(57)【要約】【課題】【解決手段】新規なホノキオール誘導体、並びにホノキオール誘導体を含んでなる医薬剤組成物。これらの化合物及び医薬剤組成物を、癌の予防及び／又は治療に使用できる。特に、ホノキオール誘導体、誘導体を含んでなる医薬剤組成物及び骨髄腫の治療へのそれらの使用方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の式Ｉａの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化１】
2008542192.tif 000070
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であって、任意に置換されてもよく、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。）
【請求項２】
請求項１記載の化合物であって、式中、
Ｒ６及びＲ７は独立にＨ又はＣ１−５アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はメチル、エチル、プロピル又はブチル基である化合物。
【請求項３】
次式の式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化２】
2008542192.tif 000071
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であって、任意に置換されてもよく、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。）
【請求項４】
請求項３記載の化合物であって、式中、
Ｒ５及びＲ７は独立にメチル、エチル又はプロピル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない化合物。
【請求項５】
以下の式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化３】
2008542192.tif 000072
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリールである。）
【請求項６】
請求項５記載の化合物であって、式中、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基である化合物。
【請求項７】
以下の群から選択される化合物。
【化４】
2008542192.tif 000073
【請求項８】
宿主の癌の治療方法であって、宿主に有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記癌が腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記癌がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を、発現又は過剰発現させる、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
宿主の骨髄腫の治療方法であって、宿主に有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、又はホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１２】
宿主の薬剤抵抗性の癌の治療方法であって、宿主に有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、又はホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体を投与することを含んでなる方法。
【請求項１３】
前記骨髄腫がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を発現又は過剰発現させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
癌が骨髄腫である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記癌がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を発現又は過剰発現させる、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨の単離された形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、単クローン性γグロブリン血症及び不応性形質細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が癌治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬と組み合わせて、又は交互に投与される、請求項８又は１２記載の方法。
【請求項１８】
前記付加的な治療薬がヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が請求項１から７のいずれか１項記載の化合物である、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項２０】
宿主の腫瘍又は癌を処置する方法であって、
（ｉ）腫瘍又は癌から生体試料を調製し、
（ｉｉ）腫瘍又は癌がホスホリパーゼＤを発現又は過剰発現するか否かを決定し、
（ｉｉｉ）その腫瘍又は癌がホスホリパーゼＤを発現又は過剰発現する場合、腫瘍又は癌を有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、ホノキオール、マグノロール又はその誘導体のいずれか１つで治療することを含んでなる方法。
【請求項２１】
前記癌が腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
宿主の炎症性症状又は骨粗鬆症の治療方法であって、宿主に有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、ホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体を、任意に、薬理学的に許容できる担体との組み合わせで投与することを含んでなる方法。
【請求項２３】
請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、及び薬理学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項２４】
異常な細胞増殖を伴う疾患の治療方法のための、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２５】
前記疾患が骨髄腫である、請求項２４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
【０００２】
本特許出願は２００５年２月２３日に出願の米国特許仮出願第６０／６５５，３４６号の優先権を主張、その開示内容は参照により本明細書に援用される。
【０００３】
（技術分野）
【０００４】
本発明は、例えば骨髄腫の治療における、血管形成、細胞増殖、腫瘍成長及び腫瘍形成を伴う障害の治療用のホノキオール関連の化合物及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００５】
癌とは細胞の異常な増殖をいう。
癌細胞は、空間的制限、他の細胞との栄養分共有又は、生体からの再生停止のためのシグナル伝達などの制限にもかかわらず、急速に複製する。
癌細胞はしばしば正常な細胞とは異なり異常な形態を示し、適切に機能せず、生体中の広範囲に拡散しうる。
異常組織（腫瘍と呼ばれる）の増殖は、途方もなく成長し、部列できる細胞クラスターである。
腫瘍は、良好（非ガン）の場合も悪性（ガン）の場合もありうる。
良性腫瘍は徐々に増殖する傾向があり、拡散しない。
悪性腫瘍は急速に増殖でき、付近の正常組織に侵入し、破壊し、生体全体に拡散する。
【０００６】
悪性癌は局所的に侵襲性であり、転移もしうる。
局所的浸潤癌は、正常組織に癌細胞の「指」を突き出し、周囲の組織に侵入できる。
転移癌は細胞を生体中の他の組織へもたらし、それは最初の腫瘍の位置から隔離している場合もありうる。
【０００７】
癌はその由来する体液又は組織に従って、又はそれが最初に生じた生体内の部位に従って分類される。
更に、若干の癌は混合型である。
癌は５つの幅広いカテゴリ（癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫）に分類でき、それは癌の組織及び血液分類を表す。
癌腫とは、器官、腺又は生体構造の表面をカバーする若しくは沿った形態で存在する上皮組織として公知の、身体組織に生じる癌である。
例えば胃の内壁ガンは癌腫と呼ばれる。
多くの癌腫は分泌（例えば乳を生産する胸部）に関与する器官又は腺に影響を及ぼす。
癌腫は全ての癌ケースのほぼ８０〜９０％を占める。
肉腫とは結合組織（例えば軟骨、脂肪、筋肉、腱及び骨）から増殖する悪性腫瘍である。
最も一般的な肉腫（骨腫瘍）は通常若年成人で生じる。
肉腫の例としては骨肉腫（骨）及び軟骨肉腫（軟骨）が挙げられる。
リンパ腫とはリンパ節又は腺（白血球を生産し、体液を浄化する）又は器官（例えば脳及び胸部）から生じる癌を指す。
リンパ腫は２つのカテゴリ（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）に分類される。
白血病（別名血液癌）とは、骨髄が通常通り赤血球、白血球及び小板状体を生産しなくなる特徴を有する、骨髄の癌である。
白血球は感染防御に必要である。
赤血球は貧血症予防に必要である。
小板状体は生体への創傷、生体液漏出を防止する。
白血病の例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病及び慢性リンパ球性白血病が挙げられる。
骨髄性及びリンパ球性という用語は、関連する細胞のタイプを示す。
最後に、骨髄腫は骨髄形質細胞において増殖する。
場合によって、骨髄腫細胞は一つの骨中に集中し、形質細胞腫と呼ばれる単一の腫瘍を形成する。
しかしながら、他の場合には骨髄腫細胞は多くの骨中で集中し、多くの骨腫瘍を形成する。
これは、多発性骨髄腫と呼ばれる。
【０００８】
現在行われる癌及び関連疾患の治療は効果が限定的であり、また多くの予想外の深刻な副作用をもたらす。
癌療法は、以下の５つの専門療法に大別される。
（１）手術、（２）放射線療法、（３）化学療法、（４）免疫療法及び（５）血管新生阻害治療。
癌の起源を発見し、癌及び関連疾患の治療法の改良を開発するためにこれまで３０年以上にわたり研究がなされたが、これらの治療は結局逐次進歩するに留まった。
現在の研究ストラテジーでは、より少ない危険性を有する有効な治療方式の探索に力点が置かれ、例えば天然物及び生物学的薬剤の使用が挙げられる。
この力点の変化は、従来の癌治療法の結果、患者及びその子孫において、多くの遺伝物質に対してそれらの影響が及ぶという事実により、更に拍車がかけられている。
癌遺伝子の起源を発見し、並びに新規な治療方法を開発するための努力が続けられている。
【０００９】
ホノキオール
【００１０】
中国医学において伝統的に、モクレン属の根及び茎樹皮が、血栓症、胃腸の不調及び不安の治療に用いられていた。
ホノキオール（ＨＮＫ）（置換ビフェニルであり、有効成分がモクレン属から単離、精製される）は、抗酸化、抗血せん症、抗菌、神経組織への栄養効果、キサンチンオキシダーゼ抑制及び、抗不安作用を有する（非特許文献１から６）。
【００１１】
１９９０年代初期において、ＨＮＫの抗癌効果が報告した。
１９９４年、平野らは、２８の天然の及び合成フラボノイド、並びに１１の天然のリガンドのヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０における抗白血病細胞の有効性を検討し、またこれらの化合物の細胞毒性に関し、４つの臨床抗癌剤との比較を行っている（非特許文献７）。
このスクリーニングで、ＨＮＫは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値を示し、最も強力な化合物の一つとして同定した。
１９９８年、Ｈｉｂａｓａｍｉらは、ＨＮＫがヒトリンパ性白血病由来のＭｏｌｔ  ４Ｂ細胞（非特許文献８）のアポトーシスを誘発することを示した。
【００１２】
ＨＮＫがヒト鱗状細胞肺癌ＣＨ２７細胞（非特許文献９）及びヒト結腸直腸ＲＫＯ細胞（非特許文献１０）のアポトーシスを誘発することも公知である。
２００４年、Ｃｈｅｎｇら（非特許文献１１）は、ＨＮＫが腫瘍増殖を阻害し、腫瘍を有するマウスの寿命を延長することから、それがヒト大腸癌のインビボ動物モデルにおいて効果的であると報告している。
【００１３】
ホノキオールは、生体内で血管新生及び抗腫瘍活性の阻害剤である。
ＨＮＫは腫瘍細胞のアポトーシスを生じさせ、また血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（主要な有糸分裂促進性及び化学誘引性の内皮細胞性増殖因子（非特許文献１２）のリン酸化のブロックにより血管新生を阻害する機能を有する。
ホノキオールはまた、腫瘍壊死因子のアポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナリングによるアポトーシス誘導を通じて直接的な抗腫瘍活性を示し、またｉｎ  ｖｉｖｏでヌードマウスの血管肉腫に対して非常に効果的であることが明らかとなっている（非特許文献１３）。
【００１４】
ＥｓｕｍｉらはＨＮＫの合成方法を開示している（非特許文献１４）。
この報告ではまた、ＨＮＫのＯメチル化及び／又はその水素化類似体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ神経栄養アッセイによる構造−活性の相関関係の評価を行っている。
Ｅｓｕｍｉらは、５−アリル及び４’−ヒドロキシル基がＨＮＫの神経栄養活性にとって重要であると結論づけている。
【００１５】
エモリー大学による特許文献１及び特許文献２では、
ホノキオール型及び／又はマグノロール型化合物（図１−４に示す）の投与により、血管新生、腫瘍性及び癌に関連する症状及び皮膚症状などの諸症状を治療するための医薬品組成物、並びに方法を開示している。
例えば、かかる組成物は、式Ａ１の少なくとも１つの化合物を含んでなる。
【化１】
2008542192.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。
ホノキオール型及びマグノロール型化合物は、ＳＶＲ細胞増殖の阻害を示す。
【００１６】
２００４年１１月、Ａｒｂｉｓｅｒらは、ホノキオールがＧ１増殖停止、更に４８時間の時点で、５〜１０μｇ／ｍＬでＩＣ５０値のアポトーシスを開始させることにより、多くの骨髄腫細胞株の増殖を阻害することを報告している。
また、ホノキオールがドキソルビン（Ｄｏｘ）耐性細胞（ＲＰＭＩ−Ｄｏｘ４０）、メファラン耐性細胞（ＲＰＭＩ−ＬＲ５）及びデキサメサゾン（Ｄｅｘ）耐性細胞（ＭＭ．１Ｒ）の増殖を阻害することも報告している。
すなわち、ホノキオールがトリガーとなる細胞障害機構が、ホノキオールにより誘導されるＢａｘ及びＢａｄの発現増加、並びにＭｃ−１タンパク質発現の負の制御、更にそれに続くｃａｓｐａｓｅ−８／９／３裂開であることを示唆されている（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００４におけるポスター発表。アブストラクトは２００４年１１月４日にオンラインで公表）。
【００１７】
２００５年７月、Ｂａｔｔｌｅらは、ホノキオールがＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞のカスパーゼに依存性アポトーシスを誘発することを報告している（非特許文献１５）。
すなわち全てのＢ−ＣＬＬ細胞（Ｂ−ＣＬＬ患者に由来する原発腫瘍細胞）における、ホノキオールにより誘導されるカスパーゼ依存性の細胞死を試験し、通常の単核細胞によりＢ−ＣＬＬ細胞に対して毒性が強かった。
またホノキオール誘導アポトーシスは、カスパーゼ−３、−８及び９の活性化、並びにポリ（アデノシン二リン酸塩−リボース）重合酵素（ＰＡＲＰ）の裂開を特徴とする。
更に、ホノキオールがフルダラビン、クラドリビン又はクロランブシルにより誘発される細胞毒性を強化するとも報告されている。
【００１８】
２００５年９月、Ｉｓｈｉｔｓｕｋａらは、ホノキオールによるカスパーゼ依存性及びカスパーゼ非依存性アポトーシスの誘導により、ヒト多発性骨髄腫の従来の薬剤耐性を克服すると報告している（非特許文献１６）。
ＨＮＫは、カスパーゼ依存性、及びカスパーゼ非依存性経路の両方を介したアポトーシスの誘導により、再発性不応性ＭＭ（多発性骨髄腫）患者からのヒトＭＭ細胞株及び腫瘍細胞における細胞毒性を誘発した。
ＨＮＫはまた、ボルテゾミブにより誘発されるＭＭ細胞毒性及びアポトーシスを強化した。
【特許文献１】国際公開第０２／０７６３９３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１０５９０６号公報
【非特許文献１】Ｔａｉｒａら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３；１９  Ｓｕｐｐｌ  ｌ：Ｓ７１−７７；
【非特許文献２】Ｔｅｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．１９８８；５０：７５７−７６５；
【非特許文献３】Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９８１；７０：９５１−９５２；
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４；１４：５０１−５０６；
【非特許文献５】Ｋｕｒｉｂａｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５０：８１９−８２６；
【非特許文献６】Ｅｓｕｍｉら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔ  ２００４，１４：２６２１−２５
【非特許文献７】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９４；５５（１３）：１０６１−９
【非特許文献８】Ｈｉｂａｓａｍｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．１９９８
【非特許文献９】Ｙａｎｇ  ＳＥ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２；６３：１６４１−１６５１
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４；１０：２２０５−２２０８
【非特許文献１１】Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４；１０：００  ３４５９−３４６３
【非特許文献１２】Ｂａｉら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７）
【非特許文献１３】Ｂａｉら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）１４：２６２１−２６２５
【非特許文献１５】Ｂｌｏｏｄ．Ｊｕｌｙ  ２００５；１０６：６９０−６９７
【非特許文献１６】Ｂｌｏｏｄ，１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．５，ｐｐ．１７９４−１８００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、血管新生、細胞増殖、腫瘍増殖、腫瘍形成及び骨髄腫を伴う疾患の治療のための新規化合物、組成物、方法及び使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ホノキオール誘導体、ホノキオール誘導体を含んでなる医薬品組成物、並びにその使用方法を提供する。
該化合物及び組成物は、血管新生、細胞増殖及び腫瘍形成及び腫瘍増殖の阻害に使用できる。
これらの化合物及び医薬品組成物は、癌（例えば多発性骨髄腫を含む骨髄腫）の予防及び／又は治療に使用できる。
【００２１】
具体的な実施態様では、骨髄腫の治療、特に多発性の骨髄腫の治療に非常に有用なホノキオール及びホノキオール誘導体を提供する。
他の具体的な実施態様では、これらの化合物は白血病（例えば慢性リンパ球性白血病）の治療に使用できる。
特に、本明細書に記載の化合物は、慢性リンパ球性白血病細胞（ＣＬＬ）（変異体ｐ５３を有するそれらを含むがこれに限定されない）の治療に使用できる。
【００２２】
本発明の一態様は、ホノキオールがカスパーゼから独立した機構で癌細胞のアポトーシスを誘発することができるという発見に基づく。
本発明はまた、非ガン腫瘍及び他の増殖的な症状の治療をカバーする。
【００２３】
低濃度の特定のカスパーゼ（例えばカスパーゼ−３及びカスパーゼ−８）を有する癌細胞株は、抗癌剤耐性を伴いうる。
本明細書に開示のホノキオール及びホノキオール誘導体は、本明細書に開示の癌及び薬剤の実施態様を含む、１つ以上の薬剤に対する耐性を示す癌の治療に使用できる。
一実施態様では、本明細書に開示するホノキオール又はその誘導体を、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及びレブリミドなどに対する薬剤抵抗性の腫瘍（例えば多剤耐性の腫瘍）を有する患者の治療における有効量で投与する。
具体的な一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体はドキソルビシン耐性多発性骨髄腫の治療に使用できる。
【００２４】
該ホノキオール又は誘導体はそれ単独で投与してもよく、又は付加的な治療用若しくは化学療法用の薬剤と組み合わせて投与してもよい。
具体的な実施態様では、ホノキオール又は誘導体は、薬剤抵抗性の多発性骨髄腫の治療における有効量で投与できる。
一実施態様では、付加的な化学療法剤は、Ｐ−糖タンパク質阻害剤（例えばベラパミル）、サイクロスポリン（例えばサイクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリンアンタゴニスト、デキスベラパミル、デキスニグルジピン、バルスポダール（ＰＳＣ８３３）、ビリコダール（ＶＸ−７１０）、タリキダール（ＸＲ９５７６）、ゾスキダール（ＬＹ３３５９７９）、ラニキダール（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３）であってもよい。
他の実施態様では、付加的な化学療法剤はヒストンデアセチラーゼ阻害剤であってもよい。
具体的な実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、スベロイラアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）であってもよい。
【００２５】
一実施態様では、本明細書に開示する有効量のホノキオール誘導体を宿主に投与することを含む、宿主の癌の治療方法を提供する。
癌は、例えば癌、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫であってもよい。
【００２６】
具体的な実施態様では、宿主の骨髄腫の治療方法であって、宿主に有効量のホノキオールを投与すること、又は宿主に本明細書に開示のホノキオール誘導体化合物を投与することを含んでなる方法を提供する。
骨髄腫は、例えば多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、単離された骨の形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、単クローン性の免疫グロブリン血症又は抵抗性の形質細胞腫瘍であってもよい。
【００２７】
他の実施態様では、化合物は癌（骨髄腫を含む）の治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬との組合せ又は交互使用において投与される。
具体的な実施態様では、宿主の血管新生、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍性の症状、癌又は皮膚疾患を特徴とする症状の治療方法であって、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて本明細書に開示の化合物の有効量を宿主に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２８】
更なる実施態様では、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて有効量の本明細書に開示の化合物を宿主に投与することによる、炎症を特徴とする症状の治療方法を提供する。
具体的な実施態様では、有効量の本明細書に開示の化合物を投与することによる、関節炎の治療方法も提供する。
【００２９】
他の実施態様では、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて本明細書に開示の化合物の有効量を宿主に投与することによる、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患の治療方法を提供する。
【００３０】
更なる本発明の目的は、本明細書に記載のホノキオール及び／又は関連化合物の毒性作用に特に感受性の高い腫瘍及び癌を確認する方法を提供することである。
本発明の一態様は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現する腫瘍が特にホノキオール又はその誘導体の毒性作用に感受性であるという発見に基づく。
一実施態様では、以下の手順を含む、哺乳類（特にヒト）の腫瘍の治療方法を提供する。
（ｉ）  腫瘍から生体試料を調製し、
（ｉｉ）  腫瘍がホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現するか否かを決定し、
（ｉｉｉ）  ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現する腫瘍を本明細書に記載のホノキオール又は関連化合物で活性化させる。
一実施態様では、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、例えばリン酸化された形態を検出できる抗体を用いて、腫瘍又は癌におけるリン酸化ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの存在をアッセイすることにより測定できる。
他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、患者から得られる腫瘍又は癌細胞をアッセイして、コントロールの組織のレベルと比較することにより測定できる。
ある実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫは、癌サンプルではコントロールと比較して少なくとも２、２．５、３又は５倍過剰発現しうる。
【００３１】
典型的な化合物としては図１から４の化合物及び本明細書に開示の化合物が挙げられ、例えば以下の化合物Ｉａ又はその塩、エステル若しくはプロドラッグが含まれる。
【化２】
2008542192.tif 000003
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例：メチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル器）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
式Ｉａの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル基）である。
【００３２】
他の実施態様では、該化合物は式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化３】
2008542192.tif 000004
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
式Ｉｂの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基））であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００３３】
更に式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ若しくはＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグを提供する。
【化４】
2008542192.tif 000005
【化５】
2008542192.tif 000006
【化６】
2008542192.tif 000007
【化７】
2008542192.tif 000008
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００３４】
式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）である。
【００３５】
他の実施態様では、該化合物は式Ｄ２で表される。
【化８】
2008542192.tif 000009
式中、アリル基は酸化又は還元された形態である。
【００３６】
他の実施態様では、化合物は式Ｄ３で表される。
【化９】
2008542192.tif 000010
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を表し、例えば、各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００３７】
他の実施態様では、該化合物は、以下の式中の１つの化合物である。
【化１０】
2008542192.tif 000011
式中、各Ｒは独立にアルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。
任意に、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルケニル又はＣ１−１０アルキニル基である。
例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる：
【化１１】
2008542192.tif 000012
式Ｄ５において、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１であって、各Ｒ１が独立に、例えばＨ又はアルキル基である。
【００３８】
式Ｄ６、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂでは、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル又はＣ１−１０アルキル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。
式Ｄ６では、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂに示すように、点線は、５員環又は６員環を形成するＣＨ２基の有無を示す。
【００３９】
式Ｄ９では、ｎが１〜８であるとき、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎである。
【００４０】
式Ｄ１０及びＤ１１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００４１】
具体的な実施態様では、上記で開示される化合物は、骨髄腫の治療における有効量において投与されうる。
【００４２】
一実施態様では、血管新生、腫瘍形成、腫瘍性の症状、癌又は皮膚疾患を特徴とする症状の治療における有効量で、それを必要とする宿主に本明細書に開示の化合物又は化合物を含んでなる医薬品組成物の有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００４３】
一実施態様では、それを必要とする個人に本明細書に開示の化合物又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステルの有効量を投与することを含んでなる、癌（例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫）の治療方法を提供する。
任意に該化合物又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステル、並びに適当な担体（例えば水）を含む薬理学的に許容できる組成物であって、それを必要とする個人に所望の投与経路で処方されるものを提供する。
任意に、該化合物は、癌又は、特定の骨髄腫の治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬との組合せ又は交互使用において投与される。
【００４４】
また、任意に薬理学的に許容できる担体に、本明細書に開示の化合物又はその塩、プロドラッグ又はエステルの癌、特に骨髄腫の治療にける使用は、本発明の範囲内であり、
また、本明細書に開示の化合物又は塩、プロドラッグ若しくはエステルの、癌（特に骨髄腫）の治療用の薬剤（任意に薬理学的に許容できる担体中に含まれる）の製造における使用を開示する。
【００４５】
一実施態様では、本発明の化合物は、癌、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫の治療及び／又は予防に使用できる。
本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は固形腫瘍の治療に使用できる。
更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、例えば、以下の器官又は組織の癌（それらに限定されない）の治療に使用できる。
胸部、前立腺、骨、肺、結腸（結腸直腸など）、尿道、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、腎臓、膵臓、咽頭、甲状腺、胃、脳及び／又は多発性骨髄腫。
本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は血管新生関連の疾患の治療に使用できる。
【００４６】
特定の本発明の実施態様では、本明細書に記載の化合物を骨髄腫の治療に使用できる。
一実施態様では、ホノキオールを骨髄腫の治療に使用できる。
本発明の他の一実施態様では、ホノキオール又は本明細書に記載の化合物又は組成物のいずれかを、例えば、形質細胞腫瘍（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨の単離形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症又はリンパ形質細胞性白血病、単クローン性γグロブリン血症、及び／又は不応性形質細胞腫瘍など）の治療に使用できる。
【００４７】
１つの態様では、該化合物及び組成物は、少なくとも１つの付加的な化学療法剤との組合せ又は交互使用において投与できる。
外薬剤は同じ組成物の一部を構成してもよく、又は同時若しくは別の時間にそれぞれの組成物として投与するように調剤してもよい。
一実施態様では、本発明の組成物は抗血管新生薬剤と組み合わせてもよい。
本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、以下のタイプの薬剤（それらに限定されない）との組合せ又は交互使用において使用できる。
抗増殖剤、有糸分裂阻害剤、抗代謝剤、アルキル化剤又はナイトロジェンマスタード、トポイソメラーゼを標的とする薬剤、腫瘍細胞のシグナル伝達を標的とする薬剤、遺伝子治療及びアンチセンス薬剤、抗体医薬、ステロイド、ステロイド類似体、抗嘔吐薬及び／又は非ステロイド性薬剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
定義
【００４９】
特に明記しない限り、本明細書で用いる用語「アルキル」には、飽和した直鎖状、分岐状、又は環状の、第一級、第二級又は第三級の炭化水素（Ｃ１−２２又はＣ１−１０のものを含む）、特にメチル、エチル、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、ヘプチル、シクロヘプチル、オクチル、シクロ−オクチル、ドデシル、トリデシル、ペンタデシル、イコシル、ヘミコシル及びデコシル基が含まれる。
例えば、アルキル基はハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩又はホスホン酸塩により任意に置換されてもよく、非保護でもよく、又は当業者に公知の方法で必要に応じて保護してもよい（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，参照により本明細書に援用）。
【００５０】
本明細書では特に明記しない限り、用語「低級アルキル」とは、Ｃ１−Ｃ４の飽和の直鎖、分岐、又は適当な場合は環状（例えばシクロプロピル）アルキル基（任意に置換されてもよい）である。
【００５１】
用語「アミノ」とは、「−Ｎ（Ｒ）２」基（第一級、第二級及び第三級アミンを含む）を指し、アルキル、アリール、ヘテロ環、又はスルホニル基などで任意に置換されてもよい。
ここで、（Ｒ）２には２つの水素、水素及びアルキル、水素及びアリール、水素及びアルケニル、２つのアルキル、２アリール、２つのアルケニル、１つのアルキル及び１つのアルケニル、１つのアルキル及び１つのアリール又は、１つのアリール及び１つのアルケニル基が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
炭素原子の範囲が指されるときは、独立に及び別にあらゆる範囲のメンバーが含まれる。
非限定的な例として、用語「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」には、独立に、グループの各メンバーを含むと考慮されること、例えば、Ｃ１−Ｃ１０アルキルは、直鎖状、分岐状及び適切であれば環状のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキル官能性が含まれる。
【００５３】
用語「アミド」とは、「−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２」の構造で表される部分を含んでなる（Ｒが任意に置換されてもよいアルキル、アルケニル及びアリール基を含んでもよい）ものを指す。
【００５４】
本明細書「保護される」の用語には、特に明記しない限り、酸素、窒素又はリン原子又は他のなど原子に付加される、更なる反応を防止するための基が含まれる。
多種多様な酸素及び窒素への保護基は、有機合成の当業者に公知である。
【００５５】
本明細書では、特に明記しない限り、「アリール」とは最高８つのメンバーを各環に有する安定な単環、二環又は三環の炭素環であって、少なくとも１つの環は芳香族であるものを指す。
例えばベンジル、フェニル、ビフェニル又はナフチル基が含まれるが、これに限定されない。
アリール基は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸塩などの１つ以上の部分により置換されされてもよく、保護されていても、又は必要に応じて当業者に公知の方法（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１）で保護してもよい。
【００５６】
本明細書で用いる用語「ハロ」とは、特にクロロ、ブロモ、ヨード及びフルオロを指す。
【００５７】
用語「アルケニル」とは、１つの少なくとも１つの二重結合を有する、Ｃ２−２２の直鎖状、分岐状、又は環状不飽和炭化水素を指す。
例えば、ビニル、アリル及びメチル−ビニル基などが挙げられる。
アルケニル基は上記アルキル基と同様に任意に置換されてもよい。
【００５８】
「アルキニル」とは、少なくとも１つの三重結合を有する、１つのＣ２−２２を含む直鎖又は分岐炭化水素を指す。
アルキニル基は上記のアルキル基と同様に任意に置換されてもよい。
【００５９】
用語「アルコキシ」は、構造の部分が含まれる−Ｏ−アルキル。
【００６０】
用語「複素環」又は「ヘテロ環」とは、飽和、不飽和、又は芳香族単環（例えば安定５〜７つの幾つかの部分から成る単環）又は二環式複素環（例えば８〜１１の幾つかの部分から成る二環式）であって、
炭素原子及び１〜３のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰなど）からなり、
窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化でき、及び／又は窒素原子は四級化されてもよく、
並びに上記の定義された任意の複素環がベンゼン環と融合したいかなる二環基も含まれる。
複素環は、安定建造の形成をもたらすいかなるヘテロ原子又は炭素原子と結合してもよい。
非限定的な複素環基の例には、ピロリル、ピリミジル、ピリジニル、イミダゾリル、ピリジル、フラニル、ピラゾール、オキサゾリル、オキシラン、イソオキサゾリル、インドリル、イソインドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チオフェン、ピペラジン及びピロリジン基が含まれる。
【００６１】
用語「アシル」とは、式Ｒ’Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ’基が直鎖、分岐又は環状の置換又は非置換のアルキル又はアリール基）を指す。
【００６２】
本明細書で用いる「宿主」には特に明記しない限り、治療を必要とする哺乳類（例えばネコ、イヌ、ウマ、マウス、その他）、ヒト又は他の生物体が包含される。
癌関連の症状のような「素因」的症状を有する宿主は、これらの症状の１つ以上の明白な徴候を呈しないが、遺伝的に、生理的に又は別の理由から、これらの症状の１つ以上を発展させる危険を有する宿主として定義できる。
すなわち、本発明の組成物はこれらの症状に対する化学的な予防薬として使用できる。
更に、本明細書に記載の「組成物」には１つ以上の化学物質が含まれてもよい。
【００６３】
本明細書で用いる用語「有効量による治療」には、例えば血管新生の疾患又は症状の１つ以上の治療、予防若しくは好転（腫瘍増殖を抑制、腫瘍体積を減少させる、あるいは腫瘍転移を減速若しくはブロックする）に充分な量を投与すること、また、疾患又は症状の１つ以上の改善及び好転をもたらす量が含まれる。
【００６４】
本明細書で用いる用語「薬理学的に許容できる塩」には、特に明記しない限り、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的であるそれらの塩が含まれる。
塩は、組成物の１つ以上の化合物の最終的な単離及び精製の間、又は別個に遊離塩基と適切な有機酸とを反応させることによりｉｎ  ｓｉｔｕで調製できる。
目的化合物の合成及び／又は精製において、例えば薬理学的に許容できない酸及び塩基も、本発明で使用できる。
かかる塩の非限定的な例としては、
（ａ）無機塩（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、など）から形成される酸付加塩、並びに有機塩（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、など）から形成される塩、
（ｂ）金属カチオン（例えば亜鉛、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、ニッケルなど）から形成される塩基付加塩、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せが挙げられる。
【００６５】
代表的な酸性付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、二硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳硫酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、酪酸塩、ラウレート、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレン硫酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクラート、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸エステル、トルエンスルホン酸塩、ウンデカノン酸塩、吉草酸塩などが含まれるが、これに限定されない。。
【００６６】
薬理学的に許容できる塩として使用できる代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、
並びに無毒性アンモニウム、四級アンモニウム及びアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなど）などが含まれるが、こられに限定されない。
【００６７】
本明細書で用いる用語「薬理学的に許容できるエステル」には、特に明記しない限り、組成物の１つ以上の化合物のエステルが含まれ、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的であるものである。
【００６８】
本明細書で用いる「薬理学的に許容できるプロドラッグ」には、特に明記しない限り、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的である組成物の１つ以上の化合物のプロドラッグが包含される。
【００６９】
薬理学的に許容できるプロドラッグには、可能なときは、組成物の１つ以上の化合物の双性イオン形が含まれる。
用語「プロドラッグ」には、例えば血液中での加水分解により、生体内で急速に変化し親化合物を産生する化合物が含まれる。
本明細書で用いる「薬理学的に許容できる担体及び／又は賦形剤」とは特に明記しない限り、溶媒、希釈剤又は他の液状担体、分散剤又は懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、アジュバント、担体、輸送システム、崩壊剤、吸収剤、表面活性剤、着色剤、風味剤又は甘味料など、要求される特定の剤形に適するいかなる担体も含まれる。
【００７０】
Ｉ．化合物
【００７１】
本明細書に開示の化合物は、一実施態様では、例えば癌（特に多発性骨髄腫）に対して有用な活性を有する方法及び組成物において使用できる。
用語「ホノキオール誘導体」には、ホノキオール型及びマグノロール型化合物、又は本明細書に記載の所望のホノキオール性の活性を有する他の化合物が含まれると解され。
【００７２】
一実施態様では、該化合物は式Ｉａの化合物又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化１２】
2008542192.tif 000013
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例：メチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル器）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
式Ｉａの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル基）である。
【００７３】
他の実施態様では、該化合物は式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化１３】
2008542192.tif 000014
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
式Ｉｂの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基））であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００７４】
更に式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ若しくはＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグを提供する。
【化１４】
2008542192.tif 000015
【化１５】
2008542192.tif 000016
【化１６】
2008542192.tif 000017
【化１７】
2008542192.tif 000018
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）である。
【００７５】
一実施態様では、該化合物はホノキオール又はマグノロールである。
【化１８】
2008542192.tif 000019
他の典型的なホノキオール誘導体は米国特許出願公開第２００４／０１０５９０６号公報にて説明したように、図１、２、３及び４の化合物が含まれる（２００４年６月３日に公開、開示は本明細書に援用される）。
誘導体は、例えばホノキオール、ホノキオール型化合物又はマグノロール型合成、並びにその他本明細書に開示の所望のホノキオール活性を有する多様な誘導体であってもよい。
【００７６】
ホノキオール型化合物には、図１記載の構造式Ａ１が含まれるが、これに限定されない。
特に、ホノキオール型化合物には図１に例示される構造式Ａ２が含まれてもよい。
ホノキオール型化合物の官能基はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５で表される。
これらの官能基は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。
図２では独立に選択できるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５を含んでなる典型的な官能基を例示する。
【００７７】
更に、ホノキオール型化合物には、上記で記載又は指した化合物の薬理学的に許容できる塩、エステル及びプロドラッグが含まれる。
【００７８】
マグノロール型化合物には、図１に示す構造式Ｂ１が含まれるが、これに限定されない。
特に、マグノロール型化合物には図１において例示される構造Ｂ２を含んでもよい。
マグノロール型化合物の官能基は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５として示される。
該官能基は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。
図２では独立に選択できるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５を含んでなる典型的な官能基を例示する。
【００７９】
ホノキオール型化合物の類似体、同族体、異性体又は誘導体もまた、宿主の血管新生、腫瘍形成及び腫瘍性の症状の治療、及び／又は予防的な化学組成物として機能し、並びに本明細書に記載の化合物の薬理学的に許容できる塩、エステル及びプロドラッグとして使用できる。
【００８０】
図３及び４は、他の有用な化合物の例である更なる構造式Ｃ１から７を例示する。
これらの化合物は、上記のホノキオール型及び／又はマグノロール型化合物の代わりに、又はそれらに追加して使用できる。
その場合、官能基Ｒ’６及びＲ’７は独立に、記載する官能基のいずれか、又は図２に関して上記したものを指す。
【００８１】
他の有用な化合物として、式Ｄ２の化合物が挙げられる。
【化１９】
2008542192.tif 000020
式中、アリル基は酸化又は還元された形態である。
【００８２】
他の実施態様では、化合物は式Ｄ３で表される。
【化２０】
2008542192.tif 000021
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を表し、例えば、各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００８３】
他の実施態様では、該化合物は、以下の式中の１つの化合物である。
【化２１】
2008542192.tif 000022
式中、各Ｒは独立にアルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。
任意に、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルケニル又はＣ１−１０アルキニル基である。
例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる：
【化２２】
2008542192.tif 000023
式Ｄ５において、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１であって、各Ｒ１が独立に、例えばＨ又はアルキル基である。
【００８４】
式Ｄ６、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂでは、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル又はＣ１−１０アルキル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。
式Ｄ６では、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂに示すように、点線は、５員環又は６員環を形成するＣＨ２基の有無を示す。
【００８５】
式Ｄ９では、ｎが１〜８であるとき、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎである。
【００８６】
式Ｄ１０及びＤ１１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００８７】
一実施態様では、該化合物は以下の化合物の１つである。
【化２３】
2008542192.tif 000024
他の実施態様では、該化合物化合物は以下の式で表される。
【化２４】
2008542192.tif 000025
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を意味し、例えば各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００８８】
他の実施態様では、該化合物は以下の式の１つである。
【化２５】
2008542192.tif 000026
各Ｒは独立に、アルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。
例えば、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルケニル基又はＣ１−１０アルキニル基であってもよい。
例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる。
【化２６】
2008542192.tif 000027
式Ｄ５−１では、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１で、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基である。
【００８９】
式Ｄ６−１では、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。
【００９０】
式Ｄ９−１では、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎであって、ｎは例えば１〜８である。
式Ｄ１０−１、Ｄ１０−２及びＤ１１−１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
【００９１】
Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００９２】
他の実施態様では、該化合物は以下の式で表される。
【化２７】
2008542192.tif 000028
式中、各Ｒ、Ｒ’Ｒ’’及びＲ’’’は独立に水素、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（例えばｎ＝１〜１０）、
【化２８】
2008542192.tif 000029
であって、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは各々独立に水素、ＯＨ、Ｏアルキル、アルキル（Ｃ１−８アルキルを含む）、アルケニル基又はハロゲンである。
【００９３】
他の実施態様では、該化合物はバルプロン酸（Ｄｅｐａｋｏｔｅ、Ｄｅｐａｋｅｎｅ）、又はその薬理学的に許容できる塩、エステル若しくはプロドラッグである。
バルプロン酸は抗てんかん薬であって、肝臓のグルクロニダーゼ及びエポキシドヒドロラーゼを阻害することが公知である。
【００９４】
他の有用な化合物は以下の式（反応式１Ａ）で示される化合物、並びにその塩、エステル、異性体及びプロドラッグである。
【００９５】
反応式１Ａ
【化２９】
2008542192.tif 000030
【００９６】
有用な化合物の更なる実施態様では、表１に列挙する化合物、並びにその塩、異性体、エステル及びプロドラッグが挙げられる。
【表１】
2008542192.tif 000031
2008542192.tif 000032
2008542192.tif 000033
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2008542192.tif 000039
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2008542192.tif 000049
本明細書に開示の化合物がキラル中心を含んでもよいことを理解すべきである。
かかるキラル中心は（Ｒ）又は（Ｓ）いずれかの立体配座でもよく、又はその混合物でもよい。
【００９７】
すなわち、本明細書の化合物は、鏡像異性的に純粋でもく、又は立体異性体若しくはジアステレオマー混合物でもよい。
本明細書に開示の化合物には、いかなるラセミ体、光学活性体、多形、立体異性体、又はそれらの混合物も含まれるものと理解される。それは好ましくは、本明細書に記載の有用な特性を有し、また光学活性体の調製方法、及び本明細書に記載の標準的な試験方法若しくは公知の他の類似の試験を使用して活性を測定できる。
化合物の光学異性体を得るために使用できる方法の例としては、以下が挙げられる。
ｉ）「結晶の物理的分離」：手作業で個々のエナンチオマーの肉眼で確認できる結晶を分離する方法。
別々のエナンチオマーの結晶が存在する場合、この技術が使用できる。すなわち、材料が集合体であり、かつ結晶が視覚的に明瞭である場合である。
ｉｉ）「同時結晶化」：個々のエナンチオマーをラセミ化合物の溶液から別々に結晶化させる方法。但しそれが固体状物の集合体である場合のみ可能である。
ｉｉｉ）「酵素的分離」：酵素とエナンチオマーとの異なる反応速度を利用した、ラセミ化合物の部分的又は完全な分離方法。
ｉｖ）「酵素的不斉合成」：少なくとも１つの処理において酵素反応を使用して、所望のエナンチオマーの鏡像異性的に純粋又は強化された合成前駆体を得る合成方法。
ｖ）「化学的不斉合成」：所望のエナンチオマーが、アシンメトリ（すなわち鏡像異性）の生成物（キラル触媒又はキラル補助剤を使用して提供できる）を生じる条件の下でアキラル前駆体から合成される合成方法。
ｖｉ）「ジアステレオマー分離」：ラセミ化合物が鏡像異性的に純粋な試薬（補助キラル）と反応し、個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換する方法。
得られるジアステレオマーを、個々の構造の違いにより更にクロマトグラフィ又は結晶化により分離し、その後キラル助剤を除去して所望のエナンチオマーを得る方法である。
ｖｉｉ）「一次元及び二次元アシンメトリ変換」ラセミ化合物からのジアステレオマーを平衡化させ、ジアステレオマーの溶液中で所望のエナンチオマーから優勢を得る方法、あるいは、所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優先結晶化が平衡を混乱させ、結局原則として全ての材料が所望のエナンチオマーから結晶ジアステレオマーに変変換される方法。
所望のエナンチオマーが更にジアステレオマーから遊離する。
ｖｉｉｉ）「動力学的分離」：この方法は、動力学的条件下でキラル、非ラセミ試薬又は触媒とエナンチオマーとの異なる反応速度を利用した、ラセミ化合物の部分的又は完全な分離（又は部分的に分離された化合物の更なる分離）を指す。
ｉｘ）「非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成」：所望のエナンチオマーを非キラル開始材料から得る方法であって、立体化学的な完全性が合成過程を通じて全く又はほとんど損なわれない合成方法。
ｘ）「キラル液体クロマトグラフィ」：ラセミ化合物のエナンチオマーが、静止相との異なる相互作用を利用して、液体移動相において分離される方法。
静止相はキラル材料で作製されてもよく、又は移動相に更にキラル材料を添加して異なる相互作用を引き起こしてもよい。
ｘｉ）「キラルガスクロマトグラフィ」：ラセミ化合物を揮発させ、エナンチオマーを、固定された非ラセミキラル吸着剤を含むカラムでガス状の移動相におけるそれらの異なる相互作用により分離する方法。
ｘｉｉ）「キラル溶媒を有する抽出」：特定のキラル溶媒への１つのエナンチオマーの優先的溶解によりエナンチオマーを分離する方法。
ｘｉｉｉ）「キラル膜輸送」ラセミ化合物を薄膜バリアと接触させて配置する方法。
バリアは通常は２つの混和性の流体（１つはラセミ化合物を含む）を分離しているが、濃度又は圧力差のような駆動力により膜バリアを透過する優先的な輸送が生じる。
ラセミ化合物中の１つのエナンチオマーだけを通過させる膜の非ラセミキラル特性を利用して分離が行われる。
【００９８】
ＩＩ．治療方法
【００９９】
本発明の化合物及び医薬品組成物は、血管新生、腫瘍形成、腫瘍性の症状、癌、皮膚疾患、炎症性障害及び／又は骨疾患（例えば骨粗鬆症）を特徴とする症状の治療に使用できる。
【０１００】
癌
【０１０１】
一実施態様では、本発明の化合物は癌、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫の治療に使用できる。
本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は固形腫瘍の治療に使用できる。
【０１０２】
例えば、本発明発明の化合物が以下の器官又は組織における癌の治療に使用できるが、以下に限定されない。
胸部、前立腺、肺、気管支、大腸、尿中、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、腎臓、膵臓、咽頭、甲状腺、胃、脳、多発性骨髄腫、食道、肝臓、肝内胆管、頸部、喉頭、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、軟組織、例えば心臓、ホジキンリンパ腫、精巣、小腸、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、肛門、肛門管、甲状腺で、肛門直腸外陰部、胆嚢、胸膜、目、鼻鼻腔、中耳、咽頭鼻部、尿管、腹膜、網、隔膜及び胃腸、高等膠腫、神経グリア芽細胞腫、大腸、直腸、膵臓、胃癌、肝癌、
頭頚部癌、癌腫、
腎細胞癌、
腺癌、
肉腫、
血管内皮腫、
リンパ腫、
白血病、菌状息肉腫。
更なる実施態様では、本発明の化合物は悪性腫瘍疾患血管肉腫、血管内皮腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫及びカポシ肉腫、並びに非悪性の疾患又は症状（例えば乾癬、リンパ管起源、幼年期の血管腫、Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ症候群、尋常性疣贅、神経線維腫症、結節硬化症、化膿性肉芽腫、劣性ジストロフィの表皮水疱症、静脈潰瘍、ざ瘡、酒さ、湿疹、接触感染性の軟属腫、脂漏性角化症及び日光性角化症）などの治療に使用できるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明の組成物は、癌の発見から進行期までのいかなる段階でもこれらの癌及び他の癌の治療に使用できる。
更に、本発明の組成物は原発癌及びその転移の治療において使用できる。
本発明の他の実施態様では、本明細書に記載の化合物は下記の表２に列記する癌をはじめとする癌の治療に使用できる。
【０１０４】
【表２】
2008542192.tif 000050
2008542192.tif 000051
2008542192.tif 000052
骨髄腫
【０１０５】
本発明の特定の実施態様では、本明細書に記載の化合物は骨髄腫の治療に使用できる。
一実施態様では、ホノキオールが骨髄腫の治療に使用できる。
本発明の他の一実施態様では、ホノキオール又は本明細書に記載の化合物又は組成物のいずれかを用いて、例えば多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症又はリンパ形質細胞性白血病、単クローン性形質細胞腫、単クローン性γグロブリン血症、くすぶり型骨髄腫、形質細胞腫瘍、ステージＩ多発性骨髄腫、ステージＩＩ多発性骨髄腫、及び／又は不応性の形質細胞腫瘍などの治療に使用できる。
【０１０６】
骨髄腫又は形質細胞腫瘍とは、血液（形質細胞と呼ばれる）の特定の細胞が癌になる疾患である。
形質細胞はリンパ球と呼ばれている白血球により作られる。
形質細胞は生体への感染源及び他の有害物質と戦う抗体を産生する。
これらの細胞が癌になると、非常に多くの抗体、並びにＭ−タンパク質と呼ばれる、血液及び尿で検出される物質を産生する。
数種類の形質細胞腫瘍が知られている。
最も一般的なタイプは多発性骨髄腫と呼ばれている。
多発性骨髄腫の場合、ガン形質細胞は骨髄に存在する。
骨髄とは生体の大きな骨内部の海綿状組織である。
骨髄は赤血球（酸素及び他の材料を生体の全ての組織へ輸送する）、白血球（感染と戦う）及び小板状体（血餅を作る）を産生する。
癌細胞は通常の血液細胞を減少させ、貧血症（数赤血球減少）を引き起こす。
形質細胞はまた、骨の破壊を引き起こしうる。
プラズマ細胞は骨中で集合し、形質細胞腫と呼ばれる小さい腫瘍を形成する。
形質細胞腫瘍はまた、骨及び軟組織の形質細胞（形質細胞腫）の腫瘍、骨髄又は血液中の非癌細胞としてのみ出現することもある。
マクログロブリン血症は、Ｍ−タンパク質を作るリンパ球が血液中に蓄積するタイプの形質細胞腫瘍である。
それによりリンパ節、肝臓及び脾臓が膨張する。
【０１０７】
多発性骨髄腫（ＭＭ）とは骨髄の単クローン性の形質細胞の激増を特徴とする悪性Ｂ細胞である。
サリドマイド、レブリミド及びボルテゾミブなどの新薬、並びに大量療法の臨床有効性にもかかわらず、再発性及び不応性ＭＭ患者の場合は効果に持続性がなく、また治癒する患者はほとんどいない。
従って、新規な治療ストラテジーが患者の症状の改善に必要である。
【０１０８】
本発明の１つの態様は、ＨＮＫが多発性骨髄腫に対して効果的であるという意外な発見に基づく。
ＨＮＫは増殖を阻害することができ、カスパーゼ依存性の及び独立した経路の両方を介してＭＭ細胞のアポトーシスを誘導でき、従来の薬剤耐性を克服し、ＢＭ環境で血管新生を阻害し、及び／又はボルテゾミブのＭＭ細胞毒性を強化する。
【０１０９】
ＨＮＫは、再発性・不応性ＭＭ患者からのヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株及び腫瘍細胞に対する細胞毒性を著しく誘導する。
骨髄間質細胞との共培養、又はサイトカイン（インターロイキン６及びインスリン様増殖因子１）との共培養を行っても、ＨＮＫで誘導される細胞毒性からは防護されない。
カスパーゼ３、７、８及び９の活性化はＨＮＫにより活性化されるものの、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはＨＮＫで誘導されるアポトーシスを阻害しない。
重要なことは、カスパーゼから独立したアポトーシスＡＩＦのミトコンドリアからの遊離が、ＨＮＫ治療により誘導されることである。
ＨＮＫは、従来の薬剤及び新規な薬剤への耐性に関連したカスパーゼ−３及び−８を低濃度で有するＳＵ−ＤＨＬ４細胞株におけるアポトーシスを誘導する。
いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＨＮＫがカスパーゼ依存性の経路及び他の独立の経路の両方を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。
更に、ＨＮＫは他の薬剤（例えばボルテゾミブ）により誘発されるＭＭ細胞毒性及びアポトーシスを強化できる。
ＭＭ細胞に対するその直接の細胞毒性に加えて、ＨＮＫはまた内皮細胞付近での管形成を抑制し、それはＨＮＫが骨髄微細環境中で血管新生を阻害することを示唆する。
このように、ＨＮＫ及びその誘導体はＭＭの患者の治療に使用できる。
【０１１０】
薬剤抵抗性癌
【０１１１】
本発明の一態様は、ホノキオールがカスパーゼから独立した機構により癌細胞のアポトーシスを誘導できるという発見に基づく。
低濃度の特定のカスパーゼ（例えばカスパーゼ−３及びカスパーゼ−８）を有する癌細胞株は抗癌剤耐性を伴いうる。
薬剤耐性は癌における深刻な問題である。
本発明は薬剤抵抗性癌の治療に使用できるホノキオール及びホノキオール誘導体を提供し、また本明細書に開示の癌及び薬の実施態様が含まれる。
一実施態様では、ホノキオール又は誘導体は第２の薬剤と共に投与される。
【０１１２】
多種薬剤耐性（ＭＤＲ）はヒト癌で生じ、化学療法の成功に対する重要な障害でありうる。
多種薬剤耐性は、１つの細胞毒性薬剤にさらされた腫瘍細胞が、構造的に及び機能的に無関係な化合物に関する、インヴィトロでの交差耐性を獲得する現象である。
更にＭＤＲは、化学療法薬剤に本質的に過去に曝露されたことのない若干の癌でも起こりうる。
すなわち、本発明は一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体の投与により、薬剤抵抗性の癌（例えば多種薬剤耐性癌）患者の治療方法を提供する。
【０１１３】
一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体が、従来技術において公知の、又は本明細書に記載の、大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓、肝臓及び／又は他の器官におけるいかなる薬剤抵抗性の癌の治療に使用できる。
具体的態様では、ホノキオール又はその誘導体（本明細書に記載の誘導体が含まれる）は、薬剤抵抗性多発性骨髄腫の治療における有効量で投与できる。
一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及び／又はレブリミドに抵抗性の多発性骨髄腫の治療において有効量で投与できる。
【０１１４】
血管新生関連の疾患
【０１１５】
本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は血管新生関連の疾患の治療に使用できる。
【０１１６】
Ｆｏｌｋｍａｎ氏は、全ての増殖性の腫瘍が血管を伴い、また複数の動物モデルによる実験結果から、腫瘍増殖は血管新生依存的であることを明らかにした（オライリーその他（１９９４），Ｃｅｌｌ７９（３１５−３２８））。
腫瘍血管新生の発見により、血管新生の腫瘍増殖因子（例えば塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））の発見をもたらした。
更に、腫瘍細胞及び腫瘍から派生した炎症細胞は、前血管新生サイトカイン（例えばインターロイキン６、８及びコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ））を遊離させることができる（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ、Ｒ．Ａ．ら，（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１４５６−１４６３、Ｌｕその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、９２１５−９２１９、Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９９）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３（８３８−８４２））。
高度な悪性腫瘍の発現は、腫瘍が、内因性の血管新生阻害因子（トロンボスポンジン、インターフェロン及びマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤）と刺激因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＣＲＨ及びマトリックスメタロプロテイナーゼ）との均衡状態から血管新生の刺激による不均衡状態へ行こうすることによる、公知の血管新生のスイッチにより開始する。
また優位なオンコジーンの活性化及び癌抑制遺伝子の損失も血管新生のスイッチを入れる役割を果たす（Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４（８６１−８６６）、Ｈａｎａｈａｎ（Ｄ．＆Ｆｏｌｋｍａｎ）Ｊ．（１９９６），Ｃｅｌｌ８６（３５３−３６４））。
血管新生スイッチの解析により、癌の治療に役立ちうる２つのストラテジーの発見につながった。
第１に、内皮の増殖因子及びそれらの受容体の特異的な相互作用をブロックする血管新生の直接の阻害剤は、動物モデル及びヒトにおいて有効性を示した（Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３４、４８６−４９７；Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９８）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（３７６−３８３））。
直接の血管新生阻害剤といｓてはアンジオスタチン、エンドスタチン及びＶＥＧＦ阻害剤が挙げられる（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙその他（１９９７）Ｃｅｌｌ８８（２７７−２８５）、Ｗｅｎその他（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（６０５２−６０５６））。
血管新生の間接的な阻害剤は腫瘍細胞が前血管新生の因子の産生を防止し、おそらく血管新生阻害剤の産生を増加させる。
間接的な血管新生阻害剤の例としては、シグナル伝達アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ、ホスホイノシトール−３キナーゼのようなシグナル伝達経路の及び阻害剤、反応性酸素及び核因子κβ（ＮＦＫＢ）が挙げられる（Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，８６１−８６６、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅその他（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５、Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１１０３、Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９，７１５−７２０、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．ら，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６、２５７３−２５８１）。
ホノキオール（小分子量化合物）は、両方の直接の血管新生を阻害する特性を有する。
すなわち、ＶＥＧＦＲ２（異常な血管新生を媒介している主要な受容体）のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘発する腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬを介した直接の抗腫瘍活性によりアポトーシスが媒介される（Ｂａｉその他（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７））。
【０１１７】
血管新生阻害剤は多種多様な機構により内皮の増殖及び血管新生を阻害する。
インターフェロンα／β（最初に発見された天然の血管新生阻害剤）は、細胞周期の阻害剤ｐ２１（Ｂｒｏｕｔｙ−Ｂｏｙｅ、Ｄ．＆Ｚｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ｒ．（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８，５１６−５１８、Ｃｈｉｎ，Ｙ．Ｅ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２、７１９−７２２）の合成を活性化させる。
アンジオスタチン及びエンドスタチンは内皮細胞面への結合を介して作用し、インテグリン介した内皮生存シグナルを妨害することによりアポトーシスを活性化させる（Ｒｅｈｎ，Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，１０２４−１０２９、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ａ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ７，８１１−８２２）。
トロンボスポンジン−１は内皮細胞（ＣＤ３６）に存在する細胞レセプタと結合し、内皮のアポトーシスをもたらす。
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰｓ）の組織阻害剤はマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素活性を、１／１化学量にて阻害（基底膜のへの侵入を防止）し、また最近では、血管新生を阻害する２４アミノ酸の断片がＴＩＭＰ２（フェルナンデス、その他（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８（４０９８９−４０９９５））から単離した。
従来発見されている血管新生阻害小分子にはサリドマイドがあり、それはＮＦＫＢ、２−メトキシエストラジオールを阻害することにより、部分的に作用する。
それは微小管活性化及び低酸素誘導因子（ＨＩＦＩａ）の活性化、シクロ−オキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）阻害剤、及び従来の化学療法剤（シクロホスファミド、タキサン及びビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン））の低用量に影響する（Ｄ‘Ａｍａｒｔ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、３９６４−３９６８、Ｄ‘Ａｍａｒｔ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、４０８２−４０８５）。
更に、特定のチロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍及び間質細胞によりＶＥＧＦ及び他の前血管新生の因子の産生を減少させることにより、間接的に血管新生を減少させる。
これらの薬剤には、ヘルセプチン、イマチニブ（グリベック）及びイレッサ（Ｂｅｒｇｅｒｓ、Ｇ．ら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１１，１２８７−１２９５、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．ら（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，１４５９−１４６５、Ｐｌｕｍ、Ｓ．Ｍ．ら（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９、４６１９−４６２６）が含まれる。
近年では、血管新生阻害剤は動物モデルからヒト患者へ移行した。
血管新生阻害剤は様々な癌に対する有望な治療薬となりうる。
【０１１８】
近年では、アバスチン（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性抗体）が、高度な腎細胞癌の単剤として延命効果があり、また高度な大腸癌の化学療法との組み合わせで延命効果を発揮することが報告されている（Ｙａｎｇ、Ｊ．Ｃ．ら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３４９、４２７−４３４、Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ、Ｆ．ら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１、６０−６５）。
【０１１９】
血管新生関連の疾患としては、限定されないが、
炎症性、自己免疫性及び感染性疾患、
血管新生依存性の癌（固形腫瘍、血液由来の腫瘍（例えば白血病）及び腫瘍転移など）、
良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫など）、
慢性関節リウマチ、
乾癬、
湿疹、
眼性の血管新生性疾患（糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑部変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖症、ルベオーシスなど）、
Ｏｓｉｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、
心筋の血管新生、
斑新血管新生、
末梢血管拡張症、
血友病者の関節症、
血管線維腫、
肉芽損傷が挙げられる。
更に、本発明の組成物は、腸癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症、疣及び肥厚性瘢痕（すなわちケロイド）などの疾患の治療に使用できる。
本発明の組成物はまた、異常な結果として血管新生を有する疾患（例えば猫ひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（ヘリコプタ桿菌幽門）結核及びライ病）の治療にも使用できる。
【０１２０】
図５にて図示するように、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物は、ＳＶＲ細胞の激増の減少に効果的であることを示した。
すなわち、形質転換ＳＶＲ内皮細胞の抑制を使用したバイオアッセイにより、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物がＳＶＲ抑制を強化することが示した。
従来、形質転換ＳＶＲ内皮細胞のバイオアッセイを行い、正確に周知の血管新生阻害剤へのインビボ反応を予測した報告が存在する（Ａｒｂｉｓｅｒその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：８６１−８６６、及びＡｒｂｉｓｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（４０：９５９−９２９）、本発明に援用される）。
従って、Ｂａｉその他がＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｔｎ（２００３）；９月１２日，２７８（３７）：３５５０１−７（本明細書に援用される）で述たように、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物は血管新生の阻害に使用できる。
【０１２１】
ウイルス感染
【０１２２】
一実施態様では、本明細書に開示の化合物は例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウィルス感染の治療において、それ単独でも、また第２の抗ウイルス剤との組合せで有効量で宿主に投与できる。
【０１２３】
炎症性疾患
【０１２４】
本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は炎症性疾患の治療に使用できる。
【０１２５】
炎症性疾患の例としては、関節炎、喘息、皮膚炎、乾癬、嚢胞性線維症、遅く移植後及び慢性実質性器官拒否、多発性硬化症、全身紅はん性エリテマトーシス、炎症性腸疾患、胃腸疾患（例えば胃炎、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎）、クローン病、頭痛、喘息、気管支炎、結核、慢性胆嚢炎、橋本甲状腺炎、月経不順、腱炎、滑液嚢炎、鼻炎、局所貧血−再かん流損傷、ポスト血管新生術再狭窄、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、乾癬、糸球体腎炎、眼球突出性甲状腺腫、消化器アレルギー、多臓器肉芽腫性疾患、播種性血管内凝固、脈管炎症候群、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、アンギナ、小動脈疾患、結膜炎などが挙げられるが、これらに限定されない。
更に、当業者に自明のように、炎症関連の症状が様々な症状（例えば血管疾患、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、鞏膜ドマ、リウマチ熱）、タイプＩ糖尿病、重症筋無力症、結直腸癌、多臓器肉芽腫性疾患、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏性、結膜炎、損傷後に生じる膨張、心筋虚血症、など）を伴うこともあり、本発明の化合物により治療できる。
【０１２６】
具体的な実施態様では、本明細書の化合物は関節炎又は関節炎条件の治療に使用できる。
関節炎及び関節炎関連症状の例としては、慢性関節リウマチ（例えば軟組織リウマチ及び関節外リウマチ）、線維症、結合組織炎、筋肉リウマチ、筋筋膜痛症、上腕骨上顆炎、四十肩、ティーツェの症候群、筋肉疾患、腱炎、腱鞘炎、滑液嚢炎、急性痛風、慢性痛風及び全身性エリテマトーデスを伴う若年性慢性病患者、脊椎関節炎（強直性脊椎炎）、変形関節炎、高尿酸血症及び関節炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
骨関連の疾患
【０１２８】
本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は骨粗鬆症をはじめとする骨関連疾患の治療に使用できる。
【０１２９】
具体的な実施態様では、本発明の化合物が、骨粗鬆症又は関連症状の治療に使用できる。
付加的な実施態様では、本明細書に開示の化合物は、骨腫瘍、頭蓋骨早期癒合症、ｅｎｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ、線維性骨異形成症、Ｋｌｉｐｐｅｌ−Ｆｅｉｌ症候群、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎（ＯＣＤ）、骨髄炎（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、骨壊死、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症、孤立性（単発性）骨嚢腫及び／又は骨軟化症の治療に使用できる。
【０１３０】
複合治療
【０１３１】
本発明の一実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、少なくとも１つの付加的な化学療法剤と組み合わせてもよい。
付加的な薬剤は、本明細書に開示の化合物との組合せ又は交互使用において投与できる。
該薬剤は、同じ組成物の一部を形成してもよく、又は同時若しくは異なる時間で別々の組成物として投与してもよい。
【０１３２】
具体的な一実施態様では、本発明の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組合せ及び／又は交互使用において投与できる。
一実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、スベロイラアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（例えばＢｕｔｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９９，１１７００−１１７０５，２００２を参照）であってもよい。
他の実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はリンベースのＳＡＨＡ類似体（例えばアピシヂン）であってもよい（Ｍａｉ、Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５、１７７８−１７８４（２００２）参照）。
他の実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、限定されないが以下から選択でき。
ナトリウム酪酸塩；
（−）−デプデリン（例えばＫｗｏｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，３３５６，１９９８を参照）；
Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（例えばＳｕ，Ｇ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０，３１３７−３１４２，２０００を参照）；
サーチノール（２−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イルメチレン）アミノ］−Ｎ−９１−フェネチル）ベンズアミド；
及び／又はトリコスタチンＡ（例えばＹｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１７，４２３−４３０，１９９５を参照）。
【０１３３】
一実施態様では、本明細書に開示の化合物は、それらの効果を強化するために血管新生阻害薬剤と組み合わせても良く、又は更に他の細胞毒性剤を伴わせて投与してもよい。
