(57)【要約】  本発明は、少なくとも部分的に、Ｔ−ｂｅｔが炎症の部位へのＴｈ１細胞動員を制御するという発見に基づく。本発明は、とりわけ、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングおよび／若しくは血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節することにより炎症の部位へのＴ細胞の動員に対するＴ−ｂｅｔの効果を調節する剤の同定方法、ならびにそのための使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）分子のＰ−セレクチンとの相互作用を可能にする条件下で、Ｔ−ｂｅｔ、Ｐ−セレクチン分子、およびＰＳＧＬ−１分子をある化合物の存在下で接触させること；ならびにＰ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用を検出することを含んでなる、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを調節する化合物の同定方法であって、Ｔ細胞ローリングを阻害する化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量と比較した相互作用の低下により示され、そして、Ｔ細胞ローリングを高める化合物の能力が、該化合物の非存在下での相互作用の量と比較した相互作用の増大により示される、上記方法。
【請求項２】
Ｐ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用が、Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１分子の間の複合体の形成を測定することにより決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が複合体の形成若しくは安定性を増大させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化合物が複合体の形成若しくは安定性を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｐ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用が、ＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化を測定することにより測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−２（ＴＰＳＴ−２）の発現を測定することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ａ）Ｔ細胞を試験化合物と接触させる工程；
ｂ）前記試験化合物の存在下でＴ−ｂｅｔの生物学的活性の調節をアッセイする工程であって、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の減少が、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を阻害する化合物と同定し、また、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の増大が、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を高める化合物と同定する、工程、
を含んでなる、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の同定方法。
【請求項８】
Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性が、ＣＸＣＲ３の発現を調節するＴ−ｂｅｔの能力を測定することにより測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＸＣＲ３の発現がＰＣＲにより測定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＸＣＲ３の発現がＴ細胞走化性アッセイにより測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
走化性アッセイがＣＸＣＬ１１若しくはＣＸＣＬ１０をさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性が、内皮細胞上のＶＣＡＭ−１へのＴ細胞のβ−インテグリン依存性結合を調節するＴ−ｂｅｔの能力である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
アッセイがＣＸＣＬ１１若しくはＣＸＣＬ１０をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が、炎症の部位へのＴ細胞の動員を調節する、請求項１若しくは７に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔ細胞がＴｈ１細胞である、請求項１若しくは７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ（Ｔ細胞動員の調節）”と題された２００５年５月３１日出願の米国仮出願第６０／６８６２２２号の利益を主張する。本出願は、２００５年１月２０日出願の米国仮出願第６０／６４５６９８号（係属中）に関する。本出願はまた、１９９９年６月２日出願の米国仮出願第６０／１３７，０８５号への優先権を主張する、英語のＰＣＴ条項２１に従って公開された２０００年６月１日出願の第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５３４５号（期限切れ）の一部継続出願である、２００１年１２月３日出願の米国特許出願第１０／００８，２６４号（係属中）の一部継続出願である２００２年１２月３日出願の米国特許出願第１０／３０９，７４７号（係属中）にも関する。これらの出願のそれぞれの内容全体は、この引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の資金援助
本明細書に記述される研究は、米国国立保健研究所により授与された助成金ＡＩ４８１２６、ＨＬ３６０２８、ＨＬ５３９９３の下で少なくとも部分的に援助された。米国政府は従って本発明にある種の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４＋  Ｔ細胞の表現型は分泌されるサイトカインのパターンに従って定義し得る（非特許文献１）。１型免疫は、顕著な特徴のサイトカインがインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）であるＴｈ１細胞の生成に左右される（非特許文献２）。Ｔｈ２細胞は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−５（ＩＬ−５）を包含する異なる範囲のサイトカインを産生し、そして２型免疫の生成で重要である（非特許文献１）。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔｈ１細胞の生成およびエフェクター機能に不可欠なＴボックス転写因子である（非特許文献３）。最近、その発現がＮＫ細胞、樹状細胞およびＣＤ８＋細胞でもまた記述された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。Ｔ−ｂｅｔは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞中でＩＦＮ−γ遺伝子を直接トランス活性化し、そして活性化された細胞上のＩＬ−１２受容体β鎖の発現を増大させる。事実、ＩＦＮ−γ受容体の下流のＳＴＡＴ１がＴ−ｂｅｔ発現を活性化し、それがさらにＩＦＮ−γ分泌を増大させるようはたらくため（非特許文献７）、ポジティブフィードバックループが観察される。Ｔ−ｂｅｔによるＩＦＮ−γの強いトランス活性化は、どの遺伝子がＴ−ｂｅｔの標的であるか、およびどれがＩＦＮ−γの下流に存するかを分析することを困難にする。このサイトカインは何百もの遺伝子の発現を誘導することが既知であるためである。完全に分極したＴｈ２細胞で過剰発現される場合、Ｔ−ｂｅｔはそれらの系譜分化を保留しかつＴｈ１特異的遺伝子、とりわけＩＦＮ−γおよびその既知の標的を誘導し得る（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献８）。Ｔ−ｂｅｔが欠損している動物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞で記述されるエフェクター機能の多数の異なる異常を伴い、ＳＬＥ、大腸炎、糖尿病、肝炎および関節炎を包含する多数の炎症性疾患に対する重症度の顕著な低減を示す（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。しかしながら、免疫系の多くの細胞型がＴ−ｂｅｔを発現するため、この保護の正確な機構を分析することは困難であった。さらに、Ｔ細胞系譜分化の主調節物質としてのその機能を考えれば、それがサイトカイン産生および他のエフェクター経路の双方に関与する多くの遺伝子の転写を指図することがありそうである。
【０００４】
エフェクターＴｈ１およびＴｈ２細胞は、それらの移動特性が全く異なる（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。Ｔｈ１細胞は炎症性免疫応
答の部位に移動する一方、Ｔｈ２細胞は主にアレルギー若しくは蠕虫感染の環境で粘膜部位に移動する。Ｅ−およびＰ−セレクチンリガンドは主としてＴｈ１細胞上で発現され、天然のＴ細胞上に存在せず、そしてＴｈ２細胞上で大きく低下される（非特許文献１８）。Ｔｈ１細胞動員の最初の段階は、活性化された血管内皮上で発現されるＰ−およびＥ−セレクチンへの結合（白血球リガンド、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）により主に媒介される相互作用）である（非特許文献１９；非特許文献２０）。興味深いことに、ＰＳＧＬ−１は、コアの２−グリコシル化、フコシル化およびチロシン硫酸化を包含するさらなる酵素的翻訳後修飾（それらの全部が機能的セレクチンリガンドを産生するのに必要とされる）を受ける（非特許文献２１）。これらのセレクチンリガンドの上方制御は、これまで、主としてＳＴＡＴ４依存性の様式の、活性化されたリンパ球上のＩＬ−１２の作用に帰されてきた（非特許文献１８；非特許文献２２）。ケモカインは、セレクチン依存性のローリングからインテグリン媒介性の堅固な接着への遷移（非特許文献２３）、ならびにＴ細胞のその後の移動および経内皮移動（非特許文献２４）の双方を媒介することにより、Ｔ細胞動員における決定的に重要な役割もまた演じている。ケモカイン受容体の差別的発現は、炎症部位へのＴ細胞移動の過程で重要な役割を演じている。ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ５は炎症部位へのＴｈ１細胞の特異的動員の原因であると考えられる。他のケモカイン受容体（例えばＣＣＲ４、ＣＣＲ１０およびＣＣＲ９）もまた、必ずしもＴｈ１特異的様式でないとは言え、組織特異的ホーミングを媒介することが記述されている（非特許文献２５）。対照的に、接着カスケードに関与する他のリンパ球接着分子、とりわけβ１およびβ２インテグリン、ＬＦＡ−１ならびにＶＬＡ−４は、Ｔｈ１細胞の特異的動員に関与せず、むしろ一般に活性化されたリンパ球の特異的動員に関与している。細胞輸送の調節は従って効果的な免疫応答に決定的に重要である。
【０００５】
炎症性疾患に対するＴ−ｂｅｔ欠損（Ｔ−ｂｅｔ−／−）マウスの抵抗性は、病的部位でのＴ細胞浸潤の顕著な欠如を特徴とする（非特許文献１０；非特許文献１１）。しかしながら、この情況で研究される疾患モデルは、疾患の発現のための無傷のエフェクター機能に危うく頼っており、そして、であるから、Ｔ細胞輸送を単独で研究することが不可能であった。Ｔ−ｂｅｔが炎症の部位へのＴ細胞動員を直接調節する機構の同定は、Ｔ細胞動員および炎症の調節を見込むとみられ、そして非常に有益であるとみられる。
【非特許文献１】Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３、７８７−７９３
【非特許文献２】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：７１３−７５８
【非特許文献３】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００、６５５−６６９
【非特許文献４】Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５、３３８
【非特許文献５】Ｌｕｇｏ−Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ，Ｇ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００、７７４９−７７５４
【非特許文献６】Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．Ｊ．ら（２００４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０、４７７−４９４
【非特許文献７】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．とＯ’Ｇａｒｒａ，Ａ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１６、７５５−７５８
【非特許文献８】Ｌａｍｅｔｓｃｈｗａｎｄｔｎｅｒ，Ｇ．ら（２００４）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１３、９８７−９９４
【非特許文献９】Ｐｅｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９、５５４５−５５５０
【非特許文献１０】Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｍ．Ｆ．ら（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５、１１２９
【非特許文献１１】Ｊｕｅｄｅｓ，Ａ．Ｅら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９９、１１５３−１１６２
【非特許文献１２】Ｈｕｌｔｇｒｅｎ，Ｏ．Ｈ．ら（２００４）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．６、５２９−５３５
【非特許文献１３】Ｓｉｅｂｌｅｒ，Ｊ．ら（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３８、１５７３−１５８０
【非特許文献１４】Ａｕｓｔｒｕｐ，Ｆ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５、８１−８３
【非特許文献１５】Ｘｉｅ，Ｈ．ら（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８９、１７６５−１７７６
【非特許文献１６】Ｉｅｚｚｉ，Ｇ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９３、９８７−９９３
【非特許文献１７】Ｒｏｔ，Ａ．とｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ，Ｕ．Ｈ．（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：８９１−９２８
【非特許文献１８】Ｌｉｍ．Ｙ．Ｃ．ら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２、３１９３−３２０１
【非特許文献１９】Ｈｉｒａｔａ，Ｔ．ら（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２、１６６９−１６７６
【非特許文献２０】Ｙａｎｇ，Ｊ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０、１７６９−１７８２
【非特許文献２１】ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．とＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００、Ｓ９７−１０３
【非特許文献２２】Ｌｉｍ．Ｙ．Ｃ．ら（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７、４４７６−４４８４
【非特許文献２３】Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９、３８１−３８４
【非特許文献２４】Ｃｉｎａｍｏｎ，Ｇ．ら（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，５１５−５２２
【非特許文献２５】Ｓｙｒｂｅ，Ｕ．ら（１９９９）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２１、２６３−２８５
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、少なくとも部分的に、Ｔ−ｂｅｔが炎症の部位へのリンパ球、例えばＴ細胞、例えばＴｈ１細胞の動員を制御するという発見に基づく。本発明の一局面は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）分子のＰ−セレクチンとの相互作用を可能にする条件下で、Ｔ−ｂｅｔ、Ｐ−セレクチン分子、およびＰＳＧＬ−１分子を化合物の存在下で接触させること；ならびにＰ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用を検出することを含んでなる、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを調節する化合物の同定方法を特徴とし、Ｔ細胞ローリングを阻害する化合物の能力は、該化合物の非存在下での相互作用の量と比較した相互作用の低下により示され、また、Ｔ細胞ローリングを高める化合物の能力は、該化合物の非存在下での相互作用の量と比較した相互作用の増大により示される。
【０００７】
一態様において、Ｐ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用は、Ｐ−セレクチンとＰＳＧＬ−１分子の間の複合体の形成を測定することにより測定される。
【０００８】
一態様において、化合物は複合体の形成若しくは安定性を増大させる。
【０００９】
一態様において、化合物は複合体の形成若しくは安定性を減少させる。
【００１０】
一態様において、Ｐ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用は、ＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化を測定することにより測定される。
【００１１】
一態様において、該方法は、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−２（ＴＰＳＴ−２）発現を測定することをさらに含んでなる。
【００１２】
別の局面において、本発明は：
ａ）Ｔ細胞を試験化合物と接触させること；
ｂ）前記試験化合物の存在下でＴ−ｂｅｔの生物学的活性の調節をアッセイすること
を含んでなる、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の同定方法に関し、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の減少は、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を阻害する化合物と同定し、また、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の増大は、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を高める化合物と同定する。
【００１３】
一態様において、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は、ＣＸＣＲ３の発現を調節するＴ−ｂｅｔの能力を測定することにより測定される。
【００１４】
一態様において、ＣＸＣＲ３の発現はＰＣＲにより測定される。別の態様において、ＣＸＣＲ３の発現はＴ細胞走化性アッセイにより測定される。
【００１５】
一態様において、走化性アッセイはＣＸＣＬ１１若しくはＣＸＣＬ１０をさらに含んでなる。
【００１６】
一態様において、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は、内皮細胞上のＶＣＡＭ−１へのＴ細胞のβ−インテグリン依存性結合を調節するＴ−ｂｅｔの能力である。
【００１７】
一態様において、アッセイはＣＸＣＬ１１若しくはＣＸＣＬ１０をさらに含んでなる。
【００１８】
一態様において、化合物は、炎症の部位へのＴ細胞の動員を調節する。
【００１９】
一態様において、Ｔ細胞はＴｈ１細胞である。
【００２０】
別の局面において、本発明は、Ｔ細胞をＴ−ｂｅｔの活性を調節する剤と接触させ、そしてそれによりＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを調節することを含んでなる、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングの調節方法に関する。
【００２１】
一態様において、該剤はＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化を上方調節してそれによりＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを上方調節する。
【００２２】
別の態様において、該剤はＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化を下方調節してそれによりＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを下方調節する。
【００２３】
［発明の詳細な記述］
本発明は、少なくとも部分的に、Ｔ−ｂｅｔが炎症の部位へのＴｈ１細胞動員を制御するという発見に基づく。本発明は、とりわけ、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングおよび／若しくは血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節することによる炎症の部位へのＴ細胞の動員に対するＴ−ｂｅｔの効果を調節する剤の同定方法、ならびにそのための使用方法に関する。下により詳細に論考されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは多様な細胞外シグ
ナルの重要な細胞内トランスデューサー若しくは媒介物質である。より具体的には、Ｔ−ｂｅｔは、多様な細胞型で細胞外シグナルを遺伝子発現の特定のパターンに変換するよう作動する転写因子である。とりわけ、Ｔ−ｂｅｔがＴｈ１およびＴｈ２双方のサイトカイン遺伝子発現で中心的な役割を有することが今や示された。多様な細胞型および多様な遺伝子がＴ−ｂｅｔに応答し、それらが順に多様な細胞応答を調節する。これらの遺伝子、およびＴ−ｂｅｔにより同様に制御される他者の発現は、Ｔ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性を制御することにより調節し（例えば高め若しくは低下し）得る。
【００２４】
ＢｒａｃｈｙｕｒｙすなわちＴは、Ｔボックスと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（Ｓｍｉｔｈ、１９９７；Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ、１９９７；Ｍｅｉｓｌｅｒ、１９９７に総説される）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短尾」のギリシア語）突然変異は、短い、わずかにもつれた尾を有したヘテロ接合性変異体動物で１９２７年に最初に記述された（Ｈｅｒｒｍａｎｎら、１９９０）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ  Ｔボックスタンパク質のアミノ末端半分（アミノ酸１−２２９）は、配列特異的ＤＮＡ結合活性を表すことが示された、Ｔボックスとして既知の保存された１ドメインを含有する（Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．とＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９３．ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：３２１１；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，Ｃ．ら  １９９７．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９：２０１；Ｋｉｓｐｅｒｔ，Ａ．ら  １９９５．ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７６３）。Ｃ末端半分は２対のトランス活性化および抑制領域を含有する。オルソロガスな種のＴボックス領域間の配列の類似性は約９９％であり得、そしてオルソロガスでない遺伝子間では約４０〜７０％である。Ｔボックスドメインは最近ＤＮＡと共結晶化され、そして、該タンパク質が主および副双方の溝でＤＮＡに接触する新規の配列特異的ＤＮＡ認識構造を示す（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．とＨｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  ３８９、８８４）。
【００２５】
酵母１ハイブリッドアプローチがＴｈ−１特異的転写因子を同定するのに使用された。酵母細胞を、ＩＬ−２プロモーター−レポーター遺伝子構築物を発現するようにし、そして抗ＣＤ３で活性化したＴｈ１細胞クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。ＩＬ−２プロモーターの検査は、ＮＦｋＢ部位のすぐ５’の−２４０ないし−２２０に優れたＴボックス結合部位を示す。付随する実施例に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔを、ＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づき酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。
【００２６】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質はＴボックスタンパク質に対する相同性を有する。現在、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを包含せずにマウスで８種以上のＴボックス遺伝子が存在する。これらはＴｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｐｉｔおよびＴ−ｂｅｔを包含し、それぞれ個別のかつ通常は複雑な発現パターンを伴う。例えば、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１発現は主として大脳皮質内の別個の領域に制限される（Ｂｕｌｆｏｎｅ，Ａ．ら  １９９５．Ｎｅｕｒｏｎ  １５、６３。Ｔ−ｂｅｔは配列がＴｂｒ−１に最も類似である。Ｔボックスを除き、本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は他のＴボックスタンパク質に対する類似性を有しない。
【００２７】
Ｔ−ｂｅｔはＴ細胞でのみ発現されるＴボックスタンパク質であり、そして配列がＴｂｒ−１に最も類似である。他の種もまたＢｒａｃｈｙｕｒｙ様遺伝子を発現する。こうした脊椎動物種は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュ、ヒヨコおよびヒト（Ｒａｏ、１９９４；ＨｏｒｂとＴｈｏｍｓｅｎ、１９９７；Ｃｏｎｌｏｎら、１９９６；Ｒｙａｎら、１９９６；Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒら、１９９４；Ｅｄｗａｒｄｓら、１９９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９６；Ｌａｗら、１９９５；Ｃａｍｂｅｌｌら、１９９８）、ならびにナメクジウオ、ホヤ類、棘皮動物、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およ
び他の昆虫のようなより遠い種（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９９５）を包含する。これらの遺伝子は配列および発現パターン双方が保存されている。
【００２８】
Ｔ−ｂｅｔは、それがチロシンリン酸化される唯一のＴボックスタンパク質であるために独特である。ヒトＴ−ｂｅｔのＴｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９およびＴｙｒ５３１の３個の予測されるチロシンリン酸化部位、ならびにマウスＴ−ｂｅｔのＴｙｒ５２５の１個が存在する。核局在化配列もまた、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８−５０１およびマウスＴ−ｂｅｔの４９３−４９６に存在する。マッピング実験は、２個のトランス活性化ドメイン（１個がＴボックスドメインの５’および１個が３’）の位置を突き止める。Ｔ−ｂｅｔが、コンセンサスＴボックス部位（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの標的部位選択（すなわちＥＭＳＡおよびＤＮＡ免疫沈降アッセイ）により５’−ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＡＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣ−３’）と定義される）、ならびにヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩ、およびマウスＩＦＮ−γ近位プロモーター中の２個の結合部位に結合することが示された。（Ｓｚａｂｏら  ２０００．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９）。Ｔ−ｂｅｔは胸腺および末梢リンパ系でのみ発現される。末梢では、Ｔ−ｂｅｔは、それがＴｃＲ刺激に応答しておよびＩＬ−１２によりの双方で誘導されるＴｈ１細胞中でのみ発現される。胸腺でのＴ−ｂｅｔのレベルはＤＮおよびＴａｇ２−／−胸腺細胞で最高である。
【００２９】
これらのデータは、Ｔ−ｂｅｔの選択的発現が組織特異的ＩＦＮ−γ発現を説明することを示す。Ｔ−ｂｅｔはＴｈ１中でのみ発現されかつＴｈ２細胞中でされず、そしてＴ細胞受容体によるシグナルの伝達に際して前者で誘導される。
【００３０】
さらに、Ｔ−ｂｅｔはＩＦＮ−γ遺伝子の強力なトランス活性化因子である。Ｔ−ｂｅｔの発現は、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および樹状細胞を包含する適応および自然免疫系の細胞中でのＩＦＮ−γ発現と相関する。Ｔ−ｂｅｔは、ナイーブなＴｈｐ細胞からのＴｈ１系譜発生を開始しかつＴｈ１遺伝子プログラムを開始することおよびＴｈ２細胞中の相対するプログラムを抑制することの双方により作用する遺伝子プログラムを司る。Ｔ−ｂｅｔは、ＧＡＴＡ−３とのＩＴＫに調節される相互作用によるＴｈ２系譜分化を抑制する。Ｔ細胞受容体シグナル伝達に際し、Ｔ−ｂｅｔは、ＴＣＲ活性化ＴｅｃキナーゼＩＴＫにより残基Ｙ５２５でリン酸化される（Ｔｈ２サイトカインの至適のＴ−ｂｅｔ媒介性の抑制に必要とされる翻訳後修飾）。こうした抑制の機構は、リン酸化されたＴ−ｂｅｔとＧＡＴＡ−３の間のＩＴＫ媒介性の相互作用であり、ＤＮＡへのＧＡＴＡ−３結合の妨害をもたらす。
【００３１】
付随する例に記述されるところのサイトカイン分泌の制御に加え、Ｔ−ｂｅｔはリンパ球、例えばＴ細胞、例えばＴｈ１細胞の炎症の部位への動員を制御する。本明細書に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔはＣＤ４＋  Ｔ細胞のＰ−セレクチンへの結合を調節し、また、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３の発現に必要とされる。Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞は、ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化およびチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−１（ＴＰＳＴ−１）発現の低下、ならびにＣＸＣＲ３発現の低下、Ｐ−セレクチンへの低下された結合を有し、そして適切な刺激に応答して接着若しくは移動しない。
【００３２】
本発明がより容易に理解されうるように、ある種の用語を最初に定義する。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「調節する」という用語は刺激（例えば特定の応答若しくは活性を増大すなわち上方制御すること）および阻害（例えば特定の応答若しくは活性を減少すなわち下方制御すること）を包含する。
