(57)【要約】  プリオン蛋白質を親和性結合させるための式（Ｉ）の化合物の使用であり、式中、Ｒ1及びＲ2は同じであっても異なっていてもよく、各々置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基であり；Ｒ3は水素又はアリール基の置換基であるか、又はＲ3はスペーサー分子を介して任意に結合した固体支持体であり；Ｚは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ4を表し；Ｙは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ5を表し；ここで、Ｒ4及びＲ5は同じであっても異なっていてもよく、水素、１〜６個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル又は置換されていてもよいβ−フェニルエチルを表し；Ｘ1及びＸ2の一方は窒素原子を表し、Ｘ1及びＸ2の他方は窒素原子又はＣＲ6を表し、ここで、Ｒ6は水素又はアリール基の置換基を表す化合物はプリオン蛋白質の親和性結合に有用である。
2008508245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリオン蛋白質を親和性結合させるための下記式（Ｉ）で表される化合物の使用：
【化１】
2008508245.tif 000012
（式中、Ｒ1及びＲ2は同じであっても異なっていてもよく、各々置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基であり；
Ｒ3は水素又はアリール基の置換基であるか、又はＲ3はスペーサー分子を介して任意に結合した固体支持体であり；
Ｚは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ4を表し；
Ｙは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ5を表し；
ここで、Ｒ4及びＲ5は同じであっても異なっていてもよく、水素、１〜６個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいβ−フェニルエチルを表し；
Ｘ1及びＸ2の一方は窒素原子を表し、Ｘ1及びＸ2の他方は窒素原子又はＣＲ6を表し、ここで、Ｒ6は水素又はアリール基置換基を表す）。
【請求項２】
試料中のプリオン蛋白質を検出し、かつ／又は試料からプリオン蛋白質を除去する方法であって、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物に試料を接触させる工程を含む該方法。
【請求項３】
ヒト又は動物被験体におけるプリオン関連病状の進展を治療する、或いは遅延させる方法であって、固体支持体に結合していない請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の治療上有効な量を被験体に投与する工程を含む該方法。
【請求項４】
プリオン関連病状の処置のための薬剤の製造における、固体支持体に結合していない請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項５】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物であって：
Ｒ3は請求項１における定義と同様であり；
Ｘ1及びＸ2は請求項１における定義と同様であり；
Ｙは請求項１における定義と同様であり；
Ｚは請求項１における定義と同様であり；
Ｒ1は基−（ＣＨ2）m−Ｑ1を表し、式中、ｍは０〜７であり、Ｑ1は−ＣＲ11Ｒ12Ｒ13又は−ＮＲ11Ｒ12を表し、ここでＲ11，Ｒ12及びＲ13は各々独立に水素、アルキル、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表し、或いはＲ11，Ｒ12及びＲ13のうち２つが、結合される炭素又は窒素原子とともに、置換されていてもよいシクロアルキル又は置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基を形成し；
Ｒ2は基−（ＣＨ2）n−Ｑ2を表し、式中、ｎは０〜７であり、Ｑ2は−ＣＲ21Ｒ22Ｒ23又は−ＮＲ21Ｒ22を表し、ここでＲ21，Ｒ22及びＲ23は各々独立に水素、アルキル、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表し、或いはＲ11，Ｒ12及びＲ13のうち２つが、結合される炭素又は窒素原子とともに、置換されていてもよいシクロアルキル又は置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基を形成する、該化合物。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって：
ａ）Ｘ1及びＸ2は共に窒素であり；
ｂ）特にＲ4が水素である場合、Ｚ及びＹは共にＮＲ4を表し、；
ｃ）ｍは０〜４、より好ましくは０〜３、最も好ましくは１〜３であり；
ｄ）Ｑ1は−ＮＲ11Ｒ12であり、Ｒ11及びＲ12は結合される窒素原子とともにヘテロシクロアルキル基を形成することが好ましく；
ｅ）ｎは０〜４、より好ましくは０〜２、最も好ましくは０であり；
ｆ）Ｒ21及びＲ22は結合される炭素原子又は窒素原子とともにシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基を形成する、該化合物。
【請求項７】
請求項５又は６のいずれかに記載の化合物であって、Ｑ2が、疎水性シクロアルキル基又はヘテロシクロアルキル基を表し、特に少なくとも６個の原子を含む環系を有する該基を表す、該化合物。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の化合物であって、Ｑ1はヘテロシクロアルキル基を表し、特にピペリジルを表し、詳細には１−ピペリジル又はピペラジニル、詳細には１−ピペラジニルを表す、該化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物であって：
Ｒ3は請求項１における定義と同様であり；
Ｘ1及びＸ2は請求項１における定義と同様であり；
Ｙは請求項１における定義と同様であり；
Ｚは請求項１における定義と同様であり；
Ｒ1はアルキレン鎖−（ＣＨ2）p−ＣＨ3を表し、式中、ｐは０〜６であり、１つ又はそれ以上のカルボキシル基により置換されており、また任意に１つ又はそれ以上の更なるアルキル基置換基に置換されていてよく；
Ｒ2は基−（ＣＨ2）q−Ａｒを表し、式中、ｑは０〜７であり、Ａｒは置換されていてもよいアリール基を表す、該化合物。
【請求項１０】
請求項９に記載の化合物であって：
ａ）Ｘ1及びＸ2は共に窒素であり；
ｂ）特にＲ４が水素である場合、Ｚ及びＹは共にＮＲ4を表し；
ｃ）ｐは０〜４、より好ましくは０〜３であり；
ｄ）Ｒ1１つ又は２つのカルボキシル基に置換され、当該カルボキシル基の少なくとも１つがアルキレン鎖−（ＣＨ2）p−ＣＨ3の末端炭素原子に担持され；
ｅ）ｑは０〜４、より好ましくは０〜３、最も好ましくは１又は２であり；
ｆ）Ａｒは単環式炭素環又は複素環芳香族基であり、フェニル、フェノキシ、トリル、クロロベンジル、メトキシベンジル、フルオロベンジル、ピリジル及びインドイルからなる群より選択される１つ又はそれ以上の置換基により置換されていてもよい、該化合物。
【請求項１１】
Ｒ1がカルボキシメチル、４−カルボキシブチル又は１−（１，３−ジカルボキシ）プロピルであることを特徴とする請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａｒがフェニル、４−ヒドロキシフェニル又はピリジルであり、特に２−ピリジルであることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項５に記載の化合物であって、
Ｒ3は請求項１における定義と同様であり；
Ｘ1及びＸ2は共にＮであり；
Ｙ及びＺは共にＮＨを表し；
ｍは２を表し；
Ｑ1はピペリジル又はピペラジニルを表し；
ｎは０又は２を表し；
Ｑ2は１−ピペリジル又はアダマンチルを表す、該化合物。
【請求項１４】
請求項９に記載の化合物であって、
Ｒ3は請求項１における定義と同様であり；
Ｘ1及びＸ2は共にＮであり；
Ｙ及びＺは共にＮＨを表し；
Ｒ1はカルボキシメチル、４−カルボキシブチル及び１−（１，３−ジカルボキシ）プロピルを表し；
ｑは２を表し；
Ａｒはフェニル、２−ピリジル又は４−ヒドロキシフェニルを表す、該化合物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用又は方法であって、式（Ｉ）の化合物が請求項５〜１４のいずれか一項に記載された化合物である、該使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質−リガンド相互作用の分野に関し、より詳細にはプリオン蛋白質に結合する化合物（「プリオン蛋白質リガンド」）及び生物試料からプリオンを検出し、或いは除去するために当該化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然型又は細胞プリオン蛋白質“ＰｒＰｃ”は哺乳類全体にわたり広範に分布し、特によく保存されたアミノ酸配列及び蛋白質構造を有する。感染性プリオンは、正常細胞（ＰｒＰｃ）プリオン蛋白質の修飾形態から成ると考えられ、“ＰｒＰｓｃ”と称される。プリオンは他の感染性病原体と共通の特性をいくつか有するが、核酸を含まないものと考えられる。その代わりに、翻訳後の構造変化が非感染性ＰｒＰｃの感染性ＰｒＰｓｃへの転換に関与しており、該転換においてαヘリックスがβシートに転換されると考えられている。ＰｒＰｃは３つのαヘリックスを有するが、βシート状構造はほとんど有していない。対照的に、ＰｒＰｓｃはβシートを豊富に含む。ＰｒＰｃのＰｒＰｓｃへの転換は伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の発症を生じると考えられ、この間にＰｒＰｓｃが中枢神経系（ＣＮＳ）に蓄積し、また神経病理的変化及び神経機能障害を伴う。「スクレイピー」型プリオン蛋白質と称されることが多いＰｒＰｓｃは、これらの動物やヒトの伝染性神経変性疾患の伝染及び発症に必要であり、また、おそらく十分であると考えられている。
【０００３】
ＴＳＥの具体例には、ヒツジ及びヤギに感染するスクレイピー；ウシに感染するウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）；伝染性ミンク脳症；ネコ海綿状脳症；並びにミュールジカ、オジロジカ、オグロジカ及びヘラジカの慢性消耗病（ＣＷＤ）が含まれる。ヒトではＴＳＥ病は、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性不眠症及び変異性クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）として発現し得る。ｖＣＪＤは英国におけるＢＳＥの流行の結果として最近になって出現し、ＢＳＥ又は「狂牛病」に感染したウシ由来の食品の消費によって引き起こされる可能性が非常に高い。１９８０年代中期から１９９０年代初期の間に未知数の英国居住者がＢＳＥ感染ウシ由来の神経組織で潜在的に汚染された食物を摂取した。経口感染症の潜伏期間はヒトでは２０年以上となり得るため、正確な罹患率は長年明らかになり得ない。現在まで主に英国で１５０人超が当該疾患に罹患したことが知られるが、症例はカナダ、フランス、香港、アイルランド、イタリア及び米国においても報告されている。汚染ウシ食品の英国から世界中への輸出は、ＢＳＥの世界的存在の可能性、従って、ｖＣＪＤの可能性を示唆する。これらの知見と一致するのは、大部分の欧州諸国、カナダ、米国、日本及びイスラエルでのＢＳＥの検出である。従って、食品を含む様々な材料から感染性プリオン蛋白質を検出し、除去可能とすることが極めて重要である。
