(57)【要約】本発明は、骨髄幹細胞を分化培地の存在下で培養することによる、ヒト成体骨髄幹細胞由来の網膜特異的細胞の産生に関する。本発明はまた、網膜特異的細胞、ならびに後天的もしくは先天的な網膜色素上皮、網膜全体の構造に隣接する細胞および脈絡膜の構造に隣接する細胞、および他の眼組織の機能不全に関連する疾患を処置するためのこれらの細胞の使用に関する。本発明によって、骨髄から単離されかつ増幅された幹細胞を、網膜特異的細胞に分化させるための方法が提供され、ここで、（ａ）幹細胞が適切な培養培地中で増幅され；（ｂ）この増幅された幹細胞が分化培地中で培養され；そして（ｃ）網膜特異的細胞がこの分化培地から細胞を分離することによって単離される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄から単離されかつ増幅された幹細胞を、網膜特異的細胞に分化させるための方法であって、ここで、
（ａ）該幹細胞は、適切な培養培地中で増幅され；
（ｂ）該増幅された幹細胞は、分化培地中で培養され；そして
（ｃ）該網膜特異的細胞は、該分化培地から該細胞を分離することによって単離される、方法。
【請求項２】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記間葉幹細胞が、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＭＨＣ  Ｉからなる群より選択される少なくとも２つの表面抗原を発現することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉幹細胞が、表面抗原ＣＤ９０および表面抗原ＣＤ１０５を発現することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
付着的に増殖する間葉幹細胞が、前記分化に使用されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記骨髄由来の幹細胞が、造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記造血幹細胞が、ＣＤ３４およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１つの表面抗原を発現することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記造血幹細胞が、表面抗原ＣＤ３４および表面抗原ＣＤ４５を発現することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞および造血幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）の後に、前記細胞が、液体培地中に浮遊させられることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地および培地１９９、ならびに、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＳＴＡＲＴ  ＶおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地のような専用培地、またはその補充物Ｎ−２およびＢ２７からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記浮遊細胞が、凍結保護剤および感受性の生物学的物質を安定化させるためのタンパク質の添加後に、低温冷凍されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地にＤＭＳＯもしくはメチルセルロースが、凍結保護剤として添加されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１０％  ＤＭＳＯが凍結保護剤として添加され、そして１０％血清もしくは無血清培養の場合には１０％アルブミンが感受性の生物学的物質を安定化させるために添加されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化培地が、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）および／または網膜抽出物（ＲＥ）を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分化培地が、１〜２０％のＣＣＭおよび／または０．１〜５．０％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化培地が、１〜１５％のＣＣＭおよび／または０．１〜５．０％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記分化培地が、１０％のＣＣＭおよび／または１％のＲＥを含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜２１日間にわたって前記分化培地中で培養されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、１４〜２１日間にわたって前記分化培地中で培養されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜１４日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、３〜９日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法の工程（ｂ）において、前記細胞が、５日間の培養時間の間に最初に分化することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中での３〜１４日間の培養時間の後に前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地中で１〜２８日間にわたってさらに分化することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中での３〜５日間の培養時間の後に前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地中で１〜１４日間にわたってさらに分化することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法の工程（ｂ）において、ＣＣＭ含有分化培地中で前記最初に分化した幹細胞が、ＲＥ含有分化培地以外の、ニューロン培養について証明済みである専用培地中でさらに分化することを特徴とする、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
さらなる分化のために使用される前記専用培地は、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌまたはＳＴＡＲＴ  Ｖであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法の工程（ｂ）における前記幹細胞の密度は、１ｃｍ３あたり０．５×１０３個と２．５×１０３個との間であることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法の工程（ｂ）における前記幹細胞の密度は、１ｃｍ３あたり２．０×１０３個であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
骨髄由来の幹細胞を網膜特異的細胞に分化させるための、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）および／または網膜抽出物（ＲＥ）の使用。
【請求項３１】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記骨髄由来の幹細胞が、造血幹細胞であることを特徴とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記骨髄由来の幹細胞が、間葉幹細胞および造血幹細胞であることを特徴とする、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）は、ＦＧＦファミリーのメンバー、ニューロトロフィンファミリーのメンバー、ＢＭＰファミリーのメンバー、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＨＧＦおよびＮＧＦからなる群からの１種以上の成長因子を含むことを特徴とする、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）であることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ＮＴ−３およびＮＴ−４であることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＢＭＰファミリーのメンバーは、ＢＭＰ−４であることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３８】
ＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３９】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法に従って得られ得る、単離細胞。
【請求項４０】
請求項３９に記載の単離された細胞であって、ＩＲＢＰおよびＣＤ３４の群より選択されるマーカーが、該細胞の表面上に発現されないかまたは検出可能に発現されないか、あるいは該細胞の細胞質において細胞内で発現されないかまたは検出可能に発現されないことを特徴とする、細胞。
【請求項４１】
請求項３９に記載の単離された細胞であって、ＲＰＥ６５、ＺＯ−１、オクルジン、ＣＤ３６、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、Ｓ−１００、ロドプシン（杆状体において）、カルビンジン（錐状体において）、ＰＫＣ、Ｓ−抗原、ＧＦＡＰ、ＧＡＢＡおよび神経フィラメントからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーが、該細胞の表面上で発現されるか、もしくは該細胞の細胞質において細胞内で発現されることを特徴とする、細胞。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の単離された細胞であって、該細胞は、１種以上の外来性遺伝子によってトランスフェクトされていることを特徴とする、細胞。
【請求項４３】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法であって、骨髄からの前記単離の後、該方法の工程（ａ）における前記増幅の後の前記分化方法の間、もしくは該方法の工程（ｂ）における前記分化の後の、前記幹細胞の１種以上の外来性遺伝子によるトランスフェクション、または該細胞から分化した前記網膜特異的細胞の１種以上の外来性遺伝子によるトランスフェクションのいずれかが存在することを特徴とする、方法。
【請求項４４】
細胞培養培地および細胞と適合性の輸送培地中、もしくは低温培地中の、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の細胞を含む細胞の調製物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の細胞の調製物であって、該細胞培養培地および細胞と適合性の輸送培地は、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、培地１９９、ＤＭＥＭ（低グルコース）およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地、ならびに、ヒト内皮−ＳＦＭ、ＳＴＡＲＴ  ＶおよびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地のような専用培地、またはその補充物Ｎ−２およびＢ２７からなる群より選択される標準培地であることを特徴とする、細胞の調製物。
【請求項４６】
前記低温培地は、９０％  ＦＣＳと１０％  ＤＭＳＯとの組み合わせ、賦形剤を添加した分化培地、もしくは無血清低温培地からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４５に記載の細胞の調製物。
【請求項４７】
前記賦形剤は、メチルセルロースおよびアルブミンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４６に記載の細胞の調製物。
【請求項４８】
