(57)【要約】少なくとも１つの点突然変異を含む変異型ＴＳＨＲ試料であって、完全長のヒトのＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、変異型ＴＳＨＲ試料の異なるアミノ酸残基に突然変異し、それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、ディファレンシャルに患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用し、（ｉ）完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失され、（ｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されず、（ｉｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して効果的であることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの点突然変異を含む変異型ＴＳＨＲ試料であって、完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、該変異型ＴＳＨＲ試料の異なるアミノ酸残基に突然変異し、それによって、該変異型ＴＳＨＲ試料は、ディファレンシャルに患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用し、（ｉ）該完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、該変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、該患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失され、（ｉｉ）該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されず、（ｉｉｉ）該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、該変異型ＴＳＨＲ試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して効果的であることを特徴とする変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項２】
前記完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置で少なくともアミノ酸Ａｒｇが、負に帯電したアミノ酸残基に点突然変異されることを特徴とする請求項１に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項３】
前記完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置で少なくともアミノ酸Ａｒｇが、Ａｓｐに点突然変異されることを特徴とする請求項２に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項４】
少なくとも１つの点突然変異を含む変異型ＴＳＨＲ試料であって、完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、該変異型ＴＳＨＲ試料でＡｓｐに突然変異し、それによって、該変異型ＴＳＨＲ試料は、ディファレンシャルに患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用し、（ｉ）該完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、該変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失され、（ｉｉ）該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されず、（ｉｉｉ）該基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、該変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、該変異型ＴＳＨＲ試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して効果的であることを特徴とする変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項５】
前記変異型ＴＳＨＲ試料は、変異した完全長のヒトＴＳＨＲであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項６】
前記変異型ＴＳＨＲ試料は、ヒトＴＳＨＲの変異した断片であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項７】
前記変異型ＴＳＨＲ試料は、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨで、前記変異型ＴＳＨＲ試料のディファレンシャルな相互作用を増強する、アミノ酸の突然変異をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項８】
前記変異型ＴＳＨＲ試料は、前記変異型ＴＳＨＲ試料の生物学的活性又は機能を変えないかあるいは実質的に変化する、サイレント置換、付加又は削除を表す、アミノ酸の突然変異をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項９】
ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られるサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別での請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料の使用。
【請求項１０】
ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られる体液サンプルに存在する、刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨと前記変異型ＴＳＨＲ試料とのディファレンシャルな相互作用をモニタリング可能な検出手段を伴うことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料からなるキット。
【請求項１１】
ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者から得られる体液サンプルの刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルなスクリーニングのための方法であって、該方法は、被験者から得られる体液のサンプルでＴＳＨＲに反応して生成される、刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料を活用することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在を診断する方法であって、該方法は、被験者から得られる体液のサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料を活用し、被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在の診断を提供することを特徴とする方法。
【請求項１３】
ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、該疾患の疑いがあるか、該疾患症状を有しているか、あるいは該疾患から回復したと思われる動物被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症を遅延させるか、又は回避する方法であって、該方法は、被験者から得られる体液のサンプル中でＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在を暗示する刺激及び／又は遮断型ＴＳＨＲ自己抗体と初期にディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料を活用し、それによって、被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症の診断方法を提供し、その後、被験者に治療処置を行い、ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の発症を遅延、及び／又は、ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患を防ぐことを特徴とする方法。
【請求項１４】
被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の治療方法であって、該方法は、被験者から得られる体液のサンプル中でＴＳＨＲに対する反応で生成される刺激及び／又は遮断型ＴＳＨＲ自己抗体と初期にディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料を活用し、それによって、被験者の自己免疫疾患の診断を提供し、被験者に対して、このような自己免疫疾患の治療に効果的な少なくとも一つの治療薬の治療上の有効量を投与することを特徴とする方法。
【請求項１５】
ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の治療に対して効果的な、少なくとも一つの治療薬の治療上の有効量を伴う組み合わせの請求項１０に記載のキット。
【請求項１６】
薬学的に受け入れられるキャリア、希釈剤または賦形剤を伴う、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料からなる医薬品組成物。
【請求項１７】
治療で使用するための請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項１８】
グレーブス病の治療のための薬剤の製造に使用するための請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項１９】
グレーブス病の目の徴候の治療のための薬剤の製造に使用するための請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料をエンコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）（ｉ）の配列の対立遺伝子のバリエーションからなるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列の断片からなるヌクレオチド配列；又は
（ｉｖ）（ｉ）の配列のストリンジェントな状況でハイブリダイズするヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチド。
【請求項２１】
表１で表される、Arg  255  Asp  F;  Arg  255  Asp  Rのプライマーヌクレオチド配列、又は、遺伝コードの変質によるコドン配列において、該プライマーヌクレオチド配列と異なっているヌクレオチド配列。
【請求項２２】
請求項２０のポリヌクレオチドを有し、宿主細胞のゲノムに対してポリヌクレオチドを導入可能な、生物学的に機能的なベクターシステム。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド、請求項２０の１つ以上のポリヌクレオチド、又は請求項２２のベクターシステムで形質転換されるか又はトランスフェクションされる宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の変異型ＴＳＨＲ試料を調製するための方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項２３に記載の宿主細胞の提供；
（ｉｉ）当該宿主細胞の成長；及び
（ｉｉｉ）当該成長した宿主細胞からの本発明による変異型ＴＳＨＲ試料の回収
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
体液のサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して使用できる変異型ＴＳＨＲ試料を識別する方法であって、該方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、該ＴＳＨＲのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、変異型ＴＳＨＲの少なくとも１つの刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体及びTSHとの結果として相互作用の阻害で生じる点突然変異を識別することを特徴とする方法。
【請求項２６】
ＴＳＨＲの１つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびＴＳＨとの相互作用において必要とされるアミノ酸残基を識別する方法であって、該識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、ＴＳＨＲのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、この方法は、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、ＴＳＨＲと１つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用において必要とされる、重要なアミノ酸を識別することを特徴とする方法。
【請求項２７】
１つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとＴＳＨＲの形態に必要なアミノ酸残基の相互作用を可能にするように、ＴＳＨＲの形態に必要なアミノ酸残基を識別する方法であって、該識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、ＴＳＨＲのための結合パートナーと相互作用するそれらの能力によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、ＴＳＨＲと１つ以上の刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用が可能となるように、ＴＳＨＲの形態において必要とされる、重要なアミノ酸を識別することを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記変異型ＴＳＨＲ試料が刺激型TSHR自己抗体、遮断型TSHR自己抗体およびTSHとディファレンシャルに相互作用するように、点突然変異がヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置に存在するアミノ酸Ａｒｇにおいて実行されることを特徴とする、請求項２５乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、少なくともアミノ酸Ａｒｇは、選択的に、負に電荷されたアミノ酸残基へと点突然変異されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記負に帯電したアミノ酸はＡｓｐであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合パートナーはｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１、９Ｄ３３及びＴＳＨから選択されることを特徴とする請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記モニタリングされる、変異型ＴＳＨＲ試料の相互作用は、変異型ＴＳＨＲの刺激又は当該刺激の遮断であることを特徴とする請求項２５乃至３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記変異型ＴＳＨＲ試料と前記結合パートナーとの相互作用の結果としてサイクリックＡＭＰ生成のモニタリングを含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、Ａｒｇによって表される結合部位と、（ｂ）当該結合部位のための結合パートナーとを含む結合複合体であって、該結合パートナーは、好ましくは、ヒトモノクローナル抗体若しくは組換え抗体、あるいは該ヒトモノクローナル抗体若しくは組換え抗体の一つ以上の断片からなるか、又は派生することを特徴とする結合複合体。
【請求項３５】
前記結合パートナーは、ＴＳＨＲと反応的なヒトモノクローナル抗体若しくは該ヒトモノクローナル抗体の一つ以上の断片からなるか、又は派生することを特徴とする請求項３４に記載の結合複合体。
【請求項３６】
前記結合パートナーは、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１であることを特徴とする請求項３５に記載の結合複合体。
【請求項３７】
前記結合パートナーは、ＴＳＨＲと反応的なヒトモノクローナル抗体若しくは該ヒトモノクローナル抗体の一つ以上の断片からなるか、又は派生することを特徴とする請求項３４に記載の結合複合体。
【請求項３８】
ＴＳＨＲ抗体における結合部位として、完全長ヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置で、ＴＳＨＲ試料におけるアミノ酸Ａｒｇの使用。
【請求項３９】
ＴＳＨＲレセプター抗体又は該ＴＳＨＲレセプター抗体の１つ以上の断片の結合部位として、完全長ヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、ＴＳＨＲ試料におけるアミノ酸Ａｒｇの使用。
【請求項４０】
ヒトモノクローナル抗体若しくは組換え抗体、あるいは該ヒトモノクローナル抗体若しくは組換え抗体の一つ以上の断片からなるか、又は派生する、ＴＳＨＲ結合パートナーにおける結合部位として、完全長ヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、ＴＳＨＲ試料におけるアミノ酸Ａｒｇの使用。
【請求項４１】
スクリーニングされる体液サンプルで１つ以上の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニングのための完全長ヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、変異型ＴＳＨＲ試料の変異型アミノ酸残基の使用。
【請求項４２】
体液のサンプルに存在しないか、存在する、刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の識別において、完全長ヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、変異型ＴＳＨＲ試料の変異型アミノ酸残基の使用。
【請求項４３】
ＴＳＨＲと関連する自己免疫疾患の診断のために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５のアミノ酸に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在する、変異型アミノ酸残基の使用。
【請求項４４】
スクリーニングされる体液のサンプルにおいて、１つ以上の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニングのために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置で変異型ＴＳＨＲ試料のＡｓｐの使用。
【請求項４５】
体液のサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の有無の識別で、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置における変異型ＴＳＨＲ試料のＡｓｐの使用。
【請求項４６】
ＴＳＨＲと関連する自己免疫疾患の診断のために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置における変異型ＴＳＨＲ試料のＡｓｐの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）の試料に関し、特に、変異型甲状線刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）の試料、抗体及びそれらとのホルモンの相互作用、それらの使用、それらを提供する方法、ＴＳＨＲ抗体を識別するためのエピトープ領域及び結合部位、並びに、それらの複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺刺激ホルモン（thyrotropin  or  thyroid  stimulating  hormone  (TSH)）は、甲状腺の機能を調整することにおいて重要な役割を果たす下垂体ホルモンである。その放出は、視床下部で形成されるホルモンＴＲＨによって刺激され、重要な甲状腺ホルモン、チロキシン（Ｔ４）及びトリヨードサイロニン（Ｔ３）の形成及び放出を制御する。フィードバック・メカニズムを基礎として、血清の甲状腺ホルモン含有量は、ＴＳＨの放出を制御する。甲状腺細胞によるＴ３及びＴ４の形成は、下垂体によって放出されるＴＳＨが甲状腺細胞膜のＴＳＨＲと結合する手順によって、ＴＳＨによって促進される。
【０００３】
我々は、ＴＳＨＲの強力な甲状腺刺激物として作用する、ＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル抗体を特許文献１に記載した。このモノクローナル抗体（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１）におけるＴＳＨＲ上の結合部位は、特許文献１に開示されておらず、結合部位またはポケット（pocket）は適合しており、共にフォールド（fold）するレセプターの不連続な領域を含むことがあり得るものと考えられた。ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１などのＴＳＨＲに対するヒトモノクローナル又は組換抗体における、ＴＳＨＲの結合部位又はエピトープ領域の識別、あるいは、必須の結合アミノ酸残基又はそれらの配列の識別は、それとともにＴＳＨＲ構造及びヒト抗体の相互作用の理解において重要であって、このように自己抗体群の改良された評価およびTSHRへの自己免疫反応と関連する甲状腺の疾患の次の処置を可能にしなければならない。
【０００４】
TSHRに対する様々な形の自己抗体が、TSHRに自己免疫と関連する疾患の経過で形成されることが従来技術において実証される。それら自己抗体の種類に依存して、Ｔ３及びＴ４の形成及び放出のいずれかの阻害は、TSH分子からTSHRの遮蔽のために起こり得る。あるいは、一方で、抗TSHR自己抗体がTSHの作用を模倣して、甲状腺のホルモン類の合成及び放出を刺激するので、これらの甲状腺のホルモン類は制御されずに放出されることができる。
【０００５】
自己免疫甲状腺疾患（ＡＩＴＤ）は、世界的に異なる人口に影響を及ぼしている最も一般的な自己免疫疾患である。先に記載されているように、一部のＡＩＴＤ患者（主にグレーブス病を有する患者）は、実質的にTSHRに自己抗体を有する。自己抗体はTSHRと結合して、通常TSHの作用を模倣する。そして、甲状腺を刺激して、高水準の甲状腺のホルモン類を生じる。それら自己抗体は、刺激的な活性を有するように記載される。自己抗体を刺激することはまた、眼球細胞でＴＳＨＲｓと相互作用し、少なくとも幾つかのグレーブス病の目の徴候をもたらす。ある患者において、自己抗体はＴＳＨＲに結合するが、甲状腺ホルモンの生成を刺激せず、活性を阻害することが非特許文献１に記載されている。
【０００６】
ＴＳＨＲ自己抗体の測定は、ＡＩＴＤ、特に、グレーブス病の診断及び管理において重要である。現在、ＴＳＨＲ自己抗体を測定するために、３種類のアッセイが使用されており、それらは、
（ａ）ＴＳＨをＴＳＨＲの試料に結合することを阻害するためにTSHR自己抗体の能力を測定する競合結合測定；
（ｂ）培養組織でＴＳＨＲを発現している細胞を刺激するためにＴＳＨＲ自己抗体の能力を測定する生物検定；
（ｃ）ＴＳＨＲ自己抗体でＴＳＨＲ試料の免疫沈降；
である。
【０００７】
このようなアッセイを用いるＴＳＨＲ自己抗体の測定は、非特許文献１及び２に記載されている。
【０００８】
しかしながら、TSHR自己抗体を測定するために上記した現在利用可能な検査法を用いて多くの限界がある。異なるフォーマットにおいて利用できるタイプ(a)の競合検査法は、通常、感度が高くて、実行するのが比較的容易で、日常的な使用に適応できる。しかしながら、TSHR自己抗体を検出するために周知の競争的放射性受容体測定法によって、実際的な自然の基本的な不利な点を有して（それは、一般に、ＴＳＨＲ試料の結合能力が非常に高感度で、レセプターのまたはそれによって結合される生体分子の変化と反応するという事実に帰する）、加えて、自己抗体群のディファレンシャル診断（differential  diagnosis）が行われることができない（例えば、上述したように、自己抗体を刺激するか又は阻害する分化）。
【０００９】
（b）で言及されるタイプの生物検定が関する限り、これらは高価で、時間がかかって、非常に熟練したスタッフを必要とする傾向がある。
【００１０】
タイプ(c)の直接の免疫沈降分析に関して、実際には、それに関連する感度問題がしばしばあり、また、自己抗体群のディファレンシャル診断は現在まで可能でなかった。
【００１１】
前述の考察から認められることができるようにTSHR自己抗体検出において改良された検査法を提供する必要がある。例えば、TSHRに対する自己免疫と関連する自己抗体を刺激することと遮断することを区別することが可能であることが有利である。この目的で、TSHR自己抗体のディファレンシャル診断決定を行う分析方法を特許文献２に記載する。それによって、刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型TSHR自己抗体および非病原性のTSHR自己抗体（刺激的でもなく遮断的でもない）もサンプルにおいて理論的には選択的に決定されることができる。ＴＳＨＲ−キメラが採用され、そこでは、ＴＳＨＲ自己抗体の刺激及び／又は遮断の結合するために必要なＴＳＨＲの配列は、レセプターのＧタンパク質結合型の異なるレセプターの配列と置換される。また、必要とされる、反応混合物の可溶性にされた野生型組換TSHRの使用が開示される。キメラＡがＴＳＨＲ−キメラを表し、ここで、ＴＳＨＲの８から１６５のアミノ酸は、ルトロピン（lutropin）/絨毛膜性腺刺激ホルモンレセプターのうちの１０から１６６のアミノ酸と置換され、キメラＢはＴＳＨＲ−キメラを表し、ここで、ＴＳＨＲの２６１から３７０のアミノ酸は、ルトロピン（lutropin）/絨毛膜性腺刺激ホルモンレセプターのうちの２６１から３２９のアミノ酸と置換され、キメラＣはＴＳＨＲ−キメラを表し、ここで、ＴＳＨＲの８−１６５及び２６１から３７０のアミノ酸は、ルトロピン（lutropin）/絨毛膜性腺刺激ホルモンレセプターのうちの１０−１６６及び２６１−３２９のアミノ酸とそれぞれ置換されることが分かる。
【００１２】
特許文献３は同様に、TSHR自己抗体のディファレンシャル診断決定を行う分析方法を記載する。それによって、刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、遮断型TSHR自己抗体および非病原性のTSHR自己抗体はサンプルにおいて再び理論的には選択的に決定されることができる。少なくとも、選別されている自己抗体を結合する任意の結合剤（例えば野生型組換えTSHR）は、過剰な選択されたTSHR―キメラ（遮断型または刺激型自己抗体にとって重要な配列を結合しているTSHRが選別されている自己抗体のそれぞれのタイプを結合しない配列と置換される）がある場合には、サンプルと作用される。特許文献３において開示されるTSHR−キメラは、上で述べた特許文献２のTSHR−キメラに対応する。
【００１３】
さらに、特許文献２及び３に記載される上述の技術は、非特許文献３によって記載されている。
【００１４】
非特許文献３に記載されているこれらの研究のための正当性は、TSHR（アミノ酸の25と165との間）のＮ末端のエピトープと相互作用する甲状腺の刺激（つまり、ＴＳＨアゴニスト）活性を有するTSHR自己抗体を報告し、一方で、より多くのＣ末端（アミノ酸261-370）であるエピトープと相互作用するTSHアンタゴニスト活性を有するTSHR自己抗体を報告する。特に、キメラＡでの研究は、それが１２５Ｉ標識のＴＳＨと良好に結合し、このキメラとトランスフェクションする細胞が、良好にＴＳＨに反応することを示した。
