(57)【要約】  本出願は、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するためにマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のアンタゴニスト、特にＭＭＰ−１５のアンタゴニストを使用することを記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２のシェディングを阻害するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストでＨＥＲ２発現細胞を処置するステップを含む、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するための方法。
【請求項２】
ＭＭＰアンタゴニストが、膜に繋ぎ止められたＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）のアンタゴニストである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭＴ−ＭＭＰが、ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）、ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）、およびＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＭＴ−ＭＭＰがＭＭＰ−１５である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞がＨＥＲ２の過剰発現、増幅、または活性化を示す、請求項１記載の方法。
【請求項６】
細胞がＨＥＲ２の過剰発現または増幅を示す、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞をＨＥＲ阻害剤で処置するステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＨＥＲ阻害剤がＨＥＲ２抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＨＥＲ２抗体がトラスツズマブまたはパーツズマブである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＨＥＲ阻害剤が、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、およびＴＡＫ１６５からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物におけるＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の血清レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストを該哺乳動物に投与するステップを含む、該哺乳動物における該ＨＥＲ２  ＥＣＤの血清レベルを低減するための方法。
【請求項１２】
哺乳動物がＭＭＰレベルの上昇を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストを哺乳動物に投与するステップを含む、該哺乳動物における該ガンを処置するための方法。
【請求項１４】
ガンがＨＥＲの発現、増幅、または活性化を示す、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ガンがＨＥＲ２の過剰発現または増幅を示す、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物が、シェディングされたＨＥＲ２の血清レベルの上昇またはｐ９５  ＨＥＲ２レベルの上昇を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＨＥＲ阻害剤耐性ガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストを哺乳動物に投与するステップを含む、該哺乳動物における該ガンを処置するための方法。
【請求項１８】
ＨＥＲ阻害剤がトラスツズマブである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストに細胞を曝露するステップを含む、該細胞における該ｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するための方法。
【請求項２０】
ガン患者由来の試料中のＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）を評価するステップを含む診断法であって、ＭＭＰ−１５レベルまたは活性の上昇が、該患者がｐ９５  ＨＥＲ２またはシェディングされたＨＥＲ２の血清レベルの上昇を有するか、または将来的に臨床的転帰不良を有することを指し示す方法。
【請求項２１】
ＭＭＰ−１５レベルの上昇が、患者が将来的に臨床的転帰不良を有することを指し示す、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年２月９日に出願された仮出願６０／６５１，３４８の米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張する非仮出願であり、その出願の全開示は本明細書によって参照により組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するためのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、特にＭＭＰ−１５のアンタゴニストの使用に関するものである。
【０００３】
背景技術
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
【０００４】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性疾患の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、当該悪性疾患の処置における治療薬として評価されている。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記；Masui et al. Cancer Research 44: 1002-1007 (1984)；およびWu et al. J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995)を参照されたい。
【０００５】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされているタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244: 707-712 (1989);および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーン中の点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229: 974 (1985)；Yokota et al., Lancet 1: 765-767 (1986)；Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6: 955-958 (1986)；Guerin et al., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988)；Cohen et al., Oncogene, 4: 81-88 (1989)；Yonemura et al., Cancer Res., 51: 1034 (1991)；Borst et al., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990)；Weiner et al., Cancer Res., 50: 421-425 (1990)；Kern et al., Cancer Res., 50: 5184 (1990)；Park et al., Cancer Res., 49: 6605 (1989)；Zhau et al., Mol. Carcinog., 3: 254-257 (1990)；Aasland et al. Br. J. Cancer 57: 358-363 (1988)；Williams et al. Pathobiology 59: 46-52 (1991)；およびMcCann et al., Cancer, 65: 88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al. Cancer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28: 827-33 (1997); Ross et al. Cancer 79: 2162-70 (1997);およびSadasivan et al. J. Urol. 150: 126-31 (1993)）。
【０００６】
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。
【０００７】
Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41: 695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al. Oncogene 2: 273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ｎｅｕでトランスフォーメーションされヌードマウスに移植されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
【０００８】
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体に曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖が決定された。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖を低減させた。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)；Kotts et al. In Vitro 26(3): 59A (1990)；Sarup et al. Growth Regulation 1: 72-82 (1991)；Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3): 117-127 (1991)；Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2): 979-986 (1991)；Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993)；Pietras et al. Oncogene 9: 1829-1838 (1994)；Vitetta et al. Cancer Research 54: 5301-5309 (1994)；Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994)；Scott et al. J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991)；D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 7202-7206 (1994)；Lewis et al. Cancer Research 56: 1457-1465 (1996)；およびSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
【０００９】
リコンビナントヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現している転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
【００１０】
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937 (1991)；McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989)；Maier et al. Cancer Res.51: 5361-5369 (1991)；Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990)；Stancovski et al. PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)；Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992)；Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993)；ＷＯ９４／００１３６；Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992)；Hancock et al. Cancer Res.51: 4575-4580 (1991)；Shawver et al. Cancer Res. 54: 1367-1373 (1994)；Arteaga et al. Cancer Res. 54: 3758-3765 (1994)；Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 (1992)；米国特許第５，７８３，１８６号；およびKlapper et al. Oncogene 14: 2099-2109 (1997)に記載されている。
【００１１】
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの二つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993)；およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）の同定が生じた。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
【００１２】
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組合せで見出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；米国特許第５，６４１，８６９号；およびSchaefer et al., Oncogene 15: 1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al. Growth Factors 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7: 247-262 (1996)、およびLee et al. Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al. Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al. Nature 387: 512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al. PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００１３】
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、チロシンキナーゼＨＥＲ２を活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊することができる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ４はＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)）。
【００１４】
ＨＥＲのシグナル伝達ネットワークを図４に示す。
【００１５】
ＨＥＲ抗体に関する特許公報には、以下が挙げられる：
【００１６】
【表１】
2008530123.tif 000002
【００１７】
ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、培養乳ガン細胞からタンパク質分解的にシェディングされ（Petch et al., Mol. Cell. Biol. 10:2973-2982 (1990)；Scott et al., Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257 (1993)；およびLee and Maihle, Oncogene 16:3243-3252 (1998)）、一部のガン患者の血清中に見出される（Leitzel et al., J. Clin. Oncol. 10:1436-1443 (1992)）。ＨＥＲ２  ＥＣＤは、転移性乳ガンの血清マーカーでありうるし（Leitzel et al., J. Clin. Oncol. 10:1436-1443 (1992)）、ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍に免疫的防除を免れさせることができる（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1997)、Brodowicz et al., Int. J. Cancer 73:875-879 (1997))。シェディングされたＨＥＲ２  ＥＣＤの血清レベルは、ＨＥＲ２を過剰発現している転移性乳ガンを有する患者における臨床的転帰不良の独立したマーカーとなる（Ali et al., Clin. Chem. 48:1314-1320 (2002); Molina et al., Clin. Cancer Res. 8:347-353 (2002)）。
【００１８】
切り詰められたＨＥＲ２の細胞外ドメインは、イントロン内にポリアデニル化シグナルを使用することにより発生した２．３kbの選択的転写物の産物でもある（Scott et al., Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257 (1993)）。この選択的転写物は、胃ガン細胞系ＭＫＮ７（Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)；およびScott et al., Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257 (1993)）で最初に同定され、切り詰められたレセプターは、これらの腫瘍細胞から分泌されるよりもむしろ核周囲の細胞質に局在した（Scott et al., Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257 (1993)）。
【００１９】
ＨＥＲ２が選択的スプライシングされた、「ハースタチン（herstatin）」と呼ばれる別の産物もまた同定されている（Doherty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96:10869-10874 (1999)；Azios et al., Oncogene 20:5199-5209 (2001)；Justman and Clinton, J. Biol Chem. 277:20618-20624 (2002)）。このタンパク質は、細胞外ドメイン由来のサブドメインＩおよびＩＩに、イントロン８によってコードされている独特のＣ末端配列が続いたものからなる。
【００２０】
ＨＥＲ２を過剰発現している腫瘍における臨床的転帰不良を説明することができる別のメカニズムは、ＨＥＲ２を過剰発現している一部の腫瘍細胞ではこのレセプターが未知のメタロプロテアーゼ（またはメタロプロテイナーゼ）によりプロセシングされて、切り詰められた膜関連レセプター（ときに「ｓｔｕｂ」と呼ばれ、ｐ９５としても公知である）および可溶性細胞外ドメイン(ＥＣＤ、ＥＣＤ１０５、またはｐ１０５としても公知である）を生じるという観察によって示唆されている。
【００２１】
他のレセプターＨＥＲと同様に、細胞外リガンド結合ドメインの欠如は、ＨＥＲ２の 細胞内膜関連ドメインを構成的に活性なチロシンキナーゼにする。したがって、ＨＥＲ２  ＥＣＤのプロセシングによって、ガン細胞に成長シグナルおよび生存シグナルを直接送達することができる構成的に活性なレセプターが生み出されると仮定されている。米国特許第６，５４１，２１４号（Clinton）および米国特許出願第２００４／０２４７６０２Ａ１号（Friedman et al.）を参照されたい。
【００２２】
Saezら、Clin Cancer Res. 12(2): 424-431（２００６年１月）は、腫瘍が高レベルのｐ９５を発現している患者が、そうではない患者に比べて有意に不良の転帰を有することを報告している。目下、ｐ９５レベルはウエスタンブロットによってのみ決定することができる。
【００２３】
発明の概要
第１の局面では、本発明はＨＥＲ２のシェディングを阻害するための方法に関し、その方法は、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストでＨＥＲ２発現細胞を処置することを含む。
【００２４】
加えて、本発明は哺乳動物におけるＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の血清レベルを低減するための方法を提供し、その方法は、その哺乳動物におけるＨＥＲ２  ＥＣＤの血清レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。
【００２５】
なお別の局面では、哺乳動物におけるガンを処置するための方法が提供され、その方法は、そのガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。
