(57)【要約】  ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチド又はｅＩＦ−ＳＡのセンスポリヌクレオチドのいずれかを取込むベクターを用いて植物内の種子の収量を増大させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチド及び前記アンチセンスポリヌクレオチドの転写を提供するべくアンチセンスポリヌクレオチドに対し作動的に連結された調節配列を含むベクターを、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に取込む段階を含み、かくして前記アンチセンスポリヌクレオチドの前記転写が該植物内の内因性ＤＨＳの発現を減少させ、かくして種子の収量を増大させる、植物内の種子の収量を増大させる方法。
【請求項２】
成長ｅＩＦ−５Ａのセンスポリヌクレオチド及び前記センスポリヌクレオチドの転写を提供するべくセンスポリヌクレオチドに対し作動的に連結された調節配列を含むベクターを、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に取込む段階を含み、かくして前記センスポリヌクレオチドの前記転写が該植物内の成長ｅＩＦ−５Ａの発現を増加させ、かくして種子の収量を増大させる、植物内の種子の収量を増大させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＨＡのポリヌクレオチド及びｅＩＦ−５Ａのアイソフォーム及びそれらの使用方法
本出願は、２００４年１２月３日付けの米国仮特許出願第６０／６３２，５６７号、２００５年６月１４日付けの米国仮特許出願第６０／６９０，１６０号、２００５年８月２５日付けの米国仮特許出願第６０／７１０，９９９号、及び２００５年１０月２１日付けの米国仮特許出願第６０／７２８，７３７号に対する優先権を請求するものであり、これらを参考として内含するものである。本出願は、その全体が本明細書に全て参考として内含されている、現在放棄済みの１９９９年７月６日付けの第０９／３４８，６７５号の一部継続出願である２０００年６月１９日付けの第０９／５９７，７７１号（現在の米国特許第６，５３８，１８２号）の一部継続出願である２０００年１１月２９日付けの第０９／７２５，０１９号（現在の米国特許第６，８７８，８６０号）の一部継続出願である２００４年６月８日付けの米国特許出願第１０／８６２，４４０号のＣＩＰである。
【０００２】
本発明は、真核生物開始因子５Ａ（「ｅＩＦ−５Ａ」）の独自のアイソフォーム、及びｅＩＦ−５Ａ及びデオキシヒプシンシンターゼ（「ＤＨＳ」）をコードするポリヌクレオチド、そしてＤＨＳをコードするポリヌクレオチド、ならびにアイソフォームｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳの発現を変調させることが関与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術の記載
老化というのは、植物の一生における生物学的発達の終末過程である。それは死の前兆となり、全植物、器官、花及び果実、組織及び個々の細胞を含めた生物学的組織のさまざまなレベルで発生する。
【０００４】
老化の始まりは、内部及び外部の両方の異なる因子により誘発され得る。老化は、果実、花及び葉といったような植物又は植物組織の一生における複雑かつ高度に調節された発達段階である。老化は、細胞膜及び巨大分子の組織的な破壊及び植物のその他の部分へのその後の代謝産物動員を結果としてもたらす。
【０００５】
植物の正常な発達の間に起こるプログラミングされた老化に加えて、細胞及び組織の死及びその結果として起こる代謝産物の再動員が、外部の環境的因子に対する組織的な応答として発生する。壊死又はアポトーシスとも呼ばれている、老化の早期開始を誘発する外部因子としては、環境的ストレス、例えば温度、干ばつ、日照不足又は栄養補給不足ならびに病原体の攻撃が含まれる。環境的ストレスに曝露された植物組織は同様に、一般にストレスエチレンとして知られるエチレンをも産生する（Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，Ｖ．，１９９７年，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔａｎｙ，４８；１８１−１９９；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｍ．，１９７４年，Ｐｌａｎｔ，１２０:６３−６９）。エチレンは、一部の植物において老化をひき起こすものとして知られている。
【０００６】
老化は、受動的プロセスではなく、むしろ特異的遺伝子の組織的な発現が関与する活発に調節されたプロセスである。老化の間、総ＲＮＡレベルは減少し、数多くの遺伝子の発現はオフ切替される。（Ｂａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１年，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｏｔａｎｙ，４２，８０１−１１；Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３年，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，５，５５３−６４）。しかしながら、老化プロセスが核遺伝子の新たな転写によって左右されるという証拠が増えてきている。例えば、老化は、タンパク質の合成及び除核及びｍＲＮＡの阻害物質によって遮断される。インビボ翻訳実験のために老化葉及び緑葉からのｍＲＮＡを使用した分子研究が、老化葉の中での葉のタンパク質産物のパターン変化を示している（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２年，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３９，４０３−１２）。示差的スクリーニング及び減法的ハイブリダイゼーション技術を使用することにより、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、トウモロコシ、キュウリ、アスパラガス、トマト、米及びジャガイモといったような双子葉植物及び単子葉植物の両方を含む一定範囲の異なる植物から、老化誘発された遺伝子を表わす数多くのｃＤＮＡクローンが同定されてきた。老化の間に特異的に発現される遺伝子の同定は、老化が開始するためにｄｅ  ｎｏｖｏ転写が求められることの確固たる証拠である。
【０００７】
老化の間に発生する事象は、壊死及び死が起こる前に細胞構成要素を最大限に使用できるようにきわめて組織的であるように思われる。このプロセスを調節するためには、特異的シグナルの感受及び遺伝子発現カスケードの誘発が関与する複雑な相互作用が発生しなければならない。老化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現が、恐らくは、それ自体ホルモンシグナルによって直接的又は間接的に活性化される共通の活性化タンパク質を介して調節される。該プロセスの初期シグナリング又は後続する組織化に関与する機序については、ほとんど知られていない。
【０００８】
組織的な遺伝子発現には、開始因子を含む転写及び翻訳に関与する因子が必要とされる。植物を含めたさまざまな生体の中で、翻訳開始因子遺伝子が単離され特徴づけされてきた。翻訳開始因子は、ｍＲＮＡ集団が核から外に移動する速度、それらがリポソームと会合する速度を制御することができ、或る程度特異的ｍＲＮＡｓの安定性に影響を及ぼすことができる。Ｚｕｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７:２９１４−２９２５（１９９８年）。実際、包括的翻訳活動に必要とされない１つのこのような翻訳開始因子が、翻訳のため核から細胞質までｍＲＮＡの特異的サブセットをシャトリングすると考えられている。Ｊａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８６:５９０−６００，（２００２年）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６:１７５４１−１７５４９（２００１年）；Ｒｏｓｏｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１２，２３６９−２３８０（１９９９年）。この翻訳因子は、真核生物開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）として知られており、アミノ酸ヒプシンを含有するものとして知られる唯一のタンパク質である。Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３:１５２６４−１５２６９（１９８８年）。
【０００９】
真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、真核生物細胞タンパク質合成の開始に関与する、サイズが約１７ＫＤａの必須タンパク質因子である。それは、ｅＩＦ−５Ａのみの中に存在するものとして知られているユニークな修飾アミノ酸であるヒプシン［Ｎ−（４−アミノ−２−ヒドロキシブチル）リジン］の存在により特徴づけられる。ヒプシンは、ポリアミン、スペルミジンからｅＩＦ−５Ａ内の特異的リジン残基の側鎖アミノ基までのブチルアミノ基の移送及びヒドロキシル化を介して翻訳後に形成される。ｅＩＦ−５Ａの活性化には、スペルミジンのブチルアミン残基をｅＩＦ−５Ａのリジンへ移送することが関与し、こうしてヒプシンが形成されｅＩＦ−５Ａが活性化される。真核生物においては、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）がｅＩＦ−５Ａ中のヒプシンの翻訳後合成を媒介する。ヒプシン修飾は、インビボでのｅＩＦ−５Ａ活性にとって不可欠であることがメチオニル−ピューロマイシン検定を用いて示されてきた。
【００１０】
ヒプシンは、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ；ＥＣ１．１．１．２４９）とデオキシヒプシンヒドロキシラーゼ（ＤＨＨ；ＥＣ１．１４．９９．２９）の作用により、保存されたリジン残基の転換を通して翻訳後にｅＩＦ−５Ａ上で形成される。ＤＨＳは、トマト（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２９６０７７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）（ＡＴ−ＤＨＳ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２９６０７８）、タバコ（Ｏｂｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｔｍａｎｎ，１９９９年）、カーネーション（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２９６０７９）及びバナナ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２９６０８０）を含め、複数の植物種から単離されてきており、一方、ＤＨＨについての遺伝子は、認識されていない。
【００１１】
ＤＨＳは、ｅＩＦ−５Ａの保存されたリジン残基を、スペルミジンから誘導されたブチルアミン基の添加を通してデオキシヒプシンに転換する。ｅＩＦ−５Ａのこの中間形態は、次にＤＨＨによりヒドロキシル化されてヒプシンとなる。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ６，１１５−１２３（１９９７）。デオキシヒプシンもｅＩＦ−５Ａのヒプシン形態も、インビトロでｍＲＮＡを結合することができる。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ６:１６６−１７４（１９９７年）。ｅＩＦ−５Ａの機能は完全に理解されているわけではないが、それが細胞分裂（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３:１５２６４−１５２６９（１９９８年）；Ｔｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｓｉｇｎａｌｓ  ６:  １５０−１５６，（１９９７年））及び老化（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（２０）:１７５４１−１７５４９（２００１年））を調節し得るということについては一定の証拠が存在している。本明細書にその全体が参考として内含されている米国特許第６，５３８，１８２号及び米国特許出願第０９／７２５，０１９号も同様に参照のこと。いくつかの生体がｅＩＦ−５Ａの複数のアイソフォームを有することは分かっているようであり、これは、各アイソフォームが、細胞分裂及び老化といったプロセスに関与する特異的なｍＲＮＡセットへの特異的シャトルであるという展望と適合すると思われる。
【００１２】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、増大したレベルのＤＨＳ  ｍＲＮＡがトマトの果実軟化及び自然及びストレス誘発型葉老化と相関関係をもつ、ということを実証した。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６（２０）:１７５４１−１７５４９（２００１年）。その上、構成性プロモーターの調節の下でＤＨＳアンチセンスｃＤＮＡフラグメントを導入することにより遺伝子導入トマト植物の中でＤＨＳの発現が抑制された場合、これらの遺伝子導入植物由来のトマト果実は、果実軟化及び損傷の遅れにより証明されるように、劇的に遅延した老化を示した。本明細書にその全体が参考として内含されている２００３年１１月２９日付けの米国特許第６，５３８，１８２号及び米国特許出願第０９／７２５，０１９号を参照のこと。ＤＨＳは、ｅＩＦ−５Ａを活性化することがわかっているため、これらのデータは、ヒプシン修飾されたｅＩＦ−５Ａ（活性ｅＩＦ−５Ａ）が、老化により必要とされるｍＲＮＡ種の選択的翻訳を通して老化を調節しうるということを示唆している。このことはさらに、構成性プロモーターの制御下で全長又は３’ＵＴＲ  ｃＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチドによるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（「ＡＴ」）内のＤＨＳのダウンレギュレーションを通して実証される。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＨＳ（「ＡＴ−ＤＨＳ」）発現をダウンレギュレートしｅＩＦ−５Ａ活性化のためのその利用可能性を低下させることにより、老化は約２週間遅延させられた（米国特許第６，５３８，１８２号参照）。各表現型の程度をＤＨＳのダウンレギュレーションの程度で判定した場合、遺伝子導入植物において、老化が遅延されたばかりでなく、種子の収量の増加、ストレス耐性の増大及びバイオマスの増大も観察された。サザンブロット法（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）及びＢＬＡＳＴ分析により示されるように、トマト及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａはそのゲノム内にＤＨＳのコピーを１つしか有していないことから、核から外への老化転写物のシャットリングを担当する特異的ｅＩＦ−５Ａをターゲティングするためには、（３’ＵＴＲの）老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス構成体を通してか又は過剰発現された遺伝子のダウンレギュレーションのために植物の天然の能力を利用すること（すなわちセンスポリヌクレオチドを用いて過剰発現を作り出すこと）によって、ｅＩＦ−５Ａの老化特異的アイソフォームを同定し特異的にダウンレギュレートしなければならない。
【００１３】
植物には免疫系が欠如しており、従って、ウイルスＲＮＡの配列特異的分解を結果としてもたらす同時抑制と呼ばれる独特のウイルス対処方法が備わっている。トランス遺伝子が、カリフラワーモザイクウイルス２重３５Ｓプロモーターのような強い構成性プロモーターの下にある場合、それは植物にとってウイルス転写物として現われ、トランス遺伝子だけのものではなく内因性遺伝子の配列特異的分解も発生する（Ｆａｇａｒｄ  ａｎｄ  Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｊｕｎｅ；５１−１６７−１９４（２０００年）の中で再考）。同時抑制が、内因性遺伝子のダウンレギュレーションのための発現のアンチセンス抑制に比べより効果的とは言わないまでも同程度に効果的であり得るという一定の証拠が存在している。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明は、真核生物開始因子５Ａ（「ｅＩＦ−５Ａ」）の単離されたアイソフォーム、すなわち老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ；創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ；成長ｅＩＦ−５Ａ；及びストレスｅＩＦ−５Ａならびにこれらのアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ｅＩＦ−５Ａアイソフォームのアンチセンス及びセンスポリヌクレオチドを提供する。該発明は、同様に、ｅＩＦ−５Ａアイソフォームのセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。本発明は同様に、ｅＩＦ−５Ａの修飾された発現を有する植物及びその植物部分及び後代に加えて、これらの因子の発現を修飾（増加／アップレギュレーション又は阻害／ダウンレギュレーション）する段階が関与する方法にも関する。さらに、本発明は、ｅＩＦ−５Ａのこれらのアイソフォームのノックダウン突然変異体をも考慮している。
【００１５】
本発明は同様に、単離されたデオキシヒプシンシンターゼ（「ＤＨＳ」）及びＤＨＳをコードするポリヌクレオチドにも関する。本発明は又、ＤＨＳのアンチセンス及びセンスポリヌクレオチドをも提供する。該発明は同様に、ＤＨＳのセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドを含む発現ベクターをも提供する。本発明は同様に、ＤＨＳの修飾された発現を有する植物及びその植物部分及び後代に加えて、ＤＨＳの発現を修飾（増加／アップレギュレーション又は阻害／ダウンレギュレーション）する段階が関与する方法にも関する。さらに、本発明は、ＤＨＳのノックダウン突然変異体をも考慮している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書で使用される「植物」という用語は、全植物、植物部分、植物細胞又は植物細胞群を意味する。該発明の方法において使用可能な植物のタイプは制限されておらず、例えば、エチレン感受性及びエチレン非感受性植物；アンズ、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、梨、トマト、イチゴ、アボカドなどといった結果植物；ニンジン、エンドウマメ、レタス、キャベツ、カブ、ジャガイモ、ブロッコリ、アスパラガスなどといった野菜；カーネーション、バラ、キクなどといったような花；コーン、米、大豆、アルファルファなどといった農耕作物植物、及び落葉樹、針葉樹、常緑樹などといったような森林種、そして一般的には、本発明のＤＮＡ分子を取込み発現できるあらゆる植物を内含する。これには、半数体、２倍体、４倍体及び倍数体を含むさまざまな倍数性レベルの植物が含まれ得る。植物は、単子葉植物又は双子葉植物のいずれかであり得る。
【００１７】
老化誘発型は、本明細書中、異種の又は同種の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳをそのゲノム内に取込んだ植物を含む（ただしこれに制限されない）、何らかの形で遺伝的に修飾された植物として定義づけされる。改変された遺伝材料は、タンパク質をコードするか、調節又は対照配列を含むことができ、そうでなければ、アンチセンス配列又はセンス配列であるかそれらを内含するか又は、植物の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳ  ＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列又はその一部分に対しアンチセンス又はセンスであるアンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡをコードすることができる。
【００１８】
本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」という用語は一般に、プローブ配列及び標的配列の性質に応じて当業者にとって直ちに明らかになると思われるような適切なストリンジェンシー条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するように用いられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は、当該技術分野において周知であり、インキュベーション時間、温度及び／又は溶液のイオン強度を変動させることによる所望のストリンジェンシーに応じた条件調整は容易に達成される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年を参照のこと。条件の選択は、ハイブリッド形成されている配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の根本的Ｇ−Ｃ含有量及び許容されるべきミスマッチ量によって決定づけられる。より低い相補性度を有するストランド間の部分的ハイブリダイゼーションが望まれる場合には、低ストリンジェンシー条件が好ましい。完全な又はほぼ完全な相補性が望まれる場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。本明細書において、高ストリンジェンシー条件が意味するのは、以下の通りのものである。すなわち、ハイブリダイゼーション溶液は、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ．、０．０１ＭのＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液及び０．５％のＳＤＳを含有する。ハイブリダイゼーションは、クローニングされたＤＮＡのフラグメントについては約３〜４時間、総真核生物ＤＮについては約１２〜約１６時間、約６８℃で実施される。より低いストリンジェンシーのためには、ハイブリダイゼーション温度は、２重鎖の融解温度（ＴM）よりも約４２℃低い温度まで低減される。ＴMは、Ｇ−Ｃ含有量及び２重鎖長ならびに溶液のイオン強度の関数であるものとして知られている。
【００１９】
本明細書で使用される「実質的な配列同一性」又は「実質的相同性」という用語は、１つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がもう１つのヌクレオチド又はアミノ酸配列と実質的な構造的又は機能的等価性を示すということを表わすために用いられる。実質的な配列同一性又は実質的な相同性をもつ配列間のあらゆる構造的又は機能的差異は、わずかなものとなる。すなわち、これらの差異は、所望の利用分野において指示されているように機能するその配列の能力に影響を及ぼすことがない。差異は、例えば異なる種の間でのコドン使用の固有の差異に起因するものであり得る。２つ以上の異なる配列間に有意な量の配列重複又は類似性が存在する場合、又は異なる配列が、たとえ長さ又は構造が異なっていても類似の物理的特徴を示す場合、構造的差異はわずかであるとみなされる。かかる特徴には、例えば、定義された条件下でハイブリッド形成する能力又はタンパク質の場合には免疫学的交差反応性、類似の酵素的活性などが含まれる。これらの特徴の各々は、当該技術分野において既知の方法により熟練した当業者により容易に決定可能である。
【００２０】
付加的には、２つのヌクレオチド配列は、該配列が少なくとも約７０パーセント、より好ましくは約８０パーセント、そして最も好ましくは約９０パーセントの配列類似性を互いの間に有している場合に、「実質的に相補的」である。２つのアミノ酸配列は、それらがポリペプチドの活性部分の間で少なくとも７０％の類似性を有する場合に、実質的に相同である。
【００２１】
本明細書で使用する１つのＤＮＡ又はＲＮＡ分子の「対応する部分に対しハイブリッド形成する」という文言は、例えばオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は任意のヌクレオチド配列を（センス又はアンチセンス配向で）ハイブリッド形成させる分子が、おおよそ同じサイズをもちかつ適切な条件下でハイブリダイゼーションをもたらすのに充分な配列類似性をそれに対して有しているもう１つの核酸分子内の１つの配列を認識しかつこれにハイブリッド形成するということを意味する。例えば、トマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの３’コーティング又は非コーティング領域からの長さ１００ヌクレオチドのアンチセンス分子は、２つの配列間に約７０％以上の配列類似性が存在するかぎり、それぞれＡＴ創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子又は任意のその他の植物の創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の３’コーティング又は非コーティング領域内部で１ヌクレオチド配列のおよそ１００ヌクレオチド部分を認識しこれに対してハイブリッド形成することになる。「対応する部分」のサイズは、該「対応する部分」が、それにハイブリッド形成する分子よりも小さいか又は大きい、例えば２０〜３０％大きいか小さい、好ましくは約１２〜１５％以下だけ大きい又は小さいものであり得るように、ハイブリダイゼーション内の幾分かのミスマッチを許容することになる、ということを理解すべきである。
【００２２】
本明細書で使用する核酸（又はポリヌクレオチド）の「機能的誘導体」という用語は、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列のフラグメント、変異体、相同体又は類似体を意味する。機能的誘導体は、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳコーディングＤＮＡの、該発明に従ったその有用性を可能にする機能の少なくとも１部分を保持する。かかる機能には、高いストリンジェンシー条件下で未変性の単離された老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳ又はもう１つの植物からの実質的に相同なＤＮＡ又はそのｍＲＮＡ転写物とハイブリッド形成する能力が含まれる可能性があり、かつアンチセンス配向でかかる老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ、ストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳの発現を阻害する。
【００２３】
遺伝子又はＤＮＡ配列の「フラグメント」は、分子の任意のサブセット、例えばより短かいポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを意味する。「変異体」というのは、単数又は複数の置換ヌクレオチドを有するものの、特定の遺伝子とハイブリッド形成する能力又は未変性ＤＮＡとハイブリッド形成するｍＲＮＡ転写物をコードする能力を維持しているヌクレオチド置換変異体といったような、全遺伝子又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する分子を意味する。「相同体」というのは、異なる植物属又は種に由来するフラグメント又は変異体配列を意味する。「類似体」というのは、分子全体、その変異体又はそのフラグメントのいずれかと実質的に類似しているか又はそれとの関係において機能する非天然分子を意味する。
【００２４】
「発現を変調する」というのは、発現が阻害されるか又はアップレギュレートされるかのいずれかを意味する。「発現の阻害」というのは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原菌誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ及びストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳといったような標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物の不在又はそのレベルの検出可能な低下を意味する。「アップレギュレーション」又は「過剰発現」というのは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原菌誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ及びストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳといったような、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物のレベルの検出可能な増加を意味する。発現を変調するという表現の意味合いには、ＤＨＳ又はｅＩＦ−５Ａのアイソフォームのうちのいずれか１つのものの活性を減少させることが入る。例えば、１つの植物の中にＤＨＳのノックダウン突然変異体を作ることができ、結果として得られた植物は、野生型ＤＨＳのより低いレベル又は効率でｅＩＦ−５Ａを活性化するＤＨＳを有することになる。発現を変調するという語には又、ＤＨＳ又はｅＩＦ−５Ａの活性を阻害又は低減させる化学物質又は薬物の使用も含まれる。
【００２５】
本発明の単離されたポリヌクレオチド及びペプチドには、天然供給源から単離されたもの、組換えにより産生されたもの又は合成されたものが含まれる。本発明の単離タンパク質には、好ましくはマルトース結合タンパク質と融合されたｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳを含む、融合タンパク質として発現される老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳが含まれる。
【００２６】
本発明の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原菌誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ及びストレスｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳペプチドの「機能的誘導体」としては、ｅＩＦ−５Ａアイソフォーム又はＤＨＳに特異的な抗体との免疫学的交差反応性又は活性の少なくとも１部分を保持するフラグメント、変異体、類似体又は化学的誘導体が含まれる。ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳペプチドのフラグメントは、分子の任意のサブセットを意味する。変異体ペプチドは、例えば当該技術分野において周知の方法を用いて直接的化学合成により作ることができる。ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳペプチドの類似体は、タンパク質全体又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似する非天然タンパク質を意味する。ｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳの化学的誘導体は、通常はペプチド又はペプチドフラグメントの一部でない付加的な化学的部分を含有する。選択された側鎖又は末端残基と反応する能力をもつ有機誘導体化剤とペプチドのターゲティングされたアミノ酸残基を反応させることにより、ペプチド又はそのフラグメント内に変調を導入することができる。
【００２７】
該発明に従ったｅＩＦ−５Ａ又はＤＨＳは、（センス配向で）本発明のヌクレオチド配列で形質転換された細胞を培養し、該細胞がタンパク質を合成できるようにし、次に培地又は細胞抽出物のいずれかからクローニングプロトコルに応じて遊離タンパク質としてか又は融合タンパク質としてタンパク質を単離することによって、産生させることができる。代替的には、該タンパク質を無細胞系内で産生させることも可能である。Ｒａｎｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６０:４５９−４８４，（１９７９年）。
【００２８】
プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動法、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＤＮＡライゲーション及び細菌形質転換は、当該技術分野において周知の従来の方法を用いて実施された。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年を参照のこと。核酸ハイブリダイゼーションの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋによって開示されている。
【００２９】
本発明に従った組換え型ヌクレオチド分子を構築するための手順は、両方共本明細書にその全体が参考として内含されているＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年及びＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，遺伝子発現の制御における分子機序、Ｎｉｅｒｌｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、１９７６年、の中で開示されている。
【００３０】
本発明に従って作られた遺伝子導入植物は、当該技術分野において既知のあらゆる植物形質転換方法を用いてＤＮＡ形質転換により調製可能である。植物形質転換方法としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとの植物、組織又は細胞の直接的共培養又は直接的感染（Ｍｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９３年），ｐ．６７−８８）；プロトプラスト内への直接的遺伝子移入（ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２:２７１７（１９８４年））；電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９:７１９（１９８６年）；粒子衝突（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６:５５９−５６３（１９８８年）；苗木及び植物の分裂組織内への注入（Ｄｅ  Ｌａ  Ｐｅｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２５:２７４−２７６（１９８７年）；培養細胞及び組織のプロトプラスト内への注入（Ｒｅｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４:１００１−１００４（１９８６年））が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００３１】
一般に、完全植物は、形質転換プロセスから得られる。植物は、プロトプラスト、カルス、組織部分又は外植片から再生される。葉、花、果実、種子、花粉などといったような、ｅＩＦ−５Ａアイソフォーム又はＤＨＳの発現が改変されている再生された遺伝子導入植物から得られた植物部分が、本明細書で使用される「植物」の定義の中に含まれる。再生された植物の後代、変異体及び突然変異体も同様に「植物」の定義の中に含まれる。
【００３２】
ｅＩＦ−５Ａ全般
本発明は、ｅＩＦ−５Ａ（真核生物翻訳開始因子５Ａ）に関する。ｅＩＦ−５Ａは、葉、花及び果実の自然老化におけるプログラミングされた細胞死；ストレス誘発型早期老化；木質化に付随する細胞死及び病原体の進入に付随する細胞死を調節する。ｅＩＦ−５Ａは、２つの酵素デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）及びデオキシヒプシンヒドラーゼ（ＤＨＨ）により翻訳後に活性化される。図１１１も参照のこと。ｅＩＦ−５Ａは、従来の翻訳開始因子ではなく、むしろシャトルタンパク質として機能する。ｅＩＦ−５Ａの３つ又は４つの全く異なるアイソフォームが同定されてきている。３つの異なるアイソフォームは、翻訳のため核からリポソームまでｍＲＮＡの異なる亜集団を選択的に転位させる。１つのアイソフォームは細胞分裂及び成長を制御し、２つ又は３つのアイソフォームが細胞死を制御する。例えば、図１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの中で単離されたｅＩＦ−５Ａの３つの異なるアイソフォームを示している。図８〜１０は、ｅＩＦ−５Ａに対するアイソフォーム特異的抗体でプローブ探査されるウェスタンブロットを示している（「Ａｔ」はａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを意味する）。これらの図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内の３つの異なるアイソフォームの発現レベル及び異なるライフサイクル及び事象を示している。より大きいゲノムを伴う植物、例えば作物植物においては、ｅＩＦ−５Ａの４つのアイソフォームが存在する。１つのアイソフォームが細胞分裂及び細胞成長に関与し、３つのアイソフォームが細胞死に関与する。
【００３３】
本発明は、ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム、すなわち老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ；創傷誘発型ｅＩＦ−５Ａ；ストレスｅＩＦ−５Ａ及び成長ｅＩＦ−５Ａに関する。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、植物又は植物組織の寿命の終りで老化を誘発する。ストレスｅＩＦ−５Ａも、環境ストレス、例えば干ばつストレスに応えて早期に老化を誘発する死のアイソフォームである。疾病／創傷ｅＩＦ−５Ａは、病原体の進入又は創傷事象に応えて細胞死を誘発する死のアイソフォームである。成長ｅＩＦ−５Ａは、植物の成長を促進する。ｅＩＦ−５Ａは、生物学的スイッチとして機能し、一方の位置での成長ともう一方の位置での死を調節するように思われる。死の位置では、死のアイソフォームのうちの単数又は複数のものが強く発現され、成長アイソフォームは、弱く発現されるにすぎないか又は全く発現されない。成長位置では、成長アイソフォームは、強く発現され、死のアイソフォームは弱く発現されるだけか又は全く発現されない。
【００３４】
ｅＩＦ−５Ａには３〜４個のアイソフォームが存在するものの、ＤＨＳのアイソフォームは１つしか存在しないと考えられており、この単一のアイソフォームは、ｅＩＦ−５Ａのアイソフォーム全てを活性化（ヒプシン化）する。
【００３５】
本発明は、さまざまな植物種から単離されたｅＩＦ−５Ａのさまざまなアイソフォーム及びｅＩＦ−５Ａのアイソフォームを単離する方法を提供する。本発明は同様に、本発明のｅＩＦ−５Ａのさまざまなアイソフォームをコードするポリヌクレオチドをも提供する。該発明は同様に、ｅＩＦ−５Ａのアイソフォームのアンチセンスポリヌクレオチド及びかかるポリヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドを含有する発現ベクターをも提供する。一部の実施形態においては、植物を形質転換するためｅＩＦ−５Ａのアイソフォームのアンチセンスポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを使用することを通して内因性ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法が提供されている。一部の実施形態では、センス配位でｅＩＦ−５Ａのアイソフォームのポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供することにより、内因性ｅＩＦ−５Ａアイソフォームをアップレギュレートする方法が提供されている。
