(57)【要約】  ５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグは、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）の予防および／または治療、ならびに移植拒絶反応の予防および／または治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）自己免疫疾患を予防および／もしくは治療するため、または（ｉｉ）移植拒絶反応を予防および／もしくは治療するための薬剤の製造における、５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグの使用。
【請求項２】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑、セリアック病、脈管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、甲状腺炎（ハシモト、グレーブス）、重症筋無力症、ギヤン・バレー症候群、ブドウ膜炎、扁平苔癬、側頭動脈炎、サルコイドーシス、乾燥症候群（シェーグレン）、気管支喘息、天疱瘡、強直性脊椎炎、強皮症、線維筋痛症またはリウマチ熱である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が、ＭＳに罹患している個体における症状の発生を遅らせるか、またはＭＳに罹患している個体におけるＭＳ（進行期）の進行を遅らせるものである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記移植が、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、造血骨髄、皮膚、肢、角膜、膵臓、幹細胞および細胞治療、ならびに移植片または生体材料から選択されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が、経口、皮下、腹腔内または静脈内投与用に設計されているものである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、自己免疫疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療に有用な別の更なる薬物と組み合わせて投与されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療に有用な別の更なる前記薬物が、ＭＴＡを含んでなる医薬組成物との同時または非同時投与を目的とした別個の組成物の形態で投与されるものである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
自己免疫疾患に罹患している個体における自己免疫疾患を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量の５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、またはその医薬的に許容される塩および／もしくはプロドラッグの１つを前記個体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑、セリアック病、脈管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、甲状腺炎（ハシモト、グレーブス）、重症筋無力症、ギヤン・バレー症候群、ブドウ膜炎、扁平苔癬、側頭動脈炎、サルコイドーシス、乾燥症候群（シェーグレン）、気管支喘息、天疱瘡、強直性脊椎炎、強皮症、線維筋痛症またはリウマチ熱である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＳに罹患している個体における症状の出現を遅らせるか、またはＭＳに罹患している個体におけるＭＳ（進行期）の進行を遅らせるための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
移植を受ける予定であるか、または移植を受けた個体における移植拒絶反応を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量の５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、またはその医薬的に許容される塩および／もしくはプロドラッグの１つを前記個体に投与することを含んでなる、方法。
【請求項１４】
前記移植が、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、造血骨髄、皮膚、肢、角膜、膵臓、幹細胞および細胞治療、ならびに移植片または生体材料から選択されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が、経口、皮下、腹腔内または静脈内投与用に設計されているものである、請求項９または１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、自己免疫疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療に有用な別の更なる薬物と組み合わせて投与される、請求項９または１３に記載の方法。
【請求項１７】
自己免疫疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療に有用な別の更なる前記薬物が、ＭＴＡを含んでなる医薬組成物との同時または非同時投与を目的とした別個の組成物の形態で投与される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、一般に、自己免疫疾患の予防および／または治療、ならびに移植拒絶反応の予防および／または治療、特に、多発性硬化症（ＭＳ）の予防および／または治療における５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグの使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
自己免疫疾患は重篤な疾患であり、著しい健康問題や個人的な問題を引き起こし、現在では先進工業国で４番目に重要な健康問題となっている。一例として、多発性硬化症（ＭＳ）はヘルスケアに関連が深い自己免疫疾患であり、著しい続発症を引き起こす。同様に、移植拒絶反応は、移植抗原特異的Ｔリンパ球の活性化がその排除につながる特定ケースの自己免疫であり、移植を受けた患者にとっては深刻な合併症であり、個人的にも社会的にも高いコストを伴う。
