(57)【要約】【解決課題】  本発明は、コガネヤナギおよびアカネの抽出粉末ならびにジンセノサイドおよびフユムシナツクサタケの粉末からなる薬草組成物に関する。本発明は、さらに、前記薬草組成物の調製方法およびＡＩＤＳ治療のためのその使用に関する。【解決手段】１００重量部の組成物に基づいて、１０〜３０重量部のコガネヤナギおよび１０〜２５重量部のアカネの抽出粉末、１８〜２５重量部のジンセノサイド粉末、ならびに３０〜５５重量部のフユムシナツクサタケ粉末からなる薬草組成物とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００重量部の組成物に基づいて、１０〜３０重量部のコガネヤナギおよび１０〜２５重量部のアカネの抽出粉末、１８〜２５重量部のジンセノサイド粉末、ならびに３０〜５５重量部のフユムシナツクサタケ粉末からなる薬草組成物。
【請求項２】
前記薬草組成物が、１００重量部の組成物に基づいて、１８重量部のコガネヤナギおよび１７重量部のアカネの抽出粉末、１８重量部のジンセノサイド粉末、ならびに４７重量部のフユムシナツクサタケ粉末からなる、請求項１に記載の薬草組成物。
【請求項３】
前記コガネヤナギおよびアカネの抽出粉末またはジンセノサイド粉末が、エタノール抽出粉末であり、フユムシナツクサタケ粉末が、天然のフユムシナツクサタケまたは人工培養したフユムシナツクサタケの粉末である、請求項１または請求項２に記載の薬草組成物。
【請求項４】
ａ）原料薬物としてのコガネヤナギの粗ハーブを破砕し、４〜５倍のエタノールを添加して少なくとも６時間浸漬させ、浸漬したコガネヤナギおよび浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いで１〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分の速度で濾過し、その後、エタノールを添加し、回収した浸透圧濾過液が前記粗ハーブの１０〜２０倍の重量になるまで同時に浸透圧濾過し、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を形成するように前記浸透圧濾過液を回収および濃縮し、前記濃縮液をコガネヤナギの抽出粉末に噴霧乾燥させる工程と、
ｂ）同時または連続的に、アカネの粗ハーブを破砕し、４〜５倍のエタノールを添加して少なくとも６時間浸漬させ、浸漬したアカネおよび浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いで１〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分の速度で濾過し、その後、エタノールを添加し、回収した浸透圧濾過液が前記粗ハーブの１０〜２０倍の重量になるまで同時に浸透圧濾過し、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を形成するように前記浸透圧濾過液を回収および濃縮し、前記濃縮液をアカネの抽出粉末に噴霧乾燥させる工程と、
ｃ）１００重量部の組成物に基づいて、１０〜３０重量部のコガネヤナギの抽出粉末、１０〜２５重量部のアカネの抽出粉末、１８〜２５重量部のジンセノサイド粉末、および３０〜５５重量部のフユムシナツクサタケ粉末を混合して、薬草組成物を得る工程と
を含む、請求項１に記載の薬草組成物の調製。
【請求項５】
前記エタノールが、３０〜７０％エタノールである、請求項４に記載の調製。
【請求項６】
抗ＨＩＶ薬の調製のための請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の薬草組成物の使用。
【請求項７】
前記薬草組成物を、通常の抗ＨＩＶ薬と組み合わせて使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
前記通常の抗ＨＩＶ薬には、ＡＺＴ、ＤＤＣ、ＤＤＩ、サキナビル、リトナビル、硫酸インジナビル、およびネフィナビルが含まれる、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、コガネヤナギ（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ  Ｇｅｏｒｇｉ）およびアカネ（Ｒｕｂｉａ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ  Ｌ）の抽出粉末ならびにジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）およびフユムシナツクサタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ (Ｂｅｒｋ.) Ｓａｃｃ）の粉末を含む薬草組成物に関する。本発明は、さらに、前記薬草組成物の調製方法およびＡＩＤＳ治療のための薬物の適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
