(57)【要約】接触性およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎の改善および処置のために変異型ヒトIL-4組成物の治療的有効量をヒト被験体に投与する方法について開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において皮膚炎応答を抑制または阻害するための方法であって、それを必要としている被験体に、N末端メチオニン残基を含むもしくは含まないヒトIL-4ムテイン、またはその機能性断片の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
ムテインが、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別のアミノ酸で置換する、少なくとも第一の修飾を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
治療的有効量が1日あたり約0.2mg/kgから約1.0mg/kgである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
治療的有効量が1日あたり約0.3mg/kgから約0.6mg/kgである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、および/またはムテインの非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される修飾をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
N末端の修飾が1つもしくは複数のアミノ酸の欠失または挿入である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
N末端の修飾がメチオニンの欠失または挿入である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
C末端の修飾が1つもしくは複数のアミノ酸の欠失または挿入である、請求項5記載の方法。
【請求項９】
非タンパク質ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位、102位、および/または104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4記載の方法。
【請求項１２】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基102位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4記載の方法。
【請求項１３】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項4記載の方法。
【請求項１４】
非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールPEGである、請求項4および7〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DまたはR121Eを含む、請求項2記載の方法。
【請求項１６】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121Dを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124DまたはY124Eを含む、請求項2記載の方法。
【請求項１８】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124Dを含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125DまたはS125Eを含む、請求項2記載の方法。
【請求項２０】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125Dを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DおよびY124Dを含む、請求項2記載の方法。
【請求項２２】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121D、Y124D、およびS125Dを含む、請求項2記載の方法。
【請求項２３】
N末端の修飾が+2位におけるアミノ酸残基の挿入である、請求項4記載の方法。
【請求項２４】
皮膚炎がアレルギー性またはアトピー性反応である、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
皮膚炎が過敏性反応である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
過敏性反応が接触性皮膚炎である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
過敏性反応がアトピー性皮膚炎である、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
アトピー性皮膚炎を有する被験体を処置するための方法であって、アトピー性皮膚炎を有する被験体に、N末端メチオニン残基を含むまたは含まないヒトIL-4ムテインを含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
【請求項３０】
ムテインが、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別の天然アミノ酸で置換する第一の修飾を含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ムテインが、N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、およびムテインの非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される第二の修飾をさらに含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
治療的有効量が1日あたり約0.2mg/kgから約1.0mg/kgである、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
治療的有効量が1日あたり約0.3mg/kgから約0.6mg/kgである、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
被験体がヒトである、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
非タンパク質ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群より選択される、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位、102位、および/または104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基102位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールPEGである、請求項35〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DまたはR121Eを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４２】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121Dを含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124DまたはY124Eを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４４】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124Dを含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125DまたはS125Eを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４６】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125Dを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DおよびY124Dを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４８】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121D、Y124D、およびS125Dを含む、請求項31記載の方法。
【請求項４９】
N末端の修飾が1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入である、請求項31記載の方法。
【請求項５０】
N末端の修飾が+2位におけるアミノ酸残基の挿入である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
C末端の修飾が1つまたは複数のアミノ酸の欠失または挿入である、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アトピー性皮膚炎および他の炎症性またはアレルギー性皮膚障害を含むアトピー性疾患を、IL-4およびIL-13のアンタゴニストとして働く変異型ヒトインターロイキン-4(IL-4)組成物を投与することにより処置するための方法に関する。