他の実施態様では、固形腫瘍の治療に用いるときは、該化合物及び組成物は以下から選択される薬剤と共に投与してもよい。例えばＩＬ−１２、レチノイド、インターフェロン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、カプトプリル、抗悪性腫瘍薬（例えばαインターフェロン）、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート及びプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトルトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びデキサメサゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタム、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンジオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリ硫酸塩、血小板第４因子、アンジオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ及び放射線などが挙げられる。
他の具体的態様では、本発明の化合物はトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）との組合せ又は交互使用において投与できる。
更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、例えば以下の薬剤とのとの組合せ又は交互使用において投与してもよい。
抗有糸分裂の効果を有する（例えば細胞骨格要素を標的とする）薬：（微小管調節物質（例えばタキサン薬（例えばタキソール、パクリタキセル、タキソテール、ドセタキセル）、ポドフィロトキシン又はビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン））、
抗代謝剤薬：（例えば５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、プリン類似体（例えばペントスタチン）メトトレキサート）、
アルキル化剤又は窒素マスタード：（例えばニトロソ尿素、シクロホスファミド又はイフォスファミド）、
ＤＮＡを標的とする薬剤：（例えばアントラサイクリン薬剤、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ファーモルビシン又はエピルビシン）、
トポイソメラーゼを標的とする薬剤：（例えばエトポシド）、
ホルモン類及びホルモンアゴニスト又はアンタゴニスト：（エストロゲン、抗エストロゲン（タモキシフェン及び関連化合物）及びアンドロゲン、フルタミド、ロイプロレリン、ゴセレリン、サイプロトロン又はオクトレオチド、
抗体誘導体（例えばヘルセプチン）を含んでなる腫瘍細胞のシグナル伝達を標的とする薬、
アルキル化薬：（例えば白金薬（シスプラチン、カーボンプラチン、オキサリプラチン、パラプラチン）又はニトロソ尿素）、
腫瘍の転移に潜在的影響を及ぼす薬剤：（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤）、
遺伝子治療及びアンチセンス用薬剤、
抗体薬剤、
他の海洋起源の生理活性化合物（特にジデムニン（例えばアプリジン））、
ステロイド類似体（特にデキサメサゾン）、
抗炎症薬（非ステロイド性薬剤（例えばアセトアミノフェン又はイブプロフェン）又はステロイド、並びにそれらの誘導体（特にデキサメサゾン））、
抗嘔吐薬（５ＨＴ−３阻害剤（例えばグラミセトロン又はオンダセトロン）、並びにそれらの誘導体（特にデキサメサゾン））。
更なる実施態様では、該化合物及び組成物は、下記の表３で開示する化学療法剤と組み合わせて、又は交互使用により使用してもよい。
【０１３４】
表３：化学療法剤
【表３】
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【０１３５】
特殊な実施態様では、本明細書に記載の化合物及び組成物は、多発性骨髄腫の治療に用いる治療薬との組み合わせで使用できる。
一実施態様では、ホノキオールは、多発性骨髄腫の治療に用いる薬剤との組み合わせで使用できる。
多発性骨髄腫の治療において使用する薬には、エリトロポエチン、ゲナセンス、パンゼム、ＰＩ−８８、レブリミド、サリドマイド、トリセノックス、ヴェルケード、ザーネストラ、ゾレドロン酸、ゾメタ、２ＭＥ２、アレディア、三酸化ヒ素、Ｂｃｌ−２アンチセンス、ビスフォスフォネート及びコロニー刺激因子が含まれるが、これらに限定されない。
具体的な実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、多発性骨髄腫の治療用のボルテゾミブとの組み合わせで投与できる。
【０１３６】
一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、本明細書に記載のような、又は表３に記載の付加的な化学療法剤との組合せ又は交互使用において、薬剤抵抗性癌（例えば多剤耐性癌）の治療に使用できる。
薬剤抵抗性の癌には、従来公知の、又は本明細書に記載の大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓、肝臓における癌及び／又は他のいかなる癌も含まれうる。
一実施態様では、付加的な化学療法剤はＰ糖蛋白質阻害剤であってもよい。
特定の非限定的な実施態様では、Ｐ糖蛋白質阻害剤は以下の薬から選択できる：
ベラパミル、サイクロスポリン（例えばサイクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリンアンタゴニスト、デキスベラパミル、デキスニグルジピン、バルスポダール（ＰＳＣ８３３）、ビリコダール（ＶＸ−７１０）、タリキダール（ＸＲ９５７６）、ゾスキダール（ＬＹ３３５９７９）ラニキダール（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３。
他の実施態様では、ホノキオール又はその誘導体（本明細書に記載の誘導体を含む）はそれのみで投与してもよく、又は多発性骨髄腫の他の治療薬との組合せ又は交互使用により投与してもよい。
具体的な実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は薬剤抵抗性癌（薬剤抵抗性骨髄腫を含む）の治療用のボルテゾミブとの組み合わせで投与できる。
【０１３７】
患者集団のスクリーニング
【０１３８】
更なる本発明の目的は、本明細書に記載のホノキオール及び／又は関連化合物の細胞毒性作用に対して特に感受性の腫瘍及び癌を確認する方法を提供する。
本発明の一態様は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼで活性化されたプロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現する腫瘍が、特にホノキオール又はその誘導体の毒作用に感受性であるという発見に基づく。
一実施態様では、該方法は哺乳類（特にヒト）の腫瘍の治療方法であって、以下の手順を含む方法を提供する。
（ｉ）腫瘍から生体試料を調製し、
（ｉｉ）該腫瘍がホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現するか否かを解析し、
（ｉｉｉ）ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現する腫瘍を、本明細書に記載のホノキオール又は関連化合物で処理する。
一実施態様では、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、例えばリン酸化形態を検出できる抗体を用いて腫瘍又は癌中におけるリン酸化されたＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの存在をアッセイすることにより解析できる。
他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、患者から得られる腫瘍又は癌細胞をアッセイして、レベルをコントロール組織と比較することにより解析できる。
一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫは、コントロールと比較して癌サンプル中では少なくとも２、２．５、３又は５倍過剰発現されうる。
一実施態様では、生体試料は生検であってもよい。
他の実施態様では、生体試料は腫瘍又は癌から得られる流体、細胞及び／又は吸引液であってもよい。
一実施態様では、腫瘍又は癌をホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。
他の実施態様では、腫瘍又は癌を核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。
更なる実施態様では、腫瘍又は癌をアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。
【０１３９】
生体試料は、当業者に公知のいかなる技術に従って調製してもよい。
一実施態様では、生検により生物学的試料を得てもよい。
生検とは、検査のために生体から組織又は細胞を採取する手順のことである。
幾つかの生検は医師の診療室で実施できが、その他の場合は病院の施設においてなされる必要がある。
更に、幾つかの生検では麻酔薬を使用して一定の部位を麻痺させる必要があるが、その他の場合はいかなる鎮静も必要ない。
一実施態様では、内視鏡生検を実施してもよい。
かかる生検は、自然の生体開口部（すなわち直腸）又は小さい切開（すなわち関節鏡検査法）を通じた光ファイバ内視鏡（観察用の端部に近焦点テレスコープを備える細長いチューブ）で実施される。
内視鏡は、試験用の少量の組織を得る目的で、異常又は疑わしい領域における問題の器官を観察するために用いる。
内視鏡法とは、器官又は生体領域を視覚化及び／又は治療するために名づけられた。
医師は、消化管（消化管内視法）、膀胱（膀胱鏡検査法）、腹くう内（腹腔鏡検査法）、関節腔（関節鏡検査法）、胸部の中央部（縦隔鏡）又は気管及び気管支系（喉頭鏡検査法及び気管支鏡検査法）に内視鏡を挿入できる。
【０１４０】
他の実施態様では、骨髄生検を実施してもよい。
かかる生検は、胸骨（胸骨）又は腸骨稜腰骨（背下部領域上の骨盤の両側の骨領域）から実施できる。
皮膚を洗浄し、局所麻酔薬により領域を麻痺させる。
長い堅い針を髄に挿入し、細胞を吸引し試験し供する。
この操作はしばしば不快感を催す。
コア生検（髄から小型骨『チップ』を取り出す）を吸引後に行ってもよい。
【０１４１】
更なる実施態様では、哺乳類における摘出又は切開生検を実施してもよい。
皮膚のより広い若しくは深い部分が必要な場合、かかる生検法がしばしば用いられる。
外科用メス（外科ナイフ）を使用した場合は、皮膚の完全な厚みは更なる検査のために取り出され、損傷は縫合される（外科的スレッドにより縫合される）。
全ての腫瘍が取り出される場合は切採生検法と呼ばれる。
一部の腫瘍のみが取り出される場合は切開生検法と呼ばれる。
切採生検は通常好まれる方法であり、例えば黒色腫（皮膚癌のタイプ）が疑われる場合に行われる。
【０１４２】
なお更なる実施態様では、微細針穿刺吸引（ＦＮＡ）生検法を使用してもよい。
かかる生検は、腫瘍から非常に小さい部分を取り除くために細い針を使用することが必要である。
領域を麻痺させるために局所麻酔薬を時々用いるが、試験による多くの不快が生じず、また瘢痕を残さない。
例えば、ＦＮＡは疑わしいホクロの診断には使用しないが、例えば、黒色腫の近くの大きいリンパ節を生検して黒色腫が転移（拡散）したか否かを観察するときには使用する。
コンピュータ断層撮影（ＣＴ又はＸ線体軸断層写真）を用いて、内部臓器（例えば肺又は肝臓）の腫瘍に針を導くことができる。
【０１４３】
他の実施態様では、パンチシェーブ及び／又は皮膚生検を実施してもよい。
パンチバイオプシは、組織の短いシリンダ又は「リンゴの芯」を取り除く生検器具により、皮膚のより深い位置のサンプルを伴う。
局所麻酔薬を投与した後、器具を皮膚表面で回転させ、全ての層（真皮、表皮及び皮下組織（脂肪の）の最浅部を含む）を切除する。
薄片生検は、シェービングにより皮膚の最上層の採取を伴う。
シェービング生検は局所麻酔薬を伴って実施される。
皮膚生検は、例えば黒色腫が存在するか否かを顕微鏡観察により検査するための、皮膚検体の採取が必要である。
生検は局所麻酔下で実施される。
【０１４４】
特定の実施態様では、該方法は腫瘍がＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを発現又は過剰発現するかどうかを解析するために行う。
一実施態様では、腫瘍生検をコントロール組織と比較してもよい。
コントロール組織は、生検を得る哺乳類からの正常組織又は健康な哺乳類からの正常組織であってもよい。
ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現又は過剰発現は、腫瘍生検内に含まれるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ量が、コントロール組織に含まれるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの量よりも最低約１．５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．５、６、７、８、９又は１０倍多く含まれるか否かで解析できる。
【０１４５】
一実施態様では、本発明は、患者又は前記患者からの生体試料における、異常なＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現を検出する方法を提供する。
該方法は、細胞、細胞抽出物、血清又は他の患者若しくは前記生体試料からのサンプルと、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／若しくはＡＭＰＫ又はそれらの抗原性部分に特異的な免疫相互作用分子を接触させ、
免疫相互作用分子の複合体形成レベルをスクリーニングする手順を含み、
異常性を表す細胞における、正常細胞と比較して高レベルでの該複合体の存在が、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現又は過剰発現の指標となる。
一実施態様では、細胞又は細胞抽出物は高いレベルでのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ含量を利用して免疫学的に選別できる。
【０１４６】
他の実施例では、細胞中でのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの異常な発現は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードする遺伝子の発現レベルのスクリーニングにより検出でき、正常細胞と比較して高いレベルでの遺伝子転写発現産物（すなわちｍＲＮＡ）レベルが異常な細胞であることの指標となる。
ある種の実施態様では、他のＰＣＲ方法と同様にリアルタイムＰＣＲを用いて転写活性を解析できる。
一実施態様では、ｍＲＮＡは患者の細胞から、又は患者からの生体試料、及び任意に得られるｃＤＮＡから調製できる。
ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡは更に、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードする核酸配列の全部若しくは一部、又はその相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ及び／又は増幅できる遺伝子プローブと接触させ、更にｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのレベルを検出し、それにより通常のコントロールと比較したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの高レベルでの存在を評価できる。
【０１４７】
本発明の更にもう１つの実施態様は、患者からの疑わしい癌細胞のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの相対的レベルを解析する定量的又は半定量的な診断キットにおける、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の使用に関し、そこにはアッセイを実施するのに必要な全ての試薬が含まれていてもよい。
一実施態様では、ＥＬＩＳＡアッセイを実施するのに必要な試薬及び材料を利用しているキットを提供する。
試薬には、例えば洗浄バッファー、抗体希釈バッファー、ブロッキングバッファー、細胞染色溶液、現像液、停止液、抗リン酸化タンパク質特異抗体、抗Ｐａｎタンパク質特異抗体、二次抗体及び蒸留水を含めてもよい。
キットには使用説明書を含めてもよく、任意に自動化又は半自動化してもよく、又は自動化機械若しくはソフトウェアと互換性を持たせてもよい。
【０１４８】
診断検査法
免疫学的アッセイ
【０１４９】
一実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞又はその哺乳動物からの生体試料における、異常なＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現を検出する方法を提供する。
該方法は、細胞、細胞抽出物、血清又は他の哺乳動物細胞又はその哺乳動物からの生体試料からのサンプルと、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／若しくはＡＭＰＫ又はそれらの抗原性部分に特異的な免疫相互作用分子を接触させ、
免疫相互作用分子−ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの複合体形成レベルをスクリーニングし、正常細胞と比較して高レベルでの該複合体が存在するか否かを解析する方法である。
【０１５０】
該免疫相互作用分子は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの特異性及び結合能を有する分子、又はその抗原性部分、そのホモログ若しくは誘導体であってもよい。
一実施態様では、免疫相互作用分子は免疫グロブリン分子であってもよい。
他の実施態様では、該免疫相互作用分子には抗体断片、単鎖抗体及び／又は非免疫化分子（ヒト化抗体及びＴ細胞関連抗原結合性分子（ＴＡＢＭｓ）が含まれる）であってもよい。
ある具体的な実施態様では、抗体は単クローン抗体であってもよい。
他の具体的な態様では、抗体はポリクローナル抗体であってもよい。
免疫と相互作用する分子は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの特異性又は特に抗原性決定要素又はＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ上の抗原決定基を表してもよい。
ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ上の抗原決定要素又は抗原決定基には、免疫応答が標的とする分子の一部が含まれる。
抗原決定要素又は抗原決定基は、Ｂ細胞抗原決定基又は必要に応じてＴ細胞抗原決定基であってもよい。
【０１５１】
本発明の一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫが存在する哺乳類の癌又は癌様の増殖の存在を診断するために提供する。
該方法は、患者から細胞又は哺乳類又は生体試料からの細胞抽出物と、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの結合有効量を有するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する特異性又は抗原決定基を有する抗体又は抗原決定基とを接触させて、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ−複合体のレベルを量的又は質的に測定し、正常細胞と比較した前記複合体のレベルの上昇を解析する方法である。
【０１５２】
抗体は、当業者に公知の多くの手段のいずれかにより調製できる。
例えば、ヒトＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出用抗体は通常、人間以外の動物（例えば霊長類、家畜動物（ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ）及び／又はペット（イヌ、ネコなど））に由来してもよい。
抗体は、原核生物又は真核生物宿主細胞において、リコンビナント的に産生させてもよい。
通常、抗体に基づくアッセイは、細胞又は組織生検上でインビトロで行ってもよい。
しかしながら、抗体が最適に脱免疫されるか、又はヒト使用においてヒト化される場合、例えば抗体を放射性タグでラベルし、患者に投与し、放射線技術により放射性ラベルの蓄積部位を解析してもよい。
ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体は、癌を標的とする薬剤であってもよい。
したがって、本発明の他の実施態様は、ヒト及び人間以外の患者の癌イメージング用の脱免疫形態の抗体を提供する。
【０１５３】
一般に、ＰＬＤに対する抗体、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの産生において、組換え手段でおこなう場合、ヒトなどの動物組織から、又は細胞培養から産生させる場合も。酵素を生体試料から除去する必要がある。
ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫはいかなる適当手段で生体試料から分離してもよい。
例えば、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの表面電荷特性、サイズ、密度、生物学的活性度及び他の物質（例えば結合又は相互作用させようとする他のタンパク質又は化学物質）との親和性などの１つ以上を利用して分離を行ってもよい。
すなわち、例えば体液からのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの分離は、超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィ（陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ）、泳動（例：ポリアクリルアミドゲル泳動、分画電気泳動）、限外分離（例：ゲル濾過、限外濾過）及び親和性による分離（イムノアフィニティ分離など、例：磁気ビーズ分離（例えばＤｙｎａｂｅａｄ（商標））、免疫クロマトグラフィ、免疫沈降）などの１つ以上の方法により実施できる。
体液からのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの分離は、タンパク質に存在する抗原決定基の立体配座を維持する、すなわちタンパク質の変性が生じない技術が好適である。
更なる実施態様では、該タンパク質は、親和性分離、ゲル濾過及び／又は限外濾過などの１つ以上の任意の方法を使用して体液から分離できる。
【０１５４】
免疫及びそれに続く単クローン抗体の産生は従来技術で公知の標準的プロトコルを使用して実施できる（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９，１９７５、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（７）：５１１−５１９，１９７６）、Ｃｏｌｉｇａｎら（”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１−１９９７）又はＴｏｙａｍａら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎｕａｌ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｋｏｄａｎｓｈａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９８７）。
基本的に、動物をＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを含む体液若しくはそのフラクション、又は組換えＰＬＤにより免疫し、ＮＦＫＢ及び／又は抗体を産生する標準的方法によりＡＭＰＫ細胞（特に抗体産生性体細胞（例：Ｂリンパ球））を得る。
更にこれらの細胞は免疫した動物から摘出し、不死化させる。
特定の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの断片を使用して抗体を産生させる。
断片を担体と結合させてもよい。
担体とは、通常は免疫源性がないか又は十分でない物質（例：ハプテン）の免疫原性を強化するために天然に又は人工的に結合させるいかなる高分子量物質であってもよい。
【０１５５】
抗体産生細胞の不死化は、従来技術において周知の方法を使用して実施できる。
例えば、不死化はＥＢウィルス（ＥＢＶ）による形質転換を使用して実施できる（Ｋｏｚｂｏｒその他、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１：１４０，１９８６）。
他の実施態様では、抗体産生細胞は細胞融合法（Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９１−１９９７、上記）などの記載されている方法により不死化でき、単クローン抗体の産生に広く使用される。
この方法では、抗体産生能を有する体性抗体産生細胞（特にＢ細胞）を骨髄腫細胞株と融合させる。
これらの体細胞は、初回抗原刺激を受けた動物、好ましくはマウス及びラットのような齧歯目の動物のリンパ節、脾臓及び末しょう血液から調製できる。
具体的な実施態様では、マウスひ細胞が使用できる。
他の実施態様では、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ細胞を用いてもよい。
特殊な骨髄腫細胞株は、ハイブリドーマ産生のための融合方法用にリンパ球性腫瘍から開発された（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，上記、Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９−２７０，１９７８；ＶｏＩｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４２（１）：２２０−２２７，１９８２）。
多くの骨髄腫細胞株が融合細胞ハイブリッドの産生のために使われることもできる（例えばＰ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ８、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−ＡＧ８．６５３、Ｐ３／ＮＳ１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）Ｓｐ２／０−Ａｇ１４及びＳ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１．）。
Ｐ３×６３−Ａｇ８及びＮＳ−１細胞株はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６、上記）に記載されている。
シャルマンその他（１９７８、上記）はＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫株を開発した。
Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１株は、トローブリッジにより報告された（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８（１）：３１３−３２３，１９７８）。
抗体を産生する脾臓若しくはリンパ節細胞及び骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法は通常、体細胞に骨髄腫細胞を、細胞膜の融合を促進する薬剤又は薬剤（化学物質、ウィルス又は電気）の存在下でそれぞれ１０：１の割合（但し割合を２０：１〜１：１まで変化できる）で混合することを含む。
融合方法は公知である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，上記、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，上記、Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−２３６，１９７７、ＶｏＩｋら、１９８２，上記）。
当業者が従来使用している融合促進剤は、センダイウイルス及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
一実施態様では、融合細胞ハイブリッドを、残留している非融合細胞（特に非融合骨髄腫細胞）から選抜する手段が存在する。
通常、融合細胞ハイブリッドの選択は、そのハイブリドーマの増殖を支持し、一方非融合骨髄腫細胞（通常無期限に分裂する）の増殖を防止する培地で細胞を培養することによりなされる。
融合に使用する体細胞は、インビトロ培養で長期間生存できず、ゆえに問題が生じない。
融合細胞ハイブリッドを選択的に数週間培養することが必要である。
この期間の初期に、所望の抗体を生産するハイブリッドを確認する必要があり、更にそれらをクローニング、増殖に供する。
通常、得られたハイブリッドの約１０％は所望の抗体を生産するが、約１〜約３０％までの範囲で変動しうる。
抗体生成ハイブリッドの検出は、酵素結合免疫学的アッセイ及びラジオイムノアッセイ法などの幾つかの標準的アッセイ方法のいずれか１つにより実施できる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，ｐｐ３７６−３８４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）及びＦＡＣＳ解析（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：８２４−８３０，１９９８）。
【０１５６】
一旦所望の融合細胞ハイブリッドが選抜されて、個々の抗体産生細胞株としてクローニングした後、各細胞株を２つの標準方法のいずれでも増殖させることができる。
ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性を有する動物に注入してもよい。
注入された動物では更に、融合細胞ハイブリッドにより作られる特異的な単クローン抗体を分泌する腫瘍が形成される。
動物の体液（例えば血清又は腹水液）を採取し、高濃度の単クローン抗体を得ることができる。
あるいは、個々の細胞株を実験室の培養容器でインビトロで増殖させてもよい。
単一の特異的な単クローン抗体を高濃度で含んでなる培地を、デカンテーション、濾過又は遠心沈降により回収でき、その後精製してもよい。
【０１５７】
細胞株を更に、任意の適切な免疫検出手段により、目的のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出する特異性に関して試験してもよい。
例えば、細胞株を多くのウェルに等分し、インキュベートし、更に各々の上澄みは酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、間接蛍光抗体法等により詳細に解析してもよい。
標的タンパク質を認識できる（目的外の抗原決定基を確認しない）単クローン抗体を産生する細胞株を単離し、更にインビトロで直接培養又は組織適合性を有する動物に注入して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生させ、回収及び精製する。
【０１５８】
したがって本発明は、サンプルにおいてＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ又はその断片、変異体又は誘導体を検出する方法を提供する。該方法は、サンプルをその抗体又は断片又は誘導体と接触させ、抗体とＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ又はその断片、変異体又は誘導体を含んでなる複合体のレベルを解析し、通常のコントロールと比較して高いレベルのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出することからなる。
複合体の形成を測定するいかなる適切な技術を使用してもよい。
例えば、本発明の抗体レポーター分子と結合させ、免疫学的アッセイに使用できる。
かかる免疫学的アッセイにはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィ技術（ＩＣＴｓ）などが含まれるが、これらに限定されない。
免疫学的アッセイ技術の当業者に公知であるウエスタンブロッティングには競合アッセイが含まれうる。
本発明には定性的及び定量的免疫学的アッセイが含まれる。
【０１５９】
適切な免疫学的アッセイ方法は例えば米国特許第４０１６０４３号、４４２４２７９号及び４０１８６５３号に記載されている。
これらには、従来の競合結合アッセイ以外にも、非競争的タイプの１サイト及び２サイトアッセイが含まれる。
これらのアッセイにはまた、標的抗原に対する、ラベルした抗原結合性分子の直接の結合方式が含まれる。
【０１６０】
本発明は更に、動物（例えば癌が疑われるヒト癌患者など）から得られる細胞又は組織サンプルにおけるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現及び活性化レベルを定量化する方法を提供する。
一実施態様では、本発明は、結像システムを使用してＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現又は活性化レベルを量的に定量化する方法を提供する。
かかる結像システムを使用して、細胞又は組織サンプル（ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質特異的に染色された）の画像を受光し、画質を向上させ、処理し、かかる動物由来の細胞又は組織サンプルにおいて発現するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質の量又は活性化濃度を測定することができる。
本発明の方法の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現の較正曲線を、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質の異なる量を発現している少なくとも２つの細胞株用に作成してもよい。
較正曲線を用いて、細胞又は組織サンプルで発現するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質量を量的に測定できる。
活性化状態特異的な試薬を使用した同様の較正曲線を、活性ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質用に作成してもよい。
癌治療臨床法の前後における、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの量及び活性化状態の変化の測定に用いてもよい。
【０１６１】
本発明の方法の１つの具体的態様では、細胞又は組織サンプル中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現は、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用したＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質量の測定により定量化できる。
かかる方法は、例えば、米国特許集ｔ癌公開第２００２／００１５９７４号に記載されている。
【０１６２】
他の実施態様では、エンザイムイムノアッセイは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出に使用できる。
かかるアッセイでは通常、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸により酵素を第二抗体とコンジュゲートする。
特異的な酵素により使用される基質は通常、その酵素による加水分解による検出可能な色変化に応じて選択される。
蛍光原基質を使用してもよく、それは化学発色基質よりも多くの蛍光生成物を与える。
酵素標識抗体を第１の抗原抗体複合体に添加し、結合させ、更に過剰な試薬を洗浄除去してもよい。
更に適当な基質を含んでなる溶液を抗体−抗原−抗体複合体に添加してもよい。
基質を第二抗体（定性的な視覚的シグナル（更に数量化できる）を提供する）に結合した酵素と反応させ、通常分光光度計で定量化し、サンプルに存在する抗原量に関する指標を与える。
あるいは、抗体の結合能力を変えない程度に、蛍光化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン及びランタニド（ユーロピウム：ＥＵ））と化学的に結合させてもよい。
特定波長の光で照射して活性化すると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、その分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色の光が放射される。
蛍光ラベルされた抗体は第１の抗体−抗原複合体と結合する。
未結合の試薬を洗浄除去した後、残留している三分子の複合体を更に適当な波長の光で曝露させる。
観察される蛍光は目的の抗原の存在を示す。
免疫蛍光定量的アッセイ（ＩＦＭＡ）は、従来技術において確立されており、特に本発明の方法に有用である。
あるいは、他の化学発光、放射性同位元素などのレポーター分子、又は生物学的発光分子を使用してもよい。
【０１６３】
具体的な実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する抗体を用いて、特に血清中又は他の循環性の体液中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをＥＬＩＳＡにより検出できる。
これは、担体に抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体を固定して、血清、血液、リンパ又は他の身体由来の液体（細胞抽出物又は細胞生検）のような生物学的抽出物と接触させることにより実施できる。
ラベルされた抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体は更に、固定されたＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出にも使用できる。
このアッセイはいかなる組み合わせにも変形でき、全てのバリエーションは本発明に含まれ、また当業者に公知である。
この方法はＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫレベルの、例えば血清ベースでの迅速な検出及び定量化アッセイを可能にする。
【０１６４】
一実施態様では、本発明ではＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫＥＬＩＳＡアッセイキットが使用できる。
該ＥＬＩＳＡアッセイキットは、抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体、並びに付加的な以下の試薬（洗浄バッファー、抗体希釈剤バッファー、ブロッキングバッファー、細胞染色溶液、現像液、停止液、二次抗体及び蒸留水など）を含んでなる。
【０１６５】
ヌクレオチド検出
【０１６６】
他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出する方法であって、細胞中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する方法を提供する。
ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の任意の適切な方法を使用して解析できる。
一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするラベルされたポリヌクレオチドを、細胞から得られるリボゾームＲＮＡ抽出物のノーザンブロットのプローブとして利用できる。
【０１６７】
他の実施態様では、核酸増幅反応（例えばＲＴ−ＰＣＲ）において、動物からの核酸抽出物を、キナーゼをコードするポリヌクレオチド又はその隣接配列のセンス及びアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーと共同して利用できる。
例えば、様々な自動化固相検出技術を利用してもよい（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７７，１９９１）、Ｋａｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２：７５３−７５９，１９９６）。
【０１６８】
他の実施態様では、ＲＮＡ転写物をコードするＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出方法を提供する。
ＲＮＡは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫのＲＮＡが含まれると疑われる細胞サンプルから単離でき、例えば全ＲＮＡをヒト癌組織から単離する。
リボゾームＲＮＡは、公知技術の方法（例：ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド）を使用）により単離できる。
オリゴｄＴ又はランダム配列オリゴヌクレオチド（配列特異的オリゴヌクレオチド）は単離されたＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を調製する逆転写酵素反応のプライマーとして使用できる。
得られる第１の鎖ｃＤＮＡを更に、ＰＣＲ反応において配列特異的オリゴヌクレオチドにより増幅し、増幅産物を得る。
【０１６９】
ポリメラーゼ鎖連鎖反応又は「ＰＣＲ」とは、予め選択された核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ断片の一定量を、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載したように増幅できる方法である。
通常、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、目的の領域の両端部、又はそれ以上を含む配列情報が使用される。
これらのプライマーは、増幅される鋳型鎖若しくはその逆の鎖と、配列が同一若しくは同様である。
ＰＣＲは、全ＲＮＡから転写される特異的なＲＮＡ配列及びｃＤＮＡを増幅するために使用できる。
一般的方法は、Ｍｕｌｌｉｓら（Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）の方法を参照。
このように、ＰＣＲによる特異的な核酸配列の増幅は、保存された核酸配列を有するオリゴヌクレオチド又は「プライマー」に依存する。
このとき、保存配列は関連遺伝子又はタンパク質の配列から推定される（例えば哺乳類のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ遺伝子の配列比較）。
例えば、アンチセンス鎖とアニーリングすると予測される１つのプライマーを調製し、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするｃＤＮＡ分子のセンス鎖にアニーリングすると予測される他のプライマーを調製する。
増幅生成物を検出するため、反応混合物を通常アガロースゲル泳動又は他の便利な分離技術に供し、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ特異的なＤＮＡ増幅物を検出する。
例えば、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの増幅ＤＮＡを、特異的なオリゴヌクレオチドプローブによるサザンブロット法を使用して検出してもよく、又はその電気泳動移動度を周知の分子量のＤＮＡ標準と比較して検出してもよい。
ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの増幅ＤＮＡの単離、精製及び同定は、ゲルから断片を切り出すか又は溶出させ（例えばＬａｗｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２：６１０３，１９８１、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７−１９８０）、
適切なベクター（例えばｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））中のクローニング部位へ増幅生成物をクローニングし、クローニングした挿入物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ塩基配列をＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの周知の配列と比較することにより行う。
更にＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの相対量を解析してもよい。
【０１７０】
一実施態様では、リアルタイムＰＣＲを用い、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫヌクレオチドの転写レベルを解析できる。
転写活性の決定には、利用できるｍＲＮＡ転写物に基づいたポテンシャル翻訳活性の測定が含まれる。
他のＰＣＲ方法と同様に、リアルタイムＰＣＲはＰＣＲ生成物の検出のために、ＤＮＡ結合フルオロフォア、５’エンドヌクレアーゼ、隣接する直鎖及びヘアピンオリゴプローブ、及び自動蛍光を発している単位複製配列などの多くの化学物質が含まれる。
これらの化学物質及びリアルタイムＰＣＲ一般については、マッカイその他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ３０（６），１２９２−１３０５，２００２、ウォーカー、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １５（３）：１２１−１２７，２００１、ルイスその他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５：６６−７１，２００１に記載されている。
【０１７１】
代替の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現を、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと生体試料から単離したヌクレオチド配列とを接触させることにより確認できる。
生体試料に対するプローブのハイブリダイゼーションは、いかなる検出可能な薬剤を使用してプローブにラベルを付与することにより検出できる。
プローブには例えば、放射性同位元素ラベル、ビオチン、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素、ハプテン又は抗体が利用できるタンパク質を結合させてもよい。
検出可能なラベルは任意の手段でアッセイしてもよく、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、放射性同位体又は化学的な手段が挙げられる。
プローブはオリゴマー制限技術、ドットブロットアッセイ、逆ドットブロットアッセイ、ラインプローブアッセイ及び５’ヌクレアーゼアッセイなどの技術を用いて検出してもよい。
あるいは、プローブは一般に適用できるＤＮＡ配列技術のいずれかを使用して検出してもよく、例えばマクロアレイ、マイクロアレイ及びＤＮＡマイクロチップ技術が挙げられる。
オリゴヌクレオチドプローブは通常は少なくとも約１４、１５、１６、１８、２０、２５又は２８ヌクレオチド長であり、ヌクレオチドにハイブリダイズする。
通常、約２５又は２８のヌクレオチド長より大きいプローブの使用は好適でない。
オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの核酸配列を認識するように設計される。
【０１７２】
作用様式
【０１７３】
本発明の特定の実施態様では、本明細書に開示の疾患及び／又は障害のいずれかの治療方法であって、本明細書に開示の化合物を投与することにより標的の生物学的経路を調節し、その経路の障害の治療にする方法を提供する。
本発明は、ホノキオール及び／又はその誘導体が細胞に以下の影響を及ぼすという発見に基づく。
ＶＥＧＦＲ２のリン酸化の阻害、ＴＲＡＩＬが媒介するアポトーシスの刺激、ＡＭＰＫ活性化の刺激、ホスホリパーゼＤ活性の抑制及び／又はＮＦＫＢ活性化の抑制。
すなわち、本発明の特定の実施態様では、ホノキオール又はその誘導体の投与により、ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害、ＴＲＡＩＬで媒介されるアポトーシスの刺激、ＡＭＰＫ活性化の刺激、ホスホリパーゼＤ活性の阻害及び／又はＮＦＫＢ活性化の阻害を行い、本明細書に開示の疾患及び／又は障害を治療する方法を提供する。
【０１７４】
更なる実施態様では、本発明は、患者にホノキオール又はその誘導体を投与することにより、細胞中のカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８濃度が低い癌を治療する方法を提供する。
なお更なる実施態様では、本発明は薬剤耐性の癌を有する個人の治療方法を提供し、該方法は、
（ｉ）患者から癌細胞の塊を調製し、
（ｉｉ）癌細胞のカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の濃度を測定し、
（ｉｉｉ）カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の濃度が低いか否かを解析し、
（ｉｖ）カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の低濃度を確認した場合、患者にホノキオール又はその誘導体を投与することを含んでなる。
【０１７５】
ＩＩＩ．生物学的アッセイ
【０１７６】
生物学的活性化合物及び組成物は、インヴビトロ又はインビボバイオアッセイにおいてスクリーニングできる。
かかるアッセイの例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞増殖アッセイ、
ＶＥＧＦ受容体機能（例えばＶＥＧＦ受容体−２リン酸化）の抑制評価、
ＭＡＰキナーゼキナーゼアッセイ、
アポトーシスアッセイ（ＴＲＡＩＬの媒介によるアポトーシスのアッセイなど）、
代表的なヒト腫瘍（例えば初期ヒト検体及び細胞株）を使用た細胞生存率アッセイ、
ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）アッセイ、
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）アッセイ、
ＮＦＫＢアッセイ及び動物（例えば免疫不全マウス）の異種移植に対するインビボアッセイ。
【０１７７】
公知技術の細胞増殖アッセイが競争アッセイとして使用できる。
このアッセイは、血管新生を阻害する及び／又は抗腫瘍薬剤として役立つ候補化合物の直接的な方法として使用できる。
一実施態様では、例えば約１０μＭのＩＣ５０以下の化合物を更なる試験に選択できる
この最初のアッセイで活性を有する細胞は更に、主要なヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、繊維芽細胞の増殖よりも内皮細胞の増殖を優先して阻害する能力を試験に供することができる。
【０１７８】
ＶＥＧＦ受容体リン酸化抑制アッセイは、ヒト真皮微小血管内皮細胞を使用してできる。
これらの細胞は、一定時間（例えば１時間）、試験化合物の有無において、組換えヒトＶＥＧＦ（例えば１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激してもよい。
タンパク質を更に抗ホスホチロシン抗体で回収し、免疫沈降させることができる。
ウエスタンブロット分析により、更に受容体リン酸化を確認できる。
【０１７９】
アポトーシスアッセイは当業者に公知である。
本発明の化合物は、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子アポトーシス誘発リガンド）アポトーシスアッセイにおいてそれらの活性を試験できる。
このアッセイは、化合物がＴＲＡＩＬによるアポトーシスを誘発できるか否かの解析に用いることができる。
この方法は、ＴＲＡＩＬ中和抗体を用いて、に潜在的に化合物の効果（腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が媒介するアポトーシス）をブロックさせるものである。
【０１８０】
ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、多くの腫瘍株のアポトーシスを誘導するが、その一方で正常細胞には毒性を呈しないペプチドである（Ｒａｖｉ，Ｒ．＆Ｂｅｄｉ，Ａ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，４１８０−４１８５）。
ＴＲＡＩＬは、２つのシグナル伝達受容体、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４及びＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５を有する（Ｒａｖｉ，Ｒ．＆Ｂｅｄｉ，Ａ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，４１８０−４１８５、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．ら、（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１６，３２９−３３４、Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，２４１−２４３）。
悪性細胞で観察される１つのポテンシャルメカニズムは、良性の相対物と比較したこれらのＴＲＡＩＬ受容体の高い発現である（Ｇｈｏｓｈら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ）。
ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ受容体の活性化及び三量体形成を通じて膜受容体で誘導されるアポトーシスによるカスパーゼ８の活性化、
並びにＡｐａｆ−１／カスパーゼ９／シトクロームｃによるミトコンドリアが媒介するアポトーシスの活性化を伴い、それによりアポトーシスを生じさせることが示されている。（Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，２４１−２４３、Ｌｉ，Ｊ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１，１５２６−１５３３）
これらの２つの経路の連関を伴うポテンシャルメカニズムは、カスパーゼ８が媒介するプロアポトーシスタンパク質Ｂｉｄ（更にミトコンドリア内に移行し、ミトコンドリアベースのアポトーシスをもたらす）の裂開／活性化により生じる。
ＴＲＡＩＬペプチド自体は症状発現前のモデルにおいて抗腫瘍活性を有することが示されており、またＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬシグナル伝達を刺激する化合物と、従来の化学療法剤との組合せによる相乗効果が観察されている（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ、Ｃ．Ｓ．ら（２００１）Ｂｌｏｏｄ９８、７９５−８０４）。
【０１８１】
本発明の化合物は、アデノシン一リン酸キナーゼ（ＡＭＰＫ）アッセイにおいてそれらの活性を試験できる。
このアッセイは、該化合物がＡＭＰＫ活性化を誘導又は阻害できるか否かを決定するために使用できる。
公知技術のいかなるリン酸化アッセイも、ＡＭＰＫの活性化の検出に使用できる。
更に、ウエスタンブロッティングによりＡＭＰＫ活性化の刺激を試験できる。
【０１８２】
ＡＭＰ経路はＡＴＰに対するＡＭＰの高い比率により活性化され、低いエネルギー状態を示す。
栄養の剥奪に加えて、ＡＭＰキナーゼは低酸素状態及びホノキオールにより活性化し、増殖停止及びアポトーシスをもたらす。
近年、ＡＭＰキナーゼ活性化が腫瘍細胞の強力な抗増殖効果を発揮することが示されている。
ＡＭＰＫは、ａｋｔ（腫瘍増殖及びアポトーシスに関するホスホイノシトール−３キナーゼの主要な下流側エフェクタであるセリントレオニンキナーゼ）に対する生理学的アンタゴニストであることが示されている。
更に、ＡＭＰＫはａｋｔによりチュベリン（ｔｓｃ２）の失活をアンタゴナイズすることが示され、すなわち抗腫瘍活性に関する更なる機構を提供した。
この活性の結果、ＡＭＰＫ活性化が哺乳類におけるラパマイシン（ｍＴＯＲ）の標的の負の制御をもたらし、腫瘍細胞におけるタンパク質合成減少をもたらしうる。
ＡＭＰＫの上流はＬＫＢ（ＡＭＰキナーゼキナーゼ）であり、それは腫瘍を起こしやすいＰｅｕｔｚ  Ｊｅｇｈｅｒｓ症候群において変異を有する。
最近のインビボ試験では、アミノイミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）の腹腔内注射によりラットのＣ６膠腫増加の顕著な抑制をもたらしている。
この抑制は、癌抑制遺伝子ｐ５３、ｐ２１及びｐ２７の上方制御を部分的に伴うものであった。
更に、ＡＩＣＡＲはＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の活性化を阻害した。
プリンストンのアーノルドレビンの研究室では、ｐ５３は、化学療法のような細胞ストレスにより活性化したとき、ｓｅｒ１５にてリン酸化を受け、ＡＭＰＫの正の制御、及びそれに続くｍＴＯＲの負の制御を行う。
ＡＭＰＫの薬理学的な抑制により、化学療法に対する細胞の感度が減少する（Ｆｅｎｇ，Ｚ．Ｈら、（２００５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，８２０４−８２０９）。
すなわちＡＭＰＫの活性化は、ｐ５３に依存性の、及び独立した経路による腫瘍の治療に有益でありうる。
【０１８３】
本発明の化合物はまた、ホスホリパーゼＤ活性（ＰＬＤ）に対する影響を試験して化合物がＰＬＤを誘導するか又は阻害するかを解析できる。
ＰＬＤを高発現するとして公知の細胞は、ＰＬＤ活性のアッセイに使用できる。
細胞は化合物により一定期間処理でき、更に脂質を細胞から抽出し、ＰＬＤ活性に対する効果を確認できる。
ＰＬＤ（例えばｍＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ及び／又はＳ６）の下流の標的に対する化合物の効果を試験してもよい。
【０１８４】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、ホスファチジルコリンをホスファチド酸及びコリンに切断するリパーゼである。
【０１８５】
ホスファチジン酸は他の生理活性を有する脂質（ホスファチジン酸など）に変換され、それはプロテインキナーゼＤを活性化させ、一方でリゾホスファチジン酸自体がプロテインキナーゼＣのアイソフォームを活性化できる。
これらの活性の全ての結果は細胞増殖の増加及びアポトーシスの減少であり、ａｋｔで観察されたのと同様である。
研究された実質的に全てのチロシンキナーゼ受容体は、適当なリガンドへの曝露によりＰＬＤ活性化を刺激できる。
ＰＬＤはこのように、ａｋｔとは交差しないが、平行的にシグナル伝達経路として機能する。
ヒトの２つの主なＰＬＤ遺伝子は単離されている（ＰＬＤ１及びＰＬＤ２）。
これらの遺伝子の両方ともプレックストリン相同領域（ＰＨ）を有し、それはホスファチジルイノシトール（Ｐｔｄｌｎｓ）ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２のリン酸エステルのペアと結合する。
ＰＬＤ１は小さいＧＴＰ結合蛋白質（Ｒｈｏ、ｒａｃ、ｃｄｃ４２）により活性化し、一方でＰＬＤ２がＰｔｄＩｎｓ４−Ｐ−５キナーゼＩａと結合し、細胞形態の変化及び腫瘍化に密接に関わることが示されている（Ｊｏｓｅｐｈ，Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８９，１０１９−１０２４、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，６７２−６７９）。
【０１８６】
周知のキナーゼの活性化に加えて、ＰＬＤ活性化は、腫瘍形成のｃ−ｍｙｃタンパク質を安定させることが示されている。
興味深いことに、乳癌では、ＰＬＤ活性化及びａｋｔ活性化は逆の関係であることが示唆される。
ａｋｔレベルが上昇した乳癌細胞は、ラパマイシンに最も感受性であることが示唆され、一方で、ＰＬＤ乳癌細胞（未分化）はラパマイシン非感受性であることが示唆される。
これは、ｍＴＯＲに対するラパマイシン及びホスファチジン酸の競争的結合に起因すると考えられる。
ホノキオールによるＰＬＤの抑制によるホスファチジン酸の産生減少は、腫瘍細胞のラパマイシンに対する感受性を増加させると考えられる（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，６７２−６７９、Ｒｏｄｒｉｋ，Ｖら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，７９１７−７９２５、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２，３９３７−３９４２）。
【０１８７】
本発明の化合物は、該化合物がＮＦＫＢを誘導する場合も、又は阻害する場合も、核因子κβ（ＮＦＫＢ）に対するそれらの効果を試験できる。
ＮＦＫＢ活性のアッセイに、公知技術のいかなるアッセイ方法も使用できる。
【０１８８】
核因子κβ（ＮＦＫＢ）は、多数の腫瘍の生存に不可欠である転写制御因子のファミリーである。
構成的なＮＦＫＢの過剰発現は、多発性骨髄腫、実質的に全ての種類の白血病、黒色腫、神経グリア芽細胞腫、上皮の悪性腫瘍及び肉腫において観察されている。
ＮＦＫＢは、多くのアポトーシス防止方法において重要であり、固有の及び外部のアポトーシス経路に影響を与えうる。
ＮＦＫＢ抑制は、リガンド（例えばＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ及びＴＮＦａ）によるアポトーシスと同様に、化学療法においても腫瘍細胞の感受性を高める（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８（７９５−８０４）、
Ｂｅｒｎａｒｄら、（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６（２７３２２−２７３２８））。
多発性骨髄腫のためのプロテアソーム阻害剤（例えばヴェルケード）を用いることにより、ヒトにおけるＮＦＫＢの抑制が臨床的になされている。
サリドマイド及びプレドニゾンなどの骨髄腫に対する他の薬剤はまたＮＦＫＢ活性を抑制し、おそらく多発性骨髄腫に対する臨床活性の原因と考えられる。
【０１８９】
ＮＦＫＢは多くのレベルで制御される。
ｐ５０及びｐ６５を含む幾つかのファミリーが、最も一般的に観察されるメンバーとして存在する。
これらのタンパク質はホモ又はヘテロ二量体化する能力を有し、またこれらの二量体は転写を媒介する。
更に、ＮＦＫＢの核移行は活性化のために必要である。
ＮＦＫＢの細胞局在はＩＫＸ（ＮＦＫＢと結合する）により制御され、核移行を防止し、更にユビキチン結合及びプロテアソームが媒介する分解を生じさせる。
ＮＦＫＢ活性は、ｐ３００との相互作用により調節されうる（Ａｒａｎｙ，Ｚ．ら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３，１２９６９−１２９７３、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，２９２７−２９３２、Ｒａｖｉ，Ｒ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，４５３１−４５３６）。
【０１９０】
代表的なヒト腫瘍（例えば多発性骨髄腫）に対する活性を試験するアッセイは、初期ヒト検体及び細胞株を使用して行ってもよい。
かかるサンプル及び細胞株は特定の化学療法剤に抵抗性であることもあり、例えばドキソルビシンに抵抗性である骨髄腫細胞が使用できる。
【０１９１】
癌増殖のインビボモデルには、動物（例えばマウス、特に免疫不全マウス）へのヒト腫瘍細胞の注入による異種移植が含まれる。
化合物の毒性はまた、動物の日々のモニタリングを行いつつ、動物に毎日化合物を投与するこれらのアッセイにおいても評価できる。
動物を２週が重量の減少、並びに他の公知の毒性（例えば異常な身繕い、マウスの運動の減少及び震え）をモニターしてもよい。
化合物の、動物における腫瘍増殖阻害能を試験してもよい。
例えば、ＳＶＲ血管肉腫細胞を動物（例えば免疫不全マウス）に注入してもよい。
マウスに約１００万のＳＶＲ細胞を皮下注入し、腫瘍が明白になった時、１日１回の投与（例えば腹膜内に１２０ｍｇ／ｋｇ）を行うことができる。
１２０ｍｇ／ｋｇで活性である薬剤を、更に８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇなどの低用量で再試験してもよい。
腫瘍体積は、（ｗ２×Ｌ）０．５２の式を使用して算出できる（ｗ（幅）は腫瘍の最小の寸法を表す）。
マウスを約３０日、又は腫瘍の増殖が１ｃｍ３になるまで処理してもよい。
【０１９２】
Ｖ．医薬組成物
【０１９３】
本明細書に記載のいずれかの化合物の有効量は、本明細書に記載のいずれかの疾患の治療に使用できる。
【０１９４】
本発明の化合物の投与に適する薬剤担体には、特定の投与様式に応じた、当業者に公知のいかなる種類の担体も含まれる。
化合物は、組成物の唯一の薬理学的な活性成分として処方してもよく、又は他の成分と組み合わせてもよい。
【０１９５】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物は、経口的、直腸、鼻、局所的（頬側及び舌下腺が含まれる）、膣、腸管外（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、眼内、気管内、大槽内、腹腔内及び硬膜外投与に適する形としてもよい。
【０１９６】
組成物は、簡便な単位用量形態とすることができ、従来の製薬技術により調製できる。
かかる技術には、１つ以上の本発明の組成物及び１つ以上の製薬用の担体又は賦形剤との混合が含まれる。
【０１９７】
化合物は溶液、懸濁液、錠剤、分散可能な錠剤、ピル、カプセル、粉、徐放性製剤又はエリキシルのような内服用、又は非経口投与（経皮パッチ調製及び乾燥粉末吸入器と同様に）用の無菌液又は懸濁液などの適切な製剤に処方できる。
一実施態様では、上記の化合物は公知の技術及び方法を使用して医薬剤組成物に処方される（Ａｎｓｅｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８５，１２６参照）。
【０１９８】
組成物において、１つ以上の化合物又はその薬理学的に許容できる誘導体の有効濃度を、１つ以上の適切な薬剤担体と混合してもよい。
化合物は、製剤化前にその対応する塩、エステル、エノールエーテル若しくはエステル、アセタール、ケタール、オルソエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物又はプロドラッグとして誘導体化できる。
組成物中の化合物濃度は、その投与により標的の疾患又は症状の１つ以上を治療、予防又は改善する量の送達のために効果的な量とする。
一実施態様では、組成物は単回投与用に処方される。
組成物を処方するために、治療される症状が緩和され、予防され、又は１つ以上の症状が改善されるだけの化合物の重量部分を溶解、懸濁、分散させ、又はさもなければ有効濃度で適切な担体に添加する。
【０１９９】
経口投与用の組成物は、限定されないが錠剤、カプレット、ピル若しくはドラゼーカプセル、又はカシェ剤のような別々の単位（各々が１つ以上の組成物の予め定められた量を含む）、
粉又は顆粒、
水溶液又は非水溶液としての溶液又は懸濁液、
又は水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョン、又はボーラス投与などの形態としてもよい。
【０２００】
薬理学的に投与可能な液状組成物は、例えば、上記の定義済みの活性化合物、及び任意の製薬アジュバントを、
担体（例えば水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、グリコール、エタノールなど）に溶解、分散又はさもなければ混合し、溶液又は懸濁液の状態を形成することにより調製できる。
必要に応じて、投与される医薬剤組成物は、無毒の補助剤（例えば湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、香料、例、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、オレイン酸トリエタノールアミン、並びに他の薬剤）を微量で含めてもよい。
かかる剤形を調製する方法は公知であるか、又は当業者であれば自明であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照されたい。
【０２０１】
口内の局所投与に適している本発明の組成物には、ロゼンジ（風味ベース（通常スクロース及びアカシア又はトラガカント）中に有効成分を含む）、
パステル（不活性ベース（例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア）中に本発明の組成物の１つ以上を含む）、
及びマウスウォッシュ（適切な液体担体中に投与される本発明の組成物の１つ以上を含む）。
【０２０２】
錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分の１つ以上又は類似の性質の化合物を含んでもよい。
結合剤、
潤滑油、
希釈剤、
滑走剤、
崩壊剤、
着色剤、
甘味剤、
香料、
湿潤剤、
吐剤コーティング、
及びフィルムコーティング。
結合剤の例としては、微結晶性セルロース、ゴムトラガカント、グルコース溶液、アカシア粘液、ゼラチン溶液、モラセス、ポリビニルピロリジン、ポビドン、クロスポビドン、スクロース及びデンプンが挙げられる。
潤滑剤としては、タルク、澱粉、マグネシウム又はカルシウムステアリン酸塩、リコポジウム及びステアリン酸が挙げられる。
希釈剤としては、例えば乳糖、スクロース、澱粉、カオリン、塩、マンニトール及び二カルシウムリン酸塩が挙げられる。
滑走剤としては、コロイド状シリカが挙げられるが、これに限定されない。
崩壊剤としては、クロスカルメロースナトリウム、ナトリウム澱粉グリコール酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、ベントナイト、メチルセルロース、寒天及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。
着色剤としては、例えば滅菌済の水溶性ＦＤ及びＣ染料及びそれらの混合物のいずれか、
並びにアルミナ水和物に懸濁した水不溶性ＦＤ及びＣ染料が挙げられる。
甘味剤としては、スクロース、乳糖、マンニトール及び人工甘味料（例えばサッカリン及び他の任意の噴霧乾燥済甘味料）が挙げられる。
香料としては、良い感じの感覚をもたらす天然の植物（例えば果物）由来の抽出物、及び化合物の合成混合物などが挙げられ、ペパーミント及びサリチル酸メチルなどが例示できるがそれらに限定されない。
湿潤剤としては、プロピレングリコールモノステアリン酸、ソルビタンモノオレイン酸、ジエチレングリコールモノラウレート及びポリオキシエチレンラウラルエーテルが挙げられる。
吐剤コーティングとしては、脂肪酸、脂肪、ワックス、セラック、アンモニア処理したセラック及びセルロースアセテートフタル酸が挙げられる。
フィルムコーティングとしては、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００及びフタル酸セルロースアセテートなどが挙げられる。
【０２０３】
皮膚に対する局所投与に適する組成物は、軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとするのが好適であり、製薬において許容できる担体中に投与される組成物の１つ以上が含まれる。
【０２０４】
直腸投与用の組成物は、例えばカカオ脂又はサリシレートなどの適切なベースを有する坐薬とするのが好適である。
【０２０５】
担体が固体であるとき、例えば、鼻噴投与に適している組成物としては２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗末が挙げられ、スナッフ（すなわち、粉に占拠された上に向かって閉じたパイプを有するコンテナから鼻へ迅速に吸入させる）により投与される。
担体が液体（例えば鼻内噴霧又は点鼻剤）であるとき、組成物の１つ以上を水性又は油性の溶液中に混合し、吸い込むか又は鼻腔内に霧散する。
【０２０６】
膣内投与に適する組成物は、組成物及び適当な担体の１つ以上を含んでなる膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤としてもよい。
【０２０７】
非経口投与に適する組成物としては、滅菌済の水溶性及び非水溶注入液であって、抗酸化剤、バッファー、抗菌剤、及び意図された受容者の血液と等張になるように製剤を調整するための溶質を含んでもよい液体が挙げられ、
滅菌済の水溶性及び非水溶には懸濁剤及び増粘剤を含めてもよい。
該組成物は単位投与用又は多数回投与用の容器（例えば密封アンプル及び同バイアル）としてもよく、また使用直前に無菌液体担体（例えば食塩水、注射用水）の添加だけを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵してもよい。
即座に使用できる注入溶液及び懸濁液は、上記の滅菌済の粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【０２０８】
経腸又は腸管外投与に適する製薬用の有機若しくは無機の固体若しくは液体担体媒体を用いて組成物を製造してもよい。
ゼラチン、乳糖、澱粉、マグネシウムステアリン酸塩、タルク、植物性及び動物性油脂、ゴム、ポリアルキレングリコール、水又は他の周知の担体の全てが担体として適切でありうる。
【０２０９】
組成物を、１つ以上の薬理学的に許容できる担体媒体及び／又は賦形剤との組み合わせにおける有効成分として使用してもよい。
本発明の「薬理学的に許容できる担体媒体」とは、全ての担体、溶媒、希釈剤又は他の液状担体、分散又は懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、アジュバント、担体、輸送剤、崩壊剤、吸収剤、防腐剤、界面活性剤、着色剤、フレーバー又は甘味料など、特定の投与形態に適する任意の形態であってもよい。
【０２１０】
更に、治療組成物を形成する際、組成物を薬理学的に許容できる賦形剤、及び、任意に徐放性マトリックス（例えば生物分解可能なポリマー）と組み合わせてもよい。
「薬理学的に許容できる賦形剤」には、いかなるタイプの無毒性固体、半固体若しくは液体充填材、希釈剤、封入材又は製造助剤が含まれる。
しかしながら、組成物の毎日における全体的な使用法が、確固とした医学判断の範囲内において主治医により決定されることを理解すべきである。
特定の宿主における特異的な治療的に有効な服用レベルは、以下の様々な因子に依存する。
すなわち、例えば治療対象の疾病及び疾病の重篤度など、
使用する具体的な組成物の活性、
使用する具体的な組成物の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性及び食事、
投与時間、
投与経路、
使用する具体的な化合物の排出速度、
治療期間、
共に使用する、又は使用する具体的な組成物と適合する薬剤、
並びに医学的に公知の諸要因など。
例えば、所望の治療的な効果を得るのに必要となる量よりも低量で組成物の投与量を開始し、及び所望の効果が得られるまでに段階的に投与量を増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
【０２１１】
組成物は好ましくは、投与の容易さ及び投与量の均一性のための投与単位の形態で製剤化される。
本明細書で使用される「投与単位の形態」とは、治療対象の宿主にとり適当な、組成物の物理的に別々の単位を指す。
各投与形態は、それらのみ、又は選択された医薬的な担体媒体との組み合わせにおいて、所望の治療効果を得るために算出された組成物量を含む必要がある。
【０２１２】
好ましい単位投与量製剤には、投与される成分の一日量又は単位、１日のサブ投与量又はその適当なフラクションが含まれる。
例えば、約１〜５ｍｇ／日のホノキオール型化合物でマウスの固形腫瘍の量を減少させることができる。
特に、毎日のホノキオール型化合物３ｍｇの投与により、腫瘍を５０％超減少させる（Ｂａｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００３）Ｓｅｐ．１２；２７８（３７）：３５５０１−７）。
これらの結果は、化合物のヒトへの投与量の推定に使用できる。
【０２１３】
投与量は、体重、年齢、表面積、代謝、組織分布、吸収速度及び排出速度などの宿主に関する要因に依存する。
一実施態様では、１日あたり０．５〜７gの本明細書に開示した化合物をヒトに投与するのが好適である。
任意に、１日あたり１〜４ｇの化合物をヒトに投与してもよい。
特定の実施態様では、０．００１〜５ｍｇ／日でヒトに投与される。
治療的に有効な投与レベルは、上記の多くの要因に依存する。
例えば、比較的低量で組成物の投与量を開始し、所望の効果が得られるまで投与量を増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
【０２１４】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物を、通常ポリマー製の支持放出マトリックス（酵素又は酸ベースの加水分解、又は溶解により分解可能）と共に使用してもよい。
一旦生体に挿入されると、マトリックスは酵素及び体液による作用を受ける。
徐放性マトリックスは、例えば生体適合性の材料（例えばリポソーム、ポリ乳酸、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリ乳酸コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）、ポリ無水塩、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーン）から選択される。
好ましい生分解性マトリックスは、ポリ乳酸、ポリグリコリド又はポリ乳酸コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）のいずれか１つのマトリックスである。
【０２１５】
化合物をリポソームの形で投与してもよい。
周知のように、リポソームは通常、リン脂質又は他の脂質に由来する。
リポソームは水性溶媒中で分散する、単一又はマルチラメラ状の水和液晶により形成される。
リポソームを形成できるいかなる無毒な、生理的に許容できる代謝性脂質も使用できる。
リポソームには、本発明の１つ以上の組成物以外にも安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含めてもよい。
脂質の例としては、リン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）（天然な及び合成）が挙げられる。
リポソームの形成方法は公知である。
化合物をエアゾールとして処方し、例えば吸入により投与してもよい。
これらの気道投与用の製剤は、ネブライザ用のエアゾール若しくは溶液の形態で、又は吹送用の微粉末として、それ単独で、又は不活性担体（例えば乳糖）との組み合わせで調製してもよい。
かかる場合、製剤中の粒子は、一実施態様では５０ミクロン未満の直径を有し、一実施態様では１０ミクロン未満である。
【０２１６】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物は、上記の症状の治療用の他の組成物及び／又は方法との組み合わせで使用できる。
例えば、腫瘍を、本発明の１つ以上の組成物との組み合わせで従来の手術、放射線療法又は化学療法で治療してもよく、更に、本発明の１つ以上の組成物をその後患者に投与して、微小転移巣の活性停止を長期化させ、いかなる残余の原発腫瘍の増殖も抑止、阻害又は減少させることができる。
【０２１７】
ＩＶ．合成
【０２１８】
本明細書に開示の化合物は、公知技術の方法を使用して合成できる。
例えば、ホノキオール類似体の５つの種類は反応式１Ａに記載のように合成できる。
【０２１９】
ホノキオール及びその誘導体の合成に利用可能な方法は、本明細書に開示の化合物の合成用に適宜変更してもよい。
例えば、Ｅｓｕｍｉ，Ｔ．，ら（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４，２６２１−２６２５の方法が使用できる。
一実施態様では、スズキジアゾカップリングをビフェニル足場の構築に用いる。
この反応により、Ｍｉｙａｕｒａ，Ｎ．及びＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５，２４５７−２４８３、並びにＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９９），Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．５７６，１４７−１６８に記載のように生成物収率を良好にできる。
この反応では、適当な中間体を用いてアリールフェノール又はビフェニル基にアリル部分を導入できる。
任意に、ヨード及びブロモ官能基の異なる反応性に基づいて、アリル基をビスフェノールの形成前に導入してもよい。
例えばＴｏｙｏｔａ，Ｓ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅｎａｇｌｉａ，Ｍ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｓ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，２６９７−２７００、及びＢａｈｌ，Ａ．，Ｇｒａｈｎ，Ｗ．，Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｓ．，Ｆｅｉｎｅｒ，Ｆ．，Ｂｏｕｒｈｉｌｌ，Ｇ，Ｂｒａｕｃｈｌｅ，Ｃ，Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｇ．（１９９５），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，１４８５−１４８８を参照されたい。
【０２２０】
一実施態様では、ホノキオールの合成中間体は、３−アリル−４−ヒドロキシベンゼンボロナート（５）及び４−アリル−２−ブロムフェノール（９）である。
ボロナート（５）は、２−ヨードフェノール１のブロム化、更にスズキカップリング反応を行いアリル基を導入し、スズキ条件下でホウ素化することにより調製できる。
化合物９は、ブロム化及びアリル化（スズキカップリング）により４−ヨードフェノール（６）から調製できる。
Ｃ＝Ｃ二重結合が存在する場合にはスズキカップリングが成功することが明らかとなっているため、スズキ条件下での５及び９の組み合わせにより、スズキカップリングによるホノキオール産生がなされ、ヘック反応からの他のアリル配向性生成物が生じない（Ｍｉｙａｕｒａ，Ｎ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５，２４５７−２４８３、及びＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９９），Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．５７６，１４７−１６８およびこれらの文献中の引用例を参照）。
【０２２１】
すなわち、ホノキオール及び誘導体は、市販の開始材料を用いて６つの処理を行い合成できる（反応式１）。
【０２２２】
反応式１
【化３０】
2008542192.tif 000057
試薬及び条件：
（ａ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｄ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流
メタノール中のＴＭＳ−ジアゾメタンによるホノキオールの処理はモノ−及びジ−メチル化化合物Ｉ〜ＩＩＩを生じさせ、ウィルキンソン触媒によるホノキオールの水素化はジ−及びテトラヒドロホノキオールＶＩ〜ＶＩＩＩを生じさせる（Ｅｓｕｍｉ，Ｔ．ら（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔ．１４，２６２１−２６２５）。
アミノ及びフルオロ類似体（ＩＶ及びＶ）は、スズキカップリング条件下でヨードアセトアニリドから調製できる。
２−ヨードアセトアニリド（１０）のブロム化、アリル化及びホウ素化により、ホウ素化中間体（１３）を調製できる。
他のブロモ中間体１６は、４−ヨードアセトアニリド（１４）のブロム化及びアリル化を経て調製できる。
ホウ素化物（１３）と臭素化物（１６）のスズキ条件下での結合により、脱保護後に、化合物ＩＶが得られる。
ジアゾ化及びそれに続くＳｃｈｉｅｍａｎｎ反応により、アミノ類似体ＩＶをフルオロ類似体Ｖに変換できる（反応式２）。
【０２２３】
反応式２
【化３１】
2008542192.tif 000058
試薬及び条件：
（ａ）ＴＭＳ−ジアゾメタン、ＭｅＯＨ、
（ｂ）ジクロロトリス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｅｔ３Ｎ、
（ｃ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｄ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｅ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｆ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流
（ｇ）ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ、
（ｈ）ｉ）ＮａＮＯ２、ｉｉ）ＮａＢＦ４
ジメトキシホノキオール誘導体（ＩＩＩ）は例えば、カリウムカルボン酸塩、ヨードメタンによるホノキオールの処理により調製することもできる（反応式２ａ）。
あるいは、水素化されたホノキオール類似体は、ホウ化水素ナトリウム及び塩化ニッケル（ＩＩ）によるホノキオールの水素化により調製でき、テトラヒドロホノキオールＶＩ−ＶＩＩＩが得られる。
【０２２４】
反応式２ａ
【化３２】
2008542192.tif 000059
ビニル類似体ＩＸの調製は、スズキカップリングとウィッティヒ反応の組み合わせに基づく。
中間体アルデヒド（１８）はライマー−ティーマン反応を介して４−ヨードフェノール（１７）から調製でき、その一方で、３−ブロモ−４−ヒドロキシベンゼンアルデヒド（２３）はブロム化及び還元を経てパラ−ヒドロキシベンゼンエステル（２１）から調製できる。
これら２つのアルデヒドのウィッティヒ反応により、対応するビニル置換されたベンゼン誘導体（１９）及び（２４）が得られる。
化合物（１９）からボロナート（２０）が得られ、それを（２４）と結合させ、化合物ＩＸが得られる（反応式３）。
【０２２５】
反応式３
【化３３】
2008542192.tif 000060
試薬及び条件：
（ａ）ＣＨＣｌ３、ａｑ．ＮａＯＨ、７０℃、
（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨ３Ｂｒ、ｎ−ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｄ）ＤＩＢＡＬＨ、−７０℃、
（ｅ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流。
【０２２６】
アリル又はヒドロキシル基の変更位置を有するホノキオール類似体の合成の際、ボロナート（５）及びブロムフェノール（４）及び（９）を中間体として使用できる。
適当なハロゲン化物又はボロナートを有するこれらの中間体の１つのスズキカップリングにより、化合物Ｘ〜ＸＶＩＩが得られる。
化合物Ｘ〜ＸＩＩ及びＸＩＶ〜ＸＶは、適当なハロゲン化物を有するボロナート（５）のスズキカップリングにより調製できる。
ハロゲン化物（２５）（化合物Ｘの調製に必要）は２−ブロモ−６−ヨードフェノール（２）のアリル化を経て調製でき、その一方で、中間体（化合物ＸＩのための５−アリル−２−ブロムフェノール（２９））は３−ヨードフェノール２６のブロム化及びアリル化を経て調製できる。
ハロゲン化物５−アリル−３−ブロモフェノール（３３）（化合物ＸＩＶの合成の中間体）の調製は、有機タリウム試薬を必要とする。
３−ブロムフェノール（３０）のタリウム化、及びそれに続くイオジドによる処理により、３−ブロモ−５−ヨードフェノール（３２）が得られる。
アリル化の後、アリル置換された中間体（３３）を調製できる。
化合物ＸＩＩの合成は、２−ヨードアセトアニリド（１０）から開始して、スルホン化、ニトロ化及び還元を経て中間体３６を得ることによりなされる。
アニリン３６をジアゾ化、それに続く酸及び塩基処理することにより、２−アミノ−３−ヨードフェノール（３７）が得られる。
化合物３７のジアゾ化、Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ反応及びアリル化によりハロゲン化物（３９）が得られる。
ボロナート（５）とこれらのハロゲン化物（２５、２９、３３、及び３９）とのカップリング反応により、化合物（Ｘ〜ＸＩＩ及びＸＴＶ）が調製できる。
