(57)【要約】  選択された分子を細胞に輸送するためのビヒクルであって、選択された分子に静電的相互作用で結合されるＳＡＩＮＴ分子が含まれる。ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に共有結合され、リンカー分子は細胞特定リガンドに結合される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された分子を細胞に輸送するビヒクルであって、ＳＡＩＮＴ分子を含み、選択された分子に静電的相互作用で結合されたビヒクルにおいて、
前記ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に結合され、前記リンカー分子は細胞特定リガンドに結合される
ことを特徴とするビヒクル。
【請求項２】
前記ＳＡＩＮＴ分子は前記リンカー分子に共有結合されることを特徴とする請求項１に記載のビヒクル。
【請求項３】
前記細胞特定リガンドは、抗体またはその誘導体、タンパク質、ペプチド、細胞面を標的とする特異的な適用を有する化合物、または所望の細胞特異性をもつ別の化合物から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載のビヒクル。
【請求項４】
共有結合分子は細胞と融合を開始することを特徴とする請求項１、２または３に記載のビヒクル。
【請求項５】
選択された分子を細胞に目標輸送するためのＳＡＩＮＴ分子の適用であって、前記ＳＡＩＮＴ分子は選択された分子に静電的相互作用により結合され、かつ前記ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に結合され、前記リンカー分子は細胞特定リガンドに結合される適用方法。
【請求項６】
請求項２，３または４に記載のビヒクルを使用する、請求項５に記載の適用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は選択された分子を細胞に輸送するためのビヒクルに関するものであり、このビヒクルは、静電的相互作用によって、特に、例えば水素結合による非共有結合によって、選択された分子に結合されるＳＡＩＮＴ分子で構成される。また本発明は選択された分子を細胞に標的輸送するためのＳＡＩＮＴ分子の適用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
選択された分子が人体の所望の細胞内または細胞の付近で活動を行うように、選択された分子を人体に投与することが技術の現況で知られている。このような分子を細胞に送る可能な方法の１つは多量の選択された分子を人体に投与することであるが、この際、選択された分子の必要な濃度は拡散によって標的細胞で得られる。選択された分子が人体の別の部分の所望しない部位に影響を与える可能性があることがこの方法の問題点である。
【０００３】
したがって、選択された分子、例えば薬剤を人体の特定の部位の特定の細胞に投与するための方法は進歩を遂げた。適用される第１の方法は選択された化合物を抗体に結合するものである。このような結合は共有結合である。その効果として、選択された化合物の活動は自由分子の活動に比べて大幅に減少する。最近適用される別の方法は選択された分子をリポソームに封入するものである。分子が封入されるリポソームの外側に抗体が結合される。抗体のリポソームへのこの結合のほとんどは選択された分子がリポソームに封入された後に起こる。選択された分子が封入される前に抗体の結合が起こる場合は、抗体がリポゾームの内側膜に位置し、その結果、リポソームの効能が減少する。選択された分子、例えば薬剤化合物をリポソームに封入する場合の欠点は薬剤がリポゾームから徐々に漏れ出すことである。第２の欠点は、選択された化合物を含む溶液で封入形成（リポソームは選択された化合物を内側に含む）を行う必要があることである。封入するとき、リポソームに含まれる選択された化合物は５％以下となる。このことは、９５％の選択された化合物はリポソームに含まれていないことを意味する。したがって、この方法の効率は非常に低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は選択された化合物の細胞への導入を大幅に改善するビヒクルを提供することが目的である。
さらに、選択された分子への結合を長持ちさせ安定させることを可能とするビヒクルを提供することが発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的の少なくとも１つを達成するため、本願発明は請求項１の前提部に記載され特徴部の手段を有するビヒクルを提供する。この方法で、選択された分子を細胞に導入する非常に安定した方法が提供される。
【０００６】
