(57)【要約】  本発明は、植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸であって、この核酸が、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のコード領域の５′末端から下流にＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のＮＢＳドメインの開始点までにわたるＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子の限定された部分を有し、その際、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子はＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子でないことを特徴とする、植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸に関する。
2008541739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸であって、この核酸が、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のコード領域の５′末端から下流にＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のＮＢＳドメインの開始点までにわたるＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子の限定された部分を有し、その際、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子はＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子でないことを特徴とする、植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸。
【請求項２】
配列モチーフＤＡＥを有するアミノ酸配列をコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列モチーフＡＶＬＸＤＡＥを有するアミノ酸配列をコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項４】
以下の群：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列
からのヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の核酸。
【請求項５】
ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子が、サトウダイコンからの耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項１記載の核酸。
【請求項６】
次の群：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５
から選択された配列を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項７】
ａ）病原体誘導可能なプロモーター並びに
ｂ）前記プロモーターの制御下にある、請求項１から６までのいずれか１項記載の核酸
を有する植物での病原体に対する耐性の産生のための核酸コンストラクト。
【請求項８】
病原体誘導可能なプロモーターが合成プロモーターであることを特徴とする、請求項７記載の核酸コンストラクト。
【請求項９】
合成プロモーターが、以下のシス要素組み合わせ：
ａ）ｎｘＳ−ｍｘＤ−ボックス
ｂ）ｎｘＷ２−ｍｘＤ−ボックス
ｃ）ｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤ−ボックス
（その際ｎ及びｍは、１〜１０の自然数を意味する）
を１個又は複数個含有することを特徴とする、請求項８記載の核酸コンストラクト。
【請求項１０】
シス要素組み合わせ
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のヌクレオチド配列、又は
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列、又は
ｄ）比較可能な特性を有する、ａ）〜ｃ）によるヌクレオチド配列の誘導体
を含有することを特徴とする、請求項９記載の核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１から６までのいずれか１項記載の核酸又は請求項７から１０までのいずれか１項記載の核酸コンストラクトを有する形質転換植物。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換植物の部分。
【請求項１３】
請求項１１記載の形質転換植物の種子又は種物。
【請求項１４】
請求項１から６までのいずれか１項記載の核酸又は請求項７から１０までのいずれか１項記載の核酸コンストラクトの、形質転換植物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物での病原体に対する耐性の産生のための自己活性化した耐性タンパク質をコードする核酸、前記核酸の形質転換植物の製造のための使用並びに形質転換植物に関する。
【０００２】
菌類、ウィルス、線虫及び細菌により引き起こされる植物の病気は、世界中で、多大な収穫損失を引き起こし、収穫産物の品質を損ない、化学的な植物保護剤の手間のかかる使用を必要とし、というのも、多数の可能性のある疾病の病原体を忌避するか、その伝播を遅延かつ制限することができるこの植物の天然の防御手段は、しばしば十分でないからである。この防御手段には、過敏感反応、感染部位での宿主組織の制御された細胞死、木質化及びカロース形成による植物細胞壁の強化、フィトアレキシンの形成及びＰＲ（感染特異的）タンパク質の産生が属する。誘導された防御手段の活性化のための鍵となる分子は、植物の耐性遺伝子（Ｒ遺伝子）である。活発な（Flohrsch）遺伝子−遺伝子−仮説に応じて、Ｒ遺伝子のタンパク質は、微生物の非病原性遺伝子（Ａｖｒ遺伝子）の相応する遺伝子と相互作用し、これにより誘導される防御反応を作動させる。
【０００３】
多数のＲ遺伝子は、この遺伝子によりコードされるＲタンパク質の構成に応じて、５つのクラスに分類されることができる（Martin et al, 2003）。クラス１は、セリン／トレオニンキナーゼをコードするトマトのＰｔｏ遺伝子のみを含有する。植物のＲ遺伝子の多数はしかしながら、「ヌクレオチド結合部位（nucleotide binding site）」（ＮＢＳ）及び「ロイシンリッチ繰り返し（Leucine rich repeat）」（ＬＲＲ）をコードするＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子のスーパーファミリーに属する。Ｎ末端で、「コイルドコイル（coiled coil）構造」（ＣＣ）、例えば「ロイシンジッパー」を有するＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子は、クラス２のＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子として割り当てられる。ＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲタイプのＲ遺伝子は、全ての被子植物中に見出される。クラス３には、ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲタイプのＲ遺伝子が属し、これは、Ｎ末端でＣＣドメインの代わりに、動物のＴＩＲ領域にホモロジーを有する配列（「ｔｏｌｌ−インターロイキン−１−レセプター（toll-interleukin-1-receptor）」）を有する。ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）中のＲ遺伝子の７５％を構成し、しかしながら、草中でもそしてサトウダイコン中でも見出されない（Tian et al., 2004）。
【０００４】
トマトのＣｆ遺伝子は、Ｒ遺伝子の第４クラスを形成する。ＣＦタンパク質はＮＢＳドメインを有しないが、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）及び細胞外ＬＲＲを有する。第５クラスには、イネからのＸａ２１−タンパク質が属し、これは細胞外ＬＬＲドメイン、膜貫通型ドメイン及び細胞内キナーゼドメインから構成されている。
【０００５】
Ｒ遺伝子が、Ｒ遺伝子プロモーターによって弱くのみ発現される一方で、クラス１、２及び３のＲ遺伝子の強力な構成的な発現は、植物の病原体防御の活性化を自体で、相応する非病原性産物の非存在下で生じ、これによりＲタンパク質の自己活性化を生じる（Tang et al., 1999; Oldroyd and Staskawicz, 1998; Bendahmane et al., 2002）。
【０００６】
一般的にはＲ遺伝子の構成的な過剰発現は、形質転換植物中ではしかしながら、農学的に不所望な特性、例えばマイクロネクローシス（Mikronekrose）（Tang et al., 1999）又は植物の制限された成長（Frost et al., 2004）に関連している。
【０００７】
クラス２及び３のＲタンパク質の自己活性化の更なる手段は、完全なＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲ−又はＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質中での特殊な、保存されたアミノ酸モチーフの突然変異生成である。ジャガイモのＲｘ遺伝子のＮＢＳドメイン又はＬＲＲドメイン中の配列の（Bendahmane et al., 2002）、そしてアマのＬ６遺伝子のＮＢＳドメインの（Howles et al., 2005）突然変異生成は、相応する非病原性遺伝子の非存在下で一過的な発現の後に細胞死を作動させる突然変異体を生じる。
【０００８】
