(57)【要約】少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/または少なくとも一つの金属キレート剤の有効量を適用する段階を含む、植物もしくは動物宿主における外部寄生生物侵襲を治療または予防する方法が提供され、ここで金属キレート剤は金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、または該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、該複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよい。2008528449.tif 000040
2008528449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/もしくは少なくとも一つの金属キレート剤またはそれらの塩の有効量を適用する段階を含む、植物宿主における外部寄生生物侵襲を治療または予防する方法であって、金属キレート剤が金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、または該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、該複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよい、方法。
【請求項２】
金属キレート剤が式(I)の化合物またはその塩である、請求項1記載の方法：
2008528449.tif 000033
式中、Xは、共有結合、-C(R5)2-、-Z-、または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、もしくはN(C1-6アルキル)2から独立して選択されるか、またはR1およびR1'は一緒になってC(R5)2-、-C(R5)2-C(R5)2-、-CR5=CR5-、C(O)、C(S)もしくはNHであり；
R2、R2'、R3、R3'、R4、およびR4'は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2、または-CH2CHNH(CO2H)から独立して選択され；または
R2およびR3もしくはR3およびR4ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環または複素環を形成し；
R5はそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、またはN(C1-6アルキル)2から独立して選択され；ならびに
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【請求項３】
金属キレート剤が式(Ia)の化合物またはその塩である、請求項2記載の方法：
2008528449.tif 000034
式中、Xは、共有結合、-C(R5)2-、-Z-、または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、またはN(C1-6アルキル)2から独立して選択され；
R2、R2'、R3、R3'、R4、およびR4'は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2、または-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6アルキレン)N(C1-6アルキル)2、または5もしくは6員炭素環または複素環から独立して選択され；または
R2およびR3もしくはR3およびR4ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環または複素環を形成し；
R5はそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立して選択され；ならびに
R6はそれぞれ、水素およびハロゲンから独立して選択され；ならびに
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【請求項４】
R1、R1'、R2、およびR2'が、水素またはC1-3アルキルから独立して選択される、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】
R3、R3'、R4、およびR4'が、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオール、もしくはCO2C1-6アルキルから独立して選択されるか、またはR3およびR4ならびに/もしくはR3'およびR4'が、それらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環または複素環を形成する、請求項2または3記載の方法。
【請求項６】
R5がそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオールまたはCO2C1-6アルキルから独立して選択される、請求項2または3記載の方法。
【請求項７】
Xが共有結合、-CH2-Z-CH2-または-Z-である、請求項2または3記載の方法。
【請求項８】
Zが-NH-、-O-または-S-である、請求項2または3記載の方法。
【請求項９】
式(Ia)の化合物が以下から選択される、請求項2または3記載の方法：
2,2'-ジピリジル、
6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、
5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、
4,4'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、および
2-(2-ピリジニル)キノロン、
またはそれらの塩。
【請求項１０】
金属キレート剤が式(II)の化合物またはその塩である、請求項1記載の方法：
2008528449.tif 000035
式中、X'は共有結合、-C(R13)2-、Z'または-C(R13)2-Z'-C(R13)2-から選択され；
UはNまたはC(R13)から選択され；
Wは-NH-、-S-または-O-から選択され；
Z'は共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-、または-C(S)-から選択され；
R10は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、N(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、または-(CH2)nR14から選択され；
R11は、(CH2)mアリールまたは(CH2)mヘテロアリールから選択され、アリールまたはヘテロアリールはそれぞれ、一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、またはハロで置換されてもよく；
R12はそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2または-(CH2)nR14から独立して選択され；または
R10およびR12はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環または複素環を形成し；
R13はそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、または-(CH2)nR14から独立して選択され；
R14はNH2、OH、SH、またはCO2Hから選択され；
mは0または1〜4の整数であり；および
nは1〜4の整数である。
【請求項１１】
金属キレート剤が式(III)の化合物またはその塩である、請求項1記載の方法：
2008528449.tif 000036
式中、Arは一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2で置換されていてもよいフェニル、ナフチルまたはインドリルであり；
R21はNH2、NHR25または-CH2SR25から選択され；
R22は水素、ヒドロキシまたはC1-6アルコキシから選択され；
R23は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニルまたはC2-6アルキニルから選択され；
R24はOH、OR26、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から選択され；
R25は水素、アルキルが-SHまたは-OHで置換されていてもよいC(O)C1-6アルキルから選択され；
R26はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたはベンジルから選択され；および
pは0または1である。
【請求項１２】
金属キレート剤が式(IV)の化合物またはその塩である、請求項1記載の方法：
2008528449.tif 000037
式中、Arは一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2で置換されていてもよいフェニル、ナフチルまたはインドリルであり；
R31はCO2H、CO2C1-6アルキル、CO2C2-6アルケニル、CO2C2-6アルキニル、CONH2、CONH(C1-6アルキル)またはCON(C1-6アルキル)2から選択され；
R32は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、CH2CH2CO2H、CH2CH2CONH2、CH2CH2OH、CH2CH2SHから選択され；および
R33は、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、CH2CO2H、CH2CO2C1-6アルキル、CH2CONH2、CH2OH、またはCH2SHから選択される。
【請求項１３】
金属キレート剤が式(V)の化合物またはその塩である、請求項1記載の方法：
2008528449.tif 000038
式中、R41およびR42は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニルから独立して選択されるか、またはR41およびR42はそれらが結合している窒素と一緒になって、一つもしくは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル基で置換されていてもよい5または6員複素環を形成し；および
R43は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、またはN(C1-6アルキル)2から選択される。
【請求項１４】
外部寄生生物侵襲が、ヘリオチス/ヘリコベルパ種(Heliothis/Helicoverpa spp.)、マイチムナ種(Mythimna spp.)、パーセクタニア種(Persectania spp.)、シューダレチア-ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)、シューダレチア-エヴァンシ(Pseudaletia evansii)、コドリンガ(Cydia pomonella)、ケブカノメイガ(Crocidolomia pavonana)、モンシロチョウ(Pieris rapae)、ジャガイモキバガ(Phthorimaea operculella)、スポドプテラ種(Spodoptera spp.)、キンウワバ種(Chrysodeixis spp.)、エピフィアス-ポストヴィタナ(Epiphyas postvittana)、およびコナガ(Plutella xylostella)からなる群より選択される種の外部寄生生物によって引き起こされる、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
外部寄生生物卵を少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/または少なくとも一つの金属キレート剤に曝露する段階を含む、外部寄生生物卵の孵化を阻害する方法であって、金属キレート剤は、金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、または該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、該複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよく、外部寄生生物卵は、ヘリコベルパ-パンクチゲラ(Helicoverpa punctigera)、マイチムナ種、パーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、スポドプテラ種、キンウワバ種、およびエピフィアス-ポストヴィタナからなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される、方法。
【請求項１６】
外部寄生生物卵を、少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/または少なくとも一つの金属キレート剤に曝露する段階を含む、外部寄生生物卵の孵化を阻害するための方法であって、金属キレート剤は、金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、または該化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、該複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよく、外部寄生生物卵は、ヒツジハジラミ(Bovicola ovis)、ウシハジラミ(Bovicola bovis)、ウシジラミ(Haematopinus eurysternus)、ヒフバエ種(Hypoderma spp.)、ノサシバエ(Haematobia irritans exigua)、コクリオミイヤ種(Cochliomyia spp.)、オビキンバエ種(Chrysomya spp.)、ウシホソジラミ(Linognathus vituli)、ソレノポテス-キャピラタス(Solenopotes capillatus)、サルコプテス種(Sarcoptes spp.)、キュウセンヒゼンダニ種(Psoroptes spp.)、およびコナヒョウダニ種(Dermatophgoides spp.)からなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される、方法。
【請求項１７】
少なくとも一つの金属キレート剤を、第二の外部寄生生物撲滅薬と同時に、別々に、または逐次的に適用する、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
第二の外部寄生生物撲滅薬が、若虫および/または成虫外部寄生生物を防除する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
外部寄生生物卵を、下記式(Ia)の少なくとも一つの化合物またはその薬学的、獣医学的、もしくは農業的に許容される塩の有効量に曝露する段階を含む、H. パンクチゲラ、マイチムナ種、パーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、スポドプテラ種、キンウワバ種、エピフィアス-ポストヴィタナ、ヒツジハジラミ、ウシハジラミ、ウシジラミ、ヒフバエ種、ノサシバエ、コクリオミイヤ種、オビキンバエ種、ウシホソジラミ、ソレノポテス-キャピラタス、サルコプテス種、キュウセンヒゼンダニ種、およびコナヒョウダニ種からなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される外部寄生生物卵の孵化を阻害する方法：
2008528449.tif 000039
式中、Xは共有結合、-C(R5)2-、-Z-または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立して選択され；
R2、R2'、R3、R3'、R4、およびR4'は、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2、CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6アルキレン)N(C1-6アルキル)2、または5もしくは6員炭素環または複素環から独立して選択され；または
R2およびR3もしくはR3およびR4ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環または複素環を形成し；
R5はそれぞれ、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立して選択され；
R6はそれぞれ、水素およびハロゲンから独立して選択され；ならびに
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、外部寄生生物を防除するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、外部寄生生物卵の孵化を阻害するための方法および組成物に関する。本発明は、外部寄生生物侵襲を予防または治療するための方法および組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
昆虫を含む外部寄生生物は、広い範囲の動物および植物において著しい有害生物問題を引き起こす。特に、外部寄生生物は典型的にはヒトおよび家畜を悩ませ、かみつき、感染の原因となる。特に問題となるのは、そのような寄生生物のヒト、イヌおよびネコなどの家庭内のペットまたはコンパニオンアニマル、ならびにヒツジ、ウシおよびウマなどの家畜における存在および影響である。等しく問題となるのは、外部寄生生物が植物に対しても著しい損傷をもたらしうることである。幼虫は商業上重要な植物の葉、花、実を食べ、毎年何百万ドルもの損失をもたらす可能性がある。
【０００３】
鱗翅目の幼虫、ガおよびチョウなどの植物有害生物、ならびにノミ、マダニ、ハエ、シラミおよびダニなどの、かみつく、または吸血有害生物(外部寄生生物)を防除または除去するための、様々な組成物および適用技術が公知である。長年の間、そのような外部寄生生物を防除するために、多数のエアロゾルおよび空間噴霧、液剤、セッケン、シャンプー、水和剤、顆粒剤、餌、ならびに粉剤が提唱されてきた。
【０００４】
外部寄生生物の従来の防除手段は、化学殺虫剤、例えば塩素化炭化水素(DDT、エンドスルファンなど)、および合成または天然ピレスロイド(ピレトリン、ペルメトリン、シペルメトリン、デルタメトリン)の使用に頼っていた。化学殺虫剤の使用に伴う問題には、標的外部寄生生物の抵抗性発現、化学物質の環境および動植物組織への残留、ならびに宿主および非標的生物に対する有害作用が含まれる。
【０００５】
他のタイプの外部寄生生物撲滅薬には、キチン合成を妨害することが知られている昆虫成長防除剤(IGR)および殺虫性細菌毒素(例えば、バチルス-スリンギエンシス(Bt)毒素)などの殺虫剤が含まれる。より有用な殺虫剤群は、有機リンおよび天然ピレトリンなどの高い殺虫活性および低い環境残留性を有するものである。しかし、これらの殺虫剤に伴う著しい問題は、標的昆虫の抵抗性発現である。
【０００６】
例えば、シラミを治療するために用いられる殺虫剤はEP 0191236(特許文献1)および米国特許第5,288,483号(特許文献2)に記載されている。これらの薬剤を用いることの著しい不都合は、シラミが抵抗性となりうることである。さらなる治療が必要となることで、これらの強い薬剤への曝露が増え、コストが上がる。
【０００７】
抵抗性の発現はまた、植物に侵襲する外部寄生生物の化学的防除に関して問題である。生物的および化学的な防除方法が、外部寄生生物が卵から出てきた後に、幼虫を防除または殺害することにより、植物外部寄生生物を防除するのに用いられてきたにも関わらず、そのような防除は、外部寄生生物によって引き起こされる植物への障害を排除するのではなく、減少させるだけである。
【０００８】
最近、外部寄生生物を防除する手段を提供する可能性がある昆虫プロテアーゼに関心が集まっている。プロテアーゼは、タンパク質およびペプチドの調節および分解を含む、様々な機能を行い、したがって消化を助ける。また、プロテアーゼは胚の発生、脱皮および蛹化中の組織再編成にも関与している。プロテアーゼは多様な酵素群であり、種内および種間で数および触媒特性の両方が非常に異なる消化プロテアーゼが含まれる。例えば、トリプシン様セリンプロテアーゼは脱皮の主要な成長調節領域に関与することが認められた(Samuels R.I. and Paterson C.J., Comparative Biochemistry and Physiology, 1995, 110B: 661-669(非特許文献1))。
