(57)【要約】  本発明は、改善された安定性および改変された活性化配列を有するヒト第Ｘ因子をコードする改変ｃＤＮＡ配列およびそれらの誘導体、このようなｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、ならびにこのような組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞に関する。本発明はまた、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有することは有するが改善された安定性を有する組換え第Ｘ因子ポリペプチドおよび誘導体、ならびにこのような組換えタンパク質およびそれらの誘導体を製造するための方法に関する。本発明はまた、このような改変されたＤＮＡを含むヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体であって、改変の一つは、プロテアーゼによって切断される部位が追加で挿入されることからなり、追加の切断部位は、第Ｘ因子の重鎖中のＩｌｅ２３５のＣ末端側に挿入される、上記変異体。
【請求項２】
プロテアーゼによって追加の切断部位が切断されると、活性化が起こる、請求項１に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項３】
プロテアーゼは、天然には第Ｘ因子を活性化しない、請求項１または２に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項４】
天然で第Ｘ因子を活性化するプロテアーゼによって第Ｘ因子変異体をもはや切断および活性化ができなくなるように、天然の第Ｘ因子活性化ペプチドが改変される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項５】
挿入されたプロテアーゼによって切断される部位によって、セリンプロテアーゼによる改変された第Ｘ因子変異体の活性化が可能になる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項６】
挿入されたプロテアーゼによって切断される配列は、第ＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、活性化されたプロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインによる改変された第Ｘ因子変異体の活性化を可能にする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項７】
挿入された切断される部位は、少なくとも３個のアミノ酸を包含する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項８】
第Ｘ因子変異体は、天然に存在する第Ｘ因子の切断される活性化ペプチド配列内に改変を含む第Ｘ因子変異体と比較して、増強された止血バイパス活性を有しており、この改変は、天然には第Ｘ因子配列のこの領域を切断しないプロテアーゼのプロセシング部位を表し、追加の切断部位が切断されると第Ｘ因子変異体が活性化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項１０に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１２】
ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである、請求項１０に記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１３】
請求項９に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の宿主細胞を、改変された組換え第Ｘ因子変異体を発現するような条件下で培養すること；および、
場合により、該宿主細胞または培地から改変された組換え第Ｘ因子変異体を回収すること、
を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体の生産方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体、請求項９に記載のポリヌクレオチド、または請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のプラスミドまたはベクターを含む医薬組成物。
【請求項１６】
血液凝固障害を治療または予防する医薬を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項１４に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１７】
血液凝固障害は、血友病Ａである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
血友病Ａは、ＦＶＩＩＩに対する自己抗体によって引き起こされるか、または悪化する、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
血液凝固障害は、血友病Ｂである、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
血友病Ｂは、ＦＩＸに対する自己抗体によって引き起こされるか、または、悪化する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
血液凝固障害は、ＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａ欠損症である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
ＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａ欠損症は、ＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａに対する自己抗体によって引き起こされるか、または悪化する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
治療は、ヒトの遺伝子治療を含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
凝血を促進する特性を有する医薬を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体、請求項９に記載のポリヌクレオチド、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、または請求項１３に記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化のために第ＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ因子、または第ＶＩＩａ／ＴＦ因子のいずれかの必要性をバイパスすることができる、第Ｘ因子ポリペプチド、具体的にはヒト第Ｘ因子およびその誘導体をコードする改変ｃＤＮＡ配列に関する。本発明はさらに、このような改変ｃＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞、改変されていない野生型タンパク質の生物活性を有することは有するが変化した活性化特性を有する組換えポリペプチドおよび誘導体、ならびにこのような組換えタンパク質およびそれらの誘導体を製造するための方法に関する。本発明はまた、ヒトの遺伝子治療に使用するための、このような改変されたＤＮＡ配列を含むトランスファーベクターも含む。
【背景技術】
【０００２】
