(57)【要約】  本発明は、ネコカリシウイルスの高病原性株を含めたネコカリシウイルスに対する免疫反応を提供するための改良法、並びに免疫原性及び／又はワクチンである組成物に関する。
2008528504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
獣医学的に許容される媒体又は賦形剤と、少なくとも１種の単離ネコカリシウイルスとを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物であって、前記少なくとも１種のネコカリシウイルスが、ＦＣＶ４３１、ＦＣＶ  Ｇ１、ＦＣＶ  ＲＭＩ６、ＦＣＶ  ＲＭＩ９、ＦＣＶ１００８６９、ＦＣＶ９４５８０、ＦＣＶ３３５８５、ＦＣＶ８９３９１、ＦＣＶ８８２８７、及びその等価物からなる群から選択される、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【請求項２】
ＦＣＶが不活化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アクセッション番号ＰＴＡ５９３０でＡＴＣＣに寄託されている単離ネコカリシウイルス株１００８６９を含むか、或いはアクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されている単離カリシウイルス株４３１と、アクセッション番号Ｉ−２１６７でＣＮＣＭに寄託されている単離ネコカリシウイルス株Ｇ１とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ネコカリシウイルス株４３１及びＧ１を含み、高病原性ネコカリシウイルス株に対する免疫反応を付与するか、或いは株１００８６９を含む高病原性ネコカリシウイルス株に対する免疫反応を付与する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ワクチンである、請求項１の組成物。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
アクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されている単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株４３１と、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤と、少なくとも１種の他のネコ病原体に対する少なくとも１結合価とを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物。
【請求項８】
アクセッション番号Ｉ−２１６７でＣＮＣＭに寄託されている単離ネコカリシウイルス株Ｇ１をさらに含む、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
少なくとも１種の高病原性ネコカリシウイルス株に対する免疫反応を付与する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
高病原性ネコカリシウイルスが株１００８６９である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＦＣＶが不活化されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
ワクチンである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
他のネコ病原体が、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びクラミジアからなる群から選択される、請求項７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の免疫原性組成物を含む多価ワクチン接種キット。
【請求項１６】
ＦＣＶ、及び少なくとも１種の他のネコ病原体に対する少なくとも１結合価が別々に包装されている、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
高病原性ネコカリシウイルスに対してネコを免疫化する方法であって、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤と、少なくとも１種の単離ネコカリシウイルスとを含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を投与するステップを含み、前記少なくとも１種のネコカリシウイルスが、ＦＣＶ４３１、ＦＣＶ  Ｇ１、ＦＣＶ  ＲＭＩ６、ＦＣＶ  ＲＭＩ９、ＦＣＶ１００８６９、ＦＣＶ９４５８０、ＦＣＶ３３５８５、ＦＣＶ８９３９１、ＦＣＶ８８２８７、及びその等価物からなる群から選択される方法。
【請求項１８】
組成物を少なくとも２回投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＣＶが不活化されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
組成物が、アクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されている単離ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）株４３１と、アクセッション番号Ｉ−２１６７でＣＮＣＭに寄託されている単離ネコカリシウイルス株Ｇ１とを含むか、或いは組成物が、アクセッション番号ＰＴＡ５９３０でＡＴＣＣに寄託されている単離ネコカリシウイルス株１００８９６を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、現在米国特許第６５３４０６６号となっている２０００年７月１４日出願の米国特許出願第０９／６１６７８１号の分割出願である２００３年２月１８日出願の米国特許出願第１０／３６８８６１号の一部継続出願であり、これは、１９９９年７月１６日出願の仏国特許出願第９９０９４２０号、２０００年２月１１日出願の仏国特許出願第０００１７５９号、及び２０００年３月３０日出願の米国特許仮出願第６０／１９３１９７号に基づく優先権を主張するものである。本出願は、２００４年１月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５７３８４９号に基づく優先権を主張する２００５年１月１９日出願の出願番号未定出願（整理番号５７４３１３−３２５８．１）のＣＩＰでもある。
【０００２】
以上の出願、特許、及び出版物、並びにそれらで引用又は参照された全文書「出願で引用された文書」と、本明細書で引用又は参照された全文書「本明細書で引用された文書」と、上記のいかなる出願、特許、及び出願で引用された文書の審査中も含めて、本明細書で引用された文書及び出願で引用された文書で参照又は引用された全文書とを、参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
この開示中、特に特許請求の範囲において、「含む（comprises）」、「含んだ（comprised）」、及び「含んでいる(comprising)」などの用語は、米国特許法でそれに属すると定められた意味を有することができ、例えば、それらの用語は、「包含する(includes)」、「包含した(included)」、及び「包含している(including)」などを意味し得ること、並びに「から本質的になっている（consisting essentially of）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法でそれに属すると定められた意味を有することができ、例えば、それらの用語は、明示的に記述されていない要素も容認するが、従来技術に存在する要素、又は本発明の基本的特徴若しくは新規な特徴に影響する要素は除外することが知られている。
【０００４】
本発明は、診断、アッセイ、及びワクチンを含めた免疫学分野に関する。詳細には、本発明は、ネコカリシウイルス感染に対する免疫原性組成物及びワクチン、特に不活化ワクチン又はサブユニットワクチンを産生するための、高病原性株を含めた、ネコカリシウイルスの特定株の使用に関する。免疫原性組成物及びワクチンにおける、高病原性株を含めたこれらの特定の株の使用は、複数の株のネコカリシウイルスに対する防御を生み出す優れた免疫反応を提供する。これらの免疫原性組成物及びこれらのワクチンは、多価の（multivalent）免疫原性組成物及びワクチンを製造するために、他のネコ病原体をベースにして調製された免疫原性組成物又はワクチンと組み合わせることもできる。本発明はさらに、ネコカリシウイルスの株に感染しているかどうかを判定するための診断検査、並びにネコカリシウイルスタンパク質及び／又は抗原の存在又は不在を判定するためのアッセイにも関する。
【背景技術】
【０００５】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、１９５７年に最初に記載された（Fastier,1957）。ネコカリシウイルス及びネコヘルペスウイルスは、ネコの上気道におけるウイルス病の２つの主要な原因である。ＦＣＶウイルスは多くの動物で疾患を引き起こすウイルスであり、ＦＣＶ保持感染率は１５〜２５％程度、抗ＦＣＶ血清陽性率は７０〜１００％である（Coutts, 1994; Ellis, 1981; Harbour, 1991; Reubel, 1992）。これらの呼吸器疾患には、初期の高熱症の後に、口蓋、舌、唇、及び／又は鼻における口腔内粘膜潰瘍形成、鼻炎、慢性口内炎、及び結膜炎が伴い、場合によっては拒食症及び無力症が伴う。ＦＣＶウイルスは、肺炎、腸炎、及び跛行症状群（lameness syndrome）としても知られている関節痛も引き起こすことがある。
【０００６】
一般に、全ネコ集団の１５〜２５％からＦＣＶを単離することができ（Harbour, 1991）、４５〜６０％のネコが上気道感染を有し（Harbour, 1991; Reubel, 1992）、５０〜９２％のネコが慢性口内炎を有する（Knowles, 1989; Harbour, 1991）。
【０００７】
ＦＣＶウイルスの感染は水平感染のみであり、これまでのところ、妊娠中の母ネコからその子への垂直感染の症例は知られていない（Johnson, 1984）。そうではなく、ＦＣＶの感染は、感染した動物と健康な動物との間の接触によって、或いはくしゃみで生じる空気中の小滴への曝露を介して起こる(Wardiey,1976)。
【０００８】
カリシウイルス科のネコカリシウイルスは、無エンベロープウイルスであり、ポリＡを有し、サイズが約７．７キロベースである１本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを含む（Radford, 1997）。ＦＣＶのキャプシドは、６６ｋＤａ（キロドルトン）の単一主要キャプシドタンパク質であるｐ６６タンパク質からなる。カリシウイルスの分子生物学に関する概説は、Clarke and Lambdenに見出すことができる。
【０００９】
多くのＲＮＡウイルスと同様に、ＦＣＶウイルス集団には、大きな不均一性が存在する。１９７０年代初めに血清交差中和実験によって実証されて以来、抗原性の相違によってＦＣＶをいくつかのウイルス株又は疑似種に分類することが可能となっている（Radford, 1997）。
【００１０】
いくつかのＦＣＶ株が同定及び単離されており、中でも、株Ｆ９（アクセッション番号ＶＲ−７８２で（American Type Culture CollectionすなわちＡＴＣＣ）に寄託されている）、株２２８０（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０５７）、株ＫＣＤ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５１）、及び株ＣＦＩ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５４）が挙げられる。