【０００９】
プロテアーゼ阻害剤は、特に外部寄生生物がこのような化学殺虫剤に抵抗性となっている場合に、化学防除法の有用な代替法であることが示唆されている。特に、セリンおよびシステインプロテアーゼ阻害剤は、幼虫の成長および/または様々な昆虫の生存を低下させることが明らかにされている(Dymock et. al., New Zealand Journal of Zoology, 1992, 19: 123-131(非特許文献2))。成長阻害は腸の主な消化酵素の阻害剤によって達成され、外部寄生生物の幼虫または成熟寄生生物を標的としている。しかし、プロテアーゼ阻害剤の様々なクラスの他のタイプの活性および機能についてはほとんど知られていない。既存の外部寄生生物撲滅薬の一般的な問題は、外部寄生生物卵に作用しないことであり、したがって寄生生物撲滅薬の宿主への適用は、それが有効となるために治療の繰り返しまたは寄生生物撲滅薬への長期間曝露を必要とすることが多い。これは不便であるだけでなく、環境および宿主へのリスクを高めることにもなる。
【００１０】
したがって、いまだに、外部寄生生物の効率的な防除を提供するために、外部寄生生物卵孵化を阻害する際に有効な代替法および組成物を提供する必要がある。
【００１１】
【特許文献１】EP 0191236
【特許文献２】米国特許第5,288,483号
【非特許文献１】Samuels R.I. and Paterson C.J., Comparative Biochemistry and Physiology, 1995, 110B: 661-669
【非特許文献２】Dymock et. al., New Zealand Journal of Zoology, 1992, 19: 123-131
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明の一局面において、少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/もしくは少なくとも一つの金属キレート剤の有効量を適用する段階を含む、植物宿主における外部寄生生物卵侵襲を治療または予防する方法が提供され、ここで金属キレート剤が金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物で、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択されており、この化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、またはこの化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、この複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよい。
【００１３】
いくつかの態様において、外部寄生生物の感染は、H. パンクチゲラ(H. punctigera)を含むヘリオチス/ヘリコベルパ種(Heliothis/Helicoverpa spp.)、マイチムナ-セパラタ(Mythimna separata)、マイチムナ-ロレイミマ(Mythimna loreyimima)、マイチムナ-コンベクタ(Mythimna convecta)、マイチムナ-ユニパンクタ(Mythimna unipuncta)を含むマイチムナ種(Mythimna spp.)、P. ディスクリタ(P. dyscrita)およびP. エウィンギ(P. ewingii)を含むパーセクタニア種(Persectania spp.)、シューダレチア-ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)およびシューダレチア-エヴァンシ(Pseudaletia evansii)、ケブカノメイガ(Crocidolomia pavonana)、モンシロチョウ(Pieris rapae)、ジャガイモキバガ(Phthorimaea operculella)、キンウワバ種(Chrysodeixis spp.)、コドリンガ(Cydia pomonella)、スポドプテラ種(Spodoptera spp.)、エピフィアス-ポストヴィタナ(Epiphyas postvittana)、ならびにコナガ(Plutella xylostella)からなる群より選択される種の外部寄生生物によって引き起こされる。
【００１４】
本出願人は、外部寄生生物卵孵化を阻害するための有効な薬剤として金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤を同定した。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤の外部寄生生物卵孵化を阻害するための使用は、外部寄生生物の繁殖周期を防止し、それにより外部寄生生物侵襲を防除するという利点を有する。
【００１５】
もう一つの局面において、外部寄生生物卵を、少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/または少なくとも一つの金属キレート剤に曝露する段階を含む、外部寄生生物卵の孵化を阻害するための方法が提供され、ここで金属キレート剤は、金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、この化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、またはこの化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、この複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよく、外部寄生生物卵は、H. パンクチゲラ、マイチムナ種、パーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、スポドプテラ種、キンウワバ種、エピフィアス-ポストヴィタナからなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの局面において、外部寄生生物卵を、少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤および/または少なくとも一つの金属キレート剤に曝露する段階を含む、外部寄生生物卵の孵化を阻害するための方法が提供され、ここで金属キレート剤は、金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物であり、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択され、この化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、またはこの化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、この複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよく、外部寄生生物卵は、ヒツジハジラミ(Bovicola ovis)(ヒツジのシラミ)、ウシハジラミ(Bovicola bovis)、ウシジラミ(Haematopinus eurysternus)(短鼻ウシシラミ)、ヒフバエ種(Hypoderma spp.)、ノサシバエ(Haematobia irritans exigua)、コクリオミイヤ種(Cochliomyia spp.)、オビキンバエ種(Chrysomya spp.)、ウシホソジラミ(Linognathus vituli)(長鼻ウシシラミ)、ソレノポテス-キャピラタス(Solenopotes capillatus)(結節含有シラミ)、サルコプテス-スカジエイ-カニス(Sarcoptes scabiei canis)、サルコプテス-スカジエイ-スイス(Sarcoptes scabiei suis)、サルコプテス-スカジエイ-ボヴィス(Sarcoptes scabiei bovis)、サルコプテス-スカジエイ-バー-ヒュマニ(Sarcoptes scabiei var. humani)を含むサルコプテス種(Sarcoptes spp.)(ヒゼンダニ)、ヒツジキュウセンヒゼンダニ(Psoroptes ovis)を含むキュウセンヒゼンダニ種(Psoroptes spp.)、およびコナヒョウダニ種(Dermatophgoides spp.)からなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される。
【００１７】
本発明のなおさらなる局面において、H. パンクチゲラ、マイチムナ種、パーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、スポドプテラ種、キンウワバ種、エピフィアス-ポストヴィタナ、ヒツジハジラミ(ヒツジのシラミ)、ウシハジラミ、ウシジラミ(短鼻ウシシラミ)、ヒフバエ種、ノサシバエ、コクリオミイヤ種、オビキンバエ種、ウシホソジラミ(長鼻ウシシラミ)、ソレノポテス-キャピラタス(結節含有シラミ)、サルコプテス-スカジエイ-カニス、サルコプテス-スカジエイ-スイス、サルコプテス-スカジエイ-ボヴィス、サルコプテス-スカジエイ-バー-ヒュマニを含むサルコプテス種(ヒゼンダニ)、ヒツジキュウセンヒゼンダニを含むキュウセンヒゼンダニ種、およびコナヒョウダニ種からなる群より選択される種の外部寄生生物によって産み出される、外部寄生生物卵の孵化を阻害するための方法であって、外部寄生生物卵を、下記式(Ia)の少なくとも一つの化合物またはその薬学的、獣医学的、もしくは農業的に許容される塩の有効量に曝露する段階を含む方法が提供される：
2008528449.tif 000003
式中、Xは共有結合、-C(R5)2-、-Z-または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立に選択され；
R2、R2'、R3、R3'、R4およびR4'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2、-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6アルキレン)N(C1-6アルキル)2、または5もしくは6員炭素環または複素環から独立に選択されるか；あるいは
R2およびR3もしくはR3およびR4ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5または6員炭素環または複素環を形成し；
各R5は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立に選択され；
R6はそれぞれ、水素およびハロゲンから独立して選択され；かつ
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【００１８】
好ましい態様の詳細な説明
本明細書において用いられる「金属キレート剤」なる用語は、金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物を意味し、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択されており、この化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、またはこの化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、この複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよい。好ましくは、金属キレート剤はアリールまたはヘテロアリール環を含む。より好ましくは、金属キレート剤は少なくとも一つの窒素ヘテロ原子を含む。好ましくは、金属キレート剤は非介在性(non-intercalating)である。
【００１９】
本明細書において用いられる「メタロプロテアーゼ阻害剤」なる用語は、外部寄生生物卵孵化に関連するメタロプロテアーゼの活性を阻害する分子、化合物、タンパク質または薬剤を意味する。阻害は、メタロプロテアーゼの発現の阻害であってもよく、またはメタロプロテアーゼの酵素活性の阻害であってもよい。好ましいメタロプロテアーゼ阻害剤は金属キレート剤である。
【００２０】
好ましい金属キレート剤は、ビアリール化合物、ペプチドおよびアミノ酸誘導体、四環式抗生物質ならびにチオ尿素から選択される。好ましいビアリール化合物には、ビピリジル化合物および1,10-フェナントロリン化合物が含まれる。
【００２１】
一つの態様において、金属キレート剤もしくはメタロプロテアーゼ阻害剤は式(I)の化合物またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩である：
2008528449.tif 000004
式中、Xは共有結合、-C(R5)2-、-Z-または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2から独立に選択されるか、またはR1およびR1'は一緒になってC(R5)2-、-C(R5)2-C(R5)2-、-CR5=CR5-、C(O)、C(S)もしくはNHであり；
R2、R2'、R3、R3'、R4およびR4'は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルもしくはN(C1-6アルキル)2、-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6アルキレン)N(C1-6アルキル)2、または5もしくは6員炭素環または複素環から独立に選択されるか；あるいは
R2およびR3もしくはR3およびR4ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5または6員炭素環または複素環を形成し；
各R5は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から独立に選択され；
R6はそれぞれ、水素およびハロゲンから独立して選択され；かつ
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【００２２】
好ましい式(I)の化合物は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：
R1およびR1'はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2、より好ましくは水素またはC1-C3アルキル、さらにより好ましくは水素またはメチルから独立に選択される；
R2およびR2'は独立に水素またはC1-3アルキル、より好ましくは水素である；
R3、R3'、R4、およびR4'は独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオール、またはCO2C1-6アルキル、好ましくは水素、またはC1-3アルキル、より好ましくは水素またはメチルから選択され；またはR3およびR4ならびに/もしくはR3'およびR4'は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5もしくは6員炭素環または複素環、好ましくは芳香環を形成し；
R5はそれぞれ独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、またはC2-6アルキニル、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオールまたはCO2C1-6アルキル、好ましくは水素またはC1-3アルキル、より好ましくは水素またはメチルから選択され；
R6はそれぞれ独立して、水素またはフッ素であり、特にR6はそれぞれフッ素であり；
Xは共有結合、-CH2-Z-CH2-またはZ、好ましくは共有結合であり；ならびに
Zは-NH-、-O-または-S-、好ましくは-NH-である。
【００２３】
式(I)の好ましい化合物は、式(Ia)のビアリール化合物、またはその薬学的、獣医学的、もしくは農業的に許容される塩であり；
2008528449.tif 000005
式中、Xは共有結合、-C(R5)2-、-Z-または-C(R5)2-Z-C(R5)2-から選択され；
R1およびR1'は独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオ、ハロゲン、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、またはN(C1-6アルキル)2から選択され；
R2、R2'、R3、R3'、R4、およびR4'は独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、ハロゲン、CN、C(R6)3、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、またはN(C1-6アルキル)2、-CH2CHNH(CO2H)、NH(C1-6アルキレン)N(C1-6アルキル)2、または5もしくは6員炭素環または複素環から選択され；または
R2およびR3もしくはR3およびR4、ならびに/またはR2'およびR3'もしくはR3'およびR4'は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5もしくは6員炭素環または複素環を形成し；R5はそれぞれ独立して、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキル、N(C1-6アルキル)2から選択され；
R6はそれぞれ独立して、水素およびハロゲンから選択され；ならびに
Zは共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-および-C(S)-から選択される。
【００２４】
式(I)の好ましい化合物には以下が含まれる：
2,2'-ジピリジル、
6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、
5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、
4,4'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、および
2-(2-ピリジニル)キノロン、
またはその薬学的、獣医学的、もしくは農業的に許容される塩。
【００２５】
もう一つの態様において、金属キレート剤は式(II)の化合物またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩である：
2008528449.tif 000006
式中、X'は共有結合、-C(R13)2-、Z'またはC(R13)2-Z'-C(R13)2-から選択され；
UはNまたはC(R13)から選択され；
Wは-NH-、-S-または-O-から選択され；
Z'は共有結合、-NH-、-O-、-S-、-C(O)-、または-C(S)-から選択され；
R10は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、または-(CH2)nR14から選択され；
R11は各アリールまたはヘテロアリールが一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、またはハロで置換されていてもよい(CH2)mアリールまたは(CH2)mヘテロアリールから選択され；
各R12は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、もしくは-(CH2)nR14から独立に選択されるか；または
R10およびR12はそれらが結合している炭素原子と一緒になって5もしくは6員炭素環もしくは複素環を形成し；
各R13は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、または-(CH2)nR14から独立に選択され：
R14はNH2、OH、SHまたはCO2Hから選択され；
mは0または1から4の整数であり；かつ
nは1から4の整数である。
【００２６】
好ましい式(II)の化合物は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：
Xは共有結合または-CH2-Z-CH2-である；
UはNである；
WはNHまたはSである；
Z'はNHである；
R10は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、または-(CH2)nR14、好ましくは水素、C1-3アルキルまたは(CH2)nR14である；
R11はフェニル、C1-3アルキルもしくはハロで置換されたフェニル、チオフェン、ピリジン、ピリジニルメチル、イミダゾールまたは1もしくは2個のC1-3アルキルで置換されたイミダゾールである；
