(57)【要約】  ヒト化抗ＴＧＦ-β抗体、並びにそれらの調整方法及び使用方法、例えば癌などのＴＧＦ-β疾患の治療方法を提供する。また、ヒト化抗体を含有する多様な使用を意図する製造品を提供する。
2008505610.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含むＶＨドメインを含んでなり、該可変ドメインがKabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)による番号付けに従った配列番号６の４８、４９、６７、６９、７１、７３及び７８からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する、ＴＧＦ-βに結合するヒト化抗体。
【請求項２】
位置４９、６７及び７１にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６７のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化される、請求項２に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
位置４８、４９及び７１にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
位置４８のバリンがイソロイシンに変化され、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化される、請求項４に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
位置４９、６９及び７１にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６９のイソロイシンがロイシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化される、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
付加的なＦＲ置換が位置７３にある、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
位置７３のアスパラギンがリシンに変化される、請求項８に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
位置４９、７１及び７３にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化され、位置７３のアスパラギンがリシンに変化される、請求項１０に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
位置４９、７１及び７８にＦＲ置換を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化され、位置７８のロイシンがアラニンに変化される、請求項１２に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：３６）又はＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：３７）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：３８）又はＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：３９）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：４０）を含んでなる、請求項１ないし１３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１５】
可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：３６）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：３８）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：４０）を含んでなる、請求項１ないし１４の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１６】
配列番号：３のＶＬドメインアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし１５の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１７】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなる、請求項１ないし１６の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４２）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなる、請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項１９】
ＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなる、請求項１ないし１７の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
配列番号：４のＶＨドメインアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし３又は１４ないし１８の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
完全なＩｇＧ１抗体である、請求項１ないし２０の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
抗体断片である、請求項１ないし２０の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
Ｆａｂ断片である、請求項２２に記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
細胞障害性剤と接合されていない、請求項１ないし２３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２５】
細胞障害性剤と接合される、請求項１ないし２３の何れか一に記載のヒト化抗体。
【請求項２６】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体と担体を含んでなる組成物。
【請求項２７】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項３０】
核酸が発現されて抗体が産生されるように、請求項２９に記載の宿主細胞を培養することを含んでなるヒト化抗体の産生方法。
【請求項３１】
さらに宿主細胞培養物から抗体を回収することを含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗体が宿主細胞培養液から回収される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
培養する前に、可変重鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターと、可変軽鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターとが宿主細胞に同時形質移入される、請求項３０ないし３２の何れか一に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物のＴＧＦ-β疾患の治療方法。
【請求項３５】
哺乳動物が霊長類である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物がヒトである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
疾患が線維形成、動脈損傷、感染、関節リウマチ又は癌である、請求項３４ないし３６の何れか一に記載の方法。
【請求項３８】
癌が大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌又は悪性黒色腫である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、有効量のヒト化抗体以外の治療的薬剤を哺乳動物に投与することを含む、請求項３４ないし３８の何れか一に記載の方法。
【請求項４０】
治療的薬剤が化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害性剤、抗血管形成剤又は抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
治療的薬剤が抗血管形成剤である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
治療的薬剤が抗体である、請求項３９ないし４１の何れか一に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が血管内皮性成長因子と結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
抗体がＨｅｒ-２抗原と結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
抗体が完全な抗体である、請求項４２ないし４４の何れか一に記載の方法。
【請求項４６】
抗体が抗体断片である、請求項４２ないし４４の何れか一に記載の方法。
【請求項４７】
抗体断片がＦａｂ断片である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が細胞障害性剤と接合される、請求項４２ないし４７の何れか一に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が細胞障害性剤と接合されていない、請求項４２ないし４７の何れか一に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体を生体試料と接触することと、ＴＧＦ-βへの抗体結合が起こっているかどうかを検出することとを含む、生体試料中のＴＧＦ-βを検出する方法。
【請求項５１】
請求項１ないし２５の何れか一に記載のヒト化抗体を含有している容器と、有効量の抗体で哺乳動物のＴＧＦ-β疾患を治療することを使用者に示す指示書とを含んでなる製造品。
【請求項５２】
さらに、ヒト化抗体以外の治療的薬剤を含有している容器を含んでなり、該指示書が有効量の薬剤と抗体とを組み合わせて疾患を治療することを使用者に示す、請求項５１に記載の製造品。
【請求項５３】
哺乳動物がヒトである、請求項５１又は５２の製造品。
【請求項５４】
有効量のＴＧＦ-β抗体と血管内皮性成長因子と結合する抗体とを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の癌の治療方法。
【請求項５５】
哺乳動物がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＴＧＦ-β抗体が以下の一又は一以上と結合する請求項５４又は５５の方法：
ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３。
【請求項５７】
抗体がＴＧＦ-β１と結合する、請求項５４ないし５６の何れか一に記載の方法。
【請求項５８】
抗体がＴＧＦ-β１とＴＧＦ-β２の両方と結合する、請求項５４ないし５７の何れか一に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法１１９条の下に、２００４年３月３１日出願の米国仮出願第６０／５５８，２９０号の優先権を主張し、この仮出願全体を出典明記により本明細書に包含する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヒト化抗ＴＧＦ-β抗体、及びその調整方法及びＴＧＦ-β関連疾患の治療方法におけるその使用に関する。例えば、本願の抗体は免疫親和性精製、免疫アッセイ、インビボ撮像、放射性レセプターアッセイ、及びＴＧＦ-β活性、特にＴＧＦ-β１活性に拮抗することを目的とする処置に有用である。
【０００３】
（発明の背景）
トランスフォーミング成長因子-β（ＴＧＦ-β）は、当初、正常な線維芽細胞を足場依存性の成長が可能な細胞に転化する能力に由来して称された多機能サイトカインである。造血性細胞及び腫瘍細胞によって主に生産されるＴＧＦ-βは様々な正常組織起源及び腫瘍性組織起源(Sporn等, Science, 233: 532 (1986))の細胞の成長及び分化を調節、すなわち亢進又は阻害することができ、様々な間質性因子の形成及び合成を刺激しうる。ＴＧＦ-β及びその機能の概説については、Sporn等, J. Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987)及びSpornとRoberts, Nature, 332: 217-219 (1988)を参照。
それらは、多くの増殖的及び非増殖的な細胞過程、例えば細胞増殖や分化、胚発生、細胞外基質形成、骨発達、創傷治癒、造血、及び免疫や炎症性の応答に関与することが知られている。Pircher等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986)；Wakefield等, Growth Factors, 1: 203-218 (1989)；Roberts及びSporn, 419-472頁, Handbook of Experimental Pharmacology M.B. Sporn & A.B. Roberts編集 (Springer, Heidelberg, 1990)；Massague等, Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990)；Singer及びClark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999)。また、ＴＧＦ-βは腸粘膜の疾患の治療及び予防にも用いられる。国際公報２００１／２４８１３。
【０００４】
免疫学的視点から特に興味があることはＴＧＦ-βの強力な免疫抑制活性であり、それはリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)及び細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)抑制(Ranges等, J. Exp. Med., 166: 991 (1987)、Espevik等, J. Immunol., 140: 2312 (1988)、Grimm等, Cancer Immunol. Immunother., 27: 53 (1988)、Kasid等, J. Immunol., 141: 690 (1988)、Mule等, Cancer Immunol. Immunother., 26: 95 (1988))、κ軽鎖発現及びＢ細胞リンパ生成の抑制 (Lee等, J. Exp. Med., 166: 1290 (1987))、造血のネガティブ制御(Hino等, Br. J. Haematol., 70: 143 (1988)、Sing等, Blood, 72: 1504 (1988))、腫瘍細胞におけるHLA-DR発現の下方制御(Czarnieck等, J. Immunol., 140: 4217 (1988)、Zuber等, Eur. J. Immunol., 18: 1623 (1988))、及びＢ細胞成長因子に応答した抗原活性化Ｂリンパ球の増殖の抑制(Petit-Koskas 等, Eur. J. Immunol., 18: 111 (1988))を引き起こす。多くのヒト腫瘍(deMartin等, EMBO J., 6: 3673 (1987)、Kuppner等, Int. J. Cancer, 42: 562 (1988))や多くの腫瘍細胞株(Derynck等, Cancer Res., 47: 707 (1987)、Roberts等, Br. J. Cancer, 57: 594 (1988))がＴＧＦ-βを産生するという所見は、これらの腫瘍が正常な免疫学的監視機構を回避しうるメカニズムを示唆している。特定の形質転換細胞系が自己分泌様式でＴＧＦ-βに応答する能力を失っていること(Wakefield等, J. Cell Biol., 105: 965 (1987)、McMahon等, Cancer Re., 46: 4665 (1986))、及びＴＧＦ-βが間質形成を促進して腫瘍の免疫監視機構を減退させるという所見と併せてこのネガティブ免疫修飾は、新生物制御緩和及び増殖の魅力的なモデルと言える(上掲のRoberts等, Br. J. Cancer)。
【０００５】
さらに、米国特許第５,８２４,２９７号及び同第５,２６２,３１９号は、正常細胞にＴＧＦ-β３などのＴＧＦ-βを投与することによる正常細胞の細胞障害性中毒を阻害する方法を開示している。
現在同定されたＴＧＦ-βには少なくとも５つの型、ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４及びＴＧＦ-β５がある。様々な種、例えば、ヒト、マウス、ミドリザル、ブタ、ウシ、ひな及びカエル、及び様々な身体供給源、例えば骨、血小板又は胎盤からＴＧＦ-βのファミリーを精製する好適な方法、組換え細胞培養物内でそれを産生する好適な方法、及びその活性を検出する好適な方法が公知である。例として、Derynck等, Nature, 316: 701-705 (1985)；１９８６年１２月１０日出願の欧州特許公開番号２００，３４１、１９８６年１月２２日出願の欧州特許公開番号１６９,０１６、１９８８年５月２５日出願の欧州特許公開番号２６８,５６１及び１９８８年５月１８日出願の欧州特許公開番号２６７,４６３；米国特許第４,７７４,３２２号；Cheifetz等, Cell, 48: 409-415 (1987)；Jakowlew等, Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988)；Dijke等, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 4715-4719 (1988)；Derynck等, J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986)；Sharples等, DNA, 6: 239-244 (1987)；Derynck等, Nucl. Acids. Res., 15: 3188-3189 (1987)；Derynck等, Nucl. Acids. Res., 15: 3187 (1987)；Derynck等, EMBO J., 7: 3737-3743 (1988))；Seyedin等, J. Biol. Chem., 261: 5693-5695 (1986)；Madisen等, DNA, 7: 1-8 (1988)；及びHanks等, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 79-82 (1988)を参照し、これら文献の内容全体は出典明記により特別に組み込まれる。
【０００６】
ＴＧＦ-β１の活性型は、３９０-アミノ酸前駆体のカルボキシ末端の１１２アミノ酸の二量体化によって形成されるホモ二量体である(上掲のDerynck等, Nature)。ＴＧＦ-β２は、４１４アミノ酸の前駆体型を有しており、ＴＧＦ-β１の活性型とおよそ７０％の相同性を有するカルボキシ末端の１１２アミノ酸からホモ二量体に処理される(Marquardt等, J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987))。ＴＧＦ-β２は、ブタの血小板(Seyedin等, J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 (1987))及びヒト神経膠芽腫細胞(Wrann等, EMBO J., 6: 1633 (1987))から精製され、組換えヒトＴＧＦ-β２はクローニングされた(上掲のdeMartin等)。組換えＴＧＦ-β１はクローニングされ(上掲のDerynck等, Nature)、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現された(Gentry等, Mol. Cell. Biol., 7: 3418-3427 (1987))。現在ではＴＧＦ-β１及び２とそれぞれ認識されているＣＩＦ-Ａ及びＣＩＦ-Ｂに関する米国特許第４,７７４,３２２号；同第４,８４３,０６３号；及び同第４,８４８,０６３号を参照。Ellingsworth等, J. Biol. Chem., 261: 12362-12367 (1986)。２つの型（ＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２）の初めの３６アミノ酸残基に１４のアミノ酸の相違がある場合でも、それらの生物学的活性度は類似である。Cheifetz等, Cell, 48: 409-415 (1987)；Seyedin等, J. Biol. Chem., 262:上掲。
【０００７】
最も近年に発見されたＴＧＦ-βの型であるＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４及びＴＧＦ-β５は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングによって同定された。これらの３つの推定タンパク質のいずれもが天然の供与源から単離されたものでなかったが、ノーザンブロットにより対応するｍＲＮＡの発現が示された。ヒト及びブタのＴＧＦ-β３はクローニングされて、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現され、ホモ二量体として解説されている(Derynck等, EMBO J., 7: 3737-3743 (1988)、ten Dijke等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988)；米国特許第４,８８６,７４７号)。ＴＧＦ-β３タンパク質及びその抗体に関しては国際公報１９９２／００３１８を参照。ＴＧＦ-β１は、２７の主要保存的変化によってＴＧＦ-β２と、そして、２２の主要保存的変化によってＴＧＦ-β３と異なる。これらの相違は三次元構造に関連があった。Schlunegger及びGrutter, Nature, 358: 430-434 (1992)。
ＴＧＦ-β４及びＴＧＦ-β５はそれぞれ、ニワトリ軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリ(Jakowlew等, Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988))及びカエル卵母細胞ｃＤＮＡライブラリからクローニングした。カエル卵母細胞ｃＤＮＡライブラリは、他のタイプのＴＧＦ-βの一以上の配列から得られるプローブを用いてスクリーニングすることができる。ＴＧＦ-β４ ｍＲＮＡは、ニワトリ胚軟骨細胞において検出可能であるが、発生胚又はニワトリ胚線維芽細胞のＴＧＦ-β３ ｍＲＮＡよりはるかに少ない。ＴＧＦ-β５ ｍＲＮＡは、神経胚状態を越えたカエル胚及びアフリカツメガエルオタマジャクシ（ＸＴＣ）細胞において発現される。
【０００８】
ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３の組換え産生は、米国特許第５,０６１,７８６号；同第５,２６８,４５５号及び同第５,８０１,２３１号において記述される。また、ホルモンの影響を受けて応答する上皮癌を治療するためと、抗体産生のために用いられるＴＧＦ-β２については米国特許第５,１２０,５３５号を参照。ＴＧＦ-β１．２と称するＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２のヘテロ二量体が同定され、その使用については、米国特許第４,９３１,５４８号及び同第５,３０４,５４１号に開示されている通りである。また、後者はその抗体について開示している。１９８９年７月２０日出願の国際公報１９９０／００９００は、ホモ二量体のＴＧＦ-β１とβ２、及びヘテロ二量体のＴＧＦ-β１．２を用いた炎症性疾患の治療を開示している。米国特許第５,４６２,９２５号は、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３のヘテロ二量体を開示している。米国特許第５,７８０,４３６号は、ＴＧＦ-βの小さなペプチド模倣体を開示している。
ＴＧＦ-β活性レベルの増加は、限定されるものではないが、以下のような多数の病理学的条件に関与される：(i)創傷治癒の間の線維形成、瘢痕化及び粘着力；(ii)肺、肝臓及び腎臓の線維形成疾患；(iii)アテローム性動脈硬化及び動脈硬化症；(iv)特定のタイプの癌、例えば前立腺癌、消化系の神経内分泌腫瘍、頸部癌、神経膠芽腫及び胃癌；(v)血管障害、脈管障害、ネフロパシ；(vi)全身性硬化症；(vii)ウィルス感染、例えばＣ型肝炎及びＨＩＶ；及び(viii)免疫学的及び炎症性疾患及び欠乏症、例えば関節リウマチ。ＴＧＦ-βによる免疫応答及び炎症性応答の調整は、以下を含む：(i)全てのＴ細胞サブセット増殖の阻害；(ii)Ｂリンパ球の増殖及び機能に対する抑制効果；(iii)ナチュラルキラー細胞活性及びＴ細胞応答の下方制御；(iv)免疫細胞によるサイトカイン産生の制御；(v)マクロファージ機能の制御；及び(vi)白血球漸増及び活性化。
【０００９】
具体的に癌に関しては、ＴＧＦ-βファミリのメンバーは、腫瘍形成（血管新生を含む）及び転移に関連した多くの生物学的活性を有することが知られている。ＴＧＦ-βは、毛細管内皮細胞及び平滑筋細胞を含む多くの細胞型の増殖を阻害する。ＴＧＦ-βは、インテグリン発現を下方制御する（内皮細胞移動に関与するα１β１、α２β１及びαｖβ３）。インテグリンは、転移のものを含む全ての細胞の移動に関与する。ＴＧＦ-βは、血管新生及び転移に必要な基質メタロプロテイナーゼ発現を下方制御する。ＴＧＦ-βはプラスミノーゲン活性化因子インヒビターを誘発し、血管新生及び転移に必要なプロテイナーゼカスケードを阻害する。ＴＧＦ-βは悪性変換細胞を阻害するために正常細胞を誘発する。例としてYingling等, Nature Reviews, 3 (12): 1011-1022 (2004)を参照。これにはＴＧＦ-βの調整緩和が様々な疾患、例えば癌及び線維形成の病理発生に関係したことを示唆し、癌治療、バイオマーカ／診断法、発達にある小分子インヒビターの構造及びそれらの発達に応用される標的の薬剤発見モデルとしてＴＧＦ-βシグナル伝達インヒビターを評価するために正当性がある。癌の早期発見は非常に重要であり(Ruth等, Nature Reviews Cancer, 3: 243-252 (2003))、癌転移の病理発生が研究されている。Fidler, Nature Reviews Cancer, 3: 453-458 (2003)。
【００１０】
ＴＧＦ-βは、内皮細胞増殖、移動、細胞外基質（ＥＣＭ）代謝および接着分子の発現を制御することによる血管新生の主要モジュレータであることが明らかとなった。正常な乳房上皮細胞及び多くの乳癌細胞株の強力な成長抑制物質である。ＴＧＦ-βはここでは乳癌の腫瘍形成に多面的効果を及ぼすようであり、すなわち、それは血管新生及び腫瘍細胞成長の直接の阻害によって初期に腫瘍形成を抑制する。しかしながら、進行した腫瘍によるＴＧＦβの過剰生産により、免疫抑制及び血管新生の間接的な刺激を介して疾患の進行が促進されうる。細胞膜抗原ＣＤ105（エンドグリン）はＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を結合して、血管形成血管内皮細胞に優先して発現される。ＨＵＶＥＣのＣＤ105レベルの減退により、ＴＧＦ-β１存在下でインビトロ血管新生阻害及び細胞死亡率の増加に至る。ＣＤ105ヌルマウスは障害のある血管構造のために子宮内で死亡する。これは血管発達におけるＣＤ105の重要な役割を示す。Li等, Microsc. Res. Tech., 52:437-449 (2001)。完全な造血能力以外の異常な血管新生は、ＴＧＦβタイプＩレセプタ欠損マウスにおいて観察された。Larsson等, EMBO J., 20 (7): 1663-1673 (2001)。さらに、ＴＧＦ-βレセプタータイプＩＩ欠乏により卵黄嚢造血及び脈管形成が欠損した。Oshima等, Developmental Biology, 179 (1): 297-302 (1996)。また、心臓と肝臓の欠損及びトランスフォーミング成長因子β２感受性の減退が、ＴＧＦβタイプＩＩＩレセプター欠損胚において観察された。Stenvers等, Mol. Cell. Biol., 23 (12): 4371-4385 (2003)。さらに、マウスＴＧＦ-β１遺伝子を標的として破壊すると多病巣性炎症性疾患となる。Shull等., Nature, 359 (6397): 693-699 (1992)。ＴＧＦ-β１-ヌルマウスの早期発症多病巣性炎症は、リンパ球媒介性であることが明らかとなった。Diebold等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 92 (26): 12215-12219 (1995)。
