(57)【要約】  本発明は、病原因子に対する防御的及び効果的な免疫応答を誘導するためにワクチン成分を抗原提示細胞に照準することができる、毛包を経由するワクチン投与法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛包を開くように角質層の５０％までをアブレーションによって前処理された皮膚表面に適用するためのワクチンを調製するための、可能な限りの変形後に０．１ｎｍと０．２μｍとの間の粒径を有する横断面を少なくとも呈するパーティクルであって、該パーティクルが防御免疫応答を誘導、刺激又は増大することを特徴とするパーティクルの使用。
【請求項２】
パーティクルが、可能な限りの変形後に、０．１ｎｍと０．１μｍとの間の粒径を少なくとも呈する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
パーティクルが、可能な限りの変形後に、０．１ｎｍと０．０５μｍとの間の粒径を少なくとも呈する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の、堅いパーティクルの使用。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の、ウイルス粒子の使用。
【請求項６】
前処理ステップが粘着性ストリップを使用して行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前処理ステップが瞬間接着剤を皮膚表面に適用することにより行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
パーティクルがワックスビーズである、請求項１〜５、６及び７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
パーティクルがポリエチレンイミン又はポリ乳酸からなる、請求項１〜４、６及び７のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
パーティクルが、タンパク類、ペプチド類、多糖類、ポリグリコシド類、リポポリ多糖類、トキソイド類、結合キャリアータンパク類、細胞抽出物、ウイルス抽出物、細菌抽出物、寄生虫抽出物、及び、生きた、弱毒化、殺した、不活化若しくは組換えのウイルス、細菌若しくは寄生虫の微小断片、及び、ウイルス偽粒子、ＤＮＡ、病原因子の組換え核酸、難病や癌に関係する分子、及び、癌細胞抽出物からなる群から選ばれる抗原を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
パーティクルが、サイトカイン類、ケモカイン類、増殖因子、病原因子の派生物、トキソイド類、油性エマルション、脂質類、リポ多糖類、共重合体、ＰＡＭｓ、“トール様受容体”リガンド、ＭＰＬ−Ａ、クイルＡ、ＩＳＣＯＭ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）若しくはジメチルジオクタデシルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ）、ＣｐＧモチーフ、リーフ（Ｌｅｉｆ）、及び無毒化若しくは非無毒化トキソイド類からなる群から選ばれるアジュバントをも含みうる、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
パーティクルがＨＩＶゲノムの一部をコードする裸のＤＮＡを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
ウイルス粒子が、組換え体であってもなくてもよい、不活化ＨＩＶ粒子である、請求項１〜３及び５〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ウイルス粒子が弱毒化ポックスウイルス粒子である、請求項１〜３及び５〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
パーティクルが、ペプチド及び／又はタンパク及び／又はＤＮＡ及び／又は核酸を担持するポリ乳酸のナノパーティクルを含む、請求項１〜４及び６〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
治療用ワクチン塑性物を調製するための、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記組成物が、毛包を経由して、ワクチン成分を抗原提示細胞に照準するために有用であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記パーティクルが防御免疫ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導、刺激又は増大する、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記パーティクルが免疫抑制された個体において防御応答を誘導、刺激又は増大する、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原因子に対する防御的及び効果的な免疫応答を誘導するために、ワクチン成分を抗原提示細胞に照準できるようにする、毛包を経由するワクチン投与法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種はウイルス又は細菌の感染を防ぐ又は低減するための有効な方法である。これらの分野におけるワクチン投与運動の成功によって、感染学領域において現在まで使われているワクチンの概念を、癌領域及び自己免疫領域にまで拡大することが可能となった。
【０００３】
“従来の”経路によるワクチン投与、つまり、溶液状態での筋肉内投与や皮内投与は、実施の際に多くの制約がある。要するに、従来のワクチン接種方法は注射針の使用を要するという欠点、並びに、同じ根拠によって、無菌性及び創の問題を引き起こすという欠点もあり、また、再溶解して溶液としたワクチンの安定性の点において、並びに、保管及び輸送中の低温流通体系を守らない場合において、やはり問題がある。
【０００４】
そのうえ、ワクチン製剤は、その後続いて、免疫応答部位である二次リンパ組織に到達しなければならない。ワクチン製剤がこれらの組織へ至る間、製剤の抗原が体液によって希釈され、期待される免疫応答に適応しない組織に捕捉され、又は、分解される可能性があり、そして、それは最初に注射されたワクチン製剤の多大な損失につながる。結果として、注射されるワクチンの量は、これらの損失を補償するために、実質的でなければならない。
【０００５】
皮膚は特に抗原提示細胞が豊富な組織であり、これらの細胞は強力で有効なワクチン応答を誘導するために絶対的に必要である。それらの配置及びそれらの機能は特によく研究され、そして、知られている。
【０００６】
実際に、効果的で強力な免疫応答が、例えば、ヒトにおける痘瘡の場合の乱切法のような、皮膚バリアの破壊に続いて誘導されうるということが長い間知られている。しかしながら、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原をコードする裸のプラスミドＤＮＡを水溶液の状態で無傷のマウスの皮膚にワクチン注射することもまた特異的で強力な免疫応答を引き起こすということを、研究は示している（Ｆａｎ，１９９９）。
【０００７】
