(57)【要約】鳥インフルエンザウイルス感染を予防または軽減するのに有効なワクチン組成物および方法が、本明細書中に記載される。このワクチンは、少なくとも２つの鳥インフルエンザ不活性株を含み、ここで合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は、このワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２５６ＨＡであり、そしてこの株の各々は、少なくとも約１２８ＨＡ／用量を提示し、さらにこの株のうちの１つはチャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じＨＡサブタイプを有し、かつこの株のうちの少なくとも１つは、このチャレンジウイルスのＮＡサブタイプとは異なるＮＡサブタイプを有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥インフルエンザ感染を予防または軽減するためのワクチン組成物であって、該組成物は、少なくとも２つの鳥インフルエンザウイルス不活性化株を含み、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は該ワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２５６ＨＡであり、該株の各々は少なくとも約１２８ＨＡ／用量を提示し、さらにここで、該株のうちの１つはチャレンジウイルスのＨＡと同じＨＡサブタイプを有し、かつ該株のうちの少なくとも１つは、該チャレンジウイルスのＮＡサブタイプとは異なるＮＡサブタイプを有する、ワクチン組成物。
【請求項２】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのさらなる家禽抗原をさらに含む、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記キャリアは、水性キャリアおよびエマルジョンからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項２または３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記キャリアは、油中水エマルジョンである、請求項２、３または４のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記エマルジョンは少なくとも２つの界面活性剤を含む、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤は、オレイン酸ソルビタンエステルおよびエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマーからなる群より選択される、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記エマルジョンは、少なくとも２つのオレイン酸ソルビタンエステルを含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記エステルは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０およびセスキオレイン酸ソルビタンエステルである、請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記抗原は、水浴中で不活性化されたウイルス抗原からなる群より選択される請求項１〜９のいずれか１つまたはそれより多い請求項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
鳥インフルエンザの発生を予防または軽減する方法であって、該方法は、家禽メンバーに、少なくとも２つの鳥インフルエンザ不活性化株を含むワクチン組成物を投与する工程を包含し、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は該ワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２５６ＨＡであり、該株の各々は少なくとも約１２８ＨＡ／用量を提示し、さらにここで、該株のうちの１つはチャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じＨＡサブタイプを有し、かつ該株のうちの少なくとも１つは該チャレンジウイルスのＮＡサブタイプとは異なるＮＡサブタイプを有する、方法。
【請求項１２】
前記ワクチン組成物は、水を飲むことまたは噴霧することによって投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記用量は、家禽メンバー当たり、約０．２５ｍＬ〜２．０ｍＬの範囲内にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンは、ただ１用量だけ投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
鳥インフルエンザウイルス感染を予防または軽減するのに有効なワクチン組成物であって、該組成物は、少なくとも２つの鳥インフルエンザ不活性化株を含み、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は、該ワクチン組成物１用量当たり少なくとも約３００ＨＡであり、該株の各々は１用量当たり少なくとも約１５０ＨＡを提示し、さらにここで、該株のうちの１つはチャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じＨＡサブタイプを有し、該株のうちの少なくとも１つは該チャレンジウイルスのＮＡサブタイプとは異なるサブタイプを有し、該組成物は本質的にオレイン酸ソルビタンエステルからなる２つの界面活性剤を含有する、組成物。
【請求項１６】
前記界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０およびセスキオレイン酸ソルビタンである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記株の各々が、約１９２ＨＡ／用量を提示する、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、接種の約２２日後において約３３．９以上の幾何平均力価をもたらし、６０匹の家禽メンバーのうち約４９匹以上が少なくとも約１：１６のＨＩ力価を有する、請求項１５、１６または１７のいずれか１項またはそれより多くの請求項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記株は、それぞれＨ５Ｎ９およびＨ７Ｎ１と同定される、請求項１５〜１８のいずれか１項またはそれより多くの請求項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記合計ＨＡ／用量が少なくとも約３００である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記合計ＨＡ／用量が約２５６〜３００の範囲内にある、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患の発生に直面しているワクチン接種感受性の鳥に予防接種するのに有用な、新規の多価鳥インフルエンザワクチンに関する。本発明はまた、家禽における鳥インフルエンザウイルス疾患を予防または軽減するための新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
