(57)【要約】本発明は、フコシル化レベルの制御、及び抗体中のＡＤＣＣ活性の向上のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の宿主細胞のＩｇＧ Ｆｃを含んでなるが抗体のフコース含量が減少している抗体の産生方法であって、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を同時に宿主細胞に導入することを含んでなり、該ｓｉＲＮＡがＦＵＴ８の発現を阻害し、抗体のフコシル化レベルを低減するものである方法。
【請求項２】
抗体をコードする核酸が抗体の軽(Ｌ)鎖及び重(Ｈ)鎖をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする核酸とｓｉＲＮＡをコードする核酸が同じ発現ベクターにある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｈ鎖をコードする核酸及びＬ鎖をコードする核酸が異なる発現ベクターにあり、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする各々の発現ベクターが少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする核酸を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
２つのｓｉＲＮＡが異なるプロモーターの制御下で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つのｓｉＲＮＡがＰｏｌIIIプロモーターであるＨ１の下で発現され、第二のｓｉＲＮＡｉはＰｏｌIIIプロモーターであるＵ６の下で発現される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第一及び第二のｓｉＲＮＡが、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列のヌクレオチド位置７３３−７５１及び１０５６−１０７４をそれぞれ標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体フコシル化レベルが少なくとも９０％低減されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗体フコシル化レベルが少なくとも９５％低減されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が治療用抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法によって生産される抗体。
【請求項１３】
ＡＤＣＣが改善しているＩｇＧ抗体の産生方法であって、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を同時に宿主細胞に導入することを含んでなり、該抗体及び該ｓｉＲＮＡが該細胞内で発現して、ｓｉＲＮＡの非存在下で細胞内で産生された抗体と比較して、フコシル化が減少し、ＡＤＣＣ活性が増加している抗体が産生されるものである方法。
【請求項１４】
抗体がＦｃγＲIII及び／又はＡＤＣＣへの抗体結合を向上する少なくとも一つのアミノ酸変異をＦｃ領域に含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗体がＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡのＦｃアミノ酸置換を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらにＦｃアミノ酸置換Ｋ３２６Ａを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗体がＣＤ２０を結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が霊長類ＣＤ２０を結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＤ２０結合抗体がヒト抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＤ２０結合抗体がキメラ抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
キメラ抗体がリツキシマブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト化ＣＤ２０結合抗体が、配列番号.２のＶＬ及び配列番号.８のＶＨ；配列番号.２５のＶＬ及び配列番号.２２のＶＨ；及び、配列番号.２５のＶＬ及び配列番号.３３のＶＨから選択されるＶＬ領域及びＶＨ領域を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト化ＣＤ２０結合抗体が配列番号１３及び１４それぞれの配列を有するＬ鎖及びＨ鎖を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト化ＣＤ２０結合抗体が配列番号２６及び２７それぞれの配列を有するＬ鎖及びＨ鎖を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト化ＣＤ２０結合抗体が配列番号２６及び３４それぞれの配列を有するＬ鎖及びＨ鎖を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
抗体がＢＲ３を結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１３の方法によって生産される抗体。
【請求項２９】
配列番号.４２及び配列番号.４３の配列を含んでなる核酸。 
【請求項３０】
Ｆｃ領域を含んでなるヒト化ＣＤ２０結合抗体と担体とを含んでなり、該組成物中の抗体の少なくとも９５％がフコースを欠いている組成物。
【請求項３１】
抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を含んでなり、該抗体及び該ｓｉＲＮＡを発現する宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(関連出願)
本出願は、出典明記によって本明細書中にその開示内容の全体が援用される、２００５年６月３日出願の米国仮出願第６０／６８７６２５号及び２００５年１１月１４日に出願の同第６０／７３６９８２号の優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明はフコースが減少し、Ｆｃ機能が向上している抗体の産生に関する。
【０００３】
(発明の背景)
組み換え治療用タンパク質はマウスの骨髄腫ＮＳ０及びチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含むいくつかの哺乳動物宿主細胞株において共通して生産される(Anderson及びKrummen, 2002；Chu及びRobinson, 2001)。各々の細胞株は、細胞によって産生されるタンパク質の生産性及び特徴に関して有利な点と不利な点がある。商業的生産細胞株の選択は、与えられる産物に求められる生産物品質条件を供給することができる高い生産性の必要性と釣り合わせることが多い。高力価を必要とすることが多い治療用組み換えタンパク質のある重要な種類はモノクローナル抗体である。いくつかのモノクローナル抗体はエフェクター機能を必要とし、Ｆｃ領域を介して媒介して、それらの生物学的機能を誘発する。例として、細胞表面ＣＤ-２０に結合してその結果Ｂ細胞を枯渇するキメラモノクローナル抗体であるリツキシマブ(RituxanTM, Genentech and Biogen-Idec)がある(Carton等, 2002；Idusogie等, 2000)。他の抗体、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ(血管内皮性増殖因子)抗体であるベバシズマブ(AvastinTM, Genentech)は、その活性のためにＦｃエフェクター機能を必要としない。
【０００４】
哺乳動物宿主細胞において生産されるモノクローナル抗体は、各々の重鎖のＡｓｎ２９７にＮ結合グリコシル化部位を含有する(インタクトな抗体分子につき２つ)。一般的に、抗体上のグリカンは、バイセクトＮ‐アセチルグルコサミン(バイセクトGlcNAc)が非常に少ないか、全く無いものであり、コアフコシル化のレベルが高い複合の二分岐構造である(Saba等, 2002)。グリカン末端は、末端のシアル酸をあまり含まないか、全く含んでおらず、可変的な量のガラクトースを含む。抗体機能に対するグリコシル化の調査のために、例えばWright & Morrison Trend Biotechnol. 15:26-31 (1997)を参照のこと。多くの研究から、抗体グリカン構造の糖組成の変化がＦｃエフェクター機能を変更しうることが示されている(Kumpel等, 1994；Kumpel等, 1995；Schuster等, 2005；Shields等, 2002；Umana等, 1999)。抗体活性に関与している重要な炭水化物構造は、Ｆｃ領域Ｎ-結合オリゴ糖のＮ‐アセチルグルコサミン(ＧｌａｃＮＡｃ)残基にα１,６結合を介して付着されるフコース残基であると考えられている(Shields等, 2002；Shinkawa等 J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003))。ＦｃγＲ結合は、Ｆｃ領域内の保存されたＡｓｎ２９７で共有結合的に付着されるオリゴ糖類の存在を必要とする(Wright & Morrison (1997))。近年、非フコシル化構造は、劇的に増加したインビトロの抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)活性と関係している(Shields等, 2002；Shinkawa等, 2003)。発明者等自身を含めいくつかの研究所は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)又はノックアウト技術をうまく利用してＣＨＯ細胞を操作し、ＦＵＴ８ ｍＲＮＡ転写産物レベルを低下させるか又は完全に遺伝子発現をノックアウトした(Mori等, 2004；Yamane-Ohnuki等, 2004)。Mori等(2004)は、樹立された安定して抗体を産生する細胞株を、ＦＵＴ８遺伝子に対して恒常的にｓｉＲＮＡを発現してＬＣＡ選別を行うことによって、ＡＤＣＣが向上した抗体を生産する細胞株に変換することを記述している。Moriは、最高７０％の非フコシル化グリカンを含有する抗体の作成を示した。Niwa R.等 (Cancer Res. 64(6): 2127-2133 (2004))は、フコース含量の少ない抗ＣＤ２０抗体がヒトＰＢＭＣ移植マウスモデルにおいて動物の生存を有意に延長しうることを報告した。
【０００５】
歴史的に、最も共通して用いられる産業的な宿主の一つであるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で産生された抗体は、非フコシル化の集団のおよそ２〜６％である。しかしながら、ＹＢ２／０(ラット骨髄腫)及びＬｅｃ１３細胞株(α１,６-フコシル基転移酵素の基質であるＧＤＰ-フコース又はＧＤＰ-糖質中間生成物の欠損を引き起こすＧＤＰ-マンノース４,６-デヒドラターゼを欠損しているＣＨＯ細胞株のレクチン変異体(Ripka等, 1986))は７８〜９８％の非フコシル化種を有する抗体を生産しうる。残念なことに、これらの細胞からの抗体の収率は極めて劣っているので、これらの細胞株は商業的に治療用抗体産物を作るために有用でない。ＦＵＴ８遺伝子は、Ｎ-グリカンのＡｓｎ-結合(Ｎ-結合)ＧｌｃＮａｃの位置６へのＧＤＰ-フコースのフコシル基の転移を触媒するα１,６-フコシル基転移酵素をコードする(Yanagidani等 1997. J. Biochem 121:626-632)。α１-６フコシル基転移酵素はＩｇＧ抗体のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７のＮ-結合二分岐炭水化物へのフコースの添加を担う唯一つの酵素であることが知られている。
【０００６】
抗体のＦｃ領域に付着されるフコースを欠いている成熟した炭水化物構造を有する抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記述される。抗ＣＤ２０抗体を含む「脱フコシル化」又は「フコース欠失」抗体に関連した刊行物の例には、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国公開特許第２００３／０１１５６１４号；米国公開特許第２００２／０１６４３２８号；米国公開特許第２００４／００９３６２１号、同第２００４／０１３２１４０号及び米国公開特許第２００４／０１１０７０４号(３つすべてKyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)；米国公開特許第２００４／０１１０２８２号；米国公開特許第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；米国公開特許第２００６／００６３２５４号；米国公開特許第２００６／００６４７８１号；米国公開特許第２００６／００７８９９０号；米国公開特許第２００６／００７８９９１号；米国特許第６６０２６８４号及び米国公開特許第２００３／０１７５８８４号(Glycart Biotechnology)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Mori等 Biotechnology and Bioengineering 88(7): 901-908 (2004)；Li等 (GlycoFi) in Nature Biology online publication 22 Jan. 2006；Niwa R.等 Cancer Res. 64(6): 2127-2133 (2004)；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Shinkawa等 J. Biol. Chem. 278(5): 3466-3473 (2003)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産する細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開特許第２００３／０１５７１０８号Ａ１、Presta, L；及び、国際公開第２００４／０５６３１２号Ａ１(Adams等)の特に実施例１１)及び、ノックアウト細胞株、例えばα-１,６-フコシル基転移酵素遺伝子であるＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞(Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))が含まれる。また、修飾グリコシル化を有する抗原結合分子については米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana等)も参照。
【０００７】
ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)は、相同的なｍＲＮＡの分解を誘発するためのシグナルとして二本鎖ＲＮＡ(二本鎖ＲＮＡ)を使用する、非常に保存された、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングメカニズムである。配列特異的ｍＲＮＡ分解のメディエーターは、より長いｄｓＲＮＡからＲＮＡ分解酵素III切断によって生成される２１-から２３-ｎｔの小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)である。ｄｓＲＮＡは、Ｉ型インターフェロン(ＩＦＮ)合成の強力な誘導因子であり、その産物が潜在的なＲＮＡ分解酵素ＲＮアーゼＬを活性化するＩＦＮ-誘導酵素の２種類の活性化因子である。これらのｄｓＲＮＡに対する非特異的な応答は３０ｂｐより短いｄｓＲＮＡによっては誘発されない。最も多いプロセシング産物は、対称性の２-ｎｔ３'のオーバーハングを有する２１-及び２２-ｎｔＲＮＡの二本鎖であり、ｍＲＮＡ分解の最も効果的なメディエーターでもある(Elbashir等, Nature 411:494-498 (2001)；Elbashir等 Methods 26: 199-213 (2002))。
【０００８】
ＣＤ２０抗体に関する特許及び特許刊行物には、米国特許第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第５８４３４３９号、同第６３９９０６１号及び同第６６８２７３４号、並びに米国公開特許第２００２／０１９７２５５号Ａ１、米国公開特許第２００３／００２１７８１号Ａ１、米国公開特許第２００３／００８２１７２号Ａ１、米国公開特許第２００３／００９５９６３号Ａ１、米国公開特許第２００３／０１４７８８５号Ａ１(Anderson等)；米国特許第6,455,043号Ｂ1及び国際公開第００／０９１６０号(Grillo-Lopez, A.)；国際公開第００／２７４２８号(Grillo-Lopez及びWhite)；国際公開第００／２７４３３号(Grillo-Lopez及びLeonard)；国際公開第００／４４７８８号(Braslawsky等)；国際公開第０１／１０４６２号(Rastetter, W.)；国際公開第０１／１０４６１号(Rastetter及びWhite)；国際公開第０１／１０４６０号(White及びGrillo-Lopez)；米国公開特許第２００１／００１８０４１号Ａ１、米国公開特許第２００３／０１８０２９２号Ａ１、国際公開第０１／３４１９４号(Hanna及びHariharan)；米国公開特許第２００２／０００６４０４号及び国際公開第０２／０４０２１号(Hanna及びHariharan)；米国公開特許第２００２／００１２６６５号Ａ１及び国際公開第０１／７４３８８号(Hanna, N.)；米国公開特許第２００２／００５８０２９号Ａ１(Hanna, N.)；米国公開特許第２００３／０１０３９７１号Ａ１(Hariharan及びHanna)；米国公開特許第２００２／０００９４４４号Ａ１及び国際公開第０１／８０８８４号(Grillo-Lopez, A.)；国際公開第０１／９７８５８号(White, C.)；米国公開特許第２００２／０１２８４８８号Ａ１及び国際公開第０２／３４７９０号(Reff, M.)；国際公開第０２／０６０９５５号(Braslawsky等)；国際公開第０２／０９６９４８号(Braslawsky等)；国際公開第０２／０７９２５５号(Reff及びDavies)；米国特許第６１７１５８６号Ｂ１及び国際公開第９８／５６４１８号(Lam等)；国際公開第９８／５８９６４号(Raju, S.)；国際公開第９９／２２７６４号(Raju, S.)；国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１、米国特許第６２４２１９５号Ｂ１、米国特許第６５２８６２４号Ｂ１及び米国特許第６５３８１２４号(Idusogie等)；国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)；国際公開第００／６７７９６号(Curd等)；国際公開第０１／０３７３４号(Grillo-Lopez等)；米国公開特許第２００２／０００４５８７号Ａ１及び国際公開第０１／７７３４２号(Miller及びPresta)；米国公開特許第２００２／０１９７２５６号(Grewal, I.)；米国公開特許第２００３／０１５７１０８号Ａ１(Presta, L.)；米国特許第６５６５８２７号Ｂ１、同第６０９０３６５号Ｂ１、同第６２８７５３７号Ｂ１、同第６０１５５４２号、同第５８４３３９８号及び同第５５９５７２１号(Kaminski等)；米国特許第５５００３６２号、同第５６７７１８０号、同第５７２１１０８号、同第６１２０７６７号、同第６６５２８５２号Ｂ１(Robinson等)；米国特許第６４１０３９１号Ｂ１(Raubitschek等)；米国特許第６２２４８６６号Ｂ１及び国際公開第００／２０８６４号(Barbera-Guillem, E.)；国際公開第０１／１３９４５号(Barbera-Guillem, E.)；国際公開第００／６７７９５号(Goldenberg)；米国公開特許第２００３／０１３３９３０号Ａ１及び国際公開第００／７４７１８号(Goldenberg及びHansen)；国際公開第００／７６５４２号(Golay等)；国際公開第０１／７２３３３号(Wolin及びRosenblatt)；米国特許第６３６８５９６号Ｂ１(Ghetie等)；米国特許第６３０６３９３号及び米国公開特許第２００２／００４１８４７号Ａ１(Goldenberg, D.)；米国公開特許第２００３／００２６８０１号Ａ１(Weiner及びHartmann)；国際公開第０２／１０２３１２号(Engleman, E.)；米国公開特許第２００３／００６８６６４号(Albitar等)；国際公開第03／００２６０７号(Leung, S.)；国際公開第０３／０４９６９４号、米国公開特許第２００２／０００９４２７号Ａ１及び米国公開特許第２００３／０１８５７９６号Ａ１(Wolin等)；国際公開第０３／０６１６９４号(Sing及びSiegall)；米国公開特許第２００３／０２１９８１８号Ａ１(Bohen等)；米国公開特許第２００３／０２１９４３３号Ａ１及び国際公開第０３／０６８８２１号(Hansen等)；米国公開特許第２００２／０１３６７１９号Ａ１(Shenoy等)；国際公開第２００４／０３２８２８号(Wahl等)；国際公開第２００４／０３５６０７号(Teeling等)；米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Shitara等)が含まれる。また、米国特許第５８４９８９８号及び欧州特許第３３０１９１号(Seed等)；米国特許第４８６１５７９号及び欧州特許第３３２８６５号Ａ２(Meyer及びWeiss)；国際公開第９５／０３７７０号(Bhat等)、米国公開特許第２００１／００５６０６６号(Bugelski等)；国際公開第２００４／０３５６０７号(Teeling等)；国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman等)；米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Shitara等)；及び、国際公開第２００４／１０３４０４号(Watkins等)も参照のこと。ＣＤ２０抗体に関する刊行物には、Teeling, J.等 "Characterisation of new human CD20 monoclonal antibodies with potent cytolytic activity against non-Hodgkin's lymphomas" Blood, Jun 2004; 10.1182が含まれる。
【０００９】
Yamane-Ohnuki 2004及び協和発酵特許に記載のＦＵＴ８ノックアウト細胞株において、抗体産生は、樹立されたノックアウト細胞株への所望の抗体をコードする遺伝子の形質移入を必要とする。そのたびに選択された細胞株においてＦＵＴ８遺伝子ノックアウトを作製するための努力を要する工程を行うことなく、組み換えて操作した抗体のフコース含量を調節しながら所望の細胞株において抗体を産生させる有効な方法が必要とされている。本発明はこの必要性を満たし、以下の詳細な説明において明らかとなる他の利点を提供するものである。
【００１０】
(発明の概要)
ＦｃγＲIIIへの抗体の結合親和性を改善するためのある方法はＦｃ領域内のアミノ酸配列(一又は複数)を変更することである(Shields等 (2002)を参照)。表３に示されるヒト化抗ＣＤ２０抗体変異体は、ＦｃγＲIII結合及びＡＤＣＣを亢進するアミノ酸置換をＦｃに組み入れる。本発明は、ＦｃγＲIII結合亢進と組み合わせた場合にＦｃ領域内のアミノ酸変異がＦｃγＲIIIへの親和性及びＡＤＣＣに対して付加的な効果を示すフコース含量の低い抗体の産生方法を提供する。