【００３４】
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ分子」という用語は、配列番号１および３
に示される核酸分子と構造の特徴を共有するＴ−ｂｅｔ核酸分子、ならびに配列番号２および４に示されるＴ−ｂｅｔタンパク質の特徴的な構造および機能の特徴を共有するＴ−ｂｅｔタンパク質を包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質はタンパク質のＴボックスファミリーのメンバーであり、そしてＢｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｔｂｘ１−６およびＴ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）に対する何らかのアミノ酸配列相同性を共有する。Ｔボックスタンパク質は、Ｔボックス結合部位でＤＮＡに結合するＴボックスドメインを含んでなる。Ｔ−ｂｅｔタンパク質のさらなる構造および機能の特徴を下に提供する。
【００３５】
本明細書で使用されるところの「核酸分子」という用語はＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）を包含する。核酸分子は一本鎖若しくは二本鎖でありうる。核酸分子という用語は、それらのフラグメント若しくは同等物（例えばＴ−ｂｅｔ、ＰＳＧＬ−１、ＴＰＳＴ−１、ＴＰＳＴ−２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＶＣＡＭ−１および／若しくはβ−インテグリンそれらのフラグメント若しくは同等物）もまた包含する。「同等物」という用語は機能上同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「単離された核酸分子」は、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該核酸に天然に隣接する遺伝子配列（すなわち、該核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中で該単離される核分子の遺伝子に隣接して配置されている遺伝子配列）を含まない核酸分子を指す。例えば、多様な態様において、単離されたＴ−ｂｅｔ核酸分子は、典型的に、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で該核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約１０ｋｂ未満を含有し、かつ、より好ましくは、天然に隣接するヌクレオチド配列の約５、ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ若しくは０．１ｋｂ未満を含有する。「単離された」Ｔ−ｂｅｔ核酸分子は、しかしながら、ゲノムＤＮＡ中でＴ−ｂｅｔ配列に通常は隣接しない他のヌクレオチド配列に連結しうる（例えば、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列はベクター配列に連結しうる）。ある好ましい態様において、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は他の細胞性物質もまた含まないことができる。しかしながら、Ｔ−ｂｅｔ核酸分子が「単離された」とみなされるために他の細胞性物質を含まないことは必要でない（例えば、他の哺乳動物ＤＮＡから分離されかつ細菌細胞に挿入されたＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡ分子はなお「単離されて」いるとみなされることができる）。
【００３７】
本発明の核酸は、例えば標準的組換えＤＮＡ技術により製造し得る。本発明の核酸は、標準的技術を使用して化学合成もまたし得る。商業的に入手可能なＤＮＡ合成機で自動化された固相合成を包含するポリデオキシヌクレオチドの多様な化学合成方法が既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら  米国特許第４，５９８，０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら
米国特許第４，４５８，０６６号；ならびにＩｔａｋｕｒａ  米国特許第４，４０１，７９６号および同第４，３７３，０７１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００３８】
本明細書で使用されるところの「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、相互に対する実質的相同性（例えば典型的には７０％以上の相同性）を有するヌクレオチド配列が相互に安定にハイブリダイズされたまま留まるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。高ストリンジェントな条件の好ましい制限しない一例は、約４５℃の温度で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中数時間ないし一夜のハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液中の１回若しくはそれ以上の洗浄である。
【００３９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の情況で（例えば、１アミノ酸配列が別のアミノ酸配
列にＸ％同一であると言われる場合に）使用されるところの「同一性パーセント（％）」という用語は、至適に整列される場合に２配列間で共有される同一残基のパーセントを指す。２種のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を至適の比較の目的上整列する（例えば、他方の配列との至適の整列のため一方の配列中にギャップを導入しうる）。対応する位置の残基をその後比較し、そして、一方の配列中の１位置が他方の配列中の対応する位置と同一の残基により占有される場合には、該分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、従って２配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【００４０】
当該技術分野で既知のコンピュータアルゴリズムを、２種のヌクレオチド若しくはアミノ酸配列を至適に整列かつ比較して該２配列間の同一性パーセントを定義するのに使用し得る。２配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい制限しない一例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７でのように改変されたＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）に組み込まれている。比較の目的上ギャップを付けた配列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら（（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２）に記述されるとおり利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ｅｘｉｓｔａｎｃｅ  ５およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２に設定したギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いるデフォルトのＢｌａｓｔｎマトリックス１−３を使用してブラストした（ｂｌａｓｔｅｄ）。本発明のアミノ酸配列は、デフォルトの設定、すなわちｅｘｉｓｔａｎｃｅ  １１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １に設定したギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いるＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを使用してブラストした。
【００４１】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい制限しない例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ
ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を使用し得る。配列を比較するのに複数のプログラムを使用する場合は、至適の整列（すなわち２配列間の最高の同一性パーセント）を提供するプログラムを比較の目的上使用し得る。
【００４２】
本明細書で使用されるところの「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する（例えば天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的、若しくは遺伝子のコーディング鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含んでなる。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合し得る。
【００４４】
一態様において、本発明の核酸分子はｓｉＲＮＡ分子である。一態様において、本発明の核酸分子はＲＮＡｉを媒介する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と同一配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解するためにｄｓＲＮＡを使用する、転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＴＲとＤｏｅｒｉｎｇ  ＴＬ．２００３．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１：３７−４３；Ｂｕｓｈｕｍａｎ  Ｆ．２００３．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７：９−１０；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴとＳｈａｒｐ  ＰＡ．２００２．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：７３７−４７）。該過程は、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡを小分子干渉ＲＮＡすなわちｓｉＲＮＡと命名されるより短い、例えば２１若しくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より小さいＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ＲＮＡｉを媒介する分子の合成のためのキットが例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ若しくはＡｍｂｉｏｎから商業的に入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用のための本明細書に記述される化学の１種若しくはそれ以上を、ＲＮＡｉを媒介する分子で使用し得る。
【００４５】
本明細書で使用されるところの「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域を指す一方、「非コーディング領域」という用語はアミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば５’および３’非翻訳領域）を指す。
【００４６】
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントを連結しうる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の型のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に連結しうるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入に際して該宿主細胞のゲノムに組込まれ、そしてそれにより宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが効果的に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。こうしたベクターは本明細書で「組換え発現ベクター」若しくは単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態にある。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、本明細では「プラスミド」および「ベクター」を互換性に使用しうる。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のようなこうした他の形態の発現ベクターを包含することを意図している。
【００４７】
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターのような本発明の核酸が導入された細胞を指す。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は本明細書で互換性に使用する。こうした用語は特定の主題の細胞のみならずしかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫も指すことが理解されるべきである。突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより、次の世代である種の改変が起こりうるため、こうした子孫は実際には親細胞と同一でないかもしれないが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。
【００４８】
本明細書で使用されるところの「単離されたタンパク質」若しくは「単離されたポリペプチド」は、細胞から単離されるか若しくは組換えＤＮＡ技術により製造される場合に他
のタンパク質、ポリペプチド、細胞性物質および培地、または化学合成される場合に化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質若しくはポリペプチドを指す。「単離された」若しくは「精製された」タンパク質、またはその生物学的に活性の部分は、該タンパク質が由来する細胞若しくは組織供給源からの細胞性物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または、化学合成される場合は化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という言語は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質がそれから単離若しくは組換え製造される細胞の細胞性成分からそれが分離されているＴ−ｂｅｔタンパク質の調製物を包含する。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわちＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような抗原を特異的に結合する（と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を包含する。本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ある抗原の特定の１エピトープと免疫反応することが可能な抗原結合部位のただ１種を含有する抗体分子の一集団を指す一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の１抗原と相互作用することが可能な抗原結合部位の複数の種を含有する抗体分子の一集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、従って、典型的に、それが免疫反応する特定の１抗原に対する単一の結合親和性を表す。
【００５０】
ここで使用されるところの「細胞内抗体」という用語は、細胞の内側の１標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に向けられた、細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を指す。
【００５１】
本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブなＴ−ｂｅｔタンパク質」という用語は、天然の（すなわち天然に存在する野生型の）Ｔ−ｂｅｔ分子と競合するがしかしＴ−ｂｅｔ活性を有しないＴ−ｂｅｔ分子（例えばその部分若しくはバリアント）を包含する。こうした分子は細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を効果的に低減する。本明細書で使用されるところの「ドミナントネガティブなＴ−ｂｅｔタンパク質」は、Ｔ−ｂｅｔ活性の強力な阻害剤である改変された形態のＴ−ｂｅｔを指す。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「細胞」という用語は原核生物および真核生物細胞を包含する。一態様において、本発明の細胞は細菌細胞である。別の態様において、本発明の細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。別の態様において、本発明の細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ若しくは哺乳動物細胞である。好ましい一態様において、本発明の細胞はマウス若しくはヒト細胞である。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「免疫細胞」若しくは「白血球」という用語は、造血起源のものでありかつ免疫応答である役割を演じる細胞を包含する。免疫細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞；ナチュラルキラー細胞のようなリンパ球；ならびに単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球および顆粒球のような骨髄細胞を包含する。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「Ｔ細胞」（すなわちＴリンパ球）という用語は、哺乳動物（例えばヒト）からの胸腺細胞、未熟なＴ細胞、成熟Ｔ細胞などを包含するＴ細胞系譜内の細胞を包含する。Ｔ細胞は、ＣＤ４若しくはＣＤ８のいずれか（しかし双方でない）およびＴ細胞受容体を発現する成熟Ｔ細胞を包含する。本明細書に記述される多様なＴ細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルおよびそれらの機能に基づき定義し得る。
【００５５】
本明細書で使用されるところの「免疫応答」という用語は、免疫細胞活性化の調節によ
り影響される免疫細胞媒介性（例えばＴ細胞および／若しくはＢ細胞媒介性）の免疫応答を包含する。例示的免疫応答は、Ｂ細胞応答（例えば抗体産生、例えばＩｇＡ産生）、Ｔ細胞応答（例えば増殖、サイトカイン産生および細胞傷害性）、ならびにサイトカイン応答性細胞例えばマクロファージの活性化を包含する。本発明の一態様において、免疫応答はＴ細胞媒介性である。本発明の別の態様において、免疫応答はＢ細胞媒介性である。本明細書で使用されるところの、免疫応答に関しての「下方制御」という用語は、いずれか１種若しくはそれ以上の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の減少を包含する一方、免疫応答に関しての「上方制御」という用語は、いずれか１種若しくはそれ以上の免疫応答、好ましくはＴ細胞応答の増大を包含する。１つの型の免疫応答の上方制御は別の型の免疫応答の対応する下方制御につながりうることが理解されるであろう。例えば、ある種のサイトカイン（例えばＩＬ−１０）の産生の上方制御は細胞性免疫応答の下方制御につながり得る。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「Ｔヘルパー１型応答」（Ｔｈ１応答）という用語は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）、ならびにＴｈ２細胞によるよりはむしろＴｈ１細胞により優先的に若しくは独占的に産生される他のサイトカインから選択される１種若しくはそれ以上のサイトカインの産生を特徴とする応答を指す。
【００５７】
本明細書で使用されるところの「Ｔヘルパー２型応答」（Ｔｈ２応答）という用語は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１種若しくはそれ以上のサイトカインの産生を特徴とし、かつ、Ｔｈ２細胞により提供される十分なＢ細胞「ヘルプ」（例えば高められたＩｇＧおよび／若しくはＩｇＥ産生）を伴う、ＣＤ４＋  Ｔ細胞による応答を指す。
【００５８】
本明細書で使用されるところの「Ｔｈ１関連サイトカイン」という用語は、Ｔｈ２細胞によるよりはむしろＴｈ１細胞により優先的に若しくは独占的に産生されるサイトカインを指す。Ｔｈ１関連サイトカインの例は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）を包含する。
【００５９】
本明細書で使用されるところの「Ｔｈ２関連サイトカイン」という用語は、Ｔｈ１細胞によるよりはむしろＴｈ２細胞により優先的に若しくは独占的に産生されるサイトカインを指す。Ｔｈ１関連サイトカインの例はＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を包含する。
【００６０】
本明細書で使用されるところの「炎症の部位へのＴ細胞の動員を下方調節する剤での処置から利益を得るとみられる疾患、障害若しくは状態」という用語は、Ｔ−ｂｅｔ活性が異常であるか、若しくはＴ−ｂｅｔ活性の調節から利益を得るとみられる障害を包含する。該剤は、炎症の部位へのＴ細胞の動員を直接（例えばＴｂｅｔに直接結合しかつその活性を調節することにより）若しくは間接的に（例えばＴｂｅｔが関わるシグナル伝達経路中の分子の活性を調節することにより）下方調節しうる。同様に、「炎症の部位へのＴ細胞の動員を上方調節する剤での処置から利益を得るとみられる疾患、障害若しくは状態」という用語は、Ｔ−ｂｅｔ活性が異常であるか、若しくはＴ−ｂｅｔ活性の調節から利益を得るとみられる障害を包含する。該剤は、炎症の部位へのＴ細胞の動員を直接若しくは間接的に上方調節しうる。
【００６１】
本明細書で使用されるところの「接触させること」（すなわち、細胞、例えばある細胞を化合物と接触させること）という用語は、化合物および細胞を一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすること（例えば化合物を培養物中の細胞に添加すること）、ならびに化合物および被験体の細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで接触されるような被験体に化合物を投与することを包含する。「接触すること」という用語は、被験体中で天然に存在しうるＴ−ｂ
ｅｔ調節物質への細胞の曝露（すなわち、天然の生理学的過程の結果として発生しうる曝露を包含しない。
【００６２】
本明細書で使用されるところの「リンパ球再循環」という句は、１種の末梢（二次）リンパ組織から別のものおよび末梢の炎症部位への血流およびリンパ系を介するリンパ球の連続的な動きを指す。正常なリンパ球再循環は抗原に依存しない。リンパ球の特定のサブセットが何れかの組織に選択的に進入するがしかし他者にしない過程は、本明細書で「リンパ球ホーミング」と称される。１組織若しくは別のものへの、例えば炎症の部位へのリンパ球のこの調節された動きは、本明細書で「動員」若しくは「リンパ球動員」と称される。リンパ球再循環のパターンは、リンパ球および血管内皮細胞上の接着分子の発現により支配される。ナイーブなリンパ球の再循環のパターンはエフェクターおよび記憶リンパ球のものと異なる。
【００６３】
付随する実施例で記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔは、炎症の部位へのリンパ球、例えばＴ細胞、例えばＴｈ１細胞の動員を調節する（厳格に調節されかつ多段階の過程）。この過程の段階１は内皮上のリンパ球のローリングである。再循環するリンパ球は、内皮表面上のセレクチン、例えばＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチン、若しくはリンパ球上のＬ−セレクチンによると相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）細胞上のそれらのリガンドの間の低親和性相互作用を介して、サイトカインで活性化された内皮に「最初に繋ぎ止められる」若しくは「ゆるく結合される」。これらのリンパ球接着分子は微絨毛突起の先端に濃縮されるので、内皮との制限された膜接触に従事する。加えて、それらの結合の特徴は迅速な解離に好都合である。微小血管系では、流動する血液の力が繋ぎ止められたリンパ球を押し、そして弱いセレクチン−リガンド相互作用の破壊を引き起こし、そして、これらの相互作用は、リンパ球が再度内皮と接触する際に下流で迅速に再形成される。これらの事象の正味の結果が内皮表面に沿った「リンパ球のローリング」である。
【００６４】
第二段階は「リンパ球の活性化」である。リンパ球が内皮の表面上をローリングしている際に、それは、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン基に結合された内皮細胞の表面上に表示されるケモカインにより「活性化された」ようになる。ケモカインに応答して、リンパ球はそれらの細胞骨格を再配列し、球形から平らにされた形状に広がり、そしてより運動性になる。該広がりは、絨毛突起から離れて細胞表面上に集中しているインテグリンが、内皮細胞上のそれらのリガンドを結合することを可能にする。活性化は内皮リガンドに対するリンパ球インテグリンの親和性の増大もまたもたらす。インテグリンのそれらのリガンドとの高親和性相互作用が該過程の第三段階（「内皮へのリンパ球の安定な接着」である）を開始する。活性化されたリンパ球は、高親和性インテグリン（例えばβ−インテグリン、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１）により内皮細胞表面に強固に結合する。これらのインテグリンは、炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１、ＴＮＦ）により内皮細胞上でのその発現が増大されるリガンド（例えばＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）を認識する。強固な接着を表すリンパ球はローリングせず、そして正しい場所に固定されて見える。事実、こうしたリンパ球は、それらが内皮細胞間結合部に達するまで、内皮細胞表面に沿ってゆっくりと移動している。
【００６５】
炎症の部位へのリンパ球動員の過程の第四段階は「血管壁を通るリンパ球の遊出」である。内皮細胞間結合部で、リンパ球は、結合部を通るそれらの遊出を誘発する付加的なシグナルを受領する。移動は、限定されるものでないが、内皮とのリンパ球の接触の領域へのインテグリンの再配向を挙げることができる複数の因子に依存する。別の接着分子Ｐｅｃａｍ−１すなわちＣＤ３１が、この過程で同様にある役割を演じているかもしれない。遊出は、内皮細胞間の強固な結合の構造の変化にもまた依存しうる。組織中にあれば、リンパ球はそれらのインテグリンを使用して、血管外遊出した血漿タンパク質から形成されるフィブリン若しくはフィブロネクチン足場構造に沿ってゆっくり動くことにより移動す
る。この「血管外移動」すなわち「血管外遊出」は、組織内で形成されたケモカインの勾配に向かって優先的に起こり、炎症をもたらす。
【００６６】
適応免疫応答の成功裏の生成は白血球輸送事象に依存する。これらの事象は、ＡＰＣの特化された集団ならびにナイーブなおよびエフェクターリンパ球の協調された様式でのそれらの作用部位への動きを伴う。ＤＣが、適応免疫系への提示のため、末梢の炎症部位から二次リンパ器官に抗原を輸送する。
【００６７】
本明細書で使用されるところの「炎症」は、液体、血漿タンパク質および白血球（主として好中球、マクロファージおよびリンパ球）の局所蓄積である。炎症は、外来若しくは変えられた内因性物質に対する防御として、大部分の種類の組織傷害若しくは感染若しくは免疫学的刺激後に起こる。炎症は通常、自己限定的エピソードである。上述されたとおり、炎症反応は、傷害の部位への血流の初期増加、高められた血管透過性、ならびに、傷害の部位での末梢血からの多様なエフェクター細胞の秩序だったかつ方向性の流入および選択的蓄積を特徴とする。
【００６８】
炎症は、炎症前サイトカインとして集合的に知られる多数のサイトカインの上方調節もまた伴う。主要な炎症前サイトカインはＩＬ１−α、ＩＬ１−β、ＩＬ６およびＴＮＦ−αである。他の炎症前メディエーターは、ＬＩＦ、ＩＦＮ−γ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ８、および炎症細胞を化学誘引する多様な他のケモカイン、ならびに多様な神経調節因子を包含する。
【００６９】
感染に対する急性炎症応答の最終的な結果は、最小限の環境的損傷を伴う病原性微生物の根絶である。対照的に、持続性感染若しくは自己免疫反応により促進されるこの活動の慢性バージョンは、不可逆的な破壊的結果を伴い一貫して増大されている。
【００７０】
本明細書で使用されるところの「相互作用する」という用語は、例えば酵母２ハイブリッドアッセイ若しくは共免疫沈降を使用して検出され得るような、分子間の検出可能な相互作用を包含することを意味している。相互作用するという用語は分子間の「結合」相互作用を包含することもまた意味している。相互作用は、例えば、性質がタンパク質−タンパク質若しくはタンパク質−核酸でありうる。
【００７１】
「剤」若しくは「化合物」若しくは「試験化合物」という用語は、本発明の方法若しくはアッセイで使用されるか若しくは本発明の組成物中に存在する試薬若しくは試験剤を包含する。「剤」若しくは「化合物」若しくは「試験化合物」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの発現若しくは活性の調節物質として以前に同定若しくはそうであることが認識されていない化合物を包含する。一態様において、１種以上の化合物、例えば複数の化合物を、Ｔ−ｂｅｔまたはシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用する分子の発現および／若しくは活性を調節するそれらの能力についてスクリーニングアッセイで同時に試験し得る。「試験化合物のライブラリー」という用語は、非常に多数の試験化合物を含んでなる一団を指す。
【００７２】
一態様において、「剤」若しくは「化合物」若しくは「試験化合物」という用語は、サイトカインのような天然に存在する化合物を除外する。別の態様において、剤という用語は天然に存在するサイトカインに結合する抗体を除外する。別の態様において、「剤」という用語はサイトカイン受容体に結合する抗体を除外する。なお別の態様において、「剤」という用語は、Ｔ細胞受容体を介してシグナルを伝達する剤、例えばＭＨＣ分子の状況での抗原、若しくはＴ細胞受容体複合体の１成分に対する抗体を除外する。一態様において、剤若しくは試験化合物は、Ｔ−ｂｅｔと直接相互作用するか若しくはＴ−ｂｅｔが相互作用する分子と直接相互作用する化合物（例えば、Ｔ−ｂｅｔとＴ−ｂｅｔ標的分子、例えばＤＮＡ若しくは別のタンパク質の間の相互作用を阻害若しくは刺激する化合物）である。別の態様において、化合物は、例えば、Ｔ−ｂｅｔが関わるシグナル伝達経路中のＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流にある分子の活性を調節することによりＴ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性を間接的に調節するものである。こうした化合物は、下に詳細に記述されるところのこうした化合物について選択するスクリーニングアッセイを使用して同定し得る。
【００７３】
「小分子」という用語は当該技術分野の用語であり、そして、約１０００分子量未満若しくは約５００分子量未満である分子を包含する。一態様において、小分子はペプチド結合を独占的に含まない。別の態様において、小分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーニングし得る例示的小分子化合物は、限定されるものでないが、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、小有機分子（例えばポリケチド）（Ｃａｎｅら  １９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：６３）、および天然産物の抽出物のライブラリーを挙げることができる。別の態様において、化合物は小型の有機非ペプチド化合物である。さらなる一態様において、小分子は生合成でない。
【００７４】
本明細書で使用されるところの「試験化合物」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの活性および／若しくは発現の調節物質、ならびに／または細胞の増殖、生存、分化および／若しくは移動の調節物質として以前に同定若しくはそうであることが認識されていない化合物を包含する。
【００７５】
