(57)【要約】本発明は、モノリス状物体、その調製のための方法、および特に選択的な生体高分子の精製および分離のためのその使用に関する。クロマトグラフィー分離材料が、選択的、効率的および再現可能な生体高分子の精製および分離を可能にする新規のモノリス状物体を用いて与えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の処理段階を含む方法によって得られるモノリス状物体：
ａ）二酸化ケイ素を反応容器に入れる；
ｂ）少なくとも一種類以上のアルカリケイ酸塩およびホウ酸カリウムを含む溶液Ａの添加、
ｃ）少なくとも一種類以上の細孔形成剤および水を含む溶液Ｂの添加、
ｄ）少なくとも一種類の有機アミドの添加、および
ｅ）反応混合物の乾燥。
【請求項２】
ホウ素０．１〜０．３％を含む点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項３】
ホウ素０．１５〜０．２５％を含む点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項４】
ホウ素０．１８〜０．２２％を含む点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項５】
ポリアルコール、好ましくはエチレングリコール、ジエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、特に好ましいポリエチレングリコール、グリセロールおよびジグリセロールおよびそれらの混合物が細孔形成剤として用いられる点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項６】
ホルムアミドおよび／または尿素が有機アミドとして用いられる点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項７】
反応混合物が最大２０時間４０℃〜６０℃にて乾燥される点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項８】
一種類以上の遷移金属塩を含む水溶液Ｃが溶液Ａに添加される点で特徴づけられる、請求項１に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
【請求項９】
銅、亜鉛および／またはマンガン塩の水溶液が溶液Ｃとして用いられる点で特徴づけられる、請求項８に記載のモノリス状物体。
【請求項１０】
反応混合物が
ケイ酸カリウム３５〜８５％、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル０．１〜２５％、
水０．１〜３０％、
少なくとも一種類の細孔形成剤０．１〜１２％、
少なくとも一種類の有機アミド６〜１２％、
ホウ酸カリウム０．１〜５％、
少なくとも一種類の遷移金属の塩０〜１０％
である点で特徴づけられる、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体。
【請求項１１】
反応混合物が好ましくは
ケイ酸カリウム（２８／３０）５０〜６０％、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル５〜１０％、
水１０〜２５％、
ポリエチレングリコールおよび／またはジエチレングリコール３〜６％、
ホルムアミドおよび／または尿素５〜１０％、
ホウ酸カリウム０．５〜２％、
グリセロール０〜２％および
少なくとも一種類の遷移金属の塩０〜１０％
である点で特徴づけられる、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体。
【請求項１２】
生体高分子の精製および分離のためのクロマトグラフィー分離材料としての、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体の使用。
【請求項１３】
生体高分子の選択的分離のためのクロマトグラフィー分離材料としての、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のモノリス状物体、その調製のための方法、および生体高分子の精製および分離のためのその使用に関する。
【０００２】
バイオテクノロジーの分野における進歩する自動化および小型化のため、特に、微量の試料の迅速および効率的な処理のための方法が近年ますます求められている。特に、完全自動化された高処理量作業端末の使用は、非常に多数の試料を可能な最短時間で処理できる一方で同時に最小量の生物試料が再現可能に検出されうる発展をますます要求する。これに関連して、たとえばいわゆるマイクロタイターまたはマルチウェルプレートのような、特にフィルターおよび分離器具の小型化が需要がある。通常の９６ウェルプレートに加えて、３８４ウェルおよびウェル当たり容量５０μｌのプレートが一方で既に標準である。さらに、ウェル当たり容量５〜１０μｌの１５３６ウェルプレートも先般から入手可能である。
