(57)【要約】  IL-13を対象とする抗体およびこのような抗体の使用。例えば、IL-13を対象とするヒトモノクローナル抗体。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする単離ポリヌクレオチド配列、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に骨格(FR)および/または相補性決定領域(CDR)に広がる隣接重鎖および軽鎖配列に対応する配列を提供する。さらに、患者を治療するためにこれらの抗体を使用する方法も提供する。さらに、IL-13依存性バイオマーカー、ならびにそれらの同定法および使用も提供する。
2008520684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-13と結合し、170pM未満のKDでヒトIL-13と結合する単離ヒト抗体。
【請求項２】
50pM未満のKDでIL-13と結合する、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３】
気道過敏症を抑制することができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４】
気道過敏症の完全な逆転を可能にする、請求項3に記載の単離ヒト抗体。
【請求項５】
肺での粘液生成を減少させることができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項６】
少なくとも約30%の粘液生成の減少を可能にする、請求項5に記載の単離ヒト抗体。
【請求項７】
慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、および喘息からなる群から選択されるIL-13関連障害を抑制することができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項８】
IL-13がα1IL-13受容体との相互作用によりシグナル伝達することを妨げるIL-13のエピトープと結合する、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項９】
前記抗体が170pM未満のKDでIL-13およびIL-13Q110Rと結合し、互いの50%以内のKDでIL-13とIL-13Q110Rの両方と結合する、IL-13に対する単離ヒト抗体。
【請求項１０】
同じKDでIL-13およびIL-13Q110Rと効果的に結合する、請求項9に記載の単離ヒト抗体。
【請求項１１】
IL-13関連障害を治療するための医薬品の調製における有効量のIL-13と結合するヒト抗体の使用であって、単離ヒト抗体が170pM以下のKDでIL-13と結合する使用。
【請求項１２】
前記IL-13関連障害が気道過敏症、粘液生成、喘息またはこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
抗体が約10pM以下のKDを有する、請求項11に記載の使用。
【請求項１４】
IL-13関連障害がホジキンリンパ腫である、請求項11に記載の使用。
【請求項１５】
前記有効量が少なくとも、HDLM-2、L-1236細胞、またはこれらの幾つかの組合せの少なくともある程度の細胞増殖を阻害するのに充分な量である、請求項11に記載の使用。
【請求項１６】
前記IL-13関連障害がCD23の発現と関係がある、請求項11に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、IL-13と関係がある化合物に関する。より詳細には、これらの化合物はインターロイキン-13と結合することができる。より詳細には、本発明は、インターロイキン-13と特異的に結合しIL-13活性に影響を与えることができるヒトモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン-13(IL-13)は、B細胞および単球に対するその影響に関して最初に認められたサイトカインであり、クラスIIの発現を上方制御し、IgEクラスの転換を促進し、炎症性サイトカインの生成を阻害する。IL-13受容体は、IL-4受容体とIL-4受容体α鎖を共有する。結果としてIL-13は、IL-4と多くの類似した生物学的活性を有する。
【０００３】
IL-13は炎症性サイトカインの放出を阻害し、in vivoで抗炎症活性を有する。IL-I3はIgE媒介型アレルギー応答において役割を果たし、アレルギー性喘息の主要なメディエーターである(Wills-Karp M.、Curr.Opin.Pulm.Med.、2003; 9: 21〜27)。肺において、IL-13は好酸性炎症、粘液分泌、および気道過敏症を制御する。喘息以外に、IL-13は多数の疾患の発症と関係がある(Wynn TA.Annu.Rev.Immunol.2003.21: 425〜456)。
【特許文献１】米国特許第4,683,195号
【特許文献２】米国特許第4,816,567号
【特許文献３】米国特許第5,500,362号
【特許文献４】米国特許第5,821,337号
【特許文献５】Schrader、米国特許第5,627,052号
【特許文献６】Stec et al.米国特許第5,151,510号
【特許文献７】米国特許出願第07/466,008号
【特許文献８】米国特許出願第07/610,515号
【特許文献９】米国特許出願第07/919,297号
【特許文献１０】米国特許出願第07/922,649号
【特許文献１１】米国特許出願第08/031,801号
【特許文献１２】米国特許出願第08/112,848号
【特許文献１３】米国特許出願第08/234,145号
【特許文献１４】米国特許出願第08/376,279号
【特許文献１５】米国特許出願第08/430,938号
【特許文献１６】米国特許出願第08/464,584号
【特許文献１７】米国特許出願第08/464,582号
【特許文献１８】米国特許出願第08/463,191号
【特許文献１９】米国特許出願第08/462,837号
【特許文献２０】米国特許出願第08/486,853号
【特許文献２１】米国特許出願第08/486,857号
【特許文献２２】米国特許出願第08/486,859号
【特許文献２３】米国特許出願第08/462,513号
【特許文献２４】米国特許出願第08/724,752号
【特許文献２５】米国特許出願第08/759,620号
【特許文献２６】米国特許第6,162,963号
【特許文献２７】米国特許第6,150,584号
【特許文献２８】米国特許第6,114,598号
【特許文献２９】米国特許第6,075,181号
【特許文献３０】米国特許第5,939,598号
【特許文献３１】日本国特許第3068180B2号
【特許文献３２】日本国特許第3068506B2号
【特許文献３３】日本国特許第3068507B2号
【特許文献３４】欧州特許No.EP0463151B1
【特許文献３５】国際特許出願No.WO94/02602
【特許文献３６】国際特許出願No.WO96/34096
【特許文献３７】WO98/24893
【特許文献３８】WO00/76310
【特許文献３９】米国特許第5,545,807号
【特許文献４０】米国特許第5,545,806号
【特許文献４１】米国特許第5,625,825号
【特許文献４２】米国特許第5,625,126号
【特許文献４３】米国特許第5,633,425号
【特許文献４４】米国特許第5,661,016号
【特許文献４５】米国特許第5,770,429号
【特許文献４６】米国特許第5,789,650号
【特許文献４７】米国特許第5,814,318号
【特許文献４８】米国特許第5,877,397号
【特許文献４９】米国特許第5,874,299号
【特許文献５０】米国特許第6,255,458号
【特許文献５１】米国特許第5,591,669号
【特許文献５２】米国特許第6,023.010号
【特許文献５３】米国特許第5,612,205号
【特許文献５４】米国特許第5,721,367号
【特許文献５５】米国特許第5,789,215号
【特許文献５６】米国特許第5,643,763号
【特許文献５７】国際米国特許出願第07/574,748号
【特許文献５８】国際米国特許出願第07/575,962号
【特許文献５９】国際米国特許出願第07/810,279号
【特許文献６０】国際米国特許出願第07/853,408号
【特許文献６１】国際米国特許出願第07/904,068号
【特許文献６２】国際米国特許出願第07/990,860号
【特許文献６３】国際米国特許出願第08/053,131号
【特許文献６４】国際米国特許出願第08/096,762号
【特許文献６５】国際米国特許出願第08/155,301号
【特許文献６６】国際米国特許出願第08/161,739号
【特許文献６７】国際米国特許出願第08/165,699号
【特許文献６８】国際米国特許出願第08/209,741号
【特許文献６９】欧州特許No.0546073B1
【特許文献７０】国際特許出願Nos.WO92/03918
【特許文献７１】WO92/22645
【特許文献７２】WO92/22647
【特許文献７３】WO92/22670
【特許文献７４】WO93/12227
【特許文献７５】WO94/00569
【特許文献７６】WO94/25585
【特許文献７７】WO96/14436
【特許文献７８】WO97/13852
【特許文献７９】WO98/24884
【特許文献８０】米国特許第5,981,175号
【特許文献８１】欧州特許出願第773288号
【特許文献８２】欧州特許出願第843961号
【特許文献８３】米国特許第4,399,216号
【特許文献８４】米国特許第4,912,040号
【特許文献８５】米国特許第4,740,461号
【特許文献８６】米国特許第4,959,455号
【特許文献８７】米国特許第4,816,397号
【特許文献８８】米国特許第5,916,771号
【特許文献８９】米国特許第6,207,418号
【特許文献９０】米国特許第3,773,919号
【特許文献９１】EP58,481
【特許文献９２】EP133,988
【特許文献９３】米国特許No.DE3,218,121
【特許文献９４】EP52,322
【特許文献９５】EP36,676
【特許文献９６】EP88,046
【特許文献９７】EP143,949
【特許文献９８】EP142,641
【特許文献９９】日本国特許出願83-118008
【特許文献１００】米国特許第4,485,045号
【特許文献１０１】米国特許第4,544,545号
【特許文献１０２】EP102,324
【特許文献１０３】PCT公開WO03/048730A2
【特許文献１０４】米国特許公開No.2005/0065327
【特許文献１０５】WO01/62933
【特許文献１０６】PCT公開No.WO2005/007699
【非特許文献１】Wills-Karp M.、Curr.Opin.Pulm.Med.、2003; 9: 21〜27
【非特許文献２】Wynn TA.Annu.Rev.Immunol.2003.21: 425〜456
【非特許文献３】Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.、J.Wiley & Sons(ニューヨーク、NY1994); Sambrook et al.Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)
【非特許文献４】Mullis et al.、Cold Spring Harbor Synp.Quant.Biol.51: 263 (1987); Erlich、ed.、PCR Technology(Stockton Pres、NY、1989)
【非特許文献５】Chothia et al.J.Mot.Biol.186: 651 (1985); Novotny and Haber、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82: 4592 (1985); Chothia et al.、Nature 342: 877〜883 (1989)
【非特許文献６】Kohler et al.、Nature、256: 495 (1975)
【非特許文献７】Clackson et al.、Nature、352: 624〜628 (1991)およびMarks et al.、J.Mol.Biol.、222: 581〜597 (1991)
【非特許文献８】Ravetch and Kinet、Annu.Rev.Immunol.9: 457〜492 (1991)の464ページの表3
【非特許文献９】Clynes et al.PNAS (USA) 95: 652〜656 (1988)
【非特許文献１０】Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5thEd.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD.(1991)
【非特許文献１１】Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196: 901〜917 (1987)
【非特許文献１２】Bruce Alberts et al.、Molecular Biology of the Cell、Garland Publishing、Inc.、ニューヨーク(3d ed.1994)
【非特許文献１３】Green et al.Nature Genetics7: 13〜21 (1994)
【非特許文献１４】Babcook et al、Prot.Natl.Acad.Sci.USA、93: 7843〜7848(1996)
【非特許文献１５】LaPlanche et al.Nucl.Acids Res.14: 9081 (1986)
【非特許文献１６】Stec et al.J.Am.Chem.Soc.106: 6077 (1984)
【非特許文献１７】Stein et al.Nucl.Acids Res.16: 3209 (1988)
【非特許文献１８】Zon et al.Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991)
【非特許文献１９】Zon et al.Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、pp.87〜108 (F.Eckstein、Ed.、Oxford University Press、Oxford England (1991))
【非特許文献２０】Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990)
【非特許文献２１】Immunology--A Synthesis(2nd Edition、E.S.Golub and D.R.Gren、Eds.、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.(1991))
【非特許文献２２】Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2: 482 (1981)
【非特許文献２３】Needleman and Wunsch J.Mol.Biol.48: 443 (1970)
【非特許文献２４】Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 85: 2444 (1988)
【非特許文献２５】Dayhoff、M.O.、in Atlas of Protein Sequence and Structure、pp.103〜110(Volume5、National Biomedical Research Foundation(1972)) and Supplement 2 to this volume、pp.1〜10
【非特許文献２６】Bowie et al.Science 253: 164 (1991)
【非特許文献２７】Proteins、Structures and Molecular Principles(Creighton、Ed.、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1984))
【非特許文献２８】Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze、eds.、Garland Publishing、ニューヨーク、(1991))
【非特許文献２９】Thornton et at.Nature 354: 105 (1991)
【非特許文献３０】Fauchere、J.Adv.Drug Res.15: 29 (1986)
【非特許文献３１】Veber and Freidinger TINS p.392 (1985)
【非特許文献３２】Evans et al.J.Med.Chem.30: 1229 (1987)
【非特許文献３３】Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61: 387 (1992)
【非特許文献３４】The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker、S.、Ed.、McGraw-Hill、サンフランシスコ(1985))
【非特許文献３５】Fundamental Immunology Ch.7(Paul、W.、ed.、2nd ed.Raven Press、N.Y.(1989)
【非特許文献３６】Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1987 and 1991))
【非特許文献３７】Chothia & Lesk J.Mol.Biol.196: 901〜917 (1987); Chothia et al.Nature 342: 878〜883 (1989)
【非特許文献３８】Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79: 315〜321 (1990)
【非特許文献３９】Kostelny et al.J.Immunol.148: 1547〜1553 (1992)
【非特許文献４０】Mendez et al.Nature Genetics 15: 146〜156 (1997)
【非特許文献４１】Green and Jakobovits J.Exp.Med.188: 483〜495 (1998)
【非特許文献４２】Babcook et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、i93: 7843〜7848(1996)
【非特許文献４３】Baldrick P.「Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.」Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2): 210〜8 (2000)
【非特許文献４４】Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」Int.J.Pharm.203(1〜2): 1〜60 (2000)
【非特許文献４５】Charman WN「Lipids、lipophilic drugs、and oral drug delivery-some emerging concepts.」J.Pharm.Sci.89 (8): 967〜78 (2000)
【非特許文献４６】Powell et al.「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA J.Pharm.Sci.Technol.52: 238〜311 (1998)
【非特許文献４７】Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20th ed、Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003)
【非特許文献４８】Langer et al.、J.Biomed Mater.Res.、(1981) 15: 167〜277
【非特許文献４９】Langer、Chem.Tech.、(1982) 12: 98〜105
【非特許文献５０】Sidman et al.、Biopolymers、(1983) 22: 547〜556
【非特許文献５１】Epstein et al.、Proc.Natl.Acad.Set.USA、(1985) 82: 3688〜3692
【非特許文献５２】Hwang et al、Proe.Natl.Acad.Sci.USA、(1980) 77: 4030〜4034
【非特許文献５３】Fanger et al.Iimmnunol Methods4: 72〜81 (1994)
【非特許文献５４】Traunecker et al.Int.J.Cancer(Suppl)7: 51〜52 (1992)
【非特許文献５５】Valerius et al.Blood 90: 4485〜4492 (1997)
【非特許文献５６】Heinzmann、A.、et al.Hum Mol Genet、2000.9(4): p.549〜59
【非特許文献５７】Howard、T.D.、et al.Am J Hum Genet、2002.70(1): p.230〜6
【非特許文献５８】Kauppi、P.、et al.Genomics、2001.77(1〜2): p.35〜42
【非特許文献５９】Graves、P.E.、et al.J Allergy Clin Immunol、2000.105(3): p.506〜13
【非特許文献６０】Arima et al.、(J Allergy Din Immunol、2002.109 (6):p.980〜7)
【非特許文献６１】van der Pouw Kraan、T.C.、et al.Genes Immun、1999.1 (1): p.61〜5
【非特許文献６２】Ewert et al、(2000) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol
【非特許文献６３】Willis-Karp M.、Murine models of asthma in understanding dysregulation in human asthma、Imnrunopharmacology、25: 48: 263〜8 (2000)
【非特許文献６４】Heinzmann et al、(Genentic variants of IL-13 signaling and human asthma and atopy、Human Molecular Genetics、9: 549〜559 (2000))
【非特許文献６５】Trieu et al、Claudio JO et al、Soluble interleukin-13Ralpha2 decoy receptor inhibits Hodgkin's lymphoma growth in vitro and in vivo、Cancer Res、64: 3271〜3275 (2004)
【非特許文献６６】Punnonen et al、Interleukin13 induces interleukin4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells、Proc Natl Acad Sci U S A、90: 3730〜3734 (1993)
【非特許文献６７】Ma et al、The C10/CCL6 chemokine and CCR1 play critical roles in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling、J Inmunol、172(3): 1872〜81 (2004)
【非特許文献６８】Zhu et al、IL-13-induced chemokine responses in the lung: role of CCR2 in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling、J Immunol.168(6): 2953〜62 (2002)
【非特許文献６９】Nomura et al、Interleukin-13 induces thymus and activation-regulated chemokine (CCL17) in human peripheral blood mononuclear cells、Cytokin、20 (2): 49〜55 (2002)
【非特許文献７０】Zhu et al、Pulmonary expression of interleukin-l3 causes inflammation、mucus hypersecretion、subepithelial fibrosis、physiologic abnormalities、and eotaxin production、J Clin Invest、103 (6): 779〜88 (1999)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の幾つかの態様は、IL-13と結合する単離ヒト抗体に関する。幾つかの実施形態では、単離ヒト抗体は170pM未満のKDでヒトIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、単離ヒト抗体は50pM未満のKDでIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、抗体は気道過敏症を抑制することができる。幾つかの実施形態では、抗体は気道過敏症の完全な逆転を可能にする。幾つかの実施形態では、抗体は肺での粘液生成を減少させることができる。幾つかの実施形態では、抗体は少なくとも約30%の粘液生成の減少を可能にする。幾つかの実施形態では、抗体は慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、喘息からなる群から選択されるIL-13関連障害を抑制することができる。幾つかの実施形態では抗体は、α1IL-13受容体との相互作用によるシグナル伝達からIL-13を妨げるIL-13のエピトープと結合する。幾つかの実施形態では、抗体は300pMのIL-13を用いるエオタキシン放出アッセイにおける60pM以下のIC50およびを有する。幾つかの実施形態では、抗体はヒトIL-13と結合するが、マウスIL-13とは検出可能なレベルでは結合しない。
【０００５】
本発明の幾つかの態様は、IL-13関連障害の治療法に関する。幾つかの実施形態では、この方法は治療を必要とする対象にIL-13と結合するヒト抗体を有効量投与することを含み、単離ヒト抗体は170pM以下のKDでIL-13と結合し、これによってIL-13関連障害を治療する。
【０００６】
幾つかの実施形態では、対象における気道過敏症、粘液生成、または両方の治療は予防的治療として行い、この方法は気道過敏症、粘液生成、または両方を発症するリスクのある患者を同定するステップをさらに含む。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害は気道過敏症、粘液生成、喘息またはこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、抗体は約10pM以下のKDを有する。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害はホジキンリンパ腫である。幾つかの実施形態では、有効量は患者における検出可能なバイオマーカーの量を減少させるのに充分な量である。幾つかの実施形態では、有効量は対象に存在するIL-13の量を相当量、例えば1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜95、95〜99、99〜100%減少させることができる量である。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはC10、TARC、エオタキシン、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、有効量は少なくともHDLM-2、L-1236細胞、またはこれらの幾つかの組合せの少なくともある程度の細胞増殖を阻害するのに充分な量である。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害はCD23の発現と関係がある。
【０００７】
本発明の他の態様は、IL-13と結合する単離ヒト抗体に関するものであり、この単離ヒト抗体はIL-13がIL-13受容体α2とさらに結合することができるようにIL-13と結合し、この単離ヒト抗体はIL-13がIL-13受容体α1と結合するのを妨げるようにIL-13と結合する。
【０００８】
本発明の他の態様は、IL-13活性の阻害を測定するための方法に関する。幾つかの実施形態では、この方法は抗体をサンプルまたは対象に投与すること、および放出されるバイオマーカーの量を測定することを含み、放出されるバイオマーカーの量の減少はIL-13活性の阻害と相関関係がある。
【０００９】
本発明の他の態様は、IL-13に対する単離ヒト抗体に関する。この抗体は170pM未満のKDでIL-13およびIL-13Q110Rと結合し、互いの50%以内のKDでIL-13とIL-13Q110Rの両方と結合する。幾つかの実施形態では、抗体は同じKDでIL-13およびIL-13Q110Rと効果的に結合する。
【００１０】
本発明の他の態様は、IL-13関連障害を治療するためのキットに関する。幾つかの実施形態では、キットはIL-13抗体、およびバイオマーカーレベルを検出するためのバイオマーカー検出剤を含む。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはエオタキシン、TARC、C10、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、バイオマーカー検出剤はエオタキシン、TARC、C10、またはこれらの幾つかの組合せからなる群から選択されるタンパク質に対する抗体を含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、IL-13関連障害の治療法に関する。幾つかの実施形態では、この方法はIL-13と結合する第1の量のヒト抗体を治療を必要とする対象に投与することであって、単離ヒト抗体が100pM以下のKDでIL-13と結合するものであること、およびバイオマーカーの量を検出して第1の量のヒト抗体の投与後に存在するIL-13関連活性のレベルを測定すること、前記バイオマーカーの検出によって示されるIL-13活性の量に基づいてより多くのまたはより少ない治療が必要とされるかどうか決定することを含む。幾つかの実施形態では、方法は第2の量のヒト抗体を投与することをさらに含み、前記第2の抗体の量は検出するバイオマーカーの量に基づく。幾つかの実施形態では、第2のヒト抗体の量は、第1のヒト抗体の量で投与した抗体の量とは異なる抗体の量である。幾つかの実施形態では、測定したバイオマーカーの量と健康な対象に関するバイオマーカーの標準量、または対象に関するバイオマーカーの設定目標量を比較することによって測定を実施する。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはTARC、エオタキシン、C10、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、治療を必要とする対象は、IL-13関連障害を予防するための予防的治療から利点を得るはずである対象である。幾つかの実施形態では、治療を必要とする対象は、IL-13関連障害に関する治癒的治療から利点を得るはずである対象である。
【００１２】
本発明の他の態様は、喘息の治療法に関する。幾つかの実施形態では、この方法は、喘息を有する対象を同定すること、および約170pM以下のKDでヒトIL-13と結合するヒト抗体を有効量投与することを含む。幾つかの実施形態では、有効量はバイオマーカーのレベルを調べることによって測定し、前記有効量は一度バイオマーカーのレベルが低下した後に得られる。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはエオタキシン、C10、TARC、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択され、バイオマーカーのレベルの増大または充分な低下がないことは、他の抗体を投与すべきであることを示す。幾つかの実施形態では、対照群より高レベルのバイオマーカーを有する対象によって、喘息を有する患者を同定する。
【００１３】
本発明の他の態様は、IL-13関連障害の症状の治療法に関する。幾つかの実施形態では方法は、喘息と共通の症状を有する対象を同定することによってIL-13関連障害の症状を有する対象を同定すること、および有効量のIL-13に対するヒト抗体を前記対象に投与することであって、前記有効量が前記症状を低下させるのに充分であることを含む。幾つかの実施形態では、症状は以下の気道過敏症、過剰な粘液生成、気管支肺胞洗浄液(BALF)中の白血球動員、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では症状は、相当量のIL-13を対象に投与すると、対象において生じる症状である。
【００１４】