【００１１】
ＦＣＶに対するワクチン接種は、１９７０年代の終わりに、弱毒化されたＦＣＶ株を用いて導入されたが、これらの弱毒化株は、主として、１９５８年に米国で単離された株Ｆ９（Billie, 1960）又はインビトロ若しくはインビボでの継代によってＦ９株から派生した株（「Ｆ９様」）であった。市販されているＦＣＶワクチンの大部分がこれらの弱毒化ワクチンに含まれる。
【００１２】
不活化ワクチンも市販されており、これらの不活化ワクチンのすべてがアジュバントを含有している。これらの不活化ワクチンは、主として株２５５及び２２８０を用いているが、これらは、米国で、それぞれ１９７０年に肺炎のネコから単離されたもの（Kahn and Gillepsie, 1970; Povey, 1980）、及び１９８３年に跛行（lameness）を有するネコから単離されたもの（Pedersen, 1983; Pedersen and Hawkins, 1995）である。
【００１３】
ワクチンで使用するためのＦＣＶの不活化は、ホルマリンの使用を含めた様々な方法で実現できる。例えば、Poveyは、子ネコで使用されるホルマリン不活化及びアジュバント添加されたＦＣＶ調製物について記述している（Povey, 1978）。
【００１４】
米国特許第６５３４０６６号は、ＦＣＶワクチンを製造するための新規のＦＣＶ株の使用について記載している。上記ワクチンが不活化ワクチンである場合、その不活化は化学的手段（例えば、ホルマリン若しくはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、又はバイナリーエチレンイミン）及び／又は熱処理で行う。上記ウイルスは、エチレンイミンによって不活化することが好ましい。上記ワクチンには、アジュバント添加することが好ましく、これには例えば、上記特許の実施例８に記載の水中油型乳剤を用いる。
【００１５】
米国特許第６３５５２４６号は、弱毒化ＦＣＶワクチン及び不活化ＦＣＶワクチンの両方について記載しているが、上記不活化ワクチンはアジュバントを含んでいることが好ましい。この特許では、ホルムアルデヒド又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の使用を介して不活化を行う。
【００１６】
前述の通り、不活化ワクチンは通常、免疫反応を亢進させるため、並びにネコ集団中に現れる異種起源のＦＣＶ株に対してより良い防御を誘導するために、アジュバントを含有している。しかし、アジュバント含有ワクチンは、アジュバントを含まないものより、高い割合で拒絶反応を誘導し（Gobar, 2002）、それによって、注射部位におけるワクチン関連の線維肉腫の危険性を増大させる（Baker, 1998）。
【００１７】
アジュバントを含まないＦＣＶワクチンは通常、前述のＦ９株を通常含有する改変生ワクチンである。数人の著者は、ＦＣＶ  Ｆ９の残留病原性がワクチン接種後のカリシウイルス感染（病原性への復帰）の原因であると訴えている（Dawson, 1993）。ＦＣＶの改変生存株は、野外での新規抗原性変種の出現に関係づけられている（Radford, 1997）。したがって、改変生ワクチンの安全性は疑わしい。
【００１８】
存在しているＦＣＶ抗原型は１種類のみであるが、ＦＣＶ単離株相互における抗原性の相違が観察されており、野外での新規単離株が定期的に同定されている（Lauritzen, 1997）。
【００１９】
したがって、経時的な連続抗原変異のため、Ｆ９、２５５、又は２２８０などの株を含めた１９６０〜７０年代に単離されたワクチン株に対して産生された抗血清は、１９９０年代及び２０００年代に一般的になっているカリシウイルス株のうち極めてわずかな単離株しか中和しない。例えば、上記の抗Ｆ９血清が中和する単離株は、１９８０〜８９年の間における米国単離株の５６％、及び１９５８〜７９年の間における単離株の８６％に比べ、１９９０〜１９９６年の間における米国単離株の４３％、及び１９９０〜９６年の間における英国単離株の１０％のみである（Lauritzen, 1997）。したがって、古いＦＣＶ株から得られた弱毒化ワクチン及び不活化ワクチンはもはや、最近のＦＣＶ株に対する十分な防御を生み出さない。
【００２０】
１９７０年代の終わり以来、ＦＣＶに対するワクチン接種が行われているのにもかかわらず、ＦＣＶ関連疾患が臨床上の重大な問題であり続けている。そして、前述の通り、新規な高病原性株が最近、生じている。ワクチン接種にもかかわらずＦＣＶ感染及びＦＣＶ関連の疾患が持続していることは、いくつかのメカニズムによって説明されているが、それらのメカニズムには、ワクチン接種によって誘導された免疫圧力下でＦＣＶ集団が進化しているため、ワクチン株による広範な交差防御が不足していること（Geissler, 1997）、弱毒化ワクチンに由来するワクチン株が急性及び慢性のＦＣＶ感染に寄与している可能性があること（Dawson, 1993; Pedersen, 1995; Radford, 1997）、不活化ワクチン及び生ワクチンは両方とも、ネコを臨床上の疾患からは防御するが、感染からは防御しないこと（Pedersen, 1995）、及びＦＣＶは、ワクチンに対してより抵抗性の変異体を生じることによって、進化し、免疫圧力から逃避できること（Knowles, 1990; Johnson, 1992）が含まれる。
【００２１】
結果として、ネコの集団で現在同定されている単離株に対してより広範な交差中和を行う現在の疫学的状況により適応したワクチンで、現在のカリシウイルスワクチンを置換しなければならない。有望なワクチンは、より新規のＦＣＶ株をベースとした不活化ワクチン又は組換え体ワクチンであろう。最近、米国及び他の国で極めて重度なカリシウイルス感染の大流行が認められた。これらの高病原性かつ免疫優性な株の１つをワクチン候補として選択した。本明細書では、この株を伝統的なＦＣＶワクチンの代替物として記述する。
【００２２】
さらに、ネコにおいてＦＣＶワクチン接種に起因するもうひとつの問題は、しばしばワクチン中のアジュバントの存在の結果として起こる注射部位での炎症の存在であり、これは、ワクチン接種後における線維肉腫の因子である可能性もある。したがって、ワクチンの局所忍容性は、戦略的に重要であり、かつ新規ワクチンを開発する際に考慮するべきものである。そのため、理想的なワクチンは、アジュバントを含まないものであり、かつ優れた局所忍容性を有するものでなければならない。
【００２３】
したがって、本発明は、ＦＣＶ集団を代表する最近の株を、ワクチンの局所忍容性が改善されている不活化ワクチン又は組換え体ワクチン（改変生ワクチンとは反対に）中で用いることによって（Pedersen, 1995）、伝統的なワクチンで明らかになったそれらの問題に取り組むものであり、上記ワクチン中で用いられているＦＣＶ株は、広範な交差防御を与えるものでなければならない。別法として、いくつかの株を包含させることが以前に提案されている（Baulch-Brown, 1997; Dawson, 1993; Knowles, 1990）。
【特許文献１】米国特許出願第１０／３６８８６１号
【特許文献２】米国特許出願第０９／６１６７８１号
【特許文献３】米国特許第６５３４０６６号
【特許文献４】仏国特許出願第９９０９４２０号
【特許文献５】仏国特許出願第０００１７５９号
【特許文献６】米国特許仮出願第６０／１９３１９７号
【特許文献７】米国特許仮出願第６０／５７３８４９号
【特許文献８】米国特許第６３５５２４６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、ネコで抗体を誘導し、かつ広範な交差中和範囲を有する新規ＦＣＶ株を検出することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、これらのＦＣＶ株に起因するネコカリシウイルス感染に対する免疫原性組成物及び／又はワクチンを製造することである。本発明のさらに別の目的には、前記免疫原性組成物及び／又はワクチンの投与を含む、免疫反応を提供する方法が含まれる。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、ネコカリシウイルス感染及び他の少なくとも１種のネコ病原体に対する多価免疫原性組成物及び／又は多価ワクチンを製造すること、並びに、前記多価免疫原性組成物及び／又は多価ワクチンの投与を含む、免疫反応を提供する方法である。
【００２７】
本発明のさらに別の目的は、前述した、ネコカリシウイルス感染に対する組成物及び／又はワクチン、並びに／或いは多価の免疫原性組成物及び／又はワクチンの製造であって、前記組成物及び／又はワクチンはアジュバントを含まない。例えば、本出願の目的の１つは、上記組成物及び／又はワクチンを調製する前に、ＦＣＶにホルムアルデヒド処理及び／又は不活化剤を用いた処理を施すことである。したがって、本発明の目的は、不活化剤によって不活化され、かつ直鎖アルキルＣ１−Ｃ５鎖の形をなすアルデヒド化合物で安定化されたＦＣＶを含む、アジュバントを含まない不活化ＦＣＶ免疫原性組成物又はワクチンを製造することであり、上記アルデヒド化合物は、上記鎖がＣ１である場合には１つのアルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５である場合には２つの末端アルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５鎖である場合、１つのアルデヒド基が、場合によってはセトン又はエポキシ基によって置換されていてもよく、上記免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥形態、又は獣医学的に許容される賦形剤若しくは媒体中の液体形態にある。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、本発明に従った、アジュバントを含まない不活化及び安定化されたＦＣＶ免疫原性組成物又はワクチンの投与を含む、新生仔、子、オス、メス、及び妊娠中のメスを含めたネコ科の動物、好ましくはネコを、ネコカリシウイルス感染に対して免疫化する方法、或いは、本発明に従った不活化及び安定化されたＦＣＶ、及び別のネコ病原体に由来する少なくとも１種の免疫原、又は別のネコ病原体に由来する少なくとも１種の免疫原を発現する組換え体ベクターを含有し、アジュバントを含まない混合ワクチンの投与を含む、ＦＣＶを含めた少なくとも２種類のネコ疾患に対して免疫化する方法である。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
これら及び他の実施形態は、以下に示す発明を実施するための最良の形態に開示されるか、それから明らかであるか、或いはそれに包含される。
【００３０】
以下に示す発明を実施するための最良の形態は、例示として提示されており、本発明を、記載される特定の実施形態に限定するものではなく、また、添付されている図面と併せて理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
一態様では、本発明は、その組成物を接種した宿主動物で抗原性又は免疫学的反応を誘導するための抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供し、上記抗原性又は免疫学的反応はＦＣＶ感染に対するものである。したがって、本発明は、ＦＣＶに対する改善された抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供する。本発明は、使用されるＦＣＶ株のタイプによって、また本発明は有利には不活化されたものであり、改変生ワクチンではないという事実によって、伝統的なＦＣＶワクチンと異なっている。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、免疫系によって認識され、かつ免疫反応を誘導する物質である。この文脈においては使用される類似の用語が「免疫原」である。
