(57)【要約】ＳｈＫトキシンの類似体および当該ＳｈＫ類似体の使用方法。ＳｈＫ類似体は全般に、アニオン電荷を有する化学物質（たとえば、原子、分子、化学基、残基、化合物、分子部分など）を付加したＳｈＫトキシンからなる。一部の実施形態では、該ＳｈＫトキシンに付加する化学物質はアミノ酸残基を含んでもよい。該ＳｈＫ類似体は、カリウムチャネルの阻害を引き起こすため、または疾患もしくは障害を治療するために、ヒト対象者もしくは非ヒト対象者に投与することができる。一部の実施形態では、該ＳｈＫトキシンに付加する化学物質は、他のカリウムチャネル（たとえばＫｖ１．１チャネル）よりも特定のカリウムチャネル（たとえばＫｖ１．３チャネル）に対し選択的阻害を提供するように選ぶことができる。一部の実施形態では、ＳｈＫトキシンに付加する化学物質には蛍光団を含めることができ、これにより蛍光団で標識されたＳｈＫ類似体が提供される。蛍光団で標識された当該ＳｈＫ類似体は、単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できるクラスＩＩ四量体と併用して、フローサイトメトリーに使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン電荷を有する有機または無機化学物質を付加したＳｈＫを含んでなる組成物。
【請求項２】
前記化学物質が、アミノ酸、ポリペプチド、アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、スレオニン、スレオニン誘導体、ホスホスレオニン、セリン、セリン誘導体、ホスホセリン、グルタミン酸、グルタミン酸誘導体、γカルボキシグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸誘導体、無機化合物または無機化学基、有機化合物または有機化学基、無水コハク酸、および無水フタル酸からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳｈＫトキシンが天然源から入手される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＳｈＫトキシンが合成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学物質がＳｈＫポリペプチドのＮ末端に付加されている請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記化学物質が結合分子または結合基を介してＳｈＫのＮ末端に付加されている請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記化学物質がアミノエチルオキシエチルオキシアセチル・リンカーによりＳｈＫのＮ末端に付加されている請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学物質が蛍光団の標識を含んでいる請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ，Ｅｔ）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒである請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＨ２）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＯ２Ｈ）である請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−アスパラギン酸塩である請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−アスパラギン酸塩である請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−グルタミン酸塩である請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−グルタミン酸塩である請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
ヒトまたは動物対象者におけるＫｖ１．３カリウムチャネルの阻害を引き起こす方法であって、前記方法は、
（Ａ）アニオン電荷を有する有機または無機化学物質を付加したＳｈＫトキシンを含んでなる組成物を、Ｋｖ１．３カリウムチャネルの阻害に有効な様式および量で前記対象者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
自己免疫疾患を予防または治療するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレーなどの自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性血小板減少症、１型糖尿病、アジソン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、ベーチェット病、関節リウマチ、歯周病に随伴する骨吸収、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発筋炎、皮膚筋炎、尋常性天疱瘡、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
移植片対宿主病を予防または治療するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
移植した組織または臓器の拒絶反応を予防または治療するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
メタボリック症候群を予防または治療するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
２型糖尿病を治療または予防するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
肥満を治療または予防するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
歯周病に随伴する骨吸収を治療または予防するために実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、アミノ酸、ポリペプチド、アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、スレオニン、スレオニン誘導体、ホスホスレオニン、セリン、セリン誘導体、ホスホセリン、グルタミン酸、グルタミン酸誘導体、γカルボキシグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸誘導体、無機化合物または無機化学基、有機化合物または有機化学基、無水コハク酸、および無水フタル酸からなる群から選択される化学物質を付加したＳｈＫトキシンを含んでなる請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（ＯＨ，Ｅｔ）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−Ｐｍｐ（Ｅｔ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒである請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項３９】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＮＨ２）である請求項２２に記載の方法。
【請求項４０】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−Ｐｈｅ（ｐ−ＣＯ２Ｈ）である請求項２２に記載の方法。
【請求項４１】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−アスパラギン酸塩である請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−アスパラギン酸塩である請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｌ−グルタミン酸塩である請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化学物質がＡＥＥＡｃ−Ｄ−グルタミン酸塩である請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
フローサイトメトリーを実施するための方法であって、
（Ａ）アニオン電荷および蛍光団標識を有する有機または無機化学物質を付加したＳｈＫを含んでなる組成物を提供する工程と、
（Ｂ）工程Ａで提供された組成物を細胞と混合する工程と、
（Ｃ）工程Ａで提供された組成物に対し親和性を有する細胞を、フローサイトメーターを用いて、計数、単離、または識別する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
前記工程Ｃがフローサイトメーターを用いてＴリンパ球を計数、単離または識別することからなる請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＳｈＫが２１位におけるＭｅｔ残基の置換により修飾されている請求項１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記２１位Ｍｅｔ残基の置換が酸化を阻止するようになされた請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＳｈＫがＣ末端酸官能基をアミドで置換することにより修飾されている請求項１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記Ｃ末端酸官能基のアミドへの置換が、Ｃ末端カルボキシペプチダーゼ酵素に対する安定性を与えるようになされた請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＳｈＫが２１位におけるＭｅｔ残基の置換により修飾されている請求項２２または４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記２１位Ｍｅｔ残基の置換が酸化を阻止するようになされた請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＳｈＫがＣ末端酸官能基をアミドで置換することにより修飾されている請求項２２または４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｃ末端酸官能基のアミドへの置換が、Ｃ末端カルボキシペプチダーゼ酵素に対する安定性を与えるようになされた請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ａ）新規な組成物、ｂ）Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに他のタイプの細胞におけるＫｖ１．３チャネルのｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害のための方法およびキット、ならびに、ｃ）ヒトまたは動物において自己免疫疾患またはその他の障害を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００４年１０月７日出願の米国仮特許出願第６０／６１７，３９５号の優先権を主張するものであり、この仮出願の内容全体を参照により本明細書に明確に組み込む。
【０００３】
（発明の背景）
細胞膜は真核細胞の外側表面を形成する。細胞膜を通る受動拡散により、種々のイオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウムなど）が細胞に出入りする。細胞に出入りするこのようなイオンの拡散は、細胞膜内に存在する「イオンチャネル」によって促進される。イオンチャネルは、細胞膜内に埋め込まれたタンパク質であり、細胞膜を横切るイオンの選択的な流れを制御しており、これによって細胞内部の内容物と細胞周囲の細胞外液との間に濃度勾配を形成させる。イオン濃度は、興奮性細胞（たとえば神経細胞）の電気的活動に直接関与するため、イオンチャネルの機能（または機能不全）は当該細胞の電気的特性および挙動を実質的に制御することができる。実際に、幅広く「チャネル病」と呼ばれる種々の疾患は、イオンチャネルの機能不全または機能異常に関連していると考えられている。
