(57)【要約】  藻類アシル−ＣｏＡシンテターゼを発現し、コエンザイムＡで長鎖脂肪酸をエステル化するためのプロセスを含む、トランスジェニック細胞に関する。
2008514221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図３Ａに示される配列からなる核酸分子、又は該配列とストリンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子がアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列を含む核酸分子を含んでなる、トランスジェニック細胞。
【請求項２】
前記核酸分子が図３Ａで示される核酸配列を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記核酸分子が図３Ａで示される核酸配列からなる請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
図３Ｂに表されるアミノ酸配列又は配列が少なくとも１アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾される変異体アミノ酸配列で示されるポリペプチドであって、該ポリペプチド又は変異体ポリペプチドがアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を発現するように適合されるトランスジェニック細胞。
【請求項５】
前記修飾が前記ポリペプチドの酵素活性を保持又は促進する請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
前記核酸分子が藻類種から単離される請求項１乃至５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
前記アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性が２０及び／又は２２炭素数の多価不飽和脂肪酸を修飾する請求項１乃至６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
前記ベクターが組織特異的なプロモーターであるように適合される請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターが種子特異的プロモーターである請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが誘導性プロモーター又は発生制御プロモーターである請求項９又は１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記細胞が真核細胞である請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞が原核細胞である請求項１乃至７のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
前記真核細胞が植物細胞である請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１４の植物細胞を含む種子。
【請求項１６】
アシル−ＣｏＡ生成するためのコエンザイムＡへの長鎖脂肪酸のエステル化における請求項１乃至７又は１２乃至１５のいずれかに記載のポリペプチド、細胞、植物又は種子の使用。
【請求項１７】
請求項１乃至７のいずれかに記載のポリペプチド、長鎖脂肪酸、ＡＴＰ及びコエンザイムＡを含む反応容器。
【請求項１８】
前記容器が発酵槽である請求項１７に記載の容器。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが請求項１２乃至１４のいずれかに記載の細胞により発現されるものである請求項１７又は１８に記載の容器。
【請求項２０】
前記細胞が真核細胞である請求項１７乃至１９のいずれかに記載の容器。
【請求項２１】
前記細胞が酵母細胞である請求項２０に記載の容器。
【請求項２２】
前記細胞が原核細胞である請求項１７乃至１９のいずれかに記載の容器。
【請求項２３】
以下の工程を含むアシル−ＣｏＡを生成するためのコエンザイムＡへの長鎖脂肪酸基質のエステル化を行う方法。
ｉ）請求項１７乃至２２のいずれかに記載の反応容器を提供し、
ｉｉ）長鎖脂肪酸のアシル−ＣｏＡへのエステル化が可能な条件下で前記反応容器に含まれる細胞を生育させる工程
【請求項２４】
前記長鎖脂肪酸が１８：３ｎ６、２０：４ｎ６、１８：４ｎ３、２０：５ｎ３及び２２：６ｎ３からなるグループより選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の方法により調製される多価不飽和脂肪酸を含むオイル、脂質、又は脂肪酸の組成物。
【請求項２６】
前記組成物がトランスジェニック植物に由来する請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項２３又は２４に記載の方法により生産されるオイル、脂質又は脂肪酸、又は食物
、食品、化粧品又は医薬品に含まれる請求項２５又は２６に記載のオイル、脂質又は脂肪酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は藻類のアシル−ＣｏＡシンテターゼを発現するトランスジェニック細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリアシルグリセロール中に脂肪酸を細胞内に貯蔵するには、脂肪酸がアシル−ＣｏＡシンテターゼ酵素の作用を通じてアシル−ＣｏＡをまず活性化する必要がある。アシル−ＣｏＡは、アシル−ＣｏＡシンテターゼにより脂肪酸、ＡＴＰ及びコエンザイムＡから作られる。アシル−ＣｏＡシンテターゼは、脂肪酸の異なる鎖長又は異なる飽和度に対して基質特異性を示す。例えば、アラキドン酸塩（２０：４ｎ−６）を好むアシル−ＣｏＡシンテターゼがラットで同定された。この酵素はアラキドン酸塩、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）に高い親和性を有し、パルミチン酸塩には低い親和性を有する。また、アシル−ＣｏＡシンテターゼのいくつかのアイソフォームがアラビドプシスで同定された。アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳｓ）は、ほとんど全ての脂肪酸由来の分子の生合成経路において重要な役割を果たしている。長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＬＡＣＳ）酵素は、アシルＣｏＡｓを生成するために遊離脂肪酸をコエンザイムＡにエステル化するが、このステップは、多くの脂質代謝酵素による脂肪酸の利用に対し必要となる重要な活性化ステップである（１）。
酵素反応のメカニズムは、アシルアデニレート（アシルＡＭＰ）中間体の形成を介して進行する２段階反応である（２）。アシル−ＣｏＡは、脂肪酸の伸長及びβ酸化、酵素の活性化、細胞情報伝達、及び転写制御など多くの代謝経路の重要な中間体として役立っている［３］。細胞代謝におけるアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）の様々な役割に対応して、多くの真核生物は、短い（Ｃ６−Ｃ８）、中程度（Ｃ１０−Ｃ１２）、長い（Ｃ１４−Ｃ２０）、非常に長い（＞Ｃ２２）鎖長の脂肪酸を特異的に活性化する幾つかの異なるＡＣＳｓをコードしている［３］。さらに、ある種の生物は各セットのアシル鎖長に対して複数の酵素を持っている。植物において、ＬＡＣＳ活性は幾つかの細胞内コンパートメントに局在し［４，５］、新規の脂肪酸合成によって合成されるアシル鎖をＣｏＡのエステルに活性化させ、その後、発生過程の種子中での膜グリセロ脂質及び貯蔵脂質（トリアシルグリセロール、ＴＡＧｓ）の合成に関与する代謝経路に使用可能にする［６］。
さらに、ＬＡＣＳ酵素は脂肪酸輸送に重要な役割を果たしている。この過程は、バクテリア［７］、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍａｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）［８］、及び哺乳類細胞［９］において詳細に研究されてきた。
【発明の開示】
【０００３】
海洋微小藻類は多種多様な脂肪酸を生成し、幾つかの種は健康に有用な多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡｓ）を含んでいるため興味を集めている［１１］。以下、多価不飽和脂肪酸をＰＵＦＡｓ、ＬＣＰＵＦＡ又はＬＣＰＵＦＡｓ（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ，ＰＵＦＡ，ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ，ＬＣＰＵＦＡ）と称する。高等植物において微小藻類の非常に長鎖の多価不飽和脂肪酸（ＶＬＣＰＵＦＡ）生合成経路の究極的な再構築が望ましいゴールであるが、そのためには、ＴＡＧｓへの取り込みに適する基質を形成するための脱飽和、伸長、及び活性化を導入する必要がある。
【０００４】
同時係属出願において、ＰＵＦＡ生合成経路に関連する活性をコードする核酸分子について記載している。ＷＯ０３／０７８６３９が引用文献としてここに含まれているが（特にそこに開示されている核酸配列）、そこには長鎖脂肪酸の修飾に関与するエロンゲース、デサチュラーゼ、アシル−ＣｏＡシンテターゼ及びジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼなど、幾つかの酵素活性について記載されている。これらの核酸分子は藻類の１種であるＰａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉから単離される。現在のところまだ公開されていない出願のＰＣＴ／ＧＢ０４／００３０５７が引用文献としてここに含まれているが（特にそこに開示されている核酸配列）、藻類種のＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａから単離されたエロンゲースポリペプチドの特徴付けについて記載されている。さらに、引用文献としてここに含まれており（特にそこに開示されている核酸配列）、現在のところまだ公開されていない出願のＧＢ０４０３４５２．６には、新規デサチュラーゼ活性を持つ酵素が記載されている。例えば、Δ１１−デサチュラーゼ活性を示すチトクロームｂ５デサチュラーゼ、さらにΔ６−デサチュラーゼ活性を持つ酵素が、各々、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａから単離される。我々は、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａのアシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＴｐｌａｓｃＡ）の特徴について記載する。この酵素は、健康に有用なＶＬＣＰＵＦＡｓ  ＥＰＡ及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に対して高い活性を示し、酵母ＴＡＧｓ中に貯蔵されるＤＨＡの量を増加させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明のある態様によると、図３Ａに示される配列からなる核酸分子、又は該配列とストリンジェントなハイブリダイズ条件下でハイブリダイズし、かつ、該核酸分子がアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の核酸配列を含む核酸分子を含んでなる、トランスジェニック細胞が提供される。
本発明の好ましい実施態様によれば、前記核酸分子は図３Ａに示される核酸配列と約５０％の相同性を持つ核酸配列を含む。
より好ましくは、前記相同性は、図３Ａに示される核酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ 又は少なくとも９９％の同一性を有し、アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を持つポリペプチドをコードする。
本発明のより好ましい実施態様において、前記核酸分子は図３Ａに示される核酸配列を含む。好ましくは、前記核酸分子は図３Ａに示される核酸配列からなる。
【０００６】
本発明の更なる態様によると、図３Ｂに表されるアミノ酸配列又は配列が少なくとも１アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって修飾される変異体アミノ酸配列で示されるポリペプチドであって、該ポリペプチド又は変異体ポリペプチドがアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を発現するように適合されるトランスジェニック細胞が提供される。
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子がお互いの間である程度の水素結合が起きるときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸を取り巻く環境、ハイブリダイゼーションの方法の性質、及び用いる核酸分子の組成と長さによって変動する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９３）；及びＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３）中で論じられている。Ｔｍは、核酸分子のある鎖の５０％がその相補鎖とハイブリダイズする温度のことである。以下にハイブリダイゼーション条件の例を示すが、これらに限定されるわけではない：
極めて高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５ｘＳＳＣ  ６５℃  １６時間
２回の洗浄            ：２ｘＳＳＣ  室温    １５分間  各回
２回の洗浄            ：０．５ｘＳＳＣ  ６５℃  ２０分間  各回
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：５ｘ−６ｘＳＳＣ  ６５℃−７０℃  １６−２０時間
２回の洗浄            ：２ｘＳＳＣ  室温    ５−２０分間  各回
２回の洗浄            ：１ｘＳＳＣ  ５５℃−７０℃  ３０分間  各回
低いストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列のハイブリダイズを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６ｘＳＳＣ  室温〜５５℃  １６−２０時間
少なくとも２回の洗浄  ：２ｘ−３ｘＳＳＣ  室温〜５５℃  ２０−３０分間  各回
【０００７】
本発明の好ましい実施態様において、前記修飾は前記ポリペプチドの酵素活性を保持又は促進する。
変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列において、組み合わされて存在し得る１又は複数の置換、付加、欠失トランケーションにより相違が生じる。中でも好ましい変異体は保存的なアミノ酸置換により、対比されるポリペプチドと異なるものである。このような置換は、類似の性質の他のアミノ酸と任意のアミノ酸を置換するものである。以下の非限定的に示すアミノ酸のリストは、保存的置換（類似の）と考えられる：ａ）アラニン、セリン及びスレオニン；ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；ｃ）アスパラギン及びグルタミンｄ）アルギニン及びリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニン及びバリン、及びｆ）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン。最も好ましくは、変異の対象となるポリペプチドと同じ生物学的機能及び活性を保持又は促進する変異体である。
【０００８】
さらに、本発明はここに開示されるポリペプチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド、又はその断片及び機能的に等価なポリペプチドを提示する。ある実施態様において、本ポリペプチドは、ここに開示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、よりさらに好ましくは少なくとも９７％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
【０００９】
本発明の好ましい実施態様において、前記核酸分子は藻類種から単離される
好ましい前記藻類種は以下のグループから選択される：Ａｍｐｈｉｄｉｎｉｕｍ  ｃａｒｔｅｒａｅ，Ａｍｐｈｉｐｈｏｒａ  ｈｙａｌｉｎａ，Ａｍｐｈｉｐｈｏｒａ  ｓｐ．，Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ，Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ  ｓｐ．，Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ，Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ，Ｈａｓｌｅａ  ｏｓｔｒｅａｒｉａ，Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ，Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ，Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｓｐ．，Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ，Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ，Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ，Ｐｒｏｒｏｃｅｎｔｒｕｍ  ｍｉｎｉｍｕｍ，Ｒｈｉｚｏｓｏｌｅｎｉａ  ｓｅｔｉｇｅｒａ，Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｃｏｓｔａｔｕｍ，Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ  ｓｐ．，Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｔｅｔｒａｔｈｅｌｅ，Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｎｉｔｚｓｃｈｉｏｉｄｅｓ，Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｏｒｍａ，Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ，Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｓｔｅｌｌａｒｉｓ。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様において、前記アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性は２０及び／又は２２炭素多価不飽和脂肪酸を修飾する。好ましくは、前記脂肪酸は２０：４ｎ６，２０：５ｎ３又は２２：６ｎ３炭素多価不飽和脂肪酸である。
本発明のさらなる態様において、本発明の核酸分子を含むベクターが提供される。
特に安定な形質転換体のためのゲノムへの組換えのために該核酸を細胞に導入するのに該ベクターが使用される場合には、本発明の核酸を含むベクターにはプロモーター又は他の制御配列が含まれる必要はない。
好ましくは、ベクター中の核酸は、原核（例えば、バクテリア）又は真核（例えば、カビ、植物、哺乳類又は昆虫細胞）などの宿主細胞中で、適当なプロモーター又は転写のための他の制御エレメントと作用可能に結合される。ベクターは複数の宿主中で機能する二作用性発現ベクターである。本発明のポリペプチドをコードする核酸の例において、その天然のプロモーター又は他の制御エレメントが含まれてもよく、また、ｃＤＮＡの場合には、宿主細胞中での発現に対し適当なプロモーター又は他の制御エレメントの制御下にあってもよい。
【００１１】
「プロモーター」は、転写開始部位の上流のヌクレオチド配列を意味し、転写に必要な全ての制御領域を含む。適当なプロモーターには、設計に応じて、植物に含まれる植物細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導的、発生的又はその他のプロモーターが含まれる。
