(57)【要約】  本発明は、（ｉ）生物学的かつ医薬的に許容される材料で作られた、結合力のある開放多孔性構造形成マトリックスおよび（ｉｉ）血清を含む、無細胞移植片を提案する。  一つの特に好ましい実施態様において、マトリックスはゲルをさらに含有する。  第二の態様により、かかる無細胞移植片の生成方法が提案され、それにより、マトリックスおよびゲルが提供される場合にはゲルは、血清と接触される。血清を含む移植片は、任意に、乾燥されてもよい。あるいは、マトリックスおよびゲル（ゲルが提供される場合）は、血清と接触される前、乾燥状態である。  最後に、第三の態様により、本発明は、組織を再生する、特に、軟骨および／または骨を再生するための無細胞移植片の使用を提案する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）生物学的かつ医薬的に許容される材料で作られた、結合力のある開放多孔性構造形成マトリックスおよび（ｉｉ）血清を含む、無細胞移植片。
【請求項２】
マトリックス材料が吸収性または非吸収性である、請求項１に記載の無細胞移植片。
【請求項３】
マトリックスが、織布あるいは不織布（特に、フリースおよびフェルト構造物）、メンブレン、スポンジ、詰め物、開放気泡フォーム、ウール、ヒモ、規則的に配列された繊維束およびランダムな繊維束、多孔質セラミック材料、海綿質およびゲル、ならびにこれらの組合せから選択される構造を有する、請求項１または２に記載の無細胞移植片。
【請求項４】
マトリックスが、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、キチン、多糖、セルロースおよびそれらの誘導体などの天然および合成ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（グリコリド、乳酸塩）、カプロラクタム、および金属の酸化物、炭化物、窒化物および炭窒化物などのセラミック材料、特に、シリコン酸化物、酸化チタンおよび酸化カルシウム；金属の、ハロゲン化物、特にはフッ化物、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの鉱物、リン酸カルシウム、アパタイト、ヒドロキシルアパタイト；チタン、アルミニウム、金、銀、ステンレス鋼などの金属およびそれらの混合物からなる群より選択される材料である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片。
【請求項５】
マトリックスの片側に適用されるか、および／または少なくとも部分的にそれを貫通するゲルをさらに含有する、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片。
【請求項６】
ゲルが天然または合成ヒドロゲルである、請求項５に記載の無細胞移植片。
【請求項７】
ゲルがマトリックスより低い剛性のものである、請求項５または６に記載の無細胞移植片。
【請求項８】
ゲルが、多糖、ポリペプチド、ヒアルロン酸、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸塩、アガロースおよびキトサン、ならびにそれらの混合物から選択され、好ましくは、ヒアルロン酸である、請求項５〜７のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片。
【請求項９】
血清が、自系、同種または異種性であり、好ましくは少なくとも１種類の要素を添加すること、および／または少なくとも１種類の血清成分を除去することにより任意に修飾される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片。
【請求項１０】
成長因子、分化因子、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、細胞接着分子、走化因子、酵素、酵素インヒビター、補酵素、鉱物、脂肪、脂質、糖類、および抗生物質、鎮痛剤、炎症阻害剤および免疫抑制剤などの医薬物質、および緩衝物質、安定剤、特に、低温安定剤、およびビタミン、好ましくは、ホルモン、成長因子および分化因子からなる群から選択される１種類以上の要素をさらに含有する、請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片。
【請求項１１】
ホルモン、成長因子および分化因子が、インスリン、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＩＬ８、ＳＤＦ１−α、ＥＧＦまたはそれらの組合せである、請求項１０記載の無細胞移植片。
【請求項１２】
マトリックスおよびゲルが提供される場合にはゲルとが血清と接触されることによる、請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片の製造方法。
【請求項１３】
接触が、滴下、軟化、含浸または浸漬により達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ゲルが、まずマトリックスに取り込まれ、および／またはそれに適用され、次に、血清と接触される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゲルが提供される場合にはゲルとマトリックスとの組合せ、ならびに他の任意の構成物質が接触前または後に乾燥される、請求項１２〜１４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
移植片が乾燥状態から元に戻される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組織を再生するための、請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載の無細胞移植片の使用。
