(57)【要約】プローブ分子を液相で固定化するのに用いられる化学架橋剤でパターン化された表面の製造および回折ベースの検出におけるその利用である。この発明の１実施例において、化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１は、パターンを形成する基板表面の領域に被着され、表面上に所望の濃度の共有結合架橋剤が得られるのに十分な期間表面と反応可能にされる。架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１と表面との間の反応は、既知の手法、例えば、加熱、マイクロ波照射、超音波分解等を用いて促進してより短い時間に所望の密度を実現できる。この発明の他の実施例では、２またはそれ以上の他の種類の架橋剤を表面上にパターン状に塗布して液体中で２またはそれ以上の異なる種類の分子を検出しても良い。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の少なくとも１種類のプローブ分子を固定化するセンサにおいて、
表面の予め選択された領域を少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化させた基板であって、Ｘ１は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、Ｒ１はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を最小化させる化学構造部分であり、Ｙ１は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であるものと、
遮断分子Ｘ２−Ｒ２が塗布されて化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化されていない、上記基板の残余領域であって、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を最小化させる化学構造部分であり、Ｒ１と同じでも異なっても良いものであるものとを有し、
上記パターン化された表面を溶液中で上記プローブ分子と接触させることにより、上記プローブ分子と上記少なくとも１つの化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の上記Ｙ１の化学的官能基との間の強い相互作用が生じ、この強い相互作用により上記プローブ分子が固定化されることを特徴とするセンサ。
【請求項２】
上記表面は当該表面を求電子性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求核性の化学官能基である請求項１記載のセンサ。
【請求項３】
Ｘ１は、アミン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびチオールからなるグループから選択される請求項２記載のセンサ。
【請求項４】
上記表面は当該表面を求核性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求電子性の化学官能基である請求項１記載のセンサ。
【請求項５】
Ｘ１は、カルボン酸およびその活性化形態、エポキシド、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、およびクロロシランからなるグループから選択される請求項４記載のセンサ。
【請求項６】
Ｒ１は、生体分子であるプローブと相性がよいように選択され、非特異性相互作用を最小化する部分である請求項１、２、３、４または５記載のセンサ。
【請求項７】
Ｒ１は、約２から約２００原子長のアルキル鎖であって、オプションとしてヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されているものから構成される請求項１、２、３、４、５または６記載のセンサ。
【請求項８】
官能基Ｙ１は塩素化酸、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスシニミジル（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯｂｔ）エステル、イミダゾリド、エポキシド、アルデヒド、アルファ−ハロカルボニル、アミン、ヒドラジド、およびイソシアネートからなるグループから選択される請求項１、２、３、４、５、６、または７記載のセンサ。
【請求項９】
上記少なくとも１つの化学架橋剤は少なくとも２つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１およびＸ３−Ｒ３−Ｙ３であり、上記２つの化学架橋剤により形成されたパターンは相互に異なり識別可能であり、Ｘ１およびＸ３は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、同一でも同一でなくとも良く、Ｒ１およびＲ３はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を最小化させる化学構造部分であり、同一でも同一でなくとも良く、Ｙ１およびＹ３は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であり、同一でも同一でなくとも良く、