【０００３】
しかし、生体高分子の精製および分離用の従来のフィルター材料に関しては、特にフィルターおよび分離材料が他方で生体高分子の精製において非常に良好な選択特性および高い結合能を示さなければならない場合は、そのような小型のセルの使用については技術的進歩は限界に達している。
【０００４】
このように、９６ウェルプレート用の現在入手可能なガラス繊維およびシリカ膜は、フィルターおよび分離表面が満足なレベルの効率および結合能を達成するためには小さすぎるため、３８４ウェルプレートにおける使用のためには限られた適性しかない。さらに、増加した製造費に加えて、打ち抜かれた小型膜はしばしば薄すぎ、およびそのため、より高い製造コストがかかるが、たとえば追加の基礎板および／またはウェル内に挿入可能な他の安定具のような補助無しには不安定すぎてウェル中で使用できない。
【０００５】
加えて、経時変化のために、 従来の ガラス繊維およびシリカ膜は短期間後でさえ相当な効率を失うので、それらは長期保存に適しない。その上、経時変化した膜の活性化は非常に不便であるだけでなく、再現可能な結果を達成するにはしばしば不適当である。
【０００６】
これに関連して、クロマトグラフィーの分野では、モノリスフィルターおよび分離材料は現在、キャピラリーカラムの調製において絶えず重要度を増している。ここでは、いわゆるゾル−ゲル法を用いて、重合可能な低分子量化合物（ゾル）がまず調製され、それが次に重合反応で凝集化または重合化材料（ゲル）に変換される。その反応は各クロマトグラフィーカラム内で直接起こる。これらの方法は、しかし、非常に小さい直径（＜３００μｍ）のキャピラリーカラムだけに適しており、なぜなら無機モノリスフィルターおよび分離材料は特に通常は相当に収縮しやすいため、それによってモノリスフィルターおよび分離材料および分離器具の間にデッドボリュームが生じ、それはカラムの分離特性を大きく損なうからである（ＤＥＯＳ１００２８５７２）。そのようなデッドボリュームを除去するため、フリットの重合およびその後の経時変化および乾燥の後、分離器具を再び重合溶液で満たしおよび調製方法のすべての段階を繰り返すことが提案されている。しかし、新たな重合が実施できる前に、経時変化したフリット材料をまず活性化溶液で再活性化しなければならず、それは全体として非常に時間およびコスト集約的な調製工程に繋がる。
【０００７】
これらの複数回重合化されたモノリスフリットの他の不利益はまた、それらの構築のため、それらは安定性がより小さく、および結果としてモノリス材料の摩耗もまたフィルターまたは分離器具の直径の増加に伴って増えることである。特に、加圧器具との併用はしばしば、摩耗の増加による汚染に繋がり、これは今度は、以降の分析段階における干渉、または誤った結果にさえ繋がりうる。
【０００８】
公知のクロマトグラフィー分離材料の先端技術における上述のような不利益を克服するために、本発明の基礎を成す目的は、選択的生体高分子の精製および分離ならびに、特に自動化および／または小型化分析手順において、多数の試料の効率的および再現可能な処理を可能にする、安定なフィルターおよび分離材料を提供することである。フィルターおよび分離材料はまた、保存中に安定でありおよび長期保存後に速やかに使用可能であるべきである。
【０００９】
この目的は、下記の処理段階を含む方法によって得られたモノリス状物体の本発明に記載の提供によって解決された：
ａ）二酸化ケイ素を反応容器に入れる；
ｂ）少なくとも一種類以上のアルカリケイ酸塩およびホウ酸カリウムを含む溶液Ａの添加、
ｃ）少なくとも一種類以上の細孔形成剤および水を含む溶液Ｂの添加、
ｄ）少なくとも一種類の有機アミドの添加、および
ｅ）反応混合物の乾燥。
【００１０】
上記で示されるモノリス状物体は本発明にしたがって重合処理によって得られる。処理段階ａ）によるとコロイドシリカゲルがまず反応容器に入れられる。本発明の好ましい一実施形態によると二酸化ケイ素が次いで水系二酸化ケイ素分散物またはシリカゲルの形で添加される。粒径、二酸化ケイ素含量および安定化の種類（たとえばアンモニア、水酸化ナトリウム溶液などの中で安定化）が互いに異なる、さまざまな市販の二酸化ケイ素分散物を使用できる。凝塊化シリカゲルに加えて、本発明によるとコロイドシリカゲルを使用できる。本発明の意味では凝塊化とは、平均粒子直径約４０ｎｍの架橋した非多孔性の球状二酸化ケイ素が水中に存在することを意味する。本発明の特に好ましい一実施形態によると、二酸化ケイ素は小さい二酸化ケイ素粒子の水系コロイド分散物の形で存在する。これらは単分散性または多分散性コロイド二酸化ケイ素分散物、たとえば、ルドックス（Ｌｕｄｏｘ）（ＷＲグレース社（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．）、米国コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ））、またはレバシル（Ｌｅｖａｓｉｌ）（バイエルＡＧ社（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）、ドイツ・レーバークーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ））などであり、本発明の意味ではコロイドとは、架橋していない個別の球状二酸化ケイ素粒子が水中に存在することを意味する。好ましくは、そのようなコロイド分散物は、重量で３０〜５０パーセント、好ましくは重量で４０〜４５パーセントの、平均粒子直径５〜１００ｎｍ、好ましくは１０〜４０ｎｍ、特に好ましくは１５〜２５ｎｍを有する二酸化ケイ素粒子を含む。
