(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを含んで成るレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞集団およびそのような細胞の作製方法に関する。本発明の細胞は、中枢神経系疾患、例えば、脳虚血、脳血管疾患、中枢神経系の損傷、神経系の遺伝性疾患、脳神経系の変性疾患、脳神経系腫瘍およびそれらの組合せを、治療するために用いることができる。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト羊膜細胞によって発現され得る外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルスベクターを含む、ヒト羊膜細胞集団。
【請求項２】
外来遺伝子エレメントが、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼをコードする、請求項１記載のヒト羊膜細胞集団。
【請求項３】
外来遺伝子エレメントが、グリア由来神経栄養因子をコードする、請求項１記載のヒト羊膜細胞集団。
【請求項４】
外来遺伝子エレメントが、脳由来神経栄養因子をコードする、請求項１記載のヒト羊膜細胞集団。
【請求項５】
レンチウイルスベクターが、RNAi誘導型、Cre-loxP型またはドキシサイクリン誘導型システムの転写制御断片を少なくとも１つ含んでなる、請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載のヒト羊膜細胞集団。
【請求項６】
請求項１、２、３、４または５のいずれか１項に記載のヒト羊膜細胞集団および医薬的に受容可能なキャリアーを含んでなる、組成物。
【請求項７】
ヒト羊膜細胞によって発現可能な外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルスベクターを含む、ヒト羊膜細胞。
【請求項８】
外来遺伝子エレメントが、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼをコードする、請求項７記載のヒト羊膜細胞。
【請求項９】
ヒト羊膜細胞集団をレンチウイルスベクターを用いて形質導入する方法であって、少なくとも１つのレンチウイルスベクターとヒト羊膜細胞集団とをインキュベートすることを含む、上記方法。
【請求項１０】
外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞集団を用いて、被験体の中枢神経系疾患を治療するための方法。
【請求項１１】
中枢神経系疾患が、脳虚血、脳出血、中枢神経系の外傷、神経系の遺伝性疾患、神経変性疾患または中枢神経系の新生物からなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
中枢神経系疾患が、脳虚血、中枢神経系の外傷または神経変性疾患からなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
中枢神経系疾患が脳虚血である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
中枢神経系疾患が、脊髄損傷からなる、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
中枢神経系疾患が、パーキンソン病である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
中枢神経系疾患を治療するための方法であって、治療を必要とする被験体に、ヒト羊膜細胞によって発現可能な外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルスベクターを含む、有効量のヒト羊膜細胞を投与することを含む、上記方法。
【請求項１７】
外来遺伝子エレメントが、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼをコードする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
中枢神経系疾患が、脳虚血、脳出血、中枢神経系の外傷、神経系の遺伝性疾患、神経変性疾患または中枢神経系の新生物からなる、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、遺伝子治療、免疫学およびウイルス学の分野に関する。より具体的には、本発明は、外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞、当該細胞の作製方法および疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトは、脳虚血、脳血管疾患、中枢神経系の損傷、神経系の遺伝性疾患、脳神経系の変性疾患(例えば、パーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病)ならびに脳神経系腫瘍などの中枢神経系疾患を罹患し得る。現在、中枢神経系疾患の有効な治療法および治療薬はわずかしかない。一般的に、中枢神経系疾患による死亡率および障害率は非常に高い。例えば、毎年、世界中で1640万人の人々が、脳卒中、脳損傷、および脊髄損傷に罹患している。さらに、これらの内、毎年410万人の人々が、それらの疾患により死亡している。
【０００３】
近年、従来方法ではこれまで治療できないと考えられていた多くの神経性疾患を治療するための有効な方法として、遺伝子治療が開発されている。一般的に、中枢神経系疾患を治療するための遺伝子治療には、３つのストラテジーが存在する。一のストラテジーでは、アンチセンス法およびRNAi法を用いて、変異劣性遺伝子タンパク質の活性を減少させる。例えば、中枢神経系疾患の変異劣性遺伝子は、タンパク質を発現し、遺伝子治療は、これらタンパク質の発現を変異mRNAに対するアンチセンスまたはRNAiを用いて、ダウンレギュレートすることができる。別のストラテジーでは、脳における機能欠損型酵素またはタンパク質を、遺伝子導入によって補う。三つ目のストラテジーでは、成長因子、抗酸化物質、HSPまたは抗アポトーシス分子などのタンパク質を送達することによって、ニューロンを防御し得る（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
現在、５種類のウイルスベクターが、遺伝子治療に用いられている：(1)増殖可能な細胞のみに感染するレトロウイルスベクター、(2)宿主細胞の染色体に挿入されず、安定して発現することができないアデノウイルス(Ad)ベクター(Adベクターは、免疫原性を生じ得る)、(3)大きな外来性断片を輸送することはできず(5kb未満)、また高い力価を有さないアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、(4)神経細胞にのみ感染する単純ヘルペスウイルス(HSV)、および(5)レンチウイルスベクター。
【非特許文献１】Natsumeら、 Exp. Neurol., 2001, 169：231-33
【非特許文献２】Berryら、 Curr. Opin. Mol Ther., 2001, 3：338-49
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、in vivo 遺伝子治療に遺伝子操作したウイルスベクターを用いることに関して、その効率、安定性、制御可能性および安全性について多くの問題がある。これらの問題としては、例えば、in vivoにおけるウイルスベクターの安定性および特異性が挙げられる。あるいは、ex vivo 遺伝子治療に胚性または体性幹細胞を用いることによって、安全性、免疫拒絶、細胞供給源および倫理的影響に関する問題が生じる（Georgievskaら、 Eur. J. Neurosci., 2004, 20(11)：3121-30；Englundら、 Exp. Neurol., 2002, 173(1)：1-2；Kahnら、 Blood, 2004, 103(8)：2942-9；De Palmaら、 Nat. Med, 2003, 9(6)：789-95；Imrenら、 J. Clin. Invest, 2004：953-62）。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞(HAC)集団に関する。ベクターの外来遺伝子エレメントは、ヒト羊膜細胞によって発現し得ることが好ましい。別の態様において、本発明は、上記細胞と少なくとも１つの医薬的に受容可能なキャリアーとを含んでなる組成物を特徴とする。本発明の別の目的は、ヒト羊膜細胞に形質導入する方法を提供することである。本発明の別の目的は、少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞を使用して、中枢神経系疾患を治療するための方法を提供することである。例えば、本発明の方法は、少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞を患者に投与することを含む。
【０００７】
本発明はまた、遺伝子治療に有用であり得る、トランスフェクトしたヒト羊膜細胞を提供する。外来遺伝子エレメントが、レンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞において高発現し得ることが好ましい。このような細胞は、中枢神経系疾患、例えば、脳虚血、脳血管疾患、中枢神経系の損傷、神経系の遺伝性疾患、脳神経系の変性疾患(例えば、パーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病)、脳神経系腫瘍およびそれらの組合せを、効果的に治療することができる。これらの細胞はまた、本明細書中に開示される何らかの疾患を治療するために用いることができる。一実施形態において、本発明のヒト羊膜細胞は、拒絶反応または局所的炎症を抑制または除去することができる。形質導入の前に、ヒト羊膜細胞を、限定しないが、ドナー、組織培養物または被験体(例えば、患者)から得ることができる。
【０００８】
