(57)【要約】  組換えタンパク質発現、例えばＡβペプチド結合抗体の発現を高め、かつ／または誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副生成物を減少若しくは排除するように改変された核酸分子が開示される。本発明はまた、組換えのＡβペプチド結合抗体の発現に適する細胞培養条件下でのこうした核酸分子の発現による、誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー副生成物を欠くＡβペプチド結合抗体の製造方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在するゲノム配列に比較して最低１個のイントロン配列が誤ってスプライスされた若しくはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副生成物を減少させるように欠失されている、１個若しくはそれ以上のイントロンおよびエキソン配列を有するヌクレオチド配列を含んでなる、Ａβ抗体鎖をコードする核酸分子。
【請求項２】
天然に存在するゲノム配列に比較して最低１個のイントロン配列がタンパク質発現を高めるように欠失されている、１個若しくはそれ以上のイントロンおよびエキソン配列を含んでなるヌクレオチド配列を含んでなる、Ａβ抗体鎖をコードする核酸分子。
【請求項３】
最低３個のイントロン配列が欠失されている、請求項１若しくは２に記載の核酸分子。
【請求項４】
抗体鎖がＨ鎖若しくはそのフラグメントである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５】
抗体Ｈ鎖若しくはそのフラグメントが、ヒト免疫グロブリンＧサブタイプのＨ鎖可変領域、ヒンジ領域、第一の定常領域（ＣＨ１）、第二の定常領域（ＣＨ２）および第三の定常領域（ＣＨ３）を含んでなる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
免疫グロブリンＧサブタイプがヒトＩｇＧ１若しくはヒトＩｇＧ４である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１若しくはヒトＩｇＧ４が変異されている、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ２領域とＣＨ３領域の間のイントロンが欠失されている、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項９】
ＣＨ１領域とヒンジ領域の間のイントロンの欠失をさらに含んでなる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ヒンジ領域とＣＨ２領域の間のイントロンの欠失をさらに含んでなる、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１１】
Ｈ鎖可変領域とＣＨ１領域の間の１個のイントロンを含んでなるＨ鎖を有する、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項１２】
Ｈ鎖ヒンジ領域、ならびに第一、第二および第三の定常領域をコードするヌクレオチド配列が、図８に示されるヌクレオチド配列（配列番号１）に最低９５％同一の配列を含んでなる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項１３】
Ｈ鎖ヒンジ領域、ならびに第一、第二および第三の定常領域をコードするヌクレオチド配列が、図９に示されるヌクレオチド配列（配列番号３）に最低９５％同一の配列を含んでなる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項１４】
ＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの欠失が、図８（配列番号１）に示されるところのヒトＩｇＧ１のほぼヌクレオチド１４０９ないし１５０５に対応する、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１５】
ＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの欠失が、図９（配列番号３）に示されるところのヒ
トＩｇＧ４のほぼヌクレオチド１４０１ないし１４９７に対応する、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロンの欠失が、図８（配列番号１）に示されるところのヒトＩｇＧ１のほぼヌクレオチド５２５ないし９１５に対応する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１７】
ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロンの欠失が、図９（配列番号３）に示されるところのヒトＩｇＧ４のほぼヌクレオチド５２５ないし９１６に対応する、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１８】
ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロンの欠失が、図８（配列番号１）に示されるところのヒトＩｇＧ１のほぼヌクレオチド９６１ないし１０７８に対応する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１９】
ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロンの欠失が、図９（配列番号３）に示されるところのヒトＩｇＧ４のほぼヌクレオチド９５３ないし１０７０に対応する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ヒトＩｇＧ１をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、図１０に示される配列（配列番号５）に最低９０％同一である、上記分子。
【請求項２１】
ヒトＩｇＧ４をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、図１１に示される配列（配列番号６）に最低９０％同一である、上記分子。
【請求項２２】
ヒトＨ鎖定常領域若しくはその変異された形態をコードするゲノムヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、天然に存在するゲノム配列中に存在する最低１個のイントロンを欠いており、かつ、前記イントロンがイントロンリードスルーを助長する、上記配列。
【請求項２３】
ヒトＩｇＧ１若しくはその変異された形態をコードするゲノムヌクレオチド配列であって、前記ヌクレオチド配列が、天然に存在するゲノム配列中に存在する最低１個のイントロンを欠いており、かつ、前記イントロンがイントロンリードスルーを助長する、上記配列。
【請求項２４】
最低１個のイントロンが、定常領域のＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンである、請求項２２若しくは２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
ヒトＩｇＧ４若しくはその変異された形態をコードするゲノムヌクレオチド配列であって、前記ゲノム配列が、天然に存在するゲノム配列中に存在する３個のイントロンを欠いている、上記配列。
【請求項２６】
イントロンが、ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンである、請求項２５に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−ＣＨ３
式中、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＨｉｎｇｅはＨ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列であり；ならびにＩｎｔ１、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３はＨ鎖ゲノム配列からのイントロンである、
により表されるヌクレオチド配列を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合する抗体をコードする核酸分子。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリンＧ  Ｈ鎖をコードする、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３
式中、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＨｉｎｇｅはＨ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列であり；ならびにＩｎｔ１はＨ鎖ゲノム配列からのイントロンである、
により表されるヌクレオチド配列を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合する抗体をコードする核酸分子。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリンＧ  Ｈ鎖をコードする、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項５に記載の核酸分子を含んでなる発現カセット。
【請求項３２】
請求項５に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項３３】
宿主細胞中での複製、選択、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡの安定性、タンパク質発現若しくはタンパク質分泌を高める１種若しくはそれ以上のヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
請求項５に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３１に記載の発現カセットを含んでなる宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３２に記載の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
請求項５に記載の核酸分子を哺乳動物宿主細胞に導入すること；
該組換え抗体若しくはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養して、それにより宿主細胞の培養物を生じさせること；および
宿主細胞の培養物から組換え抗体若しくはそのフラグメントを得ること
を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合しかつイントロンリードスルー（ＩＲＴ）生成物を実質的に含まない組換え抗体若しくはそのフラグメントの発現方法。
【請求項３９】
宿主細胞からの核酸サンプル中のＩＲＴ生成物を同定する段階をさらに含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
同定段階が、
宿主細胞の培養物から核酸サンプルを得ること；
核酸サンプルと、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸サンプルを該プローブと接触させること；
生じる複合体を検出することであって、イントロン配列に相補的な核酸プローブを使用しての前記サンプル中の複合体の検出が、ＩＴＲ生成物の存在を暗示する、
を含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、Ｌ鎖可変領域および定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
請求項５に記載の核酸分子を哺乳動物宿主細胞に導入すること；
組換え抗体の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養して、それにより宿主細胞の培養物を生じさせること；および
宿主細胞の培養物から組換え抗体を得ること
を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合する組換え抗体若しくはそのフラグメントの発現を高める方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、Ｌ鎖可変領域および定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項５に記載の核酸分子、およびＡβペプチドを選択的に結合する抗体の抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含んでなる哺乳動物宿主細胞を、ＨおよびＬ鎖が発現されるような条件下で培養すること
を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合しかつイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物を実質的に欠く組換え抗体若しくはそのフラグメントの製造方法。
【請求項４５】
培養物からＨおよびＬ鎖を精製することをさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項５に記載の核酸分子、およびＡβペプチドを選択的に結合する抗体の抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含んでなる哺乳動物宿主細胞を、ＨおよびＬ鎖が発現されるような条件下で培養すること
を含んでなる、Ａβペプチドを選択的に結合する組換え抗体若しくはそのフラグメントの発現を高める方法。
【請求項４７】
培養物からＨおよびＬ鎖を精製することをさらに含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
核酸サンプルを組換え細胞から得ること；
該核酸サンプルならびにイントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸サンプルを該プローブと接触させること；
生じる複合体を検出することであって、イントロン配列に相補的な核酸プローブを使用しての前記サンプル中の複合体の検出が、ＩＲＴ生成物の存在を暗示する、
を含んでなる、サンプル中のＩＲＴ生成物の検出方法。
【請求項４９】
抗体若しくはフラグメントの発現および集成を可能にするのに適する条件下で、請求項４０に記載の段階を含んでなる方法により作成された、Ａβペプチドを選択的に結合する
抗体若しくはその抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体である、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
ヒト化抗体である、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
ヒト５Ｔ４に結合する、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５３】
請求項４９に記載の抗体および製薬学的に許容できる担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項５４】
改変された効果的に関連付けられているヒトゲノムイントロンおよびエキソン配列を含んでなり、該イントロンおよびエキソン配列の天然の効果的関連の改変が、イントロンリードスルーＨ鎖副生成物の発現を減少若しくは排除する、Ａβペプチドを選択的に結合する抗体Ｈ鎖をコードする単離された核酸分子。
【請求項５５】
前記Ｈ鎖の発現が、天然の効果的関連にあるヒトゲノムイントロンおよびエキソン配列を含んでなる核酸分子に関して高められる、請求項５４に記載の単離された核酸分子。
【請求項５６】
ゲノムエキソン配列が、可変領域、ヒンジ領域、ならびに第一、第二および第三の定常領域をコードする、請求項５５に記載の核酸分子。
【請求項５７】
第一、第二および第三の定常領域がＩｇＧ１定常領域である、請求項５６に記載の核酸分子。
【請求項５８】
第一、第二および第三の定常領域がＩｇＧ４定常領域である、請求項５６に記載の核酸分子。
【請求項５９】
可変領域がヒト化可変領域である、請求項５６に記載の核酸分子。
【請求項６０】
可変領域がＡβペプチドに特異的に結合する、請求項５６〜５９に記載の核酸分子。
【請求項６１】
可変領域が、マウス３Ｄ６抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、請求項５６〜５９に記載の核酸分子。
【請求項６２】
１個のイントロン配列を含んでなる、請求項５４に記載の核酸分子。
【請求項６３】
２個のイントロン配列を含んでなる、請求項５４に記載の核酸分子。
【請求項６４】
３個のイントロン配列を含んでなる、請求項５４に記載の核酸分子。
【請求項６５】
第一、第二および第三の定常領域をコードするエキソンに作動可能に連結された可変領域をコードするエキソンを含んでなる、Ａβペプチド結合抗体のＨ鎖をコードする核酸分子であって、前記核酸分子は最低１個のイントロン配列をさらに含んでなり、前記イントロン配列は、前記イントロンを含まないＡβペプチド結合抗体のＨ鎖をコードする核酸分子に関して、前記核酸分子からの前記Ｈ鎖の発現を高め、また、前記核酸分子がイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物の翻訳に至らない、上記核酸分子。
【請求項６６】
先行する請求項のいずれか１つに記載の核酸分子を含んでなる発現カセット。
【請求項６７】
先行する請求項のいずれか１つに記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項６８】
