(57)【要約】  本発明は、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のためのプロセスであって、ここで、増加したＯＤＣ活性は、増加した翻訳および／または転写効率によるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって得られ、そして微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収される、プロセスに関する。好適な実施形態では、（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡおよびアグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ；または（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡおよびアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＡ、およびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＢ、ならびに場合によりまた、アグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢのいずれかの過剰発現によっても増加した酵素活性が得られる。本発明はまた、増加したレベルの活性で、１つもしくはそれ以上の上記の酵素活性を担持するベクター、プラスミドおよび宿主に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のための方法であって、
増加したオルニチンデカルボキシラーゼ活性は、増加した翻訳および／または転写効率によるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって得られ、そして微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
増加した翻訳および／または転写効率は、強力な調節プロモーターの使用、好ましくは、強力な誘導性プロモーターの使用によって得られる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増加した翻訳および／または転写効率は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導性の強力なプロモーターの使用によって得られる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
増加した翻訳および／または転写効率は、Ｔ７、Ｔ５、ｐｔａｃ、およびｐｌａｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの使用によって得られる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、リボソームによるＲＮＡ−テンプレートの良好な認識を達成するためにＲＢＳが適用される前記遺伝子のコーディング領域の上流に局在するリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はオルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦまたはｓｐｅＣ遺伝子（それぞれＥ．Ｃ．４．１．１．１７に属する）である、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はオルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦ遺伝子である、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、およびシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＦまたはｓｐｅＣである、
請求項６または７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子である、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するｓｐｅＦである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、増加したＯＤＣ活性のために、
（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）およびアグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する、アグマチンウレアヒドロラーゼをコードする遺伝子とも称される）、または
アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）、およびアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＡ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１２に属する、アグマチンデイミナーゼをコードする遺伝子とも称される）、およびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５３に属する）、および場合によりまた、アグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する）
のいずれかの過剰発現によって、少なくとも２つの他の酵素についても増加した酵素活性が得られる、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アゾトバクター・フィネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
方法は、増加した細胞内レベルのオルニチンを確実にする一方で行われる、
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われる、
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われ、オルニチンデカルボキシラーゼの増加したレベルの活性とは別に、少なくともアグマチナーゼならびに／またはアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼと組み合わされたアルギニンデカルボキシラーゼの活性のレベルも増加する、
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
増加したレベルの活性で、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の１つもしくはそれ以上の酵素活性を担持するベクター、プラスミドおよび宿主。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する微生物における１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ番号１１０−６０−１；テトラメチレンジアミンとも称される化合物；生化学的文献では、プトレシンとも称されている）の生化学合成のための新規のプロセスに関する。以後、オルニチンデカルボキシラーゼは「ＯＤＣ」とも称される。以後、「オルニチンデカルボキシラーゼ活性の増加したレベル」は「増加したＯＤＣ活性」とも称される。一般に、ＯＤＣ活性を有する微生物は、スペルミジンおよびスペルミン（それぞれ産物Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミンおよびＮ，Ｎ’−ビス−（３−アミノプロピル）−１，４−ブタンジアミンの一般名である）のようなポリアミン類を産生することが可能であることが既知である。そのような化合物、ならびに例えば、１，４−ブタンジアミンおよび１，５−ペンタンジアミン（カダベリンとも称される）のような多様な短い直鎖ジアミン自体は、しばしば、生化学研究において、ポリアミン類と称されるが、ポリアミン類の厳密な化学的定義からでも、より多数のアミノ基が予想される。しかし、本特許出願の目的のために、ポリアミン類という用語は、その生化学的意味で使用されており、従って、１，４−ブタンジアミンを含む。
【０００２】
