(57)【要約】  本発明は、微生物を殺傷又はその生育を阻害、または内在性に発現される微生物の毒素合成を阻止する、ｒｂｌ−１と命名された配列[配列番号19]から単離されたオリゴヌクレオチド配列に関する。スクリーニング法を用いて同定されたこれらのｓｓＤＮＡは、三量体形成、アンチセンス鎖による阻害、又はアプタマーのレベルで働いて遺伝子の機能を変化させ、必須の成長機能を調節していると推測される。最小機能領域、またはＭＦＲと呼ばれる配列は、敗血症及びその他の微生物が一因となり引き起こされる疾患の治療薬として、特に有用である。
2008514204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号19で示されるｒｂｌ−１インサート配列、配列番号18で示されるｒｂｌ−１配列、又は前記ｒｂｌ−１若しくは前記ｒｂｌ−１インサート配列と相同な配列、から単離されたヌクレオチド配列を含むｓｓ−ＯＤＮ又は ｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項２】
配列番号18で示される前記ｒｂｌ−１配列の20〜23番目から始まり32〜34番目までの部分を含む、請求項１に記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項３】
配列番号18で示される前記ｒｂｌ−１配列の7〜40番目の位置の部分を含む、請求項１に記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項４】
25〜31番目の位置にあたる配列部分を含む、請求項２に記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項５】
7〜15ヌクレオチド長の範囲にある請求項１に記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項６】
前記ｒｂｌ−１の配列の25〜31番目の部分を含む、請求項2に記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項７】
細胞に導入された場合、ＲＮＡポリメラ−ゼを阻害するように機能する、配列番号19で示される前記ｒｂｌ−１インサート、又はその相同配列であるｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項８】
請求項1〜7いずれかに記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
誘導性プロモーターを有する請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の発現ベクターを導入され、前記ベクターを保持する細胞。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載のｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮと、ペプチドを含む接合体(conjugate)。
【請求項１２】
前記ペプチドは、バクテリアを標的物とするペプチド、そのホモログ又はその誘導体である、請求項11の接合体。
【請求項１３】
以下のｒｂｌ−１関連配列及びそれらの相同配列のうち一つ、又はそれ以上の配列を含むｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
（ｒｂｌ−１インサート）  CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G  [配列番号：19]，
（ｒｂｌ−１）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATATCGTGG  [配列番号： 18]，
（01-35）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATAT  [配列番号: 71]，
（01-30）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC  [配列番号: 72]，
（01-25）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACA  [配列番号: 73]，
（01-20）  TTTGATGACC TTTGCTGACC  [配列番号: 74]，
（01-15）  TTTGATGACC TTTGC  [配列番号: 75]，
（06-40）  TGACCTTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 76]，
（11-40）  TTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 77]，
（16-40）  TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 78]，
（21-40）  ATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 79]，
（26-40）  ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 80]，
（21-30）  ATACA ATTGC  [配列番号: 81]，
（21-32）  ATACA ATTGC GA  [配列番号: 82]，
（21-34）  ATACA ATTGC GATA  [配列番号: 83]，
（21-36）  ATACA ATTGC GATATC  [配列番号: 84]，又は
（21-38）  ATACA ATTGC GATATCGT  [配列番号: 85]。
【請求項１４】
請求項13に記載の前記ＯＤＮ又はｓｓ−ＯＤＮのひとつ、又はそれ以上を含む発現ベクター。
【請求項１５】
さらに誘導性のプロモーターを有する請求項14に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
下流の結合部位を認識する逆転写酵素をコードする遺伝子をさらに含む請求項14に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
プライマー結合部位がｔＲＮＡＶａｌの存在下に逆転写酵素によって認識される請求項16に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項14に記載の発現ベクターが導入され、前記ベクターを保持する細胞。
【請求項１９】
請求項13に記載の前記ＯＤＮ又はｓｓ−ＯＤＮと、ペプチドとを含む接合体。
【請求項２０】
前記ペプチドがバクテリアを標的物としたもの、そのホモログ、又はその誘導体である請求項19に記載の接合体。
【請求項２１】
請求項13に記載される前記ＯＤＮ又はｓｓ−ＯＤＮ配列のひとつ又はそれ以上を含む、プラスミド、プラスミド誘導体、又はミニサークル。
【請求項２２】
さらにｔＲＮＡＶａｌ存在下で、逆転写酵素に認識されるプライマー結合部位をコードする配列を有する請求項21に記載のプラスミド。
【請求項２３】
前記プラスミドが宿主細胞に導入された場合、前記ＯＤＮ又はｓｓ−ＯＤＮ配列が微生物の生育を阻害、微生物を殺傷、又は微生物による毒素の分泌阻害に機能する請求項21に記載のプラスミド。  
【請求項２４】
プラスミドｐｓｓＸＴｅ。
【請求項２５】
請求項24に記載のプラスミドが導入され、前記プラスミドを保持する細胞。
【請求項２６】
配列番号19で示されるｒｂｌ−１インサート、配列番号 18で示されるｒｂｌ−１、配列番号71（1−35）, 配列番号72(1-30), 配列番号76(6-40), 配列番号77(11-40), 配列番号78(16-40), 配列番号79(21-40), 配列番号82(21-32), 配列番号83(21-34), 配列番号84(21-36)，配列番号85(21-38), 及びそれらに相同な配列から選択される、単離されたヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、及びペプチドを含む接合体。
