(57)【要約】  本発明は、高酸−不安定樹脂上での高純度ビバリルジンの調製方法に関する。ポリペプチドは少なくとも98.5％（HPLCによれば）の高純度で調製され、ここで0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.5重量％以下に達し、そして個々の不純物は1.0重量％以下であり、そして好ましくは、HPLCにより測定される場合、少なくとも約99.0％の純度を有し、ここで0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.0重量％以下に達し、そして個々の不純物は0.5重量％以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階：
ａ）高酸−不安定樹脂上で、保護された残基を含むビバリルジン（Bivalirudin）ペプチド配列を調製し；
ｂ）酸及び少なくとも１つのスカベンジャーを含んで成る分解溶液により、前記樹脂から保護されたペプチドを除去し、保護されていないか又は半保護された粗ビバリルジンペプチドを形成し；
ｃ）前記分解溶液から前記保護されていないか又は半保護された粗ビバリルジンペプチドを単離し、そして半保護された粗ビバリルジンペプチドの場合、前記半保護された粗ビバリルジンペプチドからいずれかの残存する保護基を除去し、保護されていない粗ビバリルジンペプチドを形成し；そして
ｄ）前記粗ビバリルジンペプチドを精製することを含んで成るビバリルジンの調製方法。
【請求項２】
前記高酸−不安定樹脂が、２−Cl−Trt−Cl樹脂、HMPB−BHA樹脂、Rink酸樹脂及びNovaSyn TGTアルコール樹脂から成る群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記高酸−不安定樹脂が、２−Cl−Trt−Cl樹脂である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記分解溶液が、約85〜約99重量％の酸、約0.1〜約15重量％のスカベンジャー、及び約0.1〜約15重量％の水を含んで成る請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記酸がTFAである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記スカベンジャーが、エタンジチオール（EDT）、チオアニソール、TIS, DDM, フェノール及びm−クレゾールから成る群から選択される請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記分解溶液が、約95重量％のTFA、約2.5重量％のEDT、及び約2.5重量％の水を含んで成る請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記粗ペプチドの単離が、低級アルキル（C4-C8）エーテル及び水から成る群から選択された溶媒における前記粗ペプチドの沈殿を含んで成る請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記低級アルキルエーテルがMTBEである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記粗ビバリルジンペプチドの単離が沈殿を包含する請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記粗ビバリルジンペプチドの精製が、クロマトグラフィーによる精製、及び得られる精製されたビバリルジンペプチドの乾燥を包含する請求項１〜10のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記クロマトグラフィーが、逆相HPLCを包含する請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記乾燥が、凍結乾燥を包含する請求項11又は12記載の方法。
【請求項１４】
段階ｄ）におけるビバリルジンが、少なくとも98.5重量％の純度を有する請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記ビバリルジンが、少なくとも99.0重量％の純度を有する請求項14記載の方法。
【請求項１６】
下記段階：
ａ）高酸−不安定樹脂上でビバリルジンの保護されたN−末端フラグメントA及び高酸−不安定樹脂上でビバリルジンの保護されたフラグメントBを調製し、ここでフラグメントA及びフラグメントBは一緒に、アミノ酸配列番号４を有するペプチドを形成し、そしてフラグメントAは前記アミノ酸配列番号４のN−末端配列D-Phe-(AA)n（ここで、ｎは１〜17の整数である）を含んで成り、そしてフラグメントBは、配列番号４の完全なアミノ酸配列を形成するためにフラグメントAを補足する、残存するアミノ酸配列を含んで成り、フラグメントBは(AA)m-Tyr-OH（ここで、mは0〜16の整数である）の配列を有し、そして前記ペプチドは保護された残基を含み、そしてフラグメントBの少なくともα−アミノ基がFmoc保護基により保護され；
ｂ）保護されたフラグメントA及び保護されたフラグメントBを形成するために、それらのそれぞれの樹脂から両ペプチドを、分解溶液により除去し；
ｃ）保護されたフラグメントBをLeu-OtBuによりカップリングし、延長されたフラグメントBを形成し；
ｄ）塩基性溶液による処理により、前記延長されたフラグメントBからα−アミノ保護基を保護解除し、遊離アミノ末端延長されたフラグメントBを供給し；
ｅ）保護されたフラグメントAを、前記遊離アミノ末端延長されたフラグメントBにより溶液においてカップリングし；
ｆ）少なくとも１つのスカベンジャーを含む適切な酸性溶液による処理により、前記保護されたペプチドのすべての残存する酸不安定保護基を保護解除し、粗ビバリルジンペプチドを形成し；そして
ｇ）前記粗ビバリルジンペプチドを精製し、ビバリルジン生成物を形成することを含んで成るビバリルジンの調製方法。
【請求項１７】
ｎが３〜15の整数である請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ｎが５〜12の整数である請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ｎが８〜10の整数である請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ｍが２〜14の整数である請求項16〜19のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
ｍが５〜12の整数である請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ｍが７〜９の整数である請求項21記載の方法。
【請求項２３】
フラグメントAがアミノ酸配列番号２であり、そしてフラグメントBがアミノ酸配列番号３である請求項16記載の方法。
【請求項２４】
前記高酸−不安定樹脂が、２−Cl−Trt−Cl樹脂、HMPB−BHA樹脂、Rink酸樹脂及びNovaSyn TGTアルコール樹脂から成る群から選択される請求項16〜23のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記高酸−不安定樹脂が、２−Cl−Trt−Cl樹脂である請求項24記載の方法。
【請求項２６】
それらのそれぞれの高酸−不安定樹脂からのペプチドの除去が、緩酸溶液による処理を包含する請求項16〜25のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記緩酸溶液が、DCM中、TFAの希薄溶液及びDCM及びトリフルオロエタノール中、酢酸の溶液から成る選択される請求項26記載の方法。
【請求項２８】
DCM中、TFAの希薄溶液が、約0.5〜約10％（v/v）の濃度のTFAを有する請求項27記載の方法。
【請求項２９】
DCM中、TFAの希薄溶液が、約１〜約２％（v/v）の濃度のTFAを有する請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記塩基性溶液が、DMF中、ピペリジンの溶液、DBU溶液、DBU/ピペリジン溶液及びジエチルアミン溶液から成る群から選択される請求項16〜29のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