請求項３９〜４２に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項４９】
前記細胞は、自系の骨髄幹細胞もしくは同種異系の骨髄幹細胞から得られていることを特徴とする、請求項４８に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
網膜色素上皮の細胞、網膜全体の隣接構造の細胞および脈絡膜の隣接構造の細胞、ならびにさらなる眼組織の後天的もしくは先天的な機能不全に関連する疾患の処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項５１】
請求項５０に記載の使用であって、脈絡膜の脈管構造の変性を特徴とする疾患の処置のための、使用。
【請求項５２】
請求項５０もしくは請求項５１に記載の使用であって、色素性網膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障もしくは糖尿病性網膜症を特徴とする疾患の処置のための、使用。
【請求項５３】
請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の使用であって、前記細胞は、自系骨髄幹細胞もしくは同種異系骨髄幹細胞から得られていることを特徴とする、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成体骨髄幹細胞に由来する網膜特異的細胞、およびその産生、ならびに後天的もしくは先天的な網膜色素上皮、網膜もしくは脈絡膜の機能不全に関連する疾患の処置のための薬学的組成物を産生するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜の変性性障害は、失明の主な原因の１つである。このような障害は、多くの場合、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の障害に由来する。
【０００３】
ＲＰＥの細胞は、大きさにおいて１０μｍから６０μｍまで異なり、窩におけるより小さい、より多くかつより大きなメラノソームに起因して非常に色素が強い細胞、ならびにより大きい、網膜周辺上のあまりメラノソームを有さないより弱い色素の細胞を有する。ＲＰＥ細胞は、光受容体に面する先端側における絨毛尖と、あまりひだを有さない基底側とに極性を有する。先端側は、光受容体外側区域を包む微絨毛を有する。基底側は、ブルーフ膜に面する。このブルーフ膜上でこの細胞は休止し、そしてこの細胞は「繋留される」。ＲＰＥ細胞は、さらに、体内で最も代謝的に活性な細胞であり、そして多くのミトコンドリア、粗面小胞体、ゴルジ装置および大きな丸い核を含む。細胞は、時折、２つの核を含む。２つの核を有する細胞の数は、年齢と共に増加する。
【０００４】
（ＲＰＥ細胞の役割は多様であり、種々の任務を含む）
・ビタミンＡ代謝において（例えば、血流からのビタミンＡの取り込みおよび１１−シス−レチナール（これは光受容体へ送達されて、そこでオプシンと結合してロドプシンを形成する）へのその変換；このロドプシンは、視覚化の間に光によって不活性化され、従って消耗されて、この消耗された形態でＲＰＥに輸送されて戻り、ここで再び１１−シス−レチナールへと変換される）；
・外側血液−網膜関門として；
・光受容体の外側区域の食作用において（何故なら各ＲＰＥ細胞は、１日あたり４０００枚までの光受容体の外側区域の取り込みが可能であり、食胞中に被包され、その後リソソームによって分解されるからである）；
・迷光の吸収を通した光の吸収において（従って、後者を最小化する）；
・光受容体間マトリックスの形成において（例えば、網膜のＲＰＥへの付着に関与する）；
・水ならびに例えばＤ−グルコースおよびチロシンのような代謝物の、先端表面上および基底面上の脈絡膜−炭酸水素輸送体上のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプを介する能動輸送において；
・修復、再生および線維脈管増殖ならびに色素移動を介した、機械的損傷および熱的損傷に対する応答において；ならびに
・ＲＰＥ中に局在するメラニンへの結合を介した、毒素およびフリーラジカルの捕捉による、隣接する組織である脈絡膜および網膜の酸化損傷からの保護において。
【０００５】
眼におけるその主要な役割（見えるようにすること）ゆえに、後天的もしくは先天的なＲＰＥ細胞の機能不全（すなわち、細胞の完全性の欠損）、この細胞の増殖もしくは移動は、非再生性光受容体の変性という二次的な結果を伴い、その後の不可逆的な中心視覚の欠損を不可避的にもたらす。
【０００６】
さらに、基礎的にＲＰＥに隣接する脈絡毛細管板（ｃｈｏｒｉｏｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｌａｙｅｒ）（ｌａｍｉｎａ  ｃｈｏｒｏｉｄｏｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）は、ＲＰＥの変性の結果として、同様に変性し得、病的な新生血管形成をもたらす。この病理学は、新しい血管からの出血を伴い、そしてさらなる視覚の低下をもたらす［非特許文献１］。
【０００７】
このような脈絡膜の変性は、糖尿病の間に頻繁に起こる。
【０００８】
ＲＰＥにおける原因を有する後天的網膜障害の１つの例は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）であり、６５歳を超える約２０％の患者が罹患している［非特許文献２；非特許文献３］。黄斑変性は、一群の疾患についての厳密ではない歴史的な用語であり、網膜の黄斑領域における光感受性細胞の機能の機能不全もしくは欠失をもたらし、そして最終的に重要な中心視覚もしくは周辺視覚の衰弱をもたらす。現在、ＡＭＤの病理学は十分に説明されていない［非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５］。
【０００９】
網膜の先天的な変性の１つの例は、色素性網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｉａ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）であり、これは、色素性網膜症（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ）とも呼ばれる一群の障害を含み、炎症を伴わない網膜上皮の変性、視神経の萎縮および網膜における広範囲な色素変化によって特徴付けられ、進行的な視覚の低下をもたらす。多くのサブタイプを有する色素性網膜症は、特に３０歳を超える人々において、最も一般的な盲目の理由の１つである［非特許文献６；Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅＰａｔｉｅｎｔｓ’  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ「Ｐｒｏ  Ｒｅｔｉｎａ  ｅ．Ｖ．」（ｗｗｗ．ｐｒｏ−ｒｅｔｉｎａ．ｄｅ）を参照］。
【００１０】
現在使用される網膜障害の処置もしくは治療への治療的アプローチ（レーザー治療もしくは新生血管形成膜の外科的除去を含む）は、疾患の進行において比較的遅く開始され、そして最高でも疾患を遅延させることしかできない。現在、網膜障害のための治療法は存在しない。
【００１１】
疾患細胞と置き換えるための、移植片として完全に機能するドナー細胞（ＲＰＥ）は、このような疾患の治療を指向する有望なアプローチを提供する。ドナー細胞は、通常、死後ドナーの眼から摘出され、そして新鮮なまま、もしくは培養工程の後のいずれかで使用される。死後摘出された細胞の不利益は、生命力の低下および、培養工程を通した細胞の分化状態の喪失である。これらの不利益にもかかわらず、動物モデルにおいては移植の中期的な成功が達成可能であった［非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６を参照］。しかし、ヒト患者における移植の試みは、ドナー細胞の質の悪さに起因して、失敗している。他の網膜細胞（例えば、光受容体）は、現在、実験的にのみそして胚性細胞としてのみしか移植されておらず［非特許文献１７参照］、従って、このアプローチは、現在、現在の科学的基準および倫理的基準に従って、治療のために受け入れることは不可能である。
【非特許文献１】ＨＯＬＺ，Ｆ．Ｇ．＆  ＰＡＵＬＥＩＫＨＯＦＦ，Ｄ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ，１９９６年，第９３巻，ｐ．２９９−３１５
【非特許文献２】ＷＩＬＬＩＡＭＳ，Ｒ．Ａ．ら，Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９９８年，第１１６巻，ｐ．５１４−５２０
【非特許文献３】ＹＯＵＮＧ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９８７年，第３１巻，ｐ．２９１−３０６
【非特許文献４】ＨＯＧＡＮ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｏｔｏｌ，１９７２年，第７６巻，ｐ．６４−８０
【非特許文献５】ＬＡＨＩＲＩ−ＭＵＮＩＲ，Ｄ．，「Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」，１９９５年，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
【非特許文献６】ＬＯＲＥＮＺ，Ｂ．ら，Ｄｔ．Ａｅｒｚｔｅｂｌ，２００１年，第９８巻，ｐ．Ａ３４４５−３４５１
【非特許文献７】ＡＬＧＥＲＶＥ，Ｐ．Ｖ．ら，Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ，１９９７年，第２３５巻，ｐ．１４９−１５８
【非特許文献８】ＣＲＡＦＯＯＲＤ，Ｓ．ら，Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｓｃａｎｄ，１９９９年，第７７巻，ｐ．２４７−２５４
【非特許文献９】ＧＯＵＲＡＳ，Ｐ．ら，Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，１９８５年，第４巻，ｐ．２５３−２６５
【非特許文献１０】ＧＯＵＲＡＳ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ，１９８９年，第３１４巻，ｐ．６５９−６７１
【非特許文献１１】ＬＩ，Ｌ．ら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，１９８８年，第４７巻，ｐ．７７１−７８５
【非特許文献１２】ＬＩ，Ｌ．ら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ，１９９１年，第５２巻，ｐ．６６９−６７９
【非特許文献１３】ＬＩＴＴＬＥ，Ｃ．Ｗ．ら，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，１９９６年，第３７巻，ｐ．２０４−２１１
【非特許文献１４】ＰＥＹＭＡＮ，Ｇ．Ａ．ら，Ｏｐｈｔｈａｌ  Ｓｕｒｇ，１９９１年，第２２巻，ｐ．１０２−１０８
【非特許文献１５】ＳＨＥＥＤＬＯ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．，１９８９年，第４８巻，ｐ．８４１−８５４
【非特許文献１６】ＳＥＩＬＥＲ，Ｍ．Ｊ．およびＡＲＡＭＡＮＴ，Ｒ．Ｂ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，１９９８年，第３９巻，ｐ．２１２１−２１３１
【非特許文献１７】ＡＲＡＭＡＮＴ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，１９９９年，第４０巻，ｐ．１５５７−１５６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
未解決の問題の点から、本発明が基づく目的は、網膜病理学のための治療を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に従い、この問題は、それぞれ、特に請求項１〜２９および４３に記載の方法によって骨髄由来の間葉幹細胞もしくは造血幹細胞またはこの両細胞型の混合物を網膜特異的細胞に分化させること、請求項３０〜３８および請求項５０〜５３のいずれか１項に記載のような使用、請求項３９〜４２および請求項４４〜４７に記載のような細胞調製物、ならびに／または請求項４９に記載の薬学的調製物によって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
用語「網膜特異的細胞」は、本明細書中で使用される場合、天然で網膜に存在する神経細胞のサブグループをいう。この用語は、さらに、網膜由来の特異的細胞に似ている神経形態学を有し、その機能を果たす細胞を含む。
