(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体（式中、Ａは既知分子量のタグ分子であり、Ｘは試料の脱離／イオン化の際に開裂されるリンカーであり、ｎは少なくとも１の整数であり、Ｂは上記タグ分子に特異的に結合する結合分子である）を用いて、組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定する方法に関する。ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるときには、上記リンカー分子Ｘは、上記ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能であるときには、試料のレーザー照射の際の光解離によって開裂することができる。あるいは、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法を用いるときには、上記リンカー分子Ｘは、試料の脱離／イオン化の際に断片化によって開裂することができる。
2008542783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定する方法であって、
ａ）  上記組織切片を少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体
（上記式中、
Ａは、既知分子量のタグ分子であり、
Ｘは、試料の脱離／イオン化中に開裂されるリンカーであり、
ｎは、少なくとも１の整数であり、
Ｂは、上記ターゲット分子に特異的に結合する結合分子であり、かつ
それぞれ異なるＢ分子が異なるＡタグ分子に連結される）
とハイブリダイズさせること；
ｂ）  組織切片表面を走査し、それぞれの隣接スポットを質量分析計で分析すること（ここで、上記リンカーＸは、試料の脱離／イオン化中に開裂され、それぞれのスポットで得られるデータは保存される）；および
ｃ）  それぞれの異なるタグ分子の分子質量ウインドウで得られたデータを解析して、異なる検討したターゲット分子の数と同じ数の組織切片のマップを作製すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
各ターゲット分子が、核酸、特にｍＲＮＡ分子、ペプチド、タンパク質、特に受容体およびリガンド、抗体、抗原、アプタマー、ハプテン、並びに有機化合物からなる群から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１種類のターゲット分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種類のターゲット分子が、ペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ターゲット分子に特異的に結合する各Ｂ分子が、核酸、特にオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、特に受容体およびリガンド、抗体、抗原、ハプテン並びに有機化合物からなる群から独立して選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ターゲット核酸に特異的に結合する各Ｂ分子が、ターゲットｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ターゲットペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンに特異的に結合する各Ｂ分子が、上記ペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンに対して向けられた抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
各Ａタグ分子が、ペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質および有機化合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種類のＡタグ分子が、ペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＡＬＤＩ質量分析法を用い、Ｘリンカー分子がＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘリンカー分子が、
【化１】
2008542783.tif 000023
2008542783.tif 000024
（上記式中、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基であり、ｍは、１〜４の整数である）
からなる群から選択される残基を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｘリンカー分子が、
【化２】
2008542783.tif 000025
2008542783.tif 000026
からなる群から選択される残基を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット分子が、ｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子が、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子が、ペプチドであり、ｎが、１であり、（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体が、下記の構造：
【化３】
2008542783.tif 000027
を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ターゲット分子が、ｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子が、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子が、ペプチドであり、ｎが、１であり、（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体が、下記の構造：
【化４】
2008542783.tif 000028
を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ターゲット分子が、ｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子が、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子が、ペプチドであり、ｎが、１より大きく、核酸プローブが、下記の構造：
【化５】
2008542783.tif 000029
の少なくとも１種類の修飾塩基を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ターゲット分子が、ｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子が、ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子が、ペプチドであり、ｎが、１より大きく、核酸プローブが、下記の構造：
【化６】
2008542783.tif 000030
の少なくとも１種類の修飾塩基を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも５種類の異なるｍＲＮＡ分子が、組織切片上でマッピングされる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
更に、組織切片のそれぞれに対応するタンパク質発現マップを作製するための、それぞれのｍＲＮＡ分子に対応するタンパク質の分子質量ウインドウで得られたデータを分析することからなる工程ｄ）を含んでなる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ターゲット分子が、ペプチド、タンパク質、またはハプテンであり、結合Ｂ分子が、上記ターゲット分子に対して向けられた抗体であり、Ａタグ分子が、ペプチドであり、ｎが、１であり、（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体が、下記の構造：
【化７】
2008542783.tif 000031
を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
上記Ｘリンカー分子が、試料のイオン化中に断片化により開裂される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
上記Ｘリンカー分子が、請求項１１または１２に定義された通りである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ターゲット分子が、ペプチド、タンパク質（抗体など）、抗原、またはハプテンであり、結合分子が、抗体または抗体断片であり、ｎが、１であり、タグ分子が、蛍光色素、酵素、ビオチン、または金である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＵＶ−ＭＡＬＤＩ、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳ、またはＤＥＳＩ質量分析法を用いる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
上記接合体が      
【化８】
2008542783.tif 000032
2008542783.tif 000033
から選択される、請求項１、１０、または２０のいずれか一項に記載の方法での使用に適した接合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（式中、Ａは既知分子量のタグ分子であり、Ｘは試料の脱離／イオン化の際に開裂するリンカーであり、ｎは少なくとも１の整数であり、Ｂは上記タグ分子に特異的に結合する結合分子である）を用いて、組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定する方法に関する。ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるときには、上記リンカー分子Ｘは、上記ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能であるときには、試料のレーザー照射の際の光解離によって開裂することができる。あるいは、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法を用いるときには、上記リンカー分子Ｘは、試料の脱離／イオン化の際に断片化によって開裂することができる。
【０００２】
最近、トランスクリプトームおよびプロテオームの研究により、幾つかの種類の癌等の多種多様な疾患に関与する多くのタンパク質が同定されてきた。
【０００３】
しかしながら、これらの結果のほとんどは精製されて抽出された核酸またはタンパク質試料について得られたものであり、病因とされるタンパク質の組織部位についての情報は生理学的過程の理解に決定的なものであるが、この種の情報を生じるものではない。利用可能なデータのほとんどのもう一つの欠点は、目的とする分子のｍＲＮＡおよびタンパク質発現を同時に分析した研究はほんの僅かに過ぎないことであるが、これは特定のタンパク質の発現パターンを明らかにする上で重要である。従って、ｍＲＮＡとタンパク質発現マップとを組み合わせたデータを有することは、極めて有用なことである。
【０００４】
ｍＲＮＡの組織発現マッピングの最新の技術は、通常はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の後に放射性、蛍光または化学発光マーカーにカップリングした核酸プローブに依存している。組織切片でのタンパク質発現マッピングについては、通常の手法としては免疫組織化学および免疫蛍光が挙げられる。
【０００５】
組織切片発現マッピングのこれら総ての手法の主要な欠点は、同時に分析することができるターゲッティング分子の数が、同一実験では僅かに３または４個の異なるターゲット分子しか検討することができないので、蛍光プローブまたは抗体を用いても限定されていることである。
【０００６】