特定の型の血友病を治療するために、ビタミンＫ依存性タンパク質が用いられる。古典的血友病すなわち血友病Ａは、遺伝性出血性疾患である。これは、Ｘ染色体連鎖の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏によって生じるほぼ例外なく男性に影響を与える疾患であり、１０,０００人あたり１〜２人の発生率を有する。Ｘ染色体異常は、本人は血友病者ではない女性キャリアーによって伝達される。血友病Ａの臨床症状は、高い出血傾向である。第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤での治療が導入される前は、重症血友病に罹った人の平均寿命は２０年未満であった。血漿由来の第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤、その後は組換え型第ＶＩＩＩ因子の濃縮製剤を使用するようになってから、血友病患者の平均寿命が大幅に長くなり、患者の多くが程度の差はあるが普通の生活を送ることができるようになり、血友病患者の状況は顕著に改善された。血友病Ｂは、血友病Ａの５分の１の有病率であり、第ＩＸ因子が機能しなかったり、または欠損していたりすることに起因するものであって、これは、血漿由来の第ＩＸ因子濃縮製剤、または組換え型の第ＩＸ因子で治療される。血友病Ａと血友病Ｂの両方において、これらの病気を治療する上で最も深刻な医学的問題は、補充された因子に対する同種抗体の発生である。全血友病Ａ患者の３０％までが、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を発生させている。ＦＩＸに対する抗体は、発生する程度が少ないが、免疫寛容導入療法の作用を比較的受け難いため、より重症な状態を伴う。
【０００３】
現在の凝固のモデルによれば、凝固の生理学的なきっかけは、通常血管系の外側に位置し、傷害が生じたときのみ利用可能になる組織因子（ＴＦ）の発現細胞の表面上でのＴＦと第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）との複合体の形成にあることが示されている。第ＶＩＩａ／ＴＦ因子の複合体は、第ＩＸ因子と第Ｘ因子を活性化し、最終的にはある種のトロンビンが生成する。正のフィードバックループにおいて、トロンビンは、第ＶＩＩＩ因子と第ＩＸ因子を活性化し、それに続いて、いわゆる血液凝固カスケードの「内因性の」アームである第Ｘ因子も活性化することによって、完全な血流遮断を達成するために十分なトロンビンバーストの発生に必要なＸａ因子の生成が増幅される。超生理学的な濃度のＦＶＩＩａを投与することによって、第ＶＩＩＩａ因子と第ＩＸａ因子を必要とする経路を回避して血流遮断が達成されることが示された。第ＶＩＩ因子に関するｃＤＮＡのクローニング（ＵＳ４,７８４,９５０）によって、血漿由来の凝固因子の代わりに組換え型を開発することが可能になった。この第ＶＩＩａ因子の、高力価のＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を有する患者への投与は、１９８８年に初めて成功した。それ以来、第ＶＩＩａ因子の適応の数は着実に増え続けており、これは、第ＶＩＩａ因子が、万能な止血薬となる可能性を示している（Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎ，２００２）。遺憾ながら、第ＶＩＩａ因子は、２時間をわずかに超える程度の血漿中半減期しか有さないため、頻繁に再投与する必要があり、このことはこのような治療を侵襲的で、極めて費用がかかるものとする。
【０００４】
従って、改善された凝固因子、特に止血バイパス薬（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ ）のようなものに対する必要性が引き続き存在する。止血バイパス薬とは、ある種の凝固因子が阻害抗体によって失われた、機能しなくなった、またはブロックされた患者に投与して、凝固を起こさせる物質である。このような化合物の凝固カスケードにおけるブロックを迂回する活性（止血バイパス活性）は、当該技術分野で既知の凝固分析によって測定することができる。実質的に止血バイパス薬は、失われた、機能しなくなった、またはブロックされた凝固因子の基質、または失われた、機能しなくなった、またはブロックされた凝固因子の「下流」にある凝固カスケードにおけるその他の基質を、失われた、機能しなくなった、またはブロックされた凝固因子が有効なトロンビン生成に必須でなくなるような直接的な方法で活性化する能力を有する。
【０００５】
また第Ｘ因子は、広範囲研究の主題でもある。
【０００６】
第Ｘ因子のｃＤＮＡは、特徴付けられている（Ｌｅｙｔｕｓ等，１９８４，ＰＮＡＳ，８２：３６９９〜３７０２）。第Ｘ凝固因子は、分子量５８.５ｋＤａを有するビタミンＫ依存性糖タンパク質であり、これは肝細胞から血漿にチモーゲンとして分泌される。最初に、第Ｘ因子は、総数４８８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドと共にプレプロペプチドとして生産される。このシグナルペプチドは、小胞体に輸出される間にシグナルペプチダーゼによって切断され、プロペプチド配列は、成熟したＮ末端鎖のＮ末端における最初の１１グルタミン酸残基でガンマカルボキシル化が起こった後に切断される。さらなるプロセシング工程が、Ａｒｇ１８２とＳｅｒ１８３との間の切断によって起こる。またこのプロセシング工程によって、トリペプチドＡｒｇ１８０−Ｌｙｓ１８１−Ａｒｇ１８２の欠失も付随して起こる。その結果得られた分泌された第Ｘ因子チモーゲンは、１３９個のアミノ酸からなるＮ末端軽鎖（Ｍr１６,２００）、および３０６個のアミノ酸からなるＣ末端重鎖（Ｍr４２,０００）からなり、これらはＣｙｓ１７２とＣｙｓ３４２とのジスルフィド架橋を介して共有結合している。さらなる翻訳後プロセシング工程は、Ａｓｐ１０３のβ−水酸化、それに加えてＮ−およびＯ−型のグリコシル化を含む。
【０００７】
第ＶＩＩＩａ因子／第ＩＸａ因子、または第ＶＩＩａ／ＴＦ因子はいずれも、生理学的条件下で、Ａｒｇ２３４のカルボキシ末端側を切断して、Ｓｅｒ１８３からＡｒｇ２３４までの５２個のアミノ酸からなるいわゆる活性化ペプチドを遊離させることによって、活性化された血小板表面上で第Ｘ因子を活性化することができる。
【０００８】
自己触媒による切断において、活性化された第Ｘ因子（Ｘａ因子）は、その重鎖のＣ末端部分中のＡｒｇ４６４のカルボキシル末端側の小さいフラグメントを切断して、それによりＸａβ因子が生じる。しかしながら、Ｘａ因子の両方の形態は同程度の触媒活性を有するため、この切断の生理学的な関連性は明らかではない。
【０００９】
第Ｘ因子を改変するいくつかの試みがなされている：
Ｗｏｌｆ等，１９９１（ＪＢＣ，２６６，第２１巻，１３７２６〜１３７３０頁）は、第Ｘ因子の活性化ペプチドを欠失させ、その代わりに、ジペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓで置換することによって、第Ｘ因子の活性化ペプチドの領域内に２個の新規なフューリン切断コンセンサス部位の導入が起こる。このような第Ｘ因子変異体は細胞内プロセシングの際に活性化され、それによって活性化された第Ｘ因子が分泌される。
【００１０】
Ｗｏｌｆ等，１９９５（Ｂｌｏｏｄ，８６，４１５３〜４１５７頁）は、Ｘａ因子のアシル化した不活性な変異体を生産しており、これは、血漿に注入した後ゆっくり脱アシル化され、それによって第Ｘ因子の活性化が長期にわたって起こる。
【００１１】
Ｒｕｄｏｌｐｈ等，１９９７（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉ．，１０：３７３〜３７８）は、プロペプチド切断部位の領域における第Ｘ因子を改変したところ、Ｔｈｒ３９をＡｒｇで置換すると、細胞培養におけるプロペプチドのプロセシングの有効性が顕著に改善されることが見出された。
【００１２】
Ｃａｍｉｒｅ等，２０００（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９  ｐｐ．１４３２２〜１４３２９）は、第Ｘ因子のプレプロペプチドをトロンビンのプレプロペプチドで置換することによって、細胞培養においてより高い程度のガンマカルボキシル化を達成した。しかしながら、ガンマカルボキシル化の速度は増加したが、第Ｘ因子の１０〜３０％がカルボキシル化されないままであった。
【００１３】
Ｒｕｄｏｌｐｈ等，２００２（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，８８：７５６〜６２）は、活性化ペプチドが欠失した第Ｘ因子変異体を作出した。このような第Ｘ因子変異体は、補因子とは独立した方法で自己活性化されたことが観察でき、この論文では、活性化ペプチドの主要な機能は、擬似的なＦＸ活性化を予防することであると結論付けている。
【００１４】
