(57)【要約】  本発明は、癌を治療するための、治療用放射性核種を有するインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを提供する。治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドを用いて、癌を治療する方法も提供する。毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含有する抗癌治療剤、および癌を治療するためにその毒素コンジュゲートを使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用放射性核種を有するインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンド。
【請求項２】
前記リガンドがリンカー部分によって前記放射性核種に結合している、請求項１に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項３】
前記リンカー部分がキレート剤を含む、請求項１に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項４】
前記治療用放射性核種が、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、レニウム１８６、またはルテチウム１７７である、請求項１に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項５】
前記リガンドがＩＧＦ−１受容体アゴニストである、請求項１に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項６】
前記リガンドがＩＧＦ−１である、請求項５に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項７】
前記リガンドがＩＧＦ−１受容体アンタゴニストである、請求項５に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項８】
前記リガンドが、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して大きな親和性を有する、請求項１に記載のＩＧＦ−１受容体リガンド。
【請求項９】
毒素に結合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを含む抗癌治療剤。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−１受容体リガンドがＩＧＦ−１受容体アゴニストである、請求項９に記載の抗癌治療剤。
【請求項１１】
前記ＩＧＦ−１受容体リガンドがＩＧＦ−１である、請求項１０に記載の抗癌治療剤。
【請求項１２】
前記ＩＧＦ−１受容体リガンドがＩＧＦ−１受容体アンタゴニストである、請求項９に記載の抗癌治療剤。
【請求項１３】
前記ＩＧＦ−１受容体リガンドが、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して大きな親和性を有する、請求項９に記載の抗癌治療剤。
【請求項１４】
前記毒素が、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン、リシン、またはそれらの毒性フラグメントである、請求項９に記載の抗癌治療剤。
【請求項１５】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、治療用放射性核種を有する治療上有効量のＩＧＦ−１受容体リガンドを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記癌が、非小細胞肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、脳腫瘍、または黒色腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、毒素に結合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを含有する治療上有効量の治療剤を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記癌が、非小細胞肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、脳腫瘍、または黒色腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドに前記癌細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２０】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、毒素に結合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを含有する治療剤に前記癌細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２３】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２６】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記接触がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２９】
前記接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触がｉｎ  ｖｉｖｏである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