本発明の他の態様は、IL-13関連障害を治療するための医薬品の調製における有効量のIL-13と結合するヒト抗体の使用であって、単離ヒト抗体が170pM以下のKDでIL-13と結合するものである使用に関する。幾つかの実施形態では、治療するIL-13関連障害は気道過敏症、粘液生成、または両方であり、その治療は予防的治療である。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害は気道過敏症、粘液生成、喘息またはこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、抗体は約10pM以下のKDを有する。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害はホジキンリンパ腫である。幾つかの実施形態では、有効量は患者における検出可能なバイオマーカーの量を減少させるのに充分な量である。幾つかの実施形態では、有効量は対象中のIL-13の量を任意の相当量、例えば1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜95、95〜99、99〜100パーセント減少させるのに充分な量である。幾つかの実施形態では、医薬品はバイオマーカーのレベルで知らせることができるバイオマーカー検出剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはC10、TARC、エオタキシン、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、バイオマーカー検出剤はバイオマーカーと結合する抗体を含む。幾つかの実施形態では、有効量はHDLM-2、L-1236細胞、またはこれらの幾つかの組合せの少なくともある程度の細胞増殖を阻害するのに少なくとも充分な量である。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害はCD23の発現と関係がある。
【００１５】
本発明の他の態様は、バイオマーカーのレベルを調べるための医薬品の製造におけるバイオマーカー検出剤の使用に関する、何故ならバイオマーカー検出剤は、IL-13関連障害を知らせるからである。
【００１６】
本発明の他の態様は、医薬品の製造におけるIL-13に対する抗体の使用に関するものであり、抗体はIL-13がIL-13受容体α2とさらに結合することができるようにIL-13と結合し、これによってIL-13受容体α2はIL-13の基質としてさらに機能することができ、これによって対象由来のIL-13のクリアランスを増大させる。
【００１７】
本発明の幾つかの実施形態は、IL-13と特異的に結合する単離モノクローナル抗体、またはその断片に関する。これらの実施形態では、単離抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体および/あるいはヒトまたはヒト化抗体であってよいことは理解されるはずである。好ましくは、抗体はヒトまたは完全ヒトモノクローナル抗体であり、200pM未満の平衡解離定数でIL-13と結合する。一実施形態では、抗体は100pM未満の解離定数でIL-13と結合する。他の実施形態では、抗体は55pM未満の平衡解離定数でIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、抗体は200pM未満のKDで、あるいはさらに50pM未満のKDでIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、これらの抗体を患者に投与すると、部分的または完全に気道過敏症を抑制する。
【００１８】
一実施形態では抗体は、重鎖配列番号50および軽鎖配列番号52を有する以下で論じる「623」抗体である。他の実施形態では抗体は、重鎖配列番号38および軽鎖配列番号40を有する「731」抗体である。
【００１９】
本発明の他の実施形態では、抗体はIL-13の特異的エピトープと結合することが好ましい。一実施形態では、抗体はIL-13のアミノ酸21〜33を含むエピトープと結合する。他の実施形態では、抗体はIL-13のアミノ酸109〜121を含むエピトープと結合する。さらに他の実施形態では、抗体はアミノ酸111〜128を含むエピトープと結合する。さらに他の実施形態は、IL-13のアミノ酸45〜108を含むエピトープと結合する抗体である。他の実施形態は、IL-13のアミノ酸70〜80または83〜92と結合する抗体を含む。さらに他の実施形態は、IL-13の特異的らせん構造と結合する抗体である。例えば、IL-13のらせん構造A、らせん構造Cまたはらせん構造Dと結合する抗体は、本発明の範囲内にある。他の実施形態では、抗体はIL-13上のエピトープと結合し、このエピトープはIL-13のアミノ酸20〜29を含む。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、特異的重鎖アミノ酸配列を有する抗体である。例えば一実施形態は、IL-13と特異的に結合し以下の表18に示す重鎖アミノ酸配列を有する抗体である。このような抗体は、以下の表19または20に示す軽鎖アミノ酸配列をさらに有することが好ましい。一実施形態では抗体は、例えば配列番号2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、および81〜88によって表されるヒト重鎖免疫グロブリン分子、および例えば配列番号4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、および89〜94によって表されるヒトkappa軽鎖免疫グロブリン分子を含む。他の実施形態は、重鎖免疫グロブリン分子とkappa軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子、およびこの逆を含む組合せ、ならびにこれらの断片および類似体によって形成される抗体分子を含む。幾つかの実施形態では、抗体は重鎖CDR1、CDR2、CDR3、FRI、FR2、FR3、および/またはFR4由来の配列、あるいは表18に列挙した配列のいずれかを有する。幾つかの実施形態では、抗体は軽鎖CDR1、CDR2、CDR3、FRI、FR2、FR3、および/またはJ由来の配列、あるいは表19および20に列挙した配列のいずれかを有する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、前述の抗体を患者に投与すると、肺での粘液生成を減少させることができる。減少は部分的、または完全な減少である可能性がある。幾つかの実施形態では、これらの抗体は、マウスにおける粘液生成を減少させるのに有効である可能性がある。幾つかの実施形態では、抗体をヒト患者に投与すると、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、および/または喘息を抑制することができる。
【００２２】
幾つかの実施形態では、抗体は、IL-13がIL-13受容体との相互作用によりシグナル伝達することを妨げるIL-13の領域と結合する。幾つかの実施形態では、抗体はIL-13受容体α1との相互作用によってIL-13シグナル伝達を阻害しながら、IL-13をIL-13受容体α2に結合させることができる。幾つかの実施形態では、単離完全ヒト抗体は、IL-13受容体α1との結合からIL-13を阻害することによってIL-13依存性シグナル伝達を阻害することができる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、抗体はマカクザルIL-13タンパク質に対して3nM以下のKDを有する。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、気道過敏症を抑制する方法である。この方法は、治療を必要とする対象に有効量のIL-13と結合する完全ヒト抗体を投与することを含む。一実施形態では、単離完全ヒト抗体は100pM以下のKDでIL-13と結合し、これによって気道過敏症を抑制する。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、粘液生成を阻害する方法である。この方法は、このような治療を必要とする対象に有効量のIL-13と結合する完全ヒト抗体を投与することを含む。単離完全ヒト抗体は100pM以下のKDでIL-13と結合し、これによって粘液生成を阻害することが好ましい。
【００２６】
幾つかの実施形態では、抗体は約50pM以下のKDでIL-13と結合する。他の実施形態では、抗体は約10pM以下のKDでIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、方法はマウスにおいて実施され、一方他の実施形態では、方法はヒトにおいて実施される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、前述の抗体は約100pM、約50pM、約30pM、および/または約20pM以下のIC50を有する。
【００２８】
さらに他の実施形態は、対象由来のIL-13のクリアランスを増大させる方法である。幾つかの実施形態では、この方法はIL-13と結合することができる抗体を対象に投与することを含む。抗体は好ましくは、IL-13がIL-13受容体α2とさらに結合するようにIL-13と結合し、これによってIL-13受容体α2はIL-13の「基質」としてさらに機能することができ、これによって対象由来のIL-13のクリアランスを増大させる。これを行うことができる抗体の1つのこのような例はmAb731である。他の実施形態では、抗体は、IL-13がα1またはα2受容体のいずれかと結合することができないようにIL-13と結合する。
【００２９】
1つの他の実施形態は、対象中のIL-13依存性活性のレベルを抑制する方法である。幾つかの実施形態では、この方法はIL-13に対する抗体を対象に投与することを含む。抗体は、IL-13がその内因性受容体を介してシグナル伝達することを妨げるように、IL-13と結合する。シグナル伝達はIL-13がIL-13受容体α1と結合することを必要とし、IL-13と結合する抗体はIL-13とIL-13受容体α2の結合は著しく干渉しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、この方法は、IL-13依存性バイオマーカーのレベルを調べること、およびそれに応じて投与する抗体の量を調節することをさらに含む。幾つかの実施形態では、抗体はmAb623、731、および623または731抗体と同じエピトープと結合する抗体である。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはエオタキシン、C10(CCケモカイン)、および/または胸腺および活性化制御ケモカイン(TARC)である。さらに企図されるのは、サンプル中のバイオマーカーのレベルを検出するための何らかの方法において使用することができる、タンパク質(例えば抗体)などの組成物であるバイオマーカー検出剤である。
【００３０】
幾つかの実施形態では、方法はIL-13の阻害の測定を可能にする。この方法は、IL-13を含むサンプルに候補抗体を施すこと、および放出されたエオタキシンの量を測定することを含む。エオタキシンの阻害は、抗体とIL-13の結合と関係がある。幾つかの実施形態では、この方法は、C10および/またはTARCの量を測定することを含む。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害に罹患している対象を同定するためにこの方法を使用することができる。
【００３１】
幾つかの実施形態では、アミノ酸位置110における点突然変異を含むIL-13の単離変異体を提供する。この点突然変異は、位置110におけるグルタミンからアルギニン残基への変化をもたらす。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態はIL-13に対する単離完全ヒト抗体を含み、この抗体はIL-13の変異体と特異的に結合する。幾つかの実施形態では、この抗体はIL-13と結合するより強く、IL-13の変異体IL-13Q110Rと特異的に結合することができる。幾つかの実施形態では、この抗体は変異体IL-13Q110Rと特異的に結合することができるが、野生型IL-13とは結合しない。幾つかの実施形態では、抗体は100pM以下のKDで変異体と結合する。幾つかの実施形態では、抗体は、IL-13の変異体IL-13Q110Rと結合するより強くIL-13と結合することができる。幾つかの実施形態では、抗体は野生型IL-13と特異的に結合することができるが、変異体IL-13Q110Rとは検出可能なほど結合しない。幾つかの実施形態では、抗体は、それがIL-13Q110Rと結合するのと同程度に有効にIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、IL-13およびIL-13Q110Rに対する完全ヒトmAbのKDの20%未満の差異、例えば20〜15、15〜10、10〜8、8〜6、6〜4、4〜2、2〜1、1〜0パーセント未満の抗体のKDの差異が存在する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、トランスジェニックマウスを提供する。このマウスはヒト化されており、ヒトIL-13を発現する。幾つかの実施形態では、このマウスはアレルゲン誘導型の気道過敏症の影響を受けやすい。
【００３４】
幾つかの実施形態では、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合成分はモノクローナル抗体である。
【００３５】
幾つかの実施形態では、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合成分、および薬剤として許容される担体を含む組成物を提供する。
【００３６】
幾つかの実施形態では、IL-13関連障害を治療するためのキットはIL-13抗体を含む。幾つかの実施形態では、キットは本明細書に開示するIL-13抗体、および対象にIL-13抗体を投与するための教示書を含む。幾つかの実施形態ではキットは、IL-13関連障害を治療するのに多量または少量の抗体が必要とされるかどうかを判定するための、IL-13依存性バイオマーカーをさらに含む。
【００３７】
本発明の実施形態は、いずれか特定の形の抗体に限られないことも理解されるはずである。例えば、提供する抗体は(例えば、完全ヒトFc領域を有する)完全長抗体または抗体断片(例えばFab、Fab'またはF(ab')2)であってよい。さらに抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは抗体をコードする1つまたは複数の遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞から組換えによって作製することができる。
【００３８】
他の実施形態は、本明細書に記載する抗体のいずれかをコードする単離核酸分子を含む。
【００３９】
さらに他の実施形態では、本発明は本明細書に記載する単離ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態では、本明細書で開示する抗体またはその変異体のいずれかを、記載する実施形態または態様のいずれかにおいて、あるいはそれ用に適切に使用することができる。
【００４０】
本発明は詳細な説明から、および添付の図面からさらに理解されるはずであり、これらは本発明を例示することを意味し、本発明を制限することは意味しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態は、IL-13と結合する単離抗体、およびヒトにおける疾患を治療するためのこれらの抗体の使用法に関する。抗体は、IL-13と結合し、高い親和性、高い有効性、あるいは両方を有する完全ヒトモノクローナル抗体であることが好ましい。一実施形態では、抗体または抗体断片は、IL-13がIL-13受容体複合体を介してシグナル伝達することを妨げるIL-13分子の領域と特異的に結合する。一実施形態では、完全ヒトモノクローナル抗体はIL-13系活性を中和している。
【００４２】
本発明の他の実施形態では抗体は、IL-13受容体α1以外の受容体とのその結合を可能にしながらIL-13と結合する。例えば、一実施形態では、抗体はIL-13と結合し、IL-13がIL-13受容体α2として知られるデコイ受容体と結合するのを可能にする。この場合、抗体は、IL-13がそのシグナル受容体と結合することは妨げるが、デコイ受容体に結合することは妨げない。本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も含む。
【００４３】
さらに、本発明の実施形態は、疾患の診断用物質または治療剤としてこれらの抗IL-13抗体を使用する方法を含む。例えば抗体は、アレルギー性(アトピー性)および非アレルギー性(非アトピー性)いずれも気管支喘息を含めた喘息、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、枯草熱、鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、接触性皮膚炎を含めたアレルギー性皮膚炎、スティーベンス-ジョンソン症候群、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、角膜炎、結膜炎、ステロイド耐性腎炎症候群、肥満細胞症、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、ベロマイシン誘導型線維症、肝臓線維症および全身性硬化症を含めた肺線維症などの線維症疾患、ホジキン病などの癌、B細胞リンパ腫、特に縦隔の大きなB細胞リンパ腫などのB細胞増殖障害、B細胞白血病、卵巣癌、全身性エリテマトーデスなどの非悪性B細胞増殖によって特徴付けられる疾患、関節リウマチ、慢性活性型肝炎およびクリオグロブリン血症、高レベルの自己抗体、溶血性貧血、血小板減少症、リン脂質症および天ぽうそう、炎症性腸疾患および移植片対宿主病を治療するのに有用である。幾つかの実施形態では、治療法はエオタキシン、TARCおよび/またはC10などのバイオマーカーのレベルを追跡することによって抗体の投与の有効性を調べることをさらに含む。
【００４４】
このような治療に関して、本発明の実施形態は抗体を含む製造品を含む。本発明の一実施形態は、IL-13活性と関係がある疾患または障害をスクリーニングするために使用するIL-13抗体を含むアッセイキットである。幾つかの実施形態では、キットはバイオマーカーを含み、個々の患者における抗体の有効性を測定することができる。
【００４５】
さらに、IL-13に対する抗体を使用して、喘息の病状および他の障害において役割を果たすエフェクターサイトカインとしてのインターロイキン-13(IL-13)の役割に影響を与えている。動物では、IL-13の直接投与は喘息を誘導し、IL-13の阻害はIL-13誘導型またはアレルゲン誘導型喘息を抑制する。本明細書に示すように、mAb623は高い親和性でIL-13(KD=24pM)およびIL-13R130Q(KD=39pM)と結合し、一般的なIL-13変異体はアレルギーおよび喘息と関係がある。さらに、mAb623はIL-13がIL-13α1およびIL-13α2と結合するのを妨げることが現在示されている。in vitroにおいてmAb623は、ヒト皮膚線維芽細胞(HDFa)細胞によるIL-13誘導型エオタキシン-1生成、および全血B細胞におけるIL-13誘導型CD23上方制御を阻害する。さらにmAb623は、HDLM-2およびL-1236細胞、オートクリン増殖因子としてIL-13を使用する2つのホジキンリンパ腫由来の細胞系の細胞増殖も阻害する。したがって、この抗体は、IL-13と関係がある障害の治療に関して広範囲の望ましい特性を有するようである。
【００４６】
さらに、喘息を調べるために設計したマウスモデルも開発および試験されている。mAb623はマウスIL-13と結合しないので、マウスIL-13遺伝子の第1エクソンとヒトIL-13をコードするcDNAを交換し、それによってマウスIL-13プロモーター下でのヒトIL-13の発現を可能にすること、および内因性マウスIL-13遺伝子の発現を排除することによって、IL-13KI/KOマウスを作製した。OVA誘導型喘息モデルを樹立するためにこれらのマウスを使用して、mAb623の予防的投与は気道過敏症(AHR)を阻害し、粘液過剰生成を有意に阻害することを、本明細書において示す。さらに、イエダニ誘発型喘息モデルでは、mAb623の予防または治療投与は気道におけるAHR、粘液過剰生成および好酸球浸潤を阻害する。
【００４７】
さらに、mAb623はOVA誘導型のTARCおよびエオタキシン-1血清レベルの上昇も阻害し、これらの化合物がバイオマーカーとして有用であり得ることを実証する。さらにこれらのデータは、mAb623および他の抗体はin vitroおよびin vivoでIL-13を効率良く中和することができることを示す。本明細書で開示する抗体、および開示する方法から作製した抗体を使用することもでき、これらは類似の性質を示し得る。抗体の個々の性質をスクリーニングし確認する方法を、本発明において提供する。
【００４８】
本明細書に記載する核酸分子、ならびにその断片および変異体を例えば非制限的に、(a)組換えまたは異型遺伝子産物としての対応するコードタンパク質、ポリペプチド、断片および変異体の生合成を誘導するために、(b)本明細書で開示する核酸を検出および定量するためのプローブとして、(c)アンチセンス分子などを調製するための配列鋳型として使用することができる。このような使用は以下でさらに完全に記載する。
【００４９】
幾つかの態様では、これらの抗体を同定する方法を提供する。一実施形態では、方法はエオタキシン放出アッセイを含む。
【００５０】
幾つかの態様では、IL-13の変異体と結合する抗体も提供する。特に関連があるのは、内因性IL-13ポリペプチドの位置110にグルタミンを有するIL-13の変異体と結合する抗体である。
【００５１】
幾つかの態様では、ヒトIL-13のみを生成するように遺伝的に改変されているマウスを提供する。このマウスは、気道過敏症および粘液生成の阻害の試験対象を与えるのに有用である。
【００５２】
幾つかの態様では、喘息または本明細書で開示するいずれかの障害の予防的治療または予防のために、抗体を使用することができる。例えば幾つかの実施形態では、以下の炎症性疾患、癌、線維症疾患および非悪性細胞増殖によって特徴付けられる疾患;炎症性疾患または障害、例えばアレルギー性(アトピー性)および非アレルギー性(非アトピー性)のいずれもの、気管支喘息を含めた喘息、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、枯草熱、鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、接触性皮膚炎を含めたアレルギー性皮膚炎、スティーベンス-ジョンソン症候群、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、角膜炎、結膜炎、ステロイド耐性腎炎症候群、肥満細胞症など;突発性肺線維症、嚢胞性線維症、ベロマイシン誘導型線維症、肝臓線維症および全身性硬化症を含めた肺線維症などの線維症疾患のいずれかを予防的に治療するために、抗体を使用することができる。他の実施形態では、抗IL-13抗体を使用して、ホジキン病などの癌、B細胞リンパ腫、特に縦隔の大きなB細胞リンパ腫などのB細胞増殖障害、B細胞白血病、卵巣癌を治療する。疾患の任意の危険状態の前または最中に抗体は投与することができる。幾つかの実施形態では、1回用量または多数回用量で抗体を与える。幾つかの実施形態では、抗体を連続的に投与する。慢性状態では、多用量かつ/あるいは連続的に抗体を投与することができる。急性状態では、1回用量または低用量、あるいは比較的低頻度で抗体を投与することができる。
【００５３】
幾つかの実施形態では、本明細書で開示する方法を、IL-13と関係があるかそれに影響を与える疾患または生物事象のバイオマーカーを同定するために使用することができる。幾つかの実施形態では、バイオマーカーはC10、TARC、エオタキシン、およびこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、対象中のC10、TARCおよび/またはエオタキシンのレベルを調べ、IL-13と関係があるバイオマーカーを調べることから利点を得ることができる。幾つかの実施形態では、抗体、例えばmAb623を患者に投与し、次いでバイオマーカーのレベルを調べて、抗体の有効性を確認する。幾つかの実施形態では、患者に投与する抗体の量を次いで調節する。幾つかの実施形態では、これらのバイオマーカーと結合する分子およびこれらのバイオマーカーを検出する分子(「バイオマーカー検出剤」)、およびIL-13関連障害を治療する有効性を測定することに関する、バイオマーカーを検出するためのこれらの使用を企図する。例えば、これらのマーカーに対する抗体はバイオマーカーを検出するのにも有用である。
【００５４】
定義:
他に定義しない限り、本発明に関して使用する科学および技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００５５】
一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関して使用する名称、およびこれらの技法は、本明細書に引用し論じる参照文献などの、さまざまな一般的およびより詳細な参照文献に記載されているように、よく知られているものであり当技術分野で一般的に使用されている。例えば、Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.、J.Wiley & Sons(ニューヨーク、NY1994); Sambrook et al.Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989))を参照のこと。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)に関する標準的な技法を使用する。酵素反応および精製技法は製造者の仕様書に従い、あるいは当技術分野で一般的に実施されているように、あるいは本明細書に記載するように行う。標準的な技法は、化学合成、化学分析、薬剤調製、配合、および送達、患者の治療にも使用する。
【００５６】
本開示に従い使用するように、他に示さない限り以下の用語は、以下の意味を有するものと理解されたい。
【００５７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「PCR」は、1987年7月28日に発行された米国特許第4,683,195号に記載されたのと同様に、微量の核酸、RNAおよび/またはDNAの特異的断片を増幅させる手順または技法を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、当該またはそれ以外の領域の端部からの配列情報を入手する必要があり、これらのプライマーは、増幅させる鋳型の反対鎖と配列が同一または類似であるはずである。2つのプライマーの5'末端ヌクレオチドは、増幅させる物質の端部と一致し得る。PCRを使用して、特定のRNA配列、全ゲノムDNA由来の特定のDNA配列、および全細胞RNAから転写されたcDNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列などを増幅させることができる。Mullis et al.、Cold Spring Harbor Synp.Quant.Biol.51: 263 (1987); Erlich、ed.、PCR Technology(Stockton Pres、NY、1989)を概略的に参照のこと。本明細書で使用するようにPCRは、プライマーとしての知られている核酸ならびに核酸の特異的断片の増幅および作製のための核酸ポリメラーゼの使用を含む、核酸試験サンプルを増幅させるための核酸ポリメラーゼ反応法の、唯一ではないが1つの例であると考えられる。
【００５８】
「抗体」(Ab)および「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原との結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルで、およびミエローマによって高レベルで生成される。
【００５９】
「元の抗体および免疫グロブリン」は通常、2つの同一軽(L)鎖と2つの同一重(H)鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結しているが、一方でジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖間で異なる。それぞれの重鎖および軽鎖は、規則的に配置された鎖間ジスルフィド架橋をさらに有する。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)次に幾つかの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)およびその他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1定常ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並んでいる。個々のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる(Chothia et al.J.Mot.Biol.186: 651 (1985); Novotny and Haber、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82: 4592 (1985); Chothia et al.、Nature 342: 877〜883 (1989))。
【００６０】
本明細書中の用語「抗体」は広い意味で使用し、詳細には少なくとも2つの完全抗体から形成される完全モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、ならびにそれらが所望の生物活性を示す限りFabおよびF(ab)'2を含めた抗体断片を含む。任意の脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる2つの明らかに異なる型の1つに割り当てることができる。結合断片は、組換えDNA技法によって、あるいは完全抗体の酵素または化学的切断によって生成させる。結合断片は、以下でさらに詳細に記載するように、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および単鎖抗体を含む。「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外の抗体は、それぞれ同一であるその結合部位を有すると理解される。
【００６１】
好ましい抗体は、IL-13受容体α-1(IL-13Rα1)などのシグナル受容体とIL-13との結合を(in vitroの競合結合アッセイで測定して)少なくとも約20%、40%、60%または80%、およびさらに通常は約85%を超えて中和し、阻害する。幾つかの実施形態では、抗体はデコイ受容体IL-13Rα2との結合も阻害し、一方、他の実施形態では、IL-13Rα2と結合するIL-13の能力は抗体がIL-13と結合する際に保たれる。
【００６２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、完全抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。5つの主なクラスの完全抗体:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらの幾つかは「サブクラス」(イソ型)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配座はよく知られている。
【００６３】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわちその集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得るおそらく自然に生じる突然変異体以外同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、1つの抗原部位を対象とする。さらに、異なる抗原決定基(エピトープ)を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の1つの抗原決定基を対象とする。それらの特異性以外に、モノクローナル抗体は、他の抗体により汚染されずにそれらを合成することができる点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、ほぼ均質な抗体群から得られた抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の生成が必要とされると解釈すべきでない。例えば、本発明に従い使用するモノクローナル抗体は、Kohler et al.、Nature、256: 495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えDNA法によって作製することができる(例えば米国特許第4,816,567号を参照)。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al.、Nature、352: 624〜628 (1991)およびMarks et al.、J.Mol.Biol.、222: 581〜597 (1991)に記載された技法を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６４】
「単離」抗体は、その自然環境の要素から同定および分離および/または回収された抗体である。その自然環境の汚染要素は、抗体の診断または治療用途に干渉し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を含めることができる。好ましい実施形態では、抗体は(1)ローリー法により測定される抗体、またはスピニングカップ型シークエネーター使用による末端または内部アミノ酸配列の重量の95%より多く、あるいは(2)クーマシーブルー、または好ましくは銀染色を使用して還元または非還元状態下においてSDS-PAGEによって均質状態まで精製する。単離抗体は組換え細胞内のin situの抗体を含む、何故なら抗体の自然環境の少なくとも1つの要素が存在しないからである。しかしながら通常は、少なくとも1つの精製ステップによって単離抗体を調製する。