【０００２】
関連出願データ
本出願は、2005年6月17日に出願された米国特許出願第11/156,221号の35 U.S.C. §119(e)による優先権を主張し、その全内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インターロイキン-4(IL-4)は、T細胞およびB細胞の活性化、増殖、ならびに分化を含む、いくつかの標的細胞への広域性の生物学的効果を有する多面的サイトカインである。IL-4は、「Th2型」炎症応答を惹起する中心的なサイトカインとしてますます認識されてきてはいるが、IL-13が、今、より有望な下流エフェクターサイトカインとして認識されている。Bリンパ球の増殖中、IL-4は、IgG1およびIgEアイソタイプへのクラススイッチを制御することによる分化因子として働く。
【０００４】
アトピー性疾患は、IgE抗体の形成により特徴付けられ、それが結果として、特定のアレルゲンへの曝露により即時型過敏性反応を生じる。アトピー性疾患患者の皮膚に起きる頻繁かつ慢性の感染は、免疫応答の障害および皮膚バリア破壊に起因する。アトピー性疾患の公知の処置には、皮膚に潤いを与えること、食事制限、環境における刺激物およびアレルゲンの回避、タール、抗ヒスタミン剤、減感作、コルチコステロイド、抗細菌剤、抗真菌剤、紫外線、ロイコトリエン遮断薬、肥満細胞内容物放出の阻害剤、ペントキシフィリン、アザチオプリン、シクロスポリンA、シクロホスファミド、タクロリムス、インターフェロンγ、チモペンチン、およびホスホジエステラーゼ阻害剤が含まれる。
【０００５】
一般的に、抗ヒスタミン剤およびステロイド剤がアトピー性疾患についての治療的処置として用いられる。抗ヒスタミン剤は、典型的には、アレルギー性応答のかゆみを低減し、塩酸ジフェンヒドラミン、メキタジン、塩酸プロメタジン、およびマレイン酸クロルフェニラミンを含む。プレドニゾロン、酪酸ヒドロコルチゾン、吉草酸デキサメタゾン、βメタゾン、ジプロピオン酸塩、プロピオン酸クロベタゾールなどを含むステロイド剤もまた、かゆみを制御するために用いられている。抗ヒスタミン剤およびステロイド剤はかゆみを軽減するが、それらが、感染、二次副腎皮質機能低下症、糖尿病、消化性潰瘍、多毛、脱毛症、および色素沈着を含む他の有害な副作用を引き起こすため、それらは望ましい治療剤ではない。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ヒトIL-4ムテイン(mhIL-4)治療用組成物を投与することによりアトピー性疾患を処置する方法を含む、被験体において皮膚炎応答を抑制または阻害するための方法を提供する。
【０００７】
本発明の一つの態様において、ヒトIL-4ムテインまたはその機能性断片の治療的有効量を投与することにより、それを必要としている被験体において皮膚炎応答を抑制または阻害するための方法であって、ムテインまたはその断片が、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別の天然アミノ酸で置換する少なくとも第一の修飾を含む、方法が提供される。一つの態様において、修飾は、置換R121DまたはR121Eを含む。もう一つの態様において、修飾は、置換Y124DまたはY124Eを含む。もう一つの態様において、修飾は、置換S125DまたはS125Eを含む。もう一つの態様において、修飾は、置換R121DおよびY124Dを含む。もう一つの態様において、修飾は、置換R121D、Y124D、およびS125Dを含む。
【０００８】
投与されるべきムテインの治療的有効量は、1日あたり約0.2mg/kg〜約1.0mg/kg、および1日あたり約0.3mg/kg〜約0.6mg/kgを含む。もう一つの態様において、ムテインは、N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、および/またはタンパク質の非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される修飾を含む。N末端の修飾は、限定されるわけではないが、メチオニンのような1つもしくは複数のアミノ酸の欠失または挿入を含む。N末端のもう一つの修飾は、+2位におけるアミノ酸残基の挿入を含む。C末端の修飾は、限定されるわけではないが、1つもしくは複数のアミノ酸の欠失または挿入を含む。ムテインが結合しうる非タンパク質ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンを含む。一つの態様において、非タンパク質ポリマーは、アミノ酸残基38位、102位、および/または104位においてムテインに結合している。
【０００９】
本発明のもう一つの態様において、アトピー性皮膚炎を有する被験体に、ヒトIL-4ムテインを含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含む、アトピー性皮膚炎を有する被験体を処置するための方法であって、ムテインが、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別の天然アミノ酸で置換する第一の修飾；ならびに、N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、および/またはタンパク質の非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される第二の修飾を含む、方法が提供される。
【００１０】
詳細な説明
本発明は、変異型ヒトIL-4組成物の治療的有効量を投与することによる、アトピー性疾患(AD)、特にアトピー性皮膚炎、の処置の方法を提供する。ヒトIL-4のアンタゴニストまたは部分的アゴニストとして用いられるヒトIL-4変異型タンパク質もまた、全内容が参照により本明細書に組み入れられている、Wild et al.の米国特許第6,130,318号に記載されている。
【００１１】
本発明の方法は、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎(すなわち、湿疹)、乾癬、脂漏性皮膚炎などを含む典型的なアトピー性疾患またはアレルギー性皮膚炎を処置するために用いられうる。本明細書に用いられる場合、「皮膚炎」という用語は、一般的に、皮膚の炎症として定義される。Stedman's Medical Dictionary, 27th edition, Lippincott Williams & Wilkins (2000)。
【００１２】
本明細書に用いられる場合、「接触性皮膚炎」という用語は、抗原(またはアレルゲン)または刺激物に対する皮膚の炎症応答である(Stedman's Medical Dictionary, 前記)。刺激物は、直接的に皮膚に影響を及ぼす、または直接的な組織損傷を引き起こす物質であり、一方、アレルゲンは、炎症および組織損傷を引き起こす免疫学的反応を誘発する。いくつかの一般的な刺激物は、羊毛および合成繊維、石鹸および洗剤、香水および化粧品、埃および砂、タバコの煙、ならびに塩素、鉱物油、または溶媒のような物質である。
【００１３】
アレルゲンは、典型的には、皮膚に炎症を起こし、かつ免疫反応を引き起こす、食物、植物、または動物由来の物質である。最初に、アレルゲンは、典型的には、細胞、例えば、T細胞、マクロファージなどの動員を含む炎症応答を誘発する。アレルゲンと繰り返し接触すると、接触性皮膚炎は、その後、細胞の苔癬化および浸潤を伴う湿疹になる。
【００１４】
本明細書に用いられる場合、「アトピー性皮膚炎」、「アトピー性湿疹」、または「湿疹」という用語および関連用語は交換可能に用いられ、主として、細胞性免疫不全および増大した免疫グロブリンE(IgE)により引き起こされる複雑な疾患を表す。皮膚への刺激物でもあるアレルゲンによって、単にアレルゲン性トリガーへ曝露するより頻繁に個体が皮膚炎を発症しやすくなると考えられている。不安、ストレス、および憂鬱はすべて、湿疹の悪化において役割を果たしうる。さらに、アトピー性湿疹をもつものは、好酸球数が増加していることが発見されうる。
【００１５】
本明細書に用いられる場合、「変異型ヒトIL-4タンパク質」、「修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニスト」、「mhIL-4」、「IL-4アンタゴニスト」という用語、およびそれらの相当語句は、交換可能に用いられ、本発明の範囲内である。これらのポリペプチドおよびそれらの機能性断片は、成熟ヒトIL-4タンパク質への特定のアミノ酸置換がなされているポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、本発明のmIL-4組成物を含み、その処置を必要としている被験体に投与される。特に、本発明のmhIL-4は、少なくとも置換のR121D/Y124Dペアを含む。mhIL-4ポリペプチドの他の態様が本明細書で考察されている。本明細書に用いられる場合、「機能性断片」とは、より小さなペプチドを含むIL-4アンタゴニスト活性を有するポリペプチドである。hIL-4の修飾のmhIL-4のこれらを始めとする局面は、米国特許第6,335,426号；第6,313,272号；および第6,028,176号に記載されており、それらの全内容は参照により本明細書に組み入れられている。
【００１６】
