(57)【要約】本発明はバーコードによるｄｓＤＮＡ分子の末端標識法ならびに一本鎖突出末端を作製し、一本鎖突出末端を延長し、標識されたｄｓＤＮＡ分子のサイズを制御下に縮小し、アダプター媒介配列決定する、アダプターを媒介した方法を提供する。また、混合物中の複数ｄｓＤＮＡ分子を並行的に目視で配列決定する方法も開示する。
2008515451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子の塩基配列に基づいて前記ｄｓＤＮＡ分子の一つの末端を差別標識する方法であって、
（ａ）少なくとも一つの一本鎖突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子を、直鎖分子の形で提供することと、
（ｂ）各末端にインデックス化分子を有する直鎖連結産物を作るために、少なくとも一つの一本鎖突出末端を有する前記ｄｓＤＮＡ分子と、異なるインデックス化分子のプールとを、ＤＮＡの連結に適する条件でインキュベートすることと、前記プールの前記異なるインデックス化分子は、前記ｄｓＤＮＡ分子の少なくとも一つの突出末端にアニールする相補的一本鎖末端を有すると共に、標識されて互いに区別可能であることと、
（ｃ）ＤＮＡの連結に適する条件下でインキュベートして、工程（ｂ）の直鎖連結産物を環状化することと、
（ｄ）制限酵素が、その認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有し、前記認識部位が、標識される元のｄｓＤＮＡからは誘導されない環状産物の一部分に存在し、前記切断部位が、標識される元のｄｓＤＮＡから誘導される前記環状産物の一部分の内部に位置し、ｄｓＤＮＡ分子の特徴を示す塩基配列を有する一本鎖突出末端を有する直線状のＤＮＡ分子が形成されるように、前記制限酵素で切断し、工程（ｃ）の環状産物を直鎖形にすることと、および、任意選択的に、
（ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの工程を一回以上繰り返す工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記ｄｓＤＮＡ分子が混合物中の複数ＤＮＡ分子の一つであり、混合物中の前記前記複数ｄｓＤＮＡ分子が異なる塩基配列を有し、その複数ｄｓＤＮＡ分子のうちの二つ以上が差別標識される、請求項２に記載の方法。  
【請求項３】
工程（ａ）のｄｓＤＮＡ分子の両末端に一本鎖突出末端が設けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）のｄｓＤＮＡ分子の一方の末端が一本鎖突出末端を有し、他方の末端が平滑末端である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
インデックス化分子のプールが、ｄｓＤＮＡ分子の可能性のあるすべての一本鎖突出末端にアニールし、そして連結するための、所定長さの可能性のあるすべての相補的一本鎖末端を有するインデックス化分子を含むする、前記請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有する制限酵素が、タイプIIａ制限酵素または分断パリンドローム制限酵素である、前記請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって標識されたｄｓＤＮＡ分子を制御下にサイズ縮小する方法であって、
（ａ）標識ｄｓＤＮＡ分子／アダプター連結産物を提供するために、前記標識されたｄｓＤＮＡ分子と、プールの異なるアダプター分子とをＤＮＡの連結に適する条件で、インキュベートすることであって、
プールの異なるアダプター分子が、
（i）インデックス化分子から誘導される標識に対して遠位にあるｄｓＤＮＡ分子の突出
末端にアニールする相補的一本鎖末端と、
（ii）認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有する制限酵素の認識部位とを有し、
工程（ａ）（ii）の制限酵素の切断部位は、標識されたｄｓＤＮＡ分子から誘導される標識ｄｓＤＮＡ分子／アダプター連結産物の一部分に配置されることと、
（ｂ）アダプター分子を除去して、標識されたｄｓＤＮＡ分子の長さを、核酸塩基の制御された数だけ減らすため、工程（ａ）（ii）の前記制限酵素を使って前記標識ｄｓＤＮＡ分子／アダプター連結産物を切断することと、
（ｃ）制御下にサイズをさらに減らすため、工程（ａ）および（ｂ）を一回以上繰り返す工程とを含む方法。
【請求項８】
前記標識されたｄｓＤＮＡ分子が、混合物中の複数の標識されたＤＮＡ分子のうちの一つであり、前記標識されたｄｓＤＮＡ分子は異なる塩基配列を有し、かつ複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子の二つ以上の長さが、制御された塩基数だけ縮小される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
異なるアダプター分子のプールが、ｄｓＤＮＡ分子の可能性のあるすべての一本鎖突出末端にアニールし、そして連結するための、所定長さの可能性のあるすべての相補的一本鎖末端を有するアダプター分子を含むする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有する制限酵素が、タイプIIａ制限酵素または分断パリンドローム制限酵素である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって標識されたｄｓＤＮＡの一つまたは複数の塩基を決定するための方法であって、
（ａ）標識されたｄｓＤＮＡ分子／配列決定アダプター連結産物を提供するために、前記標識されたｄｓＤＮＡ分子と、異なる配列決定アダプター分子のプールとをＤＮＡの連結に適する条件でインキュベートすることであって、前記プールの前記異なる配列決定アダプター分子は、インデックス化分子から誘導される標識に対して遠位置の前記ｄｓＤＮＡ分子の突出末端にアニールする相補的一本鎖末端を有し、前記異なる配列決定アダプター分子のそれぞれが、差別標識されることと、
（ｂ）工程（ａ）で、標識されたｄｓＤＮＡ分子に連結された配列決定アダプターを検出し、その検出された配列決定アダプターに基づいて、標識されたｄｓＤＮＡ分子の一つまたは複数の塩基を決定することと、を含む方法。
【請求項１２】
標識されたｄｓＤＮＡ分子のサイズが、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法により、制御された方法で縮小されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識されたｄｓＤＮＡ分子が、異なる塩基配列を有する、混合物中の複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子の一つであり、前記複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子の二つ以上に対して、一つまたは複数の核酸塩基が決定される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
塩基配列が異なるｄｓＤＮＡ分子の混合集合体中の、二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の塩基配列の、少なくとも一部分を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって、前記混合集合体に含まれる前記二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の一つの末端を差別標識することと、
（ｂ）請求項７〜１０のいずれかに記載の方法によって、混合集合体中に含まれる差別標識されたｄｓＤＮＡ分子を制御下にサイズ縮小することと、
（ｃ）制御下にサイズ縮小した試料中の二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡに対して、一つまたは複数の核酸塩基を、アダプター媒介配列決定法によって決定することと、を含む方法。
【請求項１５】
各試料中の標識されたｄｓＤＮＡ分子が、異なる程度に、制御下サイズ縮小を受けた少な
くとも二つ以上の試料中の、前記二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡ分子に対して一つまたは複数の核酸塩基が決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
制御下サイズ縮小を複数ラウンド行い、制御下縮小の各ラウンドごとに前記の決定を行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
制御下サイズ縮小を行うため、工程（ａ）で作製された差別標識されたｄｓＤＮＡの混合集合体を個々のプールに分離し、各プールを異なる程度に制御下サイズ縮小にかける、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
単一プールに対して、制御下サイズ縮小を複数ラウンド行い、制御下サイズ縮小ラウンドの少なくとも一ラウンドを終えたあとで、前記プールから試料を採取し、試料中の標識されたｄｓＤＮＡ分子に対して一つまたは複数の核酸塩基を決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
塩基配列が異なるｄｓＤＮＡ分子の混合集合体中の二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の、少なくとも部分的塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の方法により、前記混合集合体中の前記二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の、一つの末端を差別標識することと、
（ｂ）その中の標識されたｄｓＤＮＡを制御下にサイズ縮小するため、工程（ａ）で差別標識された産物を二つ以上のプールに分離することと、
（ｃ）請求項７〜１０に記載の方法により、工程（ｂ）で作られた分離プールを、異なる回数制御下サイズ縮小ラウンドにかけ、分離プールのそれぞれに対して、制御下サイズ縮小を行うことと、
（ｄ）工程（ｃ）で作られたサイズ縮小ｄｓＤＮＡ分子の各分離プールに対して、アダプター媒介配列決定法を使用し、二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡ分子に対する一つまたは複数の核酸塩基を決定することと、
を含む方法。
【請求項２０】
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの一つの鎖にニックを入れることを含む前記ｄｓＤＮＡ上に一本鎖突出末端を提供する方法であって、
（ａ）前記第一の末端に、ニック形成エンドヌクレオダーゼの認識部位を有する二本鎖アダプター分子を連結し、連結後、前記ニック形成エンドヌクレオダーゼに対するニック形成部位が、ｄｓＤＮＡ分子に由来する連結産物の一部分に配置されることと、
（ｂ）連結産物と前記ニック形成エンドヌクレオダーゼとをインキュベートして、一本鎖にニックを作ることと、
（ｃ）ニックの部位から所定位置まで延びる前記ニックを有する鎖の一本鎖フラグメントが解離して、７、８または９個の塩基を有する一本鎖突出末端をあとに残すように、所定位置で二本鎖アダプター分子を切断することと、を含む方法。
【請求項２１】
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子上の一般鎖突出末端を延長する方法であって、
（ａ）延長アダプター分子を一般鎖突出末端に連結することであって、延長アダプター分子はニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を有するか、または前記ＤＮＡ分子に連結するときに、ニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を形成するように設計されており、ｄｓＤＮＡ分子に連結させたあと、前記ニック形成エンドヌクレアーゼのニック部位はｄｓＤＮＡ分子に由来する連結産物の一部分の中に配置されること、
（ｂ）ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖にニックを入れるために、工程（ａ）の連結産物と、前記ニック形成エンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニック形成エンドヌクレアーゼとをインキュベートすることと、
（ｃ）ｄｓＤＮＡ分子が、第二の鎖の延長アダプターから誘導される塩基配列に連結した
まま残るように、そして第一の鎖の切断点とニック部位との間の塩基配列が解離して、延長された一本鎖突出末端部分が残るように、所定位置で延長アダプターを切断することと、を含む方法。
【請求項２２】
延長アダプターの切断が、ニック形成エンドヌクレアーゼとインキュベートする前に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
延長アダプターの切断が、ニック形成エンドヌクレアーゼとインキュベートした後に行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
延長アダプターが、制限エンドヌクレアーゼで切断するために、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むよう設計することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
延長アダプターの切断が制限エンドヌクレアーゼで行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
延長アダプターが所定切断位置にｄＵＴＰを含み、切断はウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを作用させて行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子上の一本鎖突出末端を延長する方法であって、
（ａ）前記一本突出を延長アダプター連結し、前記延長アダプターが
（i）タイプII制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有し、そして
（ii）タイプIIエンドヌクレアーゼ認識部位とｄｓＤＮＡ分子に連結される延長アダプターの末端との間に、ニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を有するか、または
（iii）ｄｓＤＮＡ分子に連結するとき、タイプIIエンドヌクレアーゼ認識部位とｄｓＤ
ＮＡ分子との間に、ニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を形成するように設計され、
延長アダプターを前記一本鎖突出部分分に連結し、連結後、前記ニック形成エンドヌクレアーゼに対する部位は、ｄｓＤＮＡ分子に由来する連結産物の一部分の中に配置されることと、
（ｂ）ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖にニックを入れるために、工程（ａ）の連結産物と、前記ニック形成エンドヌクレアーゼ認識部位を認識するニック形成エンドヌクレアーゼとをインキュベートすることと、
（ｃ）ニックを入れた工程（ｂ）の連結産物と、前記タイプII制限エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する前記タイプII制限エンドヌクレアーゼとを、インキュベートすることと、を含み、
工程（ｂ）と（ｃ）の順序は任意選択的に入れ替え可能である、方法。
【請求項２８】
インデックス化分子、アダプターまたは配列決定アダプターにアニールし、そして連結するための少なくとも一つの一本鎖突出末端が請求項２０に記載の方法によって作製されるか、または請求項２１〜２７のいずれかに記載の方法によって延長される請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ分子の塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）剪断または制限ヌクレアーゼで消化することにより、ＤＮＡ分子をランダムに切断してフラグメントにすることと、
（ｂ）工程（ａ）で作られたフラグメントの任意の付着末端を穴埋めして平滑末端を作製することと、
（ｃ）インデックス化用延長付着末端を作製するに適した制限部位を有する延長アダプターをフラグメントの末端に連結することと、
（ｄ）アダプター連結フラグメントによって共有された不変末端を提供するために、制限
エンドヌクレアーゼのアダプター連結フラグメントを切断することと、
（ｅ）ＰＣＲプライマー結合部位を提供するために、アダプターを前記不変部位に連結することと、
（ｆ）アダプター連結不変末端に対して遠位にインデックス化用延長付着末端を提供するように、延長アダプターに認識部位が存在する制限酵素でアダプター連結フラグメントを切断することと、
（ｇ）配列決定アダプターのプールに連結することにより、前記延長付着末端をインデックス化することであって、前記配列決定アダプターのプールは、末端延長法によってＤＮＡ分子に露出された可能な付着末端に相補的な付着末端を有するアダプターを含み、異なる配列アダプターのそれぞれは、プール中の他のアダプターから検出可能に識別する手段を有することと、
（ｈ）電気泳動でフラグメントを分離し、長さが異なるフラグメントに連結された個々の配列決定アダプターを決定することと、を含む方法。
【請求項３０】
前記検出可能に識別する手段が識別可能な標識である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記識別可能な標識が蛍光標識である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能に識別する手段がＰＣＲプライマー結合部位を含む、請求項２９〜３１に記載の方法。
【請求項３３】
長さが異なるフラグメントに連結させた配列決定アダプターの決定がＰＣＲ分析で行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
複数の起源から採取された試料が、多重検定の形で一斉に分析される、請求項２９〜３３のいずれかに記載の方法であって、たとえば、個々の起源を同定するインデクサーが、プールされる前の個々の試料に連結される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の標識化および配列決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
一つまたは複数の核酸における一つまたは複数のヌクレオチドの決定は、生物系の有用かつ価値ある理解に重要な役割を果たしている。塩基配列の決定方法は解析の律速となっているうえに、その実施には費用がかかる。
【０００３】
信頼性の高い塩基配列決定法が１９９７年に初めて報告されて以来（非特許文献１、参照により本明細書に組み込まれる）、その使用は指数関数的に増加している。これらの方法は、使いやすさ、処理量、信頼性およびコストの点で、配列の読み取りの効率および効果を高めるため、絶えず精密化が図られ、あるいは新しい方法が導入されている。革新的技術として、たとえば、自動化、新たな別の化合物、読み取りを自動化するための放射能に代わる別の標識方法、たとえば蛍光標識、固相法などを利用する化学の自動化、毛管電気泳動法、質量分析法および微小流動技術などを利用する新たな分離技術が、それぞれ単独で、あるいは組み合わせの形で使用されている。処理量を高めるためには同時並行アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ）が使用されている。新たなアプローチとしてハイブリダイゼーションとアレイによる配列決定を挙げることができるが、これらの手法は、現在なお開発あるいは精密化が進められている。
【０００４】
一分子法（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ）が処理量の増加とコストの低減の観点から、究極の結果をもたらす可能性を有することは、早くも１９８９年には認識されていた。原子間力顕微鏡のような装置との相互作用を利用する核酸の分析や、ナノポアを利用した電気泳動法による核酸の分析など、生物物理学的方法が開発されている。レーザーやその他のツール、たとえば分子ロープ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｔｈｅｒｓ）や分子レーザーが、分析対象の単一分子を酵素操作によって固定化し、反応生成物を記録するために使用されている。記録装置および／または標識によって検出感度を高める努力もつづけられている。核酸の分析操作の効率を高めようと、特に人工基質に対する許容性が要求される酵素の設計にも工夫が加えられている。分析と検出は一つの装置で行われるのが普通であるが、そのことが処理量を律速段階までに制限している。
【０００５】
塩基配列を決定するほとんどの方法に共通する段階は、フラグメントの末端のヌクレオチドを記録することである。ヌクレオチド＋１配列を決定するには、末端の内側にあるヌクレオチドを、同定のために繰り返し末端に移動させる。ヌクレオチドの同定は、ポリメラーゼとエキソヌクレアーゼのいずれを作用させて行うこともできる。ポリメラーゼの使用は、修飾ヌクレオチドを合成過程で組み込むことができるという利点がある。ポリメラーゼは、テンプレートに依存する形でヌクレオチド鎖の成長を制御することができる。そのうえ、修飾ヌクレオチドは、たとえば適切な標識を行うことで、記録しやすくすることができる。エキソヌクレアーゼによる切断法は、任意選択的に標識されているヌクレオチドをエキソヌクレアーゼで切断するポリメラーゼ法の中心をなすものである。記録は切断を行う直前か直後に行われる。生物物理学的方法は、ヌクレオチド鎖を一度に一塩基ずつ動かしながらヌクレオチド記録計を通過させるか、または記録計の方をヌクレオチド鎖に沿って移動させる。
【０００６】
フラグメント末端で配列を標識するにはリガーゼが使用されている（特許文献１、参照により本明細書に組み込まれる）。典型的には、末端に付着末端を形成させ、その付着末端にアダプター分子を連結させる。各付着末端に特異的なアダプター分子が複数使用可能
であることで、末端の実際の塩基配列が決定できる。このような方法にはいくつかの利点がある。各付着末端は、典型的には複数個のヌクレオチドの長さがあるため、末端当たり一度に複数個のヌクレオチドを同定することができる。対象となる次のヌクレオチドの露出は、タイプ１１ｓ制限エンドヌクレアーゼの作用を通して行われ、その部位は、検査対象フラグメントの切断で所要塩基が末端に残るように、検出に使用されるアダプターに置かれる（特許文献２、参照により本明細書に組み込まれる）。それゆえ、このプロセスは、切断と連結のサイクルが、体系的に対象フラグメントを進むという点で、操作の進行を大幅に速めることができる。ポリメラーゼまたはエンドヌクレアーゼの反応は制御がはるかに困難であり、正確な反応混合物、典型的にはレーザーを使って行われる個々の分子の操作、あるいは連鎖停止剤として使用され化学修飾時には鎖のさらなる延長を可能にする精密な修飾が施されたヌクレオチドを必要とする。大量の並行配列決定が切断と連結の反復操作によって行われている（たとえば非特許文献２、参照により本明細書に組み込まれる）。これは手のこんだプロセスであり、混合物中の各対象フラグメントは、まず、それ自身のハイブリダイゼーション可能な固有のタグで標識される。複数個のビーズが使用され、各ビーズには、ハイブリダイゼーションによって、フラグメントの標識に使用された一種類のタグだけを捕捉できる固有のオリゴヌクレオチドの複数コピーが取り付けられている。したがって、各フラグメントは特定ビーズによって固有に取り込まれる。フラグメントをあらかじめ増幅することにより、所定フラグメントの複数の例をビーズが捕捉できるようになり、検出が容易になる。次に、ビーズに対して、切断、連結、検出の反復プロセスを実行し、それぞれから固有のヌクレオチド配列の読み取りが行われる。一つの分析ラウンドから次の分析ラウンドに移るときには、ビーズの位置をたどらなければならない。
【０００７】
ハイスループット配列決定も、ポリメラーゼを使った配列決定法で行われている。対象ヌクレオチド鎖は平坦な表面に無作為に固定される。一つの固定鎖当たり一つの一本鎖ヌクレオチドを組み込むには、テンプレート合成が使用される。プロセスを実行できるようにするには、組み込まれたヌクレオチドの手のこんだ修飾が必要である。鎖当たり最初のヌクレオチドが一たび組み込まれると、鎖の延長を防止するために一つの修飾タイプが必要である。組み込まれたヌクレオチドを同定可能にするにはヌクレオチド上に標識が必要である。この標識は、固定化された単一分子であっても検出可能できるよう十分な明るさを有しなければならない。検出終了後、組み込みヌクレオシドを化学修飾することで、さらにこのあとの検出ラウンドのために行われる、次のヌクレオチドの取り込みが可能となる。複数ラウンドの実行によって大量の配列決定が可能となるが、それには単一分子の位置をそれぞれたどる必要がある。複雑な核酸を分析するのは長い配列を決定できることが有益である。それは、複雑な核酸では短い配列が何回も現れ、そしてそれらは、このプロセスにより短いと判定された場合は、識別することが困難だからである。このプロセスで十分な長さの配列が得られない各単一分子は、分析対象からはずさなければないため、すぐ上に述べたプロセスには特別な要求がだされる。失敗の理由として修飾ヌクレオチドの純度が１００％でない、また組みこみ効率が１００％未満、修飾効率が１００％未満である可能性が考えられる。固定化分子から配列を決定するということは、化学修飾が完了しなければ、分子ごとの検出ラウンドが進まないことを意味し、それゆえ、化学サイクルの持続長さが、最終的には一分子当たりの配列作製速度を決定することを意味する。上記ＭＰＳＳの速度が、固体支持体、そしてこの場合はビーズ上での切断速度と連結（連結）速度によって決まる点を除けば、ＭＰＳＳでも同様の問題がある。さらに、ＭＰＳＳは、連結速度も制限も１００％ではなく、特定のビーズ上の分子は、それが存在しているとされているプロセスのサイクルに関して、相から脱落する傾向があるという不利点もある。最終的には、このことが、信頼性のあるデータを得ることができるサイクル数を制限し、そのため、得ることができるフラグメント当たりの配列の大きさを制限する。
【特許文献１】ＷＯ第９４／０１５８２号
【特許文献２】ＷＯ第９５／２００５３号
【非特許文献１】Ｓａｎｇｅｒら、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９７７）  ７４（１２）  ５４６３−７
【非特許文献２】Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１８巻、６３０〜６３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は先行技術の問題点を克服する方法を追求し、核酸をその配列そのものに従って標識可能な方法を提供する。それゆえ、大量並行処理の形で、新規の核酸および／または既知の核酸を比較し、配列決定することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの実施形態では、本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）の一つの末端を、その塩基配列に基づいて差別標識（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）する方法を提供する。この方法は：
（ａ）少なくとも一つの一本鎖突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子を、直鎖分子の形で提供する工程と、
（ｂ）各末端にインデックス化分子を有する直鎖連結産物を作るために、少なくとも一つの一本鎖突出末端を有する前記ｄｓＤＮＡ分子と、異なるインデックス化分子のプールとを、ＤＮＡの連結に適する条件でインキュベートする工程と、前記プールの前記異なるインデックス化分子は、前記ｄｓＤＮＡ分子の少なくとも一つの突出末端にアニールする相補的一本鎖末端を有すると共に、標識されて互いに区別可能であることと、
（ｃ）ＤＮＡの連結に適する条件下でインキュベートして、工程（ｂ）の直鎖連結産物を環状化する工程と、
（ｄ）制限酵素が、その認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有し、前記認識部位が、標識される元のｄｓＤＮＡからは誘導されない環状産物の一部分に存在し、前記切断部位が、標識される元のｄｓＤＮＡから誘導される前記環状産物の一部分の内部に位置し、ｄｓＤＮＡ分子の特徴を示す塩基配列を有する一本鎖突出末端を有する直線状のＤＮＡ分子が形成されるように、前記制限酵素で切断し、工程（ｃ）の環状産物を直鎖形にする工程と、および任意選択的に、
（ｅ）（ｂ）から（ｄ）までの工程を一回以上繰り返す工程と、を含む。
【００１０】
一つの実施形態では、上記方法は、塩基配列が異なる複数のｄｓＤＮＡ分子を含む混合物中の二つ以上のｄｓＤＮＡ分子を差別標識するために使用することができる。このような方法は、塩基配列によって個別に同定し、分類される混合物中の個々のＤＮＡ分子を提供する利点を有する。個々のＤＮＡ分子を同定し終わったら、配列分析のようなさらに別の特性分析を実行することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡの両末端に一本鎖突出末端を設けることができる。さらに別の実施形態では、ｄｓＤＮＡ分子の一方の末端は一本鎖突出末端を有し、他方の末端は平滑末端である。
【００１２】
インデックス化分子のプールは、ｄｓＤＮＡ分子の可能性のあるすべての一本鎖突出末端にアニールし、そして連結するための、所定長さの可能性のあるすべての相補的一本鎖末端を有するインデックス化分子を包含してもよいし、インデックス化分子の中から選択したグループ全体のサブセットであってもよい。
【００１３】
一つの実施形態では、本発明の方法により標識されたｄｓＤＮＡ分子は、標識末端よりも先端側の端部のアダプター配列決定にかけることができる。このようなアダプター配列
決定は、以下でさらに論じるように、標識した分子に対して直接適用することもできるし、標識した分子のフラグメントに適用することもできる。以下でさらに詳しく論じるが、既知のサイズと末端配列を有するフラグメントが使用されるために、フラグメントは、アダプターが媒介して制御される一回以上のサイズ縮小ラウンドによって形成させることもできるし、ランダムなフラグメント化および制限消化と、それにつづくサイズの精製とによって形成させることもできる。
【００１４】
したがって、さらに別の実施態様において、本発明は、本明細書に開示する方法によって標識されたｄｓＤＮＡ分子のサイズを制御下に縮小する方法を提供する。制御下にサイズを縮小する方法は：
（ａ）標識ＤＮＡ分子／アダプター連結産物を提供するために、標識されたｄｓＤＮＡ分子と、プールの異なるアダプター分子とをＤＮＡの連結に適する条件で、インキュベートする工程であって、
プールの異なるアダプター分子が、
（i）インデックス化分子から誘導される標識に対して遠位にあるｄｓＤＮＡ分子の突出
末端にアニールする相補的一本鎖末端と、
（ii）認識部位から物理的に離れた位置に切断部位を有する制限酵素の認識部位とを有し、
工程（ａ）（ii）の制限酵素の切断部位は、標識されたｄｓＤＮＡ分子に由来する標識ｄｓＤＮＡ分子／アダプター連結産物の一部分に配置される工程と、
（ｂ）アダプター分子を除去して、標識されたｄｓＤＮＡ分子の長さを、核酸塩基の制御された数だけ減らすため、工程（ａ）（ii）の前記制限酵素を使って前記標識ｄｓＤＮＡ分子／アダプター連結産物を切断する工程と、
（ｃ）制御下にサイズをさらに減らすため、工程（ａ）および（ｂ）を一回以上繰り返す工程とを含む。
【００１５】
一つの実施形態では、サイズの縮小を受ける標識されたｄｓＤＮＡは、混合物中に存在する複数の標識されたＤＮＡ分子の一つであり、混合物中の前記複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子は異なる塩基配列を有し、複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子のうち二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡ分子の長さが、制御された塩基数だけ減らされる。
【００１６】