選択可能なマーカーをコードする遺伝子および配列内リボソーム進入部位配列（ＩＲＥＳ）をさらに含んでなる、請求項６７に記載の発現ベクター。
【請求項６９】
請求項５４〜６８のいずれか１つに記載の核酸分子を含んでなる細胞。
【請求項７０】
請求項６６に記載のカセットを含んでなる哺乳動物細胞。
【請求項７１】
請求項６７若しくは６８に記載のベクターを含んでなる哺乳動物細胞。
【請求項７２】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項７０若しくは７１に記載の細胞。
【請求項７３】
以下の式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−ＣＨ３、
式中、ＶＨはいずれかのＨ鎖可変領域をコードするエキソンであり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、天然に存在するＩｇＧ１  Ｈ鎖遺伝子由来のヒトＨ鎖定常領域をコードするエキソンであり；
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３は前記遺伝子由来の対応するイントロンであり、かつ、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３は場合によっては存在し；ならびに
Ｈｉｎｇｅは前記遺伝子由来のヒンジをコードするエキソンである、
を有する、ＩｇＧ１  Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列。
【請求項７４】
Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３が存在する、請求項７３に記載の配列。
【請求項７５】
ＨおよびＬ鎖がイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物の非存在下で発現されかつ効果的に関連するような条件下で、Ａβペプチド結合抗体のＬ鎖をコードする核酸分子をさらに含んでなる請求項７０〜７２のいずれか１つに記載の細胞を培養すること
を含んでなる、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物を実質的に欠く抗体調製物の製造方法。
【請求項７６】
抗体鎖が配列番号１２として示される配列を有する、請求項１若しくは２に記載の核酸分子。
【請求項７７】
抗体鎖が配列番号１３として示される配列を有する、請求項１若しくは２に記載の核酸分子。
【請求項７８】
配列番号６〜１１のいずれか１つの核酸によりコードされる定常領域、および配列番号２の核酸によりコードされる可変領域を含んでなるＨ鎖を含んでなるＡβ抗体。
【請求項７９】
配列番号６〜１１のいずれか１つの核酸によりコードされる定常領域、および配列番号４の核酸によりコードされる可変領域を含んでなるＨ鎖を含んでなるＡβ抗体。
【請求項８０】
配列番号６〜１１のいずれか１つの核酸によりコードされる定常領域、および図１２−１４若しくは１６Ｃ−Ｄのいずれかに示されるアミノ酸配列を有する可変領域を含んでなるＨ鎖を含んでなるＡβ抗体。
【請求項８１】
図１５若しくは１６Ａ−Ｂの１つに示されるところの対応するＬ鎖をさらに含んでなる
、請求項７８〜８０のいずれか１つに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００４年１０月５日出願の米国特許出願第６０／６１６，４７４号（その内容全体はここに引用することにより組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の製造のための発現ベクターは、少なくとも１９８０年代中期以降存在している。典型的には、組換えタンパク質発現のためのベクターに基づく戦略は、主として、基礎研究において、およびタンパク質調製物の絶対的な純度が決定的でない小スケール実験のため使用されてきた。対照的に、組換えタンパク質を治療的応用に使用する場合は、少量の汚染物質であっても、例えば誤ってスプライスされた（ｍｉｓ−ｓｐｌｉｃｅｄ）若しくはイントロンリードスルー（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）副生成物の存在は、生じる治療的タンパク質の活性および収量を低下させ得る。誤ってスプライスされた若しくはリードスルータンパク質配列を有する治療的タンパク質の患者への投与は、望ましくない副作用の可能性を増大させうる。
【０００３】
こうした副生成物はまた製造にとっても厄介である。副生成物の存在は精製工程を損ない得る。こうした副生成物は、典型的に、大きさ、親和性若しくは生物活性に関して所望のタンパク質に類似であるためである。なおさらに、組換え宿主細胞を使用するタンパク質発現をスケールアップすることは、典型的には、とりわけ最適未満の細胞培養条件下で細胞を培養する場合に、所望の生成物に比較して増大する量の副生成物をもたらす。こうした最適以下の細胞培養条件は、大スケールのタンパク質製造、例えば生物醗酵槽の運転の最後で、若しくは他の理由から大スケール培養の健全な状態が劣化する場合に頻繁に存在する。
【０００４】
従って、とりわけ治療的タンパク質の大スケール生産のための組換えタンパク質の製造の改良方法に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００５】
［発明の要約］
本発明は、組換えタンパク質若しくはペプチドの発現および／若しくは製造を改良するための方法および組成物を提供する。一態様において、誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー副生成物を減少若しくは排除し、かつ／または組換えタンパク質の発現を高めるよう改変されている核酸分子が提供される。ある態様において、該核酸は組換え抗体（本明細書で免疫グロブリンともまた称される）若しくはそれらのフラグメントをコードする。
【０００６】
本発明はさらに、誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー副生成物を減少若しくは排除しかつ／または組換えタンパク質発現を高めるよう改変されたベクター（例えば発現ベクター）；こうした核酸分子およびベクターを包含する宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞；ならびに例えば大スケールで組換えタンパク質若しくはペプチドを製造するためのこうした細胞の培養方法を包含する。誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー生成物を実質的に含まない組換えタンパク質若しくはペプチド、例えば抗体の組成物、例えば製薬学的組成物もまた開示される。これらの組成物は、例えば神経変性および悪性の障害の処置を包含する治療的使用に適する。
【０００７】
とりわけ、本発明は、神経変性疾患の処置における使用のための治療的抗体を発現させ
るための組成物および方法を提供する。例えば単位用量あたりの該分子の治療活性が維持されかつ精製が向上されるような、こうした抗体の完全性はとりわけ重要である。特化された機能、すなわち、ある種の生物学的適応症、例えば、治療的ポリペプチドが血液脳関門（ＢＢＢ）を横断しかつ脳中の標的抗原を結合する神経変性状態の処置における使用に意図されるこうしたタンパク質の純度を向上させるための緊急の所望が存在する。本発明により製造される例示的一抗体は、神経変性疾患の標的、例えばアルツハイマー病のアミロイドタンパク質、すなわちアミロイドβペプチド（Ａβ）を結合するための高純度で製造される抗体である。
【０００８】
従って、一局面において、本発明は１個若しくはそれ以上のイントロンおよびエキソン配列を有するヌクレオチド配列を包含する核酸分子（例えば改変若しくは組換え核酸分子）を特徴とし、最低１個のイントロン配列は、タンパク質発現を高めかつ／または誤ってスプライスされた若しくはイントロンリードスルー（ＩＴＲ）副生成物（１種若しくは複数）を減少若しくは排除するために天然に存在する配列に比較して改変されている。一態様において、該核酸分子は、天然に存在する配列（例えばゲノム配列）に関して、所望のタンパク質若しくはペプチド、例えば抗体若しくはそのフラグメント（例えば免疫グロブリンＨ鎖）の高められた発現を指図しかつ／またはそのイントロンリードスルー（ＩＴＲ）副生成物（１種若しくは複数）を減少若しくは排除する。該タンパク質若しくはペプチドは哺乳動物起源、例えばヒト若しくはネズミ、典型的にはヒト起源のものであり得る。本明細書に記述される核酸分子は、天然に存在する配列から改変された形態を指すことが理解される。いくつかの態様において、該核酸分子は単離若しくは精製されている。他の態様において、それは組換え分子である。
【０００９】
一態様において、核酸分子は、天然に存在する配列（例えばゲノム配列）に比較して最低１、２、３個のイントロン、若しくは１個を除き全部までのイントロンが欠失されている。例えば、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）を助長するイントロンを、天然に存在する配列から欠失させ得る。他の態様において、核酸分子は：イントロン／エキソンの構成（例えばイントロン／エキソンの５’から３’の順序）を再配列すること；１個若しくはそれ以上のイントロンの一部分を欠失すること；または１個のイントロン若しくはその一部分を異種イントロン配列で置換することの１種若しくはそれ以上により改変されて、その結果、高められたタンパク質発現および／または誤ってスプライスされた若しくはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副生成物（１種若しくは複数）の減少若しくは排除が起こる。
【００１０】
関係する一態様において、該核酸分子は、抗体Ｈ鎖若しくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列（例えばヒトゲノム配列）を包含する。例えば、ヌクレオチド配列は、免疫グロブリンの１サブタイプ、例えば免疫グロブリンＧサブタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４抗体サブタイプ）のＨ鎖可変領域、ヒンジ領域、ならびに第一、第二および第三の定常領域（例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）をコードする１種若しくはそれ以上のヌクレオチド（例えばエキソン）配列を包含し得る。典型的には、免疫グロブリンサブタイプは哺乳動物起源、例えばネズミ若しくはヒトからである。一態様において、ヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４、またはそれらの変異されたバージョンが選ばれる。例えば、免疫グロブリンの定常領域を：増大された安定性、低下されたエフェクター機能若しくは低下された補体固定の１種若しくはそれ以上をもたらすように変異させ得る。一態様において、ヒトＩｇＧ４を、安定性を増大させる（例えばヒンジ領域の安定性を増大させるための残基２４１のセリンからプロリンへの置換を有する）ように変異させる。他の態様において、定常領域はグリコシル化を低下させるように変異させる。
【００１１】
一態様において、核酸分子は、該配列のイントロンリードスルーを助長する最低１個の
イントロンを欠失させるよう改変される。例えば、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンを欠失させ得る。個別に若しくは組合せで欠失させ得る他のＨ鎖免疫グロブリンイントロンの例は、Ｈ鎖可変領域と免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ１の間のイントロン、ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、およびヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロンを包含する。前述のイントロンの２、３個のイントロン、若しくは１個を除き全部までのイントロンの組合せを包含する、先行するイントロンのいずれの組合せも欠失させ得る。いくつかの態様において、Ｈ鎖定常領域の３個のイントロン、例えば、ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンを欠失させる。Ｈ鎖免疫グロブリンのイントロン欠失の以下の例示的組合せ、すなわち、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロン；ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、およびヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン；ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンもまた本発明の範囲内にある。
【００１２】
いくつかの態様において、核酸分子は、式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−Ｉｎｔ４−ＣＨ３、
式中、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり；ならびに
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４はＨ鎖ゲノム配列からのイントロンである、
により表されるヌクレオチド配列を包含する。一態様において、本明細書でＩｎｔ４として表されるＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンが欠失される。他の態様において、本明細書でＩｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４として表される、ＣＨ１とヒンジ領域の間、ヒンジ領域とＣＨ２の間、および／若しくはＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの１、２若しくは典型的には３個が欠失される。Ｈ鎖ゲノム配列のイントロン／エキソンの配置の付加的な図解を、図１、５および７に示す。
【００１３】
典型的には、最低１個のイントロン、例えば、本明細書でＩｎｔ１として表されるＨ鎖可変領域とＣＨ１の間のイントロンが、該核酸分子中に存在する。個別に若しくは組合せで存在し得る他のＨ鎖免疫グロブリンイントロンの例は、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン；ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン；およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンを包含する。改変した核酸分子中に最低１個のイントロンを包含することがしばしば望ましい。理論により束縛されることなく、イントロンは、転写速度、ポリアデニル化、ｍＲＮＡの輸出、翻訳効率およびｍＲＮＡの崩壊を包含するタンパク質産生過程の多数の事象に影響すると考えられる。
【００１４】
一態様において、核酸分子は、式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−ＣＨ３、
式中、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり
；ならびに
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３はＨ鎖ゲノム配列からのイントロンである、
により表されるヌクレオチド配列を包含する。一態様において、ヌクレオチド配列は、例えば構造若しくは機能を変える介在配列を伴わない、上で描かれた構成要素より本質的になる。
【００１５】
他の態様において、核酸分子は、式：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３、
式中、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列、例えば天然に存在するか若しくは変異された形態のヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子であり；ならびに
Ｉｎｔ１はＨ鎖ゲノム配列からのイントロンである、
により表されるヌクレオチド配列を包含する。一態様において、ヌクレオチド配列は、例えば構造若しくは機能を変える介在配列を伴わない、上に描かれた構成要素より本質的になる。
【００１６】
ヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を図８（それぞれ配列番号１および２）に示す。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれ、図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド２３１ないし５２４、９１６ないし９６０、１０７９ないし１４０８および１５０６ないし１８２９に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれ、図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド１から２３０まで、ほぼヌクレオチド５２５ないし９１５、ほぼヌクレオチド９６１ないし１０７８、およびほぼヌクレオチド１４０９ないし１５０５に位置するヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖ゲノム配列からのイントロンに対応する。
【００１７】
