(57)【要約】  本発明は、アフィニティークロマトグラフィーを含んで成る、流体からの精製ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための、式（Ｉ）のアフィニティーリガンドの使用
【化１】
2008542432.tif 000015
｛式中、Ａ1及びＡ2は、以下の構造のアミン、エーテル及びチオエーテルから成る群から選択される：
【化２】
2008542432.tif 000016
（式中、Ｒ1は、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、アリール、及びＣ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択される）；
Ｂ1及びＢ2は、独立に、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、及びアリールから成る群から選択され、ここで、Ｂ1及びＢ2は、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、又はＮ（Ｒ2）2で置換され得る；
各Ｒ2は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、アリール、及びＣ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択される；
各Ｘは、独立に、窒素、水素を担持する炭素、塩素基を担持する炭素、又はシアノ基を担持する炭素を表し；且つ
Ｚは、マトリクスとの反応が可能な官能基である｝。
【請求項２】
Ａ1及びＡ2が、以下の構造のアミンであり
【化３】
2008542432.tif 000017
Ｂ1及びＢ2が、独立に、Ｃ1−Ｃ6−アルキル又はアリールであり、ここで、Ｂ1及びＢ2は、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、又はＮ（Ｒ2）2で置換されることができ；
Ｒ1が、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、アリール、及びＣ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択され、且つ
各Ｒ2が、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、アリール、及びＣ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｂ1及びＢ2が、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、又はＮ（Ｒ2）2で置換されることができ、当該Ｂ1及びＢ2又は置換されたＢ1及びＢ2が、独立に、以下の群から選択される、請求項１又は２に記載の使用：
【化４】
2008542432.tif 000018
【請求項４】
Ｂ1及びＢ2がヘキシルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ａ1及びＡ2が、以下の構造を有するアミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【化５】
2008542432.tif 000019
【請求項６】
各Ｘが窒素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
Ｚが−ＮＨ−である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
マトリクスがアガロースである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
流体からＩＬ−１８ＢＰを捕獲するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアフィニティーリガンドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のアフィニティーリガンドを用いて、流体をアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含んで成る、精製ＩＬ−１８ＢＰの生成のための方法。
【請求項１１】
アフィニティークロマトグラフィーを室温で実施する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−１８ＢＰの回収率が、アフィニティークロマトグラフィーの後で、約４０％超又は約５０％超である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＬ−１８ＢＰの純度が、アフィニティークロマトグラフィーの後で、＞約６０％又は＞約７０％又は＞約８０％である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
単量体ＩＬ−１８ＢＰの比率が、アフィニティークロマトグラフィー段階の後で、約８０％超である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーから成る群から選択されるクロマトグラフィー段階を更に含んで成る、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上のウイルス除去ろ過段階を更に含んで成る、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ−１８ＢＰがヒト、組み合えＩＬ−１８ＢＰである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
流体が無血清細胞培養上清である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野におけるものである。より具体的には、それは、アフィニティークロマトグラフィーによるＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の精製に関する。具体的には、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーにおける合成リガンドの使用を含んで成る。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、一般的に「生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）」とも呼ばれる薬剤として商業的に重要になってきている。最も大きなチャレンジの１つは、商業的規模におけるタンパク質の精製に関する、費用効率が高く効率的な方法の開発である。現在、多くの方法が、タンパク質の大規模調製に利用可能である。しかし、粗生成物は、不純物の複雑な混合物も含み、これらは時々所望の生成物から分離するのが困難である。
【０００３】
保健機関は、ヒト投与を意図したタンパク質に対して高水準の純度を要求する。更に、多くの精製法は、所定のタンパク質の生物学的活性を損ない得る低い又は高いｐＨ、高い塩濃度又は他の極限的な条件の適用を必要とする段階を含み得る。従って、任意のタンパク質に対して、十分な純度を可能にし、同時にタンパク質の生物学的活性を保持する精製方法を確立することはチャレンジである。
【０００４】
クロマトグラフィーは類似の物理化学的特性を有する分子の分離を可能にするので、これは適切な精製技術である。異なるタイプのクロマトグラフィーのうち、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーは、工業的方法に対して最も一般的に用いられている。
【０００５】
イオン交換クロマトグラフィー系は、主に交換における差異に基づいたタンパク質の分離のために広く用いられてきた。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、周囲（ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ）緩衝液のイオン強度が低い場合、溶質の表面上の荷電パッチ（ｐａｔｃｈ）は、クロマトグラフィーマトリクスに結合した反対荷電により引き付けられる。一般的に、溶出は、緩衝液のイオン強度（すなわち、伝導率）を増大させて、イオン交換マトリクスの荷電部位に対して溶質と競合させることにより達成される。ｐＨを変化させ、それにより溶質の荷電を変えることは、溶質の溶出を達成する別の方法である。伝導率又はｐＨにおける変化は、漸進的（勾配溶離）又は段階的（段階溶出）であることができる。
【０００６】
陰イオン交換体は、弱又は強のいずれかで分類することができる。弱陰イオン交換体上の荷電基は、弱塩基（これは、脱プロトン化される）であり、従って、高いｐＨでその荷電を放つ。ＤＥＡＥセルロースは、弱陰イオン交換体の例であり、アミノ基は、ｐＨ９未満で正に荷電し、それよりも高いｐＨ値でその荷電を徐々に失い得る。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はジエチル−（２−ヒドロキシ−プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）は、例えば対イオンとして塩化物を有する。
【０００７】
一方、強陰イオン交換体は、強塩基を含み、これは、イオン交換クロマトグラフィーに通常用いられるｐＨ範囲（ｐＨ１〜１４）で正の荷電を保持する。Ｑ−セファロース（Ｑは、４級アンモニウムを意味する）は、強陰イオン交換体に対する例である。
【０００８】
陽イオン交換体も、弱又は強のいずれかとして分類することができる。強陽イオン交換体は、ｐＨ１〜１４で荷電を保持する強酸（例えば、スルホプロピル基）を含む；一方、弱陽イオン交換体は、弱酸（例えば、カルボキシメチル基）を含み、これは、ｐＨが４又は５未満に低下すると徐々にその荷電を失う。カルボキシメチル（ＣＭ）及びスルホプロピル（ＳＰ）は、例えば対イオンとしてナトリウムを有する。
【０００９】
疎水性固定相を有するクロマトグラフィー系も、タンパク質の精製において広く用いられてきた。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）は、この分類に含まれる。ＨＩＣおよびＲＰＬＣによる分離に関する物理化学的基礎は、疎水性効果であり、タンパク質は、疎水性の差異に基づいて疎水性固定相上で分離される。
【００１０】
ＨＩＣにおいて、一般的に、高塩濃度緩衝液中の試料分子は、ＨＩＣカラム上に入れられる。緩衝液中の塩は、水分子と相互作用し、溶液中の分子の溶媒和を減少させ、それにより、試料分子の疎水性領域を曝露し、その結果、これはＨＩＣカラムにより吸着される。分子がより疎水性であると、結合を促進するのにより少ない塩が必要とされる。通常、低下する塩勾配は、カラムから試料を溶出するのに用いられる。イオン強度が減少すると、分子の疎水性領域の曝露は増大し、分子は増大する疎水性の順にカラムから溶出する。試料溶出は、穏やかな有機変性剤又は洗浄剤の溶出緩衝液への添加によっても達成され得る。ＨＩＣは、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ページ１７６−１７９（１９８８）において概説されている。
【００１１】