【００３６】
異なるアイソフォームは、植物のライフステージ又は植物の状態に応じて自然にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる。例えば、老化組織においては、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａアイソフォームがアップレギュレートされる。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、翻訳のため核から細胞質までｍＲＮＡの特異的サブセット（老化経路に関与するもの）をシャトリングすることにより、植物又は植物組織のさらなる老化に参与していると考えられている。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現をダウンレギュレート又は阻害することにより、植物及び／又は植物組織内で老化を遅延させることができる。老化の遅延は、形質転換された／遺伝子導入植物の中で、形質転換されていない又は野生型の植物に比べて、より大きなバイオマス、果実については保管寿命の増大、花の保管寿命の増大、種子サイズの増大及び種子収穫の増大を有することによって現われる。
【００３７】
植物及び／又は植物組織が、低温、脱水又は機械的力といったような創傷事象に曝露されるか又は病原体に曝露された場合、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａアイソフォームがアップレギュレートされる。創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現をダウンレギュレートすることにより、形質転換を受けていない又は野生型の植物における毒性損傷耐性に比べ、病原体の進入から発生する毒性損傷に対する増大した耐性が植物に付与される。
【００３８】
植物が成長期にある場合、成長ｅＩＦ−５Ａアイソフォームがアップレギュレートされる。成長ｅＩＦ−５Ａをアップレギュレートすることにより、結果として得られる遺伝子導入植物は、増大した種子サイズ、増大したバイオマス、及び増大した種子収量を有する。
【００３９】
或る種の植物がストレスを受けた場合、ストレスｅＩＦ−５Ａアイソフォームがアップレギュレートされる。ストレスｅＩＦ−５Ａをダウンレギュレートすることにより、結果として得られる遺伝子導入植物は、干ばつ耐性の増大といったようなストレス耐性の増強を示す。さらに、これらの植物は、野生型植物に比べて増大した種子収穫を有する。
【００４０】
図１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（「Ａｔ」）から単離されたｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォームの整列を示す。図２は、これら３つのアイソフォームのコーディング領域の整列を示す。図３〜５は、３つのアイソフォームのゲノム配列を提供する。
【００４１】
ウェスタンブロット（図８）は、異なる植物ライフステージにおけるｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォームの発現を示す。図８は、老化誘発型因子ｅＩＦ−５Ａアイソフォームの量が、葉齢の増加に伴って増大することを明らかにしている。このことは、開いていないつぼみ、長角果又は茎には見られないが吸水種子では見られた。吸水種子の中では、子葉組織ならびに成長中の胚が存在する。かくして、子葉組織は胚が成長するにつれて老化していることから、吸水種子の中には老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが存在する。胚は活発に成長していることから、吸水種子の中には、成長ｅＩＦ−５Ａが見られる。長角果、種子及び茎の収穫が幾分か創傷を誘発することから、これらの組織内には、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａが見られる。
【００４２】
異なるアイソフォームの間及び異なる植物種内のアイソフォームの間には高度の相同性（約８５％）が存在するものの、異なるアイソフォームは３’ＵＴＲが互いに変動している。アイソフォームの間と同様種の間でもきわめて保存度の高い１つの領域は、ヒプシン部位と考えられている部域である。ヒプシン部位は、以下のアミノ酸であると考えられている：５’−ＣＫＶＶＥＶＳＴＳＫＴＧＫＨＧＨＡＫＣＨＦＶ−３’（配列番号  ）。さまざまなｅＩＦ−５Ａアイソフォーム及びいくつかの植物種の整列については図８５を参照のこと。
【００４３】
老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ
老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、老化組織内で発現される。図１１６を参照のこと。本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、トマト、カーネーション、レタス及びアルファルファ植物を含むさまざまな植物の中での老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発見に関係する。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、老化組織内でアップレギュレートされ、植物及び植物組織内の老化関連形態変化の誘発に関与する。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａアイソフォームがダウンレギュレートされた場合、天然の老化が遅延される。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのダウンレギュレーション（老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス構成体の使用、同時抑制を達成するためのセンス構成体の使用、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのノックダウン突然変異体、（ｅＩＦ−５Ａを活性化するために必要とされる）ＤＨＳの発現の減少、ＤＨＳのノックダウン突然変異体、又はＤＨＳの阻害物質の使用のいずれかを通したもの）は、植物バイオマスの増大、果実軟化又は損傷の遅延、切り花又はレタス葉といったような植物組織の褐変の遅延、種子収穫の増大及び種子サイズの増大を含めた、遺伝子導入植物のさまざまな形態変化を結果としてもたらす。図３５、３６及び１１７（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内の葉の老化の遅延）、図１１２及び１１３（カーネーションの切り花のより長い保管寿命）、図１１４（バナナの褐変の遅延）、図１１５（トマトの損傷遅延）及び図１１９（木質部形成の減少）を参照のこと。
【００４４】
老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのセンス構成体でアップレギュレートされた場合、機能獲得表現型が結果としてもたらされる。例えば、木質部の形成の増加が指摘される。図１２０を参照のこと。
【００４５】
ＤＨＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの役割をさらに解明するため、ＤＨＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの両方のプロモーター活性を、レポーター遺伝子としてＧＵＳを用いて遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の成長及び発達の間に特徴づけした。図１１８は、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが脈管組織の中で発現されることを示している。ＤＨＳ：：ＧＵＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ：：ＧＵＳ発現のレベルは、葉の老化の開始時点で強力にアップレギュレートされ、この高い発現は、葉の老化が終結するまで維持された。さらに、かつ予想外にも、発達中の子葉、ロゼット葉及び茎の脈管組織の中で、ＤＨＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが過渡的にかつ組織的に発現された。ＧＵＳ発現のタイミング及び局在化は、木質化における老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの役割を暗示している。さらに、ＤＨＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、花粉産生の変性期の間に葯組織の中で組織的に発現された。総合すると、これらの結果は、ＤＨＳ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内での木質化、葉の老化及び花の老化に付随するプログラミングされた細胞死を調節するということを示唆している。
【００４６】
老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは同様に、発達中の木質部の中でも発現される。木質部形成において老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが１つの役割を果たすか否かを見極めるために、その全長ｃＤＮＡを、遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物内で構成的に過剰発現させた。これらの植物は、対照植物と比べて、より大きなロゼット葉ならびにより背が高くより厚い花序茎を有しており、より急速な成長を反映していた。さらにそれらの主要な花序茎は、木質部の発達において有意な増強を示した。脈管及び維管束間領域の両方において、細胞層及び組織の厚みは、系統に応じてそれぞれ最高８０％及び６０％だけ増大した。木質部成長の増大は、一次木質部よりも２次木質部においてより顕著であった。その上、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの構成性アンチセンス抑制の結果、発育は不良なままになり、葉の老化は遅延し、対照植物比較して木質部組織は最高３０％削減された。
【００４７】
ｅＩＦ−５Ａは、保存されたリジンからヒプシンまでの転換により翻訳後に修飾される。木質化を調節するのは老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのヒプシン化形態であることを確認するために、我々は又、ヒプシン化され得ない老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの突然変異体形態の構成性過剰発現を伴う遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物も生成した。突然変異は、保存リジンのためのコドンＡＡＧを（アラニンのための）ＧＣＧに変更し、かくして老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのヒプシン化を無効にすることにより行なわれた。突然変異体集団においては、対照植物に比べた木質部発達の変更は全く存在しなかった。かくして、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは、場合によっては、不信な要素のプログラミングされた死を容易にすることによって木質化を積極的に調節するように思われ、かかる機能は、ヒプシン化を通したタンパク質の活性化を必要とする。
【００４８】
かくして、本発明の１つの実施形態は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の単離された老化誘発型ｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図５９に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図５９に提供されており、配列番号  である。
【００４９】
本発明のもう１つの実施形態は、トマト由来の単離された老化誘発型ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図５７及び８６に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図５７及び８６に提供されており、配列番号  である。
【００５０】
本発明のもう１つの実施形態は、カーネーション由来の単離された老化誘発型ｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図５８に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図５８に提供されており、配列番号  である。
【００５１】
本発明のもう１つの実施形態は、アルファルファ由来の単離された老化誘発型ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１３８に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１３８に提供されており、配列番号  である。
【００５２】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％の配列相同性を有し、高ストリンジェンシー条件下で該列挙された配列番号の補体へとハイブリッド形成し、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａをコードする老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの単離ポリヌクレオチドをも提供している。
【００５３】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％のアミノ酸配列相同性を有する老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ単離ポリペプチドをも提供する。
【００５４】
本発明は同様に、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドをも提供している。該アンチセンスポリヌクレオチドは、それが発現を阻害できるかぎり、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドは全長コーディング配列を含み、その他の特に好ましい実施形態においては、ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォームが３’ＵＴＲにおいてより高い変動度を有することから、アンチセンスポリヌクレオチドは３’ＵＴＲで導かれる。一部の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、５’−非コーディング配列で導かれる。主として５’−非コーディング配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害物質であるものとして知られている。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３:４２８４−４２９０（１９９３）。
【００５５】
本明細書及び請求の範囲中で使用されている「老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、列挙された配列番号の補体の１００％相同性を共有するアンチセンスポリヌクレオチドを包含するだけでなく機能的変異体であるアンチセンスポリヌクレオチドをも内含する。機能的変異体というのは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの対応する部分に対し少なくとも８０％の配列相同性をもち、かかる部分と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、天然又は人工的な変異体である。さらに、変異体は、本発明により意図されるような機能を有していなければならない。すなわち発現ベクター内に導入された時点で内因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を変調する能力を有しており、ここでかかるベクターは少なくとも１つの植物細胞のゲノム中に取込まれる。当業者であれば、転写物に結合しかつ遺伝子の発現を低減させるか又は阻害するアンチセンスポリヌクレオチドの能力に不利な影響を及ぼさないような非実質的な変化を配列の中に起こすことができる、ということがわかる。かくして、「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、転写物に対する実質的な相補性をもち、かつ転写物に特異的に結合し遺伝子の発現を阻害するか又は低減させる能力をなおも維持するようなポリヌクレオチドを包含する。アンチセンスの一般的論述については、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，「細胞の分子生物学」、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年（特に本明細書に参考として内含されている１９５〜１９６頁）を参照のこと。
【００５６】
本発明の１実施形態は、（上述のような本発明の）老化誘発型ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドか又は、（上述のような本発明の）老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供している。ベクターは好ましくはプラスミドであり得、そうでなければ植物細胞又は細菌細胞内で上にコードされた遺伝子を複製し発現するものとして知られているウイルス又はその他のベクターであってよい。ベクターは、老化誘発型ｅＩＦ−５ＡＲＮＡの所望のアンチセンスポリヌクレオチドを産生するように転写され得るような形で、染色体的に統合された状態となる。かかるプラスミド又はウイルスベクターは、当該技術分野において標準的である組換え型ＤＮＡ技術方法によって構築され得る。例えば、ベクターは、原核生物宿主の中で機能的である複製系及び該発明に従ったアンチセンスポリヌクレオチドを含有するプラスミドベクターであり得る。代替的には、ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で機能的である複製系及び該発明に従ったアンチセンスポリヌクレオチドを含有するプラスミドであり得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製可能であるプラスミドは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｍｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，「植物内に外来性ＤＮＡを導入するための手順、植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法」、Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）、６７〜８３頁。
【００５７】
ベクターはさらに、ポリヌクレオチドに対し作動的に連結されてかかるポリヌクレオチドの発現を可能にする調節配列をさらに含む。調節配列は、形質転換された植物細胞内で機能的であるプロモーターを内含し得る。プロモーターは、誘発性、構成性又は組織特異的であり得る。かかるプロモーターは、当業者にとって既知である。
【００５８】
遺伝子のセンス又はアンチセンス転写物を生成するために本発明のＤＨＳ及びｅＩＦ−５Ａのさまざまなアイソフォームと組合せた形で有用であるプロモーター調節要素には、あらゆる植物プロモーター全般、より具体的には、イチジクいぼモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター又はＭＡＳプロモーターといったような構成性プロモーター、又はカーネーション花弁ＧＳＴ１プロモーター又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＡＧ１２プロモーターといったような組織特異的又は老化誘発型プロモーターが含まれる（例えば、本明細書に参考として内含されているＪ．Ｃ．Ｐａｌａｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２:１４４７−１４５６（１９９６年）；Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１:１２３−１３２（１９９５年）；Ｆｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，６:５６７−５７７（１９９４年）；ａｎｄ  Ｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１３:３１３（１９９７年）を参照）。好ましくは、本発明の中で使用されているプロモーターは構成性プロモーターである。ＳＡＧ１２プロモーターは、好ましくは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドを使用する場合に好適である。実施例２３を参照のこと。
【００５９】
本発明にとって有用であるプロモーターからの発現レベルは、例えば、プロモーター／レポーター遺伝子が中に導入された遺伝子導入植物の葉、花、果実又はその他の組織の抽出物の中のタンパク質又はｍＲＮＡなどのレポーター遺伝子産物のレベルを測定することによって、従来の発現系を用いてテストすることができる。レポーター遺伝子の一例がＧＵＳである。
【００６０】
任意には、調節配列には、５’非翻訳リーダー配列又はポリアデニル化シグナル又はエンハンサーが含まれる。本発明はさらに、当業者によって知られているようなその他の調節配列を考慮している。
【００６１】
該発明は同様に、センス及びアンチセンス配向の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドを含む本発明のベクター又はベクター組合せで形質転換された遺伝子導入植物細胞、かかる細胞から生成された遺伝子導入幼植物又は成熟遺伝子導入植物、又は遺伝子導入植物の花、果実、葉、種子などといった植物部分を提供する。
【００６２】
本発明は同様に、内因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法を提供する。これらの方法は、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターを組込む段階を含む。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドは転写され、内因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する。
【００６３】
内因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害するもう１つの方法においては、センス配向での本発明の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に組込まれる。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの同時発現は、内因性老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現のダウンレギュレーション又は阻害をひき起こす。
【００６４】
ストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａ
本発明は、アルファルファ、トマト及びレタスを含むさまざまな植物の中のストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発見に関係する。ｅＩＦ−５Ａのストレスアイソフォームをダウンレギュレートすることにより、ストレス誘発型老化は改善される。ストレス−アイソフォームｅＩＦ−５Ａのダウンレギュレーションは、ストレス耐性の増加を提供し、結果として成長を増強させる。図１２１−１２３は、（ストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現が減少した）遺伝子導入植物が干ばつ耐性の増大を示す、ということを示している。図１２４は、（ストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現が減少した）遺伝子導入植物が、対照（野生型）植物に比べ種子収穫が増大することを示している。
【００６５】
かくして、本発明の１つの実施形態は、アルファルファ由来の単離されたストレスｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図１３９に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図１３９に提供されており、配列番号  である。
【００６６】
かくして、本発明の１つの実施形態は、トマト由来の単離されたストレスｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１４６に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１４６に提供されており、配列番号  である。
【００６７】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％の配列相同性を有し、高ストリンジェンシー条件下で該列挙された配列番号の補体へとハイブリッド形成し、ストレスｅＩＦ−５ＡをコードするストレスｅＩＦ−５Ａの単離ポリヌクレオチドをも提供している。
【００６８】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％のアミノ酸配列相同性を有するストレスｅＩＦ−５ＡのストレスｅＩＦ−５Ａ単離ポリペプチドをも提供する。
【００６９】
本発明は同様に、ストレスｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドをも提供している。該アンチセンスポリヌクレオチドは、それが発現を阻害できるかぎり、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドは全長コーディング配列を含み、その他の特に好ましい実施形態においては、ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォームが３’ＵＴＲにおいてより高い変動度を有することから、アンチセンスポリヌクレオチドは３’ＵＴＲで導かれる。一部の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、５’−非コーディング配列で導かれる。主として５’−非コーディング配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害物質であるものとして知られている。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３:４２８４−４２９０（１９９３年）。
【００７０】
本明細書及び請求の範囲中で使用されている「ストレスｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、列挙された配列番号の補体の１００％相同性を共有するアンチセンスポリヌクレオチドを包含するだけでなく機能的変異体であるアンチセンスポリヌクレオチドをも内含する。機能的変異体というのは、ストレスｅＩＦ−５Ａの対応する部分に対し少なくとも８０％の配列相同性をもち、かかる部分と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、天然又は人工的な変異体である。さらに、変異体は、本発明により意図されるような機能を有していなければならない、すなわち発現ベクター内に導入された時点で内因性ストレスｅＩＦ−５Ａの発現を変調する能力を有しており、ここでかかるベクターは少なくとも１つの植物細胞のゲノム中に取込まれる。当業者であれば、転写物に結合しかつ遺伝子の発現を低減させるか又は阻害するアンチセンスポリヌクレオチドの能力に不利な影響を及ぼさないような非実質的な変化を配列の中に起こすことができる、ということがわかる。かくして、「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、転写物に対する実質的な相補性をもちかつ転写物に特異的に結合し遺伝子の発現を阻害するか又は低減させる能力をなおも維持するようなポリヌクレオチドを包含する。アンチセンスの一般的論述については、Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，「細胞の分子生物学」、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９年（特に本明細書に参考として内含されている１９５〜１９６頁）を参照のこと。
【００７１】
本発明の１実施形態は、（上述のような本発明の）ストレスｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドか又は、（上述のような本発明の）ストレスｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供している。ベクターは好ましくはプラスミドであり得、そうでなければ植物細胞又は細菌細胞内で上にコードされた遺伝子を複製し発現するものとして知られているウイルス又はその他のベクターであってよい。ベクターは、ストレスｅＩＦ−５Ａ  ＲＮＡの所望のアンチセンスポリヌクレオチドを産生するように転写され得るような形で、染色体的に統合された状態となる。かかるプラスミド又はウイルスベクターは、当該技術分野において標準的である組換え型ＤＮＡ技術方法によって構築され得る。例えば、ベクターは、原核生物宿主の中で機能的である複製系及び該発明に従ったアンチセンスポリヌクレオチドを含有するプラスミドベクターであり得る。代替的には、ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で機能的である複製系及び該発明に従ったアンチセンスポリヌクレオチドを含有するプラスミドであり得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中で複製可能であるプラスミドは、当該技術分野において周知である。例えば、Ｍｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，「植物内に外来性ＤＮＡを導入するための手順、植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法」、Ｂ．Ｒ．Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３年）、６７〜８３頁。
ベクターはさらに、上述の通り調節配列及びプロモーター調節要素を含む。
【００７２】
該発明は同様に、センス及びアンチセンス配向のストレスｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドを含む本発明のベクター又はベクター組合せで形質転換された遺伝子導入植物細胞、かかる細胞から生成された遺伝子導入幼植物又は成熟遺伝子導入植物、又は遺伝子導入植物の花、果実、葉、種子などといった植物部分を提供する。
【００７３】
本発明は同様に、内因性ストレスｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法を提供する。これらの方法は、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に、ストレスｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターを組込む段階を含む。ストレスｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドは転写され、内因性ストレスｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する。
【００７４】
内因性ストレスｅＩＦ−５Ａの発現を阻害するもう１つの方法においては、センス配向での本発明のストレスｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に組込まれる。ストレスｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性ストレスｅＩＦ−５Ａの同時発現は、内因性ストレスｅＩＦ−５Ａの発現のダウンレギュレーション又は阻害をひき起こす。
【００７５】
創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ
創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ３とも呼ばれる）は、創傷組織及び感染組織の中で発現される。本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、トマト、アルファルファ及びレタスを含むさまざまな植物の中の創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発見に関係する。当該発明人らは、このアイソフォームが植物の創傷事象又は病原体進入中にアップレギュレートされるということを発見した。図１２５は、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５ＡがＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ感染の後でアップレギュレートされるということを表わしている。アップレギュレーションは転写レベルで発生する。さらに、それは、毒性感染の後タンパク質レベルで専らアップレギュレートされ、これが次に細胞死を発生させ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａが病原体による進入の場合に細胞死を駆動しているという推論を導く。
【００７６】
ｅＩＦ−５Ａの創傷／病原体誘発型アイソフォームのダウンレギュレーションは病原体誘発型細胞死を阻害する。図１２６は、ｅＩＦ−５Ａの創傷／病原体誘発型アイソフォームのアンチセンス抑制が毒性病原体による感染を阻害するということを示している。遺伝子導入植物は、対照植物に比べ感染阻害の９９％超の増大を示した。図１２７〜１３０は、遺伝子導入カノーラ（ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス／病原体誘発型アイソフォーム）がＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する耐性を示すということを示している。
【００７７】
創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａは、壊死栄養性細菌及び真菌病原体による感染に付随するプログラミングされた細胞死を調節する。毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｔｏｍａｔｏ  ＤＣ  ３０００による感染から７２時間以内に、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａタンパク質は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型植物の葉の中で強くアップレギュレートされる。アップレギュレーションは、疾病の進行の可視的症候と一致する。その上、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａは、感染後に発現の増加を示す唯一のｅＩＦ−５Ａアイソフォームである。さらに、アップレギュレーションは、翻訳後調節されるものと思われる。疾病の発症における創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの役割をさらにテストするために、アンチセンスＴ−ＤＮＡ挿入を用いて構成的に抑制された創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ発現を伴う遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が開発された。抑制された植物は、毒性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ  Ｔｏｍａｔｏ  ＤＣ  ３０００に対する顕著な耐性を示し、一部の系統は、野生型植物との関係において９９％の細菌負荷減少を示した。病原体成長のこの抑制は、疾病の症候の不在と相関していた。同じ系統は同様に、壊死栄養性真菌病原体Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する強い耐性をも示した。結果は、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａが壊死栄養性真菌病原体により誘発されたプログラミングされた細胞死を調節すること及び創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの抑制により感染時点で宿主細胞が死に、次に通常は病原体の成長を支持する栄養素が放出されることを表わすものとして解釈されてきた。
【００７８】
図９は、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが対照植物、模擬処理済み植物、Ａｖｒ処理済み植物及びＶｉｒ処理済み植物の中では一定であり続けていることを示している（これは植物が４週齢であった時に検出されている）。しかしながら、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａは、Ｖｉｒ処理済み植物内でアップレギュレートされる。
【００７９】
図１０は、植物の葉を止血紺子で傷つけた実験の結果を示す。ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（「Ａｔ」）内の老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ及び成長ｅＩＦ−５Ａのレベルは、創傷直後、創傷から１時間後、及び９時間後に測定された。ノーザンブロットは、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが一定にとどまったものの創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現のレベルには顕著な増加が存在した、ということを示している。成長ｅＩＦ−５Ａの発現レベルは、創傷を受けた時点で減少し始めた。
【００８０】
当該発明人らは、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａがアップレギュレートされ（苗木が移植された場合に発生するように）創傷事象が植物に課せられた時点で、この創傷が結果として成長ｅＩＦ−５Ａの非常に強い抑制をもたらす、ということを実証してきた。図１４〜１７を参照のこと。結果として得られる植物は、非常に発育が不良である。しかしながら、種子をカノマイシンの中に浸漬させ、土壌に直接植え付けた場合（移植は不要であり、従って移植体創傷も無い）、種子は正常サイズの植物へと発達する。
【００８１】
全てセンス創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ構成体（図１５）を取込んださまざまなテスト植物の間に見られる差異は、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのさまざまな発現程度に起因している。当業者であれば、遺伝子が導入された（センス又はアンチセンス）時点で、遺伝子アップレギュレーション又はダウンレギュレーションのいずれかがさまざまな度合で得られるということがわかるだろう。差異の度合は、遺伝子が取込まれた場合及び取込まれたコピーの数によって左右される。可変的な発現の度合を有することにより、さまざまな表現型を遺伝子発現と相関させることができる。所望の表現型がひとたび産生されたならば、その植物を摘み取り、所望の後代を作り出すために用いることができる。かくして図１５では、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａについて強くアップレギュレートされた植物は、創傷事象の後ほとんど成長していないが（植物タグ１０）、わずかに良好に（ただし野生型ほどは良好でない）成長した植物（植物タグ４）はさほど強くアップレギュレートされなかった。