Ｔｈｉｅｃ等，２００３（ＪＢＣ，１２，１０３９３〜１０３９９頁）は、第Ｘ因子のＧｌａドメインおよび第一のＥＧＦドメインを、ＦＩＸのそれに対応するドメインで置換することによって、このようなキメラがＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体と生産的に相互作用する能力を調査した。
【００１５】
ＷＯ９８／３８３１７（優先権：１９９７年２月２７日）は、通常は第Ｘ因子を活性化しないプロテアーゼが、以下の第Ｘ因子類似体を切断し、活性化できるように、Ｇｌｙ２２８とＩｌｅ２３５との間の天然の活性化切断部位の部位において改変された第Ｘ因子類似体を特許請求している。
【００１６】
ＷＯ９８／３８３１８（優先権：１９９７年２月２７日）は、通常はＦＸを活性化しないプロテアーゼが改変された配列を切断可能にすることによって、上述の第Ｘ因子類似体が活性化されるように、アミノ酸Ａｒｇ１８０〜Ａｒｇ２３４を欠失させ、アミノ酸Ｇｌｙ１７３〜Ａｒｇ１７９を改変した第Ｘ因子類似体を教示している。
【００１７】
ＷＯ０１／１０８９６（優先権：１９９９年８月１０日）は、Ｇｌｕ２２６〜Ｉｌｅ２３５のアミノ酸のうち少なくとも１個が置換された第Ｘ因子類似体を記載している。実施例において、ＦＩＸによって誘導された活性化切断部位を導入することによって、ＦＸＩによって切断可能な第Ｘ因子変異体が生成することが示されている。
【００１８】
ＷＯ０３／０３５８６１（優先権：２００１年１０月１９日）は、活性化ペプチドを除去してフィブリノペプチドＡのアミノ酸Ｐ10〜Ｐ1で置換した第Ｘ因子の変異体を特許請求しており、該変異体において、キメラトロンビン切断部位を作出することによって、これをトロンビンによって活性化可能な第Ｘ因子変異体にすることができる。
【００１９】
ＷＯ２００４／００５３４７（優先権：２００２年７月０３日）は、野生型の第Ｘ因子Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙにおける残基Ｐ3−Ｐ2−Ｐ1−Ｐ1’−Ｐ2’−Ｐ3’を、Ｘ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｙ−Ｚに改変することによる、トロンビンによって活性化することができる第Ｘ因子の変異体を教示している。
【００２０】
Ｖｏｌｋｅｌ等（２００５），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９（１）：１９〜３０は、前立腺特異抗原がＦＸ変異体を特異的に活性化するように、ＦＸ活性化ペプチドに新規のプロテアーゼによって切断される部位を導入することを教示している。
【００２１】
数人の著者が、活性化された第Ｘ因子（ＦＸａ）は、止血バイパス薬として使用できるかもしれないと示唆しているが（Ｎｉ等，１９９２（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６７：２６４〜２７１）；Ｈｉｍｍｅｌｓｐａｃｈ等，２００２（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８８：１００３〜１０１１））、このような医薬製剤は血栓形成の可能性があり、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）を引き起こしかねないといういくつかの懸念が残っている。
【００２２】
非活性化チモーゲンの第Ｘ因子を治療で使用することは、ずっと安全なアプローチのようである。米国特許第４,５０１,７３１号（優先権：１９８３年６月２７日）は、第Ｘ因子をそれ自体だけで止血バイパス薬として使用することを示唆している。ＷＯ０３／００６０５４（優先権：２００１年７月１０日）では、それに加えて、医薬組成物中の第Ｘ因子をＦＶＩＩａと組み合わせて、ＦＶＩＩａの止血因子の有効性を相乗的に増強できることが示されている。
【００２３】
しかしながら、内因性の凝固経路を介した第Ｘ因子の活性化の有効性は、阻害作用を受けた患者において著しく低下するが、それに対して外因性の凝固経路（組織因子の利用可能性が制限されることによる）は、凝固の開始時のフェーズに限定されるようであるため、凝固が要求されている状況における第Ｘ因子の活性化が促進されるような方法で第Ｘ因子を改変すること、および利用可能性および／または活性が限られた補因子の必要性をバイパスすることは有利である。変異第Ｘ因子のチモーゲンは、活性化なしで生成および投与が可能であるが、凝固活性（例えばトロンビン生成）が必要な状況では、内因性および外因性の凝固経路の天然のアクチベーターを必要とすることなくより速い速度で活性化が起こるように安定でなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
数人の著者が、天然でのＦＸの切断や活性化ではなく、プロテアーゼによって活性化することができる第Ｘ因子変異体の生産を試みたことを記載している。これらの第Ｘ因子変異体は、活性化ペプチドの欠失、および／またはＡｒｇ２３４における切断部位の前の活性化ペプチドの配列の改変のいずれかからなり、さらに場合によりＩｌｅ２３５を改変してもよい。また、第Ｘ因子の活性化ペプチドの主要な作用は、ＦＸａへの自己活性化を予防することであることも示されているように（Ｒｕｄｏｌｐｈ等，２００２（Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，８８：７５６〜６２）、活性化ペプチドの欠失および改変を有する第Ｘ因子変異体は、時期尚早の活性化を受けやすい。従ってこのようなＦＸ変異体を含む医薬組成物は、血栓形成の危険を伴う可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明で扱われる問題の一つは、止血バイパス薬を同定することである。特に、高力価の第ＶＩＩＩ因子インヒビターを有する患者を治療するのに用いることができる止血バイパス薬が要望されている。
【００２６】
本発明において、驚くべきことに、増強された止血バイパス活性を有する生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、追加のプロテアーゼによって切断される部位を、第Ｘ因子の重鎖中のＩｌｅ２３５のＣ末端側に挿入することによって得ることができることが見出された。この追加のプロテアーゼによって切断される部位は、ヒトのタンパク質、加えてその他の哺乳動物のタンパク質から誘導することができる。
【００２７】
本発明の一形態は、改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体であり、ここにおいて、改変の一つはプロテアーゼのための追加の切断部位の挿入からなり、ここにおいて、この追加の切断部位は、第Ｘ因子の重鎖中のＩｌｅ２３５のＣ末端側に挿入される。前記プロテアーゼにより追加の切断部位が切断されることによって、第Ｘ因子変異体の活性化が起こり、加えて、天然の切断部位が切断されることによって活性化される可能性もある。本発明の第Ｘ因子変異体は、追加の改変を有していてもよく、特に第Ｘ因子配列の他の領域における追加の改変である。従って、配列番号２で示されるように、第Ｘ因子の重鎖への挿入は、野生型配列と比較されるようなアミノ酸配列へのいくつかの改変のうちの１種であってもよい。
【００２８】
本発明のその他の形態において、改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体中の天然の第Ｘ因子活性化ペプチドは、天然で第Ｘ因子を活性化するプロテアーゼが、前記第Ｘ因子変異体を切断および活性化ができなくなるように改変される。これは、第Ｘ因子の活性化ペプチド配列に突然変異を導入することによって達成することもできる。突然変異としては、挿入、欠失および置換が挙げられる。好ましくは、天然で第Ｘ因子を活性化するプロテアーゼが、前記第Ｘ因子変異体を切断および活性化ができなくなり、追加の切断部位によってのみ活性化が起こるような、活性化ペプチド配列における欠失および／または置換である。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記改変された第Ｘ因子変異体の重鎖における新規のプロテアーゼによって切断される部位は、セリンプロテアーゼによって切断可能である。より好ましくは、セリンプロテアーゼは、第ＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、活性化されたプロテインＣ、エラスターゼ、またはカリクレインからなる群より選択される。これらのセリンプロテアーゼによって認識され、切断されるアミノ酸配列は当業者既知である（例えば、第四版，Ｃｏｌｍａｎ等．２００１の“Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”に記載されているような、第ＩＩａ因子：３４〜３５頁、１７６頁、第ＩＸａ因子：４０〜４１頁、Ｘａ因子：３４〜３５頁、第ＸＩａ因子：１２８〜１２９頁、第ＸＩＩａ因子：１９４頁、ａＰＣ：３４〜３５頁、１５９頁、カリクレイン：１０３〜１０４頁であり、またはエラスターゼ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等，１９９９；Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｐｉｎ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５，１９２６〜１９２８）である）。
