(57)【要約】  本発明は、食作用、特にアポトーシス細胞食作用の刺激のための方法及び手段に関し、アポＥ遺伝子（アポリポタンパク質Ｅ）のタンパク質産物のアポトーシス細胞クリアランスの制御因子としての役割を開示する。アポＥ模倣剤及びアポトーシス細胞のクリアランスを刺激する他の化合物は、さまざまな障害の治療において有用であることができる。本発明の１つの側面は、個体における減少した内因性アポＥ活性に関連する状態の治療のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、被験化合物の存在下においてマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定すること、を含む前記方法である。被験化合物の非存在下に対する被験化合物の存在下におけるアポトーシス細胞の摂取の増加は、該化合物が減少した内因性アポＥ活性に関連する状態の治療において有用でありうることの指標であることができる。
2008517596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における減少した内因性アポE活性に関連する状態の治療のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、以下の：
被験化合物の存在下においてマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定する、
を含む、前記方法。
【請求項２】
被験化合物の非存在下に対して被験化合物の存在下において増加したアポトーシス細胞の摂取が、該化合物が減少した内因性アポE活性に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症から成る群から選ばれる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
摂取がアポEの非存在下で測定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
摂取がアポEの存在下で測定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増加した炎症活性に関連する状態の治療又は予防のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、以下の：
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定する、
を含む、前記方法。
【請求項７】
増加した炎症活性に関連する状態の治療又は予防のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、以下の：
被験化合物の存在下における、アポE欠損マクロファージによる１つ以上のアポトーシス性アポE欠損細胞の摂取を測定する、
を含む、前記方法。
【請求項８】
被験化合物の非存在下に対して被験化合物の存在下において増加したアポトーシス細胞の摂取が、該化合物が増加した炎症活性に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又は接触性過敏性皮膚炎である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、以下の：
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療のための化合物を同定及び／又は得るための方法であって、以下の：
被験化合物の存在下で、アポE欠損マクロファージを1つ以上のアポトーシス性アポE欠損細胞と接触させ、そして
前記マクロファージによる前記アポトーシス細胞の摂取を測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
被験化合物の非存在下に対する被験化合物の存在下におけるアポトーシス細胞の摂取の増加が、前記化合物が、アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療において有用でありうることの指標である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記状態が、組織外傷、外傷性脳損傷、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎又は心膜炎である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被験化合物を、アポトーシス細胞食作用を刺激する剤として同定することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験化合物を単離することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験化合物を合成及び／又は製造することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物を、その医薬として性質を最適化するために修飾することを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物を医薬として許容可能な賦形剤を含む組成物に製剤することを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
減少した内因性のアポE活性、増加した炎症活性またはアポトーシス細胞の蓄積に関連する状態を治療するために使用される医薬組成物の製造方法であって、以下の：
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を用いて、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び／又は得て；そして
それにより同定された化合物を医薬として許容可能な担体と混合する、
を含む、前記方法。
【請求項２１】
個体におけるアポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療方法であって、以下の：
前記個体におけるアポEの発現及び／又は活性を増加させる、
を含む、前記方法。
【請求項２２】
アポEポリペプチド又はその模倣剤を前記個体に投与することにより、アポE活性が増加される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アポEポリペプチドがヒトアポEのペプチド断片である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態が、組織外傷、外傷性脳損傷、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎及び心膜炎から成る群から選ばれる、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
アポトーシス細胞の蓄積に関連する状態の治療に使用される医薬の製造における、アポEポリペプチド又はその模倣剤の使用。
【請求項２６】
前記アポEポリペプチドが、ヒトアポEのペプチド断片である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
個体における内因性のアポEの減少に関連する状態の治療方法であって、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症からなる群から選ばれる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
減少した内因性アポEに関連する状態の治療のための医薬の製造における、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物の使用。
【請求項３１】
前記化合物がヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記病気の状態が、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症からなる群から選ばれる、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
個体における増加した炎症活性に関連する状態の治療方法であって、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記化合物が、ヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ又は誘導体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又接触性過敏性皮膚炎である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
増加した炎症活性に関連する状態の治療のための医薬の製造における、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物の使用。
【請求項３７】
前記化合物が、ヒトアポEのペプチド断片である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記増加した炎症活性に関連する状態が、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬又接触性過敏性皮膚炎である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
食作用の効率を調節する化合物の同定方法であって、以下の：
（ａ）培養マクロファージを、アポＥ由来ペプチド、模倣剤又は他の被験化合物に曝露し；
（ｂ）前記マクロファージとアポトーシス細胞の懸濁液を接触させ；そして
（ｃ）前記マクロファージにより摂取されたアポトーシス細胞数を測定する、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食作用、特にアポトーシス細胞の食作用の刺激のための方法及び手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）は、アポリポタンパク質Ｂとともにトリグリセリドに富むリポタンパク質粒子ＬＤＬ及びＶＬＤＬ中に存在するタンパク質の大部分を構成する。