【請求項２８】
前記ペプチドがバクテリアを標的物としたもの、そのホモログ、又はその誘導体である、請求項27に記載の接合体。
【請求項２９】
請求項26に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれたオリゴヌクレオチドであって、前記配列番号19のｒｂｌ−１インサートの断片を含むベクター。
【請求項３０】
前記ベクターが、発現ベクター、好ましくは誘導性の発現ベクターである、請求項29に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項29又は請求項30のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
細胞が病原性の微生物である請求項31に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
治療目的に用いられる、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は請求項28に記載の接合体，又は請求項29に記載のベクター。
【請求項３４】
ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害する請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
【請求項３５】
微生物の生育を阻害、微生物を殺傷、または微生物による毒素の阻害又は分泌を阻害する、請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
【請求項３６】
抗菌、抗バクテリア、または抗真菌の目的に利用される請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
【請求項３７】
敗血症の治療に用いられる請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
【請求項３８】
微生物、バクテリア、真菌による病気を含め、微生物、バクテリア、真菌の感染の治療を目的とした薬剤製造のための、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクターの利用。
【請求項３９】
敗血症治療を目的とした薬剤製造のための、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクターの利用。
【請求項４０】
ＲＮＡポリメラーゼと、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、又は請求項29に記載のベクターとの接触によるＲＮＡポリメラーゼ活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害法。
【請求項４１】
ＲＮＡポリメラーゼと、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、又は請求項29に記載のベクターとの接触による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける病原性微生物の生育阻害、病原性微生物の殺傷、又は病原性微生物による毒素合成又は分泌の阻害方法。
【請求項４２】
前記微生物がバクテロイデス、フゾバクテリウム、腸管出血性大腸菌、肺炎桿菌、サルモネラ、赤痢菌、プロテウス、シュードモナス、ビブリオ、レジオネラ、ヘモフィルス、ボルデテラ、ブルセラ菌、カンピロバクター、ナイセリア、ブランハメラ等のグラム陰性菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ペプトコッカス、桿菌、リステリア、クロストリジウム、プロピオン酸菌等のグラム陽性菌、マイコバクテリア、トレポネーマ、レプトスピラ、ボレリア、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア、コクシエラを含めた、グラム染色ではほとんど、又は全く染まらない生物、また、カンジダ、アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、パラコクシジウム、スポロトリクム、接合菌を含む真菌から選択される請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項31に記載の宿主細胞、又は請求項41に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法。
【請求項４３】
請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクター、及び薬理学的に許容される希釈剤、補助薬、または担体を含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクター、及び、医薬剤又は抗炎症剤を含む敗血症治療用キット。
【請求項４５】
薬理学的に許容される希釈剤、補助薬、又は担体中にｒｂｌ−１[配列番号18]又はｒｂｌ−１インサート[配列番号19]の最小機能領域を処方する過程、及び微生物が最小機能領域と接触する過程からなる、敗血症に感染した個体の治療法。
【請求項４６】
さらに最小機能領域の発現を促進する過程を含む請求項45の治療法。
【請求項４７】
バクテリア病原体とｒｂｌ−１[配列番号18]又はｒｂｌ−１インサート[配列番号19]の最小機能領域を含む発現ベクターの接触過程、及び最小機能の発現誘導の過程からなる、バクテリア感染に対する治療法。
【請求項４８】
最小機能領域の発現が哺乳類、又はウイルスの逆転写酵素を用いて誘導される請求項47における方法。
【請求項４９】
バクテリア細胞と、ｒｂｌ−１[配列番号18]又はｒｂｌ−１インサート[配列番号 19]の最小機能領域を持つ発現ベクターとの接触過程、及び最小機能領域の発現誘導過程を含む、バクテリア細胞中でＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害する方法。
【請求項５０】
真核細胞のｔｅｔ誘導性プロモーター、前記プロモーターの3’側に位置する逆方向タンデム反復セット、前記逆方向タンデム反復セットの3’側に位置する、対象となる配列を挿入するためのクローニングサイト、クローニング際との3’側に位置するプライマー結合部位（PBS）、及び発現終結配列を持つ発現カセットを含む、真核生物の宿主中において、ｓｓ−ＯＤＮを発現するための、真核細胞ｓｓＤＮＡ発現ベクター。
【請求項５１】
さらに発現カセットの下流に位置するプライマー結合部位を認識する逆転写酵素をコードする遺伝子を含む請求項50に記載の真核細胞発現ベクター。
【請求項５２】
前記ベクターがｐｓｓＸＴｅである請求項51に記載の発現ベクター。
【請求項５３】
バクテリアＤＮＡ複製、転写、翻訳、又はタンパク質活性若しくは毒素の活性を阻害することにｓｓ−ＯＤＮとして関与する、ｓｓ−ＯＤＮ又はｄｓ−ＯＤＮ配列。
【請求項５４】
バクテリアＲＮＡポリメラーゼの通常の生物学的な活性を改変する請求項53に記載の配列。
【請求項５５】
バクテリアＲＮＡポリメラーゼの通常の生物学的活性を、ＤＮＡ転写、ＲＮＡプロセシング、又はＲＮＡ翻訳、またはタンパク質活性を妨げることにより改変する請求項53に記載の配列。
【請求項５６】
タンパク質の活性を阻害することでバクテリアＲＮＡポリメラーゼの通常の生物学的活性を改変する請求項53に記載の配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖抗菌オリゴヌクレオチド、及びその利用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
新規の抗菌治療法への需要が高まっている。多くの微生物感染は抗生物質治療を受けると、抗生物質耐性を増大させるため、新しい治療法が必要とされている。