段階ｃ）及びｅ）のカップリングが、カップリング溶媒中、カップリング剤の存在下で実施される請求項16〜30のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記カップリング剤が、２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム四フルオロボレート（TBTU）、DCC、DIC、HBTU、BOP及びPyBOPから成る群から選択される請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記カップリング溶媒がDMFである請求項31又は32記載の方法。
【請求項３４】
前記酸性溶液が、約85〜約99重量％の酸、約0.1〜約15重量％のスカベンジャー、及び約0.1〜約15重量％の水を含んで成る請求項16〜33のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記酸がTFAである請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記酸性溶液が、約95重量％のTFA、約2.5重量％のEDT、及び約2.5重量％の水を含んで成る請求項34又は35記載の方法。
【請求項３７】
前記スカベンジャーが、エタンジチオール（EDT）、チオアニソール、TIS, DDM, フェノール及びm−クレゾールから成る群から選択される請求項34〜36のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
段階ｂ）からフラグメントA及びBを単離し、段階ｄ）からFmoc保護解除された延長されたフラグメントBを単離し、そして続く段階へのそれらの使用の前、段階ｆ）から粗ビバリルジンペプチドを単離する段階をさらに含んで成る請求項16〜37のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドの単離が、低級アルキル（C4-C8）エーテル及び水から成る群から選択された溶媒における前記ペプチドの沈殿を含んで成る請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記低級アルキルエーテルがMTBEである請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記粗ビバリルジンペプチドの精製が、クロマトグラフィーによる精製、及び得られる精製されたビバリルジンペプチドの乾燥を包含する請求項16〜40のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記クロマトグラフィーが、逆相HPLCを包含する請求項41記載の方法。
【請求項４３】
前記乾燥が、凍結乾燥を包含する請求項41記載の方法。
【請求項４４】
段階ｄ）におけるビバリルジンが、少なくとも98.5％の純度を有する請求項16〜43のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記ビバリルジンが、少なくとも99.0重量％の純度を有する請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記αアミノ保護基がFmocある請求項１〜45のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも約98.5重量％の純度を有するビバリルジンの組成物。
【請求項４８】
0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.5重量％以下に達し、そして個々の不純物は1.0重量％以下である請求項47記載の組成物。
【請求項４９】
0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.0重量％以下に達し、そして個々の不純物は0.5重量％以下である請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
前記ビバリルジンが、少なくとも99.0重量％の純度を有する請求項47〜49のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５１】
少なくとも98.5％の純度を有するビバリルジン、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物。
【請求項５２】
前記ビバリルジンが、少なくとも99.0重量％の純度を有する請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物が、凍結乾燥された組成物の粉末投与形で存在する請求項51又は52記載の医薬組成物。
【請求項５４】
哺乳類における血液凝固を処理するための薬剤の製造のためへの請求項47〜53のいずれか１項記載のビバリルジンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ビバリルジン（Bivalirudin）の調製のための改良された方法に関する。さらに、本発明は、高い純度のビバリルジンを包含する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
トロンビンによるタンパク質分解工程は、血液凝固の制御における中枢であり、そして経皮経管冠動脈形成（PTCA）を受ける不安定狭心症を有する患者における抗凝固剤として、又は経皮冠動脈介入を受ける患者における抗凝固剤として示される。ヒルジン（Hirudin）、すなわち吸血ヒル、ヒルド・メジシナリス（Hirudo medicinalis）からの有能な臨床学的トロンビンペプチドインヒビターは、65個のアミノ酸から成り、そしてより短いペプチドセグメントアミノ酸が生命の脅威の状態である血栓症の処理において効果的であることがわかっている。
【０００３】
アメリカ特許出願番号5,196,404号は、中でも、それらの短いペプチドの１つ、すなわち次の化学名称を有する、Hirolog-8として知られている有能なトロンビンインヒビター、例えばビバリルジンを開示し：D-フェニル-アラニル-L-プロリル-L-アルギニル-L-プロリル-グリシル-グリシル-グリシル-グリシル-L-アスパラギル-グリシル-L-アスパルチル-L-フェニルアラニル-L- グルタミル-L-グルタミル-L-イソロイシル-L-プロリル-L-グルタミル-L-グルタミル-L-チロシル-L-ロイシントリフルオロアセテート (塩) 水和物、そして次のアミノ酸配列から製造される：H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH（配列番号１）。
他の通常の名称は、hirulog-8、BG-8967、Efludan、Angiomax（商標）及びHirulog（商標）を包含する。
【０００４】
PCT特許出願WO98/50563号は、組換え技法により、種々のペプチド、例えばHirulogの生成方法を明確に記載している。前記方法は、融合タンパク質（FP）の一部としてペプチドを発現し、続いて前記EPからペプチドを、アシル−受容体、例えば硫黄含有還元体により開放することを含んで成る。
【０００５】
Okayamaなど. (1996, Chem Pharm. Bull. 44:1344-1350) 及びSteinmetzer など. (1999, Eur. J. Biochem. 265:598-605)は、Wang樹脂上での異なったHirulogsの固相合成を考案している。Wang樹脂は、濃トリフルオロ酢酸による樹脂からのペプチドの分解を必要とする。ビバリルジンの調製のための類似する固相合成アプローチにおいては、PCT特許出願WO91/02750号は、BOC−L−ロイシン−O−ジビニルベンゼン樹脂の固相上に単一のBOC−保護されたアミノ酸を添加し、同時に、HF/p−クレゾール/エチルメチルスルフェートを用いて保護解除し、そしてカップリング解除し；粗Hirulog-8を凍結乾燥し、そして精製する連続的アプローチを明確に開示している。両者の場合、樹脂からの分解は、ペプチドの同時の全体的保護解除を引起し、そしてスカベンジング試薬の使用にかかわらず、アミノ酸残基との所望しない副反応を受け、従って、生成物の純度に影響を及ぼす強い酸性条件を必要とする。
【０００６】
活性化合物の純度は、API（活性医薬成分）として使用される生成物のために非常に重要なパラメーターである。同じ生成物の純度の種々の品種が生成工程の最後で可能である。一般的に、生成物の純度は、生成工程の化学及び種々の工程関連パラメーターに依存する。ペプチド生成物の場合、その情況は、ペプチドは複雑で且つ敏感な分子であるので、より複雑化される。それらは多種の出発材料を適用する多段階工程により生成され、そしてペプチド化学の一部である多くの可能性ある副反応のために実質的に汚染される。
【０００７】
