(57)【要約】  本発明は、SS1Pのポリマー複合体、およびそれを作製し使用する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に非抗原性のポリマーに共有結合しているSS1Pを含むポリマー複合化SS1P。
【請求項２】
SS1Pが、実質的に非抗原性のポリマーからin vivoで解離性または非解離性である、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項３】
実質的に非抗原性のポリマーが、ポリアルキレンオキシドである、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項４】
ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項3に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項５】
mPEG-12k-DGA2-RNL8a-SS1P、mPEG-24k-BCN3-SS1P、mPEG-12k-BCN3-モノ-SS1P mPEG-12k-RNL8a-SS1P、モノmPEG2-40k-SS1P、mPEG-12k-SC-SS1P、mPEG-12k-ヒドラジド-SS1P、モノmPEG-20k-Ald-SS1P、およびジmPEG-20k-Ald-SS1Pからなる群から選択される、請求項4に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項６】
実質的に非抗原性のポリマーが約15kDaから約50kDaまでのサイズの範囲である、請求項1に記載のポリエチレングリコールSS1Pタンパク質複合体。
【請求項７】
1個から4個までのPEG鎖を含む、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項８】
SS1Pが、ジスルフィド連結したダイマーを含み、前記ダイマーは配列番号5のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチドを含む、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項９】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pを含む薬剤組成物。
【請求項１０】
第2の抗癌剤をさらに含む、請求項9に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pの有効量を動物に投与することを含み、腫瘍または癌にメゾテリン抗原を発現する性質がある、動物における腫瘍または癌を処置する方法。
【請求項１２】
腫瘍または癌が、中皮腫、卵巣癌、扁平上皮癌、および膵臓腺癌からなる群から選択されるタイプである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pと一緒に少なくとも1つのさらなる抗癌剤を投与することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pを投与する前または後に、少なくとも1つのさらなる抗癌剤を投与することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
式:
(I)  (R1)z-NH-(ITX)
のポリマー複合体
[式中、
(ITX)は、免疫毒素、またはその誘導体もしくはフラグメントを表し、
NH-は、ポリマーに結合するための、ITX上に見られるアミノ酸、その誘導体またはフラグメントのアミノ基であり、
zは、約1から約6までの正の整数であり、
R1は、解離性または非解離性の形態のITXに結合している、実質的に非抗原性のポリマー残基である]。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、2004年12月14日出願の仮特許出願第60/636,007号の優先権を主張するものであり、その開示は本明細書に参照として組み入れるものとする。
【０００２】
本発明は、メゾテリン腫瘍細胞抗原を標的とした、ポリマー複合化免疫毒素に関する。本発明のポリマー複合化免疫毒素は、治療指数の驚くべき増強、およびメゾテリン抗原を発現する腫瘍および癌を処置する改善された方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００３】
毎年、米国における死亡の4分の1は、癌に起因するものである(Jemalら、2002年、CA Cancer J Clin、52巻、23〜47頁)。癌の環境上および遺伝上ありがちな原因のいくつかを同定する上では、実質的進歩はなされているが、癌、腫瘍、ならびに関連する疾患および障害に対する治療では実質的な改善が必要とされていることは、統計から確実である。
【０００４】
成功した抗癌治療薬剤をデザインする上での困難の1つは、腫瘍および腫瘍細胞を選択的に標的にする一方で、健常な細胞および組織に対する著しい損傷を避ける困難であった。モノクローナル抗体、すなわち「mab」の出現により、腫瘍抗原に選択的に結合するモノクローナル抗体は、安全かつ選択的な抗癌免疫毒素治療を提供するために毒素に連結し得るという可能性が提起された。残念なことに、従来の試みは、多くの技術上の困難のために、一般に満足な結果をもたらしていない。この困難には、組織への浸透が劣ること、腎クリアランスが速すぎること、その後の処置に対する患者の免疫を誘導するタンパク質治療の抗原性があることなど、タンパク質治療に関連するすべての問題が含まれていた。
【０００５】
より洗練された取組みは、ポリペプチド毒素の活性部分と、特異的な標的抗体の活性な結合ドメインとを連結、または組換え融合することにより作製した免疫毒素を作製することである。このように作製された免疫毒素は、天然のmabで構築されたものに比べて低い分子量をもたらし、したがって、組織浸透性の増強をもたらす。組換え免疫毒素は、通常切断されているポリペプチド毒素を一般的に含む。ポリペプチド毒素は、標的部分として役立ち、腫瘍抗原に特異的に結合する抗体または組換えリガンドのFv部分に連結し、および/またはそれらとともにコードされている。いくつかのそのような組換え免疫毒素が、現在知られている。毒素成分は、低濃度では全身投与後に非標的の細胞に有害ではないあらゆるものであることができる。
【０００６】
このような、技術分野では周知の毒素の1つが、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素である。天然のシュードモナス外毒素A(「PE」)は、緑膿菌が分泌する特に活性な単量体タンパク質(分子量66kD)であり、真核細胞のタンパク質合成を阻害する。天然のPEの配列は、米国特許第5,602,095号（本明細書に参照として組み入れるものとする）に提供されている。細胞毒は、伸長因子2(EF-2)のADPリボシル化の不活性化により引き起こされる。以前のPEでの試験では、この外毒素が、細胞毒性をもたらすために協調して働く3つの構造上のドメインを含むことが実証されていた。ドメインIa(アミノ酸1〜252)は、細胞の結合性を媒介し、毒素に対する天然の標的メカニズムを代表する。ドメインII(アミノ酸253〜364)は、毒素のサイトゾル中への移行を担う。ドメインIII(アミノ酸400〜613)は、伸長因子2のADPリボシル化により細胞毒性を媒介する。ドメインIb(アミノ酸365〜399)の機能は、依然として未決定であるが、その大部分であるアミノ酸365〜380は、細胞毒性を失わずに欠失させることができる。Siegallら、1989年、J.Biol.Chem.、264巻、14256〜14261頁を参照されたい。
【０００７】
当該技術分野では周知の、PEベースの免疫毒素には、腫瘍関連抗原に結合している抗体のFv部分が、その細胞結合ドメインの欠失を有する38kDaの変異型のPEに融合しているものが含まれる[すべて本明細書に参照として組み入れるものとする、Pastan、1997年、Biochim.Biophys.Acta.、24巻、1333頁;Kreitmanら、1994年、Blood、83巻、426〜434頁;Kreitmanら、1999年、Int.J.Cancer、81巻、148〜155頁;Brinkmannら、1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、8616〜8620頁;Reiterら、1994年、Cancer Res.、54巻、2714〜2718頁;Reiterら、1994年、J.Biol.Chem.、269巻、18327〜18331頁]。
【０００８】
ADPリボシル化活性および細胞膜を越えて移動する能力を保持するPEを含めた、PEの他の変異体が試されているが、それは、米国特許第4,892,872号（本明細書に参照として組み入れるものとする）に記載されているように、毒性の低い修飾された毒素を与える受容体結合ドメインIaに欠失がある。米国特許第5,696,237号、第5,863,745号、および第6,051,405号（本明細書に参照として組み入れるものとする）は、抗-Tac抗原に例証される抗腫瘍抗原に複合している、米国特許第4,892,872号のものに類似のPEを記載している。
【０００９】
米国特許第6,809,184号（本明細書に参照として組み入れるものとする）は、卵巣癌、中皮腫、およびいくつかの他のタイプのヒトの癌に特異的な腫瘍抗原であるメゾテリンに結合する抗体および抗体フラグメント、ならびにトランケートしたPEと抗メゾテリン結合タンパク質との融合物をベースにした組換え免疫毒素を記載している。
【００１０】
抗-メゾテリン-PE免疫毒素を含む、これらの以前に記載された免疫毒素は、マウスに対する毒性が低く、より高投与量を投与することができ、抗腫瘍活性を実質的に上昇させる。しかし、肝臓の損傷はネズミモデルにおいて依然として投与量を制限する問題であり、この取組みは免疫毒性物質の免疫原性を低下させるものではない。
【００１１】
治療用タンパク質およびポリペプチドの循環寿命を増強し、免疫原性または抗原性を低減する一方法は、これらを、ポリアルキレンオキシドなどのポリマーに複合化させることであった。しかし、ポリペプチドのサイズが比較的小さく、それらの構造/活性の関係は微妙であるため、ポリエチレングリコールの修飾は、困難かつ予測不可能であった。
【００１２】
ポリアルキレンオキシドのタンパク質への共有結合をもたらすためには、ポリマーのヒドロキシル末端を、最初に、反応性の官能基に変換しなければならない。このプロセスは、しばしば「活性化」と呼ばれ、生成物は「活性化されたPEG」または活性化されたポリアルキレンオキシドと呼ばれる。例えば、一方の末端を官能基でキャップし、タンパク質分子上のアミンに対して反応性である、メトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)が、ほとんどの場合で用いられる。
【００１３】
PEGのスクシンイミジルスクシネート誘導体(「SS-PEG」)など、いくつかの活性化ポリマーが紹介されている(Abuchowskiら、Cancer Biochem.Biophys.、7巻、175〜186頁(1984年))。SS-PEGは、穏やかな条件下でタンパク質と速やかに反応し(30分)、活性でありつつ広範囲に修飾された複合体を生じる。Zalipskyは、米国特許第5,122,614号で、ポリ(エチレングリコール)-N-スクシンイミド炭酸塩およびその調製物を開示している。この形態のポリマーは、タンパク質のアミノ基、ならびに遊離のアミノ基を含む低分子量のペプチドおよび他の材料と容易に反応するといわれている。ウレタン結合(Veroneseら、Appl.Biochem.Biotechnol.、11巻、141〜152頁(1985年))、カルバメート結合(Beauchampら、Aanalyt.Biochem.、131巻、25〜33頁(1983年))、およびその他などのタンパク質のアミノ基とPEGとの間の他の連結も、当技術分野では知られている。
【００１４】
しかし、これらおよび他の方法にかかわらず、得られた複合体は活性の十分な保持を欠くことがしばしば見出されている。例えば、Benharら(Bioconjugae Chem.、5巻、321〜326頁(1994年))は、組換え単鎖の免疫毒素をPEG化すると、免疫毒素の特定の標的の免疫反応性の喪失をもたらすことを観察した。免疫毒素の活性の喪失は、免疫毒素の抗体結合領域内の2つのリジン残基でPEG複合した結果であった。この問題を克服するために、Benharらは、これら2つのリジン残基をアルギニン残基で置換し、誘導化による不活性化に対して3倍耐性である活性免疫毒素を得ることができた。
【００１５】
上記で論じたこれらの問題を克服するための別の提案は、より長い、より高分子量のポリマーを使用することである。しかし、これらの材料は、調製するのが困難であり、使用するのに高価である。さらに、より容易に入手可能なポリマーを上回る改良をほとんどもたらさない。以前に提案された別の代替法は、2本のストランドのポリマーをトリアジン環を介してタンパク質のアミノ基に結合させることである。例えば、Enzyme、26巻、49〜53頁(1981年)、およびProc.Soc.Exper.Biol.Med.、188巻、364〜369頁(1988年)を参照されたい。しかし、トリアジンは、複合後に許容レベルに低減させるのが困難な毒性物質である。他者は、解離性のポリマー複合体を使用していた。しかし、今までに、腫瘍を殺す量のPEベースの免疫毒素を標的の腫瘍に首尾よく送達することを示したものはない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、当技術分野では、ポリマー連結免疫毒素、特にメゾテリン腫瘍抗原を標的にし、以前に知られているSEベースの免疫毒素の欠点を避け、または最小にするSEベースの免疫毒素は、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらの長年の必要性に取り組むために、本発明は、実質的に非抗原性のポリマーに共有結合しているSS1Pを含む、SS1Pのポリマー複合体を提供する。SS1Pは、ジスルフィド結合した2量体であることが好ましく、ダイマーは配列番号5のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチドを含む。
【００１８】
場合により、複合体は、例えば、実質的に非抗原性のポリマーからin vivoで、SS1Pが解離性または非解離性であるように選択される。
【００１９】
好ましくは、実質的に非抗原性のポリマーは、約15kDaから約50kDaのサイズの範囲である。
【００２０】
より好ましくは、実質的に非抗原性のポリマーは、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコールである。さらにより好ましくは、ポリマー複合化SS1Pは、mPEG-12k-DGA2-RNL8a-SS1P、mPEG-24k-BCN3-SS1P、mPEG-12k-BCN3-モノ-SS1P、mPEG-12k-RNL8a-SS1P、モノmPEG2-40k-SS1P、mPEG-12k-SC-SS1P mPEG-12k-ヒドラジド-SS1P、モノmPEG-20k-Ald-SS1P、および/またはジmPEG-20k-Ald-SS1Pの1つから選択される。
【００２１】
SS1Pタンパク質に複合しているポリマー鎖の数は、特定の適用に従って変化し、例えば、ポリマー鎖1個から約4個の範囲である。
【００２２】
本発明は、本発明のポリマー複合化SS1Pを含む薬剤組成物、および動物にポリマー複合化SS1Pの有効量を投与することを含む、動物における腫瘍または癌を処置する方法をさらに提供し、この場合、腫瘍または癌はメゾテリン抗原を発現する性質を有する。
【００２３】
好ましくは、腫瘍または癌は、中皮腫、卵巣癌、扁平上皮癌、および/または膵臓腺癌からなる群から選択されるタイプである。
【００２４】
場合により、薬剤組成物は、1つまたは複数のさらなる抗癌剤も含む。本発明にしたがった処置の方法では、この方法は、抗癌放射線、抗癌剤など、1つまたは複数のさらなる処置様式を、本発明のSS1Pポリマー複合体の投与の前に、後に、またはそれと同時に投与するさらなるステップも含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
したがって、本発明は改善された抗癌ポリマー複合化免疫毒素を提供する。これらの新規のポリマー複合化免疫毒素は、以前に使用された免疫毒素の上記に記載した欠点を低減または排除する一方で、いくつかの異なるタイプの腫瘍を処置することができる。特に、本発明は、メゾテリン腫瘍抗原に結合するドメインを含む、SS1Pと呼ばれる、ポリマー複合化SE免疫毒素を提供する。基本的な戦略は、天然に存在するドメインIa結合ドメインを、腫瘍特異的な抗原を標的にするFv部分で置き換えることである。SS1Pでは、免疫毒素は、メゾテリンに結合するFvを含む。
【００２６】
定義
本発明の明確な記載を提供するために、いくつかの語を以下の通りに定義する。
【００２７】
「抗体」という語は、特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子に対する言及を含み、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体両方を含む。この語は、キメラ抗体(例えば、ヒト化のネズミ科動物抗体)、ヘテロ複合化抗体(例えば2重特異性抗体)、および組換え単鎖Fvフラグメント(scFv)、ジスルフィド安定化(dsFv)Fvフラグメント(米国特許第5,747,654号（本明細書に参照として組み入れるものとする）を参照されたい)、またはpFvフラグメントなどの、遺伝子操作された形態も含む。「抗体」という語は、抗体の抗原結合形態(例えば、FAb'、F(ab')2、Fab、Fv、およびrIgG)も含む。Pierce Catalog and Handbook、1994年〜1995年(Pierce Chemical Co.、Rockford、イリノイ州)を参照されたい。
【００２８】
特定の抗原と免疫学的に反応性である抗体は、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択などの、組換え方法により産生することができる。例えば、Huseら、1989年、Science、246巻、1275〜1281頁;Wardら、1989年、Nature、341巻、544〜546頁;およびVaughanら、1996年、Nature Biotech.、14巻、309〜314頁を参照されたい。