変異されたヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を図９（それぞれ配列番号３および４）に示す。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれ、図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド２３１ないし５２４、９１６ないし９５２、１０７１ないし１４００、および１４９８ないし１８２０に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれ、図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド１から２３０まで、ほぼヌクレオチド５２５ないし９１６、ほぼヌクレオチド９５３ないし１０７０、およびほぼヌクレオチド１４０１ないし１４９７に位置するヒトＩｇＧ４  Ｈ鎖ゲノム配列からのイントロンに対応する。
【００１８】
本発明の改変された核酸分子の例は、図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド１４０９ないし１５０５に対応するヒトＩｇＧ１、若しくは図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド１４０１ないし１４９７に対応する変異されたヒトＩｇＧ４のＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの欠失を有するヒトゲノムＨ鎖定常領域配列を包含する。個々に若しくは組合せで欠失し得る他のＨ鎖免疫グロブリンイントロンの例は、図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド１ないし２３０に対応するヒトＩｇＧ１、若しくは図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド１ないし２３０に対応する変異されたヒトＩｇＧ４のＨ鎖可変領域とＣＨ１の間のイントロン；図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド５２５ないし９１５に対応するヒトＩｇＧ１、若しくは図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド５２５ないし９１６に対応する変異されたヒトＩｇＧ４のＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン；および、図８（配列番号１）のほぼヌクレオチド９６１ないし１０７８に対応するヒトＩｇＧ１、若しくは図９（配列番号３）のほぼヌクレオチド９５３ないし１０７０に対応する変異されたヒ
トＩｇＧ４のヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロンを包含する。前述のイントロンの２、３、４個のイントロン若しくは１個を除き全部までのイントロンの組合せを包含する、先行するイントロンのいかなる組合せも欠失し得る。いくつかの態様において、Ｈ鎖定常領域の３個のイントロン、例えば、ＣＨ１とヒンジ領域の間、ヒンジ領域とＣＨ２の間、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンが欠失される。いくつかの態様において、核酸分子は、本明細書に開示されるヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４のエキソンのヌクレオチド配列の１種若しくはそれ以上およびイントロンのヌクレオチド配列の１種若しくはそれ以上（しかし全部ではない）、またはそれらに実質的に同一の配列を包含する。関連する一態様において、核酸分子は、本明細書に開示されるヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４のイントロンのヌクレオチド配列の１種若しくはそれ以上（しかし全部ではない）またはそれらに実質的に同一の配列に１個の欠失を有する。
【００１９】
一態様において、改変された核酸分子は、図１０（配列番号５）として示されるヒトＩｇＧ１をコードするヌクレオチド配列、あるいはそれに実質的に同一の配列（例えば、配列番号５に最低８５％、９０％、９５％若しくは９９％同一の、または配列番号５のヌクレオチド配列に比較して１、５、１０、５０若しくはそれ以上のヌクレオチド変化を有する配列）を包含する。
【００２０】
別の態様において、改変された核酸分子は、図１１（配列番号６）として示される改変されたヒトＩｇＧ４のヌクレオチド配列、あるいはそれに実質的に同一の配列（例えば、配列番号６に最低８５％、９０％、９５％若しくは９９％同一、または配列番号６のヌクレオチド配列に比較して１、５、１０、５０若しくはそれ以上のヌクレオチド変化を有する配列）を包含する。
【００２１】
改変された核酸分子は、ＬおよびＨ鎖抗体若しくは免疫グロブリン配列をコードするヌクレオチド配列を包含し得る。こうした配列は、同一核酸分子（例えば同一の発現ベクター）中に存在し得るか、若しくは、あるいは、別個の核酸分子（例えば別個の発現ベクター）から発現させ得る。典型的には、コードされる抗体若しくは免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントは、最低１、および好ましくは２個の完全長Ｈ鎖、ならびに最低１、および好ましくは２個のＬ鎖を包含し得る。あるいは、コードされる免疫グロブリン若しくはそれらのフラグメントは、抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ若しくは一本鎖Ｆｖフラグメント）のみを包含し得る。抗体若しくはそのフラグメントはモノクローナルすなわち単一特異性抗体であり得る。抗体若しくはそのフラグメントは、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体でもまたあり得る。なお他の態様において、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥから選ばれた；より具体的には例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選ばれたＨ鎖定常領域を有する。別の態様において、抗体は例えばκ若しくはλから選ばれたＬ鎖を有する。
【００２２】
別の態様において、核酸分子は、可変領域、例えばヒト化、キメラ、ＣＤＲ移植若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された可変領域を包含する。典型的には、可変領域は、予め決められた抗原、例えば障害、例えば神経変性若しくは悪性障害と関連する抗原に特異的に結合する。
【００２３】
一態様において、障害は神経変性障害であり、そして、抗体は、アミロイドタンパク質、例えばＡβペプチド（例えばヒトＡβペプチド）に結合する。例えば、抗体は、ネズミの抗体、例えばマウス抗Ａβ  ３Ｄ６抗体、若しくはマウス抗Ａβ  １２Ａ１１抗体、若しくはマウス抗Ａβ  １０Ｄ５抗体、若しくはマウス抗Ａβ  １２Ｂ４抗体からの１個若しくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するＨ鎖およびＬ鎖可変領域を有するＡβペプチドに対するヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体の可変領域は、典型的に、ヒト
若しくは実質的にヒトのフレームワーク領域を包含する。一態様において、核酸分子は、ヒト化抗Ａβペプチド抗体のＨおよびＬ鎖可変領域を包含する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、前述の改変された核酸分子の１種若しくはそれ以上を包含するベクター（例えば発現ベクター）を特徴とする。該ベクターは、付加的に：宿主細胞中での複製、選択、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡの安定性、タンパク質発現若しくはタンパク質分泌の１種若しくはそれ以上を高めるヌクレオチド配列を包含し得る。例えば、ベクターは、複製若しくはエンハンサーの発現を司るヌクレオチド配列、エンハンサープロモーター要素、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列、選択可能なマーカー（例えばＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、配列内リボソーム進入部位配列（ＩＲＥＳ）およびポリアデニル化配列を包含しうる。
【００２５】
別の局面において、本発明は、前述の核酸分子および／若しくはベクター、例えば発現ベクターの１種を包含する細胞、例えば真核生物宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を提供する。該細胞は、本発明の核酸配列で一過性に若しくは安定にトランスフェクトし得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、参照、例えば天然に存在するゲノム配列に比較して、組換えタンパク質若しくはペプチド、例えば抗体の発現を高める方法、または組換えタンパク質若しくはペプチド、例えば誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー生成物の低下されたレベルを有する（例えばそれらを実質的に含まない）抗体の発現方法を提供する。該方法は、本明細書に記述されるところの核酸分子を宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）に導入すること；該組換えタンパク質若しくはペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養して宿主細胞の培養物を生じさせること；および、場合によっては、宿主細胞の培養物（例えば宿主細胞上清）から該組換えタンパク質若しくはペプチドを得る、例えば精製することを包含する。
【００２７】
該方法はさらに、核酸サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な、若しくは、あるいは、隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと、該核酸サンプルおよび該プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させること；生じる複合体を、例えば該プローブ配列のＰＣＲ増幅により検出することによる、核酸サンプル、例えば宿主細胞からのｍＲＮＡサンプル中のＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物を同定する（例えば検出および／若しくはそのレベルを測定する）段階を包含し得る。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含有するサンプル中の複合体の検出、例えばＰＣＲ増幅生成物は、ＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物の存在を暗示する。ＩＲＴ生成物のレベルは例えば実施例１に記述されるとおり定量し得る。
【００２８】
別の局面において、標準的参照、例えば天然に存在するゲノム配列に比較して減少されたイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物を有する（例えばそれを実質的に欠く）抗体若しくはそのフラグメントの製造方法が提供される。該方法は、本明細書に記述されるところの核酸分子、および場合によっては抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含有する細胞、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）を、該ＨおよびＬ鎖が発現されかつ場合によっては効果的に関連するような条件下で培養することを包含する。該抗体若しくはそのフラグメントは場合によっては細胞培養物から精製する。典型的には、抗体若しくはそのフラグメントは、減少された誤ってスプライスされた若しくはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副生成物を有する。
【００２９】
該方法は、宿主細胞からのサンプル、例えばｍＲＮＡサンプル中のＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物を検出かつ／若しくはそのレベル測定する段階；前記サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な、若しくは、あるいは、隣接エキソン配列に相補的な核
酸プローブと、該核酸サンプルおよびプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させる段階；生じる複合体を、例えば該プローブ配列のＰＣＲ増幅により検出する段階をさらに包含し得る。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含有するサンプル中の複合体、例えばＰＣＲ増幅産物の検出は、ＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物の存在を暗示する。ＩＲＴ生成物のレベルは例えば実施例１に記述されるとおり定量し得る。
【００３０】
別の局面において、本発明は、ゲノムＨ鎖配列から最低１個のイントロン（前記イントロンはＩＲＴを助長する）を欠失させることにより前記配列から発現されるイントロンリードスルー（ＩＲＴ）抗体Ｈ鎖副生成物の減少方法を提供する。
【００３１】
別の局面において、本発明は、サンプル、例えば核酸サンプル中のＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物の同定（例えば検出および／若しくはそのレベルの測定）方法を特徴とする。該方法は：細胞、例えば組換え細胞（例えば本明細書に記述されるところの宿主細胞）から核酸サンプル、例えばｍＲＮＡサンプルを得ること；前記核酸サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な、若しくは、あるいは、隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと、該核酸サンプルおよび該プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させること；生じる複合体を、例えば該プローブ配列のＰＣＲ増幅により検出することを包含する。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含有するサンプル中の複合体、例えばＰＣＲ増幅生成物の検出は、ＩＲＴ若しくはＩＲＴ生成物の存在を暗示する。ＩＲＴ生成物のレベルは、例えば実施例１に記述されるとおり定量し得る。
【００３２】
別の局面において、本発明は、本明細書に開示される方法により製造される、参照、例えば天然に存在するゲノム配列に比較して減少された誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー生成物を有する（例えばそれらを実質的に含まない）、抗体（例えば組換え抗体）若しくはそのフラグメントを特徴とする。一態様において、該抗体若しくはそのフラグメントはキメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体である。典型的には、該抗体若しくはそのフラグメントは、予め決められた抗原、例えば障害、例えば神経変性障害と関連する抗原に特異的に結合する可変領域を有する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、参照、例えば天然に存在するゲノム配列に比較して減少された誤ってスプライスされたおよび／若しくはイントロンリードスルー生成物を有する（例えばそれらを実質的に含まない）組換えタンパク質若しくはペプチド、例えば抗体、ならびに製薬学的に許容できる担体を含有する組成物、例えば製薬学的組成物を提供する。これらの組成物は、例えば神経変性障害の処置を包含する治療的使用に適する。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求の範囲から明らかであろう。
【００３５】
［発明の詳細な記述］
多数のアプローチを発現ベクターの設計および構築に採用することができ、そして、該過程は、典型的に、合理的なレベルのタンパク質が産生される前に実質的な試行錯誤実験を必要とする。設計過程での重大な考慮は、ベクターの構築におけるイントロン配列の使用に関する。一アプローチにおいては、遺伝子配列全体を、それが天然に存在する（イントロンおよびエキソン双方の配列の完全な相補物を含有する）ように利用しうる。こうした場合、細胞内の翻訳後スプライシング機構がイントロン配列を摘出して該遺伝子のエキソン配列のみを含有する成熟ｍＲＮＡを生じることができることが期待される。第二のアプローチは、遺伝子のｃＤＮＡのみに対応する配列を利用することである。この場合、スプライシング事象が起こらず、かつ、プレｍＲＮＡ配列はタンパク質をコードする内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）中のｍＲＮＡ配列と実質的に同一であることが予測される。なお第三
の場合には、ベクター構築は、元の遺伝子配列を通常は伴わないイントロンの選択および配置を必要とする。
【００３６】