【００２６】
また本発明は、哺乳動物におけるＨＥＲ阻害剤耐性ガンを処置するための方法に関し、その方法は、そのガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。
【００２７】
なおさらなる局面では、本発明は、細胞中のｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するための方法に関し、その方法は、そのｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストでその細胞を曝露することを含む。
【００２８】
本発明は、診断（または予後判定の）方法にも関し、その方法は、ガン患者由来の試料中のＭＭＰ-１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）を評価することを含み、ここで、ＭＭＰ−１５のレベルまたは活性の上昇は、その患者がｐ９５  ＨＥＲ２および／もしくはシェディングされたＨＥＲ２血清レベルの上昇を有し、かつ／または将来的に臨床的転帰不良を有することを指し示す。好ましくは、この方法ではＭＭＰ−１５（タンパク質または核酸）レベルが評価され、予後不良を有するか、または将来的に臨床的転帰不良を有する患者を同定するために使用される。場合により患者のガンは、ＨＥＲの発現、増幅、または活性化を、最も好ましくはＨＥＲ２の過剰発現または増幅をさらに示す。
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書における用語「マトリックスメタロプロテアーゼ」または「ＭＭＰ」は、活性に関してＺｎまたはＣａに依存するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を指す。本明細書におけるＭＭＰには、プレプロタンパク質、成熟タンパク質、およびその変異体形態が挙げられる。種々のドメインを有するＭＭＰの例については本明細書の図２０も参照されたい。ＭＭＰは、Wagenaar-Millerら、Cancer and Metastasis Reviews 23: 119-135 (2004)に総説されている。
【００３０】
本明細書における「膜に繋ぎ止められたＭＭＰ」または「ＭＴ−ＭＭＰ」は、上に定義されたＭＭＰであり、そのＭＭＰは、膜貫通（ＴＭ）ドメインまたはグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーのいずれかを介して細胞膜に付着することができる。本明細書において膜貫通ドメインによりアンカーされたＭＴ−ＭＭＰには、ＭＴ１− ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）、ＭＴ２−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１５）、ＭＴ３−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１６）、ＭＴ５−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２４）が挙げられる。ＧＰＩアンカーによりアンカーされたＭＴ−ＭＭＰの例には、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１７）およびＭＴ６−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）が挙げられる。ＭＭＰ−１５は本明細書において好ましいＭＴ−ＭＭＰである。
【００３１】
「ＭＴ２−ＭＭＰ」および「ＭＭＰ−１５」は本明細書において同義語であり、ＮＣＢＩデータベースのプレプロタンパク質ＮＰ＿００２４１５、そのアミノ酸１３２〜６９９を含む成熟タンパク質、およびその変異体形態を表す。ＭＭＰ−１５についての公知の基質には、コラーゲン、フィブロネクチン、ＣＤ４４、および補体が挙げられる。ＭＭＰ−１５は一部のガンではアップレギュレーションされ、このプロテアーゼの過剰発現は、腫瘍の浸潤および腫瘍細胞の成長を高める。
【００３２】
「ＭＭＰアンタゴニスト」は、少なくとも一つのＭＭＰに結合し、かつ／またはそのタンパク質分解活性をある程度妨害する薬剤である。好ましくは、ＭＭＰアンタゴニストはＭＭＰに選択的に結合するか、またはそれを選択的に阻害するが、ＡＤＡＭ（a disintegrin and metalloprotease）ファミリーのプロテアーゼなどの他のプロテアーゼに有意には結合せず、それを阻害もしない。本明細書におけるＭＭＰアンタゴニストの例には、ＭＭＰ、小分子阻害剤、ＭＭＰの基質を模倣する偽ペプチド（pseudopeptide）、ＭＭＰの触媒性亜鉛と結合する非ペプチド分子、単離された天然組織ＭＭＰ阻害剤（ＴＩＭＰ）、ＲＮＡなどの核酸阻害剤、またはアンチセンス阻害剤などが挙げられる。
【００３３】
「ＭＴ−ＭＭＰアンタゴニスト」は、少なくとも一つのＭＴ−ＭＭＰに結合し、かつ／またはそのタンパク質分解活性をある程度妨害する薬剤である。好ましくは、ＭＴ−ＭＭＰアンタゴニストは、ＭＴ−ＭＭＰに選択的に結合するか、またはそれを選択的に阻害するが、（膜に繋ぎ止められていない他のＭＭＰを含む）他のプロテアーゼに有意には結合せず、それを阻害もしない。ＭＴ−ＭＭＰアンタゴニストの例には、ＭＴ−ＭＭＰに結合する抗体、小分子阻害剤、ＭＴ−ＭＭＰの基質を模倣する偽ペプチド、ＭＴ−ＭＭＰの触媒性亜鉛と結合する非ペプチド分子、単離された天然組織ＭＴ−ＭＭＰ阻害剤、ＲＮＡなどのＭＴ−ＭＭＰの核酸阻害剤、またはアンチセンス阻害剤などが挙げられる。
【００３４】
「ＭＭＰ−１５アンタゴニスト」は、ＭＭＰ−１５に結合し、かつ／またはそのタンパク質分解活性をある程度妨害する薬剤である。好ましくは、ＭＭＰ−１５アンタゴニストは、ＭＭＰ−１５に選択的に結合するか、またはそれを選択的に阻害するが、（ＭＭＰ−１５以外のＭＭＰを含む）他のプロテアーゼに有意には結合せず、それを阻害もしない。ＭＭＰ−１５アンタゴニストの例には、ＭＭＰ−１５に結合する抗体、小分子阻害剤、ＭＭＰ−１５の基質を模倣する偽ペプチド、ＭＭＰ−１５の触媒性亜鉛と結合する非ペプチド分子、単離された天然組織ＭＭＰ−１５阻害剤、ＲＮＡなどのＭＭＰ−１５の核酸阻害剤、またはアンチセンス阻害剤などが挙げられる。
【００３５】
「ＭＭＰレベルの上昇」によって、ＭＭＰの正常量を超える、例えば同じ組織型の正常試料または非腫瘍性試料中の量を超える、腫瘍試料などの生体試料中のＭＭＰの量を意味する。このようなＭＭＰ（例えばＭＭＰ−１５）の「正常量」には、無含量または検出不能量のＭＭＰ−１５が含まれる。ＭＭＰタンパク質またはＭＭＰ核酸を測定する方法を含めて、ＭＭＰレベルの上昇を多様な方法で決定することができる。
【００３６】
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４を含む。レセプターＨＥＲには、ネイティブな配列のレセプターＨＥＲおよびその変異体が含まれる。好ましくは、レセプターＨＥＲはネイティブな配列のヒトレセプターＨＥＲである。
【００３７】
「完全長」レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合でき、かつ／または別のレセプターＨＥＲ分子と二量体化できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む。
【００３８】
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ＥＧＦＲ」は本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenterら、Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されたＥＧＦＲを、その変異体形態（例えば、Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)にあるような欠失突然変異ＥＧＦＲ）を含めて指す。
【００３９】
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSembaら、PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)およびYamamotoら、Nature 319:230-234 (1986)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質（Genebankアクセッション番号Ｘ０３３６３）、ならびに選択的スプライシングされた形態などのその変異体形態（Siegel et al. EMBO J. 18(8):2149-2164 (1999)）を指す。
【００４０】
本明細書において、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」または「ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、細胞膜にアンカーされているか、または循環しているかのいずれかであるＨＥＲ２の細胞外側のドメインを、そのフラグメントを含めて指す。一態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわち「ドメインＩ」（アミノ酸残基約１〜１９５；配列番号１）、「ドメインＩＩ］（アミノ酸残基約１９６〜３１９；配列番号２）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基約３２０〜４８８；配列番号３）、および「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基約４８９〜６３０；配列番号４）（シグナルペプチドを除いて残基に付番）を含みうる。Garrettら、Mol. Cell. 11:495-505 (2003)、Choら、Nature 42l:756-760 (2003)、Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)、およびPlowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)、ならびに本明細書の図１を参照されたい。
【００４１】
本明細書において、「ＨＥＲ２のシェディング」は、ＨＥＲ２を発現している細胞の細胞表面からＨＥＲ２の可溶性細胞外ドメイン(ＥＣＤ)フラグメントが放出されることを指す。当該シェディングは、細胞表面からのＥＣＤフラグメントの放出を生じる、細胞表面ＨＥＲ２のタンパク質分解性切断によって引き起こされることもあるし、また可溶性ＥＣＤもしくはそのフラグメントが選択的な転写物によりコードされていることもある。
【００４２】
「シェディングされたＨＥＲ２の血清レベル」により、哺乳動物の血清または循環中に存在するＨＥＲ２  ＥＣＤの量を意味する。Aliら、Clin. Chem. 48:1314-1320 (2002)；Molinaら、Clin. Cancer Res. 8:347-353 (2002)；１９９０年６月１２日に発行された米国特許４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；またはSiasら、J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)に記載された技法を含む様々な技法により、そのようなレベルを評価することができる。
【００４３】
本明細書において、「シェディングされたＨＥＲ２の血清レベル上昇」は、正常な哺乳動物（例えばヒト）の血清中に存在する量を超えた、哺乳動物（例えばヒト）の血清中のシェディングされたＨＥＲ２またはＨＥＲ２  ＥＣＤの量を指す。ＨＥＲ２  ＥＣＤの血清レベル上昇は、進行乳ガンを有する患者における予後不良ならびに内分泌療法および化学療法に対する応答減少と相関しうる。
【００４４】
本明細書における表現「ｐ９５  ＨＥＲ２」は、ＮＨ２末端が切り詰められたＨＥＲ２タンパク質を指す。一般に、ｐ９５はプロテアーゼまたはシェダーゼによる完全長ＨＥＲ２の切断から生じうる膜結合型のstubフラグメントである（Yuan et al. Protein Expression and Purification 29: 217-222 (2003)）。ｐ９５は約９５０００のＭｒを有することがあり、リン酸化されていることがある（Molina et al. Cancer Research 4744-4749 (2001)）。ｐ９５は一部の乳ガン試料で見出された（Christianson et al. Cancer Res. 15:5123-5129 (1998)）。
【００４５】
「ｐ９５レベルの上昇」により、正常レベル、例えばガン細胞と同じ組織型の正常細胞または非ガン細胞におけるレベルを超える、ガン細胞におけるｐ９５レベルを意味する。当該ｐ９５レベルの上昇の結果として、構成性シグナル伝達およびリンパ節転移が生じうる（Molina et al. Clin. Cancer Research 8:347-353 (2002)；Christianson et al. Cancer Res. 15:5123-5129 (1998)）。
【００４６】
ＭＭＰ−１５などのマーカーを「評価する」ことにより、そのマーカーの存在もしくは不在の分析、その量の測定、および／またはその活性（例えば活性増加）の分析を含めたその診断分析および／または予後分析を意味する。
【００４７】
「臨床的転帰不良」を有するガン患者は、化学療法またはトラスツズマブなどのＨＥＲ２抗体を用いた療法などのガン療法にあまり応答しそうにない、予後不良を有する患者である。臨床的転帰は、無病生存率などを含めた生存率などの標準的な手段により測定することができる。
【００４８】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKrausら、PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されたレセプターポリペプチドを、その変異体形態を含めて指す。
【００４９】
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば欧州特許出願第５９９，２７４号；Plowmanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993)；およびPlowmanら、Nature, 366:473-475 (1993)に開示されたレセプターポリペプチドを、１９９９年４月２２日に公開されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたアイソフォームなどのその変異体形態を含めて指す。
【００５０】
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al. Science 243: 1074-1076 (1989)；Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990)；およびCook et al. Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259: 1604-1607 (1993)；およびSasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251: 936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995)；およびKomurasaki et al. Oncogene 15: 2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387: 512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al. Oncogene 18: 2681-89 (1999)）；およびクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などのネイティブな配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合することができるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
【００５１】
本明細書に使用される場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされているポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)；および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)）；感覚および運動神経駆動因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。
【００５２】
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つのレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。このような複合体は、二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露されたときに形成することがあり、この複合体を免疫沈降により単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。当該ＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、およびＨＥＲ３−ＨＥＲ４ヘテロ二量体がある。さらに、ＨＥＲ二量体は、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、またはＥＧＦＲなどの異なるレセプターＨＥＲと組合せられた二つ以上のレセプターＨＥＲ２を含みうる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などのその他のタンパク質がその二量体と会合していることがある。
【００５３】
「ＨＥＲの発現、増幅、または活性化を示す」細胞、ガン、または生体試料は、診断検査において（過剰発現を含めて）ＨＥＲを発現し、増幅されたＨＥＲ遺伝子を含み、かつ／またはその他の方法でレセプターＨＥＲの活性化もしくはリン酸化を示すものである。そのような活性化を、（例えばＨＥＲのリン酸化を測定することによって）直接または（遺伝子発現プロファイリングもしくはＨＥＲのヘテロ二量体化を検出することによって）間接的に決定することができる。
【００５４】
「レセプターＨＥＲ２の過剰発現または増幅を有する」ガンまたは腫瘍細胞は、同じ組織型の非ガン細胞に比べて有意に高いレベルのＨＥＲ２タンパク質または遺伝子を有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅により、または転写もしくは翻訳の増加により引き起こされうる。ＨＥＲ２の過剰発現または増幅は、診断アッセイまたは予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）細胞表面に存在するＨＥＲ２タンパク質のレベル増加を評価することにより決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、サザンブロット法、または定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により細胞中のＨＥＲ２核酸レベルを測定することができる。血清などの生体液中のシェディングされたＨＥＲ２を測定することにより、ＨＥＲ２の過剰発現または増幅を研究することもできる（例えば１９９０年６月１２日に発行された米国特許第Ｎｏ．４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；およびSias et al. J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)を参照されたい）。上記アッセイ以外に、様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが当業者に利用できる。例えば、検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルされた抗体に、患者の体内の細胞を曝露することができ、例えば放射能を外部スキャンすることにより、またはその抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
【００５５】
逆に言えば、「レセプターＨＥＲを過剰発現も増幅もしない」ガン細胞または腫瘍細胞は、同じ組織型の非ガン細胞に比べて、正常よりも高いレベルのレセプターＨＥＲのタンパク質も遺伝子も有さないものである。パーツズマブなどのＨＥＲ二量体化を阻害する抗体を使用して、レセプターＨＥＲ２を過剰発現も増幅もしないガンを処置することができる。
【００５６】
「ＨＥＲ阻害剤」は、ＨＥＲの活性化または機能を妨害する薬剤である。ＨＥＲ阻害剤の例には、ＨＥＲ抗体（例えばＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ３抗体、またはＨＥＲ４抗体）；ＨＥＲ二量体化阻害剤；ＥＧＦＲターゲット薬；小分子性ＨＥＲアンタゴニスト；ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤；ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６などのＨＥＲ２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス分子（例えば、ＷＯ２００４／８７２０７参照）；ならびに／またはＭＡＰＫもしくはＡｋｔなどの下流のシグナル伝達分子に結合するか、もしくはその機能を妨害する薬剤が挙げられる。好ましくは、ＨＥＲ阻害剤はレセプターＨＥＲに結合する抗体または小分子である。ＨＥＲ阻害剤の特定の例には、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、およびＴＡＫ１６５が挙げられる。
【００５７】
