(57)【要約】  本発明は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）の哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストを含む、薬剤組成物に関する。さらに、医学的設定および薬学的設定における、前記阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストの使用を記載する。さらに、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１阻害剤／アンタゴニストの同定のためのスクリーニング法およびツールを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）の哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストを含む、薬剤組成物。
【請求項２】
ミオパシーまたは筋疾患の治療、改善および／または予防用の薬剤組成物の調製のための、カエノルハブディティス・エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストの使用。
【請求項３】
被験者において、ミオパシーまたは筋疾患を治療し、改善し、そして／または予防するための方法であって、こうした療法が必要な哺乳動物に、カエノルハブディティス・エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストが、小結合性分子、細胞内結合性受容体、アプタマー、イントラマー、ＲＮＡｉ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡおよび抗ＣＨＮ−１または抗ＣＨＩＰアンチセンス分子からなる群より選択される、請求項１の薬剤組成物、請求項２の使用または請求項３の方法。
【請求項５】
前記細胞内結合性受容体が、細胞内抗体または抗体断片である、請求項４の薬剤組成物、使用または方法。
【請求項６】
前記抗ＣＨＮ−１または抗ＣＨＩＰアンチセンス分子が、ＣＨＮ−１、ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ相同体のコード領域の逆相補鎖の相補鎖である核酸分子を含む、請求項４または５の薬剤組成物、使用または方法。
【請求項７】
前記ＣＨＮ−１オルソログまたは前記ＣＨＩＰオルソログが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、あるいは配列番号９、１１または１２に示すようなヌクレオチド配列にコードされるＣＨＮ−１またはＣＨＩＰ分子からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項の薬剤組成物、使用または方法。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１３および１４、１５および１６、１７および１８、１９および２０、２１および２２、または２３および２４に示すｓｉＲＮＡ二重鎖からなる群より選択される、請求項４の薬剤組成物、使用または方法。
【請求項９】
前記ミオパシーまたは筋疾患が筋ジストロフィーである、請求項２〜８のいずれか１項の使用または方法。
【請求項１０】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、サルコグリカノパシー、肢帯型ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性異栄養症、筋ジストロフィー、およびベッカー型ジストロフィーからなる群より選択される、請求項９の使用および方法。
【請求項１１】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性または発現の阻害剤または負の制御因子をスクリーニングする方法であって
（ａ）ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰを発現しているか、またはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰを発現可能である、細胞または非ヒト生物と、試験しようとする化合物を接触させ；
（ｂ）試験しようとする前記化合物と接触させていない細胞に比較した際の、前記化合
物の存在下の前記細胞または前記非ヒト生物の細胞におけるユビキチン化またはマルチユビキチン化の状態を決定し；そして
（ｃ）ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性を阻害する化合物を同定する
工程を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記非ヒト生物が、Ｃ．エレガンス、酵母（ｙｅａｓｔ）、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウス、ラット、モルモット、イヌおよびネコからなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
薬剤組成物を調製するための方法であって
（ａ）請求項１１または１２の方法によって、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性を阻害するかまたは負に制御することが可能な化合物を同定し；そして
（ｂ）前記化合物を、薬学的に許容しうるキャリアーとともに配合する
工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
二重突然変異を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記突然変異の第一のものは、筋疾患の表現型をもたらす遺伝子中の修飾を含み、そして前記突然変異の第二のものは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰのオルソログにおける突然変異を含む、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記の第一の突然変異が、ジストロフィン、ユートロピン（Ｕｔｒｏｐｉｎ）、α−、β−、γ−、δ−サルコグリカン、ラミニン−α２、ジスフェリン、インテグリンα５、インテグリンα７、α−ジストロブレビン、α−ジストログリカン、カルパイン３、ラミンＡ、ＬＡＲＧＥおよびカベオリン３遺伝子における突然変異からなる群より選択される、請求項１４の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記動物がマウスであり、そしてＣＨＮ−１／ＣＨＩＰの前記オルソログがマウス・オルソログである、請求項１４または１５の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
前記ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログが、非機能性のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ発現、機能または活性をもたらす突然変異を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１８】
前記ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ突然変異がノックアウト突然変異である、請求項１７の非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）の哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストを含む、薬剤組成物に関する。さらに、医学的設定および薬学的設定における、カエノルハブディティス・エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストの使用を記載する。さらに、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１阻害剤／アンタゴニストの同定のためのスクリーニング法およびツールを提供する。
【背景技術】
【０００２】
後天性筋（ミオ）パシーは、筋線維が、例えば急性炎症および線維壊死（例えば多発性筋炎）によって、複雑な免疫障害および代謝障害、例えば重症筋無力症、筋緊張症または解糖経路の酵素欠陥によって、あるいは筋線維の慢性変性、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは肢帯型ジストロフィーのような筋ジストロフィーによって、侵される障害である。
【０００３】
筋線維は、発生中、多くの別個の細胞の融合によって形成される単細胞である。細胞質の塊は筋原線維で構成され、筋原線維は、特にミオシンおよびアクチン・フィラメントを含む、収縮性単位（サルコメア）である。
【０００４】
細胞分裂、細胞運動性、小胞輸送および筋発生などの必須のプロセスを実行する構造へのモータータンパク質ミオシンの編成は、制御された多段階組み立て経路の結果である。ユビキチン依存性タンパク質分解は、筋細胞中、生理学的状態および疾患状態の両方において、例えば筋萎縮症中に、顕著に起こることが知られている。
【０００５】
ユビキチン／プロテアソーム系によるタンパク質分解は、細胞制御に重要な役割を果たす。マルチユビキチン鎖によって修飾された基質は、通常、多触媒性プロテアーゼ複合体である２６Ｓプロテアソームによるタンパク質分解のために印付けされている。タンパク質のユビキチン化は、酵素カスケードを必要とする。ユビキチン活性化酵素、Ｅ１は、ＡＴＰを加水分解し、そして内部システイン残基およびユビキチンのＣ末端間に高エネルギーチオエステル結合を形成する。次いで、活性化されたユビキチンが、ユビキチン・コンジュゲート化酵素、Ｅ２に渡され、このＥ２は、ユビキチンと、類似のチオエステル連結複合体を形成する。最後に、ユビキチンは、しばしば基質と直接相互作用するユビキチン−タンパク質・リガーゼであるＥ３によって、基質タンパク質に共有結合する（最近の概説に関しては、ＨｅｒｓｈｋｏおよびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、１９９８；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、１９９６；Ｐｉｃｋａｒｔ、２００４を参照されたい）。
【０００６】
最近、酵母タンパク質ＵＦＤ２が、さらなるコンジュゲート化因子Ｅ４として記載されてきており、これは、あらかじめ形成されたコンジュゲートのユビキチン部分に結合し、そしてＥ１、Ｅ２、およびＥ３と協力して、マルチユビキチン鎖組み立てを触媒する。Ｅ４が仲介するマルチユビキチン化は、特定のモデル基質のプロテアソーム・ターゲティング、およびそれに続くタンパク質分解に必要である（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）。ヒトＣＨＩＰタンパク質（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）は、Ｅ３酵素Ｐａｒｋｉｎのユビキチン化活性を正に制御するため、該タンパク質もまた、Ｅ４機能を示す（Ｉｍａｉ、２００２）。これらのＥ４酵素のマルチユビキチン化活性は、ユビキチン鎖伸長によって、タンパク質分解を制御する、付属的オプションとして働く可能性もある。
【０００７】
ＣＨＩＰおよびＵＦＤ２はどちらも、Ｃ末端にＵ−ボックスを含有する（Ａｒａｖｉｎｄ、２０００；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、２００１；Ｋｏｅｇｌ、１９９９）。Ｃ末端Ｕ−ボックスに加えて、ＣＨＩＰは、Ｎ末端に、３つのタンデムなテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）モチーフを含有する。これらのＴＰＲモチーフは、シャペロンＨｓｐ７０およびＨｓｐ９０に結合し、それによって、ＣＨＩＰのコシャペロン活性を仲介する。したがって、ＣＨＩＰは、シャペロンおよびプロテアソーム系間の直接の結び付きを提供し、そしてフォールディングおよび分解の間の細胞性平衡を制御するのを補助すると仮定される。この仮説は、ｉｎ  ｖｉｖｏで過剰発現されたＣＨＩＰが、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）およびＥｒｂＢ２を含む、活性化およびフォールディングが適格なシャペロン複合体中に見出され、これらの基質のユビキチン化および２６Ｓプロテアソームを通じたその分解の加速をもたらすという観察によって、支持される。さらに、熱変性されたポリペプチドもまた、ＣＨＩＰ依存性ユビキチン化の基質でありうる（最近の概説に関しては、Ｃｙｒ、２００２；Ｈｏｈｆｅｌｄ、２００１；Ｍｕｒａｔａ、２００３を参照されたい）。
【０００８】
モータータンパク質ミオシンを運動性細胞構造に編成するには、正確な時間的制御および空間的制御が必要である。ミオシン複合体は、細胞分裂、細胞運動性、小胞輸送、および筋収縮などの多様なプロセスに必須である（Ｂａｒｒａｌ、１９９９に概説される）。ＵＣＳ（ＵＮＣ−４５／ＣＲＯ１／Ｓｈｅ４ｐ）ドメインを含有する、タンパク質の新たに同定されたファミリーメンバーが、適切なミオシン機能に必要である（Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ、２００２に概説される）。これらは、収縮環および筋肉の太いフィラメントの組み立て、エンドサイトーシスおよびｍＲＮＡ局在化に関与する。このファミリーの最初のメンバーであるＣ．エレガンスＵＮＣ−４５における突然変異（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９７４）は、麻痺し（非協調性またはｕｎｃ表現型）、太いフィラメントの集積が減少し、そして重症の筋原線維崩壊を伴う動物を生じる（Ｂａｒｒａｌ、１９９８）。ＵＮＣ−４５タンパク質は、Ｃ末端ＵＣＳドメインを通じて、ミオシン頭部に対してシャペロン活性を発揮し、そしてＮ末端ＴＰＲドメインを通じて、Ｈｓｐ９０コシャペロンとして機能する（Ｂａｒｒａｌ、２００２）。ＵＮＣ−４５相同体は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ゼブラフィッシュ（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）、マウス、およびヒトを含む、多様な生物で同定されてきている（Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ、２００２）。ジストロフィー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を引き起こす主な要因は、アクチン細胞骨格と細胞外マトリックスを連結して、そして筋構造を安定化する、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を通常形成する筋タンパク質の分解である。ジストロフィンの喪失は、他のＤＧＣタンパク質のアンフォールディングおよびミスフォールディングを誘導し、これらのタンパク質は脱活性化されて、そしてユビキチン−プロテアソーム経路に渡って分解される（Ｐａｓｓｍｏｒｅ、２００４）。真核細胞において、アンフォールディングされたタンパク質およびミスフォールディングされたタンパク質の大部分は、ユビキチン−プロテアソーム系によって分解される。Ｅ１酵素は、ユビキチンを活性化し、そしてこのユビキチンをＥ２酵素に輸送し、このＥ２酵素がＥ３ユビキチン・リガーゼと相互作用し、このＥ３酵素が、ターゲットとされるタンパク質と数個のユビキチン分子のコンジュゲート化を触媒する。ユビキチン化の制御は、Ｅ３ユビキチン・リガーゼの非常に特異的な基質検出および結合によって可能にされる。ポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームで、印が付いたタンパク質をタンパク質分解するシグナルである。Ｂｏｎｕｃｃｅｌｌｉ（２００３）は、ジストロフィン・ノックアウト・マウス（ｍｄｘマウス）において、プロテアソーム阻害剤ＭＧ−１３２を用いたユビキチン−プロテアソーム系の遮断によって、ジストロフィンおよびＤＧＣタンパク質の発現および局在化をレスキュー可能であった。
【０００９】
筋ジストロフィーは、骨格筋、そして時に心筋の、進行性で遺伝的に決定される障害である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、Ｘ連鎖劣性障害として遺伝するが
、症例の３分の１は、自発的突然変異によって生じる。この障害は、３０００人に１人の男児に起こる。最近、ＤＭＤ遺伝子座が、Ｘ染色体のＸｐ２１領域に位置決定され、そしてこの疾患は、筋に見られる棒状の細胞骨格タンパク質である、遺伝子産物のタンパク質ジストロフィンが存在しないことによって特徴付けられる。ＤＭＤは、通常、４歳〜６歳までに明らかになり、そして２０歳までに、または特定の治療下では４０歳までに死を引き起こす。
【００１０】
この疾患の臨床的特徴は、少年が走る際、および立位に起き上がる際に困難があり、「手を使い足をよじ登って体を起こさ（ｃｌｉｍｂ  ｕｐ  ｈｉｓ  ｌｅｇｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓ  ｈａｎｄｓ）」なければならない（Ｇｏｗｅｒｓ徴候）ことである。初期には、ふくらはぎの仮性肥大を伴う近位四肢の脱力感がある。心筋が侵される。少年は１０年のうちにひどく体が不自由になる。
【００１１】
診断は、しばしば、臨床的グラウンドのみで行われる。クレアチン・ホスホキナーゼが大幅に上昇する（正常レベルの１００〜２００倍）。筋生検は、線維サイズの特徴的な変動、線維壊死、再生および脂肪による置換、ならびにジストロフィンの非存在を示す免疫化学染色を示す。筋電図は、ミオパシー・パターンを示す。
【００１２】
現在、治癒性の治療はない。受動的物理療法は、疾患のより後期の段階における拘縮を予防する。プレドニゾロン療法の試験は、筋力および筋機能の短期の改善を示した。
罹患した兄弟を持つ女性は、この遺伝子を所持する５０％の確率を有する。キャリアーの女性では、７０％が、上昇したクレアチン・ホスホキナーゼ・レベルを有し、そして残りは、通常、筋電図異常または生検上の変化を有する。ＤＭＤ遺伝子座で共遺伝するｃＤＮＡプローブを用いて、正確なキャリアー診断および出生前診断を行うことが可能である。
【００１３】
この状態の遺伝を説明し、そして中絶に関してカウンセリングする遺伝学的アドバイスが行われるべきである。羊水穿刺による胎児性別の決定および男児胎児の選択的中絶がときに行われる。キャリアーと証明された女性の多くは、子孫を持たないことを選択する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の根底にある技術的問題は、筋（ミオ）パシー、特に筋ジストロフィーの治療、改善および／または予防のための手段および方法の提供である。
この技術的問題に対する解決策は、本明細書および請求項において性質決定される態様を提供することによって、達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、カエノルハブディティス・エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）の哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子を含む、薬剤組成物を提供する。
【００１６】
したがって、本発明は、医学的設定において、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１発現、機能または活性のアンタゴニストを提供する。本発明にしたがって、用語「ＣＨＮ−１」は、ヒト「ＣＨＩＰ」のＣ．エレガンス・オルソログに関連し、これによってＣＨＩＰは、当該技術分野に、例えばＩｍｍａｉ、２００２；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、２００１またはＫｏｅｇｌ、１９９９に記載されるような、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端である。
【００１７】
さらに、本発明は、ＣＨＮ−１、ＣＨＩＰおよび／またはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰのオル
ソログもしくは相同体の阻害剤／アンタゴニストおよび／または負の制御因子が、本明細書に開示する薬剤組成物、使用および方法で使用されることを想定する。
【００１８】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰのオルソログならびに相同体が当該技術分野に知られ、そしてとりわけ、配列番号１、３、５、７、９、１１および１２に示す核酸分子にコードされるようなアミノ酸配列、または配列番号２、４、６、８、１０に示すようなアミノ酸配列を含み、これによって、配列番号１および２はＣ．エレガンス配列に関連し、これによって、配列番号３（ならびに１１）および４はヒト配列に関連し、これによって、配列番号５および６は、ゼブラフィッシュ配列に関連し、これによって、配列番号７および８はマウス配列に関連し、これによって、配列番号９（ならびに１２）および１０はラット配列に関連する。
【００１９】
用語「オルソログ」は、本明細書で使用する際、同じ機能を保持する、異なる種における遺伝子および遺伝子産物に関する。したがって、「ＣＨＩＰ」は、Ｃ．エレガンスＣＨＮ−１のヒト・オルソログであり、そして逆も同様である。ＣＨＩＰオルソログまたはＣＨＮ−１オルソログの機能は、本発明に関連して、少なくとも、ＵＮＣ−４５のユビキチン化／マルチユビキチン化である。ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログの別の機能は、Ｐａｒｋｉｎとの相互作用である。本発明に関連してやはり想定されるのは、本明細書に定義するようなＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１の相同体の薬学的使用および医学的使用である。相同を以下に定義する。
【００２０】
付随する実施例に立証するように、驚くべきことに、ヒトＵＦＤ２およびヒトＣＨＩＰのＣ．エレガンス相同体であるＵＦＲ−２およびＣＨＮ−１が、協調して作用して、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化することが見出され、したがって選択的タンパク質分解が、適切なミオシン組み立てに寄与することが明らかになった。予期せぬ特に重要な発見は、ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１がＵＮＣ−４５と相互作用することであった。ＵＮＣ−４５は、ミオシン組み立てに必要とされる、タンパク質のＵＣＳ（ＵＮＣ−４５／ＣＲＯ１／Ｓｈｅ４ｐ）ファミリーのメンバーである。ＵＮＣ−４５は、二重の機構を通じて：ミオシン頭部に対して直接シャペロン活性を発揮することによって、そして熱ショックタンパク質Ｈｓｐ９０に対するコシャペロンとして作用することによって、筋ミオシンが適切にフォールディングされるのを確実にするよう補助する。さらに、ＵＮＣ−４５が、ＵＦＤ−２またはＣＨＮ−１依存性ユビキチン化の基質であることが見出された。予期せぬことに、コンジュゲート化された基質の大部分は、１〜３のユビキチン部分しか含有せず、Ｃ．エレガンスＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１が、それ自体では単にＥ３ユビキチン・リガーゼとしてしか作用しないことが示された。しかし、驚くべきことに、ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１を同時に添加すると、ＵＮＣ−４５のマルチユビキチン化が劇的に増進された。これらの発見は、２つのＥ３酵素で構成されるヘテロオリゴマー複合体の形成によって、Ｅ４活性が達成されることを立証する。
【００２１】
特異的Ｅ４マルチユビキチン化活性を本明細書に記載し、一方、前記活性は、ＵＦＤ−２、およびカエノルハブディティス・エレガンスにおけるＣＨＩＰオルソログＣＨＮ−１によって形成される。驚くべきことに、このＥ３／Ｅ４複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化するのに必要であり、そして十分である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ｕｎｃ−４５温度感受性動物のミオシン組み立ての欠陥は、ｃｈｎ−１機能喪失によって部分的に抑制され、一方、ｃｈｎ−１が欠失した線虫におけるＵＮＣ−４５過剰発現は、非常に乱れた筋細胞を生じる。したがって、そして実施例に立証するように、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２は、機能するＥ３／Ｅ４複合体を形成し、この複合体がＵＮＣ−４５レベルを制御し、それによって、ミオシンを筋肉の太いフィラメントに適切に組み立てることが可能になる。
【００２２】
さらに、Ｅ４酵素ＣＨＩＰおよびＵＦＤ２のＣ．エレガンス・オルソログ、それぞれ、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２の間の制御性相互作用を記載する。この相互作用は、ＵＮＣ−４５が導く適切なミオシン組み立てに必要である。ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２は、Ｅ２酵素ＬＥＴ−７０と協力して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＵＮＣ−４５のマルチユビキチン化を駆動する。ＣＨＮ−１またはＵＦＤ−２の非存在下では、２、３のユビキチン分子がＵＮＣ−４５に連結されるだけである。大部分のＣＨＩＰ依存性基質とは異なり、ＵＮＣ−４５のユビキチン化は、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ９０の一般的なシャペロン活性に依存しない。したがって、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２は、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化するのに必要な、機能するＥ３／Ｅ４複合体を形成し、それによって、ミオシン・フォールディングおよびその結果の組み立てを制御する。
【００２３】
本発明に関連して提示される発見は、ＣＨＮ−１およびそのヒト相同体／オルソログであるＣＨＩＰが、筋細胞において、ＵＮＣ−４５の負の制御因子であることを示す。理論に束縛されることなく、これは、ＣＨＩＰが、ＵＦＤ−２と協調して、ＵＮＣ−４５のマルチユビキチン化およびプロテアソームが仲介する分解を促進する能力に関連する。これらの結果は、マルチユビキチン化が、ミオシン・フォールディングを補助するのに利用可能なＵＮＣ−４５レベルを設定することによって、適切なミオシン組み立てに必須であることを示す。
【００２４】
ユビキチン−プロテアソーム経路は、大部分でないとしても多くの、アンフォールディングされたか、ミスフォールディングされたかまたは過剰であるタンパク質の分解に必須である。しかし、多数の酵素（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）が、タンパク質分解の初期段階であるタンパク質のユビキチン化に関与する。これらの酵素は、大部分、非常に特異的な基質を有する。これは特に、Ｅ３ユビキチン・リガーゼに関して当てはまる。その結果、ごくわずかのＥ３ユビキチン・リガーゼに関してしか基質が知られていない。したがって、全プロテアソーム系の遮断は、タンパク質フォールディングおよび安定性に欠陥を持つ疾患の大部分ではないとしても多くに干渉するであろうが、効果は特異的ではなく、そして多くの場合、この非特異性の観点から、干渉は生物にとって有害でさえある。本発明は、Ｅ３リガーゼＣＨＩＰの基質を提供する。この基質は、筋ミオシンの太いフィラメントの組み立てに関与するため、付随する実施例において、筋肉の太いフィラメントに、好ましくはユビキチン−プロテアソーム経路によって分解される欠陥を持つ（温度感受性の、弱い）突然変異体は、ＣＨＩＰ活性を減少させ／取り除くことによって、抑制可能であることが示されうる。筋ジストロフィー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、とりわけ、ジストロフィン遺伝子における突然変異によって引き起こされる。表現型的に、これらの疾患は、Ｃ．エレガンスｕｎｃ−４５突然変異体によって引き起こされる筋ジストロフィーに類似であり、これによって、ＵＮＣ−４５は、本明細書に同定されるＣＨＩＰ基質である。ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの活性を減少させると、ＤＭＤ突然変異体に対して有益な効果がある。その結果、ジストロフィー筋肉組織を生じる２つの異なる種類の突然変異体は、実施例に立証するように、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１遺伝子活性を減少させることによって、抑制可能である。