【００１５】
用語「幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、骨髄由来の成体の間葉幹細胞もしくは造血幹細胞をいい、これは、当業者に公知の適切な方法による骨髄吸引物から得られる。骨髄を得るためのこれらの方法は、ドナーに無害であり、僅かな操作の間に実施される。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、骨髄から単離されかつ増幅された幹細胞は、以下の方法を用いて網膜特異的細胞に分化させられる：この方法において、
（ａ）この幹細胞は、適切な培養培地中で増幅され；
（ｂ）この増幅された幹細胞は、分化培地中で培養され；そして
（ｃ）この網膜特異的細胞は、この分化培地からこの細胞を分離することによって単離される。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、骨髄由来の成体間葉幹細胞が、この分化方法の出発物質として使用される。
【００１８】
驚くべきことに、本発明の方法は、網膜特異的細胞へ分化を導くことを示すことが可能であった。
【００１９】
さらに、まず、多数の分化細胞（例えば、骨細胞、軟骨細胞、肺細胞、脾臓細胞、中枢神経系細胞、筋肉細胞および肝細胞）へ分化する公知の能力を有する間葉幹細胞［ＰＥＲＥＩＲＡ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：４８５７−４８６１；ＡＺＩＺＩ，Ｓ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３９０８；ＦＥＲＲＡＲＩ，Ｇ．ら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：１５２８−１５３０；ＫＯＰＥＮ，Ｇ．Ｃ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９６：１０７１１−１０７１６参照］はまた、インビトロで網膜特異的細胞へ分化し得ることを示すことが可能であった。
【００２０】
本発明に従って使用される間葉幹細胞は、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＭＨＣ  Ｉからなる群より選択される少なくとも２種の代表的な表面抗原を発現する。しかし、本発明の間葉幹細胞は、１種以上の特異的表面マーカーの発現によってのみ特徴付けられるのではなく、一般に、多数の抗原の発現パターンによって特徴付けられ、この発現パターンは、これらの抗原が特定の検出方法において検出可能であること（発現が存在する）もしくは検出可能でないこと（発現が存在しない）によって識別される。したがって、例えば、ＣＤ３４およびＣＤ４５の発現がないことが、測定可能である。特に好ましい実施形態において、この間葉幹細胞は、表面抗原ＣＤ１０５（エンドグリン）およびＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）を発現する。
【００２１】
これらの特異的マーカー（表面抗原）の発現は、それぞれの抗原についての特異性を有する市販の抗体によって、標準的免疫検出方法を用いて検出され得る［ＬＯＴＴＳＰＥＩＣＨ  Ｆ．＆ＺＯＲＢＡＳ  Ｈ．“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８）参照］。例えば、完全ＭＨＣ  Ｉ複合体は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対する抗体（製造者ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５５５２）を用いて検出される。
【００２２】
細胞の増殖期（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）もしくは増殖期（ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）の間、種々の数の細胞が、それぞれの培養容器の底もしくは壁に付着する。付着的に増殖する、増幅された間葉幹細胞が、本発明の方法の工程（ｂ）において、網膜特異的細胞への分化のために使用される（実施例２参照）。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態において、骨髄由来の成体造血幹細胞が、本発明の分化方法において出発物質として使用される。
【００２４】
本発明に従って使用される造血幹細胞は、ＣＤ３４およびＣＤ４５からなる群より選択される少なくとも１種の代表的な表面抗原を発現する。本発明の造血幹細胞は、本発明の間葉幹細胞と同様に、１種以上の特異的表面マーカーの発現によってのみ特徴付けられるのではなく、一般に、多数の抗原の発現パターンによって特徴付けられる。特に好ましい実施形態において、造血幹細胞は、表面抗原ＣＤ３４および表面抗原ＣＤ４５を発現する。
【００２５】
造血幹細胞についてのこれらの特異的マーカー（表面抗原）の発現は、同様に、市販の特異的抗体によって、標準的免疫検出方法を用いて検出され得る［ＬＯＴＴＳＰＥＩＣＨ  Ｆ．＆ＺＯＲＢＡＳ  Ｈ．“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８）参照］。
【００２６】
本発明の造血幹細胞は、ＭＡＣＳ（「磁気活性化細胞選別」；Ｍｉｌｔｅｎｙｉより）の手段によって精製され得る。この技術による精製は、磁石の内側に備えられたカラム上で行われ、この上に、強磁性体と結合されている抗体と共にインキュベートされている骨髄細胞が置かれる。幹細胞と抗体との複合体は、このカラムに結合し、従って、特異的に精製され得る［ＳＵＴＨＥＲＬＡＮＤ，ら（１９９６）Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ５：２１３−２２６］。さらなる方法は、当業者に周知である。
【００２７】
造血幹細胞は、好ましくは、その精製後すぐに、本発明の方法の工程（ｂ）における網膜特異的細胞への分化のために使用される。しかし、本発明はまた、この精製細胞のさらなる培養もしくは増幅をも包含する。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態において、間葉幹細胞および造血幹細胞を含む骨髄由来の幹細胞が、本発明の分化方法において出発物質として使用される。本発明に従い、骨髄から得られた吸引物の直接の使用、ならびに、後に再び一緒にされた以前に単離された間葉幹細胞と以前に単離された造血幹細胞とを含む任意の混合物の使用の両方が、本発明に含まれる。
【００２９】
上記分化方法の工程（ｃ）において網膜特異的細胞が得られた後、これらは、好ましくは、適切な細胞培養培地中に浮遊させられ、次いで、その治療用能力の喪失を伴わない保存のために、低温冷凍（ｄｅｅｐ−ｆｒｏｚｅｎ）される。この培地は、好ましくは、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、培地１９９、ＤＭＥＭ（低グルコース；この培地は、改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ３１８８５）に相当する）、およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地からなる群より選択される、標準培地である。この培地は、さらに、ヒト内皮ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  １１１１１）、ＳＴＡＲＴ  Ｖ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｆ８０７５）およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地もしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ  ２１１０３もしくは１０８８８）からなる群より選択される専用培地、またはその補充物Ｎ−２（Ｇｉｂｃｏ  １７５０２）およびＢ２７（Ｇｉｂｃｏ  １７５０４−０４４）であり得る。これらの培地は、添加物を用いるかまたは用いずに使用される。上記特異的培地のための可能性のある添加物は、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物であり、これは、高含量のアミノ酸およびビタミンを有する。好ましくは、凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）としてのＤＭＳＯもしくはメチルセルロース、ならびに感受性の生物学的物質を安定化させるためのタンパク質が、選択された培地に添加される。
【００３０】
特に好ましくは、凍結保護剤としての１０％  ＤＭＳＯおよび感受性の生物学的物質を安定化させるための少なくとも１０％の血清（または無血清培養の場合にはアルブミン）が、添加される。
【００３１】
ＤＭＥＭ培地（低グルコース）は、必要に応じて、さらなる緩衝物質としてＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２２３２０）と共に使用されてもよく、またはこれを添加しなくてもよい。緩衝物質としてのＨＥＰＥＳは、例えば炭酸緩衝液もしくはリン酸緩衝液よりも効率的に培地のｐＨをを安定化し、幹細胞によって十分に耐容される。
【００３２】
本発明に従うＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地もしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地の使用に関連して、これらの培地は、本発明の方法の工程（ｃ）において得られた分化した細胞を培養するためにのみ使用されることが好ましいことに、留意するべきである。何故なら、未分化幹細胞の生存能力は、これらの培地中で激烈に低下するからである。
【００３３】
本発明の網膜特異的細胞のインビトロ分化、およびこの細胞の分化の開始（「プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）」）（形態学的には見えず、そしてこの細胞の眼の中への移植の後で周辺組織の影響の下でのみ完了する）は、専用培地中の工程（ｂ）における細胞の培養によって、単純かつ信頼性のある様式で行われる。この培地は、脈絡膜および／もしくはその一部が培養されている培養培地の上清（実施例３参照）、または遠心分離による網膜の完全なホモジナイゼーションの後に得られる上清のいずれかを含む（実施例４参照）。この培地は、本明細書中で以後、一般に「分化培地」と呼ばれる。
【００３４】
この分化培地は、好ましくは、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）もしくは網膜抽出物（ＲＥ）を含む［ＰＦＥＦＦＥＲ，Ｂ．Ａ．（１９９１）Ｐｒｏｇ  Ｒｅｔｉｎａ  Ｒｅｓ  １０：２５１−２９１；ＨＯ，Ｊ．およびＢＯＫ，Ｄ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ７：１４−１９；ＶＥＮＴＵＲＡ，Ａ．Ｃ．ら（１９９６）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｅ  ９３：２６２−２６７；ＶＡＬＴＩＮＫ，Ｍ．ら（１９９９）Ｇｒａｅｆｅ’ｓＡｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２３７：１００１−１００６；ＣＯＵＬＯＭＢＥ，Ｊ．Ｎ．ら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ  １０：８９９−９０６］。
【００３５】
特定の実施形態において、ＣＣＭはまた、ＲＥと一緒に使用され得る。
【００３６】
幹細胞を網膜特異的細胞に分化させるための脈絡膜馴化培地を得るために使用され得る方法は、以下の方法である：この方法において、
（ａ）前区域、硝子体および神経感覚網膜が、ヒトドナーの眼から摘出される；
（ｂ）脈絡膜および／またはその断片が、眼から切り出される；
（ｃ）網膜色素上皮に属する付着細胞が、この切り出された脈絡膜および／またはその断片から、洗浄およびその後のコラゲナーゼ溶液中でのインキュベーションによって除去される；
（ｄ）この脈絡膜および／またはその断片が、適切な培養培地中でインキュベートされる；そして
（ｅ）この培養培地の上清が、インキュベーションが行われた後に、分化培地として収集される。
【００３７】