これに反して、質量分析法では、分子量によって生体分子の複雑な混合物の同時マルチプレックス分析を行うことができる。特に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法は生物学的研究の分野において強力な手段となってきており、複雑な混合物由来の核酸、ペプチドおよびタンパク質の検出、同定および特性決定に用いられている。
【０００７】
特に、  Ｏｌｅｊｎｉｋと共同研究者らは、光開裂可能なペプチド−ＤＮＡ接合体の合成および特性決定を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法による固定した合成ターゲットＤＮＡを検出するための光開裂可能な質量マーカー（ＰＣＭＭ）ハイブリダイゼーションプローブとしてのそれらの使用と共に報告している(Olejnik et al. Nucleic Acids Res. 1999 Dec 1;27(23):4626-31)。
【０００８】
ＷＯ  ９８／２６０９５号には、生体分子ターゲットと特異的に相互作用するための質量標識化合物（ｍａｓｓ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の合成および使用が記載されている。ＷＯ  ００／６８４３４号には、ターゲット分子をシグナルでコード化した後コード化シグナルを解読することに基づく単一分析法で試料中の複数の検体を検出する方法が記載されている。
【０００９】
しかしながら、従来技術分野では、組織切片に含まれる核酸のＭＡＬＤＩ質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）による分析の方法は報告されていない。
【００１０】
本発明者らは、ターゲット分子に特異的に結合する残基（ｍｏｉｅｔｙ）、既知分子量の残基（「タグ」残基）とイオン化過程中にＭＡＬＤＩレーザーによって直接切断される光開裂可能なリンカーとから構成される接合体を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって組織切片中の生体分子、特にｍＲＮＡ、を検出する新規な方法を組み立てた（図１参照）。この新規な方法により、組織切片中のｍＲＮＡの容易かつ正確な間接マッピングを行うことができ、広汎に分散した分子量のタグ残基を用いて多数の異なる生体分子を同時に分析することができる。
【００１１】
更に、この新規な方法を用いてｍＲＮＡの組織発現をマッピングするときには、２個の連続した組織切片でｍＲＮＡおよび対応するタンパク質発現の共通画像を得ることができる。実際に、幾つかの文献では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが組織切片におけるペプチドおよびタンパク質の直接分析の有効な手段となり得ることが示されている（Caprioli, R.M.; Farmer, T.B.; Gile, J. Anal. Chem. 1997, 69, 4751-4760; Stoeckli, M.; Farmer, T.B.; Caprioli, R.M. Nat. Med. 2001, 7, 493-496; Chaurand, P.; Schwartz,. S.A.; Caprioli, R.M. Anal Chem. 2004, 87A-93A）。
【００１２】
最後に、本発明者らは、光開裂可能なリンカーが、試料の脱離／イオン化の際の断片化によって開裂されるリンカーに置換される場合には、このような方法は質量分析法に置き換えることも可能であることを見出した。この場合には、ＭＡＬＤＩ（ＵＶ−ＭＡＬＤＩまたはＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、ＳＩＭＳ（二次イオン質量分析法）またはＤＥＳＩ  （脱離エレクトロスプレーイオン化）質量分析法、好ましくはＵＶ−ＭＡＬＤＩのみをＭＡＬＤＩの代わりに用いることができる。更に、本発明者らは、選択された光開裂可能なリンカーは試料の脱離／イオン化の際の断片化によっても開裂するので、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ分析に適する光開裂可能なリンカーとの接合体は他の質量分析法の手法と共に用いることもできる。従って、本発明者らによって組み立てられた特定の接合体は、組織切片分析に適する任意の質量分析法による手法、特にＭＡＬＤＩ（ＵＶ−  ＭＡＬＤＩまたはＩＲ−ＭＡＬＤＩ）、ＳＩＭＳ（二次イオン質量分析法）またはＤＥＳＩ（脱離エレクトロスプレーイオン化）質量分析法と共に用いることができる。
【００１３】
従って、本発明は、組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定する方法であって、
ａ）  上記組織切片を少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体
（上記式中、
Ａは、既知分子量のタグ分子であり、
Ｘは、試料の脱離／イオン化中に開裂されるリンカーであり、
ｎは、少なくとも１の整数であり、
Ｂは、上記ターゲット分子に特異的に結合する結合分子であり、かつ
それぞれ異なるＢ分子が異なるＡタグ分子に連結される）
とハイブリダイズさせること；
ｂ）  組織切片表面を走査し、それぞれの隣接スポットを質量分析計で分析すること（ここで、上記リンカーＸは試料のイオン化中に開裂し、それぞれのスポットで得られるデータは保存される）；および
ｃ）  それぞれの異なるタグ分子の分子質量ウインドウで得られたデータを解析して、異なる検討したターゲット分子の数と同じ数の組織切片のマップを作製すること
を含んでなる、方法に関する。
【００１４】
本発明によれば、「組織切片」は、好ましくは下記の特性を有しており、すなわち、それを凍結またはパラフィン包埋することができ、その厚みは好ましくは哺乳類細胞直径、従って５−２０μｍのオーダーである。クライオスタットを用いて凍結組織から得られる凍結切片の場合には、ＯＣＴ（最適切断温度ポリマー）は好ましくは組織の固定のみに用いられるが凍結組織はＯＣＴに包埋されず、組織切片はＯＣＴと接触しないようにする。次に、組織切片を、金属、無機または有機材料、例えば金、鋼、ガラス繊維、ガラス、ナイロン６／６、シリコン、プラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン、またはニッケルまたはＩＴＯのような透明性を保つ伝導性金属でコーティングした任意の厚みのガラススライスなどの更なるＭＡＬＤＩ分析に適する任意の材料から構成されるＭＡＬＤＩプレートに移すことができる。
【００１５】
本発明によれば、「ターゲット分子」とは、「結合分子」と呼ばれる別の分子に特異的に結合することができる目的の分子を意味する。このような直列の（タンデム）ターゲット／結合分子は、組織切片で特異的ハイブリダイゼーションを生じることができる場合には、任意の化学構造を示すことができる。多種多様なタンデムターゲット／結合分子並びにタンデム結合／ターゲット分子は、本発明の範囲に包含され、核酸／核酸、核酸／ペプチド、核酸／タンパク質、核酸／抗体、ペプチド／ペプチド、ペプチド／タンパク質、ペプチド／抗体、タンパク質／タンパク質（特に、リガンド／受容体）、タンパク質／糖質、抗原／抗体、ハプテン／抗体、有機化合物／受容体（図２のいずれかの例を参照）が挙げられる。
【００１６】
特に、ターゲット核酸配列は、一本鎖のターゲット核酸または二本鎖のターゲット核酸の鎖の一本に相補的である核酸配列を有する一本鎖核酸プローブを用いて特異的に検出することができる（図１参照）。ターゲットｍＲＮＡ分子の場合には、ｍＲＮＡ配列に相補的な核酸プローブを、結合分子として用いることができる。このような核酸プローブは、好ましくは２５０−５５０、更に好ましくは３００−５００、３５０−４５０、最も好ましくは約４００のヌクレオチド長を有する。
【００１７】
特定の核酸配列は、例えば転写因子、または特定のＤＮＡ配列に特異的な抗体もしくは抗体断片のようなターゲット配列に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質断片（ペプチド）を用いて検出することができる。例えば、自己免疫抗ＤＮＡ抗体を用いることができる。
【００１８】
ペプチドおよびタンパク質の場合には、当該技術分野で知られている総てのペプチドリガンド／ペプチド受容体のタンデム分子は、本発明の範囲に包含される。これらのペプチドリガンド／ペプチド受容体のタンデム分子としては、ペプチド抗原／抗体または抗体断片、並びに任意のホルモン／ホルモン受容体、サイトカイン／サイトカイン受容体タンデム、ケモカイン／ケモカイン受容体、アプタマー／ペプチド、アプタマー／タンパク質が挙げられる。細胞移動に関与する膜糖質およびそれらのタンパク質受容体も、本発明の範囲にある。
【００１９】
また、任意の種類の抗原（例えば、核酸、ハプテン、ペプチドまたはタンパク質）およびそれらの特異抗体は、本発明によるタンデムターゲット／結合および結合／ターゲット分子に包含される。特に、接合体における結合分子として抗体または抗体断片を使用することによって、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を、抗体に光開裂可能に結合したタグ分子により明らかにする手法として用いる、組織切片における新規な種類の免疫細胞化学が可能になる。
【００２０】
有機化合物は、本発明による方法を用いてマッピングすることもできる。特に、投与した有機薬剤のイン・ビボでの分布は、本発明による方法を用いて観察することができる。
【００２１】
本発明による上記方法の特定の態様では、それぞれのターゲット分子は、核酸、特にｍＲＮＡ分子、ペプチド、タンパク質、特に受容体およびリガンド、抗体、抗原、ハプテン、および有機化合物から構成される群から独立して選択される。好ましい態様では、少なくとも１つのターゲット分子はｍＲＮＡ分子である。もう一つの好ましい態様では、少なくとも１つのターゲット分子はペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンから選択される。
【００２２】
本発明による任意の上記方法の特定の態様では、ターゲット分子に特異的に結合する各結合Ｂ分子は、核酸、特にオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、特に受容体およびリガンド、抗体、抗原、ハプテン、アプタマーおよび有機化合物から構成される群から独立して選択される。好ましい態様では、少なくともターゲット分子がｍＲＮＡ分子であるときには、ターゲット核酸に特異的に結合する各Ｂ分子は、上記ターゲットｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブである。もう一つの好ましい態様では、少なくともターゲット分子がペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンであるときには、ターゲットペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンに特異的に結合する各Ｂ分子は、そのペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンに対して向けられた抗体である。特に、抗体または抗体断片を結合分子Ｂとして用いるときには、上記抗体またはその断片が特異的に向けられたターゲット分子は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧまたはＩｇＥなどの特定の抗体サブクラスのフレームワーク領域となることができる。あるいは、抗体または抗体断片が結合分子Ｂとして用いられるときには、抗体またはその断片が特異的に向けられるターゲット分子は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ヒツジおよびヒトのような特定の種に生じた抗体のフレームワーク領域となることができる。これらの２つの場合には、任意の所望のターゲット分子に対して向けられる特定のサブクラスの一次未修飾抗体であって、次に本発明による抗体−タグ接合体によって認識される一次抗体を用いて、２段階間接検出を行うことができる（実施例２および図３参照）。このような接合体は、任意の抗原特異性を有する任意の一次抗体が接合体の抗体によって認識されるサブクラスに属する場合には、この一次抗体と共に用いることができるので、極めて有利である。
【００２３】
