(57)【要約】  本発明は，低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域と共に，進化的に保存されたモチーフを除去することによる，高リスクＨＰＶの全抗原を用いて免疫した場合に比較して，高リスクＨＰＶに特異性を有する抗体を構築する方法，及び該方法により得られる抗体に関する。
2008530087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域と共に，進化的に保存されたモチーフを除去することを含む，高リスクＨＰＶの全抗原を用いて免疫した場合に比較して前記高リスクＨＰＶに対して特異性を有する抗体を構築する方法。
【請求項２】
高リスクＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質断片ＥＥＥＮ ＤＥＩＤ ＧＶＮ ＨＱＨ ＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＣＨＴＭＬＣＭ（配列番号７），特にＰＡＲＲＡ（配列番号１０）の断片部分を利用する請求項１記載の方法。
【請求項３】
高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＥＥ Ｅ ＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号８），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分を利用する請求項１記載の方法。
【請求項４】
高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬ（配列番号９），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分，及び／又は，ＬＲＬＣＶＱＳＴ（配列番号１２）断片部分を利用する請求項１記載の方法。
【請求項５】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号１のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号２のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号３のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号４のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号５のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号６のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
抗体が低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域と同様に，進化的に保存されたモチーフに結合性を有さず，高リスクＨＰＶに対して特異性を有する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，子宮頸部上皮内腫瘍及び子宮頸癌に関与する，高リスク型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）株のＥ７癌タンパク質の，予め定義される領域に特異的な抗体を構築する方法に関する。本発明によれば，抗原の定義された部位が，ファージの表面上に露出しているファージコートタンパク質との融合により提示され，このようなファージ粒子を免疫原として使用することにより，予め定義された領域に対する特異的な抗体の応答が高められる。本発明は，低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する進化的に保存されたモチーフ及び断片を除去することにより，従来の完全抗原を使用しての免疫に比較して，高リスクＨＰＶのＥ７タンパク質の特異的な部位に対してモノクローナル抗体（ＭＡｂ），ポリクローナル抗体（ＰＡｂ），或いは抗体フラグメントを構築するための，改良された方法を提供する。
【０００２】
本発明は，低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域だけでなく，進化的に保存されたモチーフを除去することにより，全抗原で免疫した場合に比較して高リスクＨＰＶに特異性を有する抗体を構築するための，改良された方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ファージディスプレイ法は，ファージ粒子表面上の外来性ペプチド或いはタンパク質を発現させる技術である。この技術［１］の発明以来，ホルモン，毒素，受容体，抗体フラグメント，ペプチドライブラリー，ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等の多数の異なる分子の提示に成功している（スミス及びペトレンコ（Smith and Petrenko）［２］による概説）。ファージディスプレイ法が最も適している応用の一つが，バイオパニングにより特異的結合体を選別するために利用されるような，大きな抗体ライブラリーの構築である［３］。