上記で概要を説明した制御下のサイズ縮小法は、長さの異なる標識フラグメントを形成させるために使用できる。次に、これらの個々の標識フラグメントに対する配列情報は、フラグメントを配列特異的アダプターに露出させることで決定できる。
【００１７】
したがって、さらに別の実施態様において、本発明は、本明細書の記載にしたがって標識されたｄｓＤＮＡ分子の一つまたは複数の塩基を決定する方法を提供する。この方法は：
（ａ）標識されたｄｓＤＮＡ分子／配列決定アダプター連結産物を提供するために、前記標識されたｄｓＤＮＡ分子と、異なる配列決定アダプター分子のプールとをＤＮＡの連結に適する条件でインキュベートする工程と、前記プールの前記異なる配列決定アダプター分子は、インデックス化分子から誘導される標識に対して遠位置の前記ｄｓＤＮＡ分子の突出末端にアニールする相補的一本鎖末端を有し、前記異なる配列決定アダプター分子のそれぞれが、差別標識される）、
（ｂ）工程（ａ）で、標識されたｄｓＤＮＡ分子に連結された配列決定アダプターを検出し、その検出された配列決定アダプターに基づいて、標識されたｄｓＤＮＡ分子の一つまたは複数の塩基を決定する工程と、を含む。
【００１８】
本発明の一つの実施形態では、異なる配列アダプター分子と一緒にインキュベーションする標識されたｄｓＤＮＡ分子は、本明細書に記載するサイズ縮小方法によって、制御下
に鎖長縮小される。
【００１９】
さらに別の実施形態では、ｄｓＤＮＡ分子の一つまたは複数の塩基を決定する方法は、混合物中の複数の標識されたＤＮＡ分子の一つであるｄｓＤＮＡ分子に実施され、混合物の前記複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子は異なる核酸配列を有し、前記複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子の二つ以上に対して一つまたは複数の核酸塩基が決定される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、たとえば、配列情報がわかっていない場合は、配列決定アダプター分子のプールは、ｄｓＤＮＡ分子の突出末端にアニールするための可能性のあるすべての相補的一本鎖末端を有する分子を含むことになる。別の実施形態では、これらの相補的一本鎖末端のうち、対象となる適用に必要な相補的一本鎖末端のみが使用される。たとえば、この方法が、既知の多形を決定または区別するために使われる場合は、その既知の多形配列にアニールするために必要な数の配列アダプター分子しか必要でない。同様に、この方法を対立遺伝子のインバランス等の特徴の検出に使用しようとする場合も、やはり特徴の検出に必要な数の配列決定アダプターしか必要ではない。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、塩基配列が異なるｄｓＤＮＡ分子の混合集合体（ｍｉｘｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中に含まれる二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の、少なくとも一部の塩基配列を決定する方法を提供する。本発明のこの実施態様による方法は：
（ａ）本明細書に記載の方法によって、前記混合集合体に含まれる前記二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の、一つの末端を差別標識する工程と、
（ｂ）本明細書に記載の方法によって、混合集合体に含まれる差別標識されたｄｓＤＮＡ分子を制御下にサイズ縮小する工程と、
（ｃ）制御下にサイズ縮小した試料中の二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡに対して、一つまたは複数の核酸塩基を、本明細書に記載するアダプター媒介配列決定法によって決定する工程と、を含む。
【００２２】
一つの実施形態では、各試料中の標識されたｄｓＤＮＡ分子を制御下に異なる程度にサイズ縮小にかけた少なくとも二つの試料に含まれる二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡ分子に対して、一つまたは複数の核酸塩基が決定される。いくつかの事例において、制御下に行われるサイズ縮小の程度は、標識されたｄｓＤＮＡ分子の集合体を、制御下に複数回サイズ縮小を繰り返すことで制御される。それゆえ、いくつかの実施例では、制御下のサイズ縮小が複数回行われ、一回行うたびに得られるサイズ縮小試料について、二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡ分子に対して一つまたは複数の核酸塩基が決定される。
【００２３】
いくつかの実施例では、制御下にサイズ縮小を行うため、差別標識されたｄｓＤＮＡ分子の混合集合体が、個々のプールに分けられ、各プールは制御下のサイズ縮小に異なる程度を受ける。別の実施形態では、一つのプールについて、制御下のサイズ縮小が複数回行われ、制御下のサイズ縮小が少なくとも一回行われたあとで、そのプールから試料が採取され、その中に含まれる二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡに対して、少なくとも一つまたは複数の核酸塩基が決定される。いくつかの実施形態では、制御下にサイズ縮小が実施されるたびに、プールから試料が採取され、その中に含まれる二つ以上の標識されたｄｓＤＮＡに対して、少なくとも一つまたは複数の核酸塩基が決定される。
【００２４】
本明細書に記載されているように、塩基配列が異なるｄｓＤＮＡ分子の混合集合体に含まれる二つ以上のｄｓＤＮＡ分子の少なくとも部分的な塩基配列を決定するための本発明の方法は、その配列に応じてＤＮＡ分子を分離する必要がなく、一つの試料に含まれる多数の異なるＤＮＡ分子の塩基配列を、一度に、迅速かつ容易に分析することを提供する。配列の決定は純粋に目視によって行うこともできるし、適当なアルゴリズムを使ったコンピューターシステムによるデジタル画像処理手段を使用してもよい。
【００２５】
さらに別の実施態様において、本発明は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子の一つの鎖にニックを設けることと、そのニックを入れた鎖からの一本鎖フラグメントであり、かつ第一末端からニックまで延びるフラグメントを、前記ＤＮＡ分子から解離することを含む、前記二本鎖ＤＮＡ分子に一本鎖突出末端を提供する方法を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では、ニックは、ｄｓＤＮＡ分子に二本鎖アダプター分子を連結することによって作ることができる。たとえば、一つの鎖だけが、連結によってｄｓＤＮＡ分子と共有結合し、もう一つの鎖にはニックができる修飾アダプター分子を使用することができる。代替実施形態では、アダプター分子は、連結時にニックを形成するエンドヌクレアーゼ認識部位がアダプター内にあり、それと同種のニック形成部位が、元のｄｓＤＮＡ分子中にあるように、設計してもよい。
【００２７】
さらに別の実施態様において、本発明は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子の一本鎖突出末端を延長するための方法を提供する。本発明のこの実施態様による方法は：
（ａ）延長アダプター分子を、前記一本鎖突出末端に連結することと、延長アダプター分子は、ニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を有するか、または前記ｄｓＤＮＡに連結させるときにニック形成エンドヌクレアーゼの認識部位を形成するように設計され、形成エンドヌクレアーゼの同族ニック部位はなく、ｄｓＤＮＡに連結させたあと、前記ニック形成エンドヌクレアーゼのニック部位は、ｄｓＤＮＡ分子に由来する連結産物の一部分の中に配置されることと、
（ｂ）ニックをｄｓＤＮＡ分子の第二の鎖でなく第一の鎖に入れるため、工程（ａ）の連結産物と、ニック形成エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する前記ニック形成エンドヌクレアーゼとをインキュベートすることと、
（ｃ）ｄｓＤＮＡ分子が、第二の鎖の延長アダプターから誘導される塩基配列に連結されたまま残るように、そして第一の鎖の切断点とニック部位との間の塩基配列が解離して、延長された一本鎖突出部分が残るように、所定位置で延長アダプターを切断すること、とを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、延長アダプターの切断はニック形成エンドヌクレアーゼとインキュベートする前に行われ、別の実施形態では、延長アダプターの切断はニック形成エンドヌクレアーゼとインキュベートした後に行われる。切断は酵素の作用で行ってもよいし、あらかじめ決められた所望の位置でフラグメンテーションを起こす別の方法で行ってもよい。このように、制限酵素によって所定の部位で切断する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように延長アダプターを設計することができ、そうすれば、その制限酵素の作用によってその部位で、延長アダプターの切断を行うことができる。別の実施形態では、延長アダプターは、所定切断部位にｄＵＴＰを含むように合成され、そうすれば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）を作用させてその部位で切断することができる。
【００２９】
二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子上で一本鎖突出末端を延長させる上に定義した方法は、たとえば、相補的突出末端を有する分子に、きわめて忠実に連結することができるｄｓＤＮＡ分子の突出末端を作るのに有用である。それゆえ、特に、本発明の一つの実施形態では、インデックス化分子、アダプターまたは配列決定アダプターにアニールし、そして連結用のｄｓＤＮＡ分子の延長一本鎖突出末端を作製するために上記延長法が使用される。したがって、任意選択的に、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端は、上記方法によって延長され、そのあとつづいて、本明細書に記載の差別的標識化、サイズ縮小および配列決定の各方法のいずれか一つ、またはこれらの方法の組み合わせを受ける。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下では、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子の一方の末端を標識する方法、そしてそのように
して標識されたｄｓＤＮＡ分子の長さを制御下に短縮する方法、およびそのようにして標識されたｄｓＤＮＡ分子の一つまたは複数の核酸塩基を決定する方法をさらに詳しく述べる。さらに、ｄｓＤＮＡ分子の混合集合体に対して、一つの末端を一斉に差別標識し、それから配列決定する方法についても述べる。本発明の方法の基本は、さまざまな分子を、対象ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端にアニールし、そして連結（ライゲーション）することにある。さらに、本発明は、たとえば、忠実性の向上した耐熱性ＤＮＡリガーゼ酵素を使用できる突出末端延長法も提供する。
【００３１】
本発明のさまざまな実施態様および実施形態では、アダプター様分子が、対象となる１つのもしくは複数のｄｓＤＮＡ分子に連結される。明解な記述をするため、本明細書に限って、アダプター様分子（ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を説明するために使用される用語は、記載されているそのアダプター様分子の機能によって変化する。たとえば、ｄｓＤＮＡ分子の末端標識に関連する方法に関する記述の中では、アダプター様分子は、「インデックス化分子」を意味する。制御下でのサイズ縮小法に関する記述の中では、「アダプター」という用語が使われ、配列決定法および核酸塩基決定法に関する記述の中では、「配列決定アダプター」という用語が使用される。一本鎖突出末端を延長するための方法に関する記述の中では、「延長アダプター」という用語が使われる。用語が単に違うだけでは構造的な違いを意味するものではなく、当業者であれば容易にわかることと思うが、状況によっては、構造的特徴が共通するアダプター様分子が、上で述べた一つまたは複数の目的に使用されることがある。総称的用語である「アダプター様分子」および「アダプターによって媒介される」という表現は、上で機能的に定義された種（ｓｐｅｃｉｅｓ）またはその用途のいずれをも意味するものである。
【００３２】
さまざまな実施態様および実施形態では、たとえばタイプII、タイプIIｓ、ニック形成酵素、分断されたパリンドローム制限酵素、耐熱ＤＮＡリガーゼ酵素およびその他のＤＮＡリガーゼ酵素など（ここに列挙したものに限定されるものではない）、いくつかの酵素が使用される。特に断らない限り、このような酵素の使用条件はメーカーの説明書に記載されている条件か、あるいは当業者が容易に決定できる条件である。
【００３３】
本発明は、ｄｓＤＮＡ分子の差別標識（「タギング」または「インデックス化」とも呼ばれる）を、その塩基配列に基づいて提供する。本発明の標識法は、突出一本鎖末端を有する直鎖の形で供給されるｄｓＤＮＡ分子の各末端に、インデックス化分子を一回以上にわたって付加することを含む。インデックス化分子を付加したのち、二つのインデックス化分子を一体化するため、アダプターを連結した分子を環状化し、それから、両末端に一本鎖突出末端を有し、そのうちの一方の末端に対して近い位置に二つのインデックス化分子が一体として配置された直鎖分子を提供するよう直鎖化される。一本鎖突出末端は、元のｄｓＤＮＡ分子に由来する配列を有している。このあと、インデックス化分子への連結、環状化および直鎖化のラウンドをつづけることにより、さらにインデックス化分子をｄｓＤＮＡ分子の一方の末端に、あるいは末端近くに追加付加させることができる。
【００３４】
標識化の特異性は、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端の認識によってもたらされる。本発明の方法によれば、ラウンドのたびに（実施例によっては最初のラウンドとは限らない）ｄｓＤＮＡに、ｄｓＤＮＡ分子から誘導され、それゆえその特徴を備えた、配列を有する一本鎖突出末端が供給される。次に、異なるインデックス化分子のプールで連結が行われる。プールの中のインデックス化分子が異なれば、ｄｓＤＮＡ突出末端にアニールする一本鎖突出末端も異なり、インデックス化分子は、それらの一本鎖突出部分の配列に依存して認識できるように差別標識される。したがって、プールのインデックス化分子を連結すると、ｄｓＤＮＡ分子に組み込むため、そのｄｓＤＮＡ分子の配列に基づいて、差別標識されたインデックス化分子の選択が行われる。
【００３５】
上で指摘したように、本発明の末端標識法を一回行うだけで、二つのインデックス化分子が、ｄｓＤＮＡの、その一方の端に近い位置に組み込まれる。インデックス化分子のプールで連結するためのターゲットにされる一本鎖突出末端の配列によって、二つのインデックス化分子上の標識は同じであってもよいし、異なっていてもよい。末端標識法のそのあとのラウンドでは、直鎖分子化する過程で露出された核酸塩基配列によって選択されるさらなるインデックス化分子の組み込みが行われる（詳細はあとで述べる）。このようにして、インデックス化分子は、一緒になって、すでに組み込まれている個々のインデックス化分子上に存在する標識のそれぞれを含むバーコードと性質の似た複雑な標識を発生する。バーコード中の標識の具体的な配列は、ｄｓＤＮＡ分子に組み込まれるインデックス化分子の順序を示し、そのため、ｄｓＤＮＡ分子の配列の少なくとも一部分を示す。バーコード標識は目視か、あるいは以下で詳しく述べるその他のパターン認識手段によって識別することができる。
【００３６】
ｄｓＤＮＡ分子の一つの端にバーコードをつけることで分子配列の確認または同定が可能になる。さらに、集合体の中の異なるｄｓＤＮＡ分子は、本発明の方法によって同時に標識でき、その後はバーコードを使って、それらの塩基配列の違いにより認識したり識別したりすることができる。バーコード化と本発明の別の方法とを組み合わせれば、一つの混合物中にある多くの異なるｄｓＤＮＡ分子の配列を目視によって迅速かつ同時に決定することができる。
【００３７】
多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）の利用によって配列決定化学の効率を高めることは広く行われている。一般に、試料が異なれば、それらの試料から得られるＤＮＡの識別される特徴もそれぞれ異なる。あとの処理のために、異なるＤＮＡをプールしておいても、その後の分析では、これらのＤＮＡを、その識別可能な特徴によってそれぞれ個別に同定することができるため、効率は改善される。早期の例は、異なるＤＮＡに、それぞれ異なるオリゴヌクレオチド配列をタグとして取り付け、ハイブリダイゼーションを援用して個々のタグを個別に認識することであった（Ｃｈｕｒｃｈ  Ｇ  ＭおよびＫｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，ｐ１８５〜８参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載する手法も、同様に、多重化できることが理解されよう。いかなる時点でも、標的に保持されるアダプターは、その由来をコードする認識可能なタグを含むことができる。タグをひとたび標的に加えれば、その標的はプールされて、そのあとの分析中に識別することができる。同様に、試料処理を軽減する観点から、プールすることが、早期の、そして最大の便益となりうるためには、このようなタグをできるだけ早期に（連結の最初のラウンドで）標的に取り付けることが最もよい。たとえば、４個所４色コードによって２５６種類の異なるタグを作り、ＤＮＡを２５６種類の中から個別に同定することができる。
【００３８】
さらに、インデックス化分子の突出末端が、ｄｓＤＮＡ分子の突出末端に対して相補的であることを利用すれば、インデックス化分子を特異的に導入することができるため、本発明の方法によってｄｓＤＮＡ分子の一つの末端を標識すれば、ｄｓＤＮＡ分子に関する情報も得られる。標識法の背景にある機構を理解すれば、塩基配列の量が限られていても、このようなやり方による標識化を、ＤＮＡ分子の分類に利用することもできるし、他の配列決定法とは関係なく、ｄｓＤＮＡ分子のある位置の塩基配列に関する情報を得ることもできることは、当業者であれば容易に理解できよう。
【００３９】
ｄｓＤＮＡ分子の一方の端を標識する予備的手段として、標識すべきｄｓＤＮＡ分子に、少なくとも一つの一本鎖突出末端が提供される。適当な手段であればどんな手段でもこれを行うことができる。いくつかの実施形態では、突出末端は、出所を問わないＤＮＡ試料を、タイプII制限エンドヌクレアーゼ、たとえばＤｐｎIIで消化して作製される。当業者であればこれ以外の制限酵素も周知であり、制限酵素に要求される条件は、一本鎖突出
末端が残るように試料中のＤＮＡを切断することであることのみである。一本鎖突出末端はｄｓＤＮＡのいずれの鎖にあってもよい（すなわち、５’突出部分または３’突出部分）。この方法で突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子を調製すると、使用される制限エンドヌクレアーゼの切断部位の特徴およびｄｓＤＮＡ分子の配列の特徴を反映した配列を有する突出末端が得られる。
【００４０】
ある制限酵素でＤＮＡ試料を消化すると、生成する各ＤＮＡフラグメントに対して同一の一本鎖突出末端が生じるのに対して、別の制限酵素で消化すると、個々の酵素の切断部位内における縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）の結果、一つのフラグメントから別のフラグメントへと縮重のより大きな一本鎖突出末端が生成する。つづいて、インデックス化分子を付加する最初のラウンドで、切断部位配列が固定された制限酵素を使って作られるｄｓＤＮＡフラグメントは、１ラウンド後には、すべて同じインデックス化分子を含むフラグメントになる。縮重切断部位を有する制限酵素で切断されたｄｓＤＮＡ分子を標識すると、連結の最初のラウンド中でさえ、異なるインデックス化分子の選択が起こるため、消化によって生成したｄｓＤＮＡフラグメントの配列情報と分類がもたらされる。各ｄｓＤＮＡ分子上に一本鎖突出末端のより複雑なパターンを作製するには、二つ以上の異なる制限酵素を同時に使用することもできるし、順番に使用することもできる。
【００４１】
ｄｓＤＮＡ分子上に一本鎖突出末端を提供する別の手段は、アダプター様分子をそれぞれの末端に連結することを含む。これは、状況によっては、一本鎖突出末端でなく、平滑末端でアダプターをＤＮＡ試料に連結することを要求するが、その要求は、当業者によく知られた方法で達成できる。このやり方で一本鎖突出末端を作製すると、必ずしも試料ｄｓＤＮＡの配列の特徴を反映しない一本鎖突出末端が提供される。しかし、これは、状況によっては、インデックス化分子を導入する第一ラウンドにとって重要ではない。そのような状況では、そしてまた、以下に詳しく述べるように、ｄｓＤＮＡ分子の特徴を反映する配列を有する一本鎖突出末端が作製されるため、インデックス化分子を導入した次のランドでは、バーコード標識に特異性を持たせることができる。
【００４２】
ＤＮＡ分子に一本鎖突出末端を取り付ける別の手段は、ポリメラーゼ連鎖反応か、あるいは別の増幅法を使ってｄｓＤＮＡ分子を供給することである。たとえば、ＰＣＲ反応に使われるプライマーに、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を持たせることができ、増幅後に産物を適当な制限エンドヌクレアーゼで切断すれば一本鎖突出末端が作られる。
【００４３】
ＤＮＡ分子に一本鎖突出末端を取り付ける別の手段は、エキソヌクレアーゼ酵素、たとえばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼに付随するエキソヌクレアーゼ活性を利用することである。当業者であれば容易に理解できることであろうが、エキソヌクレアーゼの活性の程度（たとえば停止点）は、たとえばチオヌクレオチドのようなヌクレオチドの修飾によって、あるいはエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼの循環を制限するためにポリメラーゼが必要とするヌクレオチドの供給を制限することによって、定義することができる。
【００４４】
一本鎖突出末端は、ｄｓＤＮＡ分子の一つの鎖の一方の端に近い位置にニックを入れ、生成する一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントを解離させて作製することもできる。ニックは当業者に知られたいかなる手段によっても簡便に作ることができよう。いくつかの実施形態では、ニックは、ｄｓＤＮＡ分子の一方の端にアダプター分子を連結して設けられる。連結時にアダプターの一つの鎖だけが、ｄｓＤＮＡ分子と共有結合によって連結されるように、アダプターを当業者に知られた手段で修飾することも可能である。たとえばＤＮＡホスファターゼ酵素を使って、たとえばアダプターの５’末端をヒドロキシル化してもよい。別のブロック機構も考えられ、アダプターの一つの鎖の５’末端または３’末端での共有結合の形成防止に使用され得る。連結反応の結果は、一つの鎖の、一方の端に近い位置にニックを有するｄｓＤＮＡ分子である。次に、ニックを有する鎖から短い一本
鎖オリゴヌクレオチドフラグメントを解離させれば一本鎖突出末端が形成される。短い一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントは、ニックの近くにある連結産物の末端からニックに向かって延びている。当業者には明らかであるように、解離は適当な温度あるいは溶液条件に置くことで行うことができる。
【００４５】
別の実施例では、アダプター分子は、ｄｓＤＮＡ分子の両鎖に連結すると共有結合を形成する。アダプター分子には、ニック形成エンドヌクレアーゼ酵素の認識部位を提供することができ、同種のニック形成部位がｄｓＤＮＡ分子にあるように設計してもよい。連結が終わったのち、ニック形成エンドヌクレアーゼとインキュベートすると、ｄｓＤＮＡ／アダプター分子連結産物の一つの鎖にニックが形成されるので、生成する短い一本鎖オリゴヌクレオチドをここで再び解離させれば、一本鎖突出末端が作製される。
【００４６】
一つの鎖にニックを入れることにより、突出末端を作製する本発明の方法は、どちらか一方（両方）の鎖の、５’あるいは３’のいずれにも突出末端を形成できる利点がある。さらに、アダプター分子を目標物に合わせて設計することにより、所望の配列または鎖長を有する出末端を作製することもできる。
【００４７】
当業者であれば、一本鎖突出末端を作製する別の手段（たとえば剪断等の物理的手段）も考えられるであろうし、ｄｓＤＮＡ分子それ自身の配列を反映した一本鎖突出末端を提供するか否かにかかわらず、そうした手段を使用することもできる。
【００４８】
かくして、ｄｓＤＮＡ分子上の一本鎖突出末端の長さは、ただ一つのヌクレオチド塩基であってもよいが、状況によってはそれより長い突出部分を使用することもできる。典型的には４以上の塩基長、好ましくは５以上の塩基長、たとえば６〜１８塩基長、好ましくは６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５．１６，１７または１８塩基長の一本鎖突出末端を提供するために、本発明の方法によって一本鎖突出部分を構築し、あるいは延長してもよい。つづいて、Ｔ４  ＤＮＡ酵素等のＤＮＡリガーゼ酵素より忠実性の高い、たとえば耐熱性ＤＮＡリガーゼ酵素を使用する連結反応に、このような延長一本鎖突出末端を使うことができる。
【００４９】
一本鎖末端の延長は図３に示すように進めることができる。すなわち、（たとえば、ＤｐｎIIのような酵素の活性によって作られた）一本鎖突出末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、相補的付着末端を有する延長アダプターに連結させる。延長アダプターは、Ｎ  ＡｌｗＩのようなヌクレアーゼ下ニック形成制限（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）の認識部位を有していてもよいし、延長すべき末端に連結させるときに、このような酵素の認識部位が作られるように設計されてもよい。延長アダプターは、ヌクレアーゼ下ニック形成制限の認識部位が、延長アダプター自身の中に存在しないで、その一本鎖を延長したい最初のｄｓＤＮＡ分子に由来する生成連結産物の一部分の中に存在するように設計される。したがって、ニック形成エンドヌクレアーゼとのインキュベーションが終わったあとには、延長すべき最初のｄｓＤＮＡ分子の一本鎖にニックが形成されている。構築されたニック形成エンドヌクレアーゼ、たとえば既知酵素を融合したものを含め、あらゆる既知ニック形成エンドヌクレアーゼが使用できる。
【００５０】
ニックの形成が完了したら、次に、短い一本鎖オリゴヌクレオチドを残すため、連結産物の延長アダプター部分が、たとえばＢｓｏＢＩのような制限エンドヌクレアーゼを使って所定の位置で切断され、つづいて、延長すべき末端を有するｄｓＤＮＡ分子から、短い一本鎖オリゴヌクレオチドが解離される。図３に示すように、長い一本鎖突出末端が得られ、図３に示されているものでは、端部が一つの鎖の３つの開始端上に作製されている。
【００５１】
標識されるｄｓＤＮＡはいかなる供給源から入手してもよい。いくつかの実施形態では
、当業者に既知の方法でゲノムＤＮＡを分離することができ、そのＤＮＡは（上に記載したように必要な一本鎖突出末端を提供できる）制限ヌクレアーゼを使って適当なサイズのフラグメントに切断してもよい。別の実施形態では、ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応を使うか、別の増幅反応、たとえばリガーゼ連鎖反応を使って提供することができる。ｄｓＤＮＡは、天然供給源から分離することもできるし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作ることもでき、そしてゲノムＤＮＡでも可能であるし、たとえばｃＤＮＡであってもよい。その配列に従って標識すべきｄｓＤＮＡ分子は均質な溶液の形でもよく、その溶液中のＤＮＡはすべて同じ塩基配列を有するか、実質的に同じ塩基配列を有し、あるいは塩基配列が異なるｄｓＤＮＡ分子の不均一な混合物の一部であってもよい。
【００５２】
一本鎖突出端を有するｄｓＤＮＡ分子が提供されたら、次は、延長されているかいなかにかかわらず、これらのｄｓＤＮＡ分子はインデックス化分子に連結される。インデックス化分子は、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端に対するアニーリングに適した一本鎖末端（相補的一本鎖末端）を有するＤＮＡ分子であることに特徴がある。
【００５３】
インデックス化分子は、標識されるｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端に対して相補的な可能性のあるすべての配列のサブセットが存在するように、相補的一本鎖末端の配列が異なるインデックス化分子のプールとして提供される。一本鎖末端配列が異なるインデックス化分子は差別標識され、そのため、これらの配列は互いに識別が可能である。いくつかの実施形態では、インデックス化分子を付加する最初のラウンドで、標識されるｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端配列は即知であり、それに合わせてプールのインデックス化分子の相補的一本鎖末端配列を選ぶことができる。インデックス化分子を付加するその後のラウンドでは、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端配列は、標識される分子の配列に特有のものであり、それゆえ（いくつかの実施形態では配列を知ることができる）予想不可能であり得る。配列が予想不可能な場合、実質的にすべてのｄｓＤＮＡ分子を確実に標識したければ、プールの中に相補的一本鎖末端に可能性のあるすべての配列を有するインデックス化分子を含める必要がある。いくつかの実施例では、混合物中の一部のｄｓＤＮＡ分子種を標識するだけで十分であり、そのような場合、当業者は、プールに入れるために、インデックス化分子の相補的一本鎖末端配列の好適なサブセットの組み合わせを決めることができる。
【００５４】
本発明の末端標識法は、最初に、インデックス化分子を直鎖ｄｓＤＮＡ分子の各末端に連結する工程と、それに続いて、直鎖分子を環状化する工程と、そのあとに、二つのインデックス化分子のそれぞれが、共に、直鎖ＤＮＡ分子のその一方の端にまたはその一方の端に近い位置にとどまるように、再び分子を直鎖にする工程とを含む。直鎖化するこの工程は、認識部位から物理的に移動した位置に切断部位を有する制限酵素、たとえばタイプIIｓ制限酵素または分断パリンドローム制限酵素を使って行われる（本明細書では「切断位置が離れて存在する制限酵素（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）またはエンドヌクレアーゼ」と呼ぶ）。インデックス化の、各ラウンドの最初の工程で直鎖ＤＮＡに連結されるインデックス化分子の一つは、切断位置が離れて存在する制限酵素の認識部位を提供する。制限酵素の切断部位は、標識される元のｄｓＤＮＡ分子に由来する分子の一部分の中に存在している（すなわち、ｄｓＤＮＡ分子に組み込まれるインデックス化分子の中ではない）。
【００５５】
当業者であれば、切断部位が移動した好適な酵素は明らかであろうし、市販品として購入することもできる。例として、タイプIIｓ制限酵素は、その認識部位の外で切断するため、おおむね、切断によって一本鎖突出末端に、塩基のいかなる組み合わせでもできる可能性があるという点に特徴がある。図１は、タイプIIｓ制限エンドヌクレアーゼが、どのようにして、末端に短い配列署名（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を含むフラグメントを形成し、その配列署名がそのようにして作られた末端に特有であるかを示して