【００２９】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域すなわちCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、定義されている(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST、Kabat, E.ら、U.S.Department of Health and Human Services、(1987年（本明細書に参照として組み入れるものとする）)を参照されたい)。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内では比較的保存されている。構成成分の軽鎖および重鎖の組み合わさったフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、3次元空間でCDRを配置し、整列させる。CDRは、主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。CDRは、典型的には、N末端から始まって順次番号付けて、CDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれる。
【００３０】
「単鎖Fv」または「scFv」の句は、抗体の伝統的な2本鎖の重鎖および軽鎖が結合して1本鎖を形成する抗体を意味する。典型的には、2本鎖の間にリンカーペプチドが挿入されて、活性な結合部位の適切なフォールディングおよび作製が可能になっている。
【００３１】
「リンカーペプチド」の語は、可変の重鎖の、可変の軽鎖への間接的な結合に役立つ抗体結合性フラグメント(例えばFvフラグメント)内のペプチドに対する言及を含む。
【００３２】
「ジスルフィド結合」または「システイン-システインジスルフィド結合」の句は、システインのイオウ原子が酸化されてジスルフィド結合を形成する2つのシステイン間の共有の相互作用を意味する。ジスルフィド結合の結合エネルギーの平均は、水素結合の1〜2kcal/molに比べて、約60kcal/molである。本発明のコンテクストでは、ジスルフィド結合を形成するシステインは、単鎖抗体のフレームワーク領域内にあり、抗体の高次構造を安定化するのに役立つ。
【００３３】
「組換え」の語は、その天然の状態において、タンパク質を発現することができるDNAの内在性のコピーを持たない細胞を用いて生成したタンパク質を意味する。細胞は、適切な単離された核酸配列の導入により遺伝子改変されており、組換えタンパク質を生成する。この語は、異種性核酸の導入、または天然の核酸のその細胞にとって天然でない形態への変更により修飾された、あるいは細胞がそのように修飾された細胞由来である、細胞、または核酸、またはベクターに対する言及も含む。したがって、例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に見られない遺伝子を発現し、天然型内に見られる遺伝子の変異体を発現し、あるいは、その他の方法では異常に発現され、低発現され、またはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００３４】
「接触する」の語は、直接の物理的関係における配置に対する言及を含む。本発明に関しては、この語は、抗体-抗原の結合を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる「核酸」または「核酸配列」は、1本鎖または2本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーに対する言及を含み、特に限定されなければ、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で核酸にハイブリダイズする自然のヌクレオチドの既知の類似体を包含する。別段の記載がなければ、特定の核酸配列には、その相補的な配列、および保存的変異体、すなわちタンパク質に翻訳される場合にアミノ酸の保存的置換をもたらす、コドンおよび変異体のゆらぎの位置に存在する核酸が含まれる。
【００３６】
特定された核酸に関して「コードする」の語は、特定されたタンパク質に翻訳するための情報を含む核酸に対する言及を含む。この情報は、コドンの使用により特定される。典型的には、アミノ酸配列は、「普遍的な」遺伝暗号を用いて核酸によりコードされている。しかし、いくつかの植物、動物、および真菌のミトコンドリア、細菌マイコプラズマカプリコラム(Mycoplasma capricolum)(Proc.Nat'l Acad.Sci.USA、82巻、2306〜2309頁(1985年))、または繊毛虫マクロヌクレウス(macronucleus)の翻訳機構を用いて核酸が発現される場合は、これらの生物体に存在するような、普遍的なコードの変異型を用いてもよい。
【００３７】
抗体に関して、本明細書で用いられる「抗メゾテリン」の語を用いる場合は、メゾテリンに対する抗体に対する言及を含み、好ましくは結合は選択的である。好ましい実施形態では、メゾテリンは、ヒトメゾテリンなど、霊長動物のメゾテリンである。特に好ましい一実施形態では、ヒトメゾテリンをコードする動物のcDNA中に導入した後に、非霊長類の哺乳動物により合成された、ヒトメゾテリンに対して抗体が産生される。
【００３８】
「宿主細胞」は、発現ベクターの複製または発現を支持することができる細胞である。宿主細胞は、大腸菌(E.coli)などの原核細胞、または酵母菌、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物の細胞などの真核細胞であってよい。
【００３９】
「悪性細胞」または「悪性」の句は、侵襲性であり、かつ/または転移を起こすことができる腫瘍または腫瘍細胞、すなわち癌性の細胞または癌細胞を意味する。
【００４０】
「哺乳動物の細胞」の句は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジー、またはマカクを含む哺乳動物由来の細胞に対する言及を含む。細胞は、in vivoまたはin vitroで培養することができる。
【００４１】
「毒素」の語は、好ましくは、例えば、アブリン、リシン、シュードモナス外毒素(PE)、ジフテリア毒素(DT)、ボツリヌス毒素、またはそれらの修飾された毒素を含む、高度に強力なポリペプチドベースの生物学的毒素を意味する。例えば、PEおよびDTは、典型的に、肝臓毒性により死を引き起こす高度に毒性の化合物である。しかし、PEおよびDTは、毒素の天然の標的コンポーネント(例えば、PEのドメインIa、およびDTのB鎖)を除去し、抗体またはそのフラグメントなどの様々な標的部分でそれを置換することにより、免疫毒素として用いるための形態に修飾することができる。本発明の好ましい実施形態では、毒素はシュードモナス外毒素(PE)である。本明細書で用いられる「シュードモナス外毒素」または「PE」の語は、全長の天然の(天然に存在する)PEまたは修飾されているPEを意味する。このような修飾には、それだけには限定されないが、ドメインIaの除去、ドメインIb、II、およびIIIにおける様々なアミノ酸の欠失、Siegallら、1989年、J.Biol.Chem.、264巻、142〜56頁により記載されているカルボキシル末端における1つまたは複数の配列の1個のアミノ酸の置換および付加が含まれ得る。好ましい一実施形態では、PEの細胞毒性のフラグメントは、天然のPEの細胞毒性の、少なくとも50%、好ましくは75%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは95%を保持している。最も好ましい一実施形態では、細胞毒性フラグメントは、天然のPEよりも毒性である。
【００４２】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーに対する言及を含む。これらの語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーに加えて、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。この語は、タンパク質が機能を維持しているアミノ酸の保存的置換を含むポリマーにも当てはまる。
【００４３】
「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」の語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド(集合的に「ペプチド」)中に組み込まれるアミノ酸に対する言及を含む。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、特に限定されなければ、天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能できる自然のアミノ酸の既知の類似体を包含してもよい。
【００４４】
さらに、記載の便宜上、単数形の語の使用は、決して限定的であることを意図するものではない。したがって、例えば、複合化免疫毒素を含む組成物に対する言及は、例えばバルク量の複合体を含む、1つまたは複数のそのような複合体に対する言及を含む。本発明は、特定の立体配置、工程段階、および本明細書に開示された材料に限定されないことも理解されたい、というのは、そのような立体配置、工程段階、および材料はある程度変動することがあるからである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを記載する目的で用いられ、限定的なものを意図するものではないことも理解されたい、というのは、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物のみにより限定されるからである。
【００４５】
技術分野ではCAK1としても知られるメゾテリンは、中皮細胞の表面上に存在する、40kDの、GPI連結した糖タンパク質抗原である。これは、卵巣の扁平細胞、およびいくつかの胃癌、ならびに中皮腫に共通である(Changら、1992年、Cancer Res.、52巻、181〜186頁;Changら、1992年、J.Surgical Pathology、16巻、259〜268頁:およびChangら、1996年、Nat'l Acad.Sci.USA、93巻、136〜140頁)。これは、69kDの前駆物質として合成され、次いでタンパク分解によりプロセシングされる。30kDのアミノ終端が分泌され、巨核球増強因子と呼ばれている(Yamaguchiら、1994年、J.Biol.Chem.、269巻、805〜808頁)。40kDのカルボキシル終端は、成熟メゾテリンとして依然として膜に結合している(Changら、1996年、Nat'l Acad.Sci.USA、93巻、136〜140頁)。癌細胞上に存在する細胞表面抗原の多くと異なり、膜結合型のメゾテリンは、癌患者の血液中で検出することができず、培養された細胞により培地中に流れることもない(Changら、1992年、Cancer Res.、52巻、181〜186頁)。メゾテリンは、悪性細胞の他に、卵巣癌を含む、中皮起源の細胞の細胞表面上にも見られる。これらの組織における細胞を損傷しても生命を脅かす結果をもたらさないので、癌細胞の表面上のメゾテリンの存在は、分子標的治療に対する有望な候補となっている。
【００４６】
抗メゾテリン抗体が誘導されており、メゾテリン抗原の可変領域をコードするベクターが、例えば、米国特許第6,083,502号（本明細書に参照として組み入れるものとする）に記載されているように調製されている。作製されたFv部分に対して、技術分野では知られているいくつかの異なる立体配置が存在する。1つの立体配置は、組換えFvをコードして、1本のポリペプチド鎖として発現するためのものであり、ペプチドのリンカーが、それぞれVLおよびVHドメインに共有的に接続している。SS1P免疫毒素では、VHドメインは、PE毒素ドメインとともに融合またはキメラタンパク質としてコードされている。VLドメインは、別々のベクターとして発現され、次いでPE免疫毒素のVHドメインにジスルフィド結合する。得られた構築物は、当技術分野ではdsFvと呼ばれる。
【００４７】
本明細書において、ポリエチレングリコール複合体に対する様々なリンカーの化学を論じるのに、以下の略語を使用してもよい。
【数１】
2008523105.tif 000003
【００４８】
免疫毒素
作製された免疫毒素の一部分として本発明で用いることができるPE毒素には、天然のPE配列、天然の配列の細胞毒性フラグメント、および天然のPEおよびその細胞毒性フラグメントの保存的に修飾された変異体が含まれる。PEの細胞毒性フラグメントには、標的細胞におけるその後のタンパク質分解または他のプロセシングにより、またはそれなしで細胞毒性であるものが含まれる(例えば、タンパク質またはプレタンパク質として)。PEの細胞毒性フラグメントには、PE40、PE38、およびPE35が含まれる。PE40は、当技術分野で以前に記載されているトランケートされたPE誘導体である。Paiら、1991年、Proc.Nat'l Acad.Sci.USA、88巻、3358〜62頁;およびKondoら、1988年、J.Bol.Chem.、263巻、9470〜9475頁を参照されたい。PE35は、280位のメチオニン、それに続く天然のPEの281〜364位および381〜613位のアミノ酸から構成される、PEの35kDのカルボキシル末端フラグメントである。好ましい実施形態では、細胞毒性フラグメントであるPE38が使用される。PE38は、細胞内でのプロセシングの際その細胞毒性型に活性化される、253〜364位および381〜613位のアミノ酸から構成されるトランケートされたPEプロタンパク質である(米国特許第5,608,039号（本明細書に参照として組み入れるものとする）を参照されたい)。
【００４９】
好ましい一実施形態では、PE38が本発明の免疫毒素の毒性部分であるが、他の細胞毒性フラグメントであるPE35およびPE40が企図されており、その各々が米国特許第5,602,095号、および第4,892,827号（本明細書に参照として組み入れるものとする）に開示されている。
【００５０】
保存的に修飾された、PEまたはその細胞毒性フラグメントの変異体は、アミノ酸レベルで、PE38などの対象のPEと、少なくとも80%の配列類似性を有し、好ましくは少なくとも85%の配列類似性を有し、より好ましくは少なくとも90%の配列類似性を有し、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有する。
【００５１】
「保存的に修飾された変異体」の語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらの核酸配列を意味し、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の核酸配列を意味する。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸があらゆる所与のポリペプチドをコードしている。例えば、GCA、GCC、GCG、およびGCUのコドンはすべて、アミノ酸のアラニンをコードしている。したがって、コドンがアラニンを特定するすべての位置で、コドンを、コードされているポリペプチドを変更しないで記載されている対応するコドンのあらゆるものに変更することができる。これらの核酸の変異は、「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする、本明細書のすべての核酸配列も、核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載するものである。当業者であれば、核酸における各コドン(通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるAUGを除いて)を修飾して、機能的に同一の分子をもたらすことができることを理解されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載した各配列に暗に示されている。
【００５２】
アミノ酸配列に関しては、当業者であれば、コードされた配列において単一のアミノ酸または少ないパーセント値のアミノ酸を変更し、付加し、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、変更が化学的に類似したアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす、「保存的に修飾された変異体」であることを理解されよう。
【００５３】
本発明で使用するシュードモナス外毒素は、当業者にはよく知られているアッセイにより、望ましいレベルの細胞毒性についてアッセイすることができる。例示的な毒性のアッセイは、例えば、米国特許第6,809,184号（本明細書に参照として組み入れるものとする）の、例えば実施例2に記載されている。したがって、PEの細胞毒性のフラグメント、およびこのようなフラグメントの保存的に修飾された変異体を、細胞毒性について容易にアッセイすることができる。多数の候補PE分子を、当技術分野ではよく知られている方法により、同時に細胞毒性についてアッセイすることができる。例えば、候補分子のサブグループを、細胞毒性についてアッセイすることができる。候補分子の、陽性に反応するサブグループを、望ましい細胞毒性のフラグメントが同定されるまで、連続的にさらに細かく分け、再びアッセイすることができる。このような方法により、多数の細胞毒性フラグメント、またはPEの保存的変異体を迅速にスクリーニングすることができる。
【００５４】