現在、米国だけで毎年１３０万人が癌と診断され、５０万を超す人々が死亡している。癌の新しい種類の治療法として浮上している方法の１つが、治療用放射性核種に結合した抗体を用いる放射線療法の一種であり、その抗体は、特定の種類の癌に特異的であるか、または主として癌細胞に見出される標的を認識する。現在、米国では２例が治療のために承認されており、イブリツモマブ・チウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標））とトシツモマブ（ＢＥＸＡＲ（登録商標））である。イブリツモマブ・チウキセタンは、正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞に見出されるＣＤ２０抗原を認識する。この抗体は、チウキセタンキレート化部分によって治療用イットリウム９０放射性核種と結合している。トシツモマブもＣＤ２０抗原を認識するが、これはＩ−１３１放射性核種で標識されている。共にＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療に用いられている。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞に見出される標的を認識する抗体と結合している、ジフテリア毒素またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素などの毒素を含む抗癌剤も研究されているが、この種の薬剤はいずれも現在のところ米国では承認されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
癌を治療するための新しい薬剤が求められている。それらの薬剤は癌細胞を標的とし、健常細胞には概して影響を与えないことが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、治療用放射性核種、あるいはジフテリア毒素またはシュードモナス外毒素などの細胞毒素に結合した、ＩＧＦ−１自体などのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体のリガンドを含む新規な抗癌治療剤を提供する。
【０００５】
これまでの研究において、癌細胞に特異的に見出される抗原に毒素および放射性核種を送達するために、毒素および放射性核種は、抗体と結合していた。抗体を使用する欠点の１つは、抗体が大きな分子であり、投与される患者にしばしば免疫反応および過敏性反応を引き起こすことである。これはそれらの治療的な使用を妨げ得る。抗体の大きさはさらに、それらが固形腫瘍に有効に浸透できない可能性のあることを意味する。抗体はまた、それらが結合する細胞に通常は内在化されない。抗体は単に細胞表面に位置する。放射性核種標識抗体の場合、放射性核種が標的細胞に内在化され、したがって細胞の表面上にあるよりも、放射能の治療標的である細胞の核酸に近ければ、いくらか好ましいであろう。毒素コンジュゲート抗体の場合、細胞を殺すためには、通常、毒素は細胞に内在化されなければならないため、抗体および毒素が標的癌細胞に内在化されないならば、より大きな問題である。
【０００６】
癌を定義づける特徴は、適切な制御なしに癌細胞が分裂することである。放射線は分裂していない休止細胞に比べて、活発に分裂している細胞に対してより毒性であるため、放射線は抗癌療法に用いられている。しかしながら、癌細胞は常に分裂しているわけではない。放射線に暴露される時点またはその前後に、細胞の分裂を誘発することができれば、放射線療法の有効性を増大できるだろう。
【０００７】
ＩＧＦ−１受容体は、ほぼすべての種類の癌によるほとんどの腫瘍において著しく過剰に発現している。ＩＧＦ−１は、プロインスリンと４０％の同一性を有する７０アミノ酸残基のペプチドである（Ｄａｕｇｈａｄａｙ，Ｗ．Ｈ．等、１９８９年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｓ．１０：６８）。ＩＧＦ−１は肝臓によって循環系に分泌され、多くの細胞型の成長を刺激する。ＩＧＦ−１はまた、オートクリン作用およびパラクリン作用のために、多くの癌を含む全身の多くの細胞型によって産生される。ＩＧＦ−１産生は、成長ホルモンに刺激される（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．Ｈ．等、１９９６年、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｓ．７６：１００５；Ｙａｋａｒ，Ｓ．等、２００２年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、１９：２３９）。ＩＧＦ−１受容体は、良性乳房組織に比べて、悪性乳癌組織で４３倍多く見出された（Ｊａｍｍｅｓ，Ｈ．等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６６：２４８〜２５３）。
【０００８】
ＩＧＦ−１の生物学的役割は、細胞分裂を刺激することである。放射線は非分裂細胞に比べて分裂細胞に対してより毒性であるため、これは大きな意義を有する。したがって、放射性標識ＩＧＦ−１受容体アゴニストは、高い特異性で癌細胞を標的とするだけでなく、それらが照射されるときに細胞の分裂を引き起こし、放射性に対して細胞を感作する可能性もある。
【０００９】
さらに、その受容体と結合することによって、ＩＧＦ−１は受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞に内在化される。これによりＩＧＦ−１または別のＩＧＦ−１受容体リガンドに結合した放射性核種は細胞に取り込まれ、標的核酸に近づく。この要因は、毒素−ＩＧＦ−１受容体リガンドコンジュゲートの場合に、より重要である。なぜなら、これが毒素を細胞内に取り込み、ほとんどの毒素はその毒性を発揮するために細胞に浸透しなければならないためである。
【００１０】