化合物１，４−ブタンジアミンは、主なエンジニアリングプラスチック：ホモポリマー、または例えば、約５重量％のポリアミド−６モノマー（カプロラクタム）とのコポリマー化されたいずれかの形態のポリアミド−４，６のいくつかの生成のための重要な原材料である。ホモポリマーのポリアミド−４，６（ナイロン−４，６）は、１９３８年と早くから記載されていた（米国特許第２，１３０，９４８号明細書、カラザーズ（Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ））。それは、モノマーの１，４−ブタンジアミンとアジピン酸との重縮合産物である。現在、特に、ポリアミド−４，６の化合物が生産され、ＳＴＡＮＹＬ（登録商標）の商品名で蘭国においてＤＳＭより販売されている。
【０００３】
１，４−ブタンジアミンの合成のための多くの化学的経路が既知である。これらのすべての化学的経路は、出発物質が、再生不能と考えられている供給源から入手しなければならないという欠点を免れない。しかし、再生可能な炭素源から出発し、生細胞における生化学的プロセス（「生体内変化」とも称される）を使用する１，４−ブタンジアミンの合成のための新規かつ容易な経路を提供する実質的な必要性がある。一般に、ポリアミン類は、生化学的産生におけるいずれの細胞または微生物においても毒性であると考えられる。従って、しかしながら、現在まで、生化学合成によるそのような新規の経路は魅力がないと考えられていた。
【０００４】
これは、例えば、次の参考文献：フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻（１９９５年）、１８８３１−１８８３５頁；およびスズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻（１９９４年）、８９３０−８９３４頁から認めることができる。
【０００５】
フクチ（Ｆｕｋｕｃｈｉ）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ欠乏細胞における（即ち、アセチルトランスフェラーゼＳｐｅＧを欠く細胞における）スペルミジンの蓄積による細胞生存能（およびほとんどすべての種類のタンパク質の合成）の減少について明確に記載している。スペルミジンは、中間体としての１，４−ブタンジアミンから細胞において産生されている産物である。従って、１，４−ブタンジアミンの生合成は、必然的に、スペルミジンの形成をももたらす。
【０００６】
一方、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）もまた、（マウス細胞において）ＯＤＣの過剰産生がポリアミン類、具体的には、スペルミジンの蓄積を生じ、ｓｐｅＧ欠乏でない細胞であっても、少量のスペルミジンの添加時に、常に細胞死が観察されることを実証している。
【０００７】
リムスウム（Ｌｉｍｓｕｗｕｍ）ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１８２巻（２０００年）、５３７３−５３８０頁）が、低い温度で、特定の遺伝子ｓｐｅＧの過剰発現によってそのような問題を克服することができることを示していることに留意すべきである。スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら（上記において引用した）は、低減された細胞生存能はアンチザイムによるＯＤＣの不十分なフィードバック阻害によるものであり、適切なアンチザイムの過剰産生によって克服することができることを示唆している。次いで、アンチザイムのそのような過剰産生もまた、細胞におけるポリアミン類の産生を低減し、従って、ＤＡＢ産生にはふさわしくない。
【０００８】
さらに、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１７０巻（１９８８年）、３１３１−３１３５頁においてカシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）らが説明しているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるポリアミン類の含量は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子、特に、構成性に発現されるｓｐｅＣの過剰発現によって調整することができる。それらの実験のために、ボイル（Ｂｏｙｌｅ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第９４巻（１９８３年）、１１７−１２１頁によって産生されるようなプラスミドｐＯＤＣがクローニングにおいて使用された。カシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）らによって教示されているように、生来の転写および翻訳制御下（即ち、リボソーム結合部位およびプロモーターからなる生来の遺伝子エレメントを使用する）オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＣの７０倍の過剰産生でも、細胞内および外１，４−ブタンジアミン含量の合計で僅かに増加したレベルしかもたらさなかった。引用したカシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）の参考文献において認められるように、前記著者らは、（オルニチン供給を伴わずに）約２５ｍｇ／ｌより高い産生レベルの１，４−ブタンジアミンに達することができなかった。さらに、彼らは、細胞におけるＯＤＣの過剰産生が、細胞におけるオルニチン含量の強度の減少（約６５μｍｏｌ／ｌから１μｍｏｌ／ｌへ）をもたらしたことを示し、ＯＤＣが過剰産生される場合、細胞がオルニチン欠乏になると結論した。カシワギ（Ｋａｓｈｉｗａｇｉ）らは、オルニチンの外部供給によるオルニチン含量の観察された限界を取り除くことを試みたが、僅かな改善が達成されたが、１，４−ブタンジアミンの産生レベルは約３０ｍｇ／ｌよりも高くなかった。ＯＤＣ過剰産生による前駆体供給の記載の制限のため、およびさらに、より高いレベルのＯＤＣのようなタンパク質は、より多量のポリアミン類の存在のため細胞における毒性の影響の増加を生じることが予想されるため、当業者であれば、上記の参考文献を考慮して、３０ｍｇ／ｌより有意に高いレベルでの１，４−ブタンジアミンの産生のための生化学合成プロセスを提供することは不可能であると想定するであろう。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０７２６２４０号明細書は、現在までのところ、１，４−ブタンジアミンを含むポリアミン類の生化学合成に関する数少ない特許文献の１つである。しかし、それは、主な成分としてタンパク質を含有する天然産物の発酵による、とりわけ、１，４−ブタンジアミンの産生について、記載している。前記プロセスでは、天然産物は、まず、それらを部分または全分解に供することによって処置し、次いで、発酵工程の前に、任意の好ましくない成分（例えば、Ｈｇ、Ｃｒ、Ａｓ、Ｃｄ、ＳｅおよびＰｂ）、細胞増殖インヒビター、農薬、抗生物質、界面活性剤、石鹸、脂肪、油、シアン化物およびフェノール類を取り出す。そのような方法で産生されるプトレシンおよび他のジアミン類は、肥料および肥やしとして（再）利用されているが、非常に多量の他の物質を含有するため、それらは例えば、ポリアミド−４，６の産生のための原材料として不適切である。
【００１０】
従って、約３０ｍｇ／ｌよりも有意に高い力価で、好ましくは、（高価な）オルニチンの外部供給をも伴うことなく、１，４−ブタンジアミンの合成のための効率的な生合成経路の必要性が依然としてある。このような１，４−ブタンジアミンの改善された利用可能性に対する必要性は、主に、例えば、ポリアミド−４，６の産生のための出発物質としてのその意図される使用に基づく。一般に、今日までのところ既知である１，４−ブタンジアミンへの経路は、かなり労力を要し、面倒であり、さらなる精製を伴わなければナイロンの産生において使用が困難であるような前記産物の品質をもたらし得る。１，４−ブタンジアミンへの既知の化学経路は、相対的に高価な出発物質および反応物（取り扱いが困難な反応物を含む）、および多段階およびマルチリアクター設計における温度および圧力の相対的に厳密な反応条件、ならびに高価な触媒系の使用を必要とする。従って、好ましくは、はるかに安価な原材料からで、およびシアン化水素酸のような反応物を取り扱う問題を回避する１，４−ブタンジアミンへの代替的経路の必要性が依然としてある。天然において増殖し、従って、農業生産から再生可能な材料が、発酵において使用することができるグルコースのような炭素源（または他の適切な炭素源およびそれらの混合物）の基本であることは周知である。そのような再生可能な材料は、相対的に安価であり、豊富に利用可能である。一般に、再生可能な材料をすべての種類の化学材料の出発物質として使用することができれば、きわめて有利であると考えられる。
【００１１】
従って、本発明の目的は、生体内変化による１，４−ブタンジアミンの大規模産業生産のための改善された可能性を提供することである。
【００１２】