【００２５】
本発明の発見は、哺乳動物、特にヒトの筋障害、好ましくはジストロフィー、そして最も好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの療法において、特に興味深い。
ＣＨＮ１のヒト相同体（またはオルソログ）、ＣＨＩＰ（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、１９９９）（ＳＴＵＢ１としても知られる）は、それ自体、Ｅ４活性を発揮しうるが、Ｃ．エレガンスにおいて、ＵＦＤ−２／ＣＨＮ−１へテロオリゴマーの形成は、ＵＮＣ−４５ユビキチン化／マルチユビキチン化に必須である。本発明に関連して、ＣＨＩＰ、好ましくはＣＨＩＰホモオリゴマーは、哺乳動物の系、特にヒトの系において、ＵＦＤ−２／ＣＨＮ−１ヘテロオリゴマーと類似の方式で機能すると想定される。したがって、本発明は、ＣＨＩＰ発現、機能および／または活性の阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストの使用に
よる、筋疾患、特にジストロフィーの治療のための手段および方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、ミオパシーまたは筋疾患の治療、改善および／または予防用の薬剤組成物の調製のための、Ｃ．エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストの使用である。したがって、被験者において、ミオパシーまたは筋疾患を治療し、改善し、そして／または予防するための方法であって、こうした療法が必要な哺乳動物に、Ｃ．エレガンスＣＨＮ−１および／またはヒトＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストを投与することを含む、前記方法もまた提供する。
【００２７】
用語「治療」、「治療する」等は、本明細書において、一般的に、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する観点から、予防的であることも可能であるし、そして／または疾患および／または該疾患に起因すると考えられる副作用を部分的にまたは完全に治療する観点から、療法的であることも可能である。用語「治療」は、本明細書において、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいかなる治療も含み、そして：（ａ）疾患に対する素因がありうるが、まだその疾患を有すると診断されていない被験者において、疾患が生じるのを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発展を抑止すること；または（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００２８】
用語「阻害剤」は、とりわけ、Ｍｕｔｓｃｈｌｅｒ，  "Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｗｉｒｋｕｎｇｅｎ"（１９８６），  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙに記載されるような、競合的、非競合的、機能的および化学的アンタゴニストを含む。用語「部分的阻害剤」は、本発明にしたがって、とりわけ非競合的機構を通じて、アゴニストの作用を不完全に遮断することが可能な、分子または物質または化合物または組成物または剤あるいはその組み合わせいずれかを意味する。本明細書に定義し、そして付随する実施例に例示するように、前記阻害剤が、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現、活性化または機能、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ結合パートナーとＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの相互作用を改変し、調節し、そして／または予防することが好ましい。好ましくは、前記阻害は、部分的な、好ましくは完全な停止をもたらす。前記停止は、可逆的であっても、または不可逆的であってもいずれでもよい。
【００２９】
好ましくは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤／アンタゴニストは、ユビキチン化事象を改変し、調節し、そして／または予防する。改変され、調節され、または予防されることが可能なさらなる機能は、ＵＦＤ２との相互作用、他のＥ３酵素との相互作用、Ｅ２酵素との相互作用、あるいはＵＮＣ−４５またはＵＮＣ−４５断片との相互作用を含む。付随する実施例は、ユビキチン化事象の調節、改変および／または予防が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば培養細胞、細胞溶解物または細胞不含系において）、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで（例えばＣ．エレガンスのような非ヒト試験動物において）、どのように測定可能であるかの試験系を提供する。
【００３０】
したがって、付随する実施例に立証するように、当業者は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰに対する阻害活性に関して、所定の化合物または物質のいずれも、容易にスクリーニングできる立場にある。対応するアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞に基づくアッセイ、ならびに非ヒト試験動物に対する、そして非ヒト試験動物を用いたアッセイを含むことも可能である。付随する実施例に立証されるように、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰに対する阻害効果はまた、培養ヒト筋肉細胞のような細胞系においても試験可能である。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、本発明の薬剤組成物、薬剤の調製または方法において
用いようとする阻害剤／負の制御因子／アンタゴニストは、小結合性分子、細胞内結合性受容体、アプタマー、イントラマー、ＲＮＡｉ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡおよび抗ＣＨＮ−１または抗ＣＨＩＰアンチセンス分子からなる群より選択される。好ましいｓｉＲＮＡを配列番号１３〜２４に示す。さらに、阻害剤／アンタゴニストを、本明細書に提供する本発明のスクリーニング法に関連して、以下に記載する。
【００３２】
用いようとする細胞内結合性受容体は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰおよび／またはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰのオルソログに対して向けられる細胞内抗体または抗体断片であることも可能である。
【００３３】
付随する実施例に立証するように、特に阻害性または干渉性核酸分子、例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉは、本発明と関連して、成功裡に使用されうるし、そしてこれらを用いて、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性または機能を修飾することも可能である。
【００３４】
やはり想定されるのは、本明細書に定義し、そして本発明の実験部分に記載する結合パトナーとＣＨＮ−１／ＣＨＩＰの複合体形成に干渉するかまたは干渉可能な、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）および／または突然変異ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ分子（例えばＣ．エレガンスおよびヒト以外の種のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ）である、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ機能または活性の阻害剤／アンタゴニスト／負の制御因子である。
【００３５】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ機能、活性または発現の阻害剤／アンタゴニスト／負の制御因子として使用されるべき（小）結合性分子は、天然化合物ならびに合成化合物を含むことも可能である。用語「化合物」は、本発明に関連して、単一の物質または複数の物質を含む。前記化合物／結合性分子は、例えば、試料、例えば植物、動物または微生物由来の例えば細胞抽出物に含まれることも可能である。さらに、前記化合物（単数または複数）は、当該技術分野に知られているが、現在までに、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの活性に（負の）影響を及ぼすことが可能であると知られていないか、あるいはそれぞれ、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをコードする核酸分子の発現に影響を及ぼすことが可能であると知られていないことも可能である。複数の化合物を、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで試料に、培地に、添加するか、または細胞内に注入することも可能である。
【００３６】
化合物（単数または複数）を含有する試料（化合物のコレクション）が、当該技術分野において、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの特異的阻害性結合性分子と同定されたならば、問題の化合物を含有すると同定された元来の試料から、化合物を単離することも可能であるし、または例えば該試料が複数の異なる化合物からなる場合、試料あたりの異なる物質の数を減少させるように、元来の試料をさらに分割して、そして元来の試料の再分割分を用いて、方法を反復することも可能である。次いで、当該技術分野に知られる方法によって、前記試料または化合物が、所望の特性、すなわちＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害を示すかどうかを決定することも可能である。試料の複雑性に応じて、上述の工程を数回、好ましくはスクリーニング法にしたがって同定される試料が、限定される数の、またはただ１つの物質（単数または複数）しか含まなくなるまで、行うことも可能である。好ましくは、前記試料は、類似の化学的および／または物理的特性の物質を含み、そして最も好ましくは、前記物質は同一である。
【００３７】
上に示すように、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの結合性分子／阻害性分子を当該技術分野の方法によって推定可能である。こうした方法は、例えば限定されるわけではないが、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ、あるいはその断片（単数または複数）との相互作用に関して物質のコレクション
を試験し、そして対応する読み出し系において相互作用に関して陽性反応が出た物質を、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現または機能に対する阻害効果に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでさらに試験する方法を含む。
【００３８】
当該技術分野に周知であり、そして例えば本明細書に以下に記載するような、均質アッセイおよび不均質アッセイを含む、特異的免疫学的、分子生物学的および／または生化学的アッセイによって、上述の方法の前記の「ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ相互作用に関する試験」を行うことも可能である。
【００３９】
読み出し系を使用する前記相互作用アッセイは、当該技術分野に周知であり、そしてとりわけ、２ハイブリッドスクリーニング（とりわけ、ＥＰ−０  ９６３  ３７６、ＷＯ  ９８／２５９４７、ＷＯ  ００／０２９１１に記載されるようなもの）、ＧＳＴプルダウンカラム、とりわけＫａｓｕｓ−Ｊａｃｏｂｉ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（２０００），  ２０５２−２０５９に記載されるような、細胞抽出物からの同時沈降アッセイ、「相互作用捕捉」系（とりわけ、ＵＳ  ６，００４，７４６に記載されるようなもの）、発現クローニング（例えばラムダｇｔ１１）、ファージ・ディスプレイ（とりわけ、ＵＳ  ５，５４１，１０９に記載されるようなもの）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ等を含む。さらなる相互作用アッセイ法および対応する読み出し系は、とりわけ、ＵＳ  ５，５２５，４９０、ＷＯ  ９９／５１７４１、ＷＯ  ００／１７２２１、ＷＯ  ００／１４２７１、ＷＯ  ００／０５４１０に記載されるるか、またはＳａｎｄｒｏｋ  ＆  Ｅｇｌｙ，  ＪＢＣ  ２７６（２００１），  ３５３２８−３５３３３に記載されるような酵母４ハイブリッドアッセイである。
【００４０】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログに関する前記相互作用アッセイはまた、ＦＲＥＴアッセイ、ＴＲ−ＦＲＥＴ（"Ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｕｓ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ"  ：Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．中  Ｋｏｌｂ，  （１９９７）Ｊ．  Ｄｅｖｌｉｎ．  ＮＹ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ
３４５−３６０）または「増幅蛍光近接均質アッセイ」、ＢｉｏＳｉｇｎａｌ  Ｐａｃｋａｒｄのような商業的に入手可能なアッセイも含む。さらに、酵母２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系を使用して、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのさらなる特定のそして特異的相互作用、会合パートナーを解明することも可能である。阻害効果、特にまたユビキチン化に対する効果に関して、前記相互作用／会合パートナーをさらにスクリーニングする。
【００４１】
同様に、当該技術分野に周知の、細胞に基づく技術によって、相互作用分子（例えば）（ポリ）ペプチド（例えばまた、結合性分子および阻害性分子として機能するＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ断片）を推定することも可能である。これらのアッセイは、とりわけ、例えばＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの（遺伝子）発現に影響を及ぼす薬剤／小化合物の同定に関して記載されるような、レポーター遺伝子構築物の発現または「ノックイン」アッセイを含む。前記「ノックイン」アッセイは、組織培養細胞における、ならびに（トランスジェニック）動物における、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ（またはその断片（単数または複数））の「ノックイン」を含むことも可能である。成功した「ノックイン」の例が当該技術分野に知られる（とりわけ、Ｔａｎａｋａ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ４１（１９９９），  ５２４−５３９またはＭｏｎｒｏｅ，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１（１９９９），  ２０１−２１２を参照されたい）。さらに、生化学アッセイを使用することも可能であり、こうしたアッセイは、限定されるわけではないが、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオ
ルソログ（またはその断片（単数または複数））の他の分子／（ポリ）ペプチド、ペプチドへの結合、あるいはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ（またはその断片（単数または複数））のそれ（ら）自体への結合（ダイマー化、オリゴマー化、マルチマー化）、およびとりわけシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または均質時間分解蛍光アッセイ（ＨＴＲＦＡ）による前記相互作用のアッセイを含む。
【００４２】
前記「相互作用の試験」はまた、複合体形成の測定も含むことも可能である。複合体形成の測定は、当該技術分野に周知であり、そしてとりわけ、不均質アッセイおよび均質アッセイを含む。均質アッセイは、結合パートナーが、溶液中に留まるアッセイを含み、そして凝集アッセイのようなアッセイを含む。不均質アッセイは、とりわけ、イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＦＩＡ、ＣＬＩＡまたはＥＣＬのようなアッセイを含む。
【００４３】
以下に論じるように、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログｍＲＮＡおよびＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ・タンパク質またはその断片の阻害性分子の相互作用は、２、３または４ハイブリッドアッセイ、ＲＮＡ保護アッセイ、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、マイクロアレイ、マクロアレイ、およびタンパク質アレイまたは抗体アレイ、ドットブロットアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学、定量的ＰＣＲ、同時沈降、ファーウェスタンブロッティング、ファージに基づく発現クローニング、表面プラズモン共鳴測定、酵母１ハイブリッドスクリーニング、ＤＮアーゼＩ、フットプリント分析、移動度シフトＤＮＡ結合アッセイ、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、一次元または二次元ゲル電気泳動、アプタマー技術、ならびにハイスループット合成およびスクリーニング法のような分子生物学的方法によってもまた、試験可能である。
【００４４】
上述の方法（単数または複数）にしたがって同定され、そして／または得られた化合物、特に、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログまたはその断片（単数または複数）の阻害剤は、本明細書に開示する薬学的設定において剤として非常に有益であり、そして特に、本明細書記載の筋障害の治療において、医学的目的のため用いられると期待される。
【００４５】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの特異的阻害として機能可能な化合物は、また、（小）有機化合物を含み、本発明にしたがって使用可能な同様の化合物には、とりわけ、ペプチド、タンパク質、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを含む核酸、小有機化合物、リガンド、ＰＮＡ等が含まれる。前記化合物はまた、機能する誘導体または類似体であることも可能である。化学的誘導体および類似体の調製法は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ，  "Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに、または”Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。さらに、当該技術分野に知られる方法にしたがって、前記誘導体および類似体を、その効果、すなわちＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害性効果に関して試験することも可能である。さらに、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの適切な阻害剤のペプチド擬似体および／またはコンピュータ補助設計を用いてもよい。例えばタンパク質およびペプチドのコンピュータ補助設計に適したコンピュータ系が、先行技術に、例えばＢｅｒｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  ２２（１９９４），  １０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５０１（１９８７），  １−１３；Ｐａｂｏ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６），  ５９８７−５９９１に記載される。例えば既知の化合物、物質または分子を最適化するために、上述のコンピュータ分
析から得られる結果を、本発明の方法と組み合わせて用いることも可能である。連続的な化学修飾を通じてペプチド擬似体コンビナトリアルライブラリーを合成して、そして例えば本明細書記載の方法にしたがって、生じた化合物を試験することによって、適切な化合物を同定することもまた可能である。ペプチド擬似体コンビナトリアルライブラリーの生成法および使用法が、先行技術に、例えばＯｓｔｒｅｓｈ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７（１９９６），  ２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４（１９９６），  ７０９−７１５に記載される。さらに、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤の三次元構造および／または結晶学的構造を、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの（ペプチド擬似体）阻害剤を設計するのに用いることも可能である（Ｒｏｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９９６），  １２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｎｂｅｒ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４（１９９６），  １５４５−１５５８）。
【００４６】
本明細書に上述するように、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現または機能の阻害剤はまた、アプタマーも含むことも可能である。
本発明に関連して、用語「アプタマー」は、高特異性および高親和性を有する複数のターゲット配列に結合する、ＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ（ｓｓ＝一本鎖）、修飾ＲＮＡ、修飾ｓｓＤＮＡ、またはＰＮＡなどの核酸を含む。アプタマーは当該技術分野に周知であり、そしてとりわけ、Ｆａｍｕｌｏｋ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２（１９９８），  ３２０−３２７に記載される。アプタマーの調製は、当該技術分野に周知であり、そしてとりわけ、コンビナトリアルＲＮＡライブラリーを使用して、結合性部位を同定することを伴いうる（Ｇｏｌｄ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４（１９９５），  ７６３−７９７）。
【００４７】
したがって、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮による体系的リガンド進化）と呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化プロセスから得られるオリゴヌクレオチドである。ランダム化ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ配列のプールを、特定のターゲットに対して選択する。ターゲットとより緊密に結合する配列を単離し、そして増幅する。第一周期の選択から得た濃縮プールを用いて、選択を反復する。このプロセスを数周期行うと、「アプタマー」または「リガンド」と呼ばれる、獲得配列がもたらされる。アプタマーは、いくつかの疾患状態と関連するタンパク質に結合するよう進化してきている。この方法を用いて、こうしたタンパク質の多くの強力なアンタゴニストを見出すことも可能である。これらのアンタゴニストが、疾患の動物モデルにおいて、そしてヒトにおいて働くためには、通常、アプタマーを修飾する必要がある。まず第一に、生じたアプタマーを、血清に見られるヌクレアーゼに対して抵抗性にするために、ヌクレオシド三リン酸の糖修飾が必要である。リボースの２’ＯＨ基を２’Ｆまたは２’ＮＨ２基に変化させると、血中で長く存続するアプタマーが生じる。比較的低分子量のアプタマー（８０００〜１２０００）は、血液からの迅速なクリアランスにつながる。アプタマーに、より高分子量のビヒクルをコンジュゲート化することによって、アプタマーを数時間から数日、循環中に維持することも可能である。修飾し、コンジュゲート化したアプタマーを動物に注入すると、これらは、そのターゲットタンパク質と関連することが知られる生理学的機能を阻害する。アプタマーを動物およびヒトに全身性に適用して、臓器特異的疾患を治療することも可能である（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆ（２００１）Ｊ．  Ａｍ  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈ．  １２，  ９０９−９１８）。第１相臨床研究に進んだ最初のアプタマーはＮＸ−１８３８であり、これは、黄斑変性症が誘導する失明を治療するのに潜在的に使用可能な、注射可能血管形成阻害剤である（Ｓｕｎ（２０００）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２，  １００−１０５）。アプタマーの細胞質発現（「イントラマー」）を用いて、細胞内ターゲットを阻害することも可能である（Ｍａｙｅｒ（２００１）ＰＮＡＳ  ９８，  ４９６１−４９６５）。前記イントラマーもまた、本発明に関連して使用されると想定される。
【００４８】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの前記の（他の）受容体は、例えば、ペプチド擬似体によって、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログに対する抗体（単数または複数）から得られうる。認識の特異性は、他の既知のタンパク質、分子が結合しないことを暗示する。
【００４９】
ＲＮＡｉアプローチもまた、本発明と関連して、本明細書に開示する筋疾患の治療用の薬剤組成物の調製における使用に関して想定される。
用語、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、分解し、それによって発現をサイレンシングするため、特定のｍＲＮＡをターゲティングする二本鎖ＲＮＡの使用を表す。遺伝子配列にマッチした二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、そして細胞内に導入する。ｄｓＲＮＡは、天然であるが、部分的にしか理解されていないプロセスに入り、このプロセスには、ｄｓＲＮＡ前駆体分子を短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断する、非常に保存されたヌクレアーゼＤＩＣＥＲ（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ、２００１；Ｇｒｉｓｈｏｋ、２００１）が含まれる。ｓｉＲＮＡ（単数または複数）の生成および調製、ならびにターゲット遺伝子の発現を阻害するための方法は、とりわけ、ＷＯ  ０２／０５５６９３、Ｗｅｉ（２０００）Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １５，  ２３９−２５５；Ｌａ  Ｃｏｕｎｔ（２０００），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓ．  １１１，  ６７−７６、Ｂａｋｅｒ（２０００）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １０，  １０７１−１０７４、Ｓｖｏｂｏｄａ（２０００），  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７，  ４１４７−４１５６またはＭａｒｉｅ（２０００）Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  １０，  ２８９−２９２に記載される。次いで、これらのｓｉＲＮＡは、サイレンシング誘発因子に相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊するマルチ複合体ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の配列特異的部分を構築する。リボ核タンパク質複合体の１つのタンパク質部分は、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ｈａｍｍｏｎｄ、２００１）と同定されている。Ｅｌｂａｓｈｉｒ（２００１）は、２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖を細胞培養中に使用して、哺乳動物細胞における遺伝子発現に干渉することが可能であることを示した。
