(57)【要約】  本発明は、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を測定するための基質としての、式Ｒ−（Ｘａａ）n−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｙ−Ｚ−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）m−Ｒ1（Ｉ）で示されるチオペプトリドの使用、およびＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、より詳しくは阻害剤を発現する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
R−(Xaa)n−Pro−X−Gly−S−Y−Z−Gly−(Xaa)m−R1      (Ｉ)
［式中、
Ｒは、Ｈ、またはＮ保護基であり、好ましくはカルボキシルの基であり、特にＣ1〜Ｃ5−アルキルの、とりわけＣ1〜Ｃ3−アルキルのものであり、特に好ましくはアセチル基であり、
Ｘａａは、任意のアミノ酸であり、
ｎ、ｍは、同一または異なって、０〜２４１５の整数であり、好ましくは０〜３５の整数、特に０〜１４の整数、とりわけ０〜１１の整数であり、格別に好ましくは０であり、
Ｘは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｌａであり、
Ｚは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｌａであり、
Ｒ1は、末端のアミド、カルボキシルまたはエステル基、好ましくはＣ1〜Ｃ5−アルキルの、特にＣ1〜Ｃ3−アルキルのものであり、とりわけエチルエステルであり、
Ｓ−Ｙは、式：
【化１】
2008543273.tif 000010
（式中、Ｒ2は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり、特に、
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、
−ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ2Ｈ5、
−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、
−ＣＨ（ＣＨ3）2、または
−ＣＨ3である）である］
で示されるチオペプトリドまたはその塩の、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの基質としての使用。
【請求項２】
Ｘは、ＬｅｕまたはＡｌａであり、Ｚは、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、Ｒ2は、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
（Ｘａａ）nおよび／または（Ｘａａ）mは、配列番号２に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
チオペプトリドは、以下の構造：
Ac−Pro−Leu−Gly−S−Y−Leu−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり、Ａｃはアセチル基である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
チオペプトリドは、以下の構造：
Ac−Pro−Leu−Gly−S−Y−Phe−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり、Ａｃはアセチル基である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
チオペプトリドは、以下の構造：
Ac−Pro−Ala−Gly−S−Y−Phe−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり、Ａｃはアセチル基である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
チオペプトリドは、以下の構造：
Ac−Pro−Ala−Gly−S−Y−Ala−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり、Ａｃはアセチル基である）
を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、４、５、１１および／または１３であり、好ましくはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ４、またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ５であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を測定するための、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼを精製するための、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列のファンクショナルクローニングのための、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を発見するための、または損傷した組織マトリックスに関連する病気、特に変形性関節症、リウマチ、がん、炎症、血管形成、細胞移動、血液凝固および／もしくは血液凝集、とりわけ変形性関節症、リウマチもしくはがんの、発病または進行を観察するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
方法が、以下：
（ａ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼと、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるチオペプトリド基質とをインキュベートすること、および
（ｂ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性計測または測定を行うこと、
の工程を含むことを特徴とする、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を定量する方法。
【請求項１２】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、４、５、１１および／または１３であり、好ましくはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ４、またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ５であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を、分光測光法によって計測または測定することを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼを、チオール基の検出試薬の存在下で、好ましくはヨードアセトアミド、特に５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、マレイミド、特にフルオレセイン−５−マレイミド、またはＮ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチン、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、もしくは特に４，４’−ジチオジピリジンもしくは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の存在下で、計測または測定することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を発現する方法であって、該方法が以下：
