(57)【要約】  本発明は、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の処置及び／又は予防のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置におけるウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターの阻害剤の新規使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の予防及び／又は処置のための薬剤学的組成物の製造における、一般式Ｉ
【化１】
2008543900.tif 000012
［式中、
Ａｒは、芳香族環系又はヘテロ芳香族環系を表し、
Ｅは、
【化２】
2008543900.tif 000013
を表すか、
又はＡｒ及びＥは一緒になって、
【化３】
2008543900.tif 000014
｛ここで、Ｚは、Ｏ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであってよく、かつＸ4は、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であってよく、かつＷは、Ｎ、ＣＲ3又はＣＲ6であってよく、かつＸ5は、ＣＨ、ＣＲ３、ＣＲ6又はＮであってよい｝で示される残基を形成し、
Ｂは、−ＳＯ2−、−ＣＲ32−、−ＮＲ3−又は−ＮＨ−を表し、
Ｘ1は、ＮＲ13Ｒ4、ＯＲ3、ＳＲ3、ＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ1は、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表し、
Ｒ3は、Ｈ又は任意の有機残基を表し、
Ｒ13は、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の基を表し、
【化４】
2008543900.tif 000015
Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、
Ｘ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表し、
Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表し、
Ｒ4は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表し、
Ｒ5は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシ−アルキル、カルボキシ−アルケニル、カルボキシル−アルキニル、カルボキシ−アリール、カルボキシ−ヘテロアリール、−（ＣＯ）ＮＲ3Ｒ4又は−ＣＯＯ−Ｒ3を表し、ここで、前記のアルキル、アリール及びヘテロアリール残基は、場合により置換されていてよく、
Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦであり、
Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、
Ｒ8は、その都度独立して、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル残基又は／及び置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ9は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表し、
Ｒ10は、残基（Ｃ（Ｒ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表し、
Ｒ11は、Ｈ、カルボニル残基−ＣＯ−Ｒ12、カルボンアミド残基−ＣＯＮＲ122、オキシカルボニル残基−ＣＯＯ−Ｒ12又は特に好ましくはスルホニル残基−ＳＯ2Ｒ12を表し、
Ｒ12は、Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は置換又は非置換の環式アルキル残基又は置換又は非置換のアラルキル、アルキルアリール又はヘテロアラルキル残基又は置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ15は、Ｃ＝Ｘ2、ＮＲ3又はＣＲ32を表し、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍは、０〜５の整数であり、
ｏは、１〜５の整数であり、
ｐは、１〜５の整数である］
で示されるウロキナーゼ阻害剤又はこれらの化合物の塩の使用。
【請求項２】
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ウロキナーゼ阻害剤が、４−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド又はその薬剤学的に受け入れることができる塩、例えば塩酸塩である、請求項１及び２のいずれか１項記載の使用。
【請求項４】
神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患におけるウロキナーゼの活性を阻害する方法であって、一般式Ｉ
【化５】
2008543900.tif 000016
［式中、
Ａｒは、芳香族環系又はヘテロ芳香族環系を表し、
Ｅは、
【化６】
2008543900.tif 000017
を表すか、
又はＡｒ及びＥは一緒になって、
【化７】
2008543900.tif 000018
｛ここで、Ｚは、Ｏ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであってよく、かつＸ4は、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であってよく、かつＷは、Ｎ、ＣＲ3又はＣＲ6であってよく、かつＸ5は、ＣＨ、ＣＲ３、ＣＲ6又はＮであってよい｝で示される残基を形成し、
Ｂは、−ＳＯ2−、−ＣＲ32−、−ＮＲ3−又は−ＮＨ−を表し、
Ｘ1は、ＮＲ13Ｒ4、ＯＲ3、ＳＲ3、ＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ1は、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表し、
Ｒ3は、Ｈ又は任意の有機残基を表し、
Ｒ13は、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の基を表し、
【化８】
2008543900.tif 000019
Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、
Ｘ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表し、
Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表し、
Ｒ4は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表し、
Ｒ5は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシ−アルキル、カルボキシ−アルケニル、カルボキシル−アルキニル、カルボキシ−アリール、カルボキシ−ヘテロアリール、−（ＣＯ）ＮＲ3Ｒ4又は−ＣＯＯ−Ｒ3を表し、ここで、前記のアルキル、アリール及びヘテロアリール残基は、場合により置換されていてよく、
Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦであり、
Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、
Ｒ8は、その都度独立して、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル残基又は／及び置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ9は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表し、
Ｒ10は、残基（Ｃ（Ｒ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表し、
Ｒ11は、Ｈ、カルボニル残基−ＣＯ−Ｒ12、カルボンアミド残基−ＣＯＮＲ122、オキシカルボニル残基−ＣＯＯ−Ｒ12又は特に好ましくはスルホニル残基−ＳＯ2Ｒ12を表し、
Ｒ12は、Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は置換又は非置換の環式アルキル残基又は置換又は非置換のアラルキル、アルキルアリール又はヘテロアラルキル残基又は置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ15は、Ｃ＝Ｘ2、ＮＲ3又はＣＲ32を表し、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍは、０〜５の整数であり、
