抗体の軽鎖及び重鎖の両方をコードする、請求項27に記載のベクター。
【請求項２９】
ポリシストロン性ベクターである、請求項28に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項26〜28のいずれか1項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】
請求項1〜25のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項３２】
ヒト抗体の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードする配列を更に含む、請求項4又は8に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項12に記載の第1のポリヌクレオチドと、抗体軽鎖の可変領域をコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞。
【請求項３４】
請求項13に記載の第1のポリヌクレオチドと、抗体重鎖の可変領域をコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞。
【請求項３５】
以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24、又はその変異体から成る群から選択される配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３６】
以下の：配列番号28、配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；及び配列番号52、又はその変異体から成る群から選択される配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項３７】
請求項35又は請求項36に記載の融合ポリペプチドを含む抗原結合分子。
【請求項３８】
前記抗原結合分子が、ヒトMCSPに選択的に結合する、請求項37に記載の抗原結合分子。
【請求項３９】
請求項35に記載の融合ポリペプチドと、請求項36に記載の融合ポリペプチドを含む抗原結合分子。
【請求項４０】
前記抗原結合分子が抗体である、請求項37〜39のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項４１】
前記抗体がヒト化されている、請求項40に記載の抗原結合分子。
【請求項４２】
前記抗体が霊長類化されている、請求項40に記載の抗原結合分子。
【請求項４３】
前記抗原結合分子が、抗体のFc領域に相当する領域を含む抗体フラグメントである、請求項37に記載の抗原結合分子。
【請求項４４】
前記抗原結合分子が、scFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、Fab、又はFab2フラグメントである、請求項37に記載の抗原結合分子。
【請求項４５】
前記抗原結合分子が、組み換え抗体である、請求項40に記載の抗原結合分子。
【請求項４６】
前記組み換え抗体が、ヒト化されている、請求項45に記載の抗原結合分子。
【請求項４７】
前記組み換え抗体が、ヒトFc領域を含む、請求項40に記載の抗原結合分子。
【請求項４８】
前記ヒトFc領域が、ヒトIgGのFc領域である、請求項47に記載の抗原結合分子。
【請求項４９】
前記抗原結合分子が、修飾オリゴ糖を伴うFc領域を持つように糖操作された、請求項40〜48のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項５０】
前記Fc領域が、非糖操作抗原結合分子と比べて、フコース残基の数が減少するように修飾された、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項５１】
前記Fc領域が、非糖操作抗原結合分子と比べて、高い割合の分枝オリゴ糖を持つ、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項５２】
前記分枝オリゴ糖が、主に分枝複合体である、請求項51に記載の抗原結合分子。
【請求項５３】
前記糖操作した抗原結合分子が、非糖操作抗原結合分子と比べて、上記抗原結合分子のFc領域内に、高い割合の分枝、非フコシル化オリゴ糖を持つ、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項５４】
前記糖操作した抗体が、非糖操作抗原結合分子と比べて、Fc領域内のGlcNAc残基対フコース残基の高い比を有する、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項５５】
前記の分枝、非フコシル化オリゴ糖が、主にハイブリッド型である、請求項53に記載の抗原結合分子。
【請求項５６】
前記の分枝、非フコシル化オリゴ糖が、主に複合型である、請求項53に記載の抗原結合分子。
【請求項５７】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも20%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項５８】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも30%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項57に記載の抗原結合分子。
【請求項５９】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも35%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項58に記載の抗原結合分子。
【請求項６０】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも40%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項59に記載の抗原結合分子。
【請求項６１】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも50%が、分枝している、請求項60に記載の抗原結合分子。
【請求項６２】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも60%が、分枝している、請求項61に記載の抗原結合分子。
【請求項６３】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも70%が、分枝している、請求項62に記載の抗原結合分子。
【請求項６４】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも80%が、分枝している、請求項63に記載の抗原結合分子。
【請求項６５】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも90%が、分枝している、請求項64に記載の抗原結合分子。
【請求項６６】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも50%が、非フコシル化されている、請求項49に記載の抗原結合分子。
【請求項６７】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも60%が、非フコシル化されている、請求項66に記載の抗原結合分子。
【請求項６８】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも70%が、非フコシル化されている、請求項67に記載の抗原結合分子。
【請求項６９】
前記Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも75%が、非フコシル化されている、請求項68に記載の抗原結合分子。
【請求項７０】
ヒトMCSPへの結合に関して、マウス225.28Sモノクローナル抗体と競合できる抗原結合分子の製造方法であって、以下のステップ：
a）  上記抗原結合分子をコードする前記ポリヌクレオチドの発現を許容する条件下、請求項30又は請求項31に記載の宿主細胞を培養し；そして
b）  上記抗原結合分子を回収する、
を含む前記方法。
【請求項７１】
前記抗原結合分子が、抗体である、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗原結合分子が、ヒト化抗体である、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
請求項37〜69のいずれか1項に記載の抗原結合分子と、医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項７４】
前記組成物が、補助剤を更に含む、請求項73に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
サンプル又は対象におけるMCSPを発現する細胞の識別方法であって、請求項37〜69のいずれか1項に記載の抗原結合分子を上記サンプル又は対象に投与するステップを含む前記方法。
【請求項７６】
前記識別が、診断目的のためのものである、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
前記識別が、治療目的のためのものである、請求項75に記載の方法。
【請求項７８】
その治療方法を必要とする対象におけるMCSP媒介性細胞増殖障害の治療方法であって、治療的有効量の請求項73又は請求項74に記載の医薬組成物を上記対象に投与するステップを含む前記方法。
【請求項７９】
前記対象がヒトである、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
前記治療が、以下の：MCSPリガンドの結合、メラノーマ細胞の接着、周皮細胞の活性化、フィブロネクチンに対する走化性反応、ECMタンパク質上の細胞伸展、FAKシグナル伝達、及びERKシグナル伝達、から成る群から選択されるMCSP媒介性相互作用を遮断することを含む、請求項78に記載の方法。
【請求項８１】
β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有する第1のポリペプチドをコードする少なくとも1種類の核酸を、同じ宿主細胞によって産生される、請求項37〜69のいずれか1項に記載の抗原結合分子である第2のポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現するように糖操作した宿主細胞。
【請求項８２】
前記宿主細胞が、マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドを更に発現する、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
前記第1のポリペプチドが、ゴルジ体常在性ポリペプチドの局在化ドメインを更に含む、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
前記抗原結合分子が、組み換え抗体である、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８５】
前記抗原結合分子が、抗体フラグメントである、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８６】
前記抗原結合分子が、ヒトIgGのFc領域又はヒトIgGのFc領域に相当する領域を含む、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８７】
前記宿主細胞によって産生された前記抗原結合分子が、非糖操作宿主細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、増強されたFc受容体結合親和性を示す、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
前記宿主細胞によって産生された前記抗原結合分子が、非糖操作宿主細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、増強されたエフェクター機能を示す、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
前記第1のポリペプチドが、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIの触媒領域を含む、請求項83に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
前記第1のポリペプチドが、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを更に含む、請求項83に記載の宿主細胞。
【請求項９１】
前記ゴルジ体局在化ドメインが、マンノシダーゼIIの局在化ドメインである、請求項90に記載の宿主細胞。
【請求項９２】
前記ゴルジ体局在化ドメインが、β（1,2）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの局在化ドメインである、請求項90に記載の宿主細胞。
【請求項９３】
前記ゴルジ体局在化ドメインが、β（1,2）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIの局在化ドメインである、請求項90に記載の宿主細胞。
【請求項９４】
前記ゴルジ体局在化ドメインが、マンノシダーゼIの局在化ドメインである、請求項90に記載の宿主細胞。
【請求項９５】
前記ゴルジ体局在化ドメインが、α1-6コア・フコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインである、請求項90に記載の宿主細胞。
【請求項９６】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたFc媒介性細胞傷害性である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項９７】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたNK細胞への結合である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項９８】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたマクロファージへの結合である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項９９】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された多形核細胞への結合である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項１００】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された単球への結合である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項１０１】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項１０２】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された樹状細胞の成熟である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項１０３】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたT細胞の初回刺激である、請求項88に記載の宿主細胞。
【請求項１０４】
前記Fc受容体が、Fcγ活性化受容体である、請求項87に記載の宿主細胞。
【請求項１０５】
前記Fc受容体が、FcγRIIIA受容体である、請求項87に記載の宿主細胞。
【請求項１０６】
前記宿主細胞が、HEK293-EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、又はハイブリドーマ細胞である、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項１０７】
β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1種類の核酸が、構成的プロモーター要素に作動できるように連結されている、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項１０８】
β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有する前記ポリペプチドが、融合ポリペプチドである、請求項81に記載の宿主細胞。
【請求項１０９】
前記障害が、以下の：メラノーマ、グリオーマ、小葉性乳癌、急性白血病、又は血管の固形腫瘍誘導性新生血管形成から成る群から選択される、請求項78に記載の方法。
【請求項１１０】
少なくとも1種類のマウス225.28Sモノクローナル抗体の相補性決定領域、あるいは少なくとも上記相補性決定領域に関する特異性決定残基を含むその変異体又は切断型を含む単離されたポリヌクレオチドであって、融合ポリペプチドをコードするもの。
【請求項１１１】
少なくとも2種類のマウス225.28Sモノクローナル抗体の相補性決定領域、あるいは少なくとも上記相補性決定領域に関する特異性決定残基を含むその変異体又は切断型を含む、請求項110に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
少なくとも3種類のマウス225.28Sモノクローナル抗体の相補性決定領域、あるいは少なくとも上記相補性決定領域に関する特異性決定残基を含むその変異体又は切断型を含む、請求項110に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記相補性決定領域が、以下の：配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；配列番号75；配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；配列番号93；及び配列番号95から成る群から選択される、請求項110に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記相補性決定領域が、以下の：配列番号97、配列番号99、配列番号101；配列番号103；配列番号105；配列番号107から成る群から選択される、請求項110に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記融合ポリペプチドが、抗原結合分子をコードする、請求項110に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記相補性決定領域が、以下の：配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；配列番号75；配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；配列番号93；及び配列番号95から成る群から選択される少なくとも1種類の配列；並びに以下の：配列番号97、配列番号99、配列番号101；配列番号103；配列番号105；配列番号107から成る群から選択される少なくとも1種類の配列、又は少なくとも上記相補性決定領域のそれぞれに関する特異性決定残基を含む上記配列の変異体又は切断型を含む、請求項111に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
請求項110〜116のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１１８】
請求項117に記載のポリペプチドを含む抗原結合分子。
【請求項１１９】
前記抗原結合分子が、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を含む、請求項118に記載の抗原結合分子。
【請求項１２０】
前記抗原結合分子が、キメラ又はヒト化された抗体である、請求項118に記載の抗原結合分子。
【請求項１２１】
宿主細胞における修飾オリゴ糖を伴う抗原結合分子の産生方法であって、以下のステップ：
a.  β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1種類の核酸を発現するように糖操作した宿主細胞を、上記抗原結合分子の産生を可能にし、且つ、上記抗原結合分子のFc領域上に存在するオリゴ糖の修飾を可能にする条件下で培養し；そして
b.  上記抗原結合分子を単離する、
を含み、ここで、上記抗原結合分子が、MCSPへの結合に関して、マウス225.28Sモノクローナル抗体と競合でき、且つ、ここで、上記抗原結合分子又はそのフラグメントが、キメラ又はヒト化されている前記方法。
【請求項１２２】
前記修飾オリゴ糖が、非糖操作抗原結合分子のオリゴ糖と比べて、フコース残基の比率が低い、請求項121に記載の方法。
【請求項１２３】
前記修飾オリゴ糖が、主にハイブリッド型である、請求項121に記載の方法。
【請求項１２４】
前記修飾オリゴ糖が、主に複合型である、請求項121に記載の方法。
【請求項１２５】
前記宿主細胞によって産生された前記組み換え抗体又はそのフラグメントが、非糖操作細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、上記ポリペプチドのFc領域内の分枝、非フコシル化オリゴ糖の比率が高い、請求項121に記載の方法。
【請求項１２６】
前記の分枝、非フコシル化オリゴ糖が、主にハイブリッド型である、請求項125に記載の方法。
【請求項１２７】
前記の分枝、非フコシル化オリゴ糖が、主に複合型である、請求項125に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも20%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項125に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも30%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項128に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも35%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
請求項121〜130のいずれか1項に記載の方法によって産生される、エフェクター機能を増強するように糖操作した抗原結合分子。
【請求項１３２】
前記抗原結合分子が、抗体である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１３３】
請求項121〜130のいずれか1項に記載の方法によって産生される、Fc受容体結合親和性を増強するように操作した抗原結合分子。
【請求項１３４】
前記抗原結合分子が、抗体である、請求項133に記載の抗原結合分子。
【請求項１３５】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたFc媒介性細胞傷害性である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１３６】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたNK細胞への結合である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１３７】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたマクロファージへの結合である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１３８】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された単球への結合である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１３９】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された多形核細胞への結合である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１４０】
前記増強されたエフェクター機能が、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１４１】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された樹状細胞の成熟である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１４２】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたT細胞の初回刺激である、請求項131に記載の抗原結合分子。
【請求項１４３】
前記Fc受容体が、Fc活性化受容体である、請求項133に記載の抗原結合分子。
【請求項１４４】
前記Fc受容体が、FcγRIIIa受容体である、請求項133に記載の抗原結合分子。
【請求項１４５】
前記抗原結合分子が、Fc領域を含み、且つ、エフェクター機能を増強するように操作した抗体フラグメントである、請求項121〜130のいずれか1項に記載の方法によって産生された抗原結合分子。
【請求項１４６】
以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24から成る群から選択される配列；並びに免疫グロブリンのFc領域に相当し、且つ、エフェクター機能を増強するように操作した領域を持つポリペプチドを含む融合タンパク質である、請求項121〜130のいずれか1項に記載の方法によって産生した抗原結合分子。
【請求項１４７】
配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36；配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチド、並びに免疫グロブリンのFc領域に相当し、且つ、エフェクター機能を増強するように操作した領域を含む融合タンパク質である、請求項121〜130のいずれか1項に記載の方法によって産生した抗原結合分子。
【請求項１４８】
請求項131〜147のいずれか1項に記載の抗原結合分子と、医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４９】
前記単離されたポリヌクレオチドが、融合ポリペプチドをコードする、請求項4又は8に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５０】
前記治療が、MCSP発現性細胞を死滅させることを含む、請求項78に記載の方法。
【請求項１５１】
前記細胞が、MCSPを過剰発現する、請求項150に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも40%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項125に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも50%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項152に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも60%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項153に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも70%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項154に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも80%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも90%が、分枝し、非フコシル化されている、請求項156に記載の方法。
【請求項１５８】
その方法を必要とする対象の腫瘍新生血管系における活性周皮細胞の溶解の誘導方法であって、請求項49〜69のいずれか1項に記載の抗原結合分子を上記対象に投与するステップを含む前記方法。
【請求項１５９】
前記新生血管系が、メラノーマ新生血管系でもなく、神経膠芽腫新生血管系でもない、請求項158に記載の方法。
【請求項１６０】
前記抗原結合分子を、他の抗血管新生剤と同時投与する、請求項158に記載の方法。
【請求項１６１】
前記抗血管新生剤が、抗VEGF-1抗体である、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
MCSP媒介性細胞増殖障害の治療において医薬品として使用するための、請求項37〜69、118〜120、又は131〜147のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項１６３】
前記MCSP媒介性細胞増殖障害が、以下の：メラノーマ、グリオーマ、小葉性乳癌、急性白血病、又は血管の固形腫瘍誘導性新生血管形成から成る群から選択される、請求項162に記載の抗原結合分子。
【請求項１６４】
腫瘍新生血管系の活性周皮細胞の溶解において医薬品として使用するための、請求項37〜69、118〜120、又は131〜147のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項１６５】
特に、癌において使用するための、医薬品として使用するための、請求項37〜69、118〜120、又は131〜147のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項１６６】
癌の治療用又は予防用医薬品の製造のための、請求項37〜69、118〜120、又は131〜147のいずれか1項に記載の抗原結合分子の使用。
【請求項１６７】
前記抗原結合分子を、約1.0mg/kg〜約15mg/kgの治療的有効量で使用する、請求項166に記載の使用。
【請求項１６８】
前記治療的有効量が、約1.5mg/kg〜約12mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１６９】
前記治療的有効量が、約1.5mg/kg〜約4.5mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１７０】
前記治療的有効量が、約4.5mg/kg〜約12mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１７１】
前記治療的有効量が、約1.5mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１７２】
前記治療的有効量が、約4.5mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１７３】
前記治療的有効量が、約12mg/kgである、請求項167に記載の使用。
【請求項１７４】
本明細書中に記載の新規の化合物、過程、医薬組成物、方法、及び用途。
【請求項１７５】
以下の：β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド；α-マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、及びβ-（1,4）-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドから成る群から選択される第1のポリペプチドをコードする少なくとも1種類の核酸性分子を、同じ宿主細胞によって産生される第2のポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現するように糖操作した宿主細胞であって、上記第2のポリペプチドが、請求項37〜69のいずれか1項に記載の抗原結合分子であるもの。
【請求項１７６】
前記第1のポリペプチドが、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドである、請求項175に記載の宿主細胞。
【請求項１７７】
前記第1のポリペプチドが、α-マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドである、請求項175に記載の宿主細胞。
【請求項１７８】
前記第1のポリペプチドが、β-（1,4）-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項175に記載の宿主細胞。
