(57)【要約】  本発明は、更に詳しくは、肥満および関連した障害の診断、予防および処置のためならびに治療的に活性な薬物をスクリーニングするために使用することができるヒト肥満感受性遺伝子の同定を開示する。本発明は、更に具体的には、肥満に対する感受性に関係しておりそして治療的介入のための新規な標的を表す電位依存性カリウムチャンネル（ＫＣＮＡ）のある種のアレルを開示する。更に詳しくは、電位依存性カリウムチャンネル（ＫＣＮＡ）遺伝子は、染色体１２上に位置しそしてＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。本発明は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６遺伝子およびそれらの発現産物における特定の突然変異、ならびにこれらの突然変異に基づく診断ツールおよびキットに関する。本発明は、低アルファリポタンパク血症、家族性混合性高脂質血症、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多発性代謝障害、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症、および異常脂血症を含むが、それらに限定されない、冠動脈性心疾患及び代謝障害の素因の診断、該冠動脈性心疾患及び代謝障害の検出、予防および／または処置において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、被験体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法。
【請求項２】
（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、被験体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法。
【請求項３】
（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法。
【請求項４】
（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、肥満または関連した障害の処置に対する被験体における不利な効果を評価する方法。
【請求項５】
被験体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出し、該変化の存在は肥満または関連した障害の素因を示し、そして肥満または関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、被験体における肥満または関連した障害を予防する方法。
【請求項６】
染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により検出する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記変化が、肥満または関連した障害と関連した１つまたは複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ１遺伝子ローカスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ５遺伝子ローカスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ６遺伝子ローカスである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物を、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドもしくは遺伝子またはそのフラグメントと接触させ、該試験化合物のそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドもしくは遺伝子またはそのフラグメントに結合する能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して生物学的に活性な化合物を選択する方法。
【請求項１２】
ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドを発現するリコンビナントホスト細胞を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物のそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに結合する能力およびそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して生物学的に活性な化合物を選択する方法。
【請求項１３】
試験化合物を、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子と接触させ、そして該試験化合物のそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子の発現をモデュレーションする能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して生物学的に活性な化合物を選択する方法。
【請求項１４】
試験化合物をレポーター構築物を含むリコンビナントホスト細胞と接触させ、該レポーター構築物は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子プロモーターのコントロール下のレポーター遺伝子を含み、そしてレポーター遺伝子の発現をモデュレーションする（例えば刺激するかまたは減少させる）試験化合物を選択することを含む、肥満または関連した障害に対して生物学的に活性な化合物を選択する方法。
【請求項１５】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントは、変化または突然変異を含む、それぞれ変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該モデュレーションが活性化である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該モデュレーションが阻害である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子がＫＣＮＡ１遺伝子である、請求項１１、１３および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子がＫＣＮＡ５遺伝子である、請求項１１、１３および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子がＫＣＮＡ６遺伝子である、請求項１１、１３および１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドがＫＣＮＡ１ポリペプチドである、請求項１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドがＫＣＮＡ５ポリペプチドである、請求項１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドがＫＣＮＡ６ポリペプチドである、請求項１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
被験体における肥満または関連した障害を処置または予防するための医薬組成物の製造における、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに対して特異的な抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体からなる群より選ばれる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に遺伝学及び医学の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
現代の工業化された国の全健康コストの約３〜８％は、現在肥満の直接コストによるものである（Wolf, 1996）。ドイツでは、肥満および随伴疾患（comorbid disorders）に関係した（直接及び間接の両方）全コストは、１９９５年には２１０億ドイツマルク（２９．４ＵＳドル）と評価された（Schneider, 1996）。２０３０年までに、これらのコストは肥満の有病率（prevalence）が更に増加しないとしても、５０％上昇するであろう。
【０００３】
肥満は、健康が損なわれうる程度に脂肪組織における異常なまたは過剰な脂肪蓄積の状態としてしばしば簡単に定義される。基礎をなす疾患は望ましくない正のエネルギーバランス及び重量増加のプロセスである。腹部脂肪分布は、女性的脂肪分布よりも高い健康的リスクと関連している。
【０００４】
ボデイ．マス．インデックス（ＢＭＩ；kg/m2）は、粗いとはいえ、最も有用な集団レベルの肥満の目安を与える。それは、集団内の肥満の有病率及びそれに関連した危険を評価するのに使用することができる。しかしながら、ＢＭＩは、身体の組成又は身体脂肪分布を考慮していない（WHO, 1998）。
【０００５】
【表１】
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【０００６】
肥満は、肥満及び重度の肥満の定義のためのカットオフとして８５ＢＭＩパーセンタイル（８５ｔｈ ＢＭＩ percentile）及び９５ＢＭＩパーセンタイル（９５ｔｈＢＭＩ percentile）を使用しても定義された。ＢＭＩパーセンタイルは、いくつかの母集団内で計算されている；German National Nutrition Surveyに基づいてドイツ人口に対するセンタイルは１９９４年以来入手可能であった（Ｈeberand et al., 1994, 1996）。異なる体重クラスのＷＨＯ分類は成人のみに適用することができるので、子供及び青年期の個体の肥満の定義についてＢＭＩパーセンタイルを指すことが普通になった。
【０００７】
肥満の有病率の最近の上昇は、いくつかの国の健康システムにとって大きな関心のある問題である。Center of Disease Control and Prevention（ＣＤＣ）の報告に従えば、合衆国では過去２０年間に肥満が劇的に増加した。１９８５年には、少数の州のみがCDC's Behavioral Risk Factor Surveillance System（ＢＲＦＳＳ）に参加していて、肥満データを提供していた。１９９１年に、４つの州が１５〜１９％の肥満有病率を報告しておりそして２０％又は２０％より高い率を報告する州はなかった。２００２年には、２０の州が１５〜１９％の肥満有病率を有しており；２９の州が２０〜２４％の率を有し、そして１つの州は２５％を越える率を報告する。同様な傾向がヨーロッパ及び南アメリカの他の国々でも観察された。
【０００８】
子供及び青年期の個体は、この傾向から免がれなかった。それどころか、ＵＳＡでの増加は、実質的であった。従って、１９６０年代と１９９０年との間に体重超過及び肥満は６〜１７歳において劇的に増加した。この増分は、カットオフとして８５ＢＭＩセンタイル（１９６０年代に計算された）を使用して４０％の相対的増加になりそして９５センタイルの使用では１００％の相対的増加になる。１９８５年と１９９５年の間に極端な肥満のため入院患者として処置されたドイツの子供及び青年の横断研究では、この１０年間の期間にわたり殆ど２kg/m2の平均ＢＭIの有意な増加が報告された。この極端なグループ内では、増分は最高のＢＭＩ範囲において最も顕著であった。
【０００９】
肥満の有病率のこの増加の基礎となる機構は知られていない。環境的因子が基礎をなす原因としてよく引き合いに出された。基本的には、増加したカロリー摂取及び減少したレベルの身体活動の両方が検討された。英国では、肥満率の増加は、後者の機構に帰された。したがって、この国では、平均カロリー摂取はここ２０年間に幾分減少すらしたが、これに対してテレビジョンを観て過ごす時間の増加及び家庭当りの車の平均数から生じる間接の証拠は、関係のある原因因子として減少したレベルの身体活動を指摘している。
【００１０】
遺伝的因子は寄与する原因として以前は考えられなかった。全く反対に、増加した率の肥満がここ２０年間に観察されたという事実は、遺伝的因子が原因となることはできないという証拠とみなされてきた。しかしながら、選択的配偶（assortative mating）の率の増加は、観察された現象への遺伝的寄与を非常によく形成することができるということが提唱された。この仮説は、肥満した個体の烙印を押すことはむしろ最近の社会現象を表し、従って、常に増加した率の選択的配偶をもたらしたということを示唆する証拠に基づいている。結果として、子孫は、肥満の基礎をなす相加的及び非相加的遺伝因子のより高い負荷（loading）を有している。実際に、極端に肥満した子供及び青年期の個体の両親の間の格別に高い率の（推定された）選択的配偶が観察された。
【００１１】
肥満と関連した潜在的に生命を脅かす慢性の健康問題は下記の主な分野に入る：
１）高血圧、慢性心臓疾患及び発作を含む心臓血管問題、２）インスリン抵抗性と関連した状態、即ち、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、３）あるタイプの癌、主としてホルモンが関係した癌及び大腸癌、ならびに４）胆嚢疾患。肥満と関連した他の問題は、呼吸困難、慢性筋骨格問題、皮膚問題および無生殖性を含む(WHO, 1998)。
【００１２】
これらの障害を処置するための最近利用可能な主なストラテジーは、食事制限、身体活動の増加、薬理学的アプローチ及び外科的アプローチを含む。成人では、伝統的介入を使用する長期間の体重損失は格別である。現在の薬理学的介入は、典型的には、５〜１５キログラムの体重損失を誘導し；もし薬剤処理が中断されるならば、再び始まる重量増加が続いて起こる。外科処置は比較的成功しておりそして極端な肥満および／または重い医学的合併症を有する患者のために取ってある。
【００１３】
最近、レプチン欠失突然変異が検出された１０歳の甚だしく肥満した少女がリコンビナントレプチンで処置されて成功した。これは、彼女の病的な肥満の基礎をなす突然変異の検出を治療的に生かした最初の個体である。
【００１４】
いくつかの双生児の研究が行われてＢＭＩの遺伝率が評価され、そのいくらかは、１０００組以上の双生児ペアーを包含していた。結果は、非常に首尾一貫していた：一卵性双生児間のペアー内相関は、年齢及び性とは無関係に、典型的には０．６〜０．８であった。１つの研究では、一卵性双生児及び二卵性双生児についての相関は、双生児が離れて育てられたかまたは一緒に育てられたかとは無関係に、基本的に同じであった。ＢＭＩの遺伝率は、０．７と評価され；非共有環境因子は分散の残りの３０％を説明した。驚くべきことに、共有された環境因子は、分散の実質的な割合を説明しなかった。過度のカロリー及び不足カロリーの栄養は、一卵性双生児ペアーの両メンバー間で同様な程度の体重増加または損失をもたらしたが、これは、体重に対するエネルギー利用性の環境的に誘導された変動の効果を遺伝的因子が調節することを示す。過食及び過小食した際の代謝反応および体脂肪分布の変化も遺伝的コントロール下にある（Hebebrand et al., 1998に概説されている）。