【０００４】
さらに，繊維状ファージにより提示された抗原で免疫した場合には，免疫応答が効率的に引き起こされることも示されている。このことは，熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）スポロゾイト周囲タンパク質のファージディスプレイ繰返し領域で，マウス及びウサギを免疫することにより最初に実証された［４］。また，組換えファージにより免疫されたマウスが，病原体に対する免疫能を獲得できることが，更なる研究により実証されている［５−８］。
【０００５】
ファージ提示ミモトープは元の抗原に対する免疫系を活性化できること［９−１２］，及び，繊維状ファージは，特異的細胞障害性Ｔリンパ球を誘発できること［１３，１４］がいくつかの研究により明らかにされている。
【０００６】
発明の開示
本発明は，種々の形態の抗体，例えば，モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体，単鎖Ｆｖｓ又はＦａｂフラグメントを構築するための免疫原として使用される，高リスクヒトＨＰＶ株に特異的なＥ７癌タンパク質の特定断片をファージ上に提示させることに関する。高リスク及び低リスクＨＰＶ株のＨＰＶＥ７配列を，他のウイルスタンパク質と同様に詳細に検討した結果，ＨＰＶの高リスク群に特異的な断片部位を見出した。ＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質のＮ末端には，シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)の腫瘍抗原と同様に，アデノウイルスＥ１Ａタンパク質にも相同性を有する配列である二つの保存されたドメイン（ｃｄ１及びｃｄ２）が存在する（図１）。これらの保存ドメインは，これらのウイルス性癌タンパク質のそれぞれの形質転換能に必要であり，網膜芽細胞腫抑制遺伝子産物(the retinoblastoma tumor suppressor gene product)ｐＲＢを含む多数の重要な細胞制御タンパク質との相互作用に関与している［１５］。また，ｃｄ２の保存モチーフＬ×Ｃ×Ｅは，サイクリンＤ１のＮ末端にも存在する（図１）。したがって，Ｅ７タンパク質全体で免疫して得られた抗体は，これらのタンパク質と交差反応性を有すると考えられる。Ｅ７タンパク質の配列には，低リスクＨＰＶと高リスクＨＰＶとで実質的に異なる部位があることが明らかになった。しかしながら，高リスク株間での相違も大きく，Ｅ７を標的として使用して全高リスク株を検出するための試薬は，関連株群に特異的な抗原での一連の免疫により得られた抗体から成ることが必要である。本研究では，Ｅ７タンパク質には低リスク株とＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型のそれぞれの間で大きく異なる領域が存在することを確認した（図２）。前記領域に対応する遺伝子断片をファージディスプレイベクターｆ８８−４及びｐＭＫ１０１にクローン化し，発現させて得られたペプチドは，ファージコートタンパク質ｐＶIIIと融合して，ファージ粒子表面上に提示された。高リスクＨＰＶに特異的な免疫応答を高めるために，この組換えファージクローンを使ってマウスを免疫した。このように，詳細な配列分析，及び，選択した遺伝子断片のファージベクターｆ８８−４へのクローニングにより，高リスクＨＰＶに対して所望の特異性を有する抗体を作製することができた。
【０００７】
実施例１
ＨＰＶ１６型及び１８型Ｅ７癌タンパク質のクローニング及び発現
１．１  ＰＣＲ増幅
細胞株ＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５５０）及びＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２）のｍＲＮＡ（クイックプレップマイクロｍＲＮＡ（Quick prep micro mRNA）精製キット：ＧＥヘルスケア(GE Healthcare)）から調製したｃＤＮＡ（ファーストストランドｃＤＮＡ（First-strand cDNA）合成キット：ＧＥヘルスケア）を表１に示したプライマーを用いて，ＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型それぞれのＥ７遺伝子のコード領域の増幅の鋳型として使用した。約100ngの各ｃＤＮＡを鋳型として，0.5μMの各プライマー，７5mMのトリス塩酸（pH8.8，25℃），20mMの（ＮＨ４）２ＳＯ４，0.1%（ｖ／ｖ）のツイン２０(Tween 20)，1.5mMのＭｇＣｌ２，0.02u/μlのタック−ポリメラーゼ（Taq−polymerase），（アブジン；Abgene）及び0.1mMの各デオキシヌクレオチドを含有する反応混合物を全量50μlとし，95℃，55℃及び72℃の温度サイクルで，各１分間のインキュベーションを３０回繰り返した。5μlのＰＣＲ産物を1%のアガロースゲル上で分離し，ＰＣＲ産物の大きさ及び純度を確認した。ＰＣＲ産物はキアクイックＰＣＲ（QIA quick PCR）精製キット（キアゲン；Qiagen）を用いて，取り扱い説明書に従って，プライマーとデオキシヌクレオチドを除去し，精製した。
