(57)【要約】  一実施形態において、本開示は染色されたサンプルの照明パラメーターを決定する方法に関し、方法は染色されたサンプルを提供してサンプルの吸収帯域を得ること、サンプルの発光帯域を得て、サンプルの吸収帯域と発光帯域の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定することを含むことができる。
2008529000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオロフォアで標識を付けた生物サンプルを提供すること、
照明波長範囲内の波長を有するフォトンでサンプルを照射すること、
サンプルのスペクトル像を得ること、
スペクトル像から前記化学的像を発生させることを含み、
前記化学的像が、サンプルの少なくとも２つの同時に得られたスペクトル像を画定する、生物サンプルの化学的像を得る方法。
【請求項２】
前記標識を付けたサンプルの照明パラメーターを決定し、前記照明波長範囲がサンプルの同時スペクトル像を提供することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
照明波長を決定するステップが、標識を付けたサンプルの蛍光発光ピークを画定し、発光ピークよりも小さな波長を選択することをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルの化学的像が蛍光信号とラマン信号の少なくとも１つを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルのスペクトル像の化学的像が蛍光、反射、吸収、透過、光学的およびラマン像からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フルオロフォアが、免疫蛍光化合物、好塩基性化合物、好酸性化合物、中性染色剤、および任意の天然産出発光分子をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記好酸性染色剤がエオシンである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記好塩基染色剤がヘマトキシリンである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記照明波長が吸収帯域の領域に重なり合う請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルと相互作用してサンプルの第１と第２スペクトルを同時に提供する照明波長の範囲を決定する手段と、
前記範囲内の波長を有するフォトンをサンプルに導き、前記照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを生成するフォトン源と、
相互作用したフォトンを受け取り、サンプルのスペクトル像を形成する調整可能なフィルターとを含む、生物サンプルのスペクトル像を得るための装置。
【請求項１１】
前記サンプルの第１および第２スペクトルが同じ相互作用したフォトンから形成される請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記第１スペクトルがサンプルのラマンスペクトルである請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記第２スペクトルが前記サンプルの蛍光スペクトルである請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記装置が、前記フォトン源からのフォトンを濾波するための排除フィルターをさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項１５】
前記装置が、相互作用したフォトンを濾波するための排除フィルターをさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項１６】
前記装置が、相互作用したフォトンを収集し、相互作用したフォトンを調整可能なフィルターへ導くための対物レンズをさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記調整可能なフィルターが、ＬＣＴＦ、ＡＯＴＦ、およびファイバーアレイスペクトル中継器からなる群から選択される請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
前記サンプルのスペクトル像が、蛍光信号とラマン信号の少なくとも１つを含む請求項１０に記載の装置。
【請求項１９】
前記サンプルがフルオロフォア物質をさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項２０】
前記照明波長を決定する手段が、サンプルを選択するための蛍光発光ピークを画定する手段と、前記発光ピークよりも短い波長の範囲を選択する手段とをさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項２１】
