(57)【要約】レクチン様バレルドメインを有するＰＲ−５ファミリーのタンパク質は、レセプター結合を介して酵母においてアポトーシスを制御する。レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質に特異的に結合するレセプターは、哺乳動物アディポネクチンレセプターと相同であることが見出されており、このようなＰＲ−５タンパク質は、アディポネクチンの機能的ホモログとして作用し、哺乳動物においてアディポネクチン応答を制御できる。レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質（例えば、オスモチン）は、アディポネクチンレセプター媒介性の代謝経路の活性化又は阻害の結果である、哺乳動物における状態の治療において使用できる。レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸及びこのようなタンパク質に特異的に結合するレセプターは、哺乳動物において使用するための新規治療剤のスクリーニング及び合理的設計においても使用できる。【選択図】なし
2008514626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＰＲ−５タンパク質は、オスモチン［配列番号３］又はレクチン様βバレルドメインを有するそのホモログである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
アディポネクチン又はアディポネクチン様タンパク質によって媒介される代謝経路の活性化又は阻害の結果である障害、に罹患した哺乳動物を治療するための方法であって、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質の投与を含む、方法。
【請求項４】
前記障害は、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化及び心疾患からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記障害は、ＩＩ型糖尿病である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記障害は、インスリン抵抗性である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記障害は、高脂血症である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記障害は、動脈硬化である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記障害は、心疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＲ−５タンパク質は、オスモチン［配列番号３］又はレクチン様βバレルドメインを有するオスモチンのホモログである、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＲ−５タンパク質は、オスモチン［配列番号３］又はレクチン様βバレルドメインを有するオスモチンのホモログである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物細胞における、アディポネクチンの標的の全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤の合理的設計における、ＰＲ−５タンパク質の使用。
【請求項１３】
前記治療剤がアゴニストである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記治療剤がアンタゴニストである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＰＲ−５タンパク質がオスモチン［配列番号３］である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記合理的設計が構造／機能分析を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
哺乳動物細胞における、アディポネクチンの標的の全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤の合理的設計における、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質をコードする核酸配列の使用。
【請求項１８】
前記治療剤は、アゴニストである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記治療剤は、アンタゴニストである、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記核酸配列は、配列番号１である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
前記核酸配列は、配列番号２である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２２】
前記合理的設計は、構造／機能分析を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
前記構造／機能分析は、ＤＮＡシャッフリング、増強された選択的変異誘発及びファージディスプレイからなる群より選択される１種又は複数の技術を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
哺乳動物細胞における、アディポネクチンの標的の全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤を同定するための一次スクリーニングとしての、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質に対する特異的結合親和性を有するレセプタータンパク質の使用。
【請求項２５】
前記ＰＲ−５レセプターは、ＰＨＯ３６である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記スクリーニングは、単離された形態のレセプターを使用して実施される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記スクリーニングは、前記レセプターを発現する細胞株又は組織培養物を使用して実施される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２８】
細胞株又は組織培養物が前記レセプターを過剰発現している、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記スクリーニングは、酵母細胞株を使用して実施される、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
酵母が前記レセプターを過剰発現している、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本願は、２００４年９月２７日出願の米国仮特許出願番号６０／６１３，６４７及び２００５年２月２８日出願の米国仮特許出願番号６０／６５７，３３５に関する。
【０００２】
[0002]本発明は、哺乳動物の障害、特にグルコース及び脂質代謝の障害の治療、このような状態の治療のための治療剤、並びにこのような治療剤の設計及び／又は同定に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]植物防御に関連する抗菌タンパク質のファミリーの中で、病原性関連タンパク質ファミリー５（ＰＲ−５）は、甘味タンパク質タウマチンに構造的に関連する（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、２００３）。ＰＲ−５タンパク質は、（ａ）分子のコンパクトなコアを形成するβバレル（ドメインＩ）（この構造は、レクチン中に共通に見出され、以下本明細書中で「レクチン様βバレル」と呼ぶ）；ドメインＩから延び、４つのジスルフィド結合によって安定化された数個のループからなるドメイン（ドメインＩＩ）；及びこれもまたドメインＩから延び、２つのジスルフィド結合によって安定化された小さいループからなるドメインＩＩＩからなる３ドメイン構造、（ｂ）Ｎ末端リーダー配列の切断部位に共通に位置するアラニン、（ｃ）当該タンパク質中に空間的に保存された分布を有し、ジスルフィド結合によって連結された１６個までのシステイン残基（Ｍｉｎら、２００４）、及び（ｄ）生物学的活性に関連し得るドメインＩ及びＩＩによって形成されるクレフト、を有することによって、識別される。
【０００４】
[0004]オスモチンはタバコの抗真菌ＰＲ−５タンパク質である。オスモチンは、ＲＡＳ２／ｃＡＭＰを介して細胞ストレス応答の抑制をシグナル伝達することによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてプログラム細胞死を誘導する（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）。オスモチンを含むほとんどのＰＲ−５タンパク質は、広いスペクトルの特異的抗真菌活性を有し、これは、それらの標的認識が、病原体細胞表面成分との相互作用によって決定され得ることを示唆する。オスモチンの場合、特定の真菌細胞壁成分が、オスモチンの抗真菌活性を増強又は抑制する（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００３；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、２００３）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ＰＩＲファミリーの細胞壁糖タンパク質は、オスモチン抵抗性の決定因子である（Ｙｕｎら、１９９７）。酵母細胞壁糖タンパク質のホスホマンナンは、おそらくはオスモチンに対するドッキング構造として働くことによってその局所的濃度及び細胞壁を横切る拡散を増大させることにより、オスモチンの毒性を増大させることが報告されている（Ｉｂｅａｓら、２０００）。遺伝学的分析により、細胞壁形態形成及びＰＩＲタンパク質の堆積に影響を与えるタンパク質であるＳＳＤ１が、オスモチンに対する抵抗性の決定因子であることが明らかになっている（Ｉｂｅａｓら、２００１）。毒性を増強する酵母細胞壁中の未同定の変化が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼカスケードの活性化を介して、オスモチンによって誘導される（Ｙｕｎら、１９９８）。タバコオスモチンに対して感受性の酵母スフェロプラストは、他の植物種由来のＰＲ−５タンパク質に対して抵抗性であり得るので、原形質膜での特異的相互作用もまた、オスモチンの抗真菌活性に必要なようである（Ｙｕｎら、１９９７）。ＰＲ−５タンパク質の最も研究された役割は抗真菌活性であるが、シグナル伝達又は認識の役割が示唆されてきた。Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、２００３