本明細書に用いられる場合、「野生型IL-4」または「wtIL-4」およびそれらの相当語句は交換可能に用いられ、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第5,017,691号に開示されているように、天然のヒトIL-4の129個の通常存在するアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を有する、天然または組換えのヒトインターロイキン-4を意味する。さらに、本明細書に記載された修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストは、wtIL-4に従って番号が付けられる、様々な挿入および/もしくは欠失、ならびに/または非タンパク質ポリマーへの結合を有し、選択された特定のアミノ酸が、wtIL-4に通常存在するものと同じアミノ酸であることを意味する。一つの態様において、当業者は、位置、例えば、121位(アルギニン)、124位(チロシン)、および/または125位(セリン)における通常存在するアミノ酸が、ムテインにおいてシフトされうることを認識している。もう一つの態様において、当業者は、システイン残基のアミノ酸位置、例えば、38位、102位、および/または104位への挿入がムテイン上でシフトされうることを認識している。しかしながら、シフトされたSer(S)、Arg(R)、Tyr(Y)、または挿入Cys(C)の位置は、その隣接アミノ酸の、wtIL-4におけるSer、Arg、Tyr、またはCysに隣接するものとの検討および相関により決定されうる。
【００１７】
本発明の一つの態様において、修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストは、IL-4およびIL-13の多面発現効果の一つと関連した様々な状態を処置するのに有用である。例えば、IL-4およびIL-13のアンタゴニストは、喘息、アレルギー、または他の炎症応答関連状態を含むIL-4およびIL-13産生によって悪化する状態を処置するのに有用である。修飾ヒトIL-4ムテイン受容体アンタゴニストのいくつかの使用は、全内容が参照により本明細書に組み入れられている米国特許第6,130,318号に記載されている。本発明の治療用化合物であるMHIL-4は米国特許第6,130,318号に記載されているように、修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの一つの型である。
【００１８】
IL-4のアンタゴニストは、文献に報告されている。アンタゴニストとして機能するIL-4の変異体は、IL-4アンタゴニストムテインIL-4/Y124D(Kruse, N., Tony, H.P., Sebald, W., Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement, Embo J. 11:3237-44, 1992)および二重ムテインIL-4[R121D/Y124D](Tony, H., et al., Design of Human Interleukin-4 Antagonists in Inhibiting Interleukin-4-dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency, Eur. J. Biochem. 225:659-664 (1994))を含む。単一ムテインは、D-ヘリックスにおける124位でのアスパラギン酸によるチロシンの置換である。二重ムテインは、D-ヘリックスにおける121位でのアスパラギン酸によるアルギニンの置換、および124位でのアスパラギン酸によるチロシンの置換である。D-ヘリックスのこのセクションにおける変異は、第二結合領域における相互作用の変化と正に相関する。
【００１９】
本発明のもう一つの態様において、修飾IL-4受容体アンタゴニストポリペプチドまたはその機能性断片は、様々なアミノ酸残基において、特に、28位、36位、37位、38位、102位、104位、105位、または106位において、非タンパク質ポリマーと結合している。アミノ酸位置は、野生型IL-4(すなわち、ヒトインターロイキン-4)アミノ酸配列(SEQ ID NO:1)に従って番号が付けられる(参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第5,017,691号参照)。本発明のもう一つの局面において、28位、36位、37位、38位、104位、105位、または106位におけるアミノ酸残基はシステインである。非タンパク質ポリマーへの変異型ヒトIL-4の共有結合修飾は、2004年4月8日に出願された米国特許出願第10/820,559号、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；第4,179,337号に記載されており、それらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００２０】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に示されているようなポリペプチドおよびその機能性断片の適した変種を決定することができる。特定の態様において、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより活性を破壊することなく変化されうる、ポリペプチドの適した領域を同定しうる。他の態様において、当業者は、類似したポリペプチド間で保存されているポリペプチドの残基および部分を同定できる。さらなる態様において、生物活性または構造にとって重要である可能性がある領域でさえも、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供されうる。
【００２１】
加えて、当業者は、活性または構造にとって重要である類似したポリペプチドにおける残基を同定する構造-機能研究を検討することができる。そのような比較を考慮すると、当業者は、類似したタンパク質における活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測された重要なアミノ酸残基の代わりとしての化学的に類似したアミノ酸の置換を選びうる。
【００２２】
当業者はまた、類似したポリペプチドにおいて、3次元構造およびその構造に関するアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報を考慮すると、当業者は、ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントをその3次元構造に関して予測しうる。特定の態様において、当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に過激な変化を生じさせないように選択しうるが、それはそのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるためである。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含む試験変種を作製しうる。変種は、その後、当業者に公知の活性アッセイ法を用いてスクリーニングされうる。そのような変種は、適した変種についての情報を集めるために用いられうる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が結果として、破壊された、望ましくなく低下した、または不適当な活性を生じたことを見出したならば、そのような変化をもつ変種は避けられうる。換言すれば、そのような日常的実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でまたは他の突然変異と組み合わせて避けられるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【００２３】
いくつかの科学的刊行物は、二次構造の予測を専門としている。Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol Relat. Areas Mol. Biol 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276;およびChous et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384参照。さらに、コンピュータープログラムは、現在、二次構造を予測するのを援助するために利用できる。二次構造を予測する一つの方法は、ホモロジーモデリングに基づいている。例えば、約30%より高い配列同一性、または40%より高い配列類似性を有する2つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベースの最近の発達は、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の可能性のある折り畳みの数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供している。Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247参照。所定のポリペプチドまたはタンパク質に限られた数の折り畳みがあること、および一旦、臨界数の5つの構造が解明されたならば、構造予測は劇的により正確になることが示唆されている(Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376)。
【００２４】
二次構造を予測する追加の方法には、「スレッディング(threading)」(Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19)、「プロファイル分析」(Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzyme. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358)、および「進化的連鎖」(Holm, 1999, 前記;およびBrenner, 1997, 前記参照)が含まれる。
【００２５】