本発明者らは、意外なことに、この目的が、生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有する微生物における１，４−ブタンジアミンの生化学合成のための新規のプロセスであって、ここで、増加したオルニチンデカルボキシラーゼ活性は、増加した転写および／または翻訳効率によるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって得られ、そのような微生物において産生される１，４−ブタンジアミンは、発酵ブロスに分泌され、発酵ブロスから回収される、プロセスによって達成されることを見出した。
【００１３】
本発明に従えば、１，４−ブタンジアミンの合成のための改善された生化学的プロセスが提供され、得られた１，４−ブタンジアミンは、例えば、ポリアミド−４，６の産生のための原材料として極めて適切である。
【００１４】
本特許出願において意味するように、用語「生化学合成」（本特許出願において、「生体内変化」と代替的に称される用語）は、（多くの純粋な化学的反応工程の他に）適切な産生株の細胞全体を使用する１つもしくはそれ以上の生体触媒反応を伴うプロセスだけではなく、適切な産生株の細胞全体を使用する純粋な生化学的プロセスをも含む。そのような純粋な生化学的プロセスは、それぞれ、生化学合成が適切な炭素源から出発する場合は発酵と称され、または生合成が、合成しようとする標的分子を得ることができる炭素骨格を既に有する中間産物から出発する場合には、前駆体発酵と称される。プロセスは、好気的または嫌気的条件下で行われ得る。
【００１５】
本発明の生化学合成における生体触媒反応は、インビボまたはインビトロのいずれでも行うことができる。一般に、インビボプロセスは、生細胞（従って、用語「生細胞」は、いわゆる休止細胞も含む）を使用する場合に行われるプロセスであり；一方、インビトロプロセスは、通常、細胞溶解物または（部分的に）精製された酵素を使用して、行われている。本発明に従う生化学合成は、微生物において行われる。これは、適切な産生株の細胞全体を使用して行うことができるが、また、透過した細胞を使用して行ってもよく；しかし、インビボとインビトロとを区別することは、透過した細胞または固定化された宿主細胞で行われるプロセスに対してあまり意味を成さない。しかし、例えば、固定化された酵素などを使用することによって行う場合の本発明のプロセス由来の個々の生体触媒工程は、本出願において意味するとおりの生化学合成におけるそのような工程に等価であるとみなされることは明白である。
【００１６】
オルニチンデカルボキシラーゼ（即ち、オルニチン脱炭酸反応活性を有する酵素、またはＯＤＣ）は、クラスＥ．Ｃ．４．１．１．１７に分類される酵素である。過剰産生される場合、オルニチンデカルボキシラーゼの活性のレベルは、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ二酸化炭素検出キット（Ｓｉｇｍａ）；オステルマン，Ａ．Ｌ．（Ｏｓｔｅｒｍａｎ，Ａ．Ｌ．）ら１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３，１３６６２−１３６６７頁に記載のアッセイを使用して、無細胞抽出物内において標準的条件（オルニチンおよびＰＬＰの存在下３７℃）下で、生来の（即ち、過剰産生されていない）レベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と容易に比較することができる。従って、当業者であれば、タンパク質含量の決定、またはＲＮＡレベルを決定することによって、使用する微生物における生来のレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性と比較して増加した翻訳および／または転写効率に基づいて、使用するＯＤＣが増加したレベルのオルニチンデカルボキシラーゼ活性（増加したＯＤＣ活性）を有するかどうかを容易に確立することができる。タンパク質含量の決定のための多様な標準的手順、例えば、比色定量的ならびに分光的方法については、ロットスパイヒ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）およびゾルバス（Ｚｏｒｂａｓ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ／Ｂｅｒｌｉｎ，ＩＳＢＮ３−８２７４−００４１−４（１９９８年）、第３、５、２１、２２および２４章に記載されている。タンパク質レベルならびにＲＮＡレベルの決定のための方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、および他の多くの方法については、Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６（１９８９年）において記載されている。しかし、他の多くの標準的な手順は、この分析分野における当業者に公知であり、ここで述べる必要はない。
【００１７】
本発明のプロセスにおいて使用することができる適切なオルニチンデカルボキシラーゼは、オルニチンを脱炭酸化することが可能であるすべての酵素およびその変異体である。そのような任意の酵素は、増加したレベルの活性で、即ち、増加した転写および／または翻訳効率でオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させることによる過剰産生される形態で、本発明のプロセスにおいて使用することができる。さらに、任意の具体的に命名された酵素活性について本明細書において使用される用語「増加したレベルの活性」もまた、そのような酵素活性、例えば、オルニチンデカルボキシラーゼの活性が微生物の天然の供給源において全く存在しないような状況を包含することが意図され、ここで、反応は生じているが、そこで、増加した転写および／または翻訳効率で、遺伝子修飾により意図的に誘導されることに留意すべきである。
【００１８】
上記のように、１，４−ブタンジアミンの生化学合成では、いずれのＯＤＣ酵素を使用してもよく、その増加したＯＤＣ活性は、増加した翻訳および／または転写効率でのＯＤＣをコードする遺伝子の過剰発現によって得られる。好ましくは、増加した翻訳および／または転写効率は、強力な調節プロモーターの使用、好ましくは、強力な誘導性プロモーターの使用によって得られる。
【００１９】
最も好ましくは、増加した翻訳および／または転写効率は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性の強力なプロモーターの使用によって得られる。適切な強力なプロモーターについては、Ｊ．サンブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッシュ（Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６（１９８９年）に記載されている。
【００２０】
詳細には、増加した翻訳および／または転写効率は、Ｔ７、Ｔ５、ｐｔａｃ、およびｐｌａｃプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの使用によって得られる。プロモーターの至適な選択は、使用すべき宿主および適用すべき反応条件に依存することは当業者に明らかである。
【００２１】
本発明の極めて好適な実施形態では、オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、リボソームによるＲＮＡ−テンプレートの良好な認識を達成するためにＲＢＳが適用される前記遺伝子のコーディング領域の上流に局在するリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する。ＲＢＳの適応は、当業者に公知の任意の方法によって行うことができ、使用する宿主の特定の特性などを考慮する。
【００２２】
最も好ましくは、過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子はオルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦまたはｓｐｅＣ遺伝子（それぞれＥ．Ｃ．４．１．１．１７に属する）である。これまでのところ、文献的には、ＳｐｅＣがＳｐｅＦよりもはるかによく調べられている。最も意外なことに、しかし、最も好ましくは、本発明に従う最も良好な結果は、それがオルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦ遺伝子である場合に達成される。
【００２３】