【請求項１８】
間葉組織、特に、軟骨および／または骨を再生するための、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織を再生するため、特に、軟骨を再生するための無細胞移植片、それを生成する方法および組織を再生するための移植片の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は結合組織から生成された中胚葉組織の形態であり、そしてそれは、多分化能の未分化中胚葉系前駆細胞によって生成される。３種類の軟骨間の区別は、硝子軟骨、弾性軟骨および線維軟骨である。硝子軟骨は、最も一般的な軟骨の形態であり、例えば、関節表面においてみられる。摩耗または損傷により引き起こされる軟骨の欠損は、広範囲に及ぶ医療上の問題である。身体の通常の炎症系および修復系は軟骨に関しては機能しないので、それは低い自己治癒能しか有さない。それ故に、関節軟骨における軟骨領域ならびに骨軟骨領域を置き換える手段としての方法および技術が、過去、特に、ここ数年にわたり開発されてきた。例えば、関節軟骨は、骨膜、軟骨膜、同種異系および自家骨軟骨移植片、同種異系半月または合成材料で作られた人工関節により置き換えられてきた。
【０００３】
軟骨細胞の自家移植にあっては、患者から採取された軟骨細胞は細胞培養において成長し、再び患者に戻される。それらは、種々の異なる種類の移植片の形態で戻されてもよい。これらの例は、関節に注射される注射液、軟骨細胞を注入されたマトリックスおよび類似のものである。
【０００４】
例えば、特許文献１には、三次元細胞外マトリックスおよび遺伝子操作された細胞を含む人工組織が記載されており、該マトリックスが免疫抑制因子または細胞分化誘導因子を放出することができる。好ましくは、これらのマトリックスは、ポリマーフリースの形態を取り、それを介して、細胞懸濁液（フィブリノーゲン溶液に懸濁されていてもよい）が分布される。成長および／または分化過程に必要な対応する細胞外マトリックスの因子または成分もマトリックスに添加されてよい。マトリックスにおいて細胞を維持するために、細胞懸濁液は、トロンビンを添加することにより固められてもよく、それにより完成した移植片が得られる。
【０００５】
特許文献２には、細胞培養物からの移植物の生成方法が記載されており、該方法において、細胞が適用される三次元担体構造物がまず被包され、次に、栄養溶液が浸み込まされる。吸収性の微小体が担体構造物に取り込まれ、そしてそれらが吸収されると、組織形成に影響する因子を放出する。
【０００６】
特許文献３には、三次元担体構造物（好ましくは、ポリマーフリースで作られる）が記載されており、該構造物中に細胞が取り込まれる。次いで、この担体構造物に、細胞成長および細胞外マトリックスの形成を細胞により促進するために、栄養溶液を浸み込ませる。細胞が遊走したり、あるいは排出されることを防ぐために、担体構造物はアガロースで被包される。
【０００７】
特許文献４には、滑液における間葉系細胞の使用も記載されている。必要に応じて、この組成物はまた、フリースまたはプラスチックなどの担体に適用され、この形態の移植片として用いられ得る。そうでなければ、滑液中の細胞懸濁液自体が、関連の関節に注入される。
【０００８】
あるいは、実質的に細胞を全く含有しない、マトリックス構造物が作られる特許文献５には、細胞成長に適した１種類以上の構造形成タンパク質を含有する補強マトリックスメンブレンが記載されている。適当なタンパク質は、例えば、コラーゲンである。得られた、メンブレン中のマトリックスに、細胞が注入されてもよく、あるいはそのまま移植されてもよい。後者の場合、身体自身の組織由来の細胞がマトリックス構造物に遊走すると考えられる。それは、例えば、通常のプライディー（Ｐｒｉｄｉｅ）穿刺または微破砕により行われる。これらの技術を用いて、わずかな穿刺穴または破砕が、関節骨（骨髄の範囲まで）において作られる。血液は、穿刺穴を介して欠損部まで流れ、結果として、欠損部が血液移植片で満たされる。移植片は、間葉系前駆細胞を含有し、それは適当な起動力により刺激され、いわゆる線維軟骨である軟骨型置換組織を形成することができる。マトリックス材料がプライディー穿刺穴を覆って置かれると、血液細胞は、このマトリックス材料内に遊走することができ、それにより、次に、それらは定着する。
【０００９】
特許文献６および特許文献７は、この効果を使用し、動員手段としてマトリックス構造物中に成長因子および分化因子（前記特許文献６）またはケモカイン（前記特許文献７）を取込むことよってそれを増強する。全ての因子は、軟骨形成間葉系前駆細胞の動員を増大するように意図されている（究極の目的は、軟骨をより迅速に再生することである）。
【００１０】
最後に、特許文献８には、血液由来の適当な移植片を生成する可能性およびポリマー成分が開示されている。この明細書により強調される根本的な問題は、プライディーの穿刺技術を用いて標準として形成する血液移植片が、凝固物上で収縮し、ゆえに、形を変えるという事実である。添加されたポリマーは、この形状の変化を阻止し、形状に忠実な治癒を可能にする。移植片を生成するために、ポリマーは血液または赤血球、白血球、単球、血小板、フィブリノーゲン、トロンビンおよび血小板濃縮血漿などの血液成分と混合され、欠損部に導入される。しかしながら、血液成分を用いる場合には、凝固させることが可能な材料の存在が所望の効果の達成に関して重要な因子となる。
【００１１】
キトサンで作られた移植片および軟骨細胞が、代替物として用いられてもよい。細胞は上述の通り欠損部に導入されるので、誘引目的の物質および／または成長因子および分化因子の添加なしですますことができる。
【００１２】