【００６５】
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原のエフェクター機能を排除または有意に低下させることができる抗体分子である。したがって「中和」IL-13抗体は、IL-13受容体によるIL-13シグナル活性などの、エフェクター機能を排除または有意に低下させることができる。一実施形態では、中和抗体は1〜10、10〜20、20〜30、30〜50、50〜70、70〜80、80〜90、90〜95、95〜99、99〜100%エフェクター機能を低下させる。
【００６６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ADCC」は、IgFc受容体(FcR)を発現する非特異的な細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、後に標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ADCCを媒介する主要細胞、NK細胞はFcγRIIIのみを発現し、一方単核細胞はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcRの発現は、Ravetch and Kinet、Annu.Rev.Immunol.9: 457〜492 (1991)の464ページの表3に要約されている。当該の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または米国特許第5,821,337号に記載されたアッセイなどのin vitroでのADCCアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞がある。代替的あるいは追加的に、当該の分子のADCC活性をin vivoで、例えばClynes et al.PNAS (USA) 95: 652〜656 (1988)に開示された動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。
【００６７】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が抗体間の配列と広く異なり、その特定抗原のそれぞれ個々の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら可変性は、抗体の可変ドメインに均一に分布しているわけではない。それはIgの軽鎖と重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3つのセグメントまたは超可変領域に集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分は骨格(FR)と呼ばれる。元の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にβシート立体配座をとり、ループ結合を形成し、幾つかの場合はβシート構造の一部分を形成する3つのCDRによって結びついた4つのFR領域を含む。各鎖中のCDRはFR領域の非常に近くに他の鎖由来のCDRと一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する(Kabat et al.(1991)を参照のこと)。定常ドメインは抗体と抗原の結合と直接関係ないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの、さまざまなエフェクター機能を示す。
【００６８】
酵素パパインによる抗体の消化は、抗原結合活性は有していないが結晶化能力を有する「Fab」断片および「Fc」断片としても知られる2つの同一の抗原結合断片をもたらす。酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の2つのアームが連結状態であり2つの抗原結合部位を含むF(ab')2断片をもたらす。F(ab')2断片は抗原を架橋状態にする能力を有する。
【００６９】
「Fv」は本明細書で使用するとき、抗原認識部位と抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指す。
【００７０】
「Fab」は本明細書で使用するとき、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含む抗体の断片を指す。
【００７１】
「Fv」は、完全な抗原認識部位と抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖Fv種では、この領域は強く非共有結合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv種では、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖と重鎖が二本鎖Fv種中のそれと類似した「二量体」構造で結合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合し得る。それぞれの可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのは、この立体配座内である。集合的に、6個のCDRは抗原結合特異性を抗体に与える。しかしながら、1つの可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、結合部位全体より低い親和性ではあるが、抗原を認識し抗原と結合する能力を有する。
【００７２】
用語「超可変領域」は本明細書で使用するとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」すなわち「CDR」由来のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(L1)、50〜62(L2)、および89〜97(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の31〜55(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3);Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD.(1991))、および/または「超可変ループ」由来の残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜32((H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3);Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196: 901〜917 (1987))を含む。「骨格領域」または「FR」残基は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン中の残基である。
【００７３】
用語「相補性決定領域」すなわち「CDR」は本明細書で使用するとき、特異的リガンドと接触しその特異性を決定する免疫受容体の一部分を指す。免疫受容体のCDRは受容体タンパク質の最も変化しやすい部分であり、受容体にその多様性を与え、受容体の可変ドメインの末端において6個のループ上に保持されており、3個のループは受容体の2個の可変ドメインのそれぞれに由来する。
【００７４】
用語「エピトープ」を使用して、タンパク質抗原上の抗体の結合部位を指す。エピトープ抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的活性がある表面の分子群からなり、特異的三次元構造特性、および特異的電荷特性を通常有する。解離定数が≦1μM、好ましくは≦100nMおよび最も好ましくは≦10nMであるとき、抗体は抗原と結合すると言われている。増大したまたは高い平衡定数(「KD」)は、エピトープと抗体の間に低い親和性が存在することを意味する。言い換えると、抗体とエピトープは結合する、すなわち1つに結合した状態になるのはあまり好ましくない。低下したまたは低い平衡定数は、エピトープと抗体の間に高い親和性が存在することを意味する。言い換えると、抗体とエピトープが結合する、すなわち1つに結合した状態になる可能性がより高い。ある量「超えない」KDを有する抗体は、抗体が所与のKDで、あるいはより強く(または固く)エピトープと結合することを意味する。幾つかの実施形態では、抗体は200pm以下のKD、例えば200〜180、180〜170、170〜60、160〜150、150〜140、140〜130、130〜120、12〜100、100〜80、80〜60、60〜50、50〜40、40〜30、30〜20、20〜10、10〜1、1〜0.1pM以下で結合する。
【００７５】
KDはエピトープおよび抗体の結合特性を記載するものであるが、「力価」は抗体の機能に関する抗体自体の有効性を記載するものである。比較的低いKDが高い力価を自動的に意味するわけではない。したがって抗体は、比較的低いKDと高い力価(例えば、抗体は充分に結合し機能を強く変える)、比較的高いKDと高い力価(例えば、抗体は充分に結合せず機能に対して強い影響を有する)、比較的低いKDと低い力価(例えば、特定の機能を変えるのに有効な方法ではなく、抗体は充分に結合する)、または比較的高いKDと低い力価(例えば、単に抗体は標的と充分に結合しない)を有する可能性がある。一実施形態では、高い力価は高レベルの阻害および低濃度の抗体が存在することを意味する。一実施形態では、そのIC50が小さな値、例えば130〜110、110〜90、90〜60、60〜30、30〜25、25〜20、20〜15pM以下であるとき、抗体は力価がある、すなわち高い力価を有する。
【００７６】
「実質的」は、他の用語に関して他に指定しない限り、実施形態の作製または実施に生じる可能性がある測定誤差の一因となる任意の量の範囲内で、値が変化する可能性があることを意味する。「有意」は、それが特許請求する本発明をその目的とする用途に機能させるのに充分である限り、値が変化する可能性があることを意味する。
【００７７】
抗体に関する用語「選択的に結合する」は、抗体が1つの物質のみと結合することを意味するわけではない。そうではなくて、「選択的に結合する」は、第1の物質に対する抗体のKDが、第2の物質に対する抗体のKDより低いことを示す。1つのエピトープと独占的に結合する抗体は、その1つのエピトープとのみ結合する。
【００７８】
本明細書で使用する用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、変異体に関して以下でさらに記載するように天然に存在するLアミノ酸またはDアミノ酸を指す。一般的に使用されているアミノ酸に関する1および3文字の略語を、本明細書では使用する(Bruce Alberts et al.、Molecular Biology of the Cell、Garland Publishing、Inc.、ニューヨーク(3d ed.1994))。
【００７９】
用語「および/または」は、1)関連選択肢の全てを含むこと、2)幾つかの代替選択肢のただ1つ(またはサブセット)のみを含むこと、3)前の記載事項(1)または2))の両方を含むこと、および4)前の記載事項(1)または2))の一方のみを含むことを示す。
【００８０】
用語「mAb」はモノクローナル抗体を指す。
【００８１】
用語「XENOMOUSE(登録商標)」は、Green et al.Nature Genetics 7: 13〜21 (1994)に記載されたような、ヒト重鎖遺伝子座およびkappa軽鎖遺伝子座の245kbおよび190kbの大きさの生殖細胞系形状断片を含むように遺伝子工学処理されたマウス系統を指す。XENOMOUSE(登録商標)系統は、Abgenix、Inc.(Fremont、CA)から入手可能である。
【００８２】
用語「XENOMAX(登録商標)」は、XENOMOUSE(登録商標)動物と共に使用するとき、「Selected Lymphocyte Antibody Method」(Babcook et al.、Prot.Natl.Acad.Sci.USA、93: 7843〜7848(1996))の使用を指す。
【００８３】
用語「SLAM(登録商標)」は、「Selected Lymphocyte Antibody Method」(Babcook et al.、Prot.Natl.Acad.Sci.USA、93: 7843〜7848(1996)、およびSchrader、米国特許第5,627,052号)を指す。
【００８４】
用語「疾患」、「疾患状態」および「障害」は、細胞または身体機能、系、または器官の妨害、中断、または障害が生じている、細胞または哺乳動物全体の生理状態を指す。
【００８５】
用語「症状」は、それがその障害に一般に特有であろうとなかろうと、障害の任意の物理的または観察可能な徴候を意味する。用語「症状」は、全てのこのような徴候または任意のこれらの部分集合を意味することができる。
【００８６】
用語「治療する」または「治療」は治癒的治療および予防または防止策を指し、その目的は癌または喘息の進行または蔓延などの、望ましくない生理的変化または障害を防止または遅延(軽減)させることである。「予防的治療」は、治療によって対象が病気になる確率が低下する、あるいは病気になるか障害と関係がある症状または状態を示すのに対象が必要とする時間の量が増大するときの事象を含む。本発明の目的のための、有益または望ましい臨床結果には、症状の緩和、疾患の程度の低下、安定した(すなわち悪化していない)疾患状態、疾患進行の遅延または遅れ、疾患状態の回復または一時的緩和、および(部分的または全体的であれ)、検出可能または検出不能であれ寛解があるが、これらだけには限られない。「治療」は治療を施さない場合の予想生存期間と比較して、長い生存期間も意味することができる。治療を必要とする人には、その状態または障害を既に有する人、およびその状態または障害を有する傾向がある人、またはその状態または障害を予防すべき人がある。疾患または症状に関して使用するとき用語「抑制する」は、抗体がその疾患または症状を低下させるか排除することができることを意味し得る。予防的治療が、疾患または症状を完全に予防する必要はない。幾つかの実施形態では、予防的治療は疾患の発症を遅らせる。他の実施形態では、予防的治療は疾患または症状の強度を低下させる。幾つかの実施形態では、低下は任意の量、例えば1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜95、95〜99、99〜100%の低下であってよい。用語「治療」は、類似の改善量または回復量も含むことができる。
【００８７】
用語「患者」はヒトおよび獣動物の対象を含む。
【００８８】
治療目的での「投与」は、患者に送達することを意味する。例えば非制限的に、このような送達は静脈内、腹腔内、吸入、筋肉内、皮下、経口、局所、経皮、または外科的であってよい。
【００８９】
治療目的での「治療有効量」は、患者の状態および/または症状の観察可能な変化が、単独あるいは他の治療と組み合わせて、その投与から生じ得るような量を意味する。本明細書で論じ、当業者により理解されるように、有効量を測定することができるさまざまな方法が存在する。例えば、有効量はバイオマーカーの量を、例えば0〜1、1〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、505〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜95、95〜99、99〜100パーセントのバイオマーカーの減少を含めた任意の相当量、減少させるのに必要とされる量であってよい。あるいはこの量は、対象に存在する類似の割合の量のIL-13を減少させるのに必要とされる量であってよい。
【００９０】
「IL-13関連障害」は、IL-13が場合によっては疾患の症状を含めた疾患を制御するか、あるいはそれらに影響を与える、任意の疾患、障害、または類似のこのような用語である。例には炎症性疾患、癌、非悪性細胞増殖によって特徴付けられる線維症疾患、アレルギー性(アトピー性)および非アレルギー性(非アトピー性)のいずれもの、気管支喘息を含めた喘息、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、枯草熱、鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、接触性皮膚炎を含めたアレルギー性皮膚炎、スティーベンス-ジョンソン症候群、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、角膜炎、結膜炎、ステロイド耐性腎炎症候群、肥満細胞症、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、ベロマイシン誘導型線維症、肝臓線維症および全身性硬化症を含めた肺線維症などの線維症疾患、ホジキン病などの癌、B細胞リンパ腫、特に縦隔の大きなB細胞リンパ腫などのB細胞増殖障害、B細胞白血病、卵巣癌、全身性エリテマトーデスなどの非悪性B細胞増殖によって特徴付けられる疾患、慢性関節リウマチ、慢性活性型肝炎およびクリオグロブリン血症、高レベルの自己抗体によって特徴付けられる疾患、溶血性貧血、血小板減少症、リン脂質症および天ぽうそう、炎症性腸疾患および移植片対宿主病がある。幾つかの実施形態では、「IL-13リガンド依存性障害」は、抗体とIL-13の結合によって直接影響を受ける可能性がある前述のいずれかである。言い換えると、障害は過剰量のIL-13の直接の結果である。幾つかの実施形態では、IL-13抗体により治療可能な障害は、本明細書で開示する抗体の1つを加えるによって効果的に治療することができる前述のいずれかである。「IL-13関連活性」を変えることは、抗体を用いた前述の障害のいずれかの治療を含むことができ、それはIL-13の活性を変えることができる抗体の他の非治療的または予防用途も含むことができる。幾つかの実施形態では、「IL-13関連障害」は、高レベルのIL-13が患者に存在する任意の障害を含むことができる。幾つかの実施形態では、「IL-13関連障害」は、IL-13に特徴的である表現型を有する任意の障害を含むことができる。IL-13関連障害を有する患者に特徴的である表現型は、一定量のIL-13を患者に投与してさまざまな表現型を誘導することによって決定および観察することができる。投与するIL-13の量は変わる可能性があり、当業者により通常決定することができる。幾つかの実施形態では、IL-13関連障害は、TH2サイトカイン媒介性または関連障害である障害である。
【００９１】
本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、サンプル中のIL-13関連活性または濃度のレベルを追うすなわち追跡することができる、任意の分子を含むことができる。IL-13バイオマーカーの例にはC10、TARC、およびエオタキシンがある。「バイオマーカー検出剤」は、サンプル中のバイオマーカーの量、および幾つかの実施形態ではその量の変化の測定を可能にする任意の分子または技法である。例えば、バイオマーカーに対する抗体、バイオマーカーに対するリガンドまたは受容体、受容体と結合するさまざまな小ペプチドはいずれも、幾つかのタイプのバイオマーカー検出剤として含まれるはずである。
【００９２】
治療目的での「薬剤として許容される媒体」は、患者に投与することができる物理的実施形態である。薬剤として許容される媒体は、ピル、カプセル、カプレット、錠剤、経口投与流体、注射用流体、スプレー、エアロゾル、トローチ剤、機能性食品、クリーム、ローション、オイル、溶液、ペースト、粉末、蒸気、または液体だけには限られないが、これらのものであってよい。薬剤として許容される媒体の一例は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの緩衝等張溶液である。
【００９３】
治療目的での「中和する」は、化学的および/または生物学的活性を部分的または完全に阻害することを意味する。
【００９４】
治療目的での「下方制御する」は、特定の標的組成のレベルを低下させることを意味する。
【００９５】
治療目的での「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農場動物、および動物園、競技、またはペット動物、例えばサル、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた哺乳動物として分類される任意の動物を指す。
【００９６】
本明細書で言及する用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10塩基長のポリマー形のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドまたは修飾形のいずれかの型のヌクレオチドを意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖形のDNAを含む。
【００９７】
本明細書で使用する用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、または合成起源、あるいはこれらの幾つかの組合せのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源によって、「単離ポリヌクレオチド」は、(1)「単離ポリヌクレオチド」が本来見られるポリヌクレオチドの全部または一部分と結合していない、(2)それが本来連結していないポリヌクレオチドと動作可能に連結している、あるいは(3)大きな配列の一部分として本来存在しない。
【００９８】
本明細書で言及する用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する、および非天然オリゴヌクレオチド結合によって1つに連結した天然に存在するヌクレオチド、および修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、200塩基以下の長さ部分を一般に含むポリヌクレオチドの部分集合である。オリゴヌクレオチドは10〜60塩基長であることが好ましく、12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長であることが最も好ましい。オリゴヌクレオチドは、例えばプローブ用に通常一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築において使用するために二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００９９】
本明細書で使用する用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及する用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾または置換糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及する用語「オリゴヌクレオチド結合」は、例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニラダート、ホスホロアミダートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えばLaPlanche et al.Nucl.Acids Res.14: 9081 (1986); Stec et al.J.Am.Chem.Soc.106: 6077 (1984); Stein et al.Nucl.Acids Res.16: 3209 (1988); Zon et al.Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al.Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、pp.87〜108 (F.Eckstein、Ed.、Oxford University Press、Oxford England (1991)); Stec et al.米国特許第5,151,510号; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990)を参照のこと。望むならば、オリゴヌクレオチドは検出用標識を含むことができる。
【０１００】
本明細書で言及する用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的核酸との相当量の検出可能な結合を最少にするハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下において、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を使用して、当技術分野で知られており本明細書で論じる選択的ハイブリダイゼーション条件を得ることができる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と当該の核酸配列の間の核酸配列相同性は少なくとも80%であり、およびより典型的かつ好ましくは少なくとも85%、90%、95%、99%、および100%の高い相同性である。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「制御配列」は、それらが結合するコード配列の発現およびプロセシングを実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、このような制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写停止配列を含み、真核生物では、一般にこのような制御配列はプロモーターおよび転写停止配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必要不可欠である全ての要素を少なくとも含むものとし、その存在が有利である他の要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「動作可能に連結した」は、それらがその目的とする形式で機能することができる関係にあるように記載される要素の位置を指す。例えば、コード配列と「動作可能に連結した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合性がある条件下で実施されるように結合している。
【０１０３】
本明細書で言及する用語「単離タンパク質」は、cDNA、組換えRNA、または合成起源、あるいはこれらの幾つかの組合せのタンパク質を意味し、その起源または誘導源によって、「単離タンパク質」は、(1)本来見られるタンパク質と結合していない、(2)同じ源由来の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まない、(3)異なる種由来の細胞によって発現される、あるいは(4)本来存在しない。
【０１０４】
用語「ポリペプチド」は、ポリペプチド配列の元のタンパク質、断片、または類似体を指す一般用語として本明細書では使用する。したがって、元のタンパク質、断片、および類似体はポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドは、例えば配列番号2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、および81〜88によって表されるヒト重鎖免疫グロブリン分子、および例えば配列番号4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、および89〜94によって表されるヒトkappa軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子とkappa軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子、およびこの逆を含む組合せによって形成される抗体分子、ならびにこれらの断片および類似体を含む。幾つかの実施形態では、抗体は重鎖CDR1、CDR2、CDR3、FRI、FR2、FR3、および/またはFR4由来の配列、あるいは表18に列挙した配列のいずれかを有する。幾つかの実施形態では、抗体は軽鎖CDR1、CDR2、CDR3、FRI、FR2、FR3、および/またはJ由来の配列、あるいは表19および20に列挙した配列のいずれかを有する。
【０１０５】
他に指定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は5'端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を5'方向と呼ぶ。新生RNA転写産物を5'から3'に加える方向を転写方向と呼び、RNAと同じ配列を有しRNA転写産物の5'端に対して5'であるDNA鎖上の配列領域を「上流配列」と呼び、RNAと同じ配列を有しRNA転写産物の3'端に対して3'であるDNA鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。
【０１０６】
本明細書で使用するように、20種類の従来のアミノ酸およびそれらの略称は従来の使用に従う。Immunology--A Synthesis(2nd Edition、E.S.Golub and D.R.Gren、Eds.、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.(1991))を参照のこと。20種類の従来のアミノ酸、α-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸、および他の非従来型アミノ酸の立体異性体(例えばD-アミノ酸)も、本発明のポリペプチドに適した要素である可能性がある。非従来型アミノ酸の例には4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン)がある。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的使用および慣例に従い、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【０１０７】
用語「〜に相当する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部分と相同的である(すなわち同一である、厳密に言わなければ進化上関連がある)、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために本明細書で使用する。
【０１０８】
対照的に用語「〜と相補的である」は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部分と相同的であることを意味するために本明細書で使用する。例示のため、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に相当し、参照配列「GTATA」と相補的である。
【０１０９】
以下の用語は:「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、「実質的同一性」、および「相同性」、2つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列関係を記載するために特に使用する用語である。「参照配列」は、配列比較の基盤として使用すると定義した配列である。参照配列は、例えば配列表に与える完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメントとしての、大きな配列の部分集合であってよく、あるいは完全なcDNAまたは遺伝子配列を含むことができる。一般に、参照配列は少なくとも18ヌクレオチドまたは6アミノ酸長、頻繁には少なくとも24ヌクレオチドまたは8アミノ酸長、およびしばしば少なくとも48ヌクレオチドまたは16アミノ酸長である。2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列はそれぞれ、(1)2分子間で類似している配列(すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部分)を含む可能性があり、かつ(2)2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間で異なる配列をさらに含む可能性があるので、2つ(あるいはそれより多くの)分子間の配列比較は典型的には、2分子の配列を「比較ウインドウ」で比較して配列が類似した局所領域を同定し比較することによって行う。
【０１１０】
本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を少なくとも18の隣接ヌクレオチドまたは約6アミノ酸配列の参照配列と比較し、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分が、2配列の最適アラインメント用の(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して20パーセント以下の付加、欠失、置換など(すなわちギャップ)を含み得る、少なくとも約18の隣接ヌクレオチド位置または約6アミノ酸の概念上のセグメントを指す。比較ウインドウを一直線に並べるための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman Adv.Appl.Math.2: 482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch J.Mol.Biol.48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 85: 2444 (1988)の類似性に関する方法の検索によって、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実施(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、(Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、Wis.)、GENEWORKS(商標)、またはMACVECTOR (登録商標)ソフトウエアパッケージ)によって、あるいは調査によって実施することができ、さまざまな方法によって生じる最適アラインメント(すなわち、比較ウインドウで最高率の相同性をもたらす)を選択する。