【００１５】
多数の養子関係の研究は、養子のＢＭＩはその生物学的両親のＢＭＩと相関しておりそして養子両親のＢＭＩと相関していないことを示した。家族の研究に依存して、同胞（sibs）のＢＭＩ間の相関は０．２〜０．４であった。親子間相関は、典型的には僅かにより低い。分離分析（segregation analysis）は、主要な劣性遺伝子効果（major recessive gene effect）を繰り返して示唆した。これらの分析に基づいて、サンプルサイズの計算は、一致及び不一致アプローチの両方に基づいて行われた。予想とは対照的に、一致同胞ペアーアプローチは優れており；同じパワーを達成するのにより少ない数の家族が必要であった。
【００１６】
極端に肥満した若いインデックスの患者、母または父または両方に基づいた家族研究は、大多数の家族においてＢＭＩ＞９０デシル（ＢＭＩ＞９０ｔｈdecile）を有する。ＢＭＩ＞９５センタイル（ＢＭＩ＞９５ｔｈcentile）を有するインデックスの患者に基づいて、それぞれの家族の約２０％は、ＢＭＩ＞９０センタイルを有する同胞を有する。
【００１７】
結論として、環境因子は、個体を多少肥満の発生に感受性とする特異的遺伝子型と相互作用することは明らかである。更に、主要な遺伝子が検出されたという事実にもかかわらず、スペクトルがこのような主要な遺伝子からほんの僅かな影響を有する遺伝子に及ぶことを考慮することが必要である。
【００１８】
１９９４年の終わりにおけるレプチン遺伝子の発見（Zhang et al., 1994）に続いて、食欲及び体重調節の基礎をなす調節システムを明かすための科学的努力が実質的に激増した。それは最近最も早く成長する生物医学的分野である。この発展は、明らかな臨床的興味により、ヒト、げっ歯類及び他の哺乳動物の肥満に基本的にすべて関係している大規模な分子遺伝的活動ももたらした（Hebebrand et al., 1998）。
【００１９】
これに関して、突然変異が現在知られている単一遺伝子形の肥満をもたらした多くの遺伝子がげっ歯類においてクローニングされた。これらの突然変異の全身性結果は、現在分析されつつある。これらのモデルは、体重調節に関与する複雑な調節システムへの洞察を与え、その最ももよく知られているのはレプチン及びそのレセプターを含む。
【００２０】
マウスでは、しかしブタでも、体重調節に最も関係がありそうな１５以上の量的形質ローカス（quantitative trait loci）（ＱＴＬ）が同定された（Chagnon et al., 2003）。
【００２１】
ヒトでは、４つの非常にまれな常染色体劣性形態の肥満が１９９７年に記載された。レプチン、レプチンレセプター、プロホルモンコンベルターゼ１及びプロ−オピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）をコードする遺伝子の突然変異が、過食と関連した早期開始型のはなはだしい肥満を引き起こすことが示された。異なる追加の臨床的（例えば、赤毛、原発性無月経）および／または内分泌学的異常（例えば、顕著に変わった血清レプチンレベル、ＡＣＴＨ分泌の欠如）は、それぞれの候補遺伝子を正確に示す（pinpoint）。単一遺伝子動物モデル及びヒト単一遺伝子形態の両方とも、体重調節の基礎をなす複雑なシステムへの新規な洞察をもたらした。
【００２２】
極めて最近では、ヒトにおける第１常染色体優性形態の肥満が記載された。メラノコルチン−４−レセプター遺伝子（ＭＣ４Ｒ）内の２つの異なる突然変異は、これらの変異体についてのヘテロ接合性発端者（probands heterozygous）において極端な肥満をもたらすことが観察された。上記した発見とは対照的に、これらの突然変異は、極端な肥満以外の容易に明らかな表現型異常を包含しない（Vaisse et al., 1998; Yeo et al., 1998）。興味深いことに、両グループとも相対的に小さな研究グループ（ｎ＝６３およびｎ＝４３）における系統的スクリーンにより突然変異を検出した。
【００２３】
Hinney et al., (1999)は、総計４９２人の肥満した子供および青年期の個体においてＭＣ４Ｒをスクリーニングした。全部で、ハプロ不全（haplo-insufficiency）をもたらす２つの異なる突然変異を有する４つの個体が検出された。１つはYeo et al., (1998)により以前に観察された突然変異と同じであった。３つの個体で検出された他の突然変異は、レセプターの細胞外ドメインにおける停止突然変異（stop mutation）を誘導した。約１％の極端に肥満した個体は、ＭＣ４Ｒにおけるハプロ不全突然変異を有する。２つの形態のハプロ不全に加えて、Hinney等(1999)は、保存性及び非保存性のアミノ酸交換の両方をもたらす追加の突然変異も検出した。興味深いことに、これらの突然変異は、主として肥満研究グループにおいて観察された。これらの突然変異の機能的関与は現在未知である。
【００２４】
ＭＣ４Ｒ突然変異を有する個体の同定は、可能な薬理学的介入を考慮に入れると興味深い。従って、すべてのメラノコルチンのコア配列を表す副腎皮質刺激ホルモン４〜１０（ＡＣＴＨ４〜１０）の鼻内適用は健常な対照において減少した体重、体脂肪質量および血漿レプチン濃度をもたらした。それらの減少したレセプター密度を理論的に釣り合わせることができたこの処置に対して突然変異キャリアーがいかに反応するかに関して疑問が生じる。
【００２５】
体重調節における特定の遺伝子の関与は、トランスジェニックマウスから得られたデータにより更に立証される。例えば、ＭＣ４Ｒ欠失マウスは早期開始肥満を発生する（Huszar et al., 1997）。
【００２６】
異なるグループは、肥満又は依存性表現型（ＢＭＩ、レプチンレベル、脂肪質量等）に関係したゲノムスキャンを行っている。このアプローチは、非常に有望と思われる。何故ならば、それは系統的でありそしてモデルフリーであるからである。更に、それは格別に成功していることが既に示された。従って、比較的小さな研究グループを分析することによってすら、ポジティブな連鎖結果が得られた。更に重要なことに、いくらかの発見は、既に追試されている。下記の領域の各々は、少なくとも２つの独立したグループにより同定された：染色体１ｐ３２、染色体２ｐ２１、染色体６ｐ２１、染色体１０および染色体２０ｑ１３（Chagnon et al., 2003）。
【００２７】
発明の要約
本発明は、肥満および関連した障害の診断、予防および処置ならびに治療的に活性な薬物のスクリーニングのために使用することができるヒト肥満感受性遺伝子の同定を今や開示する。
【００２８】
更に詳しくは、本発明は、肥満および関連した障害の診断、予防および処置のためならびに治療的に活性な薬物のスクリーニングのために使用することができるヒト肥満感受性遺伝子の同定を開示する。さらに具体的には、本発明は、肥満に対する感受性に関係しそして治療的介入のための新規な標的を表す電位依存性カリウムチャンネル（potassium voltage-gated channel）（ＫＣＮＡ）遺伝子のあるアレルを開示する。更に詳しくは、電位依存性カリウムチャンネル（ＫＣＮＡ）遺伝子は、染色体１２上に位置しておりそしてＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。本発明は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６遺伝子おける特定の突然変異およびそれらの発現産物、ならびにこれらの突然変異に基づく診断ツールおよびキットに関する。本発明は、低アルファリポタンパク血症、家族性混合性高脂質血症（familial combined hyperlipidemia）、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多発性代謝障害（multiple metabolic disorder）、冠動脈疾患、糖尿病及び関連合併症、および異常脂血症（dyslipidemia）を含むが、それらに限定されない、冠動脈性心疾患（coronary heart disease）及び代謝障害の素因の診断、該冠動脈性心疾患及び代謝障害の検出、予防および／または処置において使用することができる。
【００２９】
本発明は、肥満および関連した障害の素因の診断、該肥満および関連した障害からの保護、該肥満および関連した障害の検出、予防および／または処置に使用することができ、そして被験体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子または関連したポリペプチドにおける変化の存在を検出することを含む方法であって、該変化の存在は肥満または関連した障害の存在または素因を示す、方法において使用することができる。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子およびポリペプチドは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子またはポリペプチドにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子またはポリペプチドにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドにある。場合により、変化は、３つのすべての遺伝子にあるかまたは２つの遺伝子の組合せにあり、そして該変化は互いに相互作用する。該変化の存在は、肥満または関連した障害から保護するために指示されることもできる。
【００３０】
本発明の特定の目的は、被験体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカス（locus）における変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は肥満または関連した障害の存在または素因を示す、被験体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００３１】
本発明の更なる特定の目的は、被検体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は肥満又は関連した障害からの保護を示す、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００３２】
本発明の他の特定の目的は、被検体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は該処置に対する特定の応答を示す、肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００３３】
本発明の更なる特定の目的は、被検体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は該処置に対する不利な効果を示す、肥満または関連した障害の処置に対する被験体における不利な効果を評価する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００３４】
本発明は、被検体からのサンプルにおいて染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出し、該変化の存在は肥満または関連した障害の素因を示し；そして肥満または関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、被験体における肥満または関連した障害を予防する方法にも関する。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００３５】
好ましい態様では、前記変化は、肥満または関連した障害と関連した１つまたは複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。
【００３６】
好ましくは、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化は、ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、アレル特異的増幅アッセイを行うことにより決定される。
【００３７】
本発明の特定の局面は、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子またはその組み合わせを含むゲノム領域における肥満または関連した障害と関連した少なくとも１つのSNP又はハプロタイプを特異的に検出するようにデザインされる、プライマー、プローブおよび／またはオリゴヌクレオチドを含む物質の組成物にある。
【００３８】
本発明は、ＫＣＮＡ発現もしくは活性、更に詳しくはＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６発現または活性のモデュレーションにより被験体における肥満または関連した障害を処置する方法にもある。このような処置は、例えば、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチド、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６  ＤＮＡ配列（ＣＮＴＮＡＰ２遺伝子ローカスを指向したアンチセンス配列およびＲＮＡｉを含む）、抗ＫＣＮＡ１抗体、抗ＫＣＮＡ５抗体および／または抗ＫＣＮＡ６抗体または、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６発現または活性をモデュレーションする薬物を使用する。
【００３９】
本発明は、例えば、遺伝子治療、タンパク質置換治療によるまたはＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６タンパク質模倣物および／または阻害剤の投与による、前徴処置または併用治療を含む、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子の有害なアレルを有する個体を処置する方法にも関する。
【００４０】
本発明の更なる局面は、肥満または関連した障害と関連したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子のアレルまたはその遺伝子産物のモデュレーションまたは該アレルまたはその遺伝子産物への結合に基づいた、肥満または関連した障害の治療のための薬物のスクリーニングにある。
【００４１】
本発明の更なる局面は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチドフラグメントの特異的抗体およびこのような抗体の誘導体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、およびこれらの抗体を含む診断キットを含む。更に好ましくは、該抗体は、変化を含むＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的であり、該変化は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６の活性を改変する。