前記照明波長を決定する手段が、サンプルの吸収帯域を画定する手段と、前記吸収帯域幅に重なり合う波長の範囲を選択する手段とをさらに含む請求項１０に記載の装置。
【請求項２２】
前記照明波長が、吸収帯域幅の領域に重なり合う波長の範囲である請求項１０に記載の装置。
【請求項２３】
前記サンプルの発光バンド幅の関数として前記サンプルの照明パラメーターを決定するための命令をプログラムされたプロセッサーと、
前記サンプルの照明パラメーター内の波長を有するフォトンを導き、前記照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを提供する照明源と、
前記サンプルから相互作用したフォトンを受け取り、前記サンプルの少なくとも第１と第２スペクトルを提供するための調整可能なフィルターとを含む、生物サンプルの多重スペクトルを得るためのシステム。
【請求項２４】
前記第１および第２スペクトルが前記サンプルから実質上同時に検出される請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記第１スペクトルが前記サンプルの蛍光スペクトルである請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記第１スペクトルが前記サンプルの吸収スペクトルである請求項２３に記載のシステム。
【請求項２７】
前記第２スペクトルが前記サンプルのラマンスペクトルである請求項２３に記載のシステム。
【請求項２８】
前記照明源が、排除フィルターをさらに含む請求項２３に記載のシステム。
【請求項２９】
前記システムが、前記相互作用したフォトンを収集し前記調節可能なフィルターへ導くための光学レンズをさらに含む請求項２３に記載のシステム。
【請求項３０】
前記調整可能なフィルターが、ＬＣＴＦおよびＡＯＴＦからなる群から選択される請求項２３に記載のシステム。
【請求項３１】
前記照明パラメーターが、前記サンプルの少なくとも２つのスペクトルを包含的に検出可能である周波帯域を画定する請求項２３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は本願の発明者の名称で２００５年１月３１日出願された出願番号第１１／０４５，０８１号の部分継続であり、その明細書は背景情報のためにその全体を参照して本出願に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
分光学的像形成はデジタル像形成と分子分光学技術が組み合わされて、ラマン散乱、蛍光、ホトルミネセンス、紫外線、可視および赤外吸収スペクトルを含むことができる。材料の化学分析に用いられるとき、通常、分光学的像形成は化学的像形成と称される。分光学的（すなわち化学的）像形成を行う装置は典型的に像収集光学系、焦点面像形成検出器、および像形成分光計を含む。
【０００３】
一般に、サンプルのサイズによって像収集光学系の選択が決定される。例えば、サブミクロンからミリメートルの空間寸法のサンプルには典型的に顕微鏡が用いられる。ミリメートルからメートルの範囲のより大きな対象物にはマクロレンズ光学系が適している。比較的アクセスしにくい環境内に位置するサンプルには可撓性ファイバースコープまたはボアスコープを用いることができる。惑星対象物などの非常に大規模の対象物には望遠鏡が適切な像収集光学系である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
光学系装置の種類にかかわらず、あらゆる分光学的研究において、第１ステップはサンプルを照明するための適切な波長を画定することである。複数のサンプル像を同時に調査するとき、サンプル照明の適切な波長を画定するステップはより重要になる。従来の方法は、第１像を得るために第１波長（例えば、ＮＩＲまたはＶＩＳ）でサンプルを照明し、続いて第２像（例えば、ラマンまたは分散性ラマン）を得るために第２波長でサンプルを照明することを示唆する。したがって、従来の工程は時間がかかり、サンプルの同時像形成には適していない。サンプル照明に先立って、サンプルの照明パラメーターを決定する装置および方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は上述の必要性に対処する。一実施形態において、本開示は、フルオロフォアで標識を付けた生物サンプルを提供することと、照明波長範囲内の波長を有するフォトンでサンプルを照射することと、サンプルのスペクトル像を得ることと、スペクトル像から化学的像を形成することとによって生物サンプルの化学的像を得る方法に関する。化学的像は少なくとも２つの同時に得られたサンプルのスペクトル像を画定することができる。スペクトル像はラマン像および蛍光像を含むことができる。
【０００６】
他の実施形態において、生物サンプルのスペクトル像を得るための装置は、サンプルと相互作用してサンプルの第１と第２スペクトルを同時に提供する照明波長の範囲を決定する手段と、範囲内の波長を有するフォトンをサンプルに導き、照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを生成するフォトン源と、相互作用したフォトンを受け取り、サンプルのスペクトル像を形成するための調整可能なフィルターとを含む。