R12は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、もしくは(CH2)nR14、好ましくは水素、C1-3アルキルもしくは(CH2)nR14であるか；または
R10およびR12はそれらが結合している炭素原子と一緒になって縮合フェニル環を形成する；
R13は水素またはC1-3アルキル、好ましくは水素またはメチルである；
R14はNH2またはCO2Hである；
mは0または1である；および
nは1または2である。
【００２７】
もう一つの態様において、金属キレート剤は式(III)の化合物またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩から選択される：
2008528449.tif 000007
式中、Arは一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2で置換されていてもよいフェニル、ナフチルまたはインドリルであり；
R21はNH2、NHR25または-CH2SR25から選択され；
R22は水素、ヒドロキシまたはC1-6アルコキシから選択され；
R23は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニルまたはC2-6アルキニルから選択され；
R24はOH、OR26、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から選択され；
R25は水素、アルキルが-SHまたは-OHで置換されていてもよいC(O)C1-6アルキルから選択され；
R26はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたはベンジルから選択され；かつ
pは0または1である。
【００２８】
好ましい式(III)の化合物は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：
Arはフェニルまたはナフチルである；
R21はNH2、SHで置換されていてもよい-NHC(O)C1-6アルキル、-CH2SC(O)C1-6アルキルまたはCH2SHである；
R22は水素またはヒドロキシである；
R23は水素またはC1-3アルキル、好ましくは水素またはメチルである；
R24はOH、NH2またはOベンジルである；および
pは0またはlである。
【００２９】
好ましい式IIIの化合物には、ベスタチンおよびチオロファンまたはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩が含まれる。
【００３０】
さらにもう一つの態様において、金属キレート剤は式(IV)の化合物またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩である：
2008528449.tif 000008
式中、Arは一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2で置換されていてもよいフェニル、ナフチルまたはインドリルであり；
R31はCO2H、CO2C1-6アルキル、CO2C2-6アルケニル、CO2C2-6アルキニル、CONH2、CONH(C1-6アルキル)またはCON(C1-6アルキル)2から選択され；
R32は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、CH2CH2CO2H、CH2CH2CONH2、CH2CH2OH、CH2CH2SHから選択され；かつ
R33はC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NH(C1-6アルキル)、N(C1-6アルキル)2、CH2CO2H、CH2CO2C1-6アルキル、CH2CONH2、CH2OH、またはCH2SHから選択される。
【００３１】
好ましい式(IV)の化合物は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：
Arはフェニルまたはインドリルである、
R31はCO2HまたはCONH2である、
R32はC1-6アルキル、CH2CH2CO2H、CH2CH2CONH2、CH2CH2OH、またはCH2CH2SHである、
R33はCH2CO2H、CH2CONH2、CH2OH、またはCH2SHである。
【００３２】
さらにもう一つの態様において、金属キレート剤は式(V)の化合物またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩である：
2008528449.tif 000009
式中、R41およびR42は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニルから独立に選択されるか、またはR41およびR42はそれらが結合している窒素と一緒になって一つまたは複数のC1-6アルキル、C2-6アルケニルもしくはC2-6アルキニル基で置換されていてもよい5もしくは6員複素環を形成し；かつ
R43は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、ヒドロキシ、C1-6アルコキシ、チオール、C1-6アルキルチオール、CO2H、CO2C1-6アルキル、SO3H、SO3C1-6アルキル、NH2、NHC1-6アルキルまたはN(C1-6アルキル)2から選択される。
【００３３】
好ましい式(V)の化合物は、下記の特徴の少なくとも一つを有する：
R41およびR42はC1-6アルキルから独立に選択されるか、またはそれらが結合している窒素と一緒になってピペリジン、ピペラジン、N-メチルピペラジンまたはモルホリン基を形成する；
R43は水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、またはC2-6アルキニルである。
【００３４】
さらなる態様において、金属キレート剤は、テトラサイクリン、ドキシサイクリンもしくはミノサイクリンからなる群より選択される四環式抗生物質、またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩である。
【００３５】
さらなる態様において、金属キレート剤は1-[(2S)-3-メルカプト-2-メチル-1-オキソプロピル]-L-プロリン(カプトプリル)もしくはN-(α-ラムノピラノシルオキシ-ヒドロキシホスフィニル)-L-ロイシル-L-トリプトファン(ホスホラミドン)、またはその薬学的、獣医学的もしくは農業的に許容される塩から選択される。
【００３６】
本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味し、規定の数の炭素原子を有していてもよい。例えば、「C1-C6アルキル」中のC1-C6には、1、2、3、4、5または6炭素を直鎖または分枝配列で有する基が含まれる。適当なアルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、4-メチルブチル、n-ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、5-メチルペンチル、2-エチルブチルおよび3-エチルブチルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３７】
本明細書において用いられる「アルケニル」なる用語は、炭素原子の間に一つまたは複数の二重結合を有する直鎖または分枝炭化水素基を意味し、規定の数の炭素原子を有していてもよい。例えば、「C2-C6アルケニル」中のC2-C6には、2、3、4、5または6炭素原子を直鎖または分枝配列で有する基が含まれる。適当なアルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ペンテニルおよびヘキセニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３８】
本明細書において用いられる「アルキニル」なる用語は、炭素原子の間に一つまたは複数の三重結合を有する直鎖または分枝炭化水素基を意味し、規定の数の炭素原子を有していてもよい。例えば、「C2-C6アルキニル」中のC2-C6には、2、3、4、5または6炭素原子を直鎖または分枝配列で有する基が含まれる。適当なアルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよびヘキシニルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
本明細書において用いられる「ハロ」または「ハロゲン」なる用語は、フッ素(フルオロ)、塩素(クロロ)、臭素(ブロモ)およびヨウ素(ヨード)を意味する。
【００４０】
本明細書において用いられる「アルキルオキシ」なる用語は、酸素の橋を通じて結合された前述の定義のアルキル基を意味する。適当なアルキルオキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、n-プロピルオキシ、i-プロピルオキシ、n-ブチルオキシ、i-ブチルオキシ、t-ブチルオキシ、n-ペンチルオキシおよびn-ヘキシルオキシが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４１】
本明細書において用いられる「アルキルチオ」なる用語は、硫黄の橋を通じて結合された前述の定義のアルキル基を意味する。適当なアルキルチオ基の例には、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、i-プロピルチオ、ブチルチオ、i-ブチルチオ、t-ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４２】
本明細書において用いられる「アルキレン」なる用語は、特定の数の炭素原子を有する2価のアルキル基を意味する。例えば、C1-6アルキレンは-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、および-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-を含む。
【００４３】
本明細書において用いられる「炭素環」なる用語は、環を形成する原子がすべて炭素原子である、3から10員環または縮合環系を意味する。C3-10炭素環は飽和でも、不飽和でも、または芳香族であってもよい。適当な炭素環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、フェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４４】
本明細書において用いられる「複素環」なる用語は、環を形成する原子の少なくとも一つがヘテロ原子である、3から10員環または縮合環系を意味する。好ましくは、ヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄およびリンから選択される。C3-10複素環は飽和でも、不飽和でも、または芳香族であってもよい。適当な複素環の例には、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾイル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフタピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにそのN-オキシドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子を介してでも、またはヘテロ原子を介してでも起こりうる。
【００４５】
本明細書において用いられる「アリール」なる用語は、少なくとも一つの環が芳香族である、各環6原子までのいかなる安定な単環式または二環式炭素環も意味することが意図される。そのようなアリール基の例には、フェニル、ナフチルおよびテトラヒドロナフチルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４６】
本明細書において用いられる「ヘテロアリール」なる用語は、少なくとも一つの環が芳香族であり、少なくとも一つの環がO、NおよびSからなる群より選択される1個から4個のヘテロ原子を含む、各環6原子までの安定な単環または二環を意味する。本定義の範囲内のヘテロアリール基には、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４７】
本発明の化合物は薬学的、獣医学的または農業的に許容される塩の形であってもよい。適当な塩には、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸などの無機酸の塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、粘液酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリル酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸および吉草酸などの有機酸の塩が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４８】
塩基性塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムおよびアルキルアンモニウムなどのカチオンと形成されたものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４９】
塩基性窒素含有基は、塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチルなどのハロゲン化低級アルキル；硫酸ジメチルおよびジエチルなどの硫酸ジアルキルなどの物質で4級化されていてもよい。
【００５０】
本発明の多くの化合物は不斉中心を有し、したがって複数の立体異性体で存在しうることも理解されると思われる。したがって、本発明は、一つまたは複数の不斉中心において実質的に純粋な異性体、例えば光学純度が約95％もしくは97％ee、または99％eeよりも高いなどの、約90％eeよりも高い化合物、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物にも関する。そのような異性体は、不斉合成、例えばキラル中間体を用いて、またはキラル分割によって調製することができる。
【００５１】
本発明において有用ないくつかの金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤が専門の化学会社から市販されている。市販されていないものは市販の出発原料から当業者には公知の反応を用いて合成することができる。
【００５２】
例えば、置換2,2'-ビピリジルおよび1,10-フェナントロリンは適当なハロゲン化2,2'-ビピリジルまたは1,10-フェナントロリンから得ることができる。例えば、2,2'-ビピリジン-6,6'-ジカルボン酸は6,6'-ジブロモ-2,2'-ジピリジルからブチルリチウムを用いてのハロゲン-金属交換、ドライアイス処理および酸性化により得ることができる［Buhleier et. al., Chem. Ber., 1978, 111: 200-204］。ビピリジルの6位の例えばCH2CHNH2(CO2H)による一置換は、6-メチル-2,2'-ビピリジルのN-ブロモスクシンイミドでの処理と、続くN-保護グリシンエステルでのアルキル化により得ることができる。次いで、保護基を酸加水分解によって除去することができる(Imperiali B. and Fisher S. L., J. Org. Chem., 1992, 57: 757-759)。
【００５３】
2,2'-ジピリジルはC6およびC4位で求核置換を行い置換基を導入することができる。この反応はハロゲン化ジピリジルを出発原料として用いる場合により好ましい。例えば、6-モノまたはジ-ハロゲン化2,2'-ジピリジルを用い、この出発原料をアンモニアと反応させることにより、C6および/またはC6'にアミンを導入することができる。
【００５４】
ビピリジル-スルホン酸は、2,2'-ビピリジルから、発煙硫酸(濃硫酸中の三酸化硫黄の溶液)または硫酸水銀(III)/濃硫酸のいずれかと300℃で加熱することにより調製することができる。
【００５５】
非対称に置換されたピリジルは対称ビピリジルから得ることができ、例えば、6'-メチル-2,2'-ビピリジル-6-カルボン酸は6,6'-ジメチル-2,2'-ビピリジルから二酸化セレンでの酸化と、続く硝酸銀処理により調製することができる(Al-Saya et. al., European J. Org. Chem., 2004, 173-182)。
【００５６】
式(III)および(IV)の化合物は、市販のアミノ酸、例えばフェニルアラニンおよびトリプトファンから、アミノ酸のカルボン酸またはアミノ基との公知のカップリング反応を用いて調製することができる(Jones J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Chemistry Press, 1992)。当技術分野において公知であるとおり、適当な保護および脱保護段階が必要とされる場合もあり、Jones, 1992, 前記またはGreen T. W. and Wutz P., Protecting Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Son, 3rd Ed., 1999に示されている。
【００５７】
式(V)のチオ尿素は、適当なベンズアミドのブチルリチウムと、続いてチオホスゲンとの反応によって調製することができる。次いで、スキーム1に示すとおり、得られた生成物を適当なアミンまたはアミノ酸と反応させることができる。
2008528449.tif 000010
【００５８】
本明細書において、用語「外部寄生生物」は、宿主を外部から侵襲し、産卵により繁殖する、任意の寄生動物種を含むと考えられる。好ましい本発明の外部寄生生物には、鱗翅目(Lepidoptera)、同翅亜目(Homoptera)および異翅亜目(Heteroptera)を含む半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、チャタテムシ目(Psocoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、網翅目(Dictyoptera)、総翅目(Thysanoptera)、双翅目(Diptera)、シラミ目(Anaplura)または吸血シラミおよびマルツノハジラミ亜目(Amblycera)を含むシラミ目(Phthiraptera)、ハジラミ目(Malophaga)または咀嚼シラミ由来のホソツノハジラミ亜目(Ischnocera)、およびゾウハジラミ亜目(Rhynchophthirina)、ノミ目(Siphonaptera)、ならびに蛛形綱(Arachnida)からなる群より選択される目由来の種が含まれる。
【００５９】
本発明の方法を用いて防除し得る適した外部寄生生物には下記が含まれる：