ｏは、１〜５の整数であり、
ｐは、１〜５の整数である］
で示されるウロキナーゼ阻害剤又はこれらの化合物の塩の阻害に十分な量を、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患におけるウロキナーゼの活性の阻害方法。
【請求項５】
対象がヒトである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ウロキナーゼ阻害剤が４−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩又は前記化合物の他の任意の塩である、請求項４又は５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項４から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の予防及び／又は処置のための薬剤学的組成物であって、活性成分として、一般式Ｉ
【化９】
2008543900.tif 000020
［式中、
Ａｒは、芳香族環系又はヘテロ芳香族環系を表し、
Ｅは、
【化１０】
2008543900.tif 000021
を表すか、
又はＡｒ及びＥは一緒になって、
【化１１】
2008543900.tif 000022
｛ここで、Ｚは、Ｏ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであってよく、かつＸ4は、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であってよく、かつＷは、Ｎ、ＣＲ3又はＣＲ6であってよく、かつＸ5は、ＣＨ、ＣＲ３、ＣＲ6又はＮであってよい｝で示される残基を形成し、
Ｂは、−ＳＯ2−、−ＣＲ32−、−ＮＲ3−又は−ＮＨ−を表し、
Ｘ1は、ＮＲ13Ｒ4、ＯＲ3、ＳＲ3、ＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ1は、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表し、
Ｒ3は、Ｈ又は任意の有機残基を表し、
Ｒ13は、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の基を表し、
【化１２】
2008543900.tif 000023
Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、
Ｘ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表し、
Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表し、
Ｒ4は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表し、
Ｒ5は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシ−アルキル、カルボキシ−アルケニル、カルボキシル−アルキニル、カルボキシ−アリール、カルボキシ−ヘテロアリール、−（ＣＯ）ＮＲ3Ｒ4又は−ＣＯＯ−Ｒ3を表し、ここで、前記のアルキル、アリール及びヘテロアリール残基は、場合により置換されていてよく、
Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦであり、
Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、
Ｒ8は、その都度独立して、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル残基又は／及び置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ9は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表し、
Ｒ10は、残基（Ｃ（Ｒ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表し、
Ｒ11は、Ｈ、カルボニル残基−ＣＯ−Ｒ12、カルボンアミド残基−ＣＯＮＲ122、オキシカルボニル残基−ＣＯＯ−Ｒ12又は特に好ましくはスルホニル残基−ＳＯ2Ｒ12を表し、
Ｒ12は、Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は置換又は非置換の環式アルキル残基又は置換又は非置換のアラルキル、アルキルアリール又はヘテロアラルキル残基又は置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ15は、Ｃ＝Ｘ2、ＮＲ3又はＣＲ32を表し、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍは、０〜５の整数であり、
ｏは、１〜５の整数であり、
ｐは、１〜５の整数である］
で示されるウロキナーゼ阻害剤又はこれらの化合物の塩を含有し、かつ場合によりさらに薬剤学的に受け入れることができる担持剤、希釈剤、補助剤及び／又は付形剤を含有することを特徴とする、ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の予防及び／又は処置のための薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記組成物が、活性成分として治療上有効な量のウロキナーゼ阻害剤４−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩又は前記化合物の他の任意の塩を含有し、かつ場合によりさらに薬剤学的に受け入れることができる担持剤、希釈剤、補助剤及び／又は付形剤を含有する、ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の予防及び／又は処置のための薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項８又は９記載の組成物。
【請求項１１】
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及び／又はスーパーオキシドジスムターゼ／カタラーゼ阻害剤及び／又は擬態から特に選択される、ウロキナーゼ随伴神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の予防及び／又は処置に適している薬剤学的に活性な成分をさらに少なくとも１つ含有する、請求項８から１０までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
神経病理学的疾患又は神経変性疾患の予防及び／又は処置のための補助プロトコルにおける、請求項８から１２までのいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項１３】
疾患が、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病及び／又は細菌性髄膜炎から選択される、請求項１２記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の処置及び／又は予防のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、筋萎縮性側索硬化症の処置におけるウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターの阻害剤の新規使用を提供する。
【０００２】
発明の背景
プラスミノゲン活性化系
血液循環からの血餅の除去及び細胞外マトリックスタンパク質のターンオーバーは、特殊化された酵素により促進される。この調節における極めて重要な一酵素は、プラスミンである。プラスミンは多くの機能を果たすが、しかし、その主要な役割は、フィブリン、すなわち血餅の構造上の足場を分解することにあることが一般的に認められている。セリンプロテアーゼ組織型プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）及びウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）は、その不活性前駆物質プラスミノゲンからプラスミンの生成を媒介する。特殊な生理学的セリンプロテアーゼ阻害剤、例えばプラスミノゲンアクチベーター阻害剤（ＰＡＩ）−１及びＰＡＩ−２はそしてまた、ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡのタンパク分解活性を調節する。ｕ−ＰＡのための特殊な細胞表面レセプターもまた存在し、このレセプターは、細胞周囲の環境中での局在的なタンパク分解活性を発生させる手段を提供するだけでなく、隣接した膜貫通タンパク質の助けを借りて、信号を細胞核に伝達することができ、かつその他の遺伝子の発現パターンに影響を及ぼすことができる。