構成的なプロモーターには、例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  プロモーター（Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，９８１０−８１２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら、（１９９０）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３−１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、（１９８９）  Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  １８（６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら、（１９９１）  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３．２７２３−２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国特許出願番号第０８／４０９，２９７）などである。他の構成的プロモーターは、米国特許第５，６０８，１４９；５，６０８，１４４；５，６０４，１２１；５，５６９，５９７；５，４６６，７８５；５，３９９，６８０，５，２６８，４６３；及び５，６０８，１４２に含まれる。
【００１２】
化学物質によって制御されるプロモーターは外部からの化学物質制御因子の適用を通じて植物における遺伝子発現を修飾するために使用することができる。目的に応じて、化学物質誘導性遺伝子発現の用途の場合、化学物質誘導性プロモーターを、又は化学物質抑制性発現の用途の場合、化学物質抑制性プロモーターを使用してもよい。化学物質誘導性プロモーターは、当該技術分野において知られており、限定はしないが、ベンゼンスルホンアミド  ハーミサイド  セーフナーによって活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、発芽前散布除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが含まれる。その他の対象となる化学物質制御プロモーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｍａら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５及びＭｃＮｅｌｌｉｅら（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７−２５７に記載のグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照のこと）、及びテトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚら（１９９１）ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７及びここに出典として含まれる、米国特許第５，８１４，６１８号及び第５，７８９，１５６号を参照のこと）が含まれる。
【００１３】
特定の組織における増強した発現が望まれる場合、組織特異的なプロモーターを利用することができる。組織特異的プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２（２）：２５５−２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７）ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｎｉら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８；Ｌａｍ（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８；Ｍｕｔｓｕｏｋａら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６−９５９０；及びＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５−５０、に記載されるものが含まれる。
本発明の好ましい実施態様において、前記組織特異的プロモーターは、発生中の脂肪種子のオイルの蓄積の間に活性化されるプロモーターである；Ｂｒｏｕｎら（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１３（２）：２０１−２１０を参照のこと
【００１４】
「作用可能に結合」とは、プロモーターから開始される転写にとって適切な位置及び方向で、同じ核酸分子の一部として結合されることを意味する。プロモーターに作用可能に結合したＤＮＡは、そのプロモーターの「転写開始制御下」にある。
好ましい実施態様において、プロモーターは誘導性プロモーター又は発生において制御されるプロモーターである。
【００１５】
特定のベクターは植物ベクターとして作用する核酸コンストラクトである。植物においてこれまでに広く、有効に使用されている特定の方法及びベクターは、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ及びＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３）（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（Ｃｒｏｙ  ＲＲＤ  ｅｄ）  Ｏｘｆｏｒｄ，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ｐｐ  １２１−１４８中、「Ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」）に記載されている。適切なベクターには植物ウィルス由来のベクターが含まれてもよい（例えば、ＥＰ−Ａ−１９４８０９を参照のこと）。
また、ベクターには除草剤（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ）に耐性な選択的表現型を付与するような選択的遺伝子マーカー（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン及びグリフォセート）が含まれていてもよい。
【００１６】
上記の代わりに、又は加えて、前記ベクターは哺乳類細胞のトランスフェクション又は酵母細胞のトランスフェクションに適切なベクターである。後者の例として、２μエピソーム型ベクターなどのマルチコピーベクターが好ましい。あるいは、酵母のＣＥＮベクター及びＹＩＰベクターなどのインテグレート型ベクターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．に適する。
【００１７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、前記細胞が前記核酸分子によってコードされるものを過剰発現する。
本発明の好ましい実施態様において、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較した場合、前記過剰発現は少なくとも２倍高い。
好ましくは、前記過剰発現は、同じ種で形質転換していない対照となる細胞と比較して、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は少なくとも１０倍である。
【００１８】
本発明の好ましい実施態様において、前記核酸分子はｃＤＮＡである。
さらにより好ましい実施態様において、前記核酸分子はゲノムＤＮＡである。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様において、前記トランスジェニック細胞は真核細胞である。
他の好ましい実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
さらに好ましい実施態様において、前記真核細胞は植物細胞である。本発明の植物細胞を含む植物は、前記植物によって作られる種子としても提供される。
本発明の好ましい実施態様において、前記植物は以下に示される中から選択される：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ），キャノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｓｐ．），  麻（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ），アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ），ライス（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ），ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒａｔｅ），モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ），ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ），小麦（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ），大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ），タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ），ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ），  ピーナッ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ），綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ），サツマイモ（Ｉｏｐｍｏｅａ  ｂａｔａｔｕｓ），  キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ），コーヒー（Ｃｏｆｅａ  ｓｐｐ．），ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ），パイナップル（Ａｎａｎａ  ｃｏｍｏｓｕｓ），  柑橘類（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｐｐ．），ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ），茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｅｎｅｎｓｉｓ），バナナ（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．），アボカド（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ），イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｓｉｃａ），グアヴァ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ），マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ  ｉｎｄｉｃａ），オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ），パパイア（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ），カシューナッツ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ），マカデミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ  ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ），アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ），砂糖大根（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ），エン麦，大麦，野菜及びオーナメンタル（ｏｒｎａｍｅｎｔａｌｓ）。
【００２０】
好ましくは、本発明の植物は、作物（例えば、穀類とパルス（ｐｕｌｕｓｅ）、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ、タピオカ、ライス、モロコシ、あわ、キャッサバ、大麦、えんどう）、及びその他の根、塊茎又は種子作物である。重要な種子作物は、アブラナ、砂糖大根、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆、モロコシ、及び麻（アマニ）である。本発明が適用される園芸植物には、レタス、エンダイブ、及びキャベツ、ブロッコリー、カリフラワーを含むアブラナ属の野菜である。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、ストロベリー、ヒマワリ、トマト、コショウに適用される。
対象の種子を提供する穀物植物には脂肪種子植物及び豆科植物が含まれる。対象の種子には、トウモロコシ、小麦、大麦、ライス、モロコシ、ライ麦などの穀物の種子が含まれる。
オイル種子植物には、綿、大豆、紅花、ヒマワリ、アブラナ属、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツなどが含まれる。 豆科植物にはビーンズとえんどうが含まれる。 ビーンズには、グアール（ｇｕａｒ）、イナゴマメ、コロハ（ｆｅｎｕｇｒｅｅｋ）、大豆、ガーデンビーンズ、カウピー、マングビーン、ライマビーン、ソラマメ、レンズ豆、ヒヨコマメなどが含まれる。
【００２１】
本発明の更なる態様によると、本発明の植物細胞を含む種子が提供される。好ましくは、前記種子は脂肪種子植物である。
本発明のある態様によると、アシル−ＣｏＡを形成するために長鎖脂肪酸をコエンザイムＡにエステル化する際の、本発明のポリペプチド又は細胞の使用が提供される。
さらに本発明の他の態様によると、本発明のポリペプチド、長鎖脂肪酸、ＡＴＰ及びコエンザイムＡを含む反応容器が提供される。好ましくは、容器は発酵槽である。
本発明の好ましい実施態様において、前記ポリペプチドは本発明の細胞によって発現される。
好ましくは、前記細胞は、例えば酵母などの真核細胞である。
あるいは本発明のその他の実施態様において、前記細胞は原核細胞である。
【００２２】
本発明のさらなる態様によると、以下の工程を含むアシル−ＣｏＡを生成するためのコエンザイムＡへの長鎖脂肪酸基質のエステル化を行う方法が提供される：
ｉ）本発明の反応容器を提供し、
ｉｉ）長鎖脂肪酸のアシル−ＣｏＡへのエステル化が可能な条件下で前記反応容器に含まれる細胞を生育させる工程。
有利には、本発明の方法で生産される多価不飽和脂肪酸には、少なくとも２、有利には、３、４又は５の二重結合が含まれる。特に有利には、本脂肪酸には４又は５の二重結合が含まれる。本方法において有利に生産される脂肪酸は、１８、２０、２２又は２４の炭素原子を脂肪酸鎖中に有する；好ましくは、脂肪酸は２０、２２又は２４の炭素原子を脂肪酸鎖中に含む。有利には、飽和脂肪酸は、本方法に使用される核酸とマイナーな限度で反応するか、又は全く反応しない。マイナーな限度とは、飽和脂肪酸が、多価不飽和脂肪酸と比較して、有利には、活性の５％未満、３％未満、特に有利には、２％未満でしか反応しない。生産されるこれらの脂肪酸は、単一の製造物又は脂肪酸の混合物として生産され得る。
【００２３】
本発明の好ましい方法において、前記長鎖脂肪酸は以下のグループから選択される：１８：３ｎ６、２０：４ｎ６、１８：４ｎ３、２０：５ｎ３及び２２：６ｎ３である。
本方法で生産される多価不飽和脂肪酸は、膜脂質及び／又はトリアシルグリセリドと有利に結合するが、遊離脂肪酸としても生物体内に生じ、又は他の脂肪酸エステルの形体で結合する。このような関係において、それらは「純粋な製造物」、又は有利には種々の脂肪酸の混合物又は異なるグリセリドの混合物の形体であると言われるような状態で存在する。トリアシルグリセリドと結合している種々の脂肪酸は、４〜６炭素原子の短鎖脂肪酸、８〜１２炭素原子の中鎖脂肪酸、又は１４〜２４炭素原子の長鎖脂肪酸に由来し、好ましくは長鎖脂肪酸であり、特に好ましくはＣ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−及び／又はＣ２４−脂肪酸の長鎖脂肪酸、ＬＣＰＵＦＡｓである。
本発明の方法は、多価不飽和脂肪酸のＣ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−及び／又はＣ２４−脂肪酸分子との脂肪酸エステルを生産し、少なくとも２つの二重結合が脂肪酸エステル中に存在する。これらの脂肪酸分子は、好ましくは３、４又は５の二重結合を含み、有利に、ヘキサデカジエン酸（Ｃ１６：２Δ９，１２），γ−リノレン酸（＝ＧＬＡ，Ｃ１８：３Δ６，９，１２），ステアリドン酸（＝ＳＤＡ，Ｃ１８：４Δ６，９，１２，１５），ジホモ−γ−リノレン酸（＝ＤＧＬＡ，２０：３Δ８，１１，１４），エイコサテトラエン酸（＝ＥＴＡ，Ｃ２０：４Δ５，８，１１，１４），アラキドン酸（ＡＲＡ），エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）又はこれらの混合物、好ましくは、ＥＰＡ及び／又はＡＲＡを生み出す。
【００２４】
多価不飽和脂肪酸のＣ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−及び／又はＣ２４−脂肪酸分子との脂肪酸エステルは、脂肪酸エステルの調製に用いられる生物から、オイル又は脂質の形体で、例えば、少なくとも２つ、好ましくは３つの二重結合を持つ多価不飽和脂肪酸を含むスフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖スフィンゴ脂質などの糖脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール又はジホスファチジルグリセロールなどのリン脂質、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドなどの化合物の形体で単離することができる；それらは、そのジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド及び／又はホスファチジルコリン、特に好ましくはトリアシルグリセリドの形体で有利に単離される。これらのエステルの他、多価不飽和脂肪酸は生物体、有利には、植物中に遊離脂肪酸又は他の化合物と結合しても存在する。通常、上記種々の化合物（脂肪酸エステル及び遊離脂肪酸）は、だいたい、トリグリセリドの８０〜９０重量％、ジグリセリドの２〜８重量％、モノグリセリドの５〜１０重量％、遊離脂肪酸の１〜５重量％、リン脂質の２〜５重量％、種々の化合物の総量の１００重量％の分布で生物中に存在している。
【００２５】
本発明の方法は、トランスジェニック生物、有利にはトランスジェニック植物中の総脂肪酸に基づいて、少なくとも３重量％、有利には少なくとも５重量％、好ましくは少なく後も８重量％、特に好ましくは少なくとも１０重量％、最も好ましくは少なくとも１５重量％の含量で生産されるＬＣＰＵＦＡｓを製造する。有利には、脂肪酸は結合型で生産される。本発明の方法で使用される核酸を用いて、これらの不飽和脂肪酸は、有利に調製されるトリグリセリドのｓｎ１、ｓｎ２及び／又はｓｎ３の位置に作り出される。本発明の方法において、ヘキサデカジエン酸（Ｃ１６：２）、リノール酸（Ｃ１８：２）及びリノレン酸（Ｃ１８：３）の出発化合物により複数の反応ステップが進行するため、本方法の最終産物、例えば、アラキドン酸（ＡＲＡ）又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などは、完全に純粋な産物としては得られない；極微量の前駆体が常に最終産物中に存在する。例えば、リノレン酸とリノール酸は出発生物及び出発植物中に存在すれば、ＡＲＡやＥＰＡなどの最終産物は混合物として存在する。前駆体は、問題となる最終産物の量に基づいて、有利には、２０重量％、好ましくは１５重量％、特に好ましくは１０重量％、最も好ましくは５重量％を超えない。有利には、本発明の方法において、ＡＲＡのみ又はＥＰＡのみが、結合型又は遊離脂肪酸の形体で、トランスジェニック植物中に最終産物として生産される。両方の化合物（ＡＲＡ及びＥＰＡ）が同時に生産される場合、それらは有利には少なくとも１：２（ＥＰＡ：ＡＲＡ）、有利には少なくとも１：３、好ましくは１：４特に好ましくは１：５で生産される。
【００２６】
本発明の核酸配列により、多価不飽和脂肪酸の少なくとも５０％、有利には少なくとも８０％、特に有利には１００％、さらに特に有利には少なくとも１５０％の収量の増大が、非トランスジェニック出発生物に対し、ＧＣ分析における比較によって得られる。さらなる有利な実施態様において、多価不飽和脂肪酸の収量は、少なくとも２００％、好ましくは２５０％、さらに特に好ましくは少なくとも３００％増大し得る。
【００２７】
また、化学的に純粋な多価不飽和脂肪酸又は脂肪酸組成物が上述の方法によって合成される。このために、脂肪酸又は脂肪酸組成物が微生物、植物又は生物が成育した培地、又は生物体及び培地から、既知の方法で、例えば、抽出、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー又はこれらの方法の組合せによって単離される。これらの化学的に純粋な脂肪酸又は脂肪酸組成物は、食品産業領域、化粧品産業領域及び特に製薬産業領域において有利に使用することが出来る。