【００３３】
これも本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」という用語は、ネコに投与されたならば、ネコ病原体に対して引き起こされたと考えられる免疫反応を誘導できるいかなる調製物も包含する。「ワクチン」は、効果的な防御を誘導できる調製物を意味するものと理解される。
【００３４】
本発明の一態様では、有利には不活化形態又はサブユニット形態にあり、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤中にあるネコカリシウイルス株４３１、又はその等価物から調製され、抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供する。本発明の別の態様では、有利には不活化形態又はサブユニット形態にあり、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤中にあるネコカリシウイルス株４３１及びＧ１、又はその等価物から調製された、抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供する。本発明のさらに別の態様では、有利には不活化形態又はサブユニット形態にあり、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤中にあるネコカリシウイルス株１００８６９、９４５８０、３３５８５−１、８９３９１、若しくは８８２８７のうちの１つ若しくは複数、又はその等価物から調製された、抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供する。本発明のさらに別の態様では、有利には不活化形態又はサブユニット形態にあり、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤中にある、交差中和を引き起こす少なくとも１株のネコカリシウイルス株から調製された、不抗原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物、又は治療組成物を提供する。
【００３５】
上記ＦＣＶ株は、最近、野外から単離されたものから選択されることが好ましい。好ましい株には、株４３１（アクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されているもの；又はアクセッション番号Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体４４と反応するいかなる株も含む；米国特許第６５３４０６６号を参照）、Ｇ１（アクセッション番号Ｉ−２１６７でＣＮＣＭに寄託されているもの）（ＣＮＣＭ＝「Collection Nationale de Cultures de Microorganismes」、仏国パリ所在Pasteur Institute）、米国株ＲＭＩ６及びＲＭＩ９（これらは両方とも本発明者から入手可能である）、ＵＳ１００８６９（２００４年４月２２日に、アクセッション番号ＰＴＡ５９３０でＡＴＣＣに寄託）（ＡＴＣＣ＝「American Type Culture Collection」、米国バージニア州マナッサス（Manassas）所在）、及び、より一般的に、出版物に記載された新規の高病原性株（Pedersen et al. Vet. Microbiol. 2000. 73. 281-300; Schorr-Evans et al. JFMS. 2003. 5. 217-226; Hurley et al. Vet. Clin. Small Anim. 2003. 33. 759-772）が含まれる。好ましい実施形態では、上記免疫原性組成物又はワクチンは、不活化及び安定化されたＦＣＶ４３１（又はモノクローナル抗体４４と反応する任意の株）と、不活化及び安定されたＦＣＶ  Ｇ１とを含む。別の好ましい実施形態では、上記免疫原性組成物又はワクチンは、不活化及び安定化されたＦＣＶ  ＵＳ１００８６９を含む。
【００３６】
一般的に、異種血清中和力価が１．２  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０以上である場合に、ＦＣＶ株は別のＦＣＶ株を血清中和すると考えられる（Povey C. and Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 877-885）。本明細書では、この値を陽性閾値として用いる。しかし、２  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０以下の同種血清中和力価有するＦＣＶ単離株で得られた交差血清中和結果は解釈不能である。
【００３７】
ＦＣＶ４３１株と比較したＦＣＶ株の等価性を確立する第２の方法は、ＦＣＶ４３１株に特異的なモノクローナル抗体を使用し、候補ＦＣＶ株を間接的免疫蛍光法（ＩＩＦ）によって試験することである。したがって、本発明者は、４３１株に特異的であることが証明されたいくつかのモノクローナル抗体を産生するのに成功した。それらの１つがモノクローナル抗体４４である。４３１に特異的なモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体４４を用いた免疫蛍光法で反応性があれば、等価性がある。このモノクローナル抗体及びそれに対応するハイブリドーマは、簡単な請求によって本発明者から入手可能であり、Poulet et al. Arch. Virol. 2000. 145. 1-19による論文でも開示されている。対応するハイブリドーマは、ブダペスト条約の条項に従って、ＣＮＣＭにも、１９９９年８月１１日にアクセッション番号Ｉ−２２８２で寄託された。しかし、当然ながら、当業者ならば何の問題もなく、従来の技法によってモノクローナル抗体を産生し、パネルと比較して４３１株に特異的な抗体を選択することができる。
【００３８】
本明細書で４３１の等価物として特定されている株は、実施例４の参照パネルの１８株のＦＣＶ単離株の間での交差血清中和試験中に同定されたものであるが、その際、驚いたことに、参照パネルの１７株の異種単離株のうち１４株を、単離株４３１の抗血清が中和することが判明した（同種血清中和力価は考慮されていない）。比較して、「歴史的」ワクチン株２５５及びＦ９の抗血清が中和するのは、１８株のパネル単離株のうち２株のみである。
【００３９】
したがって、本発明者は、予期せずに、ＦＣＶ４３１株が、ほとんどのＦＣＶ株からネコ科動物、特にネコを防御するのに使用できる優勢株であることを見出した。本明細書に開示されているＦＣＶ株のパネルを利用して、当業者ならば、他の優勢ＦＣＶ株を選択することが可能である。等価性によって、本発明は、ＦＣＶ４３１株を介して、それに等価であり、広範な交差中和範囲をもつ抗体を有するＦＣＶ株も包含する。
【００４０】
したがって、あるＦＣＶ株の抗血清が、参照パネルにある１８株の異種単離株のうち少なくとも１３株を血清中和する場合（すなわちＦＣＶ４３１も含まれる）、好ましくは参照パネルにある１８株の異種単離株のうち少なくとも１４株を血清中和する場合、さらにより好ましくは参照パネルにある１８株の異種単離株のうち少なくとも１５株を血清中和する場合に、等価性が存在している。
【００４１】
さらに、本発明者らは、ＦＣＶ１００８６９及び他の高病原性株が、ほとんどのＦＣＶ株からネコ科動物、特にネコを防御するのに使用できる優勢株であることも見出した。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「高病原性」という用語は、当技術分野でそれに属すると考えられている定義を有するものと理解され、詳細には、高病原性株は、伝統的な株よりも著しく増強された病原性を示す。したがって、本明細書で使用される場合、例えば、株１００８６９は、４３１及び２５５及びＦ９などの、より古い株より増強された病原性を有する。
【００４３】
同様に、１００８６９などのＦＣＶ株の等価物は、実施例１０の参照パネルにある４４株の異種単離株のうちの少なくとも４１株、好ましくは４４株の異種単離株のうちの少なくとも４２株、又は４４株の異種単離株のうちの少なくとも４３株、又は参照パネルにある４４株の異種単離株のうちの４４株も血清中和する株を同定することによって決定できる。さらに、当業者ならば、本明細書に記載されているか、当業者に知られている他の技法を介して、過度の実験をしないでも、本明細書で同定されている株１００８６９、９４５８０、３３５８５−１、８９３９１、又は８８２８７のうちの任意のものの等価物を同定することができる。
【００４４】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明によるＦＣＶ４３１株又はその等価物の１つの抗原に加えて、他の少なくとも１株のＦＣＶ株、特に相補的な株、詳細には、Ｇ１、ＲＭＩ６、及びＲＭＩ９、並びにこれらの等価物を含む群から選択された株の抗原を、獣医学的に許容される媒体又は賦形剤の中、そして場合によっては、それとアジュバントとの中に含む免疫原性組成物及びワクチンである。上記他のＦＣＶ株から得られた抗原は、不活化ウイルス又はサブユニットを含むことが好ましい。
【００４５】
ＦＣＶ  Ｇ１、ＲＭＩ６、及びＲＭＩ９株が選択された。これは、それらがＦＣＶ４３１株に相補的であったため、すなわち、４３１の抗血清と、これら３株のＦＣＶのうち１株の抗血清との組合せによって参照パネルにある単離株の１００％が血清中和されるため、すなわち、４３１抗血清が血清中和しないか、微弱に血清中和する（ｌｏｇ１０  ＶＮ５０値が１．２未満）参照パネルのＦＣＶ単離株に関して、これら３株のＦＣＶ株が、２  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０以上の同種血清中和力価、及び１．２  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０以上の異種血清中和力価を有するためである。本発明は、ＦＣＶ４３１株に関して、同じ相補性を有する等価なＦＣＶ株も包含する。これらの株、より詳細にはＧ１に特異的なモノクローナル抗体を産生し、選択することも可能であり、それによって、この他のベースに基づいて等価物を決定することが可能となる。
【００４６】
本発明の別の態様は、多価の免疫原性組成物及びワクチンを製造するため、又は不活化ワクチン若しくはサブユニットワクチンを製造するための、詳細にはＦＣＶ４３１株及びＧ１株という２株の組合せである。
【００４７】
驚いたことに、ＦＣＶ  Ｇ１及び４３１の２株の組合せは有利に相乗効果を引き起こす。ＦＣＶ  Ｇ１株及び４３１株の相補性に関する試験中に、Ｇ１単独、４３１単独、又は両方（Ｇ１＋４３１）の組合せによって誘導された免疫反応を比較した。ＦＣＶ  Ｇ１株及び４３１株の２株の組合せで免疫化された動物の群は、臨床上の防御が他より良いという恩恵があった。実際、本発明の一実施形態は、本明細書に同定された株を含めた、ＦＣＶの高病原性株、詳細には１００８６９株に対する免疫反応を誘導するための、組成物の調製物中における、ＦＣＶ  Ｇ１と組み合わせたＦＣＶ４３１の使用である。同様に、本発明の別の実施形態は、本明細書で同定されたもの、より詳細には１００８６９株を含めた、ＦＣＶの高病原性株を含めたほとんどのＦＣＶ株からネコ科動物、特にネコを防御するのに使用できる、ＦＣＶ  Ｇ１又はその等価物と組み合わせてＧＣＶ３４１を含む免疫原性及びワクチン組成物である。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、少なくともその等価物を含めたＦＣＶ４３１株と、場合によっては他の少なくとも１株のＦＣＶ株、より詳細には本発明の意味する範囲内の相補的な株、より詳細にはＧ１、ＲＭＩ６、及びＲＭＩ９から選択された株とを含む少なくとも１結合価の不活化ネコカリシウイルス、並びに別のネコ病原体用の少なくとも１結合価を獣医学的に許容される媒体又は賦形剤と、好ましくはアジュバント、より詳細には上述したもののうちの１つとの中に含む多価ワクチンである。サブユニットベースの多価ワクチンを製造することも、同様に可能である。