以下に水素相互作用および水素結合が一般的に記載されるが、相互作用はこの形態だけに限定されるものではない。あらゆる場合にあらゆる種類の静電的相互作用が関係する。
この明細書では用語「細胞」が一般に使用される。しかし、この用語でこの分野の専門家が明確に理解するように、「特定の細胞」とは選択された化合物を輸送しなければならない細胞を意味する。
【０００７】
好ましい実施形態は請求項２，３および４に記載される。
別の態様によると、本発明は選択された分子を目標とする方法で細胞に輸送するのにＳＡＩＮＴ分子を適用する方法に関する。ＳＡＩＮＴ分子は一般に知られており、輸送ビヒクルとしても記載され、本願出願人のＥＰ特許（公告番号ＥＰ−０７５５９２４Ｂ１）およびアメリカ特許（特許番号ＵＳ５８５３６９４およびＵＳ６７２６８９４）に詳しく記載されている。これらの特許出願の記載内容は本出願に参考に含まれる。ＳＡＩＮＴ分子は広義には合成の両親媒性化合物であると考えられる。
【０００８】
選択された分子、例えば一般に高分子あるいは薬剤がＳＡＩＮＴ分子に封入される方法は前記ＥＰ特許（公告番号ＥＰ−０７５５９２４Ｂ１）およびアメリカ特許（特許番号ＵＳ５８５３６９４およびＵＳ６７２６８９４）に詳しく記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施形態によると、ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に共有結合されている。この共有結合によってＳＡＩＮＴ分子は安定したビヒクルと一体となった固体部分であることが確認される。リンカー分子はＲ５およびＲ５’が同一であるかまたは異なるかを考慮に入れ、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５およびＲ５’の位置でＳＡＩＮＴ分子に結合される。このタイプのＳＡＩＮＴ分子のさらに詳細な記載についてはＵＳ６７２６８９４が参照される。リンカー分子の例としては、例えば、１−Ｎ’−メチル−４−（アミノブチル、シス−９−オレイル）−メチルピリジニウムクロライド（ＳＡＩＮＴ−アミノ−リンカ−）があり、さらに１−Ｎ’−メチル−４−（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート、シス−９−オレイル）−メチルピリジニウムクロライド（ＳＡＩＮＴ−ＳＡＴＡ−リンカ−）がある。これら２つの例の場合、アセチルチオアセテートおよびＳＡＴＡ基はリンカー（部分）として機能する。しかし、等価化合物もリンカー部分として適用でき、ＳＡＩＮＴ分子に共有結合できるすべての化学化合物が含まれる。一般には１つのリンカー分子しかＳＡＩＮＴ分子に結合できないが、位置の組み合わせ、例えばＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５またはＲ５’単独で、またはこれらの組み合わせで最大５つのすべてのリンカー位置がリンカー分子で占められることが可能である。
【００１０】
また好ましい実施形態によると、細胞特定リガンドは、抗体またはその誘導体、タンパク質、ペプチド、細胞面を標的とする特異的な適用を有する化合物、または所望の細胞特異性のある他の化合物から選択される。
【００１１】
抗体またはその誘導体は合成でつくられるか自然に生じた変異体である。  
本発明の範囲内では細胞の受容体またはタンパク質に結合可能なすべての化合物をリガンドであると考える。リガンドの前提条件は受容体および／または細胞種類に対して特異性を有することである。これらのタイプのリガンドの例はＬ−ドーパまたはアドレナリン誘導体である。第１のタイプのリガンドは特に実質的黒質のドーパミン受容体に結合し、第２のタイプのリガンドは特に人体のアドレナリン受容体に結合する。勿論、本発明はこの例に限定されない。
【００１２】
特に、封入される分子はＳＡＩＮＴ分子の活性面に結合する。この実施形態に限定されることなく、ここでは正の電荷のピリジニウム基が使用される。このピリジニウム基は封入される高分子の負の電荷に結合する。さらにＳＡＩＮＴ分子は、高分子が正の電荷の場合には高分子を取り囲む水の層と相互作用することで、間接的な方法で高分子に結合することが可能である。したがって、ＳＡＩＮＴ分子は静電的相互作用によって、例えば水素結合を形成して高分子に結合するので、選択された分子がＳＡＩＮＴ分子から漏洩することが防止される。
【００１３】
さらに、例えばピリジニウム環の炭素原子またはオルト電子からの静電的相互作用が結合用になる可能性が存在する。
