(57)【要約】血液癌をプロファイリングするシステムが提供されている。当該システムは、遺伝子セット群の同定に基づき、これらの遺伝子セット群は、一つの遺伝子セット内のそれぞれの遺伝子の発現における変化が、ある特定の血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴と相関関係を示し得るという点において特徴付けられる。当該の血液癌プロファイリングシステムは、「血液癌プロファイリング」遺伝子のセット群を提供し、さらに、一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリングセット群に由来するポリヌクレオチドプローブの組み合わせを提供する。これらのポリヌクレオチドプローブの組み合わせは、溶液に形態で、あるいはアレイの形態で提供され得る。プローブの組み合わせおよびアレイは、疾患の予後予測、診断、病期あるいはグレードの判断、治療管理、疾患進行のモニター、疾患のアウトカムあるいは合併症の予測などに利用することができる。本発明のシステムは、悪性リンパ腫および白血病から成る群から選択された血液癌をプロファイルするために使用することができる。
2008514190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブから成る、血液癌をプロファイリングするシステムで、前記プローブのそれぞれが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成り、当該配列では前記遺伝子の発現レベルが前記血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を示すことを特徴とする前記システム。 
【請求項２】
前記の一つあるいはそれ以上の特徴が、存在、欠如、種、亜種、病期、進行、グレード、攻撃性、アウトカム、生存率および薬剤反応性から成る群から選択された、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記プローブのそれぞれが、表2から表19に記載された遺伝子の群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、請求項1および2に記載のシステム。
【請求項４】
前記の少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブが、 
表2に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表3に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表4に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表5に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表6に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表7に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表8に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表9に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表10に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表11に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表12に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表13に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表14に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表15に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表16に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表17に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表18に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； および
表19に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ  
から成る群から選択されている、請求項1および2に記載のシステム。
【請求項５】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列の少なくとも15個のヌクレオチドから成る、 請求項1、２、３、あるいは4のいずれかに記載のシステム。
【請求項６】
前記プローブのぞれぞれが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、請求項1、２、３、あるいは4のいずれかに記載のシステム。
【請求項７】
前記システムが、少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブから成る、請求項1、2、3、4、5、あるいは6のいずれかに記載のシステム。
【請求項８】
前記システムが、少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成る、請求項1、2、3、4、5、あるいは6のいずれかに記載のシステム。
【請求項９】
前記血液癌が、悪性リンパ腫および白血病から成る群から選択されている、請求項1、2、3、4、5、6、7あるいは8のいずれかに記載のシステム。 
【請求項１０】
前記血液癌が、B細胞性慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、B細胞前リンパ球性白血、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞性骨髄腫/形質細胞腫、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫、およびびまん性Ｂ大細胞型リンパ腫(DLBCL)ホジキンリンパ腫、リンパ芽球型リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)、皮下T細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、末梢性T細胞リンパ腫、血管免疫芽球型リンパ腫、血管中心性リンパ腫(鼻型T細胞リンパ腫)、消化管のＴ細胞リンパ腫、および成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病から成る群から選択された悪性リンパ腫である、 請求項1、2、3、4、5、6、7あるいは8のいずれかに記載のシステム。  
【請求項１１】
前記血液癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病から成る群から選択された白血病である、請求項1、2、3、4、5、6、7あるいは8のいずれかに記載のシステム*16。 
【請求項１２】
核酸アレイを調製するために、請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 あるいは11のいずれかに記載のシステムを使用すること。
【請求項１３】
(a) 一つあるいはそれ以上の遺伝子セット群を提供する段階で、それぞれの遺伝子セットが表1に記載された遺伝子群から選択された少なくとも5個の遺伝子から成り、当該の一つあるいはそれ以上の遺伝子セット群内のそれぞれの遺伝子の発現レベルが一つの血液癌の一つの特徴を表すことを特徴とする前記段階と；
(b) 発現パターンプロファイルを提供することを目的として、前記被験者から採取した被験検体における前記の一つあるいはそれ以上の遺伝子セット群内のそれぞれの遺伝子の発現レベルを定量する段階と；および
(c) 前記発現パターンプロファイルを参照発現パターンプロファイルと比較する段階と
から成る、被験者における血液癌をプロファイリングする方法。
【請求項１４】
前記特徴が、存在、欠如、種、亜種、病期、進行、グレード、攻撃性、アウトカム、生存率および薬剤反応性から成る群から選択された、請求項13 に記載の方法。
【請求項１５】
それぞれの遺伝子の発現レベルが段階(b)で被験検体を複数のポリヌクレオチドプローブに接触させることにより定量され、前記プローブのそれぞれが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ前記の一つあるいはそれ以上の遺伝子セット群由来の1個の遺伝子に対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成る、請求項13 あるいは14に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列の少なくとも15個のヌクレオチドから成る、 請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記血液癌が悪性リンパ腫および白血病から成る群から選択されている、請求項13、14、15あるいは16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記血液癌が、B細胞性慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、B細胞前リンパ球性白血、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞性骨髄腫/形質細胞腫、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫、およびびまん性Ｂ大細胞型リンパ腫(DLBCL)ホジキンリンパ腫、リンパ芽球型リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)、皮下T細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、末梢性T細胞リンパ腫、血管免疫芽球型リンパ腫、血管中心性リンパ腫(鼻型T細胞リンパ腫)、消化管のＴ細胞リンパ腫、および成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病から成る群から選択された悪性リンパ腫である、請求項13、14、15あるいは16のいずれかに記載の方法。 
【請求項１９】
前記血液癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病から成る群から選択された白血病である、請求項13、14、15あるいは16のいずれかに記載の方法。*17。
【請求項２０】
前記遺伝子セット群が少なくとも10個の遺伝子から成り、前記の一つあるいはそれ以上の遺伝子セット群が、
表32に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット；
表33に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット；
表34に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット；
表35に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット； 
表36に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット； 
表37に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット； 
表38に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット； 
表39に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット； 
表40に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット；および
表41に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子群から成る一つの遺伝子セット；
から成る群から選択されている、請求項13に記載の方法。
【請求項２１】
固相支持体の固定された少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブから成る、核酸アレイで、前記プローブのそれぞれが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成り、当該配列では前記遺伝子の発現レベルが前記血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を示すことを特徴とする前記核酸アレイ。
【請求項２２】
前記の一つあるいはそれ以上の特徴が、存在、欠如、種、亜種、病期、進行、グレード、攻撃性、アウトカム、生存率および薬剤反応性から成る群から選択された、 請求項21に記載の核酸アレイ。
【請求項２３】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列の少なくとも15個のヌクレオチドから成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２４】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２５】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1-1153のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２６】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 1154-2299のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２７】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 2300-3426のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２８】
前記プローブのそれぞれが、SEQ ID NOs: 3427-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、 請求項21あるいは22に記載の核酸アレイ。
【請求項２９】
前記システムが少なくとも50個のポリヌクレオチドプローブから成る、請求項21、22、23、24、25、26、27あるいは28のいずれかに記載の核酸アレイ。
【請求項３０】
前記システムが少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成る、請求項21、22、23、24、25、26、27あるいは28のいずれかに記載の核酸アレイ。
【請求項３１】
前記プローブのそれぞれが、表2に記載された遺伝子の群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、請求項21、22、23、24、25、26、27、28、29あるいは30のいずれかに記載の核酸アレイ。 
【請求項３２】
前記プローブのそれぞれが、表3に記載された遺伝子の群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、請求項21、22、23、24、25、26、27、28、29あるいは30のいずれかに記載の核酸アレイ。
【請求項３３】
前記の少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブが、 
表32に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表33に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表34に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表35に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表36に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表37に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；
表38に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表39に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ； 
表40に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ；および
表41に記載された一つあるいはそれ以上の遺伝子から成る遺伝子のセットから選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれに相補的である配列から成る、少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブ
から成る群から選択されている、請求項21、22、23、24、25、26、27、28、29あるいは30のいずれかに記載の核酸アレイ。
【請求項３４】
さらに一つあるいはそれ以上のコントロールプローブから成る、請求項21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31あるいは32のいずれかに記載の核酸アレイ。
【請求項３５】
約15ヌクレオチドから約500ヌクレオチドの長さを有し、且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成る、ポリヌクレオチドプローブで、前記プローブが、SEQ ID NOs: 1-4530のいずれかに記載されている配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成ることを特徴とする、前記ポリヌクレオチドプローブ。 
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NOs: 1-4530に記載されているような1個の配列から成る、請求項35に記載のポリヌクレオチドプローブ *18。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドプローブが、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような1個の配列から成る、請求項35に記載のポリヌクレオチドプローブ。
【請求項３８】
ある血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を表し、
表32に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表33に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表34に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表35に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表36に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表37に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表38に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表39に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表40に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；および
表41に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子
から選択された少なくとも10個の遺伝子から成る、発現パターン一つの遺伝子セット。
【請求項３９】
前記の一つあるいはそれ以上の特徴が、存在、欠如、種、亜種、病期、進行、グレード、攻撃性、アウトカム、生存率および薬剤反応性から成る群から選択された、請求項38に記載の遺伝子セット。
【請求項４０】
前記血液癌が悪性リンパ腫であり、前記の少なくとも10個の遺伝子が
表32に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表33に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表34に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表35に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表36に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表37に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；および
表38に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子
から選択されている、請求項38あるいは39に記載の遺伝子セット。
【請求項４１】
前記血液癌が白血病であり、前記の少なくとも10個の遺伝子が
表39に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；
表40に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子；および
表41に記載されている遺伝子群から選択された少なくとも10個の遺伝子
から選択されている、請求項38あるいは39に記載の遺伝子セット。
【請求項４２】
表1に記載した遺伝子群から成る、血液癌をプロファイリングする遺伝子のライブラリー。 
【請求項４３】
請求項38から41のいずれかに記載の遺伝子セットを表す、一つあるいはそれ以上のデジタルコード化した発現パターンプロファイルから成る、コンピューター読み出し可能な媒体で、前記の一つあるいはそれ以上のデジタルコード化した発現パターンプロファイルが一つあるいはそれ以上の値と関連し、前記の一つあるいはそれ以上の値がそれぞれ血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴の一つと相関関係を示すことを特徴とする、前記のコンピューター読み出し可能な媒体。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の診断およびプロファイリングの分野、より詳細には血液癌を診断およびプロファイリングするツールに関する。 
【背景技術】
【０００２】
血液癌は、血液およびリンパ系の癌である。これらの癌は通常、赤血球（酸素を運搬する細胞）よりもむしろ白血球（疾患および感染と闘う細胞）に影響を及ぼし、血液細胞が作られる骨髄、あるいは白血球が流れているリンパ節やリンパ組織で起こる。一般的な血液癌には、白血病、悪性リンパ腫、および骨髄腫がある。 
【０００３】
悪性リンパ腫は、リンパ系の細胞に影響を及ぼす癌の一種であり、最も一般的にはB細胞あるいはT細胞リンパ球の遺伝物質の突然変異により引き起こされる。これらの突然変異を起こしたリンパ球は、自己の増殖をコントロールする能力を失ってしまうため、健常な組織を襲い腫瘍を形成する能力を有する。突然変異の種類および当該突然変異が起こった時点の発達段階により、悪性リンパ腫の分類あるいは種が決まる。リンパ球は、幹細胞から成熟B細胞あるいはT細胞に発達する過程で、造血の分化の段階をいくつか経るので、[その発達段階に基づき]悪性リンパ腫の多くの類が分類されている(Staudt LM. N Engl J Med. 2003; 348(18):1777-85. [Erratum:  N Engl J Med. 2003; 348(25):2588.]) *1。悪性リンパ腫の種が異なると予後が異なり、また多様な種に対する治療が全く異なるため、悪性リンパ腫の種および／または亜種を正しく分類することは非常に重要である (Soukup J, Krskova L, Mrhalova M, et al. Cas Lek Cesk. 2003; 142(7):417-2)。さらに、最近の研究によると、一つの疾患分類内でも、治療に対する反応が個人により異なるということが報告されている。例えば、一群の患者が病理医によりびまん性Ｂ大細胞型リンパ腫(DLBCL)であると診断され、治療を受けた。これらの患者の何人かは治療に対しよく反応した完全に治癒したが、その他の患者は治療に対し反応せず一年以内に当該疾患が原因で死亡した (Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Nature. 2000; 403(6769):503-11)。
【０００４】
大まかな分類としては、悪性リンパ腫は、ホジキン病あるいはホジキンリンパ腫(HD あるいはHL)と非ホジキンリンパ腫(NHL)に分類される。NHL は、影響を受けるリンパ球の種（すなわち、B細胞リンパ腫あるいはT細胞リンパ腫）に基づき、さらに分類される。
【０００５】
世界保健機関(WHO)は、形態学、免疫学、遺伝子の特徴、および臨床的特徴を組み合わせたものに基づき、非ホジキンリンパ腫を分類している。この分類システムによると、成熟B細胞リンパ腫は以下の種に分類されている： B細胞性慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、B細胞前リンパ球性白血、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞性骨髄腫/形質細胞腫、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫、およびDLBCL。ホジキンリンパ腫もまた、Ｂ細胞由来である。
【０００６】
DLBCL は、50%から60%の死亡率を有する攻撃性の高いリンパ腫形態である。WHO は、DLBCL を幅広い分類群に亜種分類しており、正確な診断を下すことが困難になっている(Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Nature. 2000; 403(6769):503-11)。しかしながら、より最近になって、何百個ものDLBCL患者の検体の分子プロファイリングにより、以下に示すDLBCL の亜種の分類が遺伝子発現パターンに基づき可能になった：分化活性化された末梢性血液B細胞(ABC)に由来する亜種、リンパ節の分化されていない胚中心(GC) に由来する第二の亜種、前縦隔Ｂ大細胞型リンパ腫(MLBCL)と呼ばれる第三の亜種、さらに依然として大部分は雑多である第四の亜種 (Rosenwald A, Wright G, Chan WC et al. N Engl J Med. 2002, 346(25):1937-47; Rosenwald A, Wright G, Leroy K. et al. J Exp Med. 2003, 198(6):851-62; Wright G, Tan B, Rosenwald A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 100(17):9991-6; Savage KJ, Monti S, Kutok JL, et al. Blood. 2003, 102(12):3871-9)。
【０００７】
T細胞リンパ腫は、以下の種に分類されている：リンパ芽球型リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)、皮下T細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、末梢性T細胞リンパ腫、血管免疫芽球型リンパ腫、血管中心性リンパ腫(鼻型T細胞リンパ腫)、消化管のＴ細胞リンパ腫、および成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病。 
【０００８】
WHO およびその他の機構の悪性リンパ腫を分類しようとする努力にも関わらず、これらの癌は、臨床医が多様な悪性リンパ腫の全てを分類するために考慮できるマーカーが全くないので、分類が困難である (Harris NL, Jaffe ES, Diebold J et al. Ann Oncol. 2000; 11 Suppl 1:3-10)。ほとんどの場合は、医師は患者の疾患を明確に分類するためにあらゆるテクニックを用いなければならない。これらのテクニックには、外部形態学的検査および顕微鏡的形態学的検査、特徴的な染色体配列換えの検出、および異常な遺伝子発現がある。これらのテクニックを用いて得られた結果を解釈することに関与する複雑性および主観性が、悪性リンパ腫に罹患した患者を診断および治療しようとしている臨床医および病理医にとって、さらなる難題となっている。 
【０００９】
白血病は、骨髄で発生し、血液、リンパ節、さらにその他の器官に転移する白血球の癌である。子供も成人も白血病に罹り、白血病はあらゆる種および亜種のある複雑な疾患である。白血病に罹患した患者の治療および見通しは、その種およびその他の個人的要因により大きく異なる。白血病は、それが関与する血液細胞の種類（リンパ球様細胞か骨髄性細胞）および疾患の進行速度（急性か慢性）に基づき種に分類されている。急性リンパ球性白血病(ALL)は、子供に起こる最も一般的な白血病の形態であり、乳児期に起こることが多い。急性骨髄性白血病(AML)は、成人にも子供にも起こるが、慢性リンパ球性白血病(CLL)および慢性骨髄性白血病(CML)は主として成人に見られる。多くの白血病の亜種は多様な種内に存在する。亜種は、それらが共有する特定の突然変異により定義される場合が多い。一般的な亜種には、以下が含まれる：MLL、T-ALL (T細胞急性リンパ芽球型白血病)、BCR-ABL、TEL-AML1、E2A-PBX1、t(4;11)を伴ったALL。悪性リンパ腫については、白血病の種および亜種を正確に区別することが、正しい診断を下し最も有益な治療プロトコルを選択するためには必須である。白血病を診断し種および亜種を区別するための現行の方法には、患者の病歴を調査すること、身体検査、完全血液算定、骨髄検査、細胞遺伝学的研究、分子診断および免疫学的マーカー診断があり、場合によっては患者を特定のリスク群に指定することもある。この過程は困難でありまた高価である可能性がある。 
【００１０】
DNAアレイ技術の到来により、悪性リンパ腫および白血病の双方において、スループットの高い遺伝子発現の分析が可能となった。例えば、悪性リンパ腫の「分子プロファイリング」により、悪性リンパ腫を特徴付けるために使用する潜在的可能性のある予測因子あるいはバイオマーカーの分類が促進された。例えば、「リンパ球チップ」を用いて悪性リンパ腫の一つの種における亜種を分類しており、合計17,856 個のcDNA クローンを含み、そのほとんどが胚中心B細胞ライブラリーに由来するものであるかあるいはDLBCL、FL、MCL、およびCLLライブラリー群 に由来するcDNA クローンである(Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Nature. 2000; 403(6769):503-11))。オリゴヌクレオチドアレイもまた説明されており、これはDLBCL 患者に由来する診断用腫瘍標本における6,817個の遺伝子の発現を分析するために使用するものである(Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al. Nat Med. 2002 Jan; 8(1):68-74)。このアレイはまた、この特定の種の悪性リンパ腫の結果（治癒か致死）を予測するため、および潜在的治療標的を見つけるためにも使用された。  
【００１１】
その他の出版物は、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて白血病の亜種を正確に区別することについて説明している。6,817個の遺伝子に使用できるプローブを含む市販のマイクロアレイを用いて、白血病を分類し、種類を予測するツールとして一組の遺伝子を同定した (Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA, Bloomfield CD and ES Lander.  Science 1999 Oct 15; 286(5439): 531-537)。また別の出版物は、市販のマイクロアレイを用いて(Affymetrix U133A)、小児のALL を96%の正確さで区別している (Ross ME, Zhou X, Song G, Shurtleff SA, Girtman K, Williams WK, Liu HC, Mahfouz R, Raimondi SC, Lenny N, Patel A and JR Downing.  Blood 2003 October 15; 102(8): 2951-2959)。 
【００１２】
さらに、米国特許出願番号20020110820は、1,000個の遺伝子を14セット集めたものについて説明しており、それらのセットはそれぞれ悪性リンパ腫および白血病を含む一つの癌を表している。これらの収集セットを用いて、腫瘍を分類し、腫瘍発達の尤度を予測し、腫瘍を診断し、あるいは癌治療に使用できる化合物を見つける方法も、説明されている。この特許はさらに、これらの収集セットに特異的である複数のオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイについても説明している。 
【００１３】
米国特許出願番号20030175761は、その発現パターンにより良性のリンパ節組織、FL、MCL、およびSLL 間の区別ができる120個の遺伝子群について説明している。この特許申請書はさらに、これらの遺伝子に対応するプローブを含む核酸アレイについても説明している。米国特許出願番号20030219760は、癌組織検体などの組織検体に由来する遺伝子発現データの率に基づき、生物学的状態あるいは体調を診断する方法群について説明している。この出願は、フォーカスマイクロアレイを用いたプロファイリングに基づくある方法について説明しており、この方法は、悪性胸膜中皮腫の存在を確認することができる。この出願はまた、この方法が悪性リンパ腫および白血病を含む多様なその他の癌に適用可能であることを示しており、従来の技術で明らかになっている遺伝子発現データの分析に基づき選択した複数のセットの遺伝子を一覧表示している。一覧表示されている遺伝子には、多様なDLBCL亜種において特異に発現されている遺伝子、DLBCL およびFLにおいて過剰発現されている遺伝子、さらに望ましいアウトカムおよび不運なアウトカムのDLBCLにおいて過剰発現されている遺伝子を含む。