本発明の複合体で使用することが好ましい免疫毒素は、一般的に、組換え修飾され、抗-メゾテリンFv部分に融合しているPE毒素である。Fvは、安定化したジスルフィド、またはdsFvであることが好ましい。好ましいPE免疫毒素は、本明細書に記載するSS1P、すなわち、SS1-PE38VHのSS1VLペプチドとのジスルフィド結合により形成されたdsFvPE免疫毒素である。SS1Pは、米国特許第6,809,184号('184特許（本明細書に参照として組み入れるものとする）)の図1により記載されているPE免疫毒素の修飾である。'184特許では、SSVL CDR3配列はQQWSGYPLT(配列番号3)である。次いでこれを2つの位置で修飾し(変異し)て、Chowdhuryら、1999年、Nature Biotechnology、17巻、568〜572頁（本明細書に参照として組み入れるものとする）により記載されている高親和性をそれに与える。したがって、本明細書に記載される免疫毒素のSS1VL CDR3配列は、QQWSKHPLT(配列番号4)である。完全なSS1-PE38VHポリペプチド配列は、配列番号5のものであり、配列番号6のポリヌクレオチドによりコードされる。完全なSS1VLポリペプチド配列は、配列番号7のものであり、配列番号8のポリヌクレオチドによりコードされる。したがって、配列番号5および7を有する変性したポリペプチドを、リフォールディングの条件下で混合すると、SS1Pがもたらされる。
【００５５】
免疫毒素の生成
本発明の組換え免疫毒素を発現させた後は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む、当技術分野では標準の方法に従って精製することができる(一般には、R.Scopes、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.(1982年)を参照されたい)。薬剤上の使用には、均質性が少なくとも約90から95%である実質的に純粋な組成物が好ましく、98から99%、またはそれを超える均質性が最も好ましい。精製は部分的でもよく、または望ましい均質性まで精製してもよい。免疫毒素を治療的に用いようとする場合には、ポリペプチドは実質的に外毒素なしでなければならない。
【００５６】
大腸菌(E.coli)などの細菌から、単鎖抗体を発現させる方法、および/または単鎖抗体を含む好適な活性型にリフォールディングするための方法は記載され、よく知られており、本発明に従って使用される免疫毒素に適用可能である。例えば、すべて参照として本明細書に組み込まれるBuchnerら、1992年、Anal.Biochem.、205巻、263〜270頁;Pluckthun、1991年、Biotechnology、9巻、545頁;Huseら、1989年、Science、246巻、1275頁、およびWardら、1989年、Nature、341巻544頁を参照されたい。
【００５７】
一般的に、大腸菌またはその他の細菌からの、機能的な異種性のタンパク質は、強力な変性剤を用いた可溶化、およびその後のリフォールディングにより封入体から単離される。当技術分野で知られている変性剤には、例示により挙げるにすぎないが、尿素、チオシアン酸カリウム、HClグアナジン(guanadine)(「GuHCl」)、ヨウ素酸カリウム、および/またはヨウ化ナトリウム、ならびにこれらの組合せが含まれる。好ましくは、GuHClを、例えば約6Mから約8Mまでの濃度で還元剤として、例えばpH約8のアルカリ性条件下で使用する。場合により、別の還元剤であるジチオスレイトール(「DTT」)を、単独で、またはGuHClと組み合わせて使用する。DTTを使用する場合は、濃度は、例示にすぎないが、DTT約50mMから約0.5mMまでの範囲である。可溶化のステップの間には、当技術分野ではよく知られているように、ジスルフィド結合を分離または変性するために、還元剤が存在しなければならない。例示の還元バッファーを以下に記載する:0.1M Tris pH8.0、6Mグアニジン、2mM EDTA、および0.3M DTE(ジチオエリスリトール)。
【００５８】
再生は、変性され、還元されたタンパク質をリフォールディングバッファー中に酸化剤の存在下で希釈(例えば、100倍)することにより、通常実現される。優れた収量で正確なリフォールディングができるのであれば、当技術分野では知られているあらゆる適切な酸化剤を使用することができる。例えば、酸化、およびリフォールディングは、Saxenaら、1970年、Biochemistry、9巻、5015〜5021頁（本明細書に参照として組み入れるものとする）、特にBuchnerら（上述）に記載されている、還元型および酸化型の低分子量のチオール試薬によりもたらされ得る。再生は、変性され、還元されたタンパク質をリフォールディングバッファー中に希釈(例えば、100倍)することにより、通常実現される。例示のリフォールディングバッファーを、以下に記載する(Tris HCl 100mM、pH10.0、25mM EDTA、NaCl 0.1M、GSSG 551mg/L、0.5Mアルギニン)。GSSGは、グルタチオンの酸化型である。
【００５９】
2本鎖抗体の精製のプロトコールに対する修飾として、重鎖および軽鎖の領域を別々に可溶化し、還元し、次いでリフォールディング溶液で組み合わせる。一方のタンパク質が、他のタンパク質の5倍モル過剰を上回らないようなモル比で、これら2つのタンパク質を混合する場合に、好ましい収量が得られる。過剰の酸化されたグルタチオン、または他の酸化性の低分子量の化合物を、酸化還元-シャフリングが完了した後に、リフォールディング溶液に加えることが望ましい。
【００６０】
ポリマー-細胞毒素複合体
本発明の、免疫毒素-ポリマー複合体は、一般的に式(I):
(I)  (R1)z-NH-(ITX)
に相当する
[式中、
(ITX)は、免疫毒素、またはその誘導体もしくはフラグメントを表し、
NH-は、ポリマーに結合するための、ITX上に見られるアミノ酸、その誘導体またはフラグメントのアミノ基であり、
zは、正の整数であり、好ましくは約1から約6までであり、
R1は、解離性のまたは非解離性型のITXに結合している、実質的に非抗原性のポリマー残基である]。
【００６１】
複合体(R1)の非抗原性のポリマー残基部分は:
【化１】
2008523105.tif 000004
2008523105.tif 000005
2008523105.tif 000006
2008523105.tif 000007
2008523105.tif 000008
などのポリマーベースの系の非限定的なリストの中から選択することができる
[式中、
R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、同一でも異なっていてもよく、非抗原性のポリマー残基から独立に選択され、
R3〜9、R12〜21、およびR24(下記を参照されたい)は、同一でも異なっていてもよく、各々、水素、C1〜6アルキル、C3〜12分枝アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6へテロアルキル、置換C1〜6へテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ、およびC1〜6ヘテロアルコキシの中から独立に選択され、
Arは、多置換の芳香族炭化水素、または多置換の複素環基を形成する部分であり、
Y1〜11、およびY13は、同一でも異なっていてもよく、O、S、およびNR24から独立に選択され、
Aは、アルキル基、標的部分、脱離基、官能基、診断用物質、および生物学的活性部分の中から選択され、
Xは、O、NQ、S、SO、またはSO2であり、この場合QはH、C1〜8アルキル、C1〜8分枝アルキル、C1〜8置換シクロアルキル、アリール、またはアラルキルであり、
ZおよびZ'は、標的細胞中に能動輸送される部分、疎水性部分、2官能基性の連結部分、およびこれらの組合せの中から独立に選択され、
L1〜6、およびL8は、同一でも異なっていてもよく、独立に選択される2官能基性のリンカー基であり、
a、c、d、f、g、I、j、j'、k、l、n、o、p、およびtは同一でも異なっていてもよく、独立に、0、または、ほとんどの局面において好ましくは正の整数であり、
b、r、r'、s、h、h'、およびmは、同一でも異なっていてもよく、独立に、0または1であり、
mPEGは、H3CO(-CH2CH2O)u-であり、
uは、好ましくは約10から約2300まで、より好ましくは約200から約1000までの正の整数である]。
【００６２】
上記の中では、Y1〜11およびY13はOであることが好ましく、R3〜8、R12〜21、およびR24は、各々独立して、水素またはC1〜6アルキルであり、メチルおよびエチルが最も好ましいアルキルであり、R9は好ましくはCH3である。
【００６３】
本発明のさらなる一態様では、複合体のポリマー部分は、免疫毒素に対して複数の結合点を与えるものであり得る。そのような系の非限定的なリストには、
【化２】
2008523105.tif 000009
[式中、変数はすべて、上記に述べたものと同じである]
が含まれる。
【００６４】
免疫毒素複合体を作製するのに使用することができる活性化されたポリマーは、自然に、上記に記載したポリマー部分に直接一致する。主な違いは、免疫毒素上に見出されるアミノ基へのポリマー系の解離性の結合を促進する、本明細書ではB1と呼ばれることがある、脱離基または活性化基の存在である。したがって、化合物(i)〜(xiii)は、
【化３】
2008523105.tif 000010
などの脱離基または活性化基、または、N-ヒドロキシスクシンイミジル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、N-ヒドロキシフタルイミジル、p-ニトロフェノキシ、イミダゾリル、チアゾリジニル  チオン、O-アシルウレア、ペンタフルオロフェノール、または2,4,6-トリ-クロロフェノール、または、複合反応後に免疫毒素が結合する場所に見られる当業者には明らかである他の適切な脱離基などの、他の適切な脱離基または活性化基を含む。
【００６５】
本発明の目的では、脱離基は、免疫毒素上に、例えばLys上に見られるアミン基(求核試薬)と反応することができる基と理解されたい。
【００６６】
本発明の目的では、前記は活性化したポリマーリンカーも意味する。ポリマー残基は、好ましくはポリアルキレンオキシドベースであり、より好ましくはポリエチレングリコール(PEG)ベースであり、この場合PEGは直鎖または分枝のいずれかである。
【００６７】
次に、上記に記載した活性化したポリマーについて述べると、Arは、多置換された芳香族炭化水素、または多置換された複素環基を形成する部分であることがわかる。重要な特徴は、Ar部分は、天然における芳香族であるということである。一般的には、芳香族であるために、π電子は、環状分子の平面の上下両方の「雲」内で共有されなければならない。さらに、π電子の数は、Huckle則の(4n+2)を満足させなければならない。当業者であれば、無数の部分が部分の芳香族の要件を満たし、したがって、当技術分野でこれらの語が一般的に理解されるように、ハロゲンおよび/または側鎖とともに本明細書で用いるのに適切であることを理解するであろう。
【００６８】
本発明のいくつかの好ましい態様では、活性化したポリマーリンカーを、本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第6,180,095号、第5,965,119号、および第6,303,569号（その内容は本明細書に参照として組み入れるものとする）に従って調製する。このコンテクスト内では、以下の活性化されたポリマーリンカーが好ましい。
【化４】
2008523105.tif 000011
2008523105.tif 000012
【００６９】
本発明の別の一態様では、免疫毒素のポリマー複合体は、本発明の譲渡人に譲渡された米国特許出願第10/218,167号、第10/449,849号、および第11/011,818号に記載されているもののようなある種の分枝の、またはビシンのポリマー残基を用いて作製される。そのような特許出願の各々の開示は、本明細書に参照として組み入れられる。好ましい活性化したポリマーには、
【化５】
2008523105.tif 000013
が含まれる。
【００７０】
上記に示した脱離基は、適切な基の1つにすぎず、本明細書で述べる他のものも、不必要な実験を行わずに用いることができることも理解すべきである。
【００７１】
代替の態様では、活性化したポリマーリンカーを、本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第5,643,575号、第5,919,455号、および第6,113,906号（その開示の各々は本明細書に参照として組み入れるものとする）に記載されているものなどの分枝のポリマー残基を用いて調製する。このような活性化したポリマーは、以下に代表されるポリマー系(v)〜(ix)に相当する
【化６】
2008523105.tif 000014
[式中、変数はすべて、先に定義した通りである]。
【００７２】
実質的に非抗原性のポリマー
上記に記載したように、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、ポリアルキレンオキシド(PAO)など実質的に非抗原性であることが好ましく、mPEGなどのポリエチレングリコールであることがより好ましい、各々水に可溶性のポリマー残基であるのが好ましい。例示を目的とし、限定するものではないが、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23のポリエチレングリコール(PEG)残基部分は、
J-O-(CH2CH2O)u-
J-O-(CH2CH2O)u-CH2C(O)-O-、
J-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2NR25-、および
J-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2SH-
の中から選択することができる
[式中、
uは、重合度、すなわち約10から約2300までであり、
R25は、水素、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜12分枝アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール置換アリール、アラルキル、C1〜6へテロアルキル、置換C1〜6へテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ、およびC1〜6ヘテロアルコキシの中から選択され、
Jは、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端上に見られ、いくつかの態様では、任意のNH2、OH、SH、CO2H、C1〜6アルキル、好ましくはメチル、または他のPEG末端の活性化基から選択することができ、このような基は当業者であれば理解される]。
【００７３】
ポリマーのキャッピングに用いられる好ましいJ基には、OH、NH2、SH、CO2H、CH3などのC1〜6アルキル部分などの部分が含まれる。好ましい特定の一実施形態では、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、CH3-O-(CH2CH2O)u-、CH3-O-(CH2CH2O)u-CH2C(O)-O-、CH3-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2NH-、およびCH3-O-(CH2CH2O)u-CH2CH2SH-の中から選択され、式中、uは正の整数であり、好ましくは平均分子量が約200Daから約80000Daまでの重量であるように選択される。より好ましくは、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、独立に、平均分子量が約2000Daから約42000Daまでの重量であり、平均分子量が約5000Daから約40000Daまでの重量が最も好ましい。当業者の必要性に適応するために他の分子量も企図される。
【００７４】
PEGは、一般的に、構造式:
【化７】
2008523105.tif 000015
により表され、好ましくはR1〜2、R10〜11、およびR22〜23はこの式の残基を構成する。このポリマーに対する重合度は、ポリマー鎖における繰り返し単位の数を表し、ポリマーの分子量に依存している。
【００７５】
プロピレングリコール、本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第5,643,575号('575特許)に記載されているものなどの分枝したPEG誘導体である「星型PEG」、およびShearwater Corporationの2001年カタログの「生物医学上の応用のためのポリエチレングリコールおよび誘導体(Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application)」に記載されているものなどの多分岐PEGも有用である。前述の各々の開示は、本明細書に参照として組み入れられる。'575特許によりもたらされる分枝は、単一の結合点からの生物学的に活性な分子上におけるポリマー含浸率を増大する方法として、2級または3級の分枝を可能にしている。必要とされるならば、不必要な実験を行わずに、2官能基性の連結基に結合させるために、水溶性のポリマーを官能基化することができることが理解されよう。
【００７６】
本明細書に含まれるポリマー性物質は、好ましくは室温で水溶性である。このようなポリマーの非限定的なリストには、ブロック共重合体の水溶性が維持されるのであれば、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレネーテッド(polyoxyethylenated)多価アルコール、それらのコポリマーおよびそれらのブロック共重合体が含まれる。
【００７７】
さらなる一実施形態において、およびPAOベースのポリマーに対する代替として、R1〜2、R10〜11、およびR22〜23は、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭化水素ベースのポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド(HPMA)、ポリアルキレンオキシド、および/またはこれらのコポリマーなどの、1つまたは複数の事実上非抗原性の材料の中から、各々任意に選択される。本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第6,153,655号（その内容は本明細書に参照として組み入れるものとする）も参照されたい。当業者であれば、PEGなどのPAOに関して、本明細書に記載したのと同じタイプの活性化が使用されることを理解するであろう。当業者であれば、前述のリストは例示にすぎず、本明細書に記載した品質を有するポリマー材料がすべて企図され、ポリプロピレングリコールなどの他のポリアルキレンオキシド誘導体も企図されることを、さらに理解するであろう。