従って、従来技術の欠点を有さないそれぞれのビバリルジンペプチドを合成する他の及び特に改良された方法を考案することが本発明の目的である。
従って、高い純度のペプチド生成物の生成が高く所望されるが、但しその目的を達成するのは困難である。実際、そのような高い純度の生成物を生成するよう開発された、特定の方法が、この目的を達成するために使用され得る。本発明は、高い純度のビバリルジンペプチドを調製するためのそのような方法を提供する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約：
本発明は、従来技術の欠点を有さないビバリルジンペプチドの改良された合成方法を包含する。その生成方法は、固相合成、又は固相及び溶液合成の組合せ（ハイブリッドアプローチ）に基づく。ペプチド鎖の合成は、ビバリルジン分子の最終配列を形成するために、連続的に、又は２以上の短いフラグメントを連結することにより行われる。これらのフラグメントは、保護された、部分的に保護された又は保護されていない形で、溶液において又は固体支持体上で調製され得る。フラグメント間のカップリングが、適切なカップリング試薬又は他の適切な方法、例えば活性エステルを通してのカップリングにより、１つのペプチドフラグメント（C末端）からもう１つのフラグメント（N末端）のカルボキシル基の活性化を通して実施され得る。合成の完結後、側鎖保護基は除去され、そしてペプチドが最適な方法、例えば分離用HPLCにより、高い純度に精製される。
【０００９】
１つの態様においては、（ａ）高酸−不安定樹脂上で、適切な保護されたアミノ酸を含むビバリルジンペプチドを調製し；（ｂ）樹脂にカップリングされたビバリルジンペプチドを、酸溶液により処理し、樹脂を有さない、保護されていないか又は半保護された粗ペプチドを得；（ｃ）半保護された粗ペプチドの場合、いずれかの残存する保護基を除去し；そして（ｄ）粗ビバリルジンペプチドを回収することを含んで成る、ビバリルジンの調製方法が提供される。
【００１０】
本発明の特に好ましい態様においては、適切に保護されたビバリルジンペプチド配列は、Fmocにより保護されたα−アミノ残基を含み、そして前記アミノ酸の他の官能残基は適切な酸安定性保護基により保護されている。
（ａ）ビバリルジンのN−末端保護されたペプチドフラグメントA、好ましくは[Xa-D-PhC-PrO-ATg(X)-PrO-GIy-GIy-GIy-GIy-ASn(X)-GIy-OH]（配列番号２）（ここで、Xαは適切なα−アミノ保護された基、好ましくはBOC又はFMOCであり、そしてXは適切な保護基、好ましくはArgのためのPbf及び他の残基のためのtBu又はTrtである）を供給し、前記フラグメントAは、高酸−不安定樹脂上で調製され、そして続いて、緩酸条件下での処理により、保護された形で分離され、そして任意には単離され；
（ｂ）ビバリルジンの保護されたフラグメントB、好ましくは[FMOC-ASp(X)- Phe-Glu(X)-Glu(X)-Ile-Pro-Glu(X)-Glu(X)-Tyr(X)-OH] （配列番号３）（ここで、Xは適切な保護基、好ましくはtBu又はTrtである）を供給し、前記フラグメントBは、高酸−不安定樹脂上で調製され、そして続いて、緩酸条件下での処理により保護された形で分離され、そして任意には、単離され；
（ｃ）Leu-OtBuにより前記フラグメントBをカップリングし、延長されたフラグメントBを形成し；
（ｄ）前記延長されたフラグメントBからα−アミノ保護基を保護解除し；
（ｅ）段階（ｄ）の延長されたフラグメントBによりフラグメントAをカップリングし；
（ｆ）強酸性溶液における処理により、前記ペプチドからのすべての残存する保護基を保護解除することを含んで成る。
【００１１】
任意には、次の粗ビバリルジンは単離され、そして精製され、高い収率で高純度ビバリルジンが得られる。
もう１つの態様においては、少なくとも約98.5％の純度、好ましくは少なくとも約99.0％の純度を有する高純度ビバリルジンが供給される。
もう１つの態様においては、少なくとも約98.5％の純度を有する高純度ビバリルジン及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物が供給される。
【００１２】
もう１つの態様においては、ビバリルジンを、高酸−不安定樹脂上でフラグメント又はその全体として調製し、そしてその高純度ビバリルジンと、少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤とを混合することを含んで成る、少なくとも98.5％の純度を有するビバリルジンを含んで成る医薬組成物の調製方法が提供される。
さらにもう１つの態様においては、少なくとも約98.5％の純度を有するビバリルジン及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物の治療的有効量を投与することを含んで成る、その必要な患者を処理するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の特定の記載：
本発明は、高純度のビバリルジンの生成方法を包含する。より特定には、本発明は、調製され、そして精製されたペプチドが高純度のペプチドであるような手段でのビバリルジンの生成方法を包含する。本明細書において使用される場合、用語“高純度”とは、少なくとも約98.5％の純度を有する組成物を言及する。さらに、用語％純度とは、本明細書において使用される場合、重量％でのペプチドの％純度を言及する。
本発明の方法の利点の１つは、すべての合成段階が、穏やかな条件下で実施され、低い含有率の副生成物及びそれにより、高収率及び高純度の最終ビバリルジンペプチド生成物を供給することである。もう１つの利点は、それが標準的な市販の保護されたアミノ酸を使用することである。
【００１４】
本発明の方法の１つにより合成されるペプチドは、高酸不安定樹脂、すなわち非常に酸不安定又は超酸不安定樹脂を用いての固相合成により調製される。高酸−不安定樹脂の例は、当業界において良く知られており、そしてBodanszkyなど., Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989に十分に記載され、そして言及されている。いくつかの例は、2-C1- Trt-Cl樹脂（商標）、HMPB-BHA樹脂（商標）、Rink 酸樹脂（商標）、又は NovaSyn TGT アルコール樹脂（商標）である。
【００１５】
本発明の方法に使用される高酸−不安定樹脂は、そのような樹脂とのペプチドの供給が緩酸条件下で分解に対して敏感であるので、緩酸条件下での合成されたペプチドの分解を可能にする。従って、本発明のビバリルジンペプチドを調製するための適切な高酸−不安定樹脂は、2-C1- Trt-Cl樹脂（商標）、HMPB-BHA樹脂（商標）、Rink 酸樹脂（商標）、又は NovaSyn TGT アルコール樹脂（商標）から選択される。好ましい態様においては、本発明の方法に使用される高酸−不安定樹脂は、２−Cl−Trt−Cl樹脂である。
【００１６】
固相結合の酸−不安定性のために、そのような合成方法は、固相合成の間、カップリング反応を実施するためにFmoc化学を使用し、そして末端D−Phe残基のみが、Boc又はFmoc保護され得る。本発明の好ましい態様においては、Fmoc保護が使用され、そしてペプチド−樹脂接合体を生成するために、当業界において知られている、20％ピペリジン又は他のFmoc保護塩基試薬による標準処理により、樹脂上に残存するペプチドから排除され得る。そのようなFmoc保護塩基試薬は例えば、CDM中、TFAの希薄溶液、好ましくはDCM中、0.5〜10％TFA（v/v）、より好ましくはDCM中、１〜５％TFA（v/v）、さらにより好ましくはDCM中、１〜２％TFA（v/v）、最も好ましくはDCM中、２％TFA（v/v）、又はDCM及びトリフルオロエタノール中、酢酸の溶液である。
【００１７】
第１のアミノ酸が、高い酸不安定エステル結合を通して樹脂に結合され、そしてα−アミン基以外の他の官能アミノ酸残基が樹脂からのペプチドの分解のために必要とされる条件下で分解又は保護解除されないより安定した保護基により保護される。そのような多官能アミノ酸は、α−アミン基以外の官能基に対して、強酸不安定保護基により保護される。アミノ酸の他の可能残基に対して使用されるそれらのより酸安定性の保護基は、Pbf, tBu, Trt及びBoc、好ましくはArg残基のためのPbf, 及びすべての他のアミノ酸残基のためのtBu, Trt及びBocを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００１８】