【請求項１７９】
前記宿主細胞が、α-マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を更に発現する、請求項176に記載の宿主細胞。
【請求項１８０】
前記の宿主細胞が、β-（1,4）-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を更に発現する、請求項179に記載の宿主細胞。
【請求項１８１】
前記第1のポリペプチドが、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドの局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである、請求項175又は176に記載の宿主細胞。
【請求項１８２】
前記宿主細胞によって産生された前記抗原結合分子が、非糖操作宿主細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、増強されたエフェクター機能を示す、請求項175〜181のいずれか1項に記載の宿主細胞。
【請求項１８３】
前記宿主細胞によって産生された前記抗原結合分子が、非糖操作宿主細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、増強されたFc受容体結合親和性を示す、請求項175〜181のいずれか1項に記載の宿主細胞。
【請求項１８４】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたFc媒介性細胞傷害性である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１８５】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたNK細胞への結合である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１８６】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたマクロファージへの結合である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１８７】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された多形核細胞への結合である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１８８】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された単球への結合である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１８９】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１９０】
前記増強されたエフェクター機能が、増強された樹状細胞の成熟である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１９１】
前記増強されたエフェクター機能が、増強されたT細胞の初回刺激である、請求項182に記載の宿主細胞。
【請求項１９２】
前記Fc受容体が、Fcγ活性化受容体である、請求項183に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
前記Fc受容体が、FcγRIIIA受容体である、請求項183に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原結合分子（ABMs）に関する。特定の態様において、本発明は、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、別名、メラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）に特異的な、キメラ、霊長類化、及びヒト化抗体を含めた組み換えモノクローナル抗体に関する。加えて、本発明は、そのようなABMsをコードする核酸分子、並びにそのような核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、更に、本発明のABMsの製造方法、及び疾患の治療におけるこれらのABMsの使用方法に関する。加えて、本発明は、増強されたFc受容体結合と増強されたエフェクター機能を有する抗体を含めた治療特性が改善された、修飾グリコシル化を伴うABMsに関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ関連抗原
悪性メラノーマは、ヒトにおいて最も一般的なタイプの致死性の皮膚癌であり、そして、その発生率は、1年ごとに5%の割合で増加していると推定されている。Campoliら、Crit. Rev. Immunol. 24（4）：261-296ページ（2004年12月）。診断及び治療法の進歩にもかかわらず、死亡率もまた、ここ10年間にわたって増加している。初期メラノーマは十分に処置可能であるが、進行期メラノーマは、従来の治療計画に対して抵抗性であることが多い。従来の療法の限界が、悪性メラノーマの患者を治療するための新規ストラテジーの研究を促した。研究の多くが免疫療法に注目した。
【０００３】
開発されるヒト・メラノーマの免疫療法レジメンの大部分は、メラノーマ関連抗原（MAA）に注目している。免疫療法のための好ましいMAAは、メラノーマの大部分で発現されるが、正常組織における分布が制限されている抗原である。そのような抗原の1つが、メラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）、別名、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）である。Pluschkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：9710-9715ページ（1996年）；Yangら、J. Cell Biol. 165（6）：881-891ページ（2004年6月）。MCSPは、N結合型の280kDaの糖タンパク質成分と、細胞膜上に発現される450kDaのコンドロイチン硫酸プロテオグリカン成分から成る高度にグリコシル化された膜内在性コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである。Rossら、Arch. Biochem. Biophys. 225：370-383ページ（1983年）。プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン（GAG）が共有結合で連結されたタンパク質である。MCSPの280kDaの成分と450kDaの成分の両方が、同じコア・タンパク質を含んでいる。Rossら、Arch. Biochem. Biophys. 225：370-383ページ（1983年）；Bumolら、J. Biol. Chem. 259：12733-12741ページ（1984年）。
【０００４】
完全長MCSPコア・タンパク質をコードするcDNAが同定され、そして、アミノ酸配列が推定された。Pluschkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：9710-9715ページ（1996年）；Yangら、J. Cell Biol. 765（6）：881-891ページ（2004年6月）（上記文献それぞれの内容全体を本明細書中に援用する）。MCSP配列は寄託されて、そして、以下の受入番号：ジェンバンク受入番号MIM：601172（遺伝子）；GI：1617313、GI：21536290、GI：34148710、及びGI：47419929（mRNA）；GI：1617314、GI：4503099、GI：34148711、及びGI：47419930（タンパク質）、を割り当てられた。2322個のアミノ酸から成るコア・タンパク質は、3つの主要なドメイン：大きな細胞外ドメイン、疎水性の膜貫通領域、及び短い細胞質尾部、を含んでいる。MCSP配列を使用したホモロジー検索では、相同体が他の動物種で発現されることが指摘されている。特に、ラット及びマウスのMCSP相同体は、それぞれ、NG2及びAN2として知られている。それぞれが、MCSPとの十分なアミノ酸配列同一性を共有し、且つ、同様の発現特徴を有する。Stallcupら、J. Neurocytol 31：423-435ページ（2002年）；Schneiderら、J. Neurosci. 21：920-933ページ（2001年）。
【０００５】
MCSPは、当初、メラニン細胞系統の細胞、並びに毛嚢内の細胞、皮膚表皮の基底細胞層、内皮細胞、及び周皮細胞だけで検出されたので、そもそも、生体内分布が限られていると考えられた。Ferroneら、Pharmacol. Ther. 57：259-290ページ（1993年）；Schlingemannら、Am. J. Pathol. 136：1393-1405ページ（1990年）。しかしながら、最近になって、MCSPが、数多くの正常細胞及び形質転換細胞に広く分布していることが測定された。特に、MCSPは、表皮のほとんど全ての基底細胞において見られる。
【０００６】
MCSPとメラノーマとの関連性は十分に立証されている。MCSPはメラノーマ細胞で差別的に発現され、そして、分析した良性母斑とメラノーマ病巣の90%超において発現されていることがわかった。Campoliら、Crit. Rev. Immunol. 24（4）：267-296ページ（2004年12月）。そのうえ、MCSP発現は、全てのタイプのメラノーマにおいて原発性病巣と転移性病巣の間で変化が見られなかった。Kageshitaら、Int. J. Cancer 56：370-374ページ（1994年）。MCSPは、また、基底細胞腺癌、神経冠起源の様々な腫瘍を含めた非メラニン形成細胞起源の腫瘍、及び乳癌において発現されることがわかった。Kageshitaら、J. Invest. Dermatol. 55：535-537ページ（1985年）；Chekenyaら、Int. J. Dev. Neurosci. 77：421-435ページ（1999年）；Chekenyaら、J. Neurocytol. 37：507-521ページ（2002年）；Shoshanら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96：10361-10366ページ（1999年）；Godalら、Br. J. Cancer 53：839-841ページ（1986年）；Dell’Erbaら、Anticancer Res. 21：925-930ページ（2001年）。
【０００７】
実質的証拠では、MCSPがメラノーマ細胞の悪性挙動を左右するのに差別的にかかわることが指摘されている。プロテオグリカンのGAG構成要素とコア・タンパク質の両方が、一般に、これだけに制限されることなく、接着分子、ケモカイン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ECM）成分、及び成長因子を含めた、いくつかの異なったリガンドの結合に関与することは周知である。Bernfieldら、Ann. Rev. Biochem. 68：729-777ページ（1999年）。MCSPに関して、具体的には、研究では、MCSP特異的抗体がメラノーマ細胞の血管内皮への接着、並びにコラーゲン及びコラーゲン−フィブロネクチン複合体を含めた様々なECM成分上での伸展を抑制することができることが実証された。Harperら、J. Natl. Cancer Inst. 11：259-263ページ（1983年）；de Vriesら、Int. J. Cancer 35：465-473ページ（1986年）；Iidaら、Cancer Res. 55：2177-2185ページ（1995年）；Burgら、J. Cell. Physiol. 777：299-312ページ（1998）。他の研究では、MCSP発現が、遊走性メラノーマ細胞上の細胞表面微小突起ドメインに限定されることが示された。Garriguesら、J. Cell Biol. 103：1699-1710ページ（1986年）。微小突起ドメインは、遊走性細胞のECM成分との接着接触の形成に重要であるアクチンに富む構造物である。まとめると、証拠では、MCSPが遊走性細胞の先端での初めの接着接触の形成を促進することが指摘されている。
【０００８】
更なる証拠では、MCSPが細胞内シグナル伝達事象の開始に関与する第2の作用機序を通してメラノーマ細胞の遊走も調節することが指摘されている。具体的には、MCSPとNG2の両方が、Rho GTPアーゼ・ファミリー・タンパク質の活性化を通してシグナル伝達経路を始動させることが示された。Stallcupら、J. Neurocytol. 37：423-435ページ（2002年）；Eisenmannら、Nat. Cell Biol. 1：507-513ページ（1999年）。他の研究では、MCSP発現がインテグリン依存性機構によって接着斑キナーゼ（FAK）の活性化増強を、そして、非依存性機構によって細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の活性化増強を導くことが示されている。Yangら、J. Cell Biol. 165：881-891ページ（2004年6月）。
【０００９】
MCSPは、また、メラノーマ細胞増殖にも関係がある。具体的には、MCSP又はNG2を発現するようにトランスフェクトされたメラノーマ細胞は、試験管内における増殖速度の上昇、及び生体内における成長速度の上昇を示す。これらの効果は、抗MCSP又は抗NG2モノクローナル抗体によって抑制される。
【００１０】
実質的証拠では、MCSPが血管新生とメラノーマ細胞浸潤に重要な役割を果たしていることが指摘されている。最初に、MCSPが腫瘍血管新生性血管系内の「活性化された」周皮細胞と周皮細胞の両方において高レベルで発現される。Ruiterら、Behring Inst. Mitt. 92：258-272ページ（1993年）。周皮細胞は、血管系を発現する内皮細胞に関連することが知られ、そして、内皮細胞の増殖と浸潤を制御することによって血管新生の調節に加わると考えられている。Witmerら、J. Histochem. Cytochem 52（1）：39-52ページ（2004年）；Erberら、FASEB 75：338-340ページ（2004年）；Darlandら、Dev. Biol. 264：215-288ページ（2003年）。次に、MCSPとNG2は、正常に生み出された組織内の血管新生血管によって広く発現される。Chekenyaら、FASEB 16：586-588ページ（2002年）；Ruiterら、Behring Inst. Mitt. 92：258-272ページ（1993年）。
【００１１】
正常組織における限定的な分布に加えてメラノーマ細胞でのMCSPの高い発現レベル、及びMCSP特異的なmAbsの利用可能性は、MCSPを、メラノーマ病巣に関する論理的なマーカー、そして、免疫療法のための標的候補にする。実際に、MCSPに対する数多くのマウス・モノクローナル抗体が開発された。Campoliら、Crit. Rev. Immunol. 24（4）：267-296ページ（2004年）。マウス抗MCSP mAbsは、動物モデルにおける腫瘍増殖を制御することが示されたが、これらの抗体を用いた臨床実験において、軽微な臨床反応しか観察されなかった。どのような利益が見込まれるかは、通常、抗体媒介性の免疫機構ではなく、メラノーマ細胞の生態に影響を与える抗MCSP抗体の能力に起因する。従って、MCSP標的化免疫療法の大部分は、MCSPエピトープを真似た抗イディオタイプ抗体を利用する。
【００１２】
進行性乳癌の治療のためのトラスツズマブ（Herceptin（商標）；Genentech Inc.）（Grillo-Lopez, A.-J.ら、Semin. Oncol. 26：66-73ページ（1999年）；Goldenberg, M. M.、Clin. Ther. 21：309-18ページ（1999年））、CD20陽性B細胞、低悪性度若しくは濾胞性非ホジキン・リンパ腫の治療のためのリツキシマブ（Rituxan（商標）；DDEC Pharmaceuticals（現在のBiogen IDEC）、San Diego, CA及びCambridge, MA、並びにGenentech Inc.、San Francisco, CA）、再発した急性骨髄性白血病の治療のためのゲムツズマブ（Mylotarg（商標）、Celltech/Wyeth-Ayerst）、そして、B細胞慢性リンパ性白血病の治療のためのアレムツズマブ（CAMPATH（商標）、Millenium Pharmaceuticals/Schering AG）に関する米国食品医薬品局の承認によって実証されるように、非結合モノクローナル抗体（mAbs）は、癌治療のための有用な薬剤である可能性がある。これらの生成物の成功は、それらの有効性だけではなく、それらの傑出した安全性特性にも依存している（Grillo-Lopez, A.-J.ら、Semin. Oncol. 26：66-73ページ（1999年）；Goldenberg, M. M.、Clin. Ther. 21：309-18ページ（1999年））。これらの薬物の成果にもかかわらず、現在、非結合mAb療法によって通常適用されているものに比べてより高度に特異的な抗体活性を得ることに大きな関心がある。
【００１３】
数多くの研究の結果では、Fc受容体依存性の機構が腫瘍に対する細胞傷害性抗体の作用に実質的に貢献することが示唆され、そして、腫瘍に対する最適な抗体が活性化Fc受容体に優先的に結合し、且つ、抑制パートナーのFcγRIIBに最小限に結合するであろうことが指摘されている（Clynes, R. A.ら、Nature Medicine 6（4）：443-446ページ（2000年）；Kalergis, A. M.、及びRavetch, J. V.、J. Exp. Med. 195（12）：1653-1659（2002年6月））。例えば、少なくとも1つの研究結果では、特に、FcγRIIIa受容体が抗体療法の有効性に強く関連することが示唆されている（Cartron, G.ら、Blood 99（3）：754-757ページ（2002年2月））。その研究は、FcγRIIIaの多型性に関してホモ接合の患者がヘテロ接合の患者に比べてリツキシマブに対する優れた応答を有することを示した。発明者らは、優れた応答はFcγRIIIaに対する抗体のより優れた生体内での結合に起因し、それがリンパ腫細胞に対するより良いADCC活性をもたらしたという結論を下した（Cartron, G.ら、Blood 99（3）：754-757ページ（2002年2月））。
【００１４】
MCSPを標的とする様々な免疫療法ストラテジーが報告された。始めの頃の免疫療法は、進行性メラノーマ患者における抗体ベースの受動免疫療法の標的としてMCSPを使用した。一般に、抗MCSP抗体は、単独で、又は毒素に結合して患者に投与された。Schroffら、Cancer Res. 45：879-885ページ（1985年）；Spitlerら、Cancer Res. 47：1717-1723ページ（1987年）；Bumolら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80：529-533ページ（1983年）。そのような抗体は、動物モデルにおいて腫瘍抑制を示したが、数人の患者において軽微な臨床反応のみが観察されただけだった。Matsuiら、Jap. J. Cancer Res. 76：119-123ページ（1985年）；Morganら、J. Natl. Cancer Inst. 78：1101-1106ページ（1987年）；Ghoseら、Cancer Immunol. Immunother. 34：90-96ページ（1991年）。最近になって、改善された治療反応が、MCSPを標的とした一本鎖Fv免疫複合体、及び抗イディオタイプ抗体モノクローナル抗体によって観察された。Wangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：1627-1632ページ（1999年）；Kangら、Clin. Cancer Res. 6：4921-4931ページ（2000年）；Mittelmanら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89：466-470ページ（1992年）；米国特許番号第5,270,202号；米国特許番号第5,780,029号；米国特許番号第5,866,124号。しかしながら、これらの免疫療法には、欠点がある。具体的には、抗イディオタイプ抗体は、MCSP発現細胞を標的化するのに有用でない。また、scFv構造物はFc領域を欠くので、それ故に、単独でMCSP陽性標的細胞の溶解を誘発できない。
【００１５】
開発された抗MCSPモノクローナル抗体の大部分はマウスのものである。それらは、mAb 149.53、mAb 225.28；mAb 763.74；及びmAb 9.2.27を含んでいる。Campoliら、Crit. Rev. Immunol. 24（4）：267-296ページ（2004年）。これまで、ほんのいくつかのヒト起源からの抗MCSP抗体しか単離されなかった。Wangら、Proc. Nat. Acad. Sci. 96：1627-1632ページ（1999年）。これまで、マウス（又はあらゆるヒト以外の）抗MCSP抗体はヒト化されなかったと考えられる。治療上の療法におけるマウス抗体の使用に伴う潜在的な問題点は、ヒト以外のモノクローナル抗体がヒト宿主によって外来タンパク質として認識されるかもしれず；それ故に、そのような外来抗体の反復注射が有害な過敏反応につながる免疫応答の誘導を導く可能性があることにある。マウス・ベースのモノクローナル抗体に関しては、これは、多くの場合、ヒト抗マウス抗体応答、若しくは「HAMA」応答、又はヒト抗ラット抗体、若しくは「HARA」応答と呼ばれる。そのうえ、これらの「外来」抗体は、その標的部位に達する前に、事実上、中和されるように、宿主の免疫系によって攻撃されるかもしれない。更に、ヒト以外のモノクローナル抗体（例えば、マウス・モノクローナル抗体）は、通常、ヒト・エフェクターの機能を欠いている、すなわち、それらは、とりわけ、相補体依存性溶解を媒介するか、又は抗体依存性細胞傷害性若しくはFc受容体媒介性食作用によってヒト標的細胞を溶解することができない。
【００１６】
2種類以上の異なった種（例えば、マウスとヒト）からの抗体の一部を含むキメラ抗体が、「結合」抗体に代わる手段として開発された。
【００１７】
抗体のグリコシル化
オリゴ糖成分は、物理的安定性、プロテアーゼ攻撃に対する抵抗性、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特異的な生物活性を含めた治療学的な糖タンパク質の有効性に関連する特性に大きな影響を与える。そのような特性は、オリゴ糖の存在又は不存在に依存するだけではなく、その特定の構造にも依存するかもしれない。オリゴ糖構造と糖タンパク質機能の間のいくつかの一般法則を作ることができる。例えば、ある特定のオリゴ糖構造は、特定の糖鎖結合タンパク質との相互作用を通して血流からの糖タンパク質の急速なクリアランスを媒介する一方で、その他のものは、抗体によって結合され、そして、望ましくない免疫反応を引き起こす可能性がある（Jenldnsら、Nature Biotechnol. 14：975-81ページ（1996年））。
【００１８】
哺乳動物細胞は、タンパク質をヒト適用に最も適合した形態にグリコシル化する能力のため、治療学的な糖タンパク質の産生に好ましい宿主である（Cummingら、Glycobiology 1：115-30ページ（1991年）；Jenkinsら、Nature Biotechnol. 14：975-81ページ（1996年））。細菌は、タンパク質をめったにグリコシル化することがなく、そして、他のタイプの一般的な宿主、例えば、酵母、糸状菌、昆虫、及び植物細胞と同様に、血流からの急速なクリアランスに関連するグリコシル化パターン、望ましくない免疫相互作用、及びいくつかの特別な場合において、低減された生物活性をもたらす。哺乳動物細胞の中で、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が、ここ20年間で最も一般的に使用されている。好適なグリコシル化パターンを与えることに加えて、これらの細胞は、遺伝的に安定した、非常に生産力の高いクローン細胞系の一貫した製造を可能にする。それらは、無血清培地を使用した簡単なバイオリアクター内で高密度まで培養することができ、且つ、安全で再現性のあるバイオプロセスの開発を可能にすることができる。他の一般的に使用される動物細胞には、ベビー・ハムスター腎（BHK）細胞、NS0-、及びSP2/0-マウス骨髄腫細胞が含まれる。最近になって、トランスジェニック動物からの製造もまた試験された（Jenkinsら、Nature Biotechnol. 14：975-81ページ（1996年））。
【００１９】
全ての抗体が、タンパク質集合、分泌、又は機能的活性に可変的に影響するN結合型糖鎖構造の独特なアレイを持つ各アイソタイプで、重鎖定常領域内の保存部位に糖鎖構造を含む（Wright, A.及びMorrison, S. L.、Trends Biotech. 15：26-32ページ（1997年））。取り付けられたN結合型糖鎖の構造物は、加工の度合いによって大幅に変化し、そして、高マンノース、多重分枝、並びに二分枝オリゴ糖を含むことができる（Wright, A.及びMorrison, S. L.、Trends Biotech. 75：26-32ページ（1997年））。通常、モノクローナル抗体さえ複数のグリコフォームとして存在するような、特定のグリコシル化部位に取り付けられたコア・オリゴ糖構造の不均一化過程が存在する。同様に、抗体グリコシル化における主要な相違点は細胞株間で発生し、さらに、わずかな相違点は異なる培養条件下で培養した所定の細胞株に見られる（Lifely, M. R.ら、Glycobiology 5（8）：813-22ページ（1995年））。
【００２０】
単純な製造工程を維持し、且つ、重大で、望ましくない副作用を回避する可能性がある一方で、効能の大きな増加を得る1つの方法は、Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 77：176-180ページ（1999年）及び米国特許番号第6,602,684号（その内容全体を本明細書中に援用する）に記載のとおり、それらのオリゴ糖成分を操作することによってモノクローナル抗体の性質、細胞媒介性エフェクター機能を高めることである。癌の免疫療法における最も一般的に使用される抗体である1型IgG抗体は、それぞれのCH2ドメインのAsn297に保存されたN結合型グリコシル化部位を持っている糖タンパク質である。Asn297に取り付けられた2つの複合二分枝オリゴ糖は、CH2ドメインの間に埋まり、ポリペプチド骨格との広範囲に及ぶ接触を形成するので、それらの存在は、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）などのエフェクター機能を媒介するために抗体にとって不可欠である（Lifely, M. R.ら、Glycobiology 5：813-822ページ（1995年）；Jefferis, R.ら、Immunol Rev. 163：59-76ページ（1998年）；Wright, A.及びMorrison, S. L.、Trends Biotechnol. 15：26-32ページ（1997年））。
【００２１】
Umanaらは、以前に、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞における、分枝オリゴ糖（bisected oligosaccharides）の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（「GnTIII」）の過剰発現が、遺伝子工学的CHO細胞によって作り出された抗神経芽細胞腫キメラ・モノクローナル抗体（chCE7）の試験管内ADCC活性を顕著に増強することを示した（Umafia, P.ら、Nature Biotechnol. 17：176-180ページ（1999年）；及び国際公開番号WO 99/54342を参照のこと、上記文献の内容全体を本明細書中に援用する）。抗体chCE7は、高い腫瘍親和性及び特異性を有する非結合mAbsの大きなクラスに属するが、GnTIII酵素を欠く標準的な産業用細胞において産生される時には、あまりにもわずかな効能しかないので臨床的に有用ではかった（Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17：176-180ページ（1999年））。その研究は、天然の抗体に見られるレベルを上回る、分枝非フコシル化オリゴ糖を含めた定常領域（Fc）に関連する分枝オリゴ糖の比率の上昇にもつながる、GnTIIIを発現するように抗体産生細胞を操作することによって、ADCC活性の大きな増加が得られるだろうことを最初に示した。
【００２２】
これだけに制限されることなく、ヒトを含む哺乳動物の細胞増殖障害の治療のためにMCSPを標的化する治療的アプローチを強化する必要性が残っている。ここで、前述の障害は、MCSP発現、特に異常発現（例えば、過剰発現）を特徴とし、これだけに制限されることなく、メラノーマ、グリオーマ、小葉性乳癌、及び新生血管系を引き起こす腫瘍も含む。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
マウス225.28S抗体の結合特異性を有し、且つ、Fc受容体結合親和性とエフェクター機能を高めるように糖操作された抗原結合分子（ABMs）の素晴らしい治療的潜在能力を認識して、当該発明者らは、そのようなABMsの製造方法を開発した。とりわけ、この方法は、組み換え、（ヒト化を含む）キメラ抗体、又はそのキメラ・フラグメントを作り出すことを伴う。これらのABMsの有効性は、抗体Fc領域のグリコシル化特性を操作することによって更に高められる。
【００２４】
よって、1つの態様において、本発明は、以下の：（A）以下の：配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；配列番号75から成る群から選択される配列；（B）以下の：配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；及び配列番号93から成る群から選択される配列；並びに（C）配列番号95、を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられる。好ましくは、前記単離されたポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする。
【００２５】
他の態様において、本発明は、以下の：（A）以下の：配列番号97；配列番号99；及び配列番号101から成る群から選択される配列；（B）配列番号103又は配列番号105；並びに（C）配列番号107、を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられる。好ましくは、前記単離されたポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする。
【００２６】
更なる態様において、本発明は、以下の：配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、以下の：配列番号29、配列番号31、及び配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；配列番号51から成る群から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドにも関する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする。
【００２７】
本発明の更なる態様は、以下の：（A）以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに（B）以下の：配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、及び配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号44；配列番号46；配列番号48；配列番号50；配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列、を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23、から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ここで、前記単離されたポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードする。前述の単離されたポリヌクレオチドは、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含むかもしれない。
【００２９】