Ｒｘ遺伝子を用いた欠失実験は、ＣＣドメイン及びＮＢＳドメインの部分からなる欠失産物が、その一過的な過剰発現の後に、同様に、更に細胞死を作動させることができ、これは、完全長Ｒ遺伝子の使用の際に生じるよりもより迅速に生じることを示す。この欠失産物は、ＣＣドメインの他に、更にＮＢＳドメインのＰループ、キナーゼ２及び完全なキナーゼ３ａを必要とする。これに対して、ＮＢＳドメインの更なる短縮化は、完全長Ｒ遺伝子と比較して、より緩慢なＨＲ作動を生じた（Bendahmane et al. 2002）。
【０００９】
アマからのＬ１０遺伝子、クラス３のＲ遺伝子、の自己活性化は、短縮したＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質の形成により達成されることができ、これはＴＩＲドメイン及び隣接するＮＢＳドメインの３４アミノ酸から、Ｐループを含めてなる（Frost et al., 2004）。
【００１０】
Ｒ遺伝子の自己活性化の複数の方法が公知であるにもかかわらず、これまでには、Ｒタンパク質の自己活性化が、高められた菌類耐性を、農学的特性を同時に損なうことなしに生じる、形質転換植物は記載されていない。Ｌ６遺伝子の２つの自己活性化した完全長変異体をそのつど、天然のＬ６耐性遺伝子プロモーター又は菌類誘導されたプロモーターの制御下で、アマ中で安定にトランスフォーメーションする試みは、正常に成長する、菌類に抵抗性の少ない植物、又は、制限された成長の、菌類に耐性のある植物のいずれかを生じる（Howles et al., 2005）。
【００１１】
本発明の課題は従って、病原体に対する植物の防御能力を、病原体の攻撃の際の植物の防御反応が植物の農学的な特性を負に損なうことなく確実に活性化されるように変更することである。
【００１２】
本発明により、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のコード領域の５′末端から下流へＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のＮＢＳドメインの開始点までのびるＮＢＳ−ＬＲＲ−耐性遺伝子の限定された部分を有し、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子はＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子でない核酸により、課せられた課題の解決はなされる。このような核酸は、植物から単離されるか又は合成により製造される。
【００１３】
ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子の限定された部分は、翻訳のための開始コドン（ＡＴＧコドン）で開始し、かつ根本的にＰループ（キナーゼ１ａモチーフ）により特徴付けられるＮＢＳドメインまで達する。ＮＢＳ−ＬＲＲ−耐性遺伝子の本発明による部分の機能のためには、Ｐループは含有されないことが望ましい。同様に、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のＮＢＳドメイン及びＬＲＲドメインのその他の断片があまり存在しないことが望ましい。無論、Ｐループを含めたＮＢＳドメインの若干のヌクレオチドがまだなお残存することも、これらがＨＲの作動を損なわない限りは可能である。
【００１４】
自己活性化した耐性タンパク質とは、相応する非病原性遺伝子産物の非存在下で、植物の病原体の防御の活性化を生じるタンパク質が理解される。この点で本発明は、病原体に対する耐性の形成には、耐性タンパク質と非病原性タンパク質との間での相互作用を必要とせず、これにより、植物の防御反応は、実質的に、直接的に、そして最終的には確実に経過することができる点で利点を有する。
【００１５】
自己活性化は例えば、耐性遺伝子の一過的な過剰発現により達成されることができる。過剰発現とは、天然のＲ遺伝子プロモーターの発現強度を、Ｒタンパク質により制御されるシグナルトランスダクションカスケードを相応する微生物の非病原性遺伝子産物の非存在下で活性化する範囲内で上回ることを意味する。これにより、病原体防御の活性化が生じ、これは、部分的又は完全な疾病耐性に現れる。
【００１６】
耐性タンパク質の自己活性化はしかしながら、サトウダイコンの完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_165、BvKWS3_135、Bv13033及びBv12069並びにジャガイモのStR3a遺伝子の５′領域での短縮化によっても達成されることができ、これは場合によってはＣＣドメインを含めた、タンパク質のＮＢＳ−及びＬＲＲ−ドメイン不含のＮ末端のみをコードする。ＮＢＳドメイン不含のＮ末端はこの関連において、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のコード領域の５′末端が、ＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子のＰループはその有効な構造において含有されていない程度にのみ３′末端へとのびることを意味する。単純な場合には、Ｐループは完全に取り除かれている。しかしながら、ＨＲの作動が遅延化されない限りは、Ｐループの若干のヌクレオチドが短縮された耐性遺伝子中に残存することもできる。Ｎ末端でのＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子の短縮により、キナーゼ−２−、キナーゼ３−、ＧＬＰＣ−及びＭＨＤ−モチーフも、隣接アミノ酸を含めて、データバンクProsite (Bairoch et al., 1996)及びPfam (Sonnhammer et al., 1997)並びにBendahmane et al. (2002)で挙げられたモチーフ定義の情報に応じて除去される。
【００１７】
短縮したＲ遺伝子165_#176、135_#147、13033_#159及びBv12069及びStR3a-#1-155の使用は、完全長Ｒ遺伝子と比較して、細胞死のより迅速な作動を植物組織中で生じる。病原体誘発可能なプロモーターとの組み合わせにおいて、これにより、改善された、誘導された病原体防御がもたらされる。これは、ＭＨＤドメイン又はＶＨＤドメイン中での公知の突然変異生成によっては自己活性化されることはできないＲタンパク質に対してもあてはまり、例えば、遺伝子135_#147及びBvKWS3_135-D480Vの発現が示すとおりである。
【００１８】
完全長Ｒ遺伝子と比較した短縮したＲ遺伝子は顕著により早期に、細胞死を作動させることができるので、この短縮されたＲ遺伝子については、病原体防御のために臨界的なタンパク質濃度を達成するためにより少ない発現で十分であり、例えばＲ遺伝子135_#147について示されるとおりである。
【００１９】
Ｐループ又はキナーゼ１ａモチーフは、キナーゼ−２及びキナーゼ−３モチーフと一緒になって、ＡＴＰ又はＧＴＰ加水分解タンパク質に特徴的であり(Traut, 1994)、かつ、ＮＢＳ−ＬＲＲ遺伝子のＮＢＳドメイン中に見出される。ＰループはＮＢＳドメインのＮ末端領域を特徴付ける（Bendahmane et al., 2002）。Ｒ遺伝子Prf、Rx、Rpm1 、BvKWS3_135、BvKWS3_133及びBvKWS3_165のためのＰループのコンセンサス配列は、次のとおりである：(1/V)VG(M/I)GG(L/I/S)GKTT(L/V)。
【００２０】
意外にも、特に良好な自己活性化が、配列モチーフＤＡＥを有するアミノ酸配列をコードする核酸を用いて明らかになった。特に前記核酸は、配列モチーフＡＶＬＸＤＡＥをコードする。この配列モチーフＤＡＥ及びＡＶＬＸＤＡＥは、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及び１５中に見出される。
【００２１】
有利な核酸配列は、以下の群からの配列である：
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列と、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
このＮＢＳ−ＬＲＲ耐性遺伝子の限定された部分は、有利なヌクレオチド配列では、次のように及ぶ；
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、１２４−６５４位
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、１５５−５９８位
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、９４−５７３位
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、１９４−６９４位。
【００２２】
ここで使用される概念「ハイブリダイズする」は、通常の条件下、例えばSambrook et al. (1989)が記載している条件下で、有利にはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイズ条件は例えば、次のようである：４×ＳＳＣ中で６５℃でハイブリダイズ、引き続き６５℃で０．１×ＳＳＣ中で複数回の洗浄、全体として約１時間。あまりストリンジェントでない条件は例えば次のとおりである：４×ＳＳＣ中で３７℃でハイブリダイズ、引き続き１×ＳＳＣ中で室温で複数回の洗浄。「ストリンジェントなハイブリダイズ条件」は、次のことも意味できる：０．２５Ｍ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ中で６８℃で１６時間ハイブリダイズ、引き続き２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６８℃での２回の洗浄。
【００２３】
有利な様式では、自己活性化した耐性タンパク質をコードする耐性遺伝子は、サトウダイコン（Zuckerruebe）又はジャガイモに由来する。
【００２４】
更なる有利な様式においては、本発明による核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３〜１５によるコンセンサス配列の１つを有するアミノ酸配列をコードする。コンセンサス配列内で、機能的に等価のアミノ酸は、お互いに交換されることができ、例えばＡｓｐとＧｌｕとは、ＬｅｕとＩｌｅ、Ａｌａ又はＶａｌとは、ＡｒｇとＬｙｓとは、ＰｈｅとＴｒｐとは交換されることができる。