【００８２】
本発明の１つの実施形態は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の単離された創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図４１に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図４１に提供されており、配列番号  である。
【００８３】
本発明のもう１つの実施形態は、トマト由来の単離された創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１０３に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１０３に提供されており、配列番号  である。
【００８４】
本発明のもう１つの実施形態は、アルファルファ由来の単離された創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１３７に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１３７に提供されており、配列番号  である。
【００８５】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％の配列相同性を有し、高ストリンジェンシー条件下で該列挙された配列番号の補体へとハイブリッド形成し、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａをコードする創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの単離ポリヌクレオチドをも提供している。
【００８６】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％のアミノ酸配列相同性を有する創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ単離ポリペプチドをも提供する。
【００８７】
本発明は同様に、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドをも提供している。該アンチセンスポリヌクレオチドは、それが発現を阻害できるかぎり、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドは全長コーディング配列を含み、その他の特に好ましい実施形態においては、ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォームが３’ＵＴＲにおいてより高い変動度を有することから、アンチセンスポリヌクレオチドは３’ＵＴＲで導かれる。一部の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、５’−非コーディング配列で導かれる。主として５’−非コーディング配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害物質であるものとして知られている。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３:４２８４−４２９０（１９９３年）。
【００８８】
本明細書及び請求の範囲中で使用されている「創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、列挙された配列番号の補体の１００％相同性を共有するアンチセンスポリヌクレオチドを包含するだけでなく機能的変異体であるアンチセンスポリヌクレオチドをも内含する。機能的変異体というのは、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの対応する部分に対し少なくとも８０％の配列相同性をもち、かかる部分と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、天然又は人工的な変異体である。さらに、変異体は、本発明により意図されるような機能を有していなければならない。すなわち発現ベクター内に導入された時点で内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を変調する能力を有しており、ここでかかるベクターは少なくとも１つの植物細胞のゲノム中に取込まれる。当業者であれば、転写物に結合しかつ遺伝子の発現を低減させるか又は阻害するアンチセンスポリヌクレオチドの能力に不利な影響を及ぼさないような非実質的な変化を配列の中に起こすことができる、ということがわかる。かくして、「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、転写物に対する実質的な相補性をもちかつ転写物に特異的に結合し遺伝子の発現を阻害するか又は低減させる能力をなおも維持するようなポリヌクレオチドを包含する。
【００８９】
本発明の１実施形態は、（上述のような本発明の）創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドか又は、（上述のような本発明の）創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供している。ベクター、調節配列及びプロモーター調節要素は上述の通りである。
【００９０】
該発明は同様に、センス及びアンチセンス配向の創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドを含む本発明のベクター又はベクター組合せで形質転換された遺伝子導入植物細胞、かかる細胞から生成された遺伝子導入幼植物又は成熟遺伝子導入植物、又は遺伝子導入植物の花、果実、葉、種子などといった植物部分を提供する。
【００９１】
本発明は同様に、内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法を提供する。これらの方法は、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターを組込む段階を含む。創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドは転写され、内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する。
【００９２】
内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害するもう１つの方法においては、センス配向での本発明の創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に組込まれる。創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの同時発現は、内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現のダウンレギュレーション又は阻害をひき起こす。
【００９３】
内因性創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害することによって、結果として得られる遺伝子導入植物は、病原体の進入から発生する毒性損傷に対する増大した耐性を有する。病原体としては、バナナ中のＢｌａｃｋ  Ｓｉｇａｔｏｋａ（ブラックシガトカ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（レタス及び芝草の主要な真菌病）、Ｐｙｔｈｉｕｍ（温室野菜作物内の主要な真菌病）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅが含まれるが、これらに制限されるわけではない。実施例１６及び図４３及び４４を参照のこと。
【００９４】
成長ｅＩＦ−５Ａ
本発明は同様に、成長ｅＩＦ−５Ａにも関係する。成長ｅＩＦ−５Ａは、成長する組織内で発現される。ｅＩＦ−５Ａがセンス配向で成長ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドでアップレギュレートされた場合、種子サイズの増加、バイオマスの増加及び種子収量の増加という３つの表現型変化が指摘される。図１３２〜１３４を参照のこと。
【００９５】
本発明の１つの実施形態は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の単離された成長ｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図１に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図２に提供されており、配列番号  である。
【００９６】
本発明のもう１つの実施形態は、トマト由来の単離された成長ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１０１に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１０１に提供されており、配列番号  である。
【００９７】
本発明のもう１つの実施形態は、カノーラ由来の単離された成長ｅＩＦ−５Ａにある。アミノ酸配列は図９５に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図９５に提供されており、配列番号  である。
【００９８】
本発明のもう１つの実施形態は、アルファルファ由来の単離された成長ｅＩＦ−５Ａである。アミノ酸配列は図１４０に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１４０に提供されており、配列番号  である。
【００９９】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％の配列相同性を有し、高ストリンジェンシー条件下で該列挙された配列番号の補体へとハイブリッド形成し、成長ｅＩＦ−５Ａをコードする成長ｅＩＦ−５Ａの単離ポリヌクレオチドをも提供している。
【０１００】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％のアミノ酸配列相同性を有する成長ｅＩＦ−５Ａの単離ポリペプチドをも提供する。
本発明は同様に、成長ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドをも提供している。該アンチセンスポリヌクレオチドは、それが発現を阻害できるかぎり、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態においては、アンチセンスポリヌクレオチドは全長コーディング配列を含み、その他の特に好ましい実施形態においては、ｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォームが３’ＵＴＲにおいてより高い変動度を有することから、アンチセンスポリヌクレオチドは３’ＵＴＲで導かれる。一部の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、５’−非コーディング配列で導かれる。主として５’−非コーディング配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害物質であるものとして知られている。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３:４２８４−４２９０（１９９３年）。
【０１０１】
本明細書及び請求の範囲中で使用されている「成長ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、列挙された配列番号の補体の１００％相同性を共有するアンチセンスポリヌクレオチドを包含するだけでなく機能的変異体であるアンチセンスポリヌクレオチドをも内含する。機能的変異体というのは、成長ｅＩＦ−５Ａの対応する部分に対し少なくとも８０％の配列相同性をもち、かかる部分と高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成する、天然又は人工的な変異体である。さらに、変異体は、本発明により意図されるような機能を有していなければならない。すなわち発現ベクター内に導入された時点で内因性成長ｅＩＦ−５Ａの発現を変調する能力を有しており、ここでかかるベクターは少なくとも１つの植物細胞のゲノム中に取込まれる。当業者であれば、転写物に結合しかつ遺伝子の発現を低減させるか又は阻害するアンチセンスポリヌクレオチドの能力に不利な影響を及ぼさないような非実質的な変化を配列の中に起こすことができる、ということがわかる。かくして、「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、転写物に対する実質的な相補性をもち、かつ転写物に特異的に結合し遺伝子の発現を阻害するか又は低減させる能力をなおも維持するようなポリヌクレオチドを包含する。
【０１０２】
本発明の１実施形態は、（上述のような本発明の）成長ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドか又は、（上述のような本発明の）成長ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターを提供している。ベクター、調節配列及びプロモーター調節要素は上述の通りである。
【０１０３】
該発明は同様に、センス及びアンチセンス配向の成長ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドを含む本発明のベクター又はベクター組合せで形質転換された遺伝子導入植物細胞、かかる細胞から生成された遺伝子導入幼植物又は成熟遺伝子導入植物、又は遺伝子導入植物の花、果実、葉、種子などといった植物部分を提供する。
【０１０４】
本発明は同様に、内因性成長ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する方法を提供する。これらの方法は、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に、成長ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターを組込む段階を含む。成長ｅＩＦ−５Ａのアンチセンスポリヌクレオチドは転写され、内因性成長ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害する。
【０１０５】
内因性成長ｅＩＦ−５Ａの発現を阻害するもう１つの方法においては、センス配向での本発明の成長ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に組込まれる。成長ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性成長ｅＩＦ−５Ａの同時発現は、内因性成長ｅＩＦ−５Ａの発現のダウンレギュレーション又は阻害をひき起こす。
【０１０６】
本発明のもう１つの実施形態においては、成長ｅＩＦ−５Ａの発現をアップレギュレートする方法が提供されている。センス配向で本発明の成長ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチドを含む発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノム内に組込まれている。成長ｅＩＦ−５Ａのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性成長ｅＩＦ−５Ａの同時発現が原因となって細胞は非遺伝子導入細胞よりも多くの成長ｅＩＦ−５Ａを発現することになる。
【０１０７】
図１９は、成長ｅＩＦ−５Ａについてアップレギュレートされた植物が、対照植物のものに比べ増大したバイオマスを有していたことを示している。成長ｅＩＦ−５Ａは、成長ｅＩＦ−５Ａの発現をアップレギュレートするべくセンス配向でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物内に挿入された。一般的な成長ｅＩＦ−５Ａ発現レベルを決定するために、１６の母系統（１〜１６）が検定された。各々の母系統から、８個の姉妹系統が産生された（Ａ−Ｈ）。各母系統中の成長ｅＩＦ−５Ａの発現レベルをテストし、結果は図２０に示されている。母系統全体を通してさまざまな発現度に気付く。例えば、系統２及び１０は非常に高い発現レベルを有し、一方系統１１及び１６は、非常に低い発現を示すか又は全く発現を示さない。
【０１０８】
図２１及び２２は、系統１及び２からの植物を示す。これらの植物は、対照植物よりも大きい。成長ｅＩＦ−５Ａは細胞分裂アイソフォームであり、構成的に発現されることから、増大した細胞分裂が存在する。植物が成長モードにロックされ老化経路に対するスイッチを行なうことができないため、老化の減少が発生する。
【０１０９】
図２３及び２４は、成長ｅＩＦ−５Ａの中間的発現レベルを有していた系統に由来するものである。これらは、より大きな葉と遅延した老化を有すると思われる。
【０１１０】
図２５及び２６は、低いアップレギュレーションレベルを有していた系統に由来する。これらは大きな葉と大きなロゼットを有する。
【０１１１】
図２７及び２８は、（遺伝子の同時抑制に起因し得る）アップレギュレーションを全くもたない系統に由来する。植物はカノマイシン耐性であることから、植物が培地上で成長するためには、遺伝子が存在しなければならない。老化誘発型ｅＩＦ−５Ａは同様に、同時抑制され、従ってサイズの増加を発生させると思われる。
【０１１２】
バイオマスの増大に加えて、成長ｅＩＦ−５Ａがアップレギュレートされた植物の中には、種子サイズの増大も存在する。全ての系統の種子サイズが測定された。成長ｅＩＦ−５Ａの最高の発現レベルを有する系統内では、種子サイズの３倍超の増大が見られる。これは、成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションが細胞分裂を増大させ、かくして種子サイズを増大させるために発生する。
【０１１３】
上述の実施例における（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの）成長ｅＩＦ−５Ａは、構成的に発現されていた、すなわち、万能プロモーターの使用を通して植物内の至る所で発現されている。これとは対照的に、組織特異的プロモーターを使用することにより、特定の組織内でアップレギュレーションを導くことができる。例えば、種子特異的プロモーターを用いることにより、成長ｅＩＦ−５Ａは、種子内でアップレギュレートされるだけとなり、葉は正常に成長できることになるが、種子の量の増大を生み出すことになる。かくして、特異的プロモーターを用いると、成長ｅＩＦ−５Ａは所望の植物部分内でアップレギュレートされて、所望の表現型を得ることができる。
【０１１４】
成長ｅＩＦ−５Ａをアップレギュレートすることにより、少なくとも３つの表現型、つまりバイオマスの増大、種子収穫の増大又は種子サイズの増大が結果としてもたらされるが、３つの表現型全てが同時に（又は同じ植物内に）存在するわけではない。例えば、植物が種子サイズの増大を示す場合、より小さい植物が存在することになる。成長ｅＩＦ−５Ａの最高のアップレギュレーションを有していた植物系統では、最大の種子が産生されたが、該植物は、（より大きな葉のために必要とされる）細胞の拡大を犠牲にした全植物を通しての大規模な細胞分裂が進行していたことから、植物はより小さいものであった。より低い成長ｅＩＦ−５Ａ発現アップレギュレーションレベルでは、種子に対する影響無く、葉に対する影響（より大きい）が見られる。かくして、組織特異的発現を用い、所望の表現型を摘み取ることができる。例えば、産生された木質部の量の増加を達成するために木質部特異的プロモーターの下に成長ｅＩＦ−５Ａを置くことができる。かくして、所望の組織特異的アップレギュレーションを達成するために所望のプロモーターを使用することが可能である。
【０１１５】
成長ｅＩＦ−５Ａならびにその他のｅＩＦ−５Ａアイソフォームは、植物種全体にわたって高度に保存されている。図８５は、ヒプシン領域の保存度がきわめて高いことを表わす、複数の植物種からのさまざまなｅＩＦ−５Ａアイソフォームのアミノ酸整列を示している。実際、ｅＩＦ−５Ａは、非常に高レベルに保存されていることから、１つの植物成長ｅＩＦ−５Ａをコードする単離ポリヌクレオチドをセンス配向でもう１つの植物種の中に挿入し成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションを達成させることが可能である。図１６２は、ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの中にハコヤナギ成長センス配向を導入することの効果を示している。図１６２は、７週齢のＴ1植物を示している。大きい方の植物は、２つの異なる遺伝子導入系統に由来するものである。小さい方の植物は対照である。図１６３は、３つの別々の系統（系統２、３及び４と標識されている）に由来するＴ２植物を示し、「ＢＩＮ」と標識されている植物は、対照の空ベクターである。植物は２８日齢である。遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓは、対照植物に比べて増大した成長速度を有する。図１６４は、対照植物に比較して、３２日齢のＴ２植物（系統３）を示している。
【０１１６】
成長ｅＩＦ−５Ａの互換性のさらなる証拠は、図１６５に示されている。成長因子ｅＩＦ−５Ａは、３５Ｓプロモーターの制御下でセンス配向で、カノーラ成長因子ｅＩＦ−５Ａ又はａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ成長ｅＩＦ−５Ａ（全長）でカノーラの中でアップレギュレートされた。結果としての遺伝子導入植物は、野生型対照植物に比べ、種子収穫が増大していた。センス配向でａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ成長ｅＩＦ−５Ａを有する遺伝子導入カノーラ植物内及びセンス配向で外因性カノーラ成長ｅＩＦ−５Ａを有する遺伝子導入カノーラ植物内の種子収穫の増大は、きわめて類似している。
【０１１７】
ＤＨＳ
ＤＨＳは、ｅＩＦ−５Ａの活性化のために必要であり、老化しつつある組織の中で発現される。本発明は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、トマト、カーネーション、カノーラ、レタス、アルファルファ、バナナ、ハコヤナギ、酵母、ペチュニア及びｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ由来の単離ＤＨＳを提供する。
【０１１８】
かくして、本発明の１つの実施形態は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来の単離されたＤＨＳにある。アミノ酸配列は図４６に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図４６に提供されており、配列番号  である。
【０１１９】
本発明のもう１つの実施形態は、トマト由来の単離されたＤＨＳである。アミノ酸配列は図４５Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図４５Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。
【０１２０】
本発明のもう１つの実施形態は、カーネーション由来の単離されたＤＨＳにある。アミノ酸配列は図５４に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図５４に提供されており、配列番号  である。
【０１２１】
本発明のもう１つの実施形態は、カノーラ由来の単離されたＤＨＳである。アミノ酸配列は図９７に提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図９７に提供されており、配列番号  である。
【０１２２】
本発明のもう１つの実施形態は、レタス由来の単離されたＤＨＳである。図１０５はレタスＤＨＳポリヌクレオチド配列の一部分を提供している。
本発明のもう１つの実施形態は、アルファルファ由来の単離されたＤＨＳにある。アミノ酸配列は図０１７Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図１０７Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。
【０１２３】
本発明のもう１つの実施形態は、バナナ由来の単離されたＤＨＳである。アミノ酸配列は図１０８Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは図１０８Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。
【０１２４】
本発明のもう１つの実施形態は、ハコヤナギ由来の単離されたＤＨＳにある。アミノ酸配列は図１０９Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。アミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、図１０９Ａ及びＢに提供されており、配列番号  である。
【０１２５】
本発明のもう１つの実施形態は、ｍｙｃｏｓｈａｅｒｅｌｌａ由来の単離されたＤＨＳである。配列は図１１０に提供されている。
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％の配列相同性を有し、高ストリンジェンシー条件下で該列挙された配列番号の補体へとハイブリッド形成し、ＤＨＳをコードするＤＨＳの単離ポリヌクレオチドをも提供している。
【０１２６】
本発明は同様に、以上で列挙した配列番号に対する６５〜１００％のアミノ酸配列相同性を有するＤＨＳのＤＨＳ単離ポリペプチドをも提供する。図４７及び図４８（ａ）及び（ｂ）は、種全体にわたってきわめて保存度の高いＤＨＳの性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸アライメントを提供している。
【０１２７】
本発明は同様に、ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチドをも提供している。該アンチセンスポリヌクレオチドは、全長コーディング配列を含んでいてよく、又は３’ＵＴＲで方向づけされ得、そうでなければ５−非コーディング配列で方向づけされ得る。主として５’−非コーディング配列に相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現の有効な阻害物質であるものとして知られている。Ｂｒａｎｃｈ，Ｍ．Ａ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３:４２８４−４２９０（１９９３年）。アンチセンスポリヌクレオチドは、それらが発現を阻害できるかぎり、任意の長さのものであってよい。
【０１２８】
本明細書及び請求の範囲中で使用されている「ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、列挙された配列番号の補体の１００％相同性を共有するアンチセンスポリヌクレオチドを包含するだけでなく機能的変異体であるアンチセンスポリヌクレオチドをも内含する。機能的変異体というのは上述の通りである。変異体は、本発明により意図された通りに機能し、発現ベクター内に導入された時点で内因性ＤＨＳの発現を変調する能力を有し、ここでかかるベクターは少なくとも１つの植物細胞のゲノム内に取込まれている。
【０１２９】
本発明は同様に、ＤＨＳのセンスポリヌクレオチドをも提供する。センスポリヌクレオチドは全長コーディング配列を含んでいてよく、又、３’ＵＴＲで導かれ得、そうでなければ５’−非コーディング配列にて導かれ得る。センスポリヌクレオチドは、それが同時抑制を通して発現をダウンレギュレートできるか又は代替的には発現をアップレギュレートできるかぎり、任意の長さのものであり得る。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態は、（上述の通りの本発明の）ＤＨＳポリヌクレオチド又は（上述の通りの本発明の）ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチド又は（上述の通りの本発明の）ＤＨＳのセンスポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ベクターは上述の通りである。
【０１３１】
該発明は同様に、センス及びアンチセンスのいずれかの配向のＤＨＳのポリヌクレオチドを含む本発明のベクター又はベクター組合せで形質転換された遺伝子導入植物細胞、かかる細胞から生成された遺伝子導入幼植物又は成熟遺伝子導入植物、又は遺伝子導入植物の花、果実、葉、種子などといった植物部分を提供する。
【０１３２】
本発明は同様に、内因性ＤＨＳの発現を阻害する／減少させる方法を提供する。これらの方法は、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に、ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチドを含む本発明の発現ベクターを組込む段階を含む。ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチドは転写され、内因性ＤＨＳの発現を阻害する／減少させる。結果としての植物は、増大したバイオマス、増大した種子収量及びより長い保管寿命を有する。
【０１３３】
例えば、図６５〜６８は、アンチセンス構成体によりもたらされるＤＨＳのダウンレギュレーションを有するａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に比較した野生型ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の写真を示している。アンチセンスａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ構成体でダウンレギュレートされたＤＨＳを有するａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物は、（ＤＨＳのダウンレギュレーションをもたない）野生型ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに比べて増大したバイオマスを有する。図１５３及び１５４を参照のこと。さらに、図６９及び１５５は、ダウンレギュレートされたＤＨＳ  ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が野生型植物に比べ増大した種子収量を有することを例示している。図１５６は、ＤＨＳのダウンレギュレーションが根の発達を増大させることを示している。アンチセンス配向でのａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ（配列番号３０）の３’領域又は全長のいずれかをもつａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換するのに使用されるさまざまな構成体を描写する実施例１３を参照のこと。
【０１３４】
実施例１４及び１５は、アンチセンス配向でのトマトＤＨＳの３’領域又は全長を有するトマト植物の形質転換について記述している。図７０〜７９は、結果としてのトマト植物が、野生型トマト植物に比べて遅延したトマト軟化及び損傷を有するということを示している。図８４（ａ）及び８４（ｂ）は、アンチセンス配向でトマトＤＨＳで形質転換されたトマトの尻腐れ発生率が低くなり、かくして、ＤＨＳの発現の低下により生理病から発生する組織及び細胞の死の開始が妨げられるということを表わしている、ということを示すトマト果実の写真である。
【０１３５】
カノーラにおけるＤＨＳ発現の抑制は、植物バイオマスを増大させ、種子収穫を増加させる。実施例２８及び図１５７〜１６１を参照のこと。図１５７は、葉質量の増加により実証される通り、遺伝子導入カノーラがバイオマスを増大させたということを示している。図１５８は、カノーラの遺伝子導入系統の１つにおけるＤＨＳの部分的ダウンレギュレーションを示すウェスタンブロットの結果を示している。図１５９は、カノーラにおけるＤＨＳのダウンレギュレーションが結果としてより大きい長角果をもたらすことを示している。図１６０は、カノーラにおけるＤＨＳのダウンレギュレーションが、種子収穫の増大を結果としてもたらすということを示している。図１６１（ａ）は、「種子重量あたり」ベースで表わしたトリアシルグリセロールの合計収量を例示している。これは、種子１つあたりの油の数量の変化が全くないことを実証している。かくして、種子収穫の最高６５％の増大は、種子油の最高６５％の増大という結果になる。図１６１（ｂ）は、ＤＨＳがダウンレギュレートされたカノーラ植物内の油の脂肪酸組成には、いかなる変化もないことを例示している。
【０１３６】
図９９は、植物に対してわずかなストレス（致死下）を与える、小さい鉢の中でカノーラ植物を成長させた実験の結果を示している。ＤＨＳがダウンレギュレートされた時点で、種子収穫の増大を観察することができる。カノーラＤＨＳの３’ＵＴＲは、アンチセンスヌクレオチドとして使用された。アンチセンスポリヌクレオチドは、３５Ｓプロモーターを用いて構成的に発現された。構成性プロモーターを用いて、ＤＨＣアンチセンスポリヌクレオチドは、植物全体の成長及び発達全体を通して発現される。植物が致死下ストレス（例えば過度に小さい鉢の中で成長させられること又は次善の成長条件期間など）発生に曝露された場合、植物は、老化経路に入る可能性がある。しかしながら、植物が低減したＤＨＳ発現をもつ遺伝子導入植物である場合、植物は、致死下ストレスを受けた場合でも老化モードに入らない。図９９は、ＤＨＳがダウンレギュレートされた植物におけるカノーラの収量の増加を示す。図９９はＴ1〜Ｔ4の世代及び特定の植物系統（「Ｐ」及び「Ｔ」系統として呼称されている）の特定のＴ4世代を示す。
【０１３７】
カーネーションにおいてＤＨＳをダウンレギュレートすると、花は長い花瓶寿命を有することになる。図２９は、アンチセンス構成体の使用ならびにＤＨＳ反応の阻害物質の使用によりもたらされるダウンレギュレーションが花の保管寿命を最高８３％延長させるということを示している。
【０１３８】
アンチセンスＤＨＳを有する遺伝子導入バナナは、野生型に比べ植物が大きいことによって証明されるように、増大したバイオマスを示す。図１３１を参照のこと。遺伝子導入植物からの果実は同様に、野生型に比べ損傷の遅延を示す。図１１４を参照のこと。バナナＤＨＳをコードするヌクレオチドを、３５Ｓプロモーター又は果実特異的プロモーター（ｐＰＤＫ）のいずれかの制御下でアンチセンス配向でベクター内に挿入した。全長バナナＤＨＳ又は３’ＵＴＲのいずれかを使用した。
【０１３９】
市販の予備包装されたサラダは一般に、人工空気条件下で保管され、これにより酸素レベルは、その大気濃度よりも大幅に低減され製品の保管寿命を延ばしている。損傷を受けた予備包装済みサラダの最も一般的な症候は、レタスのカット表面上の褐変である。人工空気包装はまさに褐変の遅延を達成するものの、それは同様に、結果としてオフオーダー及びオフフレーバーももたらし得る。ＤＨＳのダウンレギュレーションは、レタスのカット表面上の褐変を遅延させるための代替的戦略としての潜在的可能性を有することが示されている。ｍＲＮＡの精選された集団のための核細胞質間シャトルタンパク質として作用する真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ５Ａ）の活性化の触媒としてＤＨＳが作用する。ＤＨＳは、（アンチセンス技術による）ＤＨＳの抑制の結果大気条件下での褐変の開始の著しい遅延がもたらされたことから、カットレタスの褐変において１つの役割を果たすように思われる。具体的には、野生型レタス植物の切片の８０％が、切断後６日目に褐変を示したのに対し、５つの分離型系統由来の遺伝子導入植物の切片の平均２７％しか同じ期間で褐色にならず、一部の個別植物は褐変率０％を示した。アンチセンス構成体の使用を通してのレタスにおけるＤＨＳ発現の抑制は、結果として、野生型レタスに比べたカットレタスの褐変の開始の遅れをもたらす。実施例２７及び図１４９〜１５１を参照のこと。
【０１４０】
ジャトリファクルカ（Ｊａｔｒｏｐｈａ  ｃｕｒｃａ）Ｌは、その高い含油量で知られる植物であり、場合によってはバイオ燃料の供給源となり得る。種子から絞り出される透明な油は、照明及び潤滑用に使用されてきており、より最近では、エネルギー用途に提案されており、１トンの木の実は７０ｋｇの精油、４０ｋｇの「軽油（ｇａｓｏｉｌ  ｌｅｇｅｒ）」（軸量燃料油）、４０ｋｇのレギュラー燃料油、３４ｋｇの乾燥タール／ピッチ／ロジン、２７０ｋｇのコークス様炭化物及び２００ｋｇのアンモニア水、天然ガス、クレオソートなどを生成できる。かくして、種子収穫（ひいては含油量）を増強させる能力が、貴重であることが判明するかもしれない。種子収穫の増大は、３つの戦略を通して達成可能である。第１の戦略には、構成的に成長ｅＩＦ−５Ａをアップレギュレートすることが関与している。好ましくは、これは、同時抑制の可能性を最小限におさえるべく、成長ｅＩＦ−５Ａの異種アイソフォームで（すなわちカノーラ又はａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ成長ｅＩＦ−５Ａを用いて）行なわれる。これには、２種の効果がある。すなわち、それを活性化（ヒプシン化）するのに利用できるＤＨＳよりも多くのｅＩＦ−５Ａが産生されていることから、ヒプシン化成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションが存在すると同時に、非ヒプシン化老化ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションも存在する。いかなる植物成長ｅＩＦ−５Ａでも使用でき、例えば、トマト又はハコヤナギ成長ｅＩＦ−５ＡをＪａｔｒｏｐｈａ（ジャトロファ属）の中で使用することができる。第２の戦略には、通常ヒプシン化される保存リジンがアラニンに転換されている突然変異を受けた老化ｅＩＦ−５Ａを構成的にアップレギュレートすることが関与している。この突然変異を受けたｅＩＦ−５Ａは、ヒプシン化（活性化）され得ず、その非ヒプシン化形態で成長を促進する。突然変異を受けた老化ｅＩＦ−５Ａを有する遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が野生型ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物よりも大きいことを示す図１６６及び１６７を参照のこと。より大きい植物は、より多くの花茎及びより多くの種子を有する。同様に、非ヒプシン化老化ｅＩＦ−５Ａは植物に対し、増強された窒素利用効率を付与し、かくして、それらが土壌内の低窒素条件下で対照植物の能力を陵ぐことができるようにする。第３の戦略には、ＤＨＳを構成的にダウンレギュレートすることが関与する。植物は適切に機能するのに幾分かのＤＨＳを必要とするため、これはＤＨＳの部分的ダウンレギュレーションでなくてはならない。しかし上で見てきたように、ＤＨＳの部分的ダウンレギュレーションは、おそらくは非ヒプシン化老化ｅＩＦ−５Ａの蓄積を理由として、成長を実質的に促進し、種子収穫を増大させる。
【０１４１】
図４７及び１４８（ａ）及び（ｂ）は、さまざまなＤＨＳのアミノ酸アライメントを示し、ＤＨＳが非常に高い保存度を示すことを明らかにしている。図１４８（ａ）及び（ｂ）は、ＤＨＳの非常に高い保存度を示すリジンならびにその他の領域を標示する。実際には、ＤＨＳは、きわめて保存度が高いことから、１つの植物ＤＨＳをコードする単離されたポリヌクレオチドをアンチセンス配向でもう１つの植物種の中に挿入しＤＨＳのダウンレギュレーションを達成することが可能である。
【０１４２】
図１００は、植物成長のための能力を増強することによってなされる）カノーラ収量を測定する棒グラフを示す。この図は、成長ｅＩＦ−５Ａ発現を増大させること（センス構成体の使用）又はＤＨＳの発現を増大させる（センス構成体の使用）ことの両方により収量を増大させることができるということを示している。「カノーラ」と標識された第２の棒は、センス配向でカノーラＤＨＳを使用することによりカノーラＤＨＳをアップレギュレートした時点で達成される増大を示している。第４の棒は、カノーラ植物内でセンス配向でトマトＤＨＳを使用することによるカノーラ収量の増加を示している。