【０００８】
１．２  発現ベクターへのクローニング
精製したＰＣＲ産物及び発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−３（ＧＥヘルスケア）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（ＧＥヘルスケア）を用いて切断し，通常の方法により切断断片を沈殿及び連結した(precipitate and ligated)。ＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型Ｅ７転写物をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーザ（ＧＳＴ）と融合し，連結されたＤＮＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プロメガ；Promega）に形質転換した。プラスミドＤＮＡは，ウィザードプラスミニプレップＤＮＡ（Wizard Plus Minipreps DNA）精製システム（プロメガ）を使用して作製し，配列が確認されたクローンを，タンパク質発現に使用した。
【０００９】
１．３  組換えＥ７タンパク質の発現
それぞれＯＤ６００＝０．８に達するまで成長させたＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型のＥ７癌タンパク質を発現するそれぞれのクローンは，イソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＤ）を最終濃度0.1Mになるように添加することにより，３時間誘導される。回収された菌体はリゾチームで破砕し，上清を0.2μmの滅菌ろ紙（ミレックスＧＶ；Millex GV）でろ過した。組換えＥ７‐ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース（アマシャムバイオサイエンス；Amersham Biosciences）に結合させ，洗浄した後，グルタチオン溶出緩衝液（アマシャムバイオサイエンス）で溶出した。Ｅ７‐ＧＳＴ融合タンパク質の純度をヌページビス−トリス（NuPAGE Bis-Tris）ゲル電気泳動（インビトロジェン；Invitrogen）により測定した。
【００１０】
実施例２
ＨＰＶ１６型及びＨＰＶ１８型Ｅ７癌タンパク質断片のクローニング
２．１  ＰＣＲ増幅
ＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質の断片２種（１６−１及び１６−２）及びＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質の断片１種を表２に示すプライマーを用いて増幅した。ｃＤＮＡのそれぞれ約10ngを，発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−３に導入し，これを鋳型として，0.5μMの各プライマー，75mMのトリス塩酸（pH8.8，25℃），20mMの（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．1%（ｖ／ｖ）のツイン２０，1.5mMのＭｇＣｌ２，0.02u/μlのタック−ポリメラーゼ（アブジン），及び，0.1mMの各デオキシヌクレオチドを含有する反応混合物を全量50μlとし，95℃，55℃及び72℃の温度サイクルで各１分間のインキュベーションを３０回繰り返した。ＰＣＲ産物5μlを2%のアガロースゲル上で分離し，ＰＣＲ産物の大きさ及び純度を調べた。ＰＣＲ産物はキアクイックＰＣＲ（QIA quick PCR）精製キット（キアゲン）を用いて，取り扱い説明書に従って，プライマーとデオキシヌクレオチドを除去し，精製した。
【００１１】
２．２  ｆ８８−４へのクローニング
約100ngの各ＰＣＲ産物と5μgのファージディスプレイクローニングベクターｆ８８−４（ジーピースミス（G.P.Smith）氏からの贈与）をＨｉｎｄIII及び膵分泌性トリプシンインヒビター（PstI）（ＧＥヘルスケア）を用いて，取り扱い説明書に従って切断した。消化されたクローニングベクターを0.8%のアガロースゲル上で分離し，ベクターバンドを切除し，キアエックスII（QIAEX Il）ゲル抽出キット（キアゲン）を用いてＤＮＡを精製した。約100ngの精製したベクターＤＮＡを，消化された各ＰＣＲ産物との反応に供した。反応物を通常の方法に従ってフェノール及びクロロフォルムで抽出し，酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。ベクター及びＰＣＲ産物のペレットを20μlの１×ＲＸ緩衝液，及び，0.05ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ／μl（ＵＳＢ）に溶解し，室温で一晩連結反応を行った。各連結物の10μlは，ＣａＣｌ２による処理により，大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに形質転換され，上部寒天に混合され，40μg/mlのテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上に塗布し，37℃で１６〜１８時間インキュベートし，個々のクローンを分取した。