【０００３】
それらの独特の特徴（機構および治療応答）のため、自己免疫疾患は、炎症性疾患における特定のサブグループを形成している。周知のように、炎症性疾患は、先天的炎症が主流であるか、または先天的炎症と闘うためにその治療が計画されているものである。しかし、自己免疫疾患は以下の点において炎症性疾患とは異なっている：適応免疫（リンパ球）による炎症が主流であり、結果として先天的炎症の調節を目的とする伝統的な抗炎症治療は、自己免疫疾患の治療においては効果的ではない。これは、自己免疫疾患の慢性的な活性を制御するためには、局所的な炎症を抑制することに加え、免疫調節剤によってリンパ球の活性を調節することが必要であるという事実に起因するようである。
【０００４】
自己免疫疾患の治療は重大な問題である。その理由は、多くの療法が対症療法であり、かつ、疾患過程を改変する療法は部分的にしか有効ではなく、副作用を伴うと共に、かなりのコストを要するからである。自己免疫疾患の制御は、一般には、免疫抑制療法または免疫調節療法によるＴリンパ球活性化の調節をもとに行われるものであり、そのため、伝統的な抗炎症療法は効果的ではない。
【０００５】
現在、自己免疫疾患および移植拒絶反応の治療では、３種類の療法が用いられる傾向にあり、それらは全て自己反応性Ｔリンパ球の活性化および効果を制限することに重点を置いている：
【０００６】
ａ）コルチコイド（例えば、プレドニゾン、５’−メチルプレドニゾン、デキサメタゾン、および特にＡＣＴＨ）を経口的に、皮下的に、または静脈内に、ボーラス形態で、短時間または無期限に投与すると、通常は部分的に、それらの使用を制限する著しい長期的副次作用を伴うものの、これら疾患の幾つかが緩和され得る；
【０００７】
ｂ）他方、免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド、ミトキサントロン、メトトレキセート（methrotrexate）、アザチオプリン、および特にシクロスポリンＡ）を経口的に、または静脈内に投与すると、それらの使用を大幅に制限する潜在的に深刻な、更には致命的な副作用を伴うものの、これらの疾患の多くの制御が改善される；
【０００８】
ｃ）他方、免疫調節剤（例えば、インターフェロン−β、インターフェロン−α、酢酸ガラティラメル、抗ＣＤ２０、または特に抗ＴＮＦａモノクローナル抗体）を投与すると、部分的に、有害な副作用を伴うと共に、それらがバイオテクノロジー産物であるために高いコストを伴うものの、これらの疾患の制御が改善される。
【０００９】
故に、リンパ球活性化を防止するのに効果的であり、かつ、副次作用を制限しつつ、自己免疫疾患および移植拒絶反応の活性を阻止するか、または低下させる、利用可能な新規治療薬を得ることは、大きな関心事である。
【００１０】
本発明では、自己免疫疾患の予防および／または治療、ならびに移植拒絶反応の予防および／または治療、特に多発性硬化症（ＭＳ）の予防および／または治療に、５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を用いることができることが見出された。
【００１１】
ＭＴＡは、疎水性アデニン硫黄−ヌクレオシドであり、リボースの５’位にあるヒドロキシル基がメチルチオ基に置換されている。ＭＴＡは、原核生物、酵母、植物および高等真核生物などのあらゆる種類の細胞において低い割合で認められ、哺乳類の全組織に天然に存在することが観察されている。ＭＴＡは、癌制御、ならびに再生および先天的炎症に関して非常に多様な特性を有する周知の分子である。
【００１２】
米国特許第４，４５４，１２２号明細書には、抗炎症剤、鎮痛剤および解熱剤としてのＭＴＡの使用、とりわけ、先天的炎症の治療におけるＭＴＡの使用が開示されている。抗炎症活性は、浮腫、胸膜炎および異物肉芽腫モデルにおける先天性免疫応答を抑制することによって分析されている。リンパ球活性化の抑制におけるＭＴＡの役割については分析されておらず、自己免疫疾患や移植拒絶反応における免疫調節剤としてのその役割も分析されていない。
【００１３】
癌に対するＭＴＡの効果も研究されている。多くの悪性細胞ではＭＴＡＰ（５’−メチルチオアデノシンホスホリラーゼ）活性が欠如しており、培養時に、これらのＭＴＡＰ欠失細胞がＭＴＡを代謝するのではなく、それを分泌することが広く観察されている。一例として、国際特許出願ＷＯ２００４／０７４３２５には、癌治療においてＭＴＡＰ酵素を阻害する化合物を使用することが開示されている。化学的に誘発された肝細胞癌発症の実験モデルでは、ＭＴＡレベルの低下が観察されており、ＭＴＡの投与により、肝臓の前癌病変およびＤＮＡ合成の用量依存的阻害が誘発される。
【００１４】
一方、Ｔリンパ球の機能および増殖は、ＭＴＡによる阻害に対して特に感受性が高いようである。この化合物は、マイトジェン刺激型マウスリンパ細胞系およびヒト末梢リンパ球の増殖を、可逆的かつ無毒的に、そして用量依存的に阻害する。細胞増殖に干渉し得るＭＴＡ効果の中で、タンパク質メチル化の阻害またはホスホジエステラーゼ活性の阻害を挙げることができる。本発明の著者らは、彼ら自身、国際神経免疫学会連合（International Society of Neuroimmunology）の第７回会議（２００４年９月、ベニス）における「A methylation-Inhibitor Suppresses T Cell Activation and Prevents Experimental Autoimmune Encephalomyelitis」という名称の会議論文［Journal of Neuroimmunology 2004, Vol. 154, numbers 1-2, page 85に公表された要約書］中で、メチル化反応の強力な阻害剤としてのＭＴＡの有用性について明らかにしており、ＭＴＡは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）で免疫されたＬｅｗｉｓラットからなる実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）（ＥＡＥ）の動物モデルにおける自己免疫反応の発生を阻止するものである。
【発明の概要】
【００１５】
今般、驚くべきことに、ＭＴＡがＴリンパ球活性化に対する調節効果を発揮することができ、それにより自己免疫疾患および移植拒絶反応における炎症を改変することが可能となるので、このＭＴＡを自己免疫疾患の予防および／または治療、ならびに移植拒絶反応の予防および／または治療、特にＭＳの予防および／または治療において使用できることが見出された。この点について、本発明では、ＭＴＡはその効果がリンパ球に対して特異的に発揮されるために免疫調節剤として作用する。