【０１４３】
内因性ＤＨＳの発現を阻害するもう１つの方法においては、センス配向での本発明のＤＨＳポリヌクレオチドを含有する発現ベクターが、植物の少なくとも１つの細胞のゲノムの中に組込まれる。ＤＨＳのポリヌクレオチドは転写され、結果としてもたらされる外因性ＤＨＳの同時発現は、内因性ＤＨＳの発現のダウンレギュレーション又は阻害をひき起こす。
【０１４４】
内因性ＤＨＳの発現を阻害することにより、結果として得られる遺伝子導入植物は、ｅＩＦ−５Ａを活性化するためのＤＨＳタンパク質を全く又は実質的に有していない。先に論述した通り、ｅＩＦ−５Ａは、それを生物学的に有用なものにするべく活性化されなくてはならない。かくして、センスポリヌクレオチドでの同時抑制によって又はアンチセンスポリヌクレオチドによってのいずれかによりＤＨＳの発現を阻害するか又は低減させることによって、結果として得られる遺伝子導入植物は、活性ｅＩＦ−５Ａを全くもたないか又は低減させているかのいずれかとなる。これらの遺伝子導入植物は、植物のバイオマス増加、種子収穫の増加及び／又は種子サイズの増大を示すことになる。ＤＨＳのアンチセンスポリヌクレオチドを有する遺伝子導入植物は、光合成の増加を示すと同時に、でんぷん含有量を増大させる。実施例２４及び２５を参照のこと。
【０１４５】
本発明は同様に、ＤＨＳのアップレギュレーションをも提供する。アップレギュレーションをひき起こすために植物の中にセンスＤＨＳを提供することにより、結果として得られる植物は、増大した量のＤＨＳを有する。結果として得られる遺伝子導入植物は、増大したバイオマス及び種子収穫を有する。
【０１４６】
ＤＨＳ及びｅＩＦ−５Ａが老化における調節の役割を果たすという主張を裏づけるさらなる証拠は、ＤＨＳに特異的な阻害物質でカーネーションの花を処理することによって提供された。スペルミジン及びｅＩＦ−５Ａは、ＤＨＳ反応の基質である（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７年）。スペルミジンに類似した構造的特長を有するいくつかのモノ、ジ、及びポリアミンが、インビトロでＤＨＳを阻害する（Ｊａｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３年）。カーネーションの花瓶寿命を延長させるために、一般に一部のポリアミン、例えばスペルミジン、プトレッシン及びスペルミンが用いられてきた（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，１９８０年）。異なる濃度の異なるポリアミンでの処理を通して、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（未公開ｂ）はカーネーションの花の花瓶寿命を２倍延ばすことができた。ＤＨＳをダウンレギュレートするために過渡的感染システムを利用するさらなる研究が進行中である。予備データは、生存率が、未処理の花に比べアンチセンスＤＨＳを発現する過渡的感染系の真空浸潤を受けたカットカーネーションにおいて、８日目でほぼ４倍高いものであることを示している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，未公開ｂ）。
【０１４７】
ストレスに起因する成長損失以外の農業におけるさらなる多大な損失は、収穫後のストレス誘発型老化である（ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年）。これは、カットレタスといったような部分的に加工された植物について言えることである。レタスをカットすることによる症候は、フェノール成分の産生の結果である褐変である（Ｍａｔｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９年）。レタスｅＩＦ−５Ａ（ＬｅＩＦ−５Ａ）のアンチセンスポリヌクレオチド又はアンチセンス全長ＤＨＳでのレタスの野外実験は、遺伝子導入レタスが対照レタスに比べ、切断後褐変に対しはるかに高い耐性を有することを実証した。図１４９〜１５１を参照のこと。収穫に起因するストレス誘発型老化が全く異なる回路を有するとしても（Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年）、褐色及び恐らくはその他の老化兆候の上流側での翻訳制御は、少なくとも部分的にはＤＨＳ及びｅＩＦ−５Ａにより調節される。老化の調節の下流は、実行遺伝子である。これらは、老化のエフェクタであり、老化症候群をひき起こす代謝変化の原因となる。ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳは、ダウンレギュレートされた時点で、老化によりひき起こされる症候の全範囲を弱めさせる能力を有すると思われる。
【０１４８】
実施例１は、さまざまな植物における単離及びＤＨＳをコードするｍＲＮＡについて記述している。実施例２は、ソルビトールでトマト葉を処理することによるトマト内の老化誘発型ＤＨＳの誘発について記述する。図５２及び６２は、葉をソルビトールで処理した場合にＤＨＳ発現が増大させられることを示している。実施例３及び図５０及び６３は、老化しつつある花においてＤＨＳがアップレギュレートされていることを示す。実施例４及び図５１及び６１は、成熟果実においてＤＨＳがアップレギュレートされていることを示している。
【０１４９】
本発明は同様に、（老化誘発型因子ｅＩＦ−５Ａ）；（創傷因子ｅＩＦ−５Ａ）及び（成長因子ｅＩＦ−５Ａ）というｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォームを認識する抗体にも関係する。
【０１５０】
本発明は同様に、その他の植物及び真菌において老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、成長ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳを同定する方法をも提供する。本明細書で記述されている方法及び提供されている配列を使用することにより、所望のアイソフォーム又はＤＨＳを単離／同定するようにプローブが設計される。ｅＩＦ−５Ａのアイソフォーム（老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ、及び成長ｅＩＦ−５Ａ）はコーディング領域内で高い相同性を有することが多いことから（図２参照）、所望のアイソフォームの同定を確保しさらにはその増殖を改変させるべく、プローブ又はプライマーは好ましくは５’ＵＴＲの始めから、及び３”ＵＴＲの終りで設計される（図３、４及び５を参照のこと）。創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの増幅のためのプライマーと創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの同定のためのプローブの好ましいセットは、以下の通りである。下流プライマーは、５’ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＴＡＡ  ＧＡＡＡＣ３’（配列番号  ）である。上流プライマーは、５’ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＡＧＧ３’（配列番号  ）である。
【０１５１】
植物又は植物の一部分から創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａを単離する前に、植物が創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａを発現し始めることができるようにするため創傷事象を導入することが最良である。いかなる創傷事象も受容可能であり、かかる創傷事象の一例としては、中心静脈で葉を押しつぶすことが含まれていた。同様にして、老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを単離する前には、老化を誘発するために植物組織にストレスを与えることが最良である。
【０１５２】
以上で該発明についての一般的な記述を行なってきたが、例示を目的として提供され該発明を制限することを意図していない以下の実施例を参照することにより、本発明をより容易に理解できることであろう。
【実施例】
【０１５３】
実施例
実施例１
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の単離
さまざまな発育段階のトマトの花及びトマトの果実から、及び（未処理の又は低温処理又はソルビトール処理後の）葉から、総ＲＮＡを単離した。組織（５ｇ）を液体窒素内で短時間すりつぶした。すりつぶした粉末を３０ｍｌのグアニジン緩衝液（４Ｍのイソチオシアン酸グアニジン、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％のメルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスを通してろ過し、３０分間４℃で１０，０００×ｇで遠心分離した。その後、２０時間、２６０００×ｇで塩化セシウム密度勾配遠心分離に付した。７５％のエタノールで、ペレット化したＲＮＡを洗い流し、６００μｌのＤＥＰＣ処理済み水の中で再懸濁させ、ＲＮＡを０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３ＭＮａＯＡｃを用いて−７０℃で沈殿させた。１０μｇのＲＮＡを、１．２％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。一晩４２℃で膜をプローブ探査するために、ランダムプライミングされた32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識済み全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を使用した。その後、１５分間室温で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣの中で一回、各１５分間６５℃で０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で３回、膜を洗浄した。膜を−７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１５４】
ＰｏｌｙＡ+トラクトｍＲＮＡ単離システムを用いて総ＲＮＡからＰｏｌｙＡ+ｍＲＮＡを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｃＤＮＡ合成系を用いたｃＤＮＡ合成のための鋳型として、ＰｏｌｙＡ+ｍＲＮＡを使用した。
【０１５５】
トマト葉ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
６時間２Ｍのソルビトールに曝露されたＭａｔｃｈ  Ｆ１ハイブリッドトマトの葉から単離させたｍＲＮＡを用いて作られたｃＤＮＡライブラリーを、約５×１０6ＰＦＵ／ｍｌまで希釈した。32Ｐ−標識済みの６００ｂｐのＲＴ−ＰＣＲフラグメントを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。３つの陽性ｃＤＮＡクローンを切除し、メーカーの指示事項の中の方法を用いて、ｐＢＫ−ＣＭＶ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージミドの中に再循環させた。全長ｃＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶベクター内に挿入した。
【０１５６】
プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡの配列決定
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）によって記述されたアルカリ溶菌法を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列決定方法を用いて全長陽性ｃＤＮＡクローンを配列決定した。Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４:５４６３−５４６７。ＢＬＡＳＴ探査（ＧｅｎＢａｎｋ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて読取り枠をコンパイルし分析し、ＢＣＭ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒ:多重配列整列パターン誘発型多重整列方法（Ｆ．Ｃｏｒｐｅｔ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６:１０８８１−１０８９０，（１９８７年）を参照のこと）を用いて、コードされた遺伝子の誘導されたアミノ酸配列と５つの最も相同性の高いタンパク質の整列を達成した。誘導されたアミノ酸配列の中に存在する機能的モチーフを、ＭｕｌｔｉＦｉｎｄｅｒにより同定した。
【０１５７】
トマトＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション
１％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で、さまざまな段階（つぼみと花そして広く開いているか又は乾燥しかけている老化花弁）のトマトの花、トマト葉及びさまざまな成熟段階（催色期（すなわち赤色が１０％未満の熟していない果実）、桃熟期（すなわち果実全体がオレンジ色又はピンクである）、及び軟質又は硬質の完熟期）にあるトマト果実から単離された１０μｇの総ＲＮＡを分離し、ナイロン膜上で固定化した。フィルター（７×１０7ｃｐｍ）をプローブ探査するために、ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで標識された全長トマトｃＤＮＡを用いた。フィルターを、室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回、そして６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。フィルターを乾燥させ、−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに曝露した。結果は図５０〜５２に示されている。
【０１５８】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション
５週齢（レーン１）、６週齢（レーン２）及び７週齢（レーン３）におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉からの総ＲＮＡを、上述の通りに単離し、１％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上で固定化した。フィルター（７×１０7ｃｐｍ）をプローブ探査するために、ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで標識された全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ＤＨＳ  ｃＤＮＡを用いた。フィルターを、室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回、そして６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。フィルターを乾燥させ、−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに曝露した。結果は図５５に示されている。
【０１５９】
カーネーションＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション
花の発達のさまざまな段階、即ち固いつぼみの花（レーン１）、開花し始め（レーン２）完全開花の花（レーン３）、及び花弁が巻き込んだ花（レーン４）にけるカーネーション植物の花弁からの総ＲＮＡを、上述の通りに単離し、１％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上で固定化した。フィルター（７×１０7ｃｐｍ）をプローブ探査するために、ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて32Ｐ−ｄＣＴＰで標識された全長カーネーション老化誘発型ＤＨＳｃＤＮＡを用いた。フィルターを、室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回、そして６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３回洗浄した。フィルターを乾燥させ、−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに曝露した。結果は図５６に示されている。
【０１６０】
実施例２
トマト老化誘発型ＤＨＳ遺伝子のソルビトール誘発
密封したチャンバー内で６時間２Ｍのソルビトールを用いてトマトの葉を処理した。以下のとおりに、ソルビトール処理済の葉からＲＮＡを抽出した。
【０１６１】
葉（５ｇ）を液体窒素内ですりつぶした。すりつぶした粉末を３０ｍｌのグアニジン緩衝液（４Ｍのイソチオシアン酸グアニジン、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％のメルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスを通してろ過し、３０分間４℃で１０，０００×ｇで遠心分離した。その後、２０時間、２６，０００×ｇで塩化セシウム密度勾配遠心分離に付した。７５％のエタノールで、ペレット化したＲＮＡを洗い流し、６００μｌのＤＥＰＣ処理済み水の中で再懸濁させ、ＲＮＡを０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃを用いて−７０℃で沈殿させた。１０μｇのＲＮＡを、１．２％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。一晩４２℃で膜をプローブ探査するために、ランダムプライミングされた32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識済み全長ＤＨＳｃＤＮＡ（配列番号１）を使用した。その後、１５分間室温で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣの中で一回、各１５分間６５℃で０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で３回、膜を洗浄した。膜を−７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。
結果は、図５２に示されている。ここでわかるように、ＤＨＳの転写がソルビトールにより葉の中で誘発されている。
【０１６２】
実施例３
老化しつつある花におけるトマトＤＨＳの誘発
トマト植物の硬い花のつぼみ及び開いた老化しつつある花を収穫し、実施例２にある通りにＲＮＡを単離した。１０μｇのＲＮＡを、１．２％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。一晩４２℃で膜をプローブ探査するために、ランダムプライミングされた32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識済み全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を使用した。その後、１５分間室温で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣの中で一回膜を洗浄し、各１５分間６５℃で０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で３回、洗浄した。膜を−７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。
結果は図５０に示されている。ここでわかるように、ＤＨＳの転写が老化しつつある花の中で誘発されている。
【０１６３】
実施例４
成熟中の果実におけるトマトＤＨＳの誘発
実施例２の通りに、催色期、桃熟期及び完熟期の果実からＲＮＡを単離した。１０μｇのＲＮＡを、１．２％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。一晩４２℃で膜をプローブ探査するために、ランダムプライミングされた32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識済み全長ＤＨＳｃＤＮＡ（配列番号１）（図４５）を使用した。その後、１５分間室温で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣの中で一回膜を洗浄し、各１５分間６５℃で０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で３回、洗浄した。膜を−７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。
結果は図５０に示されている。ここでわかるように、老化の開始直前の完熟した赤色果実においてＤＨＳの転写が最も強く、損傷へと導いている。
【０１６４】
実施例５
低温によるトマト老化誘発型ＤＨＣ遺伝子の誘発
鉢植えのトマト植物（７〜８週齢）を、成長チャンバー内で２日、３日又は６日間６℃に曝露した。照明サイクルを、暗所８時間、照明１６時間にセットした。植物を温室に戻すことで再度温めた。再度温めなかった植物は、成長チャンバーから取出した直後に収穫した。以下の通り、葉からＲＮＡを抽出した。
【０１６５】
葉（５ｇ）を液体窒素内ですりつぶした。すりつぶした粉末を３０ｍｌのグアニジン緩衝液（４Ｍのイソチオシアン酸グアニジン、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％のメルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスを通してろ過し、３０分間４℃で１０，０００×ｇで遠心分離した。その後、２０時間、２６，０００×ｇで塩化セシウム密度勾配遠心分離に付した。７５％のエタノールで、ペレット化したＲＮＡを洗い流し、６００μｌのＤＥＰＣ処理済み水の中で再懸濁させ、ＲＮＡを０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃを用いて−７０℃で沈殿させた。１０μｇのＲＮＡを、１．２％の変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移した。一晩４２℃で膜をプローブ探査するために、ランダムプライミングされた32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識済み全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を使用した。その後、１５分間室温で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣの中で一回、各１５分間６５℃で０．１％のＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ中で３回、膜を洗浄した。膜を−７０℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。
【０１６６】
結果は、図５３に示されている。ここでわかるように、低温に曝露し、その後、再度温めることにより葉の中でＤＨＳの転写が誘発され、増強された転写は、膜の漏れやすさとして測定される低温損害と相関関係をもつ。
【０１６７】
実施例６
未同定のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム配列に基づいたプライマーを用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＰＣＲ産物の生成
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃＤＮＡ鋳型からの部分長老化誘発型ＤＨＣ配列を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノム配列から設計された一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより生成した。５’プライマーは、配列５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴ５ＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号７）を有する１９−ｍｅｒであり；３’−プライマーは、配列ＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号８）を有する２０ｍｅｒである。鋳型としてのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化葉ｃＤＮＡライブラリー及びＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応が、以下の通りに実施された。
【０１６８】
反応構成要素
反応成分：
ｃＤＮＡ                                １μｌ（５×１０7ｐｆｕ）
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）                  １μｌ
ＭｇＣｌ2（５ｍＭ）＋１０倍緩衝液      ５μｌ
プライマー１及び２（各１００μＭ）        ２μｌ
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ  １．７５Ｕ
反応体積                                ５０μｌ
反応パラメータ：
３分間９４℃
４５サイクル、９４℃／１分、５８℃／１分、７２℃／２分、
１５分間７２℃
【０１６９】
実施例７
ゲノミックＤＮＡの単離及びサーザン分析
液体窒素下で１０グラムのトマト葉組織を細かい粉末へとすりつぶすことにより、トマト葉からゲノミックＤＮＡを抽出した。６０℃に予め温められた２５ｍｌの均質化緩衝液［１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍｍ  ＥＤＴＡ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％サルコシル、１％の２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ、及び１２．５ｍｌのフェノール］を含有する混合物３７．５ｍｌを、すりつぶした組織に添加した。混合物を１５分間振とうさせた。混合物に対し付加的な１２．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、さらに１５分間振とうさせた。混合物を遠心分離し、水相を２５ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で再抽出した。室温で１５ｍｌのイソプロパノールを用いた沈殿により、核酸を回収した。沈殿物を水１ｍｌ中で再懸濁させた。
【０１７０】
以下の通りのゲノミックＤＮＡを制限酵素消化に付した：１０μｇのゲノミックＤＮＡ、４０μｌの１０倍反応緩衝液及び１００Ｕの制限酵素（ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ又はＨｉｎＤＩＩＩ）を、合計４００μｌの反応体積中で５〜６時間反応させた。その後、混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。消化したＤＮＡを、約１５時間、１５ボルトで０．８％のアガロースゲル上のアガロースゲル電気泳動に付した。ゲルを変性緩衝液［８７．６６ｇのＮａＣｌ及び２０ｇのＮａＯＨ／リットル］中に、穏やかに攪拌しながら３０分間沈め、精製水中で洗い流し、３０分間穏やかに攪拌しながら中和緩衝液［８７．６６ｇのＮａＣｌ及び６０．５５ｇのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／リットル］中に沈めた。ＤＮＡを、毛管ブロッティングによりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+ナイロン膜に移した。
【０１７１】
１×１０6ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ−ｄＣＴＰで標識された全長ＤＨＳｃ  ＤＮＡ又はＤＨＳ  ｃＤＮＡクローンの３’−非コーディング領域を用いてハイブリダイゼーションを実施した。５０％のホルムアミド、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性済みサケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中で、予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを実施した。膜を２〜４時間予備ハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーションを一晩実施した。
【０１７２】
ハイブリダイゼーションが完了した時点で、膜を２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で室温で洗い流し、その後２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５分間そして０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５分間洗い流した。その後、−８０℃でＸ線フィルムに膜を曝露した。結果は図４９に示されている。
【０１７３】
実施例８
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の単離
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉の中で発現された全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを、鋳型としてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの老化する葉ｃＤＮＡライブラリーを使用してＰＣＲによって得た。最初に、遺伝子の５’及び３’末端に対応するＰＣＲ産物を、Ｔ７プライマー＜ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ＞（配列番号１８）と対合された縮重上流側プライマー＜ＡＡＡＲＲＹＣＧＭＣＣＹＴＧＣＡＡＧＧＴ＞（配列番号１７）及びＴ３プライマー＜ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ＞（配列番号２０）と対合された縮重下流側プライマー＜ＴＣＹＴＴＮＣＣＹＴＣＭＫＣＴＡＡＨＣＣ＞（配列番号１９）を用いて作った。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。その後、全長ｃＤＮＡを、３’−特異的プライマー＜ＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣ＞（配列番号２２）と対合された５’−特異的プライマー＜ＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣ＞（配列番号２１）を用いて獲得し、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。
【０１７４】
実施例９
トマト果実からの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の単離
トマト果実の葉の中で発現された全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを、鋳型としてトマト果実ｃＤＮＡライブラリーを使用してＰＣＲによって得た。最初に、遺伝子の５’及び３’末端に対応するＰＣＲ産物を、Ｔ７プライマー（配列番号１８）と対合された縮重上流側プライマー（配列番号１７）及びＴ３プライマー（配列番号２０）と対合された縮重下流側プライマー（配列番号１９）を用いて作った。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。その後、全長ｃＤＮＡを、Ｔ７プライマー（配列番号１８）と対合された５’−特異的プライマー＜ＡＡＡＧＡＡＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧ＞（配列番号２３）を用いて獲得し、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。
【０１７５】
実施例１０
カーネーションからの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の単離
カーネーションの花の中で発現された全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを、鋳型としてカーネーションの老化する花ｃＤＮＡライブラリーを使用してＰＣＲによって得た。最初に、遺伝子の５’及び３’末端に対応するＰＣＲ産物を、Ｔ７プライマー（配列番号１８）と対合された縮重上流側プライマー（配列番号１７）及びＴ３プライマー（配列番号２０）と対合された縮重下流側プライマー（配列番号１９）を用いて作った。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。その後、全長ｃＤＮＡを、３’−特異的プライマー＜ＡＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴＣＣ＞（配列番号２５）と対合された５’−特異的プライマー＜ＴＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡ＞（配列番号２４）を用いて獲得し、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。
【０１７６】
実施例１１
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからの老化誘発型ＤＨＳ遺伝子の単離
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉の中で発現された老化誘発型ＤＨＳ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの老化する葉ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得た。スクリーニングのために使用したプローブの配列（配列番号２６）は、図８２に示されている。鋳型としての老化葉ｃＤＮＡライブラリー及びＧｅｎＢａｎｋで未同定ゲノム配列（ＡＢ０１７０６０）から設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲによりプローブを得た。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。
【０１７７】
実施例１２
カーネーションからの老化誘発型ＤＨＳ遺伝子の単離
カーネーションの花弁の中で発現された老化誘発型ＤＨＳ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを、カーネーションの老化する花弁ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって得た。スクリーニングのために使用したプローブの配列（配列番号２７）は、図８３に示されている。鋳型としての老化花弁ｃＤＮＡライブラリー及び縮重プライマー（上流側５’ＴＴＧ  ＡＲＧ  ＡＡＧ  ＡＴＹ  ＣＡＴ  ＭＡＡ  ＲＴＧ  ＣＣＴ３’）（配列番号２８）；（下流側５’ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＡＹ  ＴＣＹ  ＴＧＫ  ＧＣＲ  ＧＴＧ  ＴＴ３’）（配列番号２９）を用いて、ＰＣＲによりプローブを得た。ＰＣＲ産物を、配列決定のためｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内にサブクローニングした。
【０１７８】
実施例１３
アンチセンス配向でのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳの全長又は３’領域を用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの形質転換
２重３５Ｓプロモーターの調節の下で、共にアンチセンス構成で発現された全長老化誘発型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ  ｃＤＮＡ配列又はＤＨＳ遺伝子の３’末端（配列番号３０）（図８０）を含む二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを形質転換させた。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を、真空浸潤により、形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを用いて形質転換させ、結果として得られたＴ0植物からの形質転換された種子をアンピシリン上で選択した。
【０１７９】
図６５〜６８は、形質転換された植物内のアンチセンス配向でのＤＨＳ遺伝子又はその３’末端の発現が、結果として増大したバイオマス、例えばより大きな葉及び増大した植物サイズをもたらすことを示す、形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の写真である。図６９は、遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が種子収量を増大させたことを例示している。
【０１８０】
もう１つの実施形態においては、ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ａｔ−ｒｂｃＳプロモーター）の調節の下でアンチセンス構成で、ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ遺伝子の３’末端（配列番号３０）を用いてベクターを構築した。ベクター構成体は、プラスミドｐＢＩ１０１を使用していた。ＧＵＳ遺伝子は除去されたが、ＮＯＳ−ｔｅｒは残った。Ｒｕｓｂｉｓｏアクセス番号はＸ１４５６４である。使用されたプロモーター配列は、ヌクレオチド２８２１〜４７８０である。構成体については図１５２を参照のこと。このベクターを、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換するために使用した。図１５３及び１５４は、野生型対照及び空の二成分ベクター対照に比べて、結果として得られた遺伝子導入植物がバイオマスを増大させたことを示している。図１５５は、遺伝子導入系統が種子収量の最高約１００％の増加を有していたことを示している。図１５６は、遺伝子導入系統は根の発達を増大させたことを示している。
【０１８１】
実施例１４
アンチセンス配向でのトマトＤＨＳの全長又は３’領域を用いたトマト植物を用いた形質転換
２重３５Ｓプロモーターの調節の下で、共にアンチセンス構成で発現された全長老化誘発型トマトＤＨＳ  ｃＤＮＡ配列又はＤＨＳ遺伝子の３’末端（配列番号３１）（図８１）を含む二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを形質転換させた。トマト葉外植片をこれらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａで形成し、形質転換されたカルス及び幼植物を標準的な組織培養方法で生成し選択した。形質転換された幼植物を、温室条件下で成熟した果実産生Ｔ1植物になるまで成長させた。
【０１８２】
図７０〜７９は、形質転換された植物内の老化誘発型トマトＤＨＳ遺伝子の発現の減少が結果として、形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物において見られるような増大したバイオマス、例えばより大きな葉のサイズ及びより大きな植物、ならびにトマト果実の軟化遅延及び損傷をもたらすということを示す写真である。