マウスにおいて、ケラチノサイトを事前に除去したこれらの動物の皮膚にワクチンを局所的に適用した後に、免疫応答を誘導できることが最近になって示された(Ｉｓｈｉｉ，Ｎ．ら，（２００１）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．，Ｎｏｖ．，６（１），ｐｐ．７６-８０）。同様に、ＨＩＶウイルスに感染したサルにおいてこのウイルスＤＮＡに対する応答を誘導することもできる（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．ら，第９回レトロウイルス・日和見感染症会議，シアトル，２００２年２月）。研究はサルに粒径０．１μｍのポリエチレンイミン及びＤＮＡでコーティングされたマンノースからなる粒子を接種してから行われた。サルの皮膚の約４０ｃｍ２の表面積がこの試験を実施するために必要であった。粗見積では、ランゲルハンス細胞（抗原提示細胞）のうちの１％が誘導されるＤＮＡ（ＤｅｒｍａＶｉｒ）を発現すると評価する（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．ら，（２００５）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｊａｎ．，１２４（１），ｐｐ．１６０−９）。
【０００８】
これらの研究は、上のように、動物モデルにおける経皮的なワクチン接種によって効果的な免疫応答を誘導できることを示した。しかし、今日までに利用可能な経皮的ワクチン接種法は、しばしば複雑なワクチンの調製手順及び、患者の皮膚の大きな表面積を使用することと関連した最も普通に侵襲的な投与方法（シェービング、乱切法、表皮上層の掻爬法等）を伴う。そのうえ、血流を経由することによる製品を損失するリスクが全く考慮に入れられていない。
【０００９】
無傷の皮膚に塗布された化合物の経皮的吸収は、実際に、皮膚の表面に非常に構造化されたバリアを形成する角質層によって制限されるが、これによってこれまでずっとこの角質層を物理的方法によって変性することの必要性が説明される。皮膚角化層を介する分子の通過は非常に遅い拡散速度で起こり、最も大きな分子は、タンパクはその一つであるが、大変な困難さを伴ってこのバリアを通り抜けることに成功する。
【００１０】
しかしながら、ＵＳ  ５，９１０，３０６号及びＵＳ  ５，９８０，８９８号（米国陸軍）の特許から、ワクチンの経皮的投与によるアプローチがヒトにも適用しうることが知られる。実際、例えば、ＵＳ  ５，９８０，８９８号特許の著者らは、パッチシステムを使用してＥ．  ｃｏｌｉ細菌の易熱性エンテロトキシンで経皮的に免疫した後に、強力な免疫応答を誘導した。しかし、このアプローチの欠点は、ワクチン製剤を個人の広い表面積に適用することを必要とするということである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
生理学的状態の下では、局所的に適用される活性生成物の濃度は、特にそれらが希釈された医薬組成物の形に調合されるときに、低い。これは一部には活性化合物を溶液状態で含む従来の製剤は皮膚表面で拡散し、その結果として活性化合物が低い局所的濃度となるという事実のためである。さらに加えて、有効な局所的濃度が低くなるほど、これらの活性化合物が皮膚のタンパクに非特異的に結合するリスクが増大し、それによってワクチン投与に利用可能なフリーの濃度がさらに減少する。
【００１２】
とりわけ、表皮は常に新陳代謝されているので、結合した活性化合物はこの新陳代謝中に必然的に失われる。
【００１３】
しかし、皮膚の構成要素、特に毛包は、皮膚のバリア機能において重要な切れ目の部位である。
【００１４】
様々な研究によって、毛包は、２つの毛包間の表皮のサイズに比べ、その小さなサイズにも関わらず、活性化合物を含む外来物質の経皮的吸収のための主要な進入経路であることが示されている（Ｈｕｅｂｅｒ，１９９４；Ｔｅｎｊａｒｌａ，１９９９）。さらに、毛包を改変した皮膚に挿入することによって、ヒドロコルチゾンの浸透速度が増加する（Ｍｉｃｈｅｌ，１９９９）。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
出願人は、病原因子に対して防御的で効果的な免疫応答を誘導するために、ワクチン製剤の成分を抗原提示細胞に照準することができる、毛包を経由するワクチン接種方法を開発した。
【００１６】
出願人は、上述のように、この照準を定めたワクチン接種方法によってワクチンが毛包の周囲に位置するプロフェッショナル抗原提示細胞に到達できるようになることを知得した。従って、本発明の目的は、照準を定めたワクチン接種方法であり、また、ワクチン製剤の成分が抗原提示細胞に選択的に到達することでもある。
【００１７】
ワクチン投与の照準を定めることによって、ワクチン製剤の濃度を、毛包内、つまり、毛包に存在する抗原提示細胞の近くで、高くする結果となり、これは、毛包間のスペースと違って、細胞が局所的に適用された活性化合物に非常に接触しやすい。
【００１８】
上述のように、出願人は、ワクチン製剤の経皮的進入経路を限定すること及び皮膚（真皮及び表皮）の抗原提示細胞に照準を定めることによる最適化された治療又は防御のためのワクチンの使用によって、ワクチン投与表面積を減らすことができるということを知得した。
【００１９】
本発明の目的は、従って、ワクチン調製のための、所定サイズのパーティクルの使用である。詳細には、可能な限りの変形後、これらのパーティクルは、少なくとも０．１ｎｍと０．２μｍとの間の粒径をもつ横断面を呈する。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、治療用途のワクチン組成物を調製するための、そのようなパーティクルの使用である。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、免疫抑制された個体にとって有用な治療用途又は予防用途のワクチン組成物を調製するための、そのようなパーティクルの使用である。
【００２２】
本発明の別の目的は、明細書、後述の実施例及び本願に添付された図面を考慮して明らかになるだろう。
【００２３】
発明による、このワクチン調製物の使用は次のステップを含んでなる：
ａ）  毛包の開口を大きくするために角質層の５０％までをアブレーションすることによって皮膚の前処理をする。
ｂ）  このワクチン調製物を調製するために、可能な限りの変形後に少なくとも０．２μｍまでの粒径をもつ横断面を呈するパーティクルを使用する。
ｃ）  このワクチン調製物を、毛包を経由して特異的に進入させ、そして、その小さなサイズのおかげで毛包上皮を通過して拡散することができる。
ｄ）  防御免疫及び細胞応答を誘導、刺激及び増強する。
【００２４】
活性化合物を毛包の中心部に直接照準することは、所定のサイズのパーティクルによって行われる。実際に、ヒトの皮膚に局所的に適用された３〜１０μｍのオーダーのサイズをもつビーズが毛包の開口部で団粒を形成し、ビーズが１０μｍを超えるサイズとなって皮膚表面にとどまることが知られていた（Ｒｏｌｌａｎｄ，１９９３）。
【００２５】
しかし、数マイクロメートルまでのサイズのビーズ又は結晶は、実際に、毛包管内部に入っていくことができる。
【００２６】
それゆえ、溶液は皮膚の表面を非特異的に広がるのだけれども、Ｔｏｌｌと彼のチームは、ビーズが、そのサイズに依存して、毛包開口部に団粒を形成するということを示した。詳細には、彼らは粒径１．５〜６μｍのサイズをもつパーティクルが、ヒトの頭皮からとった毛包の毛包管に選択的に進入するが、しかしながら、これらのサイズのパーティクルは上皮には進入していかなないということを観察した（Ｖｏｇｔ，未公表の実験結果）。
【００２７】
しかし、それに対して、粒径０．２μｍのオーダーの、より小さなパーティクルは、毛包に深く進入する。このサイズのパーティクルは、例えば、抗原を含むか、又は、抗原でコーティングすることができる。その後、これらのパーティクルは、表皮のランゲルハンス細胞に通常の生理学的状態の下で到達することができ、ワクチン製剤を関係する細胞に直接接触して放出することができる。
【００２８】
ランゲルハンス細胞は、表皮の未成熟な樹状細胞であり、真皮に位置する樹状細胞とともに、免疫系の監視細胞の供給源を構成する（Ｋｕｐｐｅｒ，Ｔ．ら（２００４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（３），ｐｐ．２１１−２２２）。それらは経皮的経路での免疫応答に密接に関係する。それらの活性化に続き、それらは次に流入領域リンパ節に移動し、免疫応答に寄与する。ヒトにおいては、ランゲルハンス細胞は毛包の周囲に集中している。この性質が、ランゲルハンス細胞を抗原性製剤を経皮的に投与するための、選ばれるべき標的とする。