【００７８】
2官能基性のリンカー基
本発明の多くの態様では、L1〜6およびL8は、R1〜2、R10〜11、および/またはR22〜23などのポリマーストランドの結合を促進するリンカー基である。もたらされる連結は、直接でもよく、または当業者には知られているさらなるカップリング基を介してもよい。本発明のこの態様では、L1〜6およびL8は同一でも異なっていてもよく、2官能基性、およびヘテロ2官能基性脂肪族、および芳香族-脂肪族基、アミノ酸など、当業者にはよく知られている広範囲の基から選択することができる。このように、L1〜6およびL8は同一でも異なっていてもよく、
【化８】
2008523105.tif 000016
などの基を含むことができる。
【００７９】
好ましくは、L1〜6およびL8は、
-C(O)CH2OCH2C(O)-、
-C(O)CH2NHCH2C(O)-、
-C(O)CH2SCH2C(O)-、
-C(O)CH2CH2CH2C(O)-、および
-C(O)CH2CH2C(O)-
の中から選択される。
【００８０】
あるいは、適切なアミノ酸残基は、知られている天然に存在するL-アミノ酸のあらゆるものから選択することができ、例えば、いくつかを挙げると、アラニン、バリン、ロイシンなど、および/またはそれらの組合せである。L1〜6およびL8は、例えば、アミノ酸残基約2個から約10個までのサイズの範囲であるペプチドも含むことができる。
【００８１】
天然に存在するアミノ酸の誘導体および類似体、ならびに様々な当技術分野では知られている天然に存在しないアミノ酸(DまたはL)は、疎水性でも非疎水性でも、やはり本発明の範囲内であることが企図される。
【００８２】
部分
1.脱離基または活性化基
Aが活性化基であるこれらの態様では、適切な部分には、制限なく、N-ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、N-ヒドロキシフタルイミジル、p-ニトロフェノキシル、イミダゾリル、N-ヒドロキシスクシンイミジル、チアゾリジニルチオン、O-アシルウレア、ペンタフルオロフェノキシル、2,4,6-トリクロロフェノキシルなどの基、または当業者には明らかである他の適切な脱離基が含まれる。
【００８３】
本発明の目的では、脱離基は、望ましい標的、すなわち生物学的に活性な部分、診断用物質、標的部分、2官能基性のスペーサー、中間体などの上に見られる求核試薬と反応することができるこれらの基と理解されたい。したがって、標的には、タンパク質、ペプチド、酵素、ドキソルビシンなどの天然または化学的に合成された治療用分子、モノ保護型ジアミンなどのスペーサー上に見られるNH2基など、置換のための基が含まれる。Aに選択されるこれらの部分は、生物学的に活性な求核試薬の他に他の部分とも反応することができることを理解されたい。
【００８４】
2.官能基
Aは官能基であってもよい。このような官能基の非限定的な例には、アミン含有スペーサーを介してビシン部分に結合することができる、マレイミジル、ビニル;スルホン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、メルカプト、ヒドラジド、カルバザート(carbazate)の残基などが含まれる。官能基(例えばマレイミド)は、ビシン部分に結合した後、ビシンポリマーを、ポリペプチド、アミノ酸、またはペプチドスペーサーなどのシステイン残基などの標的に結合させるために用いられる。
【００８５】
3.アルキル基
Aがアルキル基である式(I)のこれらの態様では、適切な基の非限定的なリストは、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分枝アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アラルキル、C1〜6へテロアルキル、および置換C1〜6へテロアルキルからなる。
【００８６】
Z部分およびその機能
本発明の一態様では、ZおよびZ'はL7-C(=Y12)であり、L7は、L1〜6を規定する基の中から選択される2官能基性のリンカーであり、Y12は、Y1を規定する基と同じ基の中から選択される。本発明のこの態様では、Z基は、免疫毒素と残りのポリマー送達システムとの間の連結として働く。本発明の他の態様では、Zは、標的細胞中に能動輸送される部分、疎水性部分、およびこれらの組合せである。Z'が存在する場合は、2官能基性のリンカー、標的細胞中に能動輸送される部分、疎水性部分、およびこれらの組合せとして働くことができる。
【００８７】
本発明のこの態様では、解離性のポリマー系を、in vivoの加水分解が免疫毒素からポリマーを切断し、免疫毒素を細胞外液中に解離し、それでも依然としてZ部分に連結しているように調製する。例えば、1つの可能なZ-Bの組合せは、ロイシン-免疫毒素である。
【００８８】
SS1P複合体の調製
特定のタンパク質-ポリマー複合体またはプロドラッグの合成を、実施例で述べる。しかし例示の目的では、適切な複合反応には、SS1P免疫毒素またはフラグメントなどを、本明細書に記載した適切に活性化したポリマー系と反応させることが含まれる。この反応は、約6.5〜8.5の範囲のpHで、PBS緩衝系などの使用を含む、タンパク質修飾の技術者にはよく知られている条件を用いて行うことが好ましい。ほとんどの場合では、過剰の活性化したポリマーがSS1Pと反応することが企図される。
【００８９】
この種の反応は、SS1Pに結合している1つまたは複数のポリマーを含む複合体の形成をもたらすことが多い。理解されるように、様々な分画を単離し、より均一の製品を提供することが望ましいことが多い。本発明のほとんどの態様では、反応混合物を採取し、適切なカラム樹脂上に充填し、バッファーのレベルを増大して望ましい分画を連続的に溶出し出す。分画を適切な分析ツールにより分析して、複合化タンパク質の純度を決定した後、さらに処理する。合成経路、および活性化した選択されたポリマーにかかわらず、複合体は、本明細書で定義する式(I)に一致する。本明細書に記載した合成技術からもたらされる好ましい化合物のいくつかには、
【化９】
2008523105.tif 000017
が含まれ、式中、BはSS1Pである。
【００９０】
本発明に従って作製される、いっそうさらなる複合体には、
【化１０】
2008523105.tif 000018
が含まれ、式中、変数はすべて上記に記載したものと同じであり、T1は、
【化１１】
2008523105.tif 000019
の1つであり、式中、BはSS1Pである。
【００９１】
さらなる複合体には、
【化１２】
2008523105.tif 000020
が含まれ、式中、T2は、
【化１３】
2008523105.tif 000021
であり、式中、BはSS1Pである。
【００９２】
特に好ましい複合体は、
【化１４】
2008523105.tif 000022
であり、式中、mPEGの分子量は約10000から約40000までである。
【００９３】
ビシンベースのポリマー系を用いる場合、2つの好ましい複合体は、
【化１５】
2008523105.tif 000023
であり、式中、mPEGの分子量は、上記と同じである。
【００９４】
薬剤組成物および免疫毒素の投与
本発明の薬剤組成物は、ポリマー連結免疫毒素を「治療有効量」または「予防有効量」含むことができる。「治療有効量」は、望ましい治療上の結果を達成するのに必要な投与量、必要な期間における有効な量を意味する。ポリマー連結免疫毒素の治療有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体または抗体部分が個体において望ましい反応を誘導する能力などの要因に従って変化させることができる。治療有効量は、治療上有効な効果が、抗体または抗体部分の、あらゆる毒性の、または有害な効果にまさるものでもある。「予防有効量」は、望ましい予防上の結果を達成するのに必要な投与量、必要な期間における有効な量を意味する。典型的には、予防上の投与量は、疾患の前に、または疾患の初期の段階に、対照に用いられるので、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
【００９５】
したがって、ポリマー連結免疫毒素、例えば、静脈投与するためのPEG-SS1P複合体に対する典型的な投与量範囲は、患者1人1日あたり、約0.1mgから10mgまでのPEGなしのSS1Pの等価物を送達する量である。患者1人1日あたり、約0.1mgから約100mgまでのPEGなしのSS1Pの等価物を送達する投与量を、投与することができる。
【００９６】
投与量レジメンを調節して、最適の望ましい反応(例えば、治療上の、または予防上の反応)をもたらすことができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割した投与量を経時的に投与してもよく、または投与量を治療状況の緊急性により指摘されるように比例的に低減または増大してもよい。投与を容易にし、投与量を均一にするために、投与量単位形態に非経口の組成物を配合すると特に有利である。本明細書で用いられる投与量単位形態は、処置すべき哺乳動物の対象に対する単位の投与量として適する物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要とされる薬剤上の担体と共同して望ましい治療上の効果を生成するように計算された、予め決定された量の有効成分を含んでいる。本発明の投与量単位形態についての詳記は、(a)有効成分の独特な特徴、および達成すべき特定の治療上または予防上の効果、ならびに(b)個体における感受性を処置するためにそのような有効成分を調剤する当技術分野に固有の限界ということで表され、それらに直接依存している。
【００９７】
本発明のPEG-SS1Pの治療上または予防有効量に対する、例示の非限定的な範囲は、約0.1mg/kgから約20mg/kgまでであり、より好ましくは約1m/kgから約10m/kgまでである。投与量の値は、緩和する状態のタイプおよび重症度とともに変化しうることに留意されたい。任意の特別の対象に対しては、個々の必要性、または組成物の投与を監督する人間の専門的な判断に従って、特定の投与量レジメンを経時的に調節すべきであり、本明細書に述べる投与量範囲は例示にすぎず、特許請求された組成物の範囲または実施を限定しようとするものではないことを、さらに理解されたい。
【００９８】
さらに好ましい一実施形態では、本発明のポリマー連結免疫毒素を、それに対して抗-メゾテリン免疫毒素が結合する腫瘍または癌を、処置し、および/または診断するために使用する。したがって、ポリマー連結免疫毒素を当業者には知られている方法により、ポリマー連結免疫毒素による処置に反応性の腫瘍または癌を有する動物または人間に投与する。
【００９９】
投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者であれば知っており、または明らかであり、より詳しくは、REMINGTON'S PHARMACMACEUTICAL SCIENCE、第19版、Mack Publishing Company、Easton、ペンシルベニア州(1995年)のような出版物に記載されている。例えば、本発明のポリマー連結免疫毒素は、対象、例えば、そのような投与を必要としている動物または人間に投与するのに適する薬剤組成物中に組み込むことができる。典型的には、薬剤組成物は、少なくとも1タイプの結合特異性を有するポリマー連結免疫毒素、および薬学的に許容できる担体を含む。
【０１００】
「薬学的に許容できる担体」の語には、あらゆる、かつすべての、生理学的に相容性である、溶剤、分散媒体、コーティング、抗微生物薬、例えば、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる担体の例には、1つまたは複数の、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せが含まれる。多くの場合では、組成物に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール(例えば、マンニトール、ソルビトール)、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【０１０１】
薬学的に許容できる担体は、湿潤剤または乳化剤;抗体または抗体部分の有効期間または有効性を増強する、保存剤またはバッファーなどの補助物質の少量をさらに含むことができる。
【０１０２】
本発明のポリマー連結免疫毒素は、必要に応じて様々な形態に調製される。これらには、例えば、液体、半固体、および固体の投与形態、例えば、液体の溶液(例えば、注射用、および注入用溶液)、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソーム、および座剤が含まれる。好ましい形態は、意図された投与様式、および治療上の適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射用または注入用溶液の形態、例えば、他の抗体でヒトを受動免疫するために用いられるものに類似した組成物である。好ましい投与様式は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ポリマー連結免疫毒素を、静脈内注入または注射により投与する。別の好ましい一実施形態では、抗体を筋肉内または皮下の注射により投与する。スプレー、エアロゾル、またはミストとしての、吸入による投与も企図されており、この場合、この経路は、例えば、全身の吸収および/または呼吸器系内の局所作用に有利である。
【０１０４】
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、または高濃度の薬物に適した他の秩序構造として配合することができる。滅菌の注射用溶液は、必要量の有効化合物(例えば、抗体または抗体部分)を、必要に応じて上記に列挙した成分の1つまたは組合せを含む好適な溶剤に組み入れ、その後ろ過滅菌することにより調製することができる。
【０１０５】
一般的に、分散剤は、活性なポリマー連結免疫毒素を、基本の分散媒体、および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌のビヒクル中に組み入れることにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から有効成分の粉末とあらゆるさらなる望ましい成分を生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適当な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には必要とされる粒度の維持により、および界面活性剤の使用により、維持することができる。注射用組成物の長期の吸収を、組成物に、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。
【０１０６】
本発明のポリマー連結免疫毒素は、当技術分野では公知の様々な方法により投与することができるが、多くの治療的適用では、好ましい投与の経路/様式は、静脈内注射または注入である。当業者であれば、投与の経路および/または様式は、望まれる結果に応じて変わることを理解するであろう。
【０１０７】
さらなる好ましいある実施形態では、処置すべき腫瘍または癌が、口腔、食道、または胃腸系の他の部分の裏層に存在する場合には、ポリマー連結免疫毒素を、例えば、不活性の希釈剤または吸収できる食用の担体と混合して、そのような胃腸系の腫瘍または癌を処置するのに適した薬剤組成物で経口投与することができる。ポリマー連結免疫毒素(および、所望により他の所望の成分)を、所望によりハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入し、錠剤に圧縮し、または対象の食餌中に直接組み入れる。経口の治療用投与では、組成物を、賦形剤とともに組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハーなどの形態で用いることができる。本発明のポリマー連結免疫毒素を非経口投与以外により投与するためには、その不活性化を防ぐ材料で化合物をコーティングし、またはそれと化合物を同時投与することが必要なこともある。
【０１０８】
追加の抗癌剤も、薬剤組成物中に組み入れることができる。ある実施形態では、本発明のポリマー連結免疫毒素を、腫瘍または癌に対して、相加的な、相乗的な、または補充性の治療上の活性または診断上の活性を提供する1つまたは複数のさらなる治療様式(例えば、化学療法剤、放射線照射、外科手術、およびこれらの組合せ)と組み合わせて、同時配合し、かつ/または同時投与(同時に、または逐次に)する。そのようなさらなる様式には、所望により、X線、ガンマ線、もしくは粒子線放射などの照射、レーザー光線、および/または赤外線照射が含まれる。本発明のポリマー連結免疫毒素と組み合わせることができる抗癌剤には、例示にすぎないが、そのような薬剤の名前を少数挙げると、Taxol(登録商標)、シクロホスファミド、メルファラン、レバミソールNAC、5フルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミドとイホスファミド、ブレオマイシン、マムサ(mamsa)、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、エトポシド、ドキシコホルミシン(doxycoformycin)、フルダラビン、クロロデオキシアデノシン、ドキソルビシンおよびダウノマイシン、パクリタキセル、ビンクリステイン(vincristein)、ビンブラスチン、mAMSA、チオテパ(ThioTEPA)、エピルビシン、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、L-フェニルアラニンマスタード、MDR、MRP、トポイソメラーゼI、トポイソメラーゼII、トクサール(toxal)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、VP-16、VM-26、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン-C、ブレオマイシン、メトトレキセート、ロイコボリンとともに、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、ロイコボリンとともに5-フルオロウラシル、5-フルオロデオキシウリジン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタルビン、5-アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、フルダラビン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびメスナ、メルファラン、CCNU、MeCCNU、BCNU、クロラムブシル、CBDCA(カルボプラチン)、アジリジニルベンゾキノン(AZQ)、DTIC(ダカルバジン)、mAMSA、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ならびにミトキサントロンが含まれる。