【０１８３】
実施例１５
アンチセンス配向でのトマトＤＨＳの３’領域を用いたトマト植物の形質転換
２重３５Ｓプロモーターの調節の下で、アンチセンス構成で発現されたＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８１）を含む二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを形質転換させた。トマト葉外植片をこれらのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａで形成し、形質転換されたカルス及び幼植物を標準的な組織培養方法で生成し選択した。形質転換された幼植物を、温室条件下で成熟した果実産生Ｔ1植物になるまで成長させた。
【０１８４】
対照植物由来の果実の約３３％が尻腐れを発生させた条件の下で、ＤＨＳ発現が減少したこれらの遺伝子導入植物由来の果実はこの病気を全く有していなかった。尻腐れというのは、果実の底（花床端部）を老化させ腐らせる栄養素ストレスを原因とする生理病である。図８４Ａ及び８４Ｂは、尻腐れを示す対照果実及び尻腐れの無い遺伝子導入果実を示した写真である。
結果は、ＤＨＳの発現を低減させることで、生理病から発生する組織及び細胞死の始まりが妨げられる、ということを表わしている。
【０１８５】
実施例１６
野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ−植物材料中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ翻訳開始因子５Ａ（ＡｔｅＩＦ−５Ａ）アイソフォームの発現
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型の種子を、６インチの鉢の中でＰｒｏｍｉｘ  ＢＸ土壌（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｒａｎｄｓ，Ｂｒａｍｐｔｏｎ，ＯＮ，カナダ）内で生成させた。播種されたばかりの鉢を２日間４℃で維持し、その後、１６時間照明／８時間暗所のサイクルで２２℃で作動する成長チャンバーに移した。１５０μｍｌの放射線ｍ-2・ｓ-1での照明は、白色蛍光電球によって提供された。２週齢から７週齢で１週間の間隔をおいてロゼットを収集し、５週齢に茎出葉を収集し、６週齢に茎、長角果、つぼみ及び花を収集し、吸水した種子（水中２４時間）も同様に収集し、液体窒素中で急速冷凍させ、−８０℃で保管した。
【０１８６】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ感染
６４個の成長細胞の入った平箱の中でＰｒｏｍｉｘ  ＢＸ土壌（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｒａｎｄｓ，Ｂｒａｍｐｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）の上でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型の種子を播いた。播種済み平箱を２日間４℃に維持し、９時間照明／１５時間暗所の光周期をもつ成長チャンバーに移した。全ての植物を、４週齢に処理したが、生理学的に光周期が短かくなったことから、これらは発達が比較的緩慢であるように思われる。
【０１８７】
４週齢の植物のロゼット葉を、Ｒｏｂｉｎ  Ｃａｍｅｒｏｎ博士（カナダ、トロント市トロント大学）から得た無毒性（ａｖｒ）及び毒性（ｖｉｒ）菌種Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．Ｔｏｍａｔｏ  ＤＣ３０００で感染させた。各植物のロゼット葉の背軸面に、針無しの１ｍｌ入りシリンジを用いて接種した。植物を、無接種、１０ｍＭのＭｇＣｌ2での模擬接種、ａｖｒ  Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ菌種（１０6ｃｆｕ／ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）での接種、又はｖｉｒ  Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ菌株（１０6ｃｆｕ／ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）での接種、という４つの処理のうちの１つを用いて処理した。２回の細菌計数を、１回は接種直後に、そして２回目は３日後に行ない、ａｖｒ処理において全身獲得抵抗性を誘発するのに充分な量の細菌が確実に浸潤するようにした。接種を受けた葉を、後続する分析のため、予め定めた時点で収穫した。
【０１８８】
ＤＨＳ又は創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ発現が低減された植物を、いずれかの遺伝子のためにアンチセンスＴ−ＤＮＡ挿入を用いて開発した。これらの植物系統は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．Ｔｏｍａｔｏ  ＤＣ３００に対する顕著な耐性を示し、遺伝子導入系統は、野生型植物に比べ細菌負荷の最高９９％の減少を示した。図４３及び４４を参照のこと。作物植物を用いたデータは同様に、病原体耐性の増強をも示した。
【０１８９】
止血鉗子を用いたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物の創傷形成
通常の照明条件下で成長させた４週齢の植物を、Ｓｔｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ（２０００年）に従って中央葉脈（葉面のおよそ６０％）に沿った止血鉗子を用いた圧壊により創傷を発生させた。０分、１時間及び９時間の時点で組織を収穫し、液体窒素内で直ちに凍結させ、さらなる分析のため−８０℃で保管した。
【０１９０】
ＲＮＡ単離及びノーザンブロット法
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６年）に従ってＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａロゼット葉からノーザンブロット分析のための総ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを１％のアガロースゲル上で分画し、ナイロン膜上に移した（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６年）。固定化したＲＮＡを、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又は成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの放射性標識済み３’ＵＴＲ部分を用いて４２℃で一晩ハイブリッド形成させた。ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて［α−32Ｐ］−ｄＣＴＰで３’ＵＴＲを標識した。ハイブリッド形成された膜を、１５分間４２℃で０．１％のＳＤＳを含有する２×ＳＳＣの中で２回、そして３０分間４２℃で０．１％のＳＤＳを含有する１×ＳＳＣ中で２回洗浄した。−８０℃で一晩曝露した後、オートラジオグラフィによりハイブリダイゼーションを視覚化した。
【０１９１】
抗体の産生及び精製
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）の真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）アイソフォームは、アミノ酸レベル、特にタンパク質のＮ末端領域及び中央領域において高い相同性を有する（図１）。アイソフォーム特異的となる抗体を得るために、互いにユニークであると思われるＡｔｅＩＦ−５Ａのアイソフォーム内の領域と対照してペプチドを設計した。ＫＬＨと接合するためＮ末端で各ペプチドに対し付加的なシステイン残基を添加した。使用される配列は、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５ＡについてはＣＮＤＤＴＬＬＱＱＩＫＳ、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５ＡについてはＣＴＤＤＧＬＴＡＱＭＲＬ、そして成長ＡｔｅＩＦ−５ＡについてはＣＴＤＥＡＬＬＴＱＬＫＮであった。これらの配列がタンパク質ＢＬＡＳＴに付された場合（短くほぼ正確な配列；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａにより制限されているもの；予想数２００００；ワードサイズ２；マトリクスＰＡＭ９０；Ｇａｐコスト９１）、データベース内に見い出される有意な配列は、整合したＡｔｅＩＦ−５Ａのみであり、その他のものは全くなかった。ペプチドは、ウェスタンオンタリオ大学のペプチド合成施設で合成された。担体タンパク質、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ）を、Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３年）及びＣｏｌｌａｗｎ及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９９年）に従ってｍ−マレイミドベゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを用いて、ペプチドのＮ末端システインに接合させた。ウサギに２週間の間隔で、連結したペプチドを注射した。最後の注射から２週間後に、ウサギの放血及び収集血の凝固により血液を収集して、抗血清を蓄える。
【０１９２】
タンパク質の分画及びウェスタンブロット法
以上で列挙した組織を、小さい乳棒を伴うエッペンドルフ型試験管内又は大きな乳鉢と乳棒の中で、緩衝液（５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ７．４、０．２５Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのアミノ−ｎ−カプロン酸、植物組織用プロテアーゼ阻害物質カクテル（Ｓｉｇｍａ））内で均質化した（最高０．５ｇ／ｍｌ）。ホモジネートを最高速度で微小遠心管の中で短時間遠心分離に付し、ペレットを廃棄した。合計タンパク質をＧｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８８年）に従って定量した。Ｍｉｎｉタンパク質Ｄｕａｌ  Ｓｌａｂ細胞（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、ゲル（１２％のポリアクリルアミド）をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１年）で染色するか又は、半乾燥移送方法（半乾燥移送細胞、Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜まで移送した。１ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール中で３０秒（Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０及び５％（ｖ／ｖ）の粉乳を含むリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ中で１時間、ブロットを遮断した。（２回目の注射の後の出血からの）一次抗体を、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０及び１％（ｗ／ｖ）の粉乳を含むＰＢＳ中で１：５０に希釈した。アルカリホスファターゼ（Ｂｉｏｓｈｏｐ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ）及びホスファターゼ基質、ＮＢＴ及びＢＣＩＰ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）にカップリングされたウサギに対するヤギの抗体の中で作られた二次抗体を用いて抗原を視覚化した。
【０１９３】
実施例１７
３つのｅＩＦ−５Ａアイソフォームを過剰発現する形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物の産生
プライマーの設計
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ａｔ）の真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）は、コーディング領域において高い相同性を有する（図２）。適正な遺伝子の増幅についての問題を回避するため、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ及び成長ｅＩＦ−５Ａのためのプライマーを、それぞれ図３、４及び５の中で示されているように、５’ＵＴＲのおおよその初めから及び３’ＵＴＲの終りで設計した。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを、ＥＳＴ情報及びＧｅｎＢａｎｋデータベース内のその他の配列情報に基づいて推定した。ｐＫＹＬＸ７１二成分ベクター内でセンス配向でライゲーションのためプライマーの末端に対し適切な制限部位を加えた（図６）。老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａについては、上流側プライマーは５’ＡＡＧＣＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣ３’であり、下流側プライマーは５’ＧＡＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣ３’である。創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａについては、上流側プライマーは５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＡＧＧ３’であり、下流側プライマーは５’ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＴＡＡＣＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣ３’である。成長ＡｔｅＩＦ−５Ａについての上流側プライマーは５’ＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＧＣ３’であり、下流側プライマーは５’ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＴＧＣ３’である。プライマーに付加された制限部位は、以上に列挙したプライマー内で下線により表わされている通り、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５ＡについてはＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩであり、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５ＡについてはＸｈｏＩ及びＳａｃＩであり、成長ｅＩＦ−５ＡについてはＸｈｏＩ及びＳａｃＩであった。
【０１９４】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからのゲノミックＤＮＡの単離
３週齢のロゼット葉からゲノミックＤＮＡを単離した。抽出緩衝液（２００ｍＭのトリスｐＨ７．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）の中で組織を均質化させ、結果として得られたホモジネートを１５分間ボルテックス処理させた。残りの破片を、１分間最大速度で微小遠心分離機の中での遠心分離により除去した。上清を収集し、１：１の比率でイソプロパノールと混合し、ボルテックス処理し、２分間室温で放置した。５分間最大速度で微小遠心分離機の中での遠心分離によりペレットを収集し、７０％のエタノールで洗浄し、２分間真空乾燥させた。乾燥したペレットを水中に再懸濁させ、１：１の体積のクロロホルムで処理し、ボルテックス処理した。２分間最大速度での微小遠心分離機の中での遠心分離の後、最上層を収集し、２０μｌの塩（３Ｍの酢酸ナトリウム）と２体積のエタノールで、３０分間−２０℃で沈殿のため処理した。精製されたゲノミックＤＮＡをその後、微小遠心分離機内で３０分間最大温度で遠心分離し、乾燥させ、ＰＣＲのため水中に再懸濁させた。
【０１９５】
ゲノミックＤＮＡからのＰＣＲ
上述のプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応混合物は、１×Ｔｓｇ又はＴａｑポリメラーゼ反応緩衝液、１ＵのＴｓｇ又はＴａｑポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ2及び１５ｐｍｏｌの各々の特異的プライマーをしかるべく含有していた。反応は、１０分間の９５℃での高温スタートで始まり、第１のサイクルは、１分間の９５℃という変性温度、２分間の５５℃というアニーリング温度、及び２分間の７２℃という拡張温度で構成されていた。後続する２９サイクルが、タッチダウンプログラムに先行して行なわれ、このプログラムでは、アニーリング温度が１サイクルあたり０．５℃だけ低下され、最終サイクルのアニーリング温度は４０℃であった。７２℃という最終拡張は１０分間保持された。１％のアガロースゲル電気泳動法によりＰＣＲ産物を分離し、切りとり、使用法に従ってアガローススピンカラムからのＤＮＡ抽出用のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって回収した。
【０１９６】
ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ内へのライゲーション
精製したＰＣＲ産物を、Ｐｒｏｍｅｇａによって提供された使用法に従って、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（図７）内にライゲートした。簡単に言うと、ＰＣＲ産物を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）内に入って提供される高速ライゲーション緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、及び５％のポリエチレングリコール（ＭＷ８０００、ＡＣＳグレード）ｐＨ７．８）中のｐＧＥＭ  Ｔ−Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ，３  Ｗｅｉｓｓ  Ｕｎｉｔｓ．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと３：１の比率で混合した。ライゲーション反応を１５℃で一晩インキュベートし、コンピーテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５−α細胞懸濁液（ＲｂＣｌ／ＣａＣｌを用いてコンピテントにされたもの；Ｋｕｓｈｎｅｒ，１９７８）へと形質転換させた。形質転換混合物をまず最初に３０分間氷上でインキュベートし、４２℃で９０秒間熱ショックを与え、２ｍｌの２×ＹＴブロスの添加後１時間３７℃で回収した。形質転換させた細胞をペレット化し、少量の２×ＹＴブロスの中に再度懸濁させ、選択のため５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する寒天プレート上で固定した。ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒは細胞に対しアンピシリン耐性を提供することから、形質転換体のみがアンピシリン含有プレート上で成長することができる。形質転換体を選択し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ内にライゲートされたＰＣＲ産物インサートについてスクリーニングした。
【０１９７】
制限酵素消化を通したｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ内のＰＣＲ産物インサートについてのスクリーニング
選択培地上で成長したコロニーを、３７℃で一晩５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌの２×ＹＴブロスの中で成長させた。選択されたコロニーからの組換え型プラスミドを、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。プラスミドＤＮＡを３７℃で１時間ＥｃｏＲＩで消化させ、ＡｔｅＩＦ−５Ａｓインサートサイズが存在したことを確認するために１％のアガロースゲル上で視覚化した。その後陽性プラスミドは、配列がｉｎ  ｐｌａｎｔａでの過剰発現に適していることを確認するため、中核分子生物学施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒｌｏｏ，Ｗａｔｅｒｌｏｏ，ＯＮ）により配列決定された。
【０１９８】
ｐＫＹＬＸ７１内へのライゲーション
ｐＧＥＭ：創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びｐＧＥＭ：成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの構成体をＸｈｏＩ及びＳａｃＩで２重消化し、同じくＸｈｏＩとＳａｃＩで消化された二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１内にサブクローニングした。これらの酵素消化は、カリフラワーモザイクウイルス２重３５Ｓプロモーターの制御下で二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１内にセンス配向で創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及び成長ＡｔｅＩＦ−５Ａが確実に挿入されるようにした。ライゲーション反応では、１μｇの二成分ベクターと３μｇの創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又は成長ＡｔｅＩＦ−５Ａのいずれかが用いられた。ライゲーションは、３ワイス単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、ライゲーション緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、及び５％のポリエチレングリコール（ＭＷ８０００、ＡＣＳグレード）ｐＨ７．８）の中で行なわれた。ライゲーション反応を１５℃で一晩インキュベートし、コンピーテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５−α細胞懸濁液（ＲｂＣｌ／ＣａＣｌを用いてコンピテントにされたもの；Ｋｕｓｈｎｅｒ，１９７８年）へと形質転換させた。形質転換混合物をまず最初に３０分間氷上でインキュベートし、４２℃で９０秒間熱ショックを与え、２ｍｌの２×ＹＴブロスの添加後１時間３７℃で回収した。形質転換させた細胞をペレット化し、少量の２×ＹＴブロスの中に再度懸濁させ、選択のため５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する寒天プレート上で固定した。二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１は細菌細胞に対しテトラサイクリン耐性を提供することから、形質転換体のみがテトラサイクリン含有プレート上で成長することができる。形質転換体を選択し、ＰＣＲ及びＸｈｏＩ及びＳａｃＩでの２重消化により創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又は成長ＡｔｅＩＦ−５Ａインサートについてスクリーニングした。ＰＣＲ増幅（以上で説明したゲノミックＤＮＡで行なわれたものと同じもの）及び消化の後、適正なサイズのインサートの立体配置のため、１％のアガロース電気泳動法を用いて産物を分離した。
【０１９９】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ電気穿孔法及び選択
構成体ｐＫＹＬＸ７１；創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１；成長ＡｔｅＩＦ−５Ａを、コンピテントＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３０１０内に電気穿孔した。コンピテントＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞の調製においては、単一のコロニーを、５０μｍ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する５ｍｌの２×ＹＴブロスの中に接種した。これは、２８０ｒｐｍでＦｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｓｈａｋｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で２８℃で一晩成長し、さまざまな希釈度（１：５００、１：１０００、１：２０００）で同じく５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと共に２倍ＹＴの３０ｍｌの培養に接種するのに使用された。新たに接種された培養は、ＯＤ600が０．５〜０．８となるまで成長し、その後で冷却され、１５分間２０００ｇでＳＳ−３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）の中で遠心分離を受けた。５０ｍｌの氷冷水の中でペレットを再懸濁させ、１５分間２０００ｇで遠心分離した。この洗浄手順を、塩及び死細胞を培養から除去するため合計４回反復した。最終的ペレットを、４０ｍｌの氷冷１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に再懸濁させ、１５分間２０００ｇで遠心分離させ、１回反復した。その後ペレットを１００μｌの氷冷１０％グリセロール中に再懸濁させ、充分混合した。細胞を１００μｌのアリコートに分割し、氷上に保管した。
【０２００】
コンピテントＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞内へのＤＮＡ構成体の電気穿孔のためには、１００μｌのアリコートを各々５００ｎｇのＤＮＡ構成体と充分に混合した。その後、細菌：ベクター混合物を予備冷却された電気穿孔キュベットに移し、２．５ｋＶ、２５μＦ及び２００Ωという設定値に調整したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）の中に入れた。電気穿孔の後、１ｍｌの２×ＹＴブロスを添加し、全懸濁液を培養管に移した。電気穿孔を受けた培養を２８℃、２８０ｒｐｍで３時間インキュベートし、回復させ、次に２ｍｌの２×ＹＴブロスを５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと共に添加した。２日間の培養成長の後、テトラサイクリン、ゲンタマイシン及びリファンピシン（全て５０μｇ／ｍｌ）上に電気穿孔済み細胞をプレート固定し、さらに付加後２日間成長させた。結果として得たコロニーを、ＰＣＲ及びＳａｃＩとＸｈｏＩでの２重消化により、ｐＫＹＬＸ７１；創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又はｐＫＹＬＸ７１；成長ＡｔｅＩＦ−５Ａについてスクリーニングし、１％のアガロースゲル上の分離により視覚化した。
【０２０１】
植物の形質転換
ｐＫＹＬＸ７１：創傷/病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又はｐＫＹＬＸ７１：成長ＡｔｅＩＦ−５Ａのいずれかを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３０１０の陽性コロニーを、野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型の形質転換のために使用した。植物の形質転換に使用される細菌スラリーの調製においては、ｐＫＹＬＸ７１：創傷/病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ又はｐＫＹＬＸ７１：成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ構成体について陽性である単一のコロニーを、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する５ｍｌの２倍ＹＴブロスの中に接種した。これを、２８０ｒｐｍでＦｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｓｈａｋｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で２８℃で一晩成長させ、同じく５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと共に３５ｍｌ（合計）の２×ＹＴに接種するのに使用した。３５ｍｌの培養を一晩２８℃、２８０ｒｐｍで成長させ、５０μｇ／ｍｌのリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンと共に５３５ｍｌ（合計）の２×ＹＴに接種するのに使用した。再び培養を一晩２８℃、２８０ｒｐｍで、約２．０のＯＤ600まで成長させた。
【０２０２】
培養物を、２本の２５０ｍｌ入り試験管に移し、ＧＳＡローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）内で４℃で１９４５ｇにて１５分間遠心分離した。ペレットを５００ｍｌの浸潤培地（１．１ｇのＭＳ塩、２５ｇのスクロース、０．２５ｇのＭＥＳ、ＫＯＨでｐＨ５．７、１００ｎｇ／ｍｌのベンジルアミノプリン及び５０μｌのＶａｃ−Ｉｎ−Ｓｔｕｆｆ（Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７；Ｌｅｈｌｅ  Ｓｅｅｄｓ））の中で再度懸濁させ、４つの大きなゴムストッパ付き真空デシケータ内のプラスチック製大皿の中に置いた。各々正しい発達段階にある８本の植物の入った５つの鉢を、浸潤のために逐次的に使用した。ゆるんだ土壌があればそれを除去するため、ごみ箱の上でまず各々の鉢を倒立させ、次に４つの大型ゴムストッパが倒立した鉢のためのスタンドとして作用しかくして花茎をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍスラリー内に浸漬させることができるもののロゼットは浸漬されないようにする形で、ガラス製デシケータ内のプラスチックコンテナの中に（なお倒立状態で）入れた。その後、植物を１０分間この倒立状態で真空（４００ｍｍＨｇ）に付した。真空浸潤された植物を次に回復させ、通常通り、植物材料の項で説明した成長チャンバー条件下で成長させた。数週間後、長角果が乾燥し、種子が成熟した時点で、各鉢を一緒にプールして、種子を収集した。
【０２０３】
植物形質転換体の選択及び分離比分析
一次形質転換体を同定するために、真空浸潤させた植物からの種子を、１％（ｖ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム及び０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ８０の溶液中で２０分間、ローター（Ｂａｒｓｔｅａｄ/Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）上にて表面滅菌し、無菌水で４回洗い流し、無菌０．８％寒天中に再度懸濁させた。再懸濁された種子を次に、１％の（ｗ／ｖ）スクロース、０．５ｇ／Ｌ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．７％（ｗ／ｖ）の細菌学的寒天及び４０〜５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｈｏｏｇ，１９６２）で補足された無菌で半強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（２．２ｇ／Ｌ）上に植えた。二成分ベクターはカナマイシン耐性遺伝子を形質転換体の苗に提供することから、形質転換体のみがカナマイシン含有プレート上で成長することができる（図６）。二成分ベクターを宿していない苗は、カナマイシン耐性遺伝子が全く存在しないことから、黄色くなって死滅する。野生型の苗が対照として用いられ、培地にカナマイシンが添加されることなく、ＭＳ培地上にプレート固定され、同様に、空のｐＫＹＬＸ７１ベクターを含有するホモ接合性系統からの苗も、カナマイシン含有プレート上に対照としても播種された。空のベクター対照は、カナマイシンが苗の成長に対し及ぼす効果ならびにＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのゲノム内への二成分ベクターの無作為組込みの効果を実証する上で有用である。ＭＳ培地及び４０〜５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する各プレートの小さな部域上に、野生型種子を少量プレート固定した。これは、培地が形質転換体について充分な選択性を確実に有しているようにするため、そしてカナマイシンの強度をテストするために行なわれた。
【０２０４】
播種されたプレートを、発芽を同期化するべく３日間４℃に保った。３日後に、プレートを成長チャンバーに移し、ここでこれらのプレートをさらに７日間、２０±２℃で１６時間照明／８時間暗所のサイクルで成長させた。照明は、１５０μｍｏｌ放射線ｍ-2・ｓ-1に維持され、白色蛍光電球により提供された。ｐＫＹＬＸ７１：創傷/病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１：成長ＡｔｅＩＦ−５ＡベクターでのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物の形質転換についての効率を判定した。
【０２０５】
播種から合計１０日後に、それぞれセンス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａについての１４の形質転換体又は１６の形質転換体を、３２個の細胞を含む平箱の中でＰｒｏｍｉｘ  ＢＸ土壌（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｒａｎｄｓ，Ｂｒａｍｐｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に移植した。これらの移植済みのＴ１世代植物を、１６時間の照明／８時間の暗所のサイクルで２２℃で作動するもう１つの成長チャンバーに移した。１５０μｍｏｌ放射線ｍ-2・ｓ-1での照明は、白色蛍光電球により提供された。Ｔ１世代の植物は、成熟するまで成長し、Ｔ２世代の種子を産生した。これらを収穫し、スクリーニングを行なうまで−２０℃に保管した。Ｔ１世代を１、２、３などと名付けた。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの１６系統は全て生存し、種子を産生したが、センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の１４の形質転換体のうちでは９つのみが生き残り、種子を産生した。
【０２０６】
Ｔ２世代の形質転換体の選択は、Ｔ１世代の形質転換体と同じ要領で行なわれた。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の系統１２は、選択可能培地上でいかなる形質転換体も産生せず、さらなる研究作業には内含されなかった。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の系統１〜１６（系統１２は控除）は各々、その８つの亜系統が存続させられた。これらは、Ａ〜Ｈと名付けられ、かくして、例えばＴ１の系統１ではＴ２世代の植物は１Ａ、１Ｂ、１Ｃと命名された。センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の系統１、２、３、４、５、７、９及び１１は、各々存続した亜系統を８個有していた（Ａ〜Ｈ）。系統１２のＴ１植物は、約３０のＴ２種子しか産生せず、Ｔ２世代内の１つの亜系統のみが存続させられることになる。センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５ＡのＴ２の植物はなおも成長し続け、特徴づけされつつある。センス成長ＡｔｅＩＦ−５ＡについてのＴ２植物は成熟し、種子を産生し、これは、収穫されてさらなる分析まで−２０℃に保管された。
【０２０７】
センス成長ＡｔｅＩＦ−５ＡのＴ３世代の形質転換体の選択は、Ｔ２と同じ要領で行なわれた。表現型分析ならびにセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの過剰発現の度合いに基づいて８個の系統を選択した。発現レベルを、高レベル発現、中レベル発現、低レベル発現及び発現無し（同時抑制に起因する）という４つのカテゴリーに分類した。各発現レベルについて２つの系統を選択し、各系統からの１２本の植物を移植した。これら４つの発現レベルについての対応する系統は、１Ａ、２Ｄ、４Ｄ、１５Ａ、８Ｄ、９Ｈ、１１Ｃ及び１６Ｃである。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物についてのＴ３世代は、なおも成長し続け、特徴づけされつつある。
【０２０８】
実施例１８
センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの表現型分析
写真記録
センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統の形態学的表現型を、対応する対照野生型植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型）及び空二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１で形質転換された植物の発現型と同様に、分離の間に写真記録した。
【０２０９】
種子の測定
センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａから収集したＴ３の種子を合計種子収量（重量と体積の両方）、種子サイズ（長さと幅）及び産生された種子の計算上の個々の重量と体積について測定した。重量での合計種子収量を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ分析デジタル化スケール上で測定し、１００μｌ毎に目盛づけされたガラス製の１ｍｌ入りシリンジ中に各植物が生み出した全種子を注ぎ込み詰め込むことにより体積を決定した。長さ、幅及び計算上の体積により種子のサイズを決定するためには、マイクロメータを含むスライド上に種子を置き、オリンパスＢＸ５１顕微鏡で検分した。マイクロメータ上の種子の写真を、Ｃｏｍｐａｑ  Ｅｖｏ  Ｄ５００（Ｃｏｍｐａｑ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｉｎｔｅｌ（登録商標）Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）  ４  ＣＰＵ  １．７ＧＨｚ，２６２  ＭＧ  ＲＡＭ，Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００をラン）に取付けられたＳｐｏｔ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｃｏｌｏｒ  Ｃａｍｅｒａ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）で撮影した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓバージョン４．０を用いた。各々の亜系統内の１０個の種子の測定は、サイズ較正用の画像の中でマイクロメータを用いて行なった。測定値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにインポートし、標準誤差及び体積といったような計算を実施した。
【０２１０】
実施例１９
センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの生化学分析−タンパク質分画及びウェスタンブロット法
センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の各亜系統からの第１茎出葉を収集し、上述の通りにタンパク質を抽出した。系統１Ａ、２Ａから１６Ａまでの総タンパク質を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＰＶＤＦ膜に移した。１：５０希釈度で成長αＡｔでブロットをプローブ探査した。対照の総タンパク質を、野生型及び空二成分ベクター対照植物由来の第１茎出葉から抽出した。
【０２１１】
実施例２０
野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ内のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ翻訳開始因子５Ａ（ＡｔｅＩＦ−５Ａ）アイソフォームの発現
異なる発達段階で複数の組織を収集し、これらの組織からの抽出タンパク質をウェスタンブロット法のために使用した。図８のウェスタンブロット法は、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａが２週齢のロゼット葉には存在せず、３週齢のロゼット葉の中でアップレギュレートされ、５週齢までは大量に増加し、大量に下降するものの７週齢でもなお存在している、ということを実証している。ＰＥＧで処理された植物又は対照ではいかなる老化ＡｔｅＩＦ−５Ａも検出されなかったが、（老化花を誘発した）花のレーン及び子葉組織の老化を反映する吸水した種子のレーンでは存在した。ブロットを創傷／病原体誘発型αＡＴｅＩＦ−５Ａ抗体でプローブ探査した場合、長角果及び吸水した種子及び葉のレーンでかすかなバンドが現われた。長角果及び茎のレーンに見られるバンドは、組織の収集と共に発生した創傷に起因するかもしれない。長角果と茎を収集するのは困難であることから、これらは、直ちに急速冷凍されず、ＡｔｅＩＦ−５Ａの創傷／病原体誘発型アイソフォームの幾分かのアップレギュレーションを可能にした。成長αＡＴ−ｅＩＦ−５Ａでブロットがプローブ探査された場合に現われた唯一のバンドは、吸水種子であり、これが細胞分裂に関与するアイソフォームであるという概念と調和している。
【０２１２】
いかなる処理もなされなかった植物、ＭｇＣｌ2、ａｖｒ  Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ又はｖｉｒ  Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅでの模擬接種で処理された植物を、複数の時点で収集し、病原体の進入中のＡｔｅＩＦ−５Ａの発現を分析した。ａｖｒ菌株は、植物により認識可能であり、感染領域内の壊死又は細胞死を導く過敏応答を誘発し、かくして病原体が病気をひき起こすのを許さない。さらに、局所化された応答は、最終的に全身的応答となり、植物をさらなる進入から保護する。これは、発病機序応答（ＰＲ）遺伝子として知られる一連の遺伝子の発現が関与する全身獲得抵抗性（ＳＡＲ）として知られている。一方、ｖｉｒ菌株は、植物により認識されず、過敏応答を誘発せず、疾病を導くことになる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの病的状態としては、感染から数日経過後の葉の黄変及び細胞死が含まれる。処理後７２時間経ってから、対照植物、模擬処理植物、ａｖｒ処理植物及びｖｉｒ処理植物を３つのＡｔｅＩＦ−５Ａ抗体でのウェスタンブロット法のために収集した（図９）。この時点で、ＳＡＲ及び疾病の両方が、それぞれ、ａｖｒ処理及びｖｉｒ処理植物の中で見受けられた。老化誘発型αＡｔｅＩＦ−５Ａ抗体でプローブ探査された時点で全ての試料において相対的に同じであったバンドが観察された。全ての植物は４週齢であり、又図８では３週齢から始まって老化アイソフォームが見られたため、このことは全く驚くべきことではなかった。次にブロットが創傷／病原体誘発型αＡｔｅＩＦ−５Ａ抗体でプローブ探査された時点で、未処理、模擬処理及びａｖｒ処理の植物ではかすかなバンドが検出可能であり、ここで、ｖｉｒ処理植物には強いバンドが検出された。この創傷アイソフォームのアップレギュレーションは、（或る種の細胞創傷と同様）疾病によりひき起こされたＣＬ死に起因している可能性がある。老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａはこれらの処理中に発現の変化を示さなかったことは、自然老化に対するその特異性を実証している。創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ発現の増大は同様に、創傷に起因する死に対するその特異性を実証している。この可能性をさらに調査するため、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの創傷葉で実験が実施された。
【０２１３】
創傷実験は、発病機序実験と類似の結果を示した（図１０）。老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及び成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの転写の変化を示すために、ノーザンブロット法を使用した。プローブはＡｔｅＩＦ−５Ａの各々に特異的であり、各々の３’ＵＴＲで構成されていた。発病機序実験と同様、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ発現は、それらが４週齢の植物であり、試料が９時間の間隔でしか引き継がれなかったことから、変化しなかったということが観察された。このことも又、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａが自然老化に特異的なアイソフォームであるという事実と一貫性を有している。しかしながら、創傷／病原体誘発型Ａｔの発現は９時間以降に実際増加した。転写物はかなり構成性であると思われる（図１０）が、タンパク質は、誘発されない場合さほど高度に発現されないと思われること（図９）から、恐らくは、幾分かの翻訳制御が発生する。成長ＡｔｅＩＦ−５Ａのための転写物は、全ての試料においてほとんど検出不可能であり、創傷後の発現の下降を示している。
【０２１４】
実施例２１
３つのｅＩＦ−５Ａアイソフォームを過剰発現する形質転換されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの産生
ゲノミックＤＮＡからＰＣＲによりＡｔｅＩＦ−５Ａを単離した（図１１）。ｐＧＥＭ内で産物をライゲートし（図１２）、ｉｎ  ｐｌａｎｔａでの過剰発現の適切性について配列を確認した。創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及び成長ＡｔｅＩＦ−５Ａを、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩでｐＧＥＭから２重消化し、ｐＫＹＬＸ７１内でカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ2プロモーターの後にセンス配向でライゲートした。消化及びＰＣＲにより、陽性ライゲーションを確認した（図１３）。その後、ｐＫＹＬＸ７１：老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１：成長ＡｔｅＩＦ−５Ａを、Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型の真空浸潤を介した形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３０１０の中に電気穿孔した。植物の形質転換の後、種子を収集し、カナマイシン含有ＭＳプレート上で形質転換体を選択した。
【０２１５】
創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ（センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ）を過剰発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物
Ｔ１世代の植物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＭＳプレート上に播種し、３日間４℃で、又７日間成長チャンバー内で保管した（図１４）。土壌に移植された１４の形質転換体が存在していた。これらの１４のＴ１世代の植物の中の一般的表現型が、発育不全であった。系統１、４、６、８、１０、１１、１２、１３及び１４が著しく成長が妨げられ、６、８、１０、１３、及び１４はいかなる種子も産生しなかった。系統２及び３は、穏やかに発育が妨げられ、一方系統５、７及び９は、野生型植物と類似した形で成長した（図１５及び図１６）。センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物のＴ１世代の中に観察されたいくつかのその他の表現型には、黄色葉、紫色子葉、巻き上った葉、及び花の形状差異、が含まれる。発育不全における外観は、植物が土壌に移植されるまで観察されなかったという点に留意すると興味深い。これに対する考えられる理由は、移植中に根がわずかに損害を受け（不可避的な移植の影響）回復できなかったということにあると思われる。実際、カナマイシン溶液中に種子が浸漬され、土壌に直接播種された予備実験では、移植がなければ根の損害が全く誘導されないと思われることから、発育不全の植物は観察されなかった（一方、以前では７０％の植物が幾分かの度合の発育不全を示していた）。
【０２１６】
系統１、２、３、４、５、７、８、１１及び１２は、Ｔ２種子を産生し、存続させられた（図１７）。各々のＴ２系統は、亜系統Ａ〜Ｈを有しているが、１２だけは、１つの形質転換体しか生育させず、現在分析中である。
【０２１７】
成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ）を過剰発現するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物
センス成長ＡｔｅＩＦ−５ＡのＴ１世代の種子を、選択的培地上で成長させ、１６の形質転換体が成長した（図１８）。形質転換体をその一生にわたり写真撮影した。表現型は、野生型に類似したもの（系統１、２、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５及び１６）から穏やかな発育不全及び黄色（系統２、４及び９；図１９）まで変動した。全ての系統は、Ｔ２まで存続し、各系統はＡ〜Ｈと標識された８つの亜系統を有していた。系統１２はＴ２においていかなる形質転換体も産生せず、野生型であるとみなされた。Ｔ２世代の植物は、Ｔ１世代の植物のものに比べはるかに誇張された表現型を有していた。Ｔ３まで存続させられた系統について以下で詳述する。
【０２１８】
センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ  Ｔ２世代の系統を、成長ＡｔｅＩＦ−５Ａトランス遺伝子の発現レベルに従った群の中で特徴づけした。各系統からの茎出葉から抽出したタンパク質についてウェスタンブロット法を実施した（図２０）。１つの系統内で大部分の亜系統Ａ〜Ｈの大部分が類似の表現型を実証したことから、成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの発現レベルの概覧を得るため、各系統の亜系統Ａでのみウェスタンブロットを行なった。野生型植物及び空の二成分ベクターを含む植物の茎出葉からのタンパク質を、ゲル上で対照として使用した。これらの亜系統の中で観察された発現レベルを、高（系統１、２、３、１０、１３）、中（系統４、５、６、１５）、低（系統７、８、９、１４）又は無（系統１１、１６、野生型及び２成分対照）として分類できる。ブロットを、老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ及び創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａに対する抗体でもプローブ探査した。これらのウェスタンは、いずれのアイソフォームも有意な量で検出されないことから、センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統内での発現の増大が、その他のＡｔｅＩＦ−５Ａアイソフォームの一般的アップレギュレーションではなく成長ＡｔｅＩＦ−５Ａに起因するものであることを示した。このことは、アイソフォーム特異的抗体も同様に受容可能であることも実証した。
【０２１９】
Ｔ３世代まで存続させられたセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統を、成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの発現レベルと同様に表現型にも基づいて選択した（各系統内部の表現のまとめについては表１を参照のこと）。各々の発現レベルカテゴリからの２つの系統が選択された。存続させられることになる系統は１Ａ、２Ｄ、４Ｄ、１５Ａ、８Ｄ、９Ｈ、１１Ｃ及び１６Ｃである。
【０２２０】
図２０でのウェスタンブロットに従った系統１は、高レベルの成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ発現を有する。これらの植物は、野生型植物に比べてかなり丸い葉と共に大きな暗緑色のロゼットを有していた（図２１）。系統１のロゼットは、同様に葉が全て同じ方向に巻いている輪生の表現型を有していた。系統２は同様に、高レベルの成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ発現をも実証したが、これらの植物の小さく黄変していたという点で、系統１とは異なっていた（図２２）。系統２の植物は同様に、野生型及び２成分対照植物に比べて遅く抽苔し、又より小さな花茎（約半分のサイズ）及びより少ない長角果を産生した。
【０２２１】
中間発現レベル系統のうち、系統４は、葉／ロゼットサイズ及び花茎サイズについて野生型と類似であるように思われたが、野生型及び２成分対照植物よりもほんの数日前に抽苔するように思われた。成長ＡｔｅＩＦ−５Ａの発現レベルが中間レベルである第２の系統は、系統１５である。これらの植物は、系統４と同様に、野生型にきわめて類似しているが、ロゼットが占有していた面積は対照のものよりも広いものであった（図２３及び２４）。ロゼットの葉は同様に、対照よりも先端でより丸いものに思われた。しかしながら花茎は、特色ある表現型を全くもっていないように見えた。
【０２２２】
Ｔ３まで存続させられることになる発現レベルの低いセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統は、系統８及び９である。系統８は、対照植物に比べて非常に大きい葉及び大きいロゼットを有していた（図２５）。葉は同様に、対照植物よりも広く丸いものであるように見えた。抽苔の時期、花茎のサイズ及び数は、対照と一貫性あるように見えた。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統９は、系統８の場合と類似の葉の形状を有していたが、はるかに黄色く小さいものであった（図２６）。系統２（発現レベルの高い系統の１つ）の場合と同様に、これらの植物は、発育不全、より短かい花茎を示すが、系統２と異なり、系統９は、対照植物とほぼ同じ時期に抽苔した。
【０２２３】
ウェスタンブロット（図２０）に従ったセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の２つの系統１１及び１６は、成長ＡｔｅＩＦ−５Ａのアップレギュレートされた発現を全く有していない。これはトランス遺伝子の同時抑制ならびに内因性遺伝子に起因する可能性がある。これらの植物は対照と正に類似している（図２７及び図２８）ものの、トランス遺伝子は、複数の理由から系統１１及び１６のゲノム内に取込まれると考えられている。まず第１に、これらは、カナマイシン含有ＭＳプレート上での選択性により実証されるように、カナマイシン耐性を実際有している。第２に、系統１６のロゼットサイズ、葉サイズ及び花茎サイズ（図２８）は少なくとも５０％対照より大きい。しかし、最も強力な証拠は、それらが産生するＴ３種子のサイズ及び組成にある。
【０２２４】
Ｔ３種子は、Ｔ２センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物の全ての系統から測定された。各系統の写真が撮影され（図２９で、最大のものと最小のものが強調表示されている）、較正のために使用された写真の中でマイクロメータを用いてコンピュータ内で測定が行なわれた。各系統及び対照について、視野内の最大の種子のうちの１０個を測定し、計算に使用した。高発現度の系統２は野生型及び２成分対照に比べ最高３倍大きい種子を有することがわかった。最低の発現を示した系統（系統１１及び１６）は、野生型及び２成分対照の種子のサイズの約８８％でしかない最小の種子のいくつかを有していた。各系統についての平均種子サイズを、ｎｍ3で表現し（図３０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａからの種子はほぼ楕円形であることから、楕円形の体積についての等式を用いて計算した。対照種子の測定されたサイズは、Ｂｏｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１年）により決定された通りの公示された指針の中に入っていた。個々の種子の測定されたサイズ及び合計種子収量（重量及び体積の両方）から、平均個別種子重量を計算し、プロットした（図３１）。対照種子と異なるサイズを実証した系統の大部分が同様に、個々の種子重量において同じ傾向を有しているように思われた。実際、種子重量を種子サイズ（体積）に対してプロットした場合、関係は、Ｒ2＝０．７４１２で大部分が直線関係であった。増大した密度（うち３つ）又は減少した密度（うち２つ）のいずれかを有する外れ値である５つの系統が存在していた。増大した密度を有する系統の１つが８Ｄであり、Ｔ３世代まで存続させられることになる。Ｔ２世代植物の全てからの合計種子収量は、わずかの傾向を伴って、かなり可変的であった。しかしながら１つの顕著な系統は、最大の種子（重量及び体積の両方）を産生した、中発現レベルのセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統４Ｄである。実際、４Ｄは対照植物に比べ２．５倍多くを産生し、Ｔ３まで存続させられることになる。
【０２２５】
Ｔ３種子を、前述の通りに選択培地上でプレート固定した。系統１Ａ、２Ｄ、４Ｄ、１５Ａ、８Ｄ、９Ｈ、１１Ｃ及び１６Ｃを土壌に移植した。センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統１のいくつかのその他の亜系統は発芽せず、全ての亜系統のうちで最大の種子を有していた系統２Ｈも発芽しなかった。系統１１（同時抑制系統の１つ）からの植物は、この週齢で標準的に発見されるほど健康ではなかった。これらの種子は同様に、測定された最小のものの１つであった。カナマイシン耐性をもたない植物ならびに全ての系統から発芽しなかった種子がなおも存在していたため、これらの系統はなお分離中である。同じ要領で処理された対照種子が全て発芽したことから、これはおそらく、トランス遺伝子の副作用であり、技術ではない。
【０２２６】
実施例２２
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの特徴づけ
全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを得るための方法
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃ  ＤＮＡライブラリーからのｅＩＦ−５Ａ遺伝子をＰＣＲするために、ベクタープライマーＴ３及びＴ７と組合わせて複数の植物ｅＩＦ−５Ａ遺伝子に基づく縮重プライマーを使用した。具体的には、Ｔ３プライマー（ライブラリーベクター内でＦ５Ａ遺伝子の上流側に位置する）及び下流側（逆方向配位）縮重プライマーの１つの両方を用いてＰＣＲ反応から、ｅＩＦ−５Ａ遺伝子の５’領域を得た。同様にして、Ｔ７プライマー（ライブラリーベクター内のｅＩＦ−５Ａ遺伝子の下流側に位置する）と上流側（順方向配向）縮重プライマーの両方を用いてＰＣＲ反応から遺伝子の３’領域を得た。遺伝子の５’領域及び３’領域の整列分析から、全長ｅＩＦ−５Ａ遺伝子を誘導した。
【０２２７】
各々のＰＣＲ反応について２〜３個の主要産物が存在する。これらのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにクローニングし、配列決定した。ｅＩＦ−５Ａ陽性ＰＣＲフラグメントを、遺伝子バンクに対するマッピング解析に基づいて同定した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓについては１つの上流側及び下流側陽性ｅＩＦ−５Ａ  ＰＣＲフラグメントしか存在しない。
【０２２８】
５’及び３’ＰＣＲフラグメント配列結果に従って、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅＩＦ−５Ａ遺伝子のための特異的５’−及び３’−末端プライマーを設計した。その特異的５’−及び３’末端プライマー及び対応するｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いて、ＰＣＲ反応から全長ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅＩＦ−５Ａ遺伝子を得た。配列決定により全長遺伝子をさらに確認した。最終的に、我々は、１つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｅＩＦ−５Ａアイソフォーム遺伝子をクローニングし、これを老化誘発型ｅＩＦ−５Ａと命名した。
【０２２９】
Ｔ３及びＴ７プライマー：
Ｔ３：５’−ＡＴＴ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＡＧ−３’
Ｔ７：５’−ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧ−３’
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅＩＦ−５Ａのための縮重プライマー
順方向（上流側）プライマー：５’−ＡＡＡ  ＲＲＹ  ＣＧＭ  ＣＣＹ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴ−３’
逆方向（下流側）プライマー：５’−ＴＣＹ  ＴＴＮ  ＣＣＹ  ＴＣＭ  ＫＣＴ  ＡＡＨ  ＣＣ−３’
【０２３０】
（ＳＡＧ１２プロモーターを含む）ｐＫＹＬＸ７１内へのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアンチセンス全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのサブクローニング
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａアンチセンス全長構成体のための特異的（相同性）プライマー：順方向全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａプライマー（３０−ｍｅｒ）：５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣ−３’（注：下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内でＳａｃＩ部位内にＰＣＲフラグメントの５’末端をライゲートするために用いられるＳａｃＩ認識配列である）。逆方向全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａプライマー（３６−ｍｅｒ）：５’−ＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣ−３’（注：下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭＣＳ内へのライゲーションのために用いられるＮｏｔＩ認識配列である）。
【０２３１】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＭＣＳ内部のＳａｃＩ及びＮａｔＩ部位の配向は、遺伝子がそのアンチセンス配向でサブクローニングされる（すなわちＮｏｔＩ部位はＳａｃＩ部位の上流側になる）ようなものであった。
【０２３２】
実施例２３
アンチセンス老化誘発型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ全長ｅＩＦ−５Ａを発現するためにＳＡＧ１２プロモーターが使用された
実験的証拠は、１組の「老化関連遺伝子」つまりＳＡＧの転写が老化の開始の間に増大することを示している（Ｌｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４年；Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年）。実際、老化は新しいｍＲＮＡの合成そして恐らくはその他のｍＲＮＡのダウンレギュレーションと共に始まると思われ、老化には、タンパク質の選択的合成が必要であることを表わしている（Ｎｏｏｄｅｎ，１９８８年）。葉の老化プログラムには遺伝子発現の変化が付随するということは、インビトロ翻訳とそれに続く翻訳可能なｍＲＮＡ集団の中で発生する変化を検出するためのゲル電気泳動を用いてＷａｔａｎａｂｅ及びＩｍａｓｅｋｉ（１９８２年）によって最初に実証された。この初期の研究作業及びインビトロ翻訳されたタンパク質のその後の分析により、大部分の豊富なｍＲＮＡが老化の進行中に有意に低減し、一方その他の翻訳可能なｍＲＮＡが増大するということが明らかになったＷａｔａｎａｂｅ  ａｎｄ  Ｉｍａｓｅｋｉ，１９８２年；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，１９８９年；Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａｐｅｌ，１９９３年；Ｂｕｃｈａｎａｎ−  Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，１９９４年；Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９５年。老化葉組織のｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡライブラリーの示差的スクリーニングも同様に、老化中に数多くの遺伝子の発現がダウンレギュレートされ、一方、その他の遺伝子の発現がアップレギュレートされることを実証した。ＳＡＧは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９３年；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９３年；Ｌｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４年；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６年）、アスパラガス（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９５年）、大麦（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ａｐｅｌ，１９９３年）、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ（Ｂｕｃｈａｎａｎ−  Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ，１９９４年）、トウモロコシ（Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９５年）、大根（Ａｚｕｍｉ  ａｎｄ  Ｗａｔａｎａｂｅ，１９９１年））及びトマト（Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，１９８９年；Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９６年）を含めたさまざまな植物種から同定されてきた。
【０２３３】
老化は、葉の縁部で始まり最後に葉脈に達する特徴的にパターン化された葉の黄変として同定される（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ，１９９８年）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａロゼット葉内の目に見える老化は、その時点でのＳＡＧ１２の劇的なアップレギュレーションを伴って、発芽から約２１日目に現われる（Ｎｏｈ  ａｎ  Ａｍａｓｉｎｏ，１９９９年）。ＳＡＧ１２は、自然老化に対する最も近い特異性をもつ遺伝子であり、従って老化マーカーと呼ばれる。若葉の中にいかなる検出可能な発現もない状態で、ＳＡＧ１２は、２０％までが黄色になった後に、比較的古い葉の中で誘発されるが、葉の黄変を誘発しない処理によっては誘発され得ない（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８年）。自然老化に対するその高度の特異性は、ＳＡＧ１２の遺伝子産物がシステインプロテアーゼに対する類似性を示し、老化の間のタンパク質の代謝回転に関与し得るという事実によって説明できる（Ｌｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４年；Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８年）。
【０２３４】
遺伝子導入植物の描写
発芽から約２１日後に自然の葉の老化の開始時点で活性化される（Ｎｏｈ  ａｎｄ  Ａｍａｓｉｎｏ，１９９４年）ものの、ストレス誘発型老化の場合には活性化されない、ＳＡＧ１２（葉老化特異的）プロモーターの制御下で全長アンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａトランス遺伝子を発現する遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が生成された。この時点で、遺伝子導入植物は、制御された全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ発現に特徴的である表現型を発現する。ロゼット葉は、３〜８週齢の遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアンチセンス全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ植物から収穫された。
【０２３５】
ＳＡＧ１２プロモーターの制御下でのホモ接合性ＴＡＣアンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物の産生のための方法論
ｐＫＹＬＸ７１内へのＳＡＧ１２−アンチセンス−全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ構成体の挿入
まず最初に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでプラスミドｐＫＹＬＸ７１をカットして、その２重３５Ｓプロモーターを除去し、結果として得られた付着末端にクレノウ酵素を充てんして平滑末端を作り出した。このとき、プロモーター無しのｐＫＹＬＸ７１をライゲートしてプラスミドを再環状化させた。
【０２３６】
第２に、以下で記述する通り、ＳａｌＩ及びＸｂａＩを含むプライマーを用いてＰＣＲによりゲノミックＤＮＡからＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＳＡＧ１２プロモーターを増幅させた。このプロモーター配列を次に、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩを用いたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内に挿入して、その後Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートした。
【０２３７】
順方向ＳＡＧ１２プライマーは、５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣ−３’であった（下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内のＳａｌＩ部位内にＰＣＲフラグメントの５’末端をライゲートするために用いられるＳａｌＩ認識部位である）。逆方向ＳＡＧ１２プライマーは５’−ＣＧＴＣＴＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＧＡ−３’であった（下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内のＳａｌＩ部位内にＰＣＲフラグメントの５’末端をライゲートするために用いられるＸｂａＩ認識部位である）。
【０２３８】
第３に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＡＧ１２：アンチセンス−全長−老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ構成体を作り上げるためには、以下で概略説明される通り、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩ制限部位を伴うプライマーを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを増幅させ、前段落で記述されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＡＧ１２内にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＡＧ１２ベクターのＭＣＳ内部のＳａｃＩ及びＮｏｔＩ部位の配向は、遺伝子がそのアンチセンス配向の中でサブクローニングされるようなものであった（すなわちＮｏｔＩ部位はＳａｃＩ部位の上流側にある）ということに留意されたい。
【０２３９】
順方向全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａプライマーは、５’−ＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣ−３’であった（注：下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＡＧ１２ベクターのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内のＳａｌＩ部位内にＰＣＲフラグメントの５’末端をライゲートするために用いられるＳａｌＩ認識配列である）。逆方向全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａプライマーは５’−ＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣ−３’であった（下線部分は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＡＧ１２ベクターのＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）内へのライゲーションのために使用されるＮｏｔＩ認識配列である）。
【０２４０】
最後に、ＳａｃＩ及びＸｈｏＩでｐＫＹＬＸ７１を消化させることと同時にＳａｌＩ及びＳａｃＩでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからＳＡＧ１２：全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａカセットを切り取ることにもよって、二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１の中に所望の構成体を作り出した。
【０２４１】
ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ付着末端は、部分的に相補的であった。従って、これら２組の消化されたオーバーハング（具体的にはＳａｃＩとＳａｃＩ、及びＸｈｏＩとＳａｌＩ）は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼと共にライゲートされて、最終的構成体（ｐＫＹＬＸ７１内のＳＡＧ１２：アンチセンス−老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ）を作り出すことができた。
【０２４２】
形質転換及びＴ１種子収穫
ｐＫＹＬＸ７１−ＳＡＧ１２：アンチセンス−ｅＩＦ−５Ａ構成体を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨα細胞内で増殖させ、単離し、コンピテントＡＧ菌株の中に電気穿孔した。その後細菌を使用して、４、５週齢の野生型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を浸潤させ、結果として得られた浸潤植物を「Ｔ0」植物と呼称し、これらを次にそのライフサイクルの終りまで成長させた。種子を収穫し、収集し、Ｔ1種子と呼称した。Ｔ1種子の１０枚のプレートを固定し、野生型を対照として、カナマイシン耐性についてスクリーニングした（１／２ＭＳ塩及び５０μｇのカナマイシン／ｍＬ）。ｐＫＹＬＸ７１−ＳＡＧ１２−アンチセンス−ｅＩＦ−５Ａ構成体を含む種子のみが生存し、カナマイシン（Ｋ５０）培地上で成長する。これらのプレートから２４Ｔ1の苗を選び、土壌中に置く。Ｔ1遺伝子導入植物から収穫した種子をＴ2種子として標識した。各々の苗は、１つの植物系統を生成した（＃１＝１つの植物を含む１つの系統、＃２＝１つの植物を含む１つの系統など）。
【０２４３】
表現型のスクリーニング及び同定
カナマイシン耐性Ｔ1種子がひとたび同定されたならば、Ｔ2、Ｔ3及びＴ4植物の連続的世代を成長させた。Ｋ５０培地上で種子をスクリーニングすることによって、遺伝的構成体を受け継ぎその構成体についてホモ接合性であった植物を区別することが可能であった。鉢の中で成長させた場合、１つのＴ3植物系統内に、発育不全の表現型発現が見られた。しかしながら、同じ一組の種子を同一の条件で再度成長させた場合、表現型は観察されなかった。
【０２４４】
２４Ｔ1植物から、高い種子収量を基準にして４つの系統を選択し（系統Ｔ２．１４、Ｔ２．１８、Ｔ２．１９及びＴ２．２３）、野生型種子を対照としてＫ５０培地上にプレート固定した。各系統からの種子の約７５％がＫ５０培地上で生存し、小、中及び大のサイズカテゴリの中に入った。各系統から、小、中及び大の苗をプレートから取り出し、土壌の中に植えた。温室条件下で、小型の苗は、その中及び大型の対応物ほど迅速には回復しなかった。６週齢に、小型植物は、他の植物が抽苔し花をつけていたのに対し、抽苔の兆候をちょうど示し始めたばかりであった。合計して、６つの遺伝子導入Ｔ2植物（合計３系統×８植物＝９６遺伝子導入植物のうち）が抽苔の劇的な遅れを示し、「遅発性抽苔」植物とみなされた。これらの植物の種子収量も又その他の遺伝子導入植物よりも劇的に低いものであった。
【０２４５】
９６のＴ2植物のうち、３系統を、Ｔ3植物の産生のために選択した（遅発性抽苔であったＴ３．１９．Ｓ８及びＴ３．１４．Ｌ７；及び遅発性抽苔でなかったＴ３．２３．Ｓ３）。Ｋ５０培地プレート上にプレート固定した時点で、これらの系統はホモ接合型生存を示した。１３の苗を鉢に移植した（鉢１つあたり１０本の苗）。この１組の植物から、Ｔ３．１４．Ｌ７植物系統内に劇的な矮性表現型が観察された。Ｔ4の種子を収集し、その系統内でより低い種子収量が見られた。密度の高い成長（密度の高い長各果成長、より多くの枝）表現型が系統Ｔ３．１９．Ｓ８の中で観察され、一方野生型に類似した表現型が系統Ｔ３．２３．Ｓ３において観察された。３つの遺伝子導入系統からの種子サイズが比較されたが、統計的に有意な差異は全く見極められなかった。クロロフィルＩレベルも同様に分析されたが、野生型対照との統計学的に有意な差異は全く見極められなかった。
【０２４６】