各々のクローンを40μg/mlのテトラサイクリンを含有する1mLのＬＢ中で一晩インキュベートし，一本鎖ファージＤＮＡをファージディスプレイペプチドライブラリーキット（ニューイングランドバイオラボ；New England Biolabs）の指示書に従って調製した。クローンはＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターサイクルシークエンシング（ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing）（アプライドバイオシステムズ；Applied Biosystems）を用いて配列決定した。試料はＡＢＩプリズム３１０（ABI Prism 310）により処理した。
【００１２】
実施例３
癌タンパク質Ｅ７のファージ提示断片による免疫
３．１  免疫用ファージの作製
各クローンを，20μg/mlのテトラサイクリンを含有する5mlのＬＢ中で37℃で８時間インキュベートした後，20μg/mlのテトラサイクリン及び1mMのＩＰＴＧを含有する500mlのＬＢに接種した。37℃で一晩インキュベートした後，14500×gで4℃，２０分間遠心分離し菌体を除去し，100mlの20%ＰＥＧ８０００と2.5mlのＮａＣｌ，ＰＥＧとを添加してファージ粒子を沈殿させた。試験管を氷上で４時間インキュベートした後，上記と同様の遠心分離を再度行い，ファージ粒子を回収した。20mlのＴＢＳにファージを溶解し，残存する菌体を遠心分離により除去し，ファージ粒子を4mLのＰＥＧ，ＮａＣｌを添加して再び沈殿させ，11500×gで4℃，３０分間遠心分離して回収した。ファージ粒子を2mlのＴＢＳに溶解し，残存する菌体を遠心分離により除去した。最後にファージ溶液をろ過滅菌した（0.22μm）。ファージ調製物は使用時まで4℃で保存した。ファージ調製物の力価は，269nm及び320nmでの吸光度を測定し，スミス（Smith）のアルゴリズムに従って算出した
（http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhargeDisplayWebsiteIndex.html）。
【００１３】
２．１  マウスの免疫
５×１０１１個のファージ粒子を，100μlのＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョン（コリクサ；Corixa）と混合し，ＢＡＬＢ／ｃマウスに３〜５週間の間隔で６回腹腔内投与した。全量は200μl〜300μlの範囲で変動した。血液サンプルを免疫前，各免疫日及び最終追加免疫日から５日後に採取した。血液サンプルを抗Ｅ７抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により分析した。血液サンプルをブロッカーカゼイン含有ＰＢＳ（ピアス；Pierce）で連続希釈し，組換えＨＰＶ１６型Ｅ７及びＨＰＶ１８型Ｅ７でコートしたリアクチバインド（Reacti-Bind）グルタチオンコートウェル（ピアス）に添加し，グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させた。免疫前及び免疫血清をブロッカーカゼイン含有ＰＢＳで連続希釈し，コートウェル(coated well)に添加した。１時間インキュベートした後，ウェルを６回洗浄し（ＥＩＡキット洗浄，カンアーゲーダイアグノスティックアーベー；CanAg Diagnostics AB），ＨＲＰ標識抗マウス抗体ウサギ抗体（ダコサイトメーション；Dakocytomation）を加えてさらに１時間インキュベートし，抗Ｅ７抗体を調査した。洗浄後，結合を検出するためにホースラディッシュパーオキシダーゼの基質である増強Ｋ−ブルー（Enhanced K-blue）（ネオゲンコーポレイション；Neogen Corporation)を添加し，３０分後にプレートの吸光度を620nm（Ｖマックス(Vmax)，モレキュラーコーポレイション；Molecular Corporation）で測定した。ＨＰＶ１８型Ｅ７クローンで免疫したマウス３匹中２匹のマウスの血清サンプルは，弱いながらも，組換えＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質に対して特異的反応性を示した。さらに，ＨＰＶ１６型Ｅ７（図２）のファージクローン提示断片１で免疫したマウス３匹中２匹において，組換えＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質（図３）に特異性を有する抗体が得られた。その内，１匹のマウスの血清サンプルでは，４０００倍に希釈した場合でも高い反応性を示した。このように，Ｅ７タンパク質の定義された部位を有するファージ粒子でマウスを免疫することにより，Ｅ７に特異的な応答が誘導された。
【００１４】
実施例４
モノクローナル抗体の確立
４．１  融合及びクローニング