ビバリルジン配列の合成の完結の後、保護基は、いずれかの従来の方法を用いて除去される。例えば、１つの方法は、TFAの他に、いくつかのスカベンジャー、例えばEDT, DDM, フェノール、チオアニソール及び水を含むTFA基材のカクテルを有するが、但しそれだけには限定されない。樹脂からの本発明のペプチド又はペプチドフラグメントのこの分離、及びそれらの保護基のそれらのペプチド又はペプチドフラグメントの保護解除が、１つの段階工程で行われ得る。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語、強酸性溶液とは、完全に又はほとんど完全に解離する酸の溶液を言及する。弱酸及び緩酸はそうではない。本明細書において使用される強酸は一般的に、約１以下、好ましくは約0.5以下のpKaを有する。
最終ペプチドは、高い純度のペプチドを得るために適切な方法により精製される。好ましくは、精製は、逆相HPLC（RP−HPLC）を用いて行われる。
【００２０】
本発明の明瞭さのために、及び本発明の理解の助力として、次の用語及び略語が下記に定義される：
AA−アミノ酸
ACN−アセト二トリル
Boc−ｔ−ブチルオキシカルボニル
BOP−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Bzl−ベンジル
Cbz−ベンジルオキしカルボニル
DBU−１，８−ジアゾビシクロ[5. 4. 0]ウンデク−７−エン
DCM−ジクロロメタン
DCC−N, N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DIC−１，３−ジイソプロピルカルボジイミド
DDM−ドデシルメルカプタン
DIPEA−ジイソプロピルエチルアミン
DMF−ジメチルホルムアミド
EDT−エタンジチオール
Fmoc−９−フルオレニルメトキシカルボニル
【００２１】
HBTU−２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−アトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt−N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
MTBE−メチルtertブチルエーテル
Pbf−ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル
PyBOP−ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ピロリジノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
SPPS−固相ペプチド合成
TBTU−O−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
tBu−tert−ブチルエステル
TFA−トリフルオロ酢酸
TIS−トリイソプロピルシラン
Trt−トリチル
【００２２】
用語、半保護されたペプチドとは本明細書においては、少なくとも１つの（但し、すべてではない）残存する保護基の存在を除いて、保護されていないペプチドを記載するために使用される。好ましくは、半保護されたペプチドは、残存するα−アミノN−保護基の存在を除いて、保護されていないペプチドである。
【００２３】
本発明の１つの態様においては、下記段階：
ａ）高酸−不安定樹脂上で、保護された残基を含むビバリルジン（Bivalirudin）ペプチド配列を調製し；
ｂ）少なくとも１つのスカベンジャーを含んで成る酸溶液により、前記樹脂から保護されたペプチドを除去し、保護されていないか又は半保護された粗ビバリルジンペプチドを形成し；
ｃ）前記分解溶液から前記保護されていないか又は半保護された粗ビバリルジンペプチドを、沈殿又は他の適切な技法により単離し、そして半保護された粗ビバリルジンペプチドの場合、前記半保護された粗ビバリルジンペプチドからいずれかの残存する保護基を除去し、保護されていない粗ビバリルジンペプチドを形成し；そして
ｄ）適切な技法により前記粗ビバリルジンペプチドを精製することを含んで成るビバリルジンの調製方法が提供される。
【００２４】
好ましくは、得られるビバリルジン生成物は乾燥され、高純度の最終乾燥ビバリルジンペプチドが得られる。好ましくは、ビバリルジン生成物の乾燥は、凍結乾燥を包含する。さらに、得られるビバリルジンペプチドは好ましくは、少なくとも98.5％の純度、より好ましくは少なくとも99.0％の純度を有する。
【００２５】
好ましくは、粗ペプチドの単離は、単離された粗ペプチドを生成するために、例えば沈殿、結晶化、抽出又はクロマトグラフィーによる。段階（ｃ）におけるような保護されていないか又は半保護された粗ビバリルジンの単離は好ましくは、ペプチド材料の沈殿を通して達成される。粗ペプチドの沈殿は、不純物及び副生成物を溶解するが、ペプチドの沈殿を引起すいずれかの溶媒又は溶媒の混合物を用いることを包含する。例としては、C4-C8アルキルエーテル、より好ましくはジエチルエーテル又はMTBE、最も好ましくはMTBEを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００２６】
好ましくは、粗ビバリルジンの精製は、高純度ビバリルジンペプチドを含んで成るペプチド溶液を得るためにクロマトグラフィーによる精製、及び高純度のビバリルジンを得るために前記ペプチド溶液の乾燥を包含する。好ましくは、高純度ビバリルジンを得るためのペプチド溶液の乾燥は、凍結乾燥を通してである。
もう１つの態様においては、高純度ビバリルジンの調製方法は、次の段階を包含する。この方法においては、ビバリルジンペプチドの少なくとも２種のフラグメントが調製され、そして続いて、カップリングされ、ビバリルジンが形成される。
【００２７】
この工程は、次の段階を含んで成る：
ａ）高酸−不安定樹脂上でビバリルジンの保護されたN−末端フラグメントA及び高酸−不安定樹脂上でビバリルジンの保護されたフラグメントBを調製し、ここで前記ペプチドは適切に保護された残基を含み、そしてフラグメントBの少なくともα−アミノ基がFmoc保護基により保護され；
ｂ）保護されたフラグメントA及び保護されたフラグメントBを形成するために、それらのそれぞれの樹脂から両ペプチドを、適切な分解溶液により除去し；
ｃ）保護されたフラグメントBをLeu-OtBuによりカップリングし、延長されたフラグメントBを形成し；
【００２８】
ｄ）適切な塩基性溶液による処理により、前記延長されたフラグメントBからα−アミノ保護基を保護解除し；
ｅ）保護されたフラグメントAを、前記延長されたフラグメントBにより溶液において適切な方法によりカップリングし；
ｆ）少なくとも１つのスカベンジャーを含む適切な酸性溶液による処理により、前記保護されたペプチドのすべての残存する酸不安定保護基を保護解除し；そして
ｇ）適切な方法により、前記粗ビバリルジンペプチドを精製し、高純度のビバリルジン生成物を得、ここでフラグメントA及びフラグメントBが一緒に次のペプチド配列：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-OH（配列番号４）を形成する。
【００２９】
さらに、フラグメントA及びB（高酸−不安定樹脂からのそれらの除去の後）、Famoc保護された延長されたフラグメントB及び粗ビバリルジンペプチドは好ましくは、本発明の方法の続く段階へのそれらの使用の前、フラグメントA及びB、及び粗ビバリルジンとして単離される。本発明の方法のフラグメントA及びB、及び粗ビバリルジンの任意の単離は好ましくは、エーテル、好ましくは低級アルキル（C4-C8）エーテル、より好ましくはMTBEにおける沈殿を包含する。
【００３０】
好ましくは、段階（ｆ）の組合されたポリペプチドの残存する保護基を保護解除するための強酸溶液は、強酸及び少なくとも１つのスカベンジャーを含んで成る。好ましくは、粗ビバリルジンペプチドの精製は、高純度のビバリルジンを得るために、クロマトグラフィー、好ましくはHPLC、及び好ましくは、凍結乾燥を通してのペプチド溶液の乾燥を包含する。
【００３１】
ビバリルジンのこの調製方法はさらに、段階（ｆ）の保護解除の前、カップリング段階（ｅ）の後に得られる半保護されたビバリルジンペプチドを精製することを含んで成る。ビバリルジンのこの調製方法はさらに、いずれかの残存するα−アミノ保護基を有する、半保護されたビバリルジンペプチドを精製し、そしてそのような残存するα−アミノ保護基を、段階（ｇ）におけるように粗ビバリルジンペプチドを精製する前、除去することを含んで成る。
【００３２】
