(57)【要約】抗うつ活性について候補薬をスクリーニングするための標的として、背側縫線核のガラニン作動系が用いられる。ＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現を変化させる１種または複数種の薬剤を検出または決定するための方法であって、ａ）抗うつ量の１種または複数種の試験薬剤を投与された哺乳類からの脳サンプルを提供することと、ｂ）該サンプルにおけるＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現が変化したかどうかを検出または決定することを包含する、方法もまた提供される。
2008528951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現を変化させる１種または複数種の薬剤を検出または決定するための方法であって、
ａ）抗うつ量の１種または複数種の試験薬剤を投与された哺乳類からの脳サンプルを提供することと、
ｂ）該サンプルにおけるＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現が変化したかどうかを検出または決定すること
を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプルまたは相当するサンプル中のＧａｌＲ１の発現または活性が変化したかどうかを検出または決定することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類がヒトでない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類がげっ歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
背側縫線核におけるＧａｌＲ２の発現または活性が検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
青斑におけるＧａｌＲ２の発現または活性が検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＧａｌＲ２結合が検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
背側縫線核におけるガラニン発現が検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
青斑におけるガラニン発現が検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ガラニンＲＮＡの量またはレベルが検出または決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
背側縫線核におけるＧａｌＲ１の発現または活性が検出または決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＧａｌＲ１結合が検出または決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
抗うつ活性に関連するガラニン作動活性を有する薬剤を特定するための方法であって、
ａ）抗うつ量の試験薬剤を投与された哺乳類からの脳サンプルである試験サンプル中のＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現の量またはレベル、およびＧａｌＲ１の発現または活性の量またはレベルを、対照サンプル中のＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現の量またはレベル、およびＧａｌＲ１の発現または活性の量またはレベルと比較することと、
ｂ）ＧａｌＲ１の発現または活性を実質的に変化させずにＧａｌＲ２の発現もしくは活性またはガラニン発現の増大を増大させる薬剤を特定すること
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記哺乳類がヒトでない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類がげっ歯類である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
背側縫線核中のＧａｌＲ２の発現または活性の量またはレベルが比較される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
青斑中のＧａｌＲ２の発現または活性の量またはレベルが比較される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
背側縫線核中のガラニン発現の量またはレベルが比較される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
青斑中のガラニン発現の量またはレベルが比較される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
背側縫線核中のＧａｌＲ１発現または活性の量またはレベルが比較される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
ＧａｌＲ２の活性を変化させる１種または複数種の薬剤を特定するための方法であって、
ａ）プロモーターに作動可能に連結されたＧａｌＲ２オープンリーディングフレームを含む発現カセットを含む哺乳類宿主細胞と１種または複数種の薬剤を接触させることと、
ｂ）該１種または複数種の薬剤がＧａｌＲ２の発現または活性を変化させるかどうかを検出または決定すること
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞がＨｅｐ２９３細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ホスホイノシトール−３のターンオーバーが検出または決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
発現カセットが、ヒトＧａｌＲ２オープンリーディングフレームを含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年１月３日に出願の米国特許出願第６０／６４１，０５２号の出願日の利益を主張し、その開示が本明細書に引用されるものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗うつ薬候補をスクリーニングするための標的に関する。より詳細には、本発明は、抗うつ薬候補をスクリーニングするために、背側縫線核のガラニン作動系の上方制御を分析するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
フルオキセチン（ＦＬＸ）の作用の分子機構は、シナプスセロトニン（５‐ＨＴ）濃度を上昇させる効果以外は、十分に理解されていない。臨床的な抗うつ効果の開始の遅れは、こうした治療効果のために、主要なセロトニン作動性核背側縫線核（ＤＲＮ）内の、また、その投射領域中の、シグナル伝達の機能的変化をもたらす転写および翻訳事象が必要とされる可能性があることを示唆している（非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３）。ＦＬＸの長期効果を仲介する可能性がある、ある潜在的な作用物質は、５‐ＨＴ以外では、ニューロペプチド・ガラニンである。ガラニンは、その３つのＧタンパク質結合受容体、ＧａｌＲ１、ＧａｌＲ２、およびＧａｌＲ３を介して（非特許文献４）、恒常性や、（痛み認識、睡眠、摂食行動、性行動および学習および記憶を含めた）動機づけられた行動を調節する（非特許文献５）。ガラニン作動性伝達は、腹側被蓋野、ＤＲＮ、および青斑（ＬＣ）におけるモノアミン作動性ニューロンの活性を調節する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）。ガラニン受容体サブタイプＧａｌＲ１（非特許文献７）およびＧａｌＲ２（非特許文献１１）は、背側縫線５‐ＨＴニューロンから（非特許文献９；および非特許文献１２）、あるいは、周囲のガラニン免疫反応性末端から（非特許文献７）、樹状突起に放出されるガラニンによって活性化される可能性があるＤＲＮニューロン中で発現される。ノルアドレナリン作動性の核ＬＣ、すなわちＤＲＮに構造的および機能的に堅く連結される領域では（非特許文献１３；および非特許文献１４）、ＧａｌＲ１発現は、モルヒネ退薬によって誘導され（非特許文献１５）、ガラニン受容体アゴニスト、ガルノン（ｇａｌｎｏｎ）は、いくつかの離脱徴候を弱めることが示された（非特許文献１６）。
【０００４】