【０１０９】
PEG-SS1P免疫毒素の適応
本発明のポリマー連結SS1P免疫毒素は、メゾテリンタンパク質を発現する細胞または組織を標的とする。好ましくは、ポリマーは、上記で論じたようにポリエチレングリコールである。メゾテリンは、腫瘍または癌の細胞により主に発現されるので、PEG-SS1Pは主に抗癌剤であり、そのような抗癌処置の恩恵を受ける動物を処置するのに用いられることが企図される。恩恵を受ける動物は、メゾテリンタンパク質を発現する腫瘍または癌を有するあらゆる動物である。
【０１１０】
ヒトの他に、処置する動物には、哺乳動物、鳥類、および魚類などの脊椎動物が含まれる。脊椎動物の中では、ネコ、イヌ、ペットの鳥類などを含むコンパニオンアニマルも、メゾテリンを発現する腫瘍または癌を処置するためのPEG-SS1Pの投与の恩恵を受けることが企図されている。
【０１１１】
メゾテリンは、体腔を裏打ちする、正常の(非腫瘍の)中皮の細胞に見られるが、心臓、肺、肝臓、腎臓、および神経組織などの重要な器官には存在しない。メゾテリン抗原を発現することが知られている腫瘍には、中皮腫、卵巣癌、およびいくつかの扁平上皮癌が含まれる。メゾテリンは、ヒト上皮中皮種の90%を超えて、およびヒト膵臓腺癌の90%を超えて、およびヒト非粘液性卵巣癌の66〜74%に存在する。
【０１１２】
最初に診断されたとき、および/または処置の経過中にメゾテリン抗原の発現に対して腫瘍を試験することが企図されている。メゾテリンを検出するための試薬およびアッセイ(a/k/aメゾテリン抗原)は、例えば、米国特許第6,083,502号（本明細書に参照として組み入れるものとする）に記載されている。
【０１１３】
したがって、本発明のPEG-SS1Pを患者(ヒトまたは非ヒト)に投与するための適応には、中皮腫、卵巣癌、および扁平上皮癌、ならびにメゾテリンを発現することが確認されているあらゆる腫瘍、または抗メゾテリン抗体に結合するあらゆる抗原を発現することが確認されているあらゆる腫瘍の診断が含まれている。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供するために与えるものであり、決して本発明の有効な範囲を限定することを意味するものではない。
【０１１５】
〔実施例１〕
組換え免疫毒素の調製
発現ベクター
SS1P免疫毒素を、ジスルフィド結合した(「ds」)2量体として構築した。2つの構成成分の各々を別々に発現させ、単離し、ds2量体の形成を促進する条件下で再生した。
【０１１６】
BL21(DE3)/pPSC7-7cm細胞系
抗メゾテリン重鎖可変領域(「SS1-PE38VH」)を、pPDC7-4cmプラスミド(図1、配列番号1)を含むBL21(DE3)宿主細胞により、培養物中で発現させた。これは、BL21(DE3)pPSC7-7cm細胞系である。SS1-PE38VHポリペプチドをコードするDNA分子は、配列番号6によるものであり、SS1-PE38VHポリペプチド配列は以下の通りである。  
MQVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKCLEWIGLITPYNGASS    60
YNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSS   120
kasggpeggslaaltahqachlpletftrhrqprgweqleqcgypvqrlvalylaarlsw   180
nqvdqvirnalaspgsggdlgeaireqpeqarlaltlaaaeserfvrqgtgndeagaang   240
padsgdallernyptgaeflgdggdvsfstrgtqnwtverllqahrqleergyvfvgyhg   300
tfleaaqsivfggvrarsqdldaiwrgfyiagdpalaygyaqdqepdargrirngallrv   360
yvprsslpgfyrtsltlaapeaageverlighplplrldaitgpeeeggrletilgwpla   420
ertvvipsaiptdprnvggdldpssipdkeqaisalpdyasqpgkppredlkz       473
(配列番号5)
【０１１７】
VHドメインを表す残基は大文字で書かれ、PE38ドメインは小文字で書かれている。配列番号5の45位のセリンはシステイン(下線付き)に変更して、別々に生成されたVLと連結するためのジスルフィド結合の形成のための部位を提供している。当業者であれば、置換されたセリンは、Kabatら、1987年、「Sequences of proteins of immunological interest」第4版、U.S.Dept.Health and Human Services、Public Health Services、Bethesda、メリーランド州（本明細書に参照として組み入れるものとする）に基づいて、VHドメインの44位と実際に呼ばれていることに留意されよう。
【０１１８】
VLポリペプチドは、配列番号8による配列を有するDNA分子によりコードされ、ポリペプチドは以下の配列を有する。  
MDIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPG   60
RFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGCGTKLEIKZ              108
(配列番号7)
【０１１９】
100位のグリシン(Kabatら、同上)は、システイン(下線付き)に変更されて、SS1-PE38VHポリペプチドのVHドメインとジスルフィド結合を形成している。
【０１２０】
〔実施例２Ａ〕
大腸菌(E-Coli)発現ベクターの培養
SS1-PE38VHのcDNAを含むプラスミド発現ベクターを保有するBL21(DE3)大腸菌株を、カナマイシン(10μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を補ったSuperbroth培地で、5L発酵槽におけるバッチ培養物で、培地4.5Lとともに、密度がOD600値5〜8に達するまで5〜6時間、37℃で増殖させた。次いで、細胞を5mM IPTGで1.5時間誘導した。発現されたSS1(dsFv)-PE38免疫毒素およびSS1VLを含む増殖した細胞を、Beckman遠心分離機(Avanti J-20Iモデル、Fullerton、カリフォルニア州)で、JLA8.1000ローターを用いて、4℃、7000rpmで20分間遠心分離することにより、収集した。典型的な収量は、培養液1リットルあたり細胞15〜20g(湿重量)であった。
【０１２１】
SS1-VLのcDNAを含む発現ベクターを保有するBL21(DE3)大腸菌株を、カナマイシン(10μg/ml)およびクロラムフェニコール(25μg/ml)を補ったSuperbroth培地で、5L発酵槽におけるバッチ培養物で、培地4.5Lとともに、密度がOD600値10〜15に達するまで15〜16時間、7℃で増殖させた。次いで、細胞を5mM IPTGで1.5時間誘導した。発現されたSS1VLを含む増殖した細胞を、Beckman遠心分離機(Avanti J-20Iモデル、Fullerton、カリフォルニア州)で、JLA8.1000ローターを用いて、4℃、7000rpmで20分間遠心分離することにより、収集した。典型的な収量は、培地1リットルあたり細胞24〜28g(湿重量)であった。
【０１２２】
〔実施例２Ｂ〕
培養した大腸菌からのSS1Pタンパク質の精製
SS1(dsFV)-PE38を、上記に記載したように培養した大腸菌宿主細胞で発現させ、以下の方法により精製した。
【０１２３】
1.試薬およびバッファー
以下の試薬を、培養した宿主細胞からSS1P免疫毒素の精製に使用した。  
リゾチーム、ジチオエリスリトール(DTE)、グルタチオン、酸化型(GSSG)、L-アルギニン-HCl、TritonX-100、尿素、0.1N NaOH。  
滅菌溶液:1M Tris-HCl pH7.4、1M Tris-HCl pH8.0、0.5M EDTA pH8.0、5M NaCl、PBS(1×)カルシウムおよびマグネシウムを含まない。  
培養した宿主細胞からSS1P免疫毒素を精製するのに、以下のバッファーを使用した。
【数２】
2008523105.tif 000024
【０１２４】
リフォールディングバッファーは、以下の通りに調製した。PHは、10N NaOHで10.5に調整し、温度を4℃に等しくし、0.9mM GSSG(グルタチオン、酸化型)(551mg/L)をリフォールディングの前に加えた。
【数３】
2008523105.tif 000025
【０１２５】
2.封入体の調製
1.250ml遠心分離ボトル(Sorval GSAローター用)1本あたり、SS1VLまたはSSVH-PE38を含む細菌ペレット10〜12グラム(湿重量)のTES溶液180mlを再懸濁した。  
2.ペレットを完全に再懸濁し、塊の形成を避けるために、ティシューマイザー(tissuemizer：組織ホモジナイザー)を用いた。  
3.リゾチーム保存溶液(8mg/ml)50mlを、TESバッファーで調製した。  
4.各遠心分離ボトルにリゾチーム保存溶液8mlを加え、直ちによく振盪した。  
5.ボトルを、断続的に振盪しながら、室温で60分間インキュベートした。  
6.定着したペレット材料を、ティシューマイザーを用いて再懸濁した。  
7.25%TritonX-100(2つの溶液はゆっくりと混和するので、保存溶液は1日前に調製した)20mlを、各遠心分離ボトルに加えた。  
8.サンプルを、頻繁に、かつ完全に振盪しながら、室温で30分間インキュベートした。  
9.DNAマットが存在する場合、これを破壊するためにティシューマイザーを用い、次いでサンプルを4℃で13000rpm、50分間遠心分離した。  
10.次いで、ペレットをTE50/20バッファーに完全に再懸濁し、これに25%TritonX-100 20mlを加えた。  
11.次いで、サンプルを4℃で13000rpm、50分間遠心分離した。  
12.ステップ10〜11を3回繰り返した。  
13.次いで、ペレットをTE50/20バッファーに再懸濁した。  
14.次いで、サンプルを4℃で13000rpm、50分間遠心分離した。  
15.ステップ13〜14を3回繰り返した。
【０１２６】
3.封入体の可溶化
1.上記に記載した通りに得られた湿った封入体(「IB」)のペレット(IB1グラムあたりタンパク質約100mg)を、可溶化バッファー5〜10mlに溶解した。  
2.ティシューマイザーを用いて、封入体を再懸濁した。  
3.次いで、再懸濁したIBサンプルを、室温で一晩インキュベートした。  
4.Pierce Coomassie Blue Plusアッセイ(修飾Bradford)を用いて、タンパク質濃度を決定した。最終濃度の同じグアニジンを、基準のスタンダードタンパク質(BSA)に、およびIBタンパク質に用いた。次いで、封入体溶液を可溶化溶液で20倍に希釈し、次いで、タンパク質濃度アッセイを行った。  
5.直ちに使用しない場合は、封入体を-80℃で貯蔵した。
【０１２７】
4.DTE/GSSGにおける再生
a.乾燥ジチオエリスリトール(「DTE」)の重量を測り、上記セクション3のステップ4から得られた封入体溶液に加えて、最終濃度を65mM(10mg/ml)とした。  
b.溶液を室温で2時間インキュベートした。  
c.次いで、DTEで還元した封入体のタンパク質濃度を再測定した。典型的には、封入体は、DTEで還元した後は、より完全に可溶化し、タンパク質濃度の測定値の増大をもたらした。  
d.封入体溶液を、DTE10mg/mlを含む可溶化溶液で10mg/mlに希釈した。  
e.次いで、VLおよびVH-PE38の封入体を、重量比1:2で一緒に混合した。  
f.次いで、封入体混合物を、リフォールディングバッファーで100倍に希釈した。  
g.次いで、リフォールディング溶液を、攪拌しないで、4℃で36〜42時間インキュベートした。
【０１２８】
5.濃度および透析
a.リフォールディング溶液のpHを8.5に調整した。次いで、リフォールディング溶液を、0.1N NaOHで浄化したAreiconH1P39043ホローファイバーカートリッジを用いて10倍濃縮し、次いで大量のMilliQ水で洗浄して中性のpHにした。  
b.リフォールディング溶液を、同じカートリッジを用いて、0.1M尿素を含む20mM Tris-HCl、pH7.4に透析した。伝導率が10mMhoまたはそれより低くなったときに透析を終了した。  
c.次いで、濃縮した溶液を13000rpmで30分間遠心分離した。上清を0.2μmメンブランフィルターを通してろ過した。  
d.次いで、伝導率を、バッファーAで7mMhoまたはそれより低く調整した。
【０１２９】
6.精製
a.Q-セファロースカラム(リフォールディング溶液1リットルあたり8〜10ml)を調製した。カラムを1N NaOHで洗浄し、その後大量の水(少なくとも10カラム体積)で洗浄し、次いでバッファーAで平衡化した。次いで、ろ過した上清をカラム上に充填した。カラムを、総容積の5倍の0.1M NaClのバッファーA溶液で洗浄した。次いで、カラムを総容積の4倍の0.3M NaClのバッファーA溶液で溶出した。  
b.分画を、SDS-PAGEにより分析し、最初の主要ピークでプールした。  
c.Mono-Qカラムを、Q-セファロースカラムで行ったのと同じ方法で処理した。プールしたQ-セファロース分画を、バッファーAで5倍希釈し、カラムに充填した。次いで、タンパク質をNaCl勾配(0.1〜0.3M)のバッファーA(総容積20)で溶出した。  
ほとんどの分画はSS1(dsFv)-PE38を含むが、主要ピークの分画だけが活性が高い。主要ピークは狭いクリフ(cliff)により分離されている。主要ピークのエッジを除いて、クリフの前の1つの分画を採取し、クリフの後のほとんどの分画を採取した(分画のサイズは、総容積の半分である)。  
d.プールしたMonoQ分画を5倍に希釈し、より小さいMonoQカラム上に再充填し、次いで0.5M NaClのバッファーA溶液で溶出した。  
e.タンパク質を含む分画をすべてプールし、予め0.1N NaOHで洗浄しPBSで平衡化したSuperalex200カラム上に充填した。カラムをPBSで溶出した。主要ピークの分画をプールし、タンパク質濃度を決定した。次いで、濃度を1mg/mlに調整した。アリコートを調製し、-80℃で凍結した。  
最終の収量は、約12%であった(リフォールディングにおける封入体タンパク質の量に対して)。
【０１３０】
7.細胞毒性アッセイ
上記で得られたSS1Pタンパク質の活性を、15000細胞/ウェルを用いて細胞毒性アッセイにより確認した。A431K5細胞を、96ウェルプレートに接種した。天然のSS1PまたはSS1PのPEG複合体のいずれかのサンプルを、翌日、様々な濃度で細胞に加えた。トリチウム標識したロイシンを、SS1P/PEG複合体を加えた20時間後に加え、37℃で2時間インキュベートした。IC50値は、約0.8ng/mlであった。
【０１３１】
8.内毒素アッセイ
上記で得られたSS1Pタンパク質を、内毒素について試験し、結果は、アッセイ用の、Associates of Cape Cod社が販売するLALキットを用いて、3EU/mgタンパク質未満であった。
【０１３２】
〔実施例２Ｃ〕
培養した大腸菌からのSS1P免疫毒素の代替の精製
培養した大腸菌宿主細胞からSS1Pタンパク質を単離する代替の方法も、開発されている。この代替の方法により、収量の改善がもたらされている。
【０１３３】
1.宿主細胞の処理加工
SS1-PE38VHおよびSS1VLを発現する宿主細胞を、以下のように収集した。細胞を、12000×g(Beckmanで7000rpm)で、4℃で20分間収集した。湿重量は、それぞれ、SS1-PE38VHが約42.5g、SS1VLが22.5gであった。細胞を-20℃で貯蔵した。
【０１３４】
2.SS1VL発現性細胞からの封入体(「IB」)の調製
以下のように、SS1VLを発現する細胞からIBを単離した。  
収集した細胞を、再懸濁バッファー(「RB」)(TES:Tris、EDTA、塩化ナトリウム、pH7.4、上記に規定した通り)で、20ml/g細胞の体積で再懸濁した。  
再懸濁した細胞塊をホモジナイザーで、6000rpmで5分間ホモジナイズし、次いで、250マイクロメートル開口/米国標準試験ふるい、#60の金属メッシュを通して細胞懸濁液を通過させることにより選別した。次いで、選別した細胞を、氷上で3サイクルマイクロフルイダイズし、その後12000×g(Beckmanで7000rpm)で、4℃で20分間遠心分離することにより破壊した。  
25%TritonX-100(水溶液)の1/10体積をペレットに加え、その後、攪拌しながら室温で30分間インキュベートし、その後インキュベートした材料を12000×g(Beckmanで7000rpm)で、4℃で20分間遠心分離した。得られたペレットをTES 20ml/gで洗浄し、次いでホモジナイズした。  
次いで、上記の洗浄ステップをさらに2回繰り返したが、攪拌しながらのインキュベートは5分間に減らした。  
次いで、TES 20ml/gを加え、ホモジナイズし、次いで攪拌しながら室温で5分間インキュベートすることにより、得られたペレットをTritonX-100なしで洗浄した。インキュベートの後、12000×g(Beckmanで7000rpm)で、4℃で20分間遠心分離した。  
次いで、上記の洗浄ステップ(TritonX-100なしで)を、さらに2回繰り返した。  
得られたペレットの重量は、1.85gであった。  