【０００３】
アポＥ成分は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）及びＬＤＬ−受容体関連タンパク質又はＬＲＰのファミリーのためのリガンドである（Herz, J. and U. Beffert. 2000. Nat Rev Neurosci 1:51）。マウスにおけるアポE遺伝子のホモ接合性欠失は、コレステロール輸送に劇的な効果を有し、LDLR及びLRPを介する血液からのLDL及びVLDLのクリアランスの障害による、これらリポタンパク質の血漿レベルの大きな増加を引き起こす（Moghadasian, M. H. et al 2001. Faseb J 15：2623；Zhang, S. H. et al 1992, Science 258:468）。アポE欠損マウスの最も明白な表現型は、通常の脂肪含量の食餌をとってさえ発生する、初期のヒト動脈硬化に似た血管脂質病変である。
【０００４】
ヒトにおいては、アポε２、ε３、及びε４と名づけられ、それぞれアポE2、E３及びE4をコードする、アポE遺伝子の３つの一般的な対立遺伝子変異体がある。
【０００５】
アポE2及びE4は、最も一般的なE3アイソタイプとは、それぞれ、単一のアミノ酸置換により異なる。アポε４対立遺伝子の単一コピーの存在でさえ、野生型アポε３ホモ接合体に比べて増加した冠動脈疾患のリスクを生じる（例えば、Davignon, J., et al 1988. Arteriosclerosis 8:1; Eichner, J.E. et al. 2002. Am J Epidemiol 155:487を参照のこと）。アポε２対立遺伝子は、III型高リポタンパク質血症などのリポタンパク質代謝における複雑な欠陥に関連し、試験計画により、動脈硬化の増加及び減少の両方と関連付けられてきた。アポE遺伝子型と循環器疾患の発生率との関係についての正確な分子基盤は不確定のままである。
【０００６】
アポε４対立遺伝子の存在は、アルツハイマー病の増加したリスク（Corder, E. H. et al 1993, Science 261:921, Poirier, J. et al 1993. Lancet 342:697, Mahley, R. W. et al 2000. Annu Rev Genomics Hum Genet 1:507）、および骨粗鬆症の増加したリスク（Cauley, J. A. et al 1999. J Bone Miner Res 14:1175; Salamone, L. M., et al. 2000. J Bone Miner Res 15:308）と結び付けられてきた。実際、アポEハプロタイプとさまざまな蔓延する障害の間の関連は、アポEが寿命と明白に関連してきたわずかな遺伝子座のうちの1つに留まるのに十分強力であり：アポε２対立遺伝子は８０代のヒトの間で過剰に表現されて、アポE遺伝子型が長寿命に寄与することを示唆している。（Schachter, F. et al 1994. Nat Genet 6:29）。
【０００７】
アポEは、リポタンパク質輸送とは独立した受容体を介する情報伝達カスケードによって局所的な炎症も制御する。例えば、アポE並びにコレステロールに結合しない１４アミノ酸の受容体結合ペプチドは、インビボで実験的脳虚血に対する局所的な炎症反応を抑制することができた（Lynch, J. R. et al., 2001. J Neuroimmunol 114:107及びSheng, H. et al 1998. J Cereb Blood Flow Metab 18:361）。細胞培養試験は、この効果がマクロファージ機能の抑制を介したものかもしれないことを示唆する。（Laskowitz, D. T. et al 1997 J Neuroimmunol 76:70及びLaskowitz, D. T. et al 2001. Exp Neurol 167:74）。アポE欠損マウスにおける慢性の感染についての研究は、アポEがマクロファージ機能を何らかの方法で抑制するという類似の結論に導く（Van Oosten, M. et al. 2001. J Biol Chem 276:8820及びRoselaar, S. E. and A. Daugherty. 1998 J Lipid Res 39:1740.及びde Bont, N. et al. 1999. J Lipid Res 40:680）。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者らは、アポトーシス細胞のクリアランスの制御因子という、アポE遺伝子のタンパク質産物（アポリポタンパク質E）のこれまで思いもよらなかった役割を発見した。アポE模倣剤及びアポトーシス細胞のクリアランスを刺激する他の化合物は、さまざまな障害の治療において有用であることができる。
【０００９】
本発明の1つの側面は、以下の：被験化合物の存在下におけるマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定することを含む、個体における減少した内因性のアポE活性と関連する状態の治療のための化合物を同定及び／又は取得する方法を提供する。
【００１０】
被験化合物の存在下でのマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取が、被験化合物の非存在下における同等の反応媒質及び条件での摂取に比較されることができる。被験化合物の非存在下に比べた存在下でのアポトーシス細胞摂取の増加は、減少した内因性のアポE活性に関連する状態の治療に該化合物が有用であるかもしれないことの指標であることができる。
【００１１】
いくつかの実施態様においては、マクロファージがアポトーシス細胞摂取の測定の前に被験化合物に曝露される。
【００１２】
減少した内因性のアポE活性に関連する状態は、（１つ以上のアポE4対立遺伝子の存在などの）本来遺伝的なものか、（高レベルのコレステロールに曝露された細胞によるアポE産生の減少などの）本来環境的なものか、又はアルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症から成る群から選ばれる病気の状態であることができる。
【００１３】
いくつかの実施態様においては、摂取は、アポEの存在下で測定されてよい。例えば、ある方法は、生理学的レベルのアポEを含む緩衝液中の野生型マクロファージ及び（その中にアポEが存在する）アポトーシス細胞を用いるなどの、アポEレベルが正常である条件下で実施されてよい。かかる実施態様においては、アポEのアゴニストであり、正常な状態に比べて食作用の速度を増加させる被験化合物が同定されることができる。いくつかの実施態様においては、方法は、マクロファージを被験化合物に曝露させ、そしてマクロファージとアポトーシスポリペプチドと接触させるステップを含んでよい。
【００１４】
他の実施態様においては、方法は、アポE欠損マクロファージ及び（アポE-欠損マウス由来の細胞などの）アポトーシス細胞を（いかなるアポEも含まない培地及び緩衝液を用いるなどの）アポEを含まない条件下で用いることなどによって実施されてよい。かかる実施態様においては、アポトーシス細胞食作用の刺激におけるアポEの機能を複製する被験化合物が同定されることができる。方法は、被験化合物の存在下でのアポEを含まない条件下における、アポE欠損マクロファージによるアポE欠損アポトーシス細胞の摂取を測定することを含んでよい。
【００１５】
アポトーシス細胞クリアランスの低下が著しい前炎症性表現型に導くことが、本明細書中で示される。本明細書に記載の方法は、抗炎症特性を有する化合物を同定するために使用されることができる。好適な化合物は、アポトーシス細胞のクリアランスを刺激し、多くの食細胞が炎症組織へ補充される必要性を減少させ、該食細胞による炎症性メディエーターの産生を減少させ、そしてしたがって全身性の抗炎症作用をもたらす。結果として、本明細書に記載の方法は、炎症性成分による広範囲の病気がアポE機能の低下又は細胞細片クリアランスに対する要求の増加のいずれかと明らかに関連していなくても、かかる病気において有用な治療剤を同定するために使用されることができる。
【００１６】
本発明の他の側面は、以下の：
被験化合物の存在下における、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激するアポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含む、炎症活性の増加と関連した状態の治療又は予防のための化合物を同定及び／又は取得するための方法を提供する。
【００１７】
被験化合物の存在下におけるマクロファージによるアポトーシス細胞の摂取又は食作用のアポEポリペプチドによる刺激が、同等の反応媒質中及び被験化合物の存在しない条件下での摂取と比較されることができる。被験化合物の存在しない場合に比較したその存在下でのアポトーシス細胞摂取の増加は、該化合物が炎症活性の増加に関連した状態の治療において有用であることができることの指標となる。
【００１８】
アポEポリペプチドは、マウスアポE又はヒトアポE（例えば、ヒトアポE2、アポE3、又はアポE4）などの任意の哺乳動物種由来のアポEポリペプチド、或いは野生型タンパク質の1つ以上の活性、特にアポトーシス細胞食作用の刺激、を保持するその断片又は変異体であってよい。
【００１９】
例えば、アポEポリペプチドは、約３０％超、約４０％超、約４５％超、約５５％超、約６５％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、又は約９５％超のヒトアポE３との配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。該配列は、約３０％超、約４０％超、約約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、又は約９０％超のヒトアポE３との類似性を有してよい。
【００２０】