退薬が、しばしば抑うつの症状を誘発すること、また、抑うつは、人において一般に観察される離脱症状であることは、注目に値する（非特許文献１７；および非特許文献１８）。さらに、ＤＲＮ、海馬、および視床下部におけるガラニン発現の低下が、抑うつのラットモデルで観察されている（非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１）。最近の臨床研究は、抑うつ状態の患者におけるガラニン（静脈内）の急激な抗うつ効果の予備的証拠を報告したのに対し（非特許文献２２）、げっ歯類における２〜３の初期マイクロダイアリシスおよび行動研究では、ガラニンの抑うつ性作用が示された（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；および非特許文献２６）。てんかん重積を抑制する用量の、全身的に活性なガラニン受容体アゴニスト、ガルミック（ｇａｌｍｉｃ）は、強制水泳試験において抗うつ様効果を有することが、以前に観察されている（非特許文献２７）。
【非特許文献１】Ｄｕｍａｎ，Ｒ．Ｓ．ら「Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」１９９７年、５４、５９７〜６０６
【非特許文献２】Ｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．「Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１９９９年、２１、９９Ｓ〜１０５Ｓ
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｏｓｓ，Ｐ．ら「Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．」２００４年、１０２、４７〜６０
【非特許文献４】Ｂｒａｎｃｈｅｋ、Ｔ．Ａ．ら「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．」２０００年、２１、１０９〜１７
【非特許文献５】Ｖｒｏｎｔａｋｉｓ、Ｍ．Ｅ．「Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ＣＮＳ  Ｎｅｕｒｏｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．」２００２年、１、５３１〜４１
【非特許文献６】Ｗｒｅｎｎ，Ｃ．Ｃら「Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」２００１年、２５、２８３  ９９
【非特許文献７】Ｘｕ，Ｚ．Ｑ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９９８年、８７、７９〜９４
【非特許文献８】Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｍ．ら「Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９９８年、８６３、３６４〜８２
【非特許文献９】Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｔ．ら「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９８６年、６、３６４０〜５４
【非特許文献１０】Ｓｋｏｆｉｔｓｃｈ，Ｇ．ら「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」１９８５年、６、５０９〜４６
【非特許文献１１】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．ら「Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ」、１９９９年、４０９、４６９〜８１
【非特許文献１２】Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ，Ｊ．Ｖ．ら「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」１９９３年、４８、９９〜１１０
【非特許文献１３】Ｇａｌｌａｇｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」、１９７６年、１５、１４９〜５６
【非特許文献１４】Ａｇｈａｊａｎｉａｎ，Ｇ．Ｋ．ら「Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．」１９７８年、１５３、１６９〜７５
【非特許文献１５】Ｚａｃｈａｒｉｏｕ，Ｖ．ら「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２００１年、７６、１９１〜２００
【非特許文献１６】Ｚａｃｈａｒｉｏｕ，Ｖ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００３年、１００、９０２８〜３３
【非特許文献１７】Ｂａｒｒ，Ａ．Ｍ．ら「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．」２００２年、２３、４７５〜８２
【非特許文献１８】Ｍａｒｋｏｕ，Ａ．ら「Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１９９１年、４、１７〜２６
【非特許文献１９】Ｂｅｌｌｉｄｏ，Ｉら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」２００２年、３１７、１０１〜５
【非特許文献２０】Ｈｕｓｕｍ，Ｈ．ら「Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」２００３年、２８、１２９２〜９
【非特許文献２１】Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，Ｖ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」２００５年、１７８、１１５〜１２４
【非特許文献２２】Ｍｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」２００４年、２９、１２０５〜１１
【非特許文献２３】Ｗｒｅｎｎ，Ｃ．Ｃら「Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」２００１年、２５、２８３〜９９
【非特許文献２４】Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ｍ．ら「Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９９８年、８６３、３６４〜８２
【非特許文献２５】Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ，Ｔ．ら「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」２００３年、４４、２０６〜１３
【非特許文献２６】Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ，Ｔ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００４年、１０１、３５４〜９
【非特許文献２７】Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００４年、１０１、１０４７０〜５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、特定の抗うつ活性をもつ薬剤を特定する方法の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明によれば、ＤＲＮおよびＬＣにおけるガラニン作動性伝達は、その治療効果に妥当である期間内に、いくつかの異なる抗うつ治療によって増強される。さらに、ガラニン受容体アンタゴニスト、Ｍ４０は、ラット強制水泳試験におけるＦＬＸの抗うつ様効果をブロックし、これは、ガラニン作動系が、ＦＬＸの抗うつ様効果に寄与することを示唆した。さらに、ガラニン受容体アゴニストは、同じ行動試験における抗うつ様効果をもたらした。これらのデータを組み合わせることで、ガラニン作動系が抗うつ治療のための標的であることが示される。
【０００７】