一実施形態において、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACを、脳虚血、脳血管疾患、中枢神経系の損傷、神経系の遺伝性疾患、脳神経系の変性疾患(パーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病)、脳神経系腫瘍およびそれらの組合せ（これらに限定されない）を含む疾患の治療または予防に用いることができる。また、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACを、本明細書中に開示される何らかの疾患の状態または弊害を治療または予防するのに用いることができる。一般的に、「予防」とは、患者においてADなどの障害が発症する可能性、または障害の病状が進行する可能性を減少させることに関する。例えば、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACを、患者の健康を維持し、疾患のまん延または悪化を阻止するような方法で、予防的に用いることができる。本発明はまた、例えば、CNS疾患などの疾患を治療または予防するために、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACの有効量を患者に投与するための方法を提供する。
【０００９】
本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACはまた、例えば、CNS疾患の治療または予防に有用であると思われる他の従来的な治療法または治療薬と共に、患者に投与できる。一実施形態において、疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険にあると思われる患者に、有効量の本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACを投与する方法を提供する。この方法はまた、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACと逐次的に、または組み合わせて、CNS疾患の治療または予防に有効であり得る量で従来的な治療剤を投与することを含む。
【００１０】
本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACは、CNS疾患を治療するのに好適な量または用量で患者に投与し得ることが好ましい。一般的に、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACを含む用量または組成物は、被験体の要件に応じて変化し得る。このような要件としては、例えば、年齢、状態、性別、疾患の程度、禁忌および併用療法が挙げられる。このような要件に基づく例示的な用量または組成物はまた、当業者によって、調節または変更され得る。本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACは被験体に、局所的または全身的に投与することができ、静脈内、動脈内、髄腔内(髄液を介して)投与によって行うことができる。治療する身体部に応じて、皮内または腔内投与できる。「被験体」とは、哺乳動物、例えば、ヒトであり、好ましくは、１または複数のCNS疾患を有すると思われるヒトである。「被験体」および「患者」という用語は、本明細書中において、同じ意味で用いられる。
【００１１】
本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACはまた、注射用組成物などの組成物形態で投与しても良いし、周知の薬剤送達系（例えば、局所、経口、経腸、非経口(静脈内、筋肉内もしくは皮下)、嚢内、膣内、腹腔内、局所(散剤、軟膏剤もしくはドロップ剤)）または移植片、口腔もしくは経鼻スプレー用の形態に処方しても良い。上記したように、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACまたはその組成物は、局所的または全身的に投与することができ、静脈内、動脈内、髄腔内(髄液を介して)投与するかまたは移植片を介して投与することができる。レンチウイルスベクターで形質導入されているHACは、全身的または局所的投与経路によって、被験体に投与することができる。例えば、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACまたはその組成物は、全身に送達されるように患者に投与することができる。あるいは、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACまたはその組成物は、目的とする特定の器官または組織に投与することができる。
【００１２】
一般的な投与用組成物は、１または複数の本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACのための医薬的に受容可能なキャリアーを含むことができる。医薬的に受容可能なキャリアーとしては、例えば、塩、保存剤およびバッファーを含む水溶液ならびに非毒性の賦形剤などのキャリアーが挙げられる（Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publishing Co., 1975：1405-1487；The National Formulary XIV., 第14版, American Pharmaceutical Association, 1975）。本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACのための例示的な医薬的に受容可能なキャリアーとしてはまた、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、メトキシポリエチレングリコールおよび植物油などの非水性溶媒またはオレイン酸エチルなどの注射用の有機エステルを挙げることができる。一実施形態において、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACは、少なくとも１つの医薬的に受容可能なキャリアーと結合することができる。水性キャリアーとしては、限定しないが、水、アルコール水溶液、生理的食塩水および塩化ナトリウムまたはリンガーデキストロースなどの非経口ビヒクルが挙げられる。本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACの静脈投与用キャリアーとしては、例えば、流動性栄養補充液が挙げられる。レンチウイルスベクターで形質導入されているHACを含む組成物の様々な成分のpHおよび正確な濃度はまた、当業者に公知の従来法によって調節できる（Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics, 第７版）。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACを含むキットを提供する。本発明はまた、CNS疾患を治療または予防するための方法であって、当該方法を必要とする患者にレンチウイルスベクターで形質導入されているHACの有効量を投与することを含む、上記方法を提供する。例えば、本方法は、CNS疾患に罹患しているか、当該疾患を罹患する危険にあると思われる患者を提供することを含み得る。本方法はまた、有効量の本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACを患者に投与することを含み得る。本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACはまた、医薬的に受容可能なキャリアーを含む組成物の一部として投与することができる。
【００１４】
「有効量」とは、所望の効果を生じるのに必要とされる量を指す。有効量の一例としては、CNS疾患の影響を軽減または最小限に抑えるために用い得る量または用量を含む。有効量の別の例としては、治療用途、限定されないがCNS疾患の治療または予防において、受容可能な毒性およびバイオアベイラビリティレベルを生じる量または用量を含む。有効量の別の例としては、神経変性を最小限に抑えるか、または予防することができる量または用量を含む。所望される場合、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACまたはその組成物は、pH調整剤(例えば、酸、塩基、バッファー)、安定剤(例えば、アスコルビン酸)または等張化剤(例えば、塩化ナトリウム)などの添加剤を含むことができる。
【００１５】
当業者は、疾患の影響が低減されるまで、所定の期間にわたってレンチウイルスベクターで形質導入されているHACまたはその組成物の量を増加させながら被験体に投与することによって、当該細胞または組成物の有効量を容易に決定できる。特定の被験体に対する有効量の判定は、当業者にとって周知である。本発明はまた、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACがex vivoまたはin vivo 遺伝子治療に使用可能であることを意図する。好ましくは、CNS疾患のin vivo遺伝子治療については、HACの形質導入のために、有効量のレトロウイルス、AAV、レンチウイルス、偽型レンチウイルスまたはAdベクターを、被験体に投与できる。これらのベクターは、医薬的に受容可能なキャリアーを含む組成物中に含めて投与することができる。さらに、これらのベクターは、局所、経口、経腸、非経口(静脈内、筋肉内もしくは皮下)、嚢内、膣内、腹腔内、局所(散剤、軟膏剤もしくはドロップ剤)投与または移植片、口腔もしくは経鼻スプレーによって投与することも可能である。上記したように、局所または全身的に投与することができ、静脈内、動脈内、髄腔内(髄液を介して)投与または移植片を介した投与によって行うことができる。
【００１６】
HACにおける発現を促進するためにプロモーターを使用することに加えて、エンハンサー配列を用いて、発現レベルを増加することができる（Armelorら、Proc. Natl. Acad. Sci, 1973, 70：2702）。外来遺伝子エレメントによってコードされる例示的な成長因子としては、神経成長因子、神経栄養因子、脳由来成長因子 (BDNF)、ニューロトロフィン(NT)-3、NT-4および毛様体神経栄養因子(CNTF)が挙げられる。