本発明に従うプロセスにおいて使用される過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、およびシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＦまたはｓｐｅＣであることが、特に好適である。オルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＦは誘導性オルニチンデカルボキシラーゼであり；オルニチンデカルボキシラーゼｓｐｅＣは構成性オルニチンデカルボキシラーゼである。
【００２４】
より好ましくは、過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子である。最も好ましくは、過剰発現されるオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムチウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｔｉｕｍ）、およびシェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するｓｐｅＦである。構成性オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣの過剰発現による結果と比較すると、これまでのところ、本発明に従う最も良好な結果は、実際に、ｓｐｅＦを使用する場合に達成されている。
【００２５】
詳細には、本発明に従えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のＯＤＣと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、および最も好ましくは少なくとも６５％同一性を有し、オルニチン脱炭酸反応を触媒することが可能であるすべてのオルニチンデカルボキシラーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのＯＤＣが公知である。
【００２６】
対照酵素との同一性百分率を決定することは、当業者に既知の方法によって、例えば、例えば他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために、公的なデータベースに対する検索を実施するための「問い合わせ配列」としての参照酵素のタンパク質配列を使用することによって、実施することができる。そのような検索は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．２）を使用して、実施することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【００２７】
本発明に従えば、１，４−ブタンジアミンの合成のための改善された生化学的プロセスが提供され、得られた１，４−ブタンジアミンは、ポリアミド−４，６および／または他のポリアミド類の産生のための原材料として極めて適切である。
【００２８】
本発明において、上記のオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のいずれかと相同であり、示されるオルニチンデカルボキシラーゼに十分匹敵するオルニチンデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする任意の遺伝子は、それらの等価物であり、本発明のプロセスに適切であるとみなされるべきであることが明らかである。そのような等価な遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニングストラテジー、例えば、本明細書の実験の部に記載の方法によって、適切に得ることができる。あるいは、そのような等価なオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子はまた、意図的な構築によって得ることもできる。
【００２９】
本発明のさらなる好適な実施形態では、１，４−ブタンジアミンの生化学合成のためのプロセスは微生物において行われ、ここで、さらに、増加したＯＤＣ活性のために、以下のいずれかの過剰発現によって、少なくとも２つの他の酵素についても増加した酵素活性が得られる：
（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）およびアグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する；アグマチンウレアヒドロラーゼをコードする遺伝子とも称される）；または
（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡ（Ｅ．Ｃ．４．１．１．１９に属する）、およびアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＡ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１２に属する；アグマチンデイミナーゼをコードする遺伝子とも称される）、およびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子ａｇｕＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５３に属する）、および場合によりまた、アグマチナーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＢ（Ｅ．Ｃ．３．５．３．１１に属する）。
【００３０】
これらのさらに増加した酵素活性に対して本明細書において意味する過剰発現は、当業者に既知の任意の方法によって；例えば、それぞれの遺伝子の翻訳および／または転写効率を増加することによって、但しまた、遺伝子コピー数を増加するような他の任意の既知の方法によって、または変異による酵素の内因性活性もしくは構造を増加することによって、あるいは脱調節された酵素を使用することによって、達成することができる。上記のさらなる好適な実施形態の部（ｉ）において意味するように、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢの組み合わせは、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢの任意の機能的な組み合わせ（組み合わされた融合タンパク質としてか、または個別の酵素活性としてかにかかわらず）を表すことが意図される。事実、この組み合わせはまた、ＳｐｅＡＢとも呼ばれる。それらの部（ｉｉ）は、ＳｐｅＡおよびＳｐｅＢのそのような組み合わせで、ＳｐｅＢ部分自体が、ＡｇｕＡおよびＡｇｕＢの任意の機能的組み合わせ（組み合わされた融合タンパク質としてか、または個別の酵素活性としてかにかかわらず）によって置き換えられ得ることを表す。
【００３１】
ヤノウィッツ（Ｊａｎｏｗｉｔｚ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ５４４（２００３年）、２５８−２６１は、アグマチンデイミナーゼＡｇｕＡが高等植物のアルギニンデカルボキシラーゼ経路に関与することを記載している。ＳｐｅＢによって触媒される変換もまた、植物において生じる酵素によって、即ち、アグマチンデイミナーゼＡｇｕＡとＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼＡｇｕＢとの組み合わされた作用によって触媒され得ることが、ナカダ（Ｎａｋａｄａ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４９（２００３年）、７０７−７１４よりさらに公知である。従って、本発明においては、ＳｐｅＢの代わりに、またはさらにそれとの組み合わせで、ＡｇｕＡおよびＡｇｕＢを使用することもできる。そのようなａｇｕＡおよびａｇｕＢ遺伝子の供給源は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）およびトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）であり得るが、しかし、匹敵する遺伝子は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）の変異体においても見出され得る。
【００３２】
本発明において、上記のアルギニンデカルボキシラーゼ、それぞれアグマチナーゼ、またはアグマチンイミノヒドロラーゼもしくはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードし、それぞれの酵素に十分匹敵するアルギニンデカルボキシラーゼ（それぞれ、アグマチナーゼ、またはアグマチンイミノヒドロラーゼもしくはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ）活性を有するそのようなそれぞれの酵素をコードする遺伝子のいずれかと相同であるいずれの遺伝子も、場合により、それらの等価物であり、このような本発明のプロセスのさらなる好適な実施形態に適切であるとみなされるべきであることが明らかである。そのような等価な遺伝子は、当業者に公知の任意の適切なクローニングストラテジー、例えば、本明細書の実験の部に記載の方法によって、適切に得ることができる。あるいは、そのような等価な遺伝子はまた、意図的な構築によって得ることもできる。