【００５０】
ｓｉＲＮＡを推定し、そして構築する方法が当該技術分野に存在し、そして付随する実施例、ならびにＥｌｂａｓｈｉｒら、２００２に、ｓｉＲＮＡの商業的製造者のインターネットウェブサイト、例えばＸｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｘｅｒａｇｏｎ．ｃｏｍ／ｓｉＲＮＡ  ｓｕｐｐｏｒｔ．ｈｔｍｌ）；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ）；Ｘｅｒａｇｏｎ  Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｘｅｒａｇｏｎ．ｃｏｍ）、およびＡｍｂｉｏｎ（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）に、またはＴｏｍ  Ｔｕｓｃｈｌの研究グループのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｌａｂｈｅａｄｓ／ｔｕｓｃｈｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に記載される。さらに、所定のｍＲＮＡ配列からｓｉＲＮＡを推定するプログラムがオンラインで入手可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌまたはｈｔｔｐ：／／ｋａｔａｈｄｉｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ：９３３１／ＲＮＡｉ／）。活性を失うことなく、２ｎｔの３’オーバーハングのウリジン残基を２’デオキシチミジンによって置換することも可能であり、これは、ＲＮＡ合成コストを有意に減少させ、そしてまた哺乳動物細胞に適用した際、ｓｉＲＮＡ二重鎖の抵抗性を有意に増進可能である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ、２００１）。この修飾はまた、本出願の本明細書に提供する特定の例示ｓｉＲＮＡに取り込むことも可能である（ヒトに関しては配列番号１３〜１８、またはマウスに関しては配列番号１９〜２４を参照されたい）（以下を参照されたい）。ｓｉＲＮＡはまた、Ｔ７または他のＲＮＡポリメラーゼを用いて、酵素的に合成可能である（Ｄｏｎｚｅ、２００２）。有効なＲＮＡ干渉を仲介する短いＲＮＡ二重鎖（ｅｓｉＲＮＡ）はまた、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＩＩＩで加水分解することによっても産生可能である（Ｙａｎｇ、２００２）。さらに、真核細胞において、小さいヘアピンＲＮＡループによって連結される
二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するように、発現ベクターが開発されてきている（例えばＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ、２００２）。これらの構築物はすべて、上に列挙するプログラムの補助で、開発可能である。さらに、配列分析プログラムに取り込まれているか、または別個に販売されている、商業的に入手可能な配列予測ツール、例えばｗｗｗ．ｏｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ．ｃｏｍ（Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＷＡ）に提供されるｓｉＲＮＡ設計ツールを、ｓｉＲＮＡ配列予測に用いることも可能である。
【００５１】
したがって、本発明はまた、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現、活性および／または機能の阻害剤としての、特異的干渉ＲＮＡの使用も提供する。好ましくは、前記（小）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１４ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１６ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドを含む。対応する例を、付随する図９、ならびに配列番号１３〜２４に示し、これによって、配列番号１３／１４、１５／１６および１７／１８の対に示すような二重鎖は、ヒトＣＨＩＰの下方制御に潜在的に有用なｓｉＲＮＡに相当し、そして配列番号１９／２０、２１／２２および２３／２４に示すような二重鎖は、マウス相同体の下方制御用のｓｉＲＮＡである。上述の例示ｓｉＲＮＡは、本明細書に記載する医学的設定に有用であるだけでなく、価値ある研究ツールでもある。
【００５２】
例えば、ヒトＣＨＩＰに対して向けられるｓｉＲＮＡを、細胞培養系を用いた実験的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ設定で使用することも可能である。こうした細胞培養系は、限定されるわけではないが、患者、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、サルコグリカノパシー、ならびに肢帯型ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー等（以下を参照されたい）を患う患者由来の培養筋芽細胞を含むことも可能である。したがって、これらの細胞系は、ＣＨＩＰ−１／ＣＨＩＰの哺乳動物オルソログの阻害性分子／負の制御因子／アンタゴニストをどのように測定し、そして試験することが可能であるかの例である。
【００５３】
やはり本明細書に定義するマウスｓｉＲＮＡも、前臨床設定および研究設定で有用である。ここで、ｓｉＲＮＡを培養細胞で、好ましくは培養マウス筋芽細胞で、ならびに以下に定義するようなマウスモデルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ設定で、使用することも可能である。例は、限定されるわけではないが、ｍｄｘマウス、ｄｙマウス、Ｄａｇ−１マウスを含む（以下の表を参照されたい）。対応する実験設定を実施例部分に提供する。さらに、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２１に対して向けられるｓｉＲＮＡは、以前、ｉｎ
ｖｉｔｒｏデュシェンヌモデルで成功裡に使用された；Ｅｎｄｅｓｆｅｌｄｅｒ（２００５）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８３，  ６４−７１を参照されたい。
【００５４】
細胞内抗体が当該技術分野に知られ、そしてこれを用いて、ターゲット分子の機能活性を中和するかまたは調節することも可能である。この療法アプローチは、適切なターゲティング配列を用いて、望ましい細胞区画をターゲティングする、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆｖいずれかの組換え抗体断片の細胞内発現に基づく（Ｔｅｉｌｌａｕｄ（１９９９）Ｐａｔｈｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４７，  ７７１−７７５に要約される）。
【００５５】
本明細書で上述するように、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現および／または機能のさらに好ましい阻害剤は、アンチセンス分子である。好ましくは、前記の抗ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのアンチセンス分子は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのコード領域の逆相補鎖の相補鎖である核酸分子を含む。
【００５６】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのコード領域が当該技術
分野に知られ、そしてとりわけ、タンパク質に関して、マウス（ＡＫ００２７５２）、ラット（ＸＰ＿２１３２７０）；核酸分子に関して、ＸＭ＿２１３２７０、タンパク質に関して、ヒト（ＮＭ＿００５８６１）、Ｃ．エレガンス（ＮＭ＿０５９３８０）またはゼブラフィッシュ（ＡＡＨ５１７７５）；核酸分子に関してＮＭ＿１９９６７４のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのＧｅｎＢａｎｋエントリーを含む。当業者は、ゲノムＤＮＡならびにｍＲＮＡ／ｃＤＮＡのエントリーもまた含みうる、これらのＧｅｎＢａｎｋエントリー中のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの適切なコード領域も容易に推定可能である。
【００５７】
さらに、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現、活性または機能に対するアンチセンス分子が、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのプロモーター領域と特異的に干渉することもまた想定される。
【００５８】
本発明にしたがって使用されるべきアンチセンス分子は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ、特にヒトＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現または機能を阻害し、そしてコード領域によって発現されるようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ、上述のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号のもとに寄託されるようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、ならびに前記ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのアイソフォームおよび変異体によって発現されるようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログと相互作用する。前記アイソフォームまたは変異体は、とりわけ、アレル変異体またはスプライス変異体を含む。
【００５９】
用語「変異体」は、これに関連して、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのヌクレオチド配列、およびコードされるＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのアミノ酸配列が、それぞれ、前記ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号のもとで入手可能な別個の配列と、突然変異、例えば欠失、付加、置換、反転等によって、異なることを意味する。
【００６０】
したがって、本発明にしたがって使用されるべきアンチセンス分子は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをコードする１以上の核酸分子に特異的に相互作用する／ハイブリダイズする。好ましくは、前記核酸分子は、ＲＮＡ、すなわちプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡである。用語「ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをコードする１以上の核酸分子に特異的に相互作用する／ハイブリダイズする」は、本発明に関連して、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現に干渉することが可能な、アンチセンス分子に関する。当業者は、アンチセンス構築物が、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをコードする配列に特異的に相互作用する／ハイブリダイズするかどうかを容易に推定可能である。これらの試験は、限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット、ノースウェスタンブロット、核磁気共鳴および蛍光結合アッセイ、ドットブロット、マイクロアレイおよびマクロアレイ、ならびに定量的ＰＣＲを含む。さらに、こうしたスクリーニングは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログｍＲＮＡ分子に限定されず、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログｍＲＮＡ／タンパク質（ＲＮＰ）複合体も含むことも可能である（Ｈｅｒｍａｎｎ、２０００；ＤｅＪｏｎｇら、２００２）。さらに、特定のアンチセンス構築物が、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをコードする核酸分子に特異的に相互作用する／ハイブリダイズすることが可能であるかどうかを試験するため、付随する実施例に提供するような機能試験が、想定される。これらの機能アッセイは、実施例に提供するユビキチン化アッセイを含む。これらの機能試験にはまた、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫沈降アッセイ、およびとりわけＧＦＰレポータ
ー遺伝子融合に基づくバイオアッセイが含まれることも可能である。
【００６１】
用語「アンチセンス分子」は、本明細書において、特に、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含む。前記のアンチセンス・オリゴヌクレオチドはまた、修飾ヌクレオチド、ならびに修飾ヌクレオシド間連結、とりわけＵＳ  ６，１５９，６９７に記載されるようなものを含むことも可能である。最も好ましくは、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１４ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１６ヌクレオチドを含む。アンチセンス分子の推定ならびに調製は、当該技術分野に熟知されている。アンチセンス分子の推定は、とりわけ、Ｓｍｉｔｈ、２０００に記載される。一般的な方法は、「遺伝子ウォーキング」、ＲＮアーゼＨマッピング、ＲＮアーゼＬマッピング（ＬｅａｍａｎおよびＣｒａｍｅｒ、１９９９）、固体支持体上のコンビナトリアル・オリゴヌクレオチドアレイ、コンピュータ法による二次構造分析の決定（Ｗａｌｔｏｎ、２０００）、構築された核酸をターゲティングするアプタマー・オリゴヌクレオチド（ａｐｔａｓｔｒｕｃ）、束縛されたオリゴヌクレオチドプローブ、折りたたみ三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＦＴＦＯ）（Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ、１９９４）および最小限の非特異的結合を伴う配列の選択（Ｈａｎ、１９９４）である。
【００６２】
好ましくは、本発明のアンチセンス分子は、分解に対して安定化される。こうした安定化法は、当該技術分野に知られ、そしてとりわけ、ＵＳ  ６，１５９，６９７に記載される。オリゴヌクレオチドを分解から保護すると記載される、さらなる方法には、リンカーによって架橋されるオリゴヌクレオチド（Ｖｏｒｏｂｊｅｖ、２００１）、細胞ヌクレアーゼ活性にしたがって最小限に修飾された分子（Ｓａｍａｎｉ、２００１）、２’Ｏ−ＤＭＡＯＥオリゴヌクレオチド（Ｐｒａｋａｓｈ、２００１）、３’５’−ジペプチジルオリゴヌクレオチド（Ｓｃｈｗｏｐｅ、１９９９）、３’メチレンチミジンおよび５−メチルウリジン／シチジンｈ−ホスホネートおよびホスホンアミダイト（Ａｎ、２００１）、ならびにアニオン性リポソーム（Ｄｅ  Ｏｌｉｖｅｉｒａ、２０００）またはイオン化可能アミノ脂質（Ｓｅｍｐｌｅ、２０００）被包が含まれる。
【００６３】
本発明の好ましい態様において、アンチセンス分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９からなる群より選択されるＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのコード領域の逆相補鎖の相補鎖である核酸分子である。配列番号１、３、５、７、９、１１または１２に示すような配列は、Ｃ．エレガンス、ヒト、ゼブラフィッシュ、マウスまたはラットの実例となるコード領域（ｍＲＮＡ）に相当し、これによって、配列番号１および１１はヒトの配列に相当し、そして配列番号９および１２はラットの配列に相当する。配列番号２、４、６、８または１０は、それぞれ、Ｃ．エレガンス、ヒト、ゼブラフィッシュ、マウスまたはラットの翻訳されたＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログに相当する。したがって、本発明に関連して、そして本明細書において、上記に強調されるように、本明細書記載の使用において使用されるべきＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤は、好ましくは、配列番号２、４、６、８または１０に示すようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ分子をコードするかまたはその発現をもたらす核酸分子のプロモーターおよび／またはコード領域と相互作用する。例えば、本発明にしたがって設計されそして用いられるアンチセンス構築物が、配列番号２、４、６、８または１０に示すようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ分子の機能性相同体、変異体（例えばアレル性変異体）またはアイソフォームの発現を阻害することもまた想定される。
【００６４】
本発明に関連して、用語「ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソロ
グのコード領域」は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの翻訳された領域を含むだけでなく、翻訳されない領域も含む。したがって、本発明にしたがって用いられ、そして使用されるべき抗ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのアンチセンス分子は、翻訳されない領域を含むｍＲＮＡ配列と結合する／相互作用するアンチセンス分子であることも可能である。
【００６５】
本発明はまた、筋疾患を予防し、改善し、そして／または治療するための方法であって、こうした方法が必要な被験者に、本明細書において上に定義するような、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現または機能の特異的阻害剤を投与することを含む、前記方法にも関する。好ましくは、前記被験者は哺乳動物であり、最も好ましくは前記哺乳動物はヒトである。
【００６６】
本発明の目的のため、「患者」または「被験者」には、ヒトおよび他の動物両方、特に哺乳動物、および他の生物が含まれる。したがって、方法は、ヒト療法および獣医学的適用の両方に適用可能である。好ましい態様において、患者は哺乳動物であり、そして最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【００６７】
最も好ましくは、本発明にしたがって調製されようとし、そして抗ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの発現および／または機能阻害剤（単数または複数）を含む薬剤組成物は、以下の様式の１つまたはいくつかによって投与されるものである：投与は、経口、静脈内、動脈内、気管内、鼻内、皮下、筋内、頭蓋内（すなわち脳室内）または脊髄内（クモ膜下内）、上皮または経皮、肺（例えばエアロゾルまたは粉末の吸入または吹送）であることも、口腔粘膜または結腸粘膜への送達によることも、ならびに眼送達によることも可能である。本発明に関連して好ましいのは、筋内投与である。
【００６８】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤の投薬および投与措置は、医師によって確立可能である。例えば、アンチセンス化合物に関しては、同様のアンチセンス・ヌクレオチド特異的投薬措置が確立されてきている。こうした措置は、１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｍ２までの投薬量を含み、そしてとりわけ、Ｓｃｈｒｅｉｂｎｅｒ（２００１），  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２０，  １３９９−１３４５；Ａｎｄｒｅｗｓ（２００１），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １９，  ２１８９−２２００；Ｂｌａｙ（２０００），  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．
２，  ４６８−４７２；Ｃｕｎｎｉｇｈａｍ（２０００），  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６，  １６２６−１６３１；Ｗａｔｅｒｓ（２０００），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １８，  １８０９−１８１１またはＹａｃｙｓｈｙｎ（１９９８），  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１４，  １１３３−１１４２に記載される。例えば、本明細書記載のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ阻害剤、例えばアンチセンス化合物、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ等が、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日（ｄｉｅ）（例えば２〜８時間に渡るｉ．ｖ．）の単回用量で、１日おきの単回用量または複数の用量として、あるいは１４〜２１日間に渡り、７日間の停止を伴う、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の連続注入（単数または複数）によって投与されることが想定される。特定の臨床徴候または医学的徴候においては、本明細書に開示するようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰまたはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤を、単回用量で投与することが望ましい可能性もあることが特に注目される。さらなる投薬措置が想定され、そして医師によって容易に確立可能である。
【００６９】
最も好ましい態様において、本発明の薬剤組成物、使用または方法において、ＣＨＮ−１オルソログまたはＣＨＩＰオルソログは、配列番号１（Ｃ．エレガンス）；配列番号３（ヒト）；配列番号５（ゼブラフィッシュ）；配列番号７（マウス）；配列番号９（ラット）、配列番号１１（ヒト）または配列番号１２（ラット）に示すようなヌクレオチド配
列にコードされるＣＨＮ−１分子またはＣＨＩＰ分子からなる群より選択される。
【００７０】
したがって、本発明に関連して使用されるべきＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ分子は、限定されるわけではないが、本明細書に開示するような核酸配列によってコードされる分子を含む。やはり想定されるのは、配列番号２、４、６、８または１０に示すようなアミノ酸配列に、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最も好ましくは少なくとも８５％同一である、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログである。配列番号１および１１はヒトＣＨＩＰ（配列番号４を参照されたい）をコードし、一方、配列番号９および１２はラットＣＨＩＰ（配列番号１０を参照されたい）をコードすることが注目される。
【００７１】
さらに想定されるのは、配列番号１、３、５、７、９、１１または１２に示すようなポリヌクレオチドに、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最も好ましくは少なくとも８５％同一である核酸配列にコードされる、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログである。
【００７２】
さらに、用語、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログは、配列番号２、４、６、８または１０のいずれかに示すようなポリペプチドに、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％相同である分子を含む。
【００７３】
用語「ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ」はまた、本明細書に開示するＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの機能性断片も含む。機能性断片は、本明細書および実験部分に記載するようなユビキチン化、ならびにＵＦＤ２との相互作用、他のＥ３酵素との相互作用、Ｅ２酵素との相互作用、あるいはＵＮＣ−４５またはＵＮＣ−４５の断片との相互作用が可能である断片である。
【００７４】
本発明にしたがって、用語「核酸配列」は、核酸分子に含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基の配列を意味し、これによって、前記塩基は、核酸分子の一次構造に相当する。核酸配列には、センスおよびアンチセンス鎖両方の、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、合成型および混合ポリマーが含まれ、また当業者には容易に認識されるであろうように、核酸配列は、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有することも可能である。
【００７５】
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、所定の長さのアミノ酸鎖を含む、ペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを意味し、ここでアミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結されている。しかし、アミノ酸（単数または複数）および／またはペプチド結合（単数または複数）が、機能する類似体、ならびに遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のもの、例えばセレノシステインで置換されている、こうしたタンパク質／ポリペプチドのペプチド擬似体もまた、本発明に含まれる。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドと称することも可能である。用語、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書において、しばしば、交換可能に用いられる。用語、ポリペプチドはまた、ポリペプチドの修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等も指し、そしてこれらを排除しない。こうした修飾は、基本的な教科書、およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究文献によく記載されている。
【００７６】
核酸配列が、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログをコードする核酸配列に、ある度合いの同一性を有するかどうかを決定するため、当業者は、当該技術分野に周知の手段および方法、例えば並列を、手動で、または用語「ハイブリダイゼーション」および相同性の度合いの定義と関連して以下にさらに言及するものなどのコンピュータ・プログラムを用いることによって用いることも可能である。