化合物ＸＶはボロナート（５）とハロゲン化物４のスズキカップリングにより合成できる（反応式４）。
【０２２７】
反応式４
【化３４】
2008542192.tif 000061
試薬及び条件：
（ａ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（５）、ジオキサン、還流
（ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｃ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｄ）Ｔｉ（ＯＯＣＣＦ３）、ＣＦ３ＣＯＯＨ、
（ｅ）ＫＩ、
（ｆ）ＳＯ３、Ｈ２ＳＯ４、
（ｇ）ＨＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４、
（ｈ）Ｚｎ、ＨＣｌ、
（ｉ）ｉ）ＮａＮＯ２、Ｈ２ＳＯ４、ｉｉ）Ｈ２ＳＯ４、Ｈ２Ｏ、還流、ｉｉｉ）ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ、
（ｊ）ｉ）ＮａＮＯ２、ＨＢｒ、ｉｉ）ＣｕＢｒ
あるいは、化合物Ｘ、ＸＶ及びＸＶＩＩはアリル化−クライゼン経路により合成できる。
ビフェノール化合物を、最初にカリウムカルボン酸塩及びアリルブロマイドと、更にそれに続くＢＣｌ３と反応させ、ホノキオール様の化合物（例えばＸ、ＸＶ及びＸＶＩＩ）を調製できる。（反応式４ａ）。
ジアリル出発原料（１等量）の無水ジクロロメタン中冷却溶液（氷浴中、０℃）（溶液の濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）に、ＢＣｌ３溶液（ジクロロメタン中１Ｍ、１．５等量、アリル基ごとに０．７５等量ずつ）を滴下して添加した。
更に反応液を、ＴＬＣにおいて出発原料が消失する（１５分後である場合、反応は不十分でなく、ＢＣｌ３を更に１等量添加）まで０℃で撹拌する。
水（ジクロロメタンと同体積）による加水分解の後、２層に分離させる。
有機層を水で再び洗浄し、更に真空下で蒸発させ、ＭｇＳＯ４下で乾燥させる。
最後に残余物をカラムクロマトグラフィ精製し、ジヒドロキシ誘導体を得る。
【０２２８】
反応式４ａ
【化３５】
2008542192.tif 000062
ブロマイド（９）はまた、若干のボロナートとの結合のための有用な中間体でもある。
例えば、ボロナート（４２）（アリル化及びホウ素化を経て４−ブロモ−３−ヨードフェノール（４０）から調製される）とブロマイド９のスズキカップリングにより化合物ＸＩＩＩを調製できる。
同様に、ブロマイド（９）とボロナート（４３）とのカップリングにより化合物ＸＶＩを調製できる。
化合物ＸＶＩＩは、４−アリル−２−ブロムフェノール（９）から、ホウ素化及びそれに続く２−アリル−６−ブロムフェノール（２５）とのスズキカップリングを経て調製できる（反応式５）。
反応式５
【化３６】
2008542192.tif 000063
試薬及び条件：
（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｂ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（９）、ジオキサン、還流、
（ｄ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（２５）、ジオキサン、還流、
化合物ＸＶＩＩＩ及びＸＩＸは、市販のビスフェノール（４５）及びジヒドロキシナフタレン二硫酸塩（４７）から合成できる。
すなわち、ビスフェノール（４５）はウィリアムソン反応及びクライゼン転位で化合物ＸＶＩＩに変換できる。
同様に、ジヒドロキシナフタレン二硫酸塩（４７）の脱スルホン化、それに続くウィリアムソン反応及びクライゼン転位により化合物ＸＩＸを産生できる（反応式６）。
反応式６
【化３７】
2008542192.tif 000064
ジオキソラン化合物は、マグノロールの２，２’−ジメトキシプロパン及びｐ−トルエンスルホン酸との反応により、マグノロールから調製できる（反応式７）。
この合成もまた、ホノキオール及びマグノロールの混合物を分離する方法を提供する。
反応式７
【化３８】
2008542192.tif 000065
以下の実施例は例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２２９】
＜実施例１＞
ＭＡＰＫＫスクリーン
【０２３０】
図１２は、ドミナントネガティブＭＡＰＫＫ遺伝子又は内皮細胞の形態上の化学抑制剤ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫＫの抑制効果を示す。
ＭＳ１は、ＳＶ４０大きいＴ抗原だけを含んでなる内皮細胞を意味し、
ＳＶＲは、ｒａｓ癌遺伝子により形質転換したＭＳ１細胞を意味し、
ＳＶＲ＋  ＰＤ９８０５９はＰＤ９８０５９（５μｇ／ｍＬ）で処置したＳＶＲ細胞を意味し、
ＳＶＲＡ２２１ａは、ＭＡＰＫＫのドミナントネガティブＡ２２１対立遺伝子を安定発現する細胞を意味する。
ＳＶＲＡｎｄ  ＳＶＲｂａｇ４細胞の形態は同一である。
元の拡大倍率は×４０である。
この図はＭＡＰキナーゼ抑制に対するＳＶＲ細胞の特徴的な反応を例示する。これはＭＡＰキナーゼ阻害剤及び関連した阻害剤（また、知る、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅその他（２０００）  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（１９３７〜１９４５））を検出する視覚的なハイスループットアッセイにおいて使用できる
【０２３１】
＜実施例２＞
ホノキオールの細胞内の効果
【０２３２】
図１３は、ホノキオール及びマグノロールのアポトーシスに対する効果を例示する。
明カラムはマグノロールで処理したＳＶＲ細胞を意味し、暗カラムはホノキオールで処理したＳＶＲ細胞を意味する。
コントロールレーンは、１８及び４８時間の処理と比較した、処理直後の細胞を意味する。
この数字は、ホノキオールがマグノロールよりアポトーシスの誘導に効果的であることを示す。
【０２３３】
図１４は様々な細胞内タンパク質のリン酸化に対するホノキオールの効果を表す。
Ａは、ホノキオールがＡＫＴ、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ及びＳｒｃのリン酸化を阻害することを示す。
ＳＶＲ細胞を１時間、２０（７５μＭ）、３０（１１２．５μＭ）、４０（１５０μＭ）又は４５μｇ／ｍＬ（１６９μＭ）のホノキオールでインキュベートした。
またＳＶＲ細胞を、５０μＭ  ＬＹ２９４００２（ＬＹ）又は５０μＭ  Ｕ０１２６（Ｕ０）でも２時間インキュベートした。
細胞を溶解させ、特異的な抗体を使用しているウエスタンブロッティングによりリン酸化された（Ｐ−ＡＫＴ、Ｐ−ＭＡＰＫ及びＰ−Ｓｒｃ）又は非リン酸化ＡＫＴ及びＭＡＰＫを分析した。
Ｂは、ホノキオールは低濃度でＡｋｔのリン酸化を阻害するが、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ又はＳｒｃは阻害しないことを示す。
ＳＶＲ細胞を、２、６又は２４時間、２．７（１０μＭ）、６．７（２５μＭ）又は１３．３μｇ／ｍＬ（５０μＭ）のホノキオールでインキュベートした。
細胞を溶解し、Ａｋｔ及びＭＡＰＫのリン酸化型（Ｐ−Ａｋｔ、Ｐ−ＭＡＰＫ及びＰ−Ｓｒｃ）又は非リン酸化型に特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングにより分析した。
これらの機構の解析により、ホノキオールの主要な作用点が、ホスホイノシトール３キナーゼ活性化又は上流の現象のレベルにあることが示された。
【０２３４】
図１５は、内皮増殖のホノキオール抑制がＴＲＡＩＬ依存性であることを示す。
１０４／ｗｅｌｌの微小血管内皮細胞を、２４時間２４穴プレートで培養した。
その翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＲＡＩＬ又はアイソタイプコントロール抗体（３０μｇ／ウェル）の添加前に、３０分間０、１、６、又は９μｇ／ｍＬホノキオールにより新しいＭＥＣ培地０．５ｍｌ／ウェルで前処理した。
細胞を、試薬添加後４８時間インキュベートし、クールターカウンターにより計数した。
緑の棒はホノキオールのみで処理した内皮細胞を意味し、濃青色の棒はホノキオール及びＴＲＡＩＬ抗体で処理した細胞を意味し、及び淡青色の棒はホノキオール及びアイソタイプコントロール抗体で処理した細胞を意味する。
ＴＲＡＩＬ抗体の有無における、ホノキオール処理した内皮細胞の相違は重要である（ｐ＜０．０５）。
これらの所見はホノキオールがＴＲＡＩＬシグナル伝達の活性化によるアポトーシスを刺激することを示し、ホノキオールが他の化学療法剤及び放射線療法と協同しうることを示唆する。
【０２３５】
＜実施例３＞
多発性骨髄腫細胞上のホノキオールの効果
材料及び方法
細胞：
【０２３６】
デキサメサゾン（Ｄｅｘ）感受性ＭＭ．１Ｓ（野生型ｐ５３）及びＤｅｘ耐性ＭＭ．１Ｒ、ＲＰＭＩ８２２６−Ｄｏｘ４０（ドキソルビシン抵抗性）及びＲＰＭＩ８２２６−ＬＲ５（メルファラン抵抗性）のヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株を使用した。
ＲＰＭＩ−８２２６及びＵ２６６細胞は、ＡＴＣＣから入手した。
ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞も利用した。
新しい末しょう血液単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）は、インフォームドコンセントの後、健常者から入手した。
ＰＢＭＮＣは、フィコール−Ｈｉｐａｑｕｅ密度遠心沈降によりヘパリン化末梢血から分離した。
ＢＭ標本はインフォームドコンセントを得た後にＭＭ患者から入手し、単核細胞はフィコール−Ｈｉｐａｑｕｅ密度遠心沈降により分離した。
細胞を、１０％のウシ胎児血清を含んでなるＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃で培養した（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ、グランドアイランド、ＮＹ）。
【０２３７】
ＢＭ標本中のＭＮＣｓを、長期の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の確立にも用いた（例えばＵｃｈｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ．１９９３；８２：３７１２−３７２０、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１；２０：４５１９−４５２７を参照）。
試薬：ホノキオール（ＨＮＫ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、ＣＡ）をエタノールに溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの原液とした。
組換えヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を、０．１％のＦＢＳ（ＩＬ−６及びＶＥＧＦ）を含む滅菌済ＰＢＳ、及び０．１％のＦＢＳ（ＩＧＦ−１）を含んでなる１０ｍＭの酢酸により再構成した。
Ｐａｎ−カスパーゼ阻害剤のｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）をメタノールに溶解した。
これらの試薬を−２０℃保存し、使用直前に培地で希釈した。
ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を３．４５ｍＭの濃度で無菌水に溶解した。
Ａｓ２Ｏ３（ＰＢＳ中５ｍＭ）はＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（シアトル（ＷＡ））から入手した。
ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ケンブリッジ、ＭＡ）を１ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、−２０℃保存した。
細胞増殖及びＤＮＡ合成アッセイ：
【０２３８】
薬活性を評価するために比色アッセイを実施した。
ＭＭ細胞株及びＢＭＳＣｓは、１００μｌの培地で４８時間９６穴培養組織プレートで、ＨＮＫの所定の濃度で処理し、４時間各ウェルに、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニール）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−８，  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）１０μＬを添加した。
ＷＳＴ−８は、生細胞中に豊富に存在する電子伝達体１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム硫酸メチルの存在下、生体内還元によりＷＳＴ−８−ホルマザンに変わる。
４５０ｎｍの波長の吸光度を分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーヴェール、ＣＡ）で測定した。
【０２３９】
ＤＮＡ合成を前述のように測定した（例えばＨｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２９４３−２９５０）。
９６穴培養組織プレートの細胞に、培養組織の最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン（パーキンエルマー、ボストン、ＭＡ）を０．５μＣｉ／ウェルで添加し、自動セルハーベスタ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）でガラスフィルタ上へ回収し、ＬＫＢ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して計数した。
全ての実験を３回実施した。
【０２４０】
患者のＭＭ細胞に対するＨＮＫで誘導される細胞毒性の評価：
【０２４１】
新しいＭＭ細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を解析した（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４；５：２２１−２３０を参照）。
ＭＭ患者に由来する骨髄サンプルから分離した新しいＭＮＣｓを氷上で３０分間ＰＥコンジュゲートした抗ＣＤ１３８抗体及び／又はＦＩＴＣコンジュゲートした抗ＣＤ３８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）でインキュベートし、洗浄し、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）を使用して解析した。
ＭＭ細胞を富化したＣＤ３８ｈｌｇｈフラクションを、各場合において横及び前方の散乱パネルにおいて測定した。
ゲートで制御された細胞上のＣＤ１３８の発現も解析した。
４８時間のＨＮＫ処理の後、細胞を回収し、ＨＮＫ処理の有無にかかわらず、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージを解析した。
【０２４２】
細胞周期の解析：
【０２４３】
ＨＮＫにより培養されるＭＭ細胞を回収し、７０％のエタノールで固定し、ＲＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２５０μｇ／ｍＬで前処理した。
細胞をプロピジウムイオジド（ＰＩ；５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で着色し、細胞周期プロフィールをＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）のプロｇＭソフトウェアを用いて解析した。
【０２４４】
アポトーシス及びカスパーゼ−３活性の検出：
【０２４５】
ＴｄＴで媒介されたｄ−ＵＴＰのニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（ＭＢＬ、名古屋、日本）及びＡＰＯ２．７染色（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，  Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）を用い、アポトーシスを解析した。
手短には、各細胞を４％のパラホルムアルデヒド及び７０％のエタノールで浸透させ固定し、３７℃で１時間ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰの混合物及びＴｄＴでインキュベートし、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。
アポトーシス細胞上のミトコンドリア膜タンパク質７Ａ６発現の検出のために、細胞を２０分間のＡＰＯ２．７試薬でインキュベートした。
ＴＵＮＥＬ及びＡＰＯ２．７染色の蛍光強度を、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータで解析した。
細胞毒性をトリパンブルー除外アッセイにより測定した。
カスパーゼ３の活性化を評価するために、ＦＩＴＣコンジュゲートした単クローン性の活性カスパーゼ３抗体アポトーシスキットＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施した。
【０２４６】
ウエスタンブロッティング：
示された条件下で培養したＭＭ細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで二度洗浄し、溶解緩衝液中
（全細胞可溶化物のイムノブロット用：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３Ｖ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍＬ  ロイペプチン及び５μｇ／ｍＬ  アプロチニン）に分散させた。
ＨＮＫ処理した細胞１×１０７から調製した細胞小器官タンパク質を、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ分画キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して抽出した。
細胞可溶化物又は分画されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜へ移し、以下抗体によりイムノブロッティングを行った：
抗カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、Ｂａｄ、リン酸化（ｐ）−Ｂａｄ（Ｓｅｒｌ１２）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＸＩＡＰ、ＡＩＦ、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）２７及びｐ−Ｈｓｐ２７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）、
抗ＥＲＫ２、ｐ−ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３、ＢＣＬ−２、ＭｃＩ−Ｉ、ｇｐ８０及びＨｓｐ７０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、
抗Ｂｉｄ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、
抗ＥｎｄｏＧ（Ａｘｘｏｒａ、サンディエゴ、ＣＡ）、
及び抗ｇｐ１３０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）。
抗−α−チューブリンＡｂ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によるイムノブロットにより、等量のタンパク質のローディングを確認した。
【０２４７】
ボルテゾミブとの組合せ：
【０２４８】
ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブにより培養した。
アポトーシスの細胞増殖及び誘導を、４８時間の処理後、比色アッセイ及びＡＰＯ２．７のフローサイトメトリ検出の両方により測定した。
【０２４９】
ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓのＨＮＫに対する効果による、増殖阻害の誘導
【０２５０】
ＩＬ−６又はＩＧＦ−１の有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫで４８時間インキュベートした。
更にＭＭ細胞の激増を［３Ｈ］−チミジン取り込みにより解析した。
ＢＭＳＣｓへのＭＭ細胞の接着による増殖促進を評価するために、ＨＮＫの有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＢＭＳＣコーティングされた９６穴プレートで培養した。
ＤＮＡ合成を［３Ｈ］−チミジン取り込みで測定した。
ＩＬ−６により誘導される増殖シグナル伝達又はＨＮＫ−処理した細胞のＩＧＦ−１の調節を解明するために、ＭＭ．１Ｓ細胞を３及び６時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫを有する２．５％ＦＣＳ含有培地で培養し、更に１０及び２０分間のＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）の刺激を行った。
ウエスタンブロッティングで記載した要領で、細胞可溶化物を調製した。
血管新生アッセイ：
【０２５１】
ＨＮＫの抗血管新生効果を、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用して解析した。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＨＮＫの有無において、３７℃で重合するマトリックスゲル上で培養した。
６時間後、内皮細胞による管形成を評価した。
ＨＵＶＥＣに対するＨＮＫの直接的な毒性を比色アッセイにより測定した。
【０２５２】
結果
ＨＮＫはＭＭ細胞株の増殖を阻害する。
【０２５３】
ＨＮＫの治療有効性を確認するために、ＭＭ細胞株及び通常のＰＢＭＮＣｓを４８時間、ＨＮＫを有する所定の濃度で培養し、増殖を比色アッセイにより測定した。
８〜１０μｇ／ｍＬ、４８時間における５０％抑制（ＩＣ５０）の結果、ＨＮＫは薬感受性ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６及びＭＭ．１Ｓ細胞の増殖を阻害した。
ＨＮＫはまた、親の薬感受性細胞株と類似のＩＣ５０値で、薬剤抵抗性ＲＰＭＩ８２２６−Ｄｏｘ４０、ＲＰＭＩ８２２６−ＬＲ５及びＭＭ．ＩＲ細胞の増殖を阻害した（図６Ａ及びＢ）。
最高２０μｇ／ｍＬのＨＮＫまで、４８時間（図６Ｃ）で、通常のＰＢＭＮＣｓの生存率を阻害しなかった。
図６Ａ及びＢは、ＨＮＫによる４８時間培養後の、ＭＭ細胞株の増殖阻害を、比色アッセイにより解析した結果を示す。
データは３つの独立した実験の平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。
図６Ｃは、４８時間培養後の、３つの健康者に由来するＰＢＭＮＣｓの比色アッセイにより評価した生存率を示す。
データは、３回の培養組織の平均±ＳＤを意味する。
【０２５４】
ＨＮＫは、患者のＭＭ細胞に対する毒性を有する。
【０２５５】
６人の再発性・不応性ＭＭ患者から単離した腫瘍細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を評価した。
ＣＤ３８ｈｌｇｈ腫瘍細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリにより測定し、
コントロール培養組織（図６Ｄ）と比較した結果、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージは、４８時間、８μｇ／ｍＬのＨＮＫによる処理により、２６．２±１５．８％減少した。
図６Ｄは、４８時間（Ｎ＝６、数値は平均値±ＳＤを意味する）のＨＮＫの有無にかかわらず、培養後、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージ比較により測定された、患者のＭＭ細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を例示する。
【０２５６】
ＨＮＫは、直接ＭＭ細胞株の増殖を阻害する。
【０２５７】
ＭＭ細胞株（メルファラン（メル）−、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）−及びＤｅｘ耐性細胞株が含まれる）の増殖阻害を、＜１０μｇ／ｍＬのＩＣ５０で観察した。
更に、再発性／不応性ＭＭ患者からのＭＭ細胞は、ＨＮＫ治療によりも著しく減少していた。
通常のＰＢＭＮＣｓのＨＮＫのＩＣ５０は４０〜８０μｇ／ｍＬ（ＭＭ細胞株及び患者のＭＭ細胞のＩＣ５０より顕著に高い）であった。
これらのデータはＨＮＫが効果的にＭＭ細胞株（薬剤抵抗性細胞株及び患者のＭＭ細胞が含まれる）の細胞毒性を誘導し、通常のＰＢＭＮＣｓに対する毒性を有さないことを示す。
【０２５８】
ＨＮＫは、ＭＭ細胞株のアポトーシスを誘導する。
【０２５９】
ＭＭ細胞株に対するＨＮＫの細胞毒性を、２４時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫと共に培養したＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞の細胞周期を評価することにより解析した。
ＨＮＫ処理は、顕著にｓｕｂ−Ｇｏ／Ｇｉ細胞を増加させた。
更に、４８時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによるＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞それぞれの処理により、３８．２％及び４１．５％のＴＵＮＥＬ陽性細胞が誘導された。（図７Ａ）
２４時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによるそれぞれＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞の処理により、２１．７±３．４％及び３２．９±０．６％のＡＰＯ２．７陽性細胞を誘発したが、４８時間、１５μｇ／ｍＬのＨＮＫ処理によっても、通常のＰＢＭＮＣｓ（ｎ＝３）のＡＰＯ２．７陽性細胞は誘導されなかった。（図７Ｄ）
【０２６０】
ＨＮＫはカスパーゼ依存性の、及び独立したアポトーシスを誘導する。
ＨＮＫにより誘導されるアポトーシスの経路を解析した。
ＭＭ．１Ｓ細胞を１２及び２４時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫで処理した。
カスパーゼ６、７、８、９及びＰＡＲＰのタンパク質発現を更にＷＢにより解析し、活性カスパーゼ３を、フローサイトメトリアッセイで測定した。
【０２６１】
図７は、ＭＭ細胞におけるホノキオールで誘導された（ＨＮＫ）アポトーシスを表す。
Ａは、４８時間８μｇ／ｍＬ  ＨＮＫで処理したＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞を示す。
ＴＵＮＥＬアッセイを使用してアポトーシスを評価した。
Ｂでは、１．５時間ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）によるプレインキュベーションの有無における、カスパーゼ及びＰＡＲＰの裂開を、１２及び２４時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫ処理後の、ＭＭ．１Ｓ全細胞可溶化物のウエスタンブロッティングにより測定した結果をしめす。
Ｃは、２５μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる１．５時間の前処理の有無による、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。
カスパーゼ３の活性化をフローサイトメトリにより測定した。
７Ｄでは、１．５時間２５μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理の有無において、ＭＭ細胞を２４時間ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３で処理し、ＡＰＯ２．７の発現をフローサイトメトリで測定した結果を示す。
数値は３回の培養組織における平均±ＳＤを表す。
Ｅは、トリパンブルー除外染色により解析した細胞毒性を示す。
値は、３つの独立した実験における平均±ＳＤを表す。
Ｆでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を、ＨＮＫ（０、４、８及び１２時間、１０μｇ／ｍＬ）で処理した。
全細胞可溶化物を、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現を評価するため、ウエスタンブロッティングに供した。
Ｇは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる治療前の有無における、ＨＮＫ（２４時間、１０μｇ／ｍＬ）で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。
サイトソルフラクションのタンパク質を、ＡＩＦ及びＥｎｄｏＧのイムノブロットに供した。
【０２６２】
カスパーゼ７、８、９及びＰＡＲＰの裂開は、ＨＮＫ（図７Ｂ）で誘導される。
ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３により誘導されるカスパーゼ３の活性化は、ＭＭ．１Ｓ細胞（図７Ｃ）の２５μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理により、完全にブロックされた。
しかしながら、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＡｓ２Ｏ３で誘導されるアポトーシスの完了するブロックとは対照的に、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＨＮＫで誘導されるアポトーシスの抑制は一部分に限られた（ＰＡＲＰ裂開及びＡＰＯ２．７アッセイ（図７Ｂ及びＤ）により明示される）。
１００μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理は完全にカスパーゼ７のＨＮＫで誘導される裂開を阻害したが、ＨＮＫで誘導されるアポトーシスはまだ観察された（図７Ｄ）。
更に、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する細胞毒性は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ前処理により著しく還元しなかった。
トリパンブルー除外による増殖不能細胞のパーセンテージは、コントロール培養組織（２４時間、１０μｇ／ｍＬ、ＨＮＫで処理し、１．５時間２５μＭ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで培養し、更に２４時間、１０μｇ／ｍＬ  ＨＮＫでインキュベート）ではそれぞれ５．９±２．４％、３０．７±５．５％及び２７．６±６．４％であった（図７Ｅ）。
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のうち、ＭｃＩ−Ｉは切断され、ＸＩＡＰは刺激に対する反応が抑制され、
悪い状態は顕著に上方制御され、
更にＢｉｄ、ｐ−Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬはＨＮＫ治療の後、不変だった（図７Ｆ）。
ＨＮＫはまた、サイトソル（図７Ｇ）へのミトコンドリアプロアポトーシスタンパク質ＡＩＦの放出を誘導した。
最後に、ＨＮＫはまたＳＵ−ＤＨＬ−４細胞のアポトーシスを誘発し、それはカスパーゼ３の付随する活性化を伴わず、ドキソルビシン及びＡｓ２Ｏ３で誘導されるアポトーシス（図１９）に抵抗性であった。
【０２６３】
図１６は、ホノキオールがカスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰ媒介されたアポトーシスによる多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）のアポトーシスを誘導する更なるデータを提供するものである。
左上のパネルは、ホノキオール（ＨＮＫ）がアポトーシスのｓｕｂＧｌフラクションをコントロール水準よりも増加（ＲＰＭＩ８２２６の１．２％→４１．５％、ＭＭ．１Ｓの２．９％→３８．２％、ＴＵＮＥＬアッセイにおいて）させることを示す。
右パネルはウエスタン分析を表し、ホノキオールがカスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰの活性化によるアポトーシスを誘導することを示す。
【０２６４】
ＭＭ細胞株のＨＮＫで誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ３、７、８及び９の顕著な活性化を伴った。
ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理がほぼ完全にカスパーゼ３のＨＮＫで誘導される活性化を阻害したにもかかわらず、ＨＮＫで誘導される細胞毒性及びアポトーシスの抑制は一部分に留まった。
対照的に、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理は、完全に、Ａｓ２Ｏ３により誘導したＭＭ．１Ｓ細胞のカスパーゼ３の活性化及びアポトーシスの両方を阻害した。
ＨＮＫはまた、カスパーゼ３欠損ＭＣＦ−７細胞のアポトーシスを誘発した。
カスパーゼ７（ＭＣＦ−７細胞の細胞死関連カスパーゼ）（Ｊａｎｉｃｋｅ  ＲＵら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：９３５７−９３６０、Ｆａｔｔｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１；２０：２９１８−２９２６、Ｍｃ  Ｇｅｅ  ＭＭら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２；５１５：６６−７０）は、ＨＮＫ処理したＭＭ．１Ｓ細胞においても切断された。
これらの結果は、ＨＮＫが両方のカスパーゼ３依存性及び非依存性のアポトーシスを誘導することを示す。
【０２６５】
Ｂａｄ（プロアポトーシスのＢｃｌ−２ファミリータンパク質）はＢａｘのＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬへの結合を妨害し、それによりアポトーシスを促進する（Ｚｈａその他、Ｃｅｌｌ．１９９６；８７：６１９−６２８）。
一方では、リン酸化ＢａｄはＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬまでＢａｄの結合を防止し、それによりアポトーシスの誘導を阻害する、（Ｚｈａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２４１０１−２４１０４、Ｙａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：４５３５８−４５３６７）。
この試験では、ＨＮＫは著しく適度のリン酸化によりＢａｄ発現を強化したが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ及びＢｉｄを著しく変化させなかった。
ＸＩＡＰの発現が減少し。ＭｃＩ−ＩはＨＮＫで誘導されるアポトーシスの間切断された。
ＸＩＡＰはそのカスパーゼ阻害機序に関してよく研究されたＩＡＰファミリーである（Ｃｈａｗｌａ−Ｓａｒｋａｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：９１５−９２３）。
ＸＩＡＰは核因子（ＮＦ）−κＢにより負に制御され、ＩκＢα及びｐ６５  ＮＦ−κＢのリン酸化はＨＮＫによりＭＭ．１Ｓ細胞において調節されなかった。
ＭｃＩ−ＩはＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスのメンバーであり、カスパーゼによるＭｃＩ−Ｉの裂開により、残った完全ＭｃＩ−Ｉの機能に反対に作用する切断されたＭｃＩ−１が産生される（Ｈｅｒｒａｎｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：７８６３−７８７３）。
総合すると、これらの結果は、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化をもたらす強化されたＢａｄ発現のため、ＨＮＫがカスパーゼ８活性化により外部経路及び固有の経路を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。
そのうえ、薬剤誘導性のＸＩＡＰの負の調節は、エフェクターカスパーゼの抑制を防止、
逆にいえば、カスパーゼの活性化は切断されたＭｃ１−１により更に強化される。
【０２６６】
他の難病と同様に、ＭＭの治療に用いる大部分の薬はカスパーゼ及びアポトーシスの活性化による腫瘍細胞死を誘導する。
しかしながら、最近の検討は、活性化が死刺激によりアポトーシスを誘発して唯一の経路でないそのカスパーゼを示唆する（Ｊａａｔｔｅｌａら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：４１６−４２３、Ａｂｒａｈａｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；１４：１８４−１９３、Ｌｏｃｋｓｈｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：２７６６−２７７３）。
カスパーゼから独立したアポトーシスは、以下の臨床的に利用できる薬により、インビトロで誘発できる。
シトシンアラビノシド又はパクリタキセルで処理した急性骨髄性白血病細胞（（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：４１７９−４１８６）、
リツキシマブ及びアルメツズマブで処理したＢリンパ球系の細胞株及び慢性リンパ球性白血病細胞（Ｓｔａｎｇｌｍａｉｅｒら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４）
イマチニブメシル酸塩で処理したＢＣＲ−ＡＢＬ陽性のヒト白血病細胞（Ｏｋａｄａら、Ｂｌｏｏｄ．２００４；
１０３：２２９９−２３０７）、
並びにタキソールで処理した卵巣悪性腫瘍細胞株（Ａｈｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；９１：１０４３−１０５２）。
ＭＭでは、Ａｓ２Ｏ３により誘発されるヒ素ＲＰＭＩ８２２６細胞及び患者のＭＭ細胞のアポトーシスは、カスパーゼから独立している（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ−Ｇｒａｄら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００３；２：１１５５−１１６４）。
ＨＮＫはまた、アポトーシスＳＵ−ＤＨＬ４細胞を誘導し、それはカスパーゼ−８及び３−の低濃度を表し、ＮＫで誘導されるカスパーゼ−独立アポトーシスの経路を更に解析した。
幾つかの分子はカスパーゼから独立したＡＩＦ／エンドーＧ経路を誘導する（Ａｈｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；９１：１０４３−１０５２、Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３；５：９７−９９、Ｊｏｚａら、Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１０：５４９−５５４、Ｄａｕｇａｓら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２０００；１４：７２９−７３９、Ｃｒｅｇａｎ  ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：２７８５−２７９６、Ｃａｎｄｅら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：５９１−５９５）。
この経路では、、死刺激はミトコンドリアからサイトソル及び核までＡＩＦ及び／又はエンドーＧの発散を誘導し、それに続く染色質凝縮及び細胞死をもたらす。
ＨＮＫで誘導されるアポトーシスの間、Ｅｎｄｏ  ＧでなくＡＩＦは、ミトコンドリアからサイトソルにおいて顕著に遊離していた。
ＡＩＦ／ＥｎｄｏＧ経路を介して誘発されるアポトーシスがＡＩＦの発散を示すことによりカスパーゼに依存し、ミトコンドリアからのＥｎｄｏＧがｚ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋによりブロックされるという報告は存在しない（Ｃａｎｄｅら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：５９１−５９５、Ａｒｎｏｕｌｔら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．２００３；２２：４３８５−４３９９）。
ＡＩＦタンパク質の放出はカスパーゼとは独立していた。なぜなら、ＡＩＦに対するＨＮＫ効果がｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによりブロックされなかったからである。
結局セリンプロテアーゼインヒビター４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフッ化物（ＡＥＢＳＦ）による前処理がＨＮＫで誘導されるアポトーシスを阻害しなかったため、セリンプロテアーゼ活性により誘導されるカスパーゼ依存性及び非依存性の細胞死経路はＨＮＫで誘導されるアポトーシスを媒介するとは考えられない（Ｏｋａｄａら、Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０３：２２９９−２３０７、ｄｅ  Ｂｒｕｉｎら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００３；１０：１２０４−１２１２、Ｌｉｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００４；５６９：４９−５３）。
【０２６７】
これらの結果は、ＨＮＫが両方のカスパーゼ依存性及び非依存性の経路を介してＭＭ細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
ＨＮＫはＳＵ−ＤＨＬ４細胞のアポトーシスを誘導し、それはカスパーゼ−８及び３の低濃度を表し、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及びレブリミドに抵抗性である（Ｃｈａｕｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：６１７４−６１７７）。
したがって、カスパーゼ依存的及びカスパーゼ非依存的な経路の両方を経てＭＭ細胞を殺すＨＮＫのような薬剤は、特に薬剤耐性の克服に有用でありうる。
【０２６８】
ＨＮＫ及びボルテゾミブの組み合わせにより、ＭＭ．１Ｓ細胞増殖抑制が強化される。
【０２６９】
ＨＮＫ及びボルテゾミブによるＭＭ．１Ｓ細胞の複合処理により、各薬剤のみと比較して、細胞毒性及びアポトーシス誘導を強化した（図８Ａ及びＢ）。
図８Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理しし、細胞増殖を比色アッセイにより測定した。
値は３回の培養組織における平均±ＳＤを表す。
図８Ｂでは、ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理したＭＭ．１Ｓ細胞のアポトーシス誘導を、ＡＰＯ２．７により測定した結果をしめす。
Ｖａｌｕｅｓが２つの独立の培養組織における平均±ＳＤを意味する。
ＨＮＫ及びボルテゾミブの組み合わせによる強化された細胞毒性機構を説明するため、ＭＭ．１Ｓ細胞を８時間ＨＮＫ単独で、及びボルテゾミブと共に処理した。
【０２７０】
ボルテゾミブで誘導されるＨｓｐ２７、ｐ−Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０の増加機構は、ＨＮＫにより著しくブロックされた（図８Ｃ）。
図８Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞は８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理した結果を示す。
全細胞可溶化物を、ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０のリン酸化及びタンパク質発現を評価するためにウエスタンブロッティングに供した。
【０２７１】
いずれの薬のみと比較しても、ボルテゾミブとＨＮＫの組合せは、アポトーシスの細胞毒性及び誘導を強化した。
Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０は、ＭＭ細胞においてボルテゾミブ処理後に上方制御される（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２；９９：１４３７４−１４３７９、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１：１５３０−１５３４）。
Ｈｓｐｓはアポトーシスシグナリングを幾つかのレベルで阻害するため（Ｃｒｅａｇｈら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００；１４：１１６１−１１７３、Ｊｏｌｌｙら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２０００；９２：１５６４−１５７２、Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００；２：Ｅ１６３−１６５．）、ＰＳ−３４１−処理したＭＭ細胞のこの上方制御は、ボルテゾミブで誘導されるアポトーシスに耐性を誘導する。
ＨＮＫは著しくＨｓｐ２７及びＨｓｐ７０のボルテゾミブで誘導される発現の刺激に対する反応を抑制し、それにより、ボルテゾミブの細胞毒性を強化した。
【０２７２】
外因性ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓと培養したＭＭ細胞におけるＨＮＫの効果。
【０２７３】
外因性ＩＬ−６及びＩＧＦ−１の存在下で、ＭＭ細胞に対するＨＮＫの効果を、ＢＭＳＣｓと同様に評価した。
ＩＬ−６もＩＧＦ−１も、ＨＮＫで誘導される増殖阻害を防護しなかった（図９Ａ及びＢ）。
図９は、ＨＮＫがＩＬ−６、ＩＧＦ−１及び患者ＢＭＳＣｓへの付着の防護効果を克服できることを示す。
ＭＭ．１Ｓ細胞は、２人のＭＭ患者（Ｃ及びＤに示される）に由来するＩＬ−６（Ａに示す）、ＩＧＦ（Ｂに示す）又はＢＭＳＣｓの有無において、ＨＮＫの所定濃度により４８時間処理した。
ＤＮＡ合成は、４８時間の培養の最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン取り込みをにより測定した。
値は、３回の培養における平均±ＳＤを表す。
２人のＭＭ患者に由来するＢＭＳＣｓへのＭＭ細胞の結合によりＤＮＡ合成が活性化し、それはＨＮＫ（図９Ｃ及びＤ）により阻害された。
重要なことに、ＨＮＫは、同様の濃度でＢＭＳＣｓの生存率（比色アッセイにより測定）に影響を及ぼさなかった。
【０２７４】
更に増殖シグナル伝達へのＨＮＫの効果を詳細に解析するために、ＭＭ．１Ｓ細胞を２．５％のＦＣＳで３及び６時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによる前処理に続いて、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）により１０及び２０分間刺激した。
ＨＮＫは著しくＳＴＡＴ−３のリン酸化を減少させ、ＥＲＫ及びＡｋｔがＩＬ−６で（ＩＧＦ−１により誘発されるＥＲＫ及びＡｋｔと同様に）誘導される（図１０Ａ及びＢ）。
図１０Ａは、２．５％ＦＣＳ含有培地でＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により３及び６時間前処理されたＭＭ．１Ｓ細胞を示す。細胞を更に１０及び２０分間ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。
全細胞可溶化物は、リン酸化及びＳＴＡＴ３、ＥＲＫｌ／２及びＡｋｔのタンパク質発現を評価するウエスタンブロッティングに供した。
図１０Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を、３及び６時間、２．５％ＦＣＳ含有培地で、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により前処理し、更に１０及び２０分間ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。
全細胞可溶化物は、リン酸化及びＥＲＫ１／２及びＡｋｔのタンパク質発現のためのウエスタンブロッティングに供した。
ｇｐ１３０及びｇｐ８０の負の制御は、ＨＮＫ処理の後にも観察された（図１０Ｃ）。
図１０Ｃは、３及び６時間、２．５％ＦＣＳ含有培地で、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により前処理されたＭＭ．１Ｓ細胞を示す。
全細胞可溶化物は、カスパーゼの裂開及びｇｐ８０及びｇｐ１３０の発現を測定するために、ウエスタンブロッティングに供した。
【０２７５】
ＢＭの微細環境はＭＭ細胞の薬剤耐性を与えるため（Ｄａｍｉａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：００：００１６５８−１６６７）ＢＭ微細環境を模倣した。
外因性ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓとＭＭ細胞との共培養における、ＨＮＫの細胞毒性上の効果を解析した。
ＢＭＳＣｓ、ＩＬ−６又はＩＧＦ−１への付着は、ＨＮＫで誘導されるＭＭ細胞死を防護しなかった。
ＨＮＫはＩＬ−６により誘導されるシグナル伝達経路の調節を活性化させ、ＩＧＦ−１も更に解析した。
ＳＴＡＴ−３、ＥＲＫ及びＡｋｔのシグナル伝達（ＩＬ−６により誘発される）、並びにＥＲＫ及びＡｋｔのシグナル伝達（ＩＧＦ−１により活性化される）は、ＨＮＫによりブロックされた。
ＭＭ細胞におけるボルテゾミブ処理したアポトーシスの間の、活性カスパーゼによるＩＬ−６受容体ｇｐｌ３０の細胞質の領域の負の制御が報告されている（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３；２２：８３８６−８３９３）。
ｇｐ８０と同様にｇｐ１３０の負の制御はＨＮＫ処理した細胞においても観察され、それによりＩＬ−６で誘導されるシグナル伝達が阻害される。
【０２７６】
ＨＮＫは、ＨＵＶＥＣの血管新生を阻害する。
【０２７７】
ＨＵＶＥＣを６時間８μｇ／ｍＬのＨＮＫで培養し、内皮細胞による管形成を解析した。
ＨＮＫは著しく管形成（図１１Ａ及びＢ）を阻害したが、その濃度はＨＵＶＥＣ細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。
図１１はＨＮＫによるＨＵＶＥＣの血管新生の抑制を表す。
ＨＵＶＥＣを、６時間８μｇ／ｍＬのＨＮＫあり（Ｂで示す）、又はなし（Ａで示す）による培養において、管形成を解析した。
最初の倍率を×４０とした。
【０２７８】
図１７Ａはまた、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＶＥＧＦで誘導されるＫＤＲ自己リン酸化に対するホノキオールの効果を示す。
ＨＵＶＥＣｓを、６０分間担体又はホノキオール（５及び１０μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートし、更に５分間２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦにより刺激した。
可溶化液を抗ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）抗体により免疫沈降（ＩＰ）させ、更に抗ＫＤＲ抗体（トップパネル）によるイムノブロット（ＩＢ）を行った。
底部パネルは、ベース（無処置の細胞の比率を１に設定）に対する倍数変化の平均値のデータを表す。
値は、平均±ＳＥ（３回の独立した実験による）である。
＊ｐ＜０．０５  ＶＥＧＦのみに対する、阻害剤がある場合の、ＶＥＧＦによるリン酸化の増加。
図１７Ｂでは、ＶＥＧＦで誘導されるＲａｃ活性化上のホノキオールの効果を解析した。
ＨＵＶＥＣｓを、６０分間担体又はホノキオール（１０μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートし、更に３分間２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦにより刺激した。
Ｒａｃ活性は、ｐ２１活性化キナーゼ１タンパク質の結合ドメインによるアフィニティ沈殿で測定した。
上部：（ＧＴＰ結合Ｒａｃの代表的なイムノブロット）。
底部（デンシトメーター分析（±ＳＥを表す）、３回のイムノブロット実験、コントロールに対する倍数として表す）。
＊，ＶＥＧＦのみとの比較、ｐ＜０．０１。
このデータは、ホノキオールがその抗腫瘍活性に加えて血管新生の直接の阻害剤として作用することを示す。
【０２７９】
ＨＮＫ（ＶＥＧＦで誘導されるＶＥＧＦ受容体２自己リン酸化のブロッキング及びＨＵＶＥＣの増殖阻害により明示される）の抗血管新生活性は報告されている（Ｂａｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：３５５０１−３５５０７）。
この実験ではまた、ＨＮＫの毒性投与量以下でＨＵＶＥＣの管形成の抑制が誘導されることが明らかになり、ＨＮＫがＢＭ微細環境で脈管形成を阻害することを示唆した。
【０２８０】
＜実施例４＞
ホノキオールのインビボ効果
【０２８１】
図１８は、ヌードマウスのＳＶＲ血管肉腫のインビボ増殖に対するホノキオールの効果を例示する。
このデータは、ホノキオールがインビボ腫瘍に対して効果的で、宿主動物に対する非毒性であることを示す。
【０２８２】
＜実施例５＞
ＡＭＰＫ、ＰＬＤ及びＮＦＫＢが含まれる生物学的標的に対するホノキオール類似体候補の機能解析
細胞増殖アッセイ
【０２８３】
ＳＶＲ（形質転換内皮細胞株）増殖アッセイが、血管新生を阻害する及び抗腫瘍活性の直接の計測として使用できる。
このアッセイは、ＳＶＲ細胞、対、不死化内皮細胞株の（ＭＳ１）増殖における化合物の効果を比較する、ハイスループットスクリーンとして役立つ。
このアッセイで１０μＭのＩＣ５０を有する化合物は、活性であるとみなすことができる。
以前ホノキオールで示されたように、この最初のアッセイで活性を示す化合物を優先的に用いて、初期ヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、内皮細胞増殖、対、繊維芽細胞増殖を阻害するそれらの能力を試験できる。
ＳＶＲ細胞を２４穴プレートに播いた。
次の日、培地を阻害剤又は担体コントロールを中程度に含む培地と交換した。
細胞を７２時間、３７℃でインキュベートし（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９９  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０，９２５−９２９、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ，Ｋ．Ｒ．，ら、２０００  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５）、菌体数をコールターカウンターを使用して３回測定した（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）。
不死化及びＫ−Ｒａｓ形質転換ラット上皮細胞（ＲＩＥｐＺｉｐ及びＲＩＥｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）、並びに繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐ及びＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）を、５％のウシ胎仔血清（ＲＩＥ）又は１０％のウシ血清（ＮＩＨ３Ｔ３）を添加したダルベッコ改良イーグル培地で３７℃で（１０％のＣＯ２）培養した（Ｏｌｄｈａｍ，Ｓ．Ｍ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，６９２４−６９２８、Ｐｒｕｉｔｔ，Ｋ．，ら、２０００  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７５，４０９１６−４０９２４）。
６−ウェルプレートに細胞を１０５／ｗｅｌｌで播いた。
ベクター及びＲａｓで形質添加したＮＩＨ３Ｔ３及びＲＩＥ細胞を、担体（Ｍｅ２ＳＯの２０μｌ）、又はホノキオール（２ｍｇ／ｍＬのＭｅ２ＳＯストックから）（５、１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に形態変化を観察した。
【０２８４】
ＡＭＰＫ活性化の刺激
ホノキオールはＡＭＰＫ（図２０）を活性化させることができ、それはｐ５３依存性及び独立の経路による腫瘍細胞の増殖を抑制することを示した（Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｇ．ら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １８、２８３−２９３、Ｂｈａｒｔｉ、Ａ．Ｃ．ら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３、３１７５−３１８４、Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌら、（１９９８）  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（３７６−３８３）、Ｗｏｏｄｓ，Ａ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３、２００４〜２００８、Ｓｈａｗ，Ｒ．Ｊ．ら、（２００４）ＰＮＡＳ  １０１、３３２９−３３３５、Ｂｕｚｚａｉ，Ｍ．ら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４、４１６５−４１７３）。
図２０に示すように、ＰＣ３細胞は通常酸素条件及び低酸素症条件下でホノキオール処理した。
一番上のブロットは、ホノキオールによるＡＭＰキナーゼのン酸化（活性化）の増加を示す。
底部のブロットは、全ＡＭＰキナーゼタンパク質（ローディングコントロール）を示す。
図２０ｂに示すように、ホノキオールは投与量依存的に前立腺癌細胞のＨＩＦ−１ａを活性化させた。
ＰＣ３細胞は、酸素正常状態（左）又は低酸素（右）にてホノキオールで処理した。
いずれの場合においてもＨＩＦ−１ａ誘導は投与量依存的であり、低酸素の場合は最少の添加物でなされた。
【０２８５】
化合物はｐ５３欠損ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞株においても試験でき、処理により図２０のようなＡＭＰＫの活性化をもたらすか否かを解析できる。
ＰＣ３細胞を２４時間化合物又は担体で処理し、タンパク質を回収し、ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫ活性化の標識）のαサブユニットのリン酸化をウエスタンブロット分析した。
更に、ＡＭＰＫ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の基質のリン酸化をウエスタンブロットにより解析できる。
化合物によりＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化が生じる場合、直接ＡＭＰＫ活性を刺激する化合物の能力は、酵素ＡＭＰＫに化合物を添加することにより評価できる（Ｗｉｎｄｅｒ及びＨａｒｄｉｅ（（１９９６）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３３，Ｅ２９９−Ｅ３０４）。
更に、ドミナントネガティブＡＭＰＫ細胞をホノキオール及びホノキオール類似体の、これらの細胞の激増を阻害する能力を試験するために使用できる（Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｇ．ら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １８、２８３−２９３）。
ホノキオールは直接にインヴィトロで心臓ＡＭＰＫＫを活性化しない。
ホノキオールはインシュリンによりグルコース取り込みを強化し、ラット乳頭筋におけるアディポネクチンと同様である。
【０２８６】
ホスホリパーゼＤ活性の抑制
【０２８７】
ホノキオール類似体は、ＰＬＤ活性の抑制による腫瘍及び内皮細胞アポトーシスを刺激できる。
予備データは、ＳＶＲ細胞が、特に無血清条件の下で、ＰＬＤの高度を発現し、及びそれがＰＬＤ活性の優れたアッセイ方法であることを示す。（図２１、２２）
図２１は、ホノキオールが野生型チュベリンの効果をミミックできることを示す。
チュベリンによる治療により、回数及び投与量依存的な（ａｋｔの負の制御と同様に）のＳ６キナーゼリン酸化の負の制御が生じる。
このように、ホノキオールは野生型チュベリンの作用のいくつかを模倣する。
図２２は、０．５％及び１０％のホノキオールがＳＶＲ細胞における血清中のホスホリパーゼＤの活性を阻害することを示す。
【０２８８】
細胞をホノキオール類似体で２４時間し、脂質はフォスターらの方法（（２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８９，１０１９−１０２４）に従って抽出できる。
ＰＬＤに対して阻害力を示す化合物は、ＰＬＤ標的（例えばｍＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ及びＳ６（図２１））の下流の活性化を阻害するそれらの能力を試験できる。
【０２８９】
ＮＦＫＢ活性化の抑制
【０２９０】
ＮＦＫＢは多くの腫瘍細胞（多発性骨髄腫など）における主な生存機構である。
おそらくｖｅｌｃａｄｅから独立した経路によるＮＦＫＢの抑制で、ホノキオールはｖｅｌｃａｄｅの活性を強化できる。
図２３及び２４は、ホノキオールがＮＦＫＢ活性化をブロックし、従来の化学療法剤に対して腫瘍細胞を感受性にすることを示す。
ＮＦＫＢ上のホノキオール活性の迅速なアッセイとして、ＩｋＢａのリン酸化を行うことができる。
ＩｋＢａのリン酸化は、ホノキオール治療により減少している。
細胞をホノキオール類似体で処理し、２４時間インキュベートした後、可溶化液を調製できる。
完全及びリン酸化されたｐ６５のウエスタンブロット分析は標準プロトコルにより実施できる（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．＆Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，２４９９５−２５０００；Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ，Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．，Ｒｅｕｂｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｄ．，Ａｌｅｘａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｒａｊ−Ｖａｄｈａｎ，Ｓ．，Ｅｓｔｒｏｖ，Ｚ．，Ｔａｌｐａｚ，Ｍ．＆Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ１０３，３１７５−３１８４）。
【０２９１】
＜実施例６＞
ＰＢＭ細胞における抗ＨＩＶ−１活性、及びホノキオール及びホノキオール様化合物による細胞毒性アッセイ
ＰＢＭ細胞のＨＩＶアッセイ
合成された化合物及びホノキオールの抗ウイルス活性を、ヒト末しょう血液単核（ＰＢＭ）細胞（表４）のＨＩＶ−Ｉに関して評価した。
【０２９２】
【表４】
2008542192.tif 000066
【０２９３】
ヒト末しょう血液単核（ＰＢＭ）細胞（アトランタ赤十字から入手）は、健常な血清陰性のドナーからフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ不連続勾配遠心沈降により単離できる。
細胞を、使用の２〜３日前にフィトヘムアグルチニンＡ（ディフコ、スパークス、メリーランド）により刺激できる。
ＨＦＶ−１ＬＡＩのようなＨＩＶ−１は、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）から入手でき、抗ウイルス性のアッセイのための標準的な対照ウイルスとして使用できる。
分子伝染性クローンＨＩＶ−１ＸＸＢｒｕ及びＨＩＶ−１Ｍ１８４Ｖｐｉｎは、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｍｅｌｌｏｒｓ（ピッツバーグ大学）から入手できる。
感染は一時間で大量にできる（フラスコ（Ｔ２５）における１００ＴＣＩＤ５０／１×１０７細胞によるアッセイ、又は２４穴プレートにおける２００ＴＣＩＤ５０／６×１０５細胞／ウェルによるアッセイ）。
細胞を、試験化合物の１０倍の系列希釈を含んでなるプレート又はフラスコに添加してもよい。
アッセイ培地は、熱不活性１６％ウシ胎児血清、１．６ｍＭのＬ−グルタミン、８０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０００８％のＤＥＡＥ−デキストラン、０．０４５％のナトリウム重炭酸塩及び２６ＩＵ／ｍＬの組換えインターロイキン２（ケイロン社、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア）を添加したＲＰＭＩ−１６４０であってもよい。
ＡＺＴをアッセイ用のポジティブコントロールとして使用できる。
無処置の及び非感染ＰＢＭ細胞をコントロールとして、均等な菌体濃度でパラレルに増殖させてもよい。
細胞培養は湿潤な３７℃、５％ＣＯ２−空気条件に５日間維持し、上澄みを逆転写酵素（ＲＴ）活性の解析用に回収してもよい。
【０２９４】
上澄みは、ウイルスをペレット化するために２時間、１２，０００回転数／分で遠心分離できる。
ペレットを１００μｌのウイルス可溶化バッファー（ＶＳＢ）（０．５％のトリトンＸ−１００、０．８のＭＮａＣｌ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、２０％のグリセロール及び０．０５のＭトリス、各サンプルのｐＨ７．８）とのボルテックスにより可溶化できる。
１０μＬを７５μＬのＲＴ反応混合液０．０６Ｍトリス（ｐＨ７．８）、０．０１２ＭのＭｇＣｌ２、０．００６Ｍのジチオスレイトール、０．００６ｍｇ／ｍＬのポリ（ｒＡ）ｎ、１２−１８オリゴ（ｄＴ）、９６μｇ／ｍＬ  ｄＡＴＰ及び０．０８ｍＣｉ／ｍＬの３Ｈ−チミジン三リン酸塩（Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂｒｅａ、カリフォルニア）１μＭ）に添加し、２時間３７℃でインキュベートしてもよい。
反応は、０．０５％のナトリウムリン酸塩を含んでなる１００μＬ  １０％トリクロロ酢酸の添加により停止できる。
酸不溶性生成物はパッカードＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネティカット）を使用して濾紙で回収でき、ＲＴ活性はパッカードＤｉｒｅｃｔ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネティカット）で解析できる。
ＲＴの結果は、ｍｌあたりのカウント数／分（ＣＰＭ）において表してもよい。
抗ウイルス性の５０％有効濃度（ＥＣ５０）及び９０％の有効濃度（ＥＣ９０）は、メジアン効果法を使用して濃度−反応曲線から算出できる（Ｂｅｌｅｎ’ｋｉｉ，Ｓ．Ｍ．；Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ．Ｒｅｓ．１９９４，２５，１−１１）。
【０２９５】
細胞毒性アッセイ
【０２９６】
ホノキオール及びその類似体の細胞毒性を、ヒトＰＢＭ、ＣＥＭ及びベロー細胞（表４）において評価した。
【０２９７】
化合物は、感染してないヒトＰＢＭ細胞、ＣＥＭ（米国菌培養収集所、ロックビル、メリーランドから得られるＴ−リンパ芽球腫細胞株）及びＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞におけるそれらのポテンシャル毒作用を評価できる。
健常な血清陰性のドナー（ＨＩＶ−１）の全血から調製できるＰＢＭ細胞は、一段階のフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ不連続勾配遠心沈降により調製できる。
対数期Ｖｅｒｏ、ＣＥＭ及びＰＢＭ細胞を、それぞれ５×１０３、２．５×１０３及び５×１０４細胞／ウェルの密度で播種してもよい。
全細胞を、被検薬の１０倍の系列希釈を含んでなる９６穴細胞培養プレートにプレーティングしてもよい。
Ｖｅｒｏ、ＣＥＭ及びＰＢＭ細胞の培養液を３、４及び５日間、湿潤な５％ＣＯ２、３７℃の条件で一晩インキュベートした。
インキュベート終了時、ＭＴＴテトラゾリウム色素溶液（Cell titer 96?, Promega, Madison, Wis.）を各ウェルに添加し、一晩インキュベートした。
反応は、停止可溶化溶液（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）により停止できる。
プレートは、ホルマザンの結晶の溶解を確実にするために５時間インキュベートしてもよい。
プレートは、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ．，Ｍｏｄｅｌ  ＃  ＥＬ３１２ｅ）を使用して、５７０ｎｍの波長で測定できる。
５０％の抑制濃度（ＩＣ５０）は、メジアン効果法を使用して濃度−反応曲線から解析してもよい。
【０２９８】
＜実施例７＞
ホノキオール類似体の細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイ
【０２９９】
ＳＶＲ（形質転換内皮細胞株）増殖アッセイが、血管新生を阻害する及び抗腫瘍活性の直接の手段として使用できる。
このアッセイは、ＳＶＲ細胞、対、不死化内皮細胞株の（ＭＳ１）増殖における化合物の効果を比較する、ハイスループットスクリーンとして役立つ。
このアッセイで１０μＭのＩＣ５０を有する化合物は、活性であるとみなすことができる。
以前ホノキオールで示されたように、この最初のアッセイで活性を示す化合物を優先的に用いて、初期ヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、内皮細胞増殖、対、繊維芽細胞増殖を阻害するそれらの能力を試験できる。
幾つかの化合物がのこのアッセイの結果は、表５に示す。
ＳＶＲ細胞を２４穴プレートに播いた。
次の日、培地を阻害剤又は担体コントロールを中程度に含む培地と交換した。
細胞を７２時間、３７℃でインキュベートし（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９９  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０，９２５−９２９、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ，Ｋ．Ｒ．，ら、２０００  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５）、菌体数をコールターカウンターを使用して３回測定した（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）。
不死化及びＫ−Ｒａｓ形質転換ラット上皮細胞（ＲＩＥｐＺｉｐ及びＲＩＥｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）、並びに繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐ及びＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）を、５％のウシ胎仔血清（ＲＩＥ）又は１０％のウシ血清（ＮＩＨ３Ｔ３）を添加したダルベッコ改良イーグル培地で３７℃で（１０％のＣＯ２）培養した（Ｏｌｄｈａｍ，Ｓ．Ｍ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，６９２４−６９２８、Ｐｒｕｉｔｔ，Ｋ．，ら、２０００  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７５，４０９１６−４０９２４）。
６−ウェルプレートに細胞を１０５／ｗｅｌｌで播いた。
ベクター及びＲａｓで形質添加したＮＩＨ３Ｔ３及びＲＩＥ細胞を、担体（Ｍｅ２ＳＯの２０μｌ）、又はホノキオール（２ｍｇ／ｍＬのＭｅ２ＳＯストックから）（５、１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に形態変化を観察した。
【０３００】
【表５】
2008542192.tif 000067
2008542192.tif 000068
2008542192.tif 000069
【０３０１】
＜実施例８＞
ホノキオールは、アポトーシスを強化し、破骨細胞形成を抑制し、ＩｋＢａキナーゼの負の制御及びＮＦ−κＢで制御された遺伝子産物による浸潤を阻害する
材料及び方法
【０３０２】
ホノキオール及びマグノロールを単離した（Ｂａｉ，Ｘ．，ら、２００３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７８：３５５０１−３５５０７）。
ホノキオールの５０ｍＭ溶液を、１００％のジメチルスルフォキシド中に調製し、小アリコートとして−２０℃保存し、更に細胞培養培地で必要に応じて希釈した。
バクテリアから派生した組換えヒトＴＮＦ（５×１０Ｕ／ｍｇの７つの比活性を有するように均一に精製）は、ジェネンテク（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）より贈与された。
たばこ煙縮合物を、前述のように調製した（Ａｎｔｏ，Ｒ．Ｊ．，ら、２００２  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２３：１５１１−１５１８）。
ペニシリン、ストレプトマイシン、ＩＭＤＭ培地及びＦＢＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（グランドアイランド、ＮＹ）のものを入手した。
ＰＭＡ、オカダ酸、Ｈ２Ｏ２及び抗ｂ−アクチン抗体は、Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。
ｐ６５、ｐ５０、ＩｋＢａ、サイクリンＤｌ、ＭＭＰ−９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰ１、ＩＡＰ２、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ‘、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＣＡＭ−Ｉに対する抗体、及びアネキシンＶ染色キットは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。
抗ＣＯＸ−２及び抗ＸＩＡＰ抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から入手した。
リン酸化特異的な抗ＩｋＢａ（セリン３２）、及びリン酸化特異的な抗ｐ６５（セリン５２９）抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。
抗ＩＫＫ−ａ、抗−ＩＫＫ−ｂ及び抗ＦＬＩＰ抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ（サンディエゴ、ＣＡ）から贈与を受けた。
【０３０３】
細胞株
【０３０４】
ヒト骨髄性のＫＢＭ−５細胞、マウスマクロファージＲａｗ２６４．７細胞、ヒト肺腺癌Ｈ１２９９細胞、ヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞、扁平上皮癌ＳＣＣ４及びヒト胚腎臓Ａ２９３細胞は、ＡＴＣＣから入手した。
ＫＢＭ−５細胞は、１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭ培地で培養した。
ＲＡＷ２６４．７細胞はＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養し、Ｈ１２９９細胞及びＵ２６６はＲＰＭＩ  １６４０培地で培養し、Ａ２９３細胞は１０％のＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養した。
ＳＣＣ−４細胞は、１０％のＦＢＳ、必須ではないアミノ酸、ピルビン酸塩、グルタミン及びビタミンを含んでなるＤＭＥＭで培養した。
全ての培地は、１００のＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した。
【０３０５】
細胞毒性アッセイ
【０３０６】
細胞毒性は改変テトラゾリウム塩３−（４−５−ジメチルチオゾル−２−イル）２−５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイにより解析した（Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ．，ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）。
【０３０７】
ＰＡＲＰ裂開アッセイ
ＰＡＲＰの切断産物の検出のために、ホノキオール処理した細胞を溶解緩衝液で溶解させ、全細胞抽出物を調製した（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、
２５０ｍＭのＮａＣｌ、
２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、
０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、
０．０１ｍｇ／ｍＬのアプロチニン、
０．００５ｍｇ／ｍＬのロイペプチン、
０．４ｍＭのＰＭＳＦ、
４ｍＭのＮａＶＯ４）。
可溶化液を、不溶性物質を除去するために１０分間の１４０００回転数／分で回転し、１０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離させ、ＰＡＲＰ抗体をプローブとして解析した。
【０３０８】
生死アッセイ
【０３０９】
生死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）（細胞内のエステラーゼ活性及びプラズマ膜統合性を解析）を用い、アポトーシスを測定した。
このアッセイはカルセイン（ポリアニオン性色素）を使用する方法であり、生細胞中で保持され、緑の蛍光を発する（Ｂｈａｒｔｉ，  Ａ．Ｃ．，ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）。
エチジウムモノマー染料（赤い蛍光）を使用した（傷害性膜もにから細胞に入ることができ、核酸と結合できるが、生細胞の完全な形質膜の場合は除外される）。
簡潔には、１つ×１０５の細胞を２４時間、１０ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に３７℃で１６時間、１ｎＭ  ＴＮＦで処理する。
細胞を、生死試薬（５ｍＭのエチジウムホモ二量体、５ｍＭのカルセイン−ＡＭ）で着色し、更に３０分間３７℃でインキュベートした。
細胞は、蛍光顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ−２、ニコン、東京、日本）下で分析した。
【０３１０】
アネキシンＶアッセイ
【０３１１】
アポトーシスの早期の指標として、細胞の細胞質のインタフェースから細胞外の表面への膜リン脂質ホスファチジルセリンの急速な転座及び蓄積がある。
この膜の非対称性の損失は、アネキシンＶの結合特性を使用して検出できる。
蛍光染料ＦＩＴＣとコンジュゲートさせたアネキシンＶ抗体をアポトーシスの検出に用いた。
簡潔には、１×１０６の細胞を、１２時間、３０ｍＭのホノキオールにより前処理し、１６時間１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、更に、アネキシンＶ染色に供する。
細胞を洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗アネキシンＶ抗体で着色し、更にフローサイトメータ分析した（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０３１２】
浸潤アッセイ
【０３１３】
細胞外基質の浸潤が腫瘍転移の顕著なステップであるため、膜浸潤培養システムを用いて細胞浸潤を評価した。
ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎシステムは、８ｍｍの直径の孔を有する耐光性ポリエチレンテレフタラート膜を有し、再構成された基底膜ゲルでコーティングされたチャンバである（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
合計２．５×１０４のＨ１２９９細胞を無血清培地中に懸濁し、上のウェルに播種した。
一晩インキュベーションの後、細胞を、１２時間１０ｍＭのホノキオールで処理し、更に１％のＦＢＳ及びホノキオールがある場合には、更なる２４時間１ｎＭ  ＴＮＦにより刺激した。
マトリゲルにより侵入した細胞（すなわちインキュベーションの間、下部チャンバに移動した細胞）を、３７℃で３０分間、ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍＬのカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で着色し、Ｖｉｃｔｏｒ  ３  ｍｕｌｔｉ−ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で蛍光をスキャンした。
蛍光細胞を計数した。
【０３１４】
溶骨細胞分化アッセイ
【０３１５】
ＲＡＮＫＬ−で誘導される破骨細胞形成上のホノキオールの効果を決定するために、ＲＡＷ２６４．７細胞（インヴィトロでＲＡＮＫＬにより溶骨細胞に分化できる）を培養した。
（Ｂｈａｒｔｉ（Ａ．Ｃ．）ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）．
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で２４穴プレートで培養し、一晩付着させた。
培地を交換し、細胞を１２時間、５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に５ｎＭ  ＲＡＮＫＬで処理した。
４及び５日目に、酸性ホスファターゼキット（シグマアルドリッチ）を使用して、上記のように、細胞を酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）発現の解析ために着色し、ウェルあたりのＴＲＡＰ陽性の多核溶骨細胞（＞３の核）を計数した。
【０３１６】
ＮＦ−κＢ活性化
【０３１７】
ＴＮＦ（炎症において確立した役割を有する）によるＮＦ−κＢ活性化を解析するために、腫瘍増殖、促進、浸潤及び転移（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００３．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７４５−７５６）、ＥＭＳＡ（Ｃｈａｒｕｒｖｅｄｉ（Ｍ．Ｍ．）ら、２０００  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１９：５８５−６０２）を解析した。
簡潔には、ＴＮＦ処理した細胞（１×１０６／ｍＬ）から調製された核抽出物を３７℃で３０分間、ヒト免疫不全症ウイルス末端反復配列（５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ  ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ  ＣＧＣＴＧ  ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’（下線はＮＦ−κＢ−結合部位を示す））からの３２Ｐ−ラベルされた４５−ｍｅｒ二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（１６ｆｍｏｌのＤＮＡを有する１５ｍｇのタンパク質）でインキュベートし、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成させ、６．６％のネイティブポリアクリルアミドゲル上でフリーのオリゴヌクレオチドから分離する。
二本鎖の変異オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ  ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ  ＣＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’を、ＤＮＡとＮＦ−κＢの結合特異性を検討するために用いた。
結合特異性は、ラベルのないオリゴヌクレオチドとの競合によっても解析した。
スーパーシフトアッセイのために、複合体をＥＭＳＡにより分析する前に、ＴＮＦ処理した細胞から調製された核抽出物を３７℃で３０分間、ＮＦ−κＢのｐ５０かｐ６５サブユニットに対する抗体とインキュベートした。
免疫前血清（ＰＩＳ）を、ネガティブコントロールとして含めた。
乾燥ゲルをＳｔｏｒｍ８２０により視覚化し、放射性バンドをＩｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して定量化した。
【０３１８】
ウエスタンブロット分析
【０３１９】
ＴＮＦ依存性のＩｋＢａリン酸化、ＩｋＢａ分解、ｐ６５転座及びｐ６５リン酸化に対するホノキオールの効果を解析するため、細胞質の抽出物をＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）から調製し（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）、１２時間、２５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に０．１ｎＭ  ＴＮＦで数回曝露した。
細胞質のタンパク質（３０ｍｇ）を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜へ転写し、５％の脱脂乳でブロッキングし、ＩｋＢａ、リン酸化されたＩｋＢａ、ｐ６５及びリン酸化ｐ６５に対して特異的な抗体をプローブとして解析した。
処理した細胞（培地２ｍｌ中、２×１０６細胞）の全細胞抽出物中のサイクリンＤｌ、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ｃＩＡＰ−１、ＴＲＡＦｌ、Ｂｃｌ−２、ＢｆＩ−１、ｃＦＬＩＰ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を決定するために、５０ｍｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、製造業者の推奨プロトコルに従って特異抗体によるウエスタンブロットにより解析した。
ブロッティング膜を洗浄し、１時間ＨＲＰコンジュゲート二次抗体に曝露し、ＥＣＬ試薬（アマシャムファルマシアＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で最後に検出した。
バンドを、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア版３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｃａｎ  ｖｌ．３０において定量化した。
【０３２０】
ＩＫＫアッセイ
【０３２１】
ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化に対するホノキオールの効果を解析するため、上記の基本的な方法によりＩＫＫを分析した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。
簡潔には、全細胞抽出物から複合体ＩＫＫをＩＫＫａ及びＩＫＫｂと反応する抗体で沈殿させ、更にＰｒｏｔｅｉｎ  ＰＪＧ−セファロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で処理した。
２時間後、ビーズを溶解バッファーで洗浄し、更に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２０ｍＣｉ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１０ｍＭのラベルのないＡＴＰ及び２ｍｇの基質ＧＳＴ−ＩｋＢａ（ａａ１〜５４）を含んでなるキナーゼアッセイ混合液中に再懸濁した。