【００１６】
ＭＴＡのこの新規用途は、ＭＴＡが投与された急性ＥＡＥおよび慢性−再発性ＥＡＥの動物モデルについて発明者らが行った研究に基づくものであり、ＭＴＡで治療された動物が、当該疾患の臨床的徴候をなんら示さず、疾患が既に出現した後も、当該疾患の過程にわたって著しい衰弱を示さないことが観察された。
【００１７】
故に、一つの態様において、本発明は、（ｉ）自己免疫疾患を予防および／もしくは治療するため、または（ｉｉ）移植拒絶反応を予防および／もしくは治療するために設計された薬剤の製造における、ＭＴＡの使用に関する。特定の実施態様において、この自己免疫疾患はＭＳである。
【００１８】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患に罹患している個体における自己免疫疾患を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量のＭＴＡを前記個体に投与することを含んでなる方法に関する。特定の実施態様において、この自己免疫疾患はＭＳである。
【００１９】
別の態様において、本発明は、移植を受けたか、または移植を受ける予定である個体における移植拒絶反応を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量のＭＴＡを前記個体に投与することを含んでなる方法に関する。
【００２０】
自己免疫疾患、特にＭＳ、ならびに移植拒絶反応の予防および／または治療にＭＴＡを使用することは、現在の治療方策によって提起される問題、例えば、自己免疫疾患および移植拒絶反応の治療に用いられるコルチコイド、免疫抑制剤および免疫調節剤の長期的な副次作用などを回避する効果的な方法となる。
【発明の具体的説明】
【００２１】
一つの態様において、本発明は、ＭＴＡ：
【化１】
2008533107.tif 000002
、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグの、（ｉ）自己免疫疾患を予防および／もしくは治療するため、または（ｉｉ）移植拒絶反応を予防および／もしくは治療するために設計された薬剤の製造における使用に関する。
【００２２】
本明細書において、「医薬的に許容される塩」という用語は、薬剤の製造に使用し得るあらゆるＭＴＡ塩を指す。該塩が医薬的に許容可能であれば、その性質は重要ではない。医薬的に許容されるＭＴＡ塩の中には酸付加塩が含まれるが、これら酸付加塩は当技術分野で周知の従来法により、十分に化学量論的な量のＭＴＡと適切な酸とを反応させることにより、有機酸または無機酸から得られる。これらの酸付加塩を得るために使用され得る酸の例としては、アスコルビン酸、クエン酸、１，４−ブタンジスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸、または塩酸、硫酸などの無機酸が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＭＴＡ塩酸塩は注射用製剤で使用されてもよく、ＭＴＡ塩酸塩、ＭＴＡ硫酸塩、ＭＴＡクエン酸塩、ＭＴＡアスコルビン酸塩、ＭＴＡ１，４−ブタンジスルホン酸塩（腸溶性コーティング錠剤）、ＭＴＡｐ−トルエンスルホン酸塩などは経口用製剤で使用されてもよい。
【００２３】
更に、本発明の範囲にはＭＴＡプロドラッグが含まれる。本明細書において、「プロドラッグ」という用語は、ＭＴＡから誘導されたあらゆる化合物、例えばエステル、アミドなどを包含し、この化合物は、個体に投与されると、前記個体に対して直接的または間接的にＭＴＡを付与することができるものである。好ましくは、前記誘導体は、個体に投与されるとＭＴＡのバイオアベイラビリティを高めるか、または生体コンパートメントでのＭＴＡの放出を促進する化合物である。前記誘導体は、個体に投与してもよく、かつ個体の生体コンパートメントにＭＴＡを付与するのであれば、その性質は重要ではない。前記プロドラッグの製造は、当業者に既知の従来法によって行うことができる。
【００２４】
ＭＴＡは、Ｓｉｇｍａ社によって供給可能な市販の製品である。あるいは、前記化合物は、本明細書の実施例において言及するように、Schlenk F. et al., Arch. Biochem. Biophys., 1964, 106:95-100によって記載された手順に従い、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から開始する既知の方法により得られる。
【００２５】
ＭＳなどの自己免疫疾患の予防および／もしくは治療、または移植拒絶反応の予防および／もしくは治療におけるその投与について、ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグは、適切な医薬組成物中において、治療的に有効な量で、１つ以上の医薬的に許容される担体、アジュバントまたは賦形剤と共に製剤化される。
【００２６】
医薬組成物の例としては、例えば、経口、皮下、腹腔内、静脈内経路などのあらゆる適切な経路によって、典型的には、治療されるべき疾患の慢性的な性質のために経口投与によって投与されるべきあらゆる固体組成物（例えば、錠剤、カプセル、顆粒など）または液体組成物（例えば、溶液、懸濁液、エマルションなど）が挙げられる。
【００２７】
特定の実施態様において、前記医薬組成物は、固体または液体形態のいずれかをなす経口投与用の医薬形態であってもよい。経口投与用の医薬形態の例としては、錠剤、カプセル、顆粒、溶液、懸濁液などが挙げられ、従来の賦形剤、例えば結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、湿潤賦形剤などを含有していてもよく、従来法によって製造することができる。医薬組成物はまた、溶液、懸濁液または殺菌性凍結乾燥剤などの形態で、適切な剤形にて非経口投与に適合され得る。この場合、前記医薬組成物は、緩衝剤、界面活性剤などの十分な賦形剤を含むものである。いずれにせよ、賦形剤は、医薬形態の選択された投与に基づいて選択されるものである。薬物投与のための様々な医薬形態およびそれらの製造についての総説は、「Tratado de Farmacia Galenica」（de C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones）という本の中に見られる。