「試験化合物のライブラリー」という用語は、非常に多数の試験化合物を含んでなる一団を指すことを意図している。
【００７６】
本明細書で使用されるところの「工作された」（工作された細胞でのような）という用語は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が導入された細胞を指す。
【００７７】
本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、検出可能な遺伝子産物、例えばＲＮＡ若しくはタンパク質を発現するいかなる遺伝子も指す。好ましいレポーター遺伝子は容易に検出可能であるものである。レポーター遺伝子は、所望の転写制御配列を包含するか若しくは他の所望の特性を表す遺伝子との融合遺伝子の形態でもまた構築物中に包含しうる。レポーター遺伝子の例は、限定されるものでないがＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（ＡｌｔｏｎとＶａｐｎｅｋ（１９７９）、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２；８６４−８６９）ルシフェラーゼ、ならびに、β−ガラクトシダーゼ；ホタルルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔら（１９８７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）；細菌ルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔとＳｉｌｖｅｒｍａｎ（１９８４）、ＰＮＡＳ  １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２３１−２３８、Ｈａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（ＣｕｌｌｅｎとＭａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８）および緑色蛍光タンパク質（米国特許第５，４９１，０８４号；第ＷＯ  ９６／２３８９８号明細書）のような他の遺伝子検出系を挙げることができる。
【００７８】
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ応答配列」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの活性により直接若しくは間接的に調節されるＤＮＡ配列を指す（それによりＴ−ｂｅｔの活性は例えばレポーター遺伝子の転写を介してモニターし得る）。
【００７９】
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞」という用語は、Ｔ−
ｂｅｔが天然に欠損している被験体の細胞、ならびにそれらがＴ−ｂｅｔが欠損しているような、変えられているヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物例えばマウスの細胞を包含することを意図している。「Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される、ヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物若しくは被験体から単離された細胞を包含することもまた意図している。
【００８０】
本明細書で使用されるところの「細胞を含まない組成物」という用語は、無傷の細胞を含有しない単離された組成物を指す。細胞を含まない組成物の例は、細胞抽出液、および単離されたタンパク質を含有する組成物を包含する。
【００８１】
本明細書で使用されるところの「指標組成物」という用語は、目的のタンパク質（例えばＴ−ｂｅｔ）を包含する組成物、例えば該タンパク質を天然に発現する細胞、該タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより該タンパク質を発現するよう工作された細胞、または該タンパク質（例えば精製された天然に存在するタンパク質若しくは組換えで工作されたタンパク質）を含有する細胞を含まない組成物を指す。
【００８２】
本明細書で使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔの調節物質」という用語は、Ｔ−ｂｅｔの発現、プロセシング、翻訳後修飾若しくは活性の調節物質を包含する。該用語は、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の転写、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのプロセシング、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化若しくはリン酸化）またはＴ−ｂｅｔタンパク質の活性を調節する剤、例えば化合物（１種若しくは複数）を包含する。「Ｔ−ｂｅｔ活性の調節物質」は、Ｔ−ｂｅｔ活性を直接若しくは間接的に調節する化合物を包含する。例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性の間接的調節物質は、Ｔ−ｂｅｔを包含するシグナル伝達経路を調節しうる。Ｔ−ｂｅｔ活性を直接調節する調節物質の例は、Ｔ−ｂｅｔのｍＲＮＡ若しくはゲノムＤＮＡに結合するアンチセンス核酸分子、Ｔ−ｂｅｔに細胞内で結合しかつＴ−ｂｅｔ活性を調節（すなわち阻害）する細胞内抗体、細胞中でのＴ−ｂｅｔ活性の増大された発現を見込む標的分子およびＴ−ｂｅｔをコードする発現ベクターとのＴ−ｂｅｔの相互作用を阻害するＴ−ｂｅｔペプチド、ドミナントネガティブの形態のＴ−ｂｅｔ、ならびにＴ−ｂｅｔの活性を特異的に調節するよう作用する化合物を包含する。
【００８３】
本明細書で使用されるところのＴ−ｂｅｔタンパク質の「アゴニスト」は、天然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の実質的に同一な生物学的活性若しくはその１サブセットを保持し得る。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の「アンタゴニスト」は、例えばＴ−ｂｅｔタンパク質の細胞活性を競合的に調節することにより、天然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質の活性の１種若しくはそれ以上を阻害し得る。
【００８４】
本明細書で互換性に使用されるところの「Ｔ−ｂｅｔ活性」、「Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性」若しくは「Ｔ−ｂｅｔの機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるところの、Ｔ−ｂｅｔ応答性細胞若しくは組織、例えばＴ細胞、例えばＴｈ１細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、またはＴ−ｂｅｔの標的分子、例えば核酸分子若しくはタンパク質標的分子に対しＴ−ｂｅｔタンパク質により発揮される活性を包含する。一態様において、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子との会合のような直接活性である。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ活性はＴ−ｂｅｔ標的分子とのＴ−ｂｅｔタンパク質の相互作用により媒介される下流の生物学的事象のような間接的活性である。Ｔ−ｂｅｔの例示的生物学的活性は本明細書に記述され、そして、限定されるものでないが：Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングの調節、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着の調節、血管壁を通るＴ細胞の遊出の調節、炎症の部位へのＴ細胞の動員の調節、ＣＸＣＲ３発現の調節、チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−１（ＴＰＳＴ−１）発現の調節、内皮細胞上のＶＣＡＭ−１へのＴ細胞のβ−インテグリン依存性の結合の調節、
Ｔｈ２細胞系譜分化の調節例えば減少、自然および適応免疫系の細胞でのＩＦＮ−γ産生の調節、サイトカインの産生の調節、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達の調節、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路の調節、ＩｇＧクラススイッチの調節、Ｂリンパ球機能の調節、ならびに、Ｔ−ｂｅｔの調節から利益を得るとみられる障害の調節、または炎症の部位へのＴ細胞の動員の調節から利益を得るとみられる障害、例えば自己免疫疾患、多発性硬化症、若しくは関節リウマチ、例えばウイルス若しくは細菌への感染、喘息、およびＴｈ１若しくはＴｈ２サイトカインが関与する他の障害若しくは好ましくない状態、例えば炎症の調節を挙げることができる。これらの知見は、多様な疾患、障害若しくは状態での薬物標的および治療的介入の標的としてのＴ−ｂｅｔ（およびＴ−ｂｅｔが関与する経路中の他の分子）の使用を提供する。本発明は、なおさらに、Ｔ−ｂｅｔ活性を調節する剤を含んでなるワクチンのような免疫調節組成物を提供する。
【００８５】
本明細書で使用されるところの「その転写がＴ−ｂｅｔにより調節される遺伝子」という用語は、Ｔ−ｂｅｔにより調節される調節領域を有する遺伝子を包含する。こうした遺伝子はＴ−ｂｅｔにより正若しくは負に調節され得る。該用語は、Ｔ−ｂｅｔにより間接的に調節される、すなわち、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の活性化の結果として調節される遺伝子もまた包含する。Ｔ−ｂｅｔにより調節される例示的遺伝子は、例えば、ＣＸＣＲ３、ＴＰＳＴ−２、ＧＡＴＡ３、ならびにサイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦα、ＴＧＦ−β、ＬＴ（リンホトキシン）およびＩＬ−１０を包含する。
【００８６】
本明細書で使用されるところの「標的分子」若しくは「結合パートナー」という用語は、天然にＴ−ｂｅｔが結合若しくは相互作用しかつその相互作用が生物学的応答をもたらす分子である。標的分子はタンパク質若しくは核酸分子であり得る。本発明の例示的標的分子は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質と同一のシグナル伝達経路中のタンパク質、例えば、例えばＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングの調節、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着の調節、血管壁を通るＴ細胞の遊出の調節、炎症の部位へのＴ細胞の動員の調節、Ｔ細胞系譜分化の調節、サイトカインの産生を調節すること、ＴＧＦ−β媒介性のシグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチを調節すること、Ｂリンパ球機能を調節すること、および自己免疫疾患を調節することを伴う経路中のＴ−ｂｅｔタンパク質の上流（活性の刺激物質および阻害物質の双方を包含する）若しくは下流で機能しうるタンパク質を包含する。例示的Ｔ−ｂｅｔ標的分子は、例えば、ケモカイン、例えばＣＸＣＲ３、ＴＰＳＴ−２、チロシンキナーゼ、例えばＩＴＫ若しくはｒｌｋのようなＴｅｃキナーゼ、またはＴ−ｂｅｔが相互作用して遺伝子転写を調節するＤＮＡ配列を包含する。
【００８７】
本明細書で使用されるところの「シグナル伝達経路」という用語は、細胞が細胞外の影響若しくはシグナル（例えば、サイトカイン受容体若しくは抗原受容体のような細胞の表面上の受容体により伝達されるシグナル）を細胞応答（例えば遺伝子転写の調節）に変換する手段を包含する。例示的シグナル伝達経路は、ＪＡＫ１／ＳＴＡＴ−１経路（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．２００１．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３：２７１）およびＴＧＦ−β経路（ＡｔｔｉｓａｎｏとＷｒａｎａ．２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９６：１６４６）を包含する。「Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路」は、Ｔ−ｂｅｔがシグナルを伝えるシグナル伝達分子であるものである。
【００８８】
本明細書で使用されるところの「セレクチン」という用語は、レクチン様ドメインを介して炭水化物に結合する細胞接着分子の１族を指す。セレクチンは、Ｎ末端のＣ型レクチンドメイン、次いでＥＧＦ様ドメイン、変動する数の補体調節タンパク質の短いコンセンサス配列の反復配列、および単一の膜貫通ドメインをもつ内在性膜糖タンパク質である。３種のセレクチンが同定されており、そしてそれらの元の同一性の起源に基づき大文字により識別される（すなわちＥ−セレクチン（活性化された内皮上で発現される）、Ｌ−セレクチン（大部分の型の白血球上で発現される）およびＰ−セレクチン（血小板の貯蔵顆粒に見出される））。Ｌ−、Ｐ−およびＥ−セレクチンのリガンドの共通のオリゴ糖決定子がシアリルＬｅｗｉｓ  Ｘ（ｓＬｅＸ）若しくはその何らかのバリアントであることが確立されている。しかしながら、セレクチン認識でのｓＬｅＸの特定の役割は明瞭に確立されていない。
【００８９】
にもかかわらず、リンパ球の表面上で発現されるＰ−セレクチンの高親和性の生物学的リガンドが同定され、そして本明細書で「Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１」若しくは「ＰＳＧＬ−１」と称される。ＰＳＧＬ−１の特徴的な特徴は：オリゴ糖決定子、高密度のＯ−結合したグリカン、特異性に重要なタンパク質コア、ならびに負の電荷の集団およびチロシン硫酸化のための３個の潜在的部位を含有するＮ末端領域を包含する。加えて、翻訳後修飾、例えばチロシン硫酸化がＰＳＧＬ−１の生物学的活性に必要である。チロシン硫酸化は、「チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ」と呼ばれる２種のゴルジイソ酵素（「ＴＰＳＴ−１」および「ＴＰＳＴ−２」）の１種により媒介される。
【００９０】
本明細書で使用されるところの「ケモカイン」は、白血球中で走化性若しくはケモキネシスを誘導するその能力に基づき同定される低分子量サイトカインである。ケモカインは遺伝子、構造および機能の基準に基づきサブグループに分割される（すなわちＣＸＣおよびＣＣサブファミリー）。具体的には、ケモカインは、４システイン残基の最初の２個の配置に基づき分割される。該２個のシステインはＣＸＣケモカインで単一アミノ酸により分離される一方、該２個のシステインはＣＣケモカインでは隣接している。大部分のＣＸＣケモカインは好中球の化学誘引物質である一方、ＣＣケモカインは、一般に単球、リンパ球、好塩基球および好酸球を誘引する。ケモカインの生物学的活性は、特異的受容体により、およびＣＣケモカイン若しくはＣＸＣケモカインの群いずれかに常に属するこれらのタンパク質の数種を結合する重なるリガンド特異性をもつ受容体によってもまた媒介される。リンパ球は大部分の既知のケモカインに応答性になるために刺激を必要とし、そしてこの過程はケモカイン受容体発現に緊密に結びつけられる。ケモカイン受容体は、膜を横断する７個の疎水性α−ヘリックスセグメントを含有するＧタンパク質共役型７膜貫通ドメイン受容体の大きな群に属する。これらの受容体は、ヘテロ三量体のＧタンパク質を介してシグナル伝達を媒介する、Ｇタンパク質共役型受容体スーパーファミリー内の構造上関係した一群を形成する。ＣＸＣケモカインを結合するケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ、次いで数字で示される。同様に、ＣＣケモカインを結合するケモカイン受容体は、ＣＣＲ、次いで数字で示される。
【００９１】
本明細書で使用されるところの「Ｉｇスーパーファミリー細胞接着分子」のメンバーは、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）、および神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）を包含する、カルシウム非依存型膜貫通糖タンパク質である。各ＩｇスーパーファミリーＣＡＭは１個の細胞外ドメインを有し、それは、システイン残基が保存されている数個のＩｇ様鎖間ジスルフィド結合したループ、膜貫通ドメイン、および細胞骨格と相互作用する細胞内ドメインを含有する。典型的には、それらはインテグリン若しくは他のＩｇスーパーファミリーＣＡＭを結合する。
【００９２】
本明細書で使用されるところの「インテグリン」は、細胞と細胞および細胞と細胞外マトリックスの相互作用を媒介する、αおよびβ（例えばβ１、β２およびβ３）と称される、２個の非共有結合したポリペプチド鎖よりなるヘテロ二量体の細胞接着受容体の１ファミリーのいずれかである。本明細書で使用されるところのβ−インテグリンはβ１およびβ２双方のインテグリンを指す。「β１インテグリン」はβ１鎖を含有するいずれのインテグリンでもあり；この群のメンバーは白血球、血小板および若干の非血液細胞上で多様に発現され、そして細胞−マトリックス接着を媒介する。この分類のヘテロ二量体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化の２ないし４週後にＴ細胞上で最初に同定され、そして最晩期活性化（ＶＬＡ）抗原と呼ばれ；ＶＬＡという呼称は、個々のメンバーを示す数字を伴いこの群の他のタンパク質について継続されている。β２インテグリンはβ２鎖を含有するいずれのインテグリンでもあり；この群のメンバー（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０，９５）は白血球上で発現され、そして白血球接着を媒介しかつ補体受容体として作用し；白血球接着タンパク質ともまた呼ばれる。
【００９３】
ヒトＰ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６０３１１９６およびｇｉ：４５０６８７７（配列番号５および６）に記述されている。マウスＰ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６７５５４５５およびｇｉ：６７５５４５６（配列番号７および８）に記述されている。ヒトＥ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４５０６８７０およびｇｉ：４５０６８７１（配列番号９および１０）に記述されている。マウスＥ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６７５５４５１およびｇｉ：６７５５４５２（配列番号１１および１２）に記述されている。ヒトＬ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：５７１３３２０およびｇｉ：４５０６８７５（配列番号１３および１４）に記述されている。マウスＬ−セレクチンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６７５５４５３およびｇｉ：６７５５４５４（配列番号１５および１６）に記述されている。ヒトＰＳＧＬ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６０３１１９７およびｇｉ：４５０６８７９（配列番号１７および１８）に記述されている。マウスＰＳＧＬ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３１９８２０１８およびｇｉ：３１９８２０１９（配列番号１９および２０）に記述されている。
【００９４】
ヒトＴＰＳＴ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：２１３６１０９２およびｇｉ：４５０７６６５（配列番号３７および３８）に記述されている。マウスＴＰＳＴ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：７３０５５９０およびｇｉ：７３０５５９１（配列番号３９および４０）に記述されている。ヒトＴＰＳＴ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：５６６９９４６２およびｇｉ：５６６９９４６３（配列番号２１および２２）に記述されている。マウスＴＰＳＴ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：３１９８１９５１およびｇｉ：６６７８４２１（配列番号２３および２４）に記述されている。
【００９５】
ヒトＣＸＣＲ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４５０４０９８およびｇｉ：４５０４０９９（配列番号２５および２６）に記述されている。マウスＣＸＣＲ３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：６７５３４５７およびｇｉ：６７５３４５８（配列番号２７および２８）に記述されている。
【００９６】
ヒトＣＸＣＬ１０のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：４５０４７００およびｇｉ：４５０４７０１（配列番号２９および３０）に記述されている。マウスＣＸＣＬ１０のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：１０９４６５７５およびｇｉ：１０９４６５７６（配列番号３１および３２）に記述されている。
【００９７】
ヒトＣＸＣＬ１１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受
託番号ｇｉ：１４７９０１４５およびｇｉ：４８８５５８９（配列番号３３および３４）に記述されている。マウスＣＸＣＬ１１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｇｉ：９５０７０７０およびｇｉ：９５０７０７１（配列番号３５および３６）に記述されている。
【００９８】
本発明の多様な局面を以下の下位節でさらに詳細に記述する。
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の一局面はＴ−ｂｅｔをコードする単離された核酸分子に関する。好ましい一態様において、本発明の核酸分子は配列番号１若しくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。別の態様において、本発明の核酸分子は、配列番号１の最低約７００の連続するヌクレオチド、若しくは配列番号３の最低約５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましい一態様において、本発明の核酸分子は、配列番号１の最低約８００、最低約１０００、最低約１２００、最低約１４００若しくは最低約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる。別の好ましい態様において、本発明の核酸分子は、配列番号３の最低約６００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００若しくは最低約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【００９９】
他の態様において、該核酸分子は：配列番号１の最低約７００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００、最低約１４００若しくは最低約１６００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と最低７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびなおより好ましくは９０％の同一性を有する。他の態様において、該核酸分子は：配列番号３の最低約６００、最低約８００、最低約１０００、最低約１２００若しくは最低約１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる核酸分子と最低７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、およびなおより好ましくは９０％のヌクレオチド同一性を有する。
【０１００】
遺伝暗号の縮重により配列番号１若しくは３と異なりかつ従って配列番号１および３によりコードされるものと同一のＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子が本発明により包含される。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１０１】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子を、標準的分子生物学技術および本明細書に提供される配列情報を使用して他の供給源から単離し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１若しくは３の全部若しくは一部分、および（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９に記述されるところの）標準的ハイブリダイゼーション技術を使用して、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。さらに、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の全部若しくは一部分を包含する核酸分子は、配列番号１若しくは３の配列に基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により単離し得る。例えば、（例えばＣｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９のグアニジウム−チオシアン酸抽出手順により）細胞からｍＲＮＡを単離し得、そして、逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、メリーランド州ベセスダから入手可能なモロニーＭＬＶ逆転写酵素；若しくは、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、フロリダ州セントピーターズバーグから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用してｃＤＮＡを製造し得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１若しくは３に示されるヌクレオチド配列に基づき設計し得る。本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、若しくは、あるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用して、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って増幅し得る。そのように増幅された核酸を適切なベクターにクローン化し得かつＤＮＡ配列分析により特徴付け得る。さらに、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して製造し得る。
【０１０２】
配列番号１および３に示されるＴ−ｂｅｔヌクレオチド配列に加え、Ｔ−ｂｅｔのヌクレオチド若しくはアミノ酸配列の小さな変化につながるＤＮＡ配列多形が集団内に存在しうることが当業者により認識されるであろう。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子中のこうした遺伝子多形が天然の対立遺伝子変動により集団内の個体間に存在しうる。こうした天然の対立遺伝子変動は、典型的には、１遺伝子のヌクレオチド配列中の１〜２％の相違をもたらし得る。こうしたヌクレオチド変動、および天然の対立遺伝子変動の結果でありかつＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えないＴ−ｂｅｔ中の生じるアミノ酸多形は、本明細書の範囲内にある。
【０１０３】
本発明のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡの天然の対立遺伝子バリアントに対応する核酸分子は、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的ハイブリダイゼーション技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＤＮＡ若しくはその一部分を使用して、本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ核酸分子に対するそれらの相同性に基づき単離し得る。例示的高ストリンジェントな条件は、約４５℃の温度で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中数時間ないし一夜のハイブリダイゼーション、次いで約５０〜６５℃の温度で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄緩衝液中で１回若しくはそれ以上の洗浄を包含する。従って、別の態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列を含んでなる第二の核酸分子に高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。好ましくは、高ストリンジェントな条件下で配列番号１若しくは３の配列番号の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子。一態様において、こうした核酸分子は長さが最低約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００若しくは１６００ヌクレオチドである。別の態様において、こうした核酸分子およびは、配列番号１の最低約７００、８００、９００、１０００、１２００、１３００、１４００、１５００若しくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の最低約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００若しくは１５００の連続するヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、単離された核酸分子はＴ−ｂｅｔ核酸分子の天然に存在する対立遺伝子バリアントに対応する。
【０１０４】
集団中に存在しうるＴ−ｂｅｔ配列の天然に存在する対立遺伝子バリアントに加え、当業者は、小さな変化を突然変異により配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列中に導入して、それによりＴ−ｂｅｔタンパク質の機能的活性を変えることなくコードされるタンパク質のアミノ酸配列中の変化につながりうることをさらに認識するであろう。例えば、「不可欠でない」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を配列番号１若しくは３の配列中で行いうる。「不可欠でない」アミノ酸残基は、ＤＮＡと相互作用するその能力若しくはＩＦＮ−γプロモーターからの転写を高めるその能力のようなＴ−ｂｅｔの機能的活性を変えることなくＴ−ｂｅｔの野生型配列（例えば配列番号１若しくは３の配列）から変えることができる残基である一方、「不可欠な」アミノ酸残基は機能的活性に必要とされる。
【０１０５】
従って、本発明の別の局面は、Ｔ−ｂｅｔ活性に不可欠でないアミノ酸残基に変化を含有するＴ−ｂｅｔタンパク質をコードする核酸分子に関する。こうしたＴ−ｂｅｔタンパク質は、アミノ酸配列が配列番号２若しくは４と異なるが、それでもなおＴ−ｂｅｔ活性を保持する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の非天然のバリアントをコードする単離された核酸分子は、１個若しくはそれ以上のアミノ酸置換、付加若しくは欠失がコードされるタンパク質に導入されるような、配列番号１若しくは３のヌクレオチド配列に１個若しくはそれ以
上のヌクレオチド置換、付加若しくは欠失を導入することにより創製し得る。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発のような標準的技術により配列番号１若しくは３に導入し得る。
【０１０６】
別の態様において、１個若しくはそれ以上の不可欠でないアミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の族が当該技術分野で定義されている。従って、Ｔ−ｂｅｔ中の不可欠でないアミノ酸残基を、好ましくは、同一側鎖族からの別のアミノ酸残基で置換する。
【０１０７】
あるいは、別の態様において、飽和突然変異誘発によるようにＴ−ｂｅｔコーディング配列の全部若しくは一部に沿って無作為に突然変異を導入し得、そして、ＤＮＡに結合しかつ／若しくは転写を活性化するそれらの能力について、生じる変異体をスクリーニングして、機能的活性を保持する変異体を同定し得る。突然変異誘発後に、コードされるＴ−ｂｅｔ変異体タンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現させ得、そして、変異体タンパク質の機能的活性を、Ｔ−ｂｅｔ活性を評価するための当該技術分野で利用可能なアッセイを使用して（例えばＤＮＡ中に存在するＴボックス結合エレメントに結合する該タンパク質の能力を測定することにより、またはＴ細胞のＴｈ１若しくはＴｈ２表現型を調節する該タンパク質の能力を測定することにより、測定し得る。