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害する薬剤である。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体、例えばＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位でＨＥＲ２に結合する抗体である。本明細書における最も好ましい二量体化阻害剤は、パーツズマブまたはモノクローナル抗体２Ｃ４（ＭＡｂ  ２Ｃ４）である。ＨＥＲ二量体化阻害剤の他の例には、ＥＧＦＲに結合して、ＥＧＦＲと一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体（例えば、活性化ＥＧＦＲまたは「繋ぎ止められていない」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６（ＭＡｂ８０６）；Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)参照）；ＨＥＲ３に結合して、ＨＥＲ３と一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ＨＥＲ４に結合して、ＨＥＲ４と一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤（米国特許第６，４１７，１６８号）；アンチセンス二量体化阻害剤などが挙げられる。
【００５８】
「ＨＥＲ抗体」は、レセプターＨＥＲに結合する抗体である。場合により、ＨＥＲ抗体はＨＥＲの活性化または機能をさらに妨害する。好ましくは、ＨＥＲ抗体はレセプターＨＥＲ２に結合する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブおよびパーツズマブである。ＥＧＦＲ抗体の例にはセツキシマブ、ＡＢＸ０３０３、ＥＭＤ７２００、およびＩＭＣ−１１Ｆ５が挙げられる。
【００５９】
「ＨＥＲ活性化」は、任意の一つまたは複数のレセプターＨＥＲの活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化の結果として（例えばレセプターＨＥＲまたは基質ポリペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化する、レセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる）シグナル伝達を生じる。ＨＥＲの活性化は、対象となるレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体へのＨＥＲリガンドの結合により仲介されうる。ＨＥＲ二量体にＨＥＲリガンドが結合することにより、その二量体中の一つまたは複数のレセプターＨＥＲのキナーゼドメインを活性化することができ、その結果として、一つまたは複数のレセプターＨＥＲ中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチドのチロシン残基のリン酸化が生じる。
【００６０】
「リン酸化」は、レセプターＨＥＲまたはその基質などのタンパク質に対する一つまたは複数のリン酸基の付加を指す。
【００６１】
「ＨＥＲの二量体化」を阻害する抗体は、ＨＥＲ二量体の形成を阻害するか、または妨害する抗体である。好ましくは、そのような抗体はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位でＨＥＲ２に結合する。本明細書における最も好ましい二量体化阻害抗体はパーツズマブまたはＭＡｂ  ２Ｃ４である。ＨＥＲの二量体化を阻害する抗体の他の例には、ＥＧＦＲに結合して、ＥＧＦＲと一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体（例えば活性化ＥＧＦＲまたは「繋ぎ止められていない」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６（ＭＡｂ  ８０６）；Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)参照）；ＨＥＲ３に結合して、ＨＥＲ３と一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体；およびＨＥＲ４に結合して、ＨＥＲ４と一つまたは複数の他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害する抗体が挙げられる。
【００６２】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにその細胞外ドメイン中の領域と接触するか、またはその領域を妨害する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。この領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見出される。Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【００６３】
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブのように「ＨＥＲ２のエクトドメインの切断を阻害する」抗体（Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749(2001)）のことがあるし、またパーツズマブのようにＨＥＲ２のエクトドメインの切断を有意には阻害しない抗体のことがある。
【００６４】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩの残基に結合し、（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどのＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメインの残基にも結合し、）ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成に少なくともある程度立体障害を与えることができる。Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的な抗体を例証している、ＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴付けている。
【００６５】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩの残基と、場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどの他のドメイン残基とに結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の接合部に結合する。
【００６６】
「ネイティブな配列の」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチド（例えばレセプターＨＥＲまたはＨＥＲリガンド）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。当該ネイティブな配列のポリペプチドを天然から単離でき、また、リコンビナント手段もしくは合成手段により産生させることができる。このように、ネイティブな配列のポリペプチドは、天然ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、または任意のその他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
【００６７】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りはインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントにわたる。
【００６８】
本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を構成する個別の抗体は同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する。当該変異体は一般的に少量存在する。当該モノクローナル抗体には、典型的にはターゲットと結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここで、そのターゲットと結合するポリペプチドの配列は、複数のポリペプチド配列からの単一のターゲットと結合するポリペプチド配列を選択することを含む工程により得られたものである。例えば、その選択工程は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、またはリコンビナントＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから独特なクローンを選択することでありうる。選択されたターゲット結合配列をさらに変更して、例えばターゲットに対する親和性を改善し、ターゲット結合配列をヒト化し、細胞培養でのその産生を改善し、それのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性を低減し、多特異性抗体を生み出すことなどができること、およびその変更されたターゲット結合配列を含む抗体は本発明のモノクローナル抗体でもあることを了解すべきである。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるというその抗体の性質を表すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えばKohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981)）、リコンビナントＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ技法（例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、およびヒト免疫グロブリンローカスまたはヒト免疫グロブリン配列をコードしている遺伝子の部分または全部を有する動物においてヒト抗体またはヒト様抗体を産生させるための技法（例えばＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，５９１，６６９号（全てGenPharmの特許）；米国特許第５，５４５，８０７号；ＷＯ１９９７／１７８５２；米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１��６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号；Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Lonberg et al, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）を含めた多様な技法により作成することができる。
【００６９】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、その鎖の残りが、別の種由来の抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体がある。
【００７０】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分を含み、その部分は好ましくはその抗原結合部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体がある。
【００７１】
本明細書における「インタクトな抗体」は、二つの抗原結合領域とＦｃ部とを含む抗体である。好ましくは、インタクトな抗体は一つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００７２】
インタクトな抗体の重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、それらの抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には五つの主クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかをさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００７３】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ部（ネイティブな配列のＦｃ部またはアミノ酸配列変異体のＦｃ部）に起因しうる生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑとの結合；補体依存性細胞傷害作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などがある。
【００７４】
「抗体依存性細胞性細胞傷害作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評定するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ  ｖｉｖｏ評定することができる。
【００７５】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、そのネイティブな起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００７６】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲはネイティブな配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」によって包含される。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの輸送を担う新生児レセプターＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)）。
【００７７】
「補体依存性細胞傷害作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評定するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００７８】
「ネイティブな抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、そのもう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【００７９】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、それぞれ特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、四つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造を連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって一緒に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接には関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００８０】
本明細書に使用される場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般的に「相補性決定部」すなわち「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）、および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義されるような超可変部残基以外の可変ドメインの残基である。
【００８１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する２本の同一の抗原結合フラグメントと、名前が容易に結晶化できる能力を反映している残りの１「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原と架橋できる。
【００８２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識抗原結合部位を有する、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識してその抗原と結合する能力を有する。
【００８３】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを有する。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含む数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を有するＦａｂ’についての呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【００８４】
任意の脊椎動物種由来抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
【００８５】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
【００８６】
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインに別の鎖の相補的ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
【００８７】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものである。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部である免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照されたい。
【００８８】
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、およびｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）；ならびに本明細書に記載されるパーツズマブのようなヒト化２Ｃ４抗体がある。
【００８９】
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号５および６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００９０】
本明細書において、「パーツズマブ」および「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」は、それぞれ配列番号７および８の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００９１】
「ネイキッドな抗体」は、細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
【００９２】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。単離された抗体には、リコンビナント細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。それは、その抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素が存在しないものであるからである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
【００９３】
「親和性成熟した」抗体は、変更を有さない親抗体に比べて、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる一つまたは複数の変更を、その一つまたは複数の超可変部に有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、ターゲット抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度の親和性さえ有するであろう。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。Marksら、Bio/Technology 10: 779-783 (1992)は、ＶＨおよびＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994)；Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995)；Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995);およびHawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992)に記載されている。
【００９４】
本明細書における用語「主要種抗体」は、組成物中の量的に優占的な抗体分子である、その組成物中の抗体構造を指す。
【００９５】
本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有するものであり、好ましくは、主要種抗体と少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内の、またはそれに隣接したある位置に置換、欠失、および／または付加を有する。
【００９６】
本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、それに付着した一つまたは複数の糖質部分を有する抗体であり、その部分は、主要種抗体に付着した一つまたは複数の糖質部分とは異なる。
【００９７】
