(57)【要約】【化１】2008508234.tif 000066  本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害性酵素活性を有する式（Ｉ）［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＸは定義された意味を有する］の新規な化合物、それらの製造、それらを含有する組成物、並びに薬品としてのそれらの使用を含んでなる。
2008508234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2008508234.tif 000058
［式中、
各Ｘは独立してＮまたはＣＨであり、
Ｒ１はフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニルまたはヘテロシクリルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２は水素、−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、ここで
各Ｒ５は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、イミダゾリルまたはトリアゾリルから独立して選択され、
各Ｒ６はヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ピペラジニル、モノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはチオモルホリニルから独立して選択され、
各Ｒ７およびＲ８は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノスルホニルから独立して選択され、
Ｒ３は水素、ヒドロキシメチル、アミノメチルまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノメチルであり、
Ｒ４は水素またはＣ１−６アルキルであり、
上記におけるアリールはフェニルまたはナフタレニルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノまたはヒドロキシカルボニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、そして
上記におけるヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シ
ンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニルまたはナフチリジニルであり、ここで
該複素環の各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよい］
の化合物、そのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容可能な付加塩および立体化学的異性体形態。
【請求項２】
各ＸがＮであり、Ｒ１がフェニルまたは場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキルまたはアリールで置換されていてもよいフェニルであり、Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６であり、各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはイミダゾリルから独立して選択され、各Ｒ６がＣ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノまたはモルホリニルから独立して選択され、Ｒ３が水素でありそしてＲ４が水素またはＣ１−６アルキルである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各ＸがＮであり、Ｒ１がフェニルまたはハロで置換されたフェニルであり、Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５であり、各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、またはＣ１−６アルキルカルボニルオキシから独立して選択され、Ｒ３が水素であり、そしてＲ４が水素である請求項１および２に記載の化合物。
【請求項４】
該化合物が化合物番号１、化合物番号８、化合物番号１１、化合物番号９、化合物番号３３、化合物番号３４、化合物番号７または化合物番号２５である請求項１、２および３に記載の化合物。
【表１】
2008508234.tif 000059
【請求項５】
製薬学的に許容可能な担体および活性成分としての治療的に有効な量の請求項１〜４に記載の化合物を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項６】
製薬学的に許容可能な担体および請求項１〜４に記載の化合物を緊密に混合する請求項５に記載の製薬学的組成物の製造方法。
【請求項７】
薬品としての使用のための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
増殖性疾患の処置用の薬品の製造のための請求項１〜４のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項９】
抗癌剤および請求項１〜４のいずれかに記載のＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせ。
【請求項１０】
式（ＩＩ）の中間体を適当な酸と反応させて式（Ｉ）のヒドロキサム酸を生成せしめることを特徴とする、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【化２】
2008508234.tif 000060
【請求項１１】
式（Ｖ）
【化３】
2008508234.tif 000061
［式中、
各Ｘは独立してＮまたはＣＨであり、
Ｒ１はフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニルまたはヘテロシクリルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２は水素、−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、ここで
各Ｒ５は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、イミダゾリルまたはトリアゾリルから独立して選択され、
各Ｒ６はヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ピペラジニル、モノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはチオモルホリニルから独立して選択され、
各Ｒ７およびＲ８は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノスルホニルから独立して選択され、
Ｒ３は水素、ヒドロキシメチル、アミノメチルまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノメチルであり、
Ｒ４は水素またはＣ１−６アルキルであり、
上記におけるアリールはフェニルまたはナフタレニルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノまたはヒドロキシカルボニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、そして
上記におけるヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチア
ゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニルまたはナフチリジニルであり、ここで
該複素環の各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよい］
の化合物、そのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容可能な付加塩および立体化学的異性体形態。
【請求項１２】
ａ）ここで式（Ｖ−ａ）の化合物と称するＲ２が−ＣＨ２ＯＨでありそしてＲ４が水素である式（Ｖ）の化合物を、既知の反応または官能基変換により、ここで式（Ｖ−ｂ）の化合物と称するＲ２が−ＣＨ２ＯＨ以外である式（Ｖ）の化合物に転化し、そして
【化４】
2008508234.tif 000062
ｂ）式（ＶＩ）の中間体を１，４−ジオキサン−２，５−ジオールおよび式（ＶＩＩ）［式中、Ｒ１は以上で定義された通りである］の適当なボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）と反応させることにより式（Ｖ−ａ）の化合物を一段階で製造し、或いは
【化５】
2008508234.tif 000063
ｃ）式（ＶＩ）の中間体を式（ＶＩＩＩ）［式中、Ｒ１およびＲ２は以上で定義された通りである］の適当なケトンと反応させることにより式（Ｖ−ｂ）の化合物を製造し、
【化６】
2008508234.tif 000064
ｄ）式（ＶＩ）の中間体を適当な溶媒中で２−オキソ−プロパン酸および式（ＶＩＩ）［式中、Ｒ１は以上で定義された通りである］の適当なボロン酸と反応させそして既知の反応または官能基変換によりＲ２が−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６である式（Ｖ）の中間体にさらに転化することにより、ここで式（Ｖ−ｃ）の化合物と称するＲ２が−ＣＯＯＨである式（Ｖ）の化合物を一段階で製造する
【化７】
2008508234.tif 000065
ことを特徴とする、請求項１１に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性を阻害するヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を有する化合物に関する。それは、さらに、それらの製造方法、それらを含んでなる組成物、並びにインビトロおよびインビボの両者においてＨＤＡＣを阻害するためのそして薬品としての、例えば増殖性症状、例えば癌および乾癬を抑制するための薬品としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核ヒストン類は、遺伝子転写並びに他のＤＮＡ−鋳型化方法、例えば複製、修復、組み換え、および染色体分離を調節するために寄与する機構の重要なそして能動的な成分として知られる。それらは、アセチル化、ホスホリル化、メチル化、ユビキチン化、およびＡＤＰ−リボシル化を包含する翻訳後修飾の主体である。
【０００３】
ここでは「ＨＤＡＣ類」と称するヒストンデアセチラーゼ（類）は、コアヌクレオソームヒストン類Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を包含する蛋白質のリシン基上のアセチル修飾の除去に触媒作用を与える酵素である。ここでは「ＨＡＴ類」と称するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（類）と一緒になって、ＨＤＡＣ類はヒストン類のアセチル化水準を調節する。ヌクレオソームヒストン類のアセチル化の均衡は多くの遺伝子の転写において重要な役割を演ずる。ヒストン類の過剰アセチル化は縮合した染色質構造と関連して遺伝子転写の抑制をもたらすが、アセチル化されたヒストン類はより開放的な染色質構造および転写の活性化と関連する。
【０００４】
１１種の構造的に関連したＨＤＡＣ類が記載されておりそして２つの種類に入る。種類ＩのＨＤＡＣ類はＨＤＡＣ１、２、３、８および１１よりなるが、種類ＩＩのＨＤＡＣ類はＨＤＡＣ４、５、６、７、９および１０よりなる。第三の種類のＨＤＡＣ類の構成員は種類Ｉおよび種類ＩＩのＨＤＡＣ類と構造的に関連しない。種類Ｉ／ＩＩのＨＤＡＣ類は亜鉛−依存性機構により操作されるが、種類ＩＩＩのＨＤＡＣ類はＮＡＤ−依存性である。
【０００５】
ヒストン類の他に、他の蛋白質、特に転写因子、例えばｐ５３、ＧＡＴＡ−１およびＥ２Ｆ、核受容体、例えばグルココルチコイド受容体、チロイド受容体、エストロゲン受容体、並びに細胞周期調節蛋白質、例えばｐＲｂ、もアセチル化用の基質であった。蛋白質のアセチル化は蛋白質安定化、例えばｐ５３安定化、補因子の漸増および増加したＤＮＡ結合と関係していた。ｐ５３は、種々のストレス信号、例えばＤＮＡ損傷、に反応して細胞周期停止またはアポプトーシスを誘発しうる腫瘍抑制剤である。ｐ５３−由来細胞周期停止に関する主な標的はｐ２１遺伝子であるようである。ｐ５３によるその活性化の次に、ｐ２１がサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ複合体とのその会合により同定されて、Ｇ１およびＧ２フェーズの両者における細胞周期停止、老化中のその上方調整、および増殖性細胞核抗原とのその相互作用をもたらす。
【０００６】
ＨＤＡＣ類の阻害剤の研究は、それらが細胞周期停止、細胞分化、アポプトーシスおよび形質転換された表現型の逆転において重要な役割を演ずることを示している。
【０００７】
阻害剤であるトリコスタチン（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）Ａ（ＴＳＡ）は、例えば、Ｇ１およびＧ２フェーズの両者において細胞周期停止を引き起こし、種々の細胞系統の形質転換された表現型を逆転し、そしてフレンド白血病細胞などの分化を誘発する。ＴＳＡ
（およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸ＳＡＨＡ）はマウスにおいて細胞成長を阻止し、末端分化を誘発し、そして腫瘍の生成を予防することが報告された（非特許文献１）。
【０００８】
トリコスタチンＡは線維症、例えば肝臓線維症および肝臓チローシス（ｃｈｉｒｒｈｏｓｉｓ）の処置において有用であることも報告された（１９９８年３月１１日に公告された欧州特許出願であるＧｒｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．の特許文献１）。
【０００９】
ＨＤＡＣ阻害剤に関するファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）は、ＨＤＡＣ類の亜鉛−含有活性部位と相互作用する金属−結合領域、リンカー領域、および活性部位の縁にある基と相互作用する表面認識領域またはキャッピング領域よりなる。
【００１０】
ＨＤＡＣ類の阻害剤はｐ２１遺伝子発現を誘発することも報告された。これらの阻害剤によるｐ２１遺伝子の転写活性化はｐ２１プロモーター領域内でのヒストン類Ｈ３およびＨ４のアセチル化合物の染色質改造により促進される。ｐ２１のこの活性化はｐ５３−非依存性方式で起き、そしてそれ故、ＨＤＡＣ阻害剤は多くの腫瘍の特徴である突然変異したｐ５３遺伝子を有する細胞内で作用する。
【００１１】
さらに、ＨＤＡＣ阻害剤は間接的活性、例えば宿主免疫応答の増加および腫瘍血管形成の阻害、を有することができ、そしてそれ故、原発性腫瘍の成長を抑制しそして転移を防ぎうる（非特許文献２）。
【００１２】
上記に鑑み、ＨＤＡＣ阻害剤は突然変異したｐ５３遺伝子を有する腫瘍を包含する細胞増殖性疾患または症状の処置において大きな可能性を有しうる。
【００１３】
２００３年８月１４日に公告された特許出願である特許文献２は二環式ヒドロキサメート類をヒストンデアセチラーゼの阻害剤として開示している。
【００１４】
２００３年９月１８日に公告された特許出願である特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０は、とりわけ、置換されたピペラジニルピリミジニルヒドロキサム酸類をヒストンデアセチラーゼの阻害剤として開示しており、さらに特許文献８はＲ３０６４６５を開示している。
【００１５】
２００３年１０月９日に公告された特許出願である特許文献１１はピペラジン結合を含んでなるカルバミン酸化合物を、ＨＤＡＣ阻害剤として、開示している。
【００１６】
２００３年１０月２３日に公告された特許出願である特許文献１２は置換されたピペラジニルフェニルベンズアミド化合物を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として、開示している。
【００１７】
２００４年１月２９日に公告された特許出願である特許文献１３はアリール基およびヒドロキサメートの間にアルキルリンカーを含有する誘導体を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として、開示している。
【００１８】
２００４年２月１２日に公告された特許出願である特許文献１４は（ヘテロ）アリールアルケニル置換された二環式ヒドロキサメート類を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤として、開示している。
【００１９】
２００４年７月２９日に公告された特許出願である特許文献１５は抗−炎症および抗腫瘍活性を有するＮ−ヒドロキシ−ベンズアミド誘導体を開示している。
【００２０】
２００４年７月２９日に公告された特許出願である特許文献１６は置換されたアリールヒドロキサメート誘導体をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２１】
２００４年８月２６日に公告された特許出願である特許文献１７はインドール類、ベンズイミダゾール類およびナフヒミダゾール類（ｎａｐｈｈｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ）をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２２】
２００４年９月３０日に公告された特許出願である特許文献１８は非−芳香族複素環式環系に結合されたヒドロキサメート類をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２３】
２００４年１０月２８日に公告された特許出願である特許文献１９はヒドロキサメート誘導体をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２４】
２００５年３月３１日に公告された特許出願である特許文献２０はベンズイミダゾール類をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２５】
２００５年４月７日に公告された特許出願である特許文献２１および特許文献２２はベンズアミド類をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２６】
２００５年５月６日に公告された特許出願である特許文献２３はアシルウレア結合されたおよびスルホニルウレア結合されたヒドロキサメート類をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２７】
これも２００５年５月６日に公告された特許出願である特許文献２４はビアリール結合されたヒドロキサメート類をヒストンデアセチラーゼ阻害剤として開示している。
【００２８】
本発明の化合物は、構造、それらの薬理学的活性および／または薬理学的能力において先行技術と異なる。
【特許文献１】欧州特許第０８２７７４２号明細書
【特許文献２】欧州特許第１４７２２１６号明細書
【特許文献３】欧州特許第１４８５０９９号明細書
【特許文献４】欧州特許第１４８５３４８号明細書
【特許文献５】欧州特許第１４８５３５３号明細書
【特許文献６】欧州特許第１４８５３５４号明細書
【特許文献７】欧州特許第１４８５３６４号明細書
【特許文献８】欧州特許第１４８５３６５号明細書