【０１０８】
本発明の別の局面は、Ｔ−ｂｅｔのｍＲＮＡ若しくは遺伝子のコーディング鎖に対しアンチセンスである単離された核酸分子に関する。本発明のアンチセンス核酸は、Ｔ−ｂｅｔコーディング鎖全体若しくはその一部分にのみ相補的であり得る。一態様において、アンチセンス核酸分子は、タンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるか若しくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖のコーディング領域に対しアンチセンスである。別の態様において、アンチセンス核酸分子は、タンパク質のＴ−ｂｅｔファミリーに独特であるか若しくは特定の種からのＴ−ｂｅｔ配列に独特であるＴ−ｂｅｔをコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の非コーディング領域に対しアンチセンスである。好ましい態様において、本発明のアンチセンス分子は、配列番号１の非コーディング鎖の最低約７００の連続するヌクレオチド、より好ましくは、配列番号１の非コーディング鎖の最低８００、１０００、１２００、１４００若しくは１６００の連続するヌクレオチド、または配列番号３の非コーディング鎖の最低約５００の連続するヌクレオチド、より好ましくは配列番号３の非コーディング鎖の最低６００、８００、１０００、１２００若しくは１４００の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１０９】
本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔをコードするコーディング鎖配列（例えば配列番号１および３を考えれば、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンとクリックの塩基対形成の規則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディング領域全体に相補的でありうるか、若しくは、あるいは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのコーディング若しくは非コーディング領域の一部分にのみ対しアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、「アンチセンスオリゴヌクレオチドはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的でありうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば長さが約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素連結反応を使用して構築し得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または該分子の生物学的安定性を増大させる、若しくはアンチセンスおよびセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるよう設計された、多様に改変されたヌクレオチドを使用して化学合成し得、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの向きにサブクローニングされた発現ベクターを使用して生物学的に製造し得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対しアンチセンスの向きのものであることができる。以下の下位節でさらに記述される）。
【０１１０】
別の態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらがそれに対する相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能であるリボヌクレアーゼ活性をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計し得る。例えば、活性部位の塩基配列が、Ｔ−ｂｅｔをコードするｍＲＮＡ中で切断されるべき塩基配列に相補的であるテトラヒメナのＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Ｃｅｃｈら  米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら  米国特許第５，１１６，７４２号明細書を参照されたい。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡを、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．とＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照されたい。
【０１１１】
別の態様において、ＲＮＡｉを、Ｔ−ｂｅｔ発現を阻害するのに使用し得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と同一配列を含有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解するためにｄｓＲＮＡを使用する、転写後の標的を定められた遺伝子サイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．とＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．２８７、２４３１−２４３２（２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．ら  Ｃｅｌｌ  １０１、２５−３３（２０００）。Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３、３１９１−３１９７（１９９９））。該過程は、内因性リボヌクレアーゼが、より長いｄｓＲＮＡを小分子干渉ＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡと命名されるより短い２１若しくは２２ヌクレオチド長のＲＮＡに切断する場合に起こる。該より小さいＲＮＡセグメントがその後標的ｍＲＮＡの分解を媒介する。ｄｓＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ鎖は、Ｔ−ｂｅｔのコーディング領域の少なくとも一部分、またはＴ−ｂｅｔ遺伝子の５’若しくは３’非翻訳領域の少なくとも一部分に対しアンチセンスであり得る。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、２ｎｔの３’オーバーハングを有するようなある様式で対形成する２１ｎｔのセンスおよび２１ｎｔのアンチセンス鎖から構成される。一態様において、オーバーハングにてＴＴをもつｓｉＲＮＡ。標的領域は、例えば開始コドンの５０ないし１００ｎｔ下流であり得、３’−ＵＴＲもまた標的としうる。一態様において、２３ｎｔの配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎ、いずれかのヌクレオチド）を検索し得、そして約３０〜７０％の間のＧ／Ｃ含量をもつヒットを選択し得る。適する配列が見出されない場合は、モチーフＮＡ（Ｎ２１）を使用して検索を拡大する。ｓｉＲＮＡは、好ましくは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトおよび慣習的ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して化学合成する。ｓｉＲＮＡはまた、例えばＤｈａｒｍａｃｏｎ，Ｘｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ、ＰｒｏｌｉｇｏおよびＡｍｂｉｏｎから商業的にも入手可能である。一態様において、アンチセンスＲＮＡでの使用のための上述された化学の１種若しくはそれ以上を使用し得る。
【０１１２】
本発明のなお別の局面は、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に関する。Ｔ−ｂｅｔ以外のタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドをコードする第
二のヌクレオチド配列に効果的に連結されたＴ−ｂｅｔタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドをコードする最低１種の第一のヌクレオチド配列を含んでなるこうした核酸分子を、標準的組換えＤＮＡ技術により製造し得る。Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質は下の下位節ＩＩＩにさらに詳細に記述する。
【０１１３】
ＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の局面は、Ｔ−ｂｅｔ（若しくはその一部分）をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは組換え発現ベクターに関する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中での本発明の核酸の発現に適する形態で本発明の核酸を含んでなり、それは、該組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に効果的に連結された、発現に使用されるべき宿主細胞に基づき選択された１種若しくはそれ以上の制御配列を包含することを意味している。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、若しくは該ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞中での）ヌクレオチド配列の発現を見込む様式で制御配列（１種若しくは複数）に連結されていることを意味することを意図している。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節領域（例えばポリアデニル化シグナル）を包含する。こうした制御配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述されている。制御配列は、多くの型の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指図するもの、およびある種の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指図するもの（例えば組織特異的制御配列）を包含する。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存しうることが当業者により認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入して、それにより本明細書に記述されるところの核酸によりコードされる融合タンパク質若しくはペプチドを包含するタンパク質若しくはペプチド（例えばＴ−ｂｅｔタンパク質、変異体の形態のＴ−ｂｅｔタンパク質、Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１１４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物若しくは真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の発現のため設計し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）酵母細胞若しくは哺乳動物細胞中で発現させ得る。適する宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）にさらに論考されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳しうる。
【０１１５】
原核生物でのタンパク質の発現は、最もしばしば、融合若しくは非融合いずれのタンパク質の発現も指図する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で実施する。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を付加する。こうした融合ベクターは、１個若しくはそれ以上の目的、すなわち１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパク質の溶解性を増大させるため；３）親和性精製でリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製で補助するため；４）タンパク質の検出および／若しくは精製で補助するためのエピトープ標識を提供するため；ならびに／または５）タンパク質の検出で補助するためのマーカー（例えばβ−ガラクトシダーゼ融合を使用する色マーカー）を提供するため、にかなうことができる。しばしば、融合発現ベクター中で、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質の結合部にタンパク質分解性切断部位を導入する。こうした酵素およびそれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよび
エンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、標的組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質若しくはプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．とＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を包含する。組換えタンパク質は、上で論考された同一目的上、融合タンパク質として真核生物中でもまた発現し得る。
【０１１６】
適する誘導可能な非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）を包含する。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に頼る。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスのＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーター（Ｔ７
ｇｎ１）からの転写に頼る。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎ１遺伝子を持つ常在性λプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）若しくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１１７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での組換えタンパク質発現を最大化するための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する損なわれた能力を伴う宿主細菌中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）１１９−１２８）。別の戦略は、各アミノ酸の個別のコドンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変えることである（Ｗａｄａら、（１９９２）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこうした変化は、標準的ＤＮＡ合成技術により実施し得る。
【０１１８】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）中での発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ．ら、（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎとＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【０１１９】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔはバキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞中で発現させ得る。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．とＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．、（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を包含する。
【０１２０】
なお別の態様において、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現させる。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。哺乳動物細
胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルスの調節エレメントにより提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳＶ４０由来である。
【０１２１】
別の態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を指図することが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントを、核酸を発現するのに使用する）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で既知である。適する組織特異的プロモーターの制限しない例は、リンパ系特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅとＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞受容体（ＷｉｎｏｔｏとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎとＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経細線維プロモーター；ＢｙｒｎｅとＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば乳ホエイプロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）を包含する。発達的に調節されるプロモーター、例えばマウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌとＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓとＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
【０１２２】
さらに、哺乳動物細胞での使用のための誘導可能な制御系、例えば遺伝子発現が重金属（例えば、Ｍａｙｏら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照されたい）、熱ショック（例えばＮｏｕｅｒら（１９９１）Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ、フロリダ州ボカレイトン中、ｐｐ１６７−２２０を参照されたい）、ホルモン（例えば、Ｌｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−７３６；ＩｓｒａｅｌとＫａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９３／２３４３１号明細書を参照されたい）、ＦＫ５０６関連分子（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／１８３１７号明細書を参照されたい）若しくはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．とＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／２９４４２号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ９６／０１３１３号明細書）により調節される系が当該技術分野で既知である。従って、別の態様において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔ  ＤＮＡが誘導可能な真核生物プロモーターに効果的に連結され、それにより真核生物細胞中でのＴ−ｂｅｔタンパク質の誘導可能な発現を見込む、組換え発現ベクターを提供する。
【０１２３】
本発明はさらに、アンチセンスの向きで発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含んでなる組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子が、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を見込む様式で制御配列に効果的に連結される。多様な細胞型でアンチセンスＲＮＡ分子の継続的発現を指図する、アンチセンスの向きでクローン化された核酸に効果的に連結された制御配列、例えばウイルスプロモーターおよび／若しくはエンハンサーを選ぶことがで
きるか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的若しくは細胞型特異的発現を指図する制御配列を選ぶことができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、ファージミド若しくは弱毒ウイルスの形態にあり得、それらの活性は該ベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の論考については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
【０１２４】
本発明の別の局面は、本発明のベクター、好ましくは組換え発現ベクターが導入された組換え宿主細胞に関する。宿主細胞はいかなる原核生物若しくは真核生物細胞でもありうる。例えば、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母若しくは（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）若しくはＣＯＳ細胞のような）哺乳動物細胞中で発現させうる。他の適する宿主細胞は当業者に既知である。ベクターＤＮＡは、慣習的形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション若しくは電気穿孔法を包含する、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための多様な技術に認識された技術を指すことを意図している。宿主細胞の適する形質転換若しくはトランスフェクト方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、および他の実験室手引書に見出し得る。
【０１２５】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さな部分のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込みうることが既知である。これらの組込み体を同定かつ選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、一般に、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような化合物に対する耐性を賦与するものを包含する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、Ｔ−ｂｅｔをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入しうるか、若しくは別個のベクター上で導入しうる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は化合物選択により同定し得る（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存することができる一方、他の細胞は死ぬ）。
【０１２６】
培養物中の原核生物若しくは真核生物宿主細胞のような本発明の宿主細胞を、Ｔ−ｂｅｔタンパク質を産生（すなわち発現）するのに使用し得る。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使用するＴ−ｂｅｔタンパク質の製造方法をさらに提供する。一態様において、該方法は、（Ｔ−ｂｅｔをコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞をＴ−ｂｅｔが産生されるまで適する培地中で培養することを含んでなる。別の態様において、該方法は培地若しくは宿主細胞からＴ−ｂｅｔを単離することをさらに含んでなる。その天然の形態で、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は細胞内タンパク質であり、そして従って組換えＴ−ｂｅｔタンパク質が組換え宿主細胞中で細胞内で発現され得、そしてその後、例えば宿主細胞を溶解すること、および組換えＴ−ｂｅｔタンパク質をライセートから回収することにより宿主細胞から単離し得る。あるいは、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質は、該タンパク質が宿主細胞から分泌されるような、該タンパク質のアミノ末端に異種シグナル配列を効果的に連結することにより、細胞外タンパク質として製造し得る。この場合、組換えＴ−ｂｅｔタンパク質を、細胞を培養している培地から回収し得る。
【０１２７】
本発明のある種の宿主細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用してヒト以外のトランスジェニック動物を製造するのにもまた使用し得る。
【０１２８】
ＩＩＩ．単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質および抗Ｔ−ｂｅｔ抗体
本発明の別の局面は単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質に関する。好ましくは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質は配列番号１若しくは３によりコードされるアミノ酸配列を含んでなる。別の好ましい態様において、該タンパク質は配列番号２若しくは４のアミノ酸配列を含んでなる。他の態様において、該タンパク質は、配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列と、最低６０％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％のアミノ酸同一性、より好ましくは８０％、およびなおより好ましくは９０％若しくは９５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１２９】
他の態様において、本発明はＴ−ｂｅｔタンパク質の単離された部分を提供する。例えば、本発明は、Ｔボックスドメインを包含するＴ−ｂｅｔのアミノ末端部分をさらに包含する。多様な態様において、このアミノ末端部分は、ヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３８−３２７若しくはマウスＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸１３７−３２６を包含する。本発明により提供されるＴ−ｂｅｔの別の単離された部分は、チロシンリン酸化部位を包含する一部分である。この部分は、Ｔ−ｂｅｔの最低約２０、最低約５０、最低約１００若しくは最低約２００アミノ酸を含んでなり、また、ヒトＴ−ｂｅｔの少なくともアミノ酸Ｔｙｒ７６、Ｔｙｒ１１９および／若しくはＴｙｒ５３１またはマウスＴ−ｂｅｔのアミノ酸Ｔｙｒ５２５を包含する。本明細書で提供されるＴ−ｂｅｔのなお別の単離された部分は、ヒトＴ−ｂｅｔのアミノ酸４９８−５０１若しくはマウスＴ−ｂｅｔの４９３−４９６に示される核局在化配列を包含する一部分である。
【０１３０】
本発明のＴ−ｂｅｔタンパク質は、好ましくは組換えＤＮＡ技術により製造する。例えば、該タンパク質をコードする核酸分子を（上述されたところの）発現ベクターにクローン化し、該発現ベクターを（上述されたところの）宿主細胞に導入し、そしてＴ−ｂｅｔタンパク質を該宿主細胞中で発現させる。Ｔ−ｂｅｔタンパク質をその後、標準的タンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームにより細胞から単離し得る。組換え発現に代わり、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドを、標準的ペプチド合成技術を使用して化学合成し得る。さらに、天然のＴ−ｂｅｔタンパク質を、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を使用する免疫沈降により細胞から（例えばＴ細胞から）単離し得る。
【０１３１】
本発明はまた、Ｔ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）若しくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントにも関する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の突然変異誘発、例えば分離した点突然変異若しくは切断により生成し得る。従って、特定の生物学的効果を、制限された機能のバリアントでの処理により導き出し得る。一態様において、天然に存在する形態の該タンパク質の生物学的活性の１サブセットを有するバリアントでの被験体の処置は、天然に存在する形態のＴ−ｂｅｔタンパク質での処置に関して被験体でより少ない副作用を有する。一態様において、本発明は、当該技術分野で既知の酸化、還元若しくは他の誘導体化方法によりＴ−ｂｅｔの最低１個のアミノ酸残基を改変することにより形成されうるＴ−ｂｅｔの誘導体に関する。
【０１３２】
一態様において、Ｔ−ｂｅｔアゴニスト（模倣物）若しくはＴ−ｂｅｔアンタゴニストいずれかとして機能するＴ−ｂｅｔタンパク質のバリアントは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質の変異体、例えば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーをＴ−ｂｅｔタンパク質アゴニスト若しくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一態様において、Ｔ−ｂｅｔバリアントの多彩なライブラリーを核酸レベルのコンビナト
リアル突然変異誘発により生成し、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードさせる。Ｔ−ｂｅｔバリアントの多彩なライブラリーは、例えば、潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列の縮重組が個々のポリペプチドとして、若しくは、あるいは、その中にＴ−ｂｅｔ配列の組を含有するより一組の大きい融合タンパク質として（例えばファージディスプレイのため）発現可能であるような、遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的Ｔ−ｂｅｔバリアントのライブラリーを製造するのに使用し得る多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機で実施し得、そして合成遺伝子をその後適切な発現ベクターに連結し得る。遺伝子の縮重組の使用は、潜在的Ｔ−ｂｅｔ配列の所望の組をコードする配列の全部の１混合物での供給を見込む。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．、１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい）。
【０１３３】
加えて、Ｔ−ｂｅｔタンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを、Ｔ−ｂｅｔタンパク質のバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のためのＴ−ｂｅｔフラグメントの多彩な集団を生成するのに使用し得る。一態様において、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、ニッキングが分子あたり約１回のみ起こる条件下でＴ−ｂｅｔコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理すること、該二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生して多様なニックの入った生成物からのセンス／アンチセンス対を包含し得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより生成し得る。この方法により、多様な大きさのＴ−ｂｅｔタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１３４】