「脱アミド化」抗体は、その抗体の一つまたは複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド、またはイソアスパラギン酸に誘導体化された抗体である。
【００９８】
用語「ガン」および「ガン性」は、無秩序な細胞成長によって典型的には特徴付けられる、哺乳類における生理的状態を指すか、または記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および膵島細胞ガンを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺ガン、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、それに限定されるわけではない。当該ガンのさらに特別な例には、扁平上皮ガン（例えば上皮扁平上皮ガン）；小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）、肺腺ガンおよび肺扁平上皮ガンを含む肺ガン；腹膜ガン；肝細胞ガン；消化管ガンを含む胃ガン；膵臓ガン；神経膠芽腫；子宮頚がん；卵巣ガン；肝ガン；膀胱ガン；ヘパトーマ；乳ガン（転移性乳ガンを含む）；結腸ガン；直腸ガン；直腸結腸ガン；子宮内膜ガンまたは子宮ガン；唾液腺ガン；腎ガン；前立腺がん；外陰部ガン；甲状腺ガン；肝ガン；肛門ガン；陰茎ガン；精巣ガン；食道ガン；胆道腫瘍；ならびに頭頚部ガンが挙げられる。
【００９９】
「ＨＥＲ阻害剤耐性ガン」を有する哺乳動物は、ＨＥＲ阻害剤性療法を受けている間に進行した哺乳動物（すなわちその患者は「ＨＥＲ阻害剤抗療性」）であるか、またはその哺乳動物は、ＨＥＲ阻害剤性治療方式を完了後１２か月以内（例えば６か月以内）に進行している。ＨＥＲ阻害剤性療法には、ネイキッドなＨＥＲ阻害剤またはコンジュゲーションしたＨＥＲ阻害剤を用いた治療法が含まれ、ここで、そのＨＥＲ阻害剤は単剤として、または他の抗腫瘍薬と共に投与される。そのＨＥＲ阻害剤は、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、またはＴＡＫ１６５でありうるが、好ましくはトラスツズマブである。
【０１００】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜、および農用動物と、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの展示動物、スポーツ用の動物、または愛玩動物とを含めた哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０１】
本明細書における「腫瘍試料」は、患者の腫瘍由来の試料であるか、またはその腫瘍由来の腫瘍細胞を含む試料である。本明細書における腫瘍試料の例には、腫瘍生検、循環している腫瘍細胞、循環している血漿タンパク質、腹水、腫瘍由来の、または腫瘍様性質を示す初代細胞培養物または細胞系、およびホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料または凍結腫瘍試料などの保存処理された腫瘍試料があるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０２】
「固定」腫瘍試料は、固定剤を用いて組織学的に保存処理された試料である。
【０１０３】
「ホルマリン固定」腫瘍試料は、固定剤としてホルムアルデヒドを用いて保存処理された試料である。
【０１０４】
「包埋」腫瘍試料は、パラフィン、ろう、セロイジン、または樹脂などの堅固で一般的に硬い媒質により囲まれた試料である。包埋は、顕微鏡検査用または組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）作成用の薄切片を切り出すことを可能にする。
【０１０５】
「パラフィン包埋」腫瘍試料は、石油由来固体炭化水素の精製混合物に囲まれた試料である。
【０１０６】
本明細書において、「凍結」腫瘍試料は、凍結しているか、または凍結された腫瘍試料を指す。
【０１０７】
本明細書に使用される場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現ガン細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.の、Murakamiらによる「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題の第１章、特に１３頁に見出すことができる。
【０１０８】
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく（例えば、約５０％から約１００％）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害は決定される（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
【０１０９】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、レセプターＨＥＲ２を過剰発現する細胞である。好ましくは、この細胞は、腫瘍細胞、例えば、乳房細胞、卵巣細胞、胃細胞、子宮内膜細胞、唾液腺細胞、肺細胞、腎臓細胞、結腸細胞、甲状腺細胞、膵臓細胞、または膀胱細胞である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、この細胞は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞、ＢＴ４７４細胞、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、またはＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために様々な方法が利用できる。例えば、アネキシンの結合によってホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定でき；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価することができ；低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化と同時に核／クロマチンの凝縮を評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシン結合の誘導を招く抗体である（以下参照）。アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体の例は、７Ｃ２および７Ｆ３である。
【０１１０】
「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。好ましくは、この抗体は、ＨＥＲ２に対する２Ｃ４の結合を約５０％以上遮断する。または、 エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの結合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)。
【０１１１】
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、ＨＥＲ２  ＥＣＤの約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを評定することができる。
【０１１２】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、以下参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のＮ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。または、その抗体がＨＥＲ２上の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ（例えば、ＨＥＲ２  ＥＣＤの約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基、残基の付番にシグナルペプチドを含める）に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
【０１１３】
「処置」は、治療的処置および予防措置または阻止措置の両方を指す。処置を必要とする者には、すでにその疾患を有する者およびその疾患が予防されるべき者が含まれる。従って、本明細書において処置される患者は、その疾患を有すると診断されたこともあるし、また、その疾患の素因があるか、もしくはその疾患に感受性なこともある。
【０１１４】
用語「有効量」は、患者におけるガンを処置するのに有効な薬物の量を指す。その薬物の有効量は、ガン細胞数を減少させ；腫瘍の大きさを低減し；末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の転移を阻害し（すなわちある程度減速させて、好ましくは停止させ）；腫瘍の成長をある程度阻害し；かつ／またはガンに関連した一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。その薬物が成長を阻止して、かつ／または現存しているガン細胞を殺滅できる程度に、有効量は細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性でありうる。有効量は、無増悪生存期間を延長し、（部分奏効（ＰＲ）または完全奏効（ＣＲ）を含めた）奏効を招き、全生存期間を延ばし、かつ／またはガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
【０１１５】
「完全奏効」または「完全寛解」によって、処置に応答してガンの全ての徴候が消失したことを意味する。これは、ガンが治癒したことを必ずしも意味しない。
【０１１６】
「部分奏効」は、処置に応答した、一つもしくは複数の腫瘍もしくは病変の大きさの減少、または体内のガンの程度の減少を指す。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めて含むことを意図する。
【０１１８】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；ＴＬＫ２８６（TELCYTA（商標））；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；クロドロネートなどのビスホスホン酸塩；エンジイン抗生物質など（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照））およびアンナマイシンなどのアントラサイクリン、ＡＤ３２、アルカルビシン（alcarubicin）、ダウノルビシン、デキストラゾキサン（dexrazoxane）、ＤＸ−５２−１、エピルビシン、ＧＰＸ−１００、イダルビシン、ＫＲＮ５５００、メノガリル、ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）、エスペラマイシン、ネオカルジノスタチン発色団および関係する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含めた）ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）（ドキソルビシン）、エソルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシンなどの抗生物質；デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、およびトリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；ホリニン酸（ロイコボリン）などの葉酸補給剤；アセグラトン；ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）（ＬＹ２３１５１４、ペメトレキセド）、メトトレキサートなどのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質およびＵＦＴなどのそのプロドラッグ、Ｓ１およびカペシタビン、ならびにラルチトレキセド（TOMUDEX（商標）、ＴＤＸ）などのチミジル酸シンターゼ阻害剤およびグリシンアミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ阻害剤などの抗葉酸抗腫瘍剤；エニルウラシルなどのジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ阻害剤；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡ、およびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））：ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；パクリタキセル（TAXOL（登録商標））(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、パクリタキセルの無Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒアルブミン加工ナノ粒子製剤であるＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、およ���ドセタキセル（TAXOTERE（登録商標））（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）などのタキソイドおよびタキサン；クロランブシル；ゲムシタビン（GEMZAR（登録商標））、５−フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（XELODA（商標））、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、６−チオグアニン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アラビノシルシトシンARA-Cシタラビン（CYTOSAR-U（登録商標））、デカルバジン（DTIC-DOME（登録商標））、アゾシトシン、デオキシシトシン、ピリドミデン、フルダラビン（FLUDARA（登録商標））、クラドラビン、および２−デオキシ−Ｄ−グルコースなどの抗代謝拮抗化学療法剤；６−チオグアニン；メルカプトプリン；カルボプラチン、シスプラチン、あるいはオキサリプラチナなどのプラチナ系化学療法剤；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；ビンカアルカロイド；ビノレルビン（NAVELBINE（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；前記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ELOXATIN（商標））を５−ＦＵおよびロイコボリンと組合せて用いた処置方式についての略語）などの、前記のうち二つ以上の組合せがある。
【０１１９】
腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も本定義に含まれる。それらには、例えば、タモキシフェン（タモキシフェン（NOLVADEX（登録商標））を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（FARESTON（登録商標））を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモデュレーター（ＳＥＲＭ）；例えば４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（MEGASE（登録商標））、エキセメスタン（AROMASIN（登録商標））、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（RIVISOR（登録商標））、レトロゾール（FEMARA（登録商標））、およびアナストロゾール（ARIMIDEX（登録商標））などの、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（troxacitabine）（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）などの、接着性細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ならびに前記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体がある。
【０１２０】
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【０１２１】
用語「サイトカイン」は、ある細胞集団によって放出され、細胞間仲介物質として別の細胞に作用するタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用される用語サイトカインには、天然起源由来またはリコンビナント細胞培養物由来のタンパク質、およびネイティブな配列のサイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
【０１２２】
本明細書において使用される用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合して、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子が挙げられる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohn et al.参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ERBUTIX（登録商標））および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその変異体；ＩＭＣ−１１Ｆ８、完全ヒトＥＧＦＲターゲット抗体（Imclone）、ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載された、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ＡＢＸ−ＥＧＦなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）;ＥＧＦＲとの結合についてＥＧＦおよびＴＧＦ−αの両方と競合する、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体であるＥＭＤ７２００（マツズマブ）；ならびにｍＡｂ８０６またはヒト化ｍＡｂ８０６（Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体を細胞毒性薬とコンジュゲーションすることにより、免疫コンジュゲートを発生させることができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９すなわちゲフィチニブ（IRESSA（商標）；AstraZeneca）、ＣＰ−３５８７７４すなわちエルロチニブ（TARCEVA（商標）；Genentech/OSI)、およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Sugen）、ＥＭＤ−７２００が挙げられる。
【０１２３】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及したＥＧＦＲターゲット薬；武田から入手可能なＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの経口選択的阻害剤であるＣＰ−７２４，７１４（PfizerおよびOSI）；選好的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞およびＥＧＦＲを過剰発現している細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）；ＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Ｇｌａｘｏから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１、およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分含有チルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードしている核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（tryphostin）（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac； Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されるもの：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）が挙げられる。
【０１２４】
ＩＩ．  ＨＥＲ２のシェディングの阻害