好ましくは、上記方法においては、フラグメントA及びフラグメントBの個々を調製するために使用される高酸−不安定樹脂は、2-C1- Trt-Cl樹脂（商標）、HMPB-BHA樹脂（商標）、Rink 酸樹脂（商標）、及び NovaSyn TGT アルコール樹脂（商標）から成る群から選択される。好ましい態様においては、高酸−不安定樹脂は、２−Cl −Trt−Cl樹脂である。
本発明の方法に従って調製される、前記の得られるビバリルジンペプチドの純度は、HPLCにより測定される場合、少なくとも98.5％である。好ましくは、得られるビバリルジンペプチドの純度は、HPLCにより測定される場合、少なくとも99％である。
【００３３】
本発明の方法においては、フラグメントA及びフラグメントBは一緒に、ペプチド配列D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-OH（配列番号４）を形成する。フラグメントAは、上記アミノ酸配列番号４のN−末端配列D−Phe−(AA)nを含んで成り、ここでｎは１〜17の整数、好ましくは３〜15の整数、より好ましくは５〜12の整数、最も好ましくは８〜10の整数である。フラグメントBは、配列番号４の完全なアミノ酸配列を形成するために、フラグメントAを補足する残存アミノ酸を含んで成る配列であり、フラグメントBは(AA)m−Tyr−OH（ここで、ｍは０〜16、好ましくは２〜14、より好ましくは５〜12、最も好ましくは７〜９の整数である）の配列を有する。
【００３４】
末端α−アミノ酸残基のための適切な保護基は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）及びBocを包含するが、但しそれらだけには限定されない。フラグメントBのための好ましい末端アミノ酸残基保護基はFmocである。ビバリルジンの合成に使用するためのアミノ酸上の他の官能残基は、適切な保護基により保護され、ここで前記保護基は、Pbf, tBu, Trt及びBoc, 好ましくはArg残基のためのPbf、及びヒドロキシル及びカルボキシル含有残基のためのtBu及びTrt保護基を包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい保護されたフラグメントAは、配列[Xa-D-PhC-PrO-ATg(Pbf)-PrO-GIy-GIy-GIy-GIy-ASn(Trt)-GIy-OH]（配列番号２）（ここで、Xαは、Boc又はFmoc保護基を表す）を有する。好ましい保護されたフラグメントBは、配列[Fmoc-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)- Tyr(tBu)-OH]（配列番号３）を有する。
【００３５】
ペプチドフラグメントA及びBは、適切な分解溶液を用いて、それぞれの高酸−不安定樹脂から除去される。適切な分離溶液は、例えばCDM中、トリフルオロ酢酸（TFA）の希薄溶液、又はDCM及びトリフルオロエタノール中、酢酸の溶液を含んで成る緩酸溶液である。好ましい緩酸溶液は、DCM中、約0.5〜約10v/v％濃度でのTFAの溶液、より好ましくはDCM中、約1〜約5v/v％濃度でのTFAの溶液、さらにより好ましくはDCM中、約1〜約２v/v％濃度でのTFAの溶液、最も好ましくはDCM中、２％TFAの溶液、又はDCM及びトリフルオロエタノール中、酢酸の溶液である。得られるペプチドの酸性溶液は、等量の適切な塩基により、すぐに中和され得る。適切な塩基は、塩基−不安定保護基を除去しないで、酸性溶液を中和するであろういずれかの塩基である。好ましくは、DIPEA又はコリジンが使用され得る。
【００３６】
本発明の方法における高酸−不安定樹脂上でのビバリルジンペプチド又はそのフラグメントの調製は、固体樹脂上でペプチド鎖を延長する既知方法により実施され得る。好ましくは、ペプチド配列の合成は、高酸−不安定樹脂、好ましくは２−Cl−Trt−ClにFmoc保護された第１アミノ酸を負荷する段階を含んで成る段階的Fmoc SPPS（固相ペプチド合成）方法により実施される。樹脂の洗浄、及び塩基性溶液、好ましくはDMF中、20％ピペリジンの溶液による処理によるFmoc保護基の除去を伴う。残留試薬を除去するための洗浄、及び第１のカップリング段階を開始するためへの第２のFmoc保護されたアミノ酸の導入を伴う。
【００３７】
Fmoc保護されたアミノ酸が、カップリング剤、好ましくはTBTU/HOBt（N−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて、好ましくは現場活性化され、そして続いて、有機溶媒、好ましくはジイソプロピルエチルアミンの存在下で樹脂にカップリングされる。樹脂の洗浄、及び塩基性溶液、好ましくはDMF中、20％ピペラジンの溶液による処理によるα−アミン上のFmoc保護基の除去を伴う。それらの段階は、ペプチド配列における個々の追加のアミノ酸について反復される。好ましくは、第１のFmoc保護されたアミノ酸の負荷は、カップリグ剤の存在下で、有機溶媒、好ましくはDMF中、Fmoc保護されたアミノ酸の溶液と共に高酸−不安定樹脂を撹拌することを含んで成る。さらに、好ましくは、３当量の活性化されたアミノ酸が、カップリング反応に使用される。
【００３８】
本発明の方法におけるペプチドフラグメントへのアミノ酸の付加又はペプチドフラグメントA及びBのカップリングは好ましくは、カップリング剤を使用する。適切なカップリング剤は、２−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム四フルオロボレート（TBTU）、DCC、DIC、HBTU、BOP又はPyBOPを包含するが、但しそれらだけには限定されない。アミン含有化合物による、保護されたペプチドのカップリングは好ましくは、カップリング溶媒において行われる。
【００３９】
いずれかの非アルコール性溶媒がカップリング溶媒として使用され得るが、但し溶媒はカップリング反応においては不活性であるべきである。好ましくは、カップリング溶媒は、DMF, DMSO, DMA, NMP, DCM及びジオキサンから成る群から選択され、より好ましくは、カップリング溶場はDMFである。このカップリング溶媒はまた、有機塩基、好ましくはジイソプロピルエチレンアミン（DIPEA）又はコリジンを含むことができる。保護されたペプチドのカルボキシル基は、適切な方法により、現場活性化され得るか、又は反応混合物へのアミン化合物の導入の前、活性化され得る。
【００４０】
さらに、化学反応、例えばカップリング反応が行われる、ビバリルジンの調製方法における個々の段階においては、洗浄段階が好ましくは、未反応材料及び他の副生成物の除去のために包含される。本発明の方法の洗浄段階への使用のための適切な溶媒は、ペプチド又は樹脂と反応しない二極性溶媒である。水は、それがペプチドの部分的加水分解を引起し、そして樹脂と反応するので、許容できる洗浄溶媒ではない。洗浄段階のための好ましい溶媒は、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジクロロメタン（DCM）、メタノール（MeOH）、又はイソプロパノール（IPA）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４１】
末端アミノ酸残基Fmoc保護基は、適切な塩基性溶媒を用いてのいずれかの既知方法、例えばDMF中、ピペリジン溶液との反応により除去される。他の適切な塩基性溶液は、不活性溶媒中、DBU、BBU/ピペリジン及びジエチルアミンの溶液を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４２】
ペプチドからの酸−不安定保護基の保護解除は、強酸性溶液の添加によりもたらされ得る。強酸性溶液は好ましくは、酸（例えばTFA, TFMSA, HBr/AcOH及びHF）、少なくとも１つのスカベンジャ−試薬（例えば、エタンジチオール（EDT）、チオアニソール、TIS, DDM, フェノール及びｍ−クレゾール）、及び水を含んで成る。本発明に使用される強酸性溶液における酸性材料：スカベンジャー：水の相対的比率は好ましくは、約85〜約99％の酸：約0.1〜約15％のスカベンジャー：約0.1〜約15％の水（重量％による）を包含する。好ましい強酸溶液は、約95重量％のTFA．約2.5重量％のEDT及び約2.5重量％の水を含む。