いる。タイプIIｓ制限酵素の切断部位は、認識部位から一定の距離だけ離れて存在し、その結果、このような酵素による切断は、常に、切断される所定のフラグメントに、特有の塩基の組み合わせを残す。図１に実施例として酵素ＢｐｍＩが例示されている。ＢｐｍＩは、上の鎖では、認識部位（太字で示してあり、斜字にはなっていない）から１６塩基（図では太字の斜字で示してある）の位置に切断部位があり、下の鎖では、認識部位から１４塩基（これらも太字の斜字で示してある）の位置に切断位置があることに特徴がある。この特徴によって、切断されるＤＮＡ分子の配列に依存して、１６（４２）個の可能性のあるＤＮＡ配列のいずれかを有する二塩基対３’一本鎖突出末端が残る。すべてのタイプIIｓ制限酵素が一本鎖突出末端を残すわけではなく、そのような酵素は、形成される末端をさらに修飾しなければ、本発明の方法に使用できない。この方法に使用できるヌクレアーゼとして、切断部位が二本鎖基質の二本鎖を横切って非対称な距離に位置し、特異性が切断部位に隣接する塩基の種類に影響されない制限エンドヌクレアーゼを挙げることができる。ＢｐｍＩ以外に多くの酵素が入手可能であり、広範囲の特異性を示すこれらの酵素は当業者によく知られており、市販品を購入することもできる（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ  Ｊほか、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（２００３）４１８〜４２０ページ、参照により本明細書に組み込まれる）。このクラスの制限エンドヌクレアーゼの代表例を表１に示す。
【００５６】
【表１】
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2008515451.tif 000007
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【００５７】
さらに別の実施例では、分断パリンドローム制限酵素は、その認識部位が固有の長さを有する配列の側面に存在するという点に特徴がある。したがって、塩基のいかなる組み合わせも付着末端（形成される一本鎖突出末端）に見ることができるが、その組み合わせも、やはり、常に切断される所定ＤＮＡ末端に固有である。図２は、分断パリンドローム酵素が、どのようにしてＤＮＡフラグメントを切断するか、ＢｇｌＩ酵素と対照して示したものである。ここに示すＢｇｌＩは５個の塩基の横に認識部位を有するが、５個の塩基のうち３個のみが一本鎖突出末端を形成するため、６４（４３）種類の可能性のうち、いずれか一つの配置を有することができる（やはりこの場合も切断される分子の配列に依存する）。図２では、上の鎖と下の鎖の切断点を太字のイタリック体で表示してある。ここでも、ＢｇｌＩ以外の分断パリンドローム制限酵素は入手可能であり、当業者はそれらの酵素を知っていよう。代表例を表１に挙げておく。切断部位の位置が移動しているこれらの酵素を使えば、環状分子の直鎖化点は、インデックス化分子によって指示されるが、標識されるｄｓＤＮＡ分子に由来する環状化分子の一部分の中にあるようにすることができる。このようにして、インデクスされたｄｓＤＮＡ分子の各末端に一本鎖突出末端が提供され、それらの一本鎖突出末端は、標識される元の分子に由来する配列を有する。そのうえ、このような直鎖化によってインデックス化分子が形成され、インデックス化分子は、同時に維持されるｄｓＤＮＡ分子にすでに組み込まれていて、ｄｓＤＮＡ分子の一つの末端近くにあり、その末端でバーコードタイプの標識を完成する。
切断が離れて存在する切断制限酵素を用いて行われるとき、インデクスされた環状分子は、一回だけ切断され、そしてそのため、一方の末端に対して近位にある無傷のバーコード標識で直鎖化されるためには、各ラウンドで連結されたインデックス化分子の一つだけが、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素の認識部位を有する必要がある。それは、いくつかの実施形態では、またインデックス化の最初のラウンドに対して、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端が同じ鎖に提供され、ＤＮＡ分子の一方の末端に５’突出部分が、そしてＤＮＡ分子のもう一方の末端には３’突出末端があるようにすることによって実現される。このような二本鎖ＤＮＡ分子は、インデックス化分子のプールに連結される。そのプールは、５’突出一本鎖末端を有するインデックス化分子の第一カテゴリーと３’突出一本鎖末端を有するインデックス化分子の第ニカテゴリーとを有する。インデックス化分子の二つのカテゴリーのうち、一つだけが、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素エンドヌクレアーゼの認識部位をさらに有する。
【００５８】
別の実施形態では、インデックス化のその後のラウンドに対して、インデックス化分子のプールは、やはりインデックス化分子の第一および第二カテゴリーを有する。インデックス化分子の第一カテゴリーは、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素エンドヌクレアーゼの認識部位を有し、第二カテゴリーは認識部位を有しない。この実施例では、インデックス化分子の両カテゴリーは、標識された直鎖状ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出部分に対して相補的であるために、適切な鎖（すなわち５’突出部分か３’突出部分）に、一本鎖突出末端を有することができる。インデックス化分子の第一および第二カテゴリーの５０：５０混合物を使用した場合、標識すべきｄｓＤＮＡ分子の平均２５％が、インデックス化分子のプールへの連結後に、適当な制限酵素認識部位を有する一つのインデックス化分子と、認識部位を有しない一つのインデックス化分子とを有する。第一カテゴリーから二つのインデックス化分子を組み込むＤＮＡ分子は、直鎖化のときに消化されて標識を失うため、標識法による検出段階では不可視となる。第二カテゴリー（すなわち制限酵素の認識部位を有しない）から二つのインデックス化分子を組み込む個々のｄｓＤＮＡ分子は環状のまま残るため、これに基づいて直鎖標識分子と識別できる。
【００５９】
別のアプローチにおいて、制限酵素認識部位は、適切に連結された分子を環状化するときだけ形成される。それゆえ、どのインデックス化分子も無傷の認識部位を持たず、その部位は、感化するときに正しい二つのインデックス化分子を一つにするときに形成される。別の実施形態として、一つにされる二つの同じ分子が、間違った分子を切断して正しい
組み合わせとするための選択に使用できる制限部位を、形成するように、インデックス化分子を設計することができる。
【００６０】
当業者にとって、ペアリングの間違いを避ける別の手段を考えることは容易であろうが、実際に起きるインデックス化分子の不適当なペアリングによって引き起こされるｄｓＤＮＡ分子の異常な標識化は少なく、多くの個々分子を分析すればそうした異常な標識化は、標識分子の分析から排除できる。
【００６１】
先に記したように、標識化の手順は、ｄｓＤＮＡ分子の各末端のインデックス化分子を一体化するために、標識分子に連結されたｄｓＤＮＡ分子を環状化することを要求している。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡ分子に連結されたインデックス化分子の外側末端は、連結反応で相互に連結するよう適合性になるよう前処理（レンダリング）される。インデックス化分子の末端の前処理は、適合性のある付着末端を提供するよう適当なエンドヌクレアーゼで切断することにより達成できる。したがって、いくつかの実施形態では、インデックス化分子のプールのインデックス化分子は、ｄｓＤＮＡを切断して一本鎖突出末端を提供する制限酵素の認識部位を有する。好適な制限酵素やインデックス化分子における制限酵素認識部位の位置は、当業者にとって明らかであろう。切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素の、認識部位を有するインデックス化分子の場合、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素の認識部位は、環状化に好適な末端にするために使用されるさらなる制限酵素部位と、インデックス化分子の相補的一本鎖末端との間に位置すべきである。かくして、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素の認識部位は、末端を環状化するとき、除去も分解もされない。
【００６２】
別の実施形態では、末端を環状化することは、取り付けられたインデックス化分子の一方の鎖をｉｎ  ｖｉｔｒｏでホスホリル化して、平滑末端で連結する基質か、または付着末端で連結する基質を提供することを含む。本発明の方法のいくつかの好ましい実施形態では、アダプター様分子は、インデックス化分子も含め、生物試料から精製されるため、ホスホリル化されているだろう。いくつかの実施形態では、このようなアダプター様分子は、連結反応に使うまえにホスホリル化されている必要はなく、連結効率を向上させることができる。別の実施形態では、インデックス化分子を合成せずに精製する場合でも、環状化の直前まで連結産物の末端をホスホリル化されていない状態にしておくことが好ましい。これは、早い段階でリン酸エステルを除去するか、環状化するまでホスホリル化されない合成オリゴヌクレオチドを使って末端を修飾することにより実現できる。より好ましい実施形態では、（インデックス化分子を含め）アダプター様分子は、たとえばバクテリオファージのベクターから誘導される一本鎖分子として提供することができる。アダプター様分子として使用される一本鎖ＤＮＡは、当業者に周知の方法で容易に分離することができ、リガーゼ反応の忠実性を向上させることができる。アダプター様分子を一本鎖の形で供給すれば、そうでない場合に標識反応および配列反応に不純物が混入するといった、バクテリアＤＮＡの共精製で起きるおそれがある問題も回避することができる。
【００６３】
たとえば、インデックス化分子にするため、ΦΧ１７４  ＤＮＡを修飾し、標識してもよい。一本鎖ＤＮＡはインデックス化分子として使用するため部分的に二本鎖としてもよい。
【００６４】
連結工程において、標識すべきｄｓＤＮＡ分子に一本鎖インデックス化分子を組み込む場合、連結産物の末端を環状化に適するようにするため、第二の鎖を「ｆｉｌｌ  ｉｎ（穴埋め）」する必要がある。これは、たとえばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼを使用し、当業者に周知の条件下で行うことができる。酵素のヌクレアーゼ活性を阻害するため、あるいは消化でなく正味の穴埋めが行われる条件を使用するため、穴埋めはおよそ１２℃以下の温度で行うことが重要である。好適な条件は当業者にとって明
らかであろう。穴埋めはインデックス化分子をｄｓＤＮＡに連結する前に行ってもよいし、連結したあとで行ってもよく、インデックス化後にプロセスは完了し、最終的な穴埋めののち、はじめて制限部位は使用可能になる。
【００６５】
さらに別の実施例では、たとえばインデックス化分子を、標識されるｄｓＤＮＡ分子に組み込む前に正しくホスホリル化すれば、前処理工程は不要である。一つの実施形態では、インデックス化分子は非互換突出末端を有してもよく、環状化工程は二つの末端を連結するリンカーアダプターの付加を必要とし、それによってアダプターを連結したＤＮＡ分子を環状化する。この実施形態は、リンカーアダプターが、環状分子をあとで直鎖にするために使用される酵素の認識部位を提供するという点で有利である。
【００６６】
上で指摘したように、インデックス化分子は、標識されるｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端に対して相補的な一本鎖末端の配列によって、標識化が異なるインデックス化分子に対しては好適で検出が可能な標識であればいかなる標識でも使用できる。たとえば、いくつかの実施形態では、インデックス化分子は、蛍光物質、たとえばＦＡＭ（カルボキシフルオロセン）、ＪＯＥ（カルボキシ−４‘，５’−ジクロロ−２‘，７’−ジメトキシフルオロセン）、ＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルロージミン）、ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｃｙｅ染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ染料などで異なった標識が行われる（たとえば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ  Ｈａｕｇｌａｎｄ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，第８．２章を参照）。さらに、蛍光エネルギー共鳴移動システム（ＦＲＥＴ）のようなエネルギー移動染料およびシステムを使ってもよい。
【００６７】
代替実施形態では、インデックス化分子を蛍光ナノパーティクル、たとえばＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入できるｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔで標識することができる。他の実施形態では、インデックス化分子が、たとえばテクネチウムなどの短寿命同位体や、分枝ポリマー構造などの位相学的マーカーで標識される。インデックス化分子に共役している場合は、一般に、たとえばイムノゴールド等、顕微標識化および検出のための試薬が適していよう。分枝構造の形をした位相学的マーカーは、インデックス化分子と部分的にペアをなすオリゴヌクレオチドの形で存在することができ、それによって、さらに標識化または延長を行うための非アニール尾部を残す。もちろん、そして当業者には明らかなことであろうが、異なるインデックス化分子に対して、上記標識とインデックス化分子のプールとは、いかなる組み合わせでも使用してよい。インデックス化分子は製造後ただちに標識してもよいし、好ましい実施例では、当業者によく知られた方法により、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃから購入できるキットを使って、標識したヌクレオチドを組み込むことにより標識化し得る。
【００６８】
インデクサーは識別できるように標識することが好ましい。蛍光染料、ｑｕａｎｔｕｍ
ｄｏｔｓ（ナノパーティクル）、形状またはサイズ標識などを含め、多くの異なる標識法が従来技術で知られている。末端の配列を決定できるようにするには、単一分子として識別することが特に望ましい。識別の戦略には、空間的なものかスペクトル的なもの、あるいは両者を混合したものが可能である。空間的な戦略にはコードを作る位置によって隔てられた異なる形状分子か、位置によって隔てられた異なる色（蛍光染料または粒子）が含まれる。スペクトル的な戦略には、一つの位置に複数の可能な色を有することと、具体的な情報をコードする厳密な組み合わせとが含まれる。後者の場合、たとえば、２種類の色素は、混合しなくても３つの可能性を許す。すなわち、第一の色素が１００％または第二の色素が１００％またはそれぞれの色素が５０％の可能性である。たとえばどちらかの色素が２５％と、もう一方の色素が７５％、あるいはもっと多くの数の色素といったように、混合が増えると、それにつれて追加当たりの可能性、すなわち可能なコードの数は指
数関数的に増加する。標識化は、直接的でも間接的でも可能であるし、あるいは両者の混合でも可能である。直接的標識化は、最後のインデックス化工程後、検出を可能にするさらなる手順を必要としないという利点がある。単一分子間の識別を十分および／または迅速にするには、一般により大きなインデックス化分子が必要である。スペクトル的コード化が使用される場合は、十分な検出を行うには十分な量の異なる標識を組み込む必要があり、空間的コード化が使用される場合は、十分な分解能が必要である。すでに論じたように、より大きなインデクサーと関連する集合は、インデクサーのより複雑な混合物の反応には不利である。それゆえ、インデクサーのすべてまたは一部の二次的な検出を有することが時として有益である。その場合、より小さなインデクサーを使うことができ、そして空間的またはスペクトル的識別を維持しながら検出に対する手段があることが必要とされる。二次的検出の最も単純なケースは分枝オリゴヌクレオチドを含む。例を挙げれば、上記インデクサーとして二つの５’末端と一つの３’末端を有するオリゴヌクレオチドが使用できる。そうすれば標準的なハイブリダイゼーション技術を使って、インデックス化反応に関与しない５’分枝の配列を決定できる。各５’分子を個別に検出し、それによって特定分子を形成した反応に関係した元のインデクサーが同定できるためには、プローブと５’分枝とが一致した組み合わせ（ペア）が使用される。ハイブリダイゼーションお動力学は、インデックス化反応の現在に動力学より、高濃度プローブおよび高分子量プローブの使用に適している。
【００６９】
バーコード化用インデックス化分子は、上で言及したそれらの分枝の機能的な要件と両立可能な長さであればいかなる長さでもよい。好ましい実施形態では、インデックス化分子は少なくとも４ｋｂの長さを有するが、そうでない実施形態ではそれより短いインデックス化分子が使用できる。インデックス化分子の長さは、そのあとでバーコード標識を検出するときに、その方法に影響を及ぼす可能性があり、あとで詳細に述べる検出手順を実施する間に検出し、評点を与えることができるＤＮＡ分枝の数に大きな影響を与える。一般に、インデックス化分子の長さが長いほど、バーコード内での個々の標識の識別が容易になり、インデックス化分子当たり多くの標識が可能となる。例をあげれば、
一つのインデックス化分子は、特定の同一線形順序で２種類以上の染料を有することができる。インデックス化分子が小さいほど、検出と識別に高い倍率が使用される可能性があるが、その場合は、視野が狭くなり、視野当たり評点をつける各配列の標識分子数は少なくなる。
【００７０】
インデックス化分子は、一本鎖、二本鎖、部分的一本鎖、部分的二本鎖のいずれであってもよく、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで化学合成されたものでもよいし、生物系から分離されたものでもよい。インデックス化分子は、たとえば特異的に設計されたプラスミドやその他のベクターの形で提供してもよい。好ましい実施形態では、設計されたバクテロファージベクターφｘ１７４が使用できる。
【００７１】
次に、図４Ａおよび４Ｂを参照しながら、ｄｓＤＮＡ分子の一方の末端をインデックス化分子で標識する方法について詳しく説明する。言うまでもなく、インデックス化分子の細部の設計変更や、制限酵素の認識部位および切断部位の位置決定は、当業者によって行われよう。例をあげれば、インデックス化分子と標識される分子の残りとの間の連結点に正確に位置するように、切断位置が離れて存在する制限酵素の切断部位を調整することができる。かくして、インデックス化分子からｄｓＤＮＡ末端に既知塩基を付加することが可能である。
【００７２】
図４Ａは、一本鎖突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子を示す。図示したｄｓＤＮＡ分子上に提供された一本鎖突出末端は５’突出末端であるが、３’突出末端でも同じく可能であろう。代替実施形態として、分子の一方の末端の突出末端には３’突出末端が、そしてもう一方の末端の突出末端には５’末端が可能であろう。当業者であれば理解されると思う
が、突出末端の長さは、好適であればいかなる長さでも良く、たとえば１，２，３，４または５ヌクレオチド塩基の長さを挙げることができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。あるいは代替実施形態として、一本鎖突出末端を本発明の方法によって延長し、たとえば６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７または１８塩基長の突出末端を提供することも可能である。
【００７３】
一本鎖突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子は、ｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端に対して相補的な一本鎖を有するインデックス化分子のプールとインキュベートされる。インデックス化分子のプールは、それらの一本鎖末端に配列の可能性のあるすべての組み合わせを有する異なるインデックス化分子、あるいはそれらの一本鎖末端に可能な配列のサブセットを有するインデックス化分子の混合物を含んでもよい。プール内の各インデックス化分子は標識され、その標識は、一本鎖末端の配列が異なるインデックス化分子に対して識別可能である。
【００７４】
混合物は、インデックス化分子と、標識すべきｄｓＤＮＡ分子とを連結するのに好適な条件でインキュベートされる。日常の連結条件は、ＤＮＡリガーゼ酵素メーカーの説明書にしたがうこともできるし、当業者が容易に決めることのできる条件に従ってもよい。いくつかの実施例ではＴ４  ＤＮＡリガーゼが使われる。また別の実施形態として、別のリガーゼ酵素、たとえばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手できる耐熱性ＤＮＡリガーゼｐｆｕまたはＮＥＢから入手できるＴａｑ  ＤＮＡが使用できる。使用できるその他のリガーゼとして、やはりＮＥＢから入手できるＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼもある。
【００７５】
生じる直鎖連結物は、各末端でインデックス化分子に標識して連結すべきｄｓＤＮＡ分子を含む。直鎖連結産物の外側末端は、適宜、上に記載したように、たとえば、適合した付着末端を形成させるため、認識部位がインデックス化分子配列内に存在する一つまたは複数の制限酵素エンドヌクレアーゼで切断して、相互にアニールし、そして連結するのに適するよう前準備される。このように処理した分子は、連結を行うに適した条件でインキュベートされ、前の工程からの直鎖連結産物の外側末端を連結して環状分子に変換され、重要なこととして、二つのインデックス化分子は一緒に合わせて、標識されるｄｓＤＮＡ分子に組み込まれる。
【００７６】
環状分子に変換したら、環状連結産物は、認識部位がｄｓＤＮＡ分子に組み込まれたインデックス化分子の一つに位置し、切断部位が認識部位から離れて存在する、制限酵素と一緒にインキュベートされる（図４Ｂを参照）。酵素の切断部位が遠方に位置しているため、環状分子は、標識されるｄｓＤＮＡ分子から元々誘導される位置で切断され、ｄｓＤＮＡ分子の配列に特有の配列をした一本鎖突出末端を有する直鎖分子を与える。
【００７７】
直鎖化された産物は、一方の端から順番に、一本鎖突出末端を含む標識されるｄｓＤＮＡ分子の短いフラグメントを含み、元の直鎖ｄｓＤＮＡ分子の一方の末端に組み込まれたインデックス化分子に融合され、元の直鎖ｄｓＤＮＡ分子のもう一方の末端に連結された第二のインデックス化分子に融合され、それ自身そのもう一方の末端に一本鎖突出末端を有するｄｓＤＮＡ分子の残りに直接融合されてなる。
【００７８】
これらの工程から生成する直鎖インデックス化分子／ｄｓＤＮＡ分子を連結した産物は、連結、環状分子への変換および直鎖分子化の工程をくり返してインデックス化分子を組み込むその後のラウンドの基質として働く。かくして、あとに続くインデックス化分子組み込みラウンドは、標識されるｄｓＤＮＡ分子の一方の末端近くにあるインデックス化分子のひもを提供する。この多面的な標識に組み込まれたインデックス化分子の同定は、各ラウンドの直鎖分子化後の、突出末端の配列によって与えられ、その結果、ｄｓＤＮＡ分子に特有のバーコード標識が、その分子の一方の端の近くに付加される。標識化の最後の
ラウンドでは、必ずしも環状分子への変換／切断を実施する必要はなく、最終的な標識産物は、一方の末端に一本鎖インデクス分子を有し、もう一方の末端に一つまたは複数のインデックス化分子を有する。
【００７９】
本明細書に記載する方法によって標識されたｄｓＤＮＡ分子は、アダプターが媒介する配列決定法を使って、バーコード標識に対して遠位にある末端から配列情報を誘導するために適したテンプレートである。（インデックス化分子組み込みラウンドの数に無関係に）標識化の最終段階は、バーコード標識に対して遠位にあって、かつその配列がｄｓＤＮＡ分子から誘導され、そのｄｓＤＮＡ分子に特有な一本鎖突出末端を明らかにするよう、調整される。一本鎖突出末端内の核酸塩基は、配列決定アダプターに直接連結することにより決定され、配列アダプタープールのメンバーは、標識されたｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端にアニールするのに適した相補的一本鎖末端に、可能性のあるすべての核酸塩基配列の少なくともサブセットを有する。配列決定アダプタープールの各メンバーは、標識され、相補的一本鎖末端に同じ配列を有する各メンバーは同じ標識を有する。相補的一本鎖末端の配列が異なるプールメンバーは、識別可能な標識を有し、相互識別が可能である。
【００８０】
したがって、標識されたｄｓＤＮＡ分子は配列決定アダプターのプールに連結され、あとで詳しく述べる方法で検出が可能となる。標識されたｄｓＤＮＡ分子／並列決定アダプター連結産物の検出および分析には、同じバーコード標識を有する一つまたは複数の標識されたｄｓＤＮＡ分子を同定することが含まれる。前に言及したように、バーコード標識は、標識されるフラグメントの配列の特徴を示しており、インデックス化法の工程でインデックス化を十分な回数行えば、どれか一つのバーコード標識で同じ配列を有するｄｓＤＮＡフラグメントを一義的に同定できる。インデックス化分子によって認識するための標識法で使用される一本鎖突出末端の長さ、出発物質の複雑さなどの要因によって、バーコード標識によるＤＮＡ配列の一義的な同定の手はずをととのえるには何ラウンドのインデックス化が必要かということは、当業者にとって明らかであろう。
【００８１】
当業者であれば、インデックス化の数、平均フラグメントサイズにインデクスするための開始点の数と、それらの必要を満たすサイズ選択量またはサイズ縮小量とを決めることは容易であろう。配列がわかっていて、配列を再決定するのが目的の場合、標的配列をあらかじめ電子計算機で解析することによって決定できる。たとえば、ＥＭＢＯＳＳ  ｓｕｉｔｅの“ｆｕｚｚｎｕｃ”プログラムによって検出されたように、ヒトゲノムにはＢａｍＨＩ部位が約４０００００、ＢｇＬII部位が約８０００００ある（Ｒｉｃｅ，Ｐ，Ｌｏｎｄｅｎ，Ｉ，およびＢｌｅａｓｂｙ，  Ａ“ＥＭＢＯＳＳ”：ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ“，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｊｕｎｅ  ２０００，第１６巻、第６号、２７６〜２７７ページ、参照により本明細書に組み込まれる）。こうした部位の場所や周辺配列は即知である。フラグメント末端当たり同定の必要がある最少ヌクレオチド数は、すべての末端で見つかる可能性のある順列の最大数を超えるため、それぞれ９または１０である。これらは３個より少ないインデックス化分子で標識されてもよい。部位は、頻度に違いがあり、標識のために、その頻度に応じた数のインデクサーを必要とする。実際上、ヒトゲノムは、見いだされるべき異なる配列の数を減らす反復配列を含む。しかし、配列が長く延びている場合、反復クラスのメンバーは同じか、非常によく似ているため、これらを識別するには、もっと多くの情報が必要である。このような状況でもインデックス化のラウンド数を増やすことはできるが、インデックス化を開始する場所を多くして、容易に識別できる一つの配列における開始点の数を増やし、適宜、これらの場所から反復配列を通って読むことが好ましい。読み取りの長さ、したがって決定すべきフラグメントの最小長さは、反復配列を十分覆う長さ、典型的には数百塩基〜数万塩基の長さでなければならない。平均ほぼ５００塩基対ごとに現れる天然ヌクレオチドの違いによって、より長い
反復を識別できる。
【００８２】
ヒトゲノムより短い配列は、必要なインデックス化もそれだけ少なくてすむ。配列決定がヒトゲノムからの類推で始められるため、既知配列に適用されたのと同じ考え方が未知の配列にも適用できる。平均の反復配列が長いことがわかったら、より長いフラグメントが必要となり得る。未知の配列がより少ない反復配列で複雑であるとわかったら、より短いフラグメントを利用できる。
【００８３】
ほとんどの実施例では、インデックス化に必要なラウンド数は４を超えず、好ましくは、異なる制限エンドヌクレアーゼによって生じる複数タイプの開始点が利用される。
共通のバーコード標識（したがって共通の配列）を有し、かつ同定されたｄｓＤＮＡ分子フラグメントを分析すれば、配列決定アダプターのどのプールがこのバーコード標識に対して遠位置の末端に連結されているか判定することができる。標識されたｄｓＤＮＡ分子にアニールし、そして連結された特定配列を同定することにより、配列決定アダプターの一本鎖末端の配列を参照しながら、ｄｓＤＮＡ分子一本鎖突出末端の一つまたは複数の核酸塩基を同定することができる。かくして、ある状況下では、標識されたｄｓＤＮＡ分子一本鎖突出末端のすべての核酸塩基を決定できる。また、別の状況下では、標識されたｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端塩基のサブセットもこのようにして決定されよう。あるいくつかの実施例では、標識されたｄｓＤＮＡ分子一本鎖突出末端の配列に関する一部の情報はすでに知られており、そのような状況の場合、標識されたｄｓＤＮＡ分子一本鎖突出末端に対してアニールし、そして連結するための配列決定アダプターのプールが、可能性のあるすべての一本鎖末端配列の組み合わせを備える必要はなかろう。
【００８４】
アダプターによって媒介される、一本鎖突出末端を有する標識されたｄｓＤＮＡ分子の標識決定には、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌの名前でＰＣＴ特許出願ＷＯ第９５／２００５３号（すべての目的のため、参照してここに組み込む）に記載されている多くの技術が使われる。
【００８５】
標識されたｄｓＤＮＡ分子の内部位置からさらに配列情報を得るには、このような標識分子を、本明細書に記載の方法によって制御下に行われるサイズ縮小の一回以上のラウンドにかけることができる。制御下に行われるサイズ縮小法は、各ラウンドで、一つの末端だけ、すなわちバーコード標識に対して遠位置の末端だけから、制御された塩基の数によって標識されたｄｓＤＮＡ分子を短縮するよう設計される。図５Ａおよび５Ｂに、標識されたｄｓＤＮＡ分子を制御下にサイズ縮小する過程を示す。図５Ａは、バーコード標識されたｄｓＤＮＡ分子を示す（左側の末端にバーコードが描かれている）。制御下のサイズ縮小とそのあとの工程を効率的に行うには、ｄｓＤＮＡ分子の標識末端がさらに連結され、切断されることがないようにする一方で、その分子のもう一方の末端は自由に処理が進むようにすることが好ましい。当業者であればよく理解されるであろうが、適当なキャッピング法をこの工程に使用することができる。例をあげれば、化学的な修飾を行うかアダプター様分子に連結して、バーコードに対して近位の末端にキャップをし、このあとの工程でさらに関与することを防止することができる。標識された末端は、最大限にキャッピングすることが好ましいが、まれにしか起こらない失敗（連結効率が１００％にならない）は、小さい事柄としてあとで検出されるため、許容可能である。
【００８６】
いくつかの実施例では、標識末端だけがキャップされ、もう一方の末端は制御下のサイズ縮小および／または配列決定は自由に進行するようにするため、あるいくつかの手だてを講じることができる。例をあげれば、標識された末端に、もう一方の末端の末端配列とは異なる特定の末端配列を直接にあるいは間接に提供するため、標識の最終ラウンドで使われるインデックス化分子の適切な設計を採用することができる。その特定末端配列にはアダプター様分子でキャッピングするための標的が提供される。
【００８７】
標識末端が制御下のサイズ縮小工程の間に短縮されないようにするため、いくつかの実施形態では、（あとで述べるように）制御下のサイズ縮小工程に使用されるのとは異なる、制限部位が移動した酵素を、標識工程で使用する必要がある。代替実施例では、短縮することで検出可能レベルが乱れないようにインデックス化分子を設計することができるため、標識された末端は縮小されても許容される。このような状況では、たとえば、制御下のサイズ縮小によって除去される領域よりインデックス化分子が十分長ければ、分子両末端の短縮が、バーコード読み取り能力に影響を及ぼす必要はない。
【００８８】