本出願は、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するための方法に関し、その方法は、ＨＥＲ２発現細胞を、ＨＥＲ２のシェディングを阻害するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストで処置すること、またはそれに曝露することを含む。好ましくは、ＭＭＰアンタゴニストは膜に繋ぎ止められたＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）、ＭＴ２−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１５）、ＭＴ３−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１６）、ＭＴ５−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２４）、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１７）、またはＭＴ６−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）などのＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）のアンタゴニストである。最も好ましくは、ＭＴ−ＭＭＰはＭＭＰ−１５であり、望ましくは、そのアンタゴニストは他のプロテアーゼにもＭＭＰ−１５以外のＭＭＰにも有意に結合せずにＭＭＰ−１５に選択的もしくは選好的に結合し、かつ／またはそのアンタゴニストは他のプロテアーゼの機能もＭＭＰ−１５以外のＭＭＰの機能も有意に妨害せずにＭＭＰ−１５のタンパク質分解機能を妨害する。
【０１２５】
好ましい態様では、処置される細胞はＨＥＲおよび／またはＭＭＰの発現、増幅、または活性化を示す。例えば、その細胞はＨＥＲ２および／またはＭＭＰ−１５の過剰発現または増幅を示しうる。
【０１２６】
ＭＭＰアンタゴニストの活性は、そのアンタゴニストを別の抗腫瘍薬、ＨＥＲ阻害剤、またはＨＥＲ２抗体（トラスツズマブまたはパーツズマブなど）と組合せることにより高まりうる。ＭＭＰアンタゴニストと組合せることのできるＨＥＲ阻害剤の例には、トラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、およびＴＡＫ１６５が挙げられる。
【０１２７】
本発明は、哺乳動物におけるＨＥＲ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)の血清レベルを低減するための方法にも関し、その方法は、その哺乳動物におけるＨＥＲ２  ＥＣＤ血清レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。その哺乳動物は、場合によりＭＭＰレベルの上昇を有する。
【０１２８】
本発明は、哺乳動物におけるガンを処置するための方法も提供し、その方法は、ガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。そのガンは、ＨＥＲおよび／またはＭＭＰの発現、増幅、または活性化を示しうる。例えば、そのガンは、ＨＥＲ２またはＭＭＰ−１５の過剰発現または増幅を示しうる。一態様では、処置される哺乳動物はシェディングされたＨＥＲ２の血清レベルの上昇またはｐ９５  ＨＥＲ２レベルの上昇を有する。
【０１２９】
本発明は、哺乳動物におけるＨＥＲ阻害剤耐性ガンを処置するための方法にも関し、その方法は、そのガンを処置するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストをその哺乳動物に投与することを含む。例えば、その哺乳動物はトラスツズマブなどのＨＥＲ２抗体に耐性でありうる。
【０１３０】
細胞におけるｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するための方法も提供され、その方法は、ｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減するのに有効量のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）アンタゴニストにその細胞を曝露することを含む。
【０１３１】
様々なＭＭＰアンタゴニストを使用することができるが、好ましくはＭＭＰアンタゴニストは小分子阻害剤または抗体である。抗体を作成するための方法は本明細書に後述する。
【０１３２】
ＩＩＩ．  抗体の産生
本発明により使用される抗体の産生についての例示的な技法に関して、以下に説明する。抗体の産生に使用される抗原は、例えば、所望のエピトープを含む可溶性形態の抗原またはその一部分でありうる。または、細胞表面に抗原を発現している細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；またはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を発生させることができる。抗体の発生に有用な他の形態の抗原は、当業者に明らかであろう。
【０１３３】
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物に産生される。二官能剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫処置される種に免疫原性であるタンパク質と関連抗原をコンジュゲーションすることが有用なことがある。
【０１３４】
例えば、（それぞれウサギまたはマウスに対して）１００μgまたは５μgのタンパク質またはコンジュゲートを３倍量のフロイント完全アジュバントと混合し、複数の部位にその溶液を皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して動物を免疫処置する。１か月後、フロイント完全アジュバントに入れた初回量の１／５から１／１０のペプチドまたはコンジュゲートを用いて複数の部位で皮下注射することにより、その動物に追加免疫する。７日から１４日後、その動物から採血し、そしてその血清の抗体力価をアッセイする。力価がプラトーになるまで動物に追加免疫する。好ましくは、同抗原のコンジュゲートであるが、異なるタンパク質と、および／または異なる架橋試薬を介してコンジュゲーションしたものを用いて、その動物を追加免疫する。タンパク質融合体としてリコンビナント細胞培養でコンジュゲートを作成することもできる。また、ミョウバンなどの凝集剤を適切に使用して、免疫応答を増強させる。
【０１３５】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を作成するための様々な方法を当技術分野で利用することができる。例えば、Kohlerら、Nature, 256: 495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、リコンビナントＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によりモノクローナル抗体を作成することができる。
【０１３６】
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書の前述のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置することができる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１３７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１３８】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。これらのうち好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１３９】
その抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が中で成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにより決定する。
【０１４０】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【０１４１】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで成長させることができる。
【０１４２】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０１４３】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列解析される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にＥ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクションして、リコンビナント宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードしているＤＮＡを細菌にリコンビナント発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)がある。
【０１４４】
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技法を使用して作成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、鎖シャッフリング（chain chuffling）（Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)）による高親和性（nM範囲）ヒト抗体の産生ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏリコンビネーション（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)）について記載している。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
【０１４５】
例えば、相同マウス配列に代わり、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に繋ぐことによっても、ＤＮＡを改変することができる。
【０１４６】
典型的には、抗体の定常ドメインの代わりに当該非免疫グロブリンポリペプチドに置換するか、または、抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりにそれらに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
【０１４７】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。したがって、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際にはヒト化抗体は、典型的には一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位由来の残基に置換されているヒト抗体である。
【０１４８】
ヒト化抗体を作成する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、そのげっ歯動物の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)）。
【０１４９】
抗体が抗原に対する高い親和性およびその他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮にこれらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列より選択して組合せることができ、それにより、ターゲット抗原に対する親和性増大などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０１５０】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を作成することができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生み出すことが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃に応答したヒト抗体の産生が生じるであろう。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号,および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０１５１】
または、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体およびヒト抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかのフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを有することから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードしている遺伝子の選択も招く。このように、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣している。ファージディスプレイを様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clacksonら、Nature, 352: 624-628 (1991)は、免疫処置されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０１５２】
上記のように、ヒト抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化したＢ細胞により作成することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０１５３】
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公開されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
【０１５４】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技法が、一つまたは複数の抗原結合領域を含む抗体フラグメントの産生のために開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今やリコンビナント宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、リコンビナント宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択された抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載された「線状抗体」でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
【０１５５】
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の二つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組合せることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組合せることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１５６】
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ  Ａｂである。
【０１５７】
二重特異性抗体を作成するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その二つの鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１５８】
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも一部、ＣＨ２部、およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。軽鎖の結合に必要な部位を有する第一重鎖定常部（ＣＨ１）を、これら融合体の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードしているＤＮＡと、所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、構築に使用される等しくない比率の３本のポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、それら３本のポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、２本または３本全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１５９】
このアプローチの好ましい態様では、二重特異性抗体は、一方のアームでの第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームでのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組合せから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法に備えるからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作成するさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照されたい。
【０１６０】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を加工して、リコンビナント細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に交換する。その大型側鎖に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に交換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させるためのメカニズムを提供する。
【０１６１】
二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作成することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
【０１６２】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成するための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１６３】
最近の進歩により、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合させて、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性をトリガーすることができた。
【０１６４】
リコンビナント細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作成して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法を、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作成するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)を参照されたい。
【０１６５】
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１６６】
（ｖｉｉ）その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組合せは、最終構築物に達するように作成されるが、但し、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させることなどの、抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
【０１６７】
突然変異誘発についての好ましい位置である、抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)に記載された「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、複数のターゲット残基の中から一つの残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に交換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりにさらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているが、その突然変異自体の性質は予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、発現した抗体変異体が所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１６８】
アミノ酸配列挿入には、長さが１個の残基から１００個以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入体がある。末端挿入体の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体がある。抗体分子のその他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
【０１６９】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に交換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には超可変部があるが、ＦＲの変更も考えられている。
【０１７０】
抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
