(57)【要約】固体もしくは半固体製剤に、または経皮性もしくは経皮的送達デバイスに含まれる核酸を含む、対象における過剰増殖病巣の成長を予防または阻害するための組成物ならびに方法が開示される。また、接着剤を含む、対象における過剰増殖病巣の成長を予防または阻害することができる核酸の組成物も開示される。また、核酸摂取賦活剤を含む、対象における過剰増殖病巣の成長を予防または阻害することができる核酸の組成物も開示される。これらの治療組成物およびデバイスを含む、対象における過剰増殖病巣の成長を予防または阻害する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療核酸および/または診断核酸を含み、ロゼンジ、ロリポップ、ポプシクル、ガム、ゲルストリップ、フィルム、ヒドロゲル、溶解性ストリップ、または固体スティックとして処方される、薬学的組成物。
【請求項２】
治療核酸を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
治療核酸が治療タンパク質をコードする、請求項2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
治療タンパク質が、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、腫瘍抗原、または酵素である、請求項3記載の薬学的組成物。
【請求項５】
レポータータンパク質をコードする診断核酸を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
レポータータンパク質が、ソマトスタチン受容体、ヨウ化ナトリウム同伴輸送体、真核生物緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはチミジンキナーゼである、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
治療核酸が、siRNA、リボザイム、mRNA、オリゴヌクレオチド、またはCpGオリゴヌクレオチドを含むか、またはそれらをコードする、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
製剤が、コラーゲン、グリセリン、PEG、水和シリカ、セルロース、キサンタンガム、グリカンカルボマー956、Tween80、フッ化物、カラギーナン、接着剤、または核酸摂取賦活剤をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項９】
接着剤が、アクリレート、ヒドロコロイド、ヒドロゲル、ポリアクリル酸系ゲルマトリックス、ポリイソブチレン、シリコーンポリマー、またはそれらの混合物を含む、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
アクリレートが、シアノアクリレート、メタクリレート、またはアルキルアクリレートを含む、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
核酸摂取賦活剤がカチオン性脂質を含む、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
カチオン性脂質が、ビス-グアニジニウム-トレン-コレステロールまたは1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロペート(DOTAP)である、請求項11記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
核酸がロゼンジとして処方される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
核酸が溶解性ストリップとして処方される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ヒドロゲルとして処方される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
製剤が、キサンタンガムを含むガムである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
組成物のいくらかまたは全てが凍結乾燥されている、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
腫瘍サプレッサーが、mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
腫瘍サプレッサーがp53である、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
腫瘍サプレッサーが、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
プロアポトーシスタンパク質が、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、またはBIDである、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
サイトカインが、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFまたはmda7である、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
サイトカインがmda7である、請求項22記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
腫瘍抗原が、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、テロメラーゼ、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、ママグロビン、サイクリンB1、S100、BRCA1、BRCA2、腫瘍免疫グロブリンイディオタイプ、腫瘍T細胞受容体クローンタイプ、MUC-1、または表皮成長因子受容体である、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質を含む、請求項5記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な誘導体である、請求項25記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターは対象の細胞において活性である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
ウイルスベクターが腫瘍退縮ウイルスである、請求項28記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
腫瘍退縮ウイルスがADPを過剰発現する、請求項31記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
腫瘍退縮ウイルスが、Ad5、dl327、pm734.1、dl309、dl01/07、KD1、KD2、KD3、およびdl1520およびVRX-007からなる群より選択されるウイルスである、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
p53をコードする治療核酸を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
mda7をコードする治療核酸を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
FUS1をコードする治療核酸を含む、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
送達剤をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
送達剤が脂質である、請求項37記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
脂質がリポソームに含まれる、請求項38記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
リポソームがDOTAP：コレステロールナノ粒子としてさらに規定される、請求項39記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または組織選択的プロモーターである、請求項27記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
組織選択的プロモーターが過剰増殖性細胞において選択的に活性である、請求項41記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
プロモーターが、hTertプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、プロバシンプロモーター、ARR2PBプロモーター、およびAFPプロモーターからなる群より選択される、請求項42記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
核酸摂取賦活剤がカチオン性脂質である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
カチオン性脂質が、ビス-グアニジニウム-トレン-コレステロールまたは1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロペート(DOTAP)である、請求項44記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
カチオン性脂質が第四級サイトフェクチンである、請求項44記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
治療核酸および/または診断核酸を含み、ゲル、ペースト、フォーム、スラリー、クリーム、軟膏剤、坐薬、または粉末として処方される、非アデノウイルス薬学的組成物。
【請求項４８】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターは対象の細胞において活性である、請求項47記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項48記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
ウイルスベクターが、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、アルファウイスルベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項49記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項50記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
p53をコードする治療核酸を含む、請求項51記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
mda7をコードする治療核酸を含む、請求項51記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
p53をコードする治療核酸を含む、請求項51記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
FUS1をコードする治療核酸を含む、請求項51記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
ペーストとして処方される、請求項47記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
ペーストが練り歯磨きとしてさらに規定される、請求項56記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
治療および/または診断核酸ならびに接着剤を含む薬学的組成物。
【請求項５９】
治療核酸を含む、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
治療核酸が、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、腫瘍抗原、または酵素をコードする、請求項59記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
腫瘍サプレッサーが、mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
プロアポトーシスタンパク質が、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、またはBIDである、請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
サイトカインが、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFまたはmda7である、請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
腫瘍抗原が、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、テロメラーゼ、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、ママグロビン、サイクリンB1、S100、BRCA1、BRCA2、腫瘍免疫グロブリンイディオタイプ、腫瘍T細胞受容体クローンタイプ、MUC-1、または表皮成長因子受容体である、請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
核酸が蛍光タンパク質をコードする診断核酸である、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な誘導体である、請求項65記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターは対象の細胞において活性である、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
核酸カセットがウイルスベクターに保持される、請求項67記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項68記載の薬学的組成物。
【請求項７０】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項69記載の薬学的組成物。
【請求項７１】
p53をコードする治療核酸を含む、請求項70記載の薬学的組成物。
【請求項７２】
mda7をコードする治療核酸を含む、請求項70記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
FUS1をコードする治療核酸を含む、請求項70記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
ウイルスベクターが腫瘍退縮ウイルスである、請求項68記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
腫瘍退縮ウイルスが、Ad5、dl327、pm734.1、dl309、dl01/07、KD1、KD2、KD3、およびdl1520からなる群より選択される、請求項74記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
発現カセットが送達剤に保持される、請求項67記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
送達剤が脂質である、請求項76記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
脂質がリポソームに含まれる、請求項77記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
リポソームがDOTAP：コレステロールナノ粒子としてさらに規定される、請求項78記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または組織選択的プロモーターである、請求項67記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
組織選択的プロモーターが過剰増殖性細胞において選択的に活性である、請求項80記載の薬学的組成物。
【請求項８２】
プロモーターが、hTertプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、プロバシンプロモーター、ARR2BPプロモーター、およびAFPプロモーターからなる群より選択される、請求項81記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
接着剤が、アクリレート、ヒドロコロイド、ヒドロゲル、ポリアクリル酸系ゲルマトリックス、ポリイソブチレン、シリコーンポリマー、またはそれらの混合物を含む、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
アクリレートが、シアノアクリレート、メタクリレート、またはアルキルアクリレートを含む、請求項83記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
経皮パッチ、ストリップ、帯具、テープ、包帯、または合成皮膚を介して投与されるように処方される、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
液体、半固体、または固体として処方される、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
さらに核酸摂取賦活剤を含む、請求項58記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
核酸摂取賦活剤がカチオン性脂質である、請求項87記載の薬学的組成物。
【請求項８９】
カチオン性脂質が、ビス-グアニジニウム-トレン-コレステロールまたは1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロペート(DOTAP)である、請求項88記載の薬学的組成物。
【請求項９０】
a)パッチ；および
b)該パッチの少なくとも1つの表面に適用されたレポータータンパク質、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、成長因子、腫瘍抗原、またはサイトカインをコードする核酸を含む薬学的組成物；
を含む、治療または診断剤を対象に送達するための経皮性または経皮的送達デバイス。
【請求項９１】
核酸が、mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、およびSEM A3ポリペプチドからなる群より選択される腫瘍サプレッサーをコードする、請求項90記載のデバイス。
【請求項９２】
腫瘍サプレッサーが、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項91記載のデバイス。
【請求項９３】
核酸が、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、およびBIDからなる群より選択されるプロアポトーシスタンパク質をコードする、請求項91記載のデバイス。
【請求項９４】
核酸がサイトカインをコードし、該サイトカインが、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFおよびmda7からなる群より選択される、請求項90記載のデバイス。
【請求項９５】
核酸が腫瘍抗原をコードする、請求項90記載のデバイス。
【請求項９６】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターは対象の細胞において活性である、請求項90記載のデバイス。
【請求項９７】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項96記載のデバイス。
【請求項９８】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項97記載のデバイス。
【請求項９９】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項98記載のデバイス。
【請求項１００】
治療核酸がFUS1をコードする、請求項99記載のデバイス。
【請求項１０１】
治療核酸がmda7をコードする、請求項99記載のデバイス。
【請求項１０２】
治療核酸がp53をコードする、請求項99記載のデバイス。
【請求項１０３】
薬学的組成物がさらに核酸摂取賦活剤を含む、請求項90記載のデバイス。
【請求項１０４】
核酸摂取賦活剤がカチオン性脂質である、請求項103記載のデバイス。
【請求項１０５】
カチオン性脂質が、ビス-グアニジニウム-トレン-コレステロールまたは1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロペート(DOTAP)である、請求項104記載のデバイス。
【請求項１０６】
カチオン性脂質が第四級サイトフェクチンである、請求項104記載のデバイス。
【請求項１０７】
請求項1または請求項58記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、該対象において病気を検出し、治療し、または予防する方法。
【請求項１０８】
核酸がレポータータンパク質をコードし、方法は対象において病巣を検出する方法としてさらに規定される、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
病巣が過剰増殖性病巣である、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
過剰増殖性病巣が癌である、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、頚癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭部および頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病である、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
核酸が治療核酸である、請求項107記載の方法。
【請求項１１３】
治療核酸が、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
腫瘍サプレッサーが、mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドからなる群より選択される、請求項113記載の方法。
【請求項１１５】
腫瘍サプレッサーが、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項112記載の方法。
【請求項１１６】
プロアポトーシスタンパク質が、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、またはBIDである、請求項113記載の方法。
【請求項１１７】
サイトカインが、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFまたはmda7である、請求項113記載の方法。
【請求項１１８】
治療核酸が腫瘍抗原をコードする、請求項112記載の方法。
【請求項１１９】
方法が粘膜表面において免疫応答を誘導する方法としてさらに規定され、薬学的組成物が対象の粘膜表面に適用される、請求項112記載の方法。
【請求項１２０】
組成物がレポータータンパク質をコードする診断核酸を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１２１】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項120記載の方法。
【請求項１２２】
蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な誘導体である、請求項121記載の方法。
【請求項１２３】
組成物が成長因子をコードする治療核酸を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１２４】
成長因子が、表皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、または肝細胞成長因子である、請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
方法が対象の創傷の治癒を促進する方法としてさらに規定される、請求項107記載の方法。
【請求項１２６】
核酸が治療核酸であって、方法は対象における過剰増殖性病巣の成長を予防または阻害する方法としてさらに規定される、請求項107記載の方法。
【請求項１２７】
対象において口腔異形成または白斑症を予防または阻害する方法としてさらに規定される、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターは対象の細胞において活性である、請求項107記載の方法。
【請求項１２９】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項128記載の方法。
【請求項１３０】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項129記載の方法。
【請求項１３１】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
治療核酸がFUS1をコードする、請求項131記載の方法。
【請求項１３３】
治療核酸がmda7をコードする、請求項131記載の方法。
【請求項１３４】
治療核酸がp53をコードする、請求項131記載の方法。
【請求項１３５】
対象が哺乳動物である、請求項107記載の方法。
【請求項１３６】
哺乳動物がヒトである、請求項135記載の方法。
【請求項１３７】
ヒトが癌患者、または前癌性病巣を持つ患者である、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
薬学的組成物の投与が、アプリケーターを用いて対象の体表面に薬学的組成物を適用する段階を含む、請求項107記載の方法。
【請求項１３９】
病気の検出、予防または治療を必要とする対象を同定する段階をさらに含む、請求項107記載の方法。
【請求項１４０】
核酸が治療核酸であって、方法が療法の一つまたは複数の二次形態を対象に投与する段階をさらに含む、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
請求項47記載の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、該対象において病気を検出し、治療し、または予防する方法。
【請求項１４２】
核酸がレポータータンパク質をコードし、方法が対象において病巣を検出する方法としてさらに規定される、請求項141記載の方法。
【請求項１４３】
病巣が過剰増殖性病巣である、請求項142記載の方法。
【請求項１４４】
過剰増殖性病巣が癌である、請求項143記載の方法。
【請求項１４５】
癌が、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、頚癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭部および頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病である、請求項144記載の方法。
【請求項１４６】
核酸が治療核酸である、請求項141記載の方法。
【請求項１４７】
治療核酸が、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、または成長因子をコードする、請求項146記載の方法。
【請求項１４８】
腫瘍サプレッサーが、mda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドからなる群より選択される、請求項147記載の方法。
【請求項１４９】
腫瘍サプレッサーが、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドである、請求項148記載の方法。
【請求項１５０】
プロアポトーシスタンパク質が、CD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、またはBIDである、請求項147記載の方法。
【請求項１５１】
サイトカインが、GM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFまたはmda7である、請求項147記載の方法。
【請求項１５２】
治療核酸が、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、テロメラーゼ、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、ママグロビン、サイクリンB1、S100、BRCA1、BRCA2、腫瘍免疫グロブリンイディオタイプ、腫瘍T細胞受容体クローンタイプ、MUC-1、および表皮成長因子受容体からなる群より選択される腫瘍抗原をコードする、請求項146記載の方法。
【請求項１５３】
方法が粘膜表面において免疫応答を誘導する方法としてさらに規定され、薬学的組成物は対象の粘膜表面に適用される、請求項146記載の方法。
【請求項１５４】
組成物がレポータータンパク質をコードする診断核酸を含む、請求項141記載の方法。
【請求項１５５】
レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項154記載の方法。
【請求項１５６】
蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、またはそれらの生物学的に活性な誘導体である、請求項155記載の方法。
【請求項１５７】
組成物が成長因子をコードする治療核酸を含み、方法は対象の創傷の治癒を促進する方法としてさらに規定される、請求項141記載の方法。
【請求項１５８】
成長因子が、表皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、または肝細胞成長因子である、請求項157記載の方法。
【請求項１５９】
核酸が治療核酸であって、方法が対象において過剰増殖性病巣の成長を予防または阻害する方法としてさらに規定される、請求項141記載の方法。
【請求項１６０】
過剰増殖性病巣が口の白斑症または口の癌腫である、請求項159記載の方法。
【請求項１６１】
核酸が、該核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれ、該プロモーターが対象の細胞において活性である、請求項141記載の方法。
【請求項１６２】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項161記載の方法。
【請求項１６３】
ウイルスベクターが、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、アルファウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項162記載の方法。
【請求項１６４】
治療核酸がFUS1をコードする、請求項163記載の方法。
【請求項１６５】
治療核酸がmda7をコードする、請求項163記載の方法。
【請求項１６６】
治療核酸がp53をコードする、請求項163記載の方法。
【請求項１６７】
対象が哺乳動物である、請求項141記載の方法。
【請求項１６８】
哺乳動物がヒトである、請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
ヒトが癌患者、または前癌性病巣を持つ患者である、請求項168記載の方法。
【請求項１７０】
薬学的組成物の投与が、アプリケーターを用いて対象の体表面に薬学的組成物を適用する段階を含む、請求項141記載の方法。
【請求項１７１】
病気の検出、予防または治療を必要とする対象を同定する段階をさらに含む、請求項141記載の方法。
【請求項１７２】
核酸が治療核酸であって、方法が療法の一つまたは複数の二次形態を対象に投与する段階をさらに含む、請求項141記載の方法。
【請求項１７３】
請求項90記載の経皮性または経皮的送達デバイスを対象の表面に適用する段階を含む、該対象において病気を検出し、治療し、または予防する方法。
【請求項１７４】
発現カセットがウイルスベクターに保持される、請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項174記載の方法。
【請求項１７６】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項175記載の方法。
【請求項１７７】
治療核酸がFUS1をコードする、請求項176記載の方法。
【請求項１７８】
治療核酸がmda7をコードする、請求項176記載の方法。
【請求項１７９】
治療核酸がp53をコードする、請求項176記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野
本発明は、一般に、遺伝子導入、遺伝子治療、薬理学および医薬の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、対象において病気を検出し、予防し、または治療するために投与することができる核酸の新規の薬学的組成物、およびこれらの薬学的組成物を用いて病気を検出し、予防し、または治療する方法に関する。薬学的組成物は、皮膚表面または粘膜表面のような、対象の体表面への局所投与用の液体、半固体または固体として処方される。本発明は、診断または治療核酸の送達のための経皮的または経皮性送達デバイス、およびこれらのデバイスを用いて対象において病気を診断し、予防し、および治療する方法にも関する。
【０００２】
本出願は、その双方を参照により本明細書に組み入れられる、2005年1月21日に出願された米国特許仮出願第60/645,826号、および2005年6月21日に出願された米国特許仮出願第60/692,481号に関する。
【背景技術】
【０００３】
2.従来技術の説明
遺伝子導入は、対象において特定の遺伝子の特定の標的細胞への送達を含む比較的新しい様式である。治療目的(すなわち遺伝子療法)での遺伝子導入は、対象における治療遺伝子の標的細胞への導入を含む。単一遺伝子障害の治療として元来は考えられるが、遺伝子治療試験の大部分は癌および血管病の治療に関する。
【０００４】
癌は合衆国および他の国において死亡の主な原因であるため、癌に対する遺伝子治療の同定に大きな関心がある。癌に関連する高い罹患率および死亡率に対する重要な理由は、現在利用可能な診断および治療尺度における重要な制限があるという事実である。
【０００５】
多くの診断尺度が利用可能であり、その例は視覚的検査(例えば、皮膚病巣を同定するための物理的調査、および結腸癌を同定するための結腸鏡検査法)、マンモグラフィー、CTおよびMRIのようなイメージング実験、および血液検査(例えば、前立腺癌に対するマーカーとしてのPSA)を含む。もちろん、これらの尺度は病気の小さな病巣を同定できない。他の例において、病気は診断の時点からかなり進行している。
【０００６】
癌の慣用的な療法は外科的処置、化学療法、および/または放射線を含む。これらの処置はしばしば成功していない：外科的処置は癌の全てを除去できず；いくらかの癌は化学療法および放射線療法に対して抵抗性であり；および化学療法-抵抗性腫瘍が頻繁に発生する。
【０００７】
遺伝子治療は癌の治療において有望性を示した。癌療法における遺伝子治療の目標は、細胞増殖の正常な制御の再確立、または異常な増殖を受けている細胞の排除である。イン/ビボ遺伝子修飾が治療的利点に至り得る種々の戦略がある。戦略の例は、異常な細胞に向けての免疫原性の増強、異常な表現型に導く遺伝的欠陥の修正、およびその産物が受容体細胞に対して毒性である、または毒性とすることができる遺伝子の送達を含む。
【０００８】
癌の遺伝子治療について考慮することができる治療遺伝子の例示的なカテゴリーは腫瘍サプレッサー遺伝子を含む。腫瘍サプレッサー遺伝子は、通常は細胞成長を抑制するが、突然変異によって失われ、または不活化されると、細胞を制御されないまま成長させる遺伝子である。最も公知の腫瘍サプレッサー遺伝子の1つはp53であり、これは、細胞周期進行において中枢的役割を演じ、修復またはアポトーシスがDNA損傷に応答して起こり得るように成長を阻止する。DNA損傷が回復不可能であることが判明すれば、それはアポトーシスを開始することもできる。
【０００９】
いずれの遺伝子を用いて、細胞周期進行の制御を復帰させるかに関わらず、このアプローチの合理的かつ現実的な適用可能性は同一である。すなわち、遺伝子導入の高い効率を達成して、治療量の組換え産物を発現するためである。
【００１０】
癌または他の病気の成功した遺伝子治療の1つの局面は、異常な細胞のかなりの割合に影響する能力である。ウイルスベクターはこの目的で使用される。組換えアデノウイルスは、レトロウイルスおよび他の遺伝子送達方法よりも顕著な利点を有する(Siegfried,1993においてレビューされている)。アデノウイルスはヒトにおいて腫瘍を誘導することは決して示されておらず、生きたワクチンとして安全に用いられてきた(Straus,1984参照)。複製欠陥組換えアデノウイルスは、複製に必要なE1領域を標的遺伝子で置き換えることによって作成することができる。アデノウイルスは感染の通常の結果としてヒトゲノムに組み込まれず、それにより、挿入突然変異誘発の危険性を大いに低下させる。安定な高力価組換えアデノウイルスを作成することができ、十分な物質が大きな患者集団を治療するのに作成されるのを可能とする。さらに、アデノウイルスベクターは、広い範囲の組織および腫瘍細胞型へのかなり効果的なインビボ遺伝子導入が可能である。
【００１１】
ウイルスベクターは遺伝子送達伝達体の他の態様よりも優れたいくつかの利点を提供するが、それらは、インビボでのそれらの効果的な使用に対して制限を課すいくつかの特徴を依然として呈する。これらの制限は、主として、治療遺伝子を異常な細胞に効果的に送達し、それを標的化するベクターの能力を制限する結果となる。標的細胞を含有する領域への大量のウイルスベクターの直接的注入によってこの問題を克服しようとする試みがなされてきた。ウイルスベクターの現行局所投与は、標的細胞の領域へのほぼ1×1012ウイルス粒子の注入による。あいにく、この物質のかなりの割合は注入の領域に保持されず、循環およびリンパ系を通じて迅速に排除され、従って、標的細胞の感染を予防する。
【００１２】
ウイルス媒介遺伝子送達系以外に、遺伝子送達のためのいくつかの非ウイルスオプションがある。1つの非ウイルスアプローチは、治療遺伝子を保持するためのリポソームの使用を含む。適用が制限されるもう1つのアプローチは、標的細胞への治療DNAの直接的導入である。
【００１３】
治療の形態としての遺伝子導入以外に、少数の研究は、イメージングにおける遺伝子導入の記載された適用を有する。過去10年間に開発されてきたイメージングの新しい形態は、レポーター遺伝子のインサイチューまたはインビボイメージングを含む。レポーター遺伝子技術は、組織切片のインサイチューイメージングに最初に適用された(Blasberg et al.,2003にレビューされている)。例えば、Hooper et al.(1990)は、単一哺乳動物細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のイメージングを記載した。レポーターイメージングは、磁気共鳴、核イメージング(PET、γカメラ)および/またはインビボ光学イメージング系に基づいて記載されてきた(Blasberg et al.,2003にレビューされている)。例えば、単純疱疹ウイルス-1チミジンキナーゼまたはドーパミン受容体タイプ-2の導入は陽電子射出断層撮影法(PET)によって検出されてきた(Alauddin et al.,1996；Alauddin and Conti,1998；Gambhir et al.,1998；MacLaren et al.,1999；Tjuvajev et al.,1998)。比較において、ナトリウム-ヨウ素同伴輸送体(Mandell,1999)、ドーパミントランスポーター(Auricchio et al.,2003)、またはソマトスタチン受容体タイプ-2(Kundra,2002；Sun et al.,2001)の導入はγカメライメージングによって検出されてきた。これらの尺度のいずれかがヒト病気を診断するのに適用できるか否かが依然として判断されている。
【００１４】
従って、癌のような病気の診断および治療における遺伝子導入の新しいかつ改良された組成物および方法に対して要望が存在する。例えば、核酸と適当な標的細胞との持続性の接触を可能とする治療核酸の組成物は、製剤の治療効率を改良する。レポーター遺伝子の対象の病気細胞への送達方法は、病気細胞を標的化し、それを検出するより改善された能力を提供する。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明者らは、核酸のある種の新規の製剤、およびこれらの製剤を病気の診断、治療および予防において適用する方法を突き止めた。本明細書において記載の製剤の核酸は、病気の診断、予防または治療で用いることができる任意の核酸とすることもできる。例えば、核酸は、対象において創傷治癒を促進でき、または過剰増殖病巣の成長を治療することができるアミノ酸配列をコードする核酸であってよい。
【００１６】
核酸のこれらの新規の製剤は、対象となる核酸の対象における標的細胞へのより効果的な送達および標的化を容易とする。例えば、組成物のいくつかは接着剤で処方されて、治療核酸と対象となる標的細胞との持続性の接触をもたらす。
【００１７】
本発明者らは、診断または治療核酸配列の送達用の新規の経皮性または経皮的送達デバイスも考案した。例えば、デバイスは、対象における過剰増殖性病巣の成長を阻害することができるタンパク質をコードする核酸を送達するように設計できる。
【００１８】
遺伝子治療に使用できる病気の診断、予防または治療においてこれらの新規の製剤およびデバイスを適用する方法も突き止められた。
【００１９】
より具体的には、本発明のある態様は、一般には、対象の表面への適用のために処方される治療核酸および/または診断核酸を含む薬学的組成物に関する。対象は哺乳動物または鳥類種のような任意の対象であり得る。特別な態様において、対象は癌を持つヒトなどのヒトである。
【００２０】
対象の表面は任意の表面であり得る。用語「表面」は、生物学的生物の関係でのその通常かつ簡明な意味に従って用いられ、「動物体の、またはそのいずれかの部分の外側；皮膚の外側境界；また、中空または管状部分の内側境界」を意味する。例えば、表面は皮膚表面、粘膜表面、病巣の表面、創傷の表面、または中空内臓の表面であってよい。皮膚表面は通常の皮膚であってよく、あるいはそれは皮膚癌のような皮膚病巣の表面であってよい(例えば、基底細胞癌、扁平細胞癌)。粘膜表面は、口腔の表面、食道の表面、肺粘膜表面、胃、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、膣、または膀胱のような身体のいずれの粘膜表面であってもよい。粘膜表面は通常の粘膜であってよく、あるいはそれは口の白斑症、結腸ポリープ、または腫瘍のような粘膜の病巣の表面であってよい。病巣の表面は、良性、前癌性、または悪性であるかを問わず任意の病巣であってもよい。表面は外傷創傷、または腫瘍の外科的切除後の創傷のような外科的処置後創傷のような、創傷表面であってよい。表面は胃腸管の表面、膀胱、膣、頸部、または子宮の表面のような内部器官の表面であってよい。表面は後に詳細に議論するようにすり減らすように予め処理して、下にある組織へのより効果的な導入を可能とすることもできる。表面への適用のための製剤は、製剤が静脈内投与のような他の手段による適用に対して適切であることが後に判明しないことを意味しない。さらに、本明細書において記載の核酸製剤のあるものは、創傷表面のような1つの表面に対する製剤が適当であり、胃の表面のような他の表面に対する適用に適していないことが考えられる。
【００２１】
いずれのタイプの核酸も、本明細書において記載の組成物およびデバイスへ含めることが考えられ、例えば、siRNA、RNAi、ミクロRNA、リボザイムおよびCpGオリゴヌクレオチドのような全てのタイプのDNA、RNAを含む。
【００２２】
