(57)【要約】  本発明は、磁場を使用することで、核酸を増幅させ且つ増幅された核酸の量を決定する方法を記載する。核酸の増幅工程の間に検出を行うことができる。検出の間に、増幅された核酸は、生物学的なモジュールを介して、センサーに結び付けられる。
2008543279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上のアンプリマーを使用することでＲＮＡ又はＤＮＡ核酸を増幅させ且つ該増幅されたＲＮＡ又はＤＮＡ核酸の又は増幅工程に伴われた試薬の量を決定する方法であって、該増幅された核酸の又は該試薬の該量を決定するステップは、磁気検出を介して行われ且つ該ＲＮＡ又はＤＮＡの該増幅の工程の間における少なくとも一つの時間で行われる方法において、
該増幅されたＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は試薬の量を決定するステップは、増幅された核酸又は試薬が生物学的な分子を介してセンサーへ結び付けられる方法を介して、行われることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記生物学的な分子は、ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ又はＤＮＡは、等温の方法によって増幅させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ又はＤＮＡは、熱サイクルの方法を介して増幅させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一つのアンプリマーは、磁性粒子で標識化される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アンプリコンは、磁気的に標識化されたハイブリッド形成プローブを使用することで検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
センサーの表面に垂直な速度成分を備えた磁力サイクリングをさらに含む、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試料における核酸の又は増幅工程において伴われた試薬の量を決定する部分のキットであって、該キットは、少なくとも
−  該センサーの表面に付けられた一つ以上の生体分子を備えたセンサーの表面を備えたデバイス、
−  オリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが、磁性粒子へカップリングされ、且つ、
該キットは、
一つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの酵素
：を含む、キット。
【請求項９】
切断の活性を備えた酵素をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ＲＮＡ分解酵素の活性を備えた酵素をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、アンプリマーである、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも一つのオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成プローブである、請求項８に記載のキット。
【請求項１３】
センサーの表面は、マイクロアレイの部分である、請求項８乃至１２のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増幅された核酸の配列、例．ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅、を定量化する、又は、増幅工程に伴われた試薬の、分野に、並びに、特に、増幅された核酸の配列、例．ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅を定量化するための、又は、増幅工程に伴われた試薬の、方法及び装置に、関係する。本発明は、さらに、生体分子の磁気検出の分野に、並びに、特に、生体分子の磁気検出用の方法及び装置に関係する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を、生化学的な増幅工程を使用することによって非常に敏感に且つ特異的に測定することができる。核酸の増幅及びその後の検出は、一般に数個の工程のステップを要求する複雑化された工程である。生物学的な材料（例．微生物）の検出用に、これらのステップは、典型的には（選択的な）濃縮、単離／精製、及び識別を含む。工程を単純化し且つ分析の性能（例．感度、特定性、スピード）を改善するために継続している大きな努力がある。例えば、分子生物学的な技術及び免疫検出の組み合わせを通じたリガンドタンパク質の手段によってＲＮＡ／ＤＮＡの増幅の製品を敏感に且つ特異的に検出することは、実行可能であることが、示されてきた。信号の顕出のために、他の検定は、測色の代わりに、蛍光、化学発光、又は、幅広い種類の（免疫）センサーの検出器を使用する。しかしながら、開発された検定の大部分は、相対的に複雑な、高価なものである、及び／又は、（精巧な）器械類を要求する。
【０００３】
側方流動免疫学的検定（lateral  flow  immunoassay）（ＬＦＩＡ）の検出方法と組み合わせられた増幅された抽出及び増幅の方法が、開発されてきたが、その方法は、ゲル電気泳動法よりも数桁程度超える敏感なものであり、且つ、結果は、５から１５分以内に明らかにされる。原則として、ＬＦＩＡは、多数の検体の検出、即ち、一つの検定のデバイスにおける６個までの特異的なＲＮＡ／ＤＮＡの配列についてのスクリーニングに適したものである。黒色のコロイド状の粒子及びニトロセルロースの膜に固定化された特異的なリガンドに基づいた方法は、小型のアレイのセットアップにおける５から３０個の異なるパラメータの検出を可能とする。結果を、平面走査及び画像解析によってディジタル化することができる。
【０００４】
測定の定量的な態様及びダイナミックレンジは、生化学的な増幅における重要な問題である。これは、特に、ＰＣＲのような指数関数的な増幅方法についての場合であるが、それら方法は、一方ではサブ検出レベルのアンプリコンの濃度間における急激な移行を、及び、他方では生化学的な増幅工程の飽和を、有する。しばしば、結果は、ターゲットの濃度についての精確な値よりもむしろ、はい又はいいえの回答である。
【０００５】
改善された方法は、実時間のＰＣＲであり、ここで、アンプリコンの濃度は、指数関数的な生化学的な増幅工程の間に（例．分子ビーコンで）動的に測定される。定量的な実時間のＰＣＲにおいて、定量的なデータは、専用のプローブの設計、工程の制御、及び工程の監視を使用することで、導出される。元来のターゲットの濃度は、ある一定の信号を顕出させるために要求された時間から推論される。定量的な実時間のＰＣＲの不都合は、（ｉ）複雑化された検定の手順、（ｉｉ）試験当たりの高い費用レベル、及び（ｉｉｉ）検定の多重化を行うことの困難性である。