【０００４】
イオンチャネルは、開閉可能な場合は「ゲート型」と呼ばれる。基本タイプのゲート型イオンチャネルには、ａ）リガンドゲート型チャネル、ｂ）機械ゲート型チャネルおよびｃ）電位差ゲート型チャネルがある。特に、電位差ゲート型チャネルは神経細胞、筋細胞、およびリンパ球などの非興奮性細胞にみられる。これらのチャネルは、細胞膜を通る電荷の変化に反応して開閉する。
【０００５】
Ｋｖ１．３チャネルと自己免疫疾患
多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、関節リウマチ（ＲＡ）および乾癬などの自己免疫疾患は、世界で数億人が罹患している。これらの障害では、特異的自己反応性Ｔ細胞−たとえば、ＭＳ患者ではミエリン特異的Ｔ細胞−が疾患の経過中に自己抗原刺激を繰り返し受け、慢性的に活性化された記憶細胞に分化し、これが炎症性組織に遊走してサイトカインを分泌することにより病因に寄与すると考えられている（ヴィグリエッタ（Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ）ら、２００２年；ヴィサース（Ｖｉｓｓｅｒｓ）ら、２００２年；ウルフ（Ｗｕｌｆｆ）ら、２００３年ｂ）。慢性的に活性化された記憶Ｔ細胞を優先的に標的とする治療法があれば、自己免疫疾患に対し重要な価値を有すると考えられる。
【０００６】
記憶Ｔ細胞は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７およびホスファターゼＣＤ４５ＲＡの発現に基づき、セントラル記憶（ＴＣＭ）およびエフェクター記憶（ＴＥＭ）の２つのサブセットに分けられる（ゲギナト（Ｇｅｇｉｎａｔ）ら、２００１年；サルスト（Ｓａｌｌｕｓｔｏ）ら、１９９９年）。ナイーブおよびＴＣＭ細胞は、炎症部位に遊走する前はリンパ節に存在し、一方、ＴＥＭ細胞は炎症部位に直接存在し、その場で大量のＩＦＮ−βおよびＴＮＦ−αを分泌し、即時型エフェクター機能を示す。最近になって、ＭＳ患者ではミ
エリン特異的自己反応性Ｔ細胞は大部分が、活性化したＴＥＭ細胞であることが示され（Ｗｕｌｆｆら、２００３年ｂ）、ミエリン特異的活性化ラットＴＥＭ細胞をナイーブなレシピエントに養子移入すると重度のＥＡＥを誘発することが示された（ビートン（Ｂｅｅｔｏｎ）ら、２００１年ａ；ビートン（Ｂｅｅｔｏｎ）ら、２００１年ｂ）。電位差ゲート型Ｋｖ１．３Ｋ＋チャネルは、ＴＥＭ細胞の免疫調節に対する非常に刺激的な新しい治療標的である。ＴＥＭ細胞は活性化されるとＫｖ１．３チャネルをアップレギュレートし、その抗原誘発性増殖はＫｖ１．３ブロッカーにきわめて感受性が高い（ウルフ（Ｗｕｌｆｆ）ら、２００３年ｂ）。対照的にナイーブおよびＴＣＭ細胞は、そもそもＫｖ１．３ブロッカーへの感受性がかなり弱く、カルシウム活性化Ｋ＋チャネルＩＫＣａ１をアップレギュレートすることによりＫｖ１．３遮断に対し急速に抵抗性となる（ガンシャニ（Ｇｈａｎｓｈａｎｉ）ら、２０００年；ウルフ（Ｗｕｌｆｆ）ら、２００３年ｂ）。
【０００７】
ＴＥＭ細胞においてＫｖ１．３が優性であることは、特異的Ｋｖ１．３阻害薬により該サブセットの活性を操作する強力な方法が提供されることになる。該チャネルの組織分布が機能的に制限されていることと、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＫｖ１．３遮断が、動物モデルにおいて、ＴＥＭ媒介性ＥＡＥ、歯周病の骨吸収および遅延型過敏性反応を明白な副作用を引き起こさずに改善するという事実が、治療標的としてのＫｖ１．３の魅力をいっそう高めてきた（ビートン（Ｂｅｅｔｏｎ）ら、２００１年ｂ；クー（Ｋｏｏ）ら、１９９７年；ヴァルヴェルデ（Ｖａｌｖｅｒｄｅ）ら、２００４年）。Ｋｖ１．３ブロッカーは活性化されたＴＥＭ細胞（たとえば、ワクチン抗原に特異的なＴＥＭ細胞）をすべて抑制すると考えられるが、Ｋｖ１．３に基づいた治療法は、免疫系全体を幅広く無差別に調節する現行の治療法よりもかなり改善された治療法になると考えられる。Ｋｖ１．３ブロッカーのこのほかの利点は、可逆性であることである。このため、症状が治まるまで数カ月かかる化学療法薬とは異なり、必要時にＫｖ１．３ブロッカーの治療効果を適正に増減し、感染に直面したら治療を中止することもできる。
【０００８】
Ｋｖ１．３チャネルと肥満
Ｋｖ１．３チャネルはエネルギーホメオスタシスとエネルギーバランスに関与していることが見出された（非特許文献１）。Ｋｖ１．３チャネルを遺伝学的にノックアウトしたマウスは、脂肪食を摂取しても体重は増加しなかったが、同一の食餌を与えた対照マウスは過体重となった。Ｋｖ１．３チャネルの薬理学的遮断は、Ｋｖ１．３チャネルの遺伝子ノックアウトの上記効果を再現した。したがって、Ｋｖ１．３ブロッカーは、肥満の管理に使用できる可能性が高い。
【０００９】
Ｋｖ１．３チャネルと２型糖尿病
Ｋｖ１．３チャネルは、肝臓および筋肉などの末梢標的器官におけるインスリン感受性の調節に関与している（非特許文献２）。マウスでは、Ｋｖ１．３チャネルの遺伝子ノックアウトが肝臓および筋肉のインスリンに対する感受性を増強した。したがって、Ｋｖ１．３ブロッカーは、インスリンの末梢作用を増強し、これによって血糖値を低下させることにより、２型糖尿病の治療に使用できる可能性がある。
【００１０】
Ｋｖ１．３チャネルを阻害することが知られている天然ポリペプチド
最も強力なＫｖ１．３阻害薬はカリブイソギンチャクＳｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ由来のペプチドＳｈＫである。ＳｈＫは、３つのジスルフィド架橋により連結された３５残基のポリペプチドである。ＳｈＫは、ｐＭレベルの濃度でＫｖ１．３を遮断して（Ｋｄ＝１１ｐＭ）ＴＥＭ細胞の増殖を抑制し、さらに、ミエリン特異的ＴＥＭ細胞の養子移入により誘発したラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を改善する。考えられるＳｈＫの欠点は、神経細胞のＫｖ１．１チャネルに対し低ｐＭ濃度の親和性がある点である（Ｋｄ＝２８ｐＭ）。ＥＡＥ試験ではＳｈＫに副作用はまったく観察されなかったが、ＭＳにおいて血液脳関門に障害があると起こる可能性があるように、高
濃度のＳｈＫが脳内に進入すれば好ましくない神経毒性を招くと考えられる。したがって、特異性の高いＫｖ１．３阻害薬の開発が必要である。製薬産業および学術機関の広範囲に及ぶ努力により、中位のｎＭ範囲でＫｖ１．３を阻害する小分子がいくつか産出されたが、これらの物質は実行可能な薬剤候補となるような選択性および力価を有していない。
【００１１】
これまでにＳｈＫの断片化ペプチド類似体がいくつか報告されている。これらのＳｈＫ類似体の１つでは、天然の配列が断片化され、続いて追加の共有結合（１つの非天然ジスルフィドおよび２つのラクタムブリッジ）を導入することにより安定化された。このほかの類似体では、ジスルフィドおよび／またはラクタムブリッジにより安定化された非天然骨格構造が、天然トキシン由来の重要なアミノ酸残基を含むように修飾された。これらのＳｈＫ類似体は、程度がさまざまなＫｖ１．３阻害活性および特異性を示した（非特許文献３）。
【非特許文献１】Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．２００３年、第１２巻、ｐ．５５１−９
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＵＳＡ．２００４年、第１０２巻、ｐ．３１１２−７
【非特許文献３】ラニガン、エム．ディー．（Ｌａｎｉｇａｎ，Ｍ．Ｄ．）ら「カリウムチャネルブロッカーＳｈＫトキシンの設計したペプチド類似体（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｅｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  Ｔｏｘｉｎ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５；４０（５１）：１５５２８−３７（２００１年１２月）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当技術分野には、リンパ球のＫｖ１．３チャネルを選択的に阻害しながら、Ｋｖ１．１チャネルまたは他のカリウムチャネルを阻害する作用を最小限に抑えた、もしくはその作用がまったくない新規のＳｈＫ類似体を開発する必要が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、アニオン電荷を有する有機または無機化学物質（たとえば、原子、分子、化学基、残基、化合物、分子部分など）を付加した（たとえば、結合した、リンカーにより連結した、または別の方法で結びつけた）ＳｈＫトキシンを含んでなる新規組成物（本明細書で「ＳｈＫ類似体」と呼ぶ）を提供する。
【００１４】
さらに本発明に基づき、カリウムチャネルを阻害する方法、および／または本発明のＳｈＫ類似体の有効量をヒトもしくは動物の対象者に投与することにより該対象者において疾患または障害を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、ＳｈＫトキシンに付加する化学物質は、他のカリウムチャネル（たとえばＫｖ１．１チャネル）よりも特定のカリウムチャネル（たとえばＫｖ１．３チャネル）に対し選択的阻害を提供するように選ぶことができる。
【００１５】
またさらに本発明によれば、前記の特徴を有するＳｈＫ類似体は蛍光団の標識を有することができ、当該蛍光団で標識した本発明のＳｈＫ類似体は、単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できるクラスＩＩ四量体と併用して、フローサイトメトリーに使用することができる。
【００１６】
以下に述べる詳細な説明および実施例を読むことにより、当業者には本発明のさらなる態様、要素および詳細が明らかになるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に記載する本発明の詳細な説明および添付図面は、本発明の一部の実施例または実施形態だけを説明することを意図しており、必ずしも全部を説明することを意図したものではない。本詳細な説明および添付図面は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００１８】
本発明は、ＳｈＫの新規類似体と、当該組成物を作製する方法のほか、ヒトまたは動物の細胞におけるＫｖ１．３チャネル（または他のイオンチャネル）を阻害するための、さらにはＴ細胞媒介性自己免疫疾患などの疾患および障害を治療または予防するための当該組成物の使用方法を提供する。本発明の組成物は、アニオン電荷を有する有機または無機化学物質（たとえば、原子、分子、化学基、残基、化合物、分子部分など）を付加した（たとえば、結合した、リンカーにより連結した、または別の方法で結びつけた）ＳｈＫトキシンよりなる。本発明の少なくとも一部の実施形態では、Ｋｖ１．１チャネルよりもＫｖ１．３チャネルを阻害するために該組成物の親和性を増大または最適化できるように、アニオン電荷を有する有機または無機化学物質を選択することができる。本発明による、ＳｈＫと連結または結合しうる、アニオン電荷を有する有機または無機の分子もしくは化学基の例として、アミノ酸、ポリペプチド、アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、スレオニン、スレオニン誘導体、ホスホスレオニン、セリン、セリン誘導体、ホスホセリン、グルタミン酸、グルタミン酸誘導体、γカルボキシグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸誘導体、無機化合物または無機化学基、有機化合物または有機化学基、無水コハク酸、および無水フタル酸が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００１９】
本発明によれば、本発明の組成物の非限定的な一部の実施例であって、アニオン電荷を有する化学物質がアミノ酸残基からなる実施例は、図１および２Ｃに示されており、以下の表１に示すように、本明細書では英数字による記号で記載されている。
【００２０】
【表１】
2008515917.tif 000003
【００２１】