本発明は、哺乳動物の宿主細胞のＩｇＧ Ｆｃを含んでなるが抗体のフコース含量が減少している抗体の産生方法であって、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を同時に宿主細胞に導入することを含んでなり、該ｓｉＲＮＡがＦＵＴ８の発現を阻害し、抗体のフコシル化レベルを低減するものである方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、哺乳動物の細胞において正常なフコシル化レベルによって合成される抗体と比較して、ＡＤＣＣを向上した抗体を生産する同時フコシル化ノックダウンを有する抗体産生細胞株を作製するためのより効率的な方法を提供する。このような手法は、高い抗体生産性と制御されたフコシル化レベルを表す細胞株を構築するために行いうる。このような細胞株は、治療用抗体の商業的生産として抗体のスケールアップ生産に有用である。したがって、ＡＤＣＣが改善しているＩｇＧ抗体の産生方法であって、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を同時に宿主細胞に導入することを含んでなり、該抗体及び該ｓｉＲＮＡが該細胞内で発現して、ｓｉＲＮＡの非存在下で細胞内で産生された抗体と比較して、フコシル化が減少し、ＡＤＣＣ活性が向上している抗体が産生される方法が提供される。
ＡＤＣＣが改善したＩｇＧ抗体を生産する方法の一実施態様では、抗体は、ＦｃγＲIIIへの抗体結合及び／又はＡＤＣＣを向上させる少なくとも一のアミノ酸変異をＦｃ領域に含んでなる。抗体は、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡのＦｃアミノ酸置換を含んでなりうる。
【００１２】
また、本発明は、フコースを欠いているヒト化ＣＤ２０結合抗体の組成物を作成するための方法を提供する。
本発明の方法の一実施態様では、抗体をコードする核酸は抗体の軽(Ｌ)鎖及び重(Ｈ)鎖をコードする。一実施態様では、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖とｓｉＲＮＡは同じ発現ベクターにコードされる。代替的な実施形態では、Ｈ鎖及びＬ鎖は異なる発現ベクターにコードされ、加えてまた、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする各々の発現ベクターは少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする核酸を含んでなる。
前述のすべての方法の一実施態様では、２つのｓｉＲＮＡは異なるプロモーターの制御下で発現される。ＰｏｌIIIプロモーターが発現ベクター内のｓｉＲＮＡの転写を促すために用いられる場合、１つのｓｉＲＮＡはＨ１プロモーター下で発現され、第二のｓｉＲＮＡｉは異なるＰｏｌIIIプロモーターであるＵ６の下で発現されうる。
ある実施態様では、第一及び第二のｓｉＲＮＡはそれぞれ配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列のヌクレオチド位置７３３−７５１及び１０５６−１０７４を標的とする。
上記方法のいずれかの実施態様では、好ましくは、抗体フコシル化レベルは、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％低減している。
【００１３】
上記方法によって生産される抗体が提供される。
前述のすべての方法の好適な実施態様では、抗体は治療用抗体である。一実施態様では、抗体はＣＤ２０を結合する。一実施態様では、抗体はＢＲ３を結合する。好適な実施態様では、抗体はヒト及び他の霊長類のＣＤ２０を結合する。一実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はヒト化抗体である。好適な実施態様では、ヒト化抗体はヒト化２Ｈ７抗体、好ましくは下記の表３及び表４に記載の抗体である。異なる実施態様では、ヒト化抗体は、ＶＬ領域及びＶＨ領域：配列番号.２のＬ鎖可変領域配列及び配列番号.８のＨ鎖可変領域配列；配列番号.２５のＬ鎖可変部配列及び配列番号.２２のＨ鎖可変部配列；又は、配列番号.２５のＬ鎖可変領域配列及び配列番号.３３のＨ鎖可変領域配列のうちの一組を含んでなる。ある実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は配列番号.１３及び配列番号.１４；配列番号.２６及び配列番号.２７；並びに配列番号.２６及び配列番号.３４のＬ鎖及びＨ鎖の組を含んでなる。
【００１４】
ヒト化抗ＣＤ２０抗体の他の実施態様は、ｈＡ２０(ＩＭＭＵ-１０６としても知られる、又は９０Ｙ-ｈＬＬ２；米国公開特許第２００３／０２１９４３３号、Immunomedics)；及びＡＭＥ-１３３(米国公開特許第２００５／００２５７６４；Applied Molecular Evolution/Eli Lilly)である。異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、ヒト抗体、好ましくはＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ(GenMab)である。さらに異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はキメラ抗体であり、好適な実施態様はリツキシマブ(Genentech, Inc.)及びキメラｃＡ２０抗体(米国公開特許第２００３／０２１９４３３号、Immunomedicsに記載)である。
さらに他の実施態様では、本発明の方法によって生産される抗体は、ＢＲ３を結合する抗体である。
さらに、本発明は、ＦＵＴ８遺伝子の２つの異なるコード領域に相補的な２つのｓｉＲＮＡをコードする配列番号.４２及び配列番号.４３の配列を含んでなる核酸を提供する。
Ｆｃ領域を含んでなるヒト化ＣＤ２０結合抗体と担体とを含んでなり、該組成物中の抗体の少なくとも９５％がフコースを欠いている組成物が提供される。
好適な実施態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はその誘導体である。
他の態様は、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を含んでなり、該抗体及び該ｓｉＲＮＡを発現する宿主細胞である。
また、疾患の治療のための前述のフコース欠陥のある抗体組成物の使用も提供される。
【００１５】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官のＢ細胞の９０％以上の表面に見出される分子量がおよそ３５ｋＤの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞(プロジェニタ)又は正常プラズマ細胞には見出されない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びに悪性Ｂ細胞の双方に存在する。文献中でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局性分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、Clark及びLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)及びValentine等, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
「抗体」なる用語は、最も広義に用いられ、特にモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、多重特異的抗体(例えば二重特異的抗体)、及びそれらが所望の生物学的活性又は機能を示す限り、抗体断片を包含する。
【００１６】
本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の生物活性には、少なくともヒトＣＤ２０への抗体結合、より好ましくはヒト及び他の霊長類ＣＤ２０(カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒを含む)への結合が含まれるであろう。抗体は、１×１０−８より低いＫｄ値、好ましくは１×１０−９より低いＫｄ値でＣＤ２０に結合し、このような抗体で処置していない適当なネガティブコントロールと比較した場合、好ましくは少なくとも２０％のＢ細胞をインビボで死滅又は枯渇させうるであろう。Ｂ細胞の枯渇は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、又は他のメカニズムの一又は複数の結果でありうる。ここでの疾患治療のある実施態様では、特定のエフェクター機能又はメカニズムが他のものよりも望まれ、ヒト化２Ｈ７のある変異体がＡＤＣＣなどの生物学的機能を達成するのに好ましい。
【００１７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小限抗体断片である。この断片は、一重鎖と一軽鎖可変領域ドメインが密接に非共有結合した二量体からなる。この２つのドメインのフォールディングから６つの高頻度可変ループ(それぞれＨ鎖及びＬ鎖から３ループ)が生じ、それにより抗原結合にアミノ酸残基を寄与させて抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一可変ドメイン(又は抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分)でさえ、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識して結合する能力を持つ。
【００１８】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得、一般に少量で存在しうる可能な変異を除いて、一次アミノ酸配列において同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。そのようなモノクローナル抗体は典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られている。例えば、選択方法は、ハイブリドーマクローンのプール、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのような複数のクローンから独特のクローンを選択することでありうる。選択された標的結合配列は、例えば標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養においてその生産を改善し、インビボでのその免疫原性を減少させ、多重特異的抗体を作り出す等のために、更に改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体はまた本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なった決定基(エピトープ)に対する異なった抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物と異なり、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていない点で有利である。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要とするものであると考えてはならない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法(例えばKohler等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988)；Hammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)、ファージディスプレイ法(例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照)、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術(例えば国際公開第１９９８／２４８９３号；同第１９９６／３４０９６号；同第１９９６／３３７３５号；同第１９９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５５９１６６９号(全てGenPharm)；同第５５４５８０７号；国際公開第１９９７／１７８５２号；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号； Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)を参照)を含む様々な技術によって作製することができる。
【００１９】
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来するインタクトな全長分子と実質的に同じ親和性でのＣＤ２０への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロ又はインビボアッセイにより測定されるＢ細胞の枯渇を含む生物学的活性を示す。
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが、抗体間で配列が広く異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特異的抗原に対する特異的抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均一には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長の「高頻度可変領域」と呼ばれる高度可変性のより短い領域により分離される１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる相対的にインバリアントな伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、これは主にβシート配置をとり、３つの高頻度可変領域に結合してループ状結合を形成するが、βシート構造の一部を形成する場合もある。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域の直ぐ近傍に保持され、他の鎖からの高頻度可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照)。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的細胞障害(ＡＤＣＣ)への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００２０】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、ＶＬのおおよそ残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及びＶＨのおおよそ３１−３５Ｂ(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、ＶＬの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及びＶＨの残基２６−３２(Ｈ１)、５２Ａ−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)(Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。
【００２１】
ここで示すように、「コンセンサス配列」又はコンセンサスＶドメイン配列は、既知のヒト免疫グロブリン可変領域配列のアミノ酸配列の比較から得た人工の配列である。これらの比較に基づいて、ヒトκ及びヒトＨ鎖サブグループIIIVドメイン由来の配列のコンセンサスであるＶドメインアミノ酸をコードする組換え核酸配列を調製した。コンセンサスＶ配列は如何なる抗体結合特異性も親和性も持たない。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同である重鎖及び／又は軽鎖の一部を有するものであり、残りの鎖は他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ対応配列に一致するか又は相同であり、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで用いるヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットである。
【００２２】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種からの高頻度可変領域の残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は結合親和性のような抗体特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえＦＲ領域が結合特性を改善するような一又は複数のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲ中のこれらアミノ酸置換の数は、典型的にはＨ鎖では６個以下、Ｌ鎖では３個以下である。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００２３】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)上にあるＦｃレセプター(ＦｃＲ)に結合した分泌Ｉｇによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒でその標的細胞を死滅させるという細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害性細胞を「武装させ(arm)」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦＣγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦＣγＲI、ＦＣγＲII及びＦＣγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号又はPrestaの米国特許第６７３７０５６号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。抗体がＣＤ２０結合抗体である場合、ＡＤＣＣ活性は、以下に記載のようにヒトＣＤ２０と１６を発現するトランスジェニックマウス(hCD20+/hCD16+ Tgマウス)において試験することができる。
【００２４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲIIレセプターには、ＦｃγＲIIＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲIIＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲIIＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。
【００２５】
国際公開第００／４２０７２号(Presta) にＦｃＲへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合親和性について、一実施態様では、抗体のＥＣ５０又は見かけのＫｄ(ｐＨ６．０での)は１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下である。ＦｃγＲIII(Ｆ１５８；すなわち低親和性アイソタイプ)への増加した結合親和性について、一実施態様では、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは１０ｎＭ以下であり、ＦｃγＲIII(Ｖ１５８；高親和性)について、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは３ｎＭ以下であった。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知であり(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、以下に記載される。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。ある実施態様では、本発明のヒト化２Ｈ７抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変異をさらに含有しており、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらにより好ましくは少なくとも１５０倍からおよそ１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
【００２６】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第９９／５１６４２号に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本明細書と特許請求の範囲を通して、特に明記しない限りは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して取り込まれるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。配列又は他の番号付けシステムを特に示さない限りは、Ｖ領域内の残基はKabat番号付けに従って番号付けをした。
【００２７】
ＣＤ２０抗体の例には、現在のところ「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)／マブセラ(登録商標)」)(米国特許第５７３６１３７号)と呼ばれている「Ｃ２Ｂ８」；Biogen Idec社から市販されている「Ｙ２Ｂ８」又は「イブリツモマブ・チウキセタン」(ゼバリン(登録商標))と命名されているイットリウム-[９０]標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第５７３６１３７号；１９９３年６月２２日に受託番号ＨＢ１１３８８でＡＴＣＣに寄託された２Ｂ８)；Corixaから市販されている「１３１Ｉ-Ｂ１」又は「ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ」抗体を産生するために１３１Ｉで標識されていてもよい「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(ＢＥＸＸＡＲＴＭ)(例えば、米国特許第５５９５７２１号も参照)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(例えば、Press等 Blood 69(2):584-591 (1987)及びその変異体、例えば「パッチフレームワーク」又はヒト化１Ｆ５(例えば、国際公開第２００３／００２６０７号, Leung, S.；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０)；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(例えば、米国特許第５６７７１８０号)；ヒト化２Ｈ７(例えば、国際公開第２００４／０５６３１２号(Lowman等)及び以下に記載のもの)；Ｂ細胞の細胞膜中のＣＤ２０分子を標的とするＨＵＭＡＸ−ＣＤ２０ＴＭ完全ヒト高親和性抗体(Genmab, Denmark；例えばGlennie及びvan de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)及びCragg等, Blood 101: 1045-1052 (2003)を参照)；国際公開第２００４／０３５６０７号及び同２００５／１０３０８１号(Teeling等、GenMab/Medarex)に記載されたヒトモノクローナル抗体；米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Shitara等)に記載されたＦｃ領域に複合Ｎ-グリコシド結合糖鎖を有する抗体；ＣＤ２０に結合する抗原結合断片及びモノクローナル抗体(例えば、国際公開第２００５／０００９０１号、Tedder等)、例えばＨＢ２０−３、ＨＢ２０−４、ＨＢ２０−２５、及びＭＢ２０−１１；ＣＤ２０に結合する一本鎖タンパク質(例えば、米国公開特許第２００５／０１８６２１６号(Ledbetter及びHayden-Ledbetter)；米国特許出願第２００５／０２０２５３４号(Hayden-Ledbetter及びLedbetter)；米国公開特許第２００５／０２０２０２８号(Hayden-Ledbetter及びLedbetter)；米国公開特許第２００５／０２０２０２３(Hayden-Ledbetter及びLedbetter)−Trubion Pharm Inc.)：例えば国際公開第２００４／１０３４０４号及び米国公開特許第２００５／００２５７６４号(Watkins等, Applied Molecular Evolution Inc.)に記載されたＡＭＥ-１３３ＴＭ抗体のようなＡＭＥ抗体シリーズのようなＣＤ２０結合分子及び例えば国際公開第２００５／０７０９６３号(Allen等、Applied Molecular Evolution, Inc.)に記載されたＦｃ変異を有するＣＤ２０抗体；国際公開第２００５／０１６９６９号及び米国公開特許第２００５／００６９５４５号(Carr等)に記載されたもののようなＣＤ２０−結合分子；例えば国際公開第２００５／０１４６１８号(Chang等)に記載されたような二重特異性抗体；例えば米国公開特許第２００５／０１０６１０８号(Leung及びHansen; Immunomedics)に記載されているヒト化ＬＬ２モノクローナル抗体；例えば国際公開第２００５／０４４８５９及び米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana等；GlycArt Biotechnology AG)に記載されている、ＣＤ２０に対するキメラ又はヒト化Ｂ−Ｌｙ１抗体；キメラ又はヒト化��２０抗体(それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０)及びＩＭＭＵＮ−１０６(例えば、米国公開特許第２００３／０２１９４３３号、Immunomedics)のようなＡ２０抗体又はその変異体；及びInternational Leukocyte Typing Workshop(例えば、Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael編, p.440, Oxford University Press (1987))から入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２が含まれる。ここでの好ましいＣＤ２０抗体はキメラ、ヒト化、又はヒトＣＤ２０抗体、より好ましくはリツキシマブ、ヒト化２Ｈ７抗体、キメラ又はヒト化Ａ２０抗体(Immunomedics)、ＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭヒトＣＤ２０抗体(Genmab)、及びＣＤ２０に結合する免疫グロブリン／タンパク質(Trubion Pharm Inc.)である。