標準細胞培地は、本発明の方法の工程（ｃ）において培養培地として使用され得る（実施例参照）。脈絡膜培養は、インキュベーター内（５％  ＣＯ２および９５％空気からなる気体混合物中）で、湿潤雰囲気（９０〜９７％の湿度）下で３７℃で行われる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態において、上記の脈絡膜馴化培地を産生するために使用される培養培地は、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、培地１９９、ＤＭＥＭ（低グルコース；この培地は、改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ３１８８５）に相当する）またはＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地のような標準培地である。ＤＭＥＭ培地（低グルコース）は、必要に応じて、さらなる緩衝物質としてＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ  ２２３２０）と共に使用されてもよく、またはこれを添加しなくてもよい。この培養培地はまた、さらなる添加物として、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）をも含む。
【００３９】
好ましくは、１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳを補充された培地１９９とＨａｍ’ｓ  Ｆ１２との１：１混合物が、上記脈絡膜馴化培地を産生するために使用される。
【００４０】
上記脈絡膜馴化培地のための培地中の血清を、血清代替物と置換することもまた、可能である。これらの血清代替物は、好ましくは、インスリン、アルブミン（Ｇｉｂｃｏ  １１０２０もしくは１１０２１）、トランスフェリン、セレンおよびさらなる微量元素、脂質、リポタンパク質、エタノールアミン／ホスホエタノールアミンならびにヒドロコルチゾンのようなさらなるホルモンからなる群より選択される。
【００４１】
好ましくは、インスリン、トランスフェリンおよびセレンである血清代替物が、本発明に従って、ＩＴＳ補充物（Ｇｉｂｃｏ  ５１３００）として使用される。個々の物質の使用において、個々の物質の好ましい濃度範囲は、インスリンの場合１〜１０μｇ／ｍｌ、トランスフェリンの場合１〜２０μｇ／ｍｌ、およびセレンの場合２０ｎＭである。
【００４２】
微量元素は、好ましくは、マンガン、スズ、ニッケル、バナジウムもしくはモリブデンからなる群より選択される。脂質およびリポタンパク質は、好ましくは、細胞培養セクターについて最適化されて調製された補充物（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｆ７１７５、Ｌ０２８８、Ｌ９６５５もしくはＬ０１６３）として使用される。
【００４３】
エタノールアミンもしくはホスホエタノールアミンが、培地に添加される。何故なら、これらは、脂質輸送のため、および無血清培地もしくは血清補充を含まない培地における細胞膜構築のためのリン脂質合成の両方のために、本質的に細胞によって必要とされるからである。これらは、５０μｍｏｌ／ｌまでの細胞培養物に有用な標準的濃度で使用される［例えば、ＧＲＡＦＦ，Ｌ．ら（２００２）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０：１５６１−１５６５；ＫＩＭ，Ｅ．Ｊ．（１９９９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ  ３５（４）：１７８−１８２］。ヒドロコルチゾンは、好ましくは、１〜１０ｎＭの濃度で使用され、そして細胞培地中の特に神経細胞にフィードするために作用する。
【００４４】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、工程（ｃ）において脈絡膜および／またはその断片を培養することによって脈絡膜馴化培地を産生するために使用される培地は、全ての最小必須物質を調製された濃度で含む合成血清代替物である。この関連において特に好ましくは、合成血清代替物であるＢｉｏｃｈｒｏｍ  Ｋ３６１１もしくはＫ３６２０が使用される。
【００４５】
本発明の１つの実施形態において、脈絡膜は、２〜８日間、好ましくは４日間の期間にわたってインキュベートされて、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）を産生する。
【００４６】
この培養物の上清は、好ましくはインキュベーションの最後に、馴化培地として得られる。個々の上清を合わせることによってより大量の馴化培地を産生するために、上清の暫定的な除去を伴うインキュベーションを行うことはしない。何故なら、培養物の多数回の「搾り取り（ｍｉｌｋｉｎｇ）」は、質の低い分化培地を生じ、ある場合においては、阻害効果をもたらすからである。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態において、網膜色素上皮に属する細胞の酵素的脱着の後、１％（ｖ／ｖ）ＦＣＳが添加されたＦ９９において、４日間、ドナーの眼の脈絡膜がインキュベートされる。この培養の完了後、上記馴化培地が、遠心分離によって得られる（実施例参照）。
【００４８】
幹細胞を網膜特異的細胞に分化させるための網膜抽出物（ＲＥ）を得るために使用され得る方法（実施例４参照）は、以下の方法である：この方法において、
（ａ）ヒトドナーの眼から網膜が単離され；
（ｂ）この網膜は、プロテイナーゼインヒビターを添加してホモジナイズされ；そして
（ｃ）上清が、このホモジネートから、遠心分離によって網膜抽出物として得られる。
【００４９】
脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）およびこの分化培地への添加物としての網膜抽出物（ＲＥ）は、各々の場合において、無菌条件下で濾過され、そして約−２０℃で保存されるか、または間葉幹細胞の分化のために直接使用され得る（実施例参照）。上記で示されるように、本発明に従う、幹細胞の網膜特異的細胞への分化、およびこの分化の誘導は、分化培地の存在下でこの幹細胞を増殖させることによって行われ、ここでこの分化培地は、脈絡膜および／またはその一部分が培養された培養培地の上清、または遠心分離による網膜のホモジナイゼーションの完了後に得られる上清のいずれかを含む（実施例３および実施例４を参照）。
【００５０】
本発明の１つの実施形態において、幹細胞は、１〜２０％  ＣＣＭの存在下、かつ／または０．１〜５．０％  ＲＥの存在下でインキュベートされる。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、幹細胞は、１〜１５％  ＣＣＭの存在下、かつ／または０．５〜５％  ＲＥの存在下でインキュベートされる。
【００５２】
好ましい実施形態において、幹細胞は、１０％  ＣＣＭの存在下、かつ／または１％  ＲＥの存在下でインキュベートされる。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、幹細胞は、分化培地の存在下で、３〜２１日間の間にわたって、網膜特異的細胞への分化のために培養される。
【００５４】
幹細胞は、好ましくは、分化培地の存在下で、１４〜２１日間の間にわたって、網膜特異的細胞への分化のために培養される。
【００５５】
３〜５日間後、分化培地の存在下での分化に起因する第１の形態学的変化が、細胞において現れ、これは最初、星状の形態学に見える。この変化は、３週間までの経過にわたって、次第に顕著になる（図２〜図４参照）。細胞は、培養物中で１４日後に完全に分化し（何故なら、さらなる分化が観察されなかったからである）、そして細胞はその変化（今や明らかに神経形態学である）を保持する。
【００５６】
分化工程の後、この細胞は、その形態学において、未分化細胞もしくは完全に分化した細胞と異なる（図１〜図４参照）。未分化細胞は伸長し（図１参照）、一方、網膜特異的細胞への分化の誘導後の細胞は側枝を形成して星形の星状形態に見える（図２参照）。これらの星形細胞のいくつかは、核の周りに暗色の外観を有する顆粒堆積を示す。この細胞は、分化のさらなる進行につれその形態学を変化させ、そして樹状様突起および枝を形成する。約９日間後、第１の明らかな神経細胞が観察され得、一方、星形の細胞は、ゆっくりと、培養物中から検出不能になっていく。
【００５７】
この神経細胞は、明らかに、培養された神経幹細胞から分化している星状細胞および希突起神経膠細胞と類似の表現型を示す。約９〜１４日間後、足の形態学的外観を有する小さな膨張が、分枝した細胞の枝の末端に出現する（図３および図４を参照）。発達が続くにつれ、既に形成されたこの細胞の枝は、より太くなり、そして新たな細胞の枝はほとんど形成されなくなる。この表現型は、その後の５〜７日間維持される。
【００５８】
さらなる実施形態において、幹細胞は、３〜１４日間の短い期間のみにわたって、幹細胞から網膜特異的細胞への分化を誘導するために、分化培地の存在下で培養され、この場合、誘導後の分化プロセスは、完了しない。
【００５９】
本発明に従い、幹細胞を、網膜特異的細胞への最初の分化のために、３〜９日間、分化培地の存在下で培養することが、特に好ましい。
【００６０】
これらの例示的な実施形態において、網膜特異的細胞へと最初に分化した細胞または事前に分化させた細胞の分化の完了は、この細胞の眼への適用後、インビボで、眼の微小環境の影響下で起こる。
【００６１】
さらなる実施形態において、幹細胞は、多工程方法において分化させられ、この方法において、ＣＣＭおよびＲＥの両方が、分化のために使用される。この場合、３〜１４日間続く、単離されそしてＣＣＭ含有分化培地中で増幅された幹細胞の最初の分化の後、４週間まで、ＲＥ含有分化培地中での細胞の培養を続ける。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、ＣＣＭ含有分化培地中での３〜５日間の培養に次いで、この細胞のＲＥ含有分化培地中での１〜１４日間の培養を行い、例えば網膜色素上皮が得られる。
【００６３】
さらに特定の実施形態において、この幹細胞は、ＣＣＭ含有分化培地中での培養後に、ＲＥ含有分化培地の代わりに、ニューロン培養について証明済みである専用培地中でさらに分化させられて、ニューロン細胞が得られる。
【００６４】
さらなる分化のために使用されるこの専用培地は、好ましくは、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌもしくはＳＴＡＲＴ  Ｖである。
【００６５】
多工程培養もまた、本発明にしたがって好ましく、この培養において、ＣＣＭ含有分化培地中の培養に次いで、ニューロン培養について証明済みである専用培地（例えば、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌもしくはＳＴＡＲＴ  Ｖ）中での２週間までの培養が行われ、網膜細胞が得られる。
【００６６】
本発明に従って、本発明の方法の工程（ｂ）における網膜特異的細胞への分化のためのインキュベーションの間の幹細胞の密度は、１ｃｍ２あたり０．５×１０３個〜２．５×１０３個の細胞であることが好ましく、特に好ましくは、１ｃｍ２あたり２×１０３個の細胞である。
【００６７】
細胞密度の調整は、幹細胞の網膜特異的細胞への分化および幹細胞の形態学から標的細胞の形態学への変化のために重要である。分化のために使用され得る幹細胞の総数は、培養容器の大きさ（これは、細胞が増殖し得る面積を規定する）に依存する。１ウェルあたり２×１０２個〜５×１０３個の細胞が播種された場合、１ウェルあたり１．８８ｃｍ２の増殖可能な面積を有する２４ウェル培養皿の使用において、１×１０３個〜２．５×１０３個の範囲内の細胞総数が生じる。好ましい範囲の下限における細胞総数を使用することが、好ましい。何故なら、平板培養において、細胞は、皿上に僅かに存在し、ゆっくりと増殖するからである。１ウェルあたり５´１０３個より多くのより高い播種濃度の使用は、強力に増殖するが分化しない、従って形態学における変化は起こらない、サブコンフルエントからコンフルエントまでの細胞培養をもたらす。
【００６８】
脈絡膜馴化培地および網膜抽出物は、本発明の分化培地への添加物としてのその使用に従って、１種以上の成長因子もしくはそのサブタイプを含む。網膜抽出物は、さらに、さらなる網膜栄養因子の供給源であり、そしてさらにこの分化培地にリポタンパク質およびタンパク質ならびにビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体を補充する。
【００６９】