【００１７】
本発明はまた、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼのアナログ、ホモログ、誘導体および改変体を意図する。同様に、本発明は、例えば、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼをコードする外来遺伝子エレメントのアナログ、ホモログ、誘導体および改変体を意図する。
【００１８】
外来エレメントはまた、チロシンヒドロキシラーゼ、GTP-シクロヒドロラーゼI、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター2 (VMAT2)または任意の好適なタンパク質または抗体をコードするために用いることができる。
【００１９】
さらに、本発明は、1または複数のレトロウイルス、AAV、レンチウイルス、偽型レンチウイルス、Adベクターおよびそれらの組合せ（これらに限定しない）を介したHACの形質導入を意図する。例えば、これらのベクターを、逐次的にまたは組み合わせて使用し、HACに形質導入することができる。１個のベクターはまた、１または複数の外来エレメントを含むことができる。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、１または複数のレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞集団を提供する。例えば、レンチウイルスベクターは、ヒト羊膜細胞集団によって発現される少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを含み得る。例示的な外来遺伝子エレメントは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2またはテトラヒドロビオプテリンシンターゼのうちの一つをコードすることができる。好ましくは、レンチウイルスベクターは、RNAi誘導型、Cre-loxP型またはドキシサイクリン誘導型システムの少なくとも１つの転写制御断片を含み得る。本発明はまた、少なくとも１つの外来遺伝子を含むレンチウイルスベクターを１または複数含む組成物を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、１または複数のレンチウイルスベクターを用いて、ヒト羊膜細胞集団に形質導入する方法を提供する。好ましくは、本方法は、ヒト羊膜細胞を培養することを含む。例えば、羊膜をドナーより得られた胎盤より分離することができる。胎盤を十分に掻き出し、その下にある組織を除去することができる。必要に応じて、羊膜を少なくとも１つの酵素を用いて処理しても良い。一実施形態において、単離した細胞を、細胞培養培地中にて培養し得る。本方法はまた、少なくとも１つのベクターとヒト羊膜細胞集団とをインキュベートすることを含む。
【００２２】
一実施形態において、被験体における中枢神経系疾患を治療する方法を提供する。本方法は、外来遺伝子エレメントを有するレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞集団の使用を含むことが好ましい。例示的なCNS疾患としては、脳虚血、脳出血、中枢神経系の外傷、神経系の遺伝性疾患、中枢神経系の変性疾患(パーキンソン病、ハンチントン病およびアルツハイマー病)、神経変性疾患、脊髄損傷ならびに中枢神経系の新生物が挙げられる。
【００２３】
形質導入またはトランスフェクションは一般的に、ヒト羊膜細胞などの細胞に、ベクター（例えば、レトロウイルス、AAV、レンチウイルス、偽型レンチウイルスまたはAdベクター）を使用して遺伝物質を導入することをいう。別の種類のベクターを、HACの形質導入またはトランスフェクションに使用することができる。このようなベクターとしては、プラスミドまたはウイルスベクターが挙げられる。モロニーマウス白血病ウイルス (MoMLV)をベースとするレトロウイルスベクターを用いることができる。さらに、使用することができる他のマウスレトロウイルスベクターとしては、マウス胚性幹細胞ウイルス(MESV)およびマウス幹細胞ウイルス(MSCV)をベースとするベクターが挙げられる。
【００２４】
レトロウイルスベクターの一部であるレンチウイルスベクターもまた、高効率の形質導入のために使用することができ、これらは非分裂細胞に形質導入することが可能である。すなわち、細胞が多能性であり得る可能性を高める。スプマウイルスなどの他のレトロウイルス群もまた、非分裂細胞に効率的に形質導入することができる。本発明に用いることができる別の種類のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス (AAV)ベクター、SV40ベースのベクターまたはハイブリッドベクターの形態が挙げられる。様々な発現ベクターを、生体活性物質をコードしている遺伝子エレメント（例えば、内因性または外来遺伝子エレメント）をHACに送達するために用いることができる。これらの発現ベクターは、改変または組換えレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、偽型レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターであり得る。あるいは、発現ベクターを、非ウイルス経路、例えば、限定しないが、エレクトロポレーションおよび超音波を含む物理的方法、化学物質、リポソーム、活性化デンドリマーおよびカルシウム−リン酸に仲介される方法などにより、細胞にトランスフェクトし得る。
【００２５】
本発明において有用なプロモーターの例としては、構成的および誘導型プロモーターが挙げられる。限定されないが、このようなプロモーターとしては、CMVプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルス LTRプロモーター、EFプロモーター、テトラサイクリン誘導型プロモーター、炎症により誘発されるプロモーター、TNF-αプロモーターおよびIL-1プロモーターを含み得る。HAC以外に、本発明は、被験体への細胞送達を容易にする様々な別の構成要素および手段を含むことができる。例えば、HACは、当該細胞が保存または維持される培地に入れて提供することができる。このような培地の例としては、PBS、DMEMおよび細胞培養培地に好適な任意の種類が挙げられる。一実施形態において、本発明では、限定しないが、HEPES、PBSまたはクエン酸系バッファーなどのバッファーが意図される。さらに、本発明は、色素、パッケージ、キット、形質導入したHACを使用するための解説書、DMSOおよび凍結保存するためのグリセロールを含み得る。本発明の形質導入したHACは、限定しないが、治療、診断、化粧品または他の何らかの用途に使用することが可能である。
【００２６】
一実施形態において、外来エレメントは、限定しないが、成長因子、抗菌性タンパク質、抗炎症性タンパク質またはプロテアーゼインヒビターを含むことができる。成長因子の例としては、PDGF、FGF-2、EGF、KGF-2、GM-C SF、TGF-b、IGF-IおよびHGHを挙げることができる。さらに、抗菌性タンパク質の例としては、殺菌性/透過性タンパク質、デフェンシン、コレクチン、グラニューライシン、プロテグリン-1、SMAP-29、ラクトフェリンおよびカルグラヌリンC（calgranulin C）が挙げられる。好ましくは、抗炎症性タンパク質の例としては、インターロイキン-1レセプターアンタゴニスト、インターロイキン-10、可溶性TNFレセプターおよび可溶性CTLA4が挙げられる。また、プロテアーゼインヒビターとしては、例えば、TIMP-1、-2、-3、-4、PAI-1、PAI-2およびエコチンが挙げられる。
【００２７】
本発明ではまた、HACをトランスフェクションするためのそれぞれのベクターが、少なくとも１つのプロモーターを含み得ることを意図する。ベクターの外来遺伝子エレメントはまた、マーカー配列を含み得る。一実施形態において、ベクターを用いて形質導入され得る細胞としては、限定しないが、哺乳動物組織、上皮細胞、肺胞細胞、骨髄、心筋、結合組織、上衣細胞、上皮組織、上皮細胞、表皮、食道、線維芽細胞、グリア細胞、肝細胞、角化細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、乳腺、メラニン細胞、単球、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、骨形成原細胞、下垂体細胞、プラズマ細胞、骨格筋、平滑筋、滑膜細胞、臍帯組織、HACまたはそれらの組合せに由来するか、またはそれらを含む細胞が挙げられる。また、ベクターの外来遺伝子エレメントは、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの検出可能なマーカーをコードする配列を含むことができる。
【００２８】
一実施形態において、レンチウイルスベクターで形質導入されているHACを用いて、移植用組成物を作製することができる。移植用組成物は、内因性または外来遺伝子エレメントを含んでなるベクターによってトランスフェクトした細胞を含むことができる。例えば、移植用組成物はまた、生体適合性マトリックスを含むことができる。移植用組成物のためのHACは、被験体より採取され、再び当該被験体に戻される前に、in vitroにてトランスフェクトすることができる。移植用組成物用の例示的な生体適合性マトリックスとしては、天然または人工のマトリックスが挙げられる。移植用組成物はまた、構成的にまたは物理的もしくは化学的刺激によって誘導され、治療の間のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに作用する機能的エレメントを含み得る。好ましくは、移植用組成物は、限定しないが、消化管(経口または坐薬による)、非経口(筋肉内、静脈内または皮下)または局所的に投与することができる。
【００２９】