(a)鱗翅類の目(鱗翅目)から、例えば、リンゴコカクモンハマキ(Adoxophyes orana)、タマナヤガ(Agrotis ypsilon)、カブラヤガ(Agrotis segetum)、アラバマ-アルギラセア(Alabama argillacea)、アンティカルシア-ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)、リンゴヒメシンクイ(Argyresthia conjugella)、ガンマキンウワバ(Autographa gamma)、カコエシア-ムリナナ(Cacoecia murinana)、カプア-レティクラナ(Capua reticulana)、トウヒシントメハマキ(Choristoneura fumiferana)、チロ-パルテルス(Chilo partellus)、コリストネウラ-オクシデンタリス(Choristoneura occidentalis)、キンウワバ種、アワヨトウ(Cirphis unipuncta)、コブノメイガ(Cnaphalocrocis medinalis)、ヨツボシノメイガ(Crocidolomia binotalis)、ケブカノメイガ、コドリンガ、マツケムシ(Dendrolimus pini)、ディアファニア-ニティダリス(Diaphania nitidalis)、ディアトレア-グランディオセラ(Diatraea grandiosella)、ミスジアオリンガ(Earias insulana)、モロコシマダラメイガ(Elasmopalpus lignosellus)、エピフィアス-ポストヴィタ(ウォーカー)、ナブドウホソハマキ(Eupoecilia ambiguella)、フェルティア-サブテラネア(Feltia subterranea)、グラフォリタ-フネブラナ(Grapholitha funebrana)、ナシヒメシンクイ(Grapholitha molesta)、オオタバコガ(Helicoverpa armigera)、ヘリコベルパ-パンクチゲラ(Helicoverpa punctigera)、オオタバコガ(Heliothis virescens)、ヘリオチス-ゼア(Heliothis zea)、ハイマダラノメイガ(Hellula undalis)のようなヘリオチス/ヘリコベルパ種、ヒベルニア-デフォリアリア(Hibernia defoliaria)、アメリカシロヒトリ(Hyphantria cunea)、リンゴスガ(Hyponomeuta malinellus)、ケイフェリア-リコペルシセラ(Keiferia lycopersicella)、ランブディナ-フィスセラリア(Lambdina fiscellaria)、シロイチモンジヨトウ(Laphygma exigua)、レウコプテラ-シテラ(Leucoptera scitella)、リンゴカバホソガ(Lithocolletis blancardella)、ホソバヒメハマキ(Lobesia botrana)、ロキソステゲ-スティクティカリス(Loxostege sticticalis)、マイマイガ(Lymantria dispar)、ノンネマイマイ(Lymantria monacha)、モモハモグリガ(Lyonetia clerkella)、タバコスズメガ(Manduca sexta)、オビカレハ(Malacosoma neustria)、ヨトウガ(Mamestra brassicae)、モシス-レパンダ(Mocis repanda)、マイチムナ-セパラタ、マイチムナ-ロレイミマ、マイチムナ-コンベクタ、マイチムナ-ユニパンクタのようなマイチムナ種、ナミスジフユナミシャク(Operophthera brumata)、オルギイア-シュードツガタ(Orgyia pseudotsugata)、ヨーロッパアワノメイガ(Ostrinia nubilalis)、トビハマキ(Pandemis heparana)、マツキリガ(Panolis flammea)、ワタアカミムシ(Pectinophora gossypiella)、パーセクタニア-ディスクリタおよびパーセクタニア-エウィンギのようなパーセクタニア種、ジャガイモキバガ、ミカンハモグリガ(Phyllocnistis citrella)、オオモンシロチョウ(Pieris brassicae)、モンシロチョウ、プラティペナ-スカブラ(Plathypena scabra)、プラティノタ-スツルタナ(Platynota stultana)、コナガ、プライス-シトリ(Prays citri)、プライス-オレア(Prays oleae)、プロデニア-スニア(Prodenia sunia)、プロデニア-オルニトガリ(Prodenia ornithogalli)、シュードプルシア-インクルデンス(Pseudoplusia includens)、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、リアシオニア-フルストラナ(Rhyacionia frustrana)、スクロビパルプラ-アブソルタ(Scrobipalpula absoluta)、イネヨトウ(Sesamia inferens)、テングハマキ(Sparganothis pilleriana)、スポドプテラ-フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、スポドプテラ-リトラリス(Spodoptera littoralis)、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)、シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)のようなスポドプテラ種、シレプタ-デロガタ(Syllepta derogata)、シナンテドン-ミオパエフォルミス(Synanthedon myopaeformis)、タウマトポエア-ピティオカンパ(Thaumatopoea pityocampa)、トルトリクス-ビリダナ(Tortrix viridana)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、トリポリザ-インセルツラス(Tryporyza incertulas)、ゼイラフェラ-カナデンシス(Zeiraphera canadensis)；特に、ヘリコベルパ-パンクチゲラを含むヘリオチス/ヘリコベルパ種、M. セパラタ、M. ロレイミマ、M. コンベクタ、およびM. ユニパンクタを含むマイチムナ種、P. ディスクリタおよびP. エウィンギを含むパーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、コドリンガ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、キンウワバ種、エピフィアス-ポストヴィタナ、ならびにコナガ；
(b)半翅類の目(半翅目)から、例えば、アフィス(Aphis)、ベミシア(Bemisia)、フォロドン(Phorodon)、アエネオラミア(Aeneolamia)、エンポアスカ(Empoasca)、パルキンシエラ(Parkinsiella)、ピリラ(Pyrilla)、アオニディエラ(Aonidiella)、コッカス(Coccus)、シュードコッカス(Pseudococcus)、ヘロペルティス(Helopeltis)、リグス(Lygus)、ディスデルクス(Dysdercus)、オキシカレヌス(Oxycarenus)、ネザラ(Nezara)、アレイロデス(Aleyrodes)、トリアトマ(Triatoma)、プシラ(Psylla)、ミズス(Myzus)、メゴウラ(Megoura)、フィロクセラ(Phylloxera)、アデルゲス(Adelges)、ニラパルバタ(Nilaparvata)、ネフォテティクス(Nephotettix)またはトコジラミ(Cimex)種；
(c)直翅類の目(直翅目)から、例えば、グリロタルパ-グリロタルパ(Gryllotalpa gryllotalpa)、トノサマバッタ(Locusta migratoria)、メラノプルス-ビビタトゥス(Melanoplus bivittatus)、メラノプルス-フェムルブルム(Melanoplus femur-rubrum)、メラノプルス-メキシカヌス(Melanoplus mexicanus)、メラノプルス-サンギニペス(Melanoplus sanguinipes)、メラノプルス-スプレトゥス(Melanoplus spretus)、アカトビバッタ(Nomadacris septemfasciata)、アメリカトビバッタ(Schistocerca americana)、シストセルカ-ペレグリナ(Schistocerca peregrina)、スタウロノトゥス-マロカヌス(Stauronotus maroccanus)、サバクトビバッタ(Schistocerca gregaria)；
(d)チャタテムシ類の目(チャタテムシ目)から、例えば、ペリプソクス種；
(e)膜翅類の目(膜翅目)から、例えば、カブラハバチ(Athalia rosae)、ハキリアリ(Atta cephalotes)、チャイロハキリアリ(Atta sexdens)、ハキリアリ(Atta texana)、ホプロカンパ-ミヌタ(Hoplocampa minuta)、ホプロカンパ-テスツディネア(Hoplocampa testudinea)、イリドミルメス-プルプレウス(Iridomyrmex purpureus)、イエヒメアリ(Monomorium pharaonis)、ソレノポテス-キャピラタス、アカカミアリ(Solenopsis geminata)、ヒアリ(Solenopsis invicta)、カミアリ(Solenopsis richteri)、アシジロヒラフシアリ(Technomyrmex albipes)；
(f)シロアリの目(等翅目)から、例えば、カロテルメス-フラビコリス(Calotermes flavicollis)、コプトテルメス(Coptotermes)種、ロイコテルメス-フラビペス(Leucotermes flavipes)、マクロテルメス-サブヒアリヌス(Macrotermes subhyalinus)、ナスティテルメス-ワルケリ(Nasutitermes walkeri)などのナスティテルメス(Nasutitermes)種、タイワンシロアリ(Odontotermes formosanus)、レティクリテルメス-ルシファガス(Reticulitermes lucifugus)、テルメス-ナタレンシス(Termes natalensis)；
(g)甲虫類の目(鞘翅目)から、例えば、ワタミハナゾウムシ(Anthonomus grandis)、ナシハナゾウムシ(Anthonomus pomorum)、アピオン-ボラクス(Apion vorax)、アトマリア-リネアリス(Atomaria linearis)、ブラストファガス-ピニペルダ(Blastophagus piniperda)、カメノコハムシ(Cassida nebulosa)、セロトマ-トリフルカタ(Cerotoma trifurcata)、セウトリンクス-アシミリス(Ceuthorhynchus assimilis)、セウトリンクス-ナピ(Ceuthorhynchus napi)、カエトクネマ-ティビアリス(Chaetocnema tibialis)、コノデルス-ベスペルティヌス(Conoderus vespertinus)、クリオセリス-アスパラギ(Crioceris asparagi)、デンドロクトヌス-レフィペニス(Dendroctonus refipennis)、ディアブロティカ-ロンギコルニス(Diabrotica longicornis)、ディアブロティカ-12-パンクタタ(Diabrotica 12-punctata)、ディアブロティカ-ビルギフェラ(Diabrotica virgifera)、インゲンテントウ(Epilachna varivestis)、エピトリクス-ヒルティペニス(Epitrix hirtipennis)、エウティノボトルス-ブラジリエンシス(Eutinobothrus brasiliensis)、マツアナアキゾウムシ(Hylobius abietis)、ヒペラ-ブルネイペニス(Hypera brunneipennis)、アルファルファタコゾウムシ(Hypera postica)、ヤツバキクイムシ(Ips typographus)、レマ-ビリネアタ(Lema bilineata)、レマ-メラノプス(Lema melanopus)、コロラドハムシ(Leptinotarsa decemlineata)、リモニウス-カリフォルニクス(Limonius californicus)、イネミズゾウムシ(Lissorhoptrus oryzophilus)、メラノトゥス-コミュニス(Melanotus communis)、メリゲテス-アエネウス(Meligethes aeneus)、メロロンタ-ヒポカスタニ(Melolontha hippocastani)、ヨーロッパコフキコガネ(Melolontha melolontha)、イネクビボソハムシ(Oulema oryzae)、オルティオリンクス-スルカトゥス(Ortiorrhynchus sulcatus)、オティオリンクス-オバトゥス(Otiorrhynchus ovatus)、ファエドン-コクレアリアエ(Phaedon cochleariae)、フィロペルタ-ホルティコラ(Phyllopertha horticola)、フィロファガ(Phyllophaga)種、フィロトレタ-クリソセファラ(Phyllotreta chrysocephala)、フィロトレタ-ネモルム(Phyllotreta nemorum)、キスジノミハムシ(Phyllotreta striolata)、マメコガネ(Popillia japonica)、プシリオデス-ナピ(Psylliodes napi)、スコリトゥス-イントリカトゥス(Scolytus intricatus)、アカアシチビコフキゾウムシ(Sitona lineatus)；
(h)網翅目から、例えば、ムカシゴキブリ(Polyphagidae)、ブラドベリダエ(Bladberidae)、ゴキブリ(Blattidae)、マダラゴキブリ(Epilampridae)、カエテクシダエ(Chaetecsidae)、メタリシダエ(Metallycidae)、マントイディダエ(Mantoididae)、アモルフォスセリダエ(Amorphoscelidae)、エレミアフィリダエ(Eremiaphilidae)、ヒメカマキリ(Hymenopodidae)、カマキリ(Mantidae)およびエンプシダエ(Empusidae)科から；
(i)アザミウマ類の目(総翅目)から、例えば、フランクリニエラ-フスカ(Frankliniella fusca)、ミカンキイロアザミウマ(Frankliniella occidentalis)、フランクリニエラ-トリティシ(Frankliniella tritici)、ハプロトリプス-トリティシ(Haplothrips tritici)、クロトンアザミウマ,(Heliothrips haemorrhoidalis)、シルトトリプス-シトリ(Scirtothrips citri)、トリプス-オリザエ(Thrips oryzae)、ミナミキイロアザミウマ(Thrips palmi)、ネギアザミウマ(Thrips tabaci)；
(j)半翅目の亜目である、同翅類(同翅亜目)から、例えば、アシルトシフォン-オノブリキス(Acyrthosiphon onobrychis)、エンドウヒゲナガアブラムシ(Acyrthosiphon pisum)、カラマツカサアブラムシ(Adelges laricis)、アカマルカイガラムシ(Aonidiella aurantii)、アフィデュラ-ナスツルティイ(Aphidula nasturtii)、マメクロアブラムシ(Aphis fabae)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、アフィス-ポミ(Aphis pomi)、ジャガイモヒゲナガアブラムシ(Aulacorthum solani)、タバココナジラミ(Bemisia tabaci)、ブラキカウドゥス-カルドゥイ(Brachycaudus cardui)、ダイコンアブラムシ(Brevicoryne brassicae)、ダルブルス-マイディス(Dalbulus maidis)、ドレイフシア-ノルドマニアナエ(Dreyfusia nordmannianae)、ドレイフシア-ピセアエ(Dreyfusia piceae)、ギシギシネアブラムシ(Dysaphis radicola)、ジャガイモヒメヨコバイ(Empoasca fabae)、リンゴワタムシ(Eriosoma lanigerum)、ヒメトビウンカ(Laodelphax striatella)、ムギヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum avenae)、チューリップヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum euphorbiae)、マクロシフォン-ロザエ(Macrosiphon rosae)、メゴウラ-ビシアエ(Megoura viciae)、ムギウスイロアブラムシ(Metopolophium dirhodum)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、ミズス-セラシ(Myzus cerasi)、ツマグロヨコバイ(Nephotettix cincticeps)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、クロフツノウンカ(Perkinsiella saccharicida)、ホップイボアブラムシ(Phorodon humuli)、プシラ-マリ(Psylla mali)、プシラ-ピリ(Psylla piri)、プシラ-ピリコラ(Psylla pyricola)、トウモロコシアブラムシ(Rhopalosiphum maidis)、ムギミドリアブラムシ(Schizaphis graminum)、シトビオン-アベナエ(Sitobion avenae)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)、トキソプテラ-シトリシダ(Toxoptera citricida)、トリアレウロデス-アブチロネア(Trialeurodes abutilonea)、オンシツコナジラミ(Trialeurodes vaporariorum)、ブドウネアブラムシ(Viteus vitifolii)；
(k)半翅目の亜目である、異翅類(異翅亜目)から、例えばリガス-リネオラリス(Lygus lineolaris)のようなメクラカメムシ科(Miridae)(メクラカメムシ)、ブリサス-ロウコプテラス(Blissus leucopterus)のようなナガカメムシ科(Lygaeidae)(シードバグ(seed bug))、カメムシ科(Pentatomidae)(カメムシ)、グンバイムシ科(Tingidae)(グンバイムシ)、ヘリカメムシ科(Coreidae)(ヘリカメムシ(squash bug)およびヘリカメムシ(Leaffooted bugs))、ホソヘリカメムシ科(Alydidae)(カメムシ(broadheaded bug))、ヒメヘリカメムシ科(Rhopalidae)(クサカメムシ)ならびにイトカメムシ科(Berytidae)(イトカメムシ)。
(l)双翅類の目(双翅目)から、例えば、メキシコミバエ(Anastrepha ludens)、チチュウカイミバエ(Ceratitis capitata)、ソルガムタマバエ(Contarinia sorghicola)、ウリミバエ(Dacus cucurbitae)、オリーブミバエ(Dacus oleae)、ダシネウラ-ブラシカエ(Dasineura brassicae)、デリア-コアルクタタ(Delia coarctata)、デリア-ラディクム(Delia radicum)、イネミギワバエ(Hydrellia griseola)、ヒレミア-プラツラ(Hylemyia platura)、トマトハモグリバエ(Liriomyza sativae)、ヒフバエ(Hypoderma)種、ノサシバエ、マメハモグリバエ(Liriomyza trifolii)、ルシリア(Lucilia)種、コクリオミイヤ種、オビキンバエ種、へシアンバエ(Mayetiola destructor)、ムスカ(Musca)種、イネノシントメタマバエ(Orseolia oryzae)、オシネラ-フリト(Oscinella frit)、アカザモグリハナバエ(Pegomya hyoscyami)、フォルビア-アンティクア(Phorbia antiqua)、フォルビア-ブラシカエ(Phorbia brassicae)、フォルビア-コアルクタタ(Phorbia coarctata)、ラゴレティス-セラシ(Rhagoletis cerasi)、ラゴレティス-ポモネラ(Rhagoletis pomonella)；
(m)シラミ目(シラミ)から、例えば、ケジラミ(Pthirus pubis)、アタマジラミ(Pediculus humanus capitus)、コロモジラミ(Pediculus humanus humanus)、ウシホソジラミ、ウシジラミ、ソレノポテス-キャピラタスを含むシラミ目(吸血シラミ)；ならびにヒツジハジラミまたはウシハジラミ、ケモノハジラミ属およびタンカクハジラミ属のようなボビコーラ属由来のマルツノハジラミ亜目、ホソツノハジラミ亜目、およびゾウハジラミ亜目(ハジラミ目またはハジラミ)；特に、ヒツジハジラミ、ウシハジラミ、ウシホソジラミ、ウシジラミ、およびソレノポテス-キャピラタス；
(n)ノミ類の目(ノミ目)から、例えば、クテボセファリデス(Ctenocephalides)またはプレックス(Pulex)種
(o)蛛形綱の目から、例えば、オーストラリア種マダニ(Ixodes holocyclus)、ブーフィルス-ミクロプルス(Boophilus microplus)、クリイロコイタマダニ(Rhipicephalus sanguineus)、サルコプテス-スカジエイ-バー-ヒュマニ、サルコプテス-スカジエイ-カニス、サルコプテス-スカジエイ-スイス、サルコプテス-スカジエイ-ボヴィスを含むサルコプテス種、ヒツジキュウセンヒゼンダニを含むキュウセンヒゼンダニ種、およびヒョウヒダニ種、特に、サルコプテス-スカジエイ-バー-ヒュマニ、サルコプテス-スカジエイ-カニス、サルコプテス-スカジエイ-スイス、サルコプテス-スカジエイ-ボヴィス、ヒツジキュウセンヒゼンダニ、およびヒョウヒダニ種。
【００６０】