様々な治療法が研究されているが、現在の開発は標的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の利用も含まれる。オリゴヌクレオチドを介した治療技術は、あらゆる配列既知の遺伝子の活性を変化させる、強力な手段である。選択された細胞において、あらゆる配列・長さの一本鎖ＤＮＡ合成が可能であることから、遺伝子発現をゲノムレベルで、メッセンジャーＲＮＡレベルで、そしてタンパクレベルで改変することが可能となった。
【０００３】
ＯＭＩ治療法の効率を決定する主要なパラメーターの一つは、標的部位へのアクセシビリティである。これまで、標的ｍＲＮＡにおいてアクセス可能な部位を決定する様々な方法が開発されている。通常、リニアショットガン法がアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択するために利用されてきた。この方法では、ｍＲＮＡの様々な領域を標的としたいくつかのオリゴヌクレオチドを個々に合成し、そのアンチセンス、ＤＮＡエンザイム、またはそのほかの活性（または標的部位に対する結合親和性）を測定する。しかしながら、通常適したアンチセンス試薬として認められるものは２〜５％に過ぎない。
【０００４】
活性のあるＯＭＩ試薬を同定するため、コンピューター・プログラムも利用される。ＭＦＯＬＤのようなＲＮＡフォールディング・プログラムを用いたＲＮＡの二次構造予測などが例に挙げられる。アンチセンスＯＤＮは、分子内ペアリングが無いと予想される部分に結合するように設計される。しかしながら、エネルギー計算に基づくＲＮＡの立体構造予測は、概してアンチセンス試薬を設計するには不十分であり、このような方法を用いた成功例は限られている。
【０００５】
リボヌクレアーゼＨ( ＲＮａｓｅＨ  )がアンチセンスにより触媒される効果にかかわるという証拠から、この酵素をｍＲＮＡにおいてアクセス可能な結合部位のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの同定に用いる方法が開発された。ＲＮａｓｅは、ＤＮＡ:ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するエンドヌクレアーゼである。ＲＮＡｓｅＨは、規定の長さの、あらゆるＯＤＮ一式で構成される無作為のＯＤＮライブラリーと組み合わせて利用可能である。
【０００６】
例えば、４０塩基長のＯＤＮについて約２．５６×１０６分子というように、長さＮのオリゴヌクレオチドについて、ライブラリーセットには、互いに異なるＮの４乗のＯＤＮが存在しうる。ライブラリーを構成するＯＤＮのうち、標的ＲＮＡのアクセス可能な部位に相補的であるものは、ＲＮＡとハイブリッドを形成し、ゲル電気泳動によってＲＮＡｓｅ Ｈ切断部位として同定される。ライブラリーセット中のほとんどのＯＤＮは、AAAA…AAAAのように、全く重要性が無いものであるが、ライブラリーセットを構成するＯＤＮは、特定の標的ｍＲＮＡに対し、少しでも下方制御の効果を示すか検定される。原核生物におけるテトラサイクリンシステムのように、制御された遺伝子発現系によって、選択的な遺伝子の発現抑制又は促進が可能となり、そのため遺伝子産物に関する情報を提供することが可能となる。
【０００７】
Ｊｉらは小ブドウ球菌のゲノムＤＮＡを切断して得られたＤＮＡ断片（２００〜８００塩基長）のライブラリーを構築した。ライブラリーを黄色ブドウ球菌に形質転換することで、無作為のアンチセンスＲＮＡ分子が生じた。この方法を用いて、Jiらは抗生物質の開発のための標的となりうる、重要な遺伝子を同定した。同様の方法はＦｏｒｓｙｔｈらによって黄色ブドウ球菌で用いられている。しかしながら、この方法は必須遺伝子の同定にのみ有効である。２００〜８００塩基長のＲＮＡは、以下の理由により医療目的には有用でないためである。すなわち、１）ＲＮＡ分子の不安定性 、２）２００から８００塩基長のサイズのＲＮＡ分子の合成が困難であること、及び ３）適切な細胞にＲＮＡを届けるという問題点がその理由である。
【０００８】
最近のＤＮＡ塩基配列決定技術の進歩によって、病原性バクテリアの全ゲノム配列を解明することが可能となった。また、それによって、バクテリアやその他の微生物が原因となって起こる病気を治療する特異的な遺伝的手段のデザインに有益な情報を提供することが可能となった。これらの手段は従来の抗菌療法の代替手段を与えるものであり、また、ウイルス、原虫、真菌類、マイコプラズマ、及びその他のバクテリア以外の感染体に対しても、同様に効果的な治療法の開発のための基礎を与えるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのため、本発明の目的は、一本鎖発現ベクターを含む無作為ライブラリーを構築する方法を提供することにある。
【００１０】
この一本鎖発現ベクターのライブラリーを発現することで細胞機能を改変し、細胞増殖が制御可能となるような新規ｓｓＤＮＡ配列又はＯＤＮ同定に利用することも、本発明の目的である。
【００１１】
本発明の他の目的は、細胞増殖、又は機能を制御するうえで標的となる、バクテリアの遺伝子、ＲＮＡ、タンパク質を同定する方法を提供するものである。これら同定された標的のうちには、バクテリア感染に対する新規の治療法開発の助けとなるものもある。
【００１２】
結果として、本発明の別の目的は、原核細胞内で新しく同定されたＯＤＮを恒常的、又は選択的な化学物質による誘導により発現できるベクターを提供するものである。
【００１３】
新規に同定されたＯＤＮを、同様に真核細胞の宿主においても発現できるベクターを提供することも、本発明の目的である。この場合には真核細胞のプロモーター一本鎖ＤＮＡの発現を制御する。このようなプロモーターは、誘導性のものでも、または恒常的に発現されるものでも可能である。
【００１４】
本発明の更なる目的は、テトラサイクリンシステムのように、普遍的かつ選択的誘導が可能な発現ベクターを用いて、原核細胞又は真核細胞において選択的な発現制御の方法を提供するものである。
【００１５】
本発明のもうひとつの目的は、本発明のスクリーニング法を行うことで同定された新規の抗バクテリア標的を検証し、表現型を改変する配列を、バクテリアに由来する疾患を治療する目的で利用することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、バクテリアの生育を制御すると同定された有用な配列を、治療薬の効果的な有効成分として利用されることを目的とし、提供することにある。    
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、抗生物質耐性バクテリアに対する代替療法の需要に対して、選択的に誘導可能な一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ)発現ライブラリーの構築とスクリーニングを伴う新規の方法を提供するものである。この発現ライブラリーは、原核細胞の宿主中において、ｓｓＤＮＡを発現するよう誘導可能なものである。開示される情報はｓｓＤＮＡ発現ライブラリーを構築する方法、及びライブラリーのスクリーニング法、機能的に有効な、バクテリア細胞生育、又は毒素の合成を制御できるｓｓＤＮＡ分子を同定する方法である。
【００１８】
本方法は、一定の長さの、無作為に並べられた一連のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）鎖を構築する過程と、一本鎖発現ベクターにこれらのＯＤＮをサブクローニングする過程を含む。この発現ベクターは細胞へと形質転換され、細胞内で発現を誘導される。個々の一本鎖ＯＤＮを発現できる細胞は、コロニーを形成するまで培養され、別個のコントロールと実験群に分離される。実験コロニー群はＯＤＮプロモーターの誘導に特異的な化学誘導物質を投与されＯＤＮを一本鎖の転写物として発現する。ｓｓ−ＯＤＮは細胞内の標的物質(ＤＮＡ,ＲＮＡ,又はタンパク質）と相互作用可能となり、必須の細胞構成物質との作用によって、細胞機能を改変する可能性がある。改変された細胞機能が目的とする表現型をもたらしていれば、改変された表現型を示すコロニーのＤＮＡから、問題となる表現型を形成するｓｓ−ＯＤＮのヌクレオチド配列そのものを同定することができる。