【００３０】
第Ｘ因子の重鎖への挿入物は、切断に必須ではない１個またはそれ以上の追加のアミノ酸を含んでもよい。これらの追加のアミノ酸は、挿入物のＮ末端および／またはＣ末端に存在していてもよい。従って、重鎖への挿入物は、以下の式で示すことができる：
−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−
【００３１】
式中、Ｐは、切断のためのプロテアーゼによって認識され、切断されるアミノ酸配列（すなわち切断部位）を示し、
Ｒ1は、化学結合、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸（例えば、１〜１０個のアミノ酸）を示し、および
Ｒ2は、化学結合、または１個もしくはそれ以上のアミノ酸（例えば、１〜５個のアミノ酸）を示す。
【００３２】
Ｐは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは２０個以下のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、Ｒ1は、化学結合であるか、または１、２もしくは３個のアミノ酸からなる。さらに好ましくは、Ｒ2は、化学結合であるか、または１もしくは２個のアミノ酸からなる。最も好ましくは、新たに導入されたプロテアーゼによって切断される部位が切断された場合、切断される化学結合のＣ末端側のアミノ酸は、イソロイシンである。また、好ましくは、前記イソロイシンの代わりにバリンである。前記イソロイシンの代わりのその他の好ましいアミノ酸のＣ末端は、アラニン、セリン、またはスレオニンである。
【００３３】
重鎖に挿入が可能な適切なアミノ酸配列としては、これらに限定されないが、セリンプロテアーゼが認識し、切断することができる配列が挙げられ、例えば以下の表１に列挙されたような配列である：
【表１】
2008541742.tif 000002
【００３４】
挿入されたアミノ酸配列（−Ｒ1−Ｐ−Ｒ2−）は、少なくとも３個のアミノ酸を包含する。好ましくは、上記切断部位を含むアミノ酸の挿入物は、３〜５０個、より好ましくは４〜３０個、より好ましくは４〜２０個、最も好ましくは５〜１５個からなる。さらに本発明は、プロテアーゼによって切断される部位のフラグメントも包含し、例えばプロテアーゼによって第ＩＸ因子から切断される部位（表１の配列番号２２〜配列番号３１）の一連の欠失突然変異体が挙げられ、ただし、このようなプロテアーゼによって切断される部位のフラグメントを含むＦＸ変異体がなお切断を受けやすく、さらに該ＦＸ変異体がなお生物活性を有する場合である。
【００３５】
好ましい一実施態様において、追加の切断部位は、第Ｘ因子配列のＩｌｅ２３５と、Ｖａｌ２３６との間に挿入される。あるいは、追加の切断部位は、第Ｘ因子配列のＣ末端に近接した２個のアミノ酸の間に挿入されてもよい。例えば、追加の切断部位は、第Ｘ因子配列のＶａｌ２３６と、Ｇｌｙ２３７との間に、または、Ｇｌｙ２３７と、Ｇｌｙ２３８との間に挿入されてもよい。
【００３６】
本発明の第Ｘ因子変異体は、生物活性を有する。本明細書で用いられる用語「生物活性」は、第Ｘ因子の活性を意味する。第Ｘ因子の活性を有するタンパク質とは、チモーゲンの形態のタンパク質がプロテアーゼでの切断によって活性化することができ、その活性型でＸａ因子の活性を有するタンパク質を意味する。第Ｘ因子の活性は、インビトロでの凝固分析で決定することができる。例えば、実施例４で説明されているように、第Ｘ因子の活性は、外因性の凝固経路の活性を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）分析で決定することができる。第Ｘ因子の活性は、サンプル中での凝固活性として示され、単位はｍＵ／ｍｌである。
【００３７】
このようにして決定された第Ｘ因子の活性は、サンプル中に存在する第Ｘ因子の抗原の量ということができ、従って生成した変異体の「特異的な活性」は、典型的には、Ｕ／ｍｇタンパク質またはｍＵ／μｇタンパク質として示される。本発明の変異体の特異的な活性は、好ましくは、配列番号２で示されるような野生型の配列を有する組換え第Ｘ因子分子の第Ｘ因子の活性の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％である。
【００３８】
本発明の第Ｘ因子変異体はさらに、止血バイパス活性を有する。この活性は、実施例４で説明されているように、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを枯渇させた血漿を用いて凝固活性（ａＰＰＴ）を測定することによって決定することができる。このような分析における凝固活性は、好ましくは、野生型の配列を有する組換え第Ｘ因子の凝固活性より、７０倍大きい、より好ましくは１００倍大きい増加、最も好ましくは５００倍大きい増加を示す。
【００３９】
本発明に係る好ましい改変された生物学的に活性な組換え第Ｘ因子変異体は、天然に存在する第Ｘ因子の活性化切断ペプチドの配列内に改変を含む第Ｘ因子変異体と比較して増強された止血バイパス活性を有する第Ｘ因子変異体であり、ここにおいて、前記改変は、天然には第Ｘ因子配列のこの領域を切断しないプロテアーゼの切断部位を示し、それにより、前記追加の切断部位が切断されると、前記第Ｘ因子変異体が活性化される。
【００４０】
本発明のその他の形態は、止血バイパス薬の生産方法であり、本方法は、プロテアーゼによって切断される部位を、第Ｘ因子のアミノ酸配列の重鎖に挿入することを含む。好ましくは、この切断部位は、Ｉｌｅ２３５のＣ末端側に挿入される。この方法の好ましい実施態様は、本明細書で説明されている第Ｘ因子変異体の好ましい実施態様に対応する。
【００４１】
本発明はさらに、本願で説明されているような改変されたヒト第Ｘ因子をコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これらは、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡでもよいし、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡのいずれでもよい。また本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、１種またはそれ以上の改変された塩基、および／または通常ではない塩基、例えばイノシンを含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当然のことながら、当業者既知の多くの有用な目的に合うようにＤＮＡおよびＲＮＡに様々な改変をなすことが可能である。本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、このようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に改変された形態を包含し、加えて、ウイルスおよび細胞（例えば単純細胞および複雑細胞）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態も包含する。
【００４２】
当業者であれば、当然ながら、遺伝子コードの縮重のために、所定のポリペプチドは、様々なポリヌクレオチドによってコードされる可能性がある。これらの「変異体」は本発明に包含される。