【００２８】
本明細書で使用する「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」又は「ＢＲ３レセプター」という用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」を包含する。ヒトＢＲ３配列(配列番号４４)
2008541770.tif 000002
【００２９】
ここで用いる場合、「Ｂ細胞枯渇」は、治療前のレベルと比較して、薬剤又は抗体治療後に動物又はヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを意味する。Ｂ細胞レベルは、全血球数を得て、既知のＢ細胞マーカーに対して染色するＦＡＣＳ分析により、また実験的実施例に記載したような方法などのよく知られたアッセイを用いて測定可能である。Ｂ細胞枯渇は部分的か又は完全なものでありうる。一実施態様では、ＣＤ２０発現Ｂ細胞の枯渇は少なくとも２５％である。Ｂ細胞枯渇剤を投与されている患者では、Ｂ細胞は、一般に、薬剤が患者体内を循環している間とＢ細胞が回復する時に枯渇される。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３０】
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠内にある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「ベクター」はシャトルおよび発現ベクターを含む。一般的に、プラスミドコンストラクトも複製起源(例として、ＣｏｌＥ１複製起源)および選択マーカー(例として、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性)をそれぞれ細菌内のプラスミドの複製および選択を目的として含むであろう。「発現ベクター」は必要なコントロール配列または本発明の抗体断片を含む抗体の発現の調節因子を細菌または真核細胞内で含むベクターを表す。好適なベクターは以下に示す。
【００３２】
本願のヒト化２Ｈ７抗体のようなヒト化ＣＤ２０結合抗体を生成する細胞は抗体をコードする核酸を導入してある細菌および真核生物宿主細胞を含むであろう。好適な宿主細胞を以下に示す。
ここで使用される「標識」なる語句は、抗体に直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
【００３３】
本発明の方法及び組成物
ＲＮＡｉ干渉
長い二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ；一般的に２００ｎｔより長い)を用いて、様々な生物及び細胞型(例えば虫、ショウジョウバエ及び植物)における標的遺伝子の発現を静まらせる(サイレントさせる)ことができる。導入の際に、長いｄｓＲＮＡは、一般にＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)経路と称される細胞経路に入る。第一に、ｄｓＲＮＡは、ダイサーと称するＲＮアーゼIII-様酵素によって２０〜２５ヌクレオチドの(ｎｔ)小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)にプロセシングされる(開始工程)。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)として知られているエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に集まり、この過程で巻き戻しが起こる。その後、ｓｉＲＮＡ鎖はＲＩＳＣを相補的なＲＮＡ分子へ導き、同族のＲＮＡを切断して破壊する(エフェクター工程)。同族のＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の真ん中辺りで起こり、特定の遺伝子サイレンシングが引き起こされる。しかしながら、ほとんどの哺乳動物細胞が３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡの導入に応じてタンパク質合成及びＲＮＡ分解が非特異的に阻害されるという特性がある強力な抗ウイルス応答を有するので、研究者は２１〜２３ｂｐのｓｉＲＮＡを細胞に形質移入して抗ウイルス応答を誘発すること無くこれらの系においてＲＮＡｉを誘導する。本発明の方法では、特定の遺伝子転写物(この場合ＦＵＴ８)を標的とする少なくとも一の特定のｄｓＲＮＡを用いてＲＮＡｉ経路を誘導する。ｄｓＲＮＡは、任意の好適なｄｓＲＮＡ運搬系によって細胞に運搬される。適切なネガティブコントロールは、生物体のいずれの転写物をも標的としていないｄｓＲＮＡ(例えばルシフェラーゼを標的とするｄｓＲＮＡ)であろう。
本発明の方法では、特定の遺伝子転写物(この場合ＦＵＴ８)を標的とする少なくとも一の特定のｄｓＲＮＡを用いてＲＮＡｉ経路を誘導する。哺乳動物の培養細胞では、一般的にＲＮＡｉは、直接導入されるか、細胞内のＤＮＡコンストラクトからヘアピン構造として発現されるｓｉＲＮＡによって誘導される。
【００３４】
ｓｉＲＮＡの生産方法
遺伝子サイレンシング研究のためにｓｉＲＮＡを生成するためには５つの共通して知られる方法がある。(i) 化学的な合成；(ii) インビトロ転写；(iii) ＲＮアーゼIIIファミリー酵素(例えばダイサー、ＲＮアーゼIII)による長いｄｓＲＮＡの消化；(iv) ｓｉＲＮＡ発現プラスミド又はウイルスベクターからの細胞内での発現；そして、(vi) ＰＣＲ由来のｓｉＲＮＡ発現カセットからの細胞内での発現。初めの３つの方法は、リポフェクション、電気穿孔又は他の技術によって直接哺乳動物細胞に導入されるｓｉＲＮＡのインビトロ製法を伴う。後半の２つの方法は、細胞内でｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ-ベースのベクター及びカセットの導入によるものである。長いｄｓＲＮＡの消化によるｓｉＲＮＡ集団の作製を除き、すべての方法は、標的としない遺伝子への作用を最小限にしつつ標的遺伝子のサイレンシングを最大にするように、ｓｉＲＮＡの慎重な設定を必要とする。化学的な合成は、培養した哺乳動物細胞の一過性形質移入の後にＲＮＡｉ作用をモニターするための下流アッセイを行うために好適で最も広く用いられるｓｉＲＮＡ調製方法である。ｓｉＲＮＡは、プラスミドより容易に形質移入される。
例示的なｓｉＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６ (Kunkel及びPederson, 1988；Miyashi及びTaira, 2002)又はＨ１ポリメラーゼIIIプロモーターを用いて哺乳動物細胞内でのｓｉＲＮＡを発現するAmbion, Inc., (Austin, Texas)から市販のpSilencerTM ｓｉＲＮＡ発現ベクターである。例えば、pSilencer 3.0-H1(図３に示されるプラスミド構成成分)はＨ１ ＲＮＡプロモーターを特徴とする(Ｈ１ ＲＮＡはＲＮアーゼＰの構成成分である)。ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシンなどの様々な選択マーカーをこれらのベクターに含ませることができる。pSilencer 2.0-U6及び3.0-H1 ｓｉＲＮＡ発現ベクターをＢａｍＨI及びＨｉｎｄIIIによって線形にして、定方向性クローニングを容易にするオーバーハングを残す。サイレンシングを誘導するために、対象とする遺伝子を標的とする短いヘアピンＲＮＡをコードする小さいＤＮＡ挿入物を、ベクターのＰｏｌIIIプロモーターの下流にクローニングする。哺乳動物細胞に形質移入されると、挿入物-含有ベクターは、細胞の機構によって迅速にｓｉＲＮＡにプロセシングされる短いヘアピンＲＮＡを発現する。
【００３５】
培養細胞へのｓｉＲＮＡの運搬
多くの不死化細胞株について、ｓｉＲＮＡの形質移入は、脂質-又はアミン-ベースの試薬、例えばAmbionのsiPORTTM Lipid及びsiPORTTM Amine形質移入試薬によって行うことができる。一次細胞及び懸濁細胞への運搬のために、一般に、専用のジェントルオンセルバッファ(gentle-on-cells buffer)と最適化したパルス条件を用いた電気穿孔により、細胞の生存率を損なうことなく非常に有効にｓｉＲＮＡを運搬することができる。
【００３６】
ｓｉＲＮＡ実験のためのコントロール
いずれの内在性転写物をも標的としないネガティブコントロール(例えばルシフェラーゼを標的とするｄｓＲＮＡ)は、任意のｓｉＲＮＡの導入によって生じる遺伝子発現に対する非特異的な効果を調整するために有用である。イージートゥアッセイ(Easy-to-assay)ポジティブコントロールは、形質移入条件を最適化し、ｓｉＲＮＡが効率的に供給されることを確認して、特定の下流アッセイが働いていることを確認するために有用である。ポジティブコントロールはＲＮＡｉ実験の多くの異なる態様に使われるので、しばしば、複数のコントロールが必要とされる。形質移入最適化実験のために、SilencerTM ＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡは理想的なポジティブコントロールである。このｓｉＲＮＡは効率的にＧＡＰＤＨ発現をサイレンシングし、その作用はｑＲＴ-ＰＣＲ又はｍＲＮＡレベルの他の方法、又はタンパク質レベルのウエスタンブロットないしは免疫蛍光法によって容易にモニターすることができる。
【００３７】
ＲＮＡｉ効果のためのアッセイ
ＲＮＡｉ効果を測定するためにいくつかのアッセイがある。標的遺伝子をノックダウンすることの生物学的な効果を理解するために用いることができるアッセイには、細胞ベースのアッセイ、酵素アッセイ、アレイ分析が含まれる。ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルでのそれらの効果を表す。ｓｉＲＮＡ確認及び形質移入最適化のための最も簡単なアッセイは、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ処理細胞に対して遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ処理細胞における標的転写物レベルを測定するためのｑＲＴ-ＰＣＲに因る。４１０００より多くのヒト、マウス及びラット遺伝子に有用なApplied BiosystemsのＴａｑＭａｎ(登録商標)遺伝子発現アッセイも又本目的のために有用である。AmbionのｓｉＲＮＡデータベースにより、遺伝子特異的なSilencerTMの予め設定して確認されたｓｉＲＮＡに適合する個々のアッセイへのリンク提供される。また、タンパク質レベルでのノックダウンの程度を評価することができる。天然のタンパク質がほとんどの場合回復するので、酵素アッセイも行うことができる。ｓｉＲＮＡ、標的ｍＲＮＡ及び標的タンパク質レベルは相関しうる。
本発明の抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含んでなり、通常ＦｃγＲIIIＡに結合して、インビトロ及びインビボでのＡＤＣＣを表す。一般に、哺乳動物の宿主細胞を用いて、Ａｓｎグリコシル化部位とＡＤＣＣエフェクター機能を保持するＩｇＧ Ｆｃ領域又はその断片を有する抗体を産生し、一般的に集団中に９４〜９８％のモノクローナル抗体がフコシル化されている抗体集団を産生する。本発明の方法及びＦＵＴ８遺伝子を標的とする２以上のｓｉＲＮＡを発現させることによって生成した形質移入細胞は、正常な修飾していないＦＵＴ８発現を有する宿主細胞によって生産される抗体集団と比較して、フコシル化レベルが低い所望の抗体の集団を生産するであろう。その結果、概してフコシル化が少ない抗体の集団は適当なエフェクター細胞の存在下にてＦｃγＲIIIＡ及び／又はＡＤＣＣを向上することができる。
【００３８】
一実施態様では、本発明の方法によって産生されるフコシル化の少ない抗体はＣＤ２０、特に霊長類のＣＤ２０を結合する。一実施態様では、これらの抗体はヒトのＣＤ２０を結合する。
一実施態様では、本発明は、本発明の方法によって生成されるフコースが少ないヒト化２Ｈ７抗体を提供する。ｈｕ２Ｈ７抗体の生成は、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される国際公開第０４／０５６３１２号に詳細に記載される。ある実施態様では、変異体は、２Ｈ７.ｖ１６、ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１及びｈｕ２Ｈ７.ｖ１１４である。
【００３９】
完全長抗体では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体は、ヒト免疫グロブリンのＣドメインに結合したヒト化Ｖドメインを含んでなるであろう。好ましい実施態様では、Ｈ鎖Ｃ領域は、ヒトＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３に由来する。Ｌ鎖Ｃドメインはヒトκ鎖由来であることが好ましい。
ここでの目的では、「ヒト化２Ｈ７」は、可変軽鎖(ＶＬ)配列：
2008541770.tif 000003
；及び、可変重鎖(ＶＨ)配列：
2008541770.tif 000004
を含んでなるインタクトな抗体ないし抗体断片を指す。
【００４０】
ヒト化２Ｈ７抗体がインタクトな抗体である場合、ｖ１６軽鎖アミノ酸配列：
2008541770.tif 000005
；及び、重鎖アミノ酸配列：
2008541770.tif 000006
を含んでなることが好ましい。
【００４１】
前述のヒト化２Ｈ７ ｍＡｂの変異体が、上記の配列番号１３と同じＬ鎖配列を有し、且つＨ鎖アミノ酸配列：
2008541770.tif 000007
を含む２Ｈ７.ｖ３１である。
【００４２】
前述のヒト化２Ｈ７抗体の他の変異体は、配列番号.２５のＶＬ
2008541770.tif 000008
及び、２Ｈ７.ｖ１１４の配列番号.２２のＶＨ
2008541770.tif 000009
を含んでなるものである。
【００４３】
２Ｈ７.ｖ１１４の完全なＬ鎖アミノ酸配列は以下の配列を有する。
2008541770.tif 000010
２Ｈ７.ｖ１１４の完全なＨ鎖アミノ酸配列
2008541770.tif 000011
さらに他の変異体は、配列番号.２６のＨ鎖アミノ酸配列を含んでなる２Ｈ７.ｖ１３８である。
【００４４】
更なる変異体である２Ｈ７.ｖ４７７は、配列番号.２５のＶＬ及び配列番号.２２のＶＨを含んでなり、Ｈ鎖アミノ酸配列：
2008541770.tif 000012
を有する。
前述のヒト化２Ｈ７抗体の更なる他の変異体は、配列番号.２５のＶＬ及び２Ｈ７.ｖ５１１の配列番号.３３のＶＨを含んでなるものである。(表４を参照)
2008541770.tif 000013
【００４５】
ある実施態様では、抗体は、２Ｈ７.ｖ５１１軽鎖(配列番号.２６)
2008541770.tif 000014
及び２Ｈ７.ｖ５１１重鎖(配列番号.３４)
2008541770.tif 000015
を含んでなる。
【００４６】
バージョン１６に基づく全ての他の変異体のＶ領域は、以下の表３に示すアミノ酸置換の位置を除いてｖ１６のアミノ酸配列を有する。特段示さない限り、２Ｈ７変異体はｖ１６のものと同じＬ鎖を有する。ヒト化抗体２Ｈ７ｖ．１６はまたｒｈｕＭＡｂ２Ｈ７、ＰＲＯ７０７６９又はオクレリツマブ(Ocrelizumab)とも呼ばれる。
【００４７】
表３
2008541770.tif 000016
表４
2008541770.tif 000017
【００４８】
残基番号付けは、Kabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従っており、配列図において挿入はａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅで示し、間隙はダッシュで示す。Ｆｃ領域を含むＣＤ２０結合抗体において、Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付け系によると残基４４７)は、例えばＡｂの精製の間、又は抗体ポリペプチドをコードする核酸を組換え操作することによって、除去することができる。従って、本発明のヒト化２Ｈ７抗体組成物は、Ｋ４４７を持つ抗体、全てのＫ４４７が除去された抗体、又はＫ４４７残基を持つ抗体と持たない抗体の混合物を含みうる。
ＩｇＧ中のＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にある。本発明のヒト化２Ｈ７抗体組成物は、Ｆｃ領域を有する前述のヒト化２Ｈ７抗体の任意のものの組成物を含み、ここで組成物中の抗体の約８０〜１００％(好ましくは約９０〜９９％)は糖タンパク質のＦｃ領域に結合したフコースを欠く成熟コア糖鎖構造を含む。そのような組成物は、ＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)への結合に驚くべき改善を示すことがここで実証されており、これは、ヒトＩｇＧとの相互作用においてＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)ほど効果的ではない。ＦｃγＲIIIＡ(Ｆ１５８)は、正常で健常なアフリカ系アメリカ人及び白人においてはＦｃγＲIIIＡ(Ｖ１５８)より一般的である。Lehrnbecher等 Blood 94:4220 (1999)を参照のこと。
【００４９】
二重特異性ヒト化２Ｈ７抗体は、抗体の１本のアームが本発明のヒト化２Ｈ７抗体のＨ及び／又はＬ鎖の抗原結合領域を少なくとも有し、他のアームは第二抗原に対してＶ領域結合特異性を有する抗体を包含する。具体的な実施態様では、第二抗原は、ＣＤ３、ＣＤ６４、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ又は他のＮＫ活性化リガンドからなる群から選択される。
一実施態様では、本発明のヒト化２Ｈ７抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変異をさらに含有し、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、さらにより好ましくは少なくとも１５０倍からおよそ１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
【００５０】
ｓｉＲＮＡ形質移入細胞におけるＦＵＴ８の転写物又はタンパク質のレベルがＦＵＴ８阻害性ｓｉＲＮＡの形質移入及び発現の無い同一物のレベルと比較して、測定可能な程度に減少していれば、ＦＵＴ８の発現は阻害又はノックダウンされている。細胞中のＦＵＴ８転写物又はタンパク質及び生産される抗体のフコース含量は、後述する方法によって定量化することができる。好ましくは、ＦＵＴ８発現の阻害のレベルは、組成物中の抗体のフコシル化レベルが少なくとも６５％、好ましくは７５〜８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％又は９９％減少する。
ｓｉＲＮＡ発現を促すために有用なプロモーターは、ＰｏｌIIIタイププロモーター、例えばＨ１又はＵ６プロモーターである。また、ｔＲＮＡプロモーターが使われてもよい。
宿主細胞には真核細胞、例えば哺乳動物細胞及び植物細胞が含まれる。好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞などの哺乳動物の細胞であるが、本明細書中に他の適切な宿主細胞が提供される。
抗体が、ＲＮＡｉ及びＦＵＴ８ノックダウンの無い正常なＦＵＴ８遺伝子機能により宿主細胞内で産生された同じ抗体よりも、結合及びＡＤＣＣ活性のレベルの増加を示す場合に、ＦｃγＲIII結合及び／又はＡＤＣＣが向上されている。ＦｃγＲ結合及びＡＤＣＣの測定方法は後述する。
【００５１】
抗体の製造
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。免疫化の後、リンパ球を単離して、次いでポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００５２】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞(融合パートナーとも称する)の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための選択培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、融合していない親の細胞に対して選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系、例えば、the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２及びその誘導体、例えばＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【００５３】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、例えばマウスに細胞を腹腔内注入することによって、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティクロマトグラフィ(例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロース)又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などの常套的な抗体精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【００５４】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００５５】
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、相同的マウス配列をヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(ＣＨ及びＣＬ)配列に置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド(異種性ポリペプチド)のコード配列の全部又は一部を融合させることによって、キメラ又は融合抗体ポリペプチドを生産するように修飾されうる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対して特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００５６】