本発明の方法において生産に適する生物は、基本的には、微生物、非ヒト動物又は植物などの任意の生物である。有利には、本発明の方法は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ又はＴｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍなどのカビ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ又はＣｅｒａｔｏｄｏｎなどのコケ類、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓなどの非ヒト動物、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ又はＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍなどの藻類、又は、双子葉又は単子葉植物などの植物を使用する。本発明の方法に特に有利に用いられる生物は、オイル生産生物に属する生物、つまり、オイル生産に使用される、例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ又はＴｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍなどのカビ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍなどの藻類、又は、植物、特定の植物であって、好ましくは、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、胡麻、キンセンカ、ザクロ、月見草、モウズイカ、あざみ、野ばら、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカデミア、アボカド、月桂樹、かぼちゃ／スカッシュ、アマニ、大豆、ピスタチオ、ボリジ、木（パーム油、ココナッツ又はクルミ）などの多量の脂質化合物を含む油料穀物植物、又はトウモロコシ、小麦、ライ麦、燕麦、ライ小麦、ライス、大麦、綿、キャッサバ、コショウなどの耕地の作物、マンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナス及びトマトなどのナス科植物、エンドウ豆、アルファルファ、又はブッシュの植物（コーヒー、カカオ、紅茶）などのソラマメ属、シダレヤナギ属、及び多年生牧草と家畜用農作物である。本発明において好ましい植物は、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、けし、マスタード、大麻、トウゴマ、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、月見草、かぼちゃ/スカッシュ、アマニ、大豆、ボリジ、木(パーム油、ココナッツ) などの油料穀物プラントである。 特に好ましくは、Ｃ１８：２−及び／又はＣ１８：３−脂肪酸の多い植物で、ヒマワリ、紅花、タバコ、モウズイカ属、胡麻、綿、かぼちゃ/スカッシュ、けし、月見草、クルミ、アマニ、大麻、あざみまたは紅花などである。さらに特に好ましい植物は、紅花、ヒマワリ、けし、月見草、クルミ、アマニ又は大麻などの植物である。
【００２８】
本発明の核酸に加えて、脂肪酸又は脂質代謝のための酵素をコードするさらなる核酸を生物内に導入することは、ここに開示される進歩性において有利である。
基本的に、全ての脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は多価不飽和脂肪酸の生産過程で使用することが可能で、本発明性のあるアシルＣｏＡシンテターゼと組み合わせると有利である。以下のグループから選択される脂肪酸又は脂質代謝の遺伝子は、アシル−ＣｏＡシンテターゼとの組合せて有利に使用される：アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシルＡＣＰ［＝ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ］デサチュラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース。アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−８−デサチュラーゼ、Δ−９−デサチュラーゼ、Δ−１２−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンゲース、Δ−６−エロンゲース又はΔ−９−エロンゲースからなるグループより選択される遺伝子は、個々の遺伝子又は複数の遺伝子を組み合わせて使用することができる、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、グリセロ−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼに対する上述の遺伝子と組み合わせて使用すると特に好ましい。
【００２９】
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする、本発明の方法で使用される核酸の酵素活性によれば、また、有利には、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、Δ−４−、Δ−５−、Δ−６−、Δ−８−デサチュラーゼ又は、Δ−５−、Δ−６−若しくはΔ−９−エロンゲース活性などの脂肪酸又は脂質代謝のポリペプチドをコードする核酸配列と組み合わせると、多種多様な多価不飽和脂肪酸を本発明の方法において生産することができる。本発明の方法に使用される、有利な植物などの選択される生物に依存して、ＥＰＡ又はＡＲＡ又はＤＨＡなどの種々の多価不飽和脂肪酸又は個々の多価不飽和脂肪酸を遊離又は結合型で生産することができる。出発植物中の一般的な脂肪酸組成（Ｃ１８：２−又はＣ１８：３−脂肪酸）に依存して、ＧＬＤ、ＤＧＬＡ又はＡＲＡなどのＣ１８：２−脂肪酸由来の脂肪酸、ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ又はＤＨＡなどのＣ１８：３−脂肪酸由来の脂肪酸が得られる。リノール酸（＝ＬＡ，Ｃ１８：２Δ９，１２）のみが本方法で使用される植物中に不飽和多価脂肪酸として存在する場合、ＧＬＡ，ＤＧＬＡ及びＡＲＡのみを産物として産出することができ、それら全て遊離脂肪酸又は結合型として存在する。本方法に使用される植物中に不飽和脂肪酸として、例えば、アマニなどのように、α−リノレン酸（＝ＡＬＡ，Ｃ１８：３Δ９，１２，１５）のみが存在している場合、産物としてＳＤＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡのみを得ることができ、上述のようにそれら全ては遊離脂肪酸又は結合型として存在する。リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼを、アシルＣｏＡシンテターゼ、Δ−５−、Δ−６−デサチュラーゼ及び／又はΔ−６−デサチュラーゼ及び／又はΔ−６−エロンゲース又はアシル−ＣｏＡシンテターゼ、Δ−５−、Δ−８−デサチュラーゼ及び／又はΔ−９−エロンゲースと有利に組み合わせて、又は合成カスケードの最初の３つの遺伝子、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、Δ−６−デサチュラーゼ及び／又はΔ−６−エロンゲース、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、Δ−８−デサチュラーゼ及びΔ−９−エロンゲース、のみとを組み合わせて、合成に関与する酵素の活性を修飾することにより、上述の生物、有利には上述の植物中で個々の産物のみを、目標を絞った形で生産することができる。Δ−６−デサチュラーゼ及びΔ−６−エロンゲースの活性によると、出発植物と多価不飽和脂肪酸に依存して、例えば、ＧＬＡとＤＧＬＡ、又はＳＤＡとＥＴＡが形成される。好ましくは、ＤＧＬＡ又はＥＴＡ又はこれらの混合物が形成される。Δ−５−デサチュラーゼが付加的に生物内、有利には植物内に導入されると、ＡＲＡ又はＥＰＡがさらに形成される。また、これはΔ−８−デサチュラーゼ及びΔ−９−エロンゲースが予め導入されている生物にも適用される。有利には、合成のための出発基質として作用する、生物内又は植物内��存在する脂肪酸に依存して、ＡＲＡ又はＥＰＡのみ又はこれらの混合物が合成される。生合成カスケードが関与するため、目的の最終産物生物内で純粋な形では存在しない。少量の前駆体化合物が常に最終産物中に存在する。この少量の産物は、最終産物であるＤＧＬＡ、ＥＴＡ又はこれらの混合物、又はＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ又はこれらの混合物に対し、２０重量％未満、有利には、１５重量％未満、特に有利には、１０重量％未満、最も有利には、５，４，３，２又は１重量％未満である。
【００３０】
有利に増大した量の多価不飽和脂肪酸を持つオイル及び／又はトリグリセリドの生産に関するここに開示される方法において、収量を増やすために、脂肪酸合成のための出発産物の量を増やすと有利である；これは、例えば、生物内にΔ−１２−デサチュラーゼのポリペプチドをコードする核酸を導入することにより達成することができる。これは、オレイン酸に富むアブラナなどのオイル生産生物において特に有利である。これらの生物はリノレン酸が少ないので（Ｍｉｋｏｋｌａｊｃｚａｋら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３８，１９６１，６７８−６８１）、出発物質であるリノレン酸を生産するために上述のΔ−１２−デサチュラーゼの使用が有利である。
【００３１】
本発明の方法において使用され核酸は、有利には、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ又はＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ等の藻類、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ等の藻類／珪藻類、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ又はＣｅｒａｔｏｄｏｎ等のコケ類などの植物、Ａｌｅｕｒｉｔｉａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔａ、Ｏｓｔｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｐｉｎｅｓｃｅｎｓ又はＯｓｔｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｈｙｏｓｅｒｏｉｄｅｓ等のＰｒｉｍｕｌａｃｅａｅなどの高等植物、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ又はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ等カビなどの微生物、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａなどのバクテリア、酵母、又はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ等線虫などの動物、昆虫又はヒトに由来する。該核酸  は、有利には、カビ、動物に由来し、又は藻類若しくはコケなどの植物に由来し、好ましくは、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓなどの線虫に由来する。
【００３２】
本発明の方法は、有利には、上述の核酸配列又はそれらの誘導体又は該核酸配列によってコードされるタンパク質の酵素活性を保持するポリペプチドをコードするホモログを使用する。アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸配列と組み合わせて、これらの配列を発現コンストラクトにクローニングし、生物内に導入及び発現させるために使用する。このようなコンストラクションにより、これらの発現コンストラクトによって、本発明の方法において生産される多価不飽和脂肪酸の有利で適切な合成が可能となる。
【００３３】
好ましい実施態様において、本方法において使用される核酸配列を含む細胞又は無傷の生物を獲るステップがさらに含まれ、その細胞及び／又は生物は、本発明の核酸配列である遺伝子コンストラクト又は後述のベクター、単独又は脂肪酸又は脂質代謝のタンパク質をコードする核酸配列とさらに組み合わせて形質転換される。さらに好ましい実施態様において、本方法はさらに培地から精製化学物質を得るステップが含まれる。培養は、例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ又はＴｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍなどの微生物の培養の場合には、例えば、発酵槽培養の形式を、又は植物のグリーンハウス又は畑での栽培を行うことができる。従って、作り出される細胞又は生物は、有利には、例えば、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、アマニ、麻、大豆、紅花、ヒマワリ又はルリヂサ等、油料植物などのオイル生産生物である。
【００３４】
植物細胞、植物組織又は植物器官の場合、「生育する」とは、例えば、培養液中又は培養液上における培養、又は、例えば、水耕栽培、培養土、耕地の素地上又は素地中での無傷の植物の栽培を意味するものとして理解できる。
本発明の目的に関し、「トランスジェニック」又は「組換体」とは、核酸配列の例として、発現カセット（＝遺伝子コンストラクト）又は本発明の核酸配列を含むベクターを意味し、又は発現カセット又は本発明のベクターなどの核酸配列で形質転換された生物を意味し、これら全てのコンストラクションは組換手法によって作製されるものであり；
ａ）本発明の核酸配列、又は
ｂ）例えば、プロモーターなど、本発明の核酸と作用可能に結合した遺伝子制御配列、又は、
ｃ）（ａ）及び（ｂ）
は、その天然の遺伝的環境中には存在せず、あるいは、例えば、１又は複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、インバージョン又は挿入形体を得るための修飾を可能にする組換手法により修飾されている。天然の遺伝的環境とは、オリジナルの生物中の天然のゲノム又は染色体座、又はゲノムライブラリー中に存在することを意味するものとして理解される。ゲノムライブラリーの場合、好ましくは核酸配列の天然の遺伝子環境が、少なくとも一部保持される。周囲には少なくとも片側に核酸が隣接し、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも５００塩基対、特に好ましくは少なくとも１０００塩基対、最も好ましくは少なくとも５０００塩基対の長さの配列が存在する。自然に生じる発現カセット（例えば、自然に生じる本発明の核酸配列の天然のプロモーターの組合せ）は、本発現カセットが、例えば、変異原処理などの非天然の合成（「人工的な」）方法によって修飾される場合、トランスジェニック発現カセットとなる。適切な方法は、例えば、米国特許第５，５６５，３５０号又は国際公開第００／１５８１５号中に記載されている。
【００３５】
本発明の目的のトランスジェニック生物又は植物は、上述の通り、本発明で使用される核酸が生物ゲノムの本来の座位に存在せず、該核酸がホモローガスに又はヘテロローガスに発現され得ることを意味するものとして理解される。しかし、先に述べた通り、トランスジェニックとは、本発明の核酸が生物ゲノム中の本来の座位に存在しけれども、該配列が、天然の配列について修飾されること、及び／又は天然の配列の制御配列が修飾されることをも意味する。トランスジェニックとは、好ましくは、ゲノム中の天然の座位における本発明の核酸の発現のこと、すなわち、本発明の核酸のホモローガス、又は、好ましくは、ヘテロローガスな発現が生じることを意味するものとして理解される。好ましいトランスジェニック生物は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａなどのカビ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌなどのコケ、Ｃｒｙｐｏｃｏｄｉｎｉｕｍなどの藻類、又は油料作物などの植物である。
【００３６】
本発明の方法において使用される発現カセット又はベクターなどの核酸にとって適切な生物又は宿主生物は、基本的に有利には、脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を合成することができる全ての生物、及び／又は組換遺伝子の発現に適する全ての生物である。例えば、アラビドプシス、キンセンカ属などのキク科植物、大豆、ピーナッツ、トウゴマ、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、麻、アブラナ、ココナッツ、油やし、紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）又はココア豆などの作物植物、例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ属又はＰｙｔｈｉｕｍ属等のカビ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属又はＳｈｅｗｎｅｌｌａ属等のバクテリア、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ属等の酵母、シアノバクテリア、繊毛虫、渦鞭毛虫などの藻類又は原生動物、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍなどの微生物である。好ましい生物は、天然に相当量のオイルを合成することができる生物で、例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍなどのカビ、大豆、アブラナ、ココナッツ、油やし、紅花、麻、大麻、トウゴマ、キンセンカ、ピーナッツ、ココア豆又はヒマワリなどの植物、又はＳａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母であり、大豆、麻、アブラナ、紅花、ヒマワリ、キンセンカ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい。基本的に、適切な宿主生物は、上述のトランス下ニック生物に加えて、トランスジェニック動物、有利には、非ヒト動物、例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓなどである。
【００３７】
さらに利用可能な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）中に詳述されている。
使用可能な発現株、例えば、低いプロテアーゼ活性を持つものなどについては、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８中に記載されている。
これらには、植物の細胞及び葯、繊維、根毛、茎、胚、カルス、子葉、葉柄、収穫物、植物組織、再生組織、及び実際のトランスジェニック植物に由来し、及び／又はトランスジェニック植物を生み出すために使用し得る細胞培養物が含まれる。
【００３８】
本発明の方法において合成される多価不飽和脂肪酸を含むトランスジェニック植物は、オイル、脂質又は単離されるべく合成された脂肪酸を特に必要とすることなく、市場へ直接売り込むことができる。本発明の方法のための植物は、無傷の植物、及び植物の器官又は葉、幹、種子、根、塊茎、葯、繊維、根毛、茎、胚、カルス、子葉、葉柄収穫物、植物組織、再生組織、及び実際のトランスジェニック植物に由来し、及び／又はトランスジェニック植物を生み出すために使用し得る細胞培養物など、植物の全ての部分を意味するものとして、挙げられている。この場合、種子には種皮、表皮細胞、種子細胞、内胚乳又は胚組織などの種子の全ての部分が含まれる。しかし、本発明の方法において生産される化合物は、生物、有利には、オイル、脂肪、脂質、及び／又は遊離脂肪酸の形で植物から単離することができる。この過程で生産される多価不飽和脂肪酸は、生物体を、それらが生育する作物、又は畑から収穫することで得ることができる。植物の部分、好ましくは植物の種子を絞るか、エクストラクトすることで行うことができる。この点において、オイル、脂肪、脂質及び／又は遊離脂肪酸は、圧縮による熱を発生させないコールドビーティング（ｃｏｌｄ−ｂｅａｔｉｎｇ）又はコールドプレッシング（ｃｏｌｄ−ｐｒｅｓｓｉｎｇ）として知られる方法によって得ることができる。植物の部分、特に種子をより容易に破壊するために、種子を予め粉砕し、蒸し又はローストする。このような方法で前処理された種子は、次に、プレス又は暖かいヘキサンでエクストラクトすることができる。溶媒は、その後再度除かれる。
【００３９】
微生物の場合、回収後、例えば、更なる処理工程を行わずにエクストラクトするか、又は、破壊後、当業者に周知の種々の方法によりエクストラクトする。この方法で、本方法で生産される化合物の９６％以上を単離することができる。その後、得られた産物はさらに処理、つまり精製される。本方法において、植物の粘液及び浮遊物などの物質は最初に除去される。いわゆるデスライミングは、酵素的、又はリン酸などの酸を添加することで、例えば、物理化学的に効果を及ぼす。その後、遊離脂肪酸は例えば水酸化ナトリウム溶液などの塩基で処理し、除去される。得られた産物は、残留するアルカリを除くために水で十分に洗浄し、乾燥させる。産物に残っている色素を除くために、例えば、フラー土又は活性炭を用いて産物を漂白する。最後に、蒸気などを用いて産物を脱臭する。
【００４０】