【０００６】
それらの最も一般的に使用された形態においては、上記の方法（ＥＬＩＳＡ、ＬＦＩＡ、実時間のＰＣＲ）は、全てが、光学的な検出を伴う。光学的な検出は、
−  特に複雑な生物学的な試料が使用されるときの、高い背景の信号（例．基材若しくはデバイスの材料からの、試料の材料からの、又は、試験のデバイスにおける生物学的な材料からの、自己蛍光）。
【０００７】
−  標識の性質は、生化学的な環境（例．蛍光の効率）に依存し得るが、その環境は、測定の定量化を複雑化させる。
【０００８】
−  カートリッジと読取装置との間における誤りがちな相互接続。
【０００９】
−  デバイスからの及び流体の試料からの光散乱。
【００１０】
−  入射の及び放出された／反射された光の吸収は、流体の光学的な性質に依存する。
【００１１】
−  時々高価な読み出しの設備は必要とされる。
のような、数個の不都合を有する。
【００１２】
光に基づいた検出に対する代わりの検出方法が、存在する。例えば、磁性ナノ粒子を検出する磁気センサーは、後に続く期待された利点：高い分析の性能（感度（生物学的な材料が、非常に低い磁気の背景を有し且つ非常に敏感なセンサーが、利用可能である））、（磁気の作動による）スピード、（力の区別による）特異性、組み合わせられた検定のステップ（例．ターゲットの抽出及び検出、両方とも磁性粒子を備えたもの）、及び、使用することの容易さ（単純な且つ信頼性のある電気的な相互接続、センサー及び読取装置が、小型な且つ低い費用のものである）のおかげで生物学的な診断の目的について調査されている。
【００１３】
予備的な試行は、磁気検出と核酸の増幅を組み合わせるためになされてきた。国際公開第００／６１８０３号パンフレット（特許文献１）は、磁気センサーのチップにおける検出が後に続けられた核酸の増幅の組み合わせを開示する。工程は、磁力による厳密性の適用を含む。解決手段は、ストランド置換増幅（Strand  Displacement  Amplification）（ＳＤＡ）の方法に特に焦点を合わせられる。欧州特許出願公開第０７８１３４６号明細書（特許文献２）は、ＰＣＲ増幅が磁気検出方法と交互にされる方法を開示する。磁気検出は、磁気的に標識化されたプライマーと増幅されたＤＮＡとの間の移住における差異に基づいたものである。
【特許文献１】国際公開第００／６１８０３号パンフレット
【特許文献２】欧州特許出願公開第０７８１３４６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
光に基づいた検出の欠点を考慮して、磁気センサー及び磁性粒子を使用する代わりの検出方法に基づいた急速な、敏感な、定量的な、高いダイナミックレンジの、且つ、実時間の核酸検出工程に対する要望がある。このような方法は、できるだけ少数のステップを含有する、即ち、生化学的な工程及び検出の最大の統合を有する、べきである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、核酸、即ち、ＲＮＡ又はＤＮＡを増幅させ且つ増幅されたＲＮＡ若しくはＤＮＡの又は増幅工程に伴われた試薬の量を決定するための方法及びツールに関係する。この方法において、増幅された核酸の又は増幅工程に伴われた試薬の量を決定するステップは、磁気検出を介して行われ且つ前記のＲＮＡ又はＤＮＡの増幅工程の間における少なくとも一つの時間に行われる。本発明の方法において、増幅されたＲＮＡ若しくはＤＮＡの又は増幅工程に伴われた試薬の量を決定するステップは、増幅された核酸又は試薬が一つ以上の生物学的な分子を介してセンサーに結び付けられる方法を介して行われる。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、増幅された核酸を結び付けるために使用される一つ以上の生物学的な分子が、増幅された核酸又はアンプリコンを特異的に結び付ける、ＤＮＡ、ペプチド核酸（peptide  nucleic  acid）（ＰＮＡ）又はＲＮＡである、上に記載されたような方法を行うための方法及びツールに関係する。あるいは、生物学的な分子は、センサーの表面へのアンプリコンの結び付きを保証する、タンパク質、ビタミン、脂質、若しくは炭水化物であり得るか、又は、核酸及びタンパク質の両方の組み合わせであり得る。
【００１７】
本発明の特定の実施形態は、核酸が、等温の方法によって又は熱サイクルの方法によって増幅される、このような方法を行うための方法及びツールに関係する。
【００１８】
本発明のさらなる特定の実施形態は、増幅に使用されるプライマー（アンプリマー）が、磁性粒子と共に標識化される、このような方法を行うための方法及びツールに関係する。本発明の代替の実施形態は、アンプリコンが、標識化される、特異的なハイブリッド形成プローブ（この実施形態においては、アンプリマーは、磁性粒子で標識化されない）の方式で検出される、このような方法を行うための方法及びツールに関係する。
【００１９】
本発明は、試料における、核酸、例．オリゴヌクレオチドの又は増幅工程に伴われた試薬の存在を決定するためのキットをさらに提供するが、前記のキットは、少なくとも、前記のセンサーの表面に付けられた一つ以上の生体分子、オリゴヌクレオチドの少なくとも一つが少なくとも断続的に磁性粒子へカップリングされる一つ以上のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及び一つ以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ酵素を備えたセンサーの表面を備えたデバイスを含む。キットは、切断の活性を備えた酵素をさらに自由選択で含むか又はＲＮＡ分解酵素の活性を備えた酵素（例．）ＲＮＡｓｅＨを含むことができる。
【００２０】
本発明のキットの一つの実施形態に従って、磁性粒子へカップリングされた、ヌクレオチド、例．オリゴヌクレオチドは、増幅に使用されたプライマーであり、それによって、増幅の間におけるアンプリコンの標識化を保証する。
【００２１】
本発明のキットの別の実施形態に従って、磁性粒子にカップリングされた一つのヌクレオチドは、アンプリコンと特異的にハイブリッド形成するハイブリッド形成プローブであり、且つ、アンプリコンに結び付くことによって、磁気センサーによるそれの検出を可能にする。
【００２２】
本発明の方法及びツールは、改善されたスピード、感度、及び特異性のような、改善された分析の性能でのポリヌクレオチドの決定を可能にする。本発明の方法及びツールは、より高いロバスト性、より低い誤り率、より単純な相互接続、及びより低い費用のような、使用の改善された容易さで、ポリヌクレオチドの濃度の決定を可能にする。
【００２３】
本発明の一つの態様において、且つ、試料における核酸の濃度を測定するためには、磁性粒子のサイクリングは、核酸の増幅と組み合わせられ、磁気サイクリングの工程及び核酸増幅サイクリングの工程（例．温度サイクリング又は試薬サイクリング）の統合及び同期化の利点を取る。
【００２４】