【００２５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３及び１４によるこの両方のコンセンサス配列は、２つの機能的ブロックであり、これは定めた間隔でなく互いに存在することができる。両方のブロックの間の有利な間隔は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５によるコンセンサス配列並びに図１０によるコンセンサス配列から生じる。
【００２６】
本発明による核酸は有利には、病原体誘導可能なプロモーターと組み合わせられる。病原体誘導可能なプロモーターは、宿主組織の感染に対する反応において、疾病刺激、例えば有害菌類（Schadpilz）、細菌、ウィルス、又は線虫により活性化される。病原体誘導可能なプロモーターは、試験されたか又は成功した、植物組織の感染の間に、感染されていない植物組織中と比較してより活性がある。
【００２７】
病原体誘導可能なプロモーターは当業者に基本的に公知である。病原体誘導可能なプロモーターのための例は、キチナーゼプロモーター（Samac and Shah 1991）、グルカナーゼプロモーター（Hennig et al., 1993）、及びｐｒｐ−１プロモーター（Martini et al., 1993）である。
【００２８】
Ｒ遺伝子の病原体誘導された過剰発現により、構成的な発現の負の結果、例えば制限された成長又は植物のより少ない収穫高が回避される。
【００２９】
合成プロモーターが特に適したプロモーターとして明らかになった。この際、分子生物学的な操作技術により作成されたプロモーターは、この設計においては天然で見出されないプロモーターである。合成のプロモーターは、最小プロモーター（Minimalpromotor）の他にまだなお１つ又は複数の選択された、定義されたシス要素を含有する最小限のプロモーター（minimalistischer Promotor）である。このシス要素は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば転写因子のための結合部位であり、かつ、天然のプロモーターから単離、既に単離されたシス要素から誘導、又は、偶然指向型の（zufallsorientiert）組み換え技術により技術的に産生、かつ適した方法により選択される。天然のプロモーターと比較して、合成プロモーターは、そのより低度に複雑な構造のために、わずかな外因性及び内因性の因子により活性化され、従って特異的に制御されている。
【００３０】
最小プロモーター又は「コア」プロモーターは、基礎となる転写因子複合体のための結合部位を含有し、かつ、転写の正確な開始をＲＮＡポリメラーゼＩＩにより可能にする核酸配列である。最小プロモーターの特徴的な配列モチーフは、ＴＡＴＡボックス、イニシエーター要素（Ｉｎｒ）、「ＴＦＢＩＩ認識要素」（ＢＲＥ）、及び、「下流のコアプロモーター要素」（ＤＰＥ）である。この要素は、最小プロモーター中で単独で又は組み合わせて存在することができる。この最小プロモーター又はその配列モチーフは、任意の植物性遺伝子又はウィルス遺伝子から入手される。
【００３１】
本発明の範囲内において、新規の合成のプロモーターが開発されていて、これは自体で、自己活性化耐性タンパク質を必ずしもコードしない公知の耐性遺伝子との関連において、病原体耐性植物の製造のために使用可能である。この際、プロモーターは、タイプｎｘＳ−ｍｘＤ最小プロモーター、ｎｘＷ２−ｍｘＤ最小プロモーター、及びｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤ最小プロモーターであり、この結果合成のプロモーターは以下のシス要素組み合わせの１個又は複数個を含有する；
ａ）ｎ×Ｓ−ｍ×Ｄ−ボックス（Box）
ｂ）ｎｘＷ２−ｍｘＤ−ボックス
ｃ）ｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤ−ボックス
（その際、ｎ及びｍは自然数１〜１０を意味する）。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列を有するＳボックス（CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド配列を有するＷ２ボックス（TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のヌクレオチド配列を有するＤボックス（TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のヌクレオチド配列を有するＧｓｔボックス（TTCTAGCCACCAGATTTGACCAAAC）は、Rushton et al.,.2002により、この機能のために重要な核となる配列を含めて記載される。
【００３３】
プロモーターは、要素の選択（ｎｘＳ−ｍｘＤ、ｎｘＷ２−ｍｘＤ又はｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤ）に応じて、その基礎活性、病原体誘導性、活性化キネティックス及びプロモーター強度において相違し、例えば、次のシス要素組み合わせを有するプロモーターについて示される；
ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０を有する２×Ｓ−２×Ｄ、
ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１を有する２×Ｗ２−２×Ｄ、及び
ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を有する２×Ｇｓｔ１−２×Ｄ。合成プロモーターの特性は更に、シス要素（ｎ、ｍ＝１〜１０）の数の変更により、遺伝子発現の要求に応じて変更される。プロモーター−２×Ｓ−２×Ｄと、変形２×Ｓ−４×Ｄ、４×Ｓ−２×Ｄ及び４×Ｓ−４×Ｄの比較は、平均的なプロモーター強度が、テトラマーの使用により、ダイマーから構成されたプロモーターと比較して高められることを示す。更に、ダイマー−ダイマープロモーター（２×Ｓ−２×Ｄ）の病原体誘導性は、テトラマー−ダイマー、及び、ダイマー−テトラマープロモーター（４×Ｓ−２×Ｄ、４×Ｓ−２×Ｄ）を越えて、テトラマー−テトラマープロモーター（４×Ｓ−４×Ｄ）にまで全ての測定点で上昇する。プロモーター強度及び病原体誘導性の上昇と並行して、記載された例の場合には、テトラマー含有プロモーターの基礎活性の向上も生じる。この例は、重要なプロモーター特性が、シス要素の数により制御され、かつ、そのつどの技術的な反応のために最適なプロモーター変形が作成かつ同定されることができることを示す。
【００３４】
相応する結果はしかしながら、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の誘導体であり、かつ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のシス要素組み合わせと同様の比較可能な特性を提供するシス要素組み合わせでも得られることができる。
【００３５】
プロモーター２×Ｓ−２×Ｄ−最小プロモーター及び２×Ｗ２−２×Ｄ−最小プロモーターは、例示的に、そのつど、４つの完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_133、BvKWS3_123、BvKWS3_135及び BvKWS3_165を組み合わせられ、かつサトウダイコン中でトランスフォーメーションされた。サトウダイコンの最も重要な有害菌類、Cercospora beticola（褐斑病）（葉の斑点の疾病の病原体）を用いたこの形質転換植物の菌類耐性試験は、そのつどのコンストラクトでもって改善された菌類耐性を生じ、その際この形質転換植物は、その成長又はその他の農学的な特性において、非形質転換植物とは相違しない。この結果は、病原体誘導可能なプロモーターの使用下で、細胞死を作動させるＲ遺伝子の過剰発現、従って改善された疾病耐性を、植物成長の負の影響は生じずに達成することが基本的に可能であることを示す。最適化されたプロモーターの使用により、有利な数のシス要素繰り返しの選択に応じて、疾病耐性はまた更に改善される。
【００３６】
本発明は同様に、新規の核酸コンストラクトを用いてトランスフォーメーションされた形質転換植物、特にサトウダイコン植物、そのような植物の部分並びに種子又は種物（Saatgut）、並びにこの新規の核酸コンストラクトの、形質転換植物の製造のための使用に関する。
【００３７】
本発明は以下に、図及び実施例に関連してより詳細に説明される。
【００３８】
サトウダイコンのために例示的に記載される本発明は、問題なしに、耐性遺伝子を単離することが可能なその他の利用植物にも転用される。
【００３９】
図
図１は、バイナリーベクターpER-35Sluciの地図を示し、このベクターを、Ｒ遺伝子の、アグロバクテリウム チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）媒介一過的発現のためにサトウダイコン葉中で使用した。このベクターは、フォチナス・フィラリス （Photinus pyralis）からの、イントロンにより中断されたルシフェラーゼ遺伝子を有し、これはＡ．チュメファシエンス中では発現されることができない。
【００４０】
図２は、アグロバクテリウム チュメファシエンスを介した、Ｒ遺伝子BvKWS3_133の一過的発現後のサトウダイコン葉中での細胞死の作動を示す。コンストラクトpER-35Sluciの一過的発現の間に、強力なレポーター遺伝子活性がダイコン葉中で生じる一方で、コンストラクトpER133-35Sluciの発現は細胞死を作動させ、この結果レポーター遺伝子活性は測定されることができない。
【００４１】
図３は、サトウダイコン葉の一過的な、遺伝子銃によるトランスフォーメーションのために使用したベクターpCaMV-2を示す。この完全長の及び短縮したＲ遺伝子は、記載されたように、このベクターの二重の３５Ｓプロモーターの制御下に配置される。
【００４２】
図４は、遺伝子銃によるトランスフォーメーションによるＲ遺伝子BvKWS3_123、BvKWS3_133及びBvKWS3_165の一過的発現後のサトウダイコン葉中での細胞死の作動を示す。この遺伝子BvKWS3_123、BvKWS3_133及びBvKWS3_165は、二重の３５Ｓプロモーター（ｄ３５Ｓ）の制御下にあり、かつこれをレポーター遺伝子コンストラクトp70S-lucと同時形質転換した。このレポーター遺伝子活性をトランスフォーメーション２０時間後に測定した。過敏感反応の作動により、レポーター遺伝子活性はコントロール（空ベクターpCaMV-2及びp70S-luc）と比較して減少した。コンストラクト１個につきそのつど９個の単独実験を有する、３回の独立した試験の繰り返しの平均値を示した。このエラーバーは、標準偏差を示す。