本発明によれば、「タグ分子」は、ＭＡＬＤＩ（ＵＶ／ＩＲ）、ＳＩＭＳおよびＤＥＳＩを用いる質量分析法によって検出可能な既知分子量の分子を表す。ＭＡＬＤＩ質量分析計では、通常は広範囲のｍ／ｚ比で化合物を検出することができる。例えば、ＭＡＬＤＩ−飛行時間（ＴＯＦ）型分析装置は、１，０００，０００までのｍ／ｚ比の化合物を検出することができる。適当なタグ分子は、ターゲットおよび結合分子の特異的結合を妨げる必要がない。従って、好ましくは、適当なタグ分子は、ターゲットおよび結合分子の結合の立体障害を回避するような立体容積に制限される。従って、これら上記の理由により、適当なタグ分子は、好ましくは、ｍ／ｚ比は１０，０００を下回る。適当なタグ分子としては、ペプチド、核酸、糖類、ポリマー、脂質および有機化合物が挙げられる。これらの中、ターゲット分子と結合分子との間の複合体形成を明らかにするのに用いられる標識分子、例えば、通常のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ＴＲＩＴＣ、ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体またはＡＰＣ−Ｃｙ７接合体のような蛍光色素；アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素；ビオチン；金；または総てのＭＡＬＤＩマトリックス、または純粋なレーザー脱離モードで分析することができる総ての化合物、および例えば予備イオン化分子を、タグ分子として用いることもできる。極めて小さな分子の検出に適する質量分析法の手法を用いるときには、原子をタグ分子として用いることもできる。
【００２４】
上記した総てのタグ分子は本発明で用いることができ、いかなる場合にも、用いられる質量分析法の手法によっては、質量分析法による分析の技術にある程度習熟した者であれば、どの種類のタグ分子を選択して検出段階を最適にするかが分かるであろう。例えば、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるときには、タグ分子は好ましくはｍ／ｚ比が＜５０００である。あるいは、ＳＩＭＳを用いるときには、タグ分子は好ましくはｍ／ｚ比が＜５００であり、ＤＥＳＩを用いるときには、タグ分子は好ましくはｍ／ｚ比が＜５０００である。
【００２５】
本発明による任意の上記方法の特定の態様では、各Ａタグ分子は、ペプチド、核酸、糖類、および有機化合物から構成される群から選択される。好ましい態様では、少なくとも１種類のＡタグ分子はペプチドである。
【００２６】
本発明による上記方法の好ましい態様では、ターゲット分子はｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子はｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子はペプチドである。本発明による上記方法の好ましい態様では、ターゲット分子は、ペプチド、タンパク質（抗体など）、抗原またはハプテンであり、結合分子は抗体または抗体断片であり、タグ分子はペプチドである。本発明による上記方法のもう一つの好ましい態様では、ターゲット分子は、ペプチド、タンパク質（抗体など）、抗原またはハプテンであり、結合分子は抗体または抗体断片であり、タグ分子は、通常の抗体標識分子であり、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＰＥ−Ｃｙ５接合体、ＰＥ−Ｃｙ７接合体またはＡＰＣ−Ｃｙ７接合体のような蛍光色素；アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵素；またはビオチンまたは金；または総てのＭＡＬＤＩマトリックス、または純粋なレーザー脱離モードで分析することができる総ての化合物、および例えば予備イオン化分子である。
【００２７】
本発明によれば、「上記組織切片を少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体とハイブリダイズさせる」とは、組織切片と接合体を、接合体の結合Ｂ分子が組織切片におけるそのターゲット分子に特異的に結合することができる条件で接触させる反応を意味する。結合およびターゲット分子の性質によっては、当業者は周知のハイブリダイゼーションプロトコルを利用することができる。実際に、結合分子が核酸プローブであるときには、組織切片におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは詳細に報告されており、従って当該技術に熟練した者には容易に利用することができる。組織切片での抗体染色も、当該技術に熟練した者には容易に利用することができるごく普通の技術である。
【００２８】
本発明による方法を用いると、組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子のマップを得ることができる。組織切片におけるターゲット分子の「マップ」とは、この組織切片における上記ターゲット分子の発現を二次元的に表したものを意味する。この二次元的表現は、組織切片表面をＭＡＬＤＩ分析装置を用いて画定したスポット密度で走査し、それぞれの連続スポットについてＭＡＬＤＩ分析を行い、得られたデータとそれぞれのスポットの座標の両方を蓄積することによって得られる。スポット密度が高くなれば、得られるマップの精度は一層高くなる。ＭＡＬＤＩレーザーの直径は、一般的には系の焦点形成に応じて５０−２００μｍであるので、２個の隣接する照射スポットはレーザー光線の直径（すなわち、５０−２００μｍ）で離れているのが好ましい。精確なターゲット分子マップを得るには、隣接スポットは好ましくは最大で３００μｍ、最大で２００μｍ、更に好ましくは最大で１００μｍ、最大で８０μｍ、最大で６０μｍ、最大で５０μｍ、最大で４０μｍ、最も好ましくはＭＡＬＤＩレーザーの直径だけ離れている。
【００２９】
次に、それぞれのスポットのデータをタグ分子の分子ウインドウで分析し、タグ分子のシグナル強度をスポット座標に記録する。このようなイメージ再構築は、当該技術分野で知られているまたは市販されている任意の適当なイメージ再構築ソフトウェアを用いて自動的に行うことができる。適当なソフトウェアの例は、ＲＳＩ（ＲＳＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ．  ４９９０  パール・イースト・サークル．  ボールダー，コロラド  ８０３０１）によって商品化されているＩＤＬ  （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄａｔａ  Ｌａｎｇｕａｇｅ）ソフトウェア、ｆｌｅｘＩｍａｇｉｎｇ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，ブレンメン，デラウェア）、ＭＩＴ（Ｍ．  Ｓｔｏｅｃｋｌｉ，  Ｎｏｖａｒｔｉｓ，バーゼル，スイス国）である。
【００３０】
組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定するための本発明による方法では、数個の異なるターゲット分子を同時にマッピングすることができる。実際に、幾つかの異なるターゲット分子の検出を行うには、異なるタグＡ分子を有し、よって異なる分子量を示す、幾つかの接合体を用いることで十分である。広く分散した分子量を有するタグ分子を用いることによって、本発明による任意の上記方法を用いて、同一組織切片における多数の異なるターゲット分子の発現を同時にマッピングすることができる。特定の態様では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５または少なくとも１００個の異なるターゲット分子を、同時にマッピングすることができる。特に、ｍＲＮＡターゲット分子の場合には、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５または少なくとも１００個の異なるターゲットｍＲＮＡ分子を、同一組織切片で同時にマッピングすることができる。
【００３１】
ターゲット分子がｍＲＮＡ分子である任意の上記方法の特定の態様では、この方法は、更に、組織切片のそれぞれ対応するタンパク質発現マップを作製するためのそれぞれのｍＲＮＡ分子に対応するタンパク質の分子質量ウインドウで得られたデータを分析することからなる工程ｄ）を含んでなることがある。
【００３２】
第一の好ましい態様では、ＭＡＬＤＩ質量分析法を用い、Ｘリンカー分子はＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能である。従って、本発明は、組織切片における少なくとも１個のターゲット分子マップを決定する方法であって、
ａ）  上記組織切片を少なくとも１種類の（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体
（上記式中、
Ａは、既知分子量のタグ分子であり、
Ｘは、ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能なリンカーであり、
ｎは、少なくとも１の整数であり、
Ｂは、上記ターゲット分子に特異的に結合する結合分子であり、
それぞれの異なるＢ分子は異なるＡタグ分子に連結している）
とハイブリダイズさせること；
ｂ）  組織切片表面を走査し、それぞれの隣接スポットを質量分析計で分析すること（ここで、ＭＡＬＤＩレーザーは、タグ分子Ａを放出し、かつ試料のイオン化を誘発するのに用いられ、それぞれのスポットで得られるデータは保存される）；および
ｃ）  それぞれの異なるタグ分子の分子質量ウインドウで得られたデータを解析して、異なる検討したターゲット分子の数と同じ数の組織切片のマップを作製すること
を含んでなる、方法に関する。
【００３３】
本発明によれば、「ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能なリンカー」とは、２つの他の化学残基（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）を分離し、ＭＡＬＤＩレーザーへの暴露下で少なくとも１つの部位で開裂することができる化合物を表す。大抵のＭＡＬＤＩレーザーは、通常は３００−５００ｎｍの紫外（ＵＶ：  ５００ｎｍより短波長）波長を有する。例えば、多くのＵＶ−ＭＡＬＤＩ分析装置は、３３７ｎｍの波長のパルス窒素レーザーを有する。従って、本発明によるリンカーは、特定の態様では、２５０−５００ｎｍの波長、好ましくは３２０−３６０ｎｍまたは３２０−３５０ｎｍの波長、更に好ましくは３３７ｎｍの波長への暴露下で少なくとも１つの部位で効率的に開裂するので、ＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザーはリンカーを開裂し、かつ試料をイオン化するという両方の作用をする。他のＭＡＬＤＩ分析装置は、赤外（ＩＲ：  ７７０ｎｍより長波長）レーザーを示す。例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（波長＝１０６０ｎｍ）、Ｅｒ：ＹＡＧレーザー（波長＝２９４０ｎｍ）、中赤外光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）（波長＝２９４０ｎｍ）またはＴＥＡ−ＣＯ２レーザー  （波長＝１０６００ｎｍ）をＩＲ−ＭＡＬＤＩレーザーとして用いることができる。他の特定の態様では、本発明によるリンカーは、従って１０００−１１００ｎｍの波長、好ましくは１０６０ｎｍの波長、または２９００−３０００ｎｍの波長、好ましくは２９４０ｎｍの波長、または１０５００−１０７００ｎｍの波長、好ましくは１０６００ｎｍの波長への暴露下で少なくとも１つの部位で効率的に開裂し、それぞれＮｄ：ＹＡＣ、Ｅｒ：ＹＡＧまたはＴＥＡ−ＣＯ２  ＩＲ−ＭＡＬＤＩレーザーはリンカーを開裂し、かつ試料をイオン化するという両方の作用をする。
【００３４】
ＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザーの場合には、幾つかのリンカーが報告されており（Olejnik et al. Nucleic Acids Res. 1999 Dec 1;27(23):4626-31; BaiX, et al. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 26;32(2):535-41; Wenzel T et al. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2003 May-Aug;22(5-8): 1579-81）、有機分子に光開裂可能なリンカーを導入するのに有用な幾つかの試薬が、特に、ＡｍｂｅｒＧｅｎ（登録商標）（１１０６  コモンウェルスアベニュー  ボストン，マサチューセッツ  ０２２１５，米国）、Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（３  マラードウエイ，ストラスサイクル・ビジネス・パーク，ベルシル，ラナークシアＭＬＡ  ３ＢＦ，スコットランド）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （１７１０  コマーシャル・パーク°コーラルビル，アイオワ  ５２２４１，米国）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２２８２５  デービス・ドライブ，スターリング，バージニア  ２０１６４，米国）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ  ｓ．ａ．  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ．  リエージュ・サイエンス・パーク．  リュ・ボア・サン・ジァン５．  ４１０２  セライング．  ベルギー国）などから市販されている。