キャップされなかった末端（すなわちバーコード標識に対して遠位にある末端）は、アダプター分子のプールに連結される。プールのアダプター分子は、少なくともそれらが、試料中に、ｄｓＤＮＡ分子一本鎖突出末端にアニールし、そして連結するための、可能性のあるすべての相補的一本鎖末端サブセットを含み、かつ認識部位から物理的に移動した切断部位を有する制限酵素の認識部位（たとえば、上で詳しく記載したタイプIIｓ制限酵素または分断パリンドローム制限酵素）を有することを特徴とする。標識されたｄｓＤＮＡ分子をプールのアダプター分子の一つに連結すると、アダプター分子から誘導された部分に、切断部位が離れて存在する制限酵素の認識部位を有し、標識されたｄｓＤＮＡ分子に由来する連結産物に制限酵素の切断部位を有する、連結産物が形成される。次に、標識されたｄｓＤＮＡ分子自体から誘導される新しい一本鎖突出末端を明らかにするため、切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素で連結産物を切断すると（図５Ａに示す）、ｄｓＤＮＡ分子への「戻し切断（“ｃｕｔｔｉｎｇ  ｂａｃｋ”）」が起きる。プールのアダプター分子を適切に設計することで、ｄｓＤＮＡ分子内の切断部位の位置を設計することが可能であり、ｄｓＤＮＡ分子から除去される塩基の数をあらかじめ選択することができる。例をあげれば、認識位置から１６塩基離れた位置で切断する酵素（たとえばＢｐｍＩ）を用いると、プールのアダプター内の認識位置によって、１〜１５塩基を制御下にサイズ縮小することができる。実際に除去できる塩基の数は、エンドヌクレアーゼに対する部位が末端配列といかにして並列配置をとるかに依存する。たとえば、末端配置は平滑末端とすることもできようし、５’または３’突出末端部を有することできよう。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡ分子末端の配列が、エンドヌクレアーゼに対する部位の形成に一部使用できるかもしれない。当業者であれば、各状況が、除去される塩基の実際の数に関係することは理解できよう。アダプター分子が３’突出部分か５’突出部分のどちらかに欠けた鎖を形成するか、末端が平滑末端であり、そしてすべての場合に、その部位が切断されるフラグメントのすぐ近くで始まる最も単純な場合、最後の２塩基は切断されたフラグメント上に２塩基突出部分として残るため、１４塩基が除去される。
【００８９】
上記記載のようにして制御下サイズ縮小の一ラウンドを実行すると、あとに残るものは一本鎖突出末端を有する標識されたｄｓＤＮＡ分子であり、その配列は、最初に標識されたｄｓＤＮＡ分子の等価な部分の特徴を反映しており、アダプター媒介配列決定技術を使用する上記記載の方法によって配列決定できることは、当業者であれば明らかであろう。このようにして、標識されたｄｓＤＮＡ分子内の制御された位置から配列情報を得ることができる。アダプター媒介配列決定法によって配列を決定するには、より多くの核酸塩基を露出させるため、標識されたｄｓＤＮＡ分子のサイズを制御下で縮小することができ、プール内のアダプター分子の設計に応じて、各ラウンドごとに大きさを変えて制御下のサイズ縮小工程を実施できる。また、当業者であれば、プール内アダプターの一本鎖突出末端のサイズおよび切断部位が認識部位から離れて存在する制限酵素の認識部位の位置を制御することにより、アダプター媒介配列決定法によって一つまたは複数の塩基を一度に決定する手段を設計できる。したがって、適切な設計により、当業者は、制御下サイズ縮小工程で作製される標識されたｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端のサイズに依存して、一つまたは複数の塩基を一度に決定することを想定した条件を決定できる。このような突出末端は、実験の設計に（および本明細書に記載の方法による一本鎖突出末端の延長が使用さ
れるか否かにも）依存して、１，２，３，４，５，６，７，８またはそれより長い塩基長であることが可能である。
【００９０】
制御下サイズ縮小工程によって作製される一本鎖突出末端を長くするほど、アダプター媒介配列決定工程の各段階で大きな配列情報の提供が見込まれるが、塩基が加わるごとに配列決定アダプターのプールに含まれる配列決定アダプターの数は４の係数がかかるため、配列決定工程の複雑さは指数関数的に増加する。
【００９１】
混合試料中の複数の異なるｄｓＤＮＡ分子を配列決定するため（並行配列決定）、本発明の方法は、試料中の各異なるｄｓＤＮＡ分子の末端をバーコードで標識し、つづいてそれを、それぞれに応じたて御下サイズ縮小を受けるように適合される。かくして、混合物中の二つ以上の異なるｄｓＤＮＡ分子のバーコード標識につづいて、本明細書に記載の方法により、制御下サイズ縮小に複数ラウンドかけることができる。各分子中の複数の位置から、標識されたｄｓＤＮＡ分子のそれぞれについて、配列情報を入手するため、２ラウンド以上の制御下サイズ縮小を行ったあとで、サンプリングを行うことができる。混合物から採取した各試料は、目視またはデジタル分析を行うため、顕微鏡スライドガラスに薄く塗り広げることができる。同じバーコードを有し、同じ程度に短縮された分子に連結された配列決定アダプターを同定できるよう、目視またはデジタル分析を使って、同じバーコードを有する分子を同定および／または評点をつける。このようにして、試料中のそれぞれ異なるそして個々のバーコードを有する分子に対して、連結された配列決定アダプターが、そしてそれゆえ配列が決定できる。方法の一部の工程は効率が１００％より低いため、同じバーコードを有し、同じ程度の制御下サイズ縮小を受けた分子に結合する配列アダプターがすべて同じであると予想されないが、誤りはそのような試料の中でも少数であり、配列アダプター連結の観察された頻度に基づいて考えればそのような誤りは排除できる。
【００９２】
代替実施形態では、ｄｓＤＮＡ分子のバーコード標識混合物は、制御下サイズ縮小を行う前にプールに分けられる。つづいて、各プールは、プールごとに制御下サイズ縮小ラウンド数を変えるかアダプター媒介サイズ縮小を差別設計することによって、程度の異なる制御下サイズ縮小を受ける。その結果、各プールは、同じだけ短縮されたバーコード標識されたｄｓＤＮＡ分子の混合物を含む。次に、試料は、上に記載したのと同じように顕微鏡スライド板に薄く広げて分析される。代替実施形態では、分子は、たとえば電気泳動分析により、パルス状に流して検出系を通過させて分析できる。
【００９３】
薄く広げられたプールまたは試料の目視検査またはデジタル検査は、いずれかの方法において、それぞれ異なる配列を有し、異なるバーコード標識されたｄｓＤＮＡ分子の多数セットを同定することが想定されている。各試料またはプールごとに、各バーコード標識配列が複数回表され、バーコードに連結されたもう一方の末端の配列決定アダプターに対して評点が与えられる。したがって、各試料またはプールは、複数の異なるＤＮＡ分子の、一つの位置における配列情報を与え、異なる試料またはプールは、同じバーコード標識されたｄｓＤＮＡ分子の異なる位置における配列情報を与える。このように、本発明は、本発明に記載する並列ｄｓＤＮＡ標識化、制御下サイズ縮小およびアダプター媒介配列決定の各方法を組み合わせることで、混合物中の複数分子の大量並列配列決定手段を提供する。
【００９４】
配列を与えるべきすべての可能な末端位置がすでに存在しているか、あるいは容易に形成できる場合は、規定された位置まで制御下にサイズ縮小する必要はないことは理解されよう。一つの特に好ましい実施形態では、本発明は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＭＩＤＡＳ）技術に対する配慮がされている。
【００９５】
この実施形態では、従来知られていなかった長い塩基配列が決定される。配列決定されるフラグメントの決められた配列末端にはバーコードがつけられ、バーコードとは反対のフラグメント末端の配列が決定される。各フラグメントの配列決定された末端は、バーコードからランダムな距離にあり、それゆえ、全フラグメントのサイズが決められたら、バーコードからの距離が短い順に配列を集めようとするとき、配列情報とサイズ情報が使用できる。
【００９６】
図７を参照しながらこのことについてさらにくわしく説明する。元の長さが十分長い標的核酸集合体、たとえば全染色体を考えると、集合の大部分は、破断した分子として分離されるのが普通であり、その平均サイズは、それらを分離する方法に依存している。このことを模式的にあらわしたのが図７Ａである。この図は、任意に選んだ３つの異なる点で個々のフラグメントが示されており、フラグメントに対して垂直な矢印でＡ、ＢまたはＣの印がつけられている。固定された点は、与えられたフラグメント末端に対して特別な位置にあるが、全集合体としてはフラグメントの末端に対してランダムな距離にある。たとえばＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで切断することにより、核酸フラグメントの中の特定の点で切断することが可能である。与えられた切断点は、固定点切断部位と元々重なったすべてのフラグメントに共通する新しい末端になる。新しいフラグメントは水平な実線で示されており、全体として集合体をなしており、各メンバーは、切断によって決定される特定の末端点、すなわち固定された点からある距離を有する。実際上、水平な点線で示されるフラグメントの第二のセットがあり、これらは切断点から反対方向に延びている。
【００９７】
セットＢにおいて、右側に延びるフラグメントを例にすれば、これらのフラグメントの向きを規定することができる。このケースでは二つの異なるアダプターをフラグメントに連結することで向きが規定されている。一つのアダプターは、制限酵素によって固定位置に作られた付着末端に相当する付着末端を有しており、それゆえその末端に特異的に連結する。残るもう一つのアダプターは、平滑末端を有しており、ランダムな剪断によって露出したフラグメントの末端に特異的に連結する。
【００９８】
フラグメントの向きが規定されると、図７Ｂでそれぞれインデクサー１およびインデクサー２として示されているように、それらのフラグメントは、その各末端がそれと反対の末端に見られるタイプと違うインデクサーを受けるように、インデックス化可能になる。インデックス化するための末端は、固定された距離で、未知配列を元のフラグメントの末端中へ露出させるため、元のアダプターから切断するタイプIIｓ制限酵素か、それと同等の酵素を作用させて作られる。適切に標識されたインデクサー１および２は、それらの末端が相補的であるフラグメント末端に連結してはじめて、実際の配列を決定する。インデクサー１および２は、最初は、非インデックス化末端で、このケースでは５’ヒドロキシル基を有することを通じて、連結することを許されていない。インデックス化が終わると、このインデクサーの非インデックス化末端は連結を許されて、たとえば、まずポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化することにより、環状体が形成され、このあとの連結が可能となる。
【００９９】
インデクサー１は、タイプIIｓ制限酵素の部位を有するため、この酵素の作用によって環状体を直鎖化することができる。直鎖化は二つの重要な結果を実現するために行われる。第一に、インデクサー１および２は、元のフラグメントに結合されたままで残り、第二に、非冗長インデックス化を露出された両末端で行えるよう、新しい位置が元のフラグメントに露出される。それゆえ、使用可能な各末端の適切に標識されたインデクサー３および４を使って、インデックス化の第二ラウンドが実施できる。
【０１００】
このようにして、集合体中のインデクスされたフラグメントは、サイズを決定してから
可視化することもできるし、可視化してからサイズを決定することもできる。この実施例では、フラグメントは、それぞれが個々の分子として見ることができるように、ランダムに広げられた。サイズは等高線長さ（ｃｏｎｔｏｕｒ  ｌｅｎｇｔｈ）で決定できるが、好ましい実施形態では、広げるまえにまず分子のサイズが決定される。
【０１０１】
記載した工程によって、各分子の末端に二つのインデクサーが形成され、それらは、同定できるように薄く広げられ可視化される。ここで１、３、４で表示されているインデクサーは、それぞれ＋１〜＋４、＋５〜＋８および＋７‘〜＋１０’塩基をインデクスした。それゆえ、これらは一緒に一つのコードとして、元の固定点からのフラグメントを同定するために使用できる。インデクサー２は、フラグメントの、バーコードに対して反対の末端の配列を決定する。それゆえ、特定のバーコードを有するフラグメントをサイズ順に並べ、それらの末端配列を順次読みとって、固定点からの配列を決めることは、簡単なことである。
【０１０２】
かくして、たとえば、有用な各固体点が異なるバーコードを与えられるように配列することができ、かつ異なるバーコードを識別できれば、たとえ複数の配列であっても同時に決定することができる。そうすると、配列を組み立てるため、たとえば図７ＡのＡ，Ｂ，Ｃおよび固定点からの各可能な方向に対して、各配列と個々のバーコードとの関連づけを行うことができる。
【０１０３】
上記と同様、インデクサー３および４が、最終的に、それらの非インデックス化末端で結合することができ、それらの一つが、タイプIIｓエンドヌクレアーゼの部位を有し、さらなるインデックス化を行うため、そのフラグメントの新しい部分で新しい環状体の切断を許すなら、バーコードによる標識化および／または末端配列の決定のさらなるラウンドが可能である。情報の必要度に応じた頻度で、複数ラウンドを行うことができるが、実際の目的では１ラウンドか２ラウンドで十分であろう。
【０１０４】
元の核酸を完全に消化するために、タイプII制限エンドヌクレアーゼを使用する必要はない。元のフラグメントの大きさによって、これは、剪断によって生じる一つの末端より、むしろ酵素によって両末端を有する多くのフラグメントを生じる可能性がある。大部分のフラグメントは、一回だけ切断されるが、集合体は全体として可能性のあるすべての切断部位が十分に表されるよう、部分消化を行うことが好ましい。これは、消化時間を制限するか、酵素濃度を低く抑えることで実現可能である。ある種の酵素はメチル化に敏感である。その場合は、修飾酵素の組み込みを制限するか、部位特異的なメチラーゼを抑制使用すれば部分消化を達成できよう。
【０１０５】
本法が要求するように、タイプIIｓ制限酵素か、それと同等の酵素は、インデクサーの部位以外に由来するフラグメントを完全に切断できるべきではない。したがって、標的フラグメントは、上記と同様に、的確な修飾を行って保護されるべきである。
【０１０６】
フラグメントの配向が、平滑末端から生じるかそれとも接着末端から生じるかは、本質的ではない。識別できる末端であれば任意の末端で十分である。たとえば、識別を行う接着末端をフラグメント部位に形成させようと思えば、アダプターを連結することで、タイプIIｓエンドヌクレアーゼのための部位を置くことができよう。読み込みに必要な配列の可能性あるすべての位置を露出させる方法であれば任意の方法で十分であろう。制御的な方法、たとえば環状化連結および切断などが使用でき可能性があり、制御的な方法は、上記サイズ決定法に代わって、制御的なサイズの縮小が可能であるという利点を有する。頻度の高い微を有する制限エンドヌクレアーゼで部分的に切断することで準ランダムな切断を作り出すこともできる。この場合は、固定末端が形成されるが、さらにこれをエキソヌクレアーゼによる消化か環状化によって、可能性のあるすべての必要な末端を露出させる
処理を行うことができる。実質的に無傷な核酸をエキソヌクレアーゼで分解する方法は、配列を読みとるため、可能性あるすべてのヌクレオチドを露出させるもう一つの方法である。このような分解は、たとえば修飾ヌクレオチドの使用を通じても制御できる。基本的にランダムな場所で切断されたＤＮＡを作るには、特異的な認識配列を欠くエンドヌクレアーゼを使用することもできる。これはマンガンイオンの存在で、デオキシリボヌクレアーゼＩによって行うことができる。デオキシリボヌクレアーゼＩの適切な希釈によって、平均切断速度を、そしてそれゆえ得られるフラグメントの平均サイズを簡便に制御できる。
【０１０７】
バーコードは、元々同時線形であった塩基から作る必要はなく、個々の末端を相互に識別できる数の塩基を標識すればよい。環状化も不可欠というわけではない。これは現在入手できる材料を使って複雑な混合物中の個々の末端を識別するために十分な情報を得る、便利な方法である。混合物がそれほど複雑でない場合は、末端当たり一つのインデクサーしか必要としない単純なバーコードで十分であろう。高忠実度でインデクスするために長い接着末端を露出させる手段が存在すれば、複雑な混合物の末端でも一工程でインデクスすることができよう。しかしそれには、可能なバーコードの出発セットとして、もっと大きなセットが必要であろう。それゆえ、それほど複雑でないユニットを連結してバーコードを寄せ集める方が有利である。
【０１０８】
上記のプロセスをインデクスして配列を決定するまえに、インデクスして一種類のフラグメントを導くこともできる。これはフラグメントをそれらの末端配列によって規定されたプールに仕分けする効果を有する。したがって、各プールの複雑さは、当然に、最初の集合体（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と比べて小さく、各プール内の固定された末端はそれだけ容易に識別できる。さらにこのことは、インデックス化の結果として、各プールを構成するメンバーの末端配列がわかり、バーコードに加えるべき事実上の情報として使用でき、末端配列が妥当なものと判定できるという利点も有する。
【０１０９】
配列を組み立てるためにフラグメントの大きさがわかっている必要はない。単一分子を可視化することでサイズ分けした集合体から集められたフラクション中の、各配列の頻度を求めることができる。各末端配列の頻度は、最初上昇するが、その後は個々のフラクションを通じてその大きさとともに段階的に低下するため、その絶対的大きさを知る必要はなく、相対的な桁がわかればよい。たとえば電気泳動によってできるフラクションにおいて、最も短いフラグメントの末端配列の頻度は、最も早いフラクションで高く、次第に長いフラクションの末端配列によって置き換えられる。サイズを分ける別の方法、たとえば、イオン交換クロマトグラフィまたは逆相クロマトグラフィ、あるいはＣｈｏｕら、ＰＮＡＳ  １９９９；９６：１１〜１３（参照により本明細書に組み込まれる）で使われた方法が同じ様な考えから使用できる。
【０１１０】
サイズ分けに使われる技術の分解能には限界があるであろうため、サイズを分けるだけで正確な順番を決めることができない事例が起きる可能性が高い。しかし、この曖昧さを解決するにはオイラー経路組立てアルゴリズムを追加使用できる−たとえばＰａｖｅｌ  Ｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００１；９８：９７４８〜９７５３（すべての目的のため、参照してここに組み込む）。この解析では、基本的には、すでに観察されたことの限界によって規定される、可能性ある順序を考えることによって、塩基の実際の順序を予想する。従って、末端配列の長さが十分に長い場合、必ずしも正確なサイズを知らなくても、塩基の可能性ある順序は決定可能な範囲に限定されよう。たとえば、各フラグメントについて６塩基を決定し、５’ＡＡＡＡＣが観察されると、５’ＮＡＡＡＡの組み合わせがすぐ前を先行しなければならず、５’ＡＡＡＣＮがすぐうしろに続かなければならない。したがってぴったり合うかもしれない可能性の数は少なかろう。そのため可能性の高い順序を決めることは、比較的単純明快である。上記で述べたよう
にインデックス化によってフラグメントを分類することは、解析されるフラグメント集合の複雑さを軽減し、フラグメント末端の既知配列の数を増やすため、この点でも役立つ。例を挙げれば、ある特定の４塩基配列は２５６個のニュークレオチドごとに一回現れるのに対して、６塩基配列では平均４０９６個の塩基ごとに現れる。それゆえ、６塩基配列の方が、それに必要な分解能が平均して低いため、６塩基配列の出現を相対的順序で並べる方が、４塩基配列よりも容易である。
【０１１１】
このことが、キロ塩基よりかなり長い配列読み取り長さの構築を初めて可能にする、ということを指摘しておかなければならない。たとえば、特定の４塩基末端配列を認識する特定のインデクサーで検出されるフラグメントは、１キロ塩基当たり、平均わずか４塩基に過ぎない。すなわち、２５０塩基対当たり１フラグメントである。寒天ゲル電気泳動のような比較的分解能の低い技術を使ってさえ、１０キロ塩基程度まで、特定のフラグメントで平均間隔２５６塩基の分解能を得ることは比較的簡単なことである。上記で述べた原理を使ってフラグメントの正確な順序、そしてそれゆえフラグメントを構成する配列を推定することができる。
【０１１２】
上記で論じたことは、複雑な混合物からの複数の固定点に限定されている。もし、配列の特定の領域に焦点を当てる必要があれば、同じ原理を適用することができる。一つの方法は、その領域全体を通して読むため、インデクサーを選びだして特異的な固定点にバーコードをつけることである。この方法は、偶然に別の領域の配列を決定する可能性もある。適切に標識されたプローブにハイブリダイゼーションすることにより、対象となる固定点を標識することも可能であり、その場合、バーコードは不可欠ではない。複数既知領域を同時に読みとるにはプローブを多重化することも可能である。
【０１１３】
次に、実施例をあげながらさらに本発明を説明する。これらの実験で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、すべて、標準的なホスホロアミダイト法で委託合成されたものをＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  Ｌｔｄから購入した。これらのオリゴヌクレオチドは、使用前にメーカーによってＨＰＬＣで精製された。
【０１１４】
実施例１：  ターゲットｄｓＤＮＡ分子の一本鎖突出末端の形成および延長
ターゲットｄｓＤＮＡの一本鎖突出末端の形成および延長は多段階法で達成される。先ずターゲットＤＮＡを標準ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼで切断する。本実施例では、これは、その後で、ニック形成酵素  Ｎ．ＡｌｗＩによって認識されるＮ．ＡｌｗＩ部位の挿入を可能にする制限エンドヌクレアーゼであるＤｐｎ  ＩＩまたはＢｇ１  ＩＩを用いて達成される。延長アダプター分子を作製した後、このアダプターをターゲットｄｓＤＮＡに連結する。次いで、上記連結産物をＮ．ＡｌｗＩに暴露してニック形成する。ニック形成後、連結産物をさらなる制限エンドヌクレアーゼ、本実施例の場合はＡｖｒ  ＩＩで切断する。次いで、得られた伸長一本鎖突出末端を含むターゲットｄｓＤＮＡを精製し、アガロースゲル電気泳動にかけて可視化し得る。本実施例では、延長アダプター分子は、得られた産物を電気泳動にかけて分離するときに可視化しやすいように標識する。
【０１１５】
上記に手短に述べた本実施例で行った延長法のステップを以下に別個に詳述する。
ターゲットｄｓＤＮＡの作製
種々の細胞系由来のラムダＤＮＡとゲノムＤＮＡとをターゲットＤＮＡ源として用い、当技術分野で十分特性化されている方法で分離する。
【０１１６】
ラムダＤＮＡは、ＮＥＢ社によって提供されたＮ６−メチルアデニンフリーである。これをフェノール抽出により精製し、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡに透析する。
【０１１７】
さらに、ゲノムＤＮＡを、以下の細胞系、すなわち、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨ−ｔｅｒｔ、ＤＫＦＺ社のＭＣ７およびＫＰＬ１、ＡＴＣＣ由来のＵ９３７から作製した。種々の細胞系を製造業者が推奨する組織培養培地で増殖させ、製造業者が推奨するＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ｓｙｓｔｅｍ〔キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）〕を用いて精製するために収穫した。
【０１１８】
ラムダＤＮＡは、そのサイズと配列が分かっているので、特定の制限エンドヌクレアーゼで生成させた断片およびそれらのプロセス中での挙動を容易に予測かつモニターし得るという理由で、この実施例に適している。
【０１１９】
ラムダＤＮＡおよびゲノムＤＮＡをそれぞれ以下に概説する反応混合物中でインキュベートして、制限エンドヌクレアーゼ  Ｄｐｎ  ＩＩおよびＢｇ１  ＩＩで切断した：
ラムダＤＮＡ用には、以下の反応混合物を調製した：
ラムダＤＮＡ（メチルアデニンフリー；０．５μｇ／μｌ）
６０μｌ（合計３０μｇ）
Ｘ１０  Ｄｐｎ  ＩＩ  緩衝液（ＮＥＢ社）      ６０μｌ
Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ（逆浸透により精製）        ４８０μｌ
Ｄｐｎ  ＩＩ（ＮＥＢ社；１０ユニット／μｌ）  ２０μｌ
合計                                          ６２０μｌ
ゲノムＤＮＡ用には、以下の各反応混合物を調製した：
【０１２０】
【表２】
2008515451.tif 000011
上記全反応混合物を３７℃の温度で一晩インキュベートする。インキュベーション後、反応混合物をキアゲン・スピンカラム（製造業者が推奨するＱＩＡｗｕｉｃｋＤＮＡクリーンアップキット）にかけて、得られたターゲットＤＮＡ消化産物を精製する。反応混合物からラムダＤＮＡ消化産物を精製するために、３つのＱｉａｇｅｎカラムを用い、反応混合物から約１０μｇのＤＮＡを各カラムに加える。ゲノムＤＮＡ消化産物を精製する際には、２つのＱｉａｇｅｎカラムを用いて反応混合物を精製する。ラムダＤＮＡ消化産物もゲノムＤＮＡ消化産物も標準的０．１５Ｘ溶出緩衝液、ＥＢ（１×ＥＢは１０ｍＭ  Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０であり、キアゲン社から供給される）を用いてカラムから溶出する。各カラムには、６０μｌの溶出緩衝液を加える。
【０１２１】
ラムダＤＮＡ消化産物およびゲノムＤＮＡ消化産物の想定収量は、６μｌ溶離液当たり１μｇである。これは、以下のように計算すると、それぞれラムダＤＮＡ消化産物およびゲノムＤＮＡ消化産物について約７ピコモル末端／μｇおよび０．７４ピコモル末端／μｇに相当する：
ラムダＤＮＡは１１６のＤｐｎＩＩ部位を有する。したがって、ＤｐｎＩＩで切断したラムダＤＮＡの各分子は、各切断により２つの末端が生じるために２３２のＤｐｎＩＩ末端を有する。１キロベースの二本鎖ＤＮＡ１μｇは１．５２ピコモルに相当する。ラムダは長さが３８，５０２キロベースであり、したがって、１μｇはラムダの０．０３１ピコモルに過ぎないが、これらは、０．０３１×２３２ピコモルのＤｐｎＩＩ末端、すなわち、ラムダＤＮＡ１μｇ当たりもしくは溶出液の場合には６μｌの溶出液当たり７．２７ピコモルのＤｐｎＩＩ末端を生成する。
【０１２２】
ヒトゲノムＤＮＡは長さが３１億塩基対であり、平均して４０９６（４６）塩基対間隔でＢｇｌＩＩ部位を有すると考えられている。これは、ヒトＢｇｌＩＩ消化産物当たり７５６，８３６のＢｇｌＩＩ断片と１，５１３，６７２のＢｇｌＩＩ末端を生成する。ヒトゲノムＤＮＡ１μｇは４．９ｅ−７ピコモルであり、これは、４．９ｅ−７×１，５１３，６７２ピコモルのＢｇｌＩＩ末端、すなわちヒトＤＮＡ１μｇ当たり、または溶出液の場合には溶出液６μｌ当たり、０．７４ピコモルのＢｇｌＩＩ末端を生成する。
【０１２３】
延長アダプター分子の作製
延長アダプター分子、この実施例では、Ｎ．ＡｌｗＩ  アダプターは、ターゲットｄｓＤＮＡの切断に用いる第１酵素によって生成される末端に特異的であり、ニック形成エンドヌクレアーゼＮ．ＡｌｗＩ用部位をもたらす。Ｎ．ＡｌｗＩアダプターの２つの相補鎖は別々に作製する。別々の鎖の配列を以下に詳述する：
AvDｐL8b  5 ’GATCCTAGGTCTGAGATTCTCAGGATCT  3 ’   
FaAvDp U8b  3 ’GATCCAGACTCTAAGAGTCCTAGA  5 ’    
（AvDｐL8b…配列番号１、FaAvDp U8b…配列番号２）
ＦａＡｖＤｐＵ８ｂアダプター鎖はその５′末端を蛍光染料ＦＡＭ（合成時５′末端にホスホロアミダイトとして付加された５／６異性体）で標識する。この標識により、アダプターの成り行きを延長プロセスでの使用中および／または使用後にモニターできる。ＡｖＤｐＬ８ｂアダプター鎖の５′末端のリン酸化は、このアダプター鎖がキナーゼ反応混合物中に組み込まれることによって生じる。従来、標準キナーゼ反応混合物は、５０μｇの反応混合物当たり２００ピコモルのターゲットオリゴを用いている。したがって、以下の反応混合物を調製する：
アダプター  ＡｖＤｐＬ８ｂ（５０ピコモル／μｌ）            ６０μｌ
Ｘ１０  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）      ７５μｌ
ＡＴＰ（１０ｍＭ）                                          ７５μｌ
Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ                                        ５４０μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社；１０ユニット／μｌ）１５μｌ
合計                                                      ７６５μｌ
上記キナーゼ反応は、通常の加熱ブロックに収容し易いので、１．５ｍｌ管中で設定するのが最も都合が良い。
【０１２４】
調製が済んだら、反応混合物を３７℃で３時間インキュベートする。次いで、熱失活により反応を停止させる。これは、反応混合物を９５℃で１０分間インキュベートすることにより達成される。
【０１２５】
熱失活後、キナーゼ処理（ｋｉｎａｓｅｄ）アダプターオリゴヌクレオチドをその標識された相補鎖、ＦａＡｖＤｐＵ８ｂにアニーリングする。これらのオリゴヌクレオチドを１：１混合する。先ず、相補鎖を、反応ミックス中に存在するキナーゼ処理オリゴヌクレオチドの濃度に等しい濃度（すなわち、２００ピコモル／５０μｌまたは４ピコモル／μｌ）で作製する。次いで、これらのオリゴヌクレオチドを１：１混合して、２ピコモル／μｌ／オリゴヌクレオチド鎖の最終濃度にする。この反応ミックスを５分で９５℃に加熱して、二次構造を再溶解させる。次いで、反応ミックスを６５℃で５分間インキュベートして鎖をアニーリングする。得られたアニール化アダプター分子は、使用時まで−２０℃で保存する。
【０１２６】
アダプターとターゲットＤＮＡの連結（ライゲーション）
作製後、アダプターをアニーリングして、上記のように消化したターゲットＤＮＡの末端鎖に連結することができる。ターゲットＤＮＡとしてラムダＤＮＡ消化産物を使う場合、これは、以下の基本的反応混合物を調製することにより達成される：
ラムダＤＮＡ消化産物（１μｇ／６μｌ；すなわち、７ピコモル／６μｌ）
６μｌ
アダプター分子（５６０ピコモル／８０ｘ過剰）
Ｘ１０リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）                          ７．５μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社；４００ＣＥＬ／ｍｌ）    ０．７５μｌ
Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ                                合計７５μｌまでの量
上記に基き、この実施例のために、以下の２種の反応混合物を調製する：
＋リガーゼ            ＋リガーゼ
アダプター無し        ＋アダプター
（コントロール）
ラムダまたはヒト                １２μｌ                １８μｌ
消化産物                          
アダプター                      ０μｌ                ８４０μｌ
Ｘ１０  Ｔ４                    １５μｌ              １０２μｌ
Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ              １２３μｌ            ５２０μｌ
Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ          １．５μｌ            ７．５μｌ
合計                            １５０μｌ          １４８０μｌ
上記反応混合物を１６℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、１００〜１２０ボルトで約２時間泳動する２％アガロースゲル分離により連結産物を可視化し得る。
【０１２７】
このゲルは、無染色泳動させ、アマーシャム・ファーマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）〔ＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）〕のＴｙｐｈｏｏｎまたはＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（蛍光スキャナー）を用いて可視化する。