【００１５】
キメラＡと野生型ＴＳＨＲの両方に対する標識ＴＳＨの結合は、ＴＳＨＲ自己抗体を含む血清によって阻害された。しかしながら、血清の阻害作用は野生型レセプターを使用して強力であり、これはTSHアゴニスト及び／又はTSHアンタゴニスト活性を有する自己抗体における場合であった。キメラと結合しているTSHの阻害に基づくアッセイは、TSHアゴニスト及びTSHアンタゴニスト活性を有するTSHR自己抗体間の改良された分化（野生型TSHRと比較して）を示すように見えたが、相当な重なりがあった。この重なりは、臨床応用を制限する。さらに、かなり以前の調査で、天然の（つまり、野生型）TSHRと結合している標識されたTSHの阻害に基づくTSHR自己抗体のアッセイは、分析感度を減少する（つまり、希釈されたテストサンプルを使用する）ことによってTSHアンタゴニスト活性を有するTSHR自己抗体において選択するために変更された。通常、TSHアンタゴニスト自己抗体が、TSHアゴニスト自己抗体よりも非常に高い濃度の血清に存在するので、これは効果的である。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５０７０８Ａ２
【特許文献２】WO  01/27634
【特許文献３】WO  01/63296
【非特許文献１】J  Sanders,  Y  Oda,  S-A  Roberts,  M  Maruyama,  J  Furmaniak,  B  Rees  Smith  "Understanding  the  thyrotropin  receptor  function-structure  relationship."  Bailliere's  Clinical  Endocrinology  and  Metabolism.  Ed.  T  F  Davies  1997  1  1(3):  451-479.  Pub.  Bailliere  Tindall,  London
【非特許文献２】J  Sanders,  Y  Oda,  S  Roberts,  A  Kiddie,  T  Richards,  J  Bolton,  V  McGrath,  S  Walters,  D  Jaskolski,  J  Furmaniak,  B  Rees  Smith  "The  interaction  of  TSHR  autoantibodies  with  125I-  labelled  TSHR",  Journal  of  Clinical  Endocrinology  and  Metabolism  1999  84(10):3797-3802
【非特許文献３】Minich  et  al  in  Journal  of  Endocrinology  &  Metabolism,  89  (1):  352-356
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＴＳＨＲに対する反応で生成されるＴＳＨＲ自己抗体の検出及び分析のために改良したアッセイを提供し、さらに、従来技術を使用して経験される問題を軽減するために、本発明は、非特許文献３に記載の従来技術と異なる方法を提供する。特に、我々は、TSHRの一つのアミノ酸を突然変異させて、様々な新規なリガンドによって、TSHRの結合及び刺激における突然変異の効果を研究した。それらの新規なリガンドは、ヒトモノクローナル甲状腺刺激型自己抗体（hMAb  TSHRl）、強力なhMAb  TSHRl（及びTSH）アンタゴニストであるマウスモノクローナル抗体（9D33）並びに強力なTSHアゴニストであるマウスモノクローナル抗体を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
従来技術とは対照的に、我々の研究は、驚くべきことに、様々なＴＳＨＲリガンド間の非常に明確な差異を提供するシステムを導いた。特に、我々は、TSHアゴニスト活性を有するTSHR抗体（自己抗体およびモノクローナル抗体）の作用を基本的に消失するが、TSHアンタゴニスト活性を有するTSHレセプター抗体（自己抗体およびモノクローナル抗体）の効果の影響を受けないか、あるいは同じ突然変異によって増加した、ＴＳＨＲの特定の点突然変異を明らかにした。
【００１８】
したがって、本発明は、ＴＳＨＲ自己抗体群の刺激と遮断とを区別する、新規の改良された手段を提供する。ここで、本発明によって、少なくとも１つの点突然変異を含む、変異型ＴＳＨＲ試料が提供され、完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、変異型ＴＳＨＲ試料の異なるアミノ酸残基に突然変異したことを特徴とする。それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、ディファレンシャルに（differentially）患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用する。（ｉ）完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失される。（ｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されない。（ｉｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング（differential  screening）及び識別に対して効果的である。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様において、完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置で少なくともアミノ酸Ａｒｇが、負に帯電したアミノ酸残基、好ましくは、Ａｓｐに点突然変異される。好ましくは、したがって、少なくとも１つの点突然変異を含む、変異型ＴＳＨＲ試料が提供され、完全長のヒトのＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置の少なくともアミノ酸Argが、変異型ＴＳＨＲ試料の異なるアミノ酸残基に突然変異したことを特徴とする。それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、ディファレンシャルに患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体及びTSHと相互作用する。（ｉ）完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失される。（ｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されない。（ｉｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇し、それによって、変異型ＴＳＨＲ試料は、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して効果的である。
【００２０】
最適には、本発明によって提供される変異型ＴＳＨＲ試料は、上述したように突然変異された、完全長の野生型ヒトＴＳＨＲを含むことができる。代替として、変異型ＴＳＨＲ試料は、上述のように突然変異された完全長の野生型ヒトＴＳＨＲの断片を含み、その断片は、同じく、上述したように、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとディファレンシャルに相互作用する。さらに、アミノ酸の突然変異が、ここに記載したように、変異型ＴＳＨＲ試料に存在し、さらに、そのような突然変異は、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨと変異型ＴＳＨＲ試料とのディファレンシャルな相互作用をさらに促進するための点突然変異であるか、または、本発明によって提供される変異型ＴＳＨＲ試料の生物学的活性又は機能を変えないか或いは実質的に変化するサイレント置換、付加又は削除であってよい。
【００２１】
更なる突然変異が保存的アミノ酸置換を意味する場合には、この種の置換は、同様の特徴の他のアミノ酸による変異型ＴＳＨＲ試料の所与のアミノ酸を置換するものである。保守的な置換として、典型的には、脂肪族アミノ酸、ヒドロキシ残基、酸性の残基、アミド残基、塩基の残基及び芳香族の残基の中で、１つが別のものにとって代わる置換である。
【００２２】
ここで使用される用語“断片”は、本発明による変異型ＴＳＨＲ試料に関するアミノ酸配列を意味し、そのアミノ酸配列は、野生型ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列のすべての配列ではなく、その一部に対応しており、完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置で少なくともアミノ酸Ａｒｇが、上述のように、異なるアミノ酸残基への突然変異を含み、その断片は、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルに相互作用する。このようにして、スクリーニングされる体液のサンプル中、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別を可能にする。本発明による変異型ＴＳＨＲ試料において提供される“断片”は、“フリースタンディング（free  standing）”、つまり、他のアミノ酸又はポリペプチドの一部でないか、あるいは他のアミノ酸又はポリペプチドに連合されてよく、または、それら断片は、それらが一部または領域を形成する、より大きなポリペプチドの範囲内に含まれることができる。このような断片は、このように“スキャホールド”タイプのポリペプチドに取り入れられてもよく、ここで、付加アミノ酸は、野生型ＴＳＨＲ試料の活性部位に存在するようなアミノ酸の形態、配列または配列に類似しているか、または実質的に類似している形態、配列または配列の変異型ＴＳＨＲ断片の試料のアミノ酸を“保持”するように提供される。
【００２３】
野生型ヒトＴＳＨＲのアミノ酸配列における完全な配列の情報は当該技術分野の刊行物及び／又はレセプター配列のアミノ酸データベースを参照することによって容易に得ることができる。そのように、本発明に基づき適切な変異型試料及び変異型断片の完全な配列は、本明細書の開示に関連して周知の野生型の配列に基づいて、容易に決定できる。
【００２４】
本発明によって提供されるような変異型ＴＳＨＲ試料は、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別における診断において用いられ、したがって、重要なステップはTSHRへの自己免疫反応と関連する自己免疫疾患の信頼性が高い診断を提供し、上述した従来技術で知られていた診断方法及びキットに関連する多数の問題を軽減する、重要なステップを提供する。特に、特許文献２及び３によって提供される教示に対する利点を提供する。
【００２５】
本発明によると、したがって、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる被験者（特に、ヒト）から得られるサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別において、実質的に、ここで記載したような変異型ＴＳＨＲ試料の活用が提供される。
【００２６】
また、本発明によって、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる被験者（特に、ヒト）のＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患の診断において、実質的に、ここで記載したような変異型ＴＳＨＲ試料の活用が提供される。
【００２７】
さらに、本発明は、スクリーニングされる体液のサンプルに存在する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨで、変異型ＴＳＨＲ試料のディファレンシャルな相互作用のモニタリングを可能にする検出手段を伴い、実質的に、ここで記載したような変異型ＴＳＨＲ試料を有するキットを提供する。
【００２８】
さらに、本発明によって、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる被験者から得られる体液のサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニングの方法が提供され、その方法は、被験者から得られる体液のサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、変異型ＴＳＨＲ試料を採用する。
【００２９】
さらに、本発明は、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる被験者（特にヒト）のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在を診断する方法を提供し、その方法は、被験者から得られる体液のサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、実質的に上述されるような変異型ＴＳＨＲ試料を採用し、被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在の診断方法を提供する。
【００３０】
さらにまた、本発明は、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる動物被験者（特にヒトの被験者）のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症を遅延させるか、又は回避する方法を提供し、その方法は、被験者から得られる体液のサンプル中でＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症または存在を暗示する刺激及び／又は遮断型ＴＳＨＲ自己抗体と初期にディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、実質的に上述されるような変異型ＴＳＨＲ試料を採用する。それによって、被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の見込まれる発症の診断方法を提供し、その後、被験者に治療処置を行い、ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の発症を遅延、及び／又は、ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患を防ぐ。