（ａ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼと、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるチオペプトリド基質とを、試験化合物の存在下でインキュベートすること、および
（ｂ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性に対する該試験化合物の影響を計測または測定すること、
を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１７】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、４、５、１１および／または１３であり、好ましくはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ４、またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ５であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を、分光測光法によって計測または測定することを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼを、チオール基の検出試薬の存在下で、好ましくはヨードアセトアミド、特に５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、マレイミド、特にフルオレセイン−５−マレイミド、またはＮ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチン、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、もしくは特に４，４’−ジチオジピリジンもしくは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の存在下で、計測または測定することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試験化合物が、化学物質ライブラリーの形態で利用可能にすることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
方法を、アレイ上で行うことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
方法を、ロボットによって行うことを特徴とする、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
方法を、マイクロフルイディック技術を用いて行うことを特徴とする、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
方法は、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を得るためのハイスループットスクリーニングであることを特徴とする、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
損傷した組織マトリックスに関連する病気、特に変形性関節症、リウマチ、がん、炎症、血管形成、細胞移動、血液凝固および／または血液凝集、特に変形性関節症、リウマチ、またはがんを治療するための医薬の製造方法であって、該方法が以下：
（ａ）請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法を行うこと、
（ｂ）工程（ａ）において適切であることが見出された試験物質を単離すること、および
（ｃ）工程（ｂ）で単離した試験物質を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたはアジュバントを用いて製剤化すること、
の工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項２７】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるチオペプトリド基質、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ、および必要に応じて１またはそれ以上の緩衝液を含むキット。
【請求項２８】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０であることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、４、５、１１および／または１３であり、好ましくはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ４、またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ５であることを特徴とする、請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
少なくとも１種のチオール基の検出試薬、好ましくはヨードアセトアミド、特に５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、マレイミド、特にフルオレセイン−５−マレイミド、またはＮ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチン、５−（ブロモメチル）フルオレセイン、もしくは特に４，４’−ジチオジピリジンもしくは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）をさらに含むことを特徴とする、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を測定するための基質としての、式Ｒ−（Ｘａａ）n−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｙ−Ｚ−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）m−Ｒ1（Ｉ）で示されるチオペプトリド（ｔｈｉｏｐｅｐｔｏｌｉｄｅ）の使用、およびＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特に阻害剤を発現する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨マトリックスが無傷であることは、動物や人の体のあらゆる関節が機能するための決定的な必要条件である。関節軟骨が損傷すると、骨関節症（変形性関節症）やリウマチのような関節炎の病気が引き起こされ、これらは、罹患した動物またはヒトにおいて機能不全を引き起こし、最終的に動かなくなることを特徴とする。