【００７７】
例えば、基本的局所並列検索ツールを表すＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１９９７），  ３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６（１９９３），  ２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５（１９９０），  ４０３−４１０）を用いて、局所配列並列に関して検索することも可能である。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の両方の並列を生じて、配列類似性を決定する。並列が局所性であるため、ＢＬＡＳＴは、正確なマッチを決定する際に、または類似の配列を同定する際に、特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位は、ハイスコアリング・セグメント対（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、並列が局所で最大であり、そして並列スコアが、使用者に設定された閾値スコアまたは切り捨てスコアを満たすかまたはこれらを超える、任意のしかし等しい長さの２つの配列断片からなる。ＢＬＡＳＴアプローチは、クエリー配列およびデータベース配列間のＨＳＰを探して、見出されたマッチいずれの統計的有意性も評価して、そして使用者が選択した有意性の閾値を満たすマッチのみを報告するものである。パラメーターＥは、データベース配列マッチを報告するための統計的に有意な閾値を確立する。Ｅは、全データベース検索の関連の中で、ＨＳＰ（またはＨＳＰセット）の偶発的存在の予期される頻度の上限と解釈される。そのマッチがＥを満たすデータベース配列をいずれも、プログラム出力中に報告する。
【００７８】
ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７）前掲；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）、前掲；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）、前掲）を用いた類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどのヌクレオチド・データベース中の同一分子または関連分子に関して検索する。この分析は、多数の膜に基づくハイブリダイゼーションよりはるかに速い。さらに、コンピュータ検索の感受性を修飾して、特定のマッチいずれかが正確であるかまたは類似であると分類されるかどうか、決定することも可能である。検索の基本は：
配列同一性％ｘ最大ＢＬＡＳＴスコア％
１００
と定義される積のスコアであり、そしてこれは２つの配列間の類似性の度合いおよび配列マッチの長さの両方を考慮に入れる。例えば、積のスコアが４０であると、マッチは１〜２％のエラー内で正確であろうし；そして７０であると、マッチは正確であろう。類似の分子は、通常、１５〜４０の間の積のスコアを示すものを選択することによって、同定されるが、より低いスコアが関連する分子を同定することも可能である。
【００７９】
本発明はまた、上述の核酸分子の１つにハイブリダイズし、そしてＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１活性を有する核酸分子にも関する。用語「ハイブリダイズする」は、本発明にしたがって使用した際、ストリンジェントな条件下または非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに関することも可能である。さらに明記しない限り、好ましくは、条件は非ストリンジェントである。前記のハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，  "Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ"，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｎ．Ｙ．（１９８９）、またはＨｉｇｇｉｎｓおよびＨａｍｅｓ（監修）  "Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ" ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，  （１９８５）に記載される慣用的プロトコルにしたがって、確立することも可能である。条件の設定は、十分に当業者の技術範囲内であるし、そして当該技術分野に記載されるプロトコルにしたがって決定可能である。したがって、特異的にハイブリダイズする配列のみの
検出は、通常、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を必要とするであろう。相同な、または正確には相補的でない配列を検出するための非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃に設定可能である。周知であるように、プローブの長さおよび決定しようとする核酸の組成が、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑制するのに用いられる別のブロッキング試薬を含み、そして／またはこうした試薬と交換することを通じて、上述の条件における変動を達成することも可能であることに注目されたい。典型的なブロッキング試薬には、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および商業的に入手可能な専売（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配合物が含まれる。適合性の問題のため、特定のブロッキング試薬の包含には、上述のハイブリダイゼーション条件の修飾が必要である可能性もある。ハイブリダイズする核酸分子はまた、上述の分子の断片も含む。こうした断片は、少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２１ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも６０ヌクレオチドの長さを有する核酸配列に相当することも可能である。さらに、前述の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子にはまた、これらの分子の相補的断片、誘導体およびアレル性変異体も含まれる。さらに、ハイブリダイゼーション複合体は、相補的ＧおよびＣ塩基の間、ならびに相補的ＡおよびＴ塩基の間の水素結合の形成による、２つの核酸配列間の複合体を指し；これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化されることも可能である。２つの相補的核酸配列は、逆平行立体配置で水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で（例えばＣｏｔまたはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する１つの核酸配列および固体支持体（例えば膜、フィルター、チップ、ピン、または例えば細胞が固定されているガラススライド）上に固定される別の核酸配列間で形成可能である。用語、相補的または相補性は、塩基対形成による、許容されうる塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの天然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、「部分的」であることも可能であり、この場合、核酸のいくつかのみが結合するか、または一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合には、完全であることも可能である。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して有意な効果を有する。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において、特に重要である。
【００８０】
用語、「ハイブリダイズする配列」は、好ましくは、上述のコードＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのような核酸配列と、上述のように、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、さらに特に好ましくは少なくとも９０％、さらにより特に好ましくは少なくとも９５％、９７％または９８％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す配列を指す。さらに、用語「ハイブリダイズする配列」は、好ましくは、本明細書に上述するようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログのアミノ酸配列と、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８０％、より特に好ましくは少なくとも９０％、さらにより特に好ましくは少なくとも９５％、９７％または９８％、そして最も好ましくは少なくとも９９％の同一性のＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログをコードする配列を指す。
【００８１】
本発明にしたがって、用語「同一」または「同一性パーセント」は、２以上の核酸配列またはアミノ酸配列と関連して、比較ウィンドウに渡って、または当該技術分野に知られるような配列比較アルゴリズムを用いて測定されるような、指定された領域に渡って、あるいは手動並列および視覚的検査によって、最大応答に関して比較しそして並列した際、
同一であるか、または明記される割合の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（例えば６０％または６５％同一性、好ましくは７０〜９５％同一性、より好ましくは９５％、９７％、９８％または９９％同一性）、２以上の配列または下位配列を指す。例えば６０％〜９５％またはそれより高い配列同一性を有する配列は、実質的に同一であると見なされる。こうした定義はまた、試験配列の相補体にも適用される。好ましくは、記載する同一性は、長さ少なくとも約１５〜２５アミノ酸またはヌクレオチドである領域に渡って、より好ましくは、長さ約５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドである領域に渡って存在する。当業者は、配列間／配列のうちの同一性パーセントを、例えば当該技術分野に知られるような、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータ・プログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２（１９９４），  ４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ６（１９９０），  ２３７−２４５）に基づくものなどのアルゴリズムを用いて、どのように決定するかを知るであろう。
【００８２】
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは、典型的には、計算において、配列中の内部非マッチ欠失または付加、すなわちギャップを考慮しないが、同一性％の過大評価を回避するため、これを手動で修正することも可能である。しかし、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、同一性計算において、ギャップを考慮に入れる。当業者にやはり利用可能であるのは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＳＡＴ２．０アルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１９９７），  ３３８９−３４０２）。核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、および１０の期待値（Ｅ）を用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８９，  （１９８９），  １０９１５）は、５０の並列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を用いる。
【００８３】
さらに、本発明は、その配列が上述のハイブリダイズする分子の配列と比較して縮重している、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログをコードする核酸分子を使用し、そしてこうした分子に関連する。本発明にしたがって用いる場合、用語「遺伝暗号の結果として縮重している」は、遺伝暗号の冗長のため、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。
【００８４】
ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１オルソログをコードする核酸分子は、いかなる種類の核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）であることも可能である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡ類似体のポリアミド型であり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンの単量体単位が商業的に入手可能である（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００８５】
ＤＮＡの特定の構成要素、例えばリン、酸化リン、またはデオキシリボース誘導体は、ＰＮＡには存在しない。Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７（１９９１）；およびＥｇｈｏｌｍら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６６６（１９９３）に開示されるように、ＰＮＡは、相補的ＤＮＡ鎖に特異的にそして緊密に結合し、そしてヌクレアーゼによっては分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合するよりも、より強くＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電反発力がないためであり、そしてまた、ポリアミド主鎖がより柔軟であるためであろう。このため、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも、より広い範囲のストリンジェンシー条件下で結合し、多重ハイブリダイゼーションを行うことがより容易になる。結合が強いため、ＤＮＡを用いるより小さいプローブが使用可能である。さらに、ＤＮＡ／ＤＮＡ  １５量体二重鎖
の単一ミスマッチは融点（Ｔｍ）を４〜１６℃低下させるのに対して、ＰＮＡ／ＤＮＡ  １５量体では、８〜２０℃低下させるため、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いると、単一塩基ミスマッチを決定可能である可能性がより高い。また、ＰＮＡ中には荷電基が存在せず、これは、低いイオン強度でハイブリダイゼーションが実行可能であり、そして分析中の塩による干渉の可能性を減少させることが可能であることを意味する。ＤＮＡは、例えばｃＤＮＡであることも可能である。好ましい態様において、ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。ＲＮＡは、例えばｍＲＮＡであることも可能である。核酸分子は、天然、合成、または半合成であることも可能であるし、あるいは核酸分子は、誘導体、例えばペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（１９９１）１４９７−１５００）またはホスホロチオエートであることも可能である。さらに、核酸分子は、単独でまたは組み合わせてのいずれかで、前述の核酸分子いずれかを含む、組換え的に産生されるキメラ核酸分子であることも可能である。
【００８６】
上記で指摘するように、そして本明細書に提供するｉｎ  ｖｉｖｏ実験に例示するように、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１阻害剤、アンタゴニストまたは負の制御因子は、筋疾患またはミオパシーの治療、改善または予防に特に有用である。前記ミオパシーまたは筋疾患は、好ましくは、筋ジストロフィーである。前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型ジストロフィー、顔面肩甲上腕型ジストロフィー、筋緊張性異栄養症、ベッカー型筋ジストロフィーからなる群より選択されることも可能である。しかし、最も好ましいのは、ＤＭＤの治療である。
【００８７】
本発明のさらなる態様において、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性、機能または発現の阻害剤、アンタゴニストまたは負の制御因子をスクリーニングするための方法を提供し、ここで前記方法は
（ａ）ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰを発現しているか、またはＣＨＮ−１／ＣＨＩＰを発現可能である、細胞または非ヒト生物と、試験しようとする化合物を接触させ；
（ｂ）試験しようとする前記化合物と接触させていない細胞に比較した際の、前記化合物の存在下の前記細胞または前記非ヒト生物の細胞におけるユビキチン化またはマルチユビキチン化の状態を決定し；そして
（ｃ）ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性、機能または発現を阻害する化合物を同定する
工程を含む。
【００８８】
当業者は、（培養）細胞または生物の細胞において、ユビキチン化／マルチユビキチン化状態を容易に推定する／決定する立場にある。対応する例を、本発明の実験部分に提供する。
【００８９】
当業者は、本明細書記載の方法のいずれかにしたがって同定され、そして／または性質決定されるべき、試験化合物の阻害効果および／または特性を解明するため、本明細書記載の化合物および本発明の方法を容易に使用可能であり、そしてどれがＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの機能、活性または発現の阻害剤であるか、推定可能である。
【００９０】
用語「試験化合物」または「試験しようとする化合物」は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの機能、活性または発現の推定上の阻害剤として、本発明の１以上のスクリーニング法（単数または複数）によって試験しようとする、分子または物質または化合物または組成物または剤あるいはそのいかなる組み合わせも指す。試験化合物は、いかなる化学薬品、例えば無機化学薬品、有機化学薬品、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、またはその組み合わせ、あるいは本明細書記載の化合物、組成物または剤であることも可能である。用語「試験化合物」は、本発明に関連して用いた場合、用語「試験分子」、「試験物質」、「潜在的候補」、「候補」または本明細書に上述する用語と交換可能であることが理解されるものとする。
【００９１】
したがって、本明細書に上述するような小ペプチドまたはペプチド様分子は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの機能、活性または発現の阻害剤（単数または複数）のスクリーニング法において使用されると想定される。こうした小ペプチドまたはペプチド様分子は、タンパク質の活性部位に結合し、そして該部位を占有し、それによって、触媒部位に基質がアクセス不能であるようにして、正常な生物学的活性が妨げられるようにする。さらに、いかなる生物学的または化学的組成物（単数または複数）または物質（単数または複数）もＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ阻害剤として想定可能である。当該技術分野に知られる方法によって、そして本明細書記載の方法によって、阻害剤の阻害機能を測定することも可能である。こうした方法は、免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡのような相互作用アッセイ、ならびに付随する実施例に提供するアッセイのような特異的アッセイを含む。本出願に関連して、本明細書に記載するようなＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログを発現する細胞を、スクリーニングアッセイに用いることが想定される。付随する実施例に示すようなユビキチン化／マルチユビキチン化の経路の要素、例えば酵素が使用可能であることもまた想定される。前記酵素は、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログを発現する全細胞抽出物または細胞に存在することも可能であるし、あるいは前記酵素は、本明細書の以下に記載するように、精製されるか、部分的に精製されるか、または組換え的に発現されることも可能である。
【００９２】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログまたは本明細書に定義しそして記載するユビキチン化／マルチユビキチン化経路の要素を発現する細胞と接触させる際に使用するべき、やはり好ましい潜在的な候補分子または候補分子混合物は、とりわけ、化学的起源または生物学的起源であり、天然存在であり、そして／または合成的に、組換え的に、そして／または化学的に産生される、物質、化合物または組成物であることも可能である。したがって、候補分子は、本明細書の以下の実験部分に詳細に記載する、本明細書に定義する酵素および／またはその断片と同様に、本明細書に定義するユビキチン化／マルチユビキチン化経路の要素と結合し、そして／または相互作用する、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、アミノ酸および／またはその誘導体、あるいは他の化合物、例えばイオンであることも可能である。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，  Ｃｏｒｎｗａｌｌ，  ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，  Ｎ．Ｈ．）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎ．）から商業的に入手可能である。まれな化学薬品ライブラリーがＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  Ｗｉｓ．）から入手可能である。あるいは細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーが、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，  Ｗａｓｈ．）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（Ｎ．Ｃ）から入手可能であり、あるいは容易に産生可能である。さらに、天然にそして合成で産生されるライブラリーおよび化合物が、慣用的な化学的、物理的、および生化学的手段を通じて、容易に修飾される。
【００９３】
さらに化学ライブラリーの生成が当該技術分野に周知である。例えば、コンビナトリアルケミストリーは、本明細書に記載するアッセイにおいてスクリーニングされるべき化合物のライブラリーを生成するのに用いられる。コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成または生物学的合成いずれかによって、いくつかの化学的「構築ブロック」試薬を組み合わせることによって生成される、多様な化学的化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖コンビナトリアル化学ライブラリーは、すべてのあり得る組み合わせでアミノ酸を組み合わせて、所定の長さのペプチドを生じることによって形成される。化学的構築ブロックのこうした組み合わせた混合を通じて、理論的には、何百万もの化学的化合物が合成可能である。例えば、解説者の１人は、１００の交換可能な化学的構築ブロックを体系的に組み合わせて混合すると、１億の四量体化合物また
は１００億の五量体化合物の理論的合成が生じることを観察した（Ｇａｌｌｏｐ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．３７，  Ｎｏ．９，  １２３３−１２５０（１９９４））。天然産物ライブラリーを含む、当業者に知られる他の化学ライブラリーもまた、使用可能である。ひとたび生成したならば、望ましい生物学的特性を所持する化合物に関して、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする。例えば、薬剤として、または薬剤を開発するために有用でありうる化合物は、本明細書に記載するように同定され、発現され、そして精製されたターゲットタンパク質に結合する能力を有する可能性がある。
【００９４】
本発明に関連して、化合物のライブラリーをスクリーニングして、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤として機能する化合物を同定する。まず、当該技術分野に周知のコンビナトリアルライブラリー形成法を用いて、小分子のライブラリーを生成する。米国特許第５，４６３，５６４号および第５，５７４，６５６号は、こうした解説の２つである。次いで、ライブラリー化合物をスクリーニングして、所望の構造特性および機能特性を所持する化合物を同定する。米国特許第５，６８４，７１１号は、ライブラリーをスクリーニングするための方法を論じる。スクリーニング・プロセスを例示するため、ターゲット細胞または遺伝子産物およびライブラリーの化学的化合物を合わせ、そして互いに相互作用するのを可能にする。標識された基質をインキュベーションに添加する。基質上の標識は、代謝された基質分子から検出可能なシグナルが放出されるようなものである。このシグナルの放出によって、コンビナトリアルライブラリー化合物の非存在下で放出されるシグナルに比較して、ターゲット酵素の酵素活性に対するコンビナトリアルライブラリー化合物の影響を測定することが可能になる。細胞／酵素に対して活性を示す化合物を分析し、そして同定された多様な化合物に共通の特徴を単離し、そしてライブラリーの将来の反復に組み合わせることが可能であるように、各ライブラリー化合物の特性を符号化する。化合物ライブラリーをひとたびスクリーニングしたならば、最初の周期のスクリーニングにおいて、ターゲット細胞／酵素に対する活性を有することが示された特徴を所持する化学的構築ブロックを用いて、続くライブラリーを生成する。この方法を用いて、候補化合物の続く反復は、酵素に対して高い特異性を持つ（酵素）阻害剤のグループを見出すことが可能になるまで、ターゲット細胞／酵素の機能を阻害するのに必要な構造特徴および機能特徴をますます多く所持するであろう。次いで、哺乳動物などの動物において使用するための抗生物質として、安全性および有効性に関して、これらの化合物をさらに試験することも可能である。この特定のスクリーニング方法論が例示のみであることが容易に認識されるであろう。当業者には、他の方法が周知である。例えば、ターゲットタンパク質の生化学的機能が知られる場合、多数の天然存在ターゲットに関して、非常に多様なスクリーニング技術が知られる。例えば、いくつかの技術は、薬剤リードを同定し、そして開発するために、生化学的および遺伝子的の両方で、ターゲットタンパク質を探査し（ｐｒｏｂｅ）そして分析するため、小ペプチドを生成しそして使用することを伴う。こうした技術には、ＰＣＴ公報第ＷＯ  ９９／３５４９４号、第ＷＯ  ９８／１９１６２号、第ＷＯ  ９９／５４７２８号に記載される方法が含まれる。
【００９５】
好ましくは、試験されるべき候補剤は、多くの化学種を含むが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは５０ダルトンより大きく、そして約２，５００ダルトン未満、好ましくは約７５０ダルトン未満、より好ましくは約３５０ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物である。候補剤はまた、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合形成に必要な官能基を含むことも可能であり、そして典型的には、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基の少なくとも１つ、好ましくは官能化学基の少なくとも２つを含む。候補剤はしばしば、上記官能基の１以上で置換された、炭素環または複素環構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。