【００４９】
前記ネコ病原体は、とりわけ、ネコ鼻気管支炎ウイルス若しくはネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少ウイルス、若しくはネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びクラミジア（例えばクラミジア・フェリス種（Chylamydophila felis））を含む群から選択されたものである。
【００５０】
前記ワクチンは、
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、ＦＰＶ、ＦｅＬＶ、及びクラミジア
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、ＦＰＶ、及びＦｅＬＶ
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、ＦＰＶ、及び狂犬病
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、ＦＰＶ、及びクラミジア
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、ＦＰＶ、クラミジア、及び狂犬病
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、及びＦＰＶ
−ＦＣＶ、ＦＨＶ、及びクラミジア
−ＦＣＶ及びＦＨＶ
のワクチン成分を併せたものが好ましい。
【００５１】
これらの様々な組合せの好ましい実施形態では、弱毒化された生存微生物がＦＨＶ、ＦＰＶ及びクラミジア用に使用され、ＦｅＬＶ遺伝子を発現する組換え体ベクターがＦｅＬＶ用に使用される。上記組換え体ベクターは、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ  ＦｅＬＶ遺伝子を発現するカナリア痘ウイルス（例えば米国特許第５７５３１０３号に記載のｖＣＰ９７）でもよい。
【００５２】
したがって、本発明の別の目的は、１種の安定化及び不活化されたＦＣＶと、少なくとも１種の他のネコ病原体に対する免疫反応を宿主で誘導するための少なくとも１種のワクチン成分とを含む、アジュバントを含まない混合免疫原性組成物又はワクチンであり、前記成分は、別のネコ病原体由来の免疫原、又はこの免疫原を発現する組換え体ベクターであり得、上記アジュバントを含まない混合免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥形態、又は獣医学的に許容される媒体若しくは賦形剤中の液体形態にある。凍結乾燥された形態が好ましい。
【００５３】
好ましい実施形態では、上記アジュバントを含まない混合免疫原性組成物又はワクチンは、生きている弱毒化微生物の形態、又はネコ病原体由来の少なくとも１種の免疫原を発現する組換え体ベクターの形態のワクチンの成分である。上記組換え体ベクターは、プラスミドでも、ウイルスベクターでもよく、例えば、上記ベクターは、ポックスウイルス、アデノウィルス、又はヘルペスウイルスである。この場合も、凍結乾燥された形態が好ましい。
【００５４】
本発明の特徴に応じて、ウイルスからのキャプシドを抽出し、場合によっては抽出の前又は後に不活化することによって、免疫原性組成物又はサブユニットワクチンを製造することが可能である。したがって、これらの調製物及びワクチンは、場合によっては不活化されている、その等価物を含めた本発明によるウイルス株、より詳細には株４３１から産生されたキャプシドタンパク質であって、場合によっては別のＦＣＶ株、より詳細にはＧ１若しくはその等価物からも産生されたキャプシドタンパク質と、場合によっては細断片とを主として含有するそのような抽出産物を、その唯一の活性成分として、又はそれ以外の形態で含む。これらのサブユニットワクチン及び調製物は、アジュバント、例えば上述のもので補足されているものが有利である。不活化ワクチン又は調製物と、サブユニットワクチン又は調製物との全体を混合することも可能である。
【００５５】
Ｇ１株をベースとした免疫原性組成物又はワクチン、より詳細には不活化されているか、抽出物のサブユニットであるものも本発明の対象である。
【００５６】
ＦＣＶウイルスの培養及び増殖は、ネコ細胞、より詳細にはCrandell-Reeseネコ腎臓細胞、すなわちＣＲＦＫ細胞（番号ＣＣＬ−９４でＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手可能）において、５０％細胞培養感染量（ＣＣＩＤ５０）が１細胞あたり２〜０．０１、好ましくは０．５  ＣＣＩＤ５０／細胞となる感染多重度（ｍｏｉ）で行うのが好ましい。
【００５７】
収集及び清澄化の後、不活化免疫原性組成物又は不活化ワクチンを製造することになっているＦＣＶウイルスを化学処理（例えば、ホルマリン若しくはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＤ））及び／又は熱処理によって不活化する。本発明によるウイルスは、使用する直前にブロモエチルアミン（ＢＥＡ）から形成されたエチレンイミンの作用によって不活化することが好ましい。ウイルス粒子は、従来の濃縮法、より詳細には限外濾過によって濃縮することができ、その後、場合によっては、従来の精製手段、より詳細にはゲル濾過法又は選択的沈殿法、より詳細にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下での選択的沈殿法によって精製する。先行の濃縮をせずに精製することもできる。
【００５８】
免疫原性組成物又は不活化ワクチン若しくはサブユニットワクチンを製造するためには、場合によってはアジュバントで補足された獣医学的に許容される媒体又は賦形剤の中にウイルス粒子を取り込む。抗原の量は、詳細には、不活化前の力価が１用量あたり約１０５〜約１０１０  ＣＣＩＤ５０、好ましくは１用量あたり約１０８〜約１０９  ＣＣＩＤ５０となる量に等しい。そのような投与は、全身性免疫反応、すなわち体液性若しくは細胞生免疫反応を可能にする。
【００５９】
本発明のＦＣＶ組成物は、製薬分野又は獣医学分野の当業者によく知られている標準的な技法に従って調製できる。そのような組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、種、及び状態、並びに投与経路などの因子を考慮して、医学分野又は獣医学分野の当業者によく知られている用量及び技法で投与することができる。上記組成物は単独で投与することもでき、或いは組成物、例えば、「他」の免疫学的組成物、又は弱毒化、不活化、若しくは遺伝子組換え型のワクチン若しくは治療組成物と共に同時投与又は逐次投与して、それによって本発明の多価組成物、若しくは「カクテル」組成物、若しくは混合組成物、又はそれらを用いた方法を提供することもできる。上記組成物は、ＦＣＶ成分と、１つ又は複数の無関係のネコ病原体ワクチン（例えば、対象とする１つ又は複数のエピトープ、１つ又は複数の抗原及び／又はベクター、或いは組換え体ウイルスなどのウイルス）との組合せを含有するものでもよい。この場合も、投与の成分及び方法（逐次投与、同時投与）、並びに用量は、年齢、性別、体重、種、及び投与経路などの因子を考慮して決定することができる。
【００６０】
本発明の組成物の例には、懸濁液など、粘膜投与用、例えば経口投与用、鼻腔投与用、眼投与用などの液体調製物、並びに、無菌懸濁液又は乳剤など、非経口投与用、皮下投与用、皮内投与用、筋肉内投与（例えば注射投与）用の調製物が含まれる。そのような組成物中では、ＦＣＶを、滅菌水、生理食塩水、又は同様のものなど、適当な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合することができる。上記組成物は、凍結乾燥することもできる。上記組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、保存剤、及び同様のものなど、補助物質を含有し得る。
【００６１】
本発明の免疫原性組成物及びワクチンをアジュバントで補足するために、（１）水酸化アルミニウム、又は（２）アクリル酸若しくはメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸の重合体、及びアルケニル誘導体の重合体をアジュバントとして用いること、或いは（３）免疫原性組成物又はワクチンを水中油型乳剤の形態、より詳細には、p 147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995に記載の乳剤ＳＰＴＭ、及び同書ｐ１８３に記載の乳剤ＭＦ５９の形態に処方することができる。
【００６２】
上記水中油型乳剤は、詳細には、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアラン、スクワレンなどのイソプレノイド油；アルケン、詳細にはイソブテン又はデセンのオリゴマー形成の結果に生じる油；直鎖アルキル基を含有する酸エステル又はアルコール、より詳細には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）、プロピレングリコールジオレイン；分岐脂肪族アルコール又は酸エステル、詳細にはイソステアリン酸エステルをベースにしたものでよい。上記の油は、乳剤を形成させるために乳化剤と併用される。乳化剤は、非イオン性界面活性剤、より詳細にはソルビタン、マンナイド、グリセロール、ポリグリセリン、プロピレングリコールのエステル、及び場合によってはエトキシ化されている、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、又はヒドロキシステアリン酸のエステル、及びポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、詳細にはPluronic（登録商標）共重合体、特にL121であることが好ましい。
【００６３】
好ましいアジュバント化合物は、架橋、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルの架橋を有するアクリル酸又はメタクリル酸の重合体である。これらの化合物は、カルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者ならば、米国特許第２９０９４６２号（参照により本明細書に組み込まれている）を参照することができる。この開示は、少なくとも３つ、好ましくは８つ以上のヒドロキシ基を有し、上記少なくとも３つのヒドロキシ基の水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されているポリヒドロキシル化化合物で架橋されたそのようなアクリル重合体について記載する。好ましい官能基は、２〜４個の炭素原子含有するもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン不飽和基である。上記不飽和基は、それ自体で、メチルなどの他の置換基を含有してもよい。とりわけ、Carbopol（登録商標）（米国オハイオ所在BF Goodrich社製）という名で販売されている商品が適している。それらは、アリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されている。それらの中でも、Carbopol（登録商標）974P、934P、及び971Pを挙げることができる。
【００６４】
無水マレイン酸及びアルケニル誘導体の共重合体の中でも、共重合体ＥＭＡ（登録商標）（Monsanto社製）が好ましい。これは、無水マレイン酸及びエチレンの線状共重合体若しくは架橋共重合体、例えば、ジビニルエーテルで架橋された共重合体である。参照により本明細書に組み込まれている、J. Fields et al.を参照することができる。