蒸し暑さを解決するための薬物の１つとしてのコガネヤナギは、シソ科植物の根であり、主にフラボノイドを含む。その主な薬学的効果には、抗炎症、抗アレルギー、抗菌、解熱機能、および解毒が含まれる。ルビア（ｒｕｂｉａ）の根としても公知の止血剤および血液を活性化させる草であるアカネは、アカネ科植物の乾燥根および茎である。ルビアの主成分は、脂溶性アントラキノン、還元アントラキノン、そのグリコシド、および水溶性シクロヘキサペプチドである。さらに、カルシウムイオンも豊富である。その主な薬学的効果は、血液の冷却、止血、鬱血の除去、循環の増強、腫瘍の死滅、および抗菌性である。甘みとほろ苦さを有する味および穏やかな作用を有する朝鮮人参の根は、エネルギーの流れ、血液の滋養、鎮静、英知に磨きをかけること、唾液の分泌、咳の緩和、栄養補給、および身体の強壮を調整することができる。「ハーブの王様」として公知のように、古代中国より身体調整薬として望ましいとされてきた。冬虫夏草は、フユムシナツクサタケと同類であり、子嚢菌類ニクザキン科（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）に属する。これらは、ヒナコウモリ科宿主のヘピアルス・アルモリカヌス・オベルスル（Ｈｅｐｉａｌｕｓ  ａｒｍｏｒｉｃａｎｕｓ  ｏｂｅｒｔｈｕｒ）の幼若昆虫の体で構成されている。冬虫夏草は、粗タンパク質、脂質、粗繊維、炭水化物、灰分、虫草酸、コルジセピン、冬虫夏草ポリサッカリド、ヌクレオチド、ペプチド、およびエイコサンを含む。主な薬学的効果には、気分の高揚、陽を高めること、抵抗性を高めること、エネルギーの充填、腎臓の滋養、咳の緩和、身体の強壮、および長寿が含まれる。抗炎症、抗不整脈、および腫瘍の死滅も可能である。
【０００３】
多数の実験によって証明されるように、朝鮮人参は、動物およびヒトの身体の活動および知的活動を増強し、身体の種々の有害な刺激に対する非特異的抵抗性を高めることができる。治療範囲内で、正常な生理学的機能を妨害せず、副作用もない。全身用の有利且つ無害の増強剤および強壮剤の種類と見なされている。
【０００４】
朝鮮人参の薬理学的の発見の積み重ねにより、研究者は、朝鮮人参抽出物の研究を行っている。主な薬理学的作用を有する３０種を超えるジンセノサイド（Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ、Ｒｈ１、Ｒｈ２、Ｆ２、偽ジンセノサイドＦ１、ＲＴ、およびアメリカンジンセノサイドなど）が存在することが見出されている。これらのジンセノサイドの主な薬理学的研究には、老化防止、免疫増強、および脂質低下の効果、ならびに心臓および血管のいくらかの変化が含まれる。しかし、今まで、ＡＩＤＳ治療のための朝鮮人参、朝鮮人参抽出物、または任意のジンセノサイドの使用についての報告は未だ存在しない。ＡＩＤＳは、後天性免疫不全症候群を示す。原因物質は、ヒト免疫不全ウイルスである。これは、主に、ヒト免疫系、詳細には、ＣＤ４リンパ球を攻撃する。最終的に、身体の免疫機能を破壊し、日和見感染症によって患者は死亡する。
【０００５】
スラミンは、ＨＩＶウイルスと戦うことが最初に報告された薬物であった。１９８５年に、ＡＺＴが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ＨＩＶ活性を保有することが見出された。１９８６年に、臨床試験が行われた。１９８７年に、ＡＺＴは、ＡＩＤＳ治療薬としてＦＤＡで承認された最初の薬物となった。しかし、その薬物の毒性および耐性が主な問題であった。その後数年にわたって他の薬物が出現した。今まで、２０種を超える抗ＨＩＶ薬が、ＵＳでの使用を許可されている。その作用機構によって、これらは、主に３つのカテゴリーに分類される。Ｔ２０（２００２年末に承認された細胞侵入遮断薬）を除き、全ての他の薬物は、ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）インヒビター（ＡＺＴ、ＤＤＣ、ＤＤＩおよびウイルスプロテアーゼインヒビターなど）に属する。ＦＤＡは、５つのプロテアーゼインヒビター薬（すなわち、サキナビル、リトナビル、硫酸インジナビル、およびネフィナビル（ｎｅｆｉｎａｖｉｒ）など）を既に承認している。１９９５年に、米国の科学者は、２つのＲＴインヒビターと１つのプロテアーゼインヒビターとの「三重組み合わせ」投薬計画を採用した。ＨＡＡＲＴとして公知のこのような治療法は、現在一般的に使用されている。この治療法は、治療結果を向上させ、患者の寿命をさらに延ばしている。現在、６〜７年使用されている。また少数の患者がいまだ生存している。
【０００６】
現在、中国でＨＡＡＲＴのカクテルに使用可能な３つの薬物が存在する。しかし、ＲＴ阻害薬のみが存在し、プロテアーゼインヒビターは依然として欠如している。毒性が非常に高く、ほぼ２０％の患者が許容することができない。したがって、臨床への適用において薬物の毒性および耐性の問題が存在する。上記のように、Ｔ２０は、ウイルスの細胞侵入を遮断することができる。しかし、Ｔ２０は、ペプチドであるので、経口摂取することができない。それは注射しなければならない。さらに、その価格は非常に高価である。したがって、毒性の低い抗ＨＩＶ薬を開発することが急務である。
【０００７】
伝統的な漢方薬は、我々が調査し研究を進展させる高い価値がある実に偉大な宝の山である。１０年を超える研究により、本発明者らは、いくつかのハーブの抽出物、成分、または単一成分が十分に定義された抗ＨＩＶ活性を有することを見出した。その抗ＨＩＶ活性の標的を研究した。ＨＡＡＲＴよりも安価で毒性が低いなどの利点に加えて、これらは免疫機能を顕著に増強することができる。ＨＡＡＲＴが薬物耐性に関して問題を有するので、治療カクテルを常に更新する必要がある。したがって、臨床目的でＡＩＤＳを治療するためにＴＣＭを適用する見込みが非常にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、コガネヤナギおよびアカネの抽出粉末ならびにジンセノサイドおよびフユムシナツクサタケの粉末からなる薬草組成物がＡＩＤＳに顕著な効果を有することを見出した。
【０００９】
したがって、一方で、本発明は、１００重量部の組成物に基づいて、１０〜３０重量部のコガネヤナギおよび１０〜２５重量部のアカネの抽出粉末、１８〜２５重量部のジンセノサイド粉末、ならびに３０〜５５重量部のフユムシナツクサタケ粉末からなる薬草組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記組成物の範囲内で、より好ましくは、それぞれ、コガネヤナギの抽出粉末は１８重量部の量であり、アカネの抽出粉末は１７重量部の量であり、ジンセノサイド粉末は１８重量部の量であり、フユムシナツクサタケ粉末は４７重量部の量である。