【０１１１】
用語「配列同一性」は、比較ウインドウで2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が同一である(すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドあるいは残基と残基の単位で)ことを意味する。用語「配列同一性の割合」は、2つの最適にアラインメントをとる配列を比較ウインドウで比較すること、2つの配列中の同一の核酸塩基(例えばA、T、C、G、U、またはI)またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を得ること、一致する位置の数を比較ウインドウ中の位置の合計数(すなわちウインドウサイズ)で割ること、およびその結果に100を掛けて配列同一性の割合を得ることによって計算する。本明細書で使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特性を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は少なくとも18ヌクレオチド(6アミノ酸)位置の比較ウインドウ、頻繁には少なくとも24〜48ヌクレオチド(8〜16アミノ酸)位置のウインドウで参照配列と比較して少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の割合は比較ウインドウで参照配列の20パーセント以下の欠失または付加を含み得る配列と、参照配列を比較することによって計算する。参照配列は、大きな配列の部分集合であってよい。
【０１１２】
2つのアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、これらの配列間に部分的または完全な同一性が存在するが存在する場合「相同的」である。例えば85%の相同性は、2つの配列に最大の一致性でアラインメントをとらせるとき、85%のアミノ酸が同一であることを意味する。(一致する2つの配列のいずれかにおける)ギャップは最大の一致性において許容される、5以下のギャップ長が好ましく、2以下であることがより好ましい。あるいはかつ好ましくは、2つのタンパク質配列(または少なくとも約30アミノ酸長のそれらに由来するポリペプチド配列)は、この用語を本明細書で使用するように、それらがプログラムALIGNおよび突然変異データマトリクスおよび6以上のギャップペナルティーを使用して(標準偏差単位で)5を超えるアラインメントスコアを有する場合相同的である。Dayhoff、M.O.、in Atlas of Protein Sequence and Structure、pp.103〜110(Volume 5、National Biomedical Research Foundation(1972)) and Supplement 2 to this volume、pp.1〜10を参照のこと。2つの配列またはその一部分は、そのアミノ酸配列がALIGNプログラムを使用して最適にアラインメントをとらせて50%以上同一である場合、相同的であることがより好ましい。
【０１１３】
ポリペプチドに適用したように、用語「実質的同一性」は、2つのペプチド配列は、デフォルトギャップ加重を使用するプログラムGAPまたはBESTFITなどによって最適にアラインメントをとらせると、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基の位置は、保存型アミノ酸置換とは異なることが好ましい。保存型アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存型アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
【０１１４】
本明細書で論じるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は本発明によって含まれると企図されるが、アミノ酸配列の変化は少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、および最も好ましくは99%保持する状態であるとする。特に、保存型アミノ酸置換が企図される。保存型置換は、その側鎖に関連があるアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般に、ファミリー(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸、(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3)無極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および(4)無電荷極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンに分けられる。より好ましいファミリーは以下の通りである。セリンおよびスレオニンは脂肪族-ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。
【０１１５】
例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの単離型置換、あるいはアミノ酸と構造上関連があるアミノ酸の類似の置換は、その置換が骨格部位内のアミノ酸と関係がない場合は特に、生成する分子の結合または性質に対して重大な影響はないと予想することが妥当である。アミノ酸の変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定する。アッセイは本明細書に詳細に記載する。
【０１１６】
抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近に存在する。構造および機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列データと、公開または専有配列データベースを比較することによって同定することができる。コンピュータによる比較法を使用して、知られている構造および/または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質立体配座ドメインを同定することが好ましい。知られている三次元構造にフォールディングされている、タンパク質配列を同定するための方法は知られている。Bowie et al. Science 253: 164 (1991)。前述の例は、本発明に従い構造および機能性ドメインを画定するために使用することができる配列モチーフおよび構造立体配座を、当業者は理解し得ることを実証する。
【０１１７】
好ましいアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解に対する感受性を低下させる、(2)酸化に対する感受性を低下させる、(3)タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変える、(4)結合親和性を変える、および(5)このような類似体の他の物理化学的性質または機能性を与える、あるいは改変する置換である。本来存在するペプチド配列以外の配列のさまざまなムテインを、類似体は含むことができる。例えば、1つまたは多数のアミノ酸置換(好ましくは保存型アミノ酸置換)を、本来存在する配列(好ましくは、分子間接触部分を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分中)に施すことができる。保存型アミノ酸置換は、親配列の構造特性は実質的に変えないはずである(例えば、置換型アミノ酸が親配列に存在するらせん構造を破壊する、あるいは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を害する傾向はないはずである)。当技術分野で認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins、Structures and Molecular Principles(Creighton、Ed.、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク(1984));Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze、eds.、Garland Publishing、ニューヨーク、(1991));およびThornton et at.Nature 354: 105 (1991)に記載されている。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば完全長cDNA配列から誘導された本来存在する配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。典型的には断片は、少なくとも5、6、8または10アミノ酸長、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長である。他の実施形態では、ポリペプチド断片は少なくとも25アミノ酸長、より好ましくは少なくとも50アミノ酸長、およびさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。
【０１１９】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの性質と類似した性質を有する非ペプチド薬剤として、製薬産業において一般的に使用されている。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模倣体」と呼ばれる。Fauchere、J.Adv.Drug Res.15: 29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985);およびEvans et al.J.Med.Chem.30: 1229 (1987)。このような化合物は、コンピュータによる分子モデル化によって開発されることが多い。治療上有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣物を使用して、均等な治療または予防効果を生み出すことができる。一般にペプチド模倣体は、ヒト抗体などの典型ポリペプチド(すなわち、生化学的性質または薬理活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当技術分野でよく知られている方法により--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH=CH--(シスおよびトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、および-CH2SO--からなる群から選択される結合によって場合によっては置換された1つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸と同じ型のDアミノ酸(例えば、Lリシンの代わりにDリシン)の系統的置換を使用して、より安定性のあるペプチドを作製することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一であるコンセンサス配列の変形を含む制約型ペプチドは、当技術分野で知られている方法によって(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61: 387 (1992)、例えばペプチドを環状化する分子間ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることによって作製することができる。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「標識」または「標識した」は、例えば放射標識したアミノ酸の取り込み、または標識アビジン(例えば、光学または比色定量法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン)によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの取り込みを指す。幾つかの状況では、標識またはマーカーは治療用であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識するさまざまな方法は当技術分野で知られており、これらを使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、以下の放射性同位体または放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光標識(例えばFITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素標識(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光物質、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)があるが、これらだけには限られない。幾つかの実施形態では、標識をさまざまな長さのスペーサーアームによって結合させて、考えられる立体障害を減らす。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「薬剤物質または薬剤」は、患者に適切に投与すると望ましい治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker、S.、Ed.、McGraw-Hill、サンフランシスコ(1985))により例示されたように、当技術分野の従来の使用法に従い使用する。
【０１２２】
本明細書で使用する「実質的に純粋」は、対象の種が存在する主な種である(すなわちモルベースで、それが組成物中の任意の他の個々の種より豊富である)ことを意味し、実質的に精製された分画は、対象の種が(モルベースで)存在する全マクロ分子種の少なくとも約50パーセントを構成する組成物であることが好ましい。一般に、実質的に純粋な組成物は、その組成物に存在する全マクロ分子種の約80パーセントより多く、より好ましくは約85%、90%、95%、および99%より多くを含むはずである。最も好ましくは、組成物が1つのマクロ分子種から本質的になる、(従来の検出法によって組成物に汚染種を検出することができない)ほぼ均質な状態に対象の種を精製する。
【０１２３】
抗体構造
基本的な抗体の構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、各対が一本の「軽」鎖(約25kDa)および一本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する、2つの同一のポリペプチド鎖対から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖はkappaおよびlambda軽鎖として分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgA、およびIgEとして抗体のイソ型を定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域が約12以上のアミノ酸の「J」領域によって接合しており、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域をさらに含む(Fundamental Immunology Ch.7(Paul、W.、ed.、2nd ed.Raven Press、N.Y.(1989)を概略的に参照のこと)。各軽鎖/重鎖対の可変領域が、抗体結合部位を形成する。
【０１２４】
したがって、完全抗体は2つの結合部位を有する。二重機能性または二重特異性抗体以外では、その2つの結合部位は同一である。
【０１２５】
鎖はいずれも、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって接合した、比較的保存された骨格領域(FR)の同じ一般構造を示す。各対の2本の鎖由来のCDRは骨格領域と一直線に並んでおり、特異的エピトープとの結合を可能にする。N末端からC末端に、軽鎖および重鎖のいずれもドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1987 and 1991))、またはChothia & Lesk J.Mol.Biol.196: 901〜917 (1987); Chothia et al.Nature 342: 878〜883 (1989)の定義に従う。
【０１２６】
二重特異性または二重機能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含めた、さまざまな方法によって生成することができる(例えば、Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79: 315〜321 (1990)、Kostelny et al.J.Immunol.148: 1547〜1553 (1992)を参照のこと)。二重特異性抗体の生成は、従来の抗体の生成と比較して比較的労力を有するプロセスである可能性があり、二重特異性抗体に関する一般的に低い収率および純度をもたらす。二重特異性抗体は、1つの結合部位を有する断片(例えばFab、Fab'、およびFv)の形では存在しない。
【０１２７】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラット可変および/または定常領域を有する抗体に関する幾つかの問題を回避する。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は抗体の迅速なクリアランスをもたらす可能性があり、あるいは患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらす可能性がある。マウスまたはラット由来の抗体の利用を避けるために、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するようにヒト抗体機能をげっ歯類に導入することによって、完全ヒト抗体を作製することができる。本明細書で特に区別しない限り、「ヒト」と「完全ヒト」抗体は本明細書において交互に使用することができる。一部分のみがヒトである抗体と全体すなわち完全にヒトである抗体を区別するとき、用語「完全ヒト」は有用である可能性がある。
【０１２８】
完全ヒト抗体を作製するための1つの方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびkappa軽鎖遺伝子座の245kbおよび190kbの大きさの生殖細胞系形状断片を含むように遺伝子工学処理されたXENOMOUSE(登録商標)マウス系統を使用することによる方法である。Green et al. Nature Genetics 7: 13〜21 (1994)を参照のこと。XENOMOUSE(登録商標)系統は、Abgenix、Inc.(Fremont、CA)から入手可能である。
【０１２９】
XENOMOUSE(登録商標)の生成は、1990年1月12日に出願された米国特許出願第07/466,008号、1990年11月8日に出願された米国特許出願第07/610,515号、1992年7月24日に出願された米国特許出願第07/919,297号、1992年7月30日に出願された米国特許出願第07/922,649号、1993年3月15日に出願された米国特許出願第08/031,801号、1993年8月27日に出願された米国特許出願第08/112,848号、1994年4月28日に出願された米国特許出願第08/234,145号、1995年1月20日に出願された米国特許出願第08/376,279号、1995年4月27日に出願された米国特許出願第08/430,938号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,584号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,582号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/463,191号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,837号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,853号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,857号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,859号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,513号、1996年10月2日に出願された米国特許出願第08/724,752号、および1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、ならびに米国特許第6,162,963号、米国特許第6,150,584号、米国特許第6,114,598号、米国特許第6,075,181号、および米国特許第5,939,598号、ならびに日本国特許第3068180B2号、日本国特許第3068506B2号、および日本国特許第3068507B2号中でさらに論じられ示されている。Mendez et al.Nature Genetics 15: 146〜156 (1997)およびGreen and Jakobovits J.Exp.Med.188: 483〜495 (1998)も参照のこと。1996年6月12日に付与公開された欧州特許No.EP0463151B1、1994年2月3日に公開された国際特許出願No.WO94/02602、1996年10月31日に公開された国際特許出願No.WO96/34096、1998年6月11日に公開されたWO98/24893、2000年12月21日に公開されたWO00/76310も参照のこと。
【０１３０】
他の手法では、GenPharm International、Inc.を含めた他者が「小遺伝子座」手法を利用している。小遺伝子座手法では、Ig遺伝子座由来の小片(個々の遺伝子)を封入することによって外因性Ig遺伝子座を模倣する。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、mu定常領域、および第2の定常領域(好ましくはガンマ定常領域)は、動物に挿入するための構築体に形成される。この手法はSurani et alへの米国特許第5,545,807号、ならびにそれぞれLonbergおよびKayへの米国特許第5,545,806号、米国特許第5,625,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、および米国特許第6,255,458号、KrimpenfortおよびBernsへの米国特許第5,591,669号および米国特許第6,023.010号、Berns et alへの米国特許第5,612,205号、米国特許第5,721,367号、および米国特許第5,789,215号、およびChoiおよびDunnへの米国特許第5,643,763号、および1990年8月29日に出願されたGenPharmの国際米国特許出願第07/574,748号、1990年8月31日に出願された国際米国特許出願第07/575,962号、1991年12月17日に出願された国際米国特許出願第07/810,279号、1992年3月18日に出願された国際米国特許出願第07/853,408号、1992年6月23日に出願された国際米国特許出願第07/904,068号、1992年12月16日に出願された国際米国特許出願第07/990,860号、1993年4月26日に出願された国際米国特許出願第08/053,131号、1993年7月22日に出願された国際米国特許出願第08/096,762号、1993年11月18日に出願された国際米国特許出願第08/155,301号、1993年12月3日に出願された国際米国特許出願第08/161,739号、1993年12月10日に出願された国際米国特許出願第08/165,699号、1994年3月9日に出願された国際米国特許出願第08/209,741号に記載されている。欧州特許No.0546073B1、国際特許出願Nos.WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852、およびWO98/24884および米国特許第5,981,175号も参照のこと。Taylor et al、1992、Chen et al、1993、Tuaillon et al、1993、Choi et al、1993、Lonberg et al、(1994)、Taylor et al、(1994)、およびTuaillon et al、(1995)、Fishwild et al、(1996)をさらに参照のこと。
【０１３１】
Kirinも、ミクロ細胞融合によって染色体の大きな断片または染色体全体を導入した、マウス由来のヒト抗体の作製を実証している。欧州特許出願第773288号および欧州特許出願第843961号を参照のこと。
【０１３２】
ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答によっても、産業はキメラまたは他の場合はヒト化抗体を調製している。キメラ抗体はヒト定常領域およびマウス可変領域を有するが、特に抗体の慢性的または多用量の使用において、幾つかのヒト抗キメラ抗体(HACA)応答が観察されると予想される。したがって、多量体酵素に対する完全ヒト抗体を与えてHAMAまたはHACA応答の懸念および/または影響を無くすことが望ましいはずである。
【０１３３】
抗体の調製
本明細書に記載する抗体は、以下に記載したようにXENOMOUSE(登録商標)の技術を使用して調製した。このようなマウスはヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の生成に欠陥がある。同じことを実施するために利用される技術は、本明細書で言及する特許、出願、および参照文献に開示されている。しかしながら特に、そこからのマウスおよび抗体のトランスジェニック生成の好ましい実施形態は、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、および1998年6月11日に公開された国際特許出願WO98/24893、および2000年12月21日に公開されたWO00/76310に開示されている。Mendez et al.Nature Genetics 15: 146〜156 (1997)も参照のこと。
【０１３４】
このような技術を使用することによって、以下に詳細に記載したように、IL-13に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成させた。実際XENOMOUSE(登録商標)マウス系統をヒトIL-I3で免疫処置し、リンパ細胞(B細胞など)を抗体を発現したマウスから回収し、回収した細胞系を骨髄型細胞系と融合させて、不死ハイブリドーマ細胞系を調製した。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし選択して、IL-13に特異的な抗体を生成したハイブリドーマ細胞系を同定した。さらに本明細書で提供するのは、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含めた、このような細胞系によって生成される抗体の特徴付けである。
【０１３５】
あるいは、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製する代わりに、免疫処置したXENOMOUSE(登録商標)マウス系統から単離した回収細胞を、初期抗原、好ましくはヒトIL-13に対する反応性に関してさらにスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングには、所望のIL-13タンパク質を用いるELISA、およびIL-13誘導型エオタキシン-1生成アッセイなどの機能アッセイがある。IL-13と特異的に結合する抗体を分泌する一種のB細胞は、望ましいIL-13特異的溶血プラークアッセイを使用して、したがって単離することができる(Babcook et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、i93: 7843〜7848(1996))。溶解の標的となる細胞は、IL-13でコーティングされたヒツジ赤血球細胞(SRBC)であることが好ましい。当該の免疫グロブリンおよび補体を分泌するB細胞培養物の存在下では、プラークの形成は特異的な標的細胞のIL-13媒介性溶解を示す。
【０１３６】
プラークの中心の一種の抗原特異的プラズマ細胞を単離することができ、その遺伝情報は、その一種のプラズマ細胞から単離した抗体の特異性をコードしている。逆転写酵素PCRを使用して、分泌抗体の可変領域をコードするDNAをクローニングすることができる。このようにクローニングしたDNAは次いで適切な発現ベクター、好ましくはpcDNA(Invitrogen、Carlsbad、CA)などのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むようなpcDNAベクターにさらに挿入することができる。生成したベクターは次いで宿主細胞、好ましくはCHO細胞にトランスフェクトすることができ、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、あるいは望ましい配列をコードする遺伝子を増幅させるのに適したものとして改変した従来の栄養培地で培養することができる。
【０１３７】
本明細書では、IL-13に特異的な抗体を生成する多数の一種のプラズマ細胞の単離を記載する。さらに、IL-13と特異的に結合した抗体をコードしていた遺伝物質を単離し、その物質を適切な発現ベクターに導入し、後に宿主細胞にトランスフェクトした。
【０１３８】
一般に、前述の細胞系によって生成された抗体は、完全ヒトIgG1またはIgG2重鎖およびヒトkappa軽鎖を有していた。固体相および溶液相のいずれかによって測定したとき、抗体は高い親和性を有しており、典型的には約10-9〜約l0-13MのKDを有していた。
【０１３９】
前述のように、抗IL-13抗体はハイブリドーマ細胞系以外の細胞系において発現され得る。個々の抗体をコードする配列を、CHO細胞などの適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、例えばウイルス中(またはウイルスベクター中)へのポリヌクレオチドのパッケージ化、およびウイルス(またはベクター)を用いた宿主細胞の形質導入を含めた、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の知られている方法による形質転換、あるいは米国特許第4,399,216号、米国特許第4,912,040号、米国特許第4,740,461号、および米国特許第4,959,455号によって例示される当技術分野で知られているトランスフェクション手順による形質転換であってよい。使用する形質転換手順は、形質転換させる宿主に依存する。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入するための方法は当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへの被包、および核へのDNAの直接的マイクロインジェクションを含む。
【０１４０】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当技術分野でよく知られており、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、および幾つかの他の細胞系だけには限られないが、これらを含めた、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。どの細胞系が高い発現レベルを有し、IL-13結合性を有する抗体を生成するかを決定することによって、個々の傾向の細胞系を選択する。
【０１４１】
抗体の配列
代表的なヒト抗IL-13抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列表に与え、その内容は以下の表1に要約する。
【０１４２】
【表１】
2008520684.tif 000003
2008520684.tif 000004
【０１４３】
抗体治療