【００６５】
それらの構造の観点からは、上記アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、及び共重合体ＥＭＡ（登録商標）は、下記の化学式を基本単位にして形成されていることが好ましい。
【００６６】
【化１】
2008528504.tif 000003
【００６７】
式中、
−  Ｒ１及びＲ２は、同じ又は異なっており、Ｈ又はＣＨ３を表し、
−  ｘ＝０又は１、好ましくはｘ＝１、
−  ｙ＝１又は２、かつｘ＋ｙ＝２である。
【００６８】
共重合体ＥＭＡ（登録商標）では、ｘ＝０、かつｙ＝２である。カルボマーでは、ｘ＝ｙ＝１である。
【００６９】
これらのポリマーを水に溶解させると、酸性溶液が生じ、これは、アジュバント溶液を得るために、好ましくは生理的ｐＨに中和されるであろう。そして、このアジュバント溶液にワクチンそれ自体が組み込まれるであろう。中和によって、重合体のカルボキシル基は部分的にＣＯＯ−の形態になる。
【００７０】
本発明によるアジュバントの溶液、特にカルボマーは、蒸留水中に、好ましくは塩化ナトリウムの存在下で調製することが好ましく、得られる溶液は酸性のｐＨとなる。望ましい量（所望の最終濃度を得るために）、又はそのかなりの部分であるＮａＣｌ含有水、好ましくは生理的食塩水（ＮａＣｌ  ９ｇ／ｌ）に、この保存液を、いくつかの部分ですべて同時に添加することによって、これを希釈し、それと同時に、若しくはそれに続いて、好ましくはＮａＯＨで中和する（ｐＨ７．３〜７．４）。生理的なｐＨであるこの溶液は、ワクチンを混合するのにそのまま使用されるであろう。それを、とりわけ、凍結乾燥形態、液体形態、又は凍結形態で保存することができる。
【００７１】
最終ワクチン組成物の重合体濃度は、０．０１％〜２％ｗ／ｖ、より詳細には０．０６〜１％ｗ／ｖ、好ましくは０．１〜０．６％ｗ／ｖであろう。
【００７２】
参照により本明細書に組み込まれている"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985などの標準的教科書を参考にして、過度の実験をせずに、適した調製物を調製することができる。
【００７３】
本発明では、様々な投与経路用の形態にある組成物が想定されている。この場合もまた、投与の有効量及び経路は、そのネコの年齢、性別、体重、状態、及び性質などの既知因子によって、そしてＬＤ５０、及び既知であり、かつ過度の実験を必要としない他のスクリーニング手順によって決定される。各活性物質の用量は、本明細書で引用された文書（又は本明細書で引用された文書で参照又は引用された文書）の通りでよく、かつ／又は、サブユニット免疫原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物では、１若しくは数μｇ〜数百若しくは数千μｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇの範囲；そして、不活化免疫原性組成物、免疫学的組成物、若しくはワクチン組成物では、１０４〜１０１０  ＴＣＩＤ５０、有利には１０６〜１０８  ＴＣＩＤ５０の範囲であり得る。
【００７４】
本発明による同じＦＣＶ株及び／又は本発明による異なったＦＣＶ株の不活化ウイルスと、サブユニットとを混合することも当然可能である。
【００７５】
本発明によるＦＣＶワクチンは、使用する直前にネコにおける他の結合価（複数でもよい）と混合でき、前記結合価は、弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、組換え体ワクチン、又はポリヌクレオチドワクチンの形態であり得る。
【００７６】
しかし、適した免疫学的反応を引き出す組成物の用量及びその中の成分の濃度、並びに組成物を投与するタイミングは、血清の抗体力価測定などの方法によって、例えばＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和アッセイ分析によって決定できる。そのような測定は、当業者の知識、この開示、及び本明細書に引用された文書に基づき、過度の実験を必要としない。また、逐次投与の回数も同様に、この開示及び当技術分野における知識から確定できる方法を用いて、過度の実験をせずに、確定することができる。
【００７７】
一実施形態では、免疫化の方法は、本発明によるサブユニット又は不活化多価混合ＦＣＶワクチンをネコに投与するステップを含む。前記ワクチンの投与は、詳細には非経口経路によって、好ましくは皮下経路又は筋肉内経路によって実施できる。
【００７８】
例えば、希釈剤で再構成された凍結乾燥成分を含むワクチンを用いて、ＦＣＶによる疾患を予防するために、週齢６週以上の健康なネコを免疫化することができる。１ｍｌ用量を筋肉内又は皮下に注射することができる。初回ワクチン接種には、例えば、初回投与の３〜４週間後に、追加免疫を与えることができる。当業者ならば、過度の実験をせずに適切な投与計画を決定できる。例えば、週齢１２週未満のネコには、３〜４週間毎に再接種して、週齢１２週以上のときに最終投与を与えることができる。初回ワクチン接種の後には、追加免疫を毎年与えることができる。
【００７９】
したがって、本発明の別の実施形態は、免疫原性組成物又はワクチン組成物を少なくとも１回投与するステップを含む、ＦＣＶに対してネコ免疫化する方法である。別の実施形態では、免疫原性組成物又はワクチン組成物を少なくとも２又は３又は４回以上投与できる。
【００８０】
当業者ならば、各ワクチン接種プロトコールに使用されるべき注射の回数及び各ワクチンの用量を正確に決定するのに必要な能力を有する。例えば、一実施形態では、投与容積が、詳細には０．２〜２ｍｌであり得、好ましくは１ｍｌ程度である。
【００８１】
別法では、経皮送達（皮内送達、皮下送達、及び場合によっては筋肉内送達）に、無針注射器を用いることができる。投与容積は０．１ｍｌ〜１ｍｌの間でよい。
【００８２】
適した用量は、下記の実施例に基づいたものであり得る。
【００８３】
本発明の一実施形態では、上記免疫原性組成物又はワクチン組成物が不活化ＦＣＶを含む。したがって、本発明は、不活化剤に曝露され、かつ直鎖アルキルＣ１−Ｃ５鎖の形をなす安定化アルデヒド化合物に曝露されたＦＣＶを含む、アジュバントを含まない不活化ＦＣＶ免疫原性組成物又はワクチンに関し、上記アルデヒド化合物は、上記鎖がＣ１である場合には１つのアルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５である場合には２つの末端アルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５鎖である場合、アルデヒド基の１つが、場合によってはセトン又はエポキシ基によって置換されていてもよく、上記免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥形態、又は獣医学的に許容される賦形剤若しくは媒体中の液体形態にある。
【００８４】
定義上、不活化剤は、そのウイルスの免疫原特性に実質的に影響を与えずに、主としてウイルス核酸との不可逆反応によって、ウイルスの増殖を阻止できる薬剤である。不活化剤の好ましい例は、エチレンイミン及びアミド誘導体（例えばアセチルエチレンイミン）、プロピレンイミン、β−プロピオラクトンである。好ましい実施形態では、不活化剤がエチレンイミンである。
【００８５】
好ましい実施形態では、エチレンイミンの作用によって、ＦＣＶが不活化される。エチレンイミンの最終濃度は約０．５ｍＭ〜約２０ｍであり、好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭである。温度は、約２℃〜約４０℃であり、好ましくは約５℃〜約３０℃であり得る。
【００８６】
安定化アルデヒド化合物は、タンパク質のアミノ基（例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジンアミノ酸のアミノ基）及び水酸基（例えばチロシンアミノ酸の水酸基）に作用し、２つのタンパク質間及び／又はタンパク質内部の連結を形成し得る。安定化アルデヒド化合物は、ホルムアルデヒド（すなわちメタナール）、グリシドアルデヒド（すなわち２，３−エポキシ−１−プロパナール）、グルタルアルデヒド（すなわち１，５−ジアル−ペンタン）、グリオキサール（すなわち１，２−ジアル−エタン）、及びメチルグリオキサール（すなわちピルブアルデヒド）からなる群から選択されることが好ましい。好ましい実施形態では、安定化アルデヒド化合物がホルムアルデヒドである。
【００８７】
不活化及び／又は安定化を終了した後に、当業者に知られている技法を用いて、例えばチオール基を含む中和化合物（例えば、チオ硫酸塩、システイン）を添加することによって、不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物を中和することが可能である。
【００８８】
当業者に知られている技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖勾配上の超遠心分離、塩化セシウム勾配上の超遠心分離、又は選択的沈殿、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿を用いて、不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物を除去することが可能である。
【００８９】
安定化条件（温度、安定化アルデヒド化合物の濃度、及び処理時間）を調整するために、ＦＣＶビリオンの定量を行うことができる。ビリオンの定量化を可能にする任意の適切な技法、例えばＦＣＶキャプシドタンパク質に特異的なモノクローン抗体又はポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用できる。ＥＬＩＳＡによる定量化の前に、当業者に知られている技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖勾配上の超遠心分離、塩化セシウム勾配上の超遠心分離、選択的な沈殿、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿を用いて、処理されたウイルス培養物からビリオンを単離する。
【００９０】
ホルムアルデヒドを用いる場合：
−最終濃度は、約０．０５ｇ／ｌ〜約０．８ｇ／ｌであり得、好ましくは約０．０７５ｇ／ｌ〜約０．６ｇ／ｌ、より好ましくは約０．１ｇ／ｌ〜約０．５ｇ／ｌである。
−温度は約２℃〜約３７℃であり得、好ましくは約２℃〜約２２℃、より好ましくは約４℃〜約７℃である。
【００９１】
本発明の一実施形態では、上記免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥された安定化及び不活化ＦＣＶと、凍結乾燥された賦形剤、例えばアミノ酸、例えばグルタミン酸、糖質、例えばラクトース、及びこれらの混合物、例えばＳＰＧＡ（ショ糖／リン酸／グルタミン酸／アルブミン；欧州特許第０４９６１３５号）とを含む。別の実施形態では、上記免疫原性組成物又はワクチンが液体であり、生理的溶液又は緩衝液中にＦＣＶを含む。
【００９２】
本発明の別の実施形態は、ＦＣＶを不活化剤、及び直鎖アルキルＣ１−Ｃ５鎖の形をなす安定化アルデヒド化合物と反応させることを含む、不活化及び安定化されたＦＣＶを産生する方法であり、上記アルデヒド化合物は、上記鎖がＣ１である場合には１つのアルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５である場合には２つの末端アルデヒド基を含み、上記鎖がＣ２−Ｃ５鎖である場合、アルデヒド基の１つが、場合によってはセトン又はエポキシ基によって置換されていてもよい。不活化剤及び安定化アルデヒド化合物、並びにそれらの使用条件に関する好ましい実施形態は上述されている。
【００９３】