本方法により生産されるＰＵＦｓ又はＬＣＰＵＦＡｓは、好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２つの二重結合を、好ましくは３つ、４つ、５つ又は  ６つの二重結合を持つＣ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−又はＣ２４−脂肪酸分子である。これらのＣ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−又はＣ２４−脂肪酸分子生物からオイル、脂質又は遊離脂肪酸の形で単離することができる。適切な生物は、例えば、上述されている。好ましい生物はトランスジェニック植物である。
【００４１】
従って、本発明のある実施態様は、上述の方法で生産されるオイル、脂質又は脂肪酸又はそれらのフラクションであり、特に好ましくは、ＰＵＦＡｓ及びトランスジェニック植物から得られるものを含むオイル、脂質又は脂肪酸組成物である。
本発明のさらなる実施態様は、飼料、食品、化粧品及び医薬品中の脂肪酸及び／又は脂肪酸組成物である。
「オイル」、「脂質」又は「脂肪」とは、不飽和又は飽和、好ましくはエステル化された脂肪酸を含む脂肪酸混合物を意味するものと理解される。オイル、脂質又は脂肪は、好ましくは、多価不飽和遊離又は有利にはエステル化された脂肪酸、特に、リノレン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸が多く含まれる。不飽和のエステル化された脂肪酸含量は、好ましくはおよそ３０％に達し、５０％の含量がより好ましく、６０％、７０％、８０％又はそれ以上の含量はさらにより好ましい。分析に関し、脂肪酸含量は、例えば、エステル交換により脂肪酸をメチルエステルに変換した後、ガスクロマトグラフィーによって決定することができる。オイル、脂質又は脂肪は、種々の他の飽和又は不飽和脂肪酸、例えば、カレンジュリン酸（ｃａｌｅｎｄｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸などを含むことができる。
【００４２】
上述のように、本方法で生産された少なくとも２つの二重結合を有利に保持する多価不飽和脂肪酸は、例えば、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、リン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール又は他の脂肪酸エステルである。
少なくとも２つの二重結合を有利に有し、酸は本発明の方法で調製された多価不飽和脂肪酸から出発すると、そこに含まれる多価不飽和脂肪酸を、例えば、有利には、メタノール又はエタノールなどのアルコール存在下においてＫＯＨ又はＮａＯＨ水溶液などのアルカリ処理又は酸加水分解など介し、あるいは、酵素的切断を介して遊離することができ、また、例えば、相分離及びＨ２ＳＯ４などによる酸性化によって単離することができる。また、脂肪酸は上述処理ステップを介さずに直接遊離させることもできる。
【００４３】
有利には植物細胞又は植物などの生物内にそれらを導入した後、本方法において使用される核酸は、別のプラスミド上に存在するか、又は、宿主細胞のゲノム中にインテグレートされる。ゲノム中へのインテグレーションの場合、インテグレーションはランダムであるか、又は、それにより細胞による目的の化合物の生産が影響を受けるような、天然の遺伝子が導入されたコピーによって置換されるような組換えによって、又はトランスに遺伝子を使用することにより影響され、そのため、遺伝子の発現を保証する少なくとも１つの配列、及び機能的に転写される遺伝子のポリアデニル化を保証する少なくとも１つの配列を含む機能的発現ユニットと機能的に連結する。
【００４４】
コケ類と藻類は、アラキドン酸（ＡＲＡ）及び／又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの不飽和脂肪酸の相当量を生産する唯一の植物システムとして知られている。コケ類は、ＰＵＦＡｓを膜脂質中に含んでおり、一方、藻類、藻類及びカビ類と関連する生物は、相当量のＰＵＦＡｓをトリアシルグリセロール画分にも蓄積している。そのため、トリアシルグリセロール画分中にもＰＵＦＡｓを蓄積するような株から単離される核酸分子が、特に、本発明の方法にとって有利に適しており、従って、宿主、特に、アブラナ、キャノーラ、アマニ、大麻、大豆、ヒマワリ及びルリヂサなどの油料作物植物中の脂質及びＰＵＦＡ生産システムにとって有利に適している。
【００４５】
本発明の長鎖ＰＵＦＡｓを生産するために、多価不飽和Ｃ１６−又はＣ１８−脂肪酸は、まず、デサチュラーゼの酵素活性によって脱飽和化され、次に、エロンゲースによって少なくとも２つの炭素原子で伸長される。１つの伸長サイクルの後、この酵素活性は、Ｃ１８−又はＣ２０−脂肪酸を生じさせ、２又は３の伸長サイクルの後、Ｃ２２−又はＣ２４−脂肪酸が生じる。本発明の方法によって使用されるデサチュラーゼ及びエロンゲース活性は、好ましくは、Ｃ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−及び／又はＣ２４−脂肪酸を生じさせ、有利には、脂肪酸分子中に少なくとも２つ、好ましくは３、４又は５つの二重結合を有し、特に好ましくは、脂肪酸分子中に２つの二重結合、好ましくは、３、４又は５つの二重結合を分子中に有するＣ２０−及び／又はＣ２２−脂肪酸を生じさせる。最初の脱飽和及び伸長が起こった後、更なる不飽和化ステップが、例えば、Δ５位に１つ生じる。特に好ましい本発明の方法による産物は、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸である。脂肪酸中に少なくとも２つの二重結合を持つＣ１８−脂肪酸は、遊離脂肪酸又はリン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールなどのエステルの形体で本発明の酵素活性によって伸長される。
【００４６】
植物中の脂肪酸、オイル、脂質又は脂肪の有利に使用される好ましい生合成部位は、例えば、通常、種子又は種子の細胞層（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｔａ）であるため、本方法で使用される核酸の種子特異的な発現が意味をなす。しかし、脂肪酸、オイル又は脂質の生合成は、種子組織に限定される必要はなく、植物のその他全ての部位、例えば、表皮細胞又は塊茎においても生じ得ることは明らかである。
【００４７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの酵母、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ、Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ又はＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍなどのカビは、本発明の方法における生物として使用される場合、これらの生物は発酵培養中で有利に生育できる。
基本的には、本方法で使用される生物中における、本発明の方法により生産される不飽和脂肪酸は、２つの異なる方法で増大される。有利には、本方法により生産される遊離不飽和脂肪酸のプール、及び／又は本方法により生産されるエステル化され多価不飽和脂肪酸の含量を拡大することができる。有利には、トランスジェニック生物に存在するエステル化された多価不飽和脂肪酸のプールは、本発明の方法によって詳説される。
【００４８】
微生物は本発明の方法の生物として使用される場合、それらは、宿主生物に依存して、当業者にとっても通常の方法で生育される。原則として、微生物は、一般に糖などの炭素源、一般にイーストエクストラクトなどの有機的窒素源又は硫安などの塩の形で窒素源を、鉄、マンガン及びマグネシウムの塩などの微量成分、適当な場合には、ビタミンなどを含む液体培地中で、０℃及び１００℃の間、好ましくは、１０℃及び６０℃の間の温度で、酸素ガスを供給しながら生育させる。液体培地のｐＨは一定に保たれても、又は保たれなくてもよく、つまり、培養期間中制御される。培養はバッチ状態、セミバッチ状態又は連続的に生育させる。栄養素は発酵の最初に供給されるか、又は半連続的又は連続的に与えられる。生産される多価不飽和脂肪酸は、上述のように、当業者に知られた方法、例えば、抽出、蒸留、結晶化。適当な場合には、塩による沈殿、及び／又はクロマトグラフィーによって生物から単離することができる。そのためには、有利には、生物を予め破砕してもよい。
【００４９】
宿主生物が微小生物である場合、本発明の方法は、０℃〜９５℃、好ましくは１０℃〜８５℃、特に好ましくは１５℃〜７５℃、非常に特に好ましくは、１５℃〜４５℃の温度で有利に実施することができる。
この過程において、ｐＨ値はｐＨ４〜１２、好ましくは、ｐＨ６〜９、特に好ましくはｐＨ７〜８に有利に保つことができる。
本発明の方法は、バッチ状態、セミバッチ状態又は連続的に操作することができる。既知の培養方法を概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅβｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｍｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ  ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］  （Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  １９９１）又はＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ  ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４）を参照のこと）に見出すことができる。
【００５０】
使用される培地は、対象となっている株の必要条件を適切に満たす必要がある。種々の微生物に対する培地の詳細については、米国細菌学会（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）の教科書“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に記載されている。
上述のように、本発明に従って使用できるこれらの培地は、通常、１又は複数の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／又は微量成分を含んでいる。
好ましい炭素源は、モノ−、ジ−又は多糖類などの糖である。非常に適した炭素源の例として、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、スターチ又はセルロースを挙げることができる。また、糖は、糖液又はその他精糖による副産物などの複合化合物を介して培地に添加することもできる。また、種々の炭素源混合物の添加も有益である。その他使用可能な炭素源は、例えば、ソーヤ油、ヒマワリ油、ピーナッツオイル及び／又はココナッツ脂肪などのオイル及び脂肪、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び／又はリノレン酸、などの脂肪酸、アルコール及び／又は、例えば、グリセロール、メタノール及び／又はエタノール、などのポリアルコール、及び／又は例えば、酢酸及び／又は乳酸などの有機酸である。
【００５１】
窒素源は、通常、有機又は無機窒素化合物又はこれらの化合物を含む物質である。窒素源の例として、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの硫酸塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸などに由来する液体又は気体のアンモニアを含む窒素源、又はコーンスティープリカー、ソーヤミール、ソーヤタンパク質、イーストエクストラクト、肉汁などの複合窒素源を挙げることができる。窒素源は個別に又は混合物として使用できる。
培地中に存在する無機塩化合物には、塩素、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅及び鉄のリン酸及び硫酸塩が含まれる。
例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物などの無機硫黄含有化合物、又は、例えば、メルカプタン及びチオールなどの他の有機硫酸化合物を、硫黄含有精製化学品の生産のための硫黄源として使用でき、特に、メチオニンが好ましい。
リン酸、二水素リン酸カリウム又は水素リン酸ジカリウム又はこれらに対応するナトリウム含有塩をリン源として使用してもよい。
溶液中に金属イオンを保つために培地へキレート剤を添加してもよい。特に適当なキレート剤には、カテコール又はプロトカテク酸塩などのジヒドロキシフェノール及びクエン酸などの有機酸が含まれる。
【００５２】
また、微生物の培養に対し本発明で使用される発酵培地には、通常、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸及びピリドキシンなどのビタミン又は成長プロモーターなどの成長因子も含まれる。成長因子及びその塩は、しばしば、イーストエクストラクト、糖液、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来する。培地に適切な前駆体を添加することもできる。正確な培地化合物の組成は、特定の実験に大きく依存し、各特定のケースに対し個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｐ．Ｍ．  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，編集  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）に記載されている。また、成長培地は、例えば、Ｓｔａｎｄａｒｄ１（Ｍｅｒｃｋ）又はＢＨＩ（ｂｒａｉｎ  ｈｅｒａｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）など、業者から購入することができる。
全ての培地成分は、高熱（１．５ｂａｒ、１２１℃で２０分間）又はフィルター滅菌により滅菌される。構成成分は、一緒に滅菌しても、又必要ならば、個別に滅菌してもよい。全ての培地成分は培養開始時に存在するか、又は連続的バッチ的に、望ましい様に添加される。
【００５３】
培養温度は、通常、１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、そして一定に維持されるか、又は実験の間に変動されてもよい。培地のｐＨは、５〜８．５の範囲、好ましくは、約７．０である。培養のためのｐＨは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア及びアンモニア水などの塩基化合物、又はリン酸又は硫酸などの酸化合物を添加して、培養中、コントロールすることができる。発砲は例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて制御することができる。プラスミドの安定性を維持するための、例えば、抗生物質などの選択的効果を有する培地に適する物質を添加することができる。好気的状態は、酸素又は外気などの酸素を含む気体混合物を導入することによって維持される。培養温度は、通常、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養は、所望の産物の形成が最大になるまで続ける。この目的は、通常、１０〜１６０時間で達成される。
このような方法で得られた発酵ブロース、特に、多価不飽和脂肪酸を含むものは、通常、７．５〜２５重量％の乾燥総量が含まれる。
次に、発酵ブロースはさらに処理される。バイオマスは、例えば、遠心、濾過、デカンテーション又はこれらの方法の組合せた分離方法により、発酵ブロースから必要に応じて完全に又は部分的に除去されるか、又は該ブロース中に全て残存させる。分離後にバイオマスを処理した方が有効である。
しかし、また、発酵ブロースは細胞を分離することなく、既知の方法、例えば、ロータリーエバポレーター、薄膜エバポレーター、フォーリングフィルムエバポレーターなどを用いて、逆浸透などにより、濃く、濃縮することができる。最後に、この濃縮された発酵ブロースはその中に存在する脂肪酸を得るために処理される。
【００５４】
また、本方法で得られる脂肪酸は、目的の更なる産物の化学合成に対する出発物質としても適当である。例えば、それらは互いに組み合わせて、又は単独で、医薬品、食品、動物飼料又は化粧品の調製に使用することができる。本方法で使用される核酸を導入するために、既知の方法で有利に増幅及びライゲーションすることができる。好ましくは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ又はＰｆｕ／ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ混合物に関するプロトコールに従う方法による。プライマーは、増幅する配列を考慮に入れて選択される。プライマーは便宜上、増幅産物が開始コドンから停止コドンまでの全コード配列を含むように選択される必要がある。増幅後、増幅物は便宜上分析される。例えば、ゲル電気泳動分離は質及び量について実施することができる。その後、増幅物は標準的なプロトコール（例えば、Ｑｉａｇｅｎｎ）により精製することができる。その後、精製した増幅物のアリコットを次のクローニングのステップで使用することができる。適切なクローニングベクターは、一般に、当業者に周知である。特に、これらには微生物のシステムで複製可能なベクターであり、つまり、主として酵母又はカビでの有効なクローニングを保証し、安定な植物への形質導入を可能にするベクターが含まれる。特に挙げるとすれば、Ｔ−ＤＮＡを介する形質転換に適した種々のバイナリー又は共導入（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）用のベクターシステムである。一般に、これらのベクターシステムは、少なくとも、アグロバクテリウムを介する形質転換に必要なｖｉｒ遺伝子とＴ−ＤＮＡ境界（Ｔ−ＤＮＡ  ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ）配列（Ｔ−ＤＮＡ  ｂｏｒｄｅｒ）を含む。また、好ましくは、これらのベクターシステムは、さらに、プロモーター及びターミネーター及び／又は、適切に形質転換された生物を同定するための選択マーカーなどのシス制御領域を更に含む。共導入ベクターシステムにおいて、ｖｉｒ遺伝子とＴ−ＤＮＡ配列を同じベクター上に配置するが、バイナリーシステムは、ｖｉｒ遺伝子を持つがＴ−ＤＮＡを持たないベクターと、これに対し、Ｔ−ＤＮＡを持つがｖｉｒ遺伝子を持たない第２のベクターの少なくとも２つのベクターに基づいている。この事実によると、後者のベクターは比較的小さく、操作が容易で、大腸菌とアグロバクテリウムの両方において複製することができる。これらのバイナリーベクターは、一連のｐＢＩＢ−ＨＹＧ，ｐＰＺＰ，ｐＢｅｃｋｓ，ｐＧｒｅｅｎに由来するベクターが含まれる。本発明によると、Ｂｉｎｌ９，ｐＢＨＯｌ，ｐＢｉｎＡＲ，ｐＧＰＴＶ及びｐＣＡＭＢＩＡが好適に使用される。バイナリーベクターの概説及びその使用については、Ｈｉｌｌｅｎｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）５，４４６−４５１中に記載されている。ベクターを調製するために、ベクターはまず制限エンドヌクレアーゼで直鎖化し、適当な形に酵素的に修飾する。その後、ベクターを精製し、アリコットをクローニングステップに使用する。クローニングステップにおいて、酵素的切断し、適当な場合には、増幅物を精製し、同様の方法で調製したベクター断片を使用し、ラーゲースによりクローン化する。この場合、特定の核酸コンストラクト、又��ベクター又はプラスミドコンストラクトは、１又は複数のコード化遺伝子断片を有する。これらのコンストラクト中のコード化遺伝子断片は、好ましくは、制御配列と作用可能に結合する。制御配列には、特に、上述のプロモーター及び御ターミネーターなどの植物配列が含まれる。コンストラクトは微生物、特に大腸菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中にて、選択的条件下で増殖することができ、ヘテロローガスなＤＮＡを植物又は微生物中に導入することを可能にする。
【００５５】
本方法において使用される核酸は、つまり、本発明の核酸及び核酸コンストラクトは、微生物または有利には植物などの生物に、有利には、クローニングベクターを用いて導入することが可能であり、従って、以下に発行され引用されているように、植物の形質転換に使用される：Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ），  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６／７，  ｐｐ．７１−１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ；  ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．：Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，１５−３８；Ｂ．  Ｊｅｎｅｓら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｄ．：Ｋｕｎｇ及びＲ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８−１４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１），２０５−２２５。従って、本発明に使用される核酸、つまり、本発明の核酸及び核酸コンストラクト、及び／又はベクターは、広い範囲の生物、有利には植物の組換え修飾に使用可能であり、後者はＰＵＦＡ生産物としてより適切、及び／又はより効果的である。