【００３３】
従って、本発明のプロセスのこのような好適な実施形態では、過剰発現される遺伝子のさらなる組み合わせ、即ち、（ｉ）アルギニンデカルボキシラーゼおよびアグマチナーゼ、または（ｉｉ）アルギニンデカルボキシラーゼならびにアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ、ならびに場合により、アグマチナーゼをコードする遺伝子もまた、使用されている。
【００３４】
本発明のこのようなさらなる好適な実施形態では、好ましくは、過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである。より好ましくは、過剰発現されるアルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、パスツレラ菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子ｓｐｅＡである。
【００３５】
詳細には、本発明に従えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のアルギニンデカルボキシラーゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、および最も好ましくは少なくとも６５％同一性を有し、アルギニン脱炭酸反応を触媒することが可能であるすべてのアルギニンデカルボキシラーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアルギニンデカルボキシラーゼが公知である。
【００３６】
本発明のこのようなさらなる好適な実施形態では、過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、フォトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである。より好ましくは、過剰発現されるアグマチナーゼをコードする遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、フォトルハブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチナーゼ遺伝子ｓｐｅＢである。
【００３７】
詳細には、本発明に従えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素由来のアグマチナーゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４５％、および最も好ましくは少なくとも６０％同一性を有し、アグマチナーゼ反応を触媒することが可能であるすべてのアグマチナーゼを使用することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアグマチナーゼが公知である。
【００３８】
本発明のこのようなさらなる好適な実施形態では、さらに、過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである。より好ましくは、過剰発現されるアグマチンイミノヒドロラーゼをコードする遺伝子および／または過剰発現されるＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトマイセス・アバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アゾトバクター・フィネランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ノボスフィンゴビウム・アロマチシボラン（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）、およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からなる群から選択される種のうちの１つから由来するアグマチンイミノヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＡおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ遺伝子ａｇｕＢである。
【００３９】
詳細には、本発明に従えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）対照酵素由来のアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼと十分な、即ち、少なくとも３０％、および最も好ましくは少なくとも４０％同一性を有し、アグマチンイミノヒドロラーゼ、それぞれＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ反応を触媒することが可能であるすべてのアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼを使用することができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）対照酵素とそのような相対的に高いレベルの同一性を有する多くのアグマチンイミノヒドロラーゼおよび／またはＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼが公知である。
【００４０】
本発明に従うプロセスは、オルニチンの増加した細胞内レベルを確実にする一方で行われていることが好ましい。このことは、例えば、オルニチンの外的供給によって達成することができる。
【００４１】
本発明のプロセスは、任意の適切な宿主生物体において行われ得る。宿主は、生合成において当業者に一般に公知の産生生物体（または細胞）の群から選択され得る。そのような生物体は、真核生物由来であっても、またはより好適には、原核生物由来であってもよい。真核細胞は、例えば、植物および真菌、ならびに他の多様な群（該他の群は集合的に「原生生物界」と称される）由来の細胞であり得る。
【００４２】
本発明に従うプロセスは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐ．、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群から選択される宿主生物体において行われることが特に好ましい。
【００４３】
本発明のプロセスでは、宿主として使用すべき微生物は、アミノ酸、オルニチンおよび／またはアルギニンを産生することが可能であることが特に好ましい。ほとんどの天然の微生物について、アルギニンは必須アミノ酸であることから、通常、そのような能力はすべての野生型株において利用可能であるため、この要件は満たされる。
【００４４】
これらの種のうち、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．は、それらが、所望の過剰発現される酵素活性を伴う株を提供するために、遺伝子操作によって取り扱うことが容易であるため、好適である。さらに、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．は、天然において既に、ほとんどの上記の酵素活性のそれぞれ（即ち、植物由来のａｇｕ遺伝子は別として）を含有し、そのため、過剰発現される遺伝子のほとんどを相同遺伝子として使用することができる。また、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．（但し、天然のオルニチンデカルボキシラーゼを欠く）は、発酵プロセスにおいて容易に取り扱うことができる適切なグルタミン酸産生株であるため、特に好ましい。
【００４５】
本発明のプロセスでは、グルタミン酸は極めて適切な前駆体である。従って、プロセスは、好ましくは、グルタミン酸の発酵が可能な宿主株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））において行われている。
【００４６】