配列類似性及び同一性は、一般に、アルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）によって定義される。GAPは、マッチ数を最大化しかつギャップ数を最小化する、2つの完全な配列を整列化するために、Needleman and Wunschアルゴリズムを使用する。一般に、ギャップクリエーションペナルティー（gap creation penalty）=１２及びギャップエクステンションペナルティー（gap extension penalty）＝４とともに、デフォルトパラメータが使用される。GAPの使用が好ましいが、（Altschul et al (1990) J. Mol Biol. 215: 405-410の方法を用いる）BLAST、（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）FASTA、又はSmith-Watermanアルゴリズム（Simth and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147:195-197)、又は上記のAltschul et al. (1990)のTBALSTIプログラムなどの一般にデフォルトパラメータを使用する他のアルゴリズムも使用されてよい。特に、psi-BLASTアルゴリズム（Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402）が使用されてよい。配列同一性及び類似性は、Genomequest（商標）ソフトウエア（Gene-IT, Worcester MA USA）を用いて決定されてもよい。
【００２１】
配列比較は、本明細書に記載の関連する配列の完全長にわたって行われることが好ましい。
【００２２】
類似性は、「保存的変異」、すなわちイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの1つの疎水性残基の他への置換、或いはアルギニンからリジン、グルタミン酸からアスパラギン酸、又はグルタミンからアスパラギンなどの1つの極性残基の他への置換を許容する。
【００２３】
いくつかの実施態様においては、アポEポリペプチドは、データベース登録番号AAH83351.1の配列を有するマウスアポE或いはデータベース登録番号P02649又はNP 000032.1又はその中に記載された対立遺伝子変異体の配列を有するヒトアポEなどの哺乳動物アポEポリペプチドであってよい。
【００２４】
完全長配列の断片は、完全長配列よりも少ないアミノ酸から成ることができる。例えば、断片は、完全長配列の少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０又は少なくとも１００のアミノ酸であるが、２９０以下、２８０以下、２７０以下、２６０以下、２５０以下、２４０以下、２３０以下、２２０以下、２１０以下、又は２００以下のアミノ酸からなることができる。
【００２５】
炎症活動の増加に関連した状態は、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬及び接触性過敏性皮膚炎を含むことができる。
【００２６】
いくつかの実施態様においては、アポEポリペプチドはマクロファージ及び／またはアポトーシス細胞の表面上にあってよい。他の実施態様においては、アポEポリペプチドは、反応媒体中に存在してよい。
【００２７】
いくつかの実施態様においては、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を刺激する、被験化合物の能力がアポEの非存在下で決定されることができる。炎症活動の増加と関連した状態の治療又は予防のための化合物を同定及び／または得るための方法は、以下の：
被験化合物の存在下における、アポE欠損マクロファージによる1つ以上のアポトーシスアポE欠損細胞の摂取を測定すること、
を含むことができる。
【００２８】
アポE欠損細胞は、例えば、本明細書に記載の知られた方法によって作製されたアポE欠損マウスから得ることができる。
【００２９】
被験化合物の存在下における、アポE欠損マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取は、同等のアポE欠損反応媒体中かつ被験化合物の存在しない状態での摂取と比較されることができる。
【００３０】
例えば、（頭部外傷又は銃創などの）組織外傷又は（細菌性敗血症、膵炎又は心膜炎などの）激しい感染症の結果としての個体における細胞細片の蓄積は、顕著な医学的問題へ導くことができる。
【００３１】
本明細書に記載の方法は、アポトーシス細胞クリアランスを刺激し、そしてアポトーシス細胞の蓄積と関連した状態の治療において有用であることのできる化合物を同定及び／または得ることにおいて有用であることができる。
【００３２】
アポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療のための化合物を同定及び／または得る方法は、以下の：
被験化合物の存在下における、アポトーシス細胞のマクロファージによる摂取を刺激する、アポEポリペプチドの能力を測定すること、
を含んでよい。
【００３３】
被験化合物の存在下における、アポトーシス細胞のマクロファージによる摂取又は食作用のアポEポリペプチドによる刺激は、同等の反応媒体中かつ被験化合物の存在しない状態での摂取と比較されることができる。被験化合物の存在しない場合に比較したその存在下でのアポトーシス細胞摂取の増加は、該化合物がアポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療において有用であることができることの指標となる。
【００３４】
いくつかの実施態様においては、アポEポリペプチドは、マクロファージ及び／またはアポトーシス細胞の表面上にあってよい。他の実施態様においては、アポEポリペプチドは、反応媒体中に存在してよい。
【００３５】
アポトーシス細胞の蓄積と関連した状態は、組織外傷、外傷性脳損傷、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎又は心膜炎を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様においては、アポトーシス細胞のマクロファージによる摂取を刺激する被験化合物の能力が、アポEの非存在下で測定されてよい。アポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療又は予防のための化合物を同定アポトーシス細胞とアポE欠損マクロファージを接触させ、そして
マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取を測定すること、
を含むことができる。
【００３７】
被験化合物の存在下におけるアポE欠損マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取は、同等のアポE欠損反応媒体中かつ被験化合物の存在しない条件下での摂取と比較されることができる。
【００３８】
マクロファージは、血液、リンパ液及び他の組織中に存在する、大きな単核食細胞であり、外来物質及びアポトーシス細胞を含む細胞細片を摂取する。マクロファージは、特異的及び非特異的免疫反応に関与する。
【００３９】
本発明において使用されるためのマクロファージは、培養マクロファージであってよい。培養マクロファージは、新たに調製されたヒト末梢血単球の（ホルボールエステルへの曝露などの）インビトロでの分化；ヒト骨髄単球細胞株THP−１などの単球細胞株のインビトロでの分化；及び（マウス又はラットなどの）動物の腹膜を滅菌緩衝液で洗浄し、得られた腹膜滲出液を培養する、などを含むさまざまな好適な方法のいずれかによって得ることができる。
【００４０】
アポトーシス細胞は、アポトーシス又はプログラムされた細胞死を起こしているか又は起こした細胞である。本方法において使用されるアポトーシス細胞は、哺乳動物細胞であることが好ましく、マクロファージが得られたのと同じ組織、同じ生物体又は同じ種の生物体由来であるか、或いは異なる組織、生物体及び／または種由来であってよい。アポトーシス性の胸腺細胞が本方法において便利に使用されることができる。
【００４１】
培養初代リンパ球、典型的には胸腺細胞由来の血清の回収；Fasリガンド又はGranzyme Bなどのアポトーシス誘導物質による培養細胞の処理；及び（Annexin V結合などの）アポトーシス誘導の選択的細胞表面マーカーを用いたアポトーシスを起こしている細胞のインビボでの単離を含む、本分野で知られた、アポトーシス細胞を得るためのさまざまな好適な方法がある。典型的には、使用される母集団中の５０％超の細胞が、標識アネキシンVによる染色又は活性カスパーゼ３の染色などにより定義されたアポトーシスをおこすであろう。
【００４２】
マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取は、任意の便利な方法によって測定されることができる。例えば、固定数のアポトーシス細胞が、マルチウエルプレートのウエルに反復して、マクロファージあたり０．１のアポトーシス細胞〜マクロファージあたり１，０００のアポトーシス細胞、典型的にはマクロファージあたり１〜１００のアポトーシス細胞の範囲で、マクロファージ又はマクロファージ母集団に添加されることができる。好ましい実施態様においては、食作用がおこっている時間の間中、培地中に被験化合物が存在する。
【００４３】
食作用が起こっている時間の所定の期間の間、マクロファージはアポトーシス細胞とともにインキュベートされることができる。典型的には、インキュベーションは、２５℃〜４０℃の温度、より典型的には３７℃で実施される。インキュベーションの持続時間は、検出可能な数のアポトーシス細胞が取りこまれたが、（アポトーシス細胞の利用可能性がさらなる食作用を制限しないように）添加された全アポトーシス細胞の５０％未満がとりこまれるように選択されてよい。これは、例えば、３７℃で１０分〜１０時間、より典型的には３０分〜２時間かかるかもしれない。
【００４４】
いくつかの実施態様においては、食作用によりマクロファージ中に取り込まれたアポトーシス細胞の数又は比率が測定されることができる。これは、マクロファージに添加されたアポトーシス細胞を検出し、そしてマクロファージの外部又はその外部表面上にあるアポトーシス細胞を、マクロファージの内部又は内部表面上にあるアポトーシス細胞から識別することによって便利に達成されることができる。
【００４５】