鳥インフルエンザ（「ＡＩ」とも呼ばれる）は、鳥および他の家禽の急性かつ高度に接触伝染性のウイルス感染である。インフルエンザウイルスのように、鳥インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ；Ｈと略されることもある）分子およびノイラミニダーゼ（ＮＡ；Ｎと略されることもある）分子における抗原の差異に基づくサブタイプで分類される。これらの分子は、季節ごとに「再集合」または「変異」する。鳥インフルエンザウイルスは絶えず変異するので、どの株が次の季節に再び現れるのかを予測できないことに起因して、ワクチンの調製は困難である。ワクチン調製のために使用される株は、製造条件下では非常に速い速度ではほとんど複製せず、その結果、特定の株の出現を待ち、次いでその株に対して保護する適切なワクチンを製造することは、実行可能な選択肢ではない。代表的には、特定の株の流行は、数ヶ月間続き、次いでおそらく数年間消失する。
【０００３】
根絶が、鳥における疾患を制御するための原則的な方法であるが、明らかな経済的不利を伴う。しかしながら、免疫の開始が早いワクチンが産生され得るならば、そのような製品は群れ全体の集団虐殺に対する実行可能な代替法を提供する。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、そのウイルスが有する抗原基に従って、種々のＡ、Ｂ、Ｃトポロジーに分類されることが公知である。Ａ、Ｂ、Ｃ型のインフルエンザウイルスは、ウイルスのヌクレオカプシド（ＮＰ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質において見出され得る抗原の差異に基づいて、互いに区別され得る。特に、Ａ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）分子およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）分子における抗原の差異に基づいて、サブタイプに分類され得る。ＮＡ１〜ＮＡ９と命名された９個のノイラミニダーゼＮＡタンパク質のサブタイプ、およびＨＡ１〜ＨＡ１５と命名された血清ヘマグルチニンＨＡタンパク質の１５個の異なるサブタイプが、現在同定されている。鳥においては、ＨＡ（またはＨ）およびＮＡ（またはＮ）サブタイプのいずれかを有するウイルスが、単離されている。
【０００５】
ＨＡは、約５６０アミノ酸を含むウイルス表面糖タンパク質であり、総ウイルスタンパク質の２５％を占める。ＨＡは、感染の初期段階における、ウイルス粒子への宿主への接着および宿主へのウイルスの侵入を主に担う。ウイルスタンパク質の中でヘマグルチニンは、翻訳後再配列に最も供されるもののうちの１つである。その合成が完了した後、その分子は宿主細胞の細胞外放出経路に従い、その過程においてＨＡはフォールディングされ、三量体にアセンブルされ、そしてグリコシル化される。最終的に、ＨＡは、Ｈ１およびＨ２の２つのサブユニットに切断される。この切断が、分子の活性化およびビリオンによる感染能の獲得における重要な段階である。
【０００６】
実際、塩基性アミノ酸残基に関して切断部位の異なる組成物は、能力のある鳥インフルエンザウイスルに翻訳され、局所的、または症候的感染（逆もまた同様）、多くの鳥種に対して致死的な結果を有する汎化した感染を生じる。それゆえ、この事実は、ウイルスの器官指向性、宿主特異性、ならびに病原性に影響し得ることが示唆されている。ウイルスの病原性に関しては、マルチベース部位（ｍｕｌｔｉｂａｓｅ−ｓｉｔｅ）のＨＡを有する株には、ＨＯ分子を切断するプロテアーゼが見出され、それによっていくつかの細胞型におけるＨ１およびＨ２活性型において２５種の感染性ウイルス粒子の大規模産生を伴う多数の感染サイクルが生じ、そして短い期間において全ての地区において感染の汎化を引き起こす（ＨＰＡＩ株）。この感染は、結果的に、死亡率が非常に高い急性−超急性過程を生じる。
【０００７】
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、インフルエンザＡウイルスの第二の膜糖タンパク質である。４１３アミノ酸ペプチドをコードする１４１３ヌクレオチド長の遺伝子（ウイルスＲＮＡのセグメント６）によってコードされる。このタンパク質は、少なくとも２つの重要な１０種の機能を有する：シアル酸分子とヘマグルチニン自身との間を切断することによるウイルスヘマグルチニンのための細胞レセプターの破壊。この様式において、新しく形成されたウイルス粒子が細胞膜に蓄積するのを防ぐこと、および粘膜表面上に存在する粘液を通るウイルスの輸送を促進することによって、ウイルス子孫の解放がおそらく容易になると考えられている。ＮＡはさらに、抗原性変動に供される重要な抗原決定基に相当する。
【０００８】
感染した群れの根絶に対する有用な代替法を提供する、鳥インフルエンザワクチンの必要性が、現在当該分野に存在する。そのようなワクチンは、ワクチン接種された鳥において迅速な免疫応答を惹起する必要があり、そして好ましくは、ワクチン接種された鳥を、感染した鳥から分別させることができる。二価または多価インフルエンザワクチンは、いわゆる「ＤＩＶＡ」法において利用可能になると主張されている。ここで、感染した鳥からワクチン接種された鳥を分別する手段を提供するように、ワクチン接種される株とは異なるＮを有するワクチンが投与される。特許文献１（この開示は、その全体が参考として援用される）は、ＤＮＡ技術およびその方法において利用可能ないくつかの代表的なワクチンについて記載している。
【０００９】
組み合わせたワクチンまたは多価ワクチンは、一価のワクチンに対して、多数の明白な利点を提供する。多価ワクチンの１つの利点は、より少ないワクチン接種しか必要とされないことである。単一の調製物が、１回の接種において投与され得、かつ複数の疾患または単一疾患の複数の株に対して有効である。製剤的なウイルス株の範囲が増えるにつれて、接種回数を最小限にするために、ワクチンの組み合わせがさらにより必須になる。ワクチンが組み合わされたときに必要とされる接種の回数が減ることは、ワクチン接種スケジュールの遵守の向上につながる。これは次いで、ワクチン範囲の増加という結果につながり、このことは最終的によりよい疾患の制御につながる。
【００１０】
組み合わせたワクチンの予想外の問題は、ワクチン組み合わせにおいてあるワクチンが別のワクチンについて有し得る、最近同定された負の影響（いわゆる、「抗原干渉」効果）である。２つの既存のワクチンが単純に混合されるとき、一方または両方がその能力を失うことがあることが発見されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【００１１】
不幸なことに、個々のワクチン成分がその能力を維持するか否かは、研究室における現在確立された能力試験の使用によって、常に予想することができるわけではない。例えば、いくつかの独立した研究が、Ｈｉｂワクチンが全細胞百日咳ワクチンと組み合わされた場合には、その２つのワクチン間では干渉は存在しないが、Ｈｉｂワクチンが無細胞百日咳ワクチンと組み合わされた場合、Ｈｉｂ免疫原性に実質的な損失が存在することを報告した。ＨｉｂがＤＴａＰと組み合わされた場合、別個の部位に与えられたときはその免疫原性を維持する一方で、そのワクチンが同じ部位に組み合わせて投与される場合は、その免疫原性は５〜１５倍低下することが示された。この予想外の結果により、２つの既存のワクチンを組み合わせることは、単純なプロセスでも日常的なプロセスでもなく、そのような組み合わせは、しばしば、初期研究の間には検出されない非常に予測できない結果を与えることが確認される。非干渉を実証するのに必要とされる研究は、非干渉および使用適合性を実証するためのさらなる数ヶ月または数年間の研究をしばしば加える。
【特許文献１】国際公開第03/086453号パンフレット