【０１２８】
可視化は、アダプターがＤｐｎＩＩ断片に連結したことを示すために実施する。このために、３種の試料をロードする。ＤｐｎＩＩ消化ラムダＤＮＡの試料と、上記の２種の反応混合物の産物。アダプター不在の場合、ラムダは染色しないと見ることができない。アダプターとリガーゼが存在する場合、ＤｐｎＩＩ断片は、ＦＡＭ標識鎖に連結されるために見ることができる。それらのサイズは、例えば臭化エチジウム染色後にのみ見ることができる原物質に比べ、付加されたアダプターの長さだけ増大しているのも分かる。リガーゼは存在するが、アダプターが不在の場合、ラムダＤｐｎＩＩ断片は互いに連結する。これは、高分子量スメアとして現われ、染色後にのみ見ることができる。それは、これらの断片が連結可能であることを示している。
【０１２９】
連結後、連結産物をニック形成エンドヌクレアーゼに暴露する前に過剰な非結合アダプター分子を除去する必要がある。本実施例では、過剰な非連結アダプター分子の除去は、限外濾過し、その後、以下に詳述するようなＱｉａｇｅｎ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）スピンカラムにかけることによって達成される。
【０１３０】
名目分子量限界が５０，０００ダルトンのサイズ排除フィルターを有する限外濾過カラム、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ５０を用いる。このフィルターは、カラムの中央にあり、試料は、遠心分離すると、水と未使用アダプターを含む低分子量物質とがフィルターを通過し、アダプター標識断片がフィルターの上にトラップされてそこで濃縮状態になるように、カラムの上半分にロードする。ローディングおよび／または緩衝液もしくは水の添加を繰り返し実施して、さらに断片を濃縮するか、さらに精製する。いったん断片を回収したい場合、カラムを未使用管上に伏せ、溶液状で管内に落下するように再遠心分離する。
【０１３１】
すべての断片をロードし終わるまで、ラン１回につきカラム当たり通常４００μｌの断片／アダプター含有溶液をロードする。次いで、フィルターをラン１回につき３００μｌの水で洗浄、次いで１５０μｌの水で最終洗浄し、回収前に遠心分離する。精製断片の濃度が最大になるように、回収前に１５０μｌの洗浄で残留溶液を最小限にする。
【０１３２】
遠心分離は１５００ｇで１２分間行う。損失は有意ではないので、限外濾過カラムの数は重要ではない。小数の使い勝手の良いものを使用する。小数のカラムを使う場合、大量のオリジナル連結を得るためにより多くの充填量を必要とする。
【０１３３】
次いで、製造業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを用いて、オリジナル連結に対応する限外濾過物質を精製する。３回の精製を実施する。１回目は３カラム、２回目は２カラム、最終回は１カラムを用いる。
【０１３４】
それぞれ第１回、第２回、第３回後に、１８０μｌ、１２０μｌ、６０μｌの溶出液が得られるように、カラム当たり６０μｌの溶出緩衝液を用いる。最初の２回には１×ＥＢを用いるが、最終溶出には、上記のように（０．１５×溶液を生成するために）１５：８５希釈する。
【０１３５】
次いで、未使用アダプター分子を除去した後で得た溶離液を、使用するまで−２０℃で保存する。
アダプター／ターゲットＤＮＡ連結産物のニック形成
上述のように精製した連結産物のニック形成は、産物を以下の反応混合物中でインキュベートすることにより達成される：
【０１３６】
【表３】
2008515451.tif 000012
上記反応混合物に加えて、コントロールとして、上記と同一であるが、ニック形成酵素Ｎ．ＡｌｗＩを省いた第２反応混合物を調製する。
【０１３７】
上記反応混合物を３７℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、ニックが入った連結産物を下記のような方法で消化し得る。
ニック形成後連結産物の消化
この場合には、インデックス化分子（ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）との連結用にターゲットＤＮＡの末端に８塩基の３′突出部を形成するために制限エンドヌクレアーゼ  Ａｖｒ  ＩＩを用いる。ニックが入った連結産物を切断するために、上記ニック形成プロセス由来の反応混合物にＡｖｒ  ＩＩを加える。この酵素は、１μｌ当たり４ユニットのストック濃度で供給され（ＮＥＢ社）、Ｎ．ＡｌｗＩと同じ緩衝液を用い、先の反応混合物に直接加えることができる。このストック濃度のうち、以下の量のＡｖｒ  ＩＩを反応混合物に組み込む：
【０１３８】
【表４】
2008515451.tif 000013
さらに、必要なら、例えば好ましくない濃度のグリセロールが酵素に付着するのを回避するために反応量を増やすことができる。例えば、総酵素が総量の１０％を超える場合には、緩衝液を追加する必要がある。しかし、反応緩衝液の濃度は１×に維持しなければならないので、加える水に比例して１０×の反応緩衝液を加える必要がある。
【０１３９】
上述のように、Ａｖｒ  ＩＩを連結産物と一緒に３７℃で少なくとも３時間インキュベートする。
しかし、当技術分野では周知のように、不要な副反応、例えばエキソヌクレアーゼ活性を防ぐために長時間のインキュベーションは回避すべきである。
【０１４０】
制限エンドヌクレアーゼ消化の後、試料を７５℃で５分以上インキュベートする。インキュベーション後、３′突出末端を含むＤＮＡターゲット分子を以下のようにＱｉａｇｅｎカラムにかけて精製する。
【０１４１】
断片に連結していないか、断片から切断された残留アダプターを除去するために最終ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製を行う。このアダプターは断片にアニーリングし得るが、必ずしも共有結合するとは限らない。したがって、先ず、断片を７５℃でインキュベートしてアニーリングされたアダプターを断片から融解させて、ＱＩＡｑｕｉｃｋにより断片からそれら
が除去される可能性を最大限にするのが有益である。ゲル分析で、まだ残留アダプターがあると確認されたら、追加のＱＩＡｑｕｉｃｋ精製を実施し得る。熱処理直後、断片を少なくとも５容量のＰＢ〔ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ｂｕｆｆｅｒ（登録名緩衝液）、キアゲン社〕に加え、直ちにＱＩＡｑｕｉｃｋカラムにロードする。カラム当たり最大１０μｇまでの断片を加え得る。
【０１４２】
試料をＱｉａｇｅｎカラムにかけ、ＰＢで洗浄した後、ＤＮＡ断片をカラムからカラム当たり６０μｌの０．１５×ＥＢ中で溶出する。
得られた精製ＤＮＡ断片は、２％アガロースゲル上で電気泳動後に可視化し得る。ゲルを１００〜１２０ボルトで約２時間無染色泳動させ、アマーシャム・ファーマシア社（ＧＥヘルスケア社）のＴｙｐｈｏｏｎまたはＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（蛍光スキャナー）を用いて可視化する。
【０１４３】
可視化は、Ｎ．Ａｗ１  ＩおよびＡｖｒ  ＩＩ消化を確認するために実施する。４種の試料をロードする；ＤｐｎＩＩ消化ラムダ、前以てアダプターを付加しておいたＤｐｎＩＩ消化ラムダＤＮＡ試料、Ｎ．ＡｌｗＩ消化産物試料、およびＡｖｒ  ＩＩ消化産物試料。後者は、最終ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製後に採取するのがベストである。ただ、アダプター付加（ａｄａｐｔｏｒｅｄ）ラムダは、そのアダプターのＦＡＭ標識の結果として無染色ゲルでも見える筈である。Ｎ．ＡｌｗＩは、ラムダ断片の末端にニックを入れるという作用を有する。これによって、上述のように精製することにより（すなわち、アダプターのニック入り鎖とラムダ断片の数塩基が残りの部分から融解されると）ＦＡＭ標識を除去することができる。ゲルローディングの前にただ加熱するだけでも同様に有益である。染色ゲルでは、Ｎ．ＡｌｗＩ消化産物とアダプター付加ラムダとの間にサイズの差はほとんど見られない。しかし、Ａｖｒ  ＩＩで首尾良く消化された試料は、アダプターが付いていないラムダＤｐｎ  ＩＩ消化産物に極めて近似したサイズを示すが、これは、アダプター付加末端が適切に除去されたことを示している。
【０１４４】
ゲノム消化産物もラムダ消化産物の場合と同じように処理する。
実施例２：  二本鎖ターゲットＤＮＡの示差標識（インデックス化）
ターゲットＤＮＡを２種の異なるインデックス化分子と共に以下の連結混合物中でインキュベートする：
【０１４５】
【表５】
2008515451.tif 000014
したがって、２０μｌ連結当たり０．５μｇのラムダＤｐｎ  ＩＩ消化産物を使用する。２種のインデクサー（ｉｎｄｅｘｅｒ）を用いる；すなわち、３′ＣＴＡＧＡＧＴＧ末端を選択するために１μｌ当たり１ピコモルでＧＡＴＣＴＣＡＣ  ３′末端を有する反応物２０μｌ当たり１μｌのＡインデクサーおよび３′ＣＴＡＧＡＣＡＡ、３′ＣＴＡＧＡ
ＣＡＣ、３′ＣＴＡＧＡＣＡＧ、３′ＣＴＡＧＡＣＡＴ、３′ＣＴＡＧＡＣＣＡ、３′ＣＴＡＧＡＣＣＣ、３′ＣＴＡＧＡＣＣＧ、３′ＣＴＡＧＡＣＣＴ、３′ＣＴＡＧＡＣＧＡ、３′ＣＴＡＧＡＣＧＣ、３′ＣＴＡＧＡＣＧＧ、３′ＣＴＡＧＡＣＧＴ、３′ＣＴＡＧＡＣＴＡ、３′ＣＴＡＧＡＣＴＣ、３′ＣＴＡＧＡＣＴＧ、または３′ＣＴＡＧＡＣＴＡ末端を選択するために１μｌ当たり１６ピコモルでＧＡＴＣＴＧＮＮ  ３′末端を有する２０μｌ反応物当たり１μｌのＢインデクサー。Ｂインデクサーは、１６倍多い生成可能末端に対応するために、Ａインデクサーより１６倍高い濃度で用いる。実施例１の連結とは異なり、ターゲット末端に対して大過剰のインデクサーは用いない。何故なら、インデックス化（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）の忠実度は、試料末端の相互結合に必要とされるであろう誤連結事例を減少させるからである。
【０１４６】
次いで、上記反応混合物を、一晩、少なくとも１６時間、以下に概説するような連続サイクルにかける：
７２℃で３０分
４５℃で３分
５０℃で３分
５５℃で５分
あるいは、上記のサイクル反応の代わりに、５０→５５℃での連続インキュベーションを少なくとも１６時間実施する。
【０１４７】
インデックス化後、以下のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して、一本鎖領域を埋める：
２０μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ反応物当たり；
８μｌ  ｄＮＴＰ    １０ｍＭ
８μｌ  ×１０  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
４４μｌ  Ｈ２Ｏ
０．８μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）
８０μｌ  合計
上記反応は１２℃で３０分間実施する。
【０１４８】
充填反応後、供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋ（キアゲン社）を用いてＤＮＡを精製する。
次いで、精製物質を制限エンドヌクレアーゼ、Ｂｇｌ  Ｉで切断する。この反応は、２０μｌ反応量当たり１０ユニットのＢｇ１  ＩＩ／μｇ  ＤＮＡを用い、３７℃で２時間実施する。
【０１４９】
ＤＮＡを上記のように再精製し、１０μｌ当たり１ｍＭのＡＴＰと０．１μｇのＤＮＡを含む１０μｌのＢｐｍＩ緩衝液（ＮＥＢ社）当たり０．１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用いた１６℃で１６時間の連結により環状化を行う。
【０１５０】
環状化後、環状化産物を上述のようにＱｉａｇｅｎカラムにかけて精製する。
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを６８℃で２０分間熱失活させた。インデクサーＡのＢｐｍＩ部位は、最初のインデックス化部位を越えた２塩基の切断に用いる。ＢｐｍＩ切断は、最初の４つのインデックス化塩基を２塩基越えたところである。したがって、線状化は、１μｇ当たり４ユニットのＢｐｍＩ（ＮＥＢ社）を３７℃で２時間または反応が完了するまで付加することにより達成される。これは、２つの結合したインデクサーをそれらの断片の
同じ末端に残すという効果を有する。
【０１５１】
上記のようにＱＩＡｑｕｉｃｋを用いて線状化連結産物を精製した後、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ切断の部位でできた可能な塩基に相補的なインデックス分子と共にインキュベートして、第２回目のインデックス化を開始する。
【０１５２】
第２回目に用いるインデックス化分子は、配列を以下に略記する相補鎖を有する：
AvDpL8                5’GATCCTAGGTCTGAGATTCTCAGGATCT  3 ’
FaAvDpU8I          5 ’NNCTAGGATCCAGACTCTAAGAGTCCTAGA  3 ’
（AvDｐL8b…配列番号３、FaAvDp U8b…配列番号４）
第２回目のインデックス化には、実施例１に記載の手順を用い、実施例２の手順をインデクサー上のＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼとの連結時点まで続ける。
【０１５３】
これらの末端は、ＤｐｎＩＩではなくＢｐｍＩによって生成された。したがって、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼによって連結された第１アダプターは、上記のＡｖＤｐＬ８およびＦａＡｖＤｐＵ８ｌから生成される。ＦａＡｖＤｐＵ８ｌの２つの塩基、ＮＮは、露出された可能な末端に適切であるとして選択される。
【０１５４】
最終インデクサーは、その断片の次の塩基に対応するＡＡＴＧ  ３′で終端する。ＭｅｇａＢＡＣＥ（ＧＥへルスケア社）上で可視化するためには、５′末端は、検出を可能にするＨＥＸ  ＴＡＡＴＧＡＴＣである。ＭｅｇａＢＡＣＥは、供給業者が推奨する遺伝子型決定セットアップと共に用いる。サイズマーカーは、毛管当たり０．２μｌのＥＴ  ＲＯＸ  ９００（ＧＥヘルスケア社）である。ローディングの前に、試料を先に説明したように限外濾過により脱塩し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に入れる。この手順の中間産物は、このプロセスをモニターする別個の毛管中で分析し得る。０．５μｇの初期出発物質に対応するＤＮＡは検出に十分以上である。
【０１５５】
エピ蛍光により単分子を可視化するために、いずれもＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲＭ  Ｒｅｖ
２．０  Ｍｏｎｏデジタルカメラを内臓したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐまたは電動式Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ．１をＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４  Ｐ４  ３．０ＧＨｚシステムに連結した。方法は、光学マッピング法〔ジング  ジェイら（Ｊｉｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９８年７月７日；第９５巻（１４）：ｐ．８０４６−５１、本明細書に文献援用〕を改変した。これらの方法の改変は、実施例９に記載のような疎水性分子に対して推定される手順に従った。
【０１５６】
本実施例では、インデックス化分子はｐｈｉＸ１７４ＤＮＡ由来であった。０．５μｇの一本鎖ビリオンＤＮＡ（ＮＥＢ社）を２５μｌのＢｓｓＨＩＩ緩衝液（ＮＥＢ社）中で２分かけて９５℃に加熱し、１６塩基からＢｓｓＨＩＩ部位に、その部位およびＰｓｔＩ部位を介して、ＰｓｔＩ部位を越えて末端の１６塩基まで伸びるオリゴヌクレオチドにアニーリングした。このＤＮＡを５ユニットのＢｓｓＨＩＩにより５０℃で１．５時間かけて線状化した。反応物を５分で７２℃に加熱し、第２ロットの酵素を加えた。５０℃でさらに１．５時間インキュベーションを続けた。反応物をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）に適合させたが、但し、ｄＴＴＰををアミノアリル  ｄＵＴＰ〔インビトロジェン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、前モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）〕に変え、非鎖置換条件下（５０℃）に、２．５ユニットのＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖領域を充填した。ＤＮＡを精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用いて、ＢｇｌＩＩ部位を欠失し、ＢｓｓＨ
ＩＩ適合性付着末端を残すように相補オリゴヌクレオチドで部分的に二本鎖とした適切なインデクサーに連結した。ＤＮＡを上記のように精製し、ＰｓｔＩ（ＮＥＢ社）で切断し、ＢｇｌＩＩ部位を有するＰｓｔＩ付着末端アダプターに連結して平滑とした。ＤＮＡを上記のように再精製し、供給業者条件（インビトロジェン社−前モレキュラー・プローブス社）に従い、Ａｒｅｓ  Ａｌｅｘｏｆｌｕｏｒシステムを用いて最適なＡｌｅｘｏｆｌｕｏｒ染料で標識した。Ａｌｅｘｏｆｌｕｏｒ染料は、上記ジングらに記載のインターカレート染料の代わりであった。
【０１５７】
実施例３  −  ＭＩＤＡＳによるφＸ１７４（図７）
以下の実施例では、特に明記しない限り、種々のプロセスの各ステップ後に、製造業者の指示に従って、ＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィで日常的に精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、キアゲン社）。オリゴヌクレオチドを合成し、ユーロジェンテック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）に基いてＨＰＬＣ精製した。
【０１５８】
ここでは、例として、バクテリオファージφＸ１７４由来のゲノムＤＮＡを分析する。このゲノムＤＮＡは、比較的単純であり、プロセス中に使用されるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、ＡｃｕＩ用部位を欠失するという長所がある。したがって、メチル化または他の形態の修飾によりＡｃｕＩ部位をブロックする必要がない。
【０１５９】
インデクサーもφＸ１７４から作る。ＡｃｕＩの欠失を別にすれば、これは、一本鎖φＸ１７４  ＤＮＡが標識用に簡単に得られ、かつそのサイズが可視化に好都合であるという点で関連するに過ぎない。
【０１６０】
ターゲットの作製
サイズ縮小
このプロセスは、ＤＮＡが精製中にランダムに切断されることをうまく利用する。平均読み取り長は得られた断片の平均サイズに等しい。断片の平均サイズが大きいと、可能な読み取り長も長くなり得るが、断片の末端塩基のみが読み取られるので、塩基読み取りごとにより多量の断片が必要とされる。したがって、平均長が長過ぎる場合には、さらなるランダム切断により断片を短くすることが望ましい。これは、一般に、（短い断片を得るための）超音波処理、または穏やかな切断が必要な場合には適当な大きさの注射針でＤＮＡ溶液を繰り返し汲み上げることによって達成される（注射針のゲージが細いほどより細かく剪断できる）。本発明者らはさらに、ＤＮＡの断片化にマンガン存在下のＤＮＡｓｅＩも用いた。通常、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１０ｍＭの塩化マンガン、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ＮＥＢ社）、０．５〜０．０５ユニットのＤＮＡｓｅＩ（ＮＥＢ社）を含む反応物１５μｌ当たり０．２〜０．４μｇのＤＮＡを用いた。反応は、３７℃で２０分間実施し、すぐに上記定法通りに精製した。この方法にはＤＮＡの起源は重要ではないが、ただ、実験により、切断または適切な酵素希釈条件が要求されるサイズ縮小度を達成することが分かった。
【０１６１】
末端修復
剪断または他の形態の切断では、通常、平滑でなく、従って配列を決定するための末端に必要な平滑末端アダプターを連結するのに良好な基質としては役立たない末端が生じる。平滑末端が必要な場合、本発明者らは、日常的に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）１ユニット当たり１μｇのＤＮＡを、１２℃で３０分間、緩衝液２（ＮＥＢ社）中１００ｍＭの、４種のデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの等モル混合物を含有する３０μｌ容量中でインキュベートした。
【０１６２】
メチル化保護
このプロセスは、制限エンドヌクレアーゼ作用を利用する。当前記断片の２つの末端の
間にはこれらのエンドヌクレアーゼ用の１つ以上の部位が存在し得る。これらの部位を切断して、当前記末端を別個の分子に分離すると、必要な情報、すなわち、どの末端配列がどのコード化末端と組みになるかという情報の提供が妨げられるであろう。そのような切断は、ターゲット部位を適切にメチル化することにより回避できる。本発明者らが有用であると判断した酵素の組み合せとしては、部位がｄａｍメチラーゼで保護されたニック形成エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩ、部位がＭ．ＳｓｓＩメチラーゼおよびＩＩＧ型エンドヌクレアーゼ、ＡｃｕＩで保護されたＡｖａＩ、エンドヌクレアーゼおよび同種メチル化保護活性を共に有するポリペプチド（すべてＮＥＢ社）が挙げられる。後者の場合、２価のカチオン、この場合にはマグネシウムとＳ−アデノシルメチオニンを入れるか排除するかして、２種の活性間でスイッチすると便利であった。マグネシウムはエンドヌクレアーゼには必要であるが、この活性が不要な場合には、反応物からマグネシウムを外すか、ＥＤＴＡにより反応物中でキレートし得る（本発明の反応物では１５ｍＭが最終濃度）。最終濃度１６０マイクロモルのＳ−アデノシルメチオニンを日常的に使用した。これは、ターゲットに合わせて適合させる必要があった。さもないと、すべての可能な部位を保護するのには不十分な量のＳ−アデノシルメチオニンが加えられるという状況が発生し得る。インキュベーションは３７℃で１６時間であった。全３種のメチラーゼを一度に使用し得る。その場合、ｄａｍメチラーゼ（ＮＥＢ社）用の緩衝液は万能緩衝液としての役割を果たした。ある種の酵素は切断頻度が高くないことが知られており、二本鎖エンドヌクレアーゼとして用いる場合、ターゲット中のそれらの部位を保護しなくてもよい。例えば、ＳａｌＩやＳａｐＩは、ヒトにおいてそれぞれ平均サイズが８３，０００および１４，０００塩基の断片を生成し、異なる認識配列の性質の故に異なる部位選択バイアスを示すであろう。最初に５′ＧＡＴＣ突出部（ｄａｍメチラーゼ認識部位）を残す酵素で切断する方法は、ニック形成エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＡｌｗＩと適合させ得る末端を残す最も簡単な方法であることに留意すべきである。後者は、ｄａｍメチラーゼ感受性なので、形成された部位がブロックされないように注意する必要がある。例えば、ＥｃｏＲＶ部位は、アダプター連結によりＮ．ＡｌｗＩ部位に変換可能であり、前者はｄａｍメチル化されない。
【０１６３】
付着末端の作製および延長
ターゲット二本鎖として使用するために、φＸ１７４ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ、ＨｉｎｆＩで消化した。ＨｉｎｆＩは、配列ＧＡＮＴＣ、すなわち、
（5 ’G∧ANTC  3 ’
3 ’CTNA∧G  5 ’)
で切断し、その結果、末端配列に関して規定の配向を有するいくるかの断片を生成する。供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋ精製システムを用いてＤＮＡを精製し、２セットのアダプターに同時に連結した。第１セットのアダプターは、５′ＡＣＴ付着末端および第１内側塩基としてのＣを有するので、相補配列５′ＡＧＴに連結すると、ＮＢｓｔＮＢ１部位が形成される。第２セットのアダプターは５′ＡＤＴ付着末端（ここで、Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ）を有し、すべての他の可能なＨｉｎｆＩ末端に連結することによりブロッカーとしての役割を果たすので、相互連結が防止され、アダプターとのＮＢｓｔＮＢ１制限部位を形成しない。第１セットのアダプターは、ＮＢｓｔＮＢ１部位を形成する塩基と並列するＸｂａＩ部位を有するので、ＮＢｓｔＮＢ１、次いでＸｂａｉで消化すると、８塩基の３′付着末端を生成し、そのうち、３′末端の最初の４塩基は既知であり、次の４塩基は最初のＨｉｎｆＩ部位のすぐ向こう側のターゲット断片由来である。第１セットのアダプターも、それらの成り行きをモニターし得るように５′末端をＦＡＭで標識した。したがって、これらのアダプターの配列は以下の通りであった：
セット１
HfX bL8b：5 ’ACTCTAGATCTGAGATTCTCAGGATCT
FaHfX bU8b：3 ’GATCTAGACTCTAAGAGTCCTAGA-6-FAM
（HfX bL8b…配列番号５、FaHfX bU8b…配列番号６）
セット２
Hf920L：5 ’ADTGCACCAAAGTAACCCTG  D＝A,G,T  ミックス
Hf20 U：3 ’CGTGGTTTCATTGGGAC
（Hf920L…配列番号７、Hf20 U…配列番号８）
未知のターゲットＤＮＡ集合体は１：３のセット１：セット２の割合でアダプターに連結されるであろう。しかし、φＸ１７４  ＤＮＡの配列は分かっていたので、実際の末端を考慮に入れることができた。ＨｉｎｆＩ断片、すなわち、１０末端が「ＡＣＴ」相補突出部を有し、３２末端が「ＡＤＴ」相補突出部を有するであろう４２末端が存在する。したがって、適切な割当量は、１０のセット１に対し３２のセット２である。
【０１６４】
延長アダプターの合成
各アダプターを、標準化学〔ユーロジェンテック社（Ｅｕｒｇｅｎｔｅｃ）〕により、２種の非リン酸化オリゴヌクレオチドとして合成し、次いで、連結用にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５′リン酸を付加する。標準キナーゼ反応は、反応物５０μｌ当たり２００ピコモルのターゲットオリゴヌクレオチドを用いる。したがって、オリゴヌクレオチドは、２００ピコモル（４μｌ）を反応物に付加しやすくするのに都合の良い濃度、例えば、５０ピコモル／μｌ水とした。セット１およびセット２において、リン酸化オリゴヌクレオチドは、それぞれＨｆＸｂＬ８ｂおよびＨｆ９２０Ｌであった。
【０１６５】
キナーゼ反応：
７５μｌ    Ｘ１０  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
７５μｌ    ＡＴＰ  １０ｍＭ
６０μｌ    オリゴヌクレオチド ５０ピコモル／μｌ
５４０μｌ  Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
１５μｌ    Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ  １０μ／μｌ（ＮＥＢ社）
７６５μｌ  合計
インキュベーションは３７℃で３時間行った（水浴）。ポリヌクレオチドキナーゼの熱失活は９５℃で１０分間行った。
【０１６６】
アダプターを生成するためにキナーゼ処理オリゴヌクレオチドをそれらの相補鎖にアニーリングした。相補鎖をＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏに、キナーゼ処理オリゴヌクレオチドと同じ濃度（５０μｌ当たり２００ピコモルまたは４ピコモル／μｌ）すなわち、６０μｌ相補オリゴ５０ピコモル／μｌ＋７００μｌ水になるように希釈した。
【０１６７】
相補オリゴヌクレオチドを１：１混合（１．５ｍｌ管中３８０μｌ＋３８０μｌ）して、最終濃度２ピコモル／μｌの二本鎖オリゴヌクレオチドを得、これを５分で９５℃に加熱して、二次構造を減少させ、次いで、６５℃で５分間アニーリングした。必要に応じ、−２０℃で貯蔵した。
【０１６８】
延長アダプターとターゲットＤＮＡの連結
ＨｉｎｆＩ末端の大部分が確実にアダプター付加されるように、アダプターを８０倍モル過剰でＨｉｎｆＩ断片上に連結した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼはＰＮＫ緩衝液中で機能するので、最終反応物は、ただ以下のような他の付加物質からなるように調整した：
８０μｌ（１０μｇ）    ＨｉｎｆＩ消化φＸ１７４  ＤＮＡ
１１４４μｌ            セット１アダプター２ピコモル／μｌ
３６６１μｌ            セット２アダプター  ｄｓ２ピコモル／μｌ
２８０μｌ              Ｘ１０  Ｔ４リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
９μｌ                  Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
２６μｌ                Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）
５２００μｌ            総量
１６℃で１６時間インキュベートした。コントロール反応物も同様に調製したが、但し、無アダプターコントロールでは、アダプターを０．５×ＰＮＫ緩衝液に替え、無リガーゼコントロールでは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを除いた。
【０１６９】
連結産物を、限外濾過、次いで３回連続のＱＩＡｑｕｉｃｋ精製により精製した。後者は、供給業者が推奨する通りであったが、但し、溶出緩衝液ＥＢをＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏで１５／１００希釈した。
【０１７０】
限外濾過器を４００μｌのＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏでプリウェットし、１５００×ｇで１２分間または残りが４０μｌ未満になるまで遠心分離してドレーンした。連結反応物３５０μｌを一度に（総濾過膜当たり２．５μｇ）限外濾過器にかけ、すべての反応物が充填され、濃縮されるまで、追加のたびに上記のように遠心分離した。さらに、４００μｌのＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏで洗浄した後、１５０μｌのＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏで最終洗浄して、反応物の量を４０μｌ未満とした。濾過膜を未使用管に反転させ、再遠心分離して、試料を回収した。１回目のＱＩＡｑｕｉｃｋ精製にはＱＩＡｑｕｉｃｋカラムを３つ、２回目には２つ、最終回には１つを用いた。黄色変化が見られたら、それは、残留ＦＡＭ標識アダプターが残っていることを示すので、透明になるまでさらに精製を行った。試料は必要なときまで−２０℃で保存し得る。
【０１７１】
インデックス化用末端の作製
以下のように、ＮＢｓｔＮＢ１、次いでＸｂａＩの作用により断片上にインデックス化用末端を生成し、次いで精製した。
【０１７２】
〜５０μｌ    （９μｇ）ＨｉｎｆＩ消化・アダプター付加φＸ１７４  ＤＮＡ
２１．５μｌ  ＮＢｓｔＮＢ１１０μ／μｌ（ＮＥＢ社）
６１．５μｌ  Ｘ１０緩衝液３（ＮＥＢ社）
４７７μｌ    Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
最終量      ６１０μｌ
反応物を５５℃で１６時間インキュベートした。ＸｂａＩは緩衝液３中では十分機能しないので、反応量を以下のように希釈した：
５７６μｌ    上記由来のＮＢｓｔＮＢ１反応物
２３０μｌ    Ｘ１０緩衝液２（ＮＥＢ社）
１４８２μｌ  Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
１６μｌ      ＸｂａＩ（ＮＥＢ社）
最終量        ２３０４μｌ