【００１１】
ＴＧＦ-βの最も重要な非増殖性機能は、細胞外基質の形成を亢進する際にある。これは主として、コラーゲンとフィブロネクチンの両方の転写の増加によって達成されるが、プロテアーゼの基質分解の阻害もその安定性に寄与している。細胞外基質の分解は、プロテアーゼ自体の分泌の減少及びプロテアーゼインヒビターレベルの同時増加によって阻害される。
国際公報１９８４／００１１０６は、ＴＧＦ-β１及び細胞増殖の促進及び組織修復、、創傷治癒及び外傷の治療への用途を開示している。米国特許第４,８０６,５２３号は、ＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２が抗炎症作用を有し、分裂促進因子刺激性Ｔ細胞増殖及びＢ細胞活性化のインヒビターであることを開示している。また、ＴＧＦ-βが造血及びリンパ生成の中心であること、それゆえにＴＧＦ-βは造血又はリンパ生成の不調又は機能不全に関連する徴候を治療するために有用であり得ることが報告されている。
【００１２】
ＴＧＦ-β２は、神経網膜、網膜色素上皮絨毛膜様、及びヒト眼の硝子体(Pfeffer等, Exp. Eye Res., 59: 323-333 (1994))内の優性イソ型ＴＧＦ-βであることが示され、眼内レンズ移植を有する白内障摘出歴のある眼の検査材料のヒト水溶性体液において検出された。Jampel等, Current Eye Research, 9: 963-969 (1990)。非形質転換ヒト網膜色素上皮細胞は主にＴＧＦ-β２を分泌する。Kvanta, Ophthalmic Res., 26: 361-367 (1994)。
ＴＧＦ-βに対する抗体を用いて治療しうる他の疾患には、成人呼吸窮迫症候群、肝硬変、心筋梗塞後、血管形成再狭窄後、ケロイド瘢痕、及び強皮症が含まれる。骨粗鬆症におけるＴＧＦ-β２の発現レベルの上昇は(Erlenbacher等 J. Cell Biol., 132: 195-210 (1996))、ＴＧＦ-β２に対する抗体によって潜在的に治療できる疾患であることを意味する。
多数の深刻な病的状態にＴＧＦ-βが関与していることから、ＴＧＦ-βのインヒビターを発達させることがとても注目されている。ＴＧＦ-βインヒビターの提案の多くは抗体を伴っていた。
【００１３】
同じ種のＴＧＦ-βに特異的な抗体断片を単離するのは労力を要する作業である。動物は自己抗原に対する抗体、つまり耐性と称する現象を通常生産しない(Nossal, Science, 245: 147-153 (1989)。一般に、自己抗原による予防接種により循環抗体は産生されない。したがってヒト自己抗原に対するヒト抗体を上昇させることは難しい。加えて、ヒトに予防接種する際の倫理的問題もある。ＴＧＦ-βに特異的な非ヒト抗体の上昇に関して、多くの問題がある。ＴＧＦ-βは免疫抑制分子であり、更に、ヒト及びマウスのＴＧＦ-β分子間には強い配列保存性がある。マウス及びヒトのＴＧＦ-β１は、１のアミノ酸残基が異なるのみである。それは埋設された残基のアラニン（ヒト）とセリン（マウス）変化である。Derynck等, J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986)。マウス及びヒトのＴＧＦ-β２は３つの残基が異なるだけである；残基５９（Ｔマウス、Ｓヒト）；残基６０（Ｋマウス、Ｒヒト）及び残基９４（Ｎマウス；Ｋヒト）。これはヒトＴＧＦ-βに対する抗体をマウスにおいて上昇させることを難しくしている。さらに、エピトープの制限された一群に対してのみ任意の抗体が上昇しうる。
ＴＧＦ-βに対するモノクローナル抗体は、ニワトリを免疫化して、Ｂ細胞を不死化することによって産生し、例えば米国特許第６,１４３,５５９号にて説明したように、疾患の診断及び受動的な治療に用いられた。
【００１４】
中和性及び非中和性の両方のエピトープに対するヒトＴＧＦ-β１及びヒトＴＧＦ-β２に結合するポリクローナル抗体は、ウサギ(Danielpour等, Growth Factors, 2: 61-71 (1989)；Roberts等 Growth Factors, 3: 277-286 (1990))、ニワトリ(R&D Systems, Minneapolis)及び七面鳥(Danielpour等, J. Cell Physiol., 138: 79-86 (1989)；Danielpour及びSporn, J. Cell Biochem., 13B: 84 (1989))において上昇した。
また、一部又は完全なＴＧＦ-β配列を表すペプチドを免疫源として用いて、ウサギのポリクローナル抗血清の中和を上げた。Ellingsworth等, J. Biol. Chem., 261: 12362 (1986)；Ellingsworth等, Cell. Immunol., 114: 41 (1988)；Border等 Nature, 346: 371-374 (1990)；Flanders, Biochemistry 27: 739-746 (1988)；Flanders等, Growth Factors, 3: 45-52 (1990)；Flanders等, Development, 113: 183-191 (1991)。加えて、ＴＧＦ-βに対するマウスモノクローナル抗体の単離について特別に報告があった。ウシＴＧＦ-β２（ヒトＴＧＦ-β２と同一）による免疫化後、ＴＧＦ-β２に特異的な３つの非中和性モノクローナル抗体とＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２に特異的な１つの中和抗体が単離された。Dasch等, J. Immunol., 142: 1536-1541 (1989)。他の報告では、ヒトＴＧＦ-β１による免疫化後、ＴＧＦ-β１に特異的か又はＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３と交差反応する中和抗体が単離された。Lucas等, J. Immunol., 145: 1415-1422 (1990)。ヒト及びブタのＴＧＦ-β(Keski-Oja等, Cancer Res., 47: 6451-6458 (1987))及び、ブタのＴＧＦ-β２(Rosa等, Science, 239: 783-785 (1988))に対するポリクローナル抗血清はそれぞれ、ＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２の生物学的活性を中和することが示された。ウサギ抗ＴＧＦ-β血清は、Roberts等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4167-4171 (1986)に記述されている。加えて、ウサギ抗血清を用いたＴＧＦ-β１に対するＲＩＡは、血小板凝集の間に放出されたタンパク質を定量化するために確立された。Assoian及びSporn, J. Cell Biol., 102: 12178-1223 (1986)。
【００１５】
ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３イソ型の両方を結合するマウスモノクローナル中和抗体は、Genzyme Diagnosticsから市販されている。ヒトＴＧＦ-β１に対するマウスモノクローナル抗体は、R&D Systemsから入手可能である。この抗体は、中和反応アッセイにおいてＴＧＦ-β１を弱く中和するだけである。また、マウスモノクローナル中和抗体は、アミノ酸位４８〜６０（ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３と反応する抗体）とアミノ酸位８６〜１０１（ＴＧＦ-β１に特異的な抗体）を含んでなるヒトＴＧＦ-β１ペプチドによって免疫化されたマウスから生成された。Hoefer及びAnderer, Cancer Immunol. Immunother., 41: 302-308 (1995)。
ファージ抗体技術（国際公報１９９２／０１０４７；国際公報１９９３／１９１７２；国際公報１９９２／２０７９１；国際公報１９９３／０６２１３；及び、国際公報１９９３／１１２３６）は、ヒトＴＧＦ-βに対する抗体を直接単離させる能力を与える。ファージに表出される抗体部分レパートリーからの抗自己抗体の単離が記述された。Griffiths等, EMBO J., 12: 725-734 (1993)；Nissim等 EMBO J., 13: 692-698 (1994)；Griffiths等 13: 3245-3260 (1994)；Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10003-10007 (1993)；及び国際公報1993/11236。さらに、Tempest等, Immunotechnology, 2: 306 (1996)は、ファージディスプレイライブラリから得られるヒトＴＧＦ-βに特異的なヒト抗体を記述している。
【００１６】
国際公報１９９７／１３８４４は、ヒトＴＧＦ-β１に特異的なヒト抗体及びヒトＴＧＦ-β２に特異的なヒト抗体の単離を開示している。それは、３１Ｇ９ ＶＨドメイン及びドメインの変異形を有する抗体、より具体的には３１Ｇ９ ＶＨドメインと共にＣＳ３７  ＶＬとこのドメインの変異形を含んでなる抗体ＣＳ３７を記載している：その抗体には(i)ＴＧＦ-β１への結合についてのＣＳ３７によるＥＬＩＳＡにおいて競合する抗体、(ii)ＴＧＦ-β３に関するＴＧＦ-β１を優先的に結合する抗体、そして(iii)ＴＧＦ-β１を中和する抗体が含まれる。
米国特許第６,４９２,４９７号は、ＣＳ３７に関連があるが、ＴＧＦ-β１の結合及び中和反応に関して予想外に有益な特性を有する抗体の同定に基づく。それらは、ＴＧＦ-β２又はＴＧＦ-β３に対して結合も中和もしない。これらの抗体のエピトープはＴＧＦ-β１（残基８３−１１２）のＣ末端領域にあり、ＴＧＦ-β１の残基９２−９８からなるループを含んでおり、フィンガー２とも呼ばれるＴＧＦ-βのレセプターと相互作用することが同定された領域として知られている。
【００１７】
非常に特異的で、腫瘍診断及び親和性クロマトグラフィに用いることができるヒトＴＧＦ-β-１に対するモノクローナル抗体は、１９９５年７月２６日に出願のＪＰ  ９５０６８２７８ Ｂ２に開示されている。
ＴＧＦ-β及び血圧を調整するためのそのアンタゴニスト及び、高血圧及び低血圧を治療するための使用についてはそれぞれ、国際公報１９９１／１９５１３において開示されている。
国際公報１９９１／１５２２３は、ＴＧＦ-β１を特異的に結合するシチメンチョウ抗ＴＧＦ-β抗体と共にインキュベートされうる精製された呼吸突発抑制因子を開示している。抗体は、活性化マクロファージ上でＴＧＦ-β１の活性を完全に中和したが、マクロファージ上の呼吸突発抑制因子の活性には効果がなかった。
抗ＴＧＦ-β抗体などのＥＣＭ産生活性抑制因子との接触による糸球体腎炎などの線維形成疾患の診断及び治療における細胞外基質蓄積及びＴＧＦ-β活性の抑制については、国際公報１９９１／０４７４８及び国際公報１９９３／１０８０８に開示されている。ＴＧＦ-β由来の線形ペプチドに対する抗体及び抗体を生産している細胞もまた開示されている。
【００１８】
米国特許第５,８８８,７０５号は、肝細胞増殖因子単独又は抗ＴＧＦ-β抗体と組み合わせてヒト成人膵細胞の一次培養物と接触させることによってそれら細胞の増殖又は分化を誘発する方法を開示している。
国際公報２００１／６６１４０は、ＴＧＦ-βアンタゴニスト、例えば腎機能の欠損を治療するか又は予防する抗体の使用を開示している。
国際公報２０００／４０２２７は、抗体などのＴＧＦ-βを阻害する薬剤による過剰な細胞外基質の蓄積に関連する症状の治療方法を開示している。
Miyajima等, Kidney International, 58: 2301-2313 (2000)には、片側の尿管閉塞における管のアポトーシスを改善するＴＧＦ-βに対する抗体が開示されている。
ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウスのモノクローナル抗-ＴＧＦ-β抗体を用いた治療による腎不全、過剰な基質遺伝子発現及び腎糸球体間質基質拡張の長期予防について、Ziyadeh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 (14): 8015-8020 (2000)に開示されている。
実験的糖尿病性腎症において抗ＴＧＦ-β抗体を中和することに関する良好な治療結果は、Han及びZiyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999)に開示されている。ＴＧＦ-βは、高血糖及び糖尿病性腎症の重要なメディエータであることが明らかとなった。Sharma及びZiyadeh, Diabetes, 44 (10) p1139-46 (1995)。糖尿病性ネフロパシにおけるＴＧＦ-βの使用は、Border等, Diabetes Metab. Rev., 12/4: 309-339 (1996)に開示されている。
【００１９】
米国特許第５,６６２,９０４号は、瘢痕組織形成を阻害する損傷治療に用いられる組成物を記述している。例示的なこのような組成物は、成長因子-中和抗体、例えばＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＰＤＧＦに対する抗体を有する。
米国特許第５,９７２,３３５号は、線維形成疾患の創傷治癒を促進するために、少なくとも２の抗体をを含んでなる組成物を開示しており、ここで、第一抗体はＴＧＦ  β１上の単一エピトープに特異的であり、第二抗体はＴＧＦ  β２上の単一エピトープに特異的である。
米国特許第５,９５８,４１１号は、抗ＴＧＦ-β中和抗体を投与することによってＣＮＳ病理を治療する方法を開示している。
米国特許第５,６１６,５６１号は、抗体などのＴＧＦ-βアンタゴニストを用いた放射線によって生じる組織損傷を治療する方法を記述している。
米国特許第６,５００,９２０号は、ＴＧＦ-β２のアミノ酸４９−５８を含んでなる１０−２５アミノ酸のペプチドを開示しており、該ペプチドは細胞上のＴＧＦ-βレセプターへのＴＧＦ-βの特異的な結合を阻害することが可能である。
【００２０】
米国特許出願番号２００２／０１７６８５８及び米国特許第５,６９３,６０７号；同第６，４１９，９２８号；同第６，０９０，３８３号；同第５，７８３，１８５号；同第５，７７２，９９８号；及び同第５,５７１,７１４号並びに、欧州特許第４８９，０６２号；同第５５７，４１８号；及び同第６６９，８３３号、並びに国際公報１９９２／０８４８０；国際公報１９９４／０９８１５；及び国際公報１９９４／１８９９１は、ＴＧＦ-βに対するモノクローナル抗体、例えばＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２の活性を中和する抗体、ＴＧＦ-βが過剰に産生されている徴候（例えば急性の肝損傷、間隙肺線維形成、肝硬変、慢性肝臓線維形成及び強皮症などの線維形成皮膚疾患）の治療及び悪性腫瘍（例えば肉腫及びメラノーマ）ないしは転移性癌の診断及び治療への治療的応用への抗体の使用を開示している。
ＴＧＦ-β３に関連する疾患、例えば骨粗鬆症、エイズ、癌などを治療するための新しい抗体は、国際公報１９９２／００３３０及び米国特許第５,２６２,３１９号に開示されている。このような抗体はヒトＴＧＦ-β３と結合して、ＴＧＦ-β１及びβ２と交差反応性を示さない。
【００２１】
米国特許第６,５０９,３１８号は、創傷治癒の間の瘢痕組織阻害などの使用のためにＴＧＦ-β活性に抑制性であることが明らかな小ペプチドのファミリを開示している。
大脳疾患、例えば脳虚血を治療するための損傷前神経に対するＴＧＦ-βの生物活性を阻害しうる化合物（例えば抗体）の使用は国際公報２０００／１３７０５に開示されている。
大脳疾患を治療するために有用な損傷前神経に対するＴＧＦ-βの生物活性を阻害しうるＴＧＦ-βの全３つのイソ型を認識するモノクローナル抗体は、国際公報２０００／５４８０４に開示されている。このような抗体を、ニワトリ胚の脊髄運動ニューロン並びに毛様体神経節（ＣＧ）及び後根神経節（ＤＲＧ）の個体発生の細胞死の主要期間の間に内在性ＴＧＦ-βを中和するために用いた。
血管形成因子又はレセプターに特異的な抗体、例えばＴＧＦ-β３に特異的な抗体を用いるタモキシフェン感受性又はタモキシフェン耐性乳癌の発達の可能性を診断又は予測することについては、国際公報２０００／３４７８８に開示されている。
欧州特許第９４５４６４号 Ｂ１は、ヒトＴＧＦ-βに特異的に結合するメンバー、つまりＴＧＦ-β３と比較して優先的にイソ型ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β１又はその両方に特異的に結合するヒトＴＧＦ-βに特異的なヒト抗体-抗原結合ドメインを含んでなる特異的結合メンバーを開示している。特異的な結合メンバーは、単離してもよく、疾患、特に線維形成疾患や更には免疫性／炎症性疾患の治療に利用されてもよい。
【００２２】
ＴＧＦ-βに対する抗体は、糸球体腎炎(Border等, Diabetes Metab. Rev., 上掲)；神経瘢痕(Logan等, Eur. J. Neurosci., 6: 355-363 (1994)；国際公報１９９３／１９７８３）；真皮瘢痕(Shah等, Lancet, 339: 213-214 (1992)；Shah等, J. Cell Science, 107: 1137-1157 (1994)；Shah等, J. Cell Science, 985-1002 (1995)；国際公報1992／17206）；肺線維形成(Giri等, Thorax, 48: 959-966 (1993))；動脈損傷(Wolf等, J. Clin. Invest., 93: 1172-1178 (1994))；及び関節リウマチ(Wahl等, J. Exp. Medicine, 177: 225-230 (1993))の治療に効果を示した。ＴＧＦ-β３が真皮瘢痕においてのＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２に相反して作用することが示唆されている(上掲のShah等, 1995)。
Arteaga等, J. Clin. Invest., 92: 2569-2576 (1993)は、抗ＴＧＦ-β抗体が乳癌細胞腫瘍原性を阻害して、マウス脾臓ナチュラルキラー細胞活性を増やすことを開示している。
抗ＴＧＦ-βを含む線維形成疾患の治療及び創傷治癒のための抗線維形成剤は、国際公報１９９３／１９７６９に記述されている。
抗ＴＧＦ-β２の特異的な配列は、欧州特許第853,661号Ｂ1に記述されている。
ＴＧＦ-βに対する抗体が治療有効性の見込みを示した他の適用には、眼性線維形成を伴う眼病、例えば増殖性網膜症(Pena等, Invest. Ophthalmology. Vis. Sci., 35: 2804-2808 (1994))、白内障の予防（国際公報１９９５／１３８２７）、網膜剥離、及び緑内障排水手術後(Khaw等, Eye, 8: 188-195 (1994))の治療のためのＴＧＦ-βに対する抗体の使用がある。Connor等, J. Clin. Invest., 83: 1661-1666 (1989)に、ＴＧＦ-β２が眼性線維形成のない単純網膜剥離患者と比較して増殖性網膜症と関連している眼内線維形成患者の硝子体吸引液に非常に高いレベルで存在すること、及びこのＴＧＦ-β２の生物活性がＴＧＦ-β２に対する抗体によって中和されうることが示されている。
【００２３】
疾患の治療へのＴＧＦ-βに対する抗体の使用は、線維形成疾患（国際公報１９９１／０４７４８）；マクロファージ-欠乏病（国際公報１９９３／１４７８２）；マクロファージ病原感染（国際公報１９９３／１７７０８；米国特許第５,７３０,９７６号）；及び、血管疾患（国際公報１９９３／２１９４５）の特許出願の対象であった。
インビトロ又はエクスビボで１４日間生存しうるＴＧＦ-β抗体処理幹細胞組成物、及び急速インビボ細網内皮系再増殖物は、国際公報２０００／４３４９９に記述されている。
２０００年１０月４日のScrip 2580 p14で、Cambridge Antibody Technology (CAT)とGenzymeがＴＧＦ-βに対するヒトモノクローナル抗体を共に開発していることが報告された。ＣＡＴは２つの完全なヒトＴＧＦ-β抗体、ＣＡＴ-１５２及びＣＡＴ-１９２を有し、Genzymeは１Ｄ１１（ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３を中和するマウスパン特異的モノクローナル抗体）を有し、広汎性強皮症の潜在的治療薬として評価されている。ＣＡＴは、そのファージディスプレイ技術を用いて１Ｄ１１のヒト類似体を開発させていた。また、抗ＴＧＦ-β治療のための多様な他の臨床症状、例えば眼の徴候、術後に瘢痕、肺、腎臓及び肝臓などの主要器官の線維形成、及び特定の癌だけでなくＴＧＦ-β２の成長を阻害することによる悪性脳腫瘍の治療も考慮される。ＣＡＴ-１５２（抗ＴＧＦ-β２）は緑内障に起因する外科手術を行った患者における手術後瘢痕を予防するための第ＩＩ相試験にあり、ＣＡＴ-１９２（抗ＴＧＦ-β１）は第Ｉ相試験を終わっている。また、「Trends in Antibody Research: The Monoclonal Elite」 by Tim Searle, Bioventure-View 1510 p14, ２０００年１０月１日を参照。
【００２４】
抗ＴＧＦ-β抗体を用いたＴＧＦ-βの定量方法は、国際公報１９９５／１９９８７に開示されている。ＴＧＦ-β応答性発現ベクターを含有する真核細胞を用いた試料中の活性ＴＧＦ-βを測定する新しいアッセイは、国際公報２０００／００６４１に記述されている。このアッセイは試料中のＴＧＦ-βイソ型レベルを測定するため方法を含み、この凍結切片を抗ＴＧＦ-βイソ型中和抗体と共に予めインキュベートする。ＴＧＦ-β抗体を用いるＴＧＦ-βイムノアッセイは、例えば１９９２年７月７日に発行の日本特許第９２０４１３０７号及び同第２１２６１５７号に記述されている。
Darland及びD'Amore, J. Clin. Invest., 103: 157-158 (1999)は、生存因子の損失によりアポトーシスに至る成長因子依存のステージから脈管の発達が生じることを開示している。脈管安定化は、壁細胞を有する外被、ＴＧＦ-βの局所活性化及び基底膜産生に特徴がある。それは、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ-βを含む成人血管内の成長因子の役割であることに関して、いくつかの質問が提起される。Benjamin等, J. Clin. Invest., 103: 159-165 (1999)は、ＶＥＧＦの使用中止の後に定着したヒト腫瘍内の未成熟血管の選択的切断が起こるを開示している。
【００２５】
キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法については、例えば、ヒトの上皮性成長因子レセプターに対する完全なヒトモノクローナル抗体についての米国特許第６,２３５,８８３号；マウス-ヒトキメラ抗体についての欧州特許第１８４１８７号；ファージ技術を用いた抗体の組み換え作製方法についての欧州特許第８４４，３０６号；ＣＤＲ融合抗体、好ましくはヒト化抗体で、非ヒトドナー及びヒトアクセプターフレームワークを有するものについては米国特許第５,８５９,２０５号、欧州特許第１２０,６９４号；欧州特許第１２５，０２３号；欧州特許第１７１,４９６号；欧州特許第１７３，４９４号；欧州特許第２３９，４００号；国際公報１９８９／０７４５２；国際公報１９９０／０７８６１；及び、ヒト化技術についての国際公報１９８６／０１５３３；超ヒト化抗体についての米国特許出願番号２００３／００３９６４９；ヒトＴＮＦ-αに特異性を有するヒト化抗体についての米国特許出願番号２００３／００３９６４５；組換え抗体及びその産生についての欧州特許第２３９，４００号；ヒト化抗体についての国際公報１９９１／０９９６７；抗体産生についての国際公報１９９２／０１０４７；ヒト化抗体の作製方法についての国際公報１９９２／２２６５３；多価抗原結合性タンパク質についての国際公報１９９３／１１１６１；多価抗原結合性タンパク質についての国際公報１９９４／１３８０４；ＴＧＦ-βに特異的な結合メンバーについての国際公報２０００／６６６３１；及び、Henry "Special Delivery: Alternative methods for delivering drugs improve performance, convenience, and patient compliance." C &EN, 49-65頁 (2000)に記載されており、この分野の他の文献が含まれる。また、米国特許第６,１４０,４７１号及び同第５，９６９，１０８号及び同第５，８７２，２１５号及び同第５，８７１，９０７号及び同第５，８５８，６５７号及び同第５，８３７，２４２号及び同第５，７３３，７４３号；欧州特許第１，０２４，１９１号；欧州特許第７７４，５１１号；国際公報１９９７／１３８４４；欧州特許第656,941号及び同第６０５，５２２号及び国際公報１９９４／１３８０４；欧州特許第５８９，８７７号；欧州特許第５８５，２８７号；国際公報１９９３／１９１７２；欧州特許第５４０，５８６号；国際公報１９９３／０６２１３；国際公報１９９２／２０７９１；国際公報１９９２／０１７８７；及び、国際公報１９９２／０１０４７を参照。更に、国際公報２００４／０６５４１７は、効率を改良するための抗体及び抗原結合性フラグメントへの多様な変更について開示している。また、ＵＳ２００５００４９４０３を参照。
【００２６】
上記のような疾患における有害作用を予防するために、ＴＧＦ-β分子を調節することが必要である。また、ＴＧＦ-β特異的に結合する高親和性のモノクローナル抗体及びＴＧＦ-βアンタゴニストとして作用するためのＴＧＦ-β活性を中和する高親和性のモノクローナル抗体を提供する必要もある。ＴＧＦ-β誘導性間質形成と免疫機能の抑制因子と結合した新生細胞によるＴＧＦ-β調節の見かけ上の欠損によりＴＧＦ-βアンタゴニストを用いた処置が癌治療の魅力的な選択肢となりうる。加えて、ＴＧＦ-β抗体は、診断検査法及び免疫親和性精製に有用である。
【００２７】
（発明の概要）
第一の態様では、本発明は、ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含むＶＨドメインを含んでなり、該可変ドメインがKabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)による番号付けに従った配列番号６の４８、４９、６７、６９、７１、７３及び７８からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する、ＴＧＦ-βに結合するヒト化抗体を提供する。抗体は完全なＩｇＧ１抗体又はＦａｂなどの抗体断片を含有してなる。
好ましくは、ヒト化抗体は位置４９、６７及び７１にＦＲ置換を含有し、さらに、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６７のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。
他の好ましい実施態様では、ヒト化抗体は位置４８、４９及び７１にＦＲ置換を含有し、さらに、位置４８のバリンがイソロイシンに変化され、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。
【００２８】
また好ましくは、ヒト化抗体は位置４９、６９及び７１にＦＲ置換を含有しており、さらに、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置６９のイソロイシンがロイシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましい。他の態様では、さらにＦＲ置換が位置７３にあり、位置７３のアスパラギンがリシンに変化されるのがより好ましい。
さらに他の好ましい実施態様では、ヒト化抗体は位置４９、７１及び７３にＦＲ置換を含有しており、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化され、位置７３のアスパラギンがリシンに変化されるのがより好ましい。
さらに他の好ましい実施態様では、ヒト抗体は位置４９、７１及び７８にＦＲ置換を含有しており、位置４９のアラニンがグリシンに変化され、位置７１のアルギニンがアラニンに変化され、位置７８のロイシンがアラニンに変化されるのがより好ましい。
【００２９】