【０００３】
プラスミノゲン活性化系はまた、細胞運動、創傷治癒及びガンの転移拡大に積極的に関係する。最後に、さらに加えて、プラスミノゲン活性化系が中枢神経系中での細胞外マトリックスのターンオーバーにも寄与する証拠がある。
【０００４】
脳中でのウロキナーゼ系の機能は、可塑性及び神経疾患及び神経性及び／又は膠性の誘導腫瘍を含めた、多様な正常の事象及び病的な事象に見出されるとも考えられる。故に、中枢神経系中で発現されるウロキナーゼ及びそのレセプターは、ニューロン細胞及び／又は（星状）膠細胞の移動、シナプス形成、リモデリング及び反応プロセスにおいて役割を果たすように思われる（Del Biglio他, Int J Dev Neurosci, 1999, 17, 387-99）。例えば、ｔ−ＰＡは、認知記憶において役割を果たすことが示されており、視覚皮質の逆の閉塞の可塑性(reverse occlusion plasticity)を媒介することができ、かつ神経変性を促進する。
マクロファージ及び小膠細胞は、多様な条件下にプラスミノゲンアクチベーターを分泌する。興味深いことに、小膠細胞及びマクロファージは、増殖し、かつ損傷された脳領域中に蓄積し、その際にもしかすると、他の効果に加えて、細胞外タンパク質分解の引き金となる。細胞外マトリックスタンパク質の破壊は、二次性脳損傷だけでなく血管形成も含む。さらに、脳中のｕＰＡが食品消費の調節において役割を果たしうることが記載されている（Miskin及びMasos, J Gerontol. A Biol Sci Med Sci, 1997, 52, B118-24）。最近の発見は、学習関連可塑性におけるウロキナーゼ系の介在を示している（Meiri他, Proc Natl. Acad Sci, 1994, 91, 3196-3200）。
【０００５】
脳腫瘍、例えば悪性神経膠腫に加えて、セリンプロテアーゼが有意な役割を果たしうる神経病理学的疾患に罹っている西洋人口の百分率が着実に増加している。
【０００６】
セリンプロテアーゼは、神経筋接合部の可塑性において積極的な役割を果たすように思われ、故に神経性の機能及び機能障害に対する有数の主題アプローチである。プラスミノゲン系は、脳外傷及び炎症におけるタンパク分解プロセス中にも含まれており、かつ、一緒になって、神経変性疾患、例えば、例えばアルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病等の病因に寄与しうる。
【０００７】
多発性硬化症（ＭＳ）病変においてプラスミノゲンアクチベーター系の成分は特性決定されており、かつ炎症細胞上に濃縮されると思われる。ＭＳ病変でのウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターの増加が、脳実質中への細胞浸潤を促進しうるものであり、かつこうしてＭＳ患者の中枢神経系中での炎症プロセスを支えうることが提案されている（Washington他, J Neurosci. Re 1998, 45, 392-399）。
【０００８】
ＡＬＳは、運動ニューロンの喪失が増加することにより特徴付けられており、その病的変化は、顕著な筋肉衰弱をまねき、診断後２〜５年の経過で罹った患者の大部分を死に至らしめる。その病理学は、脊髄の前角細胞、大脳皮質中のベッツ細胞の喪失及び皮質脊髄路の変性として２０世紀の初めに既に記載されていた（Holmes, 1909）。
【０００９】
ゼラチナーゼＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の増加された発現は、ＡＬＳ患者の中枢神経系及び脊髄中で示されており、その際に、ＭＭＰ−９の最高濃度は、胸部及び腰部の切片中に見出される。対照群と比較して統計学的に有意な差異が、ＡＬＳ患者の前頭及び後頭の皮質中で並びに脊髄全体で見出された（Lim他, J Neurochem. 1996,67, 251-9）。ＡＬＳ患者の血漿は、ＭＭＰ−２濃度の有意な増加を示す（Beuche他, Neuroreport, 2000, 11, 3419-22）。他方では、ＴＩＭＰ−１、すなわちＭＭＰ−２の重要な対抗調節剤(counter regulator)の濃度は、対照群と比較した場合に変わらない。これらのデータは、ＡＬＳにおけるＭＭＰ類の潜在的な病原性の役割の示唆を提供する。
【００１０】
ＡＬＳの家族性の形で、突然変異は、Ｃｕ2+／Ｚｎ2+スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子中で同定された（Deng他, Science, 1993, 261, 1047-51；Rosen他, Am J Med Genet, 1994, 51, 61-9）。さらに加えて、細胞を取り巻くマトリックス中での特異的な変質が、神経筋終板で発生されたタンパク質分解の結果であることが記載されていた（Maselli他, Muscle Nerve, 1993, 16,1193-203；Tsujihata他, Muscle Nerve, 1984, 7, 243-9）。
【００１１】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、フリーラジカルによる損傷からの細胞の傑出した保護的役割を果たす酵素のファミリーを含む（Fridovich J Biol Chem, 1989, 264, 7761-4）。ＳＯＤ１は、多数の真核細胞の細胞質並びに核中に見出され、長さが１５３個のアミノ酸の可溶性ホモ二量体である。この酵素の主な機能は、スーパーオキシドアニオンラジカル及び付随して合成される過酸化水素の解毒にある。生じる過酸化水素は、グルタチオンペルオキシダーゼ又はカタラーゼのいずれかの作用を通じて水に変換される（Halliwell J Neurochem, 1992, 59, 1609-23；Ann Neurol, 1992, 32, Suppl. S10-5）。
【００１２】
ＡＬＳ病因の調査における重要な進展は、家族性ＡＬＳと診断された患者の１５〜２０％におけるＳＯＤ１遺伝子中の突然変異の発見であった（Rosen他, Nature, 1993, 362, 59-62）。これらの突然変異は、ＳＯＤ１が、前記酵素の生体内での減少した酵素活性及び減少した半減期を引き起こすようにする（Bowling他, 1993, J. Neurochem, 61, 2322-2325; Borchelt他 1994, Proc. Natl Acad Sci USA, 91 8292-8296）。しかしながら、最近の調査の結果は、突然変異した酵素の機能の喪失に近づいている。しかしながら、機能の全喪失に対する強い主張は、前記疾患の優性遺伝及び機能の喪失と前記疾患の臨床上の経過との相関を含む（Brown 1995, Cell, 80, 687-692）。ＳＯＤ１遺伝子の欠いているトランスジェニックマウスは、短くなった寿命を有さず、かつ運動ニューロン関連疾患を発症しない（Reaume他, 1996, Nature Genet, 13, 43-47）。さらに、内因性マウスＳＯＤに比較して等量レベルの自然のままの突然変異していないヒトＳＯＤ１を発現するマウスも、運動ニューロン随伴疾患を発症しない。それとは異なり、より高いＳＯＤ１活性となるヒトＳＯＤ１遺伝子のＧ９３Ａ又はＧ３７Ｒ突然変異を発現するトランスジェニックマウス、又は内因性レベルに匹敵しうるタンパク質及び活性濃度となるＧ８５Ｒ  ＳＯＤ１突然変異を発現するマウスは、進行性の不全対麻痺及び顕著な筋肉萎縮を示す（Bruijn他, 1997, Neuron, 18, 327-338；Gurney他, 1994, Science, 264, 1772-1775；Wong他, 1995, Neuron, 14, 1105-1116）。
【００１３】
基本的には２つの仮説が、ＳＯＤ１突然変異によるＡＬＳの発症を説明することを試みている。１つの仮説によれば、突然変異したタンパク質の間違った折り畳みが、有毒な細胞内凝集体の沈殿及び形成をまねく。第二の仮説は、突然変異したＳＯＤ１が、変化した基質特異性を有し、これが有毒な副生成物の形成をまねくことを主張する。
【００１４】