ベクターの情況内での遺伝子の発現に対するイントロン配列の影響は不完全に理解されている。イントロンが、転写速度、ポリアデニル化、ｍＲＮＡの輸出、翻訳効率およびｍＲＮＡの崩壊を包含するタンパク質産生の過程の多数の事象を遂げうることが報告された（Ｎｏｔｔら（２００３）ＲＮＡ  ９：６０７−６１７）。ｍＲＮＡ発現の情況内で、ベクターからのタンパク質の収量に対するイントロンの成果に関する予測可能性の明白な線は存在しなかった。例えば、多様なイントロン配列を包含することが、発現の大きな増大を引き起こし得るか、影響を有し得ないか、若しくはｍＲＮＡ発現を低下させ得ることが多様に報告された（Ｂｅｒｇら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４３９５−４４０５；Ｂｏｕｒｄｏｎら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２：３９４−３９８）。大部分のより高等な真核生物遺伝子はイントロンを含有するため、不必要なリードスルー副生成物の非存在下で、イントロンを含有する遺伝子を、高レベルでかつ該遺伝子のエキソン配列に対する近接した忠実度を伴い予測可能に発現するのに使用しうる系の開発は、明らかに、タンパク質発現系の予測可能な開発に対する補助である。
【００３７】
イントロン配列と関連する予測不可能性は信頼できる発現ベクターの設計に障害をもたらす一方、大きな設計の利益は、遺伝子工学技術の影響を受けやすいモジュラー形態を目的のタンパク質が有する場合に実現され得る。抗体は、イントロン配列の包含が発現ベクターの設計を助長するこうした一例を提供する。
【００３８】
本明細および請求の範囲で使用されるある種の用語を下に定義する。
【００３９】
本明細書で使用されるところの「イントロン」という用語は、転写されるがしかしそれのいずれかの側の配列（エキソン）と一緒にスプライスされることによりＲＮＡ転写物から除去されるＤＮＡのセグメントを包含する。イントロンは、遺伝子のタンパク質コーディング領域内の介在配列であるとみなされており、そして、一般には、該遺伝子から産生されるタンパク質中に表される情報を含有しない。
【００４０】
「エキソン」という用語は、成熟ＲＮＡ産物中に表される介在配列を含有する遺伝子のいかなるセグメントも包含する。エキソンは、タンパク質に翻訳される遺伝子内の情報を含んでなる。
【００４１】
「プレｍＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写から生じる最初のＲＮＡ産物を包含する。プレｍＲＮＡと呼称されるＲＮＡはイントロンおよびエキソン双方の配列を含有し、そしてこれゆえに細胞のスプライシング機構によりプロセシングされていない。
【００４２】
「ｍＲＮＡ」という用語は、イントロンを除去するようにプロセシングされておりかつポリペプチドに翻訳されることが可能であるＲＮＡ転写物を包含する。
【００４３】
「スプライシング」という用語は、イントロンがプレｍＲＮＡ種から除去される、真核生物細胞の核で発生する細胞事象を包含する。一般に、該過程は、５’スプライスドナー部位が３’スプライスアクセプター部位との近接にもたらされかつ介在イントロン配列が転写物から除去される、スプライソソーム複合体の形成を必要とする。
【００４４】
「ベクター」という用語は、目的の遺伝子（１個若しくは複数）をしばしば含んでなりかつ核酸が宿主細胞中で複製しかつ／若しくは転写されるために必須の最小要素をさらに含んでなる核酸構築物を包含する。こうした構築物は染色体外要素として存在しうるか、
若しくは宿主細胞のゲノム中に組込まれうる。
【００４５】
「イントロンリードスルー」（「ＩＲＴ」）という句は、それによりプレｍＲＮＡ転写物の異常なスプライシングが代替の大きさ若しくはアミノ酸の構成要員（ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｃｙ）のタンパク質若しくはペプチドを生じる過程を指す。誤ってスプライスされた転写物から産生される最終的なタンパク質に関して変動する結果が起こりうる。例えば、予測されたより大きいタンパク質若しくは不正確な終止コドンをもつタンパク質が発生することがあり、この場合、該タンパク質はそれぞれ予測されたより長い若しくは短いことができる。さらに、タンパク質はまた、グリコシル化、ミリストイル化、リン酸化、ユビキチン化のためのタンパク質修飾、若しくは他の翻訳後修飾を助長する不正確な若しくは付加的な残基も有しうる。
【００４６】
「イントロンリードスルー副生成物」という用語は、イントロンリードスルーに由来する異常にスプライスされたｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質若しくはペプチド、例えば予測されない大きさ若しくはアミノ酸構成要員のタンパク質を指す。イントロンリードスルー副生成物は、遺伝子既知のアミノ酸配列により予測されかつ／若しくは該遺伝子のｃＤＮＡにより予測されるポリペプチドより短いことも若しくは長いこともある。イントロンリードスルー副生成物はまた、該遺伝子の正確にスプライスされたｍＲＮＡから生じるタンパク質の受け入れられている分子量と異なる見かけの分子量も有しうる。さらに、「イントロンリードスルー副生成物」という用語は、目的のタンパク質と通常は関連しないタンパク質分解性プロセシング事象から発生するタンパク質を包含し、前記タンパク質分解性プロセシングは、潜在的に、イントロン−エキソン接合部のリードスルーによりフレームシフトしたタンパク質生成物から生じる。
【００４７】
「Ｈ鎖副生成物」という用語は、イントロンリードスルーに由来する異常にスプライスされた免疫グロブリンＨ鎖のｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、例えば予測されない大きさ若しくはアミノ酸構成要員のＨ鎖タンパク質を指す。Ｈ鎖副生成物は、免疫グロブリン遺伝子の既知のアミノ酸配列により予測されかつ／若しくは該遺伝子のｃＤＮＡにより予測されるポリペプチドより短いことも若しくは長いこともある。Ｈ鎖副生成物はまた、Ｈ鎖遺伝子の正確にスプライスされたｍＲＮＡから生じるタンパク質の受け入れられている分子量と異なる見かけの分子量も有しうる。さらに、「Ｈ鎖副生成物」という用語は、該タンパク質と通常は関連しないタンパク質分解性プロセシング事象から発生するポリペプチドを包含する。
【００４８】
「天然に存在する配列」若しくは「天然に存在するゲノム配列」という句は、その天然のすなわち自然の状態で見出される遺伝子のイントロンおよびエキソンの構成を指す。天然に存在する配列は、例えばその天然の染色体位置に見出し得るか、若しくは、該配列のイントロンおよびエキソンの構成が保持される限りはベクター中にクローン化し得る。
【００４９】
「免疫グロブリン」若しくは「抗体」（本明細書で互換可能に使用される）という用語は、２個のＨおよび２個のＬ鎖よりなる４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化され、該免疫グロブリン若しくは抗体は抗原を選択的若しくは特異的に結合する能力を有する。
【００５０】
Ａβ免疫グロブリン若しくはＡβ抗体という用語は、Ａβペプチドを選択的若しくは特異的に結合する抗体を指す。
【００５１】
「一本鎖免疫グロブリン」若しくは「一本鎖抗体」（本明細書で互換可能に使用される）という用語は、１個のＨおよび１個のＬ鎖よりなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を指し、前記鎖は例えば鎖間ペプチドリンカーにより安定化され、該免疫グロブリ
ン若しくは抗体は抗原を特異的に結合する能力を有する。
【００５２】
「免疫グロブリン若しくは抗体ドメイン」という用語は、例えばβプリーツシートおよび／若しくは鎖内ジスルフィド結合により安定化されているペプチドループを包含する（例えば３ないし４個のペプチドループを包含する）Ｈ若しくはＬ鎖ポリペプチド内の球状領域を指す。ドメインはさらに本明細書で「定常」若しくは「可変」と称され、「定常」という用語は、「定常」ドメインの場合に多様なクラスメンバーのドメイン内の配列の変動の相対的欠如を指し、また、「可変」という用語は、「可変」ドメインの場合に多様なクラスメンバーのドメイン内の有意の変動を指す。抗体若しくはポリペプチドの「ドメイン」は、しばしば、当該技術分野で抗体若しくはポリペプチドの「領域」と互換可能に称される。抗体Ｌ鎖の「定常」ドメインは、「Ｌ鎖定常領域」、「Ｌ鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域若しくは「ＣＬ」ドメインと互換可能に称される。抗体Ｈ鎖の「定常」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域若しくは「ＣＨ」ドメインと互換可能に称される。抗体Ｌ鎖の「可変」ドメインは、「Ｌ鎖可変領域」、「Ｌ鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域若しくは「ＶＬ」ドメインと互換可能に称される。抗体Ｈ鎖の「可変」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域若しくは「ＶＨ」ドメインと互換可能に称される。
【００５３】
「領域」という用語はまた、抗体鎖若しくは抗体鎖ドメインの一部若しくは一部分（例えば本明細書で定義されるところのＨ若しくはＬ鎖の一部若しくは一部分、または定常若しくは可変ドメインの一部若しくは一部分）、ならびに前記鎖若しくはドメインのより分離した一部若しくは部分も指すことができる。例えば、ＬおよびＨ鎖若しくはＬおよびＨ鎖可変ドメインは、本明細書に定義されるところの「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」間に散在された「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」を包含する。
【００５４】
免疫グロブリン若しくは抗体は単量体若しくは重合体で存在し得る（例えば、五量体の形態で存在するＩｇＭ抗体、および／または単量体、二量体若しくは多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体）。「フラグメント」という用語は、無傷のすなわち完全な抗体若しくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を包含する抗体若しくは抗体鎖の一部若しくは一部分を指す。フラグメントは、無傷すなわち完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントは組換え手段によってもまた得ることができる。例示的フラグメントはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃおよび／若しくはＦｖフラグメントを包含する。「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原を結合するか若しくは抗原結合（すなわち特異的結合）について無傷の抗体と（すなわちそれらが由来した無傷の抗体と）競合する免疫グロブリン若しくは抗体のポリペプチドフラグメントを指す。
【００５５】
「コンホメーション」という用語は、タンパク質若しくはポリペプチド（例えば抗体、抗体鎖、それらのドメイン若しくは領域）の三次構造を指す。例えば、「Ｌ（若しくはＨ）鎖のコンホメーション」という句はＬ（若しくはＨ）鎖可変領域の三次構造を指し、また、「抗体のコンホメーション」若しくは「抗体フラグメントのコンホメーション」という句は抗体若しくはそのフラグメントの三次構造を指す。「コンホメーション」という用語はまた、１若しくは数個のタンパク質若しくはペプチド鎖の三次元の関係から生じる四次構造も指すことがある。抗原決定子に関して、「高次構造エピトープ」という句は、緊密な並置に存在する１若しくは数種のタンパク質内のアミノ酸の特定の空間的配置を包含する抗原決定子を指す。抗体の多機能の性質（すなわち、同時に１種以上のタンパク質分子上の数個のエピトープを結合するＩｇＧ分子の能力）を考えれば、抗体は、数個のアミノ酸鎖により含まれる高次構造エピトープを結合する生得の能力を有するとみなし得る。例えば、斑を形成するＡ□の沈着は、１個の抗体が数個の緊密に配置されたＡ□ペプチドを結合しうる高次構造エピトープを提供する。
【００５６】
結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または無傷の免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断により生じられる。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖および一本鎖抗体を包含する。「二特異性」若しくは「二官能性」免疫グロブリン若しくは抗体以外に、免疫グロブリン若しくは抗体は、同一のその結合部位のそれぞれを有することが理解される。「二特異性」若しくは「二官能性抗体」は、２個の異なるＨ／Ｌ鎖対および２個の異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合若しくはＦａｂ’フラグメントの連結を包含する多様な方法により製造し得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉとＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００５７】
抗体の「特異的結合」若しくは「選択的結合」は、抗体が特定の抗原若しくはエピトープに対する認識可能な親和性を表しかつ一般に有意の交差反応性を表さないことを意味している。「認識可能な」すなわち好ましい結合は、最低１０６、１０７、１０８、１０９Ｍ−１若しくは１０１０Ｍ−１の親和性を伴う結合を包含する。１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上の親和性がより好ましい。本明細書に示されるものの中間の値もまた本発明の範囲内にあることを意図しており、そして、好ましい結合親和性は親和性のある範囲、例えば１０６ないし１０１０Ｍ−１、好ましくは１０７ないし１０１０Ｍ−１、より好ましくは１０８ないし１０１０Ｍ−１として示され得る。「有意の交差反応性を表さない」抗体は、望ましくない実体（例えば望ましくないタンパク質性の実体）に認識可能に結合しないことができるものである。例えば、Ａβに特異的に結合する抗体は、Ａβを認識可能に結合することができるが、しかしＡβ以外のタンパク質若しくはペプチド（例えば斑に包含されるＡβ以外のタンパク質若しくはペプチド）と有意に反応しないことができる。特定の１エピトープに特異的な抗体は、例えば、同一のタンパク質若しくはペプチド上の離れたエピトープと有意に交差反応しないことができる。例示的態様において、抗体は交差反応性を表さない（例えば、Ａβ以外のペプチド若しくはＡβ上の離れたエピトープと交差反応しない）。特異的結合は、こうした結合を測定するためのいずれかの技術に認識された手段により測定し得る。好ましくは、特異的結合はスキャッチャード分析および／若しくは競合結合アッセイにより測定する。
【００５８】
「有意な同一性」という用語は、２配列、例えば２種のポリペプチド配列が、デフォルトのギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用してプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴによるように至適に整列される場合に、最低５０〜６０％の配列同一性、好ましくは最低６０〜７０％の配列同一性、より好ましくは最低７０〜８０％の配列同一性、より好ましくは最低８０〜９０％の配列同一性、なおより好ましくは最低９０〜９５％の同一性、およびなおより好ましくは最低９５％の配列同一性若しくはそれ以上（例えば９９％の配列同一性若しくはそれ以上）を共有することを意味している。「実質的同一性」若しくは「実質的に同一の」という用語は、２配列、例えば２種のポリペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ若しくはＢＥＳＴＦＩＴによるように至適に整列される場合に、最低８０〜９０％の配列同一性、好ましくは最低９０〜９５％の配列同一性、およびより好ましくは最低９５％の配列同一性若しくはそれ以上（例えば９９％の配列同一性若しくはそれ以上）を共有することを意味している。配列の比較のため、典型的には、１配列が試験配列を比較する参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は下位配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。配列比較アルゴリズムがその後、指定したプログラムパラメータに基づき、参照配列に関して試験配列（１種若しくは複数）について配列同一性のパーセントを計算する。
【００５９】
比較のための配列の至適の整列は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の相同性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、若しくは目視（全般として、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）により実施し得る。配列同一性および配列類似性パーセントの決定に適するアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記述されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通じて公的に入手可能（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のＮＣＢＩインターネットサーバーを通じて公的にアクセス可能）である。典型的にはデフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実施し得るとは言え、カスタマイズしたパラメータもまた使用し得る。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３の語長（ｗｏｒｄｌｅｎｔｇｈ）（Ｗ）、１０の期待（ｅｘｐｅｃｔａｉｏｎ）（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。
【００６０】