【００２９】
従って、本発明のパーティクルは、可能な限りの変形後、少なくとも０．１ｎｍと０．２μｍとの間の粒径をもつ横断面を呈する。粒径が０．１ｎｍと０．２μｍとの間である堅いパーティクルを使用することもできる。或いは、例えば、ウイルス粒子のような、０．１ｎｍと０．２μｍとの間の粒径をもつ横断面が形成されるまで変形可能なパーティクルもまた本発明に含まれる。
【００３０】
好ましくは、本発明のパーティクルは、可能な限りの変形後、少なくとも０．１ｎｍと０．１μｍとの間の粒径をもつ横断面を呈する。より好ましくは、これらのパーティクルは、可能な限りの変形後、少なくとも０．１ｎｍと０．０５μｍとの間の粒径をもつ横断面を呈する。
【００３１】
上に記載された方法とは反対に、ワクチン製剤の成分を毛包に照準することは、このワクチン製剤の成分をより小さな皮膚表面積（２０ｃｍ２未満）に適用することを可能にする。ワクチン製剤の成分は、そのサイズのおかげで、毛包を通って特異的に進入し、そして、免疫応答の誘導に不可欠である抗原提示細胞に必ず照準を定める。
【００３２】
そういうわけで、本発明に係る使用は、角質層の５０％までを除去することによる毛包の前処理、即ち、毛包を開くという事前のステップを含む。
【００３３】
このステップは、粘着性ストリップ又は“テープストリッピング”を使用して行うことができる。実のところ、毛のない皮膚では、毛法の約３分の１が通常の状態で開いている。ワクチン製剤の照準を定めた進入を改善するために、皮膚に対して攻撃的でないＴＥＳＡ商標の製品のような、粘着性ストリップが使用され、表皮及び真皮のレベルで皮膚統合性を維持しつつ、毛包を開いて皮膚の角質層上部の死んだ細胞を取り除くことができる（５０％まで）。
【００３４】
テープストリッピングそれ自体が抗原提示細胞の活性化及び毛包周囲のランゲルハンス細胞供給源の維持を誘導する（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８２）。
【００３５】
或いは、接着剤又は糊を使用して行うことができる。これは、皮膚に数滴の瞬間接着剤（シアノアクリレート系接着剤）を適用すること、被覆剤（粘着性ストリップ、布等）を押し付けて貼り付け、そして、数分後に取り除くこと、にある。この行為は閉じた毛包の上部を除去する。そして、この処理は接着剤の適用１回につき、角質層の厚さの３０％を除去することを可能にする。従って、毛包へのパーティクルの進入の特異性に影響せずに角質層の厚さの５０％までを除去することが可能である。
【００３６】
本発明のパーティクルは抗原を含む。即ち、それらは抗原を含みうるか、又は、抗原でコーティングされうる。本発明のパーティクルは、少なくとも１つの横断面について、可能な限り変形可能なパーティクルに対して０．２μｍの粒径を超えないように、抗原でコーティングされるか、又は、公知の吸着及び凍結乾燥方法によってカプセル化されることが理解される。
【００３７】
“抗原”という用語はタンパク、糖タンパク、ペプチド若しくはペプチド画分、多糖類、ポリグリコシド、リポ多糖、トキソイド類、キャリア結合タンパク、細胞抽出物、ウイルス抽出物、細菌抽出物、寄生虫抽出物、又は、生きた、弱毒化した、殺した、不活化した若しくは組換えのウイルス、細菌若しくは寄生虫の微小断片、又は、ウイルス偽粒子、ＤＮＡ、ポリヌクレオチド、病原因子の組換え核酸、難病若しくは癌に関係する分子、癌細胞抽出物を意味するものである。“抗原”という用語は、タンパク全体の断片が少なくとも１つの免疫学的エピトープ決定基を有しているという条件で、それらの断片をも意味するものである。
【００３８】
ワクチン製剤の１回用量における抗原量は、副作用を起こさずに防御免疫応答を誘導する量である。そのような量は使用される抗原によって異なり、ワクチン投与された個体で得られる抗体力価の測定を含む従来の研究によって決定されうる。一般的には、ヒトにおける用量は、核酸の形の抗原に対して、０．１〜１０００μｇである。
【００３９】
或いは、ワクチン製剤は、３７〜４０℃の融点を有するワックス製のパーティクルに包含することができ、そして、０．１ｎｍと０．２μｍの間の粒径をもつパーティクル又はビーズは、当業者に知られた方法によって、このように、作られる。これらのワックスビーズの水性製剤は当業者に知られた方法によって調製される。これらのワックスパーティクルはワクチン投与される個体の皮膚に適用することができる。毛包に入ると、それらはそこの熱によって溶け、ｉｎ  ｓｉｔｕでワクチン製剤を放出する。
【００４０】
或いは、パーティクルはリポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、リポペプチド（ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ヴィロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、又は、ホスホリポソーム（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を含むグリコリポソーム（ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）であってもよい。
【００４１】
使用は、ワクチン抗原をコーティング又は封入した、並びに、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような、ポリエステル重合体ベースのナノパーティクルから構成されてもよい。ペプチド及び／又はタンパク及び／又はＤＮＡ及び／又は核酸を詰め込まれるポリ乳酸製のナノパーティクルを含むナノパーティクルの使用もまた、本発明に含まれる。
【００４２】
適切なサイズのマイクロスポンジもまた本発明のパーティクルに含まれる。好ましくは、これらのマイクロスポンジは熱吸収色である。これらのマイクロスポンジは、凍結乾燥の前に、浸潤によってワクチン製剤を含ませられる。かくして、それらの小さなサイズのおかげで、ワクチン製剤を含むこれらのミクロスポンジは、毛包管の中に深く進入する。適切なミクロスポンジは、例えば、Ｃａｒｄｉｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＆  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，ＵＳＡによって販売されるものである。
【００４３】
チャコール、ニ酸化チタン、二酸化亜鉛、酸化鉄（ＩＩ）及び適切なサイズのタルクを分散することもまた予見可能である。ワクチン製剤が担持されると、これらのパーティクルは、オイルのような非水性輸送体中に調製され、ミクロスポンジと同様の方法で使用される。いかなる化粧品用又は医薬用の疎水性オイル、好ましくは薬局方に収載されているオイルを使用することができる。
【００４４】
発明のパーティクルは、ＨＩＶゲノムの一部をコードする裸のＤＮＡを含むか、又は、それからなることもできる。
【００４５】
発明のパーティクルは、可能な限り変形できるウイルス粒子をも含む。好ましくは、ウイルス粒子は、組換え体であってもなくてもよい不活化ＨＩＶ粒子である。これらの粒子は、弱毒化ポックスウイルスのウイルス粒子であってもよい。
【００４６】
ランゲルハンス細胞に接触して、ワクチン製剤の放出を早め、その分散を促進するために、例えば、赤色若しくは赤外線ランプを使って、又は、マイクロ波放射装置若しくは類似の装置を使って、処理される皮膚の範囲を適度に温めることができる。
【００４７】