【０００７】
さらに他の実施形態において、本開示は生物サンプルの多重スペクトルを得るシステムに関する。本システムは、前記サンプルの発光帯域幅の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定するための命令をプログラムされたプロセッサーと、サンプルの照明パラメーター内の波長を有するフォトンを導き、照明フォトンがサンプルと相互作用して相互作用したフォトンを提供する照明源と、サンプルから相互作用したフォトンを受け取り、サンプルの少なくとも第１と第２スペクトルを提供するための調整可能なフィルターとを含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本開示は、全体的にサンプルの照明パラメーターを決定する方法および装置に関する。サンプルのスペクトル像を得るための最適照明パラメーター（例えば、最適照明波長範囲）の知識を先験的に有することは、最適照明パラメーターによって１つ以上のサンプルのスペクトルが同時に検出可能になる点で特に重要である。また、最適照明パラメーターは、広い領域、ラマン化学的像形成、多重点、分散性単一点および分散性線など、異なる検出モードで用いることができる。
【０００９】
図１は強度とサンプルの波長の関係をグラフで示す。吸収と発光帯域を得る方法は従来から知られている。また、蛍光像形成に付随する発光波長が吸収波長よりも長いことも知られている。したがって、第１ステップとしてサンプルを異なる波長のフォトン（互換可能に検出フォトンまたは照明フォトン）で照明してサンプルの吸収および発光波長を求めることができる。
【００１０】
図１において、線１２５は照明フォトンに露出されたサンプルのエネルギー吸収関係を表す。ピーク１３０はサンプルの吸収スペクトルのピーク波長（λＡｂｓ，Ｐ）を示し、ピーク１５０はサンプルの発光スペクトル（λｍ）のピーク波長を示し、ラマン散乱はそれよりも短い波長のピーク１５０で発生する。サンプルの吸収エネルギーを検出することのできる波長範囲はλａｂｓ−Ｌからλａｂｓ−Ｈへ展在することが示される。同様に、サンプルの発光エネルギーを検出することのできる波長範囲はλＥｍ−ＬからλＥｍ−Ｈへ展在する。
【００１１】
詳細に論じるであろうように、本開示の一実施形態によれば、多重スペクトル像形成のための最適波長は略λａｂｓ−Ｌよりもわずかに長い波長で存在する。したがって、方法は照明パラメーターを画定するために開示され、（ｉ）サンプルの吸収波長の範囲を画定すること、（ｉｉ）サンプルの発光波長の範囲を画定すること、（ｉｉｉ）吸収波長と発光波長の関数としてサンプルの適切な照明パラメーターを評価することを含む。これらのステップは逐次的にまたは同時に行うことができる。例として、図１に１５５で示した領域は、吸収および発光スペクトルのピーク波長よりも短くすることの可能な照明波長を示す。また、照明パラメーターは照明レーザー線または適切なラマン照明波長を画定するために用いることができる。波長と周波数は逆比例するので、ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）は周波数帯域を考慮して実施し画定することができる。すなわち、サンプルの吸収波長範囲を考慮してサンプルの等価周波数帯域幅を画定することができる。
【００１２】
本開示の他の実施形態において、サンプルの照明パラメーターを決定する方法は、照明フォトンでサンプルを同時に照明することを含む。照明フォトンはいくつかの異なる波長を有しまたは広範囲の波長を画定することができる。次に、サンプルの発光および吸収波長を画定することができる。替わりに、サンプルの発光と吸収帯域幅を決定することができる。また、発光および吸収帯域はピーク強度波長ならびに各帯域の下方と上方の波長範囲を画定することができる。出発点として吸収帯域（λａｂｓ−Ｌ）の下方波長を用いて、サンプルの最適ラマン波長検出波長は、λａｂｓ−Ｌまたはそれよりも長い波長を有するラマン散乱フォトンとして画定することができる。例として、それらの１つの領域は図１の領域１５５として示される。このようにして得られた照明パラメーターを用いて、異なる波長の照明フォトンでサンプルを照明し、サンプルのスペクトル像を同時に得ることができる。照明フォトンは、レーザー線、広い領域、ラマン化学的像形成、多重点像形成、分散性単一点および特に望ましい波長範囲内にあるようにした分散性線によって提供することができる。
【００１３】
図２Ａ〜２Ｇは、各々、異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。さらに詳細には、図２Ａ〜２Ｇは、染料で染色した生物サンプルの吸収、発光、およびラマンスペクトルを示し、サンプルの吸収および発光スペクトルを考慮してサンプルの照明パラメーターを決定する方法を示す。本開示の一実施形態において、染料はフルオロフォアである。適切なフルオロフォア染色剤は免疫蛍光化合物、好塩基性化合物、好酸性化合物、中性染色剤、および天然産出発光分子を含む。染色されると、サンプルはサンプルのスペクトル像を得るために照明波長内の波長を有するフォトンで照射することができる。