【００４３】
図５は、完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_165の発現と比較したＲ遺伝子BvKWS3_165の５′末端領域の発現による増強した細胞死作動を示す。このＮ末端領域及び完全長Ｒ遺伝子を、ｄ３５Ｓプロモーター（p70S-165_#175及びp70S-BvKWS3_165）の制御下で、コンストラクトp70S-lucと一緒に、遺伝子銃によるトランスフォーメーションによりサトウダイコン葉中に同時形質転換した。１コンストラクトにつきそのつど９〜１２個の単独実験を有する３回の独立した試験繰り返しの平均値を記載する。
【００４４】
図６は、完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_135の発現による細胞死作動及びこれと比較したＲ遺伝子BvKWS3_135の５′末端領域135_#147による増強された細胞死作動を示す。完全長Ｒ遺伝子及びＮ末端領域135_#147を、ｄ３５Ｓプロモーター（p70SBvKWS3_135及びp70S-135_#147）の制御下で、コンストラクトp70S-lucと一緒に遺伝子銃によるトランスフォーメーションによりサトウダイコン葉中で同時形質転換した。１コンストラクトにつきそのつど９〜１２個の単独実験を有する２回の独立した試験繰り返しの平均値を記載する。
【００４５】
図７は、完全長Ｒ遺伝子Bv13033の発現と比較したＲ遺伝子Bv13033の５′末端領域13033_#159の発現による増強した細胞死作動を示す。完全長Ｒ遺伝子及びＮ末端領域13033_#159を、ｄ３５Ｓプロモーター（p70S-13033及びp70S13033_#159）の制御下で、コンストラクトp70S-lucと一緒に遺伝子銃によるトランスフォーメーションによりサトウダイコン葉中で同時形質転換した。１コンストラクトにつきそのつど９〜１２個の単独実験を有する２回の独立した試験繰り返しの平均値を記載する。
【００４６】
図８は、Ｒ遺伝子Bv12069の発現による細胞死の作動を示す。
【００４７】
図９は、ＮＢＳドメインのＶＨＤモチーフの変異体と比較した、ｃＤＮＡクローン135_#147の５′領域での短縮化によるタンパク質BvKWS3_135の自己活性化を示す。
【００４８】
図１０ａ）〜ｃ）は、短縮した、自己活性化したタンパク質Bv12069、Bv13033_#159、BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175及びStR3a#1-155のアミノ酸配列の相互の比較並びに自己活性化されない短縮した、ジャガイモからの耐性タンパク質（RX-160）及びStR1（355-540）並びに、シロイナズナ（AtAB028617）、マメ（PvulgarisJ71）、イネ（OsativaAP003073）、ダイズ（GmaxKR4）及びトマト（Tomato-I2）からのＮＢＳ−ＬＲＲタイプの完全長Ｒタンパク質比較配列を示す。コンセンサス配列が強調されている。
【００４９】
図１１は、アミノ酸１４７〜１７５の欠失が、タンパク質165_#175の自己活性化能力を顕著に減少させることを示す。
【００５０】
図１２は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中での合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄの活性化を示す。
【００５１】
図１３は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中での合成プロモーター２×Ｗ２−２×Ｄの活性化を示す。
【００５２】
図１４は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中でのプロモーター２×Ｓ−２×Ｄ、４×Ｓ−２×Ｄ、２×Ｓ−４×Ｄ及び４×Ｓ−４×Ｄのレポーター遺伝子活性の比較を示す。
【００５３】
図１５及び１６は、完全長Ｒ遺伝子123、133、135、165と、合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄとの組み合わせを示す。
【００５４】
図１７及び１８は、完全長Ｒ遺伝子123、133、135、165と合成プロモーター２×Ｗ2−２×Ｄとの組み合わせを示す。
【００５５】
図１９は、形質転換していないコントロール3DC4156と比較した、有害菌類、褐斑病（Cercospora beticola）に対する形質転換サトウダイコン系列PR68-6の耐性向上を示す。
【００５６】
図２０は、形質転換していないコントロール3DC4156と比較と比較した、褐斑病に対する形質転換サトウダイコン系列PR70-32の耐性向上を示す。
【００５７】
図２１及び２２は、Ｒ遺伝子165_#176及び12069のＮ末端領域の、合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄ及び２×Ｗ2−２×Ｄとの組み合わせを示す。
【００５８】
実施例
遺伝子BvKWS3_133の過剰発現によるサトウダイコン葉中での迅速な耐性反応の作動の検出
アグロバクテリウム・チュメファシエンスによるサトウダイコン葉中での遺伝子BvKWS3_133の完全長ｃＤＮＡクローンの一過的過剰発現は、可視可能なネクローシス形成無しに迅速な細胞死を作動する。ｃＤＮＡクローンBvKWS3_133を、ｄ３５Ｓプロモーターと組み合わせ、そしてバイナリーベクターpER-35Sluci（図１）中に挿入した。この生じるベクターは、名称pER133-35Sluciを有する。このベクターpER-35Sluci及びpER133-35Sluciをアグロバクテリウム株C58C1中にトランスフォーメーションした（An 1987）。ポジティブアグロバクテリウムを、一過的発現のためにスペクチノマイシン１００ｍｇ／ｍｌ及びアセトシリンゴン２０μＭを有するＬＢ培地５０ｍｌ中で４〜５時間生育した。引き続き前記細菌を遠心分離し、この沈殿物を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＭＥＳ、１００μＭ  アセトシリンゴンの溶液中に取り込ませ、そして細菌密度ＯＤ600＝０．１に調整した。この細菌懸濁物を２〜３時間放置し、次いで２．５ｍｌシリンジを用いて、１０週齢のサトウダイコンの葉の裏側を介して葉中に注射した。２５℃でのインキュベーション後に、栽培棚中で、接種１、２及び３日間後に、フォチナス・フィラリス  ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を、前記のトランスフォーメーションした葉中で測定した。このために、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Mannheim, ドイツ国）を用いて、Sirius Luminometer中（Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, ドイツ国）で、製造指示に従って測定した。測定に適した酵素抽出物の獲得のために、測定点につきそのつど２つの葉円形部分（Blattrondelle）を打ち抜いた。コンストラクトにつき８つの測定点を、測定日１日につき得た。この葉の試料を、海砂（Seesand）の添加下で、１０倍の容積（ｖ／ｗ）のパッシブ溶解バッファー（Passive Lysis Buffer）（ＰＬＢ）を用いて、乳鉢中で均質化した。この液状の上清を、１．５ｍｌのエッペンドルフ容器中に移し、５分間４℃及び２００００ｇで遠心分離した。この透明な上清を取り出し、そのつど１０μｌの粗抽出物を、フォチナス  ルシフェラーゼ活性測定のために使用した。コントロールコンストラクトpER-35Sluciでトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉は、１日目に少なく、かつ２日目及び３日目に、ルシフェラーゼ活性１２４．０００又は１１６．０００ＲＬＵ／ｍｇ葉組織を示した。コンストラクトpER133-35Sluciでトランスフォーメーションしたダイコン葉は、全ての３つの測定点で活性を示さず、これは、ＭｇＣｌ2で接種された葉の活性と比較して高かった（図２）。従ってｃＤＮＡクローンBvKWS3_133の一過的発現は、極めて迅速な細胞死を接種されたダイコン葉中で作動させる。
【００５９】
Ｒ遺伝子BvKWS3_123、BvKWS3_133及びBvKWS3_165の構成的発現は、サトウダイコン葉中で細胞死を作動させる
Ｒ遺伝子BvKWS3_133並びにＲ遺伝子BvKWS3_165（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５によるヌクレオチド配列を有する）及びＲ遺伝子 BvKWS3_123を、ベクターpCaMV-2（図３）の二重の３５Ｓプロモーターと組み合わせた。この生じるベクターは、名称p70S-BvKWS3 _133、p70S-BvKWS3_165及びp70S-BvKWS3_123を有する。Ｒ遺伝子の機能性を試験すべく、コンストラクトp70S-BvKWS3_133、p70S-BvKWS3_165及びp70S-BvKWS3_123をレポーター遺伝子ベクターp70S-lucを用いてサトウダイコン葉中に、Schmidt et al., 2004に応じて、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより一過的に発現させた。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。標準化したベクターの使用は、Schmidt et al.(2004)からは逸脱して、断念した。このルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Mannheim, ドイツ国）を用いてトランスフォーメーション２０時間後に測定した。このトランスフォーメーション実験を３回繰り返し、そのつどの実験は１コンストラクトにつき９回の試験繰り返しを含んだ。３回の実験からの平均値の形成は、ポジティブコントロール（空ベクター）の１００％に設定したルシフェラーゼ活性に比較して、p70S-BvKWS3_133で３７．７％のみ、p70S-BvKWS3_165で６６％のみ、そしてp70S-BvKWS3_123で６８．７％のみのレポーター遺伝子活性を有した（図４）。Ｒ遺伝子BvKWS3_133、BvKWS3_165及びBvKWS3_123の強力な発現は、ｄ３５Ｓプロモーターにより細胞死又は過敏感反応を、トランスフォーメーションした細胞の部分中で作動し、これは同時形質転換したレポーター遺伝子ベクターの共発現を妨げた。これにより、３個のＲ遺伝子の強力な発現が、細胞死又はＨＲを、相応する非病原体遺伝子産物の非存在下で生じることを示した。