【００１１】
１．前記組成物の範囲内で、抽出粉末はエタノール抽出粉末であり、当該分野で公知の任意の技術から採取することができる。コガネヤナギおよびアカネの抽出粉末を、好ましくは、下記のように調製することができる。ジンセノサイド粉末は、調製の品質基準を満たす市販の製品であってよい。至適な選択基準としてのジンセノサイド粉末は、１５〜２０重量％のＲｂ１、１５〜２０重量％のＲｂ２、３０〜９０重量％のＲｂ３、および３０〜９０重量％のＲｃを含む。フユムシナツクサタケ粉末は、天然のフユムシナツクサタケまたは人工培養したフユムシナツクサタケの粉末である。
【００１２】
他方では、本発明は、ａ）原料薬物としてのコガネヤナギの粗ハーブを破砕し、４〜５倍のエタノールを添加して少なくとも６時間浸漬させ、浸漬したコガネヤナギおよび浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いで１〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分の速度で濾過し、その後、エタノールを添加し、回収した浸透圧濾過液が前記粗ハーブの１０〜２０倍の重量になるまで同時に浸透圧濾過し、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を形成するように前記浸透圧濾過液を回収および濃縮し、前記濃縮液をコガネヤナギの抽出粉末に噴霧乾燥させる工程と、
ｂ）同時または連続的に、アカネの粗ハーブを破砕し、４〜５倍のエタノールを添加して少なくとも６時間浸漬させ、浸漬したアカネおよび浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いで１〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分の速度で濾過し、その後、エタノールを添加し、回収した浸透圧濾過液が前記粗ハーブの１０〜２０倍の重量になるまで同時に浸透圧濾過し、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を形成するように前記浸透圧濾過液を回収および濃縮し、前記濃縮液をアカネの抽出粉末に噴霧乾燥させる工程と、
ｃ）１００重量部の組成物に基づいて、１０〜３０重量部のコガネヤナギの抽出粉末、１０〜２５重量部のアカネの抽出粉末、１８〜２５重量部のジンセノサイド粉末、および３０〜５５重量部のフユムシナツクサタケ粉末を混合して、薬草組成物を得る工程と
を含む、薬草組成物の調製方法に関する。
【００１３】
上記方法の範囲内で、好ましくは３０〜７０％、より好ましくは５０％のエタノールを使用する。
【００１４】
さらに、本発明は、抗ＨＩＶ薬の調製における薬草組成物の使用に関する。
【００１５】
薬草組成物を、通常の抗ＨＩＶ薬と組み合わせて使用する。通常の抗ＨＩＶ薬には、ＡＺＴ、ＤＤＣ、ＤＤＩ、サキナビル、リトナビル、硫酸インジナビル、およびネフィナビルが含まれる。
【００１６】
抗ＨＩＶ薬の投与処方物は、液体または固体であり得る。例えば、液体処方物は、真の溶液型、コロイド型、微粒子型、乳濁形態、および懸濁形態であり得る。他の処方物には、錠剤、カプセル、点滴薬、エアゾール、丸薬、ペレット、溶液、懸濁液、乳濁液、顆粒、座剤、および凍結乾燥粉末注射薬が含まれる。
【００１７】
本発明の薬草組成物を、一般的な調製物、徐放性調製物、制御放出調製物、標的調製物、および種々のミクロソーム薬物送達系にすることができる。
【００１８】
当該分野で公知の全キャリアを使用して、単位投薬処方物を錠剤に調製することができ、例えば、希釈剤および吸収剤としてのキャリアには、デンプン、デキストラン、硫酸カルシウム、ラクトース、マンニトース、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、炭酸カルシウム、白土、微結晶性セルロース、およびケイ酸アルミニウムなどが含まれ、潤滑剤および接着剤には、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、デンプンスラリー、デキストラン、シロップ、ハチミツ、グルコース溶液、アラビア糊、ゼラチン糊、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、およびＰＶＰなどが含まれ、崩壊剤には、乾燥デンプン、アルギン酸塩、アガロース粉末、アルギンデンプン、重炭酸ナトリウム、クエン酸塩、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタンアルフェート、ドデシル硫酸ナトリウム、メチルセルロース、およびエチルセルロースなどが含まれ、崩壊インヒビターには、スクロース、トリステアリン酸グリコール、カカオバター、および硬化油などが含まれ、吸収促進剤には、第四級アンモニウムおよびドデシル硫酸ナトリウムなどが含まれ、潤滑剤には、滑石粉、酸化ケイ素、コーンスターチ、ステアリン酸塩、ホウ酸塩、流動パラフィン、およびポリエチレングリコールなどが含まれる。他のキャリアには、ポリアクリル酸樹脂およびリポソームなどが含まれ、水溶性キャリアには、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、およびＰＶＰなどが含まれる。錠剤を、糖衣錠、薄膜コーティング錠、腸溶性錠剤、または二層錠剤および単層錠剤などのコーティングした丸薬にさらに調製することができる。
【００１９】