アポトーシス細胞は、本分野で知られた好適な任意の方法により検出されることができ、そしてアポトーシスの誘発前に細胞をプレ標識することによって便利に達成される。Cell Track Green (Molecular Probes Inc.)を含む、さまざまな好適な標識及び色素が商業的に入手可能である。そして、標識されたアポトーシス細胞は同定され、顕微鏡などの適切な条件下で標識を検出することによって計数される。
【００４６】
内部及び外部のアポトーシス細胞が、マクロファージの内部にあるか又はその内部表面に接着しているアポトーシス細胞が保持される一方、マクロファージの外部にあるか又はその外部表面に接着しているアポトーシス細胞が除去され、廃棄される条件下でマクロファージを洗浄することによって識別されることができる。氷温のダルベッコPBSでの一連の洗浄などを含む、外部のアポトーシス細胞を除去するが、内部のアポトーシス細胞は除去しない任意の好適な洗浄手順が採用されることができる。洗浄後、摂取されたアポトーシス細胞の数が食作用を行うマクロファージの総数とともに計数されることができる。
【００４７】
食作用の速度は、定義された期間の間に起こる食作用の範囲から決定されることができ、そして一時間あたりでマクロファージごとに取り込まれた（胸腺細胞などの）アポトーシス細胞の数として便利に表されることができる。典型的には、この値は食作用刺激剤の非存在下、野生型細胞で０．１〜１００の範囲である。例えば、アポトーシス性の胸腺細胞を摂取するマウス腹腔マクロファージについては、この値は、アポE欠損胸腺細胞を摂取するアポE欠損マクロファージについては、２〜４の範囲であることができ、そしてアポE欠損胸腺細胞を摂取するアポE欠損マクロファージについてはこの値は、０．５〜１の範囲であることができる。
【００４８】
被験化合物の効果は、化合物に曝露されない対照細胞に比較したこの値の倍率変化として表されることができる。組換えヒトアポEを被験化合物として用いた、典型的な反応を図２に示す。
【００４９】
被験化合物は、好適な濃度で添加されることができ、これは、通常、使用する化合物のタイプによって試行錯誤で決定されるが、典型的には１０pM〜１０mM、より典型的には１nM〜１００μMである。被験化合物は、その中で該化合物が十分に可溶性である、DMSO、エタノール、メタノール、DMSO、DMA、DMF又は水などの、本分野で知られた生物学的に適応性の任意の好適な緩衝液中に添加されてよい。
【００５０】
典型的には、培養マクロファージが、（ビヒクル単独に曝露される対照を含む）異なる濃度の被験化合物に曝露され、例えば、化合物は、１群２〜１０ウエル、より典型的には３〜５ウエルで、マルチウエルプレートの複製ウエルに添加されることができる。その後細胞は、数分〜数時間又はそれ以上のさまざまな期間、典型的には３７℃で、被験化合物に曝露される。
【００５１】
本発明の方法における使用に好適な被験化合物は、小化学物質、ペプチド、抗体分子又はアポトーシス細胞食作用に対するその効果が決定されるべき他の分子であることができる。天然又は合成の化合物、或いは数種の特徴付けられた又は特徴付けされない成分を含む植物抽出物が使用されることができる。
【００５２】
好適な被験化合物は、化合物のコレクション及び設計された化合物から選択されることができる。コンビナトリアルライブラリー技術（Schultz, JS (1996) Biotechnol. Prog. 12:729-743）は、アポトーシス細胞食作用を刺激する能力について潜在的に莫大な数の異なる物質を試験する有効な方法を提供する。
【００５３】
いくつかの好ましい実施態様においては、好適な被験化合物は、ヒトアポE或いはそのアナログ、模倣剤、誘導体又は修飾物などの、哺乳動物アポEポリペプチドのペプチド断片であってよい。例えば、アポEの５〜４０アミノ酸、例えば、６〜１０アミノ酸がアポトーシス細胞食作用を刺激する能力について試験されることができる。
【００５４】
アポEのペプチド断片は、化学合成又は組換え体のインビトロ又はインビボでの発現によるなどの本分野で知られた任意のペプチド合成法によって生成されることができる。
【００５５】
アポEペプチドは、化合合成によって全体として又は部分的に生成されることができる。本明細書に記載のアポEペプチドは、その一般的な説明が広く利用可能であり、よく確立された標準的な液体又は好ましくは固相ペプチド合成法（例えば、J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984),  M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California,; Roberge, J.Y. et al. (1995) Science 269:202-204; Caruthers, M.H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232; 及びMerrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154を参照のこと）によって容易に調製されることができるか、或いは例えば、液相法または最初に各ペプチド部分を完成させ、そして望ましくかつ適切である場合には存在する任意の保護基を除去後、それぞれの炭酸又はスルホン酸誘導体若しくは反応性誘導体の反応によって残基Xを導入することによる、固相、液相及び溶液化学の任意の組み合わせによって溶液中で調製されることができる。ABI431A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems)を用いるなどの自動化された合成が実施されることができる。
【００５６】
アポEペプチドは、使用中に末端残基を望ましくない化学反応から保護するか、又は該ペプチドのさらなるコンジュゲーション又は操作を可能とするための、アミノ末端（N-末端）キャッピング基（アセチル基など）及び／またはカルボキシ末端（C-末端）キャッピング基（アミド基など）を有してよい。例えば、上記のペプチド断片の調節特性は、以下の基：クロロメチルケトン、アルデヒド及びボロン酸のうちの1つをC末端に付加することによって増加されることができる。これらの基は、セリン、システイン、及びトレオニンプロテアーゼの遷移状態アナログである。ペプチド断片のN末端は、カルボベンジルでブロックされてアミノペプチダーゼを阻害し安定性を改善することができる（Proteolytic Enzymes 2nd Ed, Edited by R. Beynon and J. Bond Oxford University Press 2001）。
【００５７】
新たに合成されたペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, W H Freeman and Co., New York, N.Y.）、又は本分野で利用可能な他の類似の技術によって実質的に精製されることができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定（エドマン分解法など）によって確認されることができる。
【００５８】
アポEペプチドの組換え体のインビボ又はインビトロでの生成は、慣用の組換え技術を用いる、コーディングヌクレオチド配列を含む核酸の発現によって達成されることができる。
【００５９】
他の候補化合物は、アポEの３次元構造をモデル化し、そして合理的なドラッグデザインを用いて、特定の分子形状、サイズ及び荷電特性を有する潜在的なエンハンサー化合物を提供することに基づくことができる。合理的なドラッグデザインの方法及び手段は、本分野で周知である。
【００６０】
上記の方法によって同定された化合物の効果は、2次スクリーニングにおいて評価されることができる。例えば、本明細書に記載の状態の１つ以上の症状に対する該化合物の効果は、動物モデルにおいてインビボで決定されることができる。
【００６１】
対照実験が、本明細書に記載の方法において適宜実施されることができる。好適な対照の能力は、本分野の当業者の実力及び能力で十分に対応できる範囲にある。
【００６２】
本明細書に記載の方法は、アポトーシス細胞食作用を刺激し、促進し、又は増加させる剤としての被験化合物を同定することを含んでよい。
【００６３】
同定された化合物は、単離及び／または精製されることができる。いくつかの実施態様においては、該化合物は、慣用の合成技術を用いて調製され、合成され及び／または製造されることができる。
【００６４】
場合により、本明細書に記載の方法を用いて、アポトーシス細胞食作用を刺激する剤として同定された化合物は、活性を最適化するため又は増加した半減期又は個体に投与後の減少した副作用などの他の有益な特徴を提供するために、修飾されるか又は合理的なドラッグデザイン技術に供されてよい。
【００６５】
そして、1つ以上の最終化合物はインビボ試験又は臨床試験に到達するために、さらなる最適化又は修飾が実施される。
【００６６】
上記の本発明の方法によって生成された化合物は、医薬として許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は本分野の当業者に周知である他の物質とともに、医薬、医薬組成物又は薬物などの組成物に製剤されることができる。
【００６７】
医薬として許容可能な賦形剤又は他の物質は、無毒性でなければならず、かつ活性成分の有効性を妨害してはならない。担体又は他の物質の正確な性質は、経口或いは皮内、皮下又は静脈内などの注射によることができる、投与経路に依存するであろう。
【００６８】
本明細書に記載の状態を治療するために使用される医薬組成物の製造方法は、以下の：
本明細書に記載の方法を用いて、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び／又は得て；そして
上記により同定された化合物を、医薬として許容可能な担体と混合する、
を含む。
【００６９】
上記のとおり、化合物は、医薬としてのその特性を最適化するために修飾されてよい。
【００７０】
本明細書に記載の状態の治療のための医薬組成物を調製するための方法は、以下の：
ｉ）本明細書に記載の方法を使用するなどして、アポトーシス細胞食作用を刺激する化合物を同定及び／または得ること、
ｉｉ）上記同定された化合物を合成すること、及び
ｉｉｉ）上記化合物を医薬組成物中に取り込むこと、
を含んでよい。
【００７１】