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅ，Ｆ．Ｅ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ’  Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９４）２２：３１７−３２１
【非特許文献２】Ｈａｄｌｅｒ，Ｓ．Ｃ．，「Ｃｏｓｔ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（１９９４）２２：４１５−４１８
【非特許文献３】Ｇｏｌｄｅｎｔｈａｌ．Ｋ，Ｌ．ら、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ−Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｐａｓｔ，Ｐｒｅｓｅｎｔ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ．」Ｉｎ：Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｃ．ら編）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９５）ｐｐ．１  ＸＩ−ＸＶ
【非特許文献４】Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．ら、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＰＲＰ−Ｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｔｙｐｅ  ｂ  ａｎｄ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．」、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｃ．ら編）、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９５）ｐｐ．２５５−２６６
【非特許文献５】Ｉｎｓｅｌ，Ｒ．Ａ．、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｂｙ  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｏｒ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，」、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｊ．Ｃ．ら編）、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９５）ｐｐ．３５−４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
二価の鳥インフルエンザワクチン（例えば、Ｍｅｒｉａｌによって市販されている、Ｆｌｕｖａｃ（登録商標）として公知のワクチン）は、市場において入手可能である。しかしながら、迅速な免疫応答およびより高い力価応答を惹起し、それゆえ発生に直面している鳥を迅速に保護するのに使用され得る、改善された二価または多価鳥インフルエンザウイルスに対する必要性が、なお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
一局面において、本発明は、鳥インフルエンザの予防または軽減において効果的であり、かつＤＩＶＡ技術において使用され得、そして免疫応答の迅速な発生を提供するという利点をさらに有する、ワクチン組成物に関する。このワクチン組成物は、約２００ＨＡ／用量より多いＨＡ／用量比率を含み、より好ましくは、少なくとも約２５６ＨＡ／用量を含み、そして最も好ましくは、２５０〜３００ＨＡ／用量の範囲にあり、そしてなおより望ましくは、約２５６〜３００ＨＡ／用量である。本発明のワクチン組成物において、少なくとも３００ＨＡ／用量を有することもまた、企図される。
【００１４】
したがって、本発明は、少なくとも２つの鳥インフルエンザ株を含むワクチン組成物を提供し、合わせたＨＡ／用量は約２００ＨＡ／用量よりも大きく、より好ましくは、約２５６ＨＡ／用量であり、そして好ましくは約２５０〜３００ＨＡ／用量であり、より好ましくは２５６〜３００ＨＡ／用量である。各鳥インフルエンザ株のＨＡ／用量の量は変動し得るが、代表的には少なくとも約７５ＨＡ／用量であり、そして最も好ましくは、約１２８ＨＡ／用量よりも多い。
【００１５】
本発明の二価または多価ワクチンのために選択される具体的な鳥インフルエンザ株は、そのワクチンが投与される領域における具体的な株の流行に依存する。最も好ましくは、その株のうちの１つが、流行株またはチャレンジ株のＨＡサブタイプと同一のＨＡサブタイプ、および異なるＮ成分を有し、それによってＤＩＶＡ技術の使用が可能になる。さらなる株は、処置される領域における出現を有する他のＨＡサブタイプから選択され得、ここでも異なるＮサブタイプが好ましい。
【００１６】
本発明のさらなる部分として、鳥インフルエンザウイルス感染を予防または軽減するのに有効なワクチン組成物が提供される。このワクチン組成物は、鳥インフルエンザウイルスの少なくとも２つの不活性化株を含み、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は、そのワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２００ＨＡであり、好ましくは少なくとも約２５６ＨＡ／用量であり、そしてこの株の各々は、少なくとも約１２８ＨＡ／用量を提示し、そしてさらにここで、この株のうちの１つは、チャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じサブタイプを有し、その株のうちの少なくとも１つは、そのチャレンジウイルスのＮＡサブタイプとは異なるＮＡサブタイプを有する。
【００１７】
鳥インフルエンザウイルス感染の発生を予防または軽減する方法もまた、本明細書中で提供される。この方法は、家禽メンバーに、少なくとも２つの不活性化鳥インフルエンザ株を含むワクチン組成物を投与する工程を包含する。ここで、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は、そのワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２００ＨＡであり、好ましくは少なくとも約２５６ＨＡ／用量であり、そしてその株の各々は、少なくとも約１２８ＨＡ／用量を提示し、そしてさらに、その株のうちの１つは、チャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じＨＡサブタイプを有し、かつその株のうちの少なくとも１つは、そのチャレンジウイルスとは異なるＮＡサブタイプを有する。
【００１８】
鳥インフルエンザ感染を予防または軽減するのに有効なワクチン組成物もまた提供される。このワクチン組成物は、少なくとも２つの不活性化鳥インフルエンザ株を含む。ここで、合わせたヘマグルチニン（ＨＡ）の合計は、そのワクチン組成物１用量当たり少なくとも約２５０ＨＡであり、その株の各々は少なくとも約１５０ＨＡ／用量を提示し、そしてさらに、その株のうちの１つは、チャレンジウイルスのＨＡサブタイプと同じＨＡサブタイプを有し、その株のうちの少なくとも１つはこのチャレンジウイルスとは異なるＮＡサブタイプを有し、この組成物はまた、オレイン酸ソルビタンエステルから本質的になる２つの界面活性剤を含有する。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の実施形態、特徴および利点は、以下の本明細書に記載される詳細な説明および添付の特許請求項の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