粗ビバリルジン生成物は、任意の既知の方法で精製することができる。好ましくは、ペプチドは、逆相（RP）カラム上でのHPLCを用いて精製される。粗ビバリルジンペプチドを精製するための好ましい方法は、逆相C18カラムを含むHPLCシステムを包含する。得られる精製された生成物は好ましくは、乾燥され、より好ましくは凍結乾燥される。得られる高く精製されたビバリルジンは、HPLCにより測定される場合、少なくとも約98.5％の純度を有し、ここで0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.5重量％以下に達し、そして個々の不純物は1.0重量％以下である。好ましくは、高く精製されたビバリルジンは、HPLCにより測定される場合、少なくとも約99.0％の純度を有し、ここで0.5重量％以下の[Asp9−ビバリルジン]を含んで成る合計不純物は1.0重量％以下に達し、そして個々の不純物は0.5重量％以下である。ビバリルジンペプチドの純度の決定のための適切な方法は、HPLCの使用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。ビバリルジンペプチドの純度を決定するための好ましい方法は、逆相C12カラムと共にHPLCシステムを包含し、ここでペプチドは、水中、TFA/アセト二トリルのグラジエントにより溶離される。
【００４３】
もう１つの態様においては、HPLCにより測定される場合、少なくとも約98.5％の純度を有する、高い純度のビバリルジン、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物が供給される。
【００４４】
さらに、もう１つの態様においては、HPLCにより測定される場合、少なくとも98.5％の純度を有するビバリルジンを含んで成る医薬組成物の調製方法が提供され、ここで前記方法は、高酸−不安定樹脂上で、フラグメント又はその全体として、高純度のビバリルジンを調製し、そしてその高純度のビバリルジンと、少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤とを混合することを含んで成る。
【００４５】
本発明の医薬製剤は、高く精製されたビバリルジンを含む。本発明の方法により調製された、高い純度のビバリルジンは、医薬製剤のために理想的である。活性成分の他に、本発明の医薬組成物は、１又は複数の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、種々の目的のために組成物に添加される。
【００４６】
希釈剤は、固体医薬組成物の嵩を高め、そして前記組成物を含む医薬用量形を患者及び取り扱うケアー供与者を、より容易にすることができる。固体組成物のための希釈剤は、例えば微晶性セルロース（例えば、AVICEL（商標））、微小セルロース、ラクトース、スターチ、プレゲル化されたスターチ、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、糖、デキストレート、デキストリン、第二リン酸カルシウム・二水和物、第三リン酸カルシウム、カオリン、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、ポリメタクリレート（例えば、EUDRAGIT（商標））、塩化カリウム、粉末化されたセルロース、塩化ナトリウム、ソルビトール及びタルクを包含する。
【００４７】
投与量形、例えば錠剤に圧縮される固体医薬組成物は、圧縮の後、活性成分及び他の賦形剤を一緒に結合することための賦形剤を含むことができる。固体医薬組成物のための結合剤は、アカシア、アルギン酸、カルボマー（例えば、カルボポール）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、水素化された植物油、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、KLUCEL（商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、METHOCEL（商標））、液体グルコース、珪酸アルミニウム・マグネシウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポビドン（例えば、KOLLIDON（商標）, PLASDONE（商標））、プレゲル化されたスターチ、アルギン酸ナトリウム及びスターチを包含する。
【００４８】
患者の胃における圧縮された固体医薬組成物の溶解速度は、組成物への砕解剤の添加により高められ得る。砕解剤は、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、AC−DI−SOL（商標）, PRIMELLOSE（商標））、コロイド状二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（例えば、KOLLIDON（商標）, POLYPLASDONE（商標））、グアーガム、珪酸アルミニウム・マグネシウム、メチルセルロース、微晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、粉末化されたセルロース、プレゲル化されたスターチ、アルギ酸ナトリウム、ナトリウムスターチグリコレート（例えば、EXPLOTAB（商標））及びスタートを包含する。
【００４９】
潤滑剤は、圧縮されていない固体組成物の流動性を改良するために、及び投与量の精度を改良するために添加され得る。潤滑剤として機能することができる賦形剤は、コロイド状二酸化珪素、三珪酸マグネシウム、粉末化されたセルロース、スターチ、タルク及び第三リン酸カルシウムを包含する。
【００５０】
用量形、例えば錠剤が、粉末化された組成物の圧縮により製造される場合、その組成物は、パンチ及び染料からの圧縮にゆだねられる。パンチ及び染料からの圧縮にゆだねられる。いくつかの賦形剤及び活性成分は、ピット及び他の表面不規則性の生成物による獲得を引起すことができる、パンチ及び染料の表面への付着傾向を有する。滑剤は、付着性を低め、そして染料からの生成物の開放を容易にするために組成物に添加され得る。滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、グリセリルモノステアレート、グルセリルパルミトステアレート、水素化されたヒマシ油、水素化された植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク及びステアリン酸亜鉛を包含する。
【００５１】
風味剤及び風味増強剤は、用量形を、患者に対して口に合うようにする。本発明の組成物に含まれ得る、医薬生成物のための通常の風味剤及び風味増強剤は、マルトール、バニリン、エチルバニリン、メンソール、クエン酸、フマル酸、エチルマルトール及び酒石酸を包含する。
【００５２】
固体及び液体組成物はまた、それらの外観を改良し、そして/又は生成物及び/又は生成物及び単位用量レベルの患者による同定を促進するために、いずれか医薬的に許容できる着色剤を用いて着色され得る。
本発明の液体医薬組成物においては、高い純度のビバリルジン及びいずれか他の固体賦形剤が、液体キャリヤー、例えば水、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリンに溶解されるか又は懸濁される。
【００５３】
液体医薬組成物は、液体キャリヤーに不溶性である活性成分又は他の賦形剤を、組生物を通して均等に分散するために乳化剤を含むことができる。本発明の流体組成物において有用である乳化剤は、例えばゼラチン、卵黄、カゼイン、コレステロール、アカシア、トラガカント、コンドラス、ペクチン、メチルセルロース、カルボマー、セトステアリルアルコール及びセチルアルコールを包含する。
【００５４】
本発明の液体医薬組成物はまた、生成物の口内感触を改良し、そして/又は胃腸管の内層を被覆するために粘度増強剤を含むことができる。そのような剤は、アカシア、アルギン酸ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースカルシウム又はナトリウム、セトステアリルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ゼラチングアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、ポビドン、プロピレンカーボネート、プロピレングリコールアルギネート、アルギン酸ナトリウム、ナトリウムスターチグリコレート、スターチトラガカント及びキサントガムを包含する。
【００５５】
甘味剤、例えばソルビトール、サッカリン、ナトリウムサッカリン、スクロース、アスパータム、フルクトース、マンニトール、及び転化糖が、味覚を改良するために添加され得る。
保存剤及びキレート化剤、例えばアルコール、安息香酸ナトリウム、ブチル化されたヒドロキシルトルエン、ブチル化されたヒドロキシアニソール、及びエチレンジアミン四酢酸が、貯蔵安定性を改良するために摂取のための安全レベルで添加され得る。
【００５６】