【００５６】
本方法で有利に使用される核酸は、バクテリア、例えばＳｈｅｗａｎｅｌｌａ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ，Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ，Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ，Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ，Ａｌｅｕｒｉｔａ，Ｍｕｓｃａｒｉｏｉｄｅｓ，Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ，Ｂｏｒａｇｏ，Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ，Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍなど藻類若しくはコケ類などの植物、又はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓなどの線虫に由来し、特に、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｎｅｄａｉ，Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ，Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎａｅｕｍ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ，Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ，Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ，Ａｌｅｕｒｉｔａ  ｆａｒｉｎｏｓａ，Ｍｕｓｃａｒｉｏｉｄｅｓ  ｖｉａｌｌｉｉ，Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ，Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ，Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍの属又は種に由来し、特に有利には、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（シーエレガンス）に由来する。
【００５７】
本方法で使用される核酸は、微生物又は植物などの生物中における核酸の発現を可能にする発現カセット中に有利に導入される。
これを行う場合、本発明の核酸の核酸をコードする核酸配列、及び組み合わせて使用されるアシル−ＣｏＡシンテターゼ、デサチュラーゼ及び／又はエロンゲースをコードする核酸配列は、１又は複数の制御シグナル、有利には、遺伝子発現を促進するものと機能的に連結される。これらの制御配列は、遺伝子及びタンパク質の特異的な発現を可能ならしめることを目的とされる。宿主生物に依存するが、このことは、例えば、遺伝子が、誘導が行われた後のみ、発現及び／又は過剰発現され、あるいは、即時に発現及び／又は発現されることを意味する。例えば、これらの制御配列は誘導因子又は抑制因子が結合する配列の形態をとり、核酸の発現をコントロールする。これらの新規制御配列に加えて、又はこれらの配列の代わりに、現実の構造遺伝子の前にこれらの配列の天然の制御が依然として存在することがあり、適当であるならば、天然の制御を除去して、該遺伝子の発現を促進するように遺伝学的に修飾してもよい。しかし、発現カセット（＝発現コンストラクト＝遺伝子コンストラクト）は、コンストラクトにおいてよりシンプルであってもよい。つまり、核酸配列又はその誘導体の前に何ら制御シグナルを挿入せずに、その制御と共に天然のプロモーターを除去する。その代わり、天然の制御配列には、もはや制御が起こらず、及び／又は遺伝子発現が促進されるように変異を導入される。これらの修飾されたプロモーターは、活性を促進するために部分配列の形態で（＝本発明の核酸配列の一部を持つプロモーター）天然の遺伝子の前に各々配置してもよい。さらに、遺伝子コンストラクトは、プロモーターと機能的にリンクしたエンハンサー配列として知られる１又は複数の配列、つまり、核酸配列の増強した発現を可能にする配列を有利に含んでもよい。さらなる有利な配列、更なる制御エレメント又はターミネーターをＤＮＡ配列の３’末端に挿入してもよい。脂肪酸生合成に関与するアシルＣｏＡシンテターゼ、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ及び／又はΔ−８−デサチュラーゼ遺伝子及び／又はΔ−５−エロンゲース、Δ−６−エロンゲース及び／又はΔ−９−エロンゲース遺伝子、又は他の遺伝子は、発現カセット（＝遺伝子コンストラクト）中に１又は複数のコピーとして存在してもよい。好ましくは、遺伝子の１コピーのみが各発現カセット中に存在する。この遺伝子コンストラクト又は遺伝子コンストラクト（群）は、宿主生物中で共に発現される。この場合、遺伝子コンストラクト（群）は、１又は複数のベクター中に挿入され、遊離型で細胞内に存在し、あるいは、ゲノム中に挿入される。宿主ゲノム中への更なる遺伝子の挿入にとって、発現される遺伝子が１つの遺伝子コンストラクト中に共に存在することは有利である。
この場合制御配列又は因子は、上述のように、好ましくは、導入された遺伝子の遺伝子発現に対しポジティブな効果を示し、その結果、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、有利には転写レベルであり、プロモーター及び／又はエンハンサーなど強力な転写シグナルを用いることで行われる。しかしながら、さらに、増強された翻訳も、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改善することで可能である。
【００５８】
新規方法のための有利な制御配列は、例えば、ｃｏｓ，ｔａｃ，ｔｒｐ，ｔｅｔ，ｔｒｐ−ｔｅｔ，ｌｐｐ，ｌａｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，ｌａｃｌｑ，Ｔ７，Ｔ５，Ｔ３，ｇａｌ，ｔｒｃ，ａｒａ，ＳＰ６，λ−ＰＲ又はλ−ＰＬなどのプロモーター中に存在し、グラム陰性細菌中で有利に使用される。さらに有利な制御配列は、例えば、酵母のグラム陽性プロモーター、ａｍｙ、ＳＰＯ２、又はカビのプロモーターのＡＤＣｌ，ＭＦａ，ＡＣ，Ｐ−６０，ＣＹＣｌ，ＧＡＰＤＨ，ＴＥＦ，ｒｐ２８，ＡＤＨ、又は植物プロモーターのＣａＭＶ／３５Ｓ［Ｆｒａｎｃｋら，Ｃｅｌｌ  ２１（１９８０）２８５−２９４］，ＰＲＰｌ［Ｗａｒｄら，Ｐｌａｎｔ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９３）］，ＳＳＵ，ＯＣＳ，Ｉｉｂ４，ｕｓｐ，ＳＴＬＳｌ，Ｂ３３，ｎｏｓ、又はユビキチン又はファゼオリンプロモーター中に存在する。この点において、ＥＰ−Ａ−０３８８１８６（ベンジルスルホンアミド−誘導性）、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２，１９９２：３９７−４０４（Ｇａｔｚら，テトラサイクリン−誘導性）、ＥＰ−Ａ−０３３５５２８（アブサイシン酸−誘導性）、又はＷＯ９３／２１３３４（エタノール−又はシクロヘキセノール−誘導性）中に記載されているプロモーターなどの誘導性プロモーターも有効である。さらに適切な植物プロモーターは、ジャガイモのサイトゾルＦＢＰａｓｅプロモーター又はＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Ｓｔｏｃｈｈａｕｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．８，１９８９，２４４５）、グリシン  マックス  ホスホリボシルピロホスフェート  アミドトランスフェラーゼプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８７９９９）又はＥＰ−Ａ−０２４９６７６に記載のノード特異的プロモーターである。さらに特に有利なものは、前述のＵＳＰプロモーターなどの種子特異的プロモーター、また、ＬｅＢ４、ＤＣ３、ファセオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーターなどの他のプロモーターである。特に有利なプロモーターは、脂肪酸の生合成に関与する組織に発現を可能にするプロモーターである。非常に、特に有利なプロモーターは、単子葉又は双子葉植物で使用することができる種子特異的プロモーター、及びＵＳ５，６０８，１５２（アブラナｎａｐｉｎプロモーター）、ＷＯ９８／４５４６１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉ  ｏｌｅｏｓｉｎプロモーター）、ＵＳ５，５０４，２００（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーター）、ＷＯ９１／１３９８０（アブラナ属Ｂｃｅ４プロモーター）、Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２，２，１９９２：２３３−２３９（マメ科植物のＬｅＢ４プロモーター）により記載されもので、これらのプロモーターは、双子葉植物に適している。単子葉植物に適するプロモーターの例として、大麦のｌｐｔ−２又はｌｐｔ−１プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０）、大麦麦粒腫プロモーター及びＷＯ９９／１６８９０に記載の他の適切なプロモーターが挙げられる。
【００５９】
原則として、新規方法に対し、全て天然プロモーターを、上述したようなその制御配列と共に使用することができる。また、合成プロモーターを付加的に又は単独で使用することも可能かつ有効であり、特に、種子特異的発現を媒介する場合は、ＷＯ９９／１６８９０に記載されるようなものである。
【００６０】
特に高いＰＵＦＡ含量を、特にトランスジェニック植物で達成するためには、ＰＵＦＡ生合成遺伝子は、種子特異的な方法で油料作物中で有利に発現することができる。このために、種子特異的プロモーターを使用し、又は胚及び／又は内乳中で作用するプロモーターを使用することができる。原則として、種子特異的プロモーターは、双子葉植物及び単子葉植物の両方から単離することができる。有利に好ましいプロモーターを以下に挙げる：ＵＳＰ（＝ｕｎｋｎｏｗｎ  ｓｅｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びｖｉｃｉｌｉｎ（ソラマメ科）［Ｂａｕｍｌｅｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．，１９９１，２２５（３）］、ｎａｐｉｎ（アブラナ）［ＵＳ５，６０８，１５２］、ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（アブラナ）［ＵＳ５，３１５，００１及びＷＯ９２／１８６３４］、ｏｌｅｏｓｉｎ（シロイヌナズナ）［ＷＯ９８／４５４６１及びＷＯ９３／２０２１６］、ｐｈａｓｅｏｌｉｎ（インゲンマメ）［ＵＳ５，５０４，２００］、Ｂｃｅ４［ＷＯ９１／１３９８０］、ｌｅｇｕｍｅｓ  Ｂ４（ＬｅｇＢ４プロモーター）［Ｂａｕｍｌｅｉｎら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２，２，１９９２］、Ｌｐｔ２及びｌｐｔｌ（大麦）［ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０］、ライス、トウモロコシ及び小麦由来種子特異的プロモーター［ＷＯ９９／１６８９０］、Ａｍｙ３２ｂ、Ａｍｙ  ６−６及びａｌｅｕｒａｉｎ［ＵＳ５，６７７，４７４］、Ｂｃｅ４（アブラナ）［ＵＳ５，５３０，１４９］、  ｇｌｙｃｉｎｉｎ（大豆）［ＥＰ５７１７４１］、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（大豆）［ＪＰ０６／６２８７０］、ＡＤＲ１２−２（大豆）［ＷＯ９８／０８９６２］、イソクエン酸リアーゼ（アブラナ）［ＵＳ５，６８９，０４０］又はα−アミラーゼ（大麦）［ＥＰ７８１８４９］。
【００６１】
また、植物遺伝子の発現は化学的に誘導可能なプロモーターによって促進される（Ｇａｔｚ  １９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：８９−１０８を参照のこと）。化学的誘導プロモーターは、遺伝子発現が時間特異的に行われるべき場合に特に適している。そのようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４）及びエタノール誘導性プロモーターなどがある。
【００６２】
繰り返し配列モチーフは、Ｔ−ＤＮＡ又は組換えの不安定性を生じさせるため、複数の世代を通してトランスジェニック植物中に生合成遺伝子の安定なインテグレーションを保証するために、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−８−デサチュラーゼ及び／又はΔ−５−エロンゲース、Δ−６−エロンゲース及び／又はΔ−９−エロンゲースをコードする各核酸、及び本方法で使用される各核酸は、個別のプロモーター、好ましくは、他のプロモーターと異なるプロモーターの支配下で発現される。この点において、発現カセットは、発現されるべき核酸の挿入に対して、適当な切断部位の後にプロモーターが配置されるように、有利には、ポリリンカー中に構築され、適当な場合には、ターミネーターがポリリンカーの後に配置される。この配列は数回、好ましくは３回、４又は５回繰り返され、その結果、５遺伝子までが１つのコンストラクト中で組み合わされ、発現されるようにトランスジェニック植物中に導入される。有利には、配列は３回繰り返される。核酸配列を発現するために、該核酸は適当な切断部位によりプロモーターの後に挿入される。有利には、各核酸はそれ自身のプロモーターを、適切ならば、それ自身のターミネーターを有している。しかし、複数の核酸配列をプロモーターの後に、適切ならば、ターミネーターの前に挿入することもできる。ここで、発現カセット中の挿入核酸の挿入部位又は配列は、決定的に重要というわけではなく、つまり、核酸配列は、その発現が実質的に影響を受けないカセット中の最初又は最後の位置に挿入することができる。有利には、例えば、ＵＳＰ、ＬｅｇＢ４又はＤＣ３プロモーターなどの異なるプロモーター、及び異なるターミネーターを発現カセット中で使用することができる。しかし、カセット中で唯一のタイプのプロモーターを使用することもできる。しかし、これは望ましくない組換えを引き起こす可能性がある。
【００６３】
上述の通り、導入された遺伝子の転写は、導入された（停止コドンの後に）生合成遺伝子の３’末端にある適当なターミネーターによって都合よく停止される。この点において、使用可能な配列の例には、ＯＳＣ１ターミネーターがある。プロモーターの場合、異なるターミネーター配列が各遺伝子に対して使用される。
上述の通り、遺伝子コンストラクトは、生物に導入される更なる遺伝子を含むこともできる。生合成過程の１又は複数の遺伝子の制御に関与するインダクター、リプレッサー、又はその酵素活性により制御に関与する酵素の遺伝子などの制御遺伝子を、宿主生物に導入し、それにより発現させることは可能であり、都合がよい。これらの遺伝子はヘテロローガス又はホモローガスな由来であってもよい。さらに、脂肪酸又は脂質代謝の更なる生合成遺伝子を、核酸コンストラクト又は遺伝子コンストラクト中に都合良く配置することもできる；しかし、これらの遺伝子は１又はさらなる遺伝子コンストラクト上に配置することもできる。都合よく使用される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシルＡＣＰ［＝ａｃｙｌ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ］デサチュラーゼ、アシルＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ、脂肪酸ヒドロキシラーゼ、アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、脂肪酸デサチュラーゼ、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロパーオキサイドリアーゼ又は脂肪酸エロンゲース又はこれらの組合せからなるグループより選択される遺伝子である。特に、本発明の核酸の組み合わせる上で都合のよい核酸配列は、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−８−デサチュラーゼ、Δ−９−デサチュラーゼ、Δ−１２−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンゲース、Δ−６−エロンゲース又はΔ−９−エロンゲースからなるグループより選択される脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子である。
【００６４】
この点において、上述の核酸および遺伝子は、本発明の発現カセット中に、他のエロンゲース及びデサチュラーゼと組み合わせてクローン化することができ、アグロバクテリアを利用して植物をトランスフォームするために使用することができる。
ここで、上述の制御配列又は因子は、好ましくは、導入された遺伝子の発現に対してポジティブな効果を有し、発現を促進する。従って、制御エレメントの促進は、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの強力な転写シグナルを使用することにより、転写レベルで都合良く引き起こされる。しかし、増強された翻訳も、例えばｍＲＮＡの安定性を改善することにより可能である。原則として、発現カセットは直接植物中に導入するために使用することができ、あるいは、ベクターに導入することができる。
【００６５】
これらの有利なベクター、好ましくは、発現ベクターは、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロ−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼをコードし、本方法で使用される核酸、又は、単独であるいは、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−８−デサチュラーゼ、Δ−９−デサチュラーゼ、Δ−１２−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンゲース、Δ−６−エロンゲース及び／又はΔ−９−エロンゲースなどの更なる脂肪酸又は脂質代謝の生合成遺伝子と組み合わせて、使用される核酸を含む核酸コンストラクトを含んでいる。この文脈で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに結合する他の核酸を運ぶことができる核酸分子のことである。ベクターの１つのタイプは、付加的なＤＮＡ断片をライゲートすることができる環状二重鎖ＤＮＡループである「プラスミド」である。さらなるベクターのタイプは、ウィルスベクターであり、付加的なＤＮＡ断片をウィルスゲノム中にライゲートすることができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、バクテリア性複製起点を持つバクテリアベクター）。他のベクターは宿主細胞中に導入されたとき、宿主ゲノム中に都合良くインテグレートされ、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的な関連を持つ遺伝子の発現をコントロールすることができる。これらのベクターは、ここでは、「発現ベクター」と称される。通常、ＤＮＡの組換え技術に適した発現ベクターは、プラスミドの形態をとる。プラスミドは、最もしばしば使用されるベクターの形態であるため、本明細書中では、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に用いられる。しかし、本発明は、類似の機能を示すウィルスベクターなど、他の形態の発現ベクターを含むことも意図される。さらに、「ベクター」という用語は、当業者に周知のベクター、例えば、ファージ、ＳＶ４０などのウィルス、ＣＭＶ、ＴＭＶ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、直鎖又は環状ＤＮＡなどを含むことが意図される。
【００６６】