上記少なくとも２つの化学架橋剤によりパターン化されていない、上記基板の残余領域は遮断分子Ｘ２−Ｒ２が塗布されており、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１またはＸ３と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｒ１またはＲ３と同じでも異なっても良いものであり、上記パターン化された表面を第１のプローブ分子を含む溶液に接触させて、上記第１のプローブ分子と上記化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の官能基Ｙ１との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記第１のプローブ分子を固定化させ、上記パターン化された表面を第２のプローブ分子を含む溶液に接触させて、上記第２のプローブ分子と上記化学架橋剤Ｘ３−Ｒ３−Ｙ３の官能基Ｙ３との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記第２のプローブ分子を固定化させる請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のセンサ。
【請求項１０】
上記表面は当該表面を求電子性表面とする部分を含み、Ｘ３は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求核性の化学官能基である請求項９記載のセンサ。
【請求項１１】
Ｘ３は、アミン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびチオールからなるグループから選択される請求項１０記載のセンサ。
【請求項１２】
上記表面は当該表面を求核性表面とする部分を含み、Ｘ３は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求電子性の化学官能基である請求項９記載のセンサ。
【請求項１３】
Ｘ３は、カルボン酸およびその活性化形態、エポキシド、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、およびクロロシランからなるグループから選択される請求項１２記載のセンサ。
【請求項１４】
Ｒ３は、生体分子であるプローブと相性がよいように選択され、非特異性相互作用を最小化する部分である請求項９、１０、１１、１２または１３記載のセンサ。
【請求項１５】
Ｒ３は、約２から約２００原子長のアルキル鎖であって、オプションとしてヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されているものから構成される請求項９、１０、１１、１２、１３または１４記載のセンサ。
【請求項１６】
官能基Ｙ３は塩素化酸、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスシニミジル（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯｂｔ）エステル、イミダゾリド、エポキシド、アルデヒド、アルファ−ハロカルボニル、アミン、ヒドラジド、およびイソシアネートからなるグループから選択される請求項９、１０、１１、１２、１３、１４または１５記載のセンサ。
【請求項１７】
回折に基づく検定に用いられる請求項１〜１６のいずれかに記載のセンサであって、流体中のプローブ分子を少なくとも上記化学架橋剤に結合させて、回折画像を形成させ、この回折画像は、プローブ分子の上記プローブ分子への結合がない場合に観測される回折画像と異なるセンサ。
【請求項１８】
パターン状の固定化されたプローブ分子を具備する基板を製造する方法において、
少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１により基板の表面の予め選択された領域をパターン化するステップであって、Ｘ１は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、Ｒ１はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｙ１は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であるステップと、
遮断分子Ｘ２−Ｒ２を上記基板に対して露出させ、上記少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化されていない、上記基板の残余領域に塗布するステップであって、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｒ１と同じでも異なっても良いものであるステップと、
上記パターン化された表面を溶液中で上記プローブ分子と接触させることにより、上記プローブ分子と上記少なくとも１つの化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の上記Ｙ１の化学的官能基との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記化学的官能基に結合した上記プローブ分子を固定化させるステップとを有することを特徴とする方法。
【請求項１９】
上記表面は当該表面を求電子性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求核性の化学官能基である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｘ１は、アミン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびチオールからなるグループから選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
上記表面は当該表面を求核性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求電子性の化学官能基である請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