「治療核酸」は、病気または健康関連疾患の治療または予防において役に立つことが公知であるか、またはそれが推測される核酸を指すために本明細書において定義される。例えば、「治療核酸」は、病気または健康関連疾患の治療において役に立つことが公知であるか、またはそれが推測されるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸であってよい。また、「治療核酸」の定義には、病気または健康関連疾患の治療において役に立つことが公知であるか、またはそれが推測される第2の核酸を転写する核酸も含まれる(例えば、リボザイムまたはsiRNAに転写されたDNA)。あるいは、「治療核酸」は、転写を受けることなく治療的利点を提供することが公知の、またはそれが推測されるものであってよい(例えば、siRNAまたはリボザイム)。
【００２３】
治療的利点は、例えば、核酸による特定の遺伝子の発現の改変の結果として起こり得る。特定の遺伝子の発現の改変は、特定の遺伝子の発現の阻害または増加であってよい。本発明の特別な態様において、治療核酸は、対象における病気または健康関連疾患の治療または予防に適用できる一つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする。
【００２４】
「病気」は、感染、遺伝的欠陥、または環境ストレスのようないずれかの原因に由来する身体の部分、器官または系の病理学的状態と定義される。「健康関連疾患」は、病理学的ではないが、治療が求められる身体の部分、器官または系の状態を指すように本明細書において定義される。その例は、皮膚皺形成、皮膚傷等のような、化粧的療法が求められる状態を含む。病気は任意の病気であり得、非限定的例は癌のような過剰増殖病、ならびに前癌性病巣、創傷、および感染を含む。
【００２５】
「予防」および「予防する」は、「前に作用する」またはそのような行為を意味するように、その通常かつ簡明な意味に従って用いられる。特定の病気または健康関連疾患の関係では、それらの用語は薬剤、薬物、もしくは療法の対象への投与または適用、あるいは病気または健康関連疾患の開始をブロックする目的での対象に対する手法または様式の実行を指す。
【００２６】
治療核酸は腫瘍サプレッサー、(アポトーシスを促進するタンパク質を意味する)プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、腫瘍抗原、または酵素のような治療タンパク質をコードし得る。腫瘍サプレッサー遺伝子の例はmda7、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAM、CTS-1、zac1、ras、MMAC1、FCC、MCC、FUS1、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。特別な態様において、腫瘍サプレッサーはp53および/またはFUS1である。プロアポトーシス遺伝子の例はCD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PARP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、およびBIDを含む。サイトカインの例はGM-CSF、G-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α、TNF-β、PDGF、TGF-α、TGF-β、VEGFおよびmda7を含む。特別な態様において、サイトカインはmda7である。
【００２７】
核酸は腫瘍抗原をコードし得る。腫瘍抗原は当業者に公知の任意の腫瘍抗原であってもよい。腫瘍抗原の例は、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、エプスタインバーウイルス抗原、EBNA、ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7、TSP-180、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、およびMAGE遺伝子ファミリーの他のメンバー、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、mn-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、テロメラーゼ、43-9F、5T4、791Tgp72、アルファ-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29/BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68/KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結合タンパク質/シクロフィリンC関連タンパク質)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、ING1、ママグロビン、サイクリンB1、S100、BRCA1、BRCA2、腫瘍免疫グロブリンイディオタイプ、腫瘍T細胞受容体クローンタイプ、MUC-1、または表皮成長因子受容体、腫瘍サプレッサー、または前記腫瘍関連抗原、癌遺伝子、またはpepのいずれかのペプチドを含む。核酸は腫瘍サプレッサー遺伝子、または癌遺伝子もしくは腫瘍サプレッサー遺伝子の野生型もしくは突然変異形態を含むことができる。腫瘍抗原の例は、染色体トランスロケーションまたは癌遺伝子/腫瘍サプレッサー遺伝子突然変異によって形成された抗原(例えば、bcr/abl、ras)；発生/分化抗原(例えば、MUC-1、MAGE、チロシナーゼ、melan-Aおよびgp75)；悪性トランスフォーメーションにおいてアップレギュレートされた抗原(癌胎児抗原癌胎児性抗原/CEA、アルファフェトプロテイン/AFP、成長因子受容体-Her2/neu、テロメラーゼ、およびp53)および腫瘍病因(肝炎、パピローマーおよびエプスタイン-バールウイルス)およびジ(MUC-1、Melan-A)に関連するウイルス抗原を含む。
【００２８】
成長因子の例は表皮成長因子、ケラチノンサイト成長因子、および肝細胞成長因子を含む。ホルモンおよび酵素を含むさらなる治療タンパク質の例は本明細書中にて後に議論する。具体的には、本パラグラフで確認されるタンパク質のいずれも本発明の一部として考慮できると考えられ；加えて、具体的には、これらのタンパク質の一つまたは複数はいくつかの態様においては本発明の一部としてはやはり考慮されないと考えられる。
【００２９】
「診断核酸」は、病気または健康関連疾患の存在または非存在を同定するのに利点があることが公知の、もしくはそれが推測されるか、または特定の病気もしくは健康関連疾患を発症する危険性がある対象を同定するのに利点があることが公知の、もしくはそれが推測される核酸である。また、「診断核酸」の定義には、一つまたは複数のレポータータンパク質をコードする核酸配列も含まれる。「レポータータンパク質」とは、細胞または組織に存在する場合、細胞に存在する他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドから検出可能であり、区別できるアミノ酸配列を指す。レポータータンパク質は天然のタンパク質、または非天然のタンパク質であってよい。天然であれば、それは遺伝子導入に続く発現量の結果として検出可能であり、またはそれは検出可能なタグを付着させることができるタンパク質であってよい。そのようなレポータータンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質(gfp)、シアン蛍光タンパク質(cfp)、赤色蛍光タンパク質(rfp)、または青色蛍光タンパク質(bfp)のような蛍光タンパク質、またはこれらのタンパク質の誘導体、またはβ-ガラクトシダーゼのような酵素タンパク質、ルシフェラーゼのようなケミルミネセントタンパク質、ソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウム同伴輸送体アミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、およびチミジンキナーゼアミノ酸配列を含む。これらおよび他のレポータータンパク質は本明細書中において後により詳細に議論する。
【００３０】
本明細書において記載の新規の薬学的組成物のいくつかは、製剤が水性製剤である治療核酸および/または診断核酸の組成物に関する。水性製剤の例はマウスウオッシュ、マウスリンス、灌注、浣腸、スプレイ、およびエアロゾルを含む。
【００３１】
さらなる製剤は分散液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、懸濁液、マトリックス、微小粒子、マイクロカプセル、エマルジョン、マイクロエマルジョン、または分散液を含む。
【００３２】
他の組成物は固体または半固体として処方される。固体および半固体製剤とは、水性製剤以外の任意の製剤を指す。特別な態様において、固体または半固体は、経口投与に関するように、丸剤または錠剤ではないと考えられる。その例はゲル、マトリックス、フォーム、クリーム、軟膏、ロゼンジ、ロリポップ、ポプシクル、ガム、粉末、ゲルストリップ、フィルム、ヒドロゲル、溶解性ストリップ、ペースト、練り歯磨き、または固体スティックを含む。ある態様においては、本発明は、ロゼンジ、ロリポップ、ペプシクル、ガム、ゲルストリップ、フィルム、ヒドロゲル、溶解性ストリップ、または固体スティックのうちの一つまたは複数を具体的には含まない。
【００３３】
固体または半固体製剤に関しては、固体または半固体である本発明の薬学的組成物の任意の製剤が本発明に含まれると考えられる。これらは本明細書において他の箇所で詳細に扱われる。製剤は、後により詳細に議論するように、任意の数のさらなる賦形剤も含むことができる。その例はコラーゲン、グリセリン、PEG、水和シリカ、セルロース、キサンタンガム、グリコーゲンカルボマー956、Tween80、フッ化物、カラギーナン、接着剤および/または核酸摂取賦活剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、後により詳細に議論するように、化粧的成分を含んでもよい。
【００３４】
後により詳細に議論するように、本明細書において記載の薬学的組成物は任意の数のさらなる治療および/または診断剤を含んでもよい。その例は、さらなる治療剤、制酸剤、およびアルジネート-ラフト形成成分を含む。
【００３５】
ある特別な態様において、薬学的組成物は治療および/または診断核酸を含み、組成物はロゼンジ、ロリポップ、ポプシクル、ガム、ゲルストリップ、フィルム、ヒドロゲル、溶解性ストリップ、クリーム、軟膏薬、坐薬、または固体スティックとして処方される。
【００３６】
本明細書において記載の治療および/または診断核酸の薬学的組成物は一つまたは複数の接着剤をさらに含んでもよい。「接着剤」は、一般には、核酸と表面との接触を促進し、もしくは容易にし、または1つの表面ともう1つの表面との接触を促進し、もしくは容易にする薬剤または薬剤の組合せを指すように本明細書において定義される。薬学的目的で適当な当業者に公知の任意の接着剤を、本発明の薬学的組成物およびデバイスに含めることができる接着剤と考えられる。例えば、接着剤はアクリレート、ヒドロコロイド、ヒドロゲル、ポリアクリル酸系ゲルマトリックス、ポリイソブチレン、シリコーンポリマー、またはそれらの混合物であってよい。接着剤は本明細書中において後に詳細に議論する。アクリレート接着剤の例示的なタイプはシアノアクリレート、メタクリレート、またはアルキルアクリレートを含む。
【００３７】
当業者に公知の任意の核酸摂取賦活剤が、本明細書において記載の本薬学的組成物に含まれると考えられる。「核酸摂取賦活剤」は、細胞の表面に適用できるか、または細胞に対して外部にある核酸の摂取を容易とするように細胞の表面に接触できる任意の薬剤、または複数の薬剤の組成物を指すように本明細書において定義される。例示的なカチオン性脂質は第4級サイトフェクチン、ビス-グアニジニウム-トレン-コレステロール、および1,2-ジオレオイル-3-(トリメチルアンモニウム)プロペート(DOTAP)を含む。これらの薬剤は本明細書中において後により詳細に取り扱われる。
【００３８】
いくつかの態様において、固体または半固体薬学的組成物は化粧品として処方される。化粧品はリップスティック、軟膏薬、クリーム、ペースト、ゲルまたはローションの形態であってよい。着色剤、ワックス、油、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ポリマー、表面活性剤、着色剤、顔料、粉末、薬物、アルコール、溶媒、フレグランスまたはフレーバーのようなさらなる賦形剤を含めることもできる。
【００３９】
薬学的組成物は練り歯磨きとして処方してもよく、フッ化物、フラグラントおよび白化剤のような、練り歯磨きに通常存在する一つまたは複数のさらなる薬剤を含んでもよい。
【００４０】
いくつかの他の態様において、薬学的組成物はガムとして処方される。ガムはチューインガムであってよい。甘味剤およびフラグラントのようなさらなる賦形剤を製剤に含めてもよい。ガムは、いくつかの態様において、キサンタンガムを含む。
【００４１】
本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は凍結乾燥されている。当業者であれば凍結乾燥に精通している。
【００４２】
核酸は、核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含めることができ、プロモータは対象の細胞中で活性である。発現カセットはウィルスベクターに含めてもよい。当業者であれば、利用可能な多くのタイプのウィルスベクターに精通している。例えば、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、パルボウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターであってよい。ある特別な態様において、ウイルスベクターは、p53、mda7、またはFUS1をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのようなアデノウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは腫瘍退縮ウイルスである。腫瘍退縮ウイルスは本明細書中で後に詳細に議論する。腫瘍退縮ウイルスの例は、ADPを過剰発現するウイルス、およびAd5、dl327、pm734.1、dl309、dl01/07、KD1、KD2、KD3、dl1520およびVRX-007のようなウイルスを含む。ウイルスベクターを含む薬学的組成物は凍結乾燥されていてもいなくてもよい。
【００４３】
さらなる態様において、治療および/または診断核酸を含む薬学的組成物は一つまたは複数の送達剤を含む。「送達剤」は、対象となる標的細胞への核酸の送達を容易とする、ウイルスベクター以外の任意の薬剤または物質を指すように本明細書において定義される。当業者であれば、利用可能な種々のタイプの送達剤に精通している。例えば、送達剤は脂質であってよい。脂質はリポソームに含まれていてもいなくてもよい。リポソーム製剤は当技術分野において周知である。いくつかの態様において、DOTAP、コレステロールナノ粒子は送達剤である。
【００４４】
本発明の組成物およびデバイスの発現カセットは、プロモーターが対象の細胞において活性な限り、任意のタイプのプロモーターを含んでもよい。例えば、プロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または組織選択的プロモーターであってよい。組織選択的プロモーターは、他の組織タイプと比較して、ある組織タイプにおいて比較的より活性である任意のプロモーターを指すように本明細書において定義される。従って、例えば、肝臓特異的プロモーターは、身体中の他の組織と比較して、肝臓においてより活性なプロモーターである。組織選択的プロモーターの1つのタイプは腫瘍選択的プロモーターである。腫瘍選択的プロモーターは、他の組織タイプと比較して、腫瘍組織においてより活性であるプロモーターを指すように本明細書において定義される。他の組織タイプにおいていくらか機能があり得るが、プロモーターは他の組織タイプと比較して腫瘍組織において比較的より活性である。腫瘍選択的プロモーターの例はhTERTプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、プロバシンプロモーター、ARR2PBプロモーター、およびAFPプロモーターを含む。
【００４５】
本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、治療核酸および/または診断核酸を含む非アデノウイルス組成物である。組成物はゲル、ペースト、フォーム、スラリー、クリーム、軟膏薬、坐薬または粉末として処方される。特別な局面においては、組成物はp53、mda7、および/またはFUS1をコードする核酸を含む。
【００４６】
薬学的組成物は経皮パッチ、ストリップ、帯具、テープ、包帯、または合成皮膚を介して投与されるように処方してもよい。これらの製剤は後により詳細に議論する。
【００４７】
本発明は、一般には、パッチ、およびレポータータンパク質、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、成長因子、またはサイトカインをコードする核酸を含む薬学的組成物を含む、治療または診断剤を対象に送達するための経皮性または経皮的送達デバイスにも関し、薬学的組成物はパッチの少なくとも1つの表面に適用される。薬学的組成物に関する前記議論は、本明細書においては、これらの経皮性または経皮的送達デバイスに適用される。例示的な腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、成長因子、レポーター、およびサイトカインは本明細書において他の箇所で議論される。前記のように、核酸は、核酸に機能的にカップリングしたプロモーターを含む発現カセットに含まれてよく、プロモーターは対象において細胞中で活性である。発現カセットに関する前記議論は、本明細書においては、このセクションに適用される。特別な態様において、発現カセットはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターである。いくつかの態様において、核酸は、p53、mda7、またはFUS1をコードする治療核酸である。
【００４８】
本発明の態様は、前記の薬学的組成物のいずれかを対象に投与する段階を含む、対象において病気を検出し、予防し、または治療する方法にも関する。さらに、本発明の態様は、本明細書において記載した経皮性または経皮的送達デバイスの一つまたは複数を対象の体表面に適用する段階を含む、対象において病気を検出し、予防し、または治療する方法にも関する。
【００４９】
いくつかの例において、核酸がレポータータンパク質をコードすることができ、方法は対象において病巣を検出する方法としてさらに規定される。
【００５０】
病気は任意の病気であってもよい。例えば、病気は過剰増殖性病巣であってよい。例示的な過剰増殖性病巣は前癌性病巣、癌、および腫瘍を含む。過剰増殖性病巣、前癌性病巣または癌は乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、子宮頚癌、子宮頚部異形成、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、異形成母斑、頭部および頸部癌、骨癌、食道癌、角質増殖症、円背、脂漏性角化症、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、白血病、またはこれらの同一組織または器官の異形成病巣であってよい。他の病気は糖尿病性潰瘍、静脈うっ血性潰瘍、褥瘡性潰瘍、火傷、創傷、および粘膜炎を含む。
【００５１】
ある態様において、過剰増殖性病巣は対象の口に影響し得る病気である。その例は白斑症、扁平細胞過形成病巣、前癌性上皮病巣、口腔異形成、上皮内新形成病巣、病巣上皮過形成、および扁平上皮癌病巣を含む。
【００５２】
対象は哺乳動物のような任意の対象であり得る。ある態様において、哺乳動物はヒトである。例えば、ヒトは前癌性病巣を持つ患者、または癌を持つ患者であってよい。ある態様において、対象は、二次抗癌療法のような過剰増殖性病巣に対する二次的治療を受けている。本明細書中で後により詳細に議論するそのような療法の例は外科的療法、化学療法、放射線療法、および免疫療法を含む。
【００５３】
核酸は、さらに、腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、または成長因子をコードする核酸のような治療核酸であってよい。これらは本明細書において前記および他の箇所においてより詳細に議論される。核酸は、さらに、先に議論したレポータータンパク質をコードする核酸のような診断核酸であってよい。他の態様において、具体的には、治療核酸は腫瘍サプレッサー、プロアポトーシスタンパク質、サイトカイン、または成長因子、または本明細書において議論する特別なそのようなタンパク質のいずれかを特異的にコードしないと考えられる。
【００５４】
いくつかの態様において、方法は、さらに、対象の創傷の治癒を促進する方法として規定される。これらの態様において、例えば、核酸は前記議論のような成長因子をコードしてもよい。さらなる態様において、核酸は治療核酸であって、方法は、さらに、対象において過剰増殖性病巣の成長を予防または阻害する方法として規定される。例えば、過剰増殖性病巣は対象において口腔異形成または白斑症であってよい。方法は病気または健康関連疾患の検出、治療または予防を必要とする対象の同定をさらに含んでもよい。危険性がある対象を同定する方法の例は、病歴または調査医師によるインタビュー、またはそのような危険因子を同定するための質問の完了に基づく臨床的スクリーニングを含む。
【００５５】
前記のように、核酸は核酸に機能的にカップリングされたプロモーターを含む発現カセットに含まれてよく、プロモーターは対象の細胞において活性である。特別な態様において、発現カセットはアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターに保持される。より特別な態様において、発現カセットはアデノウイルスベクターに保持され、核酸はp53、mda7、またはFUS1をコードする。
【００５６】
当業者に公知の薬学的組成物を投与する任意の方法が本発明によって考えられる。「投与する」は、薬学的組成物を対象に提供することを含む。当業者であれば、薬学的組成物を投与することができる多くの方法に精通している。例えば、投与は、対象の体表面に製剤を局所適用することを含んでもよい。例えば、綿先端アプリケーターおよびスパチュラを用いるように、ゲルまたはペーストの適用のためにアプリケーターを用いてもよい。アプリケーターはディスポーサブルであってもなくてもよい。組成物は、健康ケアの専門家、または組成物が投与される対象のような任意の個人によって適用されてもよい。また、「投与する」の定義において、健康ケア専門家による製剤のような薬学的組成物を処方することも考えられる。本明細書において記載の薬学的組成物は、ディスポーサブルまたは再使用可能なアプリケーターおよび薬学的組成物を含むキットの形態であってもよい。そのようなキットは、健康ケア供給者または対象による薬学的組成物の適用のために設計されてもよい。
【００５７】
本明細書において記載の治療方法は、療法の一つまたは複数の二次形態を対象に投与する段階を含んでもよい。療法の二次形態は当業者に公知のいずれかを含み、病気プロセスに多いに依存する。その例は、本明細書中で後に記載される。
【００５８】
本明細書において記載のある種の核酸は本明細書において記載の各製剤および製剤毎に使用できなくてもよい。従って、例えば、クリームとして製剤に適した特定の核酸はロゼンジとしての製剤に必ずしも適当でなくてよい。
【００５９】
本発明の1つの局面に関する前記のいずれの態様も、同様に、本発明の他の局面に適用される。
【００６０】
実施例セクションにおける態様は、本発明の全ての局面に適用可能である本発明の態様であると理解される。
【００６１】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すように明示的に他のことが示されなければ「および/または」を意味するように用いられ、または代替物は相互に排除しあうが、開示は代替物のみ、「および/または」を指す定義を裏付ける。
【００６２】
本出願を通じて用語「約」は、値を決定するのに使用されるデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を値が含むことを示すように用いられる。
【００６３】
本明細書において、「ある(「a」または「an」)」は、一つまたは複数を意味することができる。特許請求の範囲において本明細書において、用語「含む」と組み合わせて用いる場合、用語「ある」は1つまたは複数を意味することができる。本明細書において用いられるように、「もう1つ」は少なくとも第二以上を意味することができる。
【００６４】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかとなる。しかしながら、本発明の好ましい態様を示しつつ、詳細な記載および具体的な例は説明のみにより与えられることは理解されるべきである。というのは、本発明の精神および範囲内の種々の変形および修飾はこの詳細な記載から当業者に明らかとなるからである。
【００６５】
例示的な態様の記載
本発明者らは対象における病気の診断、治療および/または予防で用いることができる核酸のある新規の組成物を突き止めた。これらの組成物は、例えば、皮膚、病巣の表面、粘膜表面、創傷表面、腫瘍表面のような対象の体表面、または胃のような中空内臓の裏面への適用のために処方される核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、病気の診断において適用することができるレポーター遺伝子をコードする。また、本明細書において記載の核酸の新規の製剤の使用を含む、対象において病気を診断および治療する新規の方法も記載される。本明細書において記載の新規の組成物および方法は、多数の病気および健康関連疾患のうちのいずれかの検出、予防または治療において適用することができる。そのような病気の例は癌、および感染、および創傷治癒を含む。病気の診断、治療、および予防におけるこれらの新規の組成物の適用は、現存の遺伝子治療技術における改良を表す。
【００６６】
A.核酸
1.一般的な核酸
本発明の薬学的組成物および方法は、対象における病気または健康関連疾患の診断、治療または予防において利点があることが公知の、またはそれが推測される核酸を含む。
【００６７】
用語「核酸」は当技術分野において周知である。本明細書において用いられる「核酸」は、一般には、DNA、(RNAi、siRNA、およびリボザイムを含めた)RNAの分子(すなわち、ストランド)、およびオリゴヌクレオチド、CpG部位を含むオリゴヌクレオチド、または核酸塩基を含む誘導体またはそのアナログを指す。用語「核酸」は、各々、用語「核酸」の亜属としての用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を含む。用語「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約3〜約100核酸塩基の間の分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが約100核酸塩基よりも大きな少なくとも1つの分子を指す。
【００６８】
これらの定義は、一般には、一本鎖分子を指すが、特別な態様においては、さらなるストランドも含む。さらなるストランドは一本鎖分子に対して部分的に、実質的にまたは十分に相補的であってよい。従って、核酸は、一つまたは複数の相補的ストランド(部位)、または分子を含む特定の配列の「相補体(類)」を含む二本鎖分子または三本鎖分子を含んでよい。本明細書において、一本鎖核酸は接頭辞「ss」によって示すことができ、二本鎖核酸は接頭辞「ds」によって示すことができ、および三本鎖核酸は接頭辞「ts」によって示すことができる。
【００６９】
a.核酸塩基
本明細書において、「核酸塩基」とは、例えば、少なくとも1つの天然の核酸(すなわち、DNAおよびRNA)に見出される天然の核酸塩基(すなわち、A、T、G、CまたはU)、およびそのような核酸塩基の天然の、または非天然の誘導体(類)およびアナログのような複素環塩基を指す。核酸塩基は、一般には、天然の核酸塩基対合(例えば、AおよびT、GおよびC、AおよびUの間の水素結合)に代えて置換することができるような、少なくとも1つの天然の核酸塩基と一つまたは複数の水素結合を形成することができる(「アニール」または「ハイブリダイズ」することができる)。
【００７０】
「プリン」および/または「ピリミジン」核酸塩基(類)は天然のプリンおよび/またはピリミジン核酸塩基を含み、限定されるわけではないが、一つまたは複数のアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、(すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード)、チオールまたはアルキルチオール基によって置換されたプリンまたはピリジンを含めたそれらの誘導体(類)およびアナログ(類)も含む。好ましいアルキル(例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど)基は、約1、約2、約3、約4、約5、〜約6の炭素原子を含む。プリンまたはピリミジンの他の非限定的例はデアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-(6-アミノヘキシル/シトシン)などを含む。表1はプリンおよびピリミジンの誘導体およびアナログの非限定的例を示す。
【００７１】
（表１）プリンおよびピリミジンの誘導体またはアナログ
2008528508.tif 000002
【００７２】
核酸塩基は、本明細書において記載の、または当業者に公知のいずれかの化学的または天然合成方法を用い、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに含めることができる。
【００７３】
b.ヌクレオシド
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、核酸塩基リンカー部分に共有結合された核酸塩基を含む個々の化学的ユニットを指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定的例は、限定されるわけではないが、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または5-炭素糖の誘導体またはアナログを含めた、5-炭素原子を含む糖(すなわち、「5-炭素糖」)である。5-炭素糖の誘導体またはアナログの非限定的例は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボースまたは炭素が糖環中の酸素原子に代えて置換した炭素環糖を含む。
【００７４】
核酸塩基リンカー部分への核酸塩基の共有結合の異なるタイプが当技術分野において公知である。非限定的例としては、プリン(すなわち、AまたはG)を含むヌクレオシドまたは7-デアザプリン核酸塩基は、典型的には、プリンまたは7-デアザプリンの9位置を5-炭素糖の1'-位置に共有結合させる。もう1つの非限定的例においては、ピリミジン核酸塩基(すなわち、C、TまたはU)を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの1位置を5-炭素糖の1'-位置に共有結合させる(Kornberg and Baker,1992)。
【００７５】
c.ヌクレオチド
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、さらに「骨格部位」を含むヌクレオシドを指す。骨格部位は、一般には、ヌクレオチドをヌクレオチドを含むもう1つの分子に、またはもう1つのヌクレオチドに共有結合させ、核酸を形成する。天然のヌクレオチド中の「骨格部位」は、典型的には、5-炭素糖に共有結合したリン部位を含む。骨格部位の結合は、典型的には、5-炭素糖の3'-または5'-位置いずれかで起こる。しかしながら、特に、ヌクレオチドが天然の5-炭素糖の誘導体またはアナログ、またはリン部位を含む場合に、他のタイプの結合が当技術分野において公知である。
【００７６】
d.核酸アナログ
核酸は、天然の核酸に存在し得る、核酸塩基、ヌクレオリンカー部分、および/または骨格部位の誘導体またはアナログを含んでもよく、またはそれより全部が構成される。本明細書において、「誘導体」とは、天然の分子の化学的に修飾されたまたは改変された形態をいい、他方、用語「ミミック」または「アナログ」とは、天然の分子または部位に構造的に似ていても似ていなくてもよいが、同様な機能を保有する分子を指す。本明細書において、「部位」は、一般には、大きな化学的または分子構造のより小さな化学成分または分子成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのアナログまたは誘導体は当技術分野において周知であり、記載されてきた(例えば、参照により本明細書に組み入れられるScheit,1980参照)。当業者に公知のヌクレオシドまたはヌクレオチドのいずれの誘導体またはアナログも本発明の方法および組成物で用いることができる。非限定的例は「ポリエーテル核酸」および「ペプチド核酸」である。
【００７７】
e.核酸の調製
核酸は、当業者に公知の任意の技術によって作成することもできる。その例は化学合成、酵素的生産または生物学的生産を含む。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的例は、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学および固相技術を用いてインビトロ化学合成によって作成された核酸を含む。酵素的に生産された核酸の非限定的例は、PCR(商標)および当業者に公知の他の技術のような増幅反応(例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号)、または参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,645,897号に記載されたオリゴヌクレオチドの合成において酵素によって生産されたものを含む。生物学的に生産された核酸の非限定的例は、細菌中で複製された組換えDNAベクターのような生きた細胞において生産された(すなわち、複製された)組換え核酸を含む(例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al.2001参照)。
【００７８】
f.核酸相補体
また、本発明は、対象において病気を診断、治療、または予防することができるアミノ酸配列をコードする核酸に対して相補的な核酸も含む。核酸「相補体(類)」は、標準的なワトソン-クリック、フーグスチーン、または逆フーグスチーン結合相補性則に従ってもう1つの核酸と塩基対合することができる場合に、もう1つの核酸に対して「相補的」である。本明細書において「もう1つの核酸」とは、別の分子または同一分子の空間的に分離された配列を指すことができる。
【００７９】
本明細書において、用語「相補的」または「相補体(類)」は、全て未満の核酸塩基がカウンターパート核酸塩基と塩基対合をたとえしなくても、もう1つの核酸ストランドまたはデュプレックスにハイブリダイズすることができる連続核酸塩基またはセミ連続核酸塩基の配列を含む核酸も指す(例えば、一つまたは複数の核酸塩基部位は分子に存在しない)。ある態様において、「相補的」核酸は、核酸塩基配列の約70％〜約100％、およびその中で誘導可能ないずれかの範囲のものがハイブリダイゼーションの間に一本鎖または二本鎖核酸分子と塩基対合できる配列を含む。ある態様において、用語「相補的」とは、当業者によって理解されるように、ストリンジェントな条件においてもう1つの核酸ストランドまたはデュプレックスにハイブリダイズすることができる核酸を指す。
【００８０】
ある態様において、「部分的に相補的な」核酸は、一本鎖または二本鎖核酸に低ストリンジェンシー条件においてハイブリダイズすることができる配列を含み、またはハイブリダイゼーションの間に、核酸塩基配列の約70％未満が一本鎖または二本鎖核酸分子と塩基対合することができる配列を含有する。
【００８１】
2.治療核酸
本明細書において記載の製剤のある態様において、核酸は治療核酸である。「治療核酸」は、病気を治療または予防する目的で対象に投与することができる核酸を指すように本明細書において定義される。核酸は、対象において病気または健康関連疾患の治療において利点があることが公知の、またはそれが推測されるものである。病気および健康-関連疾患は本明細書において他の箇所で詳細に議論される。
【００８２】
治療的利点は、例えば、核酸による特定の遺伝子の発現の改変の結果として生じ得る。特定の遺伝子の発現の改変は、特定の遺伝子の発現の阻害または増加であり得る。本発明のある態様において、治療核酸は、対象において病気または健康関連疾患の治療または予防に適用することができる一つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドをコードする。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書においては相互交換可能に用いられる。双方の用語は、2以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を指す。
【００８３】
病気または健康関連疾患の治療または予防において利点があることが公知の、またはそれが推測される当業者に公知の任意の核酸が、治療核酸として本発明によって考えられる。本出願を通じて記載されるフレーズ「をコードする核酸配列」とは特定のタンパク質またはペプチドの発現を指令する核酸を指す。核酸配列は、RNAに転写されるDNAストランド配列、およびタンパク質に翻訳されるRNA配列を共に含む。いくつかの態様において、核酸は治療遺伝子を含む。用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド-コーディングユニットをコードする核酸配列を指す。
【００８４】
当業者によって理解されるように、用語「治療核酸」は、ゲノム配列、cDNA配列、およびタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現し、またはそれを発現するように適合させることができるより小さな作成された遺伝子断片を含む。核酸は約5〜約12000以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基対の連続核酸配列を含むことができる。
【００８５】
「治療核酸」の定義内には、病気または健康関連疾患の治療または予防において利点があることが判明した治療核酸の「生物学的に機能的な同等体」が含まれる。従って、公知の核酸に対して約70％〜約99％相同性を有する配列は本発明によって考えられる。
【００８６】
a.腫瘍サプレッサーおよびプロアポトーシスタンパク質をコードする核酸
いくつかの態様において、特許請求される薬学的組成物の核酸は、癌または他の過剰増殖病の治療または予防において適用することができるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。そのようなタンパク質の例は、限定されるわけではないが、Rb、CFTR、p16、p21、p27、p57、p73、C-CAM、APC、CTS-1、zac1、scFV ras、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、BRCA1、VHL、MMAC1、FCC、MCC、BRCA2、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、GM-CSF、G-CSF、チミジンキナーゼ、mda7、fus、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ADP、p53、ABLI、BLC1、BLC6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS2、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3、YES、MADH4、RB1、TP53、WT1、TNF、BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFCF、bFGF、NT3、NT5、ApoAI、ApoAIV、ApoE、Rap1A、シトシンデアミナーゼ、Fab、ScFv、BRCA2、zac1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、OVCA1、MADR2、53BP2、IRF-1、Rb、zac1、DBCCR-1、rks-3、COX-1、TFPI、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはMCCを含む。
【００８７】
「腫瘍サプレッサー」とは、細胞に存在する場合、細胞の腫瘍形成性、悪性、または過剰増殖表現型を低下させるポリペプチドを指す。腫瘍サプレッサー遺伝子アミノ酸配列をコードする核酸配列は、腫瘍サプレッサー遺伝子の全長核酸配列、ならびに全長配列に由来するいずれかの長さの非全長配列を共に含む。さらに、配列は天然配列、または特異的宿主細胞におけるコドン優先性を提供するために導入することができる配列の縮重コドンを含むと理解される。
【００８８】
腫瘍サプレッサーをコードする核酸は、一般には、細胞の腫瘍形成性、悪性、または過剰増殖表現型を低下させる核酸配列を指す。従って、そうでなければ健康な細胞における腫瘍サプレッサー遺伝子の正常な発現の非存在、突然変異、または破壊は、新形成状態を達成する細胞の、または細胞における結果の尤度を増加させる。逆に、機能的腫瘍サプレッサー遺伝子またはタンパク質は細胞に存在する場合、その存在は宿主細胞の腫瘍形成性、悪性または過剰増殖表現型を抑制する。腫瘍サプレッサーの例は、限定されるわけではないが、APC、CYLD、HIN-1、KRAS2b、p16、p19、p21、p27、p27mt、p53、p57、p73、PTEN、Rb、ウテログロビン、Skp2、BRCA-1、BRCA-2、CHK2、CDKN2A、DCC、DPC4、MADR2/JV18、MEN1、MEN2、MTS1、NF1、NF2、VHL、WRN、WT1、CFTR、C-CAN、CTS-1、zac1、scFV、ras、MMAC1、FCC、MCC、遺伝子26(CACNA2D2)、PL6、β＊(BLU)、Luca-1(HYAL1)、Luca-2(HYAL2)、123F2(RASSF1)、101F6、遺伝子21(NPRL2)、またはSEM A3ポリペプチドをコードする遺伝子、およびFUS1を含む。他の例示的な腫瘍サプレッサー遺伝子は、www.cise.ufl.edu/〜yy1/HTML-TSGDB/Homepage.htmlにおける腫瘍サプレッサー遺伝子のデータベースに記載されている。このデータベースは、ここに、参照により、本出願のこのおよび全ての他のセクションに具体的に組み入れられる。腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸は、前記のように、腫瘍サプレッサー遺伝子、またはそれに由来する核酸(各腫瘍サプレッサーアミノ酸配列の活性断片をコードするcDNA、cRNA、mRNA、およびそれらのサブ配列)、ならびにこれらの配列を含むベクターを含む。当業者であれば、本発明に適用することができる腫瘍サプレッサー遺伝子に精通している。
【００８９】
最良な公知の腫瘍サプレッサー遺伝子の1つはp53である。p53は細胞の抗癌メカニズムの多くに対して中枢的である。それは成長阻止、アポトーシスおよび細胞老化を誘導できる。正常な細胞において、p53は、その作用を妨げ、その分解を促進するタンパク質MDM-2に結合した通常は不活性なものである。活性なp53は、UV放射、癌遺伝子およびいくつかのDNA-損傷薬物のような種々の癌を引き起こす薬剤の効果の後に誘導される。DNA損傷は細胞周期において「チェックポイント」によって検知され、ATM、Chk1、およびChk2のようなタンパク質が、タンパク質のMDM2-結合領域近くの部位においてp53をリン酸化させる。癌遺伝子は、タンパク質p14ARFによって媒介されるp53活性化も刺激する。いくつかの癌遺伝子はMDM2に結合し、その活性を阻害するタンパク質の転写を刺激することもできる。一旦活性化されたp53が多くの抗癌メカニズムを有すれば、最良に記載されているのはDNAの領域に結合し、細胞周期阻害、アポトーシス、遺伝子安定性、および脈管形成の阻害で重要な遺伝子の転写を活性化するその能力である(Vogelstein et al.,2000)。研究は、タンパク質p14ARFを介して、p53およびpRB腫瘍サプレッサー経路に連結され、経路は相互に調節できる可能性を引き上げる(Bates et al.,1998)。
【００９０】
プロアポトーシスタンパク質をコードする核酸は、活性な形態に対するアポトーシスを誘導し、または維持するタンパク質をコードする。本発明では、当業者に公知のプロアポトーシスタンパク質をコードする任意の核酸を含めることも考えられる。例示的なプロアポトーシスタンパク質はCD95、カスパーゼ-3、Bax、Bag-1、CRADD、TSSC3、bax、hid、Bak、MKP-7、PERP、bad、bcl-2、MST1、bbc3、Sax、BIK、BID、およびmda7を含む。当業者であれば、本明細書において具体的に記載されていないものを含めたプロアポトーシスタンパク質に精通している。