中程度及び高程度の抗ＨＰＶ１６型Ｅ７力価を示したマウス２匹のそれぞれの脾臓細胞をデセントグロス及びシャイデガー（de St. Groth and Scheidegger）［１６］に記載された方法と実質的に同様の方法で，ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８と融合させた。抗ＨＰＶ１６型モノクローナル抗体のスクリーニングは抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ジャクソンイムノリサーチ；Jackson Immunoresearch）をコートしたマキシソープ（Maxisorp）マイクロタイタープレート（ヌンク；Nunc）を用いて行った。融合細胞を含む上清をインキュベートし，プレートを洗浄した後，ＨＰＶ１６型Ｅ７−ＧＳＴ融合タンパク質を添加し，さらに６０分間インキュベートした。再度洗浄した後，結合した抗原を抗ＧＳＴ抗体ウサギ抗体（サンタクルーズバイオテクノロジー；Santa Cruz Biotechnology），次いで，ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体ブタ抗体（ダコサイトメーション）を用いて調査，検出した。１回目のスクリーニングで融合細胞陽性だったものについて，さらにインビトロでインキュベートし，２回目のスクリーニングを行った。ＨＰＶ１６型Ｅ７に対して特異的な反応性を有する抗体を産生する３個の融合細胞（Ｅ７１６−１，Ｅ７１６−２及びＥ７１６−９）を確認した。これらの融合細胞をクローン化し，さらにスクリーニングを行い，各融合細胞について５個のクローンを選択した。
【００１５】
４．２  アイソタイピング
抗体のアイソタイプ（Ｇ１，Ｇ２ａ，Ｇ２ｂ，Ｇ３，Ｍ，Ａ）をＥＬＩＳＡにより決定した。モノクローナル抗体のアイソタイプはアイソタイプ特異的なＨＲＰ−標識ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて決定した（表３）。
【００１６】
４．３  ウェスタンブロット分析
３個のクローンのヒト癌細胞株であるＨｅＬａ細胞及びＣａＳｋｉ細胞のライセート中のＥ７タンパク質に対する反応性をウェスタンブロット分析により調べた。細胞タンパク質をＳＤＳ−ポリアシルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），12%のビストリス−ゲル（インビトロジェン）及び抗酸化剤含有１×ＭＥＳ緩衝液（インビトロジェン）で還元，変性し，ＰＶＤＦ膜に転写した。非特異的結合を低減するために，転写膜及び抗体はブロッキング緩衝液で処理した。該膜をクローン培地（約1μg/mlのｍＡｂ）中で１時間インキュベートした後，0.2%のツイン(Tween)を含有するＴＢＳで２０分間３回洗浄した。次いで，第２抗体であるＨＲＰ標識抗マウス抗体ウサギ抗体（ダコサイトメーション）を含有するブロッキング緩衝液（1:1000）中で１時間インキュベートした後，洗浄し，シグナルをＥＣＬ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて使用説明書に従って検出した。３個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）全てがＥ７タンパク質（予想分子量：10.9kDa）に特異的に結合した（図４）。
【００１７】
４．４  エピトープマッピング
ＨＰＶ１６型Ｅ７の断片１の３個の重複する部分を提示するファージを作製し，モノクローナル抗体の大まかなエピトープマッピングに使用した。表４に示すプライマーを用いて上記２．２及び２．３に従ってファージクローンを構築し，上記３．１と同様にファージを増幅した。マッピングはＥＬＩＳＡを利用して行った。アフィニピュア（AffiniPure）抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ジャクソンイムノリサーチ）でコートしたマキシソープウェル（ヌンク）により抗Ｅ７ｍＡｂを捕獲した。３つの異なる組換えファージ粒子を添加し，その結合を抗Ｍ１３抗体ウサギ抗体（カンアーゲーダイアグノスティックアーベー）及びＨＲＰ標識抗ウサギ抗体ブタ抗体（ダコサイトメーション）を用いて検出した。ＴＭＢと数分間インキュベートした後，シグナルを検出した。Ｅ７１６−１：２及びＥ７１６−９：１は提示された断片２８−４６及び３７−５３に反応性を示した。これら２つの抗体の対応するエピトープはアミノ酸残基３７から４６の間に位置していると推測される。ＭＡｂＥ７１６−２：１は，ペプチド２８−４６と４７−６２の結合部に位置するエピトープであるペプチド断片３７−５３にのみ反応性を示した。
【００１８】
４．５  免疫細胞化学（ＩＣＣ）
ＩＣＣのためにＨｅＬａ及びＣａＳｋｉ細胞を展開，固定化するいくつかの方法について検討した結果，亜鉛による固定化（ウェスター他（Wester et al）の方法［１７］の変形法）による方法が最も良好であった。細胞中のＥ７タンパク質に結合したｍＡｂの検出はベクタステイン（Vectastain）ＡＢＣキット（ベクターラボラトリーズ；Vector Laboratories）を用いて行った。Ｅ７１６−１：２及びＥ７１６−９：１クローンはＨｅｌａ細胞（ＨＰＶ１８型）には結合することなく，ＣａＳｋｉ細胞質（ＨＰＶ１６型）のみを特異的に染色した。
【００１９】
【表１】
2008530087.tif 000003
【００２０】