ＨＩＣにおいて、異なるクロマトグラフィー支持体は、様々なリガンドを担持するのに利用することができる。リガンドは、それらの疎水性に関して異なる。一般的に用いられる疎水性リガンドは、フェニル−残基、ブチル−残基又はオクチル−残基である。
【００１２】
逆相クロマトグラフィーは、ＨＩＣに密接に関係したタンパク質精製方法である。両方とも、生体分子の表面上の溶媒接触可能な非極性基とマトリクスの疎水性リガンドとの間の相互作用に基づいている。しかし、逆相クロマトグラフィーにおいて用いられるリガンドは、ＨＩＣリガンドよりも疎水性リガンドにより高度に置換される。ＨＩＣ吸着剤の置換の程度は、Ｃ２〜Ｃ８アリールリガンドのマトリクスの１０〜５０μモル／ｍＬの範囲のであることができ、Ｃ４〜Ｃ８アルキルリガンドのマトリクスの数百μモル／ｍＬが、逆相クロマトグラフィー吸着剤として通常用いられる。
【００１３】
疎水性相互作用クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーが水性溶媒条件で実施され、イオン強度における交換がカラムを溶出するのに用いられる点でも区別される。典型的には、タンパク質は、タンパク質の表面上に位置した疎水性基により自然の状態で結合し、自然の状態は、溶出条件の間保持される。これとは対照的に、逆相クロマトグラフィーは疎水性溶媒を利用し（典型的には、アセトニトリル）、リガンドの結合は、溶媒の疎水性とカラム官能基の間の相分配の作用である。典型的には、タンパク質は、そのような溶媒中である程度変性し、全ポリペプチド配列の疎水性により結合する。大部分の疎水性基は球状タンパク質のコア中に存在するので、結合は、タンパク質の変性の程度及びこれらの基のカラム官能基への接近可能性に関係する。
【００１４】
タンパク質精製に関する異なる技術の中で、アフィニティークロマトグラフィーは特に注目に値する。それは、不純物の複雑な混合物からの標的タンパク質の超高度の選択性に対する要求を満たし、それにより、より優れた生成物品質を提供する。
【００１５】
アフィニティークロマトグラフィーは、カラムマトリクスに結合したリガンド、すなわち、具体的な成分、例えば金属イオン、ペプチド、化学分子、タンパク質、核酸に結合するタンパク質の生物学的機能に依存する。このリガンドは、様々なマトリクス、例えばセルロース又はアガロースに固定又は結合されることができる。その後、標的タンパク質は、カラムを通り、リガンドによりそれに結合し、同時に他のタンパク質は溶出する。標的タンパク質の精製は、通常、標的タンパク質を含む溶液を、多量の結合又は固定化リガンドを提示するカラムに通すことにより達成される。これは、標的タンパク質の生物学的特異性、例えば基質に対する酵素の親和性に依存するので、非常に効率的な精製方法である。
【００１６】
しかし、マトリクスに結合させることのできる様々なリガンドは莫大であり、最適なリガンドの選択は、１つのタンパク質から他のものに対して容易に推測され得ない。少なくとも３つの制限的な要素、すなわち、タンパク質の特定のリガンドに対する異なる親和性、十分な多量のリガンドのマトリクスへの固定化、及び潜在的に制限されたリガンドのタンパク質の結合部位への接近可能性が関与する。従って、どのアフィニティークロマトグラフィーマトリクスが標的タンパク質に結合するかを推測的に述べるのは極めて困難である。
【００１７】
インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、初めにＩＬ−１８カラム上で尿素からアフィニティー精製された天然の可溶性タンパク質である（Ｎｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ＩＬ−１８ＢＰは、インビトロにおけるＩＦＮ−γのＩＬ−１８誘導及びＮＦ−κＢのＩＬ−１８活性化を無効にする。更に、ＩＬ−１８ＢＰは、ＬＰＳを注射されたマウス中でＩＦＮ−γの誘導を阻害する。
【００１８】
ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子は、ヒト第１１染色体に位置し、膜貫通ドメインをコードするエキソンは、ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子を含んで成る８．３ｋｂゲノム配列中に見出すことはできなかった。別のｍＲＮＡスプライシングにより生成されるＩＬ−１８ＢＰの４つのアイソフォームが、これまでヒトで同定された。それらは、指名されたＩＬ−１８ＢＰａ、ｂ、ｃ及びｄであり、全て、同一のＮ末端を共有し、Ｃ末端では異なる（Ｎｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ  １９９９）。これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８に結合するそれらの能力の点で異なる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。４つのヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｈｌＬ−１８ＢＰ）アイソフォームのうちで、アイソフォームａ及びｃは、ＩＬ−１８に対して中和能を有することが知られている。最も豊富なＩＬ−１８ＢＰアイソフォームである、アイソフォームａは、ラピッドオンレート（ｒａｐｉｄ  ｏｎ−ｒａｔｅ）及びスローオフレート（ｓｌｏｗ  ｏｆｆ−ｒａｔｅ）でＩＬ−１８に対して高い親和性を示し、解離定数（Ｋｄ）は約０．４ｎｍである（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＩＬ−１８ＢＰは、脾臓中で構成的に発現し、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＩＬ−１８のＩＬ−１８ＢＰとの相互作用に関わる残基は、コンピューターモデリングの使用（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、及び類似のタンパク質ＩＬ−１βのＩＬ−１ＲタイプＩとの相互作用に基づいて説明された（Ｖｉｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。
【００１９】
ＩＬ−１８ＢＰは、多くの細胞中で構成的に存在し（Ｐｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）、健康なヒトにおいて循環し（Ｕｒｕｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、サイトカイン生物学において独特な現象を示す。ＩＬ−１８ＢＰのＩＬ−１８に対する高い親和性（Ｋｄ＝０．４ｎｍ）並びに循環中で見出されるＩＬ−１８ＢＰの高い濃度（ＩＬ−１８より２０倍モル過剰である）により、循環中ＩＬ−１８分子の全部ではないがほとんどのＩＬ−１８分子がＩＬ−１８ＢＰに結合していることが推測された。従って、ＩＬ−１８に対する細胞表面受容体と競合する循環するＩＬ−１８ＢＰは、天然の抗炎症性免疫抑制分子として作用し得る。
【００２０】
ＩＬ−１８ＢＰは、多くの疾病及び疾患、例えば乾癬、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、肝臓損傷、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、アレルギー等における治療タンパク質として示唆されてきた。例えば、ＷＯ９９／０９０６３、ＷＯ０１／０７４８０、ＷＯ０１／６２２８５、ＷＯ０１／８５２０１、ＷＯ０２／０６０４７９、ＷＯ０２／０９６４５６、ＷＯ０３／０８０１０４、ＷＯ０２／０９２００８、ＷＯ０２／１０１０４９、ＷＯ０３／０１３５７７を参照のこと。ＩＬ−１８ＢＰが例えばヒトに対する投与のための治療タンパク質として提案された場合、十分に高い純度の十分な量のＩＬ−１８ＢＰに対する満たされない必要性が存在する。
【００２１】
ＩＬ−１８ＢＰに対する精製方法は、ＷＯ２００５／０４９６４９に記載されている。しかし、この方法は、アフィニティークロマトグラフィーの段階を含んでいない。
【００２２】
従って、優れた純度及び高い収率のＩＬ−１８ＢＰをもたらす別の精製方法が望ましい。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
本発明は、タンパク質、特にＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）に対する精製方法の開発に基づく。
【００２４】
従って、第一の側面において、本発明は、式（Ｉ）の合成アフィニティークロマトグラフィーリガンドの使用に関する
【化１】
2008542432.tif 000002
｛式中、Ａ1、Ａ2、Ｂ1、Ｂ2、Ｘ及びＺは、精製されたＩＬ−１８ＢＰの生成のために、以下の詳細な説明において記載されているように規定される｝
【００２５】
第二の側面において、本発明は、マトリクスに結合する式（Ｉ）の合成リガンドを利用するアフィニティークロマトグラフィー段階を含んで成る、流体からの精製ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための方法に関する。
【００２６】
発明の詳細な説明
以下の段落は、本発明の化合物を構成する様々な化学部分の定義を提供し、明確に記載された定義がより広い定義を提供しない限り、明細書及び特許請求の範囲を通して一様に適用されることが意図される。
【００２７】
「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する一価のアルキル基を指す。この用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどのような基により例示される。
【００２８】
「アリール」は、単環（例えば、フェニル）又は多縮合環（例えば、ナフチル）を有する６〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。好ましいアリールとしては、フェニル、ナフチル、フェナントレニルなどが挙げられる。アリール環は、ヘテロシクロアルキル基に縮合されることもできる。このような縮合アリールとしては、ジヒドロベンズイミダゾール−２−オン、ベンゾ［１，３］ジオキソールなどが挙げられる。
【００２９】
「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」は、アリール置換基を有するＣ1−Ｃ6−アルキル基、例えばベンジル、フェネチルなどを指す。
【００３０】
「ヘテロアリール」は、単環式複素芳香族基、又は二環式若しくは三環式縮合環複素芳香族基を指す。複素芳香族基の具体例としては、任意に置換されたピリジル、ピロリル、ピリミジニル、フリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，５−トリアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアジニル、１，３，５−トリアジニル、１，３，４−チアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イソベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズオキサゾリル、キノリジニル、キナゾリニル、フタラジニル、キノキサリニル、シンノリニル、ナフチリジニル、ピリダジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピリジル、ピリド［３，２−ｂ］ピリジル、ピリド［４，３−ｂ］ピリジル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、キサンテニル又はベンゾキノリルなどが挙げられる。