得られたSS1VLIB材料を、-20/-80℃で貯蔵した。
【０１３５】
3.SS1-PE38VH発現性細胞からのIBの調製
収集したSS1-PE38VHを発現する細胞を、細胞1gあたり20mlの割合で、RB:TES、Tris、EDTA、塩化ナトリウム、pH7.4で再懸濁した。再懸濁した細胞塊を、ホモジナイザーで6000rpmで5分間ホモジナイズし、次いで、250マイクロメートル開口、米国標準ふるい、#60の金属メッシュを通して細胞懸濁液を通過させることにより選別した。次いで、選別した細胞を、氷上で3サイクルマイクロフルイダイズし、その後12000×g(Beckmanで7000rpm)で、4℃で20分間遠心分離することにより破壊し、次いでTritonX-100で処理し、SS1VLの調製について上記で提供したプロトコールを用いて、繰り返し遠心分離により洗浄した。  
最終のペレットの湿重量は5.85g。  
採集したIB材料を、-20/-80℃で貯蔵した。
【０１３６】
4.SS1VLIB材料の可溶化
収集したSS1VLIB材料を可溶性のSS1VLタンパク質に転換するために、収集したIB材料に以下のプロセスを受けさせた。  
IBの重量は1.85gであった。  
可溶化バッファー(6M GuHClの100mM Tris HCl溶液、pH8.0、1.0mM EDTA(GTEバッファー)
バッファー体積は、IB材料1gに対して5〜10mlであった。  
採集したIB材料を、攪拌しながら25℃で一晩抽出した。材料がGuHClに溶解すると、外観は麦わら色でわずかに混濁していた。次いで、GuHCl溶液を、Sorvallで45分間、15〜20℃で14000×rpmで遠心分離し、上清を採集した。  
体積15.0ml
タンパク質濃度15.0mg/ml
タンパク質濃度をGTEバッファーで10mg/mlに調整
【０１３７】
5.SS1-PE38VHIBの可溶化
上記でSS1VLIB材料に関して記載したのと同じ試薬およびプロセスを、採集したSS1-PE38VHIB材料に適用した。  
IBの重量5.85g
体積22.0ml
タンパク質濃度20.0mg/ml
GTEバッファーでタンパク質濃度を10mg/mlに調整
【０１３８】
6.VLの変性
上記に記載した通りに調製した、可溶化したSS1VLIB材料22.0mlを10mg/mlのDTEと混合し、攪拌しないで、一晩RTでインキュベートした。
【０１３９】
7.SS1-PE38VHの変性
上記に記載した通りに調製した、可溶化したSS1-PE38VHIB材料44.0mlを10mg/mlのDTEと混合し、攪拌しないで、一晩RTでインキュベートした。
【０１４０】
8.ジスルフィド結合した完全なSS1P[dsFvSS1P]を形成するためのリフォールディング
最終のSS1Pタンパク質(dsFvSS1PまたはSS1P)を形成するために、変性したSS1VLおよびSS1-PE38VHを、リフォールディング、ならびにSS1VLおよびSS1-PE38VHの両部分に存在する作製されたシスチン残基間のジスルフィド結合の形成を促進する条件下で混合した。  
リフォールディングバッファーは、Tris HCl 100mM、pH10.0、25mM EDTA、NaCl 0.1M、GSSG 551mg/L、0.5Mアルギニンであった。  
変性したSS1-VL溶液22.0mlを、変性したSS1-PE38VH 44.0mlと、全体積66.0mlに対して、モル比1:2(SS1-VL:SS1-PE38VH)で混合した。混合物を、5分未満、穏やかに、しかし完全に攪拌した。  
次いで、リフォールディングバッファー100体積を、混合した変性したIBの各1体積に加え、その後RTで2分間、急速に攪拌した。SS1-VLおよびSS1-PE38VHタンパク質を、攪拌しないで、4℃で45分間リフォールディングさせた。  
リフォールディング混合物の全体積は、6600.0mlであった。  
全タンパク質濃度(mg/ml)0.1mg/ml
全タンパク質660mg
SS1-PE38VHの純度58%
SS1-VLの純度44.5%
推定の純粋SS1-PE38VH 255.2mg
推定の純粋SS1-VL 97.9mg
SS1P形成の推定収量22〜25%
【０１４１】
9.再生したSS1PのpHの調整
再生したSS1Pを含むバッファーの全体積は6600.0mlであった。  
HClの濃度は12Nであった。  
再生したSS1Pを含むバッファーの最初のpHは10.5であった。  
加えたNaOHの体積は約300mlであった。  
再生したSS1Pを含むバッファーの最終pHは8.5であった。  
サンプルの最終体積は6900.0mlであった。
【０１４２】
10.再生したSS1Pの清澄化
フィルターユニットは、ACROPAK 1000 Capsule(0.8u/0.45u)、PALLであった。  
開始体積は6900.0mlであった。  
最終体積は6900.0mlであった。  
タンパク質濃度は0.095mg/mlであった。  
全タンパク質は6600.0mgであった。  
純度(SDS-PAGEに対して)は20〜25%であった。  
ステップの収率>95%
タンパク質の回収率>95%
【０１４３】
11.MEP-HyperCelクロマトグラフィー
MEP-HyperCel樹脂は、SS1P-VLドメインに特異的に結合する。再生したSS1Pは、リフォールディングしたタンパク質のさらなるプロセシングなしにMEP-HyperCelカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。リフォールディングしたSS1Pは、リフォールディング溶液を通過させることにより、MEP-HyperCelカラムに結合させた。次いで、非特異的に結合したタンパク質を、低いpH(pH5.0)で洗浄することにより除去した。完全に再生したSS1Pを、250mM NaClの存在下で、pH4.0のバッファーでカラムから溶出させた。溶出したSS1PサンプルのpHを、0.1N NaOHを用いて7.4に変更し、pH7.4で10体積の20mMリン酸バッファーに透析することにより、高濃度の塩分を除去した。SourceQ-30カラムを用いて、SS1Pをさらに精製した。カラムを、25mM NaClを含むpH7.4の20mMリン酸塩で予め平衡化した。サンプルを充填した後、非特異性のタンパク質を洗浄して除き、直線塩濃度勾配でSS1Pを溶出した。分画をSDS-PAGEにより分析し、純度の最も高い分画をプールした。PEG化するために、精製したSS1Pを望ましいバッファーに透析した。  
樹脂は、MEP-HyperCel(Ciphergen,Inc)であった。  
結合能は、10mg/mlから20mg/mlまでと報告されている。  
総容積100ml
流速5〜10ml/分
平衡バッファーは、20mM Tris、pH7.6、NaCl 250mM、および1mM EDTAであった。  
平衡体積>5×CV[CVはカラム体積]
タンパク質充填は353mgであった。  
洗浄500ml(5×CV)
洗浄バッファーは、20mM Tris、pH7.6、NaCl 250mM、および1mM EDTAであった。
【０１４４】
12.低pHの洗浄
バッファーは、酢酸Na、50mM、pH5.0、および250mM NaClであった。  
バッファー体積は500ml(5×CV)であった。  
溶出は、酢酸Na、50mM、pH4.0、および250mM NaClで行った。  
溶出体積は10×CVであった。  
採集した体積は660mlであった。  
タンパク質濃度は0.098mg/mlであった。  
全タンパク質は64.7mgであった。  
純度(SDS-PAGEに対して)は85%であった。  
収量は18.3%(総タンパク質に対して)であった。
【０１４５】
13.NaOHでのpHの調整
溶液の最初のpH:4.0
NaOHの濃度は1.0Nであった。  
加えたNaOHの体積は31mlであった。  
最終のpHは7.4であった。  
最終体積は691mlであった。
【０１４６】
14.清澄化(必要な場合)
13000rpmで30分間遠心分離。  
上清は約690mlであった。  
タンパク質濃度0.093mg/ml
全タンパク質64.17mg
タンパク質回収率99.1%
ステップ収率99%
【０１４７】
15.透析
MEP-HyperCelで溶出したサンプルを、10体積のpH7.4の20mMリン酸バッファーに対して、一晩4℃で透析して、サンプルから過剰の塩を除去した。  
開始体積691ml
最終体積726ml
開始伝導率〜35〜40mS/cm
最終伝導率6〜8mS/cm
タンパク質濃度0.09mg/ml
全タンパク質64mg
タンパク質回収率99%
【０１４８】
16.SourceQ-30クロマトグラフィー
樹脂は、SourceQ-30[GE HealthCare/以前のAmersham/Pharmacia]であった。  
結合能15mg/mlから25mg/ml
総容積8ml
流速4ml/分
平衡バッファーは、Tris.HCl、20mM、pH7.4、1mM EDTA、20mM NaCl
平衡体積5C×V
タンパク質充填45mg
洗浄は5C×Vで行った。  
洗浄バッファー(バッファーA:20mM リン酸Na、pH7.4、および50mM NaCl)
溶出バッファー(バッファーB:20mM リン酸Na、pH7.4、および500mM NaCl)
溶出は、50mM NaClと225mM NaClの間での、勾配溶出によった。  
溶出体積20C×V
採集した体積38ml
タンパク質濃度0.75mg/ml
全タンパク質28.5mg
純度((特異的活性)ゲルスキャニングに対して>95%
ステップ収率は73.8%であった。  
最終収率は8.1%であった。
【０１４９】
最終精製生成物の調整
精製したタンパク質を、特異的なPEG化プロセスに適したバッファーに透析した。例えば、DGA-2またはBCN3-PEG化を意図したSS1Pは、50mMリン酸ナトリウム、pH7.8、および50mM NaClを含むリン酸バッファー、またはpH7.6で0.1Mリン酸ナトリウムを含むリン酸バッファーのみに透析した。
【０１５０】
〔実施例３〕
解離性PEG-SS1P複合体の調製
DGA2、RNL-8a、およびBCNなどの解離性のリンカーを使用するPEG化反応で、1.5〜2.5mg/mLのSS1Pを、0.05〜0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.6、25℃でPEG化した。泡を発生させずに迅速に攪拌して、PEG対SS1Pの反応モル比10:1から50:1で、活性化したPEG粉末を、1g/分の速度でSS1P溶液に加えた。反応を25℃で1時間続け、グリシンを加えることによりクエンチした。クエンチの直後に、溶液のpHをリン酸ナトリウム、一塩基酸で6.5に低下させ、複合体をサイズ排除カラム(Superdex 200または75 Hiload、Amersham、ニュージャージー州)上で精製し、20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化した。
【０１５１】
あるいは、複合体を、陰イオン交換カラム(Q Sepharose Fast Flowカラム、Amersham、ニュージャージー州)上で、平衡バッファーとして10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、および勾配溶出バッファーとして0.3M塩化ナトリウムの10mMリン酸ナトリウム溶液、pH7.4、あるいは平衡バッファーとして10mM Tris、pH7.6、および勾配溶出バッファーとして0.3M塩化ナトリウムの10mM Tris溶液、pH7.6を用いて精製した。ピークを含むカラム分画を合わせ、PBS、pH6.5に透析した。サンプルを、Centriplus 30k(Millipore、マサチューセッツ州)を用いて約1mg/mLに濃縮し、滅菌フィルター(Acrodisc Syringe Filter、0.2μm HT Tuffynメンブレン、Pall、ミシガン州)を通過させた。
【０１５２】
タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ(PIERCE、イリノイ州)により、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いて決定し、細胞毒性をA431/K5細胞に対して分析した。SS1P 1分子あたりのPEGポリマーの数を、SDS-PAGE(予め成形した4〜20% SDS非還元性ゲル、Invitrogen、カリフォルニア州)により推定した。解離性のPEG-SS1PからのSS1Pの放出は、pH8.5のバッファーで37℃で4時間インキュベートすることにより行った。生成物の純度を、50mMリン酸ナトリウム、pH6.5、150mM NaClで平衡化したTSKゲルろ過カラム(G4000SWXXL)、7.8×30cm、8μm、Tosoh Biosciences)上で分析した。ピーク面積を、220nmで計算した。
【０１５３】
〔実施例３Ａ〕
解離性DGA2-SS1Pの調製
1.2.5mg/mL SS1Pの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH7.6の4mLに、DGA2-12k-NHS粉末(Enzon、EZ1064/E1029-154A)48mg(25:1)を加えた。反応を25℃で60分間続け、グリシン対PEGのモル比10:1のグリシンでクエンチした。複合体を20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化したSuperdex 200 Hiloadカラム上で精製した。ピークの分画を合わせ、0.2μm滅菌フィルターを通してろ過した。
【表１】
2008523105.tif 000026
【０１５４】
〔実施例３Ｂ〕
解離性24K BCN3-SS1Pの調製
SS1P 1.8mg/mLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH7.6の2.2mLに、BCN3-24k-NHS粉末(Enzon、1165〜170)38mg(25:1)を加えた。反応を25℃で60分間続け、グリシン対PEGのモル比10:1のグリシンでクエンチした。複合体を20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化したSuperdex 200 Hiloadカラム上で精製した。ピークの分画を合わせ、0.2μm滅菌フィルターを通してろ過した。SS1P 1分子あたり2〜4個のPEGが存在した。
【表２】
2008523105.tif 000027
【０１５５】
〔実施例３Ｃ〕
解離性24K BCN3-SS1Pの調製
SS1P 1.7mg/mLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液(pH7.6)の5.9mLに、BCN3-24k-NHS粉末(Enzon、1165-170)152mg(反応モル比40:1)を加えた。25℃で60分間反応後、反応混合液をH2Oで15倍希釈して伝導率を1mSにし、Qカラム(総容積4mL、1×5.3cm)上で精製した。平衡バッファーは10mMリン酸ナトリウム、pH7.6であり、勾配溶出バッファーは10mMリン酸ナトリウム、pH7.6、0.3M NaClから構成されていた。分画を合わせ、0.2μm滅菌フィルターを通過させた。
【表３】
2008523105.tif 000028
【０１５６】
〔実施例３Ｄ〕
解離性BCN3-3モノ-12k/20k/30k BCN3-SS1Pの調製
BCN3-モノ-12k/20k/30k-NHSなどの解離性のリンカーを使用するPEG化反応で、1.5〜2.5mg/mLの抗メゾテリン免疫毒素SS1Pを、0.05〜0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.6〜7.8、25℃でPEG化した。泡を発生させずに迅速に攪拌して、PEG対SS1Pの反応モル比40:1〜50:1のPEG粉末をSS1P溶液に1g/分の速度で加えた。あるいは、PEG粉末を、1mM HClに予め溶解し、攪拌しながらSS1P溶液に加えた。反応を25℃で1時間続け、グリシンを加えることにより、またはリン酸ナトリウム、一塩基酸でpHを6.5に低下させることによりクエンチした。複合体をサイズ排除カラム(Superdex 200または75 Hiload、Amersham、ニュージャージー州)上で精製し、20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化した。あるいは、複合体を、陰イオン交換カラム(Q Sepharose Fast Flowカラム、Amersham、ニュージャージー州)上で、平衡バッファーとして10mMリン酸ナトリウム、pH7.4、および勾配溶出バッファーとして0.3M塩化ナトリウムの10mMリン酸ナトリウム溶液、pH7.4、あるいは平衡バッファーとして10mM Tris、pH7.6、および勾配溶出バッファーとして0.3M塩化ナトリウムの10mM Tris溶液、pH7.6を用いて精製した。BCN3-モノ-SS1を含む分画を、予め成形した4〜20%SDS非還元性ゲル(Invitrogen、カリフォルニア州)上で同定し、Centriplus 30k(Millipore、マサチューセッツ州)を用いて濃縮し、滅菌フィルター(Acrodisc Syringe Filter、0.2μm  HT Tuffynメンブレン、Pall、ミシガン州)を通過させた。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ(PIERCE、イリノイ州)により、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いて決定し、細胞毒性をA431/K5細胞に対して分析した。SS1P 1分子あたりのPEGポリマーの数を、SDS-PAGE(予め成形した4〜20%SDS-非還元性ゲル、Invitrogen、カリフォルニア州)により推定した。生成物の純度を、50mMリン酸ナトリウム、pH6.5、150mM NaClで平衡化したTSKゲルろ過カラム(G4000SWXXL)、7.8×30cm、8μm、Tosoh Biosciences)上で分析した。ピーク面積を、220nmで計算した。
【０１５７】
〔実施例３Ｅ〕
解離性BCN3-モノ-30K-SS1Pの調製