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性及び、抗体がヒトの治療用途に意図される場合にはＨＡＭＡ応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定して、その中のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)をヒト化抗体とする(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００５７】
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作製するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全長抗体、例えば完全長ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００５８】
ヒト抗体及びファージディスプレイ法
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５５９１６６９号(すべてGenPharm)、同第５５４５８０７号；及び国際公開公報９７／１７８５２を参照されたい。
【００５９】
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
前記したように、またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号を参照)。
【００６０】
抗体断片
特定の状況では、全抗体よりもむしろ抗体断片を使用する利点がある。より小さいサイズの断片は迅速にクリアランスされ、固形腫瘍へのアクセスが向上しうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて大腸菌で発現されて分泌されるため、これら断片の大量の生産が容易である。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有するインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は、米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３／１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部位を有する唯一の種類である；したがって、それらは、インビボ使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端で、エフェクタータンパク質の融合を得るために設定されうる。上記のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００６１】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＣＤ２０タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位と、ＣＤ２０結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＣＤ２０アームは、ＣＤ２０発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させて局所化させるために、ＩｇＧ(ＦｃγＲ)、例えばＦｃγＲI(ＣＤ６４)、ＦｃγＲII(ＣＤ３２)及びＦｃγＲIII(ＣＤ１６)、又はＮＫＧ２Ｄないし他のＮＫ細胞活性化リガンドに対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＣＤ２０を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＣＤ２０結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性の抗ＥｒｂＢ２／ＦｃγＲIII抗体が記載され、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／ＦｃγＲI抗体ＩＤＭ１(Osidem)が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示する。
【００６２】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Milstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所望の二重特異性抗体の最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節により大きな融通性(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が所望の鎖組合せの収率に有意に影響しないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
【００６３】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００６４】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合(ヘテロコンジュゲート)」抗体を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００６５】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーによりＶＬにＶＨを結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００６６】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【００６７】
他のアミノ酸配列の修飾
ここで記載のＣＤ２０結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗ＣＤ２０抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの抗ＣＤ２０抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗ＣＤ２０抗体の特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244:1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とＣＤ２０抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗ＣＤ２０抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００６８】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗ＣＤ２０抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗ＣＤ２０抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドの抗ＣＤ２０抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗ＣＤ２０抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００６９】
アミノ酸置換の表
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【００７０】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００７１】
抗ＣＤ２０抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な交差を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特にこの場合、抗体はＦｖ断片などの抗体断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む(例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＣＤ２０の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【００７２】
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【００７３】
抗ＣＤ２０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗ＣＤ２０抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。
【００７４】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考えられる。例えば、抗体は様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合されてもよい。抗体はまた例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に(例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に)、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中に、又はマイクロエマルション中に捕捉されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16版, Oslo, A編(1980)に開示されている。
【００７５】
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
実験的実施例に示すようにある生物学的特徴を有する抗体を選択する。
本発明の抗ＣＤ２０抗体の成長阻害効果は、当業者に知られた方法、例として、ＣＤ２０遺伝子を内因性または形質移入してＣＤ２０を発現する細胞を用いるなどの方法によって評価しうる。例えば、腫瘍細胞株およびＣＤ２０形質移入細胞を、様々な濃度の本発明の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体で２、３(例として２−７)日間処理し、クリスタル・バイオレットまたはＭＴＴで染色、または他の比色アッセイ法によって分析した。増殖を測定する他の方法には、本発明の抗ＣＤ２０抗体存在または非存在下にて処理した細胞による３Ｈ-チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理後、細胞を回収して、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線量をシンチレーションカウンターで定量した。細胞株の成長を阻害することが知られている成長阻害抗体で選択した細胞株を処理して適当な陽性コントロールとする。
【００７６】
細胞死を誘導する抗体を選択するために、プロピジウムヨウ素化物(ＰＩ)、トリファンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みなどにより表される膜の完全性の欠損を対照と相対的に評価した。補体および免疫エフェクター細胞非存在下でＰＩ取り込みアッセイを行う。ＣＤ２０発現腫瘍細胞を単独培地または例として約１０μｇ／ｍｌの適当なモノクローナル抗体を含む培地で培養する。それぞれの処理後、細胞を洗浄して、細胞塊を除去するために３５ｍｍ濾過器をかぶせた１２×７５チューブ(１チューブ当たり１ｍｌ、各処理群につき３チューブ)に分注する。その後、ＰＩ(１０μｇ／ｍｌ)をチューブに加える。試料をFACSCANＴＭフローサイトメーターおよびFACSCONVERTTM CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)により分析しうる。ＰＩ取り込みにより決定されるような統計学上有意なレベルの細胞死を引き起こす抗体を細胞死誘導抗体として選択しうる。
対象の抗体により結合されるＣＤ２０上のエピトープに結合する抗体を検索するために、例としてAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に示されているように平凡なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗ＣＤ２０抗体として同じ部位に結合するかエピトープに結合するかを決定するのに用いられる。代わりにまたは加えて、エピトープマッピングはこの分野でよく知られた方法によって行うことができる。例えば、接触する残基を同定するためにアラニンスキャニングによるように抗体の配列に突然変異が誘発される。変異した抗体は確実にフォールディングされるように初めにポリクローナル抗体との結合を試験する。異なる方法では、ＣＤ２０の異なる領域に一致するペプチドを用いて、試験抗体の競合アッセイ、または試験抗体と特徴のあるまたは既知のエピトープを持つ抗体の競合アッセイを行うことができる。
【００７７】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明はまた、ヒト化２Ｈ７変異体抗体をコードしている単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び抗体の生産に対する組換え方法を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００７８】
(i) シグナル配列成分
この発明のヒト化２Ｈ７抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ＣＤ２０結合抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、ヒト化２Ｈ７抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレーム内でライゲーションさせる。
【００７９】
(ii) 複製開始点
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００８０】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、細胞成分を同定してヒト化２Ｈ７抗体をコードする核酸を取り出すことができるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６)。
【００８１】
あるいは、ヒト化２Ｈ７抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００８２】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識されヒト化２Ｈ７抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまたＣＤ２０結合抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００８３】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００８４】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのヒト化２Ｈ７抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)などのウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００８５】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明のヒト化２Ｈ７抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ＣＤ２０結合抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００８６】
(vi) 転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、ＣＤ２０抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００８７】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００８８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＣＤ２０結合抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００８９】
グリコシル化ヒト化２Ｈ７抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
【００９０】
培地における脊椎動物細胞の増殖(組織培養)はルーチンな手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株(ＣＯＳ-７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚性腎臓細胞株(２９３細胞又は懸濁培養のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼体ハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０)；アフリカのミドリザル腎臓細胞(ＶＥＲＯ-７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頚癌細胞(ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎臓細胞(ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４)；バッファロラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及び、ヒト肝腫瘍細胞株(Ｈｅｐ Ｇ２)である。
宿主細胞は、ＣＤ２０結合抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９１】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明のＣＤ２０結合抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ), Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ), Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９２】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、とりわけアフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXTM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのSEPHAROSETMクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９４】
抗体コンジュゲート
抗体は細胞障害性剤、例として毒素または放射性同位体とコンジュゲートしうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥおよびその類似体または誘導体が好ましい。
好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤および代謝阻害剤を含む。細胞障害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、およびチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、および分化誘導物質を含む。特に有用なものの中には、例としてメトトレキサート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、５フルオロウラシル、６メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン(leurosine)、レウロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、Ｎ(５,５-ジアセトキシペンチル)ドキソルビシン、モルフォリノ-ドキソルビシン、１(２-クロエチル)-１、２-ジメタネスルホニル(dimethanesulfonyl)ヒドラジッド、Ｎ８-アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシドまたはエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８-アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ-１、メイタンシン、メイタンシノール、 Ｎ-デスメチル-４,５-デセポキシメイタンシノイド、Ｃ-１９-デクロロメイタンシノイド、Ｃ-２０-ヒドロキシメイタンシノール、 Ｃ-２０-デメトキシメイタンシノール、Ｃ-９-ＳＨ メイタンシノール、Ｃ-１４-アルコキシメチルメイタンシノール、Ｃ-１４-ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、Ｃ-１５-ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、Ｃ-１５-メトキシメイタンシノール、 Ｃ-１８-N-デメチルメイタンシノールおよび４,５-デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンＥ、Ｍ、ＰＨＥおよびＰＥ；ドロスタチン(dolostatin)、例としてドロスタチンＡ、ドロスタチンＢ、ドロスタチンＣ、ドロスタチンＤ、ドロスタチンＥ (20-epi及び11-epi)、ドロスタチンＧ、ドロスタチンＨ、ドロスタチンＩ、ドロスタチン１、ドロスタチン２、ドロスタチン３、ドロスタチン４、ドロスタチン５、ドロスタチン６、ドロスタチン７、ドロスタチン８、ドロスタチン９、ドロス��チン１０、deo-ドロスタチン１０、ドロスタチン１１、ドロスタチン１２、ドロスタチン１３、ドロスタチン１４、ドロスタチン１５、ドロスタチン１６、ドロスタチン１７、及びドロスタチン１８；セファロスタチン(cephalostatin)、例として セファロスタチン１、セファロスタチン２、セファロスタチン３、セファロスタチン４、セファロスタチン５、セファロスタチン６、セファロスタチン７、25'-epi-セファロスタチン７、20-epi-セファロスタチン７、セファロスタチン８、セファロスタチン９、セファロスタチン１０、セファロスタチン１１、セファロスタチン１２、セファロスタチン１３、セファロスタチン１４、セファロスタチン１５、セファロスタチン１６、セファロスタチン１７、セファロスタチン１８、及びセファロスタチン１９を含む。
【００９５】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【００９６】
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chariら, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、上記特許文献に開示されているように、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【００９７】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能価性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能価性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])及びジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【００９８】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、１つ又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗ＴＡＳＫ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【００９９】