本発明によれば、液体組成物はまた、緩衝液、例えばグルコン酸、乳酸、クエン酸又は酢酸、グルコン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、又は酢酸ナトリウムを含むことができる。賦形剤の選択及び使用される量は、この分野における標準の方法及び基準研究の経験及び考慮に基づいて配合科学者により容易に決定され得る。
【００５７】
本発明の固体組成物は、粉末、顆粒、凝集体及び圧縮組成物を包含する。用量は、経口、頬、直腸、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内）、吸入及び眼投与のために適切な用量である。いずれかの所定の場合における最も適切な投与は、処理される病状の性質及び重症度に依存するが、本発明の最も好ましい経路は非経口である。その用量は、単位用量形で便利には提供され、そして医薬業界において良く知られているいずれかの方法により調製され得る。
【００５８】
用量形は、固体用量形、例えば錠剤、粉末、好ましくは凍結乾燥された粉末組成物、カプセル、坐剤、サケット、トローチ及びロゼンジ、並びに液体シロップ、懸濁液及びエリキシルを包含する。
本発明の用量形は、組成物、好ましくは本発明の粉末化された又は顆粒化された固体組成物を含むカプセル（ハード又はソフトシェルのいずれか）であり得る。シェルは、ゼラチンから製造され、そして任意には、可塑剤、例えばグリセリン及びソルビトール、及び不透明剤又は着色剤を含む。
【００５９】
活性成分及び賦形剤は、当業界において知られている方法に従って、組成物及び用量形に配合され得る。アメリカ特許第5,196,404号に記載される医薬的に許容できる組成物の投与量はガイダンスとして使用され得る。
【００６０】
錠剤化又はカプセル充填のための組成物は、湿式顆粒化により調製され得る。湿式顆粒化においては、粉末形での活性成分及び賦形剤のいくらか又はすべてが、ブレンドされ、そして次に、液体、典型的には粉末の顆粒への凝集を引起す水の存在下で、さらに混合される。顆粒はスクリーンされ、そして/又は微粉砕され、乾燥され、そして次に、所望する粒度にスクリーンされ、そして/又は微粉砕される。次に顆粒は錠剤化されるか、又は他の賦形剤、例えば滑剤及び/又は潤滑剤が、錠剤化の前、添加され得る。
【００６１】
錠剤組成物は、便利には、ドライブレンドにより調製され得る。例えば、活性剤及び賦形剤のブレンドされた組成物が、スラグ又はシートに圧縮され、そして次に、圧縮された顆粒に微粉砕される。続いて、圧縮された顆粒が錠剤に圧縮され得る。
【００６２】
乾燥顆粒化に変わるものとして、ブレンドされた組成物は、直接的圧縮技法を用いて、圧縮された用量形に直接的に圧縮され得る。直接的な圧縮は、顆粒を有さないより均等な錠剤を生成する。直接的な圧縮錠剤化のために特に適切である賦形剤は、微晶性セルロース、噴霧乾燥されたラクトース、リン酸二カルシウム・二水和物及びコロイド状シリカを包含する。直接的圧縮錠剤化におけるそれらの及び他の賦形剤の正しい使用は、当業者、特に直接的に圧縮錠剤化の配合専門家に知られている。
【００６３】
本発明のカプセル充填は、錠剤化に関して記載された前述のブレンド及び顆粒のいずれかを含んで成るが、しかしながら、それらは最終錠剤化段階にゆだねられない。
投与量は好ましくは、静脈内ボーラス用量として、又は注入により投与される注入溶液の形で存在する。静脈内ボーラス用量として投与される場合、その好ましい用量は約0.75mg/kgである。好ましい注入用量は、約1.75mg/kg/時である。
【００６４】
もう１つの態様においては、HPLCにより測定される場合、少なくとも約98.5％の純度を有するビバリルジン及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物の治療的有効量を投与することを含んで成る、その必要な患者を処理するための方法が提供される。好ましくは、前記方法は、経皮経管冠動脈形成（PTCA）を受ける不安定狭心症を有する患者に、又は経皮冠動脈介入を受ける患者に抗凝固剤を投与することである。
【００６５】
一定の好ましい態様に関して本発明を記載して来たが、他の態様も、本明細書の考慮から当業者に明らかに成るであろう。本特許出願において言及される引例の開示は、引例により本明細書に組み込まれる。本発明はさらに、アリピペラゾール結晶形の分析、及び本発明の結晶形の調製方法を詳細に記載する次の例により定義される。材料及び方法に対する多くの修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【実施例】
【００６６】
例１：連続的固相合成による高純度ビバリルジンの調製：
ペプチド配列の合成を、２−Cl−Trt−Cl樹脂にFmoc−Leu−OHを負荷することにより開始する段階的Fmoc SPPS（固相ぺプチド合成）により行った。洗浄の後、樹脂（２−Cl−Trt−Cl樹脂、20g）を、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、DMF中、Fmoc−Leu−OH（17.0g）の溶液と共に２時間、撹拌した。樹脂の洗浄の後、Fmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンによる処理により除去した。残留試薬の洗浄の後、第２のアミノ酸（Fmoc−Tyr（tBu））を導入し、第１のカップリング段階を開始した。Fmoc保護されたアミノ酸を、TBTU/HOBt（N−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて現場活性化し、そして続いて、樹脂に50分間、カップリングした。ジイソプロピルエチルアミンを、有機塩基として、カップリングの間、使用した。
【００６７】
カップリングの完結を、ニンヒドロン（Ninhydrine）試験により示した。樹脂の洗浄の後、α−アミン上のFmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンにより20分間、除去した。それらの段階を、ペプチド配列に従って、もう１つのアミノ酸により、それぞれ反復した。使用されるすべてのアミノ酸をFmoc−Nα保護し、但し配列中の最後のアミノ酸Boc−D−Pheを除く。三官能アミノ酸は、次の通りに保護された側鎖であった：Ser(tBu), Arg(Pbf), Tyr(tBu), Asp(OtBu) 及び Glu(OtBu)。三当量の活性化されたアミノ酸を、カップリング反応に使用した。合成の最後で、ペプチド樹脂を、DMF、続いてメタノールにより洗浄し、そして真空下で乾燥し、57gの乾燥ペプチド樹脂を得た。
【００６８】
保護基の同時保護解除を伴って樹脂からのペプチドの分解を次の通りに行った：ａ．上記のようにして得られたペプチド樹脂57gを、95％のTFA、2.5％のTIS, 2.5％のEDTの冷溶液を含む反応器に添加し；ｂ．前記混合物を室温で２時間、混合し；ｃ．生成物を、10体積のエーテル（MTBE）の添加により沈殿し、濾過し、そして真空下で乾燥し、31.7gの粗生成物を得た。
【００６９】
上記で得られる粗ペプチド（31.7g）を、アセト二トリルの水溶液に溶解した。得られる溶液を、C18 RP-HPLCカラム上に負荷し、そして精製し、97.5％以上の純度でのビバリルジンを含む画分を得た。純粋な画分を集め、そして凍結乾燥し、少なくとも99.0％の純度（HPLC）である最終乾燥ペプチド（4.4g）を得た。それは、0.5％以下の[Asp9−ビバリルジン]及び0.5％以下のいずれかの不純物を含んだ。ビバリルジンの純度を、Synergi C12 Max−RP（250×4.6mm, 4μm）カラム上でのHPLCにより決定した。移動相Aは、水中、0.05％（v/v）TFAであり、そして移動相Bは、アセト二トリル中、0.05％（v/v）TFAであった。次のグラジエントを、25μlのサンプルを負荷されたカラムに適用した；t0で、A＝83％、B＝17％、t30で、A＝60％、B＝40％、t33で、A＝10％、B＝90％、及びt38で、A＝10％、B＝90％。流速は、40℃のオーブン温度で1.0ml/分であった。UV−検出器を214nmで設定した。
【００７０】
例２：保護されたフラグメントA[Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly- Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-OH]の調製：