医薬組成物は、アポトーシス細胞食作用の刺激剤として同定された化合物に加えて、医薬として許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤又は本分野の当業者に周知の他の物質を含んでよい。
【００７２】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、散剤又は液剤形態であってよい。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体又はアジュバントを含んでよい。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物油又は植物油、鉱油或いは合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース、又は他のサッカライド溶液又はエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてよい。
【００７３】
静脈内、皮内もしくは皮下注射のため、又は苦痛のある部位における注射のためには、組成物は、パイロジェンフリーでありかつ好適なpH、等張性及び安定性を有する、非経口で許容可能な水性溶液の形態であってよい。本分野における関連する当業者は、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液または乳酸加リンガー注射液などの等張性ビヒクルを用いて、好適な溶液を調製することが十分にできる。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／または他の付加剤が必要に応じて含まれてよい。
【００７４】
本発明は、上記の方法を用いて本明細書に記載の状態の治療において有用であることのできる剤として同定及び／又は得られた化合物、医薬または獣医学的組成物、医薬、薬物またはかかる化合物を含む他の組成物、本明細書に記載の状態の（予防的治療を含むことのできる）治療のために、かかる組成物をヒト又は非ヒト動物などの個体に投与することを含む方法、本明細書に記載の状態の治療などのために投与されるための組成物の製造におけるかかる化合物の使用、及びかかる化合物を、医薬として許容可能な賦形剤、ビヒクル又は担体などの賦形剤、ビヒクル又は担体及び場合により他の成分と混合することを含む、医薬又は獣医学的組成物の製造方法を包含する。
【００７５】
上記化合物の投与は、（場合によっては、予防は治療と考えられるが）「予防的有効量」又は「治療的有効量」であることが好ましく、これは、個体に利益を示すのに十分である。投与される実際量及び投与速度と時間経過は、治療されるものの性質及び重篤度に依存するであろう。用量の決定などの治療の処方は、一般的な施術者及び他の医師の責任の範囲内にある。
【００７６】
本発明の他の側面は、アポトーシス細胞の蓄積と関連した状態の治療などにおけるアポトーシス細胞のクリアランスの刺激のためのアポEポリペプチド及びその模倣剤の使用に関する。
【００７７】
個体におけるアポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療方法は、以下の：
上記個体におけるアポEの発現及び／または活性を増加させることを含んでよい。
【００７８】
アポトーシス細胞の蓄積に関連した状態は、組織外傷、外傷性脳傷害、急性呼吸窮迫症候群、細菌性敗血症、膵炎又は心膜炎を含む。
【００７９】
アポE活性は、上記個体にアポEポリペプチド又はその模倣剤を投与することなどによって増加されることができる。
【００８０】
アポEポリペプチドは、上記でより詳細に説明される。
【００８１】
アポE模倣剤は、アポトーシス細胞食作用の刺激におけるアポE活性を保持する化合物である。アポE模倣剤は、標的とする性質を測定するのに決定的及び／または重要である化合物の特定の部分を決定することなどによって、生成されることができる。これは、各残基をかわるがわる置換することなどによって該ペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変化させることなどによって行われることができる。アポEの活性領域を構成する、これらの部分又は残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。
【００８２】
ファルマコフォアが発見されたら、分光学的技術、X線回折データ及びNMRなどのさまざまな供給源からのデータを用いて、立体化学、結合、サイズ及び／または電荷などの物理学的性質にしたがって、その構造がモデル化される。コンピュータによる分析、（ファルマコフォアの原子間の結合よりも、その電荷及び／または体積をモデル化する）類似性マッピング及び他の技術が、このモデル化プロセスにおいて使用可能である。
【００８３】
そして、ファルマコフォアを模倣する化学基がその上に接がれる鋳型分子が選択される。鋳型分子及びその上に接がれる化学基は、アポトーシス細胞の食作用を刺激する能力を保持する一方、修飾された化合物の合成が簡単で、薬理学的に許容可能であり、インビボで分解しないように、便利に選択されることができる。そして、この方法によって生成されたアポE模倣剤は、それらがアポトーシス細胞の食作用を刺激するか又はどの程度まで刺激するかを、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングされることができる。
【００８４】
本発明の他の側面は、アポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療において使用されるアポEポリペプチド又はその模倣剤、及びアポトーシス細胞の蓄積に関連した状態の治療に使用される医薬の製造におけるアポEポリペプチド又はその模倣剤の使用を提供する。
【００８５】
本発明の他の側面は、内因性アポEの減少又は炎症活性の増加に関連した状態の治療などにおけるアポトーシス細胞のクリアランスの刺激に関する。
【００８６】
個体における内因性アポEの減少又は炎症活性の増加に関連した状態の治療方法は、アポトーシス細胞の食作用を刺激する化合物を投与することを含んでよい。
【００８７】
上記化合物は、ヒトアポEのペプチド断片又はそのアナログ若しくは誘導体であることができる。好適な化合物は、上記でより詳細に記載される。
【００８８】
内因性のアポEの減少に関連した状態は、アルツハイマー病、動脈硬化、脳卒中及び骨粗鬆症から成る群から選ばれることができる。
【００８９】
増加した炎症活性に関連した状態は、多発性硬化症、リューマチ関節炎、過敏性腸症候群、クローン病、脳卒中、心筋梗塞、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、乾癬及び接触性過敏性皮膚炎から成る群から選ばれることができる。
【００９０】
本発明の他の側面は、内因性アポEの減少又は増加した炎症活性と関連した状態の治療のための、アポトーシス細胞の食作用を刺激する化合物、及び内因性アポEの減少又は増加した炎症活性と関連した状態の治療のための医薬の製造における、アポトーシス細胞の食作用を刺激する化合物の使用を提供する。
【００９１】
本発明のさらなるさまざまな側面及び実施態様が、本開示を参照することによって本分野の当業者に明らかとなるであろう。本明細書中に示されたすべての文献は、その全体が参考文献として本明細書中に援用される。
【００９２】
本発明は、上記の特徴のそれぞれ及びすべての組み合わせ及びサブコンビネーションを包含する。
【００９３】
本発明のある側面及び実施態様は、実施例及び以下に記載の図を参照することによって例解されるであろう。
【実施例】
【００９４】
方法及び材料
インビトロの食作用アッセイ
マウス腹腔マクロファージをすべての食作用アッセイのために使用した。マウス腹腔を氷温の滅菌Hank's溶液（Sigma）で洗浄することによって、マクロファージをC57B1/6（野生型）又はアポE-/-マウスのいずれかから無菌的に単離した。腹腔滲出細胞を予め冷却した滅菌ガラスチューブに保存し、その後RPMI培地で２回洗浄した（３００ｇ、１０分で沈殿した）。細胞ペレットを最終的にRPMI+１０％FCSに再懸濁し、そしてml当たり５×１０5細胞でプラスチック組織培養チャンバースライド（Nunc）上に蒔いた。マクロファージを３７℃で２時間付着させ、そして単離の４〜１０日後に食作用アッセイにおいて使用するまでRPMI+１０％FCS中でインキュベーションする前に、冷Dulbecco's PBSで洗浄した。細胞の維持に使用したFCS中のウシアポEの存在による、いなかる可能性のある効果も除くために、血清を含まない条件下で、食作用アッセイにおいて使用するためのすべての細胞を完全に洗浄した。
【００９５】
ラテックスビーズ食作用アッセイは、Ichinose（Ichinose, M. et al 1994 Cell Immunol 156:508）から改変した。すなわち、４．５×１０9個のビーズ／mlの蒸留水中２μmの蛍光ミクロスフィア（カルボキシレート修飾された、Molecular Probe）を１％BSAでコーティングし、そして５分間超音波処理した。HEPES-緩衝食塩水pH７．５でマクロファージ単層を洗浄し、そして２５０μlの同じ溶液とともに３０分間プレインキュベーションした。BSAコーティングしたラテックスビーズをくわえて、２．５×１０6個のビーズ／ウエルとし、マクロファージを３７℃で１時間インキュベーションし、その間に食作用が起こった。摂取されないビーズを氷温のDulbecco's PBSで５回激しく洗浄して除去した。そして、０．２５％トリプシン（ブタ膵臓由来のIIS型、Sigma）を加えることによってマクロファージを放出させ、グルタルアルデヒド（最終濃度０．５％）を加えることによって固定した。FACStar（Becton Dickinson）を使用するフローサイトメトリーによって、摂取された粒子の数を測定し、チューブあたり１０，０００細胞を分析し、マクロファージあたりの摂取された粒子数の平均(食作用指数)をFCSPressソフトウエアを用いて計算した。
【００９６】