【００１４】
米国特許出願番号20040018513は、白血病患者を診断し治療法を選択するために有用である方法群および成分群について説明している。これらの方法群は、HG_U95Av2 Affymetrix(tm)オリゴヌクレオチドアレイを用いた遺伝子発現の分析に基づくものであり、T-ALL、E2A-PBX1、TEL-AML1、BCR-ABL、MLL、高二倍体>50から選択された白血病リスク群、および発現プロファイリングに基づく一覧表に記載されているその他のものとは異なる「新規」と呼ばれるリスク群に指定される患者に関する。これらの方法群を用いて、白血病に罹患した被験者白血病リスク群に指定し、再発のリスクが高まっていることを予測し、二次的な急性骨髄性白血病を発症するというリスクを予測し、よそを判断し、治療法を選択し、疾患の状態をモニターすることができる。この出願はまた、この出願で説明されている特異的に発現された遺伝子に対応するキャプチャープローブを有するアレイについて説明している。 
【００１５】
この背景情報は、本発明に関連性があると出願人が考える情報を知らせる目的で、提供されている。先に記載した情報が本発明に反する従来の技術の一部をなすということは、故意に意図されておらず、あるいはそのように解釈されるべきでない。
【発明の要約】
【００１６】
本発明の目的は、血液癌プロファイリングシステムを提供することである。本発明の一局面と一致して、血液癌をプロファイリングするシステムが提供されており、当該システムは少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブから成り、前記プローブのそれぞれが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成り、当該配列では前記遺伝子の発現レベルは前記血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を示すものである。
【００１７】
本発明の別の局面と一致して、本発明に従って核酸アレイを作製するために当該システムを使用する方法が提供されている。  
【００１８】
本発明の別の局面と一致して、被験者に見出される血液癌をプロファイリングする方法が提供されており、当該方法は、(a) それぞれが表1に記載した遺伝子から選択された少なくとも5個の遺伝子から成る一つあるいはそれ以上の遺伝子のセットを提供すること（ここで、当該の一つあるいはそれ以上の遺伝子のセットにおけるぞれぞれの遺伝子の発現レベルは、血液癌の一つの特徴を示す）(b)発現パターンプロファイルを提供する目的で、前記被験者から採取した検体における前記の一つあるいはそれ以上の遺伝子のセットにおけるぞれぞれの遺伝子の発現レベルを決定すること、および(c)前記発現パターンプロファイルを参照発現パターンプロファイルと比較することから成る。
【００１９】
本発明の別の局面と一致して、固相支持体に固定された少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブから成る核酸アレイが提供されており、前記プローブのそれぞれが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成り、当該配列では前記遺伝子の発現レベルは前記血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を示すものである。 
【００２０】
本発明の別の局面と一致して、１個のポリヌクレオチドプローブが提供されており、前記プローブが15ヌクレオチドから500ヌクレオチドの長さを有し且つ表1に示した遺伝子群から選択された1個の遺伝子から転写されたmRNAに対応するかあるいはそれと相補的な1個の配列から成り、ここで前記プローブは、SEQ ID NOs: 1-4530のどの配列にも記載されているような、1個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。
【００２１】
本発明の別の局面と一致して、血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を表している発現パターンを有し且つ以下から選択された10個の遺伝子から成る1セットの遺伝子が提供されている：(a) 表32に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；表33に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；(c) 表34に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；(d) 表35に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；(e) 表36に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；(f) 表37に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子； (g) 表38に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；(h) 表39に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子； (i) 表40に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子；および表41に記載された遺伝子から選択された少なくとも10個の遺伝子。
【００２２】
本発明の別の局面と一致して、血液癌をプロファイリングするための遺伝子ライブラリーが提供されており、当該遺伝子ライブラリーは表１に記載された遺伝子から成る。 
【００２３】
本発明の別の局面と一致して、コンピューター読み出し可能な媒体が提供されており、当該媒体は請求項38から41のいずれかに記載の遺伝子のセットを表す電子的にコード化された一つあるいはそれ以上の発現パターンプロファイルから成り、前記の一つあるいはそれ以上の発現パターンプロファイルのそれぞれが一つあるいはそれ以上の値と関連しており、ここで前記の一つあるいはそれ以上の値のそれぞれが血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴と相関関係にある。 
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明は、血液癌をプロファイリングするシステムを提供している。このシステムは、遺伝子のプールあるいはライブラリーに基づいており、これらの遺伝子は、それぞれの遺伝子の発現における変化が血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴と相関関係を示すという点において特徴付けられる。本発明により提供されるライブラリーは、それぞれが特定の血液癌（例えば、悪性リンパ腫または白血病、あるいは悪性リンパ腫または白血病の種あるいは亜種）を表す、「血液癌をプロファイリングする」遺伝子のセットを選択する情報源として用いることができる。血液癌プロファイリングセットにおけるそれぞれの遺伝子の発現レベルは、その遺伝子セットにより表される当該血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を表している。その後、一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリングセット群の遺伝子に由来するプローブから成るポリヌクレオチドプローブの組み合わせ（「血液癌プロファイリング組み合わせ」）を、一つあるいはそれ以上の対象血液癌をプロファイリングする目的で、作製することができる。従って、本発明のシステムは、適切な血液癌プロファイリング組み合わせを選択することにより、特に関心の持たれている血液癌（群）の種（群）および／または特徴（群）を評価する柔軟性をユーザーに提供する。本発明と一致して、当該血液癌は、悪性リンパ腫および白血病の群から選択される。本発明のシステムを用いて評価することができるこれらの癌の特徴の非限定的な例には、血液癌の存在・欠如、種、亜種、病期、進行、グレード、攻撃力、アウトカム、生存率、および薬剤反応性などが含まれる。 
【００２５】
本発明のシステムは、従って、遺伝子ライブラリーから選択された「血液癌プロファイリング」遺伝子のセットを提供する。本システムはさらに、一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリングセット群の遺伝子群の配列群に由来するポリヌクレオチドプローブの組み合わせ（「血液癌プロファイリング組み合わせ」）を提供する。血液癌プロファイリング組み合わせは、従って、一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリングセット群を表す複数のプローブから成る。 
【００２６】
上記のように、本発明のシステムにより、特に関心の持たれている血液癌（群）の種（群）および／または特徴（群）を評価するために合わせた血液癌プロファイリング組み合わせを選択することができる。プローブの組み合わせは、従って、説明されているように、その組み合わせが単一の血液癌の単一の特徴、単一の血液癌の複数の特徴、複数の血液癌の単一の特徴、あるいは複数の血液癌の複数の特徴を表すように合わせることができる。 
【００２７】
本システムは、プローブの組み合わせ群を、例えば、標準溶液ハイブリダイゼーションテクニックで使用できるように、また定量PCR応用例で使用できるように、溶液の形態で提供し、さらに例えばアレイなどの固定フォーマットの形態でプローブの組み合わせを提供する。本システムを使用して、血液癌に罹患した、罹患していると疑われる、あるいは血液癌を発症するリスクがあると疑われる患者から採取した血液あるいは生検検体内の一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリング(HCP)セット群に属する遺伝子の発現パターンを分析することができる。得られた情報により、先に説明したような一つあるいはそれ以上の血液癌の特徴を判定することができ、従って、当該情報は、疾患の予後、診断、段階あるいはグレードの決定、治療管理、疾患の進行のモニター、疾患のアウトカムあるいは合併症の予測などに有用である。従って、本システムを用いて、悪性リンパ腫および白血病の群ｋら選択された血液癌をプロファイリングすることができる。  
【定義】
【００２８】
別途定義しない限りは、本書で使用している全ての専門用語および特有な用語は、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００２９】
本書で使用しているように、「約」という語は、記載された値から+/-10%の変動を意味する。そのような変動は、特に言及されるか否かに関わらず、本書に記載されている所与の値に常に含まれていると理解されたい。 
【００３０】
「血液癌の特徴」という語は、本書で使用しているように、血液癌の特徴を意味する。そのような特徴には、被験者における当該疾患の有無および血液癌の種などの診断を下すために有用である根本的な局面；および亜種、段階、進行、グレード、攻撃力、薬剤反応性などの疾患の管理および患者の治療に有用である特徴が含まれる。 
【００３１】
「遺伝子」という語は、本書で使用しているように、個々のタンパク質あるいはRNA を、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなどの関連制御領域と共にコード化する核酸のセグメント（「コード配列」あるいは「コード領域」と呼ばれる）を意味する（これらのプロモーター、オペレーター、ターミネーターなどの関連制御領域は、当該コード配列の上流あるいは下流に位置している）。
【００３２】
「標的遺伝子」という語は、本書で使用しているように、その発現が血液癌プロファイリング組み合わせのポリヌクレオチドプローブを用いて検出されるべき遺伝子を意味する。本発明の文脈では、標的遺伝子は血液癌プロファイリングセットの構成遺伝子である。  
【００３３】
「標的mRNA 」という語は、本書で使用しているように、mRNA 標的遺伝子から転写されたmRNA を意味する。 
【００３４】
「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という語は、本発明で相互に取り替えて使われているように、1ヌクレオチドを超える長さの重合体を意味し、そのような重合体にはリボ核酸 (RNA)、デオキシリボ核酸 (DNA)、ハイブリッドRNA/DNA、改変RNA またはDNA、あるいはRNAまたはDNAミメティクスがある。ポリヌクレオチドは、一本鎖あるいは二本鎖である。これらの語は、天然型核酸塩基、糖類、および共有結合のインターヌクレオシド（バックボーン）結合から成るポリヌクレオチド、また同様に機能する非天然型部分を有するポリヌクレオチドを含む。そのような改変あるいは置換ポリヌクレオチドは、当業者に既知であり、本発明の目的に沿って、「類似体」と呼ぶ。
【００３５】
「プローブ」および「ポリヌクレオチドプローブ」という語は、本書で使われているように、標的遺伝子あるいは標的mRNAにハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドを意味し、溶液中に溶解したポリヌクレオチドおよび固相支持体に固定されたポリヌクレオチド（例えば、アレイ）を含む。
【００３６】
「遺伝子発現パターン」あるいは「発現パターン」という語は、検体中のひとつあるいはそれ以上の標的遺伝子の遺伝子発現のレベルを意味し、例えば、血液癌プロファイリングセットの遺伝子は、本書で説明されている方法群により評価される。「遺伝子発現のレベル」という語は、標的遺伝子（群）の転写産物の絶対量あるいは相対量を意味する。一般的に、遺伝子発現のレベルは、参照検体に比較して測定され、参照検体に比較して増加している（アップレギュレート）か、減少している（ダウンレギュレート）か、あるいは変化無しである。遺伝子発現パターンは、単一の時間ポイントあるいは幅のある時間内に測定してよい。  
【００３７】
「改変された遺伝子発現」という語は、下記に説明しているように、遺伝子発現内の増加あるいは減少を意味する。 
【００３８】
「遺伝子発現における減少」という語は、参照検体に比較して発現レベルが低下することを意味する。一般的に、減少は、参照に比較して少なくとも10%の減少である。一つの実施例においては、遺伝子発現の減少は、当該遺伝子の発現における25%の減少を意味している。その他の実施例では、遺伝子発現の減少は、当該遺伝子の発現における少なくとも30%、40%、50%、 60%、70%、80%、および90%の減少を意味している。あるいはまた、遺伝子発現における減少は、参照と比較して、少なくとも2倍の減少である。さらなる実施例においては、遺伝子発現における減少は、参照と比較して、少なくとも3倍、5倍、7倍、あるいは10倍の減少である。 
【００３９】
「遺伝子発現における増加」という語は、参照検体に比較して発現レベルが上昇することを意味する。一般的に、増加は、参照に比較して少なくとも10%の増加である。一つの実施例においては、遺伝子発現の増加は、当該遺伝子の発現における25%の増加を意味している。その他の実施例では、遺伝子発現の増加は、当該遺伝子の発現における少なくとも30%、40%、50%、 60%、70%、80%、および90%の増加を意味している。あるいはまた、遺伝子発現における増加は、参照と比較して、少なくとも2倍の増加である。さらなる実施例においては、遺伝子発現における増加は、参照と比較して、少なくとも3倍、5倍、7倍、あるいは10倍の増加である。 
【００４０】
「選択的にハイブリダイズする」という語は、本書で使われているように、検出可能に且つ特異的に標的遺伝子あるいはそれに由来する核酸に結合するポリヌクレオチドの能力を意味する*2。ポリヌクレオチドプローブは、非特異的な核酸への検出可能な結合の評価可能量を最小限に抑えるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的遺伝子あるいは核酸を選択的にハイブリダイズする。高度過酷条件を用いて、当業界で既知であるようにまた本書に記載されているように、選択的ハイブリダイゼーションを達成することができる。一般的に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、慣行ハイブリダイゼーション手続きに従って、高度過酷度で行なう。洗浄条件は、一般的に、1 x SSC -3 x SSC、0.1% SDS -1% SDS、50 oC -70oC であり、洗浄液を5分から30分後に取り替える。
【００４１】
「対応している」あるいは「対応する」という語は、あるポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てあるいは一部と同一であるということを意味する。対比的に、「相補的な」という語は、本書で使用されているように、当該ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の相補的な鎖の全てあるいは一部と同一であるということを意味している。説明すれば、ヌクレオチド配列「TATAC」は、参照配列「TATAC」と対応し、参照配列GTATA」に相補的である。
【００４２】
以下の語群は、本書において2個あるいはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために使用されている：「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、および「配列同一性の割合」。「参照配列」は、配列比較において基礎として使用される配列と定義される；参照配列は、より大きな配列のサブセット（例えば、全長cDNAの1個のセグメント）あるいは遺伝子配列であってよく、さらに完全なcDNAあるいは遺伝子配列であってもよい。一般的に、参照ポリヌクレオチド配列は、少なくとも20ヌクレオチドの長さで、多くの場合50ヌクレオチドの長さである。
【００４３】
「比較ウィンドウ」という語は、本書で使用されているように、少なくとも15個の連続ヌクレオチド部位から成る参照配列の概念上のセグメントを意味し、当該概念上セグメント上では、候補配列を参照配列に比較し、さらに当該概念上セグメント内では、当該比較ウィンドウの候補配列の部分が、当該の2個の配列の最適アライメントのため、参照配列（付加も削除も含まない）に比較して、20％あるいはそれ未満の付加あるいは削除（すなわち、ギャップ）を含む。本発明は、比較ウィンドウについて多様な長さを考慮しており、その長さは、最高で参照配列あるいは候補配列の長さが全長である場合を含む。比較ウィンドウをアラインするための最適な配列アライメントは、SmithおよびWatermanの局部相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. (1981) 2:482)、Needleman およびWunschの相同性アライメントアルゴリズ(J. Mol. Biol. (1970) 48:443)、Pearson およびLipmanの類似性検索方法(Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) (1988) 85:2444)を用いて行なうことができ、またこれらのアルゴリズムをコンピュータを用いて具現化したもの(例えば、573 Science Dr., Madison, WI に本拠地を定めるGenetics Computer Group社製のWisconsin Genetics Software Package Release 7.0に含まれているGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、ALIGN または Megalign (DNASTAR)などの市販のコンピュータソフトウェアー、あるいは検査を用いて、行なうことができる。このようにして、最上のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の同一性が結果として得られる）を選択することができる。 
【００４４】
「配列同一性」という語は、比較ウィンドウ上で2個のポリヌクレオチド配列が同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドの基盤で）ということを意味する。
【００４５】
「配列同一性の割合(%)」という語は、参照配列に関し本書で使用されているように、当該配列の最適アライメントを行いさらに必要な場合には最大割合の配列同一性を達成するためにギャップを導入した後に、比較ウィンドウ上で参照ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドと同一である、候補配列におけるヌクレオチドの百分率と定義される。
【００４６】
1. 血液癌プロファイリングシステム  
本発明のシステムは、遺伝子群の同定に基づいている。当該の遺伝子群は、それらを参照被験者と比較した場合に、それらの発現レベルが血液癌に罹患した被験者の体内において改変されているので、当該血液癌の特徴を表すものである。例えば、当該の血液癌が悪性リンパ腫あるいは白血病であれば、対象となっている特徴に拠って、参照被験者は、例えば、疾患のない被験者、悪性リンパ腫あるいは白血病の異なった種あるいは亜種に罹患している被験者、異なった治療計画を受けている被験者、悪性リンパ腫あるいは白血病の異なった発達段階にある被験者、不活性の疾患に罹患している被験者などであってよい。そのような遺伝子は、本発明の一つあるいはそれ以上の血液癌プロファイリング(HCP)セット群に組み入れるべき候補である。遺伝子を選択しHCP セット（群）に組み入れると、当該セット群内で当該遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブをデザインする。その後、当該HCP セット群を表し、関心が持たれている当該血液癌（群）および／または当該血液癌（群）の特徴と相関関係にある当該プローブの組み合わせを形成する。 
【００４７】
1.1 血液癌プロファイリング(HCP)セット群
HCP セットは、悪性リンパ腫あるいは白血病などの血液癌に関連した一つあるいはそれ以上の遺伝子、つまりその発現パターンが選択された悪性リンパ腫あるいは白血病あるいは選択された悪性リンパ腫あるいは白血病の特徴を表す遺伝子から成る。例えば、当該遺伝子の発現レベルは、以下を表すものであってよい：特定の悪性リンパ腫あるいはその亜種の存在；悪性リンパ腫あるいはその亜種の発達段階、グレード、あるいは攻撃性；悪性リンパ腫あるいはその亜種の進行度（例えば、当該悪性リンパ腫が局所性、領域性、あるいは転移性のものか）；悪性リンパ腫あるいはその亜種の薬剤反応性 （例えば、当該悪性リンパ腫が薬剤感受性を有するか、薬剤耐性を有するか、あるいは多剤耐性をゆうするのか）；悪性リンパ腫の一種が他の種へ転換する尤度（例えば、FL からDLBCLへの転換）； 当該悪性リンパ腫が不応であるか否か（つまり、治療に反応しないということ）；当該悪性リンパ腫が致死的になる尤度；悪性リンパ腫の突然変異状態など。あるいはまた、HCP セット内の遺伝子の発現レベルは、以下を反映していてもよい：白血病に罹患した被験者が白血病の特定の亜種に罹患しているのか、再発のリスクが高いのか、二次的急性骨髄性白血病を発症するリスクが高いのか、血病に罹患した被験者の予後、白血病に対する適切な治療法の選択、白血病あるいはその亜種の薬剤反応性、あるいは白血病の進行度*3。 
【００４８】
当業界で既知であるように、一つ以上の血液癌と相関関係を示す遺伝子がこれまでにいくつか同定されている。例えば、ある遺伝子の発現レベルは、悪性リンパ腫および白血病の双方に見られる一つの特徴を表しているかもしれない。さらに、一つ以上の特定の血液癌の特徴と相関関係を示す遺伝子がこれまでにいくつか同定されている。例えば、ある遺伝子の発現レベルは、悪性リンパ腫の一種から別の種への転換と相関関係を示しており、さらに当該の悪性リンパ腫の亜種を表しているかもしれない。そのような遺伝子も、本発明のHCP セット群に組み入れるのに適切である。
【００４９】
特定のHCP セットに組み入れられるべく選択された各々の遺伝子は、同一の血液癌、あるいはある血液癌の種または亜種に関連している。上記のように、本発明で考慮されている血液癌群は、悪性リンパ腫および白血病から選択されている。従って、例えば、あるHCP セットの遺伝子の全部が、概して悪性リンパ腫に関連している。あるいはまた、あるHCP セットを形成する場合に対象となる悪性リンパ腫の種の例には、以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯B細胞リンパ腫、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、形質細胞性骨髄腫/形質細胞腫、濾胞性リンパ腫(FL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫、びまん性Ｂ大細胞型リンパ腫(DLBCL)、ホジキンリンパ腫、リンパ芽球型リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)、皮下T細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、末梢性T細胞リンパ腫、血管免疫芽球型リンパ腫、血管中心性リンパ腫(鼻型T細胞リンパ腫)、消化管のＴ細胞リンパ腫、および成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病。本発明の一つの実施例では、あるHCP セットに組み入れられるべく選択された遺伝子群は、DLBCL、FL、CLL/SLL、MCL、HL、およびALCL から成る群から選択された悪性リンパ腫の一種に関連している。
【００５０】
同様に、本発明では、あるHCP セットの遺伝子の全てが、概して白血病に関連しているということをさらに考慮している。あるいはまた、あるHCP セットの遺伝子の全てが、白血病の亜種に関連していてもよい。あるHCP セットをデザインする場合に対象となる白血病の亜種の例には、以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：B細胞性慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、T-ALL、MLL、BCR-ABL、TEL-AML1、E2A-PBX1、t(4;11)を伴ったALL。本発明の一つの実施例では、あるHCP セットに組み入れられるべく選択された遺伝子群は、CLL、AML、およびT-ALLから成る群から選択された白血病に関連している。
【００５１】
CLL について言えば、当業者は、この亜種の血液癌は、悪性リンパ腫の亜種と考えられているということを理解しているであろう。あるいはまた、これは白血病の亜種と考えられている。 
【００５２】
HCP セット群に組み入れるべき適切な候補遺伝子は、血液癌の特定の特徴のマーカーとして当業界で既知である遺伝子群から選択することができる。そのような遺伝子は、当業界で既知である多様な「データマイニング」アプローチを用いて、市販のデータベースから同定することができる。あるいはまた、ある特徴を呈示している血液癌に由来する核酸ライブラリーをスクリーニングすることにより、またその発現レベルが参照核酸ライブラリーと比較されこのライブラリーにおいて調整される遺伝子を選択することにより、候補遺伝子を同定することができる。核酸ライブラリーを作製する方法群は、当業界で既知である(例えば、Ausubel et al., (1997 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New Yorkを参照せよ)。
【００５３】
本発明の一つの実施例では、HCP セット群に組み入れるべき候補遺伝子は、データマイニングにより同定される。当業界で既知であるように、多様な検索戦略を用いて、出版物および配列データベースを利用する。例えば、現在利用可能な科学的および医学的な出版されているデータベース｛例えば、Medline、Current Contents、OMIM (ヒトのメンデル遺伝する疾患に関するオンライン情報)、多様な生物学関連および化学関連の要約、学会誌の索引など｝を、用語またはキーワード検索、著者、表題、あるいはその他の関連検索パラメーターを用いて検索することができる。多くのそのようなデータベースが広く利用可能であり、さらに出版物およびその内容（遺伝子、その他の核酸配列、説明、適応症、発現パターンなど）を見つける戦略および手続きは当業者に既知である。多数のデータベースが、インターネット上において無料であるいは定期購読の形で利用可能であり、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター[National Center Biotechnology Information (NCBI)]、インフォトリーブ[Infotrieve] 、トムソンISI [Thomson ISI] 、およびサイエンス・マガジン[Science Magazine] (米国科学振興協会[AAAS]発行) のウェブサイトを参照せよ。上記に記したものに加えてあるいはそれ以外の出版データベースあるいは引用データベースもまた、利用可能であり、それらは同じあるいは類似した種類の情報を提供しており、そのような情報はいかなるものも本発明の文脈で使用することができる。これらのデータベースに検索をかけ、血液癌の特徴間で改変遺伝子発現について比較説明している出版物を見つけることができる。血液癌の特徴とは、血液癌の種（例えば、悪性リンパ腫または白血病の種）あるいは特定の血液癌の亜種（例えば、悪性リンパ腫または白血病の亜種）ということである。 
【００５４】
例えば、遺伝子はまず、出版物に助言を求め、血液癌の特徴を表すと報告されている遺伝子を同定することにより選択することができる。これらの遺伝子の発現レベルを定量するために用いられる方法群には、PCR、ノーザンブロット法、およびマイクロアレイ研究を含む多様な方法群が含まれる。当該血液癌につき転形を検出する独立した研究者の数、および当該血液癌につきこれらの遺伝子の発現レベルを定量するために使用される様々な方法群の数に拠って、候補となる可能性のある遺伝子にポイントを与えることができる。その後、当該遺伝子を与えられたポイント数に従ってランク付けし、最も高得点を与えられた遺伝子を候補遺伝子として選択することができる。候補遺伝子の数は、分析する特徴に拠って、異なる。  
【００５５】
関心の持たれている遺伝子の遺伝子配列を、広く利用可能な且つ所有権のある多様な配列データベース(Genbank、dbEST、UniGene、さらにTIGR および SAGEデータベースを含む)から入手することができ、このような配列データベースには、発現ヌクレオチド配列に対応した配列（例えば、発現配列タグ、ESTs）が含まれている。例えば、NCBI ウェブサイトにあるGenbank(tm) ウェブサイトは、特に、容易にアクセスでき、インターネットを利用して検索することができる。これらの配列およびその他の配列さらにクローンに関するデータベースが現在利用可能であるが、遺伝子配列、EST配列、クローンレポジトリー、PCRプライマー配列、および個々のヌクレオチド配列に対応した類似物から成る数多くの付加的なあるいは代替のデータベースが、既知でありまた本発明の目的に適している。 
【００５６】
上記の考察は、主として、「ゲノミクス」アプローチに関するものであるが、当業者は、数多くの類似した「プロテオミクス」アプローチもまたHCPセット群に組み入れるべく候補遺伝子を選択する目的に適切であるということを理解するであろう。例えば、特異的に発現したタンパク質産物を、ウェスタン分析、二次元ゲル分析、クロマトグラフを用いた分離、質量分析法、タンパク質融合レポーターコンストラクト、カロリメトリックアッセイ、タンパク質アレイへの結合、あるいはポリソームmRNA の特徴を用いて同定することができる。得られたタンパク質をさらに特徴付け、標準テクニックを用いて（例えば、タンパク質配列情報に基づきプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより）、当該タンパク質をコードするヌクレオチドを同定する。このように同定された遺伝子も、HCP セットに含めることができる。 
【００５７】
本発明によりHCP セットに含めるべき代表的且つ非限定的な候補遺伝子の例を、表1に示す。 
【００５８】
表1：その発現パターンが悪性リンパ腫および白血病の群から選択された血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を表す候補遺伝子
【表１】
2008514190.tif 000003
2008514190.tif 000004
2008514190.tif 000005
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【００５９】
従って、本発明の一実施例は、血液癌をプロファイリングするのに適切な候補遺伝子のライブラリーを提供する。さらなる実施例において、当該の候補遺伝子のライブラリーは、表1に記載した遺伝子から成る。当該ライブラリーは、HCPセット群に組み入れるき適切な遺伝子を選択することができる情報源を提供する。 
【００６０】
候補遺伝子が同定されたら、研究対象である血液癌の特徴を表している対象血液癌に関連した遺伝子を選択することにより、HCPセットを作製する。 一つ以上の血液癌が研究対象である場合、あるいは血液癌の一つ異常の亜種が研究対象である場合は、関心の持たれている特徴（群）を表す複数の遺伝子を含む異なった複数のHCPセット群を作成する。例えば、悪性リンパ腫と白血病が研究対象である場合は、異なった複数のHCPセット群を作成する。これらのHCPセット群のそれぞれが悪性リンパ腫の亜種あるいは白血病の亜種に関連しており、関心の持たれている特徴（群）を表している。 
【００６１】
いくつかの遺伝子が一つ以上のHCPセットに組み入れるのに適切であるということは明白であろう。例えば、二種の悪性リンパ腫（例えば、DLBCL とFL）の区別を可能にする遺伝子は、DLBCLに関するHCPとFLに関するHCPに組み入れるのに適切であろう。あるいはまた、例えば、二種の白血病（例えば、CLL と AML）の区別を可能にする遺伝子は、CLLに関するHCPとAMLに関するHCPに組み入れるのに適切であろう。一つ以上のHCPセットに組み入れるのに適切である遺伝子の例には、AKR1C1、MAL (T細胞分化タンパク質)、およびTIMP1がある。
【００６２】
HCP セットは、当該セットが表そうとしている悪性リンパ腫の特徴の数に拠って、1個から2000個の遺伝子から成る。セットが1個以上の遺伝子から成る場合、セット内の遺伝子はそれぞれ異なった一つの血液癌特徴に関連しているか、あるいはHCPセット内の複数の遺伝子は同じ特徴に関連していてもよい。このように、HCPセットは、ある血液癌の一つの特徴を表す遺伝子から成っていてもよいし、あるいはまたある血液癌の一つ以上の特徴を表す遺伝子から成っていてもよいし、あるいはまたそれらの組み合わせから成っていてもよい。
【００６３】