【００４３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、分離されたポリヌクレオチドである。用語「分離された」ポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えばこれらに限定されないが、他の染色体ＤＮＡおよび余分な染色体ＤＮＡおよびＲＮＡから実質的に遊離のポリヌクレオチドを意味する。分離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製してもよい。分離されたポリヌクレオチドを得るために、当業者既知の従来の核酸精製法が使用可能である。またこの用語は、組換えポリヌクレオチドや化学合成されたポリヌクレオチドも含む。
【００４４】
本発明のさらにその他の形態は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、プラスミドまたはベクターは発現ベクターである。格別な実施態様において、ベクターは、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである。
【００４５】
本発明のさらにその他の形態は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞である。
【００４６】
本発明の宿主細胞は、ヒト第Ｘ因子の改変された相同体の生産方法で用いることが可能であり、これも本発明の一部である。このような方法は、以下を含む：
ａ）本発明の宿主細胞を、ヒト第Ｘ因子の改変された相同体が発現されるような条件下で培養すること；および
ｂ）場合により、該宿主細胞または培地からヒト第Ｘ因子の改変された相同体を回収すること。
【００４７】
グリコシル化、またはその他の翻訳後修飾の程度と位置は、選択された宿主細胞と宿主細胞の環境の特徴に応じて変動し得る。特異アミノ酸の配列について言及する場合、このような配列の翻訳後修飾は本願に包含される。
【００４８】
本願で用いられる「第Ｘ因子」は、非活性型からなる生成物（第Ｘ因子）を意味する。「第Ｘ因子」は、上記の定義において、天然型のヒト第Ｘ因子のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。また「第Ｘ因子」は、わずかに改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質、例えばＮ末端にアミノ酸欠失または付加を含む改変されたＮ末端を有するタンパク質も含み、ただしこのようなタンパク質が、実質的にＸａ因子の活性を保持する場合である。また「第Ｘ因子」は、上記の定義において、個体ごとに存在し、発生する可能性がある天然の対立遺伝子変異も含む。「第Ｘ因子」はさらに、上記の定義において、第Ｘ因子の変異体を含む。このような変異体は、１個またはそれ以上のアミノ酸残基に関して野生型の配列とは異なる。このような差異の例としては、Ｎおよび／もしくはＣ末端における１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基（例えば１〜１０個のアミノ酸残基）のトランケーション、またはＮおよび／もしくはＣ末端における１個もしくはそれ以上の追加の残基の付加、例えばＮ末端におけるメチオニン残基の付加、加えて保存的アミノ酸置換、すなわち類似の特徴を持ったアミノ酸のグループ、例えば（１）小さいアミノ酸、（２）酸性アミノ酸、（３）極性アミノ酸、（４）塩基性アミノ酸、（５）疎水性アミノ酸、（６）芳香族アミノ酸の中で行われる置換が挙げられる。表２に、このような保存的置換の例を示す。
【００４９】
【表２】
2008541742.tif 000003
【００５０】
用語「組換え」は、例えば、遺伝子工学技術によって変異体が宿主生物中に生産されることを意味する。
【００５１】
企画された変異体の発現：
適切な宿主細胞における高レベルでの組換えタンパク質生産は、上述の改変ｃＤＮＡを、組換え発現ベクター中の適切な調節因子を共に含む効率的な転写単位へ構築することを必要とし、このような転写単位は、当業者既知の方法に従って様々な発現系で増殖させることができる。効率的な転写調節因子の構成要素は、それらの天然の宿主としてウイルスを有する動物細胞から、または動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルスから誘導されたプロモーター−エンハンサーの組み合わせ、またはラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート、または例えばベータ−アクチンもしくはＧＲＰ７８のような動物細胞中で構成的に強く転写された遺伝子を含むプロモーター−エンハンサーの組み合わせを用いることができる。ｃＤＮＡから転写された安定な高レベルのｍＲＮＡを達成するために、転写単位は、その３’近位部分に転写終結ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含む方がよい。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、またはヒト組織プラスミノゲン活性化因子遺伝子から誘導される。
【００５２】
続いてｃＤＮＡは、第Ｘ因子変異体を発現させるために適切な宿主細胞系のゲノムに統合される。好ましくは、この細胞系は、正しいフォールディング、Ｇｌａ−ドメイン合成、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化、およびその他の翻訳後修飾、加えて培地への分泌が確実に行われるように、脊椎動物起源の動物細胞系であるとよい。その他の翻訳後修飾の例としては、新生のポリペプチド鎖の水酸化、およびタンパク質分解プロセシングが挙げられる。使用可能な細胞系の例としては、サルＣＯＳ−細胞、マウスＬ−細胞、マウスＣ１２７−細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞が挙げられ、選択的にはハムスターＣＨＯ−細胞である。
【００５３】
対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、いくつもの様々な方法で動物細胞系に導入することができる。例えば組換え発現ベクターは、種々の動物ウイルスをベースとしたベクターから作出することができる。この例としては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスをベースとするベクターが挙げられ、好ましくはウシパピローマウイルスをベースとするベクターである。
【００５４】
また対応するＤＮＡをコードする転写単位は、組換えＤＮＡがそれらのゲノムに統合された特異的な細胞クローンの分離を容易にするために、これらの細胞中で優勢な選択マーカーとして機能し得るその他の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することもできる。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例としては、ゲネチシン（Ｇ４１８）耐性を付与するＴｎ５アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシン耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質のｃＤＮＡをコードするベクターと同じベクターに存在していてもよいし、または同時に導入されて宿主細胞のゲノムに統合された別個のベクターにコードされていてもよく、この場合、異なる転写単位との間に強固な物理的な結合が生じることが多い。
【００５５】
所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に使用可能なその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位に基づく。このタイプの遺伝子を、内因性のｄｈｆｒ活性が欠けている細胞、選択的にはＣＨＯ−細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入した後、これらをヌクレオシドが存在しない培地で増殖させることができる。このような培地の例としては、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン不含のＨａｍＦ１２が挙げられる。これらのｄｈｆｒ−遺伝子は、同じベクターまたは異なるベクターのいずれかに連結させて、凝固因子のｃＤＮＡ転写単位と共に上記のタイプのＣＨＯ−細胞に導入することができ、このようにして組換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性細胞系を作出することができる。