他の好ましい実施態様では、上記の何れかの抗体は可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：３６）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：３８）；及びＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：４０）を含有しているか、第一ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１）がヒト生殖系κ遺伝子座Ｌ８／Ｌ９の配列：ＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：３７）に変換され、及び／または、第二ＣＤＲ（ＣＤＲＬ２）がヒト生殖系κ遺伝子座Ｌ８／Ｌ９／Ｌ１４／Ｌ１５の配列：ＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：３９）に変換されているＶＬドメインＣＤＲ残基を含有している。他の好ましい実施態様では、上記の何れかの抗体はＶＨドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）を含んでなる。
また、本発明は細胞障害性剤と接合されているか、接合されていない。さらに、本発明はそのような抗体と担体を含んでなる組成物を提供する。
【００３０】
更なる実施態様では、本発明はヒト化抗体をコードする単離した核酸、そのような核酸を含むベクター、及びそのような核酸を含有する宿主細胞を提供する。
さらに、本発明は、核酸が発現されて抗体が産生され、好ましくは宿主細胞物から回収され、より好ましくは宿主細胞培養液から回収されるように、前記抗体をコードする核酸を含有する宿主細胞を培養することを含むヒト化抗体の産生方法を提供する。また、可変重鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターと、可変軽鎖ドメインをコードする核酸を含有するベクターとが宿主細胞に同時形質移入されるものである。
さらに他の実施態様では、本発明は、有効量のヒト化抗体を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトのＴＧＦ-β疾患の治療方法を提供する。さらに、有効量のヒト化抗体以外の治療的薬剤、例えば化学療法剤、抗血管形成剤又は細胞障害性剤又はサイトカインを哺乳動物に投与することを含む。
【００３１】
さらに他の実施態様では、本発明は、ヒト化抗体を生体試料と接触することと、ＴＧＦ-βへの抗体結合が起こっているかどうかを検出することとを含む、生体試料中のＴＧＦ-βを検出する方法を提供する。
また、本発明は、ヒト化抗体を含有する容器と、抗体で哺乳動物、好ましくはヒトのＴＧＦ-β疾患を治療することを使用者に示す指示書とを含んでなる製造品を提供する。また、この製造品はヒト化抗体以外の治療的薬剤を含有する容器を含んでなり、該指示書が有効量の薬剤と抗体とを組み合わせて疾患を治療することを使用者に示す。
他の実施態様では、本発明は、有効量のＴＧＦ-β抗体と血管内皮性成長因子と結合する抗体とを哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の癌の治療方法を提供する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。他の実施態様では、ＴＧＦ-β抗体がＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３のうちの一又は一以上と結合する。更なる実施態様では、抗体はＴＧＦ-β１、又はＴＧＦ-β１とＴＧＦ-β２の両方に結合する。
【００３２】
好ましい実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
「ＴＧＦ-β」及び「トランスフォーミング成長因子-β」なる用語は、ここで同義に用いられ、潜在型及び結合型を含む任意のヒトＴＧＦ-βの完全長天然アミノ酸配列、又は前駆体及び成熟ＴＧＦ-βの非結合の複合体（「潜在的ＴＧＦ-β」）を有する、上記の分子のファミリーを意味する。本明細書のＴＧＦ-βを参照すると、現在同定されている何れかの型、つまりＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４及びＴＧＦ-β５とその潜在的変異形、並びに今後同定されるヒトＴＧＦ-β種、例えば公知のＴＧＦ-β配列由来のポリペプチド及び該配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％及び更により好ましくは約９５％の相同性を有するものであることが理解されるであろう。特定の用語「ＴＧＦ-β１」、「ＴＧＦ-β２」及び「ＴＧＦ-β３」、並び「ＴＧＦ-β４」及び「ＴＧＦ-β５」は、引用文献の例えば上掲のDerynck等, Nature、上掲のSeyedin等, J. Biol. Chem., 262及び上掲のdeMartin等, に定義されるＴＧＦ-βを意味する。「ＴＧＦ-β」なる用語は、ヒトＴＧＦ-βをコードする遺伝子を意味する。好適なＴＧＦ-βは天然配列ヒトＴＧＦ-βである。
ＴＧＦ-βファミリのメンバーは、分子の成熟部分の９つのシステイン残基を有するものとして定義され、他の成熟領域内の公知のＴＧＦ-β配列と少なくとも６５％の相同性を有し、同じレセプターに対して拮抗する。加えて、それらの全ては、Ｎ末端の近くに高い相同性領域を共有する大きな前駆体としてコードされており、後にプロセシングによって除去される前駆体の部分内の３つのシステイン残基を共有する。さらに、ＴＧＦ-βは、４又は５つのアミノ酸を有するプロセシング部位を持つようである。
【００３３】
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド(例えば、ＴＧＦ-β１)と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。従って、天然配列ポリペプチドは、自然発生ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、又は特定の他の哺乳動物種のアミノ酸配列を有しうる。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチド由来と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アミノ酸配列変異体はその変異体が比較する天然配列のポリペプチド又はその一部と少なくとも約７０％の相同性を有しており、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％の相同性、更により好ましくはそのような天然配列ポリペプチド又は一部と少なくとも約９５％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列列内の或る位置での置換、欠失及び／又は挿入を有している。
「相同性」は、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するために間隙を導入した後に、同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義される。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られている。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテック（Genentech）Inc．の著作の「Align ２」であり、これは1991年12月10日に20559ワシントンＤＣの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。
【００３４】
ここでの「抗体」という用語は最も広義に使用され、特に完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常のポリクローナル抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されないで合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、第１にKohlerら, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClacksonら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００３５】
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象とするキメラ抗体は、非ヒト(例えばオナガザル、サルなど)及びヒト定常領域配列から誘導される可変ドメイン抗原結合配列を含んでなる「霊長類化」抗体を含む。
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域が含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「完全な」抗体は、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなるものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、完全な抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００３６】
抗体「エフェクター機能」は抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域)に帰因するこれらの生物学的活性に関する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)、等を含む。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な抗体は異なる「クラス」に分類できる。完全な抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１(ヒトＡ及び非Ａアロタイプ)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造がよく知られている。
【００３７】
「抗体依存性細胞媒介細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)を発現する非特異性細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応に関する。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγII及びＦｃγIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第5,500,362号又は5,821,337号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このアッセイで使用できるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。他に、又はさらに対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されている様な哺乳動物のモデルでインビボの評価がされうる。
「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然ソースより単離されてもよい；例えばここにおいて記載の血液又はＰＢＭＣ類である。
【００３８】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
【００３９】
「補体依存性細胞障害活性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で目的物を溶解させる分子の能力に関する。補体活性化経路は、同系の抗原と複合体形成する分子(例えば、抗体)への補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J.Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイが実施されうる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００４０】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(上掲のKabat等,を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；上掲のKabat等,を参照）又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４２】
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。抗-ＴＧＦ-β抗体ｓｃＦｖ断片はWO93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号に記載されている。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、EP404,097；ＷＯ93/11161；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００４３】
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」形とは、非非と免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に、又はドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含んでなる。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmanら, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)を参照。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４４】
対象とする抗原、例えばＴＧＦ-β抗原に「結合する」抗体は、抗体が抗原発現細胞を標的にしての治療剤として利用できる程、十分な親和性で抗原に結合することができるものである。抗体がＴＧＦ-βに結合するものである場合、通常ＴＧＦ-βスーパーファミリーの他のメンバーに優先的してＴＧＦ-βに結合し、ＢＭＰ、アクチビンなどのファミリーの他のタンパク質と有意には交差反応しないようなものである。このような実施態様では、これらの非ＴＧＦ-βタンパク質に対する抗体の結合度合いは、蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)分析又は放射性免疫沈降(ＲＩＡ)による測定では約１０％未満であろう。
命名された抗体の、例えば２Ｇ７と命名されたモノクローナル抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗体(例えばＴＧＦ-β)に結合する他の抗体から識別する、抗体の一又は複数の生物学的特性を有するものである。例えば、２Ｇ７の生物学的特性を有する抗体は、ＴＧＦ-βの活性化を阻害しても、及び／又は２Ｇ７により結合するようなＴＧＦ-βの細胞外ドメインの同じエピトープに結合してもよい。
【００４５】
別に示されなければ、表記「モノクローナル抗体２Ｇ７」は以下の実施例のマウス２Ｇ７抗体の、又は該抗体由来の抗原結合残基を有する抗体に相当する。例えば、モノクローナル抗体２Ｇ７は、マウスモノクローナル抗体２Ｇ７又はその変異体、例えばマウスモノクローナル抗体２Ｇ７の抗原結合アミノ酸残基を有するヒト化抗体２Ｇ７でありうる。ヒト化２Ｇ７抗体の例は、以下の実施例２で提供される。他に示されなければ、ここで使用される場合の発現「ｒｈｕＭＡｂ２Ｇ７」はそれぞれ配列番号：１及び２の可変軽鎖(ＶＬ)及び可変重鎖(ＶＨ)配列を含み、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により通常発現されるヒト軽鎖及び重鎖ＩｇＧ１(非-Ａアロタイプ)定常領域配列に融合する抗体を意味する。
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞、特にＴＧＦ-β発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期におけるＴＧＦ-β発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行を阻害する薬剤(Ｓ期以外のところで)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。またＧ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、癌遺伝子、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００４６】
「成長阻害」抗体の例は、ＴＧＦ-βに結合して、ＴＧＦ-βを過剰発現する癌細胞の成長を抑制するものである。好ましい成長阻害抗-ＴＧＦ-β抗体は、成長阻害がＳＫ-ＢＲ-３細胞の抗体への暴露から６日後に決定される場合に、抗体濃度約０．５から３０μg/mlで２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく(例えば約５０％から１００％)細胞培養物のＳＫ-ＢＲ-３乳癌細胞の成長を阻害する(1997年10月14日公開の米国特許第5,677,171号参照)。ＳＫ-ＢＲ-３細胞成長阻害アッセイは、該特許及び以下に更に詳しく記載される。
「細胞死を誘発」する抗体は、生存している細胞を生存不能とさせるものである。該細胞は一般に、ＴＧＦ-βレセプターを発現するもので、特に該細胞はＴＧＦ-βレセプターを過剰発現する。好ましくは細胞は癌細胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫ-ＢＲ-３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。インビトロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)により誘発される細胞死と区別される。よって、細胞死に対するアッセイは、熱不活性化血清(すなわち補体の不在下)を使用し、免疫エフェクター細胞の不在下で行うことができる。抗体が細胞死を誘発可能であるか否かを測定するために、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Mooreら, Cytotechnology 17:1-11(1995)を参照)又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜インテグリティの損失度合いが未処理細胞と比較して評価される。好ましい細胞死誘発抗体は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取込みアッセイにおいて、ＰＩの取込みを誘発するものである(下記参照)。
【００４７】
「アポトーシスを誘発」する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、通常ＴＧＦ-βレセプターを過剰発現するものである。好ましくは細胞は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫ-ＢＲ-３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである(下記参照)。時として、プロアポトーシス抗体は、ＴＧＦ-β結合更に阻害するであろう(例えば２Ｇ７抗体)；つまり抗体はＴＧＦ-βに対する抗体と生物学的特性を共有する。他の状況では、抗体は、ＴＧＦ-βを有意に阻害しないものであろう。さらに、抗体は、アポトーシスを誘発しながら、Ｓ期中の細胞のパーセントの大きな低減を誘発しないものでありうる(例えば、コントロールに対して、これらの細胞のパーセントの約０−１０％の低減だけを誘発するもの)。
【００４８】
「エピトープ２Ｇ７」は抗体２Ｇ７(ＡＴＣＣ ＨＢ１０２４０)が結合するＴＧＦ-βの細胞外ドメイン中の領域である。２Ｇ７エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。
「ＴＧＦ-β抗体」は、ＴＧＦ-βのイソ型に結合する、好ましくはＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２又はＴＧＦ-β３の何れか又はそれらのうちのいくつか、より好ましくは少なくともＴＧＦ-β１、又は少なくともＴＧＦ-β２、そして最も好ましくはＴＧＦ-β１、又はＴＧＦ-β１とＴＧＦ-β２に結合する抗体を意味する。場合によっては抗体は少なくともＴＧＦ-β３に結合してもよい。
「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必要があるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが含まれる。従って、ここでの治療されるべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されてもよく、又は疾患に罹りやすい又は敏感であると診断されていてもよい。
治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭又は農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物は、霊長類、例えばサル(monkey, ape)又はヒト、例えば最も好ましくはヒトである。
【００４９】
「ＴＧＦ-β疾患」又は「ＴＧＦ-β関連疾患」は、抗ＴＧＦ-β抗体を用いた治療により利益を得る任意の疾患、疾病又は症状を指す。これには哺乳動物の問題とする疾患の素因になる病的状態を含む慢性及び急性の疾患又は疾病を含む。本願明細書において治療される疾患には、細胞外基質の蓄積を特徴とする疾患、局所部位で活性化されるＴＧＦ-β又は循環ＴＧＦ-βによって生じる疾患、内在性ＴＧＦ-β産生による免疫系の抑制によって生じる症状、ウイルス又は細菌の感染などの疾病、熱傷及び重症障害から生る急性の免疫不全、ＴＧＦ-β産生又は過剰生産による多臓器全身性疾病、及びＴＧＦ-β産生性腫瘍が含まれる。限定するものでなく、具体的例として、神経系疾患、神経膠疾患、星状性疾患、視床下部疾患、他の腺性疾患、マクロファージ性疾患、上皮性疾患、間質性疾患、胚盤胞性疾患、線維形成、瘢痕、放射線によって生じるなどの組織損傷、及び創傷治癒中の癒着、強皮症などの線維形成皮膚疾患、ＣＮＳ病理学瘢痕組織、真皮性瘢痕、ケロイド瘢痕、及び神経性瘢痕、腹腔、肺、肝臓及び腎臓の線維形成疾患、例えば慢性肝臓線維形成、急性肝損傷、間隙肺及び腎臓線維形成、そして、肝硬変、嚢胞性線維症、血管疾患、例えば心臓線維形成、アテローム性動脈及び動脈硬化症などの動脈損傷、良性及び悪性の腫瘍、ＴＧＦ-βによって阻害されない特定の白血病、及び悪性腫瘍（例えば肉腫、上皮癌及びメラノーマ）、例として前立腺、線維形成性、卵巣、悪性のメラノーマ、胸部、肺、大腸、直腸、結腸直腸、又は、頸部癌及び転移性癌、並びに消化系及び神経膠芽腫の神経内分泌腫瘍、血管障害、脈管障害、ネフロパシ、全身性硬化症、感染、例えばマクロファージ病原感染およびウイルス感染、例えばＣ型肝炎およびＨＩＶ、免疫系、血管形成性、炎症性の疾患及び欠損、関節リウマチ、眼性疾患、特に眼性線維形成を伴うもの、例えば増殖的な網膜症、網膜剥離及び緑内障ドレナージ手術後、例としてヒト眼の硝子体、網膜色素上皮絨毛膜様及び神経網膜、及び白内障、骨粗鬆症、成人呼吸窮迫症候群、心筋梗塞後、血管形成後再狭窄、糸球体腎炎、糖尿病関連症状、例えば高血糖、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性ネフロパシ、糖尿病性神経症又は網膜症、及びマクロファージ-欠乏病がある。
【００５０】
好ましくは、疾患は線維形成、動脈の損傷、感染、関節リウマチ、糖尿病又は糖尿病性症状、又は悪性腫瘍、例えばＴＧＦ-βを発現する癌であり、より好ましくは、癌はＴＧＦ-βの過剰な活性化に特徴がある。このような癌はＴＧＦ-βを過剰発現させてもよいか、又はあるいは、ＴＧＦ-βの過剰発現に特徴がなくてもよい。
「有効量」なる用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を徴するために効果的な量の薬剤を意味する。癌の場合、薬剤の治療的に有効な量により、癌細胞の数が減少する；腫瘍の大きさが小さくなる；周辺器官内への癌細胞の浸潤が抑制される（つまり、ある程度ゆっくりになるか止まるのが好ましい）；ある程度腫瘍の成長が抑制される；及び／又は癌関連の症状の一又は複数がある程度軽減される。薬剤が存在する癌細胞の成長を阻害するか及び／又は癌細胞を殺すという意味において、細胞増殖抑制性及び／又は細胞障害性であるといえる。癌治療において、効果を、例えば疾患進行に対する時間（ＴＴＰ）の評価、及び／又は応答率（ＲＲ）の測定によって測定することができる。
【００５１】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態に相当するか、または表すものである。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮癌(squamous cell cancer)(例えば、上皮性扁平上皮癌（epithelial squamous cell cancer）)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric又はstomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney又はrenal)癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
「ＴＧＦ-β発現癌」は、抗ＴＧＦ-β抗体が結合して、癌に応答して治療効果を有するようにその細胞表面に十分量のＴＧＦ-βを発現するものである。
ＴＧＦ-βレセプターの「過剰活性化に特徴がある」癌は、癌細胞のＴＧＦ-βレセプター活性化の範囲が、同じ組織型の非癌性細胞で該レセプターの活性化のレベルを十分に超えるものである。このような過剰活性化は、ＴＧＦ-βレセプターの過剰発現及び／又は癌細胞のＴＧＦ-βレセプターを活性化する通常レベルよりも大きいＴＧＦ-βリガンド活性化により生じうる。このような過剰活性化は、癌細胞の悪性状態を引き起こす、及び／又はそれにより引き起こされうる。いくつかの実施態様としては、ＴＧＦ-βレセプターのこのような過剰活性化を生じるＴＧＦ-βレセプターの増殖及び／又は過剰発現が引き起こされるかどうかを決定するために、癌を診断又は予後予測のための対象となる。あるいは、又は加えて、レセプターの過剰活性化によるものである、癌におけるＴＧＦ-βリガンドの増幅及び／又は過剰発現が起こっていいるかどうかを決定するために、癌を診断又は予後予測のための対象となる。このような癌のサブセットでは、レセプターの過剰活性化が自己分泌刺激性経路に起因する。
【００５２】
「自己分泌」促進経路において、ＴＧＦ-βリガンド及びその同族のＴＧＦ-βレセプターの両方を産生する癌細胞の効力によって自己促進が引き起こされる。例えば、癌は、ＴＧＦ-βレセプターを発現又は過剰発現しても、又はＴＧＦ-βリガンド（例えばＴＧＦ-β１）を発現又は過剰発現してもよい。
ＴＧＦ-βレセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、細胞表面のＴＧＦ-βレセプターの有意に高いレベルを有している。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。ＴＧＦ-βレセプター過剰発現は、細胞表面に存在するＴＧＦ-βタンパク質の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる(例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる)。あるいは、又は加えて、細胞のＴＧＦ-βコード化核酸のレベルを測定してもよい、例えば、蛍光インサイトハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；1998年10月公開のWO98/45479参照)、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)。また、血清のような生体液中の脱落抗原(例えば、ＴＧＦ-β細胞外ドメイン)を測定することにより(例えば、1990年6月12日に公開の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開のWO91/15264；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990))ＴＧＦ-βレセプター過剰発現を研究してもよい。前記アッセイのみならず、様々なインビボアッセイが技術熟練者において利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に先に暴露された患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