ＣＣＭ、ＲＥもしくはＦＣＳのような生物学的補充物の分化培地への添加に関連する、この補充物由来の病原性生物によるこの分化培地の汚染の危険の可能性は、これらの複合物の添加との置き換えによって回避され得る。この置き換えは、この場合、規定の１つの物質の添加によって行われ、ここでこの物質は、この複合媒体中に存在し、そしてＦＧＦファミリーのメンバー（ＦＧＦ：「線維芽細胞成長因子」）、ＮＴファミリーのメンバー（ＮＴ：「ニューロトロフィン」）、ＢＭＰファミリーのメンバー（ＢＭＰ：「骨形成タンパク質」）、ＰＤＧＦ（「血小板由来成長因子」）、ＥＧＦ（「上皮成長因子」）、ＢＤＮＦ（「脳由来神経栄養因子」）、ＣＮＴＦ（「毛様体神経栄養因子」）、ＨＧＦ（「肝細胞成長因子」）およびＮＧＦ（「神経成長因子」）のメンバーを含む群から選択される。
【００７０】
本発明に従い、個々の成長因子の名前は、そのサブタイプもまた含み、本発明に従うサブタイプの使用もまた、同様に特許請求される。成長因子のサブタイプは、当業者に公知であり、とりわけ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢが挙げられる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、ＦＧＦファミリーのメンバーは、好ましくは、塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）である。
【００７２】
ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、好ましくは、ＮＴ−３およびＮＴ−４である。
【００７３】
ＢＭＰファミリーのメンバーは、好ましくはＢＭＰ−４である。
【００７４】
成長因子ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＮＴファミリーの成長因子の、神経および／または神経膠細胞（ＢＤＮＦ）ならびに種々の神経細胞型の分化（ＣＮＴＦ）に対する効果は、非常に多様である。
【００７５】
ＮＴ−３は、一方で、一般に、網膜先祖細胞におけるマイトジェンとして作用し、従って、未分化細胞プールの形成を促進し、このプールから、全ての網膜細胞型が形成され得る（ＤＡＳ，ら（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０（８）：２８８７−２８９５）が、他方、ＮＴ−３はまた、ニューロンの発達にも関与し、そしてＢＤＧＦによる相乗的増大により、例えばニューロン前駆細胞からの軸索突起の枝を促進する［ＨＯＳＳＡＩＮ，ら（２０００）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７５（１）：１３８−１５１］。さらに、ＮＴ−３について、細胞周期依存性細胞死をもたらすことのない、感覚ニューロンの先祖細胞における細胞周期制御機能の実証が可能であった［ＥＬＳＨＡＭＹ，ら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ  ２１（５）：１００３−１０１５］。胚性線条由来の神経先祖細胞の培養物は、神経栄養因子（例えば、ＮＴ−３およびＣＮＴＦ）の影響下で、両極性ニューロンおよび希突起神経膠細胞へ分化し、一方、ＢＤＮＦは、多極性ニューロンへの分化を促進する［ＬＡＣＨＹＡＮＫＡＲ，ら（１９９７）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １４４（２）：３５０−３６０］。
【００７６】
ＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦのようなニューロトロフィンは、線条のニューロンについての「生存因子」のような活性を有する。何故なら、これらは、このような細胞を、変性性障害の間、死から保護し得るからである［ＰＥＲＥＺ−ＮＡＶＡＲＲＯ，ら（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７５（５）：２１９０−２１９９］。ＣＮＴＦと組み合わせたＢＤＮＦは、損傷後の軸索の成長および分枝を促進する［ＬＯＨ，ら（２００１）Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １７０（１）：７２−８４］一方で、ＢＤＮＦ自身は、海馬の外でニューロン幹細胞の分化を促進する［ＳＵＺＵＫＩ，ら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３０９（４）：８４３−８４７］。
【００７７】
ＦＧＦファミリーおよびＢＭＰファミリーの成長因子とＨＧＦとは、網膜細胞の細胞分裂において協調する。これらの細胞としては、網膜神経節細胞（ニューロン）、無軸索細胞、両極性細胞および水平細胞、光受容体細胞（杆状体および錐状体）、ミュラー放射状細胞、ならびに網膜色素上皮（ＲＰＥ）が挙げられる。ＢＭＰファミリーのメンバーとしてのＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７は、眼における種々の構造（例えば、網膜、網膜色素上皮、毛様体色素上皮および視神経）の発達に重要に関与しており、これらの構造は、感覚上皮の外で、そして視神経円板における脳と網膜との間の神経接続の作製において分化する［ＬＩＵ，ら（２００３）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５６（１）：３４−４８；ＡＤＬＥＲ，ら（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９（１３）：３１６１−３１７１］。ＢＭＰ−４は、細胞分裂を通して、およびプログラム細胞死の標的化誘導を通して、その制御作用を発揮し［ＴＲＯＵＳＳＥ，ら（２００１）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５；２１（４）：１２９２−１３０１］、そして、細胞における種々のシグナル伝達経路を活性化することおよび幹細胞の平滑筋細胞もしくは神経膠細胞への分化を引き起こすことの両方が可能である［ＲＡＪＡＮ，ら（２００３）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６１（５）：９１１−９２１］。一般に、ＢＭＰは、皮質幹細胞のニューロンおよび星状細胞への分化に重要に関与しており［ＣＨＡＮＧ，ら（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３（３）：４１４−４１６］、一方、ＢＭＰ−７は、眼の毛様体の発達を担う［ＺＨＡＯ，ら（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９（１９）：４４３５−４４４２］。
【００７８】
ｂＦＧＦは、濃度に依存して、角膜の内皮細胞および網膜色素上皮の両方において、マイトジェンもしくは分化因子として作用する。ｂＦＧＦは、網膜細胞、特に光受容体細胞のための因子として作用することがさらに公知であり、このことは、これらの細胞の生存を確実にする［ＧＵ，ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３７：２３２６−２３３４；ＩＴＡＹＡ，ら（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １３２：９４−１００；ＴＲＡＶＥＲＳＯ，ら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４４：４５５０−４５５８；ＶＡＬＴＥＲ，ら（２００２）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ２０：１７７−１８８；ＥＺＥＯＮＵ，ら（２０００）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９：５２７−５３７；ＡＫＩＭＯＴＯ，ら（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４０：２７３−２７９；ＳＴＥＲＮＦＥＬＤ，ら（１９８９）Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ８：１０２９−１０３７；ＳＣＨＷＥＧＬＥＲ，ら（１９９７）Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ３：１０を参照］。
【００７９】
肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、網膜色素上皮の移動および増殖をインビトロで刺激し、従って、新しく形成された細胞によるＲＰＥ欠陥の創傷治癒を促進する。この新しく形成された細胞は、ＨＧＦの影響下で明らかな上皮の形態学を呈し、そして接着結合の喪失を通して自由に移動可能になる［ＭＩＵＲＡ，ら（２００３）Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ４７：２６８−２７５；ＪＩＮ，ら（２００２）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４３：２７８２−２７９０］。ＨＧＦはまた、ニューロン幹細胞についての成長および分化の因子であり、そして、神経球（神経先祖細胞からなる細胞凝集体）の増殖および神経幹細胞のニューロンへの分化を促進する［ＫＯＫＵＺＡＷＡ，ら（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２４：１９０−１９７］。
【００８０】
本発明は、骨髄由来の幹細胞の網膜特異的細胞への分化のための、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）の使用にさらに関連する。
【００８１】
本発明の１つの実施形態において、ＣＣＭは、骨髄由来の成体間葉幹細胞を網膜特異的細胞へ分化させるために使用される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、ＣＣＭは、骨髄由来の成体造血幹細胞を網膜特異的細胞へ分化させるために使用される。
【００８３】
本発明のさらなる実施形態において、ＣＣＭは、骨髄由来の成体間葉幹細胞と成体造血幹細胞との混合物を網膜特異的細胞へ分化させるために使用される。
【００８４】
上記したように、脈絡膜馴化培地は、本発明の分化培地として使用される場合、以下からなる群より選択される１種以上の因子を含む：ＦＧＦファミリーのメンバー（ＦＧＦ：「線維芽細胞成長因子」）、ＮＴファミリーのメンバー（ＮＴ：「ニューロトロフィン」）、ＢＭＰファミリーのメンバー（ＢＭＰ：「骨形成タンパク質」）、ＰＤＧＦ（「血小板由来成長因子」）、ＥＧＦ（「上皮成長因子」）、ＢＤＮＦ（「脳由来神経栄養因子」）、ＣＮＴＦ（「毛様体神経栄養因子」）、ＨＧＦ（「肝細胞成長因子」）およびＮＧＦ（「神経成長因子」）もしくはこれらのサブタイプ。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態において、ＦＧＦファミリーのメンバーは、好ましくは、塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）であり、ニューロトロフィンファミリーのメンバーは、好ましくは、ＮＴ−３およびＮＴ−４であり、そしてＢＭＰファミリーのメンバーは、好ましくはＢＭＰ−４である。
【００８６】
本発明は、骨髄由来の幹細胞の網膜特異的細胞への分化のための、網膜抽出物（ＲＥ）の使用に関する。
【００８７】
ＲＥは、本発明に従って、好ましくは、骨髄由来の成体間葉幹細胞および／または造血幹細胞を網膜特異的細胞へ分化させるために使用される。
【００８８】
本発明はまた、骨髄由来の幹細胞を網膜特異的細胞へ分化させるための、脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）および網膜抽出物（ＲＥ）の使用に関する。
【００８９】
【表１】
2008520215.tif 000002
（表１  本発明の種々の網膜特異的細胞における抗原の発現のパターン）
本発明は、幹細胞に由来しそして本発明の方法によって得られ得る網膜特異的細胞にさらに関連する。本発明のこれらの網膜特異的細胞（これは、単離された形態である）によって示される特定の特徴は、特異的発現パターン（表１を参照）であり、これは、表面上に配置される特定の抗原もしくは細胞質内に細胞内で配置される特定の抗原の発現（「陽性シグナル」欄を参照）または検出不能な発現（「陰性シグナル」の欄を参照）によって特徴付けられる。ＲＰＥ６５およびロドプシンを除き、調べた抗原は、細胞型に特異的ではない。しかし、調べた抗原は、網膜についておよび神経組織についてもまた、組織特異的であるので、細胞における形態学的相違に加えて、免疫染色および特有の染色結果の解析（陽性／陰性染色）によって、網膜特異的細胞をそれらが由来する幹細胞（上記参照）から識別することを可能にする。
【００９０】
