(57)【要約】  本発明は、ＰＴＢ含有タンパク質、すなわちＡＰＰＬ（ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質）とヒストン・デアセチラーゼ、特にＨＤＡＣ１との結合と相互作用する化合物のためのアッセイ分野に関する。該アッセイを使用して同定された化合物は、ＨＤＡＣ活性の阻害において、そして医薬として、特に、がんおよび乾癬のような増殖性症状を抑制する薬物の製造において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質とＨＤＡＣ酵素との相互作用の使用をなすアッセイ。
【請求項２】
ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質が、
ｉ）アミノ酸配列、配列番号：２を含んでなる、ＡＰＰＬをコードしている単離されたポリペプチド；
ｉｉ）ＡＰＰＬから誘導され、そしてＨＤＡＣに結合することが可能な単離されたポリペプチド；または
ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号：３またはその同族体を含んでなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
からなる群から選ばれる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ＨＤＡＣ酵素が、
ｉ）アミノ酸配列、配列番号：５またはその同族体を含んでなる、ＨＤＡＣ１をコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；または
ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を含んでなる、ヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を含んでなる、ＡＰＰＬ結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
からなる群から選ばれる、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
アミノ酸配列、配列番号：７によってコードされた単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメント。
【請求項５】
核酸、配列番号：４の２３５〜３３６によってコードされたＡＰＰＬ結合性フラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載のアッセイにおける、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質をコードしている単離され、精製された核酸分子の使用。
【請求項７】
請求項１に記載のアッセイにおける、ＨＤＡＣ１またはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の使用。
【請求項８】
ａ）ＨＤＡＣ酵素またはそのフラグメントを含有する給源を、
ｉ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質、
ｉｉ）該試験化合物
とともにインキュベートし；そして
ｂ）酵素に結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること：
を含んでなる、ＨＤＡＣ酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法
。
【請求項９】
ＨＤＡＣを含有する給源が、
ａ）アミノ酸配列、配列番号：５またはその同族体を有する、単離され、精製されたＨＤＡＣ１タンパク質であって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
ｂ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
ｃ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質が、
ａ）アミノ酸配列、配列番号：２を含んでなる、ＡＰＰＬをコードしている単離されたポリペプチド；
ｂ）ＡＰＰＬから誘導され、そしてＨＤＡＣに結合することが可能な単離されたポリペプチド；
ｃ）アミノ酸配列、配列番号：３またはその同族体を含んでなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
単離され、精製されたＨＤＡＣ１タンパク質またはＡＰＰＬ結合性フラグメントが固体支持体に結合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質が標識され、そして該標識が、酵素に結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定するために使用される、請求項８〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
方法が、段階：
ａ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質によるＨＤＡＣ上のリガンド結合部位の構造を探査し；
ｂ）結合においてＡＰＰＬリガンドと相互作用するＨＤＡＣ酵素のリガンド結合部位において接触する原子を同定し；
ｃ）ＨＤＡＣ酵素の活性を調節するように、（ｂ）において同定された原子と相互作用する試験化合物を設計し；そして
ｄ）該設計された試験化合物をＨＤＡＣまたはその機能性フラグメントと接触させて、ＨＤＡＣ活性を調節する該化合物の能力を測定すること；
を含んでなる合理的な薬物設計の方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ＨＤＡＣまたはその機能性フラグメントを、該試験化合物とともにインキュベートし；
ｂ）ＨＤＡＣ酵素の活性に及ぼす試験化合物の影響を測定し：そして
ｃ）この影響を、ＡＰＰＬリガンドまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の結合におけるＨＤＡＣ酵素の活性と比較すること；
を含んでなる、ＨＤＡＣの活性を調節することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法。
【請求項１５】
ＨＤＡＣ酵素が、
ａ）配列番号：５のアミノ酸配列またはその同族体を有するＨＤＡＣ１であって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
ｂ）ＨＤＡＣ１の機能性フラグメント；または
ｃ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有するＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
からなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＤＡＣ酵素に及ぼす試験化合物の影響が、基質として放射能標識または蛍光標識されたアセチル化ヒストンを用い、そして標識されたアセチル基の遊離を測定して調査される、請求項１４〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
基質が放射能標識されたアセチル化ヒストンＨ４ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物がＨＤＡＣ酵素に結合し、そして／またはその活性を調節することが可能である、請求項８〜１７のいずれか１つにおいて定義される方法のいずれか１つによって同定され、かつ得られる化合物。
【請求項１９】
請求項８〜１７のいずれか１つにおいて定義される方法のいずれか１つによって同定された化合物および製薬学的に許容できる添加物または担体を含んでなる、製薬学的組成物。
【請求項２０】
医薬として使用するための配列番号：７によってコードされたＡＰＰＬ結合性フラグメント。
【請求項２１】
限定されるものではないが、肺がん（例えば、非小細胞肺がんを含む腺がん）、膵臓がん（例えば、外分泌膵臓がん腫のような膵臓がん腫）、結腸がん（例えば、結腸腺がんおよび結腸腺腫のような結腸直腸がん腫）、後生的疾病を含む前立腺がん、リンパ様系統の造血性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺胞状がん、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉原発の腫瘍（例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫）、黒色腫、奇形がん、神経芽細胞腫、膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳がん（例えば、後生的乳がん）、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がんおよび表皮がんを含む、がんおよび乾癬のような増殖性病状の処置において、医薬として使用するための組成物の製造における、請求項７に記載の配列番号：３によってコードされたＨＤＡＣ結合性フラグメントまたはＡＰＰＬ関連ペプチドの使用。
【請求項２２】
化合物が、限定されるものではないが、肺がん（例えば、非小細胞肺がんを含む腺がん）、膵臓がん（例えば、外分泌膵臓がん腫のような膵臓がん腫）、結腸がん（例えば、結腸腺がんおよび結腸腺腫のような結腸直腸がん腫）、後生的疾病を含む前立腺がん、リンパ様系統の造血性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺胞状がん、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉原発の腫瘍（例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫）、黒色腫、奇形がん、神経芽細胞腫、膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳がん（例えば、後生的乳がん）、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がんおよび表皮がんを含む、がんおよび乾癬のような増殖性病状の処置のための組成物の製造におけるＨＤＡＣアンタゴニストである、請求項８〜１７のいずれか１つに記載の方法によって同定され、かつ得られる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＴＢ含有タンパク質、すなわちＡＰＰＬ（ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー（ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを含有するアダプタータンパク質）とヒストン・デアセチラーゼ、特にＨＤＡＣ１との結合と相互作用する化合物のためのアッセイ分野に関する。該アッセイを使用して同定された化合物は、ＨＤＡＣ活性の阻害において、そして医薬として、特に、がんおよび乾癬のような増殖性症状を抑制する薬物の製造において有用である。
【背景技術】
【０００２】
核ヒストンは、遺伝子転写および他のＤＮＡを鋳型とするプロセス、例えば複製、修復、組み換えおよび染色体分離の調節に関与する機構の全体的かつ動的な構成成分として知られる。それらは、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化およびＡＤＰ−リボシル化を含む翻訳後修飾の主体である。
【０００３】
本明細書では「ＨＤＡＣ」と呼ばれる、ヒストン・デアセチラーゼは、コアヌクレオソーム・ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む、タンパク質のリジン残基におけるアセチル修飾の除去を触媒する酵素である。本明細書では「ＨＡＴ」と呼ばれる、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼとともに、ＨＤＡＣはヒストンのアセチル化のレベルを調節する。ヌクレオソーム・ヒストンのアセチル化の平衡は、多くの遺伝子の転写において重要な役割を演じる。ヒストンの低アセチル化（ｈｙｐｏａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）は、遺伝子転写の抑制をもたらす凝縮されたクロマチン構造に関係していて、これに対してアセチル化ヒストンは、より開かれたクロマチン構造および転写の活性化に関係している。
【０００４】
１１種の構造的に関連するＨＤＡＣが記述されていて、そして２クラスに分類される。クラスＩＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ１、２、３、８および１１からなり、これに対してクラスＩＩＨＤＡＣは、ＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０からなる。ＨＤＡＣの第３のクラスのメンバーはクラスＩおよびクラスＩＩＨＤＡＣに対して構造的に関連していない。クラスＩ／ＩＩＨＤＡＣは亜鉛依存性メカニズムによって作動し、これに対してクラスＩＩＩＨＤＡＣはＮＡＤ依存性である。
【０００５】
ヒストンに加えて、他のタンパク質もまたアセチル化の基質であった、特に、転写因子、例えばｐ５３、ＧＡＴＡ−１およびＥ２Ｆ；核受容体、例えばグルココルチコイド受容体、甲状腺受容体、エストロゲン受容体；およびｐＲｂのような細胞周期調節タンパク質。タンパク質のアセチル化は、タンパク質の安定化、例えばｐ５３安定化、コ・ファクターの補充およびＤＮＡ結合の増加と結び付けられた。ｐ５３は、種々のストレスシグナル、例えばＤＮＡ損傷への応答に際して細胞周期の停止またはアポトーシスを誘導できる腫瘍サプレッサーである。ｐ５３誘導細胞周期停止の主標的は、ｐ２１遺伝子であると思われる。ｐ５３によるその活性化に次いで、ｐ２１は、両Ｇ１およびＧ２期における細胞周期停止、老化におけるその上方調節および増殖中の細胞の核抗原とのその相互作用をもたらすサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体とそれとの会合によって同定された。
【０００６】