抗IL-13抗体には、IL-13活性と関係がある症状および状態(例えば、IL-13関連障害)を治療するための治療価値がある。IL-13は炎症性疾患、癌、線維症疾患および非悪性細胞増殖によって特徴付けられる疾患を含めた広くさまざまな疾患および障害に関与している。特定の実施形態では、アレルギー性(アトピー性)および非アレルギー性(非アトピー性)のいずれもの、気管支喘息を含めた喘息、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、枯草熱、鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、接触性皮膚炎を含めたアレルギー性皮膚炎、スティーベンス-ジョンソン症候群、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、角膜炎、結膜炎、ステロイド耐性腎炎症候群などの炎症性疾患または障害の治療において、本明細書で開示する抗IL-13抗体を使用する。他の実施形態では、抗IL-13抗体を使用して肥満細胞症を治療する。さらに他の実施形態では、抗IL-13抗体を使用して突発性肺線維症、嚢胞性線維症、ベロマイシン誘導型線維症、肝臓線維症および全身性硬化症を含めた肺線維症などの線維症疾患を治療する。他の実施形態では、抗IL-13抗体を使用してホジキン病などの癌、B細胞リンパ腫、特に縦隔の大きなB細胞リンパ腫などのB細胞増殖障害、B細胞白血病、卵巣癌を治療する。
【０１４４】
さらに他の実施形態では、抗IL-13抗体を使用して全身性エリテマトーデスなどの非悪性B細胞増殖によって特徴付けられる疾患、慢性関節リウマチ、慢性活性型肝炎およびクリオグロブリン血症、高レベルの自己抗体によって特徴付けられる疾患、溶血性貧血、血小板減少症、リン脂質症および天ぽうそうなど、炎症性腸疾患、および移植片対宿主病を治療する。幾つかの実施形態では、ヒト、マウス、または他の動物における喘息を治療または予防するために、これらの抗体を使用する。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、IL-13関連障害(IL-13と関連がある疾患、状態など)を治療するための医薬品における抗体の使用が企図される。医薬品は治療有効量の抗体を含むことができる。幾つかの実施形態では、医薬品中のIL-13の量は少なくとも1つの有益な結果、例えば症状の低下を観察するのに充分である。幾つかの実施形態では、投与する量がIL-13関連障害の症状の全てを取り除く。幾つかの実施形態ではその量は、医薬品を投与した後に対象中のバイオマーカーのレベルを低下させるのに充分である。幾つかの実施形態では、投与する抗体の量は約0.001〜1000、0.1〜100、0.5〜50、1〜10、1、3、または10mgの抗体/対象1kgである。当業者により理解されるように、実際の抗体の量は個々の障害(例えば、急性または慢性である喘息)、投与の方法、投与の頻度、所望の結果、患者の特性、および抗体の特性に依存する可能性がある。投与する実際の量は、本開示を鑑みて通常の実験により、当業者によって決定することができる。幾つかの実施形態では、1回投与量で充分であるはずである。他の実施形態では、他数回または連続投与量が有益である可能性がある。実際の量および投与法は、特に本明細書に記載する他の技法、バイオマーカーおよび実施例を使用することによって決定することができる。例えば、エオタキシン、C10、および/またはTARCレベルを調べて、IL-13関連障害の治療において最適レベルの有効性を与えることができる。当業者によって理解されるように、医薬品の調製または製造における抗体の使用は、対象とする特定の状態を治療するのに充分な任意の量の、開示する抗体のいずれかに関するものであり得る。本明細書に開示する状態のいずれか、または任意のIL-13関連障害が治療される状態であり得る。幾つかの実施形態では、医薬品の調製における抗体の使用はmAb731、643、または623などの特定の抗体の1つ、あるいは表1に列挙した抗体のいずれかを用いるものである。幾つかの実施形態では、使用する抗体は50または10pM未満のKDを有する。幾つかの実施形態では、使用する抗体が少なくとも30%の粘液生成の低下をもたらす。当業者によって理解されるように、本明細書に開示する使用法は、使用するための医薬品を製造するために利用することができる。幾つかの実施形態では、医薬品はバイオマーカーに対する抗体またはバイオマーカー検出剤をさらに含む。他の態様では、IL-13に対する抗体を含まない医薬品の製造においてバイオマーカー検出剤を使用する。医薬品中のバイオマーカー検出剤は、バイオマーカーと特異的に結合する抗体または他のタンパク質であってよい。
【０１４６】
当業者によって理解されるように、障害の性質が投与量、しばしば投与法において役割を果たす可能性がある。例えば、慢性障害では、比較的多量、より強力な抗体、および/またはより頻繁に投与される用量の抗体が必要とされる可能性がある。同様に急性障害では、予防を含めた治療に必要とされる抗体の量は比較的少ない可能性がある。攻撃前に感作が初期に必要とされる対象では、本来アレルギー性である対象に必要とされる量と比較して、少量の抗体が有益である可能性がある。このような慢性系では、多量の抗体、および高頻度の投与が有利である可能性がある。正確な量は、本開示を鑑みて当業者により容易に決定することができる。当業者は他の要因、およびそれに応じた抗体の投与の調節の仕方をさらに理解しているはずである。
【０１４７】
望むならば、抗IL-13抗体のイソ型を変えて、例えば異なるイソ型の生物学的性質を利用することができる。例えば幾つかの状況では、IL-13に対する治療用抗体は補体を固定し補体依存性細胞毒性(CDC)に関与することができることが望ましい可能性がある。以下のマウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、およびヒトIgG3を非制限的に含めた、同じことができる幾つかのイソ型の抗体が存在する。作製される抗体はこのようなイソ型を最初に有している必要はなく、作製される抗体は任意のイソ型を有することができ、当技術分野でよく知られている従来の技法を使用して、抗体のイソ型を後に変えることができることは理解されるはずである。このような技法には特に、直接的組換え技法(例えば米国特許第4,816,397号を参照)、細胞-細胞融合技法(例えば米国特許第5,916,771号および米国特許第6,207,418号を参照)の使用がある。
【０１４８】
例えば、本明細書で論じる抗IL-13抗体はヒト抗体である。抗体がIL-13との望ましい結合を有する場合、容易にイソ型を変えて、(抗体の特異性およびある程度のその親和性を定義する)同じ可変領域を依然として有する、ヒトIgM、ヒトIgG1、またはヒトIgG3イソ型を作製することができるはずである。したがってこのような分子は、補体を固定しCDCに関与することができるはずである。
【０１４９】
細胞-細胞融合技法では、重鎖および任意の所望のイソ型を有するミエローマまたは他の細胞系を調製し、軽鎖を有する他のミエローマまたは他の細胞系を調製する。このような細胞は後に融合させることができ、完全抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【０１５０】
したがって、前に論じた望ましい「構造」特性に見合う抗体候補を作製すると、それらは一般にイソ型変更によって少なくとも幾つかの望ましい「機能」特性を備え得る。
【０１５１】
IL-13と結合する生物学的活性がある抗体を滅菌済み薬剤調製物または配合物に使用して、IL-13の活性を低下させることが好ましい。抗IL-13抗体は、標的治療範囲内でIL-13活性を強く阻害するのに適した親和性を有することが好ましい。阻害は、IL-13Ra1(IL-13Rα1、Rα1、IL-13Rアルファ1、IL-13受容体アルファ1、または他の類似の用語としても知られる)などのシグナル受容体とIL-13の結合に干渉する抗体の能力から生じることが好ましい。他の実施形態では、それが結合することができる場合でも、受容体を介してシグナルを送るIL-13の能力に干渉することによって、抗体はIL-13活性を阻害することができる。例えば抗体は、IL-4受容体α鎖などのシグナルを送るのに必要である共通受容体と、IL-13Ra1の相互作用を妨げる可能性がある。幾つかの実施形態では抗体は、IL-13Rα2などのデコイ受容体とのIL-13の結合を可能にしながら、シグナル受容体を介してIL-13活性を妨げることができる。この場合、デコイ受容体との結合によって結合IL-13を除去することができ、IL-13活性を阻害する抗体の能力を増大させることができる。
【０１５２】
in vivo投与に使用するとき、抗体配合物は滅菌済みであることが好ましい。当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば滅菌済み濾過膜を介した濾過によって、これは容易に実施される。抗体は通常、凍結乾燥形または溶液で保存されるはずである。凍結乾燥および還元の前後に滅菌濾過を実施することができる。
【０１５３】
治療用抗体組成物は一般に、滅菌済みアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーなどの、配合物を回収することができるアダプターを有する静脈内注射溶液用バッグまたはバイアルに入れる。
【０１５４】
抗体投与の形式は知られている方法、例えば皮下、静脈内、腹腔内、脳内、皮内、筋肉内、眼内、動脈内、クモ膜下、または病巣内経路による、あるいは以下に示す吸入または徐放性システムによる注射または注入に従う。幾つかの状況では、抗体は注入または大量注射によって投与することが好ましい。他の状況では、抗体を含む治療用組成物は鼻または肺を介して、好ましくは液体または粉末エアロゾル(凍結乾燥済み)として投与することができる。組成物は望むならば静脈内、非経口的あるいは皮下に投与することもできる。全身に投与するとき、治療用組成物は滅菌済みであり、発熱物質を含まず、pH、等張性、および安定性に関する妥当な考慮事項を有する非経口的に許容される溶液に存在するはずである。これらの条件は当業者によく知られている。
【０１５５】
本明細書に記載する治療用途の抗体は、改善された移動性、送達性、耐性などを与えるために配合物に取り込ませる適切な担体、賦形剤、および他の物質を用いて典型的には調製する。簡単に言うと、本明細書に記載する抗体の投与配合物は、所望の純度を有する抗体と1つまたは複数の生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を混合させることによって保存または投与用に調製する。これらの配合物は、例えば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有小胞体(Lipofectin(商標)など)、DNA結合体、無水吸収性ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、カーボワックス(さまざまな分子量のポリエチレングリコール)、半固体状ゲル、およびカーボワックスを含む半固体状混合物を含むことができる。配合物は、TRIS HCl、リン酸、クエン酸、酢酸および他の有機酸塩などのバッファー、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリアルギニンなどの低分子量(約10個未満の残基)ペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの対イオンおよび/またはTWEEN、PLURONICSまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【０１５６】
他の許容される担体、賦形剤、または安定剤が当業者によく知られている。前述の混合物はいずれも、本発明の従う治療および療法に適している可能性がある、ただし配合物中の活性成分が配合物によって不活性化することはなく、配合物は投与経路に生理的適合性および耐性があるものとする。Baldrick P.「Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.」Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2): 210〜8 (2000)、Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」Int.J.Pharm.203(1〜2): 1〜60 (2000)、Charman WN「Lipids、lipophilic drugs、and oral drug delivery-some emerging concepts.」J.Pharm.Sci.89 (8): 967〜78 (2000)、Powell et al.「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA J.Pharm.Sci.Technol.52: 238〜311 (1998)および他の情報に関するその中の引用も参照のこと。
【０１５７】
注射用の滅菌済み組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy(20th ed、Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))に記載されたのと同様の従来の製薬実践に従い配合することができる。例えば、水またはゴマ、ピーナッツ、または綿実油のような天然に存在する植物油、あるいはオレイン酸エチルなどの合成脂質媒体などの媒体中での活性化合物の溶解または懸濁が望ましい可能性がある。バッファー、防腐剤、抗酸化剤などを承認されている製薬実践に従い取り込ませることができる。
【０１５８】
抗体は徐放性調製物の形で投与することもでき、徐放性調製物から経時的に放出させることもできる。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスがある。マトリクスは成形品、フィルムまたはマイクロカプセルの形であってよい。徐放性マトリクスの例には、Langer et al.、J.Biomed Mater.Res.、(1981) 15: 167〜277およびLanger、Chem.Tech.、(1982) 12: 98〜105によって記載されたポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー(Sidman et al.、Biopolymers、(1983) 22: 547〜556)、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer at al.、上記)、LUPRON Depot(商標)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロレリンから構成される注射用ミクロスフェア)、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133,988)がある。
【０１５９】
エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは100日間分子を放出することができるが、幾つかのヒドロゲルはさらに短い時間の間タンパク質を放出する。被包タンパク質が身体に長時間留まるとき、それらは37℃における湿気への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の消失および考えられる免疫原性の変化をもたらす可能性がある。関連する機構に応じてタンパク質を安定化させるための、合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、含水量を調節すること、適切な添加剤を使用すること、および特異的ポリマーマトリクス組成物を開発することによって安定化を実施することができる。
【０１６０】
徐放性組成物は、懸濁液に結晶を保つことができる適切な配合物に懸濁させた、抗体の結晶の調製物も含む。皮下または腹腔内注射すると、これらの調製物は徐放効果をもたらし得る。他の組成物は、リポソーム被包抗体も含む。このような抗体を含むリポソームは、それ自体が知られている方法:米国特許No.DE3,218,121; Epstein et al.、Proc.Natl.Acad.Set.USA、(1985) 82: 3688〜3692; Hwang et al.、Proe.Natl.Acad.Sci.USA、(1980) 77: 4030〜4034; EP52,322; EP36,676; EP88,046; EP143,949; EP142,641; 日本国特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045号、および米国特許第4,544,545号;およびEP102,324によって調製される。
【０１６１】
所与の患者に関する抗体配合物の用量は、主治医によって決定することができる。適切な用量を決定する際に医師は、例えば疾患の重度および型、体重、性別、食生活、投与の時間および経路、他の薬物療法、および他の関連する臨床要因を含めた、療法の作用を変えることが知られているさまざまな要因を考慮に入れることができる。治療有効用量はin vitroまたはin vivo法のいずれかによって決定することができる。
【０１６２】
治療上使用する本明細書に記載する抗体の有効量は、例えば治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存するはずである。したがって、治療者が必要に応じて用量を測定し、投与の経路を変えて、最適な治療効果を得ることが好ましい。前述の要因に応じて、典型的な1日の用量は約0.001mg/kg〜100mg/kg以上までの範囲である可能性がある。典型的には、所望の効果を得る用量に達するまで、臨床医は治療用抗体を投与する。この療法の進行は、従来のアッセイによって容易に調べられる。
【０１６３】
本明細書に記載する抗体は、IL-13の活性から生じるかあるいはそれと関係がある症状および状態の治療において、治療効果を有することは予想される。
【０１６４】
投与する(あるいはキットに使用する)実際の用量を決定または確認することができる1つの方法は、IL-13依存性バイオマーカーの同定および使用によるものである。バイオマーカーの同定法およびその使用と同様に、このようなバイオマーカーを以下の実施例および図23〜28に略述する。関連バイオマーカーの例にはC10、エオタキシン、およびTARCがある。一般にはバイオマーカーを同定するために、健康および/またはIL-13障害状態(例えばOVA誘導型喘息)を有する対象中の候補バイオマーカーの量を測定することができ、対象中のバイオマーカーのレベルを、有効な抗体の1つ(例えばmAb623、731など)を対象に投与するときのバイオマーカーのレベルと比較することができる。抗体の投与はIL-13の活性を阻害する可能性があるので、候補バイオマーカーのレベルも、対象への抗体の投与によって低下するはずである(ただし、それが実際のバイオマーカーであるとする)。
【０１６５】
バイオマーカー、および/またはそれを試験する方法は、さまざまな方法において使用することができる。例えば、対象中のバイオマーカーのレベルを、抗体、あるいは類似の効果を有する他の治療法または組成物を用いて対象の治療に追跡して、治療の有効性を調べることができる。対象に最初に存在したバイオマーカーの量を測定することができ、抗体を加えることによる任意の変化を測定することができる。バイオマーカーのレベルが抗体の初回投与時に変化しない場合、他の抗体を対象に施すことができ、より頻繁に施すことができ、あるいは他の経路によって施すことができる。バイオマーカーのレベルはさまざまな方法で測定することができ、技法を過度に制限するはずがないことを、当業者は理解しているはずである。タンパク質(またはmRNAなど)の量を測定することができる任意の技法、例えばELISA、またはBiacore(商標)技法を使用することができる。さらに、幾つかの実施形態では、多数のバイオマーカーを同時に追跡することができる。これによって、IL-13関連態様を調べることに関して、さらなる確信を与えることができる。
【０１６６】
当然ながら、幾つかの実施形態では、治療モニタリングの他の変数を用いることなく、障害の進行を簡単に追跡するために、バイオマーカーを使用する。
【０１６７】
さらに、対象のバイオマーカーのレベルを使用して、対象がIL-13関連障害を有するかどうか決定することができる。健康な個体の標準レベルまたは範囲より著しく高いまたは低いバイオマーカーレベルを有する対象は、IL-13関連障害に罹患していると考えることができる。
【０１６８】
バイオマーカー、またはそれを試験する方法を、IL-13関連障害を治療するためのキットに含めることができる。
【０１６９】
当業者によって理解されるように、本開示は過剰量のIL-13と関係がある状態または障害を広く論じるが、これらの組成物および方法は、有効レベルのIL-13が低すぎる状況に適用することもできるはずである。例えば、抗体はIL-13とその正常な受容体の結合を妨げる必要はないが、その代りにそのデコイ受容体とのIL-13の結合を妨げ、それによって系において利用可能なIL-13の量を効率良く増大させることができる。しかしながら、多くの実施形態では、抗体はIL-13がそのシグナル受容体と結合するのを少なくとも妨げる。
【０１７０】
他の療法物質の設計および作製
本発明に従い、IL-13に関して本明細書において生成し特徴付けする抗体の活性に基づいて、最先端の抗体療法物質を使用して、特定の疾患を治療することができる。これらの最先端の療法物質は、二重特異性抗体、免疫毒素、放射標識療法物質、ペプチド療法物質、遺伝子療法物質、特にイントラボディ、アンチセンス療法物質および小分子を含むことができる。
【０１７１】
最先端の抗体療法物質の作製に関して、補体結合が望ましい特性である場合、例えば二重特異性抗体、免疫毒素、または放射標識の使用による細胞殺傷に関して補体への依存を回避することが可能である。
【０１７２】
例えば、(i)1つがIL-13に対する特異性を有し他方が第2の分子に対する特異性を有する、1つに結合した2つの抗体、(ii)IL-13に特異的な一本の鎖および第2の分子に特異的な第2の鎖を有する1つの抗体、または(iii)IL-13と他の分子の両方に対する特異性を有する単鎖抗体を含む、二重特異性抗体を作製することができる。このような二重特異性抗体は、よく知られている技法を使用して作製することができる。例えば、(i)および(ii)に関しては例えばFanger et al.Iimmnunol Methods4: 72〜81 (1994)およびWright and Harris、上記を参照のこと、ならびに(iii)に関しては例えばTraunecker et al.Int.J.Cancer(Suppl)7: 51〜52 (1992)を参照のこと。それぞれの場合、第2の特異性を望むように施すことができる。例えば第2の特異性を、CD16またはCD64(例えばDeo et al.18: 127 (1997)を参照のこと)またはCD89(例えばValerius et al.Blood 90: 4485〜4492 (1997)を参照のこと)を非制限的に含めた重鎖活性化受容体に施すことができる。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、抗IL-13抗体を含む組成物を含む容器、IL-13によって媒介される疾患を治療するために組成物を使用することができることを示すパッケージ挿入物またはラベルを含む製造品を提供する。好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトに抗IL-13抗体を与える。好ましい実施形態では、治療する疾患はアレルギー性(アトピー性)および非アレルギー性(非アトピー性)のいずれもの気管支喘息を含めた喘息、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、枯草熱、鼻炎、蕁麻疹、血管浮腫、接触性皮膚炎を含めたアレルギー性皮膚炎、スティーベンス-ジョンソン症候群、アナフィラキシーショック、食物アレルギー、角膜炎、結膜炎、ステロイド耐性腎炎症候群、肥満細胞症、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、ベロマイシン誘導型線維症、肝臓線維症および全身性硬化症を含めた肺線維症などの線維症疾患、ホジキン病などの癌、B細胞リンパ腫、特に縦隔の大きなB細胞リンパ腫などのB細胞増殖障害、B細胞白血病、卵巣癌、全身性エリテマトーデスなどの非悪性B細胞増殖によって特徴付けられる疾患、慢性関節リウマチ、慢性活性型肝炎およびクリオグロブリン血症、高レベルの自己抗体によって特徴付けられる疾患、溶血性貧血、血小板減少症、リン脂質症および天ぽうそうなど、炎症性腸疾患、および移植片対宿主病からなる群から選択される。
【０１７４】
幾つかの実施形態では、抗IL-13抗体を使用して喘息を治療する。特定の実施形態では、抗体は本明細書に記載する623抗体またはその変異体である。他の特定の実施形態では、抗体は本明細書に記載する731抗体またはその変異体である。どのようにこれらの抗体を使用して、喘息および他の障害を治療することができるかの具体例は、以下の実施例に記載する。
【０１７５】
(実施例)
実施した実験および得られた結果を含めた以下の実施例は単なる例示目的で与え、本明細書の教示を制限するものとして解釈すべきではない。
【０１７６】
(実施例1:抗体の作製)
IL-13およびIL-13抗原の調製
以下のIL-13ペプチドを以下に記載した実験中で使用した。
組換えヒトIL-13(R&D213-IL-005;配列番号:61):
【０１７７】
【化１】
2008520684.tif 000005
【０１７８】
組換えヒトIL-13(Peprotech200-13;配列番号62):
【０１７９】
【化２】
2008520684.tif 000006
【０１８０】
組換えヒトIL-13(Peprotech200-13A;配列番号63):
【０１８１】
【化３】
2008520684.tif 000007
【０１８２】
ヒトIL-13-ヒトFc融合タンパク質(およびリーダー配列;配列番号64):
【０１８３】
【化４】
2008520684.tif 000008
【０１８４】
ヒトIL-13-ウサギFc融合タンパク質(およびリーダー配列;配列番号65):
【０１８５】
【化５】
2008520684.tif 000009
【０１８６】
ヒトIL-13-マウスIL-13らせん構造A(下線部分;配列番号66):
【０１８７】
【化６】
2008520684.tif 000010
【０１８８】
ヒトIL-13-マウスIL-13らせん構造B(下線部分;配列番号67):
【０１８９】
【化７】
2008520684.tif 000011
【０１９０】
ヒトIL-13-マウスIL-13らせん構造C(下線部分;配列番号68):
【０１９１】
【化８】
2008520684.tif 000012
【０１９２】
ヒトIL-13-マウスIL-13らせん構造D(下線部分;配列番号69):
【０１９３】
【化９】
2008520684.tif 000013
【０１９４】
当業者によって理解されるように、前述の残基の部分集合のみがエピトープの形成と実際に関係し得る。例えば、前述の配列番号66〜69では、実際エピトープは各ペプチドのらせん構造部分(下線部分)であり得る。一実施形態では、本明細書に記載する抗体は、各ペプチドのらせん構造部分を含めた、IL-13エピトープまたはその断片のいずれかを対象とする。
【０１９５】
動物の免疫処置
IL-13に対するモノクローナル抗体を、XenoMouse(登録商標)マウス(XenoMouse(登録商標)XMG2L3およびXenoMouse(登録商標)XMG2、Abgenix、Inc.Fremont、CA)を免疫処置することによって開発した。ヒトIL-13-ヒトFc融合タンパク質(配列番号64)またはヒトIL-13-ウサギFc融合タンパク質(配列番号65)を、抗体作製用の免疫原として使用した。それぞれのマウスはフットパッド投与経路によって免疫処置した。動物は第0、4、7、11、14、18、21および25日に免疫処置した。初回免疫処置は、マウス１匹当たりCpG/Alumに10ugの抗原を用いて行った。後の追加抗原刺激はマウス当たりCpG/Alumに5ugの抗原を用いて行った。第25日の最後の追加抗原刺激は、マウス当たりアジュバントを含まないPBSに5ugの抗原を用いて行った。動物は第20日に出血させて、以下に記載した力価の測定用の血清を得た。
【０１９６】
力価分析
標準的なプロトコルを使用して力価を測定した。簡単に言うと、Costar3368プレートを、4℃において一晩、IL-13ウサギFc融合タンパク質(配列番号65)または完全長ウサギ抗体のいずれかでコーティングした。プレートはTitertekプログラムADG9を使用して洗浄し、乾燥させ、250μlの1%無脂肪スキムミルク/1×PBSでブロッキングした。ブロッキング後、TitertekプログラムADGPを使用してプレートを再度洗浄し、乾燥させた。試験した血清は、1:100の最初の希釈から二連で階層的に1:2で滴定した。サンプルは1%無脂肪スキムミルク/1×PBSに50μl/ウエルで施し、室温で1時間インキュベートした。
【０１９７】
TitertekプログラムADG9を使用した洗浄および乾燥の後、1%無脂肪スキムミルク/1×PBS中のウサギFcと最少の交差反応性を有するPODと結合した二次ウサギ抗ヒトFc抗体(1:8000希釈;50μL/ウエル)と共に、プレートを室温で1時間インキュベートした。次いでプレートをTitertekプログラムADG9を使用して最後に洗浄し、乾燥させた。POD基質一段階TMB溶液(50μl/ウエル)を加え、室温で30分間染色した。1NのHCL(50μl/ウエル)を用いて反応を停止させ、Titertekプレートリーダーを用いて光学濃度を直ぐに読み取った。
【０１９８】
表2に示すように、IL-13免疫原に関する高い力価を有する3匹の動物を採取用に選択した。
【０１９９】
【表２】
2008520684.tif 000014
【０２００】
一次スクリーニング
過剰免疫動物を採取し、CD19+B細胞を後のB細胞培養用に単離した。これらの細胞を誘導して増殖させ、最終的にはプラズマ細胞に分化させた。これらのプラズマ細胞由来の上清をELISAによりスクリーニングして、抗IL-13特異的抗体を含む主なウエルを確認した。培養はウエル当たり50〜500のCD19+B細胞を用いて一般的に行って、モノクローナル抗原特異的B細胞培養物を同定することができた。
【０２０１】
簡単に言うと、IL-I3-RbFcをCostar336896ウエルプレート上に1ug/mLで一晩コーティングした。それぞれのプレートはdH2Oで5回洗浄し、40μLの1%ミルクPBS中をプレートに加えた。その後、10μLのB細胞懸濁液をそれぞれのウエルに加えた。室温で1時間後、プレートを再度dH2Oで5回洗浄した。それぞれのウエルに、最少の抗ウサギ交差反応性を有する50μLのウサギ抗ヒトFc-HRP(Jackson Laboratories;1:8000希釈)を加えた。室温で1時間後、プレートを再度dH2Oで5回洗浄し、50μLのTMB基質(Neogen)をそれぞれのウエルに加えた。50μLの1N塩酸をそれぞれのウエルに加えることによって30分後に反応を停止させ、プレートは波長450nmで読み取った。
【０２０２】
一次スクリーニングから生じた代表的データは、以下の表3に示す。陽性ウエルは、対照ウエルの少なくとも3倍シグナルを有することが分かったウエルとして確認した。合計968の陽性抗原特異的B細胞ウエルを、一次スクリーニングにおいて確認した。全てのこれらのウエルは、以下に記載したように機能アッセイのスクリーニングに使用した。
【０２０３】
【表３】
2008520684.tif 000015
【０２０４】
IL-13誘導型エオタキシン生成アッセイ
968のELISA陽性ウエルの全てを、IL-13-誘導型エオタキシン-1放出アッセイにおいて2回スクリーニングした。高濃度の抗体を含むウエルまたは高親和性抗体を含むウエルのみが中和されたとして確認されるように、このアッセイを実施した。合計78の中和抗体が、このアッセイに中和されたとして確認した。当該の幾つかのウエルからの具体的なデータも、表4に例示目的で示す。
【０２０５】
アッセイ用に、96ウエルアッセイプレートの半分の領域に、少量の血清増殖サプリメント(Cascade)を補った50μLの培地106に4000HDFa細胞/ウエルを接種した。次いでプレートを5%CO2中で37℃において一晩インキュベートした。別のプレートでは、12.5μLのサンプル抗体、陰性対照または陽性対照を、滅菌済み96ウエルアッセイプレートに等分した。約600pMのIL-13を培地106に調製し(4×最終濃度)、約100ng/mLのTNF-αを培地106に調製した(2×最終濃度)。
【０２０６】
アッセイを開始するために、12.5μLのIL-13または培地のみをそれぞれのウエルに加え、1時間5%CO2中で37℃においてインキュベートした。1時間のインキュベーションの後、HDFa細胞の培地はマルチチャンネルピペットを使用して注意深く除去した。25μLのTNF-αをそれぞれのウエルに加えた。25μLのサンプル/IL-13をHDFa/TNF-αウエルに移し、細胞は48時間5%CO2中で37℃においてインキュベートした。
【０２０７】
48時間のインキュベーションの後、HFDaアッセイウエル由来の上清を96ウエルVEE底プレートに回収した。サンプルは5分間1500rpmで遠心分離にかけた。
【０２０８】
30μLのサンプルを、標準的プロトコルに従い以下の修飾で、アッセイキット(R&D systems)でエオタキシン-1の放出に関してアッセイした。(1)50μLの捕捉抗体を2μg/mLでコーティングした;(2)50μLのサンプルまたは標準を使用した(50μLの最終体積の30μLのサンプル+20μLの培地);(3)50μLの検出抗体を0.1μg/mLで使用した;(4)50μLのストレプトアビジン-HRPを0.5μg/mLで使用した;かつ(5)50μLの基質溶液を使用した。
【０２０９】
【表４】
2008520684.tif 000016
【０２１０】
抗IL-13特異的B細胞培養ウエルの高抗原(HA)分析