植物に侵襲する特に好ましい外部寄生生物は、オオタバコガおよびヘリコベルパ-パンクチゲラを含むヘリオチス/ヘリコベルパ種、マイチムナ-セパラタ、マイチムナ-ロレイミマ、マイチムナ-コンベクタ、およびマイチムナ-ユニパンクタを含むマイチムナ種、パーセクタニア-ディスクリタおよびパーセクタニア-エウィンギを含むパーセクタニア種、シューダレチア-ユニパンクタ、シューダレチア-エヴァンシ、コドリンガ、ケブカノメイガ、モンシロチョウ、ジャガイモキバガ、キンウワバ種、コナガ、ならびにエピフィアス-ポストヴィタナを含む。
【００６１】
家畜に侵襲する特に好ましい外部寄生生物は、ヒツジハジラミ(ヒツジのシラミ)、ウシハジラミ、ウシジラミ(短鼻ウシシラミ)、ヒフバエ種、ノサシバエ、コクリオミイヤ種、オビキンバエ種、ウシホソジラミ(長鼻ウシシラミ)、ソレノポテス-キャピラタス(結節含有シラミ)、サルコプテス-スカジエイ-カニス(ダニ症)、サルコプテス-スカジエイ-スイス、サルコプテス-スカジエイ-ボヴィス、およびヒツジキュウセンヒゼンダニを含む。
【００６２】
ヒトに侵襲する特に好ましい外部寄生生物は、ケジラミ、アタマジラミ、コロモジラミ、サルコプテス-スカジエイ-バー-ヒュマニ、およびコナヒョウダニ種を含む。
【００６３】
一つの態様において、本発明によって孵化を妨げられる外部寄生生物卵は、シラミ、ノミ、マダニ、ハエ、ダニおよび他のかみつく、または吸血外部寄生生物の卵からなる群より選択される。一つの態様において、外部寄生生物卵はシラミ卵、より好ましくはアタマジラミ卵である。シラミは、動物の皮膚および血液を餌にする寄生生物で、その消化液および糞便を皮膚内に沈積させる。これらの材料、ならびに刺傷自体が皮膚の刺激や、その結果として引っ掻き傷の原因となり、神経節炎症を伴う重篤な感染を引き起こすこともある。シラミは、発疹または流行性発疹チフスおよび回帰熱などの特定の疾患の媒介生物でもある。雌のシラミ成虫は約1ヶ月の寿命を有し、1日に10個も産卵する。ヒトを感染させるシラミには、ケジラミ属(Pthirus pubis)および別のヒトジラミ属(Pediculus humanus)が含まれ、後者は二つの亜種、ヒトアタマジラミ(Pediculus humanus capitis)またはアタマジラミ(head lice)およびコロモジラミ(Pediculus humanus humanus)またはコロモジラミ(clothing lice)で構成される(Busvine, Antenna, 1993, 17: 196-201)。上記のシラミの亜種は密接に関連しており、実験室で交配が成功することが示されている(Busvine, Cutaneous Infestations and Insect Bites, 1985, 163-174)。
【００６４】
アタマジラミ(Pediculus humanus var. capitis)は、もっぱらヒトの頭に住み着き、頭皮から血を吸うことで栄養摂取する、宿主特異的外部寄生生物である。血液摂取後、成熟した雌のシラミ成虫は24時間で頭皮の近くに10個もの卵を産むことになる。卵は毛幹に接着物質によってしっかり付着する。温度および湿度に応じて産卵の7日から10日後、卵は孵化し、新しく出現した若虫が栄養摂取し始めることになる。若虫は、それぞれ完了するのに3日〜5日かかる三回の脱皮(第一齢、第二齢、第三齢)を通して前進する。最後の脱皮後、雄または雌の成虫が現れ、早くも2日後には交尾を行う。栄養摂取数時間以内に、産卵が行われ、サイクルが続く。卵から卵までの全生活周期が完了するのに、温度および湿度の条件に応じて、約20日〜30日かかる。卵孵化後、卵殻は毛幹に付着して残り、毛髪が伸びるにつれて徐々に頭皮から移動することになる。孵化した卵(nit)は人工照明下で白く見える屈折特性を有するため、比較的容易に検出されるが、これに対して未孵化の卵は薄い褐色で、ほとんどの毛髪色にとけ込むことができ、したがって検出がより困難になる。
【００６５】
もう一つの態様において、本発明により孵化が阻止される外部寄生生物卵は、植物宿主に侵襲するものである。好ましい態様において、外部寄生生物卵は鱗翅目の卵である。鱗翅目の幼虫は、コットン、アブラナのような油種子作物、観賞植物、花、果樹、穀物、つる作物、根菜類、牧草地作物、タバコ、豆類、および野菜などの有用な作物植物、特にカリフラワーおよびブロッコリーのようなアブラナ属作物、コットン、トウモロコシ、スイートコーン、トマト、タバコ、ならびにダイズ、白いんげん豆、ヤエナリ、キマメ、およびヒヨコマメのような豆類を餌とする。
【００６６】
コナガ(コナガ)の幼虫は、アブラナおよびマスタードを含むアブラナ科、ブロッコリー、カリフラワー、およびキャベツなどの野菜作物における全ての植物、ならびにまたいくつかの温室植物も餌とする。通常、コナガは、卵から成虫まで成長するのに約32日間を要する。しかしながら、食物および気象条件に応じて、発生は完了まで21〜51日間を要することもある。成虫雌蛾は、約16日の寿命にわたり平均160の卵を産む。卵は、小さく、球状または楕円形で、かつ黄白色であり、葉の上面または下面に、単独でまたは2もしくは3の群で接着される。卵は、通常、葉面が不規則である葉の葉脈に沿って産卵される。卵は約5〜6日で孵化する。孵化後、幼虫は、葉に隠れ、内部で葉組織を食べ始める。約一週間後、幼虫は葉から出、外部で餌をとる。幼虫は、10〜21日にわたって3回脱皮し、成熟期は体長約12 mmである。幼虫は、葉に付着する繊細で目の荒いメッシュの繭に蛹化し、蛹の段階は5〜15日まで持続する。
【００６７】
トウモロコシ害虫(corn ear worm)、トマト蛆、タバコ青虫(tobacco budworm)、およびコットンボールワーム(cotton Bollworm)のようなヘリオチス/ヘリコベルパ種は、ヒマワリ、ズッキーニ、マメ、コショウ、アルファルファ、ジャガイモ、ニラ、コットン、トウモロコシ、プラム、柑橘類植物、トマト、タバコ、およびレタスなどの多くの作物、ならびにゼラニウムおよびナデシコなどの花において重篤な害虫である。これらの鱗翅目の昆虫は世界の多くの地域で発生し、温帯の気候において、土壌中で蛹での越冬を伴い、2〜3世代/季節を有し得る。熱帯性の地域において、青虫は年中活動的であり続けることもある。卵は小さく(直径〜0.5 mm)、わずかに平坦な底面を有するドーム型である。卵は、通常単独で、芽もしくは開花部分の近く、または葉の上に産卵される。成虫は、500〜3000個の卵を産み得る。卵は、25℃でわずか3日後に孵化し、またはより低い温度ではより長くかかり、例えば17℃では9日で孵化する。幼虫の摂食期間は、好ましい温度および摂食条件下で約19〜26日であり、十分に成長すると、幼虫は土壌に移動し蛹になる。蛹の期間は一般に8〜21日間持続するが、温帯の地域において休眠する蛹は土壌中で越冬することができる。
【００６８】
淡褐色リンゴガ(エピフィアス-ポストヴィタナ(ウォーカー))の幼虫は、リンゴ、西洋ナシ、ブドウ、柑橘類品種、黒および赤スグリ、キーウィ、ホップ、赤および白クローバー、ムラサキウマゴヤシ、ルピナス、オオバコ、トゥトゥ、ハリエニシダ、キク、ミカエルマスデイジー、および他の顕花植物、低木の葉ならびに果実、特に成長の若い段階のアラビアゴムおよび針葉樹に損傷を引き起こす。蛾は、温帯の気候において毎年2〜4世代を有し得る。卵は、葉または果実上に3〜150個の卵の集団で産卵され、孵化し幼虫を提供する。 
【００６９】
広分布ヨトウムシであるマイチムナ-セパラタは、東部オーストラリアで見られ、牧草、穀類、およびトウモロコシを含むイネ科草本の害虫である。卵は毎年1月から4月にかけて産卵される。卵は、薄いクリーム色であり、イネ科草本の下葉に、通常葉身または葉鞘の間に、集団で産卵される。幼虫発生は、気象条件に応じて、幼虫が5齢を過ぎるのに約1ヵ月かかる。蛹は典型的に1月〜3月の期間、および成虫は1月〜4月に見られる。春に、越冬した幼虫から、結果として蛾が存在する。典型的に、年間3世代である。
【００７０】
コドリンガ(Cydia pomonella)は、リンゴおよび西洋ナシなどの種果実を含む梨状果実の主要な害虫である。頻繁ではないが一貫して攻撃される他の植物は、クルミおよびプラムである。他の公知の宿主には、モモ、ネクタリン、およびアプリコットが含まれる。典型的に、卵は12月/1月の期間に産卵される。休眠する第5齢幼虫は、宿主樹木の木の樹皮下および穴の中で、繭で越冬する。これらの幼虫は、1月を通り春に蛹に変化する。成虫は11月、12月、および1月に現れる。卵は、直径約1 mmで、通常単独で、果実の近くの葉または果実自体に産卵される。1世代/年［一化性］である場合、海外で一化性個体群において多くの場合見られる短い産卵期間とは対照的に、産卵期間が夏季全体にわたって延長する。
【００７１】
本発明の一つの態様において、本発明の方法および組成物は、シラミ卵の孵化を阻害することにより、シラミの対象を治療するためのものである。本出願人らは、外部寄生生物シラミの卵孵化を阻害するための有効な薬剤として、金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤を同定した。外部寄生生物シラミの卵孵化を阻害するための、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤の使用は、外部寄生生物の繁殖周期を妨げ、それにより外部寄生生物侵襲を防除するという利点を有する。
【００７２】
本発明のもう一つの態様において、本発明の方法および組成物は、外部寄生生物卵の孵化を阻害することにより、幼虫の植物侵襲を阻止するためのものである。本出願人らは、商業的に有用な植物を餌とする幼虫をもたらす外部寄生生物卵の孵化を阻害するための有効な薬剤として、金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤を同定した。外部寄生生物卵の孵化を阻害するための、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤の使用は、商業的に有用な植物を餌とする幼虫を産み出す外部寄生生物の繁殖周期を妨げ、それにより商業的に有用な植物の外部寄生生物侵襲を防除するという利点を有する。
【００７３】
本明細書において用いられる「メタロプロテアーゼ」なる用語は、外部寄生生物卵孵化または発生に関与するプロテアーゼであって、触媒としてはたらく活性金属イオンを有するプロテアーゼを意味すると理解される。好ましくは、メタロプロテアーゼは基質のペプチド結合を攻撃するために水分子を分極することにより触媒作用に関わる亜鉛イオンまたは別の2価イオンを含む。より好ましくは、メタロプロテアーゼはそれらの活性を遮断または阻害することができる金属キレート剤に感受性である。メタロプロテアーゼは、卵の内部で作用することにより卵孵化を誘導しうる。例えば、シラミの場合、メタロプロテアーゼは卵の小蓋またはハッチフラップ(hatch-flap)に作用して卵孵化を促進する。外部寄生生物卵孵化に関与する適当なメタロプロテアーゼには、エンドプロテアーゼ(ペプチド鎖内で切断する酵素)およびエキソプロテアーゼ(ペプチド末端からアミノ酸を切断する酵素)が含まれうる。エキソプロテアーゼはさらにカルボキシプロテアーゼ(アミノ酸をC末端から切断する)またはアミノペプチダーゼ(アミノ酸をN末端から切断する)に分類することができる。メタロ-カルボキシプロテアーゼは活性のために二価のカチオン(通常はZn2+)を必要とするが、アミノペプチダーゼは一般に金属イオン(Zn2+またはMg2+)への依存性にしたがって分類される。これらは遊離および膜結合型の両方で存在し、高いpH(8〜10)で活性に有利である。卵孵化に関連するメタロプロテアーゼを検出する一つの方法は、発生中の胚周囲の液体を卵孵化時に採取するか、または卵孵化直後に空の卵殻を洗浄し、試料をゼラチン基質SDS-PAGE分析を用いてプロテアーゼの有無について分析する段階を含みうる。試料からタンパク質分解活性が示されれば、試料をメタロプロテアーゼ阻害剤、例えば1,10-フェナントロリン存在下でインキュベートし、処理試料を再度分析して、卵から抽出されたプロテアーゼ活性が阻害されたかどうかを調べることができる。孵化卵から得たメタロプロテアーゼ活性の阻害が示されれば、未孵化卵を同じ阻害剤に曝露し、卵孵化の阻害が起こるかどうかを評価することができる。卵孵化に関与するメタロプロテアーゼは、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を同定し、その遺伝子をサイレンシングし、当業者には公知の方法により卵が孵化できないことを示すことによって同定することもできる。
【００７４】
本明細書において用いられる「外部寄生生物卵の孵化を阻害する」なる句は、外部寄生生物卵の孵化が妨害されることを意味すると理解される。本発明において、外部寄生生物卵を、未処理の外部寄生生物卵に比べて卵孵化を妨害することができる金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤に曝露する。卵孵化は卵のハッチフラップまたは小蓋の開放およびその直後の幼虫または若虫の出現によって特徴付けられうる。シラミの場合、頭がまず現れ、続いて脚がついた胸部が現れる。最後に、腹部が現れ、若虫は卵から自由に移動する。ガまたはチョウの卵の場合、卵が孵化し、幼虫が現れる。卵孵化は卵殻の損傷または偶発的破損を除外すると理解される。
【００７５】
好ましくは、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、産卵から孵化の間のいかなる時点でも、卵に適用すると卵孵化を阻害することができる化合物である。
【００７６】
外部寄生生物卵は、好ましくは、動物の皮膚、毛髪、外皮もしくは毛被、またはヒトの皮膚もしくは頭髪などの毛髪などの宿主生物上に存在するが、それらに限定されるわけではない。本発明のもう一つの態様において、外部寄生生物卵は、禾穀類、果樹、綿、脂肪種子作物、装飾植物、花、つる作物、根作物、牧草および野菜を含む宿主植物、または家屋および建築物、家畜および農業用動物の囲い、カーペット、シーツおよび毛布などの寝具、カーテンならびに家具などであるが、それらに限定されるわけではない、他の繁殖部位に存在することもある。
【００７７】
本発明によれば、外部寄生生物卵をいかなる適当な手段によって金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤に曝露してもよい。当業者であれば、これらの手段は、阻害剤が植物もしくはヒトを含む動物または様々な他の繁殖部位などの宿主に適用されるかどうかに応じて、ならびに標的とされる外部寄生生物の性質およびタイプに応じて大きく変動しうることを理解すると思われる。動物上の外部寄生生物卵を金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤に曝露する適当な手段には、浸漬または噴霧などの直接局所適用、埋込、遅延放出製剤または装置が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明をヒトに適用する場合、局所適用に適した製剤には、噴霧剤、エアロゾル、シャンプー、ムース、クリームおよびローションが含まれるが、それらに限定されるわけではなく、内部適用に適した製剤には、錠剤、カプセル剤または液体製剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの状況においては、注射による非経口投与がヒトおよび動物を治療するための最も適当な手段である場合もある。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤を植物に適用する場合、適当な手段には、噴霧剤、粉剤、ペレット、液体またはエアロゾルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明の方法は、複数の金属キレート剤もしくはメタロプロテアーゼ阻害剤の同時もしくは逐次使用、または一つもしくは複数の金属キレート剤および/もしくはメタロプロテアーゼ阻害剤を、外部寄生生物を防除する他の公知の薬剤と同時もしくは逐次組み合わせての使用も含む。
【００７８】
本発明のさらにもう一つの局面において、方法および組成物は、孵化、幼虫、若虫および/または成体外部寄生生物を防除する他の外部寄生生物撲滅薬を含んでもよい。例えば、本発明の金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤と同時に、別々に、または逐次的にのいずれかで組み合わせて用いてもよい、適した外部寄生生物撲滅薬は、スピノサドのような大環状ラクトン、植物性殺虫剤、カルバメイト系殺虫剤、乾燥殺虫剤、ジニトロフェノール殺虫剤、フッ素殺虫剤、アルミトラズ(armitraz)のようなホルムアミジン殺虫剤、燻蒸剤殺虫剤、無機殺虫剤、昆虫成長調節物質(キチン合成阻害物質、幼若ホルモン擬態、幼若ホルモン、脱皮ホルモンアゴニスト、脱皮ホルモン拮抗剤、脱皮ホルモン、脱皮阻害剤を含む)、ニコチノイド殺虫剤、有機塩素殺虫剤、有機リン殺虫剤、複素環有機チオリン酸殺虫薬、有機チオリン酸フェニル殺虫剤、ホスホナート殺虫剤、ホスホノチオアート殺虫剤、ホスホラミダート殺虫剤、ホスホラミドチアート殺虫剤、ホスホロジアミド殺虫剤、オキサジアジン殺虫剤、フタルイミド殺虫剤、ピラゾール殺虫剤、ピレスロイド殺虫剤、ピリミジンアミン殺虫剤、ピロール殺虫剤、テトロン酸殺虫剤、チオ尿素殺虫剤、および尿素殺虫剤を含み、EP 0191236、US 5,288,483、およびUS 6,727,228に記載の薬剤を含む。他の有用な殺虫剤には、US 6,663,876およびUS 6,607,716に記載のものなどの毒性が低いジメチコンポリオールが含まれる。そのような組み合わせの利点は、外部寄生生物の生活周期全体を防除するのに、一回の適用しか必要とされないことである。
【００７９】
金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、宿主がヒトまたは動物である場合に、宿主の毛髪または皮膚、好ましくは外部寄生生物に侵襲されている領域に適用することができる。外部寄生生物侵襲は、好ましくは、シラミ、ノミ、マダニ、ハエ、ダニおよび他のかみつく、または吸血外部寄生生物、ならびにその組み合わせからなる群より選択される外部寄生生物によるものであり、特にシラミによる外部寄生生物侵襲でありうる。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、軟膏、液剤および懸濁剤を含む水性組成物、クリーム、ローション、エアロゾル噴霧剤または散布剤の形で局所適用することができる。宿主が植物である場合、外部寄生生物侵襲は好ましくはチョウまたはガなどの鱗翅類から選択される外部寄生生物によるものである。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、例えば噴霧剤または粉剤の形で局所適用することができる。
【００８０】
「有効量」なる用語は、宿主における外部寄生生物侵襲の治療または予防を提供するのに十分な、少なくとも一つの金属キレート剤または少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤の濃度を意味する。本発明の方法において用いる金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤の有効量は、宿主ならびに外部寄生生物のタイプおよびレベルに応じて変動しうる。一つの態様において、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤を、アタマジラミ侵襲を患っているヒトの頭皮に適用し、シラミ卵の孵化を防止するための期間、治療したヒトの頭皮上に残留させる。好ましくは、期間は5分から15分の間である。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、約0.0001mMから1Mの間、好ましくは0.01mMから100mMの間、より好ましくは0.1mMから30mMの範囲の濃度で用いる。有効量は用いる金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤に依存する。しかし、いくつかのジピリジル化合物は5mMから15mMの範囲、特に約10mMのレベルで適当に適用することができる。多数の哺乳動物プロテアーゼはその活性のために亜鉛を必要とし、金属キレート剤および/またはメタロプロテアーゼ阻害剤によって影響を受けるため、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤を安全かつ有効な量で確実に用いることが必要であると考えられ、好ましくは外部寄生生物卵を特異的に標的とする。
【００８１】