放射性同位元素
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗ＣＤ２０抗体を生成するために、種々の放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１００】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０１０１】
治療的用途
本発明のヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体は、多くの悪性腫瘍および非悪性疾患、例えばＢ細胞リンパ腫及び白血病などのＣＤ２０陽性癌及び自己免疫性疾患の治療に有用である。骨髄の幹細胞(Ｂ細胞プロジェニター)はＣＤ２０抗原を欠損しており、治療後には健康なＢ細胞の再産生が可能となり、数か月以内には正常レベルにまで回復する。ｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１は本明細書に記載の治療方法に用いられるべき好適な抗体である。
ＣＤ２０陽性癌は、細胞表面上にＣＤ２０を発現する細胞の異常な増殖を含むものである。ＣＤ２０陽性Ｂ細胞腫瘍には、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むＣＤ２０陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞性中心細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；線毛細胞白血病が含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用する「非ホジキンリンパ腫」又は「ＮＨＬ」という用語は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系の癌を意味する。通常、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫とは、ホジキンリンパ腫にはリードシュテルンベルク細胞が存在し、非ホジキンリンパ腫には前記細胞が不在であることにより区別することができる。本明細書で使用する用語に含まれる非ホジキンリンパ腫の例は、従来技術に既知の分類方式、例えばColor Atlas of Clinical Hematology第３版; A. Victor Hoffbrand及びJohn E. Pettit(編)(Harcourt Publishers Limited 2000)に記載の改訂版European-American Lymphoma (REAL)方式に従って当業者(腫瘍学者または病理学者)によって認識されるあらゆるものを含む。特に図11.57、11.58及び11.59参照。より具体的な例としては、限定するものではないが、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、前線低悪性度ＮＨＬ、第III／IV期ＮＨＬ、化学療法に抵抗性のＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病及び／又はリンパ腫、小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病及び／又は前リンパ球性白血病及び／又は小リンパ球リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、免疫細胞腫(immunocytoma)及び／又はリンパ形質細胞性リンパ腫、周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、脾周辺帯リンパ腫、結節外周辺帯−ＭＡＬＴリンパ腫、結節周辺帯リンパ腫、有毛細胞白血病、プラズマ細胞腫及び／又は形質細胞骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞性中心リンパ腫(濾胞性)、中悪性度拡散性ＮＨＬ、広汎性大Ｂ細胞リンパ腫、高悪性度ＮＨＬ(高悪性度前線ＮＨＬ及び高悪性度再発性ＮＨＬを含む)、自己幹細胞移植後の又は自己肝細胞移植に抵抗性のＮＨＬ再発、原発性縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、原発性浸出リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度非切断小細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体(末梢性)大顆粒リンパ球性白血病、菌状息肉腫及び／又はセザリー症候群、皮膚(皮膚性)リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管動原体リンパ腫が挙げられる。
【０１０３】
無痛性リンパ腫は増殖が遅い難病であり、その平均患者生存率は多くの寛解期と再発期を繰り返しながら６〜１０年である。一実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体又はその機能的断片を、無痛性ＮＨＬを治療するために用いる。
本ヒト化２Ｈ７抗体又はその機能的断片は、例えば再発性又は抵抗性の低悪性度又は濾胞性の、ＣＤ２０陽性のＢ細胞ＮＨＬの単剤療法として有用であるか、多薬剤投与計画において多剤と組み合わせて患者に投与することができる。
具体的な実施態様では、ヒト化ＣＤ２０結合抗体及びその機能的な断片を用いて、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)、小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)及び慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)を治療する。
【０１０４】
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、アトピー、例としてアトピー性疾患、例えば花粉症及びジョブ症候群、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状及び応答、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、外因性の抗原、例えば妊娠中の胎児のＡＢＯ血液型に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス��炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、輸血後紫斑病(ＰＴＰ)、ヘパリン誘導性血小板減少症、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系��経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病及び慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、間質性肺線維症、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性又は慢性)、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗精子抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ
症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
【０１０５】
具体的な実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体及びその機能的な断片を用いて、関節リウマチ及び若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、例えばループス腎炎、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、ＡＮＣＡ関連血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群、視神経脊髄炎(ＮＭＯ)及び糸球体腎炎を治療する。
【０１０６】
「治療すること」または「処置」または「寛解」は、治療的処置を表し、この目的は標的とした病態または疾患を治癒しない場合に衰退(減少)させる、又は症状の再発を予防することである。本発明の方法に従って本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量を投与した後、患者のＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍または自己免疫性疾患がうまく「治療」されれば、患者は特定の疾患の一またはそれ以上の兆候および症状が明らかにおよび／または測定可能な程度に減少または消失する。例えば、癌では、癌細胞数の有意な減少または癌細胞の消失；腫瘍の大きさの減少；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止)；ある程度の腫瘍成長の阻害；緩解期の延長、および／または特定の癌が関与する一またはそれ以上の症状のある程度の除去；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善がある。疾患の兆候または症状の減弱は患者が感じ得るものである。癌のすべての兆候の消失を定義するならば、腫瘍の大きさが好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上減少すると、処置が完全な反応または部分的な反応を達成し得たことになる。患者が疾患の安定を体験するならば、患者も治療されたと考える。好ましい実施態様では、本発明の抗体による治療は、治療後４か月、好ましくは６か月、より好ましくは１年、さらにより好ましくは２年又は２年以上に癌患者に癌の進行がないほどに有効である。疾患の改善および治療の成功を評価するこれらのパラメーターは医師などの適切な当業者に知られた常法によって容易に測定可能である。
【０１０７】
「治療的有効量」という用語は、対象物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体または薬剤の量を指す。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は癌に関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。「治療する」の定義を参照。自己免疫性疾患の場合、治療的有効量の抗体又は他の薬剤は、疾患の徴候及び症状が軽減する低度に有効である。
【０１０８】
腫瘍治療の効果又は成功を評価するパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の軽減を求めるであろう。パラメータには、疾患増悪の中央値、寛解期間及び安定期間が含まれうる。
次の文献は、リンパ腫及びＣＬＬ、それらの診断、治療、及び治療効果を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1998；van Besien K及びCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 70章, pp 1293-1338, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000；及びRai, K及びPatel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, 72章, pp1350-1362, Hematology, Basic Principles and Practice, 3版 Hoffman 等(編者) Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫又は自己免疫関連疾患の治療の効果又は成功を評価するためのパラメータは適切な疾患に技量のある医師には知られているであろう。一般に、技量のある医師は特定の疾患の徴候や症状の減退を求めるであろう。以下は例として挙げる。
【０１０９】
一実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体及び具体的なｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１及びその機能的断片を用いて関節リウマチを治療する。
ＲＡは、二百万を超える米国人が罹っており患者の日常の活動を妨げる消耗性自己免疫疾患である。ＲＡは身体自体の免疫系が不適切に関節組織を攻撃し健康な組織を破壊する慢性的な炎症を引き起こし関節内に損傷を生じる。症状には関節の炎症、腫れ、凝り、及び疼痛が含まれる。また、ＲＡは全身性の疾患であるので、肺、眼及び骨髄のような他の組織に影響を持ちうる。知られている治療法はない。治療には、様々なステロイド系及び非ステロイド系薬剤、免疫抑制剤、疾患修飾性抗リウマチ薬(ＤＭＡＲＤ)、及び生物製剤が含まれる。しかしながら、多くの患者は治療に対して不十分な応答性のままである。
【０１１０】
抗体は初期ＲＡ(つまり、メトトレキセート(ＭＴＸ)を受けたことがない)の患者において第一選択治療薬として、また単剤療法として、あるいは例えばＭＴＸ又はシクロホスファミドとの併用で、使用することができる。あるいは、抗体は、ＤＭＡＲＤ及び／又はＭＴＸに不応性の患者に対する二次療法として、また単剤療法あるいは例えばＭＴＸとの併用で、使用することができる。ヒト化ＣＤ２０結合抗体は、関節損傷の予防及び管理、構造損傷の遅延化、ＲＡの炎症に伴う疼痛の軽減、及び中程度から重篤なＲＡの症状及び徴候の低減一般に有用である。ＲＡ患者は、ＲＡの治療に使用される他の薬剤(以下の併用療法を参照)での治療に先立って、その治療後に、又はその治療と併せて、ヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療することができる。一実施態様では、疾患修飾性抗リウマチ薬での治療が過去に失敗したか、及び／又はメトトレキセート単独に対しては不十分な応答であった患者が、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療される。この治療の一実施態様では、患者は、ヒト化ＣＤ２０結合抗体を単独で投与(１日目と１５日目に１ｇの静脈内注入)；ＣＤ２０結合抗体＋シクロホスファミド投与(３日目と１７日目に７５０ｍｇの静脈内注入)；又はＣＤ２０結合抗体＋メトトレキセート投与を受ける１７日の治療計画で治療される。
【０１１１】
ＲＡの治療効果を評価する一方法は、American College of Rheumatology (ＡＣＲ)基準に基づくものであり、これはとりわけ圧痛及び腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療(例えば、治療前のベースライン)又はプラセボ治療と比較して例えばＡＣＲ２０(２０パーセントの改善)でスコア付けをすることができる。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例えば骨の侵食及び関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられるSharpＸ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中又は治療後の時間期間においてHealth Assessment Questionnaire [ＨＡＱ]スコア、ＡＩＭＳスコア、ＳＦ-３６に基づいて能力障害の予防又は改善について評価をすることができる。ＡＣＲ２０基準は、圧痛(痛み)関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、かつ５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含みうる。
１．視覚的アナログ尺度(ＶＡＳ)による患者の疼痛評価
２．疾患活動性の患者の全体評価(ＶＡＳ)
３．疾患活動性の医師の全体評価(ＶＡＳ)
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、及び
５．急性反応物質、ＣＲＰ又はＥＳＲ
ＡＣＲ５０及び７０も同様に定義される。好ましくは少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、更により好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量の本発明のＣＤ２０結合抗体を患者に投与する。
【０１１２】
乾癬性関節炎は独特で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の場合、関節侵食及び関節腔狭小化も同様にシャープ(Sharp)スコアにより評価しうる。本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体は関節損傷の予防並びに疾患の徴候及び疾病の症状の減弱に用いることができる。
本発明の更に他の態様は、本発明の治療的有効量のヒト化ＣＤ２０結合抗体が、ＳＬＥ又はループス腎炎に罹患している患者に投与されることによるＳＬＥ又はループス腎炎の治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアは疾患活動性の数値的定量化を付与する。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床及び治験パラメータの荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk及びJohn Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照のこと。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は腎性発赤及び他のループスの症状を引き起こすと考えられている。抗体治療を受けている患者を、血清クレアチニン、尿タンパク、又は尿中の血液の有意で再現可能な増加として定義される腎性発赤までの時間についてモニターすることができる。あるいは又は加えて、抗核抗体及び二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルについて患者をモニターできる。ＳＬＥの治療は高用量のコルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド(ＨＤＣＣ)を含む。
【０１１３】
脊椎関節症は一群の関節疾患であり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者及び医師の全体的評価測定ツールによって決定しうる。
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価(ＰＧＡ)変化、及び乾癬領域及び重症度指数(ＰＡＳＩ)スコア、乾癬症状評価(ＰＳＡ)を含む臨床兆候及び疾患の症状の変化をモニターし、ベースライン症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的アナログ尺度で処置を通して定期的に、ｈｕ２Ｈ７.５１１などの本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体で治療された乾癬患者を測定することができる。
患者はその治療抗体の最初の注入で注入反応又は注入関連症状を経験する場合がある。これらの症状の重症度はまちまちで、一般に医学的介入で改善することが可能である。これらの症状には、限定されるものではないが、インフルエンザに似た発熱、悪寒／寒気、吐き気、掻痒、頭痛、気管支痙攣、血管性浮腫が含まれる。本発明の疾患治療法が注入反応を最小にすることが望ましい。そのような副作用を軽減又は最小にするために、患者には、抗体の初期順化又は寛容化用量の後に治療的に有効な用量が投与されうる。順化用量は治療的に有効な用量よりも少なく、患者をより多い用量に耐えるように順化させる。
【０１１４】
用量
治療される徴候及び当分野の技量のある医師が理解する投薬に関連する因子に応じて、本発明の抗体は、毒素及び副作用を最小化する一方で、その徴候の治療に効果のある用量で投与される。所望の用量は、疾患及び疾患の重症度、疾患の段階、望ましいＢ細胞調節のレベル、及び当分野の技量のある医師に知られる他の因子に依存しうる。
自己免疫疾患の治療の場合、個々の患者の疾患及び／又は症状の重症度に応じて、ヒト化２Ｈ７抗体の用量を調節することによってＢ細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。Ｂ細胞の枯渇は完全でなければならないものではない。あるいは、全Ｂ細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみを達成するように用量を調節してもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％であり、すなわち治療前のベースライン値と比較して８０％以下のＣＤ２０陽性Ｂ細胞が残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上である。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾患の進行を停止させるのに、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解するのに、更により好ましくは疾患を治癒するのに、十分である。
【０１１５】
ジェネンテック及びバイオジェン・アイデックの臨床試験では、１０ｍｇの少なさから１ｇの用量までの範囲の抗ＣＤ２０(ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６及びリツキシマブ)の用量を使用して自己免疫疾患の治療効果が評価された(リツキシマブ研究に関する発明の背景の項目；及び国際公開公報04/056312の実施例１６を参照)。一般に、約２週間の間隔をあけて２用量の抗体をこれらの臨床試験において投与した。臨床試験で治験した治療計画の例は、関節リウマチではヒト化ＣＤ２０抗体２Ｈ７.ｖ１６に対して、２×１０ｍｇ(つまり１用量当たり１０ｍｇで２用量；７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜１０．１ｍｇ／ｍ２の全用量)、２×５０ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して５５ｍｇ／ｍ２の全用量)、２×２００ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して２２０ｍｇ／ｍ２の全用量)、２×５００ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜５５０ｍｇ／ｍ２の全用量)及び２×１０００ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して１１００ｍｇ／ｍ２の全用量)であり；リツキサンに対して、２×５００ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜５５０ｍｇ／ｍ２の全用量)、２×１０００ｍｇ(７０ｋｇ、身長６７インチの患者に対して〜１１００ｍｇ／ｍ２の全用量)である。これらの用量のそれぞれにおいて、抗体の最初の用量の投与後に循環Ｂリンパ球の実質的な枯渇が観察された。
【０１１６】
自己免疫疾患を治療し、自己免疫疾患に罹っている患者のＢ細胞を枯渇させる方法では、一実施態様では、０．１ｍｇから１０００ｍｇの範囲の一定(フラット)な用量でヒト化２Ｈ７.５１１抗体が患者に投与される。我々は、３００ｍｇ未満の一定用量、また１０ｍｇの用量でさえ、大幅なＢ細胞枯渇が達成されることを見出した。よって、異なる実施態様の本Ｂ細胞枯渇及び治療方法では、ｈｕ２Ｈ７.５１１抗体は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、又は２５０ｍｇの投薬量で投与される。例えば２０ｍｇ、１０ｍｇ又はそれ以下の低い用量は部分的な又は短期間のＢ細胞枯渇が目的である場合に使用することができる。