一局面において、本発明は、約２００ＨＡ／用量より多い総ＨＡ含量を有する、新規の多価鳥インフルエンザワクチンに関し、少なくとも約２５６ＨＡ／用量、好ましくは約２５６〜３００ＨＡ／用量の範囲にある。
【００２１】
本発明のワクチンに有用な鳥インフルエンザ単離体は、当該分野で利用可能な技術を使用して単離され得る。例えば、感染した鳥由来の組織または血清が、市販のブロイラーの群れから得られ得る。次いで、ウイルスは、マスター種ウイルスを確立するのに適した組織または他の適した媒体において継代され得る。当業者によるさらなる特徴付けもまた、利用可能な方法を使用して実行され得る。このウイルスは、例えば熱処理および化学的処理のような、利用可能な方法を使用して不活性化され得る。
【００２２】
本明細書中のさらなる局面において、本発明はまた、少なくとも２つの鳥インフルエンザ株を含有するワクチン組成物も包含する。
【００２３】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアと一緒に、利用可能な技術を使用して処方され得る。例えば、一実施形態において、水性処方物が企図される。そのような処方物は、水、生理食塩水もしくはホスフェートまたは他の適した緩衝液を使用する。なお別の実施形態において、このワクチン組成物は、好ましくは、油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョンである。しばしば水中油中水エマルジョンとして特徴付けられる両面エマルジョンもまた企図される。この油は、上記処方物を安定化するのを助け得、そしてさらにアジュバントまたはエンハンサーとして機能し得る。適した油としては、ホワイトオイル、Ｄｒａｋｅｏｉｌ、スクアランまたはスクアレン、ならびに天然由来であろうと合成由来であろうと、他の動物性、植物性または鉱油が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
さらに、上記ワクチン組成物は、当該分野で利用可能な他の適したアジュバントも含有し得る。これらとしては、例えば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、ならびに他の適した金属塩が挙げられる。
【００２５】
さらなる賦形剤（例えば、界面活性剤または他の湿潤剤または製剤化補助剤）もまた、上記ワクチン組成物中に含まれ得る。界面活性剤としては、モノオレイン酸ソルビタンエステル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）シリーズ）、ならびにエチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックコポリマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）シリーズ）、ならびに当該分野で利用可能な他のものが挙げられる。安定剤または保存剤として認識されている他の化合物もまた、そのワクチン中に含まれ得る。これらの化合物としては、例えば、ソルビトールのような炭水化物、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストリンまたはグルコースなど、ならびに保存用ホルマリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
上記ワクチン組成物はまた、外部の水を実質的に含まない乾燥粉末として処方され得、これは次いで、投与前に最終使用者によって再構築され得る。
【００２７】
上記ワクチン組成物は、最も好ましくは、殺されたかまたは不活性化されたウイルスを使用して処方される。約２００、そして好ましくは約２５６、そしてより好ましくは少なくとも約３００を超える総ＨＡ含量を提供するような、必須レベルで必要とされるＨＡタンパク質を発現する組み換えワクチンもまた、本明細書中における使用が企図される。
【００２８】
本発明のワクチン組成物は、好ましくは、そのインフルエンザウイルス成分由来の最低合計約２００ＨＡを含有する。本発明の一実施形態において、このワクチンは、各株由来の約１２８ＨＡ／用量を含有し、そしてなおより好ましくは各株由来の約１９２ＨＡ／用量を含有する。
【００２９】
他の疾患に対する他の家禽抗原もまた、本発明のワクチン組成物に含まれ得、そして本発明のワクチン組成物と一緒に投与され得る。例えば、鳥ヘルペスウイルス、鳥貧血ウイルス（ＣＡＶ）、ニューカッスル病ウイルスおよび伝染性気管支炎（ＩＢ）ウイルスに対するワクチン抗原、ならびにレオウイルス抗原が、本発明のワクチン組成物の一部として含まれ得る。１つ以上のレオウイルス抗原が、本発明のワクチン組成物の一部として特に好ましくあり得る。
【００３０】
本発明はまた、鳥インフルエンザウイルスからの感染に対する保護を誘導するための方法にも関する。この方法は、家禽動物に、少なくとも２つの鳥インフルエンザ株を含有するワクチン組成物を投与する工程を包含する。このワクチン組成物は、合わせたＨＡ含量が、約２００ＨＡ／用量よりも大きく、より好ましくは少なくとも約２５６ＨＡ／用量よりも大きく、２５０〜３００ＨＡ／用量が特に好ましく、そして約２５６〜３００がなおより好ましい。この方法はさらに、さらなる実施形態において、少なくとも約３００ＨＡ／用量を投与する工程を包含する。
【００３１】
投与方法は、当業者によって選択され得る。例えば、上記ワクチン組成物は、飲料水、スプレーまたは点眼剤によって、孵化後の若い（数日齢〜数週齢）鳥に投与され得る。卵投与（ｏｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が、本明細書中で企図される。例えば、胚に、通常約１８〜１９日において、接種し得る。本発明のワクチン組成物が非経口的に、皮下に、腹膜に、経口的に、鼻腔内に、または他の利用可能な手段で（好ましくは非経口的に、より好ましくは筋肉内に）、スケジュールに従う有効量で投与される他の方法もまた、本発明の範囲内にある。このスケジュールは、疾患を引き起こす鳥インフルエンザウイルスのキャリアへの予想される潜在的な曝露時期に従って決定され得る。
【００３２】
用量は、代表的に、家禽動物１匹当たり、約０．２５ｍＬ〜約２．０ｍＬの範囲内にあり、より好ましくは、動物１匹当たり約０．５ｍＬ〜約１．０ｍＬである。従って、１用量、２用量またはそれより多い用量が本明細書中で企図され、可能な限り少ないのが特に好ましい。
【００３３】
上述のように、本発明は、新規の鳥インフルエンザワクチン、およびその家禽における使用のための方法に関する。用語「家禽」とは、全ての商業的に飼育された家禽動物（鶏（ｃｈｉｃｋｅｎ）、アヒル、ガチョウ、七面鳥、クジャク、チャボ、鶏（ｆｏｗｌ）などが挙げられる）を包含することを意図するが、これらに限定されない。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例は、本発明の種々の好ましい局面を例示するが、決して本発明の全範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００３５】
（実施例１）
【００３６】
【化１】
2008515906.tif 000002
（薬剤の開発）
（ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１に含まれる株）
ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１のための鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ９および鳥インフルエンザウイルスＨ７Ｎ１株を、地域の流行に基づいて選択した。いずれの株も、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ（ＩＺＳ），Ｉｔａｌｙから供給された。その有効性を、鶏のセロコンバージョンによって実証した。