一つの実施例では、HCPセットは少なくとも5個の遺伝子から成っている。別の実施例では、HCPセットは少なくとも10個の遺伝子から成っている。さらにまた別の実施例では、HCPセットは少なくとも15個の遺伝子から成っている。その他の実施例では、HCPセットは少なくとも20個の遺伝子、少なくとも25個の遺伝子、少なくとも30個の遺伝子、少なくとも35個の遺伝子、さらに少なくとも40個の遺伝子から成っている。上記のように、HCPセットは、一般的には、2000個未満の遺伝子から成っている。本発明の一つの実施例では、従って、HCPセットは5個から2000個の遺伝子から成っている。別の実施例では、HCPセットは少なくとも5個から1500個の遺伝子から成っている。さらなる実施例では、HCPセットは少なくとも5個から1000個の遺伝子から成っている。その他の実施例では、HCPセットは少なくとも5個から750個の遺伝子、少なくとも5個から500個の遺伝子、少なくとも5個から400個の遺伝子、さらに少なくとも5個から300個の遺伝子から成っている。その他の実施例では、HCPセットは少なくとも10個から1500個の遺伝子、少なくとも15個から1000個の遺伝子、少なくとも20個から750個の遺伝子、少なくとも25個から500個の遺伝子、少なくとも30個から400個の遺伝子、少なくとも30個から300個の遺伝子、さらに少なくとも30個から250個の遺伝子から成っている。
【００６４】
上記のように、HCPセットは、血液癌の少なくとも一つの特徴を表している。本発明の一つの実施例では、HCPセットは、特定の血液癌の二つあるいはそれ以上の特徴を表している。別の実施例では、HCPセットは、特定の血液癌の1個から20個の特徴を表している。さらなる実施例では、HCPセットは、特定の血液癌の2個から20個の特徴を表している。さらに別の実施例では、HCPセットは、特定の血液癌の3個から20個の特徴を表している。その他の実施例では、HCPセットは、特定の血液癌の1個から18個、1個から16個、1個から14個、1個から12個の特徴を表している。 
【００６５】
本発明の一つの実施例では、HCPセット群に組み入れるべき遺伝子が、表１に記載した遺伝子から選択されている。HCPセット群の代表的且つ非限定的な例を、下記の表2から表19に示す。その他の血液癌、血液癌の種または亜種、あるいはそれらの一つまたはそれ以上の特徴を表す付加的なHCPセット群を、当業者は表1に記載した遺伝子を参考にして容易に作製することができる。 
【００６６】
本発明は、これらのHCPセット群を、拡大HCPセット群（下記の表群に各々のセットに用いられる遺伝子としてリストした遺伝子に加えて付加的な遺伝子を含むHCPセット群）および縮小HCPセット群（いくつかの遺伝子あるいはほとんどの遺伝子が除去されているHCPセット群）を作製する基盤として使用することができるということを考慮している。当業者はまた、下記の表2から表19にリストした遺伝子の組み合わせを用いて、遺伝子を研究対象となっている血液癌およびその特徴に基づき選択し、付加的なHCPセット群を作製することができるということをよく理解するであろう。このように、表2から表19に記載したあるHCPセット群から選択した一つあるいはそれ以上の遺伝子を表2から表19に記載した別のHCPセット群から選択した一つあるいはそれ以上の遺伝子と組み合わせることにより、HCPセット群を作製することができる。そのようなセット群は全て、本発明の範囲内であると考えられる。 
【００６７】
表2：本発明の一つの実施例に従った、悪性リンパ腫に特異的なHCPセット： 
【表２】
2008514190.tif 000014
2008514190.tif 000015
【００６８】
表 3:  本発明の一実施例による白血病に特異的であるＨＣＰセット
【表３】
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【００６９】
表 4:  本発明の一実施例に従ったALCLに特異的であるＨＣＰセット
【表４】
2008514190.tif 000023
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【００７０】
表 5: 本発明の一実施例に従った、CLL・SLLに特異的であるＨＣＰセット
【表５】
2008514190.tif 000030
2008514190.tif 000031
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【００７１】
表 6:本発明の一実施例に従った、DLBCLに特異的であるＨＣＰセット
【表６】
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【００７２】
表 7:本発明の一実施例に従った、FLに特異的であるＨＣＰセット
【表７】
2008514190.tif 000061
2008514190.tif 000062
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【００７３】
表 8:本発明の一実施例に従った、HLに特異的であるＨＣＰセット
【表８】
2008514190.tif 000079
2008514190.tif 000080
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【００７４】
表9:本発明の一実施例に従った、MCLに特異的であるＨＣＰセット
【表９】
2008514190.tif 000087
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2008514190.tif 000104
2008514190.tif 000105
【００７５】
表10：本発明の一実施例に従った、DLBCLに特異的であるHCPセット
【表１０】
2008514190.tif 000106
【００７６】
表11：本発明の一実施例に従った、FLに特異的であるHCPセット
【表１１】
2008514190.tif 000107
【００７７】
表12：本発明の一実施例に従った、HL に特異的であるHCPセット
【表１２】
2008514190.tif 000108
【００７８】
表13：本発明の一実施例に従った、MCLに特異的であるHCPセット
【表１３】
2008514190.tif 000109
【００７９】
表14：本発明の一実施例に従った、MZLに特異的であるHCPセット
【表１４】
2008514190.tif 000110
2008514190.tif 000111
【００８０】
表15：本発明の一実施例に従った、SLLに特異的であるHCPセット
【表１５】
2008514190.tif 000112
2008514190.tif 000113
【００８１】
表16：本発明の一実施例に従った、TCLに特異的であるHCPセット
【表１６】
2008514190.tif 000114
【００８２】
表17：本発明の一実施例に従った、CLLに特異的であるHCPセット
【表１７】
2008514190.tif 000115
【００８３】
表18：本発明の一実施例に従った、AMLに特異的であるHCPセット
【表１８】
2008514190.tif 000116
【００８４】
表19：本発明の一実施例に従った、T-ALLに特異的であるHCPセット
【表１９】
2008514190.tif 000117
【００８５】
1.2    ポリヌクレオチドプローブ
本発明のシステムは、一つあるいはそれ以上のHCPセットの遺伝子を検出する能力を有するポリヌクレオチドプローブ群の組み合わせ（血液癌プロファイリング(HCP) 組み合わせ）を提供する。当該HCP組み合わせのポリヌクレオチドプローブはそれぞれ、HCPセット内の1個の遺伝子（標的遺伝子）のヌクレオチド配列に由来する1個のヌクレオチド配列から成る。当該ポリヌクレオチドプローブの当該ヌクレオチド配列は、当該標的遺伝子あるいはその遺伝子から転写されたmRNAに対しユニークである領域に対応するかあるいは当該領域に相補的であるようにデザインされている。 
【００８６】
ポリヌクレオチドプローブは、過酷なハイブリダイゼーション条件下あるいは過酷度を下げたハイブリダイゼーション条件下において、A標的遺伝子の領域、当該標的遺伝子から転写されたmRNA、あるいはそれらに由来する核酸配列（例えば、cDNA）に、特異的にハイブリダイズすることができる。遺伝子のスプライスバリアント群が既知であれば、プローブを単一のスプライスバリアントにのみハイブリダイズするようにデザインすることができ（例えば、当該スプライスバリアントにユニークであるmRNA の領域に相補的な配列から成る）、あるいはまた、全てのスプライスバリアントにハイブリダイズするようにデザインすることもできる（例えば、全てのスプライスバリアントに共通であるmRNA の領域に相補的な配列から成る）。スプライスバリアントに特異的なプローブを使用する場合は、それぞれが異なったスプライスバリアントに特異的である複数の異なったプローブをデザインしてよい。 
【００８７】
ポリヌクレオチドプローブ配列の選択およびそのユニークさの判断は、in silico で、当業界で既知のテクニックを用いて行なうことができ、そのような既知のテクニックには、例えば、対象ポリヌクレオチド配列を、Human Genome Sequence、UniGene、dbEST あるいはNCBIの非重複データベースなどの遺伝子配列データベースに照らし合わせて検索するBLASTN検索がある。本発明の一つの実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、HCPセットにおける標的遺伝子に由来する標的mRNAの領域に相補的である。コンピュータープログラムを用いて、クロスハイブリダイズしないかあるいは非特異的にハイブリダイズしないプローブ配列を選択することもできる。
【００８８】
ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、その標的配列に特異的にハイブリダイズするためには、当該標的配列に同一である必要はないということを、当業者は理解するであろう。本発明のポリヌクレオチドプローブは、従って、標的遺伝子あるいはmRNAの領域と少なくとも約75%同一であるヌクレオチド配列から成る。別の実施例では、ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、標的遺伝子あるいはmRNAの領域と少なくとも約90%同一である。さらなる実施例では、ポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、標的遺伝子あるいはmRNAの領域と少なくとも約95%同一である。配列同一性を決定する方法群は、当業界で既知であり、例えば、University of Wisconsin Computer Group (GCG)ソフトウェアーのBLASTN プログラムあるいはNCBIウェブサイトに提供されているBLASTN プログラムを用いて決定することができる。本発明のポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列は、1個、2個、3個、4個あるいはそれ以上のヌクレオチドにおいて標的遺伝子の配列とは異なっている（例えば、遷移あるいは転換を含むヌクレオチド置換により）ことにより、変動性を呈示するかもしれない。
【００８９】
当業界で既知であるその他の判断基準を、本発明のポリヌクレオチドプローブをデザインする際に用いてもよい。例えば、プローブを、G 含有量が<50%、および／またはG+C 含有量が約25%から約70%の間であるようにデザインすることができる。プローブの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションを最適化する戦略群を、プローブ選択過程に含めてもよい。特定のpH 、塩、および温度条件下におけるハイブリダイゼーションを、融点を考慮することおよび望ましいハイブリダイゼーション特性と相関する実験実証規則を用いることにより、最適化することができる。コンピューターモデルを用いて、プローブハイブリダイゼーションの強度および濃度依存性を予測してもよい。 
【００９０】
当業界で既知であるように、ヒトゲノムにおけるユニーク配列を表すためには、プローブは少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する必要がある。従って、本発明のポリヌクレオチドプローブの長さは、約15ヌクレオチドから、標的遺伝子あるいは標的mRNAの全長の範囲である。本発明の一つの実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも約15ヌクレオチドの長さを有する。別の実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも約20ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも約25ヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、約15ヌクレオチドから約500のヌクレオチド長さを有する。その他の実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、約15ヌクレオチドから約450、約15ヌクレオチドから約400、約15ヌクレオチドから約350、約15ヌクレオチドから約300ヌクレオチドの長さを有する。より例えば、525、550、575、600、625、650、675、あるいは700ヌクレオチドの長さを有する大きなポリヌクレオチドプローブも、本発明で考慮されている。その他の実施例では、ポリヌクレオチドプローブは、約15ヌクレオチドから約100、約20ヌクレオチドから約100、約25ヌクレオチドから約100、約25ヌクレオチドから約75ヌクレオチドの長さを有する。
【００９１】
本発明の一つの実施例において、HCP組み合わせにおけるポリヌクレオチドプローブはぞれぞれ、表1にリストした遺伝子群の一つから転写されたmRNAに対応しているかあるいは当該mRNAの配列に相補的である配列から成る。適切なプローブ配列の代表例には、SEQ ID NOs:1-4530（下記の表20から表23）のいずれかに記載されているような配列群の1個の配列の全部あるいは一部から成るプローブが含まれる。一つの実施例では、プローブ群は、SEQ ID NOs:1-4530（下記の表20から表23）のいずれかに記載されているような配列群の1個の配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。 
【００９２】
表20：一つの実施例に従った、30mer ポリヌクレオチドプローブ
【表２０】
2008514190.tif 000118
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【００９３】
表21：一つの実施例に従った、50mer ポリヌクレオチドプローブ
【表２１】
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【００９４】
表22：一つの実施例に従った、60mer ポリヌクレオチドプローブ
【表２２】
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【００９５】
表23：一つの実施例に従った、70mer ポリヌクレオチドプローブ  
【表２３】
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【００９６】
HCP 組み合わせのポリヌクレオチドプローブは、RNA、DNA、RNAまたはDNA ミメティクス、あるいはそれらの組み合わせから成っていてよく、一本鎖あるいは二本鎖であってよい。このように、ポリヌクレオチドプローブは、天然型核酸塩基、糖類、および共有結合のインターヌクレオシド（バックボーン）結合から成っていてよく、また同様に機能する非天然型部分を有するポリヌクレオチドプローブであってよい。そのような改変あるいは置換されたポリヌクレオチドプローブは、例えば標的遺伝子に対する親和性が高く安定性が高いといった、望ましい性質を有する。 
【００９７】
当業界で既知であるように、ヌクレオシドは塩基と糖の組み合わせであり、ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドを形成する過程において、リン酸基群は、隣接するヌクレオシドを相互に共有結合させ、線形の重合体化合物を形成し、この場合RNAとDNAの通常結合すなわちバックボーンは3'―5'リン酸ジエステル結合である。本発明において有用であるポリヌクレオチドプローブには、改変バックボーンあるいは非天然型のインターヌクレオシド結合を含んだオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義しているように、改変バックボーンを含んだオリゴヌクレオチドには、リン原子をバックボーンに保持しているものと、リン原子をバックボーンから欠くものとの双方が含まれる。本発明の目的について言えば、また当業界で時に言及されるように、リン原子をインターヌクレオシドバックボーンに有していない改変オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドと考えられる。 
【００９８】
改変オリゴヌクレオチドバックボーンを有するポリヌクレオチドプローブの例には、例えば以下が含まれる：一つあるいはそれ以上の改変インターヌクレオチド結合を有するポリヌクレオチドで、当該改変インターヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート[phosphorothioates]、キラルホスホロチオエート[chiral  phosphorothioates]、ホスホロジチオエート[phosphorodithioates]、ホスホトリエステル[phosphotriesters]、アミノアルキルホスホトリエステル[aminoalkylphosphotriesters]、3'-アルキレンホスホン酸[3'-alkylene phosphonates]およびキラルホスホン酸[chiral phosphonates]を含むメチル[methyl]およびその他のアルキルホスホン酸[alkyl phosphonates]、ホスフィン酸[phosphinates]、3'アミノホスホロアミデート[3'amino phosphoramidate]およびアミノアルキルホスホロアミデート[aminoalkylphosphoramidates]を含むホスホロアミデート[phosphoramidates]、チオノホスホロアミデート[thionophosphoramidates] 、チオノアルキル-ホスホン酸[thionoalkyl-phosphonates]、チオノアルキルホスホトリエステル[thionoalkylphosphotriesters]、および通常3'-5' 結合を有するボラノホスフェート [boranophosphates] 、これらの2'-5' 結合類自体であるもの；および逆極性を有するポリヌクレオチド（このポリヌクレオチドでは、ヌクレオシドユニットの隣接する対は、結合された3'-5'から5'-3'、あるいは2'-5' から5'-2'である）。多様な塩類、混合塩類、および遊離酸形態類も含まれる。 
リン原子を含まない改変オリゴヌクレオチドバックボーンの例は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのインターヌクレオシド結合、混合へテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのインターヌクレオシド結合、あるいは一つあるいはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環式のインターヌクレオシド結合により、形成することができる。そのようなバックボーンには、以下が含まれる：モルフォリノ結合（部分的には、ヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチル[formacetyl] および チオホルムアセチル[thioformacetyl] バックボーン；メチレンホルムアセチル[methylene formacetyl] およびチオホルムアセチル [thioformacetyl] バックボーン；アルケンを含むバックボーン；スルファメート[sulphamate] バックボーン；メチレンイミノ[methyleneimino] および メチレンヒドラジノ[methylenehydrazino] バックボーン；スルフォネート[sulphonate] およびスルフォンアミド[sulphonamide] バックボーン；アミド[amide] バックボーン；および混合N、O、S および CH2 構成要素部分を有するその他バックボーン。 
【００９９】
本発明はまた、ヌクレオチドユニットの糖とインターヌクレオシド結合の双方が新規の基で置換されているオリゴヌクレオチドミメティクスも考慮している。塩基ユニットは、適切な核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために維持されている。優れたハイブリダイゼーション性質を有すると報告されているそのようなオリゴヌクレオチドミメティクスの一例は、ペプチド核酸(PNA)である（Nielsen et al., Science, 254:1497-1500 (1991)）。PNA 化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンが、アミド[amide] を含むバックボーン、特にアミノエチルグリシン[aminoethylglycine] バックボーンと、置換されている。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のaza-窒素原子に直接的にあるいは間接的に結合されている。 
【０１００】
本発明はまた、「ロックされた核酸[locked nucleic acids]」(LNAs)から成るポリヌクレオチドプローブも考慮しており、これは新規のコンフォメーション的に制限されたオリゴヌクレオチドで、リボースの2′-Oを4′-Cと繋いでいるメチレン架橋を含む (Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4:455-456を参照せよ)。LNA および LNA 類自体は、相補的DNAおよびRNAと共に非常に高い二重鎖熱安定性、3′-エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解度を呈する。アデニン、シトシン、グアニン、5-メチルシトシン、チミン、およびウラシルを用いてLNA 類自体を合成する方法、その二量体化、さらに核酸認識特性が説明されている(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54:3607-3630を参照せよ)。ミスマッチ配列に関する研究により、LNAは、その対応する未改変の参照鎖に比較して、一般的に改善された選択性を以って、ワトソン-クリック型塩基対の法則に従うということが報告されている。
【０１０１】
LNAは、相補的なDNAまたはRNAと共に、あるいは相補的なLNAと共に、二重鎖を形成し、高い熱親和性を有する。LNA が介在するハイブリダイゼーションの普遍性は、非常に安定性の高いLNA：LNA 二重鎖の形成により強調されている(Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120:13252-13253)。LNA：LNA ハイブリダイゼーションは、最も熱学的に安定した核酸型二重鎖システムであると報告されており、LNA のRNA 模倣特徴は二重鎖レベルで確立された。3個のLNA モノマー(T あるいは A)を導入すると、DNA補体において融点が著しく上昇する。 
【０１０２】
2′-アミノ-LNA の合成(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039) および2'-メチルアミノ-LNA が説明されており、それらが相補的RNAおよびDNAと構成する二重鎖の熱安定性が報告されている。ホスホロチオエート-LNA [phosphorothioate-LNA] および2′-チオ-LNA [2′-thio-LNA] もまた説明されている (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8:2219-2222)。
【０１０３】
改変ポリヌクレオチドプローブもまた、一つあるいはそれ以上の糖部分を含んでいる。例えば、オリゴヌクレオチドは、2'部位に以下の置換基群の1個を有する糖類から成っていてよい：OH； F； O-、 S-、あるいは N-アルキル；O-、 S-、あるいはN-アルケニル；O-、S- あるいはN-アルキニル；あるいは O-アルキル-O-アルキル。ここでアルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換されたあるいは置換されていないC1 からC10 のアルキルあるいはC2 から C10の アルケニルおよびアルキニルであってよい。そのような基の例には、O[(CH2)n O]m CH3, O(CH2)n OCH3、O(CH2)n NH2、O(CH2)n CH3,、O(CH2)n ONH2、およびO(CH2)n ON[(CH2)n CH3)]2があり、ここでn および m は、１から約10である。あるいはまた、当該オリゴヌクレオチドは、2'部位に以下の置換基群の1個から成っていてよい： C1から C10の 低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリール あるいはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2 CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA 割裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特質を改善するための基、あるいはオリゴヌクレオチドの薬力学的特質を改善するための基、および類似した特質を有するその他の置換基。具体例には、2'-メトキシエトキシ (2'-O--CH2 CH2 OCH3、別名2'-O-(2-メトキシエチル) あるいは 2'-MOE) [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 78:486-504(1995)]、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ(O(CH2)2 ON(CH3)2 基、別名2'-DMAOE)、2'-メトキシ (2'-O--CH3)、2'-アミノプロポキシ(2'-OCH2 CH2 CH2 NH2) および 2'-フルオロ (2'-F)がある。 
【０１０４】
類似した改変を、当該ポリヌクレオチドプローブのその他の部位において、特に、3'末端ヌクレオチド上あるいは2'-5' 結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'部位、あるいはおよび5'末端ヌクレオチドの5'部位において、行なってもよい。ポリヌクレオチドプローブはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖ミメティクスを有していてもよい。 
【０１０５】
ポリヌクレオチドプローブはまた、核酸塩基への改変あるいは置換を含んでいてもよい。本書で使用されているように、「改変されていない」あるいは「天然型」の核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン(A)およびグアニン(G)、さらにピリジン塩基であるチミン (T)、シトシン(C) および ウラシル (U)が含まれる。改変ヌクレオチドには、その他の合成および天然型の核酸塩基が含まれ、その例には、以下がある：5-メチルシトシン (5-me-C) [5-methylcytosine (5-me-C)]、 5-ヒドロキシメチルシトシン[5-hydroxymethyl cytosine]、 キサンチン[xanthine]、ヒポキサンチン[hypoxanthine]、2-アミノアデニン [2-aminoadenine]、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル [2-thiouracil]、2-チオチミン [2-thiothymine] および 2-チオシトシン[2-thiocytosine]、5-ハロウラシル[5-halouracil] およびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-azo ウラシル [6-azo uracil]、シトシンおよびチミン、5-ウラシル (偽性ウラシル) [5-uracil (pseudouracil)]、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニン類およびグアニン類、5-ハロ特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび5-置換ウラシル類およびシトシン類、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニン[8-azaguanine] および 8-アザアデニン[8-azaadenine]、7-デアザグアニン [7-deazaguanine] および 7-デアザアデニン[7-deazaadenine] および3-デアザグアニン [3-deazaguanine] および3-デアザアデニン [3-deazaadenine]。さらなる核酸塩基には、米国特許番号3,687,808；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, (1990) pp 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons；Englisch et al., Angewandte Chemie, Int. Ed., 30:613 (1991)；および Sanghvi, Y. S., (1993) Antisense Research and Applications, pp 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Pressに記載されている核酸塩基がある。これらの核酸塩基のあるものは、本発明のポリヌクレオチドプローブの結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、 2-アミノプロピルアデニン [2-aminopropyladenine]、5-プロピルウラシル[5-propynyluracil] および5-プロピニルシトシン [5-propynylcytosine] を含む、5-置換ピリミジン類、6-アザピリミジン類[6-azapyrimidines] および N-2、N-6 および O-6置換プリン類が含まれる。5-メチルシトシン[5-methylcytosine] 置換は、核酸二重鎖安定性を0.6oC から1.2oC増すと報告されている （Sanghvi, Y. S., (1993) Antisense Research and Applications, pp 276-278, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, Boca Raton）。  
【０１０６】
当業者は、所与のポリヌクレオチド内の全ての部位が画一的に改変されている必要はないということを認識するであろう。従って、本発明は、一つ以上の前記の改変を、単一のポリヌクレオチドプローブに組み入れること、あるいはプローブ内の単一のヌクレオシドにおいても組み入れることを、考慮している。 
【０１０７】
当業者はまた、ポリヌクレオチドプローブの全長ヌクレオチド配列が標的遺伝子に由来するものである必要はないということをよく理解するであろう。従って、ポリヌクレオチドプローブは、5′末端および／または 3′ 末端に位置する標的遺伝子に由来しないヌクレオチド配列群から成っていてよい。標的遺伝子のヌクレオチド配列に由来しないヌクレオチド配列群は、ポリヌクレオチドプローブに付加的な官能性を提供することができる。例えば、それらのヌクレオチド配列群は、制限酵素認識配列、すなわち検出、単離、精製、あるいは固相支持体への固定を促進する「タグ」を提供することができる。あるいはまた、付加的なヌクレオチドは、プライマー／プローブがヘアピン構成を採用することを可能にする自己相補的配列を提供することができる。そのような構成は、溶液ハイブリダイゼーションテクニックにおいて用いられるある種のプローブ（例えば、モレキュラーベーコン法およびスコルピオンプローブ）には必要である。 
【０１０８】
ポリヌクレオチドプローブは、必要であれば、検出、単離、精製、あるいは固定に有用である部分を組み入れることができる。そのような部分は、当業界で既知であり(例えば、Ausubel et al., (1997 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New Yorkを参照せよ) 、その標的配列とハイブリダイズするプローブの能力が影響を受けないように選択される。 
【０１０９】
適切な部分の例には、検出可能ラベル（例えば、放射線同位体、蛍光体、化学発光原子団、酵素、コロイド粒子、および微粒子など）、抗体、ハプテン、アビジン／ストレプトアビジン、ビオチン、ハプテン、酵素補因子／基質、酵素などがある。
【０１１０】
1.2.1ポリヌクレオチドプローブの調製
本発明のポリヌクレオチドプローブは、当業者に既知である従来のテクニックを用いて調製することができる。例えば、ポリヌクレオチドプローブは、市販されている設備（例えば、カナダ国ミシソーガ市Applied Biosystems Canada Inc.製の設備）を使って固相合成により調製することができる。当業界で既知であるように、ホスホロチオエート[phosphorothioates] およびアルキル化誘導体のような改変オリゴヌクレオチドもまた、類似方法群により調製することができる。ポリヌクレオチドプローブはまた、当業界で標準である方法群に従って、直接固相支持体に合成することもできる。ポリヌクレオチドを合成するこの方法は、ポリヌクレオチドプローブが核酸アレイの一部である場合に、特に有用である。 
【０１１１】
あるいはまた、本発明のポリヌクレオチドプローブは、天然型の標的遺伝子、あるいはそれから由来するmRNA または cDNAの酵素的消化により、当業界において既知である方法群に従って、調製することができる。
【０１１２】
1.2.2ポリヌクレオチドプローブのテスト
HCP 組み合わせにおいて用いるポリヌクレオチドプローブは、HCPセット内の標的遺伝子の発現を特異的に検出する能力を有するものでなければならない。先に述べたように、ポリヌクレオチドプローブの特異性あるいはユニークさは、当業界において既知である方法群を用いてin silico で判断することができる。
【０１１３】