アポトーシス性の胸腺細胞の食作用アッセイは、先に記載の手順（Scott, R. S. et al 2001.Nature 411:207）を改変した。胸腺細胞は、C57Bl/6又はアポE-/-マウスから、胸腺を２０mMトリス−HCｌで緩衝化したRPMI+１０％FCS、pH７．２中に取り出し、そして４０メッシュスクリーンの細胞解離ふるい（Sigma）を通すことによって調製した。得られた細胞懸濁液を沈殿させ（５００ｇ×５分）、１０7細胞／mlでRPMI＋１０％FCS中に再懸濁した。食作用アッセイに細胞を使用する前日に（培養中に細胞を入れた３〜９日後）、胸腺細胞を滅菌Dulbecco's PBSで３回洗浄し、そして５×１０6細胞で再構成し、そしてCell Tracker Green(Molecular Probes；最終濃度２μM)で、３７℃で３０分間標識した。そして、標識された細胞をPBSで洗浄し、そして新鮮な血清を含まないRPMI培地中で、３７℃で３０分間インキュベートし、PBS中で再度洗浄し、血清を含まないRPMI中で一夜インキュベートした。Annexin V染色及びフローサイトメトリーにより測定して、血清の除去により７０％超のアポトーシス性の胸腺細胞が回収された。ウエルあたり２×１０6のアポトーシス性の胸腺細胞を加えた以外は、ラテックスビーズと同様に食作用アッセイを実施した。７０％エタノール中１％酢酸で９０分間マクロファージをスライドガラス上に固定し、それらを画像分析システムに取付けた蛍光顕微鏡（Provis AX; Olympus）下で観察することによって、摂取された胸腺細胞を計数した。ウエルあたり１８の視野のそれぞれにおいて、摂取された胸腺細胞数及びマクロファージの総数を計数し、そして食作用指数の平均を計算した。
【００９７】
組織標本
成体雄性マウス（C57/Bl16、アポE-/-又はLDLR-/-マウスのいずれか（Ishibashi, S. et al 1994. J Clin Invest 93:1885）；１群６匹）をCO2で窒息させてと殺し、そして血清の調製のために心臓穿刺によって血液を採取した。組織（肝臓の左葉、左肺及び脳の左辺縁）を解剖して迅速に氷温食塩水中にいれ、そしてOCT包埋媒体中に包埋し、−８０℃で凍結した。食餌性脂肪負荷を受ける動物については、と殺前の１０週間、通常の固形飼料を高脂肪含量固形飼料（１．２５％コレステロール、７．５％飽和脂肪）に換えた。すべての他の動物は通常の固形飼料を受容し、そしてずっと水は自由摂取した。
【００９８】
そして、凍結切片（４μm）を各組織から調製し、そしてポリ−L−リジンでコーティングしたスライドガラス上に集め、氷温のアセトン中で９０分間固定し、空気乾燥させて−２０℃で分析するまで凍結した。体軸上の組織のおよそ中心点から、約４mmにわたって横断面を取った。各抗原（又は２色若しくは３色の免疫蛍光実験における抗原群）について、４mmにわたって等間隔（２５０μmごと）の１６の切片を使用し、Mosedaleら（Mosedale, D. E. et al 1996. J Histochem Cytochem 44:1043）により推奨されたとおり、１０の切片は一次抗体を、そして（１６のうちから無作為に選んだ）６の切片は最初の抗体を省略した対照としての役割を果たした。
【００９９】
免疫蛍光染色
すべての免疫蛍光染色は、Mosedale et alの記載の通りに、定量的免疫蛍光法のために最適化された条件下で実施した（Mosedale et al.上記）。すなわち、脂肪酸を含まないBSAを３％含むPBS中で３０分間、切片を脱水し、そしてPBS/３％BSA中の一次抗体に１８時間曝露した。PBS中での３分間の洗浄を３回した後、直接に標識した一次物を使用する以外は、スライドガラスを、PBS/３％BSA中２５μg/mlの好適な蛍光標識した2次抗体に６時間曝露した。PBS中でさらに３回洗浄後、スライドガラスを水ですすぎ、空気乾燥してCitiflour AF-1下でマウントし、そして画像分析システムを用いて分析するまで、-２０℃で保存した。以下の商業的に入手可能な一次抗体を使用した：抗マクロファージF4/80抗原抗体（MCAP497; Serotec; 25μg/ml）；抗CD11b抗体（M1/70(MCA74G); Serotec; 25μg/ml）；抗MHCクラスII抗体（I-Ab）（MCA1500F；Serotec; 20μg/ml）；抗フィブリン抗体（ogen）（4440-8004；Biogenesis; 20μg/ml）；抗マウスTNF-抗体（AB-410-NA；R&D Systems; 50μg/ml）；抗PCNA抗体（M0879；Dako;１２μg/ml）。すべての2次抗体は、最小交差反応性のロバ抗体（Jackson Immunoresearch）、すべての抗体溶液は、核を対比染色するためのブルーチャネル上で可視的なHoechst 33342（最終濃度１μg/ml）も含んだ。
【０１００】
アポトーシス性及び壊死性細胞の検出
先に記載されたとおり（Gavrieli, Y. et al 1992. J Cell Biol 119:493）、In Situ Cell Death Detectionキット（Roche）を製造者の指示にしたがって使用するTUNEL反応により、瀕死の細胞を検出した。ウシDNase I（Roche; ５０mM Tris pH７．５、１mM MgCl2中最終濃度10μg/ml）を陽性対照として；フルオレッセイン標識dUTPを除いたものを陰性対照として使用して、切片を前処理した。マウス肝臓においては、約７０％のTUNEL+細胞が（CM-1抗体を使用して）活性化カスパーゼ−３について陽性に染色し、Hoechst 33342の蛍光について見ると核の濃縮の兆候を示し、このキットを用いてTUNEL＋と検出された細胞の大部分が、製造者により要求されたとおりのStadelmann & Lassmann (Stadelmann, C., and H. Lassmann. 2000. Cell Tissue Res 301:19)の定義による壊死とは対照的に アポトーシスを起こしていた。
【０１０１】
リポタンパク質プロフィールの分析
プールした血清サンプルを、先に記載の通りに（Grainger, D. J. et al 1995. Nat Med 1:1067）Sepharose 6Bカラムを正確に使用するゲルろ過クロマトグラフィーにかけた。コレステロールオキシダーゼ法を用いて、得られた分画中にコレステロールを検出し、先に記載されたゲル電気泳動及びウエスタンブロッティング（Yokode, M. et al (1990) Science 250:1273）により分析したアポリポタンパク質溶出プロフィールに基づいてさまざまなリポタンパク質クラスに割り当てた。
【０１０２】
結果
インビトロのマクロファージによるアポトーシス細胞の取り込みに対するアポE欠損の効果
アポE−欠損マウス（E-/-）及び対照としての野生型（WT）マウスから、腹腔マクロファージを調製した。９６時間培養後、E-/-及びWT細胞をそれぞれ蛍光標識したアポトーシス性WT胸腺細胞に提示し、これを３７℃で１時間にわたって摂取させた。各マクロファージが摂取した胸腺細胞数を、アポトーシス小体を排除するマクロファージの能力の尺度として、免疫蛍光顕微鏡観察により定量した(図２A)。この期間に、WTマクロファージはそれぞれ１．６５±０．１２個のアポトーシス性WT胸腺細胞を摂取したが、生きた胸腺細胞を用いた場合には摂取は見られず(データは示さない)、このアッセイがアポトーシス小体の取り込み特異的であったことを確認した。対照的に、E-/-マクロファージは２５％未満のアポトーシス性胸腺細胞を同じ期間内に摂取した（ｐ＜０．０５、スチューデントの対のないｔ−検定；図２B）。
【０１０３】
マウスアポEに対するFITC標識した抗体を用いるフローサイトメトリーは、胸腺細胞がアポEを発現するが、マクロファージよりも低レベルであることを示した。したがって、我々は、E-/-胸腺細胞を用いて実験を繰り返した。興味深いことに、WTマクロファージは、それらがWT胸腺細胞を摂取した（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ-検定；図２C）ようにはE-/-胸腺細胞を摂取せず、摂取するマクロファージ及びアポトーシス性胸腺細胞の両方がアポE-欠損である場合には、アポトーシス小体の取り込みにおけるより大きな障害が見られ、野生型の系よりも約６０％少ないアポトーシス細胞が摂取された（ｐ＜０．０５、ANOVA；図２C）。これらの結果を合わせると、アポトーシス小体の摂取がアポEの完全な非存在下でも起こりうるが、そのプロセスが大きく減弱されていることが実証される。
【０１０４】
アポトーシス小体の摂取が、マクロファージ又は胸腺細胞パートナーにおけるアポE欠損によって同程度低下するため、我々は可溶性アポEの外因性の添加が正常な機能を回復することが出来るか否かを試験した。(ヒト血漿に類似した濃度の)１μMヒトアポE３の添加は、内因性のアポE欠損により引き起こされた胸腺細胞摂取の減弱を回復した（アポEを加えないものに対して、ｐ＜０．０５；野生型細胞に対してｐ＝０．９８、スチューデントの対のないｔ−検定；図２C）。我々は、アポEはアポトーシス小体の取り込みの重要な調節剤であり、それが取り込みの間の直接的な細胞相互作用に参加する受容体：リガンド対において機能するのではないであろうが、おそらく細胞表面における情報伝達を含むより複雑な制御的役割を有するであろうと結論した。
【０１０５】
次に、我々はアポEがマクロファージ食作用のスペクトルの広い調節剤であるか又はアポトーシス細胞の取り込みに特異性を有するのかを試験した。フローサイトメトリーを用いて測定した（図２D）、E-/-マクロファージによる蛍光標識されたラテックスビーズの取り込みは、WTマクロファージによる取り込みから識別不可能であり（ｐ＝０．８６、スチューデントの対のないｔ−検定；図２E）、食作用に対するアポEの効果がアポトーシス小体の取り込みに特異的であったことを実証した。
【０１０６】
インビボにおけるアポトーシス小体のクリアランスに対するアポE欠損の効果
アポE−欠損マウス及び野生型同腹子対照中にインビボで存在するアポトーシス小体の数を分析した。肝臓の左葉の４mmにわたって２５０μｍの間隔で凍結切片を調製し、瀕死の細胞及び細胞断片を、DNAの切断を標識するTUNEL 反応を用いて検出した。一般的なマクロファージマーカーF4/80との同時染色は、TUNEL陽性の細胞の大半（＞９８％）が野生型及びアポE欠損の肝臓の両方においてF4/80+であったことを明らかにした（ほとんどのTUNEL陽性細胞はマクロファージであった）。しかしながら、TUNEL標識がアポトーシス細胞だけでなく、組織調製の方法に依存して、壊死性細胞又はさらに健康な細胞をも染色するかもしれないことに注意することは重要である。しかしながら、われわれの切片では、Hoechst 蛍光について見た場合、多くのTUNEL+細胞がアポトーシス細胞の特徴を有した（すなわち、核のクロマチン濃縮及び空胞形成が明白であった）。さらに、TUNEL +細胞の６０〜７０％も活性カスパーゼ３に関して染色した。これらの観察を併せると、TUNEL染色は、肝臓におけるマクロファージ細胞の死の有用な指標であり、Stadelmann 及びLassmann （上記）の発見と一致することが示された。