【００１９】
本方法は、転写、翻訳、又はタンパク機能のレベルにおいて、細胞機能を制御するために必須の原核・真核細胞構成物質を標的とするｓｓ−ＯＤＮを同定するために用いられる。病原体バクテリアに対して用いられた場合、本発明の方法によって、すべての病原性バクテリアの増殖を阻害する目的で抗菌療法での利用が可能となる。
【００２０】
一旦バクテリアの増殖制御に有効なｓｓ−ＯＤＮが同定されれば、そのＯＤＮは、真核細胞の発現系用に設計された、同様の一本鎖発現ベクターにクローニングされる。この二段階の真核細胞ＯＤＮ発現ベクターは、バクテリアに感染した患者、動物、又は植物の治療に用いられる。接種者は、真核細胞ＯＤＮ発現ベクターを投与され、宿主細胞にベクターが取り込まれると、宿主細胞がＯＤＮを発現する。一旦ｓｓ−ＯＤＮが発現されると、ホストの細胞間にＯＤＮが分泌され、標的バクテリア細胞に接触する。バクテリア細胞にＯＤＮが取り込まれ、バクテリアの細胞機能を制御する標的に作用して、バクテリア増殖、又はバクテリア毒素の合成を阻害する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１は、本発明のクローニングベクターの模式図である。図１(Ａ)に示されるクローニングベクターであるｐｓｓＸＧは、哺乳類のｓｓＤＮＡ発現ベクターｐｓｓＸＥを、ｐｓｓＸＥの発現カセット、バクテリアｔｅｔプロモーター、及びｔＲＮＡＶａｌにより結合される原核細胞のＰＢＳ配列（ＴＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＡＧ）を含む原核細胞のｓｓＤＮＡ発現ベクターとなるよう改変したものである。図１（Ｂ）に示されるように、クローニングベクターｐｓｓＸＴｅは、誘導可能な真核細胞ｔｅｔプロモーター下に、ｐｓｓＸＥのｓｓＤＮＡ発現カセットをサブクローニングして入れ込んだ真核細胞ベクターｐｃＤＮＡ／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) を含む。
【００２２】
図２は、ＤＨ５αｐｒｏ細胞内のａＴｃによる逆転写酵素（ＲＴ）の発現誘導を示す。標的となるＤＮＡエンザイムベクターであるｐｓｓＸＧｂを保持しているＤＨ５αｐｒｏ細胞は、０，１００,又は２００ｎｇのａＴｃ存在下で一時間（レーン１−３）、二時間（レーン４−６）、又は三時間（レーン７−９）培養された。ａＴｃ処理された細胞は、溶解され、ウエスタンブロット解析によってＲＴの発現を同定した。
【００２３】
図３は、ａＴｃ処理細胞において発現されたＲＴの活性を示す。この図３に示される活性は、ＣｈｅｎらによってＡｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, １０： ４１５.に記述されているように、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された。ＲＴ−ＰＣＲ産物を矢印で示す。
【００２４】
図４は、バクテリアにおけるＴｅｔ誘導を受けるｓｓＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングを示す。図４（Ａ）に示されるように、形質転換されたバクテリアは３４μg／ｍｌ Cm及び５０μg／ｍｌ Ｓｐｅｃ含有ＬＢ培地にて３７℃で一晩培養したのち回収された。このＬＢプレートは、誘導条件(２００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃ)及び非誘導条件（ａＴｃなし）のＬＢプレートにレプリカ培養された。矢印で示されたクローンＣＹ０１は、非誘導条件のＬＢプレートでは普通に生育する。しかし、誘導条件のプレートにおいては増殖しないため、更なる解析対象として選ばれた。図４（Ｂ）は，クローンＣＹ０１の致死表現型の確認を示す。クローンＣＹ０１細胞の表現型はＬＢ液体培地に細胞を再懸濁後、誘導条件、及び非誘導条件のプレートでの生育を再試験することで確認された。コントロール細胞はｐｓｓＸＧｂベクターのみを持つ。
【００２５】
図５は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成されたｒｂｌ−１によるバクテリア細胞増殖の阻害を示す。図５（Ａ）に示されるように、ｒｂｌ−１の発現誘導、及びバクテリア宿主細胞内で合成されたｒｂｌ−１によるバクテリア細胞増殖阻害効果は生存細胞数を測定することによって決定された。ＣＹ０１細胞は０，１０，５０，１００又は２００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ存在下で一時間培養された。サンプル１ｍｌが一時間後採取、希釈され、生存細胞数を測定される。三通りの適切な抗生物質を含むＬＢプレートプレートは３７℃で一晩培養したのち、目視検査によってコロニー数が数えられる。バクテリア細胞生育を四角で（ＣＹ０１細胞）、又は円で（コントロールＣＹ０１ｃ細胞）示す。図５（Ｂ）は、真核ＨｅＬａ宿主細胞内におけるｒｂｌ−１の発現による、ＨｅＬａ培養細胞へのバクテリア感染の阻害を示す。図５（Ｂ）の左に示されるように、ｒｂｌ−１を導入され、発現するＨｅＬａ培養細胞はＥ．ｃｏｌｉに感染しない。図５（Ｂ）の右は、ｒｂｌ−１を導入され、発現するＨｅＬａ培養細胞１０５ＣＦＵ／ｍｌのＣＹ０１細胞に感染したものを示す。ＨｅＬａ培養細胞として、０,５０，１００又は２００ｎｇ／ｍｌのａＴｃ存在下で一晩培養され他者を用いた。
【００２６】
図６は、ｒｂｌ−１結合タンパクの同定を示す。ｒｂｌ−１結合タンパクはアビジン-ビオチン法によって精製された。ＤＨ５αｐｒｏ細胞の溶解物を５００ｎｇビオチン化ｒｂｌ−１、ｒｂｌ−１c存在下、又は何も無い条件で培養した後、ストレプトアビジンアガロースビーズを添加した。ビーズに結合したタンパクを溶出し（５０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ  ＫＣｌ、及び４％グリセロール）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った。製造者の使用説明書に従いSilverQuest kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、銀染色法によってタンパク質を可視化した。矢印で示した分子量〜１６０ｋＤａのタンパク質について配列決定を行った。
【００２７】
図7は、ｒｂｌ−１による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡＰ活性の阻害を示す。ＲＮＡ産物は１％アガロースにて分離された。レーン１、ｒｂｌ−１を含まないコントロール；レーン２、０．５μＭ  ｒｂｌ−１;レーン３、０．２５μＭ  ｒｂｌ−１; レーン４、０．１２５μＭ  ｒｂｌ−１；レーン５、０．０５μＭ  ｒｂｌ−１；レーン６、０．５μＭ  コントロール ｒｂｌ−１ｃ。更に詳細には、本発明は、ｐｓｓＸＥ一本鎖発現ベクターシステムに基づき、一本鎖ＤＮＡの発現ライブラリーの構築することを意図している。
【００２８】
本発明においては、バクテリア宿主細胞内において一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド配列（ｓｓ−ＯＤＮ）の発現を誘導する新規の一本鎖発現ベクター、ｐｓｓＸＧが構築された。ｐｓｓＸＥベクターはｓｓ−ＯＤＮを真核の宿主細胞において発現誘導する目的で利用されていたが、同様のｓｓ−ＯＤＮの発現を原核の宿主細胞内でも達成するため、ｐｓｓＸＧは誘導性のテトラサイクリンプロモーター系、異なるプライマー結合部位（ＰＢＳ）を保持している。
【実施例１】
【００２９】
実施例１  誘導性原核ｓｓＤＮＡ発現ベクターの構築  
逆方向反復配列、興味の対象となる配列部位（ＳＯＩ）、逆転写酵素特異的プライマー結合部位、マウスマロニー逆転写酵素遺伝子を含む発現カセットのＰＣＲ増幅を、プラスミドｐｓｓＸＥをＰＣＲ鋳型として用いて行った。ＰＣＲ反応に用いたＤＮＡプライマー、５’ＮｈｅＩＰｖｕＩＡＴＧ