【００９１】
プロアポトーシスアミノ酸配列をコードする核酸は、例えば、各プロアポトーシスアミノ酸配列の活性断片をコードするcDNA、cRNA、mRNA、およびそれらのサブ配列を含む。
【００９２】
当業者であれば、本明細書において具体的に記載されていない病気または健康関連疾患の治療に適用できるタンパク質またはポリペプチドをコードする他の核酸があることを理解する。さらに、サイトカインをコードする核酸のような、本明細書において他の箇所に言及された治療核酸のいずれも、癌の治療および予防において適用できることは理解されるべきである。
【００９３】
b.サイトカインをコードする核酸
本明細書において記載の薬学的組成物のいくつかの態様において、核酸はサイトカインをコードする。用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとしてもう1つの細胞に作用する1つの細胞集団によって放出されるタンパク質に対する総括的用語である。核酸配列はサイトカインの全長核酸配列、ならびに全長配列に由来するいずれかの長さの非全長配列をコードすることができる。前記のように、配列は、天然配列、または特異的宿主細胞におけるコドン優先性を供するために導入することができる配列を含むことはさらに理解される。
【００９４】
そのようなサイトカインの例はリンホカイン、モノカイン、成長因子および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、および黄体形成ホルモン(LH)のような糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；プロスタグランジン、FGF-αおよびFGF-βのような線維芽細胞成長因子(FGF)；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、OBタンパク質；腫瘍壊死因子-αおよび-β；ムレリアン-阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(TPO)；NGF-βのような神経成長因子；血小板-成長因子；TGF-αおよびTGF-αのようなトランスフォーミング成長因子(TGF)；インスリン様成長因子-Iおよび-II；エリスロポエチン(EPO)；骨誘導因子；インターフェロン-α、-β、および-γのようなインターフェロン；マクロファージ-CSF(M-CSF)のようなコロニー刺激因子(CSF)；顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF)；および顆粒球-CSF(G-CSF)；IL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、LIF、G-CSF,GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-リガンドまたはFLT-3のようなインターロイキン(IL)が含まれる。
【００９５】
創傷治癒に関与する成長因子サイトカインの非限定的例は、表皮成長因子、血小板-由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、肝細胞成長因子、TGF-αおよびTGF-βのようなトランスフォーミング成長因子(TGF)、および血管内皮成長因子(VEGF)を含む。これらの成長因子は、Ras、MAPK、PI-3K/Akt、PLC-ガンマおよびRho/Rac/アクチンシグナリングを利用するマイトジェン、モトジェニック(motogenic)および生存経路を誘発する。低酸素症はプロ-脈管形成遺伝子(例えば、VEGF、アンジオポエチン)をHIFを介して活性化し、他方、血清応答因子(SRF)はVEGF-誘導脈管形成、再上皮化および筋肉回復に対して臨界的である。EGF、その受容体、HGFおよびCox2は上皮細胞増殖、胃腺の移動再-上皮化および再構成で重要である。VEGF、アンジオポエチン、酸化窒素、エンドセリンおよびメタロプロテイナーゼは、潰瘍内での脈管形成、血管再形成および粘膜再生で重要である(Tarnawski,2005)。
【００９６】
サイトカインのもう1つの例はIL-10である。IL-10は免疫系細胞ならびにいくつかの腫瘍細胞によって生産される多面発現ホモダイマーサイトカインである(Ekmekcioglu et al., 1999)。その免疫抑制機能は、IFNγ、TNFα、およびIL-6のそれを含めた、プロ炎症サイトカイン合成の優れた阻害を含む(De Waal et al.,1991)。IL-10様サイトカインのファミリーは、染色体1q32上の小さな195kb遺伝子クラスターにコードされ、IL-10に対して構造的および配列相同性を有する多数の細胞タンパク質(IL-10、IL-19、IL-20、MDA-7)からなる(Kotenko et al.,2000；Gallagher et al.,2000；Blumberg et al.,2001；Dumoutier et al.,2000；Knapp et al.,2000；Jiang et al.,1995a；Jaing et al.,1996)。
【００９７】
サイトカインファミリーの最近発見された推定メンバーはMDA-7である。MDA-7はIL-10ファミリーメンバーとして特徴付けられ、IL-24としても公知である。染色体位置、転写調節、ネズミおよびラットの相同な発現、および推定タンパク質構造は、全て、サイトカインであるMDA-7に割り当てられる(Knapp et al.,2000；Schaefer et al.,2000；Soo et al.,1999；Zhang et al.,2000)。その全てが迅速な分解についてのそれらの3'UTR標的化mRNAにおいてAU-リッチなエレメントを含有するGM-CSF、TNFα、およびIFNγ転写体と同様に、MDA-7はその3'UTRにおいて3つのAREを有する17。Mda-7 mRNAはヒトPBMCにおいて同定されており(Ekmekcioglu et al.,2001)、ヒトMDA-7タンパク質のサイトカイン機能は十全には報告されていないが、MDA-7は遺伝子およびタンパク質配列の特徴に基づいて、IL-24と命名されている(NCBIデータベースアクセッションXM 001405)。
【００９８】
c.酵素をコードする核酸
治療核酸の他の例は酵素をコードする核酸を含む。その例は、限定されるわけではないが、ACPデサチュラーゼ、ACPヒドロキシラーゼ、ADP-グルコースピロフォリラーゼ、ATPase、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ヒアルロンシンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、GTPase、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子、インターロイキン、またはサイトカインを含む。しかしながら、本発明のある態様においては、本発明は、具体的には、先に、または以下のパラグラフで確認されている酵素の一つまたは複数を含まないと考えられる。
【００９９】
治療遺伝子のさらなる例はカルバモイルシンテターゼI、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ-1抗トリプシン、グルコース-6-ホスファターゼ、低密度リポタンパク質受容体、ポルフォビリノゲンデアミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオンベータ-シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-CoAデヒドロゲナーゼ、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ、メチルマロニルCoAムターゼ、グルタリルCoAデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ-グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、H-プロテイン、T-プロテイン、メンケス病銅-輸送ATPase、ウィルソン病銅-輸送ATPase、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース-1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α-L-イズロニザーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、HSVチミジンキナーゼ、またはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含む。
【０１００】
本発明の治療核酸はスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)をコードすることができる。いくつかのイソ形態で存在するSODは、スーパーオキサイドラジカルを過酸化水素水に解毒するメタル酵素である。2つのイソ形態が細胞内である。細胞質で発現されるCu/Zn-SOD、およびミトコンドリアで発現されるMn-SOD(Linchey and Fridovich,1997)。Mn-SODはMnSOD cDNAでトランスフェクトされた造血系腫瘍細胞株における放射線に対する抵抗性を増大させることが示されている(Suresh et al.,1993)。Cu/Zn-SODのアデノウイルス送達は、エタノール誘導肝臓負傷に対して保護することが示されている(Wheeler et al.,2001)。Mn-SODおよびCu/Zn-SOD双方のさらなるアデノウイルス媒介遺伝子送達は、温かい虚血症再プロフシュージョンのモデルにおいて酸化的ストレスに対する保護で等しく有効である(Wheeler et al.,2001)。
【０１０１】
d.ホルモンをコードする核酸
治療核酸はホルモンをコードする核酸も含む。その例は、限定されるわけではないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、絨毛ゴナトトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、β-エンドルフィン、β-メラノサイト刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンI、ゲラニン、胃阻害性ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィジン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、β-カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性因子の高カルシウム血症、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、グルカゴン様ペプチド、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドYY、PHM、セクレチン、血管活性腸ペプチド、オキシトシン、バソプレッシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトルフィナミド、アルファメラノサイト刺激ホルモン、心房ナトリウム利尿因子、アミリン、アミロイドP成分、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン-放出ホルモン、ニューロペプチドY、サブスタンスK、サブスタンスPおよびチロトロピン放出ホルモンを含む。
【０１０２】
治療遺伝子の他の例は病原体に存在する抗原、または自己免疫に関与する免疫エフェクターをコードする遺伝子を含む。これらの遺伝子は、例えば、感染症および自己免疫疾患の免疫療法または免疫予防のためのワクチン接種に適用される製剤に適用することができる。
【０１０３】
本発明の他の態様において、レポーター遺伝子は、単独で、または治療遺伝子と組み合わせて利用される。レポーター遺伝子の例は、限定されるわけではないが、gfp、rfp、またはbfpのような蛍光タンパク質、酵素タンパク質様β-gal、またはケミルミネセントタンパク質様ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。
【０１０４】
「レポーター遺伝子」の定義内に含まれるのは、「生物学的に同等な」治療遺伝子である。従って、レポーター遺伝子のアミノ酸と同一である、または機能的に同等なアミノ酸の約70％〜約99％相同性を有する配列は、生物学的に機能的な同等体である配列であり、但し、タンパク質の生物学的活性が維持されるものとする。
【０１０５】
e.抗原をコードする核酸
本明細書において記載の薬学的組成物は一つまたは複数の抗原をコードする核酸を含むことができる。例えば、治療遺伝子は腫瘍、病原体、または自己免疫に関与する免疫エフェクターに存在する抗原をコードすることができる。これらの遺伝子は、例えば、新形成、感染症および自己免疫疾患の免疫療法または免疫予防のためのワクチン接種に適用される製剤において適用することができる。
【０１０６】
i.腫瘍抗原
ある態様において、治療核酸は腫瘍抗原をコードする。腫瘍抗原は当業者に周知である。その例は、限定されるわけではないが、その各々が参照により本明細書にその全体を組み入れる、Dalgleish(2004)、Finn(2003)、およびHellstrom and Helstrom(2003)によって記載されたものを含む。他の例は、具体的に参照により本明細書に組み入れられる、http：//www.bioinfo.org.cn/hptaa/search.phpで見出すことができる。
【０１０７】
ii.微生物抗原
いくつかの態様において、核酸は微生物抗原をコードする。用語「微生物」はウイルス、細菌、顕微鏡的菌類、原生動物および他の顕微鏡的寄生虫を含む。「微生物抗原」とは、抗原提示細胞(APC)によって細胞表面に提示された場合に、免疫応答を誘導するポリペプチドを指す。この応答は、細胞傷害性T細胞応答、または抗体の生産、または双方を含むことができる。
【０１０８】
微生物抗原が由来するウイルスの例は、ヒトヘルペスウイルス(HHV)-1〜8；ヘルペスBウイルス；HPV-16、18、31、33、および45；肝炎ウイルスA、B、C、δ；ポリオウイルス；ロタウイルス；インフルエンザ；レンチウイルス；HTLV-1；HTLV-2；ウマ感染性貧血ウイルス；東洋ウマ脳炎ウイルス、西洋ウマ脳炎ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウイルス；リフトバレー熱ウイルス；西ナイルウイルス；黄熱病ウイルス；クリミア-コンゴ出血性熱ウイルス；デングウイルス；SARSコロナウイルス；天然痘ウイルス；サル痘ウイルスおよび/または等を含む。
【０１０９】
ウイルス微生物の例は、限定されるわけではないが、レトロウイルス科、フラウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、トガウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ポリオーマウイルス科、パピローマウイルス科、ヘルペスウイルス科およびヘパドナウイルス科を含む。
【０１１０】
レトロウイルス科の例はHIV-1、HIV-2、SIV、FIV、Visna、CAEV、BIVおよびEIAVのようなレンチウイルスを含む。レンチウイルスによってコードされる遺伝子はgag、pol、env、vif、vpr、vpu、nef、tat、vpxおよびrevを含むことができる。レトロウイルスの他の例は鳥類白血病ウイルス、鳥類骨髄芽球症ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、フジナミ肉腫ウイルスおよびラウス肉腫のようなアルファレトロウイルスを含む。アルファレトロウイルスによってコードされる遺伝子はgag、polおよびenvを含むことができる。レトロウイルスのさらなる例はヤーグジークテヒツジレトロウイルス、ラングールウイルス、マソン-ファイザーサルウイルス、マウス乳癌ウイルス、シミアンレトロウイルス1およびシミアンレトロウイルス2を含む。βレトロウイルスによってコードされる遺伝子はgag、pol、proおよびenvを含むことができる。レトロウイルスのなおさらなる例はHTLV-1、HTLV-2、ウシ白血病ウイルス、およびヒヒT細胞白血病ウイルスのようなデルタレトロウイルスを含む。デルタレトロウイルスによってコードされる遺伝子は、gag、pol、env、taxおよびrexを含むことができる。レトロウイルスのなおさらなる例はウシ、ネコ、ウマ、サルおよびヒト泡沫状ウイルスのようなスプマウイルスを含む。スプマウイルスによってコードされる遺伝子はgag、pol、env、bel-1、bel-2およびbetを含むことができる。
【０１１１】
フラビウイルス科の例は、限定されるわけではないが、C型肝炎ウイルス、蚊で生じる黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパマダニで生じるウイルス、極東マダニで生じるウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病IIIウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス、属ルビウイルス(風疹ウイルス)および属ペスチウイルス(粘膜病ウイルス、豚コレラウイルス、ボーダー病ウイルス)を含む。フラビウイルスによってコードされる遺伝子は、全てのフラビウイルスタンパク質が由来するフラビウイルスポリプロテインを含む。フラビウイルスポリプロテインをコードする核酸配列は、C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B,NS3、NS4A、NS4BおよびNS5のような最終のプロセッシングされたフラビウイルスタンパク質産物をコードする配列を含むことができる。
【０１１２】
コロナウイルス科の例は、限定されるわけではないが、SARSおよびウシコロナウイルスのようなヒト呼吸器系コロナウイルスを含む。コロナウイルスによってコードされる遺伝子はpol、S、E、MおよびNを含むことができる。
【０１１３】
ピコルナウイルス科の例は、限定されるわけではないが、属エンテロウイルス(ポリオウイルス、コクサッキーウイルスAおよびB、腸細胞傷害ヒトオーファン(ECHO)ウイルス、A型肝炎ウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎(ME)ウイルス、ポリオウイルスムリス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、属カルジオウイルス(脳心筋炎ウイルス(EMC)、メンゴウイルス、属ライノウイルス(少なくとも113のサブタイプを含むヒトライノウイルス；他のライノウイルス)および属アプトウイルス(口蹄疫(FMDV))を含む。ピコルナウイルスによってコードされる遺伝子はピコルナウイルスポリプロテインを含むことができる。ピコルナウイルスポリプロテインをコードする核酸配列は、VPg、VPO、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3Cおよび3Dのような最終のプロセッシングされたピコルナウイルスタンパク質産物をコードする配列を含むことができる。
【０１１４】
トガウイルス科の例は、限定されるわけではないが、属アルファウイルス(東洋ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョング-ニョングウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西洋ウマ脳炎東洋ウマ脳炎ウイルス)を含む。トガウイルス科によってコードされる遺伝子の例はnsP1、nsP2、nsP3、nsP4、C、E1およびE2をコードする遺伝子を含むことができる。
【０１１５】
ラブドウイルス科の例は、限定されるわけではないが、属ベシクロウイルス(VSV)、チャンディプラウイルス、フランダーズ-ハートパークウイルス)および属リッサウイルス(狂犬病ウイルス)を含む。ラブドウイルス科によってコードされる遺伝子の例はN、P、M、GおよびLを含むことができる。
【０１１６】
フィロウイルス科の例はエボラウイルスおよびマールブルグウイルスを含む。フィロウイルスによってコードされる遺伝子の例はNP、VP35、VP40、GP、VP35、VP24およびLを含むことができる。パラミクソウイルスの例は、限定されるわけではないが属パラミクソウイルス(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、HAウイルス、パラインフルエンザウイルス2〜5型、ニューキャッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス)、属モルビリウイルス(麻疹ウイルス、亜急性硬化汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、属ニューモウイルス(呼吸器系シンシチウムウイルス(RSV)、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス)、属パラミクソウイルス(パラインフルエンザウイルス1型、センダイウイルス、HAウイルス、パラインフルエンザイウルルス2〜5型、ニューキャッスル病ウイルス、おたふくかぜウイルス)、属モルビリウイルス(麻疹ウイルス、亜急性硬化汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス)、属ニューモウイルス(呼吸器系シンシチウムウイルス(RSV)、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス)を含むパラミクソウイルス科を含む。パラミクソウイルス科によってコードされる遺伝子の例はN、P/C/V、P/C/V/R、M、F、HN、L、V/P、NS1、NS2、SHおよびM2を含むことができる。
【０１１７】
オルトミクソウイルス科の例はインフルエンザウイルスを含む。オルトミクソウイルス科によってコードされる遺伝子の例はPB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1およびNS2を含むことができる。
【０１１８】
ブンヤウイルス科の例は、限定されるわけではないが、属ブニウイルス(ビニャムウエラおよび関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス)、属フレボウイルス(サシチョウバエ熱シリシアンウイルス、リフトバレー熱ウイルス)、属ナイロウイルス(クリミア-コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス)および属ウンクウイルス(ウンクニエミおよび関連ウイルス)を含む。ブンヤウイルスによってコードされる遺伝子の例はN、G1、G2およびLを含むことができる。
【０１１９】
アレナウイルスの例は、限定されるわけではないが、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アルゼンチン出血性熱ウイルス、ボリビア出血性熱ウイルス、およびベネズエラ出血性熱ウイルスを含む。アレナウイルスによってコードされる遺伝子の例は、NP、GPC、LおよびZを含むことができる。
【０１２０】
レオウイルスの例は、限定されるわけではないが、属オルトレオウイルス(哺乳動物および鳥類レトロウイルス双方の複数血清型)、属オルビウイルス(ブルータングウイルス、エンゲナンジウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、およびコロラドマダニ熱ウイルス)、および属ロタウイルス(ヒトロタウイルス、ネボラスカコウシ下痢ウイルス、ネズミロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、鳥類ロタウイルス)を含む。レオウイルスによってコードされる遺伝子の例は、VP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、NSP3、NSP2、VP7、NSP4、NSP5およびNSP6のようなそれらの対応するタンパク質産物について命名されたゲノムセグメントを含むことができる。
【０１２１】
ポリオーマウイルス科の例は、限定されるわけではないが、BKおよびJCウイルスを含む。ポリオーマウイルスによってコードされる遺伝子の例は、Agno、P2、VP3、VP2、VP1、大Tおよび小tを含むことができる。
【０１２２】
パピローマウイルス科の例は、限定されるわけではないが、HPV-16およびHPV-18を含む。パピローマウイルスによってコードされる遺伝子の例はE1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1およびL2を含むことができる。
【０１２３】
ヘルペスウイルス科の例は、限定されるわけではないが、ヒトヘルペスウイルス(HHV)1、HHV2、HHV3、HHV4、HHV5、HHV6、HHV7およびHHV8を含む。ヘルペスウイルスによってコードされる遺伝子の例は、γ134.5、ORF P、ORFO、αO、UL1〜UL56、α4、α22、US2〜Us12、OrisTUおよびLATUを含むことができる。
【０１２４】
ヘパドナウイルスの例は、限定されるわけではないが、B型肝炎ウイルスを含む。ヘパドナウイルスによってコードされる遺伝子の例は、S、C、PおよびXを含むことができる。
【０１２５】
微生物抗原が由来し得る真菌の例は、ヒストプラスマ・カプスラーツム(histoplasma capsulatum)；アスペルギルス(aspergillus)；アクチノミセス(actinomyces)；カンジダ(candida)、ストレプトミセス(streptomyces)および/または等を含む。
【０１２６】
抗原が由来し得る原生動物または他の微生物の例は、熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(plasmodium malariae)等を含む。プラスモジウム種に由来する遺伝子はPyCSP、MSP1、MSP4/5、Pvs25およびPvs28を含むことができる。
【０１２７】
微生物抗原が由来し得る細菌の例は、ヒト型結核菌(mycobacterium tuberculosis)；ペスト菌(yersinia pestis)；発疹チフス・リケッチア(rickettsia prowazekii)；ロッキー山紅斑熱リケッチア(rickettsia rickettsii)；野兎病菌(francisella tularensis)；炭疽菌(bacillus anthracis)；ヘリコバクター・ピロリ(helicobacter pylori)；チフス菌(salmonella typhi)；ライム病ボレリア(borrelia burgdorferi)；ミュータンス連鎖球菌(streptococcus mutans)；および/または等を含む。ヒト型結核菌(mycobacterium tuberculosis)に由来する遺伝子は85A、85B、85CおよびESAT-6を含むことができる。ペスト菌(yersinia pestis)に由来する遺伝子はlcrVおよびcaf1を含むことができる。リケッチア(rickettsia)種に由来する遺伝子はospA、invA、ompA、ompB、virB、cap、tlyAおよびtlyCを含むことができる。野兎病菌(francisella tularensis)に由来する遺伝子はヌクレオシド二リン酸キナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、HfqおよびClpBを含むことができる。炭疽菌(bacillus anthracis)に由来する遺伝子はPA、BclAおよびLFを含むことができる。ヘリコバクター・ピロリ(helicobacter pylori)に由来する遺伝子はhpaA、UreB、hspA、hspB、hsp60、VacA、およびcagEを含むことができる。チフス菌(salmonella typhi)に由来する遺伝子はmpC、aroC、aroD、htrAおよびCS6を含むことができる。ライム病ボレリア(borrelia burgdorferi)に由来する遺伝子はOspCを含むことができる。
【０１２８】
微生物抗原が由来し得る真菌の例は、ヒトプラスマ(hitoplasma)；シクシジス(ciccidis)；イミティス(immitis)；アスパルギルス(aspargillus)；アクチノミセス(actinomyces)；ブラストミセス(blastomyces)；カンジダ(candida)、ストレプトミセス(streptomyces)および/または等を含む。
【０１２９】
抗原が由来し得る原生動物および他の微生物の例は、熱帯熱マラリア原虫(plasmodium flaciparum)、三日熱マラリア原虫(plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(plasmodium malariae)；ジアダリア・インテスティナリス(giadaria intestinalis)および/または等を含む。
【０１３０】
微生物抗原はストレプトコッキー・ミュータンス(Streptococci mutans)に由来するグルコシルトランスフェラーゼであってよい。グルコシルトランスフェラーゼは歯の表面へのS・ミュータンス(S.mutans)の蓄積を媒介する。グルコシルトランスフェラーゼの不活化は、虫歯の低下を引き起こすことが示された(Devulapalle and Mooser,2001)。
【０１３１】
ストレプトコッキー・ミュータンスに由来する抗原のもう1つの例はPAcタンパク質である。PAcは、この生物の歯の表面への初期接着を媒介するストレプトコッキー・ミュータンスのコロニー化に関与する190-kDa表面タンパク質抗原である。最近、S・ミュータンスのグルコシルトランスフェラーゼ-Bによってコードされるアミノ酸残基1185〜1475、S・ミュータンスのPac遺伝子によってコードされるアミノ酸残基222〜965の融合タンパク質をコードするプラスミドDNAのインビボ投与は、これらの各遺伝子産物に対する免疫応答を誘導したことが報告されている(Guo et al.,2004)。
【０１３２】
f.抗体をコードする核酸
本明細書において記載の核酸は抗体をコードすることができる。用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すように用いられ、Fab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(単一鎖Fv)等のような抗体断片を含む。種々の抗体ベースの構築体および断片を調製し、およびそれを用いる技術は当技術分野において周知である。抗体を調製し、特徴付けるための手段も当技術分野において周知である。本明細書において、用語「抗体」は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEのような任意の免疫学的結合剤を広く指すように意図する。一般に、IgGおよび/またはIgMが好ましい。なぜならば、それらは生理学的状況において最も普通の抗体だからであり、かつそれらは実験室設定において最も容易に作成されるからである。
【０１３３】
本発明のある態様において、本明細書において記載の薬学的組成物の核酸は単一鎖抗体をコードする。単一鎖抗体は、その各々を参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,946,778号および第5,888,773号に記載されている。
【０１３４】
g.リボザイム
本発明のある態様において、本明細書において記載の薬学的組成物の核酸はリボザイムをコードし、またはそれを含む。タンパク質は、伝統的には、核酸の触媒で用いられてきたが、もう1つのクラスのマクロ分子がこの努力で有用なものとして出現した。リボザイムは、部位特異的様式に核酸を切断するRNA-タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する(Kim and Cook,1987；Gerlach et al.,1987；Forster and Symons,1987)。例えば、非常に多数のリボザイムが高度な特異性でもってホスホエステル移動反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質においていくつかのホスホエステルの唯1つを切断する(Cook et al.,1981；Michel and Westhof,1990；Reinhold-Hurek and Shub,1992)。この特異性は、化学反応に先立って、リボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)へ特異的塩基対合相互作用を介して基質が結合する要件に帰せられてきた。
【０１３５】
リボザイム触媒は、主として、核酸が関与する配列特異的切断/連結反応の一部として観察されてきた(Joyce,1989；Cook et al.,1981)。例えば、米国特許第5,354,855号は、ある種のリボザイムが、公知のリボヌクレアーゼのそれよりも大きな配列特異性でもってエンドヌクレアーゼとして作用でき、DNA制限酵素のそれに近づくことを報告する。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介阻害は、治療適用に特に適する(Scanlon et al.,1991；Sarver et al.,1990)。最近、リボザイムが、それらが適用されたいくつかの細胞株において遺伝子変化を誘導したことが報告され；改変された遺伝子は癌遺伝子H-ras、c-fosおよびHIVの遺伝子を含んだ。この業績のほとんどは、特異的リボザイムによって切断される特異的突然変異体コドンに基づく、標的mRNAの修飾を含んだ。
【０１３６】
h.RNAi
本発明のある態様において、本明細書において記載の薬学的組成物の治療核酸はRNAiである。(「RNA媒介干渉」またはRNAiとも言われる)RNA干渉は、遺伝子発現を低下させ、または排除できるメカニズムである。二本鎖RNA(dsRNA)は、多工程プロセスである低下を媒介することが観察されている。dsRNAは、ウイルス感染およびトランスポゾン活性から細胞を防御するよう機能するように見える転写後遺伝子発現監視メカニズムを活性化する(Fire et al.,1998；Grishok et al.,2000；Ketting et al.,1999；Lin and Avery et al.,1999；Montgomery et al.,1998；Sharp and Zamore,2000；Tabara et al.,1999)。これらのメカニズムの活性化は、破壊のために成熟したdsRNA-相補的mRNAを標的とする。RNAiは、遺伝子機能の研究のための主な実験的利点を提供する。これらの利点は非常に高い特異性、細胞膜を横切っての移動の容易性、および標的化遺伝子の持続性のダウンレギュレーションを含む(Fire et al.,1998；Grishok et al.,2000；Ketting et al.,1999；Lin and Avery et al.,1999；Montgomery et al.,1998；Sharp et al.,1999；Sharp and Zamore,2000；Tabara et al.,1999。さらに、dsRNAは、植物、原生動物、真菌、シノラブディス・エレガンス(C.elegans)、トリパノソーマ属(Trypanasoma)、ショウジョウバエ(Drosophila)、および哺乳動物を含む広い範囲の系において遺伝子をサイレントとすることが示されている(Grishok et al.,2000；Sharp et al.,1999；Sharp and Zamore,2000；Elbashir et al.,2001)。一般に、RNAiは転写後に作用し、分解のためにRNA転写体を標的とすることが認められている。核および細胞質RNA双方は標的化できるようである(Bosher and Labouesse,2000)。
【０１３７】
RNAiの当業者は、限定されるわけではないが、本発明でやはり同様に使用することができるミクロRNAを含むさらなるタイプのRNAiがあることを理解する。ミクロRNAは、具体的に参照により本明細書に組み入れられるDu and Zamore,2005に記載されている。
【０１３８】
エンドリボヌクレアーゼDicerは、遺伝子発現を調節する2つのタイプの小さな調節性RNA：小さな干渉性RNA(siRNA)およびミクロRNA(miRNA)を生産することが公知である(Bernstein et al.,2001；Grishok et al.,2001；Hutvagner et al.,2001；Ketting et al.,2001；Knight and Bass,2001)。動物においては、siRNAは標的mRNAの切断を指令し(Elbashir et al.,2001)、他方、miRNAは標的mRNA翻訳をブロックする(Reinhart et al.,2000；Brennecke et al.,2003；Xu et al.,2003)。最近のデータは、siRNAおよびmiRNAが共に同様な恐らくは同一でさえあるタンパク質複合体に取り込まれ、mRNA破壊対翻訳調節の臨界的決定因子は、小さなRNAおよびそのmRNA標的の間の配列相同性の程度であることを示唆する(Hutvagner and Zamore 2002；Mourelatos et al.,2002；Zeng et al.,2002；Doench et al.,2003；Saxena et al.,2003)。ゲノムまたは染色体における多くの公知のmiRNA配列およびそれらの位置はhttp：//www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/help/summary.shtmlにおいて見出すことができる。
【０１３９】
siRNAは、それらが対象となる遺伝子の発現を抑制するにおいて特異的かつ効果的なように設計されなければならない。標的配列、すなわち、siRNAがそれに対して分解マシーナリーをガイドする対象となる遺伝子に存在する配列を選択する方法は、遺伝子に特異的な配列を含みつつ、siRNAガイド機能に干渉し得る配列を排除することに向けられる。典型的には、長さが約21〜23ヌクレオチドのsiRNA標的配列が最も効果的である。この長さは、前記のかなりより長いRNAのプロセッシングから得られる消化産物の長さを反映する(Montgomery et al.,1998)。
【０１４０】
siRNAの作成は、主として、直接的化学合成を介する；ショウジョウバエ胚溶解物への曝露を通じてのより長い二本鎖RNAのプロセッシングを介する；またはS2細胞に由来するインビトロ系を介するものであった。細胞溶解物またはインビトロプロセッシングの使用は、さらに、溶解物からの短い21〜23ヌクレオチドsiRNAの引き続いての単離などを含むことができ、プロセスを幾分面倒かつ出費がかかるものとする。化学合成は、2つの一本鎖RNA-オリゴマーを作成し、続いて、二本鎖RNAへの2つの一本鎖オリゴマーのアニーリングによって進行する。化学合成の方法は多様である。非限定的例は、明示的に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,889,136号、第4,415,723号および第4,458,066号において、およびWincott et al.(1995)において提供される。
【０１４１】
siRNA配列に対するいくつかのさらなる修飾が、それらの安定性を改変し、またはそれらの有効性を改良するために示唆されてきた。ジヌクレオチド突出を有する合成相補的21量体RNA(すなわち、19相補的ヌクレオチド＋3'非相補的ダイマー)は抑制の最大レベルを提供することができると示唆されている。これらのプロトコルは、主として、ジヌクレオチド突出としての2つの(2'-デオキシ)チミジンヌクレオチドの配列を用いる。これらのジヌクレオチド突出は、しばしば、RNAに取り込まれた典型的なヌクレオチドからそれらを区別するためにdTdTとして書かれる。文献は、dT突出の使用が、化学的に合成されたRNAのコストを低下させる必要性によって動機付けされることを示した。また、利用できるデータはUU突出でのsiRNAと比較して、dTdT突出のわずかな(＜20％)を示すに過ぎないが、dTdT突出は、UU突出よりも安定であることが示唆されている。
【０１４２】
化学的に合成されるsiRNAは、25〜100nMの濃度において細胞培養中にある場合に最適に働くことが見出されているが、約100nMの濃度は哺乳動物細胞において発現の効果的な抑制を達成した。siRNAは、約100nMにおいて哺乳動物細胞培養において最も効果的であった。しかしながら、いくつかの場合において、化学的に合成されたsiRNAのより低い濃度が用いられてきた(Caplen,et al.,2000；Elbashir et al.,2001)。
【０１４３】
WO 99/32619およびWO 01/68836は、siRNAで用いられるRNAは化学的にまたは酵素的に合成できることを示唆する。これらのテキストの双方は参照により本明細書にその全体を組み入れる。これらの文献に考えられる酵素合成は、当技術分野において公知のように、発現構築体の使用および生産を介する細胞RNAポリメラーゼまたはバクテリオファージRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)によるものである。例えば、米国特許第5,795,715号参照。考えられる構築体は、標的遺伝子の部分と同一であるヌクレオチド配列を含有するRNAを生じる鋳型を提供する。これらの文献によって提供される同一配列の長さは少なくとも25塩基であり、長さが400以上と多くの塩基であり得る。この文献の重要な局面が、著者らが、インビボで長いdsRNAをsiRNAに変換する内因性ヌクレアーゼ複合体でより長いdsRNAを21〜25量体長さを消化することを考えていることである。本発明者は、インビトロ転写21〜25量体dsRNAを合成し、それを用いるためのデータを記載せず、または提示しない。RNA干渉におけるその使用において化学的にまたは酵素的に合成されたdsRNAの予測される特性の間で区別がなされない。
【０１４４】
同様に、参照により本明細書に組み入れられるWO 00/44914は、RNAの一本鎖が酵素的に、または部分的/全体的有機合成によって生産することができることを示唆する。好ましくは、一本鎖RNAはDNA鋳型、好ましくはクローン化されたcDNA鋳型のPCR(商標)産物から酵素的に合成され、RNA産物は、数百のヌクレオチドを含むことができるcDNAの完全な転写体である。参照により本明細書に組み入れられるWO 01/36646は、siRNAが合成される方法に対して制限を課さず、但し、RNAは手動および/または自動手法を用いてインビトロまたはインビボで合成することができるものとする。この文献は、インビトロ合成が、例えば、内因性DNA(またはcDNA)鋳型、または双方の混合物の転写のためにクローン化されたRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7、SP6)を用いて化学的または酵素的であり得ることを提供する。再度、RNA干渉において用いるための望ましい特性における区別は、化学的にまたは酵素的に合成されたsiRNAの間でなされない。
【０１４５】
米国特許第5,795,715号は単一反応混合物における2つの相補的DNA配列ストランドの同時転写を報告し、そこでは、2つの転写体は直ちにハイブリダイズされる。用いる鋳型は40〜100塩基対の間であり、それには各末端においてプロモーター配列が備えられている。鋳型は好ましくは固体表面に付着される。RNAポリメラーゼでの転写の後に、得られたdsRNA断片が、核酸標的配列を検出し、および/またはアッセイするために用いることができる。
【０１４６】
米国特許出願第20050203047号は、siRNAまたはmiRNA配列を、トランスファーRNA(tRNA)をコードする配列に取り込むことによってRNA干渉を介して遺伝子発現を変調する方法を報告する。siRNAまたはmiRNA配列を含有するtRNAは、この配列が発現されたtRNAからスプライスされるように、核酸発現構築体に取り込むことができる。siRNAまたはmiRNA配列は、プロセッシングされていないtRNA転写体に関連するイントロン内に位置させることができ、またはtRNA転写体のいずれかの末端に位置させることができる。
【０１４７】
i.他の治療核酸
治療核酸の他の例は、CpGドメインを含むオリゴヌクレオチド(「CpGオリゴヌクレオチド」)を含む。細菌DNAは、インビトロにて末梢血液単核細胞に対して直接的な免疫刺激効果を有することが示されている(Messina et al.,1991)。そのような効果はB細胞の増殖、および増大した免疫グロブリンIg分泌を含む(Krieg et al.,1995)。加えて、これらの効果は、単球、マクロファージおよび樹状細胞の活性化を介するIL-12を含むTh1サイトカイン分泌を含む(Klinman,et al.,1996；Halpern et al.,1996；Cowdery et al.,1996)。分泌されたTh1サイトカインはナチュラルキラー(NK)細胞を刺激して、γ-インターフェロンを分泌させ、増大した溶解活性を有する(Klinman et al.,1996,前記；Cowdery et al.,1996,前記；Yamamoto et al.,1992)。これらの刺激効果は、しばしば、特定の配列との関係でメチル化されていないCpGジヌクレオチドの存在の結果である(CpG-S)(Krieg et al.,1995)。