ELISA法を使用して、抗原特異的抗体の濃度の上清を標準化した。並行して滴定した知られている濃度の抗標的(IL-13)抗体を使用して、標準曲線を作製し、上清中の抗原特異的抗体の量を標準と比較し、その濃度を測定した、以下の表5を参照のこと。
【０２１１】
【表５】
2008520684.tif 000017
【０２１２】
それぞれのウエル中の抗原特異的抗体の量を定量し、そのウエルに関する中和データに対してプロットして、最高有効度のウエルを確認した(図1)。最高有効度の抗体を含むウエルは、最少濃度の抗体を最も阻害したウエルである(グラフの上左四半分)。
【０２１３】
抗IL-13特異的B細胞培養ウエルの制限的抗原(LA)分析
制限的抗原分析は、親和性によってB細胞培養物上清中で調製した抗原特異的抗体を、全ての他の抗原特異的抗体に対して位置付ける方法である。非常に少量の抗原コーティングの存在下では、最高親和性の抗体のみが、平衡状態において任意の検出可能なレベルで結合することができるはずである(例えばPCT公開WO03/048730A2を参照)。
【０２１４】
ここで、ビオチン化IL-13を、96ウエル培養プレート上で室温において1時間、4つの濃度(250ng/mL;125ng/mL;62ng/mL;および31ng/mL)でストレプトアビジンプレートと結合させた。それぞれのプレートはdH2Oで5回洗浄し、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中1%のミルク45μLをプレートに加えた。この後に5μLのB細胞上清をそれぞれのウエルに加えた。室温において18時間後シェーカー上で、プレートを再度dH2Oで5回洗浄した。それぞれのウエルに、1μg/mLで50μLのGt抗ヒト(Fc)-HRPを加えた。室温において1時間後、プレートを再度dH2Oで5回洗浄し、50μLのTMB基質をそれぞれのウエルに加えた。50μLの1Mリン酸をそれぞれのウエルに加えることによって反応を停止させ、プレートは波長450nmで読み取った。
【０２１５】
しかしながら、2388A10および2357G11を含めた幾つかのウエルは、図2に示すように、最少抗原コーティングでODにより測定して明らかに優勢であった。図2に表す結果は、低濃度の抗原コーティングで結合する異なる抗体の能力を示す。最高のODシグナルを与える抗体は、このアッセイの条件下で最高の親和性を有する。特異的抗体の濃度を測定する最高抗原のデータと制限的抗原の出力データを組み合わせることによって、残りのクローンをさらに分析した。このようにして、B細胞培養物上清中の異なる濃度における抗体の親和性を比較することができた。最高の親和性の抗体を含むウエルは、最小濃度のAg特異的抗体に関連して最高のELISAのODを有するウエルである。
【０２１６】
全てのスクリーニングデータに基づいて、他の分析(プラークアッセイおよび極微操作、単細胞PCRおよび組換え体発現)用に表6に列挙したウエルを確認した。5つのウエル:2372B8、2383H5、2398C5、2401G12および2413G11を有効性(阻害/完全特異的抗体)に基づいて選択した。3つのウエル:2357G11、2361G5および2384G12は親和性および阻害に基づいて選択し、2つのウエル:2388A10および2407G11は中和データのみに基づいて選択した。
【０２１７】
【表６】
2008520684.tif 000018
【０２１８】
IL-13特異的溶血プラークアッセイ
当該のIL-13特異的抗体を分泌する細胞を、Babcook et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93: 7843〜7848 (1996))におおまかに記載されたIL-13特異的溶血プラークアッセイを使用して単離した。単離した細胞は以下の表7において確認する。
【０２１９】
ヒツジ赤血球細胞(SRBC)のビオチン化
SRBCをRPMI培地に25%ストックとして保存した。250μlのSRBC充填型細胞ペレットは、1.0mlのストックをエッペンドルフチューブに等分し、細胞をスピン処理し(マイクロフュージにおいて8000rpm(6800rcf)でのパルススピン)、上清を除去することによって得た。次いで細胞を1mlのPBSpH8.6で2回洗浄した。次いで細胞ペレットは、15mlチューブ中でpH8.6において4.75mlのPBSに再懸濁させた。別の50mlチューブにおいて、2.5mgのSulfo-NHSビオチンをpH8.6において45mlのPBSに加えた。ひとたびビオチンが完全に溶けた後、5mlのSRBCを加え、チューブは室温で1時間回転させた。SRBCは3000gで5分間の遠心分離にかけ、上清を回収し、SRBCはエッペンドルフチューブ中でpH7.4において1mlのPBSに再懸濁させた。SRBCはpH7.4において1mlのPBSで3回洗浄した。次いでSRBCは、15mlチューブ(5%B-SRBCストック)中で4.75mlの免疫細胞培地(10%FCSを含むRPMI1640)に再懸濁させた。ストックは必要となるまで4℃で保存した。
【０２２０】
B-SRBCのストレプトアビジン(SA)コーティング
1mlの5%B-SRBCストックを、新たなエッペンドルフチューブに移した。B-SRBCはペレット状にし、上清を回収し、ペレットはpH7.4において1mlのPBSに再懸濁させ、遠心分離を繰り返した。洗浄サイクルを2回繰り返し、次いでB-SRBCペレットをpH7.4において1.0mlのPBSに再懸濁させて、5%(v/v)の最終濃度を得た。10μLの10mg/mlストレプトアビジン(CalBiochem、サンディエゴ、CA)ストック溶液を加え、チューブを混合し、室温で20分間回転させた。洗浄ステップを繰り返し、SA-SRBCはpH7.4において1mlのPBSに再懸濁させた(5%(v/v))。
【０２２１】
SA-SRBCのヒトIL-13コーティング
SA-SRBCを100ug/mlでフォトビオチン化ヒトIL-13-RbFc融合体を用いてコーティングし、次いで混合させ、室温で20分間回転させた。前述のようにpH7.4において1.0mlのPBSで2回SRBCを洗浄した。IL-13コーティングSRBCはRPMI(+10%FCS)に再懸濁させて、5%(v/v)の最終濃度を得た。
【０２２２】
免疫蛍光法(IF)によるIL-13-SRBCの質の測定
約10μlの5% SA-SRBCおよび10μlの5%IL-13コーティングSRBCをそれぞれ、40μlのPBSを含む別々の新たな1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。対照のヒト抗IL-13抗体は、45μg/mlでSRBCの各サンプルに加えた。チューブは室温で20分間回転させ、次いで細胞を100ulのPBSで3回洗浄した。細胞は50μlのPBSに再懸濁させ、Alexa488(Molecular Probes、Eugene、OR)と結合した20μg/mLのGt-抗ヒトIgGFc抗体と共にインキュベートした。チューブは室温で20分間回転させ、次いで100ulのPBSで洗浄し、細胞は10μlのPBSに再懸濁させた。10μlの染色細胞をクリーンなガラス製顕微鏡スライド上にスポットし、カバーグラスを載せ、蛍光下で観察し、0〜4の任意単位で記録した。
【０２２３】
プラズマ細胞の調製
当該の免疫グロブリンを分泌するB細胞クローンを含むとして前に記載した、さまざまなアッセイによって前に確認した、1つのB細胞培養ウエルの中身を採取した。100〜1000μLのピペットマンを使用して、37CRPMI(+10%FCS)を加えることによってウエルの中身を回収した。細胞はピペット処理によって再懸濁させ、次いで新たな1.5mlのエッペンドルフチューブに移した(最終体積約700〜1000μl)。細胞は室温で1分間2500rpmで、マイクロフュージにおいて遠心分離にかけた。次いでチューブを180度回転させ、2500rpmで1分間再度スピン処理した。凍結培地を回収し、免疫細胞は100μLのRPMI(10%FCS)に再懸濁させ、次いで遠心分離にかけた。RPMI(10%FCS)を用いたこの洗浄を繰り返し、細胞は75μLのRPMI(10%FCS)に再懸濁させ、使用する準備ができるまで氷上に保存した。
【０２２４】
プラークアッセイ
75μLの細胞サンプルに、75μLの各IL-13コーティングSRBC(5%(v/v)ストック、SRBC群が密集しすぎた場合、必要に応じて希釈)、RPMI(10%FCS)に調製した4×モルモット補体(Sigma、Oakville、ON)ストック、および4×増大血清ストック(RPMI(10%FCS)に1:900)を加えた。混合物(3〜5μL)はTCプレートの蓋(BD Biosciences、San Jose、CA)上にスポットし、非希釈パラフィン油でスポットを覆った。スライドは37℃で少なくとも1時間インキュベートした。
【０２２５】
【表７】
2008520684.tif 000019
【０２２６】
クローニングおよび発現
血漿単細胞を単離した後、mRNAを抽出し、逆転写PCRを実施して、各細胞によって分泌される抗体の可変重鎖および軽鎖をコードするcDNAを作製した。ヒト可変重鎖領域は、IgG2発現ベクターにクローニングした。このベクターは、ヒトIgG2の定常ドメインをpcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、Burlington、ON)のマルチクローニングサイトにクローニングすることによって作製した。ヒト可変軽鎖領域は、IgKまたはIgL発現ベクターにクローニングした。これらのベクターは、ヒトIgKまたはヒトIgLの定常ドメインをpcDNA3.1+/Neo(Invitrogen、Burlington、ON)のマルチクローニングサイトにクローニングすることによって作製した。
【０２２７】
次いで重鎖および軽鎖発現ベクターを、リポフェクタミンを使用して70%融合状態のヒト胚腎臓(HEK)293細胞の60mm皿にコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、元の血漿細胞と同じ特異性を有する組換え抗体を24〜72時間分泌した。3mLの上清をHEK293細胞から採取し、完全抗体の分泌をサンドイッチELISAによって実証して、ヒトIgGを特異的に検出した。ELISAを使用して組換え抗体とIL-13の結合によって特異性を確認した。
【０２２８】
分泌ELISA試験を以下のように実施した。対照プレートを結合プレートと同様に一晩2mg/mLのヤギ抗ヒトIgGH+Lでコーティングし、IL-13はCostar Labcoat Universal Binding Polystyrene96ウエルプレート上にコーティングし、4℃に一晩保った。プレートはdH2Oで5回洗浄した。非希釈リポフェクション上清由来の7ウエルに関して、組換え抗体を1:2で滴定した。プレートはdH2Oで5回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGFc特異的HRP結合抗体は、分泌および2つの結合アッセイ用に室温において1時間1μg/mLの最終濃度で加えた。プレートはdH2Oで5回洗浄した。プレートは30分間TMBを加えることによって顕色させ、1Mリン酸を加えることによってELISAを停止させた。それぞれのELISAプレートを分析して、450nmにおいてそれぞれのウエルの光学濃度を測定した。
【０２２９】
組換え抗IL-13抗体の精製
大規模な生成用に、重鎖および軽鎖発現ベクター(2.5μg各鎖/皿)を、10枚の100mm皿において70%融合状態であったHEK293細胞にリポフェクション処理した。トランスフェクトした細胞は37℃で4日間インキュベートし、このとき上清(6mL)を採取し、6mLの新たな培地と交換した。第7日に、上清を除去し、最初の採取物と合わせた(10のプレートから合計120mL)。
【０２３０】
それぞれの抗体は、プロテイン-Aセファロース(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)親和性クロマトグラフィーを使用して上清から精製した(1mL)。500mLの0.1Mグリシン(pH2.5)を用いてプロテイン-Aカラムから抗体を溶出させた。溶出物はPBS(pH7.4)中で透析し、濾過滅菌した。抗体は非還元SDS-PAGEにより分析して、純度および収率を評価した。濃度もOD280でのUV分析によって測定した。
【０２３１】
(実施例2:組換え抗体の特徴付け)
組換え抗体を、前に記載したエオタキシンアッセイにおける有効性に関して分析した。その結果は以下の表8に示す。マウスIL-13受容体α2/FCおよびヒトIL-13受容体α2/Fcに関して、このアッセイにおいて測定したIC50も含む。図3は、イソ型一致対照、例えば無関係なIgG2モノクローナル抗体と比較した組換え抗体643および731による、IL-13誘導型エオタキシン放出の阻害率を示す。
【０２３２】
【表８】
2008520684.tif 000020
【０２３３】
BiaCore親和性
ヒトIL-13(R&D)に対する親和性を、6種の抗体(602、623、643、693rep1、693rep2および7310)に関するBiaCoreアッセイによって調べた。最初に、2つの高密度ヤギα-ヒト抗体表面を、一度に3個のモノクローナル抗体を捕捉するために通常のアミンカップリングを使用してCM5Biacoreチップで調製した。100μg/mlのBSAを含むHBS-Pランニングバッファーを使用して、全てのモノクローナル抗体を約5μg/Mlに希釈した。それぞれの精製モノクローナル抗体は、Biacore2000装置を使用して各IL-13注射サイクルで異なるフローセル表面において1分間捕捉した。
【０２３４】
IL-13(R&D)は、mAb693、713および731に関して100.9、50.4、25.2、12.6、6.30、3.15、1.58および0.788nM、mAb602、623、および643に関して25.2、12.6、6.30、3.15、1.58、0.788、および0.394nMの濃度でKINJECTコマンドを使用して全表面に1.5分間注射し、次に20分間解離させた。IL-13サンプルは、100μg/mlのBSAを含むHBS-Pランニングバッファー中で調製した。全てのサンプルは、2回の参照に挿入した数回のモノクローナル抗体捕捉/バッファーKINJECTサイクルで、二連でランダムに注射した。
【０２３５】
高密度ヤギα-ヒト抗体表面を、各サイクル後に1/100希釈濃リン酸(146mM、pH1.5)の12秒間のパルスで再生した。mAb693は2回実施した、何故なら最後の一連の媒体決定実験に、装置上に利用可能な余分なフローセルが存在したからである。
【０２３６】
データは、CLAMPを使用して質量移動の点で1:1相互作用モデルに適合させた。6個の抗体に関するデータは表9に示す。
【０２３７】
【表９】
2008520684.tif 000021
【０２３８】
キネティック分析
数個の抗体のキネティック測定値を、KinExA(登録商標)法を使用して評価した。この方法は、平衡時の正式な親和性測定値の溶液に基づく測定を含む。
【０２３９】
100μgの各モノクローナル抗体を、CNBr活性型セファロース4Bまたはアズラクトンビーズと結合させた。ビーズ上の残りの活性基は、製造者により推奨されたようにブロッキングした。次いでビーズは1Mトリスに溶かした10mg/mlBSAでブロッキングし、ブロッキング溶液に保存した。幾つかの実験用に、製造者により推奨されたようにモノクローナル抗体をPMMAビーズに直接吸収コーティングし、PBSに溶かした10mg/mlBSAでブロッキングし、ブロッキング溶液に保存した。
【０２４０】
関連モノクローナル抗体と結合したビーズが固相として働く、自動フローイムノアッセイシステム、KinExA3000を使用して、KinExA実験を行った。簡単に言うと、標準的なプロトコルに従いPBMCを精製および刺激することによって調製した、一定量の元のヒトまたはマカクザルIL-13(10〜650pM)を、サンプルバッファー(非特異的結合を減らすために0.1%BSAを含むPBS)に25nMで始めて、滴定濃度の抗ヒトIL-l3モノクローナル抗体と共にインキュベートした。抗原/抗体複合体は室温で48時間〜168時間インキュベートして、平衡状態に到達させた。混合物は対応する抗体結合ビーズによって回収して、非結合抗原を蓄積させた。混合物の体積および流速は、それぞれの実験で得た特異的シグナルに応じて変化した。
【０２４１】
サンプルバッファーに溶かした二次抗体(他のエピトープと結合するポリクローナル抗IL-13抗体またはモノクローナル抗体のいずれか)、および二次抗体に対するCy5結合抗種Igを含む溶液を使用して、捕捉IL-13を検出した。幾つかの場合、ビーズ固定抗体によって結合するエピトープ以外のエピトープと結合するビオチン化抗体とSA-Cy5の混合物を使用して、ビーズ結合IL-13を検出した。
【０２４２】
二次抗体溶液の濃度、体積、および流速を変えて、各実験においてシグナル対ノイズ比を最適化した。結合シグナルは、hIL-13の不在下での対照の割合として相対値に変換した。それぞれのサンプルの3つの複製を、全ての平衡実験用に測定した。平衡解離定数(KD)は、KinExAソフトウエアに含まれる一部位相同結合モデルを使用して、データの非線形回帰分析から得た。このソフトウエアは、データポイントを理論上のKD曲線に適合させることによって、KDを計算し95%信頼区間を決定する。95%信頼区間は、低いKDおよび高いKDとして与える。ヒトIL-13に関する親和性は表10に、元のマカークIL-13に関する親和性は表11に要約する。
【０２４３】
【表１０】
2008520684.tif 000022
【０２４４】
【表１１】
2008520684.tif 000023
【０２４５】
会合率定数を、2つの抗体623および731に関してKinExAを使用して調べた。同じIL-13結合ビーズをプローブとして使用し、「直接」または「注射」法を使用した。これらの方法は、抗原捕捉、抗原濃度および抗原検出の点でKinExA平衡アッセイと同一である。直接法では、抗原と抗体を事前に混合して、次いでKinExAに施す。注射法では、抗体と滴定抗原を読み取り前に一定時間1つに混合する。簡単に言うと、平衡実験に基づき約80%の抗原と結合すると思われる量のモノクローナル抗体と、hIL-13を混合させた。サンプルに存在した遊離抗原は、平衡前に繰り返しプローブ処理した。結合シグナルは溶液中の遊離抗原の濃度に正比例するので、溶液が平衡状態に達するまでシグナルは経時的に低下した。抗原-モノクローナル抗体混合物およびCy5標識二次抗体の体積および流速は、試験したモノクローナル抗体に応じて変わった。データはKinExA分析ソフトウエアを使用して分析した。このソフトウエアは経時的な結合シグナルの低下を図式的に表し、回収したデータポイントを結合に関する動力学的微分方程式の正確な解に適合させる。この曲線から、Konに関する最適な解を決定した(表12)。KoffはKonおよびKDに関する解から間接的に計算した。
【０２４６】
【表１２】
2008520684.tif 000024
【０２４７】
IL-13変異体タンパク質との結合
野生型アルギニン110をグルタミンと交換したIL-13変異体タンパク質(IL-13Q110R)と結合する、抗体623および731の能力を調べた。
【０２４８】
簡単に言うと、4℃で一晩、1×PBS(pH7.4)および0.05%アジド中でのインキュベーションによって、IL-13RbFc(2.5μg/mLの50μl)でプレートをコーティングした。次いでプレートを1×PBSで洗浄し、室温において100μLの1%無脂肪スキムミルク/1×PBSで30分間ブロッキングした。
【０２４９】
IL-13またはIL-13Q110Rを、抗IL-13抗体と共に室温において1時間プレインキュベートした。および30μl/ウエルの最終体積で2000ng/mlからIL-13を階層的に滴定した。30μlのモノクローナル抗体を、40ng/ml(sc731、623)および80ng/ml(sc693)でウエル毎に加え、滴定の最初の点で1000ng/mlのIL-13の最終濃度、滴定の最初の点で20ng/mlの抗体623および731の最終濃度、および滴定の最初の点で40ng/mlの抗体693の最終濃度をもたらした。
【０２５０】
プレインキュベーションの後、50μl/ウエルをプレインキュベーション溶液からIL-13RbFcでプレコーティングしたプレートに移し、室温において30分間プレインキュベートした。プレートを洗浄し、ウサギ抗HuIgGFcHRPを200ng/mlの濃度で加えた。さらに30分間のインキュベーションおよびその後の洗浄の後、TMBを加え、さらに30分間インキュベートした。反応は1NのHCLを用いて停止させ、PowerwaveX34096ウエルマイクロプレートリーダー(Biotek)でプレートを可能な限り読み取った。
【０２５１】
図4に見ることができるように、IL-13とのプレインキュベーションは抗体623および731とIL-13コーティングELISAプレートの結合を阻害したが、一方、IL-13変異体IL-13Q110Rとのプレインキュベーションは、623の結合よりはるかに高い程度で731の結合を阻害した。
【０２５２】
この特定の変異体に対する抗体は、幾つかの疾患の治療において特に有用である可能性があることを記す。例えば、米国特許公開No.2005/0065327に記されたように、IL-13遺伝子の幾つかの遺伝的多型はアレルギー性疾患と関連している。特に、アミノ酸130におけるアルギニン残基がグルタミンに置換されているIL-13遺伝子の変異体(Q130R)は、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎および高い血清IgEレベルと関係している(例えば、Heinzmann、A.、et al.Hum Mol Genet、2000.9(4): p.549〜59; Howard、T.D.、et al.Am J Hum Genet、2002.70(1): p.230〜6; Kauppi、P.、et al.Genomics、2001.77(1〜2): p.35〜42;およびGraves、P.E.、et al.J Allergy Clin Immunol、2000.105(3): p.506〜13を参照のこと)。この特定のIL-13変異体は、20アミノ酸のシグナル配列がアミノ酸数から除去されているので、(アミノ酸110におけるアルギニン残基がグルタミンに置換されている)Q110R変異体と本明細書では呼ぶ。Arima et al.、(J Allergy Din Immunol、2002.109 (6):p.980〜7)は、この変異体は血清中の高レベルのIL-I3と関係があることを報告している。IL-13変異体(Q110R)およびこの変異体に対する抗体はWO01/62933中で論じられている。IL-13生成を変えるIL-13プロモーター多型は、アレルギー喘息とも関連している(van der Pouw Kraan、T.C.、et al.Genes Immun、1999.1 (1): p.61〜5)。変異体はIL-13リガンドの有効な半減期を増大させることによって、喘息の発生率の増大を誘導すると考えられる。IL-13Q110RはデコイIL-13受容体に対する低い親和性を有する可能性があると考えられる。
【０２５３】
当業者によって理解されるように、本開示を鑑みて、幾つかの実施形態では、抗体はほぼ等しい親和性またはKDでIL-13とIL-13変異体の両方と結合することができる。これによって、両方の形のIL-13(野生型および変異体)を有する患者を単抗体で治療することができる。したがって、幾つかの実施形態では、同じまたは類似のKDでIL-13およびIL-13変異体と結合することができる抗体は、有用である可能性がある。幾つかの実施形態では、IL-13およびIL-13Q110Rに対する完全ヒトモノクローナル抗体のKDの20%未満の差異、例えば20〜15パーセント未満、15〜10、10〜8、8〜6、6〜4、4〜2、2〜1、1〜0パーセントの抗体のKDの差異が存在する。幾つかの実施形態では、野生型とIL-13Q110R変異体の間のKDは1000倍未満、1000〜100、100〜10、10〜1、または1〜0.2倍異なる。IL-13の他の変異体に関する類似性を、抗体を選択または使用する際に使用することもできる。
【０２５４】
受容体鎖競合
受容体IL-13Rα1およびIL-13Rα2とのIL-13結合を阻害する抗IL-13抗体の能力を調べた。サンプルはフローサイトメーターを使用して分析した。その結果は図5Aおよび図5Bに表す。データは、IL-13および結合プロセスにおいて関係がある受容体と結合する、抗体643(図5A)および抗体731(図5B)またはイソ型対照抗体の能力を実証した。IL-13と結合し抗体が細胞と相互作用するのを可能にした、特定の受容体(例えば、IL-13Ra2、IL-13Ra1、またはIL-4R)を、HDFa細胞上で発現される全ての考えられるIL-13受容体に対する中和抗体を使用して決定した。さまざまな実験および予想した結果の概要は、図5Cおよび図5Dに示す。
【０２５５】
簡単に言うと、HDFa細胞をFACSバッファーに再懸濁させて約200000細胞/ウエル/l00μLを得て、100μLの細胞を96ウエルVEEボトムプレートに等分した。中和抗受容体抗体(抗ヒトIL-13Ra1(R&D Systems)、抗ヒトIL-13Ra2(R&D Systems)または抗ヒトIL-4R(R&D Systems))を、最終濃度(10μg/mLFINAL)で2回FACSバッファーに希釈した。抗IL-13および対照抗体も、IL-13と同様に(ヒトR&D;10ng/mLFINAL)、最終濃度(1μg/mLFINAL)で2回FACSバッファーに希釈した。
【０２５６】
HDFa細胞のVEEボトムプレートは180×gで7分間遠心分離にかけ、逆さにすることによって上清を除去した(プレート#1)。細胞は50μLのFACSバッファーに再懸濁させ、さらに50μLの抗ヒトIL-13Ra1、抗ヒトIL-13Ra2、抗ヒトIL-4RまたはFACSバッファー(受容体抗体対照なし)を、適切なウエルに加えた。細胞および抗体は、次いで氷上で約1.5時間インキュベートした。
【０２５７】
抗体/IL-13のプレインキュベーション用に、第2のVEEボトムプレートを使用した(プレート#2)。60μLの試験抗体をVEEボトムプレートに等分した。60μLのIL-13を適切なウエルに加え、混合物は氷上で約1.5時間インキュベートした。
【０２５８】
インキュベーションの後、HDFa細胞は180×gで7分間遠心分離にかけ、逆さにすることによって上清を除去した。プレート#1中の細胞は100μLのFACSバッファーまたは100μLの抗体/IL-13に再懸濁させ、さらに1.5時間インキュベートした。
【０２５９】
2回目のインキュベーションの後、細胞を遠心分離にかけ、FACSバッファーおよび100μLのFACSバッファーで1回洗浄し、7AADまたは2μg/mLのヤギ抗HuIgG-Fc-Cy5を適切なウエルに加えた。
【０２６０】
細胞および二次抗体は氷上で20分間インキュベートし、次にFACSバッファーで洗浄した。次いで細胞を100μLのFACSバッファーに再懸濁させ、300μLの冷FACSバッファーを含む予め標識したFACSチューブに等分した。
【０２６１】
サンプルはフローサイトメーターを使用して分析した。その結果は図5Aおよび図5Bに表す。抗体のそれぞれに関する前述のプロトコルおよび予想した結果の概要は、図5Cおよび図5Dに示す。図5Aによって示すように、IL-13は抗体643の存在下ではHDFa細胞と結合しない。図5Cの各パネルに示すように、抗体643はIL-13がHDFa細胞上でその受容体と結合するのを妨げるようである。図5Bに見ることができるように、抗体731の場合はそうではない。IL-13は抗体731をHDFa細胞と結合させる。図5Dに示すように、この結合はIL-13Ralpha1またはIL-4Rに対する抗体によって阻害されないが、IL-13Ralpha2に対する抗体によって阻害され、抗体731はIL-13がIL-13Ralpha1またはIL-4Rと結合するのは妨げるが、IL-13Ralpha2と結合するのは妨げないことが示される。mAb643と類似した抗体であるmAb623に関する結果も以下に表す。
【０２６２】
HDFa細胞上でのIL-13Ra1、IL-13Ra2およびIL-4Rの表面発現の量を、抗受容体抗体を使用してFACS分析によって測定した。前に記載したように調製したHDFa細胞を、氷上で1時間5μg/mLの濃度の抗受容体抗体と共にインキュベートした。細胞をFACSバッファーで洗浄し、氷上で30分間2μg/mLの濃度のCy5二次(抗ヒト)抗体と共にインキュベートした。洗浄後、フローサイトメトリーによってサンプルを分析した。結果は以下の表13に表す。
【０２６３】
【表１３】
2008520684.tif 000025
【０２６４】
mAb643およびmAb731に関する前述の結果以外に、mAb623に関する同様の実験を実施した。結果は図5Eに示す。mAb623に関する結果はmAb643に関する結果と同様であり、図5DにmAb731に関して示す相互作用ではなく図5Cに示す相互作用が示唆される。
【０２６５】
エピトープマッピング
抗体-IL-13複合体のエピトープを、3つの方法、1)SELDI、2)ランダムなペプチドのファージディスプレーライブラリーのスクリーニング、および3)キメラヒト/マウスIL-13分子の発現によって分析した。IL-13の構造の知識と組み合わせたこの3つの技法によって、これらのモノクローナル抗体の相対的結合部位および抗原領域の一貫した見解を得た。これによって機能的エピトープ、特にシグナル受容体との結合と関係がある領域の同定が可能となった。
【０２６６】
最初の実験として、IL-13精製タンパク質とのモノクローナル抗体の結合のドットブロット分析によって、どの抗体がどの形(線状または立体配座的)のエピトープと結合したかが明らかになった。mAb693および785は、還元変性型抗原、線状エピトープと結合した。mAb602、623、643、および713は非還元型(立体配座的エピトープ)IL-13と結合したが、還元変性型抗原とは結合しなかった。mAb763は結合を示さなかった。この後、線状エピトープを、ランダムなペプチドのファージディスプレーライブラリーを使用してマッピングした。ファージ上で発現された12量体のランダムなペプチドライブラリーに対するmAb693の2ラウンドの選別後、一種の特異的結合物質を塩基配列決定し、IL-13の残基109〜120(らせん構造D)を一直線に並べた(図6A)。IL-13抗体は3つの異なるビンにグループ分けしたが、ビンは他の手段によって測定したエピトープと常に関連があるわけではなかった。それぞれのビンから1個の抗体を、SELDIによるマッピング用に集めた。表14は、IL-13抗体のビンニング結果を示す。
【０２６７】
【表１４】
2008520684.tif 000026
【０２６８】
SELDIを使用するエピトープのマッピング
抗体-抗原複合体を、高濃度のLys-CおよびAsp-Nで消化した。次いでエピトープをSELDIによって測定し、断片の質量によって同定した。表15は、エンドプロテイナーゼLys-Cを用いて消化したIL-13の消化によって誘導したペプチドに関する予想質量を示す。
【０２６９】
【表１５】
2008520684.tif 000027
【０２７０】
切断後に同定した質量は(ペプチド断片45〜108に関して)6842.8、(ペプチド断片45〜116に関して)7733.7、および(ペプチド断片21〜108に関して)9461.4であった。したがって、mAb731に関する結合部位は、IL-13の残基45〜108内に存在すると決定した。
【０２７１】
立体配座的エピトープをマッピングするためのペプチドアレイ
IL-13配列の残基21〜132に広がる101,12量体ペプチドのペプチドアレイを作製した(SIGMA-Genosys)。それぞれの連続したペプチドは、前のアミノ酸由来の1アミノ酸によって補われ、入れ子状の重複型ライブラリーが生じた。アレイはmAb731でプローブ処理し、mAb731とペプチドの結合は、HRP結合二次抗体と共にPVDF膜をインキュベートし、次に化学発光を増大させることによって検出した。IL-13のアミノ酸70〜80に対応する2つの連続したスポット、およびIL-13のアミノ酸83〜92に対応する3つの連続したスポットを観察した。アレイをさらにmAb731でプローブ処理した。IL-13のアミノ酸70〜80に対応する1つのスポットを観察した。同様の実験をさらに行ってmAb623のエピトープを測定し、これは以下の実施例10に記載する。結果は、mAb623は残基21〜29と結合することを示した。
【０２７２】
マウスIL-13キメラ分子を使用するエピトープのマッピング
マウスのらせん構造A、らせん構造B、らせん構造C、およびらせん構造Dの配列をヒト配列とシャッフルし、4個の新たなマウスキメラを作製した。らせん構造の位置の表示は図6Bに示す。マウスIL-13と結合したモノクローナル抗体は存在しなかった。4個のキメラは以下の通りである:
【０２７３】
【化１０】
2008520684.tif 000028
(配列番号77);
【０２７４】
【化１１】
2008520684.tif 000029
(配列番号78);
【０２７５】
【化１２】
2008520684.tif 000030
(配列番号79);
【０２７６】
【化１３】
2008520684.tif 000031
(配列番号80);
【０２７７】
次いでキメラを発現させ、分泌されたIL-13キメラタンパク質はELISAアッセイにおいて検出した。結果は表16に要約し、「*」はサンドイッチELISAにおいて結合が弱かったことを示す。
【０２７８】
【表１６】
2008520684.tif 000032
【０２７９】
IL-13のエピトープの前述の3試験の結果は、表17.1に要約する。
【０２８０】
【表１７】
2008520684.tif 000033
【０２８１】
したがって、幾つかの異なる考えられるエピトープ位置が、本明細書で開示するさまざまな抗体によって使用されるようである。
【０２８２】
抗体ビンニング分析