投与されるワクチン製剤に、例えば、油性エマルション、ワセリンのような脂肪性物質、サイトカイン類、ケモカイン類、成長因子、病原因子の派生物、脂質類、多糖類、ポリペプチド類、リポ多糖類、オリゴ糖類、共重合体、ＰＡＭｓ（病原因子関連分子パターン）、“トール様受容体”リガンド類、ＭＰＬ−Ａ（モノホスホリルリピドＡ）、クイルＡ、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）若しくはジメチルジオクタデシルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ）、ＣｐＧモチーフ、リーフ（Ｌｅｉｆ）、例えばコレラトキシン（ＣＴ）、ＬＴ（易熱性トキシン）や無毒化したＣＴ若しくはＬＴ等のようなトキソイドの形のアジュバントを加えることができる。文献に記載された他の全ての“アジュバント”型分子もこの免疫経路のために使用することができる。
【００４８】
これらのアジュバントは、抗原が存在する状態で投与されるとき、ヒトの免疫系の反応を増強する生成物である。それらは、特異的な免疫グロブリン、抗体の産生を増加し、免疫防御機構に関わる多数の細胞を刺激する。
【００４９】
可能な限りの変形後に０．１ｎｍと０．２μｍとの間の粒径をもつ横断面を呈する、これらのパーティクルは、適切なキャリア、例えば、ワクチン製剤を溶解せず、かつ、皮膚、好ましくは頬又はワクチン投与されるヒトの背面下部に塗ることができるワセリン、の中に入れることができる。前処理された皮膚表面に付着すれば、パーティクルはその小さな粒径のおかげで、目的のやり方で、毛包内に入ってゆく。ワクチン製剤はそれから、しかるべきところで溶解し、ｉｎ  ｓｉｔｕで高濃度でワクチンを与える。
【００５０】
本発明のパーティクルは、このように、それらを含む治療用ワクチン組成物を調製するために有用である。ワクチン組成物は、治療又は予防の目的で、ヒトに使用されることを意図している。この治療用ワクチン組成物は、ワクチン組成物のワクチン成分を、毛包を経由して、抗原提示細胞に照準するために有用である。いったん調製されれば、このワクチン組成物は熱に安定であるという長所を有し、そのため、難しい気象条件の下でもすぐに使用可能である。
【００５１】
従って、本発明の使用は、ワクチン製剤の成分を毛包に、そして、結果的に、非常に多数の真皮及び表皮の抗原提示細胞に照準することができる。この特異的な投与方法によって、照準を定められた細胞（ランゲルハンス細胞及び樹状細胞）はワクチン製剤を迅速に取込むことができ、また、抗原提示細胞がワクチン成分を捕獲して発現し、さらに、これらの細胞を活性化することができる。プロフェッショナルな抗原提示細胞の抗原の主要な供給源は、その結果、維持される。
【００５２】
照準の特異性のおかげで、高い濃度の抗原が患者の皮膚への縮小されたワクチン適用面積で得られる。
【００５３】
次に、抗原提示細胞が二次リンパ組織に移動し、液性及び細胞性免疫応答の誘導が観察される。そのため、これによってワクチン投与後に長期にわたる防御免疫を確立できる。
【００５４】
免疫反応はリンパ球細胞、特にＢ細胞及びＴリンパ球、によってリレーされることが思い出されるかもしれない。後者は、とりわけ、それらのＣＤ４及びＣＤ８表面抗原の発現に基づいて２つのサブタイプに分類できる。ＣＤ４  Ｔ細胞は一般に“ヘルパー”機能に関わる。特に、それらは他のリンパ球細胞の増殖と成熟を誘導するサイトカインを分泌する。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞に比べ圧倒的に発現されるが、ＣＴＬタイプといわれる、細胞傷害性細胞性免疫応答に関わる細胞に該当する。
【００５５】
特に、直接的な細胞傷害活性が、ある種のＣＤ４＋Ｔリンパ球について記載されている。２つのタイプのエフェクター免疫応答が存在する。抗体による液性応答及び主にＣＤ８  Ｔリンパ球による細胞傷害応答がそれである。効果的な細胞傷害応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）への、主要組織適合性複合体ＭＨＣクラスＩ分子と共同しての抗原提示だけではなく、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩ分子と共同しての抗原提示をも必要とする。
【００５６】
粘膜抗体及び全身抗体がある種の感染を防ぐにあたり主要な役割を演じると考えられるが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を含む、細胞性免疫の誘導は、細胞内の病原因子（ウイルス、細菌又は寄生虫）と闘うため、及び、腫瘍化プロセスを制御するために特に必要である。ＣＴＬｓの誘導及び制御は、ＣＤ４ヘルパー細胞のＴｈ１亜集団によって生産されるサイトカイン類（ＩＬ−２等）に依存する。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）は、細胞内病原因子の“クリアランス”において、及び、腫瘍の制御においても、本質的役割を演じる。ＣＤ８  Ｔリンパ球は、抗原の細胞内分解により生じたペプチド断片を細胞表面に発現されるＭＨＣクラスＩ分子との複合体の形で認識する。この認識が、ＭＨＣ抗原性ペプチド複合体をもつ細胞の溶解につながる。ＣＴＬｓは、また、直接的に細胞を、補助として、溶解しうる様々なリンホカイン類（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を生産する。ＣＴＬｓの誘導は、従って、これらの疾患の予防及び治療のためにデザインされるワクチンの本質的要素と考えられる。癌及び慢性ウイルス感染と闘うための現在提案されている治療法のうちで、ワクチン投与がますます重要な要素となってきている。治療用ワクチンの目的は、感染した細胞又は腫瘍細胞を破壊しうる特定の免疫応答を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、誘導又は再び刺激することである。患者の免疫応答は、それが効果を発揮し、発現された抗原に対して特異的な細胞性免疫応答を誘導するように、例えば、腫瘍によって発現された抗原を認識して、がん細胞を除去できるように、調節されなければならない。
【００５７】
このワクチン製剤の経皮的な使用は、ヒトにおいて、全ての細胞性（ＣＤ４、ＣＤ８等）及び液性（抗体産生、Ｂ細胞応答等）免疫応答を誘導する。従って、経皮的ワクチン投与法はあらゆるタイプのワクチンに適用でき、そして、ワクチンをプロフェッショナルな抗原提示細胞に直接照準することによってワクチンに対する防御免疫反応を誘導することを可能とする。
【００５８】
さらに、経皮的ワクチン投与によって誘導される免疫応答は、従来の筋肉内注射によって獲得される免疫応答とは質的に異なりうる。実際に、ヒトのボランティアにおいて、ＣＤ８陽性細胞が経皮的ワクチン投与後に見つけられうるが、一方、筋肉内ワクチン投与後には検出可能なＣＤ８細胞は発見されなかった。特定の態様では、このワクチンの経皮的な使用によってＣＤ８  Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる。
【００５９】
この投与経路は、また、免疫抑制された個体において重要であり得た。実のところ、これらの個体は、従来の経路（筋肉内、皮下、皮内）で投与される大部分のワクチンにあまり反応しない。
【００６０】
筋肉内経路で健康な個体に注射された場合、従来の生弱毒化ワクチンは、多くの病原因子（たいていはウイルス）及び腫瘍をコントロールするために不可欠な、強力なＣＤ８  Ｔ細胞を容易に誘導する。しかし、これらのワクチン（結核、麻疹、おたふくかぜ、はしか、水痘、黄熱、痘瘡等に対するもののような）は、免疫抑制された個体における生弱毒化病原因子のコントロールされない播種のため、全ての免疫抑制状態の個体、慢性又は妊娠中のような一時的な免疫抑制状態では、禁忌となる。対照的に、そのような免疫抑制された個体でも使える不活性の又は不活化された増殖しないワクチンは、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導できない。従って、免疫抑制された個体は上述の病気又は他のＣＤ８  Ｔ細胞応答を必要とするものから保護され得ない。
【００６１】