【特許文献９】欧州特許第１４８５３７０号明細書
【特許文献１０】欧州特許第１４８５３７８号明細書
【特許文献１１】欧州特許第１４９２５３４号明細書
【特許文献１２】欧州特許第１４９５００２号明細書
【特許文献１３】国際公開第０４／００９５３６号パンフレット
【特許文献１４】欧州特許第１５２５１９９号明細書
【特許文献１５】国際公開第０４／０６３１４６号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第０４／０６３１６９号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第０４／０７２０４７号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第０４／０８２６３８号パンフレット
【特許文献１９】国際公開第０４／０９２１１５号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第０５／０２８４４７号パンフレット
【特許文献２１】国際公開第０５／０３０７０４号パンフレット
【特許文献２２】国際公開第０５／０３０７０５号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第０５／０４０１０１号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第０５／０４０１６１号パンフレット
【非特許文献１】Ｆｉｎｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０１：  １８８−１９３，  １９９９
【非特許文献２】Ｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２５：  ２６１−３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
解決すべき課題は、増加したバイオアベイラビリティーおよび／またはインビボ能力を有する高い酵素および細胞活性を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明の新規な化合物は上記の課題を解決するものである。本発明の化合物は優れたヒストンデアセチラーゼ阻害性の酵素および細胞活性を示す。それらは、細胞およびインビボ水準の両者において、ｐ２１遺伝子を活性化する高い能力を有する。それらは望ましい薬物動力学特徴およびｐ４５０酵素に対する低い親和力を有し、それが不利な薬品−薬品相互作用の危険性を減じて、より広い安全域を可能にする。
【００３１】
本発明の有利な特徴は代謝安定性、溶解性および／またはｐ２１誘発能力である。より特に、本発明の化合物はラットの肝細胞中で増加した半減期を有し、水溶液中で増加した溶解性／安定性を有し、および／または増加したインビボｐ２１プロモーター誘発能力を有する。
【００３２】
本発明は、式（Ｉ）
【００３３】
【化１】
2008508234.tif 000003
【００３４】
［式中、
各Ｘは独立してＮまたはＣＨであり、
Ｒ１はフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニルまたはヘテロシクリルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２は水素、−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、ここで
各Ｒ５は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−
６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、イミダゾリルまたはトリアゾリルから独立して選択され、
各Ｒ６はヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ピペラジニル、モノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはチオモルホリニルから独立して選択され、
各Ｒ７およびＲ８は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノスルホニルから独立して選択され、
Ｒ３は水素、ヒドロキシメチル、アミノメチルまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノメチルであり、
Ｒ４は水素またはＣ１−６アルキルであり、
上記におけるアリールはフェニルまたはナフタレニルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノまたはヒドロキシカルボニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、そして
上記におけるヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニルまたはナフチリジニルであり、ここで
該複素環の各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ、モノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよい］
の化合物、それらのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容可能な付加塩および立体化学的異性体形態に関する。
【００３５】
用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」または「ヒストンデアセチラーゼの阻害剤」は、ヒストンデアセチラーゼと相互作用しそしてその活性、より特にその酵素活性を阻害しうる化合物を同定するために使用される。ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することは、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を減ずることを意味する。好ましくは、そのような阻害は特異的であり、すなわちヒストンデアセチラーゼ阻害剤はある種の別の無関係な生物学的効果を生ずるのに必要な阻害剤の濃度より低い濃度においてヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を減ずる。
【００３６】
前記の定義および以下で使用される際、ハロは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを総称し、Ｃ１−４アルキルは、炭素数１〜４の直鎖状および分枝鎖状の飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、１−メチルエチル、２−メチルプロピルなどを定義し、Ｃ１−６アルキルは、Ｃ１−４アルキルおよび炭素数５〜６のそれより高級な同族体、例えば、ペンチル、２−メチルブチル、ヘキシル、２−メチルペンチルなどを包含し、ポリハロＣ１−６アルキルは、３個の同一もしくは相異なるハロ置換基を含有するＣ１−６アルキル、例えばトリフルオロメチルを定義し、そしてＣ３−６シクロアルキルは、炭素数３〜６の環式炭化水素基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロ
ペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシルなどを包含する。
【００３７】
製薬学的に許容可能な付加塩は、製薬学的に許容可能な酸付加塩および製薬学的に許容可能な塩基付加塩を包括する。上記の製薬学的に許容可能な酸付加塩は、式（Ｉ）の化合物が生成可能な治療的に活性な無毒の酸付加塩形態を含んでなる。塩基性を有する式（Ｉ）の化合物を、該塩基形態を適当な酸で処理することにより、それらの製薬学的に許容可能な酸付加塩に転化することができる。適当な酸は、例えば、無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸もしくは臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸および同様な酸、または有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、琥珀酸（すなわちブタンジオン酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸、パモ酸および同様な酸を含んでなる。酸性を有する式（Ｉ）の化合物を、該酸形態を適当な有機または無機塩基で処理することにより、それらの製薬学的に許容可能な塩基付加塩に転化することができる。適当な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩類、アルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩など、有機塩基、例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンとの塩、ヒドラバミン塩、並びにアミノ酸、例えば、アルギニン、リシンなどとの塩類を含んでなる。用語「酸または塩基付加塩類」は、式（Ｉ）の化合物が生成しうる水和物および溶媒付加形態も含んでなる。そのような形態の例は、例えば水和物、アルコレートなどである。
【００３８】
用語「式（Ｉ）の化合物の立体化学的異性体形態」は、ここで使用される際には、式（Ｉ）の化合物が有することができる同じ結合順序により結合された同じ原子から構成されるが交換可能でない異なる三次元構造を有する全ての可能な化合物を定義する。その他の方法で述べられたりまたは指示されたりしない限り、化合物の化学的表示は該化合物が有することができる全ての可能な立体化学的異性体形態の混合物を包括する。該混合物は該化合物の基本的分子構造の全てのジアステレオマーおよび／またはエナンチオマーを含有できる。純粋形態または互いの混合物状の両方の式（Ｉ）の化合物の全ての立体化学的異性体形態が本発明の範囲内に包括されることが意図される。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物のＮ−オキシド形態は、１個もしくは数個の窒素原子がいわゆるＮ−オキシド、特に、ピペリジン−、ピペラジンまたはピリダジニル−窒素の１個もしくはそれ以上がＮ−オキシド化されたＮ−オキシドに酸化されている式（Ｉ）の化合物を含んでなることを意味する。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物のあるものはそれらの互変異性体形態でも存在しうる。上記の式には明白には示されていないそのような形態は本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００４１】
以下で使用される際には、常に、用語「式（Ｉ）の化合物」は、製薬学的に許容可能な付加塩および全ての立体異性体形態も包含することを意味する。
【００４２】
ここで使用される際には、用語「ヒストンデアセチラーゼ」および「ＨＤＡＣ」は、ヒストンのＮ−末端におけるリシン基のε−アミノ基からアセチル基を除去する酵素群のいずれかをさすことが意図される。文脈によりその他の方法で指示されない限り、用語「ヒストン」は、いずれかの種からのＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４、およびＨ５を包含するいずれかのヒストン蛋白質をさすことを意味する。ヒトＨＤＡＣ蛋白質または遺伝子生成物は、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、ＨＤＡＣ−８、ＨＤＡＣ−９、ＨＤＡＣ−１０およびＨＤＡＣ−１１を包含するが、それらに限定されない。ヒストンデアセチラーゼは原生動物ま
たは菌・カビ源から誘導されうる。
【００４３】
興味ある化合物の第一群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）Ｒ１がフェニルまたはナフタレニルであり、ここで
各々の該フェニルまたはナフタレニルがＣ１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニルまたはＣ１−６アルキルアミノスルホニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されており、或いは
ｂ）Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、
ｃ）Ｒ４がＣ１−６アルキルである。
【００４４】
興味ある化合物の第二群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）Ｒ１がフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
各々の該フェニルがアリール、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニルまたはヘテロシクリルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されており、或いは
ｂ）Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、
ｃ）Ｒ４がＣ１−６アルキルである。
【００４５】
興味ある化合物の第三群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）Ｒ１がフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
各々の該フェニルまたはナフタレニルがＣ１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、またはＣ１−６アルキルアミノスルホニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されており、或いは
ｂ）Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、
ｃ）Ｒ４がＣ１−６アルキルである。
【００４６】
興味ある化合物の第四群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、イミダゾリルまたはトリアゾリルから独立して選択され、
ｂ）各Ｒ６がヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはチオモルホリニルから独立して選択され、
ｃ）Ｒ４が水素である。
【００４７】
興味ある化合物の第五群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）
の化合物よりなる：
ａ）各ＸがＮであり、
ｂ）Ｒ１がフェニルまたは場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキルまたはアリールで置換されていてもよいフェニルであり、
ｃ）Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６であり、
ｄ）各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはイミダゾリルから独立して選択され、
ｅ）各Ｒ６がＣ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノまたはモルホリニルから独立して選択され、
ｆ）Ｒ３が水素であり、或いは
ｇ）Ｒ４が水素またはＣ１−６アルキルである。
【００４８】
興味ある化合物の第六群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）各Ｒ６がＣ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノまたはモルホリニルから独立して選択される。
【００４９】
興味ある化合物の第七群は、下記の限定の１つもしくはそれ以上が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）各ＸがＮであり、
ｂ）Ｒ１がフェニルまたはハロで置換されたフェニルであり、
ｃ）Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５であり、
ｄ）各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、またはＣ１−６アルキルカルボニルオキシから独立して選択され、
ｅ）Ｒ３が水素であり、
ｆ）Ｒ４が水素である。
【００５０】
好ましい化合物の群は、各ＸがＮであり、Ｒ１がフェニルまたは場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキルまたはアリールで置換されていてもよいフェニルであり、Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６であり、各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはイミダゾリルから独立して選択され、各Ｒ６がＣ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノまたはモルホリニルから独立して選択され、Ｒ３が水素でありそしてＲ４が水素またはＣ１−６アルキルである式（Ｉ）の化合物よりなる。
【００５１】
好ましい化合物の別の群は、Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８である式（Ｉ）の化合物よりなる。
【００５２】
より好ましい化合物の別の群は、各ＸがＮであり、Ｒ１がフェニルまたはハロで置換されたフェニルであり、Ｒ２が−ＣＨ２−Ｒ５であり、各Ｒ５が水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、またはＣ１−６アルキルカルボニルオキシから独立して選択され、Ｒ３が水素であり、そしてＲ４が水素である式（Ｉ）の化合物よりなる。
【００５３】
最も好ましい化合物は、化合物番号１、化合物番号８、化合物番号１１、化合物番号９、化合物番号３３、化合物番号３４、化合物番号７または化合物番号２５である。
【００５４】
【表１】
2008508234.tif 000004
【００５５】
式（Ｉ）の化合物およびそれらの製薬学的に許容可能な塩並びにそれらのＮ−オキシドおよび立体化学的異性体形態は従来方法で製造することができる。出発物質および一部の中間体は既知の化合物でありそして市販されているかまたは当該技術で一般的に既知である従来の反応工程に従い製造することができる。
【００５６】
ある種の製造方法は以下でさらに詳細に記載される。式（Ｉ）の最終化合物を得るための他の方法は実施例に記載される。
【００５７】
ａ）式（ＩＩ）の中間体を適当な酸、例えば、トリフルオロ酢酸と反応させることにより、式（Ｉ）のヒドロキサム酸を製造することができる。該反応は適当な溶媒、例えば、メタノールまたはジクロロメタン中で行われる。
【００５８】
【化２】
2008508234.tif 000005
【００５９】
ｂ）式（ＩＩＩ）の中間体を適当な試薬、例えばＮ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン一塩酸塩（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の存在下で式（ＩＶ）の中間体と反応させることにより、式（ＩＩ）の中間体を製造することができる。この反応は塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で、適当な溶媒、例えばジクロロメタンおよびテトラヒドロフランの混合物中で行うことができる。