本発明の方法は、後に続くステップ：自由選択の核酸抽出ステップ、出発の核酸の量を決定するための自由選択の磁気的な予備増幅ステップ、核酸増幅ステップ、及び、生体分子（例．ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、例．センサーの表面へ又は別の本体へ増幅された核酸を結び付けるために使用される検出ステップを含むことがある。
【００２５】
本発明の方法は、それ自体センサーへ結び付けられる生体分子へ結び付くことによって、増幅された核酸の又は増幅工程に伴われた試薬検出を伴う。センサーの表面への生体分子の結び付きは、共有結合性のものであり得る。
【００２６】
一つの実施形態に従って、この工程は、後に続くステップを含む。
【００２７】
−  磁性粒子及び／又はセンサーチップの表面へ共有結合的に付けられたプライマーでのバルクの溶液における核酸の増幅。
【００２８】
−  時間の関数としての（例．センサーの表面へ生体分子を介して結び付けられた）磁気センサーの付近でのナノ粒子の測定、及び
−  第一のバルクの増幅工程及び第二の表面検出の工程が高い効率で行われることを可能にするための磁性粒子サイクリングの適用、
より具体的には、ＰＣＲの方法を使用するとき、本発明の方法は、ほぼ実時間のモードにおいて増幅の増進の検出を可能とするための、温度サイクリング及び磁力の作動の適用によって特徴付けられる。
【００２９】
一般に、本発明は、敏感な且つ実時間の磁気検出と核酸の増幅を組み合わせる方法を提供する。系は、実時間の検出、スピード、工程の制御、工程の監視、多重化、小型さ、使用の容易さ、及び低い費用に関して好都合なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
アンプリマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡ重合酵素用のプライマーとして使用されたＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドのようなヌクレオチドを指す。ＰＣＲ反応におけるアンプリマーは、一般には、順方向のプライマー及び逆方向のプライマーと呼ばれる。標識化されたアンプリマーは、磁性マイクロ粒子又はナノ粒子及び／又は生物学的な分子へ共有結合的に連結されたアンプリマーを指し、その生物学的な分子の非限定的な例は、ビオチン及びフルオレセインである。
【００３１】
アンプリコンは、増幅工程の結果として得られた核酸を指す。
【００３２】
ハイブリッド形成プローブ又はハイブリッド形成プリマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドのような、ヌクレオチドを指し、そのオリゴヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡ又はＲＮＡ（即ち、アンプリコン）を検出するために使用される。本発明のある一定の実施形態においては、ハイブリッド形成プローブを、磁性マイクロ粒子又はナノ粒子及び／又は生物学的な分子へ共有結合的に連結させることができる。
【００３３】
センサープローブ又はセンサープライマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドのようなヌクレオチドを指し、そのオリゴヌクレオチドは、センサーの表面（即ち、磁気検出系の近接であるデバイスの部分）へ直接的に又は間接的に結び付けられ且つアンプリコンを結び付けることが可能なものである。アンプリコンがＲＮＡを含む増幅技術においては、ＲＮＡセンサープローブを、増幅されたＲＮＡを結び付けるために使用することができる。センサーの表面へのセンサープローブの結び付きは、共有結合的なものであり得る。あるいは、センサープローブを、生物学的な分子へ共有結合的に連結された一つ以上の生体分子（リガンド、抗体）を通じてセンサーの表面へ連結させることができる。
【００３４】
本発明を、特定の実施形態に関して且つある一定の図面を参照して記載することにするが、しかし、本発明は、それらの限定されずに、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるいずれの符号も、その範囲を限定するものとして解釈されないものとする。記載された図面は、単に概略的なものであり且つ非限定的である。図面において、要素のいくつかの大きさは、誇張されることがあり且つ図解の目的のために一定の縮尺で描かれない。用語“を含む”が、本記載及び特許請求の範囲において使用される場合、それは、他の要素又はステップを排除するものではない。単数の名詞を指すとき不定冠詞又は定冠詞、例．“ある”、“その”が使用される場合、これは、他に何かが具体的に述べられない限り、複数のその名詞を含む。
【００３５】
さらには、本記載において及び特許請求の範囲において、用語、第一の、第二の、第三の、及び同様のものは、類似の要素の間で区別するために使用され且つ必ずしも連続した又は経時的な順序を記載するために使用されない。そのように使用される用語が、適切な状況の下で交換可能であること及びここに記載された本発明の実施形態が、ここに記載された又は図解された以外の順序で動作の可能なものであることは、理解されることである。
【００３６】
その上、本記載及び特許請求の範囲において、用語、上部の、底部の、より上の、より下の、及び同様のものは、記述的な目的のために使用され且つ相対的な位置を記載するためには必ずしも使用されない。そのように使用された用語が、適切な状況下で交換可能であること、及び、ここに記載された本発明の実施形態が、ここに記載された又は図解されたもの以外の配向で動作の可能なものであることは、理解されることである。
【００３７】
一つの態様において、本発明は、核酸の増幅が、磁気検出及びこのような方法を行うためのツールを使用する、増幅されたＤＮＡの定性的な且つ定量的な決定と交互になされる方法に関係する。
【００３８】
本発明の方法は、後に続くステップ：
−  核酸の増幅工程（段階的に又は連続的に）、
−  ＤＮＡ、ＰＮＡ、又はＲＮＡのセンサープローブが増幅された核酸を、例．センサーの表面へ又は別の本体へ、結び付けるために使用される増幅工程の間における及び／又はその増幅工程の後における一つ以上の検出ステップ
を含む。センサーの表面へのセンサープローブの結び付きは、共有結合的であり得る。
【００３９】
自由選択で、本発明の方法は、増幅に先立ち、
−  核酸の抽出ステップ、及び／又は、
−  出発の核酸の量を決定するための磁気的な予備増幅ステップ
：をさらに含む。
【００４０】
一つの実施形態に従って、増幅された核酸又はアンプリコンの検出は、標識をアンプリコンの中へ組み込むことによって保証される。この実施形態に従って、本発明の方法は、後に続くステップ：
−  磁性ナノ粒子又はマイクロ粒子に付けられたプライマーでバルクの溶液中で核酸を増幅させること、
−  センサーの表面に付けられたセンサープローブと増幅された核酸を接触させること、センサーの表面へのプライマーの付着は、共有結合的なものであることもある。
【００４１】
−  増幅工程の間における及び／又は増幅工程の後における少なくとも一つの時間での磁性ナノ粒子又はマイクロ粒子の検出又は測定
を含む。
【００４２】
自由選択で、磁性粒子サイクリングが、（第一の）バルクの増幅工程及び（第二の）表面検出工程が高い効率で行われることを可能にするために、適用される。