CTAGCTAGCTAGCGATCGATGGGACCAATGGGGCAG  [配列番号;１]
及び３’ＫｐｎＩ
CGGGGTACCAGTATTCCCTGGTC  [配列番号; 2]
を、総合ＤＮＡ技術（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅら、ＩＡ）に基づいて合成した。ｐｓｓＸＥベクターに関しては、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１３５９３にその構成と詳細な記述がなされている。また、ＰＣＲ増幅法に関しては、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７３３１に既に記述されている。どちらの出願書類も、参照することにより全体が本書のうちに組み込まれる。
【００３０】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片に、ＮｈｅＩ及びＫｐｎＩによる二重切断を行い、同様の酵素で二重切断したpｓｓＸＥベクターにサブクローニングした。原核細胞の遺伝子発現に必須ではない翻訳開始部位（ATG）上流の配列を置換し、新規にPvuＩの制限酵素サイトを入れ込んだ。新規に構築されたコンストラクトをPvuＩ及びXbaＩにより切断した。ｓｓＤＮＡ合成に必須の因子すべてを含むＰｖｕＩ−ＸｂａＩ断片は、１）不完全長かつ完全なRT活性を有するマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（ＭｏＭｕＬＶ  ＲＴ）をコードする遺伝子（Ｔａｎａｓｅ、Ｇｏｆｆ、ＰＮＡＳ，２０００、８５：１７７７−１７８１）;２）プライマー結合部位（ＰＢＳ）に加え、ＭｏＭｕＬＶ  ＲＴによる逆転写開始に必須の、プロモーター近傍部位（Ｓｈｉｎｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８１、２９３：５４３−５４８）;及び３）逆転写反応の終了のために設計されたステムループ構造を含む。これらすべては、本書に組み込まれた先述の国際出願番号ＰＳＴ／ＵＳ０４／０１７３３１に記述されている。このＤＮＡ断片はｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ  ２３３ベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）にサブクローニングされ、図１に示す新規に構築されたコンストラクトをｐｓｓＸＧと定めた。しかしながら、バクテリアｔＲＮＡＰｒｏの配列は、哺乳類ＰＢＳと結合するよう設計された哺乳類ｔＲＮＡＰｒｏの配列と異なる。バクテリアｔＲＮＡＶａｌはＲＴのプライマーとして利用できるため、哺乳類細胞で用いられたｐｓｓＸＥベクターのＰＢＳと置換する新規のＰＢＳを設計した。
【００３１】
新規ＰＢＳの配列は
TGGTGCGTCCGAG  [配列番号; 3]
であり、構築されたコンストラクトをｐｓｓＸＧｂとした。（図１Ｂ）
ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ２３３はテトラサイクリン誘導性に６ｘＨＮと融合タンパクを発現するバクテリア発現ベクターである。このベクターは新規プロモーターＰＬｔｅｔＯ１を利用している。このプロモーターは高度に特異的なＴｅｔリプレッサータンパク質により厳密に抑制される。テトラサイクリンの一種であるアンヒドロテトラサイクリン(ａＴｃ)によって誘導され、広範囲にわたる誘導を操作できる（アンヒドロテトラサイクリンはＰＲＯＴｅｔ．Ｅシステムにおいてより強力な誘導剤として働く、テトラサイクリンの誘導体である）。pｓｓXGbベクターを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Cm）と、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（spec）存在下において、バクテリア株ＤＨ５αＰｒｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）に形質転換した。
【００３２】
スペクチノマイシンを、ＴｅｔＲ(Ｌｕｔｚ、Ｂｕｊａｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５：１２０３−１２１０)をコードする転写ユニットを有するＤＨ５αＰｒｏ細胞を選択するために用いた。ＤＨ５αＰｒｏ細胞は、限られた量のＴｅｔリプレッサーを発現する。細胞の溶解物を、Ｂ−ＰＥＲ  ＩＩ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，  ）Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用い、メーカーの使用説明書に従って調整した。逆転写酵素（RT）の発現を、細胞溶解物を用いて、図２に示すようにＳｉｌｖｅｒら（Nucleic Aciｄｓ Ｒｅｓ．，  １９９３，２１：３５９３−３５９４）によるＲＴ活性測定、及び図３に示す、抗６ｘＨＮ抗体(ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ)を用いたウエスタンブロット解析によって確認した。
【実施例２】
【００３３】
実施例２. 誘導性ｓｓＤＮＡ又はｓｓＯＤＮ発現ライブラリーの構築
ライブラリーのインサートを、以下の３つのＯＤＮのアニーリングによって生成した。
ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０,
CTCTCACTCC(N)40ACTGTTGAAAGGC  [配列番号: 4]
ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｌ,
CGGAGAGTGAGG  [配列番号: 5]
及びＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｒ,
CTTTCAACAGT  [配列番号: 6]
モーラー比は１：２０：２０で行った。
【００３４】
ここで、“Ｎ”はＡ，Ｔ，Ｃ，又はＧの任意の塩基を表す。すなわち、４０塩基長の、無作為に合成された配列がＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０ＯＤＮと表される。すべてのＯＤＮを混合し、９５℃３分で変性したのち、ゆっくりとおよそ一時間、室温まで冷却した。ＣＹ（ＳａｃＩＩ）−Ｌ がＣＹ（ＳａｃＩＩ）−４０の左端に相補的であり、ＣＹ（ＳａｃＩＩ)−Ｒは同一のＯＤＮの右端に相補的であることから、アニーリング過程において、部分的に二本鎖ＯＤＮが形成される。アニールしたＯＤＮは部分的な二本鎖ＤＮＡを形成し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージ(クレノー)フラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ  ，  ＭＡ)を用いて残りの一本鎖のＮ塩基が埋められ、平滑末端化された。二本鎖ＤＮＡを新規に構築された原核ｓｓＤＮＡ発現ベクター、ｐｓｓＸＧｂにサブクローニングし、バクテリア細胞ＤＨ５αＰｒｏにエレクトロポレーションによって形質転換した。
【実施例３】
【００３５】
実施例３.ｓｓＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング
形質転換体を３４μｇ／ｍｌＣｍ及び５０μｇ／ｍｌのＳｐｅｃを含むＬＢプレートで３７℃一晩培養することにより回収した。このＬＢプレートをレプリカプレート法によって誘導条件（１００ｎｇ／ｍｌ  ａＴｃ）及び非誘導条件(ａＴｃ無し)のＬＢプレート上に写し取り、３７℃において一晩培養した。ＬＢプレート上で通常に生育し、なおかつ誘導条件のプレートでは生育しない、又は生育異常を示すコロニーを選択した。誘導剤による生育阻害効果は、選択されたコロニーの細胞増殖をと誘導による生育阻害を誘導条件、非誘導条件のプレート上で再試験することで確認された。およそ５０００の形質転換体についてスクリーニングを行った。総合で１２のコロニーがａＴｃ存在下で誘導性の生育阻害を持つものとして同定された。