【０００５】
[0005]アディポネクチン（３０−ｋＤａ脂肪細胞補体関連タンパク質−Ａｃｒｐ３０とも呼ばれる）は、アディポネクチンレセプターと相互作用して、エネルギー状態、脂肪酸酸化及びグルコース輸送の感知を調節する、哺乳動物における抗糖尿病性で抗アテローム硬化性のタンパク質ホルモンである。既知のアディポネクチンレセプターには、ヒトＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２（Ｄｉｅｚ ａｎｄ Ｉｇｌｅｓｉａｓ、２００３；Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ、ｂ）、並びにブタアディポネクチンレセプター；ｇｅｎｅｂａｎｋＮＭ＿００１００７１９３）（Ｄｉｎｇら、２００４）が含まれる。さらなるアディポネクチンレセプターの配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ中に見出され得る。血清アディポネクチンレベルは、肥満、インスリン抵抗性及びＩＩ型糖尿病の条件下では減少するが（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ）、アディポネクチンの投与は、マウスにおいて血清グルコースレベルを低下させ、インスリン抵抗性を改善する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ）。哺乳動物アディポネクチンレセプターＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）に特有の特徴である７回膜貫通ドメインを有すると予測されている。
【発明の概要】
【０００６】
[0006]ＰＲ−５ファミリーのタンパク質は、ＧＰＣＲに特徴的な７回膜貫通ドメインを含むレセプターを介して、酵母においてアポトーシスを制御する。ＲＰ−５タンパク質に特異的に結合するレセプターは、哺乳動物アディポネクチンレセプターに対して相同であることが見出されており、ＰＲ−５タンパク質は、アディポネクチンの機能的ホモログとして作用して哺乳動物においてアディポネクチン応答を制御できる。
【０００７】
[0007]酵母細胞におけるオスモチン感受性の原形質膜決定因子が、遺伝子過剰発現の際にオスモチン過感受性表現型を付与するその能力によって同定され、その後単離された。遺伝子ＯＲＥ２０／ＰＨＯ３６は、ＧＰＣＲに対する構造的相同性及び哺乳動物アディポネクチンレセプターＲ１に対する有意な配列同一性（２９％）を有する、７回膜貫通ドメインレセプター様タンパク質（ＰＨＯ３６）をコードする。ＰＨＯ３６は、酵母の脂質及びホスフェートの代謝を調節し、酵母におけるオスモチンに対する完全な感受性に必要である。ＰＨＯ３６は、オスモチン誘導性のアポトーシス経路においてＲＡＳ２の上流で機能する。ＰＨＯ３６の哺乳動物ホモログは、アディポネクチンホルモンのレセプターであり、細胞の脂質及び糖の代謝を調節する。オスモチンレセプターＰＨＯ３６とアディポネクチンレセプターとは、有意な配列相同性を共有するが、対応するレセプター結合タンパク質であるオスモチンとアディポネクチンとは、配列類似性を共有しない（１０％以下の相同性）。しかし、両方のタンパク質のレクチン様βバレルドメインの３次構造は非常に類似することが見出されており、重複し得る。オスモチンは、哺乳動物アディポネクチンレセプターに選択的に結合することができ、哺乳動物の系においてアディポネクチンアゴニストとして作用することが見出されている。
【０００８】
[0008]従って、医薬的に許容される担体中に適切に処方されたオスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５ファミリー中の関連タンパク質は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する広範な種々の哺乳動物の障害の治療のための治療剤として使用できる。このような障害には、糖尿病、動脈硬化及び心疾患が含まれる。オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物の障害の治療のための治療方法の開発において、アディポネクチンの代理としても使用できる。オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物の障害の治療のための新規治療剤の合理的設計のための基礎としても使用できる。
【０００９】
[0009]オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質が特異的に結合し得るレセプター（例えば、酵母レセプターＰＨＯ３６）は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物の障害の治療において有用な新規治療剤についてのスクリーニング系として使用できる。このようなスクリーニング方法は、単離されたレセプターの調製物（例えば、溶液中、又はカラム充填、薄層プレートもしくはマイクロアレイでの使用のために結合した）を使用して、又はレセプターが発現される細胞株もしくは組織培養物を使用して、実施できる。
【００１０】
[0010]酵母株ＢＷＧ７ａは、オスモチンレセプターＰＨＯ３６を発現し、オスモチンに対して感受性である。ＰＨＯ３６を過剰発現させると、この酵母株は、オスモチンのアポトーシス誘導効果に対して過感受性であることが見出されていた。従って、酵母株ＢＷＧ７ａ、又はＰＨＯ３６もしくは類似の感受性ＰＲ−５タンパク質レセプターを発現もしくは過剰発現する任意の他の適切な細胞株のような細胞は、哺乳動物におけるアディポネクチンレセプター機能の、化学物質及びタンパク質／ペプチドアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための一次スクリーニングとして使用され得る。このスクリーニングにより、潜在的なアディポネクチンレセプター媒介性治療剤の同定が可能となる。好ましい実施形態において、この細胞は、ＰＨＯ３６又は類似の感受性ＰＲ−５レセプターを過剰発現する細胞である。
【００１１】
[0011]オスモチンのゲノム配列［配列番号１］もしくはｃＤＮＡ配列［配列番号２］を有する核酸、又はそれらから誘導されるタンパク質産物及び治療的産物、あるいはそれらの誘導体及び機能的ホモログは、アディポネクチン、ＰＲ−５タンパク質又はそれらの誘導体もしくは機能的ホモログの治療剤としての効力を改善するために、アディポネクチンレセプター結合の構造／機能分析において使用できる。このような構造／機能分析には、ＤＮＡシャッフリング、もしくは増強された選択的変異誘発及びファージディスプレイ、又は改善されたペプチド機能についての他の選択的方法のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子進化アプローチを使用する比較分析、並びにヒト細胞におけるアディポネクチンの標的の全て又は一部の、アゴニスト又はアンタゴニストである薬物を含む改善された治療剤を開発するための合理的設計アプローチが含まれ得る。
【００１２】
[0012]本発明の１実施形態は、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質を含む医薬組成物である。好ましい実施形態において、このＰＲ−５タンパク質は、オスモチン［配列番号３］又はレクチン様βバレルドメインを有するそのホモログである。
【００１３】
[0013]本発明の別の実施形態は、アディポネクチン又はアディポネクチン様タンパク質によって媒介される代謝経路の活性化又は阻害の結果である障害に罹患した哺乳動物を治療するための方法であって、この方法は、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質の投与を含む。好ましい実施形態において、この障害は、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化及び心疾患からなる群より選択される。より好ましい実施形態において、この方法は、オスモチン［配列番号３］又はレクチン様βバレルドメインを有するオスモチンのホモログの投与を含む。
【００１４】
[0014]本発明の別の実施形態は、哺乳動物細胞におけるアディポネクチンの標的の、全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤の合理的設計における、ＰＲ−５タンパク質の使用である。好ましい実施形態において、この治療剤はアゴニストである。別の好ましい実施形態において、この治療剤はアンタゴニストである。より好ましい実施形態において、この合理的設計は、構造／機能分析を含む。最も好ましい実施形態において、このＰＲ−５タンパク質はオスモチン［配列番号３］である。
【００１５】
[0015]本発明の別の実施形態は、哺乳動物細胞におけるアディポネクチンの標的の、全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤の合理的設計における、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質をコードする核酸配列の使用である。好ましい実施形態において、この治療剤はアゴニストである。別の好ましい実施形態において、この治療剤はアンタゴニストである。より好ましい実施形態において、この合理的設計は、構造／機能分析を含み、好ましくは、構造／機能分析には、ＤＮＡシャッフリング、増強された選択的変異誘発及びファージディスプレイからなる群より選択される１種又は複数の技術が含まれる。最も好ましい実施形態において、この核酸配列は配列番号１又は配列番号２である。