【０１７１】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの変異体が作成された元の親抗体に比べて、改善された生物学的性質を有するであろう。当該置換変異体を作成するための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させて全ての可能なアミノ置換を各部位に作成する。このように作成された抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。または、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＨＥＲ２との間の接触点を同定することが有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０１７２】
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１７３】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されうるが、そのヒドロキシアミノ酸は最も一般的にはセリンまたはトレオニンである。
【０１７４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を有するようにすることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても変更を行うことができる。
【０１７５】
抗体がＦｃ部を含む場合、それに付着している糖質を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ部に付着したフコースを欠如した成熟糖質構造を有する抗体が米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Presta, L.に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）も参照されたい。糖質中の二分岐型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ０３／０１１８７８、Jean-Mairetらおよび米国特許第６，６０２，６８４号、Umanaらに参照されている。オリゴ糖中の少なくとも一つのガラクトース残基が抗体のＦｃ部に付着した抗体がＷＯ９７／３００８７、Patelらに報告されている。変更された糖質がＦｃ部に付着した抗体に関するＷＯ９８／５８９６４（Raju, S.）およびＷＯ９９／２２７６４（Raju, S.）も参照されたい。
【０１７６】
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するためのエフェクター機能に関して、本発明の抗体を改変することが望ましいことがある。これは、抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって実現することができる。または、もしくは追加的に、システイン残基をＦｃ部に導入することによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このように作成されたホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増大した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することがある。Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体を、Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。または、二つのＦｃ部を有する抗体を加工することができ、それによって、その抗体は増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１７７】
ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善したＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載している。ここで、その抗体は、そのＦｃ部にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善されたＡＤＣＣを有する抗体はＦｃ部の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む。好ましくは、変更されたＦｃ部は、これらの位置の一つ、二つ、または三つに置換を含むか、またはその置換からなるヒトＩｇＧ１のＦｃ部である。
【０１７８】
Ｃ１ｑとの結合性および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の変更を有する抗体が、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号、および米国特許第６，５３８，１２４号（Idusogie et al.）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ部のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、および／または３３４のうち一つまたは複数にアミノ酸置換を含む（KabatのようなＦｃ部残基のＥｕ番号付けを用いる）。
【０１７９】
抗体の血清半減期を増大させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込むことができる。本明細書中で使用される用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期の増大を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。
【０１８０】
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）との結合性が改善し、半減期が増大した抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）およびＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、その中にＦｃ部とＦｃＲｎとの結合性を改善する一つまたは複数の置換を有するＦｃ部を含む。例えば、Ｆｃ部はその位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８または４３４のうち一つまたは複数に置換を有しうる（KabatのようなＦｃ部残基のＥｕ番号付けを用いる）。ＦｃＲｎとの改善した結合性を有する好ましいＦｃ部含有抗体変異体は、そのＦｃ部の位置３０７、３８０、および４３４のうち一つ、二つ、または三つにアミノ酸置換を含む。
【０１８１】
三つ以上（好ましくは四つ）の機能的抗原結合部位を有する加工された抗体も考えられている（米国出願番号ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１、Miller et al.）。
【０１８２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野で公知の様々な方法により調製される。これらの方法には、天然起源からの単離（天然アミノ酸配列変異体の場合）または初期調製変異体もしくは非変異体バージョンの抗体のオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
【０１８３】
（ｖｉｉｉ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
【０１８４】
当該免疫コンジュゲートの発生に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリケアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書において考えられている。
【０１８５】
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションしている。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換でき、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを発生させることができる。
【０１８６】
関心対象の別の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリケアミシン分子とコンジュゲーションしている抗体を含む。カリケアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で、２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリケアミシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１（Hinman et al. Cancer Research 53:3336-3342 (1993)およびLode et al. Cancer Research 58:2925-2928 (1998)）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
【０１８７】
使用することができる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０１８８】
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
【０１８９】
放射性コンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用することができる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。
【０１９０】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシインミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作成することができる。例えば、Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４ラベル１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)）を使用することができる。
【０１９１】
または、抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えばリコンビナント技法またはペプチド合成によって作成することができる。
【０１９２】
その他の免疫コンジュゲートが本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０１９３】
本明細書において開示された抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているように、当技術分野において公知の方法により調製される。循環時間が高まったリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１９４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって発生させることができる。所定の孔径のフィルターを通してリポソームを押出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド交換反応を介して、Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているようにリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照されたい。
【０１９５】
ＩＶ．  薬学的製剤
本発明により使用されるＭＭＰアンタゴニストの治療用製剤は、所望の純度を有するＭＭＰアンタゴニストを、随意の薬学的に許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と共に、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される。許容されうる担体、賦形剤、または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、これらには、リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；（約１０残基未満の）低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、およびその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。凍結乾燥抗体製剤は、参照により本明細書に特に組み入れられるＷＯ９７／０４８０１に記載されている。
【０１９６】
本明細書における製剤は、処置される特定の適応に必要な一つを超える活性化合物、好ましくは相互に有害な影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有することがある。ＭＭＰアンタゴニストと組合せることのできる様々な薬物は下記の処置方法の項に記載されている。そのような分子は、適切には、意図された目的に有効な量で組合されて存在する。
【０１９７】
例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに、活性成分を捕捉することもできる。このような技法はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
【０１９８】
持続性放出製剤を調製することができる。持続性放出製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスがあり、このマトリックスは、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続性放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、またはポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に実現される。
【０２００】
Ｖ．  処置
ＭＭＰアンタゴニストで処置することができる多様なガンの例を上記定義の項に挙げる。ＭＭＰアンタゴニストの投与の結果として、ガンの兆候および症状に改善が生じるものである。
【０２０１】
ＭＭＰアンタゴニストは、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与される。
【０２０２】
疾患の予防または処置のためのＭＭＰアンタゴニストの用量は、上に定義されたような処置されるガンの型、ガンの重症度および経過、その抗体が予防目的のために、それとも治療目的のために投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴およびその抗体に対する応答、ならびに担当の医師の判断に依存するものである。
【０２０３】
ＭＭＰアンタゴニストは投与される唯一の抗腫瘍薬でありうるが、場合によっては患者はＭＭＰアンタゴニストと、一つまたは複数の他の抗腫瘍剤との組合せで処置される。組合せ投与には、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いた同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、ＭＭＰアンタゴニストの投与前または投与後に他の抗腫瘍剤を投与することができる。本態様では、ＭＭＰアンタゴニストの少なくとも１回の投与と、その他の抗腫瘍剤の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。または、ＭＭＰアンタゴニストおよび他の抗腫瘍剤は、単一の製剤または別々の製剤の形で患者に同時投与される。ＭＭＰアンタゴニストとその他の抗腫瘍剤との組合せを用いた処置により、患者に対して相乗的な、または相加的よりも大きな治療上の利益が生じうる。
【０２０４】
ＭＭＰアンタゴニストと組合せることができる第２の抗腫瘍剤の例には、一つまたは複数の化学療法剤；ＨＥＲ阻害剤（例えばトラスツズマブ、パーツズマブ、セツキシマブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ７２００、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ＣＰ７２４７１４、ＣＩ１０３３、ＧＷ５７２０１６、ＩＭＣ−１１Ｆ８、ＴＡＫ１６５など）；Ｒａｆ阻害剤および／またはｒａｓ阻害剤（例えばＷＯ２００３／８６４６７参照）；トラスツズマブなどの成長阻害性ＨＥＲ２抗体；パーツズマブなどのＨＥＲ二量体化阻害剤；ＨＥＲ２過剰発現細胞のアポトーシスを誘導する、７Ｃ２、７Ｆ３、またはそのヒト化変異体などのＨＥＲ２抗体；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４などの腫瘍関連抗原に対する抗体；抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤などの抗エストロゲン化合物；（治療に関連する任意の心筋機能障害を予防または低減するための）心保護剤；サイトカイン；ＥＧＦＲターゲット薬（TARCEVA（登録商標）、IRESSA（登録商標）、またはセツキシマブなど）;抗血管形成剤(特にAVASTIN（商標）の商標でGenentechによって販売されているベバシズマブ)；チロシンキナーゼ阻害剤；ＣＯＸ阻害剤（例えばＣＯＸ−１阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤）；非ステロイド系抗炎症薬であるセレコキシブ（CELEBREX（登録商標））；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Johnson and Johnsonから入手できるチピファルニブ（Tipifarnib）／ZARNESTRA（登録商標）Ｒ１１５７７７、またはSchering-Ploughから入手できるロナファルニブ（Lonafarnib）ＳＣＨ６６３３６）；オレゴボマブ（Oregovomab）（ＭｏＡｂ  Ｂ４３．１３）などの、ガン胎児タンパク質ＣＡ１２５と結合する抗体；ＨＥＲ２ワクチン（PharmexiaからのＨＥＲ２ AutoVacワクチン、またはDendreonからのＡＰＣ８０２４タンパク質ワクチン、またはGSK/CorixaからのＨＥＲ２ペプチドワクチン）；ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射液（DOXIL(登録商標)）；トポテカンなどのトポイソメラーゼＩ阻害剤；タキサン；ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６などのＨＥＲ２およびＥＧＦＲの二重チロシンキナーゼ阻害剤；ＴＬＫ２８６（TELCYTA（登録商標））；ＥＭＤ−７２００；アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、またはメペリジンなどの解熱薬；造血成長因子などが挙げられる。
【０２０５】
上記で同時投与された薬剤のうち任意のものについての適切な投薬量は、現在使用されている投薬量であり、その薬剤およびＭＭＰアンタゴニストの組合せ作用（相乗作用）が原因で減量されうる。
【０２０６】
上記の治療方式以外に、ガン細胞の外科的除去および／または放射線療法に患者を供することができる。
【０２０７】
タンパク質ＭＭＰアンタゴニストを患者に投与することの他に、本出願は遺伝子療法によるＭＭＰアンタゴニストの投与を考えている。例えば、１９９６年３月１４日に公開された、細胞内抗体を発生させるための遺伝子療法の使用に関するＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２０８】
（場合によりベクターに含まれる）核酸を患者の細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで到達させるための、二つの主な取組みがある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達については、患者に直接、通常はその抗体が、必要とされる部位に核酸を注射する。ｅｘ  ｖｉｖｏ処置については、患者の細胞が取出され、核酸をこれらの単離された細胞に導入して、改変された細胞をその患者に直接投与するか、または例えば多孔性膜内に封入して、その多孔性膜をその患者に植込む（例えば米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号参照）かのいずれかとする。生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技法がある。これらの技法は、核酸が培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入されるか、または意図された宿主の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで導入されるかに応じて変動する。哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸を移行させるのに適した技法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが挙げられる。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達用に通例使用されているベクターはレトロウイルスである。
【０２０９】