【００１１】
本発明の方法の処理段階ｂ）によると、溶液Ａが次に、存在する二酸化ケイ素に添加される。これは少なくとも一種類以上のアルカリケイ酸塩および市販のホウ酸カリウム（ハニーウェル・スペシャル・ケミカルズ社（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）、ドイツ・ゼールツェ（Ｓｅｅｌｚｅ））を含む。驚くべき発見であった通り、特に本発明に記載のモノリス状物体へのホウ酸カリウムの添加は、メソポアの孔表面での結合特性の改善に繋がり、およびそのようにして共同的に、単離された生体高分子のより高い収量へ繋がる。しかし、ホウ酸カリウムを反応混合物中で溶解するためには、好ましくはアルカリケイ酸塩溶液に溶解する。本発明の意味ではアルカリケイ酸塩は、ケイ酸のアルカリ塩、特にケイ酸ナトリウムおよびカリウムであると理解される。本発明の好ましい一実施形態によると、溶液Ａの調製において重量で０．１〜４パーセント、好ましくは重量で０．５〜２パーセント、特に好ましくは重量で０．５〜１．０パーセントのホウ酸カリウム（反応混合物全体に対して相対的に）を、好ましくは、たとえば、コグニス・ドイツ社（Ｃｏｇｎｉｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ．）ドイツ・デュッセルドルフ（Ｄueｓｓｅｌｄｏｒｆ））の好ましい二酸化ケイ素含量２０．５％を含むケイ酸カリウム２８°／３０°Ｂe（２８／３０ボーメ、密度１．２４０／１．２６１ｇ／ｃｍ3に相当）のような市販の無色コロイドケイ酸カリウム溶液に溶解する。
【００１２】
本発明に記載のモノリス状物体のさらに大きい機械的安定性を達成するために、恒久的なマクロポーラス・ポリマーが必要である。これらは分散相中の適当な細孔形成剤の存在によって形成される。したがって、さらなる処理段階ｃ）で少なくとも一種類以上の細孔形成剤および水を含む溶液Ｂが添加される。水溶性化合物は、添加される孔形成物質（いわゆる孔形成剤または細孔形成剤）として有益に用いられる。水溶性または混和性の高い界面活性剤および／または乳化剤が特に適している。そのような孔形成剤が知られている。本発明にしたがって用いられる細孔形成剤は、モノマーに関しては熱力学的に良好な溶媒で、しかしポリマーに関しては悪い溶媒であるべきであり、なぜならこれらは非常に遅い相分離に繋がるからである。この方法で反応混合物の均一性は有益に確実になり、これは非常に安定した透過膜を有するモノリス状物体の調製に繋がる。主に互いに連絡した連続的なマクロポアの膜が細孔形成剤の添加によって生じる一方、メソポアマクロポアの壁に位置するメソポアもまた、添加されたコロイドによって形成される。
【００１３】
本発明の好ましい一実施形態によると、溶液Ｂの調製において、ポリアルコールが細孔形成剤として好ましくは用いられる。エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロールおよび／またはジグリセロール；だけでなくポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もまた特に適している。上に示す化合物すべてが個別にまたは混合物として存在しうる。
【００１４】
驚くべきことに、本発明に従って形成されたモノリス状物体の安定性は、水に溶解した一種類以上の上に示す細孔形成剤の添加によって大幅に増大されうる。ここでは水（蒸留水または完全脱イオン水）の容量は孔形成に顕著な影響を有する。使用する細孔形成剤に応じて、水約１〜４ｍｌ、好ましくは水２〜３ｍｌが、細孔形成剤を溶解するために、または５〜４０％、好ましくは１０〜２０％細孔形成剤溶液の調製のために有益に用いられる。
【００１５】
これに関連して、ＰＥＧ（たとえばＰＥＧ３０００／フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、スイス、ブーフス（Ｂｕｃｈｓ））およびグリセロール（メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））またはジグリセロール（フルカ社、スイス、ブーフス）の水との混合物の使用は非常に特に有益であることが証明されている。このようにして調製されたモノリス状物体は、最適平均孔直径および狭い孔径分布を有する孔を示す。これは、本発明に記載のモノリスの特異的表面の増加、およびしたがって関連して結合能の増加に有益に繋がる。さらに、たとえばろ過手順などの間の、特に加圧装置の追加的な使用中の、グリセロールおよび／またはジグリセロールの添加によって、形成されたモノリス状物体の摩耗が顕著に低減または回避さえされうる。さらに、グリセロールの量の増加は、本発明に記載のモノリスのより均一な構造に繋がる。