【００４２】
本発明は、変化を含むＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはそのフラグメントにも関し、該変化は、それぞれＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６の活性を改変する。本発明は、更に、変化を含むＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントにも関し、該変化は、それぞれＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６の活性を改変する。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト肥満感受性遺伝子として染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子の同定を開示する。肥満を有する１６４の家族からの種々の核酸サンプルを特定のGenomeHIP法に供した。この方法は、肥満した被検体における変化した該集団における特定の同祖性（identical-by-descent）フラグメントの同定をもたらした。ＩＢＤフラグメントのスクリーニングにより、本発明者は、肥満および関連した障害についての候補として、染色体１２ｐ１３上の電位依存性カリウムチャンネル遺伝子（ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６）を同定した。これらの遺伝子は、クリティカルな区間（critical interval）において実際に存在しそして肥満の遺伝的調節と一致する機能的表現型を発現する。
【００４４】
従って本発明は、肥満および関連した障害の診断、予防及び処置のためならびに治療的に有効な薬物のスクリーニングのために染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子および対応する発現産物を使用することを提唱する。
【００４５】
定義
肥満および代謝障害：肥満は、健康が損なわれうる程度に、脂肪組織における異常なまたは過剰な脂肪蓄積の任意の状態とみなされるべきである。関連した障害、疾患または病理は、更に具体的には、糖尿病（更に詳しくはＩＩ型糖尿病）及び関連合併症、例えば、糖尿病性神経障害、低アルファリポタンパク血症、家族性混合性高脂質血症、インスリン過剰血症、インスリン抵抗性、インスリン抵抗性症候群Ｘ又は多発性代謝障害、心臓血管合併症、例えば冠動脈疾患および異常脂血症を含むいかなる代謝障害も含む。好ましい関連した障害は、ＩＩ型糖尿病、インスリン過剰血症、インスリン抵抗性および糖尿病性神経障害からなる群より選ばれる。
【００４６】
本発明は、成人、子供及び出生前の種々の被験体、特にヒトにおいて使用することができる。
【００４７】
本発明の状況内では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡコード配列、ＫＣＮＡ非コード配列、転写および／または翻訳をコントロールするＫＣＮＡ調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）、ならびにすべての対応する発現産物、例えばＫＣＮＡ  ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）およびＫＣＮＡポリペプチド（例えば前駆タンパク質および成熟タンパク質）を含む、細胞または生物におけるすべてのＫＣＮＡ配列または産物を意味する。ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ遺伝子内に位置したＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＫＣＮＡ遺伝子の周囲の配列も含む。
【００４８】
本願で使用された、用語「ＫＣＮＡ遺伝子」は、染色体１２ｐ１３上の電位依存性カリウムチャンネル遺伝子、ならびにその変異体、アナログおよびフラグメントを意味し、これらは、肥満および関連した障害に対する感受性に関係するそれらのアレル（例えば生殖系列突然変異（germline mutations））を含む。
【００４９】
ＫＣＮＡ１遺伝子は、電位依存性カリウムチャンネル１、シェーカー関連サブファミリーメンバー１、ＥＡ１、ＭＫ１、ＡＥＭＫ、ＨＵＫ１、ＭＢＫ１、ＲＢＫ１およびＫＶ１．１を指すこともある。
【００５０】
ＫＣＮＡ５遺伝子は、電位依存性カリウムチャンネル５、シェーカー関連サブファミリーメンバー５、ＨＫ２、ＨＣＫ１、ＰＣＮ１、ＨＰＣＮ１およびＫＶ１．５を指すこともある
【００５１】
ＫＣＮＡ６遺伝子は、電位依存性カリウムチャンネル６、シェーカー関連サブファミリーメンバー６、ＨＢＫ２およびＫＶ１．６を指すこともある。
【００５２】
用語「遺伝子」は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡ、ならびに任意の形態の対応するＲＮＡを含む任意の型のコード核酸を含むと解釈されるべきである。用語、遺伝子は、特に、ＫＣＮＡタンパク質をコードするリコンビナント核酸、即ち、例えば、配列をアセンブリング、カッティング、ライゲーションまたは増幅することにより人工的に創り出された任意の天然に存在しない核酸分子も含む。遺伝子は、典型的には二本鎖であるが、一本鎖などの他の形態も意図することができる。遺伝子は、種々のソースから当技術分野で知られた種々の技術に従って、例えば、ＤＮＡライブリーをスクリーニングすることまたは種々の天然のソースから増幅することにより得ることができる。リコンビナント核酸は、化学合成、遺伝子工学、酵素的技術またはその組み合わせを含む慣用の技術により調製することができる。適当なＫＣＮＡ１遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えば、ＫＣＮＡ１のためのUnigene Cluster(Hs.60483)およびUnigene Representative Sequence ＮＭ＿０００２１７上に見出されうる。適当なＫＣＮＡ５遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＫＣＮＡ５のためのUnigene Cluster(Hs.150208)およびUnigene Representative Sequence ＮＭ＿００２２３４上に見出されうる。適当なＫＣＮＡ６遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＫＣＮＡ６のためのUnigene Cluster(Hs.306190)およびUnigene Representative Sequence ＮＭ＿００２２３５上に見出されうる。
【００５３】
用語「ＫＣＮＡ１遺伝子」は、上記したいかなるコード配列のいかなる変異体、フラグメントまたはアナログも含む。用語「ＫＣＮＡ５遺伝子」は、上記したいかなるコード配列のいかなる変異体、フラグメントまたはアナログも含む。用語「ＫＣＮＡ６遺伝子」は、上記したいかなるコード配列のいかなる変異体、フラグメントまたはアナログも含む。このような変異体は、例えば個体間のアレル変動（例えば多型）による自然に存在する変異体、肥満または関連した障害に関連した突然変異したアレル、選択的スプライシング形態等を含む。用語変異体は、他のソースまたは生物からのＫＣＮＡ遺伝子配列も含む。変異体は、好ましくは、上記したコード配列と実質的に相同性である、即ち、上記したコード配列と少なくとも約６５％、典型的少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、更に好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子の変異体およびアナログはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に上記した配列（またはその相補性鎖）にハイブリダイゼーションする核酸配列も含む。
【００５４】
典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、更に好ましくは４２℃以上の温度および／または約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩分を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の試薬の濃度を改変することにより当業者によって調節されうる。
【００５５】
ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子のフラグメントは、上記に開示された配列の少なくとも約８の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５、更に好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの任意の部分を意味する。フラグメントは、８〜１００ヌクレオチド好ましくは１５〜１００、更に好ましくは２０〜１００ヌクレオチドのすべての可能なヌクレオチド長さを含む。
【００５６】
ＫＣＮＡ１ポリペプチドは、上記に開示されたＫＣＮＡ１遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＫＣＮＡ５ポリペプチドは、上記に開示されたＫＣＮＡ５遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。ＫＣＮＡ６ポリペプチドは、上記に開示されたＫＣＮＡ６遺伝子によりコードされたいかなるタンパク質またはポリペプチドも意味する。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のストレッチを含むいかなる分子も指す。この用語は、種々の長さの分子、例えばペプチドおよびタンパク質を含む。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングにより改変することができ、そして１つ又は複数の非天然または合成アミノ酸を含有することができる。ＫＣＮＡ１ポリペプチドの特定の例は、ＮＰ＿０００２０８配列のすべてまたは一部を含む。ＫＣＮＡ５ポリペプチドの特定の例は、ＮＰ＿００２２２５配列のすべてまたは一部を含む。ＫＣＮＡ６ポリペプチドの特定の例は、ＮＰ＿００２２２６配列のすべてまたは一部を含む。
【００５７】
用語「処置に対する応答」は、治療化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性な薬物に転換する能力および個体における薬物の薬物動態学（吸収、分布、排泄）および薬力学（レセプター関連の）を含むがこれらに限定されない処置有効性を指す。
【００５８】
用語「処置に対する不利な効果」は、薬物の主要な薬理学的作用の伸展から生じる治療の不利な効果、または独特のホスト因子と薬物の相互作用から生じる特異体質的な不利な反応を指す。「処置に対する副作用」は、不利な反応、例えば皮膚科学的、血液学的または肝臓学的毒性を含むがそれらに限定されず、そして更に胃腸潰瘍、血小板機能の障害、腎臓傷害、全身化蕁麻疹（generalized urticaria）、気管支収縮、低血圧およびショックを含む。
【００５９】
診断
本発明は、被検体における染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスの監視に基づく診断方法を今や提供する。本発明の状況内では、用語「診断」は、成人、子供および生まれる前において早期段階、前兆段階および後期段階を含む種々の段階での検出、監視、投薬、比較等を含む。診断は、典型的には、予後、発生の素因もしくは危険の評価、最も適切な処置を規定するための被検体の特徴付け（薬理遺伝学）等を含む。
【００６０】
本発明は、個体が肥満または関連した障害を発生する危険があるかどうか又は染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける突然変異又は多型から生じる肥満または関連した障害に罹患しているかどうかを決定するための診断方法を提供する。本発明は、個体が治療剤にポジティブに応答しそうであるかどうか又は個体が治療剤に対する不利な副作用を発生する危険があるかどうかを決定するための方法も提供する。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、前記変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、前記変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、前記変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６１】
本発明の特定の目的は、被験体からのサンプルにおいて、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、被検体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法にある。該変化の存在は、肥満または関連した障害の存在または素因を示す。場合によりこの方法は、被験体からのサンプルを提供する前段階を含む。好ましくは、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在は、サンプルのジェノタイピングにより検出される。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６２】
本発明の他の特定の目的は、被験体からのサンプルにおいて、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含み、該変化の存在は肥満または関連した障害からの保護を示す、被検体における肥満または関連した障害からの保護を検出する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６３】
好ましい態様では、該変化は、肥満または関連した障害と関連した１つまたは複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。
【００６４】
本発明の他の特定の目的は、（ｉ）被検体からのサンプルを提供し、そして（ｉｉ）該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法にある。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６５】
本発明の他の特定の目的は、被験体からのサンプルにおいて、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法にある。該変化の存在は該処置に対する特定の応答を示す。好ましくは、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在は、サンプルのジェノタイピングにより検出される。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６６】