【０００４】
従来、ＴＳＥの診断は当該疾患の臨床的兆候の発現に基づいており、脳組織の死後組織学的検査によってのみ確認することができた。病原体に対する測定可能な宿主免疫応答が欠如していることが全ＴＳＥの特徴である。そのため、抗体は全く産出されず、感染した動物を同定するのに従来の血清検査を用いることが全くできない。最近、脳における異常プリオン蛋白質の同定により、疾患の診断能が向上した。
【０００５】
ウシ起源の感染製品の摂取に加え、ヒト間のｖＣＪＤの伝染様式として別途あり得るのは、輸血及び臓器移植である。英国では輸血によるｖＣＪＤ伝染が疑われる２件の症例がある。ヒトにおける輸血によるｖＣＪＤの感染性は現在不明であるが、これは摂食に比べて、より有効なｖＣＪＤ伝染手段であり得る、との懸念が増大している。このことはヒツジからの伝染を含む実験動物モデル由来のデータと一致する。他のヒトＴＳＥと異なり、ＰｒＰｓｃはｖＣＪＤ患者のリンパ細網系に存在するので、血液中の感染性病原体及び輸血を介するその伝染の可能性が増大する。輸血による伝染リスクに関する懸念を高めている他の要因としては、不明であるがおそらく多人数のＢＳＥ曝露者がいることと、ｖＣＪＤの前臨床診断試験の不足とが挙げられる。更に、ｖＣＪＤの病原性は霊長動物及びマウスにおける種の適応後に増強されるように見られ、ウシ−ヒトよりもヒト−ヒトの伝染が効率的であり得ることが示唆される。従って、輸血によるｖＣＪＤの伝染を阻止する方法が緊急に必要とされる。このような対策には、感染ドナーの早期同定と、動物又はヒトの消費又はそれへの適用を目的とする動物由来の食物及び健康製品、ヒト及びウシ血液由来の産物並びに臓器移植におけるＴＳＥ病原体の除去及び不活化が含まれ得る。残念なことに、ＰｒＰｓｃは化学的及び物理学的不活化法に対して著しい抵抗性を示し、選択的不活化の方法は見出し難い。
【０００６】
リガンドとの特異的相互作用を通じたプリオン除去がより有望と思われる。プリオン蛋白質に結合する多くのリガンドが既に同定されている。あらゆる既知の哺乳動物プリオン蛋白質に見出されるオクタペプチド反復配列（ＰＨＧＧＧＷＧＱ）に結合するリガンドを求め、コンビナトリアルペプチドライブラリーがスクリーニングされており、ＷＯ  ０１／７７６８７に報告されているように一連のリガンドが発見された。他の物質としては、種々のポリマー、例えば、ＴｏｓｏＢｉｏＳｅｐ社から市販されているアミノポリメタクリレート、イオン交換樹脂全般（Ｇａｗｒｙｌらに付与された米国特許第５，８０８，０１１号を参照のこと）、アミロイド斑と相互作用するリガンド、例えば、コンゴーレッド（Ｉｎｇｒｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６９：５０６−５０８  （１９９５））、４−ヨード、４−デオキシドキソルビシン（Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１１９−１１２２  （１９９７））、アムホテリシンＢ、ポルフィリン及びフタロシアニン（Ｐｒｉｏｌａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１５０３−１５０６  （２０００））、金属（Ｓｔｏｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３７，  ７１８５−７１９３  （１９９８））、ＰｒＰと相互作用して複合体を形成するペプチド（Ｐｒｕｓｉｎｅｒらに付与された米国特許第５，７５０，３６１号及びＳｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３５５：１９２−１９７  （２０００）を参照のこと）、ヘパリンや他のポリ硫酸化ポリアニオン（Ｃａｕｇｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ「プロテアーゼ感受性型プリオン蛋白質ＰｒＰの硫酸化グリコサミノグリカン及びコンゴーレッドへの結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｒＰ  ｔｏ  Ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｇｏ  Ｒｅｄ）」、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：２１３５−２１４１（１９９４））、抗体（Ｋａｓｃｓａｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２６：２５９−２６８  （１９９７））や他の蛋白質、例えばプラスミノーゲン（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４７９−４８３  （２０００））が挙げられる。現在、多種多様な媒体由来のプリオンに結合することが可能であると十分に特性評価され、或いは見出されているリガンドはないが、その一部は特定の状況において有用であり得る（Ｇａｗｒｙｌらに付与された米国特許第５，８０８，０１１号を参照のこと）。
【０００７】
現在まで、ヒトＴＳＥ病の致死率は１００％である。残念なことに、アムホテリシン、硫酸化ポリアニオン、コンゴーレッド染料及びアントラサイクリン系抗生物質を含む、多くの化合物が候補治療薬として報告されているが、そのすべてがプリオン増殖を阻害するわずかな可能性しか実証されておらず、既に存在するプリオンを感染宿主から除去する効果が示されているものはない。従って、新規の治療薬が緊急に必要とされている。
【０００８】
通常は可溶性である蛋白質が、構造変化し不溶性形態となり、集合及び分解を起こすことが、他の種々の疾患（その多くは神経疾患である）における原因過程であると考えられている。疾患の発現と正常型から構造変化した蛋白質への変換との関係は十分に理解されていない。このような不溶性蛋白質の例には、プリオンの他、アルツハイマー病及び脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）のアミロイド斑におけるβアミロイドペプチド；パーキンソン病のレビー小体におけるαシヌクレイン沈着物；前頭側頭型認知症及びピック病での神経原線維変化におけるタウ；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ；及びハンチントン病におけるハンチンチンが含まれる。
【０００９】
これらの高不溶性蛋白質は、共通な特徴であるβシート構造を有する非分岐線維から成る凝集体を形成することが多い。中枢神経系ではアミロイドは脳・髄膜血管（脳血管沈着物）及び脳実質（プラーク）に存在し得る。ヒト及び動物モデルにおける神経病理学的研究では、アミロイド沈着物の近位にある細胞はその正常な機能を阻害されることが示されている。
【００１０】
神経プラークが形成される正確な機序と、プラーク形成の疾患関連神経変性過程に対する関係とについてはその多くが不明である。変換の過程を理解し、疾患関連形態と特異的に相互作用する構造体を見出すため、蛋白質の２つ以上の異なる構造形態、例えば、ＰｒＰｃとＰｒＰｓｃを容易に分別、或いは区別することができる方法が必要とされる。イソ型を分別、或いは区別する現行の手法原理としては、尿素などのカオトロピック剤の存在下におけるポリアクリルアミドゲル、即ち、横方向尿素勾配（ＴＵＧ）ゲル中の移動度差；プロテアーゼ（例えばプロテイナーゼＫ（ＰＫ）のような）処理に対する感受性差、及び、ＰｒＰｓｃのＰＫ抵抗性消化生成物（ＰｒＰｒｅｓと称される）の検出；温度安定性の差；非イオン性界面活性剤中での相対的な溶解度；及び、ある種の化学物質（例えばコンゴーレッド及びイソフラビンＳ）に結合するフィブリル構造の能力が含まれる。しかし、構造変化した蛋白質、特に疾患と関連する形態に特異的である、高親和性の試薬の同定の需要は満たされていない状態である。このような試薬は、診断キットの開発、異なる形態の蛋白質の分離及び精製、治療薬、生物学的製剤、ワクチン及び食品からの疾患感染形態の除去、並びに治療に対し、有用であり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、第一の態様として、プリオン蛋白質を親和性結合させるための下記式（Ｉ）で表される化合物の使用を提供する。
【００１２】
【化１】
2008508245.tif 000003
【００１３】
式中、Ｒ1及びＲ2は同じであっても異なっていてもよく、各々置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基又は置換されていてもよいヘテロアリール基であり；  Ｒ3は水素又はアリール基の置換基であるか、又はＲ3はスペーサー分子を介して任意に結合した固体支持体であり；  Ｚは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ4を表し；  Ｙは酸素原子、硫黄原子又はＮＲ5を表し；  ここで、Ｒ4及びＲ5は同じであっても異なっていてもよく、水素、１〜６個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいフェニル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいβ−フェニルエチルを表し；   Ｘ1及びＸ2の一方は窒素原子を表し、Ｘ1及びＸ2の他方は窒素原子又はＣＲ6を表し、ここで、Ｒ6は水素又はアリール基の置換基を表す。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
化学式（Ｉ）の化合物は体液又は環境試料のような試料からプリオン蛋白質を検出し、或いは除去するのに有用であり得る。当該化合物は試料からすべてのプリオン蛋白質を検出し、又は除去するために用いられても、或いは単一型のプリオン蛋白質を検出し、又は除去するために選択的に選ばれてもよく、従って、ヒトＴＳＥに罹患した患者及びスクレイピー、ＢＳＥ若しくはＣＷＤに罹患した動物に由来する試料中の、感染性プリオン蛋白質と非感染性プリオン蛋白質とを識別するために用いられ得る。当該化合物は、ヒト又は動物由来の体液又は環境試料のような試料中のプリオン蛋白質を検出する方法、並びに、プリオン病を診断し、処置する方法において有用である。例えば、本発明の化合物は、全血、血液成分、細胞、血清、血漿、血漿製剤、脳脊髄液、尿、涙液、扁桃腺、虫垂や他の組織を用いて、ＣＪＤ、ｖＣＪＤ、ＧＳＳ、致死性不眠症、スクレイピー、ＢＳＥ及びＣＷＤや他のＴＳＥのような病状を治療し、或いは診断するのに有用であり得る。当該化合物は、血液試料、血液成分、細胞、血清、血漿、血漿製剤、脳脊髄液、尿、涙液、扁桃腺、虫垂や他の材料のような試料からのプリオン蛋白質の除去にも有用であり得る。
【００１５】
本発明は、他の態様として、試料中のプリオン蛋白質を検出し、かつ／又は試料からプリオン蛋白質を除去する方法を提供し、当該方法は前記化学式（Ｉ）の化合物に試料を接触させる工程を含む。化学式（Ｉ）の化合物であって、固体支持体に結合されておらず、Ｒ3が水素又は置換基を表すものも、被験者におけるプリオン関連病状の進展を治療する、或いは遅延させるのに有用であり得る。例えば、本発明のリガンドはＣＪＤ、ｖＣＪＤ、ＧＳＳ、致死性不眠症、スクレイピー、ＢＳＥまたはＣＷＤのような病状を処置するのに有用であり得る。如何なる理論にも拘束されることを意図していないが、このようなリガンドはＰｒＰｓｃの重合を阻害することにより、或いはＰｒＰｓｃとＰｒＰｃの相互作用を阻害することを通じて作用し、こうして更なるＰｒＰｓｃの発達を遅らせ得るであろう。