更に他の態様において、本発明は、また、以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。ここで、前記単離されたポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードする。前述の単離されたポリヌクレオチドは、ヒト抗体の軽鎖又は重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含むかもしれない。
【００３０】
本発明は、また、以下の：（A）以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに（B）マウス種以外の種からの抗体Fc領域又はそのフラグメントの配列を持つポリペプチドをコードする配列、を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。あるいは、本発明は、以下の：（A）以下の：配列番号28、配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；及び配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする配列；並びに（B）マウス以外の種からの抗体の軽鎖定常ドメイン又はそのフラグメントの配列を持つポリペプチドをコードする配列、を含む単離されたポリヌクレオチドを網羅する。
【００３１】
本発明は、更に、以下の：配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに向けられる。他の態様において、本発明は、以下の：配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；配列番号52から成る群から選択される配列を持つポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに向けられる。
【００３２】
本発明は、また、先に記載した本発明のポリヌクレオチドの1種類以上を含む発現ベクターを網羅する。好ましくは、前記発現ベクターは、少なくとも、抗体の軽鎖又は重鎖をコードする。1つの態様において、発現ベクターは、抗体の軽鎖と重鎖の両方をコードする。ベクターは、ポリシストロン性ベクターであってもよい。
【００３３】
本発明は、更に、本発明の発現ベクターの1種類以上、又は本発明のポリヌクレオチドの1種類以上を含む宿主細胞に関する。1つの態様において、宿主は、以下の：配列番号1；配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号9；配列番号11；配列番号13；配列番号15；配列番号17；配列番号19；配列番号21；及び配列番号23から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、そして、抗体の軽鎖の可変領域をコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドを更に含む。更に他の態様において、本発明の宿主細胞は、以下の：配列番号27、配列番号29、配列番号31；配列番号33；配列番号35；配列番号37；配列番号39；配列番号41；配列番号43；配列番号45；配列番号47；配列番号49；及び配列番号51から成る群から選択される配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%の同一性を有する配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、そして、抗体の重鎖の可変領域をコードする配列を含む第2のポリヌクレオチドを更に含む。
【００３４】
他の態様において、本発明は、以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24、又はその変異体から成る群から選択される配列を含む融合ポリペプチドに向けられる。
【００３５】
本発明は、また、以下の：配列番号28；配列番号30、配列番号32；配列番号34；配列番号36；配列番号38；配列番号40；配列番号42；配列番号46；配列番号48；及び配列番号52、又はその変異体から成る群から選択される配列を含む融合ポリペプチドに向けられる。
【００３６】
本発明は、また、抗原結合分子にも関する。よって、1つの態様において、本発明は、本発明の融合ポリペプチドの1種類以上を含む抗原結合分子に向けられる。好ましくは、前記抗原結合分子は、ヒトMCSPに選択的に結合する。1つの好ましい態様において、抗原結合分子は抗体である。ヒト化抗体が、特に好ましい抗原結合分子である。あるいは、前記抗体は霊長類化されてもよい。他の態様において、本発明の抗原結合分子は、抗体Fc領域又は抗体のFc領域に相当する領域を持つ抗体フラグメントを含む。更に他の態様において、本発明の抗原結合分子は、scFv、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、Fab、又はFab2フラグメントである。好ましい態様において、抗原結合分子は、組み換え抗体、例えば、ヒト化組み換え抗体である。前記組み換え抗体は、ほとんどの場合、ヒトFc領域、好ましくはヒトIgGのFc領域を含む。
【００３７】
他の態様において、本発明は、修飾オリゴ糖を含むFc領域を持つように糖操作された、先に議論した抗原結合分子に関する。1つの態様において、Fc領域は、非糖操作抗原結合分子と比べてフコース残基の数が少なくなるように修飾された。他の態様において、Fc領域は、非糖操作抗原結合分子と比べて分枝オリゴ糖の比率が高い。更に他の態様において、分枝オリゴ糖は、主に分枝複合体である。他の態様において、本発明の糖操作された抗原結合分子は、非糖操作抗原結合分子と比べて、前記抗原結合分子のFc領域内に、分枝、非フコシル化オリゴ糖の比率が高い。あるいは、本発明の抗原結合分子は、非糖操作抗原結合分子と比べて、Fc領域内のGlcNAc残基対フコース残基の高い比を有するかもしれない。
【００３８】
1つの態様において、分枝、非フコシル化オリゴ糖は、主にハイブリッド型である。あるいは、前記分枝、非フコシル化オリゴ糖は、主に複合型である。ある特定の態様において、Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも35%、又は少なくとも40%が、分枝し、非フコシル化されている。他の態様において、Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%が、分枝している。更に他の態様において、Fc領域内のオリゴ糖の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%が、非フコシル化されている。
【００３９】
本発明は、また、ヒトMCSPに結合するためのマウス225.28Sモノクローナル抗体と競合できる抗原結合分子の製造方法に向けられ、上記方法は、以下のステップ：a）上記抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドの発現を許容する条件下で本発明の宿主細胞を培養し；そして、b）上記抗原結合分子を回収する、を含む。1つの態様において、抗原結合分子は、例えば、ヒト化抗体などの抗体である。
【００４０】
本発明は、更に、本発明の抗原結合分子と、医薬として許容される担体を含む医薬組成物に向けられる。前記医薬組成物は、必要に応じて、補助剤を含むかもしれない。
【００４１】
本発明は、より更に、サンプル又は対象に本発明の抗原結合分子を投与するステップを含む、サンプル又は対象においてMCSPを発現する細胞の識別方法に向けられる。1つの態様において、識別は、診断目的のためのものである。他の態様において、識別は、例えば、疾患又は障害の治療などの治療目的のためのものである。よって、ある特定の側面において、本発明は、その治療を必要とする対象におけるMCSP媒介性細胞増殖障害の治療方法であって、本発明の医薬組成物の治療的有効量を上記対象に投与するステップを含む前記治療方法に向けられる。好ましくは、前記対象はヒトである。1つの態様において、治療は、以下の：MCSPリガンド結合、メラノーマ細胞接着、周皮細胞活性化、フィブロネクチンに対する走化性反応、ECMタンパク質上での細胞伸展、FAKシグナル伝達、及びERKシグナル伝達、から成る群から選択されるMCSP媒介性相互作用の遮断を含む。他の態様において、治療される疾患又は障害が、以下の：メラノーマ、グリオーマ、小葉性乳癌、急性白血病、又は血管の固形腫瘍誘導性新生血管形成、から成る群から選択される。更に他の態様において、治療は、MCSP発現細胞、好ましくはMCSPを過剰発現する細胞を死滅させることを含む。
【００４２】
本発明は、更に、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有する第1のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を、同じ宿主細胞によって産生される第2のポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現するように糖操作された宿主細胞に向けられ、ここで、上記第2のポリペプチドは、本発明の抗原結合分子である。1つの態様において、宿主細胞は、更に、マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドを発現する。ある特定の態様において、第1のポリペプチドは、更に、ゴルジ体常在性ポリペプチドの局在化ドメインを含む。好ましくは、本発明の抗原結合分子は、抗体又は抗体フラグメントである。他の態様において、抗原結合分子は、ヒトIgGのFc領域、又はヒトIgGのFc領域に相当する領域を含む。
【００４３】
本発明の宿主細胞によって産生された抗原結合分子は、非糖操作宿主細胞によって産生された抗原結合分子と比べて、高められたFc受容体結合親和性、及び／又は増強されたエフェクター機能を示す。
【００４４】
ある特定の態様において、宿主細胞によって発現された第1のポリペプチドは、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIの触媒ドメインを含む。1つの態様において、前記第1のポリペプチドは、更に、例えば、マンノシダーゼIIの局在化ドメイン、β（1,2）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIの局在化ドメイン、β（1,2）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIの局在化ドメイン、マンノシダーゼIの局在化ドメイン、又はα1-6コア・フコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインなどの異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む。
【００４５】
本発明の宿主細胞によって産生された抗原結合分子によって示された増強されたエフェクター機能は、増強されたFc媒介性細胞傷害性、増強されたNK細胞への結合、増強されたマクロファージへの結合、増強された多形核細胞への結合、増強された単球への結合、増強された、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達、増強された樹状細胞の成熟、又は増強されたT細胞の初回刺激の中の1つ以上である。
【００４６】
本発明の抗原結合分子によって示された増強されたFc受容体結合は、1つの態様において、例えば、FcγRIIIなどのFcγ活性化受容体への結合が増強される。具体的な態様において、増強された結合は、ヒトFcγRIIIa受容体、又はその天然の変異体に対してのものである。
【００４７】
ある特定の態様において、本発明の宿主細胞は、HEK293-EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、又はハイブリドーマ細胞である。1つの態様において、本発明の宿主細胞には、構成的プロモーター要素に作動できるように連結されたβ（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を含む。他の態様において、宿主細胞によって発現されるβ（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。
【００４８】
本発明は、また、マウス225.28Sモノクローナル抗体の相補性決定領域、又は上記相補性決定領域のための特異性決定残基を少なくとも含むその変異体又は切断型を少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ含む単離されたポリヌクレオチドを網羅し、ここで、上記単離されたポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードする。好ましくは、相補性決定領域は、以下の：配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；配列番号75；配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；配列番号93；及び配列番号95から成る群から選択される。他の態様において、相補性決定領域は、以下の：配列番号97、配列番号99、配列番号101；配列番号103；配列番号105；配列番号107から成る群から選択される。好ましくは、前記融合ポリペプチドは、本発明の抗原結合分子をコードする。
【００４９】
特異的な態様において、CDRsは、以下の：配列番号61；配列番号63；配列番号65；配列番号67；配列番号69；配列番号71；配列番号73；配列番号75；配列番号77；配列番号79；配列番号81；配列番号83；配列番号85；配列番号87；配列番号89；配列番号91；配列番号93；及び配列番号95から成る群から選択される少なくとも1つの配列；並びに以下の：配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103；配列番号105；配列番号107から成る群から選択される少なくとも1つの配列、又は前記相補性決定領域のそれぞれについて少なくとも特異性決定残基を含む上記配列の変異体又は切断型を含む。本発明は、また、前述のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、並びに前述のポリペプチドを含む抗原結合分子を網羅する。
【００５０】
本発明の抗原結合分子は、いくつかの態様において、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を含む。他の態様において、ABMは、キメラ又はヒト化抗体を含む。
【００５１】
本発明は、更に、宿主細胞における修飾オリゴ糖を持つ抗原結合分子の製造方法に向けられ、上記方法は、以下のステップ：（a）上記抗原結合分子の産生を可能にし、且つ、上記抗原結合分子のFc領域に存在するオリゴ糖の修飾を許容する条件下で、β（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するように糖操作した宿主細胞を培養し；そして、（b）上記抗原結合分子を単離する、を含む。ここで、前記抗原結合分子は、MCSPへの結合の関してマウス225.28Sモノクローナル抗体と競合でき、且つ、ここで、上記抗原結合分子又はそのフラグメントは、キメラ又はヒト化されたものである。本発明の1つの方法において、修飾オリゴ糖は、非糖操作抗原結合分子のオリゴ糖と比べて、フコース残基の比率が低い。ある特定の態様において、修飾オリゴ糖は、主にハイブリッド型である。代替の態様において、修飾オリゴ糖は、主に複合型である。他の態様において、修飾オリゴ糖の少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%が、分枝し、非フコシル化されている。
【００５２】
本発明の方法の他の態様において、前記宿主細胞によって産生された組み換え抗体又はそのフラグメントは、非糖操作細胞によって産生された抗原結合分子比べて、前記ポリペプチドのFc領域内の分枝、非フコシル化オリゴ糖の比率が高い。1つの態様において、分枝、非フコシル化オリゴ糖は、主にハイブリッド型である。他の態様において、分枝、非フコシル化オリゴ糖は、主に複合型である。ある特定の態様において、前記ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも35%、又は少なくとも40%が、分枝し、非フコシル化されている。
【００５３】
本発明の方法によって産生された抗原結合分子は、ある特定の態様において、増強されたエフェクター機能、及び／又は増強されたFc受容体結合親和性を有する。1つの態様において、抗原結合分子は抗体である。前記増強されたエフェクター機能は、増強されたFc媒介性細胞傷害性、増強されたNK細胞への結合、増強されたマクロファージへの結合、増強された単球への結合、増強された多形核細胞への結合、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達、増強された樹状細胞の成熟、又は増強されたT細胞の初回刺激の中の1つ以上であるかもしれない。好ましくは、増強されたFc受容体結合は、例えば、FcγRIIIaなどのFc活性化受容体への増強された結合である。
【００５４】
本発明は、また、以下の：配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号8；配列番号10；配列番号12；配列番号14；配列番号16；配列番号18；配列番号20；配列番号22；及び配列番号24；並びに免疫グロブリンのFc領域に相当し、且つ、エフェクター機能を増強するように操作された領域、から成る群から選択される配列を持つポリペプチドを含む融合タンパク質である抗原結合分子に向けられる。他の態様において、前記抗原結合分子が、以下の：配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36；配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、及び配列番号52、並びに免疫グロブリンのFc領域に相当し、且つ、エフェクター機能を増強するように操作された領域、から成る群から選択される配列を持つポリペプチドを含む融合タンパク質である。本発明は、また、前述の抗原結合分子と、医薬として許容される担体を含む医薬組成物にも向けられる。
【００５５】
本発明は、また、その方法を必要とする対象において腫瘍新生血管系（tumor neovasculature）における活性周皮細胞の溶解の誘導方法であって、以下のステップ：本発明の抗原結合分子、又はそれを含む医薬組成物を上記対象に投与する、を含む前記方法に向けられる。好ましくは、前記の対象はヒトである。1つの態様において、前記新生血管系は、メラノーマ新生血管系でもなく、又は神経膠芽腫の新生血管系でもない。他の態様において、抗原結合分子は、例えば、抗VEGF-1抗体などの別の抗血管新生剤と同時投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
以下に別段の規定がない限り、用語は、当該技術分野で一般に使用されるように本明細書中で使用される。
【００５７】
本明細書中では、抗体という用語は、モノクローナル、ポリクローナル、多特異的（例えば、二重特異性）抗体、並びにFc領域を持ち、且つ、結合特異性を維持する抗体フラグメント、及び免疫グロブリンのFc領域に相当する領域を含み、且つ、結合特異性を維持する融合タンパク質を含めた抗体分子全体を含むものとする。また、網羅されるものは、キメラ及びヒト化抗体、並びにラクダ化及び霊長類化抗体である。
【００５８】
本明細書中では、Fc領域という用語は、ヒトIgG重鎖のC末端領域を指すものとする。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変わるかもしれないが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Cys226位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びるように規定される。
【００５９】
本明細書中では、免疫グロブリンのFc領域に相当する領域という用語は、免疫グロブリンのFc領域の天然の対立遺伝子変異体、並びに置換、付加、又は欠失を生じるが、（例えば、抗体依存性細胞傷害性作用などの）エフェクター機能を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に減少させない変更を有する変異体を含むものとする。例えば、1つ以上のアミノ酸が、生物学的機能の実質的な損失なしに、免疫グロブリンのFc領域のN末端又はC末端から取り除かれることができる。そのような変異体は、活性に最小限の影響しか及ぼさないように当該技術分野で知られている通則に従って選択できる（例えば、Bowie, J. U.ら、Science 247：1306-10ページ（1990年）を参照のこと）。
【００６０】
本明細書中では、MCSPという用語は、ヒト・メラノーマ・コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（別名、高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA））、並びにその天然のアイソフォーム及び変異体を指す。MCSP配列は、寄託され、そして、以下の受入番号：ジェンバンク受入れ番号MIM：601172（遺伝子）；GI：1617313、GI：21536290、GI：34148710、及びGI：47419929（mRNA）；GI：1617314、GI：4503099、GI：34148711、及びGI：47419930（タンパク質）、を割り当てられた。
【００６１】
本明細書中では、MCSPリガンドという用語は、MCSPに結合する、及び／又はそれを活性化するポリペプチドを指す。前記用語は、MCSPリガンドの膜結合型前駆体形態、及びMCSPリガンドのタンパク分解処理した可溶性形態を含む。
【００６２】
本明細書中では、MCSP若しくはMCSPリガンドの異常な活性化、発現、若しくは産生を特徴とする疾患若しくは障害、又はMCSP発現に関連する障害という用語は、MCSP、及び／又はMCSPリガンドの異常な活性化、産生が、疾患若しくは障害を患うか、又はそれらにかかりやすい対象の細胞又は組織で生じている病態を指し、悪性腫瘍又は癌に伴って生じるかもしれないし、そうでないかもしれない。
【００６３】
本明細書中では、MCSPを発現する細胞に関して使用される場合に、過剰発現、過剰発現された、及び過剰発現されているという用語は、同じ組織の種類の正常細胞と比べて、表面上に計測できる程度に高レベルのMCSPを持つ細胞を指す。そのような過剰発現は、遺伝子増幅によって、又は転写若しくは翻訳の増加によって引き起こされるかもしれない。MCSP発現は、（例えば、免疫組織化学アッセイ；免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ELISA、フローサイトメトリー、放射免疫測定、ウエスタンブロット、リガンド結合、キナーゼ活性などによって）細胞表面上に存在するMCSPレベルを評価することによって診断又は予後アッセイにより測定することができる（一般に、CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK、Celis, J.編、Academic Press（第2版、1998年）；CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE、Coligan, J. E.ら編、John Wiley & Sons（1995年-2003年）を参照のこと；同様に、（ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、及び免疫組織化学について説明する）Sumitomoら、Clin. Cancer Res. 10：794-801ページ（2004年）を参照のこと（上記参考文献の内容全体を本明細書中に援用する））。あるいは又は加えて、当業者は、細胞内のMCSPをコードする核酸分子のレベルを、例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション、サザンブロット、又はPCR技術によって計測するかもしれない。正常細胞内のMCSPのレベルは、MCSPが過剰発現されているか判断するために、細胞増殖障害（例えば、癌）の影響を受けた細胞のレベルと比較される。
【００６４】
本明細書中では、抗原結合分子又はABMという用語は、その最も幅広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。より詳しく述べると、MCSPに結合する抗原結合分子は、先に規定されるMCSPに特異的に結合する分子である。好ましくは、前記ABMは抗体である；しかしながら、一本鎖抗体、一本鎖Fv分子、Fabフラグメント、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体なども本発明によって想定される。
【００６５】
「特異的結合」又は「同じ特異性を有する結合」は、結合が抗原に対して選択性があり、そして、求められていない又は特異的ではない相互作用と区別できることが意味されている。
【００６６】
本明細書中では、融合及びキメラという用語は、例えば、ABMといったポリペプチドに関して使用される時、2種類以上の異種ポリペプチド、例えば、異なった種からの抗体の一部などから得られたアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。キメラABMsに関して、例えば、非抗原結合成分は、例えば、チンパンジーやヒトなどの霊長目の動物を含めた様々な種から得ることができる。キメラABMsの定常領域は、最も好ましくは、天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一のものであり；キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくは、マウス可変領域のアミノ酸配列を持つ組み換え抗MCSP抗体のものと実質的に同一のものである。ヒト化抗体は、融合又はキメラ抗体の特に好ましい形態である。
【００６７】
本明細書中では、「GnTIII活性」を有するポリペプチドは、N結合型オリゴ糖のトリマンノシル・コアのβ結合型マンノシドへの、β-1-4連結によるN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）残基の付加を触媒することができるポリペプチドを指す。これは、用量依存性のあるなしにかかわらず、特定の生物学的アッセイにより計測された場合に、国際生化学分子生物学連合の特別部会（NC-IUBMB）によるとβ（1,4）-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII、別名、β-1,4-マンノシル-糖タンパク質4-β-N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼ（EC 2.4.1.144）の活性に類似しているが、しかし、必ずしも同一でなくてもよい酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在した場合に、それがGnTIIIのものと同一ではなくむしろ、GnTIHと比べて、所定の活性の用量依存に実質的に類似することが必要である（すなわち、候補ポリペプチドは、GnTIIIに対して高い活性、又は最大で25倍低い、好ましくは、最大で約10倍低い活性、そして、最も好ましくは、最大で3倍低い活性を示す）。
【００６８】
本明細書中では、変異体（又は、類似体）という用語は、例えば、組み換えDNA技術、を使用して作り出されたアミノ酸の挿入、欠失、及び置換によって具体的に列挙された本発明のポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。本発明のABMsの変異体には、1つ又はいくつかのアミノ酸残基が抗原（例えば、MCSP）結合親和性又は抗体エフェクター機能に実質的に影響を与えないような様式による置換、付加、及び／又は欠失によって修飾される、キメラ、霊長類化、又はヒト化抗原結合分子が含まれる。着目の活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基を置換、付加、又は欠失させることができるか判断する指針が、特定のポリペプチドの配列と、相同ペプチドの配列を比較し、そして、高相同性領域（保存領域）に作られたアミノ酸配列の変更の数を最小限にすることによって、又はアミノ酸を共通配列に置き換えることによって見つけ出されるかもしれない。
【００６９】
あるいは、これらと同じか又は類似のポリペプチドをコードする組み換え変異体は、遺伝的コードの「冗長性」を使用することによって合成又は選択されるかもしれない。様々な制限部位を生み出す、例えば、サイレント変更などの様々なコドン置換は、プラスミド若しくはウイルス・ベクター内へのクローニング、又は特定の原核生物又は真核細胞系における発現を最適化するために導入されるかもしれない。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、ポリペプチド、又は例えば、リガンド結合親和性、鎖間親和性、若しくは分解／ターンオーバ速度などの特徴を変えるためにポリペプチドのいずれかの部分の特性を修飾するようにそのポリペプチドに加えられた他のペプチドのドメインに反映されるかもしれない。
【００７０】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、類似の構造的、及び／又は化学的特性を持つ別のアミノ酸による1つのアミノ酸の置き換え、すなわち、保存的なアミノ酸置換の結果である。「保存的な」アミノ酸置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいておこなわれるかもしれない。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ；陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ；並びに陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。「挿入」又は「欠失」は、好ましくは約1〜約20個のアミノ酸、より好ましくは約1〜約10個のアミノ酸の範囲内である。許容される変異体は、組み換えDNA技術を使用してポリペプチド分子内へのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を系統的におこない、そして、得られた組み換え変異体を活性についてアッセイすることによって実験的に判断されるかもしれない。
【００７１】
本明細書中では、ヒト化という用語は、親分子の抗原結合特性を維持するか、又は実質的に維持しているが、ヒトにおける免疫原性を失っているヒト以外の抗原結合分子、例えば、マウス抗体から得られた抗原結合分子（ABM）を指すために使用される。これは、以下のステップ；（a）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）の保持の有無にかかわらず、ヒト・フレームワーク及び定常領域に、ヒト以外の相補性決定領域だけを結び付けるか、又は、（b）ヒト以外の可変ドメイン全体だが、表面残基の置換によってヒト様切片でそれらを「包み込み」移植する、を含む様々な方法によって達成されるかもしれない。そのような方法は、Jonesら、Nature 321：6069, 522-525ページ（1986年）；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81：6851-6855ページ（1984年）；Morrison及びOi、Adv. Immunol., 44：65-92ページ（1988年）；Verhoeyenら、Science, 239：1534-1536ページ（1988年）；Padlan、Molec. Immun., 28：489-498ページ（1991年）；Padlan、Molec. Immun., 31（3）：169-217ページ（1994年）で開示されている。前記全文献の全体を本明細書中に援用する。通常、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインのそれぞれの中に3つの相補性決定領域、又はCDR（CDR1、CDR2、及びCDR3）が存在し、それらには4つのフレームワーク亜領域（すなわち、FR1、FR2、FR3、及びFR4）が隣接している：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。ヒト化抗体の議論は、とりわけ、米国特許番号第6,632,927号、及び公開米国出願番号第2003/0175269号で見ることができる。前記両文献の全体を本明細書中に援用する。
【００７２】
同様に、本明細書中では、霊長類化という用語は、親分子の抗原結合特性を維持するか、又は実質的に維持しているが、霊長目の動物において免疫原性を欠いている非霊長類の抗原結合分子、例えば、マウス抗体から得られた抗原結合分子を指すために使用される。
【００７３】