本発明の更なる特定の目的は、被験体からのサンプルにおいて、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、肥満または関連した障害の処置に対する被験体の不利な効果を評価する方法にある。該変化の存在は該処置に対する不利な効果を示す。好ましくは、該サンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在は、サンプルのジェノタイピングにより検出される。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６７】
好ましい態様では、該変化は、肥満または関連した障害と関連した１つまたは複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。
【００６８】
更なる態様では、本発明は、被験体からのサンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出し、該変化の存在が肥満または関連した障害の素因を示し；そして肥満または関連した障害に対する予防処置を行うことを含む、被験体における肥満または関連した障害を予防するための方法に関する。該予防処置は、薬物投与であることができる。好ましい態様では、ＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスにある。場合により、この変化は、ＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにある。
【００６９】
処置もしくは薬物に対する応答または処置もしくは薬物に対する副作用を分析しそして予測する診断は、個体が特定の処置薬物で処置されるべきかどうかを決定するのに使用することができる。例えば、診断が、個体が特定の薬物による処置にボジティブに応答する可能性を示すならば、その薬物を個体に投与することができる。反対に、もし診断が、個体が特定の薬物にネガティブに応答する可能性があることを示すならば、別の処置のコースを処方することができる。ネガティブな応答は、有効な応答の不存在又は毒性副作用の存在のいずれかとして定義されうる。
【００７０】
臨床薬物試験は、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおけるＳＮＰに対する他の適用を示す。上記した方法を使用して、薬物に対する応答または薬物に対する副作用に対する応答を示す染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける１つ以上のＳＮＰを同定することができる。したがって、このような作用物質の臨床試験における潜在力のある参加者をスクリーニングして薬物に有利に応答する可能性が最も高いこれらの個体を同定しそして副作用を引き起こす可能性のある個体を排除することができる。その方法において、薬物にポジティブに応答する個体において薬物処置の有効性を測定することができ、その際、この研究においでポジティブに応答しそうにない個体を含む結果として測定値を低下させることなくそして望ましくない安全問題の危険なしに、測定することができる。
【００７１】
前記変化は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６  ｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで決定することができる。場合により、検出は、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子のすべてまたは一部を配列決定することにより、または染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子のすべてまたは一部の選択的ハイブリダイゼーションまたは増幅により行われる。更に好ましくは、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子の特異的増幅は、変化同定段階の前に行われる。更に詳しくは、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。
【００７２】
染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化は、単独または種々の組合せにおける、該ローカスのコード領域および／または非コード領域における突然変異、欠失、転移（rearrangement(s)）および／または挿入のいかなる形態であってもよい。更に具体的には、突然変異は点突然変異を含む。欠失は、遺伝子ローカスのコード部分または非コード部分における２つ以上の残基の任意の領域、例えば２残基から全体の遺伝子またはローカスまでの領域を包含することができる。典型的な欠失は、約５０未満の連続した塩基対のドメイン（イントロン）または反復配列またはフラグメントなどのより小さな領域に影響を与えるが、より大きな欠失も起こることができる。挿入は、遺伝子ローカスのコード部分または非コード部分における１つまたは複数の残基の付加を含むことができる。挿入は、典型的には、遺伝子ローカスにおける１〜５０塩基対の付加を含むことができる。転移は、配列の反転を含む。染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスの変化は、停止コドンの創生、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングもしくはプロセッシング、産物不安定性、トランケーションされたポリペプチド産生等をもたらすことができる。この変化は、変化した機能、安定性、ターゲティングまたは構造を有するＫＣＮＡポリペプチドの産生をもたらすことができる。変化はタンパク質発現の減少又は替わりに該産生の増加を引き起こすこともある。さらに詳しくは、ＫＣＮＡポリペプチドは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。場合によりＫＣＮＡポリペプチドはＫＣＮＡ１である。場合によりＫＣＮＡポリペプチドはＫＣＮＡ５である。場合によりＫＣＮＡポリペプチドはＫＣＮＡ６である。
【００７３】
本発明に従う方法の特定の態様では、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化は、ＫＣＮＡ遺伝子または対応する発現産物における点突然変異、欠失および挿入から選ばれ、更に好ましくは点突然変異および欠失から選ばれる。この変化は、ＫＣＮＡ  ｇＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで決定されうる。更に詳しくは、ＫＣＮＡ遺伝子は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれる。場合によりＫＣＮＡ遺伝子はＫＣＮＡ１である。場合によりＫＣＮＡ遺伝子はＫＣＮＡ５である。場合によりＫＣＮＡ遺伝子はＫＣＮＡ６である。
【００７４】
本発明に従ういかなる方法においても、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子における１つまたは複数のＳＮＰおよび染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子におけるＳＮＰを含むあるハプロタイプは、肥満または関連した障害と関連しそして他の遺伝子に位置した他のＳＮＰまたはハプロタイプと組み合わせて使用することができる。
【００７５】
他の変法では、上記方法は、変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。変化したＲＮＡ発現は、変化したＲＮＡ配列の存在、変化したＲＮＡスプライシングまたはプロセッシングの存在、変化した量のＲＮＡの存在等を含む。これらは、例えば、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ＲＮＡのすべてまたは一部を配列決定することまたは該ＲＮＡのすべてまたは一部の選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によることを含む、当技術分野で知られている種々の技術により検出することができる。
【００７６】
更なる変法では、上記方法は、変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチド発現の存在を検出することを含む。変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチド発現は、変化したポリペプチド配列の存在、変化した量のＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチドの存在、変化した組織分布の存在等を含む。これらは、例えば、配列決定することおよび／または特異的リガンドに結合すること（抗体など）によることを含む、当技術分野で知られた種々の技術により検出することができる。
【００７７】
上記したとおり、配列決定すること、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンド（抗体など）に結合することを含む当技術分野で知られている種々の技術を使用して、変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡ発現または配列を検出または定量することができる。他の適当な方法は、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、アレル特異的増幅、サザーンブロット（ＤＮＡについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡについて）、一本鎖コンフォーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲルマイグレーション（gel migration）、クランプド変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis）、ヘテロ二本鎖分析、ＲＮアーゼ保護、化学的ミスマッチ開裂、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（immunoenzymatic assay）（ＩＥＭＡ）を含む。
【００７８】
これらのアプローチのいくらか（例えばＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、変化した配列の存在の結果として核酸の電気泳動移動度の変化に基づいている。これらの技術に従えば、変化した配列は、ゲルでの移動度のシフトにより可視化される。次いでフラグメントを配列決定して変化を確認することができる。
【００７９】
ある他のアプローチは、被験体からの核酸と野生型もしくは変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。プローブは、懸濁していてもよく、または基材上に固定化されていてもよい。プローブは、典型的にはハイブリッドの検出を容易にするように標識される。
【００８０】
これらのアプローチのいくらか、例えば、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡは、ポリペプチド配列または発現レベルを評価するために特に適している。これらの後者はポリペプチドに対して特異的なリガンド、更に好ましくは特異的抗体の使用を必要とする。
【００８１】
特定の好ましい態様では、上記方法は、被験体からのサンプルにおける変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子発現プロファイルの存在を検出することを含む。上記したとおり、これは、更に好ましくは、該サンプル中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により達成することができる。
【００８２】
配列決定
配列決定は、自動シーケンサーを使用して当技術分野で周知された技術を使用して行うことができる。配列決定は、完全なＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子に関して行うことができ、又は更に好ましくは、その特定のドメイン、典型的には有害な突然変異または他の変化を有することが知られているかあるいは有害な突然変異または他の変化を有する疑いのあるその特定のドメインに関して行うことができる。
【００８３】
増幅
増幅は、核酸再生（nucleic acid reproduction）を開始するのに役立つ相補性核酸配列間の特異的ハイブリッドの形成に基づいている。
【００８４】
増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）および核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）などの当技術分野で知られた種々の技術に従って行うことができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコールを使用して行うことができる。好ましい技術は、アレル特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、反応を開始するために、通常特異的核酸プライマーの使用を必要とする。
【００８５】
ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはローカスからの配列を増幅するために有用な核酸プライマーは、該ローカスの標的領域にフランキングする（flank）ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスの部分と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。
【００８６】
ＳＮＰを含むＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６標的領域を増幅するのに使用することができるプライマーは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６の配列に基づいてデザインされうる。
【００８７】
本発明の他の特定の目的は、周囲の領域（surrounding regions）を含むＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはローカスからの配列を増幅するために有用な核酸プライマーにある。このようなプライマーは、好ましくは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにおける核酸配列に対して好ましくは相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする。特定のプライマーは、該ローカスの標的領域にフランキングするＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスの部分と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、該標的領域は肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化している。