本発明は選択された分子、例えば薬剤を人体の特定の部位の特定の細胞に導入する可能性を作り出す。これによって、人体に投与しなければならない薬剤の量が処置しなければならない細胞の量に対して正確に調節できる。ＳＡＩＮＴ分子と包まれた化合物との間の適切な処方を選択することによって、その化合物の漏洩は防止される。またその化合物はリンカー結合リガンドに相補的な受容体リガンドを含む細胞膜まで運ばれた後に放出されて細胞膜と融合するか細胞膜内に導入される。この方法で、選択された分子が人体の別の部位に放出されることが防止される。選択された分子はＳＡＩＮＴ分子ビヒクルに含まれた状態でとどまる。
【００１４】
本発明の本質は以上のとおりである。上記の記載および特許請求の範囲に基づき、当分野の専門家は本発明の範囲内に属するさらなる実施形態を容易に展開できるであろう。
【実施例】
【００１５】
ヒト胚性腎細胞にトランスフェクションを行うことは困難である。これらの細胞を使用する場合、（他の製造業者の）競合する主なトランスフェクション方法はトランスフェクションを成功させるために数マイクログラムのプラスミドＤＮＡを必要とする。ＳＡＩＮＴ−１８と混合して、通常１μｇ（１２ウエル当たり）でトランスフェクション率が９０％を超える結果となる。標的部分のＳＡＩＮＴ−１８−ＲＧＤを増加した効果を可視化するためにこの実験計画では少量のプラスミドＤＮＡ（１２ウエル当たり５００ｎｇ）を使用した。ＳＡＩＮＴ−リンカー−ＲＧＤの構造式は以下の（化１）に示す。さらに、本発明で述べたように、ＲＧＤ−ペプチドをＳＡＩＮＴ−リンカーのＳＡＴＡ基に結合する。ＲＧＤ基はインテグリン受容体科用の標的部分であるが、トランスフェクション効能を増加する。ヒト胚性腎細胞、株２９３Ａを１２のウエル板で培養し、ＳＡＩＮＴ分子の４種類の組み合わせでトランスフェクションを行った（すなわち、ＳＡＩＮＴ−１８、ＲＧＤに結合したＳＡＩＮＴ−１８、ＲＧＤに結合したＳＡＩＮＴ−１８とＳＡＩＮＴ−１８との混合物、および基準としての単独のリンカー分子）。５００ｎｇのＣＭＶ−ＧＦＰプラスミドを３．７５ｎｍのＳＡＩＮＴ分子またはリンカー（ウエル当たり）に複合させた。トランスフェクションの４８時間後のＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）発現をＦＡＣＳ分析で測定した。ＧＦＰポジティブ細胞の比率（％）は図１のグラフに示す。
【００１６】
【化１】
2008517904.tif 000002
図１に示す結果で次のことが明確に示される。
【００１７】
１．（第４列の）Ｓ１８−リンカー（基準）はトランスフェクション試薬としての機能が不足する。
２．Ｓ１８／ＲＧＤは細胞をトランスフェクトできる。
【００１８】
３．Ｓ１８：Ｓ１８ＲＧＤの比率を５００：１にするとトランスフェクション率が約３３％増加する。
Ｓ１８−リンカーのみでは大きなトランスフェクション効能がない。１００％Ｓ１８−ＲＧＤのトランスフェクション効能の減少はＲＧＤ基によって発生した立体障害の結果であると考えられる。しかし、Ｓ１８ＲＧＤをＳ１８に５００：１の比率で混合すると、トランスフェクション効能は大きく増加する。一層最適化された比率を決定することができる。類似する結果が（細胞特定リガンドなどの）ＲＧＤ以外の標的部分で得られる。しかし、すべての場合において、最適な効果を得るために最適化が必要になる。この実験でＳＡＩＮＴ分子のトランスフェクション増強特性が十分示される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ヒト胚性腎細胞にトランスフェクションを行った際のＧＦＰポジティブ細胞比率（％）を示す。
【図１】
2008517904.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月31日(2006.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された分子を細胞に輸送するビヒクルであって、脂質、両親媒性化合物または別の種類の薬剤輸送体からなりＳＡＩＮＴ分子と混合したビヒクルにおいて、
前記ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に共有結合され、前記リンカー分子は抗体またはその誘導体、タンパク質、ペプチド、細胞面を標的とする特異な適用を有する化合物、または所望の細胞特異性をもつ別の化合物に共有結合される
ことを特徴とするビヒクル。
【請求項２】
選択された分子を細胞に目標輸送するためのＳＡＩＮＴ分子の適用であって、前記ＳＡＩＮＴ分子は選択された分子に静電的相互作用により結合され、かつ前記ＳＡＩＮＴ分子はリンカー分子に結合され、前記リンカー分子は細胞特定リガンドに結合される適用方法。
【請求項３】
請求項１に記載のビヒクルを使用する、請求項２に記載の適用方法。
【国際調査報告】
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