迅速に攪拌しながら、BCN3-モノ-30K-NHS(Enzon、E1245-160A)239mgを、SS1P 1.7mg/mLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH7.8、5.9mLに加えた。反応を25℃で60分間続け、複合体をQカラム(総容積4mL、1×5.3cm)上で精製した。カラム平衡バッファーは10mM Tris、pH7.4であり、溶出バッファーは0.3M NaClの10mM Tris溶液、pH7.4を含んでいた。生成物ピークを含む分画を合わせ、Centriplus 30k上で濃縮し、0.2μm滅菌フィルターを通してろ過した。
【表４】
2008523105.tif 000029
【０１５８】
〔実施例３Ｆ〕
解離性RNL-8A-SS1Pの調製
RNL-8a-12k-NHS(Enzon、E929-60A)15mgを、SS1P 1.94mg/mLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH7.6の2mLに加えた(反応モル比20:1)。反応を、25℃で60分間続け、グリシン対PEGのモル比10:1のグリシンでクエンチした。複合体を20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化したSuperdex 200 Hiloadカラム上で精製した。生成物のピークの分画を合わせ、0.2μm滅菌フィルターを通してろ過した。
【表６】
2008523105.tif 000030
【０１５９】
〔実施例３Ｇ〕
ハイブリッドDGA2-SC-SS1Pの調製
SS1Pを、最初に解離性（releasable）のDGA2-5k-NHS(Enzon、E1118-84)で、次いで永続性（permanent）のSC-12k-NHS(Enzon、V-05325)で修飾した。SS1P 1.9mg/mlの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH7.6の3mLに、DGA2-5k-NHS粉末7mgを加えた。25℃で40分反応させた後、SC-12k-NHS 11mgを加えた。反応物のモル比は、DGA2:SC:SS1P=15:10:1であった。反応を25℃で60分間続け、次いでグリシンでクエンチした(グリシン:PEG=10:1)。ハイブリッド複合体を、20mMリン酸ナトリウム、pH6.5、140mM NaClで平衡化したSuperdex 200 Hiloadカラム上で精製した。合わせた分画を、Centriplus 30k上で濃縮し、滅菌フィルターを通過させた。複合体の組成は、SS1P 1分子あたりDGA2 1〜4およびSC 1〜3であった。
【表７】
2008523105.tif 000031
【０１６０】
〔実施例４〕
非解離性PEG-SS1P複合体の調製
永続性のリンカーを使用したPEG化反応では、1.5〜2.5mg/mLのSS1Pを、0.05Mリン酸ナトリウム、pH6.0〜9.0、25℃でPEG化した。泡を発生させずに迅速に攪拌して、PEG対SS1Pの反応モル比3:1から15:1のPEG粉末を、SS1P溶液に1g/分で加えた。PH7.4〜9.0の反応では、反応を25℃で1〜2時間、pH6.0〜7.0の反応では4時間続けた。グリシンを加えることにより反応をクエンチした。複合体を陰イオン交換カラム(Q fast Flow Sepharose、Amersham、ニュージャージー州)により精製し、この場合平衡バッファーは10mM Tris、pH7.6であり、勾配溶出バッファーは0.3M塩化ナトリウムの10mM Tris溶液、pH7.6を含んでいた。サイズ排除カラム(Superdex 200または75 Hiload(Amersham、ニュージャージー州)を用いる場合、平衡バッファーはPBS、pH7.4であった。サンプルを、Centriplus 30k(Millipore、マサチューセッツ州)を用いて約1mg/mLに濃縮し、滅菌フィルター(Acrodisc Syringe Filter、0.2μm HT Tuffyn メンブレン、Pall、ミシガン州)を通過させた。タンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ(PIERCE、イリノイ州)により、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用いて決定し、細胞毒性をA431/K5細胞に対して分析した。SS1P 1分子あたりのPEGの比率を、SDS-PAGE(予め成形した4〜20%SDS-非還元性ゲル、Invitrogen、カリフォルニア州)により推定した。生成物の純度を、50mMリン酸ナトリウム、pH6.5、150mM NaClで平衡化したTSKゲルろ過カラム(G4000SWXXL、7.8×30cm、8μm、Tosoh Biosciences)上で分析した。ピーク面積を、220nmで計算した。
【０１６１】
〔実施例４Ａ〕
pH7.8でのモノPEG2-40K-SS1Pの調製
PEG2-40k-NHS(Nektar、カリフォルニア州)63mgを、迅速に攪拌しながらSS1P 1.5mg/mLの50mMリン酸ナトリウム溶液、pH7.8の7mLに加えることにより複合体を形成した(PEG対SS1Pの反応モル比は、10:1であった)。反応を25℃で90分間続け、Qカラム(総容積4mL、1×5.3cm)上で精製した。サンプルを、H2Oで6倍希釈し、10mMリン酸ナトリウム、pH7.8で平衡化したカラム上に充填し、溶出バッファーとして0.5M NaClの10mMリン酸ナトリウム溶液、pH7.8で複合体を直線勾配で溶出した。化合物を、Centriplus 30K上で、約1mg/mLに濃縮し、滅菌フィルターを通過させることにより滅菌した。
【表８】
2008523105.tif 000032
【０１６２】
〔実施例４Ｂ〕
pH6.0でのモノPEG-20K-SS1Pの調製
PEG2-20k-NHS(Nektar、カリフォルニア州)18mgを、攪拌しながら0.1Mリン酸ナトリウム1.9mg/mL溶液、pH6.0に25℃で加えた(PEG:SS1P=15:1)。反応を2時間続け、モノPEG2-20k-SS1PをMini  Q-XLカラム(Amersham、ニュージャージー州)上で精製した。この場合平衡バッファーは、10mMリン酸ナトリウム、pH7.8であり、溶出バッファーは0.5M NaClの10mMリン酸ナトリウム溶液、pH7.8を含んでいた。
【表９】
2008523105.tif 000033
【０１６３】
〔実施例４Ｃ〕
pH6.5でのSC-SS1Pの調製
複合体を、pH6.5で、反応モル比15:1(PEG:SS1P)で形成した。泡を発生させずに迅速に攪拌して、SC-12k-NHS(Enzon、V-05325)11mgを、SS1P 1.94mg/mLの0.1Mリン酸ナトリウム溶液、pH6.5の2.0mLに加えた。反応を25℃で120分間続け、グリシン:SS1P=10:1の比までグリシンを加えることによりクエンチした。複合体を、上記の通りに平衡化したQカラムまたはSuperdex 200 Hiloadカラムクロマトグラフィーにより精製した。PBS、pH7.4においてSuperdex 200 Hiloadカラム上で採集した分画は、SS1P 1個あたり2〜4個のPEGを含んでいた。
【表１０】
2008523105.tif 000034
【０１６４】
〔実施例４Ｄ〕
α-アミノN-末端-PEG-SS1Pの調製
2mg/mLのSS1Pを、100mMリン酸ナトリウム、pH6.5における反応モル比(PEG:SS1P)10:1でALD-PEG-20k(アルデヒド-PEG-20k、Nektar、カリフォルニア州)で、25℃で3時間インキュベートした。シッフ塩基の還元を15mMシアノボロヒドリドナトリウムで、25℃、16時間で完了させた。モノおよびジPEG-SS1Pを、HiTrap  Q-XL(Amersham Biosciences、ニュージャージー州)上pH7.5で単離した。IC50は、モノPEG-SS1Pでは39ng/mL、ジPEG-SS1Pでは310ng/mLであった。SDS-PAGEにより、モノPEG-SS1PにおけるPEGは、重鎖(SS1-PE38VH)上に選択的に配置され、ジPEG-SS1PにおけるPEGはSS1Pの重鎖および軽鎖(VL)の両方の上に見られることが示された。
【０１６５】
〔実施例４Ｅ〕
PEG-ヒドラジド-SS1Pの調製
SS1P(1.5mg/mL)を、250モル倍のPEG-ヒドラジド-12k(Enzon、929-12A)と、200モル倍の1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(Aldrich、ウィスコンシン州)の1mM HCl溶液、pH4.5の存在下、25℃で1時間反応させた。PEG-ヒドラジド-SS1P複合体を、HiTrap SP HPカラム(2×1mL、Amersham、ニュージャージー州)上NaClで、pH4.5で単離した。
【表１１】
2008523105.tif 000035
【０１６６】
〔実施例５〕
PEG-SS1P複合体の抗原性の分析
調製したPEG-SS1P複合体の抗原性の推定値を得るために、抗体結合反応におけるPEG-SS1P複合体の免疫反応性を、サンドイッチELISAにより分析した。ELISAプレート上に抗体200ngを含む50μL炭酸水組成物ナトリウム溶液中を載せて、25℃で一晩インキュベートし、プレートをマウスモノクローナル抗-PE40抗体(NCI、DC)でコーティングした。翌日、プレートを、1%BSA、5%ショ糖、0.05%NaN3のPBS溶液、pH7.4を250μl/ウェルで25℃で一晩ブロックし、バッファー(PBS、pH7.4、0.05%Tween-20)で洗浄した。100ng/50μL/ウェルのSS1PまたはPEG-SS1P複合体の希釈液(0.1%BSA、5%ショ糖、0.05%NaN3、PBS、pH7.4)溶液を、4℃で一晩インキュベートするために加えた。洗浄バッファーで洗浄後、100μL/ウェルの1:40000希釈ウサギポリクローナル抗-全PE794/2623抗体(35〜50%硫酸アンモニウム分画、NCI、DC)を加えた。25℃で1.5時間インキュベート後、過剰の試薬を除去し、プレートを洗浄バッファーで洗浄した。1:5000希釈のヤギ抗ウサギIgGと複合した西洋ワサビのペルオキシダーゼ50μL (Jackson、ペンシルベニア州)を加えた。25℃で1時間インキュベート後、プレートを洗浄バッファーで3回、H2Oで1回洗浄した。TMBペルオキシダーゼ基質100μLを加え(Moss,Inc、ペンシルベニア州)、15〜20分に1M硫酸50μLを加えることにより、発色を止めた。450nmで吸光度を読んだ。
【０１６７】
図5では、吸光度の読み(Y軸)を、濃度(ng)に対して(X軸)プロットした。結果は、BCN3-モノ-30K SS1Pは最も低い免疫反応性を表し、非複合化SS1Pは最も高い免疫反応性を表したことを指摘している。抗-SS1P抗体に対する免疫反応性の低減は、PEG-複合体から求められた望ましい特色の1つである。
【０１６８】
〔実施例６〕
in vitroの抗腫瘍活性を確かめる細胞毒性アッセイ
以下のように、細胞毒性アッセイにより、in vitroの抗腫瘍活性を確認した。  
1.A341K5細胞を、10%FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、750mg/ml G-418、および200mM L-グルタミンを含むダルベッコ変法イーグル培地(「DMEM」)で、37-Cw/5%CO2で増殖させた。  
2.平底の96ウェル組織培養プレートで、上記の培地50μlに、連続した2倍希釈のSS1Pを調製した。SS1P濃度は、50ng/mlから0.05ng/mlまでの範囲であった。A341/K5細胞の対照は、SS1Pを含まないものであった。  
3.細胞懸濁液50μl(細胞2×10個を含む)を、上記の培地で、組織培養プレートの各ウェル中に分配した。  
4.プレートを、37℃w/5%CO2で48時間インキュベートした。  
5.MTT染色液(Promega、カタログ番号G4100)15μlを各ウェルに加え、37℃w/5%CO2で4時間インキュベートした。  
6.可溶化/停止溶液70μlを各ウェルに加え、プレートを一晩そのままにした。  
7.プレートを、VERSA MAXプレートリーダーにより570nmで記録し、4パラメータの適合を用いてIC50を計算した。IC50値は細胞増殖の50%阻害に対応していた。天然のSS1Pは、細胞毒性アッセイからのIC50値においてPEG-SS1Pとすべて比較するためのアッセイセットに含まれていた。
【０１６９】
〔実施例７〕
in vitroの抗腫瘍活性の確認
PEG-SS1P複合体のin vivoの抗腫瘍活性を、A431K5腫瘍を有するマウスで決定した。3×106 A431K5腫瘍細胞を、0日目にヌードマウス(1グループあたりマウス2匹)中に接種し、7日間で確立させた。7日目に開始して、1.5、2.0、3.0、4.0、および6.0mg/kgの24k mPEG-BCN3-SS1P、および0.5mg/kgのSS1Pのi.v.注射でマウスを処置した。腫瘍をノギスで測定し(図6で指摘された日に)、腫瘍の体積を、Pai,L.H.、Batra,J.K.、Fitzgerald,D.J.、Willingham,M.C.、およびPastan,I.、1991年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻、3358〜3362頁における通りに測定した。
【０１７０】
図6に示すように、PEG-SS1Pで処置したマウスは、用量依存性の方法で、より長期間、腫瘍体積の有意な低減を示した。
【０１７１】
〔実施例８〕
in vivoおよびin vitroの抗腫瘍活性の比較
上記実施例6および7で使用した方法を用いて、SS1Pの、in vitroの細胞毒性、およびin vivoの抗腫瘍活性の両方に対するPEG化の効果を決定した。
【表１２】
2008523105.tif 000036
【０１７２】
表12では、細胞毒性(IC50をもたらす各化合物のmg/ml)は、各複合体のin vitroの抗腫瘍の効力の指標を提供している。腫瘍の収縮のパーセント値は、最大耐量における各複合体のin vivo活性を示している。当業者であれば、in vitroとin vivoの活性の間には完全な相関が存在しないことに留意するであろう。例えば、化合物No.6(mPEG2-40k-SS1P、永続性のリンカー)は、試験をした腫瘍細胞の低いin vitroの阻害を示したが、それにもかかわらずin vivoでは驚くべき程度の腫瘍の収縮をもたらした。8.8というIC50値は、天然の、非複合型のSS1Pに対して測定したIC50値の約3%である。さらに、化合物3〜5は、広範囲のin vitroの効力を示すが、すべて、約50%の腫瘍の収縮をもたらす。これらの化合物すべてについて、投与量を2倍に増大しても著しい腫瘍の収縮は観察されなかった。一方、化合物No.1および2はin vivoで明確な、用量依存性を示し、腫瘍に対する処置の特異性をほのめかしていた。
【０１７３】
7日目、非複合化SS1P(上記の表で示していない)は、マウス1匹あたり10μgの単回投与(LD10)後、腫瘍体積のわずか3%の収縮をもたらした。非複合化SS1Pは、in vitroで0.3ng/mlのIC50を示した。それとは対照的に、複合体のSS1P化合物は、著しい腫瘍の収縮をもたらした。
【０１７４】
〔実施例９〕
さらなるin vivoの試験
解離性、および永続性のPEG-SS1P複合体の毒性および抗腫瘍活性をさらに決定するために、さらなる試験を行った。
【０１７５】
A.動物毒性試験
PEG化した免疫毒素の非特異的な毒性を、マウスで、2.0、3.0、4.0、または6.0mg/kg静脈内投与することにより試験した。処置4日以内に、ほとんどすべてが死んだ。以下の表13は、毒性データを示す。天然のSS1PのLD50は、約1.0mg/kgであることが見出され、それとは対照的に、PEG化したSS1P化合物の耐容性はずっと良好であった。抗腫瘍の試験では、本発明者らは、病気または死亡を引き起こす投与量未満の、1または2回の投与レベルを使用した。
【表１３】
2008523105.tif 000037
【０１７６】
B.解離性または永続性PEG-SS1Pの抗腫瘍活性
SS1PおよびPEG-SS1P化合物の抗腫瘍活性を、メゾテリンを発現するA431-K5ヒト癌細胞を有するヌードマウスで決定した。細胞(3×106個)を、0日目に、ヌードマウス中にs.c.注射した。腫瘍移植7日後までに、サイズが〜140mm3の腫瘍が動物に発生し、その後、動物を各免疫毒素化合物のi.v.注射で処置した。天然のSS1PまたはPEG-SS1Pでの実験治療のほとんどでは、化合物を7日目に1回だけ投与した。いくつかの実験では、動物にPEG-SS1Pを7日目および9日目に2回投与し、SS1Pを7、9、および11日目の3回投与した。対照グループにはビヒクルだけを投与した。SS1Pは腫瘍の増殖を投与量依存の方法で阻害し、このマウス異種移植モデルで退縮を達成するのに、天然SS1P(0.5mg/kg)の少なくとも3投与が必要とされることが予め決定されていた。通常、SS1P複合体の2つの異なる調製物を用いて、各PEG化化合物で3つの独立した試験を行った。
【０１７７】
以下の表14に示すように、DGA2-12kDa-PEG-SS1P(D-SS1P)が特に活性であった。2.0mg/kgの単回投与により14日目に90%の腫瘍の収縮がもたらされ、2/4のマウスで完全な腫瘍の退縮を示した。D-SS1Pを2回投与したマウスも著しい抗腫瘍反応を示し、4/8のマウスが完全な反応、および90%の平均腫瘍サイズの退縮を示した。
【表１４】
2008523105.tif 000038
【０１７８】
以下の表15に示すように、ビシン3-U-24kDa PEG-SS1P(B-SS1P)も、非常に活性であった。2.0mg/kgを投与したマウスの1/4、および3.0mg/kgを投与したマウスの3/4で完全な退縮を達成した。2.0mg/kgを2回投与したマウスでは、4/8のマウスが腫瘍の完全な退縮を示した。
【表１５】
2008523105.tif 000039
【０１７９】
以下の表16は、ビシン3-モノ-30kDa-PEG-SS1Pの抗腫瘍効果を示している。試験した最初の2化合物よりもいくらか活性が劣る様子である。3mg/kgでは、単回投与により68%の腫瘍サイズの最大の低下がもたらされ、一方、2.0mg/kgを2回投与することにより92%に平均サイズの低下がもたらされ、1/5に完全な退縮がもたらされた。
【表１６】
2008523105.tif 000040
【０１８０】