一般に好まれるｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移行技法には、（アデノウイルス、Herpes simplex Iウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの）ウイルスベクターおよび脂質に基づく系を用いたトランスフェクションが挙げられる（遺伝子の脂質介在性移行に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、およびＤＣ−Ｃｈｏｌである）。いくつかの状況では、細胞表面膜タンパク質またはターゲット細胞に特異的な抗体、ターゲット細胞上のレセプターに対するリガンドなどの、ターゲット細胞をターゲティングする薬剤を核酸の供給源に提供することが望ましい。リポソームが採用された場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型に親和性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、サイクリングにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、および細胞内局在をターゲティングして細胞内半減期を延ばすタンパク質を、ターゲティングに、かつ／または取込みを促進するために使用することができる。レセプター介在性エンドサイトーシスの技法は、例えば、Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)；およびWagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。現在公知の遺伝子マーカー作成および遺伝子治療プロトコールの総説については、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３および本明細書に引用された参考文献も参照されたい。
【０２１０】
ＶＩ．材料の寄託
以下のハイブリドーマ細胞系は、American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA（ＡＴＣＣ）に寄託された:
抗体の名称      ＡＴＣＣ番号                    寄託日
７Ｃ２          ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１５      １９９６年１０月１７日
７Ｆ３          ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２２１６      １９９６年１０月１７日
４Ｄ５          ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４６３      １９９０年  ５月２４日
２Ｃ４          ＡＴＣＣ  ＨＢ−１２６９７      １９９９年  ４月  ８日
【０２１１】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例によって例示される。本明細書における全ての引用の開示は、参照により本明細書に特に組み入れられる。
【０２１２】
実施例１
以下の実施例は、ＨＥＲ２のシェディングに果たすマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の役割を検討したものである。
【０２１３】
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
本研究で使用した全ての細胞系は、American Type Tissue Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から得られたものである。１０％熱不活性化ＦＢＳおよび２mM  Ｌ−グルタミンを補充した高グルコースＤＭＥＭ：ＨａｍのＦ１２（５０：５０）中でＢＴ４７４、ＭＣＦ−７、およびＳＫＢＲ−３細胞を維持した。１０％熱不活性化ＦＢＳおよび２mM Ｌ−グルタミンを補充した高グルコースＤＭＥＭ中でＣｏｓ−７細胞を維持した。５％ＣＯ２を供給した加湿インキュベータ中で、細胞系を３７℃で維持した。製造業者の説明書通りにキットＶ（AMAXA（商標））を使用して、ＢＴ４７４細胞およびＳＫＢＲ−３細胞に、記載された構築物をエレクトロポレーションにより一過性トランスフェクションした。製造業者の推奨通りにＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Invitrogen）を使用して、記載されたようにＣｏｓ−７細胞にトランスフェクションを行った。
【０２１４】
Ｆｏ５およびｆ２：１２８２マウス異種移植腫瘍系
Ｆｏ５系およびＦ２：１２８２系は以前に記載されている（Finkle et al., Clin. Cancer Res. 10:2499-2511 (2004)）。ＭＭＴＶ  ＨＥＲ２トランスジェニックマウス由来の初代腫瘍からこれらの系を得て、これらの系をＦＶＢマウスの乳腺脂肪体中で継代した。
【０２１５】
ＧＭ６００１の注射
Ｆｏ５腫瘍をＦＶＢマウスに移植し、平均サイズ４００〜６００mm3に成長させてから研究を開始した。ＧＭ６００１（  ３−［Ｎ−ヒドロキシカルボミル］−［２Ｒ］−イソブチルプロピオニル−Ｌ−トリプトファンメチルアミド）をCalbiochemから入手し、４％カルボキシメチルセルロース／０．９％ＰＢＳのスラリー中で再構成し、１００mg/kg体重で３日間腹腔内注射することにより毎日投与した。３日目の注射の２４時間後に動物を屠殺し、心穿刺により血清を収集した。０日目および４日目に腫瘍のサイズを測定した。腫瘍を除去し、さらに分析するために急速冷凍した。
【０２１６】
ＲＮＡの調製およびＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（商標）アレイ
ＲＮＡＥＡＳＹ（商標）キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を用いて、急速冷凍された腫瘍試料から総ＲＮＡを単離した。残留したゲノムＤＮＡをＤＮＡｓｅ  Ｉ処理（Roche Molecular Biochemicals）により除去した。マイクロアレイ実験を行い、以前に記載されたように解析した（Jin, H et al., Circulation 103:736-742 (2001)）。試料をＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（商標）マウスゲノム単一アレイ（ＭＯＥ４３０Ｐ）および公知の遺伝子アレイ（ＭＯＥ４３０Ａ）（AFFYMETRIX（商標）, Inc., Santa Clara, CA）にハイブリダイゼーションした。Ｆｏ５腫瘍試料３個およびＦ２：１２８２腫瘍試料３個について実験を３回の繰り返しで行った。対応のあるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの比較を行い、８０％を超える一致率で、発現の２倍の増大を有する遺伝子を有意とみなした。細胞系および組織のＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（商標）マイクロアレイ解析からの遺伝子発現データのコレクションであるＧｅｎｅＬｏｇｉｃ  Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（GeneLogic, Gaithersburg, MD）を使用して、ＳＫＢＲ−３細胞系およびＢＴ４７４細胞系での発現についてＦｏ５−ｆ２：１２８２腫瘍分別スクリーニングから同定されたプロテアーゼの発現を検討した。
【０２１７】
ＨＥＲ２  ＥＣＤのＥＬＩＳＡ
Ｆｏ５またはｆ２：１２８２異種移植腫瘍を有するマウス由来の血清を心穿刺により収集し、以前に記載されたＨＥＲ２  ＥＬＩＳＡを使用してＨＥＲ２  ＥＣＤレベルを検出した（Finkle et al. Clin. Cancer Res. 10:2499-2511 (2004)）。アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％TWEEN（登録商標）２０、１０ppm PROCLIN（登録商標）３００、０．２％  ＢＢＧ、０．２５％  ＣＨＡＰＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））を使用して血清を１：５０に希釈し、続いて追加的に１：２の段階希釈を行った。ＮＵＮＣ（登録商標）Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上でヤギ抗ＨＥＲ２ポリクローナル抗体（Genentech）を用いて、シェディングされたＨＥＲ２を捕捉し、ビオチンとコンジュゲーションしたウサギ抗ＨＥＲ２ポリクローナル抗体（Genentech）に続いてＡＭＤＥＸ（商標）−ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して、以前に記載された手順通りにそれを検出した（Sias et al., J. Immunol. Meth. 109:219-27 (1990)）。細胞培養実験については、示されたように細胞を処理して、順化培地を収集し、アッセイ緩衝液で１：２の段階希釈を行った。標準物質として精製リコンビナントＨＥＲ２  ＥＣＤタンパク質（Genentech）を使用して、標準曲線の４変数フィッティングにより、血清中または順化培地中のシェディングされたＨＥＲ２の濃度を決定した。
【０２１８】
ＤＮＡ構築物およびタンパク質の精製
テンプレートとして本来のクローンを使用したＰＣＲにより、ヒトＭＭＰ−１５をｐＲＫ５にクローニングした。以下のプライマーを使用したＰＣＲにより、Ｃ末端にＶ５Ｈｉｓタグを付けた完全長版を発生させ、それをｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５Ｈｉｓにクローニングした。
【０２１９】
【表２】
2008530123.tif 000003
【０２２０】
以下のプライマーを使用したＰＣＲにより、膜貫通ドメインを欠如した可溶性版のＭＭＰ−１５を発生させた。
【０２２１】
【表３】
2008530123.tif 000004
【０２２２】
部位特異的突然変異誘発により成熟タンパク質のアミノ酸２６０のグルタミンをアラニン残基に置換することによって、ＭＭＰ−１５の触媒機能喪失（catalytically dead）突然変異体を発生させた。
【０２２３】
以下のプライマーを使用したＰＣＲにより、ｐＲＫ５．ｇＤＨＥＲ２−Ｆｃ（ｐＲＫ５．ｇＤＨＥＲ２−ＩｇＧ）を発生させ、ＸｈｏＩ−Ｍｌｕで消化したｐＲＫ５．ｇＤＨＥＲ２−Ｆｃにそれをクローニングした（Fitzpatrick et. al., FEBBS Lett. 431(1):102-6 (1998)）。
【０２２４】
【表４】
2008530123.tif 000005
【０２２５】
これにより、ＨＥＲ２の推定上の切断部位が導入された。その切断部位は、ＳＫＢＲ−３順化培地から単離された精製ＨＥＲ２  ＥＣＤから同定されたものである（Yuan et al, Protein Expression and Purification 29:217-222 (2003)）。
【０２２６】
以下のＰＣＲプライマーを使用して、ＨＥＲ２のドメインＩＶだけを含む切り詰め版のｇＤＨＥＲ２−Ｆｃも発生させた。
【０２２７】
【表５】
2008530123.tif 000006
【０２２８】
pRK5.HER3-FcおよびpRK5.HER4-Fcは以前に記載されている（Fitzpatrick et al., FEBBS Lett. 431(1):102-6 (1998)）。ＦＬＡＧエピトープ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１７））をｐＲＫ５のＮ末端に導入した。ＨＥＲ−Ｆｃ融合タンパク質を２９３細胞にトランスフェクションし、以前に記載された通りに無血清順化培地からその融合タンパク質を精製した（Fitzpatrick et. al., FEBBS Lett, 431(1):102-6 (1998)）。可溶性ＭＭＰ−１５Ｖ５ＨｉｓおよびｓＭＭＰ−１５Ｖ５Ｈｉｓ（Ｅ２６０Ａ）タンパク質を、一過性トランスフェクションした２９３細胞の順化培地から発生させ、製造業者（Qiagen）の推奨通りにＮｉ−ＮＴＡアガロースを使用してそれを精製した。
【０２２９】
ｓｈＲＮＡによるＭＭＰ−１５のノックダウン
細胞に導入した場合にＭＭＰ−１５タンパク質レベルを低減する能力について、いくつかの異なるｓｈＲＮＡを評価した。ヒトＭＭＰ−１５に対する最も有効なｓｈＲＮＡは、ｎｔ１３９６〜１４１４（GENBANK（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００２４２８）に対応するｂｐである
【０２３０】
【表６】
2008530123.tif 000007
【０２３１】
を認識することが見出された。ＭＭＰ−１５に対するＲＮＡｉを、ｓｈＲＮＡを形成するための内部ヘアピンを含むオリゴである
【０２３２】
【表７】
2008530123.tif 000008
【０２３３】
として、ｐＳＩＲＥＮベクター（BD Biosciences）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に導入した。ＭＭＰ−２５に対するｓｈＲＮＡをＯＰＥＮＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（商標）から購入した。製造業者の推奨通りにＡＭＡＸＡ（商標）キットＶを使用して、ＳＫＢＲ−３細胞およびＢＴ４７４細胞にｐＳＩＲＥＮ  ｓｈＲＮＡ構築物またはベクター単独を一過性トランスフェクションした。４８時間後に順化培地を収集し、ＨＥＲ２  ＥＬＩＳＡにより、シェディングされたＨＥＲ２についてアッセイし、２×試料緩衝液を使用してプレート上で直接細胞を溶解させた。ウサギ抗ＭＭＰ−１５ポリクローナル抗体（Labvisionカタログ番号ＲＢ−１５４６−Ｐ）またはマウス抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体Ａｂ−１５（Labvision、カタログ番号ＭＳ−５９９−Ｐ０）を使用したウエスタンブロットにより、ＭＭＰ−１５、完全長ＨＥＲ２、およびｐ９５  ＨＥＲ２タンパク質を検出した。
【０２３４】
ＨＥＲ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
基質として精製ｇＤＨＥＲ２−Ｆｃ融合タンパク質を使用して、候補となるプロテアーゼがＨＥＲ２  ＥＣＤを切断する能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定した。ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）、ＭＴ２−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１５）、ＭＴ３−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１６）、ＭＴ４−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１９）、およびＭＴ５−ＭＭＰ（ＭＭＰ−２５）の精製された触媒ドメインをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。記載されたようにアッセイ緩衝液（１００mMトリス（ｐＨ＝７．４）、１００mM  ＮａＣｌ、２．５μM  ＺｎＣｌ２、１０mM  ＣａＣｌ２、０．００１％Ｂｒｉｊ３５）中で精製ＭＭＰタンパク質をｇＤＨＥＲ２−Ｆｃまたは他のＨＥＲ−Ｆｃタンパク質と酵素：基質が１：１００の比になるように混合し、３７℃で２０分間インキュベーションした。等量の２×試料緩衝液（Invitrogen）を使用して反応を停止させ、５分間煮沸してから４〜２０％のトリス−グリシン勾配ゲル（Invitrogen）にロードした。製造業者の推奨通りにＧＥＬ  ＣＯＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）染色試薬（Pierceカタログ番号２４５９２）で染色することによりタンパク質を可視化した。自動タンパク質シーケンサを使用した自動エドマン分解によるタンパク質Ｎ末端配列決定によりＭＭＰの切断部位を決定した（Kishiyama, A., Anal. Chem. 72(21):5431-6 (2000)）。
【０２３５】
免疫沈降アッセイおよびウエスタンブロット
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００を使用して、ｐＲＫ５．Ｆｌａｇ−ＨＥＲ２構築物およびｐｃＤＮＡ３．ＭＭＰ−１５構築物、またはｐｃＤＮＡ３．１ベクター単独をＣｏｓ−７細胞に同時トランスフェクションした。細胞を４８時間回復させた。トランスフェクションされた細胞をＰＢＳで洗い、溶解緩衝液（１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標）、５０mMトリス（ｐＨ＝７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、１mM  ＰＭＳＦ、１０μg/mlロイペプチン、１０U/mlアプロチニン、および２mM  Ｎａ２ＶＯ４）中で細胞を破裂させた。遠心分離により溶解液から不溶性物質を除き、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierceカタログ番号２３２２９）を使用して総タンパク質レベルを決定した。細胞総タンパク質２００μgを溶解緩衝液に加えて終容積１mlとして、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２−アガロース（Sigma）を使用して、またはプロテインＡ／Ｇアガロースと複合体を形成した抗ＭＭＰ−１５ポリクローナル抗体を用いて、Ｆｌａｇ−ＨＥＲ２を免疫沈降させた。免疫複合体を溶解緩衝液で２回洗い、ＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁して煮沸した。試料を４〜１２％トリス−グリシン勾配ゲル（Invitrogen）で分離させ、ニトロセルロース膜に移行させた。ブロットを５％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中でブロッキングし、ＭＭＰ−１５またはＨＥＲ２いずれかに対する抗体に続いて、記載されたようにペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体を用いて探査した。強化化学ルミネセンスによりブロットを発色させた（ＥＣＬ、Amersham Pharmacia Biotech）。
【０２３６】
プロテアーゼ阻害剤と共にＦｏ５腫瘍およびｆ２：１２８２腫瘍を溶解緩衝液中に再懸濁し、氷上でＰＯＬＹＴＲＯＮ  ＴＩＳＳＵＥＭＩＺＥＲ（商標）（ＰＴ２１００）を使用して均質化した。遠心分離により、腫瘍溶解液から不溶性物質を除き、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して総タンパク質レベルを決定した。プロテインＡ／Ｇセファロースと複合体を形成したマウスモノクローナル抗体Ａｂ−１５（Labvision, カタログ番号ＭＳ−５９９−Ｐ０）を使用して、少なくとも三つの独立した腫瘍溶解液由来の総タンパク質１ｍｇから４℃で一晩ＨＥＲ２を免疫沈降させた。遠心分離により複合体をペレットにして、溶解緩衝液で２回洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁して煮沸した。４〜１２％トリス−グリシンゲルで試料を分離し、ニトロセルロース膜に移行させた。リン酸化ＨＥＲ２を検出するためのマウスモノクローナル抗体Ａｂ−１８（Labvisionカタログ番号ＭＳ−１０７２−Ｐ）、またはＡｂ−１５（Labvsion カタログ番号ＭＳ−５９９−Ｐ０）でブロットを探査した。ＭＭＰ−１４を検出するためのウサギポリクローナルＡｂ−１（Labvisionカタログ番号ＲＢ−１５４４−Ｐ）、ＭＭＰ−１５を検出するためのウサギポリクローナルＡｂ−１（Labvision カタログ番号ＲＢ−１５４６−Ｐ）、またはＭＭＰ−２５を検出するためのウサギポリクローナルＡｂ−１（Oncogene Research Productsカタログ番号ＰＣ４９９）を使用して、腫瘍溶解液５０ugから、またはＢＴ４７４もしくはＭＣＦ−７もしくはＳＫＢＲ−３細胞溶解液からの５０ugから、ウエスタンブロットによりＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、およびＭＭＰ−２５の発現を評価した。
【０２３７】
細胞溶解液５０μgのウエスタンブロットにより、活性化ＭＡＰＫ（Cell Signaling Technology カタログ番号９１０１）、ホスホＡｋｔ  Ｓｅｒ４７３（Cell Signaling Technologyカタログ番号９２７１）、総Ａｋｔ（Cell Signaling Technologyカタログ番号９２７２）、総Ｅｒｋ（Cell Signaling Technologyカタログ番号９１０２）、ホスホＨＥＲ３（Cell Signaling Technologyカタログ番号４７９１）を決定した。
【０２３８】
増殖アッセイ
４回の繰り返しで、ウェル１個あたり１０４細胞の密度で９６ウェルの皿（Nunc）に細胞を蒔き、一晩接着させた。示されたように細胞を処理するか、または示されたようにトランスフェクションを行った。３日間のインキュベーション後に、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Trek Diagnostic Systems、カタログ番号００−１００）２５μlを各ウェルに加え、追加的に３時間インキュベーションした。励起波長５３０nmおよび発光波長５９０nmで製造業者の推奨通りに蛍光計でプレートを読み取った。以前に記載されたように、トランスフェクションされた未刺激細胞または対照細胞に比べた増殖を決定した（Lewis et al., Cancer Res. 56(6):1457-65 (1996)）。
【０２３９】
結果
ＨＥＲ２のＥＣＤは培養した乳ガン細胞からタンパク質分解的にシェディングされ、転移性乳ガンを有する患者の血清中に検出された。この場合、ＨＥＲ２のＥＣＤは臨床的予後不良と関連している（Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749 (2001)）。しかし、ＨＥＲ２のシェディングの生物学的役割ははっきりしない。本明細書における実験は、ＨＥＲ２シェダーゼを同定するために実施された。
【０２４０】