当該技術分野の中で使用される、及び／又は認められる、用語の2つ以上の定義が存在する場合において、本明細書中では、用語の定義は、反対の意味がはっきりと述べられない限り、前述の意味の全てを含むものとする。具体的な例は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を説明する「相補性決定領域」（「CDR」）という用語の使用である。前記定義が、互いを比べた時のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む場合には、この特定の領域は、Kabatら、U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest"（1983年）によって、及びChothiaら、J. Mol. Biol. 196：901-917ページ（1987年）によって説明される。前記文献を本明細書中に援用する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のCDRを指すための定義のいずれの適用も、本明細書中に規定され、そして、使用される用語の範囲内にあるものとする。先の引用文献のそれぞれによって規定されるCDRを網羅する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表1に記載される。特定のCDRを網羅する正確な残基数は、CDRの配列又はサイズによって異なる。当業者は、どの残基が抗体の可変領域アミノ酸配列を生じさせる特定のCDRを含むか、日常的に測定することができる。
【００７４】
【表１】
2008533985.tif 000002
【００７５】
Kabatらは、また、あらゆる抗体に適用できる可変ドメイン配列の番号付けシステムも規定した。当業者は、配列自体以外にいずれの実験データに頼ることなく、あらゆる可変ドメイン配列に「Kabatの番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書中では、「Kabatの番号付け」は、Kabatら、U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Merest"（1983年）によって記載された番号付けシステムを指す。別段の指定がない限り、ABMの特定のアミノ酸残基位置の番号付けは、Kabatの番号付けシステムに従う。配列表の配列（すなわち、配列番号1〜配列番号110）は、Kabatの番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、先に述べたように、そこに提示された配列の番号付けに基づいて、配列表中のあらゆる可変領域配列のKabatの番号付けスキームを決定することは、十分に当業者の範疇にある。
【００７６】
本発明の基準ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも95%「同一」のヌクレオチド配列を持つ核酸又はポリヌクレオチドに関しては、ポリヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の100個のヌクレオチドごとに最大5つの点突然変異を含むかもしれないことを別にすれば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、基準配列と同一であるものとする。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを得るために、基準配列のヌクレオチドの最大5%が、削除されるか、別のヌクレオチドで置換されるかもしれず、あるいは基準配列内の総ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドが、基準配列に挿入されるかもしれない。
【００７７】
実際問題として、いずれか特定の核酸分子又はポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列又はポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるかどうかは、公知のコンピュータ・プログラムを使用することで従来法により測定することができる。全体的な配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列の間の最良の総合的な合致を測定するための好ましい方法は、Brutlagら、Comp. App. Biosci. 6：231-245ページ（1990年）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータ・プログラム使用することで測定されてもよい。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列と対象配列は共にDNA配列である。RNA配列は、UのものをTのものに変換することによって比較できる。前記全体的な配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで存在する。同一性パーセントを計算するためのDNA配列のFASTDBアラインメントに使用される好ましいパラメーターは、以下の：Matrix=Unitary、k-tuple=4、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=30、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty 0.05、Window Size=500又は対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方、である。
【００７８】
内部欠失が原因ではなく5’又は3’欠失が原因で、対象配列が問い合わせ配列より短い場合、手動補正が結果に対しておこなわれる必要がある。これは、同一性パーセントについて計算する時、FASTDBプログラムが対象配列の3’及び5’先端切断を考慮しないためである。問い合わせ配列に対して5’又は3’末端で先端切断された対象配列に関して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして、一致／アラインしなかった対象配列の5’及び3’であるところの問い合わせ配列の塩基数を計算することによって補正される。ヌクレオチドが一致／アラインするかどうかが、FASTDB配列アラインメントの結果によって判断される。このパーセンテージは、次に、指定されたパラメーターを使用した上記FASTDBプログラムによって計算した同一性パーセントから引き算されて、最終同一性パーセント・スコアが導き出される。この補正スコアが、本発明の目的に使用されるものである。問い合わせ配列に一致／アラインしない、FASTDBアラインメントによって示されるような、対象配列の5’及び3’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセント・スコアを手動で調整する目的で計算される。
【００７９】
例えば、同一性パーセントを測定するために、90塩基の対象配列が100塩基の問い合わせ配列にアラインされる。欠失が対象配列の5’末端に起こるために、FASTDBアラインメントは5’末端の最初の10塩基の一致／アラインメントを示さない。10個の不対塩基は配列の10%（一致しなかった5’及び3’末端の塩基数／問い合わせ配列内の総塩基数）に相当し、そのため、10%がFASTDBプログラムで計算された同一性パーセント・スコアから引き算される。残りの90塩基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは90%になるであろう。他の例において、90塩基の対象配列が、100塩基の問い合わせ配列と比較される。今回、欠失は、問い合わせに一致／アラインしない対象配列の5’又は3’に塩基が存在しないような、内部欠失である。この場合、FASTDBによって計算される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、問い合わせ配列と一致／アラインしない対象配列の5’及び3’の塩基だけが、手動で補正される。その他の手動補正が、本発明の目的のためになされることはない。
【００８０】
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも、例えば、95%「同一」のアミノ酸配列を持つポリペプチドに関しては、対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の100個のアミノ酸ごとに最大5つのアミノ酸の変更を含むかもしれないことを別にすれば、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列と同一であるものとする。言い換えれば、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドを得るために、対象配列中のアミノ酸残基の最大5%が、挿入されるか、削除されるか、又は別のアミノ酸で置換される。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノ末端若しくはカルボキシ末端の位置、又は基準配列において又は基準配列内の1つ以上の隣接基において残基の中のいずれかに個別に点在したそれらの末端の位置の間のどこかに生じるかもしれない。
【００８１】
実際問題として、いずれか特定のポリペプチドが基準ポリペプチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるかどうかは、公知のコンピュータ・プログラムを使用することで従来法により測定することができる。全体的な配列アラインメントとも呼ばれる、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列の間の最良の総合的な一致を測定するための好ましい方法は、Brutlagら、Comp. App. Biosci. 6：237-245ページ（1990年）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータ・プログラムを使用することで測定されてもよい。配列アラインメントにおいて、問い合わせ配列と対象配列は、共にヌクレオチド配列であるか、又は共にアミノ酸配列であるかのいずれかである。前記全体的な配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで存在する。FASTDBアミノ酸配列に使用される好ましいパラメーターは、以下の：Matrix=PAM 0、k-tuple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=20、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Window Size=sequence length、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=500又は対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方、である。
【００８２】
内部欠失ではなく、N又はC末端欠失が原因で、対象配列が問い合わせ配列より短い場合、手動補正が結果に対してなされる必要がある。これは、全体的な同一性パーセントについて計算する時、FASTDBプログラムが対象配列のN及びC末端切断を考慮しないためである。問い合わせ配列に対してN及びC末端で先端切断された対象配列に関して、同一性パーセントは、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／アラインしなかった対象配列のN及びC末端であるところの問い合わせ配列の残基数を計算することによって補正される。残基が一致／アラインするかどうかが、FASTDB配列アラインメントの結果によって判断される。このパーセンテージは、次に、指定されたパラメーターを使用した上記FASTDBプログラムによって計算した同一性パーセントから引き算されて、最終同一性パーセント・スコアが導き出される。この最終同一性パーセント・スコアが、本発明の目的に使用されるものである。問い合わせ配列に一致／アラインしない、対象配列のN及びC末端に対する残基のみが、同一性パーセント・スコアを手動で調整する目的で計算される。すなわち、対象配列の最も遠いN及びC末端残基の外側に位置する問い合わせ残基だけである。
【００８３】
例えば、同一性パーセントを測定するために、90アミノ酸残基の対象配列が100残基の問い合わせ配列に対してアラインされる。欠失が対象配列のN末端に起こるために、FASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基の一致／アラインを示さない。10個の不対残基は配列の10%（一致しなかったN及びC終端の残基数／問い合わせ配列内の総残基数）に相当し、そのため、10%がFASTDBプログラムで計算された同一性パーセント・スコアから引き算される。残りの90残基が完全に一致した場合に、最終的な同一性パーセントは90%になるであろう。他の例において、90残存の対象配列が、100残基の問い合わせ配列と比較される。今回、欠失は、問い合わせに一致／アラインしない対象配列のN又はC末端に残基が存在しないような、内部欠失である。この場合、FASTDBによって計算される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、問い合わせ配列と一致／アラインしない、FASTDBアラインメント内に表示されるような、対象配列のN及びC末端の外側の残基位置だけが、手動で補正される。その他の手動補正が、本発明の目的のためになされることはない。
【００８４】
本明細書中では、本発明の核酸配列に「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」核酸は、50%のホルムアミド、5×SSC（750mMのNaCl、75mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハート液、10%のデキストラン硫酸、及び20μg/ml変性、剪断サケ精子DNAを含む溶液中、42℃で一晩、インキュベーションし、続いてフィルターを約65℃で0.1×SSCで洗浄することによってハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
【００８５】
本明細書中では、ゴルジ体局在化ドメインという用語は、ゴルジ体複合体内の場所にポリペプチドを据えつけるのに関与するゴルジ体常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般に、局在化ドメインは、酵素のアミノ末端「テール」を含む。
【００８６】
本明細書中では、エフェクター機能という用語は、抗体のFc領域（天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域）に起因するそれらの生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、これだけに制限されることなく、Fc受容体結合親和性、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体の下方調節などが含まれる。
【００８７】
本明細書中では、操作する、操作された、操作、糖操作された、及びグリコシル化操作されたという用語は、例えば、抗原結合分子（ABM）若しくはそのフラグメントなどの天然に存在する又は組み換えポリペプチドのあらゆるグリコシル化パターンの操作を含むと見なされる。グリコシル化操作は、細胞内で発現された糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含めた、細胞のグリコシル化機構の代謝操作を含む。更に、グリコシル化操作は、グリコシル化に対する突然変異及び細胞環境の効果を含む。1つの態様において、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変更である。特定の態様において、操作は、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性、及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性の変更をもたらす。
【００８８】
本明細書中では、宿主細胞という用語は、本発明のポリペプチド及び抗原結合分子を作り出すために操作できるあらゆる種類の細胞系を対象とする。1つの態様において、宿主細胞は、修飾グリコフォームを持つ抗原結合分子の産生を可能にするように操作される。好ましい態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体フラグメント、又は融合タンパク質である。ある特定の態様において、宿主細胞は、GnTIII活性を有する増強されたレベルの1種類以上のポリペプチドを発現するように更に操作された。他の態様において、宿主細胞は、コアα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を排除するか、減弱するか、又は抑制するように操作された。用語「コアα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性」は、コアα1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、並びにコアα1,6-フコシルトランスフェラーゼ酵素の基質との相互作用の両方を網羅する。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、又は融合細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれ、ほんのいくつか例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物組織若しくは動物組織に含まれる細胞もまた含まれる。
【００８９】
本明細書中では、Fc媒介性細胞傷害性という用語は、抗体依存性細胞傷害性、及びヒトFc領域を含めた可溶性Fc融合タンパク質によって媒介される細胞傷害性が含まれる。それは、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「抗体標的細胞」の溶解につながる免疫機構である。
【００９０】
ここで、ヒト免疫エフェクター細胞は、それらが抗体又はFc融合タンパク質のFc領域に結合することを通して自己表面にFc受容体を提示し、そして、エフェクター機能を実施する白血球集団である。そのような集団には、これだけに制限されることなく、末梢血単核細胞（PBMC）、及び／又はナチュラルキラー（NK）細胞が含まれるかもしれない。
【００９１】
抗体標的細胞は、本発明のABMs（例えば、抗体又はFc融合タンパク質）に結合される細胞である。一般に、抗体又はFc融合タンパク質は、N末端からFc領域までのタンパク質部分を介して標的細胞に結合する。
【００９２】
本明細書中では、増強されたFc媒介性細胞傷害性という用語は、先に規定されるFc媒介性細胞傷害性の作用機序によって、標的細胞を取り囲む媒質中、所定の濃度の抗体若しくはFc融合タンパク質にて、所定の時間内に溶解される「抗体標的細胞」の数の増大、及び／又はFc媒介性細胞傷害性の作用機序によって、所定の時間内に、所定の数の「抗体標的細胞」の溶解を達成するのに必要とされる、標的細胞を取り囲む媒質中の抗体若しくはFc融合タンパク質の濃度の減少として規定される。Fc媒介性細胞傷害性の増大は、当業者に知られている同じ標準的な産生、精製、処方、及び保存方法を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生されたが、しかし、本明細書中に記載の方法によってグリコシルトランスフェラーゼGnTIIIを発現するように糖操作された宿主細胞によって産生されなかった、同じ抗体又はFc融合タンパク質によって媒介された細胞傷害性に対して相対的なものである。
【００９３】
抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有する抗体は、その用語が本明細書中で規定されるとおり、当業者に知られているいずれかの適切な方法によって測定される増強されたADCCを有する抗体を意味する。当業者に認められた試験管内ADCCアッセイは、以下の通りである：
1）  前記アッセイは、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する。
2）  前記アッセイは、エフェクター細胞として、無作為に選ばれた健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単核細胞（PBMCs）を使用する。
3）  前記アッセイは、以下のプロトコール：
i）  PBMCsは、標準的な密度遠心分離法を使用して単離され、そして、RPMI細胞培地中に5×106細胞/mlにて懸濁され；
ii）  標的細胞は、標準的な組織培養法で培養され、90%を超える生存率の状態で指数増殖期から採集され、RPMI細胞培地で洗浄され、100マイクロ・キュリーの51Crで標識され、細胞培地で2度洗浄され、そして、105細胞/mlの密度で細胞培地中に再懸濁され；
iii）  上記の最終標的細胞懸濁液100マイクロリットルが、96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに移され；
iv）  抗体は、細胞培地中に4000ng/ml〜0.04ng/mlに連続的に希釈され、そして、得られた抗体溶液50マイクロリットルが、96ウェルのマイクロタイタープレート内の標的細胞に加えられ、上記の全ての濃度範囲をカバーする様々な抗体濃度の三重反復試験において試験し；
v）  最大放出（MR）対照のために、標識された標的細胞を含むプレート内の3つの追加ウェルが、抗体溶液（上記ポイントiv）の代わりに非イオン性界面活性剤（ノニデット、Sigma, St. Louis）の2%（V/V）水溶液50マイクロリットルを受け入れ；
vi）  自然放出（SR）対照のために、標識された標的細胞を含むプレート内の3つの追加ウェルが、抗体溶液（上記ポイントiv）の代わりにRPMI細胞培地50マイクロリットルを受け入れ；
vii）  96ウェルのマイクロタイタープレートは、次に、50×gで1分間、遠心分離され、そして、4℃で1時間、インキューベートされ；
viii）  50マイクロリットルのPBMC懸濁液（上記ポイントi）が、各ウェルに加えられて、25：1のエフェクター：標的細胞比を得、そして、そのプレートは、5% CO2の雰囲気下のインキュベータ内に37℃で4時間、置かれ；
ix）  各ウェルからの細胞を含まない上清が採集され、そして、実験的に放出された放射能（ER）が、ガンマカウンターを使用して定量化され；
x）  特異的な溶解のパーセンテージが、式（ER−MR）/（MR−SR）×100｛式中、ERが、その抗体濃度について定量化された（上記ポイントixを参照のこと）平均放射能であり、MRが、MR対照（上記ポイントvを参照のこと）について定量化された（上記ポイントixを参照のこと）平均放射能であり、そして、SRが、SR対照（上記ポイントviを参照のこと）について定量化された（上記ポイントixを参照のこと）平均放射能である。｝に従って各抗体濃度について計算される、
に従って実施される。
4）  「増強されたADCC」は、先に試験された抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大パーセンテージの増大として、及び／又は試験された抗体濃度範囲内で観察された特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するのに必要とされる抗体濃度の減少として規定される。ADCCの増大は、当業者に知られている同じ標準的な産生、精製、処方、及び保存方法を使用して、同じ種類の宿主細胞によって産生されるが、GnTIIIを過剰発現するために操作された宿主細胞によって産生されていない、同じ抗体によって媒介された、上記アッセイで計測されたADCCに対して相対的なものである。
【００９４】
1つの側面において、本発明は、マウス225.28S抗体と同じ結合特異性を有する（すなわち、実質的に同じ親和性で実質的に同じエピトープに結合する）抗原結合分子、及びそれらのエフェクター機能がグリコシル化を変更することによって増強される可能性があることの発見に関する。1つの態様において、抗原結合分子はキメラ抗体である。好ましい態様において、本発明は、表3又は4（配列番号62〜108）の中の相補性決定領域の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つを含むキメラ抗体若しくはそのフラグメントに向けられる。具体的には、好ましい態様において、本発明は、以下の：（a）以下の：配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、及び配列番号75から成る群から選択される配列；（b）以下の：配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、及び配列番号93から成る群から選択される配列；並びに（c）配列番号95、を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられる。他の好ましい態様において、本発明は、以下の：（a）以下の：配列番号97；配列番号99；及び配列番号101から成る群から選択される配列；（b）配列番号103及び配列番号105から成る群から選択される配列；並びに（c）配列番号107、を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられる。1つの態様において、これらのポリヌクレオチドのいずれも、融合ポリペプチドをコードする。
【００９５】
他の態様において、抗原結合分子は、表6中の配列によってコードされる225.28抗体のVHドメイン（配列番号1〜23の奇数番）、又はその変異体；及び非マウス・ポリペプチドを含む。他の好ましい態様において、本発明は、配列番号27〜51（奇数番）によってコードされるラット抗体のVLドメインを含む抗原結合分子又はその変異体；及び非マウス・ポリペプチドに向けられる。
【００９６】
他の側面において、本発明は、225.28Sの切断型相補性決定領域の1種類以上を含む抗原結合分子に向けられる。そのような切断型相補性決定領域は、所定のCDRの特異性決定アミノ酸残基を最小限で含む。「特異性決定残基」は、抗原との相互作用に直接的に関与するそれらの残基を意味する。通例、所定のCDR内の残基の約3分の1〜5分の1だけが、抗原への結合に加わる。特定のCDRにおける特異性決定残基は、例えば、三次元モデリングからの原子間接触の計算と、Padlanら、FASEB J. 9（1）：133-139ページ（1995年）に記載の方法に基づく所定の残基位置における配列可変性の測定によって特定されるかもしれない。前記参考文献の内容の全体を本明細書中に援用する。
【００９７】
従って、本発明は、また、前記相補性決定領域に関する特異性決定残基を少なくとも含むマウス225.28S抗体の相補性決定領域、又はその変異体若しくは切断型の少なくとも1つを含む単離されたポリヌクレオチドにも向けられ、ここで、上記単離されたポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードする。好ましくは、前述の単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子である融合ポリペプチドをコードする。1つの態様において、ポリヌクレオチドは、マウス225.28S抗体の2、3、4、5、若しくは6個の相補性決定領域を含むか、あるいは上記2、3、4、5、若しくは6個の相補性決定領域のそれぞれに関する特異性決定残基を少なくとも含むその変異体又は切断型を含む。1つの態様において、ポリヌクレオチドは、以下の表2及び5に記載されるCDRの少なくとも1つを含む。他の態様において、ポリヌクレオチドは、キメラ（例えば、ヒト化）抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域全体をコードする。本発明は、更に、前述のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに向けられる。
【００９８】
他の態様において、本発明は、マウス225.28S抗体の相補性決定領域の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、若しくは少なくとも6つを含むか、あるいは上記相補性決定領域のそれぞれに関する特異性決定残基を少なくとも含むその変異体又は切断型、並びに異種ポリペプチドから得られた配列を含む抗原結合分子に向けられる。1つの態様において、抗原結合分子は、マウス225.28S抗体の3つの相補性決定領域、又は上記の3つの相補性決定領域のそれぞれに関する特異性決定残基を少なくとも含むその変異体又は切断型を含む。1つの態様において、抗原結合分子は、以下の表3及び4に規定されるCDRの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つを含む。他の側面において、抗原結合分子は、抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域を含む。1つの特に有用な態様において、抗原結合分子は、キメラ抗体、例えば、ヒト化抗体である。本発明は、また、前述の抗原結合分子の作製方法、並びにMCSPが発現される、特に、同じ組織タイプの正常細胞と比較してMCSPが異常に発現され（例えば、過剰発現される）疾患、特に、細胞増殖障害の治療におけるその使用に向けられる。そのような障害には、これだけに制限されることなく、メラノーマ、グリオーマ、小葉性乳癌、いくつかの急性白血病、及び全ての腫瘍誘導新生血管系が含まれる。MCSP発現レベルは、当該技術分野で知られている方法及び本明細書中に記載のものによって（例えば、免疫組織化学アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫酵素アッセイ、ELISA、フローサイトメトリー、放射免疫測定、ウエスタンブロット、リガンド結合、キナーゼ活性などによって）測定することができる。
【００９９】
本発明は、また、MCSPを発現する生体内、又は試験管内の細胞を標的化する方法に向けられる。MCSPを発現する細胞が、（例えば、リガンドに結合するMCSPの崩壊によって、又は免疫系による破壊のためのMCSP発現細胞の標的化によって治療可能な障害の治療のために）治療目的で標的化されるかもしれない。1つの態様において、本発明は、対象のMCSPを発現する細胞を標的化する方法であって、本発明のABMを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む前記方法に向けられる。MCSPを発現する細胞は、また、（例えば、それらが正常に又は異常に、MCSPを発現しているかどうか測定するために）診断目的のためにも標的化されるかもしれない。よって、本発明は、また、生体内又は試験管内における、MCSPの存在、又はMCSPを発現する細胞の存在の検出方法にも向けられる。本発明によるMCSP発現を検出する方法の1つは、ABMとMCSPの間の複合体の形成を許容する条件下で、必要に応じて、対照サンプルと共に、試験されるサンプルを、本発明のABMと接触させるステップを含む。前記複合体形成が、次に、（例えば、ELISA、又は当該技術分野で知られている他の方法によって）検出される。試験サンプルと共に対照サンプルを使用する時、試験サンプルと対照サンプルを比較した時に、ABM-MCSP複合体の形成におけるいずれかの統計学的に有意な差が、試験サンプル中のMCSPの存在を示す。
【０１００】
【表２】
2008533985.tif 000003
【０１０１】
【表３】
2008533985.tif 000004
【０１０２】
【表４】
2008533985.tif 000005
【０１０３】
【表５】
2008533985.tif 000006
【０１０４】
いくつかの作用機序が、MCSPへの結合、MCSPリガンドの遮断、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、メラノーマ細胞の接着と遊走の阻害、フィブロネクチンへの走化性反応の阻害、及び周皮細胞の阻害／死滅、例えば、コラーゲンやフィブロネクチンなどのECMタンパク質上の細胞伸展の阻害、細胞骨格再構築の阻害、並びにMCSP媒介性シグナル伝達ネットワーク（例えば、FAK及びERKネットワーク）の阻害を含めた抗MCSP抗体の治療的有効性に関与することが知られている。よって、本発明のABMsが、これらの目的のいずれにも使用できる。
【０１０５】
マウス・モノクローナル抗体225.28Sが、悪性メラノーマの放射性免疫検出法に使用された。Buraggiら、Nuklearmedizin 25（6）：220-224ページ（1986年）。最近になって、それは、細菌による可溶性発現のための一本鎖Fv立体配位でクローン化された。Neriら、J. Invest. Dermatol. 107（2）：164-170ページ（1996年）。前記参考文献の全体を本明細書中に援用する。