【００４３】
本発明の具体的な実施形態において、温度サイクリング及び磁力の作動が、ほぼ実時間のモードにおける増幅の増進の検出を可能とするために、適用される。
【００４４】
上に示唆されたように、本発明の方法は、例．バルクの液体における、核酸の増幅ステップを含む。当技術において知られる異なる増幅の方法を、本発明の方法において統合することができる。増幅のプロトコルは、一般的には、ターゲット及びプローブタイプの増幅へと分割される（Ｈｉｌｌ，Ｃ．Ｓ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  １９，４３−５２）。
【００４５】
‘ターゲット’の増幅は、鋳型としてターゲットの核酸の分子を使用する個々のヌクレオチドからの合成によって所望のターゲットの配列の複製を生じる。例は、重合酵素の連鎖反応（polymerase  chain  reaction）（ＰＣＲ）、転写に媒介された増幅（transcription  mediated  amplification）（ＴＭＡ）、核酸に基づいた配列の増幅（nucleic  acid  based  sequence  amplification）（ＮＡＳＢＡ）、及びストランド置換増幅（strand  displacement  amplification）（ＳＤＡ）である（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１；Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０，９１−９２；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０，１６９１−１６９６；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｄｓ．Ｌｅｅ，Ｈ．，Ｍｏｒｓｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｏｌｓｖｉｋ，Ｏ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，１１３−１２３）。この方法における変形は、センサーにおけるプローブに対して相補的な特異的なＤＮＡ鎖のみが増幅される、非対称的なＰＣＲである。この方法においては、不等な量のプライマーが、増幅を一本鎖の増幅工程へ方向付けるために、加えられる。この方法の変形は、指数関数形の後の線形の（Linear-After-Exponential）（ＬＡＴＥ）−ＰＣＲ（Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ，１０２，２４，８６０９−８６１４）であり、ここでプライマーの対は、不等な濃度での使用について故意に設計される。本発明の具体的な実施形態は、ＰＣＲを使用する特異的なＤＮＡ又はＲＮＡの増幅を伴う。他方では、‘プローブタイプ’の増幅が、反応の中へ入れられた元来のプローブの変更されたバージョンを生じさせる。このアプローチの例は、リガーゼ連鎖反応（ligase  chain  reaction）（ＬＣＲ）である（Ｌａｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ  ５０，８２１−８２６）。
【００４６】
ＰＣＲ及びＬＣＲの場合には、熱サイクル器が、二本鎖の中間体を変性させるために、使用される。他のプロトコル（例．ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ及びＳＤＡ）は、等温性のものであり、且つ、一般に、一定の温度における一つの加熱デバイス（例．水浴又は熱ブロック）のみを要求する。
【００４７】
ＴＭＡのような転写方法は、ＰＣＲ／ＬＣＲと比較された数個の差異を有する。ＴＭＡは、ターゲットとして直接的にＲＮＡ又は一本鎖のＤＮＡのいずれかを使用することができる。理論的には、これらの方法は、ＰＣＲ／ＬＣＲが類似の量を生じさせるために３−４時間かかり得る一方で、それらが、１５分程度の少ない時間で十億倍の増幅を生じさせ得るという点で、ＰＣＲ／ＬＣＲよりも速いものである。他方では、ＴＭＡは、工程が、より低い温度で行われるため、潜在的に、ＰＣＲよりもあまり特異的ではないものである。特異的なプローブは、この差異を補償するために、使用される。
【００４８】
最近の技術（ＥＸＰＡＲ）は、熱に安定な切断酵素及び重合酵素の組み合わせを使用する（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００，４５０４−４５０９）。それは、短いオリゴヌクレオチドが発生させられる、等温の分子の連鎖反応である。その方法は、高度に敏感であり、且つ、＞１０６倍の増幅を達成することができる。指数関数的な反応のロバスト性、スピード、及び感度は、試料における少量の特異的なＤＮＡの配列の存在を急速に検出する際に有用である。
【００４９】
上記の異なる増幅の技術は、一般に、増幅の工程、即ち、試料の増幅の開始から所望の量のアンプリコンが得られるまで又はアンプリマーが排出される及び／又は増幅に伴われた酵素がそれらの活性を失ってしまうまでの工程と称される。
【００５０】
熱サイクルの増幅工程の場合には、この工程は、そのようなものとして、多くの不連続的な増幅ステップを含む。等温の工程の場合には、増幅は、連続的な工程である。プローブで標識化された粒子及びセンサーの表面に固定化された別のプローブでの磁気的なサイクリングによって、増幅された材料（例．ＭＡＳＢＡの場合における一本鎖のＲＮＡのオリゴヌクレオチド）を、ほぼ実時間の定性的な又は定量的なデータの検出を可能とするために、表面へ結び付けることができる。好ましくは、プローブは、アンプリマーの配列と異なる増幅された材料の配列に対してハイブリッド形成する。
【００５１】
あるいは、この工程を、しかしながら、温度を操作することによって又はアンプリマーから鋳型を物理的に分離することによって、増幅ステップへと分割することができる。二つのステップの方法として本発明の方法を参照するとき、増幅（及び自由選択で精製）及び検出が、使用されたデバイスの異なるユニット、モジュール、又はチャンバーで行われる方法。典型的には、本発明の二つのステップの方法は、増幅が行われる増幅モジュール及びセンサーの（チップの）表面を含む保温チャンバーを含むデバイスにおいて行われることになる（図２）。自由選択で、デバイスは、遊離のプライマーが精製される第三のモジュールを含む。
【００５２】
本発明の特定の実施形態に従って、試料は、（第一の）増幅に先立ち、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの抽出ステップで、予備処理される。適切なプロトコルが、分子クローニングについての解説書に記載される（例．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。数個のタイプのＤＮＡ又はＲＮＡの抽出キットは、商業的に入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｙｎａｌ，Ｗａｔｅｒｓ）。（典型的には磁性粒子の使用をなす）これらの抽出方法は、多糖類及びポリフェノール類のような、擾乱する化合物を取り除く。