【００３１】
「Ｃ2−Ｃ6−アルケニル」は、好ましくは２〜６個の炭素原子を有し、１つ以上のアルケニル不飽和の部位を有するアルケニル基を指す。好ましいアルケニル基としては、エテニル（−ＣＨ＝ＣＨ2）、ｎ−２−プロペニル（アリル、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）などが挙げられる。
【００３２】
「Ｃ2−Ｃ6−アルキニル」は、好ましくは２〜６個の炭素原子を有し、１つ以上のアルキニル不飽和の部位を有するアルキニル基を指す。好ましいアルキニル基としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）、プロピニル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）などが挙げられる。
【００３３】
「アシル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｒを指し、ここで、Ｒとしては、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル」、「Ｃ3−Ｃ8−ヘテロシクロアルキル」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」が含まれる。
【００３４】
「アシルオキシ」は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｒを指し、ここで、Ｒとしては、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」が含まれる。
【００３５】
「アルコキシ」は、基−Ｏ−Ｒを指し、ここで、Ｒとしては、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」又は「アリール」又は「ヘテロアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」が含まれる。好ましいアルコキシ基としては、例により、メトキシ、エトキシ、フェノキシなどを含む。
【００３６】
「アルコキシカルボニル」は、基−Ｃ（Ｏ）ＯＲを指し、ここで、Ｒとしては、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」又は「アリール」又は「ヘテロアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」が含まれる。
【００３７】
「アミノカルボニル」は、基−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指し、ここで、各Ｒ、Ｒ’としては、独立に、水素又はＣ1−Ｃ6−アルキル又はアリール又はヘテロアリール又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」が含まれる。
【００３８】
「アシルアミノ」は、基−ＮＲ（ＣＯ）Ｒ’を指し、ここで、各Ｒ，Ｒ’は、独立に、水素又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」又は「アリール」又は「ヘテロアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」である。
【００３９】
「ハロゲン」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を指す。
【００４０】
「スルホニル」は、基「−ＳＯ2−Ｒ」を指し、ここで、Ｒとしては、Ｈ、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、ハロゲンで置換された「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、例えば−ＳＯ2−ＣＦ3基、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニル」、「Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6− アルケニルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルシクロアルキル」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロシクロアルキル"から選択される。
【００４１】
「スルファニル」は、基−Ｓ−Ｒを指し、ここで、Ｒとしては、Ｈ、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、任意にハロゲンで置換された「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」 、例えば−Ｓ−ＣＦ3基、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2−Ｃ6− アルキニル」、「Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」が含まれる。或いは、「アミノ」は、基−ＮＲＲ’を指し、ここで、各Ｒ、Ｒ’は、独立に、水素、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニル」、「Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6− アルケニルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルシクロアルキル」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロシクロアルキル」であり、ここで、Ｒ及びＲ’は、それらが結合する窒素原子と共に、任意に３−８−員ヘテロシクロアルキル環を形成することができる。
【００４２】
「アミン」は、構造−ＮＲＲ’を有する基を指し、ここで、Ｒ及びＲ’としては、水素、又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニル」、「Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル」、「ヘテロシクロアルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」又は「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6− アルケニルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニルヘテロアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルシクロアルキル」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロシクロアルキル」が含まれる。
【００４３】
「エーテル」は、構造−Ｏ−を有する基を指す。
【００４４】
「チオエーテル」は、構造−Ｓ−を有する基を指す。
【００４５】
「置換又は非置換」、別段個々の置換基の定義により制約されなければ、上記の基、例えば「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アルコキシ」、「アリール」及び「ヘテロアリール」などの基は、「Ｃ1−Ｃ6−アルキル」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリール」、「Ｃ1−Ｃ6−アルキルヘテロアリール」、「Ｃ2−Ｃ6−アルケニル」、「Ｃ2−Ｃ6−アルキニル」、１級、２級若しくは３級アミノ基又は４級アンモニア部分、「アシル」、「アシルオキシ」、「アシルアミノ」、「アミノカルボニル」、「アルコキシカルボニル」、「アリール」、「アリールオキシ」、「ヘテロアリール」、「ヘテロアリールオキシ」、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、スルファニル、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、スルホンアミド、アルコキシ、チオアルコキシ、トリハロメチルなどから成る群から選択される１〜５個の置換基により任意に置換されることができる。本発明の枠組みの中で、「置換」は、隣接した置換基が閉環を受ける状況も含むことが意図されている。具体的には、近接の官能置換基が関連する場合、例えば保護基を得る試みの中で閉環により形成されたラクタム、ラクトン、環状無水物、及びアセタール、チオアセタール、アミナールを形成する。
【００４６】
本発明は、精製されたＩＬ−１８ＢＰを生じさせるＩＬ−１８ＢＰのための精製方法の開発に基づいている。
【００４７】
第一の側面において、本発明は、精製ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための、式（Ｉ）の合成アフィニティークロマトグラフィーリガンドの使用に関する
【化２】
2008542432.tif 000003
｛式中、Ａ1及びＡ2は、以下の構造のアミン、エーテル及びチオエーテルから成る群から選択される：
【化３】
2008542432.tif 000004
（式中、Ｒ1は、水素、置換又は非置換Ｃ1−Ｃ6−アルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択される）；
Ｂ1及びＢ2は、独立に、置換又は非置換Ｃ1−Ｃ6−アルキル、置換又は非置換Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル、及び置換又は非置換アリールから成る群から選択され、ここで、Ｂ1及びＢ2は、独立に、任意に、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、又はＮ（Ｒ2）2で置換される；ここで、
各Ｒ2は、独立に、水素、置換又は非置換Ｃ1−Ｃ6−アルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換Ｃ1−Ｃ6−アルキルアリールの群から選択される；
各Ｘは、独立に、窒素、水素を担持する炭素、塩素基を担持する炭素、又はシアノ基を担持する炭素を表し；且つ
Ｚは、マトリクスとの反応が可能な官能基である｝。
【００４８】
更なる実施態様において、式（Ｉ）のアフィニティークロマトグラフィーリガンドは、精製タンパク質の生成に使用することができる。
【００４９】