Ｘ１は、カルボン酸およびその活性化形態、エポキシド、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、およびクロロシランからなるグループから選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１は、生体分子であるプローブと相性がよいように選択され、非特異性相互作用を最小化する部分である請求項１８、１９、２０、２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
Ｒ１は、約２から約２００原子長のアルキル鎖であって、オプションとしてヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されているものから構成される請求項１８、１９、２０、２１、２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
官能基Ｙ１は塩素化酸、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスシニミジル（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯｂｔ）エステル、イミダゾリド、エポキシド、アルデヒド、アルファ−ハロカルボニル、アミン、ヒドラジド、およびイソシアネートからなるグループから選択される請求項１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれかに記載の方法であって、上記少なくとも１つの化学架橋剤は少なくとも２つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１およびＸ３−Ｒ３−Ｙ３であり、上記２つの化学架橋剤により形成されたパターンは相互に異なり識別可能であり、Ｘ１およびＸ３は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、同一でも同一でなくとも良く、Ｒ１およびＲ３はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を最小化させる化学構造部分であり、同一でも同一でなくとも良く、Ｙ１およびＹ３は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であり、同一でも同一でなくとも良く、
上記少なくとも２つの化学架橋剤によりパターン化されていない、上記基板の残余領域は遮断分子Ｘ２−Ｒ２が塗布されており、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１またはＸ３と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｒ１またはＲ３と同じでも異なっても良いものであり、上記パターン化された表面を第１のプローブ分子を含む溶液に接触させて、上記第１のプローブ分子と上記化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の官能基Ｙ１との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記第１のプローブ分子を固定化させ、上記パターン化された表面を第２のプローブ分子を含む溶液に接触させて、上記第２のプローブ分子と上記化学架橋剤Ｘ３−Ｒ３−Ｙ３の官能基Ｙ３との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記第２のプローブ分子を固定化させる、上記方法。
【請求項２７】
上記表面は当該表面を求電子性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求核性の化学官能基である請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
Ｘ１は、アミン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、およびチオールからなるグループから選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
上記表面は当該表面を求核性表面とする部分を含み、Ｘ１は上記基板の表面と共有結合的に反応可能な求電子性の化学官能基である請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
Ｘ１は、カルボン酸およびその活性化形態、エポキシド、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、およびクロロシランからなるグループから選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ１は、生体分子であるプローブと相性がよいように選択され、非特異性相互作用を最小化する部分である請求項２６、２７、２８、２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ３は、生体分子であるプローブと相性がよいように選択され、非特異性相互作用を最小化する部分である請求項２６、２７、２８、２９、３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ３は、約２から約２００原子長のアルキル鎖であって、オプションとしてヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されているものから構成される請求項２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
官能基Ｙ３は塩素化酸、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスシニミジル（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯｂｔ）エステル、イミダゾリド、エポキシド、アルデヒド、アルファ−ハロカルボニル、アミン、ヒドラジド、およびイソシアネートからなるグループから選択される請求項２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