ＣＤ２０陽性癌の治療の場合、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞の枯渇を最大限にすることが望まれうる。よって、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療の場合、Ｂ細胞を十分枯渇して、例えば腫瘍の成長(大きさ)、癌性細胞タイプの増殖、転移、特定の癌の他の徴候や症状をモニターすることによって技量のある医師によって評価され得る疾患の進行を少なくとも防ぐことが望まれる。好ましくは、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、更により好ましくは４か月、より好ましくは５か月、更により好ましくは６か月以上の間、疾患の進行を防ぐのに十分な程度である。更により好ましい実施態様では、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、更により好ましくは５年以上緩解の時間を増やすのに十分な程度である。最も好ましい実施態様では、Ｂ細胞枯渇は十分に疾患を治癒する。好ましい実施態様では、癌患者のＢ細胞の枯渇は、治療の前の基本の値の少なくとも約７５％、及びより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％及び更に１００％である。
【０１１７】
ＮＨＬの治療の治験におけるｖ１６及びｖ５１１を含むｈｕ２Ｈ７抗体の用量及び投薬計画の例は、下記の実験的実施例１８−２０に記載する。
また、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０ｍｇ／用量のｍｇ／用量の用量が、ＮＨＬなどのＢ細胞悪性腫瘍の維持療法に用いられうる。
投薬の頻度はいくつかの因子に従って変化しうる。患者は、ヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体を少なくとも２用量で投与される。異なる実施態様では、２−４、２−８用量、２−１０用量が投与されうる。一般的に、２用量は、１か月以内、一般に１、２又は３週空けて投与される。疾患又は再発の改善のレベルに応じて、更なる用量が、疾患過程を通じて、又は疾患維持療法として投与されうる。
一又は複数の現行の治療法について十分に効果を示さない、耐性に乏しい又は禁忌を示す、自己免疫性疾患又はＢ細胞悪性腫瘍を有する患者は、本発明の何れかの投薬計画を用いて治療されうる。例えば、本発明は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)インヒビター治療に、または、疾患を修飾している抗リウマチ剤(ＤＭＡＲＤ)治療に不十分な応答を有したＲＡ患者のための本治療方法を意図する。
他の実施態様では、２００ｍｇ／用量以下の低用量治療は維持療法において有用である。
一実施態様では、本用量及び投薬計画は関節リウマチ(ＲＡ)を治療する際に使われる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【０１１８】
投与経路
ヒト化２Ｈ７抗体は既知の方法で、例えば静脈内投与、例えばボーラス又は一定期間の連続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、又は吸入経路で、一般的には静脈内又は皮下投与で、ヒト患者に投与される。
ある実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は、注入溶媒として０．９％の塩化ナトリウム溶液を用いて静脈内注入によって投与される。
他の実施態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は皮下注入により投与される。
【０１１９】
併用療法
上述のＢ細胞腫瘍の治療では、患者を、一又は複数の治療剤、例えば多剤併用療法の化学療法剤での治療と併せて本発明のヒト化２Ｈ７抗体で治療することができる。ヒト化２Ｈ７抗体は、化学療法剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性後に、投与することができる。リンパ腫の治療に対する標準的な化学療法には、シクロホスファミド、シタラビン、メルファラン及びミトキサントロン＋メルファランが含まれうる。ＣＨＯＰは非ホジキンリンパ腫の治療に対する最も一般的な化学療法の一つである。次のものはＣＨＯＰ療法で用いられる薬剤である：シクロホスファミド(商品名シトキサン、ネオザール(neosar))；アドリアマイシン(ドキソルビシン／ヒドロキシドキソルビシン)；ビンクリスチン(オンコビン)；及びプレドニゾロン(しばしばデルタゾン又はオラゾン(Orasone)と呼ばれる)。特定の実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、次の化学療法剤：ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの一又は複数と併用して、それを必要とする患者に投与される。特定の実施態様では、リンパ腫(例えば非ホジキンリンパ腫)の患者はＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化２Ｈ７抗体で治療される。他の実施態様では、癌患者がＣＶＰ(シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾロン)化学療法と併用して本発明のヒト化２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体で治療されうる。具体的な実施態様では、ＣＤ２０陽性ＮＨＬの患者はＣＶＰと組み合わせてヒト化２Ｈ７.ｖ５１１が投与される。ＣＬＬの治療の具体的な実施態様では、２Ｈ７.ｖ５１１抗体が、フルダラビン及びシトキサンの一又は双方での化学療法と併用して投与される。
【０１２０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシトキサン(CYTOXAN)(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；ＴＬＫ２８６(TELCYTATM)；アセトゲニン類(特にブラタシン及びブラタシノン(bullatacinone))；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、マリノール(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン類；ベツリン酸；カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトセシン、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトセシン)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン(podophyllinic)酸；テニポシド；クリプトフィシン類(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；デュオカルマイシン(合成アナログＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１；エレウテロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン；サルコジクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア類(nitrosureas)；クロドロネートなどのビスホスホネート類；抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質(例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγＩＩ及びカリケアマイシンωＩＩ(例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)及びアントラサイクリン類、例えばアナマイシン(annamycin)、ＡＤ３２、アルカルビシン、ダウノルビシン、デキストラゾキサン(dextrazoxane)、ＤＸ-５２-１、エピルビシン、ＧＰＸ-１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ダイネミシンＡを含むダイネミシン、エスペラマイシン、ネオカルチノスタチン発色団及び関連色素蛋白エンジイン抗生物質発光団、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン類(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、アドリアマイシン(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エソルビシン(esorubicin)、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、及びゾルビシン(zorubicin)；デノプテリン(denopterin)、プテロプテリン(pteropterin)、及びトリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸アナログ；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンのようなプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジンアナログ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタンのような抗副腎剤；ホリニン酸(ロイコボリン)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；抗葉酸抗腫瘍剤、例えばＡＬＩＭＴＡ(登録商標)、ＬＹ２３１５１４ペメトレキセド、ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート、代謝拮抗物質、例えば５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)及びそのプロドラッグ、例えばＵＦＴ、Ｓ-１及びカペシタビン、及びチミジル酸シンターゼインヒビター及びグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼインヒビター、例えばラルチトレキセド(raltitrexed)(TOMUDEXRM、TDX)；ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのインヒビター、例えばエニルウラシル(eniluracil)；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)
；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類及びタキサン類、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルの無クレモホア(Cremophor)アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びタキソテール(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナアナログ又はプラチナ系アナログ；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；ビンカアルカロイド；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロネート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド類；上述したものの何れかの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに上記のものの二以上の組合せ、例えばＣＨＯＰで、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の省略形、及びＦＯＬＦＯＸで、５-ＦＵ及びロイコボリンと併用したオキサリプラチン(ELOXATINTM)での治療方法の省略形が含まれる。
【０１２１】
この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(登録商標)トレミフェンを含む抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節因子(ＳＥＲＭ)；例えば、４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストール酢酸、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン(exemestane)、フォルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールなどの、副腎のエストロゲン産物を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター；及び抗アンドロゲン類、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；及び上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【０１２２】
上述の自己免疫疾患又は自己免疫関連症状の治療では、患者を、例えば多剤治療法においては、免疫抑制剤のような第二の治療剤と併用して一又は複数のｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１などのｈｕ２Ｈ７抗体で治療することができる。ｈｕ２Ｈ７抗体は、免疫抑制剤と同時に、連続して、又は交互に、あるいは他の治療での非反応性時に、投与することができる。免疫抑制剤は、当該分野で決められたものと同じか又は少ない用量で投与することができる。好適な補助免疫抑制剤は、治療される疾患のタイプ並びに患者の病歴を含む多くの因子に依存する。
【０１２３】
補助療法についてここで用いられる「免疫抑制剤」という用語は、患者の免疫系を抑制し又はマスクするように作用する物質を意味する。そのような薬剤には、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現をダウンレギュレート又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質が含まれる。そのような薬剤の例には、糖質コルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾン及びデキサメタゾン；２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン類(米国特許第４６６５０７７号参照)；アザチオプリン(又はアザチオプリンに対して副作用があるならばシクロホスファミド)；ブロモクリプチン；グルタルアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；抗インターフェロン-γ、-β又は-α抗体を含むサイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト；抗腫瘍壊死因子-α抗体；抗腫瘍壊死因子-β抗体；抗インターロイキン-２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗リンパ球グロブリン；Ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを持つ可溶型ペプチド(１９９０年７月２６日に公開の国際公開第９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシイン(rapamycin)；Ｔ細胞レセプター(米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；及び国際公開第９１／０１１３３号)；及びＴ１０Ｂ９等のＴ細胞レセプター抗体(欧州特許出願公開第３４０１０９号)を含む。
【０１２４】
関節リウマチの治療では、患者を、次の薬剤のいずれか一又は複数と組み合わせてｈｕ２Ｈ７抗体で治療することができる：ＤＭＡＲＤＳ(疾患修飾性抗リウマチ薬(例えばメトトレキセート))、ＮＳＡＩ又はＮＳＡＩＤ(非ステロイド系抗炎症薬)、ＨＵＭＲＩＡＴＭ(アダリムマブ；Abbott Laboratories)、ＡＲＡＶＡ(登録商標)(レフルノミド)、ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標)(インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa)、ＥＮＢＲＥＬ(エタネルセプト；Immunex, WA)、ＣＯＸ-２インヒビター。ＲＡに一般的に使用されるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン、サルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ、アザチオプリン、Ｄ-ペニシルアミン、ゴールド(経口)、ゴールド(筋肉内)、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌性プロテインＡ免疫吸着である。アダリムマブは、ＴＮＦαと結合するヒトモノクローナル抗体である。インフリキシマブは、ＴＮＦαと結合するキメラモノクローナル抗体である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に結合されるヒトの７５ｋＤ(ｐ７５)腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。ＲＡの一般的な治療については、例えば“Guidelines for the management of rheumatoid arthritis” Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。特定の実施態様では、ＲＡの患者はメトトレキセート(ＭＴＸ)と併用して本発明のｈｕ２Ｈ７ ＣＤ２０抗体で治療される。ＭＴＸの投薬量の例は、約７．５−２５ｍｇ／ｋｇ／週である。ＭＴＸは経口及び皮下的に投与することができる。
【０１２５】
強直性脊椎炎、乾癬性関節炎及びクローン病の治療では、患者を、例えばレミケード(Remicade)(登録商標)(インフリキシマブ；Centocor Inc., Malvern, Pa.)、エンブレル(ENBREL)(エタネルセプト；Immunex, WA)と併用して本発明のＣＤ２０結合抗体で治療する。
ＳＬＥの治療は、高用量コルチコステロイド及び／又はシクロホスファミド(ＨＤＣＣ)を含む。
乾癬の治療では、患者には、局所治療剤、例えば局所ステロイド類、アントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾール、及びタザロテンと併用して、あるいはメトトレキセート、レチノイド類、シクロスポリン、ＰＵＶＡ及びＵＶＢ療法と共に、ＣＤ２０結合抗体を投与することができる。一実施態様では、乾癬患者はシクロスポリンと連続して又はそれと同時にＣＤ２０結合抗体で治療される。
毒性を最小にするために、伝統的な全身療法剤は、本投薬量のＣＤ２０結合抗体組成物と共により低用量の併用計画で、又は循環、連続、組合せ、又は間欠的な治療計画で投与することができる。
【０１２６】
製薬的製剤
本発明に従って使用されるｈｕ２Ｈ７ ＣＤ２０結合抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、任意の薬剤的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合して、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で貯蔵するために調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリン類を含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)TM、プルロニクス(PLURONICS)TM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２７】
例示的なｈｕ２Ｈ７抗体製剤は、出典明示によりここに援用される国際公開第９８／５６４１８号に記載されている。他の製剤は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つｈｕ２Ｈ７抗体４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベート２０をｐＨ５．０で含む液体複数回用量製剤である。興味ある他の抗ＣＤ２０抗体製剤は、抗体１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、及び注入用の滅菌水を含み、ｐＨ６．５のものである。更に、他の水性医薬製剤は、ｐＨ約４．８からｐＨ約５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、界面活性剤として約０．０１−０．１％ｖ／ｖ量のポリソルベート、約２−１０％ｗ／ｖ量のトレハロース、及び保存剤としてベンジルアルコールを含む(米国特許第６１７１５８６号)。皮下投与に適合化させた凍結乾燥製剤は国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は適当な希釈剤で高タンパク質濃度に再構成され得、また再構成製剤はここで治療される哺乳動物に皮下投与されうる。
【０１２８】
ヒト化２Ｈ７.ｖ５１１変異体のある製剤は、１０ｍＭ ヒスチジン、６％スクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．８に１２〜１４ｍｇ／ｍＬの抗体を含むものである。ある実施態様では、２Ｈ７変異体及び特に２Ｈ７.ｖ５１１は、１０ｍＭ ヒスチジン硫酸塩、６ｍｇ／ｍｌ スクロース、０．２ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０、及び注入用の滅菌水、ｐＨ５．８に２０ｍｇ／ｍＬの抗体で調製する。
ここでの製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものをまた含みうる。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン又はＴ細胞に結合する抗体、例えばＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞に作用するもの)を更に提供することが望ましい場合がある。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、疾患又は疾病又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量でここに記載された投与経路又はこれまで用いられている用量の約１〜９９％量で用いられる。
【０１２９】
また活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例えば、コロイド状のドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョン中に、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に封入されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
徐放製剤を調製することができる。徐放製剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含むものであり、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号), Ｌ-グルタミン酸及びＬ-グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレンビニル酢酸塩、分解性の乳酸・グリコール酸共重合体、例えばLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸・グリコール酸共重合体及びロイプロリド酢酸塩からなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリＤ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって直ぐに達成できる。
【０１３０】