本発明の網膜特異的細胞は、遺伝子改変および遺伝子治療についての広範な分野を開く。本発明の１つの実施形態において、骨髄から単離された幹細胞自体またはこの細胞から最終的に分化した網膜特異的細胞の、１種以上の遺伝子を用いるトランスフェクションもしくは形質導入が存在する。本発明の好ましい実施形態において、トランスジーンとしての１種以上のヒト網膜特異的遺伝子を用いるトランスフェクションであって、骨髄からの単離後または上記分化方法の間（この方法の工程（ａ）における増幅後もしくはこの方法の工程（ｂ）における分化後）の単離された幹細胞のトランスフェクション、あるいはこの単離された細胞から分化した網膜特異的細胞のトランスフェクションが、存在する。
【００９１】
網膜特異的トランスジーンとは、本明細書中で、健康な網膜細胞においては天然で発現されるが、未分化幹細胞もしくは分化した幹細胞においては発現しない遺伝子を意味する。
【００９２】
患者の自系の幹細胞および網膜細胞は、そのゲノムにおいて同一の欠損を示す。この欠損は、発現の非存在もしくは不完全な発現を通して、病理学的状態（例えば、網膜細胞の場合網膜において）の確立に関連する遺伝子の活性化をもたらす。このような疾患（例えば、色素性網膜症）の標的化遺伝子治療は、細胞の移植前の、欠損遺伝子の健康なコピーを用いる、本発明に従って使用される幹細胞のトランスフェクション、またはこの幹細胞から分化した網膜特異的細胞のトランスフェクションによって可能になる。本発明の方法の間に遺伝子が幹細胞に導入される場合、これらの遺伝子は、幹細胞から分化した網膜特異的細胞においても維持され、そしてレシピエントへの移植後の移植部位においてもまた、トランスフェクトされた遺伝子が発現することが好ましい。細胞をトランスジーンでトランスフェクトする方法は、当業者に周知である［ＳＡＭＢＲＯＯＫ，Ｊ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ］．
幹細胞もしくはそれから分化した網膜特異的細胞をトランスフェクトするために使用される遺伝子構築物は、当業者に公知の、種々の設計および組成を有し得る。
【００９３】
理想的には、欠損しているかもしくは失われている遺伝子は、その天然の構成で修復されるかまたは置換されるべきであるが、これは、実際の現行の技術に従っては達成され得ない。従って、幹細胞もしくは網膜特異的細胞のゲノム内に、この失われているかもしくは欠損している遺伝子を最初に導入し、そしてそこで異所的に発現させる必要がある。導入遺伝子の安定的な発現および細胞分裂の間の娘細胞への伝達を確実にするため、ベクターは、現行の技術に従えば、レトロウイルス［Ｂａｕｍら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９９年１０月；１（５）：６０５−６１２］もしくはレンチウイルス［Ｔｒｏｎｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；７：２０−３３］であるべきであり、そしてＡＡＶベクター［Ｍｏｎａｈａｎ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；７：２４−３０］でもあり得る。これらのベクターが由来するウイルスは、天然で標的細胞ゲノム中に安定的に組み込まれること、およびさらに、内因性遺伝子のようにさらに伝達されることによって区別される。
【００９４】
γレトロウイルスに由来する従来のベクターによる形質導入後に、導入されたトランスジーンの制御不能な発現が存在する。この発現のレベルは、しかし、適切なウイルスプロモーターの選択を通して、事前に比較的広い範囲内で決定される［Ｂａｕｍら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９９９年１０月；１（５）：６０５−６１２；Ｗａｈｌｅｒｓら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１年３月；８（６）：４７７−４８６］。他方、いわゆるＳＩＮ（「自己不活性化」）ベクターは、ウイルスプロモーターを、選択される他の任意のプロモーターによって置き換えることを可能にする［Ｋｒａｕｎｕｓら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００４年１１月；１１（２１）：１５６８−１５７８］。バイオセーフティーの理由のため、ＳＩＮ構築物は、レンチウイルス（通常はＨＩＶ由来である）ベクターと共にのみで使用される。ＳＩＮベクターは、ウイルスのプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントを欠いているので、これらは、有害な副作用（「挿入突然変異誘発」）の危険がより少ないことに関連し得る［ｖｏｎ  Ｋａｌｌｅら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ：Ｇｅｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｉｄｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｓｈｏｕｌｄ  Ｂｅ  Ａｖｏｉｄａｂｌｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，印刷中］。本明細書中の文脈で、ＳＩＮベクターが重要であり、何故なら、特に、これらは遺伝子特異的プロモーターの使用［Ｍｏｒｅａｕ−Ｇａｕｄｒｙら，Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：２６６４−２６７２］または他の調節可能プロモーターもしくは誘導可能プロモーターの使用を可能にするからである。網膜特異的プロモーターの使用は、確かに最適な解決策である。誘導可能な系は、現在、ほとんどの場合、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄのテトラサイクリン系［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２；８９（１２）：５５４７−５１］に基づいている。このような系において、幹細胞の増殖の間もしくは幹細胞の網膜特異的細胞への分化の間の対応する阻害性物質の対応する培養培地への添加により、培養の間、トランスジーンの発現は抑制され得る。患者が、網膜特異的細胞の移植後にこの物質を投与されない場合、阻害は停止され、プロモーターが活性化されて、トランスジーンは発現される。
【００９５】
１種以上の外来性遺伝子によるトランスフェクションは、一方で、網膜特異的細胞における細胞型代謝活性の維持のために必要である遺伝子の細胞への導入を可能にするが、また、他方で、この網膜特異的細胞に新規な機能を付与するかまたはこの細胞を標識する遺伝子のトランスフェクションである。本発明の特に好ましい実施形態において、細胞は、細胞を標識するためのマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、増強型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子またはｌａｃＺ遺伝子によってトランスフェクトされる。［ＡＬＬＡＹ，Ｊ．Ａ．ら（１９９７）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：１４１７；ＡＹＵＫ，Ｆ．ら（１９９９）Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ６：１７８８−１７９２；ＦＥＨＳＥ，Ｂ．ら（１９９８）Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ５：４２９−４３０を参照］。
【００９６】
本発明は、本発明の網膜特異的細胞を単離された細胞として含む再膨張生物にさらに関連する。このような細胞調製物は、この細胞の貯蔵もしくは輸送のために使用され得る。
【００９７】
細胞調製物は、本発明の単離された生存網膜特異的細胞を含み得、この細胞は、適切な培地中での、ＩＲＢＰおよびＣＤ３４からなる群より選択されるマーカーの発現の非存在もしくは検出不能な発現によって特徴付けられるか、またはＲＰＥ６５、ＺＯ−１、オクルジン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、ＣＤ３６、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、Ｓ−１００、ロドプシン（杆状体において）、カルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）（錐状体において）、ＰＫＣ、Ｓ−抗原、ＧＦＡＰ、ＧＡＢＡおよび神経フィラメントからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの、調製物中に存在する細胞の総数に基づいて少なくとも１％、好ましくは１〜５０％、特に好ましい様式では５０〜７０％、そして非常に好ましい様式では７０〜９０％の量での発現によって特徴付けられる（全ての整数値（すなわち、１１、１２、１３・・・９０％）は、明白に上記の値の範囲内に含まれる）。細胞適合性の細胞培養培地もしくは細胞輸送培地中の細胞浮遊液が好ましく、このような培地は、例えば、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１／１混合物であるＲＰＭＩ、培地１９９、ＤＭＥＭ（低グルコース；この培地は、改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ３１８８５）に相当する）、およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地のような標準培地である。この培地はさらに、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物を添加物として含有するかまたは含有しないヒト内皮ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  １１１１１）、ＳＴＡＲＴ  Ｖ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｆ８０７５）およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地もしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ  ２１１０３もしくは１０８８８）のような専用培地であり得る。
【００９８】
低温冷凍細胞調製物もまた適切であり、この調製物において、細胞は、遠心分離によって沈殿させられており、そして例えば９０％  ＦＣＳおよび１０％  ＤＭＳＯ中に入れられている。１０％メチルセルロースもしくはＤＭＳＯが、この低温培地（ｃｒｙｏｍｅｄｉｕｍ）を調整するために添加されて、低温保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）の間の細胞の生存を補助する。細胞の無血清処理の場合、さらに、保護タンパク質を添加する必要がある。感受性のタンパク質がこの保護タンパク質に付着し、それによって、低温保存の間保護される。これらは、好ましくは、アルブミンとして添加される。この細胞を、分化培地の代わりに無血清低温培地（例えば、ｃｒｙｏ−ＳＦＭ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ−２９９１０））中に入れることもまた可能である。この関連において、低温培地は、細胞を損傷することなくこの細胞を低温冷凍することを可能にする培地である。
【００９９】
分化の後の本発明の１つの実施形態において、分化した網膜特異的細胞は、本発明の網膜特異的細胞の可能な最大の富化および同時に未分化幹細胞の枯渇を達成するために、未分化幹細胞から分離される。分化した網膜特異的細胞からの未分化幹細胞の分離は、（部分的に）分化した網膜特異的細胞上に特異的に発現するが、未分化幹細胞上では発現しないかまたは発現が検出不能である（表面）抗原の助けによって果たされる。このような分離のために使用され得る抗原は、例えばＣＤ３６もしくはＳ−１００、および「陽性シグナル」欄（表１参照）からの全ての抗原である。細胞の分離は、細胞の集団の中に、分化可能な非常に大量の細胞が単に増殖能力のみを有する網膜特異的細胞と共に存在することを、かなり実質的に妨げる。さらにこの方法において、例えば薬学的組成物の産生の間、実際に本発明の網膜特異的細胞を表す細胞数を調整することを確実にし得る。
【０１００】
本発明のさらに好ましい実施形態において、分化の次に、未分化幹細胞からの分化した網膜特異的細胞の分離ではなく、分化した細胞の富化もしくは未分化幹細胞の枯渇が行われる。このような富化もしくは枯渇は、同様に、特異的表面抗原の助けによって果たされる。
【０１０１】