【００１６】
現在のゾル−ゲル法から知られている通り、ｐＨ値を低下させる物質、たとえば有機酸または無機酸が、ゲル形成を開始するため、つまりゾル形からゲル形への反応混合物の変化のための開始剤として反応混合物（ゾル）に添加される。しかし、有機酸または無機酸は、ｐＨ値の非常に急速な低下を引き起こすという欠点を有し、これは結果として、即時のゲル形成に繋がり、ゲル形成は形成すべきモノリス状物体の形状および大きさ次第で不均一または不完全でさえありうる。特に、対応する成型器具への反応混合物の移送は、時間遅延的なゲル形成を必要とする。本発明の意味においては、成型器具は、一方では生体高分子の精製および分離に用いられる市販の器具、たとえばスピンカラム、マルチウェルプレート、ピペットチップなど、および他方ではフリット、ペレットの製造に用いられる成型器具またはモノリスフィルターおよび分離材料のすべての他の考えられる形（たとえば、球、円柱など）と理解される。本発明の好ましい一実施形態によると、塩基性条件下で熱分解しおよび加水分解を通じて反応混合物のｐＨ値を低下させる低分子量化合物が反応混合物に添加され、重縮合反応が開始される。驚くべきことに、有機アミドの使用が、特に有益に均一なおよび低速のゲル形成を可能にすることが見出された。したがって、本発明の特に好ましい一実施形態では、少なくとも一種類の有機アミド（たとえばポリアクリルアミド、アセトアミド、尿素、ホルムアミドなど）が、処理段階ｄ）の通りの反応混合物へ続いてゆっくり添加される。これに関連して、市販のホルムアミドおよび／または尿素（メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））の使用は非常に特に有益であり、なぜならこれらの化合物は低分子量化合物の形成を伴って分解して調製手順中に脱出し、または形成されたモノリス状物体から後で容易に除去でき、および従って、本発明に記載のモノリスを用いて実施される分析中に干渉または誤った結果に繋がらないからである。
【００１７】
これらの化合物のさらに大きな利点は、ホルムアミドおよび／または尿素で処理された反応混合物は、添加後３０分以内にゲル形成処理に対する悪影響無しに各成型器具へ移すことができる点である。
【００１８】
後の使用目的に適した成型器具中への反応混合物の移動または重合の成功後、本発明に記載のモノリス状物体の形成のために、ゲル形を処理段階ｅ）に従って乾燥する。乾燥は、約１２〜２５時間、好ましくは１７〜２２時間、特に好ましくは最大２０時間、３０〜８０℃にて、好ましくは４０〜６０℃にて、適当な乾燥器具、たとえばオーブン、乾燥キャビネットまたは乾燥庫などで実施される。
【００１９】
処理段階ａ）〜ｄ）の間に、反応混合物は、反応混合物中の抽出物の均一な分布を達成しおよびそれによって本発明に記載のモノリス状物体の均一な構造形成を連帯して確実にするため、たとえば振とう、撹拌、ボルテックスによって、または超音波などの使用によって、連続的な動きに有益に保たれる。                                                                                              
【００２０】
本発明に記載の調製手順に基づき、予め定められた孔径および予め定められた孔径分布を有するモノリスフィルターおよび分離材料を調製することがこのように可能である。これらは、生体高分子の精製および分離のためのクロマトグラフィー分離材料としての使用中に明らかな長所を示す。特に、ガラス繊維膜のような従来のフィルターおよび分離材料と対比して、本発明に記載のモノリスはより大きな安定性および結合能によって特徴づけられる。
【００２１】
驚くべきことに本発明に従って形成されたモノリス状物体のこれらの有益な特性は、フィルター材料中へのホウ素（ホウ酸カリウムの形で）の組み込みによって増強される。特に、本発明に記載のモノリス状物体の調製中の、メソポアの有益な孔径の形成は、ホウ素化合物の添加によって影響されまたは調節さえされうる。
【００２２】
結合能の有意な増大のような、特に有益なフィルターおよび分離特性が、ホウ素０．１〜０．３％、好ましくはホウ素０．１５〜０．２５％ホウ素、特に好ましくはホウ素０．１８〜０．２２％の重量画分を含む本発明に記載のモノリス状物体によって示された。
【００２３】
上に記載される方法の別の長所は、本発明に記載のモノリス状物体の形成に必要な抽出物を、たとえばピペットチップまたは３８４マルチウェルプレートなどのような非常に小型の賦形器具へ簡単におよび迅速に導入でき、およびモノリス状物体がその場（ｉｎ ｓｉｔｕ）で形成されうることである。