本方法で使用される組換え発現ベクターは、以下の核酸又は宿主細胞で使用される核酸を発現するのに適した形態の上述の遺伝子コンストラクトを含むが、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべき核酸配列と機能的に関連する１又は複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に関連する」とは、対象のヌクレオチド配列が発現可能に制御配列と結合し、両配列が配列に割り当てられた予測される機能（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいて、又はベクターが宿主細胞に導入された場合宿主細胞中において）を実行するように互いに結合することを意味する。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現コントロールエレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。これらの制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０），又は：Ｇｒｕｂｅｒ及びＣｒｏｓｂｙ，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｅｄ．：Ｇｌｉｃｋ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，８９−１０８、これらに引用される文献中に記載されている。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現を支配するもの、及び特定の条件下、特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の直接的な発現を支配するものが含まれる。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存することを知っている。
【００６７】
使用される組換え発現ベクターは、本発明の核酸単独又は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及びエロンゲースなどの原核又は真核細胞に存在する脂肪酸合成酵素をコードするその他の核酸と組み合わせて、設計することができる。この点は、ベクター構築の中間ステップを、しばしば、微生物中で簡単に行うことができるため、都合がよい。例えば、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び／又はエロンゲース遺伝子は、バクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウィルス発現システムを使用して）、酵母、その他のカビ細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．  Ａ．ら，（１９９２）“Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ”，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら，（１９９１）“Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ”，ｉｎ：Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ＆Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ，Ｅｄ．，ｐｐ．  ３９６−４２８：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．ＪＪ．，＆Ｐｕｎｔ，ＰＪ．（１９９１）“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ，Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｅｄ．，ｐｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅを参照のこと）、藻類（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら，１９９９，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１，３：２３９−２５１）、以下の繊毛虫：Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈｉａ，Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｉａ，Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｉａ，Ｓｕｃｔｏｒｉａ，Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ，Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ，Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ，Ｇｌａｕｃｏｍａ，Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ，Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ，Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ，Ｅｕｐｌｏｔｅｓ，Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ及びＳｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ，特に、Ｓｔｙｌｏｎｙｃｈｉａ  ｌｅｍｎａｅ属中で、ＷＯ９８／０１５７２に開示される形質転換法でベクターを使用し、好ましくは、多細胞植物の細胞中で（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．及びＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．（１９８８）“Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌ���ａｎａ  ｌｅａｆ  ａｎｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ  ｅｘｐｌａｎｔｓ”  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．：５８３−５８６；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６／７，ｐｐ．７１−１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．  Ｊｅｎｅｓら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｅｄ．：Ｋｕｎｇ及びＲ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１２８−４３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２（１９９１），２０５−２２５（及びこれらに引用された文献）を参照のこと）で発現することができる。適切な宿主細胞については、さらにＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）中に記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７−プロモーター制御配列及びＴ７−ポリメラーゼを用いて、インビトロにて転写及び翻訳を行わせることができる。
【００６８】
多くの場合、原核生物でのタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質の発現を支配する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターの使用を伴う。典型的な融合発現ベクターは、特に、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、  ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であり、各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース−Ｅ結合タンパク質及びプロテインＡが組換え標的タンパク質と融合している。
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、特に、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，（１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）６０−８９）などがある。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターから宿主のＲＮＡポリメラーゼによる転写に基づいている。ベクターｐＥＴ１１ｄからの標的遺伝子の発現は、共発現されるウィルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によってメディエートされるＴ７−ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターの転写に基づいている。このウィルスポリメラーゼは宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写コントロール下にＴ７ｇｎ１遺伝子を持つ在住λプロファージから提供される。
【００６９】
原核生物に適する他のベクターは、当業者に既知であり、これらのベクターとして、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２などのｐＢＲシリーズ、ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９などのｐＵＣシリーズ、Ｍ１１３ｍｐシリーズ、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳｌ、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ、ストレプトミセスのｐＩＪ１０ｌ、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２又はｐＩＪ３６１、バチラスのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４、コリネバクテリウムのｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。
【００７０】
さらなる実施態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現ベクターの例として、ｐＹｅＤｅｓａｔｕｒａｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，（１９８７）  Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などがある。糸状菌などの他のカビ中での使用に適するベクター構築のためのベクター及び方法には、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．，＆  Ｐｕｎｔ，ＰＪ．（１
９９１）“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，ｉｎ：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇｉ，Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙら，Ｅｄ．，ｐｐ．１−２８，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，又はｉｎ：Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ［Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ  ＆  Ｌ．Ｌ．  Ｌａｓｕｒｅ，Ｅｄ．，  ｐｐ．３９６−４２８：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］に詳細に記載されるものが含まれる。さらに、適切な酵母のベクターは、例えば、ｐＡＧ−１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３又はｐＥＭＢＬＹｅ２３である。
【００７１】
あるいは、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び／又はエロンゲースは、バキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内で発現できる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）でタンパク質の発現に利用できるバキュロウィルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）が含まれる。前記ベクターは、利用可能な適当なベクターのほんの一部の概要である。さらなるプラスミドが当業者によって知られており、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｐｏｕｗｅｌｓ，  Ｐ．Ｈ．ら，編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）中に開示されている。原核生物及び真核生物に関するさらなる適切な発現ベクターについては、ｔｈｅ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６  ａｎｄ  １７  ｉｎ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章及び１７章を参照のこと。
【００７２】
本発明のさらなる実施態様において、アシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び／又はエロンゲースは、単細胞植物細胞（藻類など）−Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら，１９９９，Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２３９−２５１及びそこに挙げられた参考文献を参照のこと−、及び高等植物由来の植物細胞中で発現することができる（例えば、耕地作物などの種子植物）。植物発現ベクターの例として、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｅ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．及びＭａｓｔｅｒｓｏｎ，  Ｒ．  （１９９２）“Ｎｅｗ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ”，Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７；及びＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．（１９８４）“Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１；  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ；ｉｎ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｖｏｌ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，：Ｋｕｎｇ及びＲ．Ｗｕ編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，ｐｐ．１５−３８に詳細に記載されるものが含まれる。
【００７３】
植物発現カセットは、好ましくは、植物細胞中で遺伝子発現を支配可能で、各配列がその機能を果たすように作用可能に結合された制御配列、例えば、転写ターミネーション、ポリアデニル化シグナルなどを含む。好ましいポリアデニル化シグナルは、オクトピンシンターゼとして知られるＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のｇｅｎｅ３など、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ−ＤＮＡに由来するものであるが、植物で機能的に活性な他のターミネーターも適している。植物遺伝子発現は、転写レベルにそれほど限定されないので、植物発現カセットには、好ましくは、作用可能に結合する、例えば、タバコモザイクウィルス５’−非翻訳リーダー配列を含む、タンパク質／ＲＮＡ比を増大させるオーバードライブ配列などの翻訳エンハンサーなどの他の配列を含む（Ｇａｌｌｉｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８６９３−８７１１）。
【００７４】
上述のように、植物遺伝子発現は、正確なタイミングで、細胞又は組織に特異的な方法で遺伝子発現を誘起する適切なプロモーターと作用可能に結合する必要がある。利用可能なプロモーターは、３５Ｓ  ＣＡＭＶ（Ｆｒａｎｃｋら，Ｃｅｌｌ  ２１（１９８０）２８５−２９４）、１９Ｓ  ＣａＭＶ（ＵＳ５３５２６０５及びＷＯ８４／０２９１３も参照のこと）などの植物ウィルスに由来するものなどの構成的プロモーター（Ｂｅｎｆｅｙら，ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９）２１９８−２２０２）、又はＵＳ４，９６２，０２８に開示されるｓｍａｌｌ  ｒｕｂｉｓｃｏ  ｓｕｂｕｎｉｔのプロモーターなどの植物プロモーターである。
【００７５】
植物遺伝子発現カセット中に作用可能に結合させる上で使用可能なその他の好ましい配列としては、遺伝子産物を対応する細胞内コンパートメント（Ｋｅｒｍｏｄｅ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５，４（１９９６）２８５−４２３中の総説及びこれに引用される参考文献を参照のこと）、例えば、液胞、核、アミロプラスト、葉緑体、有色体、細胞外空間、ミトコンドリア、小胞体、エライオプラスト、ペルオキシソーム及び他の植物細胞コンパートメントなどの、全ての植物細胞小器官に移動させるのに必要な標的配列である。
【００７６】
上述の通り、植物遺伝子発現は、化学的誘導性プロモーターによっても促進することができる（Ｇａｔｚ  １９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：８９−１０８中の総説を参照のこと）。化学的誘導性プロモーターは、遺伝子発現が時間特異的な方法で生じることが望ましい場合に特に適している。そのようなプロモーターの例として、サリチル酸誘導プロモーター（ＷＯ９５／１９４３３）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２，３９７−４０４）及びエタノール誘導プロモーターなどがある。
【００７７】
生物的又は非生物的なストレス条件に応答するプロモーター、例えば、病原体誘導ＰＲＰ１遺伝子プロモーター（Ｗａｒｄら，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（１９９３）３６１−３６６）、熱誘導性トマトｈｓｐ８０プロモーター（ＵＳ５，１８７，２６７）、低温誘導性ポテトαアミラーゼプロモーター（ＷＯ９６／１２８１４）又は創傷誘導性ｐｉｎＩＩプロモーター（ＥＰ−Ａ−０３７５０９１）なども適している。
特に好ましくは、脂肪酸、脂質及びオイルの生合成が行われる組織及び器官、内乳及び発生中の胚の細胞など、種子細胞中で遺伝子発現を引き起こすようなプロモーターである。適切なプロモーターは、アブラナｎａｐｉｎプロモーター（ＵＳ５，６０８，１５２）、ソラマメ科ＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．，１９９１，２２５（３）：４５９−６７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉ  ｏｌｅｏｓｉｎプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｐｈａｓｅｏｌｉｎプロモーター（ＵＳ５，５０４，２００）、アブラナ属Ｂｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）又はレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら，１９９２  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２（２）：２３３−９）、及びトウモロコシ、大麦、小麦、ライ麦、ライスなどの単子葉植物中で種子特異的に発現を誘導するプロモーターである。適切な注目すべきプロモーターは、大麦のｌｐｔ２又はｌｐｔ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５−２３２３０）又は大麦麦粒腫遺伝子、ライスグルテリン遺伝子、ライスオリジン（ｏｒｙｚｉｎ）遺伝子、ライスプロラミン遺伝子、小麦グリアディン遺伝子、小麦グルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン（ｚｅｉｎｅ）遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン（ｋａｓｉｒｉｎ）遺伝子又はライ麦セカリン（ｓｅｃａｌｉｎ）遺伝子由来のプロモーター（以上、ＷＯ９９／１６８９０に開示されている）などである。
【００７８】