【００１６】
従って、本発明は更なる他の態様として、ヒト又は動物被験体におけるプリオン関連病状を治療する、或いは該病状の進展を遅延させる方法を提供し、当該方法は固体支持体に結合していない化学式（Ｉ）の化合物の治療上有効な量を被験体に投与する工程を含む。
【００１７】
同様に、本発明は、プリオン関連病状の処置のための薬剤の製造における、固体支持体に結合していない化学式（Ｉ）の化合物の使用を更に提供する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び好ましい実施形態から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
用語の定義  本明細書で用いられる単数形（ａ，  ａｎ及びｔｈｅ）の用語は「１つ又はそれ以上」を意味すると定義され、内容が不適切でなければ複数形を含む。
【００２０】
“３Ｆ４”という用語はＰｒＰｃの天然型に特異的なモノクローナル抗体を指すが、天然型ＰｒＰｓｃ又はＰｒＰｒｅｓに特異的なモノクローナル抗体を指すものではない。当該抗体はハムスター及びヒトＰｒＰｃ，ＰｒＰｓｃ及びＰｒＰｒｅｓの変性型に対する特異性を有する。
【００２１】
「アルケニル」という用語は炭素−炭素二重結合を有する脂肪族炭化水素基を指し、これは直鎖であっても分岐鎖であってもよい。好ましくはアルケニル基は鎖中に２〜１２個の炭素原子を有し、より好ましくは鎖中に２〜６個の炭素原子を有し、例えば、プロペニル、ｎ−ブテニル、イソブテニル、３−メチルブタ−２−エニル、ｎ−ペンテニル及びヘプテニルが挙げられる。「シクロアルケニル」及び「ヘテロシクロアルケニル」という用語と類似している。
【００２２】
「アルコキシ」という用語はアルキル−Ｏ−基を指し、アルキルについては本明細書で述べる。その例にはメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ及びペントキシが含まれる。
【００２３】
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は単独又は組合せで、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素を指す。１〜６個の炭素を有する低級アルキルが好ましく、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、ネオペンチル及び２，２−ジメチルプロピルが挙げられる。アルキル基が「置換されていてもよい」と記載される場合、当該基は１つ又はそれ以上の置換基、詳細には本明細書で定義される１つ又はそれ以上の「アルキル基置換基」により置換され得る。
【００２４】
「アルキル基置換基」という用語は別途定義しない場合、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシアルキル、アミド、アシル、アシルアミノ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキレンジオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アロイル、アロイルアミノ、アリール、アリールアルコキシ、アリールアルコキシカルボニル、アリールアルキルチオ、アリールオキシ、アリールオキシカルボニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオ、カルボキシ（若しくは酸性生物学的等価体）、シアノ、ヘテロアロイル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルオキシ、ヘテロアロイルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ニトロ又はトリフルオロメチルを指す。
【００２５】
「アロイル」という用語は、アリール基については本明細書で述べるようなアリール−ＣＯ−基を指し、例えば、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイルを指す。
【００２６】
基又は基の一部としての「アリール」という用語は、
ａ）置換されていてもよい６〜１８個の炭素原子を有する単環式又は多環式芳香族炭素環部分、例えば、フェニル、ナフタレン、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アズレン、クリセン、インダセン、インデン、フッ素、フェナレン及びフェナントレン；或いは
ｂ）アリールとシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニルが互いに融合して環状構造を形成する、置換されていてもよい部分飽和多環式芳香族炭素環部分、例えば、インドリニル、テトラヒドロナフチル、インデニル又はインダニル環  を指す。
【００２７】
好ましいアリール基は置換されていてもよいフェニル基である。
【００２８】
アリール基が「置換されていてもよい」と述べる場合、当該基は１つ又はそれ以上の置換基、詳細には本明細書で定義される１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の「アリール基置換基」に置換され得る。
【００２９】
「アリール基置換基」という用語は特に明示しない場合、ヒドロキシル、アミノ、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシアルキル、アミド、アシル、アシルアミノ、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキレンジオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルチオ、アロイル、アロイルアミノ、アリール、アリールアルコキシ、アリールアルコキシカルボニル、アリールアルキルチオ、アリールオキシ、アリールオキシカルボニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アリールチオ、カルボキシ（若しくは酸性生物学的等価体）、シアノ、ヘテロアロイル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキルオキシ、ヘテロアロイルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ニトロ、オキソ又はトリフルオロメチルを指す。
【００３０】
本明細書で用いる「血液由来の組成物」の範囲には、全血、赤血球細胞濃縮物、血漿、血清、多血小板及び血小板欠乏画分、血小板濃縮物、白血球細胞、血漿沈殿物、血漿分画沈殿物及び上澄、ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭを含む免疫グロブリン調製物、精製凝固因子濃縮物、フィブリノーゲン濃縮物、或いはヒト又は動物由来の他の様々な組成物を含むものとする。これは、イオン交換、アフィニティー、ゲル透過及び／又は疎水性クロマトグラフィーを含む、当該技術分野で一般的な種々の方法の任意の方法によって、或いは分別沈殿によって調製される精製血液由来蛋白質も含む。
【００３１】
「コンビナトリアルライブラリー」という用語は、固相コンビナトリアルケミストリー技術によって合成された化学物質の採集物を指す。この定義は、何百万ものランダム化合物を生成する分離−結合−再結合法（ｓｐｌｉｔ−ｃｏｕｐｌｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｄ）の使用をその範囲に含み、或いは所定の構造を含むように策定され得る。構成単位はトリアジン骨格等であり得る。
【００３２】
「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の炭素原子を有する飽和単環、二環又は多環式環系を指し、側鎖を有する場合又は有さない場合があり、任意に−（Ｃ＝Ｏ）−により分断される。好ましいシクロアルキル基はモノシクロアルカン、例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル；１個の炭素において結合したビシクロアルカン、例えば、ｓｐｒｉｏｎｏｎａｎｅ；２個の炭素において結合したビシクロアルカンを含む飽和架橋環系、例えば、ノルボルナン、ビシクロ［４．３．２］ウンデカン、ビシクロ［４．１．０］ヘプタン及びデカリン並びに多環式架橋系、例えば、アダマンチン（ａｄａｍａｎｔｉｎｅ）である。より好ましくは、シクロアルキル基はモノシクロアルカン又は架橋環系である。最も好ましくは、シクロアルキル基はシクロヘキシル、ノルボルナン又はアダマンタンである。
【００３３】
シクロアルキル基が「置換されていてもよい」と述べる場合、当該基は１つ又はそれ以上の置換基、詳細には本明細書で定義される１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の「アルキル基置換基」に置換され得る。
【００３４】
「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００３５】
基又は基の一部としての「ヘテロアリール」という用語は、
ａ）１つ又はそれ以上の環部分が炭素以外の元素、例えば、Ｎ，Ｏ又はＳである、置換されていてもよい単環式アリールであり、好ましい例は単環式又は二環式であり、例として、ベンズイミダゾイル、ベンズチアゾイル、フリル、イミダゾイル、インドリル、インドリジニル、イソキサゾイル、イソキノリル、イソチアゾイル、オキサジアゾイル、ピラニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピラゾイル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル及びトリアゾリル基が挙げられ、特に明示しない場合、本明細書で述べる１つ又はそれ以上のアリール基置換基により任意に置換され、或いは
ｂ）ヘテロアリールと、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニル基とが互いに融合して環状構造を形成する、置換されていてもよい部分飽和多環式ヘテロ炭素環部分（このような基はｐｙｒｉｎｄａｎｙｌ基を含み、特に明示する場合を除き、本明細書で述べる１つ又はそれ以上のアリール基置換基に置換されていてもよい）を指す。
【００３６】
ヘテロアリール基が「置換されていてもよい」と述べる場合、当該基は１つ又はそれ以上の置換基、詳細には本明細書で定義される１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の「アリール基置換基」に置換され得る。
【００３７】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、少なくとも１個の環炭素原子がヘテロ原子又はヘテロ原子含有基、例えば、Ｏ，Ｓ，Ｎ又はＮＲ7に置換されたシクロアルキル基を指し、ここで、Ｒ7は水素又はアルキルである。好ましいヘテロシクロアルキル基は１つ又はそれ以上のＮ原子を含み、例としては、イミダゾリジン、ペピリジン、モルホリン、ピペラジン、ピロリジノン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、ピラゾリジン及びキヌクリジンが挙げられる。より好ましい例は１つ又はそれ以上のＮ原子を有するヘテロモノシクロアルカンであり、例としては、ペピリジン及びピペラジンが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基が「置換されていてもよい」と述べる場合、当該基は１つ又はそれ以上の置換基、詳細には本明細書で定義される１つ又はそれ以上の１つ又はそれ以上の「アルキル基置換基」に置換され得る。