回折に基づく検定に用いられる請求項１８〜３４のいずれかに記載の方法であって、流体中のプローブ分子を少なくとも上記化学架橋剤に結合させて、回折画像を形成させ、この回折画像は、プローブ分子の上記少なくとも１つの架橋剤への結合がない場合に観測される回折画像と異なる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、「パターン化された表面およびその回折に基づく検出への利用」という名称で２００４年８月４日に出願された仮特許出願第６０／５９８４３８号に関連する。
【０００２】
この発明は、プローブ分子の液相固定化に用いる化学架橋剤でパターン化された表面の製造およびその回折に基づく検出への利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
回折に基づくセンサは、生物学的に活性なプローブ分子でパターン化された基板表面を製造できるかどうかに依拠する。表面のパターン化は多くの手法で実現できる。多くの種々の方法に加え、最も実用的な方法はミクロ接触プリンティングである。この方法は、表面の浮き彫りパターンを具備するエラストマー性スタンプを用い、分子溶液をスタンプに付け、パターン化対象の基板の表面にスタンプを接触させ、これにより、スタンプと基板表面の接触領域に分子を転写するものである。Ｋｕｍａｒ、その他の米国特許第５，５１２，１３１号（特許文献１）は、表面に自己組織化単一層（ＳＡＭ）を形成する分子のミクロ接触プリンティングによりパターン化された表面を形成することを説明している。使用表面の単一の例は金である。ＣｈｉｌｋｏｔｉおよびＹａｎｇの米国特許第６，４４４，２５４号（特許文献２）は、活性化されたポリマー表面に配位子をミクロ接触プリントすることによりパターン化を行うことを説明している。配位子は、活性可されたポリマーの表面と共有結合される反応性末端を含む。配位子は、生物学的分子または非生物学的な合成ポリマーおよびプラスチックとして説明されている。タンパク質を直接に珪素、二酸化珪素、ポリスチレン、ガラス、およびシラン化ガラスに直接にミクロ接触プリントすることが、Ｂｅｒｎａｒｄ，Ａ、Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ，Ｅ、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｈ、Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂ、Ｂｏｓｓｈａｒｄ，Ｈ．Ｒ、Ｂｉｅｂｕｙｃｋ，Ｈの”Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９８）１４、２２２５−２２２９（非特許文献１）に報告されている。
【０００４】
米国特許第５，９２２，５５０号（回折画像を生成する生物検出装置。特許文献３）は、金属コートポリマー上に受容体の自己組織化単一層をミクロ接触プリントしてパターン化表面を製造する方法を説明する。この方法は、米国特許第６，０６０，２５６号（光学回折生物検出器。特許文献４）において受容体（自己組織化である必要はない）の予め定められたパターンの場合に拡張されている。
【０００５】
これはすべての特許はミクロ接触プリントにより表面上にプローブ分子を直接にパターン化することを説明する。ミクロ接触プリントは小さな分子、例えば、アルカンチオールおよび配位子のパターン化をうまく行うように見えるけれども、タンパク質は処理過程で生物学的に非活性化されてしまう傾向がある。
【０００６】
タンパク質および他の生物分子を他のタンパク質、小さな分子、ポリマー、蛍光タグ、その他に結合するためにヘテロ２官能性の化学架橋剤を用いることが広く知られており、これは生物学的な活性の損失を伴わない（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＧＴ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６。）。したがって、表面上にこれら化学架橋剤をパターン化し、その後、タンパク質および他のプローブ分子をこれら架橋剤と共有反応させることにより、高度に生物活性を有する生物分子を固定化できる。
【０００７】
回折に基づく試験にパターン化された表面を使用することは説明されている。米国特許第５，９２２，５５０号（回折画像を生成する生物検出装置。特許文献３）は、金属でコートされたポリマーフィルム上の受容体で自己組織化単一層を予めパターン化させておくことにより、媒体中の検体を検出し定量化する装置および方法を説明している。検体のサイズは、伝送される光の波長と同一のオーダーであり、その結合結果は可視である。米国特許第４，６４７，５４４号（光学干渉検出を利用した免疫学的検定。特許文献５）は、配位子または抗体が基板上に予め定められたパターン、好ましくはストライプで配列され、配位子およびアンチ配位子の間、または抗体および抗原の間の結合が、ブラッグ反射角に設定された光学検出器により検出され、それが光学的な干渉に由来すると考えられる、光学装置および方法を説明している。配位子または抗体のパターンは、まず、基板に抗体の一様な層を塗布し、その後、被覆部分を非活性化することにより、生成される。米国特許第４，８７６，２０８号（回折免疫学的検定装置および方法。特許文献６）は、結合が起こり得る生物学的プローブの等間隔の線から成るパターン（「生物学的回折格子」）を具備するシリコンまたはポリシリコンの基板に基づく免疫学的検定のための装置および方法を説明している。パターンは、まず、基板を抗体の一様な層でコートし、この後、マスクおよび紫外（ＵＶ）線を使用して領域を非活性化することにより生成される。このアイデアは米国特許第５，０８９，３８７号（ＤＮＡプローブ回折検定および試薬。特許文献７）においてＤＮＡの分析に拡張され、この特許は、生物学的回折格子、ならびに、混成化剤の一様な層を平滑な面に固定化し、その後、回折格子線のマスクを介してこの面に対してＵＶ照射を行なうことにより、それを製造する方法を説明している。ＵＶ照射により混成化剤が非活性化され、活性混成化剤の線パターンが残される。