特に図１を参照すると、チロシンもしくはフェニルアラニン、または荷電したこれらの非天然誘導体を、ＳｈＫのＮ末端（影付き灰色で示した残基Ａｒｇ１）に付加したリンカーを介してＳｈＫ（左上）に結合させた。チャネルの遮断に必要なＬｙｓ２２は暗灰色の影で示している。ＳｈＫの分子モデルは発表されているＮＭＲ構造に基づいており、上記リンカーおよび新規残基の構造をモデル化した。本発明の組成物の上記実施形態は全般に、アニオン電荷を有する少なくとも１つのアミノ酸残基と結合された（たとえば、化学的に結合された、連結された、または別の方法で結び付けられた）ポリペプチドＳｈＫトキシンを構成する。アミノ酸残基がキラル中心を有する実施形態では、当該アミノ酸残基のＤおよび／またはＬエナンチオマーを使用することができる。アニオン電荷を有するアミノ酸残基は、非天然残基であってもよく、ＳｈＫポリペプチドのＮ末端に付加または連結させることができる。一部の実施形態では、アニオン電荷を有するアミノ酸残基は、アミノエチルオキシエチルオキシアセチル・リンカーなどのリンカーを介してＳｈＫのＮ末端に連結させてもよい。これらのＳｈＫ類似体は、他のカリウムチャネル（たとえばＫｖ１．１）に対する親和性が低下しているため、ＳｈＫよりもＫｖ１．３チャネルをより特異的に阻害する。ＳｈＫは、当技術分野で周知のように天然源から単離してもよいし、合成してもよい。
【００２２】
ＳｈＫトキシンの合成
ＳｈＫトキシンは任意の適切な方法で合成することができる。そのような方法の１つでは、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）およびＴｈｒ（ｔＢｕ）を含む市販のＦｍｏｃ−アミノ酸（バッケム社（Ｂａｃｈｅｍ  Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ））を入手し、組み立ててＳｈＫトキシンを形成する。アプライドバイオシステムズ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３１Ａペプチド合成装置を用い、０．２５ｍｍｏｌスケールでＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｒから開始してアミノ酸の段階的組立てを行ってもよい。残基３４〜２２を単結合させる。その後、樹脂の等分量（たとえば半量）を分取してさらに適切に混合する。続いて、残った等分量の樹脂に残りのペプチド配列を二重結合させる。カップリングはすべて、２当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下でジシクロヘキシルカルボジイミドを介して行なう。最後の２残基もＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ法で結合させる。当該２残基はＡｅｅａ（Ｆｍｏｃ−アミノエチルオキシエチルオキシ酢酸）と、Ｎ末端残基としてのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ４）モノベンジルエステルである。最終的にＦｍｏｃ基を除去した後、ペプチド樹脂（２．４２ｇ）を樹脂から切断し、同時に試薬Ｋを用いて室温で２時間にわたって脱保護する。当技術分野では試薬Ｋは周知であり、文献に記載されている。キング、ディー．エス．（Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．）、フィールズ、シー．ジー．（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｃ．Ｇ．）およびフィールズ、ジー．ビー．（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．）（１９９０年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｒｅｓ．第３６巻、ｐ．２５５−２６６を参照されたい。切断後、ペプチドを濾過して消耗した樹脂ビーズを取り除き、氷冷ジエチルエーテルで沈殿させる。続いて微細なフィルタ漏斗で該ペプチドを収集し、氷冷エーテルで洗浄し、最後に２０％ＡｃＯＨ水溶液で抽出する。次に該ペプチド抽出物をＨ２Ｏで希釈して２リットルとし、ＮＨ４ＯＨでｐＨを８．０に調整し、室温で３６時間にわたって空気酸化させる。ジスルフィド結合を酸化して還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの比が２：１になった後、該ペプチド溶液をｐＨ２．５に酸性化し、レイニン社（Ｒａｉｎｉｎ）のＤｙｎａｍａｘ（商標）Ｃ１８カラム（５．０×３０ｃｍ）にポンプで送り込む。０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏに混和したアセトニトリル５〜３０％を用い、直線濃度勾配で上記試料を溶出する。２つのＲＰ−ＨＰＬＣ分析装置ＴＦＡおよびＴＥＡＰを用いて、得られた画分を分析する。純粋画分を併せ、凍結乾燥する（ペニントン、エム．ダブリュ．（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．）、バーンズ、エム．イー．（Ｂｙｒｎｅｓ，Ｍ．Ｅ．）、ザイデンバーグ、アイ．（Ｚａｙｄｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．）、カイティン、アイ．（Ｋｈａｙｔｉｎ，Ｉ．）、デカストナイ、ジェイ．（ｄｅ  Ｃｈａｓｔｏｎａｙ，Ｊ．）、クラフテ、ディー．（Ｋｒａｆｔｅ，Ｄ．）、ヒル、アール．（Ｈｉｌｌ，Ｒ．）、マーニル、ブイ．（Ｍａｈｎｉｒ，Ｖ．）、ボルバーグ、ダブリュ．エイ．（Ｖｏｌｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．）、ゴルチカ、ダブリュ．（Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｗ．）およびケム、ダブリュ．アール．（Ｋｅｍ，Ｗ．Ｒ．）（１９９５年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．第４６巻、ｐ．３５４−３５８を参照）。
【００２３】
別の方法としてＢｏｃ−Ｂｚｌ保護基戦略を用いる固相ペプチド合成を使用して、該ペプチドの一次構造ならびに類似体を組み立ててもよい。次に該ペプチドを無水ＨＦで固相から切断すると、上記のＦｍｏｃで合成したペプチドと同じく、折り畳み（フォールディング）の準備ができている直線ペプチドが生成される（スチュアート、ジェイ．エム．（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．）およびヤング、ジェイ．ディー．（Ｙｏｕｎｇ  Ｊ．Ｄ．）（１９８４年）「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在のピアスケミカルカンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ＩＩを参照）。
【００２４】
あるいは、ＳｈＫまたは類似体の一次構造を組み立てる別の合成方法として化学的ライゲーション技術が挙げられるが、この方法では、ペプチドは、Ｃ末端チオエステルペプチドを有するように設計された一連の断片として作製される。該チオエステルペプチドは、Ｎ末端にＣｙｓ残基を含む別のペプチドと反応して天然ペプチド結合を備えたペプチドを形成することができる。この技術を使用することにより、ＳｈＫの一次構造を効果的に組み立てることができると考えられる（（４）ウィルケン、ジェイ．（Ｗｉｌｋｅｎ，Ｊ．）およびケント、エス．ビー．エイチ．（Ｋｅｎｔ  Ｓ．Ｂ．Ｈ．）（１９９８年）「化学的タンパク質合成（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．第９巻、ｐ．４１２−４２６を参照）。
【００２５】
また、ＳｈＫの一次構造を組み立てるために使用しうる別の合成方法は、アルベリキオ、エフ．（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．）、ロイド‐ウィリアムス、ピー．（Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．）およびギラルト、イー．（Ｇｉｒａｌｔ，Ｅ）（１９９７年）「コンバージェントペプチド合成（Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ジー．フィールズ（Ｇ．Ｆｉｅｌｄｓ）編「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．」、ニューヨーク州ニューヨーク所在のアカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に収録（ｐｐ３１３−３３５）に記載されているように、保護ペプチド断片のコンバージェント法を利用することであると考えられる。当該方法では、直線状の保護断片を完全な側鎖保護断片として組み立てる。続いて、該断片をコンバージェント法で互いに結合させ、ＳｈＫまたはその１つの類似体の一次配列を組み立てることができる。該断片の組立ては、固相樹脂を用いてカップリング工程および洗浄工程を容易にすることもできると考えられる。
【００２６】
また別の方法として遺伝子組換え法を使用することも可能であり、この方法では、原核生物または真核生物の発現系のいずれかで発現できるように、ＳｈＫをコードするｃＤＮＡ配列を作製することができると考えられる。非標準コドンを利用する装荷済み（プレロード）ｔＲＮＡ分子を活用することにより、非天然アミノ酸を含有する組換えＳｈＫ類似体も可能である。上記の未使用コドンの１つを使用してホスホチロシン残基のほかＡｅｅａ残基を付加するように、ｃＤＮＡ構築物を設計することができる。次に、組換え生産したＳｈＫ類似体の折り畳みは、合成ペプチドに使用する方法と類似した方法で完成させることができると考えられる（ペニントン、エム．ダブリュ．（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．）、バーンズ、エム．イー．（Ｂｙｒｎｅｓ，Ｍ．Ｅ．）、ザイデンバーグ、アイ．（Ｚａｙｄｅｎｂｅｒｇ，Ｉ．）、カイティン、アイ．（Ｋｈａｙｔｉｎ，Ｉ．）、デカストナイ、ジェイ．（ｄｅ  Ｃｈａｓｔｏｎａｙ，Ｊ．）、クラフテ、ディー．（Ｋｒａｆｔｅ，Ｄ．）、ヒル、アール．（Ｈｉｌｌ，Ｒ．）、マーニル、ブイ．（Ｍａｈｎｉｒ，Ｖ．）、ボルバーグ、ダブリュ．エイ．（Ｖｏｌｂｅｒｇ，Ｗ．Ａ．）、ゴルチカ、ダブリュ．（Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｗ．）およびケム、ダブリュ．アール．（Ｋｅｍ，Ｗ．Ｒ．）（１９９５年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．第４６巻、ｐ．３５４−３５８を参照）。
【００２７】
アニオン性アミノ酸残基のＳｈＫへの付加およびＳｈＫの任意の修飾
アニオン性アミノ酸残基は、アミノエチルオキシエチルオキシアセチル・リンカーなどのリンカーにより、もしくは他の何らかの適切な手段により、天然または合成ＳｈＫトキシンのＮ末端に付加してもよい。当該実施例では、図１に示した９つのＳｈＫ類似体が作製される。まず、Ｆｍｏｃ−Ａｅｅａ−ＯＨを、上述のように組み立てた合成ＳｈＫトキシンのＮ末端に結合させる。続いて樹脂を９つに等分する。次に、ＤＩＣおよびＨＯＢＴを用いて、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ４Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｄ−Ｔｙｒ（ＰＯ４Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ４Ｍｅ２）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｍｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｄ−Ｐｍｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｍｐ（Ｅｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｍｐ（Ｅｔ）２−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ａｍｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨのいずれかを等分した樹脂の１つに結合させる。続いて非ブロック化したペプチド樹脂を切断し、５％トリイソプロピルシランを含有する試薬Ｋ（キング（Ｋｉｎｇ）ら、１９９０年）を用いて室温で２時間にわたって脱保護する。ｔ−１５分時点で切断混合物に固体のＮＨ４Ｉを加えてＭｅｔ（Ｏ）を還元する（ニコラス（Ｎｉｃｏｌａｓ）ら、１９９５年）。Ｔｙｒ（ＰＯ４Ｍｅ２）−ＯＨを含有するペプチドについては、スカベンジャーとしてチオアニソールを含有する１ＭのＴＭＳＢｒのＴＦＡ溶液を含有する切断混合物を４℃で１８時間にわたって使用した（ティアン（Ｔｉａｎ）ら、１９９３年）。この方法を用いると、メチル保護基の不完全な除去がよくみられ、２つの種（Ｔｙｒ（ＰＯ４）