【００６０】
【化３】
2008508234.tif 000006
【００６１】
ｃ）別の方法では、式（ＸＩ）の中間体を、適当な溶媒、例えばアルコール、例えばエタノール中で、１，４−ジオキサン−２，５−ジオールおよび式（ＶＩＩ）［式中、Ｒ１は以上で定義された通りである］の適当なボロン酸（ｂｏｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）と反応させることにより、ここで式（ＩＩ−ａ）の中間体と称するＲ４が水素である式（ＩＩ）の中間体を一段階で製造することができる。
【００６２】
【化４】
2008508234.tif 000007
【００６３】
ｄ）式（Ｖ）の中間体を、適当な溶媒、例えばアルコール、例えばエタノールまたはプロパノール中で、適当な酸性溶液、例えば塩酸、または塩基性溶液、例えば臭化水素もしくは水酸化ナトリウムと反応させることにより、式（ＩＩＩ）の中間体を製造することができる。
【００６４】
【化５】
2008508234.tif 000008
【００６５】
本発明は、また、式（Ｖ）
【００６６】
【化６】
2008508234.tif 000009
【００６７】
［式中、
各Ｘは独立してＮまたはＣＨであり、
Ｒ１はフェニル、ナフタレニルまたはヘテロシクリルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ１−６アルキルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニルまたはヘテロシクリルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ２は水素、−ＣＨ２−Ｒ５、トリフルオロメチル、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６、または−ＣＨ２−ＮＲ７Ｒ８であり、ここで
各Ｒ５は水素、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキルオキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ、ピペラジニル、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、イミダゾリルまたはトリアゾリルから独立して選択され、
各Ｒ６はヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルオキシ、アミノまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６シクロアルキルアミノ、ヒドロキシＣ１−６アルキルアミノ、ピペラジニル、モノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノＣ１−６アルキルアミノ、Ｎ−メチルピペラジニル、モルホリニルまたはチオモルホリニルから独立して選択され、
各Ｒ７およびＲ８は水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノスルホニルから独立して選択され、
Ｒ３は水素、ヒドロキシメチル、アミノメチルまたはモノ−もしくはジ（Ｃ１−６アルキル）アミノメチルであり、
Ｒ４は水素またはＣ１−６アルキルであり、
上記におけるアリールはフェニルまたはナフタレニルであり、ここで
該フェニルまたはナフタレニルの各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノまたはヒドロキシカルボニルから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよく、そして
上記におけるヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジ
ニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニルまたはナフチリジニルであり、ここで
該複素環の各々は場合によりハロ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ、またはモノ−もしくはジ（Ｃ１−４アルキル）アミノから各々独立して選択される１個もしくは２個の置換基で置換されていてもよい］
の化合物、それらのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容可能な付加塩および立体化学的異性体形態にも関する。
【００６８】
式（Ｖ）の化合物に関する、興味ある、好ましい、より好ましいおよび最も好ましい化合物の群は、式（Ｉ）の化合物に関して定義された群に従い定義される。
【００６９】
式（Ｖ）の新規な中間体は、ａ）ここで式（Ｖ−ａ）の中間体と称するＲ２が−ＣＨ２ＯＨでありそしてＲ４が水素である式（Ｖ）の中間体を、既知の反応または官能基変換により、ここで式（Ｖ−ｂ）の中間体と称するＲ２が−ＣＨ２ＯＨ以外である式（Ｖ）の化合物に転化することにより製造することができる。例えば、式（Ｖ−ａ）のアルコールをアミン、エステルおよびエーテルに転化させることができる。アミンを対応するアミドに変換させることができそして第一級アミンを第二級または第三級アミンに転化させることができる。
【００７０】
【化７】
2008508234.tif 000010
【００７１】
ｂ）式（ＶＩ）の中間体を、適当な溶媒、例えばアルコール、例えばエタノール中で、１，４−ジオキサン−２，５−ジオールおよび式（ＶＩＩ）［式中、Ｒ１は以上で定義された通りである］の適当なボロン酸と反応させることにより、式（Ｖ−ａ）の新規な中間体を一段階で製造することができる。
【００７２】
【化８】
2008508234.tif 000011
【００７３】
ｃ）式（ＶＩ）の中間体を、適当な試薬、例えばテトラキス（エタノレート）チタンまたは水素化ホウ素ナトリウムの存在下で、適当な溶媒、例えば１，２−ジクロロエタン中で、式（ＶＩＩＩ）の適当なケトンと反応させることにより、式（Ｖ−ｂ）の新規な中間体を製造することができる。
【００７４】
【化９】
2008508234.tif 000012
【００７５】
ｄ）式（ＶＩ）の中間体を、適当な溶媒、例えば１，２−ジクロロメタン中で、２−オキソ−プロパン酸および式（ＶＩＩ）［式中、Ｒ１は以上で定義された通りである］の適当なボロン酸と反応させることにより、ここで式（Ｖ−ｃ）の化合物と称するＲ２が−ＣＯＯＨである式（Ｖ）の新規な中間体を一段階で製造することができる。Ｒ２が−ＣＯＯＨである式（Ｖ−ｃ）の中間体を、当該技術で既知の反応または官能基変換、例えばアミン類およびアミド類への転化により、Ｒ２が−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ６である式（Ｖ）の中間体に転化することができる。
【００７６】
【化１０】
2008508234.tif 000013
【００７７】
式（ＩＸ）の中間体を、適当な溶媒、例えばジクロロメタン中で、ピペリジンと反応させることにより、式（ＸＩ）の中間体を製造することができる。
【００７８】
【化１１】
2008508234.tif 000014
【００７９】
式（Ｘ）の中間体を、適当な試薬、例えばＮ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン一塩酸塩（ＥＤＣ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の存在下で、式（ＩＶ）の中間体と反応させることにより、式（ＩＸ）の中間体を製造することができる。反応は塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で、溶媒、例えばジクロロメタンおよびテトラヒドロフランの混合物中で行うことができる。
【００８０】
【化１２】
2008508234.tif 000015
【００８１】
式（ＶＩ）の中間体を、水酸化ナトリウムの存在下で、適当な溶媒、例えばテトラヒドロフラン中で、式（ＸＩＩ）の中間体と反応させ、引き続き塩酸を用いて中和しそして炭酸ナトリウムを添加することにより、式（Ｘ）の中間体を製造することができる。
【００８２】
【化１３】
2008508234.tif 000016
【００８３】
式（Ｉ）の化合物および一部の中間体はそれらの構造中に少なくとも１個のステレオジェン中心を有することができる。このステレオジェン中心はＲまたはＳ立体配置で存在しうる。
【００８４】
上記の方法で製造される式（Ｉ）の化合物は一般的にエナンチオマー類のラセミ混合物であり、それらは当該技術で既知の分離工程に従い互いに分離することができる。式（Ｉ）のラセミ化合物は、適当なキラル酸との反応により、対応するジアステレオマー塩形態に転化することができる。該ジアステレオマー塩形態はその後に、例えば、選択的または分別結晶化により分離されそしてエナンチオマーはアルカリによりそこから遊離される。式（Ｉ）の化合物のエナンチオマー形態の別の分離方法はキラル静止相を使用する液体クロマトグラフィーを包括する。該純粋な立体化学的異性体も、反応が立体特異的に起きる条件下で、適当な出発物質の対応する純粋な立体化学的異性体形態から誘導することもできる。好ましくは、特異的な立体異性体が所望される場合には、該化合物は立体特異的製造方法により合成されるであろう。これらの方法は有利にはエナンチオマー的に純粋な出発物質を使用するであろう。
【００８５】
式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容可能な酸付加塩類および立体異性体形態は、それらがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害効果を有する点で、価値ある薬理学的性質を有する。
【００８６】
本発明は、有効量の本発明の化合物を投与することにより、形質転換された細胞を包含する細胞の異常成長を抑制する方法を提供する。細胞の異常成長は、正常な調節機構とは別の細胞成長（例えば、接触抑制の損失）をさす。これは癌細胞の成長停止、末端分化および／またはアポプトーシスを引き起こすことによる直接的なもの並びに腫瘍の新生血管形成を抑制することによる間接的なものの両方の腫瘍成長の抑制を包含する。
【００８７】
本発明はまた、有効量の本発明の化合物をそのような処置を必要とする患者、例えば哺乳動物（そしてより特に人間）に投与することにより腫瘍成長を抑制する方法も提供する。特に、本発明は有効量の本発明の化合物の投与により腫瘍の成長を抑制する方法を提供する。抑制できる腫瘍の例は、肺癌（例えば腺癌、そして非−小細胞杯盤を包含する）、
膵臓癌（例えば、膵臓癌腫、例えば外分泌膵臓癌腫）、結腸癌（例えば、結腸直腸癌腫、例えば、結腸腺癌および結腸腺腫）、進行した疾患を包含する前立腺癌、リンパ系統の造血腫瘍（例えば、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＣ））、甲状腺小胞癌、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、間葉器官の腫瘍（例えば線維肉腫および横紋筋肉主）、黒色腫、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば角化棘細胞腫）、肺癌腫（例えば進行した肺癌）、腎臓癌腫、卵巣癌腫、膀胱癌腫および表皮癌腫であるが、それらに限定されない。
【００８８】
本発明に従う化合物は他の治療目的、例えば：
ａ）癌を処置するための腫瘍の照射の前、最中または後に本発明に従う化合物を投与することによる放射療法に対する腫瘍の感作、
ｂ）関節炎および骨病理学症状、例えば慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎、痛風、多発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および全身的紅斑性狼瘡、の処置、ｃ）脈管増殖性疾患、アテローム硬化症および再狭窄を包含する平滑筋細胞増殖の抑制、ｄ）炎症症状および皮膚症状、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、対宿主性移植片病、結膜炎、喘息、ＡＲＤＳ、ベーチェット病、移植拒絶反応、蕁麻疹、アレルギー性皮膚炎、円形脱毛症、強皮症、発疹、湿疹、皮膚筋炎、ざ瘡、糖尿病、全身的紅斑性狼瘡、カワサキ病、多発性硬化症、気腫、嚢胞性線維症および慢性気管支炎の処置、
ｅ）子宮内膜症、子宮類線維腫、機能不全性子宮出血および子宮内膜肥厚症の処置、
ｆ）網膜および脈絡膜管に影響する血管疾患を包含する眼の血管新生の処置、
ｇ）心不全の処置、
ｈ）免疫抑制症状の抑制、例えばＨＩＶ感染症の処置、
ｉ）腎不全の処置、
ｊ）内分泌疾患の抑制、
ｋ）糖新生不全の抑制、
ｌ）神経病理学、例えばパーキンソン病または認識疾患をもたらす神経病理学、例えば、アルツハイマー病もしくはポリグルタミン関連ニューロン疾患の処置、
ｍ）精神医学疾患、例えば統合失調症、双極性疾患、鬱病、不安症および精神病の処置；ｎ）神経筋肉病理学、例えば、筋萎縮性側策硬化症の抑制、
ｏ）脊椎筋肉萎縮症の処置、
ｐ）遺伝子の発現を増強させることによる処置を受けることが可能な他の病理学的症状の処置、
ｑ）遺伝子療法の促進、
ｒ）脂質生成の抑制、
ｓ）寄生虫症、例えばマラリアの処置
のために使用することができる。
【００８９】
従って、本発明は薬品としての使用のため式（Ｉ）の化合物の並びに上記症状の１つもしくはそれ以上を処置するための薬品の製造用の式（Ｉ）の化合物の使用を開示する。
【００９０】
式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容可能な酸付加塩および立体異性体形態は、それらが標識の付いた化合物およびＨＤＡＣの間の複合体の生成を検出または測定することを含んでなる生物学的試料内でＨＤＡＣを検出または同定するために使用できる点で、価値ある診断性質を有することができる。
【００９１】
検出または同定方法は、標識剤、例えば放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質などで標識付けされる化合物を使用することができる。放射性同位体の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃを包含する。酵素は一般的に適当な基質の抱合により検出可能にされ、基質はまた検出可能な反応に触媒作用を与える。それらの例は、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシダー
ゼおよびマレートデヒドロゲナーゼ、好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼ、を包含する。発光物質は、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼを包含する。
【００９２】
生物学的試料は体組織または体液として定義することができる。体液の例は脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、痰、唾液などである。
【００９３】
それらの有用な薬理学的性質のためには、当該化合物は投与目的のための種々の製薬学的形態に調合することができる。
【００９４】
本発明の製薬学的組成物を製造するために、有効量の活性成分としての、塩基または酸付加塩形態の、特定化合物を投与に望ましい調合形態によって広範囲の形態をとりうる製薬学的に許容可能な担体と緊密に混合して組み合わせる。これらの製薬学的組成物は望ましくは、好ましくは経口的な、直腸への、経皮的な、または非経口的注射による投与に適する単位薬用量形態である。例えば、組成物を経口的薬用量形態で製造する際には、一般的な製薬学的媒体、例えば、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤および液剤の如き経口的液体調合物の場合には水、グリコール類、油類、アルコール類など、または粉剤、丸剤、カプセル剤および錠剤の場合には固体担体、例えば澱粉、糖類、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などを使用することができる。
【００９５】
それらの投与の容易さのために、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口的薬用量単位形態であり、この場合にはもちろん固体の製薬学的担体が使用される。非経口的組成物用には、担体は一般的には少なくとも大部分は殺菌水を含んでなるが、例えば溶解を助けるための他の成分を含むことができる。例えば、担体が食塩水溶液、グルコース溶液または食塩水およびグルコース溶液の混合物を含んでなる注射液剤を製造することができる。注射懸濁剤を製造することもでき、その場合には適当な液体担体、懸濁化剤などを使用することができる。経皮投与に適する組成物中では、担体は場合により浸透促進剤および／または適当な湿潤剤を、場合により少量部分のいずれかの性質の適当な皮膚に対して有意な悪影響を引き起こさない添加剤と組み合わせて含んでなることができる。該添加剤は皮膚への投与を促進させることができおよび／または所望する組成物の製造を助けとなりうる。これらの組成物は種々の方法で、例えば、経皮パッチとして、滴下剤としてまたは軟膏剤として、投与することができる。
【００９６】
上記の製薬学的組成物を投与の容易さおよび薬用量の均一さのために薬用量単位形態に調合することが特に有利である。ここで明細書および特許請求の範囲で使用される薬用量単位形態は、各々の単位が所望する治療効果を生ずるように計算された予め決められた量の活性成分を必要な製薬学的担体と共に含有する単位薬用量として適する物理的に分離した単位をさす。そのような薬用量単位形態の例は錠剤（刻み目付きまたはコーティング錠剤を包含する）、カプセル剤、丸剤、粉末パケット剤、ウエファー剤、注射液剤または懸濁剤、小匙一杯分、大匙一杯分など、並びにそれらの分離された複数分である。
【００９７】
当業者は以下に示される試験結果から有効量を容易に決めることができるであろう。一般的に、治療的に有効な量は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの体重、そして特に０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの体重であろう。必要な服用量を１日にわたり適当な間隔で２回、３回、４回またはそれ以上の回数の分割−服用量として投与することが適切でありうる。そのような分割−服用量は、例えば、単位薬用量形態当たり０．５〜５００ｍｇ、そして特に１０ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分を含有する単位薬用量形態として調合することができる。
【００９８】
本発明の別の面として、ＨＤＡＣ−阻害剤と別の抗癌剤との組み合わせが、特に薬品と
しての使用のために、より具体的には他の癌または関連疾患の処置において推奨される。
【００９９】
上記症状の処置のためには、本発明の化合物は１種もしくはそれ以上の薬剤、より特に、他の抗癌剤と組み合わせて有利に使用することができる。抗癌剤の例は、
−白金配位化合物、例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｎ）またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｙｐｌａｔｉｎ）、
−タキサン化合物、例えばパルシタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）またはドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、