反対に、不活性又は不活化ワクチン製剤を経皮的に投与することによって、毛包周囲の皮膚の樹状細胞に直接照準することができ、ｉｎ  ｖｏｖｏでワクチンの抗原をこれらの樹状細胞により多く運び、そして、標的の樹状細胞が流入領域リンパ節に到達すれば、外部からの不活性の抗原をＨＬＡクラスＩ分子を介してＣＤ８  Ｔリンパ球に相互提示することができる。
【００６２】
免疫抑制された個体の全グループが次のプロセスによって利益を得る：
・ＨＩＶ感染患者
・臓器移植された者
・免疫抑制的な化学療法を受けている患者、又は、放射線治療を受けている患者
・後天的又は先天的又は遺伝的な免疫不全の患者（ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症），ダイジョージ症候群等のような）
・胎児に伝播するリスクのために、生ワクチンへのもう一つの禁忌を負わせる妊娠（妊娠期間中に観察される一時的な免疫抑制による）
【００６３】
次の実施例は発明をいかなる限定もすることなく説明する。
【実施例１】
【００６４】
実施例１：接着剤による皮膚の処理の影響
形成手術中に採取されたヒトの皮膚のサンプルが、モイストサポート上に置かれ、そして固定された。接着剤（ＵＨＵ  シアノアクリレート系接着剤）が皮膚表面を覆うように塗られ、粘着性ストリップ（ＴＥＳＡ）がその上に置かれる。粘着性ストリップは、それから、室温で１０〜１５分後に除去される。“黄緑色蛍光”分子（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ（登録商標），モルキュラー・プローブ社，オレゴン，ＵＳＡ）をコーティングした、粒径０．０４μｍのポリスチレン製のナノパーティクルが、１ｃｍ２の表面積に、３７℃で１８時間適用される。
【００６５】
皮膚は、その後、接着剤で４回以上繰返し処理されるか、又は、この処理の角質層の破壊に対する影響を評価するために、ただ１回、処理される。
【００６６】
接着剤の各適用によって、実に、角質層の３０％を除去できる。
【００６７】
図１の下部分は、シアノアクリレート系接着剤を使用した皮膚の攻撃的処理（皮膚の同じ表面部分に接着剤を４回以上適用）が角質層と表皮上層部分の破壊を引き起こすことを示す。パーティクルは、その後、表皮を通過し、無秩序にケラチノサイト層に分散する。
【００６８】
シアノアクリレート系接着剤を使用した皮膚のマイルドな処理（この場合、接着剤を１回適用する）は、図１の上部分に見られるように、角質層を部分的（５０％以下）にのみ除去することとなる。
【実施例２】
【００６９】
実施例２：パーティクルのサイズの特異性
形成外科手術後に体外培養したヒトの皮膚に由来する毛包が、接着剤を１回適用する上述の方法を使って開かれた。実施例１で使用されたものと同じだが様々なサイズ（１．５から０．０４μｍのサイズ）の、堅い球状ビーズを含む溶液が３分間超音波処理され、それから、３７℃で１５〜１６時間の間、前処理された皮膚にのせられる。粘着性ストリップはそれから、表面のビーズの残りを取り除くように貼り付けられた。皮膚サンプルはそれから液体窒素中で凍結され、５μｍの厚さに切片化され、その後、真皮から表皮までカットすることによって調製される。共焦点走査型レーザー顕微鏡によって、０．０４μｍのビーズの進入が可視化される。
【００７０】
図２は、０．７５μｍのオーダーのサイズをもつビーズが毛包孔の表面レベルに留まる（図３）のに対して、０．０４μｍのビーズは毛包に深く進入し、続いて行われる洗浄の後もそこに留まることを示す。
【実施例３】
【００７１】
実施例３：ランゲルハンス細胞の配置
タンパク溶液（ＤＡＫＯプロテインブロック，Ｄａｋｏ社）を使用する飽和ステップの後、凍結されたヒト皮膚切片は、ランゲルハンス細胞及び樹状細胞に特異的な抗ＣＤ１ａ抗体（１／５０希釈，Ｄａｋｏ社）の溶液中でインキュベートされる。実のところ、これらの細胞はＣＤ１ａ分子を特異的に発現する。
【００７２】
切片はリン酸緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．４）中で洗浄され、その後、フルオレセインに結合した抗マウスイムノグロブリン抗体（１／５０，ベクター・ラボラトリーズ社，バーリンガム，カリフォルニア，ＵＳＡ）の溶液中で、４５分間、インキュベートされる。洗浄後、スライドはＶＥＣＴＲＡＳＨＩＥＬＤマウント溶液中でマウントされる。
【００７３】
これらのランゲルハンス細胞の特異的な標識によって、蛍光顕微鏡を使用して、それらの配置を可視化することができる。図４は、毛包の下部領域が特にランゲルハンス細胞（表皮の抗原提示細胞）及び樹状細胞（表皮及び真皮）に対するマーカーに富んでいることを示す。
【実施例４】
【００７４】
実施例４：ビーズの標的をランゲルハンス細胞に合わせる
上記の実施例は蛍光パーティクルが、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）に富む基部領域に分布することを示した。ＡＰＣｓの一部である、ランゲルハンス細胞の大部分は、実に、毛包を囲むこの領域に沿って存在する。
【００７５】
皮膚は、シアノアクリレート系接着剤を１回適用した後、上述の毛包開口方法によって処理される。フルオレセインで標識された２．５×１０１２個の０．０４μｍのサイズの球状パーティクルを含む溶液が、３分間超音波処理され、その後、前処理された皮膚上に、３７℃で１５〜１６時間の間、のせられた。ディスパーゼ溶液（２．４Ｕ／ｍｌ，ディスパーゼＩ，ロシュ社）中で、３７℃で、１８時間の間、消化が行われ、次いで、皮膚細胞を１５％ウシ胎児血清（Ｐａａ社，オーストリア），ペニシリン及びストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０（ギブコ，スコットランド）に再懸濁する前に、トリプシン（０．０２５％  トリプシン（シグマ）及び１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２をＰＢＳ中に含む，ｐＨ７．４）消化を、３７℃で１０分間行う。細胞懸濁液中に存在するランゲルハンス細胞は、その後、抗ＣＤ１ｃ抗体を使用し、製造元の指示（ＭＡＣＳ（登録商標），ミルテニー社）に従ってビーズ精製法によって精製される。
【００７６】
精製された細胞はそれからスライドにのせられる。図５は０．０４μｍの球状パーティクルが存在することが、蛍光顕微鏡によってランゲルハンス細胞の細胞質中に観察されることを示す。
【実施例５】
【００７７】
実施例５：マウスモデルにおける経皮的なワクチン接種：
麻酔剤の溶液が３０μｌの２％キシラジン（バイエル社，ドイツ）及び１６０μｌのケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  ５００，メリアル）を１ｍｌの濃度９ｇ／ｌのＮａＣｌ水溶液に希釈することによって調製される。５〜８週齢の、Ｈ−２Ｋｂハプロタイプを有するＣ５７ＢＬ６マウス（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ，チャールズ・リバー社，フランス）が、この溶液をマウスの体重１ｇにつき１０μｌの用量を腹腔内注射することによって麻酔される。粘着性ストリップ（Ｌｙｒｅｃｏ社，フランス）を使って、体毛が右わき腹の約１ｃｍ２の表面領域が除去される。引き続く粘着性ストリップの適用（マウスにつき１１回以上適用）の後に毛包が開かれた。この方法で、角質層を部分的に除去することによって、毛穴を開くことができる。免疫原性ワクチン製剤（１０μｌの“ＴＥＴＡＧＲＩＰ”商用ワクチン（アベンティス・パスツール社））がそれから体毛が除去された領域に、ピペットを使って、０．５ｃｍ２の表面領域にわたって、のせられる。ワクチン製剤が浸透するために必要な３０分間から１時間を待った後、サリチル酸（１．５％）（剥脱及び除去活性剤）、トリクロサン（０．３％）（抗細菌及び抗真菌剤）、及びビサボロール（１％）（抗炎症及び鎮痛剤）（ＳＶＲ社，Ｌｙｓａｎｅｌパッチ）を含むパッチが１時間の間適用される。
【００７８】