【００５３】
また、単一の細胞における何千もの複製に存在するｒＲＮＡが抽出される単純な抽出方法を、使用することができる（Ｋｏｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。Ｔｈｏｒｎｓｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄ）：Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０７−１０８）において。ある一定の予備処理の使用は、試料の複雑さ及び濃度のようなパラメータに依存する。
【００５４】
さらなる自由選択のステップにおいて、磁性粒子を使用することで初期に抽出される、核酸を、予備増幅のステップにおける出発の材料の量を決定するために、磁気センサーのチップによって検出に直接的に使用することができる。
【００５５】
本発明の方法は、磁気センサーを使用する検出ステップをさらに含む。本発明の方法の具体的な実施形態に従って、生体分子は、センサーの表面へ増幅された核酸を結び付けるために使用される。検出ステップは、増幅工程の間に少なくとも一度且つまた自由選択で増幅工程の終了の際に行われる。連続的な増幅の工程において、検出を、増幅工程の間における、ある一定の時点で行うことができる。ＰＣＲのような段階的な増幅工程において、検出ステップは、典型的には、伸張ステップの後に行われる。検出ステップを、増幅の工程の各々の増幅サイクルの後に行うことができる。定量的な決定が望まれる、ある一定の実施形態において、検出ステップは、ＰＣＲ反応の指数関数的なフェーズの段階において、典型的には約サイクル１５から約サイクル２５までの間に、行われる。
【００５６】
センサーへ又は前記のセンサーによる検出を許容する分子へアンプリコンを結び付けるために使用された、生体分子は、タンパク質、核酸、しかしまた、炭水化物又はビタミン類（例．ビオチン）のような他の生物学的な化合物であり得る。
【００５７】
本発明の特定の実施形態に従って、アンプリコンは、アンプリコンに特異的なオリゴヌクレオチドであるセンサープローブの方式によって、センサーの表面へ直接的に又は間接的に連結される。自由選択で、このセンサープローブは、センサーの表面へ共有結合的に連結される。
【００５８】
センサープローブ又はハイブリッド形成プローブを含む、ここで定義されたプローブの全てのタイプを、オリゴヌクレオチドへ直接的にか又はオリゴヌクレオチドへ結び付けられる磁性粒子への付着を介してかのいずれかで、タンパク質又は有機分子のような他の分子にもまた連結することができる。ある一定の用途において、開裂可能なリンカー（例．還元剤によって開裂可能な化学的なリンカー、又は、酵素で開裂させることができるタンパク質若しくはＤＮＡのフラグメント）が、予見される。本発明において予見された生物学的な分子の間における結び付きを保証する生物学的な相互作用は、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡの結び付き、ＤＮＡ／ＲＮＡの結び付き、抗原−抗体の結び付き、リガンド−受容体の結び付き、基質−酵素の結び付き、阻害剤−酵素の結び付き、親和性の結び付き（例．ビオチン−（ストレプト）アビジン、亜鉛−Ｈｉｓ−タグ、ＧＳＴ−ＧＳＴを結び付けるタンパク質など）である。
【００５９】
一つの実施形態に従って、捕獲分子として作用する生物学的な分子は、例．抗体、特別な誘引性のタンパク質又は重合体の表面などのようなセンサーの表面に固定化される。これらの捕獲分子は、例．プライマー（センサープローブ）に結び付けられたタグを通じて、アンプリコンを特異的に結び付ける。図１は、アイテム１において、本発明で使用することができる様々な捕獲のスキームを示す。例えば、抗体のような捕獲分子１６は、磁場発生器１２、例．基板１４に埋め込まれた磁性棒又は電磁石を含むセンサー１０の表面へ結び付けられることがある。捕獲分子１６は、センサーの表面へ共有結合的に結び付けられることがある。捕獲分子１６は、少なくとも磁場発生器１２の付近におけるセンサーの表面へ結び付けられる。基板１４は、例．“バイオチップ”の、半導体の基板であり得る。抗体１６は、直接的にか又はアンプリコンに特異的なプローブへ連結されたタグを通じてかのいずれかで、増幅ステップによって発生させられたアンプリコン１８に特異的に結び付く。磁性粒子２０は、リガンドのタンパク質２２を通じて又は別の手段によって、例．直接的に（増幅の間における組み込み）又はハイブリッド形成プローブを通じて、アンプリコン１８へ結び付けられる。
【００６０】
本発明の代わりの実施形態において、センサー−プローブは、センサーの表面へ直接的に連結され、これは、センサーで固定化された配位子であるが、事実上、図１のアイテム２に示されたように磁性粒子２０に付けられないアンプリコン１８の末端に対してハイブリッド形成する特異的なオリゴヌクレオチドの配列２４である。磁性粒子２０は、リガンドのタンパク質２２を通じて又は別の手段によって、例．直接的に（増幅の間における組み込み）又はハイブリッド形成プローブを通じて、アンプリコン１８へ結び付けられる。
【００６１】
本発明において使用された、磁性粒子２０は、典型的には、２ｎｍから５マイクロメートルまでの範囲にある、即ち、磁性ナノ粒子又はマイクロ粒子である。磁性粒子２０の大きさは、検出を容易にするために、且つ、印加された磁場と共に粒子を作動させることができるように、小さすぎないものであるべきである。大きさは、また、これが非特異的な結び付き及び沈降に至り得るため、大きすぎないものであるべきである。好ましくは、粒子の大きさは、１０ｎｍと１マイクロメートルとの間の範囲にある。粒子の構造及び形状は、いずれの適切なもの、例．単一の磁性コア、多重の磁性コア、球体のもの、ロッド形状のものなど、であることができる。磁性粒子２０を、安定性を向上させるために及び上に述べたように生物学的な分子を付着させるための官能基を提供するために（生体）重合体でさらに被覆することができる。
【００６２】
本発明に従って使用されるものであるセンサー１０は、付近における、例えば１００μｍ以内の、より好適なのは１０μｍ以内の、磁性マイクロ粒子又はナノ粒子２０の存在を検出する又は測定する。“特定の実施形態に従って、センサーは、センサーの表面から１０μｍの距離におけるナノ粒子に対するよりもセンサーの表面の１μｍ以内のナノ粒子に対して十倍敏感であることになる。”センサー１０は、磁性粒子の存在を検出することができるいずれの適切な電磁的なセンサー、例．電極、ワイヤー、コイル、磁気抵抗センサー、磁気ひずみセンサー、Ｈａｌｌセンサー、平坦なＨａｌｌセンサー、ＳＱＵＩＤ、磁気共鳴センサーなど、でもあり得る。好ましくは、センサー１０は、磁気抵抗センサー、例．１ｋＡ／ｍよりはるかに下の磁場について高い信号対雑音比に到達するためには、巨大磁気抵抗（giant-magneto-resistive）（ＧＭＲ）センサーである。センサーを、チップにおいて自由選択で統合することができる。
【００６３】