したがって、本発明は、抗うつ活性をもつ試験薬剤のスクリーニングのための方法を提供する。この方法は、治療用量の試験薬剤で対象を処置することを含む。対象は、ウマ、鳥、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ネコ、イヌ、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ミンクまたはハムスターなど）を含めて、ヒトまたはヒト以外の動物である可能性がある。一実施形態では、対象は、少なくとも１０〜１４日間、治療用量の試験薬剤で処置される。サンプル、例えば脳サンプルは、治療された対象から得られる。一実施形態では、脳サンプルは、背側縫線核（ＤＲＮ）または青斑（ＬＣ）から選択される脳組織を含む。サンプルにおけるガラニン作動系の活性は、その後分析される。より詳細には、分析されるガラニン作動系の活性は、抗うつ活性と相関するタイプのものである。好ましい活性としては、ＧａｌＲ２のｍＲＮＡまたはタンパク質発現またはリガンド結合、およびガラニンのｍＲＮＡまたはタンパク質発現が挙げられる。ガラニンｍＲＮＡ発現を分析するために、ガラニン作動活性は、定量的な増幅反応、例えば、ガラニンｍＲＮＡプライマーを使用する定量的な逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析することができる。ガラニンのタンパク質発現を分析するために、抗ガラニン抗体または他のガラニンリガンド（例えば、末端切断されたＧａｌＲなどのガラニン受容体など）が用いられる可能性がある。ＧａｌＲ２を分析するために、ガラニン作動活性を、ＧａｌＲ２タンパク質または結合実験を使用して分析することができる。サンプルにおけるガラニン作動系の活性は、上方調節されたあるいは基準のガラニン作動活性のための対照サンプルと比較される。ガラニン作動活性の上方制御は、ガラニンのｍＲＮＡまたはタンパク質発現、またはＧａｌＲ２の発現（ｍＲＮＡまたはタンパク質）または結合の上方制御のいずれかによって示される可能性がある。治療されたサンプルのガラニン作動活性が上方調節される場合、この薬剤はまた、潜在的な抗うつ活性を有するものと特徴づけられる可能性がある。サンプル中の比較されたガラニン作動活性が上方調節されない場合、薬剤は、おそらく抗うつ活性を有さない。
【０００８】
薬剤が潜在的な抗うつ活性を有するものであると特定される場合、薬剤の特異性が決定される可能性がある。サンプルまたはサンプル相当物は、ＧａｌＲ１発現または活性について分析される可能性がある。サンプル中のＧａｌＲ１発現または活性は、その後、上方調節されたあるいは基準のＧａｌＲ１発現または活性の対照サンプルと比較される可能性がある。サンプル中のＧａｌＲ１発現または活性が上方調節される場合、薬剤は、おそらく、抗うつ活性に対する特異性を欠く。サンプル中のＧａｌＲ１発現または活性が、実質的に変化しない場合、例えば、実質的に上方調節されない場合（例えば、Ｐ＜０．０５）、薬剤は、抗うつ活性に対する特異性を有する可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）（例えばＦＬＸ）は、大うつ病の治療に最も一般に使用される薬物である。しかし、その作用の分子機構の理解は限られている。シナプスセロトニン濃度の上昇におけるＳＳＲＩの短期効果がよく知られている一方、抑うつ症状の臨床的改善は、１４〜２１日の治療を必要とし、これは、ＣＮＳにおける機能の非常に多くの他の再編が起こらなければならないことを示している。
【００１０】
１４日間のＦＬＸ処置によって、（ガラニンが、セロトニンと共存する場合）ガラニンｍＲＮＡレベルが１００％、ラット背側縫線核（ＤＲＮ）におけるＧａｌＲ２結合部位が５０％上方調節されたことを、本明細書に開示する。さらに、ガラニン受容体アンタゴニスト、Ｍ４０は、強制水泳試験、すなわち抗うつ様有効性を評価するために一般に使用されるげっ歯類臨床前スクリーニングにおいて、ＦＬＸの抗うつ様効果を弱めた。ガラニン受容体アゴニスト、ガルノンによるガラニン受容体の直接的な活性化も、同じ作業において抗うつ様効果をもたらすことが判明した。２つの他の抗うつ治療も、モノアミン作動性の核におけるガラニン作動系に影響した：電撃ショックが、ＤＲＮ中のガラニンｍＲＮＡレベルを上昇させたのに対し、睡眠遮断は、ＬＣ中のガラニンｍＲＮＡレベルを上昇させ、ガラニン作動系の活性化と、臨床的に試験済みの様々な処置の抗うつ作用との関係が、さらに明白に示された。
【００１１】
したがって、本発明は、潜在的な抗うつ活性をもつ候補薬をスクリーニングするための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、治療用量の抗うつ薬候補で対象を処置することを含む。一実施形態では、対象は、ヒト以外の哺乳類（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモットまたはミンクを含めたげっ歯類）である。一実施形態では、治療された対象からの脳組織が切開され、例えばＧａｌＲ２発現およびガラニンｍＲＮＡ発現から選択される、抗うつ活性と相関するタイプのガラニン作動系の活性が分析される。対象のガラニン作動系の活性は、対照の活性と比較され、対照と比較した場合の、対象におけるガラニン作動活性の上方制御または上方制御の欠如が決定される。対象の比較されたガラニン作動活性が上方調節される場合、その候補薬は、潜在的な抗うつ活性を有するものである。対象の比較されたガラニン作動活性が上方調節されない場合、その候補薬は、潜在的な抗うつ活性を有さないものである。
【００１２】
一実施形態では、対象は、少なくとも１０から１４日間、治療用量の抗うつ薬候補で処置される。一実施形態では、脳組織が切開され、脳のある種の領域を含むサンプルが分析される。一実施形態では、こうした領域は、ＤＲＮおよび／またはＬＣから選択される。ガラニン作動活性を数量化するために、任意の適切な方法が用いられる可能性がある。例えば、ガラニン発現を検出するために、ガラニンＲＮＡまたはタンパク質を検出することができる。一実施形態では、ガラニンｍＲＮＡは、増幅反応、例えば、ガラニンｍＲＮＡプライマーを用いる定量ＰＣＲで検出される。別の実施形態では、ガラニンに対して特異的な抗体が用いられる可能性がある。ガラニンのｍＲＮＡまたはタンパク質の増加量またはレベル（上方制御）は、ガラニン作動活性の上方制御の指標となる。別の実施形態では、ＧａｌＲ２のＲＮＡまたはタンパク質発現または結合が、検出または決定される。例えば、ガラニン作動活性を検出または決定するために、ＧａｌＲ２結合実験を用いることができる。ＧａｌＲ２の結合または発現の増加量またはレベルは、ガラニン作動活性の上方制御の指標となる。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、候補薬が潜在的な抗うつ活性を有するかどうか検出または決定することをさらに含む。例えば、ガラニン作動活性を検出または決定するために用いられるのと同じまたはそれに相当する脳サンプルが、ＧａｌＲ１発現について分析される。一実施形態では、ＧａｌＲ１結合が検出または決定される。別の実施形態では、ＧａｌＲ１のｍＲＮＡまたはタンパク質発現の量またはレベルが検出または決定される。対象から得られたサンプルにおけるＧａｌＲ１発現または結合が、ＧａｌＲ１発現または結合について対照と比較され、対象におけるＧａｌＲ１発現または結合の上方制御または上方制御の欠如が、対照と比較して決定される。比較されたＧａｌＲ１発現が上方調節される場合、この候補薬はおそらく、抗うつ活性について特異性を欠く。比較されたＧａｌＲ１発現が上方調節されない場合、この候補薬はおそらく、抗うつ活性について特異性を有する。
【００１４】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００１５】
（材料および方法）
（動物）
体重２５０〜２７５グラムの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、食品および水を無制限に入手できるようにし、１２時間の明／暗サイクルで維持した。すべての手順は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）「実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」に従って実施された。
【００１６】
（睡眠遮断および電撃ショック）
２４時間の睡眠遮断は、ラットを睡眠行動が観察される度に妨害することによって達成された。電撃ショック療法については、ラットに、左右対称に、１日４回のショックを２日間与えた。これは、小さな哺乳類のための定電流ＵＧＯ  Ｂａｓｉｌｅ装置（Ｖａｒｅｓｅ，Ｉｔａｌｙ；９０ｍＡ、７０Ｈｚ、強直間代発作が出現するまで）を使用して与えられ、１時間間隔で区切られた。
【００１７】
（免疫組織化学）