あるいはまた、検体の標的遺伝子あるいはmRNAの発現を検出するポリヌクレオチドプローブの能力は、その他の標準方法群を用いて(例えば、 Ausubel et al., (1997 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New Yorkを参照せよ)評価することができ、そのような標準方法群には、適切な対照群を用いたサザンブロット法あるいはウェスタンブロット法などのハイブリダイゼーションテクニックがある。また、[ポリヌクレオチドプローブの能力を測定する方法には]、逆転写、転写、PCR、RT-PCRなどの一つあるいはそれ以上の付加段階を含めてもよい。HCP組み合わせ内のポリヌクレオチドプローブの特異性をこれらの方法群を用いてテストすることは、十二分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１４】
1.3     血液癌プロファイリング(HCP)組み合わせ
HCP 組み合わせは、上記のように、一つあるいはそれ以上のHCPセット内の遺伝子を標的とするためにデザインされた複数のポリヌクレオチドプローブから成る。HCP 組み合わせは、血液癌および／または血液癌の関心の持たれている特徴(群)を表す当該HCPセット群に対応するポリヌクレオチドプローブ群の選択により、固特殊目的のために合わせることができる。このように、例えば、単一血液癌（例えば、悪性リンパ腫）の多様な特徴を研究することが関心事である場合は、関心の持たれている悪性リンパ腫を表しているHCPセットに対応しているプローブから成るHCP 組み合わせを選択すればよい*4。同様に、複数の血液癌の特徴群を研究することが関心事である場合は、複数のHCPセット群を表すプローブから成る組み合わせを選択すればよい。
【０１１５】
本発明の一つの実施例では、HCP 組み合わせは、一つのHCPセットの遺伝子群のヌクレオチド配列群に由来する複数のポリヌクレオチドプローブから成る。別の実施例では、HCP 組み合わせは、二つあるいはそれ以上のHCPセット群の遺伝子群のヌクレオチド配列群に由来する複数のポリヌクレオチドプローブから成る。別の実施例では、HCP 組み合わせは、三つあるいはそれ以上のHCPセット群の遺伝子群のヌクレオチド配列群に由来する複数のポリヌクレオチドプローブから成る。さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、四つあるいはそれ以上のHCPセット群の遺伝子群のヌクレオチド配列群に由来する複数のポリヌクレオチドプローブから成る。その他の実施例群では、HCP 組み合わせは、五つあるいはそれ以上、および六つあるいはそれ以上のHCPセット群の遺伝子群のヌクレオチド配列群に由来する複数のポリヌクレオチドプローブから成る。
【０１１６】
HCP セットの構成物は、HCP組み合わせ内にある一つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドプローブの標的となっていてよい。従って、HCP組み合わせは、HCPセット内の一つの遺伝子のみに標的を当てたいくつかのポリヌクレオチドプローブ、およびそれぞれが異なった遺伝子を標的としているその他のプローブ群から成る。一つの実施例では、HCP 組み合わせ内のポリヌクレオチドプローブ群は、それぞれがHCPセットの異なった構成物を標的としている。別の実施例では、HCP 組み合わせ内の1個あるいはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ群は、HCPセットの同一の構成物を標的としている。
【０１１７】
従って、HCP 組み合わせは、1個から約10,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。本発明の一つの実施例では、HCP 組み合わせは、少なくとも2個のポリヌクレオチドプローブから成る。別の実施例では、HCP 組み合わせは、少なくとも5個のポリヌクレオチドプローブから成る。その他の実施例では、HCP 組み合わせは、少なくとも10個、20個、30個、40個、50個、100個、150個、200個および 300個のポリヌクレオチドプローブから成る。 一つの実施例では、HCP 組み合わせは、約10個から約300個のポリヌクレオチドプローブから成る。別の実施例では、HCP 組み合わせは、約20個から約300個のポリヌクレオチドプローブから成る。さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、約30個から約300個のポリヌクレオチドプローブから成る。その他の実施例では、HCP 組み合わせは、約40個から約300個、約50個から約300個、約75個から約300個、約100個から約300個のポリヌクレオチドプローブから成る。
【０１１８】
代替の実施例では、HCP 組み合わせは、約100個から約10,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、約200個から約5,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。別の実施例では、HCP 組み合わせは、約200個から約4,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。さらに別の実施例では、HCP 組み合わせは、約200個から約3,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。その他の実施例では、HCP 組み合わせは、約200個から約2,000個、約300個から約2,000個、約400個から約2,000個、約500個から約2,000個、約500個から約1,500個、約750個から約1,500個、約750個から約1,250個、約800個から約1,200個のポリヌクレオチドプローブから成る。
【０１１９】
さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、約1,000個から約10,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。例えば、HCP 組み合わせは、約2,000個から約10,000個のポリヌクレオチドプローブから成っていてよい。一つの実施例では、HCP 組み合わせは、約2,500個から約9,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。さらに別の実施例では、HCP 組み合わせは、約3,000個から約8,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。その他の実施例では、HCP 組み合わせは、約3,000個から約7,000個、約3,000個から約6,000個、約3,500個から約6,000個、約4,000個から約6,000個、約4,000個から約5,000個のポリヌクレオチドプローブから成る。
【０１２０】
上記のように、HCP 組み合わせは、一つあるいはそれ以上のHCPセットの遺伝子を標的とするようにデザインされた複数のポリヌクレオチドプローブから成る。HCPセット群に組み入れるべき候補遺伝子群の代表的且つ非制限的な例を、上記表1に示した。それに従って、本発明の一つの実施例では、HCP 組み合わせは、10個から5,000個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、表１にリストした遺伝子群の1個の遺伝子の配列に対応しているかあるいは相補的である一つの配列から成る。HCPセット群の代表的且つ非制限的な例を、上記表2から表19に示した。このように、別の実施例では、HCP 組み合わせは、10個から5,000個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、以下の群から選択されたHCPセットの1個の遺伝子に対応しているかあるいは相補的である一つの配列から成る： 
(a) 表2に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(b) 表3に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(c) 表4に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(d) 表5に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(e) 表6に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(f) 表7に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(g) 表8に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(h) 表9に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(i) 表10に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(j) 表11に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(k) 表12に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(l) 表13に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(m) 表14に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(n) 表15に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット； 
(o) 表16に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(p) 表17に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(q) 表18に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；
(r) 表19に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット；および 
(s) 表2から表19に記載した1個あるいはそれ以上の遺伝子から成るHCPセット。 
【０１２１】
さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、10個から5,000個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、以下の群から選択されたHCPセットの1個の遺伝子に対応しているかあるいは相補的である一つの配列から成る：
(a) 表2に記載したHCPセット；
(b) 表3に記載したHCPセット；
(c) 表4に記載したHCPセット；
(d) 表5に記載したHCPセット；
(e) 表6に記載したHCPセット；
(f) 表7に記載したHCPセット；
(g) 表8に記載したHCPセット；
(h) 表9に記載したHCPセット；
(i) 表10に記載したHCPセット；
(j) 表11に記載したHCPセット；
(k) 表12に記載したHCPセット；
(l) 表13に記載したHCPセット；
(m) 表14に記載したHCPセット；
(n) 表15に記載したHCPセット；
(o) 表16に記載したHCPセット；
(p) 表17に記載したHCPセット；
(q) 表18に記載したHCPセット；および
(r) 表19に記載したHCPセット。
【０１２２】
別の実施例では、HCP 組み合わせは、一つ以上のHCPセットを表し、10個から5,000個のポリヌクレオチドプローブから成り、前記プローブはそれぞれ、表2から表19にリストした1個の遺伝子に対応しているかあるいは相補的である一つの配列から成る。
【０１２３】
さらなる実施例では、HCP 組み合わせは、10個から5,000個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、表20から表23のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に対応しているかあるいは相補的である一つの配列を有し、ここでHCP 組み合わせは、以下の群から選択された一つあるいはそれ以上のHCPセット群を表す：
(a) 表2に記載したHCPセット；
(b) 表3に記載したHCPセット；
(c) 表4に記載したHCPセット；
(d) 表5に記載したHCPセット；
(e) 表6に記載したHCPセット；
(f) 表7に記載したHCPセット；
(g) 表8に記載したHCPセット；
(h) 表9に記載したHCPセット；
(i) 表10に記載したHCPセット；
(j) 表11に記載したHCPセット；
(k) 表12に記載したHCPセット；
(l) 表13に記載したHCPセット；
(m) 表14に記載したHCPセット；
(n) 表15に記載したHCPセット；
(o) 表16に記載したHCPセット；
(p) 表17に記載したHCPセット；
(q) 表18に記載したHCPセット；および
(r) 表19に記載したHCPセット。
【０１２４】
表2から表19に記載したHCPセット群の遺伝子を標的とする適切なプローブ配列の代表的且つ非限定的な例は、表20から表23に示した。それに従って、本発明の特定の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも10個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs:1-4530 (表20から表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。別の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs:1-4530 (表20から表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。別の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも30個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs:1-4530 (表20から表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。別の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも40個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs:1-4530 (表20から表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。その他の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、さらに少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs:1-4530 (表20から表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。さらなる実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、さらに少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs: 1-1153 (表20)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。その他の実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、さらに少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs: 1154-2299 (表21)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。さらなる実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、さらに少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs: 2300-3426 (表22)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。さらなる実施例では、HCP組み合わせは少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、さらに少なくとも100個のポリヌクレオチドプローブから成り、ここでプローブはそれぞれ、SEQ ID NOs: 3427-4530 (表23)に記載した配列群の１個の配列の少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。 
【０１２５】
1.3.1 HCP組み合わせのテスト 
HCP組み合わせを、それが表す一つあるいはそれ以上のHCPセット群内の遺伝子の発現パターンを検出するその能力につき、当業界に既知である方法群および当該HCP組み合わせを使って研究する対象である血液癌および特徴群を表すひとつあるいはそれ以上の生物学的検体を用いて、テストすることができる。適切な生物学的検体には、当該血液癌に罹患した患者から採取した血液検体または組織検体が含まれ、当該検体はそれぞれ特定の血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を呈するものとして既知である。代替として、あるいは、上記に加えて、生物学的検体は、適切な血液癌細胞ラインの培養から得ることもでき、当該細胞ラインはそれぞれ特定の血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を呈するものとして既知である。HCP組み合わせをテストする目的で使用することができる血液癌細胞ラインの例は、下記の表24に示した。当業者は、HCP組み合わせをテストする目的に適切であるその他の血液癌細胞ラインも入手可能であるということをよく理解するであろう。特定のHCP組み合わせのテストを行なうために適切な細胞ラインを選択することは、当業者の通常の技術の範囲内である。必要であれば、一つあるいはそれ以上の対照検体（例えば、健常被験者あるいは正常な細胞ラインから採取した生物学的検体）を比較のため使用することができる。
【０１２６】
一つあるいはそれ以上の生物学的検体の発現パターンを検出するHCP組み合わせの能力は、遺伝子発現分析の業界で既知である方法群を用いて定量することができる(例えば、Ausubel et al., (1997 & updates) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New Yorkを参照せよ)。そのような方法群は、一般的に、ノーザンブロット法などのハイブリダイゼーションに基づく方法群である。例えば、上記のように、患者あるいは細胞ラインの培養から採取した血液検体あるいは組織検体から、RNA を調製することができ、ゲル上に単離することができる。当業界で既知である方法群に従って、HCP 組み合わせのプローブに標識を付け、ゲル上の検体に由来する特定のmRNAの発現を検出するために使用することができる。その他のテスト方法群に、逆転写、RT-PCRおよび／またはPCR（マルチプレックスPCRを含む）などの付加的な段階を含めることができる。アレイに基づく方法群もまた、HCP組み合わせをテストするために使用することができる。HCP組み合わせのプローブを用いて検出した発現パターンは、それぞれの検体について予測された発現パターンに対応するはずである。
【０１２７】
表24：悪性リンパ腫の一種あるいは白血病の一種を表す遺伝子発現パターンを呈する細胞ライン 
【表２４】
2008514190.tif 000226
2008514190.tif 000227
【０１２８】
2.    血液癌プロファイリング(HCP)アレイ
本発明は、HCP組み合わせをアレイ（HCPアレイ）として提供することも可能であるということを考慮している。本発明の文脈においては、「アレイ」は、空間的にあるいは論理的に編成されたポリヌクレオチドプローブの集まりである。一般的に、ポリヌクレオチドプローブは、固相基質に付着してあり、それぞれのプローブの位置（固相基質上の）および同一性が既知であるように順序だてて並べてある。ポリヌクレオチドプローブは、試液およびアレイを使用するために必要な条件に耐える能力を有する多様な固相基質のひとつに付着してある。その例には、ポリテトラフルオロエチレン、 ポリビニリデンジフルオライド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリスチレン*5などのポリマー類；磁器；シリコン；二酸化珪素； 改変シリコン；(融合)シリカ、石英、あるいは硝子；官能化硝子；ろ過紙のような紙；ジアゾ化セルロース；ニトロセルロースフィルター；ナイロンメンブレン；およびポリアクリルアミドゲルパッドが含まれるがそれらに限定されるものではない。光に透明である基質は、光学的検出を行なうアッセイに使用するアレイに有用である。 
【０１２９】
アレイフォーマットの例には、メンブレンアレイあるいはフィルターアレイ（例えば、ニトロセルロース、ナイロンアレイなど）、プレートアレイ（例えば、24穴、96穴、256穴、384穴、864穴あるいは1536穴などのマルチウェル、マイクロタイタープレートアレイ）、ピンアレイ、およびビーズアレイ（例えば、液体スラリー内）が含まれる。硝子あるいは磁器などの基質上のアレイは、多くの場合チップアレイあるいは「チップ」と呼ばれている。そのようなアレイは当業界において既知である。本発明の一つの実施例では、HCPアレイはチップである。
【０１３０】
HCPアレイは、例えば固相表面に置かれたスポットの形態で、各々のポリヌクレオチドプローブの単一の表現から成っていてよく、あるいはまたアレイは、同一のポリヌクレオチドプローブの複数の表現から成っていてもよい。現在利用可能なチップアレイ作製方法群では、例えば、単一のチップ上に約40,000個のスポットを組み込むことが可能である。 
【０１３１】
本発明のHCPアレイにおけるスポットの数は、従って、わずか2個から40,000個までであることが可能である。一般的には、アレイというものは、約15個から約40,000個のスポットから成る。アレイに含まれる実際のスポットの数は、アレイを作成するために使用されているHCP組み合わせ内のプローブの数、各々のプローブが当該アレイで何回表されるか、当該アレイに含まれているコントロールプローブの数（もしあれば）、および当該アレイのフォーマットに依存する。
【０１３２】
当業界で既知であるように、異なった長さのプローブをHCPアレイに組み入れることができる。本発明の一つの実施例では、アレイに組み入れるプローブは、約20ヌクレオチドから100ヌクレオチドの長さである。本発明の別の実施例では、アレイに組み入れるプローブは、約25ヌクレオチドから40ヌクレオチドの長さである。別の実施例では、プローブは、約28ヌクレオチドから32ヌクレオチドの長さである。さらなる実施例では、アレイに組み入れるプローブは、30-merである。代替の実施例では、アレイに組み入れるプローブは、約40ヌクレオチドから55ヌクレオチドの長さ、あるいは約48ヌクレオチドから52ヌクレオチドの長さである。さらなる実施例では、アレイに組み入れるプローブは、50-merである。さらなる実施例では、アレイに組み入れるプローブは、約55 ヌクレオチドから65ヌクレオチドの長さ、あるいは約58ヌクレオチドから62ヌクレオチドの長さである。さらに別の実施例では、アレイに組み入れるプローブは、60-merである。その他の実施例では、アレイに組み入れるプローブは、約65 ヌクレオチドから75ヌクレオチドの長さ、あるいは約68ヌクレオチドから72ヌクレオチドの長さである。さらなる実施例では、アレイに組み入れるプローブは、70-merである。
【０１３３】
HCPアレイは、例えば、「小型」フォーマットあるいは「大型」フォーマットなど、多様なフォーマットにデザインすることができる。小型アレイは、一般的に500個未満の遺伝子を表すポリヌクレオチドプローブから成る。一つの実施例では、本発明で考慮している小型アレイは、約15個から499個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。別の実施例では、小型アレイは、約50個から400個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。さらなる実施例では、小型アレイは、約100個から350個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。さらに別の実施例では、小型アレイは、約200個から300個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。上記のように、小型アレイ上にある、各々の遺伝子を表すプローブは、単一であるいは複数でスポットされてよい。  
【０１３４】
あるいはまた、HCPアレイは「大型」フォーマットにデザインされてもよい。大型アレイは、一般的に500個あるいはそれ以上の遺伝子を表すポリヌクレオチドプローブから成る。一つの実施例では、本発明で考慮している大型アレイは、約500個から6000個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。別の実施例では、大型アレイは、約600個から4000個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。さらなる実施例では、大型アレイは、約700個から2000個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。さらに別の実施例では、大型アレイは、約900個から1000個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。さらに別の実施例では、大型アレイは、約1000個から1300個の遺伝子を表すポリヌクレオチドから成る。小型アレイの場合と同様に、大型アレイ内にある、各々の遺伝子を表すプローブは、単一であるいは複数でスポットされてよい。
【０１３５】
当業者は、アレイ作製テクノロジーが進歩するにつれ、単一のアレイに多数のプローブを含めることが可能になるであろうということをよく理解するであろう。本発明のHCP組み合わせを利用しそのようなテクノロジーを用いて作製したアレイは、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１３６】
HCPアレイの作製に使用することができるプローブの組み合わせの代表的且つ非制限的な例には、表20、21、22、23、25、26、27、および28のいずれかに記載されているようなポリヌクレオチドプローブ少なくとも10個から成る組み合わせが含まれる。本発明の一つの実施例では、HCPアレイは、少なくとも10個のポリヌクレオチドから成り、ここで当該プローブはそれぞれ、表20、21、22、23、25、26、27、および28に記載されているような配列群の1個の配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。その他の実施例では、HCPアレイは、少なくとも20個、少なくとも 30個、少なくとも 40個、少なくとも 50個、 少なくとも 60個、少なくとも 70個、少なくとも 80個、少なくとも90個 および少なくとも 100個のポリヌクレオチドから成り、ここで当該プローブはそれぞれ、表20、21、22、23、25、26、27、および28に記載されているような配列群の1個の配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。
【０１３７】
別の実施例では、HCPアレイは、少なくとも100個のポリヌクレオチドから成り、ここで当該プローブはそれぞれ、表20、21、22、23、25、26、27、および28に記載されているような配列群の1個の配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。その他の実施例では、HCPアレイは、少なくとも200個、少なくとも 300個、少なくとも 400個、少なくとも 500個、 少なくとも 600個、少なくとも 700個、少なくとも 800個、少なくとも900個 および少なくとも 100個のポリヌクレオチドから成り、ここで当該プローブはそれぞれ、表20、21、22、23、25、26、27、および28に記載されているような配列群の1個の配列の、少なくとも15個の連続したヌクレオチドから成る。
【０１３８】
別の実施例では、HCPアレイは、表20、21、22、23、25、26、27、および28のいずれかに記載されているようなプローブの組み合わせから成る。
【０１３９】
表25：小型50mer 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブ配列群
【表２５】
2008514190.tif 000228
2008514190.tif 000229
2008514190.tif 000230
2008514190.tif 000231
2008514190.tif 000232
【０１４０】
表26：小型30mer 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブ配列群
【表２６】
2008514190.tif 000233
2008514190.tif 000234
2008514190.tif 000235
2008514190.tif 000236
2008514190.tif 000237
【０１４１】
表27：大型50mer 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブ配列群
【表２７】
2008514190.tif 000238
2008514190.tif 000239
2008514190.tif 000240
2008514190.tif 000241
2008514190.tif 000242
2008514190.tif 000243
2008514190.tif 000244
2008514190.tif 000245
2008514190.tif 000246
2008514190.tif 000247
2008514190.tif 000248
2008514190.tif 000249
2008514190.tif 000250
2008514190.tif 000251
2008514190.tif 000252
2008514190.tif 000253
2008514190.tif 000254
2008514190.tif 000255
【０１４２】
表28：大型30mer 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブ配列群
【表２８】
2008514190.tif 000256
2008514190.tif 000257
2008514190.tif 000258
2008514190.tif 000259
2008514190.tif 000260
2008514190.tif 000261
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2008514190.tif 000263
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2008514190.tif 000270
2008514190.tif 000271
2008514190.tif 000272
2008514190.tif 000273
2008514190.tif 000274
【０１４３】
本発明はさらに、血液癌をプロファイリングする以外の応用として、大型プローブ収集のサブセットとしてのHCP組み合わせから成るアレイを考慮している。 
【０１４４】
上記のように、HCP組み合わせのポリヌクレオチドプローブに加えて、アレイは、一つあるいはそれ以上のコントロールプローブから成っていてよい。本発明のアレイに含めることができるコントロールには、ハイブリダイゼーションコトロール、スキャンニングコントロール、ノーマライゼーションコントロール、発現レベルコントロールおよびミスマッチコントロールが含まれる。コントロールは、陽性あるいは陰性コントロールであってよく、ヒトに見られないバクテリア配列を標的とするように選択されてよい。アレイに含めることができる陽性コントロール標的遺伝子の例は、下記の表29に示した。アレイに含めることができる陰性コントロール標的遺伝子の例は、下記の表30に示した。
【０１４５】
表29：陽性コントロール標的遺伝子の例
【表２９】
2008514190.tif 000275
2008514190.tif 000276
【０１４６】
表 30:  陰性コントロール標的遺伝子の例  
【表３０】
2008514190.tif 000277
2008514190.tif 000278
【０１４７】
ハイブリダイゼーションコントロールの一例は、一つのチップ上に同一ポリヌクレオチドのいくつかのスポットを含めることであり、ここでスポットはそれぞれ異なった量のプローブを含んでいる。これにより、所与の配列のプローブの量の最適化が可能になる。ハイブリダイゼーションコントロールの別の例はジメチルスルホキシド(DMSO)であり、ジメチルスルホキシドは陰性コントロールとして使用され（つまり、シグナルを全く出さない）、スキャンニングコントロールとしても使用可能である。ヒトの配列との相同性が充分に低い植物あるいはバクテリア配列を、陰性のハイブリダイゼーションコントロールおよびスキャンニングコントロールとして用いることができる。植物のスポットでシグナルが検出された場合は、ハイブリダイゼーションに関する問題（すなわち、使用されたハイブリダイゼーションの過酷度が低すぎた）、あるいはスキャンニングに関する問題（例えば、チップがスキャナーに挿入された時に、その配向が正しくなかった）を示している可能性がある。ポリ（A）を陽性ハイブリダイゼーション特異性／非特異性コントロールとして使用することができる。ポリ（A）スポットは、常に強力なハイブリダイゼーションを提供するので、ポリ（A）スポットにおいてシグナルが検出されなければ、これは使用されたハイブリダイゼーション過酷度が高すぎるということを示している可能性がある。 
【０１４８】
染料（例えば、Cy3 あるいはCy5などの蛍光染料）を、PCR産物などの核酸配列に組み入れることができ、そのような核酸配列は、これらの蛍光染料を用いたチップアレイについて陽性スキャンニングコントロールとして用いることができる。金（例えば、コロイド状の金あるいはその他の粒子）のようなその他の検出可能標識も、用いることができる。陽性スキャンニングコントロールは常にシグナルを出すはずである。 
【０１４９】