本発明の特定の態様はまた、米国特許出願第10/820,559号、前記、および米国特許第6,130,318号；第6,313,272号；第6,335,426号；第6,028,176号；ならびに関連する優先権書類および参考文献を含む、それらの中の関連出願に記載されており、それらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００２６】
一つの態様において、本発明の修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、wtIL-4タンパク質においてアミノ酸121位、124位、および/または125位に存在する1つまたは複数のアミノ酸を別の天然アミノ酸、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸、または任意の正電荷アミノ酸、で置換する修飾を含む。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明の修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、1つもしくは複数のアミノ酸の欠失および/または挿入によるN末端およびC末端のもう一つの修飾；および/またはその中の潜在的グリコシル化部位の欠失を含む。一つの好ましい態様において、N末端修飾は、アミノ酸+2位におけるアミノ酸の挿入である。もう一つの好ましい態様において、C末端修飾は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、および少なくとも5個のアミノ酸の欠失である。しかしながら、C末端からの5個より多いアミノ酸の欠失は、mhIL-4の活性に影響を及ぼす可能性がある。上記および本明細書で述べられた修飾のいずれかからのmhIL-4の活性は、関連出願および/または特許で以前に記載された方法、ならびに本明細書に記載された方法(例えば、米国特許出願第10/820,559号に記載されているような、二分子相互作用分析(BIA)および増殖アッセイ法(実施例4および5参照))のいずれかを用いることにより測定されうる。米国特許出願第10/820,559号の全内容は参照により本明細書に組み入れられている。
【００２８】
特定の態様において、タンパク質変種は、グリコシル化部位の数および/または型が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変化しているグリコシル化変種を含む。特定の態様において、タンパク質変種は、天然タンパク質より多いまたは少ない数のN結合型グリコシル化部位を含む。N結合型グリコシル化部位は、以下の配列により特徴付けられる：Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr、ただしXと表されたアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基でありうる。この配列を生じうるアミノ酸残基の置換は、N結合型糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。または、この配列を排除する置換は、既存のN結合型糖鎖を除去する。1つまたは複数のN結合型グリコシル化部位(典型的にはそれらは天然に存在する)が排除される、および1つまたは複数の新しいN結合型部位が作出されるN結合型糖鎖の再編成もまた提供される。
【００２９】
さらなる好ましい変種は、親アミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のシステイン残基が付加されている、除去されている、または別のアミノ酸(例えば、セリン)を置換しているシステイン変種を含む。システイン変種は、不溶性封入体の単離後のような、生物活性のある立体構造へ再び折り畳まれなければならない場合、有用でありうる。システイン変種は、一般的に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的には、不対システインに起因する相互作用を最小にするために偶数個を有する。本発明の一つの態様において、本発明の修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、アミノ酸38位、102位、および/もしくは104位にまたは近くに付加されているシステイン残基を含む。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの態様において、置換、付加、欠失、またはそれらの任意の組み合わせのような突然変異を含むタンパク質変種が提供され、典型的には、本明細書に記載された方法による、および当技術分野において公知の方法による、1つまたは複数の変異原性オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発により作製される(例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y.およびBerger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA.参照)。
【００３１】
特定の態様により、アミノ酸置換は以下であるものである：(1)タンパク分解性に対する感受性を低下させる、(2)酸化に対する感受性を低下させる、(3)タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、(4)結合親和性を変化させる、および/または(5)そのようなポリペプチド上の他の物理化学的もしくは機能的性質を付与するもしくは改変する。特定の態様により、単一または複数のアミノ酸置換(特定の態様において、保存的アミノ酸置換)は、天然の配列において(特定の態様において、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分において)行われうる。
【００３２】
好ましい態様において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、ヌクレオチド配列の構造的特性を実質的に変化させない(例えば、置換アミノ酸は、ヌクレオチド配列に存在するヘリックスを壊す、またはヌクレオチド配列を特徴付ける他の型の二次構造を崩壊させる傾向があるべきではない)。当技術分野で認識されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W.H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden and J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.;およびThornton et al., 1991, Nature 354:105に記載されており、それぞれは、参照により本明細書に組み入れられている。
【００３３】
ペプチド類似体は、一般的に、鋳型ペプチドの性質と類似した性質をもつ非ペプチド薬として製薬産業において用いられる。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体(peptide mimetics)」または「ペプチド模倣薬(peptidomimetics)」と呼ばれる。いかなる目的に対しても参照により本明細書に組み入れられている、Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392;およびEvans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229を参照のこと。そのような化合物は、しばしば、コンピューター化された分子モデリングの助けを借りて、開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣体は、類似した治療的または予防的効果を産生するために用いられうる。一般的に、ペプチド模倣薬は、ヒト抗体のようなパラダイムポリペプチド(すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当技術分野において周知の方法により、以下から選択される結合によって置換されていてもよい1つまたは複数のペプチド結合を有する：-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(シスおよびトランス)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、およびCH2SO-。共通配列の1つまたは複数のアミノ酸の同じ型のD-アミノ酸での系統的置換(例えば、L-リシンの代わりにD-リシン)は、特定の態様において、より安定なペプチドを作製するために用いられうる。加えて、共通配列または実質的に同一の共通配列変異を含む強制されたペプチドは当技術分野において公知の方法により(いかなる目的に対しても参照により本明細書に組み入れられている、Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387)；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィドを形成する能力がある内部システイン残基を付加することにより、作製されうる。
【００３４】
さらにもう一つの好ましい態様において、本明細書に用いられる場合の修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、全内容が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許第6,028,176号および第6,313,272号に記載されたIL-4RAムテインを含む。本明細書に記載されているような修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール(PEG)分子のような少なくとも1つの非タンパク質ポリマーのムテインへの部位特異的結合を可能にする置換を含む、追加のアミノ酸置換を有するそれらのポリペプチドおよびその機能性断片を含む。例えば、PEGの部位特異的結合により、ポリエチレン-グリコシル化(PEG化)分子の利点、すなわち、N末端およびリシン側鎖PEG化のような非特異的PEG化ストラテジーと比較して、より大きな効力を維持すると同時に、血漿中の半減期の増加(例えば、非修飾IL4RAより少なくとも2〜10倍長い、または10〜100倍長い)を有する修飾ムテインの作製が可能となる。効率的なPEG化を提供する方法は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第10/820,559号に記載されている。