成体雄ラットに強く麻酔をかけ、４％パラホルムアルデヒドで潅流させ、クライオスタットを用いて３０μｍの冠状断面を切断した。断片を、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００中で３０分間透過処理し、１０％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、以下の一次抗体と共に室温で終夜保温した：ウサギ・ポリクローナル・ガラニン（Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ；１：５０００）、およびマウス・モノクローナル・トリプトファン・ヒドロキシラーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；１：１０００）。ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１：４００で、室温で２時間使用した。この断片を、適切なフィルター組み合わせを備えている共焦点走査型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ、東京、日本）を用いて調べた。
【００１８】
（組織切開）
屠殺後、ＲＮＡ抽出または結合研究のために使用される組織を速やかに切開し、直ちにドライアイス上で凍結した。切開はすべて、ラットブレインスライサーを用いて、経験豊かな神経解剖学者によって実施され、ＬＣおよびＤＲＮのような小さな構造については、再現可能な解剖を確実にするために、パンチング法（ｐｕｎｃｈｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）が使用された。
【００１９】
（定量リアルタイムＰＣＲ）
１２ラット（ＤＲＮ、ＬＣ、視床下部の室傍核）または６ラット（前前頭皮質、扁桃体、海馬）から得られる脳組織をプールし、製造業者の指示書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを調製した。ＦＬＸ処置後のＤＲＮおよびＬＣにおけるガラニンｍＲＮＡ定量化については、この実験を、脳領域あたり１処置あたり４ラットの３つの独立したプールを用いて繰り返した。その後、一定分量の全ＲＮＡ（２μｇ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、５１℃で６０分間逆転写させた。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉミックスを使用して、定量ＰＣＲを実施した（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。特異的なプライマー（β−アクチン：５’  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣ  ３’（配列番号１）および５’  ＴＧＣ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  Ｃ  ３’（配列番号２）；ガラニン：５’  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ３’（配列番号３）および５’  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＧＡＴ  Ｇ  ３’（配列番号４））は、ゲノムＤＮＡコンタミネーションの増幅の可能性を回避するために、異なるエキソン上の配列に相当するように設計した。リアルタイムＰＣＲ分析は、最初の１０分（Ｔａｑポリメラーゼを活性化する９４℃のステップ）、それに続く３５サイクル（９４℃１０秒の変性、５８℃１０秒のアニーリング、および７２℃２５秒の伸長）を含んでいた。これらの結果を、参照遺伝子であるβ−アクチンの発現レベルによって、規準化された任意単位で表した。
【００２０】
（細胞系）
ラットＧａｌＲ２を発現する安定に形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびヒトＧａｌＲ１を発現するＢｏｗｅｓのメラノーマ細胞を、以前に記載された通りに培養した（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９９８年、３７、６７１１〜７；およびＨｅｕｉｌｌｅｔ，Ｅ．ら「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１９９４年、２６９、１３９〜４７）。
【００２１】
（膜調製および結合実験）
ＤＲＮおよびＬＣを、群ごとに合計１６のラットから切開し、４動物からのサンプルをプールした。ラット脳のシナプス膜（Ｌｕ，Ｘ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」２０００年、２８６、１４９〜５３）および細胞は、前述の通りに調製した（Ｈｅｕｉｌｌｅｔ，Ｅ．ら「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１９９４年、２６９、１３９  ４７）。海馬膜調製物への１２５Ｉガラニン（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の平衡結合を、１５０μＬの結合緩衝液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｃｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、プロテアーゼ阻害剤を補充］中で実施した。室温で４５分間保温を行い、ガラス繊維フィルター（Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を介する迅速な濾過によって終結させた。０．０１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００を含有する冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、フィルターを、Ｃｏｂｒａ  ＩＩ自動ガンマ計数システム（Ｐａｒｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｄｏｗｎｅｒ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて計数した。
【００２２】
組織中のＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２受容体部位の合計を決定するために、１２５Ｉガラニンは、１ｎＭの飽和濃度で使用され、５μＭのガラニンが存在する場合に、非特異的結合が決定された
【００２３】
【表１】
2008528951.tif 000003
ＧａｌＲ２部位の数は、競合物質として、５μＭの非常に選択的なＧａｌＲ２リガンドであるガラニン（２‐ｌ１）を使用して推定した
【００２４】
【表２】
2008528951.tif 000004
ＧａｌＲ３は、試験される領域では豊富でないので、ＧａｌＲ１部位は、ＧａｌＲ１とＧａｌＲ２受容体部位の合計から、ＧａｌＲ２部位を減算することによって推定した。
【００２５】
【表３】
2008528951.tif 000005
（手術）
ラットは、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）麻酔で、無菌定位手術を受けた。２６ゲージ・ステンレススチール皮下注射管の、長さ１．４ｃｍのガイドカニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、ブレグマより０．５ｍｍ後部、１．０ｍｍ横、かつ頭蓋骨の表面から３．５ｍｍ内面という座標で、右側脳室に挿入した。３１ゲージ・スタイレットを、手術後にガイドカニューレに固定した。手術後、ラットは少なくとも８日間回復させ、その後行動試験を開始した。
【００２６】
（薬物処置）