【００８８】
本発明は、肥満または関連した障害を有するある種の被検体において変化しているＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６コード配列（例えば、遺伝子またはＲＮＡ）の部分に対して相補性でありそして特異的にハイブリダイゼーションする核酸プライマーにも関する。これに関して、本発明の特定のプライマーは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡにおける変化した配列に対して特異的である。このようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにおける変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の不存在は、特異的変化がサンプルにおいて存在しないことを示す。
【００８９】
本発明の典型的なプライマーは、長さが約５〜６０ヌクレオチド、更に好ましくは長さが約８〜約２５ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。この配列は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスの配列に直接由来することができる。完全な相補性は、高い特異性を確実にするのに好ましい。しかしながら、ある種のミスマッチは許容されうる。
【００９０】
本発明は、被験体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法または肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法における上記した核酸プライマーまたは核酸プライマーの対の使用にも関する。
【００９１】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション検出法は、核酸配列変化を検出するのに役立つ相補性核酸配列間の特異的ハブリッドの形成に基づいている。
【００９２】
特定の検出技術は、野生型または変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、次いでハイブリッドの存在の検出を含む。プローブは、懸濁していてもよく又は基材もしくは支持体に固定化されていてもよい（核酸アレー又はチップ技術におけるように）。プローブは典型的には標識されてハイブリッドの検出を促進する。
【００９３】
この点で、本発明の特定の態様は、被検体からのサンプルを、変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスに特異的な核酸プローブと接触させそしてハイブリッドの形成を評価することを含む。特定の好ましい態様では、本方法は、前記サンプルを、それぞれ、野生型ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスおよびその種々の変化した形態に対して特異的なプローブのセットと同時に接触させることを含む。この態様では、サンプル中のＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子ローカスにおける種々の形態の変化の存在を直接検出することが可能である。また、種々の被検体からの種々のサンプルを平行して処理することができる。
【００９４】
本発明の状況内では、プローブは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）に対して相補性でありそしてＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡ（の標的部分）と特異的にハイブリダイゼーションすることができ、そして肥満または関連した障害の素因を作るか、肥満又は関連した障害と関連しているＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６アレルと関連したポリヌクレオチド多型を検出するのに適当な、ポリヌクレオチド配列を指す。プローブは、好ましくは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子、ＲＮＡまたはその標的部分に対して完全に相補性である。プローブは、典型的には、長さが８〜１０００ヌクレオチド、例えば１０〜８００、更に好ましくは１５〜７００、典型的には、２０〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸を含む。より長いプローブも使用することができることは理解されるべきである。本発明の好ましいプローブは、変化を有するＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイゼーションすることができる、長さが８〜５００ヌクレオチドの一本鎖核酸分子である。
【００９５】
本発明の特定の態様は、変化した（例えば突然変異した）ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡに対して特異的な核酸プローブ、即ち、それぞれ、該変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡに対して特異的にハイブリダイゼーションしそしてそれぞれ該変化を欠いているＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡに対して本質的にハイブリダイゼーションしない核酸プローブである。特異性は、標的配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって発生するシグナルとは区別されうる特異的シグナルを発生することを示す。完全に相補性の配列は、本発明に従うプローブをデザインするのに好ましい。しかしながら、特異的シグナルが非特異的ハイブリダイゼーションから識別されうる限りは、ある程度のミスマッチは許容されうることは理解されるべきである。
【００９６】
このようなプローブの特定の例は、点突然変異を有するＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはＲＮＡを含むゲノム領域の標的部分に対して相補性の核酸配列である。更に詳しくは、プローブは、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６配列からなる群より選ばれる配列に由来する配列を含むことができる。
【００９７】
プローブの配列は、本願で提供されたＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子およびＲＮＡの配列に由来することができる。ヌクレオチド置換を行うことができ、そしてプローブの化学的改変も行うことができる。このような化学的改変は、ハイブリッドの安定性を増加させるため（例えばインターカレーション基）又はプローブを標識するために達成することができる。標識の典型的な例は、放射能、螢光、ルミネッセンス、酵素標識等を含むがそれらに限定されない。
【００９８】
本発明は、被験体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法または肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法における上記した核酸プローブの使用にも関する。
【００９９】
特異的リガンド結合
上記したとおり、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチド配列または発現レベルにおける変化についてスクリーニングすることにより検出することもできる。この点について、本発明の特定の態様は、前記サンプルをＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれるポリペプチドに対して特異的なリガンドと接触させそして複合体の形成を決定することを含む。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ１である。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ５である。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ６である。
【０１００】
特異的抗体などの異なるタイプのリガンドを使用することができる。特定の態様では、サンプルを、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６からなる群より選ばれるポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、そして免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための種々の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を使用することができる。
【０１０１】
本発明の状況内では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメントまたは誘導体を意味する。フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域等を含む。誘導体は、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多官能性抗体等を含む。
【０１０２】
ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに対して特異的な抗体は、それぞれ、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに対して選択的に結合する抗体を意味する。更に詳しくは、それは、それぞれ、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドあるいはそのエピトープ含有フラグメントに対して生じた抗体を意味する。他の抗原に対する非特異的な結合が起こりうるけれども、標的ＫＣＮＡポリペプチドへの結合は、より高いアフイニティーで起こり、そして非特異的結合から信頼可能に識別されうる。
【０１０３】
特定の態様では、本方法は、被検体からのサンプルを、変化した形態のＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに対して特異的な抗体（でコーティングされた支持体）と接触させ、そして免疫複合体の存在を決定することを含む。特定の態様では、サンプルを、異なる形態のＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチド、例えば野生型およびその種々の変化した形態に対して特異的な種々の抗体（でコーティングされた支持体）と、同時にまたは平行して又は順次に接触させることができる。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ１である。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ５である。場合により、ポリペプチドはＫＣＮＡ６である。
【０１０４】
本発明は、被験体における肥満または関連した障害の存在または素因を検出する方法、あるいは肥満または関連した障害の処置に対する被験体の応答を評価する方法における上記したリガンド、好ましくは抗体、そのフラグメントまたは誘導体の使用にも関する。
【０１０５】
本発明は、被験体からのサンプルにおいて、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドにおける、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチド発現における、および／または、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６活性における変化の存在を検出するための産物および試薬を含む診断キットにも関する。本発明に従う該診断キットは、本発明に記載されたいかなるプライマー、いかなるプライマーの対、いかなる核酸プローブおよび／またはいかなるリガンド、好ましくは抗体も含む。本発明に従う該診断キッドは、ハイブリダイゼーション、増幅または抗原−抗体免疫反応を行うための試薬および／またはプロトコールを更に含むことができる。
【０１０６】
診断方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行うことができる。診断方法は、被検体からのサンプルを使用して、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスの状態を評価する。更に詳しくは、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。サンプルは、核酸又はポリペプチドを含有する、被検体に由来するいかなる生物学的サンプルであってもよい。このようなサンプルの例は、体液、組織、細胞サンプル、器官、生検等を含む。最も好ましいサンプルは、血液、血漿、唾液、尿、精液等である。例えば、胎児細胞または胎盤細胞を試験することにより、出生前診断を行うこともできる。サンプルは、慣用の方法により採集することができ、そして診断のために直接使用するか又は保存することができる。サンプルは、試験するための核酸またはポリペプチドの利用性（availability）を与えるか又は改善するために、本方法を行う前に処理することができる。処理は、例えば、ライシス（lysis）（例えば、機械的、物理的、化学的等）、遠心等を含む。また、核酸および／またはポリペプチドは、慣用の技術により予備精製するか又は濃縮することができおよび／または複雑度（complexity）を減少させることができる。核酸およびポリペプチドは、酵素又は他の化学的処理または物理的処理により処理してそのフラグメントを産生させることもできる。請求された方法の高い感度を考えると、非常に少ない量のサンプルがアッセイを行うのに十分である。
【０１０７】