−トポイソメラ−ゼＩ阻害剤、例えばカンプトテシン化合物、例えばイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）またはトポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、
−トポイソメラ−ゼＩＩ阻害剤、例えば抗−腫瘍ポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）またはテニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、
−抗−腫瘍ビンカアルカロイド類、例えばビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）またはビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、
−抗−腫瘍ヌクレオシド誘導体、例えば５−フルオラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲンシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）またはカペシタビン（ｋａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、
−アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタードまたはニトロソウレア、例えばシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）またはロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、
−抗−腫瘍アンスラサイクリン誘導体、例えばダウロルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）またはミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、
−ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、
−エストロゲン受容体拮抗物質または選択的エストロゲン受容体調節剤、例えばタモキシフェンン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、ドロロキフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ファスロデックス（ｆａｓｌｏｄｅｘ）またはラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、
−アロマターゼ阻害剤、例えばエキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）およびボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）、
−分化剤、例えばレチノイド類、ビタミンＤおおよびレチン酸代謝妨害剤（ＲＡＭＢＡ）、例えばアククタン（ａｃｃｕｔａｎｅ）、
−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばアザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、
−キナーゼ阻害剤、例えばフラボペリドール（ｆｌａｖｏｐｅｒｉｄｏｌ）、イマチニブ・メシレート（ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）またはゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、
−ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、
−他のＨＤＡＣ阻害剤、
−ユビキチン−プロテアソーム経路の阻害剤、例えばベルケード（Ｖｅｌｃａｄｅ）、或いは
−ヨンデリス（Ｙｏｎｄｅｌｉｓ）
である。
【０１００】
用語「白金配位化合物」は、ここでは、白金をイオンの形態で提供する腫瘍細胞成長阻害性白金配位化合物を示すために使用される。
【０１０１】
用語「タキサン化合物」は、タキサン環を有しそしてある種のイチイ（Ｔａｘｕｓ）樹木からの抽出物に関連するまたはそこから誘導される化合物の種類を示す。
【０１０２】
用語「トピソメラーゼ阻害剤」は、真核生物細胞中でＤＮＡトポロジーを変更しうる酵素を示すために使用される。それらは重要な細胞機能および細胞増殖にとって必須である。真核生物細胞中には２種のトポイソメラーゼ類、すなわちタイプＩおよびタイプＩＩ、がある。トポイソメラーゼＩは約１００，０００の分子量の単量体状酵素である。この酵素はＤＮＡに結合しそして過渡的な一本鎖切断を導入し、二重螺旋を巻き戻し（またそのまま巻き戻しを可能にし）そして引き続きＤＮＡストランドからの解離前に切断部を再封印する。トピソメラーゼＩＩは、ＤＮＡストランド切断の誘発またはフリーラジカルの生成を含む同様な作用機構を有する。
【０１０３】
用語「カンプトテシン化合物」は、中国の樹木であるカンプトテシン・アクミナタ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）およびインドの樹木であるノタポジテス・フォエチダ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ  ｆｏｅｔｉｄａ）から誘導される水−不溶性アルカロイドである親カンプトテシンに関連するかまたはそこから誘導される化合物を示すために使用される。
【０１０４】
用語「ポドフィロトキシン化合物」は、マンドレーク植物から抽出される親ポドフィロトキシンに関連するかまたはそこから誘導される化合物を示すために使用される。
【０１０５】
用語「抗−腫瘍ビンカアルカロイド類」は、キョウチクトウ植物（Ｖｉｎｃａ  ｒｏｓｅａ）の抽出物に関連するかまたはそこから誘導される化合物を示すために使用される。
【０１０６】
用語「アルキル化剤」は、それらが生理学的条件下でアルキル基を生物学的に必須である高分子、例えばＤＮＡを与える能力を有する共通の特徴を有する化学物質の多様な群を包括する。例えばナイトロジェンマスタードおよびニトロソウレアの如きより重要な剤のほとんどでは、活性アルキル化部分が複雑な退化反応後にインビボで生成し、それらの一部は酵素性である。アルキル化剤の最も重要な薬理学的作用は、特定のＤＮＡ合成および細胞分割において細胞増殖に関係する基本的機構を妨害することである。アルキル化剤がＤＮＡ機能および急速に増殖する組織中での一体性を妨害する能力が、それらの治療用途およびそれらの毒性の多くの基礎を提供する。
【０１０７】
用語「抗−腫瘍アンスラサイクリン誘導体」は、グリコシド性結合により結合された異常な糖であるダウノサミンを有するテトラサイクリン環構造を有することにより特徴づけられるカビ・菌であるＳｔｒｅｐ．  ｐｅｕｔｉｃｕｓ  ｖａｒ．  ｃａｅｓｉｕｓおよびそれらの誘導体から得られる抗生物質を含んでなる。
【０１０８】
原発性乳癌腫におけるヒト表皮成長因子受容体２蛋白質（ＨＥＲ２）の増殖がある種の患者に関しては劣悪な臨床予後に関係することが示された。トラスツズマブは、ＨＥＲ２受容体の細胞外領域に高い親和度でそして特異的に結合する高度に精製された組み換えＤＮＡ−由来のヒト化されたモノクローン性ＩｇＧ１カッパ抗体である。
【０１０９】
多くの乳癌はエストロゲン受容体を有しそしてこれらの腫瘍の成長はエストロゲンにより刺激される。用語「エストロゲン受容体拮抗物質」および「選択的エストロゲン受容体調節剤」は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合するエストラジオールの競合阻害剤を示すために使用される。選択的エストロゲン受容体調節剤は、ＥＲに結合される時には、受容体の三次元形状における変化を誘発して、ＤＮＡ上のエストロゲン原因要素（ＥＲＥ）に対するその結合を調節する。
【０１１０】
閉経後女性では、循環するエストロゲンの主要源は末梢組織内のアロマターゼ酵素による副腎および卵巣アンドロゲン類（アンドロステネジオンおよびテツソステロン）のエストロゲン類（エストロンおよびエストラジオール）への転化からである。アロマターゼ阻害または不活性化によるエストロゲン欠乏は、ホルモン−依存性乳癌を有するある種の閉経後患者に対する有効なそして選択的な処置である。
【０１１１】
用語「抗エストロゲン剤」は、ここでは、エストロゲン受容体拮抗物質および選択的エストロゲン受容体調節剤だけでなく以上で論じられたアロマターゼ阻害剤も包含するために使用される。
【０１１２】
用語「分化剤」は、種々の方法で細胞増殖を阻害しそして分化を促進しうる化合物を包括する。ビタミンＤおよびレチノイド類は広範囲の正常なおよび悪性の細胞タイプの成長および分化の調節において主要な役割を演ずることが知られる。レチン酸代謝妨害罪（ＲＡＭＢＡ類）は、レチン酸のシトクロムＰ４５０−介在代謝を抑制することにより、内因性レチン酸類の水準を増加させる。
【０１１３】
ＤＮＡメチル化変動はとりわけヒト新形成における最も普遍的な異常である。選択された遺伝子のプロモーター内の過剰メチル化は一般的に関係する遺伝子の不活性化と関連する。用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの薬理学的阻害および腫瘍抑制剤遺伝子発現の再活性化により作用する化合物を示すために使用される。
【０１１４】
用語「キナーゼ阻害剤」は、細胞周期進化およびプログラムされた細胞死滅（アポプトーシス）に関与するキナーゼ類の有効な阻害剤を含んでなる。
【０１１５】
用語「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤」は、Ｒａｓおよび他の細胞内蛋白質のファルネシル化を防止するように設計された化合物を示すために示される。それらは悪性細胞増殖および生存に対する影響を有することが示された。
【０１１６】
用語「他のＨＤＡＣ阻害剤」は
−カルボキシレート類、例えばブチレート、桂皮酸、４−フェニルブチレートまたはバルプロ酸、
−ヒドロキサム酸類、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ピペラジン含有ＳＡＨＡ同族体、ビアリールヒドロキサメートＡ−１６１９０６およびそのカルボゾリルエーテル−、テトラヒドロピリジン−およびテトラロン−同族体、二環式アリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキサミド類、ピロキサミド、ＣＧ−１５２１、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、オキサムフラチン、スクリプタイド、スクリプタイド関連三環式分子、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）、ＣＢＨＡ−類似ヒドロキサム酸類、トラポキシン−ヒドロキサム酸同族体、Ｒ３０６４６５並びに関連するベンゾイル−およびヘテロアリール−ヒドロキサム酸類、アミノスベレート類およびマロニルジアミド類、
−環式テトラペプチド類、例えばトラポキシン、アピジシン、デプシペプチド、スピルコスタチン−関連化合物、ＲｅｄＦＫ−２２８、スルフヒドリル−含有環式テトラペプチド類（ＳＣＯＰ類）、ヒドロキサム酸含有環式テトラペプチド類（ＣＨＡＰ類）、ＴＡＮ−１７４類およびアズムアミド類、
−ベンズアミド類、例えばＭＳ−２７５またはＣＩ−９９４、或いは
−デプデシン
を含んでなるが、それらに限定されない。
【０１１７】
用語「ユビキチン−プロテアゾーム経路の阻害剤」は、細胞周期調節蛋白質を包含する
プロテアゾーム内の細胞蛋白質の標的化された破壊を抑制する化合物を同定するために使用される。
【０１１８】
癌の処置のために、照射と組み合わせて、本発明に従う化合物を上記の患者に投与することができる。照射はイオン化照射および特にガンマ照射、特に線状加速器によりまたは現在普遍的に使用されている放射性核種により発生されるもの、を意味する。放射性核種による腫瘍の照射は外的または内的でありうる。
【０１１９】
本発明は、また、抗癌剤と本発明に従うＨＤＡＣ阻害剤との本発明に従う組み合わせにも関する。
【０１２０】
本発明は、また、例えば腫瘍細胞の成長を抑制するための医学的療法における使用のための本発明に従う組み合わせにも関する。
【０１２１】
本発明は、また、腫瘍細胞の成長を抑制するための本発明に従う組み合わせにも関する。
【０１２２】
本発明は、また、患者に有効量の本発明に従う組み合わせを投与することを含んでなるヒト患者における腫瘍細胞の成長を抑制する方法にも関する。
【０１２３】
本発明は、さらに、有効量の本発明に従う組み合わせを投与することによる形質転換された細胞を包含する細胞の異常成長を抑制する方法にも関する。
【０１２４】
他の薬剤およびＨＤＡＣ阻害剤を同時に（例えば別個のもしくは単一の組成物状で）またはいずれかの順序で連続的に投与することができる。後者の場合には、有利なまたは相乗的な効果が確実に得られるのに充分な期間内に且つ充分な量および方法で２種の化合物が投与されるであろう。投与の好ましい方法および順序並びに組み合わせの各成分に関するそれぞれの薬用量および処方は投与される特定の他の薬剤およびＨＤＡＣ阻害剤、それらの投与方式、処置される特定の腫瘍および処置される特定の宿主に依存することは認識されよう。投与の最適な方法および順序並びに薬用量および処方は従来方法を用いてそしてここに示された情報に鑑みて当業者により容易に決めることができる。
【０１２５】
白金配位化合物は、有利には、処置の経過中に１〜５００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば５０〜４００ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特にシスプラチンに関しては約７５ｍｇ／ｍ２の薬用量でそしてカルボプラチンに関しては約３００ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１２６】
タキサン化合物は、有利には、処置の経過中に５０〜４００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば７５〜２５０ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特にパクリタキセルに関しては約１７５〜２５０ｍｇ／ｍ２の薬用量でそしてドセタキセルに関しては約７５〜１５０ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１２７】
カンプトテシン化合物は、有利には、処置の経過中に０．１〜４００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば１〜３００ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特にイリノテカンに関しては約１００〜３５０ｍｇ／ｍ２の薬用量でそしてトポテカンに関しては約１〜２ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１２８】
抗−腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は、有利には、処置の経過中に３０〜３００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば５０〜２５０ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特にエトポシドに関しては約３５〜１００ｍｇ／ｍ２の薬用量でそしてテニポシ
ドに関しては約５０〜２５０ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１２９】
抗−腫瘍ビンカアルカロイドは、有利には、処置の経過中に２〜３０ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積の薬用量で、特にビンブラスチンに関しては約３〜１２ｍｇ／ｍ２の薬用量で、ビンクリスチンに関しては約１〜２ｍｇ／ｍ２の薬用量で、そしてビノレルビンに関しては約１０〜３０ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１３０】
抗−腫瘍ヌクレオシド誘導体は、有利には、処置の経過中に２００〜２５００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば７００〜１５００ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特に５−ＦＵに関しては約２００〜５００ｍｇ／ｍ２の薬用量で、ゲンシタビンに関しては約８００〜１２００ｍｇ／ｍ２の薬用量でそしてカペシタビンに関しては約１０００〜２５００ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１３１】
アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタードまたはニトロソウレアは、有利には、処置の経過中に１００〜５００ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば１２０〜２００ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で、特にシクロホスファミドに関しては約１００〜５００ｍｇ／ｍ２の薬用量で、クロランブシルに関しては約０．１〜０．２ｍｇ／ｍ２の薬用量で、カルムスチンに関しては約１５０〜２００ｍｇ／ｍ２の薬用量で、そしてロムスチンに関しては約１００〜１５０ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１３２】
抗−腫瘍アンスラサイクリン誘導体は、有利には、処置の経過中に１０〜７５ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば１５〜６０ｍｇ／ｍ２の体表面積、の薬用量で、特にドキソルビシンに関しては約４０〜７５ｍｇ／ｍ２の薬用量で、ダウノルビシンに関しては約２５〜４５ｍｇ／ｍ２の薬用量で、そしてイダルビシンに関しては約１０〜１５ｍｇ／ｍ２の薬用量で投与される。
【０１３３】
トラスツズマブは、有利には、処置の経過中に１〜５ｍｇ／平方メートル（ｍｇ／ｍ２）の体表面積、例えば２〜４ｍｇ／ｍ２の体表面積の薬用量で投与される。
【０１３４】
抗エストロゲン剤は、有利には、特定の剤および処置される症状によるが、１日当たり約１〜１００ｍｇの薬用量で投与される。タモキシフェンは、有利には、経口的に５〜５０ｍｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇの薬用量で１日２回投与され、治療効果を達成し且つ維持するのに充分な時間にわたり療法を続ける。トレミフェンは、有利には、経口的に約６０ｍｇの薬用量で１日１回投与され、治療効果を達成し且つ維持するのに充分な時間にわたり療法を続ける。アナストロゾールは、有利には、経口的に約１ｍｇの薬用量で１日１回投与される。ドロキシフェンは、有利には、経口的に約２０−１００ｍｇの薬用量で１日１回投与される。ラロキシフェンは、有利には、経口的に約６０ｍｇの薬用量で１日１回投与される。エキセメスタンは、有利には、経口的に約２５ｍｇの薬用量で１日１回投与される。
【０１３５】
これらの薬用量は処置の経過当たり例えば１回、２回またはそれ以上投与され、それは例えば７、１４、２１または２８日毎に繰り返すことができる。
【０１３６】
それらの有用な薬理学的性質のために、本発明に従う組み合わせの成分、すなわち他の薬剤およびＨＤＡＣ阻害剤を投与目的のための種々の製薬学的形態に調合することができる。成分は個別の製薬学的組成物中に別個にまたは両方の成分を含有する単一の製薬学的組成物中に調合することができる。