【００９６】
典型的な種類の候補剤は、複素環、ペプチド、サッカリド、ステロイド等を含むことも
可能である。化合物を修飾して、有効性、安定性、薬学的適合性等を増進することも可能である。剤の構造的同一性を用いて、さらなる剤を同定し、生成し、またはスクリーニングすることも可能である。例えば、ペプチド剤を同定する場合、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、特にＤ−アラニンを用いるか、アミノ末端またはカルボキシル末端を官能化することによって、例えばアミノ基に関してはアシル化またはアルキル化によって、そしてカルボキシル基に関してはエステル化またはアミド化によって、または同様の方式によって、多様な方式でこれらを修飾して、安定性を増進することも可能である。安定化の他の方法は、例えばリポソーム中の被包等を含むことも可能である。
【００９７】
上述のように、候補剤はまた、ペプチド、アミノ酸、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸、およびその誘導体、構造類似体または組み合わせを含む生体分子の中にも見出される。候補剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、非常に多様な供給源から得られる。例えば、非常に多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および指定合成のため、多様な手段が利用可能であり、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーが入手可能であり、または容易に産生される。さらに、天然にまたは合成的に産生されるライブラリーおよび化合物が、慣用的な化学的、物理的および生化学的手段を通じて容易に修飾され、そしてこれを用いて、コンビナトリアルライブラリーを産生することも可能である。既知の薬理学的剤を、指定またはランダム化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等に供して、構造類似体を産生することも可能である。
【００９８】
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤をスクリーニングする出発点として使用されるべき他の候補化合物は、アプタマー、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡザイム、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、抗体、アフィボディ（ａｆｆｙｂｏｄｉｅｓ）、トリネクチン（ｔｒｉｎｅｃｔｉｎｓ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、または本明細書に記載する類似の化合物である。これらの候補化合物は、したがって、本明細書に提供する薬剤組成物、使用および医学的方法において、使用されるべき化合物でもある。したがって、当業者は、とりわけ、候補化合物がＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの活性、機能または発現を阻害する能力を改善するかまたはさらに発展させる基礎として、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤に関するスクリーニング法において使用可能なこうした候補化合物を、自由に有することが容易に出来る立場にある。したがって、当業者は、当該技術分野に知られる方法によって、こうした化合物を容易に修飾して、本発明の意味において、阻害剤として作用する能力を改善することも可能である。１以上の前述の化合物が、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの活性、機能または発現を阻害する能力を、上述のように試験する。
【００９９】
本発明の１つの態様において、本明細書に記載するようなユビキチン化／マルチユビキチン化に関与する酵素を単離し、そして発現させる。次いで、潜在的な薬剤候補に関して化合物のライブラリーをスクリーニングするアッセイにおいて、これらの組換えタンパク質をターゲットまたは基質として用いることも可能である。
【０１００】
上述のように、細胞に基づくスクリーニングアッセイもまた、本発明の範囲内にある。薬剤発見および開発のため、化合物を同定するかまたは性質決定するのに用いられる現在の細胞に基づくアッセイは、しばしば、試験化合物が、細胞内に位置するか、または細胞表面上に位置するターゲット分子の活性を調節する能力を検出することに依存する。ほとんどの場合、こうしたターゲット分子は、酵素等のタンパク質である。試験化合物と指定のターゲット分子の結合および相互作用を検出する、いくつかの非常に高感度の細胞に基づくアッセイ法が、当業者に利用可能である。
【０１０１】
薬剤化学およびコンビナトリアルケミストリーの技術分野で使用される現在の方法は、直接結合アッセイおよび細胞に基づくアッセイを含む、多様な生物学的アッセイにおいて、試験化合物から得られる構造−活性関係の情報を利用することが可能である。こうしたアッセイにおいて、時折、薬剤として開発されるのに十分強力な化合物が、直接同定される。より頻繁には、最初にヒットする化合物は、中程度かまたは低い強度を示す。低い強度または中程度の強度を持つヒット化合物が同定されたならば、より強力なリードを同定するために、化合物の指定ライブラリーを合成して、そして試験する。一般的には、これらの指定ライブラリーは、ヒット化合物と関連する構造を持つが、多様な構造特徴の付加、欠失および置換を含む、体系的な変動を含有する化合物からなる、コンビナトリアル化学ライブラリーである。ターゲット分子に対する活性に関して試験する際、単独で、または他の特徴と組み合わせてのいずれかで、活性を増進させるかまたは減少させる構造特徴を同定する。この情報を用いて、ターゲット分子に対して増進した活性を持つ化合物を含有する次の指定ライブラリーを設計する。このプロセスを１回または数回反復した後、ターゲット分子に対して、実質的に活性が増加した化合物が同定され、そしてこれをさらに薬剤として発展させることも可能である。本発明の感作された細胞に基づくアッセイにおいて、選択されるターゲットで作用する化合物は、増加した強度を示し、したがってより多くの化合物が、ここで、別の方式で得られるであろうより多くの情報を提供して性質決定可能であるため、このプロセスは、本発明の感作された細胞の使用によって促進される。
【０１０２】
前記スクリーニング法で用いられるべき非ヒト生物は、好ましくは、Ｃ．エレガンス、酵母、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコからなる群より選択される。
【０１０３】
最も好ましい態様において、使用されるべき前記非ヒト生物は、トランスジェニック生物である。用いられるべきＣ．エレガンスは、とりわけ、ｄｙｓ−１遺伝子の突然変異体、またはｄｙｓ−１およびｈｌｈ−１遺伝子に突然変異を持つ株、あるいは好ましくは活性または発現を減少させるかまたは改変するコード領域の欠失または点突然変異を持つ、Ｋ０８Ｂ１２．５（ｄｍｐ−１）の突然変異体、あるいはｕｎｃ−６０（コフィリン）の突然変異体であることも可能である。
【０１０４】
やはり本発明の態様は、薬剤組成物を調製するための方法であって
（ａ）上に開示する方法によって、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ活性を阻害するかまたは負に制御することが可能な化合物を同定し；そして
（ｂ）前記化合物を、薬学的に許容しうるキャリアーとともに配合する
工程を含む、前記方法である。
【０１０５】
本発明はまた、二重突然変異を含む非ヒトトランスジェニック動物にも関し、ここで、前記突然変異の第一のものは、筋疾患の表現型をもたらす、遺伝子中の修飾を含む。ここで、前記の第一の突然変異は、ジストロフィン、ユートロフィン、α−、β−、γ−、δ−サルコグリカン、ラミニン−α２、ジスフェリン、インテグリンα５、インテグリンα７、α−ジストロブレビン、α−ジストログリカン、カルパイン３、ラミンＡ、ＬＡＲＧＥ、カベオリン３、ＣＨＩＰ遺伝子における突然変異からなる群より選択され、そして前記突然変異の第二のものは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログにおける突然変異を含む。筋疾患をもたらす遺伝子中の修飾を含む、トランスジェニック非ヒト動物が当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが：
【０１０６】
【表１−１】
2008508224.tif 000002
【０１０７】
【表１−２】
2008508224.tif 000003
【０１０８】
を含む。
好ましくは、前記非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ならびにショウジョウバエである。前記突然変異は、好ましくは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ「ノックアウト」突然変異、または例えばｃｒｅ／ｌｏｘ系に基づく「条件付きノックアウト」突然変異である。対応するノックアウト動物（マウス）が当該技術分野に知られ；例えばＤａｉら（２００３）を参照されたい。
【０１０９】
しかし、特に本明細書に提供するスクリーニングアッセイにおいて、前記二重トランスジェニック非ヒト動物において、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログにおけるさらなる突然変異または他の突然変異が含まれていることも可能である。したがって、前記突然変異はまた、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログ過剰発現突然変異、またはより活性があるＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログをもたらす突然変異であることもまた可能である。機能しない分子またはより機能しない分子をもたらす、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログにおける突然変異もまた、本明細書に提供する二重トランスジェニック非ヒト動物に含まれると想定される。やはり想定されるのは、本明細書に提供するスクリーニング法における単一トランスジェニック非ヒト動物の使用である。好ましくは、前記の単一トランスジェニック非ヒト動物は、ＣＨＩＰオルソログを過剰発現するか、またはより活性であるＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの機能をもたらす動物である。
【０１１０】
非ヒトトランスジェニック動物を、本明細書に開示するスクリーニング法において、使用することも可能である。特に好ましいのは、ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ、ＣＨＩＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの阻害剤／アンタゴニスト／負の制御因子に関する試験におけるこれらの動物（本明細書記載の単一または二重トランスジェニック）である。これらの動物を用いた試験は、限定されるわけではないが：ａ）力測定；ｂ）組織学；ｃ）免疫組織化学；ｄ）ＣＫ測定またはｅ）膜安定性を含むことも可能である。これらの試験は、適用可能である場合、生存動物を用いた試験に限定されず、前記動物由来の臓器、組織または細胞を用いた試験を含むものである。
【０１１１】
動物の力を測定する技術は、例えば握力の測定を含む。さらに、単離された筋肉に対して、特定の痙攣力、特定の強縮（ｔｅｔａｎｉｃ）力、伸張性収縮に対する抵抗性または等尺性強縮力を測定することも可能である。前記の単離された筋肉は、例えばＥＤＬ、四頭筋、前脛骨筋、ヒラメ筋および横隔膜を含む。
【０１１２】
例えば筋横断切片上またはウェスタンブロット上で、試験動物の組織学の研究を行うこ
とも可能である。ジストロフィー筋は、健康な筋肉から特定の逸脱を示し、これは末梢に位置する核を持つ、多角形型でそして巨大な等しい細胞によって特徴付けられる。筋線維形状を決定するため、横断切片に対してＨ＋Ｅ染色を行うことも可能である。さらなる組織学的分析は、結合組織および脂肪組織を視覚化するファン・ギーソン染色（線維症）、ジストロフィー筋における中央核生成を評価する核ビスベンズイミド染色、または代謝線維型（解糖線維型に対する酸化線維型）を明らかにするＮＡＤＨ−テトラゾリウム・レダクターゼ染色を含む。
【０１１３】
例えば筋肉横断切片に対して、免疫組織化学を行って、筋膜の完全性（ｉｎｔａｃｔｎｅｓｓ）を調べることも可能であるし、そしてジストロフィー筋では存在しない／減少している、ジストログリカン−サルコグリカン複合体の分子の発現および正しい筋線維膜局在をチェックすることによって評価することも可能である。こうした免疫組織化学は、とりわけ、ジストロフィンおよびサルコグリカン複合体膜局在を明らかにする抗体染色、ならびに（筋幹細胞、いわゆるサテライト細胞によって）永続的に再生されるジストロフィー筋の検出を含む。ＮＣＡＭ抗体で免疫染色することによって、再生を評価することも可能である。さらに、炎症性細胞は、ジストロフィー組織に侵入し、そしてこれを取り除き、そして例えばｍａｃ１抗体によって、検出可能である。
【０１１４】
また、ＣＫ測定も、本発明に関連して、そして特に本発明のスクリーニング法において、有用である可能性があり、これは、ジストロフィー筋線維が、高い血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを示すためである。
【０１１５】
さらに、本明細書記載のトランスジェニック非ヒト動物（あるいはその臓器、組織または細胞のようなその一部）を使用して、本発明の方法において、膜安定性アッセイを使用することもまた可能である。例えば「エバンスブルー」は、（「漏洩性」）ジストロフィー筋を青く染色する。
【０１１６】
Ｃ．エレガンスＣＨＩＰ−１またはヒトＣＨＩＰ（および好ましくはヒトＣＨＩＰ）の哺乳動物オルソログのアンタゴニスト／阻害剤／負の制御因子の解明、決定、検証のためのスクリーニング法を、ハイスループットスクリーニングのため、最適化することも可能である。これらのＨＴＰスクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系または細胞に基づく系（改変された筋細胞など）を使用する場合、特に有用である。例えば、そして限定せずに、ＨＴＰＳ系において、ユビキチン化／マルチユビキチン化に関する試験を行うことも可能である。上に論じるように、本発明は、ＣＨＮ−１発現または機能を阻害すると推定される剤を同定する方法をさらに開示し、該方法は、（ａ）Ｃ．エレガンスまたは単離Ｃ．エレガンス細胞（好ましくは筋細胞）と、目的の剤を接触させ、ここでＣ．エレガンスまたは単離Ｃ．エレガンス細胞は野生型ＣＨＮ−１アレルを含む；そして（ｂ）Ｃ．エレガンスまたは単離Ｃ．エレガンス細胞の生じた表現型を観察する工程を含み、ここでユビキチン化、ＣＨＩＰユビキチン・リガーゼ活性の活性、ミオシン組み立てまたは移動運動の修飾は、目的の剤がＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ発現または機能を阻害すると推定される剤である指標となる。これらのアッセイはまた、実験部分に記載するように、Ｃ．エレガンスの適切な突然変異体、例えば筋ジストロフィー突然変異体（例えばｄｙｓ−１遺伝子の突然変異体）を用いて行うことも可能である。付随する実施例に立証するように、ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１阻害剤を、対応する筋変性／筋ジストロフィー突然変異体上でスクリーニングすることも可能であるし、そして突然変異体Ｃ．エレガンスの移動運動速度の増加は、機能するＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ阻害剤の指標となりうる。これらのアッセイおよび他のアッセイにおけるさらなる読み取り値は、実施例に例示するような、ユビキチン−プロテアソーム経路の阻害である。したがって、（潜在的な）ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ阻害剤は、とりわけ、そして例えば、ＵＮＣ−４５のユビキチン化の減少をもたらす。
【０１１７】
本発明の別の態様において、目的の剤と接触させた後、ＣＨＮ−１アレルの発現レベルを測定することによって、推定上のＣＨＮ−１／ＣＨＩＰ阻害剤を同定し、ここで、適切な対照（すなわち、各場合で、目的の剤で処理していない、野生型Ｃ．エレガンス線虫または野生型Ｃ．エレガンス線虫由来の細胞において測定した発現レベル）と比較したＣＨＮ−１発現レベルの減少は、目的の剤が、ＣＨＮ−１（および潜在的にまた、哺乳動物／ヒトＣＨＩＰ）発現を阻害すると推定される剤であることの指標となる。
【０１１８】
線虫類、および特にまたＣ．エレガンス野生型または突然変異体をハイスループットスクリーニングに使用することもまた、適切である。ハイスループットスクリーニングを自動化し、そしてアレイ形式でスコアリングすることによって、スループットにおける有意な増加、研究者が要する時間の減少、ならびに客観性および正確性の増加を獲得可能である。ハイスループットのプレートに基づくロボット工学の存在によって、アレイ形式を管理することも可能である。例えば、ハイスループット形式で行われるように適応された、線虫、特に排他的ではないが、Ｃ．エレガンスを用いたスクリーニング法に関するＷＯ００／６３４２７に、線虫類を用いたハイスループットスクリーニングが記載されてきている。自動化された線虫取り扱い技術を適用する、線虫に関するさらなるハイスループットスクリーニングが、ＷＯ２００４／０３３６５４に記載されている。薬剤効果を試験／アッセイするための、ｄｙｓ欠損Ｃ．エレガンスＨＴＰＳ系もまた記載されており、例えばＧａｕｄ（２００４）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １４，  ３６５−３７０を参照されたい。ＤＭＤ研究においてＨＴＰＳ系もまた用いられてきており、そして特にマウス系におけるものが、Ｋｈｕｒａｎａ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：ｐ３７９−３９０に記載された。
【０１１９】
本発明は、ここで、以下の生物学的実施例に関連して記載されるが、これは単なる例示であり、そして本発明の範囲の限定とは解釈されない。
本発明を詳細に記載する前に、方法論、プロトコル、細胞、動物、ベクター、試薬等は多様でありうるため、本発明は、本明細書に記載するこれらの特定のものに限定されないことが理解されるものとする。本明細書に用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的のためのみのものであり、そして付随する請求項によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定することは意図されないこともまた、理解されるものとする。別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての技術的用語および科学的用語は、一般の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
材料および方法
株
別に記載しない限り、標準的方法にしたがって、線虫を取り扱い、そして２０℃で成長させた（Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９７４）。本研究で用いる突然変異は、染色体単位で、以下のように列挙される：ＬＧＩ：ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）、ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）、（？）ｏｋ５９、ｕｎｃ−５４（ｅ１３０１）；ＬＧＩＩＩ：ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）、ｕｎｃ−４５（ｓｔ６０４）、ｄａｆ−７（ｎ６９６）。ブリストル株Ｎ２を野生型株として用いた。ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）突然変異体は、Ｃ．
ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，  Ｏｋｌａｈｏｍａより厚意で提供された。
プラスミド
ｃｈｎ−１およびｕｆｄ−２をＰＣＲによって増幅し、そしてｐＧＢＫＴ７（ｐＧＢＫ−ＵＦＤ−２）、ｐＧＡＤＴ７（ｐＧＡＤ−ＣＨＮ−１）およびｐＧＥＸ４Ｔ１（ｐＧＥＸ−ＣＨＮ−１、ｐＧＥＸ−ＵＦＤ−２）にクローニングした。ｃｈｎ−１、ｕｆｄ−２およびｈｓｐ−１  ｃＤＮＡの５’端に、ＰＣＲによってｍｙｃタグを導入し、そしてｐ
ＥＴ２１ａにクローニングした（ｐＥＴ−ｍｙｃＣＨＮ−１、ｐＥＴ−ｍｙｃＵＦＤ−２、ｐＥＴ−ｍｙｃＨＳＰ−１）。ｐＥＴ−ｍｙｃＣＨＮ−１およびｐＧＡＤ−ＣＨＮ−１を修飾して、欠失型ｐＥＴ−ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス、ｐＥＴ−ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＴＰＲ、ｐＥＴ−ｍｙｃＣＨＮ−１ΔおよびｐＧＡＤ−ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス、ｐＧＡＤ−ｍｙｃＣＨＮ−１Δを生成した。ｐＥＴ−ｍｙｃＵＦＤ−２を用いて、同じことを行って、ｍｙｃＵＦＤ−２ΔＵ−ボックスを得た。ｈｓｐ−１をｐＧＢＫＴ７にサブクローニングした（ｐＧＢＫ−ＨＳＰ−１）。Ｅ２酵素ＬＥＴ−７０およびＵＢＣ−１８をコードするｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ４Ｔ１にクローニングした（ｐＧＥＸ−ＬＥＴ−７０、ｐＧＥＸ−ＵＢＣ−１８）。各構築物の詳細は、要求に応じて、入手可能である。
導入遺伝子構築
予測される開始コドン上流の１．２ｋｂの制御配列および完全３．２ｋｂゲノムｕｆｄ−２遺伝子座（予測される遺伝子Ｔ０５Ｈ１０．５）を、３’ＧＦＰカセットとインフレームで、ベクターｐＰＤ９５．７５（Ａ．  Ｆｉｒｅより寄贈）にサブクローニングすることによって、ｕｆｄ−２：：ＧＦＰ導入遺伝子を構築した。生じた構築物を、８０ｎｇ／μｌの最終濃度で、２０ｎｇ／μｌのマーカープラスミドｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）（Ｍｅｌｌｏ、１９９０）と共に同時インジェクションした。０．６ｋｂの予測されるプロモーター配列上流および完全２．９ｋｂゲノムｃｈｎ−１遺伝子座（予測される遺伝子Ｔ０９Ｂ４．１０）下流を、ＧＦＰカセットとインフレームで、ベクターｐＰＤ１１７．０１（Ａ．  Ｆｉｒｅより寄贈）にサブクローニングすることによって、ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１を構築した。生じた構築物を、２０ｎｇ／μｌの最終濃度で、２０ｎｇ／μｌのマーカープラスミドｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）と共に同時インジェクションした。少なくとも３つの独立のトランスジェニック株を分析して、ｕｆｄ−２：：ＧＦＰおよびＧＦＰ：：ｃｈｎ−１の発現パターンを決定した。同じｐＰＤ１１７．０１−Ｐｃｈｎ−１：：ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１構築物をレスキュー実験に用いた。さらに、ｃｈｎ−１  ｃＤＮＡをｐＰＤ８８．２７にサブクローニングして、ｐＰＤ８８．２７−Ｐｕｎｃ−５４：：ｃｈｎ−１を得た。過剰発現研究のため、３’  ＦＬＡＧタグ配列を含有するｕｎｃ−４５  ｃＤＮＡを、ｐＰＤ３０．３８にサブクローニングして、そして生じた構築物ｐＰＤ３０．３８−Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５ＦＬＡＧを、２０ｎｇ／μｌで、２０ｎｇ／μｌのマーカープラスミドｐＰＤ１１４．１０８（ｍｅｃ−７：：ＧＦＰ）と共に同時インジェクションした。
酵母２ハイブリッド研究
ベクターｐＧＢＫＴ７を用いて、全長ＵＦＤ−２タンパク質をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合させ、そしてＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）から得た酵母宿主株ＡＨ１０９（Ｊａｍｅｓ、１９９６）に形質転換した。製造者の指示にしたがって、タンパク質相互作用研究を行った。
タンパク質の発現および精製
ＢＬ２１（ｐＲＩＬ）大腸菌細胞を用いて、組換え酵素を産生し、そして緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８；１０ｍＭ  ＤＴＴ、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））中で溶解した。ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＵＦＤ−２、ＧＳＴ−ＣＨＮ−１、ＧＳＴ−ＬＥＴ−７０、ＧＳＴ−ＵＢＣ−１８）を精製するため、清浄化した溶解物を、５００μｇのグルタチオン−セファロース・ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ中で徹底的に洗浄した後、ＧＳＴ−融合タンパク質を１０ｍＭグルタチオンで溶出させた。ＵＮＣ−４５を記載されるように精製した（Ｂａｒｒａｌ、２００２）。
結合アッセイおよび免疫沈降
ＧＳＴ−ＵＦＤ−２またはＧＳＴ−ＣＨＮ−１へのＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ、ｍｙｃＣＨＮ−１、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＴＰＲ、ｍｙｃＣＨＮ−１Δ、ｍｙｃＵＦＤ−２、ｍｙｃＵＦＤ−２ΔＵ−ボックス、ｍｙｃＨＳＰ−１の結合を
、緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ＣｏｍｐｌｅｔｅTMプロテアーゼ阻害剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、４℃で６０分間行った。グルタチオン−セファロース・ビーズを、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ中で、少なくとも５回洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を用いて、結合したタンパク質を溶出させた。導入遺伝子Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５ＦＬＡＧを発現している野生型線虫由来の超音波処理した溶解物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および５ｍＭ  ＰＭＳＦ中の抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−アガロース・ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と４℃で３時間インキュベーションした。プロテインＧ−アガロース・ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で試料を沈降させた。免疫沈降物を同じ溶解緩衝液中で少なくとも５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出し、そしてＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗ユビキチン・モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイ
先に記載されるように反応を行った（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）。精製ウサギＥ１（Ａｆｆｉｎｉｔｉ）、ＬＥＴ−７０、ＵＢＣ−１８およびｍｙｃＣＨＮ−１、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＴＰＲ、ｍｙｃＣＨＮ−１Δ、ｍｙｃＵＦＤ−２、ｍｙｃＵＦＤ−２ΔＵ−ボックス、ｍｙｃＨＳＰ−１未精製大腸菌細胞抽出物を、自己ユビキチン化反応のため、そして精製ＵＮＣ−４５のｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化のため、用いた。
ノーザンブロット分析