【００３５】
IL-4ムテインは効率的なPEG化を可能にするために適切に精製されなければならない。精製は、米国特許出願第10/820,559号に記載されている(実施例2参照)。例えば、ムテインは、β-メルカプトエタノール、グルタチオン、またはシステインのようなスルフヒドリル保護剤の存在下で再び折り畳まれる場合には、精製されたムテインは、IL-4上の導入されたシステインにおける活性スルフヒドリルが酸化保護剤により不活性化されるため、PEG化されることができない。共有結合性ジスルフィド結合は、IL-4ムテインの遊離システインと保護剤との間に形成される。対照的に、安定なジスルフィドを形成するように酸化するスルフヒドリル保護剤ジチオスレイトール(DTT)の使用は、IL-4ムテインの遊離システインとの共有結合を形成せず、従って、PEGマレイミド試薬と反応するようにそのスルフヒドリル基を遊離状態にしておく。β-メルカプトエタノール、グルタチオン、またはシステインの存在下における再折り畳み後精製されたIL-4ムテインは、DTTで処理された場合にはPEG試薬と反応できるが、単一PEG化および多PEG化生成物の混合物が生じ、既存のIL-4システインもまたPEG化されることを示唆する。既存のシステインのPEG化は、不活性である誤って折り畳まれた生成物をもたらす。
【００３６】
修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのIL-4受容体へのKiは、米国特許出願第10/820,559号に記載されているように、リアルタイム二分子相互作用分析(BIA)のような技術を含む、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイされうる(実施例4参照)。修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの、免疫細胞の増殖性応答を阻害する能力は、米国特許出願第10/820,559号に記載されているように、増殖性アッセイ法を用いて評価されうる(実施例5参照)。
【００３７】
上記の特徴をもついくつかの修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、上記アッセイ法で候補をスクリーニングすることにより、参照により本明細書に組み入れられている米国特許出願第10/820,559号において同定されている。一つの態様において、非タンパク質ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)は、少なくともアミノ酸残基38位、102位、および/または104位に結合している。
【００３８】
発現後ポリペプチドの正しい折り畳みを可能にするアミノ酸置換の特定部位の選択もまた、本発明に内在している。修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4およびIL-13に結合し、親和性喪失は、IL-4RAのそれと比較して最高10倍まである。修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4およびIL-13媒介性活性を阻害し、効力の喪失は、IL-4RAのそれと比較して最高10倍まである。加えて、修飾IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、非修飾IL-4RAより少なくとも2〜10倍多い血漿中の半減期を有する。
【００３９】
上記のポリペプチド変種は、本明細書において特許請求される方法に用いられうる修飾ヒトIL-4ポリペプチドの型の例証であるが、本発明により具現されうる、特許請求される発明のバリエーションの型を網羅するものではない。特許請求の範囲の基準に合う上記ポリペプチドの誘導体もまた考慮されるべきである。ポリペプチドおよびそれらの機能性断片のすべては、本明細書および実施例に教示された方法に従って効力についてスクリーニングされうる。
【００４０】
本発明の一つの好ましい態様において、「mhIL-4」と名付けられた修飾ヒトIL-4ムテインアンタゴニストが提供される。mhIL-4およびその誘導体は、組換え技術での使用において一般的な、幅広い種類の宿主細胞において達成される。mhIL-4の組換え産生に適した宿主細胞は、当業者に公知であり、大腸菌(E. coli)、バチルス(Bacillus)、もしくはシュードモナス(Pseudomonas)の菌株のような原核細胞(Kung, H.-F., M. Boublik, V. Manne, S. Yamazaki and E. Garcia, Curr. Topics in Cell. Reg. 26:531-542, 1995)、または酵母サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような単細胞の真核細胞(Bemis, L.T., F.J. Geske and R. Strange, Methods Cell Biol., 46:139-151, 1995)を含む。組換え産生のための宿主細胞はまた、昆虫(ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞)(Altmann F., E. Staudacher, IB Wilson, and L. Marz, Glycoconj J., 16:109-123, 1999)のような無脊椎動物、ならびにマウス線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO/-DHFR)(Urlaub and Chasin, Proc Nat Acad Sci 77:4216, 1980)、ベビーハムスター腎臓(9BHK, ATCC CCL 10)；SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7, ATCC CRL 1651)、およびヒト胚腎臓細胞株293(Tartaglia et al., Proc Nat Acad Sci 88:9292-9296, 1991およびPennica et al., J. Biol. Chem. 267:21172-21178, 1992)を含む多数の哺乳動物細胞株を含む脊椎動物細胞を含む多細胞真核生物由来でありうる。
【００４１】
細菌および酵母は、mhIL-4を含む多くの組換えポリペプチドのための標準的な組換え宿主細胞であるが、最近、抗体(Hiatt, A.T. and J.K. Ma, Int. Rev. Immunol., 10:139-152, 1993)およびヘモグロビン(Theisen, M., Chemicals Via Higher Plant Bioengineering, F. Shahidi et al., eds, Plenum PUblishers, NY. p. 211-220, 1999)のようなヒト組換えタンパク質を発現するための高等植物由来の形質転換細胞。植物バイオテクノロジーは、異種性ポリペプチドの効率的な産生について多くの利点を与え、このアプローチは、mhIL-4およびその誘導体を含む本明細書に記載された修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストの産生に有用でありうる(Plant Technology: New Products and Applications, John Hammond, et al., eds., Springer, N.Y., 1999も参照)。宿主細胞の適切な選択は、モノマーSP-B1-15の正確な発現、処理、および回収のために効率的で、かつ必要とされるものにより決定される。
【００４２】
本発明の一つの好ましい態様において、皮膚炎に関連した症状を改善させるために、mhIL-4を含む修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストの治療的有効量を被験体に投与する方法が提供される(実施例1参照)。mhIL-4をカニクイザルに投与する研究により、ヒスタミン、PBS、およびブタ回虫(Ascaris suum)を含む様々な抗原に曝露され、かつ約1mg/kgのmhIL-4を週に3回、16週間、皮下に(sc)受けた動物(実施例1参照)は、皮膚検査およびIgEのレベルの低下により測定される、第8週目までの膨疹発赤応答が低減することが示された(図1〜5参照)。研究を通じて、ヒスタミンまたはPBSの皮内注射に対する膨疹発赤応答においても有意な変化がなかった(図1および2参照)。しかしながら、mhIL-4を受けたそれらの動物において、第12週目以降、膨疹発赤応答の再発があった。膨疹発赤応答の再発は、インビボでの活性または保護の喪失を示唆し、mhIL-4に結合し、かつmhIL-4がその受容体に結合するのを妨げる阻害性物質または阻害剤による可能性が高い(図6参照)。データは、活性の喪失がIgEレベルにおける増加によりほぼ同時、すなわち約第12週目に観察されるため、阻害性物質が抗体であることを示唆している(図4参照)。それゆえに、膨疹発赤応答の再発は、mhIL-4がヒト組換えタンパク質(すなわち、ヒトIL-4)由来であるため、種依存性効果でありうる。つまり、ヒト由来タンパク質の非ヒト被験体への全身的または局所的、例えば、皮下注射は、サル研究において観察される、より高い免疫応答を生じうる。