本発明に従うプロセスがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ｓｐ．からなる群由来の宿主生物体において行われる場合、最も良好な結果が達成されており、ここで、オルニチンデカルボキシラーゼの活性は別として、アルギニンデカルボキシラーゼおよび少なくともアグマチナーゼまたはアグマチンイミノヒドロラーゼおよびＮ−カルバモイルプトレシンアミドヒドロラーゼ酵素活性は、宿主微生物に相同である前記酵素活性の生来のレベルと比較して増加した活性レベルで宿主微生物に存在している。
【００４７】
本発明のプロセスは、好ましくは、発酵条件として通常的でもある反応条件下で行われることが明らかである。従って、プロセスは、バッチ式、但しまた、所望であれば、流加培養で行うことができる。宿主生物体として使用される生物体が、形成される１，４−ジアミノブタンに適切な輸送系を有するかまたは備えることを確実にすることは好都合であり得る：好ましくは、そのような輸送系は生来のものである。
【００４８】
もちろん、本発明はまた、増加したレベルの活性で、添付の特許請求の範囲に従う１つもしくはそれ以上の上記の酵素活性を担持するすべてのベクター、プラスミドおよび宿主を包含する。
【００４９】
以下、いくつかの実験結果によって本発明を説明するが、本発明の範囲を限定する意図は全くない。
【００５０】
実験の部
一般的手順
すべてのＤＮＡ操作については、標準的な手順を適用した（サンブルック，Ｊ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）。ＤＮＡは、他に示さない場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら（２０００年）、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２，４４４３−４４５２）の染色体ＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造のプロトコルに従い、プルーフリーディング酵素ＳＡＷＡＤＹ  Ｐｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｐｅｑｌａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ、独国）またはＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）を使用して実施する一方、構築された株の確認は、ＴａｑポリメラーゼＲＥＡＤＹＭＩＸ（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、独国）を利用するコロニーＰＣＲによって行った。その後のクローニングならびにさらなる操作のための制限部位は、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、独国）から購入したオリゴヌクレオチドにより導入した。ＤＮＡフラグメントは、製造のプロトコルに従い、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ、独国）で精製した。プラスミドＤＮＡの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐスピンＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ、独国）の利用によって達成した。構築されたプラスミドの確認は、制限解析および以後の配列決定（Ａｇｏｗａ，Ｂｅｒｌｉｎ、独国）によって行った。
【００５１】
プラスミドの構築
（ｉ）プラスミドｐＤＡＢ３（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣｎＲＢＳ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（構成性、生合成性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングし、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃＩＱ）下の転写制御に基づく強力な遺伝子発現を可能にした。従って、コーディング遺伝子ｓｐｅＣを、本来のＲＢＳ、開始および終止コドンと共にクローニングした。
【００５２】
２２３５ｂｐのｓｐｅＣｎＲＢＳ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７９；ヌクレオチド２６５０−４８６７）：
５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＴ  ＡＴＣ  Ｔ−３’  ［配列番号１］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’  ［配列番号２］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）
【００５３】
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＰＣＲ産物を、同じ様式で切断したプラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ３（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣｎＲＢＳ、７４９１ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００５４】
（ｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ４（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣａＲＢＳ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（構成性、生合成性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＣを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングし、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃＩＱ）下の転写制御に基づく強力な遺伝子発現を可能にした。従って、コーディング遺伝子ｓｐｅＣを、本来の開始および終止コドンと共にクローニングした。インシリコ研究を利用してｓｐｅＣに対する保存されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を決定することができなかったため、部位特異的変異誘発により、ｓｐｅＣ開始コドンの７ｂｐ上流に局在するＲＢＳを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコンセンサス配列に適応した。
【００５５】
２２３５ｂｐのｓｐｅＣａＲＢＳ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７９；ヌクレオチド２６５０−４８６７）：
５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  Ｔ−３’［配列番号３］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＴＴ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＡＣ−３’  ［配列番号２］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）
【００５６】
エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＰＣＲ産物を、同じ様式で切断したプラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ４（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＣａＲＢＳ、７４９１ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００５７】
（ｉｉｉ）プラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の（誘導性、生分解性の）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＦを、発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングした。このベクターは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃｌＱ）下で、クローニングされた遺伝子の転写制御に基づく高レベルタンパク質産生を可能にする。発現プラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ）の構築のために、コーディング遺伝子ｓｐｅＦを、本来のＲＢＳ（リボソーム結合部位）、開始および終止コドンと共にクローニングした。