【００１６】
[0016]本発明の別の実施形態は、哺乳動物細胞におけるアディポネクチンの標的の、全て又は一部のアゴニスト又はアンタゴニストである治療剤を同定するための一次スクリーニングとしての、レクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５タンパク質に対する特異的結合親和性を有するレセプタータンパク質の使用である。１つの好ましい実施形態において、このスクリーニングは、単離された形態のレセプターを使用して実施される。別の好ましい実施形態において、このスクリーニングは、レセプターを発現する、より好ましくはレセプターを過剰発現する細胞株又は組織培養物を使用して実施される。この実施形態での使用に好ましい細胞株は、酵母細胞株、最も好ましくはレセプターを過剰発現する酵母細胞株である。この実施形態での使用に最も好ましいＰＲ−５レセプターはＰＨＯ３６である。
【詳細な説明】
【００１７】
[0022]ＰＲ−５及びアディポネクチンレセプター−リガンド系の相同性。ＰＨＯ３６のゲノム配列は、ＧＰＣＲ間で保存された唯一の特徴である細胞原形質膜に局在する推定７回膜貫通ドメインを有するポリペプチドをコードする。（ａ）ＰＨＯ３６発現は、ホスフェート、Ｃ１４：０脂肪酸であるミリスチン酸、及びオレイン酸依存性転写因子であるＯＡＦｌ及びＰＩＰ２によって誘導され、（ｂ）酵母における脂肪酸代謝及びホスフェートシグナル伝達に関与する種々の遺伝子がｐｈｏ３６変異体において誘導され、（ｃ）このｐｈｏ３６変異体が、高レベルの酸ホスファターゼ及び液胞におけるポリリン酸の蓄積を有し、（ｄ）Δｐｈｏ３６変異体がステロール結合抗生物質ナイスタチンに対して抵抗性であり、（ｅ）炭素源としてグリセロール＋ミリスチン酸上でΔｐｈｏ３６変異体の増殖が乏しく（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖら、２００２）、（ｆ）ＰＨＯ３６発現は、増殖培地中の亜鉛レベル及び亜鉛欠乏を感知する転写因子ＺＡＰ１によって制御される（Ｌｙｏｎｓら、２００４）ので、ＰＨＯ３６は、脂質、ホスフェート及び亜鉛の代謝において調節的な役割を有すると推測されている。現在、オスモチンは、ＰＨＯ３６と相互作用し、その天然の機能に影響を与えることが見出されている：（ａ）ＰＨＯ３６は、溶液中でオスモチンと特異的に相互作用し、（ｂ）原形質膜に対する放射標識オスモチンの結合、並びにオスモチンに対する感受性は、ＰＨＯ３６の豊富さと相関し、（ｃ）アディポネクチン及びオスモチン（その主鎖の折りたたみが重複し得るタンパク質）は、アディポネクチンレセプターを介して（即ち、ＰＨＯ３６の哺乳動物ホモログを介して）、Ｃ２Ｃ１２筋細胞において同じ細胞内シグナル伝達経路に関与する。
【００１８】
[0023]ＰＨＯ３６及びＲＡＳ２が同じ経路で機能するという証拠は、栄養感知におけるＰＨＯ３６の役割と一致する。酵母のＲＡＳタンパク質は、細胞の分裂、分化、アポトーシス、長寿命、炭素及び窒素栄養に関連する（Ｊａｚｗｉｎｓｋｉ、１９９９；Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１；Ｆｏｒｓｂｅｒｇａｎｄ Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、２００１）。アディポネクチンレセプターは、グルコース取り込み、脂肪酸β酸化、及び細胞のエネルギー状態を感知するいくつかのタンパク質の活性を調節する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ）。最近の報告により、アディポネクチンが上皮細胞においてアポトーシスを誘導することもまた示されている（Ｂｒａｋｅｎｈｅｉｌｍら、２００４）。アポトーシスとの関連に起因して、ＰＨＯ３６は、細胞のエネルギー状態又はミトコンドリアの機能（不全）に応答した栄養素獲得及び使用の調節に関連付けられ得る。合わせて考えると、これらの知見は、ＰＨＯ３６レセプターリガンドとアディポネクチンとの間の機能的類似性を示す。
【００１９】
[0024]ＰＨＯ３６オスモチンレセプターは、（構造分析に基づき）ＧＰＣＲレセプターファミリーに特有の特徴である７回膜貫通ドメインを含むと予測されている。オスモチンの甘味のある構造的ホモログであるタウマチンは、ＧＰＣＲである甘味レセプターに結合する（Ｌｉら、２００２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｍｂｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／７ｔｍ／）。従って、ＧＰＣＲに結合する能力は、真菌種標的のサブセットに対するそれらの特異性に寄与する、ＰＲ−５タンパク質の保存された特徴であるといえよう。ＰＨＯ３６に対して有意な（２９％）配列相同性を有するアディポネクチンレセプターＡｄｉｐｏＲ２及びＡｄｉｐｏＲ１もまた、ＧＰＣＲに特徴的な７回膜貫通ドメインを有すると予測されているが、別個のシグナル伝達分子を活性化する。しかし、典型的なＧＰＣＲとは異なり、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、Ｇタンパク質とは共役しない（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ）。
【００２０】
[0025]オスモチン誘導性の細胞死における、酵母ＧαサブユニットであるＧＰＡ１又はＧＰＡ２の関与の証拠はなかった。ＳＴＥ４及びＳＴＥ１８（Ｇβサブユニット及びＧγサブユニット）もまた、ＰＨＯ３６と共役しない（図２Ｆ）。従って、ＰＨＯ３６は、アディポネクチンレセプターのようにヘテロトリマーＧタンパク質と共役しない可能性があるか（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａを参照のこと）、あるいはＧＰＡ２と会合する異常なタンパク質と共役し得る（Ｈａｒａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｈｅｉｔｍａｎ、２００２を参照のこと）かのいずれかである。遺伝学的証拠は、ＰＨＯ３６がオスモチン誘導性のアポトーシス経路においてＲＡＳ２の上流で機能するとしており（図２）、その原形質膜への局在と一致している（図３）。オスモチン感受性に対するＰＨＯ３６の効果は、ＲＡＳ２の効果よりも小さいので、他の「レセプター」もまた、ＲＡＳ２経路と関連する可能性がある。酵母におけるＰＨＯ３６の代替的機能は、膜透過性（ＰＲ−５タンパク質についてｉｎｖｉｔｒｏで実証された活性）を促進する、オスモチンに対するドッキングレセプターであり得る（Ａｎｚｌｏｖａｒら、１９９８；Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、２００３）。ＲＡＳタンパク質は、酵母においてＧＰＣＲによって活性化されるとは知られていないので（Ｒｏｌｌａｎｄら、２００２）、この仮説は魅力的であり、そのように増大した膜透過性は、ＲＡＳ２とＰＨＯ３６との間の間接的なシグナル伝達連結である可能性がある。
【００２１】
[0026]オスモチンの毒性作用機構は多因子性であり、個々の因子がタンパク質の全体的な毒性に部分的に寄与する（図２Ｅ）。全ての生物において自然免疫の成分である防御的抗菌ペプチドの抗菌活性もまた、マルチヒット作用機構に起因する（Ｈａｎｃｏｃｋａｎｄ Ｓｃｏｔｔ、２０００）。種を超えた抗菌タンパク質及びペプチドのマルチヒット機構主題の保存は、宿主−病原体共進化をおそらく反映する。病原体は、単一の変異によって宿主の防御的タンパク質／ペプチドに対するその感受性を大きく変更することができないので、これはまた、宿主に選択的利点を提供する。
【００２２】
[0027]オスモチン分子及びアディポネクチン分子は、類似した全体的折りたたみ及び生物学的活性を示す。ＰＨＯ３６の哺乳動物ホモログであるＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、脂肪細胞によって分泌されるタンパク質ホルモンであるアディポネクチンに対するレセプターである。マウス及びヒトにおけるアディポネクチン欠損は、インスリン抵抗性及びグルコース不耐性と関連する（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００１ａ、ｂ；Ｋｕｂｏｔａら、２００２；Ｄｉｅｚａｎｄ Ｉｇｌｅｓｉａｓ、２００３）。注射、過剰発現、又は体重減少及びチアゾリジンジオン治療の併用によるアディポネクチンレベルの増大は、マウス及びヒトを肥満及び糖尿病から保護し、インスリン抵抗性を減少させ（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００１ａ、ｂ；２００３ｂ）、血清の遊離脂肪酸、グルコース及びトリグリセリドのレベルを減少させた（Ｆｒｕｅｂｉｓら、２００１；Ｄｉｅｚａｎｄ Ｉｇｌｅｓｉａｓ、２００３）。アディポネクチンの治療上の潜在能力及びＰＨＯ３６とアディポネクチンレセプターとの間の相同性を考慮して、オスモチン及びアディポネクチンの３次構造が比較された。アディポネクチンは３０ｋＤａのタンパク質であり、コラーゲン様のＮ末端ドメイン及び補体１ｑ様のＣ末端球状ドメインを有する（Ｓｃｈｅｒｅｒら、１９９５）。このＣ末端球状ドメイン（１７ｋＤａ）はしばしば、球状アディポネクチンと呼ばれ、少量の球状アディポネクチンがヒト血漿中で検出可能であることが報告されている。球状アディポネクチンは、筋細胞又は骨格筋におけるＡＭＰキナーゼ活性化、グルコース取り込み及び脂肪酸酸化のような生物学的活性について、全長アディポネクチンと同等の効力を有することが報告されている（Ｆｒｅｕｂｉｓら、２００１；Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００１ａ、２００３ａ、２００３ｂ）。オスモチンは、全長又は球状のアディポネクチンと有意な配列相同性を有さない（１０％以下）球状タンパク質（２６ｋＤａ）である。Ｘ線結晶解析研究により、球状アディポネクチン及びオスモチンが、βバレルの形状で配置された逆平行β鎖を含むことが示されている（Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ、１９９８；Ｍｉｎら、２００４）。オスモチンのドメインＩ（レクチン様βバレルドメイン）は、１２１Ｃα原子について３．１Åの平均二乗偏差でアディポネクチンと重複し得、このことは、２つのタンパク質がレクチン様ドメインを共有することを示唆している（図５）。タウマチンの甘みに必須のアミノ酸は、抗真菌ＰＲ−５タンパク質のドメインＩ及びＩＩによって形成される酸性クレフトに対応し、それらの抗真菌活性に重要であると予測される、その表面上のクレフトに位置する（図５；Ｋａｎｅｋｏ ａｎｄ Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、２００１；Ｍｉｎら、２００４）。この領域は、アディポネクチントリマーの外側表面に局在し、このことは、これがレセプターとの相互作用に関与することを示唆し、本発明者らの結果は、これがアディポネクチンレセプターへの結合を制御する重要な因子であることを示している。