雑多な期の線虫のプレートからＲＮＡを単離し、そして製造者の指示にしたがって、ＲＮＡｅａｓｙキットを用いて調製した（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）。レーンあたり５μｇの総ＲＮＡを装填し、そして標準的方法（Ｌａｋｏｗｓｋｉ、２００３）にしたがってブロットを行った。製造者の指示にしたがってＭｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、α３２Ｐ  ｄＣＴＰでプローブを標識した。ａｃｔ−１特異的プローブを装填対照として用いた。
ｃｈｎ−１（ｌｇ１５５）欠失突然変異体の単離
ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを用いて、３．５ｘ１０６突然変異誘発ゲノムで構成されるＥＭＳ突然変異誘発線虫ライブラリーにおいて、より短いアレルのｃｈｎ−１に関してスクリーニングした。ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）欠失アレル（欠失ブレークポイント（Ｔ０９Ｂ４座標）：３２７５６／３３７４６〜３２７５７／３３７４７）由来の１９３１ｂｐに比較して、野生型ｃｈｎ−１アレルは、２９２０ｂｐの断片を増幅した。ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体株を野生型バックグラウンドの動物に８回戻し交配した。レスキュー実験のため、２０ｎｇ／μｌのサブクローンｐＰＤ１１７．０１−Ｐｃｈｎ−１：：ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１またはｐＰＤ８８．２７−Ｐｕｎｃ−５４：：ｃｈｎ−１を２０ｎｇ／μｌのマーカープラスミドｐＲＦ４（ｒｏｌ−６）またはｐＢＹ１１５３（ｓｅｌ−１２：：ＧＦＰ）と共に、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｍ９４）動物に同時インジェクションした。それぞれ、３つ（ｂｙＥｘ３９５、ｂｙＥｘ３９６、ｂｙＥｘ３９８）および２つ（ｂｙＥｘ３９９、ｂｙＥｘ４００）の独立の株をｕｎｃ−４５（ｍ９４）のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）依存性抑制のレスキューに関して分析した。運動性アッセイ
各株１０匹の若い成虫を、大腸菌細胞（ＯＰ５０）の菌叢を完全に植え付けた１０枚のプレートの中央に置いた。線虫を１時間這わせて、そして痕跡の写真を撮影した。各実験において、同じ株の１０匹の線虫すべてが同様の運動性を示した。
ソフトウェアおよび顕微鏡
ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ５．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて、ノーザンブロットの定量的評価を行った。ＧＦＰ発現の写真を撮影し、そしてＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ３．０ソフトウェアを用い、ＡｘｉｏＰｌａｎ２顕微鏡（Ｚｅｉｓ
ｓ）で、体壁筋の偏光顕微鏡検査を行った。
【０１２１】
（実施例２）
ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２は互いに直接相互作用し、そしてどちらもＥ２酵素ＬＥＴ−７０と共同で働く
全体の同一性が２６％であり、Ｕ−ボックス含有タンパク質をコードする、Ｃ．エレガンス・データベース中の酵母ＵＦＤ２（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）のＣ．エレガンス相同体（オープンリーディングフレームＴ０５Ｈ１０．５）を同定し、そしてこれをｕｆｄ−２と名づけた。Ｃ．エレガンスにおけるＵＦＤ−２の役割を調べるため、酵母の２ハイブリッド系を用いて、ＵＦＤ−２と相互作用するタンパク質に関して検索し、そしてヒトＥ４酵素ＣＨＩＰ（Ｃｙｒ、２００２）の相同体であるＣＨＮ−１（図１Ａ）を同定した。さらに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイを行った。細菌で発現されるｍｙｃタグ化ＣＨＮ−１（ｍｙｃＣＨＮ−１）が大腸菌から精製されたＧＳＴ−ＵＦＤ−２タンパク質と相互作用し、そしてその逆も当てはまることが見出された（図１Ｂおよび未提示のデータ）。さらなる２ハイブリッド分析（図２Ｅ）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質結合アッセイは、Ｃ．エレガンスＨｓｐ７０相同体ＨＳＰ−１（Ｈｅｓｃｈｌ、１９９０）がＣＨＮ−１と相互作用可能であり（図１Ｃ）、そしてＵＦＤ−２結合に競合しない（図１Ｄ）ことを示した。
【０１２２】
自己ユビキチン化は、ユビキチン系に属する酵素の特徴である（Ｌｏｒｉｃｋ、１９９９）。ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１の酵素活性を研究するため、特異的基質の非存在下での自己ユビキチン化のアッセイを行い、そしてユビキチン・リガーゼ自体に対してユビキチン・コンジュゲート化が起こることが明らかになった。細菌で発現されたＵＦＤ−２またはＣＨＮ−１を、ユビキチン、Ｅ１および精製Ｃ．エレガンスＥ２酵素ＬＥＴ−７０またはＵＢＣ−１８を含有する別個の反応中でインキュベーションした。どちらのＥ２酵素も、酵母ＵＦＤ２と同じ分解経路において機能する、酵母ＵＢＣ４（Ｊｏｎｅｓ、２００２；Ｋｏｅｇｌ、１９９９）の相同体である。ＣＨＩＰがまた、ＵＢＣ４／５ファミリーのＥ２酵素と共に特異的に機能することもまた示されている（Ｊｉａｎｇ、２００１；Ｍｕｒａｔａ、２００１）。したがって、Ｅ２酵素はＵＦＤ−２と協力する。驚くべきことに、ｍｙｃタグ化ＵＦＤ−２（ｍｙｃＵＦＤ−２）は、Ｅ２酵素ＬＥＴ−７０とのみ関連した自己ユビキチン化を示し、そしてＵＢＣ−１８と関連した自己ユビキチン化は示さない（図１Ｅ、上部）。ＣＨＮ−１自己ユビキチン化は、ＬＥＴ−７０に対して、同じ依存性を示した（図１Ｅ、下部）。全長ＵＦＤ−２またはＣＨＮ−１に比較して、Ｕ−ボックスを欠く一部切除タンパク質は、自己ユビキチン化活性を持たなかった（図１Ｅ）。ＵＦＤ−２がＣＨＮ−１自己ユビキチン化能に何らかの影響を有するかどうかを試験するため、過剰量のＵＦＤ−２の非存在下および存在下で、ＣＨＮ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ自己ユビキチン化を比較した。反応の有効性に明らかな相違はなかった（図１Ｅ、下部）。
【０１２３】
したがって、ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１は、同じコンジュゲート化経路で作用して、少なくとも１つの特異的基質を分解する。
（実施例３）
ｃｈｎ−１機能喪失突然変異体は、ストレス寛容と結び付けられる
ｃｈｎ−１のｉｎ  ｖｉｖｏ機能にさらなる洞察を得るため、Ｃ．エレガンス欠失ライブラリーをスクリーニングした後、ｃｈｎ−１欠失突然変異体を単離した。アレルｂｙ１５５の突然変異は、エクソン４の３’スプライス部位、ならびにエクソン５および６を完全に取り除く、０．９キロ塩基の欠失である（図２Ａ）。ノーザンブロット分析によって、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体動物におけるｃｈｎ−１遺伝子は、予期されるように、野生型と比較して、有意に減少した量のより短いメッセージとして転写されることが示された。同じオペロンに属する下流遺伝子Ｔ０９Ｂ４．９（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、２００２）の転写効率は、この欠失によって影響を受けない（図２Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｖｏ
で発現された場合、対応するタンパク質は、Ｃ末端が一部切除され、３つのＴＰＲモチーフのうち２つのみが損なわれずに残されたＮ末端からなるであろう（ＣＨＮ−１Δ）（図２Ｃ）。Ｕ−ボックスを含まないこうしたＣＨＮ−１型は、もはや、ユビキチン化酵素として働かないと予期される（図１Ｅ、下部）。ＣＨＮ−１の異なる一部切除型（図２Ｃ）を細菌で発現させ、そしてＣＨＮ−１Δは、ＧＳＴ−ＵＦＤ−２と相互作用不能であり、Ｕ−ボックスを欠いたＣＨＮ−１（ＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス）がなお結合可能であるのとは異なった（図２Ｄ）。これらの結果は、翻訳された場合、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）の遺伝子産物が、ＵＦＤ−２と相互作用不能であることを示す。さらに、ＣＨＮ−１Δは、Ｃ．エレガンスＨｓｐ７０相同体ＨＳＰ−１とも相互作用不能である（図２Ｅ）。
【０１２４】
ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体は、生存可能であり、そして明らかな形態学的欠損を示さない。通常の成長条件下で、運動性、産卵行動または寿命に重大な改変は同定されないが、一腹の子孫数の減少（２０℃で、Ｎ２野生型の２９７±５子孫（ｎ＝１８）と対照的に２５０±６子孫（ｎ＝１８））が観察された。卵を産生する前に、ｃｈｎ−１突然変異体を３０℃より高い温度にシフトすると、発生抑止がもたらされ、そしてＦ１世代の異なる幼虫期で、致死性となった（データ未提示）。ｃｈｎ−１（ＲＮＡｉ）処理した野生型線虫は、同様の温度感受性を示した（Ｃ．  ＨｏｌｍｂｅｒｇおよびＲ．  Ｍｏｒｉｍｏｔｏ、私信）。
【０１２５】
ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）およびｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）のトランス・ヘテロ接合体株を生成し、これは機能喪失アレル（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，  Ｏｋｌａｈｏｍａによって単離）に相当する（図２Ａ）。７／８のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）／ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）トランス・ヘテロ接合体は、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ホモ接合体と同様に振舞った。これは、ｂｙ１５５が完全機能喪失アレルであるという我々の結論を支持する。ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）ホモ接合体突然変異体は、隣接遺伝子の欠失のため生存不能であるため、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）をさらなる研究に用いた。
【０１２６】
細胞質分裂中の収縮環への、そして筋発生中の太いフィラメントへの、モータータンパク質ミオシンの組み立ては、なお、大部分が研究途上のプロセスである。最近の結果によって、ミオシンが自発的には集合せず、むしろ、さらなる因子を必要とすることが示唆されている（Ｓｒｉｋａｋｕｌａｍ、２００４）。このプロセスの１つのありうる候補は、Ｈｓｐ９０コシャペロンＵＮＣ−４５であり、これはこれ自体、太いフィラメント組み立て中に筋ミオシンＩＩに対してシャペロン活性を発揮し、そして非筋ミオシンＩＩおよび非慣用的なミオシンＶと相互作用する（Ｂａｒｒａｌ、２００２；Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ、２００２）。
【０１２７】
本発明と関連して、ＵＮＣ−４５がｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化され、そしてＣＨＩＰオルソログＣＨＮ−１が、ＵＦＤ−２と共に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのそのマルチユビキチン化に必要かつ十分であることが見出された。ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の「線虫バッグ」表現型および移動欠損は、ＣＨＮ−１を欠く動物で抑制可能であり、これは対応するＵＮＣ−４５（ｔｓ）タンパク質の安定化のためである可能性が最も高い。重要なことに、この抑制は、ＵＮＣ−４５活性が残っていることを必要とする。しかし、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体において、過剰量のＵＮＣ−４５は、ミオシン組み立てに有害であるようである。Ｅ２酵素ＬＥＴ−７０（Ｊｏｎｅｓ、２００２）は、自己ユビキチン化アッセイにおいて、ならびにＵＮＣ−４５コンジュゲート化において、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２と、特異的に共同で働く。したがって、このＥ２酵素は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、この経路において機能すると見なされる。この結果を支持することに、Ｊｏｎｅｓは、野生型線虫のｌｅｔ−７０（ＲＮＡｉ）処理から生じる、抑止された幼虫が、筋サルコメア組み立てに欠陥を有することを示した（Ｊｏｎｅｓ、２００２）。ＲＮＡｉによるプ
ロテアソーム・サブユニットＰＲＴ−２の下方制御は、ｃｈｎ−１機能喪失に示されるように、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の類似の抑制をもたらす。したがって、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５のタンパク質レベルは、厳密な制御を必要とし、この制御はＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２のユビキチン化活性に依存するようである（図７）。
【０１２８】
（実施例４）
ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２はミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５と相互作用する
精製ＦＬＡＧエピトープ・タグ化ＵＮＣ−４５（ＦＬＡＧＵＮＣ−４５）は、精製ＧＳＴ−ＵＦＤ−２と相互作用することが見出された（図３Ａ）。ＵＮＣ−４５は、最近、シャペロンＨｓｐ９０およびミオシンと、化学量論的に結合することが示された（Ｂａｒｒａｌ、２００２）。本発明に関連して行った、いくつかのプルダウンアッセイにおいて、Ｈｓｐ９０は、ＵＦＤ−２およびＵＮＣ−４５間の相互作用に競合しなかった。
【０１２９】
次いで、ＣＨＮ−１がＵＮＣ−４５と相互作用可能であるかどうかを試験し、そしてＣＨＮ−１のＧＳＴタグ化型が、精製ＵＮＣ−４５に結合することが見出された。結合効率を比較するため、同量の精製ＵＮＣ−４５と共に、ＧＳＴ−ＵＦＤ−２またはＧＳＴ−ＣＨＮ−１の等モル量を用いて、プルダウン実験を行った。ＧＳＴ−ＵＦＤ−２は、ＧＳＴ−ＣＨＮ−１に比較した際、〜２０倍多いＵＮＣ−４５に結合した（図３Ｂ）。次に、ＵＦＤ−２結合に関して、ＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５間に何らかの競合があるかどうかを調べた。固定ＵＦＤ−２、およびＵＮＣ−４５またはＣＨＮ−１のいずれかを含有する二元混合物、ならびに３つのタンパク質すべてを含有する三元混合物をセットアップし、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって、生じた複合体を分析した。二元混合物において、ＵＦＤ−２、ならびにＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５の両方の間の、そして三元混合物において、３つのタンパク質の間の、ほぼ等モルの複合体が検出された。二元混合物に比較して、三元混合物中のＵＦＤ−２へのＵＮＣ−４５またはＣＨＮ−１いずれかの結合に、有意な相違はなかった（図３Ｃ）。したがって、ＵＦＤ−２は、ＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５に同時に結合可能である。
【０１３０】
ＵＦＤ−２、ＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５がｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用可能であることが示された後、これらの組織分布がｉｎ  ｖｉｖｏで重複するかどうかを検討した。内因性プロモーターの調節下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された各タンパク質をコードする構築物に関してトランスジェニックである野生型動物において、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２の発現パターンを分析した。ＧＦＰ：：ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２：：ＧＦＰ融合タンパク質はどちらも、体壁筋細胞、ニューロンおよび皮下組織を含む多様な組織において、初期胚から成虫期まで、トランスジェニック動物全体で重複する発現を示したが、腸には存在しなかった（図３Ｄ〜Ｈ）。ＵＮＣ−４５もまた、発生全体を通じて、体壁筋細胞で発現される（Ａｏ、２０００；Ｖｅｎｏｌｉａ、１９９９）。重要なことに、発現分析に用いたＰｃｈｎ−１：：ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１構築物は、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）をレスキュー可能である（図４Ａ）。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されるタンパク質相互作用は、少なくとも体壁筋細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏでもまた起こりうると結論付けられた。
【０１３１】
（実施例５）
ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）は、異なるｕｎｃ−４５温度感受性突然変異体を特異的に抑制する
ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５間の推定上の相互作用を研究するため、各々、全長タンパク質をコードし、単一アミノ酸置換を含む、２つの温度感受性（ｔｓ）ｕｎｃ−４５突然変異体、ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）およびｕｎｃ−４５（ｍ９４）（Ｂａｒｒａｌ、１９９８）と、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）を交配した。ｕｎｃ−４５（ｔｓ）アレルの制限温度（２０℃以上）で成長させると、各場合で、ホモ接合体動物は、体
壁筋における乱れた筋原線維配置のため、完全に麻痺する（図５Ｃに示すとおり）。対照的に、１５℃の許容温度で成長させると、本質的に野生型の表現型がもたらされる。温度シフトは、大部分の筋原線維組み立てが起こる、発生中の胚または幼虫において、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）表現型を逆転させるが、成虫では逆転させない（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９７４）。さらに、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体を含む、非協調性線虫は、子宮中に過剰量の卵を保持する（産卵欠陥またはＥｇｌ表現型）。これらの卵は母体内で孵化しそして発生し、そして最終的に「線虫バッグ」（Ｂａｇ）表現型をもたらす（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ、１９８８）。ｃｈｎ−１機能喪失突然変異ｂｙ１５５は、Ｌ３幼虫を１５℃から２２℃にシフトした後、ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）およびｕｎｃ−４５（ｍ９４）の「線虫バッグ」表現型を、完全ではないが、有意に抑制する（図４Ａ）。ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の産卵欠陥は、生じる子孫数を非常に制限する。ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｍ９４）二重突然変異体は、単一突然変異体と対照的に、有意に増進しているが、なお、野生型と同等ではない、一腹の子孫数を示す（図４Ｂ）。この遺伝的相互作用の特異性は、ゲノム・サブクローン由来のｃｈｎ−１の機能するコピー（図３Ｄ〜Ｆの発現研究で用いたものと同一）、またはｕｎｃ−５４プロモーターの筋特異的調節下のｃｈｎ−１  ｃＤＮＡの発現による、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体に対する「線虫バッグ」表現型の回復で立証された（図４Ａ）。このトランスジェニック・レスキューは、温度感受性ｕｎｃ−４５アレルの抑制が、ｃｈｎ−１遺伝子の欠失のためであることを示す。さらに、野生型バックグラウンドに対して各導入遺伝子単独の発現は、筋構造にまったく影響を示さない（データ未提示）。かすかな運動性の欠陥も検出するため、大腸菌細胞の菌叢を完全に植え付けた寒天プレート上で、温度シフトした線虫を１時間這わせて、そして次いで、痕跡を写真撮影した（図４Ｃ）。二重変異体ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｍ９４）は、ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）またはｕｎｃ−４５（ｍ９４）単独よりも、有意により優れた運動性を示した。
【０１３２】
ｕｎｃ−４５の完全機能喪失アレルは、胚致死性を生じ、これは、Ｃ．エレガンスにおいて、正常な胚発生には、ｕｎｃ−４５機能が必要であることを立証する（Ｖｅｎｏｌｉａ、１９９９）。他のＵＣＳドメインタンパク質が、適切な細胞質分裂に必要であることが立証されている（Ｓ．ポンベ（Ｓ．  ｐｏｍｂｅ）Ｒｎｇ３ｐおよびヒト一般的細胞種ＵＮＣ−４５）（Ｐｒｉｃｅ、２００２；Ｗｏｎｇ、２０００）。これは、初期胚において分裂溝にＵＮＣ−４５が局在することと一致する。さらに、最近の２ハイブリッド分析は、筋ミオシンに加えて、細胞骨格ＩＩ型ミオシンおよび非慣用的Ｖ型ミオシンが、ＵＮＣ−４５タンパク質と相互作用することを示唆する（Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ、２００２）。しかし、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の抑制と対照的に、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）は、胚致死性アレルｕｎｃ−４５（ｓｔ６０４）（Ｖｅｎｏｌｉａ、１９９０）を抑制不能である（２５／２５のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）；ｕｎｃ−４５（ｓｔ６０４）の胚は、胚発生の２倍期で、ｕｎｃ−４５（ｓｔ６０４）単一突然変異体同様、抑止された）。ｃｈｎ−１突然変異が、ｕｎｃ−４５アレルを特異的に抑制するのか、またはむしろより一般的に、体壁筋構成要素における突然変異を抑制するのかが問われた。したがって、ｃｈｎ−１、および体壁筋ミオシンＢをコードする遺伝子であるｕｎｃ−５４（Ｅｐｓｔｅｉｎ、１９７４）の二重突然変異体を分析した。ｃｈｎ−１の欠損は、温度感受性突然変異体ｕｎｃ−５４（ｅ１３０１）のＥｇｌ表現型を抑制せず（２９／３０のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ｕｎｃ−５４（ｅ１３０１）二重突然変異体は、なおＥｇｌであった）、抑制が実際に、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）アレルに特異的であることが示された。
【０１３３】
これらの発見は、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）表現型のいくつかの欠陥が、ｃｈｎ−１機能喪失によって特異的に抑制可能であることを示す。しかし、この抑制は、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）動物に提供されるＵＮＣ−４５活性が残っていることを必要とするため、これらの発見は、ＣＨＮ−１がＵＮＣ−４５の負の制御因子として働くことを立証する。
【０１３４】
ＣＨＩＰは、最初、Ｈｓｃ７０およびＨｓｐ９０のコシャペロンとして同定された（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、１９９９）。最近の研究において、ＣＨＩＰのＣ末端Ｕ−ボックスドメインが、ユビキチン・リガーゼ活性を有することが見出された（Ｊｉａｎｇ、２００１）。したがって、ＣＨＩＰはタンパク質品質管理ユビキチン・リガーゼとして作用可能であり、分子シャペロンに認識された異常なタンパク質を、２６Ｓプロテアソームによる分解に、選択的に導く。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究からの集積する証拠は、これが当てはまりうることを示唆するが、ＣＨＩＰを伴う実際の生物学的経路は、大部分、研究途上のままである（Ｍｕｒａｔａ、２００３）。
【０１３５】
ＣＨＮ−１は、Ｕ−ボックス依存性の自己ユビキチン化活性を示し、そしてＣＨＩＰが関与する先の結果と一致して、ＣＨＮ−１は、Ｃ．エレガンスＨｓｐ７０と相互作用する（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、１９９９；Ｊｉａｎｇ、２００１）。ＣＨＮ−１は、ＣＨＩＰの真のＣ．エレガンス・オルソログである。驚くべきことに、ストレスに対する細胞性反応を調節する際、ＣＨＩＰが重要な役割を果たすと推測されるのとは対照的に、Ｃ．エレガンスにおいて単一遺伝子にコードされるＣＨＮ−１は、生存に必須ではない。ＣＨＩＰ／ＣＨＮ−１がユビキチン化を仲介する能力およびそのコシャペロン活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの異常なタンパク質分解およびタンパク質フォールディングの間の結び付きに相当しない。プロテアソーム・サブユニットＲＰＮ１０（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）に関して欠損している酵母細胞において、ＵＦＤ２もまた、ストレス寛容に必要であり、これによって、Ｕ−ボックス・タンパク質は、細胞ストレスの条件下で機能するのに特によく適していることが示唆される。
【０１３６】
本明細書において、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５のユビキチン化による、ミオシン組み立ての制御におけるＣＨＮ−１の直接的な役割を立証する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータを提供する（図７）。したがって、ＵＮＣ−４５は、ＣＨＩＰオルソログＣＨＮ−１に関して同定された、最初の天然基質に相当する。
【０１３７】
（実施例６）
ｕｎｃ−４５の筋特異的発現は、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体において、ミオシン組み立て欠陥をもたらす
ｃｈｎ−１欠損バックグラウンドに対するｕｎｃ−４５過剰発現の効果を評価するため、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）およびＮ２野生型線虫において、過剰染色体アレイから、筋特異的ｕｎｃ−５４プロモーターの調節下で、ｕｎｃ−４５  ｃＤＮＡを発現させた。重要なことに、この導入遺伝子（Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５）の発現は、運動性および筋構造改善の両方によって評価されるように、２５℃の制限温度で、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）のｔｓ表現型をレスキューし、機能するレベルのＵＮＣ−４５タンパク質を発現することが立証されている（図５Ａ〜Ｃ）。大腸菌細胞の菌叢を完全に植え付けた寒天プレート上で、線虫を１時間這わせて、そして次いで、痕跡を写真撮影した（図５Ａ）。さらに、液体培地中で、線虫が１分あたり何回体を屈曲させうるかを決定し、これはかすかな収縮欠陥を評価する、信頼性がある方法である（図５Ｂ）。機能するＵＮＣ−４５を発現する野生型およびｕｎｃ−４５（ｍ９４）の線虫は、本質的に、形質転換されていない野生型線虫と同様に振舞うことが見出された。しかし、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体における過剰なコピーのｕｎｃ−４５は、劇的なＵｎｃ表現型をもたらし、完全に麻痺した動物を生じた。