突然変異したＳＯＤ１は、酵素の活性部位での触媒銅イオンの変化された基質結合並びにその他の基質の結合の変化を示す。（Deng他, 1993, Science, 261, 1047-1051）。特に、過酸化水素及びペルオキシ亜硝酸イオンの基質結合が促進されると思われる（Beckman及びCrow, 1993, Biochem Soc Trans, 21, 330-334）。ペルオキシ亜硝酸イオンは、突然変異した酵素の触媒銅を経て高度に反応性のニトロニウム中間体に変換されうる。このニトロニウム中間体は再び、タンパク質誘導チロシン残基をニトロ化することができる。対照的に、亜鉛の結合は、顕著であるとはいえない（Crow他, 1997, J Neurochem, 69, 1936-1944；Lyons他, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12240-12244）。この不十分な亜鉛結合は前記酵素を不安定にし、その際に、増加されたニトロニウムイオン産生をまねく。これは、ニューロフィラメント軽鎖のニトロ化をまねきうるものであり、これはそしてまたニューロフィラメントトリプレット形成を防止する（Crow他, 1997, J Neurochem, 69, 1936-1944）。この反応は、ＡＬＳにとって疾病特徴的である細胞骨格変化の一部の原因である（Sasaki他, 1990, J. Neurol. Sci, 97, 233-240；Rouleau他, 1996, Ann Neuro., 39, 128-131）。３−ニトロチロシンの濃度は、Ｇ３７Ｒ又はＧ９３Ａ−突然変異を有するトランスジェニックマウス中で増加される（Bruijn他, 1997, Neuron, 18, 327-338；Ferrante他, 1997, Ann Neurol, 42, 326-334）。増加された３−ニトロチロシン濃度の検出は、その後、散発性及び家族性ＡＬＳの患者の脊髄中でも、記載されていた（Beal他, 1997, Ann Neurol. 42, 646-654）。
【００１５】
突然変異したＳＯＤ１酵素と過酸化水素との間のさらに潜在的な有毒な相互作用が記載されている。突然変異したＳＯＤ１酵素が、自然のままの酵素よりも、過酸化水素とより容易に反応して、ヒドロキシルラジカルを生成することが試験管内で示されていた（Wiedau-Pazo他, 1996, Science, 271, 515-518；Yim他, 1997, J. Biol. Chem, 272, 8861-8863）。ＰＣ−１２細胞中の突然変異したＳＯＤ１の発現は、フリー酸素ラジカルの増加された産生に随伴される。銅キレート化剤、Ｂｃｌ−２、グルタチオン、ビタミンＥ及びカスパーゼ阻害剤を添加することにより、生じる細胞死を減少させることができる（Ghadge他, 1997, J Neurosci, 17, 8756-8766）。さらに加えて、突然変異したＳＯＤ１を有する培養細胞、しかし野生型ＳＯＤ１を有するものではない細胞が、アポトーシスの速度の増加を引き起こすことが示されていた（Wiedau-Pazo他, 1996, Science, 271, 515-518；Ghadge他, 1997, J Neurosci, 17, 8756-8766）。酸素ラジカルの増加された産生及び酸素ラジカルを通じて増加されたタンパク質損傷は、ＳＯＤ１のＧ９３Ａ−突然変異を有するトランスジェニックマウスにおいて証明されていた（Liu他, 1998, Ann. Neurol. 44, 763-770；Andrus他, 1998, J. Neurochem, 71, 2041-2048）。
【００１６】
Ｇ９３Ａ−トランスジェニックマウスは、ＡＬＳのためのモデル系として使用される。Ｇ９３Ａ−マウスにおけるニューロン変性の時間経過は知られている。臨床上の症候の発症は、ほぼ９０日齢での四肢の細かい振戦、引き続き麻痺及び続けて１２０−１０日齢での死により特徴付けられている（Dal Canto及びGurney, 1994, 及び1995, Brain Res 676, 25-40；Chiu他, 1995, Molec. Cell. Neurosci. 6, 349-363）。最も早い病的変化は、脊髄の運動ニューロン中のミトコンドリア液胞化に現れ、これは、３７日目から、最初に基部軸索中で、及び後で４５日齢で細胞体中で観察されることができる（Chiu他, 1995, Molec. Cell. Neurosci. 6, 349-363）。７０日齢でこれらの変化は、ほぼ全ての運動ニューロン中に見出されることができ、９０日齢からの運動ニューロンの有意な喪失が続く。ミトコンドリア液胞化は直接的に、急速に進行する筋無力症、ひいては病態生理学的意義の相より先に起こる（Kong及びXu, 1997, Soc. Neurosci Abst. 23, 1913）。Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１突然変異体の発現は、試験管内でミトコンドリア膜電位の喪失並びにサイトゾルカルシウム濃度の増加を引き起こす（Carri他, 1997, FEBS Lett. 414, 365-368）。さらに、Ｇ９３Ａ−マウスは、軸索類球体(axonal spheroids)中でのニューロフィラメントの蓄積を発生させる（Tu他, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3155-3160）。
【００１７】
ＳＯＤ機能障害とＭＭＰ発現との間の関連性は近頃論じられている。ＣｕＺｎ−ＳＯＤの阻害は、皮膚線維芽細胞中でのＭＭＰ−１のｍＲＮＡレベルを有意に減少させた（Brenneisen他, 1997, Free. Rad. Biol. Med. 22, 515-524）。この研究は、この効果が、細胞内の過酸化水素の減少された産生と結び付いていることをさらに証明した。マンガン−ＳＯＤを阻害することにより、ＭＭＰ−１  ｍＲＮＡの上昇を駆り立てる過酸化水素が見出され、これにより部分的に転写因子ＡＰ−１が媒介された（Wenk他, 1999, J. Biol. Chem. 274, 25869-25876）。マンガン−ＳＯＤの過酸化水素産生は、多様なＭＭＰ類、例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−７の活性化と相互に関係していると考えられる（Ranganathan 他, 2001, ）。さらに過酸化水素は、試験管内でのヒト内皮細胞中のＭＭＰ類の発現を刺激する（Belkhiri他, 1997, Lab. Invest. 77, 533-539）。フリーラジカルの産生の増加は、ＳＯＤ１−突然変異の結果であると思われ、かつ増加されたＭＭＰ−発現をまねきうるものであり、これはそしてまた、ニューロン細胞死をまねきうる。故に、フリー酸素ラジカルの産生とＭＭＰ類の発現との間の密接な関係が、一方では結論が下されうるのに対し、他方ではＭＭＰ−発現は、ＣｕＺｎＳＯＤの突然変異により開始されうる。
【００１８】
筋萎縮性側索硬化症における最初の治療アプローチ及び待期的処置を通じて改善される患者ケアにもかかわらず、この疾患の予後は依然として悪い。一般的に、罹った患者は診断後２年以内に死亡する。主な原因の１つは、進行性筋無力症であり、場合により補助呼吸筋の麻痺をまねく。基礎をなす複雑な病態生理学的機構は、部分的に知られているに過ぎない。現在、ヒトにおけるＳＯＤ１−突然変異の役割を分析するか、又は疾患進行における定義された時点でヒト臓器について広範にわたる病理組織的検査を実施する手段は存在しない。興味深いことに、トランスジェニックマウスは、ヒト疾患に見出されるのに匹敵しうる病態生理学的な変化及び臨床上の所見、例えば進行性の不全対麻痺及び筋無力症を示す。
【００１９】
ＡＬＳの有病数は、毎年１００ ０００人中１．５〜２人の発生率で１００ ０００人中約６〜８人であり、増加する傾向を有する。最も多くの場合は、４０〜７０歳で診断され、より高い年齢で発生率は増加する。前記疾患は一般的に急速に進行し、かつ患者は診断の２〜５年以内に死亡する。前記疾患の最終段階は、躯幹及び呼吸筋系が侵されることにより特徴付けられており、その際に、患者は、しばしば嚥下性肺炎により随伴される呼吸機能不全で死亡する。
【００２０】
ＡＬＳの正確な原因は知られておらず、かつ多数の仮説が、神経伝達物質ハウスキーピングにおける免疫学的干渉、慢性中毒、代謝脱線、ウイルス感染、神経栄養因子欠乏症及び撹乱されたＤＮＡ修復機構を介して原因を説明することを試みている。
【００２１】
殆ど答えがでていないのは、示唆される病原性機構に対する運動ニューロンの脆弱性に関する疑問である。おそらく、活性化された小膠細胞又はニューロンを通じたＭＭＰ類の発現が、アポトーシス細胞死の発生において役割を果たしうる。
【００２２】
ただ一つ知られた治療アプローチは、リルゾール(riluzole)、すなわち、他にグルタマートの分泌を減少させる物質での処置を含む。これらの処置は、症候を減少させ、かつ物理的な能力障害の進行を遅らせることが示されている。これらの処置は約３ヶ月の延命をもたらす。
【００２３】
ＡＬＳの病因におけるプラスミノゲン系の役割は、シナプス変性の概念を解明するために、より詳細に研究された。ＡＬＳは、前記の通り、脊髄中の運動ニューロンに関して破局的波及(catastrophic repercussions)を伴いシナプス結合を撹乱する細胞外に作用するプロテアーゼのカスケードを活性化する刺激又は薬剤によって引き起こされる疾患である。動物研究及び細胞培養実験は、ＡＬＳ又は除神経の他の形に生じる撹乱を予防するために生理学的阻害剤により慎重に適合された、神経筋接合部でのリモデリングの重要な調節剤でありうるセリンプロテアーゼの介在に向けられていた。これは、中枢神経系中でのその他の類似のシナプス変性も意味しうる。
【００２４】
ウロキナーゼの意外な役割は、この衰弱させる疾患中で見出された。これらの発見は、ウロキナーゼ依存性の神経病理的疾患及び／又は神経変性疾患の患者における予防的又は治療上の戦略にとって重要な結果を有しうる。