【０１３７】
本発明は従って、他の薬剤およびＨＤＡＣ阻害剤を１種もしくはそれ以上の製薬学的担体と一緒に含んでなる製薬学的組成物にも関する。
【０１３８】
本発明は、また、抗癌剤および本発明に従うＨＤＡＣ阻害剤を１種もしくはそれ以上の製薬学的担体と一緒に含んでなる製薬学的組成物の形態の本発明に従う組み合わせにも関する。
【０１３９】
本発明は、さらに、腫瘍細胞の成長を抑制するための製薬学的組成物の製造における本発明に従う組み合わせの使用にも関する。
【０１４０】
本発明は、さらに、癌に罹っている患者の処置における同時の、別個のまたは連続的な使用のための組み合わせ調合物としての、本発明に従うＨＤＡＣ阻害剤を第一の活性成分としてそして抗癌剤を第二の活性成分として含有する製品にも関する。
【実施例】
【０１４１】
実験の部
以下の実施例は説明目的のために提供される。以下で、「ＥＤＣ」はＮ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン一塩酸塩として定義され、「ＤＣＭ」はジクロロメタンとして定義され、「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルとして定義され、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとして定義され、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルとして定義され、「ＥｔＯＨ」はエタノールとして定義され、「ＨＯＢＴ」は１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾールとして定義され、「ＭｅＯＨ」はメタノールとして定義され、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸として定義されそして「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランとして定義される。
Ａ．中間体化合物の製造
実施例Ａ１
ａ）中間体１の製造
【０１４２】
【化１４】
2008508234.tif 000017
【０１４３】
２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．０１６モル）、（２−フェニルエテニル）−ボロン酸（０．０１６モル）および１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．０１６モル）のＥｔＯＨ（２５０ｍｌ）中混合物を２日間にわたり室温において撹拌しそして次に溶媒を蒸発させた（真空）。残渣をＤＣＭ中に加えそして水および有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル（１５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９７／１）により精製した。純粋な画分を蒸発させて、４ｇ（６１％）の中間体１、融点１２８℃、を生成した。中間体１に対応するエステル類はキラルクロマトグラフィーにより分離することができる。
ｂ）中間体２の製造
【０１４４】
【化１５】
2008508234.tif 000018
【０１４５】
中間体１（０．０００７モル）の１Ｎ水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）およびＴＨＦ（２０ｍｌ）中混合物を室温において４８時間にわたり撹拌した。１Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加えた。溶媒を蒸発させた。沈殿を濾過し、水で、次にＤＩＰＥで洗浄し、そして乾燥して、０．２ｇ（７２％）の中間体２、融点２３２℃、を生成した。
ｃ）中間体３の製造
【０１４６】
【化１６】
2008508234.tif 000019
【０１４７】
トリエチルアミン（０．０１２モル）、Ｎ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．００５９３モル）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（０．００５９３モル）およびＯ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．００５９３モル）を中間体２（０．００３９５モル）のＤＣＭ（７０ｍｌ）およびＴＨＦ（７０ｍｌ）の混合物中の混合物に加え、次に反応混合物を３日間にわたり室温において撹拌した。Ｈ２Ｏを加えた。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾別しそして溶媒を蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（勾配溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１）により精製した。生成物画分を集めそして有機溶媒を蒸発させて、１．５ｇ（８４％）の中間体３を生成した。
実施例Ａ２
ａ）中間体４の製造
【０１４８】
【化１７】
2008508234.tif 000020
【０１４９】
２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．００４２モル）、１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．００４２モル）および（Ｅ）［２−（４−クロロフェニル）エテニル］−ボロン酸（０．００４２モル）のＥｔＯＨ（１００ｍｌ）中混合物を室温において７２時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（１．８ｇ）をシリカゲル（１５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１）により精製した。２つの画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．８５ｇのＦ１（油）および０．２５ｇのＦ２（全体的収率：６３％）を生成した。Ｆ１を２−プロパンオン／ＤＩＰＥから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．６ｇの中間体４、融点１１０℃、を生成した。
ｂ）中間体５の製造
【０１５０】
【化１８】
2008508234.tif 000021
【０１５１】
メタンスルホニルクロリド（０．００１２モル）を５℃において中間体４（０．０００６モル）およびトリエチルアミン（０．００２４モル）のＴＨＦ（１５ｍｌ）中溶液にＮ２流下で加えた。混合物を室温にし、次に１時間にわたり撹拌し、そして氷水中に注いだ。混合物をＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させて、０．３ｇの中間体５を生成した。この生成物を次の反応段階で直接使用した。
ｃ）中間体６の製造
【０１５２】
【化１９】
2008508234.tif 000022
【０１５３】
中間体５（０．０００６モル）、モルホリン（０．０００９モル）および炭酸カリウム（０．００１８モル）のアセトニトリル（３０ｍｌ）中混合物を８０℃において１５時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（０．２７ｇ）をシリカゲル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １００／０〜９０／１０）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．０８５ｇ（２９％）の中間体６を生成した。
ｄ）中間体７の製造
【０１５４】
【化２０】
2008508234.tif 000023
【０１５５】
中間体６（０．０００２モル）の１Ｎ水酸化ナトリウム（１．５ｍｌ）およびＴＨＦ（
３ｍｌ）中混合物を室温において７２時間にわたり撹拌した。１Ｎ塩酸（１．５ｍｌ）を加えた。混合物を乾固まで蒸発させて、中間体７を生成した。この生成物を次の反応段階で直接使用した。
ｅ）中間体８の製造
【０１５６】
【化２１】
2008508234.tif 000024
【０１５７】
中間体７（０．０００２モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．０００２モル）、ＥＤＣ（０．０００２モル）、ＨＯＢＴ（０．０００２モル）およびトリエチルアミン（０．０００２モル）のＤＣＭ／ＴＨＦ（１０ｍｌ）中混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（０．０９５ｇ）をシリカゲル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．０４ｇ（４１％）の中間体８を生成した。
実施例Ａ３
ａ）中間体１１の製造
【０１５８】
【化２２】
2008508234.tif 000025
【０１５９】
チタンエチレート（０．００８５モル）を室温において２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．００４２モル）および４−フェニル−３−ブテン−２−オン（０．００５１モル）の１，２−ジクロロ−エタン（４５ｍｌ）中溶液にＮ２流下で加えた。混合物を室温において２４時間にわたり撹拌した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（０．００８５モル）を加えた。混合物を５時間にわたり撹拌しそして氷水中に注いだ。ＤＣＭを加えた。混合物をセライト上で濾過した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（１．１６ｇ）をクロマシル（ｋｒｏｍａｓｉｌ）（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １００／０〜９５／５）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．１２ｇ（８％）の中間体１１を生成した。
ｂ）中間体１２の製造
【０１６０】
【化２３】
2008508234.tif 000026
【０１６１】
中間体１１（０．０００３モル）および水酸化ナトリウム（０．００１３モル）のＥｔＯＨ（１５ｍｌ）中混合物を３時間にわたり撹拌しそして還流し、次に室温に冷却しそして乾固まで蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中に加えた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．１２ｇ（１０％）の中間体１２、融点＞２６０℃、を生成した。
ｃ）中間体１３の製造
【０１６２】
【化２４】
2008508234.tif 000027
【０１６３】
ＥＤＣ（０．０００６モル）およびＨＯＢＴ（０．０００６モル）を室温において中間体１２（０．０００３モル）のＴＨＦ（１５ｍｌ）およびＤＣＭ（１５ｍｌ）中溶液にＮ２流下で加えた。混合物を１５分間にわたり撹拌した。Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．０００６モル）を加えた。混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、氷水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（０．２５ｇ）をクロマシル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １００／０〜９５／５）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．１ｇ（７０％）の中間体１３を生成した。
実施例Ａ４
ａ）中間体１４の製造
【０１６４】
【化２５】
2008508234.tif 000028
【０１６５】
２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．０５９モル）のＴＨＦ（３００ｍｌ）および１Ｎ水酸化ナトリウム（３００ｍｌ）中混合物を一晩にわたり室温において放置しそして次に撹拌した。１Ｎ塩酸（３００ｍｌ）を加えそして混合物を１０分間にわたり撹拌した。炭酸ナトリウム（０．１７８モル）を加えそして生じた混合物を１０分間にわたり室温において撹拌し、次に１−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］オキシ］−２，５−ピロリジンジオン（０．０５９モル）を少部分ずつ加えそして反応混合物を室温において１５時間にわたり撹拌した。混合物を濃ＨＣｌで酸性化しそして沈殿を濾別しそして乾燥して（真空）、２２．５ｇ（９０％）の中間体１４、融点２１８．５−２２１．２℃、を生成した。
ｂ）中間体１５の製造
【０１６６】
【化２６】
2008508234.tif 000029
【０１６７】
トリエチルアミン（０．０６９モル）、次にＥＤＣ（０．０３０３モル）およびＨＯＢＴ（０．０３０３モル）、引き続きＯ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．０３０３モル）を中間体１４（０．０２３３モル）のＤＣＭ／ＴＨＦ（５００ｍｌ）中混合物に加えそして反応混合物を室温において１８時間にわたり撹拌した。混合物をＤＣＭで希釈しそして水で洗浄した。有機層を分離しそして１０％炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。分離した有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾別しそして溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ
１００分間で１００／０→９７．５／２．５）により精製した。生成物画分を集めそして溶媒を蒸発させて、８．４ｇ（６８％）の中間体１５を生成した。
ｃ）中間体１６の製造
【０１６８】
【化２７】
2008508234.tif 000030
【０１６９】
中間体１５（０．０１６モル）のピリジン（０．０４０モル）およびＤＣＭ（２００ｍｌ）中混合物を一晩にわたり室温において撹拌しそして反応混合物を水で抽出し、次に水層を濃縮しそしてアセトニトリルと共−蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ３  ９５／５／０．５）により精製した。生成物画分を集めそして溶媒を蒸発させて、２．５ｇ（５０％）の中間体１６、融点７０．８−９３．９℃、を生成した。
ｄ）中間体１７の製造
【０１７０】
【化２８】
2008508234.tif 000031
【０１７１】
中間体１６（０．００２モル）、（Ｅ）［２−（４−フルオロフェニル）エテニル］−ボロン酸（０．００２モル）および１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．００２モル）のＥｔＯＨ（２５ｍｌ）中混合物を室温において１５時間にわたり撹拌し、氷上に注いだ。ＮａＨＣＯ３を加えた。混合物をＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（０．６８ｇ）をクロマシル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １００／０〜９０／１０）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．２７ｇ（２９％）の中間体１７、融点９０℃、を生成した。
実施例Ａ５
ａ）中間体１８の製造
【０１７２】
【化２９】
2008508234.tif 000032
【０１７３】
２−オキソ−プロパン酸（０．０１６９モル）、次に２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸エチルエステル（０．０１６９モル）を［２−（４−フルオロフェニル）エテニル］−ボロン酸（０．０１６９モル）のＤＣＭ（１５０ｍｌ）中溶液に加えた。混合物を室温において１５時間にわたり撹拌した。２−オキソ−プロパン酸（０．４当量）および［２−（４−フルオロフェニル）エテニル］−ボロン酸（０．１当量）を加えた。混合物を室温において１５時間にわたり撹拌した。有機層を水で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣（７．７ｇ）をシリカゲル（１５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９２／８／０．１）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させた。この残渣（６ｇ）を３Ｎ  ＨＣｌ中に溶解させた。混合物を室温において２時間にわたり撹拌した。沈殿を濾過し、水（最少量）で洗浄しそして乾燥して、２．８ｇ（３６％）の中間体１８を生成した。
ｂ）中間体１９の製造
【０１７４】
【化３０】
2008508234.tif 000033
【０１７５】
ＨＯＢＴ（０．００２２モル）、次にＥＤＣ（０．００２２モル）を中間体１８（０．００１５モル）、Ｎ−メチル−メタナミン（０．００２２モル）およびトリエチルアミン（０．００７５モル）のＤＣＭ／ＴＨＦ（４０ｍｌ）中溶液に加えた。混合物を室温において２４時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣をＤＩＰＥ中に加えた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．５８ｇ（８５％）の中間体１９、融点１９５℃、を生成した。
ｃ）中間体２０の製造
【０１７６】
【化３１】
2008508234.tif 000034
【０１７７】
中間体１９（０．００１１モル）および水酸化リチウム（０．００２３モル）のＴＨＦ（２０ｍｌ）および水（１０ｍｌ）中混合物を室温において１５時間にわたり撹拌した。３Ｎ  ＨＣｌを加えた。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿を濾過し、水で、次にジエチルエーテルで洗浄し、そして乾燥して、０．４５ｇ（８２％）の中間体２０を生成した。
ｄ）中間体２１の製造
【０１７８】
【化３２】
2008508234.tif 000035
【０１７９】
ＨＯＢＴ（０．００１４モル）、次にＥＤＣ（０．００１４モル）を室温において中間体２０（０．０００９モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．００１４モル）およびトリエチルアミン（０．００４３モル）のＤＣＭ／ＴＨＦ（５０／５０）（７５ｍｌ）中溶液に加えた。混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣（０．７ｇ）をシリカゲル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９９／１／０．１〜９４／６／０．６）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．３８ｇ（７５％）の中間体２１を生成した。
実施例Ａ６
ａ）中間体２２の製造
【０１８０】
【化３３】
2008508234.tif 000036
【０１８１】
６０％水素化ナトリウム（０．００８５モル）を一部分ずつ５℃において中間体１（０．００６５モル）のＴＨＦ（６０ｍｌ）中溶液にＮ２流下で加えた。混合物を５℃において１５分間にわたり撹拌した。ヨードメタン（０．００７８モル）のＴＨＦ（５ｍｌ）中溶液を滴下した。混合物を５℃において１時間にわたり撹拌し、次に室温において５時間にわたり撹拌し、氷上に注ぎそしてＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣（１．７５ｇ）をシリカゲル（１５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９９／１）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．８７ｇ（３４％）の中間体２２を生成した。