【０００８】
Ｋｕｍａｒ、その他の米国特許第５，５１２，１３１号（特許文献１）はＳＡＭでパターン化された表面を生物センサとして使用することを説明している。ここでは、検体の結合相手が設けられているＳＡＭを、既知の量のラベル化検体（競合検定）を混合された検体を含む媒体に、または検体および過剰な量のラベル化二次結合相手（サンドイッチ検定）を含む媒体に、露出させ、この後、「コヒーレントな電磁波で照射して回折観測することができ、回折パターンの強度を用いてラベルの量を定量化する。」この特許は、媒体に合成的に組みこんだラベル化された検体を検出することを説明しているが、実際の検体を検出する手段を提供することに成功していない。
【０００９】
本件の発明は、表面がパターン化された化学架橋剤を含有する基板を製造することにより、表面にプローブ分子、例えばタンパク質をパターン化する課題を解決しようとするものである。プローブ分子のパターン化は、溶液中で行われ、そのため、その生物学的活性の維持が保証される。また、このようなパターン化された表面を回折に基づくセンサとして使用することも言及される。
【特許文献１】米国特許第５，５１２，１３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４４４，２５４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９２２，５５０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０６０，２５６号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６４７，５４４号明細書
【特許文献６】米国特許第４，８７６，２０８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，０８９，３８７号明細書
【非特許文献１】Ｂｅｒｎａｒｄ，Ａ、Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ，Ｅ、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｈ、Ｍｉｃｈｅｌ，Ｂ、Ｂｏｓｓｈａｒｄ，Ｈ．Ｒ、Ｂｉｅｂｕｙｃｋ，Ｈの”Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９８）１４、２２２５−２２２９（非特許文献１）
【発明の開示】
【００１０】
この発明の一側面によれば、基板上の少なくとも１種類のプローブ分子を固定化するセンサであって：
表面の予め選択された領域を少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化させた基板であって、Ｘ１は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、Ｒ１はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｙ１は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であるものと；
遮断分子Ｘ２−Ｒ２が塗布されて化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化されていない、上記基板の残余領域であって、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｒ１と同じでも異なっても良いものであるものとを有し、
上記パターン化された表面を溶液中で上記プローブ分子と接触させることにより、上記プローブ分子と上記少なくとも１つの化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の上記Ｙ１の化学的官能基との間の強い相互作用が生じ、この強い相互作用により上記プローブ分子が固定化されるセンサが実現される。
【００１１】
この発明の他の側面によれば、パターン状の固定化されたプローブ分子を具備する基板を製造する方法であって：
少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１により基板の表面の予め選択された領域をパターン化するステップであって、Ｘ１は上記表面に化学的に結合可能な化学的官能基であり、Ｒ１はスペーサとして働いて上記表面と固定化対象の上記プローブ分子との間に間隔を設け、さらに非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｙ１は上記プローブ分子に対して共有結合または非共有結合の強い相互作用を形成する化学的官能基であるステップと；
遮断分子Ｘ２−Ｒ２を上記基板に対して露出させ、上記少なくとも１つの化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１によりパターン化されていない、上記基板の残余領域に塗布するステップであって、Ｘ２は上記表面と共有結合により反応可能な化学的官能基であり、Ｘ１と同じでも異なっても良いものであり、Ｒ２は非特異的相互作用を減少させる化学構造部分であり、Ｒ１と同じでも異なっても良いものであるステップと；
上記パターン化された表面を溶液中で上記プローブ分子と接触させることにより、上記プローブ分子と上記少なくとも１つの化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１の上記Ｙ１の化学的官能基との間の強い相互作用を生じさせ、この強い相互作用により上記化学的官能基に結合した上記プローブ分子を固定化させるステップとを有する方法が実現される。