【００３１】
本発明はさらに、被験者のＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の治療方法を提供し、その方法は、被験者から得られる体液のサンプル中でＴＳＨＲに対する反応で生成される刺激及び／又は遮断型ＴＳＨＲ自己抗体と初期にディファレンシャルに相互作用し、且つ、検出する、実質的に上述されるような変異型ＴＳＨＲ試料を採用する。それによって、被験者の自己免疫疾患の診断を提供し、被験者に対して、このような自己免疫疾患の治療に効果的な少なくとも一つの治療薬の治療上の有効量を投与する。
【００３２】
投与される治療薬の量は、治療されている特定の自己免疫疾患状態に依存し、おそらく、患者の年齢に依存する。また、投与される治療薬の量は、最終的に付き添いの医師の裁量となる。
【００３３】
さらにまた、本発明は、ＴＳＨＲに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患の治療に対して効果的な、実質的に上述されるような少なくとも一つの治療薬の治療上の有効量を伴って、実質的に上述されるようなキットも共に提供される。
【００３４】
典型的に、本発明によってスクリーニングされる体液のサンプルは血液サンプル又は他の流体の血液分画（例えば、特に、血清サンプルまたは血漿サンプル）であるが、サンプルは、原則として、他の生物流体（例えば、唾液、尿、若しくは可溶性の細胞抽出物）であってもよいし、又は針生検によって得てもよい。
【００３５】
実質的に上述の本発明による変異型ＴＳＨＲ試料は、TSHRに対する免疫反応と関連する自己免疫疾患を治療する治療薬として使用するために適しているか、または、自己免疫疾患の治療のための適切な治療薬の識別において使われることができる。例えば、変異型ＴＳＨＲ試料は、ＴＳＨＲに対する免疫反応に関連した自己免疫疾患であるか、その疾患の疑いがあるか、その疾患症状を有しているか、あるいはその疾患から回復したと思われる被験者（特にヒト被験者）で、循環している刺激及び／又は遮断型ＴＳＨＲ自己抗体と相互作用し、且つ、基本的に取り除くように、治療上使用できる。
【００３６】
したがって、本発明によって、薬学的に受け入れられるキャリア、希釈剤または賦形剤を伴う、実質的に上述の本発明による変異型ＴＳＨＲ試料からなる医薬品組成物が提供され、変異型ＴＳＨＲ試料は、ＴＳＨＲに対する反応で生成された刺激及び／又は遮断自己抗体とディファレンシャルに相互作用できる。
【００３７】
さらに、本発明は、グレーブス病の治療のための薬剤の製造に使用するための、実質的に上述した、変異型ＴＳＨＲ試料を提供する。特に、本発明によって提供されるような変異型ＴＳＨＲ試料は、グレーブス病の少なくとも目の徴候の治療のための薬剤の製造の使用において適している。
【００３８】
本発明による組成物又は薬剤は、薬学的に受け入れられるキャリアに、本発明により変異型ＴＳＨＲ試料の治療的又は予防的な量を含まなければならない。薬剤担体は、患者に対する変異型ＴＳＨＲ試料の送達に適した、いかなる互換性を有し、無毒な物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性な固体が、キャリアとして使用されてよい。薬学的に受け入れられる佐剤、バッファー剤、分散助剤などもまた、医薬品組成物に組み込まれてよい。このような組成物は、単一の変異型ＴＳＨＲ試料を含むことができるか、または本発明による2つ以上の変異型ＴＳＨＲ試料を含んでよい。
【００３９】
本発明による医薬品組成物は、非経口投与に有用である。好ましくは、組成物は、非経口的に、すなわち皮下に、筋注または静脈内に投与される。このように、本発明は、患者に対して非経口投与するための組成物を提供する。ここで、上述したように、組成物は、受け入れられるキャリアに、変異型ＴＳＨＲ試料の溶液または分散を含む。医薬品組成物の変異型ＴＳＨＲ試料の濃度は幅広く変化することができる、つまり、約0.1重量％未満から、通常、少なくとも約1重量％から20重量％以上までである。筋内注射のための典型的な医薬品組成物は、例えば、1mlの滅菌した緩衝水と、1〜100μgの本発明の精製された変異型ＴＳＨＲ試料を含むように形成される。静脈内注入のための典型的な組成物は、100〜500mlの滅菌したリンガー溶液と、100〜500mgの本発明の精製された変異型ＴＳＨＲ試料を含むように形成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、従来技術において周知であり、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Science,  15th  Edition,  Mack  Publishing  Company,  Easton,  Pa.  (1980)を含む様々な情報源において、より詳細に記載されている。
【００４０】
本発明のさらなる態様と一致して、
（ｉ）実質的に、上述の変異型ＴＳＨＲ試料をエンコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）（ｉ）の配列の対立遺伝子のバリエーションからなるヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列の断片からなるヌクレオチド配列；又は
（ｉｖ）（ｉ）の配列のストリンジェントな状況でハイブリダイズするヌクレオチド配列；からなるポリヌクレオチドが提供される。
【００４１】
本発明はさらに、表１で表される、プライマーヌクレオチド配列Arg  255  Asp  F;  Arg  255  Asp  R、及び／又は、そこから遺伝コードの変質によるコドン配列において、異なっているヌクレオチド配列が提供される。ヌクレオチド配列が表1において与えられるプライマーの用途にだけ提供されるにもかかわらず、本発明による残りのヌクレオチドをコードするＴＳＨＲ試料は、従来技術において刊行物及び／又はレセプター・配列（野生型ヒトTSHRの全長配列は従来技術において周知である）のためのヌクレオチド・データベースを参照することで容易に得られることができることを認識できる。
【００４２】
より詳細には、本明細書の実施例に記載の特定技術を参照することによって理解できる。その実施例で、突然変異は、本発明によって提供されるようなポリヌクレオチド配列で存在し、本発明による変異型ヒトＴＳＨＲ試料に存在する点突発変異を遂行することを要求され、表1において示されるプライマー配列の以下の一対、Arg  255  Asp  F：Arg  255  Asp  Rを用いることによって成し遂げられ、２５５（Arg）の255（Asp）への突然変異をもたらす。さらに、表１に示されるプライマーが、要求される変異型ヌクレオチド配列を得るためにＰＣＲ増幅に使用され、本発明によって対応する変異型ヒトＴＳＨＲ試料が、本発明によるポリヌクレオチドの発現によって適切に得られるか、又は得られうることが好ましい。実質的に、ここに記載のような、本発明による変異型ＴＳＨＲ試料は、組換えタンパク質を生成する様々なシステムで発現できる。例えば、哺乳動物細胞（例えば、Chinese  Hamster  Ovary（CHO）細胞など）での発現が好ましく、CHO細胞の特定の使用はpcDNA5.1/FRTベクターと共に実施例に記載されている。代替として、本発明の変異型ヒトＴＳＨＲ試料は、従来技術で周知な技術を採用する、従来のペプチド・シンセサイザーによって、総合的に生成できる。
【００４３】
本発明はさらに、実質的に、上述された変異型ＴＳＨＲ試料を調製するための方法を提供し、この方法は、
（ｉ）実質的に、ここに記載のような、宿主細胞の提供；
（ｉｉ）上記宿主細胞の成長；及び
（ｉｉｉ）その成長した宿主細胞からの本発明による変異型ＴＳＨＲ試料の回収
を含む。
【００４４】
本発明による変異型ＴＳＨＲ試料の回収は、概して、従来技術において当業者にとって公知である、従来の抽出および精製技術（例えば、クロマトグラフィ分離または免疫学的分離）を使用することができる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってよく、例えば、クローニングによって得られるか、若しくは化学的な合成技術によって生成される、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡであってよく、又は、それらの組み合わせであってもよい。本発明の好ましい実施態様は、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含むことが好ましい。
【００４６】
本発明はさらに、本発明によって提供されるような変異型ＴＳＨＲ試料をエンコードする、上述したポリヌクレオチドの異型に関する。ポリヌクレオチドの異型は、自然発生する異型（例えば、自然発生する対立遺伝子変異体）であってよく、又は、自然発生することが知られていない異型であってもよい。ポリヌクレオチドのそのような非自然発生の異型は、突然変異生成技術によって成されてよい。
【００４７】
この点に関して、ヌクレオチドの置換、欠失または付加によって上述したポリヌクレオチドと異なる異型は、異型の一つである。置換、欠失または付加は、１つ以上のヌクレオチドを含んでよい。コード領域の変更は、保守的であるか非保守的なアミノ酸の置換、欠失または付加を生成することができる。
【００４８】
本発明による異型のポリヌクレオチドは、ここで記載されるような変異型ＴＳＨＲ試料をエンコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドに相補的であるか又はハイブリダイズするポリヌクレオチドに対して、異型のポリヌクレオチドの完全長の少なくとも７０％以上が同一であることが適している。あるいは、最も好ましいポリヌクレオチドは、ここで記載されるような変異型ＴＳＨＲ試料をエンコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドに相補的であるか又はハイブリダイズするポリヌクレオチドに対して、異型のポリヌクレオチドの完全長の少なくとも８０％以上が同一である領域を含む。この点に関して、完全長の少なくとも９０％以上が同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、特に、それらの好ましいポリヌクレオチドにおいて、少なくとも９５％が同一であるものが特に好ましい。さらに、少なくとも９５％が同一であるものの中でも、少なくとも９７％が同一であるものがより好ましく、さらにそれらの中でも、特に、少なくとも９８％が同一及び少なくとも９９％が同一のものがより好ましく、少なくとも９９％が同一のものが、よりさらに好ましい。
【００４９】
実質的に上述されるように、本発明はさらに、ここで上述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関し、本発明は特に、ここで上述したポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドに関する。ここで使用される用語、“ストリンジェントな条件”は、配列間で少なくとも９５％の相補的に同一、さらに好ましくは少なくとも９７％の相補的に同一である場合にのみ、ハイブリダイゼーションが生じることを意味する。
【００５０】
本発明はまた、ベクターに関し、そのベクターは、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターで遺伝子工学的に改変された宿主細胞、及び組換え技術による、本発明のここに記載された変異型ＴＳＨＲ試料の生成を含む。
【００５１】
したがって、本発明は、さらに、実質的にここに記載されたポリヌクレオチドを有し、宿主生物のゲノムに対するポリヌクレオチドの導入が可能な生物学的に機能的なベクターシステムを提供する。
【００５２】
宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明の変異型ＴＳＨＲ試料を発現するように遺伝子工学的に改変できる。また、本発明は、さらに、ポリヌクレオチド若しくは１つ以上のポリヌクレオチドで形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞、あるいは、ここに、各々が実質的に記載されたベクターシステムを提供する。適切なＤＮＡ配列は、様々な周知の慣習的な技術によって、ベクターに挿入されてよい。
【００５３】
本発明はさらに、体液のサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別に対して使用できる変異型ＴＳＨＲ試料を識別する方法を提供し、その方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、ＴＳＨＲのための結合パートナー（hMAb  TSHRl,  9D33  又はTSHなど）と相互作用するそれらの能力（野生型ＴＳＨＲに比較して異なる能力を含む）によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、この方法は、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、変異型ＴＳＨＲの少なくとも１つの患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとの結果として相互作用の阻害で生じる点突然変異を識別する。
【００５４】
本発明はまた、ＴＳＨＲのエピトープ領域に対して重要である、アミノ酸残基を識別するために使用でき、それによって、識別方法が提供され、その識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、ＴＳＨＲのための結合パートナー（hMAb  TSHRl,  9D33  又はTSHなど）と相互作用するそれらの能力（野生型ＴＳＨＲに比較して異なる能力を含む）によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、この方法は、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、ＴＳＨＲと１つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用において必要とされる、重要なアミノ酸を識別する。