【００１４】
図２Ａにおいて、ピーク１１０は染色されたサンプルの発光ピークを示す。従来から知られたように、発光帯域幅（またはその等価波長範囲）は材料の特性である。図２Ａにおいて、発光範囲はλＡ〜λＢに及び、ピーク発光波長はλＰに発生する。照明（励起）波長は任意にλＸ１で設定される。ラマンピークはピーク１６０で識別される。ラマンピークはラマン振動によるエネルギー損失に比例した固定波長だけ励起波長（λＸ１）からシフトする。励起波長の増加または減少はラマンピークの発生する波長に直接影響を与える。これは図２Ａ〜２Ｇに図示されており、励起エネルギーを波長λＸ１からλＸ７に変化させることによってラマンピーク１６０が発生する波長がシフトする。再び図２Ａを参照すれば、ラマンピーク１６０は波長λＸ１−１／Ψに発生し、Ψは波数で表されるラマン励起によるラマンエネルギー損失であり、
Ψ＝（１／２Πｃ）（ｋ／μ）１／２で表すことができ、ここで、ｋは化学結合力定数であり、ｃは光の速度であり、μは分子振動子の質量減少である。
【００１５】
図２Ｂおよび２Ｃにおいて、ピーク１１０は吸収ピークを表し、ピーク１６０は研究中のサンプルのラマン散乱ピークを表す。ピーク１３０はサンプルの蛍光発光スペクトルを示す。図２Ｂおよび２Ｃにおいて、励起波長は、サンプルの蛍光スペクトルが図示した励起領域近傍の波長で発生するように、それぞれλＸ２とλＸ３に設定される。図２Ｂおよび２Ｃから見ることができるように、サンプルの蛍光スペクトルは、ラマンピーク１６０に重なり合い、述べたように、励起波長から固定波長で発生する。重なり合いは、ラマン信号が蛍光信号に埋没するので、不可能ではなくてもスペクトル分析を困難にする。
【００１６】
対照的に、図２Ｄにおける照明パラメーターλＸ４は、ラマンピーク１６０が蛍光スペクトル１３０の開始点直下に発生するように選択される。ここで、ラマン１６０、蛍光発光１３０および吸収１１０スペクトルの各々は狭い波長範囲内に見ることが可能であり、ラマンおよび蛍光発光信号は単一検出デバイスで実質上同時に検出することができる。
【００１７】
図２Ｅにおいて、サンプルは二重蛍光ピーク１３０および１３５を有する。蛍光ピーク１３５は蛍光ピーク１３０に比べてより低い強度のピークを画定する。ラマンピーク１６５からの信号はピーク１３５を示す蛍光信号よりも容易に検出可能である。図２Ｅにおいて、照明波長λＸ５はラマンピーク１６０が蛍光ピーク１３５に重なり合うように選択される。しかし、ラマン信号はより高い強度を有するので、ラマンピーク１６０は発光スペクトル１３５から識別することができる。
【００１８】
図２Ｆにおいて、励起波長はλＸ６へシフトし、ラマンピーク１６０はもはや蛍光ピーク１３０及び１３５によって隠蔽されない。しかし、それでもなおラマン信号はピーク１１０の吸収スペクトルによって減衰することがある。ラマンピーク１６０の少なくとも一部は蛍光ピーク１３５と吸収ピーク１１０の間にあるので、ラマン信号は少なくとも部分的に識別可能である。図２Ｇにおいて、励起波長λＸ７はより低い波長へシフトし、ラマンピーク１６０をシフトさせる。ここで、吸収ピーク１１０はラマンピーク１６０に重なり合い、それによってラマン信号を減衰させることが可能であるが、必ずしもラマン散乱の検出を妨げない。
【００１９】
図２Ａ〜２Ｇに見ることができるように、励起波長は、サンプルの少なくとも２つのスペクトルを狭い波長範囲内に同時に見ることができるように選択することができる。本開示の一実施形態によれば、ラマンピークが実質上他の信号からの妨害がない波長に現れるように励起波長が選択される。他の実施形態によれば、励起波長は、ラマンピークからの信号が発光または蛍光スペクトルを示す信号から識別可能なように選択することができる。本開示のさらに他の実施形態によれば、励起波長は像形成デバイスが蛍光ならびにサンプルのラマンスペクトルを同時に捕捉できるように選択される。本開示のさらに他の実施形態によれば、励起波長は像形成デバイスが蛍光発光ならびにサンプルのラマンスペクトルを同時に捕捉できるように選択される。
【００２０】
本開示の一実施形態において、組織学的な標識を付けたサンプルの照明パラメーターを評価する装置が提供される。サンプルはフルオロフォア物質などの従来の識別子で標識を付けることができる。次に、発光ピークとラマン散乱ピークの両方が１つの像形成装置で検出できるように、適切な照明波長を画定する照明パラメーターを選択することができる。像形成装置は、収集光学系（例えば、放出されたフォトン、ラマン散乱、サンプルから透過または反射されたフォトンを収集するための光学列）と、１個以上の調整可能なフィルター（例えば、調整可能な液晶（ＬＣＴＦ）、音響光学フィルター（ＡＯＴＦ）またはファイバーアレイスペクトル中継器）を含むことができる。スペクトルを捕捉するために、電荷結合デバイスまたは他の適切なカメラまたは記録媒体を像形成装置に結合させることができる。
【００２１】