本発明の方法は、ＦＣＶの培養、並びに不活化剤及び安定化アルデヒド化合物での処理を含む。安定化アルデヒド化合物の添加は、不活化ステップの前、実行中、又は後に行うことができる。不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物の中和は上述の通りに実施できる。
【００９４】
安定化及び不活化されたＦＣＶビリオンは、従来の濃縮法によって、例えば限外濾過でによって濃縮することができ、その後、場合によっては従来の精製手段、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖勾配上の超遠心分離、塩化セシウム勾配上の超遠心分離、又は例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下での選択的沈殿によって精製する。不活化及び安定化されたＦＣＶは約５℃で保存できる。
【００９５】
本発明のさらに別の実施形態として、本明細書に記載のいかなる免疫原性組成物又はワクチン組成物も、不活化されたＦＣＶを含むことができ、上記ＦＣＶは、本明細書に記載のいかなる方法を用いて不活化されたものでもよいことを理解されたい。
【００９６】
本発明のさらに別の実施形態では、別々に包装された、本発明によるＦＣＶ結合価と、別のネコ病原体用の少なくとも１結合価とを、好ましくはアジュバントを含む獣医学的に許容される媒体又は賦形剤中に含む多価ワクチン接種キット若しくはボックスを提供する。上記ＦＣＶ結合価は、別のネコにおける結合価、詳細には、凍結乾燥された形態で準備されている弱毒化、組換え体、又はポリヌクレオチド結合価の溶媒として働き得る。
［実施例］
【実施例１】
【００９７】
（ウイルス単離株及びハイブリドーマ）
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、ネコカリシウイルスへの感染の徴候を示しているネコにおける咽頭スワブによって得た。これらのＦＣＶは、地理的に様々な出自を有する。
【００９８】
ＦＣＶ４３１、３３７、Ｊ５、３８８ｂ、２２０、及び３９３株は、英国で単離され、University of Glasgow（英国）のProfessor O. Jarrettによって提供された。
【００９９】
ＦＣＶ  Ａ２、Ｇ１、Ｇ３、Ｆ３０３１、Ｆ１、Ｈ３−２、及びＨ１−４株は仏国で本発明者によって単離された。
【０１００】
ＦＣＶ  ＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７、及びＦＭＩ９株は米国で本発明者によって単離された。
【０１０１】
咽頭試料は、５％ウシ胎仔血清（Bayer Diagnostic社製）及び抗生物質、より詳細には５０ｍｇ／ｌゲンタマイシンで補足されたダルベッコ修正イーグル最少培地（ＤＭＥＭ、Gibco BRL社製）２ｍｌ中に収集した。各単離株は、試験までの待ち時間の間、−７０℃で冷凍される。431 2 0 17 E9 Tと特定されるハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体４４は、ＦＣＶ４３１株に特異的である。
【実施例２】
【０１０２】
（ウイルス単離株の増殖）
ネコ腎臓細胞系（Crandell-Reeseネコ腎臓、すなわちＣＲＦＫ、番号ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９４、Crandell et al. In Vitro 1973.9. 176-185）を１ｍｌあたり約１０００００の細胞を含有している、５％ウシ胎仔血清で補足されたＤＭＥＭを含有する９６ウェルプレート又は２５ｃｍ２Falcon（Falcon社製）中で培養した。上記細胞は、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養した。３日後に、細胞層が集密状態になった。その後、５０ｍｇ／ｌゲンタマイシンで補足された無血清ＤＭＥＭ培地で培地を置換し、解凍されたＦＣＶウイルス単離株（実施例１）のアリコートを、ＦＣＶウイルスの限界希釈クローニングには１ウェルあたり容積１００μｌの４倍連続希釈という割合、或いはFalcon １本あたり１ｍｌという割合で添加する。
【０１０３】
細胞変性効果（ＥＣＰ）が完全になったときに（培養開始後２４〜４８時間）、ウイルス懸濁液を採取して、−７０℃で冷凍する。ウイルスバッチの産生には、通常、３〜４回の連続継代が必要である。ウイルスバッチは−７０℃で保存される。
【実施例３】
【０１０４】
（血清の作製）
各ＦＣＶウイルスについて、１０６．０  ＣＣＩＤ５０の適切なＦＣＶウイルスを口腔鼻経路で子ネコに接種することによって、抗血清を産生させた。特定病原体不在（ＳＰＦ）子ネコは、週齢１０〜１４週であった。感染の１カ月後に各動物の血清を収集した。上記血清を熱不活化（５６℃で３０分間）し、分配及び分注して、−２０℃で保存した。
【実施例４】
【０１０５】
（インビトロ交差血清中和）
ネコカリシウイルス感染の徴候を示すネコで行った咽頭スワブによって得られた１８株の野外単離株の間で交差血清中和試験を行った。それらのうち７株は仏国を地理的な出自としており、それらは、単離株Ａ２、Ｆ３０３１、Ｇ１、Ｇ３、Ｆ１、Ｈ３−２、及びＨ１−４と同定されている。４株は英国を地理的な出自としており、それらは単離株Ｊ５、３３７、３８８ｂ、及び４３１と同定されている。最後に、７株は米国を地理的な出自としており、それらは単離株ＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７、及びＲＭＩ９と同定されている。
【０１０６】
各単離株に関して得られた血清（実施例３）を、それらが上記１８株の単離株を中和する能力について試験した。９６ウェル細胞培養プレート中で、ＤＭＥＭ培地を用いて、上記血清を３倍に連続希釈した。約１００  ＣＣＩＤ５０の選択されたウイルス株を含有する０．０５ｍｌの培地を、実施例２にある通りに産生された０．０５ｍｌの希薄血清に添加した。この混合物を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下にあるインキュベーター内で、３７℃、２時間、インキュベートした。
【０１０７】
その後、各混合物に、１ｍｌあたり約１０００００の細胞を含有するＣＲＦＫ細胞懸濁液０．１５ｍｌを添加した。５％ＣＯ２を含有する雰囲気中、３７℃で、４日間培養した後、位相差顕微鏡法によって細胞変性効果を観察した。各血清の中和力価は、Karber法に従って計算した。力価は、そのウェルの５０％で細胞変性効果を阻害する最も高い希釈率という形態で得られる。力価はｌｏｇ１０で表す。したがって、得られた最小の力価は、０．７  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０であった。各血清は、少なくとも２回、好ましくは３回力価決定した。
【０１０８】
図１は、これらの１８株のＦＣＶ株と、これらの１８種類の血清との間で行われた交差血清中和で得られた全中和力価を示す。
【実施例５】
【０１０９】
（間接的免疫蛍光（ＩＩＦ）試験）
試験するＦＣＶウイルスに感染している単層培養中で培養されたＣＲＦＫ細胞を含有する９６ウェルプレート上でＩＩＦ試験を行った。
【０１１０】
５％ウシ胎仔血清を含有するＦ１５培地（Gibco BRL社製、Cat #045-1075）中に９００００細胞／ｍｌを含有する、１ウェルあたり２００μｌのＣＲＦＫ細胞懸濁液を９６ウェルプレート中で培養する。集密状態になったときに、３２０  ＣＣＩＤ５０のＦＣＶを１００μｌのＦ１５培地に接種する。最初のＣＰＥ病巣が現れたときに、カルシウムもマグネシウムも含まない冷ＰＢＳ（ＰＢＳ、Sigma社製）で細胞をリンスし、５％ｖ／ｖの水を含有する冷アセトンを用いて、−２０℃で３０分間固定する。乾燥させた後、感染され、固定された細胞を、ウェルあたり１００μｌの、抗ＦＣＶ４３１モノクローナル抗体４４に対応する腹水（ハイブリドーマ431 2 0 17 E9 T、５０ｍＭ、約ｐＨ７．６のＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液中に約１／５０００倍希釈）と、３７℃で３０分間接触させる。
【０１１１】
ＰＢＳ中で２回リンスした後に、５０ｍＭ、ｐＨ７．６のＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液中に１／１５０倍希釈したフルオレセインイソシアネート結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Biosys社製、２ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合抗体）と、同じ条件下でインキュベーションすることによって抗体の結合を可視化する。測定は、ＵＶ光の下に光学顕微鏡で行った。
【０１１２】
このモノクローナル抗体を、上記パネルの単離株それぞれに関して試験した。それは、ＦＣＶ４３１に感染したＣＲＦＫ細胞のみに排他的に結合した。
【０１１３】
この試験は、ＦＣＶ４３１株の等価物を判定するのに用使用できる。これらの等価物は、モノクローナル抗体４４が結合するものである。
【０１１４】
モノクローナル４４は、中和抗体であり、かつ立体配座抗体であること、及び中和が防御と相関していることが知られている。図２は、抗ｐ６６（ＦＣＶ４３１）モノクローナル抗体の使用による、単離株のＩＦＡプロフィールを示す。モノクローナル抗体４４はＦＣＶ４３１に特異的である。
【実施例６】
【０１１５】
（相乗作用）
週齢約９週のワクチン非接種の３２匹のＳＰＦ子ネコを無作為化により、子ネコ各８匹の４群に分け（Ａ〜Ｄと特定される）、各群を分離した箱の中で飼育した。
【０１１６】
ウイルス懸濁液を解凍し（実施例２）、ＰＢＳで希釈した後、所望の力価を得るために、Ｂ群では１０３．３  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶ  Ｇ１接種物１ｍｌの皮下注射、Ｃ群では１０３．５  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶ４３１接種物１ｍｌの皮下注射、Ｄ群では、１０３．３  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶ  Ｇ１接種物０．５ｍｌ及び１０３．５  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶ４３１接種物０．５ｍｌ（異なった注射部位に）の皮下注射によってネコにワクチン接種する。Ａ群は対照群とする。
【０１１７】
Ａ〜Ｄの各群の半分を、２つの第１群及び２に無作為に配属し、別々の箱で飼育する。ワクチン接種後の３１日目（ｄ３１）に動物を抗原曝露する。
【０１１８】
第１群の動物は、１０７．２  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有する抗原曝露ウイルス株ＦＣＶ２２０  １ｍｌを口腔鼻経路（０．５ｍｌを経口経路によって、各鼻孔に０．２５ｍｌ）で投与することによって抗原曝露する。
【０１１９】
第２群の動物は、１０５．８  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有する抗原曝露ウイルス株ＦＣＶ３９３  １ｍｌを口腔鼻経路（０．５ｍｌを経口経路によって、各鼻孔に０．２５ｍｌ）で投与することによって抗原曝露する。
【０１２０】
高病原性株ＦＣＶ２２０及び３９３は、交差血清中和で、ウイルス株ＦＣＶ  Ｇ１及び４３１から疎遠であるので、これらの株を選択した。
【０１２１】
２つの箱の間におけるいかなる交差汚染も慎重に回避する。両群の動物の臨床モニタリングは、動物の直腸温測定及び臨床検査（一般的状態、舌及び口蓋における潰瘍の存在、歯肉炎の存在、鼻炎の存在、結膜炎の存在、跛行の存在、動物の死）によって行う。
【０１２２】
各動物の総臨床スコアは、下記も尺度に従って、各群の臨床徴候に関して得られたスコアを加算することによって計算した。すなわち、