【００３７】
（ＰＯＵＬＶＡＣ（登録商標）ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１に含まれるアジュバント）
アジュバントは、油中水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンとして処方された、鉱油エマルジョンの十分に確立された免疫刺激効果に基づいて選択した。薬学グレードの軽油（ＮＦ）Ｄｒａｋｅｏｉｌ  ５を、その処方物において使用する。
【００３８】
安定な油中水エマルジョン（Ｗ／Ｏ）を達成するために、界面活性剤を使用することが必要である。界面活性剤のセスキオレイン酸ソルビタン（植物性）（疎水性界面活性剤）およびＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（植物性）（親水性界面活性剤）を、その乳化特性のために選択した。これらの界面活性剤の組み合わせの使用は、安定なエマルジョンをもたらすことが現在示されている。
Ａｒｌａｃｅｌ  ８３Ｖ＝セスキオレイン酸ソルビタン、モノエステルとジエステルとの等モル混合物；
ＣＡＳ数＝８００７−４３−９。これは、クリーム、エマルジョンおよび軟膏の調製において使用される。
Ｔｗｅｅｎ  ８０Ｖ＝Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０＝ポリオキシエチレン２０モノオレイン酸ソルビタン；
ＣＡＳ数＝９００５−６５−６。これは、安定な水中油エマルジョンの調製において使用される。
【００３９】
ソルビタンエステル様Ａｒｌａｃｅｌ  ８３Ｖは、安定なＷ／Ｏエマルジョンを産生するが、しばしば、種々の割合のポリソルベート様Ｔｗｅｅｎ８０Ｖ５と組み合わせて使用され、Ｗ／Ｏエマルジョンを産生する。
【００４０】
この製品を処方するのに使用されるＡｒｌａｃｅｌ  ８３ＶおよびＴｗｅｅｎ  ８０Ｖは両方、植物性由来である。
【００４１】
（用量およびワクチン接種スケジュール）
０．５ｍｌの用量が、家禽産業における使用のためには一般的である。
【００４２】
（ＰＯＵＬＶＡＣ  ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１）
（血清学研究に基づいた有効性）
（１．予備的な用量応答研究）
予備的な用量滴定研究を、種々の抗原ＨＡレベルに対する抗体応答を決定するために実施した。２５６、１２８、６４または３２ＨＡ単位の抗原濃度を含有する４つの実験的ワクチンを調製し、各々１つを使用して、２週齢および４週齢において１０羽のＳＰＦ鶏に筋肉内ワクチン接種した。１０羽の似ている鶏の群を、コントロールとしてワクチン接種しないままにした。各ワクチン接種前、ならびに二回目のワクチン接種から２週間後、６週間後および１０週間後に血液サンプルを採取し、血清学をモニタリングした。血清のサンプルを、屋内でヘマグルチニン阻害（ＨＩ試験）を使用して評価し、そしてＨＩ試験によってＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（ＩＺＳ）においてもまた評価した。
【００４３】
血清学的データは、全ての鳥がワクチン接種前に上記２つの鳥インフルエンザ株に対して血清反応陰性であったこと、および全てのワクチン接種されていない鳥が研究を通して血清反応陰性であったことを示した。
【００４４】
（Ｈ５Ｎ９血清学的結果）
研究室において得た結果は、ＩＺＳにおける結果よりも一般的に高かったが、２〜４倍希釈内であった（以下の表１を参照のこと）。１２８ＨＡ単位または２５６ＨＡ単位を含有する１回目のワクチン接種の２週間後、１０羽全てのワクチン接種体は、少なくとも１６ＨＩ単位（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅデータ）および４ＨＩ単位（ＩＺＳ）を有した。ワクチンの２回目の投薬は、全ての鶏においてＨ５Ｎ９に対する強力な既往応答を誘導し、そして２週間後、少なくとも６４ＨＩ単位の力価が、より高い力価のワクチンを投与した全ての鶏において見られた。
【００４５】
（Ｈ７Ｎ１血清学的結果）
研究室において得られた結果は、また、ＩＺＳにおいて得られた結果よりも一般的に高かったが、差異は３〜８倍であり、Ｈ５Ｎ９についてよりも大きかった。いずれにしても、ＩＺＳの結果からより慎重な力価を考慮して、１回目のワクチン接種から２週間後、１２８ＨＡ単位または２５６ＨＡ単位を投与された全ての鶏は、少なくとも８ＨＩ単位の力価を有したことは明らかである。ワクチンの２回目の投与は、全ての鶏においてＨ７Ｎ１に対する非常に強力な既往応答を誘導し、２週間後、少なくとも５１２ＨＩ単位の力価が、より高い力価のワクチンを投与された全ての鳥において見られた。
【００４６】
これらの結果は、ＰＯＵＬＶＡＣ  ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９２／４０／ＥＥＣ）によって保護性であるとみなされる１：１６のレベル以上に、Ｈ５Ｎ９およびＨ７Ｎ１に対する力価を誘導し得ることを示す。
【００４７】
（表１．Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  Ｓ．Ａ．（ＦＤ）とＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ（ＩＺＳＶ）との間のＨＩ力価の比較の概要）
ＨＩ幾何平均力価
【００４８】
【表１−１】
2008515906.tif 000003
【００４９】
【表１−２】
2008515906.tif 000004
ＦＤ：Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  Ｓ．Ａ．によって得られたＨＩ力価
ＩＺＳＶ：Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅによって得られたＨＩ力価
２ｗ：１回目のワクチン接種および採血における年齢
４ｗ：２回目のワクチン接種および採血における年齢
６ｗ：２回目のワクチン接種および採血後、２週間、６週間、１０週間または１４週間
ＰＲ：未決定の結果
計算のために、血清が力価を有さなかった場合、その血清は力価１であるとみなした。
【００５０】
（２．有効性の研究）
鶏におけるＰＯＵＬＶＡＣ  ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１の有効性を、以下の手順によって評価した。
【００５１】
（１１０−Ａ１−Ｅ−１４−０４）
２０匹のＳＰＦ鶏を、両抗原について最小の力価（１２８ＨＡ単位）で処方した０．５ｍｌの単回用量で、２週齢において筋肉内にワクチン接種した。ワクチンの２回目の投薬を、３週間後、その鶏が５週齢のときに与えた。２０匹の類似の鶏を、比較のためにワクチン接種をしないコントロールとして飼った。血液サンプルを各ワクチン接種前および２回目のワクチン接種の３週間後に採取し、血清学をモニタリングした。血清サンプルを、屋内でのヘマグリチニン阻害（ＨＩ試験）を使用して評価し、ＨＩ試験によってＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ（ＩＺＳ）においても評価した。
【００５２】
血清学データは、全ての鳥がワクチン接種前には上記２つの鳥インフルエンザ株に対して血清反応陰性であったこと、および全てのワクチン接種されていない鳥が、研究を通して血清反応陰性のままであったことを示した。
【００５３】
（Ｈ５Ｎ９血清学的結果）