【００５３】
逆に、「ＴＧＦ-βレセプターの過剰発現により特徴付されない」癌は、診断アッセイにおいて、同組織型の非癌性細胞と比較して、ＴＧＦ-βレセプターの通常のレベルよりも高く発現しないものである。
ＴＧＦ-βリガンドを「過剰発現する」癌は、同組織型の非癌性細胞に比較して十分に高いレベルのリガンドを産生するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加することにより引き起こされうる。ＴＧＦ-βリガンドの過剰発現は、患者のリガンド(又はそれをコードする核酸)のレベルを評価することにより、例えば、腫瘍バイオプシーで、又はＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロット法、ＰＣＲ又は前記のインビボアッセイのような様々な診断アッセイにより診断的に決定してもよい。
「ホルモン非依存性」癌は、その増殖が癌の細胞によって発現されるレセプターと結合するホルモンの存在に依存していないものである。このような癌は、腫瘍内又はその周辺のホルモン濃度を減少させる薬剤投与又は外科的な方法に応じて、臨床的な回復がみられない。ホルモン非依存性癌の例には、アンドロゲン非依存性前立腺癌、エストロゲン非依存性乳癌、子宮体癌及び卵巣癌がある。このような癌は、ホルモン依存性腫瘍として発生し、抗ホルモン治療後にホルモン感受性期からホルモン抵抗性腫瘍へ進行しうる。
ここで使用される「細胞障害性剤」という用語は、細胞機能を阻害又は抑制するか、及び／又は細胞の崩壊を引き起こす物質を意味する。その用語は放射性アイソトープ(例えばＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射性同位体)、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒又は酵素活性毒のような毒を含み、それらの断片及び／又は変異体を含むことを意図している。
【００５４】
「化学療法剤」は癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)クレスチン(krestin)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン(taxanes)（又はタキソイド）、例えばパクリタキセル（TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラミシン(esperamicins)；カペシタビン(capecitabine)；及び上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００５５】
また、この定義に含まれるものには、腫瘍でホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）であり、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTONトレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｌｆ及びＨ-Ｒａｓ；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼＩ阻害剤；ABARELIX(登録商標)rGnRH；及び上記のものの製薬的に許容される塩、酸又は誘導体である。
【００５６】
ここで使用されるように、「ＥＧＦＲ標的薬」という用語は、ＥＧＦＲに結合し、場合によってはＥＧＦＲ活性化を抑制する治療薬に相当する。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９(ATCC CRL HB8506)、ＭＡｂ４５５(ATCC CRL HB8507)、Ｍａｂ２２５(ATCC CRL 8509)、ＭＡｂ５２８(ATCC CRL HB8509)(米国特許第4,943,533号、Mendelsohnら参照)及びその変異体、例えばキメラ２２５(Ｃ２２５)及び再構成ヒト２２５(Ｈ２２５)(WO96/40210、Imclone Systems社参照)；タイプIIマウスEGFRに結合する抗体(米国特許第5,212,290号)；米国特許第5,891,996号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体(WO98/50433、Abgenix参照)を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤とコンジュゲートされ、よって免疫コンジュゲートを作る(例えば、EP659,439A2、Merck Patent GmbH)。EGFRに結合する小分子の例は、ＺＤ１８３９(Astra Zeneca)、ＣＰ-３５８７７４(OSI/pfizer)及びＡＧ１４７８を含む。
「ヒト化抗体以外の治療薬」とは、本明細書中に記載の抗体以外のＴＧＦ-β疾患を治療するのに有効な任意の薬剤を意味し、以下に挙げる種類のものを含む。
【００５７】
「抗-血管形成剤」は、血管の発達を阻害する、又はある程度妨げる化合物に相当する。抗-血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子又は成長因子レセプターに結合する小分子又は抗体でありうる。例えば、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に拮抗するもの、例えばＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)などのＶＥＧＦに特異的に結合する抗体が含まれる。「ＶＥＧＦに結合する抗体」には、キメラ、ヒト及びヒト化抗体並びに断片が含まれ、一又は複数のＶＥＧＦレセプター、好ましくは両方のレセプターに対してＶＥＧＦを中和ないしは遮断する、又はＶＥＧＦ結合を遮断する抗体も含まれる。
「哺乳動物の免疫機能の調整因子（レギュレーター）」なる表現は、哺乳動物の免疫機能を制御する成長因子及びサイトカイン、例えばインターロイキン、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、上皮細胞成長因子、血小板由来増殖因子、ＴＧＦ-α、マクロファージ-遊走阻止因子、マクロファージ-活性化因子、線維芽細胞成長因子、マクロファージ活性化因子、インターフェロン及びコロニー刺激因子を意味する。これらの調節因子は天然源から単離するか、白血球から形成されるか、可能であれば化学的方法によって合成されるか、組み換え技術により調整されてもよい。好ましくはＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-６及びＩＦＮ-βである。
【００５８】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００５９】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等（編）, 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（例えば本明細書に開示した抗ＴＧＦ-β抗体、又場合によっては化学療法剤）の輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は細胞膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。
【００６０】
「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販用パッケージに通常含まれるインストラクションを意味するために使用される。
「心臓保護剤(cardioprotectant）」は、患者へのアントラサイクリン抗生物質及び／又は抗-ＴＧＦ-β抗体のような薬剤の投与に関連する心筋機能障害(すなわち心筋症及び／又はうっ血性心不全）を予防する又は減じる化合物或いは組成物である。心臓保護剤は、例えば、フリーラジカル媒介心毒性効果を妨害又は減じ及び／又は酸化的ストレス障害を防止或いは減じる。現定義で包含される心臓保護剤の例は、イオンキレート剤dexrazoxane(ICRF-187)(Seifertら，The Annals of Phamacotherapy 28:1063-1072(1994)）；脂肪低減剤及び／又はプロブコール(Singalら, J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063(1995)のような抗酸化剤；アミフォスチン(amifostine）(アミノチオール２-［(３-アミノプロピル)アミノ］エタンチオール-二水素リン酸塩エステル、またWR-2721と呼ばれている、及びWR-1065と呼ばれる、その脱リン酸化細胞取り込み型）及びS-3-(3-メチルアミノプロピルアミノ)プロピルホスホチオ酸(WR-151327)、Greenら，Cancer Research 54:738-741(1994)を参照のこと；ジゴキシン(Bristow, M.R. In : Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York : Elsevier 191-215[1980]）；メトプロロール(Hjalmarsonら，Drugs 47: Suppl 4:31-9[1994]; 及びShaddy ら，Am. Heart J. 129:197-9[1995]）のようなベーターブロッカー；ビタミンＥ；アスコルビン酸(ビタミンＣ）；オレアノール酸、ウルソル酸及びＮ-アセチルシステイン(ＮＡＣ）のようなラジカルスカベンジャー；アルファ-フェニル-ブチルニトロン(ＰＢＮ）のようなスピントラップ化合物(Paracchiniら，Anticancer Res. 13:1607-1612(1993)）；Ｐ２５１(Elbesen）のようなセレン有機化合物；類似物を含む。
【００６１】
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
「制御配列」なる表現は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及び、リボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸が他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸は「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのＤＮＡと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００６２】
ここで用いる、「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」なる表現は、本明細書では同義で使われ、すべてのそのような呼称は後代を含む。このように、「形質転換体」および「形質転換細胞」なる用語は、継代数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物を含む。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一であるというわけではないことが理解される。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。異なった呼称を意図する場合は、前後関係から明白となろう。
ここで使用される「生体試料」は、検出されるＴＧＦ-βを含有するか含有すると思われる任意の液体又は生物学的試料を意味する。試料には、体液、例としてヒト又は動物の体液、例えば血液、血清、尿、羊水、組織抽出物、脳脊髄液などが含まれる。貯蔵容器による変性、凝集又は吸収に対してその中に含有される成分の性質に従って、試料は、分析される前に抽出するなどの特別な処置を必要としてもよい。
【００６３】
ＩＩ．  ヒト化抗ＴＧＦ-β抗体の製造
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
他のヒト化抗体の作製方法は２００３年１月２３日出願の米国特許出願２００３／００１７５３４に記載されており、そこにはヒト化抗体及び抗体調整物はトランスジェニック非ヒト動物から産生される。非ヒト動物に遺伝的操作を加えて、トランスジェニック非ヒト動物で遺伝子再構成及び遺伝子転換が可能になるように一又は複数のヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含有させる。
【００６４】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００６５】
以下の実施例２には、ＴＧＦ-βに結合する例示的なヒト化抗-ＴＧＦ-β抗体の作製が記載される。本明細書中のヒト化抗体は、ヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメイン内に組み込まれた非ヒト高頻度可変領域残基を含んでなり、更に上掲のKabat等, による番号付けに従った可変ドメインの４８、４９、６７、６９、７１、７３及び７８からなる群から選択した位置にフレームワーク領域（ＦＲ）置換を含有する。一実施態様では、ヒト化抗体は２以上の位置４８、４９、６７、６９、７１、７３及び７８にＦＲ置換を含有する；他の実施態様では、それらの位置のうちの３又は４あるいはそれ以上にＦＲ置換を含有する。好ましい実施態様では、前記抗体は位置４９、６７及び７１、あるいは位置４８、４９及び７１、あるいは位置４９、６９及び７１、あるいは位置４９、６９、７１及び７３に、あるいは位置４９、７１及び７３、あるいは位置４９、７１及び７８にＦＲ置換を含有する。免疫原性を小さくするためによりフレームワーク置換よりも少ないが、最も重要なものとして効果を考慮する。実際に置換されたアミノ酸は免疫原性や効果を変えないように保存されていることが好ましい。位置４８のバリンがイソロイシンに変化されるのが好ましく、位置４９のアラニンがグリシンに変わっている、位置６７のフェニルアラニンがアラニンに変化され、位置６９のフェニルアラニンがアラニンに変異するのが好ましく、位置７１のアルギニンがアラニンに変化されるのが好ましく、位置７３のアスパラギンをリジンに変えるのが好ましく、そして位置７８のロイシンをアラニンに変えるのが好ましい。
【００６６】
本明細書中で対象とする例示的ヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及び／又はＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）、場合によってはこれらＣＤＲ残基のアミノ酸修飾、例えば抗体の親和性を基本的に維持する又は改良する修飾を含んでなる。例えば、対象とする抗体変異形は上記の可変重鎖ＣＤＲ配列内におよそ１からおよそ７つ又はおよそ５つのアミノ酸修飾を含んでもよい。そのような抗体変異形は例えば以下に示すような親和性成熟によって調整されうる。好ましくは、残基は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＮＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４２）又はＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）の２つ又はそれ以上、最も好ましくは３つすべて；及び／又はＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）である。最も好適なヒト化抗体は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号：４１）；ＶＩＮＰＧＳＧＧＳＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：４３）；及びＳＧＧＦＹＦＤＹ（配列番号：４４）を有するもの又は配列番号：４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含んでなる。
【００６７】
ヒト化抗体は、例えば前段落の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）残基ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：３６）又はＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡ（配列番号：３７）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：３８）又はＹＡＳＳＬＱＳ（配列番号：３９）；及び／又はＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：４０）を含んでなる。場合によってはこのようなヒト化抗体は、上記のＣＤＲ残基のアミノ酸修飾、例えば抗体の親和性を基本的に維持する又は改良する修飾を含んでなる。例えば、対象とする抗体変異形は上記の可変軽鎖ＣＤＲ配列内におよそ１からおよそ７つ又はおよそ５つのアミノ酸修飾を含んでもよい。そのような抗体変異形は例えば以下に示すような親和性成熟によって調整されうる。好ましくは、残基は、ＲＡＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号：３６）；ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：３８）；及び／又はＨＱＹＬＳＳＤＴ（配列番号：４０）の２つ又はそれ以上、最も好ましくは３つすべてである。最も好適なヒト化抗体は、配列番号：３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含んでなる。
また、本出願はＴＧＦ-βに結合する親和性成熟抗体も包含する。親抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であり、例えば配列番号：３及び４の重鎖配列及び／又は可変軽鎖をそれぞれ含んでなるもの（すなわちバージョン５）であってもよい。親和性成熟抗体はマウス２Ｇ７又は変異形５よりも優れた親和性をもってＴＧＦ-βに結合するのが好ましい（例えばＴＧＦ-β細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡによる評価などで、およそ２倍ないしはおよそ４倍〜およそ１００倍ないしはおよそ１０００倍の親和性の改善）。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が、考えられる。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１抗体であってもよい。
【００６８】
ヒト化抗体の抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第93/16185号；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。
【００６９】
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＴＧＦ-βタンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体ではＨＥＲ-２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ及び／又はＥｒｂＢ３に対する結合部位と、ＴＧＦ-β結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＴＧＦ-βアームは、ＴＧＦ-β発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＧＦ-βを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＧＦ-β結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
WO1996/16673には、抗-ＴＧＦ-β／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗-ＴＧＦ-β／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＴＧＦ-β／Ｆｃα抗体はWO1998/02463、二重特異性抗-ＴＧＦ-β／抗-ＣＤ３抗体を教示する米国特許第5,821,337号に示されている。
【００７０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がWO1993/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００７１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、WO1994/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００７２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第4,676,980号）及びＨＩＶ感染の治療（WO1991/00360、WO1992/200373及びEP03089）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に例えば米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００７３】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＴＧＦ-βレセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００７４】
ＴＧＦ-β活性を中和、拮抗又は阻害する能力、例えば文献に定義されるような少なくとも一の望ましくない成長阻害、免疫抑制、間質形成（炎症性細胞、上皮性細胞及び線維芽細胞を含む間質性因子）、又は成熟ＴＧＦ-βの足場非依存性成長促進活性を評価することによって抗体の成長阻害効果を評価してもよい。したがって、抗体は腫瘍及びサプレッサーリンパ細胞（Ｔ細胞）によって産生されるすべての内在性ＴＧＦ-βの活性を遮断することができる。そのような中和を測定する方法は、Ｍｖ-３Ｄ９などのミンク肺線維芽細胞株の３Ｈ-チミジン取り込み阻害によるものであり、そこで抗体の濃度が増加すると、ＴＧＦ-βの活性は直線的又は非直線的に着実に減少する。ミンク肺細胞株はＴＧＦ-βの成長阻害活性に対してとても敏感であり、比較的に容易に測定することができる。一般的に、２ｍＭ グルタミン及び５％胎仔ウシ血清を含有する最小必須培地中で３７℃、５％ＣＯ２にて１８−２４時間、ＴＧＦ-βと抗体の混合物と共に細胞をインキュベートした後、２０μｌ中に１μＣｉの３Ｈ-チミジンを与え、３７℃で４時間経過後に回収することによってアッセイを行う。好ましくは、抗体はＴＧＦ-βにより、モノクローナル抗体２Ｇ７よりも細胞増殖を抑制するであろう。抗体の成長阻害効果を評価する他の方法は、以下の実施例のようにマウスメサンギウム細胞増殖アッセイにおけるＴＧＦ-βの阻害を試験することである。また、本明細書中の抗体は、ＴＧＦ-βレセプター（例えばＭｖ１Ｌｕ細胞株などのミンク肺線維芽細胞株、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ-６４としてＡＴＣＣより入手可能）を含有する細胞と共に放射性標識したＴＧＦ-β（例えば放射性標識ｒｈＴＧＦ-β１）と抗体との混合物をインキュベートして、該抗体が該レセプターに対する標識ＴＧＦ-βの結合を阻害するかどうかを測定するといった従来法の放射性レセプターアッセイ又はレセプター結合アッセイに有用である。
【００７５】
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばＰＩ、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いをコントロールと比較して求める。好ましいアッセイは「ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取込みアッセイ」である。このアッセイでは、ＢＴ４７４細胞(アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション[Manassas, VA])が、ダルベッコの変性イーグル培地(D-MEM)；１０％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを補ったハムのＦ-１２(５０：５０)で培養される。(従って、アッセイは補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる)。ＢＴ４７４細胞を１００ｘ２０ｍｍ皿に、皿当たり３ｘ１０６の密度で播種し、一晩付着させたままにする。ついで培地を除去し、新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン処理により分離する。ついで、１２００ｒｐｍ、５分間、４℃で細胞を遠心分離し、ペレットを３ｍｌのＣａ２＋結合氷冷バッファー(１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２)に再懸濁させ、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(商品名）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。ＰＩ取込みにより測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体が選択される。
アポトーシスを誘発する抗体を選択するためには、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイが利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養し、先の段落において記載したように皿に播種する。ついで培地を回収し、新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。３日間インキュベートした後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。ついで細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋結合氷冷バッファーに再懸濁させ、細胞死アッセイに対して上述したようにチューブに等分する。ついでチューブに標識化アネキシン(例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ)(１μｇ／ｍｌ)を入れる。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(商品名）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。対照に対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘発する抗体がアポトーシス誘発抗体として選択される。
【００７６】
アネキシン結合アッセイに加えて、ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色アッセイが利用できる。このアッセイを行うために、先の２段落に記載したように関心のある抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２(商品名）蛍光色素プローブと共にインキュベートし、ついでＭＯＤＦＩＴＬＴ(商品名）ソフトウエア(Verity Software House)を使用し、ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ(商品名）フローサイトメータ(Coulter Corporation)で分析する。このアッセイを使用し、未処理細胞(最大１００％のアポトーシス細胞)よりも２倍又はそれ以上(好ましくは３倍以上)のアポトーシス細胞のパーセンテージの変化を誘発する抗体が、プロアポトーシス抗体として選択される。
関心のある抗体により結合したＴＧＦ-β上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。別法として、従来から公知の方法により、エピトープマッピングを実施することもできる。
【００７７】