したがって、本発明の一実施形態は、治療用放射性核種を有するインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを提供する。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含む、抗癌治療剤を提供する。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、治療用放射性核種を有する治療上有効量のＩＧＦ−１受容体リガンドをその哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含有する治療上有効量の治療剤をその哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドにそれらの癌細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の実施形態は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、毒素に結合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを含有する治療剤にそれらの癌細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義：
本明細書では、「毒素」という用語は、すべての細胞に対して一般に致死性である分子または部分を指す。これは選択的に分裂細胞に対して致死性であり、非分裂細胞に対して致死性の低い従来の抗癌化学療法剤と対照的である。選択的に分裂細胞に対して致死性であり、哺乳動物において癌を治療するために全身投与することのできる抗癌化学療法剤は、本明細書では「毒素」という用語から除外する。
【００１９】
本明細書では、「治療用放射性核種」という用語は、癌細胞を殺すのに治療上有用である放射線形態を放出する原子を指す。
【００２０】
本明細書では、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は制限がなく、名前を挙げていない他の要素を包含することができ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じ意味を有する。
説明：
本発明の一実施形態は、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドを提供する。いくつかの実施形態において、たとえばＩ−１３１によるタンパク質リガンドのチロシンまたはヒスチジン残基のヨウ素化によって、放射性核種はリガンドに直接結合することができる。
【００２１】
他の実施形態において、放射性核種は、リンカー部分によってリガンドに結合されている。このリンカー部分には、放射性核種を保持するためのキレート剤を含むことができる。キレート剤の例は、チウキセタン［Ｎ−［２−ビス（カルボキシメチル）アミノ］−（ｐ−イソチオシアネートフェニル）−プロピル］−［Ｎ−［２−ビス（カルボキシメチル）アミノ］−２−（メチル）−エチル］グリシン］がある。他の結合用リガンドの例は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）がある。ＩＧＦ−１リガンドを直接、またはキレート剤リンカーを用いて放射性標識する方法は、実施例１にさらに詳しく記載する。
【００２２】
好適な放射性核種の例は、ヨウ素１３１、イットリウム９０、インジウム１１１、レニウム１８６、およびルテチウム１７７である。これらはすべて短い半減期を持つベータまたはガンマ放射体である。細胞に内在化されているＩＧＦ−１受容体リガンドの場合、アルファ放射体も治療上有効な放射性核種でありえる。アルファ粒子は非常に短い距離で吸収されるため、癌細胞の表面または腫瘍の外面から放射された場合、通常は治療上有用でない。しかしながら、ＩＧＦ−１受容体の多くのリガンドは、受容体介在性エンドサイトーシスによって内在化される。これにより放射性核種は細胞の核に取り込まれ、ＤＮＡ標的と直接接触することになる。したがって、その場合アルファ放射の放射性同位体が有用でありえる。
【００２３】
治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドは、ＩＧＦ−１受容体アゴニストであることができる。アゴニストは細胞分裂を刺激し、放射線は非分裂細胞に比べて分裂細胞に対してより致死性であるため、これにより癌細胞は放射線による殺滅に感作されることになる。アゴニストであるＩＧＦ−１受容体リガンドの好適な例は、ＩＧＦ−１自体である。ヒトＩＧＦ−１の配列を配列番号１として示す。
【００２４】
本発明における使用に適したＩＧＦ受容体アゴニストの他の例には、受容体を活性化するが、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対して低下した親和性を有するＩＧＦ−１の変異体が含まれる。いくつかの例が米国特許第４８７６２４２号に開示されている。ＩＧＦ−１結合タンパク質は、ＩＧＦ−１に結合して循環中、ＩＧＦ−１を維持し、その生物学的半減期を延長する天然血清タンパク質である。ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合の低下により、ＩＧＦ−１受容体と結合する薬剤の放出が促進されるため、結合の低下は、本発明の放射性標識および毒素結合ＩＧＦ−１受容体リガンドに有利な可能性がある。ＩＧＦ受容体と結合するが、可溶性ＩＧＦ結合タンパク質とは結合しない特に重要なＩＧＦ−１変異体は、ＩＧＦ−１の最初の１６残基が、インスリンＢ鎖の最初の１７残基に置換されている変異体である（米国特許第４８７６２４２号）（配列番号２）。
【００２５】
他の特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体アゴニストは、ＩＧＦ−２である（配列番号８）。
【００２６】