【００６０】
遺伝子BvKWS3 165の５′領域は、完全長ｃＤＮＡクローンBvKWS3 165よりも迅速な細胞死を作動させる
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に応じたヌクレオチド配列を有する完全長ｃＤＮＡクローンBvKWS3_165から出発して、コンストラクトp70SBvKWS3_165中で、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の５′領域を、プライマーＳ３１６（CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG）及びＳ３１８（CTGGATCCTCACCTCCGTTCTTCATGTTGCTCTACC）の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、BvKWS3_165のアミノ酸配列１〜１７５をコードする（図１０）。このアミノ酸配列は、BvKWS3_165のＮ末端領域のみを含み、そしてＮＢＳを含まずＬＲＲドメインも含まない（図１０）。このＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S165_#175を有する。コンストラクトp70S-BvKWS3_165及びp70S-165_#175の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる適性は、一過的な、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験された。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。空ベクター（pCaMV-2）のトランスフォーメーションとの比較において、p70S-BvKWS3_165によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の６５％、そしてp70S-165_#175によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の３８％のみを生じた（図５）。この結果は、１７５アミノ酸の大きさの165_#175のＮ末端の唯一の発現が、１０６６アミノ酸の大きさの完全長タンパク質BvKWS3_165の使用と比較して、細胞死のより強力な作動をトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中で生じることを示す。165_#175の発現により、BvKWS3_165の発現の場合におけるよりもより多くのトランスフォーメーションした葉細胞が壊死する。この相違のための原因は、Ｎ末端での短縮化による、Ｒタンパク質の自己活性化の新規の、より強力な形態である。
【００６１】
遺伝子BvKWS3_135の５′領域は、完全長ｃＤＮＡクローンBvKWS3_135と比較してより迅速な細胞死を作動する
完全長ｃＤＮＡ  BvKWS3_135から出発して、コンストラクトp70SBvKWS3_135中で、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の５′領域を、プライマーＳ３１６（CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG）及びＳ３３０（CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC）の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、BvKWS3_135のアミノ酸配列１〜１４７をコードする（図１０）。このアミノ酸配列は、BvKWS3_135のＮ末端領域のみを含み、そしてＮＢＳを含まずＬＲＲドメイン又はこれらのドメインからのモチーフも含まない。このＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S-135_#147を有する。コンストラクトp70S-BvKWS3_135及びp70S-135_#147の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる能力を、一過的な遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験した。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて使用した。空ベクター（pCaMV-2）のトランスフォーメーションとの比較において、p70SBvKWS3__135によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の７４．５％、そしてp70S-135__#147によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の５８．５％のみを生じた（図６）。この結果は、完全長クローンBvKWS3_135の発現が、形質転換した組織中での細胞死の作動を生じることを示す。確かに、１４７アミノ酸の大きさの135_#175のＮ末端の唯一の発現が、８４４アミノ酸の大きさのタンパク質BvKWS3_135の使用と比較して、より強力な細胞死をトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中で引き起こす。135_#147の発現により、BvKWS3_135の発現の場合におけるよりもより多くのトランスフォーメーションした葉細胞が壊死する。この相違のための原因は、Ｎ末端での短縮化による、Ｒタンパク質の自己活性化の新規の、より強力な形態である。
【００６２】
遺伝子Bv13033の５′領域は、完全長ｃＤＮＡクローンBv13033と比較してより迅速な細胞死を作動する
完全長ｃＤＮＡ  Bv13033から出発して、コンストラクトp70S-13033中で、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いて遺伝子の５′領域を、プライマーＳ３１６（CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG）及びＳ３３３（CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT）の使用下で増幅させかつ同時にストップコドンをコード領域中に挿入した。増幅された領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に応じたヌクレオチド配列に相当し、かつ、Bv13033のアミノ酸配列１〜１５９をコードする（図１０）。このアミノ酸配列は、Bv13033のＮ末端領域のみを含み、そしてＮＢＳを含まずＬＲＲドメイン又はこれらのドメインからのモチーフも含まない。このＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて切断し、かつベクターpCaMV-2中にクローニングした。この生じるベクターは、名称p70S-13033_#159を有する。コンストラクトp70S-13033及びp70S-13033_#159の、サトウダイコン葉中での細胞死を作動させる適性は、一過的な遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより定量的に試験された。このために、各ベクターを、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと同時形質転換した。ポジティブコントロールとして、空ベクターpCaMV-2を使用した。空ベクター（pCaMV-2）のトランスフォーメーションとの比較において、p70S-13033によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の９５％、そしてp70S-165_#175によるトランスフォーメーションは測定可能なレポーター遺伝子活性の６８％を生じた（図７）。この結果は、完全長クローンBv13033の発現が、形質転換した組織中での弱い細胞死の作動を生じることを示す。１５９アミノ酸の大きさの、13033_#159のＮ末端の唯一の発現によりこれに対して、トランスフォーメーションしたサトウダイコン葉中での強力な細胞死を引き起こす。この相違のための原因は、Ｎ末端での短縮による、Ｒタンパク質の自己活性化の新規の、強力な形態である。
【００６３】
遺伝子Bv12069の５′領域によるサトウダイコン葉中での細胞死の作動
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に応じたヌクレオチド配列を有するＲ遺伝子Bv12069は、１６６アミノ酸の大きさの、Ｒタンパク質のＮ末端をコードする。このタンパク質Bv12069は、ＮＢＳを含有せずＬＲＲドメインも含有せず、しかしながら、自己活性化したＲタンパク質165_#175、135_#147 13033_#159の１７５、１４７及び１５９アミノ酸の大きさのＮ末端に対する顕著なホモロジーを示す（図１０）。このｃＤＮＡクローンを、ベクターpCaMV-2（図３）の二重の３５Ｓプロモーターを用いてベクターp70S-12069へと組み合わせた。遺伝子Bv12069の機能性を試験するために、コンストラクトp70S-12069を、レポーター遺伝子ベクターp70S-lucと組み合わせて、サトウダイコン中で、遺伝子銃によるトランスフォーメーションにより一過的に発現させた。p70S-12069及びp70S-lucでトランスフォーメーションした葉のレポーター活性は、３回の独立した試験において、ポジティブコントロール（空ベクターpCaMV-2及びp70S-luc）中で測定することができた活性の５１％のみであった（図８）。この１６６アミノ酸の大きさのタンパク質Bv12069の発現は、従って、サトウダイコン葉中での細胞死を引き起こした。
【００６４】
遺伝子BvKWS3 135の短縮化は、自己活性化したＲタンパク質を生じるが、しかしながらＭＨＤドメインの突然変異作成は引き起こさない