【００２５】
発明の目的
本発明は、ウロキナーゼ依存性の神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の結果に罹っている患者の健康を改善するための治療を提供することを目的とするものである。特に本発明は、そのような神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患に罹っている患者を処置するための、医薬の製造のためのウロキナーゼ阻害剤の使用を提供することを目的とするものである。本発明の別の目的は、挙げられた処置における使用のための薬剤学的組成物を提供することであり、かつ本発明のさらに別の目的は、そのようなウロキナーゼ依存性の神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患に罹っている患者を処置する方法を提供することである。
【００２６】
発明の詳細な説明
次の例に示されるように、本発明は、神経変性疾患ＡＬＳへのウロキナーゼ阻害剤の意外な治療活性を明らかにする。本発明は、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターが、神経変性疾患において固有の生物学的活性を有すると思われるという観察を提示する。そのような活性を特異的及び／又は選択的なウロキナーゼ阻害剤で遮断することによって、肯定的な治療効果が発生されうる。
【００２７】
幾つかの刊行物には、本発明における使用に適しているウロキナーゼ阻害剤が記載されている。好ましい化合物及び薬剤学的組成物は、米国特許第5,340,833号明細書、米国特許第5,550,213号明細書、米国特許第6,207,701号明細書、米国特許第6,093,731号明細書、米国特許第5,952,307号明細書、スイス国特許(CH)第689611号明細書、国際公開(WO)第00/06154号パンフレット、国際公開(WO)第00/05245号パンフレット、国際公開(WO)第00/05214号パンフレット、国際公開(WO)第01/14324号パンフレット、国際公開(WO)第99/40088号パンフレット、国際公開(WO)第99/20608号パンフレット、国際公開(WO)第99/05096号パンフレット、国際公開(WO)第98/11089号パンフレット、国際公開(WO)第01/44172号パンフレット、欧州特許(EP)第1044967号明細書、欧州特許(EP)第568289号明細書、国際公開(WO)第00/04954号パンフレット、国際公開(WO)第03/103644号パンフレット、国際公開(WO)第00/17158号パンフレット、国際公開(WO)第02/74756号パンフレット、国際公開(WO)第01/14324号パンフレット、国際公開(WO)第01/70204号パンフレット、国際公開(WO)第03/053999号パンフレット、国際公開(WO)第98/46632号パンフレット、米国特許(US)第6,586,405号明細書、欧州特許(EP-A)第1 182 207号明細書、国際公開(WO)第02/14349号パンフレット、国際公開(WO)第00/05245号パンフレット、国際公開(WO)第03/048127号パンフレット、国際公開(WO)第03/076391号パンフレット、国際公開(WO)第01/96286号パンフレット；国際公開(WO)第2004/103984号パンフレットに記載されており、それらの開示は参照により本明細書に取り込まれる。
【００２８】
好ましいウロキナーゼ阻害剤は、米国特許出願公開(US)第2004/0266766号明細書に記載されており、その開示は参照により本明細書に取り込まれ、すなわち、一般式Ｉ
【化１】
2008543900.tif 000002
［式中、
Ａｒは、芳香族環系又はヘテロ芳香族環系を表し、
Ｅは、
【化２】
2008543900.tif 000003
を表すか、
又はＡｒ及びＥは一緒になって、
【化３】
2008543900.tif 000004
｛ここで、Ｚは、Ｏ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであってよく、かつＸ4は、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ又はＣＨ2であってよく、かつＷは、Ｎ、ＣＲ3又はＣＲ6であってよく、かつＸ5は、ＣＨ、ＣＲ３、ＣＲ6又はＮであってよい｝で示される残基を形成し、
Ｂは、−ＳＯ2−、−ＣＲ32−、−ＮＲ3−又は−ＮＨ−を表し、
Ｘ1は、ＮＲ13Ｒ4、ＯＲ3、ＳＲ3、ＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ1は、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表し、
Ｒ3は、Ｈ又は任意の有機残基を表し、
Ｒ13は、一般式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の基を表し、
【化４】
2008543900.tif 000005
Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、
Ｘ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表し、
Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表し、
Ｒ4は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表し、
Ｒ5は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシ−アルキル、カルボキシ−アルケニル、カルボキシル−アルキニル、カルボキシ−アリール、カルボキシ−ヘテロアリール、−（ＣＯ）ＮＲ3Ｒ4又は−ＣＯＯ−Ｒ3を表し、ここで、前記のアルキル、アリール及びヘテロアリール残基は、場合により置換されていてよく、
Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦであり、
Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、
Ｒ8は、その都度独立して、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アルキルアリール、ヘテロアラルキル残基又は／及び置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ9は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表し、
Ｒ10は、残基（Ｃ（Ｒ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表し、
Ｒ11は、Ｈ、カルボニル残基−ＣＯ−Ｒ12、カルボンアミド残基−ＣＯＮＲ122、オキシカルボニル残基−ＣＯＯ−Ｒ12又は特に好ましくはスルホニル残基−ＳＯ2Ｒ12を表し、
Ｒ12は、Ｈ、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は置換又は非置換の環式アルキル残基又は置換又は非置換のアラルキル、アルキルアリール又はヘテロアラルキル残基又は置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
Ｒ15は、Ｃ＝Ｘ2、ＮＲ3又はＣＲ32を表し、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍは、０〜５の整数であり、
ｏは、１〜５の整数であり、
ｐは、１〜５の整数である］
で示される化合物又はこれらの化合物の塩である。
【００２９】
より好ましいウロキナーゼ阻害剤は、一般式ＩＩＩ
【化５】
2008543900.tif 000006
［式中、
Ａｒは、芳香族環系又はヘテロ芳香族環系を表し、
Ｘ1は、ＮＲ13Ｒ4、ＯＲ3、ＳＲ3、ＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ1は、Ｈ、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5を表し、
Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表し、
Ｒ3は、Ｈ又は任意の有機残基を表し、
Ｒ13は、一般式（ＩＶａ）又は（ＩＶｂ）の基を表し、
【化６】
2008543900.tif 000007
Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、
Ｘ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表し、
Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表し、
Ｒ4は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表し、