もう一つの態様において、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、商業的に有用な植物に適用され、外部寄生生物卵の孵化を阻止する。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、植物の葉、芽、茎、花、または果実に存在する卵に、直接スプレー適用、ブラッシング、または散粉によって適用してもよい。適した組成物は、乳剤、直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液、マイクロカプセル封入、希釈乳剤、水和剤、可溶性粉末、懸濁液濃縮物、粉末、または顆粒剤を含む。金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、約0.0001mMと1Mの間、好ましくは0.01mMと100mMの間、より好ましくは0.1mM〜30mMの範囲の濃度で用いる。有効量は用いる金属キレート剤またはメタロプロテアーゼに依存する。しかし、いくつかのジピリジル化合物は0.01mM〜15mMの範囲、特に約0.1mM〜15mMのレベルで、さらに特に1mM〜15mM、およびさらに特に約10mMで適切に適用することができる。
【００８２】
本発明の方法によって治療する宿主は、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、家禽、イヌおよびネコからなる群であるが、それらに限定されるわけではない群より選択されてもよい。本発明の治療または予防法は、植物および/または他の外部寄生生物繁殖部位に適用可能である。本発明の方法よって処理される植物は、好ましくは以下からなる群より選択される：コットン、アブラナのような脂肪種子作物、低木のような観賞植物、キク、ミカエルマスデイジー、ゼラニウム、およびナデシコのような花、リンゴ、西洋ナシ、プラム、キーウィ、スグリ、および例えばレモン、オレンジ、ライム、およびグレープフルーツなどの柑橘類品種のような果樹、トウモロコシおよびスイートコーンのような穀類作物、ブドウのようなつる作物、根菜類、赤および白クローバー、ムラサキウマゴヤシ、およびルピナスのような牧草、アブラナ属作物、例えばブロッコリーおよびカリフラワー、キャベツ、トマト、ズッキーニ、リーキ、レタスのような野菜、およびマメ、同様に白いんげん豆、ダイズ、ヤエナリ、キマメ、およびヒヨコマメのような豆類。
【００８３】
本発明に従う有効成分は、植物上、主に農業、園芸、および造林における有用植物ならびに観賞植物の作物上、または果実、花、葉、茎、塊茎、および根など、そのような植物の一部上の外部寄生生物卵の孵化を阻害するために用いることができ、いくつかの場合、より後期の時点で形成される植物の部分でさえ、これらの害虫から保護することができる。これらの組成物において、有効成分は、増量剤、例えば溶剤もしくは固体担体のような、または表面活性化合物(界面活性剤)のような、製剤の分野で従来用いられている補助剤の少なくとも一つと共に用いられる。
【００８４】
適した溶剤の例は以下である：非水素化または部分的水素化芳香族炭化水素、好ましくはキシレン混合物、アルキル化ナフタレン、またはテトラヒドロナフタレンなどのアルキルベンゼンのC8-C12断片、パラフィンもしくはシクロヘキサンなどの脂肪族または脂環式炭化水素、メタノール、エタノール、プロパノール、またはブタノールなどのアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコールエーテル、ヘキシレングリコール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、またはエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールならびにそれらのエーテルおよびエステル、シクロヘキサノン、イソホロン、またはジアセトンアルコールなどのケトン、N-メチルピロリド-2-オン、N-メチル-ピロリジン、ジメチルスルホキシド、もしくはN,N-ジメチルホルムアミドなどの強い極性溶媒、水、遊離もしくはエポキシ化ナタネ、トウゴマ、ココナッツ、またはダイズ油、およびシリコーン油。
【００８５】
例えば粉剤および分散粉末に用いる固体担体は、概して方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイト、またはアタパルジャイトなどの土壌天然鉱物である。物理的性質を改良するため、高度に分散したシリカまたは高度に分散した吸収性ポリマーを添加することが可能である。粒剤に適した粒状吸収性担体は、軽石、レンガ粗粒、海泡石、またはベントナイトのような多孔性型であり、適した非収着担体材料は方解石または砂である。さらに、無機または有機性質の多くの顆粒化材料、特にドロマイトまたは粉砕植物残渣を用いることができる。
【００８６】
適した表面活性化合物は、製剤化される有効成分の性質に応じて、良好な乳化、分散、もしくは湿潤特性を有する非イオン性、カチオン性および/もしくはアニオン性界面活性剤または界面活性剤混合物である。下記に列挙する界面活性剤は、例として考慮されるのみであり、製剤の分野で従来用いられ、かつ本発明に従う適したより多くの界面活性剤が、関連文献に記載される。
【００８７】
適した非イオン性界面活性剤は主に、脂肪族または脂環式アルコールの、飽和または不飽和脂肪酸のポリグリコールエーテル誘導体、ならびに3〜30のグリコールエーテル基、および(脂肪族)炭化水素ラジカル中に8〜20の炭素原子、およびアルキルフェノールのアルキルラジカル中に6〜18の炭素原子を含むことができるアルキルフェノールである。同様に適するのは、アルキル鎖内に1〜10炭素、および20〜250エチレングリコールエーテル、および10〜100プロピレングリコールエーテル基を有するポリエチレングリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコール、ならびにアルキルポリプロピレングリコールを伴う水溶性ポリエチレンオキシド付加物である。上記の化合物は通常、1〜5エチレングリコール単位/プロピレングリコール単位を含む。言及され得る例は、ノニルフェニルポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン/ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール、およびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。同様に適するのは、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアートのようなポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルである。
【００８８】
カチオン性界面活性剤は主に、置換基として、8〜22の炭素原子の少なくとも一つのアルキルラジカル、およびさらなる置換基として、低級アルキル、ベンジル、またはハロゲン化されてもよい低級ヒドロキシアルキルラジカルを有する第四級アンモニウム塩である。塩は、好ましくはハライド、メチルスルフェート、またはエチルスルフェートの形態である。例は、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、およびベンジルジ(2-クロロエチル)エチルアンモニウムブロミドである。
【００８９】
適したアニオン性界面活性剤は、水溶性の石鹸および水溶性の合成表面活性化合物のどちらでもあり得る。適した石鹸は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびオレイン酸もしくはステアリン酸のナトリウムまたはカリウム塩のような高級脂肪酸(C10-C22)の、または例えば、ココナッツもしくはトール油から得ることができる天然脂肪酸混合物の、非置換または置換アンモニウム塩；または脂肪酸メチルタウリネイト。しかしながら、合成界面活性剤、特に脂肪性スルホナート、脂肪性スルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体、またはアルキルアリールスルホナートが、より頻繁に用いられる。概して、脂肪性スルホナートおよび脂肪性スルフェートは、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、または非置換もしくは置換アンモニウム塩として存在し、一般に8〜22の炭素原子のアルキルラジカルを有し、アルキルは同様にアシルラジカルのアルキル部分を含む。脂肪性スルホナートおよび脂肪性スルフェートの例は、リグニンスルホン酸の、ドデシル硫酸エステルの、もしくは天然脂肪酸を用いて調製される高級アルコール硫酸エステル塩混合物のナトリウムまたはカルシウム塩を含む。この群は、同様に脂肪族アルコール/エチレンオキシド付加体の硫酸エステルおよびスルホン酸の塩を含む。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は好ましくは、2つのスルホ基および約8〜22の炭素原子を有する1つの脂肪酸ラジカルを含む。アルキルアリールスルホナートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸の、ジブチルナフタレンスルホン酸の、もしくはナフタレンスルホン酸/ホルムアルデヒド縮合物の、ナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアンモニウム塩である。同様に適するのは、p-ノニルフェノール(4-14)エチレンオキシド付加物のリン酸エステルの塩のような対応するリン酸塩、またはリン脂質である。
【００９０】
本発明の組成物は、液剤および乳剤として製剤化することができる。乳化剤、界面活性剤、安定化剤、色素、浸透促進剤および抗酸化剤などの適当な賦形剤も、組成物中に含むことができる。組成物に加えることができる適当な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、ステアリン酸マグネシウムおよびケイ酸が含まれうる。組成物は、滅菌および非滅菌水溶液を含んでいてもよい。一つの態様において、組成物は、可溶性の形であり、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤は、可溶性滅菌緩衝化食塩水または水溶液中で希釈される。組成物は水性、非水性または混合媒質中の懸濁液として製剤することもできる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含んでいてもよく、安定化剤を含んでいてもよい。溶液は緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤を含んでいてもよい。組成物は、金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤の活性と適合性の他の補助成分を含むこともできる。本発明の組成物は、フォーム、乳剤、マイクロエマルジョン、シャンプー、ムース、クリームおよびゼリーとして製剤し、用いることができる。前述の組成物の製剤は、外部寄生生物の分野の当業者には公知であると思われる。
【００９１】
好ましい態様において、組成物は金属キレート剤を約0.0001mMから1M、好ましくは0.1mMから100mMの間、より好ましくは0.1mMから30mMの範囲の濃度で含む。いくつかの金属キレート剤またはメタロプロテアーゼ阻害剤、例えば、ジピリジル化合物を含む組成物は、好ましくは0.01mMから15mMの間、特に約0.1mMから15mM、さらに特に1mMから15mM、さらに特に約10mMのレベルで化合物を含んでいてもよい。
【００９２】
外部寄生生物卵の孵化を阻害する化合物は、化合物が外部寄生生物卵中に存在するメタロプロテアーゼを阻害する能力を評価する段階を含む方法を用いて同定できる。
【００９３】
化合物のメタロプロテアーゼの活性に対する効果は、いくつかの様式で評価することができるが、一般には、評価は、好ましくは試験化合物の存在下および非存在下でのメタロプロテアーゼ酵素活性の比較を含む。卵孵化に関連するメタロプロテアーゼを検出する一つの方法は、発生中の胚周囲の液体を卵孵化時に採取するか、または卵孵化直後に空の卵殻を洗浄し、試料をゼラチン基質SDS-PAGE分析を用いてプロテアーゼの有無について分析する段階を含みうる。試料からタンパク質分解活性が示されれば、試料をメタロプロテアーゼ阻害剤、例えば1,10-フェナントロリン存在下でインキュベートし、処理試料を再度分析して、卵から抽出されたプロテアーゼ活性が阻害されたかどうかを調べることができる。孵化卵から得たメタロプロテアーゼ活性の阻害が示されれば、未孵化卵を同じ阻害剤に曝露し、卵孵化の阻害が起こるかどうかを評価することができる。卵孵化に関与するメタロプロテアーゼは、メタロプロテアーゼをコードする遺伝子を同定し、その遺伝子をサイレンシングし、当業者には公知の方法により卵が孵化できないことを示すことによって同定することもできる。方法は化合物を生物学的外部寄生生物卵孵化アッセイ法において試験する段階をさらに含みうる。
【００９４】
適当な生物学的外部寄生生物卵孵化アッセイ法は、好ましくは外部寄生生物卵の対照試料を対照緩衝液に曝露し、同時に外部寄生生物卵の試験試料を試験化合物を含む溶液に曝露する段階を含む。
【００９５】
外部寄生生物卵孵化を阻害する際に有効な化合物は、対照試料で卵孵化が観察され、試験試料ではそれよりも低いレベルの孵化が観察される場合に同定される。本発明の生物学的卵孵化アッセイ法において、外部寄生生物卵はシラミ、ノミ、マダニ、ハエ、ダニおよび他のかみつく、もしくは吸血外部寄生生物の卵、またはガおよびチョウなどの植物を侵襲する外部寄生生物の卵からなる群より選択される。一つの態様において、外部寄生生物卵の試料はシラミ卵であり、用いる卵試料(対照および試験試料)は産卵後4日〜5日以下である。好ましくは、用いる卵試料は産卵後1日以下である。
【００９６】
対照緩衝液には、滅菌リン酸緩衝化食塩水または水が含まれるが、それらに限定されるわけではない。試験する化合物は、好ましくは金属キレート剤および/またはメタロプロテアーゼ阻害剤である。生物学的卵孵化アッセイ法において、卵孵化は卵から幼虫または若虫が現れる際に観察される。シラミの場合、卵のハッチフラップまたは小蓋が開き、その直後に幼虫または若虫が現れ始める。シラミの場合、頭がまず現れ、続いて脚がついた胸部が現れる。最後に、腹部が現れ、幼虫は卵から自由に移動する。アタマジラミの場合、卵殻が毛幹に接合されたまま残る。
【００９７】
本発明のもう一つの局面において、外部寄生生物卵の孵化を阻害するため、または外部寄生生物侵襲を治療もしくは予防するための組成物製造における、金属キレート剤が金属イオンに同時に配位することができる少なくとも二つのヘテロ原子を含む化合物で、二つのヘテロ原子の少なくとも一つは窒素、硫黄、酸素およびリンから選択されており、この化合物は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換された少なくとも一つの炭素環を含むか、またはこの化合物は少なくとも一つのヘテロ原子を含む少なくとも一つの複素環を含み、この複素環は少なくとも一つのヘテロ原子および/もしくは少なくとも一つのヘテロ原子を含む置換基で置換されていてもよい少なくとも一つの金属キレート剤の使用が提供される。一つの態様において、外部寄生生物卵は植物宿主を侵襲するものである。もう一つの態様において、外部寄生生物卵は家畜を侵襲するものである。さらにもう一つの態様において、外部寄生生物卵はヒトを侵襲するものである。
【００９８】
本発明によって同様に含まれるものは、外部寄生生物卵の孵化を阻害するため、または外部寄生生物侵襲を治療もしくは予防するための、本明細書に記載の少なくとも一つの金属キレート剤および/または少なくとも一つのメタロプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤である。
【００９９】
本明細書の全体を通して、「含む(comprise)」なる用語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、述べられた要素、整数もしくは段階、または要素群、整数群もしくは段階群の包含を意味するが、いかなる他の要素、整数もしくは段階、または要素群、整数群もしくは段階群の除外も意味しないことが理解されると思われる。
【０１００】
本発明を下記の非限定的な図および実施例によって以下に説明する。
【０１０１】
実施例
実施例1：シラミ卵孵化のメカニズムの評価：
シラミ卵孵化のメカニズムを解剖顕微鏡下で評価した。雌コロモジラミをウサギ上で半時間栄養補給した後、ヒト毛髪を含むペトリ皿に移した。次いで、ペトリ皿を32℃；相対湿度42％のインキュベーターに入れた。栄養補給5時間以内に、雌シラミは産卵し始める。各シラミは一度に10個までの卵を産む。卵はその後7日〜9日かけて発生する。孵化前の最後の12時間以内に、下記の変化が観察された。発生中の胚の眼を卵内ではっきり検出することができ、発生中の胚はその頭がハッチフラップまたは小蓋に近くなるように向いていた。胚が卵内で動いているのを観察することができる。孵化は、小蓋が開き、その直後に胚が現れ始める時に起こる。頭がまず現れ、続いて脚がついた胸部が現れる。最後に、腹部が現れ、幼虫は卵から自由に移動するが、卵は毛髪に接合されたままである。光学顕微鏡下では、孵化を促進すると思われる、新しく現れた幼虫の頭に関連する明白な構造は見られない(すなわち、卵歯はない)。この所見は、卵内の幼虫の物理的な動きはおそらく卵孵化に寄与しているが、他の特定の生化学的事象が関与していることを示唆するものである。
【０１０２】
実施例2：シラミ卵抽出物中のプロテアーゼ活性の検出：
孵化の12時間以内に、50個のヒトジラミ(Pediculus humanus humanus)卵を毛髪から取り出し、1mlエッペンドルフチューブに入れた。蒸留水20μLを未孵化卵に加え、32℃で30分間インキュベートした。20μLを回収し、凍結乾燥して-70℃で保存した。いくつかの他の試料も前述のとおりに回収した。未孵化卵を取り出した毛髪試料も回収し、前述のとおりにインキュベートした。加えて、未孵化卵の試料およびシラミ卵を取り出した毛髪試料を、産卵の7日後(卵孵化の24時間以内)に回収した。両方の試料を1％次亜塩素酸ナトリウム溶液10ml中で1分間洗浄した後、蒸留水25ml中で5×1分間洗浄して、次亜塩素酸塩を除去した。次いで、これらの試料を前述のとおり蒸留水20μL中でインキュベートした。加えて、孵化の24時間以内のシラミ卵25個の群を、1％次亜塩素酸ナトリウムで前処理し、前述のとおり洗浄して孵化させた。孵化後1時間〜2時間以内に、空の卵殻を前述のとおり蒸留水20μL中でインキュベートし、孵化した卵殻からの洗液を回収し、-70℃で保存した。次いで、抽出試料をすべて終夜凍結乾燥した。凍結乾燥試料を非還元SDS試料緩衝液15μLに再度懸濁し、10,000gで2分間遠心分離し、15μLをすべて10％ゼラチン基質SDS-PAGEゲルに吸着させた。ゲルを4℃で、一枚あたり10mAで10分間と、続いて15mAでさらに25分間泳動した。次いで、これらを2.5％Triton-X 100溶液中2×20分間と、続いて1mM CaCl2を含む0.1M Tris/HCl(pH8.0)中3時間インキュベートした。活性を、ゲル上の澄明領域(ゲル内のゼラチンを分解するプロテアーゼ活性の結果)として検出した。
【０１０３】
これらの試験の結果より、基質SDS-PAGEを用いて分析したいくつかの異なる標本でタンパク質分解活性があることが示された。プロテアーゼ活性が孵化12時間以内の未孵化シラミ卵から得た洗液中で検出された(図1、レーン1)。この活性はゲルの高分子量領域にあった。シラミ卵を取り除いた毛髪試料をゼラチン基質SDS-PAGEで分析した場合、著しい量のプロテアーゼ活性が検出された(図1、レーン2)。この活性について最も可能性の高い説明は、産卵時に生じた母体起源のものであるということであった。毛髪試料の次亜塩素酸ナトリウム処理により、混入プロテアーゼは完全に除去された(図1、レーン3)。加えて、未孵化卵の処理によっても、このプロテアーゼ活性を除去することができた(図1、レーン4)。したがって、これらの母体プロテアーゼを除去するために、すべての卵を孵化前に1％次亜塩素酸Naで前述のとおりに処理することに決定した。新しく孵化した卵殻からの洗液(卵殻洗液)の分析により、二つの高分子量種の存在が示された(図1、レーン5)。この抽出ではシラミ卵を25個しか用いておらず、これが低いレベルのプロテアーゼ活性に寄与している可能性が最も高いことに留意されたい。これらの結果は、新しく孵化したシラミ卵に直接関連するプロテアーゼ活性の存在を示している。
【０１０４】
結論として、シラミの孵化プロセスを光学顕微鏡により調べた。卵孵化は卵内の幼虫の物理的活動性に関連しているようである。しかし、ハッチフラップまたは小蓋に穴を開ける、または弛緩させるためのいかなる特殊構造もないことは、孵化プロセスが生化学的成分も含む可能性があることを示している。シラミにおいて卵孵化の前後に活性の高いプロテアーゼが検出されたが、これらのプロテアーゼは主に母体起源であると考えられる。卵孵化前のこの活性は次亜塩素酸ナトリウムを用いて除去することができる一方で、シラミはうまく孵化することができた。続いて、新しく孵化したシラミからのESWの分析により、限られた数のプロテアーゼ種の存在が示され、これらをシラミの卵孵化を阻害するための標的としてさらに調査した。