【００２８】
その治療用途について、ＭＴＡは、医薬的に許容される形態または実質的に純粋な形態であるのが好ましく、すなわち、ＭＴＡは、医薬的に許容される賦形剤を除いて、医薬的に許容される純度レベルを有しており、かつ通常の用量レベルで毒性であると考えられる材料も含まない。ＭＴＡの純度レベルは、好ましくは５０％よりも高く、より好ましくは約７０％よりも高く、より好ましくは約９０％よりも高い。好ましい実施態様において、ＭＴＡの純度レベルは９５％よりも高い。
【００２９】
一般に、投与されるべきＭＴＡの治療的に有効な量は、要因の中でとりわけ、治療を受けるべき個体、該個体が罹患している疾患の重篤度、選択された投与形態などによって決まる。この理由により、本発明において言及される投与量は、当業者にとっては単なるガイドとして考えられており、当業者は、前記要因に基づき投与量を調節する。しかし、ＭＴＡは、日に１回以上、例えば１、２、３または４回、典型的な一日あたりの総量２５〜７５ｍｇ／ｋｇ／日で投与してもよい。
【００３０】
ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグ、ならびにそれらを含有する医薬組成物は、併用療法を行うために、自己免疫疾患または移植拒絶反応の予防および／または治療に有用である他の更なる薬物、例えば、コルチコイド、免疫抑制剤、免疫調節剤などと共に使用してもよい。前記更なる薬物は、同医薬組成物の一部を形成してもよく、あるいは、ＭＴＡまたはそのプロドラッグもしくは医薬的に許容される塩を含む医薬組成物との同時または非同時投与用の別個の組成物の形態で提供されてもよい。
【００３１】
本明細書において、「自己免疫疾患」は、患者自身の身体組織に対する患者の防御系（免疫系）における攻撃的機構の誘発に応答する疾患である。より特定的には、自己免疫疾患は、適応免疫（特異免疫または獲得免疫とも呼ばれる）による炎症が主流であり、感染体への曝露後に免疫が刺激されること、およびその主要成分がリンパ球であることを特徴とする。自己免疫疾患の一覧は、米国自己免疫関連疾患協会（American Autoimmune Related Diseases Association [http://www.aarda.org]のウェブサイトに見られる。自己免疫疾患の例としては、ＭＳ、クローン病、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、乾癬、狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑、セリアック病、脈管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、甲状腺炎（ハシモト、グレーブス）、重症筋無力症、ギヤン・バレー症候群、ブドウ膜炎、扁平苔癬、側頭動脈炎、サルコイドーシス、乾燥症候群（シェーグレン）、気管支喘息、天疱瘡、強直性脊椎炎、強皮症、線維筋痛症、リウマチ熱などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
特定の実施態様では、本発明は、ＭＳを予防および／または治療するために設計された薬剤の製造において、特定的にはＭＳの治療において、より特定的には、ＭＳに罹患している（すなわち、ＭＳが既に始まった後の）個体において、次の症状の発生を遅らせるか、または該疾患（進行期）の進行を遅らせる上でのＭＳの予防および／または治療において、ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグを使用することを意図している。本発明者らによって行われた試験は、ＭＢＰで免疫されたＬｅｗｉｓラット（急性ＥＡＥモデル）においてＥＡＥを予防する際に観察される自己免疫の発生に対するＭＴＡの予防効果に加え、ｒＭＯＧで免疫されたＤＡラットを用いたＣＲ−ＥＡＥモデルにおいて検証されたように、疾患（ＭＳ）が既に始まってからＭＴＡで治療を行うと臨床症状および生存率が改善されることから、ＭＴＡが慢性自己免疫に対する治療効果も有することを示している。現在のところ、疾患が既に始まってからは免疫調節療法しか使用できず、発症前マーカーがないために予防的治療を行うことは不可能であるので、この態様は非常に重要である。
【００３３】
別の特定の実施態様では、本発明は、移植拒絶反応の予防および／または治療用に設計された薬剤の製造において、ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグを使用することに関する。ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグを使用して、実質的に全ての移植の拒絶反応を予防および／または治療し得る。このような移植の例としては、腎臓、肝臓、心臓、肺、腸、造血骨髄、皮膚、肢、角膜、膵臓、幹細胞および細胞療法、移植片または生体材料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患に罹患している個体における自己免疫疾患を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量のＭＴＡ、またはその医薬的に許容される塩および／もしくはプロドラッグの１つを前記個体に投与することを含んでなる方法に関する。治療され得る自己免疫疾患は先に定義されており、投与、医薬組成物およびＭＴＡの治療的有効量に特徴を有するようなものである。特定の実施態様において、前記自己免疫疾患はＭＳである。ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグは、特定の実施態様において、ＭＳに罹患している個体における次の症状の発生を遅らせるか、またはＭＳに罹患している個体におけるＭＳ（進行期）の進行を遅らせるために使用してもよい。
【００３５】
別の態様において、本発明は、移植を受ける予定であるか、または移植を受けた個体における移植拒絶反応を予防および／または治療するための方法であって、治療的に有効な量のＭＴＡ、またはその医薬的に許容される塩および／もしくはプロドラッグの１つを前記個体に投与することを含んでなる方法に関する。ＭＴＡ、その医薬的に許容される塩および／またはプロドラッグを用いてその拒絶反応が予防または治療され得る移植の例については既に述べており（これらに限定されない）、投与、医薬組成物およびＭＴＡの治療的有効量に特徴を有するようなものである。前記医薬組成物は、移植の前もしくは後（即ち、予防または治療目的）に投与されてもよく、または、最初に拒絶反応の症状を呈さない場合であっても、移植の前および後（即ち、予防目的）に投与されてもよい。