本発明の特定の実施形態において、毒素コンジュゲートおよび放射性標識剤には、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する親和性が低下した変異ＩＧＦ−１タンパク質が含まれる。特定の実施形態において、変異体は、可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性が天然ＩＧＦ−１に比べて、１００分の１より低い、さらに好ましくは１０００分の１より低い。可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合親和性は、Ｂａｙｎｅ，Ｍ．Ｌ．等、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２３３〜６２３９、およびＢａｙｎｅ，Ｍ．Ｌ．等、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２６３８〜２６４２に記載のとおり検定することができる。この技法は、酸安定性ヒト血清タンパク分画に対する125Ｉ−ＩＧＦ−１の結合の阻害に関して、その変異ＩＧＦ−１の阻害定数を測定することを含む。
【００２７】
本発明の特定の実施形態において、放射性標識されているか、または毒素コンジュゲートの一部であるＩＧＦ−１受容体リガンドは、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＩＧＦ−１受容体に対するＫDを有する。好ましくは、リガンドは、約５０ｎＭ未満、より好ましくは約２０ｎＭ未満のＩＧＦ−１受容体に対するＫDを有する。ＩＧＦ−１受容体に対する結合親和性は、たとえばＢａｙｎｅ，Ｍ．Ｌ．等、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６２３３〜６２３９、およびＢａｙｎｅ，Ｍ．Ｌ．等、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２６３８〜２６４２に記載のとおり、胎盤膜に対する結合に関して放射性標識ＩＧＦ−１との競合を測定することによって求めることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、ＩＧＦ−１受容体アンタゴニストである。いくつかのアンタゴニストペプチドは、米国特許出願公開第２００４／００２３８８７号に開示されており、ペプチドＳＦＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫが含まれる（配列番号３）。
【００２９】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して大きい親和性を有する。特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリンでない。特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して高い親和性を有する。
【００３０】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、抗体または抗体フラグメントでない。その他の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、抗体または抗体フラグメントである。
【００３１】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、２００未満のアミノ酸残基、または１００未満のアミノ酸残基のポリペプチドである。
【００３２】
本発明の一実施形態は、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含有する抗癌治療剤である。
【００３３】
毒素コンジュゲートの特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、ＩＧＦ−１受容体アゴニストである。たとえば、ＩＧＦ−１であるか、または可溶性ＩＧＦ−１結合タンパク質に対する結合が低下している米国特許第４８７６２４２号の変異ＩＧＦ−１の１つであることができる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、ＩＧＦ−１受容体アンタゴニストである。いくつかのアンタゴニストペプチドは、米国特許出願公開第２００４／００２３８８７号に開示されており、ペプチドＳＦＳＣＬＥＳＬＶＮＧＰＡＥＫＳＲＧＱＷＤＧＣＲＫＫが含まれる（配列番号３）。
【００３５】
毒素コンジュゲートの特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して大きい親和性を有する。特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリンでない。特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、インスリン受容体に対してより、ＩＧＦ−１受容体に対して高い親和性を有する。
【００３６】
毒素コンジュゲートの特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、抗体または抗体フラグメントでない。その他の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、抗体または抗体フラグメントである。
【００３７】
毒素コンジュゲートの特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンドは、２００未満のアミノ酸残基、または１００未満のアミノ酸残基のポリペプチドである。
【００３８】
特定の実施形態において、毒素は、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）エンテロトキシン、リシン、またはそれらの毒性フラグメントである。
【００３９】