特定の表現マーカー細胞を選択するために使用され得る当該分野で公知の方法の例としては、免疫磁気ビーズ選別［例えば、ＲＯＭＡＮＩ，ら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３７−１５１］、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）［前掲書、同頁］が挙げられる。これらの型のさらなる方法は、当業者に公知である。
【０１０２】
本発明の１つの実施形態において、本発明の網膜特異的細胞は、それ自体が、網膜色素上皮の細胞、網膜全体の構造に隣接する細胞および脈絡膜の構造に隣接する細胞、ならびに眼のさらなる組織の後天的もしくは先天的な機能不全の処置、あるいは視神経（ｏｐｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ）（ｎｅｒｖｕｓ  ｏｐｔｉｃｕｓ）の再生（例えば、緑内障性損傷の事象または緑内障性損傷後の自称において）のための薬学的組成物の産生のために使用される。
【０１０３】
幹細胞が単離される骨髄は、自系起源もしくは同種異系起源であり得る。用語「自系」は、分化した網膜特異的細胞を移植片として与えられる個体と同じ個体から採取されている組織もしくは細胞をいう。同種異系起源は、骨髄ドナーおよびこの骨髄から分化している網膜特異的細胞のドナーが異なるが、同じ種に属している（すなわち、ドナーおよびレシピエントがヒトである）ことを示す。
【０１０４】
本発明の特に好ましい実施形態において、網膜特異的細胞は、自系細胞であり、すなわち、骨髄由来の幹細胞は、これらの幹細胞から分化した網膜特異的細胞によって処置される患者に由来する。このような場合、幹細胞から分化した網膜特異的細胞を与えることは、細胞拒絶の形態であるいかなる免疫学的問題も引き起こさない。何故なら、この細胞およびレシピエントは、同一の組織型を有するからである。
【０１０５】
薬学的製品は、生理学的耐容性培地中に浮遊している本発明の網膜特異的細胞（すなわち、部分的におよび／または完全に分化した細胞）を含み得る。適切な培地の例は、各々の場合において単独であるかまたはＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物であるＲＰＭＩ、培地１９９、添加物としてＨＥＰＥＳを含有するかまたは含有しないＤＭＥＭ（低グルコース；この培地は、改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ３１８８５）に相当する）、およびＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地からなる群より選択される、標準培地である。この培地は、さらに、ヒト内皮ＳＦＭ培地、ＳＴＡＲＴ  ＶおよびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養物を含有するかまたは含有しないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地もしくはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地からなる群より選択される専用培地であってもよい。薬学的組成物を産生するための専用培地の使用において、この培地は、この使用に適しておりかつ患者が感受性であり得るホルモン、ペプチドなどを含まないことに注意を払わなければならない。移植のために使用される培地が血清を含まないことを確実にするために、絶対に注意を払わなければならない。使用され得る代替物は、生理学的溶液（例えば、リンガー溶液）である。
【０１０６】
ＲＰＥ６５、ＺＯ−１、オクルジン、ＣＤ３６、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、サイトケラチン１９、Ｓ−１００、ロドプシン（杆状体において）、カルビンジン（錐状体において）、ＰＫＣ、Ｓ−抗原、ＧＦＡＰ、ＧＡＢＡおよび神経フィラメントからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーによって特徴付けられる本発明の網膜特異的細胞は、好ましくは、このような薬学的組成物中に、製品中に存在する細胞の総数に基づいて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の量で存在する（全ての整数値（すなわち、５１、５２・・・５９および６１、６２・・・９９、１００）は、明白に上記の値の範囲内に含まれる）。薬学的製品は、必要に応じて、薬学的に受容可能な賦形剤および／またはキャリアをさらに含む。
【０１０７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の少なくとも１×１０４個の網膜特異的細胞が、薬学的製品１μｌあたりに存在する。しかし、好ましくは、細胞の凝集を避けるために、５×１０４個以下の本発明の網膜特異的細胞が、１μｌあたりに存在する。
【０１０８】
インビトロ分化した網膜特異的細胞についての好ましい投薬形態は、眼内の特異的群集内へのこの細胞の注射、注入もしくは移植であり、それによって、一方でこの細胞の群集と直接接触する細胞の接着を達成し、そして組織に適切な分化を通して損傷した組織の機能を果たす。
【０１０９】
特に好ましい投与形態は、インビトロ分化網膜特異的細胞の注射である。これは、好ましくは、局所的眼内移植によって行われる。
【０１１０】
局所的眼内投与は、特に好ましくは、網膜の中（網膜内、ＧＵＯ，Ｙ．ら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ４４（７）：３１９４−３２０１を参照）、網膜の下側（網膜下、ＷＯＪＣＩＥＣＨＯＷＳＫＩ，Ａ．Ｂ．ら（２００２）Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ７５（１）：２３−３７参照）または網膜近くの硝子体（硝子体内、ＪＯＲＤＡＮ，Ｊ．Ｆ．ら（２００２）Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２４０（５）：４０３−４０７を参照）で行われる。
【０１１１】
本発明のさらに好ましい実施形態は、血流を介した本発明のインビトロ分化網膜特異的細胞の全身注入（細胞は網膜内に蓄積するからである）に関する。
【０１１２】
この関連において、関連した好ましい適応症の例は、色素性網膜症、加齢性黄斑変性もしくは緑内障である。この関連において、用語「緑内障」は、多くの神経線維および視神経の変性をいい、これは、ほとんどの場合異常な眼内圧に起因する。これは、網膜および神経線維の神経節細胞の欠損、ならびに視神経の萎縮によって特徴付けられる。用語「緑内障」は、本発明に従って、全ての型の緑内障（すなわち、高圧緑内障、正常圧緑内障、低圧緑内障、開放角緑内障、ＰＥＸ緑内障など）を包含する。
【０１１３】
本発明に従う緑内障の処置は、網膜内および視神経内の破壊された神経節細胞および神経細胞の置換を包含し、これは、骨髄由来の幹細胞（本発明に従って、網膜特異的細胞へと部分的にまたは完全に分化している）を与えて、破壊された細胞の置換を形成することによる。
【０１１４】
本発明に従って造血幹細胞から分化した網膜特異的細胞もまた、糖尿病に関連する脈絡膜の損傷（糖尿病性網膜症）を処置するために使用され得る。本発明の細胞の投与は、糖尿病の結果として壊れやすくなっている脈管を安定化させ、それによって、網膜の出血の発生を減少させるかまたは予防する。
【０１１５】
結果として、本発明の好ましい実施形態は、色素性網膜症、加齢性黄斑変性もしくは緑内障の処置のための薬学的組成物の産生のための、網膜特異的細胞の使用である。
【０１１６】
本発明に従って、造血幹細胞から部分的にまたは完全に分化した網膜特異的細胞を、脈絡膜の脈管構造の変性によって特徴付けられる障害（例えば、糖尿病における糖尿病性網膜症）の処置のための薬学的組成物の産生のために使用することが、特に好ましい。
【０１１７】
上記の細胞は、自系起源もしくは同種異系起源であり得、すなわち、間葉幹細胞もしくは造血幹細胞が単離された骨髄は、レシピエントもしくはその種の代理の身体に由来する。
【実施例】
【０１１８】
本発明は、実施例により、その例示的な実施形態に制限されることなく、以下で説明されそして記載される。
【０１１９】
（実施例１）
（骨髄細胞の単離）
成体間葉幹細胞を、生きているドナーから僅かな操作の間に採取した骨髄サンプル（吸引物）から得た。この幹細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＫＧ、「Ｂｉｏｃｏｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，等張溶液；密度１．０７７ｇ／ｍｌ）上の遠心分離によってサンプルから分離した。単核細胞層由来の細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で補充した培養培地（ＤＭＥＭ、低グルコース）中に再度浮遊させ、そしてコーティングしていない組織培養処理プラスチック培養皿（ポリスチレン）中で培養した。
【０１２０】
この細胞の単離後の最初の培養を、一般に、２４ウェルプレート中で行う。培養の大きさに依存して、１２ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ２５培養ボトルもしくはＴ７５培養ボトルもまた、適切である。
【０１２１】
この方法によって得られた細胞培養物を、１０％  ＦＣＳ含有のＤＭＥＭ（低グルコース）中で、播種密度、ドナーの影響、培養の経過時間およびいつコンフルエント（６０〜８０％）に達したかに依存して、７〜１４日間毎に継代することにより、数ヶ月間にわたって培養し得る（実施例２参照）。
【０１２２】
（実施例２）
（間葉幹細胞の継代）
間葉幹細胞を、プラスチックに付着している増殖中の間葉幹細胞から培養培地および非付着細胞をアスピレーションもしくは除去すること、または持ち上げることによって継代した。培養皿に付着している、付着的に増殖している間葉幹細胞を、１〜２回ＰＢＳ（カルシウムイオンおよびマグネシウムイオン非含有でなければならない）で洗浄し、さらなる非付着細胞を除去した。この後、室温でのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液（カルシウムイオンもしくはマグネシウムイオン非含有ＰＢＳ中トリプシン０．０２％、ＥＤＴＡ  ０．０５％）中で１分間インキュベーションした。インキュベーションの完了後、このトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を再びアスピレーションして捨て、そしてこの細胞を、さらに２〜３分間室温に静置した。次いで、この培養容器を、手でタッピングすることによって注意深く撹拌し、細胞を培養容器から機械応力によって脱着させた。脱着した細胞を、ＤＭＥＭ低グルコース／１０％  ＦＣＳ中に再度浮遊させた。
【０１２３】
１０μｌの浮遊液を１０μｌのトリパンブルー溶液と混合し、ノイバウアーチャンバ内にピペットで入れ、そして死んだ細胞（染まった細胞）および生きている細胞（染まっていない細胞）を顕微鏡下で計数することによるか、または０．５ｍｌの浮遊液を１２．５〜１９．５ｍｌの等張生理食塩水溶液（Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター細胞計数機における使用のための専用）で希釈し、そして後にＣｏｕｌｔｅｒカウンター細胞計数機で計数することによって、細胞数を決定した。
【０１２４】
生細胞の総数を、両方の場合において、希釈を考慮して計算する。この細胞を、次いで、適切な未コーティング容器に播種し、そして播種のために使用した同じ培養培地中でさらに培養することによって、継代した。この目的のために、細胞浮遊液を培養培地でさらに希釈することが必要であり得る。
【０１２５】
この細胞浮遊液を、さらに遠心分離によって沈殿し、この沈殿した細胞を、凍結培地（９０％  ＦＣＳ＋１０％  ＤＭＳＯ）中に浮遊させて、液体窒素中で低温保存し得る。
【０１２６】
（実施例３）
（ＣＣＭを用いることによる網膜特異的細胞の産生）
まず、骨髄からの単離後の、付着的に増殖する間葉幹細胞の分化のために、４〜８ｍｌの脈絡膜馴化培地（ＣＣＭ）を産生した（実施例１および実施例２を参照）。同種異系ドナー由来の２つの眼（１対の眼に対応する）を以下のように処理し、４ｍｌのＣＣＭを産生した：