−直腸温度：
０−３９℃未満。
１−３９℃以上かつ３９．５℃未満。
２−３９．５℃以上かつ４０℃未満。
３−４０℃以上。
−一般的状態：
０−正常な行動
１−疲労困憊
−舌及び口蓋の潰瘍（潰瘍がいくつかある場合にはすべての潰瘍のうち一部のものの直径）：
０−潰瘍は存在しない
１−直径１〜５ｍｍ
２−直径６〜１０ｍｍ
３−直径１０ｍｍ超
−歯肉炎：
０−歯肉炎は存在しない
１−歯肉炎
−鼻炎：
０−鼻炎は存在しない
１−漿液性鼻漏を伴った鼻炎
２−粘液性から粘液膿性の鼻漏を伴った鼻炎
−結膜炎：
０−結膜炎は存在しない
１−漿液性漏出を伴った結膜炎
２−粘液膿性漏出を伴った結膜炎
−跛行：
０−跛行は存在しない
１−跛行
−死亡：
０−生存
５−死亡。
【０１２３】
得られた平均臨床スコアは以下の通りである。
【０１２４】
【表１】
2008528504.tif 000004
【０１２５】
したがって、得られた結果は、最良株で得られた平均値と、２つの株の併用によって得られた値と間の有意な相違によって、ＦＣＶ  Ｇ１株とＦＣＶ４３１株との間で相乗作用があることを示す（Kruskal-Wallis検定）。
【実施例７】
【０１２６】
（不活化ワクチンの製造）
２リットルローラーフラスコ（８５０ｃｍ２）内、２．５％ラクトアルブミン加水分解産物（Gibco BRL社製）及び５％ウシ胎仔血清（Gibco BRL社製）で補足された変法イーグル培地（ＭＥＭ、Gibco BRL社製）中、３７℃でＣＲＦＫ細胞を培養する。ローラーフラスコ１本あたり、約１０００００細胞／ｍｌを含有しているＭＥＭ培地中の細胞懸濁液３００ｍｌを添加する。３日後に、細胞層が集密状態になる。その後、細胞培養培地を無血清ＭＥＭで置換し、０．５  ＣＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）でＦＣＶウイルスを添加する。ウイルス培養物は、細胞叢全体に細胞変性効果が得られるまで、３７℃で２４〜４８時間維持する。ウイルス懸濁液を採取し、１．５μｍの孔を有するバッグフィルターで清澄化する。採取されたＦＣＶウイルスの力価は、８．５＋／−０．３  ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０／ｍｌである。
【０１２７】
濃度約８ｍＭのエチレンイミンを用いて、２２℃で１８時間かけてウイルスを不活化する。
【０１２８】
エチレンイミンは、２００ｍｌの蒸留水に２８ｇの水酸化ナトリウムペレットを溶解させ、約１．２Ｍの溶液に相当する６８．１ｇのブロモエチルアミン（ＢＥＡ）を添加することによって、使用する直前に調製する（H. Bahnemann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56）。不活化ウイルス懸濁液は、１００ｋＤａのカットオフを有するUltrasette型の限外濾過カートリッジ（Filtron社製）で１００倍に濃縮し、その後、−７０℃で冷凍する。
【０１２９】
解凍後の不活化ウイルス懸濁液は、ＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ  ８ｇ／ｌ；ＫＣｌ  ０．２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ／ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４，２Ｈ２Ｏ  １．４４ｇ／ｌ）中に１／３３倍希釈する。ワクチンを同様にして調製する。すなわち、不活化ウイルスの希釈液からなる１６７ｍｌの水相を、７％ｗ／ｖの無水マンニトールオレイン酸、８％ｗ／ｖの平均１１分子のエチレンオキシド（ＥＯ）を含有するエトキシ化オレイン酸、及び８５％ｖ／ｖの軽質流動パラフィン油（欧州薬局方型）を含有している８３ｍｌの油相中に、Silverson社製タービン乳化剤の補助を用いて、３２℃で２分間乳化する。その後、ワクチンは５℃で保存する。
【０１３０】
ワクチンを調製する別法の１つは、５％ｗ／ｖスクアラン、２．５％ｗ／ｖ Pluronic（登録商標）L121、０．２％ｗ／ｖ Tween 80、及び９２．３％ｖ／ｖの、解凍後にＰＢＳ緩衝剤中に１／４６倍希釈した不活化ウイルス懸濁液の混合物を、Ｙ１１０型高圧ホモジナイザ（Microfluidics社製）に圧力６００バール、温度３０〜４０℃で３回通過させることによって乳剤を形成させるものである。その後、ワクチンは５℃で保存する。
【０１３１】
もう１つの別法は、生理食塩水（ＮａＣｌ  ９ｇ／ｌ）中に０．４％ｗ／ｖ Carbopol（登録商標）974Pを含有する溶液を調製するものである。ｐＨは、水酸化ナトリウムで７．３〜７．４に調整する。その後、このCarbopol（登録商標）溶液を、解凍後に１／２５倍希釈した不活化ＦＣＶウイルスの懸濁液と１対１で混合する。その後、ワクチンは５℃で保存する。
【０１３２】
乳剤の水相又はCarbopol（登録商標）と混合される水相は、ＦＣＶ４３１株、又はＦＣＶ  Ｇ１株、又はＦＣＶ４３１株及びＧ１株の１対１混合物に相当する濃縮不活化ウイルス懸濁液のＰＢＳ希釈液からなる。
【実施例８】
【０１３３】
（不活化ＦＣＶ４３１の免疫原性）
週齢９週のワクチン非接種のＳＰＦ子ネコ１９匹を無作為化により２群に分ける（Ａ及びＢと同定される）。第１群は１２匹の子ネコを有し、第２群は７匹の子ネコを有し、各群は分離した箱の中で飼育する。
【０１３４】
ワクチンは、実施例７に記載の通り、無水マンニトールオレイン酸、エトキシ化オレイン酸、及び軽質流動パラフィン油で構成されているアジュバントと合わせて調製する。
【０１３５】
Ａ群では、１０７  ＣＣＩＤ５０／ｍｌのＦＣＶ４３１接種物１ｍｌを皮下注射することによって、ネコに２回ワクチン接種する（Ｄ０及びＤ２８）。Ｂ群は対照群とする。
【０１３６】
これらの動物は、最初のワクチン接種の４２日後（Ｄ４２）に、１０６  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの力価を有する抗原曝露ウイルス株ＦＣＶ４３１  １ｍｌを口腔鼻経路（０．５ｍｌを経口経路によって、各鼻孔に０．２５ｍｌ）で投与することによって抗原曝露する。
【０１３７】
抗ＦＣＶ４３１中和抗体レベル及び臨床スコアをモニターした。各動物の総臨床のスコアは、実施例６で示した尺度に従って、臨床徴候に関して各群で得られたスコアを加算することによって計算した。
【０１３８】
得られた結果は以下の通りである。
【０１３９】
【表２】
2008528504.tif 000005
【０１４０】
【表３】
2008528504.tif 000006
【０１４１】
これらの結果は、同種抗原曝露に対する優れた臨床の防御及び良好な血清転換を示す。
【実施例９】
【０１４２】
（不活化及び安定化されたＦＣＶ１００８６９ウイルスの調製）
ＣＲＦＫ細胞（Crandell-Reeseネコ腎臓細胞、アクセッション番号ＣＣＬ−９４で、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手可能）を、３７℃、ｐＨ７．２、３０％酸素、及び５０ｒｐｍ（毎分回転数）のバイオジェネレーター（biogenerator）中で培養した。培地は、５％ウシ胎仔血清で補足され、１．５ｇ／ｌのCytodex 1マイクロキャリアを添加した変法イーグル培地（ＭＥＭ、Gibco BRL社製）で構成されていた。この培養物に、上記細胞を最終密度０．２  １０６細胞／ｍｌで導入した。
【０１４３】
４日後に、撹拌を停止し、デカンテーションによって、マイクロキャリアを分離した。細胞培養培地を無血清ＭＥＭで置換し、０．５  ＣＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）で株１００８６９ＦＣＶウイルスを添加した。このウイルス培養物を、細胞変性効果が得られるまで、３７℃、ｐＨ７．２、３０％酸素、及び５０ｒｐｍに１８時間維持した。
【０１４４】
この懸濁液を１０℃まで冷却し、激しく撹拌した後、撹拌を停止し、デカンテーションによって、マイクロキャリアを分離し、除去した。
【０１４５】
ウイルス懸濁液を採取し、１．５μｍの孔を有するフィルターで清澄化した。
【０１４６】
濃度８ｍＭのエチレンイミンを用いて、２２℃で１８時間かけてウイルス懸濁液を不活化した。エチレンイミンは、２５７．５ｍｌの蒸留水に３６ｇの水酸化ナトリウムペレットを溶解させ、約１．２Ｍの溶液に相当する、８７．５ｇのブロモエチルアミン（ＢＥＡ）を添加することによって調製した。
【０１４７】
１８時間のインキュベーション時間の終わりに、最終濃度０．５ｇ／ｌのホルムアルデヒドを添加し、１０℃で、２４時間撹拌することによって、不活化ウイルス懸濁液を安定化させた。
【０１４８】
不活化及び安定化されたウイルス懸濁液は、１５０ｋＤａカットオフ膜で約１２回、限外濾過を行うことによって濃縮した。
【０１４９】
不活化、安定化、及び濃縮したウイルス懸濁液を、カルシウム及びマグネシウムを含有しない、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む添加緩衝液及び溶出緩衝液を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィー（６ＦＦセファロースを充填したＢＰＧ１００／９５０カラム）によって精製した。
【０１５０】
ウイルス画分は、限外濾過によって、約１００ｋＤａカットオフ膜で約１００倍に濃縮した。
【実施例１０】
【０１５１】
（インビトロ交差血清中和）
実施例４で上述したものと同じ技法を用いて、交差血清中和試験を行った。この交差血清中和試験は、合計５１株のネコカリシウイルスの間で行った。これらの株には、
・すべて仏国由来の株である、Ａ２、Ｆ１、Ｇ１、Ｈ３−２、Ｇ３、Ｆ３０３１、Ｈ１−４、及びＦ３と、
・すべて英国由来の株である、３８８ｂ、４３１、４１９、３３７、Ｊ１、Ｊ５、２２０、及び３９３と、
・すべて米国由来の株である、ＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ４、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７、ＲＭＩ８、ＲＭＩ９、９８Ａ−１３４４５、９８Ａ−４４１７、９８Ａ−４９５２９、９８Ａ−４５６８、９６８３８４−９７、３１３８３−９７、９８Ａ−４６２６０、９４１４２１−９６、９８Ａ−８１０７、９８Ａ−４９５２６、９３１８２−９８、９８Ａ−１０３０５、９８Ａ−４９０５２と、
・すべて米国由来の株であり、高病原性であると考えられている、９４５８０、３３５８５−１、８９３９１、８８２８７、１００８６９−１と
が含まれる。
【０１５２】
血清は、各単離株の生存株で免疫化した後のネコから得た。血清は、市販のワクチン、より詳細には株２５５及びＦ９を用いたものを接種した後にも得た。
【０１５３】
これらの血清を、上記５１株の単離株を中和する能力について試験した。９６ウェル細胞培養プレート中で、ＤＭＥＭ培地を用いて、上記血清を３倍に連続希釈した。約１００  ＣＣＩＤ５０の選択されたウイルス株を含有する０．０５ｍｌの培地を、０．０５ｍｌの希薄血清に添加した。この混合物を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下にあるインキュベーター内で、３７℃、２時間、インキュベートした。
【０１５４】
その後、各混合物に、１ｍｌあたり約１０００００の細胞を含有するＣＲＦＫ細胞懸濁液０．１５ｍｌを添加した。５％ＣＯ２を含有する雰囲気中、３７℃で、４日間培養した後、位相差顕微鏡法によって細胞変性効果を観察した。各血清の中和力価は、Karber法に従って計算した。力価は、そのウェルの５０％で細胞変性効果を阻害する最も高い希釈率という形態で得られる。力価はｌｏｇ１０で表す。したがって、得られた最小の力価は、０．７  ｌｏｇ１０  ＶＮ５０であった。各血清は、少なくとも２回、好ましくは３回力価決定した。
【０１５５】