【００５５】
さらに、本発明は、１つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとそれらの相互作用を可能にするように、ＴＳＨＲの形態に必要なアミノ酸残基を識別するために用いることができ、それによって、識別方法が提供され、その識別方法は、TSHRの潜在的に相互作用している領域の識別と、ＴＳＨＲのための結合パートナー（hMAb  TSHRl,  9D33  又はTSHなど）と相互作用するそれらの能力（野生型ＴＳＨＲに比較して異なる能力を含む）によってさらに識別できる、そこに存在するアミノ酸残基の識別を含み、候補であるアミノ酸は、一つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとTSHRとの相互作用に必要とされるアミノ酸であり、さらに、この方法は、当該候補となるアミノ酸の点突然変異の実行を含み、さらに、変異型ＴＳＨＲ試料が結合パートナーと生じた相互作用のモニタリングを含み、ＴＳＨＲと１つ以上の患者の血清の刺激型TSHR自己抗体、患者の血清の遮断型TSHR自己抗体およびTSHとのそれぞれの相互作用が可能となるように、ＴＳＨＲの形態において必要とされる、重要なキーのアミノ酸を識別する。
【００５６】
各々の上記の方法において、変異型ＴＳＨＲ試料との結合パートナーの相互作用の結果として、サイクリックAMPの生成をモニターすることによって、モニターされる変異型ＴＳＨＲ試料の相互作用は、好ましくは、変異型ＴＳＨＲの刺激、又はそのような刺激の遮断である。
【００５７】
ここに記載されるように、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置に存在するアミノ酸Ａｒｇは、抗体が結合するために必要とされるヒトＴＳＨＲの重要なアミノ酸として、本発明によって識別される。さらに、それの突然変異は、抗体群の刺激及び遮断のディファレンシャル診断を達成できる。
【００５８】
したがって、本発明によると、ＴＳＨＲ抗体における結合部位として使用するために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在するアミノ酸Ａｒｇが提供される。さらに、本発明によって、ＴＳＨＲレセプター自己抗体又はその１つ以上の断片における結合部位として使用するために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在するアミノ酸Ａｒｇが提供される。さらに、本発明によって、ヒトモノクローナル若しくは組換え抗体からなるか、又はヒトモノクローナル若しくは組換え抗体から派生した、ＴＳＨＲ結合パートナー又はその１つ以上の断片における結合部位として使用するために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在するアミノ酸Ａｒｇが提供される。さらに、本発明によって、スクリーニングされる体液のサンプルにおいて、１つ以上の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニングのために、さらに、好ましくは、体液のサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の有無を識別するために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在する、変異型アミノ酸残基の活用が提供される。さらに、本発明によって、ＴＳＨＲと関連する自己免疫疾患の診断のために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在する、変異型アミノ酸残基の活用が提供される。より詳細には、本発明によって、スクリーニングされる体液のサンプルにおいて、１つ以上の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニングのために、さらに、好ましくは、体液のサンプル中の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の有無を識別するために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在する、Ａｓｐの活用が提供される。さらに、本発明によって、ＴＳＨＲと関連する自己免疫疾患の診断のために、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置でＴＳＨＲ試料に存在する、Ａｓｐの活用が提供される。
【００５９】
さらに、本発明によって、（ａ）ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置に存在する、Ａｒｇによって表される結合部位と、（ｂ）当該結合部位のための結合パートナーとを含む結合複合体が提供され、その結合パートナーは、好ましくは、ヒトモノクローナル若しくは組換え抗体からなるか、又は派生する。あるいは、結合パートナーは、ヒトモノクローナル若しくは組換え抗体の一つ以上の断片からなる。
【００６０】
最適には、結合パートナーは、ＴＳＨＲと反応的なヒトモノクローナル抗体、若しくはその１つ以上の断片からなるか、又は、当該抗体の１つ以上の断片から派生する。代替として、結合パートナーは、ＴＳＨＲと反応的なヒト組換え抗体、若しくはその１つ以上の断片からなるか、又は、当該抗体の１つ以上の断片から派生する。好ましくは、結合パートナーは、ＴＳＨＲと反応的なヒトモノクローナル若しくは組換え抗体、又は、当該抗体の１つ以上の断片から派生する。好ましくは、結合パートナーは、さらに、その能力によって、ＴＳＨＲへのＴＳＨの結合を阻害し、及び／又は、ＴＳＨＲを刺激することを特徴とすることができ、これら両者の特徴は、グレーブス病患者から得られる血清に存在するTSHR自己抗体のそれぞれの抑制及び刺激特性と同等であることが認められる。
【００６１】
本発明によって提供されるような、特に好ましい、複合体の結合パートナーは、WO  2004/050708A2に記載されるようなヒトＴＳＨＲモノクローナル抗体hMAb  TSHR  1である。従来技術に記載されるように、hMAb  TSHR  1の結合部位は開示されておらず、ＴＳＨＲの複合体の性質、さらに、それに対する抗体の異質性からみて、エピトープ領域若しくはそこに対する結合部位を決定するか又は予測するために、従来技術開示に基づいて可能ではなかった。
【００６２】
以下の図示する説明は、本願明細書において用いられる特定の条件の理解を容易にするために提供される。この説明は、便宜的に提供されて、本発明を制限するものではない。
【００６３】
ＴＳＨＲのための結合パートナーは、ＴＳＨＲにおける特異的な結合を有する分子を記載する。ここに記載される結合パートナーは、自然に派生されてよいし、又は、全体的若しくは部分的に合成的に生成されてよい。そのような結合パートナーは、特異的に結合するドメイン又は領域を有し、したがって、ＴＳＨＲの１つ以上のエピトープ領域と相補的であり、ＴＳＨＲに対する刺激及び／又は遮断抗体を含むことができ、当該抗体は、自己抗体、モノクローナル若しくは組換え抗体、あるいはＴＳＨなどのリガンドであってよい。
【００６４】
結合部位は、ＴＳＨＲの原子、官能基又はアミノ酸残基などの部位を意味し、ＴＳＨＲ抗体、他のリガンド、あるいはそれらの結合パートナーに対して結合し得る。キャビティ（cavity）の特異的な分子に依存して、部位は魅力的であるか不快な結合相互作用（電荷、立体的な条件などによってもたらされる）を呈することができる。
【００６５】
結合パートナーによるＴＳＨＲの遮断は、ＴＳＨＲに対する結合パートナーの結合能力を意味し、ここに記載されるように、例えば、ＴＳＨＲ刺激の結果として形成されるサイクリックＡＭＰの生成を阻害する。
【００６６】
遮断型ＴＳＨＲ抗体は、ＴＳＨＲに結合し、ここに記載されるようにＴＳＨＲの遮断を遂行する。
【００６７】
本発明によって提供される、変異型ＴＳＨＲ試料に関する、ディファレンシャルに相互作用する、又は、ディファレンシャルな相互作用は、下記を意味し、（ｉ）完全長のヒトＴＳＨＲのアミノ酸２５５に対応する位置でＡｒｇの変異が基準ＴＳＨＲ試料に存在しないことを除いて、変異型ＴＳＨＲ試料のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有する基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用と比較した場合、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体の刺激作用は、実質的に減少されるか、又は本質的に消失される。（ｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用するＴＳＨの刺激作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する場合のＴＳＨの刺激作用は基本的に影響されない。（ｉｉｉ）基準ＴＳＨＲ試料と相互作用する、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断作用と比較すると、変異型ＴＳＨＲ試料と相互作用する患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体の遮断効果は、基本的に影響されないか又は上昇する。上記の記載の相互作用（阻害されるか、変化されないか、又は増幅される）は、ＴＳＨＲの刺激又はＴＳＨＲの遮断である。さらに、実施例に記載されるように、変異型ＴＳＨＲの、患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとの結合の相互作用、アフィニティに関して、これは、本発明によって提供される変異型ＴＳＨＲ試料の刺激及び／又は遮断に関して観察される結果に対応して見られる、特定の事象ではなく、例えば、変異型レセプターの減じた発現レベルによるものであってよい。
【００６８】
プライマーの定義及びプライマーのネーミングの“Ｆ”は、フォワードプライマーを意味する。
【００６９】
宿主細胞は、形質転換若しくはトランスフェクションされた細胞であるか、又は外因性のポリヌクレオチド配列によって形質転換若しくはトランスフェクションできる。
【００７０】
配列を比較することによって定まる、同一性は、周知のように、2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。
【００７１】
変異型ＴＳＨＲ試料は、ＴＳＨＲ試料を意味し、当該ＴＳＨＲ試料は、結果として生じるＴＳＨＲ試料が、スクリーニングされる体液のサンプル中の患者の血清の刺激型ＴＳＨＲ自己抗体、患者の血清の遮断型ＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨのディファレンシャルスクリーニング及び識別を可能にすることを特徴とする、１つ以上の点突然変異を含む。しかしながら、特に、本発明によって提供されるような変異型ＴＳＨＲ試料は、ヒトＴＳＨＲの完全長のアミノ酸２５５に対応する位置にある少なくともアミノ酸Ａｒｇが、変異型ＴＳＨＲ試料で異なるアミノ酸残基に突然変異することを特徴とする、少なくとも１つの点突然変異を含む。
【００７２】
点突然変異は、別のアミノ酸又はヌクレオチドによる、アミノ酸又はヌクレオチドの置換を意味する。これは、本発明の範囲内でPCRプライマーの使用と突然変異したヌクレオチド配列の後の発現によって達成される点突発変異を含む。さらに、ここに使用されるような点突然変異は突然変異であり、この突然変異は、所望のポリペプチド配列の合成を成すために、例えば、従来のペプチド・シンセサイザーを用いる、周知の合成技術によって達成できる突然変異である。ここで、合成された配列は、他のアミノ酸を有する所望のアミノ酸の置換を含む。
【００７３】
プライマーの定義及びプライマーのネーミングの“Ｒ”は、リバースプライマーを意味する。
【００７４】
ここに記載される結合パートナーによるＴＳＨＲの刺激は、ＴＳＨＲに対して結合し、それによって、そのようなＴＳＨＲに対する結合の結果として、例えば、サイクリックＡＭＰの生成をなす、結合パートナーの結合能力を意味する。そのような刺激は、TSHRに対する、TSHまたはTSHR自己抗体の結合に見られる反応に類似しており、この手法で、ここに記載される結合パートナーは、ＴＳＨＲに対するＴＳＨまたはＴＳＨＲ自己抗体の結合する効果を擬態する。
【００７５】
刺激型ＴＳＨＲ抗体はＴＳＨＲに結合し、ここに記載されるＴＳＨＲの刺激をもたらす。
【００７６】
ＴＳＨは、甲状腺刺激ホルモンを意味する。
【００７７】
ＴＳＨＲは、甲状腺刺激ホルモンレセプターを意味し、さらに、当該技術分野において、ＴＳＨレセプターとしても呼ばれる。
【００７８】
ＴＳＨＲ自己抗体は、ＴＳＨＲと関連する自己免疫疾患の経過でTSHRに対して生成される抗体を意味する。生成される抗体の種類に依存して、ＴＳＨ分子からＴＳＨＲの遮断に起因して、Ｔ３及びＴ４の形成及び放出のいずれかの阻害が生じる。また一方で、生成された抗体がＴＳＨの作用を擬態し、甲状腺ホルモンの合成と放出を刺激するので、Ｔ３及びＴ４は非制御下で放出され得る。
【００７９】
ＴＳＨＲ試料は、野生型ＴＳＨＲの完全長に一致することができるか、ここに記載されたような、１つ以上の異形、類似体、派生体又はそれらの断片を含むことができる、ペプチド配列を意味する。
【００８０】
本発明は、添付図及び実施例によって例示されるが、本発明の範囲を制限しない。
【実施例】
【００８１】
ＴＳＨＲの細胞外領域の様々なアミノ酸が選択されて、アラニンに突然変異される。それらのアミノ酸は、下記を含む。
【００８２】
Ａｓｐ４３。電荷された残基、（電荷−電荷の相互作用）ＴＳＨＲとＴＳＨＲ自己抗体及びＴＳＨとの相互作用で重要であると知られているためである。（Rees  Smith  B,  McLachlan  SM,  Furmaniak  J  1988  Autoantibodies  to  the  thyrotropin  receptor.  Endocr  Rev  9:  106-121を参照。）加えて、ＡＳＰ４３はＴＳＨＲのロイシンが豊富な領域（ＬＲＤ；アミノ酸３６−２８１）の第一の（つまり、大部分のＮ末端）繰り返しに位置する。同様に、電荷されており、ＴＳＨＲ  ＬＲＤの第二の繰り返しにあるので、Ｇｌｕ６１が選択される。
【００８３】