【００３５】
ＭＡＬＤＩ質量分析法とＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能なリンカー分子Ｘとを用いる本発明による任意の上記方法の特定の態様では、Ｘリンカー分子は、
【化１】
2008542783.tif 000003
（上記式中、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル基であり、ｍは１−４の整数である）
からなる群から選択される残基である。
【００３６】
あるいは、ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能な上記リンカー分子Ｘを用いる態様では、Ｘリンカー分子は、
【化２】
2008542783.tif 000004
からなる群から選択される残基である。
【００３７】
タグ分子Ａと結合分子Ｂを連結するリンカー分子Ｘは、このような残基を含んでなる市販のリンカーを用いてＡとＢの間で得ることができる。例えば、本発明による方法で用いるための光開裂可能なリンカーとの接合体を調製するのに適したリンカーは、
ＰＣリンカー（製品番号１０−４９２０−０２）、
ＰＣスペーサーホスホルアミダイト（製品番号１０−４９１３−０２）、および
ＰＣアミノ修飾因子（製品番号１０−４９０６−０２）
などをＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（２２８２５  デービス・ドライブ，  スターリング，  バージニア  ２０１６４，米国）から、または
例えば、リンカー  Ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ  （製品番号＃２１１１１）をＰｉｅｒｃｅ  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  Ｃｕｓｔｏｍｅｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １１７  ロックフォード，  イリノイ．  ６１１０５  米国）から、または
商標Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）、例えば、リンカー
【化３】
2008542783.tif 000005
（製品番号０１−６０−００４２）をＭｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ  （ブールバード・インダストリアル・パーク，  パッジ・ロード．  ビーストン，  ノッティンガム  ＮＧ９  ２ＪＲ，  英国）から、または
Ｃｈｒｏｍａｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ  ３５４Ｓという名称の製品番号Ｂ１００１であって、３５４ｎｍの波長で開裂可能であるものをＳｏｌｕｌｉｎｋから得ることができる。
【００３８】
ターゲット分子がｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子がｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子がペプチドである、もう一つの好ましい態様では、ｎが１であり、（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体、および得られる（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体が下記の構造
【化４】
2008542783.tif 000006
を有する。
【００３９】
このような接合体は、例えば、下記の構造
【化５】
2008542783.tif 000007
のフォワード（５’）プライマーを用いて所望の核酸配列を増幅することによって得ることができる。
【００４０】
ターゲット分子がｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子がｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子がペプチドである、もう一つの好ましい態様では、ｎは１であり、（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体、および得られる（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体は下記の構造
【化６】
2008542783.tif 000008
を有する。
【００４１】
このような接合体は、例えば、下記の構造
【化７】
2008542783.tif 000009
を有するフォワード（５’）プライマーを用いて所望の核酸配列を増幅することによって得ることができる。
【００４２】
あるいは、ターゲット分子がｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子がｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子がペプチドである、もう一つの好ましい態様では、ｎは１より大きく、核酸プローブは、下記の構造：
【化８】
2008542783.tif 000010
（上記式中、「ｄＮＴＰ」はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰなどの任意のデオキシヌクレオチド三リン酸を意味する）
の少なくとも１種類の修飾塩基を含んでなる。好ましい態様では、修飾したｄＵＴＰ塩基が用いられる。
【００４３】
ターゲット分子がｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子がｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子がペプチドである、もう一つの好ましい態様では、ｎは１より大きく、核酸プローブは、下記の構造：
【化９】
2008542783.tif 000011
（上記式中、「ｄＮＴＰ」はｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＵＴＰなどの任意のデオキシヌクレオチド三リン酸を意味する）
の少なくとも１種類の修飾塩基を含んでなる。好ましい態様では、修飾したｄＵＴＰ塩基が用いられる。
【００４４】
このような修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを用いると、ペプチドタグ付き核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびペプチドタグ付きｄＵＴＰの存在下にて簡単なＰＣＲ増幅を用いて極めて簡単に生成させることができる。この方法により、特異的ハイブリダイゼーションプローブを任意のターゲットｍＲＮＡ配列について容易に合成することができる。
【００４５】
更に、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを用いて合成した所定のハイブリダイゼーションプローブはその配列にＵ塩基の数と同数のタグペプチドを有するので、これによりシグナル増幅を行うことができる。
【００４６】
最後に、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを用いて合成したハイブリダイゼーションプローブを用いると、組織切片におけるｍＲＮＡ発現を定量的に分析することができる。実際に、１または数個の検討したｍＲＮＡの対応するタグによって生じるシグナルを、参照ｍＲＮＡ配列（例えば、ＨＰＲＴのアクチンのようなハウスキーピング遺伝子）について得られたものと比較することができる。それぞれのハイブリダイゼーションプローブにおけるＵ塩基の数は知られているので、それぞれの検討したｍＲＮＡ配列と参照ｍＲＮＡ配列との間の発現比を計算することができる。
【００４７】
ターゲット分子がｍＲＮＡ分子であり、結合Ｂ分子がｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する核酸プローブであり、Ａタグ分子がペプチドである方法では、上記接合体を用いて、幾つかの異なるターゲットｍＲＮＡ分子を同時にマッピングすることができる。実際に、幾つかの異なるターゲット分子の検出を行うには、異なる核酸プローブと異なる分子量を示す異なるタグペプチドを有する幾つかの接合体を用いることで十分である。広く分散した分子量を有するタグペプチドを用いることによって、任意の上記接合体を用いて同一組織切片における多数の異なるターゲットｍＲＮＡ分子の発現を同時にマッピングすることができる。特定の態様では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００個の異なるターゲットｍＲＮＡ分子を、同時にマッピングすることができる。
【００４８】
更に、保管されたスペクトルデータは、組織切片の直接ペプチド／タンパク質分析も示し、上記接合体を用いるターゲットｍＲＮＡ分子の組織切片分析法は、更に、組織切片のそれぞれに対応するタンパク質発現マップを作製するためのそれぞれのｍＲＮＡ分子に対応するタンパク質の分子質量ウインドウで得られたデータを分析することからなる最終工程ｄ）を含んでなることがある。
【００４９】
ターゲット分子がペプチド、タンパク質（抗体など）、またはハプテンである好ましい態様では、結合Ｂ分子は上記ターゲット分子に対して向けられた抗体であり、Ａタグ分子はペプチドであり、ｎは１であり、（Ａ−Ｘ）−Ｂ接合体は下記の構造：
【化１０】
2008542783.tif 000012
を有する。
【００５０】
ＭＡＬＤＩ質量分析法を用いる本発明による任意の方法では、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に用いるマトリックスは、任意の古典的ＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、ＣＨＣＡ、２，５−  ＤＨＢ、ＳＡ、ＨＡＢＡ、３−ＨＰＡなど）または２，４−ＤＮＰＨでよい。
【００５１】
「マトリックス」とは、検体と混合するとき、レーザー照射によって良好に脱離され固相結晶から気相または蒸気相にイオン化され、分子イオンとして加速される、結晶性のマトリックス包埋検体分子を生じる任意の材料を意味する。一般に用いられるＭＡＬＤＩ−ＭＳマトリックスは、通常はレーザー波長で吸収する小さな酸性化合物であり、ニコチン酸、桂皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸またはＳＡ）、３−メトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（フェルラ酸）、３，４−ジヒドロキシ桂皮酸（カフェイン酸）、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）および２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジンが挙げられる。これらのマトリックスを調製するためのプロトコルは当該技術分野で周知であり、これらのマトリックスの大半は市販されている。ペプチド／タンパク質分析に現在一般に用いられるマトリックスとしては、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）およびシナピン酸（ＳＡ）が挙げられる。ＤＮＰＨは２，４−ジニトロフェニルヒドラジンであり、アルデヒドおよびケトンの検出に用いられる。
【００５２】