本明細書中で用いる場合、用語「マトリクス」は、クロマトグラフィーにおいて用いられる任意のマトリクス又は担体物質、例えば多糖類ベースのマトリクス（例えば、アガロース、セファロース、デキストラン、セファデックス）、合成物質ベースのマトリクス（例えば、メタクリル酸塩、ポリスチレン、ジビニルベンゼン）、又は鉱物ベースのマトリクス（例えば、セラミック、シリカ）に関する。マトリクス物質は、具体的な物質に依存して、異なる架橋形態で存在することができる。当該物質は、ビーズとして用いることができる。樹脂の体積、並びに用いられるカラムの長さ及び直径は、いくつかのパラメータ、例えば処理される流体の体積、本発明の方法にかけられる流体中のタンパク質の濃度などに依存し、これを決定することは、十分当業者の技術の範囲内である。
【００５０】
官能基Ｚは、リガンドとマトリクスの間に結合を形成することができる任意の基、例えばアミン、アジド、ヒドロキシなどであることができる。Ｚは、マトリクスに結合した官能基、例えばリガンドと直接的に反応するアミン活性化アガロースのアミンであることもできる。官能基は、標的タンパク質に対する結合能又は選択性を向上するためにスペーサーを導入することもできる。Ｃ1−Ｃ8のスペーサー長（すなわち、１〜８個の炭素原子）を、当業者に周知の容易な化学反応により導入することができる。
【００５１】
好ましい実施態様において、本発明は、精製ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための、式（ＩＩ）の合成アフィニティークロマトグラフィーリガンドの使用に関する
【化４】
2008542432.tif 000005
（式中、Ａ1、Ａ2、Ｂ1、Ｂ2及びＺは、上記のように規定される）。
【００５２】
別の実施態様において、Ａ1及びＡ2はアミンである。
【００５３】
別の実施態様において、Ｂ1及びＢ2は、独立に、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ8−シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され；ここで、Ｂ1及びＢ2は、独立に、任意に、Ｒ2、ＯＲ2、ＳＲ2、又はＮ（Ｒ2）2で置換される；且つ、
各Ｒ2は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、アリール、及びＣ1−Ｃ6−アルキルアリールから成る群から選択される。
【００５４】
好ましい実施態様において、Ｂ1及びＢ2、或いは置換Ｂ1及びＢ2は、独立に以下の群から選択される：
【化５】
2008542432.tif 000006
（式中、「＊」は、ＢがＡに結合する位置を示す）。
【００５５】
１つの実施態様において、Ｂ1及びＢ2は同一である。
【００５６】
好ましい実施態様において、Ｂ1及びＢ2はｎ−ヘキシルである。
【００５７】
更に好ましい実施態様において、Ａ1及びＡ2は、構造−Ｎ（ＣＨ3）−を有するアミンである。
【００５８】
好ましい実施態様において、各Ｘは窒素である。
【００５９】
更に好ましい実施態様において、ＺはＮＨである。
【００６０】
リガンドのマトリクスへの固定化のためのいくつかの潜在的な経路が存在する。トリクロロトリアジンのアミンとの反応により開始する１つの潜在的な経路を、スキーム１に示す：
【化６】
2008542432.tif 000007
【００６１】
別の経路は、トリクロロトリアジンのアミン活性化マトリクスへの結合により開始し、アミンとの反応へと続く。第三の経路は、２つのアミンのトリクロロトリアジンへの結合であり、置換クロロトリアジンのアミン活性化マトリクスへの結合へと続く。これらの一般的な経路は、当業者に知られた様々なプロトコルに適用することができる。
【００６２】
アミン活性化マトリクスは、任意の商業用のマトリクス物質のアミノ化により調製することができ、或いは商業的供給源から購入することができる。異なる長さのスペーサーは、エチレンジアミン、プロピレンジアミンのような二官能性試薬のマトリクス物質又はリガンドとの反応、或いはスペーサーの導入により、マトリクスと官能基又は官能基とリガンドの間に挿入することができる。
【００６３】
好ましい実施態様において、官能基は、スペーサーを用いずに、マトリクスへと直接的に結合される。
【００６４】
１つの実施態様において、カラムのアフィニティーリガンド密度は、５μｍｏｌ／ｇ〜５５μｍｏｌ／ｇである。
【００６５】
別の実施態様において、アフィニティーリガンド密度は、１０、２０、３０、４０又は５０μｍｏｌ／ｇである。
【００６６】
好ましい実施態様において、アフィニティーリガンド密度は、樹脂の２０μｍｏｌ／ｇである。
【００６７】
好ましい実施態様において、上記のアフィニティーリガンドは、精製ヒト組み換えＩＬ−１８ＢＰの生成に用いられる。
【００６８】
別の好ましい実施態様において、アフィニティーリガンドは、無血清細胞培地上清からのＩＬ−１８ＢＰの生成に用いられる。
【００６９】
別の実施態様において、アフィニティーリガンドは、流体からのＩＬ−１８ＢＰの捕獲に用いられる。
【００７０】
第二の側面において、本発明は、流体を、上記のアフィニティーリガンドを利用するアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含んで成る、精製タンパク質、具体的にはＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の生成のための方法に関する。
【００７１】
１つの実施態様において、この方法は、４〜３７℃の温度で実施する。
【００７２】
好ましい実施態様において、この方法は、室温（１６〜２５℃）で実施する。
【００７３】
１つの実施態様において、この方法は、アフィニティークロマトグラフィーの後に、４０％超又は５０％超の純粋なＩＬ−１８ＢＰを回収する。
【００７４】
好ましい実施態様において、この方法は、アフィニティークロマトグラフィーの後に、＞６０％又は７０％又は＞８０％の純粋なＩＬ−１８ＢＰを生み出す。
【００７５】
好ましい実施態様において、この方法は、純粋なＩＬ−１８ＢＰを生み出し、ここで、単量体ＩＬ−１８ＢＰの比率は８０％より高い。ここで、純度は、ブラッドフォード分析により測定した場合９５％より高い、又はＥＬＩＳＡにより測定した場合１００，０００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の純度に関する。
【００７６】
別の好ましい実施態様において、単量体ＩＬ−１８ＢＰの比率は、少なくとも９５％であり、或いはアフィニティークロマトグラフィー段階の後で９５％より高い。
【００７７】
１つの実施態様において、この方法は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（例えば、固定化リガンドとして４−メルカプトエチル−ピリジン（ＭＥＰ））、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（例えば、キレートセファロース上で）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）−樹脂、例えばＣＭセファロースＦＦ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニル樹脂、例えばフェニルセファロースＦＦ上で）、及び逆相クロマトグラフィー（例えば、逆相−ｓｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣ上で）から成る群から選択される１つ以上の追加のクロマトグラフィー段階を更に含んで成る。上記のクロマトグラフィー段階の任意の１つとの組み合わせの、或いは互いの任意の組み合わせの、本発明のアフィニティーリガンドを含んで成る精製段階を用いることが特に好ましい。好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーは、流体からのＩＬ−１８ＢＰの捕獲、例えば細胞培養物の採取に用いる。
【００７８】
より好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーには、以下の更なる精製段階が続く：
（ａ）アフィニティークロマトグラフィーの溶出液を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにかける段階；
（ｂ）金属イオンアフィニティークロマトグラフィーの溶出液を、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーにかける段階；
（ｃ）疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーの溶出液を、陽イオン交換クロマトグラフィーにかける段階；
（ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィーの流出物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける段階；
（ｅ）疎水性相互作用の溶出液を、逆相クロマトグラフィーにかける段階。
【００７９】
段階（ａ）は、好ましくは、キレートしたＺｎ2+イオンを有するキレートセファロースカラム、例えばキレートセファロースファストフローカラム上で実施する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰの結合は、ｐＨ８．５±０．１、好ましくはこのｐＨを有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び０．５ＭのＮａＣｌ中で実施する。洗浄段階は、平衡緩衝液中の１５ｍＭの塩化アンモニウムを用いて実施することができる。溶出は、好ましくは、ｐＨ９．０±０．５、例えばｐＨ８．７又はｐＨ９で、例えばこのｐＨを有する０．０７５Ｍの酢酸アンモニウム又は０．０６Ｍの酢酸アンモニウム中で実施する。
【００８０】
段階（ｂ）は、好ましくは、ＭＥＰ（４−メルカプトエチルピリジン誘導体）カラム、例えばＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上で実施する。ＩＬ−１８ＢＰの結合は、好ましくはｐＨ６．１±０．１で、例えばこのｐＨを有するＰＢＳ １× ＋１ ＮａＣｌ中で実施する。溶出は、好ましくは、ｐＨ８．４±０．１で、例えば２０ｍＭのリン酸緩衝液プラス３５％のプロピレングリコール中で実施し、この混合物はｐＨ８．４±０．１を有する。
【００８１】
段階（ｃ）は、好ましくは、カルボキシメチル−セファロース（ＣＭ）カラム上で実施する。これは、流出物を更なる精製のために回収する段階である。この段階は、例えば塩及びｐＨ条件に関連する具体的な環境下で、ＩＬ−１８ＢＰは当該樹脂に結合せず、一方、用いられる不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、血清由来のタンパク質）はそれに結合する、という事実に基づいている。好ましくは、段階（ｃ）は、ｐＨ６．０±０．２で、例えば１ｍＭのＭＥＳ（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）の存在下で実施する。
【００８２】
段階（ｄ）は、好ましくは、フェニルセファロースカラム、例えばフェニルセファロースファストフローカラム上で実施する。好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰの結合は、約ｐＨ９．１±０．２で、例えばこのｐＨを有する５０ｍＭのホウ酸ナトリウム及び０．９Ｍ硫酸ナトリウム又は０．１０Ｍの硫酸アンモニウム中で実施する。フェニルセファロースカラムからの溶出は、好ましくは、ｐＨ９．１±０．２で、高塩濃度の存在下、例えば５０ｍＭのホウ酸ナトリウム９．１±０．２、このｐＨを有する０．１５Ｍの硫酸アンモニウム中で実施する。