ノーマライゼーションコントロールは、標識を付けた参照オリゴヌクレオチドに、あるいは被験検体に加えたその他の核酸配列に、相補的である核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後にノーマライゼーションコントロールから得られたシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変化、標識の強度、「リーディング」効率、およびアレイ間における完全なハイブリダイゼーションの変容を引き起こす可能性のあるその他の因子に関し、コントロールを提供する。例えば、アレイ内のその他の全てのプローブから読み出されたシグナル（蛍光の強度など）をコントロールプローブ(群)に由来するシグナルで割ることができ、それにより、測定値を正規化する。 
【０１５０】
発現レベルコントロールは、被験検体において構成的に発現した遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブである。当業界で既知である構成的に発現した遺伝子の多様性を、発現レベルコントロールに用いることができ、そのような構成的に発現した遺伝子の例には、構成的に発現した「ハウスキーピング遺伝子」があり、そのようなハウスキーピング遺伝子の例には、ベータアクチン遺伝子、トランスフェリン受容体遺伝子、GAPDH 遺伝子などがある。ミスマッチコントロールもまた、発現レベルコントロールあるいはノーマライゼーションコントロールの代わりに、標的遺伝子に対するプローブに提供してよい。ミスマッチコントロールは、ハイブリダイゼーションを妨害するのに充分である一つあるいはそれ以上のミスマッチの塩基の存在を除いて対応する被験あるいは対照プローブと全く同じであるオリゴヌクレオチドプローブあるいはその他の核酸プローブである。アレイに用いるコントロールは、標準テクニックにより合成することができ、また例えばStratagene (SpotReport(tm), La Jolla, Calif., USA)のような多様な商業ベースのサプライヤーから購買することもできる。アレイに含めるのに適切なその他のコントロールは、当業界で既知である。  
【０１５１】
アレイは、付加的に、ひとつあるいはそれ以上のプローブから成っていてもよく、当該プローブはそれぞれ、一般的なレベルで血液癌の診断の一助となる遺伝子を標的としているが、血液癌の種／亜種あるいはその他の特徴についての情報をなんら提供しないものである。悪性リンパ腫に関するそのような遺伝子の例を、表31に示した。 
【０１５２】
表31：悪性リンパ腫の全ての亜種において共通の発現パターンを示す遺伝子
【表３１】
2008514190.tif 000279
【０１５３】
2.1 HCPアレイの調製
HCP アレイは、当業界で既知である標準アレイ合成方法群の一つあるいはそれらの方法群の組み合わせを用いて、調製することができ、そのような方法の例には、スポッティングテクノロジーあるいは固相合成がある。
【０１５４】
例えば、HCPアレイは、in situ で合成するか（例えば、Hughes, T R, et al. Nature Biotechnology, 19:343-347(2001)を参照せよ)、あるいは従来の合成法を用いて合成しその後ロボットによるスポッティングで基質に固定することができる。現在オリゴヌクレオチド系のチップを製造するために使用されているその他のin situ 合成あるいはデポジットテクノロジーを、本発明のHCPアレイを調製するために使用することができる（例えば、Lockhart DJ, et al., Nat Biotechnol. 1996 Dec;14(13):1675-80 and Yershov G, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 May 14;93(10):4913-8を参照せよ) *7。アレイ調製のための数多くのキットおよびパッケージが市販されており、そのような例には、例えば、Pronto!(tm) マイクロアレイプリンティングキット（ウィスコンシン州マディソン市Promega社製）がある。さらに、多くの会社が、特別注文のアレイ合成サービスを提供している。
【０１５５】
核酸を固相基質に付着させるための方法群に関する詳細なる考察は、例えば、以下に記載されている：米国特許番号5,837,832；5,215,882；5,707,807； 5,807,522；5,958,342；5,994,076；6,004,755；6,048,695；6,060,240；6,090,556 および6,040,138。
【０１５６】
2.2 HCPアレイのテスト 
HCPアレイを、それが表す一つあるいはそれ以上のHCPセット群内の遺伝子の発現パターンを検出するその能力につき、当業界に既知である方法群およびひとつあるいはそれ以上の適切な生物学的検体を用いて、テストすることができる。適切な生物学的検体には、上記1.3.1項に記載したものが含まれる。例えば、血液癌に罹患した患者から採取した血液検体または組織検体、あるいは1.3.1項に記載した細胞ラインの培養から採取した検体を、標識RNA検体を調製するために使用することができる。これらの標識RNA検体を、当業界で既知である方法群に従って、HCP アレイにハイブリダイズし、アレイ上でHCP組み合わせの標的となっている遺伝子の発現パターンを定量する。   
【０１５７】
3.     血液癌をプロファイリングするための方法群
本発明のシステムはさらに、上記に説明したHCP組み合わせあるいはHCPアレイを用いて、血液癌をプロファイリングする方法群を提供している。これらの方法群は、血液癌に罹患した、罹患していると疑われる、あるいは血液癌を発症するリスクがあると疑われる患者から採取した血液あるいは生検検体内の一つあるいはそれ以上のHCPセット群に属する遺伝子の発現パターンを定量することを提供している。一般的に、そのような方法群は、被験検体に存在している標的核酸(群)に当該組み合わせあるいはアレイのプローブ(群)がハイブリダイズすることを許容する条件下で被験検体をHCP組み合わせあるいはHCPアレイと接触させること、さらにその後に当該検体内の標的核酸の存在の表れとして形成されたプローブ：標的の二重鎖を検出することを含む。このようにして定量された発現パターンを、一つあるいはそれ以上の参照発現パターンと比較し、研究対象である血液癌(群)の特徴に関する情報を得る。
【０１５８】
被験検体は、順次にあるいは同時に、HCP組み合わせ内の各々のプローブと接触させてよい。被験検体をHCPアレイと接触させることにより、例えば、血液癌群の一つあるいはそれ以上の種のいくつかの特徴を同時に分析することが可能になる。本発明の一つの実施例では、方法群は、HCPアレイを使用している。別の実施例では、方法群は、血液癌群の一つあるいはそれ以上の種のいくつかの特徴を、単一のアレイにおいてスクリーニングすることを可能にしている。
【０１５９】
3.1     被験検体
本発明の方法群において使用するのに適切な被験検体は、遺伝子発現情報を提供する核酸（すなわち、mRNAあるいはmRNA に由来する核酸）から成る。被験検体は、例えば、プロファイリングする被験者から採取した血液あるいは生検検体であってよい。生検検体は、例えば、血液癌に由来する細胞あるいは組織から成っていてよい。
【０１６０】
被験検体は、本発明の方法において直接使用される生物学的検体であってよく、また一つあるいはそれ以上の調製段階に供せられる生物学的検体であってよい。例えば、被験検体は、検体内の細胞数を増やすための増殖あるいは培養段階に；検体内の核酸を単離、精製および／または増幅する一つあるいはそれ以上の抽出および／または増幅段階に；一つあるいはそれ以上の逆転写あるいは転写段階に；あるいはこれらの手順の組み合わせに供せられてよく、それにより、被験検体を本発明の方法群において使用するために提供する。 
【０１６１】
例えば、必要であれば、本発明の方法群で使用する核酸は、当業者に既知である多くの方法群のひとつあるいはそれらの組み合わせに従って、検体から単離することができる（例えば、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, New York, N.Y. (1993)を参照せよ)。例えば、検体内のmRNA に対応するcDNA を、mRNAの逆転写により調製することができ、得られたcDNAを本発明の方法群で使用することができる。あるいはまた、in vitro 転写テクニックを使ってRNA をcDNA から転写しcRNAを得、PCRのような標準増幅方法を使ってDNAをcDNAから増幅させることができる。そして、得られたcRNA あるいは増幅されたDNAを血液癌プロファイリング方法群において用いる。上記の場合、単離核酸は、本発明の方法群で使用するのに適切な検体を提供する。 
【０１６２】
検体にはまた、例えば、増幅およびまたは標識の手順が検体内の標的核酸の真の分布を変えないことを確認することを目的として、*8、コントロール核酸を含めてよい。この目的のために、検体に、既知量のコントロールポリヌクレオチド、および当該コントロールポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするコントロールプローブを混合する。ハイブリダイゼーションおよび処理の後、ハイブリダイズされたコントロールポリヌクレオチドおよびプローブから得られたハイブリダイゼーションシグナルは、当該検体に加えられたコントロール標的ポリヌクレオチドの量を正確に反映しているはずである。その他のコントロールが当業界で既知であり、被験検体に含めてよい。
【０１６３】
プロファイリング方法で被験検体を使用する前に、被験検体内の核酸を断片化することが好ましいかもしれない。断片化することにより、二次的構造、および被験検体内のその他の核酸あるいは非相補的なポリヌクレオチドプローブへのクロスハイブリダイゼーションが最小限に抑えられ、ハイブリダイゼーションが高まる。断片化は、当業界で既知である機械的手段あるいは科学的手段により行なうことができる。
【０１６４】
必要であれば、被験検体内の核酸を、一つあるいはそれ以上の検出可能な標識で標識し、ハイブリダイズされたプローブ／標的の二重鎖の検出を可能にすることができる。検出可能な標識は、分光分析的、光化学的、生化学的、生体電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的な手段などにより検出することができる部分である。その例には、放射線同位体、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、分光分析的マーカー（例えば、蛍光マーカーおよび染料）、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子移動の供与体および受容体、コロイド状の粒子などが含まれるがそれらに限定されるものではない。染料の例には、キノリン染料、トリアリルメタン染料、フタレイン、アゾ染料、シアニン染料などがある。蛍光マーカーの非限定的な例には、フルオレッセイン、フィコエリスリン、ロダミン、リサミン、Cy3 および Cy5が含まれる。ビオチンおよびコロイド状の金もまた、被験検体内の核酸を標識化するのに適切である。核酸を標識化する方法群は、当業界で既知である。
【０１６５】
3.2ハイブリダイゼーションおよび検出
本発明の方法群のハイブリダイゼーションおよび検出の段階は、当業界で既知である標準のテクニックを用いて行なうことができる。一般的に、ハイブリダイゼーション段階中には、組み合わせ内のプローブがその標的配列にハイブリダイズすることを許容するような条件下で、被験検体をHCP組み合わせに接触させる。ハイブリダイゼーションは、例えば、溶液に浸したプローブのHCP組み合わせを用いた標準溶液ハイブリダイゼーション、あるいはHCPアレイを用いたアレイハイブリダイゼーションであってよい。 
【０１６６】
本発明で考慮している溶液ハイブリダイゼーションテクニックの例には、ノーザン分析、クローンハイブリダイゼーション、cDNA断片フィンガープリンティング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャル・ディスプレイ、ディファレンシャル・スクリーニングおよびこれらのテクニックの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない（例えば、Lockhart and Winzeler (2000) Nature 405:827-836を参照せよ；参考文献が本書に引用されている）。そのような方法群は、当業界で既知である。 
【０１６７】
溶液ハイブリダイゼーションテクニックでは、プローブを検出可能な標識で標識化するが、そのような検出可能な標識の例には、放射線同位体、蛍光体、化学発光原子団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子、抗原、抗体、ハプテン、アビジン／ストレプトアビジン、ビオチン、酵素補因子／基質などがある。あるいはまた、プローブ：標的ハイブリッドを、エチジウムブロミド、 SybrGreen、SybrGoldなどのインターカレート染料を用いて検出することができる。
【０１６８】
その他のテクニックには、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびその他の増幅テクノロジーの基づくものが含まれ、その例には、in vitro 転写 (IVT)、NASBA および その他の等温度増幅テクニックがある。そのような方法群は、一般的に、逆転写酵素を含み、当該方法群では、ポリ-dTオリゴヌクレオチドプライマー[poly-dT oligonucleotide primer]を用いて、cDNAを被験検体mRNAから調製し、その後得られたcDNA をPCRに付す。PCR 産物を、その後、HCP組み合わせのプローブを用いて検出する。上記のように、プローブは標識化してよく、非標識化プローブはインターカレート染料と組み合わせて用いることができる。必要であれば、当業界で既知である方法群を用いて、PCR 産物をリアルタイムで評価することができる。当該方法群の例には、例えば、蛍光エネルギー共鳴移動法(FRET)があり、この方法では、プローブはTaqMan(r)プローブ、モレキュラーベーコンプローブ、スコルピオンプローブなどであってよい。PCR産物の分析に適切なテクノロジープラットフォームには、ABI 7700、5700、あるいは7000 Seaquence Detection Systems（カリフォルニア州フォスター市Applied Biosystems製）、MJ Research Opticon（マサチューセッツ州ウオルサム市MJ Research製）、Roche Light Cycler（インディアナ州インディアナポリス市Roche Diagnostics製）、Stratagene MX4000 (カリフォルニア州ラホラ市Stratagene製)、およびBio-Rad iCycler（カリフォルニア州ハーキュリー 市Bio-Rad Laboratories製)が含まれる。モレキュラーベーコンおよびその他の感受性プローブを用いて、増幅段階にまだ付されていないmRNA あるいはcDNA検体内の核酸配列の存在を検出することもできる。 
【０１６９】
あるいはまた、ハイブリダイゼーション段階および検出段階は、本発明のHCPアレイを用いたアレイに基づくテクニックを含むものであってよい。そのようなアレイに基づくテクニックは、ハイブリダイゼーション条件下において被験検体をアレイに接触させることを含み、それによりHCPアレイ上のポリヌクレオチドプローブと被験検体内の相補的標的核酸との間に、錯体が形成される。その後、プローブ：標的の錯体を、質的あるいは量的に検出する。発現パターンを発生させるために使用することができる特定のハイブリダイゼーションテクノロジーは当業界で既知であり、米国特許番号5,324,633；5,470,710；5,492,806；5,525,464；5,800,992；および世界特許機構特許95/21265；世界特許機構特許96/31622；世界特許機構特許97/10365；世界特許機構特許97/27317；およびヨーロッパ特許373 203に記載されているテクノロジーを含む。
【０１７０】
3.3     発現パターンの定量
評価対象の被験検体内の一つあるいはそれ以上の標的遺伝子の遺伝子発現レベル、つまり「発現パターン」を、質的および／または量的手段により評価することができる。質的テクニックは、発現における差異を検出し、これらの発現における差異を、発現の量的局面に関する情報を提供せずに、異なったモードに分類する。例えば、あるテクニックは、ある遺伝子配列の発現の有無（すなわち、発現のパターンがONかOFFかということ）を検出する場合には、質的テクニックとして説明されてよい。量的テクニックは、発現をスケール上で評価し、そのようなスケールの例には、0から5のスケール、1から10のスケール、+から+++のスケール、1から5のグレード、a から z のグレードなどがある。提供されている数による例およびシンボルによる例は恣意的であるということ、さらに多様な段階的スケール（あるいは、段階的スケールのシンボルによる表現）を本発明の文脈において遺伝子発現における量的差異を説明する目的で使用することができるということを理解されたい。一般的に、そのようなテクニックにより、適切なコントロールと比較して、発現における相対的な増加あるいは減少に対応する情報が得られる。 
【０１７１】
量的あるいは質的な発現データを提供する当業界で既知である多様なテクニックが、本発明の方法群において被験検体内の遺伝子発現を評価するのに適切である。ある場合においては、例えば、標的遺伝子の発現パターンを定量化するために複数のテクニックが使用されている場合には、定量化された発現パターンは、量的および質的データの組み合わせの結果であることがある。 
【０１７２】
3.4     データ分析
被験検体の発現パターンを定量化したら、当業界で既知である方法群を用いて参照あるいはコントロール発現パターンの一つあるいはそれ以上と比較することができる。HCP 組み合わせを用いて調べている多様な遺伝子の発現レベルにおける増加あるいは減少により、当該被験検体を採取した被験者における血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴に関する情報が得られる。本発明の文脈における参照あるいはコントロールの発現パターンは、研究対象の血液癌のある特定の特徴を呈すると既知である被験者から採取した検体（陽性の参照／コントロールパターン）あるいは血液癌のある特定の特徴を欠くと既知である被験者から採取した検体（陰性の参照／コントロールパターン）をプローブすることから得られた発現パターンである。あるいはまた、参照は、同一の被験者から異なった時点で採取した被験検体をプローブすることから得られた発現パターンであってよく、そのような異なった時点は、例えば、疾患の早期、ある特定の療法あるいは治療の前であり、このように参照は、当該被験者において当該疾患が進行したか否かを調べる参照として作用し、および／またはある種の治療の効果を調べるための参照として作用する。ある特定の血液癌の複数の特徴が研究対象である場合に、研究対象の全ての特徴に関する情報を得るためには、本発明の方法群を用いて定量化した発現パターンを、いくつかの参照と比較する必要があるということは、明白であろう。本発明の方法群はまた、参照あるいはコントロール発現パターンを提供するのにも適切である。
【０１７３】
ある実施例群では、被験核酸検体から定量した発現パターンを、単一の参照／コントロールパターンと比較し、一つの血液癌の一つの特徴を定量する。その他の実施例群では、被験核酸検体から定量した発現パターンを、二つあるいはそれ以上の参照／コントロールパターン群と比較し、一つの血液癌の複数の特徴を定量する。例えば、被験検体から定量した発現パターンを、一つの血液癌の一つの特徴に関する確認情報を得る目的で、陽性および陰性の参照パターンと比較してもよい。 
【０１７４】
被験検体および一つあるいはそれ以上の参照／コントロールパターン群から定量した発現パターンの比較を、当業界で既知である多くの方法群を用いて、行なうことができ、そのような方法群の例には、発現パターンのデジタル画像を比較すること、発現データのデータベースを比較することなどがある。発現パターンを比較する方法群を説明している特許には、米国特許番号 6,308,170 および6,228,575が含まれるがそれらに限定されるものではない。 
【０１７５】
比較段階により、得られた発現パターンがコントロール／参照パターンにどのくらい類似しているかあるいは類似していないかに関する情報が得られ、その類似／非類似情報を用いて当該血液癌の当該特徴を定量する。例えば、陽性コントロールとの類似により、当該被験検体が、コントロールに存在する当該血液癌の当該特徴(群)を有しているということが示される。同様に、陽性コントロールとの非類似により、当該被験検体が、これらの血液癌の特徴(群)を欠いているということが示される。 
【０１７６】
被験検体から定量された発現パターンと比較した参照／コントロールパターン（群）の種および性質に拠って、上記に比較段階は、検査対象である被験検体に関する多様な種類の情報を提供する。そのようなものとして、上記の比較段階は、複数の血液癌群の複数の特徴群に関する情報を提供することができる。
【０１７７】
参照／コントロールパターン（群）の一つあるいはそれ以上のデータベースを編集することができるということ、さらに被験検体の発現パターンをデータベース内の発現パターンと比較するコンピュータープログラムを用いて被験検体の発現パターンを実行することができるということが考慮されている。この種の分析により、研究対象の血液癌の特徴に関する情報を得ることが可能になり、複数の被験検体の処理量を増すことができる。 
【０１７８】
3.5 HCP 印章
上記のように、本発明の方法群およびシステムを使用して、HCP 組み合わせを用いて被験検体をプローブすることにより、一つあるいはそれ以上のHCP セット群の遺伝子群の発現パターンを定量化することができる。典型的な数の被験検体をプローブしたら、血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴群を表す「HCP印章遺伝子群」を同定する目的で、一つあるいはそれ以上のHCP セット群の遺伝子群の被験検体のそれぞれから得られた発現パターンを、分析することができる。HCP印章遺伝子群は、コントロールと比較した場合の当該遺伝子群の発現レベルの変化の程度に基づき、同定する。例えば、統計学的分析を用いて、どの遺伝子が発現レベルにおいて、コントロールと比較して、有意な変化を示すかを定量することができる。あるいはまた、予め設定したディファレンシャル発現限界を、カットオフ値として設定してもよい。一つの実施例では、HCP印章遺伝子群は、コントロールに比較して、少なくとも発現レベルにおける変化が2倍である遺伝子群として定義される。別の実施例では、HCP印章遺伝子群は、コントロールに比較して、少なくとも発現レベルにおける変化が3倍である遺伝子群として定義される。さらなる実施例では、HCP印章遺伝子群は、少なくとも発現レベルにおける変化が5倍である遺伝子群として定義される。さらなる実施例では、HCP印章遺伝子群は、少なくとも発現レベルにおける変化が10倍である遺伝子群として定義される。HCP印章遺伝子により実証される発現レベルにおける変化は、コントロールに比較して、発現における増加あるいは発現における減少であり得る。
【０１７９】
このように、同定されたHCP印章の組み合わせは、関心の持たれている血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴に対し特異的である発現パターンプロファイル（すなわち、「HCP印章」）を定義するために使用することができる精妙なHCPセットを表す。このHCP印章を、血液がんの一つあるいはそれ以上の特徴を表すと考えられる参照発現パターンとして用いることができ、さらに被験検体が血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴群を有しているか否かを判断する目的で、被験検体から得られた発現パターンと比較することができる。一つのHCP印章内で表されている遺伝子の数は、約10個から約500個の範囲内で異なる。一つの実施例では、一つのHCP印章内で表されている遺伝子の数は、約20個から約300個である。別の実施例では、一つのHCP印章内で表されている遺伝子の数は、約30個から約200個である。さらなる実施例では、一つのHCP印章内で表されている遺伝子の数は、約30個から約160個である。
【０１８０】
HCP印章の代表例を、下記の表32から表41に示す。 
【０１８１】
表32：DLBCL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [51個の遺伝子]
【表３２】
2008514190.tif 000280
【０１８２】
表33：FL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [70個の遺伝子]
【表３３】
2008514190.tif 000281
【０１８３】
表34：HL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [33個の遺伝子]
【表３４】
2008514190.tif 000282
【０１８４】
表35：MCL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [80個の遺伝子]
【表３５】
2008514190.tif 000283
2008514190.tif 000284
【０１８５】
表36：MZL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [159個の遺伝子]
【表３６】
2008514190.tif 000285
2008514190.tif 000286
【０１８６】
表37：SLL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [128個の遺伝子]
【表３７】
2008514190.tif 000287
2008514190.tif 000288
【０１８７】
表38：TCL印章（コントロールに比較して、≧2倍） [92個の遺伝子]
【表３８】
2008514190.tif 000289
2008514190.tif 000290
【０１８８】
表39：CLL印章（コントロールに比較して、≧5倍） [66個の遺伝子]
【表３９】
2008514190.tif 000291
【０１８９】
表40：AML細胞ライン印章（コントロールに比較して、≧5倍） [129個の遺伝子]
【表４０】
2008514190.tif 000292
2008514190.tif 000293
2008514190.tif 000294
【０１９０】
表41：T-ALL細胞ライン印章（コントロールに比較して、≧5倍） [111個の遺伝子]
【表４１】
2008514190.tif 000295
2008514190.tif 000296
【０１９１】
4.    血液癌群のプロファイリング
本発明のHCP システムは、ある被験者における血液癌のプロファイリングを、当該血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴群に関し、提供している。  本発明のシステムを用いてプロファイリングすることができる血液癌群は、悪性リンパ腫あるいは白血病から成る群から選択される。当該の血液癌プロファイリング方法群により提供される情報は、多様に応用することができ、そのような応用例には、疾患の予後予測、診断、病期あるいはグレードの判断、治療管理、疾患の進行のモニター、疾患のアウトカムあるいは合併症の予測、ファーマコゲノミクスなどがある。治療管理には、例えば、当該の血液癌の効果的な治療を行なうために最も適切な薬剤(群)あるいはその他の治療法を選択することが含まれる。疾患のアウトカムの予測には、例えば、患者の生存および再発の見込み度、あるいは疾患が進行する尤度が含まれる。 
【０１９２】
例えば、血液癌に罹患していることが疑われる患者から採取した検体の一つあるいはそれ以上のHCPセット群内の遺伝子群の発現レベルを、コントロール被験者から採取した検体群の同一のHCPセット群内の遺伝子群の発現レベルと比較することができる。コントロール被験者の例には、以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：ある特定の血液癌に罹患していると既知である被験者；健常被験者；ある定義済みの段階あるいはグレードの血液癌に罹患している被験者；薬剤耐性、多剤耐性、あるいは薬剤感受性の血液癌に罹患している被験者；定義済みの化学治療計画を受けている被験者；血液癌に罹患しているが治療を受けていない被験者；血液癌のある特定の亜種に罹患している被験者など。同様に、既知の有害事象を伴う治療については、HCP 組み合わせを用いて、当該の治療計画を「微調整する」ことができる。成功裏の治療を表す、遺伝子発現パターンにおける変化を引き起こす投与量を確立する。望ましくない有害事象と関連している発現パターンを避ける。このアプローチは、患者の改善状態が思わしくなくなるあるいは患者が症状を呈示するのを待ってから治療方針を変えるより、より感受性が高く迅速であろう。 
【０１９３】
本発明のHCP組み合わせにより、単一のアッセイにおいて血液癌の複数の特徴を同時に調べることができるので、単一のアッセイから得られた情報を複数の分野において応用することが可能である。このように、本発明のHCPシステムは、血液癌を診断し、血液癌を分類し、血液癌の進行をモニターし、血液癌の進行度をモニターし、治療のアウトカムを予測し、予後を予測し、治療に対する反応をモニターし、生存率を予測し、適切な薬剤(群)および／または治療を選択し、さらにそれらを組み合わせて行なうための方法群を提供している。 
【０１９４】
さらに、本発明は、当該方法群を、薬剤の発見および開発、毒物学および発がん性の研究、法医学などに用いることができるということも考慮しており、このような応用例においては、被験検体をin vitro 細胞培養から、あるいはヒトあるいはその他の動物の被験体から採取する。例えば、現在利用可能な治療用薬剤群の効果に関する発現パターンを、研究することができる。これらの薬剤群を用いて治療した被験体から得られた被験検体を、分析し治療していない患者から採取した検体と比較することができる。このようにして、既知の治療剤群の発現パターンが、開発される。ある薬剤の存在下あるいは非存在下において、異なった様態でレギュレートされる配列の正体を知ることにより、研究者はその薬剤の作用の分子機序を解明することができる。同様に、同一の発現プロファイルを有する分子群は類似した治療効果を有する可能性が高いという期待を持って、多数の候補薬剤群を、既知の治療用薬剤群の発現パターンに類似した発現パターンに基づき、スクリーニングすることができる。このように、本発明は、薬剤の作用の分子モードを判断する手段を提供している。 
【０１９５】
5. HCP組み合わせのその他の利用法
本発明のHCPシステムはさらに、HCP組み合わせの核酸配列を、in silico の応用例のためのコンピューター読み出し可能な媒体の形態で、およびHCPセットのおよび一つあるいはそれ以上の遺伝子を増幅するための遺伝子特異的なプライマーをデザインする基盤として、提供している。 
【０１９６】
本システムのHCPセット群の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいた遺伝子特異的なプライマーは、当該HCPセット群の遺伝子の増幅において使用できるようにデザインすることができる。PCRのような増幅反応で使用するには、プライマーの対を用いる。プライマー配列の正確な構造は本発明には必須ではないが、ほとんどの応用例については、当業界で既知であるように、プライマーは、HCPセットの特異的な遺伝子に、過酷な条件下で、特に過酷度の高い条件下で、ハイブリダイズする。プライマーの対は、一般的に、少なくとも約50ヌクレオチドの長さ（より一般的には、100ヌクレオチドの長さ）を有する増幅産物を生成するように選択される。プライマー配列を選択するためのアルゴリズムは、広く知られており、市販のソフトウェアーパッケージの形態で入手可能である。これらのプライマーを、標準の量的あるいは質的なPCR系のアッセイにおいて用い、HCPセットの遺伝子群の遺伝子発現レベルを評価することができる。あるいはまた、これらのプライマーを、上記のように、リアルタイムPCRを用いた増幅において、モレキュラーベーコンなどのプローブと組み合わせて用いてもよい。 
【０１９７】
6.     HCPプロファイリングキット、パッケージ、およびコンピューター読み出し可能媒体 
本発明はさらに、被験者における血液癌のプロファイリングのためのキットおよびパッケージを提供しており、それらのキットおよびパッケージは、HCP組み合わせのプローブから成るものである。当該プローブは、固相基質に固定されたキットの形態で（すなわち、HCPアレイとして）、あるいは溶液ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるのに適した単離核酸の形態で、あるいはHCPアレイの調製の過程で、提供されてよい。適切である場合には、当該キットで提供されているHCPプローブは、蛍光体、 放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などの検出可能な標識を組み込んでいてよく、さらに当該キットは、当該プローブを標識化するための試液を含んでいてよい。当該プローブは、別個の容器に入った状態で提供してもよく、あるいは使用に便利なフォーマット（例えば、マイクロタイタープレートなど）に予め入れて提供してもよい。 
【０１９８】
当該のキットは、任意に、緩衝液類、塩類、酵素類、酵素補因子、基質類、標識類、検出試液類などの付加的な試液を含んでいてよい。被験検体の単離、治療、あるいは増幅のための緩衝液および溶液などのその他の構成要素を、当該キットに含めてもよく、例えば、当該キットは、逆転写、転写、および／またはPCRのための試液類を含んでいてよく、その例には、酵素類、プライマー類およびヌクレオチドが含まれる。当該キットは、付加的に、一つあるいはそれ以上のコントロールを含んでいてよい。当該キットの構成要素の一つあるいはそれ以上は凍結乾燥されていてよく、また当該キットはさらに凍結乾燥構成要素の再構成に適切な試液類から成っていてよい。
【０１９９】
当該キットの多様な構成要素は、適切な容器に入った状態で提供されている。適切であれば、当該キットは、任意に、反応容器、混合容器、および試液類あるいは被験検体の調製を促進させるその他の構成要素を含んでいてよい。 
【０２００】
当該キットは、任意に、使用上の指示を含んでいてよく、そのような指示は、書面、あるいはディスク、CD、DVDなどのコンピューター読み出し可能な形態で提供されていてよい。
【０２０１】
本発明はさらに、上記のキットが、当該キットを使用することにより生成された遺伝子発現パターンを分析するためのコンピューターソフトウェアーを含むパッケージの一部として提供されてよいということを考慮している。 
【０２０２】
本発明はさらに、一つあるいはそれ以上のデジタルコード化されたHCP印章群から成るコンピューター読み出し可能な媒体を提供しており、このコンピューター読み出し可能な媒体では、それぞれの印章が一つあるいはそれ以上の値に関連しており、さらにそれぞれの値がHCP印章（当該印章により表される血液癌の一つの特徴と相関関係にある）により表される遺伝子の発現を表している。そのようなコンピューター読み出し可能な媒体を参照として用い、被験検体をプロファイリングすることから生成されたHCP印章の遺伝子群の遺伝子プロファイルを比較することができる。当該のデジタルコード化されたHCP印章群は、データベース内に構成されていてもよい（例えば、米国特許6,308,170に説明されているデータベース)。