それらのコロニー由来のプラスミドを分離した。そのインサートの配列は以下のとおりである。
【００３６】
【表１−１】
2008514204.tif 000003
【００３７】
【表１−２】
2008514204.tif 000004
【００３８】
なお，表中，「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ」は，配列番号を意味する。致死表現型はａＴｃ存在下において、クローンＣＹ０１で誘導されたが、残りの１１コロニーについては、生育異常が誘導された。致死表現型はＬＢ液体培地に細胞を再懸濁し、誘導条件、非誘導条件のプレートにおいて細胞の生育を再試験することによって確認された(図４)。６１ヌクレオチドのｒｂｌ−１インサート、ＣＹＧＸ０８０１０３から構成される、単離されたプラスミドをＡＳ０８０１０３と命名した。このインサートは以下の配列を有する。
CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G  [配列番号19]
この配列はもともとのライブラリーオリゴマー、配列番号4,5及び6に加えて、さらに無作為に合成され、ｒｂｌ−１と命名された前述の４０塩基長ＯＤＮ、配列番号18を含む。
コントロールベクターであるＣＹ０１ｃは、同一のベクターから成るが、ｒｂｌ−１に相補的な配列をコードする配列を有する。コントロールｒｂｌ−１cの二本鎖インサートは二つの相補的に合成されたＯＤＮをアニーリングすることで得られた。このＯＤＮの最終的な配列は
TAACTTTCAA CAGTTTTGAT GACCTTTGCT GACCATACAA TGCGATATC
GTGGGGAGTG AGAGT  [配列番号20]
である。
【実施例４】
【００３９】
実施例４.ｉｎ  ｖｉｖｏで合成されたｒｂｌ−１による、バクテリア細胞の生育阻害
ｒｂｌ−１の抗菌効果を更に解析するため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて合成されたｒｂｌ−１による生育阻害のａＴｃ投与量反応を調べた。ＣＹ０１細胞を様々な濃度のａＴｃ存在下(０，１０，５０，１００，又は２００ｎｇ／ｍｌ)において一時間培養し、生存可能な細胞を数えた。ｒｂｌ−１の相補鎖ｒｂｌ−１ｃを発現するよう構築されたベクターであるＣＹ０１ｃをコントロールとして用いた。図５から、ｒｂｌ−１による細胞の生育阻害はａＴｃ濃度依存であることが示される。しかしながら、ｒｂｌ−１ｃがコントロールのＣＹ０１ｃ細胞において合成された場合には有意な生育阻害が見られないことから、ｒｂｌ−１による阻害は配列特異的であり、ａＴｃ投与によるものではないことが示唆される。
真核細胞存在下におけるＲＢＬ−１の抗バクテリア能力を検討するため、ＣＹ０１細胞のＨｅＬａ細胞培地における生育をテストした。真核細胞存在下での抗菌能力はより生体への応用に関わるものである。ＨｅＬａ細胞培養液を、様々な濃度(０，１０，５０，１００，又は２００ｎｇ／ｍｌ)のａＴｃ存在下で１０５ＣＦＵ／ｍｌのＣＹ０１細胞に感染させた。図５に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌ、又はそれ以上の濃度のａＴｃを投与した場合、感染したＨｅＬａ培養液を完全に回復するために充分なコピー数のｒｂｌ−１が合成された。
【実施例５】
【００４０】
実施例５.ｒｂｌ−１の標的となる分子の同定
無作為に構築されたｓｓＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングを通して、抗バクテリアＯＤＮ、及びｒｂｌ−１が同定された。このｒｂｌ−１の抗菌活性の機構を理解するため、遺伝子配列の相同性解析を行った。ＲＢＬ−１のより小さな領域が既知のＧｅｎＢａｎｋ配列に相補性を持つと同定され、生体内において、ｒｂｌ−１ ＯＤＮが標的ｍＲＮＡにハイブリダイズして、アンチセンスの不活性化を行う標的の候補と考えられた。これらの、１０、又はそれ以上の塩基対相同性を持つより小さなＯＤＮを表１に示す。
【００４１】
表１  既知の標的ｍＲＮＡに対し相補的なｒｂｌ−１のサブ配列
【００４２】
【表２】
2008514204.tif 000005
【００４３】
発現ベクターはバクテリア細胞内において、Ｅ．ｃｏｌｉの遺伝子ｂｔｕＥ，ＣａｉＢに対して部分的なｒｂｌ−１配列を合成するように構築されたが、いずれも遺伝子レベルでばいかなる阻害効果も示さなかった。このことから、ｒｂｌ−１は重要なタンパク質、又はその他の構造分子を標的として阻害効果を示す可能性がある。ｒｂｌ−１の標的となる可能性があるタンパク質を同定するため、アフィニティー精製手順が開発された。ＤＨ５α細胞溶解物をビオチン化ｒｂｌ−１とともにインキュベートし、ストレプトアビジンアガロースビーズ上に固定した。ビーズ複合体を洗浄し、結合したタンパク質溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。コントロールとして、ｒｂｌ−１c又はアガロースビーズのみとインキュベートした細胞溶解物を用いた。図６に示すように、ｒｂｌ−１結合タンパク質のアフィニティープロファイルは、どちらのコントロールとも異なっており、分子量〜１６０ｋＤａのタンパク質（矢印で示す）が特異的にｒｂｌ−１に結合する。このタンパク質のバンドはＮａｎｏ−ＨＰＬＣ/エレクトロスプレー質量分析法によって解析された。表２は同定された３タンパク質のうち、３４個がＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいてバクテリアＲＮＡＰの２９箇所に局在しており、このことからＲＮＡＰが、ｒｂｌ−１に結合する可能性を持つタンパク質であることが示唆される。
【００４４】
表２  ｒｂｌ−１結合タンパク、ＲＮＡＰのペプチド配列
【００４５】
【表３−１】
2008514204.tif 000006
【００４６】
【表３−２】
2008514204.tif 000007
【実施例６】
【００４７】
実施例6.Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ｒｂｌ−１によるＲＮＡポリメラーゼ活性阻害
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼ活性を、ｒｂｌ−１又は最小機能領域が直接阻害するか検討するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写アッセイを行い、４０塩基長のｒｂｌ−１−ＯＤＮのＲＮＡポリメラーゼそのものに対する阻害効果を評価した。０．０５μＭより低い濃度では、ＲＮＡ産物は観察されたことから、この濃度では完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡポリメラーゼ活性を阻害するは出来ないことが示唆される。しかしながら、０．１２５，０．２５，０．５μＭでは、ｒｂｌ−１−ＯＤＮは著しく活性を阻害した。
【実施例７】
【００４８】
実施例7.ｒｂｌ−１の最小機能領域の同定
さらにｒｂｌ−１−ＯＤＮの活性阻害部分を同定するため、一連の不完全長ｒｂｌ−１オリゴヌクレオチドを合成し（表３）、その阻害活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ ＲＮＡポリメラーゼ活性測定によって評価した。様々な長さの３’側欠損不完全長ｒｂｌ−１オリゴが始めに合成された。５μＭの濃度においては、ｒｂｌ−１(１〜３５)及びｒｂｌ−１(１〜３０)のみが阻害活性を示し、ｒｂｌ−１(１〜２５)，ｒｂｌ−１（１〜２０）,及びｒｂｌ−１(１〜１５)は阻害活性を示さなかった(表３)。つづいて５’側欠損の効果について検討した。ｒｂｌ−１(２６〜４０)を除き、全ての不完全長ｒｂｌ−１オリゴはｒｂｌ−１(６〜４０),ｒｂｌ−１(１１〜４０),ｒｂｌ−１(１６〜４０),及びｒｂｌ−１(２１〜４０)を含め、活性型であった(表３)。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに基づき、ｒｂｌ−１の最小機能領域は７から４０のヌクレオチド長の範囲であり、ヌクレオチド２５〜３１、及びに好ましくはヌクレオチド２１〜３２全域を含む７から１５オリゴを含む。