中和力価の結果を図３に示す。株Ｇ１及び４３１は広範な交差中和を示し、それには、それぞれ、試験したすべての血清の９３％及び９８％の中和に成功したことが含まれていた。また、これらの株は、高病原性の米国株を含めた、すべての地理的な位置から得られた血清に関して、少なくともそれらの一部に対して中和に成功した。加えて、高病原性株９４５８０、８９３９１、８８２８７、及び１００８６９も広範な交差中和を示し、それらはそれぞれ、すべての株の１００％、８６％、１００％、及び９３％の中和に成功した。
【０１５６】
それぞれの株の交差血清中和活性を、全株、欧州株、及び米国株のパーセントとして比較する図及びグラフを図４に示す。図３及び４で示されている、Ｇ１、４３１、９４５８０、８９３９１、８８２８７、及び１００８６９を含めた株による広範な交差中和は、ＦＣＶ感染に対するワクチン調製物中で使用された場合、これらの株が極めて有効であり得ることを示している。
【実施例１１】
【０１５７】
（ＦＣＶ１００８６９に対するＭ７２５ワクチンの有効性）
週齢８週のＳＰＦ子ネコ５匹に、Ｄ０及びＤ２８にＲＭＢ７２５でワクチン接種した。ＲＢ７２５は、凍結乾燥されたペレットを再構成することによって得た。ＲＢ７２５は、ネコ鼻気管炎（弱毒化ＦＨＶ  Ｆ２株）、カリシウイルス感染（不活化ＦＣＶ  Ｇ１／４３１抗原）、クラミジア症（クラミジア・フェリス種（Chlamydophila felis）の弱毒化９０５株）、感染性汎白血球減少症（弱毒化ＰＬＩ  ＩＶ株）に対するワクチンを含み、ネコ白血病（カナリア痘ＦｅＬＶ＝ｖＣＰ９７）に対するワクチンを希釈剤としている。このワクチンは、各用量が２．６７  ｌｏｇ１０  ＥＬＩＳＡ単位のＦＣＶ４３１／Ｇ１抗原を含有するように構成されていた。
【０１５８】
Ｄ５６に、口腔鼻経路によって、ワクチン接種された子ネコ及び５匹の対照をＦＣＶ１００８６９に曝露した。ＦＣＶ１００８６９−１は、ワクチン株とは抗原性の異なる高病原性株である。抗原曝露株は、力価６．０〜６．５  ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０／ｍｌの懸濁液が得られるように生理食塩緩衝液（ｐＨ７．１５）で希釈した。
【０１５９】
抗原曝露後に、臨床徴候、ＦＣＶ排出、及びＥＬＩＳＡ抗体に関して、これらの子ネコをモニターした。臨床スコアは、European Pharmacopoeia Monograph No.1101に従って評価し、症状の強度を以下の通り定義した。
【０１６０】
【表４】
2008528504.tif 000007
【０１６１】
抗原曝露の２、４、６、８、１０、及び１４日後（すなわち、Ｄ５６、Ｄ５８、Ｄ６０、Ｄ６２、Ｄ６４、Ｄ６６、及びＤ７０）に咽頭スワブを収集した。スワブは、ウイルスの分離まで、抗生物質を豊富に含むＦ１５培地（３ｍＬ培地／スワブ）中に−７０℃で保存した。血液試料は、抗原曝露の日（Ｄ５６）及び１４日後（Ｄ７０）に、乾いたチューブの表面に取得した。血清は、ＦＣＶ抗体の力価測定まで−２０℃で保存した。
【０１６２】
抗原曝露後に、すべての対照ネコが臨床徴候を発症した。対象動物のすべてで、口腔鼻潰瘍（５匹のうち３匹の対照で大型かつ多数、そして、５匹のうち２匹の対照で小型かつ少数）及び３日間（５匹のうち１匹の対照）又は６〜８日間（５匹のうち４匹の対照）持続する鼻漏が観察された。眼漏は、１匹のネコで記録された。加えて、１匹の対照ネコが抑うつ状態を示した。
【０１６３】
対照的に、ワクチン接種されたネコは、より軽度な臨床徴候を示した。詳細には、５匹のうち２匹のワクチン接種されたネコが、小型の口腔鼻潰瘍を発症し、ワクチン接種された残りのネコでは、いかなる大きさの潰瘍も発症しなかった。また、ワクチン接種されたネコは、１〜２日間（５匹のうち３匹のワクチン接種動物）又は４〜６日間（５匹のうち２匹のワクチン接種動物）持続するわずかな鼻漏を発症した。ワクチン接種されたネコに、眼漏を発症したネコはいなかった。
【０１６４】
５匹のうち３匹の対照において、抗原曝露の１〜６日後に１〜５回の別々の機会で高熱症が記録された。対照的に、ワクチン接種されたネコには高熱症を患うネコはいなかった。図５に示す通り、対照動物ではＤ６１に高熱症がピークに達した。
【０１６５】
抗原曝露の１日前、並びに抗原曝露の４、８、１０、１２、及び１４日後（すなわち、Ｄ５５、Ｄ６０、Ｄ６４、Ｄ６６、及びＤ７０）に子ネコの体重を計量した。成長は抗原曝露にわずかにしか影響されておらず、正確な体重減少は、５匹のうち１匹のワクチン接種動物に対して、５匹のうち２匹の対照で記録された。平均では、対照動物の成長は、ワクチン接種動物の成長より遅かった。Ｄ７０におけるワクチン接種されたネコの平均体重は、体重が記録されなかった１匹のワクチン接種されたネコを除外したため、過小評価され、対照より低く現れた。それにもかかわらず、相対的な毎日体重増は、図６に示す通り、ワクチン接種動物の方が、対照より高かった（８．８対７．２）。
【０１６６】
すべての対照ネコが、Ｄ６０で高力価に達しＤ６２から観測期間の終わりまで低下するＦＣＶ排出を示した。ワクチン接種動物では、Ｄ５８にＦＣＶ排出がピークに達し、その後、低下し、Ｄ６４からは、Ｄ７０における１匹のネコを除いて、検出限界下になった。ウイルス排泄は、すべてのワクチン接種動物で観察されたが、２匹のワクチン接種動物では非常に低かった。平均では、図７に示す通り、対照におけるウイルス排出の方が、ワクチン接種動物より高く、より長期間持続した（曲線下面積の分散分析；ｐ＝０．００７）。
【０１６７】
ＦＣＶ抗体の産生に関してネコを評価し、ワクチン接種されたすべてネコでは２回目の注射の後にＦＣＶ抗体が産生されたが、対照では血清陰性のままであったと判定した。抗原曝露は、ワクチン接種では追加免疫効果を誘導し、対照ネコではＦＣＶ抗体の産生を誘導した。抗原曝露後における、群あたりの平均ＦＣＶ抗体力価を図８に示す。
【０１６８】
総合的には、対照群の平均総合スコア（２７．８）は、ワクチン接種群のスコア（６）より高かった（４．６×）（分散分析；ｐ＝０．０１）。この相違は、主として口腔鼻潰瘍に連結するものであり、対照における口腔鼻潰瘍は、ワクチン接種動物よりはるかに重度であった。加えて、図９に示す通り、他のすべての臨床パラメータ（一般的状態、体重減少、高熱症、鼻漏、及び眼漏）のスコアも、ワクチン接種動物より、対照の方が高かった。したがって、ＲＭＢ７２５ワクチンは、ワクチン接種されたネコを、ＦＣＶ１００８６９−１での抗原曝露から防御するのに成功したと結論することができる。
【実施例１２】
【０１６９】
（ＦＣＶ１００８６９に対するＭ７２５ワクチンの有効性）
同じワクチンであるが、ＦＣＶ抗原含量がより低いワクチン（２．６７  ｌｏｇ１０  ＥＬＩＳＡ単位に対して、２．０５  ｌｏｇ１０  ＥＬＩＳＡ単位／用量のＦＣＶ４３１／Ｇ１抗原）を用いて、実施例１１を反復した。加えて、各群で用いる動物数を減少させた。その結果、この調査に含まれる動物数が少なくなっているので、統計分析は行わなかった。
【０１７０】
図１０及び１１に示す通り、抗原曝露が厳しいものであり、ワクチン中の抗原含量が少なかったのにもかかわらず、このワクチンの投与は、全身及び局所における臨床徴候を軽減した。２匹のうち１匹の対照が高病原性のＦＣＶ感染によって死亡したが、ワクチン接種されたネコは両方とも、抗原曝露に対して生き残った。
【０１７１】
この実験では、抗原曝露の厳しさが、接種物の力価に相関していた。高病原性の感染を誘導するのには、非常に高い力価が用いられた。これは、野外調査からの報告と一致しており、成体は、子ネコよりＦＣＶ高病原性株に感受性であるかもしれないと示唆している（同様な現象がウサギにおけるＲＨＤＶで報告されている）。したがって、これにより、高力価接種物による抗原曝露の存在下でさえ、このワクチン接種は、ワクチン接種されたネコで発症する症状を、対照ネコと比較して有意に軽減するのに十分であったことが示された。
【実施例１３】
【０１７２】
（不活化及び安定化されたＦＣＶ１００８６９の免疫原性）
週齢８週のＳＰＦ（特定病原体不在）子ネコ１８匹が、無作為に、６匹の動物からなる３群に分けられるであろう。
【０１７３】
不活化及び安定化されたＦＣＶ１００８６９ウイルス（０３．０６９９．Ｐに記載の通りに取得された）をｐＨ７．１の生理水中に希釈する。ワクチンＡは、１ｍｌ用量あたり、不活化の前には、ＦＣＶの粗培養物５ｍｌと同等なウイルス量を含有している。ワクチンＢは、０．４ｍｌ用量あたり、不活化の前には、ＦＣＶの粗培養物５ｍｌと同等なウイルス量を含有している。
【０１７４】
Ａ群の子ネコには、Ｄ０及びＤ２８のそれぞれに、１用量のワクチンＡを与える。これらの投与は、注射器及び注射針を用いて皮下に行う。Ｂ群の子ネコには、Ｄ０及びＤ２８のそれぞれに、１用量のワクチンＢを与える。これらの投与は、無針注射器であるVitajet（登録商標）によって行う。Ｃ群の子ネコは、対照動物として、ワクチン接種されないままにしておく。
【０１７５】
５６日目に、すべての子ネコ（ワクチン接種されたもの及びワクチン接種されていないもの）を、口腔鼻経路によって、高病原性の異種ＦＣＶ株（ＦＣＶ９４５８０株）に抗原曝露する。（１鼻孔あたり０．２５ｍｌそして経口的に０．５ｍｌ、１０６．０  ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）。
【０１７６】
抗原曝露後２週間にわたって、抗ＦＣＶ中和抗体、動物の体重、直腸温、一般的状態、全身及び局所症状、並びにウイルス排出を観察する。
【０１７７】
総合スコアの計算に使用する採点は以下の通りである。
【０１７８】
【表５】
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【０１７９】
添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明は、上記の記述が示す特定の実施形態に限定されず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない変更形態も包含することをはっきりと理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】実施例４に記載の交差中和で得られた中和力価を示す図である。
【図２】抗ｐ６６（ＦＣＶ４３１）モノクローナル抗体の使用による、単離株のＩＦＡプロフィールを示す図である。モノクローナル抗体４４はＦＣＶ４３１に対して特異的である。
【図３Ａ】実施例１０に記載の交差中和で得られた中和力価を示す図である。
【図３Ｂ】実施例１０に記載の交差中和で得られた中和力価を示す図である。
【図４】各ＦＣＶ株によって血清中和された異種単離株のパーセントを図とグラフとの両方の形態で示す図である。
【図５】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後のネコの体温変化を示すグラフである。
【図６】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後のネコの体重変化を示すグラフである。
【図７】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後のネコの感染力価を示すグラフである。
【図８】ＦＣＶ１００８６９に曝露される前後のネコのＦＣＶ抗体変化を示すグラフである。
【図９】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後の症状の罹患率を要約するグラフである。
【図１０】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後のワクチン接種動物及び対照動物の総臨床スコアを示すグラフである。
【図１１】ＦＣＶ１００８６９に曝露された後のワクチン接種動物及び対照動物の臨床スコアを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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