【００２４】
さらに、最も異なる成型器具の使用もまた有効でありおよび費用を要しない。従来のガラス繊維プレート（特に３８４マルチウェル形式の）とは異なり、本発明にしたがって調製された成型物体は、クランプ環および基礎プレートを有しない任意の構造を用いて、より経済的におよび迅速に調製されうる。加えて、本発明にしたがって調製された成型物体は、使用後に迅速に新しいものと交換でき、材料についてさらにコスト削減に繋がる。さらに、ペレット製造は特に、本発明に記載のモノリス状物体の迅速および可変的な使用に好ましくなる。それらは同じ良好なおよび再現可能な分離特性を有し、およびまた、直径および密度を容易に変化させることができる。
【００２５】
さらに、本発明に関連して、驚くべきことに、本発明に記載のモノリス状物体は生体高分子の選択的分離のためのクロマトグラフィー分離材料として等しく適していることが見出された。これは、まずメソポアの孔径の標的調整によって達成される。本発明に記載の別の一実施形態では、しかし、メソポア内の結合化学は、一種類以上の遷移金属が本発明に記載のモノリス状物体の構造中に組み込まれうるかまたは本発明に記載のモノリス状物体中に形成される孔の表面に結合されうるような方法で随意的に影響される。この目的のために、一種類以上の遷移金属塩を含む水溶液Ｃが、本発明に記載の方法の前に調製される。
【００２６】
本発明のモノリス状物体中への遷移金属の組み込みのためには、本発明に記載の方法の開始時に、溶液Ｃを溶液Ａと混合する。明らかになったように、銅、亜鉛、および／またはマンガン塩の水溶液、好ましくは硫酸銅０．２〜１．７重量パーセントまたは過マンガン酸カリウム０．８〜２．９重量パーセントを含む溶液が得に適している。
【００２７】
本発明に記載のモノリス状物体中に形成されるメソポアの特に表面への遷移金属の結合のためには、乾燥したフィルターまたは分離材料を溶液Ｃに浸漬し、および約１８時間室温にて乾燥する。代替的に、材料特性に応じて、より迅速な乾燥を１３０℃にて実施できる（実施例１ｂおよび３参照）。使用する溶液は本質的にジルコニウムおよび／またはチタン塩の溶液、好ましくは１〜１０％ＺｒＣｌ4またはＴｉＣｌ4溶液であり、ここでこれらの化合物はまた、他の標準溶媒（たとえばジエチルエーテル、ＴＨＦ、など）に溶解されうる。
【００２８】
要約すると、本発明の好ましい一実施形態によると、本発明に記載のモノリス状物体は下記の組成の反応混合物を用いて調製されることが明らかになる（重量パーセントでの詳細）：
【００２９】
ケイ酸カリウム３５〜８５％、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル０．１〜２５％、
水０．１〜３０％、
少なくとも一種類の細孔形成剤０．１〜１２％、
少なくとも一種類の有機アミド６〜１２％、
ホウ酸カリウム０．１〜５％、
少なくとも一種類の遷移金属の塩０〜１０％。
【００３０】
下記の組成の反応混合物が特に好ましい（重量パーセントでの詳細）：
ケイ酸カリウム（２８／３０）５０〜６０％、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル５〜１０％、
水１０〜２５％、
ポリエチレングリコールおよび／またはジエチレングリコール３〜６％、
ホルムアミドおよび／または尿素５〜１０％、
ホウ酸カリウム０．５〜２％、
グリセロール０〜２％および
少なくとも一種類の遷移金属の塩０〜１０％。
【００３１】
下記で付属の図および実施例におけるさらなる実験詳細によって本発明をより詳細に説明する。
【００３２】
図１および図２に示す本発明に記載のモノリス状物体の写真から、反応混合物へのポリエチレングリコールの添加によって顕著に大きいマクロポアが生じ、それはより良好な流速を示すことが明らかに見られる。マクロポアおよびメソポアの孔径およびそれらの各比表面の測定は電子顕微鏡法によって実施された。試料の比表面は約１０ｍ2ｇ-1である。
【実施例】
【００３３】
実施例１：本発明に記載のモノリスの一般的調製
まず溶液Ａおよび溶液Ｂが調製された（表１参照）。さまざまな量の市販のコロイド二酸化ケイ素を次いで５０ｍｌＰＥ容器へ入れ、その中へ溶液Ａおよび溶液Ｂをゾル形成のために連続撹拌しながらゆっくりピペットで加えた。ゲル形成のために、わずかに濁ったしかし沈澱のない反応混合物（ＲＧ）に、さまざまな量のホルムアミド（表１参照）を加えた。次に、有機アミドの添加の３０分以内に、反応混合物それぞれ１５０μｌを、（たとえば粘着テープなどで）出口を最初閉じた（１）市販のスピンカラムまたは（２）市販のウェルプレートの孔へピペットで加えた。重合後、成型器具の一部の上側の入口もまた覆った。最後に、成型器具を乾燥キャビネット内で２０時間４０℃に加温した。
【００３４】
重縮合および／または乾燥手順中に成型器具を覆うことによって、本発明に記載のモノリス状物体のより低速の乾燥が起こり、そのことがモノリス構造のより一貫した形成をさらに促進したことが実証された。