【００５６】
上記の細胞系を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤メトトレキセートの存在下で増殖させた場合、新しいメトトレキセート耐性の細胞系が発生すると予想される。これらの細胞系は、増幅された多数の連結されたｄｈｆｒおよび所望のタンパク質の転写単位のために高率で組換えタンパク質を生産する。これらの細胞系を高濃度のメトトレキセート（１〜１００００ｎＭ）中で増殖させる場合、極めて高率で所望のタンパク質を生産する新しい細胞系を取得することができる。
【００５７】
上記の所望のタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養で、または様々な固体支持体上でのいずれかによってラージスケールで増殖させることができる。これらの支持体の例としては、デキストランまたはコラーゲンマトリックスベースのマイクロキャリアー、または中空糸または様々なセラミック材料の形態の固体支持体が挙げられる。細胞の懸濁培養で、またはマイクロキャリアー上で増殖させる場合、上記の細胞系の培養は、バッチ培養、または長期間にわたり調整培地を連続生産する潅流培養のいずれかで行うことができる。従って本発明によれば、上記の細胞系は、所望の組換えタンパク質を生産するための工業的なプロセスの開発に十分適している。
【００５８】
組換えタンパク質は上記のタイプの分泌細胞の培地中に蓄積し、これらは、様々な生化学的方法やクロマトグラフィー法によって濃縮して精製することができ、このような方法としては、細胞培地中に含まれる所望のタンパク質とおよびその他の物質との大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性などの差を利用する方法が挙げられる。
【００５９】
このような精製法の例としては、固体支持体に固定したモノクローナル抗体への組換えタンパク質の吸着が挙げられる。上記タンパク質を脱着させた後、上記の特性に基づく様々なクロマトグラフィー技術によってさらに精製してもよい。
【００６０】
本発明の改変された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、８０％以上の純度に精製することが好ましく、より好ましくは９５％以上の純度に精製することであり、特に好ましくは、高分子、特に他のタンパク質および核酸の汚染に対して９９.９％より高い純度を有し、感染性のおよび発熱性の物質を含まない製薬的に純粋な状態である。好ましくは、本発明の分離または精製された改変された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、他のポリペプチドを実質的に含まない。
【００６１】
本発明で説明される組換えタンパク質は、治療用途のための医薬調製物に製剤化することができる。精製されたタンパク質は、従来の生理学的に適合する水性緩衝溶液に溶解させてもよく、それに場合により医薬調製物を提供するための医薬添加剤を添加してもよい。
【００６２】
このような製薬キャリアーおよび添加剤、加えて適切な医薬製剤は、当技術分野でよく知られている（例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｆｒｏｋｊａｅｒ等，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）、または“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，第三版，Ｋｉｂｂｅ等，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照）。特に、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は、凍結乾燥した形態、または安定な可溶性の形態に製剤化してもよい。本ポリペプチド変異体は、当技術分野で既知の様々な手法によって凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水または滅菌生理食塩水のような１種またはそれ以上の製薬上許容できる希釈剤の添加によって使用前に再溶解される。
【００６３】
本組成物の製剤は、製薬的に適切なあらゆる投与手段によって個体に送達される。あらゆる便利な経路によって本組成物を投与するのに使用可能な様々な送達システムが既知である。選択的には、本発明の組成物は全身投与される。全身投与で使用するために、本発明の第Ｘ因子変異体は、従来の方法に従って、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、または経皮）、または経腸（例えば、経口、経膣または直腸）送達用に製剤化される。最も選択的な投与経路は、静脈内投与である。このような製剤は、持続点滴またはボーラス注射によって投与することができる。遅延放出システムを包含する製剤もある。
【００６４】
本発明の改変された生物学的に活性な第Ｘ因子変異体は、治療上有効な用量で患者に投与され、ここにおいて、治療上有効な用量は、許容できない副作用を生じる用量に達することなく、所望の効果を生じさせる、治療しようとする疾患または適応の重症度または拡散を予防したり、または減少させたりするのに十分な用量を意味する。的確な用量は、例えば適応症、製剤、投与様式などの多くの要因に依存し、それぞれの適応症については前臨床試験および臨床試験で決定する必要がある。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、単独で投与してもよいし、または他の治療剤と併用して投与してもよい。このような物質は、同一の医薬の一成分として組み入れることができる。
【００６６】
本発明のその他の形態は、血液凝固障害を治療または予防する医薬を製造するための、本明細書で説明されているようなヒト第Ｘ因子の改変された相同体、本発明のポリヌクレオチド、本発明のプラスミドまたはベクター、または本発明の宿主細胞の使用である。血液凝固障害としては、これらに限定されないが、血友病Ａ、血友病Ｂ、またはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠損症が挙げられる。好ましくは、これらの病気は、それぞれの凝固因子に対する自己免疫抗体によって引き起こされるか、または、それにより先天性の形態が悪化するものである。特定の実施態様において、治療しようとする患者は、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有する。好ましくは、このような治療は、ヒトの遺伝子治療を含む。
【００６７】
本発明はまた、血液凝固障害に罹った個体、例えば血友病Ａ、血友病ＢまたはＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ欠損症に罹った個体の治療方法に関し、好ましくは、これらの病気は、それぞれの凝固因子に対する自己免疫抗体によって引き起こされるか、または、それにより先天性の形態が悪化するものである。本方法は、前記個体に、本明細書で説明されているようなヒト第Ｘ因子の改変された相同体の有効量を投与することを含む。その他の実施態様において、本方法は、前記個体に、有効量の本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドもしくはベクターを投与することを含む。あるいは、本方法は、前記個体に、本明細書で説明されている本発明の宿主細胞の有効量を投与することを含んでもよい。
【００６８】
表および図面の説明：
図１：
実施例１で説明されているような、コンストラクトｐＦＸ６１９によってコードされたＦＸ変異体の挿入されたプロテアーゼによって切断される部位をコードする核酸配列の概略図である。
図２：
ＦＸ野生型、および新たに導入されたプロテアーゼによって切断される部位を有するＦＸ変異体の概略図である。番号は、配列番号２のアミノ酸の番号付けを参考にしており、活性化ペプチドは、Ａｒｇ１８２〜Ｉｌｅ２３５のアミノ酸配列と定義される。第ＩＸ因子から誘導された外来の活性化配列は、太字で図示した。下線で示したアミノ酸は点突然変異を意味し、このような点突然変異は、それぞれの第Ｘ因子の分子の、それぞれテナーゼ複合体および第ＶＩＩａ因子／組織因子による活性化を不可能にする。コンストラクト「ｐＦＸ−５３２」は、野生型の第Ｘ因子配列に相当する。