【００３８】
「疎水性基」という用語は、通常、電気的に中性であり且つ非極性である親油性基を指す。疎水性基は水溶性の溶媒又は環境よりも中性且つ非極性の溶媒又は分子環境を好む。従って、疎水性基は通常の生理学的環境において他の疎水性基に対して親和性を有する。通常、疎水性基の例にはアルキル及びシクロアルキル基（これらは好ましくは非置換である）並びにアリール基が含まれる。
【００３９】
一般的に、本発明において述べる化合物は生理的ｐＨと同じであるか、或いはそれに近いｐＨにて使用される。化合物又は当該化合物内の特定の部分の疎水特性は、当該部分がこのようなｐＨにて荷電性であるかによって決定される。例えば、１−（２−アミノエチル）ペピリジンは、生理的ｐＨにて窒素が荷電されていない場合、疎水性基である。
【００４０】
「リガンド」という用語は、蛋白質、ペプチド又はポリペプチドが結合する分子を指す。本発明のリガンドはトリアジンのような置換ヘテロ芳香族化合物である。
【００４１】
“ＰｒＰｃ”という用語は、哺乳動物の体内に天然且つ広範に発現される天然型プリオン蛋白質を指す。その構造は高度に保存的であり、病態とは関連しない。
【００４２】
“ＰｒＰｓｃ”という用語は、感染性でありかつ捕獲された動物及び実験動物のＴＳＥ／プリオン病（ｖＣＪＤ、ＣＪＤ、クールー、致死性不眠症、ＧＳＳ、スクレイピー、ＢＳＥ、ＣＷＤや他の希少ＴＳＥを含む）と関連すると考えられるＰｒＰｃ分子の構造的に変化した形態を指す。これは正常な細胞ＰｒＰｃと同じアミノ酸配列を有するが、一部のαヘリックスがβシートに転換され、病態と関連する。
【００４３】
“ＰｒＰｒｅｓ”という用語は、ＰＫによるＰｒＰｓｃの部分的消化後に残存する２７〜３０ｋＤａのＰｒＰｓｃ蛋白質のプロテイナーゼ抵抗性蛋白質誘導体を指す。
【００４４】
“ＰｒＰ”という用語はプリオン蛋白質一般を指す。
【００４５】
「スペーサー」という用語は、親和性リガンドを支持マトリックスに結合する任意の部分を指す。１つの好ましいスペーサーのクラスは一般式（ＩＩ）で表される。
【００４６】
−Ｔ−［−Ｌ−Ｖ−］a−      （ＩＩ）
【００４７】
式中、  ＴはＯ，Ｓ又はＮＲ7を表し；  Ｖは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＣＯＯ−，−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯ−，−ＰＯ3Ｈ−，−ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2ＣＨ2−又は−ＮＲ7−を表し；  Ｌは２〜２０個の炭素原子を有する、置換されていてもよい炭化水素結合を表し；  ａは０又は１である。
【００４８】
「支持マトリックス」という用語は、粒状又は非粒状、可溶性又は不溶性、多孔性又は非多孔性であるかに拘わらない任意の化合物又は物質を指し、これは本発明による親和性リガンド−マトリックス結合体を形成するために使用され得、また溶液中の溶質から親和性リガンドを分離する便利な手段を提供する。従って、支持マトリックスは、例えば、カラム、ビーズ、微粒子、膜又はメッシュの形態をとり得る。
【００４９】
支持マトリックスの例には、天然ポリマー（例えば、架橋アルブミンのようなポリペプチド若しくは蛋白質、又は、アガロース、アルギナート、カラギーナン、キチン、セルロース、デキストラン若しくはデンプンのような多糖）；合成ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、パーフルオロカーボン）；無機化合物（例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、アルミナ、酸化鉄又は他の金属酸化物）、或いは、２つ又はそれ以上の、天然ポリマー、合成ポリマー又は無機化合物の任意の組合せからなるコポリマーのような可溶性支持マトリックスが含まれる。
【００５０】
液分配に用いられる親和性リガンドマトリックス結合体を付与するポリマー（例えば、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又は加水分解デンプン）を含む可溶性支持マトリックス；或いは、親和性乳剤の形成に用いられる親和性リガンドマトリックス結合体を与える化合物（例えば、パーフルオロデカリン）を含む固体支持マトリックスも、支持マトリックスの定義範囲内に含まれる。
【００５１】
支持マトリックスの定義範囲内には更に、リガンドの結合前又は結合中に活性化剤による処理によって改変され、或いは改変される、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギナート、カラギーナン、合成ポリマー、シリカ、ガラス及び金属酸化物のような支持マトリックスが含まれる。
【００５２】
支持マトリックスは活性化されていてもよいアガロース、シリカ、セルロース、ガラス、メタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、スチレンジビニルベンゼン、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ又はパーフルオロカーボンであることが好ましい。支持マトリックスは商品名Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，１５６  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ  １８９３６，ＵＳＡから入手可能）により市販されているタイプのメタクリレート材料が最も好ましい。
【００５３】
ＷＯ９７／１０８８７では親和性リガンド−マトリックス結合体を形成するための、親和性リガンドを支持マトリックスに結合する方法（例えば、活性化方法の使用）、及び、スペーサーを介して親和性リガンドをマトリックスに結合する方法（例えば、縮合反応による方法）を開示している。
【００５４】
Ｘ1及びＸ2が共に窒素原子を表す化学式（Ｉ）の化合物が好ましい。
【００５５】
Ｚ及びＹが共にＮＲ4を表し、特にＲ4が水素である場合の化学式（Ｉ）の化合物が好ましい。
【００５６】
Ｒ1及びＲ2の少なくとも一方が置換されていてもよいアルキル基を表すことが好ましい。
【００５７】
一般式（Ｉ）の特に好ましい化合物の第一の群である、化学式（Ｉａ）の化合物において、  Ｒ3は前記と同様に定義され；  Ｘ1及びＸ2は前記と同様に定義され；  Ｙは前記と同様に定義され；  Ｚは前記と同様に定義され；  Ｒ1は基−（ＣＨ2）m−Ｑ1を表し、式中、ｍは０〜７であり、Ｑ1は−ＣＲ11Ｒ12Ｒ13又は−ＮＲ11Ｒ12を表し、ここでＲ11，Ｒ12及びＲ13は各々独立に水素、アルキル、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表し、或いはＲ11，Ｒ12及びＲ13のうち２つが、結合される炭素又は窒素原子とともに、置換されていてもよいシクロアルキル又は置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基を形成し；  Ｒ2は基−（ＣＨ2）n−Ｑ2を表し、式中、ｎは０〜７であり、Ｑ2は−ＣＲ21Ｒ22Ｒ23又は−ＮＲ21Ｒ22を表し、ここでＲ21，Ｒ22及びＲ23は各々独立に水素、アルキル、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルを表し、或いはＲ11，Ｒ12及びＲ13のうち２つが、結合される炭素又は窒素原子とともに、置換されていてもよいシクロアルキル又は置換されていてもよいヘテロシクロアルキル基を形成する。
【００５８】
化学式（Ｉａ）の化合物においては、
ａ）Ｘ1及びＸ2が共に窒素であることが好ましく；
ｂ）Ｚ及びＹが共にＮＲ4を表し、特にＲ4が水素である場合が好ましく；
ｃ）ｍは好ましくは０〜４、より好ましくは０〜３、最も好ましくは１〜３であり；
ｄ）Ｑ1が−ＮＲ11Ｒ12であることが好ましく、Ｒ11及びＲ12は結合される窒素原子とともにヘテロシクロアルキル基を形成することが好ましく；
ｅ）ｎが好ましくは０〜４、より好ましくは０〜２、最も好ましくは０であり；
ｆ）Ｒ21及びＲ22は結合される炭素原子又は窒素原子とともにシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル基を形成することが好ましい。
【００５９】
Ｑ2が表し得る特に好ましい基としては、疎水性シクロアルキル及びヘテロシクロアルキル基が挙げられ、特に少なくとも６個の原子を含む環系を有するものが挙げられる。このような基の例には、シクロヘキシル、ピペリジル、特に１−ピペリジル及び架橋炭素環系、例えば、ノルボルニルが含まれる。このような基は好ましくは非置換であり、特に極性置換基に置換されていないものが好ましい。
【００６０】
Ｑ1が表し得る特定の基としてはヘテロシクロアルキル基、特にピペリジル、詳細には１−ピペリジル及びピペラジニル、詳細には１−ピペラジニルが挙げられる。
【００６１】
一般式（Ｉ）の特に好ましい化合物の第二の群である、化学式（Ｉｂ）の化合物においては、  Ｒ3は前記と同様に定義され；  Ｘ1及びＸ2は前記と同様に定義され；  Ｙは前記と同様に定義され；  Ｚは前記と同様に定義され；  Ｒ1はアルキレン鎖−（ＣＨ2）p−ＣＨ3を表し、式中、ｐは０〜６であり、１つ又はそれ以上のカルボキシル基により置換されており、また任意に１つ又はそれ以上の更なるアルキル基置換基に置換されていてよく；  Ｒ2は基−（ＣＨ2）q−Ａｒを表し、式中、ｑは０〜７であり、Ａｒは置換されていてもよいアリール基を表す。
【００６２】
化学式（Ｉｂ）の化合物においては、
ａ）Ｘ1及びＸ2が共に窒素であることが好ましく；
ｂ）Ｚ及びＹが共にＮＲ4を表し、特にＲ4が水素である場合が好ましく；
ｃ）ｐは好ましくは０〜４、より好ましくは０〜３であり；
ｄ）Ｒ1は好ましくは１つ又は２つのカルボキシル基に置換され、当該カルボキシル基の少なくとも１つがアルキレン鎖−（ＣＨ2）p−ＣＨ3の末端炭素原子に担持され；
ｅ）ｑは好ましくは０〜４、より好ましくは０〜３、最も好ましくは１又は２であり；
ｆ）Ａｒが、フェニル、フェノキシ、トリル、クロロベンジル、メトキシベンジル、フルオロベンジル、ピリジル及びインドイルからなる群より選択される１つ又はそれ以上の置換基により置換されていてもよい、単環式炭素環又は複素環芳香族基であることが好ましい。Ａｒは更に好ましくはフェニル、フェノキシ又はピリジルである。
【００６３】
Ｒ1が表し得る特に好ましい基はカルボキシメチル、４−カルボキシブチル及び１−（１，３−ジカルボキシ）プロピルである。
【００６４】
Ａｒが表し得る特に好ましい基はフェニル、４−ヒドロキシフェニル及びピリジルであり、詳細には２−ピリジルを含む。
【００６５】
化学式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の化合物は新規であり、本発明の更なる態様を表す。
【００６６】
本発明において有用であることが見出された化学式（Ｉ）のある特定の化合物は、化学式（Ｉａ）の化合物であって、  Ｒ3は前記と同様に定義され；  Ｘ1及びＸ2は共にＮであり；  Ｙ及びＺは共にＮＨを表し；  ｍは２を表し；  Ｑ1はピペリジル又はピペラジニルを表し；  ｎは０又は２を表し；  Ｑ2は１−ピペリジル又はアダマンチルを表す。