本発明ではまた、ベクターで形質導入されているHACとさらなる構成成分とを含む組成物が意図される。例えば、このような構成成分としては、細胞（遺伝子改変されている細胞）、タンパク質、ペプチド、非タンパク質性生体有機物質（治療剤(抗炎症剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗新生物剤または抗真菌剤)およびそれらの組合せが挙げられる。一実施形態において、本発明のベクターで形質導入されているHACは、CNS疾患の予防または治療に用いることができるグリアまたは脳由来神経栄養因子をコードする少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを含むことができる。
【００３０】
形質導入されているHAC集団またはその組成物を患者に対して、例えば、一日あたり約103細胞〜約1010細胞の例示的な用量レベルで局所的に投与することができる。しかし、用いられる特定の用量は、当業者が適当であると判断されるように変更、または調節することができる。限定しないが、この用量は、複数の要因（投与方法、患者の要件、および治療される疾患の重篤度など）に依拠し得る。特定患者に対する最適用量の決定法は、当業者に周知である。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点はまた、図面と共に以下の詳細な説明より明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、以下の詳細な説明、ならびに図面および本明細書中の実施例などを参照することによって容易に理解することが可能であろう。本発明は、それぞれが少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを含むレンチウイルスベクターを含むヒト羊膜細胞集団を提供する。本明細書中で用いられる場合、レンチウイルスベクターとは、対象とする遺伝子を全ての細胞内で分解することなく細胞に移送することができる作用物質である。レンチウイルスベクターはまた、例えば、羊膜細胞などの細胞において遺伝子発現を生じるプロモーターを含むことができる。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスファミリー由来のウイルスの核酸骨格をベースとしている。レンチウイルスベクターはまた、第１、第２および第３世代のレンチウイルスを含むことができる。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、AdおよびAAVよりも効率的に遺伝子導入を行うことができる。さらに、レンチウイルスベクターは、ウイルスタンパク質による検出可能な病原性および免疫原性を生じることなく、外来性の導入遺伝子を安定して発現することができる。本発明のレンチウイルスベクターによって形質導入されているヒト羊膜細胞は、遺伝子治療に特に有効であり得る。
【００３３】
一実施形態において、レンチウイルスベクターは第３世代レンチウイルスである。例えば、第３世代レンチウイルスは、少なくとも3つの独立したプラスミドに分割されるレンチウイルスパッケージング遺伝子を有する。さらに、第３世代レンチウイルスなどのレンチウイルスベクターは、HIV-1 tat遺伝子(ウイルス複製に必須であるHIV-1 LTR プロモーターの強い転写アクチベーター)およびアクセサリー遺伝子(vpr, vpu, vifおよびnef)を欠いていても良い。好ましくは、HIV-1のEMV遺伝子はVSVG遺伝子によって置換されており、残りのHIVゲノムは2つの発現構築物に分割することができる。例示的なレンチウイルスとしては、PWPT、PLVTHMまたはPLVベクターが挙げられ得る。
【００３４】
HACは、受精から約8日後の胞胚における初期内部細胞塊より発生する。ヒト羊膜細胞は、ヒト羊膜から得ることができる。例示的なHACは、羊膜上皮および間葉系幹細胞を含む。ヒト羊膜細胞は、例えば、GFAP、MAP2、ネスチンおよびAFPなどの通常、幹細胞に存在するいくつかのマーカーを発現し得る（Knezevicら、 Anat, 1996, 189：1-7；Yugeら、Transplantation, 2004, 77(9)：1452-4；Takashimaら、 Cell Struct. Funct, 2004, 29(3)：73-84；Sakuragawaら、 Neurosci. Lett., 1996, 209(1)：9-12；Weiら、 Cell Transplant., 2003, 12(5)：545-52）。さらに、羊膜細胞の表面では、HLA-A、HLA-B、HLA-CおよびHLA-DR抗原ならびにβ2ミクログロブリンの発現が無いかまたは乏しいことが示され得る（Akleら、 Lancet, 1981, 2(8254)：1003-5；Adinolfiら、 Nature, 1982, 295：28）。本発明のHACは、HLAクラス1b (HLA-G)を発現し得、これは免疫拒絶をあまり生じず、長期間宿主において生存することが可能である。同様に、HACは異種移植または同種移植の後、分化することが可能である（Uetaら、 Clin. Exp. Immunol., 2002, 129(3)：464-70）。
【００３５】
哺乳動物の宿主細胞においてベクター由来の転写を制御するプロモーターは、例えば、RNAi誘導型、Cre-loxP型およびドキシサイクリン誘導型システムなど様々な供給源より得ることができる。HACに形質導入するためのベクターは、細胞で発現され得る外来遺伝子エレメントを運ぶことができるように設計することができる。外来遺伝子エレメントは、例えば、マーカー遺伝子を含み得る。このようなマーカー遺伝子は産物を生じ、遺伝子が細胞に送達され、そして発現されているのか調べるために用いることができる。例示的なマーカー遺伝子としては、E. Coli lacZ遺伝子（P-ガラクトシダーゼをコードする）、緑色蛍光タンパク質(GFP)または増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を挙げることができる。
【００３６】
一実施形態において、外来遺伝子エレメントとしてはまた、天然の遺伝子を置換または補う遺伝子などを挙げることができ、これらは中枢神経系疾患を治療し得る。例えば、外来遺伝子エレメントは、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グリア由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、コリンアセチラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ、bcl-2、テトラヒドロビオプテリンシンターゼまたはそれらの組合せをコードし得る（Bemelmansら、 Hum. Gene Ther., 1999, 10：2987-97；Ghodsiら、 Hum. Gene Ther., 1998 ,9：2331-40；Snyderら、 Nature, 1995, 374：367-70；Patellaら、 Gene, 1989, 80：137-44；Bjorklundら、Brain Res., 2000, 886：82-98；Kangら、 Hum. Cell, 2001, 14：39-48；Yamadaら、 Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96：4078；Tuszynskiら、 Exp. Neurol., 1998, 154：573-82；Sailleら、 Neurostience, 1999, 92：1455-63；Haaseら、 Ann. Neurol, 1999, 45：296-04；Mohajeriら、Hum. Gene Ther., 1999, 10：1853-66；Azzouzら、Hum. Mol Genet., 2000, 9：803-811；Adachiら、Hum. Gene Ther., 2000, 11 ：77-89.）。好ましい外来遺伝子エレメントは、グリア由来神経栄養因子 (BDNF)または脳由来神経栄養因子(GDNF)遺伝子を含み得る。
【００３７】
神経栄養因子は、発生段階における神経細胞の成長および生存、ならびに成体神経細胞の維持に役立つ。例えば、動物実験およびin vitroモデルによって、特定の神経栄養因子は損傷した神経細胞を再び成長させることができることが示されている。一実施形態において、神経栄養因子をコードする少なくとも１つの外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルスベクターを含む羊膜細胞が提供される。例示的な神経栄養因子を使用して、中枢神経系疾患の影響を治療または改善することができる。脳由来神経栄養因子 (BDNF)は、栄養素であるニューロトロフィンファミリーに属する。BDNFはCNSにおいて広範に亘って大量に発現され、いくつかの末梢神経系ニューロンに利用される。かかる末梢神経系ニューロンは、末梢組織によって産生されたニューロトロフィンを取り込む。BDNFは、発生段階における特定のニューロン集団の生存および分化を促す。
【００３８】
成体期の間、BDNFは、ニューロンのシナプス強度を調節し、学習および記憶に関する海馬のメカニズム、ならびに痛みに関する脊髄のメカニズムに関与し得る。CNS障害のいくつかはまた、栄養供給の低下に関連している。BDNFおよびその高親和性レセプターがCNS全体に亘って豊富に存在する場合、BDNFは限定しないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、うつ病、てんかんおよび慢性的な疼痛などの治療に効果的である、有効な神経保護剤であり得る。グリア細胞由来の神経栄養因子（GDNF）はまた、神経栄養因子タンパク質ファミリーに属する。GDNFは、ドーパミン作動性ニューロンの生存能および形態的分化を高め、ドーパミンの取り込みを増大させる。GDNFは、プログラム細胞死および軸索切断によってもたらされる細胞死から運動ニューロンを助けることができる。GDNFは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存および軸索成長に関して特に有効な因子であり、いくつかの動物モデルにおいて運動障害を改善し、脳の損傷を低減させたことが示されている（Bjoerklundら、 Brain Res., 2000, 886：82；Gashら、Nature, 1996, 380：252；Kordowerら、 Science, 2000, 290：767；Zurnら、BrainRes. Rev., 2001, 36：222）。