移植片自体が細胞を含有する場合には、それらはしばしば取扱い中の操作により損傷される、または細胞、特に自己細胞が移植片のため用いられる場合には、それらは、長い培養過程により生成され、かつコンタミネーションを防ぐために注意深く制御されなければならず、最終的には、保存できなくなるので、上述の技術は不都合である。同時に、誘引目的のため用いられる物質を含むか、あるいは含まない、プライディー穿刺穴を介した間葉系細胞の無細胞移植片の動員は、満足できないものであることが判った。コロニー形成は遅く、僅かな細胞により開始され、そしてまた特定的でない。このことは、異なる細胞タイプが、プライディー穿刺穴からの血液から移植片に流れ込み、そこにとどまることを意味する。しかしながら、軟骨細胞に分化する間葉系前駆細胞によるコロニー形成のみが望まれるが、通常の移植片では、これは保証されない。
【特許文献１】国際公開第９７／１５６５５号
【特許文献２】独国特許出願公開第４４３１５９８号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第４３０６６６１号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第１０１３９７８３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００３１５３号明細書
【特許文献６】独国特許出願公開第１９９５７３８８号明細書
【特許文献７】国際公開第２００５／０１４０２７号
【特許文献８】国際公開第０２／００２７２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
それゆえ、特に本発明の目的は、生成するのが簡単で、容易に保存することができ、かつ適用するのが簡単である、移植片を提供することである。さらに、移植片による動員率を増大すること、移植片に動員され、配置された細胞の種類について良好な選択性を得ること、および可能な限り、可能性のあるアレルゲンを表す、身体にとって外来性の成長因子の使用、任意に、組換え成長因子の使用さえなしですますことが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、技術分野で知られている上記および他の諸問題を解消することである。この目的のため、（ｉ）生物学的かつ医薬的に許容される材料で作られた、結合力のある開放多孔性構造形成マトリックスおよび（ｉｉ）血清を含む、無細胞移植片を提供される。特に好ましい実施態様において、マトリックスはゲルをさらに含有する。
【００１５】
第二の態様により、かかる無細胞移植片の生成方法が提案され、それにより、マトリックスおよびゲル（いずれかが提供される場合）は、血清と接触される。所望に応じて、血清を含む移植片は乾燥されてもよい。あるいは、マトリックスおよびゲル（ゲルが提供される場合）は、血清と接触する前に、乾燥状態であってもよい。
【００１６】
第三の態様に基づいて、最終的に本発明は、組織を再生する、特に、軟骨および／または骨を再生するための無細胞移植片の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
上記の通り、本発明は、（ｉ）生物学的かつ医薬的に許容される材料で作られた、結合力のある開放多孔性構造形成マトリックスおよび（ｉｉ）血清を含む、無細胞移植片に関する。驚くべきことに、本発明により提案される無細胞移植片において血清を用いることにより、骨髄（それを介して、血液が流れる）からの間葉系前駆細胞の動員効率が、数種の因子により増大される。この動員効率における驚くべき増大は、分化した細胞または前駆細胞の移植片を別途導入することを不要とし、それにより移植片の取扱いを容易、かつ短縮し、かつ保存も可能にする。
【００１８】
血清は、通常の方法で容易に得ることができる。なるべくなら、それは、移植中に患者から直接採取できるのがよい。それゆえ、自己材料が患者に移植され、他の、アレルギー誘発性因子および／または免疫活性因子を添加する必要がない。
【００１９】
本発明により提案される無細胞移植片のマトリックスは、結合力のある、開放多孔性構造形成マトリックスである。本明細書において、表現「結合力のある」はマトリックスが、個々の部分に分離することなく移植片の取扱いを可能にすることを意味すると解釈されなくてはならない。マトリックスの全ての部分が、互いに化学結合または相互作用により結合する必要はない。織物、縮充、ねじりまたは類似のものの形態の機械的結合で足りる。
【００２０】
本明細書中、表現「構造形成」は、生成されるべき組織マトリックスへの細胞遊走のための構造形成体として機能するマトリックスの特性を意味すると解釈されなくてはならない。マトリックスはまた、例えば、滑液または血液によって細胞がマトリックス外に運ばれないように、細胞がコロニー形成することができ、かつしっかりした足場を見出すフレームまたは格子として作用する。
【００２１】
最後に、本発明で意味する「開放多孔性」とは、マトリックスのフレーム構造物間の空間が、構造物とマトリックスの周辺領域との間で、物質、特には流動体の交換を可能にすることを意味すると解釈されなくてはならない。孔の孔径は、好ましくは、貫通または循環が細胞によって可能となるよう、決められる。しかしながら、本発明の意味合いで用いられる開放多孔性という表現は、例えば、ゲルに見られるような構造を意味するようにも意図されている。ここでは、マトリックスのフレーム構造物がゲル形成体の骨格により提供される。それらの間で含水ポケットおよび流動体が分配され、そしてそれを細胞が貫通することができ、かつそれが流動体の交換を可能にする。それゆえ、適当なゲル構造物とは、本発明での意味合いにおいて、開放多孔性マトリックスとも解釈される。
【００２２】