【０１０５】
実施例3：卵殻洗液中のプロテアーゼの特徴分析：
卵孵化を阻害するための標的としての卵殻洗液中のシラミ孵化プロテアーゼの可能性を評価するために、まず孵化プロテアーゼの性質を特徴付けることが必要であった。プロテアーゼの4つの主なクラスの阻害剤を用いて、ESW中のプロテアーゼを分類した。
【０１０６】
10％SDS-PAGEゼラチン基質ゲルに、シラミ卵100個からの凍結乾燥した卵殻洗液を非還元試料緩衝液50μlに再懸濁したものを、1レーンにつき試料10μlで吸着させて泳動した。ゲルを4℃で、一枚あたり10mAで10分間と、続いて一枚あたり15mAでさらに25分間泳動した。次いで、ゲルを細片に切断し、各細片を特定の阻害剤を含む2.5％Triton-X 100溶液中で2×20分間インキュベートした。用いた阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSF(5mM)、メタロプロテアーゼ阻害剤1,10-フェナントロリン(10mM)、アスパラギン酸プロテアーゼペプスタチン(5μM)およびシステイン阻害剤E-64(10μM)であった。次いで、ゲル細片を、異なるプロテアーゼ阻害剤を含む、1mM CaCl2を含む0.1M Tris/HCl(pH8)中、37℃で3時間インキュベートした後、クーマシーブルーで染色し、前述のとおりに脱染した。25kDa〜30kDa付近にタンパク質分解活性の大部分を示す図1、レーン5とは対照的に(図2の括弧参照)。続くESWの多くの標本の分析から、25kDa〜30kDa付近のこの三つのタンパク質分解活性は再現性が高いことが示された。
【０１０７】
阻害剤試験の結果より、1,10-フェナントロリン処理後にプロテアーゼ活性の著しい低下が示される(レーン2、括弧領域)。セリンプロテアーゼ阻害剤PMSFまたはシステインプロテアーゼ阻害剤E-64を用いた場合には、ESWのプロテアーゼ活性の低下は観察されなかった。加えて、アスパラギン酸阻害剤ペプスタチンは、プロテアーゼ活性のいかなる低下も示さなかった(データは示していない)。
【０１０８】
実施例4：シラミ卵孵化を測定するためのインビトロバイオアッセイ法の開発：
シラミ卵孵化に対するプロテアーゼ阻害剤の効果を評価するために、信頼性の高いインビトロバイオアッセイ法を開発する必要があった。雌雄のコロモジラミをウサギ上で前述のとおりに栄養補給した。雌雄比3：1のシラミ成虫を、約3×3cm2のナイロン布を含む清浄なペトリ皿に移し、32℃で12時間放置した。この間に、雌シラミは産卵し、卵を布に付着させた。次いで、すべてのシラミを除去し、卵をその後5日間インキュベートした。第6日に卵を含む布を1％次亜塩素酸ナトリウム溶液中に1分間置き、次いで徹底的に洗浄した。次いで、卵は発生の最終段階を通って孵化する。未処理の対照卵で、インビトロ卵孵化アッセイ法を用いて、85〜95パーセントの信頼できる平均孵化パーセンテージが得られた。その後、卵孵化アッセイ法にとって、シラミ卵を次亜塩素酸ナトリウムで前処理する必要がないことが判明した。
【０１０９】
実施例5：シラミ孵化プロテアーゼの活性を阻害しうる化合物の同定：
(a)シラミ卵孵化バイオアッセイ法を用いたプロテアーゼ阻害剤の試験
シラミの卵孵化を測定するためのバイオアッセイ法を改良し、次の調査段階はこのバイオアッセイ法を異なる阻害剤の卵孵化に対する効果を調べる手段として用いることであった。
【０１１０】
シラミ卵を前述のとおり布上に産卵させた。産卵の5日後、シラミ卵を含む布を取り出し、1％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬した後、蒸留水で徹底的に洗浄し、薄葉紙上で水分を吸い取り乾燥した。シラミ卵を解剖顕微鏡下で計数し、布を卵10個〜30個のバッチに切断し、処理ごとに3〜5の重複試料を用いた。次いで、シラミ卵を含む布をプロテアーゼ阻害剤溶液に2分〜10分間浸漬し、薄葉紙上に1分間置いて乾燥した後、清浄なペトリ皿に移し、孵化までインキュベートした。対照卵が孵化してしまうまでの次の1日〜2日間、卵を孵化の徴候について定期的に観察した。プロテアーゼ阻害剤溶液は典型的には保存溶液として調製し、適当な濃度で新しく加えた。具体的には、保存溶液を下記のとおりに調製した：1,10-フェナントロリン(メタノール中200mM)およびベスタチン(メタノール中5mg/ml)。加えて、阻害剤を含まない対照卵に等しいレベルの溶媒を加え、緩衝液だけの影響について試験した。孵化阻害パーセンテージを、未処理対照と比べての卵孵化の低下パーセンテージとして計算した。未処理対照は孵化パーセンテージ100％とした。
【０１１１】
金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤である1,10-フェナントロリンの添加は10mMでシラミの卵孵化を有意に阻害したが、1mMでは阻害レベルは対照に比べて約30％であった(図3参照)。金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤、より具体的にはアミノペプチダーゼMおよびNであるベスタチンも、5mMでシラミ卵孵化を有意に阻害することができた(図4)。
【０１１２】
これらの結果は、特定の金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤のシラミ卵孵化に対する効果についてのデータを提供するものである。しかし、1,10-フェナントロリンまたはベスタチンのいずれかを孵化24時間以内に加えると、卵孵化の様々な阻害が観察されることに気づいた(データは示していない)。この卵孵化のばらつきは、シラミの特定の発生段階に関係するいくつかの因子によると考えられた。さらに、これらの試験から、卵孵化の正確な時期を予測することは非常に難しいことが示され、したがって特定の阻害剤の卵孵化に対する効果を評価する際に、卵を処理する単一の時点を選択することは問題であると考えられる。したがって、シラミ発生におけるこのばらつきを説明するために、インビトロアッセイ系を改変した。
【０１１３】
(b)インビトロ孵化アッセイ法において用いる経時的実験
シラミ卵孵化の阻害剤を評価する手段として、一連の経時的実験を行った。卵を前述のとおりに布上に産卵させ、次いで、産卵後120時間まで24時間間隔で阻害剤を新しい卵の群に加えた。次いで、卵を28℃でさらに8日間インキュベートし、卵孵化させた。この阻害剤アッセイ法は、シラミ卵が発生の様々な段階にある現場の状況を、より厳密に反映している。
【０１１４】
これらの試験の結果を表1に示す。様々な濃度の1,10-フェナントロリンによる有意な阻害がシラミ孵化の全過程で示された。1,10-フェナントロリンの阻害効果には一定の濃度依存性も認められた。結果は、経時的実験が特定の阻害剤のシラミ卵孵化に対する効果を評価する信頼性の高い手段を提供することを示している。ベスタチンの添加は有意な阻害を示したが、卵孵化の約24時間前に適用した場合だけであった。
【０１１５】
（表１）異なる濃度の1,10-フェナントロリンおよび5mMベスタチンにより産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化阻害の割合(パーセント)
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【０１１６】
上記試験の結果は、金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤である1,10-フェナントロリンの酵素活性阻害能力により判断して、シラミ孵化酵素はメタロクラスのプロテアーゼであることを示している。さらに、この化合物は試験したすべての時点でシラミの卵孵化を有意に阻害することができ、特に卵を孵化の前後に低い濃度で処理した場合に、いくらかの用量依存性の徴候を示した。1,10-フェナントロリンは、金属イオン、好ましくは亜鉛とキレート化し、それにより亜鉛依存性プロテアーゼを阻害するその能力を通して効果を発揮する。
【０１１７】
ベスタチンについてのデータからも、卵に発生段階の後期に投与した場合、化合物が部分的にシラミ卵孵化を阻害しうることが示された。ベスタチンはアミン、ヒドロキシ基、アミドおよびカルボン酸基を含む置換基で置換されたアリール環を含む環状化合物である。ベスタチンは、非リンパ球性白血病を含む様々な形の癌、ならびに肺、胃、膀胱、頭部、頸部および食道を含む固形腫瘍の異なる形を治療するために用いられ、ユベニメックスの名称で用いられる、微生物起源の抗生物質である。これは培養細胞、無傷の動物およびヒトに対し、低い毒性で投与することができる。ベスタチンは通常、精製プロテアーゼの阻害剤としてマイクロモル濃度(10μMおよび130μM)で用いられるが、これまでに得られたデータは5mMで有効であることを示している。この結果は、ベスタチンの卵に浸透する能力およびそのシラミ孵化プロテアーゼに対する特異性を含むいくつかの因子によると考えられる。
【０１１８】
実施例6：シラミ卵孵化を阻害するためのプロテアーゼ阻害剤のスクリーニング：
シラミ卵を実施例4に記載のとおり布上に産卵させた。一連の経時的実験を実施例5((b)部分)に記載のとおりに準備した。かなりの数の市販のプロテアーゼ阻害剤/金属キレート剤をシラミ孵化アッセイ法で試験し、個々のプロテアーゼ阻害剤のシラミ卵孵化に対する効果を評価した(表2)。孵化阻害パーセンテージを、未処理対照と比べての卵孵化の低下パーセンテージとして計算した。未処理対照は孵化パーセンテージ100％とした。
【０１１９】
（表２）様々なプロテアーゼ阻害剤で処理した後のシラミ卵孵化阻害の割合(パーセント)。阻害の割合(パーセント)は、実験の時間経過を通して得られた最大卵孵化阻害を基準とする。
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*異なるプロテアーゼ阻害剤の卵孵化の阻害パーセンテージは適当な対照に対して計算し、観察された最大卵孵化阻害を表している。
【０１２０】
いくつかのプロテアーゼ阻害剤はシラミ卵孵化を顕著に阻害することが示された。試験した中で最も有効な阻害剤には、1,10-フェナントロリン、2,2-ジピリジルおよび6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジル、5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジル(それぞれ10mMで100％阻害)などの金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤が含まれた。メタロプロテアーゼ阻害剤のベスタチンも、卵孵化を有意に阻害することができた(5mMで58％)。
【０１２１】
天然由来マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)阻害剤、ならびに一つの環がアリール環である四環式化合物であって、四環式構造がいくつかのヒドロキシ基、カルボニル基、アミンおよびアミドで置換されている金属キレート剤には下記が含まれる：テトラサイクリン(5mg/mlで89％阻害)、ドキシサイクリン(5mg/mlで65％阻害)およびミノサイクリン(5mg/mlで55％)。これらの金属キレート剤は卵孵化に対する阻害活性を示したが、これらの化合物の結果は程度のばらつきが大きく、時間依存性であると考えられた。ヒドロキシメート阻害剤の全般的有用性は、一般的環境における抗生物質の使用を減らすための推進運動により、限定的となることもある。これらの結果は、MMP阻害剤もシラミ卵孵化に対する阻害効果を発揮しうることを示している。試験した他のプロテアーゼ阻害剤には、100mMのEDTA、10mMのEGTAおよび5％のトリエタノールアミンが含まれる。結果から、これらの阻害剤は用いた濃度では卵孵化に対する効果を有していないようであることが示された(結果は示していない)。
【０１２２】
実施例7：1,10-フェナントロリンによる処理後の卵洗浄の効果：
卵の洗浄が1,10-フェナントロリンの阻害活性に影響をおよぼすかどうかを調べるために、実験を行った(表3)。対照群(5％メタノール)も準備した。孵化阻害パーセンテージを、未処理対照と比べての卵孵化の低下パーセンテージとして計算した。未処理対照は孵化パーセンテージ100％とした。この実験の結果は、1,10-フェナントロリンが卵の水中での洗浄後もシラミ卵孵化阻害に際し非常に有効であることを示している。卵孵化に近づきつつある後期(第5日)の卵において、効果は低濃度の阻害剤を用いた場合に観察されたものと同様の濃度依存性を反映していると思われる。1,10-フェナントロリンで処理した卵の一部は、正常に発生はするが、孵化はできないと見られる胚を有していたことにも注目された。
【０１２３】
（表３）シラミにおいて10mM 1,10-フェナントロリンにより産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化阻害の割合(パーセント)。シラミ卵を阻害剤で10分間処理した後、未洗浄のままにしたか、または処理した後に1分間洗浄し、孵化させた。
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【０１２４】
実施例8：1,10-フェナントロリンによるアタマジラミ卵の孵化の阻害：
金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤である1,10-フェナントロリンが、ヒトジラミに対してアタマジラミ(Pediculus humanus capitus)卵孵化を阻害することができるかどうかを調べるために、試験を行った。アタマジラミ卵は下記のとおりに得た：1匹〜2匹の雄成虫および6匹〜8匹の雌成虫アタマジラミ両方の群を、綿布を含む24穴ペトリ皿の別々のウェルに入れた。ペトリ皿を加湿インキュベーターに移し、32℃、70％RHで12時間インキュベートして雌シラミを産卵させた。12時間後、すべてのシラミ成虫をペトリ皿のウェルから取り出し、一連の経時的実験を行った。卵の群(24時齢)を10mM 1,10-フェナントロリン溶液200μlで10分間処理した。対照(すなわち、阻害剤処理なし)群も含めた。卵を阻害剤から取り出し、薄葉紙上で水分を吸い取り乾燥し、32℃、70％RHに置き、孵化させた。第二の卵群(48時齢)を前述のとおりに処理し、同様に孵化させた。この工程をアタマジラミ卵に対して産卵後120時間まで24時間間隔で繰り返した。この阻害剤アッセイ法は、シラミ卵が頭上で発生の様々な段階にある現場の状況を、より厳密に反映しており、寄生生物のこれらの異なる段階に対する阻害効果の観察を可能にする。
【０１２５】
前述の試験の結果は、1,10-フェナントロリンがアタマジラミの卵孵化を有意に阻害しうることを示している(表4)。
【０１２６】
（表４）シラミにおいて10mM 1,10-フェナントロリンにより産卵後24時間間隔で処理した後の、対照に対する卵孵化阻害の割合(パーセント)。
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【０１２７】
これらの結果は、ヒトジラミがアタマジラミの卵孵化におけるプロテアーゼ阻害剤の効果をアッセイするための有効なモデルであることを強く示唆している。
【０１２８】
実施例9：金属キレート剤によるシラミ卵孵化の阻害：
メタロプロテアーゼ阻害剤として作用しうる二つの金属キレート剤を用い、これらのシラミ卵孵化に対する効果を調べるために、実験を行った。これらの化合物を標準シラミアッセイ法で試験して、その殺卵効果を評価した(阻害剤を試験するために用いた方法については、実施例5および6参照)。下記の金属キレート剤を評価した：2,2'-ジピリジルおよび6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジル。この試験の結果を表5および6に示す。
【０１２９】
（表５）2,2'-ジピリジルにより産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化の結果。結果を下記について示す：N(重複測定ごとの卵の数)、H(うまく孵化した卵の数)およびPh(部分的に孵化した卵の数)。
2008528449.tif 000016
【０１３０】
（表６）6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルにより産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化の結果。結果を下記について示す：N(重複測定ごとの卵の数)、H(うまく孵化した卵の数)およびPh(部分的に孵化した卵の数)。
2008528449.tif 000017
【０１３１】
これらの試験の結果は、6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび2,2'-ジピリジルはいずれも非常に強い殺卵活性を示し、それによりシラミ卵孵化は試験したすべての時点で完全に阻害されたことを示している。6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび2,2'-ジピリジルはいずれも非介在性の金属キレート剤およびメタロプロテアーゼ阻害剤である。
【０１３２】
実施例10：市販のシラミ製剤の1,10-フェナントロリンとの比較評価
三つの主要な市販アタマジラミ製剤の殺卵性を、標準シラミ卵孵化アッセイ法において評価した。三つの市販アタマジラミ製剤は下記のとおりであった：
1.  KP-24(登録商標)Nelson Laboratories、活性成分1％マルディソン(マラチオン)；
2.  RID(登録商標)Bayer、活性成分1％ピレトリン；および
3.  NIX(登録商標)Pfizer、活性成分1％ペルメトリン。
【０１３３】
これら三つの製剤を製造者の推奨に従って試験した。卵群(24時齢)を異なる製剤で製造者の推奨に従い適当な時間(5分〜10分間)処理した後、32℃の水中で1分〜2分間洗浄した。陽性対照(10mM 1,10-フェナントロリン)および二つの陰性対照(未処理および20％メタノール)も組み込んだ。異なる製剤への曝露後、卵を32℃の温水で洗浄し、次いで薄葉紙上で水分を吸い取り乾燥し、32℃、70％RHに置き、孵化させた。第二の卵群(48時齢)を前述のとおりに処理し、同様に孵化させた。この工程をアタマジラミ卵に対して産卵後120時間まで24時間間隔で繰り返した。この阻害剤アッセイ法は、シラミ卵が頭上で発生の様々な段階にある現場の状況を、より厳密に反映しており、寄生生物のこれらの異なる段階に対する阻害効果の観察を可能にする。これらの試験の結果を表7に示す。
【０１３４】
（表７）三つの市販アタマジラミ製剤、10mM 1,10-フェナントロリンおよび対照により産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化の結果。結果を下記について示す：N(重複測定ごとの卵の数)、H(うまく孵化した卵の数)およびPh(部分的に孵化した卵の数)。
2008528449.tif 000018
2008528449.tif 000019
【０１３５】
三つの市販殺シラミ薬の試験結果より、これらはシラミ卵孵化の異なる段階にわたって一貫性のないレベルの殺卵活性を示すことが判明した。これに対して、化合物1,10-フェナントロリンはシラミ卵孵化の阻害において非常に有効であった。
【０１３６】
実施例11：他の市販シラミ製剤の評価
二つの主要な市販アタマジラミ製剤の殺卵性を、標準シラミ卵孵化アッセイ法において評価した。2つの市販アタマジラミ製剤は下記のとおりであった：
1.  Pronto Plus(登録商標)Shampoo Del Laboratories、活性成分0.33％ピレトリン；および
2.  Pronto Plus(登録商標)Mousse Shampoo Del Laboratories、活性成分0.33％ピレトリン。
【０１３７】
これら二つの製剤を製造者の推奨に従って試験した。卵群(24時齢)を異なる製剤で製造者の推奨に従い適当な時間(5分〜10分間)処理した後、32℃の水中で1分〜2分間洗浄した。二つの陰性対照(未処理および20％エタノール)も組み込んだ。異なる製剤への曝露後、卵を薄葉紙上で水分を吸い取り乾燥し、32℃、70％RHに置き、孵化させた。第二の卵群(48時齢)を前述のとおりに処理し、同様に孵化させた。この工程をアタマジラミ卵に対して産卵後120時間まで24時間間隔で繰り返した。この阻害剤アッセイ法は、シラミ卵が頭上で発生の様々な段階にある現場の状況を、より厳密に反映しており、寄生生物のこれらの異なる段階に対する阻害効果の観察を可能にする。これらの試験の結果を表8に示す。
【０１３８】
（表８）二つの市販アタマジラミ製剤および対照により産卵後24時間間隔で処理した後の卵孵化の結果。結果を下記について示す：N(重複測定ごとの卵の数)、H(うまく孵化した卵の数)およびPh(部分的に孵化した卵の数)。