【０１０６】
キメラ・マウス／ヒト抗体は説明された。例えば、Morrison, S. L.ら、PNAS 11：6851-6854（1984年11月）；欧州特許公開番号第173494号；Boulianna, G. L.ら、Nature 312：642ページ（1984年12月）；Neubeiger, M. S.ら、Nature 314：268ページ（1985年3月）；欧州特許公開番号第125023号；Tanら、J. Immunol. 135：8564（1985年11月）；Sun, L. K.ら、Hybridoma 5（1）：517ページ（1986年）；Sahaganら、J. Immunol. 137：1066-1074ページ（1986年）を参照のこと。一般に、Muron, Nature 312：597ページ（1984年12月）；Dickson、Genetic Engineering News 5（3）（1985年3月）；Marx、Science 229：455ページ（1985年8月）；及びMorrison、Science 229：1202-1207ページ（1985年9月）を参照のこと。
【０１０７】
特に好ましい態様において、本発明のキメラABMはヒト化抗体である。ヒト以外の抗体をヒト化する方法が、当該技術分野で知られている。例えば、本発明のヒト化ABMsは、Winterに対する米国特許番号第5,225,539号；Queenらに対する米国特許番号第6,180,370号；Adairらに対する米国特許番号第6,632,927号；Footeに対する米国特許出願公開番号第2003/0039649号；Satoらに対する米国特許出願公開番号第2004/0044187号；又はLeungらに対する米国特許出願公開番号第2005/0033028号の方法に従って調製されてもよい。前記文献の内容の全体を本明細書中に援用する。好ましくは、ヒト化抗体は、ヒト以外である起源からそれに導入された1つ以上のアミノ酸残基を持つ。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と呼ばれ、通常、「移入（import）」可変ドメインから得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりに超可変領域を使うことによって、Winter及び共同研究者らの方法（Jonesら、Nature, 321：522-525ページ（1986年）；Riechmannら、Nature, 332：323-327ページ（1988年）；Verhoeyenら、Science, 239：1534-1536ページ（1988年））に従って基本的に実施できる。従って、前述の「ヒト化」抗体は、実質的に、完全にではないがヒト可変ドメインがヒト以外の種からの対応配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許番号第4,816,567号）。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかの超可変部残基、そして、もしかすると、いくつかのFR残基が齧歯動物の抗体内の類似の部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。対象のヒト化抗MCSP抗体は、通常、例えば、IgG1などのヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。
【０１０８】
ヒト化抗体を作る際に使用される、軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を下げるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングされる。齧歯動物のものに最も近いヒト配列が、次に、ヒト化抗体のためのヒト・フレームワーク領域（FR）として受け入れられる（Simsら、J. Immunol. 151：2296ページ（1993年）；Chothiaら、J. Mol. Biol., 196：901ページ（1987年））。ヒト・フレームワーク配列を選択する他の方法は、完全な齧歯動物フレームワークのそれぞれの個々の亜領域の配列（すなわち、FR1、FR2、FR3、及びFR4）、又は上記個々の亜領域のいくつかの組合せ（例えば、FR1とFR2）を、（例えば、Kabatの番号付けで決定される）そのフレームワーク亜領域に相当する公知のヒト可変領域配列のライブラリに対して比較し、そして、齧歯動物のものに最も近い各亜領域又は組合せのためにヒト配列が選択される（2003年2月27日に公開されたLeungの米国特許出願公開番号第2003/0040606A1号）（上記文献の内容の全体を本明細書中に援用する）。他の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体の共通配列から得られた特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークが、いくつかの異なったヒト化抗体に使用できる（Carterら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285ページ（1992年）；Prestaら、J. Immunol., 151：2623ページ（1993年））（上記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する）。
【０１０９】
抗体が抗原に対する高い親和性、及び他の好ましい生物的性質の維持を伴ってヒト化されることが更に重要である。この目標を達成するために、適切な方法に従って、ヒト化抗体が、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列と様々な概念的なヒト化生成物の分析過程によって調製される。三次元的な免疫グロブリン・モデルは、当業者にとって身近なコンピュータ・プログラムを使用することで作り出されることができる（例えば、InsightII、accelrys inc（former.MSI）、又はSchwedeら、Nucleic Acids Res. 2003年（13）：3381-3385ページによって説明されるhttp：//swissmodel.expasy.org/にて）。これらのモデルの検討は、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の予想される役割の分析、すなわち、抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、FR残基は、例えば、標的抗原に対する維持された親和性などの所望の抗体特性が獲得されるように、受容配列及び移入配列から選択され、そして、組み合わせられることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的、且つ、最も実質的に関与する。特定の態様において、本発明のABMは、46位（Kabat）にプロリンを持つ抗体軽鎖の可変領域を含む。他の態様において、本発明のABMは、27位のフェニルアラニン残基、30位のセリン残基、又は94位のセリン若しくはトレオニン残基の1種類以上を持つ抗体重鎖の可変領域を含む。これらの残基は、特定の軽鎖若しくは重鎖の可変領域内に天然に存在するかもしれず、又はアミノ酸置換によって導入されるかもしれない。
【０１１０】
1つの態様において、本発明の抗体はヒトFc領域を含む。特定の態様において、ヒト定常領域は、配列番号109及び110に記載の、且つ、以下に記載のIgG1である：
【０１１１】
【表６】
2008533985.tif 000007
【０１１２】
【表７】
2008533985.tif 000008
【０１１３】
しかしながら、ヒトFc領域の変異体及びアイソフォームもまた、本発明によって網羅される。例えば、本発明における使用に好適な変異型Fc領域は、Prestaに対する米国特許番号第6,737,056号（1つ以上のアミノ酸修飾によって変更されたエフェクター機能を有するFc領域変異体）；又はは米国特許出願番号第60/439,498号；同第60/456,041号；同第60/514,549号；若しくはWO 2004/063351（アミノ酸修飾により増強された結合親和性を有する変異型Fc領域）；又は米国特許番号第10/672,280若しくはWO 2004/099249（アミノ酸修飾によりFcγRに対する変更された結合性を有するFc変異体）において教示された方法に従って製造されてもよい。前記文献それぞれの内容全体を本明細書中に援用する。
【０１１４】
他の態様において、本発明の抗原結合分子は、例えば、Balintらに対する米国特許出願公開番号第2004/0132066号の中で開示された方法、に従って結合親和性を増強するように操作される。前記文献の内容全体を本明細書中に援用する。
【０１１５】
1つの態様において、本発明の抗原結合分子は、例えば、放射標識又は毒素などの追加部分に結合させる。前述の複合ABMsは、当該技術分野で周知の多数の方法によって製造されることができる。
【０１１６】
様々な放射性核種が、本発明に適用可能であり、そして、当業者は、どの放射性核種が様々な状況下で最も適切であるか容易に判断する能力があると考えられている。例えば、131ヨウ素は、標的化免疫療法に使用される周知の放射性核種である。しかしながら、131ヨウ素の臨床有用性は、以下の：8日間の物理的半減期；血液及び腫瘍部位におけるヨウ化抗体の脱ハロゲン反応；並びに腫瘍における局所的な線量堆積に関して準最適になる場合がある発光特徴（例えば、高いγ成分）、を含めたいくつかの要因によって制限される可能性がある。優れたキレート剤の出現により、タンパク質への金属キレート基の取り付の機会は、例えば、111インジウムや90イットリウムなどの他の放射性核種を利用する機会を増やした。90イットリウムは、放射免疫療法応用における利用に関するいくつかの利益を提供する：90イットリウムの64時間の半減期は腫瘍による抗体蓄積が十分に長く、且つ、例えば、131ヨウ素とは違って、90イットリウムは100〜1000細胞直径の組織の範囲に及ぶ、崩壊において付随のγ線照射のない高いエネルギーの純粋なβ放射体である。更に、透過性放射線照射の最少量は、90イットリウム標識抗体の外来患者投与を可能にする。加えて、標識抗体の内在化が細胞殺滅のために必要とされず、そして、電離放射線の局所的な放出が、標的抗原を欠いた隣接する腫瘍細胞に対して致死的であるはずである。
【０１１７】
放射性標識抗MCSP抗体に関して、それと共に、療法は、また、たった1種類の治療処置を使用してか、又は複数の治療を使用して生じてもよい。放射性核種成分のため、治療前に、末梢血幹細胞（「PSC」）又は骨髄（「BM」）が放射線照射によってもたらされる可能性のある致死的な骨髄毒性を経験した患者について「採集」されることが好ましい。BM、及び／又はPSCは、標準的な技術を使用して採集され、次に、浄化され、そして、予定される再注入のために冷凍される。加えて、治療前に、診断用標識抗体を使用した（例えば、111インジウムを使用した）診断用線量測定研究が患者で行われることが最も好ましく、その目的は（例えば、90イットリウムを使用した）治療のための標識抗体がいずれかの正常な臓器若しくは組織内に不必要に「濃縮される」ようにならないことを保証することである。
【０１１８】
好ましい態様において、本発明は、以下の表7中のアミノ酸配列（配列番号2〜52の偶数番）を持つポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドに向けられる。本発明は、更に、以下の表6中に示されるヌクレオチド配列（配列番号1〜51の奇数番）と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一の配列を含む単離された核酸に向けられる。他の態様において、本発明は、表7中のアミノ酸配列（配列番号2〜52の偶数番）と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸に向けられる。本発明は、また、保存アミノ酸置換を伴った、表7中のいずれかの構築物のアミノ酸配列（配列番号2〜52の偶数番）を持つポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸をも網羅する。
【０１１９】
【表８】
2008533985.tif 000009
【０１２０】
【表９】
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【０１２１】
【表１０】
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【０１２２】
【表１１】
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【０１２３】
【表１２】
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【０１２４】
【表１３】
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【０１２５】
【表１４】
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【０１２６】
【表１５】
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【０１２７】
【表１６】
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【０１２８】
【表１７】
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【０１２９】
【表１８】
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【０１３０】
【表１９】
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【０１３１】
他の態様において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを1種類以上含む発現ベクター、及び／又は宿主細胞に向けられる。
【０１３２】
一般に、あらゆるタイプの培養細胞系が、本発明のABMを発現するのに使用できる。好ましい態様において、HEK293-EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、ハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作した宿主細胞を作り出すためのバックグラウンド細胞株として使用される。
【０１３３】
本発明のABMsの治療的有効性は、以下の：GnTm活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ManII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；又はGalT活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、の1種類以上を更に発現する宿主細胞内でそれらを産生することによって高められる可能性がある。好ましい態様において、宿主細胞は、GnTIII活性又はManII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。他の好ましい態様において、宿主細胞は、GnTIII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにManII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。更に他の好ましい態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは、ゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。他の好ましい態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞における本発明のABMsの発現は、増強されたFc受容体結合親和性と増強されたエフェクター機能を有するABMsをもたらす。従って、1つの態様において、本発明は、（a）GnTIII活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸；及び（b）例えば、ヒトMCSPに結合するキメラ、霊長類化、又は、ヒト化抗体などの本発明のABMをコードする単離されたポリヌクレオチド、を含む宿主細胞に向けられる。好ましい態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは、GnTIIIの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドであり、そして、ゴルジ体局在化ドメインは、マンノシダーゼIIの局在化ドメインである。そのような融合ポリペプチドを作り出し、そして、増強されたエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用する方法は、米国特許仮出願番号第60/495,142号及び米国特許出願公開番号第2004/0241817 A1の中に開示されている。前記文献のそれぞれの内容全体を明確に本明細書中に援用する。他の好ましい態様において、キメラABMは、マウス225.28Sモノクローナル抗体の結合特異性を有するキメラ抗体又はそのフラグメントである。特に好ましい態様において、キメラ抗体はヒトFcを含む。他の好ましい態様において、抗体は、霊長類化されるか、又はヒト化される。
【０１３４】
代替の態様において、本発明のABMsは、少なくとも1種類のフコシルトランスフェラーゼの活性が減少、抑制、又は排除されるように操作された宿主細胞内でそれらを産生することによって高められるかもしれない。
【０１３５】
1つの態様において、本発明のABMをコードする1つ又はいくつかのポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、又は選択的に、調節された発現系の制御下で発現されるかもしれない。好適な調節された発現系には、これだけに制限されることなく、テトラサイクリン調節性発現系、エクジソン誘導性発現系、lacスイッチ発現系、グルココルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系、及びメタロチオネイン金属誘導性発現系が含まれる。本発明のABMをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、それらのいくつかが構成的プロモーターの制御下で発現されるかもしれないが、他のものは調節されたプロモーターの制御下で発現される。最大発現レベルは、細胞増殖速度に重大な悪影響を持たない可能な限り高いレベルの安定したポリペプチド発現であると見なされ、日常的な実験を使用することで測定される。発現レベルは、一般に、ABMに特異的な抗体又はABMに融合させたペプチド・タグに特異的な抗体を使用したウエスタンブロット分析；及びノーザンブロット分析を含めた当該技術分野で知られている方法によって測定される。更なる代替方法において、ポリヌクレオチドは、作動できるようにレポーター遺伝子に連結されるかもしれない。マウス225.28Sモノクローナル抗体と同じ結合特異性を実質的に有するキメラABMの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルに関連するシグナルを計測することによって測定される。レポーター遺伝子は、1つのmRNA分子として前記融合ポリペプチドをコードする核酸と一緒に転写されるかもしれず；それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（IRES）又はキャップ非依存的翻訳エンハンサ（CITE）のいずれかによって連結されるかもしれない。レポーター遺伝子は、1つのポリペプチド鎖が形成されるように、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMをコードする少なくとも1種類の核酸と一緒に転写されるかもしれない。本発明のABMsをコードする核酸は、融合ポリペプチドとレポーター遺伝子をコードする核酸が、2つの別々のメッセンジャーRNA（mRNA）分子；得られたmRNAの一方が上記レポーター・タンパク質に翻訳され、そして、もう一方が上記融合ポリペプチドに翻訳される、に選択的スプライシングされるRNA分子に転写されるように、1つのプロモーターの制御下でレポーター遺伝子に作動できるように連結されるかもしれない。
【０１３６】
当業者に周知の方法が、適切な転写／翻訳調節シグナルに加えてマウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するABMのコード配列を含む発現ベクターを構築するのに使用できる。これらの方法には、試験管内における組み換えDNA技術、合成技術、及び生体内における組み換え／遺伝的組み換えが含まれる。例えば、Maniatisら、MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.（1989年）及びAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Merscience, N.Y（1989年）中に記載の技術を参照のこと。
【０１３７】
様々な宿主発現ベクター系が、本発明のABMsのコード配列を発現するのに利用されるかもしれない。好ましくは、哺乳動物細胞が、注目のタンパク質のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組み換えプラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として使用される。最も好ましくは、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、若しくはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、宿主細胞系として使用される。発現系及び選択法のいくつかの例は、以下の参考文献及びそれらの中の参考文献：Borthら、Biotechnol. Bioen. 71（4）：266-73ページ（2000-2001年）、Wernerら、Arzneimittelforschung/Drug Res. 48（8）：870-80ページ（1998年）、Andersen及びKrummen、Curr. Op. Biotechnol. 13：117-123ページ（2002年）、Chadd及びChamow、Curr. Op. Biotechnol. 12：188-194ページ（2001年）、並びにGiddings、Curr. Op. Biotechnol. 12：450-454ページ（2001年）中に記載されている。代替の実施例において、例えば、米国特許出願番号第60/344,169号及びWO 03/056914（ヒト以外の真核生物宿主細胞内でのヒト様糖タンパク質の製造方法）（上記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する）中に教示された発現系などの本発明のABMのコード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞；マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMのコード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；これだけに制限されることなく、米国特許番号第6,815,184号（遺伝子操作された浮き草からの生物学的に活性なポリペプチドの発現及び分泌のための方法）で教示された発現系を含めた、本発明のABMのコード配列を含む、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、CaMV；タバコ・モザイク・ウイルス、TMV）を感染させたか、又は組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された植物細胞系；WO 2004/057002（グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の導入によるコケ植物類の植物細胞におけるグリコシル化タンパク質の産生）及びWO 2004/024927（コケのプロトプラストにおける細胞外での異種非植物タンパク質の産生方法）；並びに米国特許出願番号第60/365,769号、同第60/368,047号、及びWO 2003/078614（機能的な哺乳動物GnTIII酵素を含むトランスジェニック植物における糖タンパク質プロセシング）（上記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する）；又は、二重微小染色体（例えば、マウス細胞株）内で安定的な増幅されるか（CHO/dhfr）又は不安定的な増幅されるかのいずれかの、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMをコードするDNAの多重コピーを含むように操作された細胞株を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、を含めた他の真核生物宿主細胞系が使用されるかもしれない。1つの態様において、本発明のABMをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリシストロン性である。1つの態様において、先に議論したABMは、また、抗体又はそのフラグメントである。好ましい態様において、ABMはヒ���化抗体である。
【０１３８】
本願発明の方法について、安定的な発現は、通常、より再現性のある結果を実現し、そして、また、大量産生にも受け入れられるので、一過性の発現よりも一般に好まれるが、一過性の発現もまた本発明によって網羅される。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）によって制御されるそれぞれのコード核酸、及び選択マーカーで形質転換されてもよい。外来DNAの導入に続いて、操作された細胞は、富栄養培地中で1〜2日間、培養され、次に、選択培地に切り換えられるかもしれない。組み換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、そして、それらの染色体内にプラスミドを安定して組み込み、そして、次々に細胞株内にクローン化され、拡大される病巣を形成するために増殖する細胞の選択を可能にする。
【０１３９】
これだけに制限されることなく、tk、hgprt、及びaprt細胞のそれぞれで利用されることができる、単純ヘルペス・ウイルス・チミジンキナーゼ（Wiglerら、Cell 11：223ページ（1977年））、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48：2026ページ（1962年））、及びアデニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、Cell 22：817ページ（1980年））を含めた多くの選択系が、使用されるかもしれない。また、代謝拮抗剤抵抗性が、メトトレキサートに対する抵抗性を与えるdhfr（Wiglerら、Natl. Acad. Sci. USA 77：3567ページ（1989年）；O'Hareら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：1527ページ（1981年））；ミコフェノール酸に対する抵抗性を与えるgpt（Mulligan & Berg、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2012ページ（1981年））；アミノグリコシドG-418に対する抵抗性を与えるneo（Colberre-Garapinら、J. Mol. Biol. 150：1ページ（1981年））；及びハイグロマイシンに対する抵抗性を与えるhygro（Santerreら、Gene 30：147ページ（1984年））の遺伝子に関する選定基準として使用されてもよい。最近、更なる選択遺伝子、すなわち、細胞がトリプトファンに代わってインドールを利用することを可能にするtrpB；細胞がヒスチジンに代わってヒスチノールを利用することを可能にするhisD（Hartman & Mulligan、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55：8047ページ（1988年））；グルタミン・シンターゼ系；及びオルニチン・デカルボキシラーゼ阻害剤、2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに対する抵抗性を与えるODC（オルニチン・デカルボキシラーゼ）（McConlogue, in：Current Communications in Molecular Biology、Cold Spring Harbor Laboratory編（1987年））が説明された。
【０１４０】
本発明は、更に、宿主細胞によって産生される本発明のABMsのグリコシル化特徴の修飾方法であって、本発明のABMをコードする核酸とGnTIII活性を有するポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸を含むベクターを上記宿主細胞において発現するステップを含む前記方法に向けられる。好ましくは、修飾ポリペプチドは、Fc領域を含むIgG又はそのフラグメントである。特に好ましい態様において、ABMは、ヒト化抗体又はそのフラグメントである。あるいは又は加えて、そのような宿主細胞は、少なくとも1つのフコシルトランスフェラーゼの活性が削減、抑制、又は排除されるように操作されるかもしれない。他の態様において、宿主細胞は、本発明のABM、GnTIII、及びマンノシダーゼII（ManII）を同時発現するように操作される。
【０１４１】
本発明の宿主細胞によって産生される修飾されたABMsは、修飾の結果として、増強されたFc受容体親和性、及び／又は増強されたエフェクター機能を示す。特に好ましい態様において、ABMは、Fc領域を含むヒト化抗体又はそのフラグメントである。好ましくは、増強されたFc受容体結合親和性は、例えば、FcγRIIIa受容体などのFcγ活性化受容体への結合が増強される。増強されたエフェクター機能は、好ましくは、以下の：増強された抗体依存性細胞傷害性、増強された抗体依存性細胞食作用（ADCP）、増強されたサイトカイン分泌、抗原提示細胞による増強された免疫複合体媒介性抗原取り込み、増強されたFc媒介性細胞傷害性、増強されたNK細胞への結合、増強されたマクロファージへの結合、増強された多形核細胞（PMNs）への結合、増強された単球への結合、標的結合抗体の増強された架橋、アポトーシスを誘導する増強された直接的なシグナル伝達、増強された樹状細胞の成熟、及び増強されたT細胞の初回刺激、の1つ以上の増強である。
【０１４２】
エフェクター機能は、当業者に知られている様々なアッセイによって計測、及び／又は測定されることができる。Fc受容体結合親和性及び補体依存性細胞傷害性を含めたエフェクター機能を測定するための様々なアッセイは、米国特許出願公開番号第2004/0241817A1中に記載されている。前記文献の全体を本明細書中に援用する。サイトカイン分泌は、例えば、サンドイッチELISA法、例えば、McRaeら、J. Immunol. 164：23-28ページ（2000年）及びwww.bdbioscisnces.com/phamingen/protocolsにて入手可能なサイトカイン・サンドイッチELISA法のプロトコールを参照のこと、を使用するか、あるいは、Takahashiら、British J. Pharmacol. 137：315-322ページ（2002年）に記載の方法によって計測されることができる。前記文献のそれぞれの全体を本明細書中に援用する。樹状細胞の成熟は、例えば、Kalergis及びRavetch、J. Exp. Med. 195；1653-59ページ（2002年）によって記載されるアッセイを使用することで測定できる。前記文献の全体を本明細書中に援用する。食作用、及び抗原取り込み／提示のアッセイの例は、Greshamら、J. Exp. Med. 191：515-28ページ（2000年）；Kraussら、J. Immunol. 153：1769-77ページ（1994年）；Rafiqら、J. Clin. Invest. 110：71-79ページ（2002年）、及びHamanoら、J. Immunol. 164：6113-19ページ（2000年）によって提供される。前記文献の全体を本明細書中に援用する。細胞表面受容体の下方制御は、例えば、Liaoら、Blood 83：2294-2304ページ（1994年）によって記載された方法によって計測されることができる。前記文献の全体を本明細書中に援用する。一般的な方法、プロトコール、及びアッセイは、CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK、Celis, J. E.編（第2版、1998年）の中に見ることができる。前記文献の全体を本明細書中に援用する。本発明による使用のための先に参照された方法、プロトコール、及びアッセイを適合させることは、当業者の技能の範疇である。