特に、本方法で使用されるアシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ単独、又は、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アセチルトランスフェラーゼ、デサチュラーゼ及び／又はエロンゲースとの組合せで複数並行した発現を引き起こすことが望ましい。そのような発現カセットは、複数の個々の発現コンストラクトの同時形質転換を通して導入することができ、好ましくは、１つのコンストラクト上に複数の発現カセットを組み合わせることにより導入できる。また、複数のベクターは各ケース毎に複数の発現カセットで形質転換することができ、その後、宿主細胞に導入することができる。
【００７９】
さらに特に適切なプロモーターは、色素体が脂質生合成の前駆体及びいくつかの最終産物が合成されるコンパートメントを構成するため、色素体特異的な発現を引き起こすものである。ウィルスＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの適切なプロモーターについて、ＷＯ９５／１６７８３及びＷＯ９７／０６２５０に開示されており、アラビドプシス由来のｃｌｐＰプロモーターがＷＯ９９／４６３９４に開示されている。
【００８０】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換及び形質導入技術によって、原核又は真核細胞中に導入することができる。「形質転換」及び「形質移入」、コンジュゲーション及びトランスダクションという用語には、ここで使用される場合、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するために、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクチン、ナチュラルコンピテンス、化学的導入、エレクトロポレーション又は微粒子銃などを含む、先行技術において知られる複数の方法が含まれる。植物細胞を含む宿主細胞の形質転換又は形質移入に関する適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）他の研究室用教科書、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．４４，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｅｄ．：Ｇａｒｔｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｄａｖｅｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．中に記載されている。
【００８１】
本発明の核酸、本発明の遺伝子産物、又は本発明のベクターを取り込むために、基本的に適する宿主細胞は、全ての原核又は真核細胞である。好適に使用される宿主生物は、カビ、酵母、植物細胞で、好ましくは、植物又はその一部である。カビ、酵母又は植物は好ましく使用され、特に好ましくは植物であり、極めて好ましくは、オイル生産植物などの植物であって、脂質化合物の豊富であり、例えば、アブラナ、月見草、大麻、あざみ、ピーナッツ、キャノーラ、アマニ、大豆、紅花、ヒマワリ、ルリヂサなど、例えば、トウモロコシ、小麦、ライ麦、エン麦、ライコヌギ、ライス、大麦、綿、キャッサバ、コショウ、マンジュギクなどの植物、じゃがいも、タバコ、ナスやトマトなどのナス科植物、エンドウマメ、アルファルファ、ブッシュの植物（コーヒー、カカオ、茶）などのソラマメ属、木（パーム油、ココナツ）などのヤナギ属、及び多年生牧草や家畜用農作物などのである。本発明の特に好ましい植物は、大豆、ピーナッツ、アブラナ、キャノーラ、アマニ、大麻、月見草、ヒマワリ、紅花、木（パーム油、ココナッツ）などの油料作物である。本発明の上述の核酸は、動物、繊毛虫、カビ、藻類又は渦鞭毛虫などの植物に由来し、ＰＵＦＡｓを合成することができる。
【００８２】
有意な実施態様において、ここで使用される「核酸（分子）」という用語は、付加的に、遺伝子コード配列の３’及び５’末端に非翻訳配列を含んでいる：コード領域の５’末端の上流配列の、少なくとも、５００、好ましくは２００、特に好ましくは１００ヌクレオチド、遺伝子コード領域の３’末端の下流配列の、少なくとも１００、好ましくは５０、特に好ましくは２０ヌクレオチドである。「単離された」核酸分子は該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離される。「単離された」核酸は、好ましくは、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中において、元々隣接している配列（例えば、該核酸の５’及び３’に位置する配列）を保持していない。種々の実施態様において、単離されたアシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ及び／又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で元来隣接している核酸の、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ以下を含んでいる。
【００８３】
上述の核酸、及び脂質、脂肪酸、ＰＵＦＡコファクター及び酵素の生合成、又は膜を横切る親油性物質の輸送に関与するアシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質分子は、トランスジェニック生物、有利には、トウモロコシ、小麦、ライ麦、カラスムギ、ライ小麦、ライス、大麦、大豆、綿などの植物、アマニ又はアマなどのアマ属、アブラナ、キャノーラ及びターニップ、コショウ、ヒマワリ、ルリヂサ、月見草及びマンジュギクなどのアブラナ属、じゃがいも、タバコ、ナスやトマトなどのナス科植物、エンドウマメ、アルファルファ、ブッシュの植物（コーヒー、カカオ、茶）などのソラマメ属、木（パーム油、ココナツ）などのヤナギ属、及び多年生牧草や家畜用農作物中で、直接（例えば、脂肪酸合成タンパク質の過剰発現又は至適化が、修飾した生物に由来する脂肪酸の収率、生産及び又は生産効率に直接影響する場合）、及び／又は、ＰＵＦＡｓの増大した収率、生産及び／又は生産効率、又は望ましくない物質の低減を引き起こすものではあるが、間接的な効果（例えば、脂質及び脂肪酸、コファクター及び酵素の代謝における修飾が、細胞内の望ましい物質の収率、生産及び／又は生産効率の修飾を引き起こし、１又は複数の脂肪酸の生産に影響を与える場合）をもたらすことができる。
【００８４】
多価不飽和脂肪酸（＝ＰＵＦＡｓ）はトリアシルグリセロールだけではなく、膜脂質中にも取り込まれるため、種々の前駆体分子及び合成酵素の組合せは、種々の脂肪酸分子の生産を引き起こし、種々の脂肪酸分子脂質の組成に重要な影響を及ぼす。
脂質合成は、２つのセクションに分けることができる：脂肪酸の合成及びそれらのｓｎ−グリセロール−３−ホスフェートへの結合、及び水溶性頭部グループの付加又は修飾。膜で使用される通常の脂質には、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質及びホスホグリセリドが含まれる。脂肪酸合成は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼによるアセチルＣｏＡのマロニルＣｏＡへの変換、又はアセチルトランスアセチラーゼによるアセチルＡＣＰへの変換により開始される。重合反応の後、これらの２つの産物からアセトアセチルＡＣＰが生産されるが、これは、一連の重合、還元及び脱水反応によって変換され、その結果、所望の鎖長を持つ飽和脂肪酸分子が得られる。これらの分子からの不飽和多価脂肪酸の生産は、特定のデサチュラーゼにより、酸素分子を用いた好気的な方法、又は嫌気的に触媒される（微生物での脂肪酸合成については、Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（１９９６）Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ，ｐｐ．６１２−６３６及びそこに引用される参考文献；Ｌｅｎｇｅｌｅｒら，（Ｅｄ．）（１９９９）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ．Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，及びそこに引用される参考文献，及びＭａｇｎｕｓｏｎ，  Ｋ．ら，（１９９３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：５２２−５４２及びそこに引用される参考文献を参照のこと）。さらに伸長過程を行うためには、生産されたリン脂質結合脂肪酸が、リン脂質から脂肪酸ＣｏＡエステルのプールへ戻される必要がある。この過程はアシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼにより可能である。さらに、これらの酵素はＣｏＡエステルからリン脂質へ伸長した脂肪酸を戻すことも可能である。適当な場合には、この一連の反応を繰り返し行うこともできる。
【００８５】
ＰＵＦＡｓの生合成のための前駆体の例として、オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸が挙げられる。これらのＣ１８− 炭素脂肪酸はエイコサ及びドコサ鎖型の脂肪酸を得るためにＣ２０及びＣ２２へと伸長される必要がある。当該過程で使用されるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼによって、有利には、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、Δ−４−、Δ−５−、Δ−６−及びΔ−８−デサチュラーゼなどのデサチュラーゼ及び／又は、Δ−５−、Δ−６−、Δ−９−エロンゲースと組み合わせて、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸及び種々の他の長鎖ＰＵＦＡｓを得、抽出することができ、食品、飼料、化粧品又は医薬品などの種々の用途に用いることができる。好ましくは、脂肪酸分子中に少なくも２つ、有利には、少なくとも３、４、５、又は６つの二重鎖結合を持つ、好ましくは、Ｃ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−、及び／又はＣ２４−脂肪酸が上述の酵素を用いて調製され、脂肪酸中に、有利には、少なくとも３、４、５、又は６つの二重鎖結合を持つ、好ましくは、Ｃ１８−、Ｃ２０−、Ｃ２２−、及び／又はＣ２４−脂肪酸が得られる。脱飽和は、目的の脂肪酸の伸長前又は後に生じる。このようなわけで、デサチュラーゼ活性の産物、及びＣ２０−〜Ｃ２２−脂肪酸からγ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸などの脂肪酸へのさらなる伸長を含む、さらに可能な脱飽和及び伸長過程によって、好ましい高いレベルの不飽和度を有するＰＵＦＡｓが生じる。本発明の方法におけるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの基質は、例えば、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸又はステアリドン酸などのＣ１８−、Ｃ２０−又はＣ２２−脂肪酸である。好ましい基質は、リノール酸、γ−リノレン酸及び／又はα−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸又はエイコサペンタエン酸である。脂肪酸分子中に少なくとも２つの二重鎖結合を持つＣ１８−、Ｃ２０−又はＣ２２−脂肪酸は、遊離脂肪酸型又はグリセリドなどのそれらのエステル型で、本発明の方法により取得される。
【００８６】
「グリセリド」という用語は、１、２又は３のカルボキシルラジカル（モノ−、ジ−又はトリグリセリド）でエステル化されたグリセロールのことを意味する。また、「グリセリド」は種々のグリセリドの混合物を意味するものとしても理解される。グリセリド又はグリセリド混合物には、さらなる付加物、例えば、遊離脂肪酸、抗酸化物、タンパク質、炭水化物、ビタミン及び／又は他の基質を含んでもよい。
【００８７】
本発明の方法に目的に対し、「グリセリド」は、さらに、グリセロール誘導体を意味するものとしても理解される。上述の脂肪酸グリセリドに加えて、グリセロリン脂質  及びグリセロ糖脂質も含まれる。ここで言及される好ましい例には、レシチン（ホスファチジルコリン）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン及びアルキルアシルグリセロリン脂質などのグリセロリン脂質がある。
さらに、脂肪酸は、引き続き、種々の修飾サイトへ移行し、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に取り込まれる。脂質合成におけるさらに重要なステップは、例えば、グリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによって、水溶性頭部グループへ脂肪酸を転移させるステップである（Ｆｒｅｎｔｚｅｎ，１９９８，Ｌｉｐｉｄ，１００（４−５）：１６１−１６６）。
【００８８】
植物脂肪酸生合成及び脱飽和、脂質代謝及び脂質性化合物の膜輸送、β−酸化、脂肪酸修飾及びコファクター、トリアシルグリセロール貯蔵及びトリアシルグリセロール会合に関する出版物に関しては、以下の論文及びこれらに含まれる参考文献を参照のこと：Ｋｉｎｎｅｙ，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｄ．：ＪＫ  Ｓｅｔｌｏｗ，１９：１４９−１６６；Ｏｈｌｒｏｇｇｅ及びＢｒｏｗｓｅ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：９５７−９７０；Ｓｈａｎｋｌｉｎ及びＣａｈｏｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４９：６１１−６４１；Ｖｏｅｌｋｅｒ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｅｄ．：ＪＫ  Ｓｅｔｌｏｗ，１８：１１１−１３；Ｇｅｒｈａｒｄｔ，１９９２，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒ．３１：３９７−４１７；Ｇ?ｈｎｅｍａｎｎ−Ｓｃａｆｅｒ及びＫｉｎｄｌ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２５６：１８１−１８６；Ｋｕｎａｕら，１９９５，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３４：２６７−３４２；Ｓｔｙｍｎｅら，１９９３，ｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｅｄ．：Ｍｕｒａｔａ及びＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，１５０−１５８，Ｍｕｒｐｈｙ及びＲｏｓｓ  １９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ．１３（１）：１−１６。
【００８９】
本方法で生産されるＰＵＦＡｓには、高等動物が全く合成することができないため、摂取しなくてはならない、あるいは、高等動物が十分な量で合成できず付加量を摂取しなくてはならないが、それらはバクテリアなどの他の生物によって容易に合成される分子集団が含まれる；例えば、ネコはアラキドン酸を全く合成することができない。
「アシル−ＣｏＡシンテターゼ、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ」という用語には、本発明の目的に関し、脂肪酸及びそれらのホモログ、誘導体及び類似体の生合成に関与するタンパク質が含まれる。本発明の目的に対するリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び／又はホスファチジルイノシトール、有利には、ホスファチジルコリンを意味するものとして理解される。リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ核酸配列という用語には、リゾホスファチジル酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール−３−ホスフェートアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ又はレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼのコード配列、及びコード化領域部分及び５’及び３’非翻訳配列領域が含まれる。「生産」又は「生産性」という用語は、当該技術分野では周知であり、特定の期間、特定の発酵量で（例えば、生産物ｋｇ／時間／リットル）生成される発酵産物（式Ｉの産物）の濃度も包含される。生産効率という用語には、特定の生産量を得るために必要な時間（例えば、精製化学物質のあるスループットを確立するために細胞により必要とされる時間）が含まれる。収率又は産物／炭素収率という用語は、当該技術分野で周知であり、炭素源を産物（すなわち、精製化学物質）へ変換する効率が含まれる。通常、例えば、生産物ｋｇ／炭素ｋｇのように表現される。化合物の収率又は生産を増加させることにより、該化合物の得られる量、又は特定の期間、特定の培養量で得られる化合物の適当な分子の量は増加する。生合成又は生合成過程という用語は、当該技術分野では周知であり、化合物、好ましくは細胞による中間体からの有機化合物の合成、例えば、複数の工程及び強力に制御されたプロセスにおける合成を含む。異化又は異化経路という用語は、当該技術分野では周知であり、例えば、複数のステップ及び強力に制御されたプロセスにおいて、細胞により異化生成物（より一般的な用語では、より小さく、より複雑ではない分子）を生成するための、化合物、好ましくは有機化合物の切断を含む。代謝という用語は、当該技術分野では周知であり、生物で行われる生化学反応の全てを含む。従って、ある化合物の代謝（例えば、脂肪酸の代謝）には、該化合物に関係する細胞中の生合成経路、修飾経路及び異化経路の全てを含む。
【００９０】
当該特許出願に引用される全ての引用文献、特許出願、特許及び公開特許出願は、出典としてここに含まれる。
当該明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、「含む」及び「包含する」及び「含んでいる」及び「含む」などの言葉のバリエーションは、「特に限定はしない」ことを意味し、他の部分、付加物、構成要素、整数（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）又はステップを排除することを意図するものではない。
当該明細書の詳細な説明及び請求の範囲を通じて、単数は文脈が他を要求しない限り、複数も包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、文脈が他を要求しない限り、単数と同様に複数を考慮しているものと理解される。本発明の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記述される特長、整数（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）、特性、化合物、化学成分又は化学基は、不整合がない限り、ここに記述される任意の他の態様、実施態様又は実施例に適用されるものと理解される。
【実施例】
【００９１】
材料及び方法
一連の長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼをコードする推定的なゲノムＤＮＡ配列の同定
珪藻類のＴ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａのドラフトゲノムは、全ゲノムショットガン法により約９回のカバー度となるまで配列決定された。生の配列データを米国エネルギー省ジョイントゲノム研究所（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｔｔｐ：／／．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）からローカルサーバー上にダウンロードした。Ｂａｔｃｈ  ｔｂｌａｓｔｎサーチは、３つ哺乳類タンパク質を含む以下の既知の１２長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼタンパク質配列をクエリーとして使用して行った：マウスＭｍＬＡＣＳ４（ＢＣ０１６４１６）、ラットＲｎＬＡＣＳ４（Ｄ８５１８９）、ヒトＨｓＬＡＣＳ４（ＢＣ０３４９５９）、及び９種のアラビドプシス配列ＡｔＬＡＣＳｌ（ＡＦ５０３７５１）、ＡｔＬＡＣＳ２（ＡＦ５０３７５２）、ＡｔＬＡＣＳ３（ＡＦ５０３７５３）、ＡｔＬＡＣＳ４（ＡＦ５０３７５４）、ＡｔＬＡＣＳ５（ＡＦ５０３７５５）、ＡｔＬＡＣＳ６（ＡＦ５０３７５６）、ＡｔＬＡＣＳ７（ＡＦ５０３７５７）、ＡｔＬＡＣＳ８（ＡＦ５０３７５８）及びＡｔＬＡＣＳ９（ＡＦ５０３７５９）。Ｅ値が０．００１未満の全ての非縮重配列を抽出し、ＣＡＰ３配列アセンブリープログラム［１２］を用いてコンティグ中にアセンブルした。コンティグはｔｂｌａｓｔｎの結果によって示される方向で、３つの読枠でアミノ酸配列に翻訳された。８つの推定上の長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子モデルが、配列相同性に基づいて手動により構築され、インフレームのＧＴ−ＡＧイントロン境界が同定された。