製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び関連症状及び非ホジキンリンパ腫などのＣＤ２０陽性癌の治療に有用な物質を含有する製造品である。この製造品は容器と容器に付与又は添付されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のｈｕ２Ｈ７、例えばｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与する際の注意書きをさらに含む。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が非ホジキンリンパ腫を治療するために用いられることを示す。
【０１３１】
製造品はさらに、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
種々の目的、例えばＢ細胞殺傷アッセイ、アポトーシスアッセイのポジティブコントロールとして、細胞からのＣＤ２０の精製又は免疫沈降に有用なキットも提供される。ＣＤ２０の単離及び精製において、キットはビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１抗体を含むことが可能である。インビトロにおけるＣＤ２０の検出及び定量化、例えばＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットのための抗体を含むキットを提供することもできる。製造品と同様、キットも容器と容器に付与又は添付されるラベル又は能書を含んでなる。容器には少なくとも１つの本発明の抗ＣＤ２０抗体を含有する組成物が収容されている。希釈液及びバッファー、コントロール抗体等を収容する付加的な容器を具備していてもよい。ラベル又はパッケージ挿入物(能書)は、組成物についての記載、並びに意図するインビトロ又は診断での使用に関する注意書きを提供するものである。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
既存の細胞株の低フコシル化細胞株への変換
ＣＨＯ細胞において非フコシル化抗体の収率を高めるために、ＲＮＡｉ手法を行い、ＦＵＴ８遺伝子の発現をノックダウンした。Ambion, Inc. (Austin, TX)から市販のpSilencer 3.1-H1-Puroプラスミドを用いて、短いスペーサー(９ｎｔヘアピンループ)によってその逆方向の相補的なアンチセンスｓｉＲＮＡ配列、その後の３'末端に５-６Ｕ'を連結した、ＦＵＴ８の遺伝子に特異的な１９ｎｔ(ヌクレオチド)センスｓｉＲＮＡ配列からなる短いヘアピンｓｉＲＮＡを生成した(図３)。ＣＨＯ ＦＵＴ８遺伝子を標的とするようにｓｉＲＮＡプローブを設定するために用いた方法はElbashir等(2002)に記載されている。５つの異なるｓｉＲＮＡプローブは、有用なＣＨＯ ＦＵＴ８ＤＮＡ配列に基づいて、異なる領域を標的とするように設定した(図４)(プローブ＃１−５)。プローブ１(配列番号.３及び配列番号.４)；プローブ２(配列番号.５及び配列番号.６)；プローブ３(配列番号.７及び配列番号.３７)；プローブ４(配列番号.３８及び配列番号.３９)；プローブ５(配列番号.４０及び配列番号.４１)。アンチセンス配列及び５-６Ｕ'にスペーサによって連結される１９ｎｔセンス配列からなるｓｉＲＮＡコード配列は、プローブ＃２の配列番号.４２(配列番号５の位置７〜５９)とプローブ＃４の配列番号.４３である。プローブ１−５は、図５ＢのＲＮＡｉ１−５に対応する。５つのｓｉＲＮＡプローブは、pSilencer 3.1-H1-Puroプラスミドに独立してクローニングされたアニールした合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。
【０１３３】
これらのＲＮＡｉプローブの有効性を試験するために、ＦＬＡＧタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質を、Genbank(受託番号 Ｐ＿ＡＡＣ６３８９１)のＣＨＯ ＦＵＴ８の部分的なＤＮＡ配列を用いて構築した。ＣＨＯ細胞から精製した総ＲＮＡ及びＦＵＴ８プライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)によってＦＵＴ８コード配列の３'の０．９８ｋｂの断片をクローニングし、結果として生じたＰＣＲ断片を５'ＦＬＡＧタグ配列と融合させた。８アミノ酸Ｆｌａｇタグ(metAspTyrLysAspAspAspAspLys−配列番号.  )を単離した部分的なｃＤＮＡ配列の５'末端に付加した。タグ付加ＦＵＴ８断片を発現ベクターにクローニングした。ＲＮＡｉプローブプラスミド及びｆｌａｇ-タグ付加ＦＵＴ８プラスミドをＣＨＯ細胞に同時形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞溶解物を抽出して、ＦＵＴ８融合タンパク質レベルをイムノブロッティングによる抗ｆｌａｇＭ２抗体(Sigma, MO)によって分析した。ＲＮＡｉプローブの存在下では、５例のうち４例で融合タンパク質発現が有意に阻害された(図５)。
ＦＵＴ８転写物を切断するこれらのプローブの能力は、Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８プラスミドとともに各々のｓｉＲＮＡ発現プラスミドをＣＨＯ細胞に一過性に同時形質移入して試験した。形質移入の２４時間後に細胞を溶解して、細胞溶解物を抗ＦｌａｇＭ２抗体(Sigma, MO)によるウェスタンブロットによって分析した。
Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質はＲＮＡｉ１(プローブ１)が標的とする配列を含有しないので、ＲＮＡｉ１(プローブ１)形質移入細胞は、予想通り、Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８産物の強力な発現を示した(図５Ａ、５Ｂ)。それに対して、５つすべてに対してｓｉＲＮＡプローブ２(ＲＮＡｉ２)は、ＦＬＡＧタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質発現に対して様々な程度の阻害性効果を有する(図５Ｂ)。プローブ＃２及び＃４は最も高い阻害性効果を示し、更なる評価のために選択した。
【０１３４】
実施例２
一過性ｓｉＲＮＡ発現によって操作された安定して発現される抗体のフコース含量
ＲＮＡｉ２及びＲＮＡｉ４プラスミドを、ヒト化抗ＣＤ２０抗体である２Ｈ７.ｖ１６(クローン＃６０)を発現する既に樹立された安定性ＣＨＯ細胞株に、一過性に形質移入した。次いで、形質移入細胞を、抗体産生のために無血清培地を含む２５０ｍｌのスピナー管に別々に播種した。
回収した細胞培養液中の発現されて分泌された２Ｈ７.ｖ１６抗体をプロテインＡカラムによって精製し、Papac等, 1998に記載のように、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法(ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ)によってＮ-結合オリゴ糖を、フコース含量について分析した。また、抗体はＦｃγＲ結合アッセイ(下記)にてアッセイした。ヒトＦｃγレセプターには３つのグループがある：ＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIII。これらの一部は、異なるレセプター性質を有するアロタイプを生成する機能的対立形質の染色体多型を有する(Dijstelbloem等, 1999；Lehrnbecher等, 1999)。ＦｃγＲIII(Ｆ１５８)は、位置１５８にフェニルアラニンを有し、位置１５８にバリンを有するＦｃγＲIII(Ｖ１５８)よりヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する結合親和性が低い(Shields等, 2001及び2002)。
【０１３５】
ＲＮＡｉ一過性形質移入細胞は、図６に示すようにおよそ３５〜３７％の非フコシル化２Ｈ７抗体を生産した。標準的なＣＨＯ細胞から生成された抗体を代表するレベルであるおよそ２〜４％の非フコシル化抗体を有する２Ｈ７コントロール細胞株(無関係なＲＮＡｉプラスミドを形質移入したもの)と比較して、３５％〜３７％の非フコシル化を有する２Ｈ７抗体プールは、ＦｃγＲIII(Ｆ１５８対立遺伝子)及びＦｃγＲIII(Ｖ１５８対立遺伝子)に対して結合親和性がそれぞれ６倍及び４倍に増加していた(図７Ｄ、７Ｅ)。他のＦｃレセプターでは効果は見られなかった(例えば、ＦｃγＲ１及びＦｃγＲII、図７Ａ、７Ｂ、７Ｃを参照のこと)。ガラクトースなし(Ｇ０)、ガラクトース１つ(Ｇ１)及びガラクトース２つ(Ｇ２)を有する構造を比較した場合、ＲＮＡｉプラスミド形質移入細胞及びｍｏｃｋ-形質移入細胞から産生される抗体から単離したグリカンはガラクトース含量の分布が同じであった。これらのデータから、安定産生細胞株から分泌される抗体のフコース含量は一過性のＲＮＡｉプラスミド形質移入によって減少しうること、及びこの効果はＧ０、Ｇ１及びＧ２の分布を含む他の主要なグリカン組成物を変えないことが示された。
ＲＮＡｉ形質移入細胞でのＦＵＴ８ ＲＮＡ発現が実際に低いことを確認するために、形質移入の２４時間後に形質移入細胞から抽出したＲＮＡ試料を用いてノーザンブロットを行った。コントロールプラスミド(ランダムなマウスＤＮＡ配列、公知のマウスタンパク質のいずれにも相同性がない)を含有する細胞からの総ＲＮＡと２つのＲＮＡｉプラスミドを精製して、３００ｂｐプローブとハイブリダイズさせた。図８に示すように、ｍＲＮＡレベルは、２つのＲＮＡｉ形質移入細胞においてノックダウンされていた(レーン２及び３)。これは、２つのＲＮＡｉプラスミド形質移入細胞において低いＦＵＴ８タンパク質量が検出されたイムノブロットと一致する。ＣＨＯ ＦＵＴ８ ｍＲＮＡのサイズは、ラット細胞のｍＲＮＡと同じであり、およそ３．５ｋｂである。さらに、内在性α１,６-フコシル基転移酵素ＲＮＡのノックダウンは定量的ＰＣＲによって確認した(データは示さない)。
【０１３６】
ＲＮＡｉ２及びＲＮＡｉ４のコンストラクトはともに内在性ＦＵＴ８遺伝子ＲＮＡレベルを効率的にノックダウンすることができるので、ＲＮＡｉ４プラスミドのみを選択して更なる安定形質移入に用いた。６００ｎＭのメトトレキセート(ＭＴＸ)耐性であって、バイオリアクター内で１．５ｇ／Ｌ以上を生産する抗体細胞株クローン６０にＲＮＡｉ４コンストラクトを安定して形質移入して、５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンによって選択した。このコンストラクトは、pSilencerプラスミドからピューロマイシン遺伝子が除去され、ＳＶ４０プロモーターの制御下にハイグロマイシンが置換されている。ポジティブクローンは９６ウェル組織培養プレートにピックアップし、内在性ＦＵＴ８ ｍＲＮＡレベルについてＴａｑｍａｎにてスクリーニングした。異なるレベルのＦＵＴ８ ｍＲＮＡ減少示す４つのクローンをスケールアップして、２５０ｍｌのスピナー中で抗体を生産させた。ＨＣＣＦの抗体をプロテインＡ精製して、フコース含量アッセイ及びＦｃγＲIII結合アッセイのために用いた。図７Ａ−Ｅの結果から、試験したＦｃγレセプターの中で、ＦｃγＲIII結合のみがフコース含量が低い抗体に影響を受けたことが示された。したがって、安定形質移入からの抗体産物はＦｃγＲIII結合アッセイのみに用いた。
【０１３７】
フコース含量の分析から、４つの細胞株が４５〜７０％ないしは８０％の範囲の非フコシル化抗体を産生したことが示された。５つの異なるレベルのフコシル化を含有する抗体を、ＦｃγＲIIIに対する結合についてアッセイした。表１に示すようにＦｃγＲIII結合アッセイから、ＦｃγＲIII(Ｖ１５８)より低親和性ＦｃγＲIII(Ｆ１５８)によってより改善されたことが示された。倍数的な増加を各々の抗体試料中の非フコシル化物質の割合の二乗に対してプロットすると、両方のＦｃγＲIII変異体について比例関係が見られた。インタクトなヒトＩｇＧ１は２つの重鎖を含んでなり、それぞれ、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ-グリコシル化部位を有する。したがって、コア炭水化物構造のフコース占有率に関してＦｃに３つの可能性がある。１つの重鎖はフコシル化されているが他方はされていない；両方の重鎖がフコシル化されている；又は、どちらの重鎖もフコシル化されていない。ＦｃγＲIIIに対する親和性の倍数的な増加と非フコシル化グリカンの割合の二乗の間の比例関係から、この場合、どちらの重鎖もフコシル化されていない抗体分子がＦｃγＲIII結合親和性の増加の向上に重大に関与しうることが示唆される。
【０１３８】
２つの安定形質移入クローンによる抗体産生のバイオリアクターへの更なるスケールアップでは、フコース含量の分析から、フコシル化レベルは７９日の試験期間にわたっておよそ８０％の非フコシル化で安定したままであったことが示された。また、抗体価並びに抗体グリカンの％Ｇ０、Ｇ１及びＧ２はバイオリアクター実行の終了時に予想される範囲内であった。したがって、樹立されたタンパク質産生細胞株、この場合では抗体産生細胞株へのＲＮＡｉプラスミドの形質移入は、非フコシル化された炭水化物の量を制御した治療用抗体の商業的な量を生産する宿主細胞を生成するために用いることができる１つの手法である。
表１  異なるフコース含量の抗体によるＦｃγＲIII結合親和性
2008541770.tif 000019
【０１３９】
実施例３
この実施例では、我々は、ＦＵＴ８遺伝子の２つの異なる領域を標的とする２つのＲＮＡｉ転写ユニットを含有する新規のバージョンのＲＮＡｉプラスミドを構築した。このプラスミドは、遺伝子の１つの領域のみを標的とする既存のバージョンより強力であった。
【０１４０】
実施例４
フコース含量を同時代謝的に操作した(フコシル化レベルのノックダウン)新規の安定細胞株の生成
材料及び方法
細胞培養及び形質移入 
チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を、５％ ＦＢＳ(ウシ胎児血清)及び１×ＧＨＴ(グリシン、ヒポキサンチン及びチミジン)を有する増殖培養液中で３７℃で生育した。一過性の形質移入のために、ＤＭＲＩＥ-Ｃ形質移入試薬(Invitrogen)を用いた。安定形質移入のために、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いた。
【０１４１】
選別
形質移入の後に、細胞を遠心分離してペレットを回収した。次いでペレットを、２５ｎＭ メトトレキセート(ＭＴＸ)を含有する培地に再懸濁した。培地は３〜４日ごとに交換した。形質移入のおよそ２週間後に、個々のクローンをピックアップし、９６ウェルプレートにて生育した。通常、細胞が９６ウェルプレート中で集密に(コンフルエントに)なるまでにおよそ１週間かかる。
【０１４２】
等量播種密度アッセイ(Equal Seeding Density Assay)
５×１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。その翌日、増殖培地を除去して、生産培地に置き換えた。生産培地を添加した翌日、ＥＬＩＳＡアッセイ前の５〜６日間、３３℃でインキュベートした。
【０１４３】
ＥＬＩＳＡアッセイ
細胞が集密なときに、増殖培地を除去し、生産培地を各々のウェルに添加した。生産培地を添加した翌日、ＥＬＩＳＡアッセイ前の５〜６日間、３３℃でインキュベートした。一般的に、ＥＬＩＳＡは階段希釈によって行った。
【０１４４】
ＲＮＡ分析
総ＲＮＡをQiagenのＲＮＡ精製キットで精製し、遺伝子特異的なプライマー及びプローブを用いたTaqmanにて定量化した。
【０１４５】
Ｆｃγレセプター結合アッセイ−ＥＬＩＳＡ
MaxiSorp９６ウェルマイクロウェルプレート(Nunc, Roskilde, Denmark)は、５０ｍＭ 炭酸塩バッファ、ｐＨ９．６にて１００μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ 抗-ＧＳＴ(クローン8Ｅ2.1.1、Genentech)にて、４℃で終夜をかけてコートした。プレートは、１５０μｌ／ウェルの、０．０５％ポリソルベートを含有するＰＢＳ(ｐＨ７．４)(洗浄バッファ)にて洗浄し、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ(ｐＨ７．４)にてブロックした。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄バッファにて洗浄した。ヒトＦｃγＲIIIを、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ(ｐＨ７．４)にて０．２５μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。(アッセイバッファ)。プレートを１時間インキュベートして、洗浄バッファにて洗浄した。抗体は、ヤギＦ(ａｂ')２抗κ(Cappel, ICN Pharmaceuticals, Inc., Aurora, Ohio)とともに１:２(w/w)の比で１時間インキュベートして、抗体複合体を形成させた。アッセイバッファ中の複合型ＩｇＧ抗体の１１の２倍階段希釈液(３倍階段希釈では０．８５〜５００００ｎｇ／ｍｌ)をプレートに添加した。２時間のインキュベートの後、プレートを洗浄バッファにて洗浄した。結合したＩｇＧは、アッセイバッファ中１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ標識ヤギＦ(ａｂ')２抗ヒトＩｇＧ Ｆ(ａｂ')２(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を添加することによって検出した。１時間のインキュベートの後、プレートを洗浄バッファにて洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ) (Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加した。１００μｌ／ウェルの１Ｍ リン酸を添加して反応を止めた。吸光度は、マルチスキャンAscent読み取り機(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)にて４５０ｎｍを読み取った。標準曲線の中間点(ｍｉｄ-ＯＤ)の吸光度を算出した。このｍｉｄ-ＯＤでの標準物質及び試料の対応する濃度は、４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)を用いて滴定曲線から決定した。相対的な活性は、標準物質のｍｉｄ-ＯＤ濃度を試料のｍｉｄ-ＯＤ濃度で除して算出した。
【０１４６】
抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)アッセイ
ある一つのＡＤＣＣアッセイ様式は以下の通りである。基本的には乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)情報を用いて記述されるように(Shields等, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001))、２Ｈ７ ＩｇＧ変異体は、ＣＤ２０を発現するリンパ芽球状Ｂ細胞株であるＷＩＬ２-Ｓ細胞のもつナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)細胞溶解を媒介する能力についてアッセイした。ＮＫ細胞は１００ｍＬのヘパリン処理した血液から調製し、１００ｍＬのＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)で希釈し、ＣＤ１６としても知られるＦｃγＲIII(Koene等, Blood 90:1109-1114 (1997))としてアイソタイピングされている正常なヒトドナーから入手した。ＮＫ細胞は、Ｖ１５８又はＦ１５８についてホモ接合のＣＤ１６(Ｆ１５８／Ｖ１５８)についてヘテロ接合であるヒトドナーから入手することができる。希釈した血液は、１５ｍＬのリンパ球分離培地(ICN Biochemical, Aurora, Ohio)に重ね、２０００回転数／分で２０分間遠心分離した。層間の境界の白い細胞を、１５％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地を充填した４つのきれいな５０ｍＬチューブに分配した。チューブを１４００回転数／分で５分間遠心分離して、上清を廃棄した。ペレットをＭＡＣＳバッファ(０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ)に再懸濁して、製造業者のプロトコール(Miltenyi Biotech,)に従ってＮＫ細胞をビーズ(ＮＫ細胞単離キット、130-046-502)を用いて精製した。ＮＫ細胞をＭＡＣＳバッファにて２×１０６細胞／ｍＬにまで希釈した。
【０１４７】
アッセイ培地(グリシンの無いＦ１２／ＤＭＥＭ５０：５０、１ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファｐＨ７．２、ペニシリン／ストレプトマイシン(１００単位／ｍＬ；Gibco)、グルタミン、及び１％の熱不活性化ウシ胎児血清)による抗体の段階希釈液(０．０５ｍＬ)を、９６ウェル丸底組織培養プレートに添加した。ＷＩＬ２-Ｓ細胞は、４×１０５／ｍＬの濃度にアッセイバッファにて希釈した。ＷＩＬ２-Ｓ細胞(１ウェルにつき０．０５ｍＬ)を希釈した抗体と９６ウェルプレート中で混合して、室温で３０分間インキュベートしてＣＤ２０へ抗体を結合させた(オプソニン作用)。
０．１ｍＬのＮＫ細胞を各ウェルに加えてＡＤＣＣ反応を開始した。コントロールウェルでは、２％トリトンＸ-１００を添加した。次いで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。放出されるＬＤＨのレベルは、製造業者の指示に従って、細胞障害性(ＬＤＨ)検出キット(Kit#1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana.)を用いて測定した。０．１ｍＬのＬＤＨ展開剤を各ウェルに添加し、１０秒間混合した。次いで、プレートをアルミニウム箔で覆い、室温、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、４９０ｎｍの光学濃度を読み取り、それを用いてコントロールウェルにおいて測定される総ＬＤＨにて除することによって％細胞溶解を算出した。細胞溶解を抗体濃度の関数としてプロットして、４-パラメーター曲線フィット(KaleidaGraph)を用いてＥＣ５０濃度を測定した。
【０１４８】
アスパラギン結合オリゴ糖のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型(ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ)質量分析法： 
Ｎ-結合オリゴ糖は、Papac等, Glycobiology 8, 445-454 (1998)の手順を用いて組み換え糖タンパク質から放出された。簡単に言えば、９６ウェルのＰＶＤＦの並ぶマイクロタイタプレート(Millipore, Bedford, MA)のウェルを、ミリポアマルチスクリーン真空マニホールドを真空にすることによってＰＤＶＦメンブランに通した１００μｌのメタノールにて調製した。調整したＰＶＤＦメンブランを２５０μｌの水にて３回洗浄した。すべての洗浄工程の間で、マニホールドを緩やかに真空にして完全に廃液した。メンブランは、６Ｍ グアニジン塩酸塩、３６０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．６からなる還元及びカルボキシメチル化バッファ(ＲＣＭ)にて洗浄した。糖タンパク質試料(５０μｇ)を個々のウェルにアプライし、緩やかに真空にして再びＰＶＤＦメンブランに流し、ウェルを５０μｌのＲＣＭバッファにて２回洗浄した。固定した試料は、５０μｌの０．１Ｍ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)溶液を各ウェルに加えて還元し、３７℃で１時間、マイクロタイタプレートをインキュベートした。ＤＴＴを真空にして除去し、ウェルを２５０μｌの水で４回洗浄した。１Ｍ ＮａＯＨにて新たに調製してＲＣＭバッファにて０．１Ｍに希釈した５０μｌの０．１Ｍ ヨード酢酸(ＩＡＡ)溶液を添加して、システイン残基をカルボキシメチル化した。室温、暗所で３０分間インキュベートすることによってカルボキシメチル化を行った。プレートを真空にして、ＩＡＡ溶液を除去し、ウェルを２５０μｌの純水にて４回洗浄した。１００μｌの１％ＰＶＰ３６０(ポリビニルピロリジン３６００００ＭＷ)(Sigma)溶液を添加して、室温で３０分間インキュベートすることによってＰＶＤＦメンブランをブロックした。緩やかに真空にしてＰＶＰ-３６０溶液を除去し、ウェルを２５０μｌの水で４回洗浄した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ(New England Biolabs, Beverly, MA)消化溶液、１０ｍＭ トリスアセテート(ｐＨ８．３)中の２５単位／ｍｌ溶液  ２５μｌを各ウェルに添加して、３７℃で３時間消化を行った。消化後、試料を５００μｌのエッペンドルフチューブへ移し、２．５μｌの１．５Ｍ 酢酸溶液を各試料に添加した。酸性化した試料を室温で２時間インキュベートして、グリコシラミンからヒドロキシル型へオリゴ糖を変換した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析の前に、放出されたオリゴ糖は、小型の反応チューブ(US Biochemical, Cleveland, OH)に充填した泥状物の０．７ｍｌの層の陽イオン交換樹脂(水素型(hydrogen form)でAG50W-X8樹脂)(Bio-Rad, Hercules, CA)を用いて脱塩した。