開放多孔性フレーム構造物は、好ましくは、織布あるいは不織布（特に、フリースおよびフェルト構造物）、メンブレン、スポンジ、詰め物、開放気泡フォーム、ウール、ヒモ、規則的に配列された繊維束およびランダムな繊維束、多孔質セラミック材料、海綿質およびゲル、ならびにこれらの組合せから選択される。マトリックスは、好ましくは、フリースまたはフェルト構造物を有する。例えば、層状配列で異なる構造物を組合せることも可能であり、本発明の範囲内である。
【００２３】
原則として、マトリックス材料は、生物学的および医薬的に許容される適切な材料であり得る。本発明により提案されるマトリックスにおいて用いられるマトリックス材料は、吸収性または非吸収性のいずれであってもよいが、吸収性材料が好ましい。マトリックスは、好ましくは、コラーゲン、ヒアルロン酸、キトサン、キチン、多糖類、セルロースおよびそれらの誘導体などの天然および合成ポリマー、タンパク質、ポリペプチド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（グリコリド、乳酸塩）、カプロラクタム、金属の酸化物、炭化物、窒化物および炭窒化物などのセラミック材料、特に、シリコン酸化物、酸化チタンおよび酸化カルシウム；金属の、ハロゲン化物（特にはフッ化物）、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などの鉱物、好ましくは、リン酸カルシウム、アパタイト、ヒドロキシルアパタイトなどの生理的に無害な材料；チタン、アルミニウム、金、銀、ステンレス鋼およびそれらの混合物からなる群より選択される材料である。より具体的には、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸、コラーゲンまたはヒアルロン酸が好ましい。
【００２４】
ポリグリコール酸に関しては、２０，０００より大きい分子量、好ましくは、３０，０００〜７０，０００ｇ／ｍｏｌ、特に好ましくは、約５０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する純ポリグリコール酸を用いることが好ましい。マトリックス材料は、アルファ・リサーチ・スイス  ＧｍｂＨ（Ａｌｐｈａ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）により販売されているＰＧＡ−Ｓｏｆｔ  Ｆｅｌｔ７（登録商標）などのポリグリコール酸のフリースであってもよい。この製品の場合、インビボでの吸収時間は、約４０〜６０日である。インビトロで７日後、機械的強度は、加水分解の結果、依然最初の値の約５０％である。
【００２５】
一つの特に好ましい実施態様において、無細胞移植片は、マトリックスに加えてゲルをも含有する。ゲルは、マトリックスの少なくとも片側に適用されるか、および／または少なくとも部分的にそれを貫通している。なるべくなら、ゲルはそれを完全に貫通しているのがよい。マトリックスがかかるゲルを含有する場合、好ましくは、マトリックス自体がゲルのものと異なる構造を有する。特に好ましくは、ゲル以外は、上で明確に特定されたより固い構造物が用いられる。従って、ゲルは、マトリックスより低い剛性のものが好ましい。最も好ましくは、フリースおよびフェルト構造物が用いられ、それにゲルが導入される。
【００２６】
ゲルは天然または合成ヒドロゲルであってもよい。それは、マトリックスより低い剛性のものが好ましい。例えば、ゲルは、多糖類、ポリペプチド、ヒアルロン酸、フィブリン、コラーゲン、アルギン酸塩、アガロースおよびキトサン、ならびにそれらの塩、誘導体および混合物から選択することができる。適当な塩は、例えば、当該ゲルのアルカリ塩およびアルカリ土類塩である。ヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸塩が最も好ましい。
【００２７】
ヒアルロン酸の品質に関しては、発酵により生成された品質を用いることができる。あるいは、動物から得られたヒアルロン酸を用いることも可能である。用いられる品質の平均分子量は、一般に、２５０から６，０００ｋＤａの間であり、好ましくは、１，０００〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは、約１，２００ｋＤａである。好適なヒアルロン酸製品が市販されている。好適なヒアルロン酸の品質は、例えば、ＴＲＢ  ケメディカ  ＡＧ（ＴＲＢ  Ｃｈｅｍｅｄｉｋａ  ＡＧ）から販売されているオステニル（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））である。この材料は、ＥＣ認定されており、それゆえ、医薬目的に適している。
【００２８】
ゲルは、生理的に適した溶液中の適当なゲル形成材の供給源、沈殿または重合から得ることができる。かかる適当な溶液の例は、水または塩（例えば、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）化アルカリおよびアルカリ土類、炭酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および類似のもの）、有機酸、緩衝物質およびそれらの混合物の水溶液である。あるいは、培養培地または体液、あるいは滑液または血清などのそれらからもたらされた溶液などの、より複雑な溶液が用いられてもよい。用いられるゲル形成材の量は、ゲルの適切な粘性が得られるように、選択される。ヒアルロン酸の場合、これは、通常、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは、０．５〜２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２９】
最も好ましい移植片は、ヒアルロン酸ゲルが取り込まれた、ＰＧＡフリースまたはフェルトで作られたマトリックスを有するものである。