点突然変異若しくは切断により作成されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための数種の技術が当該技術分野で既知である。こうした技術は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合可能である。大型遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に従いやすい最も広範に使用される技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、ベクターの生じるライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を所望の活性の検出が容易にする条件下で該コンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技術、再帰的集団突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、Ｔ−ｂｅｔバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイと組合せで使用し得る（ＡｒｋｉｎとＹｏｕｒｖａｎ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１３５】
本発明はＴ−ｂｅｔ融合タンパク質もまた提供する。本明細書で使用されるところのＴ−ｂｅｔ「融合タンパク質」は、Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチドに効果的に連結されたＴ−ｂｅｔポリペプチドを含んでなる。「Ｔ−ｂｅｔポリペプチド」は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、若しくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特であるそれらのペプチドフラグメントを指す一方、「Ｔ−ｂｅｔ以外のポリペプチド」は、別のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク
質内で、「効果的に連結される」という用語は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドおよび他のポリペプチドが相互にインフレームで融合されていることを示すことを意図している。他のポリペプチドはＴ−ｂｅｔポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端に融合しうる。例えば、一態様において、融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質である。別の態様において、融合タンパク質は、Ｔ−ｂｅｔ配列がインフルエンザヘマグルチニンエピトープ標識にインフレームで融合されているような、Ｔ−ｂｅｔヌクレオチド配列がｐＣＥＰ４−ＨＡベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：３０６７−３０８２）のようなベクターに挿入されているＴ−ｂｅｔ−ＨＡ融合タンパク質である。こうした融合タンパク質は組換えＴ−ｂｅｔの精製を容易にし得る。
【０１３６】
好ましくは、本発明のＴ−ｂｅｔ融合タンパク質は標準的組換えＤＮＡ技術により製造する。例えば、多様なポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、慣習的技術に従って、例えば、連結のための平滑端若しくは付着端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、付着端の適切なとおりの充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用して、インフレームで一緒に連結する。別の態様において、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を包含する慣習的技術により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、その後アニーリングかつ再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成し得る２種の連続する遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実施し得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド若しくはＨＡエピトープ標識）を既にコードする多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｔ−ｂｅｔをコードする核酸は、融合部分がＴ−ｂｅｔタンパク質にインフレームで連結されるようなこうした発現ベクターにクローン化し得る。
【０１３７】
単離されたＴ−ｂｅｔタンパク質若しくはそのフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造のための標準的技術を使用して、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合する抗体を生成するための免疫原として使用し得る。該Ｔ−ｂｅｔタンパク質は抗体を生成するのに使用し得る。例えば、ポリクローナル抗血清は、完全長の組換えの細菌で産生されたＴ−ｂｅｔを免疫原として使用してウサギで製造し得る。この同一の免疫原を、マウスを免疫すること、および該免疫したマウスから脾細胞を取り出すことによりｍＡｂを製造するのに使用し得る。Ｔ−ｂｅｔに対する免疫応答を開始するマウスからの脾細胞を、骨髄腫細胞、例えばＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫に融合し得る。付随する例に記述されるとおり、本方法はＴ−ｂｅｔに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作成するのに使用した。一態様において、抗体は、Ｔ−ｂｅｔノックアウト動物のようなＴ−ｂｅｔを発現しない動物で製造し得る。別の態様において、抗体は例えば戻し交雑することにより達成されるところの特殊な遺伝的背景を有するヒト以外の動物で生成し得る。
【０１３８】
あるいは、Ｔ−ｂｅｔの抗原ペプチドフラグメントを免疫原として使用し得る。Ｔ−ｂｅｔの抗原ペプチドフラグメントは、典型的に、配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列の最低８アミノ酸残基を含んでなり、そして該ペプチドに対し生じられる抗体がＴ−ｂｅｔと特異的免疫複合体を形成するようなＴ−ｂｅｔのエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、最低１０アミノ酸残基、より好ましくは最低１５アミノ酸残基、なおより好ましくは最低２０アミノ酸残基、および最も好ましくは最低３０アミノ酸残基を含んでなる。該抗原ペプチドにより包含される好ましいエピトープは、該タンパク質の表面、例えば疎水性領域に配置されかつＴ−ｂｅｔに独特であるＴ−ｂｅｔの領域である。一態様において、こうしたエピトープは、マウス若しくはヒトのような１種からのＴ−ｂｅｔタンパク質に特異的であり得る（すなわち、種を横断して保存されないＴ−ｂｅｔの１領域にわたる抗原ペプチドを免疫原として使用し；こうした保存されない残基は、本明細書に提供されるもののようなアライメントを使用して決定し得る）。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の標準的疎水性分析を、疎水性領域を同定するのに実施し得る。
【０１３９】
Ｔ−ｂｅｔ免疫原は、典型的に、適する被験体、（例えばウサギ、ヤギ、マウス若しくは他の哺乳動物）を該免疫原で免疫することにより抗体を製造するのに使用する。適切な免疫原調製物は、例えば、組換え発現したＴ−ｂｅｔタンパク質若しくは化学合成したＴ−ｂｅｔペプチドを含有し得る。該調製物は、フロイントの完全若しくは不完全アジュバントのようなアジュバント、または類似の免疫刺激剤をさらに包含し得る。適する被験体の免疫原性Ｔ−ｂｅｔ調製物での免疫化は、ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体応答を誘導する。
【０１４０】
従って、本発明の別の局面は抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。ポリクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、適する被験体をＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫することにより上述されたとおり製造し得る。免疫した被験体での抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価を、固定したＴ−ｂｅｔを使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いるような標準的技術により時間にわたりモニターし得る。所望の場合は、Ｔ−ｂｅｔに向けられた抗体分子を哺乳動物から（例えば血液から）単離し得、そして、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製し得る。免疫化後適切な時間で、例えば抗Ｔ−ｂｅｔ抗体力価が最高である場合に、抗体産生細胞を被験体から得ることができ、そして、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）により元は記述されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５もまた参照されたい）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）若しくはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を製造するのに使用し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマの製造技術は公知である（全般として、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）中；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡潔には、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を、上述されたところのＴ−ｂｅｔ免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）に融合し、そして、生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、Ｔ−ｂｅｔに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１４１】
リンパ球および不死化細胞株を融合するのに使用される多くの公知のプロトコルのいずれも、抗Ｔ−ｂｅｔモノクローナル抗体を生成する目的上適用し得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、上で引用される；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、上で引用される；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、上で引用されるを参照されたい）。さらに、当業者は、また有用であるとみられるこうした方法の多くの変形物が存在することを認識するであろう。典型的には、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）はリンパ球と同一の哺乳動物種由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫したマウスからのリンパ球を不死化
マウス細胞株と融合することにより作成し得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株、例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３若しくはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株のいずれも、標準的技術に従って融合パートナーとして使用しうる。これらの骨髄腫株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビルから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合する。該融合から生じるハイブリドーマ細胞をその後、融合されないおよび非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択する（融合されない脾細胞は形質転換されないため、それらは数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｔ−ｂｅｔを結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出する。
【０１４２】
こうした方法を使用して、Ｔ−ｂｅｔに対する数種の抗体を生成した。モノクローナルおよびポリクローナル双方の抗体を完全長の組換えの細菌で産生されたＴ−ｂｅｔタンパク質に対し生成した。３Ｄ１０抗体はＩｇＧサブタイプのものであり、また、４Ｂ１０抗体はマウス脾細胞のＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫への融合により製造され、そしてＩｇＧサブタイプのものである。３９Ｄ抗体はヒトおよびマウス双方のＴ−ｂｅｔを認識する。
【０１４３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造する代わりに、モノクローナル抗Ｔ−ｂｅｔ抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）をＴ−ｂｅｔでスクリーニングしてそれによりＴ−ｂｅｔを結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより同定かつ単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成かつスクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａの組換えファージ抗体系、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングでの使用にとりわけ従いやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら  国際公開第ＷＯ  ９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら国際公開第ＷＯ  ９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら国際公開第ＷＯ  ９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら  国際公開第ＷＯ  ９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら国際公開第ＷＯ  ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  国際公開第ＷＯ  ９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄら国際公開第ＷＯ  ９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒら  国際公開第ＷＯ  ９０／０２８０９号明細書；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に見出し得る。
【０１４４】
加えて、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して作成し得るヒトおよびヒト以外の双方の部分を含んでなるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗Ｔ−ｂｅｔ抗体が本発明の範囲内にある。こうしたキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、
Ｒｏｂｉｎｓｏｎら  国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／００２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら欧州特許出願第１７３，４９４号；ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらＰＣＴ出願第ＷＯ  ８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら  米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記述される方法を使用する当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０１４５】
別の態様において、完全にヒトの抗体は、当該技術分野で既知である技術を使用して作成し得る。例えば、特定の１抗原に対する完全にヒトの抗体は、抗原曝露に応答してこうした抗体を産生するよう改変されたがしかしその内因性遺伝子座が無能にされているトランスジェニック動物に該抗原を投与することにより製造し得る。抗体を作成するのに使用し得る例示的技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号明細書に記述されている。他の技術は当該技術分野で既知である。
【０１４６】
抗Ｔ−ｂｅｔ抗体（例えばモノクローナル抗体）を、アフィニティークロマトグラフィー若しくは免疫沈降のような標準的技術によりＴ−ｂｅｔを単離するのに使用し得る。抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は、細胞からの天然のＴ−ｂｅｔおよび宿主細胞中で発現された組換え産生されたＴ−ｂｅｔの精製を容易にし得る。さらに、抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は（例えば細胞ライセート若しくは細胞上清中の）Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出するのに使用し得る。検出は、該抗体を検出可能な物質に結合（すなわち物理的に連結）することにより容易にしうる。従って、一態様において、本発明の抗Ｔ−ｂｅｔ抗体は検出可能な物質で標識される。検出可能な物質の例は、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質を包含する。適する酵素の例は、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適する補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適する蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド若しくはフィコエリトリンを包含し；発光物質の一例はルミノールを包含し；そして適する放射活性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ若しくは３Ｈを包含する。
【０１４７】
本発明のなお別の局面は、
（ａ）免疫原性のＴ−ｂｅｔタンパク質、若しくはＴ−ｂｅｔタンパク質に独特なその免疫原性部分で動物を免疫すること；および
（ｂ）Ｔ−ｂｅｔタンパク質に特異的に結合する抗体を動物から単離すること
を含んでなる方法により得ることができる抗Ｔ−ｂｅｔ抗体に関する。
【０１４８】
免疫化、および特異的抗Ｔ−ｂｅｔ抗体の回収方法はさらに上述されている。
【０１４９】
なお別の局面において、本発明はＴ−ｂｅｔ細胞内抗体に関する。細胞内抗体は、細胞の内側の標的、例えばＴ−ｂｅｔのような細胞内タンパク質に向けられる細胞内で発現される抗体構築物、通常は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である（Ｇｒａｕｓ−Ｐｏｒｔａ，Ｄ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（１）：１８２−９１）。例えば、細胞内抗体（例えば、およびｓｃＦｖ）は、可動性リンカーにより連結されかつ単一遺伝子から発現されるＨおよびＬ鎖の可変領域を含有し得る。ＨおよびＬ鎖の可変ドメインは、ｓｃＦｖの特異性を決定する親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、すなわち主抗原結合ドメインを含有する。ｓｃＦｖ遺伝子を細胞に移入し得、そこでｓｃＦｖタンパク質発現がその標的例えばＴ−ｂｅｔの特性を調節し得る。従って、一態様において、本発明は、例えば、細胞がそのためにこうした細胞内抗体を発現するよう改変されるｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｅｘ  ｖｉｖｏアプローチでの細胞中のＴ−ｂｅｔ活性を予防するためのこうしたＴ−ｂｅｔ細胞内抗体の使用方法を提供する。特定の一態様において、本発明のＴ−ｂｅｔ細胞内抗体はＴ−ｂｅｔ活性を直接阻害するのに使用し得る。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ細胞内抗体は、Ｔ−ｂｅｔおよびＴ−ｂｅｔが相互作用するタンパク質の相互作用を阻害するのに使用し得る。従って、本発明のＴ−ｂｅｔ細胞内抗体は、Ｔ−ｂｅｔが関与するシグナル伝達経路の調節において有用である。
【０１５０】
Ｔ−ｂｅｔ細胞内抗体は当該技術分野で既知の技術を使用して製造し得る。例えば、ファージディスプレイ技術はライブラリーからｓｃＦｖを単離するのに使用し得る（Ｌｏｗｍａｎ，ＨＢら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０（１０）：８３２−８）。特定の１抗原に結合するｓｃＦｖを選択するため、ｓｃＦｖをコートタンパク質、典型的には線維状Ｍ１３ファージのｐＩＩＩ（ｇ３ｐ）に融合する。固定した抗原を結合するファージ上のｓｃＦｖが、結合、溶出および増幅の連続周期の間に濃縮される。別の例において、リボソームディスプレイを、Ｔ−ｂｅｔ細胞内抗体を製造するのに使用し得る（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４（１）：９３７−４４）。リボソームディスプレイは、ペプチドを遺伝情報（ｍＲＮＡ）に直接結びつけるｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。ｓｃＦｖ  ＣＤＮＡライブラリーを、転写翻訳系を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させる。翻訳されたＳｃＦｖを、コードするｍＲＮＡに連結したリボソームに止める。ｓｃＦｖをその後、固定した抗原に結合させ、そして非特異的リボソーム複合体を徹底的な洗浄により除去する。残存する複合体を溶出し、そしてＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、そしてその後ＰＣＲにより再増幅する。なお別の例において、タンパク質フラグメント補完アッセイ（ＰＣＡ）を、本発明のＴ−ｂｅｔ細胞内抗体を製造するのに使用し得る（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，ＪＮら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５（１２）：１４１−６．）これは、マウスタンパク質（ｍＤＨＦＲ）による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での変異体ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の補完に基づく細胞選択手順である。マウスＤＨＦＲを、潜在的に相互作用するペプチドとの融合タンパク質として発現させる２部分に分離する。融合タンパク質の相互作用がｍＤＨＦＲの酵素活性、および従って細菌の増殖を復帰させる。抗体および抗原の特異的相互作用のみがＤＨＦＲの機能の補完を可能にし、それはｓｃＦｖの選択に従いやすい系を作成する（Ｍｏｓｓｎｅｒ，Ｅ．ら（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８：１１５−２２）。
【０１５１】
ＩＶ．本発明の方法
Ａ．Ｔ−ｂｅｔ組成物の検出
本発明の別の局面は、本発明の多様なＴ−ｂｅｔ組成物の使用方法に関する。例えば、本発明は、生物学的サンプル中のＴ−ｂｅｔ活性の存在の検出方法を提供する。該方法は、Ｔ−ｂｅｔ活性の存在が生物学的サンプル中で検出されるような、Ｔ−ｂｅｔタンパク質若しくはＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡのようなＴ−ｂｅｔ活性を検出することが可能な剤と生物学的サンプルを接触させることを必要とする。
【０１５２】
Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡを検出するための好ましい剤は、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な標識核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、長さが最低約５００、６００、８００、９００、１０００、１２００、１４００若しくは１６００ヌクレオチドかつストリンジェントな条件下でＴ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのような配列番号１若しくは３のＴ−ｂｅｔ  ＤＮＡであり得る。
【０１５３】
Ｔ−ｂｅｔタンパク質を検出するための好ましい剤は、Ｔ−ｂｅｔタンパク質に結合することが可能な標識抗体である。抗体はポリクローナル、若しくはより好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはそのフラグメント（例えばＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２）を使用し得る。プローブ若しくは抗体に関する「標識」という用語は、検出可能な物質をプローブ若しくは抗体に結合（すなわち物理的に連結）することによるプローブ若しくは抗体の直接標識、ならびに直接標識されている別の試薬との反応性によるプローブ若しくは抗体の間接的標識を包含することを意図している。間接的標識の例は、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンでそれを検出し得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を包含する。「生物学的サンプル」という用語は組織、細胞および生物学的液体を包含することを意図している。例えば、Ｔ−ｂｅｔ  ｍＲＮＡの検出のための技術はノーザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する。Ｔ−ｂｅｔタンパク質の検出のための技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。
【０１５４】
Ｂ．スクリーニング法
本発明は、さらに、Ｔ−ｂｅｔの存在下でのＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングおよび／若しくは血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節、例えば増大若しくは減少する化合物、すなわち候補若しくは試験化合物若しくは剤（例えばペプチド模倣物、小分子若しくは他の薬物）の同定方法を提供する。Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングおよび／若しくは血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着の調節物質は既知であり得る（例えば、Ｔ−ｂｅｔ活性のドミナントネガティブな阻害剤、アンチセンスＴ−ｂｅｔ、Ｔ−ｂｅｔ活性を妨害する細胞内抗体、Ｔ−ｂｅｔ由来のペプチド阻害剤）か、または本明細書に記述される方法を使用して同定され得、例えば、（本明細書に記述されるところの）Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性、Ｔ−ｂｅｔプロセシング、Ｔ−ｂｅｔ翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化若しくはリン酸化）に対する刺激若しくは阻害効果を有し得るか；またはＴ−ｂｅｔ標的分子の発現、プロセシング若しくは活性に対する刺激若しくは阻害効果を有し得る。
【０１５５】
例えば、一態様において、Ｔ−ｂｅｔの存在下でＰ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１の相互作用、例えば結合を調節する分子を同定し得る。例えば、ＴＰＳＴ−２はＰＳＧＬ−１をチロシンスルホン化し（Ｐ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１の相互作用に必要な翻訳後修飾）、そして従ってこれらの分子のいずれも主題のスクリーニングアッセイで使用し得る。本節の下および他節に記述される特定の態様はこれらの分子の１種を一例として列挙しうるとは言え、Ｔ−ｂｅｔと相互作用しかつ／若しくはＴ−ｂｅｔが関わるシグナル伝達経路に関与する他の分子もまた、主題のスクリーニングアッセイで使用し得る。
【０１５６】
一態様において、Ｔ−ｂｅｔの存在下で相互作用、例えばＰ−セレクチンおよびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）を調節する分子を同定し得る。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの存在下で血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の能力を同定する。なお態様において、Ｔ−ｂｅｔの存在下でのＰ−セレクチンとＰＳＧＬ−１の間の複合体の形成を直接調節、例えば増大すなわち安定化、または減少すなわち不安定化する化合物の能力を測定する。他の態様において、ＰＳＧＬ−１の翻訳後修
飾（例えばチロシン硫酸化）、またはＴ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性を、本発明のスクリーニングアッセイを使用して測定する。なお別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性を、Ｔ−ｂｅｔに応答性の遺伝子の調節領域へのＴ−ｂｅｔの結合を測定することにより測定する。一態様において、Ｔ−ｂｅｔに対する遺伝子例えばＣＸＣＲ３、ＴＰＳＴ−２の応答を、該遺伝子の発現を測定することにより測定する。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性を、Ｔ細胞の走化性および／若しくは内皮細胞上のＶＣＡＭ−１へのＴ細胞のβ−インテグリン依存性の結合を測定することにより測定する。
【０１５７】
本発明のスクリーニングアッセイは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質、またはＴ−ｂｅｔ若しくはＴ−ｂｅｔが関わるシグナル伝達経路中の分子と相互作用する分子を発現する細胞、例えば天然に発現する細胞、若しくは、より好ましくは該タンパク質をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより該タンパク質を発現するよう工作された細胞を使用して実施し得る。好ましくは細胞は哺乳動物細胞、例えばヒト細胞である。一態様において、細胞はＴ細胞である。好ましい一態様において、細胞Ｔｈ１細胞。あるいは、スクリーニングアッセイを、該タンパク質を包含する細胞を含まない組成物（例えば、例えば精製した天然若しくは組換えいずれかのタンパク質を包含する細胞抽出液若しくは組成物）中で実施し得る。
【０１５８】