研究室において得られた結果は、ＩＺＳにおける結果よりも一般的に高かったが、２〜４倍希釈の範囲内であった（以下の表２を参照のこと）。１回目のワクチン接種から３週間後、２０匹全てのワクチン接種体は、少なくとも１２８ＨＡ単位（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅデータ）および６４ＨＡ単位（ＩＺＳ）を有した。このことは、ＰＯＵＬＶＡＣ  ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１の単回用量が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９２／４０／ＥＥＣ）によって保護性であるとみなされる１：１６のレベル以上に、Ｈ５Ｎ９に対する力価を誘導し得ることを示す。
【００５４】
ワクチンの２回目の投与は、全ての鶏においてＨ５Ｎ９に対する強力な既往応答を誘導し、良好な保護がチャレンジに対して見られたことを再度示した。
【００５５】
（Ｈ７Ｎ１血清学的結果）
研究室において得られた結果は、またＩＺＳにおいて得られた結果よりも高かったが、３〜８倍の差異は、Ｈ５Ｎ９のものよりも大きかった。なぜ試験においてこの差異がこれほど広範なのかについては、まだ分かっていない。いずれにしても、ＩＺＳの結果からより慎重な力価を考慮して、１回目のワクチン接種から３週間後に２０匹全てのワクチン接種体が少なくとも１２８ＨＡ単位の力価を有したことは明らかである。このことは、ＰＯＵＬＶＡＣ  ｉ−ＡＩ  Ｈ５Ｎ９、Ｈ７Ｎ１の単回用量が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９２／４０／ＥＥＣ）によって保護性であるとみなされる１：１６のレベル以上に、Ｈ７Ｎ１に対する力価を誘導し得ることを示す。
【００５６】
ワクチンの２回目の投与は、全ての鶏においてＨ７Ｎ１に対する非常に強力な既往応答を誘導し、良好な保護がチャレンジに対して見られたことを再度示した。
【００５７】
（表２．Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ  Ｓ．Ａ．（ＦＤ）とＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ（ＩＺＳＶ）との間のＨＩ力価の比較の概要）
幾何平均力価として表現されたＨＩ
【００５８】
【表２】
2008515906.tif 000005
計算のために、血清が力価を有さなかった場合、その血清は力価１を有するものと考慮した。
【００５９】
（比較実施例２）
この実施例のために、２つの公開されたテキストに対する参照がなされる：参考文献１：Ｃａｐｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ＤＩＶＡ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  Ａｎｉｍａｌｓ）Ｓｔｒａｔｅｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｈｅｒｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ；Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３２，４７−５５（２００３）；および参考文献２：Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｃｋｅｎｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ５Ｎ１  Ａｖｉａｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆａｃｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ  Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ。参考文献１は、競合者のワクチンＨ７Ｎ３の二回用量で、２週および４週にてワクチン接種された鳥が、６週にて、ＨＩによって測定したところ４５の幾何平均力価で血清を有し、１３匹の鳥のうちの１１匹が、１：１６ＨＩ（保護性であるとみなされる）より大きい力価を達成したことを記している。３週齢において１回ワクチン接種し、６週において血清を採取した鳥は、ＨＩによって測定したところ、１９の幾何力価を示した。この場合において、１３匹の鳥のうち８匹のみが、１：１６より大きいＨＩ力価を達成した。対照的に、本明細書中に記載されるＨ７Ｎ１画分の結果は、この結果よりも、単回用量プログラムおよび二回用量両方に対して顕著に高かった。参考文献２は、５６日齢〜９９日齢の範囲の鳥における、別の競合者のインフルエンザワクチンの単回用量でワクチン接種された鳥について記している。ワクチン接種から１５日後、幾何平均力価は、ＨＩによって測定したところ、６０匹の鳥のうち３２匹が、１：１６以上のＨＩ力価を示した。ワクチン接種から２２日後、ＨＩによって測定したところ、この幾何平均力価は３３．９であり、６０匹の鳥のうち４９匹が１：１６以上のＨＩ力価を示した。しかしながら、本明細書中で得られた結果は、より卓越した有効性を実証しているようである。
【００６０】
（実施例３）
（七面鳥における予防的ワクチン接種についてのＰｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸ有効性治験）
（結果の概要）
・この治験は、ＯＩＥであり、そしてＡＩおよびＮＤについてのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙである、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ，  Ｐａｄｏｖａ，  Ｉｔａｌｙにおいて実施した。
・治験は、以前の研究に基づいていたが、以下に対する予防的ワクチン接種のためのツールとしてＰｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸの有効性を試験するために開発した：
−高度に適合したウイルス（Ａ／Ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／８０００／Ｈ７Ｎ３／２００２）の再出現；
−国内の宿主に対する適合の程度が低い新規の株（Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／Ｈ５Ｎ２／１９８０）の導入；
−この治験を、感染性の用量を変えて、鶏および七面鳥において実施した。
【００６１】
（実験的治験）
・七面鳥を、８日齢、３４日齢、６０日齢において、Ｐｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸ、０．５ｍｌ／ｓｃでワクチン接種した。
・４つの実験群（２つのワクチン接種群および２つの非ワクチン接種群）があり、１００ｕｌ／鼻腔内において１０４ＥＩＤ／５０で、３回目のワクチン接種後２１日にチャレンジした。
ＬＰＡＩ  Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／８０００／２００２／Ｈ７Ｎ３
ＬＰＡＩ  Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／Ｈ５Ｎ２／１９８０
・ワクチン接種されていないコントロールの群が１つ存在した。
・排出物（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）（気管および総排泄管スワブを、３日、５日、７日、１０日、１４日、２０日にて収集）、血清学および臨床的徴候を評価した。
【００６２】
（方法）
・ＥＵ指令９２／４０／ＥＣにしたがって、ウイルスの単離を行った。