３０分間、３０℃のインキュベーション後、反応を５分間ＳＤＳサンプルバッファーで沸騰させて終了させた。
最後に、タンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲルを乾燥させ、放射性バンドをＳｔｏｒｍ８２０により視覚化した。
各サンプルのＩＫＫａ及びＩＫＫｂの総量を測定するために、５０ｍｇの細胞全体タンパク質を７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜へエレクトロブロットし、更に抗ＩＫＫ−ａ又は抗−ＩＫＫ−ｂ抗体により解析した。
【０３２２】
ＮＦ−κＢ  ｐ６５の免疫局在性
【０３２３】
ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座に対するホノキオールの効果を、エピフロレッセンス顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ−２；Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ  Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＣＦ  ｃｏｌｏｒ  カメラ（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）を使用して免疫細胞化学的な方法により検討したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ  Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＣＦ  ｃｏｌｏｒ  ｃａｍｅｒａ（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）。
【０３２４】
ＮＦ−κＢに依存するリポータ遺伝子転写
【０３２５】
Ａ２９３細胞におけるＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ遺伝子の転写に対するホノキオールの効果を、従来公知の方法により測定した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。
【０３２６】
ＣＯＸ−２プロモータに依存するリポータ・ルシフェラーゼ遺伝子発現
【０３２７】
ＣＯＸ−２プロモータ活性を解析した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。
更にＣＯＸ−２プロモータに対するホノキオールの効果を解析するため、Ａ２９３細胞を６−ウェルプレートにウェルあたり１．５×１０５細胞の濃度で播種した。
一晩培養後、製造業者のプロトコルにより、６ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＴＮＥ  ２０００を用い、各々の細胞をＣＯＸ−２プロモータ−ルシフェラーゼリポータープラスミドを含む２ｍｇのＤＮＡでトランスフェクションした。
ＣＯＸ−２プロモータ（−３７５〜＋５９）を、プライマー５’−ＧＡＧＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴ−３’（センス）、及び５’−ＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣ−５’（アンチセンス）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡから増幅した。
トランスフェクション混合物への６時間の曝露後、細胞を１２時間ホノキオールを含む培地中でインキュベートした。
細胞を２４時間、ＴＮＦ（０．１ｎＭ）に曝露し、更に回収した。
ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルに従ってＬｕｃｌｉｔｅルシフェラーゼアッセイシステム（パーキン−エルマー、ボストン、ＭＡ）を用いて測定し、照度計（ビクター３、パーキン−エルマー）により検出した。
全ての実験を３回実施し、それらの再現性を証明するために少なくとも二回繰り返した。
【０３２８】
結果
【０３２９】
この実験の目的は、転写制御因子ＮＦ−κＢシグナル伝達経路における、ＮＦ−κＢで制御される遺伝子産物、及びＮＦ−κＢで媒介される細胞反応に対する、ホノキオールの効果を解析することであった。
このレチノイドの構造は図２６Ａに示される。
トリパンブルー色素排除試験により決定される、使用するホノキオールの濃度及び暴露時間は、細胞の生存率にたいして最小の影響を及ぼした。
ほとんどの実験において、ヒト骨髄性のＫＢＭ５細胞がＴＮＦ受容体の両方のタイプを発現させることを示したため、それを使用した。
【０３３０】
ＮＦ−κＢ活性化経路に対するホノキオールの効果を検討する際、この薬剤により活性化される経路が比較的周知だったため、大部分の実験ではＴＮＰを使用した。
【０３３１】
ホノキオールは、ＴＮＦ及び化学療法薬のアポトーシスの効果を強化する。
【０３３２】
ＮＦ−κＢ活性化が様々な薬剤により誘発されるアポトーシスを抑制することを示したため（Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐ，ＤＪ．，ら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：７８７−７８９、Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，ら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：７８４−７８７）、ホノキオールがＫＢＭ５細胞においてＴＮＦで誘導される、及び化学療法の薬剤により誘発されるアポトーシスを調節するか否かを解析した。
ＴＮＦ及び化学療法剤で誘導されるアポトーシスに対するホノキオールの効果を、ＭＴＴアッセイにより解析した。
ホノキオールが、ＴＮＦ、パクリタキセル及びドキソルビシン（図２６Ｂ）の細胞毒性を強化することが判明した。
【０３３３】
カスパーゼ活性化ＰＡＲＰ裂開を用いて、強化された細胞毒性がアポトーシスに起因することを明らかにした。
ＴＮＦで誘導されるＰＡＲＰ裂開は、ホノキオール処理した細胞において強化された（図２６Ｃ）。
生死アッセイ（細胞内のエステラーゼ活性及び形質膜取り込みを測定）によっても、ホノキオールが５％〜６５％までＴＮＦ誘導アポトーシスを上方制御することが示された（図２６Ｄ）。
同様に、アネキシンＶ染色でも、ホノキオールがＴＮＦ（図２６Ｅ）の効果を強化する効果を有することを示した。
これらの全てのアッセイの結果は、ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤のアポトーシスの効果を強化することを示唆するものである。
【０３３４】
ホノキオールはＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を抑制する
【０３３５】
ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー）がＮＦ−κＢの活性化による破骨細胞形成を誘導するため、（Ａｂｕ−Ａｍｅｒ，Ｙ．，ら、１９９７  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１８９−１１９０）ホノキオールがＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を抑制できるか否かを評価した。
ＴＲＡＰの発現により示されるように、ＲＡＮＫＬが溶骨細胞分化を誘導し、ホノキオールがそれを抑制することが発見された（図２７Ａ及び２７Ｂ）。
【０３３６】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤活性を抑制する
【０３３７】
ＮＦ−κＢが腫瘍細胞浸潤を媒介する遺伝子産物（例えば、ＭＭＰ−９）の発現を制御することが公知である（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，ら、１９８２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１：２７７−２８８）。
ホノキオールがＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤活性を調節できるか否かをインビトロで解析した。
解析の際、腫瘍細胞をホノキオールの有無において、ＴＮＦを有するマトリゲル浸潤チャンバーの上部チャンバに播種し、更に浸潤の有無を解析した。
図２７Ｃに示すように、ＴＮＦはほぼ５倍腫瘍細胞浸潤を誘発し、またホノキオールはこの活性を抑制した。
ホノキオールのみでは浸潤活性を示さなかった。
【０３３８】
ホノキオールは、様々な薬剤により誘発されるＮＦ−κＢ活性化をブロックする
【０３３９】
ホノキオールがＮＦ−κＢ活性化を調節するか否かを解析するため、ＴＮＦ、ＰＭＡ、オカダ酸、たばこ煙縮合物及びＨ２Ｏ２などの様々な薬剤により誘発されるＮＦ−κＢの活性化に対するホノキオールの効果を解析した。
ＤＮＡ結合実験（ＥＭＳＡ）により、ホノキオールが全てのこれらの薬剤（図２８Ａ）により誘発されるＮＦ−κＢ活性化を抑制することが示された。
これらの結果は、ホノキオールが全てのこれらの薬剤に共通であるＮＦ−κＢ活性化経路のステップに作用することを示唆する。
【０３４０】
ホノキオールは、投与量−及び回に依存する方法のＮＦ−κＢ活性化を抑制する
【０３４１】
ＥＭＳＡ結果は、ホノキオールのみではＮＦＫＢ活性化に影響を及ぼさないことを示している。
しかしながら、用量依存的にＴＮＦ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図２８Ｂ）。
ホノキオールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制が、時間依存的であることも示された（図２８Ｃ）。
【０３４２】
ホノキオールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制は細胞型特異的でない
【０３４３】
上皮細胞のＮＦ−κＢ誘導経路が、リンパ球の場合と異なることが報告されている（Ｂｏｎｉｚｚｉ，Ｇ．ら、１９９７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５２６４−５２７２）。
異なる細胞型におけるＮＦ−κＢ活性化を阻害するホノキオールの能力を解析した。
ホノキオールは完全に胚腎臓細胞（Ａ２９３）及びＴ細胞性白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞（図２８Ｄ）における、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害し、細胞型特異性がないことを示した。
【０３４４】
ホノキオールは構成的なＮＦ−κＢ活性化を阻害する
【０３４５】
ヒト多発性骨髄腫（Ｕ２６６）及び頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ４）腫瘍細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するホノキオールの効果（構成的に活性ＮＦ−κＢを発現する両者を試験した）。
（Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ．ら、２００３  Ｂｌｏｏｄ．１０１：１０５３−１０６２、Ｇｉｒｉ，Ｄ．Ｋ．及びＡｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４００８−１４０１４）
Ｕ２６６及びＳＣＣ４細胞を、２４時間ホノキオールの異なる濃度で処理し、更にＮＦ−κＢ活性化を解析した。
ホノキオールは、用量依存的にの両方の細胞における構成的な活性のＮＦ−κＢを阻害した（図２８Ｅ）。
これらの結果は、細胞型特異性がないことを示した。
【０３４６】
ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合に直接影響を及ぼさない
【０３４７】
若干のＮＦ−κＢ阻害剤（ＴＰＣＫ（セリンプロテアーゼインヒビター）、ハービマイシンＡ（タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）及びコーヒー酸フェネチルエステルを含む）は直接ＮＦ−κＢを修飾し、そのＤＮＡ結合を抑制する（Ｆｉｎｃｏ，Ｔ．Ｓ．，ら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１８８４−１１８８８、Ｍａｈｏｎ，Ｔ．Ｍ．，及びＯ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｌ．Ａ．１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８５５７−２８５６４、Ｎａｔａｒａｊａｎ，  Ｋ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：９０９０−９０９５）。
ホノキオールが類似の機構によりその効果を媒介するか否かを解析した。
ＥＭＳＡは、ホノキオールがＴＮＦ処理した細胞から調製したＮＦ−κＢタンパク質のＤＮＡ結合能力を変化させないことを示した（図２８Ｆ）。
これらの結果は、ホノキオールがＴＰＣＫ、ハービマイシンＡ又はＣＡＰＥのそれと異なる機構によりＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示唆する。
【０３４８】
ホノキオールは、ＴＮＦに依存するＩｋＢａ分解を阻害する。
【０３４９】
ＩｋＢａの分解がＮＦ−κＢの活性化のために必要であるため（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．，ら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２７４０−１２７４４）、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化のホノキオールによる抑制が、ＩｋＢａ分解の抑制に起因するか否かを解析した。
ＴＮＦが１０分という早い時期に対照細胞のＩｋＢａ分解を誘導することが判明したが、ホノキオールで前処理した細胞では、ＴＮＦはＩｋＢａ分解（図２９Ｂ）に影響を及ぼさなかった。
【０３５０】
ホノキオールは、ＴＮＦに依存するＩｋＢａリン酸化を阻害する
【０３５１】
ＩｋＢａ分解に必要とされる、ＴＮＦ誘導ＩｋＢａリン酸化に対するホノキオールの効果を解析した。
ＡＬＬＮ（リン酸化されたＩｋＢａの低下を防止する）を用いた。
ＩｋＢａのセリンがリン酸化された形のみを検出する抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ＴＮＦがＩｋＢａリン酸化を誘発し及びホノキオールがそれを完全に抑制することを示した（図２９Ｃ）。
以上より、ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化及び分解を阻害することにより、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【０３５２】
ホノキオールは、ＩｋＢａのＴＮＦに依存するユビキチン結合を阻害する。
【０３５３】
ＩｋＢａ分解をもたらす、ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａのユビキチン結合に対するホノキオールの効果を解析した。
高分子量バンドで示されるように、ＩｋＢａを検出する抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ＴＮＦがＩｋＢａユビキチン結合を誘導することが示され、ホノキオールはそれを完全に抑制した（図２９Ｄ）。
以上より、ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化、ユビキチン結合及び分解を阻害することにより、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【０３５４】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化を阻害する
【０３５５】
ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化を阻害するため、ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化（ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａのリン酸化に必要）に対するホノキオールの効果を試験した。
図２９Ｅ（上方パネル）に示すように、ホノキオールは完全にＴＮＦで誘導されるＩＫＫの活性化を抑制した。
ＴＮＦ又はホノキオールは、ＩＫＫタンパク質（底部パネル）の発現に対して直接効果を有しなかった。
インビトロでＩＫＫ活性上のホノキオールの効果を試験した結果、ホノキオールがＩＫＫ活性を直接妨げないことが判明した。
細胞の処理によりＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性が阻害されるため、ホノキオールはＩＫＫの活性化を抑制するはずである。
【０３５６】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座を阻害する
【０３５７】
ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座に対するホノキオールの効果を、ウエスタンブロット分析により試験した。
図２９Ｆに示すように、ホノキオールはＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの核転座を抑制した。
同様に、免疫細胞化学的な分析により、ホノキオールがＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座を抑制したことを示す（図２９Ｇ）。
【０３５８】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化を阻害する
【０３５９】
ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化に対するホノキオールの効果も試験した。なぜなら、リン酸化はｐ６５の転写活性のために必要であるからである（Ｚｈｏｎｇ，Ｈ．，ら、１９９８  ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．１：６６１−６７１）。
図２９Ｈに示すように、ホノキオールはほぼ完全にｐ６５リン酸化を抑制した。
【０３６０】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を抑制する
【０３６１】
ＮＦ−κＢに依存する遺伝子転写に対するホノキオールの効果を試験するため、細胞を、ＮＦ−κＢ制御されるＳＥＡＰリポーターコンストラクトによりトランジェントにトランスフェクションし、更にＴＮＦにより刺激した。
ＴＮＦはコントロールベクターと比較し、約５倍のＳＥＡＰ活性を示し、ドミナントネガティブＩｋＢａにより阻害された（すなわち特異性を示した）（図３０Ａ）。
細胞をホノキオールにより前処理したとき、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性ＳＥＡＰ発現は、用量依存的に阻害された。
これらの結果は、ホノキオールがＴＮＦにより誘発されるＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子発現を阻害することを示した。
ホノキオールが、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ及びＴＮＦの一連の中のどの部分で作用するか、及びＮＦ−κＢ活性化の誘導で特徴づけられるＩＫＫ補充を解析するための試験を行った。（Ｈｓｕ，Ｈ．ら、１９９６  Ｃｅｌｌ．８４：２９９−３０８）。
ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＩＫＫｂ及びｐ６５プラスミドによりトランスフェクトした細胞で、ＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を誘発させた。
ホノキオールは、ｐ６５でトランスフェクションしたものを除いて、全ての細胞のＳＥＡＰ発現を抑制した（図３０Ｂ）。
【０３６２】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を抑制する
【０３６３】
ＣＯＸ２プロモータ活性に関するホノキオールの効果は、ＮＦ−κＢにより制御される（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，ら、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７０：３１３１５−３１３２０）。
図３０Ｃに示すように、ホノキオールは用量依存的にＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を阻害した。
【０３６４】
マグノロールもまた、用量依存的にＮＦ−κＢ活性化を抑制する
【０３６５】
マグノロールはホノキオールと同様の構造を有する同族体であるため、ＮＦ−κＢ活性化抑制に必要となるマグノロールの投与量を測定した（図３０Ｄを参照）。
ＥＭＳＡ結果は、マグノロールのみではＮＦ−κＢ活性化に影響を及ぼさないことを示した。
しかしながら、用量依存的にＴＮＦで媒介されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図３０Ｅ）。
マグノロールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制は、ホノキオールのそれと同等だった（図３０Ｅ）。
【０３６６】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１及びＶＥＧＦ発現を阻害する
【０３６７】
ホノキオールのこれらの効果がＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１及びＶＥＧＦ遺伝子産物の抑制により媒介されるか否かを解析するため、ＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤の抑制におけるホノキオールの効果を解析した。
ＴＮＦ処理によりＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２、ＩＣＡＭ−１及びＭＭＰ−９遺伝子産物の発現が誘発され、ホノキオールが発現（図３１Ａ）を阻害したことが示された。
【０３６８】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃ発現を阻害する
サイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃは細胞増殖を制御し、ＮＦ−κＢにより制御される（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００４，Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．６：２０３−２０８）．
ホノキオールがこれらの遺伝子産物発現を制御するか否かを解析した。
ホノキオールは、回数に依存的にサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃのＴＮＦで誘導される発現を阻害することが示された（図３１Ｂ）。
【０３６９】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導される抗アポトーシス関連の遺伝子産物の活性化を阻害する
【０３７０】
上記の結果は、ホノキオールがＴＮＦにより誘発されるアポトーシスを強化することを示した。
ホノキオールのこの効果が抗アポトーシス遺伝子産物の抑制によるものか否かを解析した。
ＮＦ−κＢは、ｃＩＡＰｌ、ｃＩＡＰ−２、ＢＣｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦｌ及びサヴァイヴィンなどの多くの腫瘍細胞生存関連遺伝子の発現の上方制御に関与する（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００４  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．６：２０３−２０８）。
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるこれら全てのタンパク質の発現を阻害した（図３０Ｃ）。
本実験は、ＮＦ−１ＩｄＢ活性化経路に対する、及びＮＦ−κＢで制御される遺伝子産物の腫瘍細胞生存、増殖、浸潤、血管新生及び転移（図３２を参照）制御に対するホノキオールの効果を解析すべく設計した。
ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤により誘発されるアポトーシスを強化し、ＴＮＦで誘導される浸潤及びＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を阻害することが判明した。
ホノキオールは、様々な細胞株における、発癌物質、発癌プロモータ及び炎症性刺激により活性化するＮＦ−κＢを抑制した。
この抑制はホノキオールによるＩＫＫの抑制によりなされ、それはリン酸化の抑制及びＩｋＢａの分解をもたらした。
ホノキオールはまた、ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化、核ｐ６５の転座及びＮＦ−κＢ依存性のリポータ遺伝子活性を阻害した。
抗アポトーシス（ＩＡＰ１、ＩＡＰ−２、サヴァイヴィン、Ｂｃ１−２、Ｂｃ１−ｘ１、ＴＲＡＦ１及びｃＦＬＩＰ）、増殖（サイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃ）及び転移（ＭＭＰ−９、ＣＯＸ２及びＶＥＧＦ）関連遺伝子産物の発現もまた、ホノキオールにより抑制された。
【０３７１】
＜実施例９＞
ホノキオールはアポトーシス及び細胞周期停止を誘発し、インビトロ及びインビボの乳癌細胞増殖を阻害する
乳癌に対するホノキオールのインビトロ及びインビボ活性を解析した。
【０３７２】
材料及び方法
化学物質、抗体及び構造物：
【０３７３】
ホノキオール（本明細書でＨＮＫと称される）は、７５ｍＭの原液を調製するためにエタノールに溶解させ、更に培地中に溶解し必要な濃度の使用液を調製した。
ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）をＤＭＳＯに溶解し、５０μＭとした。
４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＨＴ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）、ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、及びＳＡＨＡ（メルク社、ホワイトハウス駅、ＮＪ）を増殖培地で希釈し、所定濃度で、ＨＮＫとともに細胞に直ちに添加した。
プロテアーゼインヒビター（完全）カクテルは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから入手した。
この実験において使用する抗体は、以下の通りである。
抗ｐ２１（Ｈ−１６４）、抗ｐ２７Ｋｉｐｌ（Ｃ−１９）、抗サイクリンＤｌ（Ｈ−２９５）、抗ＰＡＲＰ−１、抗ＢＣＬ−２（Ｎ−１９）、抗Ｂａｄ及び抗Ｂａｘ（全てＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡから入手）、
抗ＥＲＫ及び抗ホスホＥＲＫ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ、サンノゼ、ＣＡ）、
抗カスパーゼ９（９５０２）、抗カスパーゼ８（９７４６）及び抗カスパーゼ３（９６６８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、
抗グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）、
抗アクチン、
ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス免疫グロブリンＧ及び抗ウサギ免疫グロブリンＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；
ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギ（ｓｃ−２０２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）。
【０３７４】
細胞株：
【０３７５】
全ての細胞株をＡＴＣＣから入手した。
使用する乳癌細胞系：
ＭＣＦ−７及びＢＴ−４７４細胞（１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で増殖）、
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６及びＴ４７−Ｄ細胞（１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中で増殖）。
多形性神経膠芽腫細胞株（Ｕ３４３及びＴ９８Ｇ）は、１０％のＦＣＳを含む修飾ＤＭＥＭ培地において培養した。
ウエスタンブロット分析：
【０３７６】
細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（完全）と共に、バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２％のＮＰ−４０）中で溶解させ、全タンパク質を抽出した。
タンパク質抽出物のほぼ５０〜１５０μｇを、１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）電気泳動的で分離し、ＰＶＤＦ膜上へゲルからブロッティングした。
膜を更に１時間室温で、ブロッキングバッファー（１×ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．８％ＮａＣｌ及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中、５％の脱脂粉ミルク）でブロッキングした。
膜をブロッキングバッファー中の一次抗体でインキュベートし、続いてＨＲＰラベルした二次抗体でインキュベーションした。
免疫活性は、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で検出されて、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で視覚化した。
結果の定量化は、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ  ２０００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を使用して実施した。
【０３７７】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）増殖アッセイ：
【０３７８】
３×１０３の細胞／ウェルを、１０％のＦＣＳを含む適当な培地で培養し、９６穴プレートにおいて、コントロール担体又は様々な濃度のＨＮＥｌで、それらのみ、又は第２の薬剤と共に処理した。
全ての第２の薬剤を新鮮な培地で希釈し、ＨＮＫとともに細胞に直ちに添加した。
３７℃（５％のＣＯ２）の２４時間のインキュベーションの後、細胞を、１０％のＭＴＴ試薬で４時間培養した（５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）。
培地を除去し、細胞をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた。
ホルマザン生成物の吸光度を、酵素結合免疫吸着アッセイリーダー（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）で測定した。
【０３７９】
細胞周期アッセイ：
【０３８０】
２４時間において示されるように、５×１０６の細胞を、１０％のＦＣＳを含む適当な培地で培養し、コントロール担体又はＨＮＫの様々な濃度で処理した。
処理後、細胞を回収し、メタノールで固定し、プロピジウムイオジド（ＰＩ、Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）で着色した。
フローサイトメトリは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎディキンソン、フランクリンＬａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ設備で実施した。
【０３８１】
アポトーシス分析：
【０３８２】
５×１０６の細胞を、１０％のＦＣＳを含んでなる適当な培地に播き、２４時間、様々な濃度のＨＮＫ又はコントロール担体で処理した。
処理後、細胞を回収し、メタノールで固定し、プロピジウムイオジド（ＰＩ、Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）で着色した。
フローサイトメトリは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎディキンソン、フランクリンＬａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ設備で実施した。
ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを使用たカスパーゼ活性阻害の試験のために、５×１０６の細胞を、ＨＮＫの添加の前に、６０分間５０μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋでインキュベートした。
【０３８３】
動物試験：
【０３８４】
全ての動物を、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターにおいてＡｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙのために確立したＮＩＨ及びガイドラインに従って維持し、動物実験を実施した。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を回収し、滅菌済ＰＢＳで二回洗浄し、計数し、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）中に再懸濁した。
６週間齢の雌のａｔｈｙｍｉｃヌードマウスに、１×１０６の細胞／１００μｌの細胞濃度で、両方の脇腹に皮下注射した。
マウスを、総容積０．３ｍｌの２０％イントラリピド（バクスターＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）において懸濁したＨＮＫ（２ｍｇ／日）又は担体コントロールで毎日腹腔内注射した。
５匹のマウスを各群で用いた。
最高５週間、線形カリパス副木でサイズを計測し、体積を方程式Ｖ＝（ａ×ｂ２）×０．５２３６を使用して推定されたした（ａは大きい寸法、ｂは垂直方向の直径）。
【０３８５】
インヴィトロによる薬剤相互作用モデル：
【０３８６】
２つの薬剤間における相互作用の解析は、付加モデルを使用して行った（Ｘｕ  Ｄ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｊａｎ７；［Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ；ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｓｅｐ；４３（９）：３９９８−４００６）。
モデルでは、その構成要素の効果の生成物に等しい組合せの効果を予測する。
例えば、複合製剤がそれぞれ４０％及び６０％の生存率を生じさせる２つの単一薬から構成される場合、組合せは２４％（０．４×０．６）の生存率に結果としてなると考えられる。
原理は、付加モデルにより予測したより高い値が得られたときは相乗効果とし、低い値のときは劣加法的効果とする。
観察された生存率と付加モデルで予測された生存率間の比率は、全ての組合せにおいて算出した。
比率が１．２を越える場合、相互作用は劣加法的と分類され、
０．８未満では相乗的、
０．８及び１．２間の比率では添加的とする。
【０３８７】
統計分析：
【０３８８】
連続変数における結果は、平均±標準偏差として示した。
分類変数における結果は、数（％）として示した。
連続変数における２群での違いは、Ｔ検定により評価した。
分類変数のける２群での違いは、カイ二乗検定により測定した。
全ての有意性試験は、両側検定で行った。
＜０．０５のＰ値は、統計学的に有意であるとみなされる。
【０３８９】
結果
【０３９０】
ＨＮＫは乳癌細胞増殖を阻害する。
【０３９１】
乳癌細胞を２４時間、ＨＮＫの異なる濃度で処理し、ＭＴＴアッセイを行い生存率を評価した。
選択された細胞株は、エストロゲンレセプタ（ＥＲ）ＨｅＲ２及びｐ５３の異なる表現型及び異なる発現パターンを有し、すなわち乳癌の様々なサブクラスであることを表す。
全５つの細胞株は、ＨＮＫ（図３３Ｂ−Ｆ）に応答し、生存率の用量依存的な減少を示した。
５０％（ＬＣ５０）生存率を減少させる濃度は、ＥＲ陽性のＢＴ−４７４細胞の５０μＭから、低分化ＳＫＢＲ−３細胞の２９μＭにわたった。
同様の分析を、２つの多形性神経膠芽腫細胞株、Ｕ３４３及びＴ９８Ｇにおいても実施した。
同じ投与量範囲（１０−７０μＭ）において、両方の細胞株はＦＩＮＫへの抵抗性を示した（図３４Ａ、Ｂ）。
【０３９２】
ＨＮＫはＳＡＨＡの増殖阻害を強化する
【０３９３】
ＨＮＫはＢ−ＣＬＬ及び多発性骨髄腫で、毒性を強化し、細胞毒性を有する化学療法に対する耐性を克服することが報告されている。
ＨＮＫは近年では、乳癌細胞系ＭＣＦ−７／ＡＤＲの多種薬剤耐性（ＭＤＲ）を克服することも示されている。
２つの乳癌細胞系（ＭＣＦ−７（ＥＲ陽性、野生型ｐ５３）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲ陰性、突然変異ｐ５３））に対する異なる作用機構を有する５つの薬剤の増殖抑制作用に対する、ＨＮＫの効果を解析した。
コントロール担体又は付加的な薬の一定量と共に、細胞を、１０〜５０μＭの範囲のＨＮＫの様々な投与量で２４時間処理し、
生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。
薬剤は以下からなる。
細胞毒性の化学療法薬（パクリタキセル２５０ｎＭ及びドキソルビシン３００ｎＭ）、
４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＨＴ）１００ｎＭ（エストロゲン経路の阻害剤）、
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスベロイルアニリドビスヒドロキシアミド（ＳＡＨＡ、２μＭ）。
全てのこれらの薬剤は乳癌細胞に対して周知の活性を有し、４０％未満の増殖阻害が生じる投与量で使用した。
付加モデルを使用して薬剤相互作用を評価した。
このモデルによる分析は信頼性が高い手段であると確認されている（Ｘｕ  Ｄ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｊａｎ  ７；［Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ；ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｓｅｐ；４３（９）：３９９８−４００６）．
ＨＮＫは、全てのこれらの薬の活性を強化した。
しかしながら、相乗効果は、ＨＮＫ及びＳＡＨＡ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の組合せのときにのみ観察された（図３５Ａ、Ｂ）。
この効果は、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ．−７５及びＢＴ−４７４乳癌細胞系に対しても、この組合せにより観察された。
ＨＮＫ及び試験される他剤の組合せの場合も付加効果が観察された（図３５ＣからＧ）。
【０３９４】
ヒト乳癌に対するＨＮＫのインビボ活性
【０３９５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をヌードマウス（注入あたり１×１０６細胞、グループあたり５匹のマウス、各マウスあたり２つの腫瘍）の両方の横腹に注入し、腫瘍増殖を毎週モニターした。
これらの細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を容易に形成する能力（ｌａｃｒｏｉｘ）及びそれらのＨＮＫへの感度に基づいて選択した。
マウスは４週間、２ｍｇのＨＮＫ（１００ｍｇ／ｋｇ）又はコントロール担体を毎日注射して処理した。
腫瘍を毎週測定した。
ＨＮＫ処理により、腫瘍増殖が停止した（２週目から、ｐ＜０．０２）（図３６）。
【０３９６】
ＨＮＫは、乳癌細胞系のアポトーシスを誘導する
【０３９７】
ＨＮＫは、広範囲にわたる悪性の細胞タイプのアポトーシスを誘導することを示した。
乳癌細胞系のアポトーシス及び細胞死を誘導するＨＮＫの能力を解析した。
ＭＣＦ−７細胞をＨＮＫ（６又は２４時間、６０μＭ）で処理し、アポトーシス及び細胞死をアネキシンＶ及びＰＩ染色（図５Ａ）を使用して評価した。
２４時間のＨＮＫ処理後、アネキシンＶ陽性、Ｐｉ陰性細胞の数が著しく増加した１％±０．５％〜１６％±３％（ｐ＜０．０５、図３７Ｂ）。
ウエスタンブロット分析では、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の分解、ＨＮＫ処理に続くカスパーゼ８の濃度低下が明らかに示された（図３７Ｃ）。
ＢＡＸのアップレギュレーションもみられたが、ＢＣＬ−２又はＢＡＤの顕著なレベル変化がは観察されなかった（デンシトメトリ分析の結果、コントロールと比較し４０μＭで８５％増加）。
アポトーシスの部分阻害のみが、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理後に認められた。
ＨＮＫは乳癌細胞系の細胞周期を減速させる。
【０３９８】
細胞周期に対するＨＮＫの効果を、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において評価した（２４時間、１０μＭ又は３０μＭのＨＮＫ）。
ＨＮＫのこれらの投与量は、両方の細胞株におけるＬＣ５０未満である。
両方のＨＮＫ投与量は、著しくＳ期におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数を減少させた（コントロールでは２６％、１５％及び１０％、１０μＭ及び３０μＭ群、ｐ＜０．００５、図３８Ａ−Ｂ）。
顕著な効果が、ＭＣＦ−７細胞（Ｓ期のコントロールでは２６％、２０％及び２０％、１０μＭ又は３０μＭ群、図ＣＤ）では観察されなかった。
Ｇ１細胞周期調節（ｍａｓｓｇｕｅ）に関係するタンパク質の発現を、ウエスタン分析を使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において解析した。
ＨＮＫ処理（２４時間の２０、４０及び、６０μＭ  ＨＮＫ）により、サイクリンＤｌのレベルが低下し、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ２１Ｃｉｐ１／ＷＡＦｌの発現が上方制御された（図３８Ｅ）。
ＨＮＫは増殖シグナル伝達経路を阻害する。
【０３９９】
内皮細胞では、ＨＮＫは、ＫＤＲ受容体及びその下流のシグナル伝達カスケード（ＭＡＰＫ及びＡＫＴ経路）の活性を阻害する。
乳癌では、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路は表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）により活性化す、それは乳癌の主な原因となる。
ＥＧＦＲで媒介されるシグナル伝達は、特にＥＲ陰性乳癌において重要であり、
その抑制はＥＲ陰性細胞（例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の増殖を遅らせる。
ＥＧＦＲの発現に対するＨＮＫの効果及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の活性を解析した。
ＥＧＦＲの発現及びＡＫＴ及びＥＲＫ２のリン酸化（細胞外シグナル制御キナーゼ２）が、処理後に減少した。
この実施例では、ＨＮＫがアポトーシスを誘発して、乳癌細胞の細胞周期を減速し、インビボ乳癌に対して系統的に活性を有することが示された。
更に、治療的に有益なＨＮＫ投与量は、動物にとり寛容できるものであった。
これらの結果は、ＨＮＫのみ、又は他剤との組み合わせにより、乳癌治療の有効な治療薬となりうることを示唆する。
【０４００】
＜実施例１０＞
ホノキオールはアポトーシス及びミトコンドリアへ基礎キナーゼ分解を誘導する
材料及び方法
【０４０１】
Ｈｄ  ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭで培養した。
細胞を１０、２０又は４０μｇ／ｍＬで１〜２４時間、ホノキオールで処理し、回収した。
Ｓ６Ｋ、Ｓ６及びＡＫＴのリン酸化を、リン酸化特異的な抗体によるウエスタンブロッティングで測定した。
タンパク質レベルもまた、それぞれの抗体により測定した。
全ての抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ社から購入した。
【０４０２】
細胞培養：
【０４０３】
ＳＶ４０不死化ポリクローン性ｗｔ及びＢａｘ／Ｂａｋ（Ｂａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ）ＭＥＦ細胞株（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら、２００２）と同様に、ｍＡｋｔ又はコントロールベクター（Ｋｅｎｎｅｄｙら、１９９９））を安定発現するポリクローン性のＲａｔ  Ｉａ繊維芽細胞を、実験に用いた。
細胞は、特に明記しない限り、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で日常的に維持した。
【０４０４】
アポトーシスの誘導：
ホノキオールは、ＤＭＳＯにおいて調製されて、５時間の時間の間示される濃度で、無血清ＤＭＥＭの細胞に添加した。
【０４０５】
ＤＡＰＩ染色：
【０４０６】
４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）染色のために、細胞はホルムアルデヒド解決の培地への添加により固定した。
ＤＡＰＩ染色はＫｅｎｎｅｄｙら、１９９９の方法に従い行った。
【０４０７】
ＨＫ活性アッセイ：
【０４０８】
ＨＫ活性は、ゴットロープその他、２００１に記載のような、標準的なＧ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ−共役分光光度アッセイで測定した。
全細胞可溶化物は、短時間超音波処理（１５秒）により調製した（ホモジェネーションバッファー：４５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのグルコース及び０．５ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８．２））。
平行して、ミトコンドリア増量フラクションを、二倍量の細胞を使用して、ゴットロープその他、２００１に記載の方法で、機械的な溶解及び分画遠心分離を介して、２５０ｍＭのスクロース／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ７．４）のバッファー中に再懸濁し調製した。
タンパク質濃度は、市販の試薬及び標準（Bio-Rad）を使用してブラッドフォード法により、細胞全体及びミトコンドリア増量サンプルについて一様に測定した。
ＨＫ活性は、全細胞可溶化物又はミトコンドリア増量画分の、全グルコースのリン酸化能として測定した。（最終的なアッセイ混合液：５０ｍＭのトリエタノールアミン塩化物、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１１ｍＭのモノチオグリセロール、４ｍＭのグルコース、６．６ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍｇのＮＡＤＰ／ｍＬ及びイーストＧ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（シグマ社）０．５Ｕ／ｍＬ、各サンプルのｐＨ８．５）。
ＨＫ活性はランバート−ベール法によるＮＡＤＰＨ形成の共役速度として算出した。
［（Ａ３４０／ｔ）／ε］×希釈因子／［タンパク質］（式中、ε（６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）は３４０ｎｍのＮＡＤＰ時間吸光係数であり、ｔは時間であり、［タンパク質］はタンパク質濃度である。）
ｍｔＨＫ活性（％）は、式［（ｍｔＨＫ活性ミトコンドリアタンパク質／細胞内の総タンパク質）／細胞全体ＨＫ活性］×１００より算出した。
【０４０９】
結果
【０４１０】
増殖因子の非存在下での０〜４０μｇ／ｍＬホノキオール処理後の、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞（図３９Ａ）又は野生型のアポトーシス及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ（図３９Ｃ）細胞の反応速度論を示す。
Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞（図３９Ｂ）又は野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ（図３９Ｄ）細胞株は、ホノキオールの有無において、増殖因子を含めずに、ミトコンドリアと関連した全細胞ヘキソキナーゼ活性のパーセンテージを測定した。
【０４１１】
＜実施例１１＞
ホノキオールによる関節炎の治療
【０４１２】
図４０に示すように、メスＣ５７Ｂ１／６マウスを、ＮＣＩから生後５〜８週間目で購入した。
ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ導入遺伝子（ＣＤ４０−／−）を発現している雌のマウスを、発明者の遺伝子導入マウス設備において生育させた。
マウスをナイーブにし、１００ｍｇのＴｙｐｅＩＩチキンコラーゲン（シグマ社）を１０ｍＭ酢酸に溶解し、５ｍｇ／ｍＬのＨ３７  ＲＡ熱殺菌済ミコバクテリウム（ディフコ社）（ＣＦＡ）を含んでなるＩＦＡ（シグマ）にてエマルジョンとし、尾部の皮下に免疫（又はＣＦＡ中でエマルジョンにした１ｍＭ酢酸を免疫）した。
接種後日２１に一部を死亡させた。
インビボでのホノキオール処理により、Ｃ５７Ｂ１／６及びＬＭＰｌトランスジェニックマウスの病理において、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）が抑制されたが、ネガティブコントロールのレベルまでは阻害しなかった（図４０）。
更に、処理したホノキオールからの抗原想起リンパ節培養組織）では、ＣＩＩ免疫マウスは、ＩＬ−１０産生については変更なく、減少した増殖及びＩＦＮ−ｇ産生を示した。
メスのＣ５７ＢＬ／６又はｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（４ｅ５／ウェル）からの鼠径部及び傍大動脈リンパ節を、熱変性ＴｙｐｅＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）により培養し、増殖（３Ｈ編入、ＣＰＭ）及びサイトカイン産生（ＥＬＩＳＡ）のために評価した。
マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。
何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。
ホノキオール処理したマウスは、不変のＩＬ−１０産生と共に、増殖及びＩＦＮ−ｇ産生減少を示した。
ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。
メスのＣ５７ＢＬ／６又はｍＣＤ４０−ＬＭＰ１  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。
培養液上清のＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡにより評価した。
マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。
何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。
ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。
更に、メスのＣ５７ＢＬ／６又は、ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。
ＴＮＦ−ａは、ＥＬＩＳＡにより評価した。
マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。
何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。
ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。
【０４１３】
ＬＭＰ１  Ｔｇマウスでは、ネガティブコントロールマウスでさえ、ＩＬ−６及びＴＮＦαへの反応が減少していた。
しかしながら、Ｂ細胞ＩＬ−１０産生に対するホノキオール処理の役割を分析することにより定まるＩＬ−１０は、影響を受けなかった。
更に、メスのＣ５７ＢＬ／６又は、ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。
培養上清のＩＬ−１０は、ＥＬＩＳＡにより評価した。
マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。
何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。
【０４１４】
マウスＢ細胞株実験（ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌ及びＭ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰ１）
【０４１５】
ホノキオールはＣＤ４０／ＬＭＰ１媒介されたＩＬ−６（用量依存的方法のＴＮＦ−ａ産生）を阻害するが、ＩＬ−１０又はＩＬ−４は阻害しなかった（図４１）。
図４１に示すように、ＣＨ１２．ＬＸ細胞（ＩＬ−６のときは１×１０５；ＴＮＦ−ａのときは４×１０５）をｈＣＤ４０−ＬＭＰｌにより安定にトランスフェクショし、±ホノキオール（１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０又はアイソタイプコントロール（ＩＣ）又は（ＩＬ−６のときは２．５×１０４；ＴＮＦ−ａのときは１×１０５）ＣＤ１５４又はＷＴバキュロウイルスを発現しているＨｉ−５昆虫細胞を有する培地（ＢＣＭ））で所定時間刺激した。
培養液上清のＩＬ−６及びＴＮＦ−ａレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。
ＣＨ１２による次の免疫グロブリンＭ産生。
【０４１６】
ＬＸ細胞も、影響を受ける（ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌ細胞による免疫グロブリンＭ分泌により解析できる）。
前述したように、免疫グロブリンＭ分泌は、溶血プラークアッセイ法で測定した（ＧＡ  Ｂｉｓｈｏｐ．１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（４）：１１０７−１１１４）．
ホノキオールは、免疫グロブリンＭ産生を阻害した。
更に、データは、ＮＦＫＢ及びＪＮＫがＣＤ４０及びＬＭＰｌ活性化に関与する経路のうちの２本であることを示す。
ＮＦＫＢ活性化（ルシフェラーゼ・アッセイ）は、投与量に依存する方法（図４２）のホノキオールにより阻害したが、必ずしもベースライン（特にＣＤ４０−ＬＭＰｌを介して）までは到達しなかった。
マウスＭ１２．４．１細胞（１．５×１０７）（安定して、ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌキメラ分子によりトランスフェクションされた）を、２０ｍｇの４×ＮＦＫＢルシフェラーゼリポータプラスミド及び１ｍｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクターによりエレクトロポレーションによりトランジェントにトランスフェクションした（ｐＲＬ−ｎｕｌｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を１５分間氷上に置き、３０分間、培地（ＢＣＭ）のみで処理、１０ｍｇ／ｍＬ  抗ＴＮＦ−ａ（ＭＰ６−ＸＴ３；ＭＰ６−ＸＴ２２）で処理、又は１００ｍＭのホノキオールでのみ処理し、更にＢＣＭ、１０ｍｇ／ｍＬの抗−ｍｏｕｓｅ又は抗ヒトＣＤ４０又はアイソタイプコントロールで更に６時間インキュベートした。
刺激の後、細胞を比較的ルシフェラーゼ活性（ＮＦＫＢ：Ｒｅｎｉｌｌａ）のためにペレット化し、溶解し、製造業者のプロトコル（プロメガ）に従い、ターナーデザイン２０／２０照度計を使用して、アッセイ（２秒の遅延：１０秒の測定）した。
（注：抗ｍＣＤ４０は、内生的なＣＤ４０と反応し、抗ｈＣＤ４０は、トランスフェクションしたｈＣＤ４０−ＬＭＰ１と反応する）。
更に、ＩｋＢａリン酸化はホノキオールにより完全に阻害されないが、ＩｋＢａの分解後の再蓄積の用量依存性阻害が見られた。
全細胞及び細胞質フラクションでは、少ないＮＦＫＢ２  ｐ１００がｐ５２にプロセシングされ、ＲｅＩＢはホノキオールがある場合には、効率的に活性化しなかった（増加及び続く減少）。
存在するにもかかわらず、ホノキオール処理によっても、ＣＤ４０／ＬＭＰ１が媒介するｐ５２（被治療）及びＲｅＩＢ（ＮＦＫＢ２複雑なタンパク質）の核移行（ｐ５２がＲｅ１Ｂより多い）が減少した。
ＪＮＫリン酸化は、ホノキオールにより投与量依存的に阻害された。
ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌで安定にトランスフェクションしたＣＨ１２．ＬＸ細胞（１×１０６）を、±ホノキオールで数回、培養培地（Ｍ）、１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０又はアイソタイプコントロール（ＩＣ）で刺激した。
細胞を遠心沈降によりペレット化し、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
ペルオキシダーゼラベルされた抗体を、ＪＮＫリン酸化のアッセイ用の化学発光検出試薬を使用してウエスタンブロットで視覚化した。
【０４１７】
＜実施例１２＞
癌細胞に対するＴＳＡ及びホノキオール処理の組合せ
図４３では、ホノキオールとトリクロスタチンＡ（ＴＳＡ）（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）との組み合わせによる処理後の、癌細胞生存率に対する効果を解析した結果を示す。
【０４１８】
ＳＨＳＹ５Ｙ及びＳＨＥＰ神経芽腫細胞を、０〜１μＭ  ＴＳＡのみ、又はホノキオールとの組み合わせで処理した。
結果は、ＴＳＡのみと比較して、ＴＳＡ及びホノキオールの併用療法後における生細胞の顕著な減少率（％）を示した。
【０４１９】
本発明はその好ましい実施態様を記載している。
本発明のバリエーション及び変更は、上記の発明の詳細な説明から当業者にとり自明である。
これらの全てのバリエーション及び変更は本発明の範囲内に包含されると解される。
【図面の簡単な説明】
【０４２０】
【図１】ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物構造の実例である。
【図２】図１、３及び４に示されるホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物の構造式中の代表的な官能基を例示する線図である。
【図３】図１のホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物構造と構造的に類似する代表的な構造を例示する。
【図４】同上。
【図５】ホノキオール型及びマグノロール型化合物によるＳＶＲ細胞増殖の抑制を例示するグラフである。
【図６】多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からのＭＭ細胞株及び腫瘍細胞における、ホノキオール（ＨＮＫ）で誘導された細胞毒性を表す。通常の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）では毒性が示されなかった。４８時間培養後の比色アッセイによる評価において、Ａ及びＢではＨＮＫによるＭＭ細胞株の増殖阻害が示した。
【図７】ＭＭ細胞における、ホノキオール（ＨＮＫ）で誘導されたアポトーシスを表す。Ａは、４８時間、８μｇ／ｍｌのＨＮＫで処置されたＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞を示す。Ｂでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、１０μｇ／ｍｌのＨＮＫによる１２及び２４時間の処理後のカスパーゼ及びＰＡＲＰの裂開を、ＭＭ．１Ｓの全細胞可溶化物のウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す。Ｃでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３による処理後の、ＭＭ．１Ｓ細胞を示す。Ｄでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３による２４時間の処理後のＭＭ細胞におけるＡＰＯ２．７の発現を、フローサイトメトリで解析した結果を示す。Ｅでは、トリパンブルー排他染色により細胞毒性を解析した結果を示す。Ｆでは、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ、０、４、８及び１２時間）で処理した結果を示す。Ｇでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理の有無における、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ、２４時間）で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。
【図８】ボルテゾミブとホノキオール（ＨＮＫ）の組合せが、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する細胞毒性を強化することを示す。Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理し、細胞増殖を比色アッセイで解析した結果を示す。Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫ及びボルテゾミブで処理し、アポトーシス誘導をＡＰＯ２．７で解析した結果を示す。Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理した結果を示す。
【図９】ＨＮＫがＩＬ−６、ＩＧＦ−１の防護効果及び患者の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）の接着を抑制できることを示す。２人のＭＭ患者（Ｃ及びＤに示す）に由来するＩＬ−６（Ａに示す）、ＩＧＦ（Ｂに示す）又はＢＭＳＣｓの有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞を、示すＨＮＫ濃度で４８時間処理した結果を示す。
【図１０】ＨＮＫがＭＭ．１Ｓ細胞の増加及び生存シグナリング経路を調節することを示す。Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、更に１０及び２０分間ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した結果を示す。Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、更に１０及び２０分間ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）で刺激した結果を示す。Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で前処理した結果を示す。図１１では、ＨＵＶＥＣにおける血管新生のＨＮＫによる抑制を示す。ＨＵＶＥＣは８μｇ／ｍｌのＨＮＫを添加して（Ｂで示す）又は添加せずに（Ａで示す）６時間培養し、血管形成を解析した。最初の拡大倍率は×４０である。
【図１２】ドミナントネガティブＭＡＰＫＫ遺伝子、又は化学的抑制剤ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫＫ阻害による、内皮細胞の形態に与える効果を示す。ＭＳ１はＳＶ４０ラージＴ抗原のみを含む内皮細胞を表し、ＳＶＲはｒａｓ癌遺伝子により形質転換したＭＳ１細胞を表し、ＳＶＲ＋ＰＤ９８０５９は、ＰＤ９８０５９（５μｇ／ｍＬ）で処理したＳＶＲ細胞を表し、ＳＶＲＡ２２１ａは、ＭＡＰＫＫのドミナントネガティブＡ２２１対立遺伝子を安定発現する細胞を表す。
【図１３】アポトーシスにおけるホノキオール及びマグノロールの効果を示す。明るい柱は、マグノロール処置したＳＶＲ細胞を示し、暗い柱はホノキオール処置したＳＶＲ細胞を示す。コントロールのレーンは、１８及び４８時間の処理との比較例としての、処理直後の細胞を示す。
【図１４】様々な細胞内でのタンパク質のリン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ａでは、ホノキオールがＡＫＴ、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ及びＳｒｃ．ＳＶＲ．のリン酸化を阻害することを示す。Ｂでは、ホノキオールが低濃度でＡｋｔのリン酸化を阻害するが、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ又はＳｒｃでは阻害しないことを示す。
【図１５】内皮細胞の増殖のホノキオールによる阻害が、ＴＲＡＩＬ依存性であることを示す。左の柱はホノキオールのみで処理した内皮細胞を表し、中央の柱はホノキオール及びＴＲＡＩＬ抗体で処理した細胞を表し、右側の柱はホノキオール及び副基アイソタイプのコントロール抗体で処理した細胞を表す。
【図１６】ホノキオールが、カスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰが媒介するアポトーシスにより、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）のアポトーシスを誘導することを示す。
【図１７】ＶＥＧＦのリン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ａでは、ＨＵＶＥＣｓのＶＥＧＦで誘導されるＫＤＲ自己リン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ｂでは、ＶＥＧＦで誘導されるＲａｃ活性化に対するホノキオールの効果を示す。上部：ＧＴＰと結合したＲａｃのイムノブロットの代表的な結果。下部：イムノブロット（３回の実験）のデンシトメーター分析（平均±標準誤差）（コントロールに対する倍数として表示）。
【図１８】ヌードマウスのＳＶＲ血管肉腫のインビボ増殖に対するホノキオールの効果を示す。このデータは、ホノキオールがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍に対して効果的であることを示す。
【図１９】ＭＭ．１Ｓ及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞におけるアポトーシス誘導を示す。
【図２０Ａ】ホノキオールがＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することを示す。ＰＣ３細胞を、通常の酸素条件及び低酸素症条件下でホノキオール処理した。上部のブロットでは、ホノキオールによるＡＭＰキナーゼのリン酸化の増加（活性化）を示す。下部のブロットでは、コントロールとしての全ＡＭＰキナーゼタンパク質を示す。
【図２０Ｂ】前立腺癌のＨＩＦ−１ａ細胞株におけるホノキオールの効果を示す。ホノキオールは、投与量依存的に前立腺癌細胞のＨＩＦ−１ａを活性化させた。
【図２１】ホノキオールが野生型チュベリンの効果をミミックできることを示す。チュベリン処理により回数及び投与量依存的に（ａｋｔの下方制御と同様に）Ｓ６キナーゼリン酸化の負の制御がなされ、すなわちホノキオールが野生型チュベリンの作用の幾つかをミミックできることを示す。
【図２２】ホノキオールがＳＶＲ細胞において、０．５％及び１０％の血清中でホスホリパーゼＤの活性を阻害することを示す。
【図２３】提唱されたホノキオールの作用機構を示す。ホノキオールはＰＬＤ活性を阻害でき、ＡＭＰキナーゼを活性化できる。ホノキオールはホスホリパーゼの活性を阻害でき、ホスファチジン酸の産生減少をもたらす。減少したホスファチジン酸はｍＴＯＲ（哺乳動物におけるラパマイシンの標的）の活性化減少をもたらし、ＮＦＫＢの負の制御をもたらしうる。ホスファチジン酸はｍＴＯＲ活性化に対して直接効果を及ぼし、ａｋｔ活性化と同様に、ホスファチジン酸の産生によりチュベリン（ｔｓｃ２）のリン酸化及び不活性化をもたらしうる（Ｔｅｅら、２００３；Ｃｈｅｎら、２００５；Ｈｕｉら、２００４）。同様に、ＡＭＰＫ活性化は、チュベリン（Ｊｏｓｅｐｈら、２００１）の脱リン酸及び活性化をもたらしうる。ｐ５３の活性化は特定の系においてＡＭＰＫを活性化でき、ｐ５３欠損ＰＣ３細胞株の場合と同様に、ＡＭＰＫのホノキオール誘導はｐ５３を必要としない（Ｆｅｎｇら、２００５；Ｗａｎｇら、２００１）。
【図２４】ホノキオールがＮＦＫＢ活性化をブロックでき、従来の化学療法剤への腫瘍細胞の感作が可能となることを示す。（Ａ）では、ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清の状態に置き、更にＴＮＦのみ、又はホノキオールとの組み合わせでインキュベートした（２４時間後の結果）結果を示す。細胞死は、カルセインＡＭによる生死アッセイで測定した。赤色は死細胞を表し、緑色は生細胞を表す。（Ｂ）では、細胞を１２時間３０μＭホノキオールにより前処理し、更に１６時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした結果を示す。細胞を、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗アネキシンＶ抗体とインキュベートし、更に初期アポトーシスの効果をフローサイトメトリで分析した。（Ｃ）では、細胞を１２時間３０μＭホノキオールにより前処理し、更に示された時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした結果を示す。全細胞抽出物を調製し、抗ＰＡＲＰ抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。（Ｄ）では、ＫＢＭ−５細胞（５０００細胞／０．１ｍｌ）を３０μＭホノキオールの有無で、ＴＮＦ、タキソール、５−ＦＵ又はドキソルビシンと３７℃で７２時間インキュベートし、生細胞をＭＴＴ試薬を使用してアッセイした。培養組織を用いた３回の実験における平均±標準偏差を結果として示す。
【図２５】ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢに依存する、抗アポトーシス、増殖及び転移関連の遺伝子産物の発現を抑制できることを示す。（Ａ）は増殖及び転移関連タンパク質を示し、（Ｂ）は抗アポトーシス関連タンパク質を示す。ＫＢＭ−５細胞を１２時間３０μＭホノキオールでインキュベートし、更に示された時間の１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、関連抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。
【図２６】ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法薬のアポトーシスの効果を強化することを示す。（Ａ）は、ホノキオールの構造を示す。（Ｂ）は、ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤により誘発されるアポトーシスを強化することを示す棒グラフである。ＫＢＭ−５細胞（５０００細胞／０．１ｍｌ）を５ｍＭのホノキオールの有無において、ＴＮＦ、パクリタキセル又はドキソルビシンにより３７℃で７２時間インキュベートし、生細胞をＭＴＴ試薬を使用してアッセイした。培養組織を用いた３回の実験における平均±標準偏差を結果として示す。（Ｃ）ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＰＡＲＰ裂開を強化することを示す。ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清条件化に置き、ＴＮＦ（１ｎＭ）のみ、又はホノキオール（２５ｍＭ）との組み合わせで所定の時間インキュベートし、実施例８に記載のウエスタンブロット分析によりＰＡＲＰ裂開はを測定した。下の値は８７ｋＤａのバンドのデンシトメーター分析値を示す。（Ｄ）ホノキオールがＴＮＦで誘導される細胞死を強化することを表す。ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清条件に置き、更にＴＮＦ（１ｎＭ）のみ、又はホノキオール（１０ｍＭ）との組み合わせで２４時間インキュベートした。実施例８のカルセインＡＭによる生／死アッセイにより細胞死を測定した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｅ）は、ホノキオールがＴＮＦ誘導初期アポトーシスを上方制御したことを示す。細胞を１２時間２５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に１６時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした。細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗アネキシンＶ抗体でインキュベートし、更に初期アポトーシスの効果をフローサイトメトリにより分析した。
【図２７】ホノキオールがＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成及びＴＮＦで誘導される侵入活性を抑制することを示す。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４）を一晩プレート上でインキュベートし、１２時間５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に５ｎＭのＲＡＮＫＬで処理した。４及び５日後に細胞をＴＲＡＰ染色し、破骨細胞形成能を評価した。写真は、ＲＡＮＫＬによるインキュベーション開始後５日に撮影したものである。（Ｂ）ウェルあたりのトラップ陽性多核溶骨細胞（＞３の核）の数を計測した。（Ｃ）Ｈ１２９９細胞（２．５×１０４）を無血清条件下で、一晩マトリゲル浸潤チャンバーの上のウェルに播種し、１２時間１０ｍＭのホノキオールにより前処理し、１％の血清条件下で２４時間１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、更に浸潤アッセイに供した。ホノキオールなし、及びＴＮＦなしの場合の値を１．０に設定した。
【図２８】ホノキオールがＮＦ−κＢを阻害することを示す。（Ａ）ホノキオールは、ＴＮＦ、たばこ煙縮合物、ＰＭＡ、オカダ酸及びＨ２Ｏ２により誘発されるＮＦ−κＢの活性化をブロックする。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を２５ｍＭのホノキオールで３７℃で１２時間プレインキュベートし、更にＴＮＦ（０．１ｎＭ）、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）、オカダ酸（５００ｎＭ、４時間）、たばこ煙縮合物（１０ｍｇ／ｍＬ、３０分）又はＨ２Ｏ２（２５０ｍＭ、１時間）で処理した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｂ）ホノキオールは用量依存的に、ＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、３７℃で１２時間所定濃度のホノキオールによりプレインキュベートし、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出液を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。（Ｃ）ホノキオールは、時間依存的に、ＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、２５ｍＭのホノキオールで所定時間３７℃でプレインキュベートし、更に３７℃で３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出液を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。（Ｄ）ホノキオールによる誘導活性化の抑制は、細胞タイプ特異的でない。２００万のＡ２９３細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞を、２４時間所定濃度のホノキオールにより前処理し、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出物を調製し、更にＥＭＳＡでＮＦ−κＢをアッセイした。（Ｅ）ホノキオールは、多発性骨髄腫Ｕ２６６及び扁平上皮癌ＳＣＣ４の構成的なＮＦ−κＢの活性化を抑制する。細胞を２４時間所定濃度のホノキオールでインキュベートし、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした。核抽出物を調製し、更にＥＭＳＡでＮＦ−κＢをアッセイした。（Ｆ）ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＤＮＡとの結合能を調節しない。３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した又は処理しないＨ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）からの核抽出物を、室温で２時間、所定濃度のホノキオールで処理し、更にＥＭＳＡでＤＮＡ結合アッセイを行った。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。
【図２９】（Ａ）ホノキオールがＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ活性化、ＩｋＢａリン酸化及びＩｋＢａ分解を阻害することを示す。ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＴＮＦ誘導活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、０．１ｎＭ  ＴＮＦにより所定時間処理し、ＥＭＳＡでＮＦ−κＢ活性化を解析した。（Ｂ）Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、次いで所定の時間３７℃で０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、ウエスタンブロット解析によりサイトソル画分のＩｋＢａを解析した（上パネル）。タンパク質の等量のロードを確認するため、ｂ−アクチンの結果を示す（下パネル）。（Ｃ）ホノキオールは、ＩｋＢａｂｙ  ＴＮＦのリン酸化及びユビキチン結合（Ｄ）をブロックする。細胞を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでプレインキュベートし、３０分間Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシン（ＡＬＬＮ）５０ｍｇ／ｍＬでインキュベートし、次いで１０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。細胞質の抽出物を分画し、更にリン酸特異的な抗ＩｋＢａ抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。同じ膜を、抗ＩｋＢａ抗体サイドブロッティングした。（Ｅ）ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａキナーゼ活性を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、１２時間２５ｍＭのホノキオールで処理し、更に所定の時間間隔で０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、２００ｍｇの抽出物を抗ＩＫＫａ及び抗ＩＫＫｂ抗体で免疫沈降した。更に材料及び方法にて説明する要領で免疫複合体キナーゼアッセイを実施した。ＩＫＫタンパク質の発現レベルに対するホノキオールの効果を検討するため、３０ｍｇの全細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、エレクトロブロットし、材料及び方法にて説明する要領で、所定の抗体によりイムノブロットした。（Ｆ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５の核転座を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を無処置、又は３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールで前処理し、更に０．１ｎｍ  ＴＮＦで処理した。核抽出物を調製し、抗ｐ６５抗体を使用したウエスタンブロッティングで解析した。（Ｇ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５の核転座を阻害する。Ｈ１２９９細胞（１×１０６／ｍＬ）を、最初に３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールで処理し、更に０．１ｎＭ  ＴＮＦに曝露した。サイトスピンの後、材料及び方法で説明する要領で免疫細胞化学的分析を実施した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｈ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５のリン酸化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に所定時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。細胞質及び核抽出物を、抗リン酸化ｐ６５抗体を使用するウエスタンブロッティングで解析した。
【図３０】（Ａ）ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）発現を阻害することを示す。Ａ２９３細胞を、ＳＥＡＰ遺伝子にリンクしたＮＦ−κＢ含有プラスミドで一過性にトランスフェクションし、更に所定濃度のホノキオールで処理した。０．１ｎＭ  ＴＮＦで２４時間培養後、細胞上澄を回収し、ＳＥＡＰ活性をアッセイした。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。（Ｂ）ホノキオールは、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＮＩＫ及びＩＫＫｂにより誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を阻害する。Ａ２９３細胞を、ＳＥＡＰ遺伝子にリンクしたＮＦ−κＢ含有プラスミドで一過性にトランスフェクションし、更に０及び２５ｍＭのホノキオールで処理した。細胞上澄を、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ活性のアッセイに供した。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。バーは標準偏差を示す。（Ｃ）ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子にリンクしたＣＯＸ−２プロモータプラスミドにより一過性にトランスフェクションし、更に所定濃度のホノキオールで処理したた。０．１ｎＭ  ＴＮＦによる２４時間の培養後、細胞上澄を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果（平均±標準偏差、エラーバーとして示す）を示す。（Ｄ）マグノロールの構造式。（Ｅ）ホノキオール類似体であるマグノロールは、ＴＮＦ−で誘導されるＮＦＫＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、１２時間所定濃度のマグノロールで処理し、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦにより刺激した。核抽出物を調製し、ＥＭＳＡによりＮＦ−κＢ活性化を分析した。
【図３１】ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢを制御された遺伝子産物を阻害することを示す。（Ａ）ホノキオールはＴＮＦにより誘発されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−Ｉ及びＶＥＧＦ発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）は、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２抗体を用いるウエスタンブロッティングで分析した。（Ｂ）ホノキオールはＴＮＦにより誘発されるサイクリンＤｌ及びｃ−ｍｙｃ発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗サイクリンＤｌ及び抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用するウエスタンブロッティングで分析した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｃ）ホノキオールは、アンチアポトーシス遺伝子産物ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２  ＢＣＬ−ｘｌ、ＢＣＬ−２、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ２及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗ＩＡＰ１、ＩＡＰ２、ＢＣＬ−ｘｌ、ＢＣＬ−２、ｃＦＬＩＰ及びｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体を使用するウエスタンブロッティングで分析した。
【図３２】ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化及びアポトーシスに対するホノキオールの効果の概略図を示す。
【図３３Ａ】（Ａ）ホノキオール（ＨＮＫ）の化学構造式を表す。
【図３３Ｂ】（ＢからＦ）乳癌細胞系の生存率のグラフ。ＨＮＫの所定の投与量を含む培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞の増殖を阻害することを示す。
【図３４】（Ａ及びＢ）多形神経膠芽腫細胞株の生存率のグラフ。ＨＮＫの所定の投与量を含む培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。結果は、多形神経膠芽腫細胞株がＨＮＫ処理に抵抗性であることを示す。
【図３５Ａ】（Ａ−Ｇ）ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の生存率を表す棒グラフ。ＨＮＫの所定の投与量及び第２の薬剤を含む（又は含まない）培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。試験に用いた第２の薬剤：Ａ及びＢ：ＳＡＨＡ（２μＭ）、Ｃ：４−ＨＴ（１００ｎＭ）、
【図３５Ｂ】（Ａ−Ｇ）ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の生存率を表す棒グラフ。ＨＮＫの所定の投与量及び第２の薬剤を含む（又は含まない）培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。試験に用いた第２の薬剤：Ｄ及びＥ：ドキソルビシン（ＡＤＲ、３００ｎＭ）、Ｆ及びＧ：パクリタキセル（ＰＡＣ、２５０ｎＭ）。結果は、ＨＮＫがＳＡＨＡの増殖阻害活性を強化することを示す。
【図３６】マウスにおける、数週間にわたり計測した腫瘍体積のグラフ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をａｔｈｙｍｉｃヌードマウスの両側腹に注入した。マウスを４週間にわたり、担体（ｎ＝５）又はＨＮＫ（２ｍｇ／ｄ、ｎ＝５）を毎日Ｉ．Ｐ．注入した。腫瘍体積を毎週計量した結果、試験群マウスの腫瘍は、２週目から試験終了時にかけて、顕著に小さかった（ｐ＜０．０２）。