電荷しており、ＴＳＨＲ  Ｌｙｓ１８３とのソルトブリッジ（salt  bridge）の形成における関与に基づいて、Ｇｌｕ１５７が選択された。（Duprez  L,  Parma  J,  Costagliola  S,  Hermans  J,  Van-Sande  J,  Dumont  JE,  Vassart  G  1997  Constitutive  activation  of  the  TSHR  by  spontaneous  mutations  affecting  the  N-terminal  extracellular  domain.  FEBS  Letters  409:  469-474を参照。）２つの追加の電荷されたアミノ酸、Ｇｌｕ１７８及びＡｓｐ２０３は、それぞれ、ＬＲＤの第七番目と、第八番目の繰り返しのそれらの位置に基づいて選択された。
【００８４】
電荷されたアミノ酸、Ａｓｐ２３２及びＡｒｇ２５５が、それぞれ、ＴＳＨＲ  ＬＲＤの第９番目と、第１０番目の繰り返しのそれらの位置に基づいて選択された。また、ＬＲＤの第１０番目の繰り返しの芳香族アミノ酸Ｔｒｐ２５８は、アラニンに突然変異された。さらに、ＬＲＤのＣ末端のアミノ酸、Ａｓｐ２７６及びＳｅｒ２８１は、ＴＳＨＲ活性化におけるそれらの関与から、突然変異された。（Corvilain  B,  Van  Sande  J,  Dumont  J  E  and  Vassart  G  2001  Somatic  and  germ  line  mutations  of  the  TSH  receptor  and  thyroid  disease.  Clin  Endocrinol  55:  143-158;  and  Russo  D,  Arturi  F,  Chieari  E,  Filetti  S  1997  Molecular  insights  into  TSHR  abnormality  and  thyroid  disease.  J  Endocrinol  Invest  20:  36-47を参照。）
方法
ＰＣＲを用いて、ヒトＴＳＨＲ配列への特定のアミノ酸の突然変異の導入
下記の基本的なクローニング手法にしたがって、ＴＳＨＲの完全長のヌクレオチド配列（スイスプロットアクセッションナンバー（Swiss  prot  accession  number）:  Pl  6473  -  http://www.ncbi.  nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=  136448;  NCBl  Entrez  Nucleotide  accession  number  NM  000369-http://www.ncbi.  nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=4507700）は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩを用いて、ｐｃＤＮＡ５．１／ＦＲＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた。
【００８５】
ヌクレオチドのコード配列を適切なアミノ酸の突然変異のためのコードに変化するために、各突然変異（表１）において、特定の“フォワード”及び“リバース”ＰＣＲプライマーが設計された。２つの個別のＰＣＲ反応が設定された（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）。
【００８６】
ＰＣＲ１に添加された試薬：３２．５μＬのＨ２Ｏ、２．５μＬの２０ｘデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）（５mmol/L）、５μＬの１０ｘＰｆｕＤＮＡポリメラーゼバッファー（１０ｘＰｆｕバッファー；プロメガ）、２．５μＬの１０ｐｍｏｌ／μＬ  Ｔ７プライマー（表１）、２．５μＬの１０ｐｍｏｌ／μＬの突然変異のための“リバース”プライマー、４μＬのｐｃＤＮＡ５．１／ＦＲＴ  ＴＳＨＲテンプレートＤＮＡ（１００ｎｇ）及び１μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（３  ｕｎｉｔｓ、プロメガ）。ＰＣＲ２に添加された試薬：３４．５μＬのＨ２Ｏ、２．５μＬの２０ｘｄＮＴＰｓ（５mmol/L）、５μＬの１０ｘＰｆｕバッファー、２．５μＬの１０ｐｍｏｌ／μＬの突然変異のための“フォワード”プライマー（表１）、２．５μＬのウシ成長ホルモンポリアデニレーションシグナルリバースプライマー（ＢＧＨＲプライマー）（表１）１０ｐｍｏｌ／μＬ、２μＬのテンプレートＤＮＡ（１００ｎｇ）及び１μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（３  ｕｎｉｔｓ）。
【００８７】
テンプレートＤＮＡの使用量は、生成されるＰＣＲ産物の長さに依存する。上述に示された実施例において、ＰＣＲ１産物は８００塩基対の長さであり、ＰＣＲ２産物は１６００塩基対の長さである。ＰＣＲ１及びＰＣＲ２産物のサイズは、ＴＳＨＲ配列内で突然変異される、アミノ酸の位置に依存する。
【００８８】
ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステムズ）を用い、９４℃の５分間に続いて、９４℃の１分間、４０℃の１分間及び７２℃の２分間の３０サイクル（９４℃から４０℃及び４０℃から７２℃まで５０％ランプ率によって）に続いて、７２℃で７分間、その後、反応物は４℃まで冷却された。
【００８９】
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２の産物は、ＴＡＥバッファーの１％アガロースゲル（４０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１１４％氷酢酸）で泳動され、スカルペルブレードでゲルからバンドを取り出した。バンドはＧｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（(Anachem  Ltd,  Luton,  LU2  OEB,  UK）を用いて、使用説明書にしたがって洗浄された。ＤＮＡ濃度は、当該技術の基本的な方法を用いて決定された。このＤＮＡは、突然変異を含む、完全なＴＳＨＲ配列を構成するように、ＰＣＲ３反応を設定するように使用された。ＰＣＲ３反応は、２．５μＬの１０ｘＰｆｕバッファー、１μＬの２０ｘｄＮＴＰｓ、２００ｎｇのＰＣＲ１産物及び２００ｎｇのＰＣＲ２産物、１μＬのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、並びに水を２５μＬの終量に含む。この反応は、９４℃の１．５分間、６５℃の１．５分間及び７２℃の１．５分間の７サイクルのために、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００に設置された。次いで、温度は９４℃の２分間まで高められ、ＰＣＲ４反応（25  μLに対して、2.5  μL  10x  Pfuバッファー,  1.3  μL  2Ox  dNTPs,  2.5  μL  T7プライマー  10  pmol/μL,  2.5  μL  BGHR  プライマー  10  pmol/L,  1  μL  Pfu  DNAポリメラーゼ及び水)がＰＣＲ３に添加された。この混合物は、９４℃の１分間、５２℃の１分間及び７２℃の２分間の３０サイクル（９４℃から５２℃及び５２℃から７２℃まで５０％ランプ率によって）に続いて、７２℃で１０分間、その後、反応物は４℃まで冷却された。
【００９０】
ＰＣＲ産物は、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた、５０μＬの１：１フェノール／クロロフォルムの混合物を用いて洗浄され、当該技術に記載のように空気乾燥された。次いで、ＤＮＡは、制限消化（Roche  Diagnostics,  Lewes,  BN7  1LG,UK）のために１ｘバッファーＢで再懸濁されて、３７℃で４時間においてＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断された。ＰＣＲバンドは、１％アガロースゲル上で泳動されて、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔを用いて、切り出されて洗浄された。次いで、ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）にライゲーションされて、突然変異は、当該技術に記載のＤＮＡシークエンシング（アマシャムバイオサイエンス、Sequenase  version  2  DNA  sequencing  kit）を用いて確認された。次いで、突然変異されたＴＳＨＲ  ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから取り除かれ、pcDNA  5.1/FRTベクター(Invitrogen)にクローニングされて、上述したように、配列が再度確認された。
【００９１】
FIp-Inシステムを用いるＣＨＯ細胞に対する突然変異されたＴＳＨＲ構造のトランスフェクション
FIp-In-CHO細(Invitrogen)のコンフルエント（confluent）フラスコは、１ｘ１０５−１．５ｘ１０５細胞/ウェルのDMEM  (Invitrogen)、10%胎仔の仔牛血清(FCS)  (Invitrogen)、１ｘのＬ−グルタミン(Invitrogen)及び抗体がなく、１ｘの必須でないアミノ酸（ＮＥＡＡ）(Invitrogen)で、２４穴のプレートウェルで播種するために使用された。ウェルは、３７℃、５％ＣＯ２、９５％より高い湿度でオーバーナイトにわたって培養された。
【００９２】
上記のpcDNA5.1/FRT  TSHR  DNA及びPOG44  DNA  (Invitrogen)は、０．０１μｇ／ｍＬ及び０．１μｇ／ｍＬ溶液となるように、蒸留水でそれぞれ希釈された。POG44  DNAとＴＳＨＲＤＮＡは、３種類の異なる濃度に希釈された。それらは、（１）９μＬのPOG44、１０μＬのTSHR  DNA及び３１μＬのOptimem  I  (Invitrogen)；（２）８μＬのPOG44、２０μＬのTSHR  DNA及び２２μＬのOptimem  I；（３）９．５μＬのPOG44、５μＬのTSHR  DNA及び３５．５μＬのOptimem  Iであり、室温で５分間インキュベーションされた。Optimem  Iで１：２５に希釈された、５０μＬのlipofectamine  (Invitrogen)は、各試験管（上記の１−３）に加えられ、室温で２０分間インキュベーションされた。次いで、各インキュベーションされた混合物は、95%のコンフルエントな（confluent）FIp-In-CHO細胞のウェル（２４穴プレート）に添加され、上述した条件下にて、オーバーナイトでインキュベーションした。次いで、培地が取り除かれて、DMEM,  10%  FCS,  １x  L-glutamine,  １x  NEAA及び１x  ペニシリン(100u/mL)/ストレプトマイシン(100μg/mL)  (Invitrogen)に変えられ、オーバーナイトのインキュベーションが継続される。次いで、細胞は、１ｘトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Invitrogen）を用いてウェルから分離され、４つの新規なウェルに分割されて、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（hygromycin）(Invitrogen)を添加して、上述のように培地で成長される。
【００９３】
POG44プラスミドDNAとpcDNA5.1/FRT  TSHRの両者でトランスフェクションされた細胞は、ＴＳＨＲのFIp-In-CHO細胞のゲノムへの挿入を可能にし、ハイグロマイシン選択培地で成長することが可能であるように細胞にハイグロマイシンに対する耐性を与える。我々の構成のTSHRがPOG44によってFIp-In-CHO細胞のFRT部位に挿入されるように、インビトロジェンのFIp-Inシステムが設計される。FIp-In-CHO細胞は、細胞ごとに１つのFIp-In部位を含んでおり、したがって、ＴＳＨＲ  ＤＮＡは各実験においてゲノムの同一の場所に挿入され、細胞ごとに１つのコピーとして存在する。このシステムは、最適な発現レベルの細胞のコロニーのスクリーニング（安定した細胞系を見つけるために、細胞クローニングが続く）が必要でないという利点を有する。結果として、ハイグロマイシン選択培地で成長する、突然変異したTSHRを発現する細胞が、急速に膨張することができて、異なる分析法で用いられることができる。
【００９４】
サイクリックＡＭＰ生成の刺激分析
野生型及び突然変異型のＴＳＨＲの両者を発現する、FIp-In-CHO細胞のサイクリックＡＭＰの生成を刺激する、hMAb  TSHR１及びTSHの能力は、WO2004/050708A2に従って分析された。要約すると、ＣＨＯ細胞は、９６穴プレート（１２，５００−２０，０００細胞／ウェル）に播種され、１０％仔牛の胎児の血清を含むＤＭＥＭ（インビトロジェン）で４８時間にわたってインキュベーションされた。次いで、ＤＭＥＭが取り除かれ、サイクリックＡＭＰアッセイバッファー（1  g/L  グルコース,  20  mmol/L  HEPES,  222  mmol/Lスクロース,  15  g/Lウシ血清アルブミン(BSA)と0.5  mmol/L  3イソブチル−１−メチルキサンチン,  pH  7.4を含むNaClフリーのHank's  バッファー塩溶液）でのブタのＴＳＨ（RSR  Ltd;  0.01  -3  ng/mL）及びhMAb  TSHRl  Fab  (0.1-10  ng/mL)の希釈液が添加され、５％ＣＯ２の大気下にて３７℃で１時間インキュベーションされた。試験溶液を除去した後、細胞は溶解されて、アマシャムバイオサイエンスのＢｉｏｔｒａｋ酵素免疫アッセイシステムを用いて、サイクリックＡＭＰをアッセイした。ＴＳＨアゴニスト活性を有するＴＳＨレセプター抗体を含有する血清を用いた実験は、アッセイに先立ってサイクリックＡＭＰアッセイバッファーで血清サンプルが１：１０に希釈された以外は、同様の手順で実行された。
【００９５】
ＴＳＨアンタゴニスト活性の測定