示されたとおり、好ましくは、変化したＫＣＮＡ遺伝子ローカスの存在を評価するために、サンプルを、プローブ、プライマーまたはリガンドなどの試薬と接触させる。更に詳しくは、染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスは、ＫＣＮＡ１遺伝子ローカス、ＫＣＮＡ５遺伝子ローカスおよびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスからなる群より選ばれる。接触は、プレート、チューブ、ウエル、ガラス等などの任意の適当な装置において行うことができる。特定の態様では、接触は、核酸アレー又は特異的リガンドアレーなどの試薬でコーティングされた基材上で行われる。基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の支持体などの固体または半固体基材であることができる。基材は、種々の形態およびサイズ、例えば、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲル等であることができる。接触は、試薬とサンプルの核酸またはポリペプチド間で複合体が形成されるのに適当な任意の条件下に行うことができる。
【０１０８】
サンプルにおける変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡの発見は、被検体における染色体１２上の変化したＫＣＮＡ遺伝子ローカスの存在を示し、これは肥満または代謝障害の存在、素因又は進行の段階と相関することができる。例えば、生殖系列ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６突然変異を有する個体は、肥満または代謝障害を発生する危険が増加する。被検体における染色体１２上の変化したＫＣＮＡ遺伝子ローカスの存在の決定は、より効果的でありそして特注される適切な治療介入のデザインも可能とする。また前兆レベルでのこの決定は、予防治療方式を適用することを可能とする。
【０１０９】
薬物スクリーニング
本発明は、薬物候補またはリードのスクリーニングのための新規な標的および方法も提供する。本方法は、結合アッセイおよび／または機能的アッセイを含み、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞系、動物、等において行うことができる。
【０１１０】
本発明の特定の目的は、試験化合物を、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させそして該試験化合物のそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドに結合する能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。該遺伝子またはポリペプチドへの結合は、該標的の活性をモデュレーションし、従って被験体における肥満または関連した障害をもたらす経路に影響を与える該化合物の能力に関する指示を与える。好ましい態様では、本方法は、試験化合物を、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させそして該試験化合物の該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはフラグメントに結合する能力を決定することを含む。フラグメントは、好ましくは、ＫＣＮＡポリペプチドの機能的に重要な結合部位を含む。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントは、変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＣＮＴＮＡＰ２遺伝子もしくはポリペプチドまたはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子もしくはポリペプチドはＫＣＮＡ１遺伝子またはポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子もしくはポリペプチドはＫＣＮＡ５遺伝子またはポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドはＫＣＮＡ６遺伝子またはポリペプチドである。
【０１１１】
本発明の特定の目的は、試験化合物を、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはその結合部位含有フラグメントとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させそして該試験化合物のそれぞれ該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントは、それぞれ、変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ１ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ５ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ６ポリペプチドである。
【０１１２】
更なる特定の態様では、本方法は、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドを発現するリコンビナントホスト細胞を試験化合物と接触させ、そして該試験化合物の該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６に結合する能力そしてＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を決定することを含む。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントは、変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡポリペプチドはＫＣＮＡ１ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ５ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ６ポリペプチドである。
【０１１３】
結合の決定は、種々の技術、例えば試験化合物の標識、標識された基準リガンドとの競合等により行うことができる。
【０１１４】
本発明の更なる目的は、試験化合物を、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させそして該試験化合物の該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドの活性をモデュレーションする能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントは、変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ１ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ５ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ６ポリペプチドである。
【０１１５】
本発明の更なる目的は、試験化合物を、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させそして該試験化合物の該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子の発現をモデュレーションする能力を決定することを含む、肥満または関連した障害に対して活性な化合物を選択する方法にある。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはそのフラグメントは、本発明に従う変化または突然変異を含む、それぞれ変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ１遺伝子である。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ５遺伝子である。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ６遺伝子である。
【０１１６】
他の態様では、本発明は、試験化合物を、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子プロモーターのコントロールの下にレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含むリコンビナントホスト細胞と接触させ、そしてレポーター遺伝子の発現をモデュレーションする（例えば刺激または減少する）試験化合物を選択することを含む、活性な化合物、特に肥満または関連した障害に対して活性な化合物をスクリーニング、選択または同定する方法に関する。好ましくは、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子プロモーターまたはそのフラグメントは、変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子プロモーターまたはそのフラグメントである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ１遺伝子である。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ５遺伝子である。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子はＫＣＮＡ６遺伝子である。
【０１１７】
スクリーニングの方法の特定の態様では、モデュレーションは、阻害である。スクリーニングの方法の他の特定の態様では、モデュレーションは活性化である。
【０１１８】
上記スクリーニングアッセイは、任意の適当な装置、例えば、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコ等において行うことができる。典型的には、アッセイは、多重ウエルプレートで行われる。いくつかの試験化合物を、平行してアッセイすることができる。更に、試験化合物は、種々の起源、性質及び組成のものであることができる。それは、任意の有機または無機物質、例えば、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等であることができ、これらは単離されているかまたは他の物質と混合されていてもよい。化合物は、例えば、産物のコンビナトリアルライブラリーのすべてまたは一部であることができる。
【０１１９】
医薬組成物、治療
本発明の更なる目的は、（ｉ）上記した、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメント、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸、ベクターまたはリコンビナントホスト細胞および（ｉｉ）薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む医薬組成物である。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ１ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ５ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ６ポリペプチドである。
【０１２０】
本発明は、機能的（例えば、野生型）ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を被験体に投与することを含む、被験体における肥満または関連した障害を処置または予防する方法にも関する。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ１ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ５ポリペプチドである。場合により、該ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドはＫＣＮＡ６ポリペプチドである。
【０１２１】
本発明の他の態様は、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはタンパク質の発現または活性をモデュレーションする、好ましくは活性化するかまたは模倣する（mimics）化合物を被験体に投与することを含む、被験体における肥満または関連した障害を処置または予防する方法にある。該化合物は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに特異的な抗体もしくはそのフラグメントまたは誘導体であることができる。本方法の特定の態様では、モデュレーションは阻害である。本方法の他の特定の態様では、モデュレーションは活性化である。
【０１２２】
本発明は、一般に、被験体における肥満もしくは関連した障害を処置または予防するための医薬組成物の製造における、機能的ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチド、それをコードする核酸または本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはタンパク質の発現または活性をモデュレーションする化合物の使用にも関する。該化合物は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアゴニストもしくはアンタゴニスト、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６のアンチセンスもしくはＲＮＡｉ、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチドに特異的な抗体もしくはそのフラグメントまたは誘導体であることができる。本方法の特定の態様では、モデュレーションは阻害である。本方法の他の特定の態様では、モデュレーションは活性化である。
【０１２３】
本発明は、肥満または関連した障害とＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスとの相関を証明する。したがって、本発明は、治療的介入の新規な標的を与える。種々のアプローチは、被験体、特に変化したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６遺伝子ローカスを有する被験体におけるＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６活性または機能を回復するかまたはモデュレーションすることを意図することができる。このような被験体に野生型機能を与えることは、病理学的細胞または生物における肥満または関連した障害の表現型的発現を抑制することが期待される。このような機能の供給は、遺伝子またはタンパク質治療によってまたはＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６ポリペプチド活性をモデュレーションするかまたは模倣する化合物（例えば、上記スクリーニングアッセイにおいて同定されたアゴニスト）を投与することにより達成されうる。
【０１２４】