【００２３】
[0028]アディポネクチンのアディポネクチンレセプターへの結合は、リン酸化によるＡＭＰキナーゼの活性化を生じる（Ｙａｍａｕｃｈｉら、２００３ａ）。アディポネクチン及びオスモチンは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞においてＡＭＰキナーゼのリン酸化を誘導できるが（図５Ｃ、レーン４〜８、列１）、予測されるように、酵母に対する殺真菌活性を欠く植物ホモログであるＡ９は誘導できない（図５Ｃ、レーン９〜１１、列１）。ＡＭＰキナーゼのリン酸化はアディポネクチンレセプターＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の発現を必要とする（図５Ｃ、列２及び３）。従って、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるアディポネクチン及びオスモチンの保存された生物学的機能は、アディポネクチンレセプターとの相互作用に関与するβバレルドメイン（ドメイン１）中の共通の構造に起因するはずである。
【００２４】
[0029]植物シグナル伝達。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ中の２４の遺伝子座は、タウマチンファミリードメイン（これらのいくつかは推定膜アンカー配列を有し、３つは膜貫通ドメインを介してＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメインに連結されている）を有するＯＲＦをコードする。少なくとも２つの遺伝子座が、ＰＨＯ３６に対する相同性を有する配列をコードする。このことは、タウマチン様タンパク質が、植物において情報伝達の役割をおそらく有することを示す。動物における細胞内情報伝達、免疫及び／又はエネルギー恒常性に関与するタンパク質（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＣＤ４０リガンド及び冬眠調節性のタンパク質）のＣ末端ドメインは、オスモチン及びアディポネクチンのものと類似したβバレル折りたたみを有する。これらのタンパク質の機能は、アディポネクチンのエネルギー恒常性機能並びにオスモチンのアポトーシス誘導機能及び免疫関連機能にわたる。ＴＮＦα及びＣＤ４０リガンドは、可溶性及びＨ型膜アンカー形態で存在する（このことは、予測されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのタウマチン様タンパク質との類似性を示す）。オスモチンとは異なり、これらのタンパク質の全長分子は、コラーゲンドメインであり得る（アディポネクチン、補体１ｑ、冬眠誘導性タンパク質）又はあり得ない（ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド）、Ｎ末端の「トーク（ｔａｌｋｓ）」を有する。球状Ｃ末端アディポネクチン様ドメインの全てがトリマーを形成する。しかし、オスモチンはダイマーとして結晶化する（Ｍｉｎら、２００４）。溶液中ではモノマーが主であるが、より少ない量の高次構造が、特定の条件下でオスモチン及びタウマチン溶液中で観察され得る。球状アディポネクチン様ドメインのトリマー化と、Ｎ末端コラーゲンドメインを介したその後の高次マルチマーへのアセンブリは、レセプターのクラスター化を誘導することによるシグナル伝達に重要であると考えられている（Ｊｏｎｅｓら、１９８９；Ｓｈａｐｉｒｏａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ、１９９８；Ｋａｒｐｕｓａｓら、１９９５；Ｅｃｋ ａｎｄ Ｓｐｒａｎｇ、１９８９）。しかし、オスモチン及びアディポネクチンの共有されたレクチン様βバレルドメイン、他のドメインにおける有意な相同性の欠如、並びにそれらのレセプター間の高度の相同性を合わせて考えると、保存されたレクチン様βバレルドメインが、これらのタンパク質に対するレセプター結合特異性の主要な決定因子であることが示される。
【００２５】
[0030]薬理学的重要性。ＰＲ−５ファミリーの植物タンパク質は、哺乳動物アディポネクチンレセプター結合においてアゴニスト／アンタゴニストとして作用できる。オスモチンは、Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、アディポネクチンレセプター媒介性のＡＭＰキナーゼのリン酸化を誘導できる（図５Ｃ）。ＰＲ−５タンパク質は、植物に遍在する（スクリーニングされた全ての種がＰＲ−５タンパク質を含むことが報告されている）大きいファミリー（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのみで２４のメンバー）である。ＰＲ−５タンパク質は非常に安定でもあり、従って、ヒトの消化器系又は呼吸器系と接触しても活性なままであり、いくつかはアレルゲンであることが知られている（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒａｎｄ Ｅｂｎｅｒ、２０００）。ＰＲ−５タンパク質及びアディポネクチン上の類似のレセプター結合部位（即ち、レクチン様βバレルドメイン）から生じる機能的相同性及びそれらのそれぞれのレセプター間の高度の相同性が、哺乳動物における実際の又は潜在的な治療的用途（糖尿病、動脈硬化及び心疾患、又はアディポネクチンレセプター媒介性の代謝経路の活性化もしくは阻害の結果である他の疾患の治療における用途を含む）を有する非常に多数の植物産物に薬理学者を近づけている。
【００２６】
[0031]ドメインＩＩ（図５Ａ及び５Ｂを参照のこと）は、ある種のタウマチン様タンパク質において高度に短縮されている（ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｘ６８１９７、イネ；ＡＦ３８９８８４、コムギ；Ｘ９７６８７、コムギ）。この短縮はこれらのタンパク質のβバレルドメインの露出を増大させ、アディポネクチンのβバレルドメインとのより高い重複を許容する。従って、これらの短縮タウマチン様タンパク質の構造は、アディポネクチン（ある場合には、おそらくオスモチンよりも当てはまる）の構造とも類似するので、これらのタンパク質の強力なアディポネクチンレセプター結合が可能である。
【００２７】
[0032]オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有するＰＲ−５ファミリー中の関連タンパク質は、当該分野で公知の任意の種々の適切な薬学的に許容される担体中に処方され得、種々の哺乳動物障害を治療するための治療剤として直接使用され得る。アディポネクチンレセプターとの相互作用の性質（例えば、結合活性及び活性化活性の両方を有する、結合活性を有するが活性化活性を有さない、結合活性を有さないが阻害活性を有する、など）に依存して、これらのタンパク質は、アディポネクチン活性のアゴニスト又はアンタゴニストとして使用され得る。アディポネクチンは種々の代謝経路を媒介することが知られており、これらの代謝経路の破壊は、高脂血症、グルコース代謝における不均衡、インスリン抵抗性の状態を導き得、糖尿病、動脈硬化、肥満及び心疾患のような疾患を生じる。そのような医薬組成物に適切な剤形及び投与方法（投与経路及び投薬レベルを含む）の開発は、医薬の分野において慣用の手順である。
【００２８】
[0033]さらに、オスモチン、及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物障害の治療のための治療方法の開発において、アディポネクチンの代用物として使用され得る。このような方法において、この代用物は、予備試験並びに投薬レジメン、投与経路（例えば、注射、経口投与又は移植）の開発において使用される。オスモチン及び関連タンパク質のような豊富に入手可能な植物タンパク質の使用は、このような治療方法の研究及び開発段階の間の有効なコスト削減を提供できる。
【００２９】
[0034]重要かつ非常に強力な薬物開発へのアプローチは、「合理的設計」アプローチである。新たな薬物の合理的設計は、新たな薬物の設計のための出発点として、その化合物の本質的に改善されたバージョンである新たな薬物において所望される既知の活性を有する化合物を使用する。出発化合物の構造／機能分析によって、所望の薬物の品質（例えば、可溶性、安定性、結合活性又は特異性、減少した毒性及び副作用）に寄与する物性が決定され得る。一旦これが実施されると、所望の改善をより効果的かつ予測可能に導く、出発化合物への修飾を行う構造化されたアプローチが開発できる。アディポネクチンアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性又はその両方を有するＰＲ−５タンパク質は、このような合理的薬物設計における有益なツールである。
【００３０】