【０１４８】
CpG-S配列によるB細胞活性化はT細胞独立性であって、抗原非特異的である。それにも拘らず、CpG-S配列は、B細胞抗原受容体を介して送達されたシグナルについて強力な相乗作用を有する。B細胞抗原受容体とこれとの相互作用は、抗原特異的免疫応答を促進せず、免疫刺激アジュバントとしてのCpG配列の所望性を示唆する。
【０１４９】
CpG-S配列はシトシン-グアニンジヌクレオチドを含有し、一般には、サイズが2〜100塩基対の間である。コンセンサスCpG-S配列は式：5'X1X2CGX3X43'によって表され、X1、X2、X3およびX4はヌクレオチドであって、GCGトリヌクレオチド配列は5'および3'末端において、またはその近くでは存在しない。CpG-S配列の例はGACGTT、AGCGTT、AACGCT、GTCGTTおよびAACGATを含む。
【０１５０】
逆に、いくつかの微生物は、アデノウイルス血清型2のように、免疫中和性であるように見えるCpG配列を含有する。これらのウイルスにおいて、ほとんどのCpG配列は直接的リピートのクラスターにおいて、または5'側のCまたは3'側のGと共に、見出される。そのようなCpG配列は、それらがインビトロにおいてCpG-S配列によるTh1-タイプ免疫活性化をブロックする点で、免疫中和性(CpG-N)であるように見える。同様に、CpG-NおよびCpG-S配列を抗原と共に投与すると、抗原特異的免疫応答は、CpG-S配列単独のそれと比較して効果がない。CpG-N配列単独を抗原と共にインビボで投与すると、Th2様抗原特異的免疫応答が発生する。
【０１５１】
GpG-N配列もまたシトシン-グアニンジヌクレオチドを含有し、一般には、長さが2〜100塩基対の間である。コンセンサスCpG-N配列は、式：5'GCGXnGCG3'によって表され、Xはいずれかのヌクレオチドであって、nは0〜50の範囲である。
【０１５２】
従って、核酸構築体におけるヌクレオチド配列は、CpG-S配列の数を増大させるように操作することができる。そのような構築体もまた、CpG-N配列の数を減少させるように操作することができる。例えば、当業者であれば、部位特異的突然変異を利用して、一つまたは複数のCpGモチーフを持つ所望の核酸配列を生じさせるように選択することができる。または、特定のCpG配列を合成し、核酸構築体に挿入することができる。非限定的例は、明示的に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,889,136号、第4,415,723号、および第4,458,066号に提供される。
【０１５３】
米国特許第6,194,388号および米国特許第6,207,646号は、免疫刺激で用いられるGpGオリゴヌクレオチドを安定化して、分解に対する抵抗性を提供することができることを示唆する。これらのテキストの双方を、その全体を参照により本明細書に組み入れる。これらの文献において考えられる安定化プロセスは、リン酸骨格修飾を介して達成される。好ましい安定化されたオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート修飾骨格を有する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの薬物動態学は、げっ歯類における48時間の全身半減期を示す(Agrawal et al.,1991)。これらのホスホロチオエートは、ホスホルアミデートまたはHホスホネート化学いずれかを使用する自動技術を用いて合成してもよい。アリール-およびアルキル-ホスホネートは米国特許第4,469,863号に記載されたように作成することができ；荷電された酸素部分がアルキル化されたアルキルホスホトリエステルは、その各々を、具体的に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,023,243号に記載されている。DNA骨格修飾および置換を行う他の方法もまた記載されている(Uhlmann,E.and Peyman,A.,1990、およびGoodchild,1990)。
【０１５４】
米国特許第6,206,646号は、ホスホロチオエート骨格を有する核酸分子を含有するメチル化されていないCpGはB細胞活性を優先的に活性化することが見出されており、他方、ホスホジエステル骨格を有する核酸分子を含有するメチル化されていないCpGは、マクロファージ、樹状細胞、単球およびNK細胞を優先的に活性化することが見出されていることを報告する。修飾は、核酸分子の5'および/または3'末端において、またはその近くで優先的に起こる。
【０１５５】
米国特許第6,339,068号は、免疫刺激免疫についてのDNAベクターが、CpG-N配列の除去によって改良することができ、CpG-S配列の付加によってさらに改良することができることを報告する。加えて、高くかつ長く続くレベルの発現については、最適化されたベクターは、好ましくは、免疫刺激性CpG配列によって誘導されるサイトカインによってダウンレギュレートされないプロモーター/エンハンサーを含むべきである。また、B型肝炎表面抗原遺伝子をコードするそのようなプラスミドベースのDNAベクターを創製する方法も報告された。しかしながら、同一文献は、CpG-S配列は、免疫刺激効果のためには、CpG-S配列は(すなわち、抗原をコードするプラスミド上の)同一場所において、または同一時点で投与されなければならないことを示す。しかし、修飾は抗原配列それ自体内でなければならないようには見えない。
【０１５６】
また、米国特許第6,399,068号は、NFκBはCpG効果のメディエーターであることを報告する。例えば、B細胞または単球をCpG配列で処理して15分以内に、NFκB結合活性のレベルは増加し、他方、これらの配列を含有しないDNAで処理した同一細胞型は変化を示す。文献は、NFκB活性化の阻害がCpG配列によるリンパ球刺激をブロックすることも報告する。加えて、CpG DNAは、Royall and Ischiropoulos,1993に記載されているように、感受性蛍光色素ジヒドロローダミン123によって検出される反応性酸素種B細胞および単球細胞の生産の迅速な誘導を引き起こす。さらに、CpG DNAでのB細胞の処理に続いての反応性酸素種の創製は、DNAがエンドソームにおける酸性化工程を受けることを必要とすることが報告されている。CpGモチーフを含むまたは含まない5'放射性標識オリゴヌクレオチドでの電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)に基づき、CpG配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドに特異的に結合するタンパク質を表すように見えるバンドが見出された。NFκB結合部位を含有するオリゴヌクレオチドを付加すれば、この結合はブロックされると報告されていた。
【０１５７】
本明細書において具体的に記載されていない病気または健康関連疾患の治療または予防において有益であると考えられる任意の他の核酸も、本発明の組成物および方法において含めることも考えられる。本明細書において記載の治療核酸は、さらに、レポーター配列を含み、またはそれをコードすることができる。レポーター配列は後により詳細に議論する。
【０１５８】
3.診断核酸
本発明の薬学的組成物は、診断核酸である核酸を含むことができる。「診断核酸」は、病気または健康関連疾患の診断に適用することができる核酸である。また、「診断核酸」の定義には、一つまたは複数のレポータータンパク質をコードする核酸配列が含まれる。「レポータータンパク質」とは、細胞または組織に存在する場合、細胞に存在する他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドから検出可能であり、それから区別可能であるアミノ酸配列を指す。いくつかの態様において、治療遺伝子はレポーターに融合させることができるか、または別々のタンパク質として生産することができる。例えば、対象となる遺伝子、およびレポーターは、共コ-トランスフェクション(共-感染)による別々の送達ビヒクル中の別々のプロモーターによって、または同一の送達ビヒクルにおける別々のプロモーターによって誘導することができる。加えて、2つの遺伝子は、例えば、内部リボソーム進入部位によって同一プロモーターに、または二方向性プロモーターに連結することができる。そのような技術を用い、対象となる遺伝子およびレポーターの発現は相関する。従って、対象となる遺伝子の位置、量、および発現の持続を測定することができる。対象となる遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子またはプロアポトーシス遺伝子のような抗癌遺伝子であってよい。
【０１５９】
細胞はレポーター遺伝子でトランスフェクトすることができる故に、レポーターは細胞トラフィッキングを追跡するのに用いることができる。例えば、インビトロにて、特異的細胞はレポーターでトランスフェクトし、次いで、動物に戻して、ホーミングを評価することができる。多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎モデルにおいて、Costa et al.(2001)は、IL-12 p40およびルシフェラーゼを発現するように形質導入されたミエリン塩基性タンパク質特異的CD4＋T細胞を導入した。インビボにおいて、ルシフェラーゼを用いて、中枢神経系へのトラフィッキングが示された。加えて、IL-12 p40は炎症を阻害した。もう1つの系において、陽電子射出断層撮影法(PET)を用い、Koehne et al.(2003)は、インビボにて、単純疱疹ウイルス-1チミジンキナーゼ(HSV-TK)を発現するエプスタイン-バールウイルス(EBV)特異的T細胞が、T細胞の制限性HLA対立遺伝子を発現するEBV＋腫瘍に選択的に移動することを示した。さらに、これらのT細胞は、標的化腫瘍を排除するそれらの能力を保有する。順次のイメージングを利用し、Dubey et al.(2003)は、ネズミ肉腫ウイルス/モロニーネズミ白血病ウイルス(M-MSV/M-MuLV)によって誘導された腫瘍への、HSV-TKを発現するT細胞の抗原特異的局所化を示した。これらの特異的プロモーターを用いて、例えば、分化し、または肝臓細胞と融合し、かつタイプII肺胞細胞における界面活性剤促進剤の活性化のような分化された細胞の特徴を取る幹細胞の分化を評価することもできる。
【０１６０】
好ましくは、レポーター配列は、その存在、検出可能な部位とのその関連性によって、または検出可能なシグナルの発生をもたらすその活性によって、容易に検出可能なタンパク質をコードする。ある局面において、検出可能な部位は、放射性核種、フルオロフォア、ルミノフォア、微小粒子、マイクロスフィア、酵素、酵素基質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ナノ粒子、および/またはナノソフィアを含むことができ、その全ては、レポーターを認識し、および/またはそれと相互作用する抗体またはリガンドにカップリングさせることができる。
【０１６１】
種々の態様において、本発明の核酸配列は、レポーター核酸配列を含み、または検出可能なポリペプチドを生起させる産物をコードする。レポータータンパク質は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じさせることができる。一般には、必ずしもそうではないが、レポーター遺伝子は核酸配列を含み、および/またはそうでなければ細胞によって生産されない検出可能なポリペプチドをーコードする。多くのレポーター遺伝子が記載されており、いくつかは、遺伝子の調節の実験のために市販されている(例えば、その開示を参照により本明細書に組み入れられるAlam and Cook,1990)。検出できるシグナルは、限定されるわけではないが、色、蛍光、ルミネセンス、同位体または放射性同位体シグナル、細胞表面タグ、細胞生存率、細胞栄養要件の救済、細胞成長および薬物抵抗性を含む。レポーター配列は、限定されるわけではないが、β-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、例えば、G-タンパク質カップルド受容体(GPCR)を含めた膜結合タンパク質、ソマトスタチン受容体、CD2、CD4、CD8、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、(NISのような)共輸送体、および高親和性抗体またはそれに向けられたリガンドが存在し、かつ慣用的手段によって生産することができる当技術分野において周知の他のもの、および、ヘマグルチニンまたはMycからの抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするDNA配列を含む。Kundra et al.,2002は、生体分布実験およびγカメライメージングを用い、インビトロおよびインビボでの、スマトスタチン受容体2型キメラー遺伝子導入非侵入的モニタリングを示した。
【０１６２】
いくつかの態様において、レポーター配列は蛍光タンパク質をコードする。本発明に従って用いることができる蛍光タンパク質の例は緑色蛍光タンパク質(GFP)、促進された緑色蛍光タンパク質(EGFP)、レニラ・レニフォルメス(Renilla Reniformis)緑色蛍光タンパク質、GFPmut2、GFPuv4、増強された黄色蛍光タンパク質(EYFP)、促進されたシアン蛍光タンパク質(ECFP)、増強された青色蛍光タンパク質(EBFP)、ジスコソーマからのレモン色および赤色蛍光タンパク質(dsRED)を含む。
【０１６３】
種々の態様において、レポーター配列の少なくとも1つの所望レベルの発現は、診断核酸の基礎転写レベルと比較したレポーター配列の発現のレベルの増加、減少、または変化なしである。特別な態様において、レポーター配列の1つの発現の所望のレベルは、レポーター配列の基礎転写レベルと比較したレポーター配列の発現のレベルの増加である。
【０１６４】
種々の態様において、レポーター配列は、独立して、同時に、または独立してかつ同時に分析することができるユニークな検出可能なタンパク質をコードする。他の態様において、宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。例示的な真核生物細胞が酵母および哺乳動物細胞を含む。哺乳動物細胞はヒト細胞、および癌細胞のような病理学的表現型を呈する種々の細胞を含む。
【０１６５】
例えば、いくつかのレポータータンパク質は、可視光線および/または紫外線下で容易に観察することができる細胞における色の変化を誘導する。レポータータンパク質は、当業者に公知の任意のレポータータンパク質であり得る。その例はgfp、rfp、bfpおよびルシフェラーゼを含む。
【０１６６】
レポータータンパク質をコードする核酸はDNA、cRNA、mRNA、および各レポーターアミノ酸配列の活性断片をコードするそれらのサブ配列、ならびにこれらの配列を含むベクターを含む。
【０１６７】
レポータータンパク質のイメージングの例示的な方法は、γカメライメージング、CT、MRI、PET、SPECT、光学イメージング、および超音波を含む。いくつかの態様において、診断核酸は、CTおよびMRI、PETおよびSPECT等のような、複数の様式を用いるイメージングに適している。
【０１６８】
イメージングにおけるレポーターの例に関するさらなる情報は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、Kumar,2005；Kundra et al.,2005；およびKundra et al., 2002に記載されている。
【０１６９】
4.アンチセンス構築体
本明細書において記載のいくつかの態様において、核酸はアンチセンス構築体をコードする。アンチセンス方法は、核酸が「相補的」配列と対合する傾向があるという事実を利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが、標準的なワトソン-クリック相補性則に従って塩基対合できることを意味する。すなわち、より大きなプリンはより小さなピリミジンと塩基対合して、DNAの場合には、シトシンと対合したグアニン(G：C)、およびチミンと対合したアデニン(A：T)、またはRNAの場合には、ウラシルと対合したアデニン(A：U)の組合せを形成する。イノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびハイブリダイズする配列におけるその他のようなより普通でない塩基を含めると、対合に干渉しない。
【０１７０】
ポリヌクレオチドに対して二本鎖(ds)DNAを標的化すると、三重-ラセン形成に導き；RNAの標的化は二重-ラセン形成に導く。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入されると、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、RNAプロセッシング、輸送、翻訳および/または安定性に干渉する。アンチセンスRNA構築体、またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAを使用して、ヒト対象を含めた宿主動物内のような、インビトロまたはインビボいずれかでの、宿主細胞内での遺伝子転写または翻訳、または双方を阻害することができる。
【０１７１】
アンチセンス構築体は、遺伝子のプロモーター、および他の制御領域、エクソン、イントロン、またはエクソン-イントロン境界でさえに結合するように設計することができる。最も効果的なアンチセンス構築体はイントロン/エクソンスプライス接合に対して相補的な領域を含むと考えられる。従って、好ましい態様は、50〜200塩基のイントロン-エクソンスプライス接合内の領域に対して相補性を持つアンチセンス構築体を含むと提唱される。いくつかのエクソン配列は、その標的選択性にひどく影響することなく構築体に含むことができることが観察されている。含めるエクソン物質の量は、用いる特定のエクソンおよびイントロン配列に依存して変化する。インビトロにて構築体をテストして、正常な細胞機能が影響されるか否か、または相補的な配列を有する関連遺伝子の発現が影響されるか否かを決定することによって、余りにも多くのエクソンDNAが単純に含まれるかを容易にテストすることができる。
【０１７２】
前記のように、「相補的」または「アンチセンス」は、それらの全長に渡って実質的に相補的であって、非常に少数の塩基ミスマッチしか有しないポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、長さが15塩基の配列は、それらが13または14の位置において相補的ヌクレオチドを有する場合に相補的ということができる。天然では、完全に相補的な配列は、それらの全長を通じて完全に相補的であって、塩基ミスマッチを有しない配列である。より低い程度の相同性を持つ他の配列も考えられる。例えば、高い相同性の限定された領域を有するが、非相同性領域(例えば、リボザイム：後記参照)も含有するアンチセンス構築体を設計することができよう。これらの分子は、50％未満の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。
【０１７３】
ゲノムDNAの部分と、cDNAまたは合成配列と組み合わせて、特異的な構築体を生じさせるのが有意である。例えば、イントロンが最終的な構築体で望まれる場合、ゲノミッククローンを用いる必要があろう。cDNAまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築体の残りの部分についてのより便利な制限部位を提供することができ、従って、配列の残りで用いられる。
【０１７４】
B.発現カセット
1.概観
本発明のある態様において、本明細書において記載の薬学的組成物および方法は治療または診断核酸を含み、核酸は「発現カセット」に含まれる。本出願を通じて、用語「発現カセット」は、配列をコードする核酸の一部または全てが転写することができる遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築体を含むことを意味する。
【０１７５】
2.プロモーターおよびエンハンサー
発現カセットは転写体の発現を行うためには、診断または治療遺伝子をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、転写の開始および速度がそこで制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子のような調節タンパク質および分子がそこに結合することができる遺伝子エレメントを含有することができる。フレーズ「機能的に位置する」、「機能的に連結される」、「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に対して正しい機能的位置および/または向きにあって、その配列の転写開始および/または発現を制御することを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス-作用性調節配列という「エンハンサー」と組み合わせて用いても用いなくてもよい。
【０１７６】
対象におけるいずれかの細胞において、細胞中で活性である当業者に公知の任意のプロモーターを、本発明の方法および組成物において適用することができるプロモーターと考えられる。他の箇所で議論したように、対象は、ヒト、およびマウスまたは実験室動物のようなもう1つの哺乳動物を含めた任意の対象であり得る。当業者であれば、本発明の方法および組成物において適用することができる多数のタイプのプロモーターに精通している。ある態様において、例えば、プロモーターは構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または抑制性プロモーターである。プロモーターは組織選択的プロモーターでもあり得る。組織選択的プロモーターは、他の細胞型と比較してある組織タイプにおいて比較的より活性な任意のプロモーターを指すように本明細書において定義される。従って、例えば、肝臓特異的プロモーターは、身体中の他の組織と比較して、肝臓においてより活性なプロモーターである。組織-選択的プロモーターの1つのタイプは腫瘍選択的プロモーターである。腫瘍選択的プロモーターは、他の組織タイプと比較して、腫瘍組織においてより活性なプロモーターを指すと本明細書において定義される。他の組織タイプにおいていくつかの機能があり得るが、プロモーターは、他の組織タイプと比較して腫瘍組織において比較的より活性である。腫瘍組織的プロモーターの例はhTERTプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、プロバシンプロモーター、ARR2PBプロモーター、およびAFPプロモーターを含む。
【０１７７】
プロモーターは、特定の標的細胞において活性であるものであり得る。例えば、標的細胞がケラチノサイトである場合、プロモーターは、ケラチノサイトにおいて活性を有するものである。同様に、細胞が上皮細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、またはパピローマウイルスによる形質転換を受けることができるいずれかの他の細胞である場合、態様で用いるプロモーターは、その特定の細胞型において活性を有するものである。
【０１７８】
プロモーターは、コーディングセグメントおよび/またはエクソンの上流に位置する5'-非コーディング配列を単離することによって得ることができるように、遺伝子または配列に天然で会合したものであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」を指すことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流いずれかに位置した、核酸配列に天然で会合したものであり得る。または、コーディング核酸セグメントを、その天然環境において核酸配列と通常は会合しないプロモーターを指す、組換えまたは異種プロモーターの制御下にコーディング核酸セグメントを位置させることによってある種の利点が獲得される。組換えまたは異種エンハンサーとは、その天然環境において核酸配列と通常は会合しないエンハンサーも指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、いずれかの他の原核生物、ウイルス、または真核生物細胞から単離されたプロモーターおよびエンハンサーおよび「非天然の」、すなわち、異なる転写調節領域、および/または発現を改変する突然変異の異なるエレメントを含有するプロモーターまたはエンハンサーを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生産することに加え、配列は、本明細書において開示された組成物との関連で、PCR(商標)を含めた、組換えクローニングおよび/または核酸増幅技術を用いて生産することができる(各々を参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,202号および米国特許第5,928,906号参照)。さらに、ミトコンドリア等のような非核オルガネラ内の配列の転写および/または発現を指令する制御配列を同様に使用できると考えられる。
【０１７９】
天然では、発現のために選択された細胞型オルガネラおよび生物におけるDNAセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび/またはエンハンサーを使用するのは重要である。分子生物学の分野における当業者は、一般には、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用を知っている。例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al.(2001)参照。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および/またはペプチドの大規模な生産で有利なように、導入されたDNAセグメントの高レベルの発現を指令するための適切な条件下で構成的、組織特異的誘導性および/または有用である。プロモーターは異種または内因性であってよい。
【０１８０】
それが、標的化細胞においてポリヌクレオチドを十分なレベルで発現することができる限り、対象となる核酸の発現を制御するのに使用される特定のプロモーターは臨界的であると考えられない。従って、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において発現させることができるプロモーターに隣接して、かつプロモーターの制御下にポリヌクレオチドコーディング領域を置くのが好ましい。一般的に述べれば、そのようなプロモーターはヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含む。
【０１８１】
種々の態様において、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)即時型遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピートを用いることができる。ポリヌクレオチドの発現を達成することが当技術分野において周知の他のウイルスまたは哺乳動物細胞もしくは細菌ファージプロモーターの使用が同様に考えられ、但し、発現のレベルは成長阻害効果を生じさせるのに十分なものとする。
【０１８２】
周知の特性を持つプロモーターを使用することによって、トランスフェクション後のポリヌクレオチドの発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。例えば、チロシン(メラノーマ)、アルファ-フェトプロテインおよびアルブミン(肝臓腫瘍)、CC10(肺腫瘍)、および前立腺特異的抗原(前立腺腫瘍)のような、特異的細胞において活性であるプロモーターの選択は、本明細書において記載の治療核酸の組織特異的発現を可能とする。表2は、本発明の関係で、抗癌遺伝子の発現を調節するのに使用できるプロモ-ター/エレメントのさらなる例をリストする。このリストは、全ての可能なプロモーターおよびエンハンサーエレメントを尽くすものと意図されず、単に、その例示であることを意図する。
【０１８３】
（表２）
2008528508.tif 000003
2008528508.tif 000004
【０１８４】
エンハンサーは、DNAの同一分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増大させた遺伝子エレメントとして元来は検出された。かなりの距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的な研究において前例はなかった。引き続いての業績は、エンハンサー活性を持つDNAの領域はかなりプロモーターと同様に組織されることを示した。すなわち、それらは、その各々が一つまたは複数の転写タンパク質に結合する多くの個々のエレメントから構成される。
【０１８５】
エンハンサーおよびプロモーターの間の基本的な区別は操作的である。エンハンサー領域は、全体として、ある距離において転写を刺激することができるものでなければならず；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントでは必ずしも当てはまらない。他方、プロモーターは、特定の部位において、かつ特定の向きでRNA合成の開始を指令する一つまたは複数のエレメントを有さなければならず、他方、エンハンサーはこれらの特異性を欠如する。プロモーターおよびエンハンサーはしばしば重複し、かつ連続的であり、しばしば、非常に同様のモジュラー組織を有するように見える。
【０１８６】
加えて、任意のプロモーター/エンハンサー組合せ(それ自体、真核生物プロモーターデータベースEPDB)を用いて、診断または治療遺伝子の発現を駆動することもできる。T3、T7、またはSP6細胞質発現系の使用はもう1つの可能な態様である。真核生物は、適当なバクテリオファージポリメラーゼが提供されたならば、送達複合体の一部として、またはさらなる発現ベクターとして、あるバクテリオファージプロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【０１８７】
特異的生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターのさらなる選択は、構築体の誘導可能な発現を可能とすることができる。例えば、ヒトPAI-1プロモーターの制御下にあるポリヌクレオチドでもって、発現は腫瘍壊死因子によって誘導可能である。表3は特異的刺激に応答して活性化することができる核酸配列の領域である誘導性エレメントの例を提供する。
【０１８８】
（表３）
2008528508.tif 000005
【０１８９】
3.レポーター遺伝子
本発明のある態様において、発現カセットの送達は、発現ベクターにレポーター遺伝子を含めることによってインビトロまたはインビボで同定することができる。レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた細胞に対して同定可能な変化をもたらし、発現の容易な同定を可能とする。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択を助ける。または、β-ガラクトシダーゼ(β-gal)単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(tk)(真核生物)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)(原核生物)のような酵素を使用することができる。蛍光およびケミルミネセントマーカーが同様に考えられる。免疫学的マーカーを使用することもできる。治療核酸と共にそれが発現され得る限り、使用される選択可能なレポーター遺伝子は重要であると考えられる。選択可能なレポーター遺伝子のさらなる例は当業者に周知である。
【０１９０】
4.開始シグナル
コーディング配列の効果的な翻訳のために、特異的開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルはATG開始コドンまたは隣接配列を含む。ATG開始コドンを含めた外因性翻訳制御シグナルを提供する必要があろう。当業者であれば、容易にこれを決定でき、必要なシグナルを提供することができよう。開始コドンは所望のコーディング配列のリーディングフレームに対して「枠内」であって、全インサートの翻訳を確実としなければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然または合成いずれかであり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメントを含めることによって増強することができる。
【０１９１】
5.IRES
本発明のある態様において、内部リボソーム進入部位(IRES)エレメントの使用を用いて、多重遺伝子、またはポリシストロニックメッセージを作成する。IRESエレメントは、5'メチル化Cap依存性翻訳のリボソームスキャンニングモデルを迂回し、内部部位における翻訳を開始することができる(Pelletier and Sonenberg,1988)。ピコルナウイルス科(ポリオおよび脳心筋炎)の2つのメンバーからのIRESエレメントが記載されており(Pelletier and Sonenberg,1988)、並びに哺乳動物メッセージからのIRESが記載されている(Macejak and Sarnow,1991)。IRESエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結することができる。多数のオープンリーディングフレームを、各々IRESによって隔てて、一緒に転写し、ポリシストロニックメッセージを作成することができる。IRESエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効果的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。多数の遺伝子が単一プロモーター/エンハンサーを用いて効果的に発現されて、単一メッセージを転写することができる(米国特許第5,925,565号および第5,935,819号参照)。当業者であれば、遺伝子治療におけるIRESの適用に精通している。
【０１９２】
6.多数のクローニング部位
発現カセットは、そのいずれもベクターを消化するために標準的な組換え技術と組み合わせて用いることができる、多数の制限酵素部位を含有する核酸領域である多数クローニング部位(MCS)を含むことができる。Carbonelli et al.(1999)；Levenson et al.(1998)；Cocea(1997)参照。「制限酵素消化」とは、核酸分子中の特異的位置においてのみ機能する酵素での核酸分子の接触切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。そのような酵素の使用は当業者によって広く理解されている。頻繁に、MCS内で切断して、外因性配列がベクターに連結されるのを可能とする制限酵素を用いてベクターは線状化または断片化される。「連結」とは、相互に連続的であってもなくてもよい、2つの核酸断片の間でホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素および連結反応を含む技術は組換え技術の分野における当業者に周知である。
【０１９３】
ほとんどの転写された真核生物RNA分子は、初代転写体からイントロンを除去するためのRNAスプライシングを受ける。ゲノム真核生物配列を含有するベクターは、タンパク質発現用の転写体の適切なプロセッシングを確実とするためにドナーおよび/またはアクセプタースプライシング部位を必要とする(Chandler et al.,1997)。
【０１９４】
7.ポリアデニル化シグナル
発現において、典型的には、転写体の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含める。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施に対して臨界的であるとは考えられず、および/またはいずれかのそのような配列を使用することができる。好ましい態様は、便宜であり、および/または種々の標的細胞において同様に機能することが公知の、SV40ポリアデニル化シグナルおよび/またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。また、発現カセットのエレメントとして考えられるのは転写終止部位である。これらのエレメントが、メッセージレべルを増強させ、および/またはカセットからの他の配列へのリードスルーを最小化するように働くことができる。
【０１９５】
8.他の発現カセットの成分
本発明のある態様において、発現カセットはウイルス、またはウイルスゲノムに由来する作成された構築体を含む。受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に進入し、ある場合には、宿主細胞染色体に組み込まれるある種のウイルスの能力は、それらを、哺乳動物細胞への遺伝子導入用の魅力的な候補とした。しかしながら、裸のDNAの直接的摂取、並びにDNAの受容体媒介摂取は複合化することが示されているので、発現ベクターはウイルスである必要なく、その代わり、pUCまたはBluescript(商標)プラスミドシリーズのような、哺乳動物細胞においてコードされた遺伝子の発現を支持することができる任意のプラスミド、コスミドまたはファージ構築体であってもよい。
【０１９６】
ベクターを宿主細胞において増殖させるためには、それは、複製がそこで開始する特異的核酸配列である一つまたは複数の複製起点部位(しばしば、「ori」と呼ばれる)を含有することができる。または、宿主細胞が酵母であれば、自律複製配列(ARS)を使用することができる。
【０１９７】
本発明のある態様においては、処理された細胞は、発現ベクターにレポーター遺伝子を含めることによって、インビトロまたはインビボを同定することができる。そのようなレポーター遺伝子は、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能とする。一般には、選択レポーターは、選択を可能とする特性を付与するものである。陽性選択レポーターは、レポーター遺伝子の存在がその選択を可能とするものであり、他方、陰性選択レポーターは、その存在がその選択を妨げるものである。陽性選択マーカーの例は薬物抵抗性マーカーである。
【０１９８】
通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび同定を助け、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する抵抗性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の区別を可能とする表現型を付与するマーカーに加えて、GFPまたはルシフェラーゼのようなスクリーニング可能なレポーターを含めた他のタイプのレポーターも考えられる。または、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ(tk)またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)のようなスクリーニング可能な酵素を利用することができる。また、当業者であれば、どのようにして、恐らくはFACS分析と組み合わせて、免疫学的レポーターを使用するかも知っている。用いるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できる限り、重要であるとは考えられない。選択可能およびスクリーニング可能レポーターのさらなる例は当業者に周知である。
【０１９９】
本発明のある態様において、レポーター遺伝子は、GFPのようなレポーター遺伝子産物が考えられる組織タイプの細胞においてのみ発現されるように、組織特異的プロモーターに機能的に連結されると考えられる。例えば、gfpレポーター遺伝子は、複製選択的アデノウイルスベクター内でhTERTプロモーターに機能的に連結でき、それにより、テロメラーゼ特異的GFP発現でもって過剰増殖性病巣を検出する(Umeoka et al.,2004)。
【０２００】
C.ウイルスベクター
ウイルスベクターは、対象となる標的細胞への適用点からのように、1つの位置からもう1つの位置へ遺伝子物質を移動することができるウイルスである。本発明のある態様において、本明細書において記載の組成物の核酸は、脂質またはリポソームのような、ウイルスベクターまたは送達剤には含まれない「裸の」核酸配列である。しかしながら、本発明の他の態様において、核酸はウイルスベクターに含まれる。当業者であれば、対象となる標的細胞への遺伝子送達のためのベクターとして用いるのに入手可能な種々のタイプのウイルスに精通している。これらの各々は、本発明におけるベクターとして考えられる。例示的なベクターを以下に議論する。
【０２０１】
1.ウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、(a)治療核酸配列を含む発現カセットのパッキングを支持し、(b)最終的にはそこにクローン化された組換え遺伝子構築体を発現するのに十分なウイルス配列を含有する構築体を含むことを意味する。
【０２０２】
a.アデノウイルスベクター
本発明の薬学的組成物および方法は、核酸の送達用のアデノウイルスベクターに含まれる治療核酸の発現構築体を含むことができる。アデノウイルスベクターはゲノムDNAへの取込みのための低い容量を有することが公知であるが、この特徴は、これらのベクターによって提供される遺伝子導入の高い効率によって均衡される。
【０２０３】
アデノウイルスは、現在、臨床状況において遺伝子導入のために最も普通に用いられるベクターである。これらのウイルスの利点の中には、それらが、双方の非分裂性分裂細胞への遺伝子送達において効果的であり、大量に生産することができることがある。癌用の臨床試験の多くにおいて、局所的腫瘍内注射が、病気の部位へベクターを導入するのに用いられてきた。なぜならば、現行のベクターは腫瘍への優先的送達に対するメカニズムを有しないからである。インビトロ実験は、アデノウイルスベクターの投与が、系統的に、口腔粘膜での発現をもたらしたことを示した(Clayman et al.,1995)。オルガノタイプいかだ培養へのAd-βgalおよびAd-p53-FLAGの局所適用は、効率的な遺伝子形質導入および複数細胞層を介する深い細胞層進入を示した(Eicher et al.,1996)。従って、アデノウイルスベクターを用いる遺伝子導入戦略は、p53における遺伝的改変を含む病巣および悪性疾患に対して危険な患者で潜在的に使用できる。
【０２０４】
ベクターは、アデノウイルスの遺伝子工学により作成された形態を含む。遺伝子組織化またはアデノウイルス、36kbの線状二本鎖DNAウイルスの知識が、7kbまでの外来性配列でのアデノウイルスDNAの大きなピースの置換を可能とする(Grunhaus and Horwitz,1992)。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体の一体化をもたらさない。なぜならば、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝子毒性なしでエピソーマ様に複製できるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であって、遺伝子再編成はかなりの増幅の後に検出されていない。
【０２０５】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的−細胞範囲、および高い感染性のため、遺伝子導入ベクターとして用いるのに特に適している。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスDNA複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである、100〜200塩基対インバーテッドリピート(ITR)を含有する。ゲノムの初期(E)および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分けられる異なる転写ユニットを含有する。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)の発現の結果、ウイルスDNA複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質はDNA複製、後期遺伝子発現および宿主細胞のシャット-オフに関与する(Renan,1990)。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含めた、後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター(MLP)によって発行される単一の初代転写体の有意なプロセッシングの後にのみ発現される。MLP(16.8m.u．に位置する)は感染の後期相の間に特に有効であり、このプロモーターから発行された全てのmRNAは、それらを翻訳のための好ましいmRNAとする5'-三部リーダー(TPL)配列を保有する。