【００３６】
本明細書において、「個体」という用語はあらゆる哺乳類を指し、これにはペット、齧歯類、霊長類およびヒトが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、前記個体は、あらゆる年齢または人種のオスまたはメスのヒトである。
【００３７】
本発明の特定の実施態様において、ＭＴＡの投与は、単独で、または他の療法もしくは他の薬物と組み合わせて併用療法の形態で行われる。
【００３８】
以下の実施例は本発明を例証するものであり、その範囲を制限するものと考えるべきではない。
【実施例】
【００３９】
１９７０年代以来、急性実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルは、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルであり、故に、急性ＥＡＥの効果的な治療がＭＳにとっても効果的であると確信されていた。しかし、急性ＥＡＥの治療には効果的であるが、ＭＳには効果的でない数百の化合物が試験された（Hohlfeld R. & Wekerle H. Proceeding Ｎational Academy of Sciences USA, October 2004, Vol. 101, Suppl. 2, page 14,599, heading: MS and EAE paragraph 3）。これを考慮すると、急性ＥＡＥの予防における有効性を証明することに加え、慢性−再発性ＥＡＥ（一般にはＭＳのモデル）の治癒における有効性を証明することが必要である。この点に関し、本実施例では、２種の非ヒト動物モデルを使用して、自己免疫疾患、具体的にはＭＳの治療におけるＭＴＡの有効性を証明した。具体的には、（ｉ）ＭＢＰで免疫されたＬｅｗｉｓラットにおける急性ＥＡＥ［ＭＳ発症のモデルおよび急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥ）のモデル］；および（ｉｉ）ＭＯＧで免疫されたダークアグーチ（ＤＡ）ラットにおける慢性−再発性ＥＡＥ（ＣＲ−ＥＡＥ）［ＭＳのモデル］である。
【００４０】
Ｉ．材料および方法
動物
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）での免疫により作製する急性ＥＡＥモデルには、６〜８週齢、１７５−２００グラムのＣｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒメスＬｅｗｉｓラットを使用した。
【００４１】
オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）での免疫により作製する慢性−再発性ＥＡＥモデルには、体重約２００グラムのダークアグーチ（ＤＡ）ラットを使用した。
【００４２】
動物を、自然光がある部屋のプラスチックかごに収容し、食物および水を毎日与えた。
【００４３】
ＥＡＥ誘発およびスコア
Ｌｅｗｉｓラットを、食塩水と、７５μｇのＭＢＰ（モルモットミエリン塩基性タンパク質（Sigma）の６８〜８２断片）を含むフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）とを等容量で含有し、かつ４ｍｇ／ｍｌのMycobacterium tuberculosis H37RA（Difco）を補充したエマルション１００μｌで免疫した。免疫は両後肢の基部に行った。
【００４４】
ＤＡラットを、食塩水と、７５μｇのｒＭＯＧ［Villoslada, P., et al., J. Exp Med, 2000. 191 (10):1799-806］（研究室内で精製）を含むフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）とを等容量で含有し、また４ｍｇ／ｍｌのMycobacterium tuberculosisが補充されたエマルション１００μｌで免疫した。Ｌｅｗｉｓラットの場合と同様、免疫は両後肢の基部に行った。
【００４５】
動物の体重を測定し、ＥＡＥの臨床症状を、治療盲検評価器によって毎日検査した。ＥＡＥの重篤度を、以下のスケールにより測定した：０＝正常；１＝尾が弛緩；２＝後肢が僅かに不全対麻痺、不安定な歩行；３＝対麻痺；４＝四肢不全麻痺；５＝死。
【００４６】
処置
ＭＢＰで免疫したＬｅｗｉｓラットを無作為に２群に分けた。一方の群は、投与量４．３ｍｇ／動物（２８．６μｇ／ｋｇ体重と等量）のＭＴＡ（１００μＭ濃度）で処置した。Division of Hepatology and Gene Therapy of the Department of Internal Medicine（CIMA, University of Navarra）のSchlenk F. et al., Arch. Biochem. Biophys., 1964, 106:95-100に記載された手順に従って、ＳＡＭ（Europharma（マドリッド（スペイン）））からＭＴＡを合成し、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再構成し、他方のプラセボ群は、免疫後、生理的血清および１０％ＤＭＳＯを毎日腹腔内注射（ｉ．ｐ．）して処置した。
【００４７】
また、ｒＭＯＧで免疫されたＤＡラットを無作為に２群に分け、その一方の群を、３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．８）中で再構成した１００μＭのＭＴＡで処置し、他方のプラセボ群は、３００ｍＭのＴｒｉｓのみで処置した。処置は、免疫後１５日目に開始し、腹腔内注射することにより毎日行った。疾病の全過程にわたって、スコアを盲検評価した。
【００４８】
組織試料
疾病１６日目に、２つのＬｅｗｉｓラット群に麻酔をかけ、０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中４％パラホルムアルデヒドを心臓内経路で注射した。脳ならびに頸髄、胸髄および腰髄切片を摘出し、４℃で一晩定着させた。定着させた後、組織をパラフィンに浸積させ、組織病理学的および免疫組織化学的試験を行った。
【００４９】
免疫後３５日目に、２つのＤＡラット群にも麻酔をかけ、同プロトコールに従って注射した。これらの組織も同様に処置し、組織病理学的および免疫組織化学的試験を行った。
【００５０】