著しい抗腫瘍活性を示した可逆的連結を有する他の化合物は、RNL-8a-12kDa-PEG-SS1Pであった。しかし、以下の表17に示すように、これは他の化合物よりも活性が劣る。
【表１７】
2008523105.tif 000041
【０１８１】
永続性のPEG誘導体、多PEG化したSC-12kDa PEG-SS1P、およびモノ-PEG化したPEG2-40kDa PEG-SS1Pで、さらなる抗腫瘍の調査を行った。後者の化合物だけが、持続性の退縮をもたらし、1/4のマウスが3.0mg/kgの投与量で完全な退縮を示した(以下、表18を参照されたい)。
【表１８】
2008523105.tif 000042
【０１８２】
C.透過性および保持効果の増強
PEG化したタンパク質は、腫瘍が示す血管の漏出性およびリンパ液の排液の不足による、透過性および保持の増強(EPR)効果により、受動的ターゲティングにより腫瘍の異種移植片に蓄積すると報告されている。非標的のrPEG化された免疫毒素が抗腫瘍効果を示す可能性を調べるために、CD22を標的とした免疫毒素BL22の変異体、および解離性のPEG、DGA-2-12kDaまたはビシン3-U-24kDaからなる類似のrPEG化した化合物を、上記の表13にまとめたように産生した。これらの化合物は、抗腫瘍活性を示さず、SS1PのPEG化誘導体の抗腫瘍活性は特異的であることを確実にしていた。
【０１８３】
D.PEG-SS1Pの免疫原性および免疫反応性
投与された免疫毒素に対する患者のIgG反応は、それらの有効性の持続時間を制限することがあるので、抗-SS1P抗体に対するPEG-SS1P化合物の免疫反応性を、天然のSS1Pに対して評価した。プレートがPE38と反応するmabでコーティングされている、SS1PおよびいくつかのPEG化したSS1P誘導体のサンドイッチELISA分析では、増大する量の各複合体に曝露し、結合した免疫毒素の量をPE38に対するポリクローナル抗体で検出した(図3を参照されたい)。ウサギ抗-PE抗体に対するPEG-SS1P化合物の交差反応性は、天然のSS1Pに比べて減少している。2つの独立したSS1Pの調製物は、免疫反応性が等しく強力であることを表したが、高度にPEG化したビシン3-モノ-30kDa-PEG-SS1Pの2つの独立した調製物は、最も弱い交差反応性を示した。N末端にモノPEG化したALD-20kDa-PEG-SS1Pは、Fv-PE毒素のFv部分上のPEG結合により予想される通りに、抗-PE抗体と強力に反応性である。他のrPEG化した誘導体は、シグナルにおける中間体であった。これは、存在する中和抗体により、患者における迅速なクリアランスを回避するための可能な戦略を示唆している。PEG-SS1P化合物の免疫原性を評価するために、SS1PおよびPEG-SS1P化合物を、それぞれマウス1匹あたり2.5μg(SS1P)、またはマウス1匹あたり10μg(PEG-SS1P)の投与量で、4回投与に対して7日に1回、BALB/cマウスをi.v.で免疫化した。より高投与量の非修飾SS1Pは、天然毒素の毒性により、投与することができなかった。血液サンプルを7日ごとに採集し、その後引き続き免疫化した。捕獲ELISAにより、特異的なIgGおよびIgMのレベルを決定した。28日目、IgM抗体のレベルは、SS1Pおよび2つのrPEG化した誘導体に類似しており、IgG抗体のレベルも、28日目にこれらの化合物に類似していた(データは示さず)。マウスの抗血清も、細胞毒性アッセイで調査し、抗-SS1Pおよび抗-PEG-SS1Pの両方の抗血清が中和抗体を含むことが決定された。
【０１８４】
マウスにおける免疫原性は、ヒトの免疫原性を予測するものではないので、これらのデータは、免疫反応が現在のrPEG化したSS1P化合物において排除されないことを示唆している。マウスにおけるPEG-SS1P化合物の血中滞留時間が大幅に上昇することで、免疫反応の発生に対する対抗する機会がもたらされ得る。PEG-SS1Pおよび天然のSS1Pの、ヒト抗体対SS1Pに対する交差反応性を評価するために、SS1P治療を受けている2名の患者から抗血清を採集し、競合ELISAで分析した(データは示さず)。ヒト抗血清を、SS1PまたはPEG-SS1Pのいずれかの希釈物と混合し、次いで、SS1Pでコーティングしたプレートに加えた。検出試薬は、ウサギ抗-ヒトIgG(HRP複合体)であった。解離性または永続性のPEG-SS1P化合物は、抗-SS1Pヒト抗血清に対して交差反応性を示したが、PEG-SS1P化合物は、天然のSS1Pに比べた場合、この競合免疫アッセイで対数で1から2低下した結合効率を表した。これらのデータは、PEG化したSS1Pは、天然のSS1Pタンパク質に対する抗体の現存する患者においてクリアランスが迅速になりにくいことがあることを示唆している。
【０１８５】
E.PEG-SS1Pの標的結合および取り込み
(1)メゾテリン結合性、(2)細胞表面のメゾテリン結合性、(3)細胞の取り込みおよびプロセシングにおけるPEG-SS1P誘導体の生物活性を評価するために、本発明者らはいくつかの試験を行った。DGA2-12kDa-PEG-SS1Pおよびビシン3-U-24kDa-PEG-SS1P化合物について、Biacore分析により、KD、Kon、およびKoffの決定を行った。高親和性のSS1P(KD=0.7nm)は、DGA2-12(KD=39.5nM)、およびビシン-U-24(KD=8.1nM)誘導体において、親和性の低減を示した。SS1Pでは、Kon=1.1×106M-1秒であり、DGA2-12およびビシン3-U-24誘導体は、それぞれ6.3×103M-1秒-1、および6.4×104M-1秒-1のKon速度を有する。解離定数(Koff)は、化合物間で比較的保存されており、SS1P(8.3×10-4秒-1)、DGA2-12kDa-PEG-SS1P(2.5×10-4秒-1)およびビシン-3-U-24kDa-PEG-SS1P(5.1×10-4秒-1)であった。PEG-SS1P化合物でフローサイトメトリー調査を行って、それらのA431-K5細胞に対する細胞表面の結合性を評価した。等モルのSS1PおよびPEG-SS1P化合物を細胞とインキュベートし、マウス抗-PE-40mAbを加え、その後フィコエリトリン複合化ヤギ抗マウスポリクローナル抗体を加えた。上記の表13に見られるように、PEG-SS1P化合物について、細胞標的結合のより高い効率の間に定性的な相関が観察され、細胞毒性アッセイにおける効力はより高かった。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１Ａ】図1Aは、pPSC7-4cmプラスミド(配列番号1)のヌクレオチド配列1〜2452を示す図である。SS1VLをコードするオープンリーディングフレーム(「ORF」)は、ヌクレオチド81〜401(配列番号8)からであり、SS1VLの翻訳されたアミノ酸残基(配列番号7)も、対応するコドンの下に示してあり、終止部位は*により表示してある。pPSC7-4cmプラスミド(配列番号1)全体のヌクレオチド配列は、図1Aおよび1Bにわたる。
【図１Ｂ】図1Bは、pPSC7-7cmプラスミド(配列番号1、続き)のヌクレオチド2453〜3467を示す図である。
【図１Ｃ】図1Cは、ユニークな部位であるpPSC7-7cmプラスミドの制限酵素切断地図を示す図である。
【図２Ａ】図2Aは、pPSC7-4cmプラスミド(配列番号2)のヌクレオチド配列1〜1460を示す図である。SS1VHタンパク質(配列番号6)をコードするORFは、図2Aおよび2Bにわたる。SS1VHの1から460の翻訳されたアミノ酸残基も対応するコドンの下に示してあり(配列番号5)、終止部位は*により表示してある。pPSC7-7cmプラスミド配列全体(配列番号2)は、図2A〜2Cすべてにわたる。
【図２Ｂ】図2Bは、pPSC7-4cm(配列番号2、続き)のヌクレオチド配列1527から4167、および以下SS1VHの対応するコドンの翻訳されたペプチド配列の461から472のアミノ酸残基(配列番号5、続き)を示す図である。終止部位は*により表示してある。
【図２Ｃ】図2Cは、pPSC7-4m(配列番号2、続き)のヌクレオチド4168から4833を示す図である。
【図２Ｄ】図2Dは、ユニークな部位であるpPSC7-4cmプラスミドの制限酵素切断地図を示す図である。
【図３】例示のPEG-SS1P複合体のサンドイッチELISAにより分析した抗-SS1P抗体との、免疫反応性を示す図である。結果を、吸光度(450nm)対濃度(ng)としてプロットしてある。吸光度が高いほど、免疫反応性、または抗原-抗体結合性が高いことを意味する。試験した各PEG-SS1P複合体に対する曲線を、以下のように関連付けてある。「SS1P」は、非複合化SS1Pタンパク質を意味する。この図は、天然のSS1Pが、そのPEG複合化類似体のあらゆるものよりも、宿主においてより強力な免疫反応を誘導することを意味している。換言すれば、PEG複合体は、様々な程度で天然のSS1P分子における免疫原性のエピトープを隠すことができる。曲線を以下のように関連付ける。
【化１６】
2008523105.tif 000043
【図４Ａ】図4Aは、SS1Pと複合するための非解離性のリンカーを有するモノmPEG-40k(20kアーム2つを有するU-PEG)の構造を示す図であり、この場合、「mPEG」はCH3-(O-CH2-CH2)n-を表す。
【図４Ｂ】図4Bは、SS1Pと複合するための非解離性のリンカーを有するmPEG-SCの構造を示す図であり、「mPEG」は図4Aと同じである。
【図５Ａ】図5Aは、SS1Pと複合するための解離性のリンカーであるmPEG-DGA2-RNL8aの構造を示す図であり、「mPEG」は図4Aと同じである。
【図５Ｂ】図5Bは、SS1Pと複合するための解離性のリンカーであるmPEG-BCN3-Uの構造を示す図であり、「mPEG」は図4Aと同じである。
【図５Ｃ】図5Cは、SS1Pと複合するための解離性のリンカーであるmPEG-BCN3-モノの構造を示す図であり、「mPEG」は図4Aと同じである。
【図５Ｄ】図5Dは、SS1Pと複合するための解離性のリンカーであるmPEG-RNL8aの構造を示す図であり、「mPEG」は図4Aと同じである。
【図６】マウスにおける、24kmPEGBCN3-SS1Pの単回i.v.投与後のA431-k5腫瘍に対する抗腫瘍効果を示す図である。対照は処置なしを表し、SS1Pは天然の、非複合化タンパク質を意味する。図に見られるように、PEG複合化SS1Pは、1回投与後、天然のSS1Pよりも長期間腫瘍の増殖を抑制することができる。曲線を以下のように関連付ける。
【化１７】
2008523105.tif 000044
【図１Ａ】
2008523105.tif 000045
【図１Ｂ】
2008523105.tif 000046
【図１Ｃ】
2008523105.tif 000047
【図２Ａ】
2008523105.tif 000048
【図２Ｂ】
2008523105.tif 000049
【図２Ｃ】
2008523105.tif 000050
【図２Ｄ】
2008523105.tif 000051
【図３】
2008523105.tif 000052
【図４Ａ】
2008523105.tif 000053
【図４Ｂ】
2008523105.tif 000054
【図５Ａ】
2008523105.tif 000055
【図５Ｂ】
2008523105.tif 000056
【図５Ｃ】
2008523105.tif 000057
【図５Ｄ】
2008523105.tif 000058
【図６】
2008523105.tif 000059
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年3月31日(2006.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に非抗原性のポリマーに共有結合しているSS1Pを含むポリマー複合化SS1P。
【請求項２】
SS1Pが、実質的に非抗原性のポリマーからin vivoで解離性または非解離性である、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項３】
実質的に非抗原性のポリマーが、ポリアルキレンオキシドである、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項４】
ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールである、請求項3に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項５】
mPEG-12k-DGA2-RNL8a-SS1P、mPEG-24k-BCN3-SS1P、mPEG-12k-BCN3-モノ-SS1P mPEG-12k-RNL8a-SS1P、モノmPEG2-40k-SS1P、mPEG-12k-SC-SS1P、mPEG-12k-ヒドラジド-SS1P、モノmPEG-20k-Ald-SS1P、およびジmPEG-20k-Ald-SS1Pからなる群から選択される、請求項4に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項６】
実質的に非抗原性のポリマーが約15kDaから約50kDaまでのサイズの範囲である、請求項1に記載のポリエチレングリコールSS1Pタンパク質複合体。
【請求項７】
1個から4個までのPEG鎖を含む、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項８】
SS1Pが、ジスルフィド連結したダイマーを含み、前記ダイマーは配列番号5のポリペプチドおよび配列番号7のポリペプチドを含む、請求項1に記載のポリマー複合化SS1P。
【請求項９】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pを含む薬剤組成物。
【請求項１０】
第2の抗癌剤をさらに含む、請求項9に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pの有効量を動物に投与することを含み、腫瘍または癌にメゾテリン抗原を発現する性質がある、動物における腫瘍または癌を処置する方法。
【請求項１２】
腫瘍または癌が、中皮腫、卵巣癌、扁平上皮癌、および膵臓腺癌からなる群から選択されるタイプである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pと一緒に少なくとも1つのさらなる抗癌剤を投与することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1に記載のポリマー複合化SS1Pを投与する前または後に、少なくとも1つのさらなる抗癌剤を投与することを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
式:
(I)  (R1)z-NH-(ITX)
のポリマー複合体
[式中、
(ITX)は、免疫毒素、またはその誘導体もしくはフラグメントを表し、
NH-は、ポリマーに結合するための、ITX上に見られるアミノ酸、その誘導体またはフラグメントのアミノ基であり、
zは、約1から約6までの正の整数であり、
R1は、解離性または非解離性の形態のITXに結合している、実質的に非抗原性のポリマー残基である]。
【請求項１６】
原核生物宿主細胞での発現から得たSS1Pドメインコンポーネントを含む封入体物質から精製SS1Pタンパクを製造する方法であって：
(i)可溶化したSS1PドメインコンポーネントをSS1Pタンパクと非SS1Pタンパクの両方を含む溶液を生成するのに適した条件下でリフォールディングすること、ただし前記非SSIPタンパクは未反応SS1Pドメインコンポーネントを含む、
(ii)ステップ(i)の溶液を、他の非SS1PタンパクからSS1PタンパクとSS1VLドメインタンパクを分離するのに適した条件下でMEP-Hypercelカラムに通すこと、
(iii)ステップ(ii)から得られたSS1PタンパクとSS1VLドメインタンパクを含む溶液を、SS1Pタンパクの溶液を得るのに適した条件下で陰イオン交換カラムに通すこと、
を含む前記方法。
【請求項１７】
以下のステップを含む、請求項16に記載の方法：
(a)宿主細胞内でのSS1VLドメインとSS1-PE38VHドメインタンパクの発現に適した条件下で、SS1VLドメインをコードする発現ベクターを含む原核生物宿主細胞を培養し、SS1-PE38VHドメインをコードする発現ベクターを含む原核生物宿主細胞を培養すること、
(b)ステップ(a)の各宿主細胞から封入体物質を単離すること、
(c)各宿主細胞から得られた封入体物質を約6.0から約8.0モル濃度のグアニジンHCl溶液に接触させることにより、ステップ(b)で得られた各封入体物質を可溶化して、別個のSS1VLドメインタンパク溶液とSS1-PE38VHドメインタンパク溶液を調製すること、
(d)各SS1VLドメインタンパク溶液とSS1-PE38VHドメインタンパク溶液を、タンパクのフォールディングとそれらの間のタンパク間ジスルフィド結合を可能にするのに適した条件下で混合して、SS1Pタンパクと非SS1Pタンパクの両方を含む溶液を調製すること、
(e)ステップ(d)の溶液を、非SS1PタンパクからSS1PタンパクとSS1VLドメインタンパクを分離するのに適した条件下でMEP-Hypercelカラムに通すこと、
(f)ステップ(e)から得られたSS1PタンパクとSS1VLドメインタンパクを含む溶液を、SS1Pタンパク溶液を非SS1Pタンパク90重量%超フリーの状態で得るのに適した条件下で、陰イオン交換カラムに通すこと。
【請求項１８】
陰イオン交換カラムが30Q陰イオン交換樹脂を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記SS1-PE38VHドメインを発現する原核生物宿主細胞が大腸菌である、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
前記SS1VLドメインを発現する原核生物宿主細胞が大腸菌である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ(f)によって得られた精製SS1Pタンパクの溶液を透析あるいはダイアフィルター（diafiltering）して、貯蔵あるいは即時利用のための精製SS1Pタンパクの濃縮溶液を得るステップ(g)を含む、請求項17に記載の方法。
【国際調査報告】
2008523105.tif 000073
2008523105.tif 000074
2008523105.tif 000075