既に前述されたように、ヒストンのアセチル化および脱アセチル化は、遺伝子転写の調節において鍵となる役割を演じる。Ｎ末端のヒストンテールにおけるリジン残基のアセチル化状態は、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）およびデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の競合する活性の間の動的平衡によって厳格に制御される、ＨＤＡＣ媒介で減少されたヒストン・アセチル状態は、転写抑制に関連される。ＨＡＴまたはＨＤＡＣ活性の崩壊はがんの発生に関連づけることができる。ＨＡＴ酵素をコードしている遺伝子は、血液学的および上皮性起源からの腫瘍、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、結腸直腸がん、胃がんおよび乳がんにおいて、突然変異、増幅、転位または過発現される。クロマチンに対する発がん性転写因子とともに、脱調節され、一定のＨＤＡＣの補充が、白血病およびリンパ腫の特定の形態物、例えば急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）、非Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓリンパ腫およびＡＭＬ  Ｍ２サブタイプにおいて観察される。
【０００７】
ＨＤＡＣのインヒビターの研究は、それらが、細胞周期停止、細胞分化、アポトーシスおよび形質転換された表現型の逆転において重要な役割を演じることを示している。数種のＨＤＡＣインヒビターが、現在、臨床開発の第ＩＩ相にある［Ａｒｔｓら１  における総説］）ＨＤＡＣ阻害が細胞周期の停止、細胞分化およびアポトーシスを誘導する。
【０００８】
インヒビター、トリコスタチンＡ（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ）（ＴＳＡ）は、例えば、両Ｇ１およびＧ２期における細胞周期停止を惹起し、種々の細胞系の形質転換表現型を逆転し、そしてＦｒｉｅｎｄ白血病細胞およびその他の分化を誘導する。ＴＳＡ（およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸ＳＡＨＡ）は、細胞増殖を抑制し、最終（ｔｅｒｍｉｎａｌ）分化を誘導し。そしてマウスにおける腫瘍の形成を阻止することが報告された（非特許文献１）。
【０００９】
またトリコスタチンＡは、線維症、例えば肝線維症および肝硬変（ｃｈｉｒｒｈｏｓｉｓ）の処置において有用であることが報告された（特許文献１）。
【００１０】
ＨＤＡＣインヒビターは、宿主免役応答の増大および腫瘍血管形成の抑制のような間接的な活性をもつことができ、その結果、一次腫瘍の増殖を抑制し、そして転移を阻止することができる（非特許文献２）。
【００１１】
さらに、ＨＤＡＣのインヒビターはまた、ｐ２１遺伝子の発現を誘導することが報告された。これらのインヒビターによるｐ２１遺伝子の転写活性化は、クロマチンの再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）と、それに続くｐ２１プロモーター領域におけるヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化によって促進される。ｐ２１のこの活性化はｐ５３に依存しない方式で起り、その結果、ＨＤＡＣインヒビターは、変異したｐ５３遺伝子、種々の腫瘍の純正証明を有する細胞において作動する。
【００１２】
そこで、マウス胚幹細胞におけるＨＤＡＣ１の破壊が、重度に損傷された細胞増殖とインビボにおける胚の致死をもたらすことが例証された（Ｌａｇｇｅｒら２）。これは、Ｈ３およびＨ４アセチル化ならびにサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１およびｐ２７の発現増大と相関した。さらにまた、ＨＤＡＣ１のノックダウンは、細胞増殖の抑制および細胞分化の指標である形態学的変化を惹起する。
【００１３】
ＨＤＡＣ１は、少なくとも３種の異なる多タンパク質複合体：Ｓｉｎ３複合体、ＮｕＲＤ／Ｍｉ２複合体およびＣｏＲＥＳＴ複合体の成分としてその機能を発揮する［Ｓｅｎｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｓｅｔｏ３における総説］。これらの複合体における存在は、ＨＤＡＣ１の酵素活性のためには決定的である。複合体形成の他に、ＨＤＡＣ活性は翻訳後の修飾を通じて調節される。ＣＫ２によるセリン４２１およびセリン４２３におけるＨＤＡＣ１のリン酸化は、ＲｂＡｐ４８、ＭＴＡ−２、Ｓｉｎ３およびＣｏＲＥＳＴとの複合体形成を安定化し、それによってＨＤＡＣ１酵素活性を増進する４。またＨＤＡＣ１は、ユビキチン化され、そしていくつかのＣ末端リジン残基においてスモイル化（ｓｕｍｏｙｌａｔｅ）されている５，６。ＳＵＭＯ１修飾は、複合体形成を実施することなくＨＤＡＣ１による転写抑制を増進する。  
【００１４】
上記を考慮すれば、ＨＤＡＣインヒビターは、変異されたｐ５３遺伝子を有する腫瘍を含む、細胞増殖性疾患または症状の処置において大きな潜在能力をもつことができる。現ＨＤＡＣインヒビターの薬物作用団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）は、ＨＤＡＣの亜鉛含有の活性部位の周囲に焦点を定める。ＨＤＡＣ抑制のための化学的空間を拡大するために、ＨＤＡＣタンパク質の機能および調節、特にＨＤＡＣ酵素活性の調節に影響を与える他の結合性パートナーを同定することは興味あることであろう。
【００１５】
本発明の目的は、結合においてＨＤＡＣ活性を増進する新規のＨＤＡＣコ・ファクター、すなわち、ＡＰＰＬ（ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質）の同定、ならびにＨＤＡＣインヒビター、すなわち、ＨＤＡＣおよびＡＰＰＬ間の相互作用に影響を与える化合物の同定における結果として起きるその使用を提供することである。
【特許文献１】Ｇｒｅｅｔｓら、１９９８年３月１１日公開、欧州特許出願第０  ８２７  ７４２号
【非特許文献１】Ｆｉｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０１：１８８−１９３、１９９９
【非特許文献２】Ｍａｉ  ｅｔａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５：２６１−３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ＡＰＰＬまたは該ＡＰＰＬフラグメントと相互作用することが可能な、ＨＤＡＣ酵素、特にＨＤＡＣ１またはそのフラグメントと、ＡＰＰＬまたはそのフラグメントの相互作用の使用をなすアッセイを提供する。ＡＰＰＬは、またＤＩＰ１３αとしても知られ、「ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質」７−１０を表し、そして真核細胞におけるＨＤＡＣの新規な直接結合パートナーおよびその酵素活性の調節における鍵因子として同定された。アッセイは、試験化合物がＡＰＰＬとＨＤＡＣとの相互作用を変えることができるか否かを同定するために有用である。またアッセイは、試験化合物がＨＤＡＣのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定するために有用である。上記アッセイは、ＡＰＰＬ（配列番号：２）または関連ペプチドとＨＤＡＣとの相互作用が、ポジティブまたはネガティブ対照として調査されるか、または試験化合物により得られる結果に比較される、競合、非競合および比較アッセイを含む種々の形式において実施することができる。
【００１７】
その他の態様では、本発明は、ＡＰＰＬのアミノ酸５００−６３５（配列番号：３）からなるＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントならびにその同族体をコードしている、単離および精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子およびその診断的および治療的使用に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、ＨＤＡＣドメインにおける、これ以降ではＡＰＰＬ結合部位とも呼ばれるＡＰＰＬ結合性領域またはＡＰＰＬ結合部位の同定、およびＨＤＡＣ１のアミノ酸５１−８４（配列番号：７）からなる該ＡＰＰＬ結合性領域ならびにその同族体をコードしている、単離および精製されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子、および本発明によるアッセイにおける該ＡＰＰＬ結合性領域の使用に関する。
【００１９】
さらなる実施態様では、本発明は、本発明によって提供されるアッセイにおいて同定された化合物を含んでなる製薬学的組成物、および増殖性症状、例えばがんおよび乾癬を抑制するためのその治療的使用に関する。本発明は、本発明の化合物の有効量を投与することによって、形質転換された細胞を含む細胞の異常増殖を抑制する方法を提供する。細胞の異常増殖は、正常な調節機構に依存しない細胞増殖（例えば、接触抑制の喪失）を指す
。これは、増殖停止、最終分化および／またはがん細胞のアポトーシスを惹起することによって直接的に、および腫瘍の新生血管形成を抑制することによって間接的に、両腫瘍増殖の抑制を含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、細胞フラクションを、溶質基質に固定化されたＡＰＰＬまたはそのＨＤＡＣ結合性フラグメントと接触させ、そしてそこからＨＤＡＣを溶出することを含んでなる、ＨＤＡＣを含有する細胞フラクションからＨＤＡＣを単離する方法を提供する。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「ＡＰＰＬ」は、アミノ酸配列、配列番号：２を有するＤＩＰ１３αとしてもまた知られる、ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質またはＡＰＰＬ関連タンパク質を指し、ここで、該関連タンパク質は、ＡＰＰＬをコードしているアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加の方法によって前記配列から誘導され、そして該ＡＰＰＬ関連タンパク質は、配列番号：２に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有し、そして本発明によるＨＤＡＣタンパク質に結合することが可能である。その他の実施態様では、本発明は、ＡＰＰＬタンパク質のフラグメントを提供し、ここで、該フラグメントは、親タンパク質において隣接している少なくとも１００、１５０、２００、２５０または３００個のアミノ酸を含み、そして該フラグメントは、ＨＤＡＣまたはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントを結合することが可能である。特定の実施態様では、該フラグメントは、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメント（配列番号：３）ならびにその同族体からなり、ここで、該同族体は、配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有し、そしてＨＤＡＣタンパク質、特にＨＤＡＣ１に結合することが可能である。先に定義されたＡＰＰＬフラグメントは、本文をとおして使用されるように、ＡＰＰＬ関連タンパク質の定義内にあることを意味する。
【００２２】
先に使用されるように、「ＨＤＡＣ」は、コアヌクレオソームのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む、タンパク質のリジン残基におけるアセチル修飾の除去を触媒する酵素である。本発明において使用されるように、これらの酵素は、ＨＤＡＣタンパク質１〜１１、特にアミノ酸配列、配列番号：５を有するＨＤＡＣ１またはその同族体からなり、ここで、該同族体は、配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有し、そしてＡＰＰＬまたはＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントに結合することが可能である。また本発明の目的は該ＨＤＡＣタンパク質のフラグメントを提供し、ここで、該フラグメントは、親タンパク質において隣接している少なくとも２０個のアミノ酸を含むが、望ましくは、親タンパク質において隣接している少なくとも４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０個のアミノ酸を含有してもよく、そして該フラグメントは、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントを結合することが可能である。特定の実施態様では、該フラグメントは、ヒストンデアセチラーゼ・ドメイン（配列番号：６）またはその同族体を含み、ここで、該同族体は、配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する。より特定の実施態様では、該フラグメントは、ＨＤＡＣ１のアミノ酸５１−８４（配列番号：７）からなるＡＰＰＬ結合性領域またはその同族体を含み、ここで、該同族体は、配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。さらなる実施態様では、ＡＰＰＬ結合性領域の同族体は、配列番号：７に較べられた場合、位置１および１４におけるメチオニン（Ｍ）、位置３おける疎水性アミノ酸；位置６および３１におけるプロリン（Ｐ）；位置９におけるアラニン（Ａ）；位置１２および１３におけるグルタメート（Ｅ）、位置１９における芳香族アミノ酸および位置１８におけるヒスチジン（Ｈ）を有することを特徴とする。本明細書で使用されるように、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）またはヒスチジン（Ｈ）からなる群から選ばれ、そして疎水性アミノ酸は、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）またはプロリン（Ｐ）からなる群から選ばれる。なおさらなる実施態様では、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントは、配列番号：６または配列番号：７からなる。
【００２３】