Ｒ5は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、カルボキシ−アルキル、カルボキシ−アルケニル、カルボキシル−アルキニル、カルボキシ−アリール、カルボキシ−ヘテロアリール、−（ＣＯ）ＮＲ3Ｒ4又は−ＣＯＯ−Ｒ3を表し、ここで、前記のアルキル、アリール及びヘテロアリール残基は、場合により置換されていてよく、
Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦであり、
Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、
Ｒ8は、その都度独立して、Ｈ、ハロゲン、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール残基又は／及び（ＣＨ2）m−ＯＨを表し、
Ｒ9は、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表し、
Ｒ10は、残基（Ｃ（Ｒ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表し、
Ｒ11は、Ｈ、カルボニル残基−ＣＯ−Ｒ12、オキシカルボニル残基−ＣＯＯ−Ｒ12又は特に好ましくはスルホニル残基−ＳＯ2Ｒ12を表し、
Ｒ12は、分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は置換又は非置換の環式アルキル残基又は置換又は非置換のアラルキル、アルキルアリール又はヘテロアラルキル残基又は置換又は非置換の二環式又は多環式の残基を表し、
ｎは、０〜２の整数であり、
ｍは、０〜５の整数であり、
ｏは、１〜５の整数である］
で示される化合物又はこれらの化合物の塩である。
【００３０】
前記化合物は、塩として、好ましくは生理学的に受け入れることができる酸性塩として、例えば鉱酸の塩として、特に好ましくは塩酸塩として、又は適した有機酸の塩として存在していてよい。前記グアニジニウム基は、生理学的条件下に好ましくは開裂されることができる保護官能基を場合により有していてよい。前記化合物は、光学的に純粋な化合物として又は鏡像体又は／及びジアステレオ異性体の混合物として存在していてよい。
【００３１】
環系Ａｒは好ましくは、炭素原子４〜３０個及び特に５〜１０個を有する。一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）の化合物中で、Ａｒは好ましくは、１つの環を有する芳香族環系又はヘテロ芳香族環系である。Ａｒ及びＥが一緒になって二環式系を形成する化合物も好ましい。ヘテロ芳香族系は好ましくは、１個又はそれ以上のＯ、Ｓ又は／及びＮ原子を有する。好ましい芳香族環系は、ベンゼン環であり；好ましいヘテロ芳香族環系は、特に２位に窒素を有する、ピリジニル、ピリミジニル又はピラジニルである。好ましい二環式の環系は、Ｚ又はＷ位に窒素又は酸素を有する環系である。Ａｒは、最も好ましくはベンゼン環である。
【００３２】
次の構造要素を有する化合物が特に好ましい
【化７】
2008543900.tif 000008
【００３３】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩＩ）の化合物中で、環系Ａｒ中で置換基Ｂ、例えばＣＨＸ1Ｒ1及びＥ、例えばＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ2（グアニジノ）又はＮＨ2ＣＮＨ（アミジノ）は、相互に対して、好ましくはメタ又はパラ位に及び特に好ましくはパラ位にある。さらに、Ａｒは、水素とは異なる、１つ又はそれ以上のさらに付加的な置換基Ｒ2を有していてよい。置換基Ｒ2の数は、好ましくは０、１、２又は３、特に好ましくは０又は１及び最も好ましくは０である。Ｒ2は、ハロゲン、Ｃ（Ｒ6）3、Ｃ2（Ｒ6）5、ＯＣ（Ｒ6）3又はＯＣ2（Ｒ6）5を表してよく、この場合に、Ｒ6は、その都度独立して、Ｈ、又はハロゲン及び特にＦである。Ｒ2の好ましい例は、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、ＣＨ3、ＣＦ3、ＯＨ、ＯＣＨ3又はＯＣＦ3である。
【００３４】
本発明による化合物は、グアニジノ基を有し、かつ高い選択性により特徴付けられている。この理由のために、Ｅは、しばしば好ましくは−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ2である。
【００３５】
式（Ｉ）中の置換基Ｂ又は式（ＩＩＩ）中の−ＣＨＸ1Ｒ1は、阻害剤活性にとって重要である。Ｂは好ましくは、−ＳＯ2−、−ＮＲ3−、−ＮＨ−又は／及び−ＣＲ32−、特に−ＣＲ12−から選択される。
【００３６】
Ｒ1は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基又はＣＯＯＲ3、ＣＯＮＲ3Ｒ4又はＣＯＲ5であってよい。Ｒ1は、最も好ましくはＨである。
【００３７】
他に述べられていない場合には、本明細書で使用される通りのアルキル残基は、好ましくは直鎖又は分枝鎖状のＣ1〜Ｃ30アルキル基、好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキル基、特にＣ1〜Ｃ4アルキル基又はＣ3〜Ｃ30シクロアルキル基、特にＣ3〜Ｃ8シクロアルキル基であり、これらは、例えば、Ｃ1〜Ｃ3アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、スルホニル、ニトロ、シアノ、オキソ又は／及びハロゲンで並びにアリール又はヘテロアリール残基で置換されていてよい。他に述べられていない場合には、アルケニル及びアルキニル残基は、本明細書中で、既に述べた通り場合により置換されていてよい、好ましくはＣ2〜Ｃ10基、特にＣ2〜Ｃ4基である。アリール及びヘテロアリール残基は、例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ1〜Ｃ3アルコキシ−ヒドロキシル、カルボキシル、スルホニル、ニトロ、シアノ又は／及びオキソで置換されていてよい。アリール及びヘテロアリール残基は好ましくは、炭素原子３〜３０個、特に４〜２０個、好ましくは５〜１５個及び最も好ましくは６〜１０個を有する。
【００３８】
Ｘ1は好ましくは、ＮＲ13Ｒ4を表す。
【００３９】
Ｒ3はＨ又は任意の有機残基を表してよい。有機残基は、特に、炭素原子１〜３０個を有する残基である。この残基は、飽和又は不飽和、線状、分枝鎖状又は環状であってよく、かつ場合により置換基を有していてよい。好ましい一実施態様において、Ｒ3は、特に基Ｂ＝−ＣＲ32−中でＨである。
【００４０】
特に好ましい一実施態様において、Ｂは、基−ＳＯ2−を表すので、これらはスルホ化合物である。このＳＯ2基は、ＣＨ2基とアイソステリック(isosteric)である。ＣＨ2基をアイソステリックなＳＯ2基により置換することによって、阻害活性をさらに改善するウロキナーゼのＧｌｙ １９３、Ａｓｐ １９４及びＳｅｒ １９５のＮＨ基へのさらに付加的な水素結合の形成を可能にする（図１参照）。
【００４１】
Ｒ13は、式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）の基を表す
【化８】
2008543900.tif 000009
【００４２】
式（ＩＩａ）中で、Ｒ15は、Ｃ＝Ｘ2又はＣＲ3を表し、ここで、Ｘ2は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳを表し、かつＸ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表す。Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3である。Ｒ4はそしてまた、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表す。Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、ここで、Ｒ9はそしてまた、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表す。
【００４３】
Ｒ13は好ましくは、式（ＩＩｂ）の基である。
【００４４】
さらに加えて、Ｒ13は、特に式（ＩＩＩ）の化合物中で、式（ＶＩａ）又は（ＶＩｂ）の基を好ましくは表す。
【００４５】
【化９】
2008543900.tif 000010
【００４６】
式（ＩＶａ）中で、Ｘ2は好ましくは、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ又はＳ、特にＯを表し、かつＸ3は、ＮＨ、ＮＲ4、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ又はＣＯＮＲ4を表す。Ｙは、Ｃ（Ｒ8）2、ＮＨ又はＮＲ3を表す。Ｒ4はそしてまた、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル又はアルキニル残基を表す。Ｒ7は、Ｈ、又は置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はヘテロアリール残基又は−ＣＯＲ9を表し、ここで、Ｒ9はそしてまた、Ｈ、又は分枝鎖状又は非分枝鎖状の、置換又は非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又は／及びヘテロアリール残基を表す。式（ＩＩＩ）の化合物中で、Ｒ13は好ましくは、式（ＩＶｂ）の基を表す。