【０１４３】
本発明は、また、宿主細胞において、修飾されたオリゴ糖を持つ本発明のASMを産生する方法であって、以下のステップ：（a）本発明によるABMの産生を許容する条件下、GnTIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1種類の核酸を発現するように操作された宿主細胞を培養し、ここで、GnTIII活性を有する上記ポリペプチドは、上記宿主細胞によって産生された上記ABMのFc領域内のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現され；そして、（b）上記ABMを単離する、を含む前記方法に向けられる。好ましい態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは、GnTIIIの触媒領域を含む融合ポリペプチドである。特に好ましい態様において、融合ポリペプチドは、更に、ゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む。
【０１４４】
好ましくは、前記ゴルジ体局在化ドメインは、ヒト・マンノシダーゼII又はヒトGnTIの局在化ドメインである。あるいは、前記ゴルジ体局在化ドメインは、以下の：マンノシダーゼIの局在化ドメイン、GnTIIの局在化ドメイン、及びα1-6コア・フコシルトランスフェラーゼの局在化ドメイン、から成る群から選択される。本発明の方法によって産生されるABMsは、増強されたFc受容体結合親和性、及び／又は増強されたエフェクター機能を有した。好ましくは、増強されたエフェクター機能は、以下の：（増強された抗体依存性細胞傷害性を含めた）増強されたFc媒介性細胞傷害性、増強された抗体依存性細胞食作用（ADCP）、増強されたサイトカイン分泌、増強された、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、増強されたNK細胞への結合、増強されたマクロファージへの結合、増強された単球への結合、増強された多形核細胞への結合、増強された、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達、増強された標的−結合抗体の架橋、増強された樹状細胞の成熟、又は増強されたT細胞の初回刺激、の1種類以上である。増強されたFc受容体結合親和性は、好ましくは、例えば、FcγRIIIaなどのFc活性化受容体への増強された結合である。特に好ましい態様において、ABMは、ヒト化抗体又はそのフラグメントである。
【０１４５】
他の態様において、本発明は、そのポリペプチドのFc領域内の分枝オリゴ糖の比率が高められた、本発明の方法によって作り出されたマウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMに向けられる。そのようなABMはFc領域を含む抗体及びそのフラグメントを網羅することが想定される。好ましい態様において、ABMはヒト化抗体である。1つの態様において、ABMのFc領域内の分枝オリゴ糖のパーセンテージは、総オリゴ糖の少なくとも50%、より好ましくは、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%、そして、最も好ましくは、少なくとも90〜95%である。更に他の態様において、本発明の方法によって産生されたABMは、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果としてFc領域内の非フコシル化オリゴ糖の比率が高められた。1つの態様において、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも50%、好ましくは、少なくとも60%〜70%、最も好ましくは、少なくとも75%である。前記非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド型又は複合型のものであるかもしれない。特に好ましい態様において、本発明の宿主細胞及び方法によって産生されたABMは、Fc領域内の分枝、非フコシル化オリゴ糖の比率が高められた。前記分枝、非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッド又は複合であるかもしれない。具体的には、ABMのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも15%、より好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも25%、より好ましくは、少なくとも30%、より好ましくは、少なくとも35%が分岐し、フコシル化されない本発明の方法が、ABMsを産生するために使用されるかもしれない。本発明の方法は、また、ポリペプチドのFc領域内のオリゴ糖の少なくとも15%、より好ましくは、少なくとも20%、より好ましくは、少なくとも25%、より好ましくは、少なくとも30%、より好ましくは、少なくとも35%が、分枝し、ハイブリッド非フコシル化されるポリペプチドを産生するためにも使用できる（図10において、「複合」、「複合分枝」、及び「ハイブリッド」オリゴ糖の命名法で記載されている）。
【０１４６】
他の態様において、本発明は、本発明の方法によって作り出された、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有し、且つ、増強されたエフェクター機能、及び／又は増強されたFc受容体結合親和性を有するように操作されたキメラABMに向けられる。好ましくは、前記の増強されたエフェクター機能は、以下の：（増強された抗体依存性細胞傷害性を含めた）増強されたFc媒介性細胞傷害性、増強された抗体依存性細胞食作用（ADCP）、増強されたサイトカイン分泌、増強された抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、増強されたNK細胞への結合、増強されたマクロファージへの結合、増強された単球への結合、増強された多形核細胞への結合、増強された、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達、増強された標的−結合抗体の架橋、増強された樹状細胞の成熟、又は増強されたT細胞の初回刺激、の1つ以上である。好ましい態様において、増強されたFc受容体結合親和性は、増強されたFc活性化受容体、最も好ましくは、FcγRIIIaへの結合である。1つの態様において、ABMは、抗体、Fc領域を含む抗体フラグメント、又は免疫グロブリンのFc領域と同等である領域を含む融合タンパク質である。特に好ましい態様において、ABMはヒト化抗体である。
【０１４７】
本発明は、更に、本発明のABMsと、医薬として許容される担体を含む医薬組成物に向けられる。
【０１４８】
本発明は、更に、癌の治療方法における前述の医薬組成物の使用に向けられる。具体的には、本発明は、治療的有効量の本発明の医薬組成物を投与するステップを含む癌の治療方法に向けられる。
【０１４９】
更に他の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、特に癌の治療若しくは予防における使用のための、又は前癌状態の症状又は病巣における使用のための本発明によるABMに関する。前記癌は、例えば、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、ブロンチオアルビオラル（bronchioalviolar）細胞肺癌、骨肉癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頚部の癌、皮膚又は眼内メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚癌、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓又は輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性又は急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄の軸の腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣細胞腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、脳下垂体腺腫であるか、上記の癌のいずれかの難治性のバージョンを含むか、又は上記の癌の1種類以上の組合せであるかもしれない。前癌状態の症状又は病巣には、例えば、口腔白斑、光線性角化症（日光角化症）、結腸若しくは直腸の前癌状態のポリープ、胃上皮異形成、腺腫性の異形成、遺伝性非ポリポーシス大腸癌症候群（HMPCC）、バーレット食道、膀胱異形成、又は前癌状態の頚部病態から成る群が含まれる。
【０１５０】
好ましくは、前記癌は、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎癌、及び脳腫瘍から成る群から選択される。
【０１５１】
更に他の態様は、癌の治療又は予防用の医薬品の製造における本発明によるABMの使用である。癌は先に規定されるとおりのものである。
【０１５２】
好ましくは、前記癌は、乳癌、膀胱癌、頭頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎癌、及び脳腫瘍から成る群から選択される。
【０１５３】
同様に、好ましくは、前記抗原結合分子は、約1.0mg/kg〜約15mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５４】
同様に、より好ましくは、前記抗原結合分子は、約1.5mg/kg〜約12mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５５】
同様に、より好ましくは、前記抗原結合分子は、約1.5mg/kg〜約4.5mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５６】
同様に、より好ましくは、前記抗原結合分子は、約4.5mg/kg〜約12mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５７】
最も好ましくは、前記抗原結合分子は、約1.5mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５８】
同様に、最も好ましくは、前記抗原結合分子は、約4.5mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１５９】
同様に、最も好ましくは、前記抗原結合分子は、約12mg/kgの治療的有効量で使用される。
【０１６０】
本発明は、更に、増強されたFc受容体結合親和性、好ましくは、増強されたFc活性化受容体への結合、及び／又は増強された、抗体依存性細胞傷害性を含めたエフェクター機能を有する、本発明のABMsのグリコフォームの産生のための宿主細胞系の製造及び使用の方法を提供する。本発明のABMsと一緒に使用できる糖操作方法論は、米国特許番号第6,602,684号、米国特許出願公開番号第2004/0241817 A1号、同第2003/0175884 A1号、米国特許仮出願番号第60/441,307号、及びWO 2004/065540中で更に詳細に記載されている。前記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する。本発明のABMsは、あるいは、米国特許出願公開番号第2003/0157108（Genentech）、又はEP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119、及び米国特許出願公開番号第2003/0115614、同第2004/093621号、同第2004/110282号、同第2004/110704号、同第2004/132140号（全てKyowa Hakko Kogyo Ltd.に対する）の中で開示された技術に従ってFc領域内のフコース残基が減少するように糖操作されてもよい。前記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する。本発明の糖操作されたABMsは、また、例えば、米国特許出願公開番号第60/344,169号及びWO 03/056914（GiycoFi, Inc.）、又はWO 2004/057002及びWO 2004/024927（Greenovation）の中で教示されているものなどの修飾糖タンパク質を産生する発現系で作り出されるかもしれない。前記文献のそれぞれ内容全体を本明細書中に援用する。
【０１６１】
修飾されたグリコシル化パターンを持つタンパク質の産生のための細胞株の製造
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを持つ本発明のABMsの製造のための宿主細胞発現系を提供する。特に、本発明は、改善された治療的価値を有する本発明のABMsのグリコフォームの製造のための宿主細胞系を提供する。それ故に、本発明は、GnTIII活性を有するポリペプチドを発現するように選択されるか、又は操作された宿主細胞発現系を提供する。1つの態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。具体的には、そのような宿主細胞発現系は、構成的又は調節されたプロモーター系に作動できるように連結された、GnTIIIを持つポリペプチドをコードする組み換え核酸分子を含むように操作されるかもしれない。
【０１６２】
1つの特定の態様において、本発明は、GnTIII活性を有し、且つ、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するように操作された宿主細胞を供給する。1つの側面において、宿主細胞は、GnTIII活性を有し、且つ、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を含む核酸分子で操作される。
【０１６３】
一般に、先に議論した細胞株を含めた、あらゆるタイプの培養細胞系が、本発明の宿主細胞株を操作するためのバックグラウンドとして使用される可能性がある。好ましい態様において、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、若しくはハイブリドーマ細胞、他の哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は植物細胞が、本発明の操作された宿主細胞を製造するためのバックグラウンド細胞株として使用される。
【０１６４】
本発明は、本明細書中に規定される異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドを含む、GnTIII活性を有するポリペプチドを発現するあらゆる操作された宿主細胞を網羅することが想定される。
【０１６５】
GnTIII活性を有するポリペプチドをコードする1つ又はいくつかの核酸が、構成的プロモーター、又は選択的に、調節された発現系の制御下で発現されるかもしれない。そのような系は、当該技術分野で周知であり、そして、先に議論した系を含んでいる。GnTIII活性を有し、且つ、異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合に、それらのいくつかが、構成的プロモーターの制御下で発現されるかもしれない一方で、その他のものは調節されたプロモーターの制御下で発現される。GnTIII活性を有する融合ポリペプチドの発現レベルは、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、レポーター遺伝子発現分析、又はGnTIII活性の測定を含めた当該技術分野で一般に知られている方法によって測定される。あるいは、GnTIIIの生合成生成物に結合するレクチンが利用されるかもしれない、例えば、E4-PHAレクチン。あるいは、GnTIII活性を有するポリペプチドをコードする核酸で操作された細胞によって産生された抗体によって媒介される増強されたFc受容体結合、又は増強されたエフェクター機能を計測する機能アッセイが使用されるかもしれない。
【０１６６】
修飾されたグリコシル化パターンを持つタンパク質を発現する形質移入体又は形質転換体の識別
マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMのコード配列を含み、且つ、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般的なアプローチ；（a）DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション；（b）「マーカー」遺伝子機能の存在又は不存在；（c）宿主細胞におけるそれぞれのmRNA転写物の発現によって計測される転写レベルの評価；及び（d）免疫学的アッセイ又はその生物活性によって計測される遺伝子産物の検出、によって識別されるかもしれない。
【０１６７】
第1のアプローチでは、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラABMのコード配列と、GnTIII活性を有するポリペプチドのコード配列の存在は、個々に、それぞれのコード配列に相同であるヌクレオチド配列、その部分若しくは誘導体を含むプローブを使用したDNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーションによって検出されることができる。
【０１６８】
第2のアプローチでは、組み換え発現ベクター／宿主系が、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジン・キナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレキサートに対する抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスによる閉塞形成など）の存在又は不存在に基づいて識別、そして、選択されることができる。例えば、本発明のABMのコード配列、及びそのフラグメント、又はGnTIII活性を有するポリペプチドのコード配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合に、それぞれのコード配列を含む遺伝子組み換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在によって識別されることができる。あるいは、マーカー遺伝子は、コード配列の発現を制御するために使用される同じ又は異なるプロモーターの制御下、コード配列と直列に配置されてもよい。誘導又は選択に対して応答したマーカーの発現は、本発明のABMのコード配列、及びGnTIII活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を示す。
【０１６９】
第3のアプローチでは、本発明のABMのコード領域、又はそのフラグメント、及びGnTIII活性を有するポリペプチドのコード配列の転写活性は、ハイブリダイゼーション・アッセイによって評価されることができる。例えば、RNAは、本発明のABMのコード配列、又はそのフラグメント、及びGnTIII活性を有するポリペプチドのコード配列、又はその特定の部分に相同であるプローブを使用したノーザンブロットによって単離され、そして、分析されることができる。あるいは、宿主細胞の全核酸が、抽出され、そして、前述のプローブに対するハイブリダイゼーションに関してアッセイされてもよい。
【０１７０】
第4のアプローチでは、タンパク質産物の発現は、例えば、ウエスタンブロット、放射性免疫沈降、酵素結合免疫学的アッセイなどの免疫学的アッセイによって免疫学的に評価されることができる。しかしながら、発現系の成功の最終試験は、生物学的に活性な遺伝子産物の検出を伴う。
【０１７１】
抗体依存性細胞傷害性を含めた増強されたエフェクター機能を有するABMsの製造及び使用
好ましい態様において、本発明は、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有し、且つ、抗体依存性細胞傷害性を含めた増強されたエフェクター機能を有するキメラABMsのグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化操作は、先に説明された。例えば、その全体が本明細書中に援用される、米国特許番号第6,602,684号を参照のこと。
【０１７２】
何らかのタイプの癌の治療用の非結合モノクローナル抗体（mAbs）の臨床試験は、最近、後押しする結果をもたらした。Dillman、Cancer Biother. & Radiopharm. 12：223-25ページ（1997年）；Deoら、Immunology Today 18：127ページ（1997年）。キメラ、非結合IgG1は、低い悪性度又は濾胞性B細胞非ホジキン・リンパ腫に関して承認された。Dillman、Cancer Biother. & Radiopharm. 12：223-25ページ（1997年）。そのうえ、他の非結合mAbである固形乳房腫瘍を標的とするヒト化IgG1は、また、第III相臨床試験においても有望な結果を示した。Deoら、Immunology Today 18：121ページ（1997年）。これらの2つのmAbの抗原は、それらのそれぞれの腫瘍細胞において高度に発現され、そして、その抗体は、試験管内及び生体内においてエフェクター細胞による強力な腫瘍崩壊を媒介する。対照的に、すばらしい腫瘍特異性を有する他の多くの非結合mAbsは、臨床的に有用である十分な効力のエフェクター機能の引き起こすことができない。Frostら、Cancer 80：317-33ページ（1997年）；Surfusら、J. Immunother. 19：184-91ページ（1996年）。これらのいくつかのより弱いmAbに関して、付加サイトカイン療法が、現在、試験されている。サイトカインの付加は、循環リンパ球の活性及び数を増強することによって抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を刺激できる。Frostら、Cancer 80：317-33ページ（1997年）；Surfusら、J. Immunother. 19：184-91ページ（1996年）。ADCC、抗体標的細胞に対する溶解性攻撃は、抗体の定常領域（Fc）への白血球受容体の結合により引き起こされる。Deoら、Immunology Today 18：127ページ（1997年）。
【０１７３】
非結合IgG1のADCC活性を増強するための異なった、しかし、補完的なアプローチは、抗体のFc領域を操作することである。タンパク質操作の研究は、FcγRがIgG分子のヒンジ領域と主に相互作用することを示した。Lundら、J. Immunol. 157：4963-69ページ（1996年）。しかしながら、FcγR結合は、また、CH2領域内の保存されたAsn297に共有結合したオリゴ糖の存在も必要とする。Lundら、J. Immunol. 157：4963-69ページ（1996年）；Wright及びMorrison、Trends Biotech. 15：26-31ページ（1997年）は、オリゴ糖とポリペプチドが共に相互作用部位に直接的に関与すること、又は活性なCH2ポリペプチド立体構造を維持するためにオリゴ糖が必要とされることを示唆する。オリゴ糖構造の修飾は、それ故に、相互作用の親和性を増強する手段として検討される。
【０１７４】
IgG分子は、Fc領域のそれぞれの重鎖に1つずつで2つのN結合型オリゴ糖を保有する。いずれかの糖タンパク質として、抗体は、同じポリペプチド骨格を共有するグリコフォーム集団として産生されるが、グリコシル化部位に取り付けられた異なるオリゴ糖を持つ。通常、血清IgGのFc領域内に見られるオリゴ糖は、低レベルの末端シアル酸及び二分岐N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、並びに様々な程度の末端ガラクトシル化及びコア・フコシル化を持つ、複合二分枝タイプのものである（Wormaldら、Biochemistry 36：130-38ページ（1997年））。いくつかの研究が、FcγR結合に必要とされる最小限の糖鎖構造が、オリゴ糖コア内にあることを示唆している。Lundら、J. Immunol. 157：4963-69ページ（1996年）。
【０１７５】
治療用非結合mAbsの産生のために産業及び学術研究機関において使用されるマウス又はハムスター由来細胞株は、通常、必要なオリゴ糖決定基をFc部位に取り付ける。これらの細胞株において発現されたIgGsは欠いているが、しかしながら、分枝GlcNAcは血清IgGs中に少量、見られる。Lifelyら、Glycobiology 318：813-22ページ（1995年）。対照的に、最近、ラット骨髄腫が産生したヒト化IgG1（CAMPATH-1H）が、いくつかのグリコフォームで分枝GlcNAcを保有するのが観察された。Lifelyら、Glycobiology 318：813-22ページ（1995年）。ラット細胞由来抗体は、標準的な細胞株において産生されたCAMPATH-1H抗体と類似した最大の試験管内ADCC活性に達したが、顕著に低い抗体濃度においてであった。
【０１７６】
CAMPATH抗原は、通常、リンパ腫細胞上に高レベルで存在し、そして、このキメラmAbは、分枝GlcNAcの不存在下で高いADCC活性を有する。Lifelyら、Glycobiohgy 318：813-22ページ（1995年）。N結合型グリコシル化経路において、分枝GlcNAcはGnTIIIによって付加される。Schachter、Biochem. Cell Biol. 64：163-81ページ（1986年）。
【０１７７】
先の研究は、外部的に調節される様式で、異なったレベルのクローンGnTIII遺伝子酵素を発現するように前もって操作された1つの抗体産生CHO細胞系を使用した（Umana, P.ら、Nature Biotechnol. 17：176-180ページ（1999年））。このアプローチは、初めて、GnTIIIの発現と、修飾抗体のADCC活性との厳密な相関関係をはっきりさせた。よって、本発明は、増強されたGnTIII活性から生じる変更されたグリコシル化を持ち、マウス225.28Sモノクローナル抗体の結合特異性を有する、組み換え、キメラ、又は、ヒト化ABM（例えば、抗体）又はそのフラグメントを想定する。増強されたGnTIII活性は、ABMのFc領域内の分枝オリゴ糖のパーセンテージの上昇、並びにフコース残基のパーセンテージの低下をもたらす。この抗体、又はそのフラグメントは、増強されたFc受容体結合親和性、及び増強されたエフェクター機能を有する。加えて、本発明は、免疫グロブリンのFc領域に相当する領域を含む抗体フラグメント及び融合タンパク質に向けられる。
【０１７８】
本発明の方法により製造されたABMsの治療への応用
最も幅広い意味において、本発明のABMsは、生体内又は試験管内において、MCSPを発現する細胞を標的化するために使用される可能性がある。MCSPを発現する細胞は、診断又は治療的な目的のために標的化されてもよい。1つの側面において、本発明のABMsは、サンプル中のMCSPの存在を検出するために使用されてもよい。他の側面において、本発明のABMsは、例えば、識別又は標的化のために、生体内又は試験管内においてMCSP発現細胞に結合するために使用されてもよい。より特に、本発明のABMsは、MCSPリガンドに結合するMCSPを抑制するか、若しくは遮断するために、あるいは破壊のためにMCSP発現細胞を標的化するために使用されてもよい。1つの態様において、MCSP発現細胞は周皮細胞である。また、本発明のABMsは、メラノーマ細胞の接着と遊走を抑制するために、フィブロネクチンに対する走化性応答を抑制するために、周皮細胞を抑制するために、例えば、コラーゲンやフィブロネクチンなどのECMタンパク質上への細胞伸展を抑制するために、FAK及びECRシグナル伝達ネットワークを抑制するために、並びに表面上にMCSPを発現する細胞におけるMCSP媒介性シグナル伝達を抑制するか又は減少させるために使用されてもよい。
【０１７９】
MCSPは、多くのヒト腫瘍において過剰発現されている。よって、本発明のABMsは、腫瘍形成の予防、腫瘍の根絶、及び腫瘍増殖の抑制において特に有用である。本発明のABMsは、MCSPを発現するあらゆる腫瘍を治療するために使用されることができる。本発明のABMsで治療できる特定の悪性腫瘍には、これだけに制限されることなく、メラノーマ及び腫瘍の血管新生が含まれる。1つの態様において、本発明のABMsは、抗VEGF抗体、又は腫瘍の血管新生を予防するか、抑制するか、若しくは他の手段で治療するための他の抗血管形成抗体と同時投与される。
【０１８０】
本発明のABMsは、生体内において腫瘍細胞を標的化し、そして、殺滅するために単独で使用されてもよい。ABMsは、また、ヒト癌腫を治療するのに適切な治療薬と複合状態で使用されるかもしれない。例えば、ABMsは、例えば、化学療法、放射線照射療法などの標準的又は従来の治療法と組み合わせて使用される可能性があるか、あるいは、治療薬又は毒素、並びに癌腫部位への治療薬のデリバリーのためのリンフォカイン又は腫瘍増殖阻害因子と結合されるか、又は連結される可能性がある。最も重要なことである、本願発明のABMsの複合体は、（1）免疫毒素（ABMと細胞傷害性部分の複合体）及び（2）標識が標識されたABMsを含む免疫複合体を識別するための手段を提供する、標識された（例えば、放射性標識、酵素標識、又は蛍光色素標識）ABMである。ABMsは、また、自然な相補体過程による溶解を誘導し、そして、普通に存在する抗体依存性細胞傷害性細胞と相互作用するために使用されてもよい。
【０１８１】
免疫毒素の細胞傷害性部分は、細胞毒性薬物、細菌又は植物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのような毒素の酵素的に活性フラグメント（「A鎖」）であるかもしれない。使用される酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）からの）外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolacca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、及びエノマイシン（enomycin）である。他の態様において、ABMsは、小分子抗腫瘍薬に結合される。ABMとそのような細胞傷害性部分の複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング試薬を使用しておこなわれる。そのような試薬の例は、SPDP、IT、例えば、ジメチル・アジピミデートHClイミドエステルの二官能性誘導体、例えば、ジスクシンイミジル・スベレートなどの活性エステル、例えば、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなどのビス-アジド化合物、例えば、ビス-（p-ジアゾニウムベンゾイル）-エチレンジアミンなどのビス-ジアゾニウム誘導体、例えば、トリレン2,6-ジイソシアナートなどのジイソシアナート、例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなどのビス-活性フッ素化合物である。毒素の溶解部分は、ABMsのFab断片に接続されるかもしれない。追加的な適切な毒素は、例えば、その全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開番号第2002/0128448号においても分かるように、当該技術分野で知られている。
【０１８２】
1つの態様において、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有するキメラの、糖操作されたABMは、リシンA鎖に結合される。最も有利には、リシンA鎖は、脱グリコシルされ、そして、組み換え手段によって製造される。有利なリシン免疫毒素の作製方法は、本明細書中に援用されるVitettaら、Science 238、1098ページ（1987年）に記載されている。
【０１８３】
診断目的で試験管内においてヒト癌細胞を殺滅するために使用される時、複合体は、通常、少なくとも約10nMの濃度にて細胞培地に加えられる。試験管内における使用に関して製剤及び投与様式は重要でない。培養物又は潅流培地に適合する水性製剤が、通常、使用される。細胞毒性は、癌の存在又は程度を測定するための従来技術によって読み取られるかもしれない。
【０１８４】
先に議論されたように、癌を治療するための細胞傷害性の放射性医薬品が、マウス・モノクローナル抗体と実質的に同じ結合特異性を有する、キメラの、糖操作されたABMに、放射性同位体（例えば、I、Y、Pr）を結合することによって作製されるかもしれない。本明細書中では、用語「細胞傷害性部分」は、そのような同位体を含むものとする。
【０１８５】
他の態様において、リポソームは細胞毒性薬物で満たされ、そして、そのリポソームは本発明のABMsでコーティングされる。多くのMCSP分子がMCSP発現性悪性細胞の表面に存在するので、この方法は、適当な細胞型への大量の薬物のデリバリーを可能にする。