【００５８】
２２４７ｂｐのｓｐｅＦ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００１７２；ヌクレオチド１０２４２−１２４６８）：
５’−ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＡ−３’  ［配列番号４］
（変異は太字、ＫｐｎＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＣＴ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＣ−３’  ［配列番号５］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）。
【００５９】
フラグメントを制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩおよびＸｂａＩで末端修飾し、同じ様式で切断した発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ２（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ、７５０２ｂｐ）を、制限解析および以後の配列決定によって確認した。
【００６０】
（ｉｖ）プラスミドｐＤＡＢ７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＡＢ）の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の、アルギニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＡならびにアグマチナーゼをコードするｓｐｅＢを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ（フェルステ，Ｊ．Ｐ．（Ｆｕｅｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．）ら（１９８６年）、Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）にクローニングし、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ｔａｃ促進剤およびｌａｃリプレッサー系（ｌａｃＩＱ）下のクローニングされた遺伝子の転写制御に基づく高レベルタンパク質産生を可能にした。このように、遺伝子の本来のオペロン構造ならびにＲＢＳ、開始および終止コドンを維持した。
【００６１】
３０７９ｂｐのｓｐｅＡＢ含有ＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０の染色体ＤＮＡから増幅した（受託番号ＡＥ０００３７７；ヌクレオチド１１９０−４２４７）：
５’−ＡＣＡ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＴＣＧ  ＣＴＡ  ＴＧ−３’  ［配列番号６］
（変異は太字、ＸｂａＩ制限部位は斜字体）
および
５’−ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  Ｇ−３’    ［配列番号７］
（変異は太字、ＳｐｈＩ制限部位は斜字体）
【００６２】
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによる末端修飾後、ＤＮＡフラグメントを、同様に切断した発現プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨに連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、得られたプラスミドｐＤＡＢ７（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＡＢ、８３３９ｂｐ）の確認を、制限解析および以後の配列決定によって行った。
【００６３】
（ｖ）プラスミドｐＤＡＢ８（ｐＪＦ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦ−ｓｐｅＡＢ）の構築
オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦ、アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡおよびアグマチナーゼＳｐｅＢの同時産生を可能にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）のｓｐｅＡＢ遺伝子を、ｓｐｅＦ発現ベクターｐＤＡＢ２（ｉｉｉを参照のこと））にクローニングした。
【００６４】
制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＳｐｈＩによるプラスミドｐＤＡＢ７（ｉｖを参照のこと））の消化によって、ｓｐｅＡＢ遺伝子オペロンを含んでなる３０６７ｂｐを分離し、同じ様式で切断したｓｐｅＦ含有プラスミドｐＤＡＢ２（（ｉｉｉ）を参照のこと）に連結した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、独国）における形質転換後、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。調製後、ＳｐｅＦＡＢの同時産生を可能にする得られたプラスミドｐＤＡＢ８（ｐＪＨ１１９ＥＨ−ｓｐｅＦＡＢ、１０５４７ｂｐ）を、制限解析によって確認した。
【００６５】
実施例１：増加した翻訳および／または転写効率でのオルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によるＤＡＢ産生の改善
実施例１．１  オルニチンデカルボキシラーゼの過剰産生を介する１，４−ブタンジアミンの産生（フラスコ振盪法）
（増加した翻訳および／または転写効率での）オルニチンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子ｓｐｅＦまたはｓｐｅＣの過剰発現のＤＡＢ産生に対する影響について、プラスミドｐＤＡＢ２（（ｉｉｉ）を参照のこと）、またはｐＤＡＢ３（（ｉ）を参照のこと）、またはｐＤＡＢ４（（ｉｉ）を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）内において調べた。
【００６６】
これらの株を、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３００ｍｇ／ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１５ｍｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１２ｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（１００ｍｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ／ｌ）、クエン酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ（１ｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（７５ｍｇ／ｌ）、チアミン・ＨＣｌ（ビタミンＢ１）（５ｍｇ／ｌ）ならびに微量元素Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．０５ｍｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（３．７５ｍｇ／ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．７５ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（３０ｍｇ／ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（４．５ｍｇ／ｌ）、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）およびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２２．５ｍｇ／ｌ）からなる最小培地を利用するフラスコ振盪実験において試験した。グルコースのストック溶液（５００ｇ／ｌ）を個別にオートクレーブし、滅菌した培地に１０ｇ／ｌの最終濃度まで添加した。