【００４９】
表３  ＲＢＬ−１の最小機能領域（ＭＦＲ）の同定
【００５０】
【表４】
2008514204.tif 000008
【００５１】
ＲＮＡポリメラーゼに対するＯＤＮの阻害活性は、ゲル中のバンドの強度を可視化することで決定された。
++++,100%;+++,〜75%;++〜50%;+,〜25%; -, 検出不可能
【００５２】
表４  ｒｂｌ−１断片配列
【００５３】
【表５】
2008514204.tif 000009
【００５４】
当業者ならば、我々はｒｂｌ−１及び活性型最小機能領域が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて明らかにバクテリアＲＮＡポリメラーゼに結合し、その活性を阻害することを証明してはいるが、この機構のみによって、これらＯＤＮがバクテリア細胞生育阻害効果を与えていると推測するべきではないと評価するだろう。細胞内においては、ｒｂｌ−１及び最小機能領域は、その他の必須の核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、又はここに記述された生育阻害表現型の一因となる、他の必須成育制御化合物を含め、更なる細胞構成因子と相互作用している可能性がある。
【００５５】
当業者は、また、この開示から、ここに公開された配列に、実質的な相同性をもつ配列は同等の機能を持ち、そのため本発明の一部と見なされると認めるであろう。これに関して、配列が７０％もしくはそれ以上の塩基対塩基ヌクレオチド一致からなっている、又はここに記述されたアッセイに同様の機能活性を示す、また生育阻害とｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡポリメラーゼ活性の阻害に限らず、生育制御活性に関わる活性を示すならば、相同であると考えられる。
【実施例８】
【００５６】
実施例８．真核細胞ｓｓＤＮＡ発現ベクターｐｓｓＸＴｅの構築
真核細胞ｓｓＤＮＡ発現カセットをｐｓｓＸＥベクターから構築するため、タンパク質翻訳部位、ＡＴＧの上流にＸｈｏＩサイトが作られた。ＤＮＡ断片はＰＣＲ増幅によりｐｓｓＸＥベクターを鋳型として合成された。用いたプライマーは、
5’NheＩ  XhoＩ  XbaＩ  ATG，
CTAGCTAGCT AGCGATCGAT GGGACCAATG GGGCAG  [配列番号1]
及び3’ＫｐｎＩ，
CGGGGTACCAGTATTCCTGGTC  [配列番号2]
であった。増幅されたＰＣＲ断片をＮｈｅＩ及びＫｐｎＩで切断し、ＮｈｅＩ及びKpnＩで二重に切断されたｐｓｓＸＥベクターにサブクローニングした。得られた中間体プラスミドをｐｓｓＸＥ（ＮＸＸ）とした。ｓｓＤＮＡ発現カセットをｐｃＤＮＡ４/ＴＯ/ｍｙｃ-ＨｉｓＡ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した)にサブクローニングするため、ベクター中のＥｃｏＲＩサイトを破壊した。ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターを最初にＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて切断し、二本鎖オリゴを切断されたベクターにサブクローニングした。用いたオリゴは、５’ＢａｍＨＩＥｃｏＲＩ（ｍ）,
GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGT  [配列番号86]
及び３’−ＢａｍＨＩＥｃｏＲＩ（ｍ）,
GAATTACACC ACACTGGACT AGTG  [配列番号87]
の配列から構成される。
【００５７】
ｓｓＤＮＡ発現カセットはｐｓｓＸＥ（ＮＸＸ）よりＸｈｏＩ切断後に単離され、前述のように改変されたpcＤＮＡ４／ＴＯ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターのＸｈｏＩサイトにサブクローニングされた。ｓｓＤＮＡ発現カセットの正しい方向はＤＮＡ配列決定により確認され、新規に構築されたベクターはｐｓｓＸＴｅと命名された。ｐｓｓＸＴｅベクターは真核細胞においてａＴｃによって誘導されるｓｓＤＮＡ発現ベクターであり、従って真核細胞内でコントロールされたＯＤＮの誘導性発現が可能となる。ＯＤＮは真核細胞の標的に向けたものにも、又は動物宿主の真核細胞内で合成される原核細胞の標的物に向けたものにもなりうる。原核細胞の標的物は、血流中、又は発現の対象となる組織により、その他の体液中に分泌される。ここで抗菌ＯＤＮは病原体と接触し、細胞を殺傷又は不活性化、または血流に分泌されたバクテリア毒素を中和するために作用しうる。 
【００５８】
本発明は、バクテリア及び真菌性病原体に対処する新規戦略に関連し、選択されたＯＤＮと、それを合成するために用いられる発現プラスミドを治療薬として利用するものである。本発明のＯＤＮと発現プラスミドを利用してうまく治療される病気の一例に、敗血症が挙げられる。本発明に従って治療されうる、敗血症の原因となる微生物の例は、肺、腹部、血流、皮膚、軟組織、への感染を引き起こすもの、血管内組織に関わる感染、呼吸器感染を引き起こすものを含み、これらのみに限らず本発明に従って治療可能である。本発明にしたがって治療可能なその他の微生物の例は、バクテロイデス、フゾバクテリウム、腸管出血性大腸菌、肺炎桿菌、サルモネラ、赤痢菌、プロテウス、シュードモナス、ビブリオ、レジオネラ、ヘモフィルス、ボルデテラ、ブルセラ菌、カンピロバクター、ナイセリア、ブランハメラ等のグラム陰性菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ペプトコッカス、桿菌、リステリア、クロストリジウム、プロピオン酸菌等のグラム陽性菌、マイコバクテリア、トレポネーマ、レプトスピラ、ボレリア、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア、コクシエラ等の、グラム染色ではほとんど、又は全く染まらない生物、また、カンジダ、アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、パラコクシジウム、スポロトリクム、接合菌等の真菌を含み、またこれらのみに限らない。微生物が原因である、又は一因となって起こる病状の治療法として用いられる場合、ｒｂｌ−１の最小機能領域は、特定の病状、原因、又は一因となっている病原体、感染した個体のタイプ（人間対動物）、感染した個体の病状、また前述の開示から、当業者には明らかな他の因子にしたがって、次に挙げられる様々な方法に持ちられるだろう。例として、ｒｂｌ−１の最小機能領域は、感染した開放創に好ましい希釈液又は担体に含まれる多コピーの最小機能領域からなるプラスミドを噴霧、又は浸して投与できる。
【００５９】
例えばバクテリア又は真菌の肺感染の場合、懸濁液はエアロゾル、又は感染個体による吸入により投与されうる。最小機能領域が、懸濁された配列、懸濁されたプラスミド又は他の発現ベクターとして、または技術的に既知のその他多くの方法で投与されるかに関わらず、補助薬剤、及び他の治療薬（抗バクテリア、又は抗真菌性のような）も、希釈液、又は担体中に効果を向上させるため利用することができる。
【００６０】