センサーの表面において、又は、センサーの表面の近接において、好ましくは、温度の検知、加熱、及び磁気検出のような、できるだけ多数の機能が、統合される。冷却素子（例．ペルチェ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）素子）を、カートリッジに統合することができるか又は読取装置の機器の部分であり得る。急速な加熱及び冷却が、望ましいものである（例．ＰＣＲ）とき、加熱器又は冷却器の素子に対する試料の液体の接触面積は、好ましくは、できるだけ大きいものである。
【００６４】
溶液を通じて磁性粒子を移送するために要求された場の強度及び場の勾配は、数個のパラメータ、例．粒子の磁化率及び磁気モーメント、粒子の均質性及び濃度、クラスター化又は鎖の形成のような粒子−粒子相互作用の発現、並びに媒体における流れ抵抗に依存する。場を、読取装置における、カートリッジにおける、及びチップにおける、場を発生させる手段（電流のワイヤー及び磁性材料）の組み合わせによって発生させることができる。我々の系においては、これらのパラメータは、検定の時間の間において生物学的なチャンバーにおいて粒子の反復性の輸送を与えるような方式で、選択されることになる。
【００６５】
磁性粒子と別の要素（例．センサーの表面）との間における生物学的な結合を、粒子と他の要素との間に力又はトルクを発生させることによって、探査するか又は破壊することができる（例えば、国際公開第２００５／０１０５２７号パンフレットを参照のこと）。磁気的に標識化された生体分子が、反応混合物において導入され（例．標識化されたプライマー及びプローブ）且つ発生させられ（例．標識化されたアンプリコン）、且つ、次に巧みに操作される。特定の実施形態において、磁気的に標識化された生体分子は、磁場を印加することによって、この混合物内で分配される及び／又は混合される。例えば、平坦なコイルによる粒子の検出を伴った免疫学的検定において最近記載されてきたもの（Ｌｕｘｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６，１７１５）のように、生化学的な検定における磁性粒子の表面／バルクのサイクリングが、使用される。
【００６６】
本発明は、磁気抵抗センサーにおける磁性粒子サイクリング用の追加の方法、及び、例．追加の薬剤又は国際公開第２００５／０１０５２７号パンフレットに記載されたもののような専用の作動方法を使用することで、表面のみならずバルクの工程をより効率的なものとするための方法を含む。
【００６７】
マイクロ粒子又はナノ粒子との生物学的な用語作用は、おそらく協同の効果のおかげで、融解曲線の峻度の強い増加及び検出の向上させられた特異性を与えることができる。
【００６８】
異なるデバイスが、本発明の方法を行うために、適切である。デバイスは、フローオーバー又はフロースルーの設計を有し得る。フロースルーのパッケージは、例えば、（２００４年１１月に出願された）独国特許出願公開第０４０２８６号明細書に記載されたものである。急峻な角度を備えた流動の端を回避することによって、死角又は例．滑らかな移行を有する、望まれない再循環を回避するための配慮がなされる。洗浄するステップが洗浄溶液と共に使用される場合には、チャンバーの設計は、好ましくは、例．センサーの場所における流動の深さを狭めることによって、センサーの表面における大きい再生率を保証する。カートリッジは、好ましくは、カートリッジの壁へのターゲット材料及び／又は試薬の喪失を回避するために、生体材料の低い非特異的な結び付きを有する材料で作られる。
【００６９】
図２は、増幅ユニット３０、精製ユニット３２、及び検出ユニット３４の連続的な配置を使用する本発明の一つの実施形態を図解する。増幅工程は、センサー検出ステップから分離される。センサーの表面における遊離なプライマーと特異的なリガンドとの間における望まれない相互作用が、回避され、且つ、必要であれば、増幅工程の後に残留する遊離のプライマー及び他の反応の汚染物質が、例えば、シリカの材料からなる、精製モジュール３２において取り除かれる。ある一定の実施形態に従って、増幅チャンバーにおける流体は、再循環され、それによって、精製モジュールは、増幅チャンバーにおいてアンプリコンが通過すること及び全ての他の材料（例．遊離のプライマー）を維持することを可能にするように設計される。
【００７０】
図３Ａは、本発明の一つの実施形態を図解し、それによって単一のデバイスは、三個のチャンバー３０−３４と共に使用され、各々の移行は、次のチャンバーの中への溶液の制御された且つ適切な時間の通過を可能にするために、制御可能な弁の系によって分離される。三個のチャンバー３０−３４及びセンサーチップ１０は、図１に描かれたような構築物におけるモジュール３０−３４及びセンサーチップ１０と類似の役割を果たすが、しかし、ここでは、流体を、チャンバー３０−３４の間において前後に移送することができる。
【００７１】
さらなる好適な実施形態において、加工且つ検出デバイスは、図３Ｂに示されたようなものである、即ち、増幅及び検出又は測定が、形成されたアンプリコンの直接的な検出を可能にする、単一のデバイス３６において、好ましくはセンサーチップ１０の付近における単一のチャンバーにおいて、行われる。より詳しくは、デバイスは、熱に安定なセンサーの表面を、好ましくはそれに連結された固定化されたリガンドを備えて、含み、且つ、使用された増幅の方法によって要求されるような、変動する温度で（例．ＰＣＲ）、又は、一定の温度で（例．ＮＡＳＢＡ）、増幅のプロトコルを行うための能力を有する。加えて、デバイスは、プライマー−プライマーの複合体におけるもののような非特異的な相互作用の発現を回避するために、且つ、使用された磁性粒子の特異的な特性を考慮に入れるために、もし存在するとすれば競合的な遊離のプライマーの取り除きを可能にするように適合させられる。
【００７２】
図４に概略的に示されるように、本発明は、磁気抵抗センサーにおける磁性粒子サイクリング用の追加の方法及び例．追加の薬剤又は国際公開第２００５／０１０５２７号パンフレットに記載されたような専用の作動方法を使用することで、表面のみならずバルクの工程をより効率的なものとするための方法を含む。
【００７３】
加工及び検出デバイスの変更は、本発明の範囲内に含まれる。特に、他の可能なデバイスの幾何学的配置は、センサーの表面についての高い表面積の材料の使用を含む。さらに、側方の流動又はフロースルーの体系を使用することができる。
【００７４】
本発明は、多種多様な用途に適用可能である。用途の非限定的な列挙は、例えば、微生物（食品の腐敗及び中毒）の及び農芸−食品−環境の分野における遺伝子をコードする毒素の検出；作物及び果物（品質の指標）における活性な遺伝子（‘ゲノム解析’の研究におけるｍＲＮＡ）のアセスメント；ＧＭＯ（食品の安全性及び識別）の検出／粗悪品のアセスメント／虚偽（外来のＤＮＡの決定）；アレルギー性の製品／汚染物質の検出；環境的な帰結を伴った微生物、例．ＭＲＳＡ、レジオネラ、リステリア、の検出；細胞培養における微生物の識別である。臨床的な診断における用途は、例えば、種、髄膜炎、呼吸器の疾患、結核、肝炎、ＡＩＤＳなどに関する微生物の検出；例．上記の疾患に関係付けられた、細胞培養における微生物の識別である。