【００１２】
この発明は、添付図面を参照して、一例を用いて説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下の技術用語が、この発明を説明するために所与の定義に従って用いられる。
【００１４】
プローブ分子は、他の分子、例えば、抗体、抗原、オリゴヌクレオチド、その他を選択的に結合できる分子である。
【００１５】
アルキル鎖は、飽和炭素原子の直鎖または分岐鎖である。シクロアルキル基は、飽和炭素原子の環構造である。アリール基は、１つの環あたり、５〜６の炭素および／またはヘテロ原子例えば窒素、酸素または硫黄を含有する芳香族部分であり、１または融合または結合した複数の環から構成されて良い。ハロ基は塩素、臭素、フッ素、またはヨウ素部分を指すのに用いられる。
【００１６】
保護基は、官能基を一時的に不活性にしてそれが他の反応に干渉するのを阻止するために使用される化学構造部分である。直交保護基は、他に悪影響を与えることなしに、個々に脱保護できる保護基である。
【００１７】
基板表面は、一体的な材料の任意の外部領域であり、それは材料自体でもよいし、材料状のコーティングであってもよい。基板表面は、ガラス、ポリマー、または金属である、コーティングは種々の手法を用いて導入でき、気相または液相の化学または物理被着を含む。
【００１８】
ポリマー表面は、ポリスチレン、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、スチレン−アクリロニトリルコポリマー（ＳＡＮ）、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリグルタミン酸、ポリリシン、およびポリエチレングリコールであってよい。
【００１９】
一体型の材料の組成にかかわらず、基板表面は官能基を含み、これは、化学架橋剤の化学官能基Ｘと容易に反応でき、あるいは、化学架橋剤との反応に先立ってその場で活性化できる、求核試薬、求電子試薬、遊離基生成性体、アルケニル、アルキニル、光活性体を含む。基板表面の求核性官能基の例は、アミン、ヒドロキシル、ヒドラジド、およびチオールである。求電子性官能基の例は、カルボン酸、およびすべてのそれらの活性化物であり、これに限定されないが、無水物、酸塩化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、およびイミダゾリド、アルファハロカルボニル、エポキシド、アルデヒド、イソシアネート、およびイソチオシアネートを含む。
【００２０】
この発明の１実施例において、化学架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１は、パターンを形成する基板表面の領域に被着され、表面上に所望の濃度の共有結合架橋剤が得られるのに十分な期間表面と反応可能にされる。架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１と表面との間の反応は、既知の手法、例えば、加熱、マイクロ波照射、超音波分解等を用いて促進してより短い時間に所望の密度を実現できる。
【００２１】
Ｘ１は、基板表面と共有結合的に反応可能な官能基である。求電子性表面に対しては、Ｘ１は、求核性であり、アミン、ヒドラジド、ヒドロキシアミン、またはチオールを含んで良い。求核性表面に対しては、Ｘ１は、求電子性であり、カルボン酸およびすべてのその活性化物、エポキシド、トリアルコキシシラン、ジアルコキシシラン、およびクロロシランを含む。Ｘ１は、光活性および／または遊離基生成物、例えば、過酸化物、アゾ、アジドであってもよい。
【００２２】
Ｒ１は、生体分子と相性がよく、非特異性相互作用を減少させる部分である。Ｒ１は、好ましくは、２から約２００個の長さのアルキル鎖から構成されて良く、ヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されてもよく、されなくてもよい。
【００２３】
Ｙ１は、溶液中のプローブ分子の固定化を担う化学官能基であり、これはプローブ分子と共有性または非共有性の強い相互作用を形成できる。好ましい実施例では、Ｙ１は、プローブ分子の生物学的活性に著しい悪影響を与えない環境下でプローブ分子と共有性の相互作用を形成する。
【００２４】
１実施例において、Ｙ１はその場で活性化される。活性化プロセスはＹ１の性質に依存し、当業者には明らかである。好ましい実施例において、Ｙ１は、高反応性の官能基であり、プローブ分子との反応に先立って活性化させる必要がない。これには、エポキシド、アルデヒド、アルファ−ハロカルボニル、アミン、ヒドラジド、イソシアネート、および活性化されたカルボン酸、例えば、塩素化酸、混合無水物、Ｎ−ヒドロキシスシニミジル（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯｂｔ）エステルおよびイミダゾリドが含まれる。
【００２５】
図１を参照すると、この発明の１実施例において、センサが単一の検体を検出するのに用いられ、基板表面のＸ１−Ｒ１−Ｙ１でパターン化されていない基板表面の残余は、保護剤Ｘ２−Ｒ２により不動態化される。ここで、Ｘ２は基板表面と共有性相互作用を形成可能な官能基であり、Ｘ１と同じでも異なっていても良い。Ｒ２は生体分子と相性がより部分であり、非特異性相互作用を減少させる。Ｒ２は、２から約２００個の長さのアルキル鎖から構成されて良く、ヘテロ原子および／またはアリール基および／またはシクロアルキル基により分断されてもよく、されなくてもよく、これはＲ１と同様である。
【００２６】