【表２】
2008530087.tif 000004
【００２１】
【表３】
2008530087.tif 000005
【００２２】
【表４】
2008530087.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００２３】
無し
【図１】
2008530087.tif 000007
【図２】
2008530087.tif 000008
【図３】
2008530087.tif 000009
【図４】
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【配列表】
2008530087000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月16日(2007.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域と共に，進化的に保存されたモチーフを除去することを含み，
高リスクＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質断片ＥＥＥＮ ＤＥＩＤ ＧＶＮ ＨＱＨ ＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＣＨＴＭＬＣＭ（配列番号７），特にＰＡＲＲＡ（配列番号１０）断片部分，高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＥＥ Ｅ ＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号８），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分，又は高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬ（配列番号９），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分及び／又はＬＲＬＣＶＱＳＴ（配列番号１２）断片部分を利用する，高リスクＨＰＶの全抗原を用いて免疫した場合に比較して前記高リスクＨＰＶに特異性を有する抗体を構築する方法。
【請求項２】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号１のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号２のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項４】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号３のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項５】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号４のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項６】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号５のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項７】
ファージベクターｆ８８−４中にクローニングするために，配列番号６のプライマーを使用してＥ７部分を増幅する請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗体が低リスクＨＰＶのＥ７タンパク質に高い相似性を有する領域と同様に，進化的に保存されたモチーフに結合性を有さず，前記高リスクＨＰＶが，高リスクＨＰＶ１８型Ｅ７タンパク質断片ＥＥＥＮ ＤＥＩＤ ＧＶＮ ＨＱＨ ＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＣＨＴＭＬＣＭ（配列番号７）であり，特にＰＡＲＲＡ（配列番号１０）断片部分，又は，高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＥＥ Ｅ ＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号８），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分，又は，高リスクＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質断片ＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬ（配列番号９），特にＮＩＶＴＦＣＣＫ（配列番号１１）断片部分，及び／又は，ＬＲＬＣＶＱＳＴ（配列番号１２）断片部分が存在する，高リスクＨＰＶに対して特異性を有する抗体。
【国際調査報告】
2008530087.tif 000011
2008530087.tif 000012
2008530087.tif 000013
2008530087.tif 000014
2008530087.tif 000015
2008530087.tif 000016