【０１３８】
次に、偏光顕微鏡検査によって、これらの株の筋構造の欠陥の研究を狙った。野生型線虫は、Ａ帯、Ｉ帯、濃密体、およびＨ帯などの周期的サルコメア構造を示す体壁筋細胞を有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ、１９８８）。運動データと一致して、ｕｎｃ−４５の導入遺伝子発現は、野生型において、筋構造に影響を及ぼさず、そして通常は乱れたサルコメ
ア構造を示すｕｎｃ−４５（ｍ９４）アレルの筋欠陥をレスキューした。この分析はまた、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）の筋構造が、野生型のものに匹敵するが、導入遺伝子ｕｎｃ−４５の発現が、サルコメア組み立てに強い欠陥をもたらすことも示した（図５Ｃ）。組み込まれた導入遺伝子（過剰染色体アレイＥｘ［Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５ＦＬＡＧ］から産生される）からのＵＮＣ−４５タンパク質発現は、過剰な染色体アレイからのものより有意に少なく（〜２０倍少ない）、そしてｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体バックグラウンドでは、検出可能ないかなるサルコメア欠陥ももたらさなかった（データ未提示）。したがって、筋細胞に存在するＵＮＣ−４５タンパク質の量は、ＣＨＮ−１を欠く線虫において、適切な機能に非常に重要である。
【０１３９】
総合すると、結果は、ｃｈｎ−１機能喪失が、温度感受性ｕｎｃ−４５アレルを抑制するだけでなく、過剰量のＵＮＣ−４５を補正不能であることを立証する。
（実施例７）
ＵＮＣ−４５はＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２依存性マルチユビキチン化の基質である
ＣＨＮ−１およびＵＮＣ−４５間の物理的な直接相互作用、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）依存性抑制、ならびにｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）突然変異体バックグラウンドにおけるｕｎｃ−４５の過剰染色体発現から生じるミオシン組み立て欠陥によって、ＵＮＣ−４５がＣＨＮ−１依存性ユビキチン化の基質である可能性があることが示唆される。この可能性を調べるため、組換え的に発現されるＥ１、Ｅ２酵素ＬＥＴ７０（ＤｅＲｅｎｚｏ、２００３；Ｊｏｎｅｓ、２００２）およびＣＨＮ−１を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイを行った。ＡＴＰおよびユビキチンを含有する緩衝液において、これらの酵素を、精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５タンパク質と一緒にインキュベーションした。図６Ａ（左のパネル）に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＵＮＣ−４５の認識およびユビキチン化には、３つの酵素すべて一緒の活性が必要であり、そして十分である。ＬＥＴ−７０単独とは対照的に、全長ＣＨＮ−１を添加すると、効率的なユビキチン・コンジュゲート化が進行する。しかし、大部分のコンジュゲートは、１〜３のユビキチン部分しか含有しないようである。自己ユビキチン化研究から予期されるように、Ｕ−ボックスを欠くＣＨＮ−１型、ＣＨＮ−１ΔＵ−ボックスは、ＵＮＣ−４５をユビキチン化不能であった（図６Ｂ）。
【０１４０】
ＣＨＮ−１の代わりに、ＵＦＤ−２を含有する類似の反応は、対応する結果：基質タンパク質ＵＮＣ−４５への１〜３のユビキチンの付加をもたらした（図６Ａ、右パネル）。したがって、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化する限定された能力を有する。次に、反応中で、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２両方とＵＮＣ−４５を同時にインキュベーションすると、異なる結果が生じるかどうかを試験した。これらの酵素が一緒に、マルチユビキチン化反応を劇的に刺激し、ＣＨＮ−１またはＵＦＤ−２単独によってコンジュゲート化されたものより、有意により長い鎖を持つＵＮＣ−４５コンジュゲートを生じることが見出された（図６Ｃ）。
【０１４１】
ＵＮＣ−４５が、実際にｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化されるかどうかを決定するため、機能するＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５を発現する野生型線虫を調べた（過剰染色体アレイＥｘ［Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５ＦＬＡＧ］は、ミオシン組み立て欠陥、そしてしたがってｕｎｃ−４５（ｍ９４）の運動障害をレスキューする（図５Ａ〜Ｃを参照されたい））。実際、ＵＮＣ−４５の免疫沈降によって得られるタンパク質試料のイムノブロット分析によって、全長ＵＮＣ−４５よりわずかに大きいサイズのユビキチン免疫反応性タンパク質が明らかになった。さらに、組換え的に発現され、そしてバキュロウイルス感染昆虫細胞から精製された、免疫沈降ＵＮＣ−４５は、ユビキチン化されていなかった（図６Ｄ）。要約すると、これらのデータから、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５を直接マルチユビキチン化する複合体を形成すると結論付けられた。
【０１４２】
Ｅ３酵素活性は、通常、基質タンパク質のマルチユビキチン化に十分である。しかし、いくつかのＥ３酵素は、さらなる因子を必要とする。例えば、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１は、ＢＡＲＤ１を含むヘテロ二量体Ｅ３様複合体中にある場合のみ、機能するＥ３リガーゼとして活性である（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ、２００１）。酵母ＵＦＤ２は、最近、マルチユビキチン化因子として作用することが同定され、あらかじめ形成されたコンジュゲートのユビキチン部分に結合し、そしてＥ１、Ｅ２、およびＥ３と協力して、マルチユビキチン鎖組み立てを触媒し、この活性はＥ４と称される（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）。哺乳動物ＣＨＩＰに関して、Ｉｍａｉおよび同僚らによって、類似のＥ４様機能が同定されている（Ｉｍａｉ、２００２）。
【０１４３】
本研究によって、マルチユビキチン化経路の予期せぬ側面が明らかになった。本明細書に記載するＵＮＣ−４５の制御には、２つのＥ３酵素のヘテロオリゴマー複合体に関連する新規Ｅ４活性が関与するようである。酵母ＵＦＤ２でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果（Ｋｏｅｇｌら、１９９９）と対照的に、Ｃ．エレガンス・オルソログＵＦＤ−２は、さらなるＥ３酵素の非存在下では、基質ＵＮＣ−４５に、１〜３のユビキチン分子を付加することが可能である（図６Ａ、右のパネル）。ＣＨＮ−１のみを用いた場合、同様の反応が起こる（図６Ａ、左のパネル）。したがって、Ｃ．エレガンスにおいて、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２はどちらも、このユビキチン化経路中、Ｅ３酵素として独立に働く。驚くべきことに、Ｅ３酵素ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２の組み合わせのみが、基質ＵＮＣ−４５の適切なマルチユビキチン化をもたらす（図６Ｃ）。したがって、組み合わされた２つのＥ３活性が、Ｅ４様活性を持つ複合体の形成をもたらす状況が同定された（図７）。
【０１４４】
こうしたＥ３／Ｅ４複合体は、細胞経路の制御のための多様な可能性を提供する。例えば、細胞周期中に制御された組み立て因子が存在することで、同じマルチユビキチン化複合体の異なる基質が異なる分解時間を持つことが可能になりうる。Ｃ．エレガンスのような多細胞生物において、基質分解は、発生的に制御された方式で、両方のＥ３酵素の組織特異的同時発現によって、誘導可能である。異なる組み合わせのＥ３酵素が、Ｅ４活性を仲介する別の複合体をもたらしうると提唱するのは、不合理ではない。興味深いことに、ＣＨＩＰは、Ｅ３酵素Ｐａｒｋｉｎと相互作用し（Ｉｍａｉ、２００２）、そしてＮｉｋｏｌａｙは、最近、ＣＨＩＰがまた、ホモ二量体も形成可能であることを示した（Ｎｉｋｏｌａｙ、２００４）。
【０１４５】
ＣＨＩＰ過剰発現細胞を用いた実験から、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ再構成系から、いくつかのＣＨＩＰ依存性基質が同定されてきている。驚くべきことに、これらの基質のうちいくつかは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効にマルチユビキチン化されず（ＥｒｂＢ２、ｒａｆ−１キナーゼ）（Ｄｅｍａｎｄ、２００１；Ｘｕ、２００２）、そしていくつかの基質のユビキチン化は、分解に十分ではない（Ｈｓｃ７０、ＢＡＧ−１）（Ａｌｂｅｒｔｉ、２００２；Ｊｉａｎｇ、２００１）。したがって、本明細書に記載するものと同様に保存されたＣＨＩＰ／ＵＦＤ２複合体は、実際、ｉｎ  ｖｉｖｏで多様な基質を有効にユビキチン化するのに必要であると考えられる。
【０１４６】
ＵＮＣ−４５相同体は、ショウジョウバエ、ゼノパス、ゼブラフィッシュ、マウス、およびヒトにおいて同定されている。これらはすべて、Ｃ．エレガンスＵＮＣ−４５に見られるのと同じドメイン配置：Ｎ末端ＴＰＲドメイン、ユニークな中央領域およびＣ末端ＵＣＳドメインを共有する（Ｂａｒｒａｌ、２００２；Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ、２００２）。重要なことに、Ｃ．エレガンスおよびＳ．ポンベＵＣＳドメインにおける突然変異残基は、すべての同定された相同体全体で同一であるかまたは保存されている（Ｂａｒｒａｌ、２００２）。ゼブラフィッシュ由来のＵＮＣ−４５相同体は、最近、ミオシンとの相互作用に際して、筋肉の太い線維の組み立てに必要であることが示された（Ｅｔｈｅｒｉｄ
ｇｅ、２００２）。ヒトおよびマウスのゲノムはどちらも、別個であるが、横紋筋分化において、重複する可能性もある機能を有する、ＵＮＣ−４５の２つのアイソフォームを含有する（Ｐｒｉｃｅ、２００２）。したがって、ミオシン組み立てにおけるＵＮＣ−４５の機能は、無脊椎動物種および脊椎動物種間で非常に保存されている。
【０１４７】
ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２もまた、Ｃ．エレガンスを含めて、酵母からヒトの相同体を有する。ヒトＣＨＩＰの発現研究によって、成人横紋筋（骨格筋および心臓）において、ならびにマウス胚において発生的および空間的に制御された方式で、特に心筋および骨格筋形成の経過中に、ＣＨＩＰが高発現されることが示された（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、１９９９）。しかし、ＣＨＩＰのこの組織特異的発現パターンの機能上の重要性は、現在明らかではない。線虫Ｃ．エレガンスにおいて、ミオシン組み立て中、ＣＨＩＰオルソログＣＨＮ−１が制御機能を有することが示されており、これは、哺乳動物発生中のＣＨＩＰに類似の役割があるという洞察を提供しうる。同様に保存されるＣＨＩＰ／ＵＦＤ２／ＵＮＣ４５哺乳動物複合体は、おそらく、ミオシン組み立てを必要とするプロセスに対する、同等のユビキチン依存性制御を仲介する。ＣＨＩＰ同様、ヒトおよびマウスのＵＦＤ２は、骨格筋において、高発現される（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ、１９９９；Ｋａｎｅｋｏ、２００３；Ｍａｈｏｎｅｙ、２００２）。マウス相同体ＵＦＤ２ａ、ＵＦＤ２ｂおよびＣＨＩＰはどちらも、同じＥ２酵素Ｕｂｃ４およびＵｂｃＨ５ｃと共同で働く（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、２００１；Ｊｉａｎｇ、２００１；Ｍｕｒａｔａ、２００１）。プロテアソーム・サブユニットＳ５ａは、ＣＨＩＰと物理的に相互作用し（Ｃｏｎｎｅｌｌ、２００１）、そして酵母Ｓ５ａ相同体ＲＰＮ−１０は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ＵＦＤ２と上位性に（ｅｐｉｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）相互作用する（Ｋｏｅｇｌ、１９９９）。
【０１４８】
（実施例８）
筋変性に対するＣＨＩＰの影響
ＣＨＩＰは、損傷を受けたタンパク質を検出しそして修復する、シャペロン系間のリンカーおよび制御因子として、そしてユビキチン−プロテアソーム系の分解機構として作用する（Ｋｏｅｇｌ、１９９９；Ｃｏｎｎｅｌｌ、２００１）。
【０１４９】
Ｃ．エレガンス筋ジストロフィー突然変異体は、ジストロフィン遺伝子ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）中に、そして筋特異的ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子ＭｙｏＤ  ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）の相同体中に、突然変異を所持する。動物は、運動性および産卵の時間依存性の喪失を示し、そしてその筋肉は、成虫に達した際には変性する（Ｇｉｅｓｅｌｅｒ、２０００）。
【０１５０】
ＣＨＩＰユビキチン・リガーゼ活性の下方制御が、筋変性に影響を有するかどうかを試験するため、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）Ｃ．エレガンスに、ｃｈｎ−１（ＲＮＡｉ）細菌を給餌した。ｃｈｎ−１（Ｔ０９Ｂ４．１０）のｄｓＲＮＡを発現する細菌を、Ｊ．  Ａｈｒｉｎｇｅｒの研究室のＣ．エレガンスＲＮＡｉライブラリーから得た。ｃｈｎ−１（ＲＮＡｉ）は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）線虫の移動運動速度を最大２〜３倍に増加させたが、個々の単一の突然変異体ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）およびｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）の移動運動速度には検出可能な影響を持たなかった。したがって、ＣＨＩＰは、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）線虫の筋細胞の分解に影響を有する。効果のありうる説明は、ユビキチン−プロテアソーム経路を介したタンパク質分解から、シャペロンによるタンパク質修復増加にシフトしたことであった。ＣＨＩＰはこのシフトに関与すると考えられ：Ｈｓｃ７０のような熱ショックタンパク質が一般的なターゲットであり、このタンパク質は、ＣＨＩＰによってユビキチン化される（Ｊｉａｎｇ、２００１）。ユビキチン化されたシャペロンの活性は、強く減少し、そしてその後、ミスフォールディングされたタンパク質はより少量し
か修復されない。ＣＨＩＰの活性が減少するか、または該タンパク質が失われた場合、シャペロンのユビキチン化は下方制御され、そしてタンパク質修復レベルは、細胞において増加する。ＤＧＣのアンフォールディングされたかまたはミスフォールディングされたタンパク質は、正しくフォールディングされ、そしてＤＧＣ再編成は、筋肉のより高い安定性を導き、これは、個体の運動性の増加を可能にする。
【０１５１】
ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）の運動性は、動物をｃｈｎ−１突然変異体と交配すると、さらに劇的に改善された。アレルｂｙ１５５およびｂｙ１５５／ｏｋ４５９ヘテロ接合体動物をこれらの実験に用いた。Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって、そしてまた、Ｈｏｐｐｅら，  Ｃｅｌｌ  ２００４年８月６日にも記載される、２つのｃｈｎ−１アレルｏｋ４５９およびｂｙ１５５。ｂｙ１５５ホモ接合体突然変異体において、またはｂｙ１５５／ｏｋ４５９ヘテロ接合体株において、ｃｈｎ−１活性を除去した結果、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）二重突然変異体は野生型の振る舞いに回復した。
【０１５２】
野生型線虫を移動運動アッセイにおいて試験すると（ｎ＝２８７）、９５％を超える動物が、１時間後、細菌に到達した。同じ時間後、９４±４％のｃｈｎ−１（ｏｋ４５４／ｂｙ１５５）；ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）および７９±２％のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）が細菌に到達したが、１０±６％のｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）しか細菌に到達しなかった。三重突然変異体の運動性がより優れていたのは、明らかに、筋変性が減少していたためであった。ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）動物は、過剰収縮し、非協調性（ｕｎｃ）であり、そして産卵に欠陥があり（Ｅｇｌ）、これらはすべて成虫に到達した際の、筋変性の増加の結果である。これらの表現型特性は、ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９／ｂｙ１５５）ｄｙｓ−１（ｃｘ１８；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）線虫において強く減少し、そしてｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）は、再び、野生型の体形および子宮中の卵数を示す（図８）。
【０１５３】
ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）Ｃ．エレガンスにおける筋変性は、現在まで、ジストロフィン−糖タンパク質複合体の２つのメンバーの過剰発現を通じて、部分的に減少されるだけであった。ｄｙｃ−１（中性一酸化窒素シンターゼｎＮＯＳ結合性タンパク質ＣＡＰＯＮ同様）過剰発現は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８；：ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）表現型を部分的に抑制し（Ｇｉｅｓｅｌｅｒ、２０００）、そしてｄｙｂ−１（ジストロブレビン様）過剰発現は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）表現型の結果を１日遅延させた（Ｇｉｅｓｅｌｅｒ、２００２）。検出されるような、減少した筋変性は、ｅｇｌ−１９カルシウムチャネルのＲＮＡｉが仲介する阻害を伴う、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）でのみ見られた（Ｍａｒｉｏｌ、２００１）。カルシウムチャネル活性が減少したため、細胞内のカルシウムレベルが減少し、これが筋細胞のはるかに遅い変性をもたらす。
【０１５４】
ユビキチン−プロテアソーム経路の阻害は、ＤＭＤ患者において、筋変性を減少させる方法である。ＣＨＩＰは、記載するプロセスにおいて、重要な役割を果たす単一の筋特異的タンパク質であり、そしてしたがって、ＣＨＩＰは、筋疾患、特にジストロフィー、そして最も好ましくはデュシェンヌ筋ジストロフィーに対する新規療法戦略において、重要な役割を果たす。
【０１５５】
（実施例９）
筋芽細胞のｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび定量的リアルタイムＰＣＲ
Ｍｕｓｃｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍｕｎｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の確立された方法にしたがって、生検試料からヒト筋芽細胞を選択
した。初代ヒト筋芽細胞培養物を得るため、神経筋患者の筋組織試料をタンパク質分解処理した。培養２〜３週間後、各試料に関して、２ｘ１０７筋芽細胞を凍結保存した。先に記載されるように、神経細胞接着分子に対する抗体を用いた、磁気活性化細胞選別によって、純粋筋芽細胞培養物を得た。
【０１５６】
ヒトまたはマウスの筋芽細胞を、トランスフェクション前、ＳｋＭＣ増殖培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に、３７℃、５％ＣＯ２、および９５％湿度に維持した。
【０１５７】
トランスフェクション前日、６ウェル培養プレート中、６０％の密度で、細胞を蒔いた。トランスフェクション直前、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、そして血清を含まない１ｍｌ  ＳｋＭＣ増殖培地を添加した。製造者のプロトコルにしたがって、Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅｒ（ＰｅｑＬａｂ，  Ｅｒｌａｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、トランスフェクションを行った。簡潔には、５μｌのＧｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅｒ試薬を２５μｌの血清不含培地と混合した。１０００ｎｇ  ｓｉＲＮＡを２５μｌのｓｉＲＮＡ希釈剤および１５μｌの血清不含培地の混合物中で希釈し、そして室温で５分間インキュベーションした。希釈したＧｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅｒにｓｉＲＮＡ溶液を添加し、そして細胞に添加する前に、室温で５分間インキュベーションした。トランスフェクション直後の４時間は、培地中の血清は除いた。次いで、１０％の血清濃度の１体積の培地を添加して、最終濃度５％にした。トランスフェクション２４時間後、培地を、２．５％ウシ胎児血清を含むＳｋＭＣ分化培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）に交換する（筋芽細胞）か、または２％ウマ血清を含むＤＭＥＭに交換した（筋芽細胞を筋管に分化させるため）。
【０１５８】
（ｒＵｒＵ）−３’または（ｄＴｄＴ）−３’オーバーハングを含む、標準２１量体として、ＭＷＧ  ＢＩＯＴＥＣＨ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のｓｉＭＡＸオンラインサービスを介して、ｓｉＲＮＡ（ヒトに関しては配列番号１３〜１８、そしてマウスに関しては配列番号１９〜２４）を合成した。この実験設定において（または好ましくは医学的設定においても）、配列番号１３〜２４のいずれか１つに提供するｓｉＲＮＡは、本明細書に言及するように、さらなる（安定化）ｒＵｒＵ／ｄＴｄＴオーバーハングのような、さらなる修飾を含んだことに注目されたい。ｓｉＲＮＡの例を図９にもまた例示する。
【０１５９】
７２時間の総インキュベーション後、製造者の推奨にしたがって（Ｑｕｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット）、またはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８７；１６２：１５６−１５９）にしたがって、およそ５ｘ１０３筋芽細胞／筋管からＲＮＡを単離した。
【０１６０】
ペレットを風乾し、そしてヌクレアーゼ不含水（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）中で、０．２μｇ／μｌの最終濃度に再懸濁した。各１μｇのＲＮＡを２５μｌのＤＮアーゼ消化溶液（２．５μｌ  １０ｘＤＮアーゼＩ消化緩衝液、２μｌ  ＤＮアーゼＩ（１０ＩＵ／μｌ；Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））に溶解し、そして３７℃で３０分間インキュベーションして、ゲノムＤＮＡ混入を取り除いた。７５℃で１０分間酵素不活性化した後、溶液を−８０℃で保存した。陽性対照テンプレートとして、単離したＲＮＡを用いたＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡの非存在を管理した。
【０１６１】
ｍＲＮＡ定量化のため、１２．５μｌのＲＮＡ試料を１００ｎｇのランダム六量体プライマー（ｐＮ６；Ｒｏｃｈｅ）と７０℃で５分間インキュベーションし、そして氷上で冷却した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；７５ｍＭ  ＫＣｌ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０ｍＭジチオスレイトール；各１ｍＭのデオキシ（ｄ）−ＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，  Ｓｔ．  Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ
，  Ｇｅｒｍａｎｙ）；および２００ＩＵネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（高比活性；ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を含有する２０μｌの総体積中、ＲＴを行った。ＲＴ反応を２５℃で１０分間行い、次いで４２℃で１時間行い、７０℃で１０分間によって停止し、そして−８０℃で保存した。
【０１６２】
Ｊａｋｓｃｈら（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １０：３０２５−３０３５に記載されるように、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘおよびＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌプレートおよびキャップ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
【０１６３】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出装置（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、および二本鎖ＤＮＡ特異的蛍光色素としてＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いて、リアルタイムＰＣＲ検出によって、ｍＲＮＡ存在量の定量化を行った。増幅混合物（２５μｌ）は、２．５μｌの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；１２．５μｌの５ｘＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲ緩衝液；２００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および４００μＭ  ｄＵＴＰ；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２；各３００ｎＭ（＝７．５ｐｍｏｌ）のプライマー；０．２５ＩＵ  ＡｍｐＥｒａｓｅウラシルＮ−グリコシラーゼ；および０．６２５ＩＵ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を含有した。ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ（Ｘｉａｏｗｅｉ  ＷａｎｇおよびＢｒｉａｎ  Ｓｅｅｄ（２００３）Ａ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ  ｂａｎｋ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：  ｅ１５４．