フルオキセチン（ＦＬＸ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、生理食塩水に溶解し、生化学的研究のために、１日につき１０ｍｇ／ｋｇ用量で１４日間腹腔内投与した。別の群のラットは、強制水泳作業における試験のために、ＦＬＸまたは生理食塩水賦形剤の腹腔内注入を１４日間毎日受けた。１４日目に、ラットに、ＦＬＸまたは生理食塩水を強制水泳試験の４５分前に腹腔内に、さらに、Ｍ４０（Ｂａｃｈｅｍ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）またはＡＣＳＦを強制水泳試験の１５分前に脳室内に投与した（以下の方法を参照のこと）。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎポリエチレン管（ＰＥ２０）を介して、３１ゲージ皮下注射管から組み立てられた１．５ｃｍ注射器（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ）と連結された１０μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、Ｍ４０（８ｎｍｏｌ／２μｌ  ＡＣＳＦ）またはＡＣＳＦ（２μｌ）の単回脳室内微量注入を実施した。動物には、１．５分にわたる２μｌ（１０秒の間隔をあけて１μｌずつ）の注入中、小さなケージを自由に探索させ、さらに６０秒後、注射器を、ガイドカニューレから引き抜いた。これらの処置は、以下の組み合わせの処置のうちの１つを受ける等しい数のラットからなるものであった：生理食塩水＋ＡＣＳＦ、生理食塩水＋Ｍ４０、ＦＬＸ＋ＡＣＳＦ、またはＦＬＸ＋Ｍ４０。追加の処置群（１群あたりｎ＝１０）を、以下のうちの１つの腹腔内注入の４５分後に、別の強制水泳試験で試験した：５０％  ＤＭＳＯ（ｗ／ｖ）、ガルノン（Ｖｕｌｐｅｓ、Ｅｓｔｏｎｉａ；５０％  ＤＭＳＯ中に溶解）、またはデシプラミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、１５ｍｇ／ｋｇ（５０％  ＤＭＳＯ中））。強制水泳試験の一週間後、ラットを、処置群に無作為割付けさせた。ラットを、賦形剤、ガルノン、またはデシプラミンで処置した。注入の４５分後、ラットを、オープンフィールド試験にかけた。
【００２７】
（強制水泳試験）
ラットを、２７ｃｍの深さまで水道水（２５℃）を入れた円筒形のガラス容器（高さ４８ｃｍ、直径２１ｃｍ）に一匹ずつ入れ、１０分間試験した。各試験の後には、水を変え、シリンダーを完全に洗い流した。試験は、ビデオテープに記録し、後に、これらのラットの実験条件を知らない経験豊かなオブザーバーによって記録された。行動は、ラットが、逃避反応（通常、前足を水面上にバタバタさせることでわかる）に従事する場合に特徴づけられる「活動的行動」（Ｍａｎｎ、Ｊ．Ｊ．「Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１９９９年、２１、９９Ｓ〜１０５Ｓ）、あるいは、最小限の自発運動活性によって説明される「非活動的行動」として記録した（Ｄｕｍａｎ，Ｒ．Ｓ．ら、「Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」１９９７年、５４、５９７〜６０６）。薬物における抗うつ活性の存在は、活動的行動に費やされる時間を増大させるその能力から推定される（Ｇａｌｅａ，Ｌ．Ａ．ら「Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．」２００１年、１２２、１〜９）。
【００２８】
（オープンフィールド試験）
強制水泳試験の一週間後、ラットを、処置群に無作為割付けさせた。ラットを、賦形剤、ガルノン、またはデシプラミンで処置し、注入の４５分後に、ラットをオープンフィールドに置いた。装置は、高さ４０ｃｍの不透明な白色壁を備えた正方形の舞台（１００×１００ｃｍ）からなるものであった。床には、９つの等区画になるように印をつけた。蛍光灯は、拡散性の頭上照明を提供するものであった。５分にわたる自発運動活性を、ビデオテープに記録した。テープは、動物の実験条件を隠して、後に記録した。線を横切る（ｌｉｎｅ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ）行動（正方形内に少なくとも３つの足が入るものと定義される）を記録し、実験条件間で比較した。
【００２９】
（統計的方法）
ガルノンおよびデシプラミンを利用する強制水泳試験研究のデータを、被験者間因子として薬物治療を用いる一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）にかけた。Ｍ４０  ＦＬＸ研究については、データを、主要な因子として長期薬物処置（賦形剤に対するＦＬＸ）および脳室内薬物（ＡＣＳＦに対するＭ４０）を用いる２因子被験者間計画にかけた。引き続き、特定の群の違いを決定するために、有意な主効果に、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＬＳＤ  ｐｏｓｔｈｏｃ試験を行った。ＦＬＸ処置後のＤＲＮおよびＬＣ中におけるＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２結合部位のデータは、単一の対照群を用いる多重比較のためのアルファ水準を制御するために適用されるボンフェローニ補正を用いて、スチューデントｔ検定によって分析した。
【００３０】
（結果）
ガラニン様免疫活性（ガラニンＬＩ）は、セロトニン作動性およびノルアドレナリン作動性核で豊富である。コルヒチン処置された動物に対する以前の免疫組織化学的研究では、ガラニンは、中枢神経系中に広く分布し、ガラニン−ＬＩは通常、コリン作動性、カテコールアミン作動性、およびセロトニン作動性マーカーと共存することが示されている（Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｔ．ら「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９８６年、６、３６４０  ５４；およびＳｋｏｆｉｔｓｃｈ，Ｇ．ら「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」１９８５年、６、５０９〜４６）。コルヒチン処置していない未処置ラットにおけるノルアドレナリン作動系およびセロトニン作動系におけるガラニン−ＬＩの分布を再検討するために、二重免疫蛍光標識技術が用いられた。ＤＲＮにおいては、セロトニン作動性ニューロンの標識づけから予想された通り、トリプトファンヒドロキシラーゼの免疫活性は、主に細胞体および一次樹状突起中に存在していた。大部分のトリプトファンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンが、中程度のガラニン−ＬＩを示したのに対して、非セロトニン作動性ガラニン−ＬＩ繊維および細胞体も存在していた（図１Ａ）。ＬＣにおいては、強いガラニン−ＬＩが、細胞体および繊維中に観察され、これは、ノルアドレナリン作動性マーカー（ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ）とのほぼ完全な共存を示していた（図１Ｂ）。統合された画像は、ＬＣにおけるほとんどすべてのノルアドレナリンニューロンが、ガラニン陽性であることを示した。
【００３１】
（ラット脳内のガラニンｍＲＮＡの定量化）
ガラニンｍＲＮＡ発現レベルは、試験された６つの脳領域の中では、視床下部の室傍核、ＬＣ、およびＤＲＮで最も大きかった（図２Ａ）。視床下部、ＬＣ、およびＤＲＮ中のガラニンｍＲＮＡの発現レベルの大きさは、ノーザンブロット解析およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、以前に示されている（Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ａ．Ｌ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」１９９０年、１１４、２４１〜７；およびＫａｐｌａｎ，Ｌ．Ｍ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１９８８年、８５、１０６５〜９）。扁桃体および海馬は、同程度レベルのガラニンｍＲＮＡを有し、どちらも、ＤＲＮの約１３％に相当する。ガラニンｍＲＮＡ発現は、前前頭皮質中でも検出され、ＤＲＮレベルのおよそ３％であった。
【００３２】
（抗うつ治療は、いくつかの脳領域においてガラニンｍＲＮＡ発現を上方調節する）
ガラニンｍＲＮＡ発現に対する、３つの臨床的に妥当な抗うつ治療、すなわち、１４日間の長期ＦＬＸ腹腔内注入、２４時間の睡眠遮断、または２日間の電撃ショック（１時間間隔で１日４ショック）の効果を、リアルタイムＰＣＲを使用して分析した（図２Ｂ）。前前頭皮質、ＤＲＮ、およびＬＣでは、３つの抗うつ治療のうちの２つは、ガラニンｍＲＮＡレベルを著しく増大させた。ＤＲＮでは、電撃ショックと長期ＦＬＸ処置は、同様の効果を有し、２倍の増大となり、ＬＣでは、ＦＬＸおよび睡眠遮断は、それぞれ２．２および１．８倍の増大をもたらした。生理食塩水およびＦＬＸで処置された動物からの別のプールの組織サンプルに対する、ＤＲＮおよびＬＣにおける、ガラニンｍＲＮＡレベルに対する長期ＦＬＸ投与の効果をより十分に定量化するために、さらなる研究を実施した。これらの結果（図２Ｃ）は、より大きなプールのサンプルから得られたもの（図２Ｂ）と同様であった。
【００３３】
（長期ＦＬＸ処置は、ＤＲＮにおけるＧａｌＲ２結合部位を増加させる）