2008528449.tif 000020
【０１３９】
二つの市販殺シラミ薬の試験結果より、これらはシラミ卵孵化の異なる段階にわたって非常に低く、かつ一貫性のないレベルの殺卵活性を示すことが判明した。
【０１４０】
実施例12：コナガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１４１】
細密な布またはパラフィルムのいずれかに産卵されたコナガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液中に2〜10秒間浸漬し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露した。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表9に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１４２】
（表９）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果
2008528449.tif 000021
【０１４３】
表9は、金属キレート剤6,6'ジメチル-2,2'ジピリジルが、投与量依存性様式で10および1mMの両方で明らかな強い殺卵性効果を伴い、コナガにおける卵孵化を阻害することが可能であったことを示す。さらに、メタロプロテアーゼ阻害剤/金属キレート剤、1,10-フェナントロリンは同様に、この昆虫の卵孵化を10mMで有意に阻害することが可能であった。
【０１４４】
実施例13：コナガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、全ての卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１４５】
細密な布またはパラフィルムのいずれかに産卵されたコナガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液中に2〜10秒間浸漬し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露するか、または処理しなかった。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表10および11に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１４６】
（表１０）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果(布上に産卵)
2008528449.tif 000022
【０１４７】
（表１１）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果(パラフィルム上に産卵)
2008528449.tif 000023
【０１４８】
表10および11は、対照と比較して卵孵化に対する、選択されたジピリジル化合物へのコナガ卵の曝露の効果を示す。結果は、6,6'-ジメチル-2,2'ジピリジルに対する投与量依存性効果を示し、10および1mMの両方が、コナガ卵の卵孵化の阻害に有効である。0.1および.01mMで、卵孵化に対する観察可能な効果はなかった。これらの結果は、この化合物に対して実施例12に示した結果を確認する。さらに、5,5'-ジメチル-2,2'ジピリジルおよび4,4'-ジメチル-2,2'ジピリジルの両方は、10および1mMで卵孵化を有意に阻害することが可能であった。
【０１４９】
布またはパラフィルムのいずれに産卵される卵の間には、有意差は観察されなかった。
【０１５０】
実施例14：コナガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、全ての卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１５１】
細密な布に産卵されたコナガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液中に約2秒間浸漬し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露するか、または処理しなかった。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表12に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１５２】
（表１２）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果(メタノールのみ)
2008528449.tif 000024
【０１５３】
表12において提示される結果は、5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび4,4'-ジメチル-2,2'-ジピリジル両方が、10および1mMの両方で、コナガにおいて卵孵化を阻害するのに非常に有効であったことを示す。さらに、0.1mMでも、これらの化合物の両方に対して部分的阻害が観察された。
【０１５４】
実施例15：コナガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、全ての卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１５５】
細密な布に産卵されたコナガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液中に約2秒間浸漬し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露するか、または処理しなかった。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表12に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１５６】
（表１３）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果(メタノールのみ)
2008528449.tif 000025
【０１５７】
表13において提示される結果は、コナガにおける卵孵化に対して、1mMでの5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの有意な阻害を確認する。さらに、0.1mMでも、この化合物に対して部分的阻害が再度観察された。
【０１５８】
実施例16：オオタバコガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって微細なメッシュ布上に産卵された数百のオオタバコガ卵(Tatura×Toowoomba株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、全ての卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１５９】
オオタバコガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液に2〜10秒間曝露し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露した。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表14に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１６０】
（表１４）対照と比較したオオタバコガ卵の卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果
2008528449.tif 000026
naは、孵化し、かつ新しく孵化した毛虫によって喰われる卵の全てを意味する。
【０１６１】
表14の結果は、6,6'ジメチル-2,2'-ジピリジルが、10および1mMで、オオタバコガ卵の卵孵化を有意に阻害することが可能であったことを示す。このレベルより下の濃度では、阻害は記録されなかった。化合物1,10-フェノトロリンは、10mMでのみ卵孵化を阻害することが可能であった。
【０１６２】
実施例17：オオタバコガの卵孵化に対する化合物の評価
24時間にわたって微細なメッシュ布上に産卵された数百のオオタバコガ卵(Tatura×Toowoomba株)を、収集した。収集の3〜5時間以内に、下記のように、全ての卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１６３】
オオタバコガ卵のバッチを次いで、特異的阻害剤溶液に2〜10秒間曝露し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水メタノールに曝露した。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、表15に示すように対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１６４】
（表１５）対照と比較したオオタバコガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果
2008528449.tif 000027
【０１６５】
表15において示されるデータは、6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルが、10および1mMの両方で、オオタバコガ卵の卵孵化を有意に阻害することが可能であることを示す実施例4に提供される以前の結果を支持する。0.1mMで、この化合物による卵孵化の阻害は観察されなかった。さらに、5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび4,4'-ジメチル-2,2'-ジピリジル両方に対して、10mMで、卵孵化の有意な阻害を示すデータを提示する。さらに、1mMの4,4'-ジメチル-2,2'-ジピリジルで、卵孵化の有意な阻害は観察されなかった。
【０１６６】
実施例18：コナガ卵の孵化に対する2-(2-ピリジニル)キノリンの効果の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の24〜48時間以内に、下記のように、卵を異なる阻害剤により処理した。
【０１６７】
細密な布に産卵されたコナガ卵のバッチを、特異的阻害剤溶液中に約2秒間浸漬し、過剰な溶液は、乾燥薄葉紙を用いたブロット法により排出した。卵塊を次いで、湿った箱の中で25度で卵孵化まで配置した。対照卵は、上述のように無水エタノールに曝露した。産卵後6日目に、卵を、異なる処理から評価し、対照に対する卵孵化の割合を測定した。
【０１６８】
結果：
（表１６）対照と比較したコナガの卵孵化に対する阻害剤の殺卵性効果
2008528449.tif 000028
【０１６９】
表16は、金属キレート剤化合物2-(2-ピリジニル)キノリンが、10mMでコナガにおける卵孵化を阻害することが可能であることを示す。
【０１７０】
実施例19：6,6'-ジメチル-2-2'-ジピリジルによる卵孵化の阻害に対する付加した金属イオンの効果の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の24時間以内に、以下の実験的設計が選択された。卵のバッチは、10mMの6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルまたは溶媒のみ(メタノール)のいずれかに、2秒間曝露した。卵の全バッチは、20分間、室温で空気乾燥させた。卵は次いで、10、5、または1mMのいずれかで、FeSO4に2秒間曝露し、空気乾燥させ、かつ24℃のインキュベーターに入れてその後6日にわたって孵化させた。さらに、卵をこの化合物に2秒間曝露し、空気乾燥し、インキュベーター内に配置した、10mMの6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルのポジティブコントロールを準備した。
【０１７１】
結果：
（表１７）FeSO4対照と比較したコナガの卵孵化に対する10mMの6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの殺卵性効果の反転
2008528449.tif 000029
【０１７２】
表17に提示される結果は、FeSO4内のFeの形態での二価の金属イオンの付加が、金属キレート剤6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの効果を反転することが可能であったことを示す。結果は、FeSO4による阻害剤の簡単な希釈とは反対に、6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの阻害作用の反転は、この阻害剤の効果に取って代わるFeによることを示す。この効果は、阻害剤への曝露後のMEOHのみへの卵の曝露が、なお有意な程度の卵孵化の阻害をもたらしたという知見によって示される。
【０１７３】
実施例20：5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルによる卵孵化の阻害に対する付加した金属イオンの効果の評価
24時間にわたって産まれた数百のコナガ卵(Waite株)を、収集した。収集の24時間以内に、以下の実験的設計が選択された。卵のバッチは、10mMの5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルまたは溶媒のみ(メタノール)に、2秒間曝露した。卵の全バッチは、20分間、室温で空気乾燥させた。卵は次いで、10、5、または1mMで、FeSO4に2秒間曝露し、空気乾燥させ、かつ24℃のインキュベーターに入れてその後6日にわたって孵化させた。さらに、卵をこの化合物に2秒間曝露し、空気乾燥し、インキュベーター内に配置した、10mMの5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルのポジティブコントロールを準備した。
【０１７４】
結果
（表１８）FeSO4のみの対照と比較したコナガの卵孵化に対する10mMの5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの殺卵性効果の反転
2008528449.tif 000030
【０１７５】
表18に提示される結果は、FeSO4内のFeの形態での二価の金属イオンの付加が、金属キレート剤5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの効果を反転することが可能であったことを示す。結果は、FeSO4による阻害剤の簡単な希釈とは反対に、5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの阻害作用の反転は、この阻害剤の効果を除去するFeによることを示す。この効果は、阻害剤への曝露後のMEOHのみへの卵の曝露が、なお有意な程度の卵孵化の阻害をもたらしたという知見によって示される。
【０１７６】
実施例21：ヒツジハジラミにおける卵孵化に対する6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの効果
ヒツジハジラミ卵を、この寄生虫に侵襲されたヒツジの羊毛から収集した。鉗子により、および解剖顕微鏡を用いて卵を収集し、一回の実験で10個の卵の二重ロットで、24穴組織培養プレートに配置した。卵を、次いでメタノールのみ(溶媒対照)もしくは試験化合物のいずれかに、10分もしくは1分のいずれかの間曝露するか、またはウェルから除去する前に未処理対照として残し、チューブの基部に食餌を含む個々のガラスバイアルに配置した。チューブを、(湿気を68％で一定に保つために)食塩水を含むプラスチック容器に配置し、容器は32℃の温度で維持した。続く12日間にわたり、卵を孵化についてモニターし、対照と比較して、孵化の阻害％を測定した。
【０１７７】
（表１９）ヒツジハジラミにおける卵孵化に対する6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルおよび5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルの効果
2008528449.tif 000031
【０１７８】
表19に提示された結果は、ヒツジハジラミ卵の5,5'-ジメチル-2,2'-ジピリジルまたは6,6'-ジメチル-2,2'-ジピリジルのいずれかの10mM溶液への、10または1分間の曝露後、この外部寄生生物における卵孵化は、このアッセイにおいて完全に阻害することができたことを示す。
【０１７９】
当業者であれば、具体的態様において示した本発明に対し、広く記載した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多くの変更および/または改変を加えうることを理解すると思われる。したがって、本態様はすべての観点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。
【０１８０】
前述のすべての発行物はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
本明細書に含まれるいかなる文書、記録、材料、装置、論文などの議論は、本発明の文脈を提供するためにすぎない。これらのいずれか、またはすべては、それが本出願の各特許請求の範囲の優先日よりも前に任意の国に存在していたために、先行技術の基礎の一部をなす、または当技術分野における一般的知識であったとの自認であると解釈されるべきではない。
【０１８２】
引用文献：
2008528449.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】毛髪およびシラミ卵の様々な試料から得た洗液のプロテアーゼ活性について、ゼラチン基質SDS-PAGE分析を行い、ゲルをクーマシーブルー染色および脱染した後の結果を示す図である。レーン1は、孵化の12時間以内に未孵化のシラミ卵から得た洗液で検出されたプロテアーゼ活性を示している。プロテアーゼ活性はSDSゲルの高分子量領域にあった。レーン2は、卵を持つ雌のシラミが最近除去されたヒト毛髪から回収した洗液で検出されたプロテアーゼ活性を示し、母体起源と思われるいくつかの活性が高く、安定なプロテアーゼの存在を示している。レーン3には、これらの混入プロテアーゼを除去するために、次亜塩素酸ナトリウムの1％溶液で1分間洗浄した後、数回水洗した、上記と同様の毛髪試料から回収した洗液を入れた。この処理により、母体プロテアーゼを除去することができ、毛髪のみの試料ではプロテアーゼ種はまったく検出されない結果となった。レーン4は、卵孵化の12時間以内に、次亜塩素酸ナトリウムで処理(前述のとおり)した卵の洗液で検出されたプロテアーゼ活性を示している。この処理により、未洗浄の試料で観察されたプロテアーゼ活性を除去することができる(レーン1と比較されたい)。レーン5は、次亜塩素酸ナトリウムであらかじめ処理し、孵化させた、シラミ卵からの卵洗液における一つまたは二つの高分子量プロテアーゼ種の存在を示している。レーン5の試料は卵孵化後0〜2時間で回収された。これらのプロテアーゼは、卵孵化時のシラミ卵に特に関与し、卵殻洗液(ESW)と呼ばれている。
【図２】次亜塩素酸塩処理後のシラミ卵から得た卵殻洗液の、阻害剤処理したゼラチンSDS-PAGEゲルのクーマシー染色を示す図である。およそ25〜30kDaに三つのバンドが認められた(括弧で示している)。レーン1：ESW陽性対照、阻害剤未処理、レーン2：10mM 1,10-フェナントロリン処理後のESW、レーン3：5mM PMSF処理後のESW、およびレーン4：10μM E-64処理後のESW。インキュベーションは37℃で3時間行った。1,10-フェナントロリン処理後のプロテアーゼ活性の著しい低下に留意されたい(レーン2の括弧領域)。アスパラギン酸阻害剤ペプスタチンを用いた場合、ESWのプロテアーゼ活性に低下は見られなかった(データは示していない)。
【図３】シラミの卵孵化に対する1,10-フェナントロリンの効果を示す図である。卵を産卵後5日間処理し、孵化を経時観察した。
【図４】シラミの卵孵化に対するベスタチンの効果を示す図である。卵を産卵後5日間処理し、孵化を経時観察した。
【図１】
2008528449.tif 000041
【図２】
2008528449.tif 000042
【図３】
2008528449.tif 000043
【図４】
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【国際調査報告】
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