・ＥＵ指令９２／４０／ＥＣにしたがって、ヘマグルチニン阻害試験を行った。
・Ｃａｔｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３３（４），ｐｐ．４３２−４３７にしたがって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
・Ｃａｐｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３２（１），４７−５５にしたがって、抗Ｎ抗体検出試験「ＤＩＶＡ」を行った。
【００６３】
（定義および統計的試験）
・感染：ＲＲＴ−ＰＣＲ（気管または総排泄管）によるウイルス学陽性、ならびに「ＤＩＶＡ」試験に対するセロコンバージョンおよび陽性の組み合わせ。
・セロコンバージョン：少なくとも４ｌｏｇの増加（チャレンジ前およびチャレンジ後の力価）。
・ワクチン接種群と非ワクチン接種群との間の排出物の比較：Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値。
・チャレンジ前およびチャレンジ後の力価の比較：ノンパラメトリックサイン検定（同じ群内にチャレンジ前−後）およびＷｉｌｃｏｘｏｎ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）２標本検定（異なる群の間の力価における増加の比較、すなわち、チャレンジ後のワクチン接種群と非ワクチン接種群との間の力価における増加の差異があるか否かを証明するため）。
【００６４】
（結果）
七面鳥のＨ５Ｎ２  １０４ＥＩＤ／５０チャレンジ
１．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥の間の感染の達成の指標間の比較。
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．０００５（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥において感染が達成された鳥の数の間に、統計的に有意な差異が存在する。
【００６５】
【化２】
2008515906.tif 000006
２．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における排出物レベル（気管および総排泄間スワブ）の比較
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．０００５（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥において、排出物レベルは、ワクチン接種されていない鳥よりも有意に低かった。
【００６６】
【化３】
2008515906.tif 000007
３．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における、チャレンジ前およびチャレンジ後のＨＩ力価間の比較。
ノンパラメトリックサイン検定：
非ワクチン接種：Ｈ５Ｎ２：Ｐ＝０．００３９（＜０．０１）；Ｈ５Ｎ９：Ｐ＝０．００３９（＜０．０１）
ワクチン接種：Ｈ５Ｎ２：Ｐ＝０．１７９７（＞０．０５）；Ｈ５Ｎ９：Ｐ＝０．００３９（＜０．０１）。
有意性：ワクチン接種された鳥では、ウイルスのチャレンジに対する血清学的力価における上昇は、有意ではなかった。代わりにワクチン接種されていない鳥では、力価において有意な上昇が存在した。
【００６７】
【化４】
2008515906.tif 000008
（七面鳥のＨ７Ｎ３  １０４ＥＩＤ／５０チャレンジ）
１．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥の間の感染の達成の指標間の比較。
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．００１（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における感染の達成の間に、統計的に有意な差異が存在する。
【００６８】
【化５】
2008515906.tif 000009
２．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における排出物レベル（気管および総排泄間スワブ）の比較
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．００００（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥において、排出物レベルは、ワクチン接種されていない鳥よりも有意に低かった。
【００６９】
【化６】
2008515906.tif 000010
３．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における、チャレンジ前およびチャレンジ後のＨＩ力価間の比較。
ノンパラメトリックサイン検定：
非ワクチン接種：Ｈ７Ｎ１：Ｐ＝０．００３９（＜０．０１）；Ｈ７Ｎ３：Ｐ＝０．００３９（＜０．０１）
ワクチン接種：Ｈ７Ｎ１：Ｐ＝０．００２０（＜０．０１）；Ｈ７Ｎ３：Ｐ＝０．０２１５（＜０．０５）。
有意性：ワクチン接種された鳥では、ウイルスのチャレンジに対する血清学的力価における上昇は、有意ではなかった。代わりにワクチン接種されていない鳥では、力価において有意な上昇が存在した。
非有意性：ワクチン接種された鳥において、ワクチン接種されていない鳥において観察されたものに匹敵する、チャレンジウイルスに対する血清学的力価における有意な上昇が存在した。
【００７０】
【化７】
2008515906.tif 000011
°Ｈ７Ｎ１ウイルスでのより高い血清学的活性は、ウイルスの特定の株に起因するものである。有意性を評価するために、そのチャレンジウイルスの力価が考慮されなければならない。
【００７１】
（結論−七面鳥）
・３回投与（ｓｈｏｔ）プログラムにおけるＰｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸは、以下のことが可能である：
・イタリアの七面鳥群に固有のＨ７Ｎ３株の１０４ＥＩＤ／５０チャレンジにより感染する鳥の数、排出物および臨床的徴候を有意に低減する；
・新規の導入を模倣するために選択されたＨ５Ｎ２株の１０４ＥＩＤ／５０チャレンジにより感染する鳥の数および排出物を有意に低減する。
・七面鳥における予防的ワクチン接種は、実験的な感染に対する群の感受性を低下させ、排出物レベルを有意に低下させた。
【００７２】
（実施例４  鶏における予防的ワクチン接種のためのＰｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸ有効性治験）
（結果の概要）
一般情報
・ＯＩＥであり、ＡＩおよびＮＤのためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙである、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｚｏｏｐｒｏｆｉｌａｔｔｉｃｏ  Ｓｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｖｅｎｅｚｉｅ，Ｐａｄｏｖａ，Ｉｔａｌｙにおいて実施した。
【００７３】
−高度に適合したウイルス（Ａ／Ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／８０００／Ｈ７Ｎ３／２００２）の再出現；
−国内の宿主に対する適合の程度が低い新規の株（Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／Ｈ５Ｎ２／１９８０）の導入；
−この治験を、感染性の用量を変えて、鶏および七面鳥において実施した。