【図３７】（Ａ）所定時間ＨＮＫ（６０μＭ）で処理したＭＣＦ−７細胞の染色を示す。処理後、実施例９で説明する要領で細胞を回収し、ＰＩ及びアネキシンＶで染色した。（Ｂ）３つの独立した実験（ＨＮＫ６０μＭ、２４時間）の結果を示す棒グラフ。アステリクスは、ｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＭＣＦ−７細胞をＨＮＫ（２０又は４０μＭ、２４時間）で処理し、溶解し、アポトーシス関連タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
【図３８Ａ】Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のグラフを示す。実施例９と同様にＨＮＫ（３０μＭ、２４時間）で処理し、ＰＩ染色を使用して細胞周期を分析した。Ｂは、ＨＮＫの濃度に対する細胞（％）の棒グラフである。３つの独立した実験結果を示す。３０μＭ  ＨＮＫで処理したものと比較した、コントロールにおけるＳ期の細胞のパーセンテージはＰ＞０．０５である。Ｃは、ＨＮＫ（３０μＭ、２４時間）で処理し、ＰＩ染色を使用して細胞周期を分析したＭｃｆ−７細胞のグラフを示す。
【図３８Ｂ】（Ｄ）ＨＮＫの濃度に対する細胞（％）の棒グラフを示す。３つの独立した実験結果を示す。
【図３８Ｃ】Ｅは、ＨＮＫ（２０、４０又は、６０μＭ（２４時間））で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を溶解させ、細胞周期関連のタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。Ｆは、ＨＮＫ（２０、４０又は、６０μＭ（２４時間）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を溶解し、ＥＧＦＲ、並びに全ＥＲＫ２及びリン酸化ＥＲＫ２（並びにβ−アクチン）の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞の細胞周期を減速することを示す。
【図３９】Ａは、増殖因子の非存在下で０〜４０μｇ／ｍＬホノキオールで処理した後、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞株のアポトーシス（％）とホノキオール濃度の相関を示す棒グラフ。Ｂは、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞株におけるミトコンドリアＨＫ活性とホノキオール濃度の相関を、ホノキオールの有無において増殖因子から取り出し、全細胞に対するミトコンドリアのヘキソキナーゼ活性のパーセンテージの測定結果を示す棒グラフ。Ｃは、増殖因子の非存在下で０〜４０μｇ／ｍＬホノキオール処理後の、野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞株のアポトーシス（％）とホノキオール濃度の相関を示す棒グラフ。Ｄは、野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞株におけるミトコンドリアＨＫ活性とホノキオール濃度の相関を、ホノキオールの有無において増殖因子から取り出し、全細胞に対するミトコンドリアのヘキソキナーゼ活性のパーセンテージの測定結果を示す棒グラフ。
【図４０】インビボでのホノキオール処理により、Ｃ５７Ｂ１／６及びＬＭＰ１トランスジェニックマウスにおいてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）病理を沈静化したが、陰性コントロールのレベルまでは阻害しないことを示す。
【図４１】ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰ１  Ｂ細胞におけるＩＬ−６及び及びＴＮＦアルファ産生に与える、ホノキオール処理による効果を示す。
【図４２】マウスＭ１２．４．１細胞におけるＮＦＫＢ活性化が、投与量依存的にホノキオールにより阻害されることを示す。
【図４３】癌細胞におけるＴＳＡ及びホノキオールの組合せによる治療効果を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は２００５年２月２３日に出願の米国特許仮出願第６０／６５５，３４６号の優先権を主張、その開示内容は参照により本明細書に援用される。
（技術分野）
本発明は、例えば骨髄腫の治療における、血管形成、細胞増殖、腫瘍成長及び腫瘍形成を伴う障害の治療用のホノキオール関連の化合物及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌とは細胞の異常な増殖をいう。癌細胞は、空間的制限、他の細胞との栄養分共有又は、生体からの再生停止のためのシグナル伝達などの制限にもかかわらず、急速に複製する。癌細胞はしばしば正常な細胞とは異なり異常な形態を示し、適切に機能せず、生体中の広範囲に拡散しうる。異常組織（腫瘍と呼ばれる）の増殖は、途方もなく成長し、部列できる細胞クラスターである。腫瘍は、良好（非ガン）の場合も悪性（ガン）の場合もありうる。良性腫瘍は徐々に増殖する傾向があり、拡散しない。悪性腫瘍は急速に増殖でき、付近の正常組織に侵入し、破壊し、生体全体に拡散する。
【０００３】
悪性癌は局所的に侵襲性であり、転移もしうる。局所的浸潤癌は、正常組織に癌細胞の「指」を突き出し、周囲の組織に侵入できる。転移癌は細胞を生体中の他の組織へもたらし、それは最初の腫瘍の位置から隔離している場合もありうる。
【０００４】
癌はその由来する体液又は組織に従って、又はそれが最初に生じた生体内の部位に従って分類される。更に、若干の癌は混合型である。癌は５つの幅広いカテゴリ（癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫）に分類でき、それは癌の組織及び血液分類を表す。癌腫とは、器官、腺又は生体構造の表面をカバーする若しくは沿った形態で存在する上皮組織として公知の、身体組織に生じる癌である。例えば胃の内壁ガンは癌腫と呼ばれる。多くの癌腫は分泌（例えば乳を生産する胸部）に関与する器官又は腺に影響を及ぼす。癌腫は全ての癌ケースのほぼ８０〜９０％を占める。肉腫とは結合組織（例えば軟骨、脂肪、筋肉、腱及び骨）から増殖する悪性腫瘍である。最も一般的な肉腫（骨腫瘍）は通常若年成人で生じる。肉腫の例としては骨肉腫（骨）及び軟骨肉腫（軟骨）が挙げられる。リンパ腫とはリンパ節又は腺（白血球を生産し、体液を浄化する）又は器官（例えば脳及び胸部）から生じる癌を指す。リンパ腫は２つのカテゴリ（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）に分類される。白血病（別名血液癌）とは、骨髄が通常通り赤血球、白血球及び小板状体を生産しなくなる特徴を有する、骨髄の癌である。白血球は感染防御に必要である。赤血球は貧血症予防に必要である。小板状体は生体への創傷、生体液漏出を防止する。白血病の例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病及び慢性リンパ球性白血病が挙げられる。骨髄性及びリンパ球性という用語は、関連する細胞のタイプを示す。最後に、骨髄腫は骨髄形質細胞において増殖する。場合によって、骨髄腫細胞は一つの骨中に集中し、形質細胞腫と呼ばれる単一の腫瘍を形成する。しかしながら、他の場合には骨髄腫細胞は多くの骨中で集中し、多くの骨腫瘍を形成する。これは、多発性骨髄腫と呼ばれる。
【０００５】
現在行われる癌及び関連疾患の治療は効果が限定的であり、また多くの予想外の深刻な副作用をもたらす。癌療法は、以下の５つの専門療法に大別される。（１）手術、（２）放射線療法、（３）化学療法、（４）免疫療法及び（５）血管新生阻害治療。癌の起源を発見し、癌及び関連疾患の治療法の改良を開発するためにこれまで３０年以上にわたり研究がなされたが、これらの治療は結局逐次進歩するに留まった。現在の研究ストラテジーでは、より少ない危険性を有する有効な治療方式の探索に力点が置かれ、例えば天然物及び生物学的薬剤の使用が挙げられる。この力点の変化は、従来の癌治療法の結果、患者及びその子孫において、多くの遺伝物質に対してそれらの影響が及ぶという事実により、更に拍車がかけられている。癌遺伝子の起源を発見し、並びに新規な治療方法を開発するための努力が続けられている。
【０００６】
ホノキオール
中国医学において伝統的に、モクレン属の根及び茎樹皮が、血栓症、胃腸の不調及び不安の治療に用いられていた。ホノキオール（ＨＮＫ）（置換ビフェニルであり、有効成分がモクレン属から単離、精製される）は、抗酸化、抗血せん症、抗菌、神経組織への栄養効果、キサンチンオキシダーゼ抑制及び、抗不安作用を有する（非特許文献１から６）。
【０００７】
１９９０年代初期において、ＨＮＫの抗癌効果が報告された。１９９４年、平野らは、２８の天然の及び合成フラボノイド、並びに１１の天然のリガンドのヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０における抗白血病細胞の有効性を検討し、またこれらの化合物の細胞毒性に関し、４つの臨床抗癌剤との比較を行っている（非特許文献７）。このスクリーニングで、ＨＮＫは１００ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値を示し、最も強力な化合物の一つとして同定した。１９９８年、Ｈｉｂａｓａｍｉらは、ＨＮＫがヒトリンパ性白血病由来のＭｏｌｔ  ４Ｂ細胞（非特許文献８）のアポトーシスを誘発することを示した。
【０００８】
ＨＮＫがヒト鱗状細胞肺癌ＣＨ２７細胞（非特許文献９）及びヒト結腸直腸ＲＫＯ細胞（非特許文献１０）のアポトーシスを誘発することも公知である。２００４年、Ｃｈｅｎｇら（非特許文献１１）は、ＨＮＫが腫瘍増殖を阻害し、腫瘍を有するマウスの寿命を延長することから、それがヒト大腸癌のインビボ動物モデルにおいて効果的であると報告している。
【０００９】
ホノキオールは、生体内で血管新生及び抗腫瘍活性の阻害剤である。ＨＮＫは腫瘍細胞のアポトーシスを生じさせ、また血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（主要な有糸分裂促進性及び化学誘引性の内皮細胞性増殖因子（非特許文献１２）のリン酸化のブロックにより血管新生を阻害する機能を有する。ホノキオールはまた、腫瘍壊死因子のアポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナリングによるアポトーシス誘導を通じて直接的な抗腫瘍活性を示し、またｉｎ  ｖｉｖｏでヌードマウスの血管肉腫に対して非常に効果的であることが明らかとなっている（非特許文献１３）。
【００１０】
ＥｓｕｍｉらはＨＮＫの合成方法を開示している（非特許文献１４）。この報告ではまた、ＨＮＫのＯメチル化及び／又はその水素化類似体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ神経栄養アッセイによる構造−活性の相関関係の評価を行っている。Ｅｓｕｍｉらは、５−アリル及び４’−ヒドロキシル基がＨＮＫの神経栄養活性にとって重要であると結論づけている。
【００１１】
エモリー大学による特許文献１及び特許文献２では、ホノキオール型及び／又はマグノロール型化合物（図１−４に示す）の投与により、血管新生、腫瘍性及び癌に関連する症状及び皮膚症状などの諸症状を治療するための医薬品組成物、並びに方法を開示している。例えば、かかる組成物は、式Ａ１の少なくとも１つの化合物を含んでなる。
【化１】
2008542192.tif 000122
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。ホノキオール型及びマグノロール型化合物は、ＳＶＲ細胞増殖の阻害を示す。
【００１２】
２００４年１１月、Ａｒｂｉｓｅｒらは、ホノキオールがＧ１増殖停止、更に４８時間の時点で、５〜１０μｇ／ｍＬでＩＣ５０値のアポトーシスを開始させることにより、多くの骨髄腫細胞株の増殖を阻害することを報告している。また、ホノキオールがドキソルビン（Ｄｏｘ）耐性細胞（ＲＰＭＩ−Ｄｏｘ４０）、メファラン耐性細胞（ＲＰＭＩ−ＬＲ５）及びデキサメサゾン（Ｄｅｘ）耐性細胞（ＭＭ．１Ｒ）の増殖を阻害することも報告している。すなわち、ホノキオールがトリガーとなる細胞障害機構が、ホノキオールにより誘導されるＢａｘ及びＢａｄの発現増加、並びにＭｃ−１タンパク質発現の負の制御、更にそれに続くｃａｓｐａｓｅ−８／９／３裂開であることを示唆されている（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，２００４におけるポスター発表。アブストラクトは２００４年１１月４日にオンラインで公表）。
【００１３】
２００５年７月、Ｂａｔｔｌｅらは、ホノキオールがＢ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞のカスパーゼに依存性アポトーシスを誘発することを報告している（非特許文献１５）。すなわち全てのＢ−ＣＬＬ細胞（Ｂ−ＣＬＬ患者に由来する原発腫瘍細胞）における、ホノキオールにより誘導されるカスパーゼ依存性の細胞死を試験し、通常の単核細胞によりＢ−ＣＬＬ細胞に対して毒性が強かった。またホノキオール誘導アポトーシスは、カスパーゼ−３、−８及び９の活性化、並びにポリ（アデノシン二リン酸塩−リボース）重合酵素（ＰＡＲＰ）の裂開を特徴とする。更に、ホノキオールがフルダラビン、クラドリビン又はクロランブシルにより誘発される細胞毒性を強化するとも報告されている。
【００１４】
２００５年９月、Ｉｓｈｉｔｓｕｋａらは、ホノキオールによるカスパーゼ依存性及びカスパーゼ非依存性アポトーシスの誘導により、ヒト多発性骨髄腫の従来の薬剤耐性を克服すると報告している（非特許文献１６）。ＨＮＫは、カスパーゼ依存性、及びカスパーゼ非依存性経路の両方を介したアポトーシスの誘導により、再発性不応性ＭＭ（多発性骨髄腫）患者からのヒトＭＭ細胞株及び腫瘍細胞における細胞毒性を誘発した。ＨＮＫはまた、ボルテゾミブにより誘発されるＭＭ細胞毒性及びアポトーシスを強化した。
【特許文献１】国際公開第０２／０７６３９３号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１０５９０６号公報
【非特許文献１】Ｔａｉｒａら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３；１９  Ｓｕｐｐｌ  ｌ：Ｓ７１−７７；
【非特許文献２】Ｔｅｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．１９８８；５０：７５７−７６５；
【非特許文献３】Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９８１；７０：９５１−９５２；
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４；１４：５０１−５０６；
【非特許文献５】Ｋｕｒｉｂａｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８；５０：８１９−８２６；
【非特許文献６】Ｅｓｕｍｉら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔ  ２００４，１４：２６２１−２５
【非特許文献７】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９９４；５５（１３）：１０６１−９
【非特許文献８】Ｈｉｂａｓａｍｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．１９９８
【非特許文献９】Ｙａｎｇ  ＳＥ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２；６３：１６４１−１６５１
【非特許文献１０】Ｗａｎｇら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４；１０：２２０５−２２０８
【非特許文献１１】Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４；１０：００  ３４５９−３４６３
【非特許文献１２】Ｂａｉら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７）
【非特許文献１３】Ｂａｉら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）１４：２６２１−２６２５
【非特許文献１５】Ｂｌｏｏｄ．Ｊｕｌｙ  ２００５；１０６：６９０−６９７
【非特許文献１６】Ｂｌｏｏｄ，１  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００５，Ｖｏｌ．１０６，Ｎｏ．５，ｐｐ．１７９４−１８００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、血管新生、細胞増殖、腫瘍増殖、腫瘍形成及び骨髄腫を伴う疾患の治療のための新規化合物、組成物、方法及び使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ホノキオール誘導体、ホノキオール誘導体を含んでなる医薬品組成物、並びにその使用方法を提供する。該化合物及び組成物は、血管新生、細胞増殖及び腫瘍形成及び腫瘍増殖の阻害に使用できる。これらの化合物及び医薬品組成物は、癌（例えば多発性骨髄腫を含む骨髄腫）の予防及び／又は治療に使用できる。
【００１７】
具体的な実施態様では、骨髄腫の治療、特に多発性の骨髄腫の治療に非常に有用なホノキオール及びホノキオール誘導体を提供する。他の具体的な実施態様では、これらの化合物は白血病（例えば慢性リンパ球性白血病）の治療に使用できる。特に、本明細書に記載の化合物は、慢性リンパ球性白血病細胞（ＣＬＬ）（変異体ｐ５３を有するそれらを含むがこれに限定されない）の治療に使用できる。
【００１８】
本発明の一態様は、ホノキオールがカスパーゼから独立した機構で癌細胞のアポトーシスを誘発することができるという発見に基づく。本発明はまた、非ガン腫瘍及び他の増殖的な症状の治療をカバーする。
【００１９】
低濃度の特定のカスパーゼ（例えばカスパーゼ−３及びカスパーゼ−８）を有する癌細胞株は、抗癌剤耐性を伴いうる。本明細書に開示のホノキオール及びホノキオール誘導体は、本明細書に開示の癌及び薬剤の実施態様を含む、１つ以上の薬剤に対する耐性を示す癌の治療に使用できる。一実施態様では、本明細書に開示するホノキオール又はその誘導体を、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及びレブリミドなどに対する薬剤抵抗性の腫瘍（例えば多剤耐性の腫瘍）を有する患者の治療における有効量で投与する。具体的な一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体はドキソルビシン耐性多発性骨髄腫の治療に使用できる。
【００２０】
該ホノキオール又は誘導体はそれ単独で投与してもよく、又は付加的な治療用若しくは化学療法用の薬剤と組み合わせて投与してもよい。具体的な実施態様では、ホノキオール又は誘導体は、薬剤抵抗性の多発性骨髄腫の治療における有効量で投与できる。一実施態様では、付加的な化学療法剤は、Ｐ−糖タンパク質阻害剤（例えばベラパミル）、サイクロスポリン（例えばサイクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリンアンタゴニスト、デキスベラパミル、デキスニグルジピン、バルスポダール（ＰＳＣ８３３）、ビリコダール（ＶＸ−７１０）、タリキダール（ＸＲ９５７６）、ゾスキダール（ＬＹ３３５９７９）、ラニキダール（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３）であってもよい。他の実施態様では、付加的な化学療法剤はヒストンデアセチラーゼ阻害剤であってもよい。具体的な実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、スベロイラアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）であってもよい。
【００２１】
一実施態様では、本明細書に開示する有効量のホノキオール誘導体を宿主に投与することを含む、宿主の癌の治療方法を提供する。癌は、例えば癌、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫であってもよい。
【００２２】
具体的な実施態様では、宿主の骨髄腫の治療方法であって、宿主に有効量のホノキオールを投与すること、又は宿主に本明細書に開示のホノキオール誘導体化合物を投与することを含んでなる方法を提供する。骨髄腫は、例えば多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、単離された骨の形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、単クローン性の免疫グロブリン血症又は抵抗性の形質細胞腫瘍であってもよい。
【００２３】
他の実施態様では、化合物は癌（骨髄腫を含む）の治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬との組合せ又は交互使用において投与される。具体的な実施態様では、宿主の血管新生、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍性の症状、癌又は皮膚疾患を特徴とする症状の治療方法であって、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて本明細書に開示の化合物の有効量を宿主に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
更なる実施態様では、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて有効量の本明細書に開示の化合物を宿主に投与することによる、炎症を特徴とする症状の治療方法を提供する。具体的な実施態様では、有効量の本明細書に開示の化合物を投与することによる、関節炎の治療方法も提供する。
【００２５】
他の実施態様では、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせて本明細書に開示の化合物の有効量を宿主に投与することによる、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患の治療方法を提供する。
【００２６】
更なる本発明の目的は、本明細書に記載のホノキオール及び／又は関連化合物の毒性作用に特に感受性の高い腫瘍及び癌を確認する方法を提供することである。本発明の一態様は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＦＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現する腫瘍が特にホノキオール又はその誘導体の毒性作用に感受性であるという発見に基づく。一実施態様では、以下の手順を含む、哺乳類（特にヒト）の腫瘍の治療方法を提供する。
（ｉ）  腫瘍から生体試料を調製し、
（ｉｉ）  腫瘍がホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＦＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現するか否かを決定し、
（ｉｉｉ）  ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現する腫瘍を本明細書に記載のホノキオール又は関連化合物で活性化させる。一実施態様では、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、例えばリン酸化された形態を検出できる抗体を用いて、腫瘍又は癌におけるリン酸化ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの存在をアッセイすることにより測定できる。他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、患者から得られる腫瘍又は癌細胞をアッセイして、コントロールの組織のレベルと比較することにより測定できる。ある実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫは、癌サンプルではコントロールと比較して少なくとも２、２．５、３又は５倍過剰発現しうる。
【００２７】
典型的な化合物としては図１から４の化合物及び本明細書に開示の化合物が挙げられ、例えば以下の化合物Ｉａ又はその塩、エステル若しくはプロドラッグが含まれる。
【化２】
2008542192.tif 000123
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例：メチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル器）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
【００２８】
式Ｉａの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル基）である。
【００２９】
他の実施態様では、該化合物は式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化３】
2008542192.tif 000124
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００３０】
式Ｉｂの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基））であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００３１】
更に式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ若しくはＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグを提供する。
【化４】
2008542192.tif 000125
【化５】
2008542192.tif 000126
【化６】
2008542192.tif 000127
【化７】
2008542192.tif 000128
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００３２】
式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）である。
【００３３】
他の実施態様では、該化合物は式Ｄ２で表される。
【化８】
2008542192.tif 000129
式中、アリル基は酸化又は還元された形態である。
【００３４】
他の実施態様では、化合物は式Ｄ３で表される。
【化９】
2008542192.tif 000130
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を表し、例えば、各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００３５】
他の実施態様では、該化合物は、以下の式中の１つの化合物である。
【化１０】
2008542192.tif 000131
式中、各Ｒは独立にアルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。任意に、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルケニル又はＣ１−１０アルキニル基である。例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる。
【化１１】
2008542192.tif 000132
式Ｄ５において、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１であって、各Ｒ１が独立に、例えばＨ又はアルキル基である。
【００３６】
式Ｄ６、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂでは、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル又はＣ１−１０アルキル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。式Ｄ６では、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂに示すように、点線は、５員環又は６員環を形成するＣＨ２基の有無を示す。
【００３７】
式Ｄ９では、ｎが１〜８であるとき、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎである。
【００３８】
式Ｄ１０及びＤ１１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００３９】
具体的な実施態様では、上記で開示される化合物は、骨髄腫の治療における有効量において投与されうる。
【００４０】
一実施態様では、血管新生、腫瘍形成、腫瘍性の症状、癌又は皮膚疾患を特徴とする症状の治療における有効量で、それを必要とする宿主に本明細書に開示の化合物又は化合物を含んでなる医薬品組成物の有効量を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００４１】
一実施態様では、それを必要とする個人に本明細書に開示の化合物又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステルの有効量を投与することを含んでなる、癌（例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病又は骨髄腫）の治療方法を提供する。任意に該化合物又はその塩、異性体、プロドラッグ若しくはエステル、並びに適当な担体（例えば水）を含む薬理学的に許容できる組成物であって、それを必要とする個人に所望の投与経路で処方されるものを提供する。任意に、該化合物は、癌又は、特定の骨髄腫の治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬との組合せ又は交互使用において投与される。
【００４２】
また、任意に薬理学的に許容できる担体に、本明細書に開示の化合物又はその塩、プロドラッグ又はエステルの癌、特に骨髄腫の治療にける使用は、本発明の範囲内であり、また、本明細書に開示の化合物又は塩、プロドラッグ若しくはエステルの、癌（特に骨髄腫）の治療用の薬剤（任意に薬理学的に許容できる担体中に含まれる）の製造における使用を開示する。
【００４３】
一実施態様では、本発明の化合物は、癌、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫の治療及び／又は予防に使用できる。本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は固形腫瘍の治療に使用できる。更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、例えば、以下の器官又は組織の癌（それらに限定されない）の治療に使用できる。胸部、前立腺、骨、肺、結腸（結腸直腸など）、尿道、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、腎臓、膵臓、咽頭、甲状腺、胃、脳及び／又は多発性骨髄腫。本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は血管新生関連の疾患の治療に使用できる。
【００４４】
特定の本発明の実施態様では、本明細書に記載の化合物を骨髄腫の治療に使用できる。一実施態様では、ホノキオールを骨髄腫の治療に使用できる。本発明の他の一実施態様では、ホノキオール又は本明細書に記載の化合物又は組成物のいずれかを、例えば、形質細胞腫瘍（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨の単離形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症又はリンパ形質細胞性白血病、単クローン性γグロブリン血症、及び／又は不応性形質細胞腫瘍など）の治療に使用できる。
【００４５】
１つの態様では、該化合物及び組成物は、少なくとも１つの付加的な化学療法剤との組合せ又は交互使用において投与できる。外薬剤は同じ組成物の一部を構成してもよく、又は同時若しくは別の時間にそれぞれの組成物として投与するように調剤してもよい。一実施態様では、本発明の組成物は抗血管新生薬剤と組み合わせてもよい。本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、以下のタイプの薬剤（それらに限定されない）との組合せ又は交互使用において使用できる。抗増殖剤、有糸分裂阻害剤、抗代謝剤、アルキル化剤又はナイトロジェンマスタード、トポイソメラーゼを標的とする薬剤、腫瘍細胞のシグナル伝達を標的とする薬剤、遺伝子治療及びアンチセンス薬剤、抗体医薬、ステロイド、ステロイド類似体、抗嘔吐薬及び／又は非ステロイド性薬剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
定義
特に明記しない限り、本明細書で用いる用語「アルキル」には、飽和した直鎖状、分岐状、又は環状の、第一級、第二級又は第三級の炭化水素（Ｃ１−２２又はＣ１−１０のものを含む）、特にメチル、エチル、ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、ヘプチル、シクロヘプチル、オクチル、シクロ−オクチル、ドデシル、トリデシル、ペンタデシル、イコシル、ヘミコシル及びデコシル基が含まれる。例えば、アルキル基はハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸塩、ホスホン酸、リン酸塩又はホスホン酸塩により任意に置換されてもよく、非保護でもよく、又は当業者に公知の方法で必要に応じて保護してもよい（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，参照により本明細書に援用）。
【００４７】
本明細書では特に明記しない限り、用語「低級アルキル」とは、Ｃ１−Ｃ４の飽和の直鎖、分岐、又は適当な場合は環状（例えばシクロプロピル）アルキル基（任意に置換されてもよい）である。
【００４８】
用語「アミノ」とは、「−Ｎ（Ｒ）２」基（第一級、第二級及び第三級アミンを含む）を指し、アルキル、アリール、ヘテロ環、又はスルホニル基などで任意に置換されてもよい。ここで、（Ｒ）２には２つの水素、水素及びアルキル、水素及びアリール、水素及びアルケニル、２つのアルキル、２つのアリール、２つのアルケニル、１つのアルキル及び１つのアルケニル、１つのアルキル及び１つのアリール又は、１つのアリール及び１つのアルケニル基が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４９】
炭素原子の範囲が指されるときは、独立に及び別にあらゆる範囲のメンバーが含まれる。非限定的な例として、用語「Ｃ１−Ｃ１０アルキル」には、独立に、グループの各メンバーを含むと考慮されること、例えば、Ｃ１−Ｃ１０アルキルは、直鎖状、分岐状及び適切であれば環状のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９及びＣ１０アルキル官能性が含まれる。
【００５０】
用語「アミド」とは、「−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２」の構造で表される部分を含んでなる（Ｒが任意に置換されてもよいアルキル、アルケニル及びアリール基を含んでもよい）ものを指す。
【００５１】
本明細書「保護される」の用語には、特に明記しない限り、酸素、窒素又はリン原子又は他のなど原子に付加される、更なる反応を防止するための基が含まれる。多種多様な酸素及び窒素への保護基は、有機合成の当業者に公知である。
【００５２】
本明細書では、特に明記しない限り、「アリール」とは最高８つのメンバーを各環に有する安定な単環、二環又は三環の炭素環であって、少なくとも１つの環は芳香族であるものを指す。例えばベンジル、フェニル、ビフェニル又はナフチル基が含まれるが、これに限定されない。アリール基は、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノ、スルホン酸、硫酸、ホスホン酸、リン酸又はホスホン酸塩などの１つ以上の部分により置換されされてもよく、保護されていても、又は必要に応じて当業者に公知の方法（Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１）で保護してもよい。
【００５３】
本明細書で用いる用語「ハロ」とは、特にクロロ、ブロモ、ヨード及びフルオロを指す。
【００５４】
用語「アルケニル」とは、１つの少なくとも１つの二重結合を有する、Ｃ２−２２の直鎖状、分岐状、又は環状不飽和炭化水素を指す。例えば、ビニル、アリル及びメチル−ビニル基などが挙げられる。アルケニル基は上記アルキル基と同様に任意に置換されてもよい。
【００５５】
「アルキニル」とは、少なくとも１つの三重結合を有する、１つのＣ２−２２を含む直鎖又は分岐炭化水素を指す。アルキニル基は上記のアルキル基と同様に任意に置換されてもよい。
【００５６】
用語「アルコキシ」は、構造の部分が含まれる−Ｏ−アルキル。
【００５７】
用語「複素環」又は「ヘテロ環」とは、飽和、不飽和、又は芳香族単環（例えば安定５〜７つの幾つかの部分から成る単環）又は二環式複素環（例えば８〜１１の幾つかの部分から成る二環式）であって、炭素原子及び１〜３のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ及びＰなど）からなり、窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化でき、及び／又は窒素原子は四級化されてもよく、並びに上記の定義された任意の複素環がベンゼン環と融合したいかなる二環基も含まれる。複素環は、安定建造の形成をもたらすいかなるヘテロ原子又は炭素原子と結合してもよい。非限定的な複素環基の例には、ピロリル、ピリミジル、ピリジニル、イミダゾリル、ピリジル、フラニル、ピラゾール、オキサゾリル、オキシラン、イソオキサゾリル、インドリル、イソインドリル、チアゾリル、イソチアゾリル、キノリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チオフェン、ピペラジン及びピロリジン基が含まれる。
【００５８】
用語「アシル」とは、式Ｒ’Ｃ（Ｏ）（式中、Ｒ’基が直鎖、分岐又は環状の置換又は非置換のアルキル又はアリール基）を指す。
【００５９】
本明細書で用いる「宿主」には特に明記しない限り、治療を必要とする哺乳類（例えばネコ、イヌ、ウマ、マウス、その他）、ヒト又は他の生物体が包含される。癌関連の症状のような「素因」的症状を有する宿主は、これらの症状の１つ以上の明白な徴候を呈しないが、遺伝的に、生理的に又は別の理由から、これらの症状の１つ以上を発展させる危険を有する宿主として定義できる。すなわち、本発明の組成物はこれらの症状に対する化学的な予防薬として使用できる。更に、本明細書に記載の「組成物」には１つ以上の化学物質が含まれてもよい。
【００６０】
本明細書で用いる用語「有効量による治療」には、例えば血管新生の疾患又は症状の１つ以上の治療、予防若しくは好転（腫瘍増殖を抑制、腫瘍体積を減少させる、あるいは腫瘍転移を減速若しくはブロックする）に充分な量を投与すること、また、疾患又は症状の１つ以上の改善及び好転をもたらす量が含まれる。
【００６１】
本明細書で用いる用語「薬理学的に許容できる塩」には、特に明記しない限り、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的であるそれらの塩が含まれる。塩は、組成物の１つ以上の化合物の最終的な単離及び精製の間、又は別個に遊離塩基と適切な有機酸とを反応させることによりｉｎ  ｓｉｔｕで調製できる。目的化合物の合成及び／又は精製において、例えば薬理学的に許容できない酸及び塩基も、本発明で使用できる。かかる塩の非限定的な例としては、
（ａ）無機塩（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、など）から形成される酸付加塩、並びに有機塩（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、など）から形成される塩、
（ｂ）金属カチオン（例えば亜鉛、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、ニッケルなど）から形成される塩基付加塩、
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せが挙げられる。
【００６２】
代表的な酸性付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、二硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳硫酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、酪酸塩、ラウレート、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレン硫酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクラート、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸エステル、トルエンスルホン酸塩、ウンデカノン酸塩、吉草酸塩などが含まれるが、これに限定されない。
【００６３】
薬理学的に許容できる塩として使用できる代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、並びに無毒性アンモニウム、四級アンモニウム及びアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなど）などが含まれるが、こられに限定されない。
【００６４】
本明細書で用いる用語「薬理学的に許容できるエステル」には、特に明記しない限り、組成物の１つ以上の化合物のエステルが含まれ、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的であるものである。
【００６５】
本明細書で用いる「薬理学的に許容できるプロドラッグ」には、特に明記しない限り、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などのない宿主組織との接触的使用に適し、適切な利点／危険率を特徴とし、それらの使用目的において効果的である組成物の１つ以上の化合物のプロドラッグが包含される。
【００６６】
薬理学的に許容できるプロドラッグには、可能なときは、組成物の１つ以上の化合物の双性イオン形が含まれる。用語「プロドラッグ」には、例えば血液中での加水分解により、生体内で急速に変化し親化合物を産生する化合物が含まれる。本明細書で用いる「薬理学的に許容できる担体及び／又は賦形剤」とは特に明記しない限り、溶媒、希釈剤又は他の液状担体、分散剤又は懸濁剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、アジュバント、担体、輸送システム、崩壊剤、吸収剤、表面活性剤、着色剤、風味剤又は甘味料など、要求される特定の剤形に適するいかなる担体も含まれる。
【００６７】
Ｉ．化合物
本明細書に開示の化合物は、一実施態様では、例えば癌（特に多発性骨髄腫）に対して有用な活性を有する方法及び組成物において使用できる。用語「ホノキオール誘導体」には、ホノキオール型及びマグノロール型化合物、又は本明細書に記載の所望のホノキオール性の活性を有する他の化合物が含まれると解され。
【００６８】
一実施態様では、該化合物は式Ｉａの化合物又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化１２】
2008542192.tif 000133
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例：メチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル器）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
【００６９】
式Ｉａの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はＣ１−５アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル基）である。
【００７０】
他の実施態様では、該化合物は式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【化１３】
2008542192.tif 000134
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００７１】
式Ｉｂの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基））であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００７２】
更に式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ若しくはＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグを提供する。
【化１４】
2008542192.tif 000135
【化１５】
2008542192.tif 000136
【化１６】
2008542192.tif 000137
【化１７】
2008542192.tif 000138
式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル、アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）で置換されてもよい）であり、
式中、Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基（任意に、独立に、例えばＣ１−１０アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）で置換されてもよい）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）であり、
式中、任意に少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。
【００７３】
式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの他の一実施態様では、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基（アルケニル又はアルキニル基（例えばメチル、エチル又はプロピル基）であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル基（例えばＣ１−５アルキル、アルキル又はアルケニル基（例えばビニル又はアリル基）である。
【００７４】
一実施態様では、該化合物はホノキオール又はマグノロールである。
【化１８】
2008542192.tif 000139
他の典型的なホノキオール誘導体は米国特許出願公開第２００４／０１０５９０６号公報にて説明したように、図１、２、３及び４の化合物が含まれる（２００４年６月３日に公開、開示は本明細書に援用される）。誘導体は、例えばホノキオール、ホノキオール型化合物又はマグノロール型合成、並びにその他本明細書に開示の所望のホノキオール活性を有する多様な誘導体であってもよい。
【００７５】
ホノキオール型化合物には、図１記載の構造式Ａ１が含まれるが、これに限定されない。特に、ホノキオール型化合物には図１に例示される構造式Ａ２が含まれてもよい。ホノキオール型化合物の官能基はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５で表される。これらの官能基は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。図２では独立に選択できるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５を含んでなる典型的な官能基を例示する。
【００７６】
更に、ホノキオール型化合物には、上記で記載又は指した化合物の薬理学的に許容できる塩、エステル及びプロドラッグが含まれる。
【００７７】
マグノロール型化合物には、図１に示す構造式Ｂ１が含まれるが、これに限定されない。特に、マグノロール型化合物には図１において例示される構造Ｂ２を含んでもよい。マグノロール型化合物の官能基は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５として示される。該官能基は独立に水素、ヒドロキシ基、アミド、アミン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、環状炭化水素、環状ヘテロカーボン、ハロゲン化環状ヘテロカーボン、ベンジル、ハロゲン化ベンジル、有機金属セレン化合物、硫化物、カルボニル、チオール、エーテル、二窒素環化合物、チオフェン、ピリジン、ピロール、イミダゾール及びピリミジンを含むが、これに限定されない群から選択できる。図２では独立に選択できるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３、Ｒ’４及びＲ’５を含んでなる典型的な官能基を例示する。
【００７８】
ホノキオール型化合物の類似体、同族体、異性体又は誘導体もまた、宿主の血管新生、腫瘍形成及び腫瘍性の症状の治療、及び／又は予防的な化学組成物として機能し、並びに本明細書に記載の化合物の薬理学的に許容できる塩、エステル及びプロドラッグとして使用できる。
【００７９】
図３及び４は、他の有用な化合物の例である更なる構造式Ｃ１から７を例示する。これらの化合物は、上記のホノキオール型及び／又はマグノロール型化合物の代わりに、又はそれらに追加して使用できる。その場合、官能基Ｒ’６及びＲ’７は独立に、記載する官能基のいずれか、又は図２に関して上記したものを指す。
【００８０】
他の有用な化合物として、式Ｄ２の化合物が挙げられる。
【化１９】
2008542192.tif 000140
式中、アリル基は酸化又は還元された形態である。
【００８１】
他の実施態様では、化合物は式Ｄ３で表される。
【化２０】
2008542192.tif 000141
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を表し、例えば、各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００８２】
他の実施態様では、該化合物は、以下の式中の１つの化合物である。
【化２１】
2008542192.tif 000142
式中、各Ｒは独立にアルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。任意に、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル、Ｃ１−１０アルケニル又はＣ１−１０アルキニル基である。例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる：
【化２２】
2008542192.tif 000143
式Ｄ５において、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１であって、各Ｒ１が独立に、例えばＨ又はアルキル基である。
【００８３】
式Ｄ６、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂでは、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル又はＣ１−１０アルキル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。式Ｄ６では、Ｄ６−Ａ及びＤ６−Ｂに示すように、点線は、５員環又は６員環を形成するＣＨ２基の有無を示す。
【００８４】
式Ｄ９では、ｎが１〜８であるとき、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎである。
【００８５】
式Ｄ１０及びＤ１１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００８６】
一実施態様では、該化合物は以下の化合物の１つである。
【化２３】
2008542192.tif 000144
他の実施態様では、該化合物化合物は以下の式で表される。
【化２４】
2008542192.tif 000145
式中、ＯＲ１置換基はエーテル又はエステル結合を意味し、例えば各Ｒ１は独立にアルキル基（例えばＣ１−１０アルキル基）又はアシル基（例えばＣ１−１０アシル基）である。
【００８７】
他の実施態様では、該化合物は以下の式の１つである。
【化２５】
2008542192.tif 000146
各Ｒは独立に、アルキル、アルケニル、アリール又はビニル基であって、任意に直鎖状、分岐状又は環状であってもよく、任意に置換されてもよい。例えば、各Ｒは独立にＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０アルケニル基又はＣ１−１０アルキニル基であってもよい。例えば、各Ｒは以下の群から独立に選択できる。
【化２６】
2008542192.tif 000147
式Ｄ５−１では、各Ｘは独立に、例えばハロゲン（例えばＦ）、Ｎ（Ｒ１）２、ＳＨ又はＳＲ１で、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基である。
【００８８】
式Ｄ６−１では、各Ｘは独立に水素、アルキル基（例えばメチル基）又はハロゲン（例えばＦ）である。
【００８９】
式Ｄ９−１では、ＺはＯ、Ｓ、ＳＯ２、ＣＯ又は（ＣＨ２）ｎであって、ｎは例えば１〜８である。式Ｄ１０−１、Ｄ１０−２及びＤ１１−１では、各Ｙは独立に水素、ＯＨ又はアルキル基であり、各ａは独立にＯ、ＮＲ１又はＳであって、各Ｒ１は独立に、例えば水素又はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。
【００９０】
Ｄ１０では、点線は二重又は一重結合を示す。
【００９１】
他の実施態様では、該化合物は以下の式で表される。
【化２７】
2008542192.tif 000148
式中、各Ｒ、Ｒ’Ｒ’’及びＲ’’’は独立に水素、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＣＨ３、−（ＣＨ２）ｎＣＨ３（例えばｎ＝１〜１０）、
【化２８】
2008542192.tif 000149
であって、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは各々独立に水素、ＯＨ、Ｏアルキル、アルキル（Ｃ１−８アルキルを含む）、アルケニル基又はハロゲンである。
【００９２】
他の実施態様では、該化合物はバルプロン酸（Ｄｅｐａｋｏｔｅ、Ｄｅｐａｋｅｎｅ）、又はその薬理学的に許容できる塩、エステル若しくはプロドラッグである。バルプロン酸は抗てんかん薬であって、肝臓のグルクロニダーゼ及びエポキシドヒドロラーゼを阻害することが公知である。
【００９３】
他の有用な化合物は以下の式（反応式１Ａ）で示される化合物、並びにその塩、エステル、異性体及びプロドラッグである。
【００９４】
反応式１Ａ
【化２９】
2008542192.tif 000150
【００９５】
有用な化合物の更なる実施態様では、表１に列挙する化合物、並びにその塩、異性体、エステル及びプロドラッグが挙げられる。
【表１】
2008542192.tif 000151
2008542192.tif 000152
2008542192.tif 000153
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2008542192.tif 000159
2008542192.tif 000160
2008542192.tif 000161
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本明細書に開示の化合物がキラル中心を含んでもよいことを理解すべきである。かかるキラル中心は（Ｒ）又は（Ｓ）いずれかの立体配座でもよく、又はその混合物でもよい。
【００９６】
すなわち、本明細書の化合物は、鏡像異性的に純粋でもく、又は立体異性体若しくはジアステレオマー混合物でもよい。本明細書に開示の化合物には、いかなるラセミ体、光学活性体、多形、立体異性体、又はそれらの混合物も含まれるものと理解される。それは好ましくは、本明細書に記載の有用な特性を有し、また光学活性体の調製方法、及び本明細書に記載の標準的な試験方法若しくは公知の他の類似の試験を使用して活性を測定できる。化合物の光学異性体を得るために使用できる方法の例としては、以下が挙げられる。
ｉ）「結晶の物理的分離」：手作業で個々のエナンチオマーの肉眼で確認できる結晶を分離する方法。別々のエナンチオマーの結晶が存在する場合、この技術が使用できる。すなわち、材料が集合体であり、かつ結晶が視覚的に明瞭である場合である。
ｉｉ）「同時結晶化」：個々のエナンチオマーをラセミ化合物の溶液から別々に結晶化させる方法。但しそれが固体状物の集合体である場合のみ可能である。
ｉｉｉ）「酵素的分離」：酵素とエナンチオマーとの異なる反応速度を利用した、ラセミ化合物の部分的又は完全な分離方法。
ｉｖ）「酵素的不斉合成」：少なくとも１つの処理において酵素反応を使用して、所望のエナンチオマーの鏡像異性的に純粋又は強化された合成前駆体を得る合成方法。
ｖ）「化学的不斉合成」：所望のエナンチオマーが、アシンメトリ（すなわち鏡像異性）の生成物（キラル触媒又はキラル補助剤を使用して提供できる）を生じる条件の下でアキラル前駆体から合成される合成方法。
ｖｉ）「ジアステレオマー分離」：ラセミ化合物が鏡像異性的に純粋な試薬（補助キラル）と反応し、個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換する方法。得られるジアステレオマーを、個々の構造の違いにより更にクロマトグラフィ又は結晶化により分離し、その後キラル助剤を除去して所望のエナンチオマーを得る方法である。
ｖｉｉ）「一次元及び二次元アシンメトリ変換」ラセミ化合物からのジアステレオマーを平衡化させ、ジアステレオマーの溶液中で所望のエナンチオマーから優勢を得る方法、あるいは、所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優先結晶化が平衡を混乱させ、結局原則として全ての材料が所望のエナンチオマーから結晶ジアステレオマーに変変換される方法。
所望のエナンチオマーが更にジアステレオマーから遊離する。
ｖｉｉｉ）「動力学的分離」：この方法は、動力学的条件下でキラル、非ラセミ試薬又は触媒とエナンチオマーとの異なる反応速度を利用した、ラセミ化合物の部分的又は完全な分離（又は部分的に分離された化合物の更なる分離）を指す。
ｉｘ）「非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成」：所望のエナンチオマーを非キラル開始材料から得る方法であって、立体化学的な完全性が合成過程を通じて全く又はほとんど損なわれない合成方法。
ｘ）「キラル液体クロマトグラフィ」：ラセミ化合物のエナンチオマーが、静止相との異なる相互作用を利用して、液体移動相において分離される方法。静止相はキラル材料で作製されてもよく、又は移動相に更にキラル材料を添加して異なる相互作用を引き起こしてもよい。
ｘｉ）「キラルガスクロマトグラフィ」：ラセミ化合物を揮発させ、エナンチオマーを、固定された非ラセミキラル吸着剤を含むカラムでガス状の移動相におけるそれらの異なる相互作用により分離する方法。
ｘｉｉ）「キラル溶媒を有する抽出」：特定のキラル溶媒への１つのエナンチオマーの優先的溶解によりエナンチオマーを分離する方法。
ｘｉｉｉ）「キラル膜輸送」ラセミ化合物を薄膜バリアと接触させて配置する方法。バリアは通常は２つの混和性の流体（１つはラセミ化合物を含む）を分離しているが、濃度又は圧力差のような駆動力により膜バリアを透過する優先的な輸送が生じる。ラセミ化合物中の１つのエナンチオマーだけを通過させる膜の非ラセミキラル特性を利用して分離が行われる。
【００９７】
ＩＩ．治療方法
本発明の化合物及び医薬品組成物は、血管新生、腫瘍形成、腫瘍性の症状、癌、皮膚疾患、炎症性障害及び／又は骨疾患（例えば骨粗鬆症）を特徴とする症状の治療に使用できる。
【００９８】
癌
一実施態様では、本発明の化合物は癌、肉腫、リンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫の治療に使用できる。本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は固形腫瘍の治療に使用できる。
【００９９】
例えば、本発明発明の化合物が以下の器官又は組織における癌の治療に使用できるが、以下に限定されない。胸部、前立腺、肺、気管支、大腸、尿中、膀胱、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、腎臓、腎臓、膵臓、咽頭、甲状腺、胃、脳、多発性骨髄腫、食道、肝臓、肝内胆管、頸部、喉頭、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、軟組織、例えば心臓、ホジキンリンパ腫、精巣、小腸、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、肛門、肛門管、甲状腺で、肛門直腸外陰部、胆嚢、胸膜、目、鼻鼻腔、中耳、咽頭鼻部、尿管、腹膜、網、隔膜及び胃腸、高等膠腫、神経グリア芽細胞腫、大腸、直腸、膵臓、胃癌、肝癌、頭頚部癌、癌腫、腎細胞癌、腺癌、肉腫、血管内皮腫、リンパ腫、白血病、菌状息肉腫。更なる実施態様では、本発明の化合物は悪性腫瘍疾患血管肉腫、血管内皮腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫及びカポシ肉腫、並びに非悪性の疾患又は症状（例えば乾癬、リンパ管起源、幼年期の血管腫、Ｓｔｕｒｇｅ−Ｗｅｂｅｒ症候群、尋常性疣贅、神経線維腫症、結節硬化症、化膿性肉芽腫、劣性ジストロフィの表皮水疱症、静脈潰瘍、ざ瘡、酒さ、湿疹、接触感染性の軟属腫、脂漏性角化症及び日光性角化症）などの治療に使用できるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明の組成物は、癌の発見から進行期までのいかなる段階でもこれらの癌及び他の癌の治療に使用できる。更に、本発明の組成物は原発癌及びその転移の治療において使用できる。本発明の他の実施態様では、本明細書に記載の化合物は下記の表２に列記する癌をはじめとする癌の治療に使用できる。
【０１０１】
【表２】
2008542192.tif 000170
2008542192.tif 000171
2008542192.tif 000172
【０１０２】
骨髄腫
本発明の特定の実施態様では、本明細書に記載の化合物は骨髄腫の治療に使用できる。一実施態様では、ホノキオールが骨髄腫の治療に使用できる。本発明の他の一実施態様では、ホノキオール又は本明細書に記載の化合物又は組成物のいずれかを用いて、例えば多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症又はリンパ形質細胞性白血病、単クローン性形質細胞腫、単クローン性γグロブリン血症、くすぶり型骨髄腫、形質細胞腫瘍、ステージＩ多発性骨髄腫、ステージＩＩ多発性骨髄腫、及び／又は不応性の形質細胞腫瘍などの治療に使用できる。
【０１０３】
骨髄腫又は形質細胞腫瘍とは、血液（形質細胞と呼ばれる）の特定の細胞が癌になる疾患である。形質細胞はリンパ球と呼ばれている白血球により作られる。形質細胞は生体への感染源及び他の有害物質と戦う抗体を産生する。これらの細胞が癌になると、非常に多くの抗体、並びにＭ−タンパク質と呼ばれる、血液及び尿で検出される物質を産生する。数種類の形質細胞腫瘍が知られている。最も一般的なタイプは多発性骨髄腫と呼ばれている。多発性骨髄腫の場合、ガン形質細胞は骨髄に存在する。骨髄とは生体の大きな骨内部の海綿状組織である。骨髄は赤血球（酸素及び他の材料を生体の全ての組織へ輸送する）、白血球（感染と戦う）及び小板状体（血餅を作る）を産生する。癌細胞は通常の血液細胞を減少させ、貧血症（数赤血球減少）を引き起こす。形質細胞はまた、骨の破壊を引き起こしうる。プラズマ細胞は骨中で集合し、形質細胞腫と呼ばれる小さい腫瘍を形成する。形質細胞腫瘍はまた、骨及び軟組織の形質細胞（形質細胞腫）の腫瘍、骨髄又は血液中の非癌細胞としてのみ出現することもある。マクログロブリン血症は、Ｍ−タンパク質を作るリンパ球が血液中に蓄積するタイプの形質細胞腫瘍である。それによりリンパ節、肝臓及び脾臓が膨張する。
【０１０４】
多発性骨髄腫（ＭＭ）とは骨髄の単クローン性の形質細胞の激増を特徴とする悪性Ｂ細胞である。サリドマイド、レブリミド及びボルテゾミブなどの新薬、並びに大量療法の臨床有効性にもかかわらず、再発性及び不応性ＭＭ患者の場合は効果に持続性がなく、また治癒する患者はほとんどいない。従って、新規な治療ストラテジーが患者の症状の改善に必要である。
【０１０５】
本発明の１つの態様は、ＨＮＫが多発性骨髄腫に対して効果的であるという意外な発見に基づく。ＨＮＫは増殖を阻害することができ、カスパーゼ依存性の及び独立した経路の両方を介してＭＭ細胞のアポトーシスを誘導でき、従来の薬剤耐性を克服し、ＢＭ環境で血管新生を阻害し、及び／又はボルテゾミブのＭＭ細胞毒性を強化する。
【０１０６】
ＨＮＫは、再発性・不応性ＭＭ患者からのヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株及び腫瘍細胞に対する細胞毒性を著しく誘導する。骨髄間質細胞との共培養、又はサイトカイン（インターロイキン６及びインスリン様増殖因子１）との共培養を行っても、ＨＮＫで誘導される細胞毒性からは防護されない。カスパーゼ３、７、８及び９の活性化はＨＮＫにより活性化されるものの、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはＨＮＫで誘導されるアポトーシスを阻害しない。重要なことは、カスパーゼから独立したアポトーシスＡＩＦのミトコンドリアからの遊離が、ＨＮＫ治療により誘導されることである。ＨＮＫは、従来の薬剤及び新規な薬剤への耐性に関連したカスパーゼ−３及び−８を低濃度で有するＳＵ−ＤＨＬ４細胞株におけるアポトーシスを誘導する。いかなる理論にも束縛されないが、これらの結果は、ＨＮＫがカスパーゼ依存性の経路及び他の独立の経路の両方を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。更に、ＨＮＫは他の薬剤（例えばボルテゾミブ）により誘発されるＭＭ細胞毒性及びアポトーシスを強化できる。ＭＭ細胞に対するその直接の細胞毒性に加えて、ＨＮＫはまた内皮細胞付近での管形成を抑制し、それはＨＮＫが骨髄微細環境中で血管新生を阻害することを示唆する。このように、ＨＮＫ及びその誘導体はＭＭの患者の治療に使用できる。
【０１０７】
薬剤抵抗性癌
本発明の一態様は、ホノキオールがカスパーゼから独立した機構により癌細胞のアポトーシスを誘導できるという発見に基づく。低濃度の特定のカスパーゼ（例えばカスパーゼ−３及びカスパーゼ−８）を有する癌細胞株は抗癌剤耐性を伴いうる。薬剤耐性は癌における深刻な問題である。本発明は薬剤抵抗性癌の治療に使用できるホノキオール及びホノキオール誘導体を提供し、また本明細書に開示の癌及び薬の実施態様が含まれる。一実施態様では、ホノキオール又は誘導体は第２の薬剤と共に投与される。
【０１０８】
多種薬剤耐性（ＭＤＲ）はヒト癌で生じ、化学療法の成功に対する重要な障害でありうる。多種薬剤耐性は、１つの細胞毒性薬剤にさらされた腫瘍細胞が、構造的に及び機能的に無関係な化合物に関する、インヴィトロでの交差耐性を獲得する現象である。更にＭＤＲは、化学療法薬剤に本質的に過去に曝露されたことのない若干の癌でも起こりうる。すなわち、本発明は一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体の投与により、薬剤抵抗性の癌（例えば多種薬剤耐性癌）患者の治療方法を提供する。
【０１０９】
一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体が、従来技術において公知の、又は本明細書に記載の、大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓、肝臓及び／又は他の器官におけるいかなる薬剤抵抗性の癌の治療に使用できる。具体的態様では、ホノキオール又はその誘導体（本明細書に記載の誘導体が含まれる）は、薬剤抵抗性多発性骨髄腫の治療における有効量で投与できる。一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及び／又はレブリミドに抵抗性の多発性骨髄腫の治療において有効量で投与できる。
【０１１０】
血管新生関連の疾患
本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は血管新生関連の疾患の治療に使用できる。
【０１１１】
Ｆｏｌｋｍａｎ氏は、全ての増殖性の腫瘍が血管を伴い、また複数の動物モデルによる実験結果から、腫瘍増殖は血管新生依存的であることを明らかにした（オライリーその他（１９９４），Ｃｅｌｌ７９（３１５−３２８））。腫瘍血管新生の発見により、血管新生の腫瘍増殖因子（例えば塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））の発見をもたらした。更に、腫瘍細胞及び腫瘍から派生した炎症細胞は、前血管新生サイトカイン（例えばインターロイキン６、８及びコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ））を遊離させることができる（Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ、Ｒ．Ａ．ら，（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１４５６−１４６３、Ｌｕその他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、９２１５−９２１９、Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９９）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３（８３８−８４２））。高度な悪性腫瘍の発現は、腫瘍が、内因性の血管新生阻害因子（トロンボスポンジン、インターフェロン及びマトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害剤）と刺激因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＣＲＨ及びマトリックスメタロプロテイナーゼ）との均衡状態から血管新生の刺激による不均衡状態へ行こうすることによる、公知の血管新生のスイッチにより開始する。また優位なオンコジーンの活性化及び癌抑制遺伝子の損失も血管新生のスイッチを入れる役割を果たす（Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４（８６１−８６６）、Ｈａｎａｈａｎ（Ｄ．＆Ｆｏｌｋｍａｎ）Ｊ．（１９９６），Ｃｅｌｌ８６（３５３−３６４））。血管新生スイッチの解析により、癌の治療に役立ちうる２つのストラテジーの発見につながった。第１に、内皮の増殖因子及びそれらの受容体の特異的な相互作用をブロックする血管新生の直接の阻害剤は、動物モデル及びヒトにおいて有効性を示した（Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３４、４８６−４９７；Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９８）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（３７６−３８３））。直接の血管新生阻害剤といｓてはアンジオスタチン、エンドスタチン及びＶＥＧＦ阻害剤が挙げられる（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙその他（１９９７）Ｃｅｌｌ８８（２７７−２８５）、Ｗｅｎその他（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（６０５２−６０５６））。血管新生の間接的な阻害剤は腫瘍細胞が前血管新生の因子の産生を防止し、おそらく血管新生阻害剤の産生を増加させる。間接的な血管新生阻害剤の例としては、シグナル伝達アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ、ホスホイノシトール−３キナーゼのようなシグナル伝達経路の及び阻害剤、反応性酸素及び核因子κβ（ＮＦＫＢ）が挙げられる（Ａｒｂｉｓｅｒその他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，８６１−８６６、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅその他（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５、Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，１１０３、Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ���．ＵＳＡ９９，７１５−７２０、Ｈｕａｎｇ，Ｓ．ら，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６、２５７３−２５８１）。ホノキオール（小分子量化合物）は、両方の直接の血管新生を阻害する特性を有する。すなわち、ＶＥＧＦＲ２（異常な血管新生を媒介している主要な受容体）のリン酸化を阻害し、アポトーシスを誘発する腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬを介した直接の抗腫瘍活性によりアポトーシスが媒介される（Ｂａｉその他（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５５０１−３５５０７））。
【０１１２】
血管新生阻害剤は多種多様な機構により内皮の増殖及び血管新生を阻害する。インターフェロンα／β（最初に発見された天然の血管新生阻害剤）は、細胞周期の阻害剤ｐ２１（Ｂｒｏｕｔｙ−Ｂｏｙｅ、Ｄ．＆Ｚｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ｒ．（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８，５１６−５１８、Ｃｈｉｎ，Ｙ．Ｅ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２、７１９−７２２）の合成を活性化させる。アンジオスタチン及びエンドスタチンは内皮細胞面への結合を介して作用し、インテグリン介した内皮生存シグナルを妨害することによりアポトーシスを活性化させる（Ｒｅｈｎ，Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，１０２４−１０２９、Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ａ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ７，８１１−８２２）。トロンボスポンジン−１は内皮細胞（ＣＤ３６）に存在する細胞レセプタと結合し、内皮のアポトーシスをもたらす。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰｓ）の組織阻害剤はマトリックスメタロプロテイナーゼの酵素活性を、１／１化学量にて阻害（基底膜のへの侵入を防止）し、また最近では、血管新生を阻害する２４アミノ酸の断片がＴＩＭＰ２（フェルナンデス、その他（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７８（４０９８９−４０９９５））から単離した。従来発見されている血管新生阻害小分子にはサリドマイドがあり、それはＮＦＫＢ、２−メトキシエストラジオールを阻害することにより、部分的に作用する。それは微小管活性化及び低酸素誘導因子（ＨＩＦＩａ）の活性化、シクロ−オキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）阻害剤、及び従来の化学療法剤（シクロホスファミド、タキサン及びビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン））の低用量に影響する（Ｄ‘Ａｍａｒｔ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、３９６４−３９６８、Ｄ‘Ａｍａｒｔ、Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１、４０８２−４０８５）。更に、特定のチロシンキナーゼ阻害剤は、腫瘍及び間質細胞によりＶＥＧＦ及び他の前血管新生の因子の産生を減少させることにより、間接的に血管新生を減少させる。これらの薬剤には、ヘルセプチン、イマチニブ（グリベック）及びイレッサ（Ｂｅｒｇｅｒｓ、Ｇ．ら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１１，１２８７−１２９５、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．ら（２００１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，１４５９−１４６５、Ｐｌｕｍ、Ｓ．Ｍ．ら（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９、４６１９−４６２６）が含まれる。近年では、血管新生阻害剤は動物モデルからヒト患者へ移行した。血管新生阻害剤は様々な癌に対する有望な治療薬となりうる。
【０１１３】
近年では、アバスチン（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性抗体）が、高度な腎細胞癌の単剤として延命効果があり、また高度な大腸癌の化学療法との組み合わせで延命効果を発揮することが報告されている（Ｙａｎｇ、Ｊ．Ｃ．ら（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ３４９、４２７−４３４、Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ、Ｆ．ら（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１、６０−６５）。
【０１１４】
血管新生関連の疾患としては、限定されないが、炎症性、自己免疫性及び感染性疾患、血管新生依存性の癌（固形腫瘍、血液由来の腫瘍（例えば白血病）及び腫瘍転移など）、良性腫瘍（血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫など）、慢性関節リウマチ、乾癬、湿疹、眼性の血管新生性疾患（糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑部変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、水晶体後方線維増殖症、ルベオーシスなど）、Ｏｓｉｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群、心筋の血管新生、斑新血管新生、末梢血管拡張症、血友病者の関節症、血管線維腫、肉芽損傷が挙げられる。更に、本発明の組成物は、腸癒着、アテローム性動脈硬化、強皮症、疣及び肥厚性瘢痕（すなわちケロイド）などの疾患の治療に使用できる。本発明の組成物はまた、異常な結果として血管新生を有する疾患（例えば猫ひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（ヘリコプタ桿菌幽門）結核及びライ病）の治療にも使用できる。
【０１１５】
図５にて図示するように、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物は、ＳＶＲ細胞の激増の減少に効果的であることを示した。すなわち、形質転換ＳＶＲ内皮細胞の抑制を使用したバイオアッセイにより、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物がＳＶＲ抑制を強化することが示した。従来、形質転換ＳＶＲ内皮細胞のバイオアッセイを行い、正確に周知の血管新生阻害剤へのインビボ反応を予測した報告が存在する（Ａｒｂｉｓｅｒその他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：８６１−８６６、及びＡｒｂｉｓｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（４０：９５９−９２９）、本発明に援用される）。従って、Ｂａｉその他がＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｔｎ（２００３）；９月１２日，２７８（３７）：３５５０１−７（本明細書に援用される）で述たように、ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物は血管新生の阻害に使用できる。
【０１１６】
ウイルス感染
一実施態様では、本明細書に開示の化合物は例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウィルス感染の治療において、それ単独でも、また第２の抗ウイルス剤との組合せで有効量で宿主に投与できる。
【０１１７】
炎症性疾患
本発明の更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物は炎症性疾患の治療に使用できる。
【０１１８】
炎症性疾患の例としては、関節炎、喘息、皮膚炎、乾癬、嚢胞性線維症、遅く移植後及び慢性実質性器官拒否、多発性硬化症、全身紅はん性エリテマトーシス、炎症性腸疾患、胃腸疾患（例えば胃炎、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎）、クローン病、頭痛、喘息、気管支炎、結核、慢性胆嚢炎、橋本甲状腺炎、月経不順、腱炎、滑液嚢炎、鼻炎、局所貧血−再かん流損傷、ポスト血管新生術再狭窄、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、乾癬、糸球体腎炎、眼球突出性甲状腺腫、消化器アレルギー、多臓器肉芽腫性疾患、播種性血管内凝固、脈管炎症候群、アテローム性動脈硬化、冠状動脈疾患、アンギナ、小動脈疾患、結膜炎などが挙げられるが、これらに限定されない。更に、当業者に自明のように、炎症関連の症状が様々な症状（例えば血管疾患、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、鞏膜ドマ、リウマチ熱）、タイプＩ糖尿病、重症筋無力症、結直腸癌、多臓器肉芽腫性疾患、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏性、結膜炎、損傷後に生じる膨張、心筋虚血症、など）を伴うこともあり、本発明の化合物により治療できる。
【０１１９】
具体的な実施態様では、本明細書の化合物は関節炎又は関節炎条件の治療に使用できる。関節炎及び関節炎関連症状の例としては、慢性関節リウマチ（例えば軟組織リウマチ及び関節外リウマチ）、線維症、結合組織炎、筋肉リウマチ、筋筋膜痛症、上腕骨上顆炎、四十肩、ティーツェの症候群、筋肉疾患、腱炎、腱鞘炎、滑液嚢炎、急性痛風、慢性痛風及び全身性エリテマトーデスを伴う若年性慢性病患者、脊椎関節炎（強直性脊椎炎）、変形関節炎、高尿酸血症及び関節炎が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
骨関連の疾患
本発明の他の実施態様では、本明細書に開示の化合物は骨粗鬆症をはじめとする骨関連疾患の治療に使用できる。
【０１２１】
具体的な実施態様では、本発明の化合物が、骨粗鬆症又は関連症状の治療に使用できる。付加的な実施態様では、本明細書に開示の化合物は、骨腫瘍、頭蓋骨早期癒合症、ｅｎｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ、線維性骨異形成症、Ｋｌｉｐｐｅｌ−Ｆｅｉｌ症候群、硬化性腸骨炎、離断性骨軟骨炎（ＯＣＤ）、骨髄炎（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、骨壊死、骨粗鬆症、腎性骨異栄養症、孤立性（単発性）骨嚢腫及び／又は骨軟化症の治療に使用できる。
【０１２２】
複合治療
本発明の一実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、少なくとも１つの付加的な化学療法剤と組み合わせてもよい。付加的な薬剤は、本明細書に開示の化合物との組合せ又は交互使用において投与できる。該薬剤は、同じ組成物の一部を形成してもよく、又は同時若しくは異なる時間で別々の組成物として投与してもよい。
【０１２３】
具体的な一実施態様では、本発明の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤との組合せ及び／又は交互使用において投与できる。一実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、スベロイラアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）（例えばＢｕｔｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９９，１１７００−１１７０５，２００２を参照）であってもよい。他の実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はリンベースのＳＡＨＡ類似体（例えばアピシヂン）であってもよい（Ｍａｉ、Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４５、１７７８−１７８４（２００２）参照）。他の実施態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、限定されないが以下から選択でき。ナトリウム酪酸塩；（−）−デプデリン（例えばＫｗｏｎ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，３３５６，１９９８を参照）；Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ（例えばＳｕ，Ｇ，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６０，３１３７−３１４２，２０００を参照）；サーチノール（２−［（２−ヒドロキシナフタレン−１−イルメチレン）アミノ］−Ｎ−９１−フェネチル）ベンズアミド；及び／又はトリコスタチンＡ（例えばＹｏｓｈｉｄａ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１７，４２３−４３０，１９９５を参照）。
【０１２４】
一実施態様では、本明細書に開示の化合物は、それらの効果を強化するために血管新生阻害薬剤と組み合わせても良く、又は更に他の細胞毒性剤を伴わせて投与してもよい。他の実施態様では、固形腫瘍の治療に用いるときは、該化合物及び組成物は以下から選択される薬剤と共に投与してもよい。例えばＩＬ−１２、レチノイド、インターフェロン、アンジオスタチン、エンドスタチン、サリドマイド、トロンボスポンジン−１、トロンボスポンジン−２、カプトプリル、抗悪性腫瘍薬（例えばαインターフェロン）、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート及びプレドニゾン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトルトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びデキサメサゾン）、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタム、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンジオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリ硫酸塩、血小板第４因子、アンジオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧ及び放射線などが挙げられる。他の具体的態様では、本発明の化合物はトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）との組合せ又は交互使用において投与できる。更なる実施態様では、本明細書に開示の化合物及び組成物は、例えば以下の薬剤とのとの組合せ又は交互使用において投与してもよい。抗有糸分裂の効果を有する（例えば細胞骨格要素を標的とする）薬：（微小管調節物質（例えばタキサン薬（例えばタキソール、パクリタキセル、タキソテール、ドセタキセル）、ポドフィロトキシン又はビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン））、抗代謝剤薬：（例えば５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン、プリン類似体（例えばペントスタチン）メトトレキサート）、アルキル化剤又は窒素マスタード：（例えばニトロソ尿素、シクロホスファミド又はイフォスファミド）、ＤＮＡを標的とする薬剤：（例えばアントラサイクリン薬剤、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ファーモルビシン又はエピルビシン）、トポイソメラーゼを標的とする薬剤：（例えばエトポシド）、ホルモン類及びホルモンアゴニスト又はアンタゴニスト：（エストロゲン、抗エストロゲン（タモキシフェン及び関連化合物）及びアンドロゲン、フルタミド、ロイプロレリン、ゴセレリン、サイプロトロン又はオクトレオチド、抗体誘導体（例えばヘルセプチン）を含んでなる腫瘍細胞のシグナル伝達を標的とする薬、アルキル化薬：（例えば白金薬（シスプラチン、カーボンプラチン、オキサリプラチン、パラプラチン）又はニトロソ尿素）、腫瘍の転移に潜在的影響を及ぼす薬剤：（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤）、遺伝子治療及びアンチセンス用薬剤、抗体薬剤、他の海洋起源の生理活性化合物（特にジデムニン（例えばアプリジン））、ステロイド類似体（特にデキサメサゾン）、抗炎症薬（非ステロイド性薬剤（例えばアセトアミノフェン又はイブプロフェン）又はステロイド、並びに���れらの誘導体（特にデキサメサゾン））、抗嘔吐薬（５ＨＴ−３阻害剤（例えばグラミセトロン又はオンダセトロン）、並びにそれらの誘導体（特にデキサメサゾン））。更なる実施態様では、該化合物及び組成物は、下記の表３で開示する化学療法剤と組み合わせて、又は交互使用により使用してもよい。