およびＴｙｒ（ＰＯ４Ｍｅ））はＲＰ−ＨＰＬＣで容易に精製される。Ｔｒｙ（ＰＯ４Ｍｅ２）を含む類似体は標準の試薬Ｋによる切断を介して切断され、両Ｍｅ基はそのまま維持される。いずれの場合も、切断混合物を濾過し、粗ペプチドを氷冷ジエチルエーテル中で沈殿させる。沈殿を収集し、樹脂２００ｍｇから約７５ｍｇのペプチドが産出される。この粗生成物を５０％ＡｃＯＨ水溶液２０ｍｌに溶解し、０．７５ＬのＨ２Ｏで希釈する。ＮＨ４ＯＨで該溶液のｐＨを８．２に調整し、グルタチオン（２ｍＭ：１ｍＭ）（還元型：酸化型）を加えて一晩放置し、折り畳ませた。類似体はすべて、以前に記載されているようにＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製する（ペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、１９９５年；ペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、１９９６年ａ；ペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、１９９６年ｂ）。純粋な画分を併せ、凍結乾燥する。各試料をＲＰ−ＨＰＬＣ、ＡＡＡおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで確認し、バイオアッセイの前に調整してペプチド含量を明らかにする。
【００２８】
本発明の一部の実施形態では、ＳｈＫ構造のＰＫ／ＰＤ特性を改善するため、分解特性に敏感な残基を交換または置換してもよい。このため、２１位のＭｅｔ残基の置換を行なって酸化に対する安定効果を与えてもよい。さらに、Ｃ末端の酸官能基をアミドで置換すれば、Ｃ末端カルボキシペプチダーゼ酵素に対する安定性を与えることになる。Ｎ末端でアニオン性分子と結合させたＳｈＫの一次構造に上記の２つの置換を行なった物質はすでに合成され、最も安定で選択性の高いＫｖ１．３ブロッカーを生み出している。非加水分解性リン酸塩置換も、ホスファターゼ酵素に対する安定性だけでなく、リン酸塩の酸性および塩基性加水分解に対する安定効果を与えるはずである。置換について以下に要約する。使用した略語の定義は次のとおり、すなわち：Ｐｍｐ＝ｐ−ホスホノメチル−フェニルアラニン；Ｐｐａ＝ｐ−ホスファチジル−フェニルアラニンおよびＮｌｅ＝ノルロイシンである。
【００２９】
置換：
ｐ−ホスホ−Ｔｒｙ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アミド
ｐ−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アミド（Ｐｍｐ）
ｐ−ホスファチジル−Ｐｈｅ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アミド（Ｐｐａ）
ｐ−ホスホ−Ｔｒｙ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アシド
ｐ−ホスホノ−メチル−フェニルアラニン−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アシド（Ｐｍｐ）
ｐ−ホスファチジル−Ｐｈｅ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５−アシド（Ｐｐａ）
非加水分解性ＰｍｐおよびＰｐａのほかに、ｐ−ホスホノ（ジフルオロ−メチル）−フェニルアラニン（Ｐｆｐ）およびｐ−ホスホノ−メチルケト−フェニルアラニン（Ｐｋｐ）による置換もアニオン性置換であり、以下：
Ｐｆｐ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５アミド
Ｐｋｐ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５アミド
Ｐｆｐ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５アシド
Ｐｋｐ−Ａｅｅａ−ＳｈＫ−Ｎｌｅ２１−Ｃｙｓ３５アシド
が得られる。
【００３０】
Ｎ末端置換体の構造は付録Ｂに示している。本発明の範囲内にある他の構造は、ビートン、シー．（Ｂｅｅｔｏｎ，Ｃ．）らの「自己免疫疾患の治療に向けＫｖ１．３チャネルの選択的ペプチド阻害薬でエフェクター記憶Ｔ細胞を標的にする（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第６７巻、第４号、ｐ．１３６９−（２００５年）に発表されている。同文献の内容全体は参照により特別に本明細書に組み込まれ、その完全な複写は付録Ｃとして本明細書に添付される。
【００３１】
本発明のＳｈＫ類似体の治療用途
本発明は、本発明のＳｈＫ類似体（上記表１に列記した類似体を含むがこれらに限定されない）のみで構成される、または当該類似体を含んでなる薬剤学的に許容可能な製剤の治療有効量（たとえば、症状または疾患進行を軽減または消失させる予防的もしくは効果的な量）を投与することにより、ヒトまたは動物対象者におけるＴ細胞媒介性障害（たとえば自己免疫疾患、移植片対宿主病、臓器移植の拒絶反応の予防など）、他の炎症性障害、肥満および２型糖尿病などの特定の障害または疾患を治療もしくは予防するための方法を提供する。任意の適切な投与経路（たとえば、経口、経直腸、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、局所、経粘膜、経皮、薬剤供給インプラントによるなど）を使用できる。Ｔ細胞媒介性障害の予防または治療に使用する場合は、Ｔ細胞膜上のＫｖ１．３チャネルを阻害するのに十分な投与量を使用する。これに関して本発明のＳｈＫ類似体は、さまざまな種類のＴ細胞媒介性自己免疫疾患の予防または治療に使用できる可能性を有する。以下に、本発明の方法により予防または治療しうる一部のＴ細胞媒介性自己免疫疾患の一部の例を、各疾患により主に影響を受ける標的器官に着目して分類して示す。
【００３２】
神経系：
多発性硬化症
重症筋無力症
ギラン・バレーなどの自己免疫性末梢神経障害
自己免疫性ブドウ膜炎
胃腸管：
クローン病
潰瘍性大腸炎
原発性胆汁性肝硬変
自己免疫性肝炎
歯周病に随伴する骨吸収
血液：
自己免疫性溶血性貧血
悪性貧血
自己免疫性血小板減少症
内分泌：
１型糖尿病
アジソン病
グレーブス病
橋本甲状腺炎
自己免疫性卵巣炎および精巣炎
血管：
側頭動脈炎
抗リン脂質抗体症候群
ウェゲナー肉芽腫症およびベーチェット病などの血管炎
多臓器および／または筋骨格系：
関節リウマチ（ＲＡ）
変形性関節症（ＯＡ）
全身性紅斑性狼瘡
強皮症
多発筋炎、皮膚筋炎
強直性脊椎炎などの脊椎関節症
シェーグレン症候群
皮膚：
乾癬
疱疹状皮膚炎
尋常性天疱瘡
白斑
影響を受ける特定の器官とは関係なく、Ｔリンパ球は自己免疫疾患の発現に寄与していると考えられている。これらの疾患に現在利用可能な治療法は大いに不満足なものであり、グルココルチコイド（メチルプレドニゾロン、プレドニゾンなど）、非ステロイド性抗炎症薬、金塩、メトトレキサート、抗マラリア薬のほか、シクロスポリンおよびＦＫ−５０６などの他の免疫抑制薬を使用するのが通例である。さらに、本発明の方法により予防または治療しうる別のＴ細胞媒介性障害は、移植片対宿主病および／または移植臓器の拒絶反応である。実際に、組織型決定、外科技術、および有効な免疫抑制治療の改良技術の開発に伴い、臓器移植の転帰は徐々に改善されてきている。しかし、移植臓器の拒絶反応は未だに重大な問題である。Ｔリンパ球は免疫応答に中心的な役割を演じており、多くの移植臓器の拒絶反応に大きく関与している。Ｔリンパ球はいわゆる移植片対宿主病の原因でもあり、該疾患は、移植した骨髄細胞がＭＨＣ不適合の宿主組織を認識して破壊する。このため、シクロスポリンおよびＦＫ５０６などのＴ細胞性免疫を抑制する薬剤を使用して、移植拒絶反応および移植片対宿主病が予防されている。しかし残念ながら、こうしたＴ細胞阻害薬は毒性を有し、肝毒性および腎毒性のため、その使用が制限される。このため本発明の方法は、移植片対宿主病もしくは移植拒絶反応の治療または予防に対し、毒性の低い代替選択肢を提供しうる。また、電位差ゲート型Ｋｖ１．３カリウムチャネルの阻害薬はエフェクター記憶Ｔ細胞の抑制に特に有効であることが示されており、このため本発明の方法は、骨吸収および歯周病、乾癬、関節リウマチ、糖尿病および多発性硬化症など、エフェクター記憶Ｔ細胞に関連する疾患の予防または治療に特に有効である可能性がある。Ｔ細胞媒介性疾患のほか、Ｋｖ１．３チャネルは、エネルギーホメオスタシス、体重および末梢インスリン感受性を調節することが解明されている。このため本発明の方法は、細胞膜上のＫｖ１．３チャネルを阻害することにより、異常なホメオスタシス、体重および末梢インスリン感受性が関わる他の疾患および障害を治療するために使用できる。このような他の疾患および障害には、歯周病における骨吸収、２型糖尿病、メタボリック症候群および肥満が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
フローサイトメトリーにおける本発明のＳｈＫ類似体の使用
さらに本発明によれば、蛍光団で標識したＳｈＫ（Ｌ５）を単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できるクラスＩＩ四量体と併用してフローサイトメトリーに使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞媒介性障害を診断するための方法、あるいは、種々の細胞型の選別または識別の方法を提供する。フローサイトメトリーは懸濁液中の細胞を特徴付けるための柔軟な方法であり、蛍光励起細胞分取法を用いて、フローサイトメトリーで測定した特徴に基づき生細胞を選別する。フローサイトメトリーで検出しうる細胞の特徴および機能の種類には、細胞内外のタンパク質の発現、ＤＮＡの含量と生存能力とアポトーシスのタイプ、多剤耐性ポンプ活性、酵素活性、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞受容体特異性、サイトカイン発現、食作用ならびに酸化バースト活性が含まれる。このため、本発明の当該方法では、ＳｈＫに付加されるアミノ酸残基には、単独で、もしくは自己反応性細胞を検出できる特異的な自己抗原を取り付けたクラスＩＩ四量体と併用してフローサイトメトリーに使用するために、蛍光団の標識が組み込まれてもよい。当該フローサイトメトリーを行ないうる方法の具体的な説明は、ビートン、シー．（Ｂｅｅｔｏｎ，Ｃ）らの「慢性的に活性化されたＴリンパ球におけるＫｖ１．３チャネルのアップレギュレーションを検出および研究するための新規蛍光性トキシン（Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｔｏｘｉｎ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  Ｋｖ１．３  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  Ｌｙｍｈｏｃｙｔｅｓ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７８巻、第１１号、ｐ．９９２８−９９３７（２００３年３月）に記載されている。一般にフローサイトメーターは、集束レーザー光を使用して、細胞が流体の流れのなかでレーザー光線を通過するときに細胞を照射する。細胞から散乱した光と、目的の細胞に取り付けた蛍光色素から放たれた光をいくつかの検出器で分析し、コンピュータで処理する。細胞は、大きさおよび形のほか、細胞内および細胞表面上のさまざまな分子の存在によっても識別および選別しうる。
【００３４】
本発明のＳｈＫ類似体のカリウムチャネル阻害作用および治療的有用性の例