特定の実施形態において、ＩＧＦ−１受容体リガンド−毒素コンジュゲートの毒素部分は、天然毒素の毒性フラグメントである。ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびクロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシンなどの、ほとんどの細菌毒素は、毒素を特定の細胞表面受容体に向かわせる部分とその毒素タンパク質の毒性に関与する部分とを含む。たとえば、クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシンは、細胞表面でクローディン３およびクローディン４に結合する。クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）は、３１９アミノ酸残基のタンパク質である（配列番号４）。クロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシンの残基２９０〜３１９からなるペプチドは、クローディン３およびクローディン４に結合するが、毒性ではない（Ｈａｎｎａ，Ｐ．Ｃ．等、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１１０３７〜４３）。ＣＰＥの残基のおよそ４５〜１１６は、細胞膜内に大きな複合体を形成することによって、細胞溶解に関与する（Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，Ｊ．Ｆ．等、１９９６年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：１０２０〜２５；Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，Ｊ．Ｆ．等、１９９７年、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２５（補遺２）：Ｓ１６５〜Ｓ１６７；Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，Ｊ．Ｆ．等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１０１４〜１０２２；Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，Ｊ．Ｆ．等、１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５６３４〜５６４１；Ｈａｎｎａ，Ｐ．Ｃ．等、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１０３７〜４３）。受容体への結合を止めるには残基３１５〜３１９だけの欠失で充分である（Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，Ｊ．Ｆ．等、１９９９年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５６３４〜５６４１）。したがって、本発明の毒素コンジュゲートのいくつかの実施形態において、コンジュゲートの毒素部分は、配列番号４の残基４５〜１１６を含有するが、配列番号４の残基３１５〜３１９を欠く、ＣＰＥのフラグメントである。たとえば、この毒素は、配列番号４の残基１〜３１４、１〜２８９、１〜１１６、４５〜３１４、４５〜２８９、または４５〜１１６であってよい。
【００４０】
他の実施形態において、毒素は、ジフテリア毒素、またはその毒性フラグメントである。ジフテリア毒素は、５３５アミノ酸残基のタンパク質である（配列番号５）。これは３つのドメインを含有する。残基１〜１９３は、細胞において伸長因子２を不活性化して、細胞を殺すことに関与するＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を有する触媒ドメインである（Ｃｈｏｅ，Ｓ．等、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：２１６〜２２２）。残基のおよそ２０３〜３７８は、細胞膜を横切る毒素の転移に関与する（同上）。さらに、残基のおよそ３８６〜５３５は、受容体への結合に関与する（同上）。ジフテリア毒素の残基１〜３８９へのインターロイキン２の融合は、ジフテリア毒素のより長いフラグメントへの融合に比べて、インターロイキン２受容体を有する細胞に対して細胞毒性が強いことが見出されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｐ．等、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８８５〜８９；Ｋｉｙｏｋａｗａ，Ｔ．等、１９９１年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：４６３〜４６８）。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のコンジュゲートの毒素部分は、配列番号５の残基１〜３８９である。
【００４１】
一実施形態において、毒素−ＩＧＦ−１受容体リガンドコンジュゲートは、配列番号６であるか、または配列番号６を含み、これは可溶性ＩＧＦ結合タンパク質に結合しない変異ＩＧＦ−１配列番号２に結合したジフテリア毒素の残基１〜３８９である。配列番号６において、コンジュゲートのＩＧＦ−１部分とジフテリア毒素部分は、Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーで分離されている。
【００４２】
他の実施形態において、毒素−ＩＧＦ−１受容体リガンドコンジュゲートは、配列番号７であるか、または配列番号７を含み、これは配列番号２に結合したクロストリジウム・パーフリンジェンスエンテロトキシン（ＣＰＥ）の残基４５〜２８９である。配列番号７において、コンジュゲートのＩＧＦ−１部分とＣＰＥ部分は、Ｈｉｓ−Ａｌａリンカーで分離されている。
【００４３】
参照により本明細書に取り込まれる米国特許仮出願第６０／５１３０４８号、および国際公開第２００５／０４１８６５号に開示の方法によって、毒素はタンパク様ＩＧＦ−１受容体リガンドに化学的にコンジュゲートすることができる。
【００４４】