他の実施例において、センサは少なくとも２つの検体を検出するのに用いられ、パターン化ステップが繰り返されて、少なくとも２組の架橋剤が基板の同一の表面領域にパターン化される。このため、Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１のパターン化の後に、他の架橋剤Ｘ３−Ｒ３−Ｙ３が、Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１により画定されるパターンと異なるパターンを画定すべく基板表面の領域に被着され、表面上の共有結合された架橋剤の所望の密度を得るのに足る時間だけ表面と反応できるようになっている。この点については図２を参照されたい。架橋剤Ｘ３−Ｒ３−Ｙ３と表面との反応は、既知の手法、例えば、加熱、マイクロ波照射、超音波分解等を用いて促進してより短い時間に所望の密度を実現できる。Ｘ３はＸ１用に定義された官能基から選択でき、Ｘ１と同一でも異なっても良い。Ｒ３はＲ１用に定義された部分から選択でき、Ｒ１と同一でも異なっても良い。Ｙ３はＹ１用に定義された官能基から選択でき、これら官能基のいずれかの保護またはマスクされたバージョンであってよい。保護基は、第１の組のプローブ分子の生体活性に悪影響を与えない条件かでその脱保護化が可能なように選択される。
【００２７】
架橋剤のパターン化ステップを繰り返して複数の組の架橋剤でパターン化された基板表面を製造できる。しかしながら、実際には、表面にすでに固定化されている他のプローブ分子の生体活性の保持に必要な条件下で利用できる異なる直交保護機の数が限られているので、表面の所定の同一領域に繰り返せる数は有限である。具体的な好ましい実施例では、単に２組の架橋剤が所定の同一の領域にパターン化されるだけである。
【００２８】
基板の表面が架橋剤によりパターン化された後に、上述したように表面が保護剤により不動態化される。不動態化ののち、パターン化された基板の表面は、プローブ分子の液相固定化に用いることができる。１実施例において、パターン化された表面は、プローブ分子の架橋剤との反応を起こされるに足る時間だけプローブ分子の溶液に接触させられる。他の実施例では、架橋剤はその場で活性化され、パターン化表面がまず活性化剤の溶液と、十分な時間、接触させられ、架橋剤を非活性化させない条件下で過剰な活性剤を洗い流し、その後プローブ分子の溶液と接触させられる。
【００２９】
１実施例では、プローブ分子は、プローブ分子の生体活性の損失をもたらさないという条件で、すでにプローブ分子上にある任意の官能基を介して、架橋剤のＹの官能基と相互作用してよい。例えば、タンパク質がプローブ分子の場合、これら官能基はタンパク質を含み、末端を含有する反応性アミノ酸残滓であってよい。プローブ分子および架橋剤のＹの官能基の間の相互作用は共有結合性であっても、そうでなくてもよく、検定の間、プローブ分子の洗い流しを阻止できるに足るほど強固でなくてはならない。好ましい実施例では、相互作用は共有結合性である。
【００３０】
他の実施例では、タンパク質が、合成手法によってプローブ分子に導入された親和性タグを通じて作用できる。これら親和性タグはアミノ酸配列、例えば、ポリヒスチジン、化学架橋剤、および他のタンパク質、例えば、グルタチオンＳ−転移酵素（トランスフェラーゼ）、またはストレプトアビジンであってよい。
【００３１】
プローブ分子および表面の官能基の間の相互作用は、アルデヒドおよびアミンを反応させてイミンまたはシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基を付与する場合のように、その反応の間に他の試薬を添加してさらにその相互作用を促進するようなものであってよい。還元剤、例えば、この例では、シアノボロヒドリドナトリウムを添加すると、アミン結合が付与されて、元のシッフ塩基よりより安定になる。
【００３２】
第１組のプローブ分子が固定化されたのち、第１組の架橋剤のうちプローブ分子と反応しなかった残余は保護される必要があるかもしれない。これは、基板表面を保護剤Ｘ２Ｒ２または当業者に既知の保護溶液、例えば、ミルク、アルブミン溶液、鮭の精子、または鰯の精子に接触させることにより、実現される。単一組の架橋剤でしかパターン化されていない基板は、この段階で、センサは回折に基づく検定に用いることができる。
【００３３】
第２組のプローブ分子を固定化するには、架橋剤のＹの官能基を脱保護化または脱マスク化する必要がある。脱保護化または脱マスク化の条件は保護基の性質に左右され、これは当業者には知られている。脱保護化ののち、Ｙの官能基は第２組のプローブ分子と反応する前に活性化されても、されなくてもよいかもしれない。好ましい実施例では、Ｙの官能基は活性化させる必要はなく、単に基板表面を第２組のプローブ分子の液体と、プローブ分子が対応する架橋剤と反応可能となるに足る時間だけ、接触させるだけで、対応する組のプローブ分子と容易に反応できる。他の実施例では、架橋剤はその場で活性化され、パターン化表面がまず活性化剤の溶液と、十分な時間、接触させられ、架橋剤を非活性化させない条件下で過剰な活性剤を洗い流し、その後プローブ分子の溶液と接触させられる。プローブ分子を固定化したのち、架橋剤のうちプローブ分子と反応しなかった残余は保護しなければならないかもしれない。保護処理は先に説明したものと同じで良い。
【００３４】
保護処理の後、その段階で、基板はセンサとして使用できる。回折に基づく検定におけるセンサの利用方法については、関連特許や参考文献例えばＧｏｈ，Ｊ．Ｂ、Ｌｏｏ，Ｒ．Ｗ、ＭｃＡｌｏｎｅｙ，Ｒ．Ａ、Ｇｏｈ，Ｍ．Ｃ、の「複数の検体を検出するための回折に基づく検定」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ（２００２）３７４、５４−５６に基づいて、良く知られている。
【００３５】