ＳｈＫは神経細胞のＫｖ１．１チャネルとＫｖ１．３チャネルをほぼ同等の力価で遮断する。このため、血液脳関門に障害があり、Ｋｖ１．１チャネルを遮断するのに十分な量のＳｈＫが進入できる状況下では、神経毒性が懸念される。Ｋｖ１．３に特異的な阻害薬を設計するための我々の戦略は、フルオレセイン−６−カルボキシレート（Ｆ６ＣＡ）が２０Å長のＡｅｅａリンカーを介してＳｈＫのＮ末端に付加されているＳｈＫ−Ｆ６ＣＡが、Ｋｖ１．１に比べＫｖ１．３に対し８０倍の選択性を示したという我々の所見によって導かれた（ビートン（Ｂｅｅｔｏｎ）ら、２００３年）。Ｆ６ＣＡは制限されたカルボキシレートとしても、環化したラクトンとしても存在できるため、ＳｈＫ−Ｆ６ＣＡのＫｖ１．３特異性がＦ６ＣＡの陰電荷によるものか、フルオレセインの大きく嵩高い原子核により作り出される疎水性によるものか、可能性のある平面性ｐ電子スタッキングによるものなのか、もしくは、これらの可能性のある寄与因子がすべて組み合わされたことによるものなのか、はっきりしなかった。これらの可能性を区別するために、かつ非蛍光性のＫｖ１．３選択的阻害薬を開発する意図をもって、Ｎ末端を置換した一連の１２個の新規ＳｈＫ類似体を作製し、上記相互作用の一部について探査した。Ａｅｅａリンカーを介してチロシン、フェニルアラニンまたはこれらの誘導体（電荷、大きさおよび疎水性は多岐にわたる）をＳｈＫのＮ末端に付加することにより、電荷および疎水性の影響を探り、Ｆ６ＣＡ置換でみられた選択性の増強について洞察を得ることができた。
【００３５】
Ｋｖ１．１阻害に比べ選択的なＫｖ１．３阻害：
図２Ａ〜２Ｄに示した実施例では、陰電荷（実効電荷２）を有する翻訳後修飾された芳香族アミノ酸であるＬ−ホスホチロシン（Ｌ−ｐＴｙｒ）を、ＡＥＥＡリンカーを介してＳｈＫ−Ａｒｇ１に付加し、新規類似体ＳｈＫ（Ｌ５）を作製した。Ｌ９２９細胞に安定に発現しているＫｖ１．３  およびＫｖ１．１チャネルで、ＳｈＫトキシンとＳｈＫ（Ｌ５）を試験した。図２Ｂは、保持電位８０ｍＶ〜４０ｍＶの２００ｍｓにわたる脱分極パルスにより誘発したＫｖ１．３およびＫｖ１．１電流に対するＳｈＫおよびＳｈＫ（Ｌ５）の作用を示している。いずれのペプチドも、投与量依存的にＫｖ１．３およびＫｖ１．１を可逆性に遮断し、ヒル係数は１であった。Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて示した用量反応曲線から、Ｋｄを判定した。ＳｈＫはＫｖ１．３（Ｋｄ＝１０±１ｐＭ）およびＫｖ１．１（Ｋｄ＝２８±６ｐＭ）を遮断し、予測どおり力価はほぼ同等であった（図１Ｃ）。対照的にＳｈＫ（Ｌ５）は、Ｋｖ１．１（Ｋｄ＝７．４±０．８ｎＭ）に比べＫｖ１．３（Ｋｄ＝６９±５ｐＭ）に対し１００倍選択的であった（図１Ｂ、１Ｃ）。ＳｈＫ（Ｌ５）およびそのウォッシュアウトによるＫｖ１．３電流遮断の時間経過を図１Ｄに示す。ＳｈＫ（Ｌ５）ウォッシュインの時定数（ＴＯＮ）は１３１±２１秒（ｎ＝７）であり、ペプチドウォッシュアウトの時定数（ＴＯＦＦ）は１５０±２８秒（ｎ＝４）であった。ＫＯＮ（１５×１０６±０．５×１０６Ｍ−１秒−１）およびＫＯＦＦ（０．００５９±０．００１３秒−１）値から算出したＫｄ（５７±７ｐＭ）は、Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアで判定したＫｄ（６９±５ｐＭ）と一致している。
【００３６】
他のＳｈＫ類似体もＫｖ１．３およびＫｖ１．１チャネルで試験した。Ｄ−ホスホチロシン（Ｄ−ｐＴｙｒ）を含むＳｈＫ（Ｄ５）は、Ｋｖ１．１に比べＫｖ１．３に対して３５倍選択的であったが、ＳｈＫ（Ｌ５）よりは一桁低い力価であった。Ｌ−ｐＴｙｒ−モノメチルを含むＳｈＫ（Ｌ６）は、軽度（１１倍）のＫｖ１．３特異性を示し、Ｌ−ｐＴｙｒ−ジメチルまたはＬ−Ｔｙｒを含むＳｈＫ類似体はＫｖ１．１と比べてもＫｖ１．３に対し選択的ではなかった。フェニルアラニンまたはその誘導体を含んだ類似体（かさ、ｐ電子密度および電荷が多岐にわたる）は、Ｋ１．１と比べた場合のＫｖ１．３に対する特異性が軽度か、または特異性がなかった。Ｋ１．１と比べた場合のＫｖ１．３に対するＳｈＫ（Ｌ５）の１００倍の特異性は、ＳｈＫ−Ｆ６ＣＡ（８０倍）、ＳｈＫ（Ｄ５）（３５倍）、ＳｈＫ−Ｄａｐ２２（３３倍）または試験した他のいずれのＳｈＫ類似体よりも大きい。
【００３７】
本出願人は、２０種類の一群のイオンチャネルについてもＳｈＫ（Ｌ５）の特異性を評価し、そのデータを下記の表２に要約する。
【００３８】
【表２】
2008515917.tif 000004
【００３９】
上記表２のデータから理解されうるように、ＳｈＫ（Ｌ５）はＴ細胞のＫｖ１．３チャネルを遮断し、クローン化Ｋｖ１．３チャネル（６９ｐＭ）に対するＫｄと同等のＫｄ（７６ｐＭ）を示した。ＳｈＫ（Ｌ５）は、Ｋｖ１．３に対する選択性がＫｖ１．１に比べ１００倍、Ｋｖ１．６に比べ２６０倍、Ｋｖ３．２に比べ２８０倍、Ｋｖ１．２に比べ６８０倍であり、試験した他のすべてのチャネルに比べ１０００倍を超えていた。重要なことにＳｈＫ（Ｌ５）は、ヒトナイーブおよびＴＣＭ細胞の活性化を調節するカルシウム活性化Ｋ＋チャネルであるＫＣａ３．１に比べ、Ｋｖ１．３選択性が１６００倍であった（ウルフ（Ｗｕｌｆｆ）ら、２００３年）。天然ＳｈＫはＳｈＫ（Ｌ５）より選択性が低かった。ＳｈＫは、Ｋｖ１．３（Ｋｄ＝１０±１ｐＭ）に対する選択性がＫｖ１．１（Ｋｄ＝２８±６ｐＭ）に比べ２．８倍、Ｋｖ１．６（２００±２０ｐＭ）に比べ２０倍、Ｋｖ３．２（Ｋｄ＝５，０００±１，０００ｐＭ）に比べ５００倍であり、Ｋｖ１．２（１０
±１ｎＭ）およびＫＣａ３．１（Ｋｄ＝２８±３ｎＭ）に比べ１０００倍を超えていた。特異的Ｋｖ１．３阻害薬として売り込まれてきたサソリ毒由来のペプチドであるマーガトキシン（クー（Ｋｏｏ）ら、１９９７年；リン（Ｌｉｎ）ら、１９９３年；ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら、２００３年）も特異的ではなかった。マーガトキシンは、Ｋｖ１．３（Ｋｄ＝１１０±１２ｐＭ）に対する選択性がＫｖ１．２（Ｋｄ＝５２０±１ｐＭ）に比べ５倍、Ｋｖ１．１（１０±１ｎＭ）に比べ９倍であり、Ｋｖ１．６およびＫｖ３．２（Ｋｄ＞１００ｎＭ）に比べ１０００倍を超えていた。Ｋｖ１．３阻害薬であるという根拠（レイヒ（Ｌａｈｅｙ）およびラジャダクーシャ（Ｒａｊａｄｈｙａｋｓｈａ）、２００４年）から自己免疫疾患用に売られている栄養補助食品ルテオリン（www.lutimax.com ）は、Ｋｖ１．３を弱く遮断し（Ｋｄ＝６５±５ｍＭ）、Ｋｖ１．１（Ｋｄ＝７７±５ｍＭ）、Ｋｖ１．２（Ｋｄ＝６３±４ｍＭ）およびＫｖ１．５（Ｋｄ＝４１±３ｍＭ）に比べて選択性をまったく示さなかった。ＳｈＫ（Ｌ５）のＫｖ１．３に対する優れた選択性と該チャネルに対するｐＭレベルの親和性が相まって、ＳｈＫ（Ｌ５）の魅力的な免疫抑制薬としての可能性を高めている。
【００４０】
ヒトＴＥＭ細胞増殖の優先的抑制
図３Ａ〜３Ｄを参照すると、ＳｈＫ（Ｌ５）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫抑制活性を評価するために、本出願人は、ヒトＴＥＭ細胞株と、ナイーブおよびＴＣＭ細胞の混合物を含むヒトＰＢＭＣとの間で、抗ＣＤ３抗体で刺激した増殖を抑制するＳｈＫ（Ｌ５）の能力を比較した。フローサイトメトリーにより、検討した２つの母集団の細胞表面の表現型を確認した。図３Ａにみられるように、ＴＥＭ細胞株はＣＣＲ７−ＣＤ４５ＲＡ−が９０％を超え、一方、図３Ｂに示すように、ＰＢＭＣは６５％のＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋（ナイーブ）および１８％のＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ−（ＴＣＭ）細胞を含有していた。図３Ｃは、ＳｈＫ（Ｌ５）およびＳｈＫがＰＭＢＣの増殖抑制（ＩＣ５０＝５ｎＭ、ｐ＜０．０５）に比べＴＥＭ細胞の増殖抑制（ＩＣ５０＝約８０ｐＭ）において６０倍効果が高かったことを示している。ＰＢＭＣの低い感受性は、これまでに報告されているように（ガンシャニ（Ｇｈａｎｓｈａｎｉ）ら、２０００年；ウルフ（Ｗｕｌｆｆ）ら、２００３年）、ナイーブおよびＴＣＭ細胞における、刺激によるＫＣａ３．１チャネルの迅速なアップレギュレーションにより説明されると考えられる。この解釈を踏まえ、図３Ｄの上の列に示すように、ＰＢＭＣを４８時間活性化してＫＣａ３．１発現をアップレギュレートし、続いて１２時間休ませ、さらに抗ＣＤ３抗体で再活性化したところ、ＰＢＭＣはＳｈＫ（Ｌ５）遮断に対して完全に抵抗性となった。第１ラウンドの刺激でＳｈＫ（Ｌ５）により抑制されたＰＢＭＣは、洗浄して休ませ、抗ＣＤ３抗体で再度誘発すると、同じようにＳｈＫ（Ｌ５）に抵抗性を示した。上記の結果は、ナイーブおよびＴＣＭ細胞がＫＣａ３．１チャネルをアップレギュレートすることによりＫｖ１．３阻害薬を免れることを示した早期の研究を確証するものである。以上のように、ＳｈＫ（Ｌ５）は優先的かつ持続的にＴＥＭ細胞の増殖を抑制する。
【００４１】
ラットＴＥＭ細胞増殖の優先的抑制
ＳｈＫ（Ｌ５）の治療的有効性を評価することを前提として、ラットにＭＳ様疾患を引き起こす記憶Ｔ細胞株ＰＡＳの増殖を抑制するＳｈＫ（Ｌ５）の能力について検討した。対照として、本出願人はラット脾臓Ｔ細胞を使用した。２つの細胞母集団の分化状態を確認するため、ナイーブＴ細胞のマーカーであるＣＤ４５ＲＣの発現を評価した（バンス（Ｂｕｎｃｅ）およびベル（Ｂｅｌｌ）、１９９７年）。図４Ａに示すように、ラット脾臓Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＣ＋が７６％であったが（すなわち主にナイーブ細胞）、ＰＡＳ細胞はＣＤ４５ＲＣ−であったことから記憶細胞であることが示唆される。ＰＡＳ細胞がＴＥＭ状態にあるか、もしくはＴＣＭ状態にあるか判断するために、活性化の前および４８時間後にＫｖ１．３発現を調査した。ＴＥＭ細胞は刺激によりＫｖ１．３レベルを著明にアップレギュレートするが、ＴＣＭ細胞ではアップレギュレートしないと予測される。図４Ｂを参照すると、パッチクランプ法実験から、ＰＡＳ細胞のＭＢＰ刺激後にＫｖ１．３電
流の振幅が著しく増大することが明らかにされ、ＴＥＭ細胞であることと一致している。ＰＡＳ細胞上のＫｖ１．３チャネル数を測定する独自の測定法として、Ｋｖ１．３と特異的に結合することが報告されている蛍光標識したＳｈＫ類似体であるＳｈＫ−Ｆ６ＣＡを用いた。フローサイトメトリーで測定したＳｈＫ−Ｆ６ＣＡの染色強度は、細胞表面に発現したＫｖ１．３四量体の数を反映している。図４Ｃにみられるように、ＳｈＫ−Ｆ６ＣＡ（１０ｎＭ）の染色強度はＰＡＳ細胞のＭＢＰ活性化とともに増大し、過剰な非標識ＳｈＫ（Ｌ５）（１００ｎＭ）がＳｈＫ−Ｆ６ＣＡ染色を競合的に阻害した。最終試験として本出願人は、固定してＫｖ１．３特異抗体で染色した静止期ＰＡＳ細胞およびＭＢＰで刺激したＰＡＳ細胞について共焦点顕微鏡検査を行なった。図４Ｂおよび４Ｃのデータと一致して、休止期ＰＡＳ  Ｔ細胞はＫｖ１．３染色強度が４．４±０．６であり、この値は抗原による活性化後に１０．６±２．３（ｐ＜０．００５）に増大したことから（図４Ｄを参照）、活性化後にＫｖ１．３タンパク質発現が増加したことを示している。このため、ＭＢＰで活性化したＰＡＳ細胞は、ＣＤ４５ＲＣ−Ｋｖ１．３ｈｉｇｈＴＥＭ細胞であり、一方、実験に用いたラット脾臓Ｔ細胞は大部分がナイーブ状態である。
【００４２】
ＳｈＫ（Ｌ５）およびＳｈＫによる、ＰＡＳ細胞のＭＢＰ誘発増殖の抑制（ＩＣ５０＝約８０ｐＭ）は、ラット脾臓Ｔ細胞のマイトジェン誘発増殖の抑制（ＩＣ５０＝約１００ｎＭ）よりも約１０００倍も効果的であった（図４Ｅ参照、ｐ＜０．０５）。以上の結果は、上に述べたヒトＴ細胞による所見を確証するものである。図４Ｇにみられるように、ＳｈＫ（Ｌ５）はＰＡＳ細胞によるＭＢＰ誘発ＩＬ２産生を阻害し（図４Ｆ）、外因性ＩＬ２はＰＡＳ細胞増殖のＳｈＫ（Ｌ５）抑制を部分的に無効にした（図４Ｇ）。早期の研究では、ヒト、ラットおよびミニブタのＴ細胞について特異性の低いＫｖ１．３阻害薬に関する類似した所見が報告された。以上を要約すると、ＳｈＫ（Ｌ５）はヒトおよびラットのＴＥＭ細胞の強力かつ選択的な阻害薬であり、したがって自己免疫疾患の病因に寄与するＴＥＭ細胞を優先的に標的にすることにより、当該疾患において治療用途を有する可能性がある。
【００４３】
血中半減期および安定性
パッチクランプ法によるバイオアッセイを用いて、皮下注射後のＳｈＫ（Ｌ５）の血中濃度がＴＥＭ細胞の阻害に十分であるかどうか確認した。これらの実験の結果を図５Ａ〜５Ｆに示す。
【００４４】