毒素とＩＧＦ−１受容体リガンドが共にタンパク質またはペプチドである場合、それらのコンジュゲートは、好ましくは、組み換えＤＮＡ法によって発現された毒素とＩＧＦ−１受容体リガンドの融合タンパク質である。
【００４５】
毒素コンジュゲートの特定の実施形態において、毒素は、カリケアマイシンまたはその誘導体である（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ  第１３版、＃１７２２）。特にカリケアマイシンγ1Iまたはその誘導体である。カリケアマイシンの誘導体化は、典型的にトリスルフィドで生じる（Ｈａｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．等、２００５年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１６：３４６〜３５３；Ｈｉｎｍａｎ，Ｌ．Ｍ．等、Ｅｎｅｄｉｙｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ、８７〜１０６頁、Ｄ．Ｂ．Ｂｏｒｄｅｒｓ、Ｔ．Ｗ．Ｄｏｙｌｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）。カリケアマイシンは、毒素と対比して従来の抗癌化学療法剤とみなされることがある。しかしながら、カリケアマイシンは動物モデルにおいて腫瘍に対して短期的にはもっとも有効である用量で、またはその用量以下で、標的薬剤にコンジュゲートすることなく全身投与されたとき、それらの動物にほぼ１００％の遅延致死率を示すため、本明細書では「毒素」とみなす（Ｄｕｒｒ，Ｆ．Ｅ．等、Ｅｎｅｄｉｙｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ、１２７〜１３６頁、Ｄ．Ｂ．Ｂｏｒｄｅｒｓ、Ｔ．Ｗ．Ｄｏｙｌｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５年）。
【００４６】
好ましくは、タンパク質であるＩＧＦ−１受容体リガンド（たとえば、配列番号１または配列番号２）は、その１つまたは複数のリシン（ｌｙｓｉｎｅ）残基によって、Ｎ−アセチル−カリケアマイシンγ1Iにコンジュゲートされている。Ｎ−アセチル−カリケアマイシンγ1Iは、過剰の無水酢酸において、メタノール中カリケアマイシンγ1Iをアセチル化することによって作製できる。ＮＡｃ−ガンマカリケアマイシンジメチル酸Ｏ−スクシンイミジルエステル（Ｈａｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．等の化合物６、２００５年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１６：３４６〜３５３）は、Ｈａｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．等、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：４０〜４６に記載のとおり調製される。この活性化スクシンイミジルエステルは、タンパク質のアミン基と反応し、ＩＧＦ−１受容体リガンドとＮ−アセチル−カリケアマイシンγ1Iとの間にアミド結合コンジュゲートを形成する。
【００４７】
本発明の一実施形態は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、治療用放射性核種を有する治療上有効量のＩＧＦ−１受容体リガンドをその哺乳動物に投与することを含む方法である。特定の実施形態において、癌は、非小細胞肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、脳腫瘍、または黒色腫である。
【００４８】
本発明の一実施形態は、哺乳動物において癌を治療する方法であって、毒素に結合したインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）受容体リガンドを含有する治療上有効量の治療剤をその哺乳動物に投与することを含む方法である。特定の実施形態において、癌は、非小細胞肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、肝臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、脳腫瘍、または黒色腫である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドにその癌細胞を接触させることを含む方法である。接触はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏであることができる。特定の実施形態において、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドは、癌細胞を殺滅する。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含有する治療剤にその癌細胞を接触させることを含む方法である。接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであることができる。特定の実施形態において、癌細胞は殺滅される。
【００５１】
本発明の他の実施形態は、抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、治療用放射性核種を有するＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法である。この方法は、癌細胞の増殖または殺滅をモニターすることを含む。接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであることができる。
【００５２】