また本発明はここで記載され、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒又はそれらの断片)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に抱合した抗体を含有する免疫コンジュゲートに関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。抗体のコンジュゲート及び一つ以上の小分子毒素、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号）、トリコテン(trichothene）及びＣＣ１０６５抗癌剤もここにおいて考慮される。
本発明の一つの好ましい実施態様では、抗体は、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子）と共役している。マイタンシンは、例えばＭａｙ−ＳＨ３へ還元されるＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)−抗体免疫コンジュゲートを生じる。
その他の対象免疫コンジュゲートは、一つ以上のカリケアマイシン(calicheamicin)分子と共役している抗ＴＧＦ-β抗体を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチルγ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１（Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998)）を含む。また、米国特許第5,714,586号；5,712,374号；5,264,586号；及び5,773,001号参照、文献明示によりここに取り込む。
【００７８】
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日に公開の国際公開第1993/21232を参照のこと。
本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；DNA分解酵素）をともなう化合物との間に形成される免疫コンジュゲートについて考慮する。
種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗ＴＧＦ-β抗体の生成に利用できる。具体例にはＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射線各種が含まれる。
【００７９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、スクシインミジル１-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開１９９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に弱いリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら，Cancer Research 52:127-131[1992]）を使用してもよい。
あるいは、抗ＴＧＦ-β抗体及び細胞毒性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体がコンジュゲートされ得、ここで、抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【００８０】
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えばWO88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤、５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
本発明に有用な酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＴＧＦ-β抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を好適な酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312:604-608(1984)参照。
【００８１】
抗体の他の修飾がここで検討される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合されてもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol編(1980)に開示されている。
ここで開示されている抗ＴＧＦ-β抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら,J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
【００８２】
ＩＩＩ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
また、本発明は、ヒト化抗ＴＧＦ-β抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含んでなるベクター及び宿主細胞、及び抗体の産生のための組み換え技術を提供する。
抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手法を用いて(例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって）配列決定される。多くのベクターが公的に入手可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
【００８３】
（ｉ）シグナル配列成分
この発明の抗ＴＧＦ-β抗体は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗ＴＧＦ-β抗体シグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対して、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母での分泌に対して、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、好ましくは、抗ＴＧＦ-β抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【００８４】
（ｉｉ）複製起点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる)。
【００８５】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗ＴＧＦ-β抗体コード化核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。
【００８６】
あるいは、抗ＴＧＦ-β抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシのキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による、組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００８７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗ＴＧＦ-β抗体コード化核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗ＴＧＦ-β抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ（配列番号：４７）領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ（配列番号：４８）配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【００８８】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域である。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータは欧州特許７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【００８９】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗ＴＧＦ-β抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００９０】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗ＴＧＦ-β抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗ＴＧＦ-β抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００９１】
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'末端、時には３'末端の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗ＴＧＦ-β抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第１９９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００９２】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
【００９３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＴＧＦ-β抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用できる、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化抗ＴＧＦ-β抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。
【００９４】
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))、DG44 (Urlaub等, Som. Cell and Mol. Gen., 12: 555-566 (1986))及びDP12細胞株)；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗ＴＧＦ-β抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９５】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗ＴＧＦ-β抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、例えばHam等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９６】
（ｉｘ）抗ＴＧＦ-β抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎＴＭ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰｅｌｌｉｃｏｎＴＭの限外濾過装置を用いて濃縮する。フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９７】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９８】
ＩＶ．医薬製剤
本発明に従って用いられる抗体の治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液製剤又は凍結乾燥の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。好適な凍結乾燥した抗ＴＧＦ-β抗体製剤は国際公報１９９７／０４８０１に記載されており、出典明記により特別にここに組み込まれる。
【００９９】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。例えば、一製剤中の血管上皮性成長因子（ＶＥＧＦ）抗原、ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ３、ＴＧＦ-β（例えばＴＧＦ-β上の異なるエピトープに結合する抗体）、ＥＧＦＲ、又はＨＥＲ-２に結合する抗体をさらに提供することが好ましい。あるいは、又は更に、前記組成物は化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、ＴＧＦ-β標的剤、抗血管形成剤、及び／又は心筋保護剤を含んでもよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本抗体を含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１００】
Ｖ．抗ＴＧＦ-β抗体を用いた治療
本発明では、抗ＴＧＦ-β抗体が様々な疾患又は疾病を治療するために用いられうることを意図する。例示的症状又は疾患には、良性又は悪性の腫瘍；白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；及び神経系、神経膠性、星状細胞性、視床下部系、腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胚盤胞性、炎症性、血管形成性、免疫系疾患などの他の疾患が含まれる。
通常、治療される疾患は、ＴＧＦ-β疾患、最も好ましくは癌である。本願明細書において治療される癌の例は、上皮癌、芽細胞腫及び肉腫、及び特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍を含むが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例は、扁平上皮細胞癌（例えば上皮の扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む消化器又は胃癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎又は腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌、並びに頭頸部癌がある。
一実施態様では、癌は、ＴＧＦ-βレセプターを発現する（及び過剰発現しうる）ものである。ＴＧＦ-βレセプター（一又は複数）を発現／過剰発現しうる癌の例には、扁平上皮細胞癌（例えば上皮の扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む消化器又は胃癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓又は腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌、並びに頭頸部癌が含まれる。しかしながら、本願明細書中の抗体によって治療される癌は、単にＴＧＦ-βレセプターを発現又は過剰発現させるものでない任意の癌であってもよい。
【０１０１】
本願明細書中の治療される癌がＴＧＦ-βレセプターの過剰な活性化に特徴がある場合、このような過剰な活性化はＴＧＦ-βレセプターの過剰発現又は産生増加に起因しうる。本発明の一実施態様において、診断用アッセイ又は予後アッセイは、患者の癌がＴＧＦ-βレセプターの過剰な活性化に特徴があるかどうかを決定するために行う。例えば、癌におけるＴＧＦ-βレセプターの過剰発現及び／又はＴＧＦ-β遺伝子増幅を測定してもよい。このような増幅／過剰発現を決定するための様々なアッセイは、当分野で有用であり、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）；ＦＩＳＨ、サザンブロッティング又はＰＣＲ技術である。
さらに、インビボ診断検査法を用いて、例えば検出される分子を結合して、検出可能な標識（例えば放射性同位体）を付加される分子（例えば抗体）を投与して、外部から患者を標識の局在についてスキャンすることによって、ＴＧＦ-βレセプター過剰発現又は増幅を評価してもよい。
本願明細書中のヒト化抗体がインビボ及びインビトロ両方の試験においてＴＮＦ-αの腫瘍減少活性を上げるかどうか決定するために有用なアッセイを以下に挙げる：
【０１０２】
Ａ．細胞傷害能アッセイ手順
Ｌ-９２９アッセイ系は、場合によっては免疫機能の適当な調節因子と連動して本願明細書の抗体の活性の迅速な測定ができるようにする便利なインビトロアッセイである。Carswell等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3666 (1975)のインビボ腫瘍壊死アッセイとの相関の程度は現在知られていない；しかしながら、マウスの腫瘍細胞を特に利用するので、相互関係は高いと思われる。タンパク質腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α）及びリンホトキシン（ＴＮＦ-β）はこのアッセイにおいて活性を与える。前記アッセイは、マウスのＬ-Ｍ細胞及びメチレンブルー染色を用いる米国特許第４,４５７,９１６号に開示される概念に類似である。しかしながら、Ｌ-９２９アッセイは、ヒト腫瘍細胞株細胞障害性と相関する（ＨＬ-６０細胞由来のＴＮＦ-αについて）ことが示された。
本願明細書中のＬ-９２９アッセイ系において、マイクロタイタープレートの単層としてＬ-929細胞を終夜調製される。最もよい試料をプレートに対して２倍に希釈し、ＵＶを照射し、調製された細胞単層上に加える。次いで、ウェル中の培養液に１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを加える。プレートを３７℃で１８時間インキュベートし、プレートを顕微鏡の下で視覚的にスコア化する。各々のウェルに、ウェル中の細胞死の範囲を示し、２５、５０、７５又は１００％のマークを付ける。１単位のＴＮＦ活性は、５０％殺傷が起こるときの希釈物の相互作用として定められる。
【０１０３】
Ｂ．インビボアッセイ
また、腫瘍の成長を殺すか又は抑制して、死亡から腫瘍を有する動物を保護するために抗ＴＧＦ-β抗体の能力を用いて活性について調整物を試験してもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、局所化された腫瘍を引き起こすために、皮下に様々な形の腫瘍細胞を注射される。腫瘍細胞株は、ＭｅｔｈＡマウス線維肉腫（腹水液由来の細胞懸濁液として得られたもの）及びＭＣＦ-７（１ｍｍ３凝集塊の細胞として投与されるヒト胸部肉腫）を含む。
アッセイのために、０．１ｍｌの培養液中に５×１０５の線維肉腫細胞を含有する懸濁液又はＭＣＦ-７凝集塊の何れかを２６ゲージ針によって、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１９−２２ｇ）の皮下に注射する（線維肉腫懸濁液は、細胞の計数と無血清培地での希釈によって８日齢の腹水液から調製する）。９−１０日後、腫瘍が触診可能になるときに、マウスにつき１μｇのＴＮＦ-αを静脈内に注入し、その後ＴＮＦ-α投与を必要に応じて繰り返す。結果は、腫瘍容量の測定と生存率によって評価する。試験は、マウスにつき１０ｍｇ／ｋｇの抗体４Ａ１１と１μｇのＴＮＦ-αを別々に注入して試験を繰り返す。試験抗体を、活性についてこれらの薬剤に対して比較する。
治療される癌がホルモン非依存性癌である場合、ホルモン（例えばアンドロゲン）及び／又は腫瘍の同系レセプターの発現を以下に示す有用な様々なアッセイの何れかを用いて評価してもよい。あるいは、又はさらに、患者は、患者が抗アンドロゲン物質治療にもはや応じないという点でホルモン非依存性癌があると診断されてもよい。
ある種の実施形態では、細胞障害性薬剤と接合される抗ＴＧＦ-β抗体を含んでなる免疫コンジュゲートが、患者に投与される。好ましくは、免疫コンジュゲート及び／又は結合するＴＧＦ-βタンパク質が細胞内に移行すると、それが結合する癌細胞を殺す際に免疫コンジュゲートの治療有効性が増す。好ましい実施態様では、細胞障害性薬剤は癌細胞の核酸を標的とするか妨げる。このような細胞障害性薬剤の例は、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ＲＮＡ分解酵素、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０１０４】
抗ＴＧＦ-β抗体又は免疫コンジュゲートは、公知の手段に従って、例えば静脈内投与、例えば、ボーラス、又は一定期間にわたる持続的注入によって、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液腔内、くも膜下腔内、経口、局所、又は吸入手段によって、ヒト患者に投与される。抗体の静脈内、腹膜内、又は皮下投与が好適であり、皮下又は腹膜内が特に好ましい。治療される特定の哺乳動物、抗体の種類及び当業者に周知の他の因子によって、１週につき約２−３回の投与計画が好ましい。しかしながら、他の投与計画は本願明細書中で操作可能である。
他の治療的投薬計画は、抗ＴＧＦ-β抗体の投与を組み合わせてもよい。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬製剤の同時投与、及び何れかの順番での連続的な投与を含むものであり、両方の（又はすべての）活性薬剤が同時にそれらの生物活性を発揮する時間があることが好ましい。
ある好ましい実施態様では、患者は、２の異なる抗ＴＧＦ-β抗体によって治療される。
また、抗ＴＧＦ-β抗体又は抗体の投与を他の腫瘍関連抗原に対する抗体の投与と併用するのも望ましい。この症例の他の抗体は、例えば、抗原、例としてＨＥＲ-２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）又はＢ細胞表面マーカ又は抗原（結合するアンタゴニストを用いて標的とされるＢ細胞の表面に発現される抗原）と結合してもよい、例えばＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面マーカー（説明のために、The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, 編集 Barclay等 Academic Press, Harcourt Brace & Co., New Yorkを参照のこと）。他のＢ細胞表面マーカーは、ＲＰ１０５、ＦｃＲＨ２、Ｂ細胞ＣＲ２、ＣＣＲ６、Ｐ２Ｘ５、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＣＸＣＲ５、ＦＣＥＲ２、ＢＲ３、Ｂｔｉｇ、ＮＡＧ１４、ＳＬＧＣ１６２７０、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＡＴＷＤ５７８、ＦｃＲＨ３、ＩＲＴＡ１、ＦｃＲＨ６、ＢＣＭＡ、及び２３９２８７が含まれる。特に対象とするＢ細胞表面マーカーは、哺乳動物の他の非Ｂ細胞組織と比較してＢ細胞上に優先して発現され、前駆体Ｂ細胞上及び成熟Ｂ細胞上の両方に発現されうる。本願明細書中の好適なＢ細胞表面マーカーはＣＤ２０及びＣＤ２２である。他の態様において、ＴＧＦ-β抗体は抗血管形成薬剤と結合されてもよく、それは血管新生を阻害するために作用する。例えば、ＶＥＧＦ、例えば抗体に対するアンタゴニストであるＡＶＡＳＴＩＮＴＭである。
【０１０５】
一実施態様では、本発明の治療は、抗ＴＧＦ-β抗体（または複数の抗体）、および一又は複数の哺乳動物の免疫機能の調節因子、例えばサイトカイン並びに化学療法剤又は成長阻害剤の組み合わせ投与を含んでなるものであり、異なる化学療法剤のカクテル同時投与を含む。好適な化学療法剤にはタキサン（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）及び／又はアントラサイクリン抗生物質が含まれる。そのような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の指示に従って使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service M.C.Perry編, Williams ＆Wilkins, Baltimore, MD(1992)に記載されている。
抗体は、タモキシフェンなどの抗-エストロゲン化合物、又はアナストロゾールなどのアロマターゼ阻害剤；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第616,812号を参照)；又は抗-アンドロゲン、例えばフルタミドの抗ホルモン化合物を、このような分子に対して既知の投薬量で組合せてもよい。治療される癌がホルモン非依存性の場合、患者は既に抗ホルモン療法の対象とされており、癌がホルモン非依存性になった後には抗ＴＧＦ-β抗体（及び場合によっては本明細書に記載したような他の薬剤）が患者に投与されてもよい。
ときに、心臓保護剤(治療に関する心筋機能障害を防止する又は減少するために)又は一又は複数のサイトカインを患者にを同時投与することも適している。また細胞障害性剤を同時投与してもよい。前記の治療法に加えて、患者は、癌細胞の除去手術及び／又は放射線治療を受けてもよい。
【０１０６】
ここでの抗ＴＧＦ-β抗体はまた、相補的な、及び潜在的に相乗的な治療効果を生じるように、定義の章で前記したようなＥＧＦＲ-標的薬と組み合わされてもよい。
前記の同時投与される任意の薬剤の適した投与量は、現在使用されている投与量で、薬剤と抗ＴＧＦ-β抗体の組み合わせ作用(相乗効果)に応じて少なくしてもよい。
病気の予防又は治療のための抗体の適切な投与量は、上述するように、治療される病気の種類、病気の重症度及び過程、抗体を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。病気の種類及び重症度に応じて、疾患のタイプや重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、約０．１−約２０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が患者への最初の投与量の候補である。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、症状に応じて、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。
抗体の好ましい投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量(又はその任意の組み合わせ)で、患者に投与されてもよい。これらの用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に投与されうる(例えば、患者は、抗ＴＧＦ-β抗体の約２から約２０、例えば約６用量を受ける)。高い初負荷用量は、一又hあ複数の低用量の後に投与されうる。例示的な用法は、約４ｍｇ／ｋｇの初負荷用量を、毎週約２ｍｇ／ｋｇの抗ＴＧＦ-β抗体を維持した後に投与することを含む。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。この治療の進行状態は通常の技術やアッセイで容易にモニターされる。
【０１０７】
あるいは、抗体は、放射線学的治療 ― 照射又は放射性物質の導入 ― UICC (編集), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)に示されるものなど組み合わせて又は連続的に投与されるのが好ましい。
患者への抗体タンパク質の投与のみならず、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与についても検討する。抗体をコードする核酸のこのような投与は、「治療的効果量の抗体の投与」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を産生させるための遺伝子療法の使用に関する1996年3月14日に公開のWO96/07321参照。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はアンタゴニストが必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０１０８】
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、WO 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
【０１０９】