対照動物では、ＬＣとＤＲＮはどちらも、高レベルのガラニン結合部位を示し（図３）、ＧａｌＲ１部位は、ＤＲＮではタンパク質１ｍｇあたり５８ｆｍｏｌｅ、ＬＣではタンパク質１ｍｇあたり７２ｆｍｏｌｅと推定された。全ガラニン結合部位の約３分の１（ＤＲＮでは３３％、ＬＣでは３２％）は、ＧａｌＲ２受容体に相当し、ＧａｌＲ１とＧａｌＲ２のｍＲＮＡ分布に関する以前の知見と整合性がある結果が、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して得られた（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｄ．ら「Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．」１９９９年、４０９、４６９  ８１；およびＧｕｓｔａｆｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．ら「Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．」１９９６年、７、９５３〜７）。
【００３４】
ＤＲＮでは、ＦＬＸ処置によって、ＧａｌＲ２部位の数が、５８％と著しく増加されたが、ＧａｌＲ１結合部位の数は変化しなかった（図３）。電撃ショックは、ＧａｌＲ１部位またはＧａｌＲ２部位のいずれに対しても効果を有さなかった。前前頭皮質、海馬、および扁桃体では、抗うつ治療のいずれも、ＧａｌＲ１またはＧａｌＲ２受容体のレベルの有意な変化をもたらさなかった（データは示さない）。
【００３５】
（ガラニン受容体アンタゴニストＭ４０は、強制水泳試験においてＦＬＸの抗うつ様効果を弱めた）
ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２受容体に対するＭ４０のＫｉはそれぞれ、１．８２ｎＭおよび５．１ｎＭであった（図４Ａ）。強制水泳試験におけるＦＬＸおよびＭ４０の効果に関するデータ（図４Ｂ）を、二因子ＡＮＯＶＡにかけた。結果は、治療の有意な主効果［Ｆ（１，４０）＝５．５６８  ｐ＜０．０５］、および、前処置（ＦＬＸまたは生理食塩水）と処置（Ｍ４０またはＡＣＳＦ）との間の有意な相互作用［Ｆ（１，４０）＝５．５２０  ｐ＜０．０５］を示した。その後の事後分析では、ＦＬＸが１０ｍｇ／ｋｇで（腹腔内、１４日）投与される場合、ラットが、強制水泳試験中に活動的に過ごす時間が有意に増大し（ｐ＜０．０５、生理食塩水＋ＡＣＳＦに対するＦＬＸ＋ＡＣＳＦ）、抗うつ様効果を示唆することが示された。ガラニン受容体アンタゴニストＭ４０は、強制水泳試験の１５分前に、ガラニン誘発性の摂食行動増大をブロックすることが示される用量で（８．０ｎｍｏｌ、脳室内）注入される場合、強制水泳試験中に活動的に過ごす時間の増大を有意に弱め、したがって、ＦＬＸの推定上の抗うつ様効果に拮抗する（ｐ＜０．０１、ＦＬＸ＋Ｍ４０に対するＦＬＸ＋ＡＣＳＦ）（図４Ｂ）。
【００３６】
（ガルノン（ガラニン受容体アゴニスト）は、強制水泳試験およびオープンフィールド試験において行動上の効果を示す）
全身的に活性な非ペプチドガラニン受容体アゴニスト、ガルノンは、ＧａｌＲ１（Ｓａａｒ，Ｋ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００２年、９９、７１３６〜４１）とＧａｌＲ２の両方に対して中程度の親和性を示した。ガルノンが、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２受容体を、１２５Ｉ−ガラニンと置き換えることが認められ、Ｋｉはそれぞれ、１１．７μＭおよび３４．１μＭであった（データは示さない）。
【００３７】
ガルノンを、腹腔内、１〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、陽性対照としてデシプラミン（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いる強制水泳試験において試験した（図５）。ガルノン投与後の強制水泳試験のデータを、因子として薬物治療を用いる一因子分散分析（ＡＮＯＶＡ）にかけた。ＡＮＯＶＡの結果は、薬物治療の有意な主効果を示した［Ｆ（７，６１）＝３．９８、ｐ＜０．００１］。さらなる事後分析では、ガルノンは、強制水泳試験中に、用量依存的な活動性の増大をもたらすことが示された。この効果は、２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）および４０ｍｇ／ｋｇ用量（ｐ＜０．０１）で有意であった。陽性対照として使用されるデシプラミンは、活動性を強く増大させた（１２５％、ｐ＜０．００１）。
【００３８】
ガルノンおよびデシプラミンを用いるオープンフィールド試験（図５）からのデータを、因子として薬物治療を用いる一因子ＡＮＯＶＡにかけた。ＡＮＯＶＡの結果は、薬物治療の有意な主効果を示した［Ｆ（７，６１）＝３．３５、ｐ＜０．０１］。活性は、２０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０１）および４０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）の２つの高用量のガルノンで、著しく低下させられたので、事後分析では、ガルノンの用量を増加させることは、オープンフィールドにおける活動性を低下させる傾向があることが示された。デシプラミンはまた、自発運動活性の有意な減少（ｐ＜０．０１）、すなわち、文献（Ｍａｇｕｅ，Ｓ．Ｄ．ら「Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．」２００３年、３０５、３２３〜３０）中で一貫して説明されてきた効果をもたらした。
【００３９】
（考察）
以前の報告によって、ここでは、ＤＲＮおよびＬＣが、高レベルのガラニン−ＬＩを発現すること（Ｍｅｌａｎｄｅｒ，Ｔ．「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９８６年、６、３６４０〜５４；およびＳｋｏｆｉｔｓｃｈ，Ｇ．ら「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」１９８５年、６、５０９〜４６）、また、ガラニン−ＬＩは、ＤＲＮにおいてはトリプトファンヒドロキシラーゼ免疫活性と部分的に、ＬＣにおいてはドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ免疫活性とほぼ完全に共存することが確認される（図１）。ＤＲＮにおけるガラニンｍＲＮＡの１００％増大が、２つの抗うつ治療：２日間の電撃ショックおよび１４日間のＦＬＸ処置後に観察された（図２）。ＬＣにおけるガラニンｍＲＮＡの同様の大きな増大は、ＦＬＸ（１４日）および睡眠遮断（２４時間）を用いる処置の後に誘発された。以前の研究では、ガラニンｍＲＮＡ発現の増大が、ガラニン合成および放出の増大と関連することが実証されている（Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ｂ．ら「Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．」１９９０年、２６０、２７９〜９７；Ｖｉｌｌａｒ，Ｍ．Ｊ．ら「Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．」１９９４年、６５０、２１９〜２８；およびＬａｎｄｒｙ，Ｍ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ」１９９８年、８４、８９７〜９１２）。３つの異なる抗うつ治療が、臨床的に妥当な抗うつ効果が有効になる時点で、ガラニンｍＲＮＡレベルを強く上昇させたという発見は、その抗うつ様活性が、ガラニン合成および放出の誘発に関連する可能性があることを示唆している。
【００４０】