本発明の第二の好ましい態様では、試料の脱離／イオン化の際に断片化によって開裂するリンカー分子Ｘを用い、その分析はＭＡＬＤＩ質量分析法に限定されないが、一般的には組織切片分析に適する任意の質量分析法の技術に換えることができる。特に、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法を用いることができる。
【００５３】
実際に、化合物の間接的検出には、装置の線源における脱離およびイオン生成のごく初期にタグ分子を放出する必要がある。マトリックス分子によるエネルギー吸収を介したイオン脱離／イオン化の目的でレーザーを用いるＭＡＬＤＩ質量分析法を用いるときには、タグ分子の放出を誘発する幾つかの方法を考えることができる。第一の最も簡潔な方法は、ＭＡＬＤＩレーザー照射によるタグ分子の光解離を用いることである（図１および図３参照）。これは極めて特異的な放出を意味するが、必然的に一層複雑な構造および合成も意味する。
【００５４】
しかしながら、タグ分子を放出する方法として、迅速断片化を考えることもできる。この現象は一般に質量分析法の技術に存在しており、従ってその使用はＭＡＬＤＩおよび他の質量分析法の線源と両立する。特に、この断片化現象を、線源が一次イオンビームであるＳＩＭＳ（二次イオン質量分析法）またはＤＥＳＩ（脱離エレクトロスプレーイオン化）と称される最近に報告された技術のような他の質量分析法の技術と共に利用することができる。更に、ＭＡＬＤＩ／ＭＳについては、これら２種類の技術を、組織切片の直接分析に用いることができる（Touboul, D.; Kolmer, F.; Niehis, E.; Brunelle, A.; Laprevote, O.. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, (JASMS) 2005, 15, 1608-1618) ( Cooks, R.G.M.; Ouyang, Z. Takats, Z.; Wiseman, J.M.; Science, 17 March 2006, VoI 311, 1566-1570）。
【００５５】
従って、リンカー分子を介してタグ分子に連結した特異的結合分子の接合体を用いる本発明のコンセプトは、迅速断片化によって開裂されるリンカーを用いることにより、タグ分子の迅速断片化放出を生じるという条件で、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩのようなＭＡＬＤＩ以外の質量分析法の技術に取り換えることができる。この現象を考えると、迅速断片化によって開裂さえされれば、光開裂可能である必要はないので、更に単純なリンカーなしの接合体をデザインすることができ、これは容易に得ることができる。実際に、あらゆる種類のリンカーを断片化によって開裂することができ、任意のリンカーの能力を容易に試験することができる。
【００５６】
更に、ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能であると上記したリンカーは、迅速断片化によっても開裂されることが本発明者によって見出された。あるいは、このようなリンカーは、ＭＡＬＤＩ以外の質量分析法の技術を用いるときなどの上記の本発明による任意の方法、特にＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法、についての接合体で用いることができる。
【００５７】
しかしながら、迅速断片化現象を利用することによって用いることができる（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体は、光解離および断片化によって開裂することができる上記の特定の適当なリンカーに限定されないことを明確に理解しなければならない。実際に、Ａタグ分子とＢ結合分子を容易に連結することができる任意のリンカーの迅速断片化によって開裂する能力は、単に合成した接合体を溶液中で分析し、開裂したＡタグ分子の存在を観察することによって容易に試験される。この方法により、任意の可能性のあるリンカーは、本発明での使用について容易に試験し、承認しまたは拒絶することができる。更に、質量分析法の技術に熟練した者であれば、可能性のあるリンカーの大多数について、それらの化学構造から断片化により開裂されるかされないか分かるので、容易な上記試験を行うことはほとんどの場合に一層必要なくなるであろう。
【００５８】
特に、迅速断片化を用いてリンカーを開裂するときには、通常の販売さえされている標識抗体を接合体として用いることができる。例えば、蛍光接合抗体を用いることができ、蛍光分子は、タグ分子として用いられる。特に、ＦＩＴＣ接合、ＰＥ接合、ＰｅｒＣＰ接合、ＡＰＣ−接合、Ｃｙ３接合、Ｃｙ５接合、Ｃｙ７接合、テキサスレッド接合、ＴＲＩＴＣ接合、ＰＥ−Ｃｙ５接合、ＰＥ−Ｃｙ７接合、またはＡＰＣ−Ｃｙ７接合抗体を用いることができる。あるいは、酵素アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような他の分子に接合した抗体を用いることもでき、酸素はタグ分子として用いられる。この可能性は、極めて広い範囲の抗原特異性を有するあらゆる種類の抗体が標識抗体として市販されているという決定的な利点を有する。更に、標識分子を通常のリンカーを介して任意の抗体に結合させる技術は、周知の日常的技術である。この方法により、組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法を、本発明による方法を用いて非常に多数の異なる生体分子について行うことができる。
【００５９】
従って、好ましい態様では、迅速断片化を用いるときには、ターゲット分子はペプチド、タンパク質（抗体など）、抗原、またはハプテンであり、結合分子は抗体または抗体断片であり、ｎは１であり、タグ分子は蛍光色素、酵素、ビオチンまたは金である。特にＳＩＭＳ質量分析法を用いるときには、Ｂｒのような原子を抗体に接合させることもできる（実施例４参照）。この場合には、Ｓｉｇｍａから製品番号リンカーＥ１７６９で市販されているＥＤＡＣと称するリンカーを用いて、抗体をＢｒ原子に接合させることができる（実施例４参照）。
【００６０】
更に、迅速断片化によって開裂されるこのようなリンカー分子Ｘを用いるときには、潜在的に任意の質量分析法の技術を、組織切片分析に適しているという条件で（これはいかなる熟練者にとっても直ちに明らかである）用いて、本発明による方法を実行することができる。特に、ＵＶ−ＭＡＬＤＩまたはＩＲ−ＭＡＬＤＩ以外の幾つかの追加の質量分析法の技術、例えば、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法を用いることができる。従って、迅速断片化によって開裂されるリンカー分子Ｘを用いる方法の好ましい態様では、ＵＶ−ＭＡＬＤＩ、ＩＲ−ＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法が用いられる。
【００６１】
本発明は、更に本発明による任意の方法での使用に適する接合体に関し、上記接合体は
【化１１】
2008542783.tif 000013
2008542783.tif 000014
から選択される。
【００６２】
上記接合体のそれぞれは、個別的に本発明による接合体として好ましい。
【００６３】
本発明を概略的に説明してきたが、本発明の特徴と利点は、例示のためにのみ本明細書に提供されかつ特に断らない限り制限するものとは解釈されないある種の具体例および図を参照することによって一層の理解を深めることができる。
【００６４】
実施例１
ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる組織切片におけるｍＲＮＡの間接検出のための光開裂可能なリンカーを有するオリゴペプチド接合体の使用
光開裂可能なリンカーを有するオリゴペプチド接合体について、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる組織切片における特異的ｍＲＮＡを間接検出することができる能力を試験した。
【００６５】
１．１  材料および方法
１．１．１  オリゴペプチド接合体
構造
検討を行ったオリゴペプチド接合体は、下記の構造を示した。
【化１２】
2008542783.tif 000015
【００６６】
異なるペプチド残基を有する５種類のオリゴペプチド接合体を合成した。それぞれの接合体のオリゴヌクレオチドのペプチドアミノ酸配列、単一同位体（Ｍｍｏｎｏ）および平均（Ｍａｖｇ）分子量、および核酸配列を、表２に示す。
【００６７】
【表１】
2008542783.tif 000016
【００６８】
合成
オリゴペプチド接合体は、下記のプロトコルを用いて合成した。
【００６９】
ペプチドはＳｙｍｐｈｏｎｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）上で合成し、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ  １８  １５μｍ  １００Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で精製する。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（ＡＢＩ）上で３’から５’へ合成する。光開裂可能なリンカーを有するアミノ官能基を５’に付加した後、開裂と脱保護を行う。これらの工程は、２８％ＮＨ４ＯＨ溶液を用いて暗所で２４時間行う。次に、アミノオリゴヌクレオチドをＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８  １５μｍ  ３００Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で精製する。オリゴヌクレオチドのアミノ官能基を、マレイミド官能基を含んでなるヘテロ二官能性試薬にカップリングさせる。マレイミドオリゴヌクレオチドを水に可溶化し、溶液中のペプチド１．２当量に加える。混合物を１６時間攪拌する。
【００７１】
次に、オリゴペプチド接合体をＤｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８  １５μｍ  ３００Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ）上で精製し、質量分析法によって特性決定する。
【００７２】
１．１．２  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ前の試料調製
幾つかの一般に用いられるマトリックスを、区別せずＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に用いた：  α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸  （ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシピコリン酸  （ＨＰＡ）およびシナピン酸  （ＳＡ）。
【００７３】
ＣＨＣＡについては、マトリックス１０ｍｇをアセトニトリル／水（２：１，  ｖ／ｖ，  ０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）１ｍｌに溶解した。ＳＡについては、マトリックス２０ｍｇを同じ溶媒に溶解した。
【００７４】
ＳＡについては、マトリックス２０ｍｇを同じ溶媒に溶解した。
【００７５】
ＨＰＡについては、マトリックス５０ｍｇ／ｍｌを水に溶解した。
【００７６】
場合によっては、添加剤（クエン酸または酢酸アンモニウム）をマトリックスに加えた。
【００７７】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の前に、試料溶液１μｌとマトリックス溶液１μｌを乾燥小滴製剤の手順に従ってＭＡＬＤＩプレート上で混合した（Karas, M.; Hillenkamp, F.; Anal.Chem. 1998, 60, 2299-2301）。
【００７８】
３種類の異なるＭＡＬＤＩプレート材料であるステンレススチール、金およびテフロンを試験した。
【００７９】
１．１．３  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、遅延引き出し（ＤＥ）を有し、かつ３３７ｎｍのパルスド窒素レーザーで操作するＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  フラミンガム，  マサチューセッツ，  米国）で行った。
【００８０】
リニアモードでの分析