【０２０６】
現在の系において、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターおよびプロウイルスベクターの間の相同組換えから作製される。2つのプロウイルスベクターの間の可能な組換えのため、野生型アデノウイルスはこの過程から作製することができる。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調べるのは臨界的である。
【０２０７】
複製が欠乏する現行のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胚腎臓細胞から形質転換され、公正的にE1タンパク質を発現する293と命名されたユニークなヘルパー細胞株に依存する(Graham et al.,1977)。E3領域はアデノウイルスゲノムには必ずしも必要ないので(Jones and Shenk,1978)、293細胞の助けを借りて、現行のアデノウイルスベクターはE1、D3または双方の領域いずれかにおいて外来性DNAを保持することができる(Graham and Prevec,1991)。元来、アデノウイルスは野生型ゲノムのほぼ105％をパッケージすることができ(Ghosh-Choudhury et al.,1987)、約2過剰kbのDNAに対するキャパシティーを提供する。E1およびE3領域において置換可能なほぼ5.5kbのDNAと組み合わせ、現行のアデノウイルスベクターの最大キャパシティーは7.5kb未満、またはベクターの合計長さの約15％未満である。80％を超えるアデノウイルスのウイルスゲノムはベクターの骨格に残る。
【０２０８】
ヘルパー細胞株はヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞、または他のヒト胚間葉または上皮細胞のようなヒト細胞に由来することができる。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに対して許容される他の哺乳動物の種の細胞に由来することができる。そのような細胞は、例えば、Vero細胞、または他のサル胚間葉または上皮細胞を含む。前記のように、好ましいヘルパー細胞株は293である。
【０２０９】
Racher et al.(1995)は、293細胞を培養し、アデノウイルスを増殖するための改良された方法を開示している。1つの様式において、天然細胞凝集体は、個々の細胞を100〜200mlの培地を含有する1リットルのシリコン処理スピナーフラスコ(Techne,Cambrigde,UK)に接種することによって増殖される。40rpmで攪拌したのち、細胞の生存率をトリパンブルーで見積もる。もう1つの様式において、Fibra−Celマイクロキャリアー(Bibby Sterlin,Stone,UK)(5g/l)は以下のように用いられる。5mlの培地に再懸濁させた細胞接種物を、250mlのエルレンマイヤーフラスコ中の担体(50ml)に加え、時々は攪拌しつつ、1〜4時間放置する。次いで、培地を50mlの新鮮な培地で置換え、振盪を開始する。ウイルスの生産のために、細胞を約80％密集まで増殖し、その時点の後に、培地を(25％の最終容量まで)置換え、アデノウイルスを0.05のMOIで加える。培養物を一晩放置し、それに続いて、容量を100％まで増大させ、振盪をさらに72時間開始する。
【０２１０】
アデノウイルスベクターは複製に欠陥があり、または少なくとも条件によっては欠陥があり、アデノウイルスベクターの性質は本発明の成功した実施に対しては非常に重要とは考えられない。アデノウイルスは42の異なる公知の血清型またはサブ群A〜Fのいずれがあってもよい。サブ群Cのアデノウイルス5型は、本発明で用いる条件複製-欠陥アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発物質である。これは、アデノウイルス5型がそれについて多大な生化学および遺伝子情報が公知のヒトアデノウイルスであり、それは、歴史的には、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築で用いられてきた。
【０２１１】
前記のように、本発明による典型的なベクターは複製欠陥であり、アデノウイルスE1領域を有しない。従って、E1-コーディング配列がそれから除去された位置において形質転換構築体を導入するのが最も便利である。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築体の挿入の位置は本発明にとって臨界的ではない。対象となる遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、欠失されたE3の領域の代わりにKarlsson et al.(1986)によって記載されたE3置換ベクターに、またはヘルパー細胞株またはヘルパーウィルスがE4欠陥を補うE4領域に挿入することもできる。
【０２１２】
アデノウイルスの増殖および操作は当業者に公知であり、インビトロおよびインビボにて広い宿主範囲を呈する。ウイルスのこの群は高い力価、例えば、mlあたり109〜1011プラーク-形成単位で得ることができ、それらはかなり感染性である。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組込みは必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来性遺伝子はエピソーマルであり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究においては副作用は報告されておらず(Couch et al.,1963；Top et al.,1971)、インビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療的能力を示す。
【０２１３】
アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現(Levrero et al.,1991；Gomez-Foix et al.,1992)およびワクチン開発(Grunhaus and Horwitz,1992；Graham and Prevec,1992)で用いられてきた。動物実験は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療で用いることができると示唆している(Stratford-Perricaudet and Perricaudet,1991；Stratford-Perricaudet et al., 1990；Rich et al.,1993)。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与することにおける研究は、気管点滴注入(Rosenfeld et al.,1991；Rosenfeld et al.,1992)筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈内注射(Herz and Gerard,1993)および脳への定位接種(Le Gal La Salle et al.,1993)を含む。
【０２１４】
b.レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、逆-転写のプロセスによって感染した細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin,1990)。次いで、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。組込みの結果、受容体細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が滞留する。レトロウイルスゲノムは、各々、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする3つの遺伝子、gag、polおよびenvを含有する。gag遺伝子から上流で見出された配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。2つのロングターミナルリピート(LTR)配列は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムでの組込みにやはり必要である(Coffin,1990)。
【０２１５】
レトロウイルスベクターを構築するためには、対象となる遺伝子をコードする核酸をある種のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製-欠陥であるウイルスを得る。ビリオンを生じさせるためには、gag、polおよびenv遺伝子を含有するが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する(Mann et al.,1983)。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にcDNAを含有する組換えプラスミドを(例えば、リン酸カルシウム沈殿によって)この細胞株に導入すると、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写体がウイルス粒子にパッケージングされるようにし、次いで、これは培養基に分泌される(Nicolas and Rubenstein,1988；Temin,1986；Mann et al.,1983)。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、任意で濃縮し、遺伝子導入で用いる。レトロウイルスベクターは広く種々の細胞型に感染することができる。しかしながら、組込みおよび安定な発現は宿主細胞の分裂を必要とする(Paskind et al.,1975)。
【０２１６】
欠陥レトロウイルスベクターの使用での関心は、パッケージング細胞における野生型複製-コンピテントウイルスの潜在的出現である。これは、組換えウイルスからの無傷配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれたgag、pol、env配列から上流に挿入される組換え事象に由来し得る。しかしながら、細胞株のパッケージングは利用可能であり、これは組換えの尤度を大いに減少させるはずである(Markowitz et al.,1988；Hersdorffer et al.,1990)。
【０２１７】
c.AAVベクター
アデノ関連ウイルス(AAV)は本発明で用いられる魅力的なベクター系である。それは組込みの高い頻度を有し、非分裂細胞に感染できるからであり、従って、それを組織培養中の哺乳動物細胞への遺伝子への送達で有用とする(Muzyczka,1992)。AAVは感染性に対して広い宿主範囲を有し(Tratschin et al.,1984；Laughlin et al.,1986；Lebkowski et al.,1988；Mclaughlin et al.,1988)、これは、それが本発明での使用で適応できることを意味する。rAAVベクターの作製および使用に関する詳細は、各々を本明細書に組み入れる、米国特許第5,139,941号および米国特許第4,797,368号に記載されている。
【０２１８】
遺伝子送達におけるAAVの使用を示す研究は、LaFace et al.(1988)；Zhou et al.(1993)；Fotte et al.(1993)；およびWalsh et al.(1994)を含む。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子(Kaplitt et al.,1994；Lebkowski et al.,1988；Samulski et al.,1989；Shelling and Smith,1994；Yoder et al.,1994；Zhou et al.,1994；Hermonat and Muzyczka,1984；Tratschin et al.,1985；McLaughlin et al.,1988)およびヒトの病気に関与する遺伝子(Flotte et al.,1992；Ohi et al.,1990；Walsh et al.,1994；Wei et al.,1994)のインビトロおよびインビボ形質導入で首尾よく用いられてきた。最近、AAVベクターは嚢胞性線維症の治療のためのI相ヒト実験で認可されている。
【０２１９】
AAVは、培養された細胞における生産的感染を受けるのにもう1つのウイルス(アデノウイルス、またはヘルペスウイルス科のメンバーいずれか)との共感染を必要とする依存的パルボウイルスである(Muzyczka,1992)。ヘルパーウイルスとの共感染が存在しないと、野生型AAVゲノムはヒト染色体19へその末端を介して組み込まれ、そこで、それはプロウイルスとして潜伏的状態で存在する(Kotin et al.,1990；Samulski et al.,1991)。しかしながら、AAV Repタンパク質もまた発現されるのでなければ、rAAVは組込みにつき染色体19に制限されない(Shelling and Smith,1994)。AAVプロウイルスを保持する細胞がヘルパーウイルスで過剰感染されると、AAVゲノムは染色体から、または組換えプラスミドから「救済」され、正常な生産性感染が確立される(Samulski et al.,1989；McLaughlin et al.,1988；Kotin et al.,1990；Muzyczka,1992)。
【０２２０】
典型的には、組換えAAV(rAAV)ウイルスは、2つのAAVターミナルリピートが近接する対象となる遺伝子を含有するプラスミド(各々を本明細書に組み入れる、McLaughlin et al.,1988；Samulski et al.,1989)、およびターミナルリピートを含まない野生型AAVコーディング配列を含有する発現プラスミド、例えば、pIM45(参照により本明細書に組み入れられるMcCarty et al.,1991)を共トランスペクトすることによって作製される。細胞は、アデノウイルス、またはAAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保持するプラスミドでも感染されまたはトランスフェクトされる。そのようにして作製されたrAAVウイルスストックは、(例えば、塩化セシウム密度遠心によって)rAAV粒子から物理的に分離されなければならないアデノウイルスで汚染される。または、AAVコーディング領域を含有するアデノウイルスベクター、またはAAVコーディング領域、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつかまたは全てを含有する細胞株を用いることができる(Yang et al.,1994；Clark et al.,1995)。組み込まれたプロウイルスとしてのrAAV DNAを保持する細胞株も用いることができる(Flotte and Carter,1995)。
【０２２１】
d.ヘルペスウイルスベクター
単純疱疹ウイルス(HSV)は、ニューロン細胞に対するその向性のため神経系障害を治療するにおいてかなりの興味を生じさせたが、このベクターの、その広い宿主範囲を仮定して他の組織のために開発することができる。HSVを魅力的なベクターとするもう1つの因子は、ゲノムのサイズおよび組織化である。HSVは大きいので、複数遺伝子または発現カセットの取り込みは、他のより小さなウイルス系におけるよりも問題は少ない。加えて、種々の性能(一時的、強度など)を持つ異なるウイルス制御配列の利用性は、それを、他の系におけるよりも高度に発現を制御するのを可能とする。ウイルスが比較的少数のスプライスされたメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易とするのも利点である。
【０２２２】
HSVもまた操作するのが比較的容易であり、高力価まで増殖させることができる。従って、送達は、十分なMOIを獲得するのに必要な容量、および反復投与に対するより小さな必要性の双方の点で問題はより少ない。遺伝子治療ベクターとしてのHSVのレビューについては、Glorioso et al. 1995参照。
【０２２３】
サブタイプ1および2で命名されるHSVは、世界中で何百万人ものヒト対象に感染する、ヒトが遭遇する最も普通の感染剤の中にあるエンベロープを持つウイルスである。大きくて複雑な二本鎖DNAゲノムは、そのいくつかはスプライスされた転写体に由来する、数ダースの異なる遺伝子産物をコードする。ビリオンおよびエンベロープ構造成分に加えて、ウイルスは、プロテアーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、DNAポリメラーゼ、ssDNA結合タンパク質、ヘリカーゼ/プリマーゼ、DNA依存性ATPase、dUTPaseおよびその他を含めた多数の他のタンパク質をコードする。
【０２２４】
HSV遺伝子は、その発現がカスケード様式で共調的に調節され、順次の順番であるいくつかの群を形成する(Honess and Roizman,1974；Honess and Roizman 1975)。感染後に発現される遺伝子の最初の組であるα遺伝子の発現は、ビリオンタンパク質番号16、またはα-トランス誘導因子によって増強される(Post et al.,1981；Batterson and Roizman,1983)。β遺伝子の発現は、α4遺伝子によってコードされる、機能的α遺伝子産物、最も顕著にはICP4を必要とする(DeLuca et al.,1985)。γ遺伝子、ビリオン構造タンパク質を大いにコードする遺伝子の不均一群は、最適な発現のためにウイルスDNA合成の開始を必要とする(Holland et al.,1980)。
【０２２５】
ゲノムの複雑性の関係で、HSVのライフサイクルはかなり関連する。ウイルス粒子の合成および、結局は、細胞死滅をもたらす溶解サイクルに加えて、ウイルスは、まだ規定されていないシグナルのいくつかが溶解サイクルの再開をトリガーするまで、ゲノムが神経節に維持される潜伏的状態に入る能力を有する。HSVの毒性変種は開発されており、遺伝子治療に関して用いるのに容易に入手可能である(米国特許第5,672,344号)。
【０２２６】
e.ワクシニアウイルスベクター
ワクシニアウイルスベクターは、それらの構築の容易性、得られた発現の比較的高いレベル、広い宿主範囲、およびDNAを保持するための大きなキャパシティーのため、広く用いられてきた。ワクシニアは、顕著な「A-T」優先性を呈する約186kbの線状二本鎖DNAゲノムを含有する。約10.5kbのインバーテッドターミナルリピートは、ゲノムに近接する。必須遺伝子の大部分は、ポックスウイルスの間で最も高度に保存された中央領域内をマップするように見える。150〜200のワクシニアウイルス番号におけるオープンリーディングフレームが見積もられる。双方のストランドはコーディングするが、リーディングフレームのかなりの重複は普通ではない。
【０２２７】
少なくとも25kbをワクシニアウイルスゲノムに挿入することができる(Smith and Moss,1983)。プロトタイプワクシニアベクターは、相同組換えを介してウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に挿入された導入遺伝子を含有する。ベクターはtk-表現型に基づいて選択される。脳心筋炎ウイルスの非翻訳リーダー配列を含めると、発現のレベルは慣用的ベクターのそれよりも高く、導入遺伝子は24時間以内に感染した細胞タンパク質の10％以上に蓄積する(Elroy-Stein et al.,1989)。
【０２２８】
f.腫瘍退縮ウイルスベクター
腫瘍退縮ウイルスもまた本発明におけるベクターとして考えられる。腫瘍退縮ウイルスは、それらが正常な細胞を殺すよりもしばしば腫瘍または癌細胞を殺すウイルスを一般的に指すように本明細書において定義される。例示的な腫瘍退縮ウイルスはADPを過剰発現するアデノウイルスを含む。これらのウイルスは、その各々を具体的に参照によりその全体を出願の本セクションおよび出願の全ての他のセクションに組み入れる、米国特許出願公開第20040213764号、米国特許出願公開第20020028785号、および米国特許出願第09/351,778号に詳細に議論されている。例示的な腫瘍退縮ウイルスは本明細書において他の箇所で議論する。当業者であれば、本発明の薬学的組成物および方法において適応することができる他の腫瘍退縮ウイルスに精通している。
【０２２９】
g.他のウイルスベクター
本発明においてベクターとして使用できる他のウイルスベクターは、ワクチン、またはデュアルワクチンおよび免疫療法適用において適用することができるウイルスベクターを含む。ウイルスベクター、およびウイルスベクターを用いるワクチン接種および免疫療法のための技術は、その各々を具体的に参照によりその全体を出願の本セクションおよび本出願の全ての他のセクションに組み入れる、PCT出願WO 0333029、WO 0208436、WO 0231168およびWO 0285287においてより詳細に記載されている。ワクチン接種およびデュアル免疫療法/ワクチン接種のための技術において適用することができるさらなるベクターは、前記の腫瘍退縮ウイルスを含む。
【０２３０】
他のウイルスベクターはバキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、アルファウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターも含む。ポックスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを使用することができる。ベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルスの分子的にクローン化された株は、異種ウィルスタンパク質の発現のための複製成分ワクチンベクターとして遺伝子的には制限されている(Davis et al.,1996)。研究は、VEE感染が優れたCTL応答を刺激することを示しており、VEEは免疫化のための極端に有用なベクターであり得ることを示唆している(Caley et al.,1997)。本発明においては、VEEウイルスは樹状細胞を標的化するのに有用であると考えられる。
【０２３１】
欠陥B型肝炎ウイルスの最近の認識では、新しい洞察は、異なるウィルス配列の構造-機能関係につきなされている。インビトロ研究は、ウイルスが、そのゲノムの80％までの欠失にも拘らず、ウイルスはヘルパー-依存性パッケージングおよび逆転写についての能力を保有でき得ることを示した(Horwich et al.,1990)。これは、ゲノムの大きな部分が外来性遺伝子物質で置換え得ることができることを示唆さいた。Chang et al.は、最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を、ポリメラーゼ、表面およびプレ-表面コーディング配列の代わりにカモB型肝炎ウイルスゲノムに導入した。それは野生型ウイルスと共に鳥類肝癌細胞株へ共トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含有する培養基を用いて、初代子カモ肝細胞を感染させた。安定なCAT遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも24日間検出された(Chang et al.,1991)。
【０２３２】
本発明の組成物および方法における適用のための他のウイルスベクターは、ここに具体的に参照によりその全体を出願の本セクションおよび出願の全ての他のセクションに組み入れる、Tang et al.,2004に記載されたベクターを含む。
【０２３３】
i.修飾されたウイルスを用いる遺伝子送達
診断または治療核酸は、特異的結合リガンドを発現するように作製されているウイルスベクター内に収容することができる。ウイルス粒子は、従って、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能とするように設計された新規のアプローチが、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的付加によってレトロウイルスの化学的修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介する肝細胞の特異的感染を可能とすることができる。
【０２３４】
組換えレトロウイルスの標的化に対するもう1つのアプローチが設計され、そこでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対する、および特異的細胞受容体に対するビオチニル化抗体が用いられた。抗体はストレプトアビジンを用いることによってビオチン成分を介してカップリングされた(Roux et al.,1989)。主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を用い、それらは、インビトロで異所性ウイルスでのそれらの表面抗原を担う種々のヒト細胞の感染を示した(Roux et al,1989)。
【０２３５】
D.送達剤
本発明のある態様において、アミノ酸配列をコードする核酸はさらに送達剤を含むことができる。送達剤は、対象となる標的細胞への核酸の送達を容易とする、ウイルスベクター以外の任意の薬剤または物質を指すように本明細書において定義される。例示的な送達剤は、リポソームを含めた、脂質および脂質製剤を含む。ある態様において、脂質はナノ粒子に含まれる。ナノ粒子はサブミクロン粒子として本明細書において定義される。例えば、ナノ粒子は約1〜約500ナノメートルの直径を有することができる。粒子はいずれかの物質または化合物から構成できる。本発明の関係では、例えば、「ナノ粒子」は、約1〜約500ナノメートルの直径を有するある種のリポソームを含むことができる。
【０２３６】
当業者であれば、核酸配列を捕獲するためのリポソームまたは脂質製剤の使用に精通している。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラーリポソームは水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水性溶液中に懸濁させた場合に自然に形成される。脂質成分は閉じた構造の形成前に自己再編成を受け、水および溶解した溶質を脂質二層の間に捕獲する(Ghosh and Bachhawat,1991)。
【０２３７】
脂質媒介核酸送達、およびインビトロでの外来性DNAの発現は非常に成功している(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987)。Wong et al.(1980)は、脂質媒介送達、および培養されたヒヨコ胚、HeLaおよび肝癌細胞における外来性DNAの発現の可能性を示した。
【０２３８】
脂質ベースの非ウイルス製剤は、アデノウイルス遺伝子治療に対する代替法を提供する。多くの細胞培養研究が脂質ベースの非ウイルス遺伝子導入を記載してきたが、脂質ベースの製剤を介する系統的遺伝子送達は制限されない。非ウイルス脂質ベースの遺伝子送達の主な制限は、非ウイルス送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボ毒性は、インビトロおよびインビボ遺伝子導入の結果の間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータに寄与するもう1つの因子は、血清タンパク質の存在下および非存在下におけるリポソーム安定性の差である。リポソームおよび血清タンパク質の間の相互作用は、リポソームの安定性特徴に対して劇的なインパクトを有する(Yang and Huang,1997)。カチオン性リポソームは負に荷電した血清タンパク質を引きつけ、それに結合する。血清タンパク質によってコートされたリポソームは溶解され、またはマクロファージによって捕獲され、循環からのそれらの除去に至る。現在のインビボリポソーム送達方法は皮下、皮内、腫瘍内、または頭蓋内注射を用いて、循環におけるカチオン性脂質に関連する毒性および安定性の問題を回避する。リポソームおよび血漿タンパク質の相互作用は、インビトロでの効率(Felgner et al.,1987)およびインビボ遺伝子導入(Zhu et al.,1993；Solodin et al.,1995；Liu et al.,1995；Thierry et al.,1995；Tsukamoto et al.,1995；Aksentijevich et al.,1996)の間の不一致の原因である。
【０２３９】
リポソーム製剤における最近の進歩は、インビボでの遺伝子導入の効率を改良した(WO 98/07408)。1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)およびコレステロールの等モル比から構成される新規のリポソーム製剤は、系統的インビボ遺伝子導入を有意にほぼ150倍増強させる。DOTAP：コレステロール脂質製剤は、「サンドイッチリポソーム」と言われるユニークな構造を形成するといわれている。この製剤は、収容された二層または「花瓶」構造の間のDNAを「サンドイッチ」すると報告されている。これらのリポソームの有利な特徴は正のρ、コレステロールによるコロイド安定化、二次元DNAパッキング、および増大した血清安定性を含む。
【０２４０】
脂質製剤の生産は、しばしば、(I)逆相蒸発、(II)脱水再水和、(III)洗剤透析、および(IV)薄いフィルム水和後におけるリポソーム混合物の音波処理または系列的押出によってしばしば達成される。一旦製造されれば、脂質構造を用いて、循環において毒性(化学療法剤)または不安定(核酸)である化合物をカプセル化することができる。リポソームのカプセル化は、そのような化合物のより低い毒性およびより長い血清半減期をもたらした(Gabizon et al.,1990)。多数の病気治療は脂質ベースの遺伝子導入戦略を用いて、過剰増殖病を治療するための特別な療法において、慣用的な療法を増強し、または新規の療法を確立する。
【０２４１】
リポソームは、血球凝集性ウイルス(HVJ)と複合体化することができる。これは、細胞膜との融合を容易とし、リポソームカプセル化DNAの細胞進入を促進することが示されている(Kaneda et al.,1989)。他の態様において、リポソームは核非ヒストン染色体タンパク質(HMG-1)と共に複合体化され、または使用することができる(Kato et al.,1991)。なおさらなる態様において、リポソームはHVJおよびHMG-1と共に複合体化され、または使用することができる。
【０２４２】
加えて、当業者であれば、遺伝子送達に適した他のナノ粒子製剤を認識している。その例は、各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Bianco(2004)、Doerr(2005)、およびLang et al.(2005)によって記載されたナノ粒子製剤を含む。
【０２４３】
E.療法
1.定義
「治療核酸」は、病気または健康関連疾患の治療または予防において有益であることが公知の、またはそれが推測される核酸を指すように本明細書において定義される。「治療核酸」の定義内で考えられるのは、病気または健康関連疾患の治療において有益であることが公知の、またはそれが推測されるタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸、並びにリボザイムのようなより直接的な核酸である。治療核酸は、病気または健康関連疾患の治療において有益であることが公知の、またはそれが推測される核酸を転写する核酸でもありえる(例えば、リボザイムを転写する核酸)。
【０２４４】
本出願を通じて用いられる用語「治療」または「療法」は、病気または健康関連疾患に関して対象の幸福を促進し、または増強することが公知の、またはそれが推測される何かを指す。従って、「治療核酸」は、病気または健康関連疾患に関して対象の幸福を促進し、または増強することが公知の、またはそれが推測される核酸である。そのような治療的利点の非限定的例のリストは、いずれかの期間による対象の寿命の延長、または病気の発生の減少または遅延を含む。癌の場合には、治療的利点は、過剰増殖の減少、腫瘍成長の低下、転移の遅延、または転移の数の低下、癌細胞または腫瘍細胞増殖速度の低下、前癌性疾患からの新形成発生の進行の減少または遅延、および対象の疾患に帰すことができる対象に対する痛みの減少を含む。
【０２４５】
「病気」は、感染、遺伝的欠陥、または環境ストレスのようないずれかの原因に由来する体の部分、器官または系の病理学的状態と定義される。
【０２４６】
「健康関連疾患」は、病理学的ではあり得ないが、治療が求められる体部分、器官、または系の疾患を指すように本明細書において定義される。その例は、皮膚皺形成、皮膚きずなどのような化粧的療法が求められる疾患を含む。
【０２４７】
「予防」および「予防する」は、それらの通常のかつ平易な意味に従って用いられ、「前に作用する」またはそのような行為を意味する。特定の病気または健康関連疾患の関係では、それらの用語は、薬剤、薬物または救済の対象への投与または適用、または病気または健康関連疾患の開始をブロックする目的での対象に対する手法または様式の性能を指す。本発明のある態様において、方法は、対象において病気または健康関連疾患を妨げるための治療タンパク質をコードする核酸の送達を含む。病気または健康関連疾患を予防するのに適した薬学的組成物の量は、病気または健康関連疾患の開始をブロックすることが公知の、またはそれが推測される量である。
【０２４８】
本出願を通じて用いられる「診断的」または「診断」とは、病気または健康関連疾患の対象における存在または非存在を同定するにおいて有益であることが公知の、またはそれが推測される何かを指す。また、この定義には、特定の病気または健康関連疾患を発生する危険性がある対象の同定において有益であることが公知の、またはそれが推測される何かが含まれる。従って、診断核酸は、病気または健康関連疾患の存在または非存在を同定するにおいて有益であることが公知のまたはそれが推測される、または特定の病気または健康関連疾患を発生する危険性がある対象を同定するのに有益であることが公知の、またはそれが推測される核酸である。例えば、診断核酸は、検出可能なレポータータンパク質をコードする核酸であってよい。そのようなタンパク質は、例えば、イメージング方法において適用を見出すことができる。
【０２４９】
2.診断、予防または治療すべき病気
本発明では、対象において病気を予防または阻害することができるアミノ酸配列をコードする核酸の投与によって対象において病気を検出し、予防し、阻害し、または治療するための方法が考えられる。前記のように、病気を検出、予防もしくは阻害、または治療する目的で対象に適用または投与することができる任意の核酸配列を、本明細書において記載の薬学的組成物に含めることが考えられる。
【０２５０】
ある態様において、病気は、対象への核酸配列の投与を介して検出、治療または予防に使用できる対象に影響し得る過剰増殖病であり得る。例えば、病気は過剰増殖病であり得る。過剰増殖病は細胞の異常な成長または増殖に関連する病気である。過剰増殖病は対象において病巣として発現する病気であり得る。例示的な過剰増殖病巣は以下の、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺腫、腺癌、形成性胃組織炎、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ビポーマ、胆管癌、肝細胞癌、腺様嚢胞癌、カルチノイド腫瘍、プロラクチノーマ、オンコサイトーマ、ヒュルトレ細胞腺腫、腎臓細胞癌、類子宮内膜腺腫、嚢胞腺腫、腹膜偽粘液腫、ワルチン腫瘍、胸腺腫、莢膜細胞腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、セルトリ-ライディッヒ細胞腫瘍、パラガングリオーマ、クロム親和性細胞腫、グロムス腫瘍、メラノーマ、軟部組織肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、線維腫、線維肉腫、粘液腫、脂肪腫、脂肪肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、多形性腺腫、腎芽細胞腫、ブレンナー腫瘍、滑膜肉腫、中皮腫、未分化胚細胞腫、生殖細胞腫瘍、胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、テラトーマ、類皮嚢腫、絨毛癌、中腎腫、血管腫、アンギオーマ、血管肉腫、アンギオ肉腫、血管内皮腫、血管内皮腫、カポジ肉腫、血管周囲細胞腫、リンパ管腫、嚢胞性リンパ管腫、骨腫、骨肉腫、骨軟骨腫、軟骨性外骨腫、軟骨腫、軟骨腫瘍、巨細胞腫瘍、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍、セメント芽細胞腫、エナメル上皮腫、頭蓋咽頭腫、神経膠腫、混合オリゴアストロサイトーマ、脳室上衣細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、希突起神経膠腫、感覚上皮細胞腫新生物、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄膜腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経鞘腫、神経腫、神経小丘、顆粒細胞腫瘍、胞状軟部肉腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ肉腫、ホジキン病、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、縦隔(胸腺)大細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、脾臓縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織の節外性縁帯B細胞リンパ腫(MALT-リンパ腫)、節縁帯B細胞リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、腸症型T細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、原発性皮下未分化大細胞リンパ腫、節外性NK-T細胞リンパ腫、芽球性NK細胞リンパ腫、形質細胞腫、多発性骨髄腫、肥満細胞腫、肥満細胞肉腫、肥満細胞症、肥満細胞白血病、ランゲルハンス細胞組織球症、組織球肉腫、ランゲルハンス細胞肉腫樹状細胞肉腫、濾胞樹状細胞肉腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ腫様肉芽腫症、急性白血病、リンパ球白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球白血病、慢性リンパ球白血病、成人T細胞白血病/リンパ球、形質細胞白血病、T細胞大顆粒球リンパ球白血病、B細胞前リンパ球性白血病、T細胞前リンパ球性白血病、前駆体Bリンパ芽球性白血病、前駆体Tリンパ芽球性白血病、急性赤血球白血病、リンパ肉腫細胞白血病、骨髄性白血病、骨肉腫性白血病���急性骨肉腫性白血病、慢性骨肉腫性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球白血病、好塩基球白血病、好酸球白血病、急性好塩基球白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨肉腫性白血病、単球白血病、急性単球芽球性および単球白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群、緑色腫または骨髄肉腫、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症、毛様細胞白血病、若年性骨髄単球白血病、侵攻性NK細胞白血病、一次性赤血球増加症、骨髄増殖病、慢性特発性骨髄線維症、本態性血小板血症、慢性好中球白血病、慢性好酸球白血病/過剰好酸球症候群、移植後リンパ増殖障害、慢性骨髄増殖病、骨髄異形成/骨髄増殖病、慢性骨髄単球白血病および骨髄異形成症候群を含む。ある態様において、過剰増殖病巣は、対象の口に影響し得る病気である。その例は、白斑症、扁平細胞過形成病巣、前癌性上皮病巣、上皮内新形成病巣、病巣上皮過形成、および扁平上皮癌病巣を含む。
【０２５１】
ある他の態様において、過剰増殖病巣は、患者の皮膚に影響し得る病気である。その例は扁平細胞癌、基底細胞癌、メラノーマ、パピローマ(いぼ)、および乾癬を含む。ウイルスに関連する癌腫の治療もまた考えられ、これは、限定されるわけではないが、頭部および頸部癌を含む。病巣はケラチノサイト、上皮細胞、皮膚細胞、および粘膜細胞のような細胞を含むことができる。病気は肺粘膜に影響する病気でもあり得る。
【０２５２】
病気は、口腔の白斑症、または皮膚の化学作用ケラトーシスのような前癌性病巣であり得る。
【０２５３】
治療または予防すべき病気の他の例は、自己免疫疾患のような、感染症および炎症病を含む。本発明の方法および組成物は、病気の免疫療法または免疫予防において適用することができる抗原を送達するにおいて適用することができる。他の例示的な病気は創傷、火傷、皮膚潰瘍、円背、皮膚科学的疾患(Burns et al.,2004にレビューされている)、歯肉炎のような歯の病気(Neville et al.,2001にレビューされている)、および眼の病気(Yanoff et al.,2003にレビューされている)を含む。創傷の遺伝子治療は、その各々を具体的に参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Eriksson and Vranckx,2004；Atiyeh et al.,2005；Ferguson and O'Kane,2004；Waller et al.,2004；Simon et al.,2004；およびBok and Bok,2004にレビューされている。当業者であれば、本明細書において記載の薬学的組成物および方法を用いる予防または治療に使用できる多くの病気存在に精通している。
【０２５４】
3.規定された成長阻害
過剰増殖病巣の「成長の阻害」は広く定義され、例えば、病巣の成長を遅らせること、または停止させることを含む。病巣の成長の阻害は、病巣のサイズの低下、または病巣の細胞のアポトーシスの誘導も含むことができる。アポトーシスの誘導は、薬物、トキシン、化合物、組成物または生物学的存在がアポトーシスを付与する状況、または細胞へのプログラムされた細胞の死滅を指す。特別な態様において、細胞は腫瘍細胞である。もう1つの態様において、腫瘍細胞は頭部および頸部癌細胞、扁平細胞癌、頚癌細胞、または肛門生殖器いぼの細胞である。さらなる態様において、細胞はケラチノサイト、上皮細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、またはパピローマウイルスによる形質転換を受けることができるいずれかの他の細胞である。病巣の成長は、病巣の細胞に対する免疫応答の誘導によって阻害され得る。
【０２５５】
F.薬学的組成物
1.定義
フレーズ「薬学的組成物」および「処方された」とは、適切には、哺乳動物またはヒトに投与された場合に、有害な、アレルギー性または他の面倒な反応を生じない分子存在および組成物を指す。本明細書において、「薬学的組成物」は、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含む。薬学上活性な物質用のそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。いずれかの慣用的媒体または薬剤が有効成分に適合しないのを除き、治療組成物におけるその使用が考えられる。補助的な有効成分の組成物に配合することもできる。加えて、組成物は補助的な不活性な成分を含むことができる。例えば、練り歯磨きとして用いられる組成物は香味剤を含むことができ、または組成物は製剤を適時放出とするための補助的成分を含有することができる。製剤は、以下のセクションにおいてより詳細に議論する。
【０２５６】
本発明の薬学的組成物のいくつかは、経口送達用に処方される。経口送達は、適切には、動物または他の哺乳動物の口を介しての投与を含む。経口送達は、歯肉炎、歯、口腔粘膜へのように口腔のいずれかの部分への、またはプレ-新形成または新形成病巣のような、口中の病巣への局所的投与も含む。経口送達は、口創傷、または口中にある腫瘍への送達も含む。
【０２５７】
本発明の文脈では、「局所投与」は、皮膚、口腔粘膜、胃腸粘膜、眼、肛門、頸部または膣のような体の表面への投与、またはこれらの領域のいずれかにおける切除された病巣の床(すなわち、切除された咽頭HNSCCまたは切除された頸部癌腫の手術台)の表面への投与、または膀胱のような中空内臓の表面への投与を含むと定義される。
【０２５８】
本発明のなお他の態様において、薬学的組成物は腸製剤である。腸製剤は、胃の低いpHに耐えるように設計された、丸剤、保護コーティングを備えたカプセル、または懸濁液を含むと定義される。そのような腸製剤は、治療または診断遺伝子の小腸または大腸への送達を可能とする。
【０２５９】
2.固体または半固体製剤
本発明の薬学的組成物は固体または半固体として処方することができる。固体および半固体製剤とは、水性製剤以外の任意の製剤を指す。当業者であれば、固体または半固体としての薬剤の処方に精通している。
【０２６０】