ガラニンペプチド発現の増大と同時に、ＦＬＸ処置後のＧａｌＲ２結合部位の増大が検出された（図３Ｂ）。ガラニン発現とＧａｌＲ２結合の同時増大は、ＧａｌＲ２が、容易に脱感作する受容体サブタイプでないことを示す可能性がある。ＤＲＮ中のＧａｌＲ１受容体部位は、長期ＦＬＸ処置によって変更されず、処置前レベルのままであったのに対し、ＧａｌＲ２受容体結合部位は、５０％上昇し、ＤＲＮニューロンに対するガラニンの効果の、ＧａｌＲ２を介して発揮されるよりも大きな影響への相対的なシフトがもたらされた。ＧａｌＲ１は、アデニリルシクラーゼのＧｉ介在性抑制を介して作用するのに対し、ＧａｌＲ２は、ＩＰ３および細胞内Ｃａ２＋濃度のＧｑ／Ｇ１１介在性増大を介して作用する（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９９８年、３７、６７１１〜７）ので、ＦＬＸ処置が誘導する、ＤＲＮニューロンに対するＧａｌＲ２介在性の影響の増大への「偏り」が、こうしたニューロンにおける発火速度を増大させるであろうことが、本明細書で開示される。実際、神経伝達物質放出に対する（おそらくＧａｌＲ２を介して発揮される）ガラニンの興奮性の効果は、ある種の脳領域中で報告されている（Ｏｇｒｅｎ，Ｓ．Ｏ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」１９９１年、１２８、２５３〜６；およびＯｇｒｅｎ，Ｓ．Ｏ．ら「Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９９８年、８６３、３４２〜６３）。さらに、背側海馬ＧａｌＲ２受容体の活性化は、認知を容易にするのに対して、腹側海馬におけるＧａｌＲ１の活性化は、認知能力を弱め（Ｏｇｒｅｎ，Ｓ．Ｏ．ら「Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９９８年、８６３、３４２〜６３）、これは、ＧａｌＲ１とＧａｌＲ２との間の均衡が変化させられる場合、ガラニンの全体的な作用の変化が起こるであろうことを示唆する。
【００４１】
ＤＲＮ中のガラニンｍＲＮＡおよびＧａｌＲ２受容体の増大をＦＬＸの抗うつ様効果と結びつける、上の発見の妥当性は、ガラニン受容体アンタゴニスト、Ｍ４０（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１９９３年、９０、１１２８７〜９１）が、強制水泳試験においてＦＬＸの抗うつ様効果を弱めたという発見によって強調された（図４Ｂ）。こうしたデータは、ガラニンｍＲＮＡおよびＧａｌＲ２の増加が、広く使用されているこの抗うつ薬の抗うつ様効果のために妥当であることを示唆している。
【００４２】
ガルノン、すなわち低分子量のガラニン受容体アゴニストは、強制水泳試験において抗うつ様効果を示した（図５）。同様の用量のガルノンは、アヘン剤退薬の徴候を抑制すること（Ｚａｃｈａｒｉｏｕ，Ｖ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００３年、１００、９０２８〜３３）、また、フェニレンテラゾール誘発性発作の潜伏時間を増大させること（Ｓａａｒ，Ｋ．ら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」２００２年、９９、７１３６〜４１）が示されている。ガルノンは、ＧａｌＲ１／ＧａｌＲ２に対する非選択的なアゴニストであり、したがって、その短期抗うつ様効果は、おそらく、抗うつ治療によって増強されるガラニン放出の増大の効果と同様である。短期強制水泳試験では、ＧａｌＲ２レベルは、注入と試験との間に短い時間が適用されることに起因して、ＦＬＸを用いる治療の１４日後であるように調節される可能性が低いので、ＤＲＮにおけるＧａｌＲ１／ＧａｌＲ２比の変化は、ガルノンの抗うつ様効果を説明しないと思われる。ガラニン作用の他の態様は、抗うつ治療後にガラニンｍＲＮＡレベルも上昇する場合に、例えば前頭葉前部領域に対する直接的なシナプス後効果を介する、急激な効果に寄与する可能性がある（図２Ｂ）。ガラニンと５−ＨＴ１Ａ受容体活性化との間の相乗作用的効果が報告されている（Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｐ．Ｂ．ら「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１９９１年、２０４、８７〜９５）。さらに、ガラニンは、急速眼球運動（ＲＥＭ）睡眠（Ｍｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」２００４年、２９、１２０５〜１１；Ｔｏｐｐｉｌａ，Ｊ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」１９９５年、１８３、１７１〜４；およびＭｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｒｅｓ．」１９９９年、３３、２２５〜３２）、摂食（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」１９９３年、７、２２９〜７４）、およびホルモン放出（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．ら「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」１９９３年、７、２２９〜７４）（これらはすべて、抑うつにおいて妨げられる）を調節するので、視床下部におけるガラニンの効果は、抗うつ様効果に寄与する可能性がある（Ｂａｒｒ，Ａ．Ｍ．ら「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ」２００２年、２３、４７５〜８２）。ガラニンは、レム睡眠の抑制を介して、抗うつ様効果を発揮することが報告されている（Ｍｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」  ２００４年、２９、１２０５〜１１；Ｔｏｐｐｉｌａ，Ｊ．ら「Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．」１９９５年、１８３、１７１〜４；Ｍｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｒｅｓ．」１９９９年、３３、２２５〜３２；およびＦｕｊｉｈａｒａ，Ｈ．ら「Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．」２００３年、１１９、１５２〜９）。コルチコトロピン放出因子などの視床下部に豊富な他のニューロペプチド（Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ｓ．ら「Ｓｅｍｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」２００３年、８、１１９  ３６��およびアルギニンバソプレシン（ｖａｎ  Ｂｒｏｅｋｈｏｖｅｎ，Ｆ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（Ｂｅｒｌ．）２００３年、１６５、９７〜１１０）もまた、気分の調節に関係している。二重免疫標識研究によって、コルチコトロピン放出因子とガラニンとの共存が非常に低い（Ｃｅｃｃａｔｅｌｌｉ，Ｓ．ら「Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」１９８９年、４９、３０９〜２３）のに対し、アルギニンバソプレシンとガラニンとの共存は、室傍核において非常に一般的である（Ｇａｉ，Ｗ．Ｐ．ら「Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．」１９９０年、２９８、２６５〜８０）ことが示されており、また、アルギニンバソプレシン放出は、ガラニンによって調節される可能性があることが示されている（Ｃｉｏｓｅｋ，Ｊ．ら「Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」２００３年、５４、６２５〜４１）。一方、最近の調査では、レム睡眠欠乏が、コルチコトロピン放出因子またはアルギニンバソプレシンのｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさずに、ガラニン発現を選択的に上方調節することが示されており（Ｆｕｊｉｈａｒａ，Ｈ．ら「Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．」２００３年、１１９、１５２〜９）、これは、こうしたさらなるニューロペプチド系に影響せずに、ガラニン作動性の抗うつ様効果が達成される可能性があることを示唆している。
【００４３】
本明細書に開示される３つの抗うつ治療は、抗うつ治療の作用の機構に関する非常に多くの研究と同様に、未処置の「抑うつ状態ではない」動物に実施された。「抑うつ状態」と「未処置」の脳の神経化学的違いにもかかわらず、未処置動物における抗うつ薬スクリーニングは、有用であることが証明されている（Ｃｒｙａｎ，Ｊ．Ｆ．ら「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ」２００２年、２３、２３８〜４５）。未処置の動物を用いた本明細書の開示と一致して、抑うつ状態の患者において静脈内適用されたガラニンの抗うつ効果が判明した（Ｍｕｒｃｋ，Ｈ．ら「Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」２００４年、２９、１２０５〜１１）。