系統Ｔ３．１９．Ｓ８、Ｔ３．１４．Ｌ７及びＴ３．２３．Ｓ３のＴ4種子をＫ５０上でスクリーニングして植物の次の世代を得、これは、死滅した野生型と比較して、受け継がれた遺伝子構成体の証拠（プレート上の均質な緑色成長）を示した。しかしながら、個々の平箱内に植えた場合、矮正表現型は発現されず、これはｅＩＦ−５Ａアンチセンストランス遺伝子が喪失したことを示唆していた。最後に、全てのＴ5植物から収集した種子をＫ５０プレート上でスクリーニングし、これらは、カナマイシン耐性の証拠を示した。現在、アンチセンストランス遺伝子が失われこれらのＴ4植物が不対性であることを確認する研究作業が進行中である。
【０２４７】
母系統Ｔ２．１４、Ｔ２．１９及びＴ２．２３から８つの娘系統を選択し、対照としての野生型種子と共にＫ５０培地上でスクリーニングした。低い種子収量に基づいて、Ｔ３．１４．Ｌ８、Ｔ３．１４．Ｓ８及びＴ３．２３．Ｓ１という３つの系統を選択した。選択された他の５つの系統は、Ｔ３．１８．Ｓ７、Ｔ３．１８．Ｓ２、Ｔ３．１９．Ｓ１、Ｔ３．１９．Ｓ５及びＴ３．２３．Ｓ６である。Ｋ５０培地上でスクリーニングされた全ての系統は、ホモ接合性の生存を示し、一方、Ｔ３．１４．Ｌ８、Ｔ３．１４．Ｓ８及びＴ３．２３．Ｓ６はヘテロ接合性生存を示した。生存した系統Ｔ３．１４．Ｌ８及びＴ３．１４．Ｓ８からの苗は、白色で緑色の脈管組織を有し、一方、生存したＴ３．２３．Ｓ６からの苗は全体が暗緑色であった。これらの苗は、移植用に選択された。合計で、各系統から２８の苗を細胞内に移植し、温室条件で成長させた。
【０２４８】
３週齢に、系統Ｔ３．１４．Ｌ８及びＴ３．２３．Ｓ１ならびに系統Ｔ３．１８．Ｓ７、Ｔ３．１８．Ｓ２、Ｔ３．１９．Ｓ１、Ｔ３．１９．Ｓ５、Ｔ３．２３．Ｓ１及びＴ３．２３．Ｓ６内の複数の植物を除いて、全ての系統は抽苔し始めた。不規則なロゼット葉の形態（第２対葉表現型）が、Ｔ３．１４．Ｌ８及びＴ３．１４．Ｓ８系統の中に見られた。５週齢に、系統Ｔ３．１８．Ｓ７及びＴ３．２３．Ｓ６の中に、増大した数のロゼット葉及び縮縁ロゼット葉表現型の付加的な不規則な葉形態も観察された。系統Ｔ３．２３．Ｓ１、Ｔ３．１９．Ｓ１及びＴ３．１９．Ｓ５の中には、野生型よりも小さいロゼットが見られた。７週齢に、系統Ｔ３．１８．Ｓ７、Ｔ３．１８．Ｓ２、Ｔ３．１９．Ｓ１、Ｔ３．１９．Ｓ５、Ｔ３．２３．Ｓ１及びＴ３．２３．Ｓ６の中に、ひょろっとした茎及び茎伸長の無い表現型が観察された。各植物の第１及び第２の茎出葉を、老化ｅＩＦ−５Ａタンパク質発現の調査のために、それぞれ５週齢及び６週齢に収集した。
【０２４９】
実施例２４
酵素産出量の決定
葉を収穫し、秤量の前に面積を測定した。乳鉢及び乳棒で１ｍＬの低温脱気すりつぶし用緩衝液を用いて、葉を細かい粉末にすりつぶした。その後、ホモジネートをエッペドルフ型管に移し、直ちに氷上に置いた。トマト葉については、単離されたホモジネートは、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ片を通してろ過する必要があった。
【０２５０】
全ての試料からの５０μｌのホモジネートを、５ｍｌのすりつぶし用緩衝液及び２５μｌのＤＣＰＩＰ（２．６−ジクロロフェノールインドフェノール）の入った１０ｍｌ入りの試験管の中に添加した。試料を充分に振とうさせ、次に一対のランプによる照明の下に１組の試料を１５分間置き、１５分間暗所に第２組の試料を置いた。１５分のインキュベーションの後、５０μＬのＤＣＭＵ（３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１ジメチルウレア）を両方の試料セットに加えて反応を停止させ、次に１４，０００ｇで２分間、微小遠心分離機内で遠心分離に付した。収集した上清の吸光度を、ブランクとしてすりつぶし用緩衝液を用いて５９０ｎｍと読取った。
【０２５１】
この検定のためのモル吸光係数は、１６×１０3である。すなわち、１リットルあたり１モルの濃度変化は、溶液の吸光度を、１６×１０3μｍｏｌｅの１時間１ｍｌあたりの削減ＤＣＰＩＰ＝（吸光度の差）×［１／１６×１０3（ｍｏｌｅｓ／ｌ）］×［反応体積（ｍｌ）／１０3（ｍｌ／ｌ）］×［１０6（μｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ）］×［６０（ｍｉｎ／ｈｒ）／反応時間（ｍｉｎ）］×［１／試料体積（ｍｌ）］だけ変化させる。
【０２５２】
ＤＣＰＩＰが２モル削減される毎に、１モルのＯ2が生成される。参考文献：Ａｌｌｅｎ  Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｈｏｌｍｅｓ  Ｎ．Ｇ．，１９８６年「光合成における電子輸送及び酸化還元滴定：エネルギー変換」、Ｍ．Ｆ．Ｈｉｐｋｉｎｓ  ＆  Ｎ．Ｒ．Ｂａｋｅｒ．編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、１０７〜１０８頁。
【０２５３】
実施例２５
でんぷんの定量的決定
トマトの茎の中のでんぷん含有量を、Ｌｕｓｔｉｎｅｃ  ｅｔ  ａｌ．「ガラス繊維紙を用いた植物組織内のでんぷん、アミロース及びアミロペクチンの定量的決定」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２；２６５−２７１（１９８３年）から適合された方法を用いて決定した。トマト茎組織を、Ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ（各５秒ずつ１２回反復）とそれに続くＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（３０秒）を用いて、３体積の水中で均質化させた。分析の前に−２０℃で１０ｍｌのアリコートの形でホモジネートを保管した。分析のために、１０ｍｌのホモジネートを解凍し、等体積の濃縮過塩素酸（ＨＣｌＯ4、７０％ｗ／ｗ）と混合し、室温で２０分間インキュベートしてでんぷんを溶解させた。同時に、複数のじゃがいもでんぷん溶液（０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内）をトマト茎試料と並行処理して標準曲線を生成した。ホモジネート（又はじゃがいもでんぷん標準溶液）を撹拌し、吸引装置に取付けられた真空フラスコを用いて、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラス超極細繊維紙（直径９．０ｃｍ）を通してろ過した。１ｍｌのろ液を３ｍｌのヨウ素溶液Ａ（８ｍＭのＩ2、１７ｍＭのＫＩ、５１４ｍＭのＮａＣｌ）と混合し、４℃で３０分間インキュベートしてでんぷん−ヨウ素沈殿物を形成させた。吸引装置に取付けられた真空フラスコを用いて、Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ａガラス超極細繊維紙（直径９．０ｃｍ）上で沈殿物を収集し、その後、ろ液を次の溶液で洗浄した：１０ｍＬのヨウ素溶液Ｂ（８３ｍＭのＩ2、１８０ｍＭのＫＩ、８％の過塩素酸［ＨＣｌＯ4］）で一回；５ｍＬのエタノール−ＮａＣｌ溶液（６７％のエタノール、３４２ｍＭのＮａＣｌ）で一回；３ｍｌのエタノール−ＮａＯＨ溶液（６７％のエタノール、２５０ｍＭのＮａＯＨ）で２回。ひとたびエタノールを蒸発させたならば、極細繊維紙を吸引装置から取出し、ネジ蓋式ガラス管の中に挿入した。管に硫酸［Ｈ2ＳＯ4］（９ｍＬの０．７５Ｍ溶液）を加え、３０分間沸とう水浴中で管をインキュベートした。溶出液の３つの１ｍＬアリコートをガラス試験管内にピペットで取り、１ｍＬの５％フェノールと混合させ、直後に５ｍＬの濃Ｈ2ＳＯ4と混合した。管をボルテックス処理し、室温で３０分間インキュベートして発色させた。同時に、１ｍＬの５％フェノールと１ｍＬの０．７５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を混合し、５ｍＬの濃Ｈ2ＳＯ4を添加することにより、分光光度測定のためのブランクを調製した。同様に、３０分間室温でブランクをインキュベートした。ブランクを使用して分光光度計を４８０ｎｍで較正し、全ての試料及びじゃがいもでんぷん標準のＯ．Ｄ．を測定し記録した。じゃがいもでんぷん溶液を用いて標準曲線を作成し、各試料中のでんぷん量を補間するのに使用した。
【０２５４】
実施例２６
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（Ａｔ−ｅＩＦ）及びトマトセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子により独立してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生態型）を形質転換させた。これらの遺伝子を、遺伝子導入植物の全ライフサイクルの中で構成的に発現させた。これらの植物の花序茎は、木質部の発達の有意な増加を示した。図８９〜９４を参照のこと。
【０２５５】
遺伝子導入及び対照植物の種子を１／２ＭＳ培地寒天プレート上に播き２２℃、８０％ｒｈ（相対湿度）、及び一日１６時間の照明で成長チャンバー内に９日間保った。その後、苗を、市販の土壌の入った３２ウェルの平箱に移し、４８時間上述のものと同じ条件下に維持した。顕微鏡での観察のため、主要な花序茎を選択した。ロゼットから上２ｍｍ以内のところで茎の基部から横断面を手で切り取った。クロログルシノール−ＨＣｌ方法で、切片を染色した。我々は、この週齢の茎の木質部がその最大限の発達を達成していることを発見した。遺伝子導入植物と対照植物の間で、木質部のサイズ（断面積）の比較を行なった。さらに、遺伝子導入植物及び対照植物の両方において、師部及び髄について測定を行なった。
【０２５６】
組織面積の測定は、以下の通りであった。すなわちＺｅｉｓｓ顕微鏡で断面を写真撮影し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて顕微鏡写真をデジタル化した。これらの画像を紙上にプリントアウトし、異なる組織を切り取り、面積測定計によりその面積を測定した。各組織の実質の面積を計算するためには、以下の公式を使用した：実面積＝（紙上の個々の組織の面積）／（倍率）2。
【０２５７】
老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが木質化に付随するプログラミングされた細胞死に関与していると思われる。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内の老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａの構成性アンチセンス抑制が、花序茎の厚みならびに木質部細胞層の数を削減した。これとは対照的に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ又はトマトの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａが構成的に過剰発現された植物の花序茎は、平均して、対応する野生型植物のものよりも１．７倍厚く、花序茎の断面積あたりの合計木質部面積は２倍大きいものであった。過剰発現する遺伝子導入植物は同様に、野生型植物に比べはるかに増大したロゼット葉バイオマスを有し、より急速に成長しており、これは栄養素摂取の増大を反映している可能性がある。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物内でトマトからのｅＩＦ−５Ａの老化誘発型アイソフォームが過剰発現された場合に、及び表現型が観察された。これらの結果は、集合的に、ｅＩＦ−５Ａの老化誘発型アイソフォームが葉及び花の老化を調節するだけでなく木質化にも関与しているということを表わしている。
【０２５８】
実施例２７
デオキシヒプシン合成の抑制は、環境大気中での予備包装されたカットレタスの褐変を遅延させる
グルココルチコイド誘発型プロモーターによるトランス遺伝子（アンチセンスＤＨＳ）の制御された連続的誘発を得るために理想的であったことから、水耕法によってレタスを成長させた。誘発物質デキサメタゾンを直接水耕溶液に適用した。
【０２５９】
図１４９（ａ）は、収穫直前の６週齢の植物を示す。図１４９（ｂ）は、鉢の内部のエアストーンの図を示している。図１４９（ｃ）は、植物を支持するための３つの開口部を備えたフタを示す。図１５０は、環境大気中のカットレタスの褐変を示す。
【０２６０】
図１５０（ａ）は、３つの遺伝子導入系統すなわちアンチセンス配向におけるレタスＤＨＳの３’ＵＴＲを発現する系統１３（ｎ＝４）、系統２１（ｎ＝５）及び系統３４（ｎ＝７）、ならびに野生型ロメイン・レタス（Ｇｒｅｅｎ  Ｔｏｗｅｒｓ変種；ｎ＝１２）についての時間の係数として、プロットした褐変の開始を示している。トランス遺伝子は、グルココルチコイド誘発型プロモーターの制御下で発現された。レタス頭部を水耕法で成長させ、収穫し、小さな切片に切り刻んだ。切り刻んだレタスを、６日間、７．５℃で有孔ファスナー付き袋の中に維持した。カットレタスの褐変を０〜４の尺度で評価し、ここで１という格付けは、褐変の開始として定義づけされた。標準誤差バーが示されている。図１５０（ｂ）は、６日間の研究を通して褐変率０％を示した系統２１の２つの個々の植物の結果を示している。図１５０（ｃ）は、野生型レタスが褐変したのに対し、同じ期間にわたり同様に褐変しなかった系統３４の１つの個別植物の結果を示している。
【０２６１】
図１５１は、ＤＨＳタンパク質の減少した発現を示す遺伝子導入レタスのウェスタンブロットを示す。レタスＤＨＳのアンチセンス３’ＵＴＲを発現する４つの個々のレタス植物ならびにＴ２世代において分離された遺伝子としてトランス遺伝子を失なった１本の植物（「ヌル」）、及び１本の野生型植物からの総タンパク質を単離し、クーマシーブルーで染色させた１４％のアクリルアミドゲル上に２０μｇの各試料を投入した。ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットし、トマトＤＨＳに対して発生させられたポリクローナル抗体でプローブを探査した。ブロットを比色分析で現像し、これは、遺伝子導入植物内のＤＨＳの発現が、ヌル及び野生型植物との関係において削減されたことを示している。
【０２６２】
実施例２８
カノーラ内のデオキシヒプシンシンターゼ発現の抑制が、種子収量を増加させる
デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）は、不活性真核生物翻訳開始因子−５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）を、翻訳を促進できる活性化形態へと転換させる２つの酵素反応のうちの最初のものを媒介する。カノーラ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ｃｖ  Ｗｅｓｔａｒ）ＤＨＳをコードする全長ｃＤＮＡクローンを老化する葉から調製したｃＤＮＡ発現ライブラリーから単離した。構成性カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ−３５Ｓ）プロモーターの調節下でカノーラＤＨＳｃＤＮＡのアンチセンス３’ＵＴＲを発現させることにより遺伝子導入カノーラ植物内でＤＨＳを抑制させた。ＤＨＳタンパク質の発現の減少を示す図１５８を参照のこと。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのために開発されたプロトコルを修正することにより、カノーラ花序の真空浸潤により、遺伝子導入カノーラ植物を得た。植物を真空浸潤させた後で形成した新しい花を除去することで形質転換の効率を増強させることができ、５０〜６０％の形質転換率が日常的に得られた。遺伝子導入植物は、低減された葉ＤＨＳタンパク質レベルを有し、遅延した自然の葉の老化を示した。ＤＨＳの抑制は同様に、１．５〜２倍の（図１５７を参照のこと）葉のサイズを増大させ、結果として最高６５％の種子収量の増大をもたらした（図１６０参照。これは一部には、系統に応じて野生型長角果よりも平均１８％〜２６％長いものであった長角果のサイズの増大に起因していた（図１５９参照）。６インチの鉢で野生型及び遺伝子導入植物を成長させた場合、ＤＨＳの抑制の結果生じる種子収量の増加は、植物を１２インチの鉢の中で成長させた場合に比べて最高４．５倍大きいものであった。かくして、ＤＨＳの抑制は、小さなコンテナ内での成長により生み出される致死下的ストレスの影響を改善するように思われる。遺伝子導入植物のための種子収量の増大は、トリアシルグリセロールの測定に基づく種子油含有量の対応する増加の形を変え、遺伝子導入種子内には油の脂肪酸組成の変化は全く存在しなかった。図１６１（ａ）及び（ｂ）を参照のこと。
【０２６３】
実施例２９
デオキシヒプシンシンターゼの阻害物質を投与すること及びデオキシヒプシンシンターゼのアンチセンス抑制によるカーネーションの花の花瓶寿命の延長
デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）をコードする全長ｃＤＮＡクローン（ＡＦ２９６０７９）をカーネーションの花弁から単離した。ＤＨＳは、不活性真核生物翻訳開始因子−５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）を、翻訳を促進できる活性化形態へと転換させる２つの酵素反応のうちの最初のものを媒介する。ノーザン分析により、ＤＨＳ発現がカーネーションの花弁の老化と相関されるということが明らかになった。ジアミノブタン（プトレッシン）、ジアミノプロパン、ジアミノヘキサン、ジアミノオクタン及びスペルミジンを含めたＤＨＳ反応の阻害物質でのカーネーションの切り花の処理が、花の花瓶寿命を最高８３％延長した。カーネーションの花の老化におけるＤＨＳの役割をより決定的に評価するために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換を通して構成性カリフラワーモザイクウイルスプロモーターの調節の下でカーネーションＤＨＳ  ｃＤＮＡのアンチセンス３’−ＵＴＲを導入することにより、遺伝子導入植物内でタンパク質の発現を抑制した。削減されたＤＨＳ発現を有する遺伝子導入花の３つの系統を分析し、野生型花に比べて長い花びん寿命を有することを発見した。実際、系統の１つは、１００％を超える花びん寿命の増大を示した。これらの発見事実は、ＤＨＳが花の老化において中心的役割を果たすことを示している。
【０２６４】
実施例３０
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるデオキシヒプシンシンターゼの抑制により誘発される抽苔が遅れる表現型は、ＧＡ３での処理により救済可能である
デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）は、真核生物翻訳開始因子５Ａ（ｅＩＦ−５Ａ）の翻訳後活性化に必要とされる遍在する酵素である。ＤＨＳは、老化特異的ＳＡＧ１２プロモーターの調節下で遺伝子導入植物内で全長アンチセンスＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ  ｃＤＮＡを発現することにより、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内で抑制された。トランス遺伝子を発現する植物は、低減したレベルの葉ＤＨＳタンパク質を有し、遅延抽苔及び葉の老化の開始の顕著な遅延（２〜５週間）を示した。花茎は又より短くなったが、その結果バイオマス又は種子収量が減少することはなかった。ＧＡ３での遺伝子導入植物の処理は、抽苔が遅れる表現型を逆転させた。デキサメタゾン（ＤＥＸ）を投与することにより活性化され得るグルカコルチコイド誘発型プロモーターであるＧＣＩの調節下でのＤＨＳのアンチセンス抑制により類似の表現型が得られた。ここでも又、ＧＡ３の投与が、この表現型を救済した。すなわち、ＧＡ３で処理された遺伝子導入植物は正常に抽苔し、花茎は正常サイズのものであり、葉の老化開始の遅延は全く無かった。これらの結果は集合的に、ＤＨＳがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内のｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォームのうちの単数又は複数のものの活性化を通してＧＡ代謝に影響を及ぼすということを表わしている。
【０２６５】
実施例３１：バイオマスを増大させるためのハコヤナギ由来のセンス成長ｅＩＦ−５ＡでのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換
４週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を、ｐＫＹＬＸ７１−センターポプラ成長ｅＩＦ−５Ａ３を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＧＶ３１０１で浸潤させた。
【０２６６】
遺伝子導入ならびに対照植物（カナマイシン耐性を付与する、空のｐＫＹＬＸ７１ベクターのみで形質転換されたもの）の第１世代（Ｔ１）の種子を、カナマイシンで補足された１／２ＭＳ培地寒天プレート上に播いた。プレートを９日間、２２℃、８０％ｒｈ、及び１６時間の照明／日で成長チャンバー内に保った。その後、市販の土壌混合物の入った３２ウェルの平箱に苗を移し、Ｔ２種子が収穫されるまで上述のものと同じ条件下で維持した。１／２ＭＳ培地寒天プレート上で再び、対照植物ならびにＴ２種子の異なる系統をスクリーニングした。土壌中に苗を移し、Ｔ１植物の場合と同じ条件下に保った。
【０２６７】
最良の表現型を有する遺伝子導入系統３をこの実験のために選択した。ウェスタン分析により、ｅＩＦ−５Ａタンパク質が過剰発現されていることを確認した。遺伝子導入系統３植物は、６週齢にベクターのみの対照植物に比べ花序茎の長さの１．５倍の増大を示し、対照植物の４倍の種子収量を産生した。
【０２６８】
遺伝子導入系統３由来の種子を、過剰発現されたポプラｅＩＦ５Ａ３を宿す遺伝子導入苗をスクリーニングするために、（カナマイシンで補足された）１／２ＭＳ培地を伴うプレートの上に播いた。
【０２６９】
１週齢の苗を土壌、ｓｕｎｓｈｉｎｅ  ＬＣ１／ＬＧ３（基本土壌、肥料無添加）に移した。日常的に用いられているより肥沃な土壌銘柄（Ｐｒｏｍｉｘ  ＢＸ）に比べた、この土壌銘柄についての土壌分析に関する論述についてはＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３年）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５３；１２２３−１２３５を参照のこと。
【０２７０】
水遣りが必要とされる場合（約３日後）、土壌が飽和するまで、０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ及び５ｇ／Ｌで一連の肥料（２０：２０：２０）を適用した（植物の別々の平箱に対して）。最善な成長のための肥料の推奨量は、１ｇ／Ｌである。肥料は、一週間に一度再適用された。
【０２７１】
葉のサイズ及び色、抽苔時期及び花序茎高さ、長角果のサイズ及び数などについて、形態及び表現型を観察した。結果として得た遺伝子導入植物は、最善、最善未満及び超最善濃度の肥料で、バイオマスを増大させた。図１７２及び１７３を参照のこと。
【０２７２】
実施例３２：バイオマスを増大させるためのセンス配向での突然変異体老化ｅＩＦ−５ＡでのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の形質転換
上述の通りに（ヒプシン化不能な）突然変異体老化ｅＩＦ−５ＡでＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を形質転換させた。結果として得た遺伝子導入植物は、最善、最善未満及び超最善濃度の肥料でバイオマスを増大させた。図１７４及び１７５を参照のこと。
参考文献
【０２７３】
【表１】
2008521445.tif 000002
【０２７４】
【表２】
2008521445.tif 000003
【０２７５】
【表３】
2008521445.tif 000004
【０２７６】
【表４】
2008521445.tif 000005
【０２７７】
【表５】
2008521445.tif 000006
【０２７８】
【表６】
2008521445.tif 000007
【０２７９】
【表７】
2008521445.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】ｅＩＦ−５Ａ単離Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（系統１）（以前に米国特許第６，５３８，１８２号及び係属出願第０９／７２５，０１９号内で記述されたもの）；創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ（系統２）；及び成長ｅＩＦ−５Ａ（系統３）という３つのアイソフォームの整列を示す。
【図２】これら３つのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａアイソフォームのコーティング領域の整列を示す。系統１は老化誘発型ｅＩＦ−５Ａである。系統２は創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａである。系統３は成長ｅＩＦ−５Ａである。
【図３】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのゲノム配列を提供する。
【図４】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａのゲノム配列を提供する。
【図５】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの成長ｅＩＦ−５Ａのゲノム配列を提供する。
【図６】二成分ベクターｐＫＹＬＸ７１−３５Ｓ2のマップである。
【図７】二成分ベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒのマップである。
【図８】コロンビア生態系のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型の異なる組織内のｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォーム全てのウェスタンブロットを示す。
【図９】コロンビア生態系のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型の７２時間後の感染葉の創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ及び老化誘発型ｅＩＦ−５Ａについてのウェスタンブロットである。
【図１０】コロンビア生態系のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ野生型の７２時間後の創傷葉の中のｅＩＦ−５Ａの３つのアイソフォームについてのノーザンブロットである。
【図１１】それぞれ、レーン１、２及び３にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（ＡＴｅＩＦ−５Ａ）、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、及び成長ＡｔｅＩＦ−５ＡのゲノミックＤＮＡからのＰＣＲ産物を描いている。
【図１２】ｐＧＥＭ内の老化誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、及び成長ＡｔｅＩＦ−５Ａゲノム配列を伴うアガロースゲルを示す。
【図１３】ｐＫＹＬＸ７１内の創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａ、成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ、ゲノム配列を伴うアガロースゲルを示す。
【図１４】センス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａを有する構成体で形質転換された植物のためのＴ１プレートの写真である。
【図１５】４週齢のセンス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換されたＴ１植物の写真である。
【図１６】５．５週齢のセンス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換されたＴ１植物の写真である。
【図１７】播種後１０日齢のセンス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換されたＴ２植物の写真である。
【図１８】播種後１０日齢のセンス創傷／病原体誘発型ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換されたＴ１植物の写真である。
【図１９】４週齢のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換されたＴ１植物の写真である。
【図２０】センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ系統で形質転換されたＴ２植物のウェスタンブロットである。
【図２１】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統１Ａ−１Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２２】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統２Ａ−１Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２３】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統４Ａ−Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２４】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統１５Ａ−Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２５】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統８Ａ−Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２６】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統９Ｅ−Ｈ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２７】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統１１Ａ−Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２８】４週齢（上）、５週齢（左下）、及び６週齢（右下）のセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ（系統１６Ａ−Ｄ）で形質転換されたＴ２植物である。
【図２９】さまざまな植物系統由来のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ種子の写真である（野生型対照及びセンス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換された植物系統を含む）。
【図３０】センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換された各々の植物亜系統についての平均種子サイズの棒グラフである。
【図３１】センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換された各々の植物亜系統についての個々の種子重量の棒グラフである。
【図３２】個々の種子の重量と個々の種子の体積の比例関係を示すグラフである。
【図３３】センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａで形質転換された各々の植物亜系統についての１植物あたりの種子の収量を示す棒グラフである。
【図３４】センス成長ＡｔｅＩＦ−５Ａ植物内で表示された表現型のまとめである。
【図３５】野生型植物と遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）植物（アンチセンス全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａで形質転換されたもの）の比較を示す。遺伝子導入植物は老化の遅延を示している。
【図３６】（アンチセンス成長ｅＩＦ−５Ａで形質転換された）植物の写真を示す。
【図３７】（アンチセンス成長ｅＩＦ−５Ａで形質転換された）植物の写真を示す。
【図３８】（アンチセンス成長ｅＩＦ−５Ａで形質転換された）植物の写真を示す。
【図３９】アンチセンスａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ３'ＤＨＳを生成するためのベクタを構築するのに用いられるプライマーを示す。
【図４０】ベクター構成体を示す。
【図４１】ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された創傷／病原体因子ｅＩＦ−５Ａについての配列及びアンチセンス構成体の場所を示す。
【図４２】ベクター構成体を示す。
【図４３】緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の接種を受けた葉片のプレートカウントを示す。
【図４４】アンチセンス遺伝子導入植物対野生型におけるＣＦＵのグラフを示す。
【図４５Ａ】トマト葉ＤＨＳｃＤＮＡライブラリーから得た誘導アミノ酸配列（配列番号２）と共にトマト葉ＤＨＳｃＤＮＡ配列（配列番号１）のヌクレオチド配列を描く。
【図４５Ｂ】トマト葉ＤＨＳｃＤＮＡライブラリーから得た誘導アミノ酸配列（配列番号２）と共にトマト葉ＤＨＳｃＤＮＡ配列（配列番号１）のヌクレオチド配列を描く。
【図４６Ａ】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子バンク内の未同定ゲノム配列とトマトＤＨＳ配列を整列させることにより得られるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＨＳ遺伝子のヌクレオチド配列を描く（配列番号５）。アミノ酸配列間のギャップは、予測されたイントロンである。
【図４６Ｂ−Ｄ】図４６Ｂは、誘導されたＤＨＳアミノ酸配列を描く（配列番号６）。図４６Ｃは、ＰＣＲにより得られた６００塩基対のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＨＳｃＤＮＡのヌクレオチド配列を描く。図４６Ｄは、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＤＨＳｃＤＮＡフラグメントの誘導されたアミノ酸配列を描く。
【図４７】ヒト、酵母、真菌及びＡｒｃｈａｅｏｂａｃｔｅｒｉａのＤＨＳタンパク質の配列との、誘導された全長トマト葉ＤＨＳアミノ酸配列（配列番号２）及び誘導された全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ＤＨＳアミノ酸配列の整列である。配列のうち３つ又は４つのものの間の同一アミノ酸が囲みに入っている。
【図４８】トマトＤＨＳ  ｃＤＮＡの制限マップである。
【図４９】トマト葉から単離され32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長トマトＤＨＳ  ｃＤＮＡでプローブ探査されたゲノミックＤＮＡのサザンブロットである。
【図５０】異なる発育段階にあるトマトの花から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。上図版は、総ＲＮＡの臭化エチジウム染色されたゲルである。各レーンは１０μｇのＲＮＡを含んでいる。下図版は、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長トマトＤＨＳ  ｃＤＮＡでプローブ探査されたノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図５１】32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長トマトＤＨＳｃＤＮＡでプローブ探査されたさまざまな成熟段階にあるトマト果実から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。
【図５２】６時間２Ｍのソルビトールでの処理による干ばつストレスを受けたトマト葉から単離されたＲＮＡのノーザンブロットである。各レーンは１０μｇのＲＮＡを含んでいる。ブロットは、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長トマトＤＨＳｃＤＮＡでプローブ探査された。
【図５３】冷却温度に曝露されたトマト葉から単離されたＲＮＡのノーザンブロットである。図５３Ａは、総ＲＮＡの臭化エチジウム染色されたゲルである。各レーンは、１０μｇのＲＮＡを含んでいた。図５３Ｂは、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長トマトＤＨＳｃＤＮＡでプローブ探査されたノーザンブロットのオートラジオグラフである。図５３Ｃは、葉分散体の伝導率として測定された対応する漏洩データを示す。
【図５４】Ｐｏｌｙ  Ａ尾部と５’末端非コーティング領域を含まないカーネーションＤＨＳ全長（１３８４塩基対）ｃＤＮＡクローンヌクレオチド配列（（配列番号９）である。誘導されたアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列（３７３アミノ酸）の下に示されている。（配列番号１０）。
【図５５】32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ  ｃＤＮＡでプローブ探査された老化しつつあるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉からの総ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフは最上部にある。エチジウム染色されたゲルが下にある。
【図５６】さまざまな段階におけるカーネーションの花の花弁から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。ブロットは32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長カーネーションＤＨＳ  ｃＤＮＡでプローブ探査された。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図５７】トマト果実老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド（最上部）（配列番号１１）及び誘導されたアミノ酸（下部）（配列番号１２）の配列である。
【図５８】カーネーション老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド（最上部）（配列番号１３）及び誘導されたアミノ酸（下部）（配列番号１４）の配列である。
【図５９】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド（最上部）（配列番号１５）及び誘導されたアミノ酸（下部）（配列番号１６）配列である。