ＮＢＳ−ＬＲＲタイプのＲタンパク質のＮＢＳ及びＬＲＲ不含Ｎ末端での短縮化による自己活性化の本発明による機構を、ＭＨＤモチーフの突然変異作成による自己活性化の方法と比較した。ジャガイモのＲｘ遺伝子及びアマからのＬ６遺伝子のこのＭＨＤモチーフの突然変異作成は、挙げられた遺伝子の自己活性化を生じた（Bendahmane et al., 2002; Howles et al., 2005）。ｃＤＮＡクローンBvKWS3_135は、ＭＨＤモチーフに相当するＶＨＤモチーフをコードし、これはしばしば、ＭＨＤモチーフの他に同様にＲ遺伝子中で見出される（Howles et al., 2005）。この相応する突然変異は、例えばBendahmane et al. (2002)により記載されたように、完全長クローンBvKWS3_135中に挿入されている。このためには、遺伝子のＶＨＤモチーフ中の、アミノ酸アスパラギン酸を、アミノ酸バリンにより交換した。この相応する遺伝子は、名称BvKWS3_135_D480Vを有する。遺伝子135_#147、BvKWS3_135_D480V及び非変性遺伝子BvKWS3_135の有効性を、サトウダイコン葉中でのアグロバクテリウム・チュメファシエンスにより媒介された一過的な過剰発現により試験した。このために、ｃＤＮＡクローンBvKWS3_135を、ｄ３５Ｓプロモーターと組み合わせ、バイナリーベクターpER35Sluci中に挿入した。この生じるベクターは、名称pER135-35Sluciを有する。相応して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に応じたヌクレオチド配列を有する短縮したｃＤＮＡクローン135_#147を用いて、並びに、突然変異したｃＤＮＡクローンBvKWS3_135_D480Vを用いて実施した。この生じるベクターは、名称pER135_#147-35Sluci及びpER135_D480V-35Sluciを有する。このベクターを、記載したように、アグロバクテリウム株C58C1中にトランスフォーメーションし、かつ、ポジティブコントロールpER-35Sluciと一緒にサトウダイコン葉中に注射した。フォチナス・ピラリス  ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を、トランスフォーメーションした葉中で接種１、２及び３日間後に測定した。コントロールコンストラクトpER-35Sluciを用いてトランスフォーメーションしたサトウダイコン葉は、１日目に少ない、そして２及び３日目に、２９９．０００及び４３３．０００ＲＬＵ／ｍｇ葉組織のルシフェラーゼ活性を示した。コンストラクトpER135-35Sluciでトランスフォーメーションしたダイコン葉は、２及び３日目に、ルシフェラーゼ活性１９０．０００及び２４５．０００ＲＬＵ／ｍｇ葉組織を示し、従ってポジティブコントロールpER-35Sluciと比較して測定可能な細胞死を示した。コンストラクトpER_135_D480V-35Sluciのレポーター遺伝子活性は、２及び３日目に、１８８．０００及び２０６．０００ＲＬＵ／ｍｇを示した（図９）。これにより、遺伝子BvKWS3_135中のＭＨＤ突然変異の挿入は、より少ないか又はほとんど測定可能でない自己活性化を生じた。この方法に相応して短縮されたＲ遺伝子135_#147はこれに対して、２及び３日目に、レポーター遺伝子活性９００００及び６３０００ＲＬＵ／ｍｇを示し（図９）、従って、コンストラクトpER135-35Sluci及びpER_135_D480V-35Sluciに比較して顕著により強力な細胞死作動及び自己活性化を示した。
【００６５】
Ｒタンパク質BvKWS3_165、BvKWS3_135. Bv13033及びBv12069並びにStR3aのＮ末端中の共通のアミノ酸モチーフの同定
Ｒタンパク質BvKWS3_165、BvKWS3_135及びBv13033及び Bv12069の１７５、１４７、１５９及び１６６のアミノ酸の大きさの、Ｒタンパク質のＮ末端と、ジャガイモからの１５５のアミノ酸の大きさの、Ｒ３ａ遺伝子のＮ末端(Huang et al., 2005)の間のホモロジー比較を、共通の配列モチーフを同定するために実施した。この比較は、自己活性化したＲタンパク質のＮ末端中での複数のコンセンサス配列の同定を生じた。この共通の配列モチーフは、コンセンサス配列として図１０ａ中で強調されている。
【００６６】
コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３：AVLXDAEXKQXX XXXLXXWLXD LKDXVYDXDD ILDEによるアミノ酸配列に相当する。その他のコンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４によるアミノ酸配列；IXEIXXKLDDLに相当する。
【００６７】
文字Ｘはこの際、任意のアミノ酸である。
【００６８】
両方のコンセンサス配列は、記載された形態において、発現が自己活性化を生じるようなＣＣ−ＮＢＳ−ＬＲＲ  Ｒタンパク質のＮ末端中にのみ含有されている。従って、１６０アミノ酸の大きさの、ＲＸ遺伝子のＣＣドメインは、細胞死又は過敏感反応を作動させることはできない（Bendahmane et al., 2002）。１７７アミノ酸の大きさの、サトウダイコンのＲ遺伝子BvKWS3_133_eO8のＮ末端、及び、５４０アミノ酸の大きさの、ジャガイモのＲ１遺伝子のＮ末端（Ballvora et al., 2002）の一過的発現は、完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_133_eO8と比較して、増強した細胞死を作動させず、又はＲ１遺伝子の場合には細胞死を作動させなかった（データ示さず）。自己活性化したタンパク質BvKWS3_165_#176、BvKWS3_135_#147、Bv13033_#159、Bv12069及びStR3a#1-155のＮ末端と、Ｒｘ−、ＳｔＲ１及びBvKWS3_133_#177タンパク質のＣＣドメインのアミノ酸配列とのアミノ酸比較は、上記したコンセンサス配列の、自己活性化していないＮ末端中での非存在を示した（図１０ｂ）。特に、配列モチーフＤＡＥは、Ｎ末端が自己活性性であるＲタンパク質の同定のための重要な補助手段である。コンセンサス配列中の配列モチーフＤＡＥを用いて、数々の植物種中で自己活性化に適したＲ遺伝子が見出され、例えば図１０ｃは、シロイナズナ（AtAB028617）、マメ（PvulgarisJ71）、イネ（osativaAp003073）、ダイズ（GmaxKR4）及びトマト（Tomato-I2）からの例を示す。
【００６９】
１４７〜１７５のアミノ酸配列は、Ｒタンパク質165_#175の自己活性化のために重要である
ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質のＮ末端の自己活性化のために重要であるタンパク質165_#175中のアミノ酸断片を同定すべく、ｃＤＮＡクローン165_#175のコード領域を短縮化した。ｃＤＮＡクローン165_#93及び165_#146は、タンパク質165_#175のアミノ酸１〜９３又は１〜１４６をコードする。コンストラクトp70S_165_#93、p70S_165_#146及びp70S_165_#175の一過的な遺伝子銃による試験は、タンパク質165_#93及び165_#146でなくタンパク質165_#175のみが、強力な細胞死を作動させることを示した（図１１）。従って、配列領域１４６〜１７５は、ＮＢＳ−ＬＲＲタンパク質の自己活性化のために本質的である。この領域には、全ての試験したタンパク質間で保存された配列モチーフが存在する（図１０ａ）。
【００７０】
菌類攻撃による、合成の病原体誘導可能なプロモーター２×Ｓ−２×Ｄ及び２×Ｗ２−２×Ｄの迅速な活性化
病原体誘導された、完全長の又は部分的な耐性遺伝子の過剰発現のためには、特に合成のプロモーター、ｎｘＳ−ｍｘＤ、ｎｘＷ２−ｍｘＤ及びｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤのタイプ（その際ｎ＝１、２、３、４、５、６、７，８、９、１０及びｍ＝１、２、３、４、５、６、７，８、９、１０）が適する。例示的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０による2xS-2xD、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１による2xW2-2xD並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２による2xGst1-2xDのタイプのプロモーターを、フォチヌス・ピラリスからのルシフェラーゼ遺伝子と組み合わせ、サトウダイコン中にトランスフォーメーションし、かつ、菌類の攻撃に対する反応において分析した。
【００７１】
植物のトランスフォーメーションのために、バイナリーベクター２ｘＳ−２ｘＤ−luc-kan、２ｘＷ２−２ｘＤ−luc-kan及び２ｘＧｓｔ１−２ｘＤ−luc-kanを使用した。このバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・チュメファシエンス株C58C1中で、固有のプラスミドpGV2260を用いて、直接的なＤＮＡトランスフォーメーション方法（An, 1987）によりトランスフォーメーションした。組み換えたＡ・チュメファシエンスクローンの選択を、抗生物質カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）の使用下で行った。
【００７２】
このサトウダイコンのトランスフォーメーションを、Lindsey et al. (1991)に応じて、抗生物質カナマイシンの使用下で行った。この植物の遺伝子導入性（Transgenitaet）を、ＰＣＲにより試験した。プライマーGTGGAGAGGCTATTCGGTA及びCCACCATGATATTCGGCAAGの使用により、nptll遺伝子からの５５３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片の増幅を生じた。このＰＣＲを、１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、プライマー濃度０．２μＭの使用下で、アニーリング温度５５℃で、Multicycler PTC-200(MJ Research, Watertown, USA)中で実施した。