【００３９】
外来遺伝子エレメントの一例は、GDNF遺伝子からなる。図1は、GDNF外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルス構築物を示す。本明細書中に記載されるような例示的な外来遺伝子エレメントは、限定しないが、本明細書中に記載される参考文献およびGenBankなどから得られる配列を含むことができる。一実施形態において、外来遺伝子エレメントは、従来の組換え技術により構築または変更することができる。
【００４０】
本発明の別の態様では、ヒト羊膜細胞と少なくとも１つの医薬的に受容可能なキャリアーとを含む組成物を含む。例えば、外来遺伝子エレメントを含んで成るレンチウイルスベクターを含むHACおよびその組成物は、被験体の身体に遺伝子治療のために移植することができる。外来遺伝子エレメントを含んでなるレンチウイルスベクターを含むHACを、脳神経系疾患の治療に用いることが好ましい。中枢神経系疾患には、脳、脊髄、脳神経、神経根および自律神経系の障害が含まれる。中枢神経系(CNS)疾患はまた、例えば、脳虚血、脳出血、中枢神経系の外傷、神経系の遺伝性疾患、神経変性疾患、脊髄損傷、パーキンソン病および中枢神経系の新生物を含むことができる。
【００４１】
脳虚血とは、脳またはその一部分が十分な血流を得ることができず、正常な神経学的機能を維持していない虚血状態をいう。この状態は、様々な疾患または絞窄などの動脈閉塞により生じ得る。脳虚血は、ニューロン死を生じ、脳障害を引き起こし得る。さらに、脳出血は、血管の破裂または閉塞が脳における酸素欠乏を引き起こすことによる、突然の意識喪失を生じる。CNS外傷とは、脳および脊髄の損傷であり、それは脳および脊髄への直接的損傷または脳および脊髄周囲の骨、軟組織もしくは血管の損傷による間接的損傷によって生じる。
【００４２】
遺伝性神経系疾患とは、遺伝性の、緩徐進行性障害群であり、例えば、ハンチントン舞踏病(HD)、黒内障白痴(Tay-Sachs)、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)およびマシャド・ジョセフ病(MJD)などの神経に対する進行性損傷により生じ得る。神経変性疾患とは、特定の神経細胞(ニューロン)の変性によって生じる障害である。これら細胞の変化によって、その細胞に機能異常を生じ、そして最終的には細胞死をもたらし得る。アルツハイマー病、パーキンソン病ならびに筋萎縮性側索硬化症(ALS)および多発性硬化症は、中枢神経系の神経変性によるものである。
【００４３】
中枢神経系の新生物としては、限定しないが、脳半球、脳幹神経節、視床下部、視床、脳幹および小脳などの新生物を含む。脳の新生物は、原発性(脳組織を起源とする)および二次的(転移性)形態に分類できる。原発性新生物はまた、良性と悪性形態に分類することができる。一般的に、脳腫瘍は、発症年齢、組織型または存在位置によって分類できる。
【００４４】
脊髄損傷とは、脊髄の損傷であり、それは脊髄への直接的損傷または脊髄周囲の骨、軟組織または血管の損傷による間接的損傷によって生じる。パーキンソン病とは慢性進行性神経疾患であり、黒質におけるドーパミン産生の低下に関連があり、静止筋肉の振戦および衰弱ならびに引きずり歩行を特徴とし得る。パーキンソン病の症状は、黒質と呼ばれる脳部分における神経細胞の喪失によってもたらされ、それは脳全体に亘るドーパミンの(神経化学的)減少を生じる。この破壊は、遺伝的または環境的要因およびそれらの組合せによって生じる。
【００４５】
一実施形態において、中大脳動脈閉塞(MCAo)による虚血性ラットにGDNFを形質導入したHACを脳内移植(例えば、上皮)することによって、行動機能障害を顕著に改善し、また梗塞容積を減少させることができる。さらに、これら移植HACにおいて、ニューロンマーカーおよびニューロン幹細胞のマーカーを検出することができる。同様に、これら移植HACの多くは生存して、梗塞領域に移動する。
【００４６】
例えば、神経系の成長因子の一つの重要なメンバーであるBDNF遺伝子は、中枢神経系の発生および成体ニューロンの調節において生理学的役割を果たす。BDNF遺伝子はまた、様々な損傷ニューロン(損傷の原因は問わない)において有効な神経保護的効果を生じる。脳において、ADまたはPD 被験体のBDNFタンパク質量は、正常の被験体におけるよりも乏しい。BDNFを形質導入したHAC (例えば、上皮)のPD 被験体 (ラット)への脳内移植によって、行動機能障害が顕著に改善され、BDNF タンパク質量を増加し得る。本発明によって、BDNFを形質導入したHACを、後脊髄不完全損傷を伴うアカゲザルに移植することによって、行動機能障害を顕著に改善することができる。
【００４７】
本明細書中において、「場合によって」とは、以下に記載される事象または環境が生じても良いし、生じなくても良く、当該記載が、その事象または環境が生じる例も、生じない例も含むことを意味する。
【００４８】
記載するように、医薬的に受容可能なキャリアーとしては、滅菌水溶液、懸濁液およびエマルションを挙げることができる。また、水溶液キャリアーとしては、限定しないが、 PBSまたはハンクス溶液が挙げられ得る。例示的なエマルションまたは懸濁液は、コラーゲン、ヒドロキシプロキシルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、PVP、アガー、ペクチン、ケイ酸アルミン酸マグネシウムまたはアルミン酸マグネシウムを含むことができる。
【００４９】
移植される細胞の数は、患者の状態および本発明の細胞における所望される遺伝子産物を産生する能力に応じて、適切に決定することができる。一実施形態において、移植される細胞の数は、約105〜1010個であり得る。治療法はまた、細胞およびその組成物の移植法に関係し得る。さらに、治療法はまた、例えば、直接注射または脳移植などの滅菌法を含み得る。
【００５０】
本明細書中の実施例によって、これまでに記載されていない本発明の利点が示され、さらに、当業者が本発明のHACを作製および使用することを助ける。実施例は、上記本発明の変更物または実施形態のいずれかを含むか、または組込むことができる。また、上記実施形態は、さらにそれぞれ本発明のいずれかの実施形態または他の全ての実施形態の変更物を含むか、または組込むことができる。さらに、従来法を含む生物学的方法が、本明細書中に記載されている。このような従来法は、一般的に当該分野で公知であり、一般的に例えば、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 第3版, vol. 1-3, ed. Sambrookら、 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001 and Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelら、 Greene Publishing and Wiley-Interscience, N. Y., 1992などに記載されている。同様に、核酸の化学的合成に関する例示的な方法が、限定しないが、Beaucageら、 Terra. Letts., 1981, 22：1859-12およびMatteucciら、 J. Am. Chem. Soc, 1981, 103：3185に記載されている。例えば、核酸の化学的合成は、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して実施することができる。免疫学的方法もまた、限定しないが、 Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeffら、 John Wiley & Sons, N.Y., 1992に記載されている。遺伝子導入および遺伝子治療の従来法はまた、本発明による使用に適合することができる（Gene Therapy：Principles and Applications, ed. Blackensteinら、 Springer Verlag, 1999；Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. Robbinsら、 Human Press, 1997；Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed. Hodgsonら、 Springer Verlag, 1996）。
【実施例】
【００５１】
実施例Ｉ
HACの培養： 
羊膜を胎盤の絨毛膜から機械的に剥ぎ取り、十分に掻き出し、下層組織(海綿状および線維芽細胞の層)を除去し、純粋な上皮層を基底膜と共に得た。膜をかみそりで切断し、断片とした。単一の細胞を得るのに十分量の酵素溶液を加えた。次にHACを、細胞培養培地中で培養した。
【００５２】
ベクター：
パッケージされたレトロウイルスの作製方法およびレンチウイルスパッケージングシステムは、当業者に周知である。簡潔に言うと、レンチウイルスベクターを、293T 細胞の一過的なトランスフェクションによって作製した。20μgのレンチウイルスベクター (PWPT、LVTHMまたはPWPT- GDNF、図1)、10μgのpMDlg/pRRE (またはpCMVdR 8.2)、5μgのpMD2 Gおよび5μgのpRSV-REVを混合し、水で250μlに調整した。それに250μl の0.5 M CaCl2を混合し、得られた混合物に500μlのHeBS2×(0.28M NaCl, 0.05M HEPES, 1.5M Na2HPO4)を加え、30分間ベンチにて静置した。
【００５３】