３７℃で３時間インキュベーションを行った。供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋ（カラム当たり＜１０μｇ）で精製したが、但し、試料は、ＰＢおよびカラムに加える直前に７５℃で５分間インキュベートした。このようにＱＩＡｑｕｉｃｋ精製すると、ＮＢｓｔＮＢ１により遊離された短いオリゴヌクレオチドが除去され、これは必要に応じて繰り返すことができる。各ステップが正常に生じ、アダプター由来の短い産物が除去されたことを確認するために、０．５μｇの試料を２％無染色アガロースゲル電気泳動にかけて分析し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド除去後のＤＮＡの存在は、サイバーグリーンまたは臭化エチジウム染色により示された。アダプター不在下では、ＨｉｎｆＩ断片が相互連結により高分子量スメアを形成し、リガーゼ不在下では、それらの断片のＨｉｎｆＩ断片サイズの増大により示されるようなアダプター付加は生じなかった。ＮＢｓｔＮＢ１はＦＡＭ標識を除去し、ＸｂａＩは断片サイズをそれらの元のサイズ近くに縮小させた。首尾良く処理された断片はシーケンシングステップに直ぐ使える状態であった。
【０１７３】
インデックス化
インデクサー分子の作製
先ず、アミノアリルｄＵＴＰを組み込んだＤＮＡの第２鎖合成用鋳型として用いた一本鎖φＸ１７４ビリオンＤＮＡからインデクサー分子を作製した。後者を、ＡＲＥＳ  ＤＮＡ標識キット（モレキュラー・プローブス社）を用い、任意の好ましい組み合せのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料で直接標識した。第２鎖合成用プライマーは、
phiXBssH11-Pst1rc
TGGAAGCGATAAAACTCTGCAGGTTGGATACGCCAATCATTTTTATCGAAGCGCGCATAAATTTGAGCAGAT  （配列番号９）
であり、このプライマーは、φＸ１７４のＢｓｓＨＩＩとＰｓｔＩ認識部位とにオーバーラップするので、これらは、干渉の恐れなく、アミノアリルｄＵＴＰ組み込み後に切断し得る。合成は以下のように行った：
１０μｌ      ビリオンＤＮＡ  １０μｇ
３２０μｌ    Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
５０μｌ      Ｘ１０  Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（ＮＥＢ社）
６０μｌ      アミノアリルｄＵＴＰ（０．５ｍＭ）（モレキュラー・プローブス社）
１０μｌ      ｄＴＴＰ（０．５ｍＭ）（アマーシャム・ファーマシア社、現ＧＥヘスルケア社）
４０μｌ      ｄ（ＧＡＣ）ＴＰ（０．５ｍＭ）（アマーシャム・ファーマシア社−現ＧＥヘルスケア社）
１０μｌ      ｐｈｉＸＢｓｓＨ１１−Ｐｓｔ１ｒｃ６ピコモル／μｌＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
５μｌ        Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）
最終量５００μｌは１０×５０μｌアリコートとして用いた。５０℃で２時間インキュベーションを行い、ＤＮＡを供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（カラム当たり１０μｇ）で精製した。以下のように精製ＤＮＡをＰｓｔＩおよびＢｓｓＨＩＩで消化した。
【０１７４】
６０μｌ      φＸ１７４アミノアリルｄＵＴＰ組み込みＤＮＡ（１０μｇ以上）
３０μｌ      Ｘ１０緩衝液３
２００μｌ    Ａｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
１０μｌ      Ｐｓｔ１
最終量        ３００μｌ
３７℃で２時間インキュベーションを行った。２０μｌのＢｓｓＨ１１を加え、３７℃で２時間インキュベーションを続けた。消化を確認するために、０．５μｇ（１５μｌ）の試料を１％アガロースゲル電気泳動にかけて分析した。ＢｓｓＨＩＩも修飾ＤＮＡを消化することを示すために、平行コントロール反応物を設定した。ＤＮＡを供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋにかけて精製した。
【０１７５】
ＰｓｔＩ末端をインデクサーとして使用するために修飾し、ＢｓｓＨＩＩ末端を環状化させた。オリゴヌクレオチドファミリーのいずれかをインデックス化末端として用いる。環状化用末端は、自己相補的ではなく、２種の異なるタイプのインデクサー、図７の１および２の同等物を受容した断片からのみ環を形成し得るように相補末端を有する他のインデクサーに連結可能なように設計する。適切なオリゴヌクレオチドアダプターの連結によりアミノアリルｄＵＴＰφＸ１７４を修飾した。
【０１７６】
Ｐｓｔ１（インデックス化）末端は、
pxI1Hf/AAGT      5 ’AACCCACATCTACAGACCCTGAAGAAACAGTCAAGT
（配列番号１０）
および部分相補鎖
pxI1Hf/U            3 ’  ACGTTTGGGTGTAG
（配列番号１１）
を用い、図７のインデクサー１の同等物（ＩＩ型部位はＡｃｕＩ  ５′ＣＴＧＡＡＧ  １６／１４用である）、または
pxI2Hf/GCCA      5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCGCCA
（配列番号１２）
および同じ部分相補鎖を用いる。これは、ＩＩ型部位を欠失し、図中のインデクサー２と同等物であることに留意すべきである。この形態のインデクサーとして用いるためのオリゴヌクレオチド（ｐｘＩ１Ｈｆ／ＮＮＮＮおよびｐｘＩ２Ｈｆ／ＮＮＮＮ）は、上記のようなT４  ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化を必要とする。
【０１７７】
ＢｓｓＨＩＩ（環状化）末端は：
pxCIRC/GACT  5 ’GACTGAAGTGATCTCCCT  （配列番号１３）
または
px CIRC/AGTC  5 ’AGTCGAAGTGATCTCCCT  （配列番号１４）
と、
部分相補鎖：
pxCIRC／U    3 ’CTTCACTAGAGGGAGCGC  （配列番号１５）
を用いる。
ｐｘＣＩＲＣ／Ｕは、上記のような連結にリン酸付加反応を必要とする。アダプターの形成および使用法は上述の通りであるが、但し、大型のφＸ１７４は、未使用アダプターを、供給業者が示唆するように限外濾過器の代わりに使用されるＳ２００スピンゲルクロマトグラフィスピンカラム（ＧＥへルスケア社）により取り除きやすくする。スピンカラムの後で（上記のような）ＱＩＡｑｕｉｃｋ精製を１回行った。φＸ１７４の１末端はｐｘＩ２Ｈｆ／ＮＮＮＮベースのインデックス化アダプターを受容し、他末端はｐｘＣＩＲＣ環状化アダプターを受容する。インデクサー当たり単一のインデックス化オリゴヌクレオチド／環状化アダプター組み合せを用いる。
【０１７８】
環状化できなかったインデクサーも用いた。これらのインデクサーは当前記ケースには存在しない断片末端、すなわち：
pxI1Hf/TACT    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCTACT
pxI2Hf/ATTT    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCATTT
pxI2Hf/TCAT    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCTCAT
pxI2Hf/TTCT    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCTTCT
pxI2Hf/AATA    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCAATA
pxI2Hf/CGAT    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCCGAT
pxI2Hf/CACA    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCCACA
pxI2Hf/GAAA    5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCGAAA
（上から順に配列番号１６〜２３）
に特異的であった。
【０１７９】
これらは非φＸ１７４で、非標識であったが、その他の点ではインデックス化アダプターと同じであった。
供給業者が推奨するＡｒｅｓ標識キット（モレキュラー・プローブス社）を用いて、精製インデクサーをＡｌｅｘｏｆｌｕｏｒ染料で標識した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料は、極めて安定であるが、光劣化を受けやすいので、最適蛍光を得るために、プロセスのできるだけ後期でインデクサーＤＮＡを標識し、暗所で凍結保存した。凍結／解凍反復サイクルが回避された。
【０１８０】
インデクサーの連結
以下のような標識インデクサーを用いて、インデックス化するために初期に作製したφＸ１７４ターゲットＤＮＡをインデックス化した：
１．４ピコモルのφＸ１７４ターゲットＤＮＡ末端（０．５μｇ）
０．４ピコモルのインデクサー１（ｐｘＩ１Ｈｆ／ＡＡＧＴとｐｘＣＩＲＣ／ＧＡＣＴをベースとする）
０．４ピコモルのインデクサー２（ｐｘＩ１Ｈｆ／ＧＣＣＡとｐｘＣＩＲＣ／
ＡＧＴＣをベースとする）
３．２ピコモルの非環状化インデクサー（それぞれ等モル）ミックス
２μｌのＸ１０  Ｐｆｕリガーゼ緩衝液（ストラタジーン社）
最終量２０μｌまでのＡｌｐｈａ  Ｈ２Ｏ
０．２μｌのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ストラタジーン社）
インキュベーションは、連続サイクル：
７２℃で３０秒間
４５℃で３分間
５０℃で３分間
５５℃で５分間
を用いて１６時間行った。
【０１８１】
反応物を精製（供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋ−キアゲン社）し、４０μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）中１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）を用い、３７℃で１時間、インデクサーの末端をリン酸化した。０．４μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を加え、１６℃で３時間かけて断片を環状化させた。
【０１８２】
反応物を１００μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）に適合させ、１μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを加えて、１２℃で３０分かけてインデクサーの一本鎖領域を埋めた。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社）もそれ自身の緩衝液中５０℃で使用し得る。供給業者が推奨するＱＩＡｑｕｉｃｋ（キアゲン社）によりＤＮＡを直ちに反応物から精製した。
【０１８３】
末端の縮小、延長および再インデックス化
精製ＤＮＡを、４０μｌの供給業者緩衝液中、３７℃で３時間かけて、１０ユニットのＡｃｕＩ（ＮＥＢ社）で完全に消化した。ＤＮＡを精製し、上記のように再インデックス化したが、但し、ＮＢｓｔＮＢＩ部位の付加に用いたアダプターは：
3nnXbL8b:      5 ’GACTCTAGATCTGAGATTCTCAGGATCT
Fa3nnXb U8b:      NNCTGAGATCTAGACTCTAAGAGTCCTAGA-6-FAＭ  5 ’
（3nnXbL8b…配列番号２４，Fa3nnXb U8b…配列番号２５）
であった。
【０１８４】
また、図面中の３および４に対応するインデクサーはＰｆｕ  ＤＮＡ連結以後の処理は行わなかった。
インデクサー３は：
pxI2Hf/AGTA      5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCAGTA
（配列番号２６）
由来であった。
【０１８５】
インデクサー４は：
pxI2Hf/CTGA      5 ’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCCTGA
（配列番号２７）
由来であった。
反応産物を分析し、０．６％パルスフィールドアガロースゲル電気泳動にかけて精製し、完全インデックス化および部分インデックス化産物に対応する反応産物を検出するため
にＴｙｐｈｏｏｎ  Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化した。ゲルから完全インデックス化産物（＞２０Ｋｂ）を切り出し、供給業者に従ってＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）を用いて精製し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４  Ｐ４  ３．０ＧＨｚシステムに連結したＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲＭ  Ｒｅｖ  ２．０  Ｍｏｎｏデジタルカメラを内臓するＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐまたは電動式Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ．１を用いてエピ蛍光により可視化した。方法は、光学マッピング法：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９８年７月７日；第９５巻（１４）：ｐ．８０４６−５１、アレイ流体固定（ａｒｒａｙｅｄ、ｆｌｕｉｄ−ｆｉｘｅｄ）ＤＮＡ分子を用いた自動高分解能光学マッピング〔ジング  ジェイ（Ｊｉｎｇ  Ｊ）、リード  ジェイ（Ｒｅｅｄ  Ｊ）、フアン  ジェイ（Ｈｕａｎｇ  Ｊ）、フー  エックス（Ｈｕ  Ｘ）、クラーク  ブイ（Ｃｌａｒｋｅ  Ｖ）、エディントン  ジェイ（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ  Ｊ）、ハウスマン  ディー（Ｈｏｕｓｍａｎ  Ｄ）、アナンサラマン  ティー  エス（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｎ  Ｔ  Ｓ）、ハフ
イー  ジェイ（Ｈｕｆｆ  Ｅ  Ｊ）、ミシュラ  ビー（Ｍｉｓｈｒａ  Ｂ）、ポーター
ビー（Ｐｏｒｔｅｒ  Ｂ）、シェンカー  エイ（Ｓｈｅｎｋｅｒ  Ａ）、ウォルフソン
イー（Ｗｏｌｆｓｏｎ  Ｅ）、ヒオルト  シー（Ｈｉｏｒｔ  Ｃ）、カンター  アール（Ｋａｎｔｏｒ  Ｒ）、アストン  シー（Ａｓｔｏｎ  Ｃ）、シュワルツ  ディー  シー（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｄ  Ｃ）、本明細書に文献援用〕を改変した。これらの方法の改変は、実施例９に記載のような疎水性分子に対して推定される手順に従った。
【０１８６】
＞２０インデックス化ターゲットを達成するために、末端の成り行きは以下のようであった：
Ａｃｕ１部位はインデクサー１のみに存在し、環状化は、以下に示す個所でＡｃｕＩで消化した後で生じた。
インデクサー１
AcuI 
5 ’CTACAGACCCTGAAGAAACAGTCAAGT5678910NNNNNNN  ターゲット
3 ’GATGTCTGGGACTTCTTTGTCAGTTCA5678910NNNNNNN
Ｔ４リガーゼを用いて第２セットのアダプターを連結し、次いで、産物を先に述べたようにＮＢｓｔＮＢ１およびＸｂａ１で消化する。
X baI
インデクサー１  TC12345678GACTCTAGATCTGAGATTCTCAGG
AG12345678CTGAGATCTAGACTCTAAGAGTCC  アダプター２  
NBstNB1
-----TC12345678GACT              CTAGATTTCTCAGG
-----AG1234                          TAAAGAGTCC
5678CTGAGATC
１２塩基対のオリゴヌクレオチドと短い残りのアダプター２は、７５℃でインキュベートした後ＱＩＡｑｕｉｃｋクリーンアップにより除去する。次いで、最終インデクサー上でＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼを連結する。
-----TC12345678GATC                  GATGTGGGTT
-----AG12345678CTAGCAAAGTCGAACCAGACATCTACACCCAA  インデクサー４
同様にターゲット（非バーコード末端）で、ＮＢｓｔＮＢＩ、ＸｂａＩで消化し、精製
した後、Ｐｆｕ  ＤＮＡをインデクサー３と連結すると：
CCTGAGAATCTCAGATCTAGAGTC789101112-----
アダプター２  GGACTCTTAGAGTCTAGATCTCAG789101112-----ターゲット
は、
AACCCACATCTACAGACCCTGAAGAAACAGTC789101112-----
アダプター３TTGGGTGTAGA           TCAG789101112-----  ターゲット
となる。
【０１８７】
実施例４  −  連結用リガーゼと条件の選択
インデックス化反応にはＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ストラタジーン社）を５０℃で用い得る。しかし、多くのリガーゼは周知であり、異なる最適条件を有し得ることが分かっている。通常、結合される断片の５′末端にピロリン酸が堆積すると、たとえ初期には成功しなくても連結を阻止することがある。場合により、マンガンはマグネシウムより良い二価カチオン源であり得る〔例えば、リューら（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４年；第３２巻：ｐ．４５０３−４５１１．、トンら（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００年、第２８巻：ｐ．１４４７−１４５４、トンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９９年、第２７巻、ｐ．７８８−７９４〕。下記は、好ましいリガーゼの鑑別およびそれらの使用条件の説明である。
【０１８８】
ターゲットＤＮＡ末端の作製
φＸ１７４  ＲＦ  ＤＮＡ（ＮＥＢ社）をＨｉｎｆＩで完全に切断してターゲットとして使用した。ＨｉｎｆＩは、その認識部位の１つ、５′ＧＶＡＧＴＣ（ここで、Ｖは切断個所である）になり得るし、ニック形成エンドヌクレアーゼ  ＮＢｓｔＮＢＩ認識部位を形成するように適合させ得るので、使用に便利な酵素である。
【０１８９】
ＨｉｎｆＩ消化は以下の通りであった：
３０μｇ    φＸ１７４（ＲＦ１、ＮＥＢ社）
３０μｌ    ＨｉｎｆＩ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
６０μｌ    Ｘ１０緩衝液２（ＮＥＢ社）
４８０μｌ  水
３７℃で３時間のインキュベーションと、標準精製を行った。
アダプターの作製
ＮＢｓｔＮＢＩ末端作製用と残りのもの用の２種のアダプターを用いた：
５′ＡＧＴＣ／Ｇ末端でＮＢｓｔＮＢＩ部位を再生させ、ＸｂａＩをその隣に配置する
HfXbL 8b：        5 ’ ACTCTAGATCTGAGATTCTCAGGA  （配列番号２８）
とFAMHfX bU8b  3 ’ GATCTAGACTCTAAGAGTCCTAGA（5 ’FAM）
（配列番号２９）
および
すべての他の可能な末端をＴＡＭＲＡ、すなわち、５′ＣＧＴＣ／Ｇ、５′ＧＧＴＣ／Ｇおよび５′ＴＧＴＣ／Ｇで標識する
Hf920:  5 ’ A（AGT）TGCACCAAAGTACCCT （配列番号３０）
とTAMHf20 3’ CGTGGTTTCATTGGGAC(5’TAMRA)  （配列番号３１）
以下のようにＨｆＸｂＬ８ｂとＨｆ９２０をキナーゼ処理して５′リン酸を付加した。７５μｌ        ＡＴＰ  １０ｍＭ
７５μｌ        Ｘ１０  ＰＮＫ緩衝液
６０μｌ        オリゴ  ５０ピコモル／μｌ
５４０μｌ      水
１５０ユニット  Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）。
【０１９０】
３７℃で３時間インキュベートし、次いで、９５℃で１０分間熱失活させた（精製は用いなかった）。
もとの反応量に等しい水量中で相補鎖をそれぞれ２ピコモルの最終濃度まで加え、９５℃で５分間第１変性を行った後、６０℃でアニーリングした。
【０１９１】
連結
以下のようにアダプターをターゲットに付加した：
６０μｌ        φＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  ＤＮＡ（１０μｇ）
１２５９μｌ    ＦＡＭＨｆＸｂＵ８ｂ／ＨｆＸｂＬ８ｂ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
９４４μｌ      Ｈｆ９２０ＴＡＭ／Ｈｆ２０ｕ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
９４４μｌ      Ｈｆ９２０／ＴＡＭ  Ｈｆ２０ｕ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
１８８８μｌ    Ｈｆ９２０／Ｈｆ２０ｕ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
２９８．５μｌ  Ｘ１０  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
８０μｌ        水
２５μｌ        Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
次いで、１６℃で１６時間インキュベートした。
【０１９２】
アダプター付加断片を、４つの限外濾過装置〔Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ５０、アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ）〕中、４００μｌの水で２回、次いで１５０μｌの水で１回洗浄し、各洗浄の間に１５００×ｇで１２分間遠心分離して精製した後、３カラム、次いで２カラム、次いで１カラムを介して３回連続イオン交換クロマトグラフィ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、キアゲン社）にかけた。供給された６０μｌのＥＢ中で溶出した。
【０１９３】
付着末端標識
以下のようにアダプター付加物質をＮＢｓｔＮＢＩでニック形成した：
５２μｌ      φＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  Ａ／Ｍ（９μｇ）
１９μｌ      ＮＢｓｔＮＢＩ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
３８μｌ      Ｘ１０  ＮＢｓｔＮＢＩ緩衝液（ＮＥＢ社）
２７１μｌ    水
５５℃で１６時間インキュベートした。
【０１９４】
次いで、ニックが入った物質をＸｂａＩで切断した。
３７０μｌ  上記消化産物
１４８μｌ  Ｘ１０緩衝液２（ＮＥＢ社）
９μｌ      ＸｂａＩ（２０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
９５３μｌ  水
３７℃で３時間インキュベートした。
【０１９５】
エンドヌクレアーゼにより生成された短いアダプター付加末端配列断片を７５℃で１０分加熱してターゲットから融解させ、直ぐに、５容量のＰＢ緩衝液（キアゲン社）に加え、（再アニーリングを回避するために）３カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィ（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、キアゲン社）にかけて即時精製した。
【０１９６】
上記と同様に精製を繰り返したが、但し、１カラムを用いた。供給された６０μｌのＥＢ緩衝液で溶出し、新規物質はターゲット、φＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  ＤＮＡと見なされた。
【０１９７】
テストインデックス化反応
以下のようにインデックス化連結を行った：
３μｌのターゲット  φＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  ＤＮＡ
２μｌのＸ１０リガーゼ緩衝液（必要に応じて  −  表２参照）
１．２μｌまたは０．６ピコモルまでの各インデクサー
２０μｌまでの水
０．４ユニットのリガーゼ（必要に応じて  −  表２参照）。
【０１９８】
選択温度（表参照）で、１６時間インキュベートし、４００μｌの水で２回、次いで１５０μｌの水で洗浄し、各洗浄間に１５００×ｇで１２分間限外濾過して精製した後、ＭｅｇａＧＡＣＥ（ＧＥヘルスケア社）蛍光、毛管電気泳動システムを用いて反応物を分析した。
【０１９９】
【表６】
2008515451.tif 000015
インデクサーは、ターゲット断片も示す以下のリストから組み合せて用いた：
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＴＡＣＴ  −  １４０塩基  ＨｉｎｆＩ断片
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＴ  −  １４０塩基  ＨｉｎｆＩ断片
（前記の対向末端）
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡ  −  １５１塩基  ＨｉｎｆＩ断片
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴＣＴ  −  ２０７塩基  ＨｉｎｆＩ断片
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴ  −  ７２０塩基  ＨｉｎｆＩ断片
Ｈｅｘ−ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＣＣＡ  −  ７２０塩基  ＨｉｎｆＩ断片
（前記の対向末端）
（上から順に配列番号３２〜３８）
結果を部分的に図８に示す。最も弱い結果は、標準条件下にＰｆｕリガーゼを用いた場合に生じ、１５１塩基断片と７２０塩基断片の１末端のみが強く検出された。上の電気泳動図（図８Ａ）は、３７℃のＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼとマグネシウムを用いたときの結果を示しており、僅かな改善が見られる。真中の電気泳動図（図８ｂ）では、この酵素に関
する最上の結果が示されており、この場合、マグネシウムは３７℃で用いた。７２０塩基断片はＡＡＧＴ末端インデクサーで検出されたが、１４０および２０７塩基断片のシグナルは依然として弱い。Ｔａｑリガーゼを４５℃で用いると（図８Ｃ）、マグネシウムを用いた場合ても全ての断片で良好なシグナルが生成する。僅かな差は、一部には小断片を精製した際の低回収率に関係する。本発明者らは、４５℃のＴａｑリガーゼを標準としたが、これは、ユーザーが好ましい条件を決定する問題である。
【０２００】
このタイプのアッセイは、他の最適パラメータ、例えば、必要なリガーゼ量およびインデクサー量の決定に用い得る。後者は、本発明のプロセスがインデクサーの混合プールを利用するので、特に重要である。プール当たりのインデクサー量が多ければ多いほど、多くの異なるタイプの末端にアクセスできる。しかし、このようにすると、反応物中のＤＮＡの総質量が増大し、インデクサーが長くなるので、結局のところ、数は抑えられるようになり得る。図９は、インデクサーの濃度を上記反応物中で変えたとき、標識産物の収率に及ぼす影響を示している。反応物当たり０．００９ピコモルの７２０塩基ターゲット断片が存在した。Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼと共に用いたＡＡＧＴで終るインデクサーの最適な量は１．０ピコモルであったが、収率は、最適には０．６ピコモルのインデクサーを必要とするＴａｑ  ＤＮＡリガーゼの場合よりまだ著しく低かった。ターゲットに対して絶対必要量より大幅に多い約６７モル過剰のインデクサーが存在した。これらのインデクサー濃度は、反応の促進に用いられ、より多くのターゲットの使用を支持し得る。
【０２０１】
実施例５  −  平滑末端でのインデックス化
実施例２に記載のプロセスは、インデックス化分子をターゲット分子の末端に高配列特異性をもって配置し得ることを示している。ここで、本発明者らは、これは、元の断片が平滑末端を有する場合にも可能であることを示す。配列アセンブリーのための実際の配列情報が得られる断片末端に平滑末端が見込まれる。この実施例では、バクテリオファージラムダ（ＮＥＢ社）由来のＤＮＡをターゲットとして用いるためにＨｉｎｃＩＩで完全に切断した。ＨｉｎｃＩＩは当然平滑末端を残すが、その認識配列は縮重しているので、集合体全体に一連の可能な末端が見出される。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）を用いて、精製断片を８０ピコモル過剰な平滑末端アダプターに連結した。４種のアダプターを比較した：
FaNBsXbU8b   5’ FAM  AGATCCTGAGAATCTCAGATCTAGAGTC
と、NBsXbL8b  3 ’    TCTAGGACTCTTAGAGTCTAGATCTCAG
（FaNBsXbU8b…配列番号３８，NBsXbL8b…配列番号３９）
HeNBsXbU5b   5 ’HEX  TCCTGAGAATCTCAGATCTAGAGTC
と、NBsXbL5b  3 ’     TAGGACTCTTAGAGTCTAGATCTCAG
（HeNBsXbU5b…配列番号４０，NBsXbL5b…配列番号４１）
HeNBsXbU3b   5 ’ HEX  CTGAGAATCTCAGATCTAGAGTC
と、NBsXbL3b  3 ’    GGACTCTTAGAGTCTAGATCTCAG
（HeN BsXbU3b…配列番号４２，NBsXbL3b…配列番号４３）
HeNBsXbU1b   5’ HEX   GAGAATCTCAGATCTAGAGTC
と、NBsXbL１b  3’    ACTCTTAGAGTCTAGATCTCAG
HeNBsXbU1b…配列番号４４，BsXbL１b…配列番号４５）
いずれの場合にも、アダプターの上鎖の５′末端を標識し、指名された蛍光染料でブロックした。下鎖はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ社）で付加された５′リン酸を
有していた。キナーゼ処理、アニーリング、連結および非連結アダプターの除去はすべて実施例２に記載の通りであった。これらのアダプターは、これらの酵素の各作用により８塩基の３′突出部が生成し得るようにニック形成エンドヌクレアーゼ、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩおよびエンドヌクレアーゼＸｂａＩ用部位を有している。μｇ当たり１０ユニットのＮ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ社）をμｇ当たり５０μｌの緩衝液３（ＮＥＢ社）中５５℃で一晩用い、反応物をμｇ当たり１００μｌの緩衝液２（ＮＥＢ社）およびμｇ当たり１０ユニットのＸｂａＩ（ＮＥＢ社）に適合させ、３７℃でさらに３時間インキュベーションを続けた。このプロセスの各ステージ後に採取した０．５μｇの物質に相当するコントロールをアガロースゲルを介した電気泳動にかけて調べ、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥヘルスケア社）を用いて可視化し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで前染色および後染色した。意義深いことには、ＦａＮＢｓＸｂＵ８ｂ／ＮＢｓＸｂＬ８ｂに対応する試料には残留（非精製）アダプターが存在したのに対し、他の場合には、これらのアダプターは大部分除去されていた。非精製物質は消化およびその後のインデックス化連結に干渉する。この手順で効率的に除去されなかったアダプター、ＦａＮＢｓＸｂＵ８ｂ／ＮＢｓＸｂＬ８ｂは最長であり、これは、長さ（デザイン）が精製法に一致したアダプターを有することの重要性を示している。使用した染料は精製に関して有意な差をもたらさない。