【００７３】
プロモーターの病原体誘導性を、分析するために、この形質転換したサトウダイコンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、サトウダイコンの葉の斑点の病原体褐斑病（Cercospora beticola）で注射した。形質転換した系列のそのつど４つの植物をC. beticolaの菌糸体断片の懸濁液（４０００００断片／ｍｌ）中で、そして４つの植物を対照の目的で希釈した野菜ジュース中に浸漬した。注射された植物及び対照植物を引き続き２５℃で１６時間照射でもって、栽培棚中でインキュベーションした。注射された葉材料及び注射されていない葉材料を、接種１、２、３、４及び６〜７日間後に取り除き、このルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を、ルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Mannheim,ドイツ国）を用いて記載したように測定した。
【００７４】
２×Ｓ−２×Ｄも、また同様に２×Ｗ２−２×Ｄプロモーターも、迅速かつ強力な病原体誘導性をこの感染の初期相に示し、しかしながら基本活性及びプロモーター強度においては相違する（図１２〜１３）。２×Ｓ−２×Ｄプロモーターは、形質転換された系列PR39/11、PR39/48及びPR39/49の場合に、極めて迅速に、既に接種１日後に、感染していない植物と比較して、１１〜５９倍、そして、２日目には２１〜３８０倍を誘導した（図１２）。１日目が、表皮系に対する菌分節体の成長によって更に特徴付けられる一方で、２日目には、気孔を通じた葉の貫通が、そして葉組織中への侵入が生じた。感染の後期の相においては、感染の７日目に可視可能なネクローシス発達の際に、プロモーターの１１３〜７９２倍の誘導が確認された。感染していない植物のレポーター遺伝子活性として測定される２×Ｓ−２×Ｄプロモーターの基礎活性は、極めて少なく、かつ、非形質転換植物中で測定可能なルシフェラーゼ活性の１〜１０倍のみである。
【００７５】
２×Ｗ２−２×Ｄプロモーターの活性化は、２×Ｓ−２×Ｄプロモーターの活性よりもいくらかゆっくりと進行する。感染１日目には、２×Ｗ２−２×Ｄプロモーターは、２〜１７倍のみ、そして感染２日目には、５〜５６倍の病原体誘導を示す。７日目のネクローシスの出現により、最大で３１８〜６７２倍の病原体誘導が達成される（図１３）。２×Ｗ２−２×Ｄプロモーターの基礎活性は、非形質転換植物中で測定可能なレポーター遺伝子活性の１０〜５０倍でもって、２×Ｓ−２×Ｄプロモーターの場合よりもより高い。しかしながら、２×Ｗ２−２×Ｄプロモーターは、その約１０倍より高いプロモーター強度により２×Ｓ−２×Ｄプロモーターからは際だっている。
【００７６】
シス要素の数の変更によるプロモーター特性の最適化
タイプ、ｎｘＳ−ｍｘＤ、ｎｘＷ２−ｍｘＤ及びｎｘＧｓｔ１−ｍｘＤ（その際ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及びｍ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）の合成プロモーターの特性は、シス要素の数の変更により、遺伝子発現の要求に応じて変更かつ最適化される。これは、例示的にプロモータータイプｎｘＳｍｘＤについて示される。バイナリーベクター２ｘＳ−２ｘＤ−luc-kanの他に、バイナリーベクター４ｘＳ−２ｘＤ−luc-kan、２ｘＳ−４ｘＤ−luc-kan及び４ｘＳ−４ｘＤ−luc-kanを作成し、サトウダイコン中にトランスフォーメーションした。この形質転換植物を、記載したように、C. beticolaで感染させ、そしてこのレポーター遺伝子活性を、菌類接種後に毎日測定した。１３個の独立した系列2xS-2xD-lucの測定結果、１４個の独立した系列4xS-2xD-luc、１５個の独立した系列2xS-4xD-luc並びに１５個の独立した系列4xS-4xD-lucを平均化し、このプロモーター強度、病原体誘導及び基礎活性の平均値を比較した。
【００７７】
２ｘＳ−２ｘＤプロモーター特性の、変形２ｘＳ−４ｘＤ、４ｘＳ−２ｘＤ及び４ｘＳ−４ｘＤとの比較は、平均的なプロモーター強度が、テトラマーの使用により、ダイマーから構成されたプロモーターと比較して高められることを示す（図１４）。更に、ダイマー−ダイマープロモーター（２ｘＳ−２ｘＤ）の病原体誘導性は、テトラマー−ダイマー及びダイマー−テトラマープロモーター（４ｘＳ−２ｘＤ、４ｘＳ−２ｘＤ）を越えて、テトラマー−テトラマープロモーター（４ｘＳ−４ｘＤ）まで全ての測定点で上昇する。
【００７８】
【表１】
2008541739.tif 000003
表１：褐斑病Cercospora beticolaを用いた感染後の形質転換したサトウダイコン中でのプロモーター２ｘＳ−２ｘＤ、４ｘＳ−２ｘＤ、２ｘＳ−４ｘＤ及び４ｘＳ−４ｘＤの病原体誘導性示したのは、接種１〜４日間後のプロモーターコンストラクト１個につき１３〜１５個の独立した形質転換体（系列）の病原体誘導の平均値である。
【００７９】
プロモーター強度及び病原体誘導性の上昇と並行して、テトラマーを含有するプロモーターの基礎活性の向上が起こる（表２）。
【００８０】
【表２】
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表２：形質転換したサトウダイコンの葉中でのプロモーター２ｘＳ−２ｘＤ、４ｘＳ−２ｘＤ、２ｘＳ−４ｘＤ及び４ｘＳ−４ｘＤの基礎活性。
【００８１】
示しているのは、プロモーターコンストラクト１個につき１３〜１５個の独立した形質転換体（系列）の基礎活性の平均値であり、これは、４日間の感染試験において感染していないコントロールとして測定されたものである。基礎活性は、非形質転換植物の、非特異的なバックグラウンド活性と比較した形質転換植物のレポーター遺伝子活性の比を示す。
【００８２】
この例は、このコンセプトに関連して重要なプロモーター特性、例えばプロモーター強度、病原体誘導性及び基礎活性が、シス要素の数により制御され、そして、そのつどの技術的な反応について最適なプロモーター変形が作成できることを示す。病原体誘導可能なプロモーターのシス要素の最適な数は、試験した実施例において、病原体誘導能に関して、Rushton et al., 2002により記載されたダイマー手段（Dimerloesung）よりも大きい。
【００８３】
菌類耐性のサトウダイコンの、病原体誘導可能な耐性遺伝子のトランスフォーメーションによる作成
サトウダイコンの菌類耐性の上昇のために、プロモーター２ｘＳ−２ｘＤ又は２ｘＷ2−２ｘＤをそのつど、４個のＲ遺伝子 BvKWS3_123、BvKWS3_133、BvKWS3_135及びBvKWS3_165のうちの１個と組み合わせ、そしてサトウダイコン中にトランスフォーメーションした。このためには、１３９５９又は１３９６９ｋｂの大きさのバイナリーベクター2xS-2xD-luc-kan及び2xW2-2xD-luc-kanを、ＳａｃＩで切断し、そしてこの切断部位を、T4-DNAポリメラーゼ処理により満たした。引き続き、ベクターをＸｈｏＩで後切断し、電気泳動して分離し、１２２８４又は１２２９４ｋｂの大きさのベクターを、１６７５ｋｂの大きさのルシフェラーゼ遺伝子から分離及び単離した。
【００８４】
ベクターp70S-BvKWS3_123、p70S-BvKWS3_133、p70S-BvKWS3_135及びp70S-BvKWS3_165からのＺＲ耐性遺伝子の単離を行った。このために、このベクターをまずＮｏｔＩで線形化し、かつこの切断部位をＫｌｅｎｏｗ処理により満たした。このベクターを次いでＸｈｏＩで切断し、このＲ遺伝子を単離した。この生じるベクターは、名称2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xD-BvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_135及び2xS-2xD-BvKWS3_165又は2xW2-2xD-BvKWS3_123、2xW2-2xD-BvKWS3_133、2xW2-2xD-BvKWS3_135及び2xW2-2xD-BvKWS3_165を有する（図１５〜１８）。このバイナリーベクターを、記載したように、形質転換したサトウダイコンの作成のために使用した。
【００８５】
有害菌類、褐斑病（Cercospora beticola）を用いた耐性試験による、菌類耐性サトウダイコンの同定
植物の向上した菌類耐性を、菌類耐性試験、例えば以下に例示的に、サトウダイコンの褐斑病（Cercospora beticola）に対する耐性試験のために記載する菌類耐性試験で観察した。
【００８６】
葉の斑点の病原体C. beticolaを用いたサトウダイコンの感染のために、形質転換した植物サトウダイコンの他に、トランスフォーメーションのために使用した遺伝子型3DC4156を温室中で生育した。計画した接種の２週間前に、野菜ジュースプレート（４０％のAlbani野菜ジュース）を攻撃性のC. beticola単離体Ahlburgで接種し、２５℃でインキュベーションした。この接種の直前に、菌類成長性の寒天を、スライドグラス及びいくばくかの水を用いて汚れを落とした。菌糸体断片及び菌類胞子濃度を、計算板を用いて測定した。接種密度を、水を用いた希釈により、２００００断片／ｍｌの濃度に調整した。感染のために、１０〜１２週齢の植物を逆さまに、接種体で満たした５ｌのビーカーガラス中に浸漬した。試験すべき系列１つについて、３０つの植物を接種し、この植物をランダムに温室中に配置した。
【００８７】
植物を、接種後４日間にわたり、２８℃及び９５％で空気湿分で、温室中でインキュベーションした。４日後に、空気湿分を６０〜７０％に減少させた。接種２、３及び４週間後に、葉の被害を、光学的に、九分割されたKleinwanzleben Saatzucht(KWS)の評価基準（1970）を評価した（１＝健康な葉、９＝１００％崩壊した葉）。コンストラクト2xS-2xD-BvKWS3_123、2xS-2xDBvKWS3_133、2xS-2xD-BvKWS3_165、2xW2-2xD-BvKWS3_123、2xW2-2xD-BvKWS3_133、2xW2-2xD-B-vKWS3_135又は2xW2-2xD-BvKWS3_165でトランスフォーメーションした形質転換した系列は、コントロールに対して向上した菌類耐性を示した（表３）。
【００８８】
【表３】