ｐ１−８．）に列挙されるプライマー対にしたがって、増幅プライマーが合成され、これは：ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを通じて、アクセス可能である。ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ番号を介して、プライマー配列を取り出すことも可能である。ヒトＣＨＩＰ−ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００５８６１；配列番号３に示す）の定量化のため、以下のプライマー対を用いた：・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ５０３１９６３ａ１：５’−ＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣ（配列番号２５）および５’−ＣＡＴＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＧＣ（配列番号２６）
・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ５０３１９６３ａ２：５’−ＴＧＣＡＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧ（配列番号２７）および５’−ＴＴＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡＡＴ（配列番号２８）
・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ５０３１９６３ａ３：５’−ＧＣＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＴＴ（配列番号２９）および５’−ＣＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧ（配列番号３０）
ネズミＣＨＩＰ−ｃＤＮＡ（ＡＫ００２７５２；配列番号７に示す）の定量化のため、以下のプライマー対を用いた：
・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ９７８９９０７ａ１：５’−ＣＧＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＣ（配列番号３１）および５’−ＣＡＣＡＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＴ（配列番号３２）
・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ９７８９９０７ａ２：５’−ＣＣＡＣＴＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＣ（配列番号３３）および５’−ＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＴＣＴＣＣＡＴ（配列番号３４）
・ＰｒｉｍｅｒＢａｎｋ  Ｉｄ  ９７８９９０７ａ３：５’−ＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＡＡＣＴＴＴ（配列番号３５）および５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴ−３’（配列番号３６）
ヒトおよびネズミのβ−アクチン−ｃＤＮＡの定量化のため、プライマー対：５’−ＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣ（配列番号３７）および５'−ＧＴＧＴＧＧＧ
ＴＧＡＣＣＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号３８）を用いた（Ｊａｋｓｃｈら（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １０：３０２５−３０３５に記載されるとおり）。
【０１６４】
ＡｍｐＥｒａｓｅ活性化のため、５０℃２分間、そして変性のため、９５℃１０分間でＰＣＲを開始した。９５℃１５秒間および６０℃６０秒間の４０周期でプログラムを続けた。各アッセイには、目的の遺伝子（すなわちＣＨＩＰ）、参照遺伝子β−アクチン、テンプレートを含まない対照、および対応する増幅効率を計算する（Ｅ＝１０−（１／ｂ）−１；ｂ＝回帰係数）ためのｃＤＮＡの４つの希釈（１：２５、１：５０、１：１００、および１：２００）の、別個にプライミングされるｃＤＮＡ３つ組が含まれた。パラメーターＣＴ（閾値周期）は、固定された閾値を蛍光強度が超える周期数と定義される。式：（１＋Ｅ（Ｉ））−ＣＴ（Ｉ）／（１＋Ｅ（β−アクチン））−ＣＴ（β−アクチン）を用いて、目的の各遺伝子（Ｉ）の相対的ｍＲＮＡ発現を計算した。ｓｉＲＮＡで処理した筋芽細胞／筋管に関して得たこれらの値を、それぞれ、未処理の細胞および健康な対照筋芽細胞／筋管に関して得た対応する値に照会した。
Ｈｓ−ＣＨＩＰ−ｓｉＲＮＡによるヒト筋芽細胞におけるＣＨＩＰ発現の下方制御
【０１６５】
【表２】
2008508224.tif 000004
【０１６６】
この実験設定にしたがって、未処理細胞のＣＨＩＰ−ｍＲＮＡレベルの３５〜５０％に対応するＣＨＩＰ−ｍＲＮＡの下方制御、すなわち５０〜６５％の発現減少を得ることも可能である。
【０１６７】
ジストログリカンおよびサルコグリカンの存在に関して、ウェスタンブロットおよび免疫染色によって、ｓｉＲＮＡ処理した筋芽細胞および筋管を分析する。ウェスタンブロット分析によって、アドハリンまたはサルコグリカンの（二次的）減少が確認された、ＤＭＤ筋管に関しては、ｓｉＲＮＡ処理した細胞のこれらのＤＡＧ構成要素の増加が想定され、これは明らかな臨床的改善である。
【０１６８】
ｓｉＲＮＡ処理した筋芽細胞および筋管の細胞膜の安定性などの巨大分子改善は、エバンスブルー試験によって、検証可能である。
ＣＨＮ−１／ＣＨＩＰオルソログの核酸分子の配列および対応するアミノ酸配列（配列番
号１〜１２）
配列番号１  ｃｈｎ−１ゲノム（カエノルハブディティス・エレガンス）（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０５９３８０）
【０１６９】
【化１】
2008508224.tif 000005
【０１７０】
配列番号２  Ｃ．エレガンスＣＨＮ−１（タンパク質ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＮＰ＿４９１７８１）
【０１７１】
【化２】
2008508224.tif 000006
【０１７２】
配列番号３  ヒトＣＨＩＰ  ｃＤＮＡ（ＳＴＵＢ１）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５８６１．１またはＮＭ＿００５８６１．２）
【０１７３】
【化３】
2008508224.tif 000007
【０１７４】
配列番号４  ヒトＣＨＩＰタンパク質配列（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＤ３３４００）
【０１７５】
【化４】
2008508224.tif 000008
【０１７６】
配列番号５  ＣＨＩＰ、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）（配列はまた：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００２  Ｄｅｃ  ２４；９９（２６）：１６８９９−９０３にも公表されている、ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＨ５１７７５、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿１９９６７４）
【０１７７】
【化５】
2008508224.tif 000009
【０１７８】
配列番号６  ＣＨＩＰタンパク質配列、ダニオ・レリオ（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＡＡＨ５１７７５）
【０１７９】
【化６】
2008508224.tif 000010
【０１８０】
配列番号７  マウスＣＨＩＰ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＫ００２７５２）
【０１８１】
【化７】
2008508224.tif 000011
【０１８２】
配列番号８  マウスＣＨＩＰタンパク質配列（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＢＡＢ２２３２９）
【０１８３】
【化８】
2008508224.tif 000012
【０１８４】
配列番号９  ラット（Ｒａｔｔｕｓ）ＣＨＩＰ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＸＭ＿２１３２７０．２またはＸＭ＿２１３２７０．３）
【０１８５】
【化９】
2008508224.tif 000013
【０１８６】
配列番号１０  ラットＣＨＩＰタンパク質配列（ＧｅｎＰｅｐｔ寄託番号ＸＰ＿２１３２７０）
【０１８７】
【化１０】
2008508224.tif 000014
【０１８８】
配列番号１１  ヒトＣＨＩＰ  ｃＤＮＡ（ＳＴＵＢ１）（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５８６１．２）
【０１８９】
【化１１】
2008508224.tif 000015
【０１９０】
配列番号１２  ラットＣＨＩＰ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＸＭ＿２１３２７０．３）
【０１９１】
【化１２】
2008508224.tif 000016
【０１９２】
さらなる文献
【０１９３】
【化１３−１】
2008508224.tif 000017
【０１９４】
【化１３−２】
2008508224.tif 000018
【０１９５】
【化１３−３】
2008508224.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１Ａ】Ｃ．エレガンスＣＨＩＰオルソログＣＨＮ−１はＵＦＤ−２に結合する  ＣＨＮ−１とＵＦＤ−２の相互作用に関する２ハイブリッドアッセイ。示すタンパク質を発現する酵母細胞を、ヒスチジンを欠く培地プレート上にストリークして、ＨＩＳ３遺伝子の相互作用依存性活性化に関して試験した。
【図１Ｂ】組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２の相互作用。細菌発現されたｍｙｃタグ化ＣＨＮ−１（ｍｙｃＣＨＮ−１）を固定ＧＳＴまたは固定ＧＳＴ−ＵＦＤ−２とインキュベーションした。
【図１Ｃ】組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨｓｐ７０オルソログＨＳＰ−１とＣＨＮ−１の相互作用。細菌発現されたｍｙｃタグ化ＨＳＰ−１（ｍｙｃＨＳＰ−１）を固定ＧＳＴまたは固定ＧＳＴ−ＣＨＮ−１とインキュベーションした。
【図１Ｄ】組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ＨＳＰ−１はＵＦＤ−２とＣＨＮ−１の結合に関して競合しない。増加する濃度（それぞれ０、０．３、３、および３０μｇ）のＨＳＰ−１の存在下で、ｍｙｃＣＨＮ−１を、ＧＳＴ−ＵＦＤ−２と結合させた。
【図１Ｅ】ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１の自己ユビキチン化。ＵＦＤ−２またはＵＤＦ−２ΔＵ−ボックスおよびＣＨＮ−１またはＣＨＮ−１ΔＵ−ボックスの組換えｍｙｃタグ化型を、示す酵素の組み合わせとインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって反応を終結させ、そしてウェスタンブロッティングによって分析した。ＵＦＤ−２およびＣＨＮ−１の有効な自己ユビキチン化には、Ｅ１、Ｅ２酵素ＬＥＴ−７０および機能するＵ−ボックスが必要である。
【図１Ｆ】
【図２Ａ】ｃｈｎ−１の欠失  ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）欠失アレルの単離。ｃｈｎ−１遺伝子（Ｔ０９Ｂ４．１０）は染色体Ｉにマッピングされる。異なるドメインをコードするゲノム領域を示す：ＴＰＲモチーフ（ＴＰＲ）およびＵ−ボックスドメイン（Ｕ−ボックス）。欠失アレルｂｙ１５５（Δ９８９ｂｐ）およびｏｋ４５９（Δ１４２２ｂｐ）の位置および度合いを示す。
【図２Ｂ】Ｎ２野生型およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）由来のｃｈｎ−１およびＴ０９Ｂ４．９転写物のノーザンブロット分析。ブロットを、ｃｈｎ−１特異的ｃＤＮＡ断片、およびｃｈｎ−１と同じオペロンの一部である隣接遺伝子Ｔ０９Ｂ４．９に対する特異的ＤＮＡ断片で探査した。装填対照として、ａｃｔ−１特異的プローブを用いた。
【図２Ｃ】（Ｄ）および（Ｅ）で用いたＣＨＮ−１および欠失変異体の図。全長ＣＨＮ−１は、３つのＴＰＲモチーフおよびＵ−ボックス・ドメインを所持する。
【図２Ｄ】ＴＰＲモチーフは、ＣＨＮ−１とＵＦＤ−２の結合に必要である。（１Ｂ）におけるように、ＧＳＴ−ＵＦＤ−２に結合する能力に関して、ＣＨＮ−１、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＵ−ボックス、ｍｙｃＣＨＮ−１ΔＴＰＲおよびｍｙｃＣＨＮ−１Δ（ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）欠失に対応する）を試験した。
【図２Ｅ】ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）欠失に対応するＣＨＮ−１断片、ＣＨＮ−１Δは、ＨＳＰ−１と相互作用しない。ヒスチジンを欠く培地プレート上で、ＨＳＰ−１への結合に関して、ＣＨＮ−１、ならびに一部切除型、ＣＨＮ−１ΔＵ−ボックスおよびＣＨＮ−１Δの２ハイブリッド相互作用を試験した。
【図３Ａ】ＣＨＮ−１、ＵＦＤ−２およびＵＮＣ−４５の複合体  組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、ウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＵＦＤ−２およびＵＮＣ−４５の相互作用。ＧＳＴ−ＵＦＤ−２を精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）とインキュベーションし、そしてグルタチオン−セファロース・ビーズを用いてプルダウンした。ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧを伴うＧＳＴ単独が陰性対照として働いた。
【図３Ｂ】組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、ウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ＵＦＤ−２またはＣＨＮ−１によるＵＮＣ−４５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合。等モル量のＧＳＴ−ＵＦＤ−２およびＧＳＴ−ＣＨＮ−１を同量の精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）とインキュベーションし、そしてグルタチオン−セファロース・ビーズを用いてプルダウンした。ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧを伴うＧＳＴ単独が陰性対照として働いた。
【図３Ｃ】組換えタンパク質を用いたプルダウン実験、その後、ウェスタンブロッティングおよびクーマシーブルー染色。ＣＨＮ−１、ＵＦＤ−２およびＵＮＣ−４５の複合体。ＧＳＴ−ＵＦＤ−２を精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）およびｍｙｃタグ化ＣＨＮ−１（ｍｙｃＣＨＮ−１）と一緒に、ｍｙｃＣＨＮ−１のみまたはＵＮＣ−４５ＦＬＡＧのみとインキュベーションし、そしてグルタチオン−セファロース・ビーズを用いてプルダウンした。ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧおよびｍｙｃＣＨＮ−１を伴うＧＳＴ単独が陰性対照として働いた。
【図３Ｄ】Ｎ２野生型動物の筋細胞におけるｃｈｎ−１およびｕｆｄ−２のトランスジェニック発現。ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１は、二倍期の胚の大部分の細胞の細胞質で発現される。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｅ】Ｎ２野生型動物の筋細胞におけるｃｈｎ−１およびｕｆｄ−２のトランスジェニック発現。ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１は、咽頭筋で発現される。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｆ】Ｎ２野生型動物の筋細胞におけるｃｈｎ−１およびｕｆｄ−２のトランスジェニック発現。ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１は、異なる幼虫期の体壁筋細胞（矢印）で発現される。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｇ】ｕｆｄ−２：：ＧＦＰは、咽頭筋で発現される。スケールバー：１０μｍ。
【図３Ｈ】ｕｆｄ−２：：ＧＦＰは、体壁筋細胞（矢印）の細胞質および核で発現される。スケールバー：１０μｍ。
【図４Ａ】ｃｈｎ−１とｕｎｃ−４５の遺伝子相互作用  （Ａ）ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）による、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の「線虫バッグ（ｂａｇ  ｏｆ  ｗｏｒｍｓ）」（Ｂａｇ）表現型の抑制。示す株のＬ３幼虫を、１５℃から２２℃にシフトした４８時間後、内部孵化で死んだ動物の数を計数した（「線虫バッグ」パーセント）。この抑制は、ｃｈｎ−１プロモーター下のＧＦＰ：：ｃｈｎ−１の染色体外発現（Ｐｃｈｎ−１：：ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１）によって、または筋特異的ｕｎｃ−５４プロモーター下のｃｈｎ−１  ｃＤＮＡの染色体外発現（Ｐｕｎｃ−５４：：ｃｈｎ−１）によって、逆転された。３つ（Ｐｃｈｎ−１：：ＧＦＰ：：ｃｈｎ−１：ｂｙＥｘ３９５、ｂｙＥＸ３９６、ｂｙＥＸ３９８）および２つ（Ｐｕｎｃ−５４：：ｃｈｎ−１：ｂｙＥｘ３９９、ｂｙＥｘ４００）の独立の株を、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）のｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）依存性抑制のレスキューに関して分析した。
【図４Ｂ】ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）による、ｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体の産卵欠陥（Ｅｇｌ）の抑制。ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）、ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）単一突然変異体および二重突然変異体のＬ３幼虫を、１５℃から２２℃にシフトし、そして子孫を計数した。
【図４Ｃ】ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）によるｕｎｃ−４５（ｔｓ）突然変異体のＵｎｃ表現型の抑制。プレート上の菌叢は、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）、ｕｎｃ−４５（ｅ２８６）単一突然変異体および二重突然変異体に関して、温度シフトした線虫（図４Ａおよび４Ｂにおけるようにシフト）を２２℃で１時間這わせた後の痕跡を示す。各株に関して、１０匹の若い成虫をアッセイし、そしてすべてが類似の運動性を示した。
【図４Ｄ】
【図５Ａ】ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）におけるｕｎｃ−４５の染色体外発現  （Ａ）Ｎ２野生型、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）に関する運動性アッセイ。筋特異的ｕｎｃ−５４プロモーター下のｕｎｃ−４５の染色体外発現（Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５）を伴うまたは伴わない、Ｎ２、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）に関して、２０℃または２５℃で１時間這わせた後の線虫の痕跡を示すプレート上の菌叢。各株に関して、１０匹の若い成虫をアッセイし、そしてすべてが類似の運動性を示した。
【図５Ｂ】Ｎ２野生型、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）に関する体の屈曲測定。筋特異的ｕｎｃ−５４プロモーター下のｕｎｃ−４５の染色体外発現（Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５）を伴うまたは伴わない、Ｎ２、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）に関して、２５℃で成長させた若い成虫の１分あたりの体の屈曲数を計数した。
【図５Ｃ】筋特異的ｕｎｃ−５４プロモーター下のｕｎｃ−４５（Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５）を発現するまたはしない、Ｎ２、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）株の体壁筋の偏光顕微鏡検査。すべての顕微鏡写真は、２５℃で成長させた若い成虫の咽頭のすぐ後部に位置する筋細胞のものである。Ｎ２、ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）、Ｎ２＋Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５、およびｕｎｃ−４５（ｍ９４）＋Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５動物の筋細胞が、長いＡ帯（明色帯、矢印で示す）が長いＩ帯（暗色帯）と交互になっている、よく組織化されたサルコメアを有し、一方、ｕｎｃ−４５（ｍ９４）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）＋Ｐｕｎｃ−５４：：ｕｎｃ−４５動物の筋細胞は、同等の領域において（矢じり）、交互のＡ帯およびＩ帯が同定困難である、組織が乱れたサルコメアを有する。
【図６Ａ】ＵＮＣ−４５はＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２依存性ユビキチン化のターゲットである  ＵＮＣ−４５のｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化。精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）を、示した酵素の組み合わせとインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって反応を終結させ、そしてウェスタンブロッティングによって分析した。ＵＮＣ−４５ユビキチン化には、ＣＨＮ−１またはＵＦＤ−２が必要である。
【図６Ｂ】ＵＮＣ−４５のｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化。精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）を、示した酵素の組み合わせとインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって反応を終結させ、そしてウェスタンブロッティングによって分析した。ＵＮＣ−４５のユビキチン化は、ＣＨＮ−１の機能するＵ−ボックスに依存する。
【図６Ｃ】ＵＮＣ−４５のｉｎ  ｖｉｔｒｏユビキチン化。精製ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ）を、示した酵素の組み合わせとインキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって反応を終結させ、そしてウェスタンブロッティングによって分析した。ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２両方が一緒に、ＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化する。
【図６Ｄ】ＵＮＣ−４５はｉｎ  ｖｉｖｏでユビキチン化される。組換え的に発現されるＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５（ＵＮＣ−４５組換え）またはＮ２野生型動物で発現されたＵＮＣ−４５ＦＬＡＧ（ＵＮＣ−４５溶解物）をＦＬＡＧ特異的抗体で免疫沈降し、そして沈降物をＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体または抗ユビキチン（抗Ｕｂｉ）抗体を用いてウェスタンブロッティングした。ＦＬＡＧタグ化ＵＮＣ−４５を発現しないＮ２野生型の溶解物（ＷＴ溶解物）が、陰性対照として働き、そしてこれは抗Ｕｂｉ抗体と反応しなかった。
【図７】ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５のＣＨＮ−１／ＵＦＤ−２依存性制御の仮説モデル  ＵＮＣ−４５は、ミオシンおよびＨｓｐ９０に同時に結合可能であり、そしてそれによって、筋肉の太いフィラメントの組み立てにおいて、ミオシンに関する分子シャペロンとして、そしてＨｓｐ９０コシャペロンとしての両方で機能する。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）およびユビキチン・コンジュゲート化酵素（Ｅ２）ＬＥＴ−７０と共同で、ＣＨＮ−１およびＵＦＤ−２に形成されるＥ３／Ｅ４複合体は、ＵＮＣ−４５をマルチユビキチン化する。マルチユビキチン化されたＵＮＣ−４５は、おそらく、２６Ｓプロテアソームによって分解される。したがって、ミオシン・シャペロンＵＮＣ−４５のタンパク質レベルは、緊密に制御されるようであり、これは体壁筋細胞におけるミオシンの正しい組み立てのため、必要であるようである。
【図８】ｃｈｎ−１欠失は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）バックグラウンドのＣ．エレガンスの運動性を増加させる  ｃｈｎ−１バックグラウンドは、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）線虫における筋肉分解をレスキューする。ｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ｄｙｓ−１(ｃｘ１８)；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）成虫は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）成虫に比較して、野生型様の体の形状、および子宮中に、より少数の卵を示す。ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）欠失は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）の運動性を増加させる。成虫を寒天プレート上に置き、香りのよい誘引物質として新鮮な細菌をプレートの反対側に置き、そして明記する時間後、細菌上の線虫の割合を計算する。ｃｈｎ−１（ｏｋ４５９）ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）（灰色の点のカラム）およびｃｈｎ−１（ｂｙ１５５）ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）（灰色のカラム）三重突然変異体は、ｄｙｓ−１（ｃｘ１８）；ｈｌｈ−１（ｃｃ５６１）（黒のカラム）に比較して、非常に増加した移動運動を示した。水平軸は、動物をアッセイプレートに移してからの時間を示す。結果は少なくとも４回の独立実験に基づく。株あたりの試験した動物の総数を、第一のカラムの上部に示す。
【図９Ａ】本発明に関連して使用されるべきｓｉＲＮＡの実例となる例。Ａヒト。
【図９Ｂ】本発明に関連して使用されるべきｓｉＲＮＡの実例となる例。Ｂマウス。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ−Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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