ｂ）中間体２３の製造
【０１８２】
【化３４】
2008508234.tif 000037
【０１８３】
中間体２２（０．００２７モル）および水酸化リチウム一水和物（０．００５５モル）のＴＨＦ（４０ｍｌ）および水（２０ｍｌ）中混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、１Ｎ  ＨＣｌで酸性化した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿を濾過し、最少量の水で洗浄しそして乾燥して、０．９１ｇ（８３％）の中間体２３を生成した。
ｃ）中間体２４の製造
【０１８４】
【化３５】
2008508234.tif 000038
【０１８５】
ＨＯＢＴ（０．００３３モル）およびＥＤＣ（０．００３３モル）を室温において中間体２３（０．００２２モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．００３３モル）およびトリエチルアミン（０．０１モル）のＤＣＭ／ＴＨＦ（９０ｍｌ）中溶液にＮ２流下で加えた。混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、水中に注ぎそしてＤＣＭで抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過しそして溶媒を蒸発させた。残渣（１．３ｇ）をシリカゲル（１５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９７／３／０．１）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させて、０．９３ｇ（８９％）の中間体２４を生成した。
実施例Ａ７
ａ）中間体２５の製造
【０１８６】
【化３６】
2008508234.tif 000039
【０１８７】
２−（１−ピペラジニル）−５−ピリジルカルボン酸エチルエステル（０．００８５モル）、１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．００９３モル）および（Ｅ）−［２−（４−フルオロフェニル）エテニル］−ボロン酸（０．００４２モル）のＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中混合物を室温において１５時間にわたり撹拌し、次に濾過した。濾液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中に加えた。有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させた。残渣（３．３ｇ）をジエチルエーテル中に溶解させそして５℃のイソプロパノール中５−６Ｎ  ＨＣｌ（２ｍｌ）の滴下により酸性化した。沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄しそして乾燥した。この画分を水中に加え、Ｋ２ＣＯ３を加えそして混合物をＤＣＭにより抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、そして溶媒を蒸発させて、２．７ｇ（７９％）の中間体２５を生成した。
ｂ）中間体２６の製造
【０１８８】
【化３７】
2008508234.tif 000040
【０１８９】
中間体２５（０．００２モル）、水酸化リチウム（０．００４モル）の水（２０ｍｌ）およびＴＨＦ（４０ｍｌ）中混合物を室温において１５時間にわたり撹拌した。混合物を濃縮した。３Ｎ塩酸を加えた。沈殿を濾過し、水で、次にジエチルエーテルで洗浄しそして乾燥して、０．５２ｇ（６３％）の中間体２６を生成した。
ｃ）中間体２７の製造
【０１９０】
【化３８】
2008508234.tif 000041
【０１９１】
トリエチルアミン（０．００５７モル）、Ｎ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（０．００１９モル）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（０．００１９モル）およびＯ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．００１９モル）を中間体２６（０．００１２モル）のＤＣＭ（５０ｍｌ）およびＴＨＦ（５０ｍｌ）の混合物中の混合物に加えた。反応混合物を２４時間にわたり室温において撹拌し、次にＨ２Ｏ中に注ぎそしてＤＣＭにより抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾別しそして溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（勾配溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ＯＨ  ９５／５／０．２）により精製した。生成物画分を集めそして有機溶媒を蒸発させて、０．５５ｇ（９１％）を生成した。この残渣をジエチルエーテル中に加え、沈殿を濾別しそして乾燥して、０．５ｇの中間体２７、融点１３３℃、を生成した。
実施例Ａ８
中間体２８および２９の製造
【０１９２】
【化３９】
2008508234.tif 000042
【０１９３】
無水酢酸（０．０１４モル）を５℃において、中間体３（０．００１４モル）、４−Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．００９５ｇ）およびピリジン（２．５ｍｌ）のＤＣＭ（１４ｍｌ）中混合物に滴下した。混合物を室温において２４時間にわたり撹拌し、濃縮し、水中に加えそして酢酸エチルで抽出した。有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾別しそして溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル（５μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（勾配溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  ９５／５）により精製した。純粋な画分を集めそして有機溶媒を蒸発させて、０．４８ｇ（５８％）の中間体２８を生成した。シュウ酸塩を画分（０．０５ｇ）上で製造しそして２−プロパノン／ジエチルエーテルから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．０４２ｇの中間体２９、融点１５４℃、を生成した。
【０１９４】
表Ｆ−１は、上記実施例の１つに従い製造された中間体を挙げる。
【０１９５】
【表２】
2008508234.tif 000043
【０１９６】
【表３】
2008508234.tif 000044
【０１９７】
Ｂ．最終化合物の製造
実施例Ｂ１
化合物１の製造
【０１９８】
【化４０】
2008508234.tif 000045
【０１９９】
中間体３（０．００１２１モル）のＴＦＡ（２．５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中混合物を４８時間にわたり撹拌しそして次に溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（Ｒ）ＮＨ２（２５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ８０／２０／２）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中に加えそして沈殿を次に濾過しそして５０℃において乾燥して（真空）、０．２６ｇ（６４％）の化合物１、融点１８７℃、を生成した。
実施例Ｂ２
化合物２の製造
【０２００】
【化４１】
2008508234.tif 000046
【０２０１】
中間体８（０．００００７モル）のトリフルオロ酢酸（０．２ｍｌ）およびＭｅＯＨ（４．５ｍｌ）中混合物を室温において９６時間にわたり撹拌した。溶媒を乾固まで蒸発させた。残渣をジエチルエーテル／２−プロパノンから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．０２５ｇ（５７％）の化合物２、融点１３５℃、を生成した。
実施例Ｂ３
化合物７の製造
【０２０２】
【化４２】
2008508234.tif 000047
【０２０３】
中間体１３（０．０００２モル）のＴＦＡ（０．５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、次に乾固まで蒸発させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．０４４ｇ（４４％）の化合物７、融点１６１℃、を生成した。
実施例Ｂ４
化合物８の製造
【０２０４】
【化４３】
2008508234.tif 000048
【０２０５】
中間体１７（０．０００５モル）のＴＦＡ（１．２ｍｌ）およびＭｅＯＨ（２４ｍｌ）中混合物を室温において５日間にわたり撹拌した。溶媒を乾固まで蒸発させた。残渣（０．２６ｇ）をシリカゲルＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（Ｒ）ＮＨ２（２５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ７０／３０／３）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させた。残渣（０．１６ｇ）をジエチルエーテルから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．１３ｇ（６６％）の化合物８、融点１８０℃、を生成した。
実施例Ｂ５
化合物９の製造
【０２０６】
【化４４】
2008508234.tif 000049
【０２０７】
中間体２８（０．０００４モル）のＴＦＡ（１ｍｌ）およびＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中混合物を室温において９６時間にわたり撹拌し、次に蒸発させた。残渣（０．２３ｇ）をシリカゲルＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（Ｒ）ＮＨ２（２５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ８０／２０／２）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させた。残渣（０．１０６ｇ）をジエチルエーテル／ＤＩＰＥから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．０６７ｇ（３４％）の化合物９、融点１６１℃、を生成した。
実施例Ｂ６
化合物１０の製造
【０２０８】
【化４５】
2008508234.tif 000050
【０２０９】
ＴＦＡ（１．９ｍｌ）を５℃において中間体２１（０．０００７モル）のＭｅＯＨ（３８ｍｌ）中溶液に滴下した。混合物を室温において４８時間にわたり撹拌し、次に乾固まで蒸発させた。残渣をジエチルエーテル／ＣＨ３ＣＮから結晶化させた。沈殿を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄しそして乾燥して、０．２４ｇ（６２％）の化合物１０、融点１４６℃、を生成した。
実施例Ｂ７
化合物１１の製造
【０２１０】
【化４６】
2008508234.tif 000051
【０２１１】
中間体２４（０．００１８モル）のＴＦＡ（４．４ｍｌ）およびＭｅＯＨ（８７ｍｌ）中混合物を室温において４日間にわたり撹拌し、次に乾固まで蒸発させた。残渣（１．０５ｇ）をシリカゲルＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ（Ｒ）ＮＨ２（２５−４０μｍ）上のカラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ８０／２０／２）により精製した。純粋な画分を集めそして溶媒を蒸発させた。この画分（０．６３４ｇ）をジエチルエーテル中に加えた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．４３ｇの化合物１１、融点２１２℃、を生成した。
実施例Ｂ８
化合物３１の製造
【０２１２】
【化４７】
2008508234.tif 000052
【０２１３】
中間体２７（０．００１１モル）のトリフルオロ酢酸（３ｍｌ）およびＭｅＯＨ（６０ｍｌ）中混合物を室温において４８時間にわたり撹拌した。溶媒を乾固まで蒸発させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化させた。沈殿を濾別しそして乾燥して、０．５１５ｇ（８９％）の化合物３１、融点１４５℃、を生成した。
【０２１４】
表Ｆ−２は、上記実施例の１つに従い製造された化合物を挙げる。下記の略語が表で使用された：Ｃ２ＨＦ３Ｏ２はトリフルオロ酢酸塩を示す。
【０２１５】
【表４】
2008508234.tif 000053
【０２１６】
【表５】
2008508234.tif 000054
【０２１７】
【表６】
2008508234.tif 000055
【０２１８】
Ｃ．薬理学的実施例：
ヒストンデアセチラーゼの阻害に関するインビトロ検定（実施例Ｃ．１参照）が式（Ｉ）の化合物で得られたＨＤＡＣ酵素活性の阻害を測定する。
【０２１９】
式（Ｉ）の化合物の細胞活性が細胞毒性または生存に関する比色計検定を用いてＡ２７８０腫瘍細胞上で測定された（Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔｉｍ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：  ５５−６３，  １９８３）（実施例Ｃ．２参照）。
【０２２０】
化合物の溶解性が溶液中に滞在する化合物の能力を測定する。第一の方法では、希釈時の溶液中に滞在する化合物の能力（実施例Ｃ．３．ａ参照）が測定される。ＤＭＳＯ−貯蔵溶液を単一の水性緩衝溶媒を用いて三連続段階で希釈する。各希釈に関して、濁度をネフェロメーターで測定する。第二の方法では、化学ルミネッセント窒素検知器を用いて異なるｐＨにおける化合物の溶解性を測定することができる（実施例Ｃ．３．ｂ参照）。
【０２２１】
薬品の浸透性はそれが１つの媒体から他のものの中に移動するその能力を表す。具体的にはそれが腸膜を通って血液流の中におよび／または血液流から標的中に移動するその能力である。浸透性（実施例Ｃ．４）はフィルター−固定された人工膜燐脂質二層の生成により測定することができる。フィルター−固定された人工膜検定では、９６−ウエルマイクロタイタープレートおよび９６−ウエルフィルタープレートを有する「サンドイッチ」が形成され、各複合体ウエルが１２５μｍマイクロ−フィルターディスク（０．４５μｍ孔）により分離された底部に供与体溶液をそして頂部に受容体溶液を有するジオレイルホスファチジル−コリンの２％（重量／容量）ドデカン溶液でコーティングされた２つの部屋に、システムが水性緩衝溶液と接触する時に多重層性の二層がフィルター経路内に生成する条件下で、分割される。この人工膜を通る化合物の浸透性はｃｍ／ｓで測定される。目的は、２種のｐＨである４．０および７．４における平行な人工膜を通る薬品の浸透性を観察することである。化合物検出は２５０〜５００ｎｍの間の最適波長においてＵＶ−分光計を用いて行われる。
【０２２２】
薬品の代謝は、脂質−可溶性の地球外生物および地球内生物化合物が１種もしくは複数の有極性の、水−可溶性の、そして排泄可能な代謝物質に酵素的に転換されることを意味する。薬品代謝の主要器官は肝臓である。代謝産物はしばしば親薬品より活性が小さいかまたは不活性である。しかしながら、ある種の代謝産物は増加した活性または有毒な影響を有しうる。それ故、代謝は「無毒化」および「有毒化」工程の両者を包含しうる。薬品および化学物質を処理する生物の能力を決める主要な酵素系統はシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ類により代表され、それらはＮＡＤＰＨ依存性酵素である。化合物の代謝安定性はインビトロで細胞下ヒト組織を用いて測定することができる（実施例Ｃ．５．ａ．参照）。ここでは化合物の代謝安定性はミクロソーム類を用いるこれらの化合物の１５分間のインキュベーション後に代謝された薬品の％として表示される。化合物の定量化はｌＣ−ＭＳ分析により測定された。化合物の代謝安定性は、ラットの肝細胞内の化合物の半減期を計算することにより、測定することもできる（実施例Ｃ．５．ｂ．参照）。
【０２２３】
広範囲の抗−腫瘍剤がＤＮＡ損傷剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を包含するｐ２１蛋白質を活性化することは示されていた。ＤＮＡ損傷剤は腫瘍抑制剤ｐ５３によりｐ２１遺伝子を活性化するが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は転写因子Ｓｐ１を介してｐ２１遺伝子を転写的に活性化する。それ故、ＤＮＡ損傷剤はｐ５３原因要素によりｐ２１プロモーターを活性化させるが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤はｓｐｌ部位（ＴＡＴＡボックスに関して−６０ｂｐ〜＋４０ｂｐ領域に位置する）により活性化し、両者ともｐ２１蛋白質の増加した発現をもたらす。細胞内のｐ２１プロモーターがｐ５３原因要素を含んでいないｐ２１  １３００ｂｐプロモーター断片よりなる場合には、それは従ってＤＮＡ損傷剤に対して非−原因性である。化合物がｐ２１を誘発する能力は数種の方法で評
価することができる。第一の方法は、腫瘍細胞を当該化合物で処理しそして細胞の溶解後にｐ２１酵素結合された免疫吸収剤検定（オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）のＷＡＦ１
ＥＬＩＳＡ）を用いてｐ２１誘発を検出することである。２１検定は、マウスのモノクローンおよびウサギのポリクローン抗体の両者を用いる「サンドイッチ」酵素免疫検定である。ヒトｐ２１蛋白質に特異的なウサギのポリクローン抗体がキット内に準備されたプラスチックウエルの表面上で固定された。検定しようとする試料内に存在するｐ２１は捕獲抗体に結合するであろう。ビオチニル化された検知剤であるモノクローン抗体もヒトｐ２１蛋白質を認識し、そして捕獲抗体により保持されたｐ２１に結合するであろう。検知剤である抗体は、また、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−抱合ストレプタビジンにより結合される。ホースラディッシュペルオキシダーゼは無色溶液から青色（または停止試薬の添加後には黄色）溶液への発色基質であるテトラ−メチルベンジジンの転化に触媒作用を与え、その強度はプレートに結合されるｐ２１蛋白質の量に比例する。着色された反応生成物は分光計を用いて定量化される。定量化は既知濃度のｐ２１を用いる標準曲線の作成により得られる（凍結乾燥の条件下）。この検定がｐ２１誘発をＤＮＡ損傷の結果としてまたはヒストンデアセチラーゼ阻害剤の結果として測定することができる（実施例Ｃ．６．ａ．参照）。
【０２２４】