【００６７】
本発明において有用であることが見出された化学式（Ｉ）の別のある特定の化合物は、化学式（Ｉｂ）の化合物であって、  Ｒ3は前記と同様に定義され；  Ｘ1及びＸ2は共にＮであり；  Ｙ及びＺは共にＮＨを表し；  Ｒ1はカルボキシメチル、４−カルボキシブチル及び１−（１，３−ジカルボキシ）プロピルを表し；  ｑは２を表し；  Ａｒはフェニル、２−ピリジル又は４−ヒドロキシフェニルを表す。
【００６８】
例示のみの目的で示された、下記の方法及び実施例を参照し、本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００６９】
（リガンドの合成）
一般的に、化学式（Ｉ）の化合物を調製し得る方法は当業者には明らかである。例えば、ＷＯ  ９７／１０８８７に開示されている合成の方法を参照し得る。
【００７０】
化学式（Ｉ）の化合物を調製し得る方法の１つには、一般式（ＩＩ）の化合物の反応が含まれる。
【００７１】
【化２】
2008508245.tif 000004
【００７２】
式中、Ｒ1，Ｚ，Ｒ2，Ｙ，Ｘ1及びＸ2は、化学式（Ｉ）に関連して先に定義した通りであり、アミン含有支持マトリックスを有する。
【００７３】
化学式（Ｉ）の化合物を調製し得る別の方法には、一般式（ＩＩＩ）の化合物の反応が含まれる。
【００７４】
【化３】
2008508245.tif 000005
【００７５】
式中、Ｒ1，Ｚ，Ｘ1及びＸ2は化学式（Ｉ）に関連して先に定義した通りであり、化学式（ＩＶ）の化合物を形成するためのアミン含有支持マトリックスを有する。
【００７６】
【化４】
2008508245.tif 000006
【００７７】
式中、Ｒ1，Ｚ，Ｘ1及びＸ2は化学式（Ｉ）に関連して先に定義した通りであり、Ｒ3は前記支持マトリックスを表し、これは化学式（ＩＶ）の化合物と化学式Ｈ−Ｙ−Ｒ2の化合物の反応後にスペーサーを介して結合していてもよい。
【００７８】
更に、一般的な調製方法において、化学式（Ｖ）の化合物
【００７９】
【化５】
2008508245.tif 000007
【００８０】
（式中、Ｘ1及びＸ2は化学式（Ｉ）に関連して先に定義した通りであり、Ｒ3は支持マトリックスを表し、これはスペーサーを介して結合していてもよい）は、化学式Ｈ−Ｚ−Ｒ1の化合物及びＨ−Ｙ−Ｒ2の化合物と順次反応させられる。
【００８１】
（リガンドの同定）
リガンドは次のように同定することができる。模倣物ライブラリー（Ｍｉｍｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を合成し、プリオン分析物への結合能に関してスクリーニングする。プリオン分析物をカラムに通し、結合した分析物を、プリオン蛋白質に特異的な標識抗体による方法のような従来の方法を用いて検出する。分析物が結合したビーズが好適なリガンドとして同定される。
【００８２】
（プリオンを除去するためのリガンドの使用）
プリオン又はプリオンの断片に結合するリガンドは、種々の分析用途、調製用途及び診断用途に有用である。プリオン結合性リガンドはビーズ又は膜のような支持体に固定され、プリオンに結合し、試料からプリオンを除去するために用い得る。リガンドが結合した固相を、プリオン−リガンド複合体の形成を生じさせるのに十分な条件下で試料（例えば体液）と接触させると、試料中のプリオン蛋白質がリガンドに結合する。次に、固相を試料から分離し、これによって固相に結合したリガンドに結合したプリオン蛋白質を試料から除去する。汚染物の除去のための樹脂及び膜は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｕｍｂａｃｈらに付与された米国特許第５，８３４，３１８号及びＷＯ  ０１／７７６８７に開示されている。
【００８３】
生体試料の例としては、血液、血液由来の組成物及び血清が挙げられるが、これらに限定されない。更なる生体試料の例としては、脳脊髄液、尿、唾液、乳汁、管液、涙液又は精液が挙げられる。他の試料の例としてはコラーゲン、脳及び腺抽出物が挙げられる。
【００８４】
分子を種々の固体表面に固定するための多くの方法が当該技術分野で公知である。例えば、固体表面は膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレン又はポリスチレン）、試験管（ガラス又はプラスチック）、ディップスティック（例えば、ガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、マイクロ遠心管又はガラス、シリカ、プラスチック、金属若しくはポリマー製のビーズであり得る。所望の成分は共有結合されるか、或いは非特異的結合を通じて非共有的に結合され得る。
【００８５】
天然及び合成の、広範な有機及び無機ポリマーを、固体表面用の材料として用い得る。ポリマーの具体例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどが挙げられる。用いられ得る他の材料としては、紙、ガラス、セラミック、金属、半金属、半導体材料、セメントなどが挙げられる。加えて、ゲルを形成する物質、例えば、蛋白質（例えば、ゼラチン）、リポ多糖類、ケイ酸塩類、アガロース及びポリアクリルアミドなどを用いることができる。幾つかの水相を形成するポリマー、例えば、デキストラン、ポリアルキレングリコール又は界面活性剤、例えば、リン脂質、長鎖（１２〜２４個の炭素原子）アルキルアンモニウム塩なども好適である。固体表面が多孔性である場合、システムの性質に応じて様々な細孔径が用いられ得る。加えて、固体表面の重合の間、ペプチドが組み入れられ得る。
【００８６】
前記表面の調製にあたり、様々な特性を得るため、複数の異なる材料が、例えばラミネートとして、用いられ得る。例えば、非特異的な結合を回避し、共有結合を簡素化し、シグナル検出などを増強するため、ゼラチンのような蛋白質の被覆を用いることができる。
【００８７】
化合物と前記表面との間の共有結合を所望する場合、通常、前記表面は多官能性であるか、又は多官能化可能である。前記表面に存在し、結合に用いられ得る官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられる。広範な化合物を種々の表面に結合する態様は公知であり、文献に十分に例示されている。
【００８８】
プリオン蛋白質はアフィニティークロマトグラフィーを用いることによっても試料中の他の蛋白質から分離され得る。本発明によるリガンドは樹脂又は膜のような固体支持体に結合され、プリオンに結合し、溶液からプリオンを除去するために用いられ得る。この例では、リガンドは固体支持体、例えば、膜又は樹脂のような不活性支持体に固定され得、プリオン蛋白質は該固定物に結合する。固定剤／プリオンは抗体によって検出され得る。所望する場合、最初のスクリーニングから得られた１つ又はそれ以上の配列はポリメタクリレート又はアガロースのような樹脂に固定され得る。用いられ得る他のタイプの樹脂の例には、セファロース、架橋アガロース、複合性架橋多糖類、セライト、ＰＶＤＦ、アクリレート、ポリスチレン及びセルロースが含まれる。例えば、ナイロン及びセルロースのような膜も用いられ得る。樹脂はポリメタクリレート樹脂であってもよい。
【００８９】
（プリオンを検出するためのリガンドの使用）
本明細書で述べるリガンドは、生体試料中のプリオン蛋白質の存在を検出する、或いはこれを定量する方法においても有用である。前記列記されたような生体試料（前記列記分に限定されないが）は、プリオン蛋白質とリガンドの複合体の形成を生じさせるのに十分な条件下でリガンドと接触させられる。次に、当該複合体は従来の方法によって検出され、これにより生体試料中のプリオンの存在を検出する。
【００９０】
複合体は、リガンドを標識し、標識されたリガンドを試料と混合し、標識リガンド−プリオン複合体を検出することによって検出される。リガンドはリガンド作成の間（例えばペプチド合成の間など）に標識されるか、或いは共有結合又は非共有結合により標識をリガンドに結合することによって標識がリガンドに結合される。或いは、抗体のようなリガンドに特異的な結合分子を標識し、複合体を間接的に検出する。多種多様な標識及び結合技術が公知であり、科学文献及び特許文献に広範に報告されている。好適な標識としては放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光成分、化学発光成分、磁気粒子などが挙げられる。
【００９１】
検出は任意の既知の方法、例えば、大きさ及び／又は電荷の変化に基づき分子を追跡する免疫ブロッティング、ウエスタン分析、ゲルシフトアッセイ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（ＦＩＳＨ）、放射能若しくは生物発光性マーカーの追跡、核磁気共鳴、電子常磁性共鳴、ストップトフロー分光分析、カラムクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動又は他の方法によって進められ得る。アッセイで用いられる特定の標識又は検出可能な基は本発明の重要な側面ではない。該検出可能な基は検出可能な物理的又は化学的特性を有する任意の物質でよい。このような検出可能な標識は十分に開発が進められており、一般的に、このような方法において有用な任意の標識を本発明に適用することができる。従って、標識は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能な組成物であればよい。本発明において有用な標識としては、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、3Ｈ，125Ｉ，35Ｓ，14Ｃ又は32Ｐ）、酵素（例えば、ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡにおいて検出可能な酵素として一般的に用いられるＬａｃＺ、ＣＡＴ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼや他の酵素）並びに比色標識、例えば、コロイド金又は着色ガラス若しくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。標識は当該技術分野で公知の方法に従って、アッセイにおける所望の成分に直接又は間接的に結合され得る。前述で示したように、多種多様の標識が使用可能であり、標識の選択は必要な感度、化合物の結合の容易性、安定性要件、利用可能な機器及び廃棄規定に依存する。
【００９２】
非放射性標識は非直接的な手段で結合されることが多い。一般にリガンド分子（例えばビオチン）は分子に共有結合で結合する。次にリガンドは、それ自体で検出可能、又は検出可能な、酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物等の信号系に共有結合する抗リガンド分子（例えばストレプトアビジン）に結合する。複数のリガンドと抗リガンドを使用することができる。リガンドが天然抗リガンド（例えばビオチン、チロキシン、コルチゾール）を有する場合、標識された天然由来の抗リガンドと共に使用することができる。又は、抗体と組み合わせて任意のハプテン又は抗原化合物を使用することができる。
【００９３】
この分子は、例えば酵素又は蛍光団と共に、信号発生化合物に直接結合させることもできる。標識として用い得る酵素としてはまずヒドロラーゼが挙げられ、具体的にはホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシレダクターゼが挙げられ、特にペルオキシダーゼが挙げられよう。蛍光化合物としてはフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。化学発光化合物としてはルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが挙げられる。