【０１２５】
表３：化学療法剤
【表３】
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【０１２６】
特殊な実施態様では、本明細書に記載の化合物及び組成物は、多発性骨髄腫の治療に用いる治療薬との組み合わせで使用できる。一実施態様では、ホノキオールは、多発性骨髄腫の治療に用いる薬剤との組み合わせで使用できる。多発性骨髄腫の治療において使用する薬には、エリトロポエチン、ゲナセンス、パンゼム、ＰＩ−８８、レブリミド、サリドマイド、トリセノックス、ヴェルケード、ザーネストラ、ゾレドロン酸、ゾメタ、２ＭＥ２、アレディア、三酸化ヒ素、Ｂｃｌ−２アンチセンス、ビスフォスフォネート及びコロニー刺激因子が含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、多発性骨髄腫の治療用のボルテゾミブとの組み合わせで投与できる。
【０１２７】
一実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は、本明細書に記載のような、又は表３に記載の付加的な化学療法剤との組合せ又は交互使用において、薬剤抵抗性癌（例えば多剤耐性癌）の治療に使用できる。薬剤抵抗性の癌には、従来公知の、又は本明細書に記載の大腸、骨、腎臓、副腎、膵臓、肝臓における癌及び／又は他のいかなる癌も含まれうる。一実施態様では、付加的な化学療法剤はＰ糖蛋白質阻害剤であってもよい。特定の非限定的な実施態様では、Ｐ糖蛋白質阻害剤は以下の薬から選択できる：ベラパミル、サイクロスポリン（例えばサイクロスポリンＡ）、タモキシフェン、カルモジュリンアンタゴニスト、デキスベラパミル、デキスニグルジピン、バルスポダール（ＰＳＣ８３３）、ビリコダール（ＶＸ−７１０）、タリキダール（ＸＲ９５７６）、ゾスキダール（ＬＹ３３５９７９）ラニキダール（Ｒ１０１９３３）及び／又はＯＮＴ−０９３。他の実施態様では、ホノキオール又はその誘導体（本明細書に記載の誘導体を含む）はそれのみで投与してもよく、又は多発性骨髄腫の他の治療薬との組合せ又は交互使用により投与してもよい。具体的な実施態様では、ホノキオール又はその誘導体は薬剤抵抗性癌（薬剤抵抗性骨髄腫を含む）の治療用のボルテゾミブとの組み合わせで投与できる。
【０１２８】
患者集団のスクリーニング
更なる本発明の目的は、本明細書に記載のホノキオール及び／又は関連化合物の細胞毒性作用に対して特に感受性の腫瘍及び癌を確認する方法を提供する。本発明の一態様は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼで活性化されたプロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現する腫瘍が、特にホノキオール又はその誘導体の毒作用に感受性であるという発見に基づく。一実施態様では、該方法は哺乳類（特にヒト）の腫瘍の治療方法であって、以下の手順を含む方法を提供する。
（ｉ）腫瘍から生体試料を調製し、
（ｉｉ）該腫瘍がホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現するか否かを解析し、
（ｉｉｉ）ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）及び／又はアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を発現又は過剰発現する腫瘍を、本明細書に記載のホノキオール又は関連化合物で処理する。一実施態様では、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、例えばリン酸化形態を検出できる抗体を用いて腫瘍又は癌中におけるリン酸化されたＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの存在をアッセイすることにより解析できる。他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現のレベルは、患者から得られる腫瘍又は癌細胞をアッセイして、レベルをコントロール組織と比較することにより解析できる。一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫは、コントロールと比較して癌サンプル中では少なくとも２、２．５、３又は５倍過剰発現されうる。一実施態様では、生体試料は生検であってもよい。他の実施態様では、生体試料は腫瘍又は癌から得られる流体、細胞及び／又は吸引液であってもよい。一実施態様では、腫瘍又は癌をホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。他の実施態様では、腫瘍又は癌を核因子−κＢ（ＮＫＫＢ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。更なる実施態様では、腫瘍又は癌をアデノシン一リン酸キナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の発現又は過剰発現に関してアッセイしてもよい。
【０１２９】
生体試料は、当業者に公知のいかなる技術に従って調製してもよい。一実施態様では、生検により生物学的試料を得てもよい。生検とは、検査のために生体から組織又は細胞を採取する手順のことである。幾つかの生検は医師の診療室で実施できが、その他の場合は病院の施設においてなされる必要がある。更に、幾つかの生検では麻酔薬を使用して一定の部位を麻痺させる必要があるが、その他の場合はいかなる鎮静も必要ない。一実施態様では、内視鏡生検を実施してもよい。かかる生検は、自然の生体開口部（すなわち直腸）又は小さい切開（すなわち関節鏡検査法）を通じた光ファイバ内視鏡（観察用の端部に近焦点テレスコープを備える細長いチューブ）で実施される。内視鏡は、試験用の少量の組織を得る目的で、異常又は疑わしい領域における問題の器官を観察するために用いる。内視鏡法とは、器官又は生体領域を視覚化及び／又は治療するために名づけられた。医師は、消化管（消化管内視法）、膀胱（膀胱鏡検査法）、腹くう内（腹腔鏡検査法）、関節腔（関節鏡検査法）、胸部の中央部（縦隔鏡）又は気管及び気管支系（喉頭鏡検査法及び気管支鏡検査法）に内視鏡を挿入できる。
【０１３０】
他の実施態様では、骨髄生検を実施してもよい。かかる生検は、胸骨（胸骨）又は腸骨稜腰骨（背下部領域上の骨盤の両側の骨領域）から実施できる。皮膚を洗浄し、局所麻酔薬により領域を麻痺させる。長い堅い針を髄に挿入し、細胞を吸引し試験し供する。この操作はしばしば不快感を催す。コア生検（髄から小型骨『チップ』を取り出す）を吸引後に行ってもよい。
【０１３１】
更なる実施態様では、哺乳類における摘出又は切開生検を実施してもよい。皮膚のより広い若しくは深い部分が必要な場合、かかる生検法がしばしば用いられる。外科用メス（外科ナイフ）を使用した場合は、皮膚の完全な厚みは更なる検査のために取り出され、損傷は縫合される（外科的スレッドにより縫合される）。全ての腫瘍が取り出される場合は切採生検法と呼ばれる。一部の腫瘍のみが取り出される場合は切開生検法と呼ばれる。切採生検は通常好まれる方法であり、例えば黒色腫（皮膚癌のタイプ）が疑われる場合に行われる。
【０１３２】
なお更なる実施態様では、微細針穿刺吸引（ＦＮＡ）生検法を使用してもよい。かかる生検は、腫瘍から非常に小さい部分を取り除くために細い針を使用することが必要である。領域を麻痺させるために局所麻酔薬を時々用いるが、試験による多くの不快が生じず、また瘢痕を残さない。例えば、ＦＮＡは疑わしいホクロの診断には使用しないが、例えば、黒色腫の近くの大きいリンパ節を生検して黒色腫が転移（拡散）したか否かを観察するときには使用する。コンピュータ断層撮影（ＣＴ又はＸ線体軸断層写真）を用いて、内部臓器（例えば肺又は肝臓）の腫瘍に針を導くことができる。
【０１３３】
他の実施態様では、パンチシェーブ及び／又は皮膚生検を実施してもよい。パンチバイオプシは、組織の短いシリンダ又は「リンゴの芯」を取り除く生検器具により、皮膚のより深い位置のサンプルを伴う。局所麻酔薬を投与した後、器具を皮膚表面で回転させ、全ての層（真皮、表皮及び皮下組織（脂肪の）の最浅部を含む）を切除する。薄片生検は、シェービングにより皮膚の最上層の採取を伴う。シェービング生検は局所麻酔薬を伴って実施される。皮膚生検は、例えば黒色腫が存在するか否かを顕微鏡観察により検査するための、皮膚検体の採取が必要である。生検は局所麻酔下で実施される。
【０１３４】
特定の実施態様では、該方法は腫瘍がＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを発現又は過剰発現するかどうかを解析するために行う。一実施態様では、腫瘍生検をコントロール組織と比較してもよい。コントロール組織は、生検を得る哺乳類からの正常組織又は健康な哺乳類からの正常組織であってもよい。ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現又は過剰発現は、腫瘍生検内に含まれるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ量が、コントロール組織に含まれるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの量よりも最低約１．５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．５、６、７、８、９又は１０倍多く含まれるか否かで解析できる。
【０１３５】
一実施態様では、本発明は、患者又は前記患者からの生体試料における、異常なＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現を検出する方法を提供する。該方法は、細胞、細胞抽出物、血清又は他の患者若しくは前記生体試料からのサンプルと、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／若しくはＡＭＰＫ又はそれらの抗原性部分に特異的な免疫相互作用分子を接触させ、免疫相互作用分子の複合体形成レベルをスクリーニングする手順を含み、異常性を表す細胞における、正常細胞と比較して高レベルでの該複合体の存在が、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現又は過剰発現の指標となる。一実施態様では、細胞又は細胞抽出物は高いレベルでのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ含量を利用して免疫学的に選別できる。
【０１３６】
他の実施例では、細胞中でのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの異常な発現は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードする遺伝子の発現レベルのスクリーニングにより検出でき、正常細胞と比較して高いレベルでの遺伝子転写発現産物（すなわちｍＲＮＡ）レベルが異常な細胞であることの指標となる。ある種の実施態様では、他のＰＣＲ方法と同様にリアルタイムＰＣＲを用いて転写活性を解析できる。一実施態様では、ｍＲＮＡは患者の細胞から、又は患者からの生体試料、及び任意に得られるｃＤＮＡから調製できる。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡは更に、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードする核酸配列の全部若しくは一部、又はその相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズ及び／又は増幅できる遺伝子プローブと接触させ、更にｍＲＮＡ又はｃＤＮＡのレベルを検出し、それにより通常のコントロールと比較したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの高レベルでの存在を評価できる。
【０１３７】
本発明の更にもう１つの実施態様は、患者からの疑わしい癌細胞のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの相対的レベルを解析する定量的又は半定量的な診断キットにおける、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の使用に関し、そこにはアッセイを実施するのに必要な全ての試薬が含まれていてもよい。一実施態様では、ＥＬＩＳＡアッセイを実施するのに必要な試薬及び材料を利用しているキットを提供する。試薬には、例えば洗浄バッファー、抗体希釈バッファー、ブロッキングバッファー、細胞染色溶液、現像液、停止液、抗リン酸化タンパク質特異抗体、抗Ｐａｎタンパク質特異抗体、二次抗体及び蒸留水を含めてもよい。キットには使用説明書を含めてもよく、任意に自動化又は半自動化してもよく、又は自動化機械若しくはソフトウェアと互換性を持たせてもよい。
【０１３８】
診断検査法
免疫学的アッセイ
一実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞又はその哺乳動物からの生体試料における、異常なＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ発現を検出する方法を提供する。該方法は、細胞、細胞抽出物、血清又は他の哺乳動物細胞又はその哺乳動物からの生体試料からのサンプルと、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／若しくはＡＭＰＫ又はそれらの抗原性部分に特異的な免疫相互作用分子を接触させ、免疫相互作用分子−ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの複合体形成レベルをスクリーニングし、正常細胞と比較して高レベルでの該複合体が存在するか否かを解析する方法である。
【０１３９】
該免疫相互作用分子は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの特異性及び結合能を有する分子、又はその抗原性部分、そのホモログ若しくは誘導体であってもよい。一実施態様では、免疫相互作用分子は免疫グロブリン分子であってもよい。他の実施態様では、該免疫相互作用分子には抗体断片、単鎖抗体及び／又は非免疫化分子（ヒト化抗体及びＴ細胞関連抗原結合性分子（ＴＡＢＭｓ）が含まれる）であってもよい。ある具体的な実施態様では、抗体は単クローン抗体であってもよい。他の具体的な態様では、抗体はポリクローナル抗体であってもよい。免疫と相互作用する分子は、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの特異性又は特に抗原性決定要素又はＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ上の抗原決定基を表してもよい。ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ上の抗原決定要素又は抗原決定基には、免疫応答が標的とする分子の一部が含まれる。抗原決定要素又は抗原決定基は、Ｂ細胞抗原決定基又は必要に応じてＴ細胞抗原決定基であってもよい。
【０１４０】
本発明の一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫが存在する哺乳類の癌又は癌様の増殖の存在を診断するために提供する。該方法は、患者から細胞又は哺乳類又は生体試料からの細胞抽出物と、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫとの結合有効量を有するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する特異性又は抗原決定基を有する抗体又は抗原決定基とを接触させて、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ−複合体のレベルを量的又は質的に測定し、正常細胞と比較した前記複合体のレベルの上昇を解析する方法である。
【０１４１】
抗体は、当業者に公知の多くの手段のいずれかにより調製できる。例えば、ヒトＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出用抗体は通常、人間以外の動物（例えば霊長類、家畜動物（ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ）、実験動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ）及び／又はペット（イヌ、ネコなど））に由来してもよい。抗体は、原核生物又は真核生物宿主細胞において、リコンビナント的に産生させてもよい。通常、抗体に基づくアッセイは、細胞又は組織生検上でインビトロで行ってもよい。しかしながら、抗体が最適に脱免疫されるか、又はヒト使用においてヒト化される場合、例えば抗体を放射性タグでラベルし、患者に投与し、放射線技術により放射性ラベルの蓄積部位を解析してもよい。ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体は、癌を標的とする薬剤であってもよい。したがって、本発明の他の実施態様は、ヒト及び人間以外の患者の癌イメージング用の脱免疫形態の抗体を提供する。
【０１４２】
一般に、ＰＬＤに対する抗体、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの産生において、組換え手段でおこなう場合、ヒトなどの動物組織から、又は細胞培養から産生させる場合も。酵素を生体試料から除去する必要がある。ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫはいかなる適当手段で生体試料から分離してもよい。例えば、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの表面電荷特性、サイズ、密度、生物学的活性度及び他の物質（例えば結合又は相互作用させようとする他のタンパク質又は化学物質）との親和性などの１つ以上を利用して分離を行ってもよい。すなわち、例えば体液からのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの分離は、超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィ（陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ）、泳動（例：ポリアクリルアミドゲル泳動、分画電気泳動）、限外分離（例：ゲル濾過、限外濾過）及び親和性による分離（イムノアフィニティ分離など、例：磁気ビーズ分離（例えばＤｙｎａｂｅａｄ（商標））、免疫クロマトグラフィ、免疫沈降）などの１つ以上の方法により実施できる。体液からのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの分離は、タンパク質に存在する抗原決定基の立体配座を維持する、すなわちタンパク質の変性が生じない技術が好適である。更なる実施態様では、該タンパク質は、親和性分離、ゲル濾過及び／又は限外濾過などの１つ以上の任意の方法を使用して体液から分離できる。
【０１４３】
免疫及びそれに続く単クローン抗体の産生は従来技術で公知の標準的プロトコルを使用して実施できる（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９，１９７５、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（７）：５１１−５１９，１９７６）、Ｃｏｌｉｇａｎら（”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１−１９９７）又はＴｏｙａｍａら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎｕａｌ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｋｏｄａｎｓｈａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１９８７）。基本的に、動物をＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを含む体液若しくはそのフラクション、又は組換えＰＬＤにより免疫し、ＮＦＫＢ及び／又は抗体を産生する標準的方法によりＡＭＰＫ細胞（特に抗体産生性体細胞（例：Ｂリンパ球））を得る。更にこれらの細胞は免疫した動物から摘出し、不死化させる。特定の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの断片を使用して抗体を産生させる。断片を担体と結合させてもよい。担体とは、通常は免疫源性がないか又は十分でない物質（例：ハプテン）の免疫原性を強化するために天然に又は人工的に結合させるいかなる高分子量物質であってもよい。
【０１４４】
抗体産生細胞の不死化は、従来技術において周知の方法を使用して実施できる。例えば、不死化はＥＢウィルス（ＥＢＶ）による形質転換を使用して実施できる（Ｋｏｚｂｏｒその他、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１２１：１４０，１９８６）。他の実施態様では、抗体産生細胞は細胞融合法（Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９１−１９９７、上記）などの記載されている方法により不死化でき、単クローン抗体の産生に広く使用される。この方法では、抗体産生能を有する体性抗体産生細胞（特にＢ細胞）を骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、初回抗原刺激を受けた動物、好ましくはマウス及びラットのような齧歯目の動物のリンパ節、脾臓及び末しょう血液から調製できる。具体的な実施態様では、マウスひ細胞が使用できる。他の実施態様では、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ細胞を用いてもよい。特殊な骨髄腫細胞株は、ハイブリドーマ産生のための融合方法用にリンパ球性腫瘍から開発された（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，上記、Ｓｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７６：２６９−２７０，１９７８；ＶｏＩｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４２（１）：２２０−２２７，１９８２）。多くの骨髄腫細胞株が融合細胞ハイブリッドの産生のために使われることもできる（例えばＰ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ８、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−ＡＧ８．６５３、Ｐ３／ＮＳ１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）Ｓｐ２／０−Ａｇ１４及びＳ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１．）。Ｐ３×６３−Ａｇ８及びＮＳ−１細胞株はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６、上記）に記載されている。シャルマンその他（１９７８、上記）はＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫株を開発した。Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．Ｂｕ．１株は、トローブリッジにより報告された（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８（１）：３１３−３２３，１９７８）。抗体を産生する脾臓若しくはリンパ節細胞及び骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法は通常、体細胞に骨髄腫細胞を、細胞膜の融合を促進する薬剤又は薬剤（化学物質、ウィルス又は電気）の存在下でそれぞれ１０：１の割合（但し割合を２０：１〜１：１まで変化できる）で混合することを含む。融合方法は公知である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，上記、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６，上記、Ｇｅｆｔｅｒら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−２３６，１９７７、ＶｏＩｋら、１９８２，上記）。当業者が従来使用している融合促進剤は、センダイウイルス及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一実施態様では、融合細胞ハイブリッドを、残留している非融合細胞（特に非融合骨髄腫細胞）から選抜する手段が存在する。通常、融合細胞ハイブリッドの選択は、そのハイブリドーマの増殖を支持し、一方非融合骨髄腫細胞（通常無期限に分裂する）の増殖を防止する培地で細胞を培養することによりなされる。融合に使用する体細胞は、インビトロ培養で長期間生存できず、ゆえに問題が生じない。融合細胞ハイブリッドを選択的に数週間培養することが必要である。この期間の初期に、所望の抗体を生産するハイブリッドを確認する必要があり、更にそれらをクローニング、増殖に供する。通常、得ら��たハイブリッドの約１０％は所望の抗体を生産するが、約１〜約３０％までの範囲で変動しうる。抗体生成ハイブリッドの検出は、酵素結合免疫学的アッセイ及びラジオイムノアッセイ法などの幾つかの標準的アッセイ方法のいずれか１つにより実施できる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，ｐｐ３７６−３８４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）及びＦＡＣＳ解析（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５：８２４−８３０，１９９８）。
【０１４５】
一旦所望の融合細胞ハイブリッドが選抜されて、個々の抗体産生細胞株としてクローニングした後、各細胞株を２つの標準方法のいずれでも増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性を有する動物に注入してもよい。注入された動物では更に、融合細胞ハイブリッドにより作られる特異的な単クローン抗体を分泌する腫瘍が形成される。動物の体液（例えば血清又は腹水液）を採取し、高濃度の単クローン抗体を得ることができる。あるいは、個々の細胞株を実験室の培養容器でインビトロで増殖させてもよい。単一の特異的な単クローン抗体を高濃度で含んでなる培地を、デカンテーション、濾過又は遠心沈降により回収でき、その後精製してもよい。
【０１４６】
細胞株を更に、任意の適切な免疫検出手段により、目的のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出する特異性に関して試験してもよい。例えば、細胞株を多くのウェルに等分し、インキュベートし、更に各々の上澄みは酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、間接蛍光抗体法等により詳細に解析してもよい。標的タンパク質を認識できる（目的外の抗原決定基を確認しない）単クローン抗体を産生する細胞株を単離し、更にインビトロで直接培養又は組織適合性を有する動物に注入して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生させ、回収及び精製する。
【０１４７】
したがって本発明は、サンプルにおいてＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ又はその断片、変異体又は誘導体を検出する方法を提供する。該方法は、サンプルをその抗体又は断片又は誘導体と接触させ、抗体とＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ又はその断片、変異体又は誘導体を含んでなる複合体のレベルを解析し、通常のコントロールと比較して高いレベルのＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出することからなる。複合体の形成を測定するいかなる適切な技術を使用してもよい。例えば、本発明の抗体レポーター分子と結合させ、免疫学的アッセイに使用できる。かかる免疫学的アッセイにはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、免疫クロマトグラフィ技術（ＩＣＴｓ）などが含まれるが、これらに限定されない。免疫学的アッセイ技術の当業者に公知であるウエスタンブロッティングには競合アッセイが含まれうる。本発明には定性的及び定量的免疫学的アッセイが含まれる。
【０１４８】
適切な免疫学的アッセイ方法は例えば米国特許第４０１６０４３号、４４２４２７９号及び４０１８６５３号に記載されている。これらには、従来の競合結合アッセイ以外にも、非競争的タイプの１サイト及び２サイトアッセイが含まれる。これらのアッセイにはまた、標的抗原に対する、ラベルした抗原結合性分子の直接の結合方式が含まれる。
【０１４９】
本発明は更に、動物（例えば癌が疑われるヒト癌患者など）から得られる細胞又は組織サンプルにおけるＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現及び活性化レベルを定量化する方法を提供する。一実施態様では、本発明は、結像システムを使用してＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現又は活性化レベルを量的に定量化する方法を提供する。かかる結像システムを使用して、細胞又は組織サンプル（ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質特異的に染色された）の画像を受光し、画質を向上させ、処理し、かかる動物由来の細胞又は組織サンプルにおいて発現するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質の量又は活性化濃度を測定することができる。本発明の方法の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現の較正曲線を、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質の異なる量を発現している少なくとも２つの細胞株用に作成してもよい。較正曲線を用いて、細胞又は組織サンプルで発現するＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質量を量的に測定できる。活性化状態特異的な試薬を使用した同様の較正曲線を、活性ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質用に作成してもよい。癌治療臨床法の前後における、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの量及び活性化状態の変化の測定に用いてもよい。
【０１５０】
本発明の方法の１つの具体的態様では、細胞又は組織サンプル中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質発現は、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用したＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫタンパク質量の測定により定量化できる。かかる方法は、例えば、米国特許集ｔ癌公開第２００２／００１５９７４号に記載されている。
【０１５１】
他の実施態様では、エンザイムイムノアッセイは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出に使用できる。かかるアッセイでは通常、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸により酵素を第二抗体とコンジュゲートする。特異的な酵素により使用される基質は通常、その酵素による加水分解による検出可能な色変化に応じて選択される。蛍光原基質を使用してもよく、それは化学発色基質よりも多くの蛍光生成物を与える。酵素標識抗体を第１の抗原抗体複合体に添加し、結合させ、更に過剰な試薬を洗浄除去してもよい。更に適当な基質を含んでなる溶液を抗体−抗原−抗体複合体に添加してもよい。基質を第二抗体（定性的な視覚的シグナル（更に数量化できる）を提供する）に結合した酵素と反応させ、通常分光光度計で定量化し、サンプルに存在する抗原量に関する指標を与える。あるいは、抗体の結合能力を変えない程度に、蛍光化合物（例えばフルオレセイン、ローダミン及びランタニド（ユーロピウム：ＥＵ））と化学的に結合させてもよい。特定波長の光で照射して活性化すると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、その分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色の光が放射される。蛍光ラベルされた抗体は第１の抗体−抗原複合体と結合する。未結合の試薬を洗浄除去した後、残留している三分子の複合体を更に適当な波長の光で曝露させる。観察される蛍光は目的の抗原の存在を示す。免疫蛍光定量的アッセイ（ＩＦＭＡ）は、従来技術において確立されており、特に本発明の方法に有用である。あるいは、他の化学発光、放射性同位元素などのレポーター分子、又は生物学的発光分子を使用してもよい。
【０１５２】
具体的な実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫに対する抗体を用いて、特に血清中又は他の循環性の体液中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをＥＬＩＳＡにより検出できる。これは、担体に抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体を固定して、血清、血液、リンパ又は他の身体由来の液体（細胞抽出物又は細胞生検）のような生物学的抽出物と接触させることにより実施できる。ラベルされた抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体は更に、固定されたＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出にも使用できる。このアッセイはいかなる組み合わせにも変形でき、全てのバリエーションは本発明に含まれ、また当業者に公知である。この方法はＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫレベルの、例えば血清ベースでの迅速な検出及び定量化アッセイを可能にする。
【０１５３】
一実施態様では、本発明ではＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫＥＬＩＳＡアッセイキットが使用できる。該ＥＬＩＳＡアッセイキットは、抗ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ抗体、並びに付加的な以下の試薬（洗浄バッファー、抗体希釈剤バッファー、ブロッキングバッファー、細胞染色溶液、現像液、停止液、二次抗体及び蒸留水など）を含んでなる。
【０１５４】
ヌクレオチド検出
他の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫを検出する方法であって、細胞中のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の任意の適切な方法を使用して解析できる。一実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするラベルされたポリヌクレオチドを、細胞から得られるリボゾームＲＮＡ抽出物のノーザンブロットのプローブとして利用できる。
【０１５５】
他の実施態様では、核酸増幅反応（例えばＲＴ−ＰＣＲ）において、動物からの核酸抽出物を、キナーゼをコードするポリヌクレオチド又はその隣接配列のセンス及びアンチセンス配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーと共同して利用できる。例えば、様々な自動化固相検出技術を利用してもよい（Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７７，１９９１）、Ｋａｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２：７５３−７５９，１９９６）。
【０１５６】
他の実施態様では、ＲＮＡ転写物をコードするＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの検出方法を提供する。ＲＮＡは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫのＲＮＡが含まれると疑われる細胞サンプルから単離でき、例えば全ＲＮＡをヒト癌組織から単離する。リボゾームＲＮＡは、公知技術の方法（例：ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド）を使用）により単離できる。オリゴｄＴ又はランダム配列オリゴヌクレオチド（配列特異的オリゴヌクレオチド）は単離されたＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を調製する逆転写酵素反応のプライマーとして使用できる。得られる第１の鎖ｃＤＮＡを更に、ＰＣＲ反応において配列特異的オリゴヌクレオチドにより増幅し、増幅産物を得る。
【０１５７】
ポリメラーゼ鎖連鎖反応又は「ＰＣＲ」とは、予め選択された核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ断片の一定量を、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載したように増幅できる方法である。通常、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するため、目的の領域の両端部、又はそれ以上を含む配列情報が使用される。これらのプライマーは、増幅される鋳型鎖若しくはその逆の鎖と、配列が同一若しくは同様である。ＰＣＲは、全ＲＮＡから転写される特異的なＲＮＡ配列及びｃＤＮＡを増幅するために使用できる。一般的方法は、Ｍｕｌｌｉｓら（Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄｓ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）の方法を参照。このように、ＰＣＲによる特異的な核酸配列の増幅は、保存された核酸配列を有するオリゴヌクレオチド又は「プライマー」に依存する。このとき、保存配列は関連遺伝子又はタンパク質の配列から推定される（例えば哺乳類のＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ遺伝子の配列比較）。例えば、アンチセンス鎖とアニーリングすると予測される１つのプライマーを調製し、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫをコードするｃＤＮＡ分子のセンス鎖にアニーリングすると予測される他のプライマーを調製する。増幅生成物を検出するため、反応混合物を通常アガロースゲル泳動又は他の便利な分離技術に供し、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ特異的なＤＮＡ増幅物を検出する。例えば、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの増幅ＤＮＡを、特異的なオリゴヌクレオチドプローブによるサザンブロット法を使用して検出してもよく、又はその電気泳動移動度を周知の分子量のＤＮＡ標準と比較して検出してもよい。ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの増幅ＤＮＡの単離、精製及び同定は、ゲルから断片を切り出すか又は溶出させ（例えばＬａｗｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２：６１０３，１９８１、Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７−１９８０）、適切なベクター（例えばｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））中のクローニング部位へ増幅生成物をクローニングし、クローニングした挿入物の塩基配列を決定し、そのＤＮＡ塩基配列をＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの周知の配列と比較することにより行う。更にＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの相対量を解析してもよい。
【０１５８】
一実施態様では、リアルタイムＰＣＲを用い、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫヌクレオチドの転写レベルを解析できる。転写活性の決定には、利用できるｍＲＮＡ転写物に基づいたポテンシャル翻訳活性の測定が含まれる。他のＰＣＲ方法と同様に、リアルタイムＰＣＲはＰＣＲ生成物の検出のために、ＤＮＡ結合フルオロフォア、５’エンドヌクレアーゼ、隣接する直鎖及びヘアピンオリゴプローブ、及び自動蛍光を発している単位複製配列などの多くの化学物質が含まれる。これらの化学物質及びリアルタイムＰＣＲ一般については、マッカイその他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ３０（６），１２９２−１３０５，２００２、ウォーカー、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １５（３）：１２１−１２７，２００１、ルイスその他、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９５：６６−７１，２００１に記載されている。
【０１５９】
代替の実施態様では、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの発現を、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫ配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブと生体試料から単離したヌクレオチド配列とを接触させることにより確認できる。生体試料に対するプローブのハイブリダイゼーションは、いかなる検出可能な薬剤を使用してプローブにラベルを付与することにより検出できる。プローブには例えば、放射性同位元素ラベル、ビオチン、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素、ハプテン又は抗体が利用できるタンパク質を結合させてもよい。検出可能なラベルは任意の手段でアッセイしてもよく、例えば分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、放射性同位体又は化学的な手段が挙げられる。プローブはオリゴマー制限技術、ドットブロットアッセイ、逆ドットブロットアッセイ、ラインプローブアッセイ及び５’ヌクレアーゼアッセイなどの技術を用いて検出してもよい。あるいは、プローブは一般に適用できるＤＮＡ配列技術のいずれかを使用して検出してもよく、例えばマクロアレイ、マイクロアレイ及びＤＮＡマイクロチップ技術が挙げられる。オリゴヌクレオチドプローブは通常は少なくとも約１４、１５、１６、１８、２０、２５又は２８ヌクレオチド長であり、ヌクレオチドにハイブリダイズする。通常、約２５又は２８のヌクレオチド長より大きいプローブの使用は好適でない。オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＬＤ、ＮＦＫＢ及び／又はＡＭＰＫの核酸配列を認識するように設計される。
【０１６０】
作用様式
本発明の特定の実施態様では、本明細書に開示の疾患及び／又は障害のいずれかの治療方法であって、本明細書に開示の化合物を投与することにより標的の生物学的経路を調節し、その経路の障害の治療にする方法を提供する。本発明は、ホノキオール及び／又はその誘導体が細胞に以下の影響を及ぼすという発見に基づく。ＶＥＧＦＲ２のリン酸化の阻害、ＴＲＡＩＬが媒介するアポトーシスの刺激、ＡＭＰＫ活性化の刺激、ホスホリパーゼＤ活性の抑制及び／又はＮＦＫＢ活性化の抑制。すなわち、本発明の特定の実施態様では、ホノキオール又はその誘導体の投与により、ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害、ＴＲＡＩＬで媒介されるアポトーシスの刺激、ＡＭＰＫ活性化の刺激、ホスホリパーゼＤ活性の阻害及び／又はＮＦＫＢ活性化の阻害を行い、本明細書に開示の疾患及び／又は障害を治療する方法を提供する。
【０１６１】
更なる実施態様では、本発明は、患者にホノキオール又はその誘導体を投与することにより、細胞中のカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８濃度が低い癌を治療する方法を提供する。なお更なる実施態様では、本発明は薬剤耐性の癌を有する個人の治療方法を提供し、該方法は、
（ｉ）患者から癌細胞の塊を調製し、
（ｉｉ）癌細胞のカスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の濃度を測定し、
（ｉｉｉ）カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の濃度が低いか否かを解析し、
（ｉｖ）カスパーゼ−３及び／又はカスパーゼ−８の低濃度を確認した場合、患者にホノキオール又はその誘導体を投与することを含んでなる。
【０１６２】
ＩＩＩ．生物学的アッセイ
生物学的活性化合物及び組成物は、インヴビトロ又はインビボバイオアッセイにおいてスクリーニングできる。かかるアッセイの例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖アッセイ、ＶＥＧＦ受容体機能（例えばＶＥＧＦ受容体−２リン酸化）の抑制評価、ＭＡＰキナーゼキナーゼアッセイ、アポトーシスアッセイ（ＴＲＡＩＬの媒介によるアポトーシスのアッセイなど）、代表的なヒト腫瘍（例えば初期ヒト検体及び細胞株）を使用た細胞生存率アッセイ、ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）アッセイ、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）アッセイ、ＮＦＫＢアッセイ及び動物（例えば免疫不全マウス）の異種移植に対するインビボアッセイ。
【０１６３】
公知技術の細胞増殖アッセイが競争アッセイとして使用できる。このアッセイは、血管新生を阻害する及び／又は抗腫瘍薬剤として役立つ候補化合物の直接的な方法として使用できる。一実施態様では、例えば約１０μＭのＩＣ５０以下の化合物を更なる試験に選択できる。この最初のアッセイで活性を有する細胞は更に、主要なヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、繊維芽細胞の増殖よりも内皮細胞の増殖を優先して阻害する能力を試験に供することができる。
【０１６４】
ＶＥＧＦ受容体リン酸化抑制アッセイは、ヒト真皮微小血管内皮細胞を使用してできる。これらの細胞は、一定時間（例えば１時間）、試験化合物の有無において、組換えヒトＶＥＧＦ（例えば１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激してもよい。タンパク質を更に抗ホスホチロシン抗体で回収し、免疫沈降させることができる。ウエスタンブロット分析により、更に受容体リン酸化を確認できる。
【０１６５】
アポトーシスアッセイは当業者に公知である。本発明の化合物は、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子アポトーシス誘発リガンド）アポトーシスアッセイにおいてそれらの活性を試験できる。このアッセイは、化合物がＴＲＡＩＬによるアポトーシスを誘発できるか否かの解析に用いることができる。この方法は、ＴＲＡＩＬ中和抗体を用いて、に潜在的に化合物の効果（腫瘍壊死因子関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が媒介するアポトーシス）をブロックさせるものである。
【０１６６】
ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌは、多くの腫瘍株のアポトーシスを誘導するが、その一方で正常細胞には毒性を呈しないペプチドである（Ｒａｖｉ，Ｒ．＆Ｂｅｄｉ，Ａ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，４１８０−４１８５）。ＴＲＡＩＬは、２つのシグナル伝達受容体、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４及びＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５を有する（Ｒａｖｉ，Ｒ．＆Ｂｅｄｉ，Ａ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，４１８０−４１８５、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｐ．ら、（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１６，３２９−３３４、Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，２４１−２４３）。悪性細胞で観察される１つのポテンシャルメカニズムは、良性の相対物と比較したこれらのＴＲＡＩＬ受容体の高い発現である（Ｇｈｏｓｈら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ）。ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬ受容体の活性化及び三量体形成を通じて膜受容体で誘導されるアポトーシスによるカスパーゼ８の活性化、並びにＡｐａｆ−１／カスパーゼ９／シトクロームｃによるミトコンドリアが媒介するアポトーシスの活性化を伴い、それによりアポトーシスを生じさせることが示されている。（Ｂｏｄｍｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら、（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，２４１−２４３、Ｌｉ，Ｊ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７１，１５２６−１５３３）。これらの２つの経路の連関を伴うポテンシャルメカニズムは、カスパーゼ８が媒介するプロアポトーシスタンパク質Ｂｉｄ（更にミトコンドリア内に移行し、ミトコンドリアベースのアポトーシスをもたらす）の裂開／活性化により生じる。ＴＲＡＩＬペプチド自体は症状発現前のモデルにおいて抗腫瘍活性を有することが示されており、またＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬシグナル伝達を刺激する化合物と、従来の化学療法剤との組合せによる相乗効果が観察されている（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ、Ｃ．Ｓ．ら（２００１）Ｂｌｏｏｄ９８、７９５−８０４）。
【０１６７】
本発明の化合物は、アデノシン一リン酸キナーゼ（ＡＭＰＫ）アッセイにおいてそれらの活性を試験できる。このアッセイは、該化合物がＡＭＰＫ活性化を誘導又は阻害できるか否かを決定するために使用できる。公知技術のいかなるリン酸化アッセイも、ＡＭＰＫの活性化の検出に使用できる。更に、ウエスタンブロッティングによりＡＭＰＫ活性化の刺激を試験できる。
【０１６８】
ＡＭＰ経路はＡＴＰに対するＡＭＰの高い比率により活性化され、低いエネルギー状態を示す。栄養の剥奪に加えて、ＡＭＰキナーゼは低酸素状態及びホノキオールにより活性化し、増殖停止及びアポトーシスをもたらす。近年、ＡＭＰキナーゼ活性化が腫瘍細胞の強力な抗増殖効果を発揮することが示されている。ＡＭＰＫは、ａｋｔ（腫瘍増殖及びアポトーシスに関するホスホイノシトール−３キナーゼの主要な下流側エフェクタであるセリントレオニンキナーゼ）に対する生理学的アンタゴニストであることが示されている。更に、ＡＭＰＫはａｋｔによりチュベリン（ｔｓｃ２）の失活をアンタゴナイズすることが示され、すなわち抗腫瘍活性に関する更なる機構を提供した。この活性の結果、ＡＭＰＫ活性化が哺乳類におけるラパマイシン（ｍＴＯＲ）の標的の負の制御をもたらし、腫瘍細胞におけるタンパク質合成減少をもたらしうる。ＡＭＰＫの上流はＬＫＢ（ＡＭＰキナーゼキナーゼ）であり、それは腫瘍を起こしやすいＰｅｕｔｚ  Ｊｅｇｈｅｒｓ症候群において変異を有する。最近のインビボ試験では、アミノイミダゾールカルボキサミドリボシド（ＡＩＣＡＲ）の腹腔内注射によりラットのＣ６膠腫増加の顕著な抑制をもたらしている。この抑制は、癌抑制遺伝子ｐ５３、ｐ２１及びｐ２７の上方制御を部分的に伴うものであった。更に、ＡＩＣＡＲはＰＩ３Ｋ／ａｋｔシグナル伝達の活性化を阻害した。プリンストンのアーノルドレビンの研究室では、ｐ５３は、化学療法のような細胞ストレスにより活性化したとき、ｓｅｒ１５にてリン酸化を受け、ＡＭＰＫの正の制御、及びそれに続くｍＴＯＲの負の制御を行う。ＡＭＰＫの薬理学的な抑制により、化学療法に対する細胞の感度が減少する（Ｆｅｎｇ，Ｚ．Ｈら、（２００５）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０２，８２０４−８２０９）。すなわちＡＭＰＫの活性化は、ｐ５３に依存性の、及び独立した経路による腫瘍の治療に有益でありうる。
【０１６９】
本発明の化合物はまた、ホスホリパーゼＤ活性（ＰＬＤ）に対する影響を試験して化合物がＰＬＤを誘導するか又は阻害するかを解析できる。ＰＬＤを高発現するとして公知の細胞は、ＰＬＤ活性のアッセイに使用できる。細胞は化合物により一定期間処理でき、更に脂質を細胞から抽出し、ＰＬＤ活性に対する効果を確認できる。ＰＬＤ（例えばｍＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ及び／又はＳ６）の下流の標的に対する化合物の効果を試験してもよい。
【０１７０】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、ホスファチジルコリンをホスファチド酸及びコリンに切断するリパーゼである。
【０１７１】
ホスファチジン酸は他の生理活性を有する脂質（ホスファチジン酸など）に変換され、それはプロテインキナーゼＤを活性化させ、一方でリゾホスファチジン酸自体がプロテインキナーゼＣのアイソフォームを活性化できる。これらの活性の全ての結果は細胞増殖の増加及びアポトーシスの減少であり、ａｋｔで観察されたのと同様である。研究された実質的に全てのチロシンキナーゼ受容体は、適当なリガンドへの曝露によりＰＬＤ活性化を刺激できる。ＰＬＤはこのように、ａｋｔとは交差しないが、平行的にシグナル伝達経路として機能する。ヒトの２つの主なＰＬＤ遺伝子は単離されている（ＰＬＤ１及びＰＬＤ２）。これらの遺伝子の両方ともプレックストリン相同領域（ＰＨ）を有し、それはホスファチジルイノシトール（Ｐｔｄｌｎｓ）ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ２のリン酸エステルのペアと結合する。ＰＬＤ１は小さいＧＴＰ結合蛋白質（Ｒｈｏ、ｒａｃ、ｃｄｃ４２）により活性化し、一方でＰＬＤ２がＰｔｄＩｎｓ４−Ｐ−５キナーゼＩａと結合し、細胞形態の変化及び腫瘍化に密接に関わることが示されている（Ｊｏｓｅｐｈ，Ｔら、（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８９，１０１９−１０２４、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，６７２−６７９）。
【０１７２】
周知のキナーゼの活性化に加えて、ＰＬＤ活性化は、腫瘍形成のｃ−ｍｙｃタンパク質を安定させることが示されている。興味深いことに、乳癌では、ＰＬＤ活性化及びａｋｔ活性化は逆の関係であることが示唆される。ａｋｔレベルが上昇した乳癌細胞は、ラパマイシンに最も感受性であることが示唆され、一方で、ＰＬＤ乳癌細胞（未分化）はラパマイシン非感受性であることが示唆される。これは、ｍＴＯＲに対するラパマイシン及びホスファチジン酸の競争的結合に起因すると考えられる。ホノキオールによるＰＬＤの抑制によるホスファチジン酸の産生減少は、腫瘍細胞のラパマイシンに対する感受性を増加させると考えられる（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，６７２−６７９、Ｒｏｄｒｉｋ，Ｖら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，７９１７−７９２５、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈら、（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２，３９３７−３９４２）。
【０１７３】
本発明の化合物は、該化合物がＮＦＫＢを誘導する場合も、又は阻害する場合も、核因子κβ（ＮＦＫＢ）に対するそれらの効果を試験できる。ＮＦＫＢ活性のアッセイに、公知技術のいかなるアッセイ方法も使用できる。
【０１７４】
核因子κβ（ＮＦＫＢ）は、多数の腫瘍の生存に不可欠である転写制御因子のファミリーである。構成的なＮＦＫＢの過剰発現は、多発性骨髄腫、実質的に全ての種類の白血病、黒色腫、神経グリア芽細胞腫、上皮の悪性腫瘍及び肉腫において観察されている。ＮＦＫＢは、多くのアポトーシス防止方法において重要であり、固有の及び外部のアポトーシス経路に影響を与えうる。ＮＦＫＢ抑制は、リガンド（例えばＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ及びＴＮＦａ）によるアポトーシスと同様に、化学療法においても腫瘍細胞の感受性を高める（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８（７９５−８０４）、Ｂｅｒｎａｒｄら、（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６（２７３２２−２７３２８））。多発性骨髄腫のためのプロテアソーム阻害剤（例えばヴェルケード）を用いることにより、ヒトにおけるＮＦＫＢの抑制が臨床的になされている。サリドマイド及びプレドニゾンなどの骨髄腫に対する他の薬剤はまたＮＦＫＢ活性を抑制し、おそらく多発性骨髄腫に対する臨床活性の原因と考えられる。
【０１７５】
ＮＦＫＢは多くのレベルで制御される。ｐ５０及びｐ６５を含む幾つかのファミリーが、最も一般的に観察されるメンバーとして存在する。これらのタンパク質はホモ又はヘテロ二量体化する能力を有し、またこれらの二量体は転写を媒介する。更に、ＮＦＫＢの核移行は活性化のために必要である。ＮＦＫＢの細胞局在はＩＫＸ（ＮＦＫＢと結合する）により制御され、核移行を防止し、更にユビキチン結合及びプロテアソームが媒介する分解を生じさせる。ＮＦＫＢ活性は、ｐ３００との相互作用により調節されうる（Ａｒａｎｙ，Ｚ．ら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３，１２９６９−１２９７３、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，２９２７−２９３２、Ｒａｖｉ，Ｒ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８，４５３１−４５３６）。
【０１７６】
代表的なヒト腫瘍（例えば多発性骨髄腫）に対する活性を試験するアッセイは、初期ヒト検体及び細胞株を使用して行ってもよい。かかるサンプル及び細胞株は特定の化学療法剤に抵抗性であることもあり、例えばドキソルビシンに抵抗性である骨髄腫細胞が使用できる。
【０１７７】
癌増殖のインビボモデルには、動物（例えばマウス、特に免疫不全マウス）へのヒト腫瘍細胞の注入による異種移植が含まれる。化合物の毒性はまた、動物の日々のモニタリングを行いつつ、動物に毎日化合物を投与するこれらのアッセイにおいても評価できる。動物を２週が重量の減少、並びに他の公知の毒性（例えば異常な身繕い、マウスの運動の減少及び震え）をモニターしてもよい。化合物の、動物における腫瘍増殖阻害能を試験してもよい。例えば、ＳＶＲ血管肉腫細胞を動物（例えば免疫不全マウス）に注入してもよい。マウスに約１００万のＳＶＲ細胞を皮下注入し、腫瘍が明白になった時、１日１回の投与（例えば腹膜内に１２０ｍｇ／ｋｇ）を行うことができる。１２０ｍｇ／ｋｇで活性である薬剤を、更に８０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇなどの低用量で再試験してもよい。腫瘍体積は、（ｗ２×Ｌ）０．５２の式を使用して算出できる（ｗ（幅）は腫瘍の最小の寸法を表す）。マウスを約３０日、又は腫瘍の増殖が１ｃｍ３になるまで処理してもよい。
【０１７８】
Ｖ．医薬組成物
本明細書に記載のいずれかの化合物の有効量は、本明細書に記載のいずれかの疾患の治療に使用できる。
【０１７９】
本発明の化合物の投与に適する薬剤担体には、特定の投与様式に応じた、当業者に公知のいかなる種類の担体も含まれる。化合物は、組成物の唯一の薬理学的な活性成分として処方してもよく、又は他の成分と組み合わせてもよい。
【０１８０】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物は、経口的、直腸、鼻、局所的（頬側及び舌下腺が含まれる）、膣、腸管外（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、眼内、気管内、大槽内、腹腔内及び硬膜外投与に適する形としてもよい。
【０１８１】
組成物は、簡便な単位用量形態とすることができ、従来の製薬技術により調製できる。かかる技術には、１つ以上の本発明の組成物及び１つ以上の製薬用の担体又は賦形剤との混合が含まれる。
【０１８２】
化合物は溶液、懸濁液、錠剤、分散可能な錠剤、ピル、カプセル、粉、徐放性製剤又はエリキシルのような内服用、又は非経口投与（経皮パッチ調製及び乾燥粉末吸入器と同様に）用の無菌液又は懸濁液などの適切な製剤に処方できる。一実施態様では、上記の化合物は公知の技術及び方法を使用して医薬剤組成物に処方される（Ａｎｓｅｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８５，１２６参照）。
【０１８３】
組成物において、１つ以上の化合物又はその薬理学的に許容できる誘導体の有効濃度を、１つ以上の適切な薬剤担体と混合してもよい。化合物は、製剤化前にその対応する塩、エステル、エノールエーテル若しくはエステル、アセタール、ケタール、オルソエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物又はプロドラッグとして誘導体化できる。組成物中の化合物濃度は、その投与により標的の疾患又は症状の１つ以上を治療、予防又は改善する量の送達のために効果的な量とする。一実施態様では、組成物は単回投与用に処方される。組成物を処方するために、治療される症状が緩和され、予防され、又は１つ以上の症状が改善されるだけの化合物の重量部分を溶解、懸濁、分散させ、又はさもなければ有効濃度で適切な担体に添加する。
【０１８４】
経口投与用の組成物は、限定されないが錠剤、カプレット、ピル若しくはドラゼーカプセル、又はカシェ剤のような別々の単位（各々が１つ以上の組成物の予め定められた量を含む）、粉又は顆粒、水溶液又は非水溶液としての溶液又は懸濁液、又は水中油型エマルジョン又は油中水型エマルジョン、又はボーラス投与などの形態としてもよい。
【０１８５】
薬理学的に投与可能な液状組成物は、例えば、上記の定義済みの活性化合物、及び任意の製薬アジュバントを、担体（例えば水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、グリコール、エタノールなど）に溶解、分散又はさもなければ混合し、溶液又は懸濁液の状態を形成することにより調製できる。必要に応じて、投与される医薬剤組成物は、無毒の補助剤（例えば湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、香料、例、アセテート、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンナトリウムアセテート、オレイン酸トリエタノールアミン、並びに他の薬剤）を微量で含めてもよい。かかる剤形を調製する方法は公知であるか、又は当業者であれば自明であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５を参照されたい。
【０１８６】
口内の局所投与に適している本発明の組成物には、ロゼンジ（風味ベース（通常スクロース及びアカシア又はトラガカント）中に有効成分を含む）、パステル（不活性ベース（例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア）中に本発明の組成物の１つ以上を含む）、及びマウスウォッシュ（適切な液体担体中に投与される本発明の組成物の１つ以上を含む）。
【０１８７】
錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分の１つ以上又は類似の性質の化合物を含んでもよい。結合剤、潤滑油、希釈剤、滑走剤、崩壊剤、着色剤、甘味剤、香料、湿潤剤、吐剤コーティング、及びフィルムコーティング。結合剤の例としては、微結晶性セルロース、ゴムトラガカント、グルコース溶液、アカシア粘液、ゼラチン溶液、モラセス、ポリビニルピロリジン、ポビドン、クロスポビドン、スクロース及びデンプンが挙げられる。潤滑剤としては、タルク、澱粉、マグネシウム又はカルシウムステアリン酸塩、リコポジウム及びステアリン酸が挙げられる。希釈剤としては、例えば乳糖、スクロース、澱粉、カオリン、塩、マンニトール及び二カルシウムリン酸塩が挙げられる。滑走剤としては、コロイド状シリカが挙げられるが、これに限定されない。崩壊剤としては、クロスカルメロースナトリウム、ナトリウム澱粉グリコール酸塩、アルギン酸、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、ベントナイト、メチルセルロース、寒天及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。着色剤としては、例えば滅菌済の水溶性ＦＤ及びＣ染料及びそれらの混合物のいずれか、並びにアルミナ水和物に懸濁した水不溶性ＦＤ及びＣ染料が挙げられる。甘味剤としては、スクロース、乳糖、マンニトール及び人工甘味料（例えばサッカリン及び他の任意の噴霧乾燥済甘味料）が挙げられる。香料としては、良い感じの感覚をもたらす天然の植物（例えば果物）由来の抽出物、及び化合物の合成混合物などが挙げられ、ペパーミント及びサリチル酸メチルなどが例示できるがそれらに限定されない。湿潤剤としては、プロピレングリコールモノステアリン酸、ソルビタンモノオレイン酸、ジエチレングリコールモノラウレート及びポリオキシエチレンラウラルエーテルが挙げられる。吐剤コーティングとしては、脂肪酸、脂肪、ワックス、セラック、アンモニア処理したセラック及びセルロースアセテートフタル酸が挙げられる。フィルムコーティングとしては、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリエチレングリコール４０００及びフタル酸セルロースアセテートなどが挙げられる。
【０１８８】
皮膚に対する局所投与に適する組成物は、軟膏、クリーム、ゲル及びペーストとするのが好適であり、製薬において許容できる担体中に投与される組成物の１つ以上が含まれる。
【０１８９】
直腸投与用の組成物は、例えばカカオ脂又はサリシレートなどの適切なベースを有する坐薬とするのが好適である。
【０１９０】
担体が固体であるとき、例えば、鼻噴投与に適している組成物としては２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗末が挙げられ、スナッフ（すなわち、粉に占拠された上に向かって閉じたパイプを有するコンテナから鼻へ迅速に吸入させる）により投与される。担体が液体（例えば鼻内噴霧又は点鼻剤）であるとき、組成物の１つ以上を水性又は油性の溶液中に混合し、吸い込むか又は鼻腔内に霧散する。
【０１９１】
膣内投与に適する組成物は、組成物及び適当な担体の１つ以上を含んでなる膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤としてもよい。
【０１９２】
非経口投与に適する組成物としては、滅菌済の水溶性及び非水溶注入液であって、抗酸化剤、バッファー、抗菌剤、及び意図された受容者の血液と等張になるように製剤を調整するための溶質を含んでもよい液体が挙げられ、滅菌済の水溶性及び非水溶には懸濁剤及び増粘剤を含めてもよい。該組成物は単位投与用又は多数回投与用の容器（例えば密封アンプル及び同バイアル）としてもよく、また使用直前に無菌液体担体（例えば食塩水、注射用水）の添加だけを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵してもよい。即座に使用できる注入溶液及び懸濁液は、上記の滅菌済の粉末、顆粒及び錠剤から調製できる。
【０１９３】
経腸又は腸管外投与に適する製薬用の有機若しくは無機の固体若しくは液体担体媒体を用いて組成物を製造してもよい。ゼラチン、乳糖、澱粉、マグネシウムステアリン酸塩、タルク、植物性及び動物性油脂、ゴム、ポリアルキレングリコール、水又は他の周知の担体の全てが担体として適切でありうる。
【０１９４】
組成物を、１つ以上の薬理学的に許容できる担体媒体及び／又は賦形剤との組み合わせにおける有効成分として使用してもよい。本発明の「薬理学的に許容できる担体媒体」とは、全ての担体、溶媒、希釈剤又は他の液状担体、分散又は懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤、アジュバント、担体、輸送剤、崩壊剤、吸収剤、防腐剤、界面活性剤、着色剤、フレーバー又は甘味料など、特定の投与形態に適する任意の形態であってもよい。
【０１９５】
更に、治療組成物を形成する際、組成物を薬理学的に許容できる賦形剤、及び、任意に徐放性マトリックス（例えば生物分解可能なポリマー）と組み合わせてもよい。「薬理学的に許容できる賦形剤」には、いかなるタイプの無毒性固体、半固体若しくは液体充填材、希釈剤、封入材又は製造助剤が含まれる。しかしながら、組成物の毎日における全体的な使用法が、確固とした医学判断の範囲内において主治医により決定されることを理解すべきである。特定の宿主における特異的な治療的に有効な服用レベルは、以下の様々な因子に依存する。すなわち、例えば治療対象の疾病及び疾病の重篤度など、使用する具体的な組成物の活性、使用する具体的な組成物の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性及び食事、投与時間、投与経路、使用する具体的な化合物の排出速度、治療期間、共に使用する、又は使用する具体的な組成物と適合する薬剤、並びに医学的に公知の諸要因など。例えば、所望の治療的な効果を得るのに必要となる量よりも低量で組成物の投与量を開始し、及び所望の効果が得られるまでに段階的に投与量を増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
【０１９６】
組成物は好ましくは、投与の容易さ及び投与量の均一性のための投与単位の形態で製剤化される。本明細書で使用される「投与単位の形態」とは、治療対象の宿主にとり適当な、組成物の物理的に別々の単位を指す。各投与形態は、それらのみ、又は選択された医薬的な担体媒体との組み合わせにおいて、所望の治療効果を得るために算出された組成物量を含む必要がある。
【０１９７】
好ましい単位投与量製剤には、投与される成分の一日量又は単位、１日のサブ投与量又はその適当なフラクションが含まれる。例えば、約１〜５ｍｇ／日のホノキオール型化合物でマウスの固形腫瘍の量を減少させることができる。特に、毎日のホノキオール型化合物３ｍｇの投与により、腫瘍を５０％超減少させる（Ｂａｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００３）Ｓｅｐ．１２；２７８（３７）：３５５０１−７）。これらの結果は、化合物のヒトへの投与量の推定に使用できる。
【０１９８】
投与量は、体重、年齢、表面積、代謝、組織分布、吸収速度及び排出速度などの宿主に関する要因に依存する。一実施態様では、１日あたり０．５〜７ｇの本明細書に開示した化合物をヒトに投与するのが好適である。任意に、１日あたり１〜４ｇの化合物をヒトに投与してもよい。特定の実施態様では、０．００１〜５ｍｇ／日でヒトに投与される。治療的に有効な投与レベルは、上記の多くの要因に依存する。例えば、比較的低量で組成物の投与量を開始し、所望の効果が得られるまで投与量を増加させることは、当業者の技量の範囲内である。
【０１９９】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物を、通常ポリマー製の支持放出マトリックス（酵素又は酸ベースの加水分解、又は溶解により分解可能）と共に使用してもよい。一旦生体に挿入されると、マトリックスは酵素及び体液による作用を受ける。徐放性マトリックスは、例えば生体適合性の材料（例えばリポソーム、ポリ乳酸、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリ乳酸コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）、ポリ無水塩、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーン）から選択される。好ましい生分解性マトリックスは、ポリ乳酸、ポリグリコリド又はポリ乳酸コグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）のいずれか１つのマトリックスである。
【０２００】
化合物をリポソームの形で投与してもよい。周知のように、リポソームは通常、リン脂質又は他の脂質に由来する。リポソームは水性溶媒中で分散する、単一又はマルチラメラ状の水和液晶により形成される。リポソームを形成できるいかなる無毒な、生理的に許容できる代謝性脂質も使用できる。リポソームには、本発明の１つ以上の組成物以外にも安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含めてもよい。脂質の例としては、リン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）（天然な及び合成）が挙げられる。リポソームの形成方法は公知である。化合物をエアゾールとして処方し、例えば吸入により投与してもよい。これらの気道投与用の製剤は、ネブライザ用のエアゾール若しくは溶液の形態で、又は吹送用の微粉末として、それ単独で、又は不活性担体（例えば乳糖）との組み合わせで調製してもよい。かかる場合、製剤中の粒子は、一実施態様では５０ミクロン未満の直径を有し、一実施態様では１０ミクロン未満である。
【０２０１】
本明細書に開示の化合物を含んでなる組成物は、上記の症状の治療用の他の組成物及び／又は方法との組み合わせで使用できる。例えば、腫瘍を、本発明の１つ以上の組成物との組み合わせで従来の手術、放射線療法又は化学療法で治療してもよく、更に、本発明の１つ以上の組成物をその後患者に投与して、微小転移巣の活性停止を長期化させ、いかなる残余の原発腫瘍の増殖も抑止、阻害又は減少させることができる。
【０２０２】
ＩＶ．合成
本明細書に開示の化合物は、公知技術の方法を使用して合成できる。例えば、ホノキオール類似体の５つの種類は反応式１Ａに記載のように合成できる。
【０２０３】
ホノキオール及びその誘導体の合成に利用可能な方法は、本明細書に開示の化合物の合成用に適宜変更してもよい。例えば、Ｅｓｕｍｉ，Ｔ．，ら（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４，２６２１−２６２５の方法が使用できる。一実施態様では、スズキジアゾカップリングをビフェニル足場の構築に用いる。この反応により、Ｍｉｙａｕｒａ，Ｎ．及びＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５，２４５７−２４８３、並びにＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９９），Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．５７６，１４７−１６８に記載のように生成物収率を良好にできる。この反応では、適当な中間体を用いてアリールフェノール又はビフェニル基にアリル部分を導入できる。任意に、ヨード及びブロモ官能基の異なる反応性に基づいて、アリル基をビスフェノールの形成前に導入してもよい。例えばＴｏｙｏｔａ，Ｓ．，Ｗｏｏｄｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｂｅｎａｇｌｉａ，Ｍ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｊ．Ｓ．（１９９８），Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９，２６９７−２７００、及びＢａｈｌ，Ａ．，Ｇｒａｈｎ，Ｗ．，Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｓ．，Ｆｅｉｎｅｒ，Ｆ．，Ｂｏｕｒｈｉｌｌ，Ｇ，Ｂｒａｕｃｈｌｅ，Ｃ，Ｒｅｉｓｎｅｒ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｇ．（１９９５），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，１４８５−１４８８を参照されたい。
【０２０４】
一実施態様では、ホノキオールの合成中間体は、３−アリル−４−ヒドロキシベンゼンボロナート（５）及び４−アリル−２−ブロムフェノール（９）である。ボロナート（５）は、２−ヨードフェノール１のブロム化、更にスズキカップリング反応を行いアリル基を導入し、スズキ条件下でホウ素化することにより調製できる。化合物９は、ブロム化及びアリル化（スズキカップリング）により４−ヨードフェノール（６）から調製できる。Ｃ＝Ｃ二重結合が存在する場合にはスズキカップリングが成功することが明らかとなっているため、スズキ条件下での５及び９の組み合わせにより、スズキカップリングによるホノキオール産生がなされ、ヘック反応からの他のアリル配向性生成物が生じない（Ｍｉｙａｕｒａ，Ｎ．；Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５，２４５７−２４８３、及びＳｕｚｕｋｉ，Ａ．（１９９９），Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．５７６，１４７−１６８およびこれらの文献中の引用例を参照）。
【０２０５】
すなわち、ホノキオール及び誘導体は、市販の開始材料を用いて６つの処理を行い合成できる（反応式１）。
【０２０６】
反応式１
【化３０】
2008542192.tif 000177
試薬及び条件：
（ａ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｄ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流。
メタノール中のＴＭＳ−ジアゾメタンによるホノキオールの処理はモノ−及びジ−メチル化化合物Ｉ〜ＩＩＩを生じさせ、ウィルキンソン触媒によるホノキオールの水素化はジ−及びテトラヒドロホノキオールＶＩ〜ＶＩＩＩを生じさせる（Ｅｓｕｍｉ，Ｔ．ら（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．Ｌｅｔｔ．１４，２６２１−２６２５）。アミノ及びフルオロ類似体（ＩＶ及びＶ）は、スズキカップリング条件下でヨードアセトアニリドから調製できる。２−ヨードアセトアニリド（１０）のブロム化、アリル化及びホウ素化により、ホウ素化中間体（１３）を調製できる。他のブロモ中間体１６は、４−ヨードアセトアニリド（１４）のブロム化及びアリル化を経て調製できる。ホウ素化物（１３）と臭素化物（１６）のスズキ条件下での結合により、脱保護後に、化合物ＩＶが得られる。ジアゾ化及びそれに続くＳｃｈｉｅｍａｎｎ反応により、アミノ類似体ＩＶをフルオロ類似体Ｖに変換できる（反応式２）。
【０２０７】
反応式２
【化３１】
2008542192.tif 000178
試薬及び条件：
（ａ）ＴＭＳ−ジアゾメタン、ＭｅＯＨ、
（ｂ）ジクロロトリス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｅｔ３Ｎ、
（ｃ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｄ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｅ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｆ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流
（ｇ）ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ、
（ｈ）ｉ）ＮａＮＯ２、ｉｉ）ＮａＢＦ４
ジメトキシホノキオール誘導体（ＩＩＩ）は例えば、カリウムカルボン酸塩、ヨードメタンによるホノキオールの処理により調製することもできる（反応式２ａ）。あるいは、水素化されたホノキオール類似体は、ホウ化水素ナトリウム及び塩化ニッケル（ＩＩ）によるホノキオールの水素化により調製でき、テトラヒドロホノキオールＶＩ−ＶＩＩＩが得られる。
【０２０８】
反応式２ａ
【化３２】
2008542192.tif 000179
ビニル類似体ＩＸの調製は、スズキカップリングとウィッティヒ反応の組み合わせに基づく。中間体アルデヒド（１８）はライマー−ティーマン反応を介して４−ヨードフェノール（１７）から調製でき、その一方で、３−ブロモ−４−ヒドロキシベンゼンアルデヒド（２３）はブロム化及び還元を経てパラ−ヒドロキシベンゼンエステル（２１）から調製できる。これら２つのアルデヒドのウィッティヒ反応により、対応するビニル置換されたベンゼン誘導体（１９）及び（２４）が得られる。化合物（１９）からボロナート（２０）が得られ、それを（２４）と結合させ、化合物ＩＸが得られる（反応式３）。
【０２０９】
反応式３
【化３３】
2008542192.tif 000180
試薬及び条件：
（ａ）ＣＨＣｌ３、ａｑ．ＮａＯＨ、７０℃、
（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨ３Ｂｒ、ｎ−ＢｕＬｉ、ＴＨＦ、
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃、
（ｄ）ＤＩＢＡＬＨ、−７０℃、
（ｅ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、ジオキサン、還流。
【０２１０】
アリル又はヒドロキシル基の変更位置を有するホノキオール類似体の合成の際、ボロナート（５）及びブロムフェノール（４）及び（９）を中間体として使用できる。適当なハロゲン化物又はボロナートを有するこれらの中間体の１つのスズキカップリングにより、化合物Ｘ〜ＸＶＩＩが得られる。化合物Ｘ〜ＸＩＩ及びＸＩＶ〜ＸＶは、適当なハロゲン化物を有するボロナート（５）のスズキカップリングにより調製できる。ハロゲン化物（２５）（化合物Ｘの調製に必要）は２−ブロモ−６−ヨードフェノール（２）のアリル化を経て調製でき、その一方で、中間体（化合物ＸＩのための５−アリル−２−ブロムフェノール（２９））は３−ヨードフェノール２６のブロム化及びアリル化を経て調製できる。ハロゲン化物５−アリル−３−ブロモフェノール（３３）（化合物ＸＩＶの合成の中間体）の調製は、有機タリウム試薬を必要とする。３−ブロムフェノール（３０）のタリウム化、及びそれに続くイオジドによる処理により、３−ブロモ−５−ヨードフェノール（３２）が得られる。アリル化の後、アリル置換された中間体（３３）を調製できる。化合物ＸＩＩの合成は、２−ヨードアセトアニリド（１０）から開始して、スルホン化、ニトロ化及び還元を経て中間体３６を得ることによりなされる。アニリン３６をジアゾ化、それに続く酸及び塩基処理することにより、２−アミノ−３−ヨードフェノール（３７）が得られる。化合物３７のジアゾ化、Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ反応及びアリル化によりハロゲン化物（３９）が得られる。ボロナート（５）とこれらのハロゲン化物（２５、２９、３３、及び３９）とのカップリング反応により、化合物（Ｘ〜ＸＩＩ及びＸＴＶ）が調製できる。化合物ＸＶはボロナート（５）とハロゲン化物４のスズキカップリングにより合成できる（反応式４）。
【０２１１】
反応式４
【化３４】
2008542192.tif 000181
試薬及び条件：
（ａ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（５）、ジオキサン、還流
（ｂ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｃ）Ｂｒ２、ＣＳ２、０℃、
（ｄ）Ｔｉ（ＯＯＣＣＦ３）、ＣＦ３ＣＯＯＨ、
（ｅ）ＫＩ、
（ｆ）ＳＯ３、Ｈ２ＳＯ４、
（ｇ）ＨＮＯ３、Ｈ２ＳＯ４、
（ｈ）Ｚｎ、ＨＣｌ、
（ｉ）ｉ）ＮａＮＯ２、Ｈ２ＳＯ４、ｉｉ）Ｈ２ＳＯ４、Ｈ２Ｏ、還流、ｉｉｉ）ＮａＯＨ、Ｈ２Ｏ、
（ｊ）ｉ）ＮａＮＯ２、ＨＢｒ、ｉｉ）ＣｕＢｒ
あるいは、化合物Ｘ、ＸＶ及びＸＶＩＩはアリル化−クライゼン経路により合成できる。ビフェノール化合物を、最初にカリウムカルボン酸塩及びアリルブロマイドと、更にそれに続くＢＣｌ３と反応させ、ホノキオール様の化合物（例えばＸ、ＸＶ及びＸＶＩＩ）を調製できる。（反応式４ａ）。ジアリル出発原料（１等量）の無水ジクロロメタン中冷却溶液（氷浴中、０℃）（溶液の濃度：０．１ｍｏｌ／Ｌ）に、ＢＣｌ３溶液（ジクロロメタン中１Ｍ、１．５等量、アリル基ごとに０．７５等量ずつ）を滴下して添加した。更に反応液を、ＴＬＣにおいて出発原料が消失する（１５分後である場合、反応は不十分でなく、ＢＣｌ３を更に１等量添加）まで０℃で撹拌する。水（ジクロロメタンと同体積）による加水分解の後、２層に分離させる。有機層を水で再び洗浄し、更に真空下で蒸発させ、ＭｇＳＯ４下で乾燥させる。最後に残余物をカラムクロマトグラフィ精製し、ジヒドロキシ誘導体を得る。
【０２１２】
反応式４ａ
【化３５】
2008542192.tif 000182
ブロマイド（９）はまた、若干のボロナートとの結合のための有用な中間体でもある。例えば、ボロナート（４２）（アリル化及びホウ素化を経て４−ブロモ−３−ヨードフェノール（４０）から調製される）とブロマイド９のスズキカップリングにより化合物ＸＩＩＩを調製できる。同様に、ブロマイド（９）とボロナート（４３）とのカップリングにより化合物ＸＶＩを調製できる。化合物ＸＶＩＩは、４−アリル−２−ブロムフェノール（９）から、ホウ素化及びそれに続く２−アリル−６−ブロムフェノール（２５）とのスズキカップリングを経て調製できる（反応式５）。
【０２１３】
反応式５
【化３６】
2008542192.tif 000183
試薬及び条件：
（ａ）Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ａｑ．Ｎａ２ＣＯ３、ｔｏｌ、２−アリル４，４，５，５−テトラメチル−２，３，２−ジオキサボロラン、
（ｂ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、ＫＯＡｃ、ジオキサン、ビス（ピナコラート）ジボロン、８０℃
（ｃ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（９）、ジオキサン、還流、
（ｄ）ＰｄＣｌ２（ｄｐｐｆ）、ｄｐｐｆ、Ｋ３ＰＯ４、（２５）、ジオキサン、還流、
化合物ＸＶＩＩＩ及びＸＩＸは、市販のビスフェノール（４５）及びジヒドロキシナフタレン二硫酸塩（４７）から合成できる。すなわち、ビスフェノール（４５）はウィリアムソン反応及びクライゼン転位で化合物ＸＶＩＩに変換できる。同様に、ジヒドロキシナフタレン二硫酸塩（４７）の脱スルホン化、それに続くウィリアムソン反応及びクライゼン転位により化合物ＸＩＸを産生できる（反応式６）。