【００４７】
Ｒ8は、好ましくは水素又は（ＣＨ2）m−ＯＨ及び特に好ましくはＨである。Ｒ10は、残基（ＣＲＲ1）2）o−Ｘ3Ｒ5を表す。この場合にＲ1は、特に好ましくは水素であり、Ｘ3は特に好ましくは酸素であり、Ｒ5は特に好ましくは水素であり、かつｏは特に好ましくは１である。
【００４８】
Ｒ11は特に好ましくは、スルホニル残基−ＳＯ2−Ｒ12を表し、ここで、Ｒ12は、好ましくはアラルキル残基及び特にベンジル残基である。特に好ましい実施態様において、ベンジル残基は、メタ及び／又はパラ位で、ハロゲン及び最も好ましくはＣｌで置換されている。好ましい別の実施態様において、Ｒ12は、アダマンチル又はカンファー残基である。
【００４９】
Ｒ15は、特に好ましくは、カルボニル残基−ＣＯ、アミン残基−ＮＲ3−又は／及びアルキル残基−ＣＲ32、好ましくは−ＣＲ12−及び最も好ましくは−ＣＨ2−を表す。Ｒ15がＣＨ2を表す化合物は、特に単純な合成により特徴付けられている。この位置は、ウロキナーゼとの水素結合の形成に介在されないので、ＣＨ2基は、カルボニルの代わりに、阻害活性の喪失に随伴されることなく、存在することができる。
【００５０】
特に残基Ｒ10のための、構成要素としての非天然アミノ酸を含有する化合物も好ましい。さらに、例えばＹ＝ＮＨ及びｎ＝１である基ＮＨ−ＮＨを有するアザ化合物が好ましい（式ＩＩｂの化合物）。
【００５１】
特に好ましい他の化合物は、ビスルホンアミド、すなわち、要素−ＳＯ2−ＮＨを２個有する化合物である。Ｒ13が式ＩＩｂの基を表し、かつＹが−Ｃ（Ｒ8）2−を表し、ここでＲ8は一方が、Ｈを表し、かつもう一方が、芳香族基及び特に−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ5を有する残基を表す化合物も好ましい。
【００５２】
Ｘ1が、
【化１０】
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を表す化合物も好ましい。
【００５３】
次の化合物が最も好ましい：Ｎ−［２−（４−グアニジノ−ベンゼンスルホニル−アミノ）−エチル］−３−ヒドロキシ−２−フェニルメタンスルホニルアミノプロピオンアミド塩酸塩、Ｂｚ−ＳＯ2−（Ｄ）−Ｓｅｒ−（アザ−Ｇｌｙ）−４−グアニジノ−ベンジルアミド塩酸塩又はＮ−（４−グアニジノ−ベンジル）−２−（３−ヒドロキシ−２−フェニルメタン−スルホニルアミノプロピオニル−アミノ）−４−フェニル−ブチルアミド塩酸塩及びＮ−［（４−グアニジノ−ベンジルカルバモイル）−メチル］−３−ヒドロキシ−２−フェニルメタンスルホニルアミノプロピオンアミド（図２も参照：ＷＸ−５０８）。さらに好ましい化合物は、３−ニトロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩（ＷＸＣ−３１６）、３−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩（ＷＸＣ−３１８）、４−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩（ＷＸＣ−３４０）、ベンジルスルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ａｌａ−（４−グアニジノベンジル）アミド塩酸塩（ＷＸ−５３２）、４−クロロベンジルスルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｌａ−（４−グアニジノベンジル）アミド（ＷＸ−５８２）又はベンジルスルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド（ＷＸ−５３８）である。
【００５４】
特に好ましい化合物は、４−クロロベンジル−スルホニル−（Ｄ）−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−（４−グアニジノベンジル）アミド、又はその薬剤学的に受け入れることができる塩、例えば塩酸塩（ＷＸ−Ｃ３４０）である。
【００５５】
故に、第一の態様において、本発明は、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患、特にＡＬＳ、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病及び細菌性髄膜炎の処置のための薬剤学的組成物の製造におけるウロキナーゼ阻害剤の使用に関する。
【００５６】
特に、本発明は、ウロキナーゼ依存性の神経病理学及び／又は神経変性に随伴される疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のためのウロキナーゼ阻害剤の使用を提供する。
【００５７】
"ウロキナーゼ阻害剤"という用語はまた、化合物の光学異性体、光学異性体の混合物、薬剤学的に受け入れることができる塩、溶媒和物又は誘導体、例えば薬剤学的に受け入れることができる誘導体、例えばエステル又はアミドも包含する。さらに、前記用語は、それ自体がウロキナーゼ阻害剤ではないが、投与の際に活性なウロキナーゼ阻害剤に変換されるプロドラッグを包含する。
【００５８】
ウロキナーゼを阻害する活性は、例えば、米国特許出願公開(US)第2004/0266766号明細書に記載された通りに決定されることができる。
【００５９】
ウロキナーゼ阻害剤は、単独で投与されてよく、又は好ましくは薬剤学的組成物として処方されてよい。さらに、前記活性化合物は、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の処置に使用される他の知られた薬剤学的化合物との組合せで投与されることができる。例えば、ウロキナーゼ阻害剤は、スーパーオキシドジスムターゼ／カタラーゼ擬態(catalase mimetics)及び／又はその他の合成又は非合成の触媒スカベンジャー、例えば化合物ＥＵＫ−８、ＥＵＫ−１３４、ＥＵＫ−１８９、ＥＵＫ−２０７との組合せで、神経病理学的疾患及び／又は神経変性疾患の処置のために投与されることもできる。
【００６０】
薬剤学的製剤は、ヒト及び動物に、局所に、経口に、直腸に又は非経口的に、例えば静脈内に、皮下に、筋肉内に、腹膜内に、舌下に、鼻に又は／及び吸入により、例えば錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ペレット、坐剤、溶液、乳濁液、懸濁剤、リポソーム、吸入スプレー又は経皮系、例えばプラスターの形で、投与されることができる。
【００６１】
本発明は、一般式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物の有効量の投与により、生きている生物、特にヒトにおけるウロキナーゼの阻害方法を提供する。前記化合物の用量は、通常、１日あたり０．０１〜１００mg/kg体重の範囲内である。処置の期間は、疾患の重度に依存し、かつ単一投与から、場合により間隔をあけて繰り返されてよい数週間又は数ヶ月すら持続する処置までにわたっていてよい。
【００６２】
図の説明
図１：  １Ａ−１Ｄは、抗ｕＰＡＲ抗体での免疫組織化学的な染色後のＡＬＳ患者の脊髄切片中のウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡＲ）の発現を示す。矢印は、染色されたニューロンを強調する。染色は、細胞膜中でより顕著であるように思われる。Ａ）及びＢ）は、対照事例の脊髄の切片を示す。免疫反応性は、脊髄ニューロン中に見られない。Ｃ）及びＤ）には、ＡＬＳ事例の脊髄切片が見られる。これらの場合に、ｕＰＡＲ抗体は、特異的なニューロンを弱く標識付けした。
【００６３】
図２ａ：  Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１突然変異体マウスの脊髄中のｕＰＡＲ発現のＰＣＲ分析。略符号：ＭＷ＝平均；ＳＴＤ＝標準偏差。ｕＰＡＲのレベルは、トランスジェニックＡＬＳマウス中の疾患進行の間に増加する。
【００６４】
図２ｂ及び２ｃ：  齢の異なる時間の間のＧ９３Ａマウスの脊髄中のｕＰＡ−及びｕＰＡＲ−ｍＲＮＡの発現プロフィール（ｄ＝日、最終＝最終段階、対照＝１２０日齢の非トランスジェニック同腹児）。９０日齢で、ｕＰＡ−及びｕＰＡＲ−ｍＲＮＡの有意に増加された発現が、対照群と比較してＧ９３Ａマウスの脊髄中に見出すことができる。＊ｐ＜０，０５；＊＊＊ｐ＜０，００１。
【００６５】