例えば、単位投薬形態をペレットに調製するために、当該分野で公知の全てのキャリアを広く採用することが可能である。キャリアの例は、希釈剤および吸収剤（グルコース、ラクトース、デンプン、カカオバター、硬化植物油、ＰＶＰ、カオリン、および滑石粉など）、接着剤（アラビア糊、トラガカントガム、ゼラチン、エタノール、ハチミツ、液体の糖、およびコメまたは小麦粉のペーストなど）、崩壊剤（アガロース粉末、乾燥デンプン、アルギン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、メチルセルロース、およびエチルセルロースなど）である。
【００２０】
例えば、単位薬物をカプセルに調製する目的で、本発明の医薬組成物の有効成分を、種々の前記キャリアと混合して混合物を得ることができる。混合物を、硬カプセルまたは軟カプセルに入れる。
【００２１】
例えば、ハーブ組成物を、溶液、懸濁液、乳濁液、および凍結乾燥粉末注射薬などの形態の注射薬に調製することができる。この種の調製物は、水を含んでも含まなくてもよく、１つおよび／または複数の薬理学的に許容可能なキャリア、希釈剤、接着剤、潤滑剤、防腐剤、界面活性剤、分散剤を含み得る。希釈剤には、水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３−プロピレングリコール、エトキシル化プリソリン、およびポリオキシエチレンソルビタンアルフェートが含まれる。さらに、適量の塩化ナトリウム、グルコース、またはグリセロールを注射薬に添加して等張注射薬を調製することが可能である。さらに、従来の可溶化剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤を添加することができる。これらの補足材料は、本分野で一般的に使用されている。
【００２２】
さらに、必要に応じて、着色料、防腐剤、スパイス、味覚修飾物質、甘味料、および他の物質を、本発明の薬草組成物に含めることもできる。
【００２３】
薬物治療の目的を達成し、治療効果を増強するために、本薬草組成物を、任意の周知の投与方法（好ましくは、経口摂取）によって投与することができる。
【００２４】
薬草組成物の投薬量は、多数の要因（ＡＩＤＳ患者の疾病経過の重症度、性別、年齢、体重、素因、個別の反応、投与経路、投与頻度、および治療目的など）によって決定される。結果として、本発明の治療用量範囲は広い。一般的に言えば、本発明の薬物成分の実際的な量は、本分野の当業者に周知である。有効な治療レベルおよび本発明の防止または治療目的を達成するために、薬草組成物の最終調製物における実際の薬物の量を適切に調整することが可能である。薬草組成物の適切な１日量の範囲は、体重１ｋｇあたり０．０３〜０．５０ｍｇである。上記用量を、１日に２回、３回、または４回投与することができる。投与は医師の臨床経験に従い、他の治療アプローチによる投与計画に影響を受ける。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明を、図面と組み合わせて詳述する。
【実施例１】
【００２６】
本発明の薬草組成物の調製
原料薬物としての１８０ｋｇのコガネヤナギおよび１５０ｋｇの粗ルブア（ｒｕｂｕａ）ハーブを採取して破砕し、１４００Ｌの５０％エタノールを添加して６時間浸漬させる。浸漬した原料薬物および浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いだ。浸透圧濾過速度は、３〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分であった。同一のエタノールのバッチに添加し、浸透圧濾過を継続した。次いで、４０００Ｌの浸透圧濾過液を回収した。濃縮エタノール浸透圧濾過液の再利用により、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を採取した。上記濃縮液を、噴霧技術によって粉末に乾燥させた。コガネヤナギおよびアカネの抽出粉末の採取速度は、それぞれ、８〜１０％および１０〜１５％であった。このようにして得られた乾燥粉末は、１８ｋｇのコガネヤナギの抽出粉末および１７ｋｇのアカネの抽出粉末に等しかった。採取した乾燥粉末を、１８ｋｇのジンセノサイド粉末および４７ｋｇのフユムシナツクサタケ粉末と混合して、本発明の薬草組成物（ＺＬ−１）を得た。当業者に周知の過程を使用し、適量の薬用キャリアを使用して、本発明が必要とするカプセル粉末を形成した。次いで、カプセルを、その後の使用のために包装した。各カプセルは、約０．５ｇの薬草組成物を含む。
【実施例２】
【００２７】
原料薬物としての１８０ｋｇのコガネヤナギの粗ハーブを採取して破砕し、その後、７２０Ｌの５０％エタノールを添加して６時間浸漬させる。浸漬した原料薬物および浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いだ。浸透圧濾過速度は、３〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分であった。５０％エタノールを間欠的に添加し、浸透圧濾過を継続した。次いで、２２００Ｌの浸透圧濾過液を回収した。濃縮エタノール浸透圧濾過液の蒸発により、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を採取した。上記濃縮液を、噴霧によって粉末に乾燥させ、１８ｋｇのコガネヤナギの抽出粉末を得た。
【００２８】
原料薬物としての１５０ｋｇのアカネの粗ハーブを採取して破砕し、その後、６００Ｌの４０％エタノールを添加して約６時間浸漬させる。浸漬した原料薬物および浸漬液を共に浸透圧濾過タンクに注いだ。浸透圧濾過速度は、３〜４．５ｍｌ／ｋｇ／分であった。４０％エタノールを間欠的に添加し、浸透圧濾過を継続した。１８００Ｌの浸透圧濾過液を得た。濃縮エタノール浸透圧濾過液の蒸発により、水と濃縮液との重量比が１：１．１〜１．３５の最終濃縮液を採取した。上記濃縮液を、噴霧によって粉末に乾燥させ、１７ｋｇのアカネの抽出粉末を得た。
【００２９】