イノックス（ｉｎｏｘ）ＭＡＬＤＩプレートについては、取得パラメーターを下記のように設定した：  加速電圧：２０ｋＶ；第１のグリッド電圧：９４％；ガイドワイヤー電圧：０．０５％；引出遅延時間：１００−２５０ナノ秒。
【００８１】
金ＭＡＬＤＩプレートについては、取得パラメーターを下記のように設定した：  加速電圧：２５ｋＶ；第１のグリッド電圧：９６％；ガイドワイヤー電圧：０．０５％；引出遅延時間：６００ナノ秒。
【００８２】
リフレクターモードでの分析
加速電圧：２０ｋＶ，第１のグリッド電圧：７０％，ガイドワイヤー電圧：０．０５％，引出遅延時間：２００ナノ秒。
【００８３】
１．１．４  イメージ再構築のためのソフトウェア
イメージ再構築（ｉｍａｇｅ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）には、ソフトウェア  ｆｌｅｘＩｍａｇｉｎｇ  （Ｂｒｕｋｅｒ  ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，ブレーメン，ドイツ国）を用いた。
【００８４】
１．１．５  オリゴペプチド接合体を用いるＰＣＲ増幅
プロエンケファリンのＰＣＲ増幅は、タグ付き（ペプチド−光開裂可能なリンカー−オリゴヌクレオチド）または通常の（光開裂可能なリンカーおよびペプチド残基のない）フォワード（５’−ＣＡＧ−ＧＡＣ−ＴＣＣ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＣ−ＡＧＧ−Ａ−３’，配列番号：９，表２参照）およびリバーズ（５’−ＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−ＣＧＧ−ＴＡＧ−ＣＴＧ−ＣＡＴ−ＴＴ−３’，配列番号：１０，表２参照）プライマーを用いて得た。
【００８５】
次に、増幅生成物を２％アガロースゲル中の電気泳動によって分析した。
【００８６】
１．１．６  光開裂可能なリンカーを用いるｄＵＴＰ−ペプチド接合体の合成
下式を有する修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを合成した：
【化１３】
2008542783.tif 000017
【００８７】
合成には、下記の合成工程図に従った。
【化１４】
2008542783.tif 000018
【００８８】
この三リン酸塩を調製するには、Ｆｍｏｃで保護したＣＰＧ樹脂が必要であった。前駆体は入手することができなかったので、ＧＴ１１５Ａ（１００ｍｇ）からスクシニレート（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｅ）を調製した。試料は比較的純粋であったが、高流動性の非トリチル化化合物（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ反応に由来し、以後の反応を妨げず、試料のｎｍｒスペクトルでは確認されない）を少量（ＴＬＣによる）含んでいた。このスクシネートを精製することはできなかったので、反応を若干変更した。定量的収率を得るには、通常は無水コハク酸２当量を反応に加えるが、これが完全に除去されないときには、ｃｐｇ樹脂のアミノ残基を官能化の際にブロックすることができる。従って、生成物の精確な純度が決定されないので、１．５当量を用いた。反応は完結しなかった（ＴＬＣからは、これはＵＶ（２５４ｎｍ）によるＴＬＣ上の成分の強度と発煙ＨＣｌで処理したときのＤＭＴカチオンの強度を比較することによって５０％を上回った）。スクシニル化されていない生成物は反応しないので、樹脂をこの混合物を用いて官能化した。樹脂は調製したが、装填量（ｌｏａｄｉｎｇ）は極めて低く、５．４μｍｏｌ／ｇ（１８０ｍｇ）であった。
【００８９】
樹脂をＤＣＭで洗浄した２％  ＴＣＡ／ＤＣＭを用いて脱トリチル化し、ＤＭＴカチオンによる橙色が見られなくなるまでこの工程を繰り返した。
【００９０】
次いで、これを（アルゴン下にて吸引して）乾燥し、樹脂をピリジン／ＤＭＦ  １：３  （０．４ｍｌ）に５分間浸漬した後、０．１Ｍ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ試薬をジオキサンに溶解したものを加えた（０．１ｍｌ）。反応を１５分間放置した後、樹脂を洗浄し（ジオキサン，ＭｅＣＮ）、乾燥した（アルゴン下にて吸引）。
【００９１】
次に、樹脂を０．５Ｍビス−（トリブチルアンモニウム）ピロホスフェートを無水ＤＭＦとトリ−ｎ−ブチルアミンに溶解したものに２０分間浸漬し、樹脂を洗浄し（ＤＭＦ，  ＭｅＣＮ）、乾燥した（アルゴン下にて吸引）。
【００９２】
生成物を酸化し（ヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦ、３０分間）、洗浄し（ＭｅＣＮ）、乾燥した（アルゴン下にて吸引）。
【００９３】
Ｆｍｏｃ保護基を除去し（２０％ピペリジン／ＤＭＦ，０．５ｍｌ，２０分間）、樹脂を十分に洗浄し（ＤＭＦ，ＭｅＣＮ）、乾燥した（アルゴン下にて吸引）。これを次にＤＣＩで洗浄し、ＤＣＩ／光解離性アミノリンカーＣＥＰ  （１：１，０．５ｍｌ）の溶液を加え、反応を２０分間放置した。溶液を除去し、樹脂を洗浄し（ＭｅＣＮ）、乾燥した（アルゴン下にて吸引）。キャップＡ／キャップＢの混合物（１：１，０．５ｍｌ）を加え、樹脂を５分間浸漬した後、キャッピング試薬を除去し、上記の通りに樹脂を洗浄し、乾燥した。生成物を酸化し（Ｉ２／ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ２Ｏ，５分間）、樹脂を上記の通りに樹脂を洗浄し、乾燥した。これを樹脂からｃＮＨ４ＯＨを用いて室温にて３０分間開裂させた後、Ｄｉｏｎｅｘ  ＮｕｃｌｅｏＰａｃ１００  ＨＰＬＣカラム上でのアニオン交換ＨＰＬＣによって下記の溶媒系である緩衝液Ａ：１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌおよび緩衝液Ｂ：  １０％アセトニトリルを含む１Ｍ  ＮＨ４Ｃｌを用いて、流速２．５ｍｌ／分にて６Ｔｒｉｐｈｏｓ．ｍｔｈを用いて精製した。これにより、３画分（Ａ：−７分，Ｂ：−７．９分およびＣ：−１０．３分）を得た。３画分総てを一晩凍結乾燥した後、逆相ＨＰＬＣ（緩衝液Ａ：水；緩衝液Ｂ：アセトニトリル；  流速４ｍｌ／分）によって脱塩した。３画分を再度一晩凍結乾燥した後、水２００μｌに懸濁した。Ｍ．Ｓ．は、ＣＭＭ６６１Ａ  ｐｋ  １は確かに三リン酸塩ではないが、ＣＭＭ６６１ｐｋ  ２または３である可能性があることを示した（Ｍ．Ｓ．プロフィールが極めて類似）。（ＣＭＭ６６２Ａは、ＣＭＭ６６１Ａ  ｐｋ  ２から形成され、ＣＭＭ６６３Ａは、ＣＭＭ６６１Ａ  ｐｋ  ３から形成された。）
【００９４】
次に、これらの試料を、以後の反応に用いた。重炭酸塩緩衝液（１０μｌ）およびマレイミドＮＨＳエステル（５０μｌ）をそれぞれの試料に加え、反応を一晩攪拌した。試料をｍｉｌｌｉＱ水（５００μｌ）で希釈し、濾過した。試料をＲＰ−ＨＰＬＣ  （緩衝液Ａ：  ０．１Ｍ  ＴＥＡＡ，緩衝液Ｂ：  ＭｅＣＮ，流速  ４ｍｌ／分）によりＭｅＣＮ５０．ｍｔｈを用いて精製し、ペプチドのカップリングをこれらの画分で行った。
【００９５】
１．１．７  修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを組込んでいるプロエンケファリン核酸プローブ（４００ｂｐ）の合成
上記で合成した修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを組込んでいるプロエンケファリン核酸プローブ（４００ｂｐ）（１．１．６項参照）を、１．１．５項に記載の通常のフォワードおよびリバースプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって合成した。
【００９６】
１．２  結果
１．２．１  様々な分析モードでの１個または多数のオリゴペプチド接合体の検出
３種類のオリゴペプチド接合体を、様々な分析モードで別々にまたは同時に分析した（図４）。
【００９７】
リニア正モード（図４Ａ）、リニア負モードおよびリフレクター正モードでの別々のオリゴペプチド接合体の分析は、様々なＭＡＬＤＩ分析モードで容易に検出することができる。
【００９８】
感度試験も行い、様々なＭＡＬＤＩ分析モードにおける検出閾値を評価した。観察閾値は、リニア正モードでは１００ｆｍｏｌでありシグナル／ノイズ比は８であり（図４Ｂ）、リフレクター正モードでは１ｐｍｏｌでありシグナル／ノイズ比は５であった。
【００９９】
オリゴペプチド１、２および３を、更にリニア正モード、リニア負モードおよびリフレクター正モードで同時に分析した（図４Ｃ）。図４Ｃにおいて、それぞれのオリゴペプチド接合体について、異なるｍ／ｚ比の２本のピークが観察された。高い方のｍ／ｚ比のピーク（ペプチド１、３および２について、それぞれｍ／ｚ  １３４６．９５、１６０３．７４および１８９１．７２）は、予想開裂部位（光開裂可能なリンカーを含む）での光開裂ペプチドに対応する。低い方のｍ／ｚ比のピーク（ペプチド３および２について、それぞれｍ／ｚ  １１６１．８７および１４４９．８８）は、続いて気相で開裂してペプチドのみのプロトン化イオンを形成するものに対応すると思われる（光開裂可能なリンカーを含まない）。
【０１００】
いずれの場合にも、これらの結果は３種類の異なるオリゴペプチドを容易に同時検出することができることを示している。
【０１０１】
ＭＡＬＤＩプレート材料の、分解能、感度およびシグナル／ノイズ比に対する影響を、ステンレススチール、金およびテフロンＭＡＬＤＩプレートを用いてクエン酸または酢酸アンモニウムからなる添加剤の有無で検討した。
【０１０２】
結果は、どのような材料を用いても、クエン酸または酢酸アンモニウムがあってもなくても、光開裂可能なリンカーの開裂が可能であることを示している。
【０１０３】
更に、シグナル／ノイズ比およびシグナル強度が金のＭＡＬＤＩプレートで一層高くなると思われる（図４Ｄ）。
【０１０４】
１．２．２  固体支持体上でのオリゴペプチド接合体のマッピング
表面でのオリゴペプチド接合体のマッピングの可能性を評価するため、オリゴペプチド３からなるＸ文字のイメージをＭＡＬＤＩプレート上にマルチピペットを用いて描いた。
【０１０５】
次いで、対応する範囲をＭＡＬＤＩ−ＭＳによってスポット毎に分析し、ナトリウムカチオン化形態ＭＮａ＋でのオリゴペプチド３の光開裂断片に対応するイオンｍ／ｚ１６２６．３７の配分をイメージ構築ソフトウェアを用いて再構築した。
【０１０６】
図５は得られた再構築イメージを示し、直接開裂から簡単なイメージを得ることができることを立証している。
【０１０７】
１．２．３  オリゴペプチド接合体をプライマーとして用いるペプチドタグ付きプロエンケファリンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブの合成
オリゴペプチド接合体をフォワードおよび／またはリバースプライマーとして用いて一層大きなハイブリダイゼーションプローブを合成することが可能であることを確かめるために、タグ付き（ペプチド−光開裂可能なリンカー−オリゴヌクレオチド）または通常の（光開裂可能なリンカーおよびペプチド残基のない）フォワード（５’−ＣＡＧ−ＧＡＣ−ＴＣＣ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＣ−ＡＧＧ−Ａ−３’）およびリバース（５’−ＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−ＣＧＧ−ＴＡＧ−ＣＴＧ−ＣＡＴ−ＴＴ−３’）プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。
【０１０８】
生成された増幅生成物を、図６Ａに示す。得られた結果は、フォワードおよび／またはリバースペプチドタグ付きプライマーの使用が増幅を阻害せず、約４００ｂｐのプロエンケファリンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブが生じることを示している。
【０１０９】
シリカカラム精製の後、増幅されなかったプライマー二量体を除去し、純粋なＰＣＲ増幅生成物を得た（図６Ｂ）。
【０１１０】
精製したＰＣＲ増幅生成物のＭＡＬＤＩ分析を行った。タグ付きフォワードおよびリバースプライマー（図６Ｃ）およびタグ付きフォワードおよび通常のリバースプライマー（図６Ｄ）で得られた結果は、かなりの量のＰＥＧが含まれていても、ペプチドタグは開裂し、検出することができることを示している。実際に、開裂したペプチドのｍ／ｚ比（ｍ／ｚ＝１７０４）は幾つかの場合にはＰＥＧシグナルに帰因することがあるが、ｍ／ｚ比が１７２０の特徴的イオン（Ｍ−ＮＨ２）＋は容易に検出することができる。