【００８３】
段階（ｅ）は、好ましくは、Ｓｏｕｒｃｅ ３０ ＲＰＣカラム上で実施する。ＩＬ１８−ＢＰのカラム物質への結合は、好ましくは、ｐＨ９．１±０．２で、例えば５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液中で実施する。溶出は、好ましくは、勾配を用いて実施し、ＩＬ−１８ＢＰは、アセトニトリル中で０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の約２８〜３２％溶出する。
【００８４】
精製の段階（ａ）〜（ｅ）と関連する上記の条件は、本発明の１つの段階、又は段階の組み合わせ（サブコンビネーション）を実施する場合にも適用することができることが理解される。
【００８５】
別の実施態様において、この方法は、更に、１つ以上のウイルス除去ろ過段階を含んで成る。
【００８６】
別の実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰの精製ＩＬ−１８ＢＰの生成のための方法は、ヒト組み換えＩＬ−１８ＢＰを生成する。
【００８７】
別の実施態様において、この方法は、流体を用いて開始し、ここで、この流体は、無血清細胞培養上清である。
【００８８】
この精製方法のいくつかのパラメータは、アフィニティーカラムの結合能及びＩＬ−１８ＢＰの精製の選択性を向上させるために変えることができる（例えば温度、ｐＨ，平衡緩衝液の塩濃度、ローディング緩衝液及び／又は溶出緩衝液）。
【００８９】
１つの実施態様において、平衡緩衝液ＰＢＳはｐＨ７．０である。
【００９０】
別の実施態様において、平衡緩衝液は、５．５〜７．０のｐＨを有するリン酸ナトリウム緩衝液である。
【００９１】
別の実施態様において、リン酸ナトリウム平衡緩衝液は、更にＮａ2ＳＯ4を含んで成る。
【００９２】
１つの実施態様において、アフィニティーカラムには、ＩＬ−１８ＢＰを含んで成る流体を入れ、それにより、流体を、５．５〜７．０のｐＨを有するリン酸ナトリウム及び硫酸ナトリウム緩衝液の混合物中でカラムに適用する。
【００９３】
好ましい実施態様において、ローディング緩衝液のｐＨは５．５である。
【００９４】
１つの実施態様において、この緩衝液は、更に、Ｎａ2ＳＯ4を含んでなり、結合能を更に強化する。
【００９５】
別の実施態様において、流体は、浄化バイオリアクター採取物を含んで成る。
【００９６】
１つの実施態様において、アフィニティーカラムは、ＩＬ−１８ＢＰを含んで成る流体をアフィニティーカラムに入れた後、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及びＰＢＳの群から選択される緩衝液により洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去する。
【００９７】
別の実施態様において、洗浄緩衝液は、更に、Ｎａ2ＳＯ4を含んで成る。
【００９８】
１つの実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰの溶出は、ｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液及びプロピレングリコールの混合物を含んで成る緩衝液中で実施する。
【００９９】
別の実施態様において、溶出緩衝液混合物中のプロピレングリコールの比率は、５％〜７０％である。
【０１００】
別の実施態様において、プロピレングリコールの比率は、３０％〜５０％である。
【０１０１】
好ましい実施態様において、溶出緩衝液は、ｐＨ７の５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び３５％のプロピレングルコールの混合物を含んで成る。
【０１０２】
別の実施態様において、溶出緩衝液はＰＢＳを含んで成る。
【０１０３】
別の実施態様において、ＰＢＳ溶出緩衝液は、更に、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％のエチレングリコールを含んで成る。
【０１０４】
別の実施態様において、ＰＢＳ溶出緩衝液は、更に、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％のプロピレングリコールを含んで成る。
【０１０５】
別の実施態様において、ＰＢＳ溶出緩衝液は、更に、０．５Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ又は２．０Ｍの塩化ナトリウムを含んで成る。
【０１０６】
別の実施態様において、溶出緩衝液は、更に、塩化ナトリウム及びエチレングリコール又はプロピレングリコールを含んで成る。
【０１０７】
１つの実施態様において、細胞液は、細胞液をカラム上に導入する前に、遠心分離又はろ過することができる。
【０１０８】
別の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰを含んで成るこの流体は、この流体をアフィニティーカラムに入れる前に、０．４５μｍのフィルターに通してろ過する。
【０１０９】
別の実施態様において、本発明の方法は、更に、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーから成る群から選択される１つ以上の追加のクロマトグラフィー段階を含んで成る。
【０１１０】
好ましい実施態様において、本発明の方法は、更に、
ａ．疎水性相互作用クロマトグラフィー、
ｂ．逆相クロマトグラフィー、及び
ｃ．陰イオン交換クロマトグラフィー、
を含んで成る。
【０１１１】
本発明の方法により精製したタンパク質がヒトへの投与を意図している場合、この方法において１つ以上のウイルス除去の段階を更に含むことが有利である。好ましくは、ウイルス除去ろ過段階は、アフィニティークロマトグラフィーの後に実施する。
【０１１２】
ＩＬ−１８ＢＰが精製される流体の初期体積が大きい場合、精製方法を実際に開始する前に、タンパク質を捕獲し、それを少量の緩衝液に再懸濁することにより物質の体積を減少させることが有利であり得る。
【０１１３】
貯蔵又は輸送を容易にするために、例えば、本発明の任意の精製段階の前及び／又は後に、この物質を凍結及び解凍することができる。
【０１１４】
本発明によると、精製されるＩＬ−１８ＢＰは天然、すなわち天然のＩＬ−１８ＢＰであることができる。従って、これは、任意の天然の起源又は物質から、例えば尿などの体液から精製することができる。
【０１１５】
ＩＬ−１８ＢＰは、任意の動物又はヒト起源から得ることもできる。好ましくは、精製されるＩＬ−１８ＢＰがヒトであり、より好ましくは、それは組み換えＩＬ−１８ＢＰである。組み換えＩＬ−１８ＢＰは、真核生物発現系、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような細菌系で産生することができる。これは、真核発現系、例えば酵母、昆虫又は哺乳動物細胞中で産生することもできる。本発明によれば、哺乳動物細胞、例えば動物細胞株、又はヒト細胞株中でＩＬ−１８ＢＰを発現することが好ましい。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ＩＬ−１８ＢＰの発現に特に適した細胞株の例である。
【０１１６】
精製するＩＬ−１８ＢＰがそれを分泌する哺乳動物細胞により発現される場合、本発明の精製方法の出発物質は、採取物又は粗ＩＬ−１８ＢＰとも呼ばれる細胞培養上清である。細胞が動物血清を含む培地中で培養される場合、細胞培養上清は、不純物として血清タンパク質も含む。
【０１１７】
好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰ発現細胞は、無血清条件下で培養する。この場合、本発明の精製方法の出発物質は、不純物として宿主細胞タンパク質を主に含む無血清細胞培養上清である。成長因子、例えばインスリンが、細胞培地に添加される場合、例えば、これらのタンパク質も、好ましくは、精製工程の間に除去されるだろう。
【０１１８】
ＩＬ−１８ＢＰが可溶性分泌タンパク質であるので、これは、その天然のシグナルペプチドにより、或いは異種シグナルペプチド、すなわち用いる特定の発現系でより効率的であり得る別の分泌タンパク質から得られるシグナルペプチドにより、細胞培養上清中に放出される。従って、ＩＬ−１８ＢＰが精製される流体は、好ましくは、細胞培養上清、例えばＣＨＯ−細胞上清である。細胞が培地を含む血清中で培養される場合、細胞培養上清は、動物由来の血清を含んで成ることができる。無血清培地、すなわちウシ胎仔又は他の動物起源から得られる血清を含まない培地中で培養した細胞の上清から、このタンパク質を精製することが好ましい。
【０１１９】
用語「ＩＬ−１８結合タンパク質」は、本明細書中で、「ＩＬ−１８ＢＰ」と同義に用いられる。この用語は、ＩＬ−１８結合タンパク質、例えばＷＯ９９／０９０６３又はＮｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９中で定義されるものに関する。この用語ＩＬ−１８ＢＰは、Ｋｉｍ ｅｔ  ａｌ．，２０００で定義されているもののように、ＩＬ−１８結合タンパク質のスプライス変異体及び／又はアイソフォーム、特にＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォーム及びｃを含む。本明細書中で用いる場合、用語「ＩＬ−１８ＰＢ」は、ＷＯ９９／０９０６３で定義されているように、ＩＬ−１８ＢＰのムテイン、機能性誘導体、活性画分、縮合タンパク質、環状並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）タンパク質及び塩を更に含む。
【０１２０】
本発明の精製方法の対象であるＩＬ−１８ＢＰは、グリコシル化又は非グリコシル化されていることができ、これは、尿などの天然起源から得ることができ、或いは、好ましくは、これは組み換え技術により産生することができる。組み換え発現は、Ｅ．コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のような原核生物発現系において、或いは真核生物、好ましくは哺乳動物発現系で実施することができる。
【０１２１】
本明細書中で用いる場合、用語「ムテイン」は、ＩＬ−１８ＢＰのアナログ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰのアナログを指し、ここで、天然のＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの１つ以上のアミノ酸残基は、異なるアミノ酸残基により置換され、或いは欠失され、或いはＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの天然の配列に１つ以上のアミノ酸残基が付加されるが、得られる産物の活性を、野生型ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰと比較して大幅に変化させない。これらのムテインは、既知の合成法により及び／又は部位特異的突然変異誘発法、又はそれに適した他の既知の技術により調製する。