【０１８６】
抗体に前述の治療薬を結合するための技術は周知である（例えば、Arnonら、"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy"、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中、Reisfeldら（編）、243-56ページ（Alan R. Liss, Inc. 1985年）；Hellstromら、"Antibodies For Drug Delivery"、Controlled Drug Delivery（第2版）中、Robinsonら（編）、623-53ページ（Marcel Dekker, Inc. 1987年）；Thorpe、"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review"、Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications中、Pincheraら（編）、475-506ページ（1985年）；及びThorpeら、"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"、Immunol. Rev., 62：119-58ページ（1982年）を参照のこと）。
【０１８７】
本発明のABMsに関する更に他の治療用途は、例えば、組み換えDNA技術による、プロドラッグを細胞毒性薬物に変換できる酵素への結合又は連結、そして、腫瘍部位において上記プロドラッグを細胞毒性薬剤に変換するために、上記プロドラッグと組み合わせた状態でのその抗体−酵素複合体の使用を含む（例えば、Senterら、"Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 55：4842-46ページ（1988年）；"Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates"、Cancer Research 49：5789-5792ページ（1989年）；及びSenter、"Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates：A New Approach to Cancer Therapy"、FASEB J. 4：188-193ページ（1990年）を参照のこと）。
【０１８８】
本発明のABMsに関する更に他の治療的使用は、癌患者の骨髄から腫瘍細胞を取り除くための、相補体の存在下、非複合型で、又は抗体−薬物若しくは抗体−毒素複合体の一部としてのいずれかでの使用を伴う。このアプローチによると、自己骨髄は、抗体で処理し、そして、その骨髄を患者体内に注入して戻すことによって生体外において浄化されることができる［例えば、Ramsayら、"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies"、J. Clin. Immunol. 8（2）：81-88ページ（1988年）を参照のこと］。
【０１８９】
更に、本発明が、マウス225.28Sモノクローナル抗体と実質的に同じ結合の特異性を可能にする抗原結合ドメイン（例えば、マウス225.28Sモノクローナル抗体のCDRを含むポリペプチド）を含み、そして、毒素ポリペプチドを更に含む一本鎖免疫毒素を含むと想定される。本発明の一本鎖免疫毒素は、生体内においてヒト癌腫を治療するために使用されるかもしれない。
【０１９０】
同様に、少なくとも、抗腫瘍活性を有する第2のタンパク質（例えば、リンフォカイン又はオンコスタチン）の機能的活性部分に接続された少なくとも本発明のABMの抗原結合領域を含む融合タンパク質は、生体内においてヒト癌腫を治療するために使用されるかもしれない。
【０１９１】
本発明は、MCSPを発現する腫瘍細胞を選択的に殺滅する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫複合体（例えば、免疫毒素）を前記腫瘍細胞と反応させるステップを含む。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌腫からのものであるかもしれない。
【０１９２】
加えて、本願発明は、生体内における癌腫（例えば、ヒト癌腫）の治療方法を提供する。この方法は、少なくとも本発明の免疫複合体（例えば、免疫毒素）の1種類を含む組成物の医薬的有効量を対象に投与するステップを含む。
【０１９３】
更なる側面では、本発明は、メラノーマを含めた、MCSPが発現されている、特に、MCSPが異常に発現されている（例えば、過剰発現される）細胞増殖障害を治療するための改善された方法であって、それを必要とするヒト対象に、本発明のABMsの治療的有効量を投与するステップを含む前記方法に向けられる。そのうえ、MCSPは活性化された又は不活性な周皮細胞で発現されるので、本発明のABMは、新生血管形成を引き起こすあらゆる腫瘍における血管新生を治療するために使用されることができる。周皮細胞は、内皮細胞と接触し、支持し、そして、新生血管を安定させることもできるので、それらの標的化は、腫瘍誘発性血管新生を抑制するだろう。Ozerdem & Stallcup、Angiogenesis 7（3）：269-76ページ（2004年）；Erberら、FASEB J. 18（2）338-40ページ（2004年2月）；Grakoら、J. Cell Sci. 112：905-915ページ（1999年）；Invanainenら、FASEB J. 17：1609-1621ページ（2003年）。好ましい態様において、ABMは、マウス225.28Sモノクローナル抗体のものと実質的に同じ結合特異性を有する糖操作された抗MCSP抗体である。他の好ましい態様において、抗体はヒト化されている。本発明のABMによって治療できる細胞増殖障害の例には、以下の：腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、神経系（中枢、及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系、にある新生物に制限されることなく含まれる。
【０１９４】
同様に、他の細胞増殖障害もまた、本発明のABMsによって治療できる。そのような細胞増殖障害の例には、これだけに制限されることなく、以下の：高γグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及び先に列挙した臓器系にある新生物以外のあらゆる他の細胞増殖疾患、が含まれる。
【０１９５】
本願発明の実施に従って、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、及びトリの対象であるかもしれない。他の温血動物もまた、本願発明に含まれる。
【０１９６】
当該発明は、更に、ヒト腫瘍細胞の成長を抑制する方法、対象における腫瘍の治療方法、及び対象における増殖型疾患の治療方法を提供する。これらの方法は、本発明のABM組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。
【０１９７】
本発明は、更に、MCSP、若しくは1種類以上のMCSPリガンドの異常な活性化又は産生を特徴とする哺乳動物における非悪性疾患又は障害の治療方法であって、本発明のABMsの治療的有効量を上記哺乳動物に投与するステップを含む前記方法に向けられる。前記対象は、一般に、本発明のABMsが対象体内の細胞に結合することができるほど、例えば、その疾患組織内に、MCSP発現細胞を持っている。
【０１９８】
MCSP、若しくはMCSPリガンドの異常な活性化又は発現は、対象の細胞において、例えば、対象の疾患組織において、起こるかもしれない。MCSPの異常な活性化は、MCSP、及び／又はMCSPリガンドの増幅、過剰発現、又は異常産生に起因するかもしれない。本発明の1つの態様において、診断又は予後アッセイは、MCSP（又は、MCSPリガンド）の異常な産生又は活性化が対象で起こっているかどうか測定するために実施される。例えば、MCSP、及び／又はリガンドの遺伝子の増幅、及び／又は過剰発現が測定されるかもしれない。そのような増幅／過剰発現を測定するための様々なアッセイが、当該技術分野で利用可能であり、先に記載のIHC、FISH、及びshed抗原アッセイを含む。あるいは又は加えて、サンプル中の、又はそれに付随するMCSPリガンドのレベルは、知られている手順に従って測定されるかもしれない。そのようなアッセイは、試験されるサンプル中のタンパク質、及び／又は、それをコードする核酸を検出するかもしれない。1つの態様において、サンプル中のMCSPリガンド・レベルは、免疫組織化学（IHC）を使用して測定されるかもしれない；例えば、Scherら、Clin. Cancer Research 1：545-550ページ（1995年）を参照のこと。あるいは、又は加えて、当業者は、例えば、FISH、サザンブロット法、又はPCR技術によって、試験されるサンプル中のMCSPコード核酸のレベルを評価するかもしれない。
【０１９９】
そのうえ、MCSP、若しくはMCSPリガンドの過剰発現又は増幅は、生体内診断アッセイを使用して、例えば、検出されるべき分子に結合し、且つ、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）でタグ付けされた分子（例えば、抗体など）を投与し、そして、上記標識の局在について外部的に患者をスキャンすることによって、評価されるかもしれない。
【０２００】
このため、本発明は、例えば、膀胱、脳、頭頚部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺、及び腎臓のメラノーマや癌などのヒト悪性腫瘍を治療するための医薬組成物、組合せ物、及び方法を網羅することは明らかである。例えば、本発明は、医薬的有効量の本発明の抗体、及び医薬として許容される担体を含む、ヒト悪性腫瘍の治療における使用のための医薬組成物を含む。
【０２０１】
本発明のABM組成物は、これだけに制限されることなく、静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内を含めた投与、又は腫瘍内への直接な投与の従来様式を使用して投与されてもよい。静脈内投与が好ましい。
【０２０２】
本発明1つの側面において、本発明のABMsを含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、任意の医薬として許容される担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences第16版、Osol, A.編（1980年））を伴った所望の純度を有する抗体を混合することによって保存向けに調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、利用される投与量及び濃度において受容者に対して無毒性であり、そして、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチルベンジル・アンモニウム・クロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、若しくはベンジル・アルコール；例えば、メチル若しくはプロピル・パラベンなどのアルキル・パラベン；カテコール；レゾルシン；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；及びm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド；例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；例えば、ポリビニールピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含めた単糖、二糖、及び他の糖；例えば、EDTAなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトールなどの糖；例えば、ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属複合物（例えば、Zn-タンパク質複合物）；及び／又は、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、若しくはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤、を含む。
【０２０３】
例えば、単独で、又は例えば、化学療法薬、及び／又は放射線治療との併用療法で、例えば、腫瘍などの異常なMCSP又はMCSPリガンド活性を特徴とする疾患又は障害を治療するために本発明のABMsが対象に投与されるかもしれない。好適な化学療法薬には、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、パクリタクセル、ビンブラスチン、カルボプラチン、及びエトポシドが含まれる。
【０２０４】
皮下投与に適合させた凍結乾燥製剤は、WO 97/04801中に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、高タンパク質濃度に好適な希釈剤で再構成されることができ、そして、上記再構成された製剤は、本明細書中の治療されるべき哺乳動物に皮下投与されるかもしれない。
【０２０５】
本明細書中の製剤は、また、治療される特定の適応症のために必要な2種類以上の活性物質、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するそれらも含むかもしれない。例えば、更に、細胞毒性薬、化学療法薬、サイトカイン、又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンなどのT細胞に影響するもの、又はT細胞に結合する抗体、例えば、LFA-1に結合するもの）を提供することも望ましいかもしれない。そのような他の作用物質の有効量は、製剤中に存在している拮抗薬の量、疾患、障害、又は治療の種類、及び先に議論した他の要因に依存する。これらは、一般に、同じ投薬量及び上文の投与経路で使用されるか、又はこれまでに利用された投薬量の約1〜99%で使用されるかもしれない。
【０２０６】
有効成分は、また、コロイド状ドラッグ・デリバリー・システム（例えば、リポソーム、アルブミン・ミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにより、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル内に封入されるかもしれない。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences第16版、Osol, A.編（1980年）中に開示されている。
【０２０７】
徐放製剤が調製されるかもしれない。徐放製剤の適切な例には、拮抗薬を含む固体疎水性重合体の半浸透性マトリックスが含まれ、上記マトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルである。徐放マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシルエチル・メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許番号第3,773,919号）、L-グルタミン酸及びγエチル-L-グルタマートの共重合体、非崩壊性エチレン酢酸ビニル、例えば、LUPRON DEPOT（商標）などの崩壊性乳酸-グリコール酸共重合体（乳酸-グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドで構成された注射可能なミクロスフェア）、並びにポリ-D-（−）-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０２０８】
生体内投与に使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌の濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０２０９】
本発明の組成物は、これだけに制限されることなく、溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、坐剤、高分子マイクロカプセル又は微細小胞、リポソーム、及び注射可能な又は注入可能な溶液を含めた様々な投与形態であるかもしれない。好ましい形態は投与方法及び治療用途に依存する。
【０２１０】
本発明の組成物には、また、好ましくは、例えば、ヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチンなどの当該技術分野で知られている従来の医薬として許容される担体及び補助剤、例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウムなどの緩衝物質、並びに例えば、硫酸プロタミンなどの塩又は電解質が含まれる。
【０２１１】
本願発明の医薬組成物の投与及び投与計画の最も効果的な様式は、疾患の重さ及び経過、患者の健康状態、及び治療に対する応答、並びに治療医の判断に依存する。従って、組成物の投与は、個々の患者に用量設定されるべきである。それでもやはり、本願発明の組成物の有効量は、一般に、約0.01〜約2000mg/kgの範囲内にある。
【０２１２】
本明細書中に説明した分子は、これだけに制限されることなく、溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、散剤、坐剤、高分子マイクロカプセル又は微細小胞、リポソーム、及び注射可能な又は注入可能な溶液を含めた様々な投与形態であるかもしれない。好ましい形態は、投与方法と治療用途に依存する。
【０２１３】
本発明の投薬量は、場合によって、バイオマーカーの使用によって判断されるかもしれない。バイオマーカーは、治療薬の薬物動力学を評価する、及び対象が最も応答しそうな治療薬を決定するのに使用される分子マーカーである。例えば、MCSP療法のためのバイオマーカーは、細胞増殖障害につながるMCSP下流のシグナル伝達経路に存在する分子（例えば、接着斑キナーゼ（FAK）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、又はその他のもの）であるかもしれない。よって、バイオマーカーは、どんな量で本発明のABMを投与するか判断するために使用されるかもしれない。本発明は、また、MCSP発現を特徴とする障害のバイオマーカーの発現を最初に測定することによって患者に投与するABMの量を決定する方法を提供する。
【０２１４】
本発明の投薬量は、場合により、予測的バイオマーカーの使用によって決定されるかもしれない。予測的バイオマーカーは、腫瘍関連遺伝子若しくはタンパク質の発現、及び／又は活性化のパターン、あるいは腫瘍関連シグナル伝達経路の細胞成分を測定する（すなわち、観察する、及び／又は定量する）ために使用される分子マーカーである。腫瘍組織における標的療法の生物学的効果を解明すること、及び臨床反応とこれらの効果を関連させることは、腫瘍において影響を及ぼしている支配的な増殖及び生存経路を特定し、その結果、有望な応答者の特徴を確立し、そして、逆に、抵抗性を克服するストラテジーを設計するための論理的根拠を提供する助けとなる。例えば、抗MCSP療法のためのバイオマーカーは、これだけに制限されることなく、以下の：FAK、ERK、膜型3-マトリックス・メタロプロテイナーゼ（MT3-MMP）、Cdc42、Ack-1、及びp130casを含めた細胞増殖障害につながるMCSP下流のシグナル伝達経路内にある分子を含むかもしれない。Yangら、J. Cell Biol. 165（6）：881-891ページ（2004年6月）；Iidaら、J. Biol. Chem. 276（22）；18786-18794ページ（2001年）；Eisenmannら、Nat. Cell Biol. 1（8）：507-513ページ（1999年）。
【０２１５】
予測的バイオマーカーは、これだけに制限されることなく、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、免疫蛍光、捕獲及び検出アッセイ、及び逆相アッセイを含めた当該技術分野で周知の細胞アッセイ、及び／又は米国特許出願公開番号第2004/0132097 A1に記載のアッセイによって計測されるかもしれない。前記文献の内容全体を本明細書中に援用する。抗MCSP療法の予測的バイオマーカーそれら自体は、米国特許出願公開番号第2003/0190689 A1に記載の技術により特定できる。前記文献の内容全体を本明細書中に援用する。
【０２１６】
1つの側面において、本発明は、例えば、癌などのMCSP関連障害のための予測的バイオマーカーの発現、及び／又は活性化を検出する1つ又は複数の試薬により療法前にヒト対象からのサンプルをアッセイし；抗MCSP療法に対するヒト対象の応答を予測する、上記予測的バイオマーカーの1種類以上の発現、及び／又は活性化のパターンを測定し；そして、抗MCSP治療に対してプラスに応答することが予測されるヒト対象に、本発明のABMを含む組成物の治療的有効量を投与する、治療を必要とするヒト対象の抗MCSP療法に対する応答を予測するステップを含むMCSP関連障害の治療方法を提供する。本明細書中では、抗MCSP治療に対してプラスに応答することが予測されるヒト対象は、抗MCSPがMCSP関連障害（例えば、腫瘍の退縮／縮小）に測定可能な効果を有するヒト、及び抗MCSP療法の利益より副作用（例えば、毒性）が勝らないヒトである。本明細書中では、サンプルは、例えば、乳房、肺、胃腸管、皮膚、子宮頚部、卵巣、前立腺、腎臓、脳、頭頚部などの臓器、又は他の体の臓器若しくは組織のいずれかから取り出されたいずれかの起源の単独細胞、組織、又は生検サンプルを含めた1つ以上の細胞を含む生物体、特に、ヒトからのあらゆる生物学的サンプル、並びに、これだけに制限されることなく、塗抹標本、痰、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、尿、及び糞便を含めた他の身体サンプルを意味する。
【０２１７】
本発明のABMを含む組成物は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、服用され、そして、投与される。これに関連して考慮すべき要素には、治療される特定の疾患及び障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、疾患又は障害の原因、作用物質のデリバリー場所、投与方法、投与のスケジューリング、並びに開業医に知られている他の要素が含まれる。投与されるべき拮抗薬の治療的有効量は、前述の問題によって左右される。
【０２１８】
一般命題として、一服あたりに非経口的に投与される抗体の治療的有効量は、約2〜10mg/kgの範囲内である使用される拮抗薬の典型的な初期範囲を持ち、1日あたり約0.1〜20mg/kg患者体重の範囲内にある。
【０２１９】
好ましい態様において、ABMは抗体であり、好ましくは、ヒト化抗体である。そのような非結合抗体の好適な投薬量は、例えば、約20mg/m2〜約1000mg/m2の範囲内にある。例えば、当業者は、実質的に、375mg/m2より低い抗体の1つ以上の用量を患者に投与するかもしれず、例えば、上記用量は、約20mg/m2〜約250mg/m2、例えば、約50mg/m2〜約200mg/m2の範囲にある。
【０２２０】
そのうえ、当業者は、1回以上の初期用量の抗体と、それに続く1回以上のその後の用量を投与するかもしれない、ここで、上記その後の用量における抗体のmg/m2用量は初回用量における抗体のmg/m2用量を超えている。例えば、初回用量が約20mg/m2〜約250mg/m2（例えば、約50mg/m2〜約200mg/m2）の範囲にあり、そして、その後の用量が約250mg/m2〜約1000mg/m2の範囲にあるかもしれない。
【０２２１】
しかしながら、先に述べたように、ABMのこれらの常用量は、多くの治療的な裁量を受ける。適切な用量及びスケジューリングの選択における大きな要素は、先に示したように、得られた結果である。例えば、比較的に高い用量は、進行中、且つ、急性の疾患の治療のために初期に必要とされるかもしれない。最も効果的な結果を得るために、疾患又は障害に応じて、拮抗薬が、疾患若しくは障害の最初の徴候、診断、出現、又は発生の後できる限りすぐに、あるいは疾患若しくは障害の回復中に投与される。
【０２２２】
腫瘍を治療するために使用される抗MCSP抗体の場合では、最適な治療結果は、一般に、標的細胞上のMCSP分子を完全に飽和するのに十分である用量で達成される。飽和を達成するのに必要な用量は、（異なる腫瘍タイプの間で顕著に異なる可能性がある）腫瘍細胞あたりに発現されているMCSP分子の数に依存する。30nM程度まで低い血清中濃度が、いくつかの腫瘍を治療するのに有効であるかもしれないが、100nMを上回る濃度が、他の腫瘍で最適な治療効果を達成するのに必要であるかもしれない。所定の腫瘍に関する飽和を達成するのに必要な用量は、放射免疫測定又は免疫沈降法によって試験管内で容易に決定されることができる。
【０２２３】
一般に、放射線照射を伴う併用療法のために、1つの好適な治療計画は、100〜500mg/m2の負荷量とそれに続く100〜250mg/m2の維持量にて本発明の抗MCSP ABM、及び毎日2.0Gyの線量で70.0Gyの量の放射線照射の8週間の注入を伴う。化学療法との併用療法のために、1つの好適な治療計画は、3週間毎に、100mg/m2の用量のシスプラチンと組み合わせた、毎週の100/100mg/m2、400/250mg/m2、又は500/250mg/m2の負荷量／維持量として本発明の抗MCSP ABMの投与を伴う。あるいは、ゲムシタビン又はイリノテカンが、シスプラチンに代わって使用されてもよい。
【０２２４】
本発明のABMは、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含めたあらゆる好適な手段、そして、局所的な免疫抑制療法のために望まれる場合には、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。加えて、拮抗薬は、例えば、減少する用量の拮抗薬の、パルス注入によって好適には投与されるかもしれない。好ましくは、投薬は、1つには投与がより簡潔、且つ、習慣的であるかどうかによって、注射、最も好ましくは、静脈又は皮下注射によって与えられる。
【０２２５】
当業者は、本明細書中の拮抗薬と共に、例えば、細胞毒性薬、化学療法薬、免疫抑制剤、及び／又はサイトカインなどの他の化合物を投与するかもしれない。併用投与は、別々の製剤又は1つの医薬製剤を使用した同時投与、及びいずれかの順序による連続投与を含み、ここで、好ましくは、期間が存在するが、両方（全て）の活性物質がそれらの生物活性を同時に発揮する。
【０２２６】
治癒を実現するのに必要とされる本発明の組成物の用量がスケジュール最適化により更に減少されることは、明らかであるだろう。
【０２２７】
本発明の実施に従って、医薬担体は脂質担体であるかもしれない。前記脂質担体は、リン脂質であるかもしれない。更に、前記脂質担体は、脂肪酸であるかもしれない。また、脂質担体は界面活性剤であるかもしれない。本明細書中では、界面活性剤は、液体の表面張力を変更する、一般に、それを下げる、物質のいずれかである。
【０２２８】
本発明の1つの例において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であるかもしれない。非イオン性界面活性剤の例には、これだけに制限されることなく、ポリソルベート80（別名、Tween80又は（ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレアート））、Brij、又はTriton（例えば、Triton WR-1339及びTriton A-20）が含まれる。
【０２２９】
あるいは、界面活性剤はイオン性界面活性剤であるかもしれない。イオン性界面活性剤の例には、これだけに制限されることなく、アルキルトリメチルアンモニウム・ブロマイドが含まれる。
【０２３０】
加えて、本発明に従って、脂質担体はリポソームであるかもしれない。当該出願において使用される場合、「リポソーム」は、本発明の分子のいずれか、又はその組合せ物を含む膜結合小胞のいずれかである。
【０２３１】
製品
本発明の他の態様において、先に記載した障害の治療に有用な物質を含む製品を提供する。製品には、入れ物、入れ物上の若しくはそれに付随するラベル又は添付文書が含まれる。好適な入れ物には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。前記入れ物は、例えば、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されるかもしれない。前記入れ物は、病態を治療するのに有効な組成物を保持し、そして、無菌の投与口を持つかもしれない（例えば、入れ物は、皮下注射針によって貫通できる栓を持つ静脈注射用溶液バッグ又はバイアル）。組成物中の少なくとも1種類の活性物質が抗MCSP抗体である。前記ラベル又は添付文書には、組成物が、例えば、非悪性疾患又は障害などの最も合う病態を治療するために使用され、ここで、上記疾患又は障害は、MCSP、及び／又はMCSPリガンドの異常な活性化若しくは産生を伴う疾患又は障害、例えば、良性過剰増殖性疾患又は障害であることが示される。そのうえ、製品は、（a）MCSPに結合し、MCSPを過剰発現する細胞の増殖を抑制する1次抗体を含む組成物をその中に含む第1の入れ物、並びに（b）MCSPに結合し、MCSP受容体のリガンド活性化を遮断する2次抗体を含む組成物をその中に含む第2の入れ物、を含むかもしれない。本発明のこの態様において、製品は、更に、1次及び2次抗体組成物が先の定義の節内のそのような疾患又は障害の一覧の中の非悪性疾患又は障害を治療するために使用できることを示す添付文書を含む。そのうえ、添付文書は、抗体と、前節に記載されたいずれかの補助療法（例えば、化学療法薬、MCSP標的化薬、抗血管新生剤、免疫抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ホルモン化合物、心臓保護剤、及び／又はサイトカイン）を用いた療法を組み合わせるような（MCSPに結合し、MCSP受容体のリガンド活性化を遮断する抗体を含む）組成物の使用を指示するかもしれない。あるいは、又は加えて、製品は、更に、例えば、静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの医薬として許容されるバッファーを含む第2（第3）の入れ物を含むかもしれない。それは、更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めた商業的及び使用者の見地から望ましいその他の物質を含むかもしれない。
【０２３２】
以下の実施例は、より詳細に本発明を説明する。以下の調製及び実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、そして、実施できるように与えられる。しかしながら、本発明は、例示された態様によって範囲が制限されることはなく、上記態様は、単に本発明の1つの側面の例証を目的としているので、機能的に同等な方法は本発明の範囲内にある。実際、本明細書中に説明したものに加えて本発明の様々な修飾が、上記の記載及び添付した図面から当業者に明らかになる。そのような修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。
【０２３３】
当該出願において引用された、全ての特許、出願、および刊行物は、その全体を本明細書中に援用する。
【実施例】
【０２３４】
別段の指定がない限り、以下の実施例における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Kabatの番号付けシステムに従う。別段の指定がある場合を除いて、それらの実施例において抗原結合性分子を作製するのに使用される材料及び方法は、米国特許出願番号第10/981,738号の実施例に記載のものに従う。前記文献の全体を本明細書中に援用する。
【０２３５】
実施例1
ヒト化抗MCSP MAbの創出
A.  高相同性アクセプタ・アプローチ
このアプローチで、高相同性抗体アクセプタ・フレームワーク検索を、ヒト生殖細胞系配列のコレクションに対して、マウス由来scFv抗体225.28S由来の親タンパク質配列をアラインし、そして、最も高い配列同一性を示す一方で、同時に、機能レベルで全ての正規の残基を保存しているそのヒト配列を選別することによって実施した。ここに、IMGTデータベースからの配列、IGHV3-15（受入番号X92216）及びIGHV3-7（受入番号M99649）を、フレームワーク・アクセプタ配列とみなした。両方ともVH3ファミリーのメンバーである。同じデータベースのVK1ファミリーからのIGKV1-9配列（受入番号Z00013）を、軽鎖のフレームワーク・アクセプタにするために選んだ。これらの3つのアクセプタ・フレームワークに、マウス225.28Sの重鎖及び軽鎖の可変ドメインそれぞれの3つの相補性決定領域（CDRs）を、繋ぎ合わせた。第4フレームワーク領域（FR4）は生殖細胞系遺伝子の可変領域の一部でないので、その位置へのアラインメントを個別におこなった。JH6領域を重鎖に選び、そして、JK4領域を軽鎖に選んだ。設計された免疫グロブリン・ドメインの分子モデリングは、CDR領域外のヒトのものの代わりにマウス・アミノ酸残基を潜在的に必要とするいくつかの位置を明らかにした。ヒト・フレームワーク内へのマウス・アミノ酸残基の再導入は、いわゆる復帰突然変異を作り出すだろう。例えば、Kabatの94位（IGHV3-15内のトレオニン）におけるヒト・アクセプタ・アミノ酸残基は、変異体のそれをセリン残基に復帰突然変異させた。これらの復帰突然変異を必要とする仮説を立証するために、復帰突然変異を伴うか、又は削除したヒト化抗体変異体を設計した。