【０２０２】
それぞれの残留試料中の最終精製物質を可能なインデクサーそれぞれに連結した：
ＦＡＮＢｓ１１ａａｃａ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＡ
ＦＡＮＢｓ１１ａａｃｃ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＣ
ＦＡＮＢｓ１１ａａｃｇ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＧ
ＦＡＮＢｓ１１ａａｃｔ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＴ
ＦＡＮＢｓ１１ｇａｃａ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＡ
ＦＡＮＢｓ１１ｇａｃａ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＣ
ＦＡＮＢｓ１１ｇａｃａ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧ
ＦＡＮＢｓ１１ｇａｃａ    ５′  ＦＡＭ  ＴＴＴＴＡＧＴＣＧＡＴＴ
（上から順に配列番号４６〜５３）
成功した試料とインデクサーを別個に用いて、全部で２４の反応物を作製した。反応は実施例４に記載の最上条件に従った。連結産物から限外濾過（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ５０、アミコン社）により低分子量物質を除去し、ＭｅｇａＢＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社）を用いて毛管電気泳動にかけて試料を分析した。代表的な電気泳動図を図１０に示す。観察した断片は、バクテリオファージラムダの既知配列および使用した酵素とインデクサーから予測した通りである。３つずつの電気泳動図はそれぞれ、異なる出発アダプターを用いて生成された。完全に独立した反応における高度の再現性に注目されたい。
【０２０３】
実施例６  −  ヒトゲノムＤＮＡのインデックス化
このプロセスは、ヒトのような高等真核生物の全ゲノムを読み取り得る一般的なシーケンシング手段を提供する。これは、ゲノムをカバーするために図７に示す適切な頻度の固定末端を必要とする。本発明者らは、本発明のプロセスを支持するようにユニーク部位が適切な頻度で存在することを確認するために、アルゴリズムｆｕｚｚｎｕｃ（上記参照）を用いてヒトゲノム配列  ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５．１のサーチを実施した。その結果を図１１に要約するが、その場合、高頻度（Ｂｇ１ＩＩ）および低頻度（Ｓａ１Ｉ）の切断が予測される酵素についての結果を比較する。本発明者らが示唆した選択レベルで多数のユニーク部位（合計１８塩基）が存在し、総頻度は既知ジヌクレオチド頻度から予測されたものと同じである、すなわち、ＣｐＧ含有部位は過小表示される。したがって、これは、当業者が特定のニーズに適した方法を採用するという問題であり、制限酵素の広範な利用範囲および本発明の方法の普遍的な性質を考えれば、無限である。
【０２０４】
インデックス化は、実際には、この実施例で示すように、予測されたターゲット部位をサンプリングする。この方法を図１２に示すが、その場合、事前選択されなかったヒトゲノム中の部位からさまざまな短い配列を分離した。利用可能な３塩基突出部の１／４を選択して、単一のインデックス化アダプターを完全なＨｉｎｆ１消化産物に連結した。このインデクサーを上述のようにニック形成および切断部位に配置して、各末端に、４つが既知塩基、４つが未知塩基の８塩基突出部を形成させた。単一インデクサーの連結により、各末端で１／２５６断片が選択された。次いで、各分子の２末端の配列を、インデクサー由来のＩＩＳ型エンドヌクレアーゼで切断（ステップ５）した後、別々に分析した。ステップ６では、単一のインデックス化アダプターをこの切断産物に連結するのに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用い、それによって、不確定２塩基突出部が生じた。したがって、本発明者らは、ステップ６で１／１６断片：１／１６，３８４の全濃縮を選択した。本発明者らは、図１２のステップ６に示す一定の特徴を有する７４の異なる断片を予測した。
【０２０５】
第１アダプター連結：
８μｇのＨｉｎｆ１消化ヒトゲノムＤＮＡ
ＤＮＡ１μｇ［１９２０ピコモル］当たり２４０ピコモルのアダプターセット１（ＴＣＡ）。
ＤＮＡ１μｇ［５７６０ピコモル］当たり７２０ピコモルのアダプターセット２（ＴＤＡブロッカー）
１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
２４μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
４８８０μｌの量までのＨ２Ｏ
アダプターセット１(TCA)  5’FAM  AGATCCTGAGAATCTCAGATCTAG
と                        3’    TCTAGGACTCTTAGAGTCTAGATCTCA
（それぞれ配列番号５４，５５）
アダプターセット２(TDA)   5 ’  CAGGGGTTACTTTGGTGC
と、                      3 ’  GTCCCCAATGAAACCACGTDA
D=A、G、Tミックス。
（それぞれ配列番号５６，５７）
インキュベーションは１６℃で１６時間行った。
【０２０６】
精製は実施例２に記載の通りであり、６０μｌのＥＢ中で溶出して、〜７．５μｇのアダプター付加ＤＮＡを得た。
ニック形成にはＮＢｓｔＮＢＩを用いた：
７．５μｇ  ＤＮＡ
１×ＮＢｓｔＮＢＩ緩衝液（ＮＥＢ社）
１０ユニット／μｇ  ＤＮＡ  ＮＢｓｔＮＢＩ（７５Ｕ、ＮＥＢ社）。
２００μｌの量までのＨ２Ｏ
インキュベーションは５５℃で１６時間であった。
【０２０７】
二本鎖切断にはＸｂａＩを用いた：
７μｇ  ＤＮＡ
１×緩衝液２（ＮＥＢ社）
１７ユニット／μｇ  ＤＮＡ  ＸｂａＩ（１２０Ｕ、ＮＥＢ社）。
６８８μｌの量までのＨ２Ｏ
インキュベーションは３７℃で９０分であった。
【０２０８】
アダプター＋末端配列の短い断片を、実施例２に記載のように７５℃に加熱、精製して除去し、〜６．５μｇのＤＮＡを得た。
ビオチニル化インデクサーを用いてインデックス化を実施した：
〜０．１４〜０．１９μｇのＤＮＡ（上記ＮＢｓｔＮＢＩ／ＸｂａＩ消化産物）
２５ピコモルのビオチンインデクサーオリゴヌクレオチド
１×Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ストラタジーン社）
４Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ（ストラタジーン社）
１００μｌの量までのＨ２Ｏ
ビオチンインデクサーオリゴ：
5 ’ビオチン  ATTCGGCGAGCATCGGAAACTGGAGAGTCAGAT
（配列番号５８）
インキュベーションは、７２℃で３０秒、４５℃で３分、５０℃で３分、５５℃で５分の連続サイクルで１６時間行った。
【０２０９】
次いで、連結されたインデクサーの一本鎖領域をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋めた：
〜１４ｎｇ〜１９ｎｇのビオチンアダプター付加ＤＮＡ
１×緩衝液３（ＮＥＢ社）
１６ナノモルのｄＮＴＰ
８０μｌの量までのＨ２Ｏ
インキュベーションは、１２℃で３０分、その後、７５℃で１５分、−２０℃で９０分行った。
【０２１０】
試料を定法通り精製し、３０μｌのＨ２Ｏ中で溶出した。
ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ、ＢｐｍＩでインデックス化断片から短い断片を遊離させた：
〜１４ｎｇ〜１９ｎｇのＴ４充填ＤＮＡ
１×緩衝液３（ＮＥＢ社）
２０μｇのＢＳＡ
５ＵのＢｐｍＩ（ＮＥＢ社）
２００μｌの量までのＨ２Ｏ
３７℃で３時間インキュベートした後、６５℃で２０分熱失活させた。
【０２１１】
ビオチニル化物質をストレプトアビジンコート常磁気性ビーズに結合させて精製し、ＰＣＲ可能アダプターを非インデックス化末端に付加し、ＰＣＲ増幅させた：
全試料を、供給業者が推奨するように、１００μｇのダイナビーズ〔ダイナル社（Ｄｙｎａｌ）〕に結合させ、洗浄した。洗浄後、ＰＣＲアダプター（ＡＴ）を加えた：
１ピコモルのＰＣＲアダプター
１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
２００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社）
５０μｌの量までのＨ２Ｏ
ＰCＲアダプター（AT）  5 ’  GTCGTCGGTAATCATGCTAATCCCGGGAT
と                      3 ’ CAGCAGCCATTAGTACGATTAGGGCCCTA
（それぞれ配列番号５９，６０）
この反応は、周囲温度で＞＝１時間行った。
【０２１２】
ビーズは直接ＰＣＲに加えた：
ビーズを２×ＢＢ（ダイナル社、供給された状態で）、０．１ＭのＮａＯＨ（５分）、０．１ＭのＮａＯＨ、１×ＢＢで洗浄し、次いで、ビーズに５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液を加えた。次いで、ビーズを２５μｌの２つのアリコートに分け、試料当たり２ＰＣＲ反応を設定した。
〜２．５ｎｇ〜５ｎｇのＤＮＡ
１×ＰＣＲ緩衝液〔ホット・スタート（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）、キアゲン社〕。
０．０５μＭのＭｇ２＋
５ナノモルのｄＮＴＰ
２５ピコモルのプライマーＦ
２５ピコモルのプライマーＲ
２．５Ｕのホット・スタート  Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン社）
プライマーF  ５７６Ｐ  5 ’ATTCGGCGAGCATCGGA
プライマーＲ  ２２８Ｐ  5 ’GTCGTCGGTAATCATGC
（それぞれ配列番号６１，６２）
ＰＣＲ産物を定法通り精製し、推奨されたＴＯＰＯクローニングキット（インビトロジェン社）を用いてクローン化した。Ｍ１３リバースプライマーおよび−２１フォワードプライマーを用いてインサートを増幅させ、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴシステム（ＧＥヘルスケア社）によるシーケンシングに備え、ＭｅｇａＢＡＣＥ毛管電気泳動システム（ＧＥヘルスケア社）を用いてシーケンシングした。得られた配列を、Ｂｌａｓｔアルゴリズムを用いてＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５．１ヒト配列と比較した。その結果を表３に要約する。ユニークとは、ヒトゲノムに１箇所だけで一致することを意味し、マルチプルとは、反復配列に一致することを意味する。
【０２１３】
８５配列はすべて、予測された一定の特徴を示し、それらのデータは、非反復および反復配列が共にサンプリングされたことを示している。１８事例が存在するが、完全な一致は存在しない。いずれの場合も、これらは、３′末端ＡＴの１つもしくは両塩基、および／または５′末端Ｇで不一致している。後者は、Ｈｉｎｆ１部位の一部であり、したがって、本発明の出発ＤＮＡ中に存在するはずである。５′−Ｇで不一致が発生した６つの明確なケースは、恐らく多形性部位である。４つの他のケースにおいて、トップヒットは、５′−Ｇと３′−Ｔ不一致の混合物であり、この実験結果をゲノムデータと区別することは不可能である。３′末端ＡＴで１つまたは両塩基が不一致していた例が１４ある。これらの塩基はステップ６でＴ４  ＤＮＡリガーゼにより導入された。本発明者らは、単一ア
ダプター〔シブソンおよびギブス（Ｓｉｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｓ）〕の存在下に、この酵素から〜８５％の忠実度を期待し、これらの部位で観察された１６％の不一致はこのレベルに一致する。８塩基３′突出部を有する部位でのインデックス化により選択された領域に対応する配列では、不一致は観察されなかった。したがって、反復インデックス化は有効であり、新規インデックス化手順の忠実度はヒトゲノムＤＮＡに関して良好である。本発明者らは、独自に、世界的に配列表示レベル調査を行うのに有用な方法を有し、反復インデックス化の有効性および本発明の長い突出部インデックス化法の忠実度を証明した。この実験は、多重インデックス化サイクルを用いることにより、高忠実度インデックス化に一致するゲノム由来配列が生成され、非反復配列が有用な頻度で得られることを示している。Ｔ４触媒連結で生じた忠実度の低下は、フルプロセスの場合には無関係であることに留意すべきである。いずれの場合にも、高忠実度インデックス化用の鋳型として役立つ鎖は付加アダプター由来ではなくターゲット断片由来である。したがって、不適当なアダプターを受容している末端は、次回のインデックス化に進むと、アダプターがニック形成および二本鎖エンドヌクレアーゼにより除去された後に存在する元の正しい配列を有するであろう。
【０２１４】
【表７】
2008515451.tif 000016
実施例７  −  両末端にインデクサーを有するターゲット断片の環状化
この実施例では、インデックス化後のインデクサーの結合に必要な主要環状化反応を説明する。ここでは、長いインデクサーを用いたプロセスの実行可能性を示すために、インデクサーの作製にφＸ１７４  ＲＦ  ＤＮＡを用いた。実施例４で作製したφＸ１７４ＤＮＡをターゲットとして用いた。
【０２１５】
インデクサーの作製
インデクサーとして、φＸ１７４を以下のように作製した：
３０μｌ    φＸ１７４  ＲＦ１  ＤＮＡ（ＮＥＢ社）
６０μｌ    ＰｓｔＩ（２０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
１２０μｌ  Ｘ１０緩衝液３（ＮＥＢ社）
９９０μｌ  水
３７℃で３時間インキュベートし、６０μｌのＢｓｓＨＩＩ（４ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）を加え、５０℃でさらに３時間インキュベーションを続けた。上述のように標準精
製を用いた。
【０２１６】
各インデックス化分子は、ＰｓｔＩ切断により生じた末端上に連結されたインデックス化末端と、ＢｓｓＨＩＩ切断により生じた末端上の環状化用末端とを有する。後者が５′リン酸を欠失するか、インデクサー結合が早期に発生し得ることが重要である。したがって、以下のアダプターを用いてインデックス化末端を生成した：
PxI1Hf/U:  5 ’GATGTGGGTTTGCA  （配列番号６３）
ｐｘＩｉＨｆ／ＮＮＮＮまたはｐｘＩ２Ｈｆ／ＮＮＮＮにアニーリングしたが、ここで、ＮＮＮＮとは、上記実施例４でターゲットＤＮＡのＮＢｓｔＮＢＩ／ＸｂａＩ消化産物により暴露された特定ヌクレオチドに相補的な４ヌクレオチドである。
PxI1 Hf/NNNN: 5’AACCCACATCTACAGACCCTGAAGAAACAGTCNNNN
または
PxI2 Hf/NNNN: 5’AACCCACATCTACAGACCAAGCTGAAACAGTCNNNN
（それぞれ配列番号６４，６５）
ＰｘＩ１とＰｘＩ２の有意な差は、前者が、必要に応じ、再環状化後に第２回目のインデックス化を開始し得るＡｃｕＩ部位を含むことである。
【０２１７】
ＰｘＩ１Ｈｆ／Ｕは、後者がその対向末端でインデックス化ターゲットにアニーリングした後でも全長のＰｘＩ１Ｈｆ／ＮＮＮＮまたはＰｘＩ２Ｈｆ／ＮＮＮＮにアニーリングしないことに留意すべきである。したがって、ターゲット配列に隣接する各インデクサーには一本鎖ギャップが残る。２回目のインデックス化は、このギャップを埋めた後で、特に対応オリゴヌクレオチドの連結によるか、ＤＮＡポリメラーゼ作用により、ＡｃｕＩ部位から消化することにより可能になる。先ず、オリゴヌクレオチドは、上記のようにその５′末端に付加されたリン酸を有し、上記のように連結のために２〜１０モル過剰で加える。ポリメラーゼによる充填は、上記ターゲットの予備作製に関して説明したようにＴ４
ＤＮＡポリメラーゼにより達成するのが便利である。
【０２１８】
以下のアダプターを用いて再環状化末端を生成する：
PxCIRC/U:  5 ’CGCGAGGGAGATCACTTC  （配列番号６６）
ｐｘＣＩＲＣ／ＧＡＣＴまたはｐｘＣＩＲＣ／ＡＧＴＣ、すなわち、リン酸化されない限り連結しない２つの非パリンドローム相補突出部にアニーリングした。
pxCIRC/GACT：  5 ’GACTGAAGTGATCTCCCT  （配列番号６７）
pxCIRC/AGTC：  5 ’AGTCGAAGTGATCTCCCT  （配列番号６８）
アダプターを切断されたφＸ１７４  ＤＮＡに結合させるために、アダプター、  ｐｘＩ１Ｈｆ／ＮＮＮＮ、ｐｘＩ２Ｈｆ／ＮＮＮＮおよびｐｘＣＩＲＣ／Ｕを別個に以下のようにキナーゼ処理した。
７５μｌ    ＡＴＰ  １０ｍＭ
７５μｌ    Ｘ１０  ＰＮＫ緩衝液（ＮＥＢ社）
６０μｌ    オリゴ    ５０ピコモル／μｌ
５４０μｌ  水
１５μｌ    ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
３７℃で３時間インキュベートし、９５℃で１０分加熱してポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。等量の適切な相補オリゴヌクレオチドを４ピコモル／μｌで加え、２つのオリゴヌクレオチドを６０℃で１０分間アニーリングした。
【０２１９】
適切な末端が存在することを確認するために、テスト連結を実施した：
一方の末端、すなわち、ｐｘＩＨｆ（ｄｓ）、もしくはｐｘＩ２（ｄｓ）、またはＣＩＲＣ／ＧＡＣＴ（ｄｓ）、もしくはＣＩＲＣ／ＡＧＴＣ（ｄｓ）を、φＸ１７４／ＰｓｔＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化ＤＮＡ（ｄｓ）に連結した。（ｄｓ）は二本鎖を意味する。
２μｌ      φＸ１７４／ＰｓｔＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化ＤＮＡ
１１μｌ    一方の末端（ｄｓ）オリゴ（２ピコモル／μｌ）
１．４μｌ  Ｘ１０  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
０．２μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
１６℃で１６時間インキュベートし、産物をアガロースゲル電気泳動にかけて分析した。消化産物が十分に機能していれば、φＸ１７４分子は一方の末端で（ｄｓ）オリゴに連結し、オリゴで「キャップ」されるが、分子の他方の末端は第２φＸ１７４分子で二量体になり得る。８０％以上が約１０．６キロベースの二量体バンドを形成した場合に使用可能な物質が得られた。
【０２２０】
多量連結（ｂｕｌｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）により使用インデクサーを作製した：
５４μｌ    φＸ１７４／ＰｓｔＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化ＤＮＡ
６９μｌ    ｐｘＩ１Ｈｆ／ＮＮＮＮ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
６９μｌ    ＣＩＲＣ／ＧＡＣＴ（ｄｓ）２ピコモル／μｌ
１８μｌ    Ｘ１０  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
４０μｌ    水
２．５μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
各連結産物が１つのインデクサー末端と１つの環状化末端を含む限り、正確なペアリングは問題ではないが、通常、ＣＩＲＣ／ＧＡＣＴにはインデクサー１を用い、ＣＩＲＣ／ＡＧＴＣにはインデクサー２を用いた。しかし、インデックス化反応にインデクサーペアを用いる場合、ペアの一方がＣＩＲＣ／ＧＡＣＴを有し、他方がＣＩＲＣ／ＡＧＴＣを有することが重要である。さもなければ、環状化は生じ得ない。
【０２２１】
１６℃で一晩インキュベーションを行った。
上記定法通りに精製した後、推奨されたようにサイズ排除クロマトグラフィ（Ｃｈｒｏｍｏｓｐｉｎ  １０００＋ＴＥカラム、クロンテック社）を用いた。後者は、後の反応でインデクサーと不利に競合しかねない過剰なオリゴヌクレオチドを除去するのに必要であった。
【０２２２】
新規インデクサーが必要に応じて環状化末端における結合に有効であったかどうかを確認するために、それらの５′自由末端にリン酸を付加し、連結させた。
３００ｎｇ    インデクサー  Ｉ１またはＩ２
２μｌ        Ｘ１０  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
２μｌ        ＡＴＰ  １０ｍＭ
２０μｌの最終量までの水
０．４μｌ    Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
３７℃で３時間インキュベートした。次いで、以下のように連結を行った：
反応Ａ：  φＸ１７４インデクサーＩ１、ポリヌクレオチドキナーゼ処理、セルフ連結。反応Ｂ：  φＸ１７４インデクサーＩ２、ポリヌクレオチドキナーゼ処理、セルフ連結。反応Ｃ：  φＸ１７４インデクサーＩ１，ポリヌクレオチドキナーゼ処理  ＋  φＸ１７４インデクサーＩ２、ポリヌクレオチドキナーゼ処理  ＋  リガーゼ。
反応Ｄ：  φＸ１７４インデクサーＩ１  ＋  φＸ１７４インデクサーＩ２  ＋  リガーゼ（非ポリヌクレオチドキナーゼ処理）。
反応物Ａ、ＢおよびＣ：
１０μｌ    ポリヌクレオチドキナーゼ処理φＸ１７４
インデクサーＤＮＡ（５μｌのＩ１＋５μｌのＩ２）
０．２μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
反応物Ｄ
１００ｎｇ  φＸ１７４インデクサーＩ１
１００ｎｇ  φＸ１７４インデクサーＩ２
１０μｌの最終量までの水
１μｌ      Ｘ１０  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
０．２μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
すべての反応物を１６℃で一晩インキュベートし、アガロースゲル電気泳動にかけて分析した。大多数の物質は連結により５ｋｂから１０．６ｋｂ形態に変わるが、これは、要求末端が機能していることを示している。
【０２２３】
インデックス化末端も存在していることを確認するために、反応物を以下のような標識テストオリゴヌクレオチドに連結した：
５μｌ        φＸ１７４インデクサーＩ１、ポリヌクレオチドリガーゼ処理またはφＸ１７４インデクサーＩ２、ポリヌクレオチドリガーゼ処理
０．５μｌ    ｐｘＩ１ＨｆＱＣ（４ピコモル／μｌ）
２μｌ        Ｘ１０  Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
１２．５μｌ  水
０．８μｌ    Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ（４０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
ｐｘＩＨｆＱＣ：  ５′（ＨＥＸ）TTCAGGGTCTGTA  （配列番号６９）
４５℃で１６時間インキュベートした。産物をアガロースゲル電気泳動にかけて分析し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔスキャナ（ＧＥヘルスケア社）を用いて無染色可視化し、次いで、Ｓｙｂｅｒ  Ｇｏｌｄで後染色した。φＸ１７４インデクサーは、それらが存在するインデックス化用末端に標識オリゴヌクレオチドが連結できるので、染色前に検出することが可能である。
【０２２４】
インデックス化および環状化
環状化される物質を濃縮するために、上記のように作製したφＸ１７４由来インデクサーとターゲットをＧｙｒｏｖａｐ〔ハウ社（Ｈｏｗｅ）〕中で、過乾燥を回避しながら蒸発乾固した。
１μｇ        φＸ１７４インデクサー１／ＡＡＧＴ
１μｇ        φＸ１７４インデクサー２／ＧＣＣＡ
１μｇ        ターゲット  φＸ１７４／ＨｉｎｆＩ  ＤＮＡ
ＤＮＡを水１８μｌおよび２μｌのＸ１０  Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）に再溶解した。１μｌのＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ（４０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）を加え、４５℃で１６時間連結を進行させた。アガロースゲル電気泳動にかけて分析するために反応物をサンプリング（３．５μｌ）し、残りを定法通りに精製した。精製物質を（供給された）３０μｌのＥＢ中で溶出した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより環状化するために末端にリン酸を付加し、インデックス化分子を以下のようにリガーゼで環状化した：
３０μｌ  ＥＢ中の精製ＤＮＡ
４μｌ    Ｘ１０ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ社）
４μｌ    ＡＴＰ  １０ｍＭ
１μｌ    水
１μｌ    Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
３７℃で３時間インキュベートした。１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（４００ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）を加え、定法通りに精製する前に、１６℃で１６時間反応を進行させ、供給された３０μｌのＥＢ中で溶出した。
【０２２５】
アガロースゲル電気泳動にかけて分析するために、試料（３μｌ）を取り出した。残りの物質は、環状化が起ったこと、その結果、インデクサーが結合したことを示すであろう特徴的制限断片を生成するために制限エンドヌクレアーゼで切断した。
第１反応物：
１３．５μｌ  上記由来の精製ＤＮＡ
２μｌ        Ｘ１０緩衝液４（ＮＥＢ社）
２．５μｌ    水
２μｌ        ＭｆｅＩ（１０ユニット／μｌ、ＮＥＢ社）
１３．５μｌ  上記由来の精製ＤＮＡ
２μｌ        Ｘ１０緩衝液２（ＮＥＢ社）
２．５μｌ    水
２μｌ        ＳａｃＩＩ（２０ユニット／μｌ）
制限消化を３７℃で２．５時間行い、次いで、上記試料をアガロースゲル電気泳動にかけて分析した。
【０２２６】
予測断片を以下の表４に線形順序で示す。
【０２２７】
【表８】
2008515451.tif 000017
環状化を表すバンドは、サイズがＭｆｅＩ消化産物では８６０４と２８１６、ＳａｃＩＩ消化産物では６４５０と４９７２であり、予測通り、図１３に他のバンドと一緒に見られる。
【０２２８】
それぞれ第１および第２インデクサーに関して、配列５′ＴＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣまたは５′ＴＡＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣに対向するターゲット配列に隣接する各インデクサーに一本鎖ギャップが存在する。２回目のインデックス化を可能にするために、一本鎖ギャップを、特に第１インデクサーに関して対応オリゴヌクレオチドの連結によりＡｃｕＩ部位を完全なものにするか、またはＤＮＡポリメラーゼ作用により埋めることができる。先ず、オリゴヌクレオチドは、上述のようにその５′末端に付加されたリン酸を有し、上記のように連結用に２〜１０モル過剰で加えられる。ポリメラーゼによる充填は、上記ターゲットの予備作製に関して説明したようにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより達成するのが便利である。
【０２２９】
実施例８  −  インデクサー構造および標識
本発明者らは２種の異なるＭＩＤＡＳ用インデクサー標識法を開発した。第１の方法は、それぞれ、４×〜１ｋｂの標識部分を有する長いインデクサーをベースとした。この長さのインデクサーは日常的に用いられている（シブソンおよびギブス、２００２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１年；２９：ｅ９５、本明細書に文献援用）。ターゲットに連結するためのインデクサーの重要な特徴は、その全長ではなく、インデックス化に利用できる付着末端の長さである。４つの特異的塩基配列のコード化は簡単である：各１ｋｂ部分は、同じ立体秩序の異なる識別塩基を表し、４種の色の１つで標識される。公開情報は、少なくとも５種のフルオロフォアで標識された１ｋｂ部分はＣＣＤイメージング〔フェミノ  エーら（Ｆｅｍｉｎｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年；第２８０巻：ｐ．５８５−９０、本明細書に文献援用〕により立体的に識別し得ることを示している。第１の方法を図１４に概説する。以下の表５のプライマーを用いたＰＣＲを、カナマイシン耐性トランスポゾン  Ｔｎ９０３由来の〜１Ｋｂ断片の分離に用いた。それらの末端の余分な配列を、標準クローニング法によりファージミド  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−に特定配向でクローン化させた。この構造の重要な特徴は、イン
サートに隣接し、断片を、図１４に示すような既存の標識関係を保存する所定の順序でコンカテマー化するために切除可能にするＢＧｌＩおよびＥｃｏ０１９Ｉ部位である。第２の特徴は、ヌクレオチドｔがインサートに隣接する領域で回避されたことである。このようにすると、ファージミドの１つの鎖を標準法により生成される一本鎖ＤＮＡとして生成することができ、さらに、さらなる操作に関与するはずの末端領域で標識妨害のリスク無しにアリル  ｄＵＴＰ（インビトロジェン社）を組み込むことにより標識することができる。アリル  ｄＵＴＰは、コンカテマー化前に任意の標識に便利な染料の組み込みを可能にした。オリゴヌクレオチドインデックス化アダプターと上記のような環状化を可能にするアダプターはコンカテマー化に含まれる。これらのアダプターは２つの機能を有する。第１の機能は、必要に応じて実際のインデックス化部位または環状化部位としての機能を果たすことである。第２の機能は、所要の４ｋｂ産物へのコンカテマー化を制御することである。この方法は、標識インデクサーをそのまま用いることを目指すものであったが、間接標識のために、すなわち、適当なプローブ配列でインデックス化アダプターを置換することによりハイブリダイゼーションプローブとして容易に標識し得ることが当業者には当然分かるであろう。
【０２３０】
第２の方法は、二次検出を目指すものであったが、上記第１の方法と比べると、直接検出のために適当に修飾し得ることが分かるであろう。本発明者らは、この方法をキャサリン・ホイール（Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｗｈｅｅｌ）と称するが、これは、もともとは分岐したインデクサー上のプローブターゲット検出用であった。この方法は、多種多様な標識組み合せによって、情報コード化に高特異性、高標識密度、高標識フレキシビリティーを提供する。多くの異なる別標識プローブ要素を結合するために、足場として一本鎖ＤＮＡを用いる（図１５参照）。これらの要素は、ＰＣＲプライマー配列に隣接し、一本鎖足場に対応する二本鎖断片を含む。ＰＣＲプライマー配列は、インデクサータイプの１つ上のインデクサー分岐アームの１つに相補的であるか、そのようなプローブの５′末端に隣接するプローブを含む。プローブ要素は、ＰＣＲで容易に作製され、キャサリン・ホイールは、これらのＰＣＲ産物を一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡにアニーリングすることにより形成される。標識は、標識プライマーを用いるか、合成中に直接組み込むか、またはそれらの方法を一緒に用いて実施し得る。
【０２３１】
本発明者らは、共通標識プライマーを用い、ＰＣＲ時に内部標識を組み込むことにより、標識切片を作製した。
オリゴヌクレオチドを以下に列挙する。