Ｋｖ１．３チャネルに対する遮断活性について、ＳｈＫ（Ｌ５）投与ラットおよび対照ラットからの血清試料を試験した。対照血清は検出可能な遮断活性を示さなかったことから、内因性チャネルブロッカーは存在しないことが示された。該アッセイを標準化するため、既知量のＳｈＫ（Ｌ５）をラット血清に添加し、当該試料をＫｖ１．３チャネルについて試験した。添加した該血清試料は用量依存的にＫｖ１．３電流を遮断し（Ｋｄ＝７７±９ｐＭ）、血清がない場合のＳｈＫ（Ｌ５）の作用と区別できなかった（図４Ａ）。標準曲線と比較することにより、投与した動物のＳｈＫ（Ｌ５）濃度を測定した。ＳｈＫ（Ｌ５）は、２００ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射から５分後に血清中に検出可能であった。３０分で最高濃度（１２ｎＭ）に達し、その後４２０分かけて約３００ｐＭのベースライン値まで低下した。血中からのＳｈＫ（Ｌ５）の消失は、単一指数でフィッティングさせることができた。血中半減期は約５０分であると推定された。
【００４５】
２００ｍｇ／ｋｇ投与後の最高血清中濃度（１２ｎＭ）は、Ｋｖ１．３チャネルおよびＴＥＭ細胞機能を選択的に遮断する必要量を超えていることから、これより少ない投与量を試験した。１０ｍｇ／ｋｇの単回注射後、３０分以内にＳｈＫ（Ｌ５）の最高血清中濃度約５００ｐＭに達し（データ省略）、この濃度は９０％を超えるＫｖ１．３を遮断するのに十分であり、Ｋｖ１．１には影響を及ぼさない濃度である。上記投与量（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を１日１回反復投与した結果、約３００ｐＭの定常状態濃度に達し（注射後２
４時間時点で測定、図５Ｄ）、これはＴＥＭ細胞を６０〜７０％抑制するのに十分な濃度であり、ナイーブ／ＴＣＭ細胞にはほとんど影響を及ぼさない。この「定常状態」濃度は、血中半減期が約５０分と推定されたことを考えると予期しない結果であり、ＳｈＫ（Ｌ５）は反復投与により「蓄積される」ことを示している。その「貯蔵所」が皮膚なのか、または身体の他の部位なのか判断するために、１０ｍｇ／ｋｇのＳｈＫ（Ｌ５）を単回静脈内注射または皮下注射したラットの１０時間後のＳｈＫ（Ｌ５）の血中濃度を測定した。当該ペプチドは、いずれの投与経路でも同一の経時変化で消失したことから（図５Ｅ）、１０ｍｇ／ｋｇ／日の単回注射後に到達したＳｈＫ（Ｌ５）の定常状態濃度３００ｐＭには皮膚が関与しておらず（図５Ｄ）、貯蔵所はほかにあることが示された。
【００４６】
１０ｍｇ／ｋｇ／日の単回注射後にＳｈＫ（Ｌ５）の定常状態濃度３００ｐＭにうまく到達したことは、該ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで安定であることを示唆している。その安定性を直接検討するために、ラット血漿中またはラット血漿を２％含有するＰＢＳ中で、インキュベーション時間をさまざまに変えて３７℃でＳｈＫ（Ｌ５）をインキュベートし、Ｋｖ１．３の遮断活性を測定した。いずれの添加試料のセット（血漿およびＰＢＳ）においても、約５時間でＫｖ１．３遮断活性が５０％低下することを観察したが、これはおそらくペプチドの試験管プラスチック表面との結合によるものと思われ、濃度は次の２日間も定常状態を維持していた（図５Ｆ）。追加の安定性試験として、ＳｈＫ（Ｌ５）投与ラットからの血清を用いてＫｖ１．３遮断活性とＫｖ１．１遮断活性を比較した。ｐＴｙｒの脱リン酸化またはＡｅｅａ−ｐＴｙｒ側鎖の切断のいずれかにより、ＳｈＫ（Ｌ５）がｉｎ  ｖｉｖｏで修飾されるとすれば、それぞれＳｈＫ（Ｌ４）およびＳｈＫが生成されることになり、これらはいずれもＫｖ１．１と比較してＫｖ１．３への選択性がない。ＳｈＫ（Ｌ５）投与動物からの血清試料は、ＳｈＫ（Ｌ５）と同じように、Ｋｖ１．１に比べてＫｖ１．３に対する選択性を示したことから、該ペプチドは上記の修飾を受けないことが示された。以上を統合すれば、これらの結果は、ＳｈＫ（Ｌ５）は血漿中できわめて安定であり、毎日の１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下注射後に薬理学的に適切な血清中濃度に達することを示している。
【００４７】
無毒性
本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験をいくつか実施してＳｈＫ（Ｌ５）が毒性を示すかどうか判定した。当該試験の結果を付録Ａに要約する。ヒトおよびラットのリンパ系細胞を、Ｋｖ１．３半遮断量またはＴＥＭ抑制のＩＣ５０（７０〜８０ｐＭ）の１２００倍を超える濃度のＳｈＫ（Ｌ５）（１００ｎＭ）とともに４８時間インキュベートしたところ、軽微な細胞毒性を示した。同じ高濃度のＳｈＫ（Ｌ５）は、試験株ＴＡ９７Ａを用いたエイムス試験で陰性であったことから、変異原物質ではないことが示唆された。いずれのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においても特筆すべき毒性は検出できなかった。
【００４８】
薬剤誘発性のＫｖ１１．１（ＨＥＲＧ）チャネルの遮断は、重大な心毒性に寄与しており、いくつかの薬剤が市場から回収されている。ＳｈＫ（Ｌ５）は、１００ｎＭ（Ｋｖ１．３に対するＫｄの１４３０倍を超える）ではＫｖ１１．１チャネルに何の影響も及ぼさず、したがって、本出願人が選択した治療処方（１０ｍｇ／ｋｇ／日、定常状態血中濃度３００ｐＭ）は心毒性を引き起こさないはずである。さらなる試験として本出願人は、第１日に賦形剤（ＰＢＳ＋２％ラット血清）を投与し、第２日にＳｈＫ（Ｌ５）１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した覚醒ラットを用いて、心拍変動解析を行なった。ＳｈＫ（Ｌ５）は、時間および頻度のいずれの領域においても心拍および標準ＨＲＶ（心拍変動）パラメータ（欧州循環器病協会および北米心拍調節・電気生理学協会の特別委員会、１９９６年）に何の影響も及ぼさなかった。
【００４９】
上記急性毒性実験の余勢を駆って本出願人は、１０ｍｇ／ｋｇのＳｈＫ（Ｌ５）または
賦形剤を２週間にわたって１日１回皮下注射したラットを用いて亜慢性試験を行なった（各群ｎ＝６）。ＳｈＫ（Ｌ５）投与動物は、賦形剤投与動物と同じ程度に体重が増加した（付録Ａ）。血液学的および血液生化学的解析により、ＳｈＫ（Ｌ５）投与ラットと賦形剤投与ラットには差がないことが示され、フローサイトメトリー解析により、胸腺細胞およびリンパ球サブセットの割合にも差がないことが示された（付録Ａ）。これらの試験を集合すると、ＳｈＫ（Ｌ５）は安全であることが示唆される。
【００５０】
治療的安全指数を判定するため、健康なラットに６０倍高い投与量（６００ｍｇ／ｋｇ／日）のＳｈＫ（Ｌ５）を５日間投与したところ、毒性の臨床徴候は観察されず、健康なラットに１０００ｍｇ／ｋｇのＳｈＫ（Ｌ５）を単回注射したときも毒性はみられなかった。ＥＡＥおよびＭＳで起こるように、血液脳関門に障害がある場合は、この状況は楽天的ではない。ＳｈＫ（Ｌ５）１０ｍｇ／ｋｇ／日を１０日間投与されたＥＡＥラットは、毒性の徴候をまったく示さなかった。対照的に、６００ｍｇ／ｋｇ／日を５日間投与したラットは、その４０％（５／１２）が第５日にＥＡＥの臨床徴候を発現して死亡した（推定ＬＤ５０＝７５０ｍｇ／ｋｇ／日）。２００ｍｇ／ｋｇ単回注射後の血清中のＳｈＫ（Ｌ５）最高濃度（１２ｎＭ）は、５０％を超えるＫｖ１．１チャネルを遮断するのに十分な濃度であることから、６００ｍｇ／ｋｇ／日のＳｈＫ（Ｌ５）を投与したＥＡＥラットに観察された毒性は、Ｋｖ１．１を遮断するのに十分な量のＳｈＫ（Ｌ５）が脳内に進入したことによるものである可能性が高い。したがって、血液脳関門に障害がない状況（中枢神経系（ＣＮＳ）に影響を及ぼさない自己免疫疾患にみられる状況）では、ＳｈＫ（Ｌ５）の有効な治療的安全指数は１００を十分に超えるが、血液脳関門が破られると治療的安全指数は７５である。
【００５１】
ＤＴＨおよび養子移入性急性ＥＡＥの予防
図６Ａ〜６Ｃを参照すると、２つの動物モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫抑制活性についてＳｈＫ（Ｌ５）を評価した。本出願人は、ＭＢＰで活性化したＰＡＳ  ＴＥＭ細胞をＬｅｗｉｓラットに移入して誘発した急性ＥＡＥを予防および治療する能力のほか、ＴＥＭ細胞で媒介されるＤＴＨ反応を抑制する能力も試験した。ＰＡＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで４８時間にわたってＭＢＰで活性化し、続いてＬｅｗｉｓラットに養子移入した（生細胞数：６〜８×１０６）。次に予防試験では、ラットに生理食塩水（対照）またはＳｈＫ（Ｌ５）（１０μｇ／ｋｇ／日）を５日間にわたって皮下注射した。第１の予防試験では、対照ラットは軽度ＥＡＥを発現し（平均最大臨床スコア２．０±１．２）、平均発症日は５．６±０．６日であった（データ省略）。ＳｈＫ（Ｌ５）は疾患の重症度を軽減した（平均最大臨床スコア０．７±０．６、ｐ＜０．０５）。第２の予防試験では、対照ラットはより重度のＥＡＥを発現し（平均最大臨床スコア３．２±０．４）、平均発症日は４．８±０．４日であった（図６Ａ）。ＳｈＫ（Ｌ５）は疾患の重症度を有意に軽減した（平均最大臨床スコア０．６±０．４、ｐ＜０．００７）が、疾患発症日は有意には遅延させなかった（５．５±０．７日；ｐ＝０．０７）。これらの試験では毒性の徴候がまったくみられなかった。
【００５２】
治療試験（図６Ｂ）では、ラットにＭＢＰ活性化ＰＡＳ細胞を注射し、最初にＥＡＥの徴候（尾のひきずり、猫背および２４時間で６％以上の体重減少）を発現したときに生理食塩水または１０μｇ／ｋｇ／日のＳｈＫ（Ｌ５）を投与し、３日間にわたって治療を続けた。ＥＡＥの臨床徴候は、対照群では第６日に最大に達し（スコア＝３．９±０．７）、治療群では第７日に最大に達した（スコア＝１．９±０．９；ｐ＜０．０５）。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳｈＫ（Ｌ５）の免疫抑制活性の独自の評価法として本出願人は、主に皮膚ホーミング性ＴＥＭ細胞により媒介されるＤＴＨ反応を阻害する上でのＳｈＫ（Ｌ５）の有効性を検討した。卵アルブミンおよびアジュバントで免疫したＬｅｗｉｓラットに、７日後に片耳に卵アルブミンを接種し、他方の耳に生理食塩水を接種した。続
いてラットに生理食塩水（対照）またはＳｈＫ（Ｌ５）（１０μｇ／ｋｇ／日）を注射し、ＤＴＨの指標として耳の厚さを測定した。全ての対照ラットが卵アルブミン接種後２４時間および４８時間の時点で耳の腫脹を発現したが、ＳｈＫ（Ｌ５）投与動物ではＤＴＨ反応がかなり軽度であった（図６Ｃ）。したがってＳｈＫ（Ｌ５）は、ＴＥＭ媒介性ＤＴＨ反応を抑制し、ミエリン活性化ＴＥＭ細胞により誘発される重度の養子移入性ＥＡＥを予防および改善する。
【００５４】
Ｋｖ１．３は抗原提示によりＩＳに集積するが、Ｋｖ１．３を通るＫ＋の流出はＩＳの形成および安定性に必要ない
図７Ａ〜７Ｇを参照すると、高選択性Ｋｖ１．３阻害薬（２１）であるＳｈＫ（Ｌ５）は、ＧＡＤ６５特異的ＴＥＭ細胞においてＫｖ１．３電流を遮断し、Ｋｄは７２±３ｐＭであった。ＳｈＫ（Ｌ５）を薬理学的プローブとして使用して、Ｋｖ１．３機能を必要とするＴＥＭ細胞活性化のステップを明らかにした。生化学的研究から、Ｋｖ１．３およびＫｖｂ２は、ＳＡＰ９７（シナプス関連タンパク質９７）、ＺＩＰ（ＰＫＣゼータ結合タンパク質、ｐ５６ｌｃｋ関連ｐ６２タンパク質、Ａ１７０）、ｐ５６ｌｃｋおよびＣＤ４を含むシグナル伝達複合体に属することが示されている（図７Ｂ）。ヒトＴＥＭ細胞における当該複合体の存在は、Ｋｖ１．３、Ｋｖｂ２、ＳＡＰ９７、ＺＩＰおよびｐ５６ｌｃｋとＣＤ４との共キャップ形成を示す本出願人の結果により裏付けられている。さらに、ＦＲＥＴ（蛍光エネルギー変換）研究から、Ｋｖ１．３をトランスフェクトしたヒトＴ細胞ではＫｖ１．３がＣＤ３に非常に接近しており、さらに該チャネルは、Ｋｖ１．３をトランスフェクトしたヒト細胞傷害性Ｔ細胞とその標的との接点に優先的に局在していることが示されている。ＣＤ４は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）が接する領域であるＩＳに移動するため、シグナル伝達複合体のＫｖ１．３および他のタンパク質も抗原提示によりＩＳに局在する可能性がある。この考えを検討するため、Ｔ１ＤＭ患者からのＧＡＤ６５特異的Ｋｖ１．３ｈｉｇｈＴＥＭクローンを、ＧＡＤ６５  ５５７Ｉペプチドを取り付けてＤＡＰＩで染色して視覚化を助けたＨＬＡ適合ＡＰＣとともにインキュベートした。２０分後、シグナル伝達複合体中のタンパク質を検討するため、ＡＰＣ−ＴＥＭ結合体を免疫染色した。ＩＳには、Ｋｖ１．３、Ｋｖｂ２、ＳＡＤ９７、ＺＩＰおよびｐ５６ｌｃｋとともにＣＤ４が局在していた。ＡＰＣとＴＥＭとの接触のない場合では、ＣＤ４およびＫｖ１．３は細胞全体に分布していた。さらに、ＧＡＤ６５特異的ＴＥＭ細胞がＭＢＰ（無関連抗原）を取り付けたＡＰＣに曝された場合は、ＣＤ４およびＫｖ１．３は接点に局在できなかったことから、ＩＳの集積は抗原特異的であることが立証された。以上のように、ＧＡＤ６５特異的ＴＥＭ細胞では、抗原提示により、Ｋｖ１．３含有シグナル伝達複合体がＣＤ４とともにＩＳに移動することから、Ｋｖ１．３はＴＥＭ細胞におけるシグナル変換機構に不可欠な構成要素であることが示唆される。以上の試験に基づけば、Ｋｖ１．３チャネルの約９９％を遮断する濃度（１００ｎＭ）のＳｈＫ（Ｌ５）は、ＩＳの集積を妨げず、ひとたび形成されたＩＳを崩壊させなかったことから、Ｋｖ１．３チャネルを通るＫ＋の流出はＩＳの形成または安定性に不必要であることが示された。