【０１０７】
肝臓中の瀕死のマクロファージ（F4/80+  TUNEL+）の数は、野生型同腹子対照に比べて、アポE-欠損マウスにおいて劇的に増加した（図３A〜C）。アポトーシス性マクロファージの絶対数（ｐ＜０．０１、スチューデントの対のないｔ−検定；図３B）及びTUNEL+であったマクロファージ集団の比率（ｐ＜０．０５、スチューデントの対のないt-検定；図３C）の両方が増加した。野生型の動物においては、F4/80+細胞の約１０％はTUNEL+でもあったが、アポE−欠損動物においては、５０％超がTUNEL+であった。われわれは、アポトーシス性肝細胞（F4/80-  TUNEL+細胞）の数に対するアポE-欠損の影響も調べた。しかしながら、非マクロファージ細胞内コンパートメント中の細胞死の比率は、マクロファージコンパートメント中の比率よりも非常に低かった(全てのTUNEL+細胞の２％未満がF4/80+であった)ため、われわれの実験は、この集団に対するアポE-欠損の影響を検出するには足りないものであった（図３D）。
【０１０８】
アポE-欠損マウスの肝臓中において観察されたアポトーシス性マクロファージの増加は、マクロファージの死の速度の増加又はアポトーシス小体のクリアランス速度の低下のいずれかによりもたらされたのかもしれない。これらの２つの可能性を識別するために、我々はマクロファージ集団をより完全に分析して、マクロファージ集団のマウス肝臓中での動力学の図式を提供した。先ず、我々は、F4/80+細胞の総数を、肝臓中の核の総数のパーセンテージとして表すことによって、肝臓マクロファージ集団のサイズを推定した（図４A、B）。アポ欠損マウスにおけるTUNEL+マクロファージの数及び比率の劇的な増加にもかかわらず、肝臓マクロファージ集団全体は、アポE欠損動物において顕著に大きかった（ｐ＜０．０５；スチューデントの対のないｔ−検定；図３B）。この見かけのパラドクスに対しては、われわれのインビトロにおける観察に一致して、アポトーシス小体のクリアランスがアポE−欠損マウスにおいて顕著に効率が低い、又はアポEの非存在下におけるマクロファージの補充が、マクロファージの死におけるいかなる増加よりもなお高かった、という少なくとも2つの単純な説明がある。
【０１０９】
この第二の可能性を調査するために、我々は単球上で高度に発現される（モノクローナル抗体M1/70により検出される）インテグリンＣＤ11bが組織マクロファージ集団中に補充された後にダウンレギュレーションされるという観察結果を活用した。その結果、肝臓中のM1/70+ F4/80+細胞は、マクロファージ補充の代理の指標として使用可能である。アポE−欠損は、肝臓中のM1/70+ F4/80+マクロファージの絶対数を２倍超に増加させたが（ｐ＜０．０５、スチューデントの対のないｔ−検定；図４C）、これは新たに補充されたマクロファージの割合におけるわずかな増加を表すにすぎない（C57/Bl6マウスにおける８．３％に比較して、アポE−欠損マウスにおいて１０．０％）。したがって、マクロファージ補充の比率のいかなる増加も死んだ又は瀕死のマクロファージの数に見られる大きな増加よりも実質的に小さい。マクロファージ集団の増殖が非常に稀な事象であるため（分析した肝臓切片においてPCNA+F4/80+細胞は見られなかった）、我々は、マクロファージ補充の増加は、アポE−欠損マウスにおいて見られるマクロファージ集団の増加の主な原因ではないと思われる。
【０１１０】
野生型及びアポE−欠損マウス由来の肝臓におけるマクロファージ集団の動態の要約を図４Dに示す。アポE欠損は、マクロファージ集団のホメオスタシスを顕著に混乱させ、わずかであるが統計学的に有意なマクロファージ補充における増加、生きたマクロファージ数の大きな増加をもたらしたが、最も顕著な効果は、アポトーシス小体数の劇的な増加である。この分析に基づいて、我々は、アポトーシス小体のクリアランスは、インビボ並びにインビトロにおいてアポE−欠損マウスの肝臓で低下する、と結論する。
【０１１１】
他の組織におけるマクロファージ集団の動態
肝臓サンプルを取得したと同じマウスの脳（左辺縁）及び左肺から凍結切片を調製した。肝臓中と同様に、アポE−欠損は肺胞マクロファージ集団のサイズを増加させ（図５A）、この増加に寄与する主要因子は、死んだ及び瀕死の細胞の蓄積である（図５B）。肺に見られる効果の大きさは肝臓に見られるものと非常によく類似していた。
【０１１２】
脳組織マクロファージ集団（ミクログリア）を特徴づけるために、同じ抗体マーカーを使用することはできなかった、なぜなら、それらはF4/80モノクローナル抗体で弱く染色されるのみであったからである。しかしながら、（肝臓及び肺のF4/80＋細胞のサブセットを染色するのみである）MHCクラスIIに対する抗体は、ミクログリアを染色した。アポE-欠損は、脳におけるMHCクラスII＋細胞の数を増加させたが（図５C）、肺及び肝臓において見られたF4/80＋集団よりも低度であった。しかしながら、他の組織における我々の観察結果と一致して、TUNEL＋であったMHCクラスII＋細胞の絶対数及び割合は顕著に増加した（図５D）。同様の結果がミクログリア集団を検出するためのCD14に対する抗体を用いて得られたが、CD14は新たに補充されたマクロファージ又は活性化ミクログリアを選択的に検出しているのかもしれない。
【０１１３】
これらの観察結果を併せると、インビトロで観察されたアポEの非存在下におけるアポトーシス小体の取り込みの減弱は、アポE−欠損マウスにおいて平衡状態で排除されないアポトーシス小体の全身的な蓄積をもたらし、そして、おそらくアポトーシス細胞のクリアランスの欠損に応答して、さまざまな組織へのマクロファージの補充がわずかではあるが統計学的に有意に増加したことを示す。
【０１１４】
肝臓における炎症マーカーに対するアポE欠損の効果
アポE−欠損マウス及びそれらの野生型同腹子からの肝臓における2つの炎症マーカーの相対的レベルを測定するために、定量的免疫蛍光法を使用した。サイトカインTNF-αは、急性の炎症の間に上方制御されるが、正常では健康な肝臓の主に血管周囲領域に非常に低いレベルでのみ存在する（図６A）。TNF-αについての染色は、野生型同腹子に比べてアポE-欠損マウスにおいて１．５倍高かった（ｐ＜０．０５；Mann-Whitney U-検定；図６B）。このサイトカインのレベルが両群において低かったにもかかわらず、アポE欠損は、統計学的にそしておそらく生物学的に有意な変化をTNF-αレベルにおいて導いた。
【０１１５】
肝細胞生成物フィブリノーゲンについての染色も（図６C）アポE欠損によって増加した（ｐ＜０．０５；スチューデントの対のないｔ−検定；図６D）。主に血液凝固に関与するにもかかわらず、フィブリノーゲンは陽性の急性期反応体（すなわち、そのレベルが急性の炎症反応中に増加する遺伝子産物）として知られている。これらの2つの無関係の全身性の炎症マーカー（TNF-α及びフィブリノーゲン）は、対照に比べてアポE−欠損マウスにおいて高くなっている。
【０１１６】
マクロファージ集団の動態に対する血漿コレステロール濃度の効果
インビボにおいては、アポE欠損は非常に顕著なリポタンパク質代謝の制御ミスをもたらす。リポタンパク質代謝における変化が間接的にマクロファージ集団の動態に影響を及ぼすか否かを決定するために、我々はアポE欠失に依存しない、リポタンパク質代謝を変更するための2つの方法を使用した。先ず、我々は野生型マウスに高コレステロール食を１０週間与える影響を調べ、これは、先に観察されたように、血漿LDL-及びVLDL-コレステロール濃度を増加させ、HDL-コレステロールを低下させ（図７A）、脂肪を与えたC57/Bl6マウスはアポE-欠損マウスのプロフィールに非常によく似ていた。この期間の最後には、肝臓マクロファージ集団における相違はなかった（ｐ＝０．９４；正常の固形飼料を与えた野生型マウスに対するスチューデントの対のないｔ−検定；図７B）。同様に、LDL受容体の遺伝的欠失は、先に観察されたように、アポEの欠失後に見られた大きさに匹敵するリポタンパク質代謝の障害を引き起こしたにもかかわらず、肝臓中のマクロファージ集団にごくわずかな効果を及ぼし（ｐ＝０．０７；スチューデントの対のないｔ−検定；図７D）、脳および肺の集団には効果がなかった（ｐ＝０．８８、スチューデントｔ−検定；図７D）。我々は、リポタンパク質代謝における全身性の変化は、アポE-欠損マウスに見られたマクロファージ集団の動態の変化を引き起こすとは考えられず、そしてさらに、アポE：LDL受容体相互作用は、我々の観察したアポトーシス小体のクリアランスの減弱を仲介するとは考えられないと結論した。
【０１１７】
マクロファージにおけるアポEタンパク質の完全な欠損は、インビトロにおいて一般的な食作用機能に影響することなくアポトーシス細胞の摂取を特異的に減弱することが本明細書において示される。この欠損は、インビボでアポE−欠損マウスのさまざまな組織においてアポトーシス細胞及び断片の蓄積を顕著に増加させ、これらの組織における生きたマクロファージ集団を大きくする。これは次に、TNF-α及びフィブリノーゲンを含む前炎症性マーカーの全身性の増加と関連する。アポEの遺伝的欠失が血管壁へのマクロファージの補充を促進することが以前に報告されていたが（例えば、Lessner, S. et al 2002. Am J Pathol 160:2145及びReckless, J., J..C. et al 1997. Circulation 95: 1542）、これは、アポE欠損に直接的ではなく、局所的な脂質沈着への間接的な反応であると考えられてきた。脂質代謝の変化がこれらの効果の原因でないことは本明細書中で示され、そして本データは、アポトーシス細胞断片の取り込み障害によりもたらされる、リポタンパク質代謝に依存しない、アポEの組織マクロファージ補充に対する全身性の効果（図８）の最初の直接的な証拠を提供する。