Kp17SU  ACGAGTACATCGAACTACGGCTAG
Kp27SU  GGAGTTCTGCATCACTTGACGCTA
EV17SU  TGTCGGTGCGTCATTTCTAAGGAG
EV21SU  GGATCCGAATTCACTCGGGCCAAG
（それぞれ配列番号７０〜７３）
Kp17Lms  TACTAGCCGTAGTTCGATGTACTCGT
Kp27Lms  TATAGCGTCAAGTGATGCAGAACTCC
EV17Lms  TACTCCTTAGAAATGACGCACCGACA
EV21Lms  TACTTGGCCCGAGTGAATTCGGATCC
（それぞれ配列番号７４〜７７）
Kp17SU228EV
5 ’GTCGTCGGTAATCATGCGATATCACGAGTACATCGAACTACGGCTAG
Kp27SU228EV
5 ’GTCGTCGGTAATCATGCGATATCGGAGTTCTGCATCACTTGACGCTA
EV17SU228EV
5 ’GTCGTCGGTAATCATGCGATATCTGTCGGTGCGTCATTTCTAAGGAG
EV218U228EV
5 ’GTCGTCGGTAATCATGCGATATCGGATCCGAATTCACTCGGGCCAAG
Kp17Lms228EV
5 ’TACTAGCCGTAGTTCGATGTACTCGTGATATCGCATGATTACCGACGAC
Kp27Lms228EV
5 ’TATAGCGTCAAGTGATGCAGAACTCCGATATCGCATGATTACCGACGAC
EV17Lms228EV
5 ’TACTCCTTAGAAATGACGCACCGACAGATATCGCATGATTACCGACGAC
EV21Lms228EV
5 ’TACTTGGCCCGAGTGAATTCGGATCCGATATCGCATGATTACCGACGAC
（それぞれ配列番号７８〜８５）
228P_Aｘ350  5 ’ Alexa(登録商標)  350  GTCGTCGGTAATCATGC
228P_Aｘ488  5 ’Alexa(登録商標)  488  GTCGTCGGTAATCATGC
228P_Aｘ546  5 ’Alexa(登録商標)  546  GTCGTCGGTAATCATGC
228P_Aｘ568  5 ’Alexa(登録商標)  568  GTCGTCGGTAATCATGC
228P_Aｘ680  5 ’Alexa(登録商標)  680  GTCGTCGGTAATCATGC
（それぞれ配列番号８６〜９０）
Ｍ１３ｍｐ１８は都合良く制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩのための６３部位を有する。これらの部位はそれぞれ、アダプターを付加して、ＰＣＲで増幅させることができる。標識は、標識プライマーを介するか、標識オリゴヌクレオチドを用いるか、またはその両方を用いて合成時に組み込むことができる。アダプターの下の鎖は上記名称ではＬｍｓと表示されており、上記名称ではＳＵと表示されている整合名称のオリゴヌクレオチドに相補的である。最後の５つの２２８Ｐと名付けられたオリゴヌクレオチドは、対応染料でプライマー標識するためのプライマーである。これらのプライマーは共通であり、２２８と名付けられたアダプターペアのいずれとも一緒に用い得る。いずれの場合でも、上のアダプターの３′末端は下の分岐したオリゴヌクレオチドのプローブ配列に対応する。短いアダプターペアの場合、アダプターもプローブ配列にそのまま一致し、上の鎖もプライマー鎖である。内部標識には、供給業者が推奨するように、Ｃｈｒｏｍａｔｉｄｅヌクレオチド（インビトロジェン社）を用いた。
【０２３２】
内部標識を有するプローブは、より鮮やかな蛍光を発することが分かったが、どちらのタイプも使用可能である。例を図１６に示す。この場合、ハイブリダイゼーションに用いた一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡの量もさまざまに変えたが、これは、生成したプローブの相対量に反映されている。図１６の右側のエチジウム染色ゲルは、有意な量のプローブが生成し得ることを示している。
【０２３３】
これらの方法は、標識、それらの割合およびプローブ配列の精密な制御を可能にする極めてフレキシブルかつ強固なシステムであることが分かるであろう。本発明の好ましいシステムは、両方の要素を有利に組み合せている。この場合、所要切片を標識して分子当た
り１つのプローブ認識部位を生成するが、これは、キャサリン・ホイール法の場合で発生し得るような同じターゲット認識領域を有するプローブ間の交差反応を回避するという点で非常に大きな利点である。足場としてφＸ１７４を用いる。何故なら、それより小さいサイズおよび大きいサイズのＭ１３は不要であるからである。φＸ１７４の別個の〜１Ｋｂ切片を定法によりバクテリオファージ  Ｍ１３  ＳＫ−にクローン化する。インサートの末端にハイブリダイズさせたプライマーから合成し、インサートの対向末端のブロッキングオリゴヌクレオチドまでの１ｋｂ切片を標識する。このフォーマットにより、Ｍ１３が有意標識状態になるのを防ぎ、標識物質を、φＸ１７４足場にハイブリダイズさせるために変性剤逆相液体クロマトグラフィにかけて精製し得る。上記のようなプローブ配列を含むプライマーを用いて１ｋｂ切片の１つを合成する。これは、標識分子当たり単一のプローブ配列が存在という利点を有する。ユーザーが、各特定の切片と共に用いる標識の組み合せを決定するが、この側面の制御は絶対であることが分かるであろう。
【０２３４】
２種の分岐したオリゴヌクレオチドを用いた。第１の分岐オリゴヌクレオチドは完全に一本鎖形態のインデクサーとして用いるように設計されているが、分岐インデクサー１で形成された相補鎖として分岐インデクサー２とアニールすることができる。以下に示すのは（添付された別シートも参照）は、各分岐インデクサー１ａおよび１ｂと、それぞれ分岐インデクサー２ａおよび２ｂの２つの実施例である。オリゴヌクレオチドは、分岐部のどちらかの側の短い末端である相補領域に関して並んでいる。いずれの場合にも、長い５′末端は、適当なハイブリダイゼーションプローブで二次検出するための相補鎖となる。したがって、長い５′末端配列はそれぞれ異なっている。短い５′末端は、この場合には、連結への関与を阻止するためにヘキシレングリコール基でブロックされている。インデクサー１は、これだけがターゲット中で再切断するためのＡｃｕＩ部位（配列中の下線部）を含むために、長い３′末端を有する。インデックス化末端は、イタリック体のコア配列とボールド体の実際の選択塩基とを含む３′末端の８塩基にある。１つの分岐オリゴヌクレオチド当たり４つの異なるインデックス化配列を用いたことに留意すべきである。これらのインデックス化配列は、バクテリオファージラムダの、それぞれラムダゲノムの１ａと２ａの場合には１７０５８位から１７７６９位までの７１２塩基と、１ｂと２ｂの場合には１８５６１位から２１２７１位までの２７１１塩基のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ断片をターゲットとするためであった。記載手順を適切に改変して用いた。アニール化された鎖の結合は、上述の充填反応、またはこれも上述かつ示した下のインデクサーと整列させたＢｒＦｉｌｌＬおよびＢｒＦｉｌｌＲである相補的充填オリゴヌクレオチドを使用しなければ不可能である。
【０２３５】
一本鎖インデクサーは、オリゴヌクレオチド合成時に導入されるＰＭＯｃ分岐部を利用し、さらに、同じ位置に２つのヘキシレングリコールスペーサーを有する。分岐したオリゴヌクレオチドは、部分相補オリゴヌクレオチドと、２つの相補ヌクレオチドとを用いて形成することもできる。このようにして形成した、上記ＡｃｕＩ部位を含む一般的特徴を有するインデクサー１の１例を以下に示す。これは、アニーリングされた３つのオリゴヌクレオチドからなる。
【０２３６】
【表９】
2008515451.tif 000018
どうして一番上の鎖が自由に二次検出用にハイブリダイズできるかに留意すべきである。また、インデックス化末端にはオリゴヌクレオチドを充填するか、または上記のようなポリメラーゼでＡｃｕＩ部位を形成するための一本鎖ギャップが存在する。インデックス化反応のために単一の３′末端しかないと、忠実度が高まる。第３オリゴヌクレオチドは、上記実施例で説明したような環状化のための４塩基５′突出部を保有するようにアニーリングする。
【０２３７】
どちらのタイプの分岐オリゴヌクレオチドも環状化を可能にする。最初のタイプ１および２は、一本鎖であり、互いに相補的であるが、第２タイプは、環状化のためには、その二本鎖領域の末端の短い（４塩基）付着末端に依存する。
【０２３８】
ｐｈｉＸ１７４を一次検出または二次検出に用い得るように、以下のオリゴヌクレオチドセットを開発した。
phiX350F    5 ’ ctgagtccgatgctgttcaa
phiX350AS  5 ’ ttgaacagcatcggactcag 3’ スペーサー  C3
phiX1596R  5 ’ gcagcttgcagacccataat
（それぞれ配列番号９４〜９６）
phiX1718F    5 ’ cgctctaatctctgggcatc
phiX1718AS  5 ’ gatgcccagagattagagcg 3’ スペーサー  C3
phiX2884R    5 ’ cctgattcagcgaaaccaat
（それぞれ配列番号９７〜９９）
phiX2938F    5 ’ gtgctattgctggcggtatt
phiX2938AS  5 ’ aataccgccagcaatagcac 3’ スペーサー  C3
p hiX4078R    5 ’ gaaatgccacaagcctcaat
（それぞれ配列番号１００〜１０２）
phiX4082F    5 ’ tctttctcaatccccaatgc
phiX4082AS  5 ’ cgattggggattgagaaaga  3 ’ スペーサー  C3
phiX5286R    5 ’ ttcccagcctcaatctcatc
（それぞれ配列番号１０３〜１０５）
phiXendF      5 ’ cctgtgacgacaaatctgct
phiXendAS    5 ’ agcagatttgtcgtcacagg  3 ’ スペーサー  C3
phiXendR      5 ’ ccagcagtccacttcgattt  
（それぞれ配列番号１０６〜１０８）
phiX5286KP17R  5’ acgagtacatcgaactacgbgctagttcccagcctcaatctcatc
phiX5286KP27R  5’ ggagttctgcatcacttgacgctattcccagcctcaatctcatc
phiX5286EV17R  5 ’ tgtcggtgcgtcatttctaaggagttcccagcctcaatctcatc
phiX5286EV21R  5 ’ ggatccgaattcactcgggccaagttcccagcctcaatctcatc
（それぞれ配列番号１０９〜１１２） 
後者の場合、２種の異なる標識法を採用した。どちらの方法も、（場合により）バクテリオファージ  Ｍ１３にクローン化されたｐｈｉＸ１７４の断片を利用する。最初の５セットのオリゴヌクレオチドはいずれもＦまたはＲで終る名前のペアを有する。そのようなペアはいずれも、ｐｈｉＸ１７４の異なる切片のＰＣＲに用いた（ヌクレオチド領域は名前の数字で示されている）。標識ヌクレオチドは、ＰＣＲ時に別個の染料標識切片を形成するのに用い得ることに留意すべきである。これらの切片を上述のようにｐｈｉＸ１７４にアニーリングし戻し、そのようにして、ｐｈｉＸ１７４を好ましいコードに従って均一に標識することができる。定法を用いて、対応Ｍ１３一本鎖をクローン化切片の標識に用い得るように、非標識切片を別々にＭ１３ｍｐ１８にクローン化した。この場合、標識反応時に、上記セット中のＡＳで終る名前を有するオリゴヌクレオチドを、Ｒで終る対応名のプライマーに対するブロッキングプライマー（したがって、３′スペーサー）として用いた。これは、多くの利点を有しており、標識ヌクレオチドをほとんど必要としないＤＮＡポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ社）のようなポリメラーゼ、したがってより安価な反応物を使用することができた。さらに、ｐｈｉＸ１７４の１つの鎖だけが標識されることになり、したがって、プローブの再アニーリングが減少し、利用可能なプローブが最大になった。最後に、Ｍ１３とｐｈｉＸ１７４のサイズが異なるために、それらをサイズ別精製で容易に分離することができた。
【０２３９】
真中にｅｎｄを有する名前が付いているセットは、ＰｓｔＩ部位とＢｓｓＨＩＩ部位にわたる。これらの部位は、さらに、ｐｈｉＸ１７４を上記実施例に説明したように一次標識として用い得るように後で導入するために切断することができる。この場合、重合反応は概して非標識である。これらはユニーク部位であり、存在する他のユニーク部位と同じように、必要に応じてプローブまたはインデクサーを線状化するのに用い得ることに留意すべきである。
【０２４０】
ＫＰ１７Ｒ〜ＥＶ２１Ｒで終る最終セットの４つのプライマーは、ｐｈｉＸ５２８６Ｒと置き換わることに留意されたい。これらのプライマーは５′末端にプローブ配列を有する。この場合、これらのプライマーは、第１タイプの上記分岐オリゴヌクレオチドを検出するが、そのプローブ配列は相補的であることが分かるであろう。これらのプライマーはｐｈｉＸ１７４分子１つ当たりプローブ配列が１つであるという利点を有する。
【０２４１】
実施例９  −  単分子の可視化
単分子の可視化には、上述のようなエピ蛍光を用いた。単一の蛍光標識ＤＮＡ分子の拡散、配列および画像化は、１９８８年のジングらによる光学マッピングの開発を経て確立されている。ヨコタ  エイチら（ＹｏｋｏｔａＨ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９９７年、第２５巻：ｐ．１０６４−１０７０およびミシャレ  エックスら（Ｍｉｃｈａｌｅｔ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７７巻：ｐ．１５１８−１５２３（本明細書に文献援用）は、線状配列の改良にコーテッドガラススライドと機械制御メニスカスモーションを用いた。シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）グループも、光学マッピングソフトウエアを開発した。上述のインデックス化システムは大きなフレキシビリティーを有し、光学マッピングに適用されていたものより高い分解能で機能することを目的としている。フェミノらが用いた要求分解能が近い。〜５フルオロファアで標識した長さ〜５０塩基のオリゴヌクレオチドは、当技術分野では周知の技術を用いて１ピクセル当たり１００〜２００ｎｍの分解能でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行った後で容易に画像化された。さらに、約１ｋｂ離れたフルオロ
ファアが分解された。ジンガーグループ（Ｓｉｎｇｅｒ  ｇｒｏｕｐ）由来のＩＳＨ画像は、ＲＮＡ輪郭長が約３ｋｂ／μｍのシュワルツらにより画像化された配列ＤＮＡ分子と類似している。したがって、長いインデクサーまたは本発明の二次検出プローブは、コード化された各塩基に関して少なくとも１ｋｂであり、１ｋｂ当たり少なくとも５フルオロフォアを有するはずである。倍率６００Ｘのエピ蛍光顕微鏡上の１．４メガピクセル、ピクセルサイズ６．４５μｍ２のＣＣＤカメラは、上記１００〜２００ｎｍ有効ピクセルサイズ要件を満たしている。
【０２４２】
光学マッピング拡散法は極めて単純である。二次検出により非蛍光標識ＤＮＡを検出する場合、前処理したスライド〔ＡＰＴＥＳ、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）〕上、０．５％のグリセロールを含むか、含まない水中または１０ｍＭ  トリス  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５中のＤＮＡの１ミクロン以下のスポットを周囲温度で乾燥させる。図１７は、固体表面に接触しているＤＮＡが、乾燥によりメニスカスが移動するにつれ、メニスカスに直角に伸びることを示している。溶質の臨界濃度に達すると、物質はメニスカスに堆積された状態になる。堆積物質により、溶質の濃度は低下し、このプロセスが繰り返されると、低出力画像が一連の同心円状の輪として現われる。ＤＮＡが適切に希薄であるという条件で、適切な溶質濃度が達成されたら、メニスカスに直角な単一分子を容易に観察することができる（図１８参照）。このため、実験的に最上の条件を決定するために一連のＤＮＡ濃度を見極める。図１８に示すのは、拡散し、次いで、ＹＯＹＯ−１（水中１００ｎＭに希釈、モレキュラー・プローブス社）で染色した〜５０ｋｂのバクテリオファージラムダ分子である。ＤＮＡ分子はメニスカスから液滴の中心に向って広がることに留意されたい。
【０２４３】
標識ヌクレオチドを組み込むか、スクシンイミドエステルを前以て組み込んだアリル  ｄＵＴＰに結合させて、直接、蛍光染料（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ範囲、モレキュラー・プローブス社）で標識したインデクサーは、荷電表面で単分子を産生することができなかった。その代わり、すべての物質はメニスカスに堆積した（図１９参照）。これは、それらの疎水性がもたらした結果である。洗剤を入れると拡散が改善された。５％のＣＨＡＰＳが最高であったが、この濃度でデオキシコレートとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を入れた他のものも機能した。前と同じように、同心円状の光輪も生じた（図２０参照）。標識ＤＮＡは、今度は、離散スポットまたはロッドとして現われた（図２１ａおよび２１ｂ参照）。これは、視野（ｆｉｅｌｄ）当たりの分子数を増やすので、有利である。また、これは、完全にスペクトル的にコード化されたプローブ、すなわち、インデックス化分子内の空間分解能に無関係の検出と一致する。
【０２４４】
同心円状の輪に関連するサイズ分布は顕著である。乾燥時、洗剤は、ほぼ凍った波紋のような明らかな深さを持ったはっきりした円形の堆積物を形成する。サイズの明白な差は、形成された表面の屈折変化や関連拡大作用と共に、結果的に生じる焦点の違いにも起因する。例えば、ある種の洗剤は、使用可能な染料の一部とオーバーラップする蛍光放出スペクトルを有し、所定の洗剤に対してすべての染料が同じように挙動するとは限らないので、特定の要件に関して、標識、表面および洗剤または他の界面活性剤の組み合せは実験的に決定しなければならない。例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８は、ＣＨＡＰＳの蛍光とオーバーラップする。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識したインデクサーも、上述のように拡散したとき、単分子を産生しないであろう。
【０２４５】
クリュ  エーら（Ｃｒｕｔ  Ａ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２００５年；第３３巻：ｅ９８を適合させた方法は、疎水性標識を有するインデクサーに好ましい。クリュらは、ポリスチレン溶液をスピンコーティングして生成した疎水性コートを有するスライドを用いた。単分子を希薄ＤＮＡ溶液からこの表面に伸長固定（ｃｏｍｂ）し得る。単分子は、本発明の新規インデクサーおよび二次検出プローブに近似する
方法でフォーマット化した量子ドットを用いた検出に適している。これは、本発明の好ましい拡散法である。スライドを残留物がないように厳密に清浄し、加熱乾燥した後、トルエン中５％ポリスチレン溶液〔シグマ社（Ｓｉｇｍａ）〕を用いて、１５００ｒｐｍで２分間スピンコートした。ＭＥＳ（シグマ社）５ｍＭ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ５．５溶液中、１０塩基当たり１疎水性染料分子まで標識したＤＮＡを、０．２〜０．６μｌの量でスライド上に斑点状に置いた。スポットを可視化前に周囲温度で乾燥させた。結果は、蒸発によって溶質の臨界濃度になるときに、ＤＮＡが光輪中の収縮するメニスカスに堆積した荷電表面上の非標識ＤＮＡを用いて得た結果と極めて類似している。実験的に決定した適当な希釈物により単分子が産生した。２つの有意な違いがあった。第１に、量が多いと、最高の単分子収率が得られ、第２に、単分子はメニスカスに対して垂直であったが、液滴の中心に向って反対方向に放射状に広がった。疎水性標識ＤＮＡは表面に結合した状態になり、収縮メニスカスから取り残される。疎水性標識ＤＮＡは、その濃度が増大すると、溶質濃度の増大は遅くなり、単分子が結合して、広がる機会が増えるために、大量に堆積し、それ故に、より大きなスポットがより多くの単分子を生成すると予測される。単分子の密度は、クリュらが記載したように伸長固定して得たものより著しく高かった。したがって、最上の方法は、最適濃度の標識ＤＮＡを有し、全く希釈させないことである。これは機械的な方法と似ている。クリュらの方法では、溶液からＤＮＡを十分にゆっくり伸長固定することが難しいために、低収率しか得られないであろう。本発明者らは、メニスカスを移動させる理想的な非機械的方法が、コートされる表面をＤＮＡ溶液容器内に入れ、容器を適当なサイズの毛管から徐々にドレーン排出させることであることに気付いた。この方法は多くの利点を有する。この方法によって、極めてゆっくりしたドレーン排出、従ってゆっくりしたメニスカス移動が可能になる。移動速度は可変であり、結合単分子の最適収率が得られるように正確に制御することができる。ドレーン排出された試料は回収して再利用し得る。ＤＮＡ溶液と表面の比率は、容器の配置により正確に制御し得る。コートされる表面の角度を垂直位に関して変えることにより、メニスカスに関する表面の角度を、さらに最適化するために正確に制御することができる。場合により、ドレーン排出は、ポンプ輸送または流量調節が可能なタップを介して制御し得る。
【０２４６】
本発明のいくつかの態様は明確にするために上記に別個に説明している。しかし、当業者には、本発明の方法、例えば、ニック部位の設計による一本鎖突出部の形成、一本鎖突出部の延長、ｄｓＤＮＡ分子のバーコード末端標識、標識ｄｓＤＮＡ分子のサイズ縮小制御およびアダプター付加シーケンシングは、いずれも、検討中の所要実験状況に応じてどのように組み合せてもよいことが分かるであろう。したがって、本明細書に記載されているどのいずれの態様も、当業者にとって適切かつ必要と思われる場合には、本明細書に開示されている任意の他の態様とどのようにも組み合せられるように意図されている。本発明の開示は、直接上記に強調、例示、または記載した特定の組み合せにのみ限定されるものではない。技術的に実行不能でない限り、本明細書に記載の特徴の任意の組み合せが考慮される。本発明は、単なる例示を目的とする上記実施例によって限定されるものと受け止めるべきではない。
【０２４７】
実施例１０  −  低分解能サイズ分離を用いたＭ１３ｍｐ１８  ＲＦ  ＤＮＡの部分リシーケンシング
Ｍ１３ｍｐ１８  ＲＦ  ＤＮＡ（１９μｇ、ＮＥＢ社）をＤＮＡｓｅＩで消化した。各１５μｌの反応物は、０．２μｇのＤＮＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭの塩化マンガン、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ＮＥＢ社）および０．５〜０．０５ユニットのＤＮＡｓｅＩ（ＮＥＢ社）を含んでいた。３７℃で２０分反応させ、直ちに上記定法通りに精製した。数百塩基からインタクトＲＦにわたるさまざまな断片を生成するためにさまざまな酵素濃度を用いた。断片を次のステップ用にプールした。末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで修復し、上述のように、ＳｓｓＩ、ｄａｍおよびＡｃｕＩメチラーゼを用いてメチル化保護を行った。実施例５に記載のようにインデックス化するために
、平滑末端フォーマット用アダプターを加えた。
アダプターは以下の通りであった：
BlProNAl_L  5 ’GACCTGAGAATCACAGACCCGGGATC
BlProNAl_U  3 ’CTGGACTCTTAGTGTCTGGGCCCTAG
（それぞれ配列番号１１３，１１４）
ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ（共にＮＥＢ社）で完全に切断してＭ１３分子に方向性を導入した。断片を定法通り精製し、Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ  ２００スピンカラム（クロンテック社）を介して短い遊離ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片を除去した。上記定法通り、以下のアダプターを加えた。
Bio GTAC_U  5 ’ビオチン  TEG ATTCGGCGAGCATCGGAAGTA
Bio GTAC_L  3 ’              TAAGCCGCTCGTAGCCTT
（それぞれ配列番号１１５，１１６）
標準Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ反応を用いて、５′疎水基を有する上記アダプターをＫｐｎＩ末端に連結した。上記定法通り、未使用アダプターを限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィで除去した。第１アダプターのＮ．ＡｌｗＩ、次いでＡｖａＩ部位を切断してインデックス化用平滑末端を作製し、これも上述のように断片をインデックス化用に精製した。ＫｐｎＩ部位の疎水性アダプターが最後に付いた断片をＣ１８  Ｇｅｎｏｍｉｘカラム〔バリアン社（Ｖａｒｉａｎ）、１カラム当たり１μｇ〕に通して精製した。カラムを５０％アセトニトリルで提供し、試料をＥＢに充填、カラムを各１００μｌの水で３回洗浄して、疎水性アダプターを受容しなかった物質を除去した。アダプター付加物質を５０％アセトニトリルで溶出し、Ｓｐｅｅｄｉｖａｃ（ハウ社）で乾燥した。試料を０．２×ＥＢに溶解させ、５′ＸＧＡＴＣＮＮＮＮ（ここで、Ｘは、直接検出用の５′フルオレセイン染料をさらに有するＰＣＲ可能配列である）形態のインデクサーを用いて上記定法通りにインデックス化した。１反応当たり１つのインデクサーを用いた。
【０２４８】
上記インデクサーにより、インデクサー用プライマーと疎水性アダプター用プライマーを用いてインデックス化断片をＰＣＲ増幅させることができた。ＰＣＲ増幅は、通常、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社、推奨を受けて）を用いたロングレンジＰＣＲを支持する条件を用いて行った。増幅された断片を０．７％アガロースゲル電気泳動にかけて分析した。ＫｐｎＩ部位で始まり、ＤＮＡｓｅＩによるランダム切断個所まで伸び、それらの末端に適切なインデクサーを受容した断片が増幅の主なターゲットであった。（インデクサー末端に対応する）それらの既知末端配列、相対サイズ順位および近似サイズによって、配列を＞１キロベースの読み取りで予測することができた。
【０２４９】
また、インデクサーのフルオレセイン標識により、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｒｓシステム（ＧＥヘルスケア社）を用いてインデックス化末端を検出することができた。供給業者が推奨するように、アガロースゲル電気泳動およびＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにより直接反応物を分析、検出した。ＫｐｎＩ部位で始まり、ＤＮＡｓｅＩによるランダム切断個所まで伸び、それらの末端に適したインデクサーを受容した断片が、インデクサー仲介標識を介した検出のターゲットであった。上述のように、配列決定には断片サイズおよびインデックス化末端の知識を用いた。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】タイプIIｓ制限エンドヌクレアーゼの一例、ＢｐｍＩの認識部位および切断部位と、その酵素を使った切断結果。
【図２】分断パリンドローム制限酵素の一例、ＢｇｌＩの制限部位および切断部位と、その酵素を使った切断結果。
【図３】本発明の方法により、延長アダプターを使って一本鎖末端を延長し、９塩基対からなる３’突出部分を作製した例。
【図４Ａ】本発明のバーコードおよび標識法。
【図４Ｂ】本発明のバーコードおよび標識法。
【図５Ａ】バーコード末端標識二本鎖ＤＮＡ分子上で実施される本発明の制御下サイズ縮小法。
【図５Ｂ】ＢｐｍＩを使用酵素例として制御下サイズ縮小の原理をより具体的に説明した図。
【図６】本発明の方法により、それぞれバーコード末端標識が異なり、それぞれ制御下に短縮された三つの異なるｄｓＤＮＡ分子の並行配列決定を示す。三つのバーコード化ＤＮＡ分子の一つに焦点を当てて、その配列の誘導を示す。
【図７Ａ】ＤＮＡの分子インデックス化と本発明の配列決定法（Ｍｉｄａｓ）。
【図７Ｂ】ＤＮＡの分子インデックス化と本発明の配列決定法（Ｍｉｄａｓ）。
【図７Ｃ】ＤＮＡの分子インデックス化と本発明の配列決定法（Ｍｉｄａｓ）。
【図７Ｄ】ＤＮＡの分子インデックス化と本発明の配列決定法（Ｍｉｄａｓ）。
【図８】Ｈｉｎｆｌで切断したＰｉｌＸ１７４  ＤＮＡのインデックス化のリガーゼ依存性を示す。異なる条件下で行ったインデックス化反応生成物のエレクトロフェログラム：  Ａ）Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、３７℃、マグネシウム；  Ｂ）Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、３７℃、マンガン；  Ｃ）Ｔａｑリガーゼ、４５℃。
【図９】リガーゼおよびインデクサーの量を変えたときの産物収率に対する効果を示すエレクトロフェログラム；Ａ）Ｐｆｕリガーゼ；Ｂ）Ｔａｑリガーゼ。
【図１０】最初から平滑であった末端のインデックス化を示すエレクトロフェログラム。
【図１１】図に示したさらに２個の塩基に対して選択される塩基ＢｇｌIIまたはＳａｌＩおよび、各部位でインデックス化することによって規定されるさらに１０個の隣接塩基に対して、ヒトＲｅｆＳｅｑ  Ｂｕｉｌｄ３５．１における頻度を比較したもの（実施例６を参照）。
【図１２Ａ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（１）ヒトゲノムＤＮＡのＨｉｎｆｌ消化。
【図１２Ｂ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（２）ブロッカーおよび初期インデクサーの連結。
【図１２Ｃ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（３）Ｎ  ．ＢｓｔＮＢＩ消化と、それにつづくＸｂａＩ消化。
【図１２Ｄ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（４）ビオチニル化したインデクスの連結。
【図１２Ｅ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（５）ＢｐｎＩの消化。
【図１２Ｆ】インデックス化された短いゲノム配列分離法を示す：（６）ＰＣＲインデクサーの連結。
【図１３】両端をインデックス化したΦΧ１７４フラグメントの環状化と、それにつづく環の再切断の結果を示す。
【図１４】バーコード化したインデクサーを作製するための戦略を示す。
【図１５】短い分枝インデクサーに対するＣａｔｈｅｒｉｎｅの車輪標識化システムを示す。
【図１６】Ｃａｔｈｅｒｉｎｅの車輪プローブを作るために一本鎖Ｍ１３にハイブリダイゼーションした標識Ｍ１３フラグメントのアガロースゲルを示す。
【図１７】広げたのちＹＯＹＯ−１で標識されたＤＮＡによる共心乾燥リングの電子顕微鏡写真。メニスカスによってＤＮＡ分子が延びているのがわかる。
【図１８】ファージＬａｍｂｄａＤＮＡの単一分子。
【図１９】Ａｌｅｘｆｌｕｏｒで標識されたＤＮＡにはＤＮＡの延びがないことを示す。
【図２０】Ａｌｅｘｆｌｕｏｒで標識されたＤＮＡのＣＨＡＰＳ緩衝液中における広がりの乾燥前の輪（ｈａｌｏｓ）を示す。
【図２１Ａ】Ａｌｅｘｆｌｕｏｒで標識されたＤＮＡのＣＨＡＰＳ緩衝液中における広がりの乾燥前の各輪を拡大したもの。
【図２１Ｂ】Ａｌｅｘｆｌｕｏｒで標識されたＤＮＡのＣＨＡＰＳ緩衝液中における広がりの乾燥前の各輪を拡大したもの。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１ＡａｎｄＢ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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