ある特定の実施態様では、癌、例えば肺癌、メラノーマ、乳癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵癌又は前立腺癌が、哺乳動物にＴＧＦ-β抗体及びＶＥＧＦに結合する抗体を、場合によっては前記した他の好適な任意の薬剤と共に投与することによって、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて治療される。好ましくは、ＴＧＦ-β抗体はモノクローナル抗体、より好ましくはＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３の何れか一又は一以上に結合するものであり、及びより好ましくは、少なくともＴＧＦ-β１、又はＴＧＦ-β１とＴＧＦ-β２と結合するものであり、最も好ましくは本明細書中に記載したヒト化抗体である。他の実施態様では、ＶＥＧＦと結合する抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは、ＶＥＧＦを遮断又は中和する、及び／又はそのレセプターの一又は両方へのＶＥＧＦ結合を遮断する。
【０１１０】
ＶＩ．  製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器、ラベル及び容器上又は容器に貼付されるパッケージ挿入物を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、ガラス瓶、シリンジ等が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はガラス瓶であってよい)。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本明細書中のヒト化抗ＴＧＦ-β抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物には、組成物が、選択された病状、例えば癌の治療に使用されることが示されている。一実施態様では、ラベル又はパッケージ挿入物は、前記抗体を含む組成物がＴＧＦ-β疾患の治療、例えばＴＧＦ-βレセプターを発現する癌の治療に使用できることを示している。更に、ラベル又はパッケージ挿入物は、治療される患者がＴＧＦ-βレセプターの過剰な活性に特徴がある癌を有することを示してもよい。また、ラベル又はパッケージ挿入物は、前記組成物が癌の治療に使用することができ、この癌がＴＧＦ-βレセプターの過剰発現の特徴を有さないことを示していてもよい。他の実施態様では、パッケージ挿入物は抗体又は組成物が乳癌（例えば転移性乳癌）；ホルモン非依存性癌；前立腺癌（例えばアンドロゲン非依存性前立腺癌）；肺癌（例えば非小細胞肺癌）；大腸癌、直腸癌又は結腸直腸癌；又は本明細書に開示した任意の他の疾患又は疾病の治療に使用することができることを示してもよい。
【０１１１】
更に製造品は、(ａ)本明細書中のヒト化抗体を含んでなる組成物を容器内に含有された第1の該容器、及び（ｂ）ヒト化抗体以外の治療剤を含んでなる組成物を容器内に含有された第２の該容器を含んでなるものでもよい。本発明の該実施態様の製造品は、第１及び第２の組成物が癌などのＴＧＦ-β疾患の治療のために組み合わせて使用することができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでもよい。そのような治療剤は前節で記載した何れかの補助剤でもよい(例えば、化学療法剤、抗血管形成剤、抗ホルモン化合物、心臓保護剤及び／又はサイトカインを含む哺乳動物の免疫機能の調節因子)。あるいは、又は加えて、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば、注入のための静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第２（又は第３）の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
【０１１２】
ＶＩＩ．抗ＴＧＦ-β抗体の非治療的な使用
本明細書の抗体（例えばヒト化抗ＴＧＦ-β抗体）は更に非治療的な適用がある。
例えば、本抗体を親和性精製作用剤として用いてもよい。この過程において、当分野で公知の方法を用いて抗体をＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ樹脂又は濾紙などの固相に固定する。固定された抗体は精製されたＴＧＦ-βタンパク質（又はその断片）を含む試料に接触させて、その後、固定された抗体に結合するＴＧＦ-βタンパク質以外の試料中の実質的に全ての材料を除去するような適切な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を、他の適切な溶媒、例えば、ＴＧＦ-βタンパク質を抗体から放出させるグリシン緩衝液、ｐＨ５．０によって洗浄する。
また、抗ＴＧＦ-β抗体は、ＴＧＦ-βタンパク質についての診断アッセイ、例えば、特異的な細胞、組織又は血清中の発現を検出するための診断アッセイに有用であるかもしれない。
【０１１３】
診断用の使用のために、一般的に抗体を検出可能な成分で標識するであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
（ａ）ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希有土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリンおよびテキサス赤のような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えばｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて）か、またはエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１１４】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆（例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン（ＯＰＤ）又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４,２７５,１４９号および４，３１８，９８０を参照。
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
【０１１５】
本発明の他の実施態様において、抗ＴＧＦ-β抗体は標識する必要がなく、その存在をＴＧＦ-β抗体と結合する標識した抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイに用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
免疫組織化学において、腫瘍サンプルは新鮮なものでも、凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、防腐剤、例えばホルマリンなどで固定されていてもよい。
また、抗体は、インビボ診断検査法に用いられてもよい。通常例えば、腫瘍がイムノシンチグラフィを用いて局所化されるように、抗体を放射性核種（例えば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓ）で標識する。
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断アッセイを実行するための指示書とともに予め定められた総計でパッケージされ組み合わされた試薬で提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファ又は溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれうる。様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感受性を最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範囲に変化していてもよい。特に、溶解して好適な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬が提供されうる。
【０１１６】
また、本願明細書中の抗体は、インビボ画像診断に有用であり、ここで、標識された抗体は宿主、好ましくは血流に投与され、宿主内の標識抗体の存在及び位置がアッセイされる。この映像技術は足場及び新生物の治療において最適に用いられる。抗体は、例えば核磁気共鳴又は当分野で公知の他の方法によって検出可能な非放射性指示薬を含む宿主内で検出可能である任意の成分で好適に標識される。しかしながら、標識は、ヨウ素、例えば１２５Ｉ及び１３１Ｉ、セレニウム、二機能性キレート、銅、例えば６７Ｃｕ、テクネチウム、例えば９９ｍＴｃ、及びレニウム、例えば１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅを含む放射標識であることが好ましい。放射性同位体は、金属キレート化合物又はラクトペルオキシダーゼ又はヨウ素化のヨードジェン(iodogen)技術を含む任意の方法によってタンパク質に接合する。
マウスモノクローナル抗体２Ｇ７は、９／２８／８９のＨＢ１０２４０としてアメリカ培養細胞系統保存機関、10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC)）に寄託された；そして、マウスモノクローナル抗体４Ａ１１は、９／２８／８９のＡＴＣＣ  ＨＢ１０２４１として寄託された。
本発明の更なる詳細は、以下の限定するものでない実施例で例示する。本明細書中の全ての引用文献の開示内容は出典明記により確かに本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１７】
実施例１  モノクローナル抗体２Ｇ７及び４Ａ１１の産生及び特徴付け
Ａ．アッセイ手順
Ｉ．ＥＬＩＳＡ決定法
９６ウェルポリスチレンアッセイプレートを、１μｇ／ｍｌの精製されたＴＧＦ-β１を含むｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液１００μｌ／ウェルにて４℃で１８時間、コートした。コートプレートを、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＢＰＢＳと称する）にて２２℃で１時間ブロックし、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０ＴＭ界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴと称する）にて洗浄し、１００μｌのハイブリドーマ上清にて２２℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、結合した抗体をペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ(Tago, Burlingame, CA)にて検出した。プレートをＰＢＳＴにて洗浄して、ｏ―フェニレンジアミン二塩化水素化物基質を１００μｌ／ウェルで添加した。反応を１５分後に止めて、４９２ｎｍの光学密度をＵＶＭＡＸＴＭプレートリーダー(Molecular Devices, Palo Alto, CA)にて測定した。
【０１１８】
ＩＩ．ｒＴＧＦ-β１のヨウ素化
精製されたＴＧＦ-β１を、ＣＨＬＯＲＡＭＩＮＥ  ＴＴＭｎ-クロロ-パラ-トルエンスルホンアミドナトリウム塩(Greenwoodら, Biochem. J., 89: 114 (1963))を用いた変更手順によってヨード化した。簡潔には、２０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌのＣＨＬＯＲＡＭＩＮＥ  ＴＴＭｎ-クロロ-パラ-トルエンスルホンアミドナトリウム塩の添加をその都度２分間インキュベーションしながら３回繰り返すことによって、氷上で１０μｇの精製されたｒＴＧＦ-β１を１ｍＣｉのＮａ１２５Ｉにて標識した。２０μｌの５０ｍＭ Ｎ-アセチルチロシン、１Ｍ ヨードカリウムに続いて、２００μｌの８Ｍ 尿素を連続的に添加することによって前記反応を止めた。ヨード化されたｒＴＧＦ-β１を、Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ及びトリフルオロ酢酸／アセトニトリル勾配によって遊離Ｎａ１２５Ｉから分離し、メインピークを含有する分画を貯めて、−７０℃で保存した（比活性１１２μＣｉ／μｇ）。
【０１１９】
ＩＩＩ．抗原捕獲放射性免疫アッセイ
ＩＭＭＵＮＬＯＮＴＭ  ２「ＲＥＭＯＶＡＷＥＬＬ」ＴＭマイクロタイター細片(Dynatech, Chantily, VA)を、５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ (Boehringer Mannheim)を含有する炭酸塩ｐＨ９．６にて４℃で１８時間コートした。ウェルをＰＢＳＴにて洗浄し、０．１％ゼラチンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＧと称する）によってブロックし、ＰＢＳＴにて洗浄し、ハイブリドーマ上清にて２２℃で４時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴにて洗浄し、およそ７５，０００ＣＰＭ／ウェルの１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１を含有する０．１％ゼラチン、ＰＢＳＴ１００μｌを添加し、２２℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、結合した１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１をＧＡＭＭＡＭＡＳＴＥＲＴＭカウンタ(LKB, Sweden)にて数量化した。
【０１２０】
ＩＶ．１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-βの免疫沈降法
また、抗ＴＧＦ-βモノクローナル抗体の特異性を、１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１又はブタ血小板由来１２５Ｉ-ＴＧＦ-β２（R & D Systems, Minneapolis, MN；比活性１０３．４μＣｉ／μｇ）の免疫沈降能によって評価した。２μｇの精製されたモノクローナル抗体を、５×１０４ＣＰＭの１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１又は１２５Ｉ-ＴＧＦ-β２とともに２２℃で２時間インキュベートした。免疫複合体を、ウサギ抗マウスＩｇＧ (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)でコートしたプロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭアガロース(Repligen, Cambridge, MA)にてペレット化し、ＰＢＳＴにて続けて３回洗浄した。前記複合体を、還元能を有するサンプルバッファを用いてプロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭアガロースから解離させ、１２％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）に電気泳動し、オートラジオグラフィにさらした。
【０１２１】
Ｖ．ＴＧＦ-βモノクローナル抗体の親和性測定
Marianiら, J. Immunol. Methods, 71: 43 (1984)に記載される固相抗体法手順を用いて、ＴＧＦ-βに特異的なモノクローナル抗体の親和性を決定した。簡潔には、精製された抗ＴＧＦ-βモノクローナル抗体をＩＭＭＵＮＬＯＮＴＭ２「ＲＥＭＯＶＡＷＥＬＬ」ＴＭマイクロタイター細片上に、ｐＨ９．６炭酸塩緩衝液にて４℃で１８時間コートした。ウェルを洗浄して、上記の通りにブロックした。４００００ＣＰＭ／ウェルの１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１又はブタ１２５Ｉ-ＴＧＦ-β２(R & D Systems)の何れかを含む５０μｌのＰＢＳＧを、５０μｌのＰＢＳＧ中、２５００から９．７ｎｇ／ウェルの範囲の非標識ｒＴＧＦ-β１又はブタＴＧＦ-β２の２段階希釈液に添加した。結果として生じる混合物を４℃で１８時間インキュベートした。ウェルを洗浄して、上記の通りに計数し、親和定数をスキャッチャード分析(Munson及びPollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980))によって測定した。これはAntoni及びMariani, J. Immunol. Meth., 83: 61 (1985)の非線形回帰分析として同様の結果を得る。
【０１２２】
ＶＩ．腹水液からのモノクローナル抗体の精製
上記のアッセイにおいて陽性であった抗体を分泌している親のハイブリドーマ培養物を、限界希釈によってクローン化し、ＰＲＩＳＴＡＮＥＴＭプライマにてＢａｌｂ／ｃマウス(Potterら, JNCI, 49: 305 (1972))の腹水液中で生育した。モノクローナル抗体は、プロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭアガロースによって腹水液から精製し、確立された手順(Goding, J. Immunol. Methods, 20: 241 (1978))を用いて０．１Ｍ 酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ２．４にて溶出し、４℃でＰＢＳ中に無菌的に保存した。
【０１２３】
ＶＩＩ．インビトロＴＧＦ-β特異的活性のモノクローナル抗体中和
インビトロＴＧＦ-βアッセイでは、ミンク肺線維芽細胞細胞株、Ｍｖ-３Ｄ９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ-６４としてアメリカ培養細胞系統保存機関, Manassas, VAより入手可能なＭｖ１Ｌｕ由来のサブクローン）を用いた。簡潔には、精製された抗ＴＧＦ-βモノクローナル抗体及び対照を、いずれのｒＴＧＦ-β１、天然のブタＴＧＦ-β２ (R & D Systems)）、又はｒＴＧＦ-β３(Derynck等, Nature, 上掲)の何れかとともに、最終濃度１０００〜２０００ｐｇ／ｍｌ、４℃で１８時間インキュベートした。この混合物５０μｌを９６ウェルマイクロタイタープレートに添加して、次いで、２ｍＭ グルタミン及び５％ ウシ胎児血清を含有する最小必須培地 ５０μｌ中の１×１０４個のＭｖ-３Ｄ９細胞を添加して、５％ ＣＯ２、３７℃で１８〜２４時間インキュベートした。ウェルは１μＣｉの３Ｈ-チミジン ２０μｌにてパルス化して、３７℃で４時間後に回収し、シンチレーションカウンタにて計数した。ＴＧＦ-β標準物質の各希釈液について３Ｈ-チミジン取り込みの阻害割合を用いて、陰性対照モノクローナル抗体及びＴＧＦ-β特異的モノクローナル抗体治療試料のｐｇ／ｍｌにおいてＴＧＦ-β活性を予測した。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．モノクローナル抗体のイソタイピング
ＴＧＦ-β１反応性モノクローナル抗体のイソタイピングは、ＰＡＮＤＥＸＴＭ蛍光スクリーン機械技術を用いて行った。ラット抗マウスＩｇＧ抗血清コートポリスチレン粒子を用いて、ＰＡＮＤＥＸＴＭ９６ウェルアッセイプレートに分注した培養液上清からモノクローナル抗体を結合した。プレートを洗浄して、ＦＩＴＣコンジュゲートラットモノクローナル抗-マウスイソタイプ特異的試薬(Becton Dickinson Monoclonal Center)を加えた。結合した蛍光を、ＰＡＮＤＥＸＴＭ蛍光スクリーン機械技術によって定量化した。
【０１２５】
ＩＸ．エピトープ分析
精製された抗ｒＴＧＦ-β１モノクローナル抗体を、Nakane及びKawaoi, J. Histochem. Cytochem., 22: 1084 (1974)の方法によって、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた。ｒＴＧＦ-β１コートプレートを、５０μｇ／ｍｌの精製された抗ｒＴＧＦ-β１又はＰＢＳのネガティブ対照とともに２２℃で２時間インキュベートした。次いで、抗ｒＴＧＦ-βモノクローナル抗体-ＨＲＰコンジュゲートの所定の希釈液をプレートに加え、２２℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄して、基質を加え、上記のように反応を定量化した。異種性の抗ｒＴＧＦ-β１モノクローナル抗体のブロック割合を、自己由来のポジティブブロック対照と比較した。
【０１２６】
Ｘ．イムノブロット分析
１μｇ／レーンのｒＴＧＦ-β１を、二量体型のｒＴＧＦ-β１を用いて様々なモノクローナル抗体の反応性を測定するために非還元サンプルバッファを用いて１２％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥにて電気泳動をかけた。ペプチドをニトロセルロース紙上へ移し、ＨＲＰとコンジュゲートした適当なモノクローナル抗体にて探査した。結合した抗体は、不溶性基質４-クロロ-１‐ナフトール(Kirkegaard and Perry, Gathersburg, MD)を用いて視覚化した。この反応を１５分後に蒸留水にて完全に洗浄することによって止めて、イムノブロットを乾燥させて撮影した。
【０１２７】
Ｂ．抗ＴＧＦ-β１及び抗ＴＧＦ-β２特異的モノクローナル抗体の産生
初期の免疫化プロトコルにおいて、様々な免疫原調製、用量及びスケジュールで、及び完全及び不完全なフロイントアジュバントを用いて、皮下及び腹膜内への投与により、Ｂａｌｂ／ｃマウスをｒＴＧＦ-β１にて免疫化した（上掲のDerynck等, Natureにより記載のように産生及び精製）。免疫化スケジュールは最長１１週間続けた。いくつかのマウスは測定可能であるが低い抗ｒＴＧＦ-β１力価に反応し、これらのマウスのうちの２匹を屠殺し、その脾臓を融合のために用いた。１１５２の親培養物から、８４の陽性抗ＴＧＦ-β上清のみを検出した。これらのハイブリドーマのうちの１０をクローニングし、アッセイ発達又は精製に用いることができない低親和性のモノクローナル抗体とした。
【０１２８】
代替策として、１０のＢａｌｂ／ｃ雌性マウス(Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA)群の後足蹠に、第０、３、７、１０及び１４日目に、５μｇ／用量の精製したＴＧＦ-β１を含むＤＥＴＯＸＴＭアジュバント(RIBI ImmunoChem Res. Inc., Hamilton, MT)１００μｌを注射した。第１７日目に前記動物を屠殺し、排水した鼠径部及び膝窩のリンパ節を切除し、リンパ球をステンレス-鋼メッシュを用いて節間質から分離した。全１０匹のマウスからのリンパ球懸濁液をプールし、確立された手順(Oi及びHerzenberg, in Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishel及びS. Schiigi, 編集, (W.J. Freeman Co., San Francisco, CA, 1980), 351頁)によって５０％ポリエチレングリコール４０００を用いてマウス骨髄腫株Ｘ63-Ａｇ8.653 (Kearneyら, J. Immunol., 123: 1548 (1979))と融合した。融合細胞を、融合後第１日目に、２×１０５細胞／ウェルの密度で、合計１３４４の９６ウェルマイクロタイタープレートに播いて、ＨＡＴ選別(Littlefield, J.W., Science, 145: 709 (1964))を行った。
１１９０のウェルを、ＥＬＩＳＡ試験において固定した組み換えＴＧＦ-β１と反応させた。その培養物のうちの１８は広がったときに安定に維持され、細胞株を低温保存した。これらの親培養物をイソタイピングし、１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１の捕獲能及びインビトロＴＧＦ-β１活性の中和能について検定した。ｒＴＧＦ-β１の中和化について検定した後にイソタイピングした１８の親培養物のうち、２つはＩｇＧ１κアイソタイプであり；残りはＩｇＧ２ｂκアイソタイプであった。ＩｇＧ1サブクラスに属するモノクローナル抗体だけは、ｒＴＧＦ-β１抑制性（中和化）インビトロ活性を示すことが明らかとなった。高親和性抗ＴＧＦ-βモノクローナル抗体を分泌した３つの安定ハイブリドーマを選択した。これらの抗体の特徴については更に以下に詳述する。
【０１２９】
Ｃ．放射ヨウ素標識したＴＧＦ-βの免疫沈降
免疫沈降実験を行って、溶液中のＴＧＦ-β１を認識して沈殿させる３つのモノクローナル抗体の能力を測定した。オートラジオグラフにより、抗ＴＧＦ-βモノクローナル抗体２Ｇ７、４Ａ１１及び１２Ｈ５が等量の１２５Ｉ-ｒＴＧＦ-β１を免疫沈降させる一方、対照モノクローナル抗体６Ｇ１２はネガティブであったことが示された。免疫沈降したバンドは、およそ１４．５ｋＤの見かけの分子量を有した。競合阻害アッセイを用いて、ＴＧＦ-β１と各モノクローナル抗体との間の相互作用の親和性を測定した。モノクローナル抗体２Ｇ７及び４Ａ１１はともに、１．２×１０８ｌ／モルのより高い親和性を有した。
また、免疫沈降実験を行って、溶液中のＴＧＦ-β２を認識して、沈殿させるために選択されたモノクローナル抗体の能力を測定した。オートラジオグラフにより、ｒＴＧＦ-β１とは対照的に、抗体２Ｇ７だけが測定可能な程度に１２５Ｉ-ＴＧＦ-β２を免疫沈降させることが示された。ネガティブ対照に対する４Ａ１１及び１２Ｈ５の比較により、ほとんど特異的な沈殿を示さない。この結果は、交差ブロック実験が４Ａ１１及び２Ｇ７がヒトｒＴＧＦ-β１への互いの結合を阻害しうることを示した点で驚くべきことである。表１を参照。
【０１３０】
表１
2008505610.tif 000003
＊Ｍａｂ４５６はＣＤ４に反応する対照抗体である。
合わせて考えると、データにより、これら２つのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは異なっているが、非常に近くにあるかないしは遠くから互いの結合に何らかの形で影響することが示される。免疫沈降及び交差ブロック実験から、いくつかのブロックが観察されたが、１２Ｈ５は異なるエピトープであるようである。また、この結論は以下の中和化データに裏付けられる。
【０１３１】
Ｄ．ｒＴＧＦ-β１のイムノブロット検定
ＴＧＦ-βの活性型がホモ二量体であるので、イムノブロットを行って、モノクローナル抗体がこの形を認識したかどうかを調べた。ＴＧＦ-β１二量体（非還元）型を用いた間接的イムノブロットにおいて抗体２Ｇ７、４Ａ１１及び１２Ｈ５すべてを反応させた。２Ｇ７は、４Ａ１１又は１２Ｈ５の何れよりも非常に強いバンドを示した。免疫沈降実験のように、対照抗体６Ｇ１２はネガティブであった。また、このパターンの反応は、これらモノクローナル抗体のＨＲＰコンジュゲートを用いた直接ウェスタンブロットにおいても観察された。
要約すると、完全及び不完全なフロイントアジュバントを用いてＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ３Ｈマウスに様々な免疫化手順と投与スケジュールで、ｒＴＧＦ-β１に対する耐性を弱める試みを数回行って成功しなかった後に、脱水リンパ節の融合と結合した足蹠免疫化を用いたプロトコールを行った。総じて、Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫原としてフロイントアジュバントに精製されたウシ骨由来ＴＧＦ-β２を用いてＴＧＦ-β１及びＴＧＦ-β２-中和化モノクローナル抗体を生成した上掲のDasch等の経験とは対照的に、この手順はこれらの弱い免疫原に非常に高い親和性を有して急速に反応を産生させるために有用であることが明らかとなった。
【０１３２】
イムノブロット、ＥＬＩＡ、交差ブロック及び免疫沈降検定において、３つすべてのモノクローナル抗体がｒＴＧＦ-β１に結合した。抗ｒＴＧＦ-β抗体のうちの２つはインビトロｒＴＧＦ-β１活性を中和した一方、その２つのうちの１つだけがミンク肺線維芽細胞アッセイにおいてＴＧＦ-β２及びＴＧＦ-β３両方の活性を中和した。また、ＴＧＦ-β１中和化抗体が放射性レセプター検定において放射ヨウ素標識したｒＴＧＦ-β１結合をブロックしたことから、インビトロのｒＴＧＦ-β１活性の中和はレセプターブロックに依存しうることが示された。
【０１３３】
実施例２  ヒト化２Ｇ７抗体
最初にマウスモノクローナル抗体２Ｇ７の様々なドメインをマウス／ヒトキメラＦａｂ断片を生成させるベクターにクローン化した。全ＲＮＡを市販のプロトコールに従ってＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭＲＮＡ抽出キットを用いてハイブリドーマ細胞から単離した。様々なドメインをＲＴ-ＰＣＲにより増幅し、ゲルを精製し、前記されるように(Caterら PNAS(USA)89:4285(1992)；及び米国特許第5,821,337号)、ヒトκ定常ドメイン及びヒトＣＨ１ドメインを含有するｐＵＣ１１９をもとにしたプラスミドの誘導体に挿入した。その結果に生じたプラスミドをＦａｂ断片の発現のために大腸菌株１６Ｃ９に移した。培養物の成長、タンパク質発現の誘発、及びＦａｂ断片の増幅については前に記載した(Wetherら J. Immunol. 157:4986-4995(1996)；Prestaら Cancer Research 57:4593-4599(1997))。