【０１２２】
本発明のムテインは、核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされるタンパク質を含み、これは、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰ（両方とも、ＷＯ９９／０９０６３に開示されている）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が通常「ストリンジェントな」と呼ぶハイブリダイゼーション及びその後の洗浄の条件を指す。上記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３及び６．４（１９８７，１９９２）を参照のこと。ストリンジェントな条件の例としては、試験下でのハイブリッドの理論値Ｔｍより１２〜２０℃低い洗浄条件、例えば５分間の２×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ、１５分間の２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ；３７℃で３０〜６０分間の０．１×ＳＳＣ及び０．５％のＳＤＳ、その後の６８℃で３０〜６０分間の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ、が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、ストリンジェンシー条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、１０〜４０塩基）又は混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを理解する。混合プローブを用いる場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を用いるのが好ましい。上記のＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと。
【０１２３】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ又はそれ以上のポリペプチド配列又は２つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を反映する。一般に、同一性は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列それぞれの、比較する長さの配列にわたる、ヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を示す。
【０１２４】
正確な同一性が存在しない配列に対して、「％同一性」を決定することができる。一般に、配列間で最大の同一性が得られるように、比較する２つの配列を整列する。これは、１方又は双方の配列のいずれかにおいて「ギャップ」を挿入することを含み、アラインメントの程度を高めることができる。％同一性は、比較する各配列の全長にわたり決定することができ（いわゆる、グローバルアラインメント）、これは、同一の配列又は非常に似た長さの配列に特に適しており、或いは、より短い規定された長さにわたり決定することができ（いわゆる、ローカルアラインメント）、これは同等でない長さの配列により適している。
【０１２５】
２つ又はそれ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は当分野で周知である。即ち例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，１９８４）で入手可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の％同一性および%相同性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用して、２つの配列間で最良の類似性を持つ単一の領域を見いだす。配列間の同一性および／または相同性を決定するための他のプログラム、例えばＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９７、ＮＣＢＩのホームページからアクセス可能（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ））およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ  Ｒ，１９９０）もまた当分野で既知である。
【０１２６】
任意のこのようなムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰのものと十分に重複した、又はウイルスＩＬ−１８ＢＰに十分に重複したアミノ酸配列を有し、例えば実質的にＩＬ−１８ＢＰと類似の活性を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。ムテインがＩＬ−１８への実質的な結合活性を有する限り、それは、例えばアフィニティークロマトグラフィーの手段により、ＩＬ−１８の精製に用いることができ、従って、ＩＬ−１８ＢＰへの実質的に類似の活性を有すると考えることができる。このようにして、任意の所定のムテインがＩＬ−１８ＢＰと実質的に同一の活性を有するか否かは、このようなムテインを、例えばそれが適切に標識したＩＬ−１８に結合するか否かを決定するための試料サンドイッチ競合試験、例えばラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイにかけることを含んで成るルーチンな実験により決定することができる。
【０１２７】
好ましい実施態様において、ＷＯ９９／０９０６３で定義されているように、任意のこのようなムテインは、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスによりコードされたＩＬ−１８ＢＰホモログのいずれかの配列と少なくとも４０％の同一性又は相同性を有する。より好ましくは、それは、それに少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性又は相同性を有する。
【０１２８】
本発明に従って使用できるＩＬ−１８ＢＰポリペプチドのムテイン若しくはウイルスＩＬ−１８ＢＰのムテイン、又はそれらをコードしている核酸は、本明細書に記載の技術および手引きに基づき過度の実験をせずに当業者がルーチンに入手できる、置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとしての、実質的に対応する配列の有限集合を包含する。
【０１２９】
本発明に従う好ましいムテインの変化は、「保存的」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチド又はタンパク質又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの保存的アミノ酸置換は、その群のメンバー間での置換が当該分子の生物学的機能を保持するような、充分似通った物理化学的性質を有する群内の同義的アミノ酸を包含できる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。特に挿入または欠失が数個のアミノ酸、例えば３０未満、好ましくは１０未満のアミノ酸しか含まず、しかも機能的コンホメーションにとって必須のアミノ酸、例えばシステイン残基を除去または置換させない場合には、上記定義による配列においてアミノ酸の挿入および欠失を、それらの機能を変化させずに行い得るという事が明白である。このような欠失および／または挿入によって生成されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内に包含される。
【０１３０】
好ましくは、同義的アミノ酸群は表１に定義されるものである。より好ましくは、同義的アミノ酸群は表２に定義されるものであり、最も好ましくは、同義的アミノ酸群は表３に定義されるものである。
【０１３１】
【表１】
2008542432.tif 000008
【０１３２】
【表２】
2008542432.tif 000009
【０１３３】
【表３】
2008542432.tif 000010
【０１３４】
本発明で使用するためのＩＬ−１８ＢＰポリペプチド若しくはタンパク質のムテイン、又はウイルスＩＬ−１８ＢＰのムテインを取得するために使用できるタンパク質のアミノ酸置換を生成する例には、任意の既知の方法段階、例えば米国特許第４９５９３１４号、同第４５８８５８５号及び同第４７３７４６２号（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ）；同第５１１６９４３号（Ｋｏｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．）、同第４９６５１９５号（Ｎａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ）；同第４８７９１１１号（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ）；及び同第５０１７６９１号（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ）；並びに米国特許第４９０４５８４号（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ）に記載のリジン置換タンパク質がある。
【０１３５】
用語「融合タンパク質」は、例えば体液中での延長された滞留時間を有する、別のタンパク質と融合した、ＩＬ−１８ＢＰ若しくはウイルスＩＬ−１８ＢＰを含むポリペプチド、又はそのムテイン若しくはフラグメントを指す。従って、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰは、別のタンパク質、ポリペプチドなど、例えば免疫グロブリン又はそのフラグメントと融合することができる。
【０１３６】
本明細書で使用する「機能的誘導体」とは、当分野で既知の手段によって残基上の側鎖またはＮ末端基若しくはＣ末端基として存在する官能基から調製できる、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの誘導体、並びにそれらのムテインおよび融合タンパク質を包含し、それらは、医薬として許容され続ける限り、即ち、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの活性と実質的に類似のタンパク質の活性を破壊せず、それを含有する組成物に毒性を与えない限り、本発明に包含される。
【０１３７】
これらの誘導体としては、例えば、抗原部位を遮蔽し、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの体液中での滞留を延長することができるポリエチレングリコール側鎖が挙げられる。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは１級もしくは２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分を用いて生成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）、またはアシル部分を用いて生成される遊離ヒドロキシ基（例えば、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基）のＯ−アシル誘導体がある。