Ｔ細胞のＰ−セレクチン媒介性のローリングを調節する化合物の能力は、例えばＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化を測定することにより決定し得る。例えば、ＰＳＧＬ−１の翻訳後修飾、例えばチロシンスルホン化は、３５Ｓ−硫酸の存在下で増殖させた細胞から目的のタンパク質を免疫沈降すること、およびオートラジオグラフィーにより可視化することにより測定し得る。Ｔ細胞のＰ−セレクチン媒介性のローリングを調節する化合物の能力は、例えば、例えばリアルタイムＰＣＲによりチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−２（ＴＰＳＴ−２）の発現および／若しくは活性を測定することによってもまた決定し得る。例えば、ＴＰＳＴ−２は、ＰＳＧＬ−１のような標的分子をスルホン化、例えばチロシンスルホン化するスルホトランスフェラーゼである（ＰＳＧＬ−１機能、例えばＴ−ｂｅｔの存在下でのＰ−セレクチンへの結合に必要でありかつ従ってＴ細胞のＰ−セレクチン媒介性のローリングに必要である翻訳後修飾）。血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の能力は、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性の調節についてアッセイすることにより決定し得る。例えば、本明細書に記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔはケモカイン受容体ＣＸＣＲ３の発現に必要とされ、そして、ＣＸＣＲ３の発現はリアルタイムＰＣＲにより測定し得るか、若しくは、あるいは、ＣＸＣＲ３の発現はトランスウェル走化性アッセイを使用することにより測定し得る。血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の能力は、内皮細胞上のＶＣＡＭ−１へのＴ細胞のβ−インテグリン依存性の結合を測定するためのトランスウェルアッセイで、未刺激の心内皮細胞のような適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞モデルでの内皮細胞へのＴ細胞の結合を測定することによってもまた測定し得る。一態様において、炎症の部位へのＴ細胞の動員を調節する化合物の能力は、例えば、例えば養子移入アッセイを使用しかつ動物の多様な場所での細胞の数および型を決定するためのＦＡＣｓ分析によりアッセイする、例えばＴ−ｂｅｔトランスジェニック動物、ＩＦＮ−γトランスジェニック動物若しくはそれらからの細胞のような適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏモデルの使用により測定し得る。
【０１５９】
加えて、Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性を調節する化合物の能力は、例えばＴ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性を測定することによってもまた決定し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔは転写因子であり、そして従ってＤＮＡに結合しかつ遺伝子、例えばサイトカイン遺伝子の発現を調節する能力を有する。従って、本発明のスクリーニング方法の特定の態様は、ＤＮＡ若しくは他の標的分子に結合する；（例えばＧＡＴＡ３、ＴｅｃキナーゼまたはＩＬ−２若しくはＩＦＮ−γプロモーター）；遺伝子発現を調節する（例えば、例えばＩＬ−２遺伝子を抑制すること、ＩＦＮ−γ遺伝子をトランス活性化することによりＴｈ１関
連サイトカイン遺伝子の発現を調節する、あるいは、（例えばＤＮＡに結合するＧＡＴＡ３の能力を低下させることにより）Ｔｈ２関連サイトカイン遺伝子、例えばＩＬ−４遺伝子若しくはＩＬ−１０遺伝子の発現を調節する、あるいは（例えばＴＧＦ−β若しくはＴＬＲ６のようなＴｏｌｌ様受容体遺伝子を抑制することにより）他の遺伝子の発現を調節する）、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの能力を活用する。
【０１６０】
一態様において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドに結合するか；Ｔ−ｂｅｔ発現；Ｔ−ｂｅｔプロセシング；Ｔ−ｂｅｔ翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ユビキチン化若しくはリン酸化）；またはＴ−ｂｅｔ活性に対する刺激若しくは阻害効果を有するか；あるいは、Ｔ−ｂｅｔ結合パートナー若しくは標的分子の発現、プロセシング若しくは活性に対する刺激若しくは阻害効果を有する調節物質、すなわち候補若しくは試験化合物若しくは剤（例えば、酵素、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、リボザイム、若しくはＴ−ｂｅｔアンチセンス分子）の同定方法を提供する。
【０１６１】
好ましい一態様において、本発明は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）分子のＰ−セレクチンとの相互作用を可能にする条件下で、Ｔ−ｂｅｔ、Ｐ−セレクチン分子およびＰＳＧＬ−１分子を化合物の存在下で接触させること；ならびにＰ−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１分子の相互作用を検出することを含んでなる、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングを調節する化合物の同定方法を特徴とし、Ｔ細胞ローリングを阻害する化合物の能力は、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の低減により示され、また、Ｔ細胞ローリングを高める化合物の能力は、該化合物の非存在下での相互作用の量に比較しての相互作用の増大により示される。
【０１６２】
別の好ましい態様において、本発明は、
ａ）Ｔ細胞を試験化合物と接触させること；
ｂ）前記試験化合物の存在下でＴ−ｂｅｔの生物学的活性の調節をアッセイすること
を含んでなる、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を調節する化合物の同定方法を特徴とし、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の減少が、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を阻害する化合物と同定し、また、該化合物によるＴ−ｂｅｔの生物学的活性の増大は、該試験化合物を血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着を高める化合物と同定する。
【０１６３】
本明細書に記述されるアッセイを使用して同定される化合物は、異常なＴ−ｂｅｔ発現、プロセシング、翻訳後修飾、若しくは活性、異常なＰ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリング、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着、炎症の部位へのＴ細胞の動員、Ｔ細胞系譜分化、サイトカインの産生、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路、ＩｇＧクラススイッチ、および異常なＢリンパ球機能と関連する障害を処置するのに有用でありうる。
【０１６４】
一態様において、主題のスクリーニングアッセイは他の剤の存在若しくは非存在下で実施し得る。例えば、主題のアッセイは、ＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ１１のような存在多様なケモカインリガンドで実施し得る。スクリーニングされている細胞の活性化状態を調節する剤もまた包含し得る。例えば、一態様において、Ｔ細胞受容体を介してシグナルを伝達する剤を包含する。別の態様において、サイトカイン若しくはサイトカイン受容体に対する抗体を包含する。別の態様において、硫酸化、例えばチロシン硫酸化を阻害する剤もまた包含し得る。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、本明細書に記述されるアッセイの２種若しくはそれ以上の組合せに関する。例えば、調節剤を、細胞に基づく若しくは細胞を含まないアッセイを使用して同定し得、そして、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリング、血管内皮細胞へ
のＴ細胞の安定な接着、および／若しくは炎症の部位へのＴ細胞の動員を調節する該剤の能力を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば多発性硬化症（ＥＡＥ）、関節リウマチ若しくは感染症の動物モデルのような動物で確認し得る。
【０１６６】
さらに、本明細書に記述されるとおり同定された、Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリング、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着、および／若しくは炎症の部位へのＴ細胞の動員の調節物質（例えば、ドミナントネガティブなＴ−ｂｅｔ分子、Ｔ−ｂｅｔ核酸若しくはポリペプチド分子、アンチセンスＴ−ｂｅｔ核酸分子、Ｔ−ｂｅｔ特異的抗体、または小分子）を、こうした調節物質での処置の有効性、毒性若しくは副作用を決定するために動物モデルで使用し得る。あるいは、本明細書に記述されるとおり同定される調節物質を、こうした調節物質の作用機序を決定するために動物モデルで使用し得る。
【０１６７】
別の態様において、類似のスクリーニングアッセイを、例えば、上述されたもののようなスクリーニングアッセイを実施するがしかしＴ−ｂｅｔが相互作用する分子、すなわちＴｅｃキナーゼのようなシグナル伝達経路中でＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流いずれかで作用する分子を使用することにより、Ｔ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性を間接的に調節する化合物を同定するのに使用し得る。
【０１６８】
本発明の細胞に基づくおよび細胞を含まないアッセイを下により詳細に記述する。
ｉ．細胞に基づくアッセイ
本発明のスクリーニングアッセイは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド（および／またはＰ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、β−インテグリン、ＶＣＡＭ−１のような１種若しくはそれ以上のＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチド）を発現する細胞、例えば、内因性Ｔ−ｂｅｔを天然に発現する細胞、若しくは、より好ましくは、外因性Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入することにより該ポリペプチドを発現するよう工作された細胞で実施し得る。あるいは、指標組成物は、Ｔ−ｂｅｔ、および／またはＰ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、β−インテグリン、ＶＣＡＭ−１のような１種若しくはそれ以上のＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドを包含する細胞を含まない組成物（例えばＴ−ｂｅｔを発現する細胞からの細胞抽出液、または精製されたＴ−ｂｅｔ（天然若しくは組換えいずれかのポリペプチド）を包含する組成物）であり得る。
【０１６９】
Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリング、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着、および／若しくは炎症の部位へのＴ細胞の動員を調節する化合物は、多様な「読み出し」を使用して同定し得る。
【０１７０】
例えば、指標細胞を、Ｔ−ｂｅｔ発現ベクターでトランスフェクトし得、試験化合物の存在および非存在下でインキュベートし得、そして該分子の発現若しくはＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答に対する該化合物の影響を測定し得る。Ｔ−ｂｅｔの生物学的活性は、標準的技術に従ってｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定される活性を包含する。Ｔ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔの標的分子（例えば、サイトカイン遺伝子の転写調節領域のようなＴ−ｂｅｔが結合する核酸分子とのＴ−ｂｅｔの会合のような直接活性であり得る。Ｔ−ｂｅｔ活性は、ケモカイン遺伝子例えばＣＸＣＲ３若しくはＴＰＳＴ−２のような遺伝子の発現、または、例えばＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化のような標的遺伝子の翻訳後修飾に対するＴ−ｂｅｔの要求でもまたあり得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ活性は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドのＴ−ｂｅｔ標的分子との相互作用の下流で発生する細胞のシグナル伝達活性、若しくはその相互作用により誘発されるシグナル伝達カスケードの結果として発生する生物学的効果のような下流の活性である。例えば、本明細書で記述されるＴ−ｂｅｔの生物学的活性は：Ｐ−セレクチン媒介性のＴ細胞ローリングの調節、血管内皮細胞へのＴ細胞の安定な接着の調節、炎症の部位へのＴ細胞の動員の調節、Ｔ細胞系譜分化の調節（例えば直接調節する）、サイトカインの産生を調節すること、ＴＧＦ−β媒介性シグナル伝達を調節すること、Ｊａｋ１／ＳＴＡＴ−１経路を調節すること、ＩｇＧクラススイッチを調節すること、およびＢリンパ球の機能を調節することを包含する。Ｔ−ｂｅｔの多様な生物学的活性は、当該技術分野で既知である技術を使用して測定し得る。例示的技術は実施例により詳細に記述する。
【０１７１】
試験化合物がＴ−ｂｅｔ発現を調節するかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイを実施し得る。こうしたアッセイを実施するため、Ｔ−ｂｅｔの完全長のプロモーターおよびエンハンサーを、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）若しくはルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子に作動可能に連結し得、そして宿主細胞に導入し得る。
【０１７２】
本明細書で互換性に使用されるところの「作動可能に連結される」および「効果的に連結される」という用語は、ヌクレオチド配列が、宿主細胞中の（若しくは細胞抽出液による）該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味することを意図している。制御配列は技術に認識されており、そして適切な宿主細胞中で所望のポリペプチドの発現を指図するように選択し得る。制御配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよび他の発現調節領域を包含することを意図している。こうした制御配列は当業者に既知であり、そして、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に記述されている。発現ベクターの設計は、トランスフェクトされるべき宿主細胞の選択ならびに／または発現されるべき所望のポリペプチドの型および／若しくは量のような因子に依存しうることが理解されるべきである。
【０１７３】
多様なレポーター遺伝子が当該技術分野で既知であり、そして本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適する。適するレポーター遺伝子の例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ若しくはルシフェラーゼをコードするものを包含する。これらの遺伝子産物の活性の標準的測定方法は当該技術分野で既知である。
【０１７４】
多用な細胞型が、スクリーニングアッセイでの指標細胞としての使用に適する。好ましくは、Ｔｈ１細胞クローン、若しくはノックアウト動物、例えばＴ−ｂｅｔノックアウト動物からの細胞のような、Ｔ−ｂｅｔを通常は発現しない細胞株を使用する。ＨｅｐＧ２肝癌細胞株のようなリンパ系以外の細胞株もまた指標細胞として使用し得る。酵母細胞もまた指標細胞として使用し得る。
【０１７５】
本アッセイで使用される細胞は、起源が真核生物若しくは原核生物であり得る。例えば、一態様において、細胞は細菌細胞である。別の態様において、細胞は真菌細胞、例えば酵母細胞である。別の態様において、細胞は脊椎動物細胞、例えばトリ若しくは哺乳動物細胞である。好ましい一態様において、細胞はヒト細胞である。
【０１７６】
一態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での該指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより高く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を刺激する化合物と同定される。別の態様において、試験化合物の存在下での指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルは、試験化合物の非存在下での該指標細胞中のレポーター遺伝子の発現のレベルより低く、そして該試験化合物はＴ−ｂｅｔの発現を阻害する化合物と同定される。
【０１７７】
一態様において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔが関与する細胞応答を調節する化合物の同定方
法を提供する。
【０１７８】
標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する、若しくはＴ−ｂｅｔに結合する試験化合物の能力もまた決定し得る。標的分子（例えば結合パートナー）へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、Ｔ−ｂｅｔ標的分子のＴ−ｂｅｔへの結合が複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ標的分子を検出することにより測定され得るような放射性同位元素、酵素若しくは蛍光標識とＴ−ｂｅｔ標的分子を結合することにより達成し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔを、複合体中のＴ−ｂｅｔ標的分子へのＴ−ｂｅｔ結合を調節する試験化合物の能力をモニターするために、放射性同位元素、酵素若しくは蛍光標識と結合し得る。Ｔ−ｂｅｔを結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、Ｔ−ｂｅｔへの化合物の結合が複合体中の標識Ｔ−ｂｅｔ化合物を検出することにより測定され得るような放射性同位元素、酵素若しくは蛍光標識と化合物を結合することにより達成し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ標的は１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ若しくは３Ｈで直接若しくは間接的にのいずれかで標識し得、そして、放射性同位元素を放射線放射（ｒａｄｉｏｅｍｉｓｓｉｏｎ）の直接計数若しくはシンチレーション計数により検出し得る。あるいは、化合物を例えばワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ若しくはルシフェラーゼで酵素標識し得、そして、該酵素標識を適切な基質の生成物への転化の測定により検出し得る。
【０１７９】
Ｔ−ｂｅｔと相互作用する化合物の能力を相互作用体のいずれの標識も伴わずに決定することもまた本発明の範囲内にある。例えば、微小生理学測定装置（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を、化合物若しくはＴ−ｂｅｔいずれの標識も伴わずにＴ−ｂｅｔとの化合物の相互作用を検出するのに使用し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書で使用されるところの「微小生理学測定装置」（例えばサイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ））は、光を取扱可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を、化合物とＴ−ｂｅｔの間の相互作用の指標として使用し得る。
【０１８０】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用する、Ｔ−ｂｅｔが関わる経路中で作用する異なる（すなわちＴ−ｂｅｔ以外の）分子を、スクリーニングアッセイでの使用のための指標組成物に包含し得る。こうした分子を使用するスクリーニングアッセイで同定される化合物もまた、間接的であってもＴ−ｂｅｔ活性の調節において有用であるとみられる。Ｔ−ｂｅｔが相互作用する例示的一分子はＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１を包含する。
【０１８１】
本発明の細胞は、内因性Ｔ−ｂｅｔ（若しくはＴ−ｂｅｔが関わるシグナル伝達経路中の別のポリペプチド）を発現し得るか、若しくはそうするよう工作しうる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用するＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドを発現するよう工作されている細胞は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用するＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドをコードする発現ベクターを細胞に導入することにより製造し得る。
【０１８２】
指標細胞中でのＴ−ｂｅｔポリペプチドまたはＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用するＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドの発現に使用し得る組換え発現ベクターは当該技術分野で既知である。一態様において、発現ベクター内で、Ｔ−ｂｅｔのコーディング配列を、指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導可能な若しくは構成的発現を見込む制御配列に効果的に連結する（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーのようなウイルスの制御配列を使用し得る）。指標細胞中でのＴ−ｂｅｔの誘導可能な若しくは構成的発現を見込む組換え発現ベクターの使用は、Ｔ−ｂｅｔの活性を高める若しくは阻害する化合
物の同定に好ましい。代替の一態様において、発現ベクター内で、Ｔ−ｂｅｔのコーディング配列を、内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の制御配列（すなわち内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子由来のプロモーター調節領域）に効果的に連結する。Ｔ−ｂｅｔ発現が内因性制御配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、Ｔ−ｂｅｔの転写発現を高める若しくは阻害する化合物の同定に好ましい。
【０１８３】
Ｔｈ１関連サイトカイン遺伝子を（例えばＴ−ｂｅｔ活性を評価するためのレポーター遺伝子若しくは読み出しとして）利用する方法において、好ましくは、Ｔｈ１関連サイトカインはインターフェロン−γ若しくはＩＬ−２である。付随する実施例で記述されるとおり、Ｔ−ｂｅｔを、ＩＬ−２プロモーターに結合するその能力に基づき酵母１ハイブリッドスクリーニングアッセイで単離した。従って、一態様において、本発明の方法は、近位ＩＬ−２プロモーターのこの領域、最も好ましくはＩＬ−２プロモーターのヌクレオチド−２４０ないし−２２０を含有するレポーター遺伝子構築物を利用する。使用し得る他の配列は：コンセンサスＴボックス部位、ヒトＩＬ−２プロモーター、マウスＩＬ−２プロモーター、ヒトＩＦＮ−γイントロンＩＩＩ、マウスＩＦＮ−γ近位プロモーター中の２個の結合部位を包含する（Ｓｚａｂｏら  ２０００．Ｃｅｌｌ  １００：６５５−６６９）。
【０１８４】
一態様において、誘導可能な系を構築しかつＴ−ｂｅｔの発現および／若しくは活性に影響を及ぼす標的化合物を同定かつ特徴付けるためのハイスループットの細胞に基づくスクリーニングで使用し得る。誘導可能な系は、例えば、エクダイソンに駆動されるＴ−ｂｅｔ発現プラスミドとコトランスフェクトしたエクダイソン受容体およびＩＦＮ−γプロモータールシフェラーゼレポーターを発現する接着性２９３Ｔヒト胎児由来腎臓細胞株のサブクローンを使用することにより、通常はＩＦＮ−γを産生しない細胞株を使用して構築し得る。（Ｗａｋｉｔａら２００１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：４１４；Ｎｏら  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：３３４６；Ｇｒａｈａｍ．２００２  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：５２５）。昆虫ホルモンエクダイソンでの処理に際し、Ｔ−ｂｅｔが発現され、ＩＦＮ−γレポーターが活性化され、そしてルシフェラーゼ活性が生成される。この系で、Ｔ−ｂｅｔは内因性ＩＦＮ−γを産生する能力を細胞株に賦与する。
【０１８５】
ｉｉ．細胞を含まないアッセイ
別の態様において、スクリーニングアッセイは細胞を含まない組成物中で実施する。宿主細胞若しくは培地中の組換え法により発現されたＴ−ｂｅｔ、またはＴ−ｂｅｔが関わる経路中でＴ−ｂｅｔの上流若しくは下流で作用するＴ−ｂｅｔ以外のポリペプチドを、細胞を含まない組成物中で使用し得るタンパク質を製造するために、標準的なポリペプチド精製方法を使用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＴ−ｂｅｔに特異的な抗体を用いる免疫親和性精製により、宿主細胞若しくは細胞培地から単離し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ若しくはＴ−ｂｅｔ以外を発現する細胞の抽出液を、細胞を含まない組成物としての使用のため製造し得る。
【０１８６】
一態様において、Ｔ−ｂｅｔ活性を特異的に調節する化合物を、Ｔ−ｂｅｔが結合する標的分子とのＴ−ｂｅｔの相互作用を調節するそれらの能力に基づき同定する。標的分子は、ＤＮＡ分子、例えばサイトカイン遺伝子の調節領域のようなＴ−ｂｅｔ応答エレメント）、若しくはポリペプチド分子であり得る。タンパク質−タンパク質相互作用の検出を見込む（例えば免疫沈降、蛍光分極若しくはエネルギー転移、２ハイブリッドアッセイなど）、または標的ＤＮＡ配列とＤＮＡ結合タンパク質の間の相互作用の検出を見込む（例えば電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮアーゼＩフットプリントアッセイなど）適する
アッセイが当該技術分野で既知である。試験化合物の存在および非存在下でこうしたアッセイを実施することにより、これらのアッセイを、標的分子とのＴ−ｂｅｔの相互作用を調節する（例えば阻害する若しくは高める）化合物を同定するのに使用し得る。
【０１８７】
一態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の非存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より大きく、この場合は該試験化合物をＴ−ｂｅｔの結合を高めるすなわち安定化する化合物と同定する。別の態様において、試験化合物の存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量は、試験化合物の非存在下での標的分子へのＴ−ｂｅｔの結合の量より小さく、この場合は該試験化合物をＴ−ｂｅｔの結合を阻害すなわち不安定化する化合物と同定する。
【０１８８】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドへの試験化合物の結合は、上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれでも測定し得る。試験化合物に結合するＴ−ｂｅｔポリペプチドの能力を決定することは、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．とＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を使用してもまた達成し得る。本明細書で使用されるところの「ＢＩＡ」は、相互反応体のいずれも標識することなく生物特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化を、生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用し得る。
【０１８９】
Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用を調節する試験化合物の本発明の同定方法において、完全長のＴ−ｂｅｔポリペプチドを該方法で使用しうるか、若しくは、あるいは、Ｔ−ｂｅｔの１個若しくはそれ以上の部分を含んでなるポリペプチドを使用しうる。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用の程度は、例えば、ポリペプチドの一方を検出可能な物質（例えば放射標識）で標識すること、標識されないポリペプチドを単離すること、および標識されないポリペプチドと会合された検出可能な物質の量を定量することにより、決定し得る。該アッセイは、Ｔ−ｂｅｔタンパク質と標的分子の間の相互作用を刺激若しくは阻害のいずれかをする試験化合物を同定するのに使用し得る。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用を刺激する試験化合物は、試験化合物の非存在下での相互作用の程度と比較してＴ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用の程度を増大させるその能力に基づいて同定する。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用を阻害する試験化合物は、該化合物の非存在下での相互作用の程度と比較してＴ−ｂｅｔポリペプチドと標的分子の間の相互作用の程度を低下させるその能力に基づいて同定する。
【０１９０】
本発明の上のアッセイ方法の一以上の態様において、Ｔ−ｂｅｔ若しくはＴ−ｂｅｔ標的分子すなわちキナーゼのいずれかを、例えば該ポリペプチドの一方若しくは双方の複合体形成した形態の複合体形成していない形態からの分離を容易にするため、若しくはアッセイの自動化を適応するために固定することが望ましいかもしれない。Ｔ−ｂｅｔポリペプチドへの試験化合物の結合、若しくは試験化合物の存在および非存在下でのＴ−ｂｅｔ標的分子とのＴ−ｂｅｔポリペプチドの相互作用は、反応体を含有するのに適するいかなる容器中でも達成し得る。こうした容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管を包含する。一態様において、ポリペプチドの一方若しくは双方がマトリックスに結合されることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｔ−ｂｅｔ融合タンパク質若しくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）若しくはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ得、それをその後試験化合物、または試験化合物および未吸着の標的ポリペプチド若しくはＴ−ｂｅｔポリペプチドのいずれ
かと組合せ、そして該混合物を複合体形成に伝導性の条件下で（例えば塩およびｐＨについて生理学的条件で）インキュベートする。インキュベーション後にビーズ若しくはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄していかなる未結合の成分も除去し、ビーズの場合はマトリックスを固定し、そして、複合体形成を例えば上述されたとおり直接若しくは間接的にのいずれかで測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして標準的技術を使用してＴ−ｂｅｔの結合若しくは活性のレベルを測定し得る。
【０１９１】
マトリックス上にポリペプチドを固定するための他の技術もまた本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド若しくはＴ−ｂｅｔ標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの複合を利用して固定し得る。ビオチニル化したＴ−ｂｅｔポリペプチド若しくは標的分子を、当該技術分野で既知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォード）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から製造し得、そして、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド若しくは標的分子と反応性であるがしかしＴ−ｂｅｔポリペプチドのその標的分子への結合を妨害しない抗体を、プレートのウェルに誘導体化し得、そして未結合の標的若しくはＴ−ｂｅｔポリペプチドを抗体複合によりウェル中で捕捉する。ＧＳＴ固定した複合体について上述されたものに加えてのこうした複合体の検出方法は、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド若しくは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＴ−ｂｅｔポリペプチド若しくは標的分子と関連する酵素活性を検出することに頼る酵素結合アッセイを包含する。
【０１９２】