図３ａ：  Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１突然変異体マウスの脊髄中のウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）発現のＰＣＲ分析。
【００６６】
図３ｂ及び３ｃ：  脊髄ホモジェネートのザイモグラフィー（ｂ）及び光学バンド密度（ｃ）の代表例。ｕＰＡ依存性のプラスミノゲン活性化は、対照群と比較してＧ９３Ａマウス中で有意に増加した。＊＊＊ｐ＜０，００１。
【００６７】
図４：  ｕＰＡ阻害剤ＷＸ−Ｃ３４０でのＧ９３Ａ突然変異体マウスの処置の結果。
【００６８】
カプラン−マイヤー(Kaplan-Meyer)分析、Ｇ９３Ａ−ＡＬＳ−モデル：毎日腹膜内のＷＸ−Ｃ３４０  １０mg/kgで処置された動物（処置開始日３０、ｎ＝１８）との対照群動物（Ｎ＝４２）の生存の比較。
【００６９】
実施例
１．生存分析
ＦＡＬＳマウス（Ｇ９３Ａ）は、約９０日齢で行動症候を示し始めるのに対し、Ｇ８５Ｒマウスは、約８ヶ月齢で症候を発症する。初期の症候は、高頻度の安静時振戦である。これは、歩行異常及び協同を欠いた運動に進行する。後で、マウスは後肢の麻痺を示し始め、その際に場合により前肢の麻痺及び最終的には完全麻痺に進行する。動物を、それらの側部で押して１０秒以内にそれらが寝返りをうつことができなかった時に殺した。この時点が、死亡の時とみなされる。
【００７０】
２．行動試験−回転棒
マウスに、回転棒装置(Columbus Instruments、Columbus、OH)をよく知るようにするために試験前に２日間与えた。試験を初期設定し、その際に前記動物は１rpmで回転する棒上にいるように努力する。次の試行において、速さを、前記動物が落ちるまで１０秒おきに１rpmだけ増加させた。各マウスは３回の試行を有した。マウスが落ちた時の棒回転の速さを、この課題の能力の尺度として使用した。動物を、それらが課題を果たすことができなくなるまで１日おきに試験した。
【００７１】
３．ザイモグラフィー
カゼイン分解（ｕＰＡ）活性を、ザイモグラフィーによりトランスジェニックマウスの組織標本中で測定した。カゼイン分解活性を有するプロテイナーゼを、カゼイン１mg/mlを含有する１５％ポリアクリルアミドゲル(Sigma)中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。
【００７２】
試料１６μl（等しいタンパク質濃度を有する）を、６２．５mMトリス−ＨＣＬ、２％  ＳＤＳ、２５％グリセリン、０．０１％ブロモフェノールブルーを含有する試料緩衝液４μlで希釈し、４℃で１h３０min、２５mAで電気泳動にかけた。電気泳動後に、ゲルを、２％Triton X-100（VWR Scientific products、West Chester、PA）中で３０min、２回洗浄し、恒温保持緩衝液（５０mMトリス塩基、５mM ＣａＣｌ2、１μM ＺｎＣｌ2、０．０１％アジ化ナトリウム、ｐＨ ７．５）中で３７℃で２０h恒温保持した。恒温保持後に、ゲルを、２０％トリクロロ酢酸(Sigma T-4885)中で３０min固定し、０．５％クーマシーブリリアントブルー(Sigma B-7920)中で９０min染色した。染色後に、ゲルを、エタノール３５％及び酢酸１０％中で６０min脱色した。ゼラチン分解活性は、青色の背景上でクリアなバンドとして目に見えた。標準タンパク質マーカー（BioRad）を、ゲル上のカゼイン分解バンドを同定するのに使用した。
【００７３】
４．ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、２段階プロトコルを用いて、組織試料から抽出した。凍結組織を粉末化し、ＲＮＡを、第一段階において、Chomczynski及びSacchiによるグアニジニウムチオシアン化物法（Chomczynski及びSacchi、1987）を用いることにより調製した。イソプロパノールでの沈殿後に、ＲＮＡを、RNeasy mini kit（Qiagen、Hilden、独国）からの溶解緩衝液(lysis buffer)中に再溶解させ、製造者の指示書に従って調製した。全ＲＮＡ（１５μg）を、ホルムアルデヒド２．２mol/Lを含有する１．４％変性アガロースゲル中で分離し、一晩でキャピラリーブロットによりDuralton紫外膜（Stratagene、La Jolla、CA）上へ移し、紫外架橋剤（Stratagen）で架橋した。前記膜を、ＤＮＡプローブと共にランダムプライムド32Ｐ−標識ｃＤＮＡで、６８℃でQuick Hyb（Stratagene）中で１時間ハイブリダイズした。
【００７４】
前記膜を、２×標準食塩クエン酸緩衝液、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で６０℃で１５min、２回及び最後に０．１％標準食塩クエン酸緩衝液及び０．１％ＳＤＳ中で３０min、洗浄し、増感紙を有するBiomax MRフィルム（Kodak）に−８０℃で１８〜４８h露光した。ｍＲＮＡレベルを、Fluor-S Multimager system（BioRad）及びQuantity one version 4.1.0. （BioRad）を用いて、比重分析により定量した。ＧＡＰＤＨを、ローディングコントロールとして使用する。
【００７５】
全細胞ＲＮＡを、前記の通り抽出した。逆転写系（Promega、Madison、WI）を、製造者の指示書に従って最初のｃＤＮＡ鎖を生成するために使用した。その後に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、逆転写反応及びＴａｑポリメラーゼ（高適合度；Boehringer Mannheim、Germany）２μlを用いて、次の熱サイクルパラメーターで実施した：９４℃で４分；９４℃で４５秒、５５℃で１min及び７２℃で１minの３１サイクル；及び７２℃で７min。
【００７６】
ＧＡＰＤＨプライマーを、ローディングコントロールとして使用した。ネガティブコントロールとして、逆転写−ＰＣＲを、ＲＮＡの不在で実施した。増幅産物を、１．５％アガロースゲル中で分離した。
【００７７】
５．ＡＬＳの患者及び対照群からの脊髄組織中のｕＰＡＲの免疫組織化学
ＡＬＳの患者及び対照群中でのｕＰＡＲの解剖学的分布を評価するために、免疫組織化学を、抗ｕＰＡＲ抗体ＩＩＩＦ１０を用いて実施した。臨床上及び神経病理学的に定義されたＡＬＳ患者の５つの神経病理学的に確認された事例及び３つの対照患者からのヒト脳組織を研究した。顕微鏡検査を、多様な皮質領域（前頭、頭頂、海馬）、脳幹及び胸髄及び腰部脊髄標本から取り出したホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックからの１０μm切片を用いて実施した。前記切片を、２０％正常ヤギ血清（Vector、Burlingham、CA、USA）を含有する遮断溶液と共に恒温保持し、推奨される希釈でｕＰＡＲ抗体と反応させた。免疫組織化学を、アビジン−ビオチン技術（ベクター）を用いて実施し、核をヘマトキシリン／エオシンで対比染色した。ネガティブコントロールとして、切片を、一次抗体なしで恒温保持した。
【００７８】
６．ｕＰＡ阻害剤ＷＸ−Ｃ３４０での処置
ＦＡＬＳマウスへのＷＸ−Ｃ３４０  １０mgの毎日の腹膜内投与は、図４に示されている通り、疾患（前脚の麻痺の発症）の進行を遅延し、かつ動物の生存を有意に改善する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】抗ｕＰＡＲ抗体での免疫組織化学的な染色後のＡＬＳ患者の脊髄切片中のウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡＲ）の発現を示す図。
【図２ａ】Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１突然変異体マウスの脊髄中のｕＰＡＲ発現のＰＣＲ分析を示す図。
【図２ｂ】齢の異なる時間の間のＧ９３Ａマウスの脊髄中のｕＰＡ−及びｕＰＡＲ−ｍＲＮＡの発現プロフィールを示す図。
【図２ｃ】齢の異なる時間の間のＧ９３Ａマウスの脊髄中のｕＰＡ−及びｕＰＡＲ−ｍＲＮＡの発現プロフィールを示す図。
【図３ａ】Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ１突然変異体マウスの脊髄中のウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）発現のＰＣＲ分析を示す図。
【図３ｂ】脊髄ホモジェネートのザイモグラフィーの代表例を示す図。
【図３ｃ】脊髄ホモジェネートの光学バンド密度の代表例を示す図。
【図４】ｕＰＡ阻害剤ＷＸ−Ｃ３４０でのＧ９３Ａ突然変異体マウスの処置の結果を示す図。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
2008543900.tif 000030
【図４】
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【国際調査報告】
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