また、脾臓、肝臓および血液試料を各動物から採取した。ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応）により試験を行うことができるように、脾臓および肝臓を液体窒素内で急速冷凍し、−８０℃で断片として保存した。血液を８００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって血清を取得し、これを−８０℃で保存した。
【００５１】
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
脾臓および肝臓組織切片を、手動ホモジナイザーを用いて２％β−メルカプトエタノールを含むＲＮＡ溶解緩衝液中で均質化した。製造業者の説明書に従い、Ｒｎｅａｓｙミニキット（Mini Kit）（Quiagen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ精製中、ＤＮａｓｅ処理によってＤＮＡを除去した。ＲＮＡ濃度および純度は、分光光度計（Eppendorf）を用いて、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって測定した。全ＲＮＡの逆転写は、大容量ｃＤＮＡアーカイブキット（High Capacity cDNA Archive Kit）（Applied Biosystems）を用いて行った。逆転写反応は、２５℃で１０分間、３７℃で２時間行い、最終的に４℃で保持した。
【００５２】
プライマーおよびプローブ設計
真核生物ｒＲＮＡ１８Ｓ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、組織壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）については、蛍光標識されたＴａｑｍａｎプライマー配列および特異的プローブを使用した（Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Taqman Gene Expression Assays））（Applied Biosystems）。
【００５３】
定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的ＰＣＲのために、ＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（TaqMan Universal Master Mix）（Applied Biosystems）を使用した。ｃＤＮＡ増幅は、オプティコン（Opticon）２リアルタイムシステム（MJ Research）の９６ウェルプレート（MJ Research, Inc.）上で行った。反応は、１×Ｔａｑｍａｎユニバーサルマスターミックス、１×ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイミックス（各プライマー０．９μＭおよびプローブ０．２５μＭ）、ならびにＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを含まない水に溶解したｃＤＮＡ２０ｎｇからなる２５μｌの最終反応ミックスで行われた。
【００５４】
反応条件は以下の通りであった：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、および９５℃で４０  １５秒サイクルおよび６０℃で１分間。各試料を三組用意し、各プレートでは、ブランクおよび内因性対照を異なるウェル上で増幅した。
【００５５】
ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０およびｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現レベルを、ｒＲＮＡ  １８Ｓ構成遺伝子に対する相対値として定量化した。
【００５６】
組織病理学、炎症および脱髄
パラフィンに含まれる脳および脊髄断片の組織病理学的評価を行った。組織の炎症および脱髄を評価することができるように、これらの断片をヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）およびルクソール（Luxol）ファストブルーで染色した。各ラットにつき、２４〜３０個の矢状断片を検査した。炎症および脱髄に関する半定量的な組織学的盲検評価を前述のように行った［Villoslada, P., et al., J. Exp Med, 2000. 191(10):1799-806］。
【００５７】
免疫組織化学
パラフィンに含まれる１０μｍの脳および髄質断片について、免疫組織化学的手順を行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中０．３％Ｈ２Ｏ２により２０分間不活性化した。
【００５８】
これらの断片を、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および１０％ヤギまたはウマ血清（Vector Laboratorios）を含むＰＢＳ中で３０分間、および０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０および一次抗体を含むＰＢＳ中で２時間、以下の希釈でインキュベートした：ウサギ抗グリア繊維性酸ポリクローナル抗タンパク質抗体（ＧＦＡＰ）、１：１０００（Dakocytomation）；ネズミβアミロイド前駆体抗タンパク質抗体（ＡＰＰ）、１：１００（Zymed Laboratorios）；ネズミ抗ＩｇＡ抗体（ＯＸ−６）、１：２００（Serotec）；ラット抗ＣＤ８抗体、１：２５０（Serotec）；タイプＩＩ抗ｉＮＯＳ抗体、１：２５０（Serotec）；ラット抗ＣＤ６８抗体（ＥＤ１）、１：２００（Serotec）およびラット抗ＣＤ４３抗体（Ｗ３／１３）、１：５０（Serotec）。続いて、断片をＰＢＳで洗浄し、適切なビオチン化ＩｇＧ二次抗体とともに４５分間室温でインキュベートし（ＰＢＳ中１：１００；Vector Laboratorios）、その後ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中で数回洗浄し、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；Vector Laboratorios）とともに４５分間室温でインキュベートした。
【００５９】