２種以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は当該技術分野において周知である。したがって、例えば、Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Ｄｅｖｒｅｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５，１９８４）において利用できるプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰが、２種のポリヌクレオチド間の％同一性および２種のペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の％同一性および％類似性を決定するために使用されてもよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，１９５−１９７，１９８１）の「局部的相同性」アルゴリズムを使用し、そして２種配列間の類似性の最良な単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さの違う２種のポリヌクレオチドまたは２種のペプチドまたはポリペプチド配列を比較するのにより適しており、このプログラムは、より短い配列がより長い配列の一部を表すことを想定する。これに対して、ＧＡＰは２種の配列を整列して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムにしたがって「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さである配列を比較するのにより適していて、そして整列は全長にわたって期待される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメーター「ＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ」および「Ｌｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列については５０および３であり、ポリペプチド配列については１２および４である。好ましくは、％同一性および類似性は、比較される２種の配列が任意に整列される場合に決定される。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該技術分野匂い手は既知である、例えばプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Ａｌｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２、１９９７）。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「化合物」は、すべてのサイズの原子の有機または無機集合であり、そして低分子（約２５００ダルトン未満）または高分子、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質全体およびポリヌクレオチドを含む。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「試験」化合物は、該試験化合物がＨＤＡＣ酵素のアゴニストまたはアンタゴニストであるか否か調査する試験において使用される化合物である。試験化合物がＨＤＡＣ酵素の実際のアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かは、本発明によるアッセイにおいて決定される。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「アゴニスト」はＨＤＡＣ酵素と相互作用し、そして活性化する化合物である。活性化されたＨＤＡＣ酵素は、タンパク質のアセチル化されたリジン残基からアセチルの除去を触媒でき、そして例えば、検出可能に標識されたアセチル−ヒストンペプチド基質からの酢酸の遊離を測定することによって調査することができる。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「アンタゴニスト」は、ＨＤＡＣ酵素と相互作用し、そしてその活性化を抑制または妨害する化合物である。
【００２８】
ポリヌクレオチド
したがって、第１の実施態様では、本発明は、ＡＰＰＬまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の使用に関していて、ここで、該核酸分子は、ＡＰＰＬおよび関連ペプチドとＨＤＡＣまたはそのフラグメントとの相互作用の使用をなすアッセイにおける、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００２９】
第２の実施態様では、本発明は、ＨＤＡＣまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の使用に関していて、ここで、該核酸分子は、ＡＰＰＬおよびＡＰＰＬ関連タンパク質とＨＤＡＣまたはＨＤＡＣフラグメントとの相互作用の使用をなすアッセイにおける、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「単離された」は、問題のポリヌクレオチド、タンパク質およびポリペプチド、またはそれぞれそのフラグメントが、それらのインビボ環境から持ち去られる事実を指し、その単離によって、例えば限定されるものではないが、核酸フラグメントについての、配列決定、制限消化、部位特異的変異誘発および発現ベクター中へのサブクローニング、ならびに場合によっては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を生成できる量におけるタンパク質またはタンパク質フラグメントの獲得、アミノ酸配列決定およびペプチド消化のように、それらが、熟達者によって操作できるようになる。言い換えれば、「単離された」は、天然に存在する配列がその正常な細胞内容物から持ち去られたことを示す。かくして、配列は細胞を含有しない溶液において存在するか、または異なる細胞環境または核酸内容物中に置くことができる。したがって、本明細書で請求される核酸は、細胞全体においてまたは細胞溶解物において、あるいは部分的、実質的または全体的に精製された形態物において存在することができる。
【００３１】
ポリヌクレオチドは、それが環境の混入物から除かれて精製される場合に「精製された」と考えられる。かくして、細胞から単離されたポリヌクレオチドは、標準的方法によって細胞成分から精製された場合に実質的に精製されたと考えられ、一方、化学的に合成された核酸配列は、その化学的前駆物質から精製された場合に実質的に精製されたと考えられる。「実質的に純粋な」タンパク質または核酸は、より大きいパーセンテージが好適であるが、典型的にはサンプルの少なくとも８５％を含むであろう。タンパク質または核酸分子の純度を決定する１つの方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのようなマトリックスにおいて調製物を電気泳動することによる。純度は、染色後の単一バンドの出現によって証明される。純度を調べる他の方法は、クロマトグラフィー、質量分光測定法および分析用遠心分離を含む。
【００３２】
用語「そのフラグメント」は、該フラグメントが、親核酸分子において隣接している１５個以上のヌクレオチドを含むが、望ましくは親核酸分子の少なくとも４０、５０または１００個のヌクレオチドを含有してもよいような、その配列が本明細書で開示される核酸分子の断片またはサブ領域を述べる。用語「そのフラグメント」は、単離されたフラグメント、断片またはサブ領域が受容体の活性部位、結合部位またはリン酸化部位のような機能的に明確な領域を含む「機能性フラグメント」を含むことを意図している。機能性フラグメントは、クローニング技術によるか、または交互スプライシング技術の自然産物として生産されてもよい。ＨＤＡＣタンパク質に関連して使用されるように、機能性フラグメントは該タンパク質の酵素活性、すなわち、コアヌクレオソームヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む、タンパク質におけるリジン残基のアセチル修飾の除去を保持している。それらの活性は、典型的には、例えば、以下の実施例４に与えられる例のように、基質として検出可能に標識されたアセチル化ヒストンを用い、そして標識されたアセチル基の遊離を測定して調査される。ＨＤＡＣタンパク質の機能性フラグメントは、最小でも、該タンパク質のヒストンデアセチラーゼ・ドメイン、特に、アミノ酸配列、配列番号：６を有し、かつ核酸、配列番号：４の１０９〜１０４７によってコードされたＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメイン、またはその同族体を含み、ここで、該同族体は核酸、配列番号：１０９の〜１０４７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。
【００３３】
特に、本発明は、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＡＰＰＬをコードしている核酸分子；
（ｂ）ＡＰＰＬをコードしている核酸配列（配列番号：１）を含んでなる核酸分子；
（ｃ）核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８を含んでなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントならびにその同族体をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：３の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）アミノ酸配列、配列番号：３を含んでなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＡＰＰＬをコードしている核酸分子：
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、ＡＰＰＬまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を包含する。
【００３４】
また、本発明の１つの実施態様は、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を有するＡＰＰＬをコードしている核酸分子；
（ｂ）ＡＰＰＬをコードしている単離された核酸配列（配列番号：１）を含んでなる核酸分子；
（ｃ）核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８ならびにその同族体からなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該ＨＤＡＣ結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号：３を有する；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｇ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＡＰＰＬをコードしている核酸分子：
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、ＡＰＰＬまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様では、ＡＰＰＬをコードしている核酸分子は配列番号：１からなり、そしてＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子は核酸
、配列番号：１の１５５４〜１９５８からなる。
【００３６】
したがって、本発明は、
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなる、ＨＤＡＣ１をコードしている核酸分子；
（ｂ）ＨＤＡＣ１をコードしている、配列番号：４のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子；
（ｃ）核酸、配列番号：４の１０９〜１０４７ならびにその同族体を含んでなる、ＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）アミノ酸配列、配列番号：６を含んでなる、ＨＤＡＣのヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子；
（ｅ）核酸、配列番号：４の２３５〜３３６ならびにその同族体を含んでなる、ＨＤＡＣ１のＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｆ）アミノ酸配列、配列番号：７を含んでなる、ＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子；
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、ＨＤＡＣをコードしている核酸分子：
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、ＨＤＡＣまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を包含する。
【００３７】
また本発明の目的は、
（ａ）配列番号：５のアミノ酸配列を有するＨＤＡＣ１をコードしている核酸分子；
（ｂ）ＨＤＡＣ１をコードしている配列番号：４のヌクレオチド配列からなる核酸分子；（ｃ）核酸、配列番号：４の１０９〜１０４７ならびにその同族体からなる、ＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）アミノ酸配列、配列番号：６を有する、ＨＤＡＣのヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子；
（ｅ）核酸、配列番号：４の２３５〜３３６ならびにその同族体からなる、ＨＤＡＣ１のＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｆ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、ＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子；