野生型ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子またはその機能的部分は、それを必要としている被験体の細胞に上記したベクターを使用して導入することができる。ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドであることができる。遺伝子は、ネイキッド（naked）ＤＮＡとして導入することもできる。遺伝子は、レシピエントホスト細胞のゲノムに組み込むかまたは染色体外に残るように与えることができる。組み込みは、ランダムにまたは正確に規定された部位で、例えば相同性組換えにより起こることができる。特に、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子の機能的コピーは、細胞における変化したバージョンの代わりに相同性組換えにより挿入されうる。更なる技術は、遺伝子ガン、リポソーム媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション等を含む。遺伝子治療は、直接遺伝子注入によりまたは機能的ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６  ポリペプチドを発現するｅｘ  ｖｉｖｏで調製された遺伝子的に改変された細胞を投与することにより達成されうる。
【０１２５】
ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６活性を有する他の分子（例えば、ペプチド、薬物、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６アゴニストまたは有機化合物）を使用して、被験体における機能的ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６活性を回復させるかまたは細胞において有害な表現型を抑制することもできる。
【０１２６】
細胞における機能的ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５またはＫＣＮＡ６遺伝子機能の回復を使用して、肥満または関連した障害の発生を予防するかまたはこの疾患の進行を減少させることができる。このような処置は、細胞、特に有害なアレルを有する細胞の肥満に関連した表現型を抑制することができる。
【０１２７】
遺伝子、ベクター、リコンビナント細胞およびポリペプチド
本発明の更なる局面は、診断、治療またはスクリーニングにおいて使用するための新規な産物にある。これらの産物は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５および／またはＫＣＮＡ６ポリペプチドをコードする核酸もしくはそのフラグメント、それを含むベクター、リコンビナントホスト細胞および発現されたポリペプチドを含む。
【０１２８】
更に詳しくは、本発明は、本発明に従う変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６遺伝子またはそのフラグメントに関する。本発明は、該変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸分子にも関する。該変化または突然変異は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６活性を改変する。改変された活性は、増加または減少させることができる。本発明は、更に、該変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６遺伝子またはそのフラグメントあるいは、該変化または突然変異を含む変化したまたは突然変異したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸分子を含むベクター、リコンビナントホスト細胞および発現されたポリペプチドに関する。
【０１２９】
本発明の更なる目的は、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。ベクターは、クローニングベクター、または更に好ましくは発現ベクター、即ち、コンピテントホスト細胞において該ベクターからＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドの発現を引き起こす調節配列を含むベクターであることができる。
【０１３０】
これらのベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドを発現し、トランスジェニックまたは「ノックアウト」非ヒト動物を創生し、核酸を増幅し、アンチセンスＲＮＡを発現するなどすることができる。
【０１３１】
本発明のベクターは、典型的には、調節配列、例えばプロモーター、ポリＡ等に作用可能に連結された（operably linked）本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６コード配列を含む。「作用可能に連結された」という用語は、調節配列がコード配列の発現（例えば転写）を引き起こすように、コード配列と調節配列が機能的に関連していることを示す。ベクターは、１つまたは複数の複製のオリジン（origin）および／または選択可能なマーカーを更に含むことができる。プロモーター領域は、コード配列に対して相同性または異種であることができ、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を含む、任意の適切なホスト細胞における遍在性の、構成的な、調節されたおよび／または組織特異的発現を与えることができる。プロモーターの例は、バクテリアプロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーター等）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥ等）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫ等）等を含む。
【０１３２】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣ等であることができる。プラスミドベクターは、市販のベクター、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ、ｐＢＲ等から調製することができる。ウイルスベクターは、当技術分野で知られているリコンビナントＤＮＡ技術に従って、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶｓ等から産生することができる。
【０１３３】
この点で、本発明の特定の目的は、上記したＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドをコードするリコンビナントウイルスにある。リコンビナントウイルスは、好ましくは複製に欠陥があり、更に好ましくは、Ｅ１−および／またはＥ４−欠失アデノウイルス、Ｇａｇ−、Ｐｏｌ−および／またはｅｎｖ−欠失レトロウイルスおよびＲｅｐ−および／またはＣａｐ−欠失ＡＡＶｓから選ばれる。このようなリコンビナントウイルスは、当技術分野で知られている技術により、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクションすることによりまたはヘルパープラスミドまたはウイルスによる一過性トランスフェクションにより産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞等を含む。このような複製に欠陥のあるリコンビナントウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えばＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出されうる。
【０１３４】
本発明の更なる目的は、上記したリコンビナントＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６遺伝子またはベクターを含むリコンビナントホスト細胞にある。適当なホスト細胞は、原核細胞（例えばバクテリアテ）および真核細胞（例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を含むが、これらに限定されない。特定の例は、E.coli、KluyveromycesもしくはSacharomyces酵母、哺乳動物細胞系（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）ならびに初代もしくは樹立された哺乳動物細胞培養物（例えば、繊維芽細胞、胚細胞（embryonic cells）、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等）を含む。
【０１３５】
本発明は、（ｉ）上記したリコンビナント核酸もしくはベクターをコンピテントホスト細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで導入し、（ｉｉ）得られたリコンビナントホスト細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで培養し、そして（ｉｉｉ）場合により、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドを発現する細胞を選択することを含む、本発明に従うＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドを発現するリコンビナントホスト細胞を産生するための方法にも関する。
【０１３６】
このようなリコンビナントホスト細胞は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５もしくはＫＣＮＡ６ポリペプチドの産生のためおよび下記した活性分子のスクリーニングのために使用することができる。このような細胞は、肥満または関連した障害を研究するためのモデル系として使用することもできる。これらの細胞は、任意の適切な培養装置（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、パウチ等）において、適当な培養培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭ等中に維持することができる。
【０１３７】
本発明の更なる局面および利点は、下記の実験の節に開示されるが、これらは本願を説明するものであり、本願の範囲を限定するものではない。
【０１３８】
実施例
１．染色体１２感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットホーム
ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットホームを適用して肥満感受性遺伝子の迅速な同定を可能とした。
簡単に言えば、この技術は、血縁関係のある個体（related individuals）のＤＮＡからペアーを形成することからなる。各ＤＮＡは、特異的標識でマーキングされてその同定を可能とする。次いで２つのＤＮＡ間でハイブリッドを形成する。次いで多段階手順で２つのＤＮＡから同祖性（identical-by-descent）（ＩＢＤ）のすべてのフラグメントを選択する特定の方法（ＷＯ００／５３８０２）を適用する。次いで、残りのＩＢＤに富んだＤＮＡを、ＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレーに対してスコアリングし、これは染色体上のＩＢＤフラシクションの位置決めを可能とする。
【０１３９】
多くの異なる家族に対するこの方法の適用により、各ファミリーからの各ペアーについてＩＢＤフラクションのマトリックスが得られる。次いで統計的解析は、試験されたすべてのファミリー間で共有される最小ＩＢＤ領域を計算する。有意な結果（ｐ値）は、関心のある形質（ここでは肥満）とのボジティブな領域の連鎖の証拠である。連鎖した区間（linked interval）は、有意なｐ値を示す２つの最も遠いクローンにより決定されうる。
【０１４０】
この研究では、甚だしい肥満（＞９０パーセンタイルのボディ．マス．インデックスにより定義された）について一致したドイツ起源の１６４家族（１７８の独立した同胞ペアー）を、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに供した。次いで、得られるＩＢＤに富んだＤＮＡフラクションを、Ｃｙ５蛍光染料で標識し、そして１．２メガ塩基対の平均間隔（average spacing）で全ヒトゲノムを包含する２２６３ＢＡＣクローンからなるＤＮＡアレーに対してハイブリダイゼーションさせた。Ｃｙ３で標識された選ばれなかったＤＮＡを使用して、各クローンについてシグナル値および計算比（compute ratios）を正規化した。次いで比の結果のクラスタリング（clustering）を行って、各クローンおよびペアーについてＩＢＤ状態を決定した。
【０１４１】
この手順を適用することにより、染色体１２上の領域における約１．５メガ塩基に及んでいる（塩基４４８３８４２〜５９２７００４）、いくつかのＢＡＣクローン（ＢＡＣＡ２１ＺＨ０４およびＢＡＣＡ１５ＺＨ０２）を同定し、これらは肥満に対する連鎖の有意な（ｐ＝１．３０Ｅ−１１）証拠を示した。
【０１４２】
表１：それぞれＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６ローカスを含有する領域における染色体１２についての連鎖結果：連鎖の証拠を有する２つのＢＡＣクローンに相当する領域が示される。クローンの開始および終止位置は、各々染色体（ｐ−ｔｅｒ）の開始に対するＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３４配列に基づくそれらのゲノム位置に対応する。
【０１４３】
【表２】
2008520233.tif 000003
【０１４４】
２．染色体１２上の肥満感受性遺伝子の同定
連鎖した染色体領域における上記した１．５メガ塩基をスクリーニングすることにより、我々は、肥満および関連した表現型のための候補として、シェーカー関連電位依存性カリウムチャンネル（shaker-related voltage-gated potassium channels）、即ち、ＫＣＮＡ６（電位依存性カリウムチャンネル、シェ−カー関連サブファミリー、メンバー６）、ＫＣＮＡ１（電位依存性カリウムチャンネル、シェ−カー関連サブファミリー、メンバー１（ミオキミアを伴うエピソード性運動失調（episodic ataxia））およびＫＣＮＡ５（電位依存性カリウムチャンネル、シェーカー関連サブファミリー、メンバー５）のαサブユニットをコードする３つの遺伝子のクラスターを同定した。これらの遺伝子は、上記に概説されたクローンにより範囲を定められた連鎖（delimited linkage）の証拠を伴って、実際に臨界的区間において存在する。
【０１４５】