採取したアカネの乾燥粉末を、１８ｋｇのジンセノサイドおよび４７ｋｇのフユムシナツクサタケと混合して薬草組成物（ＺＬ−１）を得て、その後の使用のためにカプセルに包んだ。
【００３０】
実験１
本発明の薬草組成物の薬力学研究
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
ＨＩＶ−１ウイルス複製に対する実施例１で調製したＺＬ−１の阻害効果を観察するために、３つの細胞型（ＭＴ４、Ｈｅｌａ−ＣＤ4、ＰＢＭＣなど）を、それぞれ、ＨＩＶ−１ウイルスに感染させた。
【００３１】
（１）ＭＴ４細胞
ウイルス株：ＨＩＶ−１およびＮＬ４細胞株
方法：実施例１で得た薬草組成物を、薬物溶液として１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、その後の実験で使用するために異なる濃度に希釈した。１：９６ウェル培養プレートで実験を行い、１００μｌ薬物溶液を各ウェルに添加し、各濃度の薬物溶液を少なくとも二連で作製した。５×１０5個の新たに培養したＭＴ４細胞を、さらに試験管に取り出した。ＨＩＶ−１ウイルス（１×１０3ＴＣＩＤ50／ＭＬ、３７℃）を細胞に添加し、ＣＯ2インキュベーター中でさらに培養した。２時間後に培養物を遠心分離し、上清を破棄し、ＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄した。遊離ウイルスを取り出し、５×１０5／ｌｍｌを培養培地に添加した。１００μＬ  ＨＬＶ−１感染細胞を、９６ウェルプレートの全薬物ウェルに添加し（５×１０4／１００μＬ）、ＣＯ2インキュベーター内にて３７℃で培養した。３日目に、１００μＬの上清を各ウェルから吸い取り、１００μＬのウェルと同一濃度の新鮮な薬物溶液と置換した。コントロール群として１００μＬの培養培地を添加した。６日目に、各ウェルから上清を採取した。Ｐ24抗原量を測定するために、Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ法および試薬を採用した。各実験のために、ウイルスコントロール（ＶＣ）、細胞コントロール、およびＡＺＴ溶性薬物コントロールを使用した。Ｐ24抗原（Ｐ24−Ａｇ）の量に基づいて、以下の式にしたがって阻害率（ＩＲ）を計算した。
【数１】
2008514654.tif 000002
【００３２】
異なる濃度の薬物溶液について異なるＩＲが得られた。統計処理後、ＩＣ50を得た。
【００３３】
（２）Ｈｅｌａ−ＣＤ4細胞
ウイルス：単一生活環レポーターＨＩＶウイルスを、ＨＩＶプラスミドのトランスフェクションによって獲得した。
【００３４】
方法：Ｈｅｌａ−ＣＤ4−ＬＴＲ−ｇａｌ細胞を、２４ウェルプレートに接種して２４時間静置し、ウェルに吸収および接着したままにした。２日目に、上清をウェルから吸い取り、１００μｌの薬物（薬物コントロール）、薬物およびＨＩＶ−１（異なる濃度の薬物を含む薬物溶液）、または培養培地（偽ウェル）を添加した。２時間後、２００μｌの同一の薬物溶液または培養培地を各ウェルに添加してＣＯ2インキュベーター内にて３７℃で４８時間培養し、以下の方法によって検出した。
【００３５】
固定：上清を各ウェルから吸い取り、固定液（１ｍｌ）を添加し、次いで、Ｋ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］・３Ｈ2Ｏ、Ｋ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］、およびＸ−ｇｅｌで染色した。
【００３６】
計数：各ウェル内の青色細胞数（ＢＣＣ）について、以下の式を使用して、ＩＲを計算し、その後にＩＣ50を計算する。
【数２】
2008514654.tif 000003
【００３７】
（３）ＰＢＭＣ細胞
ウイルス：ＮＬ４−３
方法：新たに採取したＰＢＭＣ（新たに単離したヒト末梢血リンパ球）を回収し、その後、計数し、１２００ｒｐｍで遠心分離し、上清を破棄し、３×１０6細胞／ｍｌの溶液を調製した。培養培地を、ＩＬ２（各１ｍｌの培養培地あたり１μｌの１０００倍希釈のＩＬ２）にて３７℃で一晩前処理した。実験のために、５×１０6を１感染単位として計数した。二連の０．４／ｍｌの同一濃度のＪＨＲ、ウイルスコントロール、および細胞コントロールを用意した。２４ウェルプレートの各ウェルは、薬物溶液中または培養培地中に５×１０6個の細胞を含んでいた。各ウェル中のウイルス負荷が４×１０4ＩＵのＮＬ４．３ウイルス（ＨＩＶ−１）を破壊し、完全に震盪し、１２ウェルプレートに移した。次いで、１．５ｍｌの同一の薬物溶液または培養培地を添加して全体積を２ｍｌとし、３７℃でインキュベートした。３〜４日毎に上清を各ウェルにつき１００μｌ取り出し、−８０℃で保存した。回収終了時に、ＲＴを測定し、薬物群を、ウイルスコントロール群と比較して阻害率を計算した。
【００３８】
結果を以下に示した。
ＭＴ４細胞株：ＩＣ５０＝１３９μｇ／ｍｌ
Ｈｅｌａ−ＣＤ細胞株：ＩＣ５０＝５４．８μｇ／ｍｌ
ＰＢＭＣ細胞（薬草組成物の一成分−ＪＨＲ）：（新たに単離したヒト末梢血リンパ球）、投薬６日目でＩＣ５０＝７７μｇ／ｍｌ
【００３９】
結果は、ＺＬ−１がＨＩＶ−１に対して顕著なｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害効果を有することを示した。
【００４０】
実験２
この薬草組成物のｉｎ  ｖｉｖｏ実験−アカゲザルに対する治療効果
実験動物：実験動物として、Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したそれぞれ４．５〜５．５Ｋｇの５頭の雌および５頭の雄アカゲザル（全部で１０頭）を使用した。アカゲザルに、市販の膨化飼料を与えた。実験前の身体検査で異常は認められなかった。血清ＩＦＡ抗体試験によってＳＩＶ、ＳＲＶ  Ｄ型、およびＳＴＬＶ−Ｉ感染の可能性があるものを排除した。