[0035]逆に、又は相補的に、オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質が特異的に結合し得るレセプター（例えば、酵母レセプターＰＨＯ３６）は、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物障害の治療において有用な新規治療剤についてのスクリーニング系として、及び合理的薬物設計のための構造／機能分析において、使用され得る。再度、これらのレセプターのための豊富な植物供給源は、可能性のある治療剤を迅速に同定及び選択するための、大容量スクリーニング方法の使用を可能にする。このようなスクリーニング方法は、単離されたレセプターの調製物（例えば、溶液中、又はカラム充填、薄層プレートもしくはマイクロアレイでの使用のために結合した）を使用して、又はレセプターが発現される細胞株もしくは組織培養物を使用して、実施できる。好ましい実施形態において、オスモチンレセプターＰＨＯ３６を過剰発現し、オスモチンのアポトーシス誘導効果に対して過感受性の酵母株は、このようなスクリーニングを実施する効率的かつ有効な手段を提供する。このような細胞株又は組織培養物は、オスモチン及び相同タンパク質の影響に対して過感受性なので、スクリーニングは、比較的少量の薬物候補組成物を使用して信頼性高く実施できる。従って、ＰＨＯ３６又は同様に感受性のＰＲ−５タンパク質レセプターを過剰発現するこのような細胞株又は組織培養物は、哺乳動物におけるアディポネクチンレセプター機能の、化学物質及びタンパク質／ペプチドアゴニスト又はアンタゴニストを同定するための一次スクリーニングとして使用され得る。このようなアゴニスト及び／又はアンタゴニストは、ＰＨＯ３６のような植物ＰＲ−５レセプターと哺乳動物アディポネクチンレセプターとの間の高度の相同性（構造的及び機能的の両方）に起因して、アディポネクチンレセプター媒介性の経路が関与する哺乳動物の状態の治療に有用な治療剤の良好な候補である。植物ＰＲ−５レセプターに結合して影響を与える能力は、化合物が哺乳動物アディポネクチンレセプターに関して同様の活性を有することの強力な指標である。
【００３１】
[0036]同様に、タンパク質の構造とそのタンパク質をコードする核酸配列との間の厳格な関係に起因して、オスモチン及び構造的に相同なレクチン様βバレルドメインを有する関連のＰＲ−５タンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列（例えば、［配列番号１及び配列番号２］）もまた、合理的薬物設計のための手段として使用できる。コードされた産物において所望の特性に関連するコード配列の特徴を同定することによって、それらから発現される修飾及び改善された薬物産物を作成するために、このコード配列に直接修飾を行うことができる。このような構造／機能分析は、ＤＮＡシャッフリング、もしくは増強された選択的変異誘発及びファージディスプレイ、又は改善されたペプチド機能についての他の選択的方法のようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子進化アプローチを使用した比較分析を含み得る。
【００３２】
[0037]実施例１：材料及び方法。引き続く実施例２〜６で使用する材料及び方法は以下の通りである。
【００３３】
[0038]株、プラスミド及び培地。プラスミドの増幅及び単離のためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＤＨ５αを使用した。全てのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒａｎｔｅ（１９９１）に記載された公に入手可能なＢＷＧ７ａ株の同質遺伝子誘導体であった。株ＢＷＧ７ａは、ＨＯ遺伝子による接合型スイッチングによって得られた（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ、１９９１）。Δｓｔｅ、Δｒａｓ２及びΔｍｎｎ６変異体並びにこれらの遺伝子座の破壊のための手順は、他の文献に記載されている（Ｙｕｎら、１９９８；Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）。ＰＨＯ３６遺伝子座は、Ｗａｃｈら、１９９７に記載されたように、内部コード配列をＵＲＡ３（開始コドンであると予測される２番目のＡＴＧに対して＋１９２ｂｐ〜＋６８０ｂｐ）又はｋａｎＭＸ（＋７２ｂｐ〜＋７４０ｂｐ）で置換することによって欠失させた。Δｙｄｒ４９２変異は、標準的な技術を使用して、内部コード配列（＋２４４ｂｐ〜＋７２４ｂｐ）をＬＥＵ２で置換することによって作製した。正確な遺伝子破壊を、ＰＣＲ及びサザンブロッティングによって確認した。二倍体Δｐｈｏ３６／Δｐｈｏ３６変異体株は、標準的な技術を使用して、反対の接合型の一倍体株を交雑することによって作製した。
【００３４】
[0039]構成的過剰発現のために、ｐＰＨＯ３６を、株ＢＷＧ７ａからＰＨＯ３６のコード領域（−４６ｂｐ〜＋９５７ｂｐ）をＰＣＲによって単離し、多コピープラスミドｐ４２６ＧＰＤ（Ｍｕｍｂｅｒｇら、１９９５）中にクローニングすることによって構築した。プラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨは、ｃ−ｍｙｃ及び６×Ｈｉｓタグを、ＰＣＲによってＰＨＯ３６のＣ末端で、インフレームで導入することによって、ｐＰＨＯ３６から構築した。構築物ＰＨＯ３６ＭＨを配列決定して、タグの適切な融合を確認した。タグ化ＰＨＯ３６の低レベル発現のために、プラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨＳを、適切な制限酵素部位を使用して、単コピープラスミドｐ４１６ＧＰＤ中にＰＨＯ３６ＭＨ構築物をクローニングすることによって作製した。ＳＴＥ７−Ｍｙｃ転写融合物を含むプラスミドｐＮＣ２６７が記載されている（Ｚｈｏｕら、１９９３）。ＲＡＳ２Ｇ１９Ｖを、標準的な技術を使用してｐＡＤ４Ｍ中にクローニングした。
【００３５】
[0040]ＳＴＲＥ−ｌａｃＺ（ＬＥＵ２）を構築するために、ｐＳＴＲＥ−ｌａｃＺ（ＴＲＰ）（Ｓｔａｎｈｉｌｌら、１９９９）から、キメラＳＴＲＥ−ｌａｃＺ遺伝子を、フォワードプライマーとして５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＴＡＴＴＡＣＣＣＴＣＧＡＣ−３’を、リバースプライマーとして５’−ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡ−３’を使用して、ＰＣＲによって単離した。挿入物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ中にサブクローニングし、配列決定し、ＡｐａＩＩ及びＸｍａＩによって切り出し、ｐＲＳ３１５の対応部位中にサブクローニングした。
【００３６】
[0041]酵母培地の調製及び遺伝学的分析には標準的な手順を使用した（Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒａｎｔｅ、１９９１；Ｓｈｅｒｍａｎ、１９９１）。酵母形質転換は、Ｅｌｂｌｅ、１９９２中に記載された酢酸リチウム法によって実施した。酵母株表現型の分析は、標準的な手順に従って実施した（Ｈａｍｐｓｅｙ、１９９７）。
【００３７】
[0042]ｃＤＮＡライブラリー及びクローニング。株ＢＷＧ７ａを、Ｌｉｕら（１９９２）に記載された方法を使用して、ＧＡＬ１調節される酵母ｃＤＮＡ発現ライブラリーで形質転換した。ＳＣ−グルコース培地上で選択した約５０，０００の一次形質転換体を、これらの条件下で致死未満の濃度である０．２μＭのオスモチンを含まないか又は含む、０．００３％メチレンブルーを含む選択的ＳＣ−ガラクトース培地上に引き続いてレプリカプレートした。次いで、青色になった形質転換体又はオスモチンの存在下で増殖できなかった形質転換体を選択した。これらの形質転換体のガラクトース依存的なオスモチン過感受性表現型を、一定範囲のオスモチンを補充した選択的ＳＣ−ガラクトース培地及びＳＣ−グルコース培地上で、スポットアッセイによって確認した。これらの形質転換体が保有するプラスミドを、Ｒｏｂｚｙｋａｎｄ Ｋａｓｓｉｒ（１９９２）に記載された方法を使用して単離し、それらのｃＤＮＡ挿入物を標準的な技術を使用して配列決定した。
【００３８】
[0043]総膜及び細胞内画分の精製。総膜画分を、Ｄａｖｉｄら（１９９７）中に記載されたように、単コピープラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨＳからＰＨＯ３６ＭＨを発現する酵母細胞の１リットルの培養物（Ａ６００ｎｍ  １．０）から単離した。バッファーＡ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／２μｇ・ｍｌ＋１  アプロチニン／２μｇ・ｍｌ−１  キモスタチン／２μｇ・ｍｌ−１  ペプスタチン／１μｇ・ｍｌ−１  ロイペプチン／２ｍＭ  ベンズアミジン／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中１０％（ｗ／ｗ）スクロース３ｍｌ中にこれを再懸濁し、バッファーＡ中５段階のスクロース勾配（１５、２８、３５、４３及び５３％ｗ／ｗ）（１段階当たり２ｍｌ）の上部に層状化した。ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４０ローター中で４℃で２０，０００ｒｐｍで１２時間の遠心分離後、画分（２ｍｌ）を上部から底部まで収集した。それらを３倍容量の水で希釈し、１８６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットをバッファー（１０ｍＭＭｅｓ．ＫＯＨ ［ｐＨ６．５］、１０％グリセロール、バッファーＡ中と同様のプロテアーゼインヒビター）２００μｌ中に再懸濁した。
【００３９】
[0044]タンパク質方法及び酵素アッセイ。オスモチン精製及びオスモチン細胞毒性のアッセイを、Ｙｕｎら（１９９７）、Ｉｂｅａｓら（２０００）及びＮａｒａｓｉｍｈａｎら（２００１）中に以前に記載されたように実施した。α−マンノシダーゼ活性を、ｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉｇｍａ）を基質として使用して測定した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で決定した。タンパク質抽出物を、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ＰＨＯ３６ＭＨ及び原形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅを、ＥＣＬ法（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、分離したタンパク質のイムノブロット上で検出した。ＭｙｃＩ−９Ｅ１０モノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ；ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）及びウサギＰＭＡ１ポリクローナル抗体（１：１００００希釈）（Ｍｏｎｋら、１９９１）を一次抗体として使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗マウス又は抗ウサギ免疫グロブリンＧ（１：５０００希釈；Ｐｒｏｍｅｇａ）を二次抗体として使用した。