【図６０】さまざまな発育段階におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の葉から単離された総ＲＮＡのノーザンブロットである。ブロットは、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳ  ｃＤＮＡ及び全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａでプローブ探査された。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図６１】催色期（ＢＫ）、赤色硬質（ＲＦ）及び赤色軟質（ＲＳ）発育段階にあるトマト果実から単離された総ＲＮＡのノーザンブロットである。ブロットは32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ及び全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａでプローブ探査された。ＤＨＳ及びｅＩＦ−５Ａは、果実の成熟と一致して赤色軟質果実において並行してアップレギュレートされる。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図６２】干ばつストレスを誘発するべくソルビトールで処理されたトマトの葉から単離された総ＲＮＡのノーザンブロットである。Ｃは対照、Ｓはソルビトール処理済。ブロットは、32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ及び全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａでプローブ探査された。ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳは共に、干ばつストレスに応えてアップレギュレートされる。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図６３】トマト植物の花のつぼみ及び開いた老化花から単離された総ＲＮＡのノーザンブロットである。ブロットは32Ｐ−ｄＣＴＰ標識済み全長老化誘発型ＤＨＳ  ｃＤＮＡ及び全長老化誘発型ｅＩＦ−５Ａでプローブ探査された。ｅＩＦ−５Ａ及びＤＨＳは両方共に開花／老化花の中でアップレギュレートされる。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図６４】寒冷損傷を受けたトマト葉から単離された総ＲＮＡのノーザンブロットである。老化誘発型及びＤＨＳは両方共、再加温中寒冷損傷の発達と共にアップレギュレートされる。オートラジオグラフは最上部にあり、エチジウム染色したゲルが下にある。
【図６５】遺伝子導入植物における葉のサイズの増大を示すアンチセンス配向でのＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８０で示されている配列）を発現する３．１週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（左）及び遺伝子導入植物の写真である。
【図６６】遺伝子導入植物における葉のサイズの増大を示すアンチセンス配向でのＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８０で示されている配列）を発現する４．６週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（左）及び遺伝子導入植物の写真である。
【図６７】遺伝子導入植物における葉のサイズの増大を示すアンチセンス配向でのＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８０で示されている配列）を発現する５．６週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（左）及び遺伝子導入植物の写真である。
【図６８】遺伝子導入植物における葉のサイズの増大を示すアンチセンス配向でのＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８０で示されている配列）を発現する６．１週齢のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ野生型（左）及び遺伝子導入植物の写真である。
【図６９】アンチセンス配向でＤＨＳ遺伝子を発現する３つのＴ1遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物系統からの種子の収量の増大を示すグラフである。種子の収量は、種子の体積として表わされている。ｎ＝３０についてのＳＥが、野生型植物について示されている。
【図７０】遺伝子導入植物において葉のサイズの増大及び植物サイズの増大を示す、アンチセンス配向でＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８０に示されている配列）を発現する遺伝子導入トマト植物（左）及び野生型植物（右）の写真である。該写真は、土壌に未発育植物を移した後１８日目に撮影したものである。
【図７１】遺伝子導入植物において葉のサイズの増大及び植物サイズの増大を示す、アンチセンス配向でＤＨＳ遺伝子の３’末端（図３６に示されている配列）を発現する遺伝子導入トマト植物（左）及び野生型植物（右）の写真である。該写真は、土壌に未発育植物を移した後３２日目に撮影したものである。
【図７２】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７３】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７４】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７５】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７６】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７７】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７８】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図７９】野生型（上図版）及びアンチセンス配向で全長ＤＨＳ遺伝子を発現する遺伝子導入植物（下図版）からのトマト果実の写真である。果実は、催色期発育段階で収穫され成長チャンバー内で成熟された。収穫後の日数が各図版の左上コーナーに示されている。
【図８０】植物を形質転換するためアンチセンス配向で使用されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ＤＨＳ遺伝子の３’末端の誘導されたアミノ酸配列（下）及びヌクレオチド配列（上）（配列番号３０）である。
【図８１】植物を形質転換するためアンチセンス配向で使用されるトマトＤＨＳ遺伝子の３’末端の、ヌクレオチド配列（上）（配列番号３１）及び誘導されたアミノ酸配列（下）である。
【図８２】全長Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を単離するのに用いられる６００塩基対のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＤＨＳプローブの、ヌクレオチド配列（上）（配列番号２６）及び誘導されたアミノ酸配列（下）である。
【図８３】全長カーネーション遺伝子を単離するのに用いられる４８３塩基のカーネーションＤＨＳプローブの誘導されたアミノ酸配列（下）及びヌクレオチド配列（上）（配列番号２７）である。
【図８４】アンチセンス配向でＤＨＳ遺伝子の３’末端（図８１に示されている配列）を発現する遺伝子導入トマト植物からのトマト果実（右）及び野生型植物からのトマト果実（左）の写真である。野生型果実は尻腐れを示すが、遺伝子導入果実はこれを示していない。
【図８５】複数の植物種からのｅＩＦ−５Ａのさまざまなアイソフォームの整列を示す。それは同様に、ヒプシン保存領域の整列をも提供している。
【図８６】トマト老化誘発型ｅＩＦ−５Ａポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
【図８７】Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１−センス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図８８Ａ】トマト老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１−センス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図８８Ｂ】トマト老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１−センス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図８９】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを含む遺伝子導入植物とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの対照との比較写真を提供している。遺伝子導入植物は対照植物のものに比べて厚い花序茎を有する。
【図９０】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（図９０−ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を含む遺伝子導入植物が、遺伝子導入植物内の木質部の増大によって表わされるように、木質化を増大させたということを示している。
【図９１】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（図９１−トマト）を含む遺伝子導入植物が、遺伝子導入植物内の木質部の増大によって表わされるように、木質化を増大させたということを示している。
【図９２】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子導入植物とＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ対照の比較写真を提供している。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ内では、トマトセンスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを使用した。遺伝子導入植物は対照植物のものに比べ厚い花序茎を有する。
【図９３】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを含む遺伝子導入植物内の木質化の増大を示す棒グラフである。
【図９４】センスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａを含む遺伝子導入植物内の木質化の増大を示す棒グラフである。図９４は、トマトセンスポリヌクレオチド老化誘発型ｅＩＦ−５Ａの関するものであった。
【図９５】カノーラ成長ｅＩＦ−５Ａアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供している。
【図９６】カノーラ成長ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１センス成長ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図９７Ａ】カノーラＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供している。
【図９７Ｂ】カノーラＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供している。
【図９８】カノーラＤＨＳ及びｐＫＹＬＸ７１−センスＤＨＳの構築を提供している。
【図９９】ＤＨＳ発現の阻害がカノーラ内の種子の収量を増大させることを棒グラフで示している。
【図１００】左から右へのａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、カノーラ、トマトのｅＩＦ−５Ａの成長アイソフォームのアップレギュレーション及びトマトＤＨＳのアップレギュレーションを棒グラフの形で示している。
【図１０１】トマト成長ｅＩＦ−５Ａアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供している。
【図１０２Ａ】トマト成長ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１−センストマト成長ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図１０２Ｂ】トマト成長ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１−センストマト成長ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図１０３】トマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供している。
【図１０４Ａ】トマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１センストマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図１０４Ｂ】トマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａ及びｐＫＹＬＸ７１センストマト創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５Ａの構築を提供している。
【図１０５】レタスＤＨＳポリヌクレオチド配列の一部分を提供している。
【図１０６】ｐＴＡ７００１−３’ＵＴＲアンチセンスレタスＤＨＳの構成体を提供している。
【図１０７Ａ】アルファルファＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１０７Ｂ】アルファルファＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１０８Ａ】バナナＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１０８Ｂ】バナナＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１０９Ａ】ハコヤナギ（Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ）ＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１０９Ｂ】ハコヤナギ（Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ）ＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１１０】部分的ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ  ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ  ＤＨＳアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を提供する。
【図１１１】ｅＩＦ−５Ａの活性化の概略図を示す。
【図１１２】カーネーションの加齢化及びｅＩＦ−５Ａの発現のノーザン分析である。
【図１１３Ａ−Ｂ】遺伝子導入カーネーション（アンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ）が、より長い切り花保管寿命を示すことを示している。
【図１１３Ｃ−Ｄ】遺伝子導入カーネーション（アンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ）が、より長い切り花保管寿命を示すことを示している。
【図１１４】バナナ（アンチセンスＤＨＳを伴う遺伝子導入植物）の損傷遅延を示す。
【図１１５】トマト（アンチセンスＤＨＳを伴う遺伝子導入植物）の損傷遅延を示す。
【図１１６】子葉、葉及び花の中のａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ（ＡｔｅＩＦ−５Ａ１）の発現を示す。
【図１１７】遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓアンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ）（ＡｔｅＩＦ−５Ａ１）におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉の老化遅延を示す。
【図１１８】最初の本葉対におけるａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ：：ＧＵＳの発現を示す。
【図１１９】遺伝子導入植物（アンチセンス老化誘発型ｅＩＦ−５Ａ）が野生型植物に比べ少ない木質部を有することを示している。
【図１２０】遺伝子導入植物（老化誘発型ｅＩＦ−５Ａのセンス構成体）における木質部形成の増大を示す。
【図１２１】遺伝子導入植物（アンチセンス構成体を通したストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現の低下）における干ばつ耐性を示す。
【図１２２】干ばつストレス下の遺伝子導入Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及び野生型における生存を示す棒グラフである。遺伝子導入植物（アンチセンス構成体を通したストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現の低下）は生存が増大した。
【図１２３】野生型カノーラ及び遺伝子導入カノーラ（アンチセンス構成体を通したストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現の低下）の比較を示し、遺伝子導入カノーラはバイオマスが増大しているということを示している。
【図１２４】遺伝子導入カノーラ系統（アンチセンス構成体を通したストレス誘発型ｅＩＦ−５Ａの発現の低下）が、野生型植物に比べ種子の収量の増加を有することを示している。
【図１２５】創傷／病原体誘発型ｅＩＦ−５ＡがＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅでの感染の後にアップレギュレートされることを標示している。
【図１２６】ｅＩＦ−５Ａの創傷／病原体誘発型アイソフォームのアンチセンス抑制が、悪性病原体による感染を阻害することを示している。遺伝子導入植物は、対照植物に比べて、感染阻害の９９％強の増大を示した。
【図１２７】遺伝子導入カノーラ（ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス創傷／病原体誘発型アイソフォーム）が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する耐性を示す、ということを示している。「ＷＴ」は、野生型植物からの葉である。「ＴＧ−１」及び「ＴＧ−５」は、遺伝子導入植物由来の葉である。
【図１２８】遺伝子導入カノーラ（ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス創傷／病原体誘発型アイソフォーム）が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する耐性を示す、ということを示している。「ＷＴ」は、野生型植物からの葉である。「ＴＧ−１」及び「ＴＧ−５」は、遺伝子導入植物由来の葉である。
【図１２９】遺伝子導入カノーラ（ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス創傷／病原体誘発型アイソフォーム）が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する耐性を示す、ということを示している。「ＷＴ」は、野生型植物からの葉である。「ＴＧ−１」及び「ＴＧ−５」は、遺伝子導入植物由来の葉である。
【図１３０】遺伝子導入カノーラ（ｅＩＦ−５Ａのアンチセンス創傷／病原体誘発型アイソフォーム）が、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍによる感染に対する耐性を示す、ということを示している。「ＷＴ」は、野生型植物からの葉である。「ＴＧ−１」及び「ＴＧ−５」は、遺伝子導入植物由来の葉である。
【図１３１】遺伝子導入バナナ（アンチセンスＤＨＣ）（左側）及び野生型バナナ（右側）の写真を示し、遺伝子導入バナナ植物が野生型対照に比べて大きいバイオマスを有することを示している。
【図１３２】遺伝子導入トマト（センス配向での成長ｅＩＦ−５Ａ）（左側）が野生型対照植物（右側）に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１３３】遺伝子導入カノーラ（センス配向での成長ｅＩＦ−５Ａ）が野生型対照植物に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１３４】遺伝子導入カノーラ（センス配向での成長ｅＩＦ−５Ａ）が野生型対照植物に比べて増大した種子の収量を有することを示している。
【図１３５Ａ】レタスＤＨＳ配列を提供する。核酸は配列番号  であり、アミノ酸配列は配列番号  である。
【図１３５Ｂ】レタスＤＨＳ配列を提供する。核酸は配列番号  であり、アミノ酸配列は配列番号  である。
【図１３６】部分的ペチュニアＤＨＳヌクレオチド（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）、ならびにＤＨＳ配列（配列番号  ）を単離するのに用いられる２つのプライマーを提供する。
【図１３７Ａ】創傷／病原体ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１３７Ｂ】創傷／病原体ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１３８Ａ】老化ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１３８Ｂ】老化ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１３９】ストレスｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１４０Ａ】成長ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１４０Ｂ】成長ｅＩＦ−５Ａのためのアルファルファ核酸配列（配列番号  ）及びアミノ酸配列（配列番号  ）を提供する。
【図１４１Ａ】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦ５Ａ−１）についての部分配列を提供する。
【図１４１Ｂ】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦ５Ａ−１）についての部分配列を提供する。
【図１４２Ａ】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦ５Ａ−３）についての部分配列を提供する。
【図１４２Ｂ】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦ５Ａ−３）についての部分配列を提供する。
【図１４３】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦＡ−２）についての部分配列を提供する。
【図１４４】レタス内のｅＩＦ−５Ａの異なるアイソフォーム（ＬＦＡ−１）についての部分配列を提供する。
【図１４５Ａ】トマトのための成長ｅＩＦ−５Ａ配列（核酸−配列番号  ）及びアミノ酸（配列番号  ）についての配列を提供する。
【図１４５Ｂ】トマトのための成長ｅＩＦ−５Ａ配列（核酸−配列番号  ）及びアミノ酸（配列番号  ）についての配列を提供する。
【図１４６Ａ】トマト内のストレスｅＩＦ−５Ａ配列（核酸−配列番号  ）及びアミノ酸（配列番号  ）についての配列を提供する。
【図１４６Ｂ】トマト内のストレスｅＩＦ−５Ａ配列（核酸−配列番号  ）及びアミノ酸（配列番号  ）についての配列を提供する。
【図１４７Ａ−１】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ａ−２】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ａ−３】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ｂ−１】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ｂ−２】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ｂ−３】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４７Ｃ】ハコヤナギの木からの４つのｅＩＦ−５Ａ（「Ｆ１」、「Ｆ３」、「Ｆ３」及び「Ｆ４」から単離されたＮＣ及びアミノ酸ｅＩＦ−５Ａ配列を提供する。
【図１４８Ａ−１】種全体にわたるＤＨＳのきわめて保存度の高い性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸整列を提供する。
【図１４８Ａ−２】種全体にわたるＤＨＳのきわめて保存度の高い性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸整列を提供する。
【図１４８Ａ−３】種全体にわたるＤＨＳのきわめて保存度の高い性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸整列を提供する。
【図１４８Ｂ−１】種全体にわたるＤＨＳのきわめて保存度の高い性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸整列を提供する。
【図１４８Ｂ−２】種全体にわたるＤＨＳのきわめて保存度の高い性質を示すさまざまなＤＨＳのアミノ酸整列を提供する。
【図１４９】ＤＨＳのダウンレギュレーションを有するレタスを成長させるために用いられる水耕条件を示す。
【図１５０】レタスＤＨＳの発現がダウンレギュレートされたカットレタスにおける褐変の遅延を示している。
【図１５１】レタスＤＨＳのアンチセンス３’末端を有する遺伝子導入レタスがＤＨＳ発現の低下を示すことを表わすウェスタンブロットを示す。
【図１５２】ＤＨＳのアンチセンス３’末端でＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換するのに用いられるベクター構成体を示す。
【図１５３】ＤＨＳがダウンレギュレートされたａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、野生型植物に比べ増大した成長速度／バイオマスを有することを示している（図１５２に示されたベクターで生成された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。
【図１５４】ＤＨＳがダウンレギュレートされたａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、野生型植物に比べ増大した成長速度／バイオマスを有することを示している（図１５２に示されたベクターで生成された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。
【図１５５】ＤＨＳがダウンレギュレートされたａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、野生型植物に比べ増大した種子収量を有することを示している（図１５２に示されたベクターで生成された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。
【図１５６】ＤＨＳがダウンレギュレートされたａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、野生型植物に比べ増大した根発達を有することを示している（図１５２に示されたベクターで生成された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）。
【図１５７】ＤＨＳがダウンレギュレートされたカノーラ植物が野生型植物に比べ増大した成長速度／バイオマスを有することを示している。
【図１５８】アンチセンスＤＨＳがＤＨＳの発現の減少をひき起こしたことを表わすウェスタンブロットを示す。
【図１５９】ＤＨＳがダウンレギュレートされたカノーラ植物が、野生型植物に比べた長角果サイズの増大を有することを示している。
【図１６０】ＤＨＳがダウンレギュレートされたカノーラ植物が、野生型植物に比べた種子収量の増大を有することを示している。
【図１６１】ＤＨＳがダウンレギュレートされたカノーラ植物において、種子１つあたりの油の量の変化及び油の脂肪酸組成の変化が全く無いことを示している。
【図１６２】成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションを達成するためのセンス配向でａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内にハコヤナギ成長ｅＩＦ−５Ａを導入することのもつ効果を示している。結果として得られた植物は、増大した成長速度／バイオマスを有している。
【図１６３】成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションを達成するためのセンス配向でａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内にハコヤナギ成長ｅＩＦ−５Ａを導入することのもつ効果を示している。結果として得られた植物は、増大した成長速度／バイオマスを有している。
【図１６４】成長ｅＩＦ−５Ａのアップレギュレーションを達成するためのセンス配向でａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内にハコヤナギ成長ｅＩＦ−５Ａを導入することのもつ効果を示している。結果として得られた植物は、増大した成長速度／バイオマスを有している。
【図１６５】カノーラ植物中においてセンス配向でカノーラ又はａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ成長ｅＩＦ−５Ａのいずれかが使用された場合、カノーラ植物内に種子収量の増大が見られることを示している。
【図１６６】突然変異体老化ｅＩＦ−５Ａで形質転換された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ヒプシン化不可能）が野生型ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに比べてバイオマスを増大させたということを示している。
【図１６７】突然変異体老化ｅＩＦ−５Ａで形質転換された遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ヒプシン化不可能）が野生型ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに比べてバイオマスを増大させたということを示している。
【図１６８】ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ内でセンス配向で発現されたハコヤナギ（ｐｏｐｕｌａｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ）から単離された成長ｅＩＦ−５Ａが、対照植物に比べ種子収穫の増大を結果としてもたらすことを示している。
【図１６９】センス配向で発現されたハコヤナギ成長因子ｅＩＦ−５Ａを有する３つの異なる遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ系統からの種子収穫を比較し、３つの系統が全て種子収穫の増加を有していたということを示している。
【図１７０】ｐｏｐｕｌａｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ（ハコヤナギ）成長ｅＩＦ−５Ａの全長ｃＤＮＡ及びタンパク質の全長アミノ酸配列を提供する。
【図１７１】センス配向でハコヤナギ成長ｅＩＦ−５Ａを用いてａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換するために用いられるベクター構成体を提供する。
【図１７２】（図１７１に示されたベクターで形質転換された）遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、最善、次善及び超最善濃度を含めた異なるレベルの肥料で処理された場合に対照植物に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１７３】（図１７１に示されたベクターで形質転換された）遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、最善、次善及び超最善濃度を含めた異なるレベルの肥料で処理された場合に対照植物に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１７４】（突然変異体老化誘発型ｅＩＦ−５Ａで形質転換された）遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、最善、次善及び超最善濃度を含めた異なるレベルの肥料で処理された場合に対照植物に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１７５】（突然変異体老化誘発型ｅＩＦ−５Ａで形質転換された）遺伝子導入ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物が、最善、次善及び超最善濃度を含めた異なるレベルの肥料で処理された場合に対照植物に比べて増大したバイオマスを有することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８Ａ】
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【図８８Ｂ】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７Ａ】
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【図９７Ｂ】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２Ａ】
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【図１０２Ｂ】
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【図１０３】
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【図１０４Ａ】
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【図１０４Ｂ】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７Ａ】
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【図１０７Ｂ】
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【図１０８Ａ】
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【図１０８Ｂ】
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【図１０９Ａ】
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【図１０９Ｂ】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３Ａ−Ｂ】
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【図１１３Ｃ−Ｄ】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５Ａ】
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【図１３５Ｂ】
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【図１３６】
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【図１３７Ａ】
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【図１３７Ｂ】
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【図１３８Ａ】
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【図１３８Ｂ】
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【図１３９】
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【図１４０Ａ】
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【図１４０Ｂ】
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【図１４１Ａ】
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【図１４１Ｂ】
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【図１４２Ａ】
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【図１４２Ｂ】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５Ａ】
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【図１４５Ｂ】
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【図１４６Ａ】
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【図１４６Ｂ】
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【図１４７Ａ−１】
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【図１４７Ａ−２】
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【図１４７Ａ−３】
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【図１４７Ｂ−１】
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【図１４７Ｂ−２】
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【図１４７Ｂ−３】
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【図１４７Ｃ】
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【図１４８Ａ−１】
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【図１４８Ａ−２】
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【図１４８Ａ−３】
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【図１４８Ｂ−１】
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【図１４８Ｂ−２】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６２】
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【図１６３】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３】
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【図１７４】
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【図１７５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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