【００３５】
ａ）さまざまな成型器具の使用
（１）スピンカラム中で得られたモノリスはスピンカラムの下部を完全に満たした。クランプ環を挿入することによってモノリスはスピンカラム中に固定され、および血液試料、ラット肝臓組織およびラット脳組織からのゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの単離に直接用いられた。
【００３６】
（２）ウェルプレートから得られたモノリスペレットをウェルプレートから取り出しおよびピンカラム中に固定した。そのように準備されたスピンカラムが、血液試料、ラット腎臓組織およびラット脳組織からのゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの単離に直接用いられた。スピンカラム中でのペレットの特に良好な固定を確実にするために、スピンカラムの内径より大きい直径のペレットの調製のためにウェルプレートを使用した。これは、クランプ環の使用を不必要にし、および本方法の費用対効果をより高めた。
【００３７】
ｂ）本発明に記載のモノリスの乾燥時間
本発明に記載のモノリスの乾燥時間を調べるために、調製したゲルを型器具に入れ、およびこれらを乾燥キャビネット内で約４０℃に加温した。形成されたモノリスフリット（成型物体）が乾燥にどれだけの長さ必要かを決定するために毎時間チェックした。実施した実験系列に基づいて、本発明に記載のモノリスは約２時間の反応時間後に硬化しおよび一定の安定性を有したことを実証できた。しかし、それらは、それらを用いて分析結果の成功を得られるような形でシリカ摩耗を防ぐためにはまだ安定性が不十分であった。フリットの完全な性能は１７〜２０時間後に最初に達成された。
【００３８】
さらに、乾燥時間は収縮に関係しうることが実証された。高温および迅速な乾燥時間は、低温で低速の乾燥でよりも小さい収縮を結果として生じた。乾燥温度の限界はしばしば、成型材料の材質によって決定される。それは、まだ未乾燥の成型物体が成型器具から取り出される場合、最大４００℃までの温度が適当であることを意味する。
【００３９】
反応混合物の分離はゲル化中の連続的振とうによって阻害できることが示されていたため、たとえばマイクロ波照射またはサーモミキサーの使用による乾燥中に、反応混合物の可能な相分離が防げるかどうか、および防げる程度もまた調べた。これは、均一な構造の本発明に記載のモノリスの有意により均一な構造に、およびしたがってより高い容量に有益に繋がった。サーモミキサー中で３０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃にて試料を完全に縮重合するのがとくに有益であることが見出された。
【００４０】
本発明に記載のモノリス状物体に由来する、調製に関連する不純物が、分離段階中、特に高感度分析手順中に分析結果に干渉しないことを確実にするため、形成されたモノリス状物体をその後随意的に、蒸留水で１回または数回再洗浄しおよび次いで４０〜１２０℃にて乾燥した。
【００４１】
ｃ）本発明にしたがって調製されたモノリスの比較
本発明にしたがって調製されたモノリスを互いに比較可能にするため、モノリスを異なる組成の一連の反応混合物から調製しおよびそれらの特性を調べた。この下記の選ばれたものは典型的でありおよび本発明に記載のモノリスの特性を説明するのに役立つ。
【００４２】
【表１】
2008508505.tif 000002
【００４３】
安定性および摩耗ならびに色および形状の目視試験に加えて、最初に容量試験を実施した。この目的のために、ゲノムデオキシリボ核酸（ｇＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を特にさまざまな生物試料から精製した。精製は、本発明にしたがって調製されたモノリスカラム材料を用いて、および参照として従来のガラス繊維カラム材料を用いて実施した。好ましくはＲＮイージー（Ｒｎｅａｓｙ）およびキアプレップ（Ｑｉａｐｒｅｐ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を参照材料として用いた。加えて、試料材料に応じて、精製をそれぞれの現行の精製手順書，たとえば『キアンプＤＮＡブラッドミニ手順書（"ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｐｒｏｔｏｃｏｌ"）』または『ＲＮイージーミニ手順書（"ＲＮｅａｓｙ ＭＩＮＩ ｐｒｏｔｏｃｏｌ"）』などに従って実施した。
【００４４】
反応混合物ＲＧ１〜５から調製されたモノリスを用いた容量測定に基づいて、たとえば各物質の影響について予測できる。このようにして、表２によるとたとえばホウ酸カリウムの使用は、本発明に記載のモノリスの容量の増加に顕著に寄与する。
【００４５】
【表２】
2008508505.tif 000003
【００４６】