【００４１】
感染株および投薬量：ＳＩＶｍａｃ２５１株は、Ａａｒｏｎ  Ｄｉａｍｏｎｄ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳのＤａｒｘ博士から提供を受けた。各動物に３ＭＩＤ100ウイルス負荷に等しい１ｍｌのウイルス溶液を感染させた。
【００４２】
投薬および治療プロトコール：本発明者らは、ＺＬ−１およびＡＺＴを提供した。処方物をカプセル化し、動物を、ＡＺＴ溶性薬物処置群およびＳＩＶｍａｃ251感染コントロール群に分けた。各群内に３〜４頭の動物が存在し、同等の雌および雄を含んでいた。ウイルス感染１０日前に、ＺＬ−１処置群の動物に、２カプセルを1日１回、７０日間継続して経口投与し、感染３０分後から、ＡＺＴ溶性薬物コントロール群の動物に１００ｍｇを１日に１回、６０日間継続して経口投与した。ＳＩＶｍａｃ251感染コントロール群には、薬物処置を行わなかった。
【００４３】
感染前および感染後の観察−他の感染前の身体検査に加えて、各サルについて体重測定および採血を行った（全パラメーター試験を行った）。処置中および処置後に一般的観察および試験も継続して行った。所定の時点で、サルから採血して、血漿ウイルス力価、血中ＣＤ4+数、抗体力価を測定した。６０日間の実験終了後、動物を屠殺した。
【００４４】
血漿ウイルスの単離：動物にＳＩＶｍａｃ251を感染させた後、血液サンプルを、それぞれ、７、１１、１４、２１、２８、４２、６０日目に回収し、ヘパリン抗凝固薬によって血漿を分離した。２００μｌから開始して、血漿を、２４ウェルプレート中で５倍に連続希釈した。１０％ウシ血清ＲＰＭＩ−１６４０を添加することによって、各ウェルを１ｍｌにした。次いで、１０5ＳＩＶｍａｃ251の０．６ｍｌのＣＥＭＸ174細胞溶液（感受性株）を分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター中でさらに静置して、３〜４日毎に細胞株を観察し、増殖させた。サンプルのために、接種量が最も低いが典型的な細胞コンフルエンスを示すウイルス力価を選択した。各サンプルについて、全部で８力価（２００μｌ、４０μｌ、８μｌ、１．６μｌ、０．３２μｌ、０．０６４μｌ、０．０１２８μｌ、および０．００２５６μｌ）を選択した。それぞれ、各μｌの血漿ＳＩＶウイルスのＴＣＩＤ値（５、２５、１２５、６２５、３１２５、１５６２５、７８１２５、および３９０６２５）に等しかった。３週間のサンプルの観察後、ウイルス単離結果を判断した。
【００４５】
血中ＣＤ4+数の測定：ＳＩＶｍａｃ251の感染前、感染から１４日後、２８日後、４２日後、および６０日後の動物から血液サンプルを採取した。末梢血リンパ球を単離するために、Ｆｉｃｏｌｌリンパ球分離液を採用した。抗ＣＤ４モノクローナル抗体を直接蛍光でタグ化した後、細胞をＦＡＣＳ装置で計数して、ＣＤ4+率を得た。ＷＢＣ数と日常的な血液試験のＤＣとを組み合わせて、総血中ＣＤ4+リンパ球数を計算した。
【００４６】
１．薬物処置前および処置後のアカゲザル内のＣＤ4＋リンパ球の動的変化
結果：図１および表１に示す。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
上記結果は、サルにＳＩＶを感染させた後、ウイルス負荷が増加する一方で、ＣＤ4細胞数は急激に減少することを証明していた。しかし、ＺＬ−１処置群内で、感染から２および４週間後、４５〜４８％の細胞がウイルス攻撃を生き延び、ＡＺＴ群内の３５％の細胞が保護された。感染から６〜８週間後、ＺＬ−１処置群内の３２〜３８％の細胞が依然として保護された。
【００４９】
２．投薬前後のアカゲザル内のウイルス負荷の変化
結果を以下および図２に示した。
アカゲザル処置実験（アカゲザルのＳＩＶｍａｃ251での急性感染）
投薬後（週）       1         2          3          4
阻害率（%）       17.0%    80.2%      70.7%      70.2%
【００５０】
結果は、薬草組成物がアカゲザルのＳＩＶ感染に対して顕著な阻害効果を有することを証明した。
【００５１】
ＡＩＤＳの伝統的薬剤（ＡＺＴ）は、９０％を超える阻害率でＳＩＶに対して顕著な阻害効果を有している。前記薬草組成物も、顕著な阻害効果を有している。投与範囲内で、阻害率を７０〜８０％に維持することができる。
【実施例３】
【００５２】
本発明の薬草組成物の作用標的
１．ウイルス生活環における作用期の検出
目的：ウイルス生活環の時期（ウイルスの細胞侵入、逆転写酵素、インテグラーゼ、転写、およびプロテアーゼが含まれる）が薬草組成物によってターゲティングされることを観察することを目的とする。ウイルスの「単一生活環」モデルを使用して、薬物作用の標的を研究した。
【００５３】
（１）ＭＡＧＩ法：組換えウイルスは、ＬＴＲおよびＨＩＶを有する。β−ガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を、ウイルス「単一生活環」モデルの一種を形成するように発現させる。上記のように、このモデルは、Ｈｅｌａ−ＣＤ4細胞を染色するために、Ｋ4［Ｆｅ（ＣＮ）6］、Ｋ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］、およびＸ−ｇｅｌを使用する。顕微鏡下での青色細胞は、ウイルス遺伝子の存在を意味する。
【００５４】
（２）ルシフェラーゼ法：
組換えおよびトランスフェクトされたＶＳＶＧウイルスおよびＨ９細胞株を採用した。実験方法は、照明によってルシフェラーゼ活性を検出することであった。ウイルス負荷が多いほど酵素活性が高いことを意味する。
【００５５】
実験方法：ウイルス感染後、細胞を異なる群に分けた。感染から、０時間後、６時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、および３６時間後にこれらを投与した。感染から４８時間後に、ＭＡＧＩ法およびルシフェラーゼ法を採用した。