【００９４】
標識を検出する手段は当業者に公知である。例えば、標識が放射性標識である場合、検出手段としてはシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーにおける様な写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合、蛍光色素を適当な波長の光で励起し、得られた蛍光を例えば顕微鏡、目視、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光電子倍増管等の電子検出器を用いる写真フィルムにより検出して標識を検出し得る。同様に、酵素に対する適当な基質を用い、得られた反応生成物を検出して酵素標識を検出する。最後に、単純な比色標識の場合は標識による色を観察して検出し得る。従って、様々な浸漬分析では、結合した金がピンクに発色することが多く、様々な結合ビーズはそのビーズの色を示す。
【００９５】
本発明のリガンドを固体材料から溶液中に抽出された標的を検出するために使用することができる。例えば、固体試料を水溶液、有機溶媒又は臨界流体で抽出し、得られた上澄をリガンドと接触させ得る。固体試料の例には動物由来の産物、特にプリオンを伝送する因子に曝された産物、例えばウシ起源の骨肉が含まれる。ある実施形態においては、リガンドを土壌中のプリオン蛋白質を検出するために使用することができる。その他の固体試料としては脳組織、角膜組織、糞、骨肉、ビーフ副産物、羊、羊副産物、シカ及びヘラジカ、シカ・ヘラジカ副産物、及び他の動物由来の産物が挙げられる。
【００９６】
また、プリオン−リガンド複合体をＰＫで処理することができる。ＰｒＰＣはＰＫに対する感受性が高く、一方ＰｒＰｓｃは部分的に消化されてＰｒＰｒｅｓとなる。ＰｒＰｒｅｓ分子自体は蛋白質分解に対する耐性が高い。従って、ＰＫ処理はＰｒＰｃを消化し、ＰＫ感受性ＰｒＰｓｃをＰｒＰｒｅｓに転換する。ＰＫを除去後、ＰｅＰｒｅｓを変性させ、３Ｆ４等の抗体で検出し得る。
【００９７】
他の実施形態では、本発明記載のリガンドをＰｒＰｃよりＰｒＰｓｃを選択的に濃縮するために使用し得る。
【００９８】
（プリオン定量のためのリガンドの使用）
リガンド−プリオン複合体、又は抗リガンド抗体又はリガンド−プリオン複合体を、当業者に公知の任意の方法で検出・定量できる。これらの方法としては分光比色法、ラディオグラフィー、電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等の生化学分析法等、及び液体又はゲル沈降法、免疫拡散法（単一又は二重）、免疫電気泳動法、放射線免疫分析（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収体分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析法等の種々の免疫的方法が挙げられる。
【００９９】
（非特異的結合の減少）
当業者は、分析中及び試料からの分析試料の分離中において非特異的結合を減少させることが望ましいことが多い旨を理解し得よう。分析において固体基質上に固定化されたリガンド又は捕捉物質が用いられる場合、固体基質に対する非特異的結合の量を最小にすることが望ましい。この様な非特異的結合の低減法は当業者に公知である。典型的には、この手法には基質を蛋白質性組成物で被覆する工程が含まれる。具体的には、ウシ及びヒト血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳及びゼラチンが広く使用される。
【０１００】
（その他の分析法）
試料中のプリオン蛋白質の存在を検出・定量するためにウエスターンブロット分析を使用し得る。この技術は一般に、ＳＤＳの存在下に分子量に基づいて試料をゲル電気泳動によって分離する工程と、分離された蛋白質を適当な固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は修飾ナイロンフィルター）に転移する工程と、結合した試料を本明細書記載のリガンドとインキュベーションする工程が含まれる。リガンドは固体支持体上に固定化されたプリオンペプチドと特異的に結合する。これらのリガンドを直接標識するか、又はその後にリガンドに特異的に結合する標識抗体を用いて検出し得る。
【０１０１】
その他の分析法としては特定の分子（例えばリガンド）と結合し、カプセル化された試薬又はマーカーを放出する様に設計されたリポソームを用いるリポソーム免疫分析（ＬＩＡ）が挙げられる。ここで放出された薬品は、次いで標準技術により検出される。
【０１０２】
（医薬組成物）
支持マトリックスに結合させられていない本明細書に記載のリガンドは、プリオン有機体を有する哺乳動物の感染で生じるＴＳＥの処置に対する治療及び予防用途に有用である。このリガンドは、ＰｒＰｓｃのＰｒＰｓｃへの結合を阻害することにより、ＰｒＰｓｃの重合を阻止し得る。さらに、該リガンドはＰｒＰｓｃのＰｒＰｃへの結合阻害を阻止し、ＰｒＰｓｃで媒介されるＰｒＰｃのＰｒＰｓｃへの転換を減少させ、その結果、臨床症状の発症を遅らせる。その上、反応性試薬の添加によりリガンド自体を修飾可能であり、その修飾分子はＰｒＰｓｃ蓄積部位を標的とする。この様な組成物は、様々な医薬配送系における使用に適している。
【０１０３】
本発明の方法により処置される疾患としてはＢＳＥ、伝染性ミンク脳障害、ネコ海綿体脳障害、ＣＷＤ、ＣＪＤ、ＧＳＳ、致死性不眠症及びｖＣＤＪが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０４】
医薬組成物は非経口、局所、経口又は局部投与を目的としている。医薬組成物を非経口で、例えば静脈内、皮下、皮内、鼻内又は筋肉内投与することが好ましい。従って、本発明は許容し得る担体（好ましくは水性担体）中に溶解又は懸濁した上記試薬の溶液を含む、非経口投与用の組成物を提供する。様々な水性担体を使用し得、その例としては水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、フィブリンシーラント等が挙げられる。これらの組成物を通常の公知の滅菌法で滅菌するか、又は滅菌濾過してもよい。得られた水溶液をそのまま梱包するか、凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を投与前に滅菌液と組み合わせる。必要であれば組成物にｐＨ調整及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン塩等の薬学的に許容し得る補助剤を含有させ、生理条件に近付けることができる。
【０１０５】
固体組成物では通常の非毒性担体を使用し得るが、それらの例としては医薬品級のマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与では、上記担体等の通常用いられる賦形剤のいずれか、及び、一般的に１〜９５％、好ましくは２５〜７５％の活性成分を加えて、薬学的に許容し得る組成物を形成する。
【０１０６】
エアゾル投与では、活性成分を界面活性剤と噴霧剤と共に微細に分割した形で供給する事が好ましい。界面活性剤はもちろん非毒性でなければならず、噴霧剤中に可溶性であることが好ましい。この様な薬剤の代表例としては、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸及びオレイン酸、又はその無水物と、脂肪族アルコール等との、６〜２２の炭素原子を含む脂肪酸のエステル又は部分エステルが挙げられる。混合又は天然グリセリド等の混合エステルも使用し得る。所望により、担体（例えば鼻内配送用等のレシチン等）を含むこともできる。
【０１０７】
投与量は、何を投与するか、処置を受ける哺乳動物の状態、及び投与法によって変わり得る。治療のための投与では、プリオンに既に感染した哺乳動物に、プリオンの拡大を阻止するか、その病気の症候及び合併症を少なくとも部分的に阻むに十分な量を投与する。これを達成するに適当な量は、「治療上有効投与量」と定義される。この用途に効果的な量は、疾患の重篤度、特定の組成、及び受容者の体重と一般的な状態に依存する。一般的に、投与量は体重７０ｋｇの患者に対し約１ｍｇ〜約５ｍｇ／日、好ましくは約１００ｍｇ／日の範囲であろう。
【実施例１】
【０１０８】
（プリオン結合性リガンドの同定）
下記の表に記載のプリオン結合性リガンドは以下の様に定義される。
【０１０９】
（ミメティックライブラリー合成）
エポキシド活性化プラビーズ６ＸＬ（Ｐｕｒａｂｅａｄ６ＸＬ）上のミメティックリガンドの２種の８×８コンビナトリアルライブラリー（ライブラリーＡ及びＢ）を合成した。プラビーズ６ＸＬは耐久性を持たせるために架橋された多孔性ビーズ状アガロース支持体である。その合成法はＷＯ９７／１０８８７に記載の方法と類似し、当業者によって容易に再現可能である。まとめると、合成終了後、各ライブラリー構成要素には、柔軟なアミノ化スペーサーによってプラビーズ６ＸＬに結合したトリアゾール成分が含まれていた。各ライブラリー構成要素のトリアゾール成分を他の２種のアミンでさらに置換した。
【０１１０】
（ライブラリーＡ）
このライブラリーの柔軟なアミノ化スペーサーは炭素原子３個の長さであり、これは架橋プラビーズ６ＸＬとエピクロルヒドリン及びアンモニアとの逐次反応により導入された。各ライブラリー構成要素のトリアゾール上に取り込まれた前記他の２種のアミンが表１にまとめられており、これらのアミンは式（Ｉ）の−Ｚ−Ｒ1及び−Ｙ−Ｒ2基に対応する。アミンは以下の番号で呼ばれ、リガンドは２個の２−アダマンタミン基を含む１／１で定義されるリガンド、１個の４−（２−アミノエチル）モルホリン基及び１個の２−アダマンタミン基を含む２／１で定義されるリガンド等である。
【０１１１】
１＝２−アダマンタミン
２＝４−（２−アミノエチル）モルホリン
３＝１−（２−アミノエチル）ピペリジン
４＝１−（２−アミノエチル）ピペラジン
５＝（＋／−）−２−アミノボルナン
６＝１−（２−アミノプロピル）−２−ピロリドン
７＝３−アミノキヌクリジン
８＝１−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
９＝Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン
【０１１２】
【表１】
2008508245.tif 000008
【０１１３】
樹脂上へロードされたリガンドは沈殿樹脂ｇあたり１２ｍｇであり、これはアミノ化スペーサーの付加後の遊離アミンの分析と、トリクロロトリアゾールのアミノ化スペーサーへの添加後に遊離した塩素の分析で決定された。
【０１１４】
（ライブラリーＢ）
このライブラリーの柔軟なアミノ化スペーサーの長さは炭素数１０個であり、これは架橋プラビーズ６ＸＬと１，４−ブタンジオールグリシジルエーテル及びアンモニアとの逐次反応で導入された。表２に各ライブラリー構成要素のトリアジン上に取り込まれた前記他の２種のアミンをまとめるが、これらのアミンは以下の番号で呼ばれる。
【０１１５】
１０＝β−アラニン
１１＝２−アミノエチルピリジン
１２＝３−アミノベンジルアルコール
１３＝フェネチルアミン
１４＝チラミン
１５＝４−フルオロベンジルアミン
１６＝４−メチルベンジルアミン
１７＝２−（４−クロロフェニル）エチルアミン
１８＝トリプタミン
１９＝グリシン
２０＝Ｌ−グルタミン酸
２１＝ＤＬ−バリン
２２＝５−アミノ吉草酸
２３＝４−アミノ酪酸
２４＝Ｌ−チロシン
２５＝ε−アミノカプロン酸
【０１１６】