保護されたペプチド配列の合成を、２−Cl−Trt−Cl樹脂にFmoc−Gly−OHを負荷することにより開始する段階的Fmoc SPPS（固相ぺプチド合成）により行った。洗浄の後、樹脂（２−Cl−Trt−Cl樹脂、500g）を、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、DMF中、Fmoc−Gly−OHの溶液と共に２時間、撹拌した。樹脂の洗浄の後、Fmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンによる処理により除去した。残留試薬の洗浄の後、第２のアミノ酸（Fmoc−Asn（Trt）−OH）を導入し、第１のカップリング段階を開始した。Fmoc保護されたアミノ酸を、TBTU/HOBt（N−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて現場活性化し、そして続いて、樹脂に50分間、カップリングした。
【００７１】
ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを、有機塩基として、カップリングの間、使用した。カップリングの完結を、ニンヒドロン（Ninhydrine）試験により示した。樹脂の洗浄の後、α−アミン上のFmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンにより20分間、除去した。それらの段階を、ペプチド配列に従って、もう１つのアミノ酸により、それぞれ反復した。使用されるすべてのアミノ酸をFmoc−Nα保護し、但し配列中の最後のアミノ酸Boc−Phe−OHを除く。三官能アミノ酸は、次の通りに保護された側鎖であった：Arg(Pbf)-OH 及び Asn(Trt)-OH。三当量の活性化されたアミノ酸を、カップリング反応に使用した。合成の最後で、ペプチド樹脂を、DMF、続いてDCMにより洗浄し、そして真空下で乾燥し、1200gの乾燥ペプチド樹脂を得た。
【００７２】
上記のようにして調製されたペプチドを、３回の反復した洗浄（それぞれ15分）により、DCM中、１％TFA溶液を用いて、樹脂から分解した。酸性ペプチド溶液を、DIPEAにより中和した。溶媒を減圧下で蒸発し、そして保護されたペプチドを、10体積の水の添加により沈殿し、濾過し、そして真空下で乾燥し、680gの粉末を得た。それを、Boc-D- Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gry-OHとして同定した。
【００７３】
例３：保護されたフラグメントB Fmoc-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)- Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHの調製：
保護されたペプチド配列の合成を、２−Cl−Trt−Cl樹脂にFmoc-Tyr(tBu)- OHを負荷することにより開始する段階的Fmoc SPPS（固相ぺプチド合成）により行った。洗浄の後、樹脂（２−Cl−Trt−Cl樹脂、1000g）を、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、DMF中、Fmoc-Tyr(tBu)- OHの溶液と共に２時間、撹拌した。樹脂の洗浄の後、Fmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンによる処理により除去した。残留試薬の洗浄の後、第２のアミノ酸（Fmoc-Glu(OtBu)-OH）を導入し、第１のカップリング段階を開始した。Fmoc保護されたアミノ酸を、TBTU/HOBt（N−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いて現場活性化し、そして続いて、樹脂に50分間、カップリングした。
【００７４】
ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを、有機塩基として、カップリングの間、使用した。カップリングの完結を、ニンヒドロン（Ninhydrine）試験により示した。樹脂の洗浄の後、α−アミン上のFmoc保護基を、DMF中、20％ピペリジンにより20分間、除去した。それらの段階を、ペプチド配列に従って、もう１つのアミノ酸により、それぞれ反復した。使用されるすべてのアミノ酸をFmoc−Nα保護した。三官能アミノ酸は、次の通りに保護された側鎖であった：Glu(OtBu)-OH 及び Asp(OtBu)-OH。三当量の活性化されたアミノ酸を、カップリング反応に使用した。合成の最後で、ペプチド樹脂を、DMF、続いてDCMにより洗浄し、そして真空下で乾燥し、2600gの乾燥ペプチド樹脂を得た。
【００７５】
上記のようにして調製されたペプチドを、３回の反復した洗浄（それぞれ15分）により、DCM中、１％TFA溶液を用いて、樹脂から分解した。酸性ペプチド溶液を、DIPEAにより中和した。溶媒を減圧下で蒸発し、そして保護されたペプチドを、10体積の水の添加により沈殿し、濾過し、そして真空下で乾燥し、1650gの粉末を得た。それを、Fmoc- Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OHとして同定した。
【００７６】
例４：Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)‐Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBuの調製：
Fmoc-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-OH（1650g）をDMFに溶解し、そしてLeu−OtBu（224g）を室温で添加した。その混合物を反応器において撹拌し、そして−50℃に冷却した。DMF中、HOBtの溶液（300ml中、153g）、続いてDMF中、TBTUの溶液（１L 中、321g）を添加した。最終的に、DIPEA（340ml）を添加し、そして反応を室温で３時間、続けた。反応の完結を、HPLC分析によりモニターした。
【００７７】
Fmoc基を、反応混合物中への室温でのピペリジン（450ml）の添加により除去した。反応の完結を、HPLCによりモニターした。混合物を、減圧下でDMFの部分的蒸発により濃縮した。保護されるペプチドを、水の添加により沈殿した。それを分離し、洗浄し、そして乾燥し、1575gの粉末を得た。それを、Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)‐Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBuとして同定した。
【００７８】
例５：ビバリルジンの調製：
BoC-D-PhC-PrO-ATg(Pbf)-Pro-GIy-GIy-GIy-GIy-Asn(Trt)-GIy-OH (170 g)及びAsp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBu（252g）を、DMF（2L）に溶解した。コリジン（20ml）、続いてDMF中、TBTUの溶液（180ml中、35g）を添加した。その混合物を室温で撹拌し、そしてもう１つの部分のTBTU及びコリジンを、２時間後、添加し、反応を完結した。カップリング反応の完結に基づいて（HPLCによりモニターされる）、DMFを減圧下で蒸発し、そして保護されたビバリルジンを水において沈殿した。沈殿物を乾燥し、416gのBoc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(tBu)-Phe-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ile-Pro-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-OtBuを得た。
【００７９】
保護されたビバリルジンを、５％DDM及び2.5％水を含む冷TFA溶液に溶解した。その溶液を、室温で１時間、撹拌した。それを蒸発器上で濃縮し、そして冷MTBE（10体積）に添加した。沈殿されたビバリルジンを、濾過により分離し、そして乾燥し、355gの組生成物を得た。
【００８０】
上記で得られる粗ペプチド（355g）を、アセト二トリルの水溶液に溶解した。得られる溶液を、C18 RP-HPLCカラム上に負荷し、そして精製し、97.5％以上の純度でのビバリルジンを含む画分を得た。純粋な画分を集め、そして凍結乾燥し、少なくとも99.0％の純度（HPLC）である最終乾燥ペプチド（110g）を得た。それは、0.5％以下の[Asp9−ビバリルジン]及び0.5％以下のいずれかの不純物を含んだ。
【国際調査報告】
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