皿を37℃、5% CO2の加湿インキュベーター中に入れた。培地を吸引した。14時間後、37℃に予め暖めた10 mlの新鮮なDMEM-10% FBS (PAA Austria)をゆっくりと加え、その後28時間インキュベートした。ウイルスを回収し、1500 rpm にて15分間遠心分離して清澄し、そして0.45μm フィルターを通してろ過した。90 分間、80,000 g、4℃にて、超遠心分離を行った。上清のアリコートを、ペレットとして1 ml PBSを用いて再懸濁し、-8O℃に保存した。濃縮した上清の滴定を、1×10５個のHela細胞にてベクターストックを連続希釈し、その後、蛍光活性化サイトメトリー(Beckton Dickinson Immunocytometry Systems)解析によって行った。式：1×10５個のHela細胞×(%) EGFPポジティブ細胞×1000/μlウイルスによると、レンチウイルスベクターのタイターは、0.1〜1×109 TU/mlの範囲と算出された。
【００５４】
レンチウイルスベクターに感染したHAC：
ウイルスベクターを、1〜10μg/mlポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下、培養した羊膜細胞に加え、その後2日間置いた。PBSで洗浄後、HACを細胞培養培地中において継続して培養し、外来遺伝子エレメントをHACに導入した。
【００５５】
実施例ＩＩ
レンチウイルスベクターの感染：
ヒト羊膜の研究および使用については、患者および倫理委員会の審査の両方に承認を受けた。例えば、羊膜を簡単な帝王切開術によって女性から得た胎盤の絨毛膜より機械的に剥ぎ取り、十分に掻き出し、下層組織(海綿状および線維芽細胞の層)を除去し、純粋な上皮層を基底膜と共に得た。この膜を、RPMI 1640 培地を含む250ml広口フラスコに入れ、かみそりで切断し、0.5〜1.0の断片を得た。十分量のトリプシン/EDTA溶液（37℃）を培地に加え、膜が覆われるようにした。この操作は２回行い、１回目および２回目の操作はそれぞれ約30分間および15分間であった。得られた細胞を、10% ウシ胎仔血清(PAA Austria)、100μg/mlのストレプトマイシン、100 U/mlのペニシリンおよび0.3 mg/mlのグルタミンを添加したRPMI-1640 培地を入れた6ウェルプレートに播種し、5% CO2、37℃の加湿雰囲気下にてインキュベートした。HACを6ウェルプレートに播種し(2×105個の細胞/ウェル、Costar)、そしてポリブレン(Sigma-Aldrich)を、8μg/mlの最終濃度でウェルに加えた。48時間インキュベートした後、レンチウイルスベクター(PWPT)を加えた(MOI = 100)。また、DOTAP (Boehringer Mannheim)を用いてHACをトランスフェクトした。
【００５６】
形質導入したHACを1週間培養した。EGFP発現を、蛍光顕微鏡写真によって可視化し、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。ゲノムDNAを、例えば、Promegaによって記載されているように単離し、総RNAの単離および逆転写を実施した (Promega)。EGFPの相対発現量を調べるために、EGFPおよびβ-アクチン(内部基準)について半定量的PCR解析を、28サイクルのPCR増幅を用いて実施した。プライマー配列は以下のとおりであった：EGFP (上流 5'-cgagctggacggcgacgtaaac-3'および下流 5'-gcgcttctcgttggggtctttg-3')ならびにβ-アクチン(上流 5'-aacgagcggttccgatgccctgag-3'および下流 5'-tgtcgccttcaccgttccagtt-3')。増幅条件は以下のとおりであった：94℃5分間；94℃1分間、58℃1分間、72℃１分間を28サイクル；72℃10分間。EGFP RT-PCR産物の予想される大きさは597 bpであった。発現の差異を、それぞれβ-アクチン(590 bp)によって正規化した。10μｌの各RT-PCR産物を、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する1.5%アガロースゲルに負荷し、電気泳動によって分離した。
【００５７】
結果：
EGFPは、形質導入から4日後に、蛍光顕微鏡検査法によって観察することができる。対照については、HACをDOTAPを用いて形質導入した。これらの細胞は７日目に、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって記録した。レンチウイルスベクターの形質導入は、DOTAPよりも効率的であり、レンチウイルスベクターにより約90%の細胞が良好に形質導入されていることが検出され(図2A)、DOTAPを用いた場合は5%未満であることが検出された(示していない)。EGFP発現を継続して5週間調べ、そしてEGFPポジティブHACを培養期間中維持した(図2B)。HACへのEGFPの組込みを調べるために、ゲノムDNAおよびmRNAを形質導入から7日後に抽出し、PCRおよびRT-PCR増幅に供した。結果より、EGFPがHACのゲノムに組込まれており、mRNAレベルで安定して発現していることが示された(図2C)。レンチウイルスベクターは、トランスフェクション後にGO-G1段階の細胞の％に影響を与えなかったことから(図2D)、レンチウイルスベクターで改変したHACは、安定した遺伝子送達物質であることが示された。以上のように、本発明のレンチウイルスベクターで形質導入されているHACは、安定した遺伝子送達を行うことができ、CNS疾患の予防または治療に有用であり得る。
【００５８】
実施例III
HACにおけるレンチウイルスベクター介在性siGFP抑制：
HACを6ウェルプレート(2×105個の細胞/ウェル, Costar)に播種し、ポリブレン(Sigma-Aldrich)を当該ウェルに加えた。最終濃度8μg/mlで、レンチウイルスベクター(pLVTHMおよびpLVTHMsiGFP)を加えた (MOI = 100)。EGFP発現を蛍光顕微鏡写真によって可視化し、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。EGFPの相対発現量を調べるために、EGFPおよびβ-アクチン(内部基準)について、28サイクルのPCR増幅を用いた半定量的PCR解析を行った。プライマー配列は以下のとおりであった：EGFP (上流5'-cgagctggacggcgacgtaaac-3'および下流5'- gcgcttctcgttggggtctttg-3')ならびにβ-アクチン(上流5'-aacgagcggttccgatgccctgag-3'および下流5'-tgtcgccttcaccgttccagtt-3')。増幅条件は以下の通りであった：94℃5分間；94℃1分間、58℃1分間、72℃1分間を28サイクル；および72℃10 分間。EGFP PCR産物の予想される大きさは、597 bpであった。発現の差異を、それぞれβ-アクチン(590 bp)によって正規化した。10μｌの各RT-PCR産物を、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する1.5%アガロースゲルに負荷し、電気泳動によって分離した。
【００５９】
結果：
RNA干渉は、転写後におけるRNA介在型遺伝子調節の最良の遺伝子抑制経路であった。レンチウイルスベクターによって送達されたsiRNAの発現を用いて、HACにおけるEGFP発現を機能的に抑制することができる。レンチウイルスベクター(PLVTHMsiGFP)におけるsiGFP配列は、dsRNAに転写され、これがリボヌクレオタンパク質複合体を形成することによって配列特異的な切断を仲介する。第1の実験において、HACにおいてEGFPを発現するレンチウイルスベクターPLVTHMの能力を調べた(図3A)。MOI = 100によって、良好な割合で形質導入を行うことができた。PLVTHMを用いて形質導入されたHAC-EGFP細胞は、培養条件にかかわりなく強いEGFP発現を有した。一方、構成的に活性なPLVTHMとPLVTHMsiGFPとを同時形質導入したHAC-siGFP細胞は、EGFPの強いダウンレギュレーションを示した(図3C)。FACSにより、PLVTHMsiGFPが、HAC-siGFP細胞におけるEGFP発現を15%未満に抑制したことが示された(図3B)。RT-PCRの結果によると、mRNAレベルで抑制されていることがわかった(図3D)。
【００６０】
実施例IV
Cre-loxPシステムベースのレンチウイルスベクターがHACに形質導入されたEGFPを除去する：
HACを6ウェルプレートに播種し(2×105個の細胞/ウェル, Costar)、そしてポリブレン (Sigma-Aldrich)をウェルに加えた。最終濃度8μg/mlでレンチウイルスベクター(PWPTおよびPWPT-Cre)を加えた(MOI = 100)。形質導入したHACを1週間培養した。EGFP発現を蛍光顕微鏡写真によって可視化し、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって解析した。ゲノムDNAを、例えば、Promegaに記載されているように単離した。EGFPの相対発現量を調べるために、EGFPおよびβ-アクチン(内部基準)についての半定量的PCR解析を、28サイクルのPCR増幅を用いて実施した。プライマー配列は以下のとおりであった：EGFP (上流5'-cgagctggacggcgacgtaaac-3’および下流5'-gcgcttctcgttggggtctttg-3')ならびにβ-アクチン(上流5'-aacgagcggttccgatgccctgag-3’および下流5'-tgtcgccttcaccgttccagtt-3')。増幅条件は以下のとおりであった： 94℃5分間；94℃1分間、58℃1分間、72℃1分間を28サイクル；および72℃10分間。EGFP PCR産物の予想される大きさは597bpであった。発現の差異を、それぞれβ-アクチン(590 bp)によって正規化した。10μｌの各RT-PCR産物を、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する1.5%アガロースゲルに負荷し、電気泳動によって分離した。
【００６１】
Creとは、部位特異的リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーのメンバーであり、loxP DNAエレメント間の組換えを触媒する（Sternbergら、 J. Mol. Biol., 1981, 150：467-86）。Creがレンチウイルスベクターに基づいて、loxPに隣接する特定遺伝子の欠失を触媒するHAC系統の作製を試みた。例えば、レンチウイルスベクターの3'LTRにloxPが存在し、逆転写後、loxPがLTRの両端に組入れられる。Creは、HACのゲノム中のloxPに隣接しているレンチウイルス断片の欠失を触媒した。