【００５６】
上記の２つの試験方法は、「単一生活環」の両ウイルスモデルであった。その主な利点は、異なる感染時間がウイルス複製の異なる時期を示すことであった。２〜６時間で、ウイルスは細胞に侵入した。１０〜１４時間で、逆転写期に入った。２０時間後、組換えおよび転写期に入った。結果として、異なる時点での投与は、特異的標的点に作用した。本発明の実験は、ＪＨＲおよびＲｂ３の異なる標的点を分析した。
【００５７】
図３に示すように、結果は、ＺＬ−１が細胞へのウイルス侵入を遮断し、逆転写酵素期およびインテグラーゼ期に作用することを証明した。ハーブ組成物ＺＬ−１中のルビア抽出物（ＣＤ）は、ウイルス侵入期および逆転写酵素期のみで活性である。ジンセノサイド（ＪＨＲ）は、ウイルス侵入期およびインテグラーゼ期に有効であり、ハーブ組成物は任意の単一抽出物よりも優れている。
【００５８】
２．共受容体ＣＸＣＲ４ＣＣＲ５の検出
実験のために、ＭＡＧＩ法を採用した。この方法を、受容体としてＴリンパ球向性リンパ球によってＣＸＣＲ４受容体を検出する上記と同一の方法と共に使用し、ウイルスはＮＬ4であった。マクロファージ向性リンパ球を使用して、ＣＣＲ５受容体を検出し、ウイルスとしてウイルスＹＵ２を使用した。結果を、図４に示した。
【００５９】
図４からわかるように、薬草組成物は、共受容体ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の両方に対して阻害効果を有していた。したがって、効果が、おそらく、Ｔリンパ球およびマクロファージ向性リンパ球の共通のＣＤ4受容体に対する作用またはウイルス−細胞融合時の作用であることを証明することができる。これら２つの共受容体は、ターゲティングされなかった。
【００６０】
３．ＣＤ4受容体に対する作用の検出
ＪＨＲ（薬草組成物の一成分）を、本研究で使用した。
【００６１】
測定にはフローサイトメトリー法を使用した。方法は以下であった：薬物を含むＳｕｐＴ１細胞を、３７℃で２時間同時にインキュベートし、ＰＢＳ＋２％ＦＣＳで洗浄した。４℃の氷浴中で、ＣＤ4ＰＥを添加し、３０分間静置した。さらなる洗浄および遠心分離後、ＣＤ4モノクローナル抗体を添加し、その後、氷浴中で３０分間インキュベートし、再度洗浄および遠心分離を行った後、氷浴中に静置した。細胞を、５０μｌの二次抗体抗マウスＦＩＴＣに２０分間懸濁し、その後、１回洗浄し、３００〜５００μｌのＰＢＳ／２％ＣＳ＋ＰＩ中に懸濁した。ＦＡＣＳ試験を行った。試験結果を、図５に示した。
【００６２】
結果は、ＪＨＲはＣＤ4受容体に対して効果がないことを示した。
【００６３】
４．ウイルス膜貫通タンパク質ｇｐ４１の検出
本研究では、ＣＤおよびＪＨＲを採用した。ＣＤは、ルビア（本薬草組成物の一成分）である。ｇｐ４１（膜貫通タンパク質）の抱合効果の結果を、図６および７に示した。遺伝子組換えされたｇｐ４１を、ＢＩＡＣＯＲＥ分析器のチップ上に配置した。一定濃度のルビアまたはＪＨＲ抽出物の添加後、装置は、抱合しているかどうかを検出することができる。ＣＤおよびＪＨＲは共にｇｐ４１との抱合を示した。
【実施例４】
【００６４】
本発明の薬草組成物と他のＡＩＤＳ治療薬との組み合わせ投与
目的：ＺＬ−１とＡＺＴとの間に任意の相乗効果が存在するかどうかを観察することを目的とする。ＺＬ−１−ＪＨＲ薬の一成分を使用する。
【００６５】
方法：実験のために、ＭＡＧＩ試験法を採用した（上記と同一）。
１  単一薬剤の投与：
１μＭ〜３．９ｎＭのＡＺＴ（ＡＺＴ１〜５と指定した５回の投与）
４００μｇ／ｍｌ〜１．５６μｇ／ｍｌのＪＨＲ1〜5（５回の投与）
それぞれ得られたＩＣ50
２  組み合わせ適用
１つのサンプルとしての半分のＡＺＴ＋半分のＪＨＲ−１
ＡＺＴ１＋任意のＪＨＲ１〜ＪＨＲ−５のいずれか
ＡＺＴ２、ＡＺＴ３、ＡＺＴ４、ＡＺＴ５を、ＪＨＲ−１〜ＪＨＲ−５のいずれかと組み合わせた。したがって、全部で２５種の濃縮物の組み合わせを使用することができる。各濃縮物を、二連のウェル（２ウェル）中に配置した。細胞コントロールおよびウイルスコントロールのために、さらなる群を採取した。
３  阻害率についての各薬物組み合わせのウイルス群との比較。各薬物組み合わせの阻害率を、単一ＡＺＴ  ＩＣ50と比較して相違を得た。
【００６６】
以下の表２は、ＪＨＲ−１とＡＺＴとの組み合わせ使用による結果を示す。
【００６７】
【表２】
2008514654.tif 000005
【００６８】
表２に示すように、薬草組成物は、ＡＺＴと相乗薬物効果を有する。最大投与群では、７．９倍に増強することができる。
【実施例５】
【００６９】
プロテアーゼインヒビターに耐性を示すＨＩＶ株に対する本発明の薬草組成物の一成分の阻害効果
本発明者らは、プロテアーゼインヒビターに耐性を示すＨＩＶ株に対する本発明の薬草組成物の阻害効果をさらに研究した。
【００７０】
ＨＩＶ−１ウイルスは、５．７×１０4ＩＵ／ｍｌで発病力を有するプロテアーゼインヒビターに耐性を示す株であった。Ｈｅｌａ−ＣＤ4細胞を採用した。ＭＡＧＩ試験法を使用して、ＪＨＲの効果を観察し、任意の交差反応性を示すかどうかを調査した。結果は、ＪＨＲの用量は０．４ｍｇ／ｍｌであり、５μｌまたは８μｌのウイルスの阻害率はともに１００％もの高さであることを示した。これらにより、プロテアーゼインヒビターに耐性を示す株に対するいくらかの効果が証明された。結果を、表３に示す。
【００７１】
【表３】
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【実施例６】
【００７２】
本発明の薬草組成物の安全性実験