好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換により異なる。アミノ酸置換を保存的若しくは非保存的と分類する目的上、アミノ酸を後に続くとおりグループ分けする：群Ｉ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；群ＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖の方向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同一分類のアミノ酸間の置換を伴う。非保存的置換は、これらの分類の１つの１メンバーを別のものの１メンバーで交換することを構成する。
【００６１】
抗体
本発明の方法論は、不必要な若しくは望ましくない副生成物が検出される多様な抗体製造方法で応用可能である。とりわけ、該方法論は、製造されている抗体の配列が既知であるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体の製造に応用可能である。
【００６２】
「ヒト化免疫グロブリン」若しくは「ヒト化抗体」という用語は、最低１個のヒト化免疫グロブリン若しくは抗体鎖（すなわち最低１個のヒト化Ｌ若しくはＨ鎖）を包含する免疫グロブリン若しくは抗体を指す。「ヒト化免疫グロブリン鎖」若しくは「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリンＬ鎖」若しくは「ヒト化免疫グロブリンＨ鎖」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリン若しくは抗体からの可変フレームワーク領域および実質的にヒト以外の免疫グロブリン若しくは抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば最低１個のＣＤＲ、好ましくは２個のＣＤＲ、より好ましくは３個のＣＤＲ）を包含する可変領域を有し、そしてさらに定常領域（例えば、Ｌ鎖の場合は最低１個の定常領域若しくはその部分、およびＨ鎖の場合は好ましくは３個の定常領域）を包含する免疫グロブリン若しくは抗体鎖（すなわちそれぞれＬ若しくはＨ鎖）を指す。「ヒト化可変領域」（例えば「ヒト化Ｌ鎖可変領域」若しくは「ヒト化Ｈ鎖可変領域」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリン若しくは抗体からの可変フレームワーク領域および実質的に
ヒト以外の免疫グロブリン若しくは抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する可変領域を指す。
【００６３】
「実質的にヒト免疫グロブリン若しくは抗体から」または「実質的にヒト」という句は、比較の目的上ヒト免疫グロブリン若しくは抗体のアミノ酸配列に整列される場合に、該領域が、例えば保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などを見込、み、ヒトフレームワーク若しくは定常領域配列と最低８０〜９０％、９０〜９５％若しくは９５〜９９％の同一性（すなわち局所配列同一性）を共有することを意味している。保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などの導入はしばしば、ヒト化抗体若しくは鎖の「至適化」と称される。「実質的にヒト以外の免疫グロブリン若しくは抗体から」または「実質的にヒト以外」という句は、ヒト以外の生物体、例えばヒト以外の哺乳動物の配列に最低８０〜９５％、好ましくは最低９０〜９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の免疫グロブリン若しくは抗体配列を有することを意味している。
【００６４】
従って、ヒト化免疫グロブリン若しくは抗体、またはヒト化免疫グロブリン若しくは抗体鎖の全部の領域若しくは残基は、おそらくＣＤＲを除き、１種若しくはそれ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する領域若しくは残基に実質的に同一である。「対応する領域」若しくは「対応する残基」という用語は、第一および第二の配列を比較の目的上至適に整列する場合に、第一のアミノ酸若しくはヌクレオチド配列上の１領域若しくは残基と同一の（すなわち同等な）位置を占有する第二のアミノ酸若しくはヌクレオチド配列上の領域若しくは残基を指す。
【００６５】
好ましくは、ヒト化免疫グロブリン若しくは抗体は、対応するヒト化されていない抗体の親和性の３、４若しくは５の係数内である親和性で抗原を結合する。例えば、ヒト化されていない抗体が１０９Ｍ−１という結合親和性を有する場合、ヒト化抗体は最低３×１０９Ｍ−１、４×１０９Ｍ−１若しくは５×１０９Ｍ−１という結合親和性を有することができる。免疫グロブリン若しくは抗体鎖の結合特性を記述する場合、鎖は「抗原（例えばＡβ若しくは５Ｔ４）結合を指図する」その能力に基づき記述し得る。鎖は、それが無傷の免疫グロブリン若しくは抗体（またはその抗原結合フラグメント）に特異的結合特性若しくは結合親和性を賦与する場合に「抗原結合を指図する」と言われる。突然変異（例えば逆突然変異）は、それが前記突然変異を欠く同等の鎖を含んでなる抗体（若しくはその抗原結合フラグメント）の親和性に比較して、前記鎖を含んでなる無傷の免疫グロブリン若しくは抗体（またはその抗原結合フラグメント）の結合親和性に最低１桁影響を及ぼす（例えば低下させる）場合に、抗原結合を指図するＨ若しくはＬ鎖の能力に実質的に影響を及ぼすと言われる。突然変異は、それが前記突然変異を欠く同等の鎖を含んでなる抗体（若しくはその抗原結合フラグメント）の親和性の２、３若しくは４の係数のみ、前記鎖を含んでなる無傷の免疫グロブリン若しくは抗体（またはそれらの抗原結合フラグメント）の結合親和性に影響を及ぼす（例えば低下させる）場合に、「抗原結合を指図する鎖の能力に実質的に影響しない（例えば低下させない）」。
【００６６】
「キメラ免疫グロブリン」若しくは抗体という用語は、その可変領域が第一の種由来でありかつその定常領域が第二の種由来である免疫グロブリン若しくは抗体を指す。キメラ免疫グロブリン若しくは抗体は、例えば異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工作することにより構築し得る。「ヒト化免疫グロブリン」若しくは「ヒト化抗体」という用語は、本明細書に定義されるところのキメラ免疫グロブリン若しくは抗体を包含することを意図していない。ヒト化免疫グロブリン若しくは抗体はそれらの構築においてキメラである（すなわち、１種以上のタンパク質からの領域を含んでなる）とは言え、それらは、本明細書に定義されるところのキメラ免疫グロブリン若しくは抗体中で見出されない付加的な特徴（すなわち、ドナーのＣＤＲ残基およびアクセプターのフレー
ムワーク残基を含んでなる可変領域）を包含する。
【００６７】
こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら  国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書；Ａｋｉｒａら  欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら  欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら  ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ  ８６／０１５３３号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら  米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら  欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述されている方法を使用して製造し得る。
【００６８】
抗体の他の部分、例えば定常領域を例えば欠失、付加若しくは置換することにより改変されたモノクローナル、キメラおよびヒト化抗体もまた本発明の範囲内にある。例えば、抗体は後に続くとおり、すなわち、（ｉ）定常領域を別の定常領域、例えば抗体の半減期、安定性若しくは親和性を増大させることを意味されている定常領域、または別の種若しくは抗体クラスからの定常領域で置換することにより；あるいは（ｉｉ）例えば、とりわけグリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体固定を変えるように定常領域中の１個若しくはそれ以上のアミノ酸を改変することにより、改変し得る。抗体定常領域を変える方法は当該技術分野で既知である。変えられた機能、例えば、細胞上のＦｃＲ若しくは補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドに対する変えられた親和性をもつ抗体は、抗体の定常部分の最低１アミノ酸残基を異なる残基で置換することにより製造し得る（例えば、第ＥＰ  ３８８，１５１  Ａ１号明細書、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（それらの全部の内容はここに引用することにより組み込まれる）を参照されたい）。ネズミ若しくは他の種に適用される場合に免疫グロブリンがこれらの機能を低下若しくは排除するとみられる類似の型の変化が記述され得る。
【００６９】
例えば、ＦｃＲ（例えばＦｃγＲ１）若しくはＣ１ｑ結合に対する抗体（例えばヒトＩｇＧのようなＩｇＧ）のＦｃ領域の親和性を、その側鎖に適切な官能性を有する残基（１個若しくは複数）で指定された残基（１個若しくは複数）を置換することにより、あるいは、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸のような荷電した官能基、またはおそらくフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン若しくはアラニンのような芳香族の非極性残基を導入することにより、変えることが可能である（例えば米国特許第５，６２４，８２１号明細書を参照されたい）。
【００７０】
トランスジェニック動物およびファージディスプレイからのヒト抗体
あるいは、免疫化に際して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能であるトランスジェニック動物（例えばマウス）を製
造することが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体Ｈ鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記述されている。こうした生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原攻撃に際してヒト抗体の産生をもたらす。例えば米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号明細書を参照されたい。
【００７１】
完全にヒトの抗体はまたファージディスプレイライブラリーにも由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。
【００７２】
二特異性抗体、抗体融合ポリペプチドおよび一本鎖抗体
二特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、最低２種の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。こうした抗体は、完全長抗体若しくは抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ）’２二特異性抗体）に由来し得る。二特異性抗体の作成方法は当該技術分野で既知である。完全長二特異性抗体の伝統的製造は、２種の鎖が異なる特性を有する２種の免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の無作為な取り合わせ（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は多様な抗体分子の潜在的混合物を生じる（第ＷＯ  ９３／０８８２９号明細書およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５−３６５９（１９９１）中を参照されたい）。
【００７３】
二特異性抗体はまた、架橋すなわち「ヘテロ複合物」抗体も包含する。例えば、ヘテロ複合物中の抗体の一方をアビジンに、他方をビオチン若しくは他のペイロードに結合し得る。ヘテロ複合物抗体はいかなる便宜的な架橋方法を使用しても作成しうる。適する架橋剤は当該技術分野で公知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号明細書に多数の架橋技術と一緒に開示されている。
【００７４】
なお別に態様において、抗体は、ペイロードドメイン、例えば免疫毒素に化学的に若しくは遺伝子的に融合して抗体融合ポリペプチドを生じ得る。こうしたペイロードは、例えば免疫毒素、化学療法剤および放射性同位元素を包含し、それらの全部は当該技術分野で公知である。
【００７５】
一本鎖抗体はまた本発明の安定化にも適する。該フラグメントは、リンカーでＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合されたＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、各可変領域が相互と結合しかつＶＬおよびＶＨ領域が由来している親抗体の抗原結合ポケットを再創製することを可能にする。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【００７６】
抗Ａβ抗体
一般に、本発明の抗体は、Ａβペプチドを標的とすることによりアミロイド形成性疾患、とりわけアルツハイマー病を処置するための抗体を包含する。
【００７７】
「アミロイド形成性疾患」という用語は、不溶性アミロイド原線維の形成若しくは沈着と関連する（若しくはそれにより引き起こされる）いかなる疾患も包含する。例示的アミロイド形成性疾患は、限定されるものでないが全身性アミロイドーシス、アルツハイマー病、成人期発症糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭葉型痴呆、ならびにプリオン関連の伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病、ならびにヒツジおよび畜牛におけるそれぞれスクレイピーおよびＢＳＥ）を挙げることができる。多様なアミロイド形成性疾患が、沈着した原線維のポリペプチド成分の性
質により定義若しくは特徴付けられている。例えば、アルツハイマー病を有する被験体若しくは患者において、βアミロイドタンパク質（例えば野性型、バリアント若しくは切断型βアミロイドタンパク質）がアミロイド沈着物の特徴付けるポリペプチド成分である。従って、アルツハイマー病は、例えば被験体若しくは患者の脳中の「Ａβの沈着物を特徴とする疾患」若しくは「Ａβの沈着物を伴う疾患」の一例である。「βアミロイドタンパク質」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」および「Ａβペプチド」という用語は本明細書で互換可能に使用される。「免疫原性剤」若しくは「免疫原」は、場合によってはアジュバントとともにの哺乳動物への投与に際してそれ自身に対する免疫学的応答を誘導することが可能である。
【００７８】
「Ａ□抗体」、「抗Ａ□抗体」および「抗Ａ□」という用語は、ＡＰＰ、Ａ□タンパク質若しくは双方の１個若しくはそれ以上のエピトープ若しくは抗原決定子に結合する抗体を指すのに本明細書で互換可能に使用される。例示的エピトープ若しくは抗原決定子はヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内に見出し得るが、しかし、好ましくはＡＰＰのＡβペプチド内に見出される。ＡＰＰの複数のアイソフォーム、例えばＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰ内のアミノ酸はＡＰＰ７７０アイソフォーム（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０５０６７を参照されたい）の配列に従って番号を割り当てられている。Ａβ（βアミロイドペプチドおよびＡβともまた本明細書で称される）ペプチドはＡＰＰの３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内的フラグメントである（Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３）。例えばＡβ４０はＡＰＰの残基６７２−７１１よりなり、また、Ａβ４２はＡＰＰの残基６７２−７１３よりなる。ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｓｉｔｕでの異なる分泌酵素によるＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングの結果として、Ａβは長さ４０アミノ酸の「短い形態」および長さ４２〜４３アミノ酸からの範囲にわたる「長い形態」の双方で見出される。エピトープ若しくは抗原決定子はＡβペプチドのＮ末端内に配置され得、そしてＡβのアミノ酸１−１０内、好ましくはＡβ４２の残基１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、２−７、３−６若しくは３−７から、またはＡβの残基２−４、５、６、７若しくは８、Ａβの残基３−５、６、７、８若しくは９、あるいはＡβ４２の残基４−７、８、９若しくは１０内の残基を包含し得る。「中央」エピトープ若しくは抗原決定子は、Ａβペプチドの中央（ｃｅｎｔｒａｌ）すなわち中央部分（ｍｉｄ−ｐｏｒｔｉｏｎ）内に位置し、そしてＡβのアミノ酸１６−２４、１６−２３、１６−２２、１６−２１、１９−２１、１９−２２、１９−２３若しくは１９−２４内の残基を包含する。「Ｃ末端」エピトープ若しくは抗原決定子はＡβペプチドのＣ末端内に位置し、そしてＡβのアミノ酸３３−４０、３３−４１若しくは３３−４２内の残基を包含する。