同時に抗原に結合する2つの抗体の能力を測定することによって、抗IL-13抗体を3つの異なるビンにグループ分けした(1つの抗体はビーズ上の抗原を捕捉し、他方の抗体は検出用に使用した)。抗原の不在下でのビーズ上のシグナルを、抗原の存在下で得たシグナルから差し引いた。各検出用抗体のシグナルを捕捉抗体のシグナルで割って、表17.2に示すように結合の増大倍数を決定した。次いで抗体を、捕捉抗体の類似の結合パターンに基づいてビンニングした。データによって、試験した9つの検出用抗体に関する、抗体結合の3つのビンの存在を確認した(表17.2)。
【０２８３】
【表１８】
2008520684.tif 000034
【０２８４】
簡単に言うと、マウス抗ヒトIgG1、2、3、4(BDPharmingen555784)結合ビーズを、個々の暗状態のエッペンドルフチューブ中の捕捉抗体に加えた(353 & 11.18;5ug/mL)。チューブは一晩4℃において暗中で回転させた。ビーズをフィルタープレートの各ウエルに等分し(それぞれ2500ビーズ/ウエル)、洗浄した。
【０２８５】
IL-13-RbIg(5μg/ml)および対照(培地のみ)を60μl/ウエルでフィルタープレートに加え、次いでシェーカー上で室温において1時間暗所でインキュベートし、その後2回洗浄した。
【０２８６】
60μl/ウエル(ウエル当たり1抗体)で培地に希釈した二次抗体を加えた。抗体は以下の濃度で使用した(353B-5g/ml;11.18.31-5μg/ml;713-0.56μg/ml;731-1.28μg/ml;693-2.7μg/ml;623-5.7μg/ml;602-11μg/ml;643-4.3μg/ml;785-5.5μg/ml;763-5.7μg/ml;G2対照-5μg/ml)。次いでプレートを室温において2時間インキュベートし、洗浄した。
【０２８７】
5μg/mlで培地に希釈したビオチン化マウス抗HuIgG1、2、3、4(BD Pharmingen#555785)をそれぞれのウエルに加え(60μl/ウエル)、シェーカー上で室温において1時間暗所で、プレートをインキュベートした。洗浄後、培地に希釈した60μl/ウエルのストレプトアビジン-PE(5ug/mL;Pharm#554061)を加えた。プレートは次いでシェーカー上で室温において20分間暗所でインキュベートし、その後2回洗浄した。
【０２８８】
それぞれのウエルは、注意深く数回上下にピペット処理することによって80μlの保存/ブロッキングバッファー(PBS、10mg/mlのBSA、0.05%w/vのアジ化ナトリウム)に再懸濁させて、ビーズを再懸濁させた。それぞれのウエルは、8,400と14,500の間に設定した範囲でLuminexにおいて読み取ることによって分析した。
【０２８９】
Luminexプラットフォームは、一度に多数のアッセイを行うのを可能にする蛍光ビーズ系技術である。Luminexリーダーは、異なるコード型ミクロスフェアにおける陽性シグナル事象を確認することができる。これによって各ビーズを別々にコーティングすることができ、次いで異なるコーティングをしたミクロスフェアを1つに混合させ、次いで1ステップアッセイにおいて、抗体を異なるミクロスフェアのそれぞれと結合させる。抗体のイソ型を決定するために、各ビーズが特定の重鎖または軽鎖イソ型と特異的に結合することができるような方法で、ミクロスフェアをコーティングした。次いでミクロスフェアを1つに混合させ、それぞれの抗体のハイブリドーマ上清を加えた。20分のインキュベーション後、ミクロスフェアを洗浄し、結合した抗体は蛍光標識二次抗体を使用して検出した。ミクロスフェアは、次いでLuminexリーダーを使用して読み取った。
【０２９０】
(実施例3:IN VIVOデータ)
ヒト化IL-13マウス
マウスIL-13をコードする遺伝子がヒトIL-13をコードするcDNAの挿入によって阻害された、ヒト化IL-13マウスがLexicon(The Woodlands、テキサス)において作製された。マウスはA/J系統に戻し交配して、マウスが以前に記載された(Ewert et al、(2000) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.)アレルゲン誘導型気道過敏症に罹患しやすくなることを確実にした。
【０２９１】
ヒト化IL-13マウスはヒトIL-13のみを生成し、マウスIL-13は生成しないことを実証するために、ヒト化IL-13マウス(6〜8週齢)由来のOVA特異的CD4+T細胞からのサイトカイン生成を、野生型マウス由来のCD4+T細胞と比較した。0.9%滅菌済み生理食塩水に溶かした50μg OVA/1mg Imject Alum(Pierce、Rockford、IL)またはPBSの腹腔内注射によってマウスを感作させた(治療当たり3匹のマウス)。感作後第7日に、マウスを殺し、脾臓の単細胞懸濁液を調製した。赤血球を溶解させ、洗浄した脾臓細胞は、10%非働化FCS、2mMのL-グルタミン、および50mg/Lの硫酸ネオマイシンを含むHL-1(BioWhittaker、Walkersville、MD)からなる完全培地に5×106個の細胞/1mlで再懸濁させた。次いで脾臓細胞を200μg/mlのOVAの存在下で37℃において4日間培養して、Ag反応性CD4+T細胞を生成させた。CD4+T細胞(5×105個の細胞/ウエル)を単離し、次いで野生型マウス由来の新たに単離したマイトマイシンC(25μg/ml)治療脾臓細胞(5×105個の細胞/ウエル)と共に、96時間、96ウエルプレート(250μl/ウエル)中で200μg/mlのOVAの存在下で完全培地においてインキュベートした。
【０２９２】
無細胞培養物上清を回収し、サイトカイン生成に関して試験した。ヒトおよびマウスIL-13(DuoSet、R&D Systems、Minneapolis、MN)濃度は、製造者のプロトコルに従いELISAによって測定した。予想通り、in vitroでのOVA再刺激後のヒト化IL-13マウス由来のCD4+T細胞は、ヒトIL-13を生成し、マウスIL-13は生成しなかった(図7A)。対照的に、野生型マウス由来のCD4+T細胞は、マウスIL-13を生成し、ヒトIL-13は生成しなかった(図7B)。
【０２９３】
気道過敏反応性
抗IL-13抗体731および623を、前に記載したのと同様にヒト化IL-13マウスを使用してOVA誘導型喘息モデルにおいて試験した。アセチルコリンの静脈内投与に対する気道過敏反応性を測定するために、24日間のプロトコルを使用した。簡単に言うと、PBS(0.2ml)に溶かしたOVA(10μg;粗製品IV;Sigma)の腹腔内注射によってマウスを免疫処置した。PBS単独は対照として使用した。免疫処置後第14日に、ケタミンとキシラジンの混合物[それぞれ体重1キログラム当たり45および8mg(mg/kg)]を用いてマウスに麻酔をかけ、50μlの1.5%OVA溶液または対照として等体積のPBSで気管内を攻撃した。
【０２９４】
最初の抗原攻撃後第7日に、マウスの気管内をOVAまたはPBSのいずれかで再度攻撃した。731および623抗体を、それぞれの攻撃前に1日100μg/マウスの用量で腹腔内投与した(第13日および第20日)。対照マウスには、PBSまたはイソ型対照として無関係なIgG2を与えた。最後の気管内攻撃後第3日に、ペントバルビタールナトリウム(90mg/kg)を用いてマウスに麻酔をかけ、挿管し、120呼吸/1分間の割合で一定換気量の空気(0.2ml)を酸素補給させ、臭化デカメトニウム(25mg/kg)で麻痺させた。安定した気道圧が確定した後、アセチルコリンを静脈内注射し(50μg/kg)、動的気道圧を5分間測定した。アセチルコリン攻撃に対する気道過敏反応性(AHR)を測定した。アセチルコリン攻撃に対する気道過敏反応性は、ピーク気道圧の時間集約的上昇によって定義する[気道圧-時間指標(APTI)、H2Oのセンチメートル×秒]。OVA+IgG2対照群と比較して*P<0.05[多数の比較に関する一元配置分散分析(ANOVA)、次にフィッシャーの最小有意差検定]。731または623を用いた治療は、OVA誘導型AHRの完全な逆転をもたらした(図8)。この実施例では完全な逆転は、抗体およびOVAの添加が、OVAが存在せず抗体のみ(例えばIgG2)を加える場合の影響と、類似した影響をもたらすことを意味する。PBS、PBS+IgG2、PBS+731およびOVA群ではn=4マウス/群;OVA+IgG2群ではn=5マウス/群;PBS+623およびOVA+731群ではn=6マウス/群;OVA+623群ではn=8マウス/群。データは平均±SEである。
【０２９５】
OVA誘導型粘液生成
18日間のプロトコルを、OVA誘導型粘液生成の測定用に使用した。第0日および7日に2mgのImject Alumに溶かした卵白アルブミン(OVA、25μg;粗製品IV)(Sigma)で皮下を初回抗原刺激した後、イソフルランを用いてマウスに麻酔をかけ、第14、15、および17日に50μlのPBSに溶かした1.5%OVA溶液で鼻腔内を攻撃した。対照マウスには初回抗原刺激としてミョウバン、あるいは攻撃としてPBSを与えた。
【０２９６】
731および623抗体を、第13、15、および17日に100μg/マウスの用量で腹腔内投与した。対照マウスにはPBSを与えた。第18日にマウスを殺し、肺を灌流後に回収した。中枢および末梢気道を含めた肺組織を10%ホルマリンに固定し、70%エタノール中で洗浄し、脱水し、グリコールメタクリレートに包埋し、4μM切片に切断し、スライド上に載せ、ヘマトキシリンおよびエオシン、ならびに過ヨウ素酸-シッフ(PAS)で染色した。肺切片(動物一匹当たり一切片)を20倍の倍率で調べた。5つの領域をランダムに選択し、それぞれの切片に関して、各領域内の気管支の数を数えた。切片は0〜4の単位で記録した(0:<5%PAS+杯状細胞;1:5〜25%;2:25〜50%;3:50〜75%;4:>75%)。(任意単位;Uとして表す)組織学的な杯状細胞の記録値を得るために、それぞれの肺からの気道の記録値の合計を、調べた気管支の数で割った。OVA治療群では8匹のマウス中5匹が死んだ。他の群ではマウスは死ななかった。731および623の投与によって、気道中の粘液含有細胞のOVA誘導型の増大が効率良く逆転した(図9)。データは平均±SEである。OVA/OVA/PBS群(最初はn=8)に関してn=3;OVA/OVA/731群に関してn=8、OVA/OVA/623群に関してn=4;OVA/PBS/PBS群に関してn=4、Alum/OVA/PBS、およびAlum/PBS/PBS群に関してn=5。対のないスチューデントt検定によって、OVA/OVA/PBS群に対して*p<0.01。
【０２９７】
喘息を試験するためのマウスモデルおよび粘液およびAHR測定の前述の使用は、喘息を治療するための薬剤の有効性を試験するための、正確かつ科学的に認められたモデルである(Willis-Karp M.、Murine models of asthma in understanding dysregulation in human asthma、Immunopharmacology、25: 48: 263〜8 (2000))。さらにこのモデルは、これらのマウスモデルに示す症状の少なくとも1つと類似した症状を共有するIL-13関連障害用に信頼できると予想される。このように、このモデルおよび類似のこのような動物モデルは、他に確認されているIL-13関連障害を同様に試験するのに充分なはずである。
【０２９８】
(実施例4:抗体の構造分析)
表1に示す抗体の可変重鎖および可変軽鎖の塩基配列を決定して、それらのDNA配列を決定した。全ての抗IL-13抗体に関する完全な配列情報は、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含めて、ここに提示する配列表に示す。
【０２９９】
表18は、本明細書に記載するさまざまなIL-13抗体に関する、重鎖遺伝子のアミノ酸配列を示す。表18はさらに、それぞれの抗体のCDRおよび骨格領域に対応するアミノ酸配列、ならびにその生殖細胞系配列との比較を示す。
【０３００】
表19は、本明細書に記載するさまざまなIL-13抗体に関する、kappa軽鎖遺伝子のアミノ酸配列を示す。表19はさらに、それぞれの抗体のCDRおよび骨格領域に対応するアミノ酸配列、ならびにその生殖細胞系配列との比較を示す。
【０３０１】
表20は、本明細書に記載するさまざまなIL-13抗体に関する、ラムダ軽鎖遺伝子のアミノ酸配列を示す。表20はさらに、それぞれの抗体のCDRおよび骨格領域に対応するアミノ酸配列、ならびにその生殖細胞系配列との比較を示す。
【０３０２】
【表１９】
2008520684.tif 000035
2008520684.tif 000036
【０３０３】
【表２０】
2008520684.tif 000037
2008520684.tif 000038
【０３０４】
【表２１】
2008520684.tif 000039
【０３０５】
【表２２】
2008520684.tif 000040
【０３０６】
【表２３】
2008520684.tif 000041
【０３０７】
【表２４】
2008520684.tif 000042
【０３０８】
幾つかの実施形態では、前述の配列を使用して抗体の変異体を作製した。例えば変異体の作製は、配列の(抗体の切片または領域による)前述の配列および構造破壊を使用して、抗体の同一、類似、および非保存型領域を同定することを含み得る。高度に保存されているかあるいは同一の抗体の部分は変異体中で保たれるはずであり、一方、抗体間で大きく異なる部分は新たな変異体中で変えることができる。したがって、「保存型」変異体は前に列挙した抗体配列を使用することによって容易に作製することができる。当業者によって理解されるように、前に列挙した多くの変異体、例えばそのアミノ酸配列が異なる713および731または623および643が既に存在する。幾つかの実施形態では、前述の切片(例えばCDR1、CDR2、CDR3、FRI、Jなど)のそれぞれの40%以下のアミノ酸を変えることができる、例えばそれぞれの切片中の40〜30、30〜20、20〜15、15〜10、10〜5、5〜2、2〜1、または1%以下のアミノ酸を変異体抗体と考えられる生成抗体の非保存型アミノ酸に変えることができる。本明細書で実証するように、これらの変異体はそのさまざまな機能を保持しているようである。同じエピトープと結合する抗体を同定し、次いでこれらの抗体間のみで構造類似性(一次、二次、三次など)に関して配列を分析する際に、他の指針を見出すことができる。
【０３０９】
幾つかの実施形態では、IL-13と結合する抗体、および少なくとも前に同定した配列の部分集合も企図する。例えば、前に記載したCDR1領域、あるいはより詳細にはそのに配列GFTFを有するCDR1領域を含む、IL-13完全ヒト抗体を使用することができる。同様に、Knで終わる軽鎖CDR2領域、またはVKGで終わる重鎖CDR2領域、GMDVで始まるCDR3領域を有する抗体も使用することができる。特に配列が抗体間で共通であるとき、任意の前述の配列または部分列を同様に使用することができる。
【０３１０】
本明細書に記すように、幾つかの実施形態では抗体は、それらが他のIL-13変異体と結合するのと同じ親和性でIL-13と結合する。幾つかの実施形態では、他のIL-13変異体はQ110R変異体を含む。このような抗体、およびその変異体は、前に開示した方法によって作製することができる。他の指針を配列比較により見出して、野生型および他のIL-13変異体と類似の親和性で結合する抗体中の保存型領域を同定することができる。IL-13変異体は当技術分野で知られており、当業者によって容易に同定される。IL-13変異体の例はHeinzmann et al、(Genentic variants of IL-13 signaling and human asthma and atopy、Human Molecular Genetics、9: 549〜559 (2000))中で見ることができる。
【０３１１】
(実施例5:サンプル中のIL-13を検出するための診断用物質としての抗IL-13抗体の使用)
サンプル中のIL-13を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を開発することができる。このアッセイでは、数ウエルのマイクロタイタープレート、96ウエルのマイクロタイタープレートまたは384ウエルのマイクロタイタープレートなどに、IL-13を対象とする第1の完全ヒトモノクローナル抗体を数時間吸着させる。固定抗体は、試験サンプルに存在する可能性があるIL-13用の捕捉抗体として働く。ウエルをすすぎ、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理して検体の非特異的吸着を妨げる。
【０３１２】
その後ウエルを、IL-13を含む疑いがある試験サンプル、または標準量の抗原を含む溶液で処理する。
【０３１３】
試験サンプルまたは標準をすすいで除去した後、ビオチンとの結合によって標識した第2の完全ヒトモノクローナル抗IL-13抗体でウエルを処理する。標識した抗IL-13抗体は検出用抗体として働く。過剰な第2抗体をすすいで除去した後、ウエルはアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)および適切な発色性基質で処理する。試験サンプル中の抗原の濃度は、標準サンプルから開発した標準曲線との比較によって測定する。
【０３１４】
(実施例6:ヒトにおけるCOPDの治療)
COPDに罹患している患者を同定する。5mg/kgの用量の抗IL-13抗体623および/または731を、静脈内注射によって患者に投与する。患者のエオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルを測定する。エオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルが高すぎる場合、「正常」レベルのエオタキシン、C10、および/またはTARCが得られるまで他のモノクローナル抗体を患者に投与する。抗IL-13抗体は粘液の生成の阻害、気管支上皮過形成の進行、および気管支平滑筋の痙攣を引き起こす。この粘液生成の阻害および平滑筋収縮によって気道の封鎖が減り、換気が改善される。
【０３１５】
(実施例7:ヒトにおける慢性気管支炎の治療)
慢性気管支炎によって特徴付けられるCOPDに罹患している患者を同定する。5mg/kgの用量の本明細書に開示する抗IL-13抗体、好ましくは623または731を、静脈内注射によって患者に投与する。患者のエオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルを測定する。エオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルが高すぎる場合、「正常」レベルのエオタキシン、C10、および/またはTARCが得られるまで他のモノクローナル抗体を患者に投与する。抗IL-13抗体は粘液の生成の部分的または完全な阻害、ならびに炎症性呼吸組織における気管支平滑筋の収縮を引き起こす。この粘液生成の阻害および平滑筋収縮によって気道の封鎖が減り、換気が改善される。
【０３１６】
(実施例8:ヒトにおける肺気腫の治療)
肺気腫に罹患している患者を同定する。5mg/kgの用量のIL-13抗体を、静脈内注射によって患者に投与する。患者のエオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルを測定する。エオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルが高すぎる場合、「正常」レベルのエオタキシン、C10、および/またはTARCが得られるまで他のモノクローナル抗体を患者に投与する。抗IL-13抗体は呼吸組織中の部分的または完全な炎症細胞浸潤の低下を引き起こす。さらに抗IL-13抗体は、組織損傷プロテアーゼを誘導するIL-13が有する能力を阻害する可能性がある。
【０３１７】
(実施例9:ヒトにおける喘息の治療)
喘息に罹患している患者を同定する。5mg/kgの用量の本明細書に記載する抗IL-13抗体、好ましくは623または731を、静脈内注射によって患者に投与する。患者のエオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルを測定する。エオタキシン、C10、および/またはTARCのレベルが高すぎる場合、「正常」レベルのエオタキシン、C10、および/またはTARCが得られるまで他のモノクローナル抗体を患者に投与する。追加投与を後に与える。抗IL-13抗体は、患者の免疫応答によって引き起こされる肺および気道に対する組織損傷の重度を低下させる。
【０３１８】
(実施例10:mAb623によって認識される立体配座的IL-13エピトープのマッピング)
ヒトIL-13配列に広がる(実施例2に記載したものと類似した)重複ペプチドアレイを作製して、どこでmAb623がIL-13と結合するかを高い特異性で測定した。マッピングが標準手順に不充分だったので、立体配座結合部位の検出に特に適合させた最適化プロトコルを使用した。1つのアミノ酸が変化した12量体のヒトIL-13由来ペプチドを含むペプチドスキャンを、mAb623でプローブ処理した。mAb623とこれらのアレイ型ヒトIL-13由来ペプチドの結合は、PVDF膜上でのペプチド結合抗体の電気化学的移動、次にペルオキシド標識抗ヒトIgG抗体および化学発光物質を用いた検出によって分析した。1つの結合領域を同定した。IL-13用のmAb623のエピトープは、TQNQKAPLCN(配列番号95)配列(配列番号96のループA中の残基20〜29、図10)を含むようである。
【０３１９】
(実施例11:mAb623を用いたヒトIL-13の高解像度スクリーニング)
この実施例は、他の高解像度アッセイおよびヒトIL-13に対するmAb623の結合特性に関する結果を与える。ヤギ抗ヒトポリクローナル抗体(Fc特異的)は、Biacore2000(商標)装置を用いて充分な表面能力(ポリクローナル抗体の4800〜5400共鳴単位、RU)で、CM5Biacore(商標)チップの全4個のフローセルとアミン結合させた。全ての実験用のランニングバッファーおよびサンプル調製バッファーは、100μg/mLのBSAを含むHBS-Pで脱気した。mAb623は、バイオセンサー表面上でモノクローナル抗体を捕捉するためのHBS-Pに10.1μg/mLに希釈した。mAb623はフローセル1、2、および4で捕捉した。平均552、211、および390RUのモノクローナル抗体を、10〜50μL/分の間で変わる流速を使用し各サイクルに関して3つの実験用フローセルでそれぞれ捕捉して、12〜60秒の間で変わる接触時間を得た。フローセル3は対照として働いた。全てのIL-13抗原(R&D Systems)注入は、100μL/分の流速で23℃において行った。12.6〜0.394nMの連続希釈した(2倍)IL-13サンプルを、二重参照用に散在させた幾つかのバッファー注入液と共に60秒間三連でランダムに注入した。センサグラムの分離相は30分間続いた。捕捉表面は、146mMリン酸、pH1.5を1.15秒注入して再生した。センサグラムのデータはScrubberバージョン1.1gを使用して処理した。全3個のフローセルからのデータは、含まれていた質量移動の点で1:1相互作用モデルにおおまかに適合させた、それぞれのフローセルに関するRmax値は、この場合は必要に応じて部分的に適合させた、何故なら捕捉レベルが、3個のフローセルのそれぞれで異なっていたからである。このモデルは満足のいくようにデータを適合させ、結果ka=7.3×106M-1s-1、kd=2.5×10-4s-1、KD=34pMを与えた。
【０３２０】
(実施例12:マーモセットIL-13に関する623および731KINEXA親和性)
この実施例は、KINEXA分析からのマーモセットIL-13用のmAb623およびmAb731に関する親和性データを与える。mAb623を用いたマーモセットIL-13に関する他のKINEXA実験と同様に、KD制御型および抗原制御型実験を行った。n曲線分析によって、最終的なKDが403pMであったことが明らかであった。mAb731に関する幾つかの実験も実施して、n曲線分析によって731に関するKDは<7pMであると測定した。
【０３２１】
(実施例13:ヒトIL-13変異体(IL-13Q110R)を用いたmAb623および731の中解像度スクリーニング)
この実施例は、IL-13Q110Rに対するmAb623およびmAb731の結合特性を示す。無標識表面プラズモン共鳴(SPR)、またはBiacore(商標)デバイスを使用して、抗原に対する抗体の親和性を測定した。この目的のために、CM5Biacore(商標)チップ上の高密度のヤギαヒト抗体表面を、Biacore2000(商標)装置上での通常のアミンカップリングを使用して調製した。100μg/mlのBSAを含む脱気したHBS-P(0.005%ポリソルベート20を含むHepes緩衝生理食塩水)ランニングバッファーに、mAb731は4.7μg/mLに希釈し、mAb623は5.2μg/mLに希釈した。両方のモノクローナル抗体用の捕捉プロトコルを開発した。それぞれの抗原サンプルを注入する前に、それぞれのモノクローナル抗体を、10μL/分の流速で30秒間異なるフローセルにおいて捕捉した。100μL/分で4分間の洗浄ステップを続けて、モノクローナル抗体のベースラインを安定化させた。ヒトIL-13変異体(Peprotech、Inc.)を、23.6〜0.185nM(2倍連続希釈)の濃度範囲で90秒間注入し、次に15分間解離させた。IL-13変異体サンプルは100μg/mlのBSAを含むHBS-P中で調製した。二重参照用に混在させた数種のバッファー注入によって、全てのサンプルを三連でランダムに注入した。高密度のヤギαヒト抗体表面を、各サイクル後に146mMのリン酸(pH1.5)の1回の15秒間パルスによって再生した。100μL/分の流速を全ての変異体IL-13注入サイクルに使用した。センサグラムのデータはScrubber 1.1gを使用して処理し、Clamp 2000において質量移動の観点を含めて1:1相互作用モデルに適合させた。生じた結合定数は表21に列挙する。2つのモノクローナル抗体に関するデータセットは質が高く、高い再現性を示した。1:1相互作用モデルは、2つのIL-13/モノクローナル抗体複合体を適切に記載した。
【０３２２】
【表２５】
2008520684.tif 000043
【０３２３】
(実施例14:IL-13およびIL-13Q110R変異体誘導型エオタキシン生成の阻害)
この実施例は、IL-13の変異体を阻害しエオタキシン生成を阻害する、抗体の能力に関する他のデータを与える。抗IL-13抗体は、HDFa細胞、IL-13Rα1、IL-13Rα2およびIL-4Rαを発現する初代ヒト皮膚線維芽細胞系においてエオタキシン生成を阻害する、それらの能力に関して試験した。96ウエルプレートに4000細胞/ウエルで一晩細胞を接種した。別個に、IL-13またはIL-13Q110Rを、抗IL-13抗体有りまたは無しで10nMの初期濃度300pMで、37℃において1時間プレインキュベートした。IL-13またはIL-13Q110Rおよび抗体混合物を、50ng/mLのTNFαで処理した細胞に次いで加え、37℃において2日間インキュベートした。この時点で上清を回収し、定量ELISAを使用してエオタキシンの存在に関して分析した。これらの実験は、三連のデータポイントで2回または3回実施した。これらの結果は以下の表22に表す。このアッセイで測定したIL-13のIC50も含まれる。図11A〜Dは、イソ型一致対照、例えばIgG2対照モノクローナル抗体と比較した、IL-13またはIL-13Q110R変異体によって、組換え抗体623および731によって誘導される、エオタキシン放出の阻害率を示す。
【０３２４】
【表２６】
2008520684.tif 000044
【０３２５】
(実施例15:623および731によるin vitroでのIL-13の生物活性の中和)
この実施例は、HDLM-2およびL-1236細胞増殖、2つのIL-13応答性ホジキンリンパ腫由来細胞系を阻害する抗体の能力を実証する。これらの細胞系はIL-13を分泌するだけでなく、おそらくオートクリンまたはパラクリン機構によって、成長因子としてこのサイトカインを使用することが示されてきている(Trieu et al、Claudio JO et al、Soluble interleukin-13Ralpha2 decoy receptor inhibits Hodgkin's lymphoma growth in vitro and in vivo、Cancer Res、64: 3271〜3275 (2004))。関連化合物との72時間のインキュベーション後、3H-チミジンの取り込みによって細胞増殖を評価した。阻害剤の存在下での細胞増殖率を、細胞のみの対照ウエル(100%生成)と比較して計算した。値はIL-13阻害濃度(nM)対細胞増殖率としてプロットした。データは5回(L-1236アッセイ)および4回(HDLM-2アッセイ)の実験の平均を表す。mAb623およびmAb731によるIL-13の中和は、2つの細胞系の増殖の用量依存的阻害をもたらした(図12Aおよび図12B)。mAb623はL-1236増殖アッセイにおいて390pMのEC50s(図12A)、HDLM-2増殖アッセイにおいて4.5nMを有していた(図12B)。731はL-1236増殖アッセイにおいて5.2pMのEC50s(図12A)、HDLM-2増殖アッセイにおいて0.18nMを有していた(図12B)。hIL-13Rα2/FcはL-1236増殖アッセイにおいて59pMのEC50s(図12A)、HDLM-2増殖アッセイにおいて0.6nMを有していた(図12B)。HDLM-2およびL-1236細胞の上清において測定したIL-13のレベルは、それぞれ2.6ng/mlおよび118pg/mlであった。
【０３２６】
(実施例16:Bリンパ球におけるIL-13誘導型のCD23発現の阻害)
IL-13は、Bリンパ球においてCD23の上方制御を誘導することが示されてきている(Punnonen et al、Interleukin13 induces interleukin4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells、Proc Natl Acad Sci U S A、90: 3730〜3734 (1993))。この実施例は、全血中のBリンパ球におけるCD23のIL-13誘導型発現を阻害する、mAb623およびmAb731の能力を実証する。高濃度のmAb623、mAb731またはイソ型対照を、組換えヒトIL-13(10ng/ml)の存在下でヒト全血に加えた。24時間後37℃において、B細胞は抗CD19および抗CD23抗体を使用して免疫染色し、FACSによって分析した。結果(図13)は、IL-13のみを含む対照ウエルと比較した、CD19+細胞上の表面CD23のGeometric平均値として表した。データは4(hIL-13Rα2/Fc)、6(731)および11(623およびhIgG2)ドナーの平均を表す。
【０３２７】
mAb623およびmAb731によるIL-13の中和は、それぞれ6.2nMおよび0.87nMのIC50でCD23発現の用量依存的阻害をもたらした。hIL-13Rα2/Fcは、4.0nMのIC50を有していた(図13)。
【０３２８】
(実施例17:喘息モデルにおけるmAb623および731の他の試験)
前に記したように、mAb623およびmAb731はマウスIL-13と交差反応しないので、ヒトIL-13遺伝子をコードするcDNA(Lexicon、The Woodland、Texan)の導入によるマウスIL-13遺伝子の遺伝的阻害によって、129×C57BL/6マウスからヒト化IL-13マウスを作製した。
【０３２９】
IL-13ヒト化マウスにおける他の卵白アルブミン(OVA)誘導型喘息:予防的試験
mAb623およびmAb731の固定用量での予防的OVA試験
この実験は、24日間のプロトコルを使用して前の実施例3と同様の形式で実施した。気道中で低下するOVA誘導型粘液生成に対する抗体の有効性に関してサンプルを調べた。したがって、この実施例は、喘息および類似のIL-13関連障害の治療における抗体の有効性を実証する。
【０３３０】
気道上皮の粘液含量に対するmAb623およびmAb731の影響を調べるために、肺切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびに過ヨウ素酸-シッフ(PAS)で染色した。肺切片(動物1匹当たり1切片)を20倍の倍率で調べた。各切片中の5つの領域をランダムに選択した。各領域において、各気管支中のPAS陽性杯状細胞の割合を測定した。データはPAS陽性杯状細胞/気管支の平均的割合として表す。データは平均±SEである(図14に示す)。対照群では、気管支当たりの粘液含有杯状細胞の数は4%未満である。OVA攻撃によってOVA群中で19%、OVA+IgG2群中で37%に気管支中の粘液含有細胞の数が増大した。この図において観察することができるように、mAb623を用いた治療によって気管支中の粘液含有細胞の割合が9%に低下した。mAb731を用いた治療によって、気管支中の粘液含有細胞の割合が2%に低下した。
【０３３１】
気道中の白血球動員に対するmAb623およびmAb731の影響をさらに調べるために、AHR測定(実施例3)後、マウスを殺し、1mlのPBSで二回肺を洗浄することによって、気管支肺胞洗浄液(BALF)を回収した。サイトスピン調製物を光学顕微鏡で調べることによって細胞数を測定した。データは平均±SEであり図15に示す。623または731を用いた治療は、BALFにおけるOVA誘導型白血球動員に対して顕著な影響はなかった。
【０３３２】
mAb623およびmAb731の予防的用量応答OVA