本発明の他の実施形態は、抗癌活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、毒素に結合したＩＧＦ−１受容体リガンドを含む化合物に癌細胞を接触させることを含む方法である。この方法は、癌細胞の増殖または殺滅をモニターすることを含む。接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏであることができる。
【００５３】
以下の非限定的な実施例によって、本発明を例示する。
【実施例１】
【００５４】
131Ｉ−ＩＧＦ−１および90Ｙ−ＩＧＦ−１によるマウス乳癌モデルの治療
材料および方法：
ＩＯＤＯ−ＧＥＮ法（１，３，４，６−テトラクロロ−３α，６α−ジフェニルグリコールウリル；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を用いて、ＩＧＦをＩ−１３１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で放射性ヨウ素化する。簡潔には、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ５０〜１００μｇで被覆したガラス製バイアルにおいて、ＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）８５μｌ中、ＩＧＦ−１を室温でインキュベートする。１０分後、飽和チロシン溶液１００μｌを添加して、反応を停止する。その後、反応混合物をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、ＰＢＳおよび０．５％ウシ血清アルブミンで溶出して分離する。比放射能は約８０ｋＢｑ／μｇである（Ｋｏｐｐｅ，Ｍ．Ｊ．等、２００４年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５：１２２４〜１２３２）。
【００５５】
Ｙ−９０で標識するために、ＩＧＦ−１をイソチオシアネート−ベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸（ＩＴＣ−ＤＴＰＡ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ）とコンジュゲートする。Ｒｕｅｇｇ等（Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ｌ．等、１９９０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４２２１〜２６）によって記載されているとおり、１００倍モル過剰のＩＴＣ−ＤＴＰＡを用いて、室温で１時間、ＮａＨＣＯ3緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．２）中、ＩＴＣ−ＤＴＰＡをＩＧＦ−１にコンジュゲートする。酢酸アンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）に対して透析して、このＤＴＰＡ−ＩＧＦ−１コンジュゲートを精製する。ＩＧＦ−１分子当たりのＤＴＰＡリガンド数は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．等、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１４７〜１５７の方法で求めることができる。ＩＧＦ−１当たり３つまでのリガンドがコンジュゲートされていてもよい。精製したＤＴＰＡ−ＩＧＦ−１コンジュゲート（０．８ｍｇ／ｍｌ）を、室温で２０分間、酢酸アンモニウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．４）中、Ｙ−９０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．）と共にインキュベートする。比放射能は約３７０ｋＢｑ／μｇである（Ｋｏｐｐｅ，Ｍ．Ｊ．等、２００４年、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５：１２２４〜１２３２）。
【００５６】
この放射性標識調製物を、０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで溶出して、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でゲル濾過によって精製する。シリカゲル片および移動相としてクエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）を用い、薄層クロマトグラフィで遊離放射性同位体の量を求める。ＩＧＦ−１にコンジュゲートしていない標識は５％未満であるべきである。
【００５７】
６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）で、非標識ＩＧＦ−１、131Ｉ−ＩＧＦ−１、および90Ｙ−ＩＧＦ−１の最大耐用量を求める。
【００５８】
ＭＣＦ−７は、ＩＧＦ−１に反応性のヒト乳癌細胞株である（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｊ．等、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７２５６）。ＭＣＦ−７細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１０μｇ／ｍｌインスリンを添加したＦ１２／ＤＭＥ培養液において、９５％空気、５％ＣＯ2中、３７℃で培養する（Ｋａｒｅｙ，Ｋ．Ｐ．等、１９８８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４０８３〜４０９２）。細胞を４〜６日毎に移し、１０ｃｍ皿の培養液２０ｍｌに１．７５×１０6細胞／プレートで接種する。
【００５９】