図３：
野生型第Ｘ因子のヌクレオチド配列およびタンパク質配列である。
【実施例】
【００６９】
実施例１：発現プラスミドの構築
第Ｘ因子のコード配列を、ＰＣＲによって、プライマーＷｅ１２９２およびＷｅ１２９３（配列番号３および４）を用いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））から増幅した。プライマーＷｅ１３５４およびＷｅ１３５５（配列番号５および６）を用いた二回目のＰＣＲサイクルにおいて、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩのための切断部位を５’末端に導入し、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩのための切断部位をフラグメントの３’末端に導入した。次に、ＰＣＲフラグメントを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを、ｐＦＸ−４４５と命名した。
【００７０】
プロペプチドのプロセシングを改善するために、３９番目のアミノ酸スレオニン（配列番号２）を、アルギニンで置換することによって切断部位を改善した（Ｒｕｄｏｌｐｈ等，１９９７（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １０：３７３〜３７８））。そのために、ｐＦＸ−４４５を、標準的な方法に従って（クイックチェンジＸＬ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ）部位特異的変異誘発キット，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、オリゴヌクレオチドＷｅ１４８２およびＷｅ１４８３（配列番号７および８）を用いて部位特異的変異誘発で処理した。得られたプラスミドを、ｐＦＸ−５３２と命名した。
【００７１】
以下で説明される全ての突然変異を、市販の変異誘発キット（クイックチェンジＸＬ部位特異的変異誘発キット，ストラタジーン）を用いて行った。ｐＦＸ−５３２をベースとして、第ＸＩａ因子切断部位を含むコンストラクトを作製した。オリゴヌクレオチドＷｅ１４４４およびＷｅ１４４５（配列番号９および１０）を用いた置換変異誘発により、第Ｘ因子の活性化領域の８個のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸２２５〜２３３）が、ＦＩＸの活性化領域からの８個のアミノ酸で置換されたプラスミドｐＦＸ−５３５を得た（図３）。
【００７２】
オリゴヌクレオチドＷｅ１５６１ａおよびＷｅ１５６２ａ（配列番号１１および１２）を用いた挿入による変異誘発により、第Ｘ因子アミノ酸２３５位と２３６位との間にＦＩＸ活性化領域の１０個のアミノ酸からなる挿入物を含むプラスミドｐＦＸ−６１９を得た（配列番号２）。
【００７３】
ｐＦＸ−５３２におけるオリゴヌクレオチドＷｅ１５６７およびＷｅ１５６８（配列番号１３および１４）を用いた部位特異的変異誘発を用いて、プラスミドｐＦＸ−６４１を作製した。これは、第Ｘ因子活性化ペプチド内に２種の突然変異、Ｌｅｕ２３２ＡｓｐおよびＴｈｒ２３３Ａｓｐを含んでおり、それによって、活性化が不可能な第Ｘ因子の分子が得られた。同様に、プライマーＷｅ１５８７およびＷｅ１５８８（配列番号１５および１６）をプラスミドｐＦＸ−６１９に適用することによって、プラスミドｐＦＸ−６３５を作製した（図２）。
【００７４】
実施例２：改変された第Ｘ因子の分子のトランスフェクションおよび発現
このプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｕｓｉｎｇ））中で増殖させ、標準的なプロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。ＨＥＫ２９３細胞を、リポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、無血清培地（インビトロジェンの２９３エクスプレス（２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓ））中で、５０ｎｇ／ｍｌビタミンＫおよび４μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下で増殖させた。トランスフェクションから約４週間後に、生化学的な特徴付けのために上清を回収した。
【００７５】
実施例３：組換え第Ｘ因子変異体の特徴付け
第Ｘ因子変異体の発現を、第Ｘ因子に対するモノクローナル抗体を用いた定量ＥＬＩＳＡによって制御した。その後、組換えタンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによって解析した。サンプルを、還元条件下と非還元条件下で解析した。血漿の第Ｘ因子を、天然型の分子量コントロールとして利用した。Ｘａ因子を用いて、自己活性化の場合におけるあらゆる活性化された組換え第Ｘ因子変異体を検出し、比較した。ウェスタンブロットで目視で観察して、全ての組換え第Ｘ因子変異体が、正しい分子量の約５８ｋＤａで発現し、血漿の第Ｘ因子の相当する位置に移動した。還元した場合、組換え第Ｘ因子変異体は、約４０ｋＤａの重鎖（ＨＣ）と、約２０ｋＤａの軽鎖（ＬＣ）に分解する。５８ｋＤａのバンドは、プロセシングされていない一つの鎖（ｏｎｅ−ｃｈａｉｎ：ＯＣ）の第Ｘ因子を示す。ウェスタンブロットでは、Ｘａ因子も第Ｘ因子の凝集体も検出されなかった。
【００７６】
実施例４：ヒト第Ｘ因子、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を欠いた血漿中、ならびにヒトインヒビター血漿中の、組換え第Ｘ因子変異体のインビトロ活性の調査
外因性の凝固経路の活性を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）分析で、第Ｘ因子の活性を決定した。第Ｘ因子を欠いた血漿１００μｌを、第Ｘ因子変異体の細胞培養上清１００μｌまたは精製したタンパク質と混合した。３７℃で６０秒インキュベートした後、この混合物に、ヒト血漿由来のトロンボプラスチン、ＣａＣｌ2およびリン脂質を含むトロンボレル（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ；デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ））２００μｌを添加し、シュニットガー＆グロス（Ｓｃｈｎｉｔｔｇｅｒ＆Ｇｒｏｓｓ）の凝固タイマーを用いることによって凝固時間を秒で測定した。第Ｘ因子の活性を決定するために、この分析を血漿の第Ｘ因子標準を用いて較正した。突然変異した第Ｘ因子ｐＦＸ−６４１の細胞培養上清は、この分析のネガティブコントロールとしての機能を果たすことができる。この突然変異体は、野生型の第Ｘ因子活性化ペプチド内に機能しない切断部位を包含し、これはｐＦＸ６３５中のものと同様である。予想通りに、この突然変異体を、２１６.４Ｕ／ｍｌの第Ｘ因子に相当する抗原レベルで試験したところ、凝固活性は、０.５ｍＵ／ｍｌにしかならなかった。
【００７７】
ｐＦＸ５３２から誘導された組換え野生型の第Ｘ因子、ならびにｐＦＸ５３５、ｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５から誘導された第Ｘ因子変異体を精製し、抗原を、２.８〜４．３Ｕ／ｍｌの範囲の濃度の第Ｘ因子の抗原に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。Ｘａ因子による第Ｘ因子測定の混乱を取り除くために、発色分析（デイド・ベーリング）によってＸａ因子を測定した。いずれの精製した第Ｘ因子変異体も、Ｘａ因子を０.０２８〜０.０５１ｍＵ／ｍｌのレベルでしか含まず（表３）、第Ｘ因子測定を有意に妨害することはなかった。
【００７８】
発現された第Ｘ因子変異体を互いに比較するために、第Ｘ因子の凝固活性を測定し、約１.５ｍＵ／ｍｌに調整した。試験された全ての変異体は機能的に活性であり、１.４８〜１.７２ｍＵ／ｍｌの凝固活性が生じた（表３）。
【００７９】