本開示の一実施形態によるシステムにおいて、サンプルの照明パラメーターは１個以上の照明源、光学列、および照明フォトンでサンプルを同時に照明しサンプルの発光帯域を検出するための命令をプログラムされたプロセッサーを含む。また、命令は帯域の下方波長範囲と上方波長範囲の画定を含み、サンプルの吸収と発光帯域の関数としてサンプルの照明パラメーターを決定することができる。最終的に、命令は発光スペクトルの下方波長範囲（λＥＭ，Ｌ）よりも短い波長でサンプルの適切なラマン波長を画定することを含むことができる。
【００２２】
図３は本開示の一実施形態によるシステムの機能図である。図３において、システム３００はサンプル３１０の化学的像を得て分析するように考案されている。サンプル３１０は組織学的研究に適した生物学的、有機または無機サンプルとすることができる。照明源３３０は励起フォトン３３２をサンプル３１０に提供するように配置される。照明源３３０はサンプルの上方、近く、または下方に配置することができる。励起フォトン３３２は、広範囲のスペクトル（例えば、λＸ１〜λＸ７）を包含することのできる励起波長を画定する。さらに、照明源３３０はプロセッサー３２０による通信命令に基づいて励起波長を変化させるようにすることができる。検出器３４０はサンプル３４０の近くに配置されて相互作用したフォトン３４２を受け取る。相互作用したフォトン３４２は、蛍光、反射、透過、発光およびラマンフォトンを含むことができる。相互作用したフォトンは、広い波長のフォトンを集めて分析するのに適した電子光学デバイスを含むことのできる検出器３４０によって受け取り収集することができる。検出器３４０は、例えば、相互作用したフォトンを集め焦点を合わせるための光学列と、望ましくない波長のフォトンを排除するための１個以上の光学フィルターと、サンプル３１０のスペクトル像を得るためのＬＣＴＦと、サンプル３１０のスペクトル像に基づいて化学的像を描く電荷結合デバイスとを含むことができる。検出器３４０は、プリンター、ビデオレコーダー、またはインターネット通信システムなどの周辺ネットワークデバイス３６０と通信することができる。
【００２３】
プロセッサー３２０はサンプルのスペクトル像を検出器３４０から受け取り、照明波長を変更すべきかどうかを決定することができる。例えば、検出器３４０が図２Ｃと類似のサンプルのスペクトル像を描くならば、プロセッサー３２０はピーク１６０からのラマン信号が蛍光信号１３０から認識不能であることを決定することができる。この決定に基づいて、プロセッサー３２０は、信号の妨害が図２Ｄに示したものへ低減されるように、照明源３３０によって発生した励起波長を変更することができる。また、プロセッサー３５０はＣＰＵ３５０と通信して実行可能な命令を受け取り、または化学的識別子またはサンプル３１０に用いたフルオロフォアの特性などの関連情報のデータベースにアクセスすることができる。ＣＰＵ３５０を用いてプロセッサーに追加の情報を伝達することができる。
【００２４】
１回以上の繰り返しの後、プロセッサー３２０は、１個以上のスペクトル像を同時に検出できるようにサンプルの最適照明パラメーターを決定することができる。サンプルのスペクトル像を用いて、１個以上のサンプルの化学的像を画定し研究中のサンプルを識別することができる。それらの分析は、単一の検出および識別システムを用いて実施することができ、組織学的分析の効率を高める。
【００２５】
本開示の原理を特定の例示的実施形態に関して開示したが、本発明の原理はそれに制限されず、本明細書に開示された特定の実施形態に対する全ての修正及び変形を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】強度とサンプル波長の間の関係を示すグラフである。
【図２Ａ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｂ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｃ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｄ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｅ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｆ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図２Ｇ】異なる励起波長を受け取るサンプルのスペクトル像を示す図である。
【図３】本開示の一実施形態によるシステムの機能を示す図である。
【図１】
2008529000.tif 000003
【図２Ａ】
2008529000.tif 000004
【図２Ｂ】
2008529000.tif 000005
【図２Ｃ】
2008529000.tif 000006
【図２Ｄ】
2008529000.tif 000007
【図２Ｅ】
2008529000.tif 000008
【図２Ｆ】
2008529000.tif 000009
【図２Ｇ】
2008529000.tif 000010
【図３】
2008529000.tif 000011
【国際調査報告】
2008529000.tif 000012