【００４３】
もう一つの態様において、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎に関連した症状を改善させるために、mhIL-4を含む修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストの治療的有効量をヒト被験体に投与する方法が提供される。一つの好ましい態様において、約25mg、すなわち約0.4mg/kgが全身的に、または局所的に、好ましくは皮下に、1日に1回、約28日間、すなわち約4週間まで、投与される。免疫応答は、サル研究と同様に、投薬の完了前および後に、現存する皮膚炎およびIgEの血漿中レベルの観察を毎日行うことによりモニターされる。サル研究と同様に、適切な対照が行われ、従って、一部の患者は薬物を受けない。薬物を受ける患者において、サル研究と比較して免疫応答において著しい低下があることが予想される。免疫応答の低下があれば、患者は薬物、すなわちmhIL-4を取りやめ、寛解の長さについてモニターされる。従って、mhIL-4のこれらの患者への投与は、初期および/または潜在性免疫応答を低下または排除することが予想される。
【００４４】
また、アンタゴニストに対する抗体はより少ないと予想されるため、mhIL-4のヒト被験体への投与は免疫応答の低下を引き起こすはずである。mhIL-4およびそのエピトープに対するより少ない抗体は、mhIL-4に結合する阻害性物質または阻害剤がより少ないことを含意する。mhIL-4へ直接的または間接的に結合する、より少ない阻害性物質または阻害剤は、薬物がIL-4受容体に結合し、それに従って、IL-4およびIL-13誘導性応答を阻害することを可能にし、下流事象のカスケード、例えば、免疫応答に関与する様々なインターロイキン、ケモカイン、および化学誘引物質の放出を不活性化する。
【００４５】
本発明は様々な投与量を記載するが、処置を必要としている任意の特定の被験体についての特定の用量レベルおよび投薬の頻度は多様であり、様々な要因に依存することが当業者には理解されよう。これらの要因には、特定のポリペプチドもしくはその機能性断片の活性、その化合物の代謝的安定性および作用の長さ、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、混合薬、特定の状態の重症度、ならびに宿主が受けている治療が含まれる。しかしながら、一般的に、投与量は、特定の化合物の投与の公知の方法として典型的であるものに近づける。例えば、mhIL-4の投与について、適切な投与量は、ヒト被験体へ約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、またはそれ以上であり、非ヒト、すなわち動物被験体へ約1mg/kgである。もう一つの好ましい態様において、mhIL-4のヒト被験体への皮下投与について、適切な量は、より多く約0.4mg/kgでありうる。それゆえに、適切な量は、当業者によって、本明細書に提供されたもののような日常的手順を用いて、決定されうる(実施例1参照)。
【００４６】
本発明の組成物および製剤は、全身的または局所的に投与されうる。局所組成物の形態は、エアゾール(例えば、噴霧、乾燥粉末または定量吸入)、ドロップ、スプレー、クリーム、および軟膏からなる群より選択されうる。また、形態に応じて、組成物は、膨潤粘膜接着性粒子、pH感受性微粒子、ナノ粒子/ラテックス系、イオン交換樹脂ならびに他のポリマーゲルおよびポリマー剤を含む他の担体物質を含みうる(Ocusert, Alza Corp., California; Joshi, A., S. Ping and K.J. Himmelstein, 特許出願WO 91/19481)。これらの作用物質および系は、流出および非生産的薬物損失を防いで、吸収面との長時間薬物接触を維持する。
【００４７】
本発明の組成物はまた、修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストを遅延放出形態とする製剤を有する。遅延放出性をもつ調製物の適した例は、例えば、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーからなる半透性マトリックスである；これらのマトリックスは成形品、例えば、フィルム錠剤またはマイクロカプセルである。遅延放出性をもつマトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル[例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)--Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981]およびLanger, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]により記載されている--またはポリ(ビニルアルコール)]、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタミン酸のコポリマー(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 [1983])、非分解性エチレン/酢酸ビニル(Langer et al., loc. sit.)、Lupron DepotTM(乳酸/グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能ミクロスフェア)のような分解性乳酸/グリコール酸コポリマー、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)である。エチレン/酢酸ビニルおよび乳酸/グリコール酸のようなポリマーは、分子が100日間より長い期間、放出されるのを可能にするが、いくつかのヒドロゲルの場合、タンパク質は比較的短い期間に渡って放出される。カプセル化タンパク質が比較的長い期間、身体に残存する場合には、それらは、その後、37℃において湿気により変性または凝集され、結果として生物活性が喪失し、免疫原性が変化する可能性がある。タンパク質を安定化させるための重要なストラテジーは、含まれる機構に依存して開発されうる。例えば、凝集へ導く機構が、チオジスルフィド交換の結果としての分子間S-S架橋形成に基づいていることが見出された場合には、安定化は、メルカプト基ラジカルを修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含水率を調節すること、適した添加剤を用いること、および特別なポリマー/マトリックス組成物を開発することにより達成されうる。
【００４８】
遅延放出性を示す本発明の製剤はまた、リポソームに封入される修飾ヒトIL-4受容体アンタゴニストを含む。IL-4アンタゴニスト含有リポソームは、それ自体が公知である方法：DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 日本特許出願第83-118008号; 米国特許第4,485,045号および第4,544,545号；ならびにまたEP 102,324、により調製される。通例、リポソームは、約30mol%コレステロールより多い脂質含量を有する小さな(約200〜800オングストローム)単層型であり、各場合における割合は最適なIL-4アンタゴニストについて調整される。延長された循環時間を示すリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
【００４９】
遺伝子治療適用における本発明のIL-4ムテインをコードするDNA配列の使用もまた企図されている。企図される遺伝子治療適用は、IL-4がその免疫調節性活性による効果的な治療を提供することが期待される疾患、例えば、多発性硬化症(MS)、インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、ブドウ膜炎、精巣炎、原発性胆汁性肝硬変、マラリア、ハンセン病、ライム病、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、B細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、癌、変形性関節症、およびIL-4またはIL-4媒介性免疫応答に感受性のある感染物質に対して他の様式で応答性である疾患、の処置を含む。
【００５０】
遺伝子治療を用いるIL-4ムテインの局所送達は、治療剤を標的領域へ供給しうる。インビトロおよびインビボの遺伝子治療方法の両方が企図される。潜在的治療遺伝子を定義済みの細胞集団へ移入するためのいくつかの方法は公知である。例えば、Mulligan, 「The Basic Science Of Gene Therapy」, Science, 260:926-31 (1993)参照。これらの方法は以下を含む：
1)直接的遺伝子移入
例えば、Wolff et al, 「Direct Gene Transfer Into Mouse Muscle In Vivo」, Science 247:1465-68 (1990)参照；
2)リポソーム媒介性DNA移入
例えば、Caplen et al., 「Liposome-mediated CFTR Gene Transfer To The Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis」, Nature Med. 3:39-46 (1995); Crystal, 「The Gene As A Drug」, Nature Med. 1:15-17 (1995); Gao and Huang, 「A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection Of Mammalian Cells」, Biochem. Biophys. Res. Comm., 179:280-85 (1991)参照；