【００６２】
結果：
FACSの結果より、EGFPが10%未満に抑制されたことが示された(図4A、4Bおよび4C)。さらに、この欠失がゲノムDNA中に生じたこともわかった(図4D)。このように、HACにおいてPWPT-Creを伴う特定遺伝子はノックアウトすることができる。
【００６３】
実施例V
ドキシサイクリン誘導系をベースとするレンチウイルスベクターはEGFP発現を調節する
HACを6ウェルプレートに播種し(2×105個の細胞/ウェル, Costar)、そしてポリブレン(Sigma-Aldrich)をウェルに加えた。最終濃度8μg/mlでレンチウイルスベクター(pLVTHMおよびレンチ-tTRKRAB)を加えた (MOI = 100)。48時間インキュベートした後、ドキシサイクリン(最終濃度5μg /ml, Sigma)を、PLVTHMとレンチ-tTRKRABとを同時形質導入した細胞に加えた。
【００６４】
結果：
ドキシサイクリンが存在しない間、tTR-KRAB タンパク質はtetOに特異的に結合し、近隣プロモーター(そのDNA結合部位から3 kbまで)の活性を抑制するための手段を生じる。逆に、ドキシサイクリンの存在下では、tTR-KRABはtetOから離れ、それによって遺伝子発現を可能にする。PLVTHMで形質導入したHACにおいてEGFPが観察された後、レンチウイルスベクター介在型ドキシサイクリン誘導性システムを、HACにおけるEGFPのドキシサイクリン誘導性調節について試験した(図5A)。tTRKRABベースのレンチウイルスベクターは、ドキシサイクリンの非存在下においてEGFPの発現を抑制した(図5B)。一方、二重形質導入された細胞にドキシサイクリンを添加することによって、EGFPの(再)発現を生じた(図5C)。
【００６５】
実施例VI
バイオセーフティーの検出：
HACに組込まれているベクターを検出するために、細胞をPWPTを用いて3日間形質導入し、そして充分に洗浄した。その後、培地を回収し、0.45μm フィルターを通してろ過した。Hela細胞を培地で3日間培養し、そしてHela細胞およびHACのゲノムDNAを、例えば、Promegaに記載されるように単離した。ゲノムDNA (100 ng)をPCRに供した。使用したプライマーは以下の通りであった： EGFP (上流5 '- cgagctggacggcgacgtaaac-3’および下流5'-gcgcttctcgttggggtctttg-3')ならびにβ-アクチン(上流5'-aacgagcggttccgatgccctgag-3’および下流5'-tgtcgccttcaccgttccagtt-3')ならびに、HIV-I gag遺伝子に相同であるプライマー(上流5'-gagtatctgatcatactgtcctac-3’および下流5'-ggaactactagtacccttcaggaa-3')。増幅条件は以下のとおりであった： 94℃5分間；94℃1分間、58℃1分間、72℃1分間を28サイクル； 72℃10分間。EGFPおよびgagのPCR産物の予想される大きさはそれぞれ、597 bpおよび912 bpであった。発現の差異を、それぞれβ-アクチン(590 bp)によって正規化した。10μｌの各RT-PCR産物を、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する1.5%アガロースゲルに負荷し、電気泳動によって分離した。
【００６６】
結果：
EGFPはHACに良好に組込まれ、Hela細胞のゲノム中には存在しなかったことがわかった(図6A)。GAGは、ウイルス形成に必須であり得るレンチウイルスの構造タンパク質であり、EGFPを発現するHACまたはHela 細胞にて検出されなかった(図6B)。これらの結果より、レンチウイルス感染HACを、移植前にバイオセーフティーについて調べられることが示された。
【００６７】
実施例VII
脳虚血性ラットへ感染および移植されたHAC:
レンチ-GDNF (MOI = 50)を、DMEM-F 12で培養したHACに8μg/mlポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下で加え、２日間置いた。ウシ胎仔血清非含有のDMEM-F 12 培地中にて5日間培養した後、HACをPBSで洗浄し、0.25% トリプシン (Sigma)/0.05% DNase I (Sigma)/PBS中37℃にて20分間インキュベートした。細胞を0.05% DNase I/PBSで2〜3回すすぎ、単一細胞の懸濁液へ機械的に解離した。細胞懸濁液のアリコートを、細胞の生存率(トリパンブルー)および濃度について調べた。移植前の細胞懸濁液の生存率は95%を超えていた。定位固定フレーム(Narishige)および26ゲージのハミルトンシリンジを使用して、5μlのPBS中に入れた8×105個のGDNFで改変したHAC(HAC-GDNF)を、MCAo ラットの右側側背面線条体に注射した（Markgrafら、 Brain Res., 1992, 575(2)：238-46）。頭蓋骨表面の4 mm 下、十字縫合の1 mm後方かつ3 mm側方に10分間かけて注射した。これは虚血性境界域に近接していた。十字縫合より前方-後方(AP) = -1 mm、中央-側方(ML) = 3 mmおよび背側-腹側 (DV) = 4 mm。
【００６８】
各群について3匹のラットを、処置から16日後に過剰量のフェノバルビタールを用いて麻酔し、屠殺した。その脳を慎重に取り出し、モールドを使用して2 mm切片にスライスした。この切片を、塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム (TTC, PBS中2%溶液)を用いて30分間染色した。さらにこの切片を、画像取り込みシステム(Leica)を用いて撮影した。画像解析ソフトウェアAutoCAD (AutoDesk)を障害部（infracted）容積を算出するために用いた。結果は脳半球の％で表した。
【００６９】
結果：
全ての群において、梗塞容積は2〜16日目に減少した。MCAoから2日後、2つの群の間に顕著な差は見られなかった。MCAoから16日後、対照PBS群におけるラットと比べて、HAC-GDNF群のラットにおける梗塞容積の％は顕著に減少した(図7)。
【００７０】
免疫組織化学的検出：
移植から16日後、GDNFおよびMAP2染色のために、各群3匹のラットを屠殺し、免疫組織化学によって調べた。ラット脳を4%パラホルムアルデヒド固定剤を用いて2日間固定した。その後、30μmの凍結切片(注射部位付近)を-20℃にてクリオスタットを用いて切り出し、そして免疫組織化学に供した。この切片をPBS (pH 7.4)を用いて3回すすいだ。内在性ペルオキシダーゼ活性をH2O2 (0.3%)を用いて30分間クエンチした。10%正常ヤギ血清またはウマ血清を用いて4℃にて一晩ブロッキングした後、このスライドを、MAP2に特異的な第１抗体(1:200, Sigma M4403)またはGDNFに特異的な第１抗体(1：100, Santa Cruz SC-9010)と共に、4℃にて48時間インキュベートした。次にこの切片をPBS (pH 7.4)を用いて3回すすぎ、その後ビオチン結合体化抗マウスまたは抗ウサギIgG (Vector Laboratories)に付した。その後、切片をPBS中で洗浄し、アビジン-ビオチン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体と共にインキュベートした。このプレパレーションをさらに、Vectastain ABCキット(Vector Laboratories)を用いて染色した。最終的に、このスライドをジアミノベンジジン(DAB)を用いて着色した。免疫組織化学解析は、少なくとも3回繰り返し行った。
【００７１】
結果：
GDNFを用いて操作したHAC (HAC-GDNF)を、MCAoラットの側方線条体および大脳皮質に注射し、そして被験体の脳中の移植片を免疫組織化学によって検出した。移植されていない正常ラットの皮質領域では、GDNFポジティブのシグナルは得られなかった（示していない）。GDNFポジティブ細胞は、大脳皮質および線条体中に含まれる虚血性ラット脳の注射部位に検出された。多数のGDNFポジティブ細胞がまた、HACを移植したMCAoラット中にも見出された(図8)。移植から16日間後、MAP2ポジティブ細胞を注射部位に見出した(図9)。これはHACがニューロンに分化する可能性があることを示している。
【００７２】
神経学的試験：
神経学的知見を、Longaらによって開発された改良型スコアシステムによって記録した。例えば、スコアOは神経学的欠損が存在しないことを示し、スコア1はラットが対側前肢を完全に伸長することに困難性を有することを示し、スコア2はラットが対側前肢を伸長できないことを示し、スコア3は対側への軽度の回転運動を示し、スコア4は対側への重篤な回転運動を示し、そしてスコア5は対側へ落下することを示す。神経学的欠損の重篤度を3つの脳梗塞群において観察した。治療については、P < 0.05の有意水準を伴う平均値±SEによって統計学的に試験および解析した。
【００７３】
MCAo以前には、神経学的欠損は見受けられなかった。脳梗塞群(PBS処置した脳梗塞およびGDNFを形質導入したHACで処置した脳梗塞)のラットを、細胞移植後〜16日目内の4時点で調べた。
【００７４】
結果：
6段階の基準で記録される神経学的知見を示し、データは２群における顕著な差異を示した(図10)。追跡比較解析によって、4日目にHAC-GDNF群とPBS群との間に顕著な差異があることが明らかとなった(p < 0.05)。これらの結果は、HAC-GDNFが、ラットの特に初期段階の神経学的欠損の重篤性を顕著に減少させることを示す。
【００７５】
移動テスト(ビームウォーキングテスト)