別の方法は、化合物がｐ２１を誘発する能力を細胞水準におけるＨＤＡＣ阻害の結果として試験する。細胞は、ｐ５３原因要素を含んでならずそして対照水準と比べてレポーター遺伝子発現の増加が化合物をｐ２１誘発能力を有すると同定するｐ２１  １３００ｂｐプロモーター断片を含有する発現ベクターを用いて安定的にトランスフェクトすることができる。レポーター遺伝子は蛍光蛋白質でありそしてレポーター遺伝子の発現は発生した蛍光の量として測定される（実施例Ｃ．６．ｂ．参照）。最後の方法は、マウスを化合物の製薬学的活性をスクリーニングするために使用するインビボ方法である。上記の安定的に形質転換された腫瘍細胞はマウスに腫瘍の生成を行うのに充分な量で投与することができる。腫瘍細胞が腫瘍を生成するのに充分な時間が経過した後に、有効な活性化合物を動物に投与しそしてレポータ−遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞上の該化合物の効果を評価する。製薬学的に活性な化合物を用いるインキュベーションは対照水準と比べてレポーター遺伝子発現の増加をもたらすであろう（実施例Ｃ．６．ｃ．参照）。
【０２２５】
特異的なＨＤＡＣ阻害剤はたくさんあるＣＹＰ  Ｐ４５０蛋白質のように他の酵素を阻害しないはずである。ＣＹＰ  Ｐ４５０（発現された大腸菌）蛋白質３Ａ４、２Ｄ６、および２Ｃ９はそれらの特異的基質を蛍光分子に転化させる。ＣＹＰ３Ａ４蛋白質は７−ベンジルオキシ−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。ＣＹＰ２Ｄ６蛋白質は３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−４−メチルクマリン（ＡＭＭＣ）を３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチル］−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン塩酸塩に転化させそしてＣＹＰ２Ｃ９蛋白質は７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＭＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。酵素反応を抑制する化合物は蛍光信号の減少をもたらすであろう（実施例Ｃ．７参照）。
【０２２６】
実施例Ｃ．１：ヒストンデアセチラーゼの阻害用のインビトロ検定
バイオモル（Ｂｉｏｍｏｌ）のＨＤＡＣ蛍光活性検定／薬品発見キット（ＨＤＡＣ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
Ｋｉｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ）（登録番号：ＡＫ−５００−０００１）が使用された。ＨＤＡＣ蛍光活性検定はフルオル・デ・リス（Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ）（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅＡｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｌｙｓｙｌ）基質および現像剤組み合わせを基にしている。フルオル・デ・リス基質はアセチル化されたリシン側鎖を含んでなる。基質の脱アセチル化が基質を感作して、第二段階においてフルオル・デ・リス基質現像剤を用いる処置が蛍光を生成する。ＨｅＬａ核抽出物（供給業者：バイオモル
）を６０μｇ／ｍｌにおいて７５μＭの基質を用いてインキュベートした。フルオル・デ・リス基質を、２５ｍＭのトリス、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏを含有するｐＨ７．４の緩衝液の中に加えた。３０分後に、１容量の現像剤を加えた。蛍光は３５５ｎｍ光で励起されそして発光（４５０ｎｍ）を蛍光定量プレート読み取り器上で検出した。各実験に関して、対照（ＨｅＬａ核抽出物および緩衝液を含有する）、ブランクインキュベーション（緩衝液を含有するがＨｅＬａ核抽出物は含有しない）および試料（ＤＭＳＯ中に溶解させそして緩衝液およびＨｅＬａ核抽出物中でさらに希釈された化合物を含有する）を平行実験した。第一の場合には、化合物を１０−５Ｍの濃度で試験した。化合物が１０−５Ｍにおいて活性を示した時に、濃度−応答曲線を作成し、そこでは化合物は１０−５Ｍ〜１０−９Ｍの間の濃度において試験された。試料を４回試験した。各試験において、ブランク値が対照および試料値の両者から引き算された。対照試料は１００％の基質脱アセチル化であった。各試験に関して、蛍光は対照の平均値の百分率として表示された。適切なＩＣ５０−値（代謝産物の量を対照の５０％に減じるのに必要な薬品の濃度）が等級付けされたデータに関するプロビット分析を用いて計算された。ここでは試験化合物の効果はｐＩＣ５０（ＩＣ５０−値の負のＬｌｏｇ値）として表示される。（表Ｆ−３参照）
【０２２７】
実施例Ｃ．２：Ａ２７８０細胞に対する抗増殖活性の測定
試験した全ての化合物をＤＭＳＯ中に溶解させそして培養培地中でさらに希釈した。最終的なＤＭＳＯ濃度は細胞増殖検定において０．１％（ｖ／ｖ）を越えてはならなかった。対照はＡ２７８０細胞を含有したが化合物を含有せずそしてブランクはＤＭＳＯを含有したが細胞は含有しなかった。ＭＴＴを５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に溶解させた。０．１ＭのグリシンおよびＮａＯＨ（１Ｎ）でｐＨ１０．５に緩衝された０．１ＭのＮａＣｌよりなるグリシン緩衝液を製造した（全ての試薬はメルク（Ｍｅｒｃｋ）からであった）。ヒトＡ２７８０卵巣癌腫（Ｔ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ博士［米国、ペンシルバニア州のフォックス・チェース・キャンサー・センター（Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）］からの親切な提供）を２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１０％の胎牛血清が補充されたＴＰＭＩ１６４０培地の中で培養した。
【０２２８】
細胞を単層培養物として３７℃において湿された５％ＣＯ２雰囲気中で定型的に保った。細胞を１週間に１回トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて１：４０の分裂比で継代培養した。全ての培地および補充剤はライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得られた。細胞はゲン−プローブ・マイコプラズマ組織培養キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｋｉｔ）（供給業者：バイオメリエウクス（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ））を用いて測定された際にマイコプラズマ汚染がなかった。細胞をＮＵＮＣＴＭ９６−ウエル培養プレート（供給業者：ライフ・テクノロジーズ）中に接種しそして一晩にわたりプラスチックに付着させた。プレート培養用に使用された密度は２００μｌ培地の合計容量で、１個のウエル当たり１５００個の細胞であった。プレートへの細胞付着後に、培地を交換しそして薬品および／または溶媒を２００μｌの最終容量となるまで加えた。４日間のインキュベーション後に、培地を２００μｌの新しい培地により交換しそして細胞密度および生存率をＭＴＴ−ベース検定を用いて評価した。各ウエルに、２５μｌのＭＴＴ溶液を加えそして細胞を２時間にわたり３７℃においてさらにインキュベートした。培地を次に注意深く吸引しそして２５μｌのグリシン、その後の１００μｌのＤＭＳＯの添加により青色のＭＴＴ−ホルマザン生成物を溶解させた。マイクロテスト・プレートを１０分間にわたりマイクロプレート・シェーカー上で振りそして５４０ｎｍにおける吸収をエマックス（Ｅｍａｘ）９６−ウエル分光計（供給業者：ソパヘム（Ｓｏｐａｃｈｅｍ））を用いて測定した。実験において、各実験条件に関する結果は３回の反復ウエルの平均である。最初のスクリーニング目的のために、化合物を１０−６Ｍの単一の固定濃度において試験した。活性化合物に関しては、実験を繰り返して完全な濃度−応答曲線を作成した。各実験に関して、対照（薬品を含有しない）およびブランクインキュベーション（細胞または薬品を含有しない）を平行実験した。ブランク値は全ての対照および試料値から引き算された。各試料に関して、細胞成長に関する平均値（吸収単位）は対照の細胞成長に関する平均値の百分率として表示された。適宜、ＩＣ５０−値（細胞成長を対照の５０％に減ずるのに必要な薬品の濃度）が等級付けされたデータに関するプロビット分析を用いて計算された（Ｆｉｎｎｅｙ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｐｒｏｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，  Ｇｒａｄｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  １９６２）。ここでは試験化合物の効果はｐＩＣ５０（ＩＣ５０−値の負のＬｌｏｇ値）として表示される（表Ｆ−３参照）。
【０２２９】
実施例Ｃ．３：溶解性／安定性
Ｃ．３．ａ．水性媒体中の運動溶解性
第一希釈段階において、ＤＭＳＯ（５ｍＭ）中に溶解させた１０μｌの活性化合物の濃縮貯蔵溶液を１００μｌのｐＨ７．４の燐酸塩クエン酸塩緩衝液に加えそして混合した。第二希釈段階において、第一希釈段階のアリコート（２０μｌ）を１００μｌのｐＨ７．４の緩衝液中にさらに分散させそして混合した。最後に、第三希釈段階において、第二希釈段階の試料（２０μｌ）を１００μｌのｐＨ７．４の燐酸塩クエン酸塩緩衝液中でさらに希釈しそして混合した。全ての希釈は９６−ウエルプレート中で行われた。最後の希釈段階直後に、三連続希釈段階の濁度を比濁分析計を用いて測定した。偶発的な誤りを除外するために希釈は各化合物に関して３回行われた。濁度測定に基づき、３種類の等級付けを行う。高い溶解性を有する化合物が３の得点を得、そしてこの化合物に関しては第一希釈物は透明である。中程度の溶解性を有する化合物は２の得点を得た。これらの化合物に関しては、第一希釈物は不透明でありそして第二希釈物は透明である。低い溶解性を有する化合物は１の得点を得、そしてこれらの化合物に関すると第一および第二希釈物の両方とも不透明である（表Ｆ−３参照）。
【０２３０】
Ｃ．３．ｂ．溶解性
種々のｐＨにおける化合物の溶解性は化学的ルミネッセント窒素検知器を使用して測定することもできる（表Ｆ−３参照）。
【０２３１】
実施例Ｃ．４：平行人工膜浸透性分析
貯蔵試料（１００％ＤＭＳＯ中の５ｍＭの貯蔵溶液１０μｌのアリコート）を２ｍｌのｐＨ４またはｐＨ７．４の水性緩衝液システム（ＰＳＲ４システム濃厚溶液（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）（ｐＩＯＮ））を含有する深いウエルまたは予備混合プレート中で希釈した。試料を基準プレートに加える前に、１５０μｌの緩衝液をウエルに加えそしてブランクＵＶ−測定を行った。その後に緩衝液を廃棄しそしてプレートを基準プレートとして使用した。全ての測定をＵＶ−耐性プレート（供給業者：コスター（Ｃｏｓｔａｒ）またはグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））中で行った。基準プレートのブランク測定後に、１５０μｌの希釈された試料を基準プレートに加えそして２００μｌの希釈された試料をドナープレート１に加えた。
【０２３２】
アクセプターフィルタープレート１（供給業者：ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、タイプ：ＭＡＩＰ  Ｎ４５）を４μｌの人工膜−生成溶液（０．１％の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールを含有するドデカン中の１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセル−３−ホスホコリン）でコーティングしそしてドナープレート１の頂部に置いて「サンドイッチ」を形成した。緩衝液（２００μｌ）をアクセプターウエル中に分散させた。サンドイッチを蓋で覆いそして１８時間にわたり室温において暗所で貯蔵した。アクセプタープレート２のブランク測定は、ウエルへの１５０μｌの緩衝液の添加とその後のＵＶ−測定により、行われた。アクセプタープレート２のブランク測定後に、緩衝液を廃棄しそして１５０μｌのアクセプター溶液をアクセプターフィルタープレート１からアク
セプタープレート２に移した。次に、アクセプターフィルタープレート１をサンドイッチから除去した。ドナープレート２のブランク測定（上記参照）後に、１５０μｌのドナー溶液をドナープレート１からドナープレート２に移した。ドナープレート２、アクセプタープレート２および基準プレートウエルのＵＶスペクトルを（スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ）１９０を用いて）走査した。全てのスペクトルを処理してＰＳＲ４ｐコマンド・ソフトウエアを用いて浸透性を計算した。全ての化合物を３回測定した。カルバマゼピン、グリセオフルビン、アシクログアニシン、アテノロール、フロセミド、およびクロロチアジドを各実験における標準として使用した。化合物は低い浸透性（平均効果＜０．５×１０−６ｃｍ／ｓ；得点１）、中程度の浸透性（１×１０−６ｃｍ／ｓ＞平均効果＞０．５×１０−６ｃｍ／ｓ；得点２）または高い浸透性（＞１×１０−６ｃｍ／ｓ；得点３）を有するとして３種の範疇に等級付けされた。
【０２３３】
実施例Ｃ．５：代謝安定性
実施例Ｃ．５．ａ．
Ｇｏｒｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ５：  ４５３−４６２，  １９７５）に従い組織の機械的ホモジェナイジェーション後の遠心分離により、細胞下組織調合物を製造した。肝臓組織を氷冷０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中ですすいで過剰の血液を洗浄した。組織を次に乾いた瓶に詰め、重量測定しそして手術鋏を用いて粗く切断した。組織片を３容量の氷冷０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中で、テフロン乳棒またはソルボール・オムニ−ミックス・ホモジェナイザー（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｏｍｎｉ−Ｍｉｘ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ）を装備したポッター−Ｓ（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｓ）（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）、イタリー）を用いて７×１０秒間にわたりホモジェナイズした。両方の場合とも、容器はホモジェナイゼーション中は氷の中／上に保たれた。
【０２３４】
組織ホモジェネートを９０００×ｇにおいて２０分間にわたり４℃においてソルボール遠心器またはベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心器を用いて遠心した。生じた懸濁液を−８０℃において貯蔵しそして「Ｓ９」と指定した。
【０２３５】
Ｓ９部分を１００，０００×ｇにおいて６０分間にわたり（４℃）ベックマン超遠心器を用いてさらに遠心した。生じた懸濁液を注意深く吸引し、アリコートにしそして「シトゾル」と指定した。ペレットを０．１Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）中に０．５ｇの元の組織重量当り１ｍｌの最終容量で再懸濁させそして「ミクロソーム」と指定した。
【０２３６】
全ての細胞下部分をアリコートにし、直ちに液体窒素中で凍結しそして使用時まで−８０℃において貯蔵した。
【０２３７】
試験しようとする試料に関しては、インキュベーション混合物をＰＢＳ（０．１Ｍ）、化合物（５μＭ）、ミクロソーム（１ｍｇ／ｍｌ）およびＮＡＤＰＨ−発生システム（０．８ｍＭの６−燐酸グルコース、０．８ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．８単位の６−燐酸グルコースデヒドロゲナーゼ）を含有していた。対照試料は同じ物質を含有していたがミクロソームは熱不活性化された（摂氏９５℃において１０分間）ミクロソームにより交換されていた。対照試料中の化合物の回収率は常に１００％であった。
【０２３８】
混合物を５分間にわたり摂氏３７℃において予備インキュベートした。反応は時点０（ｔ＝０）において０．８ｍＭのＮＡＤＰの添加により開始されそして試料を１５分間（ｔ＝１５）にわたりインキュベートした。反応を２容量のＤＭＳＯの添加により終結させた。次に試料を１０分間にわたり９００×ｇにおいて遠心しそして上澄み液を室温において分析前に２４時間を越えない時間にわたり貯蔵した。全てのインキュベーションは２回ずつ行われた。上澄み液の分析はＬＣ−ＭＳ分析を用いて行われた。試料の溶離はエクステラＭＳ  Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、５μｍ、ウォーターズ、米国）上で行われた。アリアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９０（供給業者：ウォーターズ、米国）ＨＰＬＣシステムが使用された。溶離は緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（９５／５）中の２５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）を用いるものであり、溶媒Ｂはアセトニトリルでありそして溶媒Ｃは２．４ｍｌ／分の流速のメタノールであった。使用された勾配は０％から５分間で５０％Ｂおよび５０％Ｃを越え、１分間で１００％Ｂまでの線状方式での有機相濃度増加であり、そして有機相の濃度はさらに１．５分間にわたり静止状態に保たれた。試料の合計注入容量は２５μｌであった。
【０２３９】
ＥＳＩ源が装着されたクアットロ（Ｑｕａｔｔｒｏ）（供給業者：マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）、マンチェスター、英国）三重四極子質量分光計が検知器として使用された。源および脱溶媒和温度はそれぞれ１２０および３５０℃に設定されそして窒素がネブライザーおよび乾燥用気体として使用された。データは正の走査方式（単一イオン反応）で得られた。円錐電圧は１０Ｖに設定されそして滞在時間は１秒間であった。
【０２４０】
代謝安定性は活性ミクロソーム類の存在下における１５分間のインキュベーション後の化合物の％代謝（Ｅ（ａｃｔ））として表示された
【０２４１】
【数１】
2008508234.tif 000056
【０２４２】
であった。２０％より低い代謝率を有した化合物は高度に代謝安定性であると定義された。２０〜７０％の間の代謝を有した化合物は中程度に安定性であると定義されそして７０より高い代謝率を示した化合物は低い代謝安定性であると定義された。ベラパミルが低い代謝安定性（％代謝＝７３％）を有する化合物として含まれた。シサプリドが中程度の代謝安定性（％代謝４５％）を有する化合物として含まれそしてプロパノールが中程度ないし高い代謝安定性（２５％代謝）を有する化合物として含まれた。これらの対比化合物は代謝安定性検定を評価するために使用された。
【０２４３】
Ｃ．５．ｂ：ラット肝細胞の細胞培養を用いる代謝安定性