採取された血液は無菌条件下で扱われる。４倍量の１×ＰＢＳで希釈後、血液はピペットを使ってサンプリングされ、１．５ｍｌのリンパ球分離培地又はフィコール（ユーロバイオ，フランス）を含むチューブにゆっくりと入れられる。２２００ｒｐｍで２０分間、室温で、ブレーキなしで遠心することによって、チューブの底に沈査する、赤血球の分離及びＰＢＭＣｓ（末梢血単核球）を含むリングの出現を得ることができる。リングからとられた細胞懸濁液は、１５００ｒｐｍで５分間延伸される。末梢血はトリパンブルーを使用してＭａｌｌａｓｓｅｚヘモサイトメーターで計数される。
【００７９】
その方法の目的は、与えられた抗原に対して反応する細胞の総数を計測することである。エフェクターＴリンパ球細胞（１００００００  ＰＢＭＣｓ／ウェル）によって、抗原刺激中に産生されるインターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）は、上に述べるように、このインターフェロンに特異的なモノクローナル抗体（キャプチャー抗体：抗ＩＦＮγ（ＩｇＧ１，ｃｌｏｎｅ  ＤＢ１，ダイアクローン社））を使用して４８時間の間キャプチャーされ、ＥＬＩＳＰＯＴ−ＩＦＮγ法（製造者，ダイアクローン社に従う）を使用して測定される。ＴＥＴＡＧＲＩＰワクチンに特異的なＴ免疫細胞の頻度は、上述のように、免疫後の様々な経過日数の日に測定される（図６）。
【００８０】
経皮的ワクチン投与の、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴリンパ球増殖に関する効果を検討するため、オブアルブミン（ｏｖａ）抗原が免疫原として使用された。結果として、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセイン５−（ａｎｄ  ６）−ジアセテートスクシンイミジルエステル）で標識した抗ｏｖａ  ＣＤ８  Ｔ細胞を養子免疫細胞移入の後、オブアルブミン抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで進めることができる。
【００８１】
簡単に言えば、ＯＴ−１マウス（コンジェニックマーカー  ＣＤ４５．２，Ｈ２−Ｋｂ遺伝バックグラウンドにおいてオブアルブミンのＯＶＡエピトープ［２５７−２６４］に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）についてトランスジェニック）に由来するナイーブな抗ｏｖａ  ＣＤ８  リンパ球がＣＦＳＥでラベルされ、その後、上述のプロトコールに従ってオブアルブミンタンパクかそのタンパクをコードするプラスミドＤＮＡを経皮的にワクチン投与されたレシピエントマウス（コンジェニック・マーカー  ＣＤ４５．１）に静脈内注射された。フローサイトメトリーによって検出可能なＣＦＳＥは細胞分裂のマーカーである。それは細胞質に分布し、細胞分裂の経過とともに薄くなり、その結果として、その強度が減少する。マウスは免疫後４又は７日後に殺され、リンパ節が切除される。ＣＤ８及びＣＤ４５．２の二重のラベリングによって、ＯＴ−１マウスに由来するＣＤ８＋リンパ球集団を選択することができる。
【００８２】
図７は、使用された免疫原（タンパク又はＤＮＡ）が何であれ、免疫されたマウスにおける細胞の増殖率が、抗原を与えられない“コントロール”のマウスよりも有意に高いということを示す。
【００８３】
抗オブアルブミン抗体の産生によって検出される液性免疫反応が、オブアルブミン抗原をコードするプラスミドＤＮＡを、又は、アジュバント、つまり、コレラトキシン存在下でタンパクを、それぞれ使用してワクチン投与をした後に、抗原特異的ＥＬＩＳＡ測定法によって測定された。簡単に言えば、Ｃ５７ＢＬ６マウスが、１００μｇのオブアルブミンタンパク（ｎ＝６）、又は、１００μｇのオブアルブミンタンパクを１０μｇのＦＩＴＣ（フルオロイソチオシアネート）標識したコレラトキシン、又は、１００μｇのオブアルブミンタンパクをコードするプラスミドＤＮＡ（ｎ＝８）で免疫される。抗体は、ワクチン投与後１４日目に採取された血液サンプルに由来する血清を使って、ＥＬＩＳＡ法によって測定された。標準偏差が示される（図８）。
【実施例６】
【００８４】
実施例６：マウスモデルにおけるパーティクルの配置
蛍光マイクロビーズ（０．０４μｍのＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標））の形のパーティクルが実施例６に記載されたプロトコールに従ってマウスの皮膚に適用された。蛍光は、皮膚の様々な深さでレーザー顕微鏡技術（Ｃｅｌｌ-Ｖｉｚｉｏ（登録商標），マウナケア・テクノロジーズ社）を用いて可視化される。この方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで、様々な時間にパーティクルを検出することもできる。Ｃｅｌｌ−Ｖｉｚｉｏ（商標）は、ファイバー式共焦点顕微鏡システムである。画像取得のために使用される１番目の光プローブは直径１．５ｍｍを有する（Ｓ−１５００−５．０参照）；このプローブにより、厚さ１５μｍ及び水平解像度５μｍで、生物学的組織の表面直下の画像を取得することができる。続く２つのプローブは１．８ｍｍの直径を有し、３０μｍ（ＨＤ−１８００−２．５／３０参照）又は８０μｍ（ＨＤ−１８００−２．５／８０参照）の深さで、水平解像度２．５μｍで、２０μｍを取得することができる。取得している間、フルオロスフェアの適用後の様々な時は、マウスはまったく動かないように麻酔下に置かれる。体毛が除去された部分は、プローブを固定する前に、残った汚染物をその部分から除去するために、食塩水で予め清拭される。リンパ節を分析するために、プローブを表面に貼り付ける前に、組織から脂肪が予め取り除かれる。
【００８５】
マイクロビーズを皮膚に適用してから１〜５時間後、後者が角質層のくぼみの１５μｍから８０μｍの深さに見つけられる（図９Ａ）。２４時間後、蛍光はＡＰＣｓに富む部分の毛包周辺に分散する（図１０Ａ）。しかしながら、マウスの他の処理されない部分には微量の蛍光も存在しない（図１０Ｂ）。マイクロビーズは近位リンパ節、及び、より少ない程度に、処理された場所から遠位のリンパ節に集まる（図１１）。
【００８６】
従って、マイクロビーズは、経皮的適用後２４時間目から、免疫応答部位に輸送される。
【実施例７】
【００８７】
実施例７：特異的Ｔ応答の測定
実施例５に記載された方法に従い、オブアルブミンをコードするＤＮＡを使用して、マウスが免疫された。ワクチン投与後、オブアルブミン抗原を発現する（ＥＧ−７）又はそれを発現しない（ＥＬ−４）系統の２０００００個の腫瘍細胞が動物の左わき腹に皮下注射される。免疫された動物では、腫瘍のサイズが様々な時に測定される。
【００８８】
図１２は、経皮的なワクチン投与がマウスの９０％に防御免疫応答を誘導するが、そのマウスは、全てのコントロールマウスが２２日目に既に腫瘍を生じているものの、４０日目にも腫瘍を生じない。
【実施例８】
【００８９】
実施例８：ヒトにおける免疫応答誘導
このプロトコールは、Ａ型及びＢ型インフルエンザワクチン（Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標），カイロン社，フランス）を上腕の表面の、皮膚の表面積１６ｃｍ２以上又は３２ｃｍ２以上に、経皮的に投与された７人の正常なボランティアに適用された。この適用は室温で行われた。Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）ワクチンは精製された抗原を含むが、不活化ウイルス全体は含まない。ボランティアは適用前の３０分間及び適用の様々なステップの間のインキュベーション時間の間中、試験室内で座ったままにされた。ワクチンの適用後、ボランティアは、２４時間の間、シャワーを浴びたり、入浴をしたりしないように、及び、例えば、体操のような、汗をかいたり、試験部位に機械的なストレスを与えたりする可能性がある行動を避けるようにいわれた。４人の個体は筋肉内にもワクチン投与された。全てのボランティアがインフォームド・コンセント用紙にサインをした。ボランティアは投与後最初の１週間の間、皮膚の異常な赤み、そう痒感、又は適用後５分間の間の痛み若しくは刺すような痛みの感覚、又は、角質層の喪失のような副作用について観察された。