【０１１１】
１．２．４  ペプチドタグ付きハイブリダイゼーションプローブを用いる、パラフィン除去したラット脳切片におけるプロエンケファリンｍＲＮＡ分析
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、上記のようにパラフィンを除去したラット脳切片上でペプチドタグ付きハイブリダイゼーションプローブを用いて行った。
【０１１２】
次に、ＭＡＬＤＩ分析を異なる組織部位で行い、生成されるスペクトルを分析した。
【０１１３】
図７は、２箇所の異なる脳切片部位における得られたスペクトル（図７ＡおよびＢ）並びに非ペプチドタグ付きハイブリダイゼーションプローブを用いてハイブリダイズしたコントロール脳切片の分析によって得られたコントロールスペクトルを示す。
【０１１４】
コントロールスペクトルは、非ペプチドタグ付きハイブリダイゼーションプローブを用いるときには、開裂ペプチド（ｍ／ｚ＝１７０４）または特徴的イオン（ｍ／ｚ＝１７２０）のｍ／ｚ比でシグナルが検出されないことを示している。
【０１１５】
対照的に、プロエンケファリンｍＲＮＡ発現は、図７Ａの脳切片部位で明確に確認することができるが（ｍ／ｚ＝１７０４および１７２０のピーク参照）、プロエンケファリンｍＲＮＡ発現は、第二の異なる部位では検出することができない（図７Ｂ、ｍ／ｚ＝１７０４または１７２０にはピークがない）。
【０１１６】
プロエンケファリンのｍＲＮＡ発現は、このように組織切片の異なるスポットで明確に観察することができるので、組織切片プロエンケファリンｍＲＮＡ発現のイメージを更に再構築することができる。
【０１１７】
１．２．５  光開裂可能なリンカーを有するｄＵＴＰ−ペプチド接合体の合成およびマルチペプチドタグ付きプロエンケファリンプローブ  （４００ｂｐ）を生成するための上記修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰの使用
材料および方法の節に記載の合成プロトコルを用いて、図８Ａに示した式を有する修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰヌクレオチドを合成した。
【０１１８】
修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰをＭＡＬＤＩ分析によって分析し、ペプチドタグの検出を確認した。図８Ｂに示されるように、ペプチドタグは予想される１１６３．２３  Ｍ＋Ｈ＋に明確に検出される。
【０１１９】
このような修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを用いることによって、プロエンケファリンについてのマルチペプチドタグ付き核酸ハイブリダイゼーションプローブが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび図８Ａに示される修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰの存在下で簡単なＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いて極めて簡単に生成した。この方法により、特異的ハイブリダイゼーションプローブを、任意の他のターゲットｍＲＮＡ配列について容易に合成することができた。
【０１２０】
修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰは容易にプロエンケファリンプローブに組込まれることを確認するため、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰまたはタグなしの非修飾ｄＵＴＰを用いて増幅したプロエンケファリンの精製したＰＣＲ生成物をＭＡＬＤＩ分析を用いて分析した。
【０１２１】
図８で示されるように、ペプチドタグは修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰで増幅したプロエンケファリンの試料において予想された１１６３．０６  Ｍ＋Ｈ＋（図８Ｃ）で容易に検出されるが、タグを持たない非修飾ｄＵＴＰで増幅したプロエンケファリンの試料では、予想されたＭ＋Ｈ＋にシグナルは検出されない（図８Ｄ）。
【０１２２】
更に、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰで合成した所定のハイブリダイゼーションプローブはその配列におけるＵ塩基の数と同数のタグペプチドを有するので、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰの使用によりシグナル増幅が可能である。
【０１２３】
最後に、修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰで合成したハイブリダイゼーションプローブを用いて組織切片におけるｍＲＮＡ発現を定量的に分析することができる。実際に、１または数個の検討したｍＲＮＡの対応するタグによって生成したシグナルを、参照ｍＲＮＡ配列（例えば、ＨＰＲＴのアクチンのようなハウスキーピング遺伝子）について得たものと比較することができる。それぞれのハイブリダイゼーションプローブにおけるＵ塩基の数は知られているので、それぞれの検討したｍＲＮＡ配列と参照ｍＲＮＡ配列との間の発現比を計算することができる。
【０１２４】
１．３  結論
これらの結果は、ペプチドタグ付きプライマーで合成したハイブリダイゼーションプローブを用いて、核酸−光開裂可能なリンカー−ペプチド接合体を使用することにより組織切片中の多数のｍＲＮＡターゲット分子の間接的同時検出が可能であることを明確に示している。
【０１２５】
更に、任意のターゲットｍＲＮＡ特異性を有するペプチドタグ付きハイブリダイゼーションプローブを一層容易に合成し、タグシグナルの増幅により検出閾値を下げ、および組織切片における定量的ｍＲＮＡ発現分析を行うことができる修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを合成した。
【０１２６】
従って、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を用いる組織切片における幾つかの異なるｍＲＮＡターゲット分子の間接的同時マッピングが低い検出閾値で可能であり、マルチプレックス分析および定量分析さえも可能である。
【０１２７】
実施例２
ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる組織切片におけるタンパク質の間接検出のための光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体の使用
光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体を合成し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いる組織切片における特異的なタンパク質を間接検出するその能力について試験した。
【０１２８】
２．１  抗体−ペプチド接合体の合成
ウサギ抗体の枠組構造領域に特異的なヤギ抗体（ヤギ抗ウサギ抗体）を用いて、ＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザー波長で光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体を合成した。この方法では、この接合体は、一次ウサギ抗体が利用可能な任意のペプチド、タンパク質、抗原またはハプテンの間接分析に対する二次抗体として適している。更に、下記の合成プロトコルは任意のペプチド、タンパク質、抗原、またはハプテンなどの任意の特異性を有する任意の抗体に応用可能であるので、抗体が別の種類の抗体または任意の所望なペプチド、タンパク質、抗原もしくはハプテンに特異的である他の接合体を下記のプロトコルを用いて容易に合成することができる点に留意しなければならない。
【０１２９】
タグ分子分子としては、式ＤＳＰＥＧＬＮＲＫＱＫＰＡ（配列番号：１１）を示すペプチドを用いた。しかしながら、この場合にも、下記のプロトコルはタグ分子として所望なことがある任意の他のペプチドに応用可能である。
【０１３０】
ペプチドは固相で合成して光開裂可能なリンカーに直接カップリングし、式：
【化１５】
2008542783.tif 000019
のペプチド−光開裂可能な化合物を生成した。
【０１３１】
抗体−ペプチド接合体は、下記の反応工程を用いて合成した。
１．  光開裂可能なリンカーを用いる固相ペプチド合成（古典的Ｆｍｏｃ法）
２．  水／アセトニトリル＋０．５％  ＴＦＡを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）によるペプチドの精製
３．  ＭＢＳ  ０．５ｍｇをＤＭＦ  ３００μｌに溶解
４．  ＩｇＧ（ヤギ抗ウサギ）４ｍｇをＰＢＳ  ２ｍｌに溶解
５．  生成物３および４をゆっくり混合。反応は、２０℃で３０分間攪拌下で起こる
６．  ＰＤ１０を用いて５０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ  ６により塩を除去
７．  ペプチド１ｍｇをＤＭＦ  ３００μｌに溶解した後、ＰＢＳ  １ｍｌを加えた。
８．  このペプチド溶液を活性抗体溶液に添加すると、反応が暗所にて２０℃にて３時間攪拌下で起こる
９．  ＰＢＳを一晩透析によって除去。
【０１３２】
光開裂可能なリンカーを用いる抗体−ペプチド接合体の合成の主反応を、図９に示す。得られた抗体−ペプチド接合体は、下式：
【化１６】
2008542783.tif 000020
を有し、図１０に省略した形態で示されている。
【０１３３】
２．２  得られた抗体−ペプチド接合体の溶液中でのＭＡＬＤＩ分析
次に、光開裂可能なリンカーを用いて得られた抗体−ペプチド接合体を、最初に溶液中で試験して、タグペプチドのＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザーによって誘発される光解離によって効率的に開裂される能力を確かめた。
【０１３４】
結果は図１０に示されており、光開裂可能なリンカーＰＣに連結したままのペプチドタグ（ペプチド＋ＰＣ，  ｍ／ｚ＝１７０３）は、ＭＡＬＤＩ脱離／イオン化工程の後に容易に検出されることを明らかに示している。
【０１３５】
更に、タグペプチド、光開裂可能なリンカー、および最初は抗体に属するシステインを含んでなる迅速断片化による断片（図１１参照）（ペプチド＋ＰＣ＋システイン，  ｍ／ｚ＝１８２２）も検出され、得られた抗体−ペプチド接合体は、組織切片の他の型の質量分析法（例えば、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ）による分析にも適していることを明確に示している。
【０１３６】
２．３  得られた抗体−ペプチド接合体を用いるラット脳組織切片のＭＡＬＤＩ直接分析
光開裂可能なリンカーを用いて得られた抗体−ペプチド接合体を、次にラット脳組織切片における膜タンパク質カルボキシペプチダーゼＤ  （１８０  ｋＤａ）の間接ＵＶ−ＭＡＬＤＩ分析について試験した。
【０１３７】
ラット脳組織切片を、最初にカルボキシペプチダーゼＤに特異的な一次ウサギ抗体とハイブリダイズした。第二工程では、光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体を加えて、組織切片上に存在する一次抗体とハイブリダイズさせた。
【０１３８】
生成する着色組織切片を、次にＵＶ−ＭＡＬＤＩを用いて分析した。
【０１３９】
典型的なスペクトルを図１２に示す。これは、光開裂可能なリンカーＰＣに連結したままのペプチドタグ（ペプチド＋ＰＣ，ｍ／ｚ＝１７０３．２３）は、間接ＵＶ−ＭＡＬＤＩ組織切片分析を用いて容易に検出されることを明らかに示している。タグペプチドに対応するもう一つの断片（ペプチド＋ＰＣ＋Ｏ，ｍ／ｚ＝１６８６．４３）も、容易に検出される。
【０１４０】
本発明による方法を用いて、ラット脳組織切片を走査し、それぞれのスペクトルデータを保存し、カルボキシペプチダーゼＤの発現マップのイメージを構築した。結果を図１３に示されており、光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体を用いる本発明による方法を用いて発現マップを構築することができることを明らかに示している。
【０１４１】