【表２】
2008508245.tif 000009
【０１１７】
樹脂上へのリガンドの負荷は沈殿樹脂ｇあたり１９ｍｇであり、アミノ化スペーサーの付加後の遊離アミンの分析と、トリクロロトリアゾールのアミノ化スペーサーへの添加後に遊離した塩素の分析で決定した。
【０１１８】
（ミメティックライブラリー結合スクリーニング）
ライブラリーを数回さかさにし、静止させて重力で水切りし、次いでウエルあたり１ｍＬの水で２回洗浄し、１ｍＬの１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。ウエルを停止させ、ウエルあたり０．５ｍＬのＰＢＳを加えた。ライブラリーを冷蔵庫で終夜保存した。それぞれ１．８ｍＬの１０％ハムスター脳ホモジェネート（ＨａＢＨ）を含むチューブ２本を液体窒素中の貯蔵庫から取り出し、解凍した。１８０μＬの５％ザルコシルを各チューブに加えた。懸濁液を転置しながら室温で３０分間インキュベーションし、次いで卓上型マイクロ遠心機中で、１３，４００ｒｐｍで１０分間遠心した。上澄を集め、ＰＢＳで１：１０に希釈した（ＨａＢＨの最終希釈１：１００）。ライブラリーを重力で水切りし、ウエルあたり５００ｍＬのＨａＢＨを加え、収集プレートに重力で滴下した。ウエルの滴下後、各ウエルをさらに５００ｍＬのＰＢＳで洗浄し、洗浄液を同じ収集プレートに採集した。この収集プレートを「非結合」とラベルした。各ウエルにＰＢＳ中の１Ｍ  ＮａＣｌを５００μＬ加え、「塩溶出」とラベルした別な収集プレートに集め、次いで５００μＬの２％酢酸溶液を加え「酢酸溶出」とラベルした収集プレートに集めた。各樹脂の２６μＬ分をミクロ遠心チューブに移し、残りの結合プリオンの分析のために保存した。「非結合」、「塩溶出」及び「酢酸溶出」液を収集プレート内で凍結した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロット用の対照区として、最終濃度１：２００及び１：５００のＨａＢＨ溶液希釈液を使用した。
【０１２０】
（非結合分画のウエスターンブロット及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析）
「非結合」試料の各５０μＬを５０μＬの２×試料緩衝液／還元剤（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＮｕＰＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝液４×（２５μＬ）、インビトロゲンＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（１０μＬ）及びＡＣＳグレード水（１５μＬ）の混合物）に加えた。各チューブを９０℃で１０分間加熱した。
【０１２１】
全蛋白質のウエスターンブロット及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析のために２本のゲルを使用した。各１７ウエルゲル中の試料フォーマットは以下の通りである。
【０１２２】
【表３】
2008508245.tif 000010
【０１２３】
１７ウエルＮｕＰＡＧＥゲルカセットを脱イオン水で濯いだ。白色テープストリップと櫛を取り除き、レーンを１×ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ泳動用緩衝液（カタログ番号ＮＰ０００２）で濯ぎ、カセットをＸｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌモジュール（又は同等品）のゲルリザーバー中に置いた。中心のリザーバーに５００μＬのＮｕＰＡＧＥ抗酸化剤（カタログ番号ＮＰ０００５）を含む２００ｍＬの１×  ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ泳動用緩衝液を満たした。漏れをチェック後、外部リザーバーに１×  ＮｕＰＡＧＲ  ＭＥＳ泳動用緩衝液（抗酸化剤添加せず）を満たした。ミニゲルモジュールを適合する電源に取り付け、染料先端がゲルの底から０．５ｃｍ以内になるまで２００Ｖ定電圧で約４５分間ゲルを電気泳動した。
【０１２４】
（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）
ゲルをゲルカセットから取り外し、ＡＣＳ水で３回濯いだ（２５ｍＬ、５分）。ゲルをインビトロゲンＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎで１時間にわたって染色し、その後ＡＣＳ水で３回洗浄（２５ｍＬ、１時間）して脱色した。
【０１２５】
（ウエスターンブロット）
１７ウエルＮｕＰＡＧＥゲルカセット（カタログ番号ＮＰ０３４９）を脱イオン水で濯ぎ、レーンを１×  ＮｕＰＡＧＥ泳動用緩衝液で濯いだ。ゲルをＸｃｅｌ  Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌモジュール（インビトロゲン・カタログ番号ＥＩ０００１）又は相当する装置に置いた。貯蔵溶液（インビトロゲン２０×  ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳ泳動用緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００２又はＮＰ０００２−０２）から得た１×泳動用緩衝液で下部チャンバーを満たした。上部チャンバーを抗酸化剤（インビトロゲン・カタログ番号ＮＰ０００５）を含む１×泳動用緩衝液で満たした。
【０１２６】
各試料に還元剤（インビトロゲン・カタログ番号ＮＰ０００７及びＮＰ０００４）を含む試料緩衝液を加え、試料を９０℃で１０分間加熱、短時間遠心し、各試料５μＬを加えた。５μＬの分子量マーカー（インビトロゲン・カタログ番号ＬＣ５９２５）も加えた。定電圧２００Ｖでゲルを４５分間電気泳動した。電気泳動終了後、カセットをユニットから取り外し、開いてゲルを取り出した。冷却した転写緩衝液にゲルを５分間浸した。
【０１２７】
転写メンブレンをメタノールで湿らせ、転写緩衝液に移し、攪拌しながら２×１０分間インキュベーションした。貯蔵溶液（インビトロゲン・カタログ番号ＮＰ０００６−１）から得たエレクトロブロット転写緩衝液を２０％メタノールと抗酸化剤を加えて調製し、使用前に冷却した。転写チャンバーの貯蔵槽（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）カタログ番号１７０−４０７０）の半分を、冷却したエレクトロブロット転写緩衝液で満たした。プラスチック製バイオラッド転写カセットトレー中のバイオラッド転写ユニットを、適当な容積の冷却エレクトロブロット転写緩衝液を用いて準備した。スポンジ、濾紙、ＰＶＤＦ転写メンブレン（インビトロゲン・カタログ番号ＬＣ２００５）、ゲル、濾紙、及びスポンジをこの順に重ね、転写挟持体を準備した。カセットを折りたたみ止め付けた。ゲルを定電圧１００Ｖで、チャンバーを室温にして４５分間転写した。
【０１２８】
転写後、該メンブレンを清潔な皿の中に置き、インビトロゲン・ウエスターン・ブリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ）化学発光キット抗マウス抗体（カタログ番号ＷＢ７１０４）より得たウエスターン・ブリーズ保護剤２５ｍＬ中で、揺動プラットフォーム上、室温で１時間インキュベーションした。
【０１２９】
次いで該メンブレンを、２０ｍＬの新鮮なウエスターンブリーズ１次抗体希釈液中のシグネット（Ｓｉｇｎｅｔ）３Ｆ４−１次抗体３Ｆ４マウスモノクローン抗体（シグネット、カタログ番号９６２０）貯蔵溶液の１０，０００倍希釈液で終夜、冷却しながら揺動プラットフォーム上でインキュベーションした。該ブロットを２０ｍＬのウエスターンブリーズ２次抗体洗浄液中で３回濯ぎ、揺動プラットフォーム上で２０ｍＬウエスターンブリーズ１次抗体希釈液中の１０，０００倍希釈ＫＰＬ−ＡＰ１次抗体（ＫＰＬ、カタログ番号０７５−１８０２）で、室温で６０分間、インキュベーションした。ブロットを再度上記の様に濯ぎ、次いで２０ｍＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．８）を用い室温で１０分間洗浄した。該メンブレンを乾燥した清潔な皿に移し、５ｍＬのウエスターンブリーズとあらかじめ混合した化学発光基質（ＣＤＰ  Ｓｔａｒ）に緩やかに攪拌しながら５分間浸した。アルカリホスファターゼを３０分間反応させた。ブロットを保護シート中でフィルムカセットに移し、室温でフィルム（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カタログ番号ＲＰＮ−３１３０Ｋ）に５分間露光し、現像機中で現像した。
【実施例２】
【０１３０】
（濃縮赤血球からＰｒＰｃを捕捉するための、アガロースに付着させたリガンド５／４の使用）
プラビーズ６ＸＬベースマトリックスに付着させたリガンド５／４を有する吸着体を実施例１と同様に合成し、式（ＶＩ）の化合物を得た。
【０１３１】
【化６】
2008508245.tif 000011
【０１３２】
ＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）中の１０％ｗ／ｖ正常ハムスター脳ホモジェネートの試料を解凍し、１０％（ｗ／ｖ）のザルコシル１０μＬを加え、ボルテックスで混合し、湿った氷上に３０分間保存した。混合物を＋４℃で５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心し、上澄を除去した。濃縮ヒト赤血球（ＲＢＣＣ；２５０ｍＬ）をアドソル（Ａｄｓｏｌ、１１０ｍＬ）と混合し、倒置して緩やかに混合した。希釈ＲＢＣＣ（１．８ｍＬ）を取り出し、０．２ｍＬのハムスター脳ホモジェネート溶液と混合した。
【０１３３】
４０ｍＭのクエン酸緩衝液／２８０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）中に懸濁した化合物（ＶＩ）の１：１懸濁液（４００μＬ）を１．０ｍＬのマイクロカラムに添加し、重力で排液した。ＲＢＣＣ（１ｍＬ）中のハムスター脳ホモジェネートを、沈降した該親和性吸着体上にピペットで落し、排液した。次いで吸着体を１ｍＬの懸濁緩衝液で洗浄し、排液した。双方の溶出液を分画して集め、両者を合せて−２０℃で保存した。
【０１３４】
０．５ｍＬの懸濁緩衝液中に懸濁して親和性吸着体をカラムから取り出し、クライオバイアルに移した。バイアルの内容物を沈降させた後、移行した親和性吸着体の体積を記録し、上澄の容積を調節して１：１スラリーを調製した。試料（２００μＬ）をミクロ遠心バイアルに移し、実施例１に記載の様に結合プリオンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロット分析に用いた。
【０１３５】
ハムスターＰｒＰｃに対応する、ウエスターンブロットにおける強いバンドの存在により、プラビーズ６ＸＬ（ビーズ状アガロースマトリックス）に付着したリガンド５／４がヒト濃縮赤血球からＰｒＰｃを選択的に結合し得ることが示された。
【実施例３】
【０１３６】
（ポリメタクリレート樹脂ビーズに付着させたプリオン結合性リガンドの調製）
本発明実施例はライブラリーＡ及びＢに使用したアミンを含むいくつかのリガンドの調製について説明するが、これはアミノ化ポリメタクリレート支持体（トーヨーパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ）上においての説明であって、アガロース上における場合の説明ではない。
【０１３７】
（３．１  アミノ化トーヨーパール６５０Ｍのジクロロトリアジン誘導体）