【００４０】
[0045]β−ガラクトシダーゼアッセイ法、細胞増殖条件、オスモチン処理及びこの目的のための細胞抽出物の調製は、以前に記載されている（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）。β−ガラクトシダーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たりＡ４００ｎｍ／分の増分として、任意の単位で表した。組換えマウスアディポネクチンを精製し、マウスＣ２Ｃ１２筋細胞におけるＡＭＰキナーゼの活性化を測定するためのプロトコールは、Ｙａｍａｕｃｈｉら（２００３ａ）に記載された通りとした。
【００４１】
[0046]免疫金局在化。酵母スフェロプラストを、Ｙｕｎら（１９９７）に記載されたように固定及び包埋した。但し、１Ｍソルビトールを浸透圧安定剤として固定溶液に添加し、メタ過ヨウ素酸ナトリウム処理は省いた。引き続いて、超薄切片を、ｍｙｃ１−９Ｅ１０モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）及び２０ｎｍの金粒子にコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０希釈；ＴｅｄＰｅｌｌａ、Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）と反応させた。切片を、透過型電子顕微鏡ＥＭ２００（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＣｏ．、Ｍａｈｗａｈ、ＮＪ）で観察した。
【００４２】
[0047]３５Ｓ−オスモチン結合アッセイ。オスモチンを、３５ＳＬＲ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を製造業者の指示に従って使用して、１２Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性になるように放射能標識した。Ａ６００ｎｍ０．６まで酵母細胞をＹＰＤ培地で増殖させ、次いで遠心分離によって回収した。ペレットを１Ｍソルビトール中に再懸濁し（Ａ６００ｎｍ６）、リチカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）（１００Ｕ／ｍｌ）で処理した。細胞壁の消化が完了した後、スフェロプラストを遠心分離によって収集し、１Ｍソルビトールで２回洗浄し、１Ｍソルビトール中に再懸濁した（１０９／ｍｌ）。結合反応を、２μｌの３５Ｓ−オスモチン（１μＣｉ、３μｇ）を３００μｌのスフェロプラスト（０．３×１０９）に添加することによって開始した。３０℃で６０分間インキュベートした後、反応混合物の３つ組のアリコート（５０μｌ）を、氷冷１Ｍソルビトール（１．５ｍｌ）中に希釈した。スフェロプラストを遠心分離によって収集し、２回洗浄し、１Ｍソルビトール（５０μｌ）で再懸濁し、５ｍｌのＥｃｏＬｕｍｅ（商標）（ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）中で液体シンチレーションカウンターによって計数した。競合実験として、スフェロプラストを、３５Ｓ−オスモチンを添加する前に、Ａ９、オスモチン又はＢＳＡと共に３０分間プレインキュベーションした。
【００４３】
[0048]溶液中でのタンパク質相互作用アッセイ。オスモチンを、製造業者の指示に従ってＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にカップリングさせた。総膜画分（５０ｍｌの培養物由来）を上記のように単離し、２００μｌのバッファー（１％ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、１０％グリセロール、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁した。総膜画分（５０μｌ）を、室温で４時間穏やかに攪拌しながら、競合タンパク質（１００μｇ）の非存在下又は存在下で、５０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１ｍＭ ＰＭＳＦ（１ｍｌ）中でオスモチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（２００μｌ）と共にインキュベートした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５回洗浄した後、複合体を、室温で３０分間サンプルバッファー（１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１０％グリセロール）中でインキュベートすることによって解離させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＰＨＯ３６ＭＨタンパク質を、ｍｙｃ１−９Ｅ１０モノクローナル抗体を使用してブロット上で免疫検出した。
【００４４】
[0049]実施例２：ＰＨＯ３６はオスモチンに対する感受性を媒介する。酵母株ＢＷＧ７ａにオスモチン過感受性表現型を付与する遺伝子を、ＧＡＬ１調節されるｃＤＮＡ発現ライブラリーを使用して単離した（Ｌｉｕら、１９９２）。ＳＣ−グルコース培地中で選択した約５０，０００の一次形質転換体から、ＳＣ−ガラクトース培地中でオスモチンに対する過感受性を一貫して示すが、グルコース培地中でオスモチンに対する通常の感受性を示す、合計１２個の形質転換体を、推定オスモチン過感受性クローンとして選択した。これらの形質転換体が保有するプラスミドを単離してＢＷＧ７ａ中に再導入し、それらがガラクトース依存性オスモチン過感受性表現型を付与できることを確認し、それらのｃＤＮＡ挿入物を配列決定した。遺伝子座ＹＯＬ００２ｃ／ＰＨＯ３６に対応するＯＲＥ２０遺伝子（オスモチン抵抗性のため）（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖら、２００２）を、さらなる研究のために選択した。この遺伝子は、ＧＰＣＲの特徴的な特徴である７回膜貫通ドメインを含むと予測された３１７アミノ酸（３６．３ｋＤａ）のタンパク質をコードすることが見出された（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＧｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ）。
【００４５】
[0050]このスクリーニングから元々単離されたｃＤＮＡ（ＰＨＯ３６ｔ）は、その仮定の開始コドンの下流の最初の１９ヌクレオチドを欠失していた。ＧＡＬ１プロモーターからＰＨＯ３６ｔを過剰発現する株ＢＷＧ７ａの細胞は、空のベクターで形質転換したコントロール細胞よりもオスモチンに対して感受性であり、オスモチン含有培地中でコロニーを形成できなかった（図１Ａ）。１時間のオスモチン処理後の生存数を測定することによって実証されるように、増殖阻害が、オスモチン誘導性細胞死に対する感受性の増大から生じた。ガラクトース培地中で、ＰＨＯ３６ｔを過剰発現する細胞のオスモチンについてのＩＣ５０は、空のベクターで形質転換したコントロール細胞のＩＣ５０の３分の１であった（それぞれ、０．２μＭ及び０．６μＭ）。グルコース培地中で、同じ表現型が、多コピープラスミド中の構成的ＧＰＤプロモーターから全長ＰＨＯ３６を過剰発現する細胞について観察された。逆に、ＰＨＯ３６の破壊は、オスモチン抵抗性を増大させ（図２Ｆ）、野生型株と比較してオスモチンについてのＩＣ５０が３倍増大したと概算された（それぞれ、１．６μＭ及び０．６μＭ）。
【００４６】
[0051]株ＢＷＧ７ａにおけるＰＨＯ３６の過剰発現は、スフェロプラストのオスモチン感受性を増大させた（図１Ｂ、挿入図）。逆に、Δｐｈｏ３６変異体のスフェロプラストは、野生型株のスフェロプラストよりもオスモチンに対してより抵抗性であった（図１Ｂ）。これらの結果は、ＰＨＯ３６が、以前に同定された細胞壁媒介性のオスモチン抵抗性決定因子（Ｙｕｎら、１９９７；Ｉｂｅａｓら、２０００、２００１）とは異なり、原形質膜のレベルでオスモチンに対する感受性を媒介することを示す。
【００４７】
[0052]実施例３：ＰＨＯ３６の発現レベルに関連する表現型。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｗ３０３１ＡにおけるΔｐｈｏ３６変異体（Δｙｏｌ００２ｃ）は、ミリスチン酸及び非発酵性炭素源上であまり増殖しないことが報告されている（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖら、２００２）。しかし、同質遺伝子野生型株ＢＷＧ７ａ、ｐｈｏ３６及びＰＨＯ３６過剰発現細胞の増殖は、コロニー形成又は細胞増殖速度を異なる炭素源（２％グルコース、２％ガラクトース、２％エタノール、２％乳酸、２％酢酸カリウム、３％グリセロール又は３％グリセロール及び０．１％オレイン酸）、窒素源（なし、尿素、アスパラギン又はプロリン）、温度（１６、２８及び３７℃）、及びｐＨ（３、６．６及び８）で測定した場合、識別不能であった。
【００４８】
[0053]野生型、Δｐｈｏ３６及びＰＨＯ３６過剰発現細胞の、ソルビトール（２Ｍ）、ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＮＨ４Ｃｌ（０．７５及び１．５Ｍ）処理によって測定されるような、浸透圧即ちイオンストレスに対する感受性において、差異は見出されなかった。Σ１２７８株（Ｇｉｍｅｎｏら、１９９２）におけるＰＨＯ３６の欠失は、寒天を透過する能力を無効にしなかったので、ＰＨＯ３６は、浸潤性の増殖には必要なかった。二倍体ＰＨＯ３６／ＰＨＯ３６細胞（２１．３３±５．８９）及び二倍体Δｐｈｏ３６／Δｐｈｏ３６細胞（２６．３３±３．３６）について決定した胞子形成の割合は、有意には異ならなかった。見出された僅かな差異には、接合効率における差異（Δｐｈｏ３６、６．９％；野生型、２．７％）、ヒートショックに対する感受性における差異（５０℃で２０分の後、野生型細胞についての７８．３±３．３８％と比較して、Δｐｈｏ３６細胞について４６±１０％の生存）、並びに細胞壁撹乱剤カルコフルオルホワイト（ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ｗｈｉｔｅ）及びハイグロマイシンＢに対する抵抗性の差異（Δｐｈｏ３６細胞はより抵抗性であった）が含まれた。Δｐｈｏ３６細胞は、細胞膜撹乱抗生物質ナイスタチンに対して、野生型細胞よりも抵抗性であることが以前に示されている（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖら、２００２）。