【００７９】
多様な態様において、Ａβ抗体は末端特異的である。本明細書で使用されるところの「末端特異的」という用語は、ＡβペプチドのＮ末端若しくはＣ末端残基に特異的に結合するがしかし該残基を含んでなるより長いＡβ種すなわちＡＰＰ中に存在する場合に同一の残基を認識しない抗体を指す。
【００８０】
多様な態様において、Ａβ抗体は「Ｃ末端特異的」である。本明細書で使用されるところの「Ｃ末端特異的」という用語は、抗体がＡβペプチドの遊離Ｃ末端を特異的に認識することを意味している。Ｃ末端特異的Ａβ抗体の例は：残基４０で終端するＡβペプチドを認識するがしかし残基４１、４２および／若しくは４３で終端するＡβペプチドを認識しない；残基４２で終端するＡβペプチドを認識するがしかし残基４０、４１および／若しくは４３で終端するＡβペプチドを認識しない；などであるものを包含する。
【００８１】
一態様において、抗体は、３Ｄ６抗体若しくはそのバリアント、または１０Ｄ５抗体若しくはそのバリアントであることができ、それらの双方は、米国特許公開第２００３／０１６５４９６Ａ１号、米国特許公開第２００４／００８７７７７Ａ１号、国際特許公開第
ＷＯ０２／４６２３７Ａ３号明細書に記述されている。３Ｄ６および１０Ｄ５の記述は、例えば、国際特許公開第ＷＯ０２／０８８３０６Ａ２号および国際特許公開第ＷＯ０２／０８８３０７Ａ２号明細書にもまた見出し得る。３Ｄ６はヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基１−５に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。比較すれば、１０Ｄ５は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３−６に特異的に結合するｍＡｂである。別の態様において、該抗体は、米国特許公開第２００４００８２７６２Ａ１号および国際特許公開第ＷＯ０３／０７７８５８Ａ２号明細書に記述されるところの１２Ｂ４抗体若しくはそのバリアントでありうる。１２Ｂ４は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３−７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の態様において、抗体は、米国特許出願第１０／８５８，８５５号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７５１４号明細書に記述されるところの１２Ａ１１抗体若しくはそのバリアントでありうる。１２Ａ１１は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３−７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の態様において、抗体は、米国特許出願第１０／７８９，２７３号および国際特許出願第ＷＯ０１／６２８０１Ａ２号明細書に記述されるところの２６６抗体でありうる。本発明での使用のためのヒトβアミロイドペプチド中に位置するＣ末端エピトープに特異的に結合するよう設計された抗体は、限定されるものでないが、米国特許第５，７８６，１６０号明細書に記述されるところの３６９．２Ｂを挙げることができる。
【００８２】
例示的態様において、抗体は、Ａβペプチドを選択的に結合する、ヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体、ヒト化抗Ａβペプチド１２Ａ１１抗体、ヒト化抗Ａβペプチド１０Ｄ５抗体、ヒト化抗Ａβペプチド１２Ｂ４抗体およびヒト化抗Ａβペプチド２６６抗体から選ばれる。より具体的には、ヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体は、（例えばアルツハイマー病に罹っている患者の）脳中の斑沈着物中で見出されるヒトβアミロイド１−４０若しくは１−４２ペプチド中に位置するＮＨ２末端エピトープに特異的に結合するよう設計される。
【００８３】
Ｆｃ融合物
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は融合若しくはキメラタンパク質をコードする。融合タンパク質はターゲッティング部分、例えば可溶性の受容体フラグメント若しくはリガンド、および免疫グロブリン鎖、Ｆｃフラグメント、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含する多様なアイソタイプのＨ鎖定常領域を包含し得る。例えば、融合タンパク質は、受容体の細胞外ドメインを包含し得、かつ、例えばヒト免疫グロブリンＦｃ鎖（例えばヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１若しくはヒトＩｇＧ４、またはそれらの変異された形態）に融合され得る。一態様において、ヒトＦｃ配列は、Ｆｃ受容体結合を減少させるために、野性型配列から１個若しくはそれ以上のアミノ酸で変異されて（例えば残基２５４および２５７で変異されて）いる。融合タンパク質は、第一の部分を第二の部分、例えば免疫グロブリンフラグメントに結合するリンカー配列を付加的に包含しうる。例えば、融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば長さ約４ないし２０、より好ましくは５ないし１０アミノ酸のペプチドリンカーを包含し得；該ペプチドリンカーは長さ８アミノ酸である。例えば、融合タンパク質は、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（式中ｙは１、２、３、４、５、６、７若しくは８である）を有するペプチドリンカーを包含し得る。他の態様において、付加的なアミノ酸配列を、発現、立体的可撓性、検出および／または単離若しくは精製を助長するために、融合タンパク質のＮ若しくはＣ末端に付加し得る。
【００８４】
本発明のキメラ若しくは融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造し得る。例えば、多様なポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣習的技術に従って、例えば平滑端若しくはずらした末端をライゲーションに使用すること、適切な末端を
提供するための制限酵素消化、適切なようにの付着端の補填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションにより、インフレームで一緒に連結する。別の態様において、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成機を包含する慣習的技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、その後アニーリングしかつ再増幅してキメラ遺伝子配列を生成させ得る２個の連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施し得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当該技術分野で既知であり、かつ、例えば米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号明細書に記述されている。
【００８５】
核酸分子、構築物およびベクター
本発明の例示的態様は、不必要な若しくは望ましくない副生成物、とりわけ不必要な若しくは望ましくない抗体（若しくは免疫グロブリン）副生成物を排除するよう設計された、工作された構築物を特徴とする。ある局面において、構築物は天然に存在する抗体遺伝子配列の成分を包含し、該成分は、生じる構築物が不必要な若しくは望ましくない副生成物の非存在下で目的の所望のタンパク質（例えば抗体）を発現するような、遺伝子的に変えられ、改変され若しくは工作され（例えば遺伝子的に工作され）ている。構築物は、下に詳細に記述されるところの（例えば免疫グロブリン鎖遺伝子の成分を含んでなる）組換え核酸分子を製造するための技術に認識される技術を使用して生成させ得る。
【００８６】
抗体遺伝子配列は：ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ若しくはＩｇＥを包含する多様なアイソタイプの抗体をコードする。好ましくは、抗体遺伝子配列はＩｇＧアイソタイプである抗体をコードする。コードされる免疫グロブリン若しくは抗体分子は完全長（例えばＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４免疫グロブリン）を包含し得るか、若しくは、あるいは、１フラグメント（例えばＦｃフラグメント）のみを包含し得る。
【００８７】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列が、遺伝暗号および標準的分子生物学技術を使用して、本出願に記述されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列、若しくは当該技術分野で既知の免疫グロブリン遺伝子の配列の付加的な供給源から派生され得ることが当業者により認識されるであろう。本発明の核酸組成物は既知の免疫グロブリンＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ配列）由来でありうる。とりわけ、ヌクレオチド配列は、天然のＶ、Ｄ、Ｊ若しくは定常ｃＤＮＡ配列に実質的に同一であっても若しくはそれに由来してもよい。ＨおよびＬ鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知である。好ましくは、定常領域はヒトであるが、しかし、他の種、例えばげっ歯類（例えばマウス若しくはラット）、霊長類（サル）、ラクダまたはウサギからの定常領域もまた使用し得る。これらの種からの定常領域は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号を参照されたい）、そして、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準的ＰＣＲ増幅により得ることができる。Ｈ鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ若しくはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｈ鎖定常領域の配列は当該技術分野で既知であり、そして例えばＮＣＢＩ  ＮＧ＿００１０１９に見出し得る。いくつかの態様において、定常領域はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４定常領域である。ＦｃフラグメントのＨ鎖遺伝子について、ＦｃをコードするＤＮＡを、直接発現のためＨ鎖リーダー配列（例えばＨ鎖可
変鎖リーダー配列）に効果的に連結し得る。
【００８８】
本発明の付加的な局面は、集成した免疫グロブリンＤＮＡカセット配列を包含する。集成した免疫グロブリンカセット配列は、ヌクレオチド配列、ならびに免疫グロブリンＤＮＡカセットヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を包含する。
【００８９】
例示的一ヒトＩｇＧ１定常領域のゲノム配列をここに提供する：
【００９０】
【化１】
2008515430.tif 000002
【００９１】
例示的ＩｇＧ４定常領域のゲノム配列をここに提供する。
【００９２】
【化２】
2008515430.tif 000003
【００９３】
抗体製造
本発明の抗体は典型的に組換え発現により製造される。ＬおよびＨ鎖をコードする核酸を発現ベクターに挿入し得る。ＬおよびＨ鎖は同一若しくは異なる発現ベクターにクローン化し得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントを、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（１種若しくは複数）中の制御配列に作動可能に
連結する。発現制御配列は、限定されるものでないが、プロモーター（例えば天然に関連する若しくは異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終止配列を挙げることができる。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えばＣＯＳ若しくはＣＨＯ細胞）を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。
【００９４】
上に示されたところの本発明のポリペプチドを提供するための単離された遺伝物質の操作後に、遺伝子を、典型的には、所望の量の改変された抗体を産生させるのに使用しうる宿主細胞中への導入のため発現ベクターに挿入し、該改変された抗体は、順に、特許請求されるポリペプチドを提供する。「ベクター」という用語は、しばしば、核酸例えば遺伝子を包含しかつ核酸の複製、転写、安定性および／またはタンパク質の発現若しくは宿主細胞からの分泌に必要な最小要素をさらに包含する核酸構築物を包含する。こうした構築物は染色体外要素として存在しうるか、若しくは宿主細胞のゲノムに組込まれうる。
【００９５】
「発現ベクター」という用語は、核酸構築物が所望のタンパク質産物の高レベル発現のため至適化されている特殊な型のベクターを包含する。発現ベクターは、しばしば、特定の細胞型中での高レベルの転写のため至適化され、かつ／若しくは特定の誘導剤の使用に基づき発現が構成的となるように至適化された、プロモーターおよびエンハンサー要素のような転写調節作用因（ａｇｅｎｔ）を有する。発現ベクターはさらに、タンパク質の適正かつ／若しくは高められた翻訳を提供する配列を有する。当業者に既知のとおり、こうしたベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスよりなる群から容易に選択しうる。「発現カセット」という用語は、遺伝子を含有しかつ宿主細胞中でのその遺伝子の適正な、かつ若しくは高められた発現を見込む要素を該遺伝子に加え有する核酸構築物を包含する。
【００９６】
「作動可能に連結される」という用語は、成分が、それらがそれらの意図された様式で機能することを可能にする（例えば機能的に連結される）関係にある並置を包含する。一例として、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター／エンハンサーは、該プロモーター／エンハンサーにより指図される発現を活性化する条件下で目的のポリヌクレオチドの発現が達成されるような前記ポリヌクレオチドに連結される。本明細書に記述される本発明に関して、作動可能に連結されるはまた、目的の遺伝子の一次転写物（プレｍＲＮＡ）で見出されるスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の関係も包含する。通常、スプライスアクセプターおよびドナー部位は、該２配列が必要とされかつスプライシング事象が起こるために一緒に機能して成熟メッセンジャーＲＮＡをもたらすために、作動可能に連結される。
【００９７】
「天然の効果的関連」という句は、その天然のすなわち自然の状態で見出される遺伝子のイントロンおよびエキソンの構成を指す。目的の遺伝子のクローニングへの１アプローチは、遺伝子（エキソンおよびイントロンの双方）の核酸を単離すること、ならびに該核酸配列を該核酸配列の増幅のためベクターに挿入することを必要とする。この遺伝子配列全体は、同一若しくは異なる種での該タンパク質の発現に有用な発現ベクターにもまた挿入しうる。イントロンおよびエキソンがそれらの天然の状態で存在することが見出されるように、それらを含有する遺伝子がクローン化される場合、該イントロンおよびエキソンはそれらの天然の効果的関連を保持すると言われる。
【００９８】
発現ベクターは、典型的には、エピソーム若しくは宿主染色体ＤＮＡの一体の部分のいずれかとして宿主生物体中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性若しくはネオマイシン耐性）を含有する（例えばＩｔａｋｕｒａら、米国特許第４，７０４，３６２号明細
書を参照されたい）。免疫グロブリンＤＮＡカセット配列、挿入物配列および制御配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での該ベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子のような付加的な配列を運搬しうる。選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号明細書（全部Ａｘｅｌらによる）を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン若しくはメトトレキセートのような薬物に対する耐性を賦与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにのｄｈｆｒ−宿主細胞での使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を包含する。
【００９９】