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子；または
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなるＨＤＡＣをコードしている核酸分子：
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、ＨＤＡＣまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を提供することである。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、ＨＤＡＣをコードしている核酸分子は配列番号：４からなり、そしてＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子は、核酸、配列番号：４の〜１０４７、より特には核酸、配列番号：４の２３５〜３３６からなるそのフラグメントからなる。
【００３９】
当業者は、遺伝コードの退化により、ヌクレオチド塩基対の種々の「サイレント」置換が、コードされたアミノ酸またはタンパク質生産物の同一性を変えることなく、配列番号：１、配列番号：４として同定された配列、または該配列の先に同定されたフラグメント中に導入できることを認識できる。すべてのそのような置換は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「相補的」または「相補性」は、二本鎖核酸分子を形成するためにプリンおよびピリミジンヌクレオチドが水素結合をとおして会合する能力を指す。次の塩基対が相補性に関係している：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書で使用されるように、「相補的」は、前記関係が、該分子の全長にわたって２本の一本鎖核酸分子を含んでなる実質的に全塩基対に適用されることを意味する。「部分的に相補的」は、２本の一本鎖核酸分子の１本が、１本の分子の一部が一本鎖のまま残るように、他方よりも短い長さである前記関係を言う。
【００４１】
用語「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖の核酸分子がヌクレオチド塩基対合を介して相補的な鎖と結合するプロセスを指す。
【００４２】
用語「緊縮（ストリンジェンシー）」はハイブリダイゼーション条件を指す。高い緊縮条件は非相同的塩基対合を嫌う。低緊縮条件は反対の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば、温度および塩濃度によって変えることができる。「緊縮条件」は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌ変性、せん断されたサケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中４２℃で一夜のインキュベーション、それに続く約６５℃における０．１ｘＳＳＣ中でのフィルターの洗浄を言う。さらに適当なハイブリダイゼーション条件は実施例において記述される。
【００４３】
ＡＰＰＬ内のＨＤＡＣ結合性フラグメントおよびＨＤＡＣ内のＡＰＰＬ結合性フラグメントの同定および特性決定が与えられれば、また、本発明の目的は、
（ａ）核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８ならびにその同族体からなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該ＨＤＡＣ結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号：３を有する；
（ｃ）核酸、配列番号：４の２３５〜３３６ならびにその同族体からなる、ＨＤＡＣ１の
ＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、ＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子：
からなる群から選ばれる単離され、精製された核酸分子を提供することである。
【００４４】
また本発明は、先に定義された単離された核酸分子を含んでなるベクター、ならびにそのようなベクターにより安定に形質転換された宿主細胞を提供する。用語「ベクター」は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製および／または適当な発現のために宿主細胞中にＤＮＡを移送するために有用である外因性ＤＮＡのすべての担体を指す。したがって、特定の実施態様では、該ベクターは、ｐＧＬ３ｌｕｃ、ｐＢＬＣＡＴ５（ＬＭＢＰ２４５１）、ｐＧＭＣＳＦｌａｃＺ（ＬＭＢＰ２９７９）、ｐＥＧＦＰまたはｐＳＥＡＰｂａｓｉｃ（ＤＭＢ３１１５）のような発現ベクターであり、ここで、ＬＭＢＰおよびＤＭＢナンバーは、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓにおけるこれらの発現ベクターの受入ナンバーを指す。そのような宿主細胞は、原核細胞、単細胞の真核細胞または多細胞生物由来の細胞であってもよい。かくして、宿主細胞は、例えば、Ｅ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母細胞、またはＨＥＫ２３９細胞のような哺乳動物細胞であってもよい。宿主細胞中へのベクターの導入を実施するために使用される方法は、組み換えＤＮＡ法に習熟した者には周知の標準的な方法である。
【００４５】
したがって、本発明の目的は、
（ａ）核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８ならびにその同族体からなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号：１の１５５４〜１９５８に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該ＨＤＡＣ結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号：３またはその同族体を有し、該同族体は配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
（ｃ）核酸、配列番号：４の１０９〜１０４７ならびにその同族体からなる、ＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｄ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、ＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
（ｅ）核酸、配列番号：４の２３５〜３３６ならびにその同族体からなる、ＨＤＡＣ１のＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：４の該フラグメントに対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％
の同一性を有する；
（ｆ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、ＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する塩基を含んでなる核酸分子；または
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子：
からなる群から選ばれる単離され、精製された核酸分子を含んでなるベクターを提供することである。
【００４６】
本発明によるベクターは、ＡＰＰＬとＨＤＡＣタンパク質の相互作用を調節する化合物を同定する方法において特に有用であり；そのような方法は、例えば、分子生物学者には周知であるツー・ハイブリッドベクター系を含む（Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５  １９８９）。この技術は、レポーター遺伝子を活性化する転写因子のインビボでの機能的再構成に基づく。より具体的には、本技術は、ＤＮＡ結合性ドメインと活性化ドメインを有する転写因子によって調節されるプロモーターの制御下のレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物をもつ適当な宿主細胞を提供し、ＡＰＰＬまたはそのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸配列のフラグメントまたは全部および転写因子の該ＤＮＡ結合性ドメインまたは該活性化ドメインのいずれかの第１の融合物をコードしている第１のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞において発現し、第１の融合物において組み込まれていない転写因子のＤＮＡ結合性または活性化ドメインとともにＨＤＡＣまたはＡＰＰＬフラグメントをコードしている、少なくとも１種の第２のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主において発現し；宿主細胞におけるいずれかのレポーター遺伝子産物の存在について検出することによって本発明によるタンパク質と探索されているタンパク質のいずれかの結合を検出することを含む。
【００４７】
そのような技術の１例は酵母におけるＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡＬ４は酵母におけるガラクトース代謝の転写アクチベーターであり、そしてガラクトース代謝遺伝子ならびにタンパク質結合性ドメインの上流のアクチベーターに結合するための別のドメインを有する。ヌクレオチドベクターが構築されてもよく、これの１つは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合性ドメインをコードしているヌクレオチド残基を含む。これらの結合性ドメイン残基は、前記のＡＰＰＬまたはそのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている核酸配列に融合されてもよい。その他のベクターは、前記のＨＤＡＣまたはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントをコードしている残基に融合された、ＧＡＬ４のタンパク質結合性ドメインをコードしている残基を含む。本発明による核酸によってコードされた神経栄養因子と試験されるタンパク質との間のいずれかの相互作用は、ベクターが導入されたＧＡＬ−４転写欠陥酵母細胞においてレポーター分子の転写活性化をもたらす。好ましくは、β−ガラクトシダーゼのようなレポーター分子は、酵母のガラクトース代謝遺伝子の転写の回復により活性化される。
【００４８】
ポリペプチド
本発明はまた、ＡＰＰＬおよび関連ペプチドとＨＤＡＣ酵素との相互作用の使用をなすアッセイにおけるＨＤＡＣ酵素またはそのフラグメントの使用に関していて、該ポリペプチドは、本発明による単離され、精製された核酸分子によってコードされている。
【００４９】
本明細書で使用されるＨＤＡＣ酵素は、
（ａ）アミノ酸配列、配列番号：５またはその同族体を有する、単離され、精製されたＨＤＡＣ１タンパク質であって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｃ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれるＨＤＡＣ１酵素またはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントの１つの実施態様にある。
【００５０】
１つの実施態様では、ＨＤＡＣ１タンパク質は、配列番号：５のアミノ酸配列またはその同族体を含む。特に、ＨＤＡＣ１の機能性フラグメントが該タンパク質の酵素活性を保持するその機能性フラグメントは、すなわち、コアヌクレオソームヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を含む、タンパク質におけるリジン残基のアセチル修飾を除去する。ＨＤＡＣタンパク質の機能性フラグメントは、最小には、該タンパク質のヒストンデアセチラーゼドメイン、特にアミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有するＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼドメインを含み、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。より特定の実施態様では、ＨＤＡＣタンパク質の機能性フラグメントは、アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたポリペプチドからなり、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。その他の実施態様では、ＨＤＡＣ１タンパク質は、アミノ酸配列、配列番号：５またはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントからなる。ＡＰＰＬ結合性フラグメントは、配列番号：７からなるか、または前記の共通配列を含むかいずれかである。特にＡＰＰＬ結合性フラグメントは、配列番号：７または前記のその同族体かいずれかからなる。
【００５１】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるアッセイにおけるＡＰＰＬおよび関連ペプチドの使用に関する。好適な実施態様では、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質は、ｉ）アミノ酸配列、配列番号：２を含んでなる、ＡＰＰＬをコードしている単離されたポリペプチド；
ｉｉ）ＡＰＰＬから誘導され、そしてＨＤＡＣへの結合の可能な単離されたポリペプチド；
ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号：３またはその同族体を含んでなる、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる。
【００５２】
本発明の１つの実施態様では、ＡＰＰＬは、配列番号：２によってコードされたアミノ酸配列、前記のＡＰＰＬ関連タンパク質、または配列番号：３によってコードされたＨＤＡＣ結合性フラグメントからなる。