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表３：有害菌類、褐斑病Cercospora beticolaに対する形質転換したサトウダイコンの耐性上昇
1  耐性試験の第３の及び最後の評価値（１＝健康、９＝１００％崩壊した葉表面）。
2  ３つの評価期日（Ｔ１〜Ｔ３）にわたり算出したAUDPC (Area under disease progress curve)値。AUDPC値は、複数の評価時間点の被害強度の進行を１つの値に包括する。
【００８９】
３つの評価期日にわたる形質転換体PR68-6及びPR70-32での被害進行の時間経過の分析は、進行する試験期間と共に、コントロールと形質転換系列の間での被害進行における相違が、増加することを示す（図１９及び２０）。この結果は、サトウダイコンの相違するＲ遺伝子の誘導された発現が、病原体特異的なプロモーターを用いて、高められた菌類耐性を生じることを示す。
【００９０】
病原体応答性プロモーターの制御下でのＲ遺伝子のＮ末端領域のトランスフォーメーションによる菌類耐性植物の作成
菌類耐性植物を、Ｒ遺伝子のＮ末端の断片の使用下で作成するために、短縮化したＲ遺伝子13033_#159、135_#147、165_#175及びBv12069を、プロモーター２ｘＳ−２ｘＤ及び２ｘＷ２−２ｘＤを組み合わせ、そしてサトウダイコン中にトランスフォーメーションした。
【００９１】
このために、１３９５９又は１３９６９ｋｂの大きさのバイナリーベクター2xS-2xD-luc-kan及び2xW2-2xD-luc-kanを、ＳａｃＩを用いて切断し、この切断部位をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理により満たした。引き続き、このベクターをＸｈｏＩで後切断し、電気泳動して分離し、この１２２８４ｋｂ又は１２２９４ｋｂの大きさのベクターを、１６７５ｋｂの大きさのルシフェラーゼ遺伝子から分離及び単離した。
【００９２】
短縮したＲ遺伝子の単離を、ベクターp70S-12069、p70S13033_#159、p70S-135_#147及びp70S-165_#175から行った。このベクターをまず、ＸｂａＩで線形化し、このＤＮＡ末端をＫｌｅｎｏｗ処理により満たし、このベクターを次いでＸｈｏＩで後切断した。この単離したＲ遺伝子断片を次いで、既に準備したバイナリーベクター中にクローニングした。この生じたベクターは、名称2xS-2xD-12069、2xS-2xD-13033_#159、2xS-2xD-135_#147、2xS-2xD165_#175又は2xW2-2xD-12069、2xW2-2xD-13033_#159、2xW2-2xD-135_#147、2xW2-2xD-165_#175を得た（図２１〜２２）。このバイナリーベクターを、記載したように、サトウダイコン中にトランスフォーメーションし、菌類耐性植物を、褐斑病Cercospora beticola耐性試験により同定した。
【００９３】
【表４】
2008541739.tif 000006
【００９４】
【表５】
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【００９５】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、バイナリーベクターpER-35Sluciの地図を示す図である。
【図２】図２は、アグロバクテリウム チュメファシエンスを介した、Ｒ遺伝子BvKWS3_133の一過的発現後のサトウダイコン葉中での細胞死の作動を示す図である。
【図３】図３は、サトウダイコン葉の一過的な、遺伝子銃によるトランスフォーメーションのために使用したベクターpCaMV-2を示す図である。
【図４】図４は、遺伝子銃によるトランスフォーメーションによるＲ遺伝子BvKWS3_123、BvKWS3_133及びBvKWS3_165の一過的発現後のサトウダイコン葉中での細胞死の作動を示す図である。
【図５】図５は、完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_165の発現と比較したＲ遺伝子BvKWS3_165の５′末端領域の発現による増強した細胞死作動を示す図である。
【図６】図６は、完全長Ｒ遺伝子BvKWS3_135の発現による細胞死作動及びこれと比較したＲ遺伝子BvKWS3_135の５′末端領域135_#147による増強された細胞死作動を示す図である。
【図７】図７は、完全長Ｒ遺伝子Bv13033の発現と比較したＲ遺伝子Bv13033の５′末端領域13033_#159の発現による増強した細胞死作動を示す図である。
【図８】図８は、Ｒ遺伝子Bv12069の発現による細胞死の作動を示す図である。
【図９】図９は、ＮＢＳドメインのＶＨＤモチーフの変異体と比較した、ｃＤＮＡクローン135_#147の５′領域での短縮化によるタンパク質BvKWS3_135の自己活性化を示す図である。
【図１０ａ】図１０ａ）は、短縮した、自己活性化したタンパク質Bv12069、Bv13033_#159、BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175及びStR3a#1-155のアミノ酸配列の相互の比較並びに自己活性化されない短縮した、ジャガイモからの耐性タンパク質（RX-160）及びStR1（355-540）並びに、シロイナズナ（AtAB028617）、マメ（PvulgarisJ71）、イネ（OsativaAP003073）、ダイズ（GmaxKR4）及びトマト（Tomato-I2）からのＮＢＳ−ＬＲＲタイプの完全長Ｒタンパク質比較配列を示す図である。
【図１０ｂ】図１０ｂ）は、短縮した、自己活性化したタンパク質Bv12069、Bv13033_#159、BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175及びStR3a#1-155のアミノ酸配列の相互の比較並びに自己活性化されない短縮した、ジャガイモからの耐性タンパク質（RX-160）及びStR1（355-540）並びに、シロイナズナ（AtAB028617）、マメ（PvulgarisJ71）、イネ（OsativaAP003073）、ダイズ（GmaxKR4）及びトマト（Tomato-I2）からのＮＢＳ−ＬＲＲタイプの完全長Ｒタンパク質比較配列を示す図である。
【図１０ｃ】図１０ｃ）は、短縮した、自己活性化したタンパク質Bv12069、Bv13033_#159、BvKWS135_#147、BvKWS3_165_#175及びStR3a#1-155のアミノ酸配列の相互の比較並びに自己活性化されない短縮した、ジャガイモからの耐性タンパク質（RX-160）及びStR1（355-540）並びに、シロイナズナ（AtAB028617）、マメ（PvulgarisJ71）、イネ（OsativaAP003073）、ダイズ（GmaxKR4）及びトマト（Tomato-I2）からのＮＢＳ−ＬＲＲタイプの完全長Ｒタンパク質比較配列を示す図である。
【図１１】図１１は、アミノ酸１４７〜１７５の欠失が、タンパク質165_#175の自己活性化能力を顕著に減少させることを示す図である。
【図１２】図１２は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中での合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄの活性化を示す図である。
【図１３】図１３は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中での合成プロモーター２×Ｗ２−２×Ｄの活性化を示す図である。
【図１４】図１４は、褐斑病（Cercospora beticola）の攻撃による、形質転換したサトウダイコン中でのプロモーター２×Ｓ−２×Ｄ、４×Ｓ−２×Ｄ、２×Ｓ−４×Ｄ及び４×Ｓ−４×Ｄのレポーター遺伝子活性の比較を示す図である。
【図１５】図１５は、完全長Ｒ遺伝子123、133と、合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図１６】図１６は、完全長Ｒ遺伝子135、165と、合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図１７】図１７は、完全長Ｒ遺伝子123、133と合成プロモーター２×Ｗ2−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図１８】図１８は、完全長Ｒ遺伝子135、165と合成プロモーター２×Ｗ2−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図１９】図１９は、形質転換していないコントロール3DC4156と比較した、有害菌類、褐斑病（Cercospora beticola）に対する形質転換サトウダイコン系列PR68-6の耐性向上を示す図である。
【図２０】図２０は、形質転換していないコントロール3DC4156と比較と比較した、褐斑病に対する形質転換サトウダイコン系列PR70-32の耐性向上を示す図である。
【図２１】図２１は、Ｒ遺伝子165_#176及び12069のＮ末端領域の、合成プロモーター２×Ｓ−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図２２】図２２は、Ｒ遺伝子165_#176及び12069のＮ末端領域の、合成プロモーター２×Ｗ2−２×Ｄとの組み合わせを示す図である。
【図１】
2008541739.tif 000009
【図２】
2008541739.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008541739.tif 000016
【図９】
2008541739.tif 000017
【図１０ａ】
2008541739.tif 000018
【図１０ｂ】
2008541739.tif 000019
【図１０ｃ】
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【図１１】
2008541739.tif 000021
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2008541739.tif 000029
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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