【０１１８】
これらの結果は、アポE遺伝子型およびマクロファージに富む炎症性成分を伴うさまざまな病気との関連の根底にある、中心的な生理学的メカニズムの直接的な証拠をしめす。アポEはアポトーシス小体の効率的なクリアランスに必要であり、異なるアポE遺伝子型がアポトーシス小体のクリアランスにおけるわずかな相違に関連する。経時的に、インビボではアポトーシス小体のクリアランスにおけるこのわずかな低下でさえ、単球／マクロファージ経路を通じた流れの増加をもたらし、そして表現型における全身性の前炎症性シフトに寄与する。かかるシフトの1つの後遺症は、アルツハイマー病及び動脈硬化の指標である、機能的組織構造の損失に導く線維化傾向である。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、傷害に対する組織の反応を構成する３つの経路を示す。（損傷された領域（白色）を明らかにするために染色された正常（左）及び梗塞（右）の脳の上の画像に示される、脳卒中の間の脳梗塞などのような）組織の傷害に続いて、体は損傷された細胞からのサイトカイン及び他の生成物の放出、失われた組織の機能の損失に対抗しなければならず、そして細胞細片及びアポトーシス細胞を排除しなければならない。反応のこの第三の枝は、（アポE遺伝子に一定の多型を有する）一定の個体においては活性が低いかもしれない。
【図２Ａ】インビトロにおけるアポE欠損の食作用に対する効果を示す。（ａ）標識されたアポトーシス胸腺細胞を３７℃で３０分間取り込んだ後のマクロファージの蛍光顕微鏡写真。対照画像では胸腺細胞を添加していない。標識胸腺細胞（矢印の先端）に加えて非標識マクロファージが自己蛍光によって可視的であるように、画像を高利得で捕捉した。スケールバーは、２５μmを表す。
【図２Ｂ】インビトロにおけるアポE欠損の食作用に対する効果を示す。（ｂ）（ａ）に示したような画像からの、マクロファージ当たりの取り込まれた野生型胸腺細胞数の定量。１０の視野中の胸腺細胞の総数をマクロファージの総数で割った。値は、3つの実験のそれぞれにおける３連のウエルからの平均±ＳＥＭである。
【図２Ｃ】インビトロにおけるアポE欠損の食作用に対する効果を示す。（ｃ）マクロファージ当たりの取り込まれたアポＥ欠損胸腺細胞数の定量。１μMの可溶性組換えヒトアポE3とのプレインキュベーションの効果も示す。
【図２Ｄ】インビトロにおけるアポE欠損の食作用に対する効果を示す。（ｄ）３７℃で３０分間、蛍光標識したラテックスビーズを取り込ませたあとのマクロファージの典型的なフローサイトメトリーヒストグラム。ビーズを取り込まなかった細胞は低い蛍光強度を有したが（ＦＬ１−Ｈ）、１、２、３又はそれを超えるビーズを取り込む細胞は、次第により高い蛍光強度へシフトする。野生型マクロファージについての典型的なヒストグラムを黒く示し、アポＥ欠損マクロファージを赤くしめす。
【図２Ｅ】インビトロにおけるアポE欠損の食作用に対する効果を示す。（ｅ）（ｄ）に示したようなフローサイトメトリーのヒストグラムからの、マクロファージあたりの取り込まれたラテックスビーズ数の定量。値は、3つの実験のそれぞれにおける３連のウエルからの平均±ＳＥＭである。
【図３Ａ】マウス肝臓のＴＵＮＥＬ染色を示す。（ａ）アポＥ欠損マウス由来の肝臓の典型的な切片からの同じ視野の2つの蛍光顕微鏡写真。(ほとんどがクッパー細胞である)マクロファージを、モノクローナル抗体F4/80を用いる赤いチャネル(右のパネル)中で照射する。細胞断片及び瀕死の細胞を緑のチャネル（左のパネル）中でTUNEL反応を用いて染色する。この画像中のすべてのTUNEL+細胞はF4/80+でもあるが、約50％のF4/80+細胞はTUNEL−（白矢印）である。スケールバーは２５μmを表す。
【図３Ｂ】マウス肝臓のＴＵＮＥＬ染色を示す。（ｂ）分析した核の総数に対するパーセンテージとしてあらわした、各遺伝子型の６匹のマウスそれぞれからの肝臓の１０の切片中のTUNEL+F4/80+細胞の絶対数の定量。
【図３Ｃ】マウス肝臓のＴＵＮＥＬ染色を示す。（ｃ）（ｂ）で分析したと同じ切片中のF4/80+細胞の数のパーセンテージとして表した、TUNEL+F4/80+細胞の数。
【図３Ｄ】マウス肝臓のＴＵＮＥＬ染色を示す。（ｄ）分析した核の総数に対するパーセンテージとしてあらわした、（マクロファージでない、細胞断片又は瀕死の細胞である）TUNEL+F4/80−細胞の数。（ｂ）〜（ｄ）において、値は６匹の動物についての平均±SEMである。
【図４Ａ】マウス肝臓における、マクロファージ集団の動態を示す。（ａ）F4/80モノクローナル抗体で染色した、野生型及びアポＥ欠損マウスからの典型的な肝臓切片の低出力蛍光顕微鏡写真。この倍率では(スケールバーは２５μmを表す)、マクロファージは白色の小さい点として現れ、これは、高倍率下（挿入；スケールバーは１０μmを表す）で特異的な細胞の染色として確認される。
【図４Ｂ】マウス肝臓における、マクロファージ集団の動態を示す。（ｂ）分析した核の総数に対するパーセンテージとしてあらわした、各遺伝子型の６匹のマウスそれぞれからの肝臓の１０の切片中のTUNEL+F4/80+細胞数の定量。
【図４Ｃ】マウス肝臓における、マクロファージ集団の動態を示す。（ｃ）（ｂ）で分析したと同じ切片中の（高レベルのインテグリンCD11bを発現し、直近に補充されたマクロファージであることをあらわす）M1/70+細胞の数。分析した核の総数のパーセンテージとしてのM1/70+細胞の絶対数及び各バーの上の数字は同じ切片中のF4/80+細胞の部分としてのM1/70+細胞の数を表す。（ｂ）及び（ｃ）において、値は６匹のマウスについての平均±SEMをあらわす。
【図４Ｄ】マウス肝臓における、マクロファージ集団の動態を示す。（ｄ）野生型（左のチャート）及びアポE-欠損（右のチャート）マウスにおけるマクロファージ集団の動態の概要。各チャートの面積は、F4/80+細胞の総数に比例し、新たに補充された（M1/70+TUNEL-；緑）、成熟した（M1/70-TUNEL-；灰色）又は瀕死の（M1/70-TUNEL+；赤）マクロファージ集団の比率に再分割されることができる。核の総数のパーセンテージとして表した、生きた成熟マクロファージ（M1/70-F4/80+TUNEL-細胞）も示す。
【図５Ａ】マウスの肺及び脳中のマクロファージ集団を示す。（ａ）分析した核の総数のパーセンテージとして表した、各遺伝子型の６匹のマウス由来の肺からの１０の切片中の（ほとんど肺胞マクロファージである）F4/80+細胞の数。
【図５Ｂ】マウスの肺及び脳中のマクロファージ集団を示す。（ｂ）F4/80+細胞数のパーセンテージとして表した、（ａ）と同じ切片中のTUNEL+F4/80+細胞の数。
【図５Ｃ】マウスの肺及び脳中のマクロファージ集団を示す。（ｃ）分析した核の総数のパーセンテージとして表した、各遺伝子型の６匹のマウス由来の脳からの１０の切片中の（圧倒的にミクログリアである）MHCクラスII+細胞の数。
【図５Ｄ】マウスの肺及び脳中のマクロファージ集団を示す。（ｄ）MHCクラスII+細胞の数のパーセンテージとして表した、（ｃ）と同じ切片中のTUNEL+クラスII+細胞の数。各場合において、値は６匹の動物の平均±SEMである。
【図６Ａ】マウス肝臓における炎症マーカーを示す。（ａ）ＴＮＦ−αについて染色した、野生型マウス由来の肝臓の典型的な切片の蛍光顕微鏡写真。切片のほとんどの領域は検出可能なTNF-αをわずかしか含まないか又は含まないが、小血管の領域の細胞は強く陽性に染色した。スケールバーは２５μmを表す。
【図６Ｂ】マウス肝臓における炎症マーカーを示す。（ｂ）先に記載した、定量的免疫蛍光手順により測定した、各遺伝子型の６匹のマウスそれぞれからの肝臓の１０の切片におけるTNF-α染色。
【図６Ｃ】マウス肝臓における炎症マーカーを示す。（ｃ）フィブリノーゲンについて染色した、野生型マウス由来の肝臓の典型的な切片の蛍光顕微鏡写真。肝臓内並びに類洞内の各機能単位の中心静脈中に高レベルの染色が見られる。スケールバーは２５μmを表す。
【図６Ｄ】マウス肝臓における炎症マーカーを示す。（ｄ）先に記載した定量的免疫蛍光手順により測定した、各遺伝子型の６匹のマウス由来の肝臓の１０の切片中のフィブリノーゲン染色。各グラフにおいて、値は６匹のマウスの平均±SEMである。
【図７Ａ】変化したリポタンパク質代謝のマクロファージ集団への効果を示す。（ａ）10週間、高脂肪食（白丸）又は正常飼料（黒四角）のいずれかを与えた、２２週齢でと殺した６匹の野生型マウス由来のプールした血清のリポタンパク質プロフィール。比較のために、６匹のアポＥ欠損マウス由来のプールした血清からのリポタンパク質プロフィールを示す。（単なる直線）
【図７Ｂ】変化したリポタンパク質代謝のマクロファージ集団への効果を示す。（ｂ）分析した核の総数のパーセンテージとして表した、各群の６匹のマウスそれぞれ由来の肝臓の１０の切片中のF4/80+細胞の数。
【図７Ｃ】変化したリポタンパク質代謝のマクロファージ集団への効果を示す。（ｃ）正常の飼料をずっと与えた６匹のLDLレセプター欠損マウスからプールした血清のリポタンパク質プロフィール。比較のために、６匹のアポＥ−欠損マウス由来のプールした血清からのリポタンパク質プロフィールを示す（単なる直線）。
【図７Ｄ】変化したリポタンパク質代謝のマクロファージ集団への効果を示す。（ｄ）分析した核の総数のパーセンテージとして表した、各遺伝子型の６匹のマウスのそれぞれ由来の肝臓(濃いバー)又は肺（薄いバー）の１０の切片のF4/80+細胞の数。各グラフにおいて、値は、６匹のマウスの平均±SEMである。
【図８】マウス肝臓中のマクロファージ集団の動態のモデルを示す。成熟したマクロファージ（F4/80+）の平衡化集団を増加させる方法は、血管内皮を横切る単球前躯体の補充、M1/70+F4/80+の新たに補充されたマクロファージを介する分化及び増殖を含む。成熟したマクロファージの平衡化集団を減少させる方法は、内皮を横切ってリンパ又は血液中に遊出すること、及び食作用によるクリアランスが続く、アポトーシス又は壊死のいずれかによる死（TUNEL+F4/80+細胞；小さな斑点で覆われたピンクの細胞）を含む。我々は、アポE欠損がアポトーシス細胞断片のクリアランスを低下させることを実証した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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