【０２３６】
225.28S軽鎖の配列において、統計的分析が、FR2内の「稀な」残基の全範囲を明らかにした。これらは、Glu45、Pro46、Leu48、及びPhe49である。3D分子モデルの分析が、これらの残基の全てが軽鎖のCDRsに対して、そして、（Leu48は別として）同様にVHのCDR3にも強力に相互作用することを示した。このモデリング・ステップにおいて、また、Pro46がVH CDR3と重要な接触をすることも分かった。これらの残基の重要性を調査するために、それらを、ヒト化VL構築物に、復帰突然変異として組み込んだ。復帰突然変異を含むヒト化構築物を、抗原に結合するそれらの能力に関して、以下で議論される「混合フレームワーク」アプローチに従って調製されたヒト化構築物と比較した。
【０２３７】
B.  混合フレームワーク・アプローチ
（良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要な）ヒト・アクセプタ・フレームワーク内の重要な位置における復帰突然変異の挿入を回避するために、機能的なヒト化抗体の第1フレームワーク領域（FR1）、第1（FR1）と第2（FR2）フレームワーク領域一緒に、又はFR3のいずれかが、天然のヒト生殖細胞系配列内の重要な位置にて、すでにドナー残基を持つヒト抗体配列、又は機能的に同等なものによって置き換えられることができるかどうか調査した。このために、マウス225.28SのVH配列のVHフレームワーク、FR1、FR2、及びFR3を、ヒト生殖細胞系配列に対して個別にアラインした。ここで、最も高い配列同一性は重要でなく、またアクセプタ・フレームワークを選択するために使用されなかったが、代わりに、いくつかの重要な残基の一致がより重要であると考えた。それらの重要な残基は、いわゆる、正準な残基を含み、そして、同様に、KabatによるCDR1定義の外側にあるが、CDR1の内側としてKabatによって規定され、且つ、多くの場合、抗原結合に関与する、27、28、及び30位（Kabatの番号付け）のそれらの残基も含む。加えて、重要な残基は、分子モデリングを使用することで測定できるCDRsに対する重要な相互作用を示すものである。IMGT配列、IGHV1-58（受入番号M29809）及びIGHV1-46（受入番号X92343）を、FR1、FR2、又はFR3のいずれかを置き換えるための好適な候補として選択した。要するに、IGHV1-46が全てのフレームワークについて使用され、こうして、1つのフレームワーク・アクセプタを作り出す。前記アクセプタは、アミノ酸レベルにおいて53%までドナーのFR領域と同一である。IGHV1-46を、FR1及びFR2のアクセプタとしても使用した一方で、IGHV1-58をFR3に使用した。また、IGHV3-7を、ER1及びFR2のアクセプタとして使用した一方で、IGHV3-15をFR1、FR2、及び／又はFR3に使用した。IGHV3-7をIGHV3-15と混合する理論的根拠は、FR1及びFR2に最適な相同性を有し、且つ、Kabatの71位及び94位にて残基の一致があることであった。これらの全ての構築物において、JH6をFR4領域に使用した。
【０２３８】
高相同性アプローチに関して先に触れたように、ヒト化軽鎖のFR2領域は、何らかの試みを必要とするだろう。我々は、他の生殖細胞系抗体のいくつかのFR2領域、すなわち、IGKV2-28（受入番号X63397）及びIGKV2D-30（受入番号X63402）を導入した。言うまでもなく、「稀な」残基は、ヒト生殖細胞系レパートリーの中にめったに見られない。なので、ヒト末梢B細胞由来であり、且つ、プロリン46残基を組み込んだ非生殖細胞系抗体（ジェンバンク受入番号AAA17574）のFR2もまた、アクセプタFRコレクションに含んだ。
【０２３９】
CDR領域内に存在する、軽鎖構築物内の「稀な」残基を取り出すという考えを詳細に調査するために、変異体であるM-KV10、M-KV11、及びM-KV12を構築した。それらは皆、M-KV9デザインから開始している。M-KV10は、マウスのLys24をヒトのアルギニンによって置き換え、また、Val33をヒトのロイシンによって置き換えている。M-KV11は、マウスのVal33だけをヒトのロイシンによって置き換えている。M-KV12は、3アミノ酸範囲であるArg-Tyr-Thr（54から56まで）をヒトVK1由来Leu-Gln-Serトリペプチドによって置き換えている。
【０２４０】
タンパク質配列を設計した後に、これらのタンパク質をコードするDNA配列を、以下で詳述されるように合成した。このアプローチを使用して、良好なレベルの抗原結合を維持するために、重鎖の構築物の大部分で復帰突然変異を回避することができた。
【０２４１】
混合フレームワーク構築物の年代順序配列及び推論を、得られた部分で明らかにする。
【０２４２】
C.  抗体遺伝子の合成
ヒト化抗体V領域のアミノ酸配列を設計した後に、DNA配列を産生しなければならなかった。個々のフレームワーク領域のDNA配列データを、ヒト生殖細胞系配列に関するデータベース（例えば、European Biomformatics Instituteによって維持管理されているInternational Immunogenetics Information System、http：//imgt.cines.fr）内で発見した。CDR領域のDNA配列情報を、公になっているマウス225.28S抗体のタンパク質配列から推定した。Neriら、J. Invest. Dermatol. 107（2）；164-170ページ（1996年）。これらの配列で、全DNA配列を仮想的に組み立てた。このDNA配列データを得たので、サイレント突然変異を導入し、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を作成することによって、診断制限部位を仮想配列内に導入した。物理的なDNA鎖を得るために、遺伝子合成を実施した（例えば、Wheelerら、1995年）。この方法において、一連のオリゴヌクレオチドがコード鎖に由来し、もう1つの一連のものが非コーディング鎖に由来する、そのような、着目の遺伝子からオリゴヌクレオチドを設計する。（列の1番最初と最後を除いた）それぞれのオリゴヌクレオチドの3’及び5’末端は、向かいの鎖に由来する2つのプライマーに対する相補配列を示す。これらのオリゴヌクレオチドをいずれかの熱安定性ポリメラーゼに好適な反応バッファー中に入れ、そして、mg2+、dNTPs、及びDNAポリメラーゼを加えた時、各オリゴヌクレオチドは3’末端から伸長される。一方のプライマーの新たに形成された3’末端は、次に、向かいの鎖の次のプライマーとアニールし、そして、鋳型依存性DNA鎖伸長に好適な条件下で更に配列を伸長する。最終産物を、E.コリ（E. coli）への伝播のために従来のベクター内にクローニングした。
【０２４３】
D.  抗体の産生
ヒト重鎖（配列番号25）及び軽鎖（配列番号53）（分泌のための）リーダー配列を、上記可変領域DNA配列の上流に加えた。可変領域の下流に、重鎖のためのヒトIgG1の定常領域、及び軽鎖のためのヒトκ定常領域のそれぞれを、標準的な分子生物学技術を使用することで加えた。得られた完全長のヒト化抗体の重鎖及び軽鎖DNA配列を、MPSVプロモーターの制御下の、そして、合成ポリA部位の上流に、各ベクターがEBV OriP配列を持つ、哺乳動物発現ベクター（軽鎖のために1つと、重鎖のために1つ）内にサブクローニングした。
【０２４４】
カルシウム・リン酸トランスフェクション・アプローチを使用した、哺乳動物抗体重鎖及び軽鎖発現ベクターを用いたHEK293-EBNA細胞の同時トランスフェクションによって抗体を産生させた。対数増殖期HEK293-EBNA細胞を、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。細胞を、10%のPCSを補ったDMEM培地を使用してT型フラスコ内で接着性単層培養として培養し、そして、それらが50〜80%集密になった時に、トランスフェクトした。T75フラスコのトランスフェクションについて、800万個の細胞を、FCS（最終的に10%V/Vに）、250μg/mlのネオマイシンを補った14mlのDMEM培地中に、トランスフェクションの24時間前に播種し、そして、細胞を、5%のCO2雰囲気のインキュベータ内、37℃で一晩、置いた。トランスフェクトされるそれぞれのT75フラスコのために、DNA、CaCl2、及び水から成る溶液を、軽鎖及び重鎖発現ベクターの間で等しく分割された47μgの総プラスミド・ベクタDNA、235μlの1M CaCl2溶液を混合し、そして、469μlの終量まで水を加えることによって調製した。この溶液に、469μlの、50mMのHEPES、280mMのNaCl、1.5mMのNa2HPO4溶液、pH7.05を加え、すぐに10秒間、混合し、そして、室温にて20秒間、放置した。懸濁液を、2%のFCSを補った12mlのDMEMで希釈し、既存の培地に代えてT75に加えた。細胞を、37℃、5%のCO2で約17〜20時間インキューベートし、次に、培地を12mlのDMEM、10%のFCSで置き換えた。条件培地を、トランスフェクション後5〜7日で採取し、1200rpmで5分間、遠心分離し、続いて4000rpmで10分間、2回目の遠心分離をし、そして、4℃に保った。分泌された抗体を、リン酸緩衝食塩水にバッファー交換し、そして、純粋な単量体IgG1抗体を収集する、プロテインA親和性クロマトグラフィーと、それに続く陽イオン交換クロマトグラフィー、及びSuperdex 200カラム（Amersham Pharmacia）による最終的なサイズ排除クロマトグラフィー・ステップによって精製した。抗体濃度を、280nmの吸光度から分光光度計を使用することで概算した。抗体を、pH6.7の25mMのリン酸カリウム、125mMの塩化ナトリウム、100mMのグリシンの溶液中に処方した。
【０２４５】
E.  ヒト化抗体の糖操作
ヒト化変異体の糖操作は、GnT-IIIグリコシルトランスフェラーゼ発現ベクターと共に、又はGnT-III発現ベクターとゴルジ体マンノシダーゼII発現ベクターと共、抗体発現ベクターの哺乳動物細胞内への同時トランスフェクションによって実施した。GnTIII活性を有するポリペプチドは、米国特許出願公開番号第20040241817 A1号の中で教示されている方法に従って調製された異種のゴルジ体常在性ポリペプチドのゴルジ体局在化ドメインを含む融合ポリペプチドである。前記文献の内容全体を本明細書中に援用する。糖操作された抗体を、非糖操作抗体に関して先に記載のとおり精製し、そして、処方した。抗体のFc領域に取り付けたオリゴ糖は、以下に記載のようにMALDI/TOF-MSによって分析した。本発明のABMsと共に使用できる糖操作方法論は、米国特許番号第6,602,684号、米国特許仮出願番号第60/441,307号、及びWO 2004/065540においてより詳細に記載されている。前記文献のそれぞれの内容全体を本明細書中に援用する。本発明の糖操作されたABMsは、Fc領域内のフコース残基の量が減少した。本発明のABMsを、EP 1 176 195 A1に開示されている技術に従ってFc領域内のフコース残基が減少するように糖操作することもできる。前記文献の内容全体を本明細書中に援用する。
【０２４６】
実施例2
材料と方法
A.  オリゴ糖分析
1.  溶液中の抗体のためのオリゴ糖放出方法
40〜50μgの抗体を、終量が25マイクロリットルの2mMのTris、pH7.0中、2.5mUのPNGアーゼF（Glyko、U.S.A.）と混合し、そして、その混合物を、37℃で3時間インキューベートした。
【０２４７】
2.  MALDI/TOF-MS用のサンプル調製
放出されたオリゴ糖を含む酵素的消化物を、150mMの終濃度まで酢酸を加えた後に室温で更に3時間、インキューベートし、それに続いてmicro-bio-spinクロマトグラフィー・カラム（BioRad, Switzerland）内に詰め込んだ0.6mlの陽イオン交換樹脂（AG50W-X8樹脂、水素形態、100-200メッシュ、BioRad, Switzerland）を通して、陽イオン及びタンパク質を取り除いた。得られたサンプルの1マイクロリットルを、ステンレス・ターゲット・プレートに適用し、そして、そのプレート上で1μlのsDHBマトリックスと混合した。sDHBマトリックスを、1mlの、エタノール/10mMの塩化ナトリウム水溶液1：1（v/v）中に2mgの2,5-ジヒドロキシ安息香酸と0.1mgの5-メトキシサリチル酸を溶解することによって調製した。サンプルを風乾し、0.2μlのエタノールを適用し、そして、サンプルを最終的に空気中で再結晶させた。
【０２４８】
3.  MALPI/TOF-MS
質量分析スペクトルを取得するために使用されるMALDI-TOF質量分析計は、Voyager Elite（Perspective Biosystems）であった。機器を、20kVの加速と80nsの遅延時間を用いたリニア構成により操作した。オリゴ糖標準品を使用した外部較正を、イオンの質量数決定に使用した。200のレーザー照射からのスペクトルを、合計して、最終的なスペクトルを得た。典型的なスペクトルを図8に示す。
【０２４９】
B.  抗原結合アッセイ
精製した、単量体ヒト化抗体変異体を、以下の細胞数測定ベースのアッセイを使用して、A375ヒト・メラノーマ細胞株のヒトHMW-MAA/MCSP抗原への結合に関して試験した。（180μlのFACSバッファー（2%のPCSと5mMのEDTAを含むPBS）中の）200,000個の細胞を、5ml容ポリスチレン・チューブに移し、そして、20μlの10倍濃縮抗MCSP抗体（1次抗体）サンプル（1〜5000ng/mlの終濃度）、又はPBSのみを加えた。前記サンプルを緩やかに混合した後に、前記チューブを、暗所中、4℃で30分間、インキューベートした。続いて、サンプルを、FACSバッファーで2度洗浄し、そして、300gにて3分間でペレット状にした。上清を吸引して除き、細胞を50μlのFACSバッファー中に溶かし、2ulの2次抗体（抗Fc特異的F（ab’）2-FITCフラグメント（Jackson Immuno Research Laboratories、USA））を加え、そして、そのチューブを4℃で30分間、インキューベートした。サンプルを、FACSバッファーで2度洗浄し、そして、フローサイトメトリーによる分析のために500μlのFACSバッファー中に溶かした。結合を、抗体濃度に対して幾何平均蛍光をプロットすることによって測定した。
【０２５０】
C.  抗体依存性細胞傷害性アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、エフェクター細胞として使用し、そして、Histopaque-1077（Sigma Diagnostics Inc.、St. Louis, M063178 USA）を使用し、且つ、製造業者の指示に基本的に従って調製した。要するに、ヘパリン化シリンジを用いて健常ボランティアから静脈血を採取した。血液を、PBS（Ca＋＋又はMg＋＋不含）で1：0.75〜1.3に希釈し、そして、Histopaque-1077上に重ねた。グラジエントを、続けて、室温（RT）にて400×gで30分間、遠心分離した。PBMCを含む相間を、回収し、PBS（2つのグラジエントからの細胞につき50ml）で洗浄し、RTにて300×gで10分間の遠心分離によって採取した。PBSでのペレットの再懸濁後に、PBMCをカウントし、そして、RTにて200×gで10分間の遠心分離によってもう1度洗浄した。細胞を、次に、その後の手順のために適切な媒質中に再懸濁した。
【０２５１】
ADCCアッセイに使用されるエフェクター対標的の比は、PBMC細胞に関して100：1及び25：1であった。エフェクター細胞を、丸底96ウェル・プレートのウェルあたり50μlを加えるために適切な濃度にてAMI-V培地中に調製した。1セットの標的細胞は、10%のFCS含有DMEM中で培養された、メラノーマ患者（例えば、A375、A2058、又はSK-Mel5）に由来するヒトMCSP発現細胞であった。周皮細胞のモデルであるべき、もう1セットの標的細胞は、（Promocell, Heidelberg Germanyから入手した）HuSMCというヒト大動脈平滑筋細胞であった。HuSMC細胞を、Promocellによって供給されている培地中で培養した。標的細胞を、PBS中で洗浄し、カウントし、そして、1マイクロウェルあたり100μl中、30’000個の細胞を加えるために1mlあたり30万個にてAIM-V中に再懸濁した。抗体を、AIM-V中に希釈し、50μlを前もって播種した標的細胞に加え、そして、RTで10分間、標的に結合させた。次に、エフェクター細胞を加え、そして、プレートを、5%のCO2を含む加湿雰囲気中、37℃で、メラノーマ細胞及びHuSMCに関して、それぞれ、一晩及び4時間、インキューベートした。標的細胞の殺滅を、細胞毒性検出キット（Roche Diagnostics、Rotkreuz, Switzerland）を使用して、傷害を受けた細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出の測定によって評価した。4時間のインキュベーション後に、プレートを800×gで遠心分離した。各ウェルからの100μlの上清を、新しい透明な平底96ウェル・プレートに移した。キットの100μlの呈色基質バッファーを、ウェルごとに加えた。呈色反応のVmax値を、SOFTmax PROソフトウェア（Molecular Devices、Sunnyvale, CA94089, USA）を使用して、少なくとも10分間、490nmにてELISAリーダーにより測定した。自然発生的なLDH放出を、標的とエフェクター細胞だけを含み、抗体を含まないウェルから計測した。最大放出を、標的細胞と1%のTriton X-100だけを含むウェルから測定した。特異的抗体媒介性殺滅のパーセンテージを、以下の：（（x−SR）/（MR−SR）*100｛式中、xがある特異的抗体濃度におけるVmaxの平均であり、SRが自然放出のVmaxの平均であり、そして、MRが最大放出のVmaxの平均である｝、に従って計算した。
【０２５２】
D.  結果と考察
3種類の最初の重鎖構築物であるM-HHA、M-HHB、及びM-HHC、並びに3種類の最初の軽鎖構築物であるM-KV1、M-KV2、及びM-KV3を、その同種抗原であるMCSPに対するそれらの結合特性についてアッセイした。このために、ヒト化重鎖構築物をマウス軽鎖（mVL）と同時発現させ、そして、ヒト化軽鎖をマウス重鎖（mVH）と同時発現させた。結果を図1に示す。前記結果は、マウスVLと組み合わせた時に、2種類の重鎖構築物、M-HHA及びM-HHBが、それらの結合特性をほぼ維持することを示している。対照的に、構築物M-HHCは、その結合能力を顕著に失った。M-HHCは、2つの変化、Gly49Ala及びGlu50AsnだけがM-HHBと異なっている。49位のアラニンは実質的にはマウスのものであるので、50位のアスパラギンを固く禁止する。それ故に、マウスの50位のグルタミン酸を更なる全ての変異体において持ち続けた。これは、IGHV3-15フレーム構造が正準残基及び他の主要な残基の全ての要求を満たすことを意味する（50位がKabatのCDR2の一部であることに留意）。ヒト化軽鎖構築物であるM-KV1及びM-KV2は、マウス対応物と比べて、大きく減弱された結合活性を示す。ところが、構築物M-KV3は、マウス軽鎖に類似した結合挙動を示す。これは、突然変異Ile21Val、Leu46Pro、Ile48Leu、及びTyr49Pheが先の不活性変異体M-KV2の結合を回復させたことを意味する。これらのアミノ酸残基が相乗的に働くか、又は1つの単独残基が全ての効果の原因となる。
【０２５３】
図2は、軽鎖構築物M-KV3と組み合わせた、「低相同性」構築物であるM-HLA、M-HLB、及びM-HLCの結合データを示す。明らかに、これらの3種類の変異体の結合は完全に無効にされ、（正準なものを含めた）主要な残基の1つ以上がヒト化VH構築物において満たさなかったという結論につながった。第27及び30残基は結合特性を完全に無効するよりむしろ結合活性のいくつかの「微調整」に関与すると予想されるので、重要な残基は第3フレームワーク内に位置すると予想される。2つの明らかな候補は、225.28S配列のThr93及びSer94であるように思われる。IGHV1-58のFR3配列が使用される場合、そのとき、Ala93及びAla94が、減弱した抗原結合活性に関与すると考えられる残基であるだろう。他のFR残基の影響は除外できないが、統計的分析、並びに225.28S抗体の3D構造の分子モデルの分析に基づいて、まず起こりそうにないと思われた。第27及び30残基の重要性の裏付けを、図7に示す。構築物M-HLDがいくらかの残存結合活性を取り戻したので、Phe27及びSer30残基の導入が結合挙動に影響を与える得ることを示唆している。
【０２５４】
軽鎖の主要な残基を突き止めるために、構築物M-KV4、5、6、7、8、及び9を作り出した。M-KV4は、M-KV3（Val21Ile）の1つの復帰突然変異を取り除く。M-KV5は、新しいFR2（IGKV2-28；受入番号X63397）を使用し、それは、天然に存在するGln42及びSer43、並びにマウスGlu45と（ある程度）類似したGln45を持つ。M-KV6は、IGKV2D-30（受入番号X63402）FR2配列を持つ。M-KV7は、M-KV1のFR2領域のLeu46Pro誘導体である（よって、FR2内に1つの復帰突然変異を導入する）。M-KV8は、M-KV1のFR2領域のTyr49Phe変異体である（よって、FR2内に他の復帰突然変異を導入する）。M-HHB重鎖と対を成した時の、これらの軽鎖構築物の結合データの結果を、図3に表す。構築物M-KV4は、ch-225.28S抗体と比べて、その抗原に対する親和性を獲得した。構築物M-KV5及び6は、それらの機能的性質を取り戻さず、それらに導入された突然変異が、重要でないこと示唆した。M-KV7抗体はch-225.28S軽鎖と同じくらい良好な結合特性を示し、先の不活性軽鎖構築物M-KV1の完全な結合活性を回復するのに1つの単一点突然変異（Leu46Pro）が必要であり、且つ、十分であることを示唆した。
【０２５５】
ヒト化重鎖のハイブリッド・フレームワーク構築物の作出の可能性を検討するために、我々は、M-HLB及びM-HLCのFR1及びFR2領域を、IGHV3-15（受入番号X92216）のものに置き換えて、構築物M-HLE1及びM-HLE2を得た。これらの2つの構築物は、第61〜64残基（Kabatによって規定されるCDR2のメンバーであるが、Chothiaによっては規定されない）がヒト（M-HLE1）起源又はマウス（M-HLE2）起源のものであるという点だけが異なる。これらの構築物は、構築物M-HLB及びCの主要な残基の不足がFR1及びFR2領域に位置するということになるか、又は期待されたとおり、FR3領域に位置するかどうか、我々に伝えるだろう。新しい構築物は、VHファミリーのクラス1及び3に由来するフレームワーク領域から成るだろう。よって、3D分子モデルの分析中にこの明らかな原因が特定されない可能性があるにもかかわらず、不安定性を生じることもあり得る。同時に、（M-HHB構築物において機能的であることが分かった）IGHV3-15のFR3を、IGHV3-7配列のFR1及び2領域と組み合わせて、構築物M-HLF及びM-HLGをもたらした。M-HLFは、完全にヒト化されたCDR1を持ち、且つ、31位及び35位においてのみM-HLGと異なっている。M-HLGは、これらの位置にマウス配列を持つ。図4は、重鎖構築物であるM-HLE1、E2、F、及びGと、軽鎖構築物であるM-KV4が対を成した時の、抗原結合実験の結果を示す。構築物M-HLE1及びM-HLE2は、いくらかの残存結合を示し、その前身であるM-HLB及びCを上回るいくらかの改善を示唆した。それでも、この結合は、有効とはほど遠い。構築物M-HLFは、ほとんど結合せず、結合は、2つの変異Ser31Asn及びSer35Asn（M-HLG）を導入することによって回復できた。M-HLGは、M-HHBと似ており、親抗体ch-225.28Sに比べて、抗原に対する同等の、又はより高い親和性を示した。これは、FR3内のいくつかの重要残基（93位のトレオニン及び94位のセリン、又は先に触れたトレオニンの位置）の重要性を更に示唆する。にもかかわらず、M-HLE1及び2変異体によって実証されるように、いくらかの重要性を、FR1及び2内の残基（例えば、27位のフェニルアラニン又は30位のトレオニン）に与えなければならない。
【０２５６】
最終的に、軽鎖変異体M-KV9を、非生殖細胞系抗体（ジェンバンク受入番号AAA17574）のFR2をM-KV2構築物内に導入することによって作り出した。このアクセプタFRは、ヒト末梢B細胞に由来した（Weberら、J. Clin. Invest. 93（5）：2093-2105ページ（1994年））。この抗体を再編成し、そして、VK3ファミリーから導く。この軽鎖を、M-HHB、又はM-HLG重鎖と同時発現させ、そして、結合機能についてアッセイした。この結果を、図5に示す。ch-225.28Sと比べてわずかに減弱されているが、M-KV9は、M-HLGと一緒に、素晴らしい結合特性を示し、M-KV9は、M-HHBと組み合わされても、良好な結合データを同様に示す。図7は、構築物M-KV10〜12の全てが減弱された抗原結合活性を示したので、軽鎖のCDR1及びCDR2内の稀な残基の除去が適していないことを示す。
【０２５７】
E.  「稀な」残基の分析
定義上、「稀な」残基は、生殖細胞系配列の対応する集団の中で1%と同等か又はそれより低い頻度でしか現れないものである。
【０２５８】
225.28S VH配列では、2つの「稀な」残基：88位のグリシン及び94位のセリン、が見つかっている。88位のグリシンを、「頻繁な」ヒト残基であるアラニンによって置き換えることができる。94位のセリンを、トレオニンによって置き換えることができるが、アルギニン又はアラニンによって置き換えることができないようだ。正準な残基に関する表集計データは、Kabatの94位のアラニン及びアルギニンが、セリンが存在する時のようにCDR1内に同じ正準なループ立体構造をもたらすだろうと予測するだろう（http：//www.rubic.rdg.ac.uk/abeng/canonicals.html）。この見解は、正準なループ構造のみを考慮しており、いくつかの正準な残基に関して；例えば、94位において、観察される抗原結合への潜在的関与を考慮しない（正準のものの分析を参照のこと）。
【０２５９】
F.  ADCC実験の結果
図6は、ヒトPBMC細胞を介した抗体媒介性細胞殺滅における225.28S抗体のヒト化M-HLG/M-KV9構築物の有効性を示す。標的細胞はヒトA2058細胞であり、そして、当業者は抗体媒介性細胞殺滅の大きな増強が分かる。同じ効果が、標的細胞としてヒト平滑筋細胞を使用した時に観察できる。これらの細胞は、初代細胞であり、且つ、腫瘍由来ではない。それらの平滑筋細胞が新生血管系における周皮細胞の前駆細胞の一種であるので、それらは周皮細胞の標的化のためのモデルとなる。実験に関するこれらの間の1つの相違点が注目に値する。メラノーマ細胞が、平滑筋細胞に比べて、PBMC誘導性殺滅に対してより高度な抵抗性を示した。これに関して、抗体とエフェクターを伴った標的のインキュベーションは24時間であったが、平滑筋細胞に関して、ほとんど同じ殺滅が4時間以内に達成された。平滑筋細胞の抗体媒介性細胞殺滅を、図11に示す。
【０２６０】
グリオーマ細胞株LN229に関して、ヒト化抗MCSP抗体の糖操作が、抗体媒介性細胞傷害性（ADCC）の有効性を強力に増強するかもしれないことを明確に示すことができた（図12）。無修飾抗体がいずれの活性もほとんど示さないのに対して、同じ抗体のG2バージョンは、有意水準の標的細胞殺滅を引き起こした。これは、糖操作が、これまで不十分な活性しか示さなかった抗体の効力を増強できることを実証している。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】3種類の重鎖構築物であるM-HHA、M-HHB、及びM-HHC、並びに3種類の軽鎖構築物であるM-KV1、M-KV2、及びM-KV3の結合活性を示す。ヒト化重鎖構築物はマウス軽鎖（mVL）と同時発現させ、そして、ヒト化軽鎖構築物はマウス重鎖（mVH）と同時発現させた。マウスVLと組み合わせた時、M-HKAとM-HHBは、おおむねそれらの結合特性を維持する。対照的に、M-HHCは、その結合能を顕著に失う。M-KV1とM-KV2は、マウスの対応物と比べて、大きく減少した結合活性を示すのに対して、M-KVCは、マウス軽鎖に類似した結合挙動を示す。
【図２】「低相同性」構築物であるM-HLA、M-HLB、及びM-HLCに関する結合データを示す。
【図３】M-HHB重鎖と組み合わせた時の、軽鎖構築物であるM-KV4、M-KV5、M-KV6、M-KV7、M-KV8、及びM-KV9に関する結合データを示す。M-KV4がch-225.28S抗体と比較して、増強された抗原に対する親和性を示したが、M-KV5及びM-KV6は機能的性質を失い、そして、M-KV7はch-225.28Sに類似した結合を示した。
【図４】重鎖構築物であるM-HLE1、M-HLE2、M-HLF、及びM-HLGが軽鎖構築物であるm-KV4と組み合わされた時の抗原結合アッセイの結果を示す。構築物M-HLE1及びM-HLE2は、いくらかの残存結合を示したが、M-HLFはほとんど結合を示さなかった。その一方で、M-HLGは、親抗体であるch-225.28Sよりも、抗原に対して高い親和性を示した。
【図５】M-HHBと組み合わせた時の、軽鎖変異体であるM-KV9の結合を示す。この構築物は良好な結合データを示した。
【図６】ヒトPBMC細胞を使用した抗体媒介性細胞死における225.28S抗体のヒト化M-HLG/M-KV9構築物の異なったグリコフォームの比較を示す。標的細胞はヒトA2058細胞であり、そして、当業者には、野生型抗体と比べて、糖操作された構築物の効能及び有効性の大きな増大がわかる。
【図７】M-HLG重鎖と組み合わせた、軽鎖構築物であるM-KV10、M-KV11、及びM-KVI2の抗原結合挙動の比較を示す。これらの変異体は全て、M-KV9軽鎖構築物と比べて、減弱された結合を示す。M-KV9軽鎖と組み合わされたM-HLD重鎖もまた、この図面に示されている。M-HLDは、完全に不活性な構築物であるM-HLCのTyr27Phe及びThr30Ser変異体である。よって、これら2つの突然変異が、抗原結合活性を部分的に回復させる。これは、ヒト化工程全体に関するこれら2つの残基の重要性を指摘する。
【図８】非糖操作M-HLG/M-KV9 G2ヒト化IgG1 225.28S抗ヒトMCSP抗体のPNGアーゼFにより放出されたFcオリゴ糖のMALDI/TOF-MS特性を示す。1485.5と1647.6m/zの2つの主要ピークは、共に、ハイブリッド分枝フコシル化糖に相当する。
【図９】糖操作M-HLG/M-KV9 G2ヒト化IgG1 225.28S抗ヒトMCSP抗体のPNGアーゼFにより放出されたFcオリゴ糖のMALDI/TOF-MS特性を示す。糖操作は、抗体遺伝子と、β-1,4-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnT-III）触媒能を有する酵素をコードし、且つ、ゴルジ体α-マンノシダーゼII触媒能を有する酵素をコードする遺伝子の、宿主細胞内での同時発現によって行われる。1542.9、1688.7、1704.6、及び1850.5の4つの主要ピークの全てが、それらのフコシル化形態、並びにそれらの非フコシル化形態で存在する複合分枝糖に相当する。
【図１０】GnTIII、及び／又はManII同時発現による糖操作によって影響を受ける可能性がある種々のN結合型オリゴ糖の模式図を示す。
【図１１】M-HLG/M-KV9抗体、標的としてヒト平滑筋細胞（HuSMC）、及びエフェクター細胞としてヒトPBMCを使用した抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を示す。エフェクター／標的の比は25／1であり、且つ、実験の継続時間は4時間であった。
【図１２】糖操作された形態、並びに非糖操作形態（G2）のM-HLG/M-KV9抗体、標的としてヒト神経膠芽腫細胞株LN229、及びエフェクター細胞としてヒトPBMCを使用した抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を示す。エフェクター／標的の比は25／1であり、且つ、実験の継続時間は4時間であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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