【０２０３】
以下に、特定の例を参考にして、本発明を説明する。以下の例は、本発明の実施例を説明するために意図されたものであり、本発明をいかなる意味でも限定するために意図されたものではない。
【実施例】
【０２０４】
実施例1：DLBCL に特異的なHCPセットの遺伝子の選択
DLBCL 患者から採取した何百もの検体の遺伝的プロファイリングを研究することにより、DLBCL の亜種が分類された：分化活性化された末梢性血液B細胞(ABC)、リンパ節の分化されていない胚中心(GC)、前縦隔Ｂ大細胞型リンパ腫(MLBCL)、 さらに大部分は雑多である第四のカテゴリー(Rosenwald A, Wright G, Chan WC et al. N Engl J Med. 2002; 346(25):1937-47; Rosenwald A, Wright G, Leroy K. et al. J Exp Med. 2003; 198(6):851-62;  Wright G, Tan B, Rosenwald A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(17):9991-6;  Savage KJ, Monti S, Kutok JL, et al. Blood. 2003;102(12):3871-9)。これらの研究により、GC-DLBCLに罹患している患者は、ABC- DLBCLに罹患している患者に比較して、生存率が有意に高いということがわかった。Savage et al.もまた、MLBCLをDLBCL と区別することができるMLBCL の遺伝子印章について発表している。 
【０２０５】
DLBCL に特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表6にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２０６】
ABC 対 GC DLBCL：これらの遺伝子により、DLBCL の亜種であるABC と GC を区別することができる。DLBCL のこれらの二つの亜種は、それぞれ、特異的発現パターンを有する遺伝子を発現する。この項で選択されている遺伝子は、ABC DLBCL かあるいはGC DLBCL のどちらかにユニークであり、従ってこれらの二つの疾患を区別するために使用することができる（Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Nature. 2000; 403(6769):503-11; Rosenwald A, Wright G, Chan WC et al. N Engl J Med. 2002; 346(25):1937-47; Wright G, Tan B, Rosenwald A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(17):9991-6; Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al. Nat Med. 2002 Jan;8(1):68-74; および Pan Z, Shen Y, Du C, et al. Am J Pathol. 2003; 163(1):135-44）。
【０２０７】
DLBCL 対 FL： FLは、DLBCL と密接な関連性がある。DLBCL 対 FL の項に記載されている遺伝子により、二つの主要な疾患種を同定することができ、ある特定のFLがより攻撃性の強いDLBCL に進行するか否かを予測するツールを医療従事者に与えるものである (Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al. Nat Med. 2002 Jan;8(1):68-74; Lossos IS, Alizadeh AA, Diehn M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(13):8886-91; de Vos S, Hofmann WK, Grogan TM, et al. Lab Invest. 2003; 83(2):271-85)。 
【０２０８】
MLBCL 対 DLBCL：先のカテゴリーと同様に、これらの遺伝子により、DLBCLと前縦隔Ｂ大細胞型リンパ腫(MLBCL)を区別することができる（Savage KJ, Monti S, Kutok JL, et al.  Blood 2003; 102(12):3871-9; Kossakowska AE, Urbanski SJ, Watson A, et al. Oncol Res. 1993; 5(1):19-28）。 
【０２０９】
生存率：Shipp et al. は、患者の生存率を、96個のマーカー遺伝子と相関させた。これらの遺伝子マーカーは、患者の余命を有意に予測する能力を有し、従って、本発明のチップに含められている（Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al.  Nat Med. 2002 Jan; 8(1):68-74）。
【０２１０】
Nishiu M, Yanagawa R, Nakatsuka S, et al. Jpn J Cancer Res. 2002; 93(8):894-901で説明されているようなその他の遺伝子もまた、検体内のDLBCL の進行を示す目的で選択することができる*9。
【０２１１】
実施例2：FLに特異的なHCPセットの遺伝子の選択
濾胞性リンパ腫は、t(14;18)転座突然変異の結果であるゲノムDNAにおける不活性あるいは成長が遅い癌である。FL は、非ホジキンリンパ腫全体の25% から40% を占める。FL は成長が遅く患者の60% から70% は診断後5年以上生存するが、治癒するものではない；患者は、疾患により死に至るまで、継続して起こる再発に耐え、治療に対する感受性を減少させる。FLは、患者の25%から60%において、より攻撃性の強い前縦隔Ｂ大細胞型リンパ腫に転換する (Lossos IS, Alizadeh AA, Diehn M, et al.  Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(13):8886-91)。
【０２１２】
Lossos et al. は、FL患者について遺伝子プロファイリング実験を行ない、遺伝子プロファイリングを追跡し、DLBCL への転換を観察した。Lossos et al. は、DLBCLに転換した濾胞性リンパ腫が、マイクロアレイ分析により同定することができたある特定の遺伝子印章をデレギュレートしたということを、見出した。この項で選択されている遺伝子は、どの症例がFLからDLBCL に転換するかと予測すると報告されている。その他のいくつかのチームが、Flの遺伝子発現プロファイルを、DLBCL、バーキットリンパ腫および 正常な胚中心B細胞と比較する研究を行なっている。このセットの遺伝子には、FL組織を健常な検体およびその他のいくつかの悪性リンパ腫の種から、診断で区別することを可能にする印章パターンを形成するものがある （Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al.  Diffuse large B-cell lymphoma outcome prediction by gene-expression profiling and supervised machine learning.  Nat Med.  2002 Jan; 8(1):68-74; Lossos IS, Alizadeh AA, Diehn M, et al.  Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(13):8886-91; Maesako Y, Uchiyama T, Ohno H. Cancer Sci. 2003: 94(9):774-81; Ghia P, Boussiotis VA, Schultze JL, et al. Blood. 1998; 91(1):244-51; Akasaka T, Lossos IS, Levy R. Blood. 2003; 102(4):1443-8; Elenitoba-Johnson KS, Gascoyne RD, Lim MS, et al.  Blood. 1998; 91(12):4677-85）。
【０２１３】
FL に特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表7にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２１４】
DLBCL 対 FL: DLBCL 対 FL に記載されている遺伝子により、二つの主要な疾患種を同定することができ、さらにある特定のFlが、より攻撃性の強いDLBCL に進行するか否かを予測することができる(Shipp MA, Ross KN, Tamayo P et al.  Nat Med.  2002 Jan; 8(1):68-74; Lossos IS, Alizadeh AA, Diehn M, et al.  Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99(13):8886-91; Husson H, Carideo EG, Neuberg D, et al. Blood. 2002; 99(1):282-9; Lestou VS, Gascoyne RD, Sehn L, et al. Br J Haematol. 2003; 122(5):745-59; Ghia P, Boussiotis VA, Schultze JL, et al. Blood. 1998; 91(1):244-51)。
【０２１５】
BCL6 転座パートナー：FLのt(14;18) 転座突然変異特徴は、BCL6遺伝子をデレギュレートする。このセットに含まれている遺伝子は、BCL6と密接な関連性を有し、最初の突然変異の後に、デレギュレートされることが可能となっている。これらの遺伝子から得られた発現データは、FL印章においてこれらの遺伝子が重要であることを示すものである(Akasaka T, Lossos IS, Levy R. Blood. 2003; 102(4):1443-8)。
【０２１６】
FL 対 バーキット：Maesako et al.は、FLリンパ腫あるいはバーキットリンパ腫の発現データを比較した場合にデレギュレートされていた遺伝子のサブセットを発見した。このセットに記載されている遺伝子は、FL検体とバーキット検体を区別する一助となる（Maesako Y, Uchiyama T, Ohno H. Cancer Sci. 2003; 94(9):774-81）。
【０２１７】
実施例3：CLLに特異的なHCPセットの遺伝子の選択
慢性リンパ球性白血病（CLL）は、ヒト白血病で最も一般的な種であり、成人の白血病の30%を占める（Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Blood. 1999; 94(6):1848-54）。DLBCL およびFLと同様に、CLL患者の臨床的アウトカムは、大きく異なる。Hamblin 等（1999）は、この疾患に罹患した患者の全体の生存率は、免疫グロブリンV(H)遺伝子の突然変異状態と相関関係があるということ；その細胞が突然変異を起こしていないIg V(H) を有するCLL患者は、そのB細胞が体細胞突然変異を既に起こしている患者に比較して、臨床的アウトカムが悪かったということを、見出した（Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Blood. 1999; 94(6):1848-54）。 
【０２１８】
このように、CLLは、分子的に区別可能である少なくとも二つの亜種を有する不均質な疾患である。この項で選択されている遺伝子は、この仮説を反映しており、さらに生存率およびIg 突然変異状態の双方に関連性があることがわかっているので選択されたものである。このセットで選択されている遺伝子の発現パターンを分析することにより、不活性な形態と攻撃性の高い形態を区別することが可能となり、それにより正確且つ適切な治療計画を立てることにおいて臨床医を補助することが可能となる（Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al. J Exp Med. 2001; 194(11):1639-47; Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Blood. 1999; 94(6):1848-54; Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Blood. 1999; 94(6):1840-7; Wiestner A, Rosenwald A, Barry TS, et al. Blood. 2003; 101(12):4944-51; Nagy B, Ferrer A, Larramendy ML, et al. Haematologica. 2003;88(6):654-8; Cro L, Guffanti A, Colombi M, et al. Leukemia. 2003; 17(1):125-32;  Thieblemont C, Chettab K, Felman P, et al. Leukemia. 2002; 16(11):2326-9; Korz C, Pscherer A, Benner A, et al. Blood. 2002; 99(12):4554-61）。
【０２１９】
CLLに特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表5にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２２０】
突然変異状態：これらの遺伝子は、突然変異を起こしたIgV と突然変異を起こしていないCLL間で、異なった様態でデレギュレートされるので、これら二つを区別することができる。IgV 突然変異はまた生存率と相関関係があるので、これらの遺伝子はまた予後マーカーとして作用することが可能である。 （Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al. J Exp Med. 2001; 194(11):1639-47）。
【０２２１】
CLL 対 DLBCL：CLL と DLBCLとを区別することができる多くの遺伝子が発見された（Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al.. J Exp Med. 2001; 194(11):1639-47; Wiestner A, Rosenwald A, Barry TS, et al. Blood. 2003; 101(12):4944-51; Korz C, Pscherer A, Benner A, et al. Blood. 2002; 99(12):4554-61）。
【０２２２】
CLL 対 MCL：Korz 等は 、リアルタイム逆転写PCRを多くの遺伝子について行い、MCL および CLL 間で有意にデレギュレートされた遺伝子を発見した（Thieblemont C, Chettab K, Felman P, et al. Leukemia. 2002; 16(11):2326-9; Korz C, Pscherer A, Benner A, et al. Blood. 2002; 99(12):4554-61）。
【０２２３】
実施例4：MCLに特異的なHCPセットの遺伝子の選択
マントル細胞リンパ腫（MCL）は、非ホジキンリンパ腫患者の6%を占めるに過ぎないが、その不治の悪性度のため、不釣合いに死亡率が高い。この疾患に罹患した集団の内、一年いないに死亡する患者がいる一方で、はるかに長く生存する患者もいる。MCLに罹患した患者の生存率の中央値は、約3年である （Rosenwald A, Wright G, Leroy K. et al. J Exp Med. 2003; 198(6):851-62）。 Rosenwald 等 およびMartinez 等（Martinez N, Camacho FI, Algara P, et al. Cancer Res. 2003; 63(23):8226-32）は、数多くの検体について遺伝子発現分析を行い、生存率を、ある種の遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションと相関させた。Rosenwald とそのチームは、増殖、成長率細胞の増殖を司る機能を有する20個の遺伝子の発現を観察することにより、著しく正確なレベルで患者の生存を予測することができるということを見出した。Martinez とそのチームは、類似した研究を行ない、類似した機能を行なうことができる25個の様々な遺伝子を見出した。 
【０２２４】
MCL はまた、マントル細胞リンパ腫芽細胞変異型（MCL-BV）として既知である亜種を有する。MCL-BV は、より攻撃性が強いと報告されており、BVでない MCLに比較して、臨床アウトカムがより悪い。de Vos の論文は、MCL-BV においてデレギュレートされる遺伝子を配置しており、これらの遺伝子はより攻撃性の強い進行性の疾患と相関を示すものである。このセット内のその他の遺伝子は、MCLとその他の悪性リンパ腫（例えば、DLBCL、MZL、およびCLLなど）間で、異なった様態でレギュレートされると報告されている。MCL について選択された遺伝子の発現パターンにより、MCL を多様なその他のリンパ腫と区別して診断することが可能となり、その結果、ある種の分子マーカーの発現に基づいて正確な予後を予測することが可能となる（Rosenwald A, Wright G, Leroy K. et al. J Exp Med. 2003; 198(6):851-62; de Vos S, Hofmann WK, Grogan TM, et al. Lab Invest. 2003; 83(2):271-85; Thieblemont C, Chettab K, Felman P, et al. Leukemia. 2002; 16(11):2326-9; Korz C, Pscherer A, Benner A, et al. Blood. 2002; 99(12):4554-61; Robetorye RS, Bohling SD, Morgan JW, et al.  J Mol Diagn. 2002; 4(3):123-36; Martinez N, Camacho FI, Algara P, et al. Cancer Res. 2003; 63(23):8226-32; Kobayashi T, Yamaguchi M, Kim S, et al. Cancer Res. 2003; 63(1):60-6）。
【０２２５】
MCLに特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表9にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２２６】
印章： 当該の遺伝子は、以下に説明されている： Thieblemont C, Chettab K, Felman P, et al. Leukemia. 2002; 16(11):2326-9; Korz C, Pscherer A, Benner A, et al. Blood. 2002; 99(12):4554-61; Robetorye RS, Bohling SD, Morgan JW, et al. J Mol Diagn. 2002; 4(3):123-36；さらにKobayashi T, Yamaguchi M, Kim S, et al. Cancer Res. 2003; 63(1):60-6は、MCL および 多様なその他のリンパ腫 （MZL、CLL、 DLBCL）の間でデレギュレートすると報告されているので、MCL 陽性検体を区別することができる。  
【０２２７】
MCL 対 MCL-BV：de Vos S, Hofmann WK, Grogan TM, et al. Lab Invest. 2003; 83(2):271-85で説明されている遺伝子は、攻撃性の強いMCL-BV とより不活性の形態であるMCL 間の区別をする。  
【０２２８】
生存期間：ある種の遺伝子マーカーは、診断後の患者の全体生存期間と相関関係を示している。チップのこの項に組み入れられている遺伝子は、外部形態学的研究のみならず、微細な分子レベルの変化にも基づいた予後予測を患者に提供することができるであろう （Rosenwald A, Wright G, Leroy K. et al. J Exp Med. 2003; 198(6):851-62; Martinez N, Camacho FI, Algara P, et al. Cancer Res. 2003; 63(23):8226-32）。
【０２２９】
実施例5：HLに特異的なHCPセットの遺伝子の選択
ホジキンリンパ腫は、死亡率が20％であり、予後はかなりよい（Devilard E, Bertucci F, Trempat P, et al. Oncogene. 2002; 21(19):3095-102）。この疾患の診断は、細胞外部形態学的のある特定の種の観察に依然として依存している。このセットに組み入れるべく選択される遺伝子の発現パターンにより、顕微鏡がなくても、診断が可能になる（Devilard E, Bertucci F, Trempat P, et al. Oncogene. 2002; 21(19):3095-102; Kuppers R, Klein U, Schwering I, et al. J Clin Invest. 2003;111(4):529-37; Thorns C, Gaiser T, Lange K, et al. Pathol Int. 2002; 52(9):578-85）。
【０２３０】
HLに特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表8にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２３１】
印章：ホジキンリンパ腫は、リード・シュテルンベルク細胞[Reed-Sternberg cell] の存在により、特徴付けられる。この項で選択された遺伝子は、多様なその他のリンパ腫と比較されリード・シュテルンベルク細胞、すなわちホジキンリンパ腫に、特異的であるとわかった遺伝子である （Kuppers R, Klein U, Schwering I, et al. J Clin Invest. 2003;111(4):529-37）。
【０２３２】
生存期間：Devilard 等は、患者の生存期間を、多くの遺伝子と関係付けた。それらの遺伝子の多くが、このセットに含まれている （Devilard E, Bertucci F, Trempat P, et al. Oncogene. 2002; 21(19):3095-102）。
【０２３３】
HL 対 ALCL：この項は、HLを類似した非ホジキンリンパ腫であるALCLから区別する （Thorns C, Gaiser T, Lange K, et al. Pathol Int. 2002; 52(9):578-85）。
【０２３４】
実施例6：ALCLに特異的なHCPセットの遺伝子の選択
未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)は、T細胞に由来し、主として子供に見られる疾患である（Villalva et al., Br J Haematol. 2002; 118(3):791-8)。ALCLの大多数は、ヌクレオフォスミン(NPM)と未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)遺伝子の双方に関与するt(2;5)(p23;q35)における転座を有する。数多くの診断マーカーが発見されている （Thorns C, Gaiser T, Lange K, et al. Pathol Int. 2002; 52(9):578-85; Villalva C, Trempat P, Greenland C, et al. Br J Haematol. 2002; 118(3):791-8; Wellmann A, Thieblemont C, Pittaluga S, et al.  Blood. 2000 Jul 15;96(2):398-404; Nishikori M, Maesako Y, Ueda C, et al. Blood. 2003; 101(7):2789-96）。
【０２３５】
ALCLに特異的である遺伝子を、一般に公開されているデータベースを利用することにより、選択した。当該遺伝子は表4にリストしてあり、それらの遺伝子には以下のカテゴリーの遺伝子が含まれている。
【０２３６】
ALCL vs. HL：これらの遺伝子は、HLを類似した非ホジキンリンパ腫であるALCL から区別する（Thorns C, Gaiser T, Lange K, et al. Pathol Int. 2002; 52(9):578-85）。
【０２３７】
ALK+ 対 ALK-：これらの遺伝子は、ALCLを有するALK を、ALCL を欠いた検体から区別する（Villalva C, Trempat P, Greenland C, et al. Br J Haematol. 2002; 118(3):791-8）。
【０２３８】
実施例7：HCPセット由来のポリヌクレオチドプローブの調製に適切であるヌクレオチド配列のデザインおよび選択
HCPセット由来のポリヌクレオチドプローブの調製に適切であるヌクレオチド配列を、以下の判断基準に基づいて選択した。選択された配列は、30ヌクレオチドから50ヌクレオチドの長さを有しG+C含有量が25%から 75%の間である、当該HCPセットの標的遺伝子の領域に基づいていた。当該配列を、自己相補的が最小限に抑えられるように、さらに選択した。このように選択されポリヌクレオチドプローブの作製に利用することができるヌクレオチド配列を、表25から表28に示した。 
【０２３９】
実施例8：小型50MER 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブの選択
234個の50merポリヌクレオチドプローブを、悪性リンパ腫をプロファイリングするための小型アレイを作製する目的で、選択した。このアレイを作製するために使用するポリヌクレオチドプローブを、実施例7に記載されているように選択し、50ヌクレオチドの長さを有するようにデザインした。このアレイを作製するためのポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を、表25にリストした。 
【０２４０】
実施例9：小型30MER 核酸アレイ作製用のポリヌクレオチドプローブの選択 *10 
248個の30merポリヌクレオチドプローブを、悪性リンパ腫をプロファイリングするための小型アレイを作製する目的で、選択した。このアレイを作製するために使用するポリヌクレオチドプローブを、実施例7に記載されているように選択し、30ヌクレオチドの長さを有するようにデザインした。このアレイを作製するためのポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を、表26にリストした。 
【０２４１】
実施例10：大型50MER 核酸アレイ用／大型50MER 核酸アレイ作製用の配列の選択
971個の50merポリヌクレオチドプローブを、悪性リンパ腫をプロファイリングするための大型アレイを作製する目的で、選択した。このアレイを作製するために使用するポリヌクレオチドプローブを、実施例7に記載されているように選択し、50ヌクレオチドの長さを有するようにデザインした。一般的なレベルで悪性リンパ腫を診断するための遺伝子に対応したその他のポリヌクレオチドプローブを、当業界で既知である方法群に従って、デザインし選択した。当該の大型50mer核酸アレイのために選択されたポリヌクレオチドプローブ配列を全て、表27にリストした。 
【０２４２】
実施例11：大型30MER 核酸アレイ用／大型50MER 核酸アレイ作製用の配列の選択
971個の30merポリヌクレオチドプローブを、悪性リンパ腫をプロファイリングするための大型アレイを作製する目的で、選択した。このアレイを作製するために使用するポリヌクレオチドプローブを、実施例7に記載されているように選択し、30ヌクレオチドの長さを有するようにデザインした。一般的なレベルで悪性リンパ腫を診断するための遺伝子に対応したその他のポリヌクレオチドプローブを、当業界で既知である方法群に従って、デザインし選択した。当該の大型50mer核酸アレイのために選択されたポリヌクレオチドプローブ配列を全て、表28にリストした。
【０２４３】
実施例12：核酸アレイの作製  
小型あるいは大型の核酸アレイを、類似したプロトコルを用いて、作製することができる。 
【０２４４】
小型の50mer 核酸アレイを、UltraGAPSTM スライド（Corning Life Sciences）を用いて以下のように作製した。表25に記載した配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを、標準方法群に従って合成し精製し、Corning's Pronto!TM Universal Spotting Solutionを用いて0.50 mg/mLの濃度で正副二通りにスライドにスポットした。当該スライドを、次に、デシケーターで24時間から48時間インキュベートした。プローブを、GAPS で被覆したスライド表面に、UV架橋を用いて固定した。 
【０２４５】
実施例13：被験検体の作製  
血液癌に罹患している、罹患していると疑われる、あるいはそのリスクがあると疑われる患者から採取した被験検体（組織検体あるいは血液検体）を、以下のように、血液癌プロファイリングアレイで使用する目的で作製することができる。 
【０２４６】
RNA 単離 （Qiagen RNeasy キット使用、Boom et al., 1990）
1) 約20 mg から30 mg の組織を液体窒素中に入れ、乳ばちと乳棒を用いて完全にすりつぶす。すりつぶした粉末と液体窒素を、冷やした2 ml小型微量遠心機に入れる。液体窒素を、検体を解凍させないように、蒸発させる。細胞を分解させるために、緩衝液RLTを約600μl加える。 
【０２４７】
2) β-ME およびグアニジンチオシアン酸塩を含んだ緩衝液RLT により細胞を分解させた後、細胞を20 ゲージの針に通すことにより、ホモジナイズする。
【０２４８】
3)組織の細胞分解産物を、小型微量遠心機を用い、最大速度で3分間遠心する。上澄みを、新しい小型微量遠心機にピペットを用いて注意深く移す。後続段階では上澄み（細胞分解産物）のみを用いる。
【０２４９】
4) 70%エタノールを約600 μl 、ホモジナイズした細胞分解産物に加え、ピペットでよく混合する。遠心にかけると沈殿を起こし、RNAの産出量が減少するので、遠心にはかけない。 
【０２５０】
5) 形成された沈殿を含めて検体の約700 μl まで、2 ml の回収試験管（キットの付属品）内に置いたRNeasy ミニカラム に加える。当該カラムを≧8000 x g (≧10,000 rpm)で15秒間遠心し、フロースルーを廃棄する。回収試験管を第6段階で再度使用する。 
【０２５１】
6) その後、約700 μl の緩衝液RW1を、当該RNeasy カラム に加え、≧8000 x g (≧10,000 rpm)で15秒間遠心し、カラムを洗浄する。フロースルーを、第一洗浄段階で使用した回収試験管と共に、廃棄する。
【０２５２】
7) 当該RNeasy カラムを新しい2 ml 回収試験管（キット付属品）内に置く。その後、約500 μl の緩衝液RPEを、当該カラム にピペットで加え、≧8000 x g (≧10,000 rpm)で15秒間遠心し、洗浄する。フロースルーを、再度廃棄する。
【０２５３】
8) 二回目の約500 μl の緩衝液RPEを、当該RNeasyカラム に加え、≧8000 x g (≧10,000 rpm)で2分間遠心し、Rneasyシリカゲルメンブレンを乾燥させる。緩衝液RPE はエタノールを含むので、エタノールを完全に乾燥および除去するように特に注意する。
【０２５４】
9) 当該RNeasy カラムを、新しい1.5 ml 回収試験管（付属品）に移す。適切な量（例えば、30μl から50 μl）のRnaseを含まない水を、ピペットで直接RNeasy シリカゲルメンブレンの中央に加え、 ≧8000 x g (≧10,000 rpm)で１分間遠心し、溶出させる。
【０２５５】
10) その後、RNAの含有量を、100x 希釈の光学密度を測定しビーアの法則に由来する以下の式を適用することにより、定量化する：
A260 * 希釈倍数 * 40 =μg/ml における[RNA] 
【０２５６】
11) その後、当業界で既知である方法群に従って、アガロースゲル電気泳動法をエチジウムブロマイド染色で変性させることにより、RNA を質的に評価する。 
【０２５７】
RNA 標識化 （改変Eberwine Process, Van Gelder et al., 1990）
1) 第一鎖cDNA の合成  
1.1バクテリア由来のコントロールmRNAのワーキング溶液を調製する。
【０２５８】
1.2 手動の標的調製につき、トータルRNA検体をそれぞれ調製する（例示分量を下記に記す）：
0.2-2 μg     トータルRNA
X μl     バクテリア由来のコントロールmRNAのワーキング溶液
(トータルRNA1μgのインプットにつき、1 μl；必要に応じて希釈する)    
1 μl    T7 オリゴ(dT) プライマー
Y μl    ヌクレアーゼを含まない水
12 μl     最終量
【０２５９】
1.3  70°Cの水槽で約10分間インキュベートする；試験管を氷上に冷たくなるまで 置く。 
【０２６０】
1.4   5秒間遠心し、試験管の底の検体を回収する；試験管を氷上に戻す。
【０２６１】
1.5試験管を氷上に置いたまま、以下の試液群を、トータルRNA／コントロールmRNA／プライマーミックスの総量（上記の例では、12 μl）に加える：
2 μl    10x 第一鎖緩衝液 
4 μl    5 mM dNTP ミックス
1 μl    RNase 抑制剤
1 μl    逆転写酵素
20 μl     最終量
【０２６２】
1.6   42°Cの水槽で約2時間インキュベートする。
【０２６３】
1.7   5秒間遠心し、試験管の底の検体を回収する。
【０２６４】
2) 第二鎖cDNA の合成  
2.1 段階2で得られたそれぞれの検体につき、以下の第二鎖cDNAを調製する：
段階1.7で得られた第一鎖cDNA 約20 μl 
63 μl    ヌクレアーゼを含まない水
10 μl    10x 第二鎖緩衝液 
4 μl    5 mM dNTP ミックス
2 μl    DNA ポリメラーゼミックス
1 μl     RNaseH                        .