【００４９】
[0054]実施例４：ＰＨＯ３６は、オスモチンによって活性化されて細胞死を誘導するＲＡＳ２シグナル伝達経路において機能する。オスモチンは、ＲＡＳ２／ｃＡＭＰ経路を介して細胞ストレスシグナル伝達を抑制して、プログラム細胞死を促進する（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）。従って、オスモチン抵抗性は、ＲＡＳ２のヌル変異によって増大し、野生型株における優性の活性ＲＡＳ２Ｇ１９Ｖ対立遺伝子の発現によって減少する（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）。Δｒａｓ２変異体におけるＰＨＯ３６の変異は、アポトーシス誘導条件下でΔｒａｓ２変異体のオスモチン抵抗性を増大させず（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）、このことは、ＰＨＯ３６が、ＲＡＳ２媒介性のオスモチン誘導性のアポトーシス経路において機能することを示唆する（図２Ａ）。Δｒａｓ２変異体における多コピープラスミドからのＰＨＯ３６の過剰発現は、オスモチン感受性を有意に増大させなかったが、野生型株におけるＰＨＯ３６の過剰発現は、オスモチンに対して野生型株をより感受性にした（図２Ｂ）。また、ＰＨＯ３６がＲＡＳ２の上流で細胞死経路において機能する場合に予測されるように、Δｐｈｏ３６変異体における優性な活性ＲＡＳ２Ｇ１９Ｖ対立遺伝子の発現は、オスモチンに対する感受性を増大させた（図２Ｃ）。
【００５０】
[0055]ｌａｃＺレポーター遺伝子に融合したＳＴＲＥ（ストレス応答性）プロモーターエレメントは、ＲＡＳ２／ｃＡＭＰ経路依存的なストレスシグナル伝達に応答することが示されている（Ｓｔａｎｈｉｌｌら、１９９９）。キメラＳＴＲＥ−ｌａｃＺ構築物は、オスモチンがＲＡＳ２／ｃＡＭＰ経路を介して細胞ストレスシグナル伝達を抑制して、細胞死を促進することを実証するためにも使用されており（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）、オスモチン誘導性の細胞シグナル伝達におけるＰＨＯ３６の役割を試験するために本明細書中で使用した（図２Ｄ）。オスモチン処理した酵母細胞の集団における細胞死の程度が、ＳＴＲＥ−ｌａｃＺレポーター遺伝子活性の抑制に比例するという以前の報告（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）と一致して、β−ガラクトシダーゼ活性の抑制は、野生型細胞において最大であり、Δｐｈｏ３６変異体においてより低く、Δｒａｓ２及びΔｐｈｏ３６Δｒａｓ２二重変異体において最低であった（図２Ａ及び２Ｄ）。これらの結果は、ＰＨＯ３６がＲＡＳ２の上流で細胞死シグナル伝達経路において機能することを示す。オスモチン処理の非存在下では、Δｐｈｏ３６Δｒａｓ２二重変異体におけるＳＴＲＥ−ｌａｃＺ活性はΔｒａｓ２変異体における活性よりも低かったことに留意すべきであり（図２Ｄ、説明文）、このことは、ＰＨＯ３６の非存在下のみで明らかとなる、ストレス応答を制御するＲＡＳ２非依存的でオスモチン非依存的な経路が存在することを示す。
【００５１】
[0056]これら及び以前のデータ（Ｙｕｎら、１９９８；Ｉｂｅａｓら、２０００；Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）は、オスモチン毒性を制御する経路の存在と一致する（図２Ｅ）。例えば、Δｒａｓ２変異体のオスモチン抵抗性と比較して部分的なΔｐｈｏ３６変異体のオスモチン抵抗性は、他のタンパク質によるＰＨＯ３６の機能的重複によって説明できよう。ＹＤＲ４９２ｗ遺伝子座によってコードされる推定タンパク質は、ＰＨＯ３６と最大の同一性（４４％）を共有する。そこで、Δｙｄｒ４９２及びΔｐｈｏ３６Δｙｄｒ４９２変異を保有する株のオスモチン感受性を試験したが、それぞれ、野生型株及びΔｐｈｏ３６株のオスモチン感受性と識別できないことが見出された。
【００５２】
[0057]オスモチンがまた、酵母においてシグナル伝達経路を破壊して、防御的細胞壁バリアを弱体化させ、その毒性効力を増大させることが、以前の遺伝学的研究によって明らかとなっている（Ｙｕｎら、１９９８）。この経路の成分には、ヘテロトリマーＧタンパク質のβ（ＳＴＥ４）サブユニット及びγ（ＳＴＥ１８）サブユニット、プロテインキナーゼＳＴＥ２０、ＳＴＥ５、ＳＴＥ１１、ＳＴＥ７、ＦＵＳ３、ＫＳＳ１からなるＭＡＰキナーゼモジュール、並びに転写因子ＳＴＥ１２が含まれ、これらの成分は、フェロモン応答及び浸潤性の増殖のシグナル伝達経路によっても共有される。しかし、Ｇタンパク質共役フェロモンレセプターＳＴＥ２及びＳＴＥ３は、オスモチン誘導性のシグナル伝達にとって重要ではなかった。ＰＨＯ３６は、Ｇタンパク質共役レセプターの構造的特徴を有するがオスモチン感受性を媒介するので、オスモチンによって活性化されるＭＡＰキナーゼ経路に関連したレセプターとしてＰＨＯ３６が作用する可能性を試験した。Δｓｔｅ１８、Δｓｔｅ２０、Δｓｔｅ７及びΔｓｔｅ１２変異体におけるＰＨＯ３６の同時破壊は、いずれかの遺伝子単独の破壊よりも高いオスモチン抵抗性を生じ（図２Ｆ）、このことは、ＳＴＥ遺伝子及びＰＨＯ３６がオスモチン感受性を導く異なる過程で機能することを示している。以前の観察により、ＲＡＳ２及びＳＴＥ遺伝子がオスモチン感受性を導く遺伝学的に別個の経路で機能することが示されているので（Ｎａｒａｓｉｍｈａｎら、２００１）、これは、ＲＡＳ２シグナル伝達経路中にＰＨＯ３６を位置づける結果と一致する。
【００５３】
[0058]オスモチンに対する完全な感受性は、細胞壁糖タンパク質上のマンノシルホスフェート残基の存在を必要とする（Ｉｂｅａｓら、２０００）。マンノシルホスフェートの付加は、マンノシルホスフェートトランスフェラーゼＭＮＮ６に依存する。それらがオスモチン抵抗性を調節する異なる過程で機能した場合に予測される通り、ＰＨＯ３６の変異はΔｍｎｎ６変異体のオスモチン抵抗性を増大させ、ＰＨＯ３６の過剰発現はΔｍｎｎ６変異体のオスモチン感受性を増大させた。
【００５４】
[0059]これらのデータは、ＰＨＯ３６が、オスモチンによって活性化されるプログラム細胞死シグナル伝達経路においてＲＡＳ２の上流で機能することを、集合的に一貫して示す。
【００５５】
[0060]実施例５：ＰＨＯ３６は原形質膜タンパク質である。ＰＨＯ３６は、ＧＰＣＲの構造的特徴を有する。典型的には、これらのタンパク質は、原形質膜内在性タンパク質である。従って、ＰＨＯ３６の細胞内位置を、電子顕微鏡法のための免疫細胞化学的手順を使用して決定した。この目的のために、ｃ−ｍｙｃエピトープ及び６×ＨｉｓタグがＰＨＯ３６のＣ末端で、インフレームで融合した組換えＰＨＯ３６ＭＨタンパク質を、ＢＷＧ７ａ細胞中で構成的ＧＰＤプロモーターから発現させた（図３Ａ）。多コピープラスミドからのＰＨＯ３６ＭＨの過剰発現はオスモチン感受性を増大させ、このことは、ＰＨＯ３６ＭＨが機能的であったことを示す。ＰＨＯ３６ＭＨは、単コピープラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨＳから低レベルのＰＨＯ３６ＭＨを発現する細胞から生じたスフェロプラストの超薄切片上で、ｍｙｃ１−９Ｅ１０モノクローナル抗体で検出した。金粒子標識は、ＰＨＯ３６ＭＨの原形質膜局在を示した（図３Ｂ及び３Ｃ）。従って、ＰＨＯ３６ＭＨは、スクロース勾配で分画した総膜のより密度の高い画分中で免疫検出され（図３Ｄ）、原形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅと共に分画されたが（図３Ｅ）、液胞型α−マンノシダーゼと共には分画されなかった（図３Ｆ）。
【００５６】
[0061]実施例６：ＰＨＯ３６は、活性なＰＲ−５アイソフォームに特異的に結合する。ＰＨＯ３６ＭＨ過剰発現株及びΔｐｈｏ３６変異体の細胞溶解物から精製した膜画分を、オスモチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂと共にインキュベートした。充分洗浄した後、結合したタンパク質を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＨＯ３６ＭＨを、ｍｙｃ１−９Ｅ１０モノクローナル抗体で免疫検出した。それぞれ約３６及び７２ｋＤａの見かけの分子量を有するＰＨＯ３６ＭＨのモノマー及びダイマーを示す２本のバンドが、ＰＨＯ３６ＭＨ過剰発現株の膜画分において検出されたが（図４Ａ、レーン３〜８）、Δｐｈｏ３６変異体の膜画分中には存在しなかった（図４Ａ、レーン２）。ｃ−ｍｙｃタグ化ＳＴＥ７を発現する酵母株の細胞抽出物ではバンドは検出されず、このことは、組換えＰＨＯ３６ＭＨのオスモチンへの結合が、ＰＨＯ３６特異的であるがｃ−ｍｙｃタグには特異的でないことを示している（図４Ａ、レーン１）。結合反応中に遊離のオスモチンを含めることにより結合が減少したが、Ａ９又はＢＳＡを含めることは影響を有さず（図４Ａ、レーン３〜８）、このことは、オスモチン−ＰＨＯ３６相互作用の特異性を実証している。植物Ａｔｒｉｐｌｅｘｎｕｍｍｕｌａｒｉａから精製されたＡ９は、酵母細胞及びスフェロプラストに対する活性がオスモチンよりも低いが、他の真菌種に対しては活性なＰＲ−５タンパク質であり（Ｙｕｎら、１９９７）、従って、結合選択性についてコントロールとして使用した。
【００５７】