この実施例は、BALF中のOVA誘導型AHR、粘液生成および白血球動員に対する、mAb623およびmAb731の阻害効果の用量依存性を実証する。マウスは前に実施例3に記載した24日間のプロトコルに従い免疫処置した(図8のデータを得るために使用した)。第13日および第20日に、mAb623またはmAb731のいずれかを0.3、1、3または10mg/kgの用量で腹腔内投与した。対照マウスにはPBS、またはイソ型対照として無関係なIgG2(10mg/kg)を与えた。APTIは(図8に関して)前に記載したのと同様に測定した。n=4マウス/群、PBS、およびOVA群中;n=6マウス/群、PBS+IgG2、およびOVA+IgG2群中;n=7マウス/群、OVA+623(3mg/kg)、およびOVA+731(0.3mg/kg)群中;n=8マウス/群、OVA+623(10mg/kg)、OVA+623(1mg/kg)、OVA+623(0.3mg/kg)、OVA+731(10mg/kg)、OVA+731(3mg/kg)、およびOVA+731(1mg/kg)群中。データは平均±SEである。0.3mg/kgの用量では、623も731もOVA誘導型AHRを阻害しなかったが、一方、1mg/kg以上の用量では、アセチルコリンに対するAHRをベースライン(PBS)まで阻害した(図16参照)。
【０３３３】
この実施例項は、OVA誘導型粘液生成に対するmAb623およびmAb731の阻害効果の用量依存性をさらに実証する。肺を回収し(図14に関して)前に記載したのと同様に処理した。データはPAS陽性杯状細胞/気管支の平均的割合として表す。データは平均±SEである。mAb623とmAb731の両方が、OVA治療マウスの気道中のPAS陽性細胞の割合の同様の用量依存的阻害を示した(図17)。
【０３３４】
この実施例項は、mAb623およびmAb731は、試験した如何なる用量でもBALFにおけるOVA誘導型白血球動員を阻害しなかったことをさらに実証する(図18)。BALFを回収し、細胞計数を前に記載したのと同様に行った(図15参照)。データは平均±SEである。
【０３３５】
この実験では、10mg/kgの用量で試験したイソ型対照IgG2は、OVA誘導型AHRを85%阻害した。他方で、イソ型対照IgG2は粘液過剰生成に対して全く影響がなく、OVA群と比較して146%のBALF中の白血球数の明らかな増大を引き起こした。したがって、抗体の有効性のある程度の変動は予想され、この変動の克服は本発明の教示および当業者の知識に照らしてみれば容易なことであろう。これらの結果は、BALFにおけるOVA誘導型白血球動員の阻害の個々の表現型を観察するために、高レベルの抗体が必要とされる可能性があることを示す。
【０３３６】
(実施例18:IL-13ヒト化マウスにおけるイエダニ(HDM)誘導型喘息:予防的および治療的試験)
mAb623およびmAb731用量応答性予防的HDMの実施例
家の埃の主なアレルゲンはダニに由来する。この実施例は、臨床上関連がある喘息モデルの代表的なアレルゲンを使用する。当業者はこの実施例、およびヒトを含めた他の生物における抗体の有効性を代表するその結果を考えるはずである。
【０３３７】
第1、7および14日に、50μlのPBSに溶かしたHDM(100μg)を3回気管内投与することによってマウスを攻撃した。第-1、6および13日に、623または731のいずれかを10、3、1、0.3mg/kgの用量で腹腔内投与した。対照マウスには10mg/kgの用量でPBS、またはイソ型対照(例えば陰性対照)として無関係なIgG2を与えた。第17日に、アセチルコリンの静脈内投与に対するマウスの気道反応性を、前に記載したのと同様に測定した(図8)。n=2マウス/群、PBS群中;n=3マウス/群、HDM、HDM+IgG2群中;n=4マウス/群、PBS+IgG2群中;n=6マウス/群、HDM+731(10mg/kg)、およびHDM+731(0.3mg/kg)群中;n=8マウス/群、HDM+623(10mg/kg)、HDM+623(3mg/kg)、OVA+623(1mg/kg)、HDM+623(0.3mg/kg)、HDM+731(3mg/kg)、およびHDM+731(1mg/kg)群中。データは平均±SEである。結果は図19に示す。0.3mg/kgの用量では、623および731はHDM誘導型AHRに対して全く影響がなく、一方1mg/kg以上の用量ではベースラインレベルにAHRを阻害した(図19)。HDMおよびHDM+IgG2群中の動物は少数であったため、これらの群中で測定したAHRは非常にさまざまであった(それぞれHDMおよびHDM+IgG2群中でAPTI579±463および415±213)。10mg/kgの用量においてmAb623は、HDMで攻撃したマウス(PBS群)の肺中のPAS陽性細胞の割合をベースラインまで低下させた。
【０３３８】
前に記載したのと同様の形式で、IL-13ヒト化マウスにおけるmAb623mAb731による、HDM誘導型粘液生成の阻害の用量応答性を調べた。肺を回収し、図14に関して記載したのと同様に処理し、これらを調べた。データはPAS陽性杯状細胞/気管支の平均的割合として表す。データは平均±SEである。10mg/kgの用量において、mAb623はPAS陽性細胞の割合をベースラインまで低下させ、一方さらに低い用量はそれほど有効ではなかった。0.3mg/kgの用量では、mAb731はPAS陽性細胞の割合に対して全く影響がなかったが、さらに高い用量では、mAb731はPAS陽性細胞の割合をベースラインレベルまで低下させた(PBS群)(図20)。
【０３３９】
前に記載したのと同様の実験で、mAb623およびmAb731を試験し測定して、1mg/kgの用量で始めて用量依存式にHDM誘導型白血球動員を阻害した(図21参照)。BALFを回収し、細胞計数を図15のデータに関して記載したのと同様に行った。データは平均±SEである。イソ型対照は、BALF中でHDMによって動員された白血球の数の明らかな増大を引き起こした(それぞれHDM+IgG2およびHDM群における198±42 103細胞/BALF1mlと比較して497±156)。
【０３４０】
mAb623固定用量治療的および予防的HDM試験
この実施例は、HDMモデルにおける治療および予防としての、mAb623の有効性を実証する。この実施例では、3つの異なるスケジュール:i)それぞれのHDM攻撃の1日前(予防的治療);ii)最後のHDM攻撃の1日前およびiii)最後のHDM攻撃と同日(療法的治療)に従い100μg/マウスの固定用量でmAb623を投与した。アレルギーの表現型は最後のHDM攻撃後第3日に評価した。したがって、抗体の投与のタイミング、およびその結果生じる有効性を測定した。他の実施形態では、この手法を他の抗体に適用することができる。
【０３４１】
第1、7および14日に、50μlのPBSに溶かしたHDM(100μg)を3回気管内投与することによってマウスを攻撃した。623またはIgG2イソ型対照を、3つの異なるスケジュール:第-1、6および13日(予防的治療)、第13日または第14日(治療的治療)で、100μg/マウスの用量で腹腔内投与した。対照マウスにはPBS、またはイソ型対照として無関係なIgG2を与えた。第17日に、アセチルコリンの静脈内投与に対する気道反応性およびBALFにおける白血球浸潤を、前に記載したのと同様に測定した(図8および図15参照)。n=8マウス/群、PBS、HDM、HDM+IgG2(第-1、6および13日)、HDM+IgG2(第13日)、HDM+IgG2(第14日)、HDM+623(第13日)群中;n=10、HDM+623(第-1、6および13日)、HDM+623(第14日)群中。データは平均±SEである。図22Aに示すように、それぞれのHDM攻撃前に予防的に投与すると、mAb623はHDM誘導型AHRを完全に阻害した。さらにmAb623は、最後のHDM攻撃前に療法的に投与すると、HDM誘導型AHRを完全に阻害した。対照的に、最後の攻撃と同日の治療的投与は、AHRに対してほとんど影響がなかった(図22A)。mAb623は、それぞれのHDM攻撃前に予防的に投与するとBALFにおける白血球動員を阻害した(図22B)。
【０３４２】
当業者によって理解されるように、これらの抗体を特徴付けするために使用する実施例は、IL-13に対する任意の抗体およびその変異体に容易に適合させることができる。したがって、この実施例は、本明細書に開示する抗体、または抗体の変異体がIL-13活性を変える際に機能することができるかどうかを、どのようにして当業者が容易かつ普通に決定することができるかを表す。
【０３４３】
当業者によって理解されるように、前述の結果は抗体の予防的態様に焦点をあてることが多いが、前述の方法および結果は療法としての治療法に広げることができる。例えば、ひとたびIL-13関連障害に罹患している対象を同定した後、有効量の抗体を投与することができる。当業者によって理解されるように、予防的使用の量と比較して、追加的な量の抗体が必要とされる可能性がある。例えば、加える量は前に記載した予防に関する量の1〜10、10〜100、100〜1000倍以上であってよい。障害が多量のIL-13をもたらす場合、あるいは多量のIL-13を除去して障害の症状を低下させなければならないとき、これが必要とされる可能性がある。他の状況では、障害を予防するためよりもIL-13関連障害を有する対象を治療するために、少量の抗体が必要とされる可能性がある。例えば、1回用量の抗体が実質的に全ての過剰なIL-13と結合し除去するのに充分である状況、一方で障害を予防するために、同等の量、ただし連続的に投与される量を投与しなければならない可能性がある。さらに、さまざまな方法、例えば静脈内投与でこの量を投与することができ、望むならば連続的にこの量を投与することができる。前述の結果は、これらの抗体が治療および予防として働くという事実と完全に一致し示唆する。当業者によって理解されるように、多数回および/または連続投与、例えば対象の生命に関する治療が幾つかの状況で必要とされる可能性がある。
【０３４４】
さらに、当業者によって理解されるように、個々の宿主の性質も治療の形式および量に影響を与える可能性がある。例えば、障害(例えば喘息)が慢性である(化合物に本来敏感でありそれに感作させる必要がない)対象では、より有効な手段(例えば皮下の代わりに静脈内)によって長時間与える追加的な量は、前述の結果および当業者の知識に照らして、高い作用の可能性を有すると予想されるはずである。例えば、前述のモデルおよび用量は急性の感染モデルの代表的なものである可能性があるが、前に記載したように投与するとき、慢性モデルの1つの形において(例えば、長時間さまざまな物質に曝したサルにおいて)前述の用量は不充分である可能性がある。この結果は当業者が予想するであろうことと一致する、何故なら高レベルのIL-13は追加的な量の抗体を理論上必要とするはずだからである。さらに当業者は、さらに多量の抗体を充分頻繁に投与すると、前に記載したのと同じまたは類似の結果が生じると予想するはずである。本出願人はこれがPCT公開No.WO2005/007699に示される結果と一致することを記し、低レベルのIL-13に対する抗体はサルモデルにおいて実質的に有効ではなかったが、高レベルの抗体は有意かつ予想された結果をもたらしたことを実証する。前に記したように、(任意のIL-13依存性障害に)必要とされる抗体のレベルを測定することができる1つの方法は、対象中のバイオマーカーのレベルを調べることによる方法である。これらのバイオマーカーの例は本明細書に記載する。
【０３４５】
(実施例19:IL-13依存性バイオマーカーの特徴付け:IL-13ヒト化マウスのOVA誘導型喘息モデルにおけるTARC、エオタキシン、およびC10の血清レベルに対するmAb623の影響)
この実施例は、臨床設定で使用することができる血清IL-13依存性バイオマーカーを実証し確認する。OVA誘導型TARC、C10およびエオタキシンの血清レベルをマウスにおいて測定し、これらのレベルに対するIL-13阻害の影響を試験した。(IL-13はTARC、C10およびエオタキシンの放出を誘導することは示されてきている。(例えばMa et al、The C10/CCL6 chemokine and CCR1 play critical roles in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling、J Inmunol、172(3): 1872〜81 (2004); Zhu et al、IL-13-induced chemokine responses in the lung: role of CCR2 in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling、J Immunol.168(6): 2953〜62 (2002); Nomura et al、Interleukin-13 induces thymus and activation-regulated chemokine (CCL17) in human peripheral blood mononuclear cells、Cytokin、20 (2): 49〜55 (2002); Zhu et al、Pulmonary expression of interleukin-l3 causes inflammation、mucus hypersecretion、subepithelial fibrosis、physiologic abnormalities、and eotaxin production、J Clin Invest、103 (6): 779〜88 (1999))を参照)。当業者によって理解されるように、この手法に略述される技法を使用して、他のマーカーを同定することもできる。
【０３４６】
A/J野生型マウスにおけるOVA誘導型喘息の研究を最初に実施して、血清中のTARC、エオタキシンおよびC10の誘導の時間を確定した。第1日および7日に、マウスをOVA(25μgのOVA、2mgミョウバン中、腹腔内)または対照としてミョウバンで免疫処置した。第14、15および17日に、マウスにケタミンおよびキシラジン[それぞれ45および8mg/Kg]の混合物で麻酔をかけ、OVA(750μg、5OμL、鼻腔内)または対照として等体積のPBSで攻撃した。最後の攻撃の3、6および24時間後に血液を回収した。血清中のTARCおよびエオタキシンのレベルをELISA(Duoset、R&D System)によって測定した。血清中のC10のレベルはサンドイッチELISAによって測定した。簡単に言うと、血清サンプルは抗C10抗体(R&D System)コーティングプレート上に1時間おいて1:2で滴定した。ビオチン化抗C10検出用抗体(R&D System)を加え、次に1μg/mLのストレプトアビジン-HRPをインキュベートした。捕捉C10はTMB基質反応を使用して測定し、各サンプル中のng/ml値はプレートの標準曲線から定量した。n=6マウス/群。データは平均±SEである。OVA/OVA群では、血清中のTARCおよびエオタキシンのレベルは、ミョウバン/PBS群と比較して3および6時間で増大した。血清中のTARCのレベルは、3および6時間より低い程度ではあったがミョウバン/PBS群と比較して24時間で依然として高く、血清中のC10のレベルはミョウバン/PBS群と比較して3、6および24時間で増大し、24時間で最大の誘導であった(結果は図23、図24、および図25に示す)。
【０３４７】
次に、IL-13ヒト化マウスを使用して、血清中のTARC、エオタキシンおよびC10のレベルを阻害するmAb623の予防的投与の能力を評価した。当業者によって理解されるように、任意の本発明の抗体にこれを使用することができる。
【０３４８】
図23、図24、および図25に関して記載したOVA誘導型喘息用プロトコルに従いマウスを免疫処置した。試験の第13、15および17日に100μg/マウス(5mg/kg)の用量でmAb623を腹腔内投与した。対照マウスにはPBS、またはイソ型対照として無関係なIgG2を与えた。最後の攻撃の1および4時間または2および6時間後に血液を回収した。血清中のTARCのレベルをELISA(Duosetキット、R&D System)によって測定した。n=15マウス/群、OVA群中(1および4時間の群に関してn=8、および2および6時間の群に関してn=7);n=14マウス/群、OVA+IgG2群中(1および4時間の群に関してn=7、および2および6時間の群に関してn=7);n=17マウス/群、OVA+623群中(1および4時間の群に関してn=8、および2および6時間の群に関してn=9);n=15マウス/群、ミョウバン群中(1および4時間の群に関してn=7、および2および6時間の群に関してn=8)。データは平均±SEである。mAb623はTARCの誘導を阻害し、2および4時間の時間地点で最大の誘導であった(図26参照)。したがってTARCは適切なマーカーであるようである。
【０３４９】
エオタキシンに対する影響を追跡するために、図26に関して前に記載し論じたのと同様にマウスを治療した。血清中のエオタキシンのレベルをELISA(Duosetキット、R&D System)によって測定した。データは平均±SEである。mAb623は1、2、4および6時間でエオタキシンの誘導を阻害した(図27参照)。したがってエオタキシンは適切なマーカーであるようである。
【０３５０】
C10のレベルに対する影響を追跡するために、図26に関して前に記載したのと同様にマウスを治療した。血清中のC10のレベルは、図25に関して前に記載したのと同様にELISAによって測定した。データは平均±SEである。mAb623は、試験したいずれの時間地点でもC10のレベルに対して目に見える影響がほとんどなかった(図28)。(例えば、図25に示すように)C10はピークに達するまで長い時間があり、バイオマーカーとしての抗体由来のC10およびバイオマーカーとしてのC10の使用に対する影響を見るためには、さらなる時間がおそらく必要とされると考えられる。
【０３５１】
したがって、前に開示した方法によって当業者は、IL-13関連障害の追跡およびその治療において有用である可能性がある、他のマーカーを同定することが容易にできるはずである。
【０３５２】
(実施例20:mAb623および/またはmAb731を与えた対象におけるバイオマーカーの使用)
この実施例は、前に特徴付けしたバイオマーカーの1つなどのバイオマーカーをどのように使用して、対象に投与する抗体の量または頻度を調べ調節することができるかを略述する。
【０３５３】
喘息を有する対象を同定する。対象にはそれぞれ個々の時間単位で、例えば1〜10mg/kgの開始量のmAb623および/または731を投与する。この後、対象におけるエオタキシンのレベルを1時間毎にELISAによって測定した。投与するモノクローナル抗体の量および/または頻度は、エオタキシンのレベルが対象に関する適切な治療を示すレベルに低下するまで増大する。このレベルは任意の有意な減少、例えば前の実験に示される任意の減少、または抗体の投与によって得ることができる最大の減少であってよい。ひとたびこの減少を観察すると、抗体の投与の量および/または頻度を一定に保つことができ、かつ適切な場合さらに減少させることができる。したがってバイオマーカーによって、必要とされる抗体の最適量を決定することができる。
【０３５４】
当業者によって理解されるように、この実施例によって当業者は、それぞれの対象に充分または治療上充分な量の抗体が何であり得るかを決定することができる。開始量の抗体を投与することによって、バイオマーカーの存在が減少し始めるまで抗体の量を増大させることができ、これによって対象に治療上充分な量または用量を同定することができる。さらに、このことを使用して、どのようにして(例えば皮下、静脈内など)およびどの程度頻繁に(例えば1回、2回以上の投与、時間単位当たり、連続的など)、抗体を望ましい結果のために投与すべきかを確認することもできる。当業者によって理解されるように、任意の抗体、特に本明細書に列挙する抗体を任意のIL-13関連障害に使用することができるはずである。
【０３５５】
(実施例21:診断用物質としてのバイオマーカーの使用)
この実施例は、どのようにしてバイオマーカーを使用して、IL-13関連障害を有する患者を同定することができるかを詳述する。健康な個体(例えば、IL-13関連障害を有していない対象)に存在するエオタキシン、TARC、および/またはC10のレベルを確認する。この後、他の対象中のエオタキシン、TARC、および/またはC10のレベルを特徴付けする。(健康な個体と比較して)高レベルのエオタキシン、TARC、および/またはC10を有する対象は、IL-13関連障害に罹患している対象であろう。さらなる確認のために、高レベルのエオタキシン、TARC、および/またはC10を有する対象は、健康な対象中の他のバイオマーカーのレベルに匹敵するその他のバイオマーカーのレベルをさらに有し得る。
【０３５６】
したがって、この実施例は、当業者がIL-13関連障害または疾患を有する患者を同定するのを可能にする1つの方法を与える。あるいは、対象中のIL-13のレベルまたは対象中のIL-13の性質を調べて、IL-13関連障害を有していない対象と比較することができる。例えば、本発明で開示する抗体の1つを診断用物質として使用することができ、対象の入手可能なIL-13の任意の変化の検出、および健康な標準対照の量、または病気前の個体の量(例えば、内対照)と検出した量の比較を可能にする。
【０３５７】
当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態では、それぞれのIL-13関連障害は、エオタキシン、TARCまたはC10の増大と必ずしも関係がある必要はないはずである。異なる疾患は異なるバイオマーカー、幾つかの前述のバイオマーカーの部分集合を有する可能性があり、幾つかのIL-13関連障害はバイオマーカーを全く有していない可能性がある。
【０３５８】
前述の実施例を使用して、本明細書で論じるIL-13関連障害の1つに罹患している個体の同定を手助けすることができる。したがって幾つかの実施形態では、バイオマーカー検出剤(例えば、バイオマーカーに対する抗体)の使用は、診断用物質としてである。他の実施形態では、実施例5に記載したのと同様に、抗体自体を診断用ツールとして使用して、高レベルのIL-13を有する患者を同定することができる。抗体のKDは知られているので、サンプル中のIL-13とモノクローナル抗体の結合によってサンプル中のIL-13の量を測定することができる。
【０３５９】
(実施例22:IL-13関連障害の測定)
この実施例は、障害がIL-13関連または依存性障害であるか決定することができる1つの方法を実証する。候補障害を有する対象を同定する。これは個体群から対象をランダムに選択することによって行うことができる。他の実施形態では、本明細書に開示する障害の1つに特徴的である症状を示す候補を選択することによって、それを行うことができる。対象のエオタキシン、TARC、および/またはC10のレベルを調べる。患者には10mg/kgのmAb623または731を投与する。対象のエオタキシン、TARC、および/またはC10のレベルを再度調べる。これは多数回繰り返すことができる。バイオマーカーのレベルの低下を観察する場合、したがってその障害はIL-13関連障害として特徴付けることができる。
【０３６０】
他の実施形態では、多量の抗体を抗体の連続投与において使用する。他の実施形態では、3つ全てのバイオマーカーを調べ、3つ全てがIL-13関連障害として特徴付けられる障害の低下を示すはずである。他の実施形態では、候補障害の症状の低下とバイオマーカーの減少をさらに関連付ける。
【０３６１】
当業者によって理解されるように、本出願は多数の抗体および試験したそれらの機能を略述するが、当業者は1個のアミノ酸(または数個のアミノ酸)によって抗体を容易に調節し、「新たな」抗体を得ることができるはずである。このような抗体変異体を試験するために、前に開示した実施例のいずれかまたは全てを繰り返して、抗体が望むように機能するかどうか決定することができる。
【０３６２】
当業者によって理解されるように、前述の実施例は幾つかの結果および個々の抗体の得方を略述し、しかしながら、本教示に照らして、当業者は前述の実施例および実施形態において他の抗体、または他の類似の抗体を容易に施用することができるはずである。
【０３６３】
均等物
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに充分であると考えられる。前述の記載事項および実施例は本発明の幾つかの好ましい実施形態を詳述し、本発明者によって企図される最良の形態を記載する。しかしながら、前述の事項を本文中でどれほど詳述しようとも、本発明は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従い、本発明を解釈すべきであることは理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０３６４】
【図１】それぞれのウエルに関する中和データに対する相対的抗体濃度のプロットを示す図である。このデータを使用して、最高有効度の抗体を含むウエルを確認した。
【図２】31ng/mLの抗原コーティングにおける、それぞれの抗体のELISAのODと抗体濃度の関係を示すプロットである。
【図３】イソ型一致対照と比較した組換え抗体643および731によるIL-13誘導型エオタキシン放出の阻害率を示すグラフである。
【図４】731または623とIL-13コーティングELISAプレートの結合を阻害するIL-13またはIL-13Q11ORの能力を比較する棒グラフである。
【図５Ａ】抗体643とイソ型対照の間の細胞受容体の競合を比較する棒グラフである。
【図５Ｂ】抗体731とイソ型対照の間の細胞受容体の競合を比較する棒グラフである。
【図５Ｃ】図5Aおよび図5Eからのプロトコルおよびさまざまな予想結果を示す図である。
【図５Ｄ】図5Bからのプロトコルおよびさまざまな予想結果を示す図である。
【図５Ｅ】抗体623とイソ型対照の間の細胞受容体の競合を比較する棒グラフである。
【図６Ａ】抗体693によって認識されるファージディスプレー誘導ペプチドおよびIL-13配列の一部のアラインメントを示す図である。
【図６Ｂ】IL-13(配列番号72)の二次構造を示す図であり、キメラタンパク質を構築するためにヒトIL-13のどの領域をマウスIL-13と置換したかを示す図である。
【図７Ａ】ヒト化IL-13マウス由来のCD4+T細胞は、マウスIL-13ではなくヒトIL-13を生成することを示す棒グラフである。
【図７Ｂ】ヒト化IL-13マウス由来のCD4+T細胞は、マウスIL-13ではなくヒトIL-13を生成することを示す棒グラフである。
【図８】抗IL-13抗体731および623が、気道過敏反応性を阻害することを実証するグラフである。
【図９】731および623が、粘液生成を阻害することを実証する棒グラフである。
【図１０】mAb623の結合部位を強調するアミノ酸配列を示す図である。
【図１１Ａ】イソ型一致対照と比較した、IL-13またはIL-13Q110R変異体によって、組換え抗体623および731によって誘導される、エオタキシン放出の阻害率を示すグラフである。
【図１１Ｂ】イソ型一致対照と比較した、IL-13またはIL-13Q110R変異体によって、組換え抗体623および731によって誘導される、エオタキシン放出の阻害率を示すグラフである。
【図１１Ｃ】イソ型一致対照と比較した、IL-13またはIL-13Q110R変異体によって、組換え抗体623および731によって誘導される、エオタキシン放出の阻害率を示すグラフである。
【図１１Ｄ】イソ型一致対照と比較した、IL-13またはIL-13Q110R変異体によって誘導されるエオタキシン放出の組換え抗体623および731による阻害率を示すグラフである。
【図１２Ａ】623および731によるL-1236細胞系増殖の阻害を実証するグラフである。mAb623、mAb731またはイソ型一致対照は、0.017〜330nM(滴定1:3)の最終濃度でプレートに加えた。
【図１２Ｂ】623および731によるHDLM-2細胞系増殖の阻害を実証するグラフである。mAb623、mAb731またはイソ型一致対照は、0.017〜330nM(滴定1:3)の最終濃度でプレートに加えた。
【図１３】mAb623および731およびhIL-13Rα2Fcの、全血B細胞におけるCD23発現に対する影響を示すグラフである。
【図１４】mAb623およびmAb731による、IL-13ヒト化マウスにおけるOVA誘導型粘液生成の阻害を示すグラフである。
【図１５】mAb623または731を用いた治療が、BALFにおけるOVA誘導型白血球動員に対して観察可能な影響がほとんどなかった実験を示すグラフである。
【図１６】ヒト化IL-13マウスにおける623および731による、用量応答的なOVA誘導型AHRの阻害を示すグラフである。
【図１７】623および731による、IL-13ヒト化マウスにおけるOVA誘導型粘液生成の用量応答的な阻害を示すグラフである。
【図１８】IL-13ヒト化マウスのBALFにおける、623および731のOVA誘導型白血球浸潤に対する用量応答的な影響を示すグラフである。
【図１９】IL-13ヒト化マウスにおける623および731の用量応答による、HDM誘導型AHRの用量応答的な阻害を示すグラフである。
【図２０】IL-13ヒト化マウスにおける623および731による、HDM誘導型粘液生成の用量応答的な阻害を示すグラフである。
【図２１】IL-13ヒト化マウスにおけるBALF中のHDM誘導型による白血球浸潤に対する623および731の用量応答的な阻害を示すグラフである。
【図２２Ａ】IL-13ヒト化マウスにおけるHDM誘導型AHRおよびBALF中の白血球浸潤に対する予防的および治療的623投与の影響を示すグラフである。
【図２２Ｂ】IL-13ヒト化マウスにおけるHDM誘導型AHRおよびBALF中の白血球浸潤に対する予防的および治療的623投与の影響を示すグラフである。
【図２３】野生型マウスにおけるOVAで誘導されたTARCの血清中レベルを示すグラフである。
【図２４】野生型マウスにおけるOVAで誘導されたエオタキシンの血清中レベルを示すグラフである。
【図２５】野生型マウスにおけるOVAで誘導されたC10の血清中レベルを示すグラフである。
【図２６】IL-13ヒト化マウスにおけるOVAで誘導されたTARCの血清中レベルのmAb623による阻害を示すグラフである。
【図２７】IL-13ヒト化マウスにおけるOVAで誘導されたエオタキシンの血清中レベルのmAb623による阻害を示すグラフである。
【図２８】IL-13ヒト化マウスにおけるOVAで誘導されたC10の血清中レベルに対するmAb623による治療の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL-13と結合し、170pM未満のKDでヒトIL-13と結合する単離ヒト抗体。
【請求項２】
50pM未満のKDでIL-13と結合する、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項３】
気道過敏症を抑制することができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項４】
気道過敏症の完全な逆転を可能にする、請求項3に記載の単離ヒト抗体。
【請求項５】
肺での粘液生成を減少させることができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項６】
少なくとも約30%の粘液生成の減少を可能にする、請求項5に記載の単離ヒト抗体。
【請求項７】
慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、および喘息からなる群から選択されるIL-13関連障害を抑制することができる、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項８】
α1IL-13受容体とIL-13の結合に干渉するようにIL-13と結合する、請求項1に記載の単離ヒト抗体。
【請求項９】
前記抗体が170pM未満のKDでIL-13およびIL-13Q110Rと結合し、互いの50%以内のKDでIL-13とIL-13Q110Rの両方と結合する、IL-13に対する単離ヒト抗体。
【請求項１０】
同じKDでIL-13およびIL-13Q110Rと効果的に結合する、請求項9に記載の単離ヒト抗体。
【請求項１１】
IL-13関連障害を治療するための医薬品の調製における有効量のIL-13と結合するヒト抗体の使用であって、単離ヒト抗体が170pM以下のKDでIL-13と結合する使用。
【請求項１２】
前記IL-13関連障害が気道過敏症、粘液生成、喘息またはこれらの幾つかの組合せからなる群から選択される、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
抗体が約10pM以下のKDを有する、請求項11に記載の使用。
【請求項１４】
IL-13関連障害がホジキンリンパ腫である、請求項11に記載の使用。
【請求項１５】
前記有効量が少なくとも、HDLM-2、L-1236細胞、またはこれらの幾つかの組合せの少なくともある程度の細胞増殖を阻害するのに充分な量である、請求項11に記載の使用。
【請求項１６】
前記IL-13関連障害がCD23の発現と関係がある、請求項11に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体がIL-13のアミノ酸21〜33、109〜121、111〜128、45〜108、70〜80、83〜92、または20〜29からなるポリペプチドと特異的に結合する、請求項1または9に記載の単離ヒト抗体。
【請求項１８】
α1IL-13受容体との相互作用によるIL-13シグナル伝達を低下させるようにIL-13と結合する、単離ヒト抗体。
【請求項１９】
抗体がIL-13と結合するときIL-13がα2IL-13受容体と結合することができ、かつ抗体がIL-13と結合するとき抗体がα1IL-13受容体とIL-13の相互作用によるIL-13シグナル伝達を低下させる、請求項18に記載の単離ヒト抗体。
【請求項２０】
IL-13と結合するとき抗体がIL-13とα1IL-13受容体の結合に干渉し、IL-13と結合するとき抗体がIL-13とα2IL-13受容体の結合に干渉し、かつIL-13と結合するとき抗体がIL-13とIL-4受容体を結合させる、請求項18に記載の単離抗体。
【国際調査報告】
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