100 μl    最終量
【０２６５】
2.2 試験管を静かに振り、≧10 000 × g で遠心し、反応物質を混合する。インキュベーター内において16°C で2時間インキュベートする。
【０２６６】
2.3 最高速度で5秒間遠心し、試験管の底の検体を回収する。静かに混合し、試験管を氷上に置く。直接段階4に進むか、あるいは-20°C で一晩保存する。
【０２６７】
3) 二重鎖cDNA の精製（Qiagen, Boom et al., 1990）
3.1 約500 μl の緩衝液PB を、段階2.3で得られたcDNA に加え、ピペットを上下させ静かに混合する。
【０２６８】
3.2 QIAquick スピンカラムを、2 ml 回収試験管内に置く。
【０２６９】
3.3 cDNA 緩衝液PB 溶液を、QIAquick スピンカラムに移す。
【０２７０】
3.4 当該スピンカラムを、10 000 × g で30秒から60秒間遠心する。
【０２７１】
3.5 フロースルーを廃棄する。当該カラムを洗浄するため、700 μl の緩衝液PEを加え、10 000 × g で遠心する。
【０２７２】
3.6 フロースルーを廃棄する。当該カラムを乾燥させるために、QIAquick カラムを、新しい2-ml 回収試験管に入れ、10 000 × g で1分間遠心する。
【０２７３】
3.7当該QIAquickカラムを、清潔な1.5-ml小型微量遠心機内に置く。
【０２７４】
3.8 cDNA を溶出させるため、約30 μl のEB緩衝液を、QIAquick メンブレンの中心に加える。当該カラムを1分間そのままにし、その後10 000 × g で1分間遠心する。合計で約60 μl の溶出液を生成するために、もう一度繰り返す。
【０２７５】
3.9 cDNA 溶液を、SpeedVac濃縮器を用い、中火で乾燥させる(約1時間)。
【０２７６】
4) T7 RNA ポリメラーゼを使用した、in vitro転写 (IVT)によるcRNA の合成（全ての測定値は概数）
4.1 以下の構成要素を新しいRnaseを含まない小型微量遠心機に入れることにより、再懸濁液を調製する（量は概数）：
9.5 μl    ヌクレアーゼを含まない水 
4.0 μl    10× T7 反応緩衝液
13.5 μl    総量
【０２７７】
4.2 段階3.9で得られたそれぞれのcDNA ペレットを、上記の再懸濁液13.5 μl で再懸濁する。ピペットを上下させ、当該ペレットを再懸濁させる。
【０２７８】
4.3 以下のものを、別のRNase を含まない小型微量遠心機に入れることにより、IVT 混合物を作製する（量は概数）：
4.0 μL    T7 ATP 溶液
4.0 μL    T7 GTP溶液
4.0 μL    T7 CTP溶液
3.0 μL    T7 UTP溶液
7.5 μl     mM ビオチン-11-UTP
4.0 μl    10×T7 酵素ミックス 
26.5 μl     最終量
【０２７９】
4.4 IVT 混合物の構成要素を、試験管をボルテックスミキサーにかけることにより、混合する。当該試験管を10 000 × g で5秒間遠心する。この反応混合物(26.5 μl)を、段階4.2で得られた再懸濁cDNA を含む試験管にいれ、静かにピペットを上下させ完全に混合する。
【０２８０】
4.5 反応物を、インキュベーターを用いて37 oC で14時間インキュベートする（水槽およびオープンヒートブロックは、小型微量遠心機の蓋に結露するため、推薦しない）。
【０２８１】
5) ビオチン標識cRNAの回収 （Qiagen, Boom et al., 1990） （全ての測定値は概数）
5.1 RLT およびRPE 緩衝液群のワーキング溶液群調製する。
【０２８２】
5.2 ヌクレアーゼを含まない水の適切な量（例えば、60 μl）を加えることにより、IVT 反応量を約100 μl に調節する。
【０２８３】
5.3 350 μl の緩衝液RLTを検体に加え、ピペットを上下させ完全に混合する。 
【０２８４】
5.4 250 μl の100% エタノールを反応検体に加え、ピペットを上下させよく混合する。 遠心はしない。
【０２８５】
5.5 検体(700 μl) を、回収試験管に入ったRNeasy スピンカラムに入れる。8000 × g で15秒間遠心する。
【０２８６】
5.6 当該のRNeasy カラムを、新しい2-ml 回収試験管（付属品）に移す。500 μl の緩衝液RPE をカラムに加え、8000 × g で15秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、回収試験管を再度使用する。この洗浄段階を一度繰り返す。
【０２８７】
5.7当該のRNeasyスピンカラムを、新しい2 μl 回収試験管に入れ、8000 × g で2分間遠心し、メンブレンを乾燥させる。
【０２８８】
5.8当該のRNeasyカラムを、新しい1.5-ml 回収試験管（付属品）に移し、50 μl のヌクレアーゼを含まない水をピペットで直接メンブレンに、メンブレンに触れずに、加える。
【０２８９】
5.9 周囲温度にて10分間インキュベートする。8000 × g で1分間遠心し、cRNA を溶出させる。
【０２９０】
5.10 50 μl のヌクレアーゼを含まない水を再度、ピペットで直接同一のメンブレンに加える。
【０２９１】
5.11周囲温度にて10分間インキュベートする。8000 × g で1分間遠心し、cRNA を（段階5.8で使用したものと同一の試験管に）溶出させる。
【０２９２】
5.12 カラムを取り除く。試験管を振って、溶液を混合する。
【０２９３】
5.13 cRNA を-70 oC で保存する。
【０２９４】
6) cRNAの濃度、収量、および品質の評価  
紫外線分光光度定量法が説明されている。その他の品質分析方法群は、変性剤ゲル電気泳動法あるいはAgilent 2100 Bioanalyzer を含む。
【０２９５】
6.1 cRNAの各々の検体について、ヌクレアーゼを含まない水を用いて、適切な希釈物(for example, 1:50) を調製する：
2 μl    cRNA
98 μl    ヌクレアーゼを含まない水
100 μl    最終量
【０２９６】
6.2 得られた混合物をボルテックスミキサーにかけ、10 000 × g で5秒間遠心し、試験管の底の液体を全て回収する。
【０２９７】
6.3 当該のcRNA希釈物を、100-μlのキュベット（路程1-cm）に移し、260 nm における紫外線吸光度 を測定する。A260 値が0.15未満である場合は、cRNA の1:20希釈物を調製し、260 nm における紫外線吸光度 を測定する。濃度を正確に定量するためには、希釈物は、約0.15から0.95までの直線範囲においてA260を生じなければならない。1:50希釈物について最初の観測値が当該の直線範囲に入っていなければ、適切な希釈変更を加え、新しく検体を調製する。
【０２９８】
6.4 cRNA 濃度を計算する：
1 A260 ユニット = 40 μg/ml （路程1-cmのキュベット）：
濃度（ μg/μl） = A260 × 希釈倍数 × 40 μg/ml × 0.001 ml/μl
【０２９９】
6.5 A260:A280比は、pHに感受性を有する。このように、検体の純度を正確に定量するためには、緩衝液で処理することができる。希釈cRNA をキュベットから、新しい小型微量遠心機に移し、0.1 M Tris-HCl（pH 7.6）を11.1 μl 加える。混合物をボルテックスミキサーにかける。
【０３００】
6.6 トリス希釈cRNA (~100 μl)を、石英製のキュベットに移し、260 nm および 280 nm における紫外線吸光度を測定する。A260:A280比は、検体の純度の測定値であり、1.8から2.1の範囲内であるはずである。
【０３０１】
1.1 各々のアレイをロードするには、約10 μg の cRNA （段階6.6で得られたもの）を、ヌクレアーゼを含まない水を用いて、薄壁の小型微量遠心機内で、約20 μl の最終量にする。
【０３０２】
1.2 それぞれのマイクロアレイにつき、5 μlの5x緩衝液を加える。試験管をサーマルサイクラーに入れ、加熱可能蓋の特長を利用して、94 oC で20分間加熱する。
【０３０３】
1.2 サーマルサイクラー内で、少なくとも5分間、0 oC に達するまで冷やす。
【０３０４】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄：
1) アレイへのハイブリダイゼーションの準備におけるcRNA の断片化
1.1 各々のアレイをロードするには、約10 μg の cRNA （段階6.6で得られたもの）を、ヌクレアーゼを含まない水を用いて、薄壁の小型微量遠心機内で、約20 μl の最終量にする。
【０３０５】
1.2それぞれのマイクロアレイにつき、5 μl の5×断片化緩衝液を加える。試験管をサーマルサイクラーに入れ、加熱可能蓋の特長を利用して、94 oC で20分間加熱する。
【０３０６】
1.3 サーマルサイクラー内で、少なくとも5分間、0 oC に達するまで冷やす。
【０３０７】
2) ハイブリダイゼーション反応混合物の調製
2.1 ハイブリダイゼーションを行なうために、37 oCでインキュベーターシェーカーの温度を設定する。CodeLink Shaker Kitのマイクロアレイトレーの支柱を、インキュベータープラットフォームに組み立てる。
【０３０８】
2.2 各々のマイクロアレイを処理するには、10 μgの断片化標的を含む260 μl のハイブリダイゼーション溶液を、1.5-ml小型微量遠心機において、調製する：
78 μl     ハイブリダイゼーション緩衝液構成要素 A
130 μl     ハイブリダイゼーション緩衝液構成要素B
27 μl     ヌクレアーゼを含まない水
25 μl     断片化 cRNA （1項で得られたもの）
260 μl     総量
【０３０９】
2.3 当該溶液を、ボルテックスミキサーを用いて、最高速度で5秒間攪拌する。当該ハイブリダイゼーション溶液を、90 oC で5分間インキュベートし、cRNA を変性させる。
【０３１０】
2.4 当該試験管(群)を、少なくとも5分間長くても30分間、氷上で冷やす。cRNA を変性させた後30分以内に、全てのマイクロアレイをロードする。
【０３１１】
3) 反応混合物をマイクロアレイチェンバーにロードする
3.1 スライドシェーカートレーを平坦な表面に設置する。マイクロアレイを、入力・出力用のポートを上に向けて、シェーカートレーに入れる。マイクロアレイを、12セットあるいはそれ未満、ロードする。
【０３１２】
3.2当該ハイブリダイゼーション反応混合物を、ボルテックスミキサーを用いて、最高速度で5秒間攪拌する。短時間遠心し、試験管の底の液体を回収する。当該試験管を氷上に戻す。
【０３１３】
3.3 それぞれのマイクロアレイにつき、250 μl を1-mlワイドボアピペット先端 に吸い込み、検体全量を、ピペットのブローアウト機能を使わずに、ゆっくりとチェンバーに注入する。ピペット先端に残っている余分な標的ミックスを廃棄する。ピペット先端を用いて、ポートの外部の周囲にある余分な液体を吸出し、廃棄する。リントを含まないワイプを用いて、ポートに触れないように注意しながら、ポート周辺から残渣液体をふき取る。
【０３１４】
3.4 12セットのマイクロアレイをロードした後、Flex Chamberの ポートを、シーリングストリップおよびシーリングツールを用いて、シールする。Flex Chamber に触らない。また、ポートを直接押さない。
【０３１５】
4) ハイブリダイゼーション
4.1 12枚のスライド付のシェーカートレーのノッチを、インキュベーターシェーカーに固定した前面および背面の支柱と位置合わせし、ロード済みのシェーカートレーをインキュベーターシェーカーに設置する。Flex Chamber は、上を向けて置く。
【０３１６】
4.2 シェーカーの速度を300 rpm に設定し、スライドを37 oC で18時間から24時間インキュベートする。いかなる形態であっても比較に用いるアレイは、所与の範囲内の同一時間、ハイブリダイズすることが重大である。
【０３１７】
4.3次の段階を準備するために、大型の試液タンクを240 ml の ろ過済み0.75× TNT 緩衝液で満たす。当該タンクを覆い、46 oC の水槽で一晩インキュベートする。
【０３１８】
5)ハイブリダイゼーション後の洗浄
5.1中型の試液タンク内のそれぞれのスロットを、13 ml の ろ過済み0.75× TNT 緩衝液で、満たす。マイクロアレイラックをタンクに入れる。周囲温度で放置する。
【０３１９】
5.2 12枚のスライド付のシェーカートレーをインキュベーターシェーカーから取り除き、周囲温度の平坦な表面に置く。一度に一人の被験者につき、12枚のスライドのみ処理する。処理準備が整うまでトレーをシェーカー内に置いたままにする。
【０３２０】
5.3 処理予定の第一のマクロアレイを、Flex Chamber 除去ツールに置く。 
【０３２１】
5.4 タブを持ち上げそれを60°の角度で引き戻すことにより、Flex Chamber にしわをよせずに、Flex Chamber を除去する。
【０３２２】
5.5 マイクロアレイをマイクロアレイラックのスロット（段階5.1において、0.75× TNTを含む中型の試液タンクに置いてある）に置く*11。マイクロアレイ位置づけツールを用い（歯のある面を下にして）、マイクロアレイを適切に設置する。
【０３２３】
5.6潜在的二次汚染を避けるために、Flex Chamber 除去ツールの表面を、噴出ボトルから出る周囲温度の0.75× TNT緩衝液約5 ml で、洗う。当該中型試液タンクを、全てのマイクロアレイが処理されるまで、周囲温度に保つ。
【０３２４】
5.7 段階5.3から段階5.6を、ハイブリダイズしたマイクロアレイのそれぞれにつき、繰り返す。
【０３２５】
5.8マイクロアレイを載せたマイクロアレイラックを、該中型試液タンクから、予め温めた0.75 × TNT で満たした大型試液タンク（段階4.3）に移す。大型試液タンクに蓋を載せ、水槽にも蓋を載せる。46 oC で正確に1時間インキュベートする；インキュベーションの時間が長いと、シグナルの強度が著しく落ちる可能性がある。
【０３２６】
ストレプトアビジン染料コンジュゲートを用いた検出
6.1 小型試液タンク内のそれぞれのスロットを、3.4 ml のCy5-ストレプトアビジンワーキング溶液で満たす。周囲温度で放置する。当該小型試液タンクに蓋をし、周囲の光により蛍光体が退色するのを防ぐ。
【０３２７】
6.2 マイクロアレイを載せたマイクロアレイラックを、46 °Cの大型試液タンクから出し、Cy5-ストレプトアビジンワーキング溶液を含む小型試液タンクに入れる。蓋をし、マイクロアレイを周囲温度で30分間インキュベートする。
【０３２８】
6.3 インキュベーション中に、4個の大型試液タンクをそれぞれ240 ml の周囲温度の 1× TNT 緩衝液で満たすことにより、洗浄段階の準備をする。
【０３２９】
6.4 30分間インキュベートした後、マイクロアレイを載せたマイクロアレイラックを、染色溶液から出し、1× TNT 緩衝液で満たした大型試液タンク1個(段階6.3で準備したもの)に入れる。マイクロアレイから溶液を排出しない。光を遮断して、周囲温度で5分間インキュベートする。
【０３３０】
6.5 マイクロアレイラックを、1× TNT 緩衝液で満たした第一の大型試液タンクから出し、1× TNT 緩衝液で満たした第二の大型試液タンクに入れる。ここでも、マイクロアレイから溶液を排出しない。光を遮断して、周囲温度で5分間インキュベートする。この段階を、新鮮な1× TNT 緩衝液で満たしたさらに二つの大型試液タンクを用いて、繰り返し、第三回目および第四回目の洗浄を行なう。
【０３３１】
6.6第三回目の洗浄中に、1個の大型試液タンクを蒸留水で完全に洗浄し、乾燥させる。このタンクを、最終洗浄溶液0.1× SSC/ 0.05% Tween 20で完全に満たす。
【０３３２】
6.7 マイクロアレイラックを、周囲温度の0.1 × SSC/ 0.05% Tween 20で満たした大型試液タンクに移す。スライドを、継続して静かに上下に攪拌しながら、30秒間インキュベートする。
【０３３３】
6.8 マイクロアレイラックを、大型試液タンクから取り出し、マイクロアレイの下端を吸収性のペーパータオルでぬぐう。マイクロアレイラックを、清潔な乾燥した中型試液タンクに入れる。マイクロアレイを、以下の設定を用いたQiagen Sigma 4-15C遠心機およびその対応するバケットローター（2 × 96穴プレート）あるいは類似したシステムを用いて、遠心により乾燥させる：
速度：2000 rpm (644 × g)
加速：9
減速： 9
時間： 3 min
【０３３４】
6.9 マイクロアレイ除去ツールを用いて、マイクロアレイをマイクロアレイラックから容易に取り出し、乾燥したマイクロアレイを、スキャンするまで、光から保護されたスライドボックス入れておく。マイクロアレは、アッセイ完了後2日以内にスキャンする必要がある。
【０３３５】
6.10 全てのタンクを、脱イオン水で繰り返してすすいで清潔にし、倒立させて乾燥させる。
【０３３６】
6.11 ラックをAlconox(tm) ソープで洗浄し、レールの間をパイプクリーナー様のブラシを用いて洗う。脱イオン水ですっかりすすぎ、ソープの残渣を取り除く。ラックをエアードライに付す。
【０３３７】
7)マイクロアレイのスキャンおよび分析  
7.1 使用する15分前に、スキャナーのスイッチを入れる。
【０３３８】
7.2 カバーを左にずらし、スライドホルダーを露出させる。
【０３３９】
7.3 スライドホルダーのラッチを持ち上げ、上部クリップを持ち上げる。
【０３４０】
7.4 ラテックス手袋をはめて、ラベルのついた側を下に、スキャナーの前面の最も近い位置に、マイクロアレイをトレーにロードする。
【０３４１】
7.5 スライドの左側のクリップを引き出し、マイクロアレイを定位置に落とす。クリップを放し、マイクロアレイに圧力がかかるようにする。
【０３４２】
7.6 マイクロアレイの両端をつかみ、マイクロアレイを自分の方へ動かす。
【０３４３】
7.7 上部クリップを下げ、カチッと音がするまでラッチを押し下げる。
【０３４４】
7.8 カバーを右にずらし、スライドホルダーを覆う。
【０３４５】
7.9 アレイ分析ソフトウェアープログラムを開け、以下の設定を選択する： 
波長：635 nm
PMT 電圧：600 V
レーザーパワー： 100%
ピクセルサイズ： 10 μm
焦点部位：0 μm
【０３４６】
7.10  血液癌アレイを、標準プロトコルに従って、スキャンすることができる。
【０３４７】
7.11 マイクロアレイ製造番号を入力死、「次へ」 [Next]をクリックする。「実験」[Experiment] および「スキャン情報」 [Scan Information] のインターフェースが表示される。
【０３４８】
7.12プロジェクト名、実験名、および検体名をタイプする。ユーザーネームが自動的に入力される。このインターフェースを初めて開けると、メッセージボックスが表示され、ActiveXインタラクションを進めてよいかどうか尋ねる。 
【０３４９】
7.13 設定(.gps)ファイルを選択する。設定ファイルが以前に選択されている場合には、その名前とパスが現在の設定ファイル下に表示される。新しいファイルを選択するには、「新しい設定ファイルを選択する」[Select New Settings File]下の「参照」[Browse] をクリックする。先のマイクロアレイについて入力されたプロジェクト名、実験名、ユーザーネーム、および設定ファイルの値は、保持されるが変更することができる。
【０３５０】
7.14「ロード」[Load]および「スライドをスキャンする」[Scan Slide]のスクリーンでは、現行のマイクロアレイの標準TIFファイルネームが表示される。必要であれば、名前を変更することができる。
【０３５１】
7.15 「参照」[Browse] をクリックし、画像パスあるいは当該画像を保存するロケーションを選択する。セキュリティーアラートメッセージボックスが表示されている場合*12。
【０３５２】
7.16 「スライドをスキャンする」[Scan Slide]をクリックする。「画像」[Image]タブ が表示され、装置がスキャンを行なう。
【０３５３】
7.17 スキャンが完了すると、表示は「レポート」[Report]タブに戻る。
【０３５４】
7.18「画像を保存する」[Save Image] をクリックし、スキャンした画像を適切なファイルロケーションに保存する。
【０３５５】
7.19 カバーを左にずらし、マイクロアレイを取り除く。
【０３５６】
7.20 次のマイクロアレイをスキャンするには、「新しいスライド」[New Slide] をクリックし、 次のマイクロアレイの製造番号を入力する。先に入力した設定情報は、保持される。
【０３５７】
7.21 それぞれのマイクロアレイから得られた画像を、ソフトウェアーを用いて分析する。
【０３５８】
実施例14：悪性リンパ腫あるいは白血病に関するHCPセット群のための付加的な遺伝子の選択  
その発現パターンが、悪性リンパ腫あるいは白血病から成る群から選択された血液癌の一つあるいはそれ以上の特徴を表す遺伝子を、HCPセット群に含めるべく、以下のように選択した。最初の遺伝子選択は、数多くの出版物に助言を求めて行ない、悪性リンパ腫および／または白血病について診断あるいは予後予測の潜在的可能性を有すると報告されている遺伝子を同定した。助言を求めた出版物のリストを、下記に示す： 
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【０３５９】
悪性リンパ腫およびまたは白血病について調整を見出した独立研究者の数、および使用された異なった方法群の数に基づき、関心の持たれている遺伝子にポイントを与えた。例えば、4人の科学者が三つの異なったテクニック（マイクロアレイ分析、FISH、およびPCR）を用いてCD22 が亜種間で異なった様態で発現することを見出したとすると、CD22には独立研究者の4ポイントと異なった方法群の3ポイントで、合計7ポイントが与えられる。別の遺伝子であるCD3D は、3人の研究者により異なった様態で発現すると報告されたが、これらの研究者はみなマイクロアレイ分析を方法として用いたとする。その結果、CD3D は、独立研究者の3ポイントを与えられるが、異なった方法群のポイントは1しかないので、合計で4ポイントになる。同定遺伝子にランク付けし、最も高いポイントを与えられた1154個の遺伝子が、一つあるいはそれ以上のHCPセット群に組み入れられるべく選択された。これらの遺伝子のリストは、表1に示した。 
【０３６０】
実施例15：HCPセット群内の遺伝子の発現レベルを検出するためのポリヌクレオチドプローブの同定    
HCPセット群内の遺伝子の発現レベルを検出するためのポリヌクレオチドプローブを調製するために適切なヌクレオチド配列を、実施例7に説明したように決定した。このように選択したポリヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列を、表20に示した。 
【０３６１】
実施例16：血液癌プロファイリング（HCP）アレイの調製  
GE Healthcare（米国）製のCodeLink テクノロジーを用いて、HCPアレイを製造した。 簡単に言えば、プローブを製造し、その後、CodeLinkの専売品である3次元水様ゲルを含むアレイ硝子スライドに付着させた。この付着段階は、アレイスライド表面の汚染を避けるため、クラス1000のクリーンルームで行った。製造したアレイスライドを、次に、使用前に品質管理に付した。 
【０３６２】
当該のHCPアレイスライドは、ヒトのmRNA 配列を標的とする1192個のプローブと、ヒトに見られないバクテリアの配列を標的とする62個のコントロール（30個の陽性コントロールおよび32個の陰性コントロール）プローブとを含んでいた。これらのコントロール標的遺伝子を、表29と表30に示した。  
【０３６３】
実施例17：HCPアレイを使ってプロファイリングするための、悪性リンパ腫および白血病の被験検体の調製    