【０１３４】
キメラクローンのＤＮＡ配列により、ＣＤＲ残基を同定することができる(Kabatら, 上掲)。オリゴヌクレオチド部位指定突然変異を用いて、これら６つのＣＤＲ領域の全てを、前記したようなプラスミドＶＸ４(Prestaら, Cancer research 57:4593-4599(1997))に含まれた完全なヒトフレームワーク(ＶＬκサブグループＩ及びＶＨサブグループIII)に導入した。結果物「ＣＤＲ-スワップ」由来のタンパク質を発現し、前記のようにして精製した。結合研究は２つのバージョンを比較して実施した。簡単には、NUNC MAXISORP(商品名)プレートを１μg/mlのＴＧＦ-β細胞外ドメイン(ＥＣＤ；WO90/14357に記載されたようにして作成)の５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐH９．６、４℃で一晩覆い、次いで、室温で１時間ＥＬＩＳＡ希釈液(０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥＴＭ２０非イオン性界面活性剤、ＰＢＳ)で阻害した。ＥＬＩＳＡ希釈液の連続希釈サンプルをプレート上で２時間インキュベートした。洗浄の後、結合したＦａｂ断片をストレプトアビジンコンジュゲートホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(Sigma)に続いてビオチン化マウス抗-ヒトκ抗体(ＩＣＮ６３４７７１)を用いて検出し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersdish, MD)を基質として使用した。吸高度は４５０ｎｍで読取った。ＣＤＲ-ｓｗａｐ Ｆａｂの結合はキメラＦａｂ断片の結合と比較して顕著に減少した。
ヒト化Ｆａｂの結合を回復させるために、突然変異体を、ＣＤＲ-ｓｗａｐ由来のＤＮＡを鋳型として用いて構築した。コンピューター作成モデルを用いて、これらの突然変異体は、変化がＣＤＲ構造又は抗体-抗原相互作用を変化させる位置で、ヒトフレームワーク領域残基をマウスの相当物に変化させて生成した。突然変異体は表２に示す。（すべてのアミノ酸番号は上掲のKabat等に従って表すことを注記する。）配列については図１−４を参照のこと。
【０１３５】
表２  ヒト化２Ｇ７ ＦＲ突然変異体の設定
2008505610.tif 000004
【０１３６】
バージョン３及び４は、より後の数を有するヒト化Ｆａｂバージョンを得るための中間体として用いた。変異ＡｌａＨ４９Ｇｌｙ、ＰｈｅＨ６７Ａｌａ及びＡｒｇＨ７１Ａｌａを有するバージョン５は、バージョン７０９及び１１のように、元のキメラ２Ｇ７  Ｆａｂ断片のものに回復した結合を有するようである（図５）。バージョン７１０及び７１２はキメラ断片と同様の結合を有すると思われるが、バージョン７１２は免疫原性増加の可能性にとって望ましくない付加的なフレームワーク突然変異を有する。付加的なＦＲ又はＣＤＲ残基、例えばＬ３、Ｌ２４、Ｌ５４及び／又はＨ３５は変更してもよい（例えば以下の通りに置換される：ＧｌｎＬ３Ｍｅｔ、ＡｒｇＬ２４Ｌｙｓ、ＡｒｇＬ５４Ｌｅｕ、ＧｌｕＨ３５Ｓｅｒ）。安定性を改良するために望ましいかもしれない置換は、酸化を減少させるためのメチオニンからロイシン又はイソロイシンへの置換、又はアミド分解の可能性を減少させるためのＣＤＲ内のアスパラギンから他の残基への変異である。あるいは又はさらに、ヒト化抗体は、更にその親和性及び／又は他の生物学的活性を改良するかまたは精製するために、親和性成熟（上記参照）してもよい。
キメラ２Ｇ７ＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにヒト化Ｆａｂバージョン５、７０９及び１１を、哺乳類細胞発現(Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech., 2:3-10 (1990))のために既に記載のｐＲＫベクターにサブクローニングすることによって、完全長ＩｇＧの発現用プラスミドを構築した。簡潔には、各々のＦａｂコンストラクトをＶＬ断片を切り取るためにＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩによって消化し、それを完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現用のプラスミドｐＤＲ１（図６を参照）のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。さらに、各々のＦａｂコンストラクトをＶＨ断片を切り取るためにＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩによって消化し、それを完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現用のプラスミドｐＤＲ２（図７を参照）のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位にクローニングした。
【０１３７】
各々のＩｇＧ変異形について、アデノウイルス形質転換ヒト胚腎臓細胞株、２９３(Grahamら, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977))）内に軽鎖発現プラスミド及び重鎖発現プラスミドを共形質移入することによって一時的形質移入を行った。簡潔には、２９３細胞は、形質移入の前日に分割して、血清添加培地に播種した。次の日に、ＰＡＤＶＡＮＴＡＧＥＴＭベクターＤＮＡ (Promega, Madison, WI)と共に、軽鎖及び重鎖の二本鎖ＤＮＡからリン酸カルシウム沈殿物を調製し、プレートに滴下した。細胞を３７℃で終夜インキュベートし、次いでＰＢＳにて洗浄し、培地上清を回収するまでの４日間、無血清培地にて培養した。プロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ-4ＢＴＭアガロースを用いて、培養物上清から抗体を精製し、次いで１０ｍＭ コハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０にバッファを交換し、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ-１０ＴＭマイクロコンセントレーター（Amicon）を用いて濃縮した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍの吸光度を測定するか、定量的アミノ酸分析によって決定した。
どのＣＤＲが結合に関与したかを明らかにするためにｈｕ２Ｇ７バージョン５ＩｇＧに付加的な修飾を行い、ここで、活性を失うことなく、又は抗体を安定化するためにヒト生殖細胞系κ遺伝子座の配列に該ＣＤＲを戻すことができる。表３に示すように名称し、バージョン５とこれらのバージョンとのアミノ酸の差異を示す。
【０１３８】
表３  ヒト化２Ｇ７ＣＤＲ変異形の設定
2008505610.tif 000005
【０１３９】
Coxら, Eur. J. Immunol., 24: 827-836 (1994)の図４、及び、Schable及びZachau, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001-1022 (1993)の図２ｅに記載のように、ＣＤＲＬ１に用いる生殖細胞系配列の名前はＬ８／Ｌ９である。ＣＤＲＬ２については、生殖細胞系配列は、Ｌ８／Ｌ９／Ｌ１４／Ｌ１５と称される(上掲のCoxら、とSchable及び上掲のZachauを参照)。
すべてのＣＤＲにおいてヒト生殖細胞系（ｇｌ）κ遺伝子座の配列を戻したが、上記した結合を示す生殖細胞系復帰変異体のみを示した（図８参照）。ヒト生殖細胞系κ遺伝子座の配列に戻したＣＤＲＬ２を有するＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ２は、ＴＧＦ-β並びにＶ５Ｈ.Ｖ５Ｌもやはり結合したことが図から読み取れた。Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌだけでなく２つのバージョンＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ１ｇｌＬ２及びＨ２ＮＩ.ｇ１Ｌ１ｇｌＬ２は、キメラと同様に結合しなかった。
マウスメサンギウム細胞増殖アッセイを用いて、対照抗体及びいくつかのヒト化抗体（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ、Ｖ５Ｈ.ｇｌ  Ｌ２、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ、Ｖ５Ｈ.ｇｌＬ１ｇｌＬ２およびＨ２Ｎ１.ｇｌＬ１ｇｌＬ２）を試験した。プロトコルは以下の通りである：
【０１４０】
第１日目：マウスメサンギウム細胞を、培地（ダルベッコ変更イーグル培地とハムＦ１２培地-95%-ウシ胎児血清-5%添加１４ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファの３：１混合液）を含む９６ウェルプレートに播種し、終夜生育した。
第２日目：３つの異なる濃度（１００ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇ）のＴＧＦ-β、及び、５つの異なるタイプのヒト化ＴＧＦ抗体（２０μｇ／ｍｌ）を、無血清培地にて希釈して、細胞に加えた。対照（２Ｇ７）としてマウスＴＧＦ抗体を用いた。
第４日目：４８時間のインキュベーションの後、２０μｌの反応緩衝液（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ ９６  ＡＱＵＥＯＵＳ  ＯＮＥ  ＳＯＬＵＴＩＯＮ  ＲＥＡＧＥＮＴＴＭバッファ(Promega Inc. Cat number G3580)）をプレートの各ウェルに添加して、２時間インキュベートした。４９０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を測定した。
【０１４１】
Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（２０μｇ／ｍｌ）は、１ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦ-βによって誘発される細胞阻害を完全にブロックし、これはキメラマウス対照を用いたときと同じ結果である。また、バージョン５（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ）は対照と同じように細胞阻害をブロックした。
多様なヒト化抗体は２Ｇ７に対する様々なＴＧＦ-βを中和する際のその活性について、インビトロでの３つのＴＧＦ-βのうちの１によって刺激された脱凝集したスイスマウス胚の線維芽細胞由来の３Ｔ３細胞株を用いて試験し、次いで、その増殖を活性として測定した。結果を図１０−１４に示す。これらの図は、ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌは、対照２Ｇ７抗体に対してブロック活性が非常に優れていたことを示す。試験した他のヒト化抗体、Ｈ２ＮＩ.ｇｌＬ２（ヒト生殖細胞系κ遺伝子座の配列に復帰したＣＤＲ  Ｌ２）及びＶ５Ｈ.ｇｌＬ２（ヒト生殖細胞系κ遺伝子座の配列に復帰したＣＤＲ  Ｌ２）は、ＴＧＦ-β１からβ３の全てに対して最も効果が低いＶ５Ｈ.ｇｌＬ２に相当する阻害活性を示した。
【０１４２】
要約すると、キメラ抗体としてＴＧＦ-β（ｃｈｉｍＨ.ｃｈｉｍＬ；２Ｇ７  Ｆａｂ断片）を結合し、及び／又はＴＧＦ-βを中和あるいはインビトロでＴＧＦ-βによって誘発される細胞阻害をブロックし、そして、試験される全てのヒト化抗体の中でフレームワーク変化が最少である（患者の免疫応答のリスクを最小化する）ので、ヒト化抗体Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ、Ｖ５Ｈ.ｇｌＬ２、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ、Ｈ２ＮＩ.ｇｌＬ２及びバージョン７０９、７１０及び７１１は、最も好適なヒト化型である。加えて、３つすべてのＴＧＦ-βイソ型（ＴＧＦ-１、２、３）の中和活性が明らかに優れているようであり、ＣＤＲ  Ｈ２内の変化によって安定性を改善しうるので、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌは特に好適な抗体である。さらに、マウスモノクローナル抗体２Ｇ７と比較してインビトロでの３つすべてのＴＧＦ-βリガンド活性のブロック能の改善を示すこれらヒト化抗体は、ＴＧＦ-β誘導性線維芽細胞増殖についてのアッセイに示されるように、パン-ＴＧＦ-β誘導性効果を阻害する優れた能力の効力により以下の様々な適応症において２Ｇ７よりよく効くと予測される（図１０−１４）。
【０１４３】
実施例３  再発性又は抵抗性前立腺癌の治療
ここでの抗体は、ＴＧＦ-βに対する完全長、ヒト化モノクローナル抗体（ＣＨＯ細胞で生産される）である。それは、ホルモン抵抗性（アンドロゲン非依存性）前立腺癌患者の治療のための単一薬剤として必要とされる。効果の第一の指標には、単一薬剤として用いられるときに最も利用できるもの（ミトキサントロン／プレドニゾン）と比較したときの全体の生存率、及び安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、応答率、生活の質、疼痛及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇの抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
また抗体は、ホルモン抵抗性（アンドロゲン非依存性）前立腺癌患者の治療のための化学療法と組み合わせて必要とされる。効果の第一の指標には、化学療法と比較したときの全体の生存率、及び安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、応答率、生活の質、疼痛及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇの抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
【０１４４】
前立腺癌（例えばアンドロゲン非依存性前立腺癌）を治療するためにヒト化抗ＴＧＦ-β抗体と組み合わされうる薬剤の例には、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター；抗血管形成薬剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）；ＥＧＦＲ標的薬剤（例えばＣ２２５又はＺＤ１８３９）；ハーセプチン(登録商標) 抗ＨＥＲ-２抗体、又はアポトーシスを誘発する抗ＥｒｂＢ抗体、例として７Ｃ２又は７Ｆ３、ヒト化又は親和性成熟されたその変異形を含む；2Ｃ4又はヒト化2Ｃ4；他の抗ＴＧＦ-β抗体（例えばモノクローナルＴＧＦ-β抗体）；サイトカイン（例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２、Ｇ-ＣＳＦ又はＧＭ-ＣＳＦ）；抗アンドロゲン物質（例えばフルタミド又はシプロテロンアセタート）；ロイプロリド；スラミン；化学療法剤、例えばビンブラスチン、エストラムスチン、ミトキサントロン、リアロゾール（レチノイン酸代謝-ブロッキング剤）、シクロホスファミド、アンスラサイクリン抗生物質、例えばドキソルビシン、タキサン（例えばパクリタキセル又はドセタキセル）又はメトトレキセート、又は上記の何れか組合せ、例えばビンブラスチン／エストラムスチン又はシクロホスファミド／ドキソルビシン／メトトレキセート；プレドニソン；ヒドロコルチゾン；又は、その組合せ。これらの様々な薬剤の標準用量は、例えば４０ｍｇ／ｍ２／週  ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）；６（ＡＵＣ）カルボプラチン；及び２００ｍｇ／ｍ２  パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ(登録商標)）で投与される。
また、ＴＧＦ-βが前立腺癌に関与していたので(Shah等, Cancer Research, 62: 7135-7138 (2002))、抗体は成功が予想される前立腺癌モデル（例えば、ＴＲＡＭＰトランスジェニックマウス並びに移植ＰＣ-３細胞）で試験されうる。
【０１４５】
実施例４  乳癌の治療
ここで抗体は、特に転移性の患者に限らず乳癌患者の治療のための単一薬剤として必要とされる。効果の第一の指標には、応答率と安全性が含まれる。第二の有効性指標には、全体の生存率、時間と疾患の進行、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
またヒト化抗体は、乳癌患者の治療のための化学療法と組み合わせて必要とされる。効果の第一の指標には、化学療法単独の場合と比較したときの全体の生存率、及び安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、応答率、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
【０１４６】
乳癌（例えばＴＧＦ-β過剰発現に特徴が現れない転移性乳癌）を治療するためのここでのヒト化抗ＴＧＦ-β抗体と組み合わされうる薬剤の例には、化学療法剤、例としてアンスラサイクリン抗生物質（例えばドキソルビシン）、シクロフォスファミド、タキサン（例えばパクリタキセル又はドセタキセル）、ナベルビン、ゼローダ(xeloda)、マイトマイシンＣ、白金化合物、オキサリプラチン(oxaliplatin)、ジェムシタビン(gemcitabine)、又はこれらのうちの２以上の組合せ、例としてドキソルビシン／シクロフォスファミド；ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体又はアポトーシスを誘発する抗ＥｒｂＢ抗体、例として７Ｃ２又は７Ｆ３、ヒト化又は親和性成熟されたその変異形を含む；2Ｃ4又はヒト化2Ｃ4；他の抗ＴＧＦ-β抗体（例えばモノクローナルＴＧＦ-β抗体）；抗卵胞ホルモン（例えばタモキシフェン）；アロマターゼ阻害薬（例えばアナストロゾール）；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター；抗血管形成剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）；ＥＧＦＲ標的薬剤（例えばＣ２２５又はＺＤ１８３９）；サイトカイン（例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２、Ｇ-ＣＳＦ又はＧＭ-ＣＳＦ）；又は、上記の組合せが含まれる。このような付加的な薬剤は標準用量で用いられてもよい。
ここでのヒト化抗体は、乳癌、特に転移されたものの患者の治療のためのハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体又はｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４と組み合わせて付加的に必要とされる。効果の第一の指標には、応答率と安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体又はｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４単独と比較したときの全体の生存率、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４が供給された。ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体は４ｍｇ／ｋｇの初期量の後に毎週２ｍｇ／ｋｇの維持量を投与される。ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体は凍結乾燥粉末として投与された。ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体の各バイアルには、４４０ｍｇのハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体、９．９ｍｇのＬ-ヒスチジンＨＣｌ、６．４ｍｇのＬ-ヒスチジン、４００ｍｇのα-α-トレハロース二水和物、及び１．８ｍｇのＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ２０ＴＭ界面活性剤が含まれる。防腐剤として１．１％のベンジルアルコールを含有する注入用静菌水（ＢＷＦＩ）２０ｍＬによる還元により、２１ｍｇ／ｍＬのハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体を含有する２１ｍＬの複数回用量溶液、およそｐＨ６．０となる。
【０１４７】
乳癌の自然発生的なマウス乳房腫瘍モデル由来の4Ｔ1上皮細胞においてマウス抗体２Ｇ７を用いる、細胞（１．５×１０５）を、マウスの乳房脂肪に注入した（第０日）。このモデルでは、触診可能な原発性腫瘍が１週間までに出現する；二次転移は、第２週までに肺に、第３週までに肝臓に、そして、第４週と第５週の間に骨に出現した。組織を第５週目に回収した。２Ｇ７抗体及び２つの対照ＩｇＧ抗体を、２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週でマウスの腹膜内に注入し、４Ｔ１細胞による血清ＴＧＦ-β産生をR&D systemsから市販されているＥＬＩＳＡによって組織培養液（又はインビボ研究のための血液）中で測定した。
図１５Ａは、4Ｔ1細胞及び対照として正常なマウス上皮細胞Ｃ57によるＴＧＦ-β産生をインビトロＥＬＩＳＡにより示す。図１５Ｂは、対照(Con)抗体（イソ型一致ＩｇＧであり、抗サワギク抗体である）で処理した腫瘍を持たないマウス(-Con)、及び対照抗体で処理した腫瘍を有するマウス(+Con)に対する、腫瘍を有するマウスにおける２Ｇ７抗体(+抗ＴＧＦ-β)のインビボ４Ｔ１細胞による血清ＴＧＦ-β産生に対する効果を示す。これらの結果は、４Ｔ１上皮性腫瘍細胞がインビボの対照Ｃ５７上皮性細胞よりも多くのＴＧＦ-βを産生したこと（図１５Ａ）、及び、ここでの２Ｇ７抗体が、対照抗体で処理した腫瘍を有するマウスと比較して循環中の遊離ＴＧＦ-βの量を減少させたこと（図１５Ｂ）が示された。
【０１４８】
遊離ＴＧＦ-βの血清濃度が抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７で処理したマウスにおいて減少したことは、抗ＴＧＦ-β抗体がインビボのＴＧＦ-βの有効性を変更しうるという以前の結果と一致している(Wojtowicz-Praga等, Immunother Emphasis Tumor Immunol., 19(3): 169-75 (1996). Erratum in: J Immunother Emphasis Tumor Immunol, 19(5): 386 (1996), Verma UM (corrected to Verma UN))。加えて、媒介物と比較して１：１０、１:１００及び１:１０００の希釈で対照血漿に２Ｇ７が添加されてもＥＬＩＳＡの値に影響がなかったので、ＥＬＩＳＡアッセイではここで用いた抗体（２Ｇ７）は干渉しなかった。Ziyadeh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 8015-20 (2000)。
図１５の説明にあるマウスに投与される抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７及び抗ブタクサＩｇＧ対照による図１５に用いた腫瘍細胞モデルにより産生される二次肺腫瘍についての組織学的スコアを図１６Ａに、組織重量を図１６Ｂに示す。これは抗ＴＧＦ-βがグレード、罹患肺葉の数、組織グラム重量、及び体重の割合としての肺重量を対照と比較して減少させたことを示す。二次肺腫瘍はエクスビボコンピュータ断層撮影スキャニングにより検出した。
【０１４９】
図１７は上記マウスモデルの肺腫瘍のｕＣＴによる定量を示す。これは抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７による腫瘍容積と数が、図１５の説明にあるマウスに投与される２Ｇ７及び対照（すなわち２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹腔内投与）の両方によるＩｇＧ対照の腫瘍容積よりも低減したことを示した。
図１８Ａは、生理食塩水又はタキソールを伴うＩｇＧ対照の２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週  腹腔内投与、及びタキソールを伴う抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７の２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週  腹腔内投与による細胞注入後の日数との相関として上記マウスにおける腫瘍容積を示す。後者は腫瘍容積の減少に最も効果を示した。図１８Ｂは化学療法を伴う抗ＴＧＦ-β抗体  ２Ｇ７が、ＩｇＧ／生理食塩水対照とＩｇＧ／化学療法対照の両方よりも肺、脾臓、及び腫瘍の組織重量を減少させたことを示した。
さらに、２Ｇ７抗体はこのマウスモデルのＩｇＧ対照と比較して血管上皮性成長因子（ＶＥＧＦ）の全身濃度を減少した。図１９は、腫瘍を持たないマウス（正常）、対照ＩｇＧ(対照)又は抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７（ａＴＧＦ-β）の何れかで処理（２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹腔内投与、対照及び抗ＴＧＦ-β）した４Ｔ１乳房腫瘍を有するマウスにおける血漿ＶＥＧＦ濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。各点は個々のマウスを示す。バーはグループの平均を示す。
【０１５０】
要約すると、同系マウスの乳房脂肪層に注入されたＢａｌｂ  Ｃマウス（４Ｔ１）における自然発生乳房腫瘍由来の上皮細胞の乳癌モデルにおいて、２Ｇ７抗体は、遊離ＴＧＦ-β１の循環濃度及び全身ＶＥＧＦ濃度を減少させて、対照と比較して一次腫瘍成長を減少させる、少ないが有意な一時的能力を有することが明らかとなった。２Ｇ７による早期治療により二次肺腫瘍が減少した。
さらに、肺についても同じスキャニングを使用したところ、２Ｇ７抗体を用いた早期治療により、このモデルで生じる胸部腫瘍誘発性骨破壊の多くが克服された。表４を参照。この表では、柵状織数は柵状織（髄腔に伸びる骨の小骨片）の数を指し、柵状織厚はこれら柵状織の平均の厚さを指す。これらの両パラメータは骨の量を示し、様々な骨パラメータを数量化するためにマイクロコンピュータ断層撮影とアルゴリズムを用いて測定した（表４）。
【０１５１】
表４  骨再生の測定
2008505610.tif 000006
注記、パーセントは以下を意味する。
１）「原発性腫瘍なしの２Ｇ７」と「原発性腫瘍あり」試料についての正常マウス（すなわち腫瘍なし）との相対比。
２）「原発性腫瘍ありの２Ｇ７」試料についてのＩｇＧ対照抗体で処置した腫瘍を有するマウスとの相対比。
【０１５２】
また、Maglione等, Transgenic Polyoma middle-T mice model premalignant mammary disease, Cancer Res., 61(22): 8298-305 (2001)及びLin等, Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases, Am J Pathol., 163(5): 2113-26 (2003)にて説明されるように、抗体２Ｇ７を、乳癌モデル（ＰｙｍＴ）において試験した。抗体（ＩｇＧ対照（抗ブタクサ抗体）及び抗ＴＧＦ-β２Ｇ７）の両方は同様に：２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹膜内投与された。図２０Ａは、ＰｙｍＴモデルにおける腫瘍成長の日数の関数として、ＩｇＧ対照と比較したときの抗ＴＧＦ-β２Ｇ７の腫瘍容積に対する効果を示す。ＩｇＧ対照と比較して２Ｇ７抗体が時間と共に腫瘍容量を減少したことが示された。図２０Bはまた、ＩｇＧ対照と比較してＴＧＦ-β抗体２Ｇ７が腫瘍重量を減少したことを示す。また、Ｈｅｒ２腫瘍と比較してＰｙＭＴ腫瘍におけるＶＥＧＦ濃度が減少したことも明らかとなった。
これらのデータより、ここでの２Ｇ７抗体のヒト化型は腫瘍成長及び転移について２Ｇ７と同じ働きを有することが予測された。