その例はゲル、マトリックス、フォーム、クリーム、軟膏、ロゼンジ、ロリポップ、ガム、粉末、ゲルストリップ、フィルム、ヒドロゲル、溶解性ストリップ、ペースト、練り歯磨き、または固体スティックを含む。これらの製剤のいくつかは以下のようにより詳細に議論される。
【０２６１】
a.ゲル
ゲルは、コロイド溶液から形成された見掛け上固体のゼリー様物質として本明細書において定義される。コロイド溶液は、微粉砕粒子が、容易に濾過され、または迅速に沈降されるのを妨げるように連続媒体内に分散された溶液である。
【０２６２】
ゲルの処方に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,828,308号、米国特許第6,280,752号、米国特許第6,258,830号、米国特許第5,914,334号、米国特許第5,888,493号、および米国特許第5,571,314号に記載されている。
【０２６３】
i.局所ゲル
本明細書において記載の薬学的組成物のいくつかは局所ゲルとして処方される。例えば、核酸発現構築体は、疎水性ゲルベースの薬学的製剤として処方することができる。疎水性ゲルは、例えば、ペンタマーシクロメタコン成分(Dow Corning 245流体(商標))を、核酸発現構築体、水素化ヒマシ油、パルミチン酸オクチル、ならびにシクロメチコンおよびジメチコノールの8：2の比率の混合物と混合することによって処方することができる。好ましくは、ペンタマーシクロメチコン成分はゲルのほぼ40％であり、液体核酸発現構築体成分はゲルのほぼ30.0％であり、水素化ヒマシ油成分はゲルのほぼ10％であり、パルミチン酸オクチル成分はゲルのほぼ10.0％であり、およびシクロメチコン/ジメチコノール成分はゲルのほぼ10.0％である。前記でリストした各成分は、真空下でほぼ80〜90℃で加熱しつつ一緒に混合することができる。温度を、例えば、37℃に降下させるに際して、次いで、核酸発現構築体成分を加え、最終ゲル組成物を雰囲気温度まで冷却させるべきである。疎水性ゲル製剤中の核酸発現構築体の最終濃度は、使用する構築体のタイプおよび投与目標に依存する。
【０２６４】
ii.経口ゲル製剤
核酸発現構築体の送達用の経口ゲル薬学的製剤は、当業者に公知のいずれかの方法を用いて調製することもできる。そのような薬学的製剤は口腔に適用することができる。そのようなゲルは、例えば、水、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、EDTA二ナトリウム、ヒアルロン酸およびマルトデキストリンを混合することによって作成することができる。前記の成分の溶解の後に、ポリビニルピロリドンを攪拌および真空、例えば、30mmHg下で完全に溶媒和するまで加えることができる。ヒドロキシエチルセルロースのような他の成分、およびサッカリンナトリウムのような甘味剤を、依然として真空下で、完全に溶媒和するまで混合物に攪拌することができる。次に、水素化ヒマシ油、塩化ベンザルコニウム、ならびにプロピレングリコールおよびグリチルレチン酸の混合物を、同一条件下で、かつリストした順番で、成分が完全に溶解するまで混合物に攪拌することができる。混合物は、真空下でさらに30分間攪拌することによってゲルを形成することができる。表4は、好ましい濃度の前記の成分のリストを提供する。
【０２６５】
または、Gelclair(登録商標)(Helsinn Healthcare,Switzerland)のような前記成分を含む市販されている経口ゲル製剤を使用することができる。
【０２６６】
（表４）
2008528508.tif 000006
【０２６７】
ゲルは、引き続いて、本発明による一つまたは複数の核酸発現構築体と合わせることができる。例えば、15mlの前記ゲルを、核酸発現構築体の30〜50mlの液体懸濁液と混合することができる。液体懸濁液およびゲル製剤双方中の核酸発現構築体の濃度は、使用する発現構築体のタイプ、および治療的使用に依存する。
【０２６８】
iii.眼病用ゲル製剤
ゲルは、当業者に公知のいずれかの方法によって眼送達用に処方することができる。例えば、眼病用ゲルは、第一の溶液および第二の溶液を調製し、続いて、各溶液を合わせることによって、対象への核酸発現構築体の局所送達用に調製することができる。
【０２６９】
第一の溶液の1つの例はほぼ200gの精製水、906gのホウ酸、0.13gのホウ酸ナトリウム、1.0gのエデト酸二ナトリウム、0.1gの塩化ベンザルコニウム、4.0gの塩化ナトリウム、および0.26gの凍結乾燥または液体懸濁液核酸発現構築体を含む。第一の溶液中の核酸発現構築体の特定の濃度は、発現構築体のタイプ、ならびに療法および治療目標によって決定される。
【０２７０】
第二の溶液は、例えば、760gの精製水および35gのヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むことができる。ヒドロキシプロピルメチルセルロースは、均一な分散液になるまで精製水をほぼ90℃まで加熱することによって水に溶解させることができる。
【０２７１】
第二の溶液を混合するに際して、第一の溶液が核酸発現構築体の不活化なしで無菌的に加えることができるように温度を降下させることができる。この方法は例示にすぎない。
【０２７２】
b.マトリックス
マトリックスは、薬学的成分のような、他の何かが含有される周囲の物質として本明細書において定義される。導電性シリコーンマトリックスの処方に関する方法は米国特許第6,119,036号に記載されており、これを具体的に参照により本明細書に組み入れられる。また、Doukas et al.,2001およびGu et al.2004におけるように、コラーゲンベースのマトリックスの処方に関する方法も言及される。
【０２７３】
c.フォーム
フォームは、多くのガスバブルを液体中に捕獲することによって形成される組成物として本明細書において定義される。フォームの処方および投与に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,112,942号、米国特許第5,652,194号、米国特許第6,140,355号、米国特許第6,258,374号、および米国特許第6,558,043号に記載されている。
【０２７４】
典型的なフォーム薬学的製剤は、例えば、ガスのバブルが薬学的組成物内にあるようにガスをゲルまたは水性薬学的組成物に導入することによって作成することができる。
【０２７５】
圧縮ガスの使用を含むフォーム薬学的製剤の調製の1つの例を以下の通り議論する。簡単に述べれば、軽い真空下でほぼ30分間攪拌することによって本発明の核酸(12％w/v)を鉱油と混合して第一の混合物を得ることができる。鉱油中のセチルステアリルアルコールの溶液(6％w/v)を同一条件下で第一の混合物に加えて、最終混合物を形成することができる。最終混合物を、引き続いて、さらに10分間攪拌することができる。次いで、最終混合物を適当なキャニスター中に入れ、プロペラントガスで圧縮することができる。キャニスターは、例えば、圧縮キャニスターで通常見出されるタイプのポリエチレンバルブのような、最終混合物を分注するためのメカニズムを有することができる。この方法は例示にすぎない。
【０２７６】
d.クリームおよびローション
クリームは、一つまたは複数の油および水の混合物を含む組成物を指すように本明細書において定義される、半固体エマルジョンとして本明細書において定義される。ローションおよびクリームは同一タイプの製剤を指すと考えられる。クリームの処方に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,336,194号、米国特許第6,620,451号、米国特許第6,261,574号、米国特許第5,874,094号、および米国特許第4,372,944号に記載されている。
【０２７７】
e.軟膏
軟膏は、種々の体表面で局所的に用いられる粘性半固体調製物として本明細書において定義される。軟膏の処方に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,078,993号、米国特許第4,868,168号、および米国特許第4,526,899号に記載されている。
【０２７８】
その例として、軟膏薬学的製剤はほぼ23.75w/v％の安息香酸イソステアリル、23.85w/v％のリンゴ酸ビス(2-エチルヘキシル)、10.00w/v％のシクロメチコン、5.00w/v％のステアリルアルコール、10.00w/v％の微多孔質セルロース、15.00w/v％のエチレン/酢酸ビニルコポリマー、0.1w/v％ブチルパラベン、0.1w/v％のプロピルパラベン、および2.20w/v％の核酸発現構築体を含むことができる。第一の溶液中の核酸発現構築体の特定の濃度は、発現構築体のタイプ、ならびに療法および管理目標によって決定される。
【０２７９】
f.粉末
粉末は、砕き、粉砕し、またはトリチュレートすることによって任意の乾燥物質が低下された微細な粒子として本明細書において定義される。
【０２８０】
g.ゲルストリップ
ゲルストリップは、弾性特性を持つゲルの薄い層として本明細書において定義される。ゲルは接着剤と共に処方してもしなくてもよい。ゲルはゆっくりと経時的に溶解するように処方することができる。例えば、経口適用のために設計されたゲルは、適用後に溶解するように設計することができる。
【０２８１】
本発明に従って用いるのに適したもう1つの経口送達系は溶解性ストリップである。そのようなデバイスの例はCool Mint Listerine PocketPaks(登録商標)ストリップ、Listerine(登録商標)防腐剤(チモール、ユウカリプトール、サリチル酸メチル、メントール)で見出される成分を含浸させたミクロ-薄澱粉ベースのフィルムである。非活性ストリップ成分はプルラン、フレーバー、アスパルテーム、カリウムアセスルファーム、グルコン酸銅、ポリソルベート80、カラギーナン、オレイン酸グリセリル、ローカストビーンガム、プロピレングリコールおよびキサンタンガムを含む。
【０２８２】
h.フィルム
フィルムは、選択された薬学的成分でコートされた、セルロース誘導体または熱可塑性樹脂のようなフレキシブルな材料の薄いシートまたはストリップとして本明細書において定義される。ロリポップは、ハンドルとして用いられるスティックの一端に付着されたロゼンジである。
【０２８３】
本発明の薬学的フィルム、ロゼンジ、またはロリポップは、例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、カラギーナンおよびプルランを含むことができる成分から構成され得る。成分は精製水中で水和し、次いで、4℃にて一晩貯蔵し、その後、着色剤、グルコン酸銅、甘味剤、香味剤、およびポリソルベート80およびAtmos300(商標)(ICI Co.)のようなポリオキシエチレンソルビトールエステル、および核酸発現構築体を混合物に加えることができる。
【０２８４】
本発明のフィルム調製は、例えば、前記混合物をモールドに注ぎ、フィルムとしてキャストし、次いで、これを乾燥し、薬学的組成物の所望の剤型に依存して所望のサイズに切断することによって作成することができる。また、フィルムは、例えば、製剤が経口適用で考えられなければ、甘味剤または香味剤を加えることなく処方することもできる。
【０２８５】
i.ロゼンジ
固体ロゼンジは薬物送達分野で周知である。ロゼンジは、対象の口に入れた場合にゆっくりと溶解するように設計された、治療剤、およびバインダーおよび甘味剤のような他の薬剤の小さな固体である。ロゼンジは、酸性調節剤、不透明化剤、安定化剤、緩衝剤、フレーバー剤、甘味剤、着色剤および保存剤のような、そのような剤型で公知の他の成分を含有することができる。例えば、固体製剤は、ロゼンジ基剤(例えば、糖および液体グルコースの混合物)を真空下で加熱して、過剰の水を除去し、次いで、残りの成分を混合物にブレンドすることによってロゼンジとして調製することができる。次いで、得られた混合物を連続円筒マスに導き、それから個々のロゼンジが形成される。次いで、ロゼンジを冷却し、ビジュアルチェックに付し、適当なパッケージングにパックする。
【０２８６】
適当なパッケージングの1つの形態は、金属ホイルによって閉じられた水不浸透性プラスチック材料(例えば、ポリ塩化ビニル)のブリスターパックである。患者は、圧力をブリスターにかけて、ロゼンジを破壊し、金属ホイルシールを通すことによってロゼンジを取り出す。ロゼンジは、通常、患者によって吸われて、薬物を放出する。咀嚼性固体投与製剤は、噛むことができるキャンディ製品またはチューインガムを調製するのに用いられる方法によって作成することができる。例えば、噛むことができる固体剤型は、薬物が、起泡剤、保湿剤、滑沢剤、フレーバーおよび着色剤の任意の添加と共に加えられている糖およびグルコースシロップの押し出された混合物から調製することができる。Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets, Vol.1, 2nd Ed., Lieberman et al.(Eds.), 1989参照。
【０２８７】
j.ロリポップ
もう1つの態様において、核酸は「ロリポップ」または「サッカー(sucker)」の形態で経口送達することができる。一般に、ロリポップおよびサッカーは、その中に薬物が分散されている固体マトリックスと定義される。それらは室温で固体または半固体であって、水性環境、すなわち、口との接触によって溶解される。マトリックスの溶解(および、よって、薬物の放出)は、口の(雰囲気または室温と比較して)上昇した温度によって増強することができる。ロリポップは、患者への薬物の投与のための便宜なビヒクルとなることができ、ロリポップが患者の口から一時的に取り出すことができる点でロゼンジとは異なる。これは、必要な場合に患者が経口連絡し、送達の持続および程度を制御することを可能とする。
【０２８８】
本発明のロリポップ(またはフィルムまたはロゼンジ)は例えば、キサンタンガム、ローカストビーンガム、カラギーナンおよびプルランを含むことができる成分から構成することができる。成分は、例えば、精製水中に水和させ、次いで、4℃にて一晩貯蔵し、その後、着色剤、グルコン酸銅、甘味剤、フレーバー剤、およびポリソルレート80およびAtmos 300(商標)(ICI Co.)のようなポリオキシエチレンソルビトールエステル、ならびに核酸発現構築体を混合物に加えることができる。
【０２８９】
本発明のロリポップまたはロゼンジ製剤は、例えば、前記混合物を所望のサイズのモールドに注ぎ、次いで、これを乾燥することによって作成することができる。乾燥に先立って、典型的なロリポップ保持スティックをロリポップ調製のためにモールドに挿入する。
【０２９０】
k.ヒドロゲル
ヒドロゲルは、水が分散媒体であるコロイドゲルとして時々見出されるポリマー鎖のネットワークとして本明細書において定義される。本明細書の教示および当業者の知識を用い、それが対象への局所送達のために核酸発現構築体と複合体化することができるように、ヒドロゲルとしての薬学的製剤を含むこともできる。ウイルスベクター中での核酸の送達のためのヒドロゲル製剤の例を以下に示す。
【０２９１】
例えば、ウシI型コラーゲン(例えば、Collagen Corporation,Fremont,Calif.から入手可能)、アルギン酸ナトリウムおよびウイルスベクターの液体懸濁液を一緒に混合して、ヒドロゲル前駆体を形成することができる。コラーゲン：アルジネートの乾燥重量ベースの割合は、約7：3〜約4：6とすることができる。ヒドロゲル前駆体混合物を形成した後、混合物を固化させることによってヒドロゲルマトリックスがそれから形成される。混合物を固化させて、それをCa2＋のような多価カチオンと接触させることによってヒドロゲルを作成することができる。好ましくは、Ca2＋溶液は少なくとも2.5ミリモルとすべきである。核酸発現構築体の濃度は、用いる構築体のタイプ、および管理目標に依存する。
【０２９２】
l.溶解性ストリップ
溶解性ストリップは、体腔のような水性環境の存在下で溶解することが考えられるフイルムとして本明細書において定義される。
【０２９３】
m.ペーストおよび練り歯磨き
ペーストは、その時点でそれが流体のように流動する、十分に大きな負荷または応力が適用されるまで、固体として挙動する物質として本明細書において定義される。練り歯磨きは、歯の審美的外見を綺麗にし、改善するのに用いられるペーストまたはゲルとして本明細書において定義される。ペースト歯磨きは、水、バインダー、研磨剤、フレーバー剤、発泡剤、および保湿剤を含むことができる。練り歯磨きの処方に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,627,979号、米国特許第6,508,647号、米国特許出願第20020045148号、および米国特許出願第20040018155号に記載されている。
【０２９４】
本明細書の教示、および当業者の知識を用い、対象の口腔への核酸発現構築体の送達用の練り歯磨き薬学的製剤を構築することを選択することができる。本発明による練り歯磨きは、例えば、以下の製剤、シリカまたは炭酸カルシウムのような1重量％の研磨物質、グリセロールまたはポリエチレングリコールのような20〜75重量％のポリオール、20〜55重量％の炭酸水素ナトリウム、.001〜40重量％のラウリル硫酸ナトリウム、.001〜20重量％の二酸化チタン、.1〜10重量％のグアーガムまたはペクチンのような増粘剤、.001〜5重量％のサッカリンナトリウム、および10〜30重量％の核酸発現構築体を液体製剤中に有することができる。第一の溶液中の核酸発現構築体の特定の濃度は、発現構築体のタイプ、ならびに療法および治療目標によって決定される。
【０２９５】
n.坐薬およびペッサリー
他の形態の投与に適したさらなる製剤は膣坐薬および/またはペッサリーを含む。直腸ペッサリーおよび/または坐薬を用いることもできる。坐薬は、直腸、膣および/または尿道への挿入のために通常は投薬される種々の重量および/または形状の固体投与形態である。挿入の後、坐薬は軟化し、融解し、および/または腔流体中に溶解する。例えば、坐薬では、伝統的なバインダーおよび/または担体は、例えば、ポリアルキレングリコールおよび/またはトリグリセリドを含むことができ；そのような坐薬は、0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。坐薬の薬学的製剤に関する方法は、具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,982,091号に記載されている。
【０２９６】
本発明による坐薬製剤は、例えば、選択された核酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、親油性担体および浸透促進剤を合わせることによって処方することができる。例えば、坐薬は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、Dow Chemical,Midland,Mich.から得られるMETHOCEL K.HPMC K15M)(8％/wt)；および浸透促進性ポリオキシエチレンアルキルエーテル(例えば、Gattefosseから得られるTRANSCUTOL(登録商標))(17％/wt)を、Gattefosse, Westwood, N. J.から得られる親油性担体SUPPOCIRE CS2(75％wt)に溶解させることによって処方することができる。選択された核酸を混合物に攪拌し、適当な坐薬モールドに注ぎ、局所適用に先立って固化させることができる。
【０２９７】
o.ガム
本発明では、本発明のガムベースの薬学的製剤を核酸の対象への経口送達のために構築することができるとも考えられる。
【０２９８】
その例として、ガム基剤ペレットを凍結させて硬度を増大させ、機械的に粉砕して粉末形態とすることができる。引き続いて、ガム粉末を室温まで上昇させ、ほぼ20〜65重量％のガム甘味剤組成物を含む、フルクトースまたはアスパルテームのような甘味剤と混合することができる。次いで、ガム甘味剤組成物に、本発明の核酸の液体懸濁液を補充することができる。例えば、核酸の液体懸濁液の量は、ガム甘味剤組成物の2重量％とほぼ同等とすることができる。次いで、ガム甘味剤組成物および核酸の混合物を圧縮して所望の形状とし、対象に投与することができる。ガム中の治療剤を処方する他の方法が本発明で考えられ、当業者に周知である。
【０２９９】
3.希釈剤および担体
ある規定された態様において、経口薬学的組成物は不活性な希釈剤および/または同化可能な食用担体を含み、および/またはそれらはハードおよび/またはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、および/またはそれらは圧縮して錠剤とすることができ、および/またはそれらはダイエットの食品と直接的に一体化させることができる。経口治療投与では、活性な化合物を賦形剤と共に配合し、および/または摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーおよび/または等の形態で用いることができる。
【０３００】
局所使用に先立っての液体中の溶液、または液体中の懸濁液に適した固体形態も本発明で考えられる。
【０３０１】
本発明の固体および半固体製剤は以下の、トラガカントガム、アカシア、コーンスターチおよび/またはゼラチンとしてのバインダー；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸および/または等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；スクロース、ラクトースおよび/またはサッカリンのようなフレグランスおよび/または甘味剤を含有することができ、および/またはペパーミント、冬緑油および/またはチェリーフレーバーのようなフレーバー剤を加えることができる。投与単位形態がカプセルである場合、それは、前記タイプの物質に加えて、液体担体を含有することができる。種々の他の物質をコーティングとして存在することができ、および/またはそうでなければ投与単位の物理的形態を修飾することができる。例えば、錠剤、丸剤および/またはカプセルをシェラック、糖および/または双方でコートすることができる。当業者に公知の保存剤、色素、およびフレーバー剤が考えられる。
【０３０２】
皮膚表面での使用が考えられる本発明の固体および半固体製剤は、化粧目的で組成物に通常ブレンドされる他の成分を含むことができる。例えば、そのような化粧成分はワックス、油、保湿剤、保存剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ポリマー、表面活性剤、着色剤、顔料、粉末、薬物、アルコール、溶媒、フレグランス、フレーバー等を含む。化粧組成物の具体的な例は、限定されるわけではないが、リップスティック、リップ-グロス、リップバルム、皮膚傷コンシーラーおよびローションのようなメイキャップ化粧品を含む。薬学的担体として用いるように設計された化粧品製剤に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,967,023号、米国特許第6,942,878号、米国特許第6,881,776号、米国特許第6,939,859号および米国特許第6,673,863号に記載されている。
【０３０３】
4.水性製剤
本発明のある種の薬学的組成物は水性組成物として処方することができる。本発明の水性組成物はコンシーラーる担体または水性媒体に溶解させ、または分散させた有効量の核酸を含む。
【０３０４】
本明細書において記載の薬学的組成物のある態様の投与は、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の通常の経路を介するものである。例えば、これは食道、胃、口腔、鼻、頬、肛門、直腸、膣、局所的眼、または皮膚への適用を含む。そのような組成物は、通常、生理学的に許容される担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。他の賦形剤の例はフレグランスおよびフラグラントを含む。
【０３０５】
製剤は液体形態または懸濁液とすることができる。そのような目的での局所組成物は薬学的に許容される担体を含む。例えば、組成物はリン酸緩衝化生理食塩水の1ml当たり10mg、25mg、50mgまたは約100mgまでのヒト血清アルブミンを含有することができる。他の薬学的に許容される担体は、塩、保存剤、緩衝液等を含めた水性溶液、非毒性賦形剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射有機エステルである。水性担体は水、アルコール/水性溶液、生理食塩水、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースのような非経口ビヒクル等を含む。保存剤は抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスを含む。薬学的組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は周知のパラメーターに従って調整される。
【０３０６】
経口投与用の水性組成物の例はマウスウオッシュ、マウスリンス、アプリケーターを介して口へ投与するためのコーティング、またはマウススプレーを含む。マウスウオッシュ製剤は当業者に周知である。マウスウオッシュおよび経口リンスに関する製剤は、例えば、その各々をここに具体的に参照により本明細書の本セクションおよび本明細書の全ての他のセクションで組み入れる、米国特許第6,387,352号、米国特許第6,348,187号、米国特許第6,171,611号、米国特許第6,165,494号、米国特許第6,117,417号、米国特許第5,993,785号、米国特許第5,695,746号、米国特許第5,470,561号、米国特許第4,919,918号、米国特許出願第20040076590号、米国特許出願第20030152530号、および米国特許出願第20020044910号において詳細に議論されている。
【０３０７】
経口製剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムおよび/または等の薬学的グレードとしてのそのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物はマウスウオッシュおよびマウスリンスのような溶液の形態を採る。そのような組成物および/または製剤は少なくとも0.1％の活性化合物を含有すべきである。組成物および/または製剤のパーセンテージは、勿論、変化させることができ、および/または便宜には、約2〜約75重量％のユニット、および/または好ましくは25〜60％とすることができる。そのような治療上有用な組成物における活性化合物の量は、適当な剤型が得られるようなものである。
【０３０８】
経口投与では、本発明の発現カセットを賦形剤と共に一体化させることができ、非摂取可能マウスウオッシュおよび歯磨きの形態で用いることができる。マウスウオッシュは、必要な量の有効成分をホウ酸ナトリウム溶液(Dobell溶液)のような適当な溶媒に取り込むことによって調製することができる。または、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する殺菌洗浄に一体化させることができる。有効成分はゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含めた歯磨きに分散させることもできる。本発明の組成物は中性または塩形態で処方することができる。薬学的に許容される塩は(タンパク質の遊離アミノ基とで形成され)、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とで形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来することもできる。
【０３０９】
経口投与では本発明の発現カセットは、トルイジンブルーO色素のような、過剰増殖病巣の検出を助けるための色素と一体化させて、非消化性マウスウオッシュ、経口レンスおよび歯磨きの形態で用いることもできる。マウスウオッシュは、必要な量の有効成分を、トルイジンブルーO色素の組成物のような経口投与色素組成物、緩衝液、フラグラント、保存剤、酢酸、エチルアルコールおよび水に一体化させて調製することができる。前癌性および癌性病巣の染色におけるトルイジンブルーO色素の使用に関する方法および製剤は、例えば、その各々を具体的に参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第4,321,252号、米国特許第5,372,801号、米国特許第6,086,852号および米国特許出願第20040146919号に見出すことができる。
【０３１０】
局所表面への適用のための水性組成物の例は、エマルジョン、または遊離塩基もしくは薬理学的に許容される塩としての活性化合物、水および界面活性剤およびエマルジョンと混合した活性化合物の溶液のような薬学的に許容される担体を含む。エマルジョンは、典型的には、通常は直径が0.1umを超える液滴の形態の1つの液体に分散されたもう1つの液体の均一な系である(Idson,1988；Rosoff,1988；Block,1988；Higuchi et al.,1985)。エマルジョンは、しばしば、相互に親密に混合され、分散された2つの非混和性液体相からなる二相系である。一般に、エマルジョンは油中水型(w/o)または水中油型(o/w)のいずれかとすることができる。本発明の方法および組成物で用いることができるエマルジョンに関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,841,539号および米国特許第5,830,499号に記載されている。皮膚への適用のための水性組成物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中の分散液も含むことができる。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの製剤は微生物の成長を妨げるための保存剤を含有する。
【０３１１】
リポソームおよび/またはナノ粒子の使用も本発明で考えられる。リポソームの処方および使用は一般には当業者に公知であり、また以下に記載する。リポソームは本明細書において他の箇所でも議論する。
【０３１２】
ナノカプセルは、一般には、安定したかつ再現性がある方法で化合物を捕獲することができる。細胞内ポリマー過剰負荷による副作用を回避するためには、(0.1μm程度のサイズの)そのような超微細粒子を、インビボで分解することができるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が本発明での使用に考えられ、そのような粒子は容易に作成することができる。本発明の方法および組成物で用いることができるナノ粒子の使用に関する方法は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,555,376号、米国特許第6,797,704号、米国特許出願第20050143336号、米国特許出願第20050196343号および米国特許出願第20050260276号を含む。
【０３１３】
食道または胃送達で考えられる水性組成物の例は液体制酸剤および液体アルジネートいかだ形成組成物を含む。液体制酸剤および液体スクラルフェートまたはアルジネートいかだ形成組成物は当業者に周知である。アルジネートは一般には安全と見なされる薬学的賦形剤であり、従って、その各々をここに具体的に参照により本明細書の本セクションおよび明細書の全ての他のセクションに組み入れる、特許文献に、例えば、米国特許第6,348,502号、米国特許第6,166,084号、米国特許第6,166,043号、米国特許第6,166,004号、米国特許第6,165,615号および米国特許第5,681,827号によく記載された種々の薬学的系を調製するのに用いられる。
【０３１４】
食道または胃送達で考えられる経口製剤は、例えば、薬学的グレードのヒドロキシルエチルセルロース、水、シメチコン、炭酸ナトリウム、サッカリンナトリウム、ソルビタールおよび/または等のような通常に使用される賦形剤を含む。フラグラントもまた使用することができる。そのような組成物および/または製剤は少なくとも0.1％の活性な化合物を含有すべきである。組成物および/または製剤のパーセンテージは、勿論、変化させることができ、および/または便宜には約2〜約75重量％のユニット、および/または好ましくは25〜60％とすることができる。そのような治療上有用な組成物における活性な化合物の量は、適当な用量が得られるようである。
【０３１５】
投与のために本発明では、溶液および/またはスプレー、ハイポスプレー、エアロゾルおよび/または吸入剤を用いることもできる。1つの例は、気道管への投与のためのスプレーである。スプレーは等張であり、および/またはわずかに緩衝化させて、5.5〜6.5のpHを維持する。加えて、点眼薬で用いたものと同様な抗微生物保存剤、および/または適当な薬物安定化剤を、必要であれば、製剤に含めることができる。スプレー投与に関する方法は、その各々を具体的に参照により明細書の本セクションおよび明細書の全ての他のセクションに組み入れる、米国特許第6,610,272号、米国特許第6,551,578号、米国特許第6,503,481号、米国特許第5,250,298号および米国特許第5,158,761号に記載されている。
【０３１６】
本明細書において記載の水性薬学的組成物のある態様の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、いずれかの通常の経路を介するものである。例えば、これは経口、鼻、頬、肛門、直腸、膣または局所的眼を含む。そのような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容される組成物として投与される。他の賦形剤の例はフレグランスおよびフラグラントを含む。
【０３１７】
a.マウスウオッシュ製剤
本明細書の教示、および当業者の知識を用い、口腔への適用のためのマウスウオッシュとしての核酸発現構築体の送達用の薬学的製剤を構成することができる。例えば、マウスウオッシュ製剤は典型的なマウスウオッシュ溶液、および選択された核酸発現構築体の懸濁液を含むことができる。本発明に従って使用することができる典型的なマウスウオッシュ溶液の1つのそのような製剤を表5に示す。
【０３１８】
（表５）
2008528508.tif 000007
【０３１９】
マウスウオッシュ製剤は、核酸発現構築体、例えば、アデノウイルスベクターと混合することができる。核酸発現構築体の濃度は、使用する特定の構築体および治療目標に依存する。製剤は、引き続いて、対象の口腔に適用することができる。例えば、適用は綿棒を介し、うがいによる、またはしゅっと音をたてることによることができる。適用は1回、または数回反復することができる。
【０３２０】
または、本明細書の教示、および当業者の知識を用い、口腔への核酸発現構築体の送達用の前癌性および癌性病巣検出色素を一体化させるマウスウオッシュ薬学的製剤を構成することができる。例えば、核酸構築体を色素含有マウスウオッシュと混合することができる。口腔における前癌性および癌性病巣を検出することができる色素を含有するマウスウオッシュに関する1つのそのような方法および製剤を以下に示す。
【０３２１】
トルイジンブルーO色素(1％w/v)、フラグラント(0.2％w/v)および酢酸ナトリウム三水和物緩衝溶液を、例えば、水、氷酢酸およびエタノールの溶液に溶解させて、色素含有マウスウオッシュ溶液を形成することができる。本発明による核酸は、引き続いて、適切な量にてマウスウオッシュ溶液に加えることができる。マウスウオッシュ中の核酸の濃度は、使用する核酸構築体のタイプおよび管理目標に依存する。
【０３２２】
その例として、以下の工程を用いて薬学的製剤を対象に投与することができる。1)対象は水中の1％酢酸および安息香酸ナトリウム保存剤を含むほぼ15mlのレンス溶液で20秒間うがいし、しゅっと音をたて、引き続いて、吐き出し、2)対象はほぼ15mlの水を20秒間うがいし、しゅっと音をたて、引き続いて吐き出し、3)対象はほぼ30mlの薬学的製剤を60秒間うがいし、しゅっと音をたて、引き続いて吐き出し、4)工程1を2回反復し、および5)工程2を2回反復する。これらの組成物を投与する他の方法が考えられ、当業者に周知である。
【０３２３】
口腔の観察を薬学的製剤の適用直後に適当な倍率および適当な光下で行って、染色された前癌性および癌性細胞の存在につき口腔を調べることができる。口腔の引き続いての観察は一定期間後に行って、口腔の細胞の本発明の核酸での形質導入を可能とすることができる。そのような観察は適当な倍率および適当な光下で行うことができる。
【０３２４】
b.灌注および浣腸製剤
核酸は、さらに、灌注または浣腸として処方することができる。例えば、選択された核酸発現構築体を当業者に周知の典型的な灌注または浣腸組成物と混合することができる。典型的な灌注または浣腸の処方を表6に示す。
【０３２５】
（表６）
2008528508.tif 000008
【０３２６】
本明細書の教示、および当業者の知識に従い、典型的な灌注または浣腸製剤、例えば、表6に示された処方を選択された核酸構築体と混合することができる。灌注または浣腸製剤中の核酸発現構築体の濃度は、使用される発現構築体のタイプおよび管理目標に依存する。製剤は、引き続いて、対象に肛門、膣またはカテーテルを介して投与することができる。
【０３２７】
5.非イオン性界面活性製剤
薬学的製剤は局所送達のための非イオン性界面活性剤であってよい。そのような製剤は、例えば、3つの別々の成分を含むことができる。第一の成分は非イオン性ラメラ層形成界面活性剤とすることができる。第二の成分はもう1つの界面活性剤とすることができる。最後の成分はアデノウイルスベクターのような核酸発現構築体とすることができる。核酸発現構築体は、例えば、pH7.4の蒸留されたリン酸緩衝化生理食塩水および10％グリセロール中に凍結乾燥し、または懸濁させることができる。使用することができるラメラ層形成界面活性剤の例は表7に見出される。
【０３２８】
（表７）
2008528508.tif 000009
【０３２９】
第二の界面活性剤の例は表8に見出される。
【０３３０】
（表８）
2008528508.tif 000010
【０３３１】
アデノウイルスベクター局所送達用の非イオン性界面活性剤についての製剤は、例えば、5wt％を含有する最終水性分散液を得るのに必要な量のスクロースラウレートエステル(L-595)およびPOE(7)ドデシルエーテル(C12EO7)を混合することによって処方することができる。混合物は、例えば、各々、第一および第二の界面活性剤の0.3：0.7または0.2：0.8または0.1：0.9の比率の混合物であってよい。これらの界面活性剤は、まず、例えば、メタノールに対するクロロフォルムの3対1溶液に溶解させ、その後、溶媒を蒸発させることができる。次いで、核酸発現構築体の液体懸濁液、例えば、ほぼ5mlのそのような懸濁液を加えることによって、残りの乾燥フイルムを水和させることができる。
【０３３２】
6.制酸製剤
本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物はさらに一つまたは複数の制酸剤を含むことができる。制酸剤での製剤のいずれかの方法が本発明で考えられる。本明細書の教示および当業者の知識に従って制酸剤製剤を調製することにおいて、まず、核酸発現構築体を液体製剤に懸濁させることを望むことができる。例えば、アデノウイルスベクターを、pH7.4の蒸留したリン酸緩衝化生理食塩水および10％グリセロールの水性製剤に懸濁することができる。アデノウイルスベクターまたはいずれかの核酸発現構築体の量は治療目標に依存する。そのような液体製剤のさらなる成分は制酸剤とすることができ、これは、胃粘膜のpHを対象への投与に際して一時的に上昇させるのを可能とする。制酸剤は、例えば、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウムのような成分を含むことができる。加えて、市販されている液体制酸剤製剤でしばしば見出される他の成分をそのような薬学的製剤に加えることができる。そのような成分は、しばしば、限定されるわけではないが、ブチルパラベン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マイクロクリスタリンセルロース、プロピルパラベン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、サッカリンナトリウム、ソルビトール、蒸留水およびフラグラントを含む。
【０３３３】
7.アルジネートラフト(raft)製剤
アルジネートラフト製剤も本発明で考えられる。アルジネートラフトは、胃酸の存在下でアルギン酸の沈殿によって形成されるガスが捕獲されたゲルを指すように本明細書において定義される。例えば、核酸発現構築体はアデノウイルスベクターに含めることができる。
【０３３４】
本明細書の教示および当業者の知識に従うアルギネートラフト製剤の調製において、核酸発現構築体は、例えば、アルジネートラフト形成液体組成物に懸濁させることができる。アルジネートラフト形成薬学的組成物で考えられるそのような核酸発現構築体の例は、例えば、アデノウイルスベクターであり得る。アデノウイルスベクターはアルジネートラフト形成液体と混合することができる。そのようなアルジネートラフト形成液体は、水酸化アルミニウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウムおよびアルギン酸のようなこのタイプの市販されている製剤で見出される成分を含むことができる。市販されているアルギン酸ラフト製剤Gaviscon(登録商標)(Glaxo Smith Kline)は好ましい例である。胃酸の存在下では、アルジネートが沈殿し、ゲルを形成する。アルジネートラフト形成組成物は炭酸水素ナトリウムまたはカリウムを含有することもでき；胃酸の存在下では、炭酸水素塩は二酸化炭素に変換され、これはゲル沈殿内に捕獲され、従って、それを、胃内容物の表面に「浮かぶ」フォームに変換する。ラフト形成は投与から数秒以内に起こり、ラフトは胃の中に数時間保持できる。
【０３３５】
アルジネートラフト形成組成物は、例えば、アルギン酸ナトリウム(500mg)、炭酸水素ナトリウム(250mg)、炭酸カルシウム(150mg)、メチルパラベン(40mg)、プロピルパラベン(6mg)、およびカルボポール(Carbopol)(登録商標)(Noveon)のような架橋されたポリアクリル酸を混合することによって処方することができる。成分は一緒に混合し、アデノウイルスベクターを含有する水性製剤中に10mlの最終容量まで溶解させることができる。本発明のアルジネートラフト薬学的製剤は、引き続いて、対象が嚥下することができる。アルジネートラフト形成製剤の他の例は、その各々をここに具体的に参照により明細書の本セクション、および本明細書の全ての他のセクションで組み入れる、米国特許第6,348,502号、米国特許第5,681,827号および米国特許第5,456,918号に見出すことができる。
【０３３６】
8.ウイルスベクターを用いる組成物
本発明によるウイルス発現ベクターの臨床的適用が考えられる場合、意図した適用に適した薬学的組成物としての複合体を調製することが必要である。一般に、これは、実質的にパイロジェン、ならびにヒトおよび他の哺乳動物に有害であり得るいずれかの他の不純物を含まない薬学的組成物を調製することを含む。また、一般には、適当な塩および緩衝液を使用して、複合体を安定とし、標的細胞による複合体摂取を可能とすることが望まれる。
【０３３７】
9.エマルジョン製剤
本明細書の教示および当業者の知識を用い、核酸発現構築体の局所送達用のエマルジョンとしての薬学的製剤を構成することもできる。例えば、核酸発現構築体はアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターであってよい。ウイルスベクター中の核酸の送達用のエマルジョン製剤の1つの例は以下の通りである。
【０３３８】
ポリ(乳酸-グリコール)酸(PLGA)をジクロロメタンに溶解させ、ウイルスベクターの水性懸濁液と混合することができる。例えば、1mlのジクロロメタンおよび0.05mlのウイルスの水性懸濁液を用いることができる。次いで、溶液をほぼ30秒間渦巻かせて、油中水型エマルジョンを形成することができる。次いで、1mlの1％ポリビニルアルコールをエマルジョンに加え、引き続いてさらに30秒間渦巻かせることができる。第二ラウンドの渦巻かせの後、次いで、エマルジョンを100mlの0.1％ポリビニルアルコール溶液に加え、さらに30分間攪拌することができる。次に、2.5時間攪拌しつつ、真空をエマルジョンに適用することによって、ジクロロメタンを除去することができる。ジクロロメタンの除去の後、次いで、エマルジョンを0.2μmのナイロンフィルターで濾過し、500mlのリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄することができる。ウイルスを含有するエマルジョンの場合には、保護剤を使用して、ウイルスタンパク質の変性を妨げることができる。典型的な保護剤は、例えば、グリセロール、スクロースおよびウシ血清アルブミンを含むことができる。
【０３３９】
10.ナノ粒子リポソーム製剤
本発明は、核酸発現構築体の局所送達用のナノ粒子リポソーム製剤も含む。例えば、リポソーム製剤はDOTAPおよびコレステロールを含むことができる。核酸発現構築体を含有するそのような製剤の例を以下に示す。
【０３４０】