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）中での洗浄後、０．５ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロレート（ＤＡＢ；Sigma）を用いて、免疫活性を明らかにした。一次抗体を使用せずに断片をインキュベートすることによって免疫応答特異性を測定した。光学顕微鏡を用いて画像を取得した。
【００６０】
リンパ球増殖アッセイ
ＥＡＥに罹患しているラットおよび非免疫ラットから開始し、フィコール・ハイパック（Ficoll Hypaque）密度遠心分離法を用いて脾細胞を精製した。リンパ球増殖アッセイを文献の記載と同様に行った［Villoslada, P., et al., J. Exp Med, 2000. 191 (10):1799-806］。
【００６１】
簡潔に言えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）、ＭＢＰ（１０μｇ／ｍｌ）、ＭＴＡ（１００μＭ）およびＤＭＳＯの存在下または不存在下で、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地内において、２ｘ１０６／ｍｌの濃度にて脾細胞を培養に付した。培養物を９６ウェル丸型ベースプレート（０．２ｍｌ／ウェル）において３７℃で５日間インキュベートした。ウェルには、０．５μＣｉの［３Ｈ］ＴｄＲを１８時間かけて供給（struck）した。液体シンチレーションカウンターを用いて読み取りを行った。結果は、３組の測定の平均刺激指数として表した。
【００６２】
統計的分析
マンホイットニー両側検定および生存曲線を用いて統計的比較を行った。ｐ＜０．０５値は有意差であると考えられている。ＳＰＳＳ１１．０統計プログラムを用いて統計的評価を行った。
【００６３】
ＩＩ．結果
ＭＢＰで免疫されたＬｅｗｉｓラットにおけるＭＳ発症モデル（急性ＥＡＥ）の発現に対するＭＴＡの効果
免疫と同日に開始し、Ｌｅｗｉｓラットを、ＭＴＡで処置する群またはプラセボ群に無作為に割り当て、両群には腹腔内投与を毎日施した。一匹を除き、プラセボ処置を受けた動物は全て、進行性の体重減少、尾の力の欠如、および後肢麻痺または中程度もしくは重篤な対麻痺からなるＥＡＥの神経症状を発現した。最初の神経症状は１２日目に認められ、平均疾病発症日数は１３．６±１．２（ｎ＝２１）であった。実験過程にわたって個々の動物により達成された最大スコアは、１．４８±１であった（表１）。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
対照的に、ＭＴＡで処置した動物は、疾病の過程にわたって、いかなる臨床徴候も呈さず、また強い衰弱も示さなかった。臨床症状を発現した処置動物において、疾病の発症は、プラセボ群と比較すると遅延していた（１５±１．２日）。観察された最大臨床スコアは、プラセボ群のスコアよりも著しく低かった（０．１４±０．２３）（表１）（図１）。
【００６６】
ＭＯＧで免疫されたＤＡラットにおけるＭＳモデル（ＣＲ−ＥＡＥ）の発現に対するＭＴＡの効果
最初の症状を体験した後［最初の症状の発生から５日目（免疫からおよそ１５〜１８日後）]、ＤＡラットを、ＭＴＡで処置する群またはプラセボ群に無作為に割り当て、いずれの群にも腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を毎日行った。全ての動物は二回目の疾病症状を発現したが、神経症状、二回目の症状の重篤度および生存率に関して両群は大きく異なっていた。ＭＴＡで処置した動物において、二回目の症状の発生は、プラセボ群と比較して遅延していた（２３．４±６．５４日）が、差異は顕著ではなかった。観察された最大臨床スコアは、プラセボ群のスコアよりも低かった（２．７±１．７５）（表２）（図２）。更に、生存率は、ＭＴＡで処置した群の方が著しく高かった（図３）。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
ＭＴＡはリンパ球増殖を阻害する
ＭＴＡでの処置により、免疫で使用される抗原に対する末梢免疫系反応が調節されるかどうかを究明するために、ＭＴＡおよびプラセボで処置した動物の脾細胞において（Ｌｅｗｉｓラットにおいて）、ＭＢＰ誘発型増殖反応を測定した。ＭＢＰ特異的増殖反応は、図４に見られるように、ＭＴＡで処置した動物におけるよりもかなり低かった。故に、ＭＴＡで処置した群の刺激指数は１．１８±０．４であり、プラセボ群の刺激指数は２．１３±１．０９であった。これは、Ｔ細胞反応が、ＭＴＡでの処置によって影響を受けることを示している。故に、ＭＴＡがＭＢＰ特異的リンパ球活性化を阻害することが観察され、このことは、ＭＴＡが免疫調節効果を有することを示している。
【００６９】
ＭＴＡはサイトカインおよび前炎症性メディエータの発現を調節する
ＭＴＡがサイトカインおよび他の前炎症性メディエータの発現を調節する能力を有しているかどうかを判断した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０およびｉＮＯＳ遺伝子発現を、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。プラセボＬｅｗｉｓラットおよびＭＴＡで処置したラットから得られた脾細胞のこれら単離遺伝子の相対的なｍＲＮＡレベルを図５に示す。前記サイトカインのｍＲＮＡ発現は、プラセボ群の動物と比較して低かったが、ＴＮＦレベルのみが大きく異なっていた。
【００７０】
組織学的分析
神経病理学的評価により、観察された臨床的保護が確認された。プラセボ動物の脊髄および脳の検査では、多数の炎症病巣が示された。頸髄、胸髄および腰髄ならびに脳の白質および灰白質のいずれにおいても炎症性病変が認められた。ＭＴＡで処置したラットでは、炎症性浸潤物の数および大きさがいずれも小さいことが判明した（図６）。重篤度および中枢神経系（ＣＮＳ）の罹患領域に関してはいずれも、プラセボ動物と、ＭＴＡで処置した動物との間には大きな差異があった。ＭＴＡでの処置は、ＭＢＰで免疫されたＬｅｗｉｓラットにおける炎症性ＥＡＥの発現を阻害する。免疫組織化学染色により、炎症性浸潤物には、マクロファージおよび活性化小グリア細胞（ＥＤ１）、Ｔリンパ球（Ｗ３／１３）およびＢリンパ球（ＯＸ−６）などの数種の細胞タイプが存在することが明らかになった。陽性ＥＤ１およびＷ３／１３細胞の数はプラセボ群の方が大きかったが、両動物群とも陽性ＯＸ−６細胞については同じ比率を示した。ＡＰＰおよびｉＮＯＳについての染色は、両群とも非常に低い検出レベルであることが判明した。
【００７１】
ＩＩＩ．考察