【０１３８】
ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰ、ムテイン及び融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、その活性画分がＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似の活性を有する限り、単独の、またはそれに結合した随伴分子または残基、例えば糖又はリン酸残基を伴う当該タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメント若しくは前駆体、または、当該タンパク質分子の凝集体または糖残基自身を包含する。
【０１３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「塩」は、ＩＬ−１８ＢＰ阻害剤分子もしくはそのアナログのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を指す。カルボキシル基の塩は当分野で既知の手段によって生成でき、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛塩など、および、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどによって生成される有機塩基との塩を包含する。酸付加塩は、例えば鉱酸、例えば塩酸または硫酸との塩、および有機酸、例えば酢酸または蓚酸との塩を包含する。無論、このような塩はいずれも、ＩＬ−１８ＢＰ阻害剤の生物活性、例えば血球中のＩＦＮ−ガンマの誘導を保持しなければならない。
【０１４０】
ＩＬ−１８ＢＰ及びそのスプライス変異／アイソフォームの配列は、ＷＯ９９／０９０６３又はＮｏｖｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９、並びにＫｉｍ ｅｔ  ａｌ．，２０００から得ることができる。
【０１４１】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体は、ポリマーと結合して、タンパク質の特性、例えば安定性、半減期、バイオアベイラビリティー、人体による耐性、又は免疫原性を改善することができる。この目的を達成するために、ＩＬ−１８ＢＰは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合され得る。ＰＥＧ化は、例えばＷＯ９２／１３０９５に記載の既知の方法により実施することができる。従って、好ましい実施態様において、機能的誘導体は、１つ又はそれ以上の官能基に結合した少なくとも１つの部分を含んで成り、これは、アミノ酸残基上に１つ又はそれ以上の側鎖として生じる。この部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である１つの実施態様は、極めて好ましい。
【０１４２】
本発明の更に好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰは免疫グロブリン融合を含んで成る。すなわち、ＩＬ−１８の阻害剤は、ＩＬ−１８結合タンパク質の全て又は部分を含んで成る融合タンパク質であり、これは、免疫グロブリンの全て又は部分に融合する。免疫グロブリン融合タンパク質を生成するための方法は、当業界で周知であり、例えばＷＯ０１／０３７３７に記載されたものである。当業者は、得られる本発明の融合タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性、特にＩＬ−１８への結合を保持することを理解するだろう。融合は、直接的であるか、または長さ１ないし３アミノ酸残基という短いまたはこれより長い、例えば１３アミノ酸残基長であり得る短いリンカーペプチドを介していてもよい。このリンカーは、ＩＬ−１８ＢＰ配列および免疫グロブリン配列の間に導入される、例えば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）というトリペプチドであるか、またはＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔを含む１３アミノ酸リンカー配列であることができる。得られた融合タンパク質は、改善された特性、例えば延長された体液中での滞留時間（半減期）、増大した特異的活性、増大した発現レベルを有し、或いは融合タンパク質の精製が容易である。
【０１４３】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰは、Ｉｇ分子の定常領域に融合する。好ましくは、それは重鎖領域、例えばヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合する。ＩＬ−１８ＢＰ及び免疫グロブリンの部分を含んで成る具体的な融合タンパク質の生成は、ＷＯ９９／０９０６３の実施例１１に記載されている。Ｉｇ分子の他のアイソフォームは、本発明の融合タンパク質、例えばアイソフォームＩｇＧ2又はＩｇＧ4、或いは他のＩｇクラス、例えばＩｇＭ又はＩｇＡの生成にも適している。融合タンパク質は、単量体又は多量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体であることができる。
【０１４４】
第三の側面において、本発明は、本発明の精製の方法により精製したタンパク質に関する。以下において、このタンパク質は、「精製ＩＬ−１８ＢＰ」とも呼ばれる。この精製ＩＬ−１８ＢＰは、好ましくは高度に精製されたＩＬ−１８ＢＰである。高度に精製されたＩＬ−１８ＢＰは、例えば１レーンあたり２ｍｃｇの量でタンパク質を導入した後に銀染色ＰＡＧＥ−ゲル中で単一のバンドの存在により決定される。精製ＩＬ−１８ＢＰは、ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして動くものとして規定することもできる。精製ＩＬ−１８ＢＰは、ＨＰＬＣにおいて単一のピークとして動くものとして規定することもできる。
【０１４５】
本発明の精製方法から得られるＩＬ−１８ＢＰ調製物は、２０％未満の不純物、好ましくは１０％、５％、３％、２％又は１％未満の不純物を含むことができ、或いは、それは均質に精製されることができる。すなわち任意のタンパク質混入物質を含まない。
【０１４６】
精製ＩＬ−１８ＢＰは、治療用途、すなわち患者への投与を意図することができる。精製ＩＬ−１８ＢＰが患者に投与される場合、それは、好ましくは、全身に、好ましくは皮下又は筋肉内、或いは局所的に、すなわち局所的に投与する。精製ＩＬ−１８ＢＰの具体的な使用に依存して、直腸又は髄腔内投与も適切であり得る。
【０１４７】
この目的のために、精製ＩＬ−１８ＢＰは、医薬組成物として、すなわち医薬として許容される担体、賦形剤などと共に処方することができる。
【０１４８】
「医薬として許容し得る」という定義は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない、そしてそれが投与される宿主にとって毒性でない、任意の担体の包含を意図する。例えば、非経口投与のためには、活性タンパク質は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンゲル液のようなビヒクル中で注射用の単位投薬形態で処方できる。
【０１４９】
本発明の医薬組成物の活性成分は、種々の方法で個体に投与することができる。投与経路には、皮内、経皮（例えば、徐放製剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、直腸、及び鼻内経路がある。その他任意の治療上有益な投与経路、例えば上皮または内皮組織を介した吸収、または活性物質をコードしているＤＮＡ分子を患者に投与する（例えば、ベクターによって）遺伝子治療（これは、活性物質のインビボ発現および分泌を惹起する）を利用することもできる。加えて、本発明に係るタンパク質（群）を生物活性物質の他の成分、例えば医薬として許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルと共に投与することもできる。
【０１５０】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のためには、活性タンパク質（群）を、医薬として許容し得る非経口ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）ならびに等張性を維持する添加物（例えばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加物（例えば保存剤および緩衝剤）と共に、溶液、懸濁液、エマルジョンまたは凍結乾燥粉末に調合することができる。この製剤を、一般に使用される技術によって滅菌する。
【０１５１】
本発明の活性タンパク質（群）のバイオアベイラビリティーを、人間の体内での当該分子の半減期を増大させるコンジュゲーション方法、例えばPCT特許出願ＷＯ９２／１３０９５に記載のようにこの分子をポリエチレングリコールに結合させる方法を用いて改善することもできる。
【０１５２】
活性タンパク質（群）の治療有効量は、アンタゴニストのタイプ、ＩＬ−１８ＢＰに対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストにより発現される任意の残留細胞毒性、投与経路、患者の臨床状態（例えば、内因性ＩＬ−１８活性の無毒性レベルを保持する望ましさ）、といった多くの変化要因の関数となる。
【０１５３】
「治療有効量」とは、投与された時にＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８の生物学的活性の阻害をもたらすことである。単回または複数回投薬としての個体への投与量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬物動態学的性質、投与経路、患者の状態および性質（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、同時に行われる治療、治療頻度および所望の効果を包含する様々な因子に応じて変わる。確立された用量範囲の調節および操作、並びに個々におけるＩＬ−１８の阻害を決定するインビトロ及びインビボでの方法は、充分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１５４】
精製ＩＬ−１８ＢＰは、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇまたは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重又は約１〜３ｍｇ／ｋｇ体重又は約２ｍｇ／ｋｇ体重の量で用いることができる。
【０１５５】
更に好ましい実施態様において、精製ＩＬ−１８ＢＰは、毎日、１日おきに又は週３回又は週１回投与する。
【０１５６】