【００５３】
ＡＰＰＬ内のＨＤＡＣ結合性フラグメントおよびＨＤＡＣ内のＡＰＰＬ結合性フラグメントの同定および特性決定が与えられれば、また、本発明の目的は、
（ａ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｃ）アミノ酸配列、配列番号：３またはその同族体を有する、ＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントをコードしている単離され、精製されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる、単離され、精製されたポリペプチドを提供することである。
【００５４】
本発明による受容体タンパク質およびペプチドは、すべての可能な保存アミノ酸変更物（ｃｈａｎｇｅｓ）を含み、ここで、「保存アミノ酸変更物」は、技術的に認識されたある種のアミノ酸の置換可能性に基づいて、親分子の生物活性に影響することなく親の受容体タンパク質またはペプチドにおける１種以上のアミノ酸残基の置換物を指す（参照、例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ．３，ｐｇｓ  ３４５−３５２，１９７８）。
【００５５】
当業者は、本発明によるポリペプチド、すなわち、ＨＤＡＣ酵素、ＡＰＰＬ結合性フラグメントおよびＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質が、例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、またはｄｅ  ｎｏｖｏのＤＮＡ合成を含む、多数の組み換えＤＮＡ技術によって得られることを認識できる（参照、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ．Ｃｈａｐ．１４（１９８９））。
【００５６】
本発明のペプチドおよび誘導体は、十分に確立された、標準的液体または好ましくは固相ペプチド合成法にしたがって容易に製造することができ、この方法の一般的記述は広く利用できる、あるいはそれらは、液相法によるか、または固相、液相および溶液化学のいかなる組み合わせによっても、溶液において製造されてもよい。
【００５７】
本発明によるポリペプチドは、例えば、コードしている核酸からの発現によって生産された後、単離および／または精製（例えば、抗体を用いて）されてもよい。単離および／または精製されたポリペプチドは、少なくとも１種のさらなる成分を含んでもよい組成物、例えば、製薬学的に許容できる添加物、媒質または担体を含む製薬学的組成物の調合において使用されてもよい。
【００５８】
本発明によるポリペプチドは、特定の抗体を得る際に免疫原またはその他として使用されてもよい。抗体は、ポリペプチドの精製および他の操作、診断学的スクリーニングおよび治療学的環境において有用である。本発明のポリペプチドに対する抗体は、当該技術分野において既知である技術によって有利に製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、マウスのような宿主動物に成長因子またはそのエピトープを接種し、そして免役血清を回収することによって製造されてもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ
Ｒ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５−４９７によって記述されているような既知の技術にしたがって製造されてもよい。
【００５９】
本発明によるポリペプチドは、それに結合するか、またはその活性もしくは機能を調節する分子のスクリーニングにおいて使用されてもよい。そのような分子は治療学的（予防的を含むことも可能）環境において有用であろう。
【００６０】
本発明のポリペプチドまたは標識されたポリペプチドまたはそのフラグメントもまた、固相、例えばイムノアッセイウェルまたはディスクの表面に固定することができる。
【００６１】
そのような標識された、そして／または固定化されたポリペプチドは、適当な試薬、対照物質、指示書などとともに適当な容器におけるキット中に包装されてもよい。
【００６２】
そのようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによってサンプル中に存在するそのようなポリペプチドまたはその活性部分もしくはフラグメントに対する抗体の検出方法において使用することができる。
【００６３】
イムノアッセイ法は、当該技術分野において周知であり、そして一般に、
（ａ）該タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含んでなるポリペプチドを提供し；
（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で該ポリペプチドと生物サンプルをインキュベートし；そして
（ｃ）該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたか否かを決定すること；を含むことができる。
【００６４】
アッセイ
本発明のアッセイは、生物学的活性または結合性タンパク質について化合物をスクリーニングする当該技術分野において一般に既知の多くの形式において計画することができる。
【００６５】
本発明のポリペプチドは、１つ以上の疾病状態、特に前述の疾病を含む、１つ以上の生物学的機能のために応答することができる。したがって、ＨＤＡＣの機能を促進するか、または抑制する化合物を同定するスクリーニング法を案出することが望まれる。
【００６６】
本発明のアッセイは、有利には、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質がＨＤＡＣ酵素のためのコ・ファクターであり、そしてそれへの結合によりＨＤＡＣ酵素を活性化するという事実を利用する。
【００６７】
したがって、本発明は、ＨＤＡＣ酵素に特異的に結合する化合物を同定する方法を含み、ここで、該化合物はＨＤＡＣ酵素のアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。本発明のアッセイ法は、本アッセイが、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質とＨＤＡＣとの相互作用がアッセイに組み入れられるか、またはそれらがＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性フラグメントを応用するか、少なくとも１つの段階を組み入れているので、当該技術分野において既に記述されたアッセイ法とは異なる。
【００６８】
かくして、本発明は、
ａ）ＨＤＡＣ酵素またはそのフラグメントを含有する給源を、
ｉ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質、
ｉｉ）該試験化合物
とともにインキュベートし；そして
ｂ）酵素に結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること：
を含んでなる、ＨＤＡＣ酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
【００６９】
好適な実施態様では、本発明は、
ａ）ＨＤＡＣ１またはそのフラグメントを含有する給源を、
ｉ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質、
ｉｉ）該試験化合物
とともにインキュベートし；そして
ｂ）酵素に結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること：
を含んでなる、ＨＤＡＣ１酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
【００７０】
本発明のさらなる実施態様では、ＨＤＡＣ１を含有する給源は、
（ａ）アミノ酸配列、配列番号：５またはその同族体を有する、単離され、精製されたＨＤＡＣ１タンパク質であって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｃ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる。
【００７１】
ＡＰＰＬ結合性領域の同定に基づいて、さらに本発明は、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質と該ＡＰＰＬ結合性領域との相互作用を調節する化合物を同定するためのアッセイを提供する。そのような化合物は、ＡＰＰＬと、該ＡＰＰＬ結合性領域を含んでなる他の酵素、例えばＡＫＴ２、ＤＣＣ、ＦＳＨＲおよびＲａｂ５との相互作用を調節するアゴニストまたはアンタゴニストとして有用であろう。
【００７２】
かくして、本発明は、
ａ）ＡＰＰＬ結合性領域を含有する給源を、
ｉ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質、
ｉｉ）該試験化合物
とともにインキュベートし；そして
ｂ）結合性領域に結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること：
を含んでなる、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質と、ＡＰＰＬ結合性領域との相互作用を調節することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様では、ＡＰＰＬ結合性領域を含有する給源は、
（ａ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
（ｂ）アミノ酸配列、配列番号：７またはその同族体を有する、単離され、精製されたＡＰＰＬ結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
からなる群から選ばれる。
【００７４】
スクリーニング方法は、簡単には、ポリペプチド、またはポリペプチドを担持する細胞または膜への候補化合物の結合、あるいは候補化合物と直接または間接的に会合される標識の手段によるその融合タンパク質を測定してもよい。あるいはまた、スクリーニング方法は標識されたコンペティターとの競合を伴ってもよい。好適な実施態様では、この標識されたコンペティターは、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質のようなＨＤＡＣに結合することが知られたリガンドである。さらなる実施態様では、該ＡＰＰＬ関連タンパク質は、配列番号：３によってコードされたＨＤＡＣ結合性フラグメントまたはその同族体からなり、ここで、該同族体は、配列番号：３に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する。
【００７５】
それ故、より好適な実施態様では、スクリーニング方法は、標識されたＡＰＰＬまたは標識されたＡＰＰＬ関連タンパク質を含み、ここで、該標識は、ＨＤＡＣ酵素またはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントに結合されたＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定するために使用される。
【００７６】
したがって、本発明は、
ｉ）ＨＤＡＣ１酵素またはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントを、配列番号：２によってコードされたアミノ酸配列を含んでなる標識されたＡＰＰＬ関連タンパク質、好ましくは配列番号：３からなるヨウ素化ＡＰＰＬ関連タンパク質とともにインキュベートし；
ｉｉ）インキュベーション混合液に試験化合物を添加し；そして
ｉｉｉ）ＨＤＡＣ１酵素またはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントに結合される標識されたＡＰＰＬ関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること：
を含んでなる、ＨＤＡＣ１酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
【００７７】
１つの実施態様では、ＨＤＡＣ１酵素はアミノ酸配列、配列番号：５を有し、あるいはまた、ＡＰＰＬ結合性フラグメントは配列番号：７を含む。その他の実施態様では、ＡＰＰＬ結合性フラグメントは、配列番号：７からなるか、または先に定義された共通配列を含む。
【００７８】
可能な結合アッセイの例は、以下に示す実施例において与えられる免役沈降アッセイまたはＢｉａｃｏｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ  Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．１９９９  Ｆｅｂ；２７（２）：３３５−４０）によって開発された表面プラズモン共鳴効果の使用である。後者では、本発明のポリペプチドのＦＬＡＧ−タグまたはＨｉｓ−タグを付された改変物がＢｉａｃｏｒｅのバイオセンサーチップに付着され、そして結合性パートナーの結合が化合物の存在および不在下で試験されて、結合部位のコンペティターを同定できる。例えば、１つの実施態様では、先に定義されたＡＰＰＬのＨＤＡＣ結合性フラグメントまたはその同族体が、Ｆｌａｇタグを用いてＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化され、そしてＨＤＡＣまたはそのＡＰＰＬ結合性フラグメントの結合が化合物の存在および不在下で試験されて、結合部位のコンペティターが同定される。あるいはまた、先に定義されたＨＤＡＣのＡＰＰＬ結合性フラグメントまたはその同族体が、Ｆｌａｇタグを用いてＢｉａｃｏｒｅチップ上に固定化され、そしてＡＰＰＬまたはそのＨＤＡＣ結合性フラグメントの結合が化合物の存在および不在下で試験されて、結合部位のコンペティターが同定される。
【００７９】