23個のヒトの悪性リンパ腫の組織、2個の白血病の組織、さらに2個のコントロール組織から成る被験検体を調製した。悪性リンパ腫の被験検体はリンパ節から採取したものであり、白血病の被験検体は血液検体から調製したものであり、コントロールの組織はヒトの白血球から成るものであった。23個のヒトの悪性リンパ腫の検体は、表42に示したように、DLBCL検体が5個、FL検体が4個、HL検体が4個、MCL検体が4個、MZL検体が2個、SLL検体が2個、 さらに末梢性TCL検体が 2個から構成されていた。表43に示したように、白血病RNA検体は、CLL患者から採取したものであり、使用された2つの細胞ラインはJurkat (T-ALL) および K-562 (AML)であった。  
【０３６４】
表42：悪性リンパ腫の検体
【表４２】
2008514190.tif 000297
【０３６５】
表43：白血病の検体
【表４３】
2008514190.tif 000298
【０３６６】
白血病由来のトータルRNA 検体、およびコントロール組織を、Paxgene Blood RNA kit （Qiagen社）を用いて、キット付属のプロトコルに従って調製した。簡単に言えば、トータルRNA を、2.5 mL の血液から単離した*13。まず、血液RNA の試験管を解凍し、室温で2時間インキュベートした。次に、当該試験管を10分間遠心し、上澄みを取り除いた。5 mL のRNase を含まない水を加え、続いてペレットを懸濁させるためにボルテックスミキサーにかける。当該RNA試験管再び10分間遠心し、上澄みを取り除いた。緩衝液群 BR1 (360μL)、BR2 (300μL) および40μL プロテナーゼ K を検体に加え、ボルテックスミキサーにかけ、インキュベーターシェーカーを用いて55 °Cで10分間インキュベートした。インキュベートした後、検体を3分間遠心し、上澄みを新しい1.5 mL 試験管に移した。350μLのエタノールを加え、当該溶液を PAXgene カラムにロードした。カラムを1分間遠心し、フロースルーを廃棄した。緩衝液群 （それぞれ、700μL BR3 および 2x 500μL BR4）を当該カラムに加え、その都度遠心しフロースルーを廃棄した。カラムを新しい1.5 mL 試験管に移し、40μL の緩衝液BR5を加え、1分間遠心した。40μL の緩衝液BR5を再度加え、1分間遠心した。溶出液を65 °C で5分間インキュベートし、氷上で冷やし、-70 °C で保存した。 
【０３６７】
悪性リンパ腫検体を、Qiagen Rneasyキットを用いて、当該キット付属のプロトコルに従って、リンパ節検体から調製した。  
【０３６８】
ポリA mRNA を、mRNA 単離用のAmbion Poly(A)Purist キットを用いて当該キット付属のプロトコルに従って、細胞ラインから単離した。検体RNA の品質をAgilent 2100 Bioanalyzer を用いて、評価した。 
【０３６９】
全ての検体の検体RNA の品質をAgilent 2100 Bioanalyzer を用いて、評価した。
【０３７０】
ビオチン標識cRNA を、以下のように、RNA検体から調製した。cRNA 合成を、本質的には、Shippy et al. BMC Genomics. 2004 Sep 2;5(1):61で説明されているように、行なった。簡単に言えば、単一の標識化したヌクレオチドであるビオチン-11-UTPを用いて、1.25 mMの濃度のIVT反応において、cRNA をin vitro 転写により調製した。標識化していないUTP は3.75 mM の濃度に存在し、GTP、ATP、およびCTPは 5 mM の濃度に存在した。当該混合物を37°C で一晩14時間インキュベートした。標識cRNA を次に、RNeasy(r) mini kit （Qiagen社）を用いて製造者のプロトコルに従って精製した。cRNA の濃度および品質を、Agilent 2100 Bioanalyzer を用いて、確認した。 
【０３７１】
実施例18：被験検体のHCPアレイへのハイブリゼーション、およびハイブリゼーションの検出
それぞれの検体は、HCPアレイ上に正副二つのコピー（および場合によっては、3コピー）用意した。複製を、アレイの一貫性を確認する目的で、比較した。検体複製を、実施例16に説明されているHCPアレイを用いて、Davidson et al. Cancer Res. 2004 Sep 15;64(18):6797-6804に説明されているものに類似した方法により、ハイブリダイズした。簡単に言えば、精製したcRNA を、5×断片化 緩衝液において94°C で20分間、断片化した。60 μl のハイブリゼーション溶液中の6 μg の断片化cRNA をそれぞれのアレイチェンバーに加え、225 r.p.m.で振動させながら37°Cで18時間インキュベートした。ハイブリゼーション後、当該アレイを0.75× TNT （0.1M Tris-Hcl、pH 7.6、 0.15M NaCl、0.05% Tween 20）緩衝液を用い46°Cで1時間洗浄し、続いて、Cy5(tm)-ストレプトアビジンを用いて室温の暗室で30分間インキュベートした。次に、アレイを、1× TNT で4回5分間づつ洗浄し、洗浄の都度続けて0.05% Tween 20/SSC 緩衝液を用いてすすいだ。アレイを、次に、遠心により乾燥させ、チェンバーユニットを取り除き、スライドをスキャンするまで暗室に保存した。
【０３７２】
スライドを、GenePix 4000B （Axon Instruments社）を用いてスキャンし、画像分析を、CodeLink Expression v4 ソフトウェアー （Amersham Biosciences社）を用いて行なった。 
【０３７３】
実施例19：悪性リンパ腫被験検体のHCPアレイへのハイブリゼーションから得られたデータの分析
悪性リンパ腫被験検体cRNA のHCPアレイへのハイブリゼーションに由来する遺伝子発現プロファイルを、マイクロアレイ分析ソフトウェアーを用いて分析し、異なった様態で発現した遺伝子を同定し、さらに悪性リンパ腫亜種群に対する独特な遺伝子プロファイルを確立した。クラスタリングアルゴリズムも使用した。 
【０３７４】
悪性リンパ腫および白血病の実験を異なった時点で行なったので、別々に分析した。これらの二つのデータセットについてデータ分析方法は、悪性リンパ腫および白血病の研究の症例数および亜種が異なっていたため、異なっていた。白血病検体から得られたデータの分析は、実施例20で説明した。 
【０３７５】
分析を行なう前に、遺伝子発現を検体間で比較することができるように、分位点正規化法を用いて発現値を正規化した。技術的複製を、発現値の平均値を取って、合併させた。
【０３７６】
悪性リンパ腫データ分析
それぞれの亜種についてユニークな遺伝子印章を決定するために、二つの方法を用いて、二つの独立したリストを作成した。双方の方法とも、表1に示した発見遺伝子リストの全てを出発点として使用し、2倍の発現限界を課した。しかし、一方のリストは、コントロールに比較して、倍数変化における差異を評価することにより、手動で編集したものであり、他方のリストは、亜種間で有意に異なった様態で発現している遺伝子を判断するための統計学的分析を用いて、作製されたものである。それぞれの亜種につき、これらの二つのリストを比較し重ねあわせ、亜種特異性の遺伝子印章を生み出した。
【０３７７】
悪性リンパ腫の全ての亜種に共通である遺伝子（コントロールに対し、常に過剰発現しているか、あるいは常に過少発現している）を、亜種印章から取り除いた。これらの遺伝子は表31に示したが、亜種の相互比較において関心の対象となる可能性がある。しかし、これらの遺伝子は、コントロールに対し、亜種を区別ことにおいては補助にはならない。
【０３７８】
遺伝子印章のサイズは、HL については遺伝子33個から、MZL については遺伝子159個（表32から表38）の範囲である。MZL、SLLおよびTCL に関する印章は数少ない検体に基づいているので、それらの印章は、サイズは大きいがその他の亜種に比べ信頼性が低い。7つの悪性リンパ腫亜種特異的印章を構成する遺伝子の総数は、296であると決定された。これらの遺伝子を、表2に示した*14 。 
【０３７９】
それぞれの悪性リンパ腫亜種に対する印章遺伝子を、表32から表38にリストし、図1から図7に階層的クラスタリング画像として示した。
【０３８０】
コントロールに比較して、亜種間で異なった様態で発現していることが見出された296個の遺伝子を、図8に示したように、ユークリッド距離メトリックスを用いた群平均法を伴う階層的クラスタリングにより、クラスタリングした。異なった遺伝子発現は、悪性リンパ腫とコントロールとの間で、さらに多様な悪性リンパ腫亜種間で、見られる。  
【０３８１】
結果
本HCPアレイは、悪性リンパ腫検体およびコントロール検体において、遺伝子を検出することができた。相関係数およびその他の統計学的分析により、検体複製間の相互類似性が高いということが明らかになり、これにより、本HCPアレイの一貫性が実証された。また、統計学的分析により、悪性リンパ腫亜種と白血病亜種と（実施例20を参照せよ）コントロールの間の非類似性が明らかになり、これにより、本HCPアレイが異なった発現プロファイルを検出することができることが示された(図8および図9を参照せよ)。「疾患に罹患した」検体と「健常な」検体の間を区別するだけでなく、本HCPアレイは、異なった悪性リンパ腫および亜種により産出された独特な遺伝子発現プロファイルを同定することができた。これらのプロファイル（図1から図8）は、正確な診断およびリスク評価に有用な情報を提供する。 
【０３８２】
本HCPアレイは、研究対象の悪性リンパ腫の亜種のそれぞれについて、独特な遺伝子発現プロファイル（印章と呼ぶ）を同定した。以下に挙げる遺伝子印章は、特異的亜種を区別したものであり、コントロール検体における発現レベルと比較してリストされている。 
【０３８３】
びまん性Ｂ大細胞型リンパ腫
びまん性Ｂ大細胞型リンパ腫（DLBCL）は、非ホジキンリンパ腫の中で最も一般的な亜種であり、年間のNHL症例の40％を占める。DLBCLは、攻撃性の強い悪性腫であり、緩解する患者は半分に及ばない。DLCBL印章遺伝子を、表32に示した。
【０３８４】
濾胞性リンパ腫
濾胞性リンパ腫(FL)は、非ホジキンリンパ腫の全症例の約25％を占める不活性で成長の遅い癌である。FL の兆候が現れるのが遅いため、診断されるまでに、多くの患者は、疾患が広く広がっている。FLの別の合併症は、患者の25%から60%において、FLがより攻撃性のつよい形態のDLBCL に変換するということである。FL印章遺伝子を、表33に示した。 
【０３８５】
ホジキンリンパ腫
ホジキンリンパ腫（HL）は、予後がかなりよく、死亡率は20％である。HL は、リード・シュテルンベルク細胞として既知である、ある特殊な種の細胞形態の存在により特長付けられる。HL は、多くの亜種に比べて区別しやすいが、T細胞リンパ腫（例えば、ALCL）とHLが類似しているため、診断上の障害物が依然としてある。HL 印章遺伝子を、表34に示した。
【０３８６】
マントル細胞リンパ腫
マントル細胞リンパ腫(MCL)は、NHL のわずか6%を占めるに過ぎないが、攻撃性が強く不治の疾患であるため、不釣合いに多くの命を犠牲にしている。診断が遅いために、MCLの診断が下されるまでに、多くの患者は既に骨髄転移を起こしている。MCLにより、一年以内に死亡する患者もあれば、それより長く生存する患者もある；MCLの生存期間の中央値は3年である。MCL 印章遺伝子を、表35に示した。
【０３８７】
節性辺縁帯B細胞リンパ腫
節性辺縁帯B細胞リンパ腫（MZL）は、外形はMCL に似ているが、進行度は遥かに遅い。MZL は、その他の悪性リンパ腫と異なり、節性辺縁帯腫瘍がリンパ節の外側の領域（胃、甲状腺、あるいは膀胱など）に「リンパ節外」発生することは珍しくないので、発見しにくい。MZL印章遺伝子を、表36に示した。
【０３８８】
小リンパ球性リンパ
小リンパ球性リンパ（SLL）は、B細胞性慢性リンパ性白血病（B-CLL）に密接に関連しており、多くの悪性リンパ腫に比べ、重篤度が低い経過とたどる傾向がある。しかし、約15%の症例において、SLL は攻撃性の強いDLCBL に変換する。最近に研究によると、遺伝子発現プロファイリングがこれらの死に至らしめる変換を予測する補助となる可能性が示された。SLL印章遺伝子を、表37に示した。
【０３８９】
T細胞リンパ腫
T細胞リンパ腫（TCL）は、NHL のわずか15%を占めるに過ぎないが、予後は悪い傾向にある。TCL は、多くの場合、免疫不応答性の個体を襲い、治療に耐性を有する。TCL印章遺伝子を、表38に示した。
【０３９０】
この研究の結果により、上記の遺伝子印章を用いて悪性リンパ腫の亜種間を区別でき、それにより、患者に対し正確な診断およびタイムリーな治療を促進することができるということがわかった。
【０３９１】
作製した悪性リンパ腫亜種遺伝子印章を、それぞれの印章を参照として用い、それを全ての23個の悪性リンパ腫検体の遺伝子発現と比較することにより、テストした。それぞれの検体につき、参照印章と合致した遺伝子毎に、ポイントを与え、それらのポイントを合計し、当該印章について遺伝子数の合計の百分率として表した。このテストの結果により、印章は、悪性リンパ腫亜種を分類する上で効果的であるということが確認された。例えば、4個のFL検体が、FL印章内の70個の遺伝子の発現と、平均97.5 %の割合で、合致した。次点は、DLBCL-5検体で、88.5 %の割合で合致し、その他のほとんどの検体は遥かに低い相関を示した。このテストの手続きを、下記の表44に示した。 
【０３９２】
HL印章に関する部分的生データの一例を、下記の表45に示した*15。ページに収めるため、欄をいくつか省いたが、この表は、完全なデータを示すものではなく、どのようにして百分率の得点が得られたかを説明するものである。それぞれの検体につき得点欄を加え、合計得点を当該印章内の遺伝子の数で除し（HLの場合は33個）、百分率合致値を得た。
【０３９３】
表 44: 亜種印章についてのテスト結果の要約 (全印章および全検体についての百分率合致値)
【表４４】
2008514190.tif 000299
【０３９４】
表 ４５:  HL 印章遺伝子についての生テストデータ
【表４５】
2008514190.tif 000300
2008514190.tif 000301
【０３９５】
ある亜種において異なった様態で発現するとわかったHCPアレイ上の数多くの遺伝子は、最近の出版物と一致する。例えば、Rosenwald 等は、BANK1 と SPAP1の双方が、MCLで過剰発現されていると報告したが、これは、表35に示したように、本血液癌プロファイリング印章と一致している。同様に、本HCPアレイを用いて同定したDLBCL印章遺伝子のいくつか（すなわち、 NME1、MCM7 および BIKの過剰発現）は、複数の文献により確認されている。
【０３９６】
実施例20：白血病被験検体のHCPアレイへのハイブリダイゼーションから得られたデータの分析  
被験検体cRNAをHCPアレイへハイブリダイゼーションすることから得られた遺伝子発現プロファイルを、マイクロアレイ分析ソフトウェアーを用いて分析し、異なった様態で発現している遺伝子を同定し、悪性リンパ腫亜種に関する独特な遺伝子プロファイルを確立した。クラスタリングアルゴリズムも、使用した。 
【０３９７】
悪性リンパ腫および白血病の実験を異なった時点で行なったので、別々に分析した。これらの二つのデータセットについてデータ分析方法は、悪性リンパ腫および白血病の研究の症例数および亜種が異なっていたため、異なっていた。
【０３９８】
分析を行なう前に、遺伝子発現を検体間で比較することができるように、分位点正規化法を用いて発現値を正規化した。技術的複製を、発現値の平均値を取って、合併させた。
【０３９９】
白血病データ分析
SAM解析を行ない、有意に異なった発現を示す遺伝子を同定した。得られた遺伝子のセットから、ｐ値をステップダウン型ウェストフォール・ヤングで調整した一元配置分散分析法を用いて、p<0.01の遺伝子を選択した。これらの分析により、白血病の亜種間で異なった様態で発現する157個の遺伝子のリストが得られた。
【０４００】
異なった様態で発現していることが見出された157個の遺伝子を、図9に示したように、ユークリッド距離メトリックスを用いた群平均法を伴う階層的クラスタリングにより、クラスタリングした。これらの遺伝子にリストは、上記表3に示した。異なった遺伝子発現は、白血病とコントロールとの間で、さらに多様な白血病亜種間で、見られる。 
【０４０１】
それぞれの白血病亜種について独特な遺伝子印章を決定するために、当該の157個の有意な遺伝子に5倍のフィルターを適用した。亜種において5を超えるあるいは-5未満の倍数変化を示した遺伝子のみ、「印章」遺伝子として考慮した。CLL、AML および T-ALL の遺伝子リストを、それぞれフィルターにかけ、これらの判断基準を満たしたので、亜種特性的遺伝子印章が得られた。個々の白血病亜種についての印章遺伝子を、表39から表41にリストし、階層的クラスタリング画像を図10から図12に示した。
【０４０２】
結果
HCPアレイは、白血病検体およびコントロール検体において、遺伝子を検出することができた。本相関係数およびその他の統計学的分析により、検体複製間の相互類似性が高いということが明らかになり、これにより、本HCPアレイの一貫性が実証された。また、統計学的分析により、悪性リンパ腫亜種と白血病亜種とコントロールの間の非類似性が明らかになり、これにより、本HCPアレイが異なった発現プロファイルを検出することができることが示された(図9を参照せよ)。「疾患に罹患した」検体と「健常な」検体の間を区別するだけでなく、本HCPアレイは、異なった白血病の亜種により産出された独特な遺伝子発現プロファイルを同定することができた。これらのプロファイル（図9から図12）は、正確な診断およびリスク評価に有用な情報を提供する。 
【０４０３】
本HCPアレイは、研究対象の白血病の亜種のそれぞれについて、独特な遺伝子発現プロファイル（印章と呼ぶ）を同定した。以下に挙げる遺伝子印章は、特異的白血病亜種を区別したものであり、コントロール検体における発現レベルと比較してリストされている。   
【０４０４】
慢性リンパ性白血病
慢性リンパ性白血病（CLL） は、最も一般的な成人の白血病である。CLL は、Bリンパ性あるいはTリンパ性の癌である；B-CLL は、CLL の一般的形態である、Tリンパ性異常は重篤ではあるがCLL症例の5％未満を占めるに過ぎない。  
【０４０５】
CLL は、兆候が現れるのが遅く症状がはっきりしないので、診断が困難出る可能性がある。一般的なCLLの症状の流行性感冒のような性質（熱や疲労感など）が、診断の遅れあるいは誤診の原因となっている。  
【０４０６】
CLL は、治療に対する反応に一貫性がないため、医師の関心を引いている。多くのCLL患者は化学療法および／または放射線によく反応するが、別の患者は実質的に全く改善を見せない。Mackey et al. Blood 2005 Jan 15; 105(2): 767-774およびVallat et al. Blood 2003 Jun 1; 101(11): 4598-460による最近の研究によると、化学療法および放射線治療のそれぞれに耐性を有する独特なCLL亜種の存在を示唆している。新しいCLL亜種の同定は、CLLを理解し、CLLの予後を改善させる上で次の段階である。CLL印章遺伝子を、表39に示した。
【０４０７】
急性骨髄性白血病
急性骨髄性白血病（AML）患者は、急激に悪化するので、迅速で正確な診断が必須である。残念なことに、AML は、一般的な（先に述べた）方法群を用いると容易に誤診される。ほとんどのAML 患者は最初の治療によく反応するが、AML は再発率が高い。AML の遺伝子発現をよく理解することが、効率的な診断ツールおよびアウトカム予測につながるであろう。AML印章遺伝子を、表40に示した。
【０４０８】
急性T細胞リンパ球性白血病
急性T細胞リンパ球性白血病(T-ALL)は、子供および思春期の子供に最も一般的な白血病である。急性B細胞リンパ球性白血病に比べて理解されておらず、T-ALL は分類が困難になっている。T-ALL は、独特な種を呈することはなく、リスク評価が難しい。しかし、Chiaretti et al. Blood 2004 Apr 1; 103(7): 2771-2778による研究によると、遺伝子発現プロファイルが、T-ALL の予後について洞察を提供する（ある遺伝子が良好なアウトカムを示しその他の遺伝子が再発の高リスクを示す）という。T-ALL印章遺伝子を、表41に示した。 
【０４０９】
この研究の結果により、上記の遺伝子印章を用いて白血病の亜種間を区別でき、それにより、患者に対し正確な診断およびタイムリーな治療を促進することができるということがわかった。 
【０４１０】
本明細書に参考として組み入れられている全ての特許、出版物（出版された特許出願を含む）、およびデータベースは、そのような特許、出版物、およびデータベースが具体的に個別に参考として組み入れられていると記載されたと同程度に、そのまま参考として組み入れられているものである。
【０４１１】
本発明はある特定の実施例を参考として説明されているが、ここに添付されている請求項に概要が示されているように、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、その多様な改変が、当業者には明白である。
【図面の簡単な説明】
【０４１２】
図１は、DLBCL 検体におけるDLBCL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図2は、FL 検体におけるFL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図3は、HL 検体におけるHL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図4は、MCL 検体におけるMCL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図5は、MZL 検体におけるMZL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図6は、SLL 検体におけるSLL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図7は、TCL 検体におけるTCL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図8は、23個の悪性リンパ腫検体における悪性リンパ腫印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図9は、4個の白血病検体また3個の悪性リンパ腫検体における白血病印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図10は、CLL 検体におけるCLL印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図11は、AML 検体におけるAML印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
図12は、T-All検体におけるT-All印章遺伝子の階層的クラスター化画像を対照と比較して表している。
【図１】
2008514190.tif 000302
【図２】
2008514190.tif 000303
【図３】
2008514190.tif 000304
【図４】
2008514190.tif 000305
【図５】
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【図６】
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【図７】
2008514190.tif 000308
【図８】
2008514190.tif 000309
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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