いくつかの実験において、ブタのＴＳＨの活性を阻害するようにＴＳＨＲに対する患者の血清及びマウスモノクローナル抗体の能力が評価された。これは、（ａ）ＴＳＨ単独の刺激効果と、（ｂ）患者の血清又はマウスモノクローナル抗体が存在する際のＴＳＨの刺激効果を比較することによって実行された。簡潔すると、サイクリックＡＭＰバッファーで希釈された５０μＬの患者の血清と、５０μＬのマウスモノクローナル抗体が、細胞のウェルに添加され、続いて５０μＬのバッファー又は５０μＬのＴＳＨ（0.6ng/mL終濃度0.3  ng/mL）が添加され、上述の刺激アッセイのようにインキュベーションされた。試験溶液を除去した後、細胞は溶解されて、Ｂｉｏｔｒａｋ酵素免疫アッセイシステムを用いて、ｃＡＭＰをアッセイした。
【００９６】
洗剤に可溶性の野生型試料及び突然変異型ＴＳＨＲ試料
野生型（ｗｔ）又は突然変異型ＴＳＨＲのいずれかを発現する、FIp-In-CHO細胞は、１７５ｃm2フラスコでコンフルエンス（confluence）に成長されて、細胞はDulbecco's  PBS  (カルシウム及びマグネシウムイオンなしで)  (Invitrogen)で洗浄されて、ロシュダイアグノスティックスのプロテアーゼインヒビター(５０ｍＬの溶液に対して、1タブレット（プロダクトコード1836145）)及び1  mmol/Lのフェニルメチルスルフォニルフロライド(PMSF)を含有する１０ｍＬの冷却バッファーＡ（50  mmol/L  NaCl,  10  mmol/L  Tris-HCl  pH  7.5）にスクレープ（scrape）された。細胞は４℃下にて１０００ｘｇで５分間ペレットにされて、ペレットは１ｍＬのバッファーＡで再懸濁されて、氷上のグラスホモジナイザーでホモジナイズされた。細胞膜は４℃下にて１２，０００ｘｇで３０分間ペレットにされて、６ｍＬのバッファーＡに加えて０．５ｇ／Ｌのアジ化ナトリウム及び２．７５ｇ／Ｌのヨードアセトアミドで再懸濁されて、上述のようにペレットにされた。次いで、膜ペレットは、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．５ｇ／Ｌのアジ化ナトリウムを含有する１ｍＬの冷バッファーＡで再懸濁されて、ホモジナイズされた。可溶化されたＴＳＨＲ試料は、４℃下にて９０，０００ｘｇで２時間遠心分離されて、上澄みはアリコートに−７０℃で保存された。
【００９７】
野生型又は突然変異型ＴＳＨＲに対する標識されたＴＳＨ及び標識されたモノクローナル抗体の結合
これらの実験において、１２５Ｉを用いた標識及び未標識のブタのＴＳＨ（ＲＳＲ  Ｌｔｄの７０ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）及びモノクローナル抗体（Ｆａｂ又はＩｇＧ）が、既に記載されたように調製された（WO2004/050708A2）。
【００９８】
まず最初に、各ＴＳＨＲ試料のプロファイルが設定された。これらの実験において、プラスチックチューブ（Maxisorp  Star;  NUNC）は、１０μｇ／ｍＬのコーティング・バッファー（0.1  mmol/L  Na2CCb  pH  9.2）で、200μL  TSHR  Ｃ末端に対するマウスモノクローナル抗体を４°Cにおいて、オーバーナイトでコーティングされた。洗浄及びポストコーティング（水１０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）後、チューブは、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するアッセイバッファー（10mmol/L  Tris-HCl  pH  7.8,  50  mmol/L  NaCl及び1  mg/mL  BSA）で洗浄された。次のステップでは、２００μＬの可溶化された野生型又は突然変異型ＴＳＨＲ試料がチューブに添加されて、４℃にてオーバーナイトでインキュベーションされた。チューブの内容物はアスピレーションで取り除かれ、チューブはアッセイバッファーで洗浄され、５０μＬの開始バッファー（ＲＳＲ  Ｌｔｄ）、５０μＬのアッセイバッファー及び５０μＬの１２５Ｉ−ＴＳＨ又は１２５Ｉ標識のモノクローナル抗体（１０，０００−１５，０００ｃｐｍ）が添加されて、２時間にわたって攪拌されながら室温でインキュベーションされた。溶液のアスピレーション後、チューブは洗浄されてガンマカウンターでカウントされた。
【００９９】
１５−４０％の標識されたＴＳＨ又はモノクローナル抗体の結合を与えるＴＳＨＲ試料の希釈は、分析のためのＴＳＨＲでコーティングされたチューブを調製するために使用された。幾つかの実験において、５０μＬのアッセイバッファーは、未標識ＴＳＨ（0.4  -  500  munits/mL）又はモノクローナル抗体（(0.001  -  1.0  μg/mL）の濃度の増加と共に、溶液と置換された。結合及びフリーのＴＳＨ又はモノクローナル抗体の濃度が算出されて、結合／フリーに対する結合のプロット（スカチャード分析（Scatchard  analysis））は、ＴＳＨＲを結合するためのアフィニティを計算するために使用された。
【０１００】
突然変異型ＴＳＨＲを含有するＣＨＯの刺激の分析
様々な突然変異を含み、ＴＳＨＲでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞でサイクリックＡＭＰ生成を刺激する、ＴＳＨ又はｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１の能力が評価された。結果は表２ａ−２ｊ、１５ａ−１５ｘ及び２７ａ−２７ｈに示され、さらに、表３、１６及び２８に要約された。大部分の突然変異は、TSH及びhMAb  TSHR１の両方の反応に対して、わずかな減少を引き起こした。しかしながら、しかしながら、Alaに対するArg80、Aspに対するArg80、Alaに対するTyr82、Alaに対するGIu  107、Alaに対するArgl０９、Aspに対するArg109、Alaに対するLysl29、Aspに対するLysl29、Alaに対するPhel30、Alaに対するLysl83、Aspに対するLysl83、Alaに対するTyrl85、Alaに対するAsp232、Alaに対するArg255、Alaに対するAla、並びにダブルミューテーション（double  mutation）Alaに対するArg255及びAlaに対するTrp258；Alaに対するTrp258及びAlaに対するLysl83;  Alaに対するTrp258及びAlaに対するTyrl85の場合において、突然変異の効果の明確な相違が、ホルモン及び抗体に対する反応にあった。TSHへの反応が基本的に維持されたのに対して、これらのアミノ酸のいずれかの突然変異はhMAb  TSHR１に対する反応において、著しい減少を引き起こした。
【０１０１】
Asp232、Arg255およびTrp258を突然変異させる効果は、若干の詳細において調査された。Asp232の場合、近くのグルタミン（Glu235）は、Ａｌａに変異した。しかしながら、この突然変異は、TSH又はhMAb  TSHR１によって、刺激にほとんど影響を及ぼさなかった（野生型と比較して）（表4a）。同様に、Trp258に隣接したトレオニン257の突然変異は、ホルモン又は抗体の刺激にほとんど影響を及ぼさなかった（表4b）。しかしながら、ダブルミューテーション、Alaに対するArg255及びAlaに対するTrp258；Alaに対するTrp258及びAlaに対するLysl83;  Alaに対するTrp258及びAlaに対するTyrl85は、ＴＳＨによって、刺激にほとんど影響を及ぼさないか又は全く影響がないが、hMAb  TSHR１による刺激は、基本的に無くなった（表４ｃ、２７ｇ及び２７ｈをそれぞれ参照）。さらに、Ａｒｇ２５５（正帯電のアミノ酸）の負電荷のアスパラギン酸（中性Ａｌａに代わって）への突然変異は、また基本的に、hMAb  TSHR１に対する反応がなくなったが、TSH刺激に対しては、ほとんど影響を及ぼさないか、又は全く影響を及ぼさなかった（表４ｄ）。これらの結果は、表5及び28において要約される。
【０１０２】
14人の異なるグレーブス病患者からTSHR自己抗体を含有する血清の能力においてAspにArg255を突然変異させる効果も研究されて、結果が表6に示される。表から分かるように、この変異体を発現するＣＨＯ細胞は、１４人のすべての血清に対する反応を多大に減じた（野生型と比較して）。対照的に、Alaに対するArg80、Aspに対するArg80、Alaに対するGIu  107、Alaに対するArg109、Aspに対するArg109、Alaに対するLysl29、Alaに対するLysl  83、Aspに対するLysl83の突然変異は、血清に若干影響を及ぼしたが、試験される血清で刺激の全てを低下させるというわけではなかった（表１９ａ−１９ｈ及び表２０に要約）。唯一、ＡｓｐへのＡｒｇ２５５と、ダブルミューテーションAlaに対するArg255及びAlaに対するTrp258が、試験される全ての血清の反応を減じることができた（表６、１９ｉ及び表２０に要約）。表７は、野生型ＴＳＨＲ及びＡｓｐに変異したＡｒｇ２５５を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞でｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ1  ＩｇＧとドナーの血漿（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１  ハイブリドーマのためのリンパ球を抽出するように使用される同一の血液サンプルから得られる）の異なる投与による、サイクリックＡＭＰの生成の刺激を示す。突然変異したＴＳＨＲに対するＩｇＧと血漿の両者の効果は、野生型と比較して、かなり減じられ、投与の反応効果は同様であった。甲状腺刺激活性を有する、様々なマウスモノクローナル抗体（WO  03/018632A2のように調製されたmTSMAbs）の効果はまた、野生型TSHR及びＡｓｐに変異したＡｒｇ２５５（表８）、Ａｓｐに変異したＡｒｇ８０、Ａｌａに変異したＧｌｕ１０７、Ａｌａに変異したＡｒｇ１０９、Ａｓｐに変異したＡｒｇ１０９、Ａｌａに変異したＬｙｓ１２９、Ａｌａに変異したＬｙｓ１８３、Ａｓｐに変異したＬｙｓ１８３（表２１ａ−ｇ）を有するＴＳＨＲによってトランスフェクションされたCHO細胞のサイクリックAMP生成を刺激する、それら抗体の能力に関して試験された。表８及び表２１ａ−ｇから認識でき、表２２に要約されるように、ｍＴＳＭＡｂの刺激効果は、基本的に突然変異によって逸した。野生型ＴＳＨＲ及びＡｓｐに変異したＡｒｇ２５５を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞でのサイクリックＡＭＰ生成のＴＳＨ刺激に影響する、ＴＳＨアンタゴニストを有する、4人の患者の血清の能力もまた調査された。全ての4つの血清は、野生型及び突然変異型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞の強力なＴＳＨアンタゴニストとして作用した（表9）。さらに、投与反応の試験は、ＴＳＨアンタゴニスト効果が、変異型レセプターを発現する細胞において、患者の血清の低い投与（高い希釈）で、より強力であった（表１０）。さらに、Ａｌａへの突然変異Ｇｌｕ１０７は、患者の血清で同様の増強したアンタゴニスト効果を示した（表２３ａ及び２４）が、一方で、他の２つの突然変異（ＡｌａへのＡｒｇ１０９、ＡｌａへのＬｙｓ１８３）は効果がなかった（表２３ａ及び２４）（表２４に要約）。強力なＴＳＨアンタゴニスト（及びｈＭＡｂＴＳＨＲ１アンタゴニスト）活性（９Ｄ３３、ＷＯ２００４／０５０７８Ａ２に記載）を有する、ＴＳＨＲへのマウスモノクローナル抗体の作用もまた調査された（表１１、１３ａ−ｊ、１７ａ−ｖ並びに要約表１４及び１８）。表１１で認識できる���うに、９Ｄ３３は、野生型ＴＳＨＲ又はＡｓｐに変異したＡｒｇ２５５を有するＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞のＴＳＨ刺激を遮断することが可能であった。加えて、９Ｄ３３のアンタゴニスト効果は、変異型レセプターを発現する細胞において、低い投与で、さらに強力であった（表１１）。Ａｌａに変異するＡｓｐ１６０及びＡｌａに変異するＡｒｇ２７４の２つの他の突然変異は、野生型ＴＳＨＲと比較して、９Ｄ３３での増大したアンタゴニスト効果を示し（表１７ｎ及び１７ｖ）、一方で、Ｌｙｓ５８のＡｌａへの変異、Ａｒｇ８０のＡｌａへの変異、Ａｒｇ８０のＡｓｐへの変異、Ｔｙｒ８２のＡｌａへの変異、Ｇｌｕ１０７のＡｒｇへの変異、Ａｒｇ１０９のＡｌａへの変異、Ａｒｇ１０９のＡｓｐへの変異、Ｌｙｓ１２９のＡｓｐへの変異、Ｐｈｅ１３４のＡｌａへの変異及びＬｙｓ２５０のＡｌａへの変異は、それらの変異型ＴＳＨＲを発現するＣＨＯ細胞におけるＴＳＨ刺激を遮断する９Ｄ３３の能力の減少を示した（表１７、さらに表１８に要約）。しかしながら、検討した３２の異なる突然変異のうちの１９は、サイクリックAMPのTSH刺激を遮断する9D33の能力に、影響を及ぼさなかった（表13、14、17及び18）。
【０１０３】
変異型ＴＳＨＲに対する結合の分析
TSH、hMAb  TSHR１及び9D33  MAbの結合において、アラニン、アルギニン又はアスパラギン酸に対して変異する、様々なＴＳＨＲのアミノ酸の効果が表１２、２５、２９及び要約表２６に示される。
【０１０４】