【００３０】
本発明により提案される無細胞移植片の寸法は、一般に、処置されるべき欠損部の寸法および移植片の必須サイズに依存する。処置を施す医師により必要とされる寸法のものが適応され得る。軟骨組織、特に、膝関節における損傷の場合には、これらの寸法は、通常、１０〜５０ｍｍの長さ、１０〜５０ｍｍの幅、そして０．５〜３ｍｍの厚さ、好ましくは、１０〜３０ｍｍの長さ、１０〜３０ｍｍの幅、そして１〜２ｍｍの厚さの範囲にある。２０×２０ｍｍの幅と長さ、そして１．１〜２ｍｍの厚さからなるサイズが最も好ましい。寸法は、長方形、円形、楕円形、多面体などの非正方形について適応され得る。
【００３１】
本発明により提案される無細胞移植片におけるマトリックスとゲルの組合せの利点は、ゲルが、プライディー穿刺穴または類似の裂け目を貫通する血液の間葉系前駆細胞以外の細胞に対しては機械的バリアを形成することである。これにより、間葉系前駆細胞の移植片への選択的遊走が可能になる。これらだけが、マトリックスにおいてそれら自体を定着させ、所望の組織細胞に分化する。それゆえ所望の組織形成細胞以外の細胞の成長が妨げられるか、あるいは有意に低減される。
【００３２】
同時に、ゲルは、機械的ストレス下で所望の細胞の保持を促進し、その後軟骨の天然生物マトリックスが後者の周辺で形成する。これにより、患者は一度移植を受けると、ストレスをより早く除去できる。
【００３３】
本発明により提案される無細胞移植片に必要とされる第二の要素は、血清、通常、ヒト血清である。これは、自家、同種または異種性であってもよい。本発明の目的のための血清とは、血液が一度凝固すると、液体のままである血液の一部分を意味する。血清は、血液細胞もそして血漿とは異なりフィブリノーゲンをも全く含有しない。血漿の他の要素は、血清においても見出されるべきである。これらは、脂肪、脂肪酸、グリセリン、糖、塩、金属および血漿タンパク質である。血漿タンパク質は、例えば、輸送タンパク質、酵素、プロ酵素、酵素インヒビター、補体系、免疫タンパク質、炎症メディエーターおよび類似のものを含む。
【００３４】
本発明の目的のために用いられるべき血清は、少なくとも１種類の要素を添加することおよび／または少なくとも１種類の血清成分を除去することにより、修飾されてもよい。しかしながら、好ましい実施態様において、血清は修飾されない。特には自己血清が好ましい。これは、患者から血液を採取し、通常の方法を用いて血清を得ることにより得られる。この方法で得られると、血清は、マトリックスおよび提供される場合にはゲルと接触して置いてもよく、ゆえに場合によっては処置を施す医師により、移植の場で、直接移植片に取り込むことができる。
【００３５】
あるいは、修飾された血清が用いられる。修飾が少なくとも１種類の構成物質を添加することを含む場合、成長因子、分化因子（この点について、参照により本明細書に取り込まれる前記特許文献６：独国特許出願公開第１９９５７３８８号明細書を参照）、ホルモン、サイトカイン、細胞接着分子、（例えば、参照により本明細書に取り込まれる前記特許文献７：国際公開第２００５／０１４０２７号に記載されているような）ケモカインを含む走化因子、酵素、酵素インヒビター、補酵素、鉱物、脂肪、脂質、多糖類、医薬物質（抗生物質、鎮痛剤、炎症阻害剤および免疫抑制剤など）、緩衝物質、安定剤、特に、低温安定剤、およびビタミン、好ましくは、ホルモン、ケモカイン、成長因子および分化因子を含む群から後者を選択することが好ましい。ホルモン、ケモカイン、成長因子および分化因子は、好ましくは、インスリン、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６、ＦＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＩＬ８、ＳＤＦ１−αおよびＥＧＦから選択される。インスリンが最も好ましい。マトリックスおよび／またはゲルは、上で挙げられた要素またはそれらの混合物を取り込むことにより修飾されてもよい。
【００３６】
あるいは、例えば、酵素、免疫タンパク質、プロ酵素、糖などのような特定の要素が、例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより選択的に除去されてもよい。血清はまた希釈されてもよい。この目的のため、血清は、所望の量のクエン酸バッファー、ＰＢＳまたは類似のものなどの生理的に許容される液体と混合される。
【００３７】
上述の無細胞移植片は、マトリックスとゲルが提供される場合にはゲルとが、血清と接触されることによる方法により生成されてもよい。この接触は、滴下、軟化、含浸および浸漬により成されてもよい。好ましくは、ゲルが提供される場合、それは、マトリックスに先ずに取り込まれる、および／またはそれに適用され、血清との接触過程が行われた後、無細胞移植片が、上で挙げられたような他の要素を含有する場合、これらは、マトリックス、ゲルおよび血清のうちの１つ以上に取り込まれ得る。
【００３８】
本発明により提案される方法は、乾燥工程を含んでもよい。乾燥工程を用いる利点は、移植片が乾燥形態でより長期間保存され得ることである。マトリックスおよびゲル（提供される場合）が、血清と接触される前に乾燥される場合、この構造物は、血清と接触して置かれたときの浸漬または軟化により元に戻され、それにより、それをすぐに使用できる状態に転換することができる。あるいは、マトリックスと、提供される場合にはゲルと、血清と、を含む構造物が乾燥される場合、それは、生理的に許容される塩溶液などのゲルの形成について上述したように、血清またはいくつかの他の適当な医薬的かつ生理学的に許容される溶液中に浸漬または軟化により元に戻され、すぐに使用できる状態に転換され得る。本発明により提案される移植片が他の要素を含有する場合、これらは、無細胞移植片をすぐに使用できる状態に戻すために用いられる溶液中に取り込まれてもよい。これは、特に、他の要素がタンパク質または不安定な共因子である場合、望まれる。