3)レトロウイルス媒介性DNA移入
例えば、Kay et al., 「In Vivo Gene Therapy Of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs」, Science, 262:117-19 (1993); Anderson, 「Human Gene Therapy」, Science 256:808-13 (1992)参照；
4)DNAウイルス媒介性DNA移入
そのようなDNAウイルスには、アデノウイルス(好ましくは、Ad-2またはAd-5に基づいたベクター)、ヘルペスウイルス(好ましくは、単純ヘルペスウイルスに基づいたベクター)、およびパルボウイルス(好ましくは、「欠陥」または非自律性パルボウイルスに基づいたベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスに基づいたベクター、最も好ましくはAAV-2に基づいたベクター)が含まれる。例えば、Ali et al., 「The Use Of DNA Viruses As Vectors For Gene Therapy」, Gene Therapy, 1:367-84 (1994); 参照により本明細書に組み入れられている米国特許第4,797,368号、および参照により本明細書に組み入れられている米国特許第5,139,941号参照。
【００５１】
対象となる遺伝子を移入するための特定のベクター系の選択は、様々な要因に依存する。一つの重要な要因は、標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは広く研究されており、いくつかの遺伝子治療適用に用いられているが、これらのベクターは、一般的に、非分裂細胞を感染させるのに適していない。加えて、レトロウイルスは発癌性の可能性を有する。
【００５２】
アデノウイルスは、広い宿主域をもつ、ニューロンもしくは肝細胞のような静止細胞または最終分化細胞に感染できる、および本質的に非発癌性と考えられるという利点を有する。例えば、Ali et al., 前記を参照。アデノウイルスは、宿主ゲノムへ組み込まれないように考えられる。それらは染色体外に存在するため、挿入性突然変異誘発のリスクは大いに低減される。Ali et al., 前記, p.373。
【００５３】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスに基づいたベクターと類似した利点を示す。しかしながら、AAVは、ヒト第19染色体上に部位特異的組み込みを示す。Ali et al., 前記, p.373。
【００５４】
この態様により、本発明のIL-4ムテインをコードするDNAを用いる遺伝子治療は、診断と同時に、または診断後すぐに、それを必要としている患者に提供される。
【００５５】
このアプローチは、望ましくない自己免疫刺激を防ぐために本発明のIL-4ムテインの選択的活性を利用する。当業者は、IL-4ムテインDNAを含む任意の適した遺伝子治療ベクターがこの態様に従って用いられうることを認識する。そのようなベクターを構築するための技術は当技術分野において公知である。
【００５６】
本発明は、以下の実施例において、より具体的に記載されているが、それらの実施例は、そこでの多数の改変およびバリエーションが当業者に明らかであるため、例証としてのみ意図される。以下の実施例は、本発明を例証することを意図しており、本発明を制限するものではない。
【００５７】
実施例1
mhIL-4アンタゴニストはサルにおいて抗原誘発性皮膚応答の一過性阻害を引き起こす
材料および方法
この研究に用いた動物は、体重が約5.0〜約8.0kgである成体雄カニクイザル(Macaca fascicularis)である。すべての動物は、寄生線虫であるブタ回虫(Ascaris suum)に対する自然発生的皮膚感受性を示した。各動物を個々に目の粗いメッシュの追い込みケージで飼育し、食物を毎日与え、水は自由に飲めるようにした。部屋の温度および湿度は、それぞれ22℃および75%で一定に保ち、12時間明暗サイクルを6:00 amから始めて課した。すべての動物を研究の約12時間前に絶食させた。各研究について、すべての動物を、塩酸ケタミン(7.0mg/kg, i.m.; Ketaset, Fort Dodge, IA)およびキシラジン(1.2mg/kg, i.m.; Bayer Corp., Elkart, IN)で、ならびに必要に応じてケタミンのみ(5mg/kg, i.m.)を追加して、麻酔した。
【００５８】
以前にmhIL-4への曝露歴をもたない8匹のカニクイザルを、mhIL-4のブタ回虫誘発性膨疹発赤反応への効果を研究するために用いた。サル腹部および胸部へ、最初に、ヒスタミン(0.25mg/mL)、リン酸緩衝食塩水(PBS)、およびブタ回虫(10-3、10-5、10-7μg/mL)を注射した(40μL、i.d.)。その後、4匹のサルは、mhIL-4を1mg/kg、週3回、12週間、皮下に受け、残りの4匹の動物は、同じ投与計画でPBSを受けた。膨疹発赤応答および臨床スコア(1.0 無反応、1.5 ピンク色および隆起、ならびに2.0 赤色および隆起)を、mhIL-4の投与前に、およびすべての攻撃注射後すぐに、ならびに再び、注射から15〜20分後に、測定した。すべての8匹の動物に対して、隔週で皮膚検査(膨疹サイズの測定)を行った。研究は5ヶ月間に及んだ。Bayer CorporationにおけるInstitute for Animal Care and Use Committeeはプロトコール(#96-230)を承認した。
【００５９】
ベースライン応答は、mhIL-4での投薬の前に処置群におけるすべての動物において0週目および2週目に皮膚検査を行うことにより確立された。投薬は2週目に始まり、週3回、12週間、継続した。すべての動物は、各皮膚検査の前に、IgEおよびT細胞活性化分析のために採血された(4.5mL)。すべての皮膚検査および採血は、前の投薬から少なくとも72時間後であった。
【００６０】
抗原の注射
注射前に、胸部および腹部領域を、70%エチルアルコールで清潔にし、剪毛した。40μLの抗原(10-3、10-5、10-7μg/mL)ブタ回虫抽出物(Greer Labs. Inc., Lenoir, NC)、PBS(Gibco BRL, Grand Island, NY)、およびヒスタミン二塩酸塩(0.25mg/mL, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)をその後、各動物に投与した。すべての溶液は、試験が行われるその日に新鮮に調製された。ブタ回虫は、10-1μg/mL(Greer Labs)原液から段階的にPBS中で1:100に希釈され、ヒスタミンは、10mg(Sigma Labs, H-7250)を40mL PBSへ加え、その後、さらにPBS中で1:10に希釈することにより作製された。
【００６１】
膨疹発赤および臨床スコアの測定
膨疹発赤応答は、各動物について2つの時点、最終注射から0分後および15〜20分後に垂直軸にノギスを用いて測定された。1.0(PBS)、1.5(ピンク色および隆起)、または2.0(赤色および隆起)の臨床スコアが、各動物の注射後すぐに、および15〜20分間目に、割り当てられた。図1〜4は、これらの型の測定を示す代表的なグラフである(臨床スコア有りおよび無し)。
【００６２】
誘発された皮膚膨疹発赤応答
臨床スコア無しのデータ(mm2での面積)の要約(図1および3)は、皮下注射後すぐに取られた最初の面積測定を、15〜20分後に取られた二番目の面積測定から引き算することにより決定された。各群からの値の平均をとり、標準偏差およびSEMを計算した。これらの面積に最終値を決定する前に臨床スコアを掛けることを除いて、同じ方法を臨床スコア有りのデータを計算するために用いた(図2および4)。
【００６３】
血漿表面共鳴(Biacoreアッセイ法)
mhIL-4のIL-4受容体-αへの結合は、BIAcore 2000装置(Biacore, Inc., Piscataway NJ)を用いて表面プラズモン共鳴によりモニターされた。NTAチップを、100mM NiCl2(Sigma, St. Louis, MO)の溶液を10μL/minの流速で3分間、注入することによりNi2+で荷電させた。合計180〜200共鳴単位(RU)が結合した。Hisタグ付き可溶性IL-4受容体を、5mM EDTAおよび0.005%界面活性剤P-20を含むHBS緩衝液(Biacore, Inc.)で100ng/mlに希釈し、5μL/minの流速を用いて6分間、注入した。結果として生じたRU増加は、IL4Rの1ng/mm2または270mMの表面濃度に対応する、800〜1000の範囲であった。カニクイザル血漿試料を、HBS緩衝液に1:5希釈し、mhIL-4の0ng(対照)または100ngのいずれかでスパイクし、捕捉されたIL-4Rを含むチップ表面上へ10μL/minで5分間、注入した。表面再生は、各結合実験後、10μL/minでの20μLの500mM EDTA(Sigma)で、続いて、20μLの0.1%SDS(Sigma)で達成された。図6はこの型のアッセイ法を表す。
【００６４】
結果
mhIL-4での処置は、膨疹応答のサイズから示されているように、より低いブタ回虫濃度(10-5および10-7)について抗原誘発性皮膚応答の、全面的だが一過性の阻害を引き起こした(図3および図4ならびに表Iおよび表II参照)。図3および図4ならびに表Iおよび表IIは、皮膚応答における低下は、研究の8週間目で(すなわち、処置の6週間後)明らかになり、10週間目でピークに達した(ブタ回虫の全用量において6週間目に対してp<0.05)ことを示している。しかしながら、mhIL-4での継続的処置にも関わらず、皮膚抗原注射に対する膨疹応答は、ベースライン(未処置)レベルへ戻った。ヒスタミンは、非抗原刺激の陽性対照として用いられた。