上述のとおりＭＣＦ−７細胞を培養する。無血清培養液０．０５ｍｌ中５×１０6ＭＣＦ−７細胞を、６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の背部に皮下注射する。マウスのエストロゲン産生は、ＭＣＦ−７の増殖を支持するには不十分であるため、癌細胞注射の１日前から開始して、その後は週に１回、ゴマ油に溶解したベータ−エストラジオール（０．１ｍｇ／油０．０５ｍｌ、皮下）をマウスに注射する。直径５ｍｍまで腫瘍を成長させる（Ｈａｒｄｍａｎ，Ｗ．Ｅ．等、１９９９年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：２２６９）。
【００６０】
腫瘍が５ｍｍに達したときに、ＩＧＦ−１、131Ｉ−ＩＧＦ−１、または90Ｙ−ＩＧＦ−１を、それぞれ５匹のマウスに最大耐用量の半量で注射する。５匹のコントロールマウスには薬剤を与えない。
【００６１】
腫瘍の大きさを３日毎にモニターする。
結果：
ＭＣＦ−７腫瘍を有し、131Ｉ−ＩＧＦ−１または90Ｙ−ＩＧＦ−１を投与されたマウスは、治療を受けていないか、または非標識ＩＧＦ−１を投与されたコントロールマウスと比べて、長く生存し、腫瘍の成長が遅いことがわかる。
【実施例２】
【００６２】
ＩＧＦ−１−ｄｇリシン（Ｒｉｃｉｎ）Ａコンジュゲートによるマウス乳癌モデルの治療
材料および方法：
Ｇｒｅｇｇ，Ｅ．Ｏ．等（１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５０２〜０８）に記載のとおり、リシンＡ鎖を調製する。Ｂｌａｋｅｙ，Ｄ．Ｃ．等（１９８７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９４７〜９５２）に記載のとおり、リシンＡ鎖を脱グリコシル化する。
【００６３】
コンジュゲートの手順は一般に、Ｔｈｏｒｐｅ，Ｐ．Ｅ．等（１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜１５８）、およびＨｕａｎｇ，Ｘ．等（２００４年、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６１：１〜１１）に記載のとおりである。５０ｍＭホウ酸緩衝液（pH９．０）中のＩＧＦ−１溶液（１ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）に、ジメチルホルムアミド１０μｌに溶解した４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α−［２−ピリジルジチオ］トルエン（ＳＭＰＴ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１．２ｍｇを添加した。ＳＭＰＴとＩＧＦ−１のモル比は約３：１である。室温で３０分間攪拌した後、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムに反応混合物を通す。誘導体化タンパク質を同じ緩衝液で溶出する。リシンＡ鎖分子当たり２．６ＳＭＰＴの比率で、同じ手順によって、脱グリコシル化リシンＡ鎖をＳＭＰＴで誘導体化する。０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５カラムに溶液を通して、誘導体化脱グリコシル化リシンＡを試薬から分離する。
【００６４】
誘導体化ＩＧＦ−１を２．５ｍｌに濃縮し、ジチオスレイトール１０ｍｇを添加する。室温で３０分間攪拌した後、窒素通気ＰＢＳで平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５カラムにその溶液を通す。溶出したＩＧＦ−１をそのまま誘導体化脱グリコシル化リシンＡの溶液に流入し、ＩＧＦ−１と脱グリコシル化リシンＡ（ｄｇＡ）の比率１：１．５の混合物中で反応させる。この反応によりＩＧＦ−１当たり１ｄｇＡのＩＧＦ−１−ｄｇＡコンジュゲートが形成される。
【００６５】
ＩＧＦ−１当たり１ｄｇＡのコンジュゲートを、ＳＵＰＥＲＤＥＸ２００において、サイズ排除クロマトグラフィによって精製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでコンジュゲートの特性を明らかにして、この物質が１脱グリコシル化リシン（Ｒｉｃｉｎ）Ａ鎖に結合した１ＩＧＦ−１の精製コンジュゲートからなることを確認する。このコンジュゲートの構造を以下に示すが、リンカーはタンパク質のＮ末端アルファアミノ基またはリシン（ｌｙｓｉｎｅ）側鎖に結合している。
【００６６】
【化１】
2008517917.tif 000002
【００６７】
マウスの治療：上述のとおりＭＣＦ−７細胞を培養する。無血清培養液０．０５ｍｌ中５×１０6ＭＣＦ−７細胞を、６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の背部に皮下注射する。マウスのエストロゲン産生は、ＭＣＦ−７の増殖を支持するには不十分であるため、癌細胞注射の１日前から開始して、その後は週に１回、ゴマ油に溶解したベータ−エストラジオール（０．１ｍｇ／油０．０５ｍｌ、皮下）をマウスに注射する。直径５ｍｍまで腫瘍を成長させる（Ｈａｒｄｍａｎ，Ｗ．Ｅ．等、１９９９年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：２２６９）。
【００６８】
様々な用量のコンジュゲートをマウスに腹腔内注射して、コンジュゲートの最大耐用量を求める。その後、５ｍｍの腫瘍を有する５匹のマウスに、最大耐用量の半量のコンジュゲートを腹腔内注射する。５ｍｍの腫瘍を有する５匹のコントロールマウスには治療をしない。その後、腫瘍の大きさを３日毎にモニターする。
結果：
ＩＧＦ−１−ｄｇＡコンジュゲートを投与されたマウスは、コントロール未治療マウスと比べて、長く生存し、腫瘍の成長が遅いことがわかる。
【００６９】
引用したすべての特許、特許文献、および他の参考文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
【配列表】
2008517917000001.app
【国際調査報告】
2008517917.tif 000003