【００３９】
上述のヒアルロン酸ゲルを有するポリグリコール酸フリースで作られる好ましい実施態様の場合、２０ｍｍ×２０ｍｍ×１．１ｍｍのフリースサイズが、生理的に適当な溶液中の材料に取り込まれたか、あるいは血清に既に取り込まれた約４００μｌのヒアルロン酸溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）と共に用いられる。２０ｍｍ×２０ｍｍ×２ｍｍのフリースの場合、約７３０μｌのヒアルロン酸溶液が用いられる。このような寸法の移植片が、例えば、凍結乾燥により乾燥される場合、それらは、１〜２ｍｌの溶液にそれらを浸すことにより、元に戻され得る。血清を含まない乾燥材料の場合、それらは、好ましくは、血清または希釈血清で戻されるのに対して、血清含有乾燥マトリックス材料は、好ましくは、生理食塩水溶液において元に戻される。
【００４０】
適当な血清濃度は、マトリックスにおいて含有されるゲルおよび液体の容量の１〜１００容量％である。好ましくは、ゲルを含まないマトリックスの場合、液体容量の１０〜１００％、好ましくは、５０〜１００％、最も好ましくは、１００％の血清濃度が用いられ、他のものの中に毛管力により取り込まれる。血清濃度を１００％未満に低減するために、生理的に許容される塩溶液で希釈された血清が用いられてもよい。
【００４１】
ゲルを含むマトリックスの場合、血清の０．０１〜５０容量％、またはそれ以上、好ましくは、０．５〜２０容量％、最も好ましくは、１〜１０容量％の血清含有量が、ゲル、血清および任意に、医薬的に許容される液体の総容量に対して用いられてもよい。
【００４２】
本発明により提案される無細胞移植片は、組織を再生するため、特に、軟骨および／または骨を再生するために用いられ得る。好ましくは、それは、間葉組織を再生するために用いられる。最も好ましくは、それは、特に、プライディー穿刺法または微破砕を用いて軟骨および／または骨を再生するために用いられる。移植片は、関節表面を元に戻すために、プライディー穿刺または微破砕後、正確に合わせて軟骨に導入される理にかなったカバーとして作用する。マトリックス材料、好ましくは、フェルト材料は、機械的安定性を与え、伝導性構造物として作用し、そしてそれが、骨髄および海綿様骨から遊走した患者の細胞の均一な三次元分布を促進する。ヒアルロン酸などのゲルは、赤血球細胞および白血球の内側への遊走を防ぐために、バリアとして作用する。血清、好ましくは、自己血清は、細胞、特に間葉系前駆細胞の移植片、ゆえに、欠損部への遊走を促進する。移植片に遊走して、軟骨細胞を形成し、ゆえに、軟骨性再生組織を構築する間葉系前駆細胞の成熟または分化は、関節に存在するヒアルロン酸、血清および滑液により誘導される。驚くべきことに、血清の使用により動員数を有意に増加させることが見出された。
【００４３】
以下に示す実施例は、本発明を説明することを意図しているにすぎず、決して限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１
インビトロでの成長因子および分化因子、ケモカインおよびヒト血清によるヒト間葉系幹細胞の動員
Ａ  ヒト間葉系幹細胞の単離および培養
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を骨髄から単離する方法は、既に記載されている［独国特許出願公開第１０３３３９０１号明細書］。最大３ｍｌの骨髄穿刺液を１０ｍｌのＰＢＳと混合し、３１０ｇ、室温にて１０分間遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁し、再びＰＢＳで洗浄する。細胞を２０ｍｌのＤＭＥ培地（１０〜２０％  ＦＢＳ、２％  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）に入れる。この細胞懸濁液を５ｍｌずつ、１．０７３ｇ／ｍｌの密度を有するパーコール密度勾配（Ｐｅｒｃｏｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）２０ｍｌ上に導入する。細胞を９００ｇにて３２分間遠心分離する。上相を新しい遠心チューブに移す。２．５倍量のＰＢＳを添加した後、３１０ｇにて６分間遠心分離する。細胞ペレットをＤＭＥ培地に入れる。細胞培養フラスコにて培養するために１．５×１０５〜３．５×１０５個細胞／ｃｍ２を移し、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベートする。培地を７２時間後に初めて交換し、次に、３〜４日毎に交換する。この方法で単離すると、細胞は２〜３週間後にコンフルエントに成長し、次に、それをトリプシン処理により６，０００個細胞／ｃｍ２培養表面の細胞密度で新たな培養容器に移す（継代１）。約１週間後、再び細胞をトリプシン処理する（継代２）。ヒト間葉系幹細胞のこの培養物の均一性を、ＦＡＣＳ分析により確かめる。ＦＡＣＳ分析では表面抗原のエンドグリンとＡＬＣＡＭが同定されるが、表面抗原のＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１４は同定されない。
【００４５】
Ｂ  インビトロでのヒト間葉系幹細胞に対する成長因子および分化因子（ＣＤＭＰ１、ＣＤＭＰ２）およびケモカイン（ＳＤＦ１−α、ＩＬ−８）の走化活性の試験