【００９０】
適用の際に、ボランティアの左腕が９０°に保持され、プラスチック製の場所に上腕の外側を上に向けて、水平に肢位をとった。腕は適用中、この肢位に保持された。１個又は２個の４×４ｃｍの四角形が、ボランティアの上腕外側部分にプラスチックマトリックスを使って区切られた。調査部位は、その後、耐久性のマーカー（スキンマーカーＨ７００３，ファルク社）で区切られた。
【００９１】
調査部位及び周辺の皮膚の部分（各調査部位の各サイドの２ｃｍ）についても、乾式カミソリ（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｒａｚｏｒ，製品番号：１８２，ウイルキンソン・ソード社，ゾーリンゲン，ドイツ）を使用して毛が剃られた。
【００９２】
毛を剃った後、シアノアクリレート系接着剤（ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ，ウーハーウー社，ビュール／バーデン，ドイツ）が、各調査部位に１滴づつ適用された（９滴、即ち約１９０ｍｇ）。ガラス製の顕微鏡用スライドが調査部位に接着剤を均一に広げるために使用された。広げてから直ちに、粘着性ストリップ（６×５ｃｍ，製品番号５７１７６−０００００，６６ｍ×５０ｍｍ，Ｔｅｓａ（登録商標），バイエスドルフ社，バイエスドルフ，ドイツ）が調査部位に置かれた。１枚の紙（２１×７ｃｍ）がストリップの上に載せられ、皮膚表面に気泡が入るのを防ぐために、調査部位周辺をゴムが転がらせられる。約２０分後、スコッチ（ｓｃｏｔｃｈ）及び付着した接着剤が速やかに皮膚表面から除去された。
【００９３】
皮膚表面のシアノアクリレートでの処理によって、角質化したもの、脂質及び他の細胞屑及び角質層の約３０％が除去される。残りの角質層及び生きた表皮は無傷のまま残る。
【００９４】
次に、調査部位がシリコン（Ｗｉｎｄｏｗ−Ｃｏｌｏｕｒ−Ｋｏｎｔｕｒｐａｓｔｅ，製品番号４４６９，マックス−ブリングマン社，ヴェンデルシュタイン，ドイツ）の仕切りで、次に適用される可溶性ワクチンが広がるのを防ぐように、境界がつけられた。シリコンの仕切りは２０分間乾燥しなければならない。この放置の間中ずっと、ボランティアは座ったままで、左腕は動かさないでいた。
【００９５】
３２ｃｍ２の表面積に適用するために、２５０μｌのＡｇｒｉｐｐａｌワクチンが製造者によって提供されたシリンジを使って、各調査部位の皮膚の表面に、１滴づつ、適用された。１６ｃｍ２の表面領域に適用するために、同量のワクチンが２回適用された。この手順の後に、２０分間のインキュベーションが続く。ハイドロコロイド被覆材（Ｃｏｍｆｅｅｌ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  ９×１４ｃｍ，製品番号：３５４２，コロプラスト社，デンマーク）が、それから、調査部位を保護するために、２４時間の間貼り付けられる。
【００９６】
１５ｍｌの末梢血がその後採集され、そして、末梢血単核球がフィコールを使用して分離された。全ての免疫学的調査は新鮮な細胞及び凍結血清で行われた。
【００９７】
ヒトＰＢＭＣｓ（末梢血単核球）に対するＥＬＩＳｐｏｔ−ＩＦＮ-γを使用した検出が先に述べたように行われた（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅら，ＪＥＭ）。簡単には、９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（ミリポア社，モルスアイム，フランス）が抗ヒトＩＦＮ‐γ抗体（ＩｇＧ１／Ｂ−Ｂ１，ダイアクローン社，ストラスブール，フランス）でコーティングされた。１０％ウシ胎児血清でブロッキングした後、ウェルは３連で、１０５個の分離したてのＰＢＭＣで満たされた。プレートは、０．４５ｍｇ／ｍｌのＡｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）ワクチン（カイロン社）が入れられて、３７℃で２０時間の間インキュベートされた。ＰＨＡ（アボット社，ランジス，フランス）及び培地のみが、それぞれ、陽性及び陰性のコントロールとして使用された。ウェルはその後、洗浄され、ビオチン標識抗ヒトＩＦＮ‐γ抗体（Ｂ−Ｇ１，ダイアクローン社）を加えられて、３７℃で４時間の間反応させられ、続いて、ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼを入れられて３７℃で１時間の間インキュベートされ、次いで、５−ブロモ−４−クロロ３−インドリルリン酸／４−ニトロブルーテトラゾリウム（シグマ−アルドリッチ社，サン・クエンティン，フランス）で可視化の後にスポットが検出された。プレートは室温でスポットが出現するまでインキュベートされた。抗原特異的なスポット形成細胞（ＳＦＣｓ）が自動顕微鏡（ツァイス社，ル・ペック，フランス）で計数された。サンプルは、基準レベル以上の１００万個のＰＢＭＣｓにつき少なくとも５０個のＳＦＣｓの検出で陽性と判断された。
【００９８】
結果：
下記のボランティアにおいて副作用は観察されなかった。
【００９９】
全てのボランティアが同じ量のワクチン（０．５ｍｌのＡｇｒｉｐｐａｌ（登録商標））を投与されたので、我々はＢ型インフルエンザワクチンに対する細胞性免疫応答を０、１４及び２８日目に全てのボランティアについて比較した（図１３並びに１４Ａ及びＢ）。図１３は顕著な細胞性応答が、経皮的な投与経路又は筋肉内の投与経路のうちどちらか一方について観察されうることを示す。
【０１００】
図１４Ａ及び１４Ｂは、顕著に増大した細胞応答が１４日目（ｎ＝７，ｐ＜０．０５）及び２８日目（ｎ＝６，ｐ＜０．０５）に観察されたことを示す。この試験は、実際に、インフルエンザタンパクに対するＣＤ４及びＣＤ８エフェクターＴ細胞を検出することを可能にする。
【０１０１】
０日目に、いくつかの個体において、エフェクターＴ細胞の量が、インフルエンザＢに対する免疫が既に存在していることを示唆する基準レベル（５０ＳＦＵ／１００万ＰＢＭＣ）を超えている（図１３及び１４）。都合よく、ワクチン投与後に増大したＴ細胞応答もこれらの個体のうちのいくつかで観察さたが、これはヒトにおける経皮的ワクチン投与の有効性の証拠である。
【０１０２】
以上をまとめると、Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）ワクチンを経皮的にワクチン投与することによって、試験されたボランティアにおいて、免疫応答を誘導する結果となる。
【実施例９】
【０１０３】
実施例９：経皮的ワクチン投与によってＣＤ４及びＣＤ８の両方の細胞応答が誘導されるが、筋肉内ワクチン投与ではＣＤ４応答のみが誘導される
ＣＤ４及びＣＤ８細胞集団におけるＩＦＮ‐γの産生がフローサイトメトリ分析を使って、短期間（１６時間）の間ＰＢＭＣを“Ａｇｒｉｐｐａｌ”ワクチンで刺激した後に、測定された。Ａｇｒｉｐｐａｌワクチンの経皮的投与はこれまでに説明したように実施された。Ａｇｒｉｐｐａｌ（登録商標）ワクチン（０．５ｍｌ）の筋肉内注射は、製造者に提供されたとおり、医薬品臨床試験実施基準（ＧＣＰ）に従い、慎重に殺菌した後に左腕の三角筋に筋肉内注射された。
【０１０４】