まず、この眼の前区域、硝子体および神経感覚網膜を取り出し、その後、脈絡膜および／またはその断片をはさみおよびピンセットで切り出した［ＶＡＬＴＩＮＫ，Ｍ．ら（１９９９）Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２３７：１００１−１００６；ＶＡＬＴＩＮＫ，Ｍ．＆ＥＮＧＥＬＭＡＮＮ，Ｋ．（２００２）Ｉｎ：ＷＩＬＨＥＬＭ，Ｆ．，ＤＵＮＣＫＥＲ，Ｇ．Ｉ．Ｗ．，ＢＲＥＤＥＨＯＲＮ，Ｔ．（編集）Ａｕｇｅｎｂａｎｋｅｎ．Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７５−８７］。この脈絡膜は、通常、完全なままである。血液、ゆるく付着した死細胞および組織断片（脈絡膜のさらなる処理を妨げるもの）を、脈絡膜あたり２ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することによって除去した。この後、コラゲナーゼ溶液（１：１コラゲナーゼＩＡおよびＩＶ［ＶＡＬＴＩＮＫ，Ｍ．ら（１９９９）Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２３７：１００１−１００６；ＶＡＬＴＩＮＫ，Ｍ．＆ＥＮＧＥＬＭＡＮＮ，Ｋ．（２００２）Ｉｎ：ＷＩＬＨＥＬＭ，Ｆ．，ＤＵＮＣＫＥＲ，Ｇ．Ｉ．Ｗ．，ＢＲＥＤＥＨＯＲＮ，Ｔ．（編集）Ａｕｇｅｎｂａｎｋｅｎ．Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．７５−８７参照］；最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ；脈絡膜あたり２ｍｌの溶液）中で、５％  ＣＯ２下で３７℃のインキュベーター内で約４〜１６時間のインキュベートを行い、脈絡膜組織から網膜色素上皮の細胞を遊離させた。より高い最終濃度のコラゲナーゼ（例えば、１ｍｇ／ｍｌ）の使用においては、１〜４時間のインキュベーション時間が十分である。いくつかの場合において、脈絡膜は、コラゲナーゼの酵素活性を通して凝集力を失い、そして新しい培地への移動において崩壊する。
【０１２７】
その後の馴化プロセスは、これによって損なわれない。この酵素活性を、その後、過剰な血清含有培養培地（ＤＭＥＭ＋ＦＣＳ、実施例１を参照）の添加によって停止させた。脈絡膜組織を、次いで、脈絡膜あたり２ｍｌの（１％  ＦＣＳを補充したＦ９９培地からなる）培養培地（すなわち、１対の眼につき４ｍｌの培地）中に移した。この組織を、５％  ＣＯ２下３７℃のインキュベーター内で４日間インキュベートした。
【０１２８】
コラゲナーゼの酵素活性は、過剰な血清含有培養培地の添加によって、部分的にしか停止されない。何故なら、市販のコラゲナーゼは、主な活性であるコラーゲンのタンパク分解的切断に加えて、他のタンパク質構造に対して指向されるさらなるタンパク分解活性を示し、この活性は不活性化することが難しいからである。この不活性化不能な残留活性は、しかし、僅かであり、かつ馴化培地の形成ならびに細胞培養および分化のためのその使用に影響を有さない。
【０１２９】
このインキュベーションの間に、ＣＣＭは、上清として形成される。この上清を、室温で３００×ｇで１０分間の遠心分離によって、脈絡膜組織から分離した。得られた上清を、分化のための添加物として直接使用したか、または−２０℃で低温冷凍した。
【０１３０】
骨髄から誘導し（間葉幹細胞については実施例１および実施例２を参照）、そして６回以下の継代で培養した（実施例２を参照）約１５０００個の幹細胞を、Ｔ２５培養ボトル中で５ｍｌの培地Ｆ９９（１〜１０％のＦＣＳ、１μｇ／ｍｌのインスリン、１ｍｍｏｌ／ｌのピルビン酸ナトリウムおよび１０％  ＣＣＭで補充した培地１９９とＨａｍ’ｓ  Ｆ１２栄養混合物との１：１混合物）と共に、１４〜２１日間インキュベートした。この分化培地を、週に２〜３回取り替え、それによって、ドナー培養物を分化させるために必要な総量約３０〜４５ｍｌの分化培地を得た。
【０１３１】
５日間後、分裂の速度における低下および星形の形態学に向かう明らかな形態学的変化を、細胞において観察した（実施例２参照）。加えて、コア周辺の暗色顆粒の蓄積が観察された。
【０１３２】
培養の１０〜１４日間後、細胞は、樹状の頻繁に分枝する、しばしば隣接細胞と接触する地点での足の形成を伴う、ニューロンの形態学を発達させ始める（図３ｂおよび図４参照）。
【０１３３】
培養の１９日間後、細胞を、培養培地の除去後、未固定細胞および５％強度のホルマリンにより４℃で以前に固定した細胞に、活性なチロシナーゼ（メラニン産生の主要な酵素）を検出するために、アミノ酸誘導体Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ、ＰＢＳ中０．１％強度溶液、中性ｐＨ、１ｍｇ／ｌ当量）の溶液を添加し、そして３７℃で４５分間インキュベートすることによってさらに特徴付けた。４５分間のインキュベーションの完了後、この溶液を、各々新しくし、インキュベーションの総時間が３時間に達するまで、反応の進行に３０分間毎に注意を払った。
【０１３４】
この検出の助けにより、また、この幹細胞が、色素細胞型（たとえば、網膜色素上皮の細胞もしくはメラノサイト）へ分化し得ることが確認される。チロシナーゼ経路を介したこの細胞の色素沈着の可能性は、この場合において重要な分化の判断基準である。メラニンからなる黒っぽい茶色の粒子が、添加したＬ−ＤＯＰＡから細胞中のチロシナーゼ酵素およびその誘導体ならびにこの反応鎖中のその後の酵素によって形成された堆積物として見えるようになる場合、この検出は陽性である。
【０１３５】
この型の細胞は、培養物中で１９日後に検出可能であった。
【０１３６】
（実施例４）
（ＲＥの使用による網膜特異的細胞の産生）
網膜をホモジナイズすることによって産生した網膜抽出物（ＲＥ）を、骨髄から単離した付着的に増殖する間葉幹細胞（実施例１および２を参照）および非付着的に増殖する造血幹細胞（実施例１およびＸＹを参照）を分化させるために使用した。
【０１３７】
ＲＥを、以下のように産生した：
神経感覚網膜を、１０個のヒトドナーの眼から切り出した。この目的のために、まず、前区域、次いで硝子体を、眼から取り出した。眼の神経感覚網膜を、次いで、ピンセットを用いて持ち上げ、そして視神経円板においてはさみで切断した。得られた網膜を、容器中で、ＰＢＳで５０ｍｌの総容積にし、そしてプロテイナーゼインヒビター（例えば、５０ｍｌのホモジネートあたり完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を１錠）を添加し、ガラス製の手動ホモジナイザーもしくは組織ホモジナイザーにおいて、氷上でホモジナイズした。この上清（ＲＥと呼ぶ）を、５００×ｇで１５分間の遠心分離および１００００×ｇで４５分間のさらなる遠心分離によって得た。このＲＥを、次いで、０．２２μｍの滅菌フィルタを通して濾過することによって滅菌した。
【０１３８】
ＲＥ含有分化培地による継代した幹細胞の分化を、実施例３と同様に行った。しかし、相違点は、１％のＲＥを、ＣＣＭの代わりに分化培地に加えたことであった。幹細胞の網膜特異的細胞への分化は、この分化培地中の２〜３週間の培養の間に起こった。
【０１３９】
（実施例５）
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦによる脈絡膜馴化培地の組成の分析）
間葉幹細胞（ＭＳＣ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞の増殖および分化におけるＣＣＭの作用を示すことは可能であった（実施例３および４を参照）が、この培地の正確な組成は、当初分かっていなかった。
【０１４０】
ＣＣＭの組成を確立するために、実施例３からのこの脈絡膜培養物の上清を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でのゲル濾過によって８０画分に分画した。個々の画分のクロマトグラムを、クロマトグラフにおける個々の画分のタンパク質含量を、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定することによって構築した（図５）。
【０１４１】
クロマトグラムにおいて見られるシグナルピークに基づき、ペプチド／タンパク質の群に割り当て可能な各々の件における画分を、合わせた。例えば、画分２２〜３７、画分３８〜４１および画分４２〜４６の各々の件を、別個に合わせた。画分２２〜２７は、より低分子のペプチド／タンパク質分子を含み、これは、この培地を馴化する前にはこの濃度で存在しなかった、新しく合成された低分子のペプチド／タンパク質であるか、または血清の分解産物である。画分３８〜４１は、最も大きなピークからのペプチド／タンパク質を含み、これは、馴化前の培地に存在していたが、その量は、脈絡膜と共のインキュベーションを通して増加した。
【０１４２】
このことは、最初に培地に添加された全ての血清タンパク質が、馴化によって消費されたわけではないことを示す。画分４２〜４６は、馴化前には培地中に存在しなかったペプチド／タンパク質を含む。このピーク中に存在するペプチド／タンパク質の大きさは、これらが、血清の分解産物ではなく、脈絡膜に由来し、そしてその馴化の間に培地内に放出された筈であることを示唆する。
【０１４３】
画分を合わせた後、これらを、これらをヒト間葉幹細胞および網膜色素上皮細胞を培養するために使用する培養培地に添加することによって、その生物学的活性について試験した。
【０１４４】
この目的のために、２人のドナー由来の正常なヒトＲＰＥ細胞（１回継代および３回継代）を、１ウェルあたり５００個の細胞の播種密度で、Ｆ９９培地（１０％  ＦＣＳを補充した）とともに１２ウェル培養皿中に播種し、そして一晩インキュベートして、それによって細胞を皿に付着させ得た。この培地を、次いで、Ｆ９９、５％  ＦＣＳおよびＣＣＭの分画からの画分からなる試験培地によって置き換えた。５％  ＦＣＳと混合したＣＣＭ画分非含有のＦ９９を、ネガティブコントロールとして使用し、そして５％  ＦＣＳと混合したＣＣＭ含有のＦ９９をポジティブコントロールとして使用した。一方で全体としての分画しないＣＣＭを、また他方で分画した後新たに合わせたＣＣＭを、ポジティブコントロールとして使用した。各々の場合、同じ培地で３ウェルを提供し、各々の件で各画分を３つの複製物で２回試験した。試験１について１２日間後、および試験２について１４日間後に、細胞をトリプシン処理により培養皿から脱着させ、そして個々のウェル中の細胞数を、計数によって確立した。
【０１４５】
画分の生物学的活性を、培養の最後および最初における細胞数の相違から決定した。この方法において見出される相違は、培養の間に増殖することによって産生される細胞に対応し、添加したＣＣＭ画分の生物学的活性の関数として変化する。この場合、生物学的に活性な画分は、ネガティブコントロールと比較して細胞の増殖を増大するが、最大の増大は、ポジティブコントロールの値に達した。
【０１４６】
ヒト間葉幹細胞による試験を、同様に行ったが、相違点は、２４ウェル培養皿の１ウェルあたり５０００個の細胞を播種したことであった。
【０１４７】
幹細胞の増殖に対して陽性の作用を有した生物学的活性を有する画分を、その後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に供し、画分中の、その画分の生物学的活性を担っていたペプチドもしくはタンパク質を同定した。この目的のために、画分に対応するタンパク質を、最初にタンパク質ゲル中の２Ｄゲル電気泳動によって分画し、そして切り出したタンパク質バンド中のタンパク質を、タンパク分解的に制限した。得られたペプチドを、ゲルから抽出し、次いで、質量分析によって性質決定し、そしてその物理学的データに基づいて、データベース検索を通じて同定した。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】分化培地としてのＣＣＭの存在下での２日間の培養後の、単離された未分化な間葉幹細胞の光学顕微鏡写真（倍率×１００）。
【図２】分化培地としてのＣＣＭの存在下での５日間の培養後の、明らかに神経細胞形態学（樹状突起の形成によって特徴付けられる）を有する細胞への幹細胞の無知な（ｉｎｓｉｐｉｅｎｔ）分化を有する、単離された間葉幹細胞の光学顕微鏡写真（倍率×１００）。
【図３】分化培地としてのＣＣＭの存在下での９日間の培養後の、明らかに神経細胞形態学（樹状突起の無知な（ｉｎｓｉｐｉｅｎｔ）分岐によって特徴付けられる）を有する細胞への幹細胞の分化がさらに進行している、単離された間葉幹細胞の光学顕微鏡写真（図３Ａにおける倍率×１００、図３Ｂにおける倍率×２００）。
【図４】分化培地としてのＣＣＭの存在下での１４日間の培養後の、樹状突起および分岐を有する神経形態学を示す、単離された間葉幹細胞の光学顕微鏡写真（図４Ａにおける倍率×１００、図４Ｂにおける倍率×２００、および図４Ｃにおける倍率×３２０）。
【図５】培地中での脈絡膜のインキュベーション前の培養培地（図の上部）および培地中での脈絡膜のインキュベーション後に得た馴化培地（図の下部）の２０〜５０の画分のクロマトグラム（紫色曲線：２１４ｎｍ；青色曲線：２８０ｎｍ）。タンパク質組成における変化の表示。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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