間葉系幹細胞および前駆細胞に対する、軟骨由来形態形成タンパク質−１（ＣＤＮＰ１または成長因子および分化因子−５、ＧＤＦ５）および軟骨由来形態形成タンパク質−２（ＳＤＮＰ２または成長因子および分化因子−６、ＧＤＦ６）などの成長因子および分化因子の走化効果は、既に記載されている［前記特許文献６：独国特許出願公開第１９９５７３８８号明細書］。間葉系幹細胞および前駆細胞を動員するためのストローマ由来因子−１α（ＳＤＦ１−α）またはインターロイキン−８（ＩＬ８）などのケモカインの走化効果または使用も記載されている［独国特許出願公開第１０３３３９０１号明細書］。
【００４６】
走化活性を、いわゆる９６ウェル走化性プレート（ケモ  Ｔｘ（Ｃｈｅｍｏ  Ｔｘ）システム、ニューロプローブ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）、米国）において試験する。試験の原理は、溶液中、所定の量および濃度での、試験すべき物質のウェルへの移動に基づく。その際に、メンブレン底面が走化性溶液を含有する溶液で湿るよう、ウェルを有孔（この場合の孔のサイズは８μｍ）メンブレンで覆う。
【００４７】
試験すべき物質を含有していない細胞懸濁液の所定の量を、ウェルから離れたメンブレンの上面に置く。数時間後、試験すべき物質の濃度勾配が生じ、それは下側のウェルからメンブレンを通して始まるものである。試験すべき物質が走化活性であるなら、細胞懸濁液の細胞は、メンブレンの孔を通って、メンブレンの底面、そして下側のウェルへと遊走する。遊走した細胞を染色し、それらの数を顕微鏡を用いて決定する。
【００４８】
対照の目的で、下側のウェルに試験すべき物質の溶媒を入れ、メンブレンで覆い、次に、細胞懸濁液でコートする。メンブレン底面（表面：２５ｍｍ２）上および下側のウェル中の細胞を顕微鏡でカウントすることにより、刺激なしで走化性物質により自然に遊走した細胞を決定する。走化性物質により動員された細胞カウントを決定するために、自然に遊走した細胞数を引く。
【００４９】
上述の成長因子および分化因子およびケモカインの試験の開始に先立ち、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞をダイエット培地（ＤＭＥ培地＋１％のペニシリン／ストレプトマイシン＋０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））と２４時間接触させた。成長因子および分化因子およびケモカインをダイエット培地に異なる量で入れ、それぞれ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭおよび１０００ｎＭの因子の所定の溶液を得た。メンブレン底面が溶液で湿るよう、３６μｌのそれぞれの溶液を９６ウェル走化性プレートの下側のウェルにトリプリケートで入れ、メンブレンで覆った。ダイエット培地を対照として用いた。
【００５０】
３０，０００個のヒト間葉系幹細胞を含む４０μｌのダイエット培地をメンブレンの上面に置いた。増殖キャビネット中で、３７℃、５％  ＣＯ２にて２０時間培養後、メンブレンを取り出し、氷冷エタノール／アセトン（１：１  ｖ／ｖ）中に３分間置き、細胞を固定した。メンブレン上面を綿棒で完全にきれいにして、付着した細胞を取り除いた。メンブレン底面上の細胞をヘマカラー（Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ）、溶液（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））で染色した。下側のウェル中では細胞を全く検出できなかった。
【００５１】
メンブレンの底面上に並んだ細胞を、顕微鏡下でそれらをカウントすることによりカウントした。対照セット（走化因子なし）において遊走した細胞を引いた後、異なる濃度のＣＤＭＰ１、ＣＤＭＰ２、ＳＤＦ１−αおよびＩＬ８により動員された幹細胞数を決定した。標準偏差を伴った細胞カウントの平均値を、図１においてそれぞれの因子について示す。ＣＤＭＰ１は、最大、２５ｍｍ２当たり１５６個のＭＳＣ（７５０ｎＭ  ＣＤＭＰ１）の遊走を誘導することができた。ＣＤＭＰ２は、最大、２５ｍｍ２当たり３８個のＭＳＣ（５００ｎＭ  ＣＤＭＰ２）を、ＳＤＦ１−αは、最大、２５ｍｍ２当たり７９個のＭＳＣ（７５０ｎＭ  ＳＤＦ１−α）を、そしてＩＬ８は、最大、２５ｍｍ２当たり８１４個のＭＳＣ（５００ｎＭ  ＩＬ８）を動員した。
【００５２】
Ｃ  インビトロでのヒト間葉系幹細胞におけるヒト血清の走化活性の試験
驚くべきことに、Ｂにおいて記載した試験方法によるヒト血清の試験は、ヒト血清が、成長因子および分化因子およびケモカインと比べて、インビトロでヒト間葉系幹細胞および前駆細胞に対して有意により強い走化効果を有することを示した。異なる処方（ダイエット培地中またはヒアルロン酸中）のヒト血清により動員されたヒト間葉系幹細胞および前駆細胞の細胞カウントの平均を、対応する標準偏差と一緒に図２に示す。処方に依存して、最小２，１３５個（ＰＧＡ−ＨＡ  ｌｙｏ．＋ＨＳ）および最大１０，３３２個（５％  ＨＳ−ＨＡ−培地）のヒト間葉系幹細胞および前駆細胞がヒト血清により動員された。走化因子としてダイエット培地中にヒト血清を含まないヒアルロン酸における試験は、平均２４個（ＨＡ培地）および平均４８個（ＰＧＡ−ＨＡ  ｌｙｏ．＋ＮａＣｌ）のヒト間葉系幹細胞および前駆細胞が動員されたことを示した。
【００５３】
以下の異なる処方のヒト血清を上記試験方法において用い、ヒト間葉系幹細胞および前駆細胞を動員した。全血試料（ｎ＝５）から抗凝固剤を用いることなく自然の凝固に基づいてヒト血清を得、等量で混合し、それを用いて異なる血清処方を生成した。試験セットの「５％  ＨＳ培地」および「１０％  ＨＳ培地」を生成するために、ダイエット培地をヒト血清と混ぜて、５％および１０％の溶液を得た。「ＨＡ培地」試験セットは、ダイエット培地と、平均分子量１，２００ｋＤａを有する、発酵により得られたヒアルロン酸（オステニル（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））、ＴＲＢ  ケメディカ  ＡＧ（ＴＲＢ  Ｃｈｅｍｅｄｉｃａ  ＡＧ））とを等量含む。「１％  ＨＳ−ＨＡ培地」、「５％  ＨＳ−ＨＡ培地」および「２０％  ＨＳ−ＨＡ培地」の試験セットは、ヒト血清が添加された「ＨＡ培地」を含有し、１％、５％および１０％の強度の溶液となる。