トラスツズマブが以前に乳ガン細胞系におけるシェディングを阻害することが実証されたことから、ＨＥＲ２シェダーゼの同定も重要でありうる（Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749 (2001)）。以前に報告された結果と一致して、トラスツズマブは、乳ガン細胞系ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ−３細胞におけるシェディングを、濃度１０μg/mlで６０％を超えて低減し（図５、左欄）、これらの細胞系における細胞増殖を５０％低減した（図５、右欄）。
【０２４１】
乳腺腫瘍がＭＭＴＶＨＥＲ２トランスジェニックマウスに由来する動物モデル系（Finkle et al. Clin. Cancer Res. 10:2499-2511 (2004)）を使用して、ＨＥＲ２シェダーゼを同定した。この動物モデル系は、血清中に異なるレベルのＨＥＲ２を繰り返しシェディングし、トラスツズマブに対して感受性の差を示す（図６、右欄）。血清ＨＥＲ２レベルにおけるこの差は、３つの独立したＦｏ５腫瘍細胞溶解液から免疫沈降したタンパク質フラグメントの存在ともよく相関し、そのフラグメントはｐ９５  ＨＥＲ２のサイズと一致するみかけの分子量９５kDを有する（図６、左下欄）。このフラグメントはＦｏ５腫瘍細胞溶解液中で構成的にリン酸化され、このフラグメントはこれらの腫瘍において生物学的活性を有しうることを示している。増大したレベルのＨＥＲシェダーゼは、この細胞系のトラスツズマブ耐性に貢献するおそれがある。それは、トラスツズマブのエピトープがタンパク質分解性切断により失われると思われるからである（Cho et al. Nature 421:756-760 (2003)）。
【０２４２】
Ｆｏ５腫瘍系がさらに高レベルのＨＥＲ２をシェディングし、高レベルのｐ９５  ＨＥＲ２フラグメントを有することから、ｆ２：１２８２腫瘍に比べてＦｏ５腫瘍でアップレギュレーションされる転写物を同定するための取組みとして、発現差の分析を使用した。平均腫瘍サイズ３００〜６００mm3のＦｏ５腫瘍またはｆ２：１２８２腫瘍のいずれか由来の三つの個別の腫瘍試料からＲＮＡを調製した。独立した腫瘍試料それぞれに由来するＲＮＡを３回の繰り返しでＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（商標）マウスゲノム単一アレイチップ（ＭＯＥ４３０Ｐ）および公知の遺伝子アレイ（ＭＯＥ４３０Ａ）にハイブリダイゼーションさせた。対応のあるＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ比較を行い、Ｆｏ５腫瘍試料でアップレギュレーションされた６３８個の転写物を同定した。ＢＴ４７４細胞系およびＳＫＢＲ−３細胞系もまた順化培地中にＨＥＲ２  ＥＣＤをシェディングすることから（図５、左欄）、Ｇｅｎｅｌｏｇｉｃ  Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓデータベースを使用して、このリストを両細胞系で発現している転写物と比較した。ＨＥＲ２シェダーゼを同定するために採用された取組みを図７に示す。
【０２４３】
候補遺伝子数を絞り込むために、一般的なメタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１を使用して、ＭＭＰ活性がＨＥＲ２のシェディング調節に役割を果たすかどうかを評価した。ＨＥＲ２  ＥＣＤのＥＬＩＳＡにより決定したとき、ＳＫＢＲ−３細胞においてＧＭ６００１の立体異性体ではなくＧＭ６００１は、用量依存的にＨＥＲ２のシェディングを阻害した（図８左欄）。この結果は、乳ガン細胞系において一般メタロプロテアーゼ阻害剤ＢＢ−９４がＨＥＲ  ＥＣＤのシェディングを阻害したという、以前に公表された報告と一致するものである（Codony-Servat et al. Cancer Res. 59:1196-1201 (1999)）。Ｔｉｍｐ−１、Ｔｉｍｐ−２、およびＴｉｍｐ−３はメタロプロテアーゼ活性を調節する天然ペプチドである（Overall and Lopez-Otin Nature Reviews Cancer 2:657-672 (2002)）。精製Ｔｉｍｐ−１、Ｔｉｍｐ−２、またはＴｉｍｐ−３を濃度１μg/mlでＳＫＢＲ−３細胞の順化培地に加えると、ＨＥＲ２ ＥＣＤレベルが低減した（図８、右欄）。しかし、Ｔｉｍｐ−２は最も効率的にＨＥＲ２ ＥＣＤのシェディングを低減した（図８、右欄）。Ｔｉｍｐ−２はＭＴ−ＭＭＰサブファミリーのメタロプロテアーゼを効率的に阻害することが知られている（Overall and Lopez-Otin Nature Reviews Cancer 2:657-672 (2002)）。これらのデータは、ＳＫＢＲ−３細胞およびＢＴ４７４細胞においてＨＥＲ２のシェディングを担うプロテアーゼがメタロプロテアーゼであることを示唆し、生物情報学によるスクリーニングから同定された候補の数を有意に減らした。
【０２４４】
ＧＥＮＥＬＯＧＩＣ（商標）データベースに基づくと、ＳＫＢＲ−３細胞およびＢＴ４７４細胞にＭＴ−ＭＭＰファミリーのメンバーがいくつか発現している。ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ（商標）マイクロアレイのデータから、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ２−ＭＭＰの両方がＦｏ５腫瘍にも発現している。これらの転写物が発現しているかどうかを決定するために、ヒトタンパク質およびマウスタンパク質の両方を認識する、これらのＭＴ−ＭＭＰに対するポリクローナル抗体を用いて、Ｆｏ５およびｆ２：１２８２腫瘍ならびに乳ガン細胞系の溶解液の免疫ブロットを行った（図９）。これらの細胞系は全て、異なるレベルでＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、およびＭＭＰ−２５を発現している。ｆ２：１２８２およびＦｏ５腫瘍細胞溶解液の両方にＭＭＰ−１４は発現しているが、ＭＭＰ−１５はＦｏ５腫瘍溶解液に豊富に発現している。この結果は、Ｆｏ５腫瘍の方が２倍高いＭＭＰ−１５のｍＲＮＡ発現レベルを示したＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ比較と一致した。ＭＭＰ−１５が周囲のストローマ細胞ではなく腫瘍の上皮細胞に発現していたことを立証するために、Ｆｏ５腫瘍およびｆ２：１２８２腫瘍の切片を作り、抗ＨＥＲ２抗体（Dako）または抗ＭＭＰ−１５抗体（Ａｂ−１）のいずれかで染色した。ｆ２：１２８２腫瘍およびＦｏ５腫瘍の両方がヒトＨＥＲ２を発現しているが、ＭＭＰ−１５はｆ２：１２８２腫瘍よりもＦｏ５腫瘍で豊富に発現している。
【０２４５】
ＭＴ−ＭＭＰのメンバーについての基質は従来、細胞外マトリックスタンパク質であると考えられてきた。完全長ＨＥＲ２をｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断するマイクロアレイデータから同定された候補を試験するために生化学アッセイを組立てた。このアッセイは、候補プロテアーゼについての基質として精製されたリコンビナント融合タンパク質を使用し、ヒトＩｇＧのＦｃ重鎖と同じフレーム内の、Ｎ末端にｇＤエピトープのタグを付けたＨＥＲ２  ＥＣＤからなる。これらの研究でいくつかの異なるタンパク質を使用した。ｇＤＨＥＲ２（＋）−ＩｇＧはＨＥＲ２  ＥＣＤのアミノ酸２〜６５６を含み（GenBankアクセッション番号ＡＡＡ７５４９３）ｇＤＨＥＲ２（−）−ＩｇＧはＨＥＲ２  ＥＣＤのアミノ酸２〜６２６を含む。ｇＤＨＥＲ２（＋）−ＩｇＧリコンビナントタンパク質は、推定上のＨＥＲ２シェダーゼ部位を含むことが以前に示された膜近傍配列（ＰＡ／ＥＱＲ／ＡＳＰ；配列番号２３）を含み、ｇＤＨＥＲ２（−）−ＩｇＧタンパク質はこの配列を欠如している（Yuan et al. Protein Expression and Purification 29:217-222 (2003)）。切り詰め版のｇＤＨＥＲ２（＋）−ＩｇＧであるｇＤＨＥＲ２（ＤＩＶ）−ＩｇＧもこのアッセイに使用したが、これはヒトＦｃと同じフレーム内にＨＥＲ２のドメインＩＶ（ＤＩＶ）のみを有する。ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２５の精製触媒ドメインをｇＤＨＥＲ２（ＤＩＶ）−ＩｇＧと共に３７℃で２０分間インキュベーションした。ＭＭＰ−１４以外の全てのＭＴ−ＭＭＰはｇＤＨＥＲ２（ＤＩＶ）−ＩｇＧ基質を効率的に切断した（図１３、左欄）。切断されたタンパク質産物を切り出し、Ｎ末端の配列決定を行って切断部位を同定した。四つのＭＴ−ＭＭＰ全ては公表された配列部位近くでＨＥＲ２を切断した（Yuan et al. Protein Expression and Purification 29:217-222 (2003)）（図１３、右欄）。
【０２４６】
配列ＰＩＮＣＴＨＳＣＶＤＬＤＤＫＧＣＰＡＥＱＲＡＳＰＡＳＰＬＴＳＩＶ（配列番号２１）を有するＨＥＲ２−Ｆｃ融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの四つのＭＭＰについての基質である（図１４）。このデータは、ＨＥＲ２がＭＭＰ−１５についての基質であることを示唆している。
【０２４７】
ＭＴ−ＭＭＰの基質認識はヘモペキシンドメインにより影響されうる（Overall and Lopez-Otin Nature Reviews Cancer 2:657-672 (2002)）。Ｃ末端にＶ５  Ｈｉｓエピトープを有する可溶性形態のＭＭＰ−１５を２９３細胞に一過性発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより２９３の順化培地から精製した。図１５に示すように、この可溶性形態のＭＭＰ−１５はｉｎ  ｖｉｔｒｏシェダーゼアッセイでｇＤＨＥＲ２（＋）−ＩｇＧも切断することができる。
【０２４８】
ＭＭＰ−１５およびＨＥＲ２が膜に関連することができるかどうかを決定するために、一過性トランスフェクションされたＣｏｓ−７細胞を使用して免疫共沈アッセイを行った。ｐＲＫ５．ＦｌａｇＨＥＲ２にｐｃＤＮＡ３．ＭＭＰ−１５Ｖ５Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．ｓＭＭＰ−１５Ｖ５Ｈｉｓ、またはｐｃＤＮＡ３．ＭＭＰ−１５（Ｅ２６０Ａ）のいずれかのベクターを同時トランスフェクションした。抗ＦＬＡＧ樹脂を用いてＦｌａｇＨＥＲ２を免疫沈降させた。図１０に、可溶性ＭＭＰ−１５および触媒機能喪失（Ｅ２６０Ａ）突然変異体の両方がＦｌａｇ−ＨＥＲ２と関連することができることを示す。野生型版のプロテアーゼであるｐｃＤＮＡ３．ＭＭＰ−１５Ｖ５ＨｉｓがＦｌａｇＨＥＲ２  ＥＣＤを除去すると思われ、ＨＥＲ２−ＭＭＰ−１５複合体は免疫共沈しないと思われることから、これは、ＭＭＰ−１５が膜中のＨＥＲ２を切断することができるという見解と一致する。
【０２４９】
ＭＭＴＶＨＥＲ２トランスジェニック動物由来の乳腺腫瘍において体細胞点突然変異および欠失変異体およびスプライス変異体が同定されている（Siegel et al. EMBO J. 18:2149-2164 (1999));およびFinkle et al. Clin. Cancer Res. 10:2499-2511 (2004)）。これらの突然変異は、膜貫通ドメイン近くのＨＥＲ２細胞外ドメインで起こることが最も多い。Ｆｏ５腫瘍系は、ＨＥＲ２切断部位に隣接したアミノ酸５個ＤＬＤＤＫ（配列番号２２）の欠失を有し、一方でｆ２：１２８２腫瘍系はＲからＣへのただ一つの点突然変異（図１２）を有する。これらの突然変異は、ＭＭＰ−１５の関連に影響しない（図１１）。しかし、ＨＥＲ２  ＭＭＰ切断部位にＤＬＤＤＫ（配列番号２２）の欠失が近接していることは、このプロテアーゼの酵素活性に影響しうる可能性がある。
【０２５０】
ＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）は、ターゲットの転写レベルおよびタンパク質レベルをダウンレギュレーションすることができる方法である。ＳＫＢＲ−３細胞およびＢＴ４７４細胞におけるＭＭＰ−１５の生物学的役割を検討するために、抗ＭＭＰ−１５  ＲＮＡｉ構築物を使用した。ＳＫＢＲ−３細胞またはＢＴ４７４細胞に導入したとき、このｓｈＲＮＡｉの発現プラスミドは、両細胞系でのＭＭＰ−１５の内因性タンパク質レベルを低減した（図１７、左上欄）。このｓｈＲＮＡのトランスフェクションにより、両細胞系におけるｐ９５  ＨＥＲの量も低減した（図１７、左下欄）。これらの細胞からＭＭＰ−１５タンパク質が欠失すると、両細胞系でＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディングが有意に低減した（図１７、右欄）。しかし、ＭＭＰ−２５に対するｓｈＲＮＡｉをどちらの細胞系に導入したときも、ＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディングに有意な低減は観察されなかった（図１７、右欄）。これらの実験は、ＭＭＰ−１５の欠失がＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディングに劇的に作用することを強く示唆している。
【０２５１】
ＲＮＡｉによりＭＭＰ−１５タンパク質レベルを低減することは、ＳＫＢＲ−３細胞およびＢＴ４７４細胞の成長速度にも作用を有する（図１８、左欄）。この作用は、ＭＭＰ−２５に対するｓｈＲＮＡｉによっても再現される。これは、ＢＴ４７４細胞およびＳＫＢＲ−３細胞においてＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディングの低減がｐ９５  ＨＥＲ２の量をダウンレギュレーションすることによって、細胞成長速度を低減することも示唆している。ｇＤのタグを付けたｐ９５ＨＥＲ２構築物をこれらの細胞系に導入すると、両方の細胞型において、トランスフェクションされた対照細胞に比べて細胞成長速度の増加が検出された（図１８、左欄）。リガンド非依存的にＣｏｓ−７細胞にこの構築物を導入すると、この構築物は構成的にリン酸化され、ＭＡＰＫを活性化する（図１６）。しかし、この構築物は、以前に公表された研究と一致してＡｋｔシグナル伝達経路を活性化するためにはなおＨＥＲ３またはＥＧＦＲとヘテロ二量体化しなければならない（Xia et al. Oncogene 23:646-653 (2004)）。ＳＫＢＲ−３細胞でのｇＤｐ９５ＨＥＲ２の過剰発現は、これらの細胞においてトラスツズマブ介在性成長阻害を有意には阻害しなかった（図１８、右欄）。
【０２５２】
ＭＭＰ活性がＦｏ５腫瘍におけるＨＥＲ２のシェディングおよびｐ９５  ＨＥＲ２レベルの調節に役割を果たすかどうかを決定するために薬理学的取組みを使用した。平均サイズ４００〜６００ｍｍ３のＦｏ５腫瘍を有するＦＶＢマウスの腹腔内にＧＭ６００１または対照ビヒクルを３日のクールにわたり毎日注射した。４日目に血清を収集し、ＥＬＩＳＡによりＨＥＲ２  ＥＣＤについてアッセイし、腫瘍を収集し重量を測定した。ＨＥＲ２を腫瘍細胞溶解液から免疫沈降させ、ウエスタンブロットによりｐ９５  ＨＥＲ２レベルについてアッセイした。ＧＭ６００１で処置した動物は、対照動物に比べてｐ９５  ＨＥＲ２の量に有意な低減を示した（図１９、右欄）。血清ＨＥＲ２  ＥＣＤレベルは、ビヒクル処置動物およびＧＭ６００１処置動物の両方で低減した（図１９、左欄）が、ＧＭ６００１処置動物ではより大きい低減が観察された。
【０２５３】
概要
上記実験は、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ−１５が、シェディングされたＥＣＤをＳＫＢＲ３細胞から精製したものと一致する部位でｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＲ２を切断し、かつ完全長ＨＥＲ２と相互作用することを実証している。このＭＭＰレベルの低減は、レセプターＨＥＲ２のシェディングの低減とよく相関し、ＳＫＢＲ３細胞系およびＢＴ４７４細胞系において増殖の基礎レベルを減少させる。トラスツズマブは、間接的にＭＭＰ−１５活性を調節することによりレセプターＨＥＲ２のシェディングを阻害するようであるが、基質の結合および切断についてＭＭＰ−１５と競合しない。ＭＭＰ−１５アンタゴニストなどのＭＭＰアンタゴニストを用いてＨＥＲ２のシェディングを低減することは、トラスツズマブ耐性ガンを含むガンを処置するための治療的取組みとなる。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】完全長ＨＥＲ２タンパク質の構造の概略図およびその細胞外ドメインのドメインＩ〜ＩＶについてのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１〜４）を示す図である。
【図２Ａ】トラスツズマブの軽鎖（配列番号５）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２Ｂ】トラスツズマブの重鎖（配列番号６）のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ】パーツズマブの軽鎖（配列番号７）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖の分子量の計算値は２３５２６．２２Daである（システインは還元型）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図３Ｂ】パーツズマブの重鎖（配列番号８）のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。重鎖の分子量の計算値は４９２１６．５６Daである（システインは還元型）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図４】ＨＥＲシグナル伝達ネットワークを示す図である。
【図５】ＨＥＲ２を過剰発現していない乳ガン細胞系（ＭＣＦ−７）と比べた、トラスツズマブによる、過剰発現している乳ガン細胞系（ＳＫＢＲ３、ＭＴ４７４）からのＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディング阻害を示す図である。
【図６】ＭＭＴＶＨＥＲ２トランスジェニック腫瘍（トラスツズマブ感受性ｆ２：１２８２腫瘍およびトラスツズマブ耐性Ｆｏ５腫瘍）におけるｐ９５  ＨＥＲ２レベルおよびシェディングされたＨＥＲ２  ＥＣＤレベルの差を示す図である。
【図７】ＨＥＲ２シェダーゼを同定するために使用された戦略を示す図である。
【図８】シェダーゼがメタロプロテアーゼの性質を有することを実証した実験を示す図である。
【図９】ＭＭＴＶ−ＨＥＲ２腫瘍および細胞系におけるＭＭＰの発現を示す図である。ＭＭＰ−１５はトラスツズマブ感受性であるｆ２：１２８２腫瘍と、トラスツズマブ耐性であるＦｏ５腫瘍との間の差を説明するための候補である。
【図１０】ｆｌａｇ−ＨＥＲ２およびＭＭＰ−１５の間の相互作用を表す図である。
【図１１】ｆｌａｇＨＥＲ２−ｆ２：１２８２とＭＭＰ−１５、およびｆｌａｇＨＥＲ２−Ｆｏ５とＭＭＰ−１５の相互作用を示す図である。ｆ２：１２８２とＦｏ５との間の差は、ＭＭＰ−１５への突然変異体の結合の差により説明することはできない。
【図１２】ＭＭＴＶＨＥＲ２トランスジェニックマウスにおいて見出された体細胞突然変異を示す図である。その配列は、シェダーゼ部位（配列番号２３）、野生型（ＷＴ）（配列番号２４）、スプライス（配列番号２５）、Ｆｏ５（配列番号２６）、およびｆ２：３０７８．１０（配列番号２７）である。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏシェダーゼアッセイの結果を示す図である。ｇＤＨＥＲ２９（ＤＩＶ）−ＩｇＧはＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２５の触媒ドメインについての基質である。ＭＭＰ−１５（配列番号２８）、ＭＭＰ−１６（配列番号２９）、ＭＭＰ−１９（配列番号３０）、ＭＭＰ−２５（配列番号３１）、および他の全て（配列番号３２）のプロテアーゼ消化物の配列；ならびにＨＥＲ２  ＥＣＤのＣ末端部位についての配列（配列番号３３）である。
【図１４】ＭＭＰ−１５が他のレセプターＨＥＲを短縮しないことを実証している実験結果を示す図である。ＨＥＲ２（配列番号３４）、ＥＧＦＲ（配列番号３５）、ＨＥＲ３（配列番号３６）、ＨＥＲ４（Ｊｍａ）（配列番号３７）、およびＨＥＲ４（Ｊｍｂ）（配列番号３８）の配列は、膜貫通ドメイン近くに配列変動を示している。
【図１５】ＭＭＰ−１５「完全長」がＨＥＲ２（＋）−ＩｇＧを短縮することを示す図である。
【図１６】ｐ９５  ＨＥＲ２が構成的にリン酸化されるが、Ａｋｔを活性化するにはＨＥＲ３とヘテロ二量体化しなければならないことを示した実験を示す図である。
【図１７】ＭＭＰ−１５  ＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）がＳＫＢＲ３細胞およびＢＴ４７４細胞におけるＨＥＲ２  ＥＣＤのシェディングおよびｐ９５  ＨＥＲ２レベルを低減することを示す図である。
【図１８】ＳＫＢＲ３細胞におけるトラスツズマブ介在性成長阻害がＨＥＲ２のシェディング阻害にどの程度依存しないかを示す図である。
【図１９】Ｆｏ５異種移植腫瘍におけるメタロプロテアーゼ活性の阻害がＨＥＲ２のシェディングを低減し、ｐ９５  ＨＥＲ２レベルを阻害することを示す図である。
【図２０】マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのメンバーを示す図である。ＭＭＰファミリーのメンバーをドメイン構造により群分けする。本図で使用した略号は以下の通りである：ＰＲＥ；プレドメイン、ＰＲＯ；プロドメイン、ＣＡＴ；触媒ドメイン、Ｈ；ヒンジ、ＨＥＭ；ヘモペキシンドメイン、Ｆ；フューリン切断コンセンサスドメイン、ＦＮ；フィブロネクチン様ドメイン、ＧＰＩ；グリコホスファチジルイノシトールアンカー、ＴＭ；膜貫通ドメイン、Ｉｇ；免疫グロブリン様ドメイン、ＣＡ；システインアレイ、ＣＬ；コラーゲン様ドメイン。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008530123.tif 000031
2008530123.tif 000032
2008530123.tif 000033
2008530123.tif 000034