【０２１４】
反応式６
【化３７】
2008542192.tif 000184
ジオキソラン化合物は、マグノロールの２，２’−ジメトキシプロパン及びｐ−トルエンスルホン酸との反応により、マグノロールから調製できる（反応式７）。この合成もまた、ホノキオール及びマグノロールの混合物を分離する方法を提供する。
【０２１５】
反応式７
【化３８】
2008542192.tif 000185
以下の実施例は例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【０２１６】
＜実施例１＞
ＭＡＰＫＫスクリーン
図１２は、ドミナントネガティブＭＡＰＫＫ遺伝子又は内皮細胞の形態上の化学抑制剤ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫＫの抑制効果を示す。ＭＳ１は、ＳＶ４０大きいＴ抗原だけを含んでなる内皮細胞を意味し、ＳＶＲは、ｒａｓ癌遺伝子により形質転換したＭＳ１細胞を意味し、ＳＶＲ＋  ＰＤ９８０５９はＰＤ９８０５９（５μｇ／ｍＬ）で処置したＳＶＲ細胞を意味し、ＳＶＲＡ２２１ａは、ＭＡＰＫＫのドミナントネガティブＡ２２１対立遺伝子を安定発現する細胞を意味する。ＳＶＲＡｎｄ  ＳＶＲｂａｇ４細胞の形態は同一である。元の拡大倍率は×４０である。この図はＭＡＰキナーゼ抑制に対するＳＶＲ細胞の特徴的な反応を例示する。これはＭＡＰキナーゼ阻害剤及び関連した阻害剤（また、知る、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅその他（２０００）  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７（１９３７〜１９４５））を検出する視覚的なハイスループットアッセイにおいて使用できる
【０２１７】
＜実施例２＞
ホノキオールの細胞内の効果
図１３は、ホノキオール及びマグノロールのアポトーシスに対する効果を例示する。明カラムはマグノロールで処理したＳＶＲ細胞を意味し、暗カラムはホノキオールで処理したＳＶＲ細胞を意味する。コントロールレーンは、１８及び４８時間の処理と比較した、処理直後の細胞を意味する。この数字は、ホノキオールがマグノロールよりアポトーシスの誘導に効果的であることを示す。
【０２１８】
図１４は様々な細胞内タンパク質のリン酸化に対するホノキオールの効果を表す。Ａは、ホノキオールがＡＫＴ、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ及びＳｒｃのリン酸化を阻害することを示す。ＳＶＲ細胞を１時間、２０（７５μＭ）、３０（１１２．５μＭ）、４０（１５０μＭ）又は４５μｇ／ｍＬ（１６９μＭ）のホノキオールでインキュベートした。またＳＶＲ細胞を、５０μＭ  ＬＹ２９４００２（ＬＹ）又は５０μＭ  Ｕ０１２６（Ｕ０）でも２時間インキュベートした。細胞を溶解させ、特異的な抗体を使用しているウエスタンブロッティングによりリン酸化された（Ｐ−ＡＫＴ、Ｐ−ＭＡＰＫ及びＰ−Ｓｒｃ）又は非リン酸化ＡＫＴ及びＭＡＰＫを分析した。Ｂは、ホノキオールは低濃度でＡｋｔのリン酸化を阻害するが、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ又はＳｒｃは阻害しないことを示す。ＳＶＲ細胞を、２、６又は２４時間、２．７（１０μＭ）、６．７（２５μＭ）又は１３．３μｇ／ｍＬ（５０μＭ）のホノキオールでインキュベートした。細胞を溶解し、Ａｋｔ及びＭＡＰＫのリン酸化型（Ｐ−Ａｋｔ、Ｐ−ＭＡＰＫ及びＰ−Ｓｒｃ）又は非リン酸化型に特異的な抗体を使用するウエスタンブロッティングにより分析した。これらの機構の解析により、ホノキオールの主要な作用点が、ホスホイノシトール３キナーゼ活性化又は上流の現象のレベルにあることが示された。
【０２１９】
図１５は、内皮増殖のホノキオール抑制がＴＲＡＩＬ依存性であることを示す。１０４／ｗｅｌｌの微小血管内皮細胞を、２４時間２４穴プレートで培養した。その翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＲＡＩＬ又はアイソタイプコントロール抗体（３０μｇ／ウェル）の添加前に、３０分間０、１、６、又は９μｇ／ｍＬホノキオールにより新しいＭＥＣ培地０．５ｍｌ／ウェルで前処理した。細胞を、試薬添加後４８時間インキュベートし、クールターカウンターにより計数した。緑の棒はホノキオールのみで処理した内皮細胞を意味し、濃青色の棒はホノキオール及びＴＲＡＩＬ抗体で処理した細胞を意味し、及び淡青色の棒はホノキオール及びアイソタイプコントロール抗体で処理した細胞を意味する。ＴＲＡＩＬ抗体の有無における、ホノキオール処理した内皮細胞の相違は重要である（ｐ＜０．０５）。これらの所見はホノキオールがＴＲＡＩＬシグナル伝達の活性化によるアポトーシスを刺激することを示し、ホノキオールが他の化学療法剤及び放射線療法と協同しうることを示唆する。
【０２２０】
＜実施例３＞
多発性骨髄腫細胞上のホノキオールの効果
材料及び方法
細胞：
デキサメサゾン（Ｄｅｘ）感受性ＭＭ．１Ｓ（野生型ｐ５３）及びＤｅｘ耐性ＭＭ．１Ｒ、ＲＰＭＩ８２２６−Ｄｏｘ４０（ドキソルビシン抵抗性）及びＲＰＭＩ８２２６−ＬＲ５（メルファラン抵抗性）のヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株を使用した。ＲＰＭＩ−８２２６及びＵ２６６細胞は、ＡＴＣＣから入手した。ＳＵ−ＤＨＬ−４細胞も利用した。新しい末しょう血液単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）は、インフォームドコンセントの後、健常者から入手した。ＰＢＭＮＣは、フィコール−Ｈｉｐａｑｕｅ密度遠心沈降によりヘパリン化末梢血から分離した。ＢＭ標本はインフォームドコンセントを得た後にＭＭ患者から入手し、単核細胞はフィコール−Ｈｉｐａｑｕｅ密度遠心沈降により分離した。細胞を、１０％のウシ胎児血清を含んでなるＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃で培養した（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２μＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ギブコ、グランドアイランド、ＮＹ）。
【０２２１】
ＢＭ標本中のＭＮＣｓを、長期の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の確立にも用いた（例えばＵｃｈｉｙａｍａら、Ｂｌｏｏｄ．１９９３；８２：３７１２−３７２０、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１；２０：４５１９−４５２７を参照）。試薬：ホノキオール（ＨＮＫ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、ＣＡ）をエタノールに溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの原液とした。組換えヒトインターロイキン６（ＩＬ−６）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を、０．１％のＦＢＳ（ＩＬ−６及びＶＥＧＦ）を含む滅菌済ＰＢＳ、及び０．１％のＦＢＳ（ＩＧＦ−１）を含んでなる１０ｍＭの酢酸により再構成した。Ｐａｎ−カスパーゼ阻害剤のｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）をメタノールに溶解した。これらの試薬を−２０℃保存し、使用直前に培地で希釈した。ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を３．４５ｍＭの濃度で無菌水に溶解した。Ａｓ２Ｏ３（ＰＢＳ中５ｍＭ）はＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（シアトル（ＷＡ））から入手した。ボルテゾミブ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ケンブリッジ、ＭＡ）を１ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、−２０℃保存した。
【０２２２】
細胞増殖及びＤＮＡ合成アッセイ：
薬活性を評価するために比色アッセイを実施した。ＭＭ細胞株及びＢＭＳＣｓは、１００μｌの培地で４８時間９６穴培養組織プレートで、ＨＮＫの所定の濃度で処理し、４時間各ウェルに、２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニール）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−８，  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）１０μＬを添加した。ＷＳＴ−８は、生細胞中に豊富に存在する電子伝達体１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム硫酸メチルの存在下、生体内還元によりＷＳＴ−８−ホルマザンに変わる。４５０ｎｍの波長の吸光度を分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーヴェール、ＣＡ）で測定した。
【０２２３】
ＤＮＡ合成を前述のように測定した（例えばＨｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２９４３−２９５０）。９６穴培養組織プレートの細胞に、培養組織の最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン（パーキンエルマー、ボストン、ＭＡ）を０．５μＣｉ／ウェルで添加し、自動セルハーベスタ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）でガラスフィルタ上へ回収し、ＬＫＢ  Ｂｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して計数した。全ての実験を３回実施した。
【０２２４】
患者のＭＭ細胞に対するＨＮＫで誘導される細胞毒性の評価：
新しいＭＭ細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を解析した（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２００４；５：２２１−２３０を参照）。ＭＭ患者に由来する骨髄サンプルから分離した新しいＭＮＣｓを氷上で３０分間ＰＥコンジュゲートした抗ＣＤ１３８抗体及び／又はＦＩＴＣコンジュゲートした抗ＣＤ３８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）でインキュベートし、洗浄し、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータ分析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）を使用して解析した。ＭＭ細胞を富化したＣＤ３８ｈｌｇｈフラクションを、各場合において横及び前方の散乱パネルにおいて測定した。ゲートで制御された細胞上のＣＤ１３８の発現も解析した。４８時間のＨＮＫ処理の後、細胞を回収し、ＨＮＫ処理の有無にかかわらず、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージを解析した。
【０２２５】
細胞周期の解析：
ＨＮＫにより培養されるＭＭ細胞を回収し、７０％のエタノールで固定し、ＲＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２５０μｇ／ｍＬで前処理した。細胞をプロピジウムイオジド（ＰＩ；５０μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で着色し、細胞周期プロフィールをＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）のプロｇＭソフトウェアを用いて解析した。
【０２２６】
アポトーシス及びカスパーゼ−３活性の検出：
ＴｄＴで媒介されたｄ−ＵＴＰのニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（ＭＢＬ、名古屋、日本）及びＡＰＯ２．７染色（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用い、アポトーシスを解析した。手短には、各細胞を４％のパラホルムアルデヒド及び７０％のエタノールで浸透させ固定し、３７℃で１時間ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰの混合物及びＴｄＴでインキュベートし、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。アポトーシス細胞上のミトコンドリア膜タンパク質７Ａ６発現の検出のために、細胞を２０分間のＡＰＯ２．７試薬でインキュベートした。ＴＵＮＥＬ及びＡＰＯ２．７染色の蛍光強度を、ＥＰＩＣＳ  ＸＬフローサイトメータで解析した。細胞毒性をトリパンブルー除外アッセイにより測定した。カスパーゼ３の活性化を評価するために、ＦＩＴＣコンジュゲートした単クローン性の活性カスパーゼ３抗体アポトーシスキットＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用してフローサイトメトリー解析を実施した。
【０２２７】
ウエスタンブロッティング：
示された条件下で培養したＭＭ細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで二度洗浄し、溶解緩衝液中（全細胞可溶化物のイムノブロット用：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＦ、２ｍＭ  Ｎａ３Ｖ４、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍＬ  ロイペプチン及び５μｇ／ｍＬ  アプロチニン）に分散させた。ＨＮＫ処理した細胞１×１０７から調製した細胞小器官タンパク質を、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ分画キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して抽出した。細胞可溶化物又は分画されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜へ移し、以下抗体によりイムノブロッティングを行った：抗カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、Ｂａｄ、リン酸化（ｐ）−Ｂａｄ（Ｓｅｒｌ１２）、Ｂａｘ、Ｂａｋ、ＸＩＡＰ、ＡＩＦ、ｐ−Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）２７及びｐ−Ｈｓｐ２７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）、抗ＥＲＫ２、ｐ−ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３、ＢＣＬ−２、ＭｃＩ−Ｉ、ｇｐ８０及びＨｓｐ７０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗Ｂｉｄ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、抗ＥｎｄｏＧ（Ａｘｘｏｒａ、サンディエゴ、ＣＡ）、及び抗ｇｐ１３０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）。抗−α−チューブリンＡｂ（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によるイムノブロットにより、等量のタンパク質のローディングを確認した。
【０２２８】
ボルテゾミブとの組合せ：
ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブにより培養した。アポトーシスの細胞増殖及び誘導を、４８時間の処理後、比色アッセイ及びＡＰＯ２．７のフローサイトメトリ検出の両方により測定した。
【０２２９】
ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓのＨＮＫに対する効果による、増殖阻害の誘導
ＩＬ−６又はＩＧＦ−１の有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫで４８時間インキュベートした。更にＭＭ細胞の激増を［３Ｈ］−チミジン取り込みにより解析した。ＢＭＳＣｓへのＭＭ細胞の接着による増殖促進を評価するために、ＨＮＫの有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＢＭＳＣコーティングされた９６穴プレートで培養した。ＤＮＡ合成を［３Ｈ］−チミジン取り込みで測定した。ＩＬ−６により誘導される増殖シグナル伝達又はＨＮＫ−処理した細胞のＩＧＦ−１の調節を解明するために、ＭＭ．１Ｓ細胞を３及び６時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫを有する２．５％ＦＣＳ含有培地で培養し、更に１０及び２０分間のＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）の刺激を行った。ウエスタンブロッティングで記載した要領で、細胞可溶化物を調製した。
【０２３０】
血管新生アッセイ：
ＨＮＫの抗血管新生効果を、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用して解析した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＨＮＫの有無において、３７℃で重合するマトリックスゲル上で培養した。６時間後、内皮細胞による管形成を評価した。ＨＵＶＥＣに対するＨＮＫの直接的な毒性を比色アッセイにより測定した。
【０２３１】
結果
ＨＮＫはＭＭ細胞株の増殖を阻害する。
ＨＮＫの治療有効性を確認するために、ＭＭ細胞株及び通常のＰＢＭＮＣｓを４８時間、ＨＮＫを有する所定の濃度で培養し、増殖を比色アッセイにより測定した。８〜１０μｇ／ｍＬ、４８時間における５０％抑制（ＩＣ５０）の結果、ＨＮＫは薬感受性ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６及びＭＭ．１Ｓ細胞の増殖を阻害した。ＨＮＫはまた、親の薬感受性細胞株と類似のＩＣ５０値で、薬剤抵抗性ＲＰＭＩ８２２６−Ｄｏｘ４０、ＲＰＭＩ８２２６−ＬＲ５及びＭＭ．ＩＲ細胞の増殖を阻害した（図６Ａ及びＢ）。最高２０μｇ／ｍＬのＨＮＫまで、４８時間（図６Ｃ）で、通常のＰＢＭＮＣｓの生存率を阻害しなかった。図６Ａ及びＢは、ＨＮＫによる４８時間培養後の、ＭＭ細胞株の増殖阻害を、比色アッセイにより解析した結果を示す。データは３つの独立した実験の平均値±ＳＤ（標準偏差）を表す。図６Ｃは、４８時間培養後の、３つの健康者に由来するＰＢＭＮＣｓの比色アッセイにより評価した生存率を示す。データは、３回の培養組織の平均±ＳＤを意味する。
【０２３２】
ＨＮＫは、患者のＭＭ細胞に対する毒性を有する。
６人の再発性・不応性ＭＭ患者から単離した腫瘍細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を評価した。ＣＤ３８ｈｌｇｈ腫瘍細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリにより測定し、コントロール培養組織（図６Ｄ）と比較した結果、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージは、４８時間、８μｇ／ｍＬのＨＮＫによる処理により、２６．２±１５．８％減少した。図６Ｄは、４８時間（Ｎ＝６、数値は平均値±ＳＤを意味する）のＨＮＫの有無にかかわらず、培養後、ＣＤ３８ｈｌｇｈ細胞のパーセンテージ比較により測定された、患者のＭＭ細胞に対するＨＮＫの細胞毒性を例示する。
【０２３３】
ＨＮＫは、直接ＭＭ細胞株の増殖を阻害する。
ＭＭ細胞株（メルファラン（メル）−、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）−及びＤｅｘ耐性細胞株が含まれる）の増殖阻害を、＜１０μｇ／ｍＬのＩＣ５０で観察した。更に、再発性／不応性ＭＭ患者からのＭＭ細胞は、ＨＮＫ治療によりも著しく減少していた。通常のＰＢＭＮＣｓのＨＮＫのＩＣ５０は４０〜８０μｇ／ｍＬ（ＭＭ細胞株及び患者のＭＭ細胞のＩＣ５０より顕著に高い）であった。これらのデータはＨＮＫが効果的にＭＭ細胞株（薬剤抵抗性細胞株及び患者のＭＭ細胞が含まれる）の細胞毒性を誘導し、通常のＰＢＭＮＣｓに対する毒性を有さないことを示す。
【０２３４】
ＨＮＫは、ＭＭ細胞株のアポトーシスを誘導する。
ＭＭ細胞株に対するＨＮＫの細胞毒性を、２４時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫと共に培養したＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞の細胞周期を評価することにより解析した。ＨＮＫ処理は、顕著にｓｕｂ−Ｇｏ／Ｇｉ細胞を増加させた。更に、４８時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによるＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞それぞれの処理により、３８．２％及び４１．５％のＴＵＮＥＬ陽性細胞が誘導された（図７Ａ）。２４時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによるそれぞれＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞の処理により、２１．７±３．４％及び３２．９±０．６％のＡＰＯ２．７陽性細胞を誘発したが、４８時間、１５μｇ／ｍＬのＨＮＫ処理によっても、通常のＰＢＭＮＣｓ（ｎ＝３）のＡＰＯ２．７陽性細胞は誘導されなかった。（図７Ｄ）
【０２３５】
ＨＮＫはカスパーゼ依存性の、及び独立したアポトーシスを誘導する。
ＨＮＫにより誘導されるアポトーシスの経路を解析した。ＭＭ．１Ｓ細胞を１２及び２４時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫで処理した。カスパーゼ６、７、８、９及びＰＡＲＰのタンパク質発現を更にＷＢにより解析し、活性カスパーゼ３を、フローサイトメトリアッセイで測定した。
【０２３６】
図７は、ＭＭ細胞におけるホノキオールで誘導された（ＨＮＫ）アポトーシスを表す。Ａは、４８時間８μｇ／ｍＬ  ＨＮＫで処理したＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞を示す。ＴＵＮＥＬアッセイを使用してアポトーシスを評価した。Ｂでは、１．５時間ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）によるプレインキュベーションの有無における、カスパーゼ及びＰＡＲＰの裂開を、１２及び２４時間１０μｇ／ｍＬのＨＮＫ処理後の、ＭＭ．１Ｓ全細胞可溶化物のウエスタンブロッティングにより測定した結果をしめす。Ｃは、２５μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる１．５時間の前処理の有無による、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。カスパーゼ３の活性化をフローサイトメトリにより測定した。７Ｄでは、１．５時間２５μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理の有無において、ＭＭ細胞を２４時間ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３で処理し、ＡＰＯ２．７の発現をフローサイトメトリで測定した結果を示す。数値は３回の培養組織における平均±ＳＤを表す。Ｅは、トリパンブルー除外染色により解析した細胞毒性を示す。値は、３つの独立した実験における平均±ＳＤを表す。Ｆでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を、ＨＮＫ（０、４、８及び１２時間、１０μｇ／ｍＬ）で処理した。全細胞可溶化物を、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現を評価するため、ウエスタンブロッティングに供した。Ｇは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる治療前の有無における、ＨＮＫ（２４時間、１０μｇ／ｍＬ）で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。サイトソルフラクションのタンパク質を、ＡＩＦ及びＥｎｄｏＧのイムノブロットに供した。
【０２３７】
カスパーゼ７、８、９及びＰＡＲＰの裂開は、ＨＮＫ（図７Ｂ）で誘導される。ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３により誘導されるカスパーゼ３の活性化は、ＭＭ．１Ｓ細胞（図７Ｃ）の２５μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理により、完全にブロックされた。しかしながら、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＡｓ２Ｏ３で誘導されるアポトーシスの完了するブロックとは対照的に、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによるＨＮＫで誘導されるアポトーシスの抑制は一部分に限られた（ＰＡＲＰ裂開及びＡＰＯ２．７アッセイ（図７Ｂ及びＤ）により明示される）。１００μＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理は完全にカスパーゼ７のＨＮＫで誘導される裂開を阻害したが、ＨＮＫで誘導されるアポトーシスはまだ観察された（図７Ｄ）。更に、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する細胞毒性は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ前処理により著しく還元しなかった。トリパンブルー除外による増殖不能細胞のパーセンテージは、コントロール培養組織（２４時間、１０μｇ／ｍＬ、ＨＮＫで処理し、１．５時間２５μＭ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで培養し、更に２４時間、１０μｇ／ｍＬ  ＨＮＫでインキュベート）ではそれぞれ５．９±２．４％、３０．７±５．５％及び２７．６±６．４％であった（図７Ｅ）。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質のうち、ＭｃＩ−Ｉは切断され、ＸＩＡＰは刺激に対する反応が抑制され、悪い状態は顕著に上方制御され、更にＢｉｄ、ｐ−Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬはＨＮＫ治療の後、不変だった（図７Ｆ）。ＨＮＫはまた、サイトソル（図７Ｇ）へのミトコンドリアプロアポトーシスタンパク質ＡＩＦの放出を誘導した。最後に、ＨＮＫはまたＳＵ−ＤＨＬ−４細胞のアポトーシスを誘発し、それはカスパーゼ３の付随する活性化を伴わず、ドキソルビシン及びＡｓ２Ｏ３で誘導されるアポトーシス（図１９）に抵抗性であった。
【０２３８】
図１６は、ホノキオールがカスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰ媒介されたアポトーシスによる多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）のアポトーシスを誘導する更なるデータを提供するものである。左上のパネルは、ホノキオール（ＨＮＫ）がアポトーシスのｓｕｂＧｌフラクションをコントロール水準よりも増加（ＲＰＭＩ８２２６の１．２％→４１．５％、ＭＭ．１Ｓの２．９％→３８．２％、ＴＵＮＥＬアッセイにおいて）させることを示す。右パネルはウエスタン分析を表し、ホノキオールがカスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰの活性化によるアポトーシスを誘導することを示す。
【０２３９】
ＭＭ細胞株のＨＮＫで誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ３、７、８及び９の顕著な活性化を伴った。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理がほぼ完全にカスパーゼ３のＨＮＫで誘導される活性化を阻害したにもかかわらず、ＨＮＫで誘導される細胞毒性及びアポトーシスの抑制は一部分に留まった。対照的に、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理は、完全に、Ａｓ２Ｏ３により誘導したＭＭ．１Ｓ細胞のカスパーゼ３の活性化及びアポトーシスの両方を阻害した。ＨＮＫはまた、カスパーゼ３欠損ＭＣＦ−７細胞のアポトーシスを誘発した。カスパーゼ７（ＭＣＦ−７細胞の細胞死関連カスパーゼ）（Ｊａｎｉｃｋｅ  ＲＵら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：９３５７−９３６０、Ｆａｔｔｍａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１；２０：２９１８−２９２６、Ｍｃ  Ｇｅｅ  ＭＭら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２；５１５：６６−７０）は、ＨＮＫ処理したＭＭ．１Ｓ細胞においても切断された。これらの結果は、ＨＮＫが両方のカスパーゼ３依存性及び非依存性のアポトーシスを誘導することを示す。
【０２４０】
Ｂａｄ（プロアポトーシスのＢｃｌ−２ファミリータンパク質）はＢａｘのＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬへの結合を妨害し、それによりアポトーシスを促進する（Ｚｈａその他、Ｃｅｌｌ．１９９６；８７：６１９−６２８）。一方では、リン酸化ＢａｄはＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬまでＢａｄの結合を防止し、それによりアポトーシスの誘導を阻害する、（Ｚｈａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２４１０１−２４１０４、Ｙａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：４５３５８−４５３６７）。この試験では、ＨＮＫは著しく適度のリン酸化によりＢａｄ発現を強化したが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ及びＢｉｄを著しく変化させなかった。ＸＩＡＰの発現が減少し。ＭｃＩ−ＩはＨＮＫで誘導されるアポトーシスの間切断された。ＸＩＡＰはそのカスパーゼ阻害機序に関してよく研究されたＩＡＰファミリーである（Ｃｈａｗｌａ−Ｓａｒｋａｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：９１５−９２３）。ＸＩＡＰは核因子（ＮＦ）−κＢにより負に制御され、ＩκＢα及びｐ６５  ＮＦ−κＢのリン酸化はＨＮＫによりＭＭ．１Ｓ細胞において調節されなかった。ＭｃＩ−ＩはＢｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスのメンバーであり、カスパーゼによるＭｃＩ−Ｉの裂開により、残った完全ＭｃＩ−Ｉの機能に反対に作用する切断されたＭｃＩ−１が産生される（Ｈｅｒｒａｎｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：７８６３−７８７３）。総合すると、これらの結果は、ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化をもたらす強化されたＢａｄ発現のため、ＨＮＫがカスパーゼ８活性化により外部経路及び固有の経路を介してアポトーシスを誘導することを示唆する。そのうえ、薬剤誘導性のＸＩＡＰの負の調節は、エフェクターカスパーゼの抑制を防止、逆にいえば、カスパーゼの活性化は切断されたＭｃ１−１により更に強化される。
【０２４１】
他の難病と同様に、ＭＭの治療に用いる大部分の薬はカスパーゼ及びアポトーシスの活性化による腫瘍細胞死を誘導する。しかしながら、最近の検討は、活性化が死刺激によりアポトーシスを誘発して唯一の経路でないそのカスパーゼを示唆する（Ｊａａｔｔｅｌａら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４：４１６−４２３、Ａｂｒａｈａｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；１４：１８４−１９３、Ｌｏｃｋｓｈｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：２７６６−２７７３）。カスパーゼから独立したアポトーシスは、以下の臨床的に利用できる薬により、インビトロで誘発できる。シトシンアラビノシド又はパクリタキセルで処理した急性骨髄性白血病細胞（（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：４１７９−４１８６）、リツキシマブ及びアルメツズマブで処理したＢリンパ球系の細胞株及び慢性リンパ球性白血病細胞（Ｓｔａｎｇｌｍａｉｅｒら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４）イマチニブメシル酸塩で処理したＢＣＲ−ＡＢＬ陽性のヒト白血病細胞（Ｏｋａｄａら、Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０３：２２９９−２３０７）、並びにタキソールで処理した卵巣悪性腫瘍細胞株（Ａｈｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；９１：１０４３−１０５２）。ＭＭでは、Ａｓ２Ｏ３により誘発されるヒ素ＲＰＭＩ８２２６細胞及び患者のＭＭ細胞のアポトーシスは、カスパーゼから独立している（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ−Ｇｒａｄら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００３；２：１１５５−１１６４）。ＨＮＫはまた、アポトーシスＳＵ−ＤＨＬ４細胞を誘導し、それはカスパーゼ−８及び３−の低濃度を表し、ＮＫで誘導されるカスパーゼ−独立アポトーシスの経路を更に解析した。幾つかの分子はカスパーゼから独立したＡＩＦ／エンドーＧ経路を誘導する（Ａｈｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；９１：１０４３−１０５２、Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００３；５：９７−９９、Ｊｏｚａら、Ｎａｔｕｒｅ．２００１；４１０：５４９−５５４、Ｄａｕｇａｓら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．２０００；１４：７２９−７３９、Ｃｒｅｇａｎ  ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：２７８５−２７９６、Ｃａｎｄｅら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：５９１−５９５）。この経路では、死刺激はミトコンドリアからサイトソル及び核までＡＩＦ及び／又はエンドーＧの発散を誘導し、それに続く染色質凝縮及び細胞死をもたらす。ＨＮＫで誘導されるアポトーシスの間、Ｅｎｄｏ  ＧでなくＡＩＦは、ミトコンドリアからサイトソルにおいて顕著に遊離していた。ＡＩＦ／ＥｎｄｏＧ経路を介して誘発されるアポトーシスがＡＩＦの発散を示すことによりカスパーゼに依存し、ミトコンドリアからのＥｎｄｏＧがｚ−ＶＡＤ−ｆｒｎｋによりブロックされるという報告は存在しない（Ｃａｎｄｅら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００４；１１：５９１−５９５、Ａｒｎｏｕｌｔら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．２００３；２２：４３８５−４３９９）。ＡＩＦタンパク質の放出はカスパーゼとは独立していた。なぜなら、ＡＩＦに対するＨＮＫ効果がｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによりブロックされなかったからで��る。結局セリンプロテアーゼインヒビター４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフッ化物（ＡＥＢＳＦ）による前処理がＨＮＫで誘導されるアポトーシスを阻害しなかったため、セリンプロテアーゼ活性により誘導されるカスパーゼ依存性及び非依存性の細胞死経路はＨＮＫで誘導されるアポトーシスを媒介するとは考えられない（Ｏｋａｄａら、Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０３：２２９９−２３０７、ｄｅ  Ｂｒｕｉｎら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００３；１０：１２０４−１２１２、Ｌｉｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００４；５６９：４９−５３）。
【０２４２】
これらの結果は、ＨＮＫが両方のカスパーゼ依存性及び非依存性の経路を介してＭＭ細胞のアポトーシスを誘導することを示す。ＨＮＫはＳＵ−ＤＨＬ４細胞のアポトーシスを誘導し、それはカスパーゼ−８及び３の低濃度を表し、ドキソルビシン、Ａｓ２Ｏ３、メルファラン、デキサメサゾン、ボルテゾミブ及びレブリミドに抵抗性である（Ｃｈａｕｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：６１７４−６１７７）。したがって、カスパーゼ依存的及びカスパーゼ非依存的な経路の両方を経てＭＭ細胞を殺すＨＮＫのような薬剤は、特に薬剤耐性の克服に有用でありうる。
【０２４３】
ＨＮＫ及びボルテゾミブの組み合わせにより、ＭＭ．１Ｓ細胞増殖抑制が強化される。
ＨＮＫ及びボルテゾミブによるＭＭ．１Ｓ細胞の複合処理により、各薬剤のみと比較して、細胞毒性及びアポトーシス誘導を強化した（図８Ａ及びＢ）。図８Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理しし、細胞増殖を比色アッセイにより測定した。値は３回の培養組織における平均±ＳＤを表す。図８Ｂでは、ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理したＭＭ．１Ｓ細胞のアポトーシス誘導を、ＡＰＯ２．７により測定した結果をしめす。Ｖａｌｕｅｓが２つの独立の培養組織における平均±ＳＤを意味する。ＨＮＫ及びボルテゾミブの組み合わせによる強化された細胞毒性機構を説明するため、ＭＭ．１Ｓ細胞を８時間ＨＮＫ単独で、及びボルテゾミブと共に処理した。
【０２４４】
ボルテゾミブで誘導されるＨｓｐ２７、ｐ−Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０の増加機構は、ＨＮＫにより著しくブロックされた（図８Ｃ）。図８Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞は８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理した結果を示す。全細胞可溶化物を、ｐ３８ＭＡＰＫ、Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０のリン酸化及びタンパク質発現を評価するためにウエスタンブロッティングに供した。
【０２４５】
いずれの薬のみと比較しても、ボルテゾミブとＨＮＫの組合せは、アポトーシスの細胞毒性及び誘導を強化した。Ｈｓｐ２７及びＨｓｐ７０は、ＭＭ細胞においてボルテゾミブ処理後に上方制御される（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００２；９９：１４３７４−１４３７９、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１：１５３０−１５３４）。Ｈｓｐｓはアポトーシスシグナリングを幾つかのレベルで阻害するため（Ｃｒｅａｇｈら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０００；１４：１１６１−１１７３、Ｊｏｌｌｙら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２０００；９２：１５６４−１５７２、Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００；２：Ｅ１６３−１６５．）、ＰＳ−３４１−処理したＭＭ細胞のこの上方制御は、ボルテゾミブで誘導されるアポトーシスに耐性を誘導する。ＨＮＫは著しくＨｓｐ２７及びＨｓｐ７０のボルテゾミブで誘導される発現の刺激に対する反応を抑制し、それにより、ボルテゾミブの細胞毒性を強化した。
【０２４６】
外因性ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓと培養したＭＭ細胞におけるＨＮＫの効果。
外因性ＩＬ−６及びＩＧＦ−１の存在下で、ＭＭ細胞に対するＨＮＫの効果を、ＢＭＳＣｓと同様に評価した。ＩＬ−６もＩＧＦ−１も、ＨＮＫで誘導される増殖阻害を防護しなかった（図９Ａ及びＢ）。図９は、ＨＮＫがＩＬ−６、ＩＧＦ−１及び患者ＢＭＳＣｓへの付着の防護効果を克服できることを示す。ＭＭ．１Ｓ細胞は、２人のＭＭ患者（Ｃ及びＤに示される）に由来するＩＬ−６（Ａに示す）、ＩＧＦ（Ｂに示す）又はＢＭＳＣｓの有無において、ＨＮＫの所定濃度により４８時間処理した。ＤＮＡ合成は、４８時間の培養の最後の８時間、［３Ｈ］−チミジン取り込みをにより測定した。値は、３回の培養における平均±ＳＤを表す。２人のＭＭ患者に由来するＢＭＳＣｓへのＭＭ細胞の結合によりＤＮＡ合成が活性化し、それはＨＮＫ（図９Ｃ及びＤ）により阻害された。重要なことに、ＨＮＫは、同様の濃度でＢＭＳＣｓの生存率（比色アッセイにより測定）に影響を及ぼさなかった。
【０２４７】
更に増殖シグナル伝達へのＨＮＫの効果を詳細に解析するために、ＭＭ．１Ｓ細胞を２．５％のＦＣＳで３及び６時間、１０μｇ／ｍＬのＨＮＫによる前処理に続いて、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）により１０及び２０分間刺激した。ＨＮＫは著しくＳＴＡＴ−３のリン酸化を減少させ、ＥＲＫ及びＡｋｔがＩＬ−６で（ＩＧＦ−１により誘発されるＥＲＫ及びＡｋｔと同様に）誘導される（図１０Ａ及びＢ）。図１０Ａは、２．５％ＦＣＳ含有培地でＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により３及び６時間前処理されたＭＭ．１Ｓ細胞を示す。細胞を更に１０及び２０分間ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。全細胞可溶化物は、リン酸化及びＳＴＡＴ３、ＥＲＫｌ／２及びＡｋｔのタンパク質発現を評価するウエスタンブロッティングに供した。図１０Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を、３及び６時間、２．５％ＦＣＳ含有培地で、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により前処理し、更に１０及び２０分間ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）により刺激した。全細胞可溶化物は、リン酸化及びＥＲＫ１／２及びＡｋｔのタンパク質発現のためのウエスタンブロッティングに供した。ｇｐ１３０及びｇｐ８０の負の制御は、ＨＮＫ処理の後にも観察された（図１０Ｃ）。図１０Ｃは、３及び６時間、２．５％ＦＣＳ含有培地で、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍＬ）により前処理されたＭＭ．１Ｓ細胞を示す。全細胞可溶化物は、カスパーゼの裂開及びｇｐ８０及びｇｐ１３０の発現を測定するために、ウエスタンブロッティングに供した。
【０２４８】
ＢＭの微細環境はＭＭ細胞の薬剤耐性を与えるため（Ｄａｍｉａｎｏら、Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：００：００１６５８−１６６７）ＢＭ微細環境を模倣した。外因性ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びＢＭＳＣｓとＭＭ細胞との共培養における、ＨＮＫの細胞毒性上の効果を解析した。ＢＭＳＣｓ、ＩＬ−６又はＩＧＦ−１への付着は、ＨＮＫで誘導されるＭＭ細胞死を防護しなかった。ＨＮＫはＩＬ−６により誘導されるシグナル伝達経路の調節を活性化させ、ＩＧＦ−１も更に解析した。ＳＴＡＴ−３、ＥＲＫ及びＡｋｔのシグナル伝達（ＩＬ−６により誘発される）、並びにＥＲＫ及びＡｋｔのシグナル伝達（ＩＧＦ−１により活性化される）は、ＨＮＫによりブロックされた。ＭＭ細胞におけるボルテゾミブ処理したアポトーシスの間の、活性カスパーゼによるＩＬ−６受容体ｇｐｌ３０の細胞質の領域の負の制御が報告されている（Ｈｉｄｅｓｈｉｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００３；２２：８３８６−８３９３）。ｇｐ８０と同様にｇｐ１３０の負の制御はＨＮＫ処理した細胞においても観察され、それによりＩＬ−６で誘導されるシグナル伝達が阻害される。
【０２４９】
ＨＮＫは、ＨＵＶＥＣの血管新生を阻害する。
ＨＵＶＥＣを６時間８μｇ／ｍＬのＨＮＫで培養し、内皮細胞による管形成を解析した。ＨＮＫは著しく管形成（図１１Ａ及びＢ）を阻害したが、その濃度はＨＵＶＥＣ細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。図１１はＨＮＫによるＨＵＶＥＣの血管新生の抑制を表す。ＨＵＶＥＣを、６時間８μｇ／ｍＬのＨＮＫあり（Ｂで示す）、又はなし（Ａで示す）による培養において、管形成を解析した。最初の倍率を×４０とした。
【０２５０】
図１７Ａはまた、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＶＥＧＦで誘導されるＫＤＲ自己リン酸化に対するホノキオールの効果を示す。ＨＵＶＥＣｓを、６０分間担体又はホノキオール（５及び１０μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートし、更に５分間２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦにより刺激した。可溶化液を抗ホスホチロシン（ｐＴｙｒ）抗体により免疫沈降（ＩＰ）させ、更に抗ＫＤＲ抗体（トップパネル）によるイムノブロット（ＩＢ）を行った。底部パネルは、ベース（無処置の細胞の比率を１に設定）に対する倍数変化の平均値のデータを表す。値は、平均±ＳＥ（３回の独立した実験による）である。
＊ｐ＜０．０５  ＶＥＧＦのみに対する、阻害剤がある場合の、ＶＥＧＦによるリン酸化の増加。
図１７Ｂでは、ＶＥＧＦで誘導されるＲａｃ活性化上のホノキオールの効果を解析した。ＨＵＶＥＣｓを、６０分間担体又はホノキオール（１０μｇ／ｍＬ）でプレインキュベートし、更に３分間２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦにより刺激した。Ｒａｃ活性は、ｐ２１活性化キナーゼ１タンパク質の結合ドメインによるアフィニティ沈殿で測定した。
上部（ＧＴＰ結合Ｒａｃの代表的なイムノブロット）。
底部（デンシトメーター分析（±ＳＥを表す）、３回のイムノブロット実験、コントロールに対する倍数として表す）。
＊，ＶＥＧＦのみとの比較、ｐ＜０．０１。
このデータは、ホノキオールがその抗腫瘍活性に加えて血管新生の直接の阻害剤として作用することを示す。
【０２５１】
ＨＮＫ（ＶＥＧＦで誘導されるＶＥＧＦ受容体２自己リン酸化のブロッキング及びＨＵＶＥＣの増殖阻害により明示される）の抗血管新生活性は報告されている（Ｂａｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；２７８：３５５０１−３５５０７）。この実験ではまた、ＨＮＫの毒性投与量以下でＨＵＶＥＣの管形成の抑制が誘導されることが明らかになり、ＨＮＫがＢＭ微細環境で脈管形成を阻害することを示唆した。
【０２５２】
＜実施例４＞
ホノキオールのインビボ効果
図１８は、ヌードマウスのＳＶＲ血管肉腫のインビボ増殖に対するホノキオールの効果を例示する。このデータは、ホノキオールがインビボ腫瘍に対して効果的で、宿主動物に対する非毒性であることを示す。
【０２５３】
＜実施例５＞
ＡＭＰＫ、ＰＬＤ及びＮＦＫＢが含まれる生物学的標的に対するホノキオール類似体候補の機能解析
細胞増殖アッセイ
ＳＶＲ（形質転換内皮細胞株）増殖アッセイが、血管新生を阻害する及び抗腫瘍活性の直接の計測として使用できる。このアッセイは、ＳＶＲ細胞、対、不死化内皮細胞株の（ＭＳ１）増殖における化合物の効果を比較する、ハイスループットスクリーンとして役立つ。このアッセイで１０μＭのＩＣ５０を有する化合物は、活性であるとみなすことができる。以前ホノキオールで示されたように、この最初のアッセイで活性を示す化合物を優先的に用いて、初期ヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、内皮細胞増殖、対、繊維芽細胞増殖を阻害するそれらの能力を試験できる。ＳＶＲ細胞を２４穴プレートに播いた。次の日、培地を阻害剤又は担体コントロールを中程度に含む培地と交換した。細胞を７２時間、３７℃でインキュベートし（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９９  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０，９２５−９２９、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ，Ｋ．Ｒ．，ら、２０００  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５）、菌体数をコールターカウンターを使用して３回測定した（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）。不死化及びＫ−Ｒａｓ形質転換ラット上皮細胞（ＲＩＥｐＺｉｐ及びＲＩＥｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）、並びに繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐ及びＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）を、５％のウシ胎仔血清（ＲＩＥ）又は１０％のウシ血清（ＮＩＨ３Ｔ３）を添加したダルベッコ改良イーグル培地で３７℃で（１０％のＣＯ２）培養した（Ｏｌｄｈａｍ，Ｓ．Ｍ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，６９２４−６９２８、Ｐｒｕｉｔｔ，Ｋ．，ら、２０００  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７５，４０９１６−４０９２４）。６−ウェルプレートに細胞を１０５／ｗｅｌｌで播いた。ベクター及びＲａｓで形質添加したＮＩＨ３Ｔ３及びＲＩＥ細胞を、担体（Ｍｅ２ＳＯの２０μｌ）、又はホノキオール（２ｍｇ／ｍＬのＭｅ２ＳＯストックから）（５、１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に形態変化を観察した。
【０２５４】
ＡＭＰＫ活性化の刺激
ホノキオールはＡＭＰＫ（図２０）を活性化させることができ、それはｐ５３依存性及び独立の経路による腫瘍細胞の増殖を抑制することを示した（Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｇ．ら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １８、２８３−２９３、Ｂｈａｒｔｉ、Ａ．Ｃ．ら、（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３、３１７５−３１８４、Ａｒｂｉｓｅｒ、Ｊ．Ｌら、（１９９８）  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４（３７６−３８３）、Ｗｏｏｄｓ，Ａ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３、２００４〜２００８、Ｓｈａｗ，Ｒ．Ｊ．ら、（２００４）ＰＮＡＳ  １０１、３３２９−３３３５、Ｂｕｚｚａｉ，Ｍ．ら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４、４１６５−４１７３）。図２０に示すように、ＰＣ３細胞は通常酸素条件及び低酸素症条件下でホノキオール処理した。一番上のブロットは、ホノキオールによるＡＭＰキナーゼのン酸化（活性化）の増加を示す。底部のブロットは、全ＡＭＰキナーゼタンパク質（ローディングコントロール）を示す。図２０ｂに示すように、ホノキオールは投与量依存的に前立腺癌細胞のＨＩＦ−１ａを活性化させた。ＰＣ３細胞は、酸素正常状態（左）又は低酸素（右）にてホノキオールで処理した。いずれの場合においてもＨＩＦ−１ａ誘導は投与量依存的であり、低酸素の場合は最少の添加物でなされた。
【０２５５】
化合物はｐ５３欠損ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞株においても試験でき、処理により図２０のようなＡＭＰＫの活性化をもたらすか否かを解析できる。ＰＣ３細胞を２４時間化合物又は担体で処理し、タンパク質を回収し、ＡＭＰＫ（ＡＭＰＫ活性化の標識）のαサブユニットのリン酸化をウエスタンブロット分析した。更に、ＡＭＰＫ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）の基質のリン酸化をウエスタンブロットにより解析できる。化合物によりＡＭＰＫ及びＡＣＣのリン酸化が生じる場合、直接ＡＭＰＫ活性を刺激する化合物の能力は、酵素ＡＭＰＫに化合物を添加することにより評価できる（Ｗｉｎｄｅｒ及びＨａｒｄｉｅ（（１９９６）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３３，Ｅ２９９−Ｅ３０４）。更に、ドミナントネガティブＡＭＰＫ細胞をホノキオール及びホノキオール類似体の、これらの細胞の激増を阻害する能力を試験するために使用できる（Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｇ．ら、（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １８、２８３−２９３）。ホノキオールは直接にインヴィトロで心臓ＡＭＰＫＫを活性化しない。ホノキオールはインシュリンによりグルコース取り込みを強化し、ラット乳頭筋におけるアディポネクチンと同様である。
【０２５６】
ホスホリパーゼＤ活性の抑制
ホノキオール類似体は、ＰＬＤ活性の抑制による腫瘍及び内皮細胞アポトーシスを刺激できる。予備データは、ＳＶＲ細胞が、特に無血清条件の下で、ＰＬＤの高度を発現し、及びそれがＰＬＤ活性の優れたアッセイ方法であることを示す。（図２１、２２）図２１は、ホノキオールが野生型チュベリンの効果をミミックできることを示す。チュベリンによる治療により、回数及び投与量依存的な（ａｋｔの負の制御と同様に）のＳ６キナーゼリン酸化の負の制御が生じる。このように、ホノキオールは野生型チュベリンの作用のいくつかを模倣する。図２２は、０．５％及び１０％のホノキオールがＳＶＲ細胞における血清中のホスホリパーゼＤの活性を阻害することを示す。
【０２５７】
細胞をホノキオール類似体で２４時間し、脂質はフォスターらの方法（（２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８９，１０１９−１０２４）に従って抽出できる。ＰＬＤに対して阻害力を示す化合物は、ＰＬＤ標的（例えばｍＴＯＲ、Ｓ６キナーゼ及びＳ６（図２１））の下流の活性化を阻害するそれらの能力を試験できる。
【０２５８】
ＮＦＫＢ活性化の抑制
ＮＦＫＢは多くの腫瘍細胞（多発性骨髄腫など）における主な生存機構である。おそらくｖｅｌｃａｄｅから独立した経路によるＮＦＫＢの抑制で、ホノキオールはｖｅｌｃａｄｅの活性を強化できる。図２３及び２４は、ホノキオールがＮＦＫＢ活性化をブロックし、従来の化学療法剤に対して腫瘍細胞を感受性にすることを示す。ＮＦＫＢ上のホノキオール活性の迅速なアッセイとして、ＩｋＢａのリン酸化を行うことができる。ＩｋＢａのリン酸化は、ホノキオール治療により減少している。細胞をホノキオール類似体で処理し、２４時間インキュベートした後、可溶化液を調製できる。完全及びリン酸化されたｐ６５のウエスタンブロット分析は標準プロトコルにより実施できる（Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．＆Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，２４９９５−２５０００；Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ，Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．，Ｒｅｕｂｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｄ．，Ａｌｅｘａｎｉａｎ，Ｒ．，Ｒａｊ−Ｖａｄｈａｎ，Ｓ．，Ｅｓｔｒｏｖ，Ｚ．，Ｔａｌｐａｚ，Ｍ．＆Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ１０３，３１７５−３１８４）。
【０２５９】
＜実施例６＞
ＰＢＭ細胞における抗ＨＩＶ−１活性、及びホノキオール及びホノキオール様化合物による細胞毒性アッセイ
ＰＢＭ細胞のＨＩＶアッセイ
合成された化合物及びホノキオールの抗ウイルス活性を、ヒト末しょう血液単核（ＰＢＭ）細胞（表４）のＨＩＶ−Ｉに関して評価した。
【０２６０】
【表４】
2008542192.tif 000186
【０２６１】
ヒト末しょう血液単核（ＰＢＭ）細胞（アトランタ赤十字から入手）は、健常な血清陰性のドナーからフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ不連続勾配遠心沈降により単離できる。細胞を、使用の２〜３日前にフィトヘムアグルチニンＡ（ディフコ、スパークス、メリーランド）により刺激できる。ＨＦＶ−１ＬＡＩのようなＨＩＶ−１は、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）から入手でき、抗ウイルス性のアッセイのための標準的な対照ウイルスとして使用できる。分子伝染性クローンＨＩＶ−１ＸＸＢｒｕ及びＨＩＶ−１Ｍ１８４Ｖｐｉｎは、Ｄｒ．Ｊｏｈｎ  Ｍｅｌｌｏｒｓ（ピッツバーグ大学）から入手できる。感染は一時間で大量にできる（フラスコ（Ｔ２５）における１００ＴＣＩＤ５０／１×１０７細胞によるアッセイ、又は２４穴プレートにおける２００ＴＣＩＤ５０／６×１０５細胞／ウェルによるアッセイ）。細胞を、試験化合物の１０倍の系列希釈を含んでなるプレート又はフラスコに添加してもよい。アッセイ培地は、熱不活性１６％ウシ胎児血清、１．６ｍＭのＬ−グルタミン、８０ＩＵ／ｍＬのペニシリン、８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．０００８％のＤＥＡＥ−デキストラン、０．０４５％のナトリウム重炭酸塩及び２６ＩＵ／ｍＬの組換えインターロイキン２（ケイロン社、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア）を添加したＲＰＭＩ−１６４０であってもよい。ＡＺＴをアッセイ用のポジティブコントロールとして使用できる。無処置の及び非感染ＰＢＭ細胞をコントロールとして、均等な菌体濃度でパラレルに増殖させてもよい。細胞培養は湿潤な３７℃、５％ＣＯ２−空気条件に５日間維持し、上澄みを逆転写酵素（ＲＴ）活性の解析用に回収してもよい。
【０２６２】
上澄みは、ウイルスをペレット化するために２時間、１２，０００回転数／分で遠心分離できる。ペレットを１００μｌのウイルス可溶化バッファー（ＶＳＢ）（０．５％のトリトンＸ−１００、０．８のＭＮａＣｌ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、２０％のグリセロール及び０．０５のＭトリス、各サンプルのｐＨ７．８）とのボルテックスにより可溶化できる。１０μＬを７５μＬのＲＴ反応混合液０．０６Ｍトリス（ｐＨ７．８）、０．０１２ＭのＭｇＣｌ２、０．００６Ｍのジチオスレイトール、０．００６ｍｇ／ｍＬのポリ（ｒＡ）ｎ、１２−１８オリゴ（ｄＴ）、９６μｇ／ｍＬ  ｄＡＴＰ及び０．０８ｍＣｉ／ｍＬの３Ｈ−チミジン三リン酸塩（Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｂｒｅａ、カリフォルニア）１μＭ）に添加し、２時間３７℃でインキュベートしてもよい。反応は、０．０５％のナトリウムリン酸塩を含んでなる１００μＬ  １０％トリクロロ酢酸の添加により停止できる。酸不溶性生成物はパッカードＨａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネティカット）を使用して濾紙で回収でき、ＲＴ活性はパッカードＤｉｒｅｃｔ  Ｂｅｔａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネティカット）で解析できる。ＲＴの結果は、ｍｌあたりのカウント数／分（ＣＰＭ）において表してもよい。抗ウイルス性の５０％有効濃度（ＥＣ５０）及び９０％の有効濃度（ＥＣ９０）は、メジアン効果法を使用して濃度−反応曲線から算出できる（Ｂｅｌｅｎ’ｋｉｉ，Ｓ．Ｍ．；Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｓ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｒｕｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ．Ｒｅｓ．１９９４，２５，１−１１）。
【０２６３】
細胞毒性アッセイ
ホノキオール及びその類似体の細胞毒性を、ヒトＰＢＭ、ＣＥＭ及びベロー細胞（表４）において評価した。
【０２６４】
化合物は、感染してないヒトＰＢＭ細胞、ＣＥＭ（米国菌培養収集所、ロックビル、メリーランドから得られるＴ−リンパ芽球腫細胞株）及びＶｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓）細胞におけるそれらのポテンシャル毒作用を評価できる。健常な血清陰性のドナー（ＨＩＶ−１）の全血から調製できるＰＢＭ細胞は、一段階のフィコール−Ｈｙｐａｑｕｅ不連続勾配遠心沈降により調製できる。対数期Ｖｅｒｏ、ＣＥＭ及びＰＢＭ細胞を、それぞれ５×１０３、２．５×１０３及び５×１０４細胞／ウェルの密度で播種してもよい。全細胞を、被検薬の１０倍の系列希釈を含んでなる９６穴細胞培養プレートにプレーティングしてもよい。Ｖｅｒｏ、ＣＥＭ及びＰＢＭ細胞の培養液を３、４及び５日間、湿潤な５％ＣＯ２、３７℃の条件で一晩インキュベートした。インキュベート終了時、ＭＴＴテトラゾリウム色素溶液（Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ９６？，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を各ウェルに添加し、一晩インキュベートした。反応は、停止可溶化溶液（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）により停止できる。プレートは、ホルマザンの結晶の溶解を確実にするために５時間インキュベートしてもよい。プレートは、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏ−ｔｅｋ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ．，Ｍｏｄｅｌ  ＃  ＥＬ３１２ｅ）を使用して、５７０ｎｍの波長で測定できる。５０％の抑制濃度（ＩＣ５０）は、メジアン効果法を使用して濃度−反応曲線から解析してもよい。
【０２６５】
＜実施例７＞
ホノキオール類似体の細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイ
ＳＶＲ（形質転換内皮細胞株）増殖アッセイが、血管新生を阻害する及び抗腫瘍活性の直接の手段として使用できる。このアッセイは、ＳＶＲ細胞、対、不死化内皮細胞株の（ＭＳ１）増殖における化合物の効果を比較する、ハイスループットスクリーンとして役立つ。このアッセイで１０μＭのＩＣ５０を有する化合物は、活性であるとみなすことができる。以前ホノキオールで示されたように、この最初のアッセイで活性を示す化合物を優先的に用いて、初期ヒト内皮細胞及び繊維芽細胞を使用した、内皮細胞増殖、対、繊維芽細胞増殖を阻害するそれらの能力を試験できる。幾つかの化合物のこのアッセイの結果は、表５に示す。ＳＶＲ細胞を２４穴プレートに播いた。次の日、培地を阻害剤又は担体コントロールを中程度に含む培地と交換した。細胞を７２時間、３７℃でインキュベートし（Ａｒｂｉｓｅｒ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９９  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０，９２５−９２９、ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ，Ｋ．Ｒ．，ら、２０００  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７，１９３７−１９４５）、菌体数をコールターカウンターを使用して３回測定した（Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）。不死化及びＫ−Ｒａｓ形質転換ラット上皮細胞（ＲＩＥｐＺｉｐ及びＲＩＥｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）、並びに繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐ及びＮＩＨ３Ｔ３  ｐＺｉｐＫ−Ｒａｓｌ２Ｖ）を、５％のウシ胎仔血清（ＲＩＥ）又は１０％のウシ血清（ＮＩＨ３Ｔ３）を添加したダルベッコ改良イーグル培地で３７℃で（１０％のＣＯ２）培養した（Ｏｌｄｈａｍ，Ｓ．Ｍ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３，６９２４−６９２８、Ｐｒｕｉｔｔ，Ｋ．，ら、２０００  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７５，４０９１６−４０９２４）。６−ウェルプレートに細胞を１０５／ｗｅｌｌで播いた。ベクター及びＲａｓで形質添加したＮＩＨ３Ｔ３及びＲＩＥ細胞を、担体（Ｍｅ２ＳＯの２０μｌ）、又はホノキオール（２ｍｇ／ｍＬのＭｅ２ＳＯストックから）（５、１０、２０、及び４０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間後に形態変化を観察した。
【０２６６】
【表５】
2008542192.tif 000187
2008542192.tif 000188
2008542192.tif 000189
【０２６７】
＜実施例８＞
ホノキオールは、アポトーシスを強化し、破骨細胞形成を抑制し、ＩｋＢａキナーゼの負の制御及びＮＦ−κＢで制御された遺伝子産物による浸潤を阻害する
材料及び方法
ホノキオール及びマグノロールを単離した（Ｂａｉ，Ｘ．，ら、２００３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７８：３５５０１−３５５０７）。ホノキオールの５０ｍＭ溶液を、１００％のジメチルスルフォキシド中に調製し、小アリコートとして−２０℃保存し、更に細胞培養培地で必要に応じて希釈した。バクテリアから派生した組換えヒトＴＮＦ（５×１０Ｕ／ｍｇの７つの比活性を有するように均一に精製）は、ジェネンテク（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）より贈与された。たばこ煙縮合物を、前述のように調製した（Ａｎｔｏ，Ｒ．Ｊ．，ら、２００２  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２３：１５１１−１５１８）。ペニシリン、ストレプトマイシン、ＩＭＤＭ培地及びＦＢＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（グランドアイランド、ＮＹ）のものを入手した。ＰＭＡ、オカダ酸、Ｈ２Ｏ２及び抗ｂ−アクチン抗体は、Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。ｐ６５、ｐ５０、ＩｋＢａ、サイクリンＤｌ、ＭＭＰ−９、ＰＡＲＰ、ＩＡＰ１、ＩＡＰ２、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ‘、ＶＥＧＦ、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＣＡＭ−Ｉに対する抗体、及びアネキシンＶ染色キットは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手した。抗ＣＯＸ−２及び抗ＸＩＡＰ抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から入手した。リン酸化特異的な抗ＩｋＢａ（セリン３２）、及びリン酸化特異的な抗ｐ６５（セリン５２９）抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手した。抗ＩＫＫ−ａ、抗−ＩＫＫ−ｂ及び抗ＦＬＩＰ抗体は、Ｉｍｇｅｎｅｘ（サンディエゴ、ＣＡ）から贈与を受けた。
【０２６８】
細胞株
ヒト骨髄性のＫＢＭ−５細胞、マウスマクロファージＲａｗ２６４．７細胞、ヒト肺腺癌Ｈ１２９９細胞、ヒト多発性骨髄腫Ｕ２６６細胞、扁平上皮癌ＳＣＣ４及びヒト胚腎臓Ａ２９３細胞は、ＡＴＣＣから入手した。ＫＢＭ−５細胞は、１５％のＦＢＳを添加したＩＭＤＭ培地で培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞はＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養し、Ｈ１２９９細胞及びＵ２６６はＲＰＭＩ  １６４０培地で培養し、Ａ２９３細胞は１０％のＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養した。ＳＣＣ−４細胞は、１０％のＦＢＳ、必須ではないアミノ酸、ピルビン酸塩、グルタミン及びビタミンを含んでなるＤＭＥＭで培養した。全ての培地は、１００のＵ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加した。
【０２６９】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性は改変テトラゾリウム塩３−（４−５−ジメチルチオゾル−２−イル）２−５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイにより解析した（Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ．，ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）。
【０２７０】
ＰＡＲＰ裂開アッセイ
ＰＡＲＰの切断産物の検出のために、ホノキオール処理した細胞を溶解緩衝液で溶解させ、全細胞抽出物を調製した（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０１ｍｇ／ｍＬのアプロチニン、０．００５ｍｇ／ｍＬのロイペプチン、０．４ｍＭのＰＭＳＦ、４ｍＭのＮａＶＯ４）。可溶化液を、不溶性物質を除去するために１０分間の１４０００回転数／分で回転し、１０％のＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離させ、ＰＡＲＰ抗体をプローブとして解析した。
【０２７１】
生死アッセイ
生死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）（細胞内のエステラーゼ活性及びプラズマ膜統合性を解析）を用い、アポトーシスを測定した。このアッセイはカルセイン（ポリアニオン性色素）を使用する方法であり、生細胞中で保持され、緑の蛍光を発する（Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ．，ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）。エチジウムモノマー染料（赤い蛍光）を使用した（傷害性膜もにから細胞に入ることができ、核酸と結合できるが、生細胞の完全な形質膜の場合は除外される）。簡潔には、１つ×１０５の細胞を２４時間、１０ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に３７℃で１６時間、１ｎＭ  ＴＮＦで処理する。細胞を、生死試薬（５ｍＭのエチジウムホモ二量体、５ｍＭのカルセイン−ＡＭ）で着色し、更に３０分間３７℃でインキュベートした。細胞は、蛍光顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ−２、ニコン、東京、日本）下で分析した。
【０２７２】
アネキシンＶアッセイ
アポトーシスの早期の指標として、細胞の細胞質のインタフェースから細胞外の表面への膜リン脂質ホスファチジルセリンの急速な転座及び蓄積がある。この膜の非対称性の損失は、アネキシンＶの結合特性を使用して検出できる。蛍光染料ＦＩＴＣとコンジュゲートさせたアネキシンＶ抗体をアポトーシスの検出に用いた。簡潔には、１×１０６の細胞を、１２時間、３０ｍＭのホノキオールにより前処理し、１６時間１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、更に、アネキシンＶ染色に供する。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗アネキシンＶ抗体で着色し、更にフローサイトメータ分析した（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０２７３】
浸潤アッセイ
細胞外基質の浸潤が腫瘍転移の顕著なステップであるため、膜浸潤培養システムを用いて細胞浸潤を評価した。ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｎｖａｓｉｏｎシステムは、８ｍｍの直径の孔を有する耐光性ポリエチレンテレフタラート膜を有し、再構成された基底膜ゲルでコーティングされたチャンバである（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。合計２．５×１０４のＨ１２９９細胞を無血清培地中に懸濁し、上のウェルに播種した。一晩インキュベーションの後、細胞を、１２時間１０ｍＭのホノキオールで処理し、更に１％のＦＢＳ及びホノキオールがある場合には、更なる２４時間１ｎＭ  ＴＮＦにより刺激した。マトリゲルにより侵入した細胞（すなわちインキュベーションの間、下部チャンバに移動した細胞）を、３７℃で３０分間、ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍＬのカルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で着色し、Ｖｉｃｔｏｒ  ３  ｍｕｌｔｉ−ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で蛍光をスキャンした。蛍光細胞を計数した。
【０２７４】
溶骨細胞分化アッセイ
ＲＡＮＫＬ−で誘導される破骨細胞形成上のホノキオールの効果を決定するために、ＲＡＷ２６４．７細胞（インヴィトロでＲＡＮＫＬにより溶骨細胞に分化できる）を培養した。（Ｂｈａｒｔｉ（Ａ．Ｃ．）ら、２００４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６０６５−６０７６）。ＲＡＷ２６４．７細胞を、１×１０４細胞／ウェルの密度で２４穴プレートで培養し、一晩付着させた。培地を交換し、細胞を１２時間、５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に５ｎＭ  ＲＡＮＫＬで処理した。４及び５日目に、酸性ホスファターゼキット（シグマアルドリッチ）を使用して、上記のように、細胞を酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）発現の解析ために着色し、ウェルあたりのＴＲＡＰ陽性の多核溶骨細胞（＞３の核）を計数した。
【０２７５】
ＮＦ−κＢ活性化
ＴＮＦ（炎症において確立した役割を有する）によるＮＦ−κＢ活性化を解析するために、腫瘍増殖、促進、浸潤及び転移（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００３．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７４５−７５６）、ＥＭＳＡ（Ｃｈａｒｕｒｖｅｄｉ（Ｍ．Ｍ．）ら、２０００  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１９：５８５−６０２）を解析した。簡潔には、ＴＮＦ処理した細胞（１×１０６／ｍＬ）から調製された核抽出物を３７℃で３０分間、ヒト免疫不全症ウイルス末端反復配列（５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ  ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ  ＣＧＣＴＧ  ＧＧＧＡＣＴＴＴＣ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’（下線はＮＦ−κＢ−結合部位を示す））からの３２Ｐ−ラベルされた４５−ｍｅｒ二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（１６ｆｍｏｌのＤＮＡを有する１５ｍｇのタンパク質）でインキュベートし、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成させ、６．６％のネイティブポリアクリルアミドゲル上でフリーのオリゴヌクレオチドから分離する。二本鎖の変異オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＧＴＴＡＣＡＡ  ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ  ＣＧＣＴＧ  ＣＴＣＡＣＴＴＴＣ  ＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧ−３’を、ＤＮＡとＮＦ−κＢの結合特異性を検討するために用いた。結合特異性は、ラベルのないオリゴヌクレオチドとの競合によっても解析した。スーパーシフトアッセイのために、複合体をＥＭＳＡにより分析する前に、ＴＮＦ処理した細胞から調製された核抽出物を３７℃で３０分間、ＮＦ−κＢのｐ５０かｐ６５サブユニットに対する抗体とインキュベートした。免疫前血清（ＰＩＳ）を、ネガティブコントロールとして含めた。乾燥ゲルをＳｔｏｒｍ８２０により視覚化し、放射性バンドをＩｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して定量化した。
【０２７６】
ウエスタンブロット分析
ＴＮＦ依存性のＩｋＢａリン酸化、ＩｋＢａ分解、ｐ６５転座及びｐ６５リン酸化に対するホノキオールの効果を解析するため、細胞質の抽出物をＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）から調製し（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）、１２時間、２５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に０．１ｎＭ  ＴＮＦで数回曝露した。細胞質のタンパク質（３０ｍｇ）を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜へ転写し、５％の脱脂乳でブロッキングし、ＩｋＢａ、リン酸化されたＩｋＢａ、ｐ６５及びリン酸化ｐ６５に対して特異的な抗体をプローブとして解析した。処理した細胞（培地２ｍｌ中、２×１０６細胞）の全細胞抽出物中のサイクリンＤｌ、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ｃＩＡＰ−１、ＴＲＡＦｌ、Ｂｃｌ−２、ＢｆＩ−１、ｃＦＬＩＰ及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を決定するために、５０ｍｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、製造業者の推奨プロトコルに従って特異抗体によるウエスタンブロットにより解析した。ブロッティング膜を洗浄し、１時間ＨＲＰコンジュゲート二次抗体に曝露し、ＥＣＬ試薬（アマシャムファルマシアＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で最後に検出した。バンドを、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア版３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してＰｅｒｓｏｎａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ  Ｓｃａｎ  ｖｌ．３０において定量化した。
【０２７７】
ＩＫＫアッセイ
ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化に対するホノキオールの効果を解析するため、上記の基本的な方法によりＩＫＫを分析した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。簡潔には、全細胞抽出物から複合体ＩＫＫをＩＫＫａ及びＩＫＫｂと反応する抗体で沈殿させ、更にＰｒｏｔｅｉｎ  ＰＪＧ−セファロースビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で処理した。２時間後、ビーズを溶解バッファーで洗浄し、更に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオスレイトール、２０ｍＣｉ［ｇ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１０ｍＭのラベルのないＡＴＰ及び２ｍｇの基質ＧＳＴ−ＩｋＢａ（ａａ１〜５４）を含んでなるキナーゼアッセイ混合液中に再懸濁した。３０分間、３０℃のインキュベーション後、反応を５分間ＳＤＳサンプルバッファーで沸騰させて終了させた。最後に、タンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ゲルを乾燥させ、放射性バンドをＳｔｏｒｍ８２０により視覚化した。各サンプルのＩＫＫａ及びＩＫＫｂの総量を測定するために、５０ｍｇの細胞全体タンパク質を７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜へエレクトロブロットし、更に抗ＩＫＫ−ａ又は抗−ＩＫＫ−ｂ抗体により解析した。
【０２７８】
ＮＦ−κＢ  ｐ６５の免疫局在性
ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座に対するホノキオールの効果を、エピフロレッセンス顕微鏡（Ｌａｂｏｐｈｏｔ−２；Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ  Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＣＦ  ｃｏｌｏｒ  カメラ（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）を使用して免疫細胞化学的な方法により検討したＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ  Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＣＦ  ｃｏｌｏｒ  ｃａｍｅｒａ（Ｎｉｋｏｎ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）。
【０２７９】
ＮＦ−κＢに依存するリポータ遺伝子転写
Ａ２９３細胞におけるＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ遺伝子の転写に対するホノキオールの効果を、従来公知の方法により測定した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。
【０２８０】
ＣＯＸ−２プロモータに依存するリポータ・ルシフェラーゼ遺伝子発現
ＣＯＸ−２プロモータ活性を解析した（Ｓｈｉｓｈｏｄｉａ，Ｓ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：４３７５−４３８３）。更にＣＯＸ−２プロモータに対するホノキオールの効果を解析するため、Ａ２９３細胞を６−ウェルプレートにウェルあたり１．５×１０５細胞の濃度で播種した。一晩培養後、製造業者のプロトコルにより、６ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＴＮＥ  ２０００を用い、各々の細胞をＣＯＸ−２プロモータ−ルシフェラーゼリポータープラスミドを含む２ｍｇのＤＮＡでトランスフェクションした。ＣＯＸ−２プロモータ（−３７５〜＋５９）を、プライマー５’−ＧＡＧＴＣＴＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴ−３’（センス）、及び５’−ＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣ−５’（アンチセンス）を用いて、ヒトゲノムＤＮＡから増幅した。トランスフェクション混合物への６時間の曝露後、細胞を１２時間ホノキオールを含む培地中でインキュベートした。細胞を２４時間、ＴＮＦ（０．１ｎＭ）に曝露し、更に回収した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコルに従ってＬｕｃｌｉｔｅルシフェラーゼアッセイシステム（パーキン−エルマー、ボストン、ＭＡ）を用いて測定し、照度計（ビクター３、パーキン−エルマー）により検出した。全ての実験を３回実施し、それらの再現性を証明するために少なくとも二回繰り返した。
【０２８１】
結果
この実験の目的は、転写制御因子ＮＦ−κＢシグナル伝達経路における、ＮＦ−κＢで制御される遺伝子産物、及びＮＦ−κＢで媒介される細胞反応に対する、ホノキオールの効果を解析することであった。このレチノイドの構造は図２６Ａに示される。トリパンブルー色素排除試験により決定される、使用するホノキオールの濃度及び暴露時間は、細胞の生存率にたいして最小の影響を及ぼした。ほとんどの実験において、ヒト骨髄性のＫＢＭ５細胞がＴＮＦ受容体の両方のタイプを発現させることを示したため、それを使用した。
【０２８２】
ＮＦ−κＢ活性化経路に対するホノキオールの効果を検討する際、この薬剤により活性化される経路が比較的周知だったため、大部分の実験ではＴＮＰを使用した。
【０２８３】
ホノキオールは、ＴＮＦ及び化学療法薬のアポトーシスの効果を強化する。
ＮＦ−κＢ活性化が様々な薬剤により誘発されるアポトーシスを抑制することを示したため（Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐ，ＤＪ．，ら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：７８７−７８９、Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，ら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：７８４−７８７）、ホノキオールがＫＢＭ５細胞においてＴＮＦで誘導される、及び化学療法の薬剤により誘発されるアポトーシスを調節するか否かを解析した。ＴＮＦ及び化学療法剤で誘導されるアポトーシスに対するホノキオールの効果を、ＭＴＴアッセイにより解析した。ホノキオールが、ＴＮＦ、パクリタキセル及びドキソルビシン（図２６Ｂ）の細胞毒性を強化することが判明した。
【０２８４】
カスパーゼ活性化ＰＡＲＰ裂開を用いて、強化された細胞毒性がアポトーシスに起因することを明らかにした。ＴＮＦで誘導されるＰＡＲＰ裂開は、ホノキオール処理した細胞において強化された（図２６Ｃ）。生死アッセイ（細胞内のエステラーゼ活性及び形質膜取り込みを測定）によっても、ホノキオールが５％〜６５％までＴＮＦ誘導アポトーシスを上方制御することが示された（図２６Ｄ）。同様に、アネキシンＶ染色でも、ホノキオールがＴＮＦ（図２６Ｅ）の効果を強化する効果を有することを示した。これらの全てのアッセイの結果は、ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤のアポトーシスの効果を強化することを示唆するものである。