【００５５】
ヒトＴＥＭ細胞の抑制
図８Ａ〜８Ｅを参照すると、ＳｈＫ（Ｌ５）は、Ｔ細胞活性化に不可欠な初期段階であるＴＥＭ細胞のカルシウムシグナル伝達を阻害した。Ｔ１ＤＭ患者からのＧＡＤ６５特異的ＴＥＭクローンに、カルシウム指示薬である色素Ｆｌｕｏ３を取り付け、培養液のみで、または濃度を増大させたＳｈＫ（Ｌ５）とともにプレインキュベートし、活性化用抗ＣＤ３抗体および架橋用第２抗体の添加前後にフローサイトメトリーにより画像化した。刺激後２４２±３５秒で最高カルシウム上昇が起こり、これがＳｈＫ（Ｌ５）で遮断され、ＩＣ５０は約２００ｐＭであった（図８Ａ）。ＳｈＫ（Ｌ５）は、Ｔ１ＤＭ患者およびＲＡ患者からのナイーブ／ＴＣＭ細胞に比べ、同患者からの自己反応性ＴＥＭ細胞による［３Ｈ」チミジン取込みを１０倍効果的に抑制した（図８Ｂ、左）。第２セットの実験（図８Ｂ、右）では、ＲＡ−ＳＦおよびＲＡ−ＰＢＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で４８時間活性化し
、それぞれ「ＴＥＭエフェクター」および「ナイーブ／ＴＣＭエフェクター」を作製した。培地中で細胞を一晩休ませ、ＳｈＫ（Ｌ５）の存在下または非存在下で抗ＣＤ３抗体でさらに４８時間再刺激し、［３Ｈ」チミジン取込みを測定した。ＲＡ−ＳＦ−ＴＥＭエフェクターはＳｈＫ（Ｌ５）阻害に対する感受性を保持していたが、ＲＡ−ＰＢ−ナイーブ／ＴＣＭエフェクターはＫｖ１．３遮断に抵抗性であり（図８Ｂ，右）、これはおそらく、該エフェクターがカルシウム活性化ＫＣａ３．１／ＩＫＣａ１チャネルをアップレギュレートしたことによるものである可能性が高く、このチャネルはカルシウム流入の際にＫｖ１．３の代わりになる。ＳｈＫ（Ｌ５）は、Ｔ１ＤＭおよびＲＡ患者からのＴＥＭ細胞によるインターロイキン２（ＩＬ２）およびインターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−ｇ）の産生を大いに抑制したが、これらの患者からのナイーブ／ＴＣＭ細胞によるＩＬ２およびＩＦＮ−ｇの産生はそれほど影響を受けなかった（図８Ｃ）。ＴＥＭ細胞およびナイーブ／ＴＣＭ細胞による腫瘍壊死因子−αおよびインターロイキン４の産生は、いずれもＳｈＫ（Ｌ５）に感受性が低かった（図８Ｃ）。
【００５６】
エフェクター記憶Ｔ細胞により引き起こされる遅延型過敏症（ＤＴＨ）のラットモデルの検証
図９に示すように、アジュバント中の卵アルブミン（ＯＶＡ）でラットを免疫した。７日後に片耳にＯＶＡを接種し、他方の耳に生理食塩水を接種した。遅延型過敏症（ＤＴＨ）の徴候として、２４時間後に耳の腫脹を測定した。図９に示したＦＡＣＳヒストグラムは、ＯＶＡを接種した耳のＴ細胞はＣＤ４５ＲＣ陰性記憶細胞であり、一方、同一ラットの血液および脾臓のＴ細胞は大部分がナイーブＴ細胞であることを示している。
【００５７】
エフェクター記憶Ｔ細胞により引き起こされる遅延型過敏症（ＤＴＨ）のラットモデルにおけるＳｈＫ（Ｌ５）の治療プロトコル
図１０に示すように、ナイーブ細胞のエフェクター記憶ＴＥＭ細胞への分化を妨げるため第０日から第７日まで（初回刺激段階）、もしくはＴＥＭ細胞の機能を妨げるため耳に卵アルブミンを接種した後のエフェクター段階で、皮下注射として１０μｇ／ｋｇ／日のＳｈＫ（Ｌ５）をラットに投与した。
【００５８】
ＳｈＫ（Ｌ５）はナイーブおよびセントラル記憶Ｔ細胞またはＢ細胞の機能を損なわずにラットｉｎ  ｖｉｖｏにおいてエフェクター記憶反応を特異的に抑制する
図１１に示すように、対照ラットは耳の腫脹、すなわち陽性ＤＴＨ反応を発現した。ＳｈＫ（Ｌ５）は、初回刺激段階で投与するとＤＴＨの抑制に効果がなかったことから、ナイーブおよびセントラル記憶Ｔ細胞のエフェクター記憶細胞への分化を抑制しなかったことを示している。ＳｈＫ（Ｌ５）は、エフェクター段階で投与するとＤＴＨを抑制したことから、エフェクター記憶Ｔ細胞が耳に達する能力を妨げたか、またはエフェクター記憶Ｔ細胞の活性化を抑制したかのうち少なくともいずれかであることを示している。ＳｈＫ（Ｌ５）投与ラットの耳のＴ細胞数は、賦形剤を投与したラットの耳と同じであったため、第一の可能性は除外された。エフェクター記憶Ｔ細胞はＫｖ１．３陰性であったが、賦形剤を投与した動物の耳の記憶Ｔ細胞はＫｖ１．３陽性であったため、ＳｈＫ（Ｌ５）は耳におけるエフェクター記憶Ｔ細胞の活性化を抑制したのである。上記動物ではＩｇＭおよびＩｇＧ  Ｂ細胞の反応も影響を受けなかった。
【００５９】
Ｔ１ＤＭまたはＭＳの患者および健康な対照者からの、ＧＡＤ６５／５５５−５６７、インスリン／９−２３およびミエリン抗原に特異的なＴ細胞におけるＫｖ１．３発現
図１２Ａは、新規発症１型糖尿病患者、健康な対照者および多発性硬化症患者に由来する抗原特異的Ｔ細胞からのＫｖ１．３電流（上）およびチャネル数／細胞（下）を示している。各データ点は、３回目の抗原刺激から４８時間後に測定した、単一ドナーからの２〜４のＴ細胞株に由来する細胞２０〜５０個についての平均値±ＳＥＭを示している。Ｔ１ＤＭ患者および対照者の血中にはインスリンおよびＧＡＤ６５に特異的なＴ細胞の頻度
が低いため、スプリットウェル法を用いて短期自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞株を作製することにより、上記母集団を増幅した。対照として、ＭＳには関係しているがＴ１ＤＭには関係のない無関連自己抗原であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的なＴ細胞株を作製した。３回目の抗原刺激後に、４ｐＦを超える膜電気容量を有する活性化細胞を用い、ホールセルパッチクランプ法によりＫｖ１．３電流を測定した（細胞直径１１μｍ以上）。代表的なＫｖ１．３電流およびＫｖ１．３チャネル数／Ｔ細胞を図１２Ａに示す。電流は、Ｋｖ１．３に特徴的な生物物理学的および薬理学的特性を示した。新規発症Ｔ１ＤＭ患者由来のインスリン（９〜２３）またはＧＡＤ６５（５５５〜５６７）特異的Ｔ細胞は、Ｋｖ１．３電流が大きく、Ｋｖ１．３チャネル数が多かったが、当該患者由来の疾患とは無関連なＭＢＰ特異的Ｔ細胞はＫｖ１．３ｌｏｗであった（ｐ＝０．００１）。比較のため、反対のパターンが観察されたＭＳ患者について本出願人が発表したＫｖ１．３データをプロットした。ＭＳ患者では、ＭＢＰまたはミエリン乏突起神経膠細胞の糖タンパク質（ペプチド３５〜５５）もしくはプロテオリピドタンパク質（ペプチド１３９〜１５１）に特異的なＴ細胞はＫｖ１．３ｈｉｇｈであったが、インスリンおよびＧＡＤ６５に特異的なＴ細胞はＫｖ１．３ｌｏｗであった（ｐ＝０．０００１）。健康対照者から単離した自己反応性Ｔ細胞は、特異性に関係なくＫｖ１．３ｌｏｗであった。ＭＳおよびＴ１ＤＭの両方を有する患者１例では、３つの自己抗原に特異的なＴ細胞がＫｖ１．３ｈｉｇｈであった。長期にわたるＴ１ＤＭを有する患者からのＧＡＤ６５特異的およびインスリン特異的Ｔ細胞がＫｖ１．３ｈｉｇｈであったことは、自己反応性ＴＥＭ細胞の持続性を反映しているが、非自己免疫性２型ＤＭ患者からのＧＡＤ６５およびインスリン特異的Ｔ細胞にはＫｖ１．３ｌｏｗパターンがみられた。図１２Ｂに、個々の細胞のＫｖ１．３の染色強度（上）および蛍光強度（下）を示す。本出願人は、Ｋｖ１．３の免疫染色によりパッチクランプ法のデータを確認した。Ｔ１ＤＭ患者からのインスリン特異的およびＧＡＤ６５特異的Ｔ細胞、ならびにＭＳ患者からのＭＢＰ特異的Ｔ細胞は明るく染色されたが、無関連自己抗原に特異的な細胞の染色はかすかであった。図１２ＣはＣＣＲ７発現を示している。フローサイトメトリーにより、Ｋｖ１．３ｈｉｇｈＴ細胞はＣＣＲ７−ＴＥＭ細胞であるが、Ｋｖ１．３ｌｏｗ細胞はＣＣＲ７＋ナイーブまたはＴＣＭ細胞であることが示された。図１２Ｄは、Ｔ１ＤＭおよびＭＳの両方を有する患者からと、それぞれ５年以上および２年以上のＴ１ＤＭまたは２型ＤＭを有する患者からの自己反応性Ｔ細胞における１細胞あたりのＫｖ１．３の数を示している。図１２Ｅは、新規発症Ｔ１ＤＭ患者からのＣＤ４＋ＧＡＤ６５四量体＋Ｔ細胞におけるＫｖ１．３数を示している。さらなる対照として、ＧＡＤ６５  ５５７Ｉペプチドを含有する蛍光性ＭＨＣクラスＩＩ四量体を使用して、新規発症Ｔ１ＤＭを有するＤＲ−０４０１陽性患者からＧＡＤ６５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。四量体で選別したＧＡＤ６５活性化Ｔ細胞は、Ｔ１ＤＭ患者からのＧＡ��６５特異的Ｔ細胞株に観察されたパターンと同じＫｖ１．３ｈｉｇｈパターンを示した。以上を要約すると、Ｔ１ＤＭおよびＭＳのいずれにおいても、疾患関連性の自己抗原活性化Ｔ細胞はＫｖ１．３ｈｉｇｈＣＣＲ７−ＴＥＭエフェクターであり、一方、当該患者における疾患無関連性の自己反応性細胞はＫｖ１．３ｌｏｗＣＣＲ７＋ナイーブ／ＴＣＭ細胞である。
【００６０】
関節リウマチおよび変形性関節症におけるＫｖ１．３発現
ＲＡでは、罹患関節からの疾患関連Ｔ細胞の単離が可能である。本出願人は、抗ＣＤ３抗体で刺激後４８時間の時点でＲＡ患者７例の滑液（ＳＦ）から採取したＴ細胞についてパッチクランプ法を行なった。図１３Ａにみられるように、対照として本出願人は、非自己免疫性の退行性変形性関節症（ＯＡ）患者７例からのＳＦ−Ｔ細胞（同一プロトコルで活性化した）を分析した。ＲＡ−ＳＦのＴ細胞はＫｖ１．３ｈｉｇｈであり、一方、ＯＡ−ＳＦのＴ細胞はＫｖ１．３ｌｏｗであった（ｐ＜０．０００１）。本出願人は、ＲＡ患者の末梢血（ＰＢ）からの抗ＣＤ３活性化Ｔ細胞にＫｖ１．３ｌｏｗパターンを見出した（ｐ＜０．０００１）が、これは血液中には自己反応性Ｋｖ１．３ｈｉｇｈＴＥＭ細胞がまれであるためである。Ｋｖ１．３およびその付属のＫｖβ２サブユニットの免疫染色に
より、パッチクランプ法のデータの確証を得た。図１３Ｂは、  Ｋｖ１．３（図では明灰色）および  Ｋｖβ２（図では暗灰色）染色の共焦点画像を示している。ＲＡ−ＳＦのＴ細胞はＫｖ１．３およびＫｖβ２の両方が明るく染色されたが、ＯＡ−ＳＦおよびＲＡ−ＰＢのＴ細胞は弱い染色を示した。図１３ＣはＣＣＲ７発現を示している。フローサイトメトリーにより、Ｋｖ１．３ｈｉｇｈＲＡ−ＳＦ  Ｔ細胞はＣＣＲ７−ＴＥＭ細胞であるが、Ｋｖ１．３ｌｏｗＯＡ−ＳＦおよびＲＡ−ＰＢ  Ｔ細胞はＣＣＲ７＋ナイーブ／ＴＣＭ細胞であることが検証された。図１３Ｄ（上）は、抗ＣＤ３抗体または抗Ｋｖ１．３抗体で染色し、ヘマトキリン／エオシンで対比染色したＲＡおよびＯＡ患者からの滑膜の顕微鏡写真を示している（４０倍）。さらなる試験として、ＲＡ患者５例およびＯＡ患者５例からのパラフィン包埋滑膜組織（ＳＴ）をＣＤ３、Ｋｖ１．３およびＣＣＲ７について免疫染色した。以前に示したとおり、本出願人の染色法は、ナイーブ／ＴＣＭ細胞ではＫｖ１．３チャネル数が少ないためにＫｖ１．３を検出しない。ＲＡ−ＳＴではＣＤ３＋Ｋｖ１．３＋ＣＣＲ７−ＴＥＭ細胞の優勢がみられたが、ＯＡ滑膜ではＣＤ３＋細胞がまばらであり、これらの細胞は主にＫｖ１．３−ＣＣＲ７＋ナイーブ／ＴＣＭ細胞であった。分類法により評価したＣＤ３＋、Ｋｖ１．３＋およびＣＣＲ７＋細胞による浸潤度を図Ｓ２Ａに示す。ＣＤ３＋炎症指数：ＲＡ＝３．２±０．１；ＯＡ＝１．１±０．２（ｐ＜０．０１）；Ｋｖ１．３＋炎症指数：ＲＡ＝２．８±０．３；ＯＡ＝０．６±０．３（ｐ＜０．０１）。以上のように、異なる３つの自己免疫疾患において、我々の結果は、疾患関連性自己反応性Ｔ細胞がＫｖ１．３ｈｉｇｈＣＣＲ７−ＴＥＭエフェクターであることで一致している。
【００６１】