【００５４】
「ＰＧＡ−１０％  ＨＳ−ＨＡ，ｌｙｏ．」の試験セットを得るために、発酵により得られた２７０μｌのヒアルロン酸（オステニル（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））、ＴＲＢ  ケメディカ  ＡＧ（ＴＲＢ  Ｃｈｅｍｅｄｉｃａ  ＡＧ））を、３０μｌのヒト血清と混合し、２０ｍｍ×１５ｍｍ×１．１ｍｍの寸法を有する、ポリグルコール酸（ＰＧＡ）を含むフリース（ＰＧＡ−ソフト  フェルト（ＰＧＡ−Ｓｏｆｔ  Ｆｅｌｔ（登録商標））、アルファ・リサーチ・スイス  ＧｍｂＨ（Ａｌｐｈａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＧｍｂＨ））に適用した。ヒアルロン酸−血清混合物に浸したフリースを−２０℃で１時間凍結し、次に、凍結乾燥機にて１６時間凍結乾燥した。それをもどすために、凍結乾燥したフリースを１ｍｌの生理食塩水溶液に１０分間置き、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により約８０〜１００μｌのヒアルロン酸−血清溶液を得た。溶液を等量のダイエット培地で希釈することにより、処方「ＰＧＡ−１０％  ＨＳ−ＨＡ，ｌｙｏ．」を生成し、直接、走化活性の試験に用いた。
【００５５】
「ＰＧＡ−ＨＡ，ｌｙｏ．＋ＨＳ」の試験セットを作るために、発酵により得られた３００μｌのヒアルロン酸（オステニル（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））、ＴＲＢ  ケメディカ（ＴＲＢ  Ｃｈｅｍｅｄｉｃａ）ＡＧ）を、２０ｍｍ×１５ｍｍ×１．１ｍｍの寸法を有する、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）を含むフリース（ＰＧＡ−ソフト  フェルト（ＰＧＡ−Ｓｏｆｔ  Ｆｅｌｔ（登録商標））、アルファ・リサーチ・スイス  ＧｍｂＨ（Ａｌｐｈａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＧｍｂＨ））に適用した。ヒアルロン酸に浸したフリースを−２０℃にて１時間凍結し、次に、凍結乾燥機にて１６時間凍結乾燥した。それをもどすために、凍結乾燥したフリースを１ｍｌの血清に１０分間置き、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により約８０〜１００μｌのヒアルロン酸−血清溶液を得た。溶液を等量のダイエット培地で希釈することにより、処方「ＰＧＡ−ＨＡ，ｌｙｏ．＋ＨＳ」を生成し、直接、走化活性の試験に用いた。
【００５６】
「ＰＧＡ−ＨＡ，ｌｙｏ．＋ＮａＣｌ」の試験セットを作るために、発酵により得られた３００μｌのヒアルロン酸（オステニル（Ｏｓｔｅｎｉｌ（登録商標））、ＴＲＢ  ケメディカ（ＴＲＢ  Ｃｈｅｍｅｄｉｃａ）ＡＧ）を、２０ｍｍ×１５ｍｍ×１．１ｍｍの寸法を有する、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）を含むフリース（ＰＧＡ−ソフト  フェルト（ＰＧＡ−Ｓｏｆｔ  Ｆｅｌｔ（登録商標））、アルファ・リサーチ・スイス  ＧｍｂＨ（Ａｌｐｈａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＧｍｂＨ））に適用した。ヒアルロン酸に浸したフリースを−２０℃にて１時間凍結し、次に、凍結乾燥機にて１６時間凍結乾燥した。それをもどすために、凍結乾燥したフリースを１ｍｌの生理食塩水溶液に１０分間置き、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により約８０〜１００μｌのヒアルロン酸−溶液を得た。溶液を等量のダイエット培地で希釈することにより、処方「ＰＧＡ−ＨＡ，ｌｙｏ．＋ＮａＣｌ」を生成し、直接、走化活性の試験に用いた。
【００５７】
実施態様２の例
アルファ・リサーチ・スイス  ＧｍｂＨ（Ａｌｐｈａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）により（登録商標）ＰＤＡ−ソフト  フェルト（ＰＤＡ−Ｓｏｆｔ  Ｆｅｌｔ（登録商標））で市販されているポリグリコール酸フリースを、２０ｍｍ×１５ｍｍ×１．１ｍｍの寸法に切断した。この材料に、実施例１記載の１０％  血清含有ヒアルロン酸混合物を染み込ませ、次に、乾燥させた。乾燥をまず−２０℃で、次に、凍結乾燥機にて１６時間行った。１〜２ｍｌの生理食塩水溶液に１０分間浸すことにより、フリースをもどした。
【００５８】
別の試験セットにおいて、フリースに、生理食塩水溶液に溶解した１０ｍｇ／ｍｌの純ヒアルロン酸を染み込ませた。この方法で調製し、材料を上記の通り乾燥させた。それを１〜２ｍｌの血清に１０分間浸すことにより、それをもどした。両方のフリースを直接、移植に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】インビトロでのヒト間葉系幹細胞に対するＣＤＭＰ１、ＣＤＭＰ２、ＳＤＦ１−αおよびＩＬ８の走化効果を示す。
【図２】インビトロでのヒト間葉系幹細胞に対する血液のヒト血清の走化効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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