本発明のなお別の局面において、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド若しくはそのフラグメントは、Ｔ−ｂｅｔに結合若しくはそれと相互作用し（「Ｔ−ｂｅｔ結合タンパク質」若しくは「Ｔ−ｂｅｔ」）かつＴ−ｂｅｔ活性に関与する他のタンパク質を同定するため、２ハイブリッドアッセイ若しくは３ハイブリッドアッセイの「バイトタンパク質」として使用し得る（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号明細書；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  第ＷＯ  ９４／１０３００号明細書を参照されたい）。こうしたＴ−ｂｅｔ結合タンパク質はまた、Ｔ−ｂｅｔポリペプチド、若しくは例えばＴ−ｂｅｔ媒介性のシグナル伝達経路の下流の要素のようなＴ−ｂｅｔの標的によるシグナルの伝播に関与することもありそうである。あるいは、こうしたＴ−ｂｅｔ結合ポリペプチドはＴ−ｂｅｔ阻害剤であることがありそうである。
【０１９３】
２ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインよりなる大部分の転写因子のモジュールの性質に基づく。簡潔には、該アッセイは２種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物中で、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドをコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他方の構築物中では、同定されていないタンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーからの１ＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「バイト」および「プレイ」タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用してＴ−ｂｅｔ依存性複合体を形成することが可能である場合、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは緊密な近接にもたらされる。この近接は、転写因子に応答する転写調節部位に作動可能に連結されているレポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し得、そして、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し得、そして、Ｔ−ｂｅｔポリペプチドと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化された遺伝子を得るのに使用し得る。
【０１９４】
別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的遺伝子を単離するための発現差解析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）およびマイクロチップＤＮＡアレイ分析。例えば、ディファレンシャルディスプレイ、または、サブトラクトした若しくはサブトラクトしていないプローブを使用するＰＣＲと結合したサブトラクション法（ＲＤＡ；例えば、Ｈｕｂａｎｋ，Ｍ．とＳｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｇ．１９９４．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２、５６４０−５６４８；Ｃｈａｎｇ，Ｙ．ら１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、１８６５；ｖｏｎ  Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．Ｄ．ら１９９７．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５、２５９８；Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎ．とＷｉｇｌｅｒ，Ｍ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９、９４６を参照されたい）、若しくは、最も最近は、ＤＮＡマイクロチップアレイハイブリダイゼーション（Ｗｅｌｆｏｒｄら１９９８．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：３０５９）を使用し得る。こうしたアッセイの実施においては、多様な細胞を使用し得、例えば正常細胞、Ｔ−ｂｅｔを発現するよう工作された細胞、またはＴ−ｂｅｔを欠くか若しくはＴ−ｂｅｔを過剰発現するマウスから（例えばトランスジェニックのヒト以外の動物から）の細胞を使用し得る。
【０１９５】
なお別の態様において、Ｔ−ｂｅｔ標的タンパク質を記述するためのプロテオミクスのアプローチを実施し得る。例えば、サブトラクティブ分析、発現パターンの分析、タンパク質レベルでの遺伝子型変動の同定、ならびに翻訳後修飾のタンパク質の同定および検出を、例えばＷａｎｇら（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：２９１−３０６；Ｌｕｂｍａｎら（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８２（１−２）：１８３−９６；およびＲａｉら（２００２）Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２６（１２）：１５１８−２６に記述されるとおり実施し得る。
【０１９６】
Ｃ．Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞を使用するアッセイ
別の態様において、本発明は、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞を使用する、Ｔ−ｂｅｔの生物学的効果を調節する化合物の同定方法を提供する。本明細書に記述されるとおり、（例えばＴ−ｂｅｔ遺伝子の破壊により）Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞は、ＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化およびチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−１（ＴＰＳＰ−１）発現の低下、ならびにＣＸＣＲ３発現の低下、Ｐ−セレクチンの低下された結合を有し、そして適切な刺激に応答して接着若しくは移動しない。従って、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞を、Ｔ−ｂｅｔそれ自身を調節すること以外の手段によりＴ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する剤（すなわち、Ｔ−ｂｅｔ欠損表現型を「レスキューする」化合物）を同定するのに使用し得る。あるいは、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が条件付き様式で非機能的にされている「コンディショナルノックアウト」系を、スクリーニングアッセイでの使用のためのＴ−ｂｅｔ欠損細胞を創製するのに使用し得る。例えば、第ＷＯ  ９４／２９４４２号および米国特許第５，６５０，２９８号明細書に記述されるところの遺伝子の条件付き破壊のためのテトラサイクリンに調節される系を使用して、細胞と接触するテトラサイクリン濃度の調節により制御された様式でＴ−ｂｅｔ欠損にし得る細胞、若しくはそれから細胞を単離し得るＴ−ｂｅｔ欠損動物を創製し得る。Ｔ−ｂｅｔの他の生物学的効果に関するアッセイのためには、類似の条件付き破壊のアプローチを使用し得るか、若しくは、あるいは、ＲＡＧ−２欠損胚盤胞補完系を、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子のホモ接合性突然変異をもつ胚性幹細胞から生じるリンパ器官をもつマウスを生成するのに使用し得る。こうした動物からのＴ−ｂｅｔ欠損リンパ系細胞（例えば胸腺、脾および／若しくはリンパ節細胞）、または精製したＴ−ｂｅｔ欠損Ｂ細胞を、スクリーニングアッセイで使用し得る。
【０１９７】
該スクリーニング法において、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞を試験化合物と接触させ、そして、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答をモニターする。（例えば未処理の細胞若しくは対照剤で処理した細胞のような適切な対照と比較しての）Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞中の応答の調節が、試験化合物をＴ−ｂｅｔに調節される応答の調節物質と同定する。
【０１９８】
一態様において、試験化合物をヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物、好ましくはマウス（例えば、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が上述された手段により条件付きで破壊されているマウス、または、リンパ系器官が、上述されたところのＴ−ｂｅｔが欠損しているキメラマウス）に直接投与して、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ応答を調節する試験化合物を同定する。別の態様において、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞を、ヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物から単離し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏで試験化合物と接触させて、Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞中でＴ−ｂｅｔにより調節される応答を調節する試験化合物を同定する。
【０１９９】
Ｔ−ｂｅｔが欠損している細胞は、Ｔ−ｂｅｔが欠損しているように創製したヒト以外の動物から得ることができる。好ましいヒト以外の動物は、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヤギおよびヒツジを包含する。好ましい態様において、Ｔ−ｂｅｔ欠損動物はマウスである。Ｔ−ｂｅｔが欠損しているマウスは実施例に記述されるとおり作成し得る。典型的に特定の一遺伝子産物が欠損しているヒト以外の動物は相同的組換えにより創製する。簡潔には、欠失、付加若しくは置換が導入されてそれにより内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子を変える、例えば機能的に破壊するＴ−ｂｅｔ遺伝子の少なくとも一部分を含有するベクターを製造する。Ｔ−ｂｅｔ遺伝子は好ましくはマウスＴ−ｂｅｔ遺伝子である。例えば、マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子を、マウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡをプローブとして使用してマウスゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得る。マウスＴ−ｂｅｔ遺伝子をその後、マウスゲノム中の内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子を変えるのに適する相同的組換えベクターを構築するのに使用し得る。好ましい一態様において、相同的組換えに際して内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が機能的に破壊される（すなわち機能的ポリペプチドをもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともまた称される）ようなベクターを設計する。あるいは、相同的組換えに際して、内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子が突然変異されるか若しくは別の方法で変えられるがしかしなお機能的ポリペプチドをコードする（例えば、上流の調節領域を変えてそれにより内因性Ｔ−ｂｅｔポリペプチドの発現を変えることができる）ようなベクターを設計し得る。相同的組換えベクター中で、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の変えられた部分は、その５’および３’端で、該ベクターにより保有される外因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子と胚性幹細胞中の内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子の間で相同的組換えを起こさせるようにＴ−ｂｅｔ遺伝子の付加的な核酸により隣接されている。該付加的な隣接Ｔ−ｂｅｔ核酸は、内因性遺伝子との成功裏の相同的組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ（５’および３’双方の端）をベクターに包含する（例えば、相同的組換えベクターの記述については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．とＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを胚性幹細胞株に（例えば電気穿孔法により）導入し、そして導入されたＴ−ｂｅｔ遺伝子が内因性Ｔ−ｂｅｔ遺伝子と相同的に組換わった細胞を選択する（例えばＬｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照されたい）。選択した細胞をその後動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）中、ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。キメラ胚をその後、適する偽妊娠雌性育成動物に移植し得、そして胚を出産までもたらし得る。それらの生殖細胞中に相同的に組換えられたＤＮＡを持つ子孫を、動物の全細胞が導入遺伝子の生殖系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含有する動物を繁殖させるのに使用し得る。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９、ならびに、Ｌｅ  ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９０／１１３５４号；Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによる同第ＷＯ  ９１／０１１４０号；Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる同第ＷＯ  ９２／０９６８号；およびＢｅｒｎｓらによる同第ＷＯ  ９３／０４１６９号明細書にさらに記述されている。
【０２００】
別の態様において、野生型およびＴ−ｂｅｔヌル双方のマウスからのドナー骨髄細胞のレトロウイルス形質導入を、照射したＲＡＧレシピエントを再構成するためにＤＮすなわちドミナントネガティブな構築物を用いて実施し得る。これは、リンパ系細胞がＴ−ｂｅｔのドミナントネガティブなバージョンのみを発現するマウスの産生をもたらすことができる。これらのマウスからのＢ細胞を、その後、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答を調節する化合物について試験し得る。
【０２０１】
スクリーニングアッセイの一態様において、Ｔ−ｂｅｔより調節される生物学的応答を調節するそれらの能力について試験される化合物は、試験化合物をヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物にｉｎ  ｖｉｖｏで投与すること、および該動物での応答に対する試験化合物の影響を評価することにより、Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞と接触させる。試験化合物は製薬学的組成物としてヒト以外のＴ−ｂｅｔ欠損動物に投与し得る。こうした組成物は、典型的に試験化合物および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、製薬学的投与と適合性のいずれかのおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌化合物、等張および吸収遅延化合物などを包含することを意図している。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および化合物の使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣習的媒体若しくは化合物が有効成分と不適合性である限りを除き、組成物中でのそれらの使用を企図している。補助的有効成分もまた組成物に組み込み得る。
【０２０２】
Ｄ．試験化合物
多様な試験化合物を、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイを使用して評価し得る。ある態様において、試験されるべき化合物はライブラリー由来であり得る（すなわち、化合物のライブラリーのメンバーである）。ペプチドのライブラリーの使用は当該技術分野で十分に確立されている一方、ベンゾジアゼピン類（Ｂｕｎｉｎら（１９９２）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０９８７；ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９）ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ．（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８）オリゴカルバメート（Ｃｈｏら（１９９３）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６１：１３０３−）およびヒダントイン（ＤｅＷｉｔｔら  上記）のような他の化合物の混合物の製造を可能にした新たな技術が開発された。１０４−１０５の多様性をもつ小有機分子の分子ライブラリーの合成のための１アプローチが記述されている（Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９−；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１−）。
【０２０３】
本発明の化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー、逆重畳を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方、他の４種のアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマー、若しくは化合物の小分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。分子ライブラリーの他の例示的合成方法は、当該技術分野、例えば：Ｅｒｂら（１９９４）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−；Ｈｏｒｗｅｌｌら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３３：６８−；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−で見出し得る。
【０２０４】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、若しくはファージ（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）上に提示することができ；なお別の態様において、組み合わせポリペプチドがｃＤＮＡライブラリーから製造される。
【０２０５】
活性についてスクリーニングし得る例示的化合物は、限定されるものでないが、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子および天然産物の抽出物のライブラリーを挙げることができる。
【０２０６】
候補／試験化合物は、例えば１）Ｉｇ尾状融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリー（例えばＬａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６を参照されたい）ならびにＤおよび／若しくはＬ配置アミノ酸から構成されるコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーのメンバーを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド；２）リンペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に縮重の指向性リンペプチドライブラリーのメンバー、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８を参照されたい）；３）抗体（例えばポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；４）小有機および無機分子（例えば、コンビナトリアルおよび天然産物ライブラリーから得られる分子）；５）酵素（例えば、エンドリボヌクレアーゼ、加水分解酵素、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、合成酵素、異性化酵素、ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、酸化還元酵素およびＡＴＰアーゼ）、ならびに６）変異体の形態のＴ−ｂｅｔ分子、例えばドミナントネガティブ変異体の形態の該分子を包含する。
【０２０７】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに制限される一方、他の４種のアプローチは、ペプチド、ペプチド以外のオリゴマー、若しくは化合物の小分子ライブラリーに応用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２０８】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３で見出し得る。
【０２０９】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５−１８６９）、若しくはファージ（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ  上記）上に提示しうる。
【０２１０】
主題のスクリーニングアッセイで同定される化合物を、Ｔ−ｂｅｔにより調節される生物学的応答の１種若しくはそれ以上の調節方法で使用し得る。こうした化合物（１種若しくは複数）を、細胞とそれらを接触させる前に製薬学的組成物（上述される）として処方することが望ましいことがあることが理解されるであろう。
【０２１１】
上述された多様な方法の１種により、Ｔ−ｂｅｔ発現および／若しくは活性を直接若しくは間接的に調節する試験化合物が一旦同定されれば、該選択した試験化合物（若しくは「目的の化合物」）をその後、例えば、該目的の化合物を（例えば目的の化合物を被験体に投与することにより）ｉｎ  ｖｉｖｏ、あるいは（例えば、細胞を被験体から単離することおよび該単離した細胞を目的の化合物と接触させること、または、あるいは目的の化合物を細胞株と接触させることにより）ｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞と接触させること、ならびに（未処理の細胞、または生物学的応答を調節しない対照化合物若しくは担体で処理した細胞のような）適切な対照と比較しての細胞に対する目的の化合物の影響を決定することにより、細胞に対するその影響について、さらに評価し得る。
【０２１２】
本発明はまた、上のアッセイで同定される化合物にも関する。
【０２１３】
Ｖ．本発明のキット
本発明の別の局面は、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、Ｔ−ｂｅｔを含有する指標組成物、読み出し（例えばポリペプチド分泌）を測定するための手段、およびＴ−ｂｅｔの生物学的効果の調節物質を同定するためにキットを使用するための説明書を包含し得る。別の態様において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するためのキットは、Ｔ−ｂｅｔ欠損細胞、読み出しを測定するための手段、およびＴ−ｂｅｔの生物学的効果の調節物質を同定するためにキットを使用するための説明書を含んでなる。
【０２１４】
本発明は、制限するとして解釈されるべきでない以下の実施例によりさらに具体的に説明される。本出願を通じて引用される全部の参考文献、特許および公開特許出願の内容はここに引用することにより組み込まれる。加えて、本明細書で言及される公的データベースに寄託された全部のヌクレオチドおよびアミノ酸配列もまた、ここに引用することにより組み込まれる。
【０２１５】
ｐＪＧ４−５ベクターのＥｃｏＲＩ部位にクローン化されたマウスＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡを含んでなる核酸分子は、１９９９年１１月９日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）に寄託され、そして寄託番
号ＰＴＡ−９３０を割り当てられた。ＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローン化されたヒトＴ−ｂｅｔ  ｃＤＮＡ（ヒトＴｈ１クローンＲＯＴ−１０からのＲＮＡから製造された）を含んでなる核酸分子は、２０００年１月２８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）に寄託され、そして寄託番号ＰＴＡ−１３３９を割り当てられた。双方の寄託物はブタペスト条約の規定のもとに作成された。
［実施例］
【実施例１】
【０２１６】
新規転写因子Ｔ−ｂｅｔのクローニング
ＩＬ−２プロモーターのＴｈ１特異的領域が十分に位置推定されている（Ｂｒｏｍｂａｃｈｅｒ，．ら１９９４．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１８９−１９７、；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．ら１９９５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６２９９−６３１０；Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｊ．Ａ．ら１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、７７−８６；Ｄｕｒａｎｄ，Ｄ．ら１９８８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、１７１５−１７２４；Ｈｏｙｏｓ，Ｂ．ら１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、４５７−４５０）ため、ＩＬ−２プロモーター−レポーター、およびＯＦ６  Ｔｈ１クローンから作成したｃＤＮＡライブラリーを使用する酵母１ハイブリッドアプローチを、Ｔｈ１特異的転写因子を同定するのに選んだ。このアプローチを検証するため、ＩＬ−４プロモーターのＴｈ２特異的領域を酵母で発現させ、そして、ｃ−Ｍａｆの導入によりトランス活性化されるがしかし数種の他の転写因子（例えばＮＦＡＴ）によりされないことが示された。ｃ−Ｍａｆトランス活性化は、ｃ−Ｍａｆ応答エレメント（ＭＡＲＥ）を変異させた場合に起こらなかった。従って、該酵母１ハイブリッドアプローチを利用した。
【０２１７】
ＥＧＹ４８酵母株に、ＩＬ−２プロモーター／ヒスチジン構築物を安定に組込み、そして抗ＣＤ３で活性化したＴｈ１細胞クローンＯＦ６から作成したｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。スクリーニングした５．６×１０６クローンのうち４８８個が一次スクリーニングで陽性であった。二次スクリーニングの間に試験した２１０クローンのうち、７２個がＩＬ−２プロモーターに特異的であることが判明した。陽性クローンの数を減少させるため、われわれは、該酵母クローンｃＤＮＡを、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞株中で差別的に発現されたｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。これらのＴｈ１−Ｔｈ２およびＴｈ２−Ｔｈ１  ｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＰＣＲ選択キットを使用して作成し、放射標識し、そして１６個の最も強く陽性の酵母クローンをスクリーニングするためのパイロット実験で最初に使用した。それら１６クローンのうち、８個は、Ｔｈ１（ＰＬ１７）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性であり、そしてＴｈ２（Ｄ１０）特異的ｃＤＮＡ産物プローブで陽性でなかった。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４への該プローブの対照ハイブリダイゼーションを用いた１６個の陽性クローンでのＴｈ１−Ｔｈ２プローブを用いる発現差解析（ＲＤＡ；例えば、Ｌｉｓｉｔｓｙｎ．１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６；Ｏ’ＮｅｉｌｌとＳｉｎｃｌａｉｒ．１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２６８１；ＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚ．１９９４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２：５６４０；Ｗｅｌｆｏｒｄら１９９８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２６：３０５９）を実施した。Ｔｈ１およびＴｈ２サブトラクトしたｃＤＮＡプローブの特異性は、それぞれＩＬ−４に対するＩＬ−２およびＩＦＮ−γのそれらの検出により示される。
【０２１８】
制限酵素分析および配列決定データは、該クローンの全８個が関係したことを示した。それらは、５’および３’非翻訳領域中の差違に基づき３つの分類に分けられた（これらの範疇のそれぞれが独立の１ｃＤＮＡ分子を表す）。これらのクローンの配列をＮＣＢＩ
ＧｅｎＢａｎｋ配列データベースと比較することは、転写因子のＴボックスファミリーとの相同性を生じた。
【実施例２】
【０２１９】
Ｔ−ｂｅｔはＴボックスファミリーメンバーＴ−ｂｒａｉｎおよびＥｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎと相同な一領域を共有する
ＢｒａｃｈｙｕｒｙすなわちＴは、Ｔボックスと呼ばれる２００アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを共有する転写因子の１ファミリーの創設メンバーである（（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．１９９７．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７、４７４−４８０；ＰａｐａｉｏａｎｎｏｕとＳｉｌｖｅｒ．１９９８．Ｂｉｏｅｓｓａｙ．２０：９；Ｍｅｉｓｌｅｒ，Ｍ．Ｈ．１９９７．Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ８、７９９−８００に総説されている。）。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（「短尾」のギリシア語）突然変異は、短い、わずかにもつれた尾を有したヘテロ接合性変異体動物で１９２７年に最初に記述された（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｇ．、１９９０．Ｎａｔｕｒｅ  ３４３、６１７−６２２）。現在、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを包含せずにマウスで８種のＴボックス遺伝子が存在する。これらは、それぞれ別個のおよび通常は複雑な発現パターンをもつ、Ｔｂｘ１−６、Ｔ−ｂｒａｉｎ−１（Ｔｂｒ−１）および今やＴ−ｂｅｔを包含する。転写因子のＴボックスファミリーは、ＤＮＡ結合ドメイン中のファミリーメンバーの相同性により定義される。Ｔ−ｂｅｔのＤＮＡ結合ドメイン（マウスＴ−ｂｅｔの残基１３８−３２７）は、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエルのｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎのＴボックスドメインに最も類似であり、そして従ってＴ−ｂｅｔをＴボックス遺伝子ファミリーのＴｂｒ１サブファミリーに置く。マウスＴ−ｂｅｔタンパク質のヒトホモログはマウスＴ−ｂｅｔにおよそ８８％同一である。Ｔ−ｂｅｔは、ＴボックスファミリーメンバーのＴ−ｂｒａｉｎおよびｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎと相同な一領域を共有する。マウスＴ−ｂｅｔのＤＮＡ結合ドメインは、マウスＴ−ｂｒａｉｎおよびアフリカツメガエルのｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎのＴボックスドメインに最も類似である。該３種のＴボックス領域間におよそ６９％のアミノ酸同一性が存在する。Ｔ−ｂｅｔは、Ｔボックスドメインのほかに他のＴボックスファミリーメンバーとの配列相同性を有しない。