【００７４】
（実験的治験）
・鶏を、２週齢および５週齢において、Ｐｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸ、０．５ｍｌ／ｓｃでワクチン接種した。
・４つの実験群（２つのワクチン接種群および２つの非ワクチン接種群）があり、１００ｕｌ／鼻腔内において１０６ＥＩＤ／５０で、２回目のワクチン接種後２１日にチャレンジした。
ＬＰＡＩ  Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／８０００／２００２／Ｈ７Ｎ３
ＬＰＡＩ  Ａ／ｔｙ／Ｉｔａｌｙ／Ｈ５Ｎ２／１９８０
・ワクチン接種されていないコントロールの群が１つ存在した。
・排出物（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）（気管および総排泄管スワブを、３日、５日、７日、１０日、１４日、２０日にて収集）、血清学および臨床的徴候を評価した。
【００７５】
（方法）
・ＥＵ指令９２／４０／ＥＣにしたがって、ウイルスの単離を行った。
・ＥＵ指令９２／４０／ＥＣにしたがって、ヘマグルチニン阻害試験を行った。
・Ｃａｔｔｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３３（４），ｐｐ．４３２−４３７にしたがって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
・Ｃａｐｕａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３２（１），４７−５５にしたがって、抗Ｎ抗体検出試験「ＤＩＶＡ」を行った。
【００７６】
（定義および統計的試験）
・感染：ＲＲＴ−ＰＣＲ（気管または総排泄管）によるウイルス学陽性、ならびに「ＤＩＶＡ」試験に対するセロコンバージョンおよび陽性の組み合わせ。
・セロコンバージョン：少なくとも４ｌｏｇの増加（チャレンジ前およびチャレンジ後の力価）。
・ワクチン接種群と非ワクチン接種群との間の排出物の比較：Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値。
・チャレンジ前およびチャレンジ後の力価の比較：ノンパラメトリックサイン検定（同じ群内にチャレンジ前−後）およびＷｉｌｃｏｘｏｎ（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）２標本検定（異なる群の間の力価における増加の比較、すなわち、チャレンジ後のワクチン接種群と非ワクチン接種群との間の力価における増加の差異があるか否かを証明するため）。
【００７７】
（結果）
鶏のＨ５Ｎ２  １０６ＥＩＤ／５０チャレンジ
１．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥の間の感染の達成の指標間の比較。
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．０４３３（＜０．０５）
有意性：ワクチン接種された鳥において、感染は達成されなかった。
【００７８】
【化８】
2008515906.tif 000012
２．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における排出物レベル（気管および総排泄間スワブ）の比較
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．０００８（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥において、排出物レベルは、ワクチン接種されていない鳥よりも有意に低かった（感染が達成されなかったため）。
【００７９】
【化９】
2008515906.tif 000013
３．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における、チャレンジ前およびチャレンジ後のＨＩ力価間の比較。
ノンパラメトリックサイン検定：
非ワクチン接種：Ｈ５Ｎ２：Ｐ＝０．００７８（＜０．０１）；Ｈ５Ｎ９：Ｐ＝０．００７８（＜０．０１）
ワクチン接種：Ｈ５Ｎ２：Ｐ＝０．４５３１（＞０．０５）；Ｈ５Ｎ９：Ｐ＝０．６８７５（＞０．０５）。
有意性：ワクチン接種された鳥では、ウイルスのチャレンジに対する血清学的力価における上昇は、有意ではなかった（感染が達成されなかったため）。代わりにワクチン接種されていない鳥では、力価において有意な上昇が存在した。
【００８０】
【化１０】
2008515906.tif 000014
（鶏のＨ７Ｎ３  １０６ＥＩＤ／５０チャレンジ）
１．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥の間の感染の達成の指標間の比較。
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．００１５（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥において、感染は達成されなかった。
【００８１】
【化１１】
2008515906.tif 000015
２．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における排出物レベル（気管および総排泄間スワブ）の比較
Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定Ｐ値＝０．００００（＜０．０１）
有意性：ワクチン接種された鳥において、排出物レベルは、ワクチン接種されていない鳥よりも有意に低かった（感染が達成されなかったため）。
【００８２】
【化１２】
2008515906.tif 000016
３．ワクチン接種された鳥対ワクチン接種されていない鳥における、チャレンジ前およびチャレンジ後のＨＩ力価間の比較。
ノンパラメトリックサイン検定：
非ワクチン接種：Ｈ７Ｎ１：Ｐ＝０．００２０（＜０．０１）；Ｈ７Ｎ３：Ｐ＝０．００２０（＜０．０１）
ワクチン接種：Ｈ７Ｎ１：Ｐ＝０．００２０（＜０．０１）；Ｈ７Ｎ３：Ｐ＝１．０００（＞０．０５）。
有意性：ワクチン接種された鳥では、ウイルスのチャレンジに対する血清学的力価における有意な上昇は存在しなかった（感染が達成されなかったため）。代わりにワクチン接種されていない鳥では、力価において有意な上昇が存在した。
【００８３】
【化１３】
2008515906.tif 000017
°Ｈ７Ｎ１ウイルスでのより高い血清学的活性は、ウイルスの特定の株に起因するものである。有意性を評価するために、そのチャレンジウイルスの力価が考慮されなければならない。
【００８４】
（結論−鶏）
・２回投与（ｓｈｏｔ）プログラムにおけるＰｏｕｌｖａｃ  ＸＸＸは、以下のことが可能である：
・イタリアの七面鳥群に固有のＨ７Ｎ３株の１０６ＥＩＤ／５０チャレンジにより感染する鳥の数、排出物および臨床的徴候を有意に低減する；
・新規の導入を模倣するために選択されたＨ５Ｎ２株の１０６ＥＩＤ／５０チャレンジにより感染する鳥の数および排出物を有意に低減する。
・鶏における予防的ワクチン接種は、鶏における活性な感染の確率を予防した。
【００８５】
本発明がその種々の実施形態の各々において記載されているが、上述の説明において記載され、そして添付の特許請求の範囲において具現化されるように、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対する特定の改変が当業者によって計画および実行され得ることが予測される。
【国際調査報告】
2008515906.tif 000018
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