ＥＡＥは、Ｔ細胞活性化に臨床的に依存する自己免疫モデルである。ＭＢＰまたはＭＯＧ特異的ＣＤ４＋細胞、すなわち２つのＣＮＳ自己抗原はＥＡＥを誘発し得る。リンパ球活性化は、最初にＣＮＳへ入るために必要である。ＣＤ４＋Ｔ細胞による抗原認識には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が必要である。通常の条件下では、ＣＮＳにおけるこれら分子の発現は非常に低い。小グリア細胞や星状細胞などのＣＮＳ内に存在する抗原提示細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に対する強力な刺激剤であるＩＦＮ−γの分泌により、Ｔｈ１細胞はミエリンを認識する。故に、Ｔリンパ球活性化に干渉する治療は、ＥＡＥなどの自己免疫疾患の発現を阻害するものであり得る。
【００７２】
ＭＢＰで免疫し、かつＭＴＡで処置したＬｅｗｉｓラットにおけるＭＢＰ特異的増殖反応の減少は、メチル化がリンパ球活性化における重要な工程であることを示している。ＭＢＰに対する反応性Ｔ細胞の選択的阻害は、自己反応性リンパ球の活性化、ならびにサイトカインおよび／またはケモカイン産生を通じて、炎症性細胞のＣＮＳへの進入を阻止する。この結果として、ＥＡＥ臨床スケールおよびＭＴＡで処置した動物の組織学的分析において見られるように、疾病の重篤度が低下する。ＭＴＡで処置した群における累積ＥＡＥスケールはプラセボ群よりも著しく低く、組織学的分析は、炎症性病変の数がかなり低減されることを示している。
【００７３】
ＬｅｗｉｓラットでのＥＡＥ予防の際に観察される自己免疫発現に対するＭＴＡの予防的効果に加え、ＭＴＡが慢性的な自己免疫に対する治癒効果も有することが観察されている。ＭＯＧで免疫したＤＡラットを用いたＥＡＥモデルにおいて検証したように、ＭＴＡでの処置により、疾病が既に始まってから（最初の発症後）の臨床症状および生存率が改善された。発症前マーカーがないために現時点では予防的治療を行うことは不可能であるが、実際には疾病が既に始まってから免疫調節治療を行い得るため、この点は医療において非常に重要である。
【００７４】
Ｔ細胞により産生されたサイトカインは、疾病の過程に大きな影響を与え得る。図５に見られるように、ＭＴＡで処置したラットでは、サイトカインの発現レベルがより低いことが判明した。ＥＡＥの特徴の１つは、様々なタイプの細胞におけるｉＮＯＳ発現の活性化である。本発明者らは、ｉＮＯＳ発現が、ＭＴＡで処置したラットの脾臓においてより低いことを観察した。ＴＮＦは、全身性炎症における主要メディエータとして認識され、更にｉＮＯＳ遺伝子発現の活性化に寄与するサイトカインである。このＥＡＥモデル（ＣＲ−ＥＡＥ）では、ＭＴＡがＴＮＦ−αレベルをも低下させることが観察された。ＩＬ−２は、Ｔ細胞の増殖因子として強力な活性を有するために、Ｔ依存性免疫応答における重要なサイトカインである。観察結果によれば、ＭＴＡは特異的Ｔ細胞活性化を阻害することによってリンパ球ＩＬ−２の産生を低下させる。更に、この分子は、ＩＦＮ−γの産生を低下させることもできる。これらのＭＴＡ効果は全て、サイトカインのバランスをより抗炎症性のプロファイルへと改変できることを示している。
【００７５】
結論として、行われた研究により、ＭＴＡが、ＭＢＰで免疫されたＬｅｗｉｓラットにおけるＥＡＥモデル（急性ＥＡＥ）での自己免疫を阻止し、ｒＭＯＧで免疫されたＤＡラットの慢性ＥＡＥモデル（ＣＲ−ＥＡＥ）における疾病を改変して改善する、即ち、それに対する治療効果を発揮することが証明された。これらの保護効果に関与する機構はＭＢＰまたはＭＯＧ特異的Ｔ細胞活性化の阻害であるが、他の調節経路が保護に関与していてもよい。これらの知見は、合成しやすく、効果的であり、かつ副次作用が少ない薬物を使用することによって、自己免疫疾患および移植拒絶反応の新規な潜在的治療への道を開き、これは、これらの疾患を治療する上での著しい進歩となる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、モルモットＭＢＰ６８−８２で免疫されたＬｅｗｉｓラットにおけるＥＡＥの誘発を示すグラフである。日平均臨床スコア＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．は、ラットの各群について示されており、（＊）は、ＭＴＡでの治療と比較したときの、ｐ＜０．０５での統計学的な有意差を意味し、（＊＊）は、ＭＴＡでの治療と比較したときの、ｐ＜０．００５での統計学的な有意差を意味する。データは３つの個別実験から収集している。
【図２】図２は、ｒＭＯＧで免疫されたＤＡラットにおける慢性−再発性ＥＡＥの誘発を示すグラフである。日平均臨床スコア＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．は、ラットの各群について示されており、（＊）は、ＭＴＡでの治療と比較したときの、ｐ＜０．００５での統計学的な有意差を意味する。
【図３】図３は、ＭＯＧで免疫されたＤＡラットが中程度の不能(disability)（スコア＝３．５）に到達するまでの該ラットに関する生存曲線（ブレスロー検定によりｐ＜０．００１）［図３Ａ]、およびＭＯＧで免疫されたＤＡラットが死（スコア＝５）に到達するまでの該ラットに関する生存曲線（ブレスロー検定によりｐ＝０．０２）［図３Ｂ］を示すグラフである。
【図４】図４は、免疫後１６日目にＭＢＰで免疫したＬｅｗｉｓラットにおけるＭＢＰ特異的Ｔリンパ球応答を示す棒グラフである。結果は、平均刺激指数として表されており、（＊）は、プラセボでの治療と比較したときの、ｐ＜０．０５での統計学的な有意差を意味する。
【図５】図５は、ＥＡＥに罹患しているラットの脾細胞でのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−１０およびｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現パターンを示す棒グラフである。データは、１８Ｓ  ｒＲＮＡ構成遺伝子のレベルに対する相対値として表されており、（＊）は、ＭＴＡでの治療と比較したときの、ｐ＜０．０５での有意差を意味する。
【図６】図６は、炎症性かつ脱髄性病変の組織学的スコアを示す棒グラフであり、（＊）は、ＭＴＡと比較したときの、ｐ＜０．０５での統計学的な有意差を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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