本発明によるポリペプチドのタグ付着もまた、慣用のフィルター結合アッセイ（例えば、Ｂｒａｎｄｅｌフィルターアッセイ装置を用いる）または高処理Ｓｃｉｎｔｉｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ型結合アッセイ（ＳＰＡ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ  ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において該分子を固定化して、放射能標識リガンドの結合および結合部位に対するコンペティターによるそのような放射性リガンドの置換を検出するために有用である。放射能は、９６−、３８４−、１５３６穴ミクロタイターウェル形式からの迅速測定を可能にするＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔまたは類似の装置を用いて測定することができる。ＳＰＡ／Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔ技術は、高処理スクリーニングを特に受け入れることができ、したがって、この技術は、標準的リガンドを置換できる化合物のスクリーニングとして使用するために適当である。
【００８０】
さらに、これらのスクリーニング方法は、酵素の酵素活性に適当な検出系を用いて、候補化合物が、該酵素の活性化または阻害によって生成されるシグナルをもたらすか否かを試験してもよい。酵素活性は、一般に、処理によって測定可能なシグナルを与える適当な
基質を用いて調査される。ＨＤＡＣの活性／活性化を測定するアッセイは、一般に、当該技術分野においては既知であり、なかんずく、基質としての放射能標識または蛍光標識されたアセチル化ヒストンおよび以下の実施例４において与えられるような標識されたアセチル基の遊離の測定を含む。
【００８１】
したがって、本発明は、
ａ）ＨＤＡＣまたはその機能性フラグメントを、該試験化合物とともにインキュベートし；
ｂ）ＨＤＡＣ酵素の活性に及ぼす試験化合物の影響を測定し：そして
ｃ）この影響を、ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質の結合におけるＨＤＡＣ酵素の活性と比較すること；
を含んでなる、ＨＤＡＣの活性を調節することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
【００８２】
本発明のさらなる実施態様では、ＨＤＡＣ酵素は、
ａ）アミノ酸配列、配列番号：５またはその同族体を有するＨＤＡＣ１であって、該同族体は配列番号：５に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の同一性を有する；
ｂ）ＨＤＡＣ１の機能性フラグメント；または
ｃ）アミノ酸配列、配列番号：６またはその同族体を有するＨＤＡＣ１のヒストンデアセチラーゼ・ドメインであって、該同族体は配列番号：６に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する；
からなる群から選ばれる。
【００８３】
ＨＤＡＣ酵素に及ぼす試験化合物の影響は、典型的には、基質として放射能標識または蛍光標識されたアセチル化ヒストンを用い、そして標識されたアセチル基の遊離を測定して調査される。特に以下の実施例４において与えられるような放射能標識されたアセチル化ヒストンＨ４を用いて。
【００８４】
ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ関連タンパク質とＨＤＡＣとの相互作用の発見が、また、
ａ）ＡＰＰＬまたはＡＰＰＬ誘導体によるＨＤＡＣ上の結合部位の構造を探査し；
ｂ）結合においてＡＰＰＬリガンドと相互作用するＨＤＡＣタンパク質の結合部位において接触する原子を同定し；
ｃ）ＨＤＡＣ酵素の活性を調節するように、（ｂ）において同定された原子と相互作用する試験化合物を設計し；そして
ｄ）該設計された試験化合物をＨＤＡＣまたはその機能性フラグメントと接触させて、ＨＤＡＣ活性を調節する該化合物の能力を測定すること；
によって、ＨＤＡＣのアゴニストまたはアンタゴニストの構造に基づくまたは合理的な設計のための方法において使用されてもよいことは、当業者によって容易に評価できる。
【００８５】
これが普通に繰り返される方法であることはさらに評価できる。
【００８６】
さらに、本発明は、ＡＰＰＬ結合部位と相互作用する試験化合物の潜在性を評価するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＡＰＰＬ結合部位の三次元構造を系統的に表す分子造形技術を用い；
（ｂ）試験化合物とＡＰＰＬ結合部位の三次元構造との間の適合化操作を実施するコンピューター手段を使用し；そして
（ｃ）該適合化操作の結果を分析して試験化合物とＡＰＰＬ結合部位の三次元構造との会合を定量化すること；
を含む。
【００８７】
分子造形技術は当該技術分野においては既知であり、レセプターおよび酵素コンフォメーションの模型の創出と利用のために適当な両ハードウェアおよびソフトウェアを含む。
【００８８】
多様なコンピュータープログラムが利用でき、そして本明細書で記述される方法における潜在的なａｔｐＥ相互作用化合物のコンピューター造形、模型製作、およびコンピューターによる同定、選択および評価の処理のために適する。これらは、例えば、ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＫから得られる）、ＭＣＳＳ（Ａｃｃｅｌｒｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡから得られる）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから得られる）、ＦＬＥＸＸ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得られる）、ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから得られる）、ＣＡＶＥＡＴ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙから得られる）、ＨＯＯＫ（Ａｃｃｅｌｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得られる）および３Ｄデータベース・システム、例えばＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡから得られる）、ＵＮＩＴＹ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得られる）およびＣＡＴＡＬＹＳＴ（Ａｃｃｅｌｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得られる）を含む。潜在的な候補物質はまた、ＬＵＤＩ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得られる）、ＬＥＧＥＮＤ（Ａｃｃｅｌｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから得られる）およびＬＥＡＰＦＲＯＧ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得られる）のようなソフトウェア・パッケージを用いて、「初めから」コンピューターにより設計されてもよい。化合物ひずみエネルギーおよび静電反発は、ＧＡＵＳＳＩＡＮ  ９２，ＡＭＢＥＲ、ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭおよびＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩ／ＤＩＳＣＯＶＥＲのようなプログラムを用いて解析されてもよい。これらのコンピューター評価および造形技術は、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓおよびその他から得られるワークステーションを含むいかなる適当なハードウェアにおいて実行されてもよい。これらの造形技術、方法、ハードウェアおよびソフトウェアパッケージは代表的なものであり、そして包括的なリストであることを意図していない。当該技術分野において既知の他の造形技術もまた本発明にしたがって用いられてもよい。例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）参照。
【００８９】
本発明の１つの実施態様では、ＡＰＰＬ結合性部位の三次元構造は、ＨＤＡＣ８タンパク質の原子座標（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  １Ｗ２２）＋／−１０Å以下、好ましくは５Å以下の該アミノ酸の骨格原子の根平均平方偏差を用いて生成される。
【００９０】
治療的使用
一般に、アゴニストまたはアンタゴニストは、前述されたような疾病に対する治療的および予防的目的のために使用されてもよい。化合物は、種々の起源、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび自然生産物混合物から同定されてもよい。そのように同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、場合によっては受容体ポリペプチドの、天然または改変ペプチド、リガンド、酵素などであってもよく；または、それらの構造的または機能的模倣物であってもよい（参照、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１））。
【００９１】
したがって，本発明は、腫瘍の増殖を抑制する処置において、医薬としての、そして使用のためのＡＰＰＬ結合性フラグメントまたはその同族体の使用に関する。抑制されてもよい腫瘍の例は、限定されるものではないが、肺がん（例えば、非小細胞肺がんを含む腺
がん）、膵臓がん（例えば、外分泌膵臓がん腫のような膵臓がん腫）、結腸がん（例えば、結腸腺がんおよび結腸腺腫のような結腸直腸がん腫）、後生的疾病を含む前立腺がん、リンパ様系統の造血性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺胞状がん、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉原発の腫瘍（例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫）、黒色腫、奇形がん、神経芽細胞腫、膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳がん（例えば、後生的乳がん）、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がんおよび表皮がんである。
【００９２】
好適な実施態様では、該ＡＰＰＬ結合性フラグメントは配列番号：７からなるか、または先に定義された共通配列を含む。より好適な実施態様では、該ＡＰＰＬ結合性フラグメントは、配列番号：７またはその同族体からなり、該同族体は配列番号：７に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有する。
【００９３】
したがって、本発明は、さらに、本発明によるアッセイにおいて同定された化合物に関し、ここで、該化合物はＨＤＡＣ酵素に結合可能であり、そして／またはその活性を調節することが可能であり、そして該化合物は、前記アッセイのいずれかにおいて決定されるような酵素のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。さらにそれは、腫瘍の増殖を抑制する処置において、医薬として、そして使用のための該化合物の使用に関する。抑制されてもよい腫瘍の例は、限定されるものではないが、肺がん（例えば、非小細胞肺がんを含む腺がん）、膵臓がん（例えば、外分泌膵臓がん腫のような膵臓がん腫）、結腸がん（例えば、結腸腺がんおよび結腸腺腫のような結腸直腸がん腫）、後生的疾病を含む前立腺がん、リンパ様系統の造血性腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺胞状がん、脊髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉原発の腫瘍（例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫）、黒色腫、奇形がん、神経芽細胞腫、膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳がん（例えば、後生的乳がん）、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がんおよび表皮がんである。
【００９４】
かくして、さらなる態様では、本発明は、ＨＤＡＣ酵素活性を調節するのに有効な量において、場合によっては製薬学的に許容できる担体と組み合わせて、ＡＰＰＬ関連タンパク質およびＡＰＰＬ結合性フラグメントを含む前記ＨＤＡＣ調節化合物の治療学的に有効な量を哺乳動物被験者に投与することを含む、ＨＤＡＣ活性の障害に関係する医学的症状を予防、処置または軽減する方法を提供する。そのような担体は、限定されるものではないが、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせ物を含む。さらに本発明は、本発明の前述の組成物の１種以上の成分を充填された１種以上の容器を含んでなる製薬学的包装物およびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でも、また他の化合物、例えば治療化合物と一緒に使用されてもよい。
【００９５】
本組成物は、全身的または経口経路のような投与経路に適応されてもよい。全身的投与の好適な形態物は典型的には静脈内注射による注射を含む。他の注射経路、例えば皮下、筋肉内または腹腔内経路が使用されてもよい。全身的投与の代替手段は、浸透剤、例えば胆汁塩またはフシジン酸または他の界面活性剤を用いる経粘膜および経皮投与を含む。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物は腸溶性またはカプセル化調合物において調合できる場合には、また経口投与も可能である。これらの化合物の投与は、パッチ剤、軟膏剤、パスタ剤、ゲル剤などの形態における局所的および／または局部的に実施される。
【００９６】
要求される用量範囲は、本発明のペプチドまたは化合物の選択、投与経路、調合物の性質、被験者の症状の性質、および担当医療実施者の判断により異なる。しかしながら、適