【００７５】
今、本発明は、後に続く例で図解される。
【実施例１】
【００７６】
例１：磁気的な標識無しでアンプリマーを使用するＰＣＲの増幅
自由選択の核酸抽出ステップの後で、核酸の増幅は、溶液における二つの特異的なアンプリマーを備えたＰＣＲプロトコルに従った上に述べた加工及び検出デバイスのいずれかで行われる。増幅工程は、アンプリコン１８に帰着し、それらアンプリコンのストランドの一つは、磁性ナノ又はマイクロ粒子２０の表面へ共有結合的に結び付けられるハイブリッド形成プローブとハイブリッド形成する。アンプリコン１８のこのストランドの別の部分は、別の相補的なプローブ、即ち、センサーチップの表面に付けられた、センサープローブ、とハイブリッド形成する。付着は、共有結合的であることもある。ハイブリッド形成及びセンサープローブが、増幅工程において使用されたアンプリマーに相補的ではない伸張されたストランド内に核酸の配列とハイブリッド形成するとき、最小限の干渉が、得られる。この例では、センサーへ付けられたものになるマイクロ粒子又はナノ粒子の濃度は、繰り返しの配列（サイクル）における特定の点で、断続的に測定される。
【００７７】
三つの後に続くステップは、従来のＰＣＲサイクル：を記載する。
【００７８】
鋳型の二重鎖ＤＮＡが、個々のストランドを解離するように、典型的には９０℃と９９℃との間で、加熱される（変性）。
【００７９】
温度は、プライマーが遊離のストランドへアニール化されることを可能にするように、アンプリマーのプライマーの長さ及び配列に依存するが、典型的には４５−６５の間に、低下させられる（アニーリング）。
【００８０】
温度は、典型的には７２℃まで、上昇させられる。プライマーは、鋳型のストランドに沿って伸張させられる（伸張）。
【００８１】
増幅された核酸、例．ＤＮＡ、ＲＮＡ、を検出し且つ測定するために、後に続くステップが、行われる：。
【００８２】
ＤＮＡの増幅の完了の後、温度は、二重鎖ＤＮＡを解離するように上昇させられる。
【００８３】
磁性のマイクロ又はナノ粒子を備えたハイブリッド形成プローブは、磁力を使用することで、例．磁場発生器１２によって発生させられた磁場の勾配のおかげで、バルクの溶液からセンサーの表面に向かって付けられる。ハイブリッド形成及び検出プローブに相補的なＤＮＡ鎖は、これらのプローブの間に（ハイブリッド形成を介して）挟まれる。その結果として、ＤＮＡ鎖は、センサーの表面へ固定化され且つ磁性粒子で標識化される。
【００８４】
結び付けられないハイブリッド形成プローブは、その後に、磁力を印加することによって、例．磁場及び／又は正しい傾斜を備えた磁場の勾配によって、センサーの表面から反発させられるが、しかしながら、最大の力は、それが、ストランドハイブリッド形成プローブ−センサープローブの複合体におけるＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリッドを破壊しないようなものである。（国際公開第２００５／０１０５２７号パンフレットに記載されたように）典型的な値は、ｐＮの範囲にあり、ｎＮの範囲における力は、特異的な結合を破壊することになる。
【００８５】
ハイブリッド形成プローブに付けられた磁性粒子の磁場の強度が、測定され、この値は、ＰＣＲ増幅において形成されたアンプリコンの量に関係付けられる。この方法は、ほぼ実時間のＰＣＲ検出を可能にする。
【００８６】
測定ステップの後に、温度は、プローブ−アンプリコンのストランドの相互作用を解離するように、再度上昇させられる。ナノ粒子は、磁場を反転することによって、バルク溶液に再度分配させられ、その後に、それらは、再度、印加された磁力の作動によって、生化学的な反応において関係する。この時点で、試料は、変性させられ、且つ、次の増幅サイクルに入るための準備の整ったものとなる。
【００８７】
図５は、時間の関数としてセンサーの信号のグラフを示す。
【００８８】
当業者にとって、上記の工程における特定のステップの変更が、可能であることは、明白なことである。例えば、検出ステップは、各々の増幅ステップの後で行われ、あるいは、検出ステップは、より低い周波数で行われるか、又は、初期の数のＰＣＲサイクルが、検出ステップ無しで行われてしまった後にのみ行われる。
【００８９】
上記の工程は、温度のみならず両方の磁性粒子が循環させられると、‘磁性粒子及び温度のサイクリング’と呼ばれる。それは、マイクロ又はナノ粒子が、表面の工程におけるのみならずバルクの工程において効率的に関係することを可能にする。この実施形態において、アンプリコンの形成及び発生は、バルクの溶液で行われ、且つ、粒子の検出は、センサーの表面で行われる。それは、ある形態の断続的な検出であり、個々の測定の間における時間は、ＰＣＲの手順のサイクル時間に等しいものである。ＰＣＲのサイクリング時間を減少させることによって、増幅工程のほぼ実時間の状況は、より正確なものとなる。現在のところ、最先端の小型化された増幅は、サイクル当たり１５秒から３０秒までを要求する。
【００９０】
工程への内部標準、例．比較の目的のための知られた量の基準の鋳型及び専用のプライマー、の追加によって、このほぼ実時間の増幅もまた定量的なものとすることは、可能である。好ましくは、センサーの表面における（統計的に無作為化された）別個のスポットは、この内部標準について特異的なものとされる。増幅の効率（例．時間間隔当たりの量）を記録することによって、未知の鋳型のＤＮＡの初期の量の計算が、可能である。
【００９１】
より好適なセットアップにおいて、検出は、マイクロ又はナノ粒子に対するハイブリッド形成プライマーの量が、低いアンプリコンの被覆率、即ち、平均でナノ粒子当たり一つ未満のアンプリコン、を有する領域で行われる。これは、マイクロ又はナノ粒子当たり一つを超えるアンプリコンを有する確率が、非常に低いものであること、及び、センサーにおけるマイクロ又はナノ粒子の数を、元来の試料におけるターゲットの濃度へと定量的に且つ正確に変換することができることを保証する。
【００９２】
本発明に従って、多重化は、異なる捕獲分子と共にセンサー１０のアレイを有することによってもまた、行われることがある。いくつかの場合において、同じプライマーを、使用することができ、他の場合には、異なるプライマーが、必要とされることになる。
【実施例２】
【００９３】
例２：磁気的な標識を備えたアンプリマーを使用するＰＣＲ増幅
自由選択の核酸抽出ステップの後に、核酸の増幅は、アンプリマーを伴ったＰＣＲのプロトコルに従って行われ、それらアンプリマーの一方は、磁性粒子へ共有結合的にカップリングされ、且つ、他方は、磁気的には標識されないものである。この例は、図６において概略的に図解される。増幅工程は、付けられたプライマーを介して磁性のマイクロ又はナノ粒子へ標識化される伸張されたストランドの一つに帰着する。
【００９４】
この例では、センサー１０へ付けられたマイクロ又はナノ粒子の濃度は、繰り返しの配列（サイクル）における特定の点で、断続的に測定される。
【００９５】