本発明に記載のモノリスにおけるホウ酸カリウムの使用によって、従来のスピンカラム材料の容量と比較して容量に最大３０％以上の増加が達成されたことが証明された。
【００４７】
同様に、本発明に記載のモノリスの特性は反応混合物中のホルムアミドの量の変化によってさらに改善され得たこともまた示すことができた。このように、摩耗はホルムアミドの量の増加による容量損失無しに完全に回避できた。
【００４８】
【表３】
2008508505.tif 000004
【００４９】
さまざまな量の細孔形成剤における変化もまたモノリス構造の改善に寄与した。特に、グリセロールおよび／またはジグリセロールの添加によってモノリス構造がより均一になったことが明らかになった。さらに、グリセロールおよび／またはジグリセロールの添加はまた、摩耗の防止にも寄与した。
【００５０】
【表４】
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【表５】
2008508505.tif 000006
【００５１】
より均一なモノリス構造の別の長所として、細孔形成剤の使用はまた、ＲＮＡ収量に有意な増加をもたらしたことが明らかになった（実施例２も参照）。
【００５２】
実施例２：ＲＮＡ選択的モノリスの調製
ａ）硫酸銅を含むＲＮＡ選択的モノリスの調製
溶液Ｃの調製のために、硫酸銅１５．９ｍｇ（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、スイス、ブーフス（Ｂｕｃｈｓ））および３９．８ｍｇ酒石酸カリウム（フルカ社、スイス、ブーフス）を水０．５ｍｌに溶解しおよび水酸化カリウム１５．０ｍｇ（フルカ社、スイス、ブーフス）でゆっくり処理した。結果として生じる青色の懸濁液を、実施例１の通りに調製した溶液Ａ中へボルテックスしながらピペットで加えた。透明青色の溶液が生じた。これを５０ｍｌポリエチレン容器に入ったコロイド二酸化ケイ素０．５ｍｌへピペットでゆっくり加えた。次に、同様にボルテックスしながら、水２ｍｌに溶解した３６０ｍｇのＰＥＧ３０００および４０ｍｇのグリセロールを含む溶液Ｂをゆっくり加えた。ホルムアミド０．５ｍｌの添加後、各回１００μｌの溶液を、対応して準備したスピンカラムにピペットで入れ、および乾燥キャビネット中で２０時間４０℃に加温した。組織試料からの、ｇＤＮＡを含まないおよび再現可能なＲＮＡ単離が達成された。
【００５３】
試料１：ラット腎臓組織２０ｍｇ中のＲＮＡ含量を線維組織用手順書（Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）に従って測定した：
【００５４】
収量：ａ） 組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ２０ μｇ （ｇＤＮＡ 汚染無し）
ｂ） 組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ １９ μｇ （ｇＤＮＡ 汚染無し）
ｃ） 組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ １９ μｇ（ｇＤＮＡ 汚染無し）
ｄ） 組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ ２０ μｇ（ｇＤＮＡ 汚染無し）
【００５５】
ｂ）過マンガン酸カリウム含むＲＮＡ選択的モノリスの調製
溶液Ｃの調製のために、過マンガン酸カリウム０．０６２５ｇ（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）、スイス、ブーフス（Ｂｕｃｈｓ））を０．５ｍｌ脱イオン水０．５ｍｌに溶解した。過マンガン酸カリウム溶液を、実施例１の通りに調製した溶液Ａ中へボルテックスしながらピペットで加えた。コロイドシリカゲル０．５ｍｌを次いで５０ｍｌポリエチレン容器に入れ、および上記のケイ酸カリウムおよび過マンガン酸カリウムの混合物をゆっくりピペットで加えた。その後、再びボルテックスしながら、脱イオン水２ｍｌに溶解した３６０ｍｇのＰＥＧ３０００および４０ｍｌのグリセロールを含む溶液Ｂを加えた。最後にホルムアミド０．５ｍｌをゆっくり加え、およびそれぞれ準備したスピンカラムにピペットで入れた。乾燥キャビネット中で２０時間４０℃の乾燥時間後、結果として生じたモノリスをさまざまな組織からのＲＮＡの単離に使用できた。さまざまな組織試料からの、ｇＤＮＡを含まないおよび再現可能なＲＮＡ単離が達成された。
【００５６】
試料２：ラット脳組織４０ｍｇ中のＲＮＡ含量を脂質組織用手順書（Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）に従って測定した：
【００５７】
収量：ａ）組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ７μｇ（ｇＤＮＡ汚染無し）
ｂ）組織１０ｍｇ当たり総ＲＮＡ８μｇ（ｇＤＮＡ汚染無し）
【００５８】
ｃ）追加のコーティングによるＲＮＡ選択的モノリスの調製