【０１４９】
陽性モードの試料のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析のために、脱塩したオリゴ糖(０．５μｌ分割量)は、２５％水性エタノール中の１ｍＭ ＮａＣｌ  １ｍｌ中に０．１ｍｇの５-メトキシサリチル酸にて２ｍｇの２,５ジヒドロキシ安息香酸を溶解して調製した、０．５μｌの２,５ジヒドロキシ安息香酸基質(ｓＤＨＢ)を有するステンレスターゲットにアプライした。試料／基質混合物を真空にして乾燥した試料／基質混合物を乾燥して、次いで、分析の前に大気中の水分を吸収させた。放出されたオリゴ糖は、PerSeptive BioSystems Voyager-ELITE質量分析計のＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって分析した。質量分析計は、直線状に配位した２０ｋＶの陽性モードで遅延型抽出を用いて作動させた。およそ１１００のレーザー力を用いて、データ相加モード(２４０スキャン)で雑音に対する信号を改めて、データを得た。計測器は標準物質オリゴ糖の混合物にて較正し、質量が割り当てられる前に、１９ポイントのSavitsky-Golayアルゴリズムを用いてデータを外挿した。Caesar７．２データ分析ソフトウェアパッケージ(SciBridgeソフトウェア)を用いて質量分析データを統合した。
【０１５０】
結果及び考察
先の実施例では、ＲＮＡｉ技術を用いて、２Ｈ７.ｖ１６細胞株においてα-１,６-フコシル基転移酵素(ＦＵＴ８)活性をノックダウンした。ＲＮＡｉは、ＦＵＴ８遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)内の領域を標的とした。この細胞株によって生産される低フコシル化抗体は、高度にフコシル化された抗体よりもＦｃγＲIIIレセプターに対する結合親和性が高く、高いＡＤＣＣ活性を示した。図９Ａは、低フコシル化２Ｈ７.ｖ１６細胞株を増殖させるために用いた方法である。上記の方法は、ＲＮＡｉプラスミド形質移入の前に安定して抗体を産生する細胞株の存在を必要とする二工程の手法である。
この方法のために必要とされる時間を短縮するために、図９Ｂに図示したように、ｓｉＲＮＡユニット(一又は複数)が対象のタンパク質(例えば抗体)を発現する発現プラスミドに包含されている新規の一工程手法が検討された。第一に、抗体発現カセット及びＲＮＡｉ単位(一又は複数)を含有する発現プラスミドを試験して、抗体及びＲＮＡｉが一過性形質移入において同時に発現されるかどうかを検討した。５通りの一過性形質移入したプラスミドの配位を図１０に示す。これら５通りのプラスミドから発現されるタンパク質をフコシル化レベルについてアッセイした。
【０１５１】
下記の表２において、ｖ５１１及びｖ１１４は表３に示すｈｕ２Ｈ７抗体変異体を指す。表２に示すように、ＲＮＡｉユニットを含有していないコントロールプラスミドからの抗体は９％の非フコシル化である。１つのＲＮＡｉユニットを含有するプラスミドから発現される抗体は、３３％から４９％の範囲の非フコシル化である。２つのＲＮＡｉユニットを含有するプラスミドから発現される抗体は、６２％から６５％の範囲の非フコシル化である。これらの結果から、発現プラスミドに２つのＲＮＡｉ転写ユニットが付加していると、発現プラスミドに１つのＲＮＡｉユニットのみを有するものの３３〜４９％と比較して６２〜６５％の高い非フコシル化抗体が産生された。このことから、２つのｓｉＲＮＡｉ転写物の相加効果が示唆される。この実施例において発現される抗体は、ヒト化抗ＣＤ２０抗体２Ｈ７.ｖ５１１(本明細書においてｈｕ２Ｈ７.ｖ５１１とも称する)であり、その配列は前述のＣＤ２０結合抗体の項目に示される。
【０１５２】
表２
2008541770.tif 000020
【０１５３】
細胞に、２つのプラスミド、CMV.PD.v511.RNAi4又はCMV.PD.v511.RNAi2.4(図１０Ｃ)のうちの１つを安定して形質移入し、２５ｎＭメトトレキセート(ＭＴＸ)にて形質移入した細胞を選択した。各々の形質移入から、７２のクローンをピックアップし、抗体発現についてスクリーニングした。発現力価を図１１に示す。CMV.PD.v511.RNAi2.4プラスミド形質移入からのクローンは、その他の２つの形質移入と比較して全体的に力価が低いようであった。
良好な発現力価を有するクローンもまたフコシル化レベルが低いかどうかを検討するために、より高い発現を有するおよそ２０％のクローンをＦＵＴ８ｍＲＮＡ発現についてTaqmanにより分析した図１２に示すように、CMV.PD.v511.RNAi2.4プラスミド形質移入からのクローンは、CMV.PD.v511.RNAi4プラスミド形質移入からのクローンと比較して一般にＦＵＴ８ ｍＲＮＡレベルが低かった。
最も低いＦＵＴ８ ｍＲＮＡ発現レベルを有する６つのクローン、つまりCMV.PD.v511RNAi4プラスミド形質移入からの２つのクローンとCMV.PD.v511.RNAi2.4プラスミド形質移入からの４つのクローンは、等量播種密度アッセイ(equal seeding density assay)を用いて抗体発現についてさらに評価した。図１３に示すように、結果から、これらの６つのクローンの力価はコントロール２Ｈ７ ｖ５１１クローンと同等であることが示された(クローン１８及び６３はCMV.PD.v511プラスミド形質移入からのもの)。しかしながら、CMV.PD.v511.RNAi2.4クローンは、CMV.PD.v511.RNAi4クローン及びコントロールクローンより力価が低いようであった。
【０１５４】
図１４に示す２Ｈ７.ｖ５１１クローンによって生産される抗体のフコース含量は、上記の通りにＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法にて求めた。１つのクローン(ＲＮＡｉ２４-３ｄ)が９４〜９５％の非フコシル化に達したことが明らかとなった。
ＦｃγＲIII結合アッセイは、６５％の非フコシル化(一過性のもの由来)又は９４〜９５％の非フコシル化(最も安定しているクローンＲＮＡｉ２.４-３ｄ由来)のいずれかを含有している抗体２Ｈ７ .ｖ５１１によって行った。結果を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。およそ５％の非フコシル化を有したコントロール抗体プールと比較して、６５％の非フコシル化物質は、高親和性(Ｖ１５８対立遺伝子−図１５Ｂ)及び低親和性(Ｆ１５８対立遺伝子−図１５Ａ)レセプターのそれぞれに対して適度に４．８及び６．２倍の親和性の増加を示した。それに対して、９５％の非フコシル化物質は２つのレセプターアイソタイプに対して６．８及び９．８倍の親和性の増加を示した。
非フコシル化抗体はＦｃγＲIIIにより良好に結合するようであるので、それらのＡＤＣＣ活性について試験した。２Ｈ７.ｖ１６クローン７Ｆから回収した物質(６０〜７０％の非フコシル化の範囲)及び、２Ｈ７.ｖ５１１一過性形質移入から回収した物質(６５％の非フコシル化)をＡＤＣＣ活性アッセイに用いた。図１６Ａ及び１６Ｂに示すように、低フコシル化２Ｈ７の両バージョンは、対応する高フコシル化相対物と比較して、高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０１５５】
ここで、我々は、１−２のｓｉＲＮＡ転写ユニット(一又は複数)とともに抗体重鎖及び軽鎖転写ユニットを同じプラスミド上に組み込むことによってさらにより高い(９５％程度)非フコシル化抗体を産生するための、ＣＨＯ細胞の代謝的操作の新規の簡素化方法を記載した。この手法で用いられる２つのｓｉＲＮＡ転写物はＦＵＴ８遺伝子の異なるコード領域を標的とし、異なるＰｏｌIIIタイププロモーターであるＨ１及びＵ６の対象となる。
要約すると、我々は、ＲＮＡｉ技術をヒト化２Ｈ７細胞株の増殖に組み込んで、フコシル化レベルをノックダウンすることが可能なことを示した。既存の抗体生産細胞株を低フコシル化細胞株に成功裏に変換した。加えて、新規の抗体生産細胞株を生成しつつ同時にフコシル化をノックダウンすることも成功裏に達成した。
【０１５６】
参考文献
特許、公開出願及び他の刊行物を含む本願において引用した文献は出典明示によりここに取り込む。
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【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】フコシル残基が付着したＮ-グリカンのＡｓｎ-結合(Ｎ-結合)ＧｌｃＮａｃ。
【図２】遺伝子発現の阻害を媒介する際のＲＮＡｉ技術の図式。
【図３】ＦＵＴ８特異的ｓｉＲＮＡを作製するために用いられるｐＳｉｌｅｎｃｅｒ3.1-Ｈ1 Ｐｕｒｏプラスミドの図。実施例１を参照のこと。
【図４】ＲＮＡｉプローブ配列。５つの配列は文献で公開された規則に従って設定した。太字の配列は互いに相補的であり、生産されるＲＮＡのヘアピン部分を示す。プローブ１−５は図５ＢのＲＮＡｉ１−５に対応する。実施例１を参照のこと。
【図５】図５Ａは、完全長及びｆｌａｇ-ＦＵＴ８融合コンストラクト並びにプローブ領域の概略図である。図５Ｂは、ｆｌａｇ-タグ化した部分的なＣＨＯ ＦＵＴ８タンパク質を検出するための、Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体を用いたイムノブロットを示す。実施例１を参照のこと。
【図６】実施例２に記載のように、ＲＮＡｉ２及びＲＮＡｉ４を一過性に形質移入した細胞からの２Ｈ７抗体のフコース含量(％非フコシル化として)。
【図７Ａ】実施例２に記載のＦｃγＲIレセプターに対するフコース含量の低い２Ｈ７抗体の結合活性。
【図７Ｂ】実施例２に記載のＦｃγＲIIＡレセプターに対するフコース含量の低い２Ｈ７抗体の結合活性。
【図７Ｃ】実施例２に記載のＦｃγＲIIＢレセプターに対するフコース含量の低い２Ｈ７抗体の結合活性。
【図７Ｄ】実施例２に記載のＦｃγＲIIIＦ158レセプターに対するフコース含量の低い２Ｈ７抗体の結合活性。
【図７Ｅ】実施例２に記載のＦｃγＲIIIＶ158レセプターに対するフコース含量の低い２Ｈ７抗体の結合活性。
【図８】ノーザンブロット分析。ＦＵＴ８ ｍＲＮＡは、大きさがラットＦＵＴ８と同じおよそ３．５ｋｂである。レーン２及びレーン３は、レーン１のコントロールより少ないＦＵＴ８を示す。実施例２を参照のこと。
【図９】フコシル化の少ないクローンの増殖方法を示すフローチャート。図９Ａ：標準物質細胞株増殖手順。図９Ｂ：発現プラスミドに含まれるＲＮＡｉユニット(一又は複数)による新規の細胞株増殖手順。
【図１０Ａ】プラスミドの配位。異なるプラスミドに抗体ＨＣ及びＬＣを組み込んだコントロールプラスミド。略号：ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖；ＣＭＶ；サイトメガロウイルスプロモーター及びエンハンサー配列；ＰＵＲ-ＤＨＦＲ、ピューロマイシン及びジヒドロ葉酸還元酵素融合遺伝子。実施例４を参照のこと。
【図１０Ｂ】プラスミドの配位。１又は２つのＲＮＡｉ転写ユニットを含有する異なるプラスミドにＨＣ及びＬＣを有する試験プラスミド。略号：ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖；ＣＭＶ；サイトメガロウイルスプロモーター及びエンハンサー配列；ＰＵＲ-ＤＨＦＲ、ピューロマイシン及びジヒドロ葉酸還元酵素融合遺伝子。実施例４を参照のこと。
【図１０Ｃ】プラスミドの配位。１又は２つのＲＮＡｉ転写ユニットを含有する同じプラスミドにＨＣ及びＬＣを有する試験プラスミド。略号：ＨＣ、重鎖；ＬＣ、軽鎖；ＣＭＶ；サイトメガロウイルスプロモーター及びエンハンサー配列；ＰＵＲ-ＤＨＦＲ、ピューロマイシン及びジヒドロ葉酸還元酵素融合遺伝子。実施例４を参照のこと。
【図１１】実施例４に記載の安定して形質移入したクローンの抗体発現レベル。各々のプラスミド形質移入について、７２のＭＴＸ耐性クローンを選択して、抗体発現についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。図１１Ａ：CMV.PD.v511.RNAi4プラスミド形質移入からの発現力価。図１１Ｂ：CMV.PD.v511.RNAi2.4プラスミド形質移入からの発現力価。
【図１２】ＦＵＴ８ ｍＲＮＡレベルのTaqman分析。総ＲＮＡは、CMV.PD.v511RNAi4及びCMV.PD.v511.RNAi2.4プラスミド形質移入から得たクローンから精製した。ＦＵＴ８ ｍＲＮＡレベルは、ＦＵＴ８遺伝子に特異的なＴａｑｍａｎプライマー及びプローブを用いて測定した。実施例４を参照のこと。
【図１３】等量播種密度アッセイ(Equal seeding density assay)。ＣＭＶ.ＰＤ.ｖ５１１プラスミド形質移入からの２つのコントロールクローン、最も非フコシル化が低いＣＭＶ.ＰＤ.ｖ５１１.ＲＮＡｉ４プラスミド形質移入からの２つのクローン、及び最も非フコシル化が低いＣＭＶ.ＰＤ.ｖ５１１.ＲＮＡｉ２.４プラスミド形質移入からの４つのクローンを、抗体産生のために９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで播種した。抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。実施例４を参照のこと。
【図１４】ＲＮＡｉ４又はＲＮＡｉ２.４プラスミドを形質移入したクローンによって生産されるヒト化２Ｈ７.ｖ５１１抗体の非フコシル化レベル。コントロールとして、およそ５％の非フコシル化を有する２Ｈ７.ｖ５１１(図のｖ５１１)をアッセイに含む。実施例４を参照のこと。
【図１５】ヒト化２Ｈ７. ｖ５１１抗体のフコシル化変異体のＦｃγＲIII結合親和性。図１５Ａは、ＦｃγＲIIIレセプターのＦ１５８低親和性アイソタイプに対する抗体の結合能を比較する；図１５Ｂは、Ｖ１５８高親和性レセプターアイソタイプに対する結合親和性を比較する。およそ５％の非フコシル化を有するｈ２Ｈ７.ｖ５１１をコントロールとした。実施例４を参照のこと。
【図１６】ＡＤＣＣ活性アッセイ。ｖ１６及びｖ５１１と称するヒト化２Ｈ７の２つの変異体並びにその非フコシル化(ＮＦ)変異体を、Ｗｉｌ２-Ｓ細胞を用いた細胞ベースのアッセイにてＡＤＣＣ活性について比較した。２ｈ７.ｖ１６及び.ｖ５１１抗体組成物はおよそ５％の非フコシル化を有する。Ｖ１６-ＮＦ及びｖ５１１-ＮＦ変異体はおよそ６５〜７０％の非フコシル化を有する。図１６Ａは、アッセイにおけるＶＦ１５８ドナーＮＫ細胞を用いたＡＤＣＣ活性を示し、図１６Ｂは、ＶＶ１５８ドナー細胞を用いた活性を示す。
【図１７】完全長ＣＨＯ ＦＵＴ８をコードするＤＮＡ配列(配列番号.１)を示す。
【図１】
2008541770.tif 000021
【図２】
2008541770.tif 000022
【図３】
2008541770.tif 000023
【図４】
2008541770.tif 000024
【図５】
2008541770.tif 000025
【図６】
2008541770.tif 000026
【図７Ａ】
2008541770.tif 000027
【図７Ｂ】
2008541770.tif 000028
【図７Ｃ】
2008541770.tif 000029
【図７Ｄ】
2008541770.tif 000030
【図７Ｅ】
2008541770.tif 000031
【図８】
2008541770.tif 000032
【図９】
2008541770.tif 000033
【図１０Ａ】
2008541770.tif 000034
【図１０Ｂ】
2008541770.tif 000035
【図１０Ｃ】
2008541770.tif 000036
【図１１】
2008541770.tif 000037
【図１２】
2008541770.tif 000038
【図１３】
2008541770.tif 000039
【図１４】
2008541770.tif 000040
【図１５】
2008541770.tif 000041
【図１６】
2008541770.tif 000042
【図１７】
2008541770.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月30日(2007.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２９】
配列番号.１０及び配列番号.１１の配列を含んでなる核酸。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ヒト化抗ＣＤ２０抗体の他の実施態様は、ｈＡ２０(ＩＭＭＵ-１０６としても知られる、又は９０Ｙ-ｈＬＬ２；米国公開特許第２００３／０２１９４３３号、Immunomedics)；及びＡＭＥ-１３３(米国公開特許第２００５／００２５７６４；Applied Molecular Evolution/Eli Lilly)である。異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体は、ヒト抗体、好ましくはＨＵＭＡＸ-ＣＤ２０ＴＭ(GenMab)である。さらに異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体はキメラ抗体であり、好適な実施態様はリツキシマブ(Genentech, Inc.)及びキメラｃＡ２０抗体(米国公開特許第２００３／０２１９４３３号、Immunomedicsに記載)である。
さらに他の実施態様では、本発明の方法によって生産される抗体は、ＢＲ３を結合する抗体である。
さらに、本発明は、ＦＵＴ８遺伝子の２つの異なるコード領域に相補的な２つのｓｉＲＮＡをコードする配列番号.１０及び配列番号.１１の配列を含んでなる核酸を提供する。
Ｆｃ領域を含んでなるヒト化ＣＤ２０結合抗体と担体とを含んでなり、該組成物中の抗体の少なくとも９５％がフコースを欠いている組成物が提供される。
好適な実施態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はその誘導体である。
他の態様は、抗体をコードする少なくとも一の核酸と、配列番号：１のＦＵＴ８遺伝子配列の異なるコード領域を標的とする少なくとも２つのｓｉＲＮＡをコードする第二の核酸を含んでなり、該抗体及び該ｓｉＲＮＡを発現する宿主細胞である。
また、疾患の治療のための前述のフコース欠陥のある抗体組成物の使用も提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本明細書で使用する「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」又は「ＢＲ３レセプター」という用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」を包含する。ヒトＢＲ３配列(配列番号１２)
2008541770.tif 000044
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
２Ｈ７.ｖ１１４の完全なＬ鎖アミノ酸配列は以下の配列を有する。
2008541770.tif 000045
２Ｈ７.ｖ１１４の完全なＨ鎖アミノ酸配列
2008541770.tif 000046
さらに他の変異体は、配列番号.３０のＨ鎖アミノ酸配列を含んでなる２Ｈ７.ｖ１３８である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例１
既存の細胞株の低フコシル化細胞株への変換
ＣＨＯ細胞において非フコシル化抗体の収率を高めるために、ＲＮＡｉ手法を行い、ＦＵＴ８遺伝子の発現をノックダウンした。Ambion, Inc. (Austin, TX)から市販のpSilencer 3.1-H1-Puroプラスミドを用いて、短いスペーサー(９ｎｔヘアピンループ)によってその逆方向の相補的なアンチセンスｓｉＲＮＡ配列、その後の３'末端に５-６Ｕ'を連結した、ＦＵＴ８の遺伝子に特異的な１９ｎｔ(ヌクレオチド)センスｓｉＲＮＡ配列からなる短いヘアピンｓｉＲＮＡを生成した(図３)。ＣＨＯ ＦＵＴ８遺伝子を標的とするようにｓｉＲＮＡプローブを設定するために用いた方法はElbashir等(2002)に記載されている。５つの異なるｓｉＲＮＡプローブは、有用なＣＨＯ ＦＵＴ８ＤＮＡ配列に基づいて、異なる領域を標的とするように設定した(図４)(プローブ＃１−５)。プローブ１(配列番号.３及び配列番号.４)；プローブ２(配列番号.５及び配列番号.６)；プローブ３(配列番号.７及び配列番号.３７)；プローブ４(配列番号.３８及び配列番号.３９)；プローブ５(配列番号.４０及び配列番号.４１)。アンチセンス配列及び５-６Ｕ'にスペーサによって連結される１９ｎｔセンス配列からなるｓｉＲＮＡコード配列は、プローブ＃２の配列番号.１０(配列番号５の位置７〜５９)とプローブ＃４の配列番号.１１である。プローブ１−５は、図５ＢのＲＮＡｉ１−５に対応する。５つのｓｉＲＮＡプローブは、pSilencer 3.1-H1-Puroプラスミドに独立してクローニングされたアニールした合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
これらのＲＮＡｉプローブの有効性を試験するために、ＦＬＡＧタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質を、Genbank(受託番号 Ｐ＿ＡＡＣ６３８９１)のＣＨＯ ＦＵＴ８の部分的なＤＮＡ配列を用いて構築した。ＣＨＯ細胞から精製した総ＲＮＡ及びＦＵＴ８プライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)によってＦＵＴ８コード配列の３'の０．９８ｋｂの断片をクローニングし、結果として生じたＰＣＲ断片を５'ＦＬＡＧタグ配列と融合させた。８アミノ酸Ｆｌａｇタグ(metAspTyrLysAspAspAspAspLys−配列番号.９)を単離した部分的なｃＤＮＡ配列の５'末端に付加した。タグ付加ＦＵＴ８断片を発現ベクターにクローニングした。ＲＮＡｉプローブプラスミド及びｆｌａｇ-タグ付加ＦＵＴ８プラスミドをＣＨＯ細胞に同時形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞溶解物を抽出して、ＦＵＴ８融合タンパク質レベルをイムノブロッティングによる抗ｆｌａｇＭ２抗体(Sigma, MO)によって分析した。ＲＮＡｉプローブの存在下では、５例のうち４例で融合タンパク質発現が有意に阻害された(図５)。
ＦＵＴ８転写物を切断するこれらのプローブの能力は、Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８プラスミドとともに各々のｓｉＲＮＡ発現プラスミドをＣＨＯ細胞に一過性に同時形質移入して試験した。形質移入の２４時間後に細胞を溶解して、細胞溶解物を抗ＦｌａｇＭ２抗体(Sigma, MO)によるウェスタンブロットによって分析した。
Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質はＲＮＡｉ１(プローブ１)が標的とする配列を含有しないので、ＲＮＡｉ１(プローブ１)形質移入細胞は、予想通り、Ｆｌａｇタグ付加ＦＵＴ８産物の強力な発現を示した(図５Ａ、５Ｂ)。それに対して、５つすべてに対してｓｉＲＮＡプローブ２(ＲＮＡｉ２)は、ＦＬＡＧタグ付加ＦＵＴ８融合タンパク質発現に対して様々な程度の阻害性効果を有する(図５Ｂ)。プローブ＃２及び＃４は最も高い阻害性効果を示し、更なる評価のために選択した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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