アンプリマーは別として、センサーチップの表面に共有結合的に付けられた、ただ一つの追加のプローブ（センサープローブ）が必要であるとはいえ、好適な設計及び手順並びにこの実施形態に従って示唆された追加の選択肢を記述するステップは、例１における手順について記載されたものと本質的に同じである。このセンサープローブは、図６に描かれるように、アンプリマーのオリゴヌクレオチドと同じ配列を含むことができるか、又はアンプリマーのオリゴヌクレオチドの配列と重複することができる。あるいは、センサープローブは、アンプリマーが結び付く配列と異なる増幅されたＤＮＡの配列に対してハイブリッド形成する。
【００９６】
上記の代わりとして：検出ステップの間にセンサーへ結び付けられた磁性粒子の濃度は、元来のターゲットの濃度とある関係を有する。言い換えれば、与えられた検定の時間及び検出工程の時間の間に、形成されたアンプリコンのストランドに結び付くことによるセンサーにおける粒子の濃度は、元来のターゲットの濃度を示唆する。形成されたアンプリコンの量を測定する別の方式は、特定の検定の時間に残留するアンプリマーの量の検出である。粒子に結び付けられたアンプリマーが、このアプローチのためにターゲットにされるとすれば、結び付けられた粒子の濃度は、増幅工程の間に形成されたアンプリコンの濃度を増加させる際に、減少するであろう。ここで、このような検定の例が、与えられる：。
【００９７】
アンプリマーの一つのタイプは、磁性粒子へ共有結合的にカップリングされる。センサーにおいて、このアンプリマーに結び付くように選択されてしまったプローブが、固定化される。そのようにして、初期に、この共有結合的にカップリングされたアンプリマーを備えた粒子は、高い結び付きの率でセンサーに結び付くことができる。増幅工程が進行すると、より多くの粒子に結び付けられたアンプリマーが、最大限のアンプリコンまで伸張されることになる。その結果として、粒子におけるより少ない数のアクセス可能なアンプリマーによって及び／又は粒子へ結び付けられたアンプリコンによる立体障害のおかげで制御された、粒子がセンサーに結び付く確率は、減少する。
【実施例３】
【００９８】
例３：本発明のマイクロアレイの用途
先の例に記載された手順は、磁場サイクリング及びいくつかの場合には温度サイクリングによる増幅された遺伝物質の検出を可能とする。これらの方法のいずれも、マイクロアレイの用途において適用されることが優れて適したものである。試料の溶液からアレイ及びアンプリコンのセンサーの表面に固定化された（この場合には、磁性ナノ粒子へ付けられた）プローブの間における相互作用の強度は、多かれ少なかれ、プローブとアンプリコンとの間における相補性の程度に比例するものである。アレイにわたって異なる力（例．アレイの位置に依存する異なる磁力）を適用することによって、又は、時間の関数として力を変動させることによって、様々なタイプのアレイのサブスポットが、例．プローブとアンプリコンとの間における非常に強力な結び付き（例．高い相補性）を備えたスポットまで弱い力（例．非特異的な又は高度に退化させられたハイブリッド形成）で付けられたアンプリコン及び磁性のナノ粒子をゆるめるスポットから、識別される。この最後の場合には、磁気信号が、これらの粒子のスポットに固定化された磁性粒子の結果として、まだ記録可能である。
【００９９】
特異的なプローブが、センサーの表面の非常に小さい且つ不連続な部分に固定化されるマイクロアレイのセットアップにおいて、特定のプローブと、付けられた又は結び付けられた特異的な相補的なアンプリコン／リガンドを有する標識化された磁性粒子との間における衝突の機会は、非常に小さいものである。センサーの表面に対して垂直な速度成分を備えた磁力サイクリングは、センサーの表面より上の小さい体積における特異的な結び付きの対（即ち、表面のプローブ及びアンプリコン／リガンドで識別された磁性粒子）の濃度を増加させることになる。しかしながら、センサーの表面に対して平行な粒子の移動は、（また磁場の結果として）制限される。その結果として、測定可能な結果を与えることが必要な増幅工程に関係した特異的な結び付きの対の相互作用は、マイクロアレイのセットアップにおける非効率的な工程である。
【０１００】
この欠点を克服するために、センサーの表面に対して平行な成分を備えた磁場及び速度が、粒子を、衝突の接触をさらに増加させるために、水平に且つセンサーの表面にわたって近接近で移動させるために、断続的に又は垂直な成分と調整された方式で、適用される、マイクロアレイの形式の別の実施形態が、与えられる。
【０１０１】
結び付きの効率に影響を及ぼすための温度を調節することに加えて、磁場の作動を、特定の温度で細分の相互作用へ追加された値を与えるために、使用することができる。これは、遺伝子の差異を、配列の分析無しに（配列の分析が確認試験として使用されることもあることに留意すること）検出することができるように、核酸の配列のＳＮＰ又は他の変化の検出を可能とすることがある。これは、また、上方制御された遺伝子及び下方制御された遺伝子、即ち、マイクロアレイの実験において研究された特定の生理学的なパラメータに関するより少ない数の鍵となる遺伝子、のより敏感な且つより正確な記述を可能とする。これは、また、微生物、病原体、又は他の生物学的な材料のより多くの精確な識別を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従った実時間の検出のための、増幅された核酸の配列の検出用の磁気センサーの代わりの構成を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態に従った磁気センサーチップの検出が後に続けられた、増幅及び遊離のプライマーの精製用のモジュールを備えた二つのステップの構成における増幅された核酸の配列の検出用の磁気センサーの例を示す。検出の後で、増幅された核酸は、増幅モジュールの中へ再度導入される。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従った、単一の、増幅、精製及び検出用の三個のチャンバーモジュール（検出の後で、増幅モジュールの中へ再度導入された、増幅された核酸）（Ａ）を備えた、又は、単一の、増幅及び検出用の一つのチャンバーモジュール（Ｂ）を備えた、実時間の構成における増幅された核酸の配列の検出用の磁気センサーの例を示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従った反応チャンバー及び磁性ナノ粒子を備えたデバイスの図解を示す（入口及び出口は示されない）。粒子は、生化学的な増幅工程と同期化された、磁性粒子サイクリング工程を経由するように作動させられる。
【図５】図５は、時間の関数としてセンサーの信号のグラフを示す。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従った概略的な方法を示す。ＰＣＲ増幅が、センサーチップより上の保温チャンバーにおいて行われる。各々サイクル、温度及び磁場の作動の特定の組み合わせが、増幅工程のほぼ実時間の状態を測定するために適用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2008543279.tif 000009
2008543279.tif 000010
2008543279.tif 000011