実施例の通りにＲＧ２から調製された本発明に記載のモノリス状物体の表面のコーティングのために、乾燥フィルターまたは分離材料を二種類の異なる溶液に浸漬した。一方ではモノリス状物体を５％四塩化ジルコニウム／ＴＨＦ溶液（Ｌ１）に１８時間入れ、および他方では５％ジルコニウム（ＩＶ）イソプロポキシド−イソプロパノール複合体／エタノール溶液（Ｌ２）中に入れた。
【００５９】
約１８ｈ 室温の乾燥時間後、結果として生じたモノリス （Ｍ１ および Ｍ２）を、さまざまな組織からのＲＮＡの単離に使用できた。（Ｍ１ および Ｍ２ はＲＧ ２／Ｍ０由来の非被覆モノリス状物体と比較した）。
【００６０】
試料３：ラット腎臓組織 ２０ｍｇ中のＲＮＡ含量をＲＮイージー線維組織用手順書（Ｒｎｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）に従って測定した（１）。次の実験手順（２）で二倍量のＧＩＴＣ（１．８Ｍ）を用いた洗浄段階を、洗浄段階ＲＷ１の前に実施し、および三番目の実験手順（３）では半量のＧＩＴＣ（０．４５Ｍ）を用いた洗浄段階を、洗浄段階ＲＷ１の後に実施した。
【００６１】
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【００６２】
選択的な、すなわちｇＤＮＡを含まないＲＮＡ単離もまた、組織試料から異なる洗浄緩衝液を用いて達成された。
【００６３】
実施例３：成型器具中のさまざまな充填容量：
比較のために、１５０μｌに加えて、１００μｌの調製された反応混合物ＲＧ２をスピンカラムに入れ、および乾燥キャビネット中で４０℃に２０時間加温した。次に本発明に記載のモノリス状物体の容量を、キアクイック（ＱＩＡＱｕｉｃｋ）スピンカラム（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））の容量と比較した。
【００６４】
【表６】
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【００６５】
使用した容量の低減にかかわらず、モノリス状物体入りのスピンカラムはキアクイック（ＱＩＡＱｕｉｃｋ）スピンカラムと同等の容量を有したことが実証された。また、充填容量５０μｌ以下での実験は非常に成功し、そのためたとえば、３８４マルチウェルプレートのようなより小さい精製器具が本発明に記載のモノリス状物体を有益に装着しうる。
【００６６】
さらに、モノリス材料の摩耗はより小さい充填容量を用いて完全に防がれうる。
【００６７】
加えて、モノリス材料は現行のガラス繊維およびシリカ膜よりも有意に安定であると示すことができ、そのため特にフィルターおよび分離材料の小型化においては、たとえば、追加の基礎プレートまたはクランプ環のような補助具を省略できた。材料コストの削減に加えて、これはまたフィルターおよび分離材料のより迅速な調製に有益に繋がる。
【００６８】
試料４：各回１００μｌの反応混合物ＲＧ２をスピンカラムにピペットで加えた。スピンカラムを乾燥キャビネット中で４０℃にて２０時間乾燥した。スピンカラムの下部領域を満たすモノリスが得られた。モノリスをクランプ環の挿入によってスピンカラム内に固定し、および血液からのｇＤＮＡの精製に直接使用した。このために全血２００μｌをキアンプＤＮＡブラッドミニ手順書（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ）、ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））に従って精製した。必要な試薬はまたキアンプ（ＱＩＡａｍｐ）キット（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）から借用した。
【００６９】
収量：ａ）ｇＤＮＡ８．７μｇ
ｂ）ｇＤＮＡ１０．４μｇ
ｃ）ｇＤＮＡ８．５μｇ
ｄ）ｇＤＮＡ１０．５μｇ
【００７０】
実施例４：モノリス状物体の経時変化
この例では、本発明に記載のモノリス状物体（反応混合物ＲＧ２から調製）を乾燥キャビネット中で長い保存期間経時させた。調製されたモノリスフリット３０個のうち、１５個をさらに４０時間６０℃にて乾燥キャビネット中で乾燥させた（空気循環段階３）。
【００７１】
標準フリットと追加に乾燥させたフリットとの間に目視で差は認められなかった。加えて、室温にて長期保存後でさえ、経時に関連する容量の損失は示されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】細孔形成剤としてＰＥＧを用いた本発明に記載のモノリス状物体の電子顕微鏡下の構造。
【図２】細孔形成剤無しの本発明に記載のモノリス状物体の電子顕微鏡下の構造。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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