【００４４】
（まとめ）
抑うつの治療のためのガラニン系の妥当性は、ラットのＤＲＮおよびＬＣにおけるガラニンおよびその受容体の発現レベルに対する、３つの臨床的に実証された抗うつ治療、すなわち睡眠遮断（２４時間）、電撃ショック（２日間かけて４ショック）、および、最も一般に使用される長期ＦＬＸ処置（１４日間）の効果を試験することによって決定された。それぞれの治療の長さは、それぞれの治療の臨床的な利益の発生と、動物研究における以前の経験が相関するように選択された（Ｓｚｕｂａ，Ｍ．Ｐ．ら「Ｄｅｐｒｅｓｓ．Ａｎｘｉｅｔｙ」２０００年、１２、１７０  ７；Ｎｏｌｅｎ，Ｗ．Ａ．ら「Ｉｎｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．」１９８９年、４、２１７  ２８；Ｚｈａｏ，Ｙ．ら「Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．」２００３年、３０７、２４６  ５３；およびＨｅａｌ，Ｄ．Ｊ．ら「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．」１９８９年、５３、１０１９  ２５）。ガラニン作動性シグナル伝達の変化の、ＦＬＸ介在性抗うつ様効果への寄与をさらに試験するために、ガラニン受容体アンタゴニスト、Ｍ４０が、長期ＦＬＸ処置（１０ｍｇ／ｋｇ  腹腔内、１４日間）の抗うつ様効果をブロックしたかどうか、また、ガラニン受容体アゴニスト、ガルノンが、ラット強制水泳試験において抗うつ様効果を発揮したかどうかを試験した。この結果では、Ｍ４０は、長期ＦＬＸ処置の抗うつ様効果をブロックし、ガルノンは、ラット強制水泳試験において抗うつ様効果を発揮することが示された。
【００４５】
すべての刊行物、特許、および特許出願を、参照により本明細書に組み込む。上の明細書では、この発明を、そのある種の好ましい実施形態に関して説明し、例示目的で多くの詳細を述べてきたが、本発明にはさらなる実施形態の余地があること、また、本発明のある種の詳細を、本発明の基本原理から逸脱することなく著しく変化させることもできることは、当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ラットＤＲＮおよびＬＣにおいてガラニン様免疫活性を示す背側縫線核（ＤＲＮ）および青斑（ＬＣ）における免疫蛍光標識されたセロトニン作動性ニューロンの一連の写真を示す。（Ａ）ＤＲＮにおける、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ、カラー写真では緑色）およびガラニン（ＧＡＬ、カラー写真では赤色）の免疫蛍光二重標識。（Ｂ）ＬＣにおける、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ、カラー写真では緑色）およびガラニン（カラー写真では赤色）の免疫蛍光二重標識（スケールバー、５０μｍ）。
【図２】図２は、ガラニンｍＲＮＡ発現に対する抗うつ治療の効果を示す一連の棒グラフを示す。成体雄ラットを、３つの抗うつ治療、すなわち、２４時間の睡眠遮断、電撃ショック（１日につき４回のショックを２日間）、またはＦＬＸ（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内、１４日間）のうちの１つにかけた。異なる脳領域を切開し、６〜１２ラットから得られた組織をプールした。全ＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写させた。プールされたサンプル（ＡおよびＢ）に対して、リアルタイムＰＣＲを３回繰り返した。（Ａ）未処置ラット脳の異なる領域におけるガラニンｍＲＮＡを定量化し、任意単位として表した。（Ｂ）抗うつ治療は、様々な脳領域中のガラニンｍＲＮＡ発現を増加させた。（Ｃ）ＦＬＸ処置は、ＤＲＮおよびＬＣ中のガラニンｍＲＮＡを増加させた。ＤＲＮおよびＬＣにおけるガラニンｍＲＮＡレベルに対する長期ＦＬＸ投与の効果を確認するために、４ラット／領域／処置の３つの独立したプールに対してさらなる実験を実施した。＊、Ｐ＜０．０５、対照対ＦＬＸ、スチューデントｔ検定。ＰＦＣ、前前頭皮質；Ａｍｙ、扁桃体；Ｈｉｐ、海馬；ＰＶＮ、視床下部の室傍核；ＳＤ、睡眠遮断；ＥＣＳ、電撃ショック。
【図３】図３は、長期ＦＬＸ処置が、ＤＲＮにおけるＧａｌＲ２タンパク質レベルをどのように上方調節するかについて示している２つの棒グラフを示す。電撃ショック（１日につき４回のショックを２日間）または長期（１４日）ＦＬＸ処置（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の後、ＤＲＮおよびＬＣ中のＧａｌＲのレベルは、［１２５Ｉ］ガラニン結合（１ｎＭ）を飽和させることで決定された。各処置群は、１２〜１８のラットを含み、３動物由来のサンプルが組み合わせられた。総ガラニン結合部位（ＧａｌＲ１とＧａｌＲ２の合計）およびＧａｌＲ２部位は、それぞれ、競合物質として５μＭガラニン（１‐２９）および５μＭガラニン（２‐１１）を使用することによって推定された。ＧａｌＲ３は、これらの領域では豊富でないので、総ＧａｌＲと、ＧａｌＲ２の間の差を、ＧａｌＲ１と定義した。結果は、タンパク質１ミリグラムあたりのフェムトモル（±ＳＥＭ）として表す。長期ＦＬＸ処置は、ＬＣ中ではなくＤＲＮ中でＧａｌＲ２部位を増加させた（下図）。抗うつ治療はいずれも、ＧａｌＲ１部位に対する効果を有さない（上図）。＊、Ｐ＜０．０５、単一の対照群を用いる多重比較のためのボンフェローニｔ検定。
【図４】図４は、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２を発現する細胞から調製される膜由来のＭ４０による［１２５Ｉ］ガラニン結合の置換を示す第１のグラフと、ＦＬＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）または食塩水で１４日間前処置され、ガラニン受容体アンタゴニストＭ４０または賦形剤（ＡＣＳＦ）の所与の脳室内単回注入を行ったラットからの結果を示す棒グラフである第２のグラフを示す。強制水泳試験で試験を行う４５分前のガラニン受容体アンタゴニスト（Ｍ４０）は、強制水泳試験中のＦＬＸの抗うつ薬様効果を弱めた。（Ａ）膜由来のＭ４０による［１２５Ｉ］ガラニン結合の置換は、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２を発現する細胞から調製された。Ｍ４０は、ＧａｌＲ１とＧａｌＲ２に対して同様の親和性（それぞれ１．８ｎＭおよび５．１ｎＭのＫｉ）を有する。（Ｂ）ＦＬＸ（１０ｍｇ／ｋｇ）または食塩水で１４日間前処置され、強制水泳試験で試験を行う４５分前にガラニン受容体アンタゴニストＭ４０または賦形剤（ＡＣＳＦ）の所与の脳室内単回注入を行ったラットからの結果。活動性は、１０分間の試験中に測定された。データは、強制水泳試験中に活動的に過ごす時間の割合の群平均（±ＳＥＭ）を表す。＊、食塩水／ＡＣＳＦに対するＦＬＸ／ＡＣＳＦの有意性。ＦＬＸで１４日間前処置されたラットは、食塩水で前処置されたラットと比較して、強制水泳試験中の活動的に過ごす時間が４６％増大し、この効果は、有意であった［Ｐ＜０．０５、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差（ＬＳＤ）試験］。処置前のＦＬＸのこの効果は、Ｍ４０の脳室内投与によって完全に逆転した。＊＊、ＦＬＸ／ＡＣＳＦに対するＦＬＸ／Ｍ４０の有意性、Ｐ＜０．０１、ＦｉｓｈｅｒのＬＳＤ。
【図５】図５は、異なる用量のガルノンを用いる強制水泳試験の結果、および、異なる用量のガルノンを用いるオープンフィールド試験の結果を示すグラフを表す。第１のグラフ：活動性は、強制水泳試験中、注入４５分後の１０分間の試験中に測定された。賦形剤で処置された動物と比較して、より多い用量のガルノンは、この試験における活動性を有意に増大させた。陽性対照として、ある群を、三環系抗うつ薬、デシプラミン（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で処置したが、これもまた、活動性を著しく増加させた。第２のグラフ：同一用量の薬物を、オープンフィールド試験中に投与した。より多い用量のガルノンおよびデシプラミンは、この作業中の活動性を著しく低下させた。（＊、対照に対してＰ＜０．０５、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差試験）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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