当な用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、特に５ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、なおより特に２ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。しかしながら、利用される種々の化合物および種々の投与経路の異なる効力の観点から、必要な用量における幅広い変化が期待される。例えば、経口投与は、静脈内注射によるよりも高い用量を必要とすることが予期されるであろう。これらの用量レベルにおける変化は、当該技術分野では周知であるように、最適化のための標準の経験的慣例手段を用いて調節することができる。一般に、細胞増殖性障害、例えばアテローム性動脈硬化、再狭窄およびがんを処置するための治療作用物として投与されるＨＤＡＣモジュレーターの量は、担当する医者によってケース・バイ・ケースで決定される。
【００９７】
本発明は次に示す実験的詳細を引用してより良く理解できるが、これらが単に本発明の具体的な説明であって、以下に示す請求項においてより完全に記述されることを、当業者は容易に評価できる。さらに、本出願を通じて種々の公表物が引用される。これらの公表物の開示は、それによって、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、本出願中に引用によって組み入れられている。
【実施例】
【００９８】
例１：新規ＨＤＡＣ１結合性タンパク質としてのＡＰＰＬの同定
新規なＨＤＡＣ１会合タンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッド・スクリーニング（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎ）が、ヒト脳のｃＤＮＡライブラリーに対するバイト（ｂａｉｔ）として全長ＨＤＡＣ１を用いて実施された。これにより、既にＡＰＰＬ７またはＤＩＰ１３α８、細胞のシグナル伝達において重要な機能を発揮するであろうアダプタータンパク質、として記述されている、ＰＴＢドメインを含有するタンパク質のフラグメント（ａａ４８９−６３９）の同定がもたらされた。同定されたＡＰＰＬのフラグメント（ａａ４８９−６３９）は、ＡＰＰＬのＰＴＢドメイン（ａａ５００−６３４）と完全に重複し、そしてさらにＡＰＰＬ−ＰＴＢと呼ばれる。
【００９９】
例２：ＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬの相互作用
ＨＤＡＣ１とＡＰＰＬのフラグメント（アミノ酸４８９−６３９）との間の相互作用が真核細胞においてもまた起きるか否かを決定するために、一連の同時免役沈降アッセイがＨＥＫ２３９細胞において実施された。図１Ａに示されるように、ＡＰＰＬ−ＰＴＢは、両タンパク質が過発現された場合（列４）、ＨＤＡＣ１と同時免役沈降された。複合体はＨＤＡＣ１過発現の不在下では検出されなかったので、この相互作用は特異的である（図１Ａ、列２−４）。逆免役沈降、すなわちＡＰＰＬ−ＰＴＢの逆免役沈降もまた、ＨＤＡＣ１の同時免役沈降をもたらした（データ未掲載）。ＡＰＰＬのＰＴＢドメイン単独がＨＤＡＣ１と有効な同時免役沈降を既に示したという事実は、このドメインが相互作用のために十分であることを示す。ＰＴＢドメインは、リン酸化ＮＰＸｐＹモチーフ、ＨＤＡＣ１には存在しないモチーフと相互作用することが初めて見出された。しかしながら、近年の公表物は、ＰＴＢ結合がＮＰＸｐＹモチーフ１２，１３には厳密には依存しないことを示している。
【０１００】
続いて、本発明者らは、ＨＤＡＣ１と全長ＡＰＰＬタンパク質間の相互作用を確認した。Ｖ５−ＡＰＰＬは、これらの両タンパク質が同時にトランスフェクトされた場合、ＨＤＡＣ１−ｆｌａｇとともに同時免役沈降された（列４、図１Ｂ）。結果的に、本発明者らは、過発現されたＨＤＡＣ１が、単離されたＡＰＰＬのＰＴＢドメインならびに全長タンパク質の両方と相互作用すると言うことができる。興味あることには、今日まで、ＡＰＰＬに結合すると記述された全てのタンパク質、すなわち、Ａｋｔ２、ＤＣＣ、ＦＳＨＲおよびＲａｂ５７−１０が、ＡＰＰＬ  ＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメインを介して相互作用する。したがって、本発明者らは、全てのＡＰＰＬ−ＰＴＢ結合性パートナーを整列させ、そしてＨＤＡＣ１のアミノ酸残基５１および８８間に置かれ（図５）、そして配列番号：７を含む、強い共通配列を同定した。興味あることには、同じ共通性は、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ８を含む全クラスＩのＨＤＡＣにおいて同定されたが、クラスＩＩまたはクラスＩＩＩファミリーメンバーのいずれにおいても同定されなかった。多数のシグナル伝達タンパク質がＡＰＰＬに結合するという事実は、スカフォードタンパク質としてのＡＰＰＬの可能性のある役割を教える。ＡＰＰＬのＰＴＢドメインは各相互作用に必要であるので、このことは、種々の結合性パートナーが互いに競合するかもしれないことを示唆する。本発明者らは、Ａｋｔ２の過発現がＡＰＰＬとＨＤＡＣとの同時免役沈降を阻止する（データ未掲載）ことを見出したが、このことはＨＤＡＣ１とＡｋｔ２がＡＰＰＬとの結合に対して競合することを示している。
【０１０１】
例３：内因性ＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬは共に局在している
内因性ＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１が相互作用するか否かを決定するために、本発明者らは、ヒトのＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がんおよびＡ２７８０卵巣がん細胞におけるＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１の局在を免役細胞化学を用いて研究した。図２は、間期の細胞におけるＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬの共局在を示す。ＡＰＰＬの染色は、細胞質に顕著に存在する粒状構造を示し、このことは、またＴｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ７によって既に記述されている。しかしながら、少部分のＡＰＰＬ小胞は核に局在していて、それらはＨＤＡＣ１と重複する。内因性ＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１シグナルの共局在の共焦点３Ｄ解析は、核の内側でＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１の明瞭な重複を示した（図２、ピクセル強度グラフ）。これは、タンパク質が、実際に静止状態の細胞において相互作用する可能性をもつことを示す。これらの２種のタンパク質が細胞周期の進行中に如何にして相互作用できるかを評価するために、本発明者らは、有糸分裂中の細胞におけるＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１の局在を評価した（図６）。中期では、ＨＤＡＣ１は染色体の周囲に再組織しているが、一方ＡＰＰＬはより散漫に存在している。後期では、ＨＤＡＣ１は染色体の周囲になお存在している。興味あることには、この特殊な有糸分裂の段階中、ＡＰＰＬは、ＨＤＡＣ１と同じ場所：明確な黄色領域によって明らかなように、分裂しつつある姉妹染色分体の中間において、顕著に局在しているようである。より後期の段階では、両ＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１はより散漫に発現される。後の終期および細胞質分裂では、ＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１は再分布する。ＨＤＡＣ１は、この段階では核においてのみ存在しているが、一方ＡＰＰＬは細胞質において顕著に存在しているので、後の終期および細胞質分裂中には重複は検出できなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における共局在実験は匹敵する結果を示した；ＡＰＰＬは、より粒状に形成され、そして間期におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の核においては、Ａ２７８０細胞におけるよりも多いＡＰＰＬが存在するようである。Ａ２７８０細胞においては、より多くのＨＤＡＣ１が細胞質に存在するように見える。間期の細胞における無刺激条件下では、ＡＰＰＬの少部分のみがＨＤＡＣ１と共に局在するという事実は、同時免役沈降およびＨＤＡＣ１活性実験が、技術的に意欲をそそられ、そしてＡＰＰＬの過発現の拡大（ｅｘｔｅｎｄ）に依存した理由を説明できる。興味あることには、Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）９は、ＡＰＰＬはＨｅＬａ細胞においてＥＧＦ刺激により核に移動することを示したが、このことは、ＥＧＦシグナル伝達経路の活性化後には、より大量のＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１が相互作用することができることを示唆する。結論として、本発明者らは、内因性ＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１は明らかに共局在していて、観察される相互作用に関して生理学的関係を強調していると言うことができる。
【０１０２】
例４：ＡＰＰＬはヒトＨＥＫ２３９細胞においてＨＤＡＣ１活性を増強する
ＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬはＨＥＫ２３９細胞において直接相互作用するので、本発明者らは、ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１活性に及ぼす効果をもつか否か疑問に思った。両タンパク質はＨＥＫ２３９細胞において等しく過発現された（図３Ｂ）。過発現の４８時間後、細胞が溶解され、ＨＤＡＣ１が免役沈降され、そして活性が、［３Ｈ］アセチル−標識されたヒストンＨ４ペプチドからの酢酸の遊離を定量することによって調べられた。注目すべ
きは、過発現されたＡＰＰＬの存在下では、等量のＨＤＡＣ１が免役沈降された（図３Ｂ、上部パネル）にもかかわらず、ＨＤＡＣ１活性は約４倍増強された（図３Ａ、条件２と４を比較）。これらの結果は、ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１酵素活性の新規なレギュレーターであることを示す。しかしながら、ＨＤＡＣ１活性がＡＰＰＬによって如何にして増強されるかは、今日まだ不明確である。ＨＤＡＣ活性の既知の調節メカニズムに基づけば、これは、コアＨＤＡＣ−ＮｕＲＤ複合体の安定化および／またはＨＤＡＣ１翻訳後修飾の強化のいずれかを必要とするであろう。
【０１０３】
例５：過発現されたＡＰＰＬはＨＥＫ２９３細胞においてヒストンＨ３のアセチル化レベルを減少させる
ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１活性を増強するという本発明者らの仮説をさらに確認するために、ヒストンＨ３のアセチル化状態が決定された。ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１活性に効果を有する場合は、ヒストンＨ３のアセチル化レベルがＡＰＰＬ過発現後に減少すると仮定された。したがって、ＨＥＫ２９３細胞がＡＰＰＬによりトランスフェクトされ、そして４８時間後に細胞がｐＭＡＣＳ選択システム（実験操作、参照）を用いてトランスフェクトされた集団について富有化された。総タンパク質抽出物が調製され、そしてウエスタンブロットにおいて分析された。ＡＰＰＬ過発現の４８時間後、ヒストンＨ３のアセチル化状態における明らかな減少が模倣対照に比較されて検出でき（図４、列２と４を比較）たが、一方、総Ｈ３タンパク質レベルは全列において等しいままであった。また、期待されたように、ＨＤＡＣ１の過発現はＨ３のアセチル化の減少をもたらし、これは、存在する内因性ＨＤＡＣ１活性の量が律速的であることを示している。両過発現タンパク質の存在は、Ｈ３のアセチル化レベルをさらには減少させなかった（図４Ａ、列５）が、Ｈ３アセチル化が、この実験においてはＨＤＡＣ１またはＡＰＰＬのみによって既に抑制されていた（図５Ａ、列３および４）ことを注目すべきである。この結果は、ＡＰＰＬがヒストンＨ３のアセチル化状態を減少させ、これはＨＤＡＣ１活性の増強と合致していることを示す。
【０１０４】
例６：過発現されたＡＰＰＬはＨＥＫ２９３細胞においてｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質レベルを減少させる
ＨＤＡＣ１活性は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の低発現レベルを維持する際にきわめて重要である２，１１。ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１のプロモーターは、数種のＳｐ１結合部位を含有し、これを介してＨＤＡＣ１が補充される。本発明者らは、ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１活性を特異的に増強し、そしてＨ３のアセチル化状態を減少する場合は、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質レベルはＡＰＰＬ過発現により低下するであろうと仮定した。再び、ＨＥＫ２３９細胞がＨＤＡＣ１および／またはＡＰＰＬにより４８時間トランスフェクトされた。総タンパク質抽出物が調製され、そしてウエスタンブロットにおいて分析された。ＡＰＰＬ過発現された場合、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質レベルにおけるほとんど完全な抑制が、対照に比較されて検出できた（図４Ｂ、列１と３を比較）。効果は、ｐ１６、その他のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤では検出できなかったので、この効果はｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１について特異的である。観察されたＡＰＰＬ媒介のｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の下方調節が内因性ＨＤＡＣ１活性に依存することを確認するために、本発明者らはＨＤＡＣ１変異体（ＨＤＡＣ１−Ｈ１４１Ａ）を利用した。この変異体では、ヒスチジン１４１がアラニン残基によって置換され、そして酵素活性における５０％の低下を示す（Ｈａｓｓｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９５；３５１９−３５２４、１９９８）。しかしながら、ＨＤＡＣ１−Ｈ１４１Ａは、Ｓｉｎ３Ａクロマチン再形成複合体を形成する能力をなお有する。図４Ｂに図示したように、Ｈ１４１Ａ変異体の同時発現は、ＡＰＰＬによってｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の抑制を部分的に反転し（列４と６に比較）、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１のＡＰＰＬ媒介抑制におけるＨＤＡＣ１の重要な役割を例証している。