ベクターが適切な宿主に一旦組み込まれれば、該ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに所望の抗体の収集および精製に適する条件下で該宿主を維持する。哺乳動物細胞が本発明の抗体の発現および産生に好ましい。例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７）を参照されたい。真核生物細胞は、異種タンパク質（例えば無傷の免疫グロブリン）を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞株が当該技術分野で開発されているために好ましく、そしてＣＨＯ細胞株、多様なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株、または形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマを包含する。好ましくは、細胞はヒト以外である。本発明の抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記述されるとおり、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記述されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を包含する）、リンパ球細胞株、例えばＮＳＯ骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ならびにトランスジェニック動物由来の細胞、例えば哺乳類上皮細胞を包含する。他の適する宿主細胞は当業者に既知である。
【０１００】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーのような発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位のような必要なプロセシング情報部位、ポリアニデル化部位ならびに転写終結配列を包含し得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。例えばＣｏら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９を参照されたい。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのような）、ＳＶ４０（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーのような）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））ならびにポリオーマ由来のプロモーターおよび／若しくはエンハンサーのような、哺乳動物細胞中での高レベルのタンパク質発現を指図するウイルス要素を包含する。ウイルスの調節要素およびそれらの配列のさらなる記述については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号明細書を参照されたい。例示的態様において、抗体ＨおよびＬ鎖遺伝子は、該遺伝子の高レベルの転写を駆動するために、（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素若しくはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素のようなＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど由来の）エンハンサー／プロモーター調節要素に効果的に連結される。本発明の例示的態様において、該構築物は、真核生物宿主細胞中で比較的高レベルの本発明のポリペプチドを提供するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ
）を包含する。適合性のＩＲＥＳ配列は米国特許第６，１９３，９８０号明細書（また本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１０１】
あるいは、抗体をコードする配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入および該トランスジェニック動物の乳中でのその後の発現のため導入遺伝子に組み込み得る（例えば、Ｄｅｂｏｅｒら、米国特許第５，７４１，９５７号、Ｒｏｓｅｎ、米国特許第５，３０４，４８９号、およびＭｅａｄａら、米国特許第５，８４９，９９２号明細書を参照されたい）。適する導入遺伝子は、カゼイン若しくはβ−ラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にあるＬおよび／若しくはＨ鎖のコーディング配列を包含する。
【０１０２】
原核生物宿主細胞もまた本発明の抗体の製造に適しうる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローン化するのにとりわけ有用な一原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような桿菌、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）のような腸内細菌科、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を包含する。これらの原核生物宿主中で、典型的には宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば複製起点）を含有することができる発現ベクターもまた作成し得る。加えて、乳糖プロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系若しくはファージλからのプロモーター系のようないずれかの数の多様な公知のプロモーターが存在することができる。プロモーターは、典型的には、場合によってはオペレーター配列とともに発現を制御することができ、また、転写および翻訳を開始かつ完了するためのリボソーム結合部位配列などを有することができる。
【０１０３】
原核生物でのタンパク質の発現は、最もしばしば、融合若しくは非融合いずれかのタンパク質の発現を指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施する。融合ベクターは、その中にコードされる抗体、しばしば組換え抗体の定常領域に、該抗体の特異性若しくは抗原認識に影響を及ぼすことなく多数のアミノ酸を付加する。融合ペプチドのアミノ酸の付加は、該抗体に例えばマーカー（例えばｍｙｃ若しくはｆｌａｇのようなエピトープ標識）としての付加的な機能を付加し得る。
【０１０４】
酵母のような他の微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい酵母宿主であり、適するベクターは、発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終止配列などを所望のとおり有する。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を包含する。誘導可能な酵母プロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに麦芽糖およびガラクトース利用を司る酵素からのプロモーターを包含する。
【０１０５】
あるいは、本発明の抗体はトランスジェニック植物（例えばタバコ、トウモロコシ、ダイズおよびアルファルファ）中で産生させ得る。形質転換可能な作物種の増大と結びつけられた、改良された「プランティボディ（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」ベクター（Ｈｅｎｄｙら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１３７−１４６）および精製戦略が、こうした方法を、ヒトおよび動物治療のためのみならずしかし同様に工業的応用（例えば触媒的抗体）のための組換え免疫グロブリンの実務的かつ効率的な製造手段にする。さらに、植物で産生された抗体は安全かつ有効でありかつ動物由来物質の使用、および従って伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）病原体での汚染の危険を回避することが示された。さらに、植物および哺乳動物細胞で産生された抗体のグリコシル化パターンの差違は、抗原結合若しくは特異性に対しほとんど若しくは全く影響を有しない。加えて、毒性
すなわちＨＡＭＡの証拠は、植物由来の分泌型二量体ＩｇＡ抗体の局所経口適用を受領する患者で観察されていない（例えばＬａｒｒｉｃｋら（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：６０３−６０８を参照されたい）。
【０１０６】
多様な方法を使用してトランスジェニック植物で組換え抗体を発現させうる。例えば、抗体ＨおよびＬ鎖を発現ベクター（例えばアグロバクテリウム  ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクター）に独立にクローン化し得、次いで組換え細菌、若しくは、例えば、例えば弾道学を使用してその後植物組織中に物理的に導入されるベクターで被覆した粒子を使用する直接形質転換で植物組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換し得る。その後、個々の鎖を発現する植物全体を再構成し、次いでそれらを性的交雑し、最終的に完全に集成されかつ機能的な抗体の産生をもたらす。同様のプロトコルが、タバコ植物中で機能的抗体を発現させるのに使用された（例えばＨｉａｔｔら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６−７８を参照されたい）。多様な態様において、シグナル配列を利用して、適切な植物環境（例えばアポプラズム、または塊茎、果実若しくは種子を包含する他の特定の植物組織の水性環境）に鎖を向けることにより、未集成の抗体鎖の発現、結合およびフォールディングを促進しうる（Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１０９０−１０９３を参照されたい）。植物バイオリアクターもまた、抗体収量を増大させかつ費用を大きく低減させるのに使用し得る。
【０１０７】
適する宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴにさらに論考されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳し得る。
【０１０８】
目的のポリヌクレオチド配列（例えばＨおよびＬ鎖をコードする配列ならびに発現制御配列）を含有するベクターを、細胞宿主の型に依存して変動する公知の方法により宿主細胞に移入し得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に一般に利用される一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、遺伝子銃若しくはウイルスに基づくトランスフェクションを他の細胞宿主に使用しうる。（全般として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）（全部の目的上そっくりそのまま本明細書に引用することにより組み込まれる）を参照されたい）哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔法および微小注入法の使用を包含する（全般として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。トランスジェニック動物の製造のためには、導入遺伝子を受精卵母細胞に微小注入し得るか、若しくは胚性幹細胞のゲノムに組み込み得、そしてこうした細胞の核を除核卵母細胞に移入し得る。
【０１０９】
ＨおよびＬ鎖を別個の発現ベクターにクローン化する場合、該ベクターをコトランスフェクトして無傷の免疫グロブリンの発現および集成を得る。一旦発現されれば、本発明の抗体全体、それらの二量体、個々のＬおよびＨ鎖、若しくは他の免疫グロブリンの形態を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを包含する、当該技術分野の標準的手順に従って精製し得る（全般として、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｉｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、（１９８２）を参照されたい）。製薬学的使用のためには最低約９０ないし９５％均一な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、そして９８ないし９９％若しくはそれ以上の均一性が最も好ましい。
【０１１０】
本発明の分子に従って製造される免疫グロブリン若しくは抗体は、誘導体化し得るか、または別の機能的分子（例えば別のペプチド若しくはタンパク質）に連結し得る。従って、本明細書に記述される本発明の抗体および抗体部分若しくは該抗体の別の方法で改変された形態を、研究、診断および／若しくは治療の情況での使用のためさらに誘導体化しうる。例えば、本発明の抗体若しくは抗体部分を、別の抗体（例えば二特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）すなわち二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出可能な剤、細胞傷害剤、製薬学的剤、および／または（ストレプトアビジンコア領域若しくはポリヒスチジン標識のような）別の分子との該抗体若しくは抗体部分の関連要素（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）を媒介し得るタンパク質若しくはペプチドのような、１種若しくはそれ以上の他の分子実体に（化学結合、遺伝子融合、非共有会合により、若しくは別の方法で）機能的に連結し得る。
【０１１１】
１つの型の誘導体化した抗体は、２個若しくはそれ以上の（同一の型、若しくは例えば二特異性抗体を創製するための異なる型の）抗体を架橋することにより製造する。適する架橋剤は、適切なスペーサー（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）により分離された２個の極めて反応性の基を有するヘテロ二官能性若しくはホモ二官能性（例えばジスクシンイミジルスベラート）であるものを包含する。こうしたリンカーはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォードから入手可能である。
【０１１２】
例示的な蛍光の検出可能な剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル、フィコエリトリンなどを包含する。抗体はまた、アルカリホスファターゼ、ワサビペルオキシダーゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどのような検出可能な酵素でも誘導体化しうる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化する場合、それは検出可能な反応生成物を生じるのに該酵素が使用する付加的な試薬を添加することにより検出する。例えば、検出可能な剤ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、検出可能である着色した反応生成物につながる。抗体は補欠分子族（例えばストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）でもまた誘導体化しうる。例えば、抗体をビオチンで誘導体化しかつアビジン若しくはストレプトアビジン結合の間接測定により検出しうる。適する蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド若しくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し、生物発光物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し、そして適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ若しくは３Ｈを包含する。抗体（若しくはそのフラグメント）は、細胞毒若しくは他の治療的タンパク質のような治療的部分にもまた複合しうる。あるいは、抗体を第二の抗体に複合して、米国特許第４，６７６，９８０号明細書にＳｅｇａｌにより記述されるところの抗体ヘテロ複合物を形成し得る。
【０１１３】
不必要なポリペプチド副生成物を減少若しくは排除するための発現ベクター
治療的タンパク質のためのタンパク質発現系の開発の間に、精製された標的生成物のＨＰＬＣ分析がペプチドの期待されない低分子量（ＬＭＷ）種を同定した。より具体的には、望ましくないポリペプチド副生成物が、３Ｄ６抗体を発現させるために開発したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株で観察された。この抗体は別の場所に記述されており、そして、アルツハイマー病の処置に有用な免疫治療薬を開発するための努力の結果である。それはＡβペプチドに対する特異性を有し、また、Ａβ斑の消失において有効であることが示された。該ＣＨＯ細胞株は、技術に認識された方法を使用して開発され、そして、発現カセット含有細胞の選択的培養のための遺伝子に加えて３Ｄ６抗体のＨおよびＬ鎖のコピーを含有した。
【０１１４】
該細胞株の多数のクローン単離物の検査は、ＬＭＷ種の産生が、利用されているクローンに特異的な現象でなかったことを示した。すなわち、試験した細胞株の全部で産生された全タンパク質の小画分が期待されないＬＭＷ種のものであった。全タンパク質に関してのＬＭＷ種の画分はタンパク質発現が誘導された場合に増大したことがさらに観察された。質量分析を使用する該ポリペプチドのさらなる評価は、ＬＭＷ種が該遺伝子のエキソン配列により予測されないアミノ酸を含有したことを示した。
【０１１５】