（Ａ）本発明の薬草組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの治療指標の検出を、表４に示す。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
（Ｂ）本発明の薬草組成物のｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性実験
（１）急性毒性実験の結果は、ラットにおける２０ｇ／ｋｇを超える用量での胃内投与で毒性が認められなかったことを示す。
（２）亜急性毒性実験の結果は、６ヶ月間の連続胃内投与後に、大量、中程度の量、および少量の投与群でラットは正常に成長し、ＣＤを使用してＡＺＴ、ＢＵＮ、ＲＢＣ、ＷＢＣは全て正常であり、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、肺、膵臓、脳、精巣、および卵巣などの器官の病理学的スライドにおいて異常は認められないことを示す。
【実施例７】
【００７５】
本発明の薬草組成物の臨床試験
患者の供給源：２００２年に、シンカイおよびシャンチウ（河南省）１，０００人の患者を治療した後、６０人の患者から採血した。サンプル選択時、被験体は、１９９２年から１９９５年までに他の者からの血液提供によってＨＩＶに感染した被験体であった。２７〜５８歳の１９人の男性および４１人の女性の合計６０人であった。年齢の中央値は３８．９歳であり、全員が農業従事者であった。そのうち、５９人がＨＣＶ−Ａｂ試験で陽性であり、７人が梅毒ＰＰＲ試験で陽性であり、２人がＴＢに二重感染しており、全員がＨＢＶ試験で陰性である。
【００７６】
投与法（４カプセルを１日３回経口投与）
１．処置前後のウイルス負荷の変化
患者の血液サンプルを、処置前および処置から６ヶ月後に採取した。血漿を遠心分離し、−８０℃で保存した。測定時、Ｒｏｃｈｅｒの定量ＲＮＡ  ＰＣＲおよび試薬キットの説明書にしたがって、第１のＲＮＡサンプルを採取し、Ｒｏｃｈｅｒ装置を使用してウイルス負荷（ＶＬ）を測定した。結果を、表５に示す。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
２．処置前後のＰ24−Ａｇの変化
上記サンプルのＰ24−Ａｇを測定するためのＭｉｃｒｏｅｌｉｓａ法および試薬の使用。結果を、表６に示す。
【００７９】
【表６】
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【００８０】
表６中の結果に示すように、薬草組成物の採取後、患者の血漿中のＶＬは、治療６ヶ月後に非常に低下した。７０％の患者が変化せず、３０％で値がわずかに上昇した。
【００８１】
３．処置前後のＣＤ4測定
回収した血液サンプルについて、全血に対してフローサイトメトリーを実施してＣＤ4を測定した。結果を表７に示す。
【００８２】
【表７】
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【００８３】
表７の結果からわかるように、患者の血中ＣＤ4レベルは、薬草組成物の摂取後に顕著に上昇した。薬草組成物は、患者の血中ＣＤ4レベルを増強することができることが示された。投与から１ヶ月間でＣＤ4数は倍増した。より多くの投薬を行った場合、ＣＤ4数は、継続的に急上昇した。６ヶ月以内の増加は、１５６．７％であった。ＣＤ4数は、３００に近づいた。通常のＣＤ4の標準数は、回収時に２００を超えるが、患者では２００未満である。
【００８４】
さらに、中国本土でＡＩＤＳ患者に現在使用されている補助的投薬は、３０％〜５０％の被験体で患者の血中ＣＤ4レベルを増強する論理的根拠に基づいて承認されなければならない。本発明者らは、６ヶ月間の薬草組成物（ＺＬ−１）での処置後の全血ＣＤ4レベルも測定した。結果を、図８に示した。図８では、薬草組成物により、８６％の患者でＣＤ4レベルが３０％を超えて増強され、８０％の患者で５０％を超えて増強され、３７％の患者で４００倍に増強された。
【００８５】
４．処置前後の臨床症状の変化に関する患者６０人の所見。結果を、表８Ａ、８Ｂに示す。
【００８６】
【表８Ａ】
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【００８７】
【表８Ｂ】
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【００８８】
上記データにより、臨床症状および徴候が顕著に改善されたことが証明された。
【実施例８】
【００８９】
本実施例は、遼寧省出身のＮｉＸＸと名付けた３２歳の患者の典型的に症例を記載する。本発明の薬草組成物での処置前後のウイルス負荷の変化を表９に示す。投与法は、実施例１と同一である。
【００９０】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＺＬ−１処置サルにおけるＣＤ4＋リンパ球の動的変化を示す図である。
【図２】ＳＩＶ感染サルのウイルス複製に対する薬草組成物の阻害効果を示す図である。
【図３】ルビア（ＣＤ）、ジンセノサイド（ＪＨ）、および本発明の薬草組成物（ＺＬ−１）の作用標的の研究を示す図である。
【図４】ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の共受容体に対する薬草組成物の効果を示す図である。
【図５】ＣＤ4受容体に対するＪＨＲ（薬草組成物の一成分）の効果の試験結果を示す図である。
【図６】ルビア（ＣＤ）およびｇｐ41（膜貫通タンパク質）の抱合効果を示す図である。
【図７】ｇｐ41へのジンセノサイド（ＪＨＲ）の抱合効果を示す図である。
【図８】６ヶ月間ＺＬ−１処置を受けた患者のＣＤ4の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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