【００６５】
これは、mhIL-4の代わりにPBS注射を受けた対照動物と比較される(図1および図2ならびに表Iおよび表II参照)。図1および図2ならびに表Iおよび表IIは、ブタ回虫のすべての用量およびヒスタミンに対して一定の反応があることを示している。PBSデータは陰性対照としてベースライン応答を示した。図2は、すべての投与された化合物(PBS、ブタ回虫、およびヒスタミン)に対する類似した応答を示すが、値は、臨床スコア因子により増加する(材料および方法参照)。要約すると、媒体対照試験は、PBSでの継続的処置が、研究を通して抗原誘発性皮膚膨疹応答に効果を生じなかったことを実証している(図1および2参照)。
【００６６】
(表Ｉ)  膨疹応答測定の要約
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【００６７】
(表ＩＩ)  個々の動物データ(0〜6週目)
2008543873.tif 000003
【００６８】
(表ＩＩ)  個々の動物データ(8〜14週目)
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【００６９】
ELISA方法を用いる血漿特異的IgEレベルの分析は、皮膚膨疹応答に観察された低下と類似する4分の1への低下を示した(図5参照)。mhIL-4は組換えヒトタンパク質であり、それゆえに、薬物の複数回投与はサルにおいて免疫原性応答を引き起こした。mhIL-4のその受容体への結合を、血漿プラズモン表面共鳴を用いてモニターした(図6参照)。図6は、プラズモン共鳴単位における著しい低下が10週間目に生じたことを示し、それ以後のmhIL-4のIL-4受容体への結合の阻害を示唆している。これらの研究はまた、膨疹応答および血漿IgEのレベルの両方に観察されたmhIL-4の活性の喪失が、中和抗体の産生の結果でありうることを示唆している。
【００７０】
この研究の結果は、mhIL-4の反復投与が、カニクイザルにおいて、有意に循環IgEレベルを低下させ、かつ抗原誘発性皮膚膨疹発赤応答を阻害することを実証している。同様の、かつより甚大な結果がヒト臨床試験について予想される。
【００７１】
本過程は上記実施例においてその特定の態様の具体的な詳細に関して記載されているが、改変およびバリエーションが本発明の精神および範囲内に含まれることは理解される。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】媒体対照(PBS)処置後の臨床スコア無しの膨疹応答測定を示すグラフである。
【図２】媒体対照(PBS)処置後の臨床スコア有りの膨疹応答測定を示すグラフである。
【図３】変異型IL-4(mhIL-4)処置(1mg/kg、sid s.c. 3回/週)後の臨床スコア無しの膨疹応答測定を示すグラフである。
【図４】mhIL-4処置(1mg/kg、sid s.c. 3回/週)後の臨床スコア有りの膨疹応答測定を示すグラフである。
【図５】mhIL-4処置(1mg/kg、sid s.c. 3回/週)後の膨疹応答測定およびIgEの血漿中レベルを示すグラフである。
【図６】mhIL-4処置(1mg/kg、sid s.c. 3回/週)後の表面プラズモン共鳴単位におけるIL-4のIL-4受容体αへの結合の変化を示すグラフである。
【図７】成熟野生型ヒトIL-4のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)である。ヘリックスに下線を引き、連続的にA、B、C、およびDと名称を付けている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において皮膚炎応答を抑制または阻害するための方法であって、方法が、それを必要としている被験体に、ヒトIL-4ムテインまたはその機能性断片の治療的有効量を投与する段階を含み、ムテインが、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別のアミノ酸で置換する、少なくとも第一の修飾を含む、方法。
【請求項２】
治療的有効量が1日あたり約0.2mg/kgから約1.0mg/kgまたは1日あたり約0.3mg/kgから約0.6mg/kgである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、および/またはムテインの非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される第2の修飾をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
N末端の修飾がメチオニンの欠失または挿入である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
非タンパク質ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項６】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位、102位、および/または104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項5記載の方法。
【請求項７】
非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールPEGである、請求項3、5または6記載の方法。
【請求項８】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DまたはR121Eを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124DまたはY124Eを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125DまたはS125Eを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DおよびY124Dを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121D、Y124D、およびS125Dを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
N末端の修飾が+2位におけるアミノ酸残基の挿入である、請求項3記載の方法。
【請求項１４】
皮膚炎がアレルギー性反応、アトピー性反応、または過敏性反応である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
過敏性反応が接触性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
被験体がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
アトピー性皮膚炎を有する被験体を処置するための方法であって、方法が、アトピー性皮膚炎を有する被験体に、ヒトIL-4ムテインを含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含み、ムテインが、野生型ヒトIL-4タンパク質において121位、124位、および/または125位に存在するアミノ酸の1つまたは複数を別の天然アミノ酸で置換する第一の修飾を含む、方法。
【請求項１８】
ムテインが、N末端、C末端における修飾、その中の潜在的グリコシル化部位の欠失、およびムテインの非タンパク質ポリマーへの結合からなる群より選択される第二の修飾をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
治療的有効量が1日あたり約0.2mg/kgから約1.0mg/kgまたは1日あたり約0.3mg/kgから約0.6mg/kgである、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】
被験体がヒトである、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
非タンパク質ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシアルキレンからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
ヒトIL-4ムテインがアミノ酸残基38位、102位、および/または104位で非タンパク質ポリマーに結合している、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
非タンパク質ポリマーがポリエチレングリコールPEGである、請求項18、21または22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DまたはR121Eを含む、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換Y124DまたはY124Eを含む、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換S125DまたはS125Eを含む、請求項17記載の方法。
【請求項２７】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121DおよびY124Dを含む、請求項17記載の方法。
【請求項２８】
ヒトIL-4ムテイン修飾が置換R121D、Y124D、およびS125Dを含む、請求項17記載の方法。
【請求項２９】
N末端の修飾がメチオニンの欠失または挿入である、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
N末端の修飾が+2位におけるアミノ酸残基の挿入である、請求項18記載の方法。
【国際調査報告】
2008543873.tif 000013
2008543873.tif 000014