図１の上図は、イントロンおよびエキソンの関係ならびに配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の選択可能なマーカー遺伝子の位置を示す、３Ｄ６  Ｈ鎖発現カセットを図で提示する。示されるエキソンは、可変領域（ＶＨ１）、ヒンジならびに定常Ｈ１、２および３（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）である。発現カセットのイントロンはＩｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４を示される。図１はさらに、該発現カセット由来のｍＲＮＡについての予測される正確なスプライシング事象を具体的に説明する。中図は、該２シストロン性転写物のイントロン配列のみを含有する正確にスプライスされたｍＲＮＡを示す。
【０１１６】
発現ベクター中のイントロンおよびエキソン配列の精査ならびに質量分析データは、特異的スプライス部位の接合部のＲＮＡポリメラーゼのイントロンリードスルー（ＩＲＴ）を指摘した。該発現ベクターに含有されるイントロンおよびエキソンならびにスプライス部位のドナーおよびアクセプター部位の構成は、それらが該遺伝子の元のゲノムの形態中に存在したところのものに実質的に同一であったため、誤ったスプライスシング事象は予測可能でなかった。
【０１１７】
図１の下図は、第四のイントロンのイントロンリードスルーにより生成される予測された生成物を具体的に説明する。図２は、該３Ｄ６抗体発現ベクターのゲノム配列の第四のイントロンの領域のＤＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス鎖を示す配列情報を提供する。スプライス接合物（スプライスドナーおよびアクセプター部位）を核酸配列に垂直な縦線により示す。イントロン配列に対応するＤＮＡは下線をつけかつ斜体で示す。所望のおよびリードスルー副生成物のポリペプチドの予測されるアミノ酸を、ゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖の下に示す。正確にスプライスされたＲＮＡ由来のポリペプチドのアミノ酸配列を太字の大文字で示し；不正確にスプライスされたＲＮＡ由来のポリペプチド副生成物を小文字で示す。
【０１１８】
本発明は、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）および不必要なポリペプチド副生成物が実質的に減少若しくは完全に排除されるようなタンパク質発現カセットおよびベクターを設計するための材料および方法を記述する。部分的に、本発明は、ＩＲＴが減少若しくは排除されてそれにより不必要なＩＲＴポリペプチド種を減少若しくは排除するような、目的のタンパク質をコードする単離された核酸中のイントロンおよびエキソンの天然の効果的関連が変えられているベクターの新規設計に提供する。該独特な変化はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体にとりわけ適するが、しかし目的のいかなる遺伝子にも使用しうる。さらに、変えられた天然の効果的関連を伴うイントロンおよびエキソンを有する本発明のベクターは、標準的な技術に認識された技術を使用して設計されたベクターに関して、減少若しくは排除されたＩＲＴ副生成物のみならず、しかしまた増大された発現レベルも示す。［実施例］
【０１１９】
材料および方法
本実施例を通じ、以下の本文に例示されるところの材料および方法を、別の方法で述べられない限り使用した：
一般に、本発明の実務は、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学、とりわけ例
えば抗体技術における技術に認識された技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０、Ｐａｕｌ，Ｓ．、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、１６９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｕｓｕｂｅｌら編  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。
【実施例１】
【０１２０】
イントロンリードスルー転写の定量
イントロンリードスルーにより形成される異常な転写物の相対量を定量するため、定量的ＰＣＲアッセイを設計した。ＩＲＴ転写を評価するためのアプローチを図３に図で概説する。具体的には、定量的ＰＣＲアッセイを、ＰＣＲ増幅を使用して目的の核酸種を定量したＴａｑＭａｎ３系を使用して考案した。３種のプローブ−プライマーの組を、産生されているイントロンリードスルーｍＲＮＡの画分を測定するよう設計した。第一のプローブ−プライマーの組は、目的のイントロンと天然の効果的関連にあるエキソンの配列の転写のレベルを定量するように設計した。３Ｄ６  Ｈ鎖発現カセットの場合には、３Ｄ６の第二の定常Ｈ鎖（ＣＨ２）エキソンを含有するｍＲＮＡ種を標的とした。これは全３Ｄ６
ｍＲＮＡ産生の尺度を提供した。第二のプローブ−プライマーの組は、効果的関連にあるイントロンおよびエキソン（ここでは３Ｄ６発現カセットのＣＨ２エキソン−第四のイントロンの界面）を架橋した。このプローブ−プライマーの組に由来する増幅は、５’スプライスドナー配列を含有するイントロンリードスルー転写物、ならびにＣＨ２エキソンおよびイントロン４を架橋する配列の存在を示した。第三のプローブ−プライマーの組は第四のイントロンの配列を標的とした。このプローブ組は、内的イントロン４配列を含んでなる不正確にスプライスされたＲＮＡの画分の定量を提供した。
【０１２１】
図４は、記述されたところのプローブ−プライマーの組を使用するＱ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。簡潔には、安定に組込まれた発現ベクターを含有するＣＨＯ細胞を接種し、そして培養物中で２週間維持した。第７日に、タンパク質発現を増大させるため培養物を誘導した。実験の経過の間に、細胞培養物のサンプルを溶解し、そして先行する段落に記述されたとおり、ＣＨ２エキソンに特異的若しくはイントロンに特異的なプローブおよびプライマーの組を使用するアッセイでＲＮＡの内容を評価した。該図は、誘導前の不正確にスプライスされたＲＮＡ産物の低レベル、および誘導後の時間にわたるイントロン４を含有するＲＮＡの増大する比率を示す。ここに記述されるこのＱ−ＰＣＲ方法は、天然の効果的関連にあるイントロンおよびエキソンを含有する特定の１発現カセットがイントロンリードスルー副生成物を生じるであろうという見込みを予測する。
【０１２２】
３Ｄ６抗体発現系のＩＲＴを定量するための詳細がはっきりと提供される一方、該技術は、ＩＲＴの可能性が存在するいかなるタンパク質発現系でも実行し得る。この新規アプローチは、従って、本発明のベクター（下に詳細に記述される）を、不必要なＩＲＴポリペプチド副生成物の産生が回避されるような目的の特定のタンパク質に採用すべきであるかどうかを評価するためにとりわけ有用である。ＩＲＴ転写が約０．１％〜１％以上の豊富さにある場合、変えられた天然の効果的関連を使用するベクターを使用して所望のタンパク質を発現させ得る。イントロンリードスルーｍＲＮＡの検出方法、およびこれゆえにイントロンリードスルーポリペプチドの予測方法は、スプライシング事象が発生するいか
なるタンパク質発現系にも応用可能であることが、当業者に容易に明らかであろう。例えば、該系は、いずれの真核生物細胞系、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウス、サル、ウサギ、ラット若しくはヒト細胞に基づく系とともにも使用しうる。
【実施例２】
【０１２３】
改変された天然の効果的関連を有するイントロンおよびエキソンを含むベクター
イントロンおよびエキソンの天然の効果的関連が改変された発現ベクターを考案した。２種の例示的ベクター配列を図５に示す。この図は、イントロンリードスルー副生成物の問題を解消するため開発された発現構築物を具体的に説明する。上図は、可変領域（ＶＨ）、３種の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）およびヒンジ領域のエキソンを含有する包括的な抗体Ｈ鎖のゲノムすなわちイントロン−エキソンの構成を図で描く。中および下図は、イントロンリードスルーＨ鎖副生成物を排除した発現ベクターに組み込まれたゲノム配列に対する改変を記述する。
【０１２４】
３Ｄ６  Ｌ鎖を発現するＣＨＯ細胞を、３Ｄ６抗体の完全なゲノムＨ鎖配列で形質転換したか、若しくは、イントロンおよびエキソンの天然の効果的関連が改変された、改変３Ｄ６  Ｈ鎖発現ベクターで形質転換したかのいずれかであった。細胞を、材料および方法で記述されたところのタンパク質発現の目的上標準的な技術を使用して培養した。抗体を馴化上清から精製し、そしてその後変性逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを使用して分画した（図６）。抗体のＨおよびＬ鎖構成要素が分離されたようなカラムを運転した。
【０１２５】
３Ｄ６ゲノムクローンタンパク質調製物の分画を表す上のトレースで、ＨおよびＬ鎖のピークが容易に明白である。加えて、小さなピークが、Ｈ鎖イントロンリードスルー生成物に対応する、ＨとＬ鎖の間に分画して識別され得る。
【０１２６】
下のトレースはイントロンリードスルーの問題が低下された発現系の一例である。上のトレースでのとおり、Ｌ鎖およびＨ鎖ピークは明瞭に存在するが、しかしながら、ＩＲＴのレベルは検出限界より下に低下した。該知見は、エキソンおよびイントロンの天然の効果的関連が変えられた他のベクターに拡大された。例えば、図５に記述されるＨＣΔイントロン４配列は、同様にＩＲＴを検出不可能なレベルに低下させる。
【０１２７】
表１は図５に記述されるＨＣΔイントロン４配列の詳細を示す。
【０１２８】
【表１】
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【実施例３】
【０１２９】
イントロンの除去はタンパク質発現を増大させる
抗体発現に対するイントロン除去の影響を決定するため、抗体の発現構築物を、異なる数のイントロンを用いて創製した。１２Ａ１１ｖ３．１の可変領域をＣＨＯ細胞中で安定に発現させ、３種の定常領域発現構築物は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびに３個のイントロンが欠失されたゲノム配列（すなわち、ＣＨ１とヒンジ領域の間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロン）を含有した。１２Ａ１１ｖ３．１について、イントロンの除去は抗体発現の有意の増大を与えた。より具体的には、発現の約５倍の増大が、ゲノム配列に比較して１２Ａ１１ｖ３．１の３イントロン欠失構築物で検出された。ｃＤＮＡ配列を有する１２Ａ１１ｖ３．１構築物は、ゲノム配列に関して、発現の６倍を上回る増大を示した。一方、良好に発現された抗体は、典型的に、イントロン欠失配列とゲノム配列の間のＣＨＯ細胞の発現の有意の変化
を示さなかった。
【０１３０】
前述の発明は理解の明瞭さの目的上詳細に記述されたとは言え、付随する請求の範囲の範囲内である種の改変が実施されうることが明らかであろう。本明細書で引用される全部の刊行物および特許文書、ならびに図および配列表に出現する文言は、それぞれがそのように個々に示された場合と同一の程度まで、全部の目的上そっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる。
【０１３１】
本明細は、ここに引用することにより組み込まれる、本明細内で引用される参考文献の教示を鑑みて最も徹底的に理解される。本明細内の態様は本開示の態様の具体的説明を提供し、そして、その範囲を制限すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の態様が本開示により包含されることを容易に認識する。本開示で引用される全部の刊行物および特許、ならびに受託若しくはデータベース参照番号により同定される配列は、そっくりそのまま引用することにより組み込まれる。引用することにより組み込まれる資料が本明細と矛盾する、すなわち一致しない程度まで、本明細はいかなるこうした資料にも取って代わるであろう。本明細書のいかなる参考文献の引用も、こうした参考文献が本開示の先行技術であることの承認ではない。
【０１３２】
別の方法で示されない限り、請求項を包含する本明細で使用される成分、細胞培養物、処置条件などの量を表す全部の数字は、「約」という用語により全部の場合で修飾されていると理解されるべきである。従って、別の方法で示されない限り、逆に、数値パラメータは近似値であり、そして本発明により得られることを探求される所望の特性に依存して変動しうる。別の方法で示されない限り、一連の要素に先行する「最低」という用語は、該一連のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、わずかに慣例の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するか若しくは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】３Ｄ６  ＩｇＧ遺伝子（上）ならびに正確にスプライスされたｍＲＮＡ（中）およびイントロンリードスルーｍＲＮＡ（下）を含有する、発現ベクターから転写された期待されるプレｍＲＮＡを描く。
【図２】ゲノムの５’および３’スプライス接合部を示す、３Ｄ６  Ｈ鎖発現ベクターのＣＨ２とＣＨ３定常領域の間のイントロン（第四のイントロンと称される）にわたる核酸配列（配列番号７）を示す。正確に（配列番号８）および不正確に（配列番号９）スプライスされたｍＲＮＡ由来のポリペプチドの予測される部分的アミノ酸配列もまた示す。ＲＮＡスプライス接合部は二重実線により示す。
【図３】３Ｄ６  Ｈ鎖遺伝子転写の総レベル（ＣＨ２ｍＲＮＡ転写物のレベル）およびイントロン４のリードスルー転写のレベルを評価するのに使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）プローブの図解である。
【図４】培養の時間およびタンパク質発現の誘導に応答してのイントロン４含有転写物の増大された蓄積を示す棒グラフである。
【図５】３Ｄ６  イントロンおよびエキソンのゲノム配置、ならびにイントロンリードスルー転写を解消するため開発された発現ベクターで使用した改変された配置の図を提供する。
【図６】改変された発現ベクターで形質転換した細胞株でのイントロンリードスルーＨ鎖副生成物の欠如を示す逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラムを示す。
【図７】Ｈ鎖ゲノム構築物中のイントロンおよびエキソン、構築物、最後３イントロン配列が欠失された構築物、ならびにイントロンを含有しないｃＤＮＡ構築物の配置を描く。
【図８】ヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１および２に示される）。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれほぼヌクレオチド２３１ないし５２４、９１６ないし９６０、１０７９ないし１４０８および１５０６ないし１８２９（配列番号１）に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれほぼヌクレオチド１から２３０まで、ほぼヌクレオチド５２５ないし９１５、ほぼヌクレオチド９６１ないし１０７８およびほぼヌクレオチド１４０９ないし１５０５（配列番号１）に位置するヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖ゲノム配列からのイントロンに対応する。
【図９】ヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示すが（それぞれ配列番号３および４）に示される。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれほぼヌクレオチド２３１ないし５２４、９１６ないし９５２、１０７１ないし１４００および１４９８ないし１８２０（配列番号３）に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれほぼヌクレオチド１から２３０まで、ほぼヌクレオチド５２５ないし９１６、ほぼヌクレオチド９５３ないし１０７０およびほぼヌクレオチド１４０１ないし１４９７（配列番号３）に位置するヒトＩｇＧ４  Ｈ鎖ゲノム配列からのイントロンに対応する。
【図１０】定常領域のＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンが欠失されているヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図１１】以下のイントロン、すなわち、ＣＨ１とヒンジの間のイントロン、ヒンジとＣＨ２の間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３の間のイントロンの欠失を有する、改変されたヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図１２−】多様な付加的な３Ｄ６、１０Ｄ５、１２Ｂ４および２２６抗体のＨ鎖アミノ酸配列を示す。
【図−】多様な付加的な３Ｄ６、１０Ｄ５、１２Ｂ４および２２６抗体のＨ鎖アミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図４】
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【図７】
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【配列表】
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