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸが欠けた血漿中の組換え第Ｘ因子変異体の機能性を、内因性の凝固カスケードの活性を測定するための活性化部分プロトロンビン時間（ａＰＰＴ）で試験した。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸが枯渇した血漿１００μｌを、第Ｘ因子変異体の細胞培養上清１００μｌ、または精製したタンパク質と混合した。３７℃で６分間インキュベートした後、ＳｉＯ2、リン脂質および４０ｍＭのＮａＣｌを含むパトロンプティン（Ｐａ
ｔｈｒｏｍｐｔｉｎ，デイド・ベーリング）１００μｌ、ならびに２５ｍＭのＣａＣｌ2（１００μｌ）を添加して、凝固反応を開始させた。シュニットガー＆グロスの凝固タイマーを用いることによって、凝固時間を秒で測定した。活性を、標準的なヒト血漿と比較して、それぞれの凝固するＦＸの等量として表した。
【００８０】
組換え野生型の第Ｘ因子の凝固活性は、予想通りに、第ＶＩＩＩ因子を枯渇させた血漿ではわずか６.６ｍＵ／ｍｌであり、ＦＩＸを枯渇させた血漿ではわずか５.８ｍＵ／ｍｌであった。それに対して、第Ｘ因子変異体の凝固活性は、第ＶＩＩＩ因子を枯渇させた血漿では、４２３.７〜８５４５.８ｍＵ／ｍｌの範囲であり、ＦＩＸを枯渇させた血漿では、２７２.３ｍＩＵ／ｍｌ〜４６２０.２ｍＩＵ／ｍｌの範囲であった。これは、挿入された第ＸＩａ因子の切断部位の機能性が、ＦＸを、凝固活性を有する止血バイパス薬に変化させることを実証する（表３）。
【００８１】
驚くべきことに、そして全ての組換え第Ｘ因子変異体を第Ｘ因子の凝固活性に調整したにもかかわらず、ｐＦＸ−６１９およびｐＦＸ６３５から誘導された第Ｘ因子変異体はそれぞれ８５４５.８ｍＵ／ｍｌおよび２６９２.０ｍＵ／ｍｌの強い凝固活性を引き起こし、一方ｐＦＸ５３５から誘導された第Ｘ因子変異体の凝固活性は、ＦＶＩＩＩを枯渇させた血漿において、４２３.７にしかならなかった（表２）。ｐＦＸ−６１９およびｐＦＸ−６３５において、新規の第ＩＸ因子の活性化配列が、重鎖のアミノ酸末端部分のＩｌｅ２３５のＣ末端側に挿入されているが、第Ｘ因子の完全な活性化ペプチド配列を維持しているという点で、ｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５から誘導された変異体はｐＦＸ５３５とは異なる。ｐＦＸ５３５から誘導された第Ｘ因子変異体は、ＷＯ０１／１０８９６に記載されている野生型のＦＸ活性化ペプチドの領域内のＩｌｅ２３５のＮ末端側に挿入された新規の第ＩＸ因子の活性化配列を有する第Ｘ因子変異体に相当し、それに対してｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５は、本発明の第Ｘ因子変異体である。興味深いことに、ｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５によってコードされた第Ｘ因子変異体も、ＦＩＸを枯渇させた血漿中で、それぞれ４６２０.２ｍＵ／ｍｌおよび１６４４.８ｍＵ／ｍｌの強い凝固活性を引き起こしたが、一方で、ｐＦＸ５３５から誘導された第Ｘ因子変異体の凝固活性は２７２．３ｍＵ／ｍｌにしかならず、これは、それぞれＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを枯渇させた血漿に基づくＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固分析で得られた結果を裏付けている。
（表２）。
【００８２】
さらに、血友病Ａ患者由来のＦＶＩＩＩインヒビターを含む血漿を用いて機能的な活性の測定を行った。患者の血漿には、１ｍｌあたり約３００ベセスダ単位のＦＶＩＩＩインヒビターが含まれていた。上述のようにして、ａＰＰＴで凝固を測定し、サンプルを第Ｘ因子の凝固に調整した。
【００８３】
サンプルの緩衝液コントロールを標準の希釈に用いたところ、試験サンプルの凝固時間は１５６.５秒になり、組換え野生型の第Ｘ因子の凝固時間は１１１.４秒になった。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを枯渇させた血漿に基づく、ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固分析の驚くべき結果を確認したところ、ｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５から誘導された第Ｘ因子変異体は、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を含む血漿に基づくＦＥＩＢＡ分析において、第Ｘ因子変異体ｐＦＸ５３５を用いた場合に得られたそれぞれの凝固時間５１．１秒よりも有意に短い、３３.７および３８.４秒の凝固時間の結果になった。
【００８４】
総合すると、第Ｘ因子変異体は、止血バイパス薬として機能的に活性であること、およびこれらの第Ｘ因子変異体は、第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターを含む血友病Ａ患者の血漿において凝固活性を示すことが示された。我々が驚いたことに、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を枯渇させた血漿において、同じ第Ｘ因子の凝固等量に調整した場合、ｐＦＸ６１９およびｐＦＸ６３５によってコードされた第Ｘ因子変異体は、ｐＦＸ５３５によってコードされた第Ｘ因子変異体と比較してかなり強い凝固活性を示した。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
実施例５：モノクローナル抗体アフィニティークロマトグラフィーによる組換え第Ｘ因子変異体の精製
組換え第Ｘ因子変異体ｐＦＸ６３５の精製で精製したあらゆる第Ｘ因子変異体の実施例に代えた。第Ｘ因子に特異的なモノクローナル抗体ＦＸ−１３（ＺＬＢベーリング）を、ＣＮＢｒ活性化セファロースにカップリングした。得られた親和性樹脂をファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＸＫ１６クロマトグラフィーカラムに注入し、直径１.６ｃｍ、高さ１.８ｃｍの親和性マトリックスを形成し、ゲル３.６ｍｌを得た。この親和性マトリックスを、２.５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム塩中で保存した。使用前に、このゲルを、ゲル体積の１０倍の２０ｍＭのトリ−クエン酸ナトリウム、０.１５ＭのＮａＣｌ（ＨＣｌでｐＨ７.０にした）で平衡化した。
【００８７】
１００ｍＩＵ／ｍｌより多くの第Ｘ因子−抗原を含む細胞培養上清を、平衡緩衝液２〜４Ｌ中でヴィスキング（ＶＩＳＫＩＮＧ）チューブ（タイプ３２／３６）を用いて、４〜８℃で一晩透析した。
【００８８】
親和性ゲルに、透析した上清７０ｍｌを１ｍｌ／分の流速でローディングした。ゲルを１０倍量の平衡緩衝液で洗浄し、その後、０.１Ｍグリシン（ＨＣｌでｐＨ２.５にした）で溶離させた。溶離した物質をＮａＯＨで中和し、１.０ＭのＮａＣｌおよび０.１ｍｇ／ｍｌカプリル酸ナトリウムで安定化した。
【００８９】
流出した分画からの、および溶離した物質からの第Ｘ因子変異体ｐＦＸ６３５の細胞培養上清由来のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続いて銀染色で解析した。５８ｋＤａのタンパク質バンドを、上述の方法で精製した。５８ｋＤａのバンドは、第Ｘ因子変異体６３５と類似しており、これは、抗第Ｘ因子抗体をプローブとして用いたウェスタンブロッティングで確認された通りであった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】実施例１で説明されているような、コンストラクトｐＦＸ６１９によってコードされたＦＸ変異体の挿入されたプロテアーゼによって切断される部位をコードする核酸配列の概略図である。
【図２】ＦＸ野生型、および新たに導入されたプロテアーゼによって切断される部位を有するＦＸ変異体の概略図である。
【図３−１】野生型第Ｘ因子のヌクレオチド配列およびタンパク質配列である。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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