【００９２】
Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの培養、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ解析
Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａは既述の通り培養を行った［１３]。細胞の密度は、ヘモサイトメーターで細胞をカウントすることによりモニターした。硝酸塩の濃度は、２２０ｎｍにおける培地の吸光度の変化を測定することにより、培養期間中定期的に決定した［１４］。
トータルＲＮＡはＲＮａｓｅ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増殖の異なるステージで回収した細胞から抽出した。第１のｃＤＮＡ鎖は３μｇのＤＮａｓｅ処理したＲＮＡから、Ｐｒｏｓｔａｒ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて合成した。予想されるＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子ＴｐｌａｃｓＡに特異的なプライマー対により、無希釈及び５倍希釈のｃＤＮＡｓを用いて、以下のようにＰＣＲを行った：反応は、９５℃、５分間熱処理をした後、、９５℃３０秒、使用されるプライマーにより５５℃３０秒（ＴｐｌａｃｓＡ，１８ＳｒＲＮＡ）、７２℃２分を３５サイクル、次いで、７２℃１０分を１工程。１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は、異なるＲＮＡサンプルについて同量のｃＤＮＡが使用されることを保証するために用いられた。ＰＣＲ反応のアリコットを１％アガロースゲルで電気泳動した。
【００９３】
酵母のＴｐｌａｃｓＡのヘテローガスな発現
Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ  ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩＲｎａｓｅＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成し、プライマー、ＴｐＬＡＣＳＡＮＨ  ５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＧＣｒＡＣＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＴ−３’(オープンリーディングフレームの開始コドンを太字で示す；下線の配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトである；斜字体の配列は付加されたアラニンのコドンであり、元々のＴｐｌａｃｓＡには存在しない）、及び、ＴｐＬＡＣＳＡＣＥ  ５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡ−３’（ＯＲＦの終止コドンを太字で示す；下線の配列はＥｃｏＲＩサイトである）を用いてＴｐｌａｃｓＡコード領域の全体を増幅するために用いた。Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）は潜在的なＰＣＲエラーを最小限にするために用いた。増幅産物は、まず、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローン化され、クローン化されたＰＣＲ産物の正確性は配列決定によりチェックした。その後、プラスミドｐＹＬＡＣＳＡを作製するために、組換えベクターはＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、ｐＹＥＳ２のガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーターの後の対応部位にクローニングした。その後、ベクターコントロールのｐＹＥＳ２とｐＹＬＡＣＳＡは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに酢酸リチウム法によって形質転換し、形質転換体をウラシルを欠く最少培地上で選択した。宿主酵母株はＥｕｒｏｓｃａｒｆ  ｙｅａｓｔ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｔｒａｉｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｕｔ）から取得した：野生型ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ；ｈｉｓ３Δｌ；ｌｅｕ２Δ０，ｍｅｔｌ５Δ０；ｕｒａ３Δ０）及び欠失株Ｙ０６４７７（ＹＯＲ３１７ｗ：：ｋａｎＭＸ４，ＦＡＡｌ変異体），Ｙ０１４０１（ＹＩＬ００９ｗ：：ｋａｎＭＸ４，ＦＡＡ３変異体），及びＹ００８３３（ＹＭＲ２４６ｗ：：ｋａｎＭＸ４，ＦＡＡ４変異体）。これら３つの変異株はＢＹ４７４１とコンジェニックである。
【００９４】
摂取（ｆｅｅｄｉｎｇ）及び共摂取（ｃｏ−ｆｅｅｄｉｎｇ）実験に関し、培養は２５又は３０℃で、２％（ｗ／ｖ）ラフィノース及び１％（ｗ／ｖ）タージトールＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ）の存在下にて行った。導入遺伝子の発現は、ガラクトースを２％（ｗ／ｖ）となるように添加し、ＯＤ６０００．２−０．３で誘導した。この時点で、適当な脂肪酸を最終濃度５０μＭとなるように添加した。アシルＣｏＡ分析については、３ｍｌの細胞サンプルを５分後に回収し、２５℃で１時間及び２４時間インキュベートした。総量とトリアシルグリセロール脂肪酸の分析については、細胞（サンプルで１．５ｍｌ）を３０℃で４日間インキュベートした後、回収した。
【００９５】
酵母での酵素の過剰生産、及びアシル−ＣｏＡシンテターゼアッセイ
細胞は２％ラフィノースと２％ガラクトースを含むウラシルを欠く最少培地中で一晩培養した。増殖後、細胞は遠心により回収し、1００ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ７．５，０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，１０  ％  グリセロール，０．０１％  トリトン  Ｘ−１００及びプロテアーゼインヒビターミックス（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。次に、この懸濁溶液を、５００μｌの酸洗浄したカラスビーズ（４２５−６００ミクロン、Ｓｉｇｍａ）入りの２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１分間、５回のビードミル処理で細胞を溶解した。サンプルは、遠心により透明化し、上清をアシル−ＣｏＡの評価のために使用した。これらの酵素抽出液のタンパク質濃度は、スタンダートにウシ血清アルブミンを使用し、ブラッドフォードアッセイにより測定した[１５]。
アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＰＡＣＳ，Ｓｉｇｍａ）を用いた遊離脂肪酸、ＡＴＰ及び遊離ＣｏＡからのアシル−ＣｏＡの合成に基づく方法に適合したプロトコールに従い、酵母の無細胞溶解物中で測定した。総遊離脂肪酸の２０ｎｍｏｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で乾燥させた。１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＡＴＰ，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１％  トリトン  Ｘ−１００，及び５ｍＭ  ＣｏＡが含まれるアッセイ混合物をチューブに添加し、５分間ソニケートした。反応はチューブに２μｌのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．酵素（Ｓｉｇｍａ）又は同体積の酵母タンパク質抽出液を添加することで開始し、インキュベーションは２５℃で２５分間行った。チューブはアッセイ開始後５分及び１０分でソニケートした。反応は１００μｌの９：２メタノール：クロロホルム（ｖ／ｖ）、２μｌの飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０μｌの内部標準（１７：０−ＣｏＡ、０．１２ｍＭのストック溶液）を添加して停止し、ボルテックスを行った。タンパク質を沈殿させるため、５分間、１８，０００ｇでのスピンダウンを行った後、５μｌの上清をテイパードバイアルに移し、乾燥し、１ｍｌのクロロアセトアルデヒド識別（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｉｎｇ）バッファーを添加した。その後、サンプルを８５℃で２０分間熱処理し、２０μｌを後述の通りアシル−ＣｏＡの測定に用いた。
【００９６】
脂肪酸及びアシル−ＣｏＡ分析
酵母及び藻類細胞は遠心により回収した。脂肪酸とアシル−ＣｏＡの抽出及び測定は、すでに報告されるように［１７，１８］、サンプルペレットについて行った。
トリアシルグリセロール分析については、酵母細胞を、予め重量を測定したチューブ中での遠心により回収し、蒸留水で洗浄し、乾燥重量を測定するためにスピードバック（ｓｐｅｅｙ−ｖａｃｕｕｍ）ブロッターで一晩遠心した。翌日、沈殿は１０μｌの水で再度水和化し、１０μｌのトリペンタデカノイン（５ｍｇ／ｍｌ）及び７００μｌの２：１クロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ）を添加した。細胞を３００μｌの酸洗浄ガラスビーズ（４２５−６００ミクロン、Ｓｉｇｍａ）入りの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、３分間、２回のビードミル処理により溶解した。総脂肪酸及びトリアシルグリセロール脂肪酸の抽出及び測定はすでに報告されているように行った［１１］。
【００９７】
実施例１
Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの脂肪酸及びアシル−ＣｏＡ組成物
Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ細胞の脂肪酸のプロファイルは、藻類細胞においてパルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１ｎ７）及びＥＰＡが最も豊富なＦＡであることを示した（表１）。有意な量のω３ステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４ｎ３）及びＤＨＡに対し、極少量の割合のω６Ｃ２０ＰＵＦＡｓが検出されが、このことから、珪藻植物細胞においてω３経路が最も活性化されていることが示される。アシル−ＣｏＡのプロファイルからは、パルミチン酸、パルミトレイン酸及びＥＰＡ  ＣｏＡが最も多く、後者はアシル−ＣｏＡプールのほぼ３０％に相当する。このハイレベルのＥＰＡ  ＣｏＡは、潜在的に２２：５ｎ３への伸長及び２２：６ｎ３への不飽和化を介してＤＨＡを合成する際の中間体として作用し得る。
【００９８】
実施例２
Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの推定されるＬＡＣＳ遺伝子の同定
ＴｐｌａｃｓＡは現在の配列データ中では全長として見出され、２つのイントロンを含むことが予想される。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ細胞のＴｐｌａｃｓＡの転写をモニターするために、ＲＴ−ＰＣＲにより一過的な発現分析を行った。図１は、ＴｐｌａｃｓＡが細胞の培養の間中発現していたことを示す。藻類ｃＤＮＡ由来のＴｐｌａｃｓＡＯＲＦの増幅及び配列決定により、２０２５ｂｐ長で、６７４アミノ酸をコードすることが示される。このＯＲＦと対応するゲノムＤＮＡとのアライメントから、各９６ｂｐと８８ｂｐの２つのイントロンが配列の後半に存在することが確認された。ＴｐＬＡＣＳＡアミノ酸配列と機能解析されているＬＡＣＳとの比較により、藻類の酵素は植物と動物の両方のＬＡＣＳと３５−４０％の同一性を示し、予想されるＡＭＰ結合ドメインを含む領域において高い相同性を有することが明らかになった。我々の更なる研究は、ＴｐｌａｃｓＡの機能解析に照準が絞られた。
【００９９】
実施例３
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅの脂肪酸活性欠損変異体の評価
ＴｐｌａｃｓＡの機能解析にとって至適なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ株を同定するために、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ由来の幾つかの遊離脂肪酸活性化欠損変異体（ＦＡＡ）をテストした。ＦＡＡ１及びＦＡＡ４遺伝子でコードされるタンパク質は、取り込まれるＣ１２〜Ｃ１８ＦＡｓの活性化に関与する最初の酵素であることが示されていたが、一方、ＦＡＡ３はＣ１８より長い脂肪酸に対し最も活性を示すことが見出されたいた［８］。野生型株ＢＹ４７４１及び欠損株Ｙ０６４７７，Ｙ０１４０１及びＹ００８３３は空のベクターコントロールであるｐＹＥ２で形質転換し、３つのω６（１８：２ｎ６，１８：３ｎ６，２０：３ｎ６）又は３つのω３（１８：４ｎ３，２０：５ｎ３，２２：６ｎ３）ＰＵＦＡｓの存在下で同時にインキュベートした。表２はこれらの異なる株における、２５℃１時間のインキュベーション後のアシル−ＣｏＡ組成を示す。驚くべきことに、Ｃ２０ＰＵＦ−ＣｏＡもＣ２２ＰＵＦ−ＣｏＡも野生型又はＦＡＡ変異体では検出されず、このことから、これらの細胞は対応するアシル−ＣｏＡをこの短いインキュベーションの間に生産することができなかったことが示唆される。しかしながら、ＦＡのプロファイルは基質として使用された脂肪酸が洗浄された酵母細胞中に存在すること示したため、それら基質として使用された脂肪酸は４つの株によって取り込まれていた（データは示さず）。番号１４：０，１６：０及び１８：０ＣｏＡはＹ０６４７７細胞中に検出されず、このことからＦＡＡ１遺伝子産物が対応する飽和脂肪酸の活性化に関与することが示唆される。同様の割合の１８：３ｎ６及び１８：４ｎ３ＣｏＡが野生型細胞中で測定されたが、それらの量は１８：２ｎ６の測定値よりも低かった。異なる全ての系列において、より高い１８：２ｎ６ＣｏＡの割合は、このＦＡが酵母細胞へ効率よく取り込まれ及び／又は活性化されることを示唆した。野生型細胞との比較から、Ｙ００８３３は外から摂取した不飽和１８炭素ＣｏＡｓから合成されるアシルＣｏＡｓの最も低い含量を示した。このことは、ＦＡＡ４遺伝子産物が酵母細胞の不飽和脂肪酸の活性化において重要な役割を演じていることが示唆される。Ｙ００８３３は、ＰＵＦＡｓについて非常に低いバックグラウンドのアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性を有し、２０：５ｎ３及び２２：６ｎ３についてはゼロの活性であることに基づき、ＰＵＦＡシンテターゼ活性をコードする遺伝子の同定を目的とするヘテロローガスな発現研究に対し、有用な系統として選択した。
【０１００】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅのＦＡＡ欠損株であるＹ００８３３中でのＴｐｌａｃｓＡのヘテロローガスな発現
ＴｐＬＡＣＳＡの機能を確証する目的で、プラスミドｐＹＬＡＣＳＡを調製するために全長ＴｐｌａｃｓＡｃＤＮＡをｐＹＥＳ２のガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーターの後にクローン化した。ω６  １８：３ｎ６と２０：４ｎ６、及びω３  １８：４ｎ３と２０：５ｎ３  ＦＡｓの存在下で別々に行われたインキュベーション実験の結果を、各々表３及び４に示す。インキュベーションの５分後、Ｃ１８ＰＵＦＡ−ＣｏＡは空のベクターコントロールｐＹＥＳ２及びｐＹＬＡＣＳＡ  Ｙ００８３３形質転換体の両方において見出され、後者において高い割合であった。ＴｐｌａｃｓＡ遺伝子を含むＹ００８３３とは異なり、番号Ｃ２０ＰＵＦＡ−ＣｏＡｓは、空のベクターコントロールであるＹ００８３３中で検出された。ＡＲＡ−ＣｏＡは、ｐＹＬＡＣＳＡ形質転換体で測定される最も豊富なＰＵＦＡ−ＣｏＡｓであり、インキュベーション５分後の濃度がピークであり、その後、続く２４時間の間にこの初期濃度のおよそ半分にまで低下する。４つの外から摂取された脂肪酸は、細胞内に蓄積され、対応するアシル−ＣｏＡｓによって示される一過的な変動へは進まなかった（データは示さず）。Ｃ２０ＰＵＦＡ−ＣｏＡｓは、空のベクターコントロールでは摂取６０分後に検出されなかったが、２４時間後には検出された。Ｃ１８ω３及びω６ＦＡｓは、ｐＹＬＡＣＳＡ形質転換体中のＡＲＡ−ＣｏＡと同様に、インキュベーションの最初の１時間で増加し、その後２４時間後まで現象する蓄積パターンを示した。これに対して、ＥＰＡ−ＣｏＡは、実験の間中ずっと増加した。また、ＴｐＬＡＣＳＡは、内在性の飽和１４：０、１６：０及び１８：０−ＣｏＡｓの２倍の増加を誘導したのに対し、１６：１及び１８：１−ＣｏＡｓは減少し、２２．１−ＣｏＡは僅かに変動するのみであった。
【０１０１】
実施例５
インビトロアッセイによるアシル−ＣｏＡシンテターゼ活性の測定
ＴｐＬＡＣＳＡの基質特異性を直接測定する目的で、幾つかの脂肪酸を、遊離脂肪酸、ＡＴＰ及び遊離ＣｏＡの存在下で、アシル−ＣｏＡの酵素産物を測定するのに適したアッセイによりテストした。広範囲の脂肪酸基質を利用するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来の市販のアシル−ＣｏＡシンテターゼがポジティブコントロールとして含まれた。図２に示される結果は、この酵素の広い特異性を確認する。ｐＹＥＳ２とｐＹＬＡＣＳＡ  Ｙ００８３３形質転換体から得られる抽出液中で測定される比活性を比較すると、ＴｐＬＡＣＳＡはＣ２０及びＣ２２ＰＵＦＡｓに対して非常に活性が高いことが分かる。活性は、空のベクターコントロールと比べて、ＴｐＬＡＣＳＡ抽出液中において２０：４ｎ６、２０：５ｎ３及び２２：６ｎ３ＦＡｓに対し、６２〜２２２倍と高く効果的であり、その一方、パルミチン酸又はＣ１８ＰＵＦＡｓの存在下で行われたアッセイの値は、２−３倍程度（２−３の因数）の増加しか示さなかった。ＡＲＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡ遊離脂肪酸の存在下において、アシル−ＣｏＡの生産はＰＹＥＳ２酵母抽出液中においてかろうじて検出される程度であった。
【０１０２】
実施例６
ＴｐｌａｃｓＡを発現する酵母内でのＤＨＡの貯蔵
ＴｐｌａｃｓＡ遺伝子の発現により酵母の貯蔵脂質中に貯蔵される２２：６ｎ３（ＤＨＡ）の量が増加するかどうか確証するために、ＤＨＡの存在下、３０℃でのインキュベーション４日後に、全ての及びＴＡＧ脂肪酸をｐＹＥＳ２及びｐＹＬＡＣＳＡ  Ｙ００８３３形質転換体から抽出した。ＴｐｌａｃｓＡ遺伝子を含むＹ００８３３は、空のベクターコントロールと比較すると、乾燥重量を基礎にして、ＴＡＧｓにおいておよそ６倍のＤＨＡの量とこれに関連した総ＦＡｓの倍加を示したことが表５に提示されている。内在性の飽和及びモノ不飽和脂肪酸については、僅かな増加のみが示された（データは示さず）。
【０１０３】
【表１】
2008514221.tif 000003
【表２】
2008514221.tif 000004
【表３】
2008514221.tif 000005
【表４】
2008514221.tif 000006
【表５】
2008514221.tif 000007
【０１０４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、ＴｐｌａｃｓＡ及びＴｐｌａｃｓＩ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ発現解析を示す。Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ細胞は成長の異なるステージにおいて、トータルＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成のために回収した。その後、各ｃＤＮＡの無希釈（レーン１）及び５倍の希釈系列（レーン２−４）に対してＴｐｌａｃｓＡ及びＴｐｌａｃｓＩ特異的なプライマー対を用いてＰＣＲを実施した。１８ＳｒＲＮＡ遺伝子をｃＤＮＡ合成のコントロールとして用いた。各ローカスに対し検出される断片のサイズを括弧内に示した。
【図２】図２は、Ｙ００８３３過剰発現形質転換体の無細胞抽出液、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．アシル−ＣｏＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ，ＰＡＣＳ）由来のＬＡＣＳ酵素特異的な活性値を示す。プラスミドｐＹＥＳ２（コントロール）及びｐＹＬＡＣＳＡを含む酵母由来の無細胞抽出液は、市販のＰＡＣＳと並行して、インビトロにおけるＬＡＣＳアッセイの酵素源として使用した。各値は、典型的な実験におけるアシル−ＣｏＡの重複サンプルの平均値±標準偏差を示す。
【図３】図３ＡはＴｐＬＡＣＳＡの核酸配列を示し、図３ＢはＴｐＬＡＣＳＡのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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