簡単には、凍結したＰＢＭＣが５％ＦＣＳ（Ｓｅｒｏｍｅｄ，ドイツ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ‐グルタミン（ギブコＢＲＬ社、ライフテクノロジー、ペズリー、スコットランド）及び抗生物質（１０００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンナトリウム、１ｍｇ／ｍＬ  硫酸ストレプトマイシン、及び２５０ｎｇ／ｍＬ  アムホテリシンＢ）を含むＲＰＭＩ（ライフテクノロジーズ社、セルジー・ポントアーズ、フランス）中で解凍された。細胞は１μｇ／ｍＬのＰＨＡで、１２時間の間、３７℃で刺激された。ブレフェルディンＡ（５μｇ／ｍｌ）（シグマ・ケミカル社、都市、国）が筋肉内のサイトカインを検出するために、回収の４時間前に加えられた。細胞はそれからＣＤ４又はＣＤ８に対するＰＣ７結合抗体（ベックマン・コールター社、都市、国）で染色され、ＰＢＳで洗浄され、４％ＰＦＡ中で２０分間固定された。細胞はそれから、抗ＩＦＮ‐γ特異的抗体を加える前に、ＰＢＳ  ５％  ＦＣＳ  ０．１％  サポニンで細胞膜透過処理をされた。前方及び側方散乱による少なくとも１，０００，０００の生の事象がＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン社、都市、国）で記録及び分析をされた。
【０１０５】
図１５Ａは、１４日目と２８日目に、ＩＦＮ‐γ産生性ＣＤ４細胞が、経皮的及び筋肉内にワクチン投与の後に、増加することを示す。ＣＤ４細胞における応答の増大は、経皮的ワクチン投与後２８日目に、０日目と比較して、顕著であった。従来の筋肉内注射の後でも、１４及び２８日目には、０日目と比べ、著しく異なっていた。これらのワクチン投与は、全ての個体において、類似のＣＤ４エフェクター細胞の応答を誘導するようである。
【０１０６】
図１５Ｂは、１４日目の、経皮的ワクチン投与を受けた個体における、インフルエンザ特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ‐γ＋細胞の増加を示すが、一方、ＣＤ８応答は、筋肉内注射でワクチン投与を受けた全てのボランティアにおいて、検出されなかった。
【０１０７】
図１６は、経皮的にワクチン投与を受けた１人のボランティアのＣＤ４及びＣＤ８細胞についての典型的なフローサイトメトリ分析を示す。この図は、ＣＤ４及びＣＤ８細胞の両方がこのワクチン投与経路によって誘導されることの証拠である。
【０１０８】
結果は経皮的なワクチン投与のみがＣＤ４及びＣＤ８両方の細胞応答を誘導したが、一方、筋肉内のワクチン投与は、より顕著なＣＤ４細胞応答を誘導したが、ＣＤ８細胞応答を誘導しなかったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、接着剤を何度も適用したために表皮層が破壊された場合におけるパーティクルの無秩序な進入を示す。上の２つの図は、接着剤を１回適用した後の、蛍光を発するパーティクルを表す（矢印）。下の２つの図は、接着剤を３回適用した後の、蛍光を発するパーティクルの進入を示す。
【図２】図２は、蛍光を発する、サイズ０．４μｍのパーティクルの毛包における深い進入を示す。アスタリスクは隣接組織を表す。
【図３】図３は、１．５μｍと０．７５μｍの様々なサイズのパーティクルの毛包の表面部分における進入を示す。
【図４】図４は、ランゲルハンス細胞のマーカーであるＣＤ１ａの毛包周辺での特異的発現を、蛍光を使用して、説明する。拡大部分は蛍光標識されたランゲルハンス細胞を示す。
【図５】図５は、蛍光パーティクルの、３７℃での、経皮的な適用後のランゲルハンス細胞における進入を示す。破線はランゲルハンス細胞の輪郭を表す。
【図６】図６は、経皮的ワクチン投与のマウスモデルにおけるＴＥＴＡＧＲＩＰ（登録商標）ワクチン（アベンティス・パスツール）による特異的なＴ細胞免疫応答の測定結果を示す。ワクチン投与によって誘導される抗原特異的細胞応答は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、ワクチン投与後様々な時間の末梢血細胞を使用するＥｌｉＳｐｏｔ技術によって測定される。黒い四角はＴＥＴＡＧＲＩＰ（登録商標）ヒトワクチンの経皮的投与による免疫後の有効なＴ細胞免疫応答を表し（ｎ＝１１）、白丸は陰性コントロールを表す（ｎ＝６）。
【図７】図７は、経皮的ワクチン投与のマウスモデルにおける、ＴＥＴＡＧＲＩＰワクチンによる特異的なＴ細胞の増殖反応の測定結果を示す。
【図８】図８は、経皮的ワクチン投与のマウスモデルにおける、ＴＥＴＡＧＲＩＰワクチンによる特異的な液性応答の測定結果を示す。Ｎｏ．１はＰＢＳのコントロール投与に相当し（ｎ＝５）、Ｎｏ．２はＯＶＡタンパクに相当し（ｎ＝６）、Ｎｏ．３はＦＩＴＣ標識コレラトキシンを含むＯＶＡタンパクに相当し（ｎ＝７）、そして、Ｎｏ．４はＯＶＡプラスミドＤＮＡに相当する。
【図９】図９Ａは、経皮的ワクチン投与モデルにおける、免疫後５時間経過時の様々な深度での蛍光パーティクルの配置を示す。  図９Ｂは、パーティクルが存在しない場合における、免疫後５時間経過時の様々な深度での陰性コントロールを示す。
【図１０】図１０Ａは、経皮的ワクチン投与モデルにおける、免疫後２４時間経過時の、様々な深度で蛍光を観察するためのプローブを使用しての、蛍光パーティクルの配置、及び、蛍光の毛包周辺部分での蛍光の広がりを示す。  図１０Ｂは、パーティクルが存在しない場合における、免疫後２４時間経過時の、様々な深さで観察するためのプローブを使用しての、陰性コントロールを示す。
【図１１】図１１は、経皮的ワクチン投与後の、リンパ節におけるパーティクルの配置を示す。Ａ：コントロール，Ｂ：そ径部リンパ節，Ｃ：腋下部リンパ節．
【図１２】図１２は、経皮的ワクチン投与のマウスモデルにおける、ＴＥＴＡＧＲＩＰワクチンによる特異的なＴ細胞防御応答の測定結果を、時間の関数として示す。白丸は抗原を含まないＥＬ−４細胞の投与を受けたマウスを表し（ｎ＝４）、そして、黒丸はＥＧ−７細胞を投与されたマウスを表す（Ｎ＝４）。
【図１３】図１３は、インフルエンザ特異的エフェクターＴリンパ球の頻度を示す。Ｅｌｉｓｐｏｔによる測定は、０、１４及び２８日目の末梢血サンプルについて行われた。エフェクターＴ細胞応答は、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ法によって測定され、経皮的投与群と筋肉内投与群との間で、マン・ホイットニー検定を使って比較された。ｎｓ＝有意でない、ｐ＞０．０５（マン・ホイットニー検定）。ＩＱＲ＝四分位範囲。
【図１４】図１４Ａは、経皮的投与による免疫に続くエフェクターＴ細胞の応答を示す。黒く塗りつぶされたシンボルは１６ｃｍ２の表面部分を示す；丸はボランティア１を、上向き三角形はボランティア４を、下向き三角形はボランティア６を、そして、ダイヤ形はボランティア７を表す。白抜きのシンボルは３２ｃｍ２の適用表面部分を示す。実線はボランティア２を、長方形はボランティア３を、そして、三角形はボランティア５を表す。図１４Ｂは、筋肉内注射による免疫に続くエフェクターＴ細胞の応答を示す。影のついた四角形はボランティア８を、上向き三角形はボランティア９を、下向き三角形はボランティア１０を、そして、ダイヤ形はボランティア１１を表す。エフェクターＴ細胞の応答はＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ法によって測定される。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、それぞれ、経皮的又は筋肉内投与後のＥＬＩＳＰＯＴ測定によるインフルエンザ特異的エフェクターＴリンパ球の頻度を表す（図１５Ａ，ＣＤ４  Ｔ細胞：図１５Ｂ，ＣＤ８  Ｔ細胞）。１４日目とベースライン（又は２８日目とベースライン）の間の変化が経皮的投与群と筋肉内投与群との間で、マン・ホイットニー検定を使って比較された。ｎｓ＝有意性なし，ｐ＞０．０５（マン・ホイットニー検定）。
【図１６】図１６は、Ａｇｇｒｉｐａｌ（登録商標）ワクチン（１／１０００希釈）で１６時間刺激後のＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞でのフローサイトメトリ測定による細胞質内でのＩＦＮ‐γ産生を示す。結果は、インフルエンザ特異的ＣＤ４又はＣＤ８がＩＦＮ‐γを経皮的ワクチン投与後に異なる時点で産生していることを示す。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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