ＫＣＮＡ６遺伝子は、ＮＰ＿００３６２７（ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００２２３５、４２３７ｂｐ）について予測された５２９アミノ酸ポリペプチドをコードしそしてゲノム配列の４．２３７kbにわたり広がっている。この遺伝子によりコードされたタンパク質は、電位依存性カリウムチャンネル、シェーカー関連サブファミリーのメンバーである。このメンバーは、第４セグメントにおいてシェーカー型反復（shaker type repeat）を有する６つの膜貫通ドメイン（six membrane-spanning domains）を含有する。それは遅延整流クラス（delayed rectifier class）に属する。
【０１４６】
ＫＣＮＡ１遺伝子は、ＮＰ＿０００２０８（ｍＲＮＡ  ＮＭ＿０００２１７、１４８８bp）について予測された４９５アミノ酸ポリペプチドをコードする。この遺伝子によりコードされたタンパク質は、電位依存性カリウムチャンネル、シェーカー関連サブファミリーに属する。ＫＣＮＡ１／Ｋｖ１．１産物は、６つの推定膜貫通セグメント（Ｓ１〜Ｓ６）を有し、そしてＳ５とＳ６間のループはポアーを形成しそして保存された選択性フィルターモチーフ（ＧＹＧＤ）を含有する。この機能的チャンネルはホモテトラマーである。チャンネルのN末端は、βサブユニットと会合しており、それによりチャンネルの不活性化性質を改変することができそして発現レベルに影響を与えることができる。Ｃ末端は、ＰＤＺドメインタンパク質、例えばチャンネルターゲティングの責任を担うコンタクチン関連タンパク質様２（contactin associated protein like 2）に複合される。
【０１４７】
ＫＣＮＡ５は、ＮＰ＿００２２２５（ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００２２３４、２８６５bp）について予測されたアミノ酸ポリペプチドをコードしそしてゲノム配列の２．８６５kbにわたり広がっている。この遺伝子は、電位依存性カリウムチャンネル、シェーカー関連サブファミリー、メンバー５をコードする。このメンバーは、第４セグメントにおいてシェーカー型反復を有する６つの膜貫通ドメインを含有する。
【０１４８】
電位依存性カリウム（Ｋｖ）チャンネルは、機能的および構造的観点の両方から電位依存性イオンチャンネルの最も複雑なクラスを示す。それらの多様な機能は、神経伝達物質放出、心拍数、インスリン分泌、ニューロン興奮性、上皮電解質輸送、平滑筋収縮および細胞容積を調節することを含む。哺乳動物シェーカーカリウムチャンネルαサブユニットは、チャンネルの不活性化をモデュレーションする細胞質βサブユニットと会合する。シェーカーカリウムチャンネル複合体は、４αおよび４βサブユニットからなると考えられる。
【０１４９】
最近の研究は、Ｋｖチャンネルは、β細胞電気的活性およびインスリン分泌の調節における活性な参加者（participants）であることを示唆する（MacDonald and Wheeler, 2003）。ＫＣＮＡ５は、遅延整流クラスに属し、その機能は脱分極後にβ細胞の静止膜電位を回復し、それによりインスリン分泌の調節に寄与する。ＫＣＮＡ１およびＫＣＮＡ６は、ヒト島細胞において発現されることも見出された（MacDonald and Wheeler, 2003）。
【０１５０】
β細胞Ｋｖチャンネルは、Ｇタンパク質共役型ＧＬＰ−１レセプターの標的でありそしてグルコース代謝、インスリン分泌のコントロールに生理学的に関連しうる経路、からのシグナルの標的である（MacDonald and Wheeler, 2003）。
【０１５１】
Ｋｖ１．３欠失マウス（Ｋｖ１．３（−／−）の検査は、体重調節におけるＫｖ１．３について以前に認識されていない役割を示した（Xu et al., 2003）。Ｋｖ１．３（−／−）マウスは、コントロール同腹子より有意に少ない体重であった（Xu et al., 2003）。更に、ノックアウトマウスは、食餌で誘導される肥満から保護されそして高脂肪食を与えられたとき同腹子コントロールよりも有意に小さい体重を得た。
【０１５２】
MacDaniel et al. (2001)は、ラットにおけるＫＣＮＡＢ２によりコードされたＫｖβ２．１を含む多重Ｋｖチャンネルαおよびβサブユニットを機能的に発現する腸間膜動脈平滑筋（ＭＡＳＭＣ）および腸管上皮細胞における４−アミノピリジン（４−ＡＰ）、Ｋｖチャンネルブロッカー、の細胞外適用によるＫ＋チャンネル遮断の食欲不振効果を報告した。
【０１５３】
食欲不振薬物、フェンフルラミンおよびデキセンフルラミンは、セロトニン輸送体を阻害することに加えて（Baumann, et al,2000）、血管平滑筋細胞におけるＫｖチャンネル活性を減少させる（Hu et al, 1998, Michelakis et al, 1999; Wang et al., 1997）ことが証明された。これらの観察は、ＭＡＳＭＣにおけるＫｖチャンネルの活性が栄養輸送をコントロールすることによりエネルギー摂取の調節における重要な役割を演じうることを示唆する。
【０１５４】
既知の薬物を含むいくつかの化合物は、下記したとおりＫＶ１チャンネル、特にＫｖ１．１またはＫｖ１．５チャンネルの活性を阻害することが見出された。タンパク質キナーゼ媒介リン酸化は、これらのクラスのチャンネルの活性をモデュレーションすることにおける役割を演じるとも思われる。
【０１５５】
Yeung et al.(1999)は、哺乳動物ニューロンにおけるＫｖ１．１を含むＫＶ電流のブロックは、治療レベルのフルオキセチン、抗抑鬱薬、において起こりうると結論した。
【０１５６】
Madeja et al.(1994)は、Xenopus laevis 卵母細胞発現系におけるクローニングされたラット脳カリウムチャンネルＫｖ１．１に対するてんかん発作発現剤ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）の効果を調べた。Ｋｖ１．１チャンネルは、電位依存性方式でＰＴＺにより影響を受けた。ＰＴＺは、より高い負電位でカリウム電流を増加させそしてより高い正電位でカリウム電流を減少させた。
【０１５７】
クローニングされたラット脳Ｋｖ１．１チャンネルは、Xenopus laevis 卵母細胞発現系において電位依存性方式でてんかん発作発現剤ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）により影響を受けた（Maeda et al., 1999）。ＰＴＺはより高い負電位でカリウム電流を増加させそしてより高い正電位でカリウム電流を減少させた。
【０１５８】
Kourrich et al(2001)は、カリオトキシン、Ｋｖ１．１およびＫｖ１．３チャンネルブロッカーが、ラットにおける連合学習を改良することを示した。
【０１５９】
マルガトキシン（ＭｇＴＸ）、α−デンドロトキシン（α−ＤＴＸ）およびデンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＫ−Ｋ）によるＫｖ１、特にＫｖ１．１チャンネルの遮断は、腸神経系における神経伝達物質の放出を高めることによりモルモットの回腸の蠕動活性を増加させる（Vianna-Jorge et al., 2003）。ノルトリテルペンコレオリド（nortriterpene correolide）、すべてのＫｖ１サブタイプの非選択性阻害剤は、蠕動収縮を誘発するための圧力閾値の漸減及び持続した減少を引き起こす。マルガトキシン（ＭｇＴＸ）、α−デンドロトキシン（α−ＤＴＸ）およびデンドロトキシンＫ（ＤＴＸ−Ｋ）、あるＫｖ１サブタイプの高度に選択性ペプチジル阻害剤は、圧力閾値の即時の減少を引き起こす。
【０１６０】
Folco et al. (2004)は、カベオリン−３およびＳＡＰ９７が電位依存性カリウムチャンネルｋＶ１．５を調節するスカフォールディングタンパク質複合体を形成することを証明した。
【０１６１】
電位依存性カリウムチャンネルｋＶ１．５は、より少ない副作用を有する新規な心房選択性薬物の開発のための有望な標的と考えられる。Peukert et al.(2003)は、Ｋｖ１．５チャンネルのブロッカーとしてｏ，ｏ−二置換されたビスアリール化合物を発見する研究を示した。最も強力な化合物（例えば、１７ｃおよび１７ｏ）は、マイクロモル以下の半ブロッキング濃度でＫｖ１．５チャンネルを阻害しそしてＫｖ１．３に対する３倍の選択性を示しそしてＨＥＲＧチャンネルおよびナトリウ電流に対する有意な効果を示さなかった。更に、化合物１７ｃおよび１７ｍは、ブタモデルにおいて抗不整脈効果を既に示している。
【０１６２】
ファーマコポアをベースとするバーチャルスクリーニングアプローチを使用するアントラニルアミドスカフォールドに基づく効力のある新規なｋＶ１．５ブロッカーの研究において、（Peukert et al.(2004)は、Ｋｖ１．５のマイクロモル以下で阻害を示しそしてＨＥＲＧチャンネルに対して有意な効果を示さない効力のある化合物を同定した。
【０１６３】
カリウムチャンネルを再分極する心臓作用電位（cardiac action potential）に対すベラパミルおよびそのエナンチオマーおよび代謝物の効果が、膜電位固定法（two-electrode voltage-clamp）実験を行うことにより、カリウムチャンネルＫｖ１．１、Ｋｖ１．５、Ｋｉｒ２．１およびＨＥＲＧおよびＩＫｓチャンネル複合体のＩｓＫユニットを発現するＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において試験された（Waldegger et al., 1999）。ベラパミルは、Ｋｖ１．１電流の濃度依存性ブロツクを誘導した。
【０１６４】
ＡＶＥ０１１８、心房抗不整脈薬は、それぞれ、５．３４＋／−０．７マイクロモルおよび６．２＋／−０．４マイクロモルのＩＣ（５０）値でＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において発現されたブタＫｖ１．５およびヒトＫｖ１．５をブロッキングした（Gogelein et al., 2004）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＡＶＥ０１１８は、１．１＋／−０．２マイクロモルのＩＣ（５０）値で定常状態ｈＫｖ１．５電流を減少させた。
【０１６５】
Choi et al.(2002)からの結果は、ＡＧ−１４７８、チロシンキナーゼ阻害剤は、オープンチャンネルブロッカーとして且つＰＴＫに対するＡＧ−１４７８の効果とは無関係に、Ｋｖ１．３５電流に対して直接作用することを示唆する。
【０１６６】
Ｋｖ１．１またはＫｖ１．５チャンネルの活性をモデュレーションするプロテインキナーゼは、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣを含む。リン酸化されていないＫＶ１．１チャンネルとリン酸化されているＫｖ１．１との電流活性化の電圧依存性の差が観察された（Winkelhofer et al., 2003）。Boland and Jackson(1999)は、プロテインキナーゼＣがカエル卵母細胞においてＫｖ１．１カリウムチャンネル機能を阻害することを証明した。
【０１６７】
染色体１２上の肥満に連鎖した遺伝子変化のクリティカルな区間においてヒトＫＣＮＡ６、ＫＣＮＡ１およびＫＣＮＡ５遺伝子を同定する、本願で提供された連鎖結果を、電位依存性カリウム（Ｋｖ）チャンネルの活性化へのその関与と併せて、我々は、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＡ５およびＫＣＮＡ６遺伝子またはその調節配列における変化（例えば、突然変異および／または多型）は、ヒト肥満の発生に寄与することができ、そして診断または治療介入のための新規な標的に該当することができると結論する。肥満の発生におけるＫＣＮＡ１の関与は、本発明者等がここで研究したのと同じ集団において肥満と連鎖および関連していることも見出した（US patent application）ＣＮＴＮＡＰ２遺伝子産物との相互作用により更に支持される。
【０１６８】
【表３】
2008520233.tif 000004
2008520233.tif 000005
2008520233.tif 000006
2008520233.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】Genomic Hybrid Identity Profiling（GenomeHIP）を使用する高密度マッピング。全ヒトゲノムを示すクローン間の１．２メガ塩基対の平均間隔を有する総計２２６３のＢＡＣクローンを、GenomeHIPを使用して連鎖について試験した。各点は、クローンに対応する。連鎖の有意な証拠は、クローンＢＡＣＡ２１ＺＨ０４（ｐ値１．３×１０−１１）およびＢＡＣＡ１５ＺＨ０２（ｐ値１．６×１０−８）について計算された。全連鎖領域は、ヒト染色体１２上の４４８３８４２塩基対から５９２７００４塩基対までの領域を含む。有意な連鎖のための有意な水準に相当するｐ値２×１０−５が、LanderおよびKruglyak(1995)により提唱された、全ゲノムスクリーンのための有意水準として使用された。
【図１】
2008520233.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月24日(2007.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体からのサンプルにおける染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を検出することを含む、被験体における肥満または糖尿病の存在または素因を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法。
【請求項２】
染色体１２上のＫＣＮＡ遺伝子ローカスにおける変化の存在を、配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅により検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変化が、肥満または関連した障害と関連した１つまたは複数のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ１遺伝子ローカスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ５遺伝子ローカスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
染色体１２上の該ＫＣＮＡ遺伝子ローカスがＫＣＮＡ６遺伝子ローカスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2008520233.tif 000009
2008520233.tif 000010
2008520233.tif 000011
2008520233.tif 000012
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