ＡｌａへのＡｓｐ４３，ＡｌａへのＧｌｕ６１、ＡｌａへのＡｓｐ２０３、ＡｌａへのＧｌｎ２３５、ＡｌａへのＧｌｕ２５１、ＡｌａへのＡｓｐ２７６及びＡｌａへのＳｅｒ２８１の突然変異は、ＴＳＨ、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１又は９Ｄ３３結合に対して、ほとんど影響を及ぼさないか、全く影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＡｒｇへのＧｌｕ１０７、ＡｓｐへのＡｒｇ１０９、ＡｓｐへのＬｙｓ１２９、ＡｓｐへのＬｙｓ１８３及びＡｌａ又はＡｒｇへのＡｓｐ２３２の突然変異は、検出不可能になる、ＴＳＨ、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１又は９Ｄ３３結合に結果としてなった。ＡｌａへのＴｙｒ２０６は、ＴＳＨ及び９Ｄ３３における検出できない結合を有したが、一方で、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１は検討されなかった。ＡｌａへのＧｌｕ１５７、ＡｌａへのＡｓｐ１６０、ＡｌａへのＬｙｓ２０９、ＡｌａへのＴｈｒ２５７及びＡｌａへのＴｒｐ２５８の突然変異は検出可能なTSHが結合するのを妨げたが、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１又は９Ｄ３３  ＭＡｂ結合に対して、ほとんど影響を及ぼさないか、全く影響を及ぼさなかった。ＡｌａへのＬｙｓ５８、ＡｌａへのＩｌｅ６０、ＡｌａへのＴｙｒ８２の突然変異は検出できない９Ｄ３３  ＭＡｂ結合を示し、一方で、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１及びＴＳＨへの結合は野生型と同様であった。ＡｌａへのＡｒｇ８０及びＡｓｐへのＡｒｇ８０の突然変異は、検出できない９Ｄ３３  ＭＡｂ及びｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合に結果としてなったが、一方、ＴＳＨはいまだ良好な結合であった。ＡｌａへのＧｌｕ１０７及びＡｌａへのＰｈｅ１３４の突然変異は、結果として、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１及び９Ｄ３３  ＭＡｂにおける低い結合アフィニティとなったが、一方、ＴＳＨはいまだ良好な結合であった。ＡｌａへのＡｒｇ１０９の突然変異は、ＴＳＨ結合でわずかな減少を示したが、一方、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合の変化はなく、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は検出できなかった。ＴＳＨとｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１の両者の低い結合アフィニティは、Ｇｌｕ１７８がＡｌａに変異した際に観察されたが、一方で、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は影響を受けなかった。Ｌｙｓ１２９がＡｌａに変異した場合、ＴＳＨはいまだ良好に結合したが、一方、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１におけるアフィニティは著しく減じられ、９Ｄ３３  ＭＡｂの結合は検出できなかった。ＡｌａへのＰｈｅ１３０、ＡｌａへのＴｙｒ１８５、ＡｌａへのＡｒｇ２５５の突然変異は、結果として、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合での著しい減少及び９Ｄ３３  ＭＡｂ結合での減少となったが、一方、ＴＳＨはいまだ良好に結合した。Ａｒｇ２５５がＡｓｐに変異した場合、ＴＳＨ結合は検出不可能で、かつ、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合のアフィニティは著しく減じられたが、一方、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は影響を受けなかった。Ｌｙｓ２５０がＡｌａに、Ａｒｇ２７４がＡｌａに、及びＴｙｒ２７９がＡｌａに変異した場合、ＴＳＨ結合は検出できなかったが、一方、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１及び９Ｄ３３結合のアフィニティは減じられた。Ｌｙｓ１８３がＡｌａに変異する突然変異（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１及び９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は検討されなかった）（表２５）は、Ｔｙｒ１８５がＡｌａに変異し、Ｌｙｓ１８３がＡｌａに変異するダブルミューテーション（double  mutation）（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合は検討されなかったが、一方、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は減じられた）（表２９）でなされたように、ＴＳＨの結合アフィニティを高めた。
【０１０５】
Ａｒｇ２５５がＡｌａに変異し、Ｔｒｐ２５８がＡｌａに変異するダブルミューテーションは、検出不可能なＴＳＨ結合を示し、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１におけるわずかに減じられたアフィニティを示したが、一方、９Ｄ３３  ＭＡｂはいまだ良好に結合した（表２５）。Ａｓｐ２３２のＡｒｇへの変異及びＡｒｇ２５５のＡｓｐへの変異；Ａｓｐ２３２のＡｌａへの変異及びＴｒｐ２５８のＡｌａへの変異；Ａｓｐ２３２のＡｌａへの変異、Ａｒｇ２５５のＡｌａへの変異及びＴｒｐ２５８のＡｌａへの変異；Ｔｒｐ２５８のＡｌａへの変異及びＬｙｓ１８３のＡｌａへの変異；Ａｒｇ２５５のＡｌａへの変異及びＬｙｓ１８３のＡｌａへの変異；Ｔｒｐ２５８のＡｌａへの変異、Ｌｙｓ１８３のＡｌａへの変異及びＴｙｒ１８５のＡｌａへの変異；Ａｒｇ２５５のＡｌａへの変異、Ｔｒｐ２５８のＡｌａへの変異、Ｔｙｒ１８５のＡｌａへの変異及びＬｙｓ１８３のＡｌａへの変異の突然変異はすべてＴＳＨ、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１及び９Ｄ３３  ＭＡｂに対する検出できない結合を示した（表２９）。Ａｓｐ２３２のＡｌａに変異し、Ａｒｇ２５５がＡｌａに変異するダブルミューテーションも、ＴＳＨ又は９Ｄ３３  ＭＡｂに対する結合を示さず、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１におけるアフィニティは検討されなかった（表２９）。Ｇｌｕ１５７がＡｌａに変異し、Ａｓｐ２０３がＡｌａに変異するダブルミューテーションの場合、ＴＳＨ結合は検出できず、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１に対する結合は野生型と同様であったが、一方、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は減じられた（表２９）。Ｇｌｕ１７８のＡｌａへの変異及びＡｓｐ２０３のＡｌａへの変異；Ｔｒｐ２５８のＡｌａへの変異及びＴｙｒ１８５のＡｌａへの変異；Ａｒｇ２５５のＡｌａへの変異及びＴｙｒ１８５のＡｌａへの変異；Ａｒｇ２５５のＡｌａへの変異、Ｔｒｐ２５８のＡｌａへの変異及びＴｙｒ１８５のＡｌａへの変異の突然変異は検出できないＴＳＨ結合をもたらし、ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１結合を著しく減じ、さらに、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合をわずかに減じた（表２９）。Ａｒｇ２５５がＡｌａに変異、Ｌｙｓ１８３がＡｌａに変異及びＴＹｒ１８５がＡｌａに変異する場合、ＴＳＨ及びｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１の両者の結合は検出できなかったが、一方、９Ｄ３３  ＭＡｂ結合は減じられた（表２９）。
【０１０６】
結論／解釈
１）TSHRの選択された一つのアミノ酸を突然変異させる効果は、様々なリガンドによって、サイクリックAMP生成の刺激に関して観察された。
【０１０７】
驚いたことに、幾つかのアミノ酸の突然変異は、TSH結合および／または刺激よりも、hMAb  TSHR１結合および／または刺激に対して多大な影響を及ぼした。ホルモンと抗体の効果における、この違いは、ＡｌａへのＡｒｇ８０、ＡｓｐへのＡｒｇ８０、ＡｌａへのＴｙｒ８２、ＡｌａへのＧｌｕ１０７、ＡｌａへのＡｒｇ１０９、ＡｓｐへのＡｒｇ１０９、ＡｌａへのＬｙｓ１２９、ＡｓｐへのＬｙｓ１２９，ＡｌａへのＰｈｅ１３０、ＡｌａへのＬｙｓ１８３、ＡｓｐへのＬｙｓ１８３、ＡｌａへのＴｙｒ１８５、ＡｌａへのＡｓｐ２３２、ＡｌａへのＡｒｇ２５５及びＡｌａへのＴｒｐ２５８の突然変異の場合において、最も明白であった。加えて、ＡｌａへのＡｒｇ２５５及びＡｌａへのＴｒｐ２５８のダブルミューテーションは、ＡｌａへのＡｒｇ２５５の単独又はＡｌａへのＴｒｐ２５８の単独の突然変異よりも、より強力な効果を有した。
【０１０８】
さらに、TSHによる刺激が基本的に影響を受けない一方で、反対に電荷されたAspに対するArg255の突然変異は基本的にhMAb  TSHR１の刺激効果は消失した。さらに、また、14人の異なるグレーブス病患者のTSHレセプター自己抗体は、6つのマウスモノクローナル甲状腺刺激抗体のように、AspへのＡｒｇ２５５の突然変異によって基本的に消失される、それらの刺激効果を有した。
【０１０９】
ＡｓｐへのＡｒｇ２５５の突然変異と対照的に、ＡｌａへのＡｒｇ８０、ＡｓｐへのＡｒｇ８０、ＡｌａへのＧｌｕ１０７、ＡｌａへのＡｒｇ１０９、ＡｓｐへのＡｒｇ１０９、ＡｌａへのＬｙｓ１２９、ＡｌａへのＬｙｓ１８３、ＡｓｐへのＬｙｓ１８３を含む他のＴＳＨＲのアミノ酸の突然変異及びＡｌａへのＡｒｇ２５５とＡｌａへのＴｒｐ２５８のダブルミューテーションは、hMAb  TSHR１の刺激効果を減じるか又は消失させたが、すべての患者の血清のＴＳＨＲ自己抗体を検査しなかった。
【０１１０】
２）結果として、驚くべくことに、ＴＳＨＲのアミノ酸、Ａｒｇ２５５の突然変異は、TSHと患者の血清のTSHR自己抗体（hMAb  TSHR１を含む）との刺激作用の明確な差異をもたらす唯一のものであると我々は見出した。
【０１１１】
３）ＴＳＨアンタゴニスト活性を有する患者の血清は、変異型ＴＳＨＲ（Ａｒｇ２５５  Ａｓｐ  変異）を発現するＣＨＯ細胞のＴＳＨ刺激の遮断において効果的である。さらに、強力なＴＳＨアンタゴニスト活性を有するマウスモノクローナル抗体（９Ｄ３３）は、野生型又は変異型（Ａｒｇ２５５  Ａｓｐ）レセプターを発現するＣＨＯ細胞における効果的なＴＳＨアンタゴニストである。
【０１１２】
我々はまた、ＴＳＨ刺激を阻害する９Ｄ３３の能力を妨げる、Ａｌａに変異する、アミノ酸Ａｒｇ１０９の突然変異を見出したが、この突然変異は、ＴＳＨ刺激を遮断する、血清ＴＳＨＲ自己抗体（ＴＳＨアンタゴニスト自己抗体）の能力に効果がない。
【０１１３】
４）結果として、ＡｓｐへのＴＳＨＲ  Ａｒｇ２５５の突然変異は、基本的に、レセプターと相互作用する、ＴＳＨアゴニストタイプのＴＳＨＲ自己抗体（ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１を含む）の能力を消失する。対照的に、ＴＳＨアンタゴニストタイプのＴＳＨＲ自己抗体（及びＴＳＨ）は、変異型レセプターと良好に反応できる。ＴＳＨＲ  Ａｒｇ２５５のＡｓｐへの突然変異は、したがって、ＴＳＨアゴニストとＴＳＨアンタゴニスト活性を有するＴＳＨＲ自己抗体を区別するために使用できる。
【０１１４】
５）野生型及び変異型ＴＳＨＲ試料に対する標識ＴＳＨ及び未標識ｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１の結合の分析は、ＡｌａへのＡｒｇ２５５の突然変異がｈＭＡｂ  ＴＳＨＲ１におけるレセプターのアフィニティを減じるが、ＴＳＨ結合ではほとんど効果がないことを示す。これは、サイクリックAMP生成の刺激における突然変異の効果と整合している。
【０１１５】
Asp232  Alaの突然変異の場合、おそらく変異型レセプターの減少した表現レベルのため、ホルモン又は抗体の結合は、検出可能でなかった。
【０１１６】
hMAb  TSHR１結合が約3倍減少するだけだったのに対してTrp258がAlaに突然変異する際、TSH結合はまた、検出できなかった。
【０１１７】
【表１】
2008515387.tif 000002
【０１１８】
【表２】
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【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
【表６】
2008515387.tif 000007
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
【表８】
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【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
【表１０】
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【０１２７】
【表１１】
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【０１２８】
【表１２】
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【０１２９】
【表１３】
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【０１３０】
【表１４】
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【０１３１】
【表１５】
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【０１３２】
【表１６】
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【０１３３】
【表１７】
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【０１３４】
【表１８】
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【表１０７】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【０２２８】
【表１１２】
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【０２２９】
【表１１３】
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【０２３０】
【表１１４】
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【０２３１】
【表１１５】
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【０２３２】
【表１１６】
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【０２３３】
【表１１７】
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【国際調査報告】
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