本発明の一部の実施例および実施形態を参照しながら本明細書において本発明を説明してきたが、上記実施例および実施形態には、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の追加、削除、変更および修正を加えうることを理解されたい。たとえば、１つの実施形態または実施例の任意の要素もしくは属性は、実施形態または実施例がその意図した用途に対し不適切なものとならない限り、別の実施形態または実施例に組み込んでもよいし、別の実施形態または実施例とともに使用してもよい。また、方法または手順の工程が特定の順番で列記もしくは記述されている場合、当該工程の順番は、特に定めのない限り、または当該工程の順番の変更が本発明を特許性のないもの、もしくはその意図した用途に対し不適切なものとすることがない限り、変更してもよい。妥当な追加、削除、修正および変更はすべて、説明した実施例および実施形態と同等であるとみなすものとし、特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明のいくつかのＳｈＫ類似体の化学構造を示す図。
【図２Ａ】発表されているＮＭＲ構造に基づくＳｈＫの分子モデルを示す図。図中、チャネルの遮断に重要なＬｙｓ２２は灰色の影をつけて強調されている。Ａｅｅａリンカー（右）を介してＳｈＫのＡｒｇ１のαアミノ基（灰色の第２の影をつけて強調した）にＬ−ｐＴｙｒを接続した。該リンカーおよびＬ−ｐＴｙｒの構造をＨｙｐｅｒｃｈｅｍ（登録商標）のＡＭ１でモデル化した。
【図２Ｂ】安定にトランスフェクトした細胞におけるＫｖ１．３およびＫｖ１．１電流に対するＳｈＫ（上段）およびＳｈＫ（Ｌ５）（下段）の作用を示す図。
【図２Ｃ】ＳｈＫ（暗）およびＳｈＫ（Ｌ５）（明）によるＫｖ１．３（白記号）およびＫｖ１．１（黒記号）の用量依存的阻害を示す図。Ｋｖ１．３に対するＫｄは１０±１ｐＭ（ＳｈＫ）および６９±５ｐＭ（ＳｈＫ（Ｌ５））、Ｋｖ１．１に対するＫｄは２８±６ｐＭ（ＳｈＫ）および７．４±０．８ｎＭ（ＳｈＫ（Ｌ５））である。
【図２Ｄ】Ｋｖ１．３に対するＳｈＫ（Ｌ５）のウォッシュインおよびウォッシュアウトの時間経過を示す図。細胞を保持電位８０ｍＶで保持し、３０秒ごとに２００ミリ秒にわたって４０ｍＶまで脱分極した。
【図２Ｅ】ＳｈＫ類似体によるＫｖ１．３およびＫｖ１．１の阻害についてＫｄ値を示す図。ＳｈＫ−Ｆ６ＣＡおよびＳｈＫ−Ｄａｐ２２のＫｄ値は発表文献に基づくものである。
【図３Ａ】ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に対する抗体で染色したヒトＰＢＭＣのＣＤ３＋ゲート型母集団におけるフローサイトメトリーで測定したＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の染色強度を示すグラフ。
【図３Ｂ】ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に対する抗体で染色したヒトＴＥＭ細胞株の細胞のＣＤ３＋ゲート型母集団におけるフローサイトメトリーで測定したＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の染色強度を示すグラフ。
【図３Ｃ】抗ＣＤ３抗体で４８時間刺激したＰＢＭＣ（白記号、ナイーブ／ＴＣＭ細胞の混合物）およびＴＥＭ細胞（黒記号）による［３Ｈ］チミジン取込みの、ＳｈＫ（暗灰色）およびＳｈＫ（Ｌ５）（明灰色）による阻害作用を示すグラフ。
【図３Ｄ】ＫＣａ３．１の発現をアップレギュレートする、事前に活性化したヒトＰＢＭＣ（ナイーブ／ＴＣＭ細胞）は、抗ＣＤ３抗体で再活性化するとＳｈＫ（Ｌ５）阻害に対して抵抗性となることを示すグラフ。当該細胞は、ＫＣａ３．１に特異的な阻害薬であるＴＲＡＭ−３４に感受性となることがこれまでに報告されている。
【図４Ａ】フローサイトメトリーにより検出したラット脾臓Ｔ細胞（左）およびＰＡＳ  Ｔ細胞（右）のＣＤ４５ＲＣ染色を示すグラフ。
【図４Ｂ】静止期の（上段）およびミエリン抗原で活性化した（下段）ＰＡＳ  Ｔ細胞により示されるＫｖ１．３電流を示すグラフ。
【図４Ｃ】静止期の（上段）およびミエリン抗原で活性化した（下段）ＰＡＳ  Ｔ細胞におけるＳｈＫ‐Ｆ６ＣＡ染色のフローサイトメトリープロフィールを示すグラフ。ＳｈＫ‐Ｆ６ＣＡで染色されなかった細胞（黒線）および染色された細胞（明灰色に塗りつぶした領域）。未標識のＳｈＫ（Ｌ５）によるＳｈＫ‐Ｆ６ＣＡ染色の競合は、暗灰色に塗りつぶした領域で示されている。
【図４Ｄ】静止期の（上段）およびミエリン抗原で活性化した（下段）ＰＡＳ  Ｔ細胞におけるＫｖ１．３免疫染色の共焦点画像を示す図。マンホットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定を用いて統計解析を行なった。
【図４Ｅ】ＣｏｎＡ（１μｇ／ｍｌ）で活性化したラット（左）ナイーブ／ＴＣＭ細胞（白記号）およびＴＥＭ（黒記号）による［３Ｈ］チミジン取込みのＳｈＫ（暗線）およびＳｈＫ（Ｌ５）（明線）による用量依存的阻害を示す図。
【図４Ｆ】ＭＢＰによる刺激から７時間後のＰＡＳ  Ｔ細胞によるＩＬ２分泌のＳｈＫ（暗線）およびＳｈＫ（Ｌ５）（明線）による用量依存的阻害を示す図。
【図４Ｇ】ＰＡＳ  Ｔ細胞によるミエリン抗原誘発性［３Ｈ］チミジン取込みのＳｈＫ（Ｌ５）による阻害（白記号）は、２０μｇ／ｍｌのＩＬ２の添加により逆転する（黒記号）ことを示す図。
【図５Ａ】Ｌ９２９細胞で安定に発現されるＫｖ１．３チャネルについて測定したＳｈＫ（Ｌ５）のＫｖ１．３遮断活性を示すグラフ。
【図５Ｂ】ラット４匹に２００ｍｇ／ｋｇのＳｈＫ（Ｌ５）を単回皮下注射した後の種々の時点での血中ＳｈＫ（Ｌ５）濃度を示すグラフ。表記の時間に血液を採取し、パッチクランプ法により血清を試験してＳｈＫ（Ｌ５）の量を測定した。
【図５Ｃ】図５Ｂのデータを単一指数関数減衰にフィッティングしたグラフ。半減期は約５０分であることが示されている。
【図５Ｄ】１０μｇ／ｋｇ／日のＳｈＫ（Ｌ５）の単回皮下注射を５日間受けたＬｅｗｉｓラット５匹における血中ＳｈＫ（Ｌ５）濃度を示すグラフ。血液を毎朝（前回の注射から２４時間後に）採取し、パッチクランプ法によりＫｖ１．３チャネルに対する遮断活性について試験した。
【図５Ｅ】皮下投与（白棒；ｎ＝４）または静脈内投与（黒棒；ｎ＝４）のいずれかで１０ｍｇ／ｋｇのＳｈＫ（Ｌ５）を単回投与した後の種々の時点におけるラットの血清中ＳｈＫ（Ｌ５）濃度を示すグラフ。表記の時間に血液を採取し、パッチクランプ法により血清を試験して血中のＳｈＫ（Ｌ５）量を測定した。単回皮下注射からほぼ２４時間後には、ＳｈＫ（Ｌ５）は３００ｐＭの定常状態濃度を維持した。該濃度は、ＴＥＭ細胞の機能を選択的に阻害するのに十分な濃度である。
【図５Ｆ】ＳｈＫ（Ｌ５）の半遮断投与量をラット血漿または２％ラット血漿を含有するＰＢＳに添加し、種々の時間にわたって３７℃でインキュベートした後のＳｈＫ（Ｌ５）の回収率（％）を示すグラフ。表記の時間に等分量を採取し、Ｋｖ１．３チャネルに対する遮断活性を測定した。ＳｈＫ（Ｌ５）は血漿中できわめて安定である。
【図６Ａ】スコア化したＥＡＥの予防効果を示すグラフ。ＰＡＳ  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、洗浄し、第０日に腹腔内に注射した。ＥＡＥの臨床スコア：０＝臨床徴候なし、０．５＝尾遠位部のひきずり、１＝尾のひきずり、２＝軽度の両側不全麻痺または運動失調、３＝中等度の両側不全麻痺、４＝完全な後脚麻痺、５＝４＋失禁、６＝死亡。ラットを１群あたりｎ＝６とし、第０日から第５日まで、賦形剤単独（ｎ＝６）またはＳｈＫ（Ｌ５）（ｎ＝６；１０ｍｇ／ｋｇ／日）を皮下注射した。
【図６Ｂ】スコア化したＥＡＥの治療効果を示すグラフ。ＰＡＳ  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、洗浄し、第０日に腹腔内に注射した。ラットがＥＡＥの臨床徴候を発現したとき、１０ｍｇ／ｋｇ／日でＳｈＫ（Ｌ５）による治療を開始し、３日間継続した。
【図６Ｃ】卵アルブミンに対してラットに現れるＤＴＨ反応の指標としての耳の厚さを示すグラフ。ＳｈＫ（Ｌ５）１０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間にわたって動物（１群あたりｎ＝６）を治療し、その後、耳の腫脹を測定した。マンホットニーのＵ検定を用いて統計解析を行なった。
【図７Ａ】ＳｈＫ（Ｌ５）の構造を示す図、ならびにＴＥＭ細胞におけるＫｖ１．３チャネルの阻害をＳｈＫ（Ｌ５）濃度の関数として示したグラフ。各データ点は３つの測定値の平均を示す。
【図７Ｂ】Ｋｖ１．３を含むシグナル伝達複合体の概略図。
【図７Ｃ】ＩＳにおけるＣＤ４、Ｋｖ１．３、Ｋｖβ２、ＳＡＰ９７、ＺＩＰおよびｐ５６ｌｃｋの共局在性を示す図。
【図７Ｄ】明らかなＴＥＭ−ＡＰＣ接触がない状態におけるＣＤ４およびＫｖ１．３の染色を示す図。
【図７Ｅ】ＭＢＰを取り付けたＡＰＣに曝されたＧＡＤ６５特異的ＴＥＭ細胞におけるＣＤ４およびＫｖ１．３の染色を示す図。
【図７Ｆ】ＳｈＫ（Ｌ５）１００ｎＭはＩＳ形成を妨げないことを示す図。
【図７Ｇ】ＳｈＫ（Ｌ５）１００ｎＭはＩＳを崩壊させないことを示す図。
【図８Ａ】ＳｈＫ（Ｌ５）の不在下（黒）またはＳｈＫ（Ｌ５）０．１ｎＭ（暗灰色）、１ｎＭ（中灰色）もしくは１００ｎＭ（明灰色）の存在下で抗ＣＤ３抗体＋架橋結合二次抗体（矢印）により誘発された、Ｔ１ＤＭ患者３例からのＧＡＤ特異的ＴＥＭ細胞におけるカルシウムシグナル伝達を示すグラフ。
【図８Ｂ】Ｔ１ＤＭおよびＲＡを有する患者からのナイーブ／ＴＣＭ細胞およびＴＥＭ細胞（左）ならびにナイーブ／ＴＣＭエフェクターおよびＴＥＭエフェクター（右）による［３Ｈ］チミジン取込みを示すグラフ。ＴＥＭ細胞：Ｔ１ＤＭ患者３例からのＧＡＤ６５で活性化したＴＥＭクローンおよびＲＡ患者３例からの抗ＣＤ３抗体で活性化したＳＦ−ＴＥＭ細胞。ナイーブ／ＴＣＭ細胞：同一のＲＡ患者３例からの抗ＣＤ３抗体で活性化したＰＢ−ナイーブ／ＴＣＭ細胞。
【図８Ｃ】図８Ｂで用いたＴＥＭ細胞およびナイーブ／ＴＣＭ細胞によるサイトカイン産生を示す一連の棒グラフ。
【図８Ｄ】ＭＳ、Ｔ１ＤＭおよびＲＡにおける疾患関連性および疾患無関連性の自己反応性Ｔ細胞の表現型を示す図。
【図８Ｅ】ＳｈＫ（Ｌ５）がカルシウムシグナル伝達、リンパ球増殖およびサイトカイン産生を阻害し、ＩＳ形成を阻害しない様式を示す概略図。
【図９】エフェクター記憶Ｔ細胞により引き起こされる遅延型過敏症（ＤＴＨ）のラットモデルを表す概略図。
【図１０】エフェクター記憶Ｔ細胞により引き起こされる遅延型過敏症（ＤＴＨ）のラットモデルにおけるＳｈＫ（Ｌ５）の治療プロトコルを示す概略図。
【図１１】ナイーブおよびセントラル記憶Ｔ細胞またはＢ細胞の機能を損なわずに、ラットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＳｈＫ（Ｌ５）によりエフェクター記憶反応が特異的に抑制されることを表す概略図。
【図１２Ａ】新規発症１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）患者、健康な対照者および多発性硬化症患者からのＧＡＤ６５特異的、インスリン特異的およびミエリン特異的Ｔ細胞におけるＫｖ１．３電流（上段）およびチャネル数／細胞（下段）を示す図。
【図１２Ｂ】上記患者からの個々のＴ細胞のＫｖ１．３染色強度（上段）および蛍光強度（下段）を示す図。
【図１２Ｃ】相対的細胞数とＣＣＲ７染色強度を対比させたグラフ。高濃度のＫｖ１．３を発現している細胞は、ＣＣＲ７陰性、すなわちＴＥＭエフェクターである。低濃度のＫｖ１．３を発現している細胞は、ＣＣＲ７陽性、すなわちナイーブ細胞もしくはＴＣＭ細胞のいずれかである。
【図１２Ｄ】Ｔ１ＤＭおよびＭＳを有する患者（左）、罹患期間が５年を超えるＴ１ＤＭ患者（中）および非自己免疫性の２型ＤＭ患者からの自己反応性Ｔ細胞における１細胞あたりのＫｖ１．３の数を示す図。
【図１２Ｅ】新規発症Ｔ１ＤＭの患者からのＣＤ４＋ＧＡＤ６５四量体＋Ｔ細胞におけるＫｖ１．３の数を示す図。
【図１３Ａ】ＲＡ患者の末梢血Ｔ細胞および滑液Ｔ細胞ならびにＯＡ患者の滑液Ｔ細胞における細胞１個あたりのＫｖ１．３チャネルの数を示す図。
【図１３Ｂ】図１３Ａに示した細胞におけるＫｖ１．３染色（明灰色）およびＫｖβ２染色（暗灰色）の共焦点画像を示す図。
【図１３Ｃ】相対的細胞数とＣＣＲ７染色強度を対比させたグラフ。
【図１３Ｄ】抗ＣＤ３抗体または抗Ｋｖ１．３抗体で染色し、ヘマトキリン／エオシンで対比染色した、ＲＡおよびＯＡ患者からの滑膜の顕微鏡写真（上）（４０倍）ならびに炎症指数を示す棒グラフ（下）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【国際調査報告】
2008515917.tif 000057
2008515917.tif 000058