【００６７】
１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２のＯＤ６２０まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘発した。
【００６８】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、希釈した上清をＨＰＬＣによって分析した。ここで、含有するアミン類を、オルト−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体として、５０％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．２；緩衝液Ｂメタノール）で平衡化したＣ１８−逆相カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５Ｃ１８，Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ，Ｄｕｅｒｅｎ、独国）を使用するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  １１００Ｓｅｒｉｅｓ装置上、２３０ｎｍで検出した。分離のため、次の勾配を適用した：１〜７分：０．５ｍｌ／分の流速での５０％〜７５％緩衝液Ｂにおける直線勾配、７〜１３分：０．５ｍｌ／分の流速での７５％〜８５％緩衝液Ｂ、１３〜１４．５分：１ｍｌ／分の低速（ｌｏｗ  ｒａｔｅ）での８５％〜５０％緩衝液Ｂ、１４．５〜１７分：１ｍｌ／分の流速での５０％緩衝液Ｂ、および１７〜２０分：０．５ｍｌ／分の流速での５０％緩衝液Ｂ。
【００６９】
較正のための標準物質の利用によって、ＮＭＲ分光学により以下のＤＡＢ濃度を決定し（表１を参照のこと）、確認することができた。
【００７０】
【表１】
2008505652.tif 000002
【００７１】
実施例１．２  流加培養（２１）内のオルニチンデカルボキシラーゼの過剰産生を介する１，４−ブタンジアミンの産生
流加培養条件下での発酵ＤＡＢ産生の能力を、ｌａｂｆｏｒｓバイオリアクター（Ｉｎｆｏｒｓ，Ｅｉｎｓｂａｃｈ、独国）内での高レベルＤＡＢ産生者株ＬＪ１１０ｐＤＡＢ２の利用により調べた。ＤＡＢを産生する株は、その増殖に対しアミノ酸依存的ではないため、細胞増殖を制限するために、リン酸制限培養のために開発されたプロトコルを適用した。従って、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（３ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（１５ｍｇ／ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（４００ｍｇ／ｌ）、ＮａＣｌ（１ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ／ｌ）ならびに微量元素Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．０５ｍｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（３．７５ｍｇ／ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（０．７５ｍｇ／ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（３０ｍｇ／ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（４．５ｍｇ／ｌ）、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（３ｍｇ／ｌ）およびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２２．５ｍｇ／ｌ）からなるリン酸制限最小培地を使用した。オートクレーブ後、クエン酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ（１．５ｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１１２．５ｍｇ／ｌ）、チアミン・ＨＣｌ（ビタミンＢ１）（７．５ｍｇ／ｌ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）（１００ｍｇ／ｌ）およびグルコース（１０ｇ／ｌ）を滅菌条件下でバイオリアクターに添加した。
【００７２】
１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地（１．１を参照のこと）の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２の６２０ｎｍでの光学密度まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。その後、この培養物を、続いて、２ｌのリン酸制限最小培地からなる主培養物の１：１０播種に使用した。培養中、温度を３３℃で一定に保持し、５Ｎ  ＫＯＨの添加によりｐＨを６．８＋０．１に制御した。増殖中、１５００ｒｐｍの安定な撹拌速度を使用した。酸素制限を回避するために、培養中の容器内への気流を２．５〜１０ｌ／分に増加した。必要に応じて消泡剤Ｄｅｈｙｓａｎを添加した。
【００７３】
細胞を５のＯＤ６２０で５０μＭ  ＩＰＴＧとともにインキュベートし、続いて、グルコース（５００ｇ／ｌ）／硫酸アンモニア（２００ｇ／ｌ）の組み合わせを供給する一方、１０ｇ／ｌグルコースおよび１．５ｇ／ｌアンモニアの安定な濃度を受け入れるために供給速度を適応させた。誘導の２時間後、７ｍｌ／ｈの供給速度を伴う１８ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４からなるリン酸供給を８時間、開始した。このように、細胞増殖を約５０のＯＤ６２０に制限することができた。
【００７４】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、上清をＨＰＬＣ（１．１を参照のこと）によって分析し、５．１ｇ／ｌのＤＡＢ量（０．４０３ｇ／ｇＢＤＷ；ＢＤＷバイオマス乾燥重量を意味する）が決定され、ＮＭＲ分光法により確認された。
【００７５】
実施例２：オルニチンならびにアルギニンから出発するバッチ内の１，４−ブタンジアミンの産生（フラスコ振盪法）
オルニチンならびにアルギニンから出発するＤＡＢ形成のさらなる改善を実証するために、オルニチンデカルボキシラーゼＳｐｅＦ（増加した転写効率を伴う）、アルギニンデカルボキシラーゼＳｐｅＡおよびアグマチナーゼＳｐｅＢの組み合わされた過剰産生の影響について調べた。
【００７６】
従って、プラスミドｐＤＡＢ８（（ｖ）を参照のこと）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＬＪ１１０（ゼッペンフィールド（Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、一般的手順を参照のこと）の利用によって、最小培地（１．１を参照のこと）においてフラスコ振盪培養を行った。従って、１００ｍｇ／ｌアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）を含有する最小培地の前培養物に１〜５μｌ／ｍｌストック溶液を播種し、２の６２０ｎｍでの光学密度まで３３℃、１８０ｒｐｍで、１６時間、インキュベートした。この培養物の５ｍｌを、続いて、５０ｍｌの同培地からなる主培養物の播種に使用し、２４時間、３３℃および１８０ｒｐｍでインキュベートした。細胞が１．５のＯＤ６２０ｎｍに到達した（約７時間後）ため、１０μＭ  ＩＰＴＧの添加によって遺伝子発現を誘導した。
【００７７】
時間依存的ＤＡＢ産生を観察するため、培養中の異なる時間ポイントでサンプルを採取した。遠心分離を利用する細胞の分離後、上清をＨＰＬＣによって分析した（１．１を参照のこと）。較正のための標準物質の利用によって、以下のＤＡＢ濃度を決定することができた（表３を参照のこと）。
【００７８】
【表２】
2008505652.tif 000003
【配列表】
2008505652000001.app
【国際調査報告】
2008505652.tif 000004
2008505652.tif 000005
2008505652.tif 000006
2008505652.tif 000007
2008505652.tif 000008
2008505652.tif 000009
2008505652.tif 000010