日用量は通常、分割用量で、または所望の結果を得るために有効な持続放出剤型で投与する。２回目またはその後の投与は、初回または前回その個体に投与した用量と同じか、より少ないか、またはより多い用量で実施できる。２回目またはその後の投与は、疾患の最中または発症に先立って投与できる。
【０１５７】
本発明によると、精製ＩＬ−１８ＢＰは、治療有効量で、他の治療レジメン又は薬剤（例えば、多剤レジメン）と共に、前、同時又は連続的に、個々に対して、予防的に又は治療的に投与することができる。
【０１５８】
精製ＩＬ−１８ＢＰは、多くの疾病又は疾患の処置及び／又は予防のための薬剤の調製に用いることができる。このような疾病又は疾患は、好ましくはＩＬ−１８介在疾患である。具体的には、精製ＩＬ−１８ＢＰは、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、関節リウマチ、肝障害、例えばアルコール肝硬変、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血性心疾患、アレルギー、特に遅延型過敏症、及び閉鎖性頭部外傷の処置及び／予防に有用であり得る。
【０１５９】
本発明を完全に記載したが、過度の実験をせずに、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、広範囲の同等のパラメータ、濃度及び条件の中で同一のものを実施することができることを、当業者は理解するだろう。
【０１６０】
本発明をその具体的な実施態様との関連で説明したが、それは更なる変更が可能であることが理解されるだろう。本出願は、一般的に本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用又は適合を対象とすることを意図しており、本発明が関連する技術の既知の又は通例の実施に入るような、及び添付の特許請求の範囲に記載した上記の必須の特徴に適用することができるような、この開示からの逸脱を包含する。
【０１６１】
雑誌の記事または要約、公開されたまたは公開されていない米国又は外国特許出願、登録された米国又は外国特許、又はその他任意の参考文献を包含する、本明細書に引用した全ての参考文献は、その引用文献に記載された全てのデータ、表、図面および文章を含めて、引用により本明細書の一部とする。さらに、本明細書に引用した参考文献中に引用されている参考文献の全内容もまた、引用により本明細書の一部とする。
【０１６２】
既知方法の段階、常套的方法の段階、既知方法または常套的方法に対する言及は、本発明の何らかの側面、説明または態様が、関連技術に開示、教示または示唆されているとの容認を表すものでは決してない。
【０１６３】
前記の具体的態様の説明は、本発明の一般的性質を完全に表しているため、当分野における通常の知識（本明細書に引用した文献の内容を含む）を適用することにより、過度の実験をせずに、本発明の一般概念を逸脱することなく、そのような具体的態様を容易に修飾および／または様々な応用へと適合させる事ができる。したがって、このような適合および修飾は、本明細書に記載の教示および手引きに基づき、開示された態様の等価物の範囲内にあることが意図されている。本明細書の語法または用語は説明目的のためであって限定を目的とするものではなく、本明細書の用語または語法は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書に記載の教示および手引きに照らして当業者により解釈されるべきであることは明白である。
【実施例】
【０１６４】
実施例１：無血清ＣＨＯ細胞上清からの組み換え、ヒトＩＬ−１８ＢＰの精製
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の固定化アフィニティーリガンドを含んで成るアフィニティーカラムを、精製目的で用いた。
【０１６５】
アフィニティーリガンドを、合成スキーム１で概説したマトリクスに結合させた。市販のアフィニティークロマトグラフィー物質のための一般的な指示に従って、カラムに、合成したアフィニティーカラム物質を詰め、使用の前に一回ブランクで実施した。
【０１６６】
１ｍｌのフリット（ｆｒｉｔｔｅｄ）重力送り（ｇｒａｖｉｔｙ−ｆｅｄ）Ｐｉｋｓｉキットカラムを、１５ＣＶ（カラム体積）のＰＢＳを用いてｐＨ７．０で平衡化した。
【０１６７】
精製工程を、ＩＬ−１８ＢＰ発現ＣＨＯ細胞からの無血清細胞培養上清（非ろ過、２５℃で解凍）中に存在する組み換えヒトＩＬ−１８ＢＰを用いて開始する。
【０１６８】
カラムに、約１〜２ｍｇの採取したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰを入れた。溶液を、カラムに入れる前に、０．４５μｍのフィルターに通してろ過した。
【０１６９】
試料の導入が完了した後、カラムを、約１０ＣＶのＰＢＳ、ｐＨ７．０で洗い（１．洗浄）、約１０ＣＶのＰＢＳ／０．２  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で洗った（２．洗浄）。これらの画分（ＦＴ）は、細胞培養不純物のみを含んでいたので廃棄した。
【０１７０】
５ＣＶのＰＢＳ／０．５ ＮａＣｌ／５０％のエチレングリコールを用いて溶出を開始した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが主なピークとして溶出した。典型的な溶出プロファイルを図１に示す。
【０１７１】
溶出の完了後、カラムを、３０％のイソプロピルアルコール及び０．２ＭのＮａＯＨを含む５ＣＶの再生緩衝液でフラッシュし浄化した。
【０１７２】
一般的なアフィニティークロマトグラフィー条件：
温度：１６〜２５℃（ＲＴ）又は４℃
【表４】
2008542432.tif 000011
【０１７３】
精製タンパク質の分析
１．Ｅｌｉｓａ（導入物、流出物及び溶出液）
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢ（流出物及び溶出液）
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＷＢ（流出物及び溶出液）
４．ブラッドフォード分析（導入物、流出物及び溶出液）
【０１７４】
流出物及び溶出液画分の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける溶出液中の５５〜６６ｋＤａの純粋なタンパク質バンドを明らかにした。以下の構造のアフィニティーリガンドにより、高純度のＩＬ１８ＢＰタンパク質が得られた：
【表５】
2008542432.tif 000012
【０１７５】
図２は、アフィニティーリガンド＃２、＃５、＃６及び＃７を用いたクロマトグラフィーの実施からの画分の回収率及び純度をまとめる。タンパク質含有量は、ＨＰＬＣにより測定した。
【０１７６】
ウエスタンブロット法は、アフィニティーリガンド＃２、＃６及び＃７を用いて、混ぜ合わせた溶出液及び溶出テール画分が８０％超の純度を示すことを示唆した。リガンド＃６及び＃７は、ＩＬ−１８ＢＰの二量体及び凝集型よりも単量体の溶出に対して好ましい選択性を示した（結果は示さない）。
【０１７７】
図３は、表において、全ての回収したＩＬ−１８ＢＰタンパク質、その単量体型及び二量体型の収率における、異なる洗浄及び溶出緩衝液の影響をまとめる。精製は、アフィニティーリガンド＃６を用いて実施した。
【０１７８】
実施例２：無血清ＣＨＯ細胞上清からの組み換え、ヒトＩＬ−１８ＢＰの精製
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の固定化アフィニティーリガンドを含んで成るアフィニティーカラムを、精製方法に用いた。
【０１７９】
アフィニティーリガンドを、合成スキーム１で概説したように、マトリクスに結合させた。市販のアフィニティークロマトグラフィー物質のための一般的な指示に従って、カラムに、合成したアフィニティーカラム物質を詰め、使用の前に一回ブランクで実施した。
【０１８０】
カラムを、５ＢＶ（ベッド体積）のリン酸Ｎａ緩衝液５０ｍＭ＋Ｎａ2ＳＯ4 １．２Ｍ、ｐＨ５．５、伝導率１０３ｍＳ／ｃｍを用いて平衡化した。
【０１８１】
精製工程を、ＩＬ−１８ＢＰ発現ＣＨＯ細胞からの無血清細胞培養上清（非ろ過、２５℃で解凍）中に存在する組み換えヒトＩＬ−１８ＢＰを用いて開始する。
【０１８２】
カラムに、約１．５５ｍｇの採取したｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ＋Ｎａ2ＳＯ4 １．２Ｍを入れ、リン酸（Ｈ3ＰＯ4）によりｐＨを５．５に調整した。カラムに入れる前に、溶液を０．４５μｍのフィルターに通してろ過した。
【０１８３】
試料導入が完了した後、カラムを、約１０ＢＶのリン酸Ｎａ緩衝液５０ｍＭ＋Ｎａ2ＳＯ4 １．２Ｍ、ｐＨ５．５、伝導率１０３ｍＳ／ｃｍでフラッシュした。これらの画分（ＦＴ）は、細胞培養不純物のみを含んでいたので廃棄した。
【０１８４】
カラムを、リン酸ナトリウムと硫酸ナトリウムの混合物を含む緩衝液を用いて洗った。
【０１８５】
溶出を、Ｎａリン酸緩衝液５０ｍＭ＋プロピレングリコール３５％、ｐＨ７、伝導率７０ｍＳ／ｃｍにより開始した。ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰが主なピークとして溶出した。典型的な溶出プロファイルを図１に示す。
【０１８６】
溶出が完了した後、カラムを、３ＢＶの１，６−ヘキサンジオール５０％／ＮａＯＨ １Ｍを含む再生緩衝液を用いてフラッシュし浄化した。
【０１８７】
カラムを、１０ｍＭの水酸化ナトリウム中で、室温で、次のサイクルの使用まで保存することができる。
【０１８８】
一般的なアフィニティークロマトグラフィー条件：
温度：１６〜２５℃（ＲＴ）
【表６】
2008542432.tif 000013
【０１８９】
２回の精製の実施の平均は、ブラッドフォードにより８７％の純度を有するＩＬ−１８ＢＰを与えた（ＨＣＰ  ３００００ｐｐｍ）。単量体の回収率は、出発物質の９７％であった。
【０１９０】
【表７】
2008542432.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は、アフィニティーリガンド＃５を用いた典型的な溶出プロファイルを示す。Ｆ７−非結合；２、３−溶出；４−溶出テール（ｔａｉｌ）；Ｆ８−ストリップ（ｓｔｒｉｐ）。
【図２】図２は、アフィニティーリガンド＃２、＃５、＃６及び＃７を用いたアフィニティークロマトグラフィーの実施からの画分の回収率及び純度を示す。ＮＢ＝非結合画分、Ｅ＝溶出液、ＥＴ＝溶出テール。
【図３】図３は、全ての回収されたＩＬ−１８ＢＰタンパク質、その単量体型及びその二量体型に対する収率への、異なる洗浄及び溶出緩衝液の影響を示す。精製は、アフィニティーリガンド＃６を用いて実施した。ＥＧ＝エチレングリコール、ＰＥＧ＝プロピレングリコール、ＮＢ＝非結合画分；ｎ．ｄ．＝決定していない。「収率」に関する値は、以下のように計算する：（溶出画分中のＩＬ１８ＢＰ（ｇ））／（カラムに導入した全ＩＬ１８ＢＰ（ｇ））。
【図１】
2008542432.tif 000020
【図２】
2008542432.tif 000021
【図３】
2008542432.tif 000022
【国際調査報告】
2008542432.tif 000023
2008542432.tif 000024