当業者は、また最小機能領域は微生物細胞の増殖、または機能を改変する能力により選択されたペプチドと共役させて用いることも可能であると認めるであろう。例として、微生物が原因、または一因となる病気の治療のために、バクテリア標的ペプチドKFFKFFKFFK， FFKFFKFFK， LLKLLLKLLLK， KKFVKFVVKKC， FFRFFRFFR， LLKLLKLLK  、その他の微生物標的ペプチド、自然発生的な、又は改変されたアミノ酸からなるそれらのホモログ、派生物（Brogden，NatureOnlineReviews，doi：10．1038／nrmicrolO98，Feb．10，2005；Kaihatsu，ら．，Biochem43：14340，2004；Varra、Porro, Antimicrobial Agents  and  Chemo  40：1801，1996；U．S．PatentNos・5，652，211，5，864，010，及び6,548，651；及びWO
2004/024757）を共役させて有効に利用できる。
【００６１】
当業者は、この開示から、意図した結果を達成するために構成要素又は過程が機能する様式を変更することなく、本発明の構成部分または過程に変更を加えることが可能であると認識するであろう。このようなすべての改変、またはこの発明に関する記述から当業者に明らかなものは、以下の請求の範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、一本鎖抗菌オリゴヌクレオチド、及びその利用などに関する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明のクローニングベクターの模式図である
【図２】図２は、ＤＨ５αｐｒｏ細胞内のａＴｃによる逆転写酵素（ＲＴ）の発現誘導を示す。
【図３】図３は、ａＴｃ処理細胞において発現されたＲＴの活性を示す。
【図４】図４は、バクテリアにおけるＴｅｔ誘導を受けるｓｓＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングを示す。
【図５】図５は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生成されたｒｂｌ−１によるバクテリア細胞増殖の阻害を示す。
【図６】図６は、ｒｂｌ−１結合タンパクの同定を示す。
【図７】図7は、ｒｂｌ−１による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＮＡP活性の阻害を示す。
【図１】
2008514204.tif 000010
【図２】
2008514204.tif 000011
【図３】
2008514204.tif 000012
【図４】
2008514204.tif 000013
【図５】
2008514204.tif 000014
【図６】
2008514204.tif 000015
【図７】
2008514204.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月20日(2007.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｒｂｌ−1関連配列,及びそれらのホモログから選択される配列を含む、単離された、オリゴヌクレオチド。
（ｒｂｌ−１インサート）  CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G  [配列番号：19]，
（ｒｂｌ−１）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATATCGTGG  [配列番号： 18]，
（01-35）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATAT  [配列番号: 71]，
（01-30）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC  [配列番号: 72]，
（01-25）  TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACA  [配列番号: 73]，
（01-20）  TTTGATGACC TTTGCTGACC  [配列番号: 74]，
（01-15）  TTTGATGACC TTTGC  [配列番号: 75]，
（06-40）  TGACCTTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 76]，
（11-40）  TTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 77]，
（16-40）  TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 78]，
（21-40）  ATACA ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 79]，
（26-40）  ATTGCGATAT CGTGG  [配列番号: 80]，
（21-30）  ATACA ATTGC  [配列番号: 81]，
（21-32）  ATACA ATTGC GA  [配列番号: 82]，
（21-34）  ATACA ATTGC GATA  [配列番号: 83]，
（21-36）  ATACA ATTGC GATATC  [配列番号: 84]，又は
（21-38）  ATACA ATTGC GATATCGT  [配列番号: 85]。
【請求項２】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
さらに誘導性のプロモーターを有する請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項４】
下流の結合部位を認識する逆転写酵素をコードする遺伝子をさらに含む請求項2に記載の発現ベクター。
【請求項５】
ｔＲＮＡＶａｌの存在下において前記逆転写酵素によって認識されるプライマー結合部位を更に含む請求項4に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項2に記載の発現ベクターが導入され、前記ベクターを保持する細胞。
【請求項７】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドと、ペプチドとを含む接合体（コンジュゲート）。
【請求項８】
前記ペプチドがバクテリアを標的物としたペプチド、そのホモログ、又はその誘導体である請求項7に記載の接合体。
【請求項９】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチドを含む、プラスミド、プラスミド誘導体、又はミニサークル。
【請求項１０】
ｔＲＮＡＶａｌの存在下において前記逆転写酵素によって認識されるプライマー結合部位を更に含む請求項9に記載のプラスミド、プラスミド誘導体、又はミニサークル。
【請求項１１】
プラスミドｐｓｓＸＴｅ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドが導入され、前記プラスミドを保持する細胞。
【請求項１３】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、及び、
薬理学的に許容される希釈剤、アジュバンド、または担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項1に記載のオリゴヌクレオチド、及び、
そのほかの医薬剤又は抗炎症剤を含む敗血症治療用キット。
【請求項１５】
病原性微生物と、請求項2に記載の発現ベクターとを接触させる工程を含む、
病原性微生物の生育を阻害する方法、病原性微生物を殺傷する方法、病原性微生物による毒素合成又は分泌を阻害する方法。
【請求項１６】
前記病原性微生物は、敗血症の原因物質を含む請求項１５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008514204000001.app
【国際調査報告】
2008514204.tif 000017
2008514204.tif 000018
2008514204.tif 000019
2008514204.tif 000020