[0062]ＰＨＯ３６ＭＨを過剰発現する株、Δｐｈｏ３６変異体（図４Ｂ）及び空のベクターで形質転換した野生型株のスフェロプラストは、全てｉｎｖｉｖｏで３５Ｓ−オスモチンに結合した。Δｐｈｏ３６変異体のスフェロプラストに結合し、インキュベーションの間に１０倍過剰の非放射性オスモチンを含めることによっても置換できなかった３５Ｓ−オスモチンの量は、非特異的結合の程度を示す（図４Ｂ、左）。この非特異的結合を差し引いた後、ＰＨＯ３６ＭＨ過剰発現株のスフェロプラストに結合している３５Ｓ−オスモチンは、スフェロプラストの生存率を損なうことなく、６０分間にわたって線形であると推定された。ＰＨＯ３６ＭＨ過剰発現株のスフェロプラストは、空のベクターで形質転換した野生型株のスフェロプラストよりも約３倍の３５Ｓ−オスモチンに結合した。ＰＨＯ３６ＭＨを過剰発現する株のスフェロプラストへの３５Ｓ−オスモチンの結合（図４Ｂ、右）は、反応中に１０倍過剰の非放射性オスモチンを含めることによって部分的に妨害されたが、酵母において不活性なオスモチンホモログＡ９、又はＢＳＡのいずれによっても妨害されなかった。従って、オスモチンに対する最大の感受性に必要な原形質膜タンパク質であるＰＨＯ３６は、細胞死に先立つ、酵母スフェロプラストへのオスモチンの特異的結合にも関与する。
【００５８】
引用文献
[0063]以下の文献は、本発明を可能にする程度まで、参照により組み込まれる：
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＰＨＯ３６が酵母においてオスモチンに対する感受性を媒介する。Ａ．ＰＨＯ３６ｔ挿入物なし（ベクター）又はあり（ｐＰＨＯ３６ｔ）の動原体性プラスミドｐＲＳ３１６で形質転換した酵母株ＢＷＧ７ａの対数期培養物（Ａ６００ｎｍ０．４）の１０倍連続希釈物のアリコート（２．５μｌ）を、オスモチン補充なし（なし）又はあり（１．６μＭ）の選択的ＳＣ−ガラクトース培地上にスポットし、２８℃で３日間増殖させた。Ｂ．野生型株ＢＷＧ７ａ（白四角）又は同質遺伝子のΔｐｈｏ３６変異体（黒四角）由来のスフェロプラスト（１０６／ｍｌ）を希釈し、０．８Ｍソルビトール及び示された濃度のオスモチンを含むＹＰＤ寒天上にプレートした。生存スフェロプラストを、２８℃で３日間のインキュベーション後に計数した。生存数を、オスモチンを添加しなかった値に対して正規化する。値は、３つの異なる実験の平均±ＳＥである（挿入図）。０．８Ｍソルビトールを補充した選択的ＳＣ−ガラクトース培地中で実施した、ＰＨＯ３６ｔ挿入物なし（白丸）又はあり（ｐＰＨＯ３６ｔ；黒丸）のプラスミドｐＲＳ３１６を保有するＢＷＧ７ａ株のスフェロプラストを用いた類似の実験の結果を示す。
【図２】ＰＨＯ３６が、オスモチン誘導性アポトーシスにおいてＲＡＳ２を介して機能する。Ａ．野生型株（ｗｔ）並びに同質遺伝子のΔｐｈｏ３６、Δｒａｓ２及びΔｐｈｏ３６Δｒａｓ２変異体株の細胞（１０８／ｍｌ）を、アポトーシス誘導条件下で、ＹＰＤ中５μＭのオスモチンと共に３０℃でインキュベートした。３時間のオスモチン処理後細胞を洗浄し、生存してコロニーを形成できた全細胞の割合を測定した。値は、４回の決定の平均±ＳＥを示す。Ｂ．野生型（ｗｔ）、及びＰＨＯ３６挿入物なし（ｖｅｃ）又はあり（ｐＰＨＯ３６）のｐ４２６ＧＰＤで形質転換したΔｒａｓ２変異体株の細胞（１０８／ｍｌ）を、アポトーシス誘導条件下で、選択的ＳＣ−グルコース培地中２μＭのオスモチンと共に３０℃でインキュベートした。生存してコロニーを形成できた全細胞の割合を、上記のように１時間のオスモチン処理後に測定した。値は、２回の決定の平均±ＳＥを示す。Ｃ．株ＢＷＧ７ａ（ｗｔ）及びｐＡＤ４Ｍ（ｖｅｃ）又はｐＡＤ４Ｍ−ＲＡＳ２Ｇ１９Ｖ（ｐＲＡＳＧ１９Ｖ）で形質転換したΔｐｈｏ３６変異体のＡ６００ｎｍ０．４培養物の１０倍連続希釈物のアリコート（２．５μｌ）を、示されたオスモチン補充なし（なし）又はありの選択的ＳＣ−グルコース培地上にスポットすることによって、オスモチン感受性をアッセイした。室温で５日間のインキュベーション後、プレートを撮影した。Ｄ．ｐＳＴＲＥ−ｌａｃＺ（ＬＥＵ２）で形質転換した株ＢＷＧ７ａ（ｗｔ）並びにΔｐｈｏ３６、Δｐｈｏ３６Δｒａｓ２及びΔｒａｓ２変異体の細胞（１０８／ｍｌ）を、アポトーシス誘導条件下で、３０℃で４５分間、ＹＰＤ中８μＭのオスモチンで処理しなかった（マイナス）か、又は処理した（プラス）。無細胞抽出物中で測定したβ−ガラクトシダーゼ活性の比率を示す。各々の棒は、平均±ＳＤを示す（ｎ＝３）。これらの群の統計的比較を報告する：＊ｐ＜０．０１；アスタリスクなし、差異なし。オスモチン非存在下でのβ−ガラクトシダーゼ活性は、それぞれ、それぞれ、１５２±４、１３３±３、７０５±２３及び１３９±６単位であった。実験を１回繰り返し、類似の結果を得た。Ｅ．オスモチン媒介性細胞死経路のモデルを示す：オスモチンはＲＡＳ２／ｃＡＭＰ経路を活性化し、細胞ストレス応答（ＳＴＲＥ−ｌａｃＺレポーター）の抑制を誘導し、その後反応性酸素種の蓄積及び細胞死が生じる。オスモチンのＰＨＯ３６との相互作用により、ＲＡＳ２を介して細胞死が活性化される。オスモチンに応答してＲＡＳ２細胞死経路を刺激する上流の未同定の成分が存在する可能性がある。Δｐｈｏ３６Δｒａｓ２の遺伝学的バックグラウンドにおけるＳＴＲＥ−ｌａｃＺ活性に対するオスモチン非依存的効果によって明らかなように、ストレス応答を制御する経路は、なおより複雑であり、示されていない。記号：？、未知の成分；↓、活性化；┴、阻害；→、細胞壁弱体化；ＣＷ、細胞壁；ＰＭ、原形質膜。Ｆ．株ＢＷＧ７ａ（ｗｔ）及び示された変異体株のＡ６００ｎｍ０．４培養物の１０倍連続希釈物のアリコート（２．５μｌ）を、示されたオスモチン補充なし（なし）又はありのＹＰＤ寒天上にスポットした。２８℃で２日間のインキュベーション後、プレートを撮影した。
【図３】ＰＨＯ３６は原形質膜上に局在する。Ａ．ＰＨＯ３６ＭＨ構築物の配列を示す。ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントは、開始コドンの前に４６ｎｔのＰＨＯ３６遺伝子を含み、天然ＰＨＯ３６のＯＲＦ（薄い）は、ｃ−ｍｙｃタグ（濃い）及びＨｉｓタグ（点線の下線）に、そのＣ末端近傍でインフレームで融合した。Ｂ〜Ｃ．タグ化ＰＨＯ３６ＭＨタンパク質の免疫金局在化。ＰＨＯ３６ＭＨ挿入物なし（Ｂ）又はあり（ｐＰＨＯ３６ＭＨＳ［Ｃ］）の単コピープラスミドｐ４１６ＧＰＤを保有する株ＢＷＧ７ａのスフェロプラストの超薄切片を示す。小さい黒の点として見える２０ｎｍの金粒子は、ＰＨＯ３６ＭＨタンパク質の位置を示す。Ｄ〜Ｆ．細胞膜におけるＰＨＯ３６ＭＨタンパク質の分布。ｐＰＨＯ３６ＭＨＳを保有する細胞の抽出物を分画し、膜を含まない上清画分（レーン１）、総膜画分（レーン２）、及び軽い方の画分から濃い方の画分までのスクロース密度勾配膜画分（それぞれ、レーン３〜７）においてタンパク質の分布を分析した。ＰＨＯ３６ＭＨ（Ｄ）及び原形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅマーカー（Ｅ）を、それぞれｍｙｃ１−９Ｅ１０モノクローナル抗体及びＰＭＡ１抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質のブロット上で検出した。液胞型α−マンノシダーゼマーカーの活性を、これらの画分（Ｆ）中で測定し、タンパク質１ｍｇ当たりＡ４００ｎｍ／分の増分として任意の単位で与える。
【図４】ＰＨＯ３６は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでオスモチンと特異的に相互作用する。Ａ．オスモチン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを、競合タンパク質の非存在下（レーン１、２及び５）又は競合タンパク質Ａ９（１００μｇ、レーン３；又は１０μｇ、レーン７）、オスモチン（Ｏｓｍ；１００μｇ、レーン４；又は１０μｇ、レーン６）もしくはＢＳＡ（１００μｇ、レーン８）の存在下で、融合タンパク質ＳＴＥ７−Ｍｙｃを発現する株ＢＷＧ７ａの細胞抽出物（レーン１）、株ΔＰＨＯ３６から精製した総膜画分（レーン２）又はプラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨからｃ−ｍｙｃタグ化ＰＨＯ３６を発現する株ＢＷＧ７ａから精製した総膜画分（レーン３〜８）と共にインキュベートした。充分洗浄した後、結合したタンパク質を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ｃ−Ｍｙｃタグをｍｙｃ１−９Ｅ１０抗体で免疫検出した。Ｂ．Δｐｈｏ３６変異体（Δｐｈｏ３６）及びプラスミドｐＰＨＯ３６ＭＨを保有する野生型株ＢＷＧ７ａ（ｐＰＨＯ３６）由来のスフェロプラスト（１０９／ｍｌ）を、競合物として１０倍モル過剰のＡ９、ＢＳＡ又はオスモチンなし（なし）又はありで、３５Ｓ−オスモチン（０．４μＭ、０．１６μＣｉ）と共に１時間インキュベートした。充分洗浄した後、スフェロプラスト上に保持された３５Ｓ−オスモチンを計数した。
【図５】オスモチンとアディポネクチンの構造の比較。Ａ．オスモチン（黄緑、青及びマゼンダ）及びアディポネクチン（緑）のＣαトレースの重ね合わせの２つの異なる視点（９０°回転）による１つの図を示す。オスモチンの３つのドメインを、青（ドメインＩ即ちレクチン様ドメイン）、マゼンダ（ドメインＩＩ、アミノ酸１２１〜１７７）及び黄緑（ドメインＩＩＩ、アミノ酸５５〜８２）で着色している。オスモチンファミリーの酸性クレフト中に見出される３つの保存された残基（Ｇｌｕ８４、Ａｓｐ９７及びＡｓｐ１０２）を、赤の棒モデルで描いている。Ｂ．表面静電ポテンシャルを示す、オスモチン（左）及びアディポネクチン（右）の表面トポロジーの図。タンパク質表面を、青（最も陽性）〜白（中性）〜赤（最も陰性）まで、静電ポテンシャルに従って着色している。タンパク質の配向は、（Ａ）（左）に示されるものと同一である。図はＧＲＡＳＰ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９１）を使用して描いた。Ｃ．示されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、示された濃度の全長アディポネクチン（Ａｄ）、オスモチン（Ｏｓｍ）及びＡ９（Ａ９）で処理しなかった（なし）か、又は１０分間処理し、ホスホＡＭＰキナーゼ特異的抗体で探索した、Ｃ２Ｃ１２筋細胞の溶解物（１レーン当たり１０μｇのタンパク質）のイムノブロットを示す。Ｄ．（Ｃ）のデータの定量的分析。同じｓｉＲＮＡセットにおけるタンパク質を添加していない値（なし）と比較して、統計的に有意な差異（＊＊）及び有意でない（Ｎ．Ｓ．）差異を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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