【０２２０】
以下の材料および方法を実施例３〜６で使用した。
マウス
Ｔ−ｂｅｔ−／−マウス（Ｐｅｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９、５５４５−５５５０）を、１０以上の世代の間、ＢＡＬＢ／ｃ系統と戻し交雑し、そしてＤＯ  １１．１０  ＴＣＲ−Ｔｇ系統に交配した。全部のＤＯ  １１．１０マウスおよびＤＯ１１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−マウスはＴＣＲ導入遺伝子についてヘテロ接合性であった。Ｔ−ｂｅｔ  ＣＤ２−Ｔｇマウスを記述されるとおり生成しかつＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドで維持した（Ｊｕｅｄｅｓ，Ａ．Ｅ．ら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９９、１１５３−１１６２）。ＢＡＬＢ／ｃ  ＩＦＮ−γ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）をＴ−ｂｅｔ−／−系統と交配して、Ｔ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−系統を生成した。マウスは、ハーバード大学公衆衛生学部（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）にて特定の病原体を含まない障壁室（ｂａｒｒｉｅｒ  ｕｎｉｔ）に収容した。マウスの取扱いおよび実験手順は、施設の動物管理および使用に関する要件に従った。マウスは４〜６週齢で使用した。
【０２２１】
細胞調製
初代ＬＮ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、以前に記述された（Ｌａｍｅｔｓｃｈｗａｎｄｔｎｅｒ，Ｇ．ら（２００４）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１３、９８７−９９４）とおり、磁性ビーズ（ＭＡＣＳ、米国）での陽性若しくは陰性選択いずれかにより調製した。Ｔ細胞（フローサイトメトリーにより評価されるところの９５％以上純粋）を、ＤＯ１１．１０動物からの細胞を使用する実験で、プレートに結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）若しくはＯＶＡペプチドおよび同系脾細胞で刺激した。Ｔｈ０、Ｔｈ１およびＴｈ１分極条件は以前に記述された（Ｌａｍｅｔｓｃｈｗａｎｄｔｎｅｒ，Ｇ．ら（２００４）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１３、９８７−９９４）とおりであった。Ｔ細胞は初回刺激後第４〜５日に使用した。
【０２２２】
フローサイトメトリー
使用した抗体は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓからであった抗ＣＸＣＲ３抗体を除きＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）からであった。染色した細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で獲得し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウェアで解析した。
【０２２３】
養子移入
養子移入は記述された（Ｘｉｅ，Ｈ．ら（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８９、１７６５−１７７６）とおり実施した。簡潔には、ＤＯ  １１．１０およびＤＯ  １１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｔｈ１若しくはＴｈ２分極条件下にＯＶＡペプチドおよびＢＡＬＢ／ｃ脾細胞で活性化した。活性化５日後に、２０×１０６Ｔ細胞を未照射のＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内移入した。移入２４時間後に、レシピエントマウスにＩＦＡ中ＯＶＡをｉ．ｐ．注入した。４８時間後に、脾、腸間膜および鼠径部ＬＮを収集しかつ腹膜洗浄を実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏ輸送の分析を、抗ＫＪ１−２６（抗クローン形質）および抗ＣＤ４抗体で細胞を染色すること、ならびに多様な解剖学的場所でこれらのマーカーについて二重陽性であった細胞の数および比率を決定することにより、実施した。
【０２２４】
フローチャンバーアッセイ
可溶性Ｐ−およびＥ−セレクチンとのＣＤ４＋  Ｔ細胞の相互作用を、以前に記述された（Ｌｉｍ，Ｙ．Ｃ．ら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２、３１９３−３２０１）とおり、平行プレートフローチャンバー中流体剪断の条件下で検査した。ＥＣへのサイトカイン誘発性接着の評価のため、単離された心ＥＣを以前に記述された（Ｌｉｍ，Ｙ．Ｃ．ら（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６２、１５９１−１６０１）とおり単離しかつ使用した。
【０２２５】
硫酸化アッセイ
チロシン硫酸化についてのアッセイは記述された（Ｆａｒｚａｎ，Ｍ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６、６６７−６７６）とおり実施した。簡潔には、ＷＴおよびＴ−ｂｅｔ−／−マウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞をＴｈ１分極条件下で活性化し、そして第３日に硫酸を含まない培地に移しかつ［３５Ｓ］−硫酸の存在下で増殖させた。２４時間後に細胞を収集し、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｎ−グリカンを除去するため）若しくはニューロアミニダーゼおよびＯ−グリコシダーゼ（Ｏ−グリカンを除去するため）で処理し、そしてＰＳＧＬ−１を免疫沈降し（抗ＰＳＧＬ−１抗体Ｐ２はＢｒｕｃｅ  Ｆｕｒｉｅ博士、ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカルセンター（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）、米国ボストンからであった）、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。チロシン硫酸化をオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０２２６】
リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）でＣＤ４＋  Ｔ細胞から抽出し、そして、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて逆転写を実施した。生成された単位複製配列の量を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）装置でモニターした。レポーターおよび消光剤双方の色素で標識した特異的プローブを、反応の開始時にＴａｑｍａｎ  ＰＣＲミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。本研究で使用したプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブの配列は要求に際して入手可能である。サイクル数をβ−アクチンに対し正規化した。
【０２２７】
レトロウイルス形質導入
Ｔ−ｂｅｔおよび対照レトロウイルスは、記述された（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．ら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００、６５５−６６９）とおり製造しかつ滴定した。ＷＴ、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−マウスからのＣＤ４＋  Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化し、そして３６時間後にレトロウイルスにスピン感染（ｓｐｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ）させた。新鮮培地を２４時間後に添加し、そして、細胞は、第５日にＧＦＰ発現により選別しかつ／若しくはフローサイトメトリーおよびトランスウェル分析に使用したかのいずれかであった。
【０２２８】
トランスウェルアッセイ
トランスウェルアッセイは、フィブロネクチンでブロッキングした５μｍトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）を伴う２４ウェルプレートで実施した。３×１０５ＣＤ４＋
Ｔ細胞を上室に入れ、そしてケモカインの希釈（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）を下室に入れた。細胞を３７℃に４時間置き、そして遊出をフローサイトメトリーにより数え上げた。レトロウイルスで形質導入した細胞を用いるトランスウェル実験については、遊出した細胞を、ＧＦＰについてもまた陽性であった生存細胞でゲーティングすることにより計数した。
【実施例３】
【０２２９】
Ｔ−ｂｅｔ−／−マウスからのＴ細胞の低下されたｉｎ  ｖｉｖｏ移動
Ｔ細胞移動がこれらのマウスで損なわれたかどうかを確立するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの末梢炎症部位への養子移入したＣＤ４＋  Ｔ細胞の動員を評価した。最初に、抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（ＤＯ  １１．１０およびＤＯ  １１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成し、そしてある種の十分に記述された接着分子の発現について評価した。Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は、野生型細胞と比較した場合に、ＰＳＧＬ−１、ＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４の類似のレベルの発現を示した。この方法で生成させた細胞を、未照射の同系野生型（ＷＴ）マウスに注入し、次いでそれらの特異的Ｔ細胞抗原（卵アルブミン）で腹膜炎症を誘導した（Ｘｉｅ，Ｈ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９、１７６５−１７７６）。このモデルは、Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞中に存在することができかつセレクチン（Ｘｉｅ，Ｈ．ら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９、１７６５−１７７６）およびケモカイン媒介性相互作用（Ｘｉｅ，Ｊ．Ｈ．ら（２００３）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７３、７７１−７８０）双方に依存することが示されているエフェクター機能のいかなる欠損にも依存しない、移入された細胞の輸送の評価を可能にする。Ｔｈ１若しくはＴｈ２いずれかの分極条件下で活性化したＤＯ  １１．１０およびＤＯ１１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の移入は、Ｔ−ｂｅｔの非存在下での二次リンパ器官へのこれらの細胞の損なわれていない輸送を示した（脾およびリンパ節中の移入されたＴ細胞の比率が類似であったため）。以前に公表されたデータ（Ｘｉｅ，Ｊ．Ｈ．ら（２００３）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７３、７７１−７８０）と一致して、Ｔｈ１条件下で活性化した移入されたＤＯ  １１．１０  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の腹膜への実質的な輸送が存在した一方、この移動は、ＤＯ  １１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞で無効にされ、炎症前Ｔ細胞輸送の顕著な欠損を示す。
【実施例４】
【０２３０】
Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞はＰ−セレクチンへの損なわれた結合を表すが、しかしＥ−セレクチンへは表さない
ｉｎ  ｖｉｖｏで末梢炎症部位へのＴ細胞の移動の欠損を観察したため、Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔリンパ球は、Ｅ−および／若しくはＰ−セレクチンまたは特定のＴｈ１ケモカインいずれかとの低下された相互作用を表しうることが仮定された。これをさらに評価するため、Ｔｈ１若しくはＴｈ２分極条件下でＴＣＲおよびＣＤ２８の連結により活性化した初代野生型（ＷＴ）およびＴ−ｂｅｔ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の、固定した組換えＰ−およびＥ−セレクチンへの生理学的層剪断流の条件下の結合を評価した。Ｔ−ｂｅｔの非存在下で、Ｔｈ１細胞は、剪断依存性の様式でＰ−セレクチンへの顕著に低下した結合を表したが、しかしＥ−セレクチンへの正常な結合を表した。Ｔｈ２細胞は、Ｔ−ｂｅｔの存在若しくは非存在に関係なく、いずれのセレクチンへも最小限の結合を示した。これらの知見は、ＴＣＲトランスジェニック（ＤＯ  １１．１０対ＤＯ  １１．１０×Ｔ−ｂｅｔ−／−）マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞を抗原および抗原提示細胞により活性化した場合に反復された。さらに、Ｔｈ１細胞結合は影響を及ぼされなかった一方、ＣＤ２−Ｔ−ｂｅｔトランスジェニック（ＣＤ２−Ｔｇマウス）（全Ｔ細胞でＴ−ｂｅｔを過剰発現する系統）からのＴｈ２細胞は、Ｔ−ｂｅｔがセレクチンリガンド発現を直接遂げることを示唆する、Ｐ−セレクチン結合の顕著な増大を示した。Ｅ−セレクチンへのＴｈ２細胞の結合の小さな増大が低剪断でもまた示されたとは言え、これはＰ−セレクチンで観察されたものよりかなりより少なく顕著であった。全部のＰ−セレクチン相互作用は、Ｔ細胞への抗ＰＳＧＬ−１ポリクローナル抗体の添加により阻害された。
【実施例５】
【０２３１】
Ｐ−セレクチン結合の障害はＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化の低下による
Ｅ−セレクチンへの結合は正常であった（フコシル化に決定的に依存する過程（Ｌｏｗｅ，Ｊ．Ｂ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１８６、１９−３６））ため、ＰＳＧＬ−１の炭水化物修飾がＰ−セレクチン結合で観察される欠損の原因であったことはありそうになかった。Ｐ−セレクチンへの結合の変化は、フローサイトメトリーにより評価されるとおり、ＰＳＧＬ−１およびコア−２依存性エピトープＣＤ４３ａの正常な表面発現の情況で発生した（Ｌｉｍ，Ｙ．Ｃ．ら（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７、４４７６−４４８４；Ｓｎａｐｐ，Ｋ．Ｒ．ら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９７、３８０６−３８１１）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＦｕｃＴＶＩＩ  ｍＲＮＡの発現は、ＷＴおよびＴ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞についてもまた同様であり、従って、これらの酵素のいずれの欠損も除外した。従って、ＰＳＧＬ−１のチロシン硫酸化の欠損が、Ｐ−セレクチンへの結合の特異的低下を説明するようにＴ−ｂｅｔ−／−細胞に存在したかどうかを決定した（Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ｐ．ら（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、２２６７７−２２６８０）。Ｔ−ｂｅｔ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞がＰＳＧＬ−１チロシン硫酸化の実質的な低下を示したことが見出された。３５Ｓの取り込みの差違はＯ−およびＮ−結合したグリカン双方の除去後でさえ持続したため、この低下はグリコシル残基の硫酸化に依存しなかった。チロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼ−１（ＴＰＳＴ−１）ｍＲＮＡの発現はＷＴおよびＴ−ｂｅｔ−／−双方の細胞で同一であった一方、ＴＰＳＴ−２  ｍＲＮＡのレベルの５０％低下がＴ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞で観察された。
【実施例６】
【０２３２】
ＣＸＣＲ３の発現および機能はＴ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞中で損なわれているがしかしＣＣＲ５は損なわれていない
セレクチンリガンド発現に加え、ＣＤ４＋  Ｔｈ１細胞移動は、ケモカイン受容体発現、とりわけＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３に依存する。Ｔ−ｂｅｔの非存在下では、ＣＸＣＲ３転写物のレベルは、Ｔｈ１分極条件下で活性化したＷＴ  Ｔ細胞に比較して最小限であった。これらの変化は、Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞上に存在する検出可能な受容体を伴わずにＣＸＣＲ３の表面発現により正確に反映された。対照的に、Ｔ−ｂｅｔ  ＣＤ２−Ｔｇ  Ｔ細胞は、分極しない若しくはＴｈ２条件下で活性化される場合に、ＷＴ  Ｔ細胞より有意により多いＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡを発現した。再度、Ｔ−ｂｅｔのトランスジェニック過剰発現は、これらの細胞でのＣＸＣＲ３のより多い表面発現につながった。これらの結果は、Ｔ−ｂｅｔがＣＸＣＲ３の発現を直接調節しうることを示唆するとは言え、その発現はＩＦＮ−γ（Ｔ−ｂｅｔにより直接制御されるサイトカイン）により調節されることもまた報告された（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｃ．ら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２、１７９２−１８０１）。ＣＸＣＲ３の損なわれた発現が、Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞により産生されるＩＦＮ−γの低下されたレベルに二次的であったかどうかを決定するため、Ｔ−ｂｅｔを、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞にレトロウイルスで形質導入した。Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞へのＴ−ｂｅｔ形質導入はＣＸＣＲ３  ｍＲＮＡの顕著な上方制御を誘導した。Ｔ−ｂｅｔをＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞に導入した場合にＣＸＣＲ３の顕著な誘導が見られたため、この誘導はＩＦＮ−γ産生に全く依存しなかった。ＣＸＣＲ３は、Ｔ−ｂｅｔで形質導入したＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の表面上で高度に誘導された。顕著に対照的に、ＣＣＲ５（他のＴｈ１選択的ケモカイン受容体）のレベルはＴ−ｂｅｔの非存在により影響を及ぼされず、Ｔ−ｂｅｔによるＴｈ１特異的ケモカイン受容体の選択的調節を示す。ＣＣＲ５の表面発現は、Ｔｈ２分極条件下で活性化したいずれの遺伝子型のＴ細胞上の検出可能なＣＣＲ５も伴わず、ＷＴ、Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞で、Ｔｈ１分極条件下で活性化した初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞で同様であった（表１）。
【０２３３】
【表１】
2008541760.tif 000002
【０２３４】
加えて、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡレベルはＴ−ｂｅｔ  ＣＤ２−Ｔｇ  Ｔ細胞で不変であった。他のケモカイン受容体（例えばＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７）の発現もまた、Ｔ−ｂｅｔの非存在下で不変であった。
【０２３５】
ＣＸＣＲ３の機能の非存在が、トランスウェル走化性アッセイでのＣＸＣＲ３リガンドに対する損なわれた応答により示された。Ｔ−ｂｅｔ−／−  Ｔ細胞は、ＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡ））若しくはＣＸＣＬ−１０（ＩＰ−１０）に応答して移動することに失敗したが、しかし、ＣＣＲ５リガンドＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）に応答して、ＷＴ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞と同等に移動した。Ｔ−ｂｅｔ  ＣＤ２−Ｔｇ  Ｔ細胞は、全部の分極条件下でＷＴ  Ｔ細胞と同等にＭＩＰ−１βに移動し、Ｔ−ｂｅｔのトランスジェニック過剰発現が、Ｔｈ２分極条件下でさえ機能的ＣＣＲ５の発現を直接遂げなかったことを示した。Ｔ−ｂｅｔ−／−およびＴ−ｂｅｔ−／−×ＩＦＮ−γ−／−  ＣＤ４＋
Ｔ細胞へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス形質導入は、空のレトロウイルスでの形質導入に比較した場合に、ＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬ１１およびＸＣＸＬＩＯへのこれらの細胞の遊出を復帰させ、Ｔ−ｂｅｔがＩＦＮ−γ遺伝子のそのトランス活性化に依存しない機構によりＣＸＣＲ３の機能発現を駆動し得ることを示す。
【０２３６】
ケモカインはまたインテグリンの活性化も媒介して、インサイドアウトシグナル伝達の過程を介する高親和性（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）若しくは高親和性（ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ）状態を誘導することにより、ローリングするＴ細胞の堅固な接着をもたらす（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９、３８１−３８４）。この過程におけるＴ−ｂｅｔに対する要求を示すため、ＰＢＳ若しくはＣＸＣＲ３リガンドＣＸＣＬＩＯで処理した未刺激の心内皮細胞（ＥＣ）へのＴ細胞の接着を観察した。この型で、全部の結合はＶＣＡＭ−１へのＰ−インテグリン結合に依存しない（Ｌｉｍ，Ｙ．Ｃ．ら（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈａｔｈｏｌ  １６２、１５９１−１６０１）。ＣＸＣＬＩＯの非存在下で、ＷＴおよびＴ−ｂｅｔ’’’’’  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の結合は同一であった。対照的に、ＣＸＣＬＩＯの添加後はＷＴ（そしてＴ−ｂｅｔ−／−でない）Ｔ細胞のみが、生理学的剪断流の条件下でＥＣへの増大された接着を示した。
【０２３７】
マウスおよびヒト自己免疫疾患は病的部位へのエフェクターＴ細胞の浸潤を特徴とする。Ｔ−ｂｅｔ欠損マウスは、Ｉ型糖尿病、炎症性大腸炎および関節炎、ループス腎炎、ならびに実験的自己免疫脳脊髄炎を包含する広範な自己免疫疾患に対しｉｎ  ｖｉｖｏで抵抗性であるが、しかし原因である機構は確実に確立されてはおらず（Ｌｕｇｏ−Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ，Ｇ．ら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００、７７４９−７７５４；Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｍ．Ｆ．ら（２００２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５、１１２９；Ｊｕｅｄｅｓ，Ａ．Ｅ．ら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９９、１１５３−１１６２；Ｂｅｔｔｅｌｌｉ，Ｅ．ら（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ２００、７９−８７）損なわれた細胞のエフェクター機能がこうした抵抗性に寄与することが確かに可能である。しかしながら、上のモデルの全部で共通の知見は、Ｔ−ｂｅｔの非存在下での炎症部位への細胞浸潤の欠如であり、Ｔｈ１細胞の輸送能力における興味を駆り立てる。エフェクター細胞の移動が欠損である場合には、ある程度まで、エフェクター機能の能力が相対的により少なく重要になる。これは、スフィンゴシン−１−リン酸を標的とすることによりリンパ節からのリンパ球放出を予防しかつ従ってＴ細胞輸送を損なう薬物ＦＴＹ７２０の免疫抑制能力を考慮することにより具体的に説明される（Ｍａｔｌｏｕｂｉａｎ，Ｍ．ら（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４２７、３５５−３６０）。本明細書に示されるとおり、Ｔ−ｂｅｔの非存在下で、Ｔｈ１分極条件下で生成させた初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、硫酸化依存性のＰ−セレクチン結合ならびにＣＸＣＲ３依存性の停止および移動を包含するＴ細胞輸送経路中の複数の特定の機構の欠損により、ｉｎ  ｖｉｖｏで適切に移動することに失敗する。
【０２３８】
Ｅ−セレクチン結合の保存を伴うＰ−セレクチン欠損の特異性が、セレクチン結合に関してかなり興味深い。従って、ある種のＳＴＡＴ４依存性の過程が機能上保存されていることが推論され得る。Ｔ−ｂｅｔの非存在若しくは存在下いずれのＴｈ２分極条件下で活性化したＴ細胞の（あれば）最小限の結合が存在したこともまた注目に値する。これゆえに、Ｔｈ２細胞はＥ−セレクチンを結合しないため、Ｔｈ１細胞発生のいくつかの局面が、これらの細胞が単純に初期状態のＴｈ２細胞であるという概念を除外して保存されている（Ｅ−セレクチンに結合する）。Ｔ−ｂｅｔは、ＴＰＳＴ−２およびおそらくＴＰＳＴ−１の機能的発現を制御するようである。これら２種の決定的な酵素の制御についてほとんど知られていないが、しかし、ｍＲＮＡの減少は絶対でないため、チロシン硫酸化のＴ−ｂｅｔ制御の機構は転写レベルでない。しかしながら、これらの酵素の発現および細胞での場所は精巧に制御されている。ゴルジ中の活性のＴＰＳＴは、かなりの程度まで、効果的に機能するためにそれら自身チロシン硫酸化を必要とし（Ｍｏｏｒｅ，Ｋ．Ｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、２４２４３−２４２４６）、そして、Ｔ−ｂｅｔがこれらの酵素のいずれか、よりありそうにはＴＰＳＴ−２の翻訳後の機能をいくぶん調節するという可能性が存続する（下を参照されたい）。さらに、ＰＳＧＬ−１の硫酸化へのこれら２種の酵素の相対的な寄与は決定されておらず、そして、これらの酵素の一方若しくは双方が欠損しているマウスのさらなる特徴付けを必要とするであろう。マウスＰＳＧＬ−１は、ある点、最も適切にはヒトでの３個のチロシン残基のうち２個と比較してマウスで２個のチロシン残基の１個のみの硫酸化が必要とされることで、そのヒト対照物と異なる（Ｌｉｕ，Ｗ．ら（１９９８）．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、７０７８−７０８７；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｖ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６、１３７７１−１３７７６；Ｘｉａ，Ｌ．ら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１、５５２−５５９）。これゆえに、硫酸化のいかなる欠損もヒトＴ細胞中で誇張されうる。にもかかわらず、これら２種の酵素のいずれかの機能の妨害は、魅力的な治療戦略を表す。
【０２３９】
ケモカイン受容体の発現および機能に関する本明細書に開示されるデータは、選択的Ｔｈ１輸送応答がＴ−ｂｅｔ−／−マウスで損なわれているという仮定を改めて表明する。以前の研究は、長期間分極したＴｈ２細胞での表面ＣＸＣＲ３の誘導における過剰発現されたＴ−ｂｅｔの役割を解明し（Ｓｕｎｄｒｕｄ，Ｍ．Ｓ．ら（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１、３５４２−３５４９；Ｌａｍｅｔｓｃｈｗａｎｄｔｎｅｒ，Ｇ．ら（２００４）Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１３、９８７−９９４）、そして走化機能の関連した増大を示した。さらに、分極したＴｈ２クローンへのＴ−ｂｅｔのレトロウイルス形質導入は、ＩＦＮ−γ（ＣＸＣＲ３の発現の駆動において重要であることが示されたサイトカイン）の顕著な分泌を誘導する。本データに照らして、ＩＦＮ−γがＣＸＣＲ３の発現を駆動するという事実は、Ｔ−ｂｅｔの上流で作用してその発現を増大させるＩＦＮ−γとして再解釈することができ、すなわち、Ｔ−ｂｅｔがその場合ＣＸＣＲ３の発現を誘導する。これは、Ｔ−ｂｅｔの欠失が、活性化された内皮でのリンパ球の停止および走化性を包含する複数の機能のその後の抑止を伴うＣＸＣＲ３発現の低下につながることの最初の記述である。最近の報告が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞の作用機序がｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＦＮ−γおよびＣＸＣＲ３発現の阻害を介して抑制因子として作用しうることを示唆した（Ｓａｒｗｅｅｎ，Ｎ．ら（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３、２９４２−２９５１）ため、これらの知見はとりわけ興味深い。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ細胞の一作用機序が、ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＲ３発現のその後の低下ならびに炎症を起こした末梢組織への結果として起こる損なわれたＴ細胞輸送を伴うＴ−ｂｅｔの抑制を介しうるという興味深い可能性を提起する。ＣＸＣＲ３発現の絶対的喪失は、それがＴ−ｂｅｔの直接の転写標的であることを示唆するとみられる。しかしながら、転写開始部位の１Ｋｂ上流を包含するように並べられた（ｔｉｌｅｄ）リアルタイムＰＣＲプライマーを使用するクロマチン免疫沈降の使用によるＣＸＣＲ３プロモーターの濃縮は検出されていないとは言え、これはＴ−ｂｅｔ結合をこの近位プロモーター領域の外側に排除しない。逆に、他の原型のＴｈ１ケモカインＣＣＲ５の発現および走化機能は全く変わらない。興味深いことに、このケモカイン受容体のチロシン硫酸化はその効果的機能についてもまた記述されている（Ｆａｒｚａｎ，Ｍ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６、６６７−６７６）。従って、損なわれていないＴＰＳＴ−１機能がＣＣＲ５の有効な硫酸化を調節し得るがしかしＰＳＧＬ−１に十分でないことが可能である。一緒にすれば、これらの結果は、Ｔ−ｂｅｔが、既存の理論的枠組みにより以前に認識されなかった、あるレベルのＴｈ１リンパ球の輸送の制御を発揮することを示す。Ｔ細胞の特異的移動は適切な免疫応答の結果の主決定子である。本明細書に提示される実験は、Ｔｈ１特異的転写因子Ｔ−ｂｅｔが、Ｔ細胞の発生に際して移動プログラムを刷り込んで、Ｐ−セレクチンリガンドの翻訳後生合成ならびにＣＸＣＲ３の発現および機能の制御を介してｉｎ  ｖｉｖｏで炎症部位へ���適切なホーミングを確実にするという証拠を提供する。この知見は、自己免疫性、腫瘍性および感染性疾患の合理的処置、ならびに移植臓器の拒絶の予防の設計に大きな潜在的有用性を有する。
【０２４０】
同等物
当業者は、わずかに慣例の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識するであろうか、若しくは確かめることが可能であろう。こ
うした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【配列表】
2008541760000001.app
【国際調査報告】
2008541760.tif 000003
2008541760.tif 000004