【０２８５】
ホノキオールはＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を抑制する
ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー）がＮＦ−κＢの活性化による破骨細胞形成を誘導するため、（Ａｂｕ−Ａｍｅｒ，Ｙ．，ら、１９９７  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１８９−１１９０）ホノキオールがＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を抑制できるか否かを評価した。ＴＲＡＰの発現により示されるように、ＲＡＮＫＬが溶骨細胞分化を誘導し、ホノキオールがそれを抑制することが発見された（図２７Ａ及び２７Ｂ）。
【０２８６】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤活性を抑制する
ＮＦ−κＢが腫瘍細胞浸潤を媒介する遺伝子産物（例えば、ＭＭＰ−９）の発現を制御することが公知である（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，ら、１９８２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１：２７７−２８８）。ホノキオールがＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤活性を調節できるか否かをインビトロで解析した。解析の際、腫瘍細胞をホノキオールの有無において、ＴＮＦを有するマトリゲル浸潤チャンバーの上部チャンバに播種し、更に浸潤の有無を解析した。図２７Ｃに示すように、ＴＮＦはほぼ５倍腫瘍細胞浸潤を誘発し、またホノキオールはこの活性を抑制した。ホノキオールのみでは浸潤活性を示さなかった。
【０２８７】
ホノキオールは、様々な薬剤により誘発されるＮＦ−κＢ活性化をブロックする
ホノキオールがＮＦ−κＢ活性化を調節するか否かを解析するため、ＴＮＦ、ＰＭＡ、オカダ酸、たばこ煙縮合物及びＨ２Ｏ２などの様々な薬剤により誘発されるＮＦ−κＢの活性化に対するホノキオールの効果を解析した。ＤＮＡ結合実験（ＥＭＳＡ）により、ホノキオールが全てのこれらの薬剤（図２８Ａ）により誘発されるＮＦ−κＢ活性化を抑制することが示された。これらの結果は、ホノキオールが全てのこれらの薬剤に共通であるＮＦ−κＢ活性化経路のステップに作用することを示唆する。
【０２８８】
ホノキオールは、投与量−及び回に依存する方法のＮＦ−κＢ活性化を抑制する
ＥＭＳＡ結果は、ホノキオールのみではＮＦＫＢ活性化に影響を及ぼさないことを示している。しかしながら、用量依存的にＴＮＦ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図２８Ｂ）。ホノキオールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制が、時間依存的であることも示された（図２８Ｃ）。
【０２８９】
ホノキオールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制は細胞型特異的でない
上皮細胞のＮＦ−κＢ誘導経路が、リンパ球の場合と異なることが報告されている（Ｂｏｎｉｚｚｉ，Ｇ．ら、１９９７  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５２６４−５２７２）。異なる細胞型におけるＮＦ−κＢ活性化を阻害するホノキオールの能力を解析した。ホノキオールは完全に胚腎臓細胞（Ａ２９３）及びＴ細胞性白血病（Ｊｕｒｋａｔ）細胞（図２８Ｄ）における、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害し、細胞型特異性がないことを示した。
【０２９０】
ホノキオールは構成的なＮＦ−κＢ活性化を阻害する
ヒト多発性骨髄腫（Ｕ２６６）及び頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ４）腫瘍細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対するホノキオールの効果（構成的に活性ＮＦ−κＢを発現する両者を試験した）。（Ｂｈａｒｔｉ，Ａ．Ｃ．ら、２００３  Ｂｌｏｏｄ．１０１：１０５３−１０６２、Ｇｉｒｉ，Ｄ．Ｋ．及びＡｇｇａｒｗａｌ，Ｂ．Ｂ．１９９８．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４００８−１４０１４）。Ｕ２６６及びＳＣＣ４細胞を、２４時間ホノキオールの異なる濃度で処理し、更にＮＦ−κＢ活性化を解析した。ホノキオールは、用量依存的にの両方の細胞における構成的な活性のＮＦ−κＢを阻害した（図２８Ｅ）。これらの結果は、細胞型特異性がないことを示した。
【０２９１】
ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＤＮＡへの結合に直接影響を及ぼさない
若干のＮＦ−κＢ阻害剤（ＴＰＣＫ（セリンプロテアーゼインヒビター）、ハービマイシンＡ（タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤）及びコーヒー酸フェネチルエステルを含む）は直接ＮＦ−κＢを修飾し、そのＤＮＡ結合を抑制する（Ｆｉｎｃｏ，Ｔ．Ｓ．，ら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１８８４−１１８８８、Ｍａｈｏｎ，Ｔ．Ｍ．，及びＯ’Ｎｅｉｌｌ，  Ｌ．Ａ．１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２８５５７−２８５６４、Ｎａｔａｒａｊａｎ，  Ｋ．，ら、１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：９０９０−９０９５）。ホノキオールが類似の機構によりその効果を媒介するか否かを解析した。ＥＭＳＡは、ホノキオールがＴＮＦ処理した細胞から調製したＮＦ−κＢタンパク質のＤＮＡ結合能力を変化させないことを示した（図２８Ｆ）。これらの結果は、ホノキオールがＴＰＣＫ、ハービマイシンＡ又はＣＡＰＥのそれと異なる機構によりＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示唆する。
【０２９２】
ホノキオールは、ＴＮＦに依存するＩｋＢａ分解を阻害する。
ＩｋＢａの分解がＮＦ−κＢの活性化のために必要であるため（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｓ．，ら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１２７４０−１２７４４）、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化のホノキオールによる抑制が、ＩｋＢａ分解の抑制に起因するか否かを解析した。ＴＮＦが１０分という早い時期に対照細胞のＩｋＢａ分解を誘導することが判明したが、ホノキオールで前処理した細胞では、ＴＮＦはＩｋＢａ分解（図２９Ｂ）に影響を及ぼさなかった。
【０２９３】
ホノキオールは、ＴＮＦに依存するＩｋＢａリン酸化を阻害する
ＩｋＢａ分解に必要とされる、ＴＮＦ誘導ＩｋＢａリン酸化に対するホノキオールの効果を解析した。ＡＬＬＮ（リン酸化されたＩｋＢａの低下を防止する）を用いた。ＩｋＢａのセリンがリン酸化された形のみを検出する抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ＴＮＦがＩｋＢａリン酸化を誘発し及びホノキオールがそれを完全に抑制することを示した（図２９Ｃ）。以上より、ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化及び分解を阻害することにより、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【０２９４】
ホノキオールは、ＩｋＢａのＴＮＦに依存するユビキチン結合を阻害する。
ＩｋＢａ分解をもたらす、ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａのユビキチン結合に対するホノキオールの効果を解析した。高分子量バンドで示されるように、ＩｋＢａを検出する抗体を使用したウエスタンブロット分析により、ＴＮＦがＩｋＢａユビキチン結合を誘導することが示され、ホノキオールはそれを完全に抑制した（図２９Ｄ）。以上より、ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化、ユビキチン結合及び分解を阻害することにより、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した。
【０２９５】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化を阻害する
ホノキオールはＩｋＢａのリン酸化を阻害するため、ＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性化（ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａのリン酸化に必要）に対するホノキオールの効果を試験した。図２９Ｅ（上方パネル）に示すように、ホノキオールは完全にＴＮＦで誘導されるＩＫＫの活性化を抑制した。ＴＮＦ又はホノキオールは、ＩＫＫタンパク質（底部パネル）の発現に対して直接効果を有しなかった。インビトロでＩＫＫ活性上のホノキオールの効果を試験した結果、ホノキオールがＩＫＫ活性を直接妨げないことが判明した。細胞の処理によりＴＮＦで誘導されるＩＫＫ活性が阻害されるため、ホノキオールはＩＫＫの活性化を抑制するはずである。
【０２９６】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座を阻害する
ＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座に対するホノキオールの効果を、ウエスタンブロット分析により試験した。図２９Ｆに示すように、ホノキオールはＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットの核転座を抑制した。同様に、免疫細胞化学的な分析により、ホノキオールがＴＮＦで誘導されるｐ６５の核転座を抑制したことを示す（図２９Ｇ）。
【０２９７】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化を阻害する
ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化に対するホノキオールの効果も試験した。なぜなら、リン酸化はｐ６５の転写活性のために必要であるからである（Ｚｈｏｎｇ，Ｈ．，ら、１９９８  ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．１：６６１−６７１）。図２９Ｈに示すように、ホノキオールはほぼ完全にｐ６５リン酸化を抑制した。
【０２９８】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を抑制する
ＮＦ−κＢに依存する遺伝子転写に対するホノキオールの効果を試験するため、細胞を、ＮＦ−κＢ制御されるＳＥＡＰリポーターコンストラクトによりトランジェントにトランスフェクションし、更にＴＮＦにより刺激した。ＴＮＦはコントロールベクターと比較し、約５倍のＳＥＡＰ活性を示し、ドミナントネガティブＩｋＢａにより阻害された（すなわち特異性を示した）（図３０Ａ）。細胞をホノキオールにより前処理したとき、ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性ＳＥＡＰ発現は、用量依存的に阻害された。これらの結果は、ホノキオールがＴＮＦにより誘発されるＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子発現を阻害することを示した。ホノキオールが、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ及びＴＮＦの一連の中のどの部分で作用するか、及びＮＦ−κＢ活性化の誘導で特徴づけられるＩＫＫ補充を解析するための試験を行った。（Ｈｓｕ，Ｈ．ら、１９９６  Ｃｅｌｌ．８４：２９９−３０８）。ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ、ＩＫＫｂ及びｐ６５プラスミドによりトランスフェクトした細胞で、ＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を誘発させた。ホノキオールは、ｐ６５でトランスフェクションしたものを除いて、全ての細胞のＳＥＡＰ発現を抑制した（図３０Ｂ）。
【０２９９】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を抑制する
ＣＯＸ２プロモータ活性に関するホノキオールの効果は、ＮＦ−κＢにより制御される（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，ら、１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２７０：３１３１５−３１３２０）。図３０Ｃに示すように、ホノキオールは用量依存的にＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を阻害した。
【０３００】
マグノロールもまた、用量依存的にＮＦ−κＢ活性化を抑制する
マグノロールはホノキオールと同様の構造を有する同族体であるため、ＮＦ−κＢ活性化抑制に必要となるマグノロールの投与量を測定した（図３０Ｄを参照）。ＥＭＳＡ結果は、マグノロールのみではＮＦ−κＢ活性化に影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、用量依存的にＴＮＦで媒介されるＮＦ−κＢ活性化を阻害した（図３０Ｅ）。マグノロールによるＮＦ−κＢ活性化の抑制は、ホノキオールのそれと同等だった（図３０Ｅ）。
【０３０１】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１及びＶＥＧＦ発現を阻害する
ホノキオールのこれらの効果がＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１及びＶＥＧＦ遺伝子産物の抑制により媒介されるか否かを解析するため、ＴＮＦで誘導される腫瘍細胞浸潤の抑制におけるホノキオールの効果を解析した。ＴＮＦ処理によりＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２、ＩＣＡＭ−１及びＭＭＰ−９遺伝子産物の発現が誘発され、ホノキオールが発現（図３１Ａ）を阻害したことが示された。
【０３０２】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃ発現を阻害する
サイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃは細胞増殖を制御し、ＮＦ−κＢにより制御される（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００４，Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．６：２０３−２０８）。ホノキオールがこれらの遺伝子産物発現を制御するか否かを解析した。ホノキオールは、回数に依存的にサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃのＴＮＦで誘導される発現を阻害することが示された（図３１Ｂ）。
【０３０３】
ホノキオールは、ＴＮＦで誘導される抗アポトーシス関連の遺伝子産物の活性化を阻害する
上記の結果は、ホノキオールがＴＮＦにより誘発されるアポトーシスを強化することを示した。ホノキオールのこの効果が抗アポトーシス遺伝子産物の抑制によるものか否かを解析した。ＮＦ−κＢは、ｃＩＡＰｌ、ｃＩＡＰ−２、ＢＣｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦｌ及びサヴァイヴィンなどの多くの腫瘍細胞生存関連遺伝子の発現の上方制御に関与する（Ａｇｇａｒｗａｌ、Ｂ．Ｂ．２００４  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．６：２０３−２０８）。ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるこれら全てのタンパク質の発現を阻害した（図３０Ｃ）。本実験は、ＮＦ−１ＩｄＢ活性化経路に対する、及びＮＦ−κＢで制御される遺伝子産物の腫瘍細胞生存、増殖、浸潤、血管新生及び転移（図３２を参照）制御に対するホノキオールの効果を解析すべく設計した。ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤により誘発されるアポトーシスを強化し、ＴＮＦで誘導される浸潤及びＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成を阻害することが判明した。ホノキオールは、様々な細胞株における、発癌物質、発癌プロモータ及び炎症性刺激により活性化するＮＦ−κＢを抑制した。この抑制はホノキオールによるＩＫＫの抑制によりなされ、それはリン酸化の抑制及びＩｋＢａの分解をもたらした。ホノキオールはまた、ＴＮＦで誘導されるｐ６５のリン酸化、核ｐ６５の転座及びＮＦ−κＢ依存性のリポータ遺伝子活性を阻害した。抗アポトーシス（ＩＡＰ１、ＩＡＰ−２、サヴァイヴィン、Ｂｃ１−２、Ｂｃ１−ｘ１、ＴＲＡＦ１及びｃＦＬＩＰ）、増殖（サイクリンＤ１及びｃ−Ｍｙｃ）及び転移（ＭＭＰ−９、ＣＯＸ２及びＶＥＧＦ）関連遺伝子産物の発現もまた、ホノキオールにより抑制された。
【０３０４】
＜実施例９＞
ホノキオールはアポトーシス及び細胞周期停止を誘発し、インビトロ及びインビボの乳癌細胞増殖を阻害する
乳癌に対するホノキオールのインビトロ及びインビボ活性を解析した。
【０３０５】
材料及び方法
化学物質、抗体及び構造物：
ホノキオール（本明細書でＨＮＫと称される）は、７５ｍＭの原液を調製するためにエタノールに溶解させ、更に培地中に溶解し必要な濃度の使用液を調製した。ベンゾイルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）をＤＭＳＯに溶解し、５０μＭとした。４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＨＴ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）、ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン（登録商標））、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、及びＳＡＨＡ（メルク社、ホワイトハウス駅、ＮＪ）を増殖培地で希釈し、所定濃度で、ＨＮＫとともに細胞に直ちに添加した。プロテアーゼインヒビター（完全）カクテルは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡから入手した。この実験において使用する抗体は、以下の通りである。抗ｐ２１（Ｈ−１６４）、抗ｐ２７Ｋｉｐｌ（Ｃ−１９）、抗サイクリンＤｌ（Ｈ−２９５）、抗ＰＡＲＰ−１、抗ＢＣＬ−２（Ｎ−１９）、抗Ｂａｄ及び抗Ｂａｘ（全てＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡから入手）、抗ＥＲＫ及び抗ホスホＥＲＫ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ、サンノゼ、ＣＡ）、抗カスパーゼ９（９５０２）、抗カスパーゼ８（９７４６）及び抗カスパーゼ３（９６６８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、抗グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）、抗アクチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウス免疫グロブリンＧ及び抗ウサギ免疫グロブリンＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヤギ（ｓｃ−２０２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）。
【０３０６】
細胞株：
全ての細胞株をＡＴＣＣから入手した。
【０３０７】
使用する乳癌細胞系：
ＭＣＦ−７及びＢＴ−４７４細胞（１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で増殖）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６及びＴ４７−Ｄ細胞（１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地中で増殖）。多形性神経膠芽腫細胞株（Ｕ３４３及びＴ９８Ｇ）は、１０％のＦＣＳを含む修飾ＤＭＥＭ培地において培養した。
【０３０８】
ウエスタンブロット分析：
細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（完全）と共に、バッファー（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２％のＮＰ−４０）中で溶解させ、全タンパク質を抽出した。タンパク質抽出物のほぼ５０〜１５０μｇを、１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）電気泳動的で分離し、ＰＶＤＦ膜上へゲルからブロッティングした。膜を更に１時間室温で、ブロッキングバッファー（１×ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．８％ＮａＣｌ及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）中、５％の脱脂粉ミルク）でブロッキングした。膜をブロッキングバッファー中の一次抗体でインキュベートし、続いてＨＲＰラベルした二次抗体でインキュベーションした。免疫活性は、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で検出されて、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で視覚化した。結果の定量化は、Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ  ２０００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）を使用して実施した。
【０３０９】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）増殖アッセイ：
３×１０３の細胞／ウェルを、１０％のＦＣＳを含む適当な培地で培養し、９６穴プレートにおいて、コントロール担体又は様々な濃度のＨＮＥｌで、それらのみ、又は第２の薬剤と共に処理した。全ての第２の薬剤を新鮮な培地で希釈し、ＨＮＫとともに細胞に直ちに添加した。３７℃（５％のＣＯ２）の２４時間のインキュベーションの後、細胞を、１０％のＭＴＴ試薬で４時間培養した（５ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）。培地を除去し、細胞をジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた。ホルマザン生成物の吸光度を、酵素結合免疫吸着アッセイリーダー（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）で測定した。
【０３１０】
細胞周期アッセイ：
２４時間において示されるように、５×１０６の細胞を、１０％のＦＣＳを含む適当な培地で培養し、コントロール担体又はＨＮＫの様々な濃度で処理した。処理後、細胞を回収し、メタノールで固定し、プロピジウムイオジド（ＰＩ、Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）で着色した。フローサイトメトリは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎディキンソン、フランクリンＬａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ設備で実施した。
【０３１１】
アポトーシス分析：
５×１０６の細胞を、１０％のＦＣＳを含んでなる適当な培地に播き、２４時間、様々な濃度のＨＮＫ又はコントロール担体で処理した。処理後、細胞を回収し、メタノールで固定し、プロピジウムイオジド（ＰＩ、Ａｂｅａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）で着色した。フローサイトメトリは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎディキンソン、フランクリンＬａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ設備で実施した。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを使用たカスパーゼ活性阻害の試験のために、５×１０６の細胞を、ＨＮＫの添加の前に、６０分間５０μＭ  ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋでインキュベートした。
【０３１２】
動物試験：
全ての動物を、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  ＭｅｄｉｃａｌセンターにおいてＡｎｉｍａｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙのために確立したＮＩＨ及びガイドラインに従って維持し、動物実験を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を回収し、滅菌済ＰＢＳで二回洗浄し、計数し、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）中に再懸濁した。６週間齢の雌のａｔｈｙｍｉｃヌードマウスに、１×１０６の細胞／１００μｌの細胞濃度で、両方の脇腹に皮下注射した。マウスを、総容積０．３ｍｌの２０％イントラリピド（バクスターＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）において懸濁したＨＮＫ（２ｍｇ／日）又は担体コントロールで毎日腹腔内注射した。５匹のマウスを各群で用いた。最高５週間、線形カリパス副木でサイズを計測し、体積を方程式Ｖ＝（ａ×ｂ２）×０．５２３６を使用して推定されたした（ａは大きい寸法、ｂは垂直方向の直径）。
【０３１３】
インヴィトロによる薬剤相互作用モデル：
２つの薬剤間における相互作用の解析は、付加モデルを使用して行った（Ｘｕ  Ｄ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｊａｎ７；［Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ；ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｓｅｐ；４３（９）：３９９８−４００６）。モデルでは、その構成要素の効果の生成物に等しい組合せの効果を予測する。例えば、複合製剤がそれぞれ４０％及び６０％の生存率を生じさせる２つの単一薬から構成される場合、組合せは２４％（０．４×０．６）の生存率に結果としてなると考えられる。原理は、付加モデルにより予測したより高い値が得られたときは相乗効果とし、低い値のときは劣加法的効果とする。観察された生存率と付加モデルで予測された生存率間の比率は、全ての組合せにおいて算出した。比率が１．２を越える場合、相互作用は劣加法的と分類され、０．８未満では相乗的、０．８及び１．２間の比率では添加的とする。
【０３１４】
統計分析：
連続変数における結果は、平均±標準偏差として示した。分類変数における結果は、数（％）として示した。連続変数における２群での違いは、Ｔ検定により評価した。分類変数のける２群での違いは、カイ二乗検定により測定した。全ての有意性試験は、両側検定で行った。＜０．０５のＰ値は、統計学的に有意であるとみなされる。
【０３１５】
結果
ＨＮＫは乳癌細胞増殖を阻害する。
【０３１６】
乳癌細胞を２４時間、ＨＮＫの異なる濃度で処理し、ＭＴＴアッセイを行い生存率を評価した。選択された細胞株は、エストロゲンレセプタ（ＥＲ）ＨｅＲ２及びｐ５３の異なる表現型及び異なる発現パターンを有し、すなわち乳癌の様々なサブクラスであることを表す。全５つの細胞株は、ＨＮＫ（図３３Ｂ−Ｆ）に応答し、生存率の用量依存的な減少を示した。５０％（ＬＣ５０）生存率を減少させる濃度は、ＥＲ陽性のＢＴ−４７４細胞の５０μＭから、低分化ＳＫＢＲ−３細胞の２９μＭにわたった。同様の分析を、２つの多形性神経膠芽腫細胞株、Ｕ３４３及びＴ９８Ｇにおいても実施した。同じ投与量範囲（１０−７０μＭ）において、両方の細胞株はＦＩＮＫへの抵抗性を示した（図３４Ａ、Ｂ）。
【０３１７】
ＨＮＫはＳＡＨＡの増殖阻害を強化する
【０３１８】
ＨＮＫはＢ−ＣＬＬ及び多発性骨髄腫で、毒性を強化し、細胞毒性を有する化学療法に対する耐性を克服することが報告されている。ＨＮＫは近年では、乳癌細胞系ＭＣＦ−７／ＡＤＲの多種薬剤耐性（ＭＤＲ）を克服することも示されている。２つの乳癌細胞系（ＭＣＦ−７（ＥＲ陽性、野生型ｐ５３）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲ陰性、突然変異ｐ５３））に対する異なる作用機構を有する５つの薬剤の増殖抑制作用に対する、ＨＮＫの効果を解析した。コントロール担体又は付加的な薬の一定量と共に、細胞を、１０〜５０μＭの範囲のＨＮＫの様々な投与量で２４時間処理し、生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。薬剤は以下からなる。細胞毒性の化学療法薬（パクリタキセル２５０ｎＭ及びドキソルビシン３００ｎＭ）、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＨＴ）１００ｎＭ（エストロゲン経路の阻害剤）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスベロイルアニリドビスヒドロキシアミド（ＳＡＨＡ、２μＭ）。全てのこれらの薬剤は乳癌細胞に対して周知の活性を有し、４０％未満の増殖阻害が生じる投与量で使用した。付加モデルを使用して薬剤相互作用を評価した。このモデルによる分析は信頼性が高い手段であると確認されている（Ｘｕ  Ｄ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２００６  Ｊａｎ  ７；［Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ；ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８３  Ｓｅｐ；４３（９）：３９９８−４００６）。ＨＮＫは、全てのこれらの薬の活性を強化した。しかしながら、相乗効果は、ＨＮＫ及びＳＡＨＡ、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤の組合せのときにのみ観察された（図３５Ａ、Ｂ）。この効果は、ＳＫ−ＢＲ−３、ＺＲ．−７５及びＢＴ−４７４乳癌細胞系に対しても、この組合せにより観察された。ＨＮＫ及び試験される他剤の組合せの場合も付加効果が観察された（図３５ＣからＧ）。
【０３１９】
ヒト乳癌に対するＨＮＫのインビボ活性
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をヌードマウス（注入あたり１×１０６細胞、グループあたり５匹のマウス、各マウスあたり２つの腫瘍）の両方の横腹に注入し、腫瘍増殖を毎週モニターした。これらの細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を容易に形成する能力（ｌａｃｒｏｉｘ）及びそれらのＨＮＫへの感度に基づいて選択した。マウスは４週間、２ｍｇのＨＮＫ（１００ｍｇ／ｋｇ）又はコントロール担体を毎日注射して処理した。腫瘍を毎週測定した。ＨＮＫ処理により、腫瘍増殖が停止した（２週目から、ｐ＜０．０２）（図３６）。
【０３２０】
ＨＮＫは、乳癌細胞系のアポトーシスを誘導する
ＨＮＫは、広範囲にわたる悪性の細胞タイプのアポトーシスを誘導することを示した。乳癌細胞系のアポトーシス及び細胞死を誘導するＨＮＫの能力を解析した。ＭＣＦ−７細胞をＨＮＫ（６又は２４時間、６０μＭ）で処理し、アポトーシス及び細胞死をアネキシンＶ及びＰＩ染色（図５Ａ）を使用して評価した。２４時間のＨＮＫ処理後、アネキシンＶ陽性、Ｐｉ陰性細胞の数が著しく増加した１％±０．５％〜１６％±３％（ｐ＜０．０５、図３７Ｂ）。ウエスタンブロット分析では、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の分解、ＨＮＫ処理に続くカスパーゼ８の濃度低下が明らかに示された（図３７Ｃ）。ＢＡＸのアップレギュレーションもみられたが、ＢＣＬ−２又はＢＡＤの顕著なレベル変化がは観察されなかった（デンシトメトリ分析の結果、コントロールと比較し４０μＭで８５％増加）。アポトーシスの部分阻害のみが、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理後に認められた。
【０３２１】
ＨＮＫは乳癌細胞系の細胞周期を減速させる。
細胞周期に対するＨＮＫの効果を、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において評価した（２４時間、１０μＭ又は３０μＭのＨＮＫ）。ＨＮＫのこれらの投与量は、両方の細胞株におけるＬＣ５０未満である。両方のＨＮＫ投与量は、著しくＳ期におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数を減少させた（コントロールでは２６％、１５％及び１０％、１０μＭ及び３０μＭ群、ｐ＜０．００５、図３８Ａ−Ｂ）。顕著な効果が、ＭＣＦ−７細胞（Ｓ期のコントロールでは２６％、２０％及び２０％、１０μＭ又は３０μＭ群、図ＣＤ）では観察されなかった。Ｇ１細胞周期調節（ｍａｓｓｇｕｅ）に関係するタンパク質の発現を、ウエスタン分析を使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において解析した。ＨＮＫ処理（２４時間の２０、４０及び、６０μＭ  ＨＮＫ）により、サイクリンＤｌのレベルが低下し、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ｐ２７Ｋｉｐ１及びｐ２１Ｃｉｐ１／ＷＡＦｌの発現が上方制御された（図３８Ｅ）。
【０３２２】
ＨＮＫは増殖シグナル伝達経路を阻害する。
内皮細胞では、ＨＮＫは、ＫＤＲ受容体及びその下流のシグナル伝達カスケード（ＭＡＰＫ及びＡＫＴ経路）の活性を阻害する。乳癌では、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路は表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）により活性化す、それは乳癌の主な原因となる。ＥＧＦＲで媒介されるシグナル伝達は、特にＥＲ陰性乳癌において重要であり、その抑制はＥＲ陰性細胞（例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の増殖を遅らせる。ＥＧＦＲの発現に対するＨＮＫの効果及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の活性を解析した。ＥＧＦＲの発現及びＡＫＴ及びＥＲＫ２のリン酸化（細胞外シグナル制御キナーゼ２）が、処理後に減少した。この実施例では、ＨＮＫがアポトーシスを誘発して、乳癌細胞の細胞周期を減速し、インビボ乳癌に対して系統的に活性を有することが示された。更に、治療的に有益なＨＮＫ投与量は、動物にとり寛容できるものであった。これらの結果は、ＨＮＫのみ、又は他剤との組み合わせにより、乳癌治療の有効な治療薬となりうることを示唆する。
【０３２３】
＜実施例１０＞
ホノキオールはアポトーシス及びミトコンドリアへ基礎キナーゼ分解を誘導する
材料及び方法
Ｈｄ  ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭで培養した。細胞を１０、２０又は４０μｇ／ｍＬで１〜２４時間、ホノキオールで処理し、回収した。Ｓ６Ｋ、Ｓ６及びＡＫＴのリン酸化を、リン酸化特異的な抗体によるウエスタンブロッティングで測定した。タンパク質レベルもまた、それぞれの抗体により測定した。全ての抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ社から購入した。
【０３２４】
細胞培養：
ＳＶ４０不死化ポリクローン性ｗｔ及びＢａｘ／Ｂａｋ（Ｂａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ）ＭＥＦ細胞株（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋら、２００２）と同様に、ｍＡｋｔ又はコントロールベクター（Ｋｅｎｎｅｄｙら、１９９９））を安定発現するポリクローン性のＲａｔ  Ｉａ繊維芽細胞を、実験に用いた。細胞は、特に明記しない限り、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で日常的に維持した。
【０３２５】
アポトーシスの誘導：
ホノキオールは、ＤＭＳＯにおいて調製されて、５時間の時間の間示される濃度で、無血清ＤＭＥＭの細胞に添加した。
【０３２６】
ＤＡＰＩ染色：
４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）染色のために、細胞はホルムアルデヒド解決の培地への添加により固定した。ＤＡＰＩ染色はＫｅｎｎｅｄｙら、１９９９の方法に従い行った。
【０３２７】
ＨＫ活性アッセイ：
ＨＫ活性は、ゴットロープその他、２００１に記載のような、標準的なＧ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ−共役分光光度アッセイで測定した。全細胞可溶化物は、短時間超音波処理（１５秒）により調製した（ホモジェネーションバッファー：４５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのグルコース及び０．５ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８．２））。平行して、ミトコンドリア増量フラクションを、二倍量の細胞を使用して、ゴットロープその他、２００１に記載の方法で、機械的な溶解及び分画遠心分離を介して、２５０ｍＭのスクロース／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／１ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ７．４）のバッファー中に再懸濁し調製した。タンパク質濃度は、市販の試薬及び標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してブラッドフォード法により、細胞全体及びミトコンドリア増量サンプルについて一様に測定した。ＨＫ活性は、全細胞可溶化物又はミトコンドリア増量画分の、全グルコースのリン酸化能として測定した。（最終的なアッセイ混合液：５０ｍＭのトリエタノールアミン塩化物、７．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１１ｍＭのモノチオグリセロール、４ｍＭのグルコース、６．６ｍＭのＡＴＰ、０．５ｍｇのＮＡＤＰ／ｍＬ及びイーストＧ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（シグマ社）０．５Ｕ／ｍＬ、各サンプルのｐＨ８．５）。ＨＫ活性はランバート−ベール法によるＮＡＤＰＨ形成の共役速度として算出した。
［（Ａ３４０／ｔ）／ε］×希釈因子／［タンパク質］
（式中、ε（６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）は３４０ｎｍのＮＡＤＰ時間吸光係数であり、ｔは時間であり、［タンパク質］はタンパク質濃度である。）
ｍｔＨＫ活性（％）は、式［（ｍｔＨＫ活性ミトコンドリアタンパク質／細胞内の総タンパク質）／細胞全体ＨＫ活性］×１００より算出した。
【０３２８】
結果
増殖因子の非存在下での０〜４０μｇ／ｍＬホノキオール処理後の、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞（図３９Ａ）又は野生型のアポトーシス及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ（図３９Ｃ）細胞の反応速度論を示す。Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞（図３９Ｂ）又は野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ（図３９Ｄ）細胞株は、ホノキオールの有無において、増殖因子を含めずに、ミトコンドリアと関連した全細胞ヘキソキナーゼ活性のパーセンテージを測定した。
【０３２９】
＜実施例１１＞
ホノキオールによる関節炎の治療
図４０に示すように、メスＣ５７Ｂ１／６マウスを、ＮＣＩから生後５〜８週間目で購入した。ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ導入遺伝子（ＣＤ４０−／−）を発現している雌のマウスを、発明者の遺伝子導入マウス設備において生育させた。マウスをナイーブにし、１００ｍｇのＴｙｐｅＩＩチキンコラーゲン（シグマ社）を１０ｍＭ酢酸に溶解し、５ｍｇ／ｍＬのＨ３７  ＲＡ熱殺菌済ミコバクテリウム（ディフコ社）（ＣＦＡ）を含んでなるＩＦＡ（シグマ）にてエマルジョンとし、尾部の皮下に免疫（又はＣＦＡ中でエマルジョンにした１ｍＭ酢酸を免疫）した。接種後日２１に一部を死亡させた。インビボでのホノキオール処理により、Ｃ５７Ｂ１／６及びＬＭＰｌトランスジェニックマウスの病理において、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）が抑制されたが、ネガティブコントロールのレベルまでは阻害しなかった（図４０）。更に、処理したホノキオールからの抗原想起リンパ節培養組織）では、ＣＩＩ免疫マウスは、ＩＬ−１０産生については変更なく、減少した増殖及びＩＦＮ−ｇ産生を示した。メスのＣ５７ＢＬ／６又はｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（４ｅ５／ウェル）からの鼠径部及び傍大動脈リンパ節を、熱変性ＴｙｐｅＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）により培養し、増殖（３Ｈ編入、ＣＰＭ）及びサイトカイン産生（ＥＬＩＳＡ）のために評価した。マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。ホノキオール処理したマウスは、不変のＩＬ−１０産生と共に、増殖及びＩＦＮ−ｇ産生減少を示した。ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。メスのＣ５７ＢＬ／６又はｍＣＤ４０−ＬＭＰ１  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。培養液上清のＩＬ−６は、ＥＬＩＳＡにより評価した。マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。更に、メスのＣ５７ＢＬ／６又は、ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。ＴＮＦ−ａは、ＥＬＩＳＡにより評価した。マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。ＣＤ４０媒介によるＩＬ−６及びＴＮＦα産生も評価した。
【０３３０】
ＬＭＰ１  Ｔｇマウスでは、ネガティブコントロールマウスでさえ、ＩＬ−６及びＴＮＦαへの反応が減少していた。しかしながら、Ｂ細胞ＩＬ−１０産生に対するホノキオール処理の役割を分析することにより定まるＩＬ−１０は、影響を受けなかった。更に、メスのＣ５７ＢＬ／６又は、ｍＣＤ４０−ＬＭＰｌ  Ｔｇマウス（Ｉｅ５／ウェル）から負に選択した脾臓Ｂ細胞を、マウスＣＤ１５４（ＣＤ４０のリガンド）を発現しているバキュロウイルス（ＷＴ）で感染させたＨｉ５昆虫細胞（２．５ｅ４ｗｅｌｌ）と共培養した。培養上清のＩＬ−１０は、ＥＬＩＳＡにより評価した。マウスは、免疫後７０日で、ＣＩＦＣＦ又はＣＦＡのみ（又はナイーブ）で評価した。何匹かのマウスを、免疫後２１〜７０日においてホノキオール（３ｍｇ／日）で曝露した。
【０３３１】
マウスＢ細胞株実験（ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌ及びＭ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰ１）
ホノキオールはＣＤ４０／ＬＭＰ１媒介されたＩＬ−６（用量依存的方法のＴＮＦ−ａ産生）を阻害するが、ＩＬ−１０又はＩＬ−４は阻害しなかった（図４１）。図４１に示すように、ＣＨ１２．ＬＸ細胞（ＩＬ−６のときは１×１０５；ＴＮＦ−ａのときは４×１０５）をｈＣＤ４０−ＬＭＰｌにより安定にトランスフェクショし、±ホノキオール（１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０又はアイソタイプコントロール（ＩＣ）又は（ＩＬ−６のときは２．５×１０４；ＴＮＦ−ａのときは１×１０５）ＣＤ１５４又はＷＴバキュロウイルスを発現しているＨｉ−５昆虫細胞を有する培地（ＢＣＭ））で所定時間刺激した。培養液上清のＩＬ−６及びＴＮＦ−ａレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。
【０３３２】
ＣＨ１２による次の免疫グロブリンＭ産生。
ＬＸ細胞も、影響を受ける（ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌ細胞による免疫グロブリンＭ分泌により解析できる）。前述したように、免疫グロブリンＭ分泌は、溶血プラークアッセイ法で測定した（ＧＡ  Ｂｉｓｈｏｐ．１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（４）：１１０７−１１１４）。ホノキオールは、免疫グロブリンＭ産生を阻害した。更に、データは、ＮＦＫＢ及びＪＮＫがＣＤ４０及びＬＭＰｌ活性化に関与する経路のうちの２本であることを示す。ＮＦＫＢ活性化（ルシフェラーゼ・アッセイ）は、投与量に依存する方法（図４２）のホノキオールにより阻害したが、必ずしもベースライン（特にＣＤ４０−ＬＭＰｌを介して）までは到達しなかった。マウスＭ１２．４．１細胞（１．５×１０７）（安定して、ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌキメラ分子によりトランスフェクションされた）を、２０ｍｇの４×ＮＦＫＢルシフェラーゼリポータープラスミド及び１ｍｇのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼベクターによりエレクトロポレーションによりトランジェントにトランスフェクションした（ｐＲＬ−ｎｕｌｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を１５分間氷上に置き、３０分間、培地（ＢＣＭ）のみで処理、１０ｍｇ／ｍＬ  抗ＴＮＦ−ａ（ＭＰ６−ＸＴ３；ＭＰ６−ＸＴ２２）で処理、又は１００ｍＭのホノキオールでのみ処理し、更にＢＣＭ、１０ｍｇ／ｍＬの抗−ｍｏｕｓｅ又は抗ヒトＣＤ４０又はアイソタイプコントロールで更に６時間インキュベートした。刺激の後、細胞を比較的ルシフェラーゼ活性（ＮＦＫＢ：Ｒｅｎｉｌｌａ）のためにペレット化し、溶解し、製造業者のプロトコル（プロメガ）に従い、ターナーデザイン２０／２０照度計を使用して、アッセイ（２秒の遅延：１０秒の測定）した。（注：抗ｍＣＤ４０は、内生的なＣＤ４０と反応し、抗ｈＣＤ４０は、トランスフェクションしたｈＣＤ４０−ＬＭＰ１と反応する）。更に、ＩｋＢａリン酸化はホノキオールにより完全に阻害されないが、ＩｋＢａの分解後の再蓄積の用量依存性阻害が見られた。全細胞及び細胞質フラクションでは、少ないＮＦＫＢ２  ｐ１００がｐ５２にプロセシングされ、ＲｅＩＢはホノキオールがある場合には、効率的に活性化しなかった（増加及び続く減少）。存在するにもかかわらず、ホノキオール処理によっても、ＣＤ４０／ＬＭＰ１が媒介するｐ５２（被治療）及びＲｅＩＢ（ＮＦＫＢ２複雑なタンパク質）の核移行（ｐ５２がＲｅ１Ｂより多い）が減少した。ＪＮＫリン酸化は、ホノキオールにより投与量依存的に阻害された。ｈＣＤ４０−ＬＭＰｌで安定にトランスフェクションしたＣＨ１２．ＬＸ細胞（１×１０６）を、±ホノキオールで数回、培養培地（Ｍ）、１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０又はアイソタイプコントロール（ＩＣ）で刺激した。細胞を遠心沈降によりペレット化し、溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。ペルオキシダーゼラベルされた抗体を、ＪＮＫリン酸化のアッセイ用の化学発光検出試薬を使用してウエスタンブロットで視覚化した。
【０３３３】
＜実施例１２＞
癌細胞に対するＴＳＡ及びホノキオール処理の組合せ
図４３では、ホノキオールとトリクロスタチンＡ（ＴＳＡ）（ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）との組み合わせによる処理後の、癌細胞生存率に対する効果を解析した結果を示す。
【０３３４】
ＳＨＳＹ５Ｙ及びＳＨＥＰ神経芽腫細胞を、０〜１μＭ  ＴＳＡのみ、又はホノキオールとの組み合わせで処理した。結果は、ＴＳＡのみと比較して、ＴＳＡ及びホノキオールの併用療法後における生細胞の顕著な減少率（％）を示した。
【０３３５】
本発明はその好ましい実施態様を記載している。本発明のバリエーション及び変更は、上記の発明の詳細な説明から当業者にとり自明である。これらの全てのバリエーション及び変更は本発明の範囲内に包含されると解される。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】ホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物構造の実例である。
【図２】図１、３及び４に示されるホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物の構造式中の代表的な官能基を例示する線図である。
【図３】図１のホノキオール型化合物及びマグノロール型化合物構造と構造的に類似する代表的な構造を例示する。
【図４】同上。
【図５】ホノキオール型及びマグノロール型化合物によるＳＶＲ細胞増殖の抑制を例示するグラフである。
【図６】多発性骨髄腫（ＭＭ）患者からのＭＭ細胞株及び腫瘍細胞における、ホノキオール（ＨＮＫ）で誘導された細胞毒性を表す。通常の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮＣｓ）では毒性が示されなかった。４８時間培養後の比色アッセイによる評価において、Ａ及びＢではＨＮＫによるＭＭ細胞株の増殖阻害が示した。
【図７】ＭＭ細胞における、ホノキオール（ＨＮＫ）で誘導されたアポトーシスを表す。Ａは、４８時間、８μｇ／ｍｌのＨＮＫで処置されたＭＭ．１Ｓ及びＲＰＭＩ８２２６細胞を示す。Ｂでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、１０μｇ／ｍｌのＨＮＫによる１２及び２４時間の処理後のカスパーゼ及びＰＡＲＰの裂開を、ＭＭ．１Ｓの全細胞可溶化物のウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す。Ｃでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３による処理後の、ＭＭ．１Ｓ細胞を示す。Ｄでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（２５μＭ）による１．５時間の前処理の有無における、ＨＮＫ又はＡｓ２Ｏ３による２４時間の処理後のＭＭ細胞におけるＡＰＯ２．７の発現を、フローサイトメトリで解析した結果を示す。Ｅでは、トリパンブルー排他染色により細胞毒性を解析した結果を示す。Ｆでは、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ、０、４、８及び１２時間）で処理した結果を示す。Ｇでは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理の有無における、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ、２４時間）で処理したＭＭ．１Ｓ細胞を示す。
【図８】ボルテゾミブとホノキオール（ＨＮＫ）の組合せが、ＭＭ．１Ｓ細胞に対する細胞毒性を強化することを示す。Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を４８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理し、細胞増殖を比色アッセイで解析した結果を示す。Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞をＨＮＫ及びボルテゾミブで処理し、アポトーシス誘導をＡＰＯ２．７で解析した結果を示す。Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を８時間ＨＮＫ及びボルテゾミブで処理した結果を示す。
【図９】ＨＮＫがＩＬ−６、ＩＧＦ−１の防護効果及び患者の骨髄間質細胞（ＢＭＳＣｓ）の接着を抑制できることを示す。２人のＭＭ患者（Ｃ及びＤに示す）に由来するＩＬ−６（Ａに示す）、ＩＧＦ（Ｂに示す）又はＢＭＳＣｓの有無において、ＭＭ．１Ｓ細胞を、示すＨＮＫ濃度で４８時間処理した結果を示す。
【図１０】ＨＮＫがＭＭ．１Ｓ細胞の増加及び生存シグナリング経路を調節することを示す。Ａでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、更に１０及び２０分間ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した結果を示す。Ｂでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で処理し、更に１０及び２０分間ＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）で刺激した結果を示す。Ｃでは、ＭＭ．１Ｓ細胞を培地（ＦＣＳ２．５％含有）で３及び６時間、ＨＮＫ（１０μｇ／ｍｌ）で前処理した結果を示す。
【図１１】ＨＵＶＥＣにおける血管新生のＨＮＫによる抑制を示す。ＨＵＶＥＣは８μｇ／ｍｌのＨＮＫを添加して（Ｂで示す）又は添加せずに（Ａで示す）６時間培養し、血管形成を解析した。最初の拡大倍率は×４０である。
【図１２】ドミナントネガティブＭＡＰＫＫ遺伝子、又は化学的抑制剤ＰＤ９８０５９によるＭＡＰＫＫ阻害による、内皮細胞の形態に与える効果を示す。ＭＳ１はＳＶ４０ラージＴ抗原のみを含む内皮細胞を表し、ＳＶＲはｒａｓ癌遺伝子により形質転換したＭＳ１細胞を表し、ＳＶＲ＋ＰＤ９８０５９は、ＰＤ９８０５９（５μｇ／ｍＬ）で処理したＳＶＲ細胞を表し、ＳＶＲＡ２２１ａは、ＭＡＰＫＫのドミナントネガティブＡ２２１対立遺伝子を安定発現する細胞を表す。
【図１３】アポトーシスにおけるホノキオール及びマグノロールの効果を示す。明るい柱は、マグノロール処置したＳＶＲ細胞を示し、暗い柱はホノキオール処置したＳＶＲ細胞を示す。コントロールのレーンは、１８及び４８時間の処理との比較例としての、処理直後の細胞を示す。
【図１４】様々な細胞内でのタンパク質のリン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ａでは、ホノキオールがＡＫＴ、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ及びＳｒｃ．ＳＶＲ．のリン酸化を阻害することを示す。Ｂでは、ホノキオールが低濃度でＡｋｔのリン酸化を阻害するが、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ又はＳｒｃでは阻害しないことを示す。
【図１５】内皮細胞の増殖のホノキオールによる阻害が、ＴＲＡＩＬ依存性であることを示す。左の柱はホノキオールのみで処理した内皮細胞を表し、中央の柱はホノキオール及びＴＲＡＩＬ抗体で処理した細胞を表し、右側の柱はホノキオール及び副基アイソタイプのコントロール抗体で処理した細胞を表す。
【図１６】ホノキオールが、カスパーゼ８／カスパーゼ９／ＰＡＲＰが媒介するアポトーシスにより、多発性骨髄腫細胞（ＭＭ）のアポトーシスを誘導することを示す。
【図１７】ＶＥＧＦのリン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ａでは、ＨＵＶＥＣｓのＶＥＧＦで誘導されるＫＤＲ自己リン酸化に対するホノキオールの効果を示す。Ｂでは、ＶＥＧＦで誘導されるＲａｃ活性化に対するホノキオールの効果を示す。上部：ＧＴＰと結合したＲａｃのイムノブロットの代表的な結果。下部：イムノブロット（３回の実験）のデンシトメーター分析（平均±標準誤差）（コントロールに対する倍数として表示）。
【図１８】ヌードマウスのＳＶＲ血管肉腫のインビボ増殖に対するホノキオールの効果を示す。このデータは、ホノキオールがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍に対して効果的であることを示す。
【図１９】ＭＭ．１Ｓ及びＳＵ−ＤＨＬ−４細胞におけるアポトーシス誘導を示す。
【図２０Ａ】ホノキオールがＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することを示す。ＰＣ３細胞を、通常の酸素条件及び低酸素症条件下でホノキオール処理した。上部のブロットでは、ホノキオールによるＡＭＰキナーゼのリン酸化の増加（活性化）を示す。下部のブロットでは、コントロールとしての全ＡＭＰキナーゼタンパク質を示す。
【図２０Ｂ】前立腺癌のＨＩＦ−１ａ細胞株におけるホノキオールの効果を示す。ホノキオールは、投与量依存的に前立腺癌細胞のＨＩＦ−１ａを活性化させた。
【図２１】ホノキオールが野生型チュベリンの効果をミミックできることを示す。チュベリン処理により回数及び投与量依存的に（ａｋｔの下方制御と同様に）Ｓ６キナーゼリン酸化の負の制御がなされ、すなわちホノキオールが野生型チュベリンの作用の幾つかをミミックできることを示す。
【図２２】ホノキオールがＳＶＲ細胞において、０．５％及び１０％の血清中でホスホリパーゼＤの活性を阻害することを示す。
【図２３】提唱されたホノキオールの作用機構を示す。ホノキオールはＰＬＤ活性を阻害でき、ＡＭＰキナーゼを活性化できる。ホノキオールはホスホリパーゼの活性を阻害でき、ホスファチジン酸の産生減少をもたらす。減少したホスファチジン酸はｍＴＯＲ（哺乳動物におけるラパマイシンの標的）の活性化減少をもたらし、ＮＦＫＢの負の制御をもたらしうる。ホスファチジン酸はｍＴＯＲ活性化に対して直接効果を及ぼし、ａｋｔ活性化と同様に、ホスファチジン酸の産生によりチュベリン（ｔｓｃ２）のリン酸化及び不活性化をもたらしうる（Ｔｅｅら、２００３；Ｃｈｅｎら、２００５；Ｈｕｉら、２００４）。同様に、ＡＭＰＫ活性化は、チュベリン（Ｊｏｓｅｐｈら、２００１）の脱リン酸及び活性化をもたらしうる。ｐ５３の活性化は特定の系においてＡＭＰＫを活性化でき、ｐ５３欠損ＰＣ３細胞株の場合と同様に、ＡＭＰＫのホノキオール誘導はｐ５３を必要としない（Ｆｅｎｇら、２００５；Ｗａｎｇら、２００１）。
【図２４】ホノキオールがＮＦＫＢ活性化をブロックでき、従来の化学療法剤への腫瘍細胞の感作が可能となることを示す。（Ａ）では、ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清の状態に置き、更にＴＮＦのみ、又はホノキオールとの組み合わせでインキュベートした（２４時間後の結果）結果を示す。細胞死は、カルセインＡＭによる生死アッセイで測定した。赤色は死細胞を表し、緑色は生細胞を表す。（Ｂ）では、細胞を１２時間３０μＭホノキオールにより前処理し、更に１６時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした結果を示す。細胞を、ＦＩＴＣとコンジュゲートした抗アネキシンＶ抗体とインキュベートし、更に初期アポトーシスの効果をフローサイトメトリで分析した。（Ｃ）では、細胞を１２時間３０μＭホノキオールにより前処理し、更に示された時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした結果を示す。全細胞抽出物を調製し、抗ＰＡＲＰ抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。（Ｄ）では、ＫＢＭ−５細胞（５０００細胞／０．１ｍｌ）を３０μＭホノキオールの有無で、ＴＮＦ、タキソール、５−ＦＵ又はドキソルビシンと３７℃で７２時間インキュベートし、生細胞をＭＴＴ試薬を使用してアッセイした。培養組織を用いた３回の実験における平均±標準偏差を結果として示す。
【図２５】ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢに依存する、抗アポトーシス、増殖及び転移関連の遺伝子産物の発現を抑制できることを示す。（Ａ）は増殖及び転移関連タンパク質を示し、（Ｂ）は抗アポトーシス関連タンパク質を示す。ＫＢＭ−５細胞を１２時間３０μＭホノキオールでインキュベートし、更に示された時間の１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、関連抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。
【図２６】ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法薬のアポトーシスの効果を強化することを示す。（Ａ）は、ホノキオールの構造を示す。（Ｂ）は、ホノキオールがＴＮＦ及び化学療法剤により誘発されるアポトーシスを強化することを示す棒グラフである。ＫＢＭ−５細胞（５０００細胞／０．１ｍｌ）を５ｍＭのホノキオールの有無において、ＴＮＦ、パクリタキセル又はドキソルビシンにより３７℃で７２時間インキュベートし、生細胞をＭＴＴ試薬を使用してアッセイした。培養組織を用いた３回の実験における平均±標準偏差を結果として示す。（Ｃ）ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＰＡＲＰ裂開を強化することを示す。ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清条件化に置き、ＴＮＦ（１ｎＭ）のみ、又はホノキオール（２５ｍＭ）との組み合わせで所定の時間インキュベートし、実施例８に記載のウエスタンブロット分析によりＰＡＲＰ裂開はを測定した。下の値は８７ｋＤａのバンドのデンシトメーター分析値を示す。（Ｄ）ホノキオールがＴＮＦで誘導される細胞死を強化することを表す。ＫＢＭ−５細胞（２×１０６／ｍＬ）を２４時間無血清条件に置き、更にＴＮＦ（１ｎＭ）のみ、又はホノキオール（１０ｍＭ）との組み合わせで２４時間インキュベートした。実施例８のカルセインＡＭによる生／死アッセイにより細胞死を測定した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｅ）は、ホノキオールがＴＮＦ誘導初期アポトーシスを上方制御したことを示す。細胞を１２時間２５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に１６時間１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした。細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗アネキシンＶ抗体でインキュベートし、更に初期アポトーシスの効果をフローサイトメトリにより分析した。
【図２７】ホノキオールがＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成及びＴＮＦで誘導される侵入活性を抑制することを示す。（Ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞（１×１０４）を一晩プレート上でインキュベートし、１２時間５ｍＭのホノキオールにより前処理し、更に５ｎＭのＲＡＮＫＬで処理した。４及び５日後に細胞をＴＲＡＰ染色し、破骨細胞形成能を評価した。写真は、ＲＡＮＫＬによるインキュベーション開始後５日に撮影したものである。（Ｂ）ウェルあたりのトラップ陽性多核溶骨細胞（＞３の核）の数を計測した。（Ｃ）Ｈ１２９９細胞（２．５×１０４）を無血清条件下で、一晩マトリゲル浸潤チャンバーの上のウェルに播種し、１２時間１０ｍＭのホノキオールにより前処理し、１％の血清条件下で２４時間１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、更に浸潤アッセイに供した。ホノキオールなし、及びＴＮＦなしの場合の値を１．０に設定した。
【図２８】ホノキオールがＮＦ−κＢを阻害することを示す。（Ａ）ホノキオールは、ＴＮＦ、たばこ煙縮合物、ＰＭＡ、オカダ酸及びＨ２Ｏ２により誘発されるＮＦ−κＢの活性化をブロックする。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を２５ｍＭのホノキオールで３７℃で１２時間プレインキュベートし、更にＴＮＦ（０．１ｎＭ）、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍＬ、１時間）、オカダ酸（５００ｎＭ、４時間）、たばこ煙縮合物（１０ｍｇ／ｍＬ、３０分）又はＨ２Ｏ２（２５０ｍＭ、１時間）で処理した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｂ）ホノキオールは用量依存的に、ＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、３７℃で１２時間所定濃度のホノキオールによりプレインキュベートし、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出液を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。（Ｃ）ホノキオールは、時間依存的に、ＴＮＦ依存性ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、２５ｍＭのホノキオールで所定時間３７℃でプレインキュベートし、更に３７℃で３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出液を調製し、ＮＦ−κＢ活性化を試験した。（Ｄ）ホノキオールによる誘導活性化の抑制は、細胞タイプ特異的でない。２００万のＡ２９３細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞を、２４時間所定濃度のホノキオールにより前処理し、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。核抽出物を調製し、更にＥＭＳＡでＮＦ−κＢをアッセイした。（Ｅ）ホノキオールは、多発性骨髄腫Ｕ２６６及び扁平上皮癌ＳＣＣ４の構成的なＮＦ−κＢの活性化を抑制する。細胞を２４時間所定濃度のホノキオールでインキュベートし、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦでインキュベートした。核抽出物を調製し、更にＥＭＳＡでＮＦ−κＢをアッセイした。（Ｆ）ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＤＮＡとの結合能を調節しない。３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した又は処理しないＨ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）からの核抽出物を、室温で２時間、所定濃度のホノキオールで処理し、更にＥＭＳＡでＤＮＡ結合アッセイを行った。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。
【図２９】（Ａ）ホノキオールがＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ活性化、ＩｋＢａリン酸化及びＩｋＢａ分解を阻害することを示す。ホノキオールは、ＮＦ−κＢのＴＮＦ誘導活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、０．１ｎＭ  ＴＮＦにより所定時間処理し、ＥＭＳＡでＮＦ−κＢ活性化を解析した。（Ｂ）Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、次いで所定の時間３７℃で０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理し、ウエスタンブロット解析によりサイトソル画分のＩｋＢａを解析した（上パネル）。タンパク質の等量のロードを確認するため、ｂ−アクチンの結果を示す（下パネル）。（Ｃ）ホノキオールは、ＩｋＢａｂｙ  ＴＮＦのリン酸化及びユビキチン結合（Ｄ）をブロックする。細胞を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでプレインキュベートし、３０分間Ｎ−アセチル−ロイシル−ロイシル−ノルロイシン（ＡＬＬＮ）５０ｍｇ／ｍＬでインキュベートし、次いで１０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。細胞質の抽出物を分画し、更にリン酸特異的な抗ＩｋＢａ抗体を用いたウエスタンブロット分析を行った。同じ膜を、抗ＩｋＢａ抗体サイドブロッティングした。（Ｅ）ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＩｋＢａキナーゼ活性を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、１２時間２５ｍＭのホノキオールで処理し、更に所定の時間間隔で０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、２００ｍｇの抽出物を抗ＩＫＫａ及び抗ＩＫＫｂ抗体で免疫沈降した。更に材料及び方法にて説明する要領で免疫複合体キナーゼアッセイを実施した。ＩＫＫタンパク質の発現レベルに対するホノキオールの効果を検討するため、３０ｍｇの全細胞抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、エレクトロブロットし、材料及び方法にて説明する要領で、所定の抗体によりイムノブロットした。（Ｆ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５の核転座を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を無処置、又は３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールで前処理し、更に０．１ｎｍ  ＴＮＦで処理した。核抽出物を調製し、抗ｐ６５抗体を使用したウエスタンブロッティングで解析した。（Ｇ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５の核転座を阻害する。Ｈ１２９９細胞（１×１０６／ｍＬ）を、最初に３７℃で１２時間２５ｍＭのホノキオールで処理し、更に０．１ｎＭ  ＴＮＦに曝露した。サイトスピンの後、材料及び方法で説明する要領で免疫細胞化学的分析を実施した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｈ）ホノキオールは、ＴＮＦ誘導によるｐ６５のリン酸化を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に所定時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。細胞質及び核抽出物を、抗リン酸化ｐ６５抗体を使用するウエスタンブロッティングで解析した。
【図３０】（Ａ）ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）発現を阻害することを示す。Ａ２９３細胞を、ＳＥＡＰ遺伝子にリンクしたＮＦ−κＢ含有プラスミドで一過性にトランスフェクションし、更に所定濃度のホノキオールで処理した。０．１ｎＭ  ＴＮＦで２４時間培養後、細胞上澄を回収し、ＳＥＡＰ活性をアッセイした。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。（Ｂ）ホノキオールは、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＮＩＫ及びＩＫＫｂにより誘導されるＮＦ−κＢ依存性のレポーター遺伝子発現を阻害する。Ａ２９３細胞を、ＳＥＡＰ遺伝子にリンクしたＮＦ−κＢ含有プラスミドで一過性にトランスフェクションし、更に０及び２５ｍＭのホノキオールで処理した。細胞上澄を、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ活性のアッセイに供した。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。バーは標準偏差を示す。（Ｃ）ホノキオールは、ＴＮＦで誘導されるＣＯＸ２プロモータ活性を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、ルシフェラーゼ遺伝子にリンクしたＣＯＸ−２プロモータプラスミドにより一過性にトランスフェクションし、更に所定濃度のホノキオールで処理した。０．１ｎＭ  ＴＮＦによる２４時間の培養後、細胞上澄を回収し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。結果は、ベクターコントロールの活性に対する倍数として表示する。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果（平均±標準偏差、エラーバーとして示す）を示す。（Ｄ）マグノロールの構造式。（Ｅ）ホノキオール類似体であるマグノロールは、ＴＮＦ−で誘導されるＮＦＫＢ活性化を阻害する。Ｈ１２９９細胞を、１２時間所定濃度のマグノロールで処理し、更に３０分間０．１ｎＭ  ＴＮＦにより刺激した。核抽出物を調製し、ＥＭＳＡによりＮＦ−κＢ活性化を分析した。
【図３１】ホノキオールがＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢを制御された遺伝子産物を阻害することを示す。（Ａ）ホノキオールはＴＮＦにより誘発されるＣＯＸ−２、ＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−Ｉ及びＶＥＧＦ発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）は、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、更に異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗ＶＥＧＦ、ＭＭＰ−９、ＣＯＸ−２抗体を用いるウエスタンブロッティングで分析した。（Ｂ）ホノキオールはＴＮＦにより誘発されるサイクリンＤｌ及びｃ−ｍｙｃ発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗サイクリンＤｌ及び抗ｃ−ｍｙｃ抗体を使用するウエスタンブロッティングで分析した。データは、類似の結果を示す３つの独立した試験の代表的な結果を示す。（Ｃ）ホノキオールは、アンチアポトーシス遺伝子産物ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２  ＢＣＬ−ｘｌ、ＢＣＬ−２、ｃＦＬＩＰ、ＴＲＡＦ２及びｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を阻害する。Ｈ１２９９細胞（２×１０６／ｍＬ）を、無処置又は１２時間２５ｍＭのホノキオールでインキュベートし、異なる時間０．１ｎＭ  ＴＮＦで処理した。全細胞抽出物を調製し、全の細胞可溶化物５０ｍｇを抗ＩＡＰ１、ＩＡＰ２、ＢＣＬ−ｘｌ、ＢＣＬ−２、ｃＦＬＩＰ及びｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体を使用するウエスタンブロッティングで分析した。
【図３２】ＴＮＦで誘導されるＮＦ−κＢ活性化及びアポトーシスに対するホノキオールの効果の概略図を示す。
【図３３Ａ】（Ａ）ホノキオール（ＨＮＫ）の化学構造式を表す。
【図３３Ｂ】（ＢからＦ）乳癌細胞系の生存率のグラフ。ＨＮＫの所定の投与量を含む培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞の増殖を阻害することを示す。
【図３４】（Ａ及びＢ）多形神経膠芽腫細胞株の生存率のグラフ。ＨＮＫの所定の投与量を含む培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。結果は、多形神経膠芽腫細胞株がＨＮＫ処理に抵抗性であることを示す。
【図３５Ａ】（Ａ−Ｇ）ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の生存率を表す棒グラフ。ＨＮＫの所定の投与量及び第２の薬剤を含む（又は含まない）培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。試験に用いた第２の薬剤：Ａ及びＢ：ＳＡＨＡ（２μＭ）、Ｃ：４−ＨＴ（１００ｎＭ）。
【図３５Ｂ】（Ａ−Ｇ）ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の生存率を表す棒グラフ。ＨＮＫの所定の投与量及び第２の薬剤を含む（又は含まない）培地中で培養し、２４時間処理した後、ＭＴＴアッセイを行った。試験に用いた第２の薬剤：Ｄ及びＥ：ドキソルビシン（ＡＤＲ、３００ｎＭ）、Ｆ及びＧ：パクリタキセル（ＰＡＣ、２５０ｎＭ）。結果は、ＨＮＫがＳＡＨＡの増殖阻害活性を強化することを示す。
【図３６】マウスにおける、数週間にわたり計測した腫瘍体積のグラフ。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をａｔｈｙｍｉｃヌードマウスの両側腹に注入した。マウスを４週間にわたり、担体（ｎ＝５）又はＨＮＫ（２ｍｇ／ｄ、ｎ＝５）を毎日Ｉ．Ｐ．注入した。腫瘍体積を毎週計量した結果、試験群マウスの腫瘍は、２週目から試験終了時にかけて、顕著に小さかった（ｐ＜０．０２）。
【図３７】（Ａ）所定時間ＨＮＫ（６０μＭ）で処理したＭＣＦ−７細胞の染色を示す。処理後、実施例９で説明する要領で細胞を回収し、ＰＩ及びアネキシンＶで染色した。（Ｂ）３つの独立した実験（ＨＮＫ６０μＭ、２４時間）の結果を示す棒グラフ。アステリクスは、ｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＭＣＦ−７細胞をＨＮＫ（２０又は４０μＭ、２４時間）で処理し、溶解し、アポトーシス関連タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞のアポトーシスを誘導することを示す。
【図３８Ａ】Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のグラフを示す。実施例９と同様にＨＮＫ（３０μＭ、２４時間）で処理し、ＰＩ染色を使用して細胞周期を分析した。Ｂは、ＨＮＫの濃度に対する細胞（％）の棒グラフである。３つの独立した実験結果を示す。３０μＭ  ＨＮＫで処理したものと比較した、コントロールにおけるＳ期の細胞のパーセンテージはＰ＞０．０５である。Ｃは、ＨＮＫ（３０μＭ、２４時間）で処理し、ＰＩ染色を使用して細胞周期を分析したＭｃｆ−７細胞のグラフを示す。
【図３８Ｂ】（Ｄ）ＨＮＫの濃度に対する細胞（％）の棒グラフを示す。３つの独立した実験結果を示す。
【図３８Ｃ】Ｅは、ＨＮＫ（２０、４０又は、６０μＭ（２４時間））で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を溶解させ、細胞周期関連のタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。Ｆは、ＨＮＫ（２０、４０又は、６０μＭ（２４時間）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を溶解し、ＥＧＦＲ、並びに全ＥＲＫ２及びリン酸化ＥＲＫ２（並びにβ−アクチン）の発現をウエスタンブロッティングにより分析した一連の写真を示す。結果は、ＨＮＫが乳癌細胞の細胞周期を減速することを示す。
【図３９】Ａは、増殖因子の非存在下で０〜４０μｇ／ｍＬホノキオールで処理した後、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞株のアポトーシス（％）とホノキオール濃度の相関を示す棒グラフ。Ｂは、Ｒａｔｌａ及びＲａｔｌａ−ｍＡｋｔ繊維芽細胞株におけるミトコンドリアＨＫ活性とホノキオール濃度の相関を、ホノキオールの有無において増殖因子から取り出し、全細胞に対するミトコンドリアのヘキソキナーゼ活性のパーセンテージの測定結果を示す棒グラフ。Ｃは、増殖因子の非存在下で０〜４０μｇ／ｍＬホノキオール処理後の、野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞株のアポトーシス（％）とホノキオール濃度の相関を示す棒グラフ。Ｄは、野生型及びＢａｘ／Ｂａｋ  ＤＫＯ  ＭＥＦ細胞株におけるミトコンドリアＨＫ活性とホノキオール濃度の相関を、ホノキオールの有無において増殖因子から取り出し、全細胞に対するミトコンドリアのヘキソキナーゼ活性のパーセンテージの測定結果を示す棒グラフ。
【図４０】インビボでのホノキオール処理により、Ｃ５７Ｂ１／６及びＬＭＰ１トランスジェニックマウスにおいてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）病理を沈静化したが、陰性コントロールのレベルまでは阻害しないことを示す。
【図４１】ＣＨ１２．ｈＣＤ４０−ＬＭＰ１  Ｂ細胞におけるＩＬ−６及び及びＴＮＦアルファ産生に与える、ホノキオール処理による効果を示す。
【図４２】マウスＭ１２．４．１細胞におけるＮＦＫＢ活性化が、投与量依存的にホノキオールにより阻害されることを示す。
【図４３】癌細胞におけるＴＳＡ及びホノキオールの組合せによる治療効果を例示する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の式Ｉａの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化１】
2008542192.tif 000190
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であって、任意に置換されてもよく、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はアルキル基（例えばＣ１−５アルキル基）である。）
【請求項２】
請求項１記載の化合物であって、式中、
Ｒ６及びＲ７は独立にＨ又はＣ１−５アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基であり、
少なくとも１つのＲ８及びＲ９はメチル、エチル、プロピル又はブチル基である化合物。
【請求項３】
次式の式Ｉｂの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化２】
2008542192.tif 000191
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であって、任意に置換されてもよく、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない。）
【請求項４】
請求項３記載の化合物であって、式中、
Ｒ５及びＲ７は独立にメチル、エチル又はプロピル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基であり、
少なくとも１つのＲ６及びＲ７は水素でない化合物。
【請求項５】
以下の式Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ又はＩｆの化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグ。
【化３】
2008542192.tif 000192
（式中、Ｒ６及びＲ７は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にアルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール基である。）
【請求項６】
請求項５記載の化合物であって、式中、
Ｒ６及びＲ７は独立に水素又はＣ１−５アルキル基であり、
Ｒ８及びＲ９は独立にＣ１−５アルキル又はアルケニル基である化合物。
【請求項７】
以下の群から選択される化合物。
【化４】
2008542192.tif 000193
【請求項８】
宿主の癌の治療用の、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
請求項８記載の化合物であって、前記癌が腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫からなる群から選択されることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
前記癌がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を、発現又は過剰発現させる、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
宿主の骨髄腫の治療用の、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、又はホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体。
【請求項１２】
宿主の薬剤抵抗性の癌の治療用の、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、又はホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体。
【請求項１３】
前記骨髄腫がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を発現又は過剰発現する、請求項１１記載の化合物。
【請求項１４】
前記癌が骨髄腫である、請求項１２記載の化合物。
【請求項１５】
前記癌がホスホリパーゼＤ、ＡＭＰＫ又はＮＦＫＢの１つ以上を発現又は過剰発現する、請求項１２記載の化合物。
【請求項１６】
前記骨髄腫が多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、骨の単離された形質細胞腫、延髄外の形質細胞腫、ワルデンストレームのマクログロブリン血症、単クローン性γグロブリン血症及び不応性形質細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が癌治療用の少なくとも１つの付加的な治療薬と組み合わせて、又は交互に投与される、請求項８又は１２記載の化合物。
【請求項１８】
前記付加的な治療薬がヒストンデアセチラーゼ阻害剤である、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
宿主の腫瘍又は癌の治療用の化合物であって、当該治療が、
（ｉ）腫瘍又は癌から生体試料を調製し、
（ｉｉ）腫瘍又は癌がホスホリパーゼＤを発現又は過剰発現するか否かを決定し、
（ｉｉｉ）その腫瘍又は癌がホスホリパーゼＤを発現又は過剰発現する場合、腫瘍又は癌を有効量の請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、ホノキオール、マグノロール又はその誘導体のいずれか１つで処置することを含んでなる、化合物。
【請求項２０】
前記癌が腫瘍、肉腫、リンパ腫、白血病及び骨髄腫からなる群から選択される、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
宿主の炎症性症状又は骨粗鬆症の治療用の、任意に薬理学的に許容できる担体と組み合わせた、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、ホノキオール若しくはマグノロール、又はその誘導体。
【請求項２２】
請求項１から７のいずれか１項記載の化合物、及び薬理学的に許容できる担体を含んでなる組成物。
【請求項２３】
異常な細胞増殖を伴う疾患の治療方法用の、請求項１から７のいずれか１項記載の化合物。
【請求項２４】
前記疾患が骨髄腫である、請求項２４記載の化合物。
【国際調査報告】
2008542192.tif 000194