トーヨーパールＡＦアミノ６５０Ｍ（３６ｇ）を素焼ロート上で３６ｍＬの逆浸透水で１０回洗浄し、１Ｍ燐酸カリウム（３６ｍＬ、ｐＨ７．０）中に再懸濁した。ゲルを排液し、１Ｍ燐酸カリウム（２７ｍＬ、ｐＨ７．０）と逆浸透水（２７ｍＬ）中に再懸濁した。この混合液をガラス反応容器に移して攪拌し、５４ｍＬのアセトンを加えた。混合液を０℃に冷却し、冷アセトン（２７ｍＬ、０℃）に溶解した塩化シアヌル酸（２．７ｇ）を加え、混合液を０〜４℃で１時間攪拌した。得られたジクロロトリアジン活性化生成物のスラリーを焼結ガラス上に注ぎ、アセトン水溶液（５０％ｖ／ｖ、１８０ｍＬ）、逆浸透水（１８０ｍＬ）、アセトン水溶液（５０％ｖ／ｖ、１８０ｍＬ）及び逆浸透水（３６０ｍＬ）で洗浄した。
【０１３８】
（３．２  モノクロロトリアジン中間体）
ジクロロトリアジン活性化トーヨーパール６５０Ｍから、下記の様に様々なモノクロロトリアジン中間体を調製した。
【０１３９】
３．２．１：  １−（２−アミノエチル）ピペリジン（０．４７ｇ）を逆浸透水（２８．８ｍＬ）に溶解し、溶液を４℃に冷却して１−（２−アミノエチル）ピペリジン（アミン３）のモノクロロトリアジンアミノ化トーヨーパール６５０付加物を調製した。この混合物を、焼結ガラス上で水中に流下した７ｇのジクロロトリアジン活性化アミノ化トーヨーパールに加え、プラスチック反応容器に移して４℃に冷却した。混合物を４℃で２時間振盪し、混合物を焼結ガラス中に注ぎ、ＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、３５ｍＬ）及び逆浸透水（７０ｍＬ）で洗浄し、焼結ガラス上で水切りした。
【０１４０】
３．２．２：  （＋／−）２−アミノノルボルナン（０．８２ｇ）をＤＭＦ水溶液（１３．３％ｖ／ｖ、５７．６８ｍＬ）中に溶解し、溶液を４℃に冷却して（＋／−）２−アミノノルボルナン（アミン５）のモノクロロトリアジンアミノ化トーヨーパール６５０Ｍ付加物を調製した。１４ｇの焼結ガラス上で水切りしたジクロロトリアジン活性化アミノ化トーヨーパールに該混合液を加え、プラスチック反応容器に移し、４℃に冷却した。該混合液を４℃で２時間振盪し、焼結ガラス上に注ぎＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、７０ｍＬ）及び逆浸透水（１４０ｍＬ）で洗浄し、焼結ガラス上で水切りした。
【０１４１】
３．２．３：  Ｌ−グルタミン酸（０．５１５ｇ）をＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、２８．０ｍＬ）及び水酸化ナトリウム水溶液（１０Ｍ、０．７ｍＬ）に溶解し、溶液を４℃に冷却してＬ−グルタミン酸（アミン２０）のモノクロロトリアジンアミノ化トーヨーパール６５０Ｍ付加物を調製した。この混合液を焼結ガラス上で水切りしたジクロロトリアジン活性化アミノ化トーヨーパール（７ｇ）に加え、プラスチック反応容器に移し４℃に冷却した。該混合液を４℃で７０分間振盪し、焼結ガラス上に注ぎ、ＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、７０ｍＬ）及び逆浸透水（１４０ｍＬ）で洗浄し、次いで焼結ガラス上で水切りした。
【０１４２】
３．２．４：  ＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、２８．５ｍＬ）及び水酸化ナトリウム水溶液（１０Ｍ、０．３５ｍＬ）中に５−アミノ吉草酸（０．４１ｇ）を溶解し、溶液を４℃に冷却して５−アミノ吉草酸（アミン２２）のモノクロロトリアジンアミノ化トーヨーパール６５０Ｍ付加物を調製した。この混合液を焼結ガラス上で水切りした７ｇのジクロロトリアジン活性化アミノ化トーヨーパールに加え、プラスチック反応容器に移し４℃に冷却した。この混合液を４℃で６０分間振盪し、混合液を焼結ガラス上に注ぎ、ＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、７０ｍＬ）及び逆浸透水（１４０ｍＬ）で洗浄し焼結ガラス上で水切りした。
【０１４３】
３．２．５：  グリシン（０．５６３ｇ）をＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、６１．４ｍＬ）及び水酸化ナトリウム水溶液（１０Ｍ、０．７５ｍＬ）に溶解し、溶液を４℃に冷却してグリシン（アミン１９）のモノクロロトリアジンアミノ化トーヨーパール６５０Ｍ付加物を調製した。この混合液を焼結ガラス上で水切りした１５ｇのジクロロトリアジン活性化アミノ化トーヨーパールに加え、プラスチック反応容器に移し４℃に冷却した。この混合液を４℃で６０分間振盪し、混合液を焼結ガラス上に注ぎ、ＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、７０ｍＬ）及び逆浸透水（１４０ｍＬ）で洗浄し焼結ガラス上で水切りした。
【０１４４】
（３．３  最終生成物）
第２段階反応用のアミン溶液を以下の様に調製した。
【０１４５】
３．３．１：１−（２−アミノエチル）ピペリジン（アミン３；０．９４ｇ）を逆浸透水（１０．８ｍＬ）に溶解した。
【０１４６】
３．３．２：  １−（２−アミノエチル）ピペラジン（アミン４；１．９０ｇ）を逆浸透水（２１．６ｍＬ）に溶解し、２つの部分に分けた（各１１．８ｍＬ）。
【０１４７】
３．３．３：  ２−（２−アミノエチル）ピリジン（アミン１１；０．８４ｍＬ）をＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、１０．９ｍＬ）に溶解した。
【０１４８】
３．３．４：  フェニルエチルアミン（アミン１３；０．８８ｍＬ）をＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、１０．９ｍＬ）に溶解し、２つの等しい部分に調製した。
【０１４９】
３．３．５：  チラミン（アミン４；０．９６ｇ）をＤＭＦ（１０．８ｍＬ）に溶解した。
【０１５０】
反応混合液を適当なモノクロロトリアジン中間体と第２段階アミンとを組み合わせ、モノクロロトリアジン中間体（７ｇ）を含むプラスチック反応容器に入れ、７ｇのモノクロロトリアジン中間体（５．７５ｍｌの逆浸透水を含有する）を含む全容積３５ｍＬのアミン溶液とした。各容器を６０℃で２４時間倒置混合した。ゲルをＤＭＦ水溶液（５０％ｖ／ｖ、３５ｍＬ）、逆浸透水（３５ｍＬ）、０．１Ｍ塩酸（３５ｍＬ）、水酸化ナトリウム（０．２Ｍ）を含むイソプロパノール水溶液（３０％ｖ／ｖ、３５ｍＬ）、逆浸透水（７０ｍＬ）及びエタノール水溶液（２０％ｖ／ｖ、２１ｍＬ）で洗浄し、４℃でエタノール水溶液（２０％ｖ／ｖ）に保存した。
【実施例４】
【０１５１】
（濃縮赤血球からのＰｒＰｓｃ捕捉のための、ポリメタクリレート樹脂に付着させたプリオン結合性リガンドの使用）
ビーズ状ポリメタクリレートマトリックス（トーヨーパール）に付着させた親和性リガンドを含む化合物を実施例３に記載の通りに合成した。正常ハムスター脳ホモジェネートで説明した手順（実施例２）を用い、ヒト濃縮赤血球（ＲＢＣＣ）中に固定（spike）したスクラピー感染ハムスター脳の抽出液（１％ｗ／ｖ）を調製した。ポリメタクリレート親和性吸着体によるＰｒＰｓｃの結合を、吸着体スラリーを１ｍｌミクロカラムに充填し、実施例２に記載の手順を用いて固定されたＲＢＣＣを試用して評価した。親和性吸着体から抽出された試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロット分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元剤と混合する前に第２セットの試料の一部をプロテイナーゼＫで処理したこと以外は実施例１と同様に実施した。
【０１５２】
ウエスターンブロット分析により、リガンド５／４、１９／１３、５／３、２２／１３及び１９／１４を含む樹脂は全て、ヒト濃縮赤血球の存在下でＰｒＰｓｃに対する高い親和性を示すことが示された。ＰｒＰｓｃの結合は、＋／−プロテイナーゼＫ処理で得られたウエスターンブロットバンドパターンの比較により確認された。無処理試料と比較して、プロテイナーゼＫ処理試料における若干低い分子量の、明白に見えるバンドの存在により、ＰｒＰのプロテイナーゼＫ抵抗性型（感染型）の結合が確認された。
【実施例５】
【０１５３】
（濃縮赤血球からのヒト散発性ＣＪＤ誘発プリオンの捕捉用の、ポリメタクリレート樹脂に付着させたプリオン結合性リガンドの使用）
１％（ｗ／ｖ）ヒト散発性ＣＪＤ脳ホモジェネートで固定したＲＢＣＣを用いて、実施例４に記載の実験を繰り返した。ウエスターンブロット分析により、リガンド５／４、１９／１３、５／３、２２／１３及び３／４を含むポリメタクリレート樹脂は全て、ヒト濃縮赤血球の存在下でヒト散発性ＣＪＤ脳由来のＰｒＰに対し高い親和性を示すことが示された。
【実施例６】
【０１５４】
（ヒト血漿及びヒト血液からのＰｒＰｓｃ捕捉用の、ポリメタクリレート樹脂ビーズに付着させたリガンド５／４の使用）
ビーズ状ポリメタクリレートマトリックス（トーヨーパール）に付着させたリガンド５／４を有する親和性吸着体を、実施例３に記載の通りに合成した。ヒト保存血漿及びヒト全血中に固定したスクラピー感染ハムスター脳の抽出液（１％ｗ／ｖ）を、正常ハムスター脳ホモジェネート及びＲＢＣＣで説明した手順（実施例２）を用いて調製した。吸着体スラリーを１ｍＬマイクロカラムに充填し、実施例２に記載の手順を用いて固定した血漿及び全血試料に試用することにより、ポリメタクリレート親和性吸着体によるＰｒＰｓｃの結合を評価した。親和性吸着体から抽出した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスターンブロット分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元剤と混合する前に第２セットの試料の一部をプロテイナーゼＫで処理した以外は実施例１と同様に実施した。
【０１５５】
ウエスターンブロット分析により、リガンド５／４を含む樹脂は、ヒト血漿及び全血の存在下でＰｒＰｓｃに対する高い親和性を示すことが示された。ＰｒＰｓｃの結合は、＋／−プロテイナーゼＫ処理で得られたウエスターンブロットバンドパターンの比較により確認された。無処理試料と比較して、プロテイナーゼＫ処理試料における若干低い分子量の、明白に見えるバンドの存在により、ＰｒＰのプロテイナーゼＫ抵抗性型（感染型）の結合が確認された。
【０１５６】
ポリメタクリレート等の支持マトリックスに付着された、本明細書に記載のリガンド５／４及び他のリガンドは、全血、ＲＢＣＣ及び血漿を含む様々な血液成分から様々なプリオン蛋白質の捕捉と濃縮に特に有用であることが、当業者には明瞭に理解されると考えられる。従って、この様な材料はこの様な成分からのＰｒＰの除去に対し、またＰｒＰを濃縮しその後の検出と定量を補助する手段として特別な価値を有する。
【０１５７】
本明細書に記載のものと類似又は等価の方法と材料を本発明の実施又は試験に用いることが可能であり、適した方法と材料は上記に示されている。本明細書で述べた全ての出版物、特許出願、特許及び他の引用文献は、その全文を本明細書に引用して援用される。また、材料、方法及び実施例は説明のためのみに示されたものであり、本発明を制約するものではない。
【０１５８】
上記の説明は本発明に関する様々な実施形態を記載するために提供される。様々な変更、追加及び削除を、本発明の範囲と趣旨から逸脱せずこれらの実施形態及び／又は構成に加えることができる。
【国際調査報告】
2008508245.tif 000013
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