ラットの肝細胞を雄のスプラーグ・ドウリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄｏｗｌｅｙ）ラットから単離した。化合物を１００％ＤＭＳＯ中５ｍＭ貯蔵溶液に溶解させそして５μＭの最終濃度において０、１５、３０、６０および１２０分間にわたり肝細胞の細胞培養物（５０万個の生存細胞／０．５ｍｌ）と共に２４−ウエルプレートを用いてインキュベートした。
【０２４４】
試料をＬＣ−ＭＳ用に２種の容量のＤＭＳＯの添加により製造した。試料を充分に振りそして引き続き９００ｇにおいて１０分間にわたり（室温）遠心した。全ての実験を３回ずつ行った。生じた上澄み液の中で、５０μｌをＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０２４５】
ＬＣ−ＭＳ用に、試料の溶離をハイパーシル（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ）ＢＤＳ  Ｃ１８カラム（５０×４．６ｍｍ、５μｍ、サーモハイパーシル（Ｔｈｅｒｍｏｈｙｐｅｒｓｉｌ）、英国）上で行った。ＨＰＬＣシステムはサーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）自動試料採取装置を装着したサーベイヤー分配システム（サーベイヤー・インコーポレーテッド（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  Ｉｎｃ．）、サンノゼ、米国）を含んでなっていた。溶離は緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（９５／５）中の１０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．９）および１．２ｍｌ／分の流速の溶媒Ｂ（アセトニトリル）を用いるものであった。使用された勾配は出発条件としての０．５分間の溶媒Ａからであり、引き続き有機相濃度を２分間にわたり０％Ｂから９５％Ｂまでの線状方式で増加させた。この相はさらに２分間にわた
り静止状態に保たれそして０．５分間で０％Ｂに再び減じられた。
【０２４６】
試料の合計注入容量は５０μｌであった。カラムオーブン温度は４０℃に保たれた。ＬＣ流はＭＳ検知用に分離されそして０．１ｍｌを源の中に入れた。ＥＳＩ源が装着された三重四極子質量分光計（サーモフィニガン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ）、ラヨラ、米国）質量分光計が検知のために使用された。源電圧は３８００Ｖに設定され、毛管温度は３００℃に設定された。質量分光計は定量化目的のための１Ｄａの走査幅を有するＭ＋Ｈの質量に調節されたＳＩＭ中で正のイオン方式で操作された。器具調節、データ獲得および処理はエクスカリブル（Ｘｃａｌｉｂｕｒ）ソフトウエア（サーモフィニガン、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いて行われた。ラット肝細胞中の化合物の代謝安定性はインビトロ半減期として表示された。
【０２４７】
対照として、化合物Ｒ３０６４６５（国際公開第０３／７６４２２号明細書）が使用された（インビトロ半減期：８分間）。本出願の化合物４が試験されそして２３分間のインビトロ半減期を有していた。
【０２４８】
実施例Ｃ．６：ｐ２１誘発能力
実施例Ｃ．６．ａ：ｐ２１酵素結合された免疫吸収剤検定
下記のプロトコールがヒトＡ２７８０卵巣癌腫細胞内のｐ２１蛋白質発現水準を測定するために適用された。Ａ２７８０細胞（２００００個の細胞／１８０μｌ）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１０％の胎牛血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中の９６マイクロウエルプレートに接種した。細胞溶解の２４時間前に、化合物を１０−５、１０−６、１０−７および１０−８Ｍの最終濃度において加えた。試験した全ての化合物をＤＭＳＯ中に溶解させそしてさらなる希釈を培養培地中で行った。化合物添加の２４時間後に、上澄み液を細胞から除去した。細胞を２００μｌの氷冷ＰＢＳで洗浄した。ウエルを吸引しそして３０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス．ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）ｐ４０および１０％のグリセロール）を加えた。プレートを一晩にわたり−７０℃においてインキュベートした。
【０２４９】
適当な数のマイクロタイターをホイルポーチから除去しそして空のウエルホルダー中に入れた。洗浄緩衝液（２０×プレート洗浄濃縮物：１００ｍｌのＰＢＳの２０倍濃度溶液および界面活性剤。２％のクロロアセとアミドを含有）の作用溶液（１×）を製造した。凍結乾燥したｐ２１ＷＡＦ標準を蒸留Ｈ２Ｏで再構成しそして試料希釈剤（キット内に準備された）でさらに希釈した。
【０２５０】
それらを試料希釈剤中で１：４に希釈することにより試料を製造した。試料（１００μｌ）およびｐ２１ＷＡＦ１標準（１００μｌ）をピペットで適当なウエル中に加えそして室温において２時間にわたりインキュベートした。ウエルを１×洗浄緩衝液で３回洗浄しそして次に１００μｌの検知剤である抗体試薬（ビオチニル化されたモノクローン性ｐ２１ＷＡＦ１抗体）をピペットで各ウエル中に加えた。ウエルを室温において１時間にわたりインキュベートしそして次に１×洗浄緩衝液で洗浄した。４００×抱合体（ペロキシダーゼ・ストレプタビジン抱合体：４００倍に濃縮された溶液）を希釈しそして１００μｌの１×溶液をウエルに加えた。ウエルを室温において３０分間にわたりインキュベートしそして次に１×洗浄緩衝液で３回そして蒸留Ｈ２Ｏで１回洗浄した。基質溶液（クロモジェン基質）（１００μｌ）をウエルに加えそしてウエルを３０分間にわたり暗所で室温においてインキュベートした。停止溶液を各ウエルに以前に加えられた基質溶液と同じ順序で加えた。各ウエル内の吸収を分光計プレート読み取り器を用いて４５０／５９５ｎｍの二重波長において測定した。各実験に関して、対照（薬品を含有しない）およびブランクインキュベーション（細胞または薬品を含有しない）を平行実験した。ブランク値は全ての対照および試料値から引き算された。各試料に関して、ｐ２１ＷＡＦ１誘発に関する値（吸収単位）は対照内に存在するｐ２１ＷＡＦ１の値の百分率として表示される。１３０％より高い誘発率は有意な誘発として定義される。４種の化合物を試験しそして全てが有意な誘発を示した。
【０２５１】
実施例Ｃ．６．ｂ．：細胞方法
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃において５％ＣＯ２で湿らされたインキュベーター中で培養した。全ての細胞培養溶液はギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（ガイサーズブルグ、メインランド州）により提供された。他の物質はヌンク（Ｎｕｎｃ）により提供された。
【０２５２】
ゲノムＤＮＡを増殖中のＡ２７８０細胞から抽出しそしてｐ２１プロモーターの巣状にされたＰＣＲ単離用の鋳型として使用した。第一回増殖は２０周期にわたり５５℃のアニーリング温度においてオリゴヌクレオチド対であるＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧおよびＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣを使用して鋳型としてゲノムＤＮＡを用いて行われた。ＴＡＴＡボックスに関して−４５５１〜＋８８断片を含有する生じた４．５ｋｂ断片を２０周期にわたり８８℃においてアニーリングしながらオリゴヌクレオチド類であるＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧおよびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣを用いて再増殖させて４．５ｋｂ断片を生じそして引き続きオリゴヌクレオチド対であるＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣおよびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣを用いて再増殖させてＴＡＴＡボックスに関して−１３００〜＋８８断片を含有する１．３ｋｂ断片を生じた。オリゴヌクレオチド類内に存在する制限部位ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ（下線が引かれた配列）がサブクローニング用に使用された。
【０２５３】
ルシフェラーゼレポーターがｐＧＬ３−塩基から除去されそしてＺｓＧｒｅｅｎレポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）によりＫｐｎＩおよびＸｂａｌ制限部位において置換された。ＫｐｎＩおよびＸｂａｌ制限部位におけるｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ中へのヒトｐ２１プロモーター領域の上記の１．３ｋｂ断片の挿入により、ｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００を再構成した。全ての制限酵素はベーリンゲル・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）（ドイツ）により提供された。Ａ２７８０細胞を６−ウエルプレート中で２×１０５個の細胞の密度においてプレート培養し、２４時間にわたりインキュベートし、そして２μｇのｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００および０．２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏベクターを用いて製造業者により記載された通りにしてリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ブリュッセル、ベルギー）を使用することによりトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を１０日間にわたりＧ４１８（ギブコ−ＢＲＬ、ガイサーズブルグ、メインランド州）を用いて選択しそして単独細胞懸濁液を成長させた。３週間後に、単独クローン類が得られた。
【０２５４】
Ａ２７８０選択されたクローン類を発達させそして１個のウエル当たり１００００個の細胞で９６−ウエルプレート中に接種した。接種の２４時間後に、細胞をさらに２４時間にわたり（基部ｐ２１プロモーター領域内のｓｐ１部位に影響を与える）化合物で処理した。引き続き、細胞を４％ＰＦＡで３０’にわたり固定しそしてヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料で対比染色した。ＺｓＧｒｅｅｎ生成およびその結果としての蛍光をもたらすｐ２１プロモーター活性化をアセント・フルオロスカン（Ａｓｃｅｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ）（サーモ・ラブシステムズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、ブリュッセル、ベルギー）により監視した。
【０２５５】
各実験に関して、対照（薬品を含有しない）およびブランクインキュベーション（細胞または薬品を含有しない）を平行実験した。ブランク値は全ての対照および試料値から引き算された。各試料に関して、ｐ２１ＷＡＦ１誘発に関する値（吸収単位）は対照内に存在するｐ２１ＷＡＦ１の値の百分率として表示される。１３０％より高い誘発率は有意な誘発として定義される。２６種の化合物を試験しそして全てが有意な誘発を示した。
【０２５６】
実施例Ｃ．６．ｃ．：インビボ方法
選択されたクローンをヌードマウスの脇腹に皮下注射し（１０７個の細胞／２００μｌ）そして１２日後にカリバスで測定可能な腫瘍が得られた。１２日目から、動物に経口的または静脈内に毎日６日間にわたり溶媒および２０−４０ｍｐｋの化合物（各々４−１０匹の動物）を投薬した。腫瘍を蛍光に関して社内で開発された自動化された全身映像化システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＧＦＰフィルターが装着されそしてナショナル・インスツルメンツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（Ｒ）からのＩＭＡＱヴィジョンソフトウエアに基づくソフトウエアパッケージにより調節されるＣＣＤカメラタイプＪＡＩ（Ｒ）ＣＶ−Ｍ９０に連結された蛍光立体顕微鏡タイプであるオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）（Ｒ）ＳＺＸ１２）により評価した。対照として、化合物Ｒ３０６４６５（国際公開第０３／７６４２２号パンフレット）が使用された。化合物は、不活性（蛍光が測定可能でない）、Ｒ３０６４６５より弱い、同一であるまたはより良好であると等級付けされた。化合物１が試験されそして経口投与後にＲ３０６４６５より良好であった。
【０２５７】
実施例Ｃ．７：Ｐ４５０阻害能力
試験した全ての化合物をＤＭＳＯ（５ｍＭ）中に溶解させそして５  １０−４Ｍへのさらなる希釈をアセトニトリル中で行った。さらなる希釈は検定緩衝液（０．１ＭのＮａＫ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．４）中で行われそして最終的な溶媒濃度は２％より高くてはならなかった。
【０２５８】
ＣＹＰ３Ａ４蛋白質に関する検定は１個のウエル当たり１５ｐモルのＰ４５０／ｍｇの蛋白質（０．０１ＭのＮａＫ燐酸塩緩衝液＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成システム（検定緩衝液中の３．３ｍＭの６−燐酸グルコース、０．４Ｕ／ｍｌの６−燐酸グルコースデヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰおよび３．３ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）および１００μｌの合計検定容量の化合物を含んでなる。３７℃における５分間の予備−インキュベーション後に、検定緩衝液中への１５０μＭの蛍光プローブ基質ＢＦＣの添加により酵素反応を開始させた。室温における３０分間のインキュベーション後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応を終結させた。蛍光測定を４０５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長において行った。ケトコナゾール（ＩＣ５０−値＝３×１０−８Ｍ）がこの実験において対比化合物として含まれた。
【０２５９】
ＣＹＰ２Ｄ６蛋白質に関する検定は１個のウエル当たり６ｐモルのＰ４５０／ｍｇの蛋白質（０．０１ＭのＮａＫ燐酸塩緩衝液＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成システム（検定緩衝液中の０．４１ｍＭの６−燐酸グルコース、０．４Ｕ／ｍｌの６−燐酸グルコースデヒドロゲナーゼ、０．００８２ｍＭのＮＡＤＰおよび０．４１ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）および１００μｌの合計検定容量の化合物を含んでなる。３７℃における５分間の予備−インキュベーション後に、検定緩衝液中への３μＭの蛍光プローブ基質ＡＭＭＣの添加により酵素反応を開始させた。室温における４５分間のインキュベーション後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応を終結させた。蛍光測定を４０５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長において行った。キニジン（ＩＣ５０−値＜５×１０−８Ｍ）がこの実験において対比化合物として含まれた。
【０２６０】
ＣＹＰ２Ｃ９蛋白質に関する検定は１個のウエル当たり１５ｐモルのＰ４５０／ｍｇの
蛋白質（０．０１ＭのＮａＫ燐酸塩緩衝液＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成システム（検定緩衝液中の３．３ｍＭの６−燐酸グルコース、０．４Ｕ／ｍｌの６−燐酸グルコースデヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰおよび３．３ｍＭのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）および１００μｌの合計検定容量の化合物を含んでなる。３７℃における５分間の予備−インキュベーション後に、検定緩衝液中への２００μＭの蛍光プローブ基質ＭＦＣの添加により酵素反応を開始させた。室温における３０分間のインキュベーション後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応を終結させた。蛍光測定を４０５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長において行った。スルファフェナゾール（ＩＣ５０−値＝６．８×１０−７Ｍ）がこの実験において対比化合物として含まれた。
【０２６１】
最初のスクリーニング目的のために、化合物を１×１０−５Ｍの単一の固定された濃度で試験した。活性化合物に関しては、実験を繰り返して完全な濃度−応答曲線を作成した。各実験に関して、対照（薬品を含有しない）およびブランクインキュベーション（酵素または薬品を含有しない）を平行実験した。全ての化合物を四重に検定した。ブランク値は全ての対照および試料値から引き算された。各試料に関して、試料のＰ４５０活性の平均値（相対的な蛍光単位）は対照のＰ４５０活性の平均値の百分率として表示された。阻害率は１００％マイナス試料のＰ４５０活性の平均値として表示された。適宜、ＩＣ５０−値（Ｐ４５０活性を対照の５０％に減ずるのに必要な薬品の濃度）が計算された。
【０２６２】
【表７】
2008508234.tif 000057
【０２６３】
Ｄ．組成物実施例：フィルム−コーティングされた錠剤
錠剤芯の製造
１００ｇの式（Ｉ）の化合物、５７０ｇのラクトースおよび２００ｇの澱粉の混合物を良く混合しそしてその後に５ｇのドデシル硫酸ナトリウムおよび１０ｇのポリビニル−ピロリドンの約２００ｍｌの水中溶液を用いて湿らせる。湿った粉末混合物をふるいにかけ、乾燥しそして再びふるいにかける。次に、１００ｇの微結晶性セルロースおよび１５ｇの水素化された植物油を加える。全体を良く混合しそして錠剤に圧縮して、各々が１０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含んでなる１０，０００個の錠剤を与える。
【０２６４】
コーティング
１０ｇのメチルセルロースの７５ｍｌの変性エタノール中溶液に５ｇのエチルセルロースの１５０ｍｌのジクロロメタン中溶液を加える。次に、７５ｍｌのジクロロメタンおよ
び２．５ｍｌの１，２，３−プロパントリオールを加え、１０ｇのポリエチレングリコールを溶融しそして７５ｍｌのジクロロメタン中に溶解させる。後者の溶液を前者に加えそして次に２．５ｇのオクタデカン酸マグネシウム、５ｇのポリビニル−ピロリドンおよび３０ｍｌの濃縮された着色懸濁液を加えそして全体をホモジェネートする。コーティング装置中で錠剤芯をこのようにして得られた混合物でコーティングする。
【国際調査報告】
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2008508234.tif 000068
2008508234.tif 000069
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