センサは、回折に基づく検定に用いられ、ここでは、流体中のプローブ分子を化学架橋剤に結合して回折画像を生成し、流体中のプローブ分子を表示する。複数の架橋剤のパターンを用いて複数種類のプローブ分子を検出する場合には、種々の分子を種々の組の化学架橋剤に結合して回折画像を形成し、この回折画像はプローブ分子が架橋剤と結合しない場合に観察される回折画像と異なるものである。種々の架橋剤パターンの各々に関連する回折画像は、パターンを照射する光に起因し、１のパターンに基づく画像は、１または複数の他の架橋剤パターンに関連する画像と異なるものとなる。同様に、プローブ分子自体と結合する分子は、同様の原理を利用して液体中で検出できる。
【００３６】
この発明は以下の非制約的な実験例を用いて説明される。
【実験例】
【００３７】
［例１］
ＮＨＳ−エステルの表面にＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨでパターン化。
【００３８】
ポリオレフィンプラストマー（ＰＯＰ）またはポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）で製造し、表面浮き彫りパターンを有するスタンプを２：１のエタノール／脱イオン化水中で、５分間、超音波処理をして洗浄した。スタンプを窒素の穏やかな流れで乾燥させ、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨの溶液（３：１のエタノール／脱イオン化水中に０．１ｍＭ。ｐＨが１ＭのＮａＯＨで１０に調整）を、スタンプのパターン化領域が完全に被覆されるのに足る量だけ、スタンプに塗布する。１０分後、溶液は吸引され、スタンプを窒素ガスの穏やかな流れで乾燥させた。乾燥したスタンプをＨＮＳ−エステルにより官能化された基板表面と接触させ、５分間そのままにし、その後、剥がした。スタンプ付けされた基板に対して、Ｍｅ（ＯＣＨ２ＣＨ２）１１ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２（脱イオン化水中で０．４ｍＭ、ｐＨは、１ＭのＮａＯＨで１０に調整されている）の溶液を基板全体を被覆するに足る量だけ３０分間配置して、その基板を当該溶液に露出させる。基板は脱イオン化水で洗浄され、脱イオン化水中で５分間超音波処理した。
【００３９】
［例２］
Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨでパターン化した基板を回折に基づく検定に使用。
【００４０】
例１で準備した、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨでパターン化した基板を、それぞれ脱イオン化水中で１００および２５ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスシニミド（ＮＨＳ）の溶液中に１５時間配置した。この後、基板を蒸留水で洗浄し穏やかな窒素の流れで乾燥させた。
【００４１】
流体セルを形成するために、両面粘着テープを用いて、ガラススライド片および基板の間に挟むようにして、ガラススライド片を基板のパターン化表面に対向させて配置し、これによりチャネルを形成して液体が流れるようにし、基板表面のパターン化領域を湿潤にした。
【００４２】
流体セルを回折検定装置に装着した。検定の種々の段階で、強度変化をモニタした。当初、液体セルは緩衝剤（ＭＥＳ、２５ｍＭ、ｐＨ６）で満たした。緩衝剤をアンチラビットｌｇＧ（ＭＥＳ緩衝剤中で２５ｕｇ／ｍＬ）で置き換え、アンチラビットｌｇＧのパターン化されたＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨへの液相固定化を示す回折信号の強度増大がもたらされた。固定化が完了した後、液体セルをＭＥＳ緩衝剤で洗浄し、その後、牛血清アルビミン（ＢＳＡ）（ＭＥＳ中で５ｍｇ／ｍＬ）の溶液で保護した。液体セルを再度ＭＥＳ緩衝剤で洗浄し、ラビットアンチゴート  ｌｇＧの溶液で置換し、この結果、ラビットアンチゴート  ｌｇＧの固定化アンチラビットへの結合を示す、回折信号の強度増大がもたらされた。
【００４３】
ここで使用されるように、用語「有する」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）は内包し、限界がオープンなものとして理解され、排他的でないものとして理解されるべきである。とくに、特許請求の範囲を含む、明細書に使用される場合、用語「有する」および「含む」およびその変形物は、特定された特徴、ステップまたは要素が含まれることを意味する。これら用語は他の特徴、ステップ、または要素の存在を排除するように解釈されてはならない。
【００４４】
この発明の好ましい実施例の上述の説明は、この発明の原理を説明するために提示されたものであり、この発明を例示の具体的な実施例に制約するものではない。この発明の技術的な範囲は、特許請求の範囲およびその均等物に内包される全ての実施例により規定されることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】一意のパターンで表面上に塗布された化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１のパターンを具備し、表面の残余は遮断剤Ｘ２−Ｒ２で不能動かされた基板の平面図である。
【図２】化学的架橋剤Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１およびＸ３−Ｒ３−Ｙ３の２つのパターンを具備し、各パターンは上記表面上に一意のパターンで塗布され、表面の残余は遮断剤Ｘ２−Ｒ２で不能動かされた基板の平面図である。
【符号の説明】
【００４６】
Ｘ１−Ｒ１−Ｙ１、Ｘ３−Ｒ３−Ｙ３      化学架橋剤
Ｘ２−Ｒ２      保護剤
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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