更に、発現マップを構築する本発明による方法の信頼性を更に明らかにするため、ラット脳組織切片をカルボキシペプチダーゼＤに特異的なウサギ一次抗体で染色し、古典的な市販の二次抗体上に固定した後にＴ−クロロナフトールを色原体として用いて顕色した。得られた染色はカルボキシペプチダーゼＤのＭＡＬＤＩ検出と共存し（データは示さず）、従って、本発明による方法とＭＡＬＤＩイメージングの信頼性は古典的方法より感度が高いことを示している。
【０１４２】
これらの結果は、光開裂可能なリンカーを用いて合成した抗体−ペプチド接合体は組織切片におけるタンパク質の間接検出並びに発現マップの構築を行うことができることを示している。
【０１４３】
実施例３
組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法による分析に、光解離の代わりに迅速断片化を用いることができることの証明
迅速断片化は、通常は有害であるが避け難い現象と考えられている。
【０１４４】
本発明の場合には、本発明者らは、（Ａ−Ｘ）ｎ−Ｂ接合体であって、リンカーＸが迅速断片化によって開裂されるものを用いて、組織切片における少なくとも１種類のターゲット分子マップを決定する方法を行うのに、この必要な現象を利用することができることを見出した。
【０１４５】
３．１  リンカーがＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能な接合体を用いる組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法による分析のための迅速断片化
このコンセプトはＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法のような他の質量分析法の技術に置き換えることができるが、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ質量分析法と、リンカーがＵＶ−ＭＡＬＤＩレーザーの波長で光開裂可能な接合体を用いるこのコンセプトの使用が可能であることを最初に明らかにした。
【０１４６】
実際に、オリゴペプチド接合体または抗体−ペプチド接合体を、光開裂可能なリンカー（ＰＣ）と共に用いると、予想された（ペプチド＋ＰＣ）断片の他に、ペプチドタグを含んでなる他の断片が観察され、これらの断片は接合体の迅速断片化による断片に対応している。
【０１４７】
更に正確には、３種類の異なるオリゴペプチド接合体を光開裂可能なリンカーと共に用いるときには（これらの接合体の更に精確な定義については、実施例１を参照）、タグペプチド１、ペプチド２またはペプチド３に対応する断片が、図４Ｃで明確に示されているように、予想された断片（ペプチド１、２または３＋ＰＣ）の他に観察される。例えば、ペプチド２タグ分子を用いる接合体２については、光解離断片と迅速断片化による断片の両方が観察される：
予想された光解離断片＝（ペプチド２＋ＰＣ），ｍ／ｚ＝１８９２；および
迅速断片化による断片＝ペプチド２のみ，ｍ／ｚ＝１４５０。
【０１４８】
同じ現象は、図４Ｃで接合体３について観察される：
予想された光解離断片＝（ペプチド３＋ＰＣ），ｍ／ｚ＝１６０４；および
迅速断片化による断片＝ペプチド３のみ，ｍ／ｚ＝１１６２。
【０１４９】
例２に記載の抗体−ペプチド接合体を用いるときにも、予想された光解離断片と迅速断片化による断片との両方が図１１に示されるように観察される：
予想された光解離断片＝（ペプチド＋ＰＣ），ｍ／ｚ＝１７０２；および
迅速断片化による断片＝ペプチド＋ＰＣ＋システイン，ｍ／ｚ＝１８２２。
【０１５０】
３．２  ＦＩＴＣ標識抗体を用いる組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法による分析のための迅速断片化
本発明者らは、通常の、特に市販の標識抗体を用いる組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法による分析のために迅速断片化を用いる可能性についても分析した。
【０１５１】
実際に、通常の標識分子は一定の分子量を有しており、従ってタグ分子として用いることができる。更に、極めて広範囲の抗原特異性を有するあらゆる種類の抗体は、標識抗体として市販されている。最後に、従来のリンカーを介して標識分子を任意の抗体に結合する技術は周知の日常的技術であり、従って組織切片に存在する生体分子の間接質量分析法による分析に通常の標識抗体を用いることができることにより、本発明による方法を用いてマッピングすることができる異なる生体分子の数を確実に増やすことができる。
【０１５２】
ＦＩＴＣ標識抗体を用いて、ＣＨＣＡマトリックスを用いるＦＩＴＣ標識抗体の溶液ＭＡＬＤＩ分析を行った。
【０１５３】
結果は図１４に示されており、ＦＩＴＣ分子の特徴的シグナルが容易に検出されることを示している（ｍ／ｚ＝３６５．１８）。抗体とＦＩＴＣ分子との間のリンカーは、ＭＡＬＤＩレーザー波長で光開裂可能でないので、迅速断片化が、抗体とその標識分子との間の結合を開裂することができることを明らかに示している。
【０１５４】
これらの結果は更に組織切片で確かめなければならないが、溶液で得られた総ての上記結果はさらに組織切片上で確かめられている。従って、これらの結果は、ＭＡＬＤＩ質量分析法だけでなく、迅速断片化を含む他の質量分析法の技術、特にＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法、を用いる組織切片におけるターゲット分子の間接検出に、迅速断片化および通常の標識抗体を用いることができることを強く支持している。
【０１５５】
３．３  結論
得られた結果は、様々な質量分析法の技術、特にＭＡＬＤＩ、ＳＩＭＳまたはＤＥＳＩ質量分析法を用いる、組織切片におけるターゲット分子の間接検出に、通常は有害な迅速断片化の現象を利用することができることを明らかに示している。
【０１５６】
実施例４
抗体とＢｒ原子との間のリンカー分子を開裂するための断片化を用いて組織切片の質量分析法による分析に用いるための抗体−Ｂｒ接合体の合成
抗体−Ｂｒ接合体は、ＳＩＧＭＡから製品番号Ｅ１７６９で発売されているＥＤＡＣリンカー
【化１７】
2008542783.tif 000021
を用い、下記のプロトコル
【化１８】
2008542783.tif 000022
を用いて合成することができる。
【０１５７】
このようなプロトコルは任意の抗体または抗体断片を用いて適用され、これをＢｒ原子と接合させることができる。このような接合体を、断片化を用いて抗体とＢｒ原子との間のリンカーを開裂する本発明による方法で用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】ＭＡＬＤＩ脱離／イオン化工程中のタグ分子放出および免疫細胞化学技術による間接検出のために特異的にデザインされた標識プローブを組み合わせるＭＡＬＤＩによるｍＲＮＡ特異的マルチプレックスイメージングの模式的原理。
【図２】異なる標識プローブ（オリゴヌクレオチド、抗体、レクチン、アプタマー）を用いる異なるターゲット（ペプチド、タンパク質、ｍＲＮＡ、糖質、薬剤）の可能な特異的イメージングの概略図。
【図３】ＭＡＬＤＩ脱離／イオン化工程中のタグ分子放出および免疫細胞化学技術による間接検出のために特異的にデザインされた標識プローブを組み合わせる、ＭＡＬＤＩによるペプチド／タンパク質マルチプレックス特異的イメージングの模式的原理。
【図４】Ａ．リニア正モードでのオリゴペプチド３、Ｂ．リニア正モードでの１００ｆｍｏｌオリゴペプチド１、Ｃ．リフレクター正モードでのオリゴペプチド１、２および３の同時の、およびＤ．金製のＭＡＬＤＩ支持プレート上のオリゴペプチド３、のペプチド残基の検出。
【図５】固体支持体上のオリゴペプチド３のマッピング。オリゴペプチド３を固体支持体上にマルチピペットで沈着させ、Ｘ文字のイメージを描いた。次に、オリゴペプチド３の存在をＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析によってマッピングし、イメージをＩＤＬソフトウェアを用いて再構築した。生成するイメージを示す。
【図６】ペプチドタグ付きプロエンケファリンのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブの合成。Ａ．タグ付き（ペプチド−光開裂可能なリンカー−オリゴヌクレオチド）または通常の（光開裂可能なリンカーおよびペプチド残基のない）フォワード（５’−ＣＡＧ−ＧＡＣ−ＴＣＣ−ＣＣＡ−ＡＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＣ−ＡＧＧ−Ａ−３’）およびリバース（５’−ＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＣ−ＡＧＧ−ＣＧＧ−ＴＡＧ−ＣＴＧ−ＣＡＴ−ＴＴ−３’）オリゴヌクレオチドを用いて得たプロエンケファリンのＰＣＲ増幅生成物。ライン１：通常のフォワードおよびリバースプライマー。ライン２：タグ付きフォワードおよび通常のリバースプライマー。ライン３：通常のフォワードおよびタグ付きリバースプライマー。ライン４：タグ付きフォワードおよびタグ付きリバースプライマー。ライン５：負コントロール：水コントロール。ライン６：分子量マーカー。Ｂ．シリカカラム上での精製後の対応する増幅生成物。ライン１：通常のフォワードおよびリバースプライマー。ライン２：タグ付きフォワードおよび通常のリバースプライマー。ライン３：通常のフォワードおよびタグ付きリバースプライマー。ライン４：タグ付きフォワードおよびタグ付きリバースプライマー。ライン５：負のコントロール：水コントロール。ライン６：分子量マーカー。Ｃ．およびＤ．タグ付きフォワードおよびリバースプライマー（Ｃ）、またはタグ付きフォワードおよび通常のリバースプライマー（Ｄ）を用いた精製ＰＣＲ増幅生成物のＭＡＬＤＩ分析。
【図７】ペプチドタグ付きプロエンケファリンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブのハイブリダイゼーション後のパラフィンを除去したラット脳切片の直接ＭＡＬＤＩ分析。Ａ．第一の組織切片局在。Ｂ．第二の異なる組織切片局在。Ｃ．非ペプチドタグ付きプロエンケファリンｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブによるコントロール分析。
【図８】修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを組込んでいる核酸プローブの合成およびＭＡＬＤＩ分析。Ａ．修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰの構造および修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを組み込んでいるプロエンケファリン核酸プローブ（４００ｂｐ）のＲＴ−ＰＣＲ合成の略図。Ｂ．修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ分析。Ｃ．修飾ペプチドタグ付きｄＵＴＰを組込んでいるプロエンケファリン核酸プローブのＭＡＬＤＩ分析。Ｄ．ペプチドタグのない通常の非修飾ｄＵＴＰを組込んでいるプロエンケファリン核酸プローブのＭＡＬＤＩ分析。
【図９】光開裂可能なリンカーＸを用いる抗体−ペプチド接合体の合成反応。
【図１０】光開裂可能なリンカーＸを有する抗体−ペプチド接合体の構造。ＭＡＬＤＩ質量分析法によって検出された２個の主要断片（光開裂可能なリンカーの開裂を介するタグの光解離によって得られた第一の断片、および分子の迅速断片化によって得られた第二の断片）を示す。
【図１１】光開裂可能なリンカーＸを用いる抗体−ペプチド接合体の溶液ＭＡＬＤＩ分析中に得られる典型的な質量スペクトル（マトリックス  シナピン酸  ＳＡ）。
【図１２】接合体を用いない場合（Ａ，ラット脳コントロール）と光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体を用いる場合（Ｂ）の、ラット脳組織切片の直接分析中に得られる典型的な質量スペクトル。
【図１３】膜タンパク質カルボキシペプチダーゼＤ（１８０ｋＤａ）に対して向けられたウサギ一次抗体と、光開裂可能なリンカーを有する抗体−ペプチド接合体とによって検出された該タンパク質の発現マップ。このイメージは、ペプチドタグに対応する検出シグナルから再構築されている。
【図１４】ＣＨＣＡマトリックスを用いるＦＩＴＣ標識抗体の溶液ＭＡＬＤＩ分析中に得られる典型的な質量スペクトル。Ａ．ＦＩＴＣ標識抗体なし（ＣＨＣＡマトリックスのみ）。Ｂ．ＦＩＴＣ標識抗体あり。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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