カチオン性脂質(DOTAP)は等モル濃度の中性脂質コレステロール(Chol)と混合することができる(Avanti Lipids)。混合された粉末化脂質を1-L丸底フラスコ中のHPLC-グレードのクロロホルム(Mallinckrodt,Chesterfield,Mo.)に溶解させることができる。溶解の後、溶液をBuchiロータリーエバポレーターで30℃にて30分間回転させて薄いフイルムを作成することができる。次いで、薄い脂質フイルムを含有するフラスコを真空下で15分間乾燥することができる。一旦乾燥が完了すれば、フイルムを水中の5％デキストロース(D5W)に水和させて、最終濃度20mM DOTAPおよび20mMコレステロールが得られ、これを20mM DOTAP：Cholという。水和された脂質フイルムを水浴中で50℃にて45分間、次いで、35℃にて10分間回転させることができる。次いで、混合物をパラフィンで被覆したフラスコ中で室温にて一晩放置し、続いて、低い周波数の超音波処理(Lab-Line,TranSonic 820/H)を50℃にて5分間行った。超音波処理の後、混合物をチューブに移し、50℃にて10分間加熱し、引き続いて、シリンジを用い、減少させるサイズ：1.0、0.45、0.2および0.1μmのWhatman(Kent,UK)フィルターを通して順次に押し出した。Whatman Anotopフィルター、0.2μmおよび0.1μmを用いることができる。押出しに際して、リポソームをアルゴンガス下で4℃にて貯蔵することができる。
【０３４１】
例えば、150μgのプラスミドDNAの形態の核酸発現構築体をD5W中に希釈することができる。貯蔵されたリポソームをD5Wの別の溶液中に希釈することもできる。次いで、等容量のDNA溶液およびリポソーム溶液双方を混合して、例えば、150μg DNA/300μlで容量(2.5μg/5μl)の最終濃度を得ることができる。希釈および混合は室温にて行うことができる。次いで、ピペットマンのピペットチップを用いることによって、DNA溶液をリポソーム溶液の表面に迅速に加えることができる。次いで、DNA：リポソーム混合物をピペットチップ中で上方および下方に2回迅速に混合して、DOTAP：コレステロール核酸発現構築体複合体を形成することができる。
【０３４２】
本明細書の教示、および当業者の知識を用い、DOTAP：Chol-核酸発現複合体の粒子サイズを決定するテストを行うことができる。例えば、DOTAP：Chol-核酸発現構築体複合体の粒子サイズは、N4-コールター粒子サイズアナライザー(Beckman-Coulter)を用いて決定することができる。この決定では、5μlの新たに調製された複合体を粒子サイズ決定に先立って1mlの水に希釈すべきである。加えて、O.D.400nmにおける複合体の分光光度測定値もまた分析で使用することができる。この分析では、5μlの試料を95μlのD5W中に希釈して、100μlの最終容量を作成することができる。前記製剤技術をサイズ分析に適用する方法は、374〜400nmの複合体のサイズを示すはずである。
【０３４３】
11.ポプシクル製剤
本明細書の教示および当業者の知識を用い、口腔または胃腸管への適用のためのポプシクルとしての核酸発現構築体の送達用の薬学的製剤を構成することができる。ポプシクルは、スティックまたはシースのような手で保持されたアプリケーターを含む凍結液体製剤として本明細書において定義される。例えば、ポプシクル製剤は、ポプシクル製剤、および選択された核酸発現構築体の懸濁液を含むことができる。従って、ポプシクル製剤は糖(20％w/v)、フラグラント(1.0％w/v)、着色剤(0.5％w/v)、および本発明の核酸を含有する水性溶液(80％w/v)の凍結溶液を含むことができる。製剤の成分は液体形態で一緒に混合し、引き続いて、ポプシクルモールド中に凍結させることができる。ポプシクル製剤のさらなる例は、例えば、具体的に参照により本明細書にその各々をその全体として組み入れる、米国特許第5,194,269号および米国特許第5,660,866号に見出すことができる。
【０３４４】
12.経皮性または経皮的送達デバイス
本発明のある態様は、パッチ、および対象における過剰増殖病巣の成長のような、対象における病気を予防または阻害できるアミノ酸配列をコードする核酸を含む治療剤の送達用の経皮性または経皮的送達デバイスに関する。治療剤は、パッチの表面と接触される。前記のように、治療剤は、過剰増殖病巣の成長のような、対象における病気を予防または阻害することができるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
【０３４５】
パッチは、当業者に公知のいずれかの材料で構成することができる。さらに、パッチは、皮膚表面、口腔粘膜の表面、創傷表面、または腫瘍床の表面のような、対象の体表面へのパッチの適用によって治療剤の送達用に設計することができる。パッチは、任意の形状または配置で設計することができ、例えば、ストリップ、帯具、テープ、(創傷包帯のような)包帯、または合成皮膚を含むことができる。経皮性または経皮的パッチに関する製剤は、例えば、その各々をここに具体的に参照により本セクション、および明細書の全ての他のセクションに組み入れる、米国特許第5,770,219号、米国特許第6,348,450号、米国特許第5,783,208号、米国特許第6,280,766号、および米国特許第6,555,131号に詳細に議論されている。
【０３４６】
いくつかの態様において、デバイスは、治療剤の液体または半固体製剤が皮膚を通って血流に入る速度を制御するための膜を備えるよう設計することができる。デバイスの成分は、例えば、貯蔵庫または不活性なポリマーマトリックスに溶解させた、または分散させた治療剤；紙、プラスチックまたはホイルの外側裏打ちフイルム；およびパッチを皮膚に係留させる感圧接着剤を含むことができる。接着剤は、パッチを皮膚に適用する前にはがす必要がある、離型ライナーによって被覆してもしなくてもよい。いくつかの態様において、治療剤はヒドロゲルマトリックスに含有させる。
【０３４７】
いくつかの態様において、皮膚を通って治療剤を輸送するのが望ましい。従って、局所パッチ製剤は、ヒドロキサイド放出剤および親油性共-増進剤；エレクトロポレーションのための経皮吸収促進剤；侵入増進剤および水性補助剤；モノグリセリドおよびパルミチン酸エチルを含む皮膚浸透促進剤；刺胞動物門(cnidaria)、渦鞭毛虫(dinoflagellata)およびミクソゾア門(myxozoa)からの刺胞；および/または等のような皮膚浸透メカニズムを含むことができる。皮膚浸透メカニズムに関する製剤は、その各々を具体的に参照により本明細書のこのセクションおよび本明細書の全ての他のセクションに組み入れる、例えば、米国特許第6,835,392号、米国特許第6,721,595号、米国特許第6,946,144号、米国特許第6,267,984号および米国特許第6,923,976号において詳細に議論されている。また、Bramson et al.(2003)によって参照される、非常に小さな抵抗性エレメントの使用、引き続いて、アデノウイルスベクターを含有するパッチの適用を通じての皮膚のマイクロポレーション；Tuqan et al.(2005)によって参照される、クリオゲンスプレー冷却を通じての皮膚の浸透性を増大させる方法；Baxter et al.(2005)によって参照される、ジェット誘導皮膚刺穿；Akomeah et al.(2004)によって参照される、皮膚の加熱処理；および浸透性を増大させるための皮膚の掻き落としも考えられる。
【０３４８】
他の態様において、パッチは、皮膚を通って治療剤を輸送するための低出力電流を用いるように設計される。他の態様において、パッチは、皮膚または粘膜を通っての受動的薬物輸送のために設計される。他の態様において、デバイスは、治療剤の送達用のイオントフォレシスを利用するように設計される。
【０３４９】
デバイスは貯蔵庫を含むことができ、治療剤は裏打ち層、および治療剤の送達速度を制御する膜の間の溶液または懸濁液に含まれる。他の態様において、デバイスは治療剤を含むマトリックスを含み、治療剤は、治療剤と皮膚との接触を可能とするためにコラーゲンマトリックス、ポリマーまたはコットンパッド内に分散された溶液または懸濁液中にある。いくつかの態様において、接着剤を送達系の外側エッジに適用して、対象の表面への接着を可能とする。
【０３５０】
いくつかの態様において、デバイスは、ある時間の後に対象の表面上に溶解できる物質を含む。例えば、デバイスは、口の粘膜表面に適用することができるファイルまたは皮膚であってよく、デバイスはある時間の後に口中で溶解する。治療剤は、これらの態様において、デバイスの単一表面(すなわち、対象と接触する表面)に適用してよく、またはデバイスを含む材料に含浸させてもよい。
【０３５１】
いくつかの態様において、デバイスは複数の治療剤を配合するように設計される。デバイスは各治療剤用の別々の貯蔵庫を含んでもよく、または単一貯蔵庫中に複数の治療剤を含有してもよい。
【０３５２】
さらに、治療剤は、温度または発汗のような、対象における体の変化に基づいて治療剤の送達速度を変化させるように設計することができる。例えば、ある種の薬剤は、温度変化に応答し、種々のレベルの薬物が膜を通るのを可能とする、治療剤を被覆する膜に含めることができる。他の態様において、治療剤の経皮性または経皮的送達は、温度-制御デバイスのデバイスへの取り込みを通じてパッチの温度を変化させることによって変化させることができる。
【０３５３】
当業者であれば、パッチを用いる薬物の経皮性および経皮的送達用の方法および技術に精通している。
【０３５４】
本明細書の教示、および当業者の知識を用い、経皮性送達パッチを用いて核酸発現構築体を局所送達するのを選択することができる。本明細書の教示および当業者の知識に従って経皮パッチを調製することにおいて、核酸発現構築体、接着剤、および浸透促進剤を一緒に混合し、シリコン処理ポエリエステル離型ライナー(Release Technologies,Inc.,W.Chicago,III)上に分注することができる。例えば、経皮パッチ製剤は、ほぼ88％のアクリル酸コポリマー接着剤の組成物、2％の核酸発現構築体、および10％のARACEL 80(商標)(ICI Americas,Wilmington,Del.)のようなソルビタンモノオレエート浸透促進剤からなることができる。
【０３５５】
13.接着剤
いくつかの態様において、薬学的組成物は一つまたは複数の接着剤を含む。接着剤は、核酸と表面との接触を促進し、または容易とし、または1つの表面ともう1つの表面との接触を促進し、または容易とする薬剤または薬剤の組合せを一般的に指すように本明細書においては定義される。
【０３５６】
製剤および医用薬剤で用いられる接着剤は当業者に周知であり、滅菌された液体ニカワ、ならびに固体もしくは半固体接着剤のような局所皮膚接着剤を含む。本発明で用いる接着剤は、適用に際して液体であるが、迅速に乾燥して固体一貫性となる接着剤も含む。
【０３５７】
本発明の組成物および方法で用いる例示的な接着剤は、シアノアクリレート、メタクリレート、およびアルキルアクリレートのようなアクリレートを含む。他の例示的な接着剤はヒドロコロイド、ヒドロゲル、ポリイソブチレン、およびポリアクリル酸系ゲルマトリックス接着剤のようなゲルマトリックスに基づく接着剤を含む。
【０３５８】
本発明の薬学的組成物および方法で用いるのに、組織接着剤も考えられる。組織接着剤に関する組成物は、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れる、米国特許出願第20040199207号、米国特許出願第20030119985号、米国特許出願第20020116026号、米国特許出願第20020037323号、米国特許第6,723,114号、米国特許第6,596,318号、米国特許第6,329,337号、米国特許第6,310,036号、米国特許第6,299,631号、および米国特許第6,251,370号において詳細に議論されている。
【０３５９】
本明細書の教示および当業者の知識を用い、接着性薬学的製剤で核酸発現構築体を局所送達することができる。例えば、接着性薬学的製剤は、メトキシプロピルシアノアクリレートのようなシアノアクリレート系接着剤をコポリマーと混合することによって構築することができる。例えば、コポリマーはε-カプロラクトン-グリコリド/ラクチド-グリコリドコポリマーであり得る。
【０３６０】
ε-カプロラクトン-グリコリド/ラクチド-グリコリドコポリマーは、例えば、.13モルのグリコリドを1.18モルのε-カプロラクトンおよび触媒量のオクタン酸第一スズ(0.262ミリモル)および1-デカノール(3.275ミリモル)と混合することによって構築することができる。混合物を170℃の温度まで加熱し、ほぼ30分間攪拌し、続いて、混合物を120℃まで冷却して、ほぼ.65モルのグルコリドおよび.52モルのdl-ラクチドを加えることができる。次いで、混合物を170℃の温度まで再度加熱し、さらに6.5時間攪拌することができる。次いで、混合物を減圧下で、例えば、130℃の温度で1.5時間攪拌することによって、任意の未反応のモノマーもコポリマー溶液から除去することができる。
【０３６１】
メトキシプロピルシアノアクリレート、コポリマーおよび核酸発現構築体の薬学的製剤は一緒に混合し、対象の局所表面に適用することができる。例えば、混合物はほぼ90％のメトキシプロピルシアノアクリレート、5％のコポリマーおよび5％の核酸発現構築体であり得る。しかしながら、当業者であれば、発現構築体の正確な濃度は、用いる発現構築体のタイプ、例えば、アデノウイルスベクター、および適用の管理目標に依存することを認識する。
【０３６２】
本明細書の教示および当業者の知識を用い、接着性帯具を用いて核酸発現構築体を局所送達することを選択することができる。接着性帯具製剤で用いることができる核酸発現構築体の例はアデノウイルスベクターである。帯具によって皮膚を変換するためには、液状懸濁液としての核酸発現構築体製剤を接着性帯具のパッドにピペットで入れることができる。
【０３６３】
局所表面は発現構築体送達を促進するように予め処理することができる。例えば、局所表面を剃毛して、毛を除去することができ、または熱、ミクロポレーション、エレクトロポレーション、掻き落とし、または化学的方法で予め処理することができる。帯具は、例えば、必要であれば、18時間以上の間皮膚と皮膚との接触を保って、治療的目標を達成することができる。
【０３６４】
14.核酸摂取賦活剤
「核酸摂取賦活剤」は、細胞の表面に適用し、または細胞の表面と接触させて、細胞に対して外部にある核酸の摂取を容易とすることができるいずれかの薬剤、または複数の薬剤の組成物を指すものとして本明細書において定義される。例示的な薬剤はカチオン性脂質を含む。核酸摂取賦活剤としてのカチオン性脂質は、その各々を具体的に参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第6,670,332号、米国特許第6,399,588号、米国特許第6,147,055号、米国特許第5,264,618号、米国特許第5,459,127号、米国特許第5,994,317号、および米国特許第5,861,397号においてより詳細に議論されている。本発明の方法および組成物に適用することができるカチオン性脂質の例は第四級サイトフェクチン(cytofectin)を含む(米国特許第5,994,317号および米国特許第5,861,397号参照)。
【０３６５】
15.用量
治療剤または予防剤の有効量は、意図した目標、例えば、(i)過形成病巣の成長の阻害、または(ii)過形成病巣に対する免疫応答の誘導に基づいて決定される。
【０３６６】
当業者であれば、インビボおよびエックス・ビボ状況へ遺伝子送達をどのようにして適用するかをよく認識している。ウイルスベクターについては、一般には、ウイルスベクターストックを調製する。ウイルスの種類および達成可能な力価に応じて、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011または1×1012の感染粒子が患者に送達される。相対的摂取効率を比較することによって、同様の数字をリポソームまたは他の非ウイルス製剤で外挿することができる。薬学的に許容される組成物としての処方を以下に議論する。
【０３６７】
治療の数および用量双方に従って投与すべき量は、治療すべき対象、対象の状態および所望の保護に依存する。治療組成物の正確な量は実行者の判断にも依存し、各個人に特有である。
【０３６８】
ある態様において、治療組成物の患者への連続的供給を供するのが望ましい。局所投与では、反復適用が使用される。種々のアプローチでは、治療剤の限定されるが一定量を長時間にわたって供する遅延放出製剤を用いることができよう。内部適用では、対象となる領域の連続的灌流が好ましい。これはある場合には操作後のカテーテル処理、続いて、治療剤の連続的投与によって達成できる。灌流の時間は特定の患者および状況に対して臨床家が選択でき、時間は約1〜2時間、2〜6時間、約6〜10時間、約10〜24時間、約1〜2日、約1〜2週間以上の範囲となり得る。一般には、連続的灌流を介する治療組成物は、用量を投与する時間について調整された単一または複数注射によって与えられたものと同等である。
【０３６９】
J.対象の表面の処理
本発明のある種の薬学的組成物は対象の表面への適用のために処方される。例えば、表面は皮膚表面、病巣の表面、病巣の切除に続いての手術台、創傷の表面、粘膜表面、または胃腸管の裏面のような中空内臓の表面であってよい。
【０３７０】
癌は、表面を有する「腔」を作り出す外科的切除によって除去することができる。本発明の治療組成物は外科的処置の時点で、またはその後に投与することができる。これは、本質的には、腔の表面の「局所的」処置の1つの例である。組成物の容量は、腔の全表面が発現カセットによって接触されるのを確実とするのに十分なものとすべきである。
【０３７１】
本明細書において記載の方法のいくつかの態様において、薬学的組成物は適用を貼り付けによって適用される。貼り付けの例はスポンジ、綿棒、綿-先端アプリケーター等を含む。いくつかの態様において、機械的貼り付けは経皮性または経皮的送達デバイスを介するものであり、望ましい。綿棒を介する貼り付けは、綿棒および局所表面の間の一つまたは複数の相互作用を必要とする。本発明の薬学的製剤は、綿棒またはスポンジを表面に反復して接触させることによって、または綿棒またはスポンジを直線状運動、円状運動、またはその組合せの運動にて表面を横切って運動させることによって、綿棒またはスポンジを介して局所表面に適用することができる。加えて、綿棒、スポンジ、経皮性または経皮的送達デバイスは一定時間局所表面に置くことができる。これらのアプローチのいずれも、腫瘍除去に引き続いて、ならびに最初の外科的処置の間に用いることができる。なおもう1つの態様において、外科的侵入部位の閉鎖に先立ってカテーテルを腔に挿入する。次いで、腔を所望の時間連続的に灌流することができる。なおさらなる態様において、本発明の薬学的製剤は、タンポン様アプリケーターまたはフォーム分散液アプリケーターを用い、膣または直腸のような局所表面に適用することができる。薬学的の送達のためのタンポン様アプリケーターの使用に関する方法は、その各々を具体的に参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第6,588,043号に見出され、フォーム分散液アプリケーターの使用に関する方法は米国特許第4,112,942号に見出される。
【０３７２】
この治療のもう1つの形態において、診断または治療組成物「局所」適用は、口、咽頭、食道、喉頭、気管、胸膜腔、腹腔、もしくは膀胱、結腸、食道、胃または他の内臓器官を含めた中空器官腔のような天然体腔を標的とする。種々の方法を使用して、これらの内臓器官または腔表面への「局所」適用を行うことができる。例えば、咽頭における口腔は、マウスウオッシュまたはマウスリンスで単に口をスイッシングし、およびうがいすることによって行うことができる。いくつかの適用において、口のスイッシングまたはうがいは、複数回反復されると考えられる。ある適用においては、対象は、吐き出しまたは嚥下の前にマウスウオッシュまたはマウスリンスを口腔中に一定時間保持することができる。胃内の処理は、そうでなければ酸性環境のpHの上昇を必要とする。しかしながら、喉頭および気管内での局所処理は、内視鏡での可視化および治療組成物の局所送達、またはスプレーまたはエアロゾル製剤を介する投与を必要とする。膀胱または結腸粘膜のような内臓器官は、注入でのカテーテル留置、または再度、膀胱鏡または他の内視鏡器具での直接的可視化を必要とする。体腔は、それらの領域へのアクセスを供するカテーテル留置または外科的アプローチによってアクセスすることもできる。
【０３７３】
他の態様において、局所表面を処理または予め処理して、浸透性を増加させ、および/またはブロッキング細胞の層を除去して、核酸の摂取/ウイルスの感染性を改善することができる。処理は酢酸または他の膜浸透剤のような洗浄液の使用を含むことができる。他の薬剤は低張溶液、イオンキレーター、カチオン性ペプチド、オクルジンペプチド、接合複合体の細胞外部分を破壊するように設計されたペプチド、細胞骨格破壊剤、抗体、エーテル、神経伝達物質、グリセロール、FCCP、オキシダント、および炎症のメディエーターを含む。さらなる特別な態様において、イオンキレーターはEGTA、BAPTAまたはEDTAであってよく；カチオン性ペプチドはポリ-L-リシンであってよく；細胞骨格破壊剤はサイトカラシンBまたはコルヒチンであってよく；神経伝達物質はカプシアノシドであってよく；オキシダントは過酸化水素またはオゾンであってよく；および炎症のメディエーターはTNFαであってよい。抗体は抗E-カドヘリン抗体であってよい。
【０３７４】
または、同一の効果を機械的手段によって達成することができる。ある態様において、処理はブロッキング細胞の層を除去するための掻き落としを含むことができる。掻き落としは、例えば、ブロッキング細胞の0.1mm〜3mmを超えるまでの除去を含むことができる。ブロッキング細胞を除去するための局所表面の掻き落としは、限定されるわけではないが、医学スパチュラ、針、歯科ピック、スカルペル、ナイフ、皮膚磨耗デバイス、または皮膚磨耗に適した粒子の製剤のような種々のデバイスで達成することができる。皮膚掻き落としのための皮膚磨耗デバイスの例は、参照により本明細書にその全体を組み入れる、米国特許第6,629,091号に見出される。
【０３７５】
いくつかの態様において、処理は、ブロッキング細胞の局所表面を除去するためのレーザーの使用を含むことができる。ある態様において、処理は局所表面からブロッキング細胞を除去するための電極の使用を含むことができる。他の態様において、処理はプラズマガス電極を介するブロッキング細胞の除去を含むことができる。さらなる態様において、処理は研磨クレンザー、低温処理または加熱での予備処理を含むことができる。レーザーを用いる局所表面からのブロッキング細胞の除去に関する方法および例は米国特許第5,423,803号、および米国特許第6,273,884号に見出され、電極を介するブロッキング細胞除去の例は米国特許第6,024,733号および米国特許第6,309,387号に見出され、プラズマガス電極を介するブロッキング細胞除去に関する例は米国特許第6,629,974号に見出され、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる。薬物送達のための皮膚浸透性を増大させるための熱の使用に関する方法は米国特許第4,898,592号に見出すことができる。
【０３７６】
ある態様において、肺粘膜の処理はスプレーの形態の吸入された薬学的製剤の使用を必要とする。いくつかの態様において、ネブライザー装置を介してスプレーを肺粘膜に送達することができる。例えば、本発明の薬学的製剤の送達は、マウスピース、マスク、気管内チューブ、鼻チューブ等のような、対象の肺への送達用の界面を含むことができる。界面は吸入チューブに連結することができる。吸入チューブは、濾過された大気中に捕獲されたパルス量の薬学的製剤を供するための装置に連結することができる。装置はパルス空気用の流入口、ディフューザー邪魔板を供えた高圧チャンバー、およびフィルターを備えた大気へのコネクションを含むことができる。ネビュライザーを介する薬学的製剤の送達に関する方法は、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第6,269,810号および米国特許第6,705,316号に見出すことができる。
【０３７７】
K.予防的療法
本明細書において記載の方法のある態様は、対象において病気または健康関連疾患を予防する方法に関する。予防的戦略は今日医学において鍵となる重要なものである。例えば、HNSCCを持つ患者が治癒された後、彼らは第二の原発性腫瘍を有する有意な(30〜40％)確率を有する(Khuri et al.,1997)。危険性の高いの集団の化学予防は、第二の原発性腫瘍の発生を低下させ、生存を改善することができる(Khuri et al.,1997)。上部気道消化管(UADT)の粘膜は微小転移(Bedi et al.,1996)によって、または領域癌化(Lydiatt et al.,1998)によって、第二の原発性腫瘍を発生する危険性がある。遺伝子改変は組織学的におよび臨床的に正常に見える粘膜組織で見出されるので、これらの細胞が第二の原発性腫瘍を形成するまで進行し得る。従って、これらの前癌性細胞は、治療遺伝子導入のための標的である。前癌細胞における細胞周期のG1-相を阻止すると、細胞進行を停止させることができる。
【０３７８】
予防的療法のもう1つの例は、放射線治療によって誘導されるもののような、反応性酸素種の効果によって起こり得る正常組織の感染または炎症の予防である。例えば、スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドラジカルを過酸化水素に解毒することが公知である。スーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸の送達に関する方法および組成物は、例えば、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,599,712号、米国特許第6,221,712号および米国特許第6,887,856号に見出される。
【０３７９】
この同一戦略を他の病気に適用することができる。危険性がある集団は、危険因子、または従前に治療された病気の履歴を持つ患者を含むことができる。
【０３８０】
用量、治療の回数および治療の持続に従って投与されるべき薬学的組成物の量は、治療すべき対象、対象の状態、予防すべき病気の性質、および所望の保護に依存する。治療組成物の正確な量は、実行者の判断にも依存し、各個体に特有である。例えば、組成物の適用の頻度は1日につき1回、1日につき2回、1週間につき1回、1週間につき2回、または1ヶ月につき1回とすることができる。治療の持続は1ヶ月〜1年またはそれ以上の範囲とすることができる。再度、正確な予防養生法は、対象、危険因子の性質、および実行者の判断にかなり依存する。
【０３８１】
本発明の組成物は、ワクチン接種、またはワクチン接種および免疫療法の組合せを介するように、対象における病気の免疫予防に適用することもできる。製剤は、当業者に公知の免疫化スケジュールにて適用される。免疫予防およびワクチン接種に関する方法は、その各々を具体的参照により本明細書に組み入れる、Robinson et al.(2003)およびPlotkin et al.(2003)に記載されている。
【０３８２】
L.免疫応答の増強
本明細書において記載の方法のいくつかの態様において、治療的応答は、対象において免疫応答を増強することによって得られる。免疫応答の増強は、病気の発生または進行を妨げるための病気の免疫療法または免疫予防を目的とすることができる。ある態様において、例えば、病気は癌である。他の態様において、病気は感染症、または自己免疫疾患のような炎症性疾患である。
【０３８３】
従って、ある態様において、薬学的製剤は、免疫応答を増強し、または誘導するために対象に投与される。ある態様において、治療核酸は限定されるわけではないが、抗原アジュバントおよび他の免疫モジュレーターのような一つまたは複数の免疫刺激剤をコードし、またはそうでなければそれを保有する。
【０３８４】
標的対象内に含まれる一つまたは複数の細胞は、対象への核酸の投与の後に治療核酸によってコードされる配列を発現することができる。例示的なプロトコルは、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れる、Robinson et al.(2003)およびPlotkin et al.(2003)に記載されている。
【０３８５】
ある他の態様において、薬学的製剤それ自体は一つまたは複数のさらなる免疫刺激剤を含むことができる。なおさらに、いくつかの態様において、一つまたは複数のさらなる薬剤を抗原または他の免疫刺激剤にいずれかの組合せで共有結合させる。
【０３８６】
抗原は、例えば、癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、酵素のような他の自己遺伝子、および微生物に由来する遺伝子に由来するポリペプチド配列であり得る。種々の遺伝子についてのヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドコーディング配列は従前に開示されており、当業者に公知のコンピュータ化データベースで見出すことができる。1つのそのようなデータベースはNational Center for Biotechology Information's GenbankおよびGenPeptデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/)である。これらの公知の遺伝子についてのコーディング領域は、本明細書において開示された技術を用い、または当業者に公知であるいずれかの技術(例えば、Sambrook et al.,2001)によって増幅し、組み合わせ、および/または発現させることができる。核酸はインビトロ発現系で発現させることができるが、好ましい態様においては、核酸はインビボ複製および/または発現用のベクターを含む。
【０３８７】
適当なアジュバントは、サイトカイン、トキシンまたは合成組成物のような全ての許容される免疫刺激化合物を含む。本発明に従って使用できるアジュバントの非限定的リストは、MDA-7、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、thur-MDPおよびnor-MDPのようなMDP化合物、CGP(MTP-PE)、リピドA、およびモノホスホリルリピドA(MPL)を含む。細菌から抽出された3つの成分、MPL、トレハロースジマイコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)を2％スクアレン/Tween80エマルジョン中に含有するRIBI、MHC抗原、フロイントの完全アジュバント(死滅させたMycobacterium tuberculosisを含有する免疫応答の非特異的刺激剤)、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム、Adjumer(商標)(すなわち、PCPP塩；ポリホスファゼン)；Adju-Phos(すなわち、リン酸アルミニウムゲル)；Algal Glucan(すなわち、b-グルカン；グルカン)；アルガムムリン(Algammulin)(すなわち、ガンマイヌリン/ミョウバン複合アジュバント)；アルヒドロゲル(Alhydrogel)(すなわち、水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン)；抗原製剤(すなわち、SPT、AF)；Avridine(登録商標)(すなわち、N,N-ジオクタデシル-N',N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン；CP20,961)；BAY R1005(すなわち、N-(2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-b-D-グルコピラノシル)-N-オクタデシルドデカノイルアミドヒドロ酢酸)；カルシトリオール(Calcitriol)(すなわち、1a,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジ(OH)2D3；1,25-DHCC；1a,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール)；リン酸カルシウムゲル(すなわち、リン酸カルシウム)；コレラヘロトキシン(CT)およびコレラトキシンBサブユニット(CTB)(すなわち、CT；CTBサブユニット；CTB)；コレラトキシンA1-サブユニット-プロテインA D-断片融合タンパク質(すなわち、CTA1-DD遺伝子融合タンパク質)；CRL1005(すなわち、ブロックコポリマーP1205)；サイトカイン含有リポソーム(すなわち、サイトカイン含有脱水再水和小胞)；DDA(すなわち、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム；臭化ジメチルジステアリルアンモニウム(CAS登録番号3700-67-2))；DHEA(すなわち、デヒドロエピアンドロステロン；アンドロステノロン；プラステロン)；DMPC(すなわち、ジミリストイルホスファチジルコリン；1,2-ジミリストイル-sn-3-ホスファチジルコリン；(CAS登録番号18194-24-6))；DMPG(すなわち、ジミリストイルホスファチジルグリセロール；sn-3-ホスファチジルグリセロール-1,2-ジミリストイル、ナトリウム塩(CAS登録番号67232-80-8))；DOC/ミョウバン複合体(すなわち、デオキシコール酸ナトリウム塩；DOC/Al(OH)3/ミネラル担体複合体)；フロイントの完全アジュバント(すなわち、CIA；FCA)；フロイントの不完全アジュバント(すなわち、IFA；FIA)；ガンマイヌリン；ゲルブ(Gerbu)アジュバント；GM-CSF(すなわち、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子；サルグラモスチム(Sargramostim)(酵母-derivedrh-GM-CSF))；GMDP(すなわち、N-アセチルグルコサミニル-(b1-4)-N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CAS登録番号70280-03-4))；イミキモド(Imiquimod)(すなわち、1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ［4,5-c］キノリン-4-アミン；R-837；S26308)；ImmTherTM(すなわち、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Ana-D-イソGlu-L-Ala-グリセロールジパルミテート；DTP-GDP)；共刺激分子に対する抗体を含有するイムノリポソーム(すなわち、脱水再水和小胞(DRV)から調製されたイムノリポソーム)；インターフェロン-g(すなわち、Actimmune(登録商標)(rhIFN-ガンマ,Genentech,Ine.)；免疫インターフェロン；IFN-g；ガンマ-インターフェロン)；インターロイキン-1b(すなわち、IL-10；IL-1；ヒトインターロイキン1b成熟ポリペプチド117-259)；インターロイキン-2(すなわち、IL-2；T細胞成長因子；アルデスロイキン(デス-アラニル-1,セリン-125ヒトインターロイキン2)；Proleukin(登録商標)；Teceleukin(登録商標))；インターロイキン-7(すなわち、IL-7)；インターロイキン-12(すなわち、IL-12；ナチュラルキラー細胞刺激因子(NKSF)；細胞傷害性リンパ球成熟因子(CLMF))；ISCOM(s)TM(すなわち、免疫刺激複合体)；Iscoprep 7.0.3.TM；リポソーム(すなわち、共に捕獲されたインターロイキン-2、BisHOPまたはDOTMAを含むまたは含まないタンパク質またはTh細胞および/またはB細胞ペプチド、または微生物を含有するリポソーム(L)；A、［L(抗原)］)；ロキソリビン(Loxoribine)(すなわち、7-アリル-8-オキソグアノシン)；LT-OAまたはLT経口アジュバント(すなわち、E.coli不安定エンテロトキシンプロトキシン)；MF59；MONTANIDE ISA 51(すなわち、精製されたIFA；フロイントの不完全アジュバント)；MONTANIDE ISA 720(すなわち、代謝可能油アジュバント)；MPLTM(すなわち、3-Q-デスアシル-4'-モノホスホリルリピドA；3D-MLA)；MTP-PE(すなわち、N-アセチル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-(ヒドロキシ-ホスホリルオキシ))エチルアミド、モノナトリウム塩)；MTP-PEリポソーム(すなわち、MTP-PE抗原提示リポソーム)；ムラメチド(すなわち、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；ムラパルニチン(すなわち、Nac-Mur-L-Thr-D-イソGIn-sn-グリセロールジパルミトイル)；D-ムラパルミチン(すなわち、Nac-Mur-D-Ala-D-イソGln-sn-グリセロールジパルミトイル)；NAGO(すなわち、ノイラミニダーゼ-ガラクトースオキシダーゼ)；非イオン性界面活性剤小胞(すなわち、NISV)；プロイラン(Pleuran)(すなわち、b-グルカン；グルカン)；PLGA、PGA、およびPLA(すなわち、乳酸およびグリコール酸のホモ-およびコポリマー；ラクチド；グリコリドポリマー；ポリ-乳酸-コ-グリコリド)；プルロニックL121(すなわち、ポロキサマー401)；PMMA(すなわち、ポリメチルメタクリレート)；PODDSTM(すなわち、プロテイノイドマイクロスフィアー)；ポリrA：ポリrU(すなわち、ポリ-アデニル酸-ポリ-ウリジル酸複合体)；ポリソルベート80(すなわち、Tween80；ソルビタンモノ-9-オクタデセノエートポリ(オキシ-1,2-エタンジイル)誘導体)；プロテインコキレエート(Protein Cochleates)；QS-21(すなわち、Stimulon(商標)  QS-21アジュバント)；Quil-A(すなわち、Quil-Aサポニン、Quillajaサポニン)；リヒドラゲルHPA(すなわち、高タンパク質吸着水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン)；リヒドラゲルLV(すなわち、低粘度水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン)；S-28463(すなわち、4-アミノ-オテク,-ジメチル-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ［4,5-c］キノリン-1-エタノール)；SAF-1(すなわち、SAF-m；シンテックス(Syntex)アジュバント製剤)；スクラボ(Sclavo)ペプチド(すなわち、IL-1b 163-171ペプチド)；センダイプロテオリポソーム、センダイ含有脂質マトリックス(すなわち、センダイ糖タンパク質含有小胞；融合誘導プロテオリポソーム；FPL)；Span 85(すなわち、アルラセル(Arlacel)85,ソルビタントリオレエート)；スペコール(Specol)；スクアラン(すなわち、ス��ナカン(Spinacane)；Robane(登録商標)；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチルテトラコサン)；スクアレン(スピナセン(Spinacene)；スプラエン(Supraene)；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22テトラコサヘキサエン)；ステアリルチロシン(すなわち、オクタデシルチロシン塩酸)；Theramide(商標)(すなわち、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルイヌラミル-L-Ala-D-イソGlu-L-Ala-ジパルミトキシプロピルアミド(DTP-DPP))；スレオニル-MDP(すなわち、Termurtide(商標)；［thr1］-MDP；N-アセチルムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン)；Ty粒子(すなわち、Ty-VLP(ウイルス様粒子))；ウォルターリード(Walter Reed)リポソーム(すなわち、水酸化アルミニウムに吸着されたリピドAを含有するリポソーム、［L(リピドA＋抗原)＋ミョウバン］)。
【０３８８】
アジュバントに加えて、アンチセンスRNA、RNAi、Cpgモチーフをコードする核酸、およびT細胞免疫性をアップレギュレートし、またはサプレッサー細胞活性をダウンレギュレートすることが示されている生物学的応答モディファイアー(BRM)のような免疫モジュレーターを投与するのが望ましい。そのようなBRMは、限定されるわけではないが、シメチジン(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline,PA)；または低用量シクロホスファミド(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead,NJ)、およびg-インターフェロン、IL-2またはIL-12のようなサイトカイン、またはB-7のような免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【０３８９】
本発明のさらなる態様において、一つまたは複数の免疫刺激剤をコードする、またはそうでなければそれを保有する核酸を、核酸の発現が対象において液性または細胞媒介免疫応答を誘導できるように、対象に投与することができる。
【０３９０】
免疫応答は能動的または受動的免疫応答であり得る。または、応答はリンパ球が動物(例えば、患者)から得られ、次いで、抗原性組成物を含む組成物でパルスされた養子免疫療法のアプローチの一部であってよい。本態様において、抗原性組成物は、さらなる免疫刺激剤、またはそのような薬剤をコードする核酸を含むことができる。リンパ球は、参照により本明細書に組み入れられるRosenberg et al.,1986に開示されているように、対象の血液から、または腫瘍組織から入手して、腫瘍浸潤性リンパ球を得ることができる。特別な態様において、リンパ球は末梢血液リンパ球である。1つの特別な態様において、リンパ球は同一または異なる動物(例えば、同一または異なるドナー)に投与することができる。例えば、動物(例えば、患者)は、乳癌または前立腺癌のような癌を有してもよく、または有することが推測される。他の態様において、免疫応答を増強する方法は、例えば、後により詳細に議論するように、癌ワクチン療法のような癌療法と組み合わせて実施される。
【０３９１】
標的対象内に含まれる一つまたは複数の細胞は、対象への核酸の投与の後に核酸によってコードされる配列を発現することができる。例示的なプロトコルは、その各々を具体的に参照により本明細書に組み入れる、Robinson et al.(2003)およびPlotkin et al.(2003)に記載されている。
【０３９２】
適当な腫瘍抗原の例は、限定されるわけではないが、Dalgleish,2004；Finn,2003；およびHellstrom and Hellstrom,2003に記載されたものを含めて当業者に公知である。その各々を、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０３９３】
腫瘍抗原をコードする核酸の粘膜表面への局所適用は予防または予防的療法と考えることができる。従って、そのような粘膜適用は、癌のような過剰増殖病の引き続いての発生に対して免疫保護効果を生じさせることができる。
【０３９４】
いくつかの態様において、腫瘍抗原をコードする核酸は、癌のような過剰増殖病の発生に先立って粘膜表面に適用できると考えられる。微生物に由来する一つまたは複数の抗原を含有する組成物の粘膜適用は従前に報告されている。これらの研究は、そのような抗原の粘膜適用が、そのような表面に感染する微生物に対する予防免疫応答を誘導できることを示す(Gallichan et al.,1993；Gallichan and Rosenthal,1995；Gallichan and Rosenthal,1996)。逆に、確立された感染に引き続いてのそのような抗原の粘膜適用は、重要な治療効果を減少し、または無くするかもしれないことが報告されている。例えば、感染の確立後に投与される現在入手可能なポリオおよび肺炎球菌ワクチンは、これらの微生物への曝露に先立つ投与と比較して治療的に効果的ではない。
【０３９５】
M.療法の二次形態
1.概要
本発明のある態様において、本発明は対象における病気の検出、治療または予防に関し、対象は療法の一つまたは複数の二次形態を受ける。
【０３９６】
本発明のある局面は、ヒト対象のような対象にヒトACCのモジュレーターを投与する方法に関する。これらの組成物は、ヒトACCのモジュレーターの投与が有益であることが当業者によって知られ、または推測される病気の予防または治療に適用することができる。
【０３９７】