【０１０５】
結論
このスクリーニングにおいて、本発明者らは、ＡＰＰＬ（ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質）をＨＤＡＣ１の新規な相互作用因子として同定した。ＡＰＰＬは、またＤＩＰ１３αとして既知であり、「ＰＨドメイン、ＰＴＢドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質」７−１０を表す。ＡＰＰＬは最初は細胞質タンパク質として記述された７が、それは、近年、ＥＧＦ９による刺激によって核に移行し、そこでＮｕＲＤ／Ｍｉ２複合体と一時的に相互作用することが報告された。ＡＰＰＬが、細胞周期の調節およびアポトーシスにおいて重要な役割を演じることを示すいくつかの事実がある。第１に、ＡＰＰＬはがん遺伝子Ａｋｔ２と相互作用することが示された７。第２には、プロ・アポトーシスタンパク質ＤＣＣ（結腸直腸がんにおいて検出された）と相互作用することが記述された。ＡＰＰＬの過発現はＤＣＣ誘導の細胞死を増進する８。第３に、Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａらは、近年、ｓｉＲＮＡを用いるＡＰＰＬのノックダウンがＤＮＡ合成に抑制効果を有することを示した９。ＡＰＰＬは細胞周期の進行に明らかに影響を与えるけれども、これが起きるメカニズムは現在知られていない。
【０１０６】
この報告では、本発明者らは、ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１の新規な直接的インターラクター（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）であり、そしてその酵素活性の調節における鍵因子であることを示す。ＡＰＰＬの過発現は、ＨＤＡＣ１活性の増強およびそれに続くヒストンＨ３のアセチル化状態の減少をもたらす。さらにまた、ＡＰＰＬ過発現は、発現レベルがＨＤＡＣ１活性に厳格に依存する重要なＧＩ細胞周期チェックポイント・レギュレーターである、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の基礎タンパク質レベルの減少を惹起する。
【０１０７】
総括すれば、本発明者らは、ＡＰＰＬはＨＤＡＣ１活性を強化し、そしてＨＤＡＣ１下流の機能を調節することを見出した。ＨＤＡＣ１活性は腫瘍細胞の増殖のためには決定的であるので、これは、ＡＰＰＬについての発がん性および／またはプロ増殖性役割を具体的に説明している。興味あることには、Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａら（２００４）９は、ＨｅＬａ細胞におけるＡＰＰＬのノックダウン後、４８時間後のＳ期において細胞のパーセンテージの明らかな減少があることを、ｓｉＲＮＡを用いて示した。結論的に、本発明者らのデータは、ＡＰＰＬがＨＤＡＣ１と直接相互作用すること、そしてＡＰＰＬの過発現がヒストンＨ３アセチル化およびｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質レベルを減少させ、そしてＨＤＡＣ１の酵素活性を増強することを示す。我々の知見は、ＡＰＰＬが、がん遺伝子ＨＤＡＣ１の活性を調節する上で重要であることを示し、腫瘍細胞の増殖におけるＡＰＰＬの鍵となる役割を指摘している。
【０１０８】
【表１】
2008541749.tif 000002
【０１０９】
【表２】
2008541749.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＨＤＡＣ１はＡＰＰＬ−ＰＴＢドメインおよび全長ＡＰＰＬと同時免役沈降する。  ＨＥＫ２９３細胞が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬を用いてＨＤＡＣ１−ｆｌａｇおよびＨＡ−ＡＰＰＬ−ＰＴＢ（パネルＡ）またはＶ５−ＡＰＰＬ（パネルＢ）の指示された組み合わせ物により２４時間トランスフェクトされた。その後、全細胞溶解物が、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭＮａＣｌ、５ｍ  ＭＥＤＴＡおよび０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を含有する低緊縮バッファーにおける溶解によって調製された。ＨＤＡＣ１免役沈降されたタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてＨＡ−ＡＰＰＬ−ＰＴＢ（Ａ）またはＶ５−ＡＰＰＬ（Ｂ）の同時免役沈降がウエスタンブロットによって追跡された。対照として、免役沈降されたＨＤＡＣ１−ｆｌａｇタンパク質の総量、ならびに全溶解物中のＨＤＡＣ１−ｆｌａｇ、ＨＡ−ＡＰＰＬ−ＰＴＢおよびＶ５−ＡＰＰＬの過発現レベルが現された。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ２７８０細胞におけるＡＰＰＬおよびＨＤＡＣ１の共局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）。  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＡ２７８０細胞が８穴培養チャンバースライドに接種され、そしてＭｉｌｌｏｎｉｇバッファー中４％パラホルムアルデヒド（パネルＡおよびＢ）または冷メタノール（パネルＣおよびＤ）により固定された。スライドはＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬ特異的抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＡＰＰＬ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈによる注文製造）とともにインキュベートされ、次いでＨＤＡＣ１のためのＡｌｅｘａ４８８共役抗マウス（緑色）およびＡＰＰＬのためのＣｙ３共役抗ウサギ（赤色）とともにインキュベートされた。ＤＮＡはＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色された。パネルＡおよびＢ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（パネルＡ）およびＡ２７８０（パネルＢ）細胞の核における間期中のＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬの３Ｄ分布を描く合成画像は、ＡｐｏｔｏｍｅおよびＡｘｉｏｃａｍ  ＨＲを備えた可動Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡を用いて光学的セクションのＺ−ｓｔａｃｋシリーズから合成された。外側のパネルは、Ｚ−ｓｔａｃｋをとおしてのＸＺ（赤色矩形）およびＹＺ（青色矩形）ディメンションを示す。外側のパネルにおける白色三角は、Ｚ−ｓｔａｃｋにおけるＸＹ画像の場所を示す。ピクセル（ｐｉｘｅｌ）強度グラフは、ＸＹ画像における黄色矢印に沿った３チャンネル（青＝Ｈｏｅｃｈｓｔ；緑＝ＨＤＡＣ１、赤＝ＡＰＰＬ）のピクセル値を表す。Ａにおける白色矢印は、両ＨＤＡＣ１およびＡＰＰＬについて高ピクセル（ｐｉｘｅｌ）値を有する領域を印す。
【図３】ＡＰＰＬ過発現はＨＥＫ２９３細胞においてＨＤＡＣ１酵素活性を増大する。  ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＤＡＣ１−ｆｌａｇおよびＶ５−ＡＰＰＬの指示された組み合わせ物により４８時間トランスフェクトされた。パネルＡ：ＨＤＡＣ１活性が、ヒストンＨ４ペプチドの［３Ｈ］アセチル標識されたフラグメント（［ビオチン−（６−アミノヘキサノイク）Ｇｌｙ−Ａｌａ−（アセチル［３Ｈ］）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２］、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに免役沈降ＨＤＡＣ１複合体をインキュベートすることによって測定された。遊離された［３Ｈ］酢酸が酢酸エチルにより抽出され、そしてシンチレーションカウントによって定量された。ＨＤＡＣ１活性の結果は、単一溶解物における３回の独立した実験の平均値±標準偏差として表される。パネルＢ：等量のＨＤＡＣ１がウエスタンブロット分析によって示されるように免役沈降された。過発現されたＨＤＡＣ１−ｆｌａｇおよびＶ５−ＡＰＰＬタンパク質の量がウエスタンブロットによって全細胞溶解物において現された。
【図４】ＡＰＰＬの過発現がＨ３アセチル化およびｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１タンパク質の発現を低下させる。  ＨＥＫ２９３細胞は、ＨＤＡＣ１−ｆｌａｇおよびＶ５−ＡＰＰＬの指示された組み合わせ物により４８時間トランスフェクトされた。パネルＡ：トランスフェクトされた細胞集団は、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮された。パネルＡおよびＢ：全細胞溶解物が、ＲＩＰＡバッファーにおいて調製され、そしてタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。タンパク質発現が、アセチル化Ｈ３（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），総Ｈ３（ａｂｃａｍ）、Ｖ５−ＡＰＰＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＰＬ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈ）、ＨＤＡＣ１−ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ）、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびｐ１６（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の特異的抗原を用いてウエスタンブロットによって分析された。アクチンタンパク質レベル（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）は、等負荷のための対照として現された。タンパク質−抗体複合体は、製造者の指示にしたがって化学発光（Ｐｉｅｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）および蛍光（Ｏｄｙｓｓｅｙ）によって可視化された。
【図５】ＰＴＢ結合ドメインにおける全ＡＰＰＬ−ＰＴＢ結合パートナーの整列。  配列名は、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ ＨＵＧＯ  ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ ｓｐｅｃｉｅｓとして与えられる。下線は共通配列を提供し、ここで、３は、炭水化物セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を表し；４は、塩基性アミノ酸残基リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を表し；５は、芳香族アミノ酸残基フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し；そして６は、疎水性アミノ酸残基ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはメチオニン（Ｍ）を表す。
【図６】種々の有糸分裂段階におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡｐｏｔｏｍｅ画像。  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が８穴培養チャンバースライドに接種され、そして冷メタノールにより固定された。スライドはＨＤＡＣ１−（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＡＰＰＬ−（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃｈによる注文製造）特異的抗体とともにインキュベートされ、次いでＨＤＡＣ１のためのＡｌｅｘａ４８８共役抗マウス（緑色）およびＡＰＰＬのためのＣｙ３共役抗ウサギ（赤色）とともにインキュベートされた。ＤＮＡはＨｏｅｃｈｓｔ（青色）によって染色された。
【図５】
2008541749.tif 000004
【図１】
2008541749.tif 000005
【図２】
2008541749.tif 000006
【図３】
2008541749.tif 000007
【図４】
2008541749.tif 000008
【図６】
2008541749.tif 000009
【配列表】
2008541749000001.xml
【国際調査報告】
2008541749.tif 000016
2008541749.tif 000017
2008541749.tif 000018
2008541749.tif 000019