【０１５３】
４Ｔ１上皮細胞と異なり、Ｈｅｒ＋上皮細胞はインビトロでＴＧＦ-βを高濃度に合成せず、インビトロでＴＧＦ-βにより成長が阻害され(Siegel等, Transforming growth factor beta signaling impairs Neu-induced mammary tumorigenesis while promoting pulmonary metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(14): 8430-5 (2003))、インビボでの抗ＴＧＦ-β処理により成長が阻害されなかった。さらに、抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７をＩｇＧ対照と比較した場合、このモデルではＶＥＧＦ濃度が増加した。
基底膜（コラーゲンＩＶ）、内皮細胞（ＣＤ３１）又は周細胞（ＳＭＡ又はＮＧ２）と称する脈管支持細胞について３つの胸部腫瘍モデル（４Ｔ１、ＰｙＭｔ及びＨｅｒ２）を染色したところ、これら３成分についてモデル系の違いが明らかとなった。ある理論に基づくものではないが、これらの成分により、抗ＴＧＦ-β治療に対する腫瘍の感受性が予測しうる。
癌においてＴＧＦ-βの役割に二機能性性質があるとしたら、患者が反応するかどうか、又どれくらい反応するかを予測するための診断に使用すると、癌治療のＴＧＦ-β阻害方策の応用に有用性があり得る。例えば、与えられた患者の癌細胞がＴＧＦ-βの成長阻害効果に感受性があるか否かについて決定することは重要であろう。
【０１５４】
ある理論に基づくものではないが、抗ＴＧＦ-β治療に応答すると思われる患者／腫瘍を選択するための潜在的診断マーカーを、限定するものではないが以下に挙げる。
１）３つのＴＧＦ-βイソ型、ＴＧＦ-β１、２及び／又は３のうちの一以上の発現、特に高い発現レベルのもの、特にＴＧＦ-β１に注目する。
ａ．これは多くの異なる種類の癌、限定するものではないが乳癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、肺癌及び皮膚癌（メラノーマ）を含む。同じ組織タイプの対応する正常組織試料と比較してこれら腫瘍タイプにおいてＴＧＦ-β１が有意に過剰発現していることが明らかとなった。
ｂ．Ｈｅｒ２陽性乳癌と対照的にＨｅｒ２陰性乳癌、前者はＴＧＦ-β１が高く発現することに示されるように抗体治療に対してよく応答しうる。これに関して、同じ組織タイプの対応する正常組織試料と比較してこれら腫瘍タイプにおいてＴＧＦ-β１が有意に過剰発現していることが明らかとなった。
２）＃１の必然的結果として、腫瘍細胞の産生はＴＧＦ-βが間質／周囲で産生されるかどうかに依存する。
３）一以上のＴＧＦ-βレセプター、限定するものではないが、特にＴＧＦ-β１ＲＩ又はＴＧＦ-βＲＩＩ（タイプ-ＩＩＲ）内の突然変異、及び発現の減少。
４）ＴＧＦ-βシグナル伝達経路内の分子（限定するものではないが、ＳＭＡＤ／ホスホＳＭＡＤ、ｃ−ｍｙｃ、ＣＤＣ２５Ａ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣｉＰ１、及びｐ２７Ｋ１Ｐ１が含まれる）の濃度又は局在の突然変異又は変化。
５）ＴＧＦ-β活性に影響を与えることが知られている他のシグナル伝達経路（限定するものではないが、ＦｏｘＧ1、Ｊａｇｇｅｄ／ノッチ、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４、及び特にＨｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲンレセプターレベル、Ｒａｓ活性、ホスファチジルイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＡＫＴ及びＭＡＰＫ活性、並びにｐ５３が含まれる）内の変化。
【０１５５】
腫瘍が治療されるかどうかを測定するための上記に挙げた診断用マーカーに加えて、様々なマーカーを用いて治療前及び治療後の患者において抗ＴＧＦ-β抗体の生物学的活性を（腫瘍内で及び／又は周囲で）評価してもよい。それには限定するものではないが以下のものがある。
１）腫瘍又は循環内のＴＧＦ-β濃度（図１５Ｂ並びに腫瘍異種移植片Ｃｏｌｏ２０５及びＣａｌｕ６腫瘍、ＨＰＡＣ腫瘍及び管胸部腺癌のヒト腫瘍試料の染色組織切片におけるＴＧＦ-β１タンパク質発現を示す免疫組織化学（ＩＨＣ）データによって示される）。
２）腫瘍又は循環内のＶＥＧＦ濃度（図１９及び、２Ｇ７が対照と比較される場合に、ＶＥＧＦ濃度がＨｅｒ２陽性モデルで増加することを示すデータによっても示される）。
３）腫瘍における及び／又は血液単核細胞（ＢＭＣ）などの周辺細胞におけるＴＧＦ-βシグナル伝達経路内のＳＭＡＤ／ホスホＳＭＡＤなどの分子濃度。
４）免疫細胞機能、特にＮＫ、Ｔ細胞及びマクロファージ活性の指標。
【０１５６】
実施例５  肺癌の治療
ここでのヒト化抗体は、ステージＩＩＩｂ又はＩＶ非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のための単一薬剤として必要とされる。効果の第一の指標には、応答率と安全性が含まれる。第二の有効性指標には、全体の生存率、時間と疾患の進行、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
またヒト化抗体は、転移性非小細胞肺癌患者の治療のための化学療法と組み合わせて必要とされる。効果の第一の指標には、標準的な治療方法と比較したときの全体の生存率、及び安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、応答率、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
【０１５７】
肺癌を治療するためのここでの抗体と組み合わされうる付加的薬剤の例には、化学療法剤、例としてカルボプラスチン、タキサン（例えばパクリタキセル又はドセタキセル）、ジェムシタビン(gemcitabine)、ナベルビン、シスプラチン、オキサリプラチン(oxaliplatin)、又はこれらのうちの任意の組合せ、例としてカルボプラスチン／ドセタキセル；ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体又はアポトーシスを誘発する抗ＥｒｂＢ抗体、例として７Ｃ２又は７Ｆ３、ヒト化又は親和性成熟されたその変異形を含む；２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４；他の抗ＴＧＦ-β抗体（例えばモノクローナルＴＧＦ-β抗体）；ファルネシル転移阻害剤；抗血管形成剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）；ＥＧＦＲ標的薬剤（例えばＣ２２５又はＺＤ１８３９）；サイトカイン（例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２、Ｇ-ＣＳＦ又はＧＭ-ＣＳＦ）；又は、上記の組合せが含まれる。
【０１５８】
実施例６  結腸直腸癌の治療
ここでのヒト化抗体は、転移性結腸直腸癌の治療のための単一薬剤として必要とされる。効果の第一の指標には、応答率と安全性が含まれる。第二の有効性指標には、全体の生存率、時間と疾患の進行、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
またヒト化抗体は、転移性結腸直腸癌患者の治療のための化学療法と組み合わせて必要とされる。効果の第一の指標には、標準的な治療方法と比較したときの全体の生存率、及び安全性が含まれる。第二の有効性指標には、時間と疾患の進行、応答率、生活の質、及び／又は応答の継続期間が含まれる。疾患の進行まで、毎週又は３週間毎にそれぞれ２又は４ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体を、静脈内(ＩＶ)投与された。複数回用量液体製剤（２０ｍｇ／ｍＬ又はより高い濃度の２０ｍＬ量）として抗体が供給された。
【０１５９】
ＴＧＦ-βに結合するヒト化抗体と組み合わせて、結腸直腸癌を治療するための付加的薬剤の例には、５‐フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、ＣＰＴ-１１、レバミゾール又はこれらの何れか２つ以上もの組合せ、例えば５-ＦＵ／ＬＶ／ＣＰＴ-１１が含まれる。このような化学療法剤は標準的な容量で投与されうる。結腸直腸癌の治療のために抗ＴＧＦ-β抗体と組み合わされうる他の薬剤には、ファルネシル転移阻害剤；抗血管形成剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体）；ＥＧＦＲ標的薬剤（例えばＣ２２５又はＺＤ１８３９）；サイトカイン（例えばＩＬ-２、ＩＬ-１２、Ｇ-ＣＳＦ又はＧＭ-ＣＳＦ）；ハーセプチン(登録商標)  抗ＨＥＲ-２抗体又はアポトーシスを誘発する抗ＥｒｂＢ抗体、例として７Ｃ２又は７Ｆ３、ヒト化又は親和性成熟されたその変異形を含む；２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４；他の抗ＴＧＦ-β抗体（例えばモノクローナルＴＧＦ-β抗体）；又は、上記の組合せが含まれる。
大腸癌でＴＧＦ-βの役割が予想されれば、抗体は大腸癌モデル（例えばＨＴ２９及びＨＣＴ１１６）で試験され、効くことが予測されうる。
【０１６０】
実施例７  メラノーマの治療
この実施例のモノクローナル抗体２Ｇ７を用いた結果により、ここでのヒト化抗体が悪性メラノーマの治療に有用であることが示唆された。マウス抗ＴＧＦ-β１抗体２Ｇ７は、メラノーマの動物モデルにおいて試験された。具体的には、皮下にマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０又はＢ１６Ｂｌ６）を注入された同系のＣ５７ｂｌａｃｋ６マウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週の抗ＴＧＦ-β（２Ｇ７）を用いた治療により、イソ型一致のＩｇＧ対照（抗ブタクサ抗体）（２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹膜内）を用いた治療と比較して、原発性腫瘍のサイズが減少した（図２２、２４及び２５）。このＢ１６モデルにおいて、各腫瘍定量方法、すなわち表面計数（「surface」）、組織学的試験（「pathology」）、組織移植後のすべての可視腫瘍の数量化（「cleared」）又はマイクロコンピュータ断層撮像法（「ＣＴ」）の使用によって対照と比較したところ、抗ＴＧＦ-β２Ｇ７治療により、肺腫瘍を有するマウスの割合（すなわち肺腫瘍発生率）（図２１Ａ）及び肺腫瘍数（図２１B）が減少した。また、図２３及び２６を参照。
Ｃａｌｕ-６（ヒト非小細胞肺上皮癌）腫瘍細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関 (ATCC), Manassas, VA）は、インビトロでＴＧＦ-βを生産することが明らかとなった。Ｃａｌｕ-６  ＣＭ細胞はインビトロの線維芽細胞においてＶＥＧＦ及びＳＭＡ発現を誘発した、この効果は、マウス抗ＴＧＦ-β２Ｇ７抗体を用いた治療によって阻害された。ある理論に限定されるものではないが、これらの結果により、ＴＧＦ-βが腫瘍環境の間質細胞の活性化に関与することが示唆された。これらの細胞の異種移植は、ヌードマウス内で作製され（例としてGourdeau等, Mol Cancer Ther., 3:1375-1384 (2004)を参照)、抗ＶＥＧＦ抗体（Ａ４６１）（５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹膜内）、マウス抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７（２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週、腹膜内）及び２Ｇ７とＡ４６１の併用（上記の用量）に従って、上記のＢ１６実験で用いた対照ＩｇＧ２ｂ抗体を用いた治療の後に腫瘍容積について試験した。図２７及び２８に示す腫瘍容量および腫瘍重量の結果により、それぞれ、２Ｇ７と抗ＶＥＧＦ抗体の併用が最も優れており、その次に２Ｇ７抗体が優れた治療であることが示された。この結果により、２つの抗体（抗ＴＧＦ-β及び抗ＶＥＧＦ）が互いに付加的及び／又は協同することが示された。
【０１６１】
これらのデータに基づいて、ここでのヒト化抗体が、悪性メラノーマに伴う原発性及び二次性腫瘍を減少すると思われる。具体的には、ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌは、マウス抗体２Ｇ７によって有効性が示された２つのモデル：
１） 同系マウス内のマウスメラノーマ細胞（Ｂ16）、及び、
２） ヌードマウスへの異種移植としてのＣａｌｕ-６（ヒトＮＳＣＬＣ）腫瘍細胞において試験されてもよい。
Ｂ１６モデルでは、細胞をマウス皮下に植え付けた。両方のモデルにおいて、触診可能な腫瘍が存在する場合、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週）又は対照抗体（２５ｍｇ／ｋｇ ３回／週）などの様々な抗ＴＧＦ-β抗体を用いた治療が始められた。腫瘍は週毎に２−３回測定した。
任意の抗体を試験する前に、ＴＧＦ-β誘発性線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞成長を阻害するＨ２ＮＩ.Ｖ５Ｌの能力を確認した。
Ｈ２ＮＩ.Ｖ５ＬのマウスＦｃ部分がマウスでの活性に必要でない場合、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌがマウスの元のマウスモノクローナル２Ｇ７と同じ活性を有するか、又はより良好な活性を有することが予測される。抗体のマウスＦｃ部分がマウスでの活性に必要である場合、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌは、マウス研究の元のマウスモノクローナル２Ｇ７と同じ有効性があるとは期待できない。しかしながら、ヒトＦｃがここで活性であるので、Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（及び本明細書中で特許請求される他のヒト化抗体）は、ヒトにおいて効果を有すると思われる。
【０１６２】
実施例８  正常マウス及び腫瘍を有するマウスの２Ｇ７抗体の薬物動態学
ここでの目的は、正常マウスと腫瘍を有するマウスにおけるマウス抗ＴＧＦ-β２Ｇ７の薬物動態学的（ＰＫ）特徴を評価することである。
研究設定：
動物モデルは、４Ｔ１-細胞誘発性乳房腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスであった。４つのグループに単回４３ｍｇ／ｋｇ用量で投与した：
Ｇｒｐ  １：非腫瘍保持マウスＩＶ
Ｇｒｐ  ２：腫瘍保持マウスＩＶ
Ｇｒｐ  ３：腫瘍保持マウスＩＰ
Ｇｒｐ  ４：腫瘍保持マウスＳＣ
時間点につき一群当たりＮ＝３マウス。各々マウスは３回採血した。
５、１５、３０、６０分；３、６、２４時間；３、７、１０  １４、２１日に、マウス抗ＴＧＦ-βＥＬＩＳＡのために血清を回収した。
【０１６３】
結果：
結果は、マウス抗ＴＧＦ-βの消失特性が正常マウスよりも腫瘍保持マウスでより早く出現することを示した。更に、ＩＰ投与及びＳＣ投与に従って抗体の生物学的利用能が９５％以上であった。半減期は腫瘍保持マウスでは２−３日であった。したがって、２Ｇ７抗体のＰＫ特性は許容範囲内のように思える。
正常マウスでは、抗体の半減期は４日であり、それは正常マウスの他の抗体及び融合タンパク質で観察されるものの範囲内である。腫瘍保持マウスでは、抗体クリアランスは約２倍以上早く、それはおそらくこの服用レベルによるものではない。９５％を超える生物学的利用能は、ＩＰ投与又はＳＣ投与が治療に適切な手段であることを示す。２−３日の半減期により週に２−３回の投薬が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１Ａ】マウスモノクローナル抗体２Ｇ７の可変軽鎖（ＶＬ）（図１Ａ）及び可変重鎖（ＶＨ）（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び２）；ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢバージョン（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ）のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号：３及び４）、及びヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖κサブグループI；ｈｕｍIII、重鎖サブグループIII)（それぞれ配列番号：５及び６）を表す。アスタリスクは、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとマウスモノクローナル抗体２Ｇ７との間の、又は、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとヒトコンセンサスフレームワーク領域との間の相違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示し、実際のヒト生殖細胞系配列のＣＤＲを比較のためにコンセンサスフレームワーク領域の下に示す（配列番号７ないし１１）。
【図１Ｂ】マウスモノクローナル抗体２Ｇ７の可変軽鎖（ＶＬ）（図１Ａ）及び可変重鎖（ＶＨ）（図１Ｂ）ドメインのアミノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び２）；ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢバージョン（Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ）のＶＬ及びＶＨドメイン（それぞれ配列番号：３及び４）、及びヒトＶＬ及びＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖κサブグループI；ｈｕｍIII、重鎖サブグループIII)（それぞれ配列番号：５及び６）を表す。アスタリスクは、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとマウスモノクローナル抗体２Ｇ７との間の、又は、ヒト化ｈｕｘＴＧＦＢとヒトコンセンサスフレームワーク領域との間の相違を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示し、実際のヒト生殖細胞系配列のＣＤＲを比較のためにコンセンサスフレームワーク領域の下に示す（配列番号７ないし１１）。
【図２】多様なＣＤＲ領域（配列番号：１８ないし２３）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１２ないし１７）。
【図３Ａ】７０９.ｌａｎｄＨ.ＩｇＧ１（配列番号：２４）；Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２５）；Ｖ１１Ｈ.Ｖ１１Ｌ（配列番号：２６）；Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２７）；ｃｈｉｍＬ.ｃｈｉｍＨ（配列番号：２８）；及びＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ２（配列番号：２９）のアミノ酸配列。
【図３Ｂ】７０９.ｌａｎｄＨ.ＩｇＧ１（配列番号：２４）；Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２５）；Ｖ１１Ｈ.Ｖ１１Ｌ（配列番号：２６）；Ｖ５Ｈ.Ｖ５Ｌ（配列番号：２７）；ｃｈｉｍＬ.ｃｈｉｍＨ（配列番号：２８）；及びＶ５Ｈ.ｇ１Ｌ２（配列番号：２９）のアミノ酸配列。
【図４Ａ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３０ないし３５）。
【図４Ｂ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３０ないし３５）。
【図４Ｃ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３０ないし３５）。
【図４Ｄ】図３の配列をコードするシグナル配列を持つ及び持たない核酸配列（配列番号３０ないし３５）。
【図５】ＴＧＦ-βに対する２Ｇ７ ＩｇＧ変異形ヒト化抗体の結合曲線。
【図６Ａ】実施例２に記載の免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：４５；５３９１ｂｐ）。ｐＤＲ１は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含むものであり(Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図６Ｂ】実施例２に記載の免疫グロブリン軽鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ１の配列（配列番号：４５；５３９１ｂｐ）。ｐＤＲ１は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の軽鎖をコードする配列を含むものであり(Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図７Ａ】実施例２に記載の免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：４６；６１３５ｂｐ）。ｐＤＲ２は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含むものであり(上掲のShalaby等)、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図７Ｂ】実施例２に記載の免疫グロブリン重鎖の発現のためのプラスミドｐＤＲ２の配列（配列番号：４６；６１３５ｂｐ）。ｐＤＲ２は無関係な抗体、すなわちヒト化抗ＣＤ３抗体の重鎖をコードする配列を含むものであり(上掲のShalaby等)、その開始コドンと停止コドンを太字と下線で示す。
【図８】ＴＧＦ-βに対する２Ｇ７生殖系復帰変異体ヒト化抗体の結合曲線。
【図９】ＴＧＦ-β１抗体２Ｇ７と多様なヒト化ＴＧＦ-β変異形抗体のマウスメサンギウム細胞増殖アッセイの阻害結果。
【図１０】ＴＧＦ-βに対する３つのヒト化抗体（Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ、Ｈ２ＮＩ.ｇ１Ｌ２及びＶ５Ｈ.ｇｌＬ２）及び２Ｇ７マウス抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β３の中和反応。
【図１１】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β２の中和反応。
【図１２】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ３つの異なる濃度のＴＧＦ-β１の中和反応。
【図１３】図１０に示す４つの抗体による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおけるそれぞれ２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１、β２及びβ３の中和反応。
【図１４】ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.Ｖ５Ｌ（図１４Ａ）、ヒト化抗体Ｈ２ＮＩ.ｇ１Ｌ２（図１４Ｂ）、２Ｇ７マウス抗体（図１４C）及びヒト化抗体Ｖ５Ｈ.ｇｌＬ２（図１４D）による３Ｔ３線維芽細胞増殖アッセイにおける３つのＴＧＦ-βイソ型の中和反応。
【図１５】正常上皮細胞及び腫瘍上皮細胞によるＴＧＦ-βの産生及び阻害のＥＬＩＳＡ結果。図１５Ａは、正常上皮細胞（ＥｐＣ）（Ｃ５７）及び腫瘍ＥｐＣ（４Ｔ１モデル）によるＴＧＦ−β１のインビトロ産生を示す。図１５Ｂは、正常ＥｐＣ及び腫瘍ＥｐＣにおける腫瘍ＥｐＣの血清ＴＧＦ-β１レベルに対するインビボ抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照抗体（イソ型一致ＩｇＧであり、抗サワギク抗体である）との比較で示す。この同じＩｇＧ対照は残りの図に用いられ、図２８では同じ又は同じでないＩｇＧ対照を用いられる。
【図１６】ＩｇＧ対照と比較したときの二次肺腫瘍に対する抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果。図１６ＡはＩｇＧ対照抗体とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の両方に関与した肺葉の数とグレードを用いた組織学的スコアを示し、図１６Ｂは同じ対照とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７のグラム組織重と割合重量を示す。
【図１７】肺腫瘍の定量化に対する抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較によりｕＣＴ、腫瘍容積及び腫瘍数で示す。
【図１８】４Ｔ１乳癌モデルにおける抗ＴＧＦ-β抗体２Ｇ７と化学療法の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。図１８Ａは、生理食塩水対照、ＩｇＧとドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）対照、及び抗ＴＧＦ-β ２Ｇ７とドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）をＩｇＧの細胞接種後の時間の関数として、腫瘍容積を示す。図１８Ｂは、２つの対照（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)ドセタキセル有無のＩｇＧ）とドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)）を有する抗ＴＧＦ-βについて脳、肺、脾臓及び腫瘍の組織重量を示す。
【図１９】対照ＩｇＧ（対照）又は抗ＴＧＦ-β（２Ｇ７）で処置した４Ｔ１乳癌腫瘍マウス又は、腫瘍を持たないマウス（正常）における血漿ＶＥＧＦレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図２０】異なる乳癌モデルＰｙｍＴにおけるＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果。図２０ＡはＴＧＦ-β抗体とＩｇＧ対照の腫瘍成長の日数の関数として腫瘍容積を示し、図２０ＢはＴＧＦ-β抗体とＩｇＧ対照の腫瘍重量を示す。
【図２１】マウス黒色腫モデルＢ１６とＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。図２１Ａは対照とＴＧＦ-β抗体についてSurface及びPathologyに肺腫瘍を有するマウスの割合を示し、図２１Ｂは対照とＴＧＦ-β抗体についてのSurface、Cleared、CTの肺腫瘍数を示す。
【図２２】接種後１４日間にわたるＢ１６腫瘍成長（容積）に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果を対照ＩｇＧとの比較で示す。
【図２３】Ｂ１６（Ｅ６）可視的肺転移数に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２４】接種後１７日間にわたるＢ１６腫瘍成長（容積）に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２５】Ｂ１６原発性腫瘍重量に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２６】Ｂ１６（Ｅ７）可視的肺転移数に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７の効果をＩｇＧ対照との比較で示す。
【図２７】第４２日目までの期間にわたるヒト肺細胞Ｃａｌｕ-６マウス異種移植片における腫瘍容積に対するＴＧＦ-β抗体２Ｇ７、マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４６１、及びこの２つの抗体の組み合わせの効果をＩｇＧ対照との比較で示す。様々な薬剤での治療を第２日目に開始した。
【図２８】３つの種類の抗体処置とＩｇＧ対照について行った図２７に示すＣａｌｕ-６実験の最終腫瘍重量を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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