例えば、前記のように、治療または予防すべき病気または健康関連疾患は肥満、過剰増殖病、心血管病、糖尿病、またはインスリン抵抗性であり得る。ヒトACCのモジュレーターは、もう1つの薬剤または治療方法と共に投与することができる。例えば、ヒト対象において真性糖尿病を治療する目的でのヒトACCのモジュレーターの投与は、経口低血糖症酸またはインスリン療法のような糖尿病に対する他の療法に先行し、それに従い、またはそれと同時とすることができる。急性心筋梗塞を治療する目的でのヒトACCのモジュレーターの投与は、例えば、血管形成術または冠動脈バイパス手法の後に投与することができる。もう1つの例において、肥満を治療または予防する目的でのヒトACCのモジュレーターの投与は、肥満の治療のための食事介入または胃外科的処置に先行し、またはそれに従うことができる。
【０３９８】
患者へのヒトACCのモジュレーターの投与は、治療剤の投与のための一般的プロトコルに従い、限定されるわけではないが、患者の他の医学的状態、および患者が受ける他の療法を含めた他のパラメーターを考慮する。治療サイクルは必要に応じて反復されると予想される。
【０３９９】
本発明のヒトACCのモジュレーターでの治療は、数分〜数週間の範囲の間隔だけ他の療法に先行し、またはその後に行うことができる。もう1つの薬剤が投与される態様において、薬剤が細胞に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、各送達の時間の間に有意な時間が消滅しないことを一般には確実とする。例えば、本発明の組成物と実質的に同時に(すなわち、約1分未満内に)1つの薬剤の2、3、4以上の用量を投与することができる。他の局面において、治療剤または方法は、本発明の組成物の治療量の投与に先立っておよび/またはその後に、約1分〜約48時間以上内に、または本明細書において記載されていないいずれかの量の時間に先立って、および/または後に投与することができる。ある他の態様において、本発明のヒトACCのモジュレーターは、外科的処置または医学的療法のようなもう1つの治療様式の投与に先立って、および/または後に、約1日〜約21日内に投与することができる。いくつかの状況において、治療のための時間を有意に延長するのは望ましく、しかしながら、各投与の間に数週間(例えば、約1〜8週間、またはそれ以上)が経過する。
【０４００】
種々の組合せを使用することができ、ヒトACCのモジュレーターは「A」と命名され、いずれかの他の治療剤または方法とすることができる第二の治療剤は「B」である。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
【０４０１】
2.二次的抗癌療法
当業者に公知の多種多様の癌療法を、特許請求された本発明の組成物を組み合わせて用いることができる。現存の癌療法および化学療法剤のいくつかは後に記載する。当業者であれば、本発明の方法および組成物と組み合わせて用いることができる他の抗癌療法の存在および開発を認識し、後に記載する療法の形態に限定されるものではない。
【０４０２】
治療核酸の有効性を増大させるために、過剰増殖病の治療において有効な一つまたは複数の他の薬剤または様式とそれとを組み合わせるのが望ましい。治療組成物は組み合わせ、または別々に投与することができる。治療目標は癌性細胞を殺し、またはその増殖を阻害することである。このプロセスは、細胞を同時に発現構築体および薬剤または第二の因子と接触させることを含むことができる。これは、細胞を、双方の薬剤を含む単一組成物または薬理学的製剤と接触させることによって、または2つの区別される組成物または製剤を細胞と同時に接触させることによって達成することができ、1つの組成物は、発現構築体を含み、および他の組成物は第二の薬剤を含む。
【０４０３】
または、核酸療法は、数分〜数週間の範囲の間隔だけ他の薬剤または様式に先行し、またはその後に行うことができる。他の薬剤および発現構築体を別々に適用する態様において、薬剤および発現構築体が有利に組み合わせた療法の効果を依然として発揮できるように、有意な時間が各送達の時間の間に消滅しないことを一般には確実とする。そのような状況においては、細胞を療法の双方の停滞と、相互から約12〜24時間内に、より好ましくは、相互から約6〜12時間内に接触させることができると考えられる。いくつかの状況において、治療用の時間を有意に延長するのが望ましいが、数日(2、3、4、5、6または7)〜数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)が各投与の間に経過する。
【０４０４】
種々の組合せを使用することができ、例えば、第一の療法は「A」であって、第二の療法は「B」である。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
【０４０５】
患者への本発明の治療核酸の投与は、もしあればベクターの、毒性を考慮し、化学療法の投与のための一般的なプロトコルに従う。治療サイクルは、必要に応じて、反復されると予測される。また、種々の標準的な療法、ならびに外科的介入を、記載された過剰増殖細胞療法と組み合わせて適用することができると考えられる。
【０４０６】
a.放射線療法
放射線療法は、DNAの損傷を誘導する放射線および波、例えば、γ-照射、X線、UV-照射、マイクロ波、エレクトロニック発光、放射性同位体等を含む。療法は、局所化された腫瘍部位を放射線の前記形態で照射することによって達成することができる。これらの因子の全ては、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、および染色体の組立および維持に対して広い範囲のDNA損傷を行うようである。
【０４０７】
X線についての用量範囲は、延長された時間(3〜4週間)についての50〜200レントゲンの日用量から2000〜6000レントゲンの単一用量の範囲である。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、照射される放射線の強度およびタイプ、および新形成細胞による摂取に依存する。
【０４０８】
本発明の放射線療法の文脈では、放射線療法は本明細書において記載の治療核酸の1つでの治療の前、その間またはその後に行うことができ、標準的なプロトコル当たり反復することができる。
【０４０９】
b.外科的処置
癌性増殖の除去のための外科的治療は、一般には、腫瘍および癌の治療のための標準的な手法である。これは、全部の癌性増殖を除去することを試みる。しかしながら、外科的処置は一般には化学療法および/または放射線療法と組み合わせて、いずれかの残りの新形成または悪性細胞の破壊を確実とする。従って、本発明の関係では、本発明の腫瘍細胞特異的-ペプチドを用いることに加えて、外科的処置を用いて、細胞特異的癌療法を達成することができる。
【０４１０】
外科的介入の場合には、本発明の組成物を手術前に用いて、操作できない腫瘍を切除に従わせるようにすることができる。または、本発明を外科的処置の時点で、および/またはその後に用いて、残存するまたは転移性の病気を検出し、または治療することができる。例えば、対象の口腔中の切除した腫瘍床は、本発明の薬学的組成物の1つの適用によって検出し、または治療することができる。適用は切除後に継続することができる。周期的な外科的処置後治療も考えられる。
【０４１１】
ある態様において、治療すべき腫瘍が少なくとも最初は切除可能でなくてもよい。診断または治療ウイルス構築体での治療は、周辺における収縮のため、またはある特定の侵入性部分の排除によって、腫瘍の切除性を増大させることができる。さらに、特異的組織タイプにおいて色変化を引き起こす能力を持つレポーター遺伝子を含むウイルス構築体は、過剰増殖細胞の外科的除去を助けることができる。治療に続き、切除は可能である。切除に続いてのさらなる治療は、腫瘍部位における微視的残存病を排除するよう働くことである。
【０４１２】
原発性腫瘍または切除後腫瘍床についての、治療の典型的なコースは複数の投薬を含む。典型的な原発性腫瘍治療は、2週間にわたる6用量の適用を含む。2週間の養生法は1回、2回、3回、4回、5回、6回以上反復することができる。治療のコースの間に、計画した投与を完了する必要性は再度評価することができる。
【０４１３】
治療は種々の「単位用量」を含むことができる。単位用量は、治療組成物の所定量を含有するものとして規定される。投与すべき量、および特定の経路および製剤は臨床分野における当業者の技量内のものである。単位用量は単一注射として投与する必要はなく、設定された時間にわたる連続的注入を含むことができる。本発明の単位用量は、便宜には、ウイルス構築体についてのプラーク形成単位(pfu)換算で記載することができる。単位用量は103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfuまたはそれ以上の範囲である。
【０４１４】
c.化学療法剤
癌療法は化学および放射線ベースの双方の治療での種々の併用療法も含む。組合せ化学療法は、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、タクソール、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ベンズイミダゾール、およびメトトレキセート、またはいずれかのアナログまたはその誘導体変種を含む。本明細書において用いる用語「化学療法」は、癌のための治療として用いられる薬物、トキシン、化合物、組成物または生物学的存在の使用と定義される。これらは、例えば、DNAを直接的に架橋する薬剤、DNAにインターカレートする薬剤、微小管系を破壊することができる薬剤、腫瘍サプレッサータンパク質の蓄積を引き起こす薬物、および核酸合成に影響することによって染色体および分裂異常に導く薬剤であり得る。
【０４１５】
核酸、具体的にはDNAを直接的に架橋する薬剤が考えられ、ここでは、相乗的抗新形成組み合わせに導くDNA損傷の結果とすることが示される。シスプラチン、および他のDNAアルキル化剤のような薬剤を用いることができる。
【０４１６】
DNAを損傷する薬剤は、DNA複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化合物も含む。これらの化合物の例は(ドキソルビシンとしても公知の)アドリアマイシン、(エトポシドとしても公知の)VP-16、ベラパミル、ポドフィロトキシン等を含む。新生物の治療のために臨床的状況で広く用いられるこれらの化合物は、アドリアマイシンについての21日の間隔で25〜75mg/m2の範囲の用量で静脈内にてボーラス注射を介して、エトポシドについての35〜100mg/m2の範囲の用量にて静脈内または経口にて投与される。
【０４１７】
細胞の微小管系を破壊する薬剤は、例えば、ベンズイミダゾールを含む。ベンズイミダゾールは、寄生性線虫に対して、程度は低いが、条虫および吸虫に対して優れた活性を呈する抗蠕虫の広いスペクトルのクラスである。ベンズイミダゾールは、やはり抗真菌活性を有する非常に効果的な抗原生動物剤であることも示されている。現在、ベンズイミダゾールは、微小管系に結合し、その機能を破壊することによってそれらの細胞傷害性効果を発揮すると考えられている(Lacey,1988；Friedman and Platzer,1980)。チューブリンはベンズイミダゾールの標的であるという示唆は、蠕虫および哺乳動物チューブリンの豊富化抽出物を用いる薬物-結合実験の結果によって支持されている(Lacey,1988)。さらに、哺乳動物チューブリンを用いる競合薬物-結合実験は、ベンズイミダゾールが、コルヒチン結合について競合し、インビトロにてL1210ネズミ白血病細胞の成長を阻害することを示した(Friedman and Platzer,1978；Lacey and Watson,1989)。しかしながら、抗蠕虫剤として投与した場合にベンズイミダゾールは線虫に対して選択的に毒性であるが、宿主に対しては毒性ではない。対照的に、ベンズイミダゾールは哺乳動物チューブリンのインビトロ重合を抑制する。ベンズイミダゾールに対する宿主および寄生虫マクロ分子の間の親和性(Russell et al.,1992；Kohler and Bachmamn,1981)、および宿主および寄生虫の間のベンズイミダゾールのファルマコキネティックス双方の差は、ベンズイミダゾールの選択的毒性の原因として示唆されている(Gottschall et al.,1990)が、この選択的毒性の現実の「分子的基礎は依然として不明瞭である。
【０４１８】
メベンダゾール、または5-ベンゾイル-2-ベンズイミダゾールカルバミン酸メチルエステルはベンズイミダゾールクラスの化合物のメンバーである。最近、メベンダゾールは、非小細胞肺癌細胞においてチューブリンを脱重合することによって有糸分裂阻止およびアポトーシスを誘導することが判明している(Sasaki et al.,2002)。メベンダゾールは、インビトロおよびインビボ双方においてヒト癌細胞株に対する優れた抗腫瘍効果を誘導することも判明している(Mukhopadhyay et al.,2002)。
【０４１９】
メベンダゾールは、最初、Brugmans et al.(1971)によって行われた研究の結果として回虫感染の治療のために導入された。それは、動物およびヒト使用のための広スペクトル抗蠕虫剤としての(Van den Bossche et al.,1982)動物およびヒト双方において広く使用される広スペクトル抗蠕虫剤のシリーズのプロトタイプである(Michiels et al.,1982)。抗蠕虫特性を持つ関連ベンズイミダゾール誘導体はアルベンダゾールおよびフルベンダゾールを含む。代替ベンズイミダゾールはフェンベンダゾール、アルベンダゾール、アルベンダゾールスルホン、オキシベンダゾール、リコベンダゾール、チアベンダゾール、オクスフェンダゾール、フルベンダゾールおよびカルベンダジムを含む。
【０４２０】
メベンダゾールは、影響された虫の蓋および腸細胞において細胞質微小管の選択的消失を引き起こす。分泌物質はゴルジ領域に蓄積し、アセチルコリンエステラーゼの分泌およびグルコースの摂取は損なわれ、グリコーゲンは枯渇される。メベンダゾールのこれらの効果は宿主細胞においては認められない。メベンダゾールは、インビトロにて寄生虫のチューブリンに対する高い親和性を有するが、宿主チューブリンにも結合する。その選択的作用についての生化学的基礎は従って不明瞭である(Van den Bossche,1981；Watts et al.,1982参照)。
【０４２１】
メベンダゾールは高度に親油性であり、水溶解度は1μg/ml未満である。その結果、MZの錠剤は貧弱かつ並外れて吸収され、血漿中の薬物の濃度は低く、摂取された用量を反映しない(Witassek et al.,1981)。従って、メベンダゾールの慣用的製剤の結果、薬物の低い生物学的利用性、および胃腸管からの並外れた吸収がもたらされる。多くの他のベンズイミダゾールおよびベンズイミダゾール誘導体もまた高度に親油性であって、胃腸管から並外れて吸収される。その結果、ベンズイミダゾールは、経口または局所適用が考えられる薬学的製剤において有意である。
【０４２２】
本明細書において記載の種々の化学療法についての投与経路は、限定されるわけではないが、皮内、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、および経口および局所のような種々の経路を介して投与することができると考えられる。
【０４２３】
d.免疫療法
免疫療法は、一般には、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠して、癌細胞を標的とし、それを破壊する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独では療法のエフェクターとして働くことができるか、またはそれは他の細胞を動員して、現実に細胞殺傷を行うことができる。抗体は薬物またはトキシン(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等)にコンジュゲートすることができ、単に標的化剤として働く。または、エフェクターは腫瘍細胞標的と直接的にまたは間接的に相互作用する表面分子を保持するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。
【０４２４】
免疫療法は、従って、本明細書において記載の方法と組み合わされて、併用療法の一部として用いることができよう。併用療法についての一般的なアプローチは後に議論する。一般に、腫瘍細胞は、標的化に使用でき、すなわち、他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを担わなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも本発明の関係で標的化に適している。通常の腫瘍マーカーは癌胚性抗原、前立腺特異的抗原、子宮腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルLewis抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbBおよびp155を含む。
【０４２５】
e.遺伝子
なおもう1つの態様において、第二の治療はさらなる遺伝子療法であり、そこでは、さらなる形態の治療核酸(例えば、静脈内送達用の核酸の製剤)が、本明細書において記載さrた薬学的組成物の前に、その後に、またはそれと同時に投与される。従って、例えば、本発明では、治療または予防核酸配列の送達用の本明細書において記載の方法のうち1を超えて用いて対象を治療することができると考えられる。いくつかの態様において、双方の遺伝子を候補する単一のベクターを用いることもできる。
【０４２６】
f.他の癌療法
他の癌療法の例は光療法、低温療法、トキシン療法、またはホルモン療法を含む。当業者であれば、このリストは、癌および他の過形成病巣に適した治療様式のタイプを尽くしていないことを知っている。
【０４２７】
N.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施においてよく機能させるために本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい態様を構成すると考えられることは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に徴して、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示された特別な態様において多くの変形を成すことができ、依然として類似のまたは同様な結果を得ることができるのを認識するはずである。
【０４２８】
実施例1
p53発現ベクターの構築
本実施例は、p53発現ベクターの構築のための例示的な技術に関する。このベクターは示されたように構築され、それを用いて、アデノウイルス株AdSゲノムのE1領域(1.3-9.2m.u.)を置換え、それを使用して、実施例2にて後に記載するアデノウイルスビリオンを構築する。
【０４２９】
ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(Boshart et al.,1985)、p53 cDNA、およびSV40初期ポリアデニル化シグナルを含有する、図1に示されたp53発現カセットを、(Dr.Frank L.Graham,McMaster University,Canadaによって提供された)pXCJL1のXbaIおよびClaI部位の間に挿入した。ゲノムサイズは、100マップ単位(1m.u.＝0.35kb)に割って、約35.4kbである。p53発現カセットはAd5ゲノムのE1領域(1.3-9.2m.u.)を置き換えた。
【０４３０】
プライマー1は配列
2008528508.tif 000011
を有し、ヒトCMV主要IE遺伝子プロモーターの下流の第一のイントロンに位置する(Boshart et al.,1985)。プライマー2は配列
2008528508.tif 000012
を有し、SV40初期ポリアデニル化シグナルに位置する。両末端におけるp53 cDNAインサートから15〜20bp離れたプライマーの双方は、1.40kbのPCR産物を画定する。プライマー3は配列
2008528508.tif 000013
を有し、プライマー4は配列
2008528508.tif 000014
を有し、各々、Ad5ゲノムの11m.u.および13.4m.u.に位置し、これは、0.86kbのウイルス-ゲノム特異的PCR産物を規定する。本発明の変形を使用するそのようなベクターを構築するための他の方法は、p53発現ベクターの構築に適用することができる。
【０４３１】
実施例2
組換えp53アデノウイルスの作成および増殖
本実施例は、p53を発現するヘルパー非依存性組換えアデノウイルスを作成するのに適当な1つの例示的な方法を記載する。組換えアデノウイルスを生産するのに使用される分子戦略は、アデノウイルスのパッキング制限のため、pJM17はそれ自身にウイルスを形成できないという事実に基づいている。従って、トランスフェクトされた細胞内のp53発現ベクタープラスミドおよびpJM17の間の相同組換えの結果生きたウイルスが得られ、これは、必要なアデノウイルスタンパク質を発現する細胞においてのみパッケージングすることができる。
【０４３２】
本実施例の方法は、E1またはE3領域における異種DNA発現カセットの置換を含有するウイルスを増殖させるために宿主細胞として293細胞を利用する。このプロセスは、DNAの293細胞への共トランスフェクションを必要とする。トランスフェクションは、ウイルスの増殖の効率をかなり決定する。本発明に先立ってのDNAの293細胞へのトランスフェクションで用いる方法は、通常、リン酸カルシウム/DNA共沈殿であった(Graham and van der Eb,1973)。しかしながら、この方法は、プラークアッセイと一緒になって、比較的困難であり、典型的には、ウイルス増殖の低い効率をもたらす。本実施例に示すように、感染された細胞のトランスフェクションおよび引き続いての同定は、細胞障害(CPE)によってトランスフェクトされた細胞を同定する場合、リポソーム媒介トランスフェクションを用いることによって有意に改良された。
【０４３３】
293細胞株は、10％加熱-不活化ウマ血清を補足したダルベッコの修飾最小必須培地に維持した。相同組換えのためのp53発現ベクターおよびプラスミドpJM17(McGrory,et al.,1988)は、製造業者のプロトコルに従ってDOTAP媒介トランスフェクションによって293細胞に共トランスフェクトされた(Boehringer Mannheim Biochemicals,1992)。これを図1に模式的に示す。
【０４３４】
293細胞(継代35,60％密集)を、トランスフェクションから24時間先立って60mm皿または24ウエルプレートいずれかへ接種した。各ウエルにおける細胞を30.mu.l DOTAP.2, mu.gのp53発現ベクター、および3.mu.gのプラスミドpJM17でトランスフェクトした。トランスフェクションの後、CPEの開始まで、細胞にMEM培地を2〜3日毎に供給した。当業者に周知のこれらの技術および/または他の技術の変形を用いて組換えアデノウイルスベクターを作成し、それを増殖する他の方法を使用することができる。
【０４３５】
実施例3
導入された緑色蛍光タンパク質遺伝子のテロメラーゼ特異的増幅による光学イメージングでの腫瘍のインビボ検出
本実施例は、ネズミモデルにおいて腫瘍を検出する、緑色蛍光タンパク質遺伝子(gfp)のようなレポーター遺伝子をコードする核酸発現構築体の能力を決定することを行うことができるインビボ実験用の例示的なプロトコルを記載する。インビボ試験の最初のラウンドにおいて、ヒト肺および結腸癌を皮下注射したBALB/c nu/nuマウス(Umeoka et al.,2004)を用いることができる。例えば、ヒト癌細胞の＞85％において活性であるが、ほとんどの正常な細胞においては活性でない、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を発現する細胞においてのみ発現が可能なgfpをコードする核酸発現構築体で動物を処理することができる。従って、hTERTプロモーターは、gfpの発現を駆動するための組織選択的プロモーターとして好ましい。というのは、hTERT発現の正常な産物はヒトテロメラーゼ逆転写酵素だからである。
【０４３６】
例えば、hTERTプロモーターによる操作制御下にあるgfpをコードする核酸発現構築体は、ヒト肺および結腸癌を皮下注射したBALB/c nu/nuマウスにおいて抗腫瘍活性における腫瘍検出についてインビボでテストすることができる。
【０４３７】
次いで、蛍光顕微鏡、例えば、Eclipse TS-100蛍光顕微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)下での腫瘍組織試料の光学調査によって、hTERTプロモーターによる操作制御下にあるgfpをコードする核酸発現構築体の効果を評価することができる。
【０４３８】
実施例4
腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体を用いる胃の腫瘍発生のインビボ予防
本実施例は、ネズミモデルにおいて癌を阻害する、腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体の能力を決定するのに行うことができるインビボ実験の例を記載する。インビボ試験の最初のラウンドにおいて、ヒト胃および食道癌のマウスモデル(Dumon et al.,2001)を用いることができる。例えば、Fhit-/-マウスは、カルシノーゲンN-ニトロソメチルベンジルアミン(NMBA)への曝露の後に、食道および胃前部においてカルシノーゲン誘導腫瘍発生に罹りやすい。動物を、ヒトFHIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体で処理して、腫瘍発生の抑制を決定することができる。
【０４３９】
例えば、ヒトFHIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体を、NMBAに曝露したFhit-/-マウス、または当業者に公知の癌のいずれかの他のネズミモデルにおいて、抗腫瘍活性についてインビボでテストすることができる。これらの実験と組み合わせて、ヒトFHIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体の抗腫瘍活性はネズミモデルで評価することができる。
【０４４０】
簡単に述べれば、適当な癌モデルのマウスの異なる群を、NMBAのようなカルシノーゲンでの予備処理の後に、ヒトFTIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体の用量で処理することができる。ヒトFTIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体のいくつかの組合せおよび濃度をテストすることができる。対照マウスはNMBAで予備処理のみすべきである。
【０４４１】
処理したマウス対対照群における癌の発生に対する、ヒトFTIT腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸発現構築体の効果を、次いで、腫瘍サイズの調査、ヘマトキシリン、エオシン染色腫瘍組織のおよび組織病理学的調査によって比較することができる。また、免疫組織化学的調査は、ヒトFhitタンパク質のC末端に対するウサギ抗ヒトFhit抗体との試料組織のインキュベーション、続いての、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体とのインキュベーションによって行うこともできる。
【０４４２】
実施例5
AdCMV-p53：2週間の観察期間でのマウスにおける単一用量経口生体内分布実験
手法
8.3×1010(群2)、8.×1011(群3)または8.3×1012(群4)vp/kgの単一経口洗浄用量に従い、AdCMV-p53の生体内分布をC57BL/6Nマウスにおいて評価した。各処理群が6匹の雄および6匹の雌マウスからなるものであった：同一サイズの対照群(群1)はビヒクルのみを受けた。処理から4日後または15日後に、組織試料を以下の順序で収集した：卵巣/精巣、肝臓、腎臓、副腎、脾臓、胃、リンパ節、回腸、直腸、心臓、肺、食道、筋肉、大腿骨、脳および脊髄。組織を液体窒素中にスナップ-凍結し、-70±10℃で貯蔵した。血液試料を眼窩後洞から滅菌EDTA血液コレクターチューブに吸い込み、4±2℃で貯蔵し、3日以内にDNA抽出のために処理した。
【０４４３】
ゲノムDNAを凍結した組織試料から単離した。DNA抽出の各組は、単一動物からの全ての組織を含んだ。抽出は群1(対照)動物からの組織でまず行い、続いて、群2、3および4から組織を抽出した。組織および血液DNA試料は、260nmにおける吸光度によって定量し、使用する。-15℃未満で貯蔵した。
【０４４４】
定量的PCR分析はリアルタイムPCR(Taqman(登録商標)PCR)を用いて行った。プライマーにより、CMVプロモーターおよび非翻訳p53 5'領域の間の接合を含む70bp増幅産物が生じた。
PREYF：
2008528508.tif 000015
PREYR：
2008528508.tif 000016
プローブ：
2008528508.tif 000017
【０４４５】
アッセイ感度は0.5μgのマウスゲノムDNAにおいて100ベクターDNAコピーであり、100〜105コピーにわたる鋳型範囲にわたって直線状であった。
【０４４６】
各96ウエルPCR反応プレートは、汚染の非存在を確認するためのDNAを含有しない陰性対照、および標準曲線を作成するためのAdCMV-p53 DNAの10倍希釈のシリーズを含有した。各PCR反応は、二連で行い、そのうち1つは、AdCMV-p53 DNAでスパイクして、PCR阻害剤の非存在を確認した。
【０４４７】
陽性試料の定量は、スパイクされていない試料を標準曲線上にプロットすることによって行った。PCR分析の結果は、コピー数/0.5μgのマウス組織DNAとして報告した。10コピーを超える値を持つ試料を陽性と考えた。しかしながら、10コピーの検出は終始一貫して達成されないので、10〜100コピーの間の値は正確でないかもしれない。というのも、それらは標準曲線に基づいてABI7700によって内挿されるからである。
【０４４８】
結果
リアルタイムPCR分析は、0.5μgのDNA中のAdCMV-p53 DNAの100コピーを終始一貫して検出した。10〜100コピー/0.5μgのDNAからのベクターDNAレベルは低いと考えられ(終始一貫して検出されず)、100〜1000コピー/0.5μgのDNAは中程度と考えられ、1000を超えるコピー/0.5μgのDNAは高いと考えられた。10コピー/0.5μg DNA未満のAd5CMV-p53 DNAレベルは非定量的と決定された。というのは、偽陰性が試料中の数コピーのランダム分類から生起し得るからである。
【０４４９】
投与から4日後に収集した組織および血液試料での、高用量群(8.3×1012vp/kg)においては、AdCMV-p53 DNAは、少なくとも1つの動物の肝臓、胃、肺、食道、筋肉、脳、脊髄、および血液において中程度またはそれ以上のレベル(0.5μg DNA当たり100コピーを超える)にて検出された(表9)。15日までに、高用量群からの肺試料のみが中程度レベルにて、またはそれを超えて陽性のままであった。
【０４５０】
4日の中程度用量群(8.3×1011vp/kg)において、胃、肺、食道および血液からの試料は中程度レベル以上で陽性であった。中程度レベルの、またはそれを超えて存在するAdCMV-p53 DNAでの中程度用量動物からの試料は、15日までに副腎、心臓、肺、食道、筋肉および脊髄で見出された。
【０４５１】
低用量群(8.3×1010vp/kg)においては、肺および血液からの試料のみが、4日に中程度レベルの、またはそれを超えてAdCMV-p53 DNAについて陽性にテストされた。肺、食道および骨からの試料は、低用量AdCMV-p53から15日後に中程度レベルにて、またはそれを超えて陽性であった。対照試料のいずれにおいても定量可能なシグナルは検出されなかった。以下の表は、種々の器官および組織におけるAdCMV-p53 DNAの平均量、および0.5μgのマウスゲノムDNA当たりAdCMV-p53の＞10コピーにおいて陽性であった試料の数の双方をリストする。
【０４５２】
陽性試料のほとんど大部分は散在性であった。与えられた用量および時点における全ての試料が陽性であった唯一の器官は、中程度用量動物(ほぼ200コピー/0.5ug)における血液であった。6試料のうち4以上が陽性であった器官は、全て、抗用量群におけるものであった：肺(240,000コピー/0.5ug)、食道(900コピー/0.5ug)、血液(250コピー/0.5ug)、および胃(110コピー/0.5ug)。
【０４５３】
結論
AdCMV-p53の単一経口用量の後、AdCMV-p53 DNAは主として肺および食道に位置した。AdCMV-p53 DNAの出現は、血液、肺および食道を例外として、4日においてほとんどの器官で散在性または陰性であった。15日において、低-および中程度用量動物では、より多くの器官が4日におけるよりもAd5CMV-p53 DNAにつき陽性であった。高用量動物では、陽性器官の数、および器官におけるAdCMV-p53 DNAの絶対力価は4日から15日にかけて減少した。
【０４５４】
本実験におけるAdCMV-p53 DNA PCRシグナル強度の用量-および時間-依存性は、他の生体内分布実験のほとんどで見られた傾向に従わなかった(より高い用量およびより短い時間においてより大きなシグナル強度)。まず、AdCMV-p53 DNAは(低-中程度用量群において)4日よりも15日においてより多くの器官で検出され、これは、経口投与経路でのゆっくりとした播種性を示唆する。第二に、AdCMV-p53 DNAのレベルおよび播種性は4日において用量-依存性であったが、15日においてはそうでなかった。15日において、AdCMV-p53 DNAは(肺を例外として)中程度用量動物からの器官におけるよりも高用量動物からの器官においてより低く、低用量動物からの器官におけるよりも高用量動物からの多くの器官においてより低くさえあった。
【０４５５】
（表９）AdCMV-p53＋の経口投与後におけるマウスでのAdCMV-p53 DNAの生体内分布
2008528508.tif 000018
2008528508.tif 000019
＋試料は定量的リアルタイムPCRによって分析した。
＃非定量的試料(「NQ」)は、この表の目的では10コピー/0.5μgと定義した。
＊アッセイした試料の1または2のみが、10以上のコピー数を与え；残りの試料は陰性であった。
【０４５６】
実施例6
治療または診断核酸の製剤の効率を評価するためのアッセイ
明細書の教示および当業者の知識を用いて、核酸の種々の製剤の効率を評価するための実験を行うことができる。当業者であれば、治療または検出剤としての特定の核酸の製剤の効率は、核酸の濃度、pH、製剤の温度、製剤の他の構成要素などのような多くの因子に依存することを理解する。
【０４５７】
例えば、これらの因子のいずれかまたは全てを変化させた特定の核酸の種々の製剤は、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって治療効果について調べることができる。例えば、治療または予防すべき病気が癌のような過剰増殖病であれば、これらの製剤の治療効果は、腫瘍細胞が移植されたヌードマウスのようなヒト癌の適当なインビボモデルを用いて評価することができる。例えば、特定の製剤は動物モデルにおいて腫瘍のサイズを低下させるにおいて効果を示すか否かを判断することができる。製剤の適用の頻度および方法は、動物モデルにおいて、評価することができる。治療応答、ならびに副作用の存在または非存在は、当業者に周知の情報を用いて評価することができる。
【０４５８】
レポータータンパク質をコードする核酸のような診断核酸については、動物モデルの細胞における検出可能なタンパク質の存在または非存在を評価するための実験を、当業者に周知の多数の教示のいずれかを用いて行うことができる。例えば、実施例4に記載されたもののような技術を用いて光学イメージングを行い、適当な対照と比較することができる。
【０４５９】
実施例7
病気の治療における局所送達のための核酸製剤の使用の臨床試験-一般的な考慮
本実施例は、一般には、本発明の核酸製剤を用いるヒト治療プロトコルの開発に関する。特に、そのような治療は、核酸の投与が有益であることが公知の、またはそうであると考えられる種々の病気の治療で用いることができる。これらの病気の例は、癌、創傷治癒、および感染の治療のような過剰増殖病の治療を含む。癌に関するより詳細な例は次の実施例で議論する。
【０４６０】
患者の治療およびモニタリングを含めた臨床試験を行う種々の要素は、本開示に徴して当業者に公知である。以下の情報を、臨床試験における核酸製剤の使用を確立するのに用いる一般的なガイドラインとして用いることができる。
【０４６１】
標的とされた病気を持つ患者は新たに診断された患者、または現存の病気を持つ患者であり得る。現存の病気を持つ患者は、慣用的な療法の少なくとも1つのコースに応答するのに失敗したものを含むことができる。
【０４６２】
核酸製剤は、単独で、またはもう1つの治療剤を組み合わせて投与することができる。治療核酸は、局所投与および経口投与のような、本明細書に記載された方法のいずれかに従って投与することができる。薬剤は、病気の組織を除去するための外科的切除のような手法のコースの間に投与することができる。
【０４６３】
出発用量は、例えば、0.5mg/kg体重であってよい。3人の患者は、規定されたレベルの毒性の非存在下で各用量レベルで治療することができる。用量の上昇は、特定のレベルの薬物関連毒性が発生するまで、100％増分(例えば、0.5mg、1mg,2mg、4mg)だけ行うことができる。その後、用量の上昇は25％増分だけ進めることができる。投与される用量は分けることができる。
【０４６４】
核酸製剤は、例えば、数日または数週間の期間にわたって1回または複数回投与することができる。投与は単独で、または他の薬剤と組み合わせることができる。
【０４６５】
物理的調査、実験室的テスト、および治療すべき病気に特異的な他の臨床試験は、例えば、治療前に、およびその後約3〜4週間の間隔で行うことができる。実験室的実験はCBC、差分および血小板カウント、尿分析、ＳMA-12-100(肝臓および腎臓機能テスト)、凝固プロフィール、および病気の程度を判断し、または存在する兆候の原因を判断するためのいずれかの他の適当な化学実験を含むことができる。
【０４６６】
療法に対する応答は当業者に公知のいずれかの方法に従うことができ、治療すべき病気に大いに依存する。例えば、病気が癌である場合、応答は腫瘍のサイズの減少によって評価することができる。創傷治癒は、創傷のサイズおよび/または臨床的外観を評価することによって評価することができる。
【０４６７】
実施例8
癌の治療における局所または経口送達のための核酸製剤の使用の臨床試験
本実施例は、本明細書において記載の核酸製剤を用いるヒト癌患者の治療に適用することができる例示的なプロトコルを記載する。患者は、従前の化学-、放射線-または遺伝子治療処置を受けていてもよいが、必ずしもその必要はない。最適には、患者は適切な骨髄機能(例えば、＞2,000/mm3の末梢絶対顆粒球カウント、および100,000/mm3の血小板カウント)適切な肝臓機能ビリルビン1.5mg/dlおよび適切な腎臓機能(例えば、クレアチニン1.5mg/dl)を呈することができる。
【０４６８】
核酸製剤は、局所または経口投与に適した製剤のような、本明細書において記載の製剤のいずれかであってよい。製剤は、前記の担体、補助剤、およびビヒクルのいずかを含有する投与単位製剤において一つまたは複数の治療核酸を含むことができる。組成物は、経口摂取することができる、またはアプリケーターを用いるなどして、局所適用することができる。併用療法が考えられる場合、組成物は他の抗癌剤の前に、その後に、またはそれと同時に投与することができる。
【０４６９】
1つの例において、治療コースは、7〜21日の期間にわたって投与される約6用量を含むことができる。臨床家による選択に際し、養生法は、3週間毎に、またはそれより低頻度(毎月、毎2ヶ月、毎4ヶ月など)に基づいて、6用量継続することができる。勿論、これらは単に例示的な治療の回数であり、技量のある実行者は、多くの他の回数-コースが可能であることを容易に認識することができる。
【０４７０】
いくつかの態様において、投与は、皮膚または粘膜表面への核酸組成物の局所適用を含むことができる。もう1つの態様において、腫瘍切除に続いてカテーテルを外科的処置後創傷に挿入することができ、腔は所望の期間連続的に灌流することができる。
【０４７１】
臨床応答は、当業者に公知の許容される尺度によって規定することができる。例えば、完全な応答は、少なくとも1ヶ月の間での全ての測定可能な病気の消失によって規定することができる。部分的な応答は、全ての評価可能な腫瘍小節の垂直直径の積の合計の50％またはそれ以上の低下、または拡大を示す腫瘍部位がない少なくとも1ヶ月によって規定することができる。同様に、混合応答は、一つまたは複数の部位における進行を伴う50％以上だけの、全ての測定可能な病巣の垂直直径の積の低下によって規定することができる。当業者は、本明細書に開示された情報を採用し、治療養生法を最適化することができる。
【０４７２】
実施例9
創傷の治療用の核酸製剤の使用の臨床試験
明細書の教示および当業者の知識を用い、成長因子をコードする核酸を含む製剤のような、本明細書において記載の核酸製剤の1つを用いてヒト対象における創傷の治療を容易とするのに用いることができるプロトコルを設計することができる。創傷は、例えば、(腫瘍の切除後の創傷のような)外科的処置後創傷または外傷創傷であってよい。
【０４７３】
本発明の組成物は、前記の担体、補助剤およびビヒクルを含有する投与単位製剤において創傷に典型的には局所投与することができる。ある場合には、製剤は、成長因子に加えて、腫瘍サプレッサー遺伝子のような抗癌剤をコードする核酸を含むことができる。さらに、治療核酸は、抗生物質療法のような、創傷の他の標準的な療法と組み合わせて投与してもしなくてもよい。併用療法が考えられる場合、治療核酸はいずれかの第二の治療剤の前に、その後に、またはそれと同時に投与することができる。創傷が外科的創傷である場合、療法は外科的手法の前に、その後に、またはそれと同時に投与することができる。
【０４７４】
例えば、治療コースは1〜6日の期間にわたって投与される約6用量を含むことができる。臨床家による選択に際して、養生法は多かれ少なかれ頻度に基づいて継続することができる。勿論、これらは治療に対する例示的な回数に過ぎず、技量がある実施者は、多くの他の回数-コースが可能であることを容易に認識できる。療法に対する応答は、投与養生法を決定するにおける鍵となる因子のようである。
【０４７５】
1つの態様において、投与は、創傷への治療組成物の局所的適用を単純に含むことができる。もう1つの態様において、カテーテルを創傷に挿入し、創傷は望まれる期間継続的に還流される。
【０４７６】
臨床的応答は、創傷のサイズの減少、炎症の減少などのような、治癒の兆候についての創傷の目視観察のような、当業者に公知のいずれかの許容される尺度によって規定することができる。
【０４７７】
本明細書において開示し、特許請求する組成物および方法の全ては、本開示に徴して過度な実験なしで作成し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記載してきたが、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく、本明細書において記載の組成物および方法に、および方法の工程、または工程の系列において変形を適用することができるのは当業者に明らかである。より具体的には、化学的におよび生理学的に関連するある種の薬剤は、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細中に記載された薬剤の代わりに置き換えることができるのは明らかである。当業者に明らかな全てのそのような同様な代替物および修飾は、添付の特許請求の範囲によって提示される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０４７８】
文献
以下の文献は、それらが本明細書において開示されたものの補充である例示的な手法または他の詳細を供する程度において、具体的に参照により本明細書に組み入れる。
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【図面の簡単な説明】
【０４７９】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある局面をさらに示すことを意図する。本発明は、ここに提示した特定の態様の詳細な記載と組み合わせた、これらの図面の一つまたは複数を参照することによって良好に理解することができる。
【図１】組換えp53アデノウイルスの作成についての模式図である。p53発現カセットは、pXCJL.1のXbaIおよびClaIの間に挿入された。p53発現ベクター(pEC53)および組換えプラスミドpJM17を239細胞に共トランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、細胞障害効果の開始まで培地中に維持した。プロテイナーゼKおよびフェノール抽出で処理したCPE上清から調製されたDNA鋳型を用いるDNAのPCRによる。新たに生じたp53に組換えアデノウイルス(AdCMV-P53)の同定。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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