ビームウォーキングテストはOhlsonらによって記載されている。ビームは長さ1750mmかつ幅19mmであった。ビームは床から700 mmのところにセットした。壁はビームから2 cm付近のところに交互にセットした(ラットはビームに隣接して壁がセットされている箇所を歩く傾向がある)。スコアは0〜6で示した。具体的には、スコア0については、ラットは落下し、スコア1については、ラットはビームを渡ることができないが、ビーム内にとどまることができ、スコア2については、ラットは歩行時に落下し、スコア3については、ラットはビームを渡ることはできるが、影響の出ている後肢は前方方向への移動に機能せず、スコア4については、ラットは50%以上肢を滑らせながらビームを渡り、スコア5については、ラットはわずかに肢を滑らせながらビームを渡り、そしてスコア6については、ラットは肢を滑らすことなくビームを渡る。このようなスコア付けを、ラットがビーム上を歩行する際に行った。治療については、P < 0.05の有意水準を伴う平均値±SEによって統計学的に試験および解析した。
【００７６】
結果：
ビームウォーキングテストの結果より、移植から4〜16日後の4時点にて、3つの動物群間の差異が示された。統計学的に顕著な改善効果はHAC-GDNF移植において、時間が経過すると共に検出された(図11)。
【００７７】
さらに、HAC-GDNF群の結果は、初期段階において対照群よりも顕著に良好であった。さらに、未処置の虚血性ラット(対照群)における損なわれた調整機能は回復しなかった。
【００７８】
これらの結果は、HACにより産生されたGDNFがMCAo後の被験体における欠損を迅速にレスキューできること、さらにHACがその後の回復期に重要な機能を果たすことを示唆している。
【００７９】
これらの結果は、HACによって分泌された神経栄養因子または抗炎症因子、および神経細胞への分化によって生じ得る。
【００８０】
実施例VIII
細胞注射の準備：
本明細書中に記載されるように、HAC-GDNFはPBS中に調製および懸濁した。
【００８１】
実施例IX
PLVTHM-BDNFに感染したHACのパーキンソン病ラットへの移植
PLVTHM-BDNF (MOI = 100)を、8μg/mlポリブレン (Sigma-Aldrich)の存在下、DMEM-F12にて培養した細胞に添加しその後2日間置いた。ウシ胎仔血清を含有しないMEM-F 12培地中で5日間培養した後、HACをPBSで洗浄し、その後37℃にて20分間、0.25% トリプシン (Sigma)/0.05% DNase I (Sigma)/PBS中でインキュベートした。細胞を0.05% DNase I/PBSを用いて2〜3回すすぎ、単一細胞の懸濁液へと機械的に解離した。細胞濃度は1〜2×108に調整した。実験的PDを、神経毒である6-ヒドロキシドーパミンを成体ラットに脳内注射することによって作製した。この毒素を、定位固定ガイダンス下にあるラット脳の片側の内側前脳束に注射した。3週間後、被験体をアポモルフィンで処置した。これは黒質-線条体領域に良好な生化学的損傷を有するレシピエントに異常な回転挙動を引き起こす。細胞移植群には、5μlのPBSに入れた8×105個のBDNFで改変したHACを、PDラットの6-OHDAモデルの線条体に注射した(AP = -5.0 mm, ML = ±2.5 mm, DV = -6.5 mm)。対照群には、5μlのPBSを、PDラットの6-OHDAモデルの線条体に注射した(AP = -5.0 mm, ML = ±2.5 mm, DV = -6.5 mm)。その後、2、4および8週間後に、アポモルフィン誘導性の回転挙動が観察された。
【００８２】
結果：
PDラットにおいて、PLVTHM-BDNFに感染したHACは、アポモルフィン誘導性の回転挙動を顕著に減少させた(表1)。
【表１】
2008543319.tif 000003
【００８３】
実施例X
PLVTHM-BDNFに感染しているHACの後脊髄不完全損傷を有するアカゲザルへの移植
PLVTHM-BDNF (MOI = 80)を、8μg/mlポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下、DMEM-F12で培養した細胞に加え、その後2日間置いた。ウシ胎仔血清非含有のDMEM-F12培地中にて5日間培養し、HACをPBSで洗浄し、そして37℃にて20分間、0.25% トリプシン (Sigma)/0.05% DNase I (Sigma)/PBS中でインキュベートした。細胞を0.05% DNase I/PBSを用いて2〜3回すすぎ、そして単一の細胞懸濁液に機械的に解離した。細胞濃度は、1〜2×108に調整した。後脊髄不完全損傷を伴うアカゲザルは、Tator法に従って調べた（Bassoら、 J. Neurotrauma, 1995,12(1)：1-21）。細胞移植群には、1×lO7個のBDNFで改変したHACを、2匹のサルの損傷部位に注射した。対照群には、PBSを1匹のサルの損傷部位に注射した。2ヵ月後、BBB運動評価尺度を調べた（Bassoら、 J. Neurotrauma, 1995,12(1)：1-21）。
【００８４】
結果：
細胞移植群のBBBスコアは9.7であった。対照群のBBBスコアは5.2であった。このように、PLVTHM-BDNFに感染しているHACは、被験体の後肢運動機能を改善することを示した。
【００８５】
本発明は、好ましい実施形態と共に本明細書中に記載されているが、上記より、当業者であれば等価物の変更、置換および本明細書中に挙げたものへの別の改変を行うことができる。上記の各実施形態は、他の実施形態のいずれかまたはその全てに関して開示されている変更物を含むか、または組込んでいる。したがって、本願発明は、特許請求の範囲に含まれる発明およびその等価物によってのみその範囲が限定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本発明中で用いられるレンチウイルスベクターのマップを示す。導入遺伝子の発現を高めるウッドチャック肝炎ウイルス(WPREまたはWHV)およびセントラルポリプリン配列(cPPT)、ならびに遺伝子導入の効率を向上するcis-作用エレメントなどの転写後調節エレメントを含むベクター。全てのベクターは、プロモーター、すなわち延長因子 1-αプロモーター (EFl-α)またはヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含み、これらは多くの細胞種において強力な転写エレメントである。
【図２】HACにおけるEGFPの高効率の導入、組込みおよび長期間維持されるその発現を示す。レンチウイルスベクターまたはDOTAPを用いた形質導入から7日後の、HACにおけるEGFP発現(A)。EGFPは、蛍光顕微鏡 (×10)で撮影した写真によって評価し、形質導入の効率はFACSによって調べた。EGFP発現は、明確に変化することなく5週間維持された(B)。EGFPはゲノムDNAに組込まれ、mRNAに転写され、当該mRNAはPCR分析によって検出した(C)。ベクターの感染前後でGO-G1 細胞の％は同じであった(D)。
【図３】HACにおけるレンチウイルスベクター介在性siGFP抑制を示す。写真は、EGFP発現レンチウイルスベクターを用いてHACにトランスフェクションしてから7日後に、蛍光顕微鏡 (×10)を用いて撮影し(A)、その効率はFACSによって調べた(B)。EGFP発現レンチウイルスベクターと共にsiGFPを発現するレンチウイルスベクターをHACにトランスフェクションしてから7日後(C)、EGFP発現はsiGFP発現ベクター群においてのみ見られなかった。EGFPの転写抑制は、RT-PCR分析によって検出された(D)。
【図４】EGFPはHACにおいて、レンチウイルスベクターに依拠するCre-loxPシステムによって効率的に調節したことを示す。EGFPは、レンチ-EGFPを用いて形質導入された後、蛍光顕微鏡検査法 (×10) によって観察した(A)。蛍光は、レンチ-EGFPとレンチ-Creとのコトランスフェクションによって7日後に消えた(B)。レンチ-Creで処理したEGFP効率を、FACSによって記録した(C)。ゲノムDNAのPCRによって、レンチ-CreによりEGFPが除去されたことが示された(D)。ポジティブコントロールは、EGFPのRT-PCRの結果であった。
【図５】レンチウイルスベクター介在性DOX誘導型遺伝子発現を示す。EGFPは、HACにおいてPLVTHMに依拠して発現した(A)。HACは、LVtTR-KRABとPLVTHM (B)、およびLVtTR-KRABとPLVTHMを、DOXの存在下同時に形質導入した(C)。HACは蛍光顕微鏡 (×10)で観察した。
【図６】HAC条件培地を用いて培養したHAC細胞およびHela細胞における、ウイルスタンパク質GAGおよびEGFPの発現を示す。EGFPのRT-PCRによって、レンチ-EGFPを用いて形質導入したHACはEGFP発現を維持するが、HAC条件培地を用いて培養したHela細胞では、EGFP発現がなかったことを示す(A)。構造遺伝子GAGは、HAC条件培地を用いて培養したレンチ-EGFPを形質導入したHACおよびHela細胞のいずれにおいても検出されなかった(B)。
【図７】実験群における平均梗塞容積を示す。虚血から16日後に測定すると、PBS群と比較して細胞移植群において虚血性障害の容積が減少していることが検出された。
【図８】in vivoにおけるHAC-GDNFの免疫染色を示す。移植から14日後の、異種移植ラット脳由来のGDNFの免疫組織化学染色によって、HAC-GDNF群の脳において多数のGDNFポジティブHACが示された(A)。図Bは、図Aの一部を拡大した顕微鏡写真である。図CおよびDは、DABおよびヘマトキシリンの対比染色を示す。示されるように、対側領域にネスチンの発現はなかった。
【図９】移植から3週間後、免疫組織化学(A)、ならびにDABおよびヘマトキシリンの対比染色(C)によって、注入領域に強いMAP2発現が検出されたことを示す。図Bは対側組織の同一部位である。DABおよびヘマトキシリンの対比染色を図Dに示す。
【図１０】神経学的テストを示す。
【図１１】調整機能を検出するためのビームウォーキングテストを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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