【０００３】
障害のあるマトリックスが分解することを特徴とするさらなる疾患の中に、多様な形態のがん、特に腫瘍の転移も含める必要がある。
【０００４】
以前から、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が軟骨中のアグリカンおよびコラーゲンの分解に関与することが知られている。このようなマトリックスメタロプロテアーゼとしては、たとえばマトリキシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）群が挙げられ、これはＭＭＰ−１、２等からＭＭＰ−１６までのあらゆる既知のＭＭＰを含む。さらなる群、すなわちＡＤＡＭ−ＴＳ−ファミリーのプロテアーゼ（Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．等（２００３），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５，９４〜１０３）も同様に、組織マトリックスの分解に決定的に関与しており、それにより軟骨マトリックスへの障害が引き起こされる。これらのプロテアーゼ、特にＡＤＡＭ−ＴＳ１、ＡＤＡＭ−ＴＳ４およびＡＤＡＭ−ＴＳ５（「アグリカナーゼ」とも称される）の活性は、骨関節症、リウマチおよびがんのような障害のあるマトリックスの分解を特徴とする疾患の原因である。ＡＤＡＭ−ＴＳは、特にプロテオグリカンを切断することができるが、その他のマトリックス成分、例えばヒアルロナンまたはコラーゲンも切断することができる。ＡＤＡＭ−ＴＳ１、４、５および１１、加えてＡＤＡＭ−ＴＳ１３のさらなる作用は、炎症性のプロセス、血管形成、細胞移動、および血液凝固または血液凝集において重要である（Ａｐｔｅ，Ｓ．Ｓ．（２００４），Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６，９８１〜９８５）。
【０００５】
それゆえに、罹患する危険性がある組織またはすでに罹患した組織（例えば軟骨組織または血液）の疾患に関与するプロテアーゼの酵素活性を検出し得ることは、一方で医薬研究の重要な仕事である。しかしながら、他方で、一種の、複数種の、または全ての関連プロテアーゼを阻害することができる医薬を開発することも特に重要である。
【０００６】
関与したプロテアーゼの酵素（タンパク質分解）活性は、関連プロテアーゼと、適切な高分子量のマトリックス成分（例えばプロテオグリカンまたはコラーゲン）とをインキュベートし、分解産物の形成を測定することによってインビトロで測定することができる。
【０００７】
ヘテロジニアスな分解産物、すなわち例えばコラーゲンフラグメントやタンパク質フラグメントを単離し定量するために、特異的な切断部位の抗体認識やマススペクトロメトリーによる検査のような必要な手法をきちんと作成する様々な方法が当業者において利用可能である。
【０００８】
これまで、例えば、天然アグリカンの球間ドメインにおける重要な構造要素を含む組換え型の基質を用いて、ＡＤＡＭ−ＴＳ４の活性を測定できると云われている。分子量７２ｋＤａの組換えアグリカンは、ＣＯＳ細胞で発現する。アグリカナーゼ活性の測定は、高分子量アグリカン分子の使用に加えて、さらなる精巧な工程を必要とし、例えば構造要素、すなわちＣＤ５のシグナル配列、Ｍ１モノクローナル抗体測定のためのＦＬＡＧエピトープ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、上記の組換え基質のためのｃＤＮＡ（そのベクターなどを含む）であり、ＥＰ０７８５２７４や、Ｈｏｅｒｂｅｒ，Ｃｈｒ．等（２０００）Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，５３３〜５４３でも詳細に記載されている。
【０００９】
また、アグリカン分子のより短いフラグメントの使用も記載されている。ＷＯ００／０５２５６では、これらのペプチドフラグメントは、２０〜４０個のアミノ酸のビルディングブロックからなる可能性があることが報告された。しかしながら、特に不利な点は、２０個未満のアミノ酸しか含まないペプチドは、アグリカナーゼで変換できないことである。これは、すでに確認できている（実験の章を参照）。
【００１０】
マトリキシンファミリーのプロテアーゼを測定するために、従来技術によれば、合成で容易に得ることができる低分子量の分子をプロテアーゼの基質として切断して、酵素（タンパク質分解）活性を測定することができ、ここにおいて、これらの基質の特定の性質のために、例えば切断により、通常は可視光または紫外線波長の範囲内の定量することができる光学的なシグナルが放出される。
【００１１】
よく知られた例としては、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−３−（２’，４’−ジニトロ−フェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオニル−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2（ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ），ハイデルベルグ，ドイツ）が挙げられ、これはＫｎｉｇｈｔ，Ｃ．Ｇ．等（１９９２）ＦＥＢＳ，２９６，２６３〜２６６に記載されており、特定のマトリックスメタロプロテイナーゼによって切断されるため、酵素活性を算出するのに用いることができる測定可能な蛍光シグナルを放出する。従って、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−３−（２’，４’−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３−ジアミノ−プロピオニル−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2を、プロテアーゼＭＭＰ−３およびＭＭＰ−８を用いて変換可能であるかを確認することができる（実験の章を参照）。また、このタイプのその他多くの基質を、ＭＭＰ−３、および、ＭＭＰ−８で変換することも可能である。
【００１２】
また、チオペプトリド類の物質由来のある種の基質は、コラゲナーゼ、および膜結合型のマトリックスメタロプロテイナーゼによって変換されることも記載されている（ＥＰ０１４９５９３およびＵＳ２００２／０１４２３６２を参照）。しかしながら、Ｎ末端からアグリカナーゼ切断部位までの１６個のアミノ酸にトランケーションされたペプチドのアグリカナーゼによる切断はもはや起こらなくなる。
【００１３】
また、いくつかの実験において、より短い鎖からなるペプチドの、たとえそれらが配列Ｇｌｕ−Ａｌａを含む場合でも、ＡＤＡＭ−ＴＳでは切断不可能であることも明らかにされた。それに対して、その他のプロテアーゼファミリーの一族の、例えばマトリキシンまたはカテプシンは、オリゴペプチドを切断できることが見出されている。
【００１４】
オリゴペプチドは化学合成で容易に入手できるため、このような実験においてオリゴペプチドを使用することが特に望ましい。オリゴペプチドのさらなる利点は、個々のペプチドビルディングブロックを化学修飾できることであり、例えば、ペプチドの切断を分光分析（例えば比色分析）によって直接的または間接的に追跡できるような発色基に連結させることもできる。
【００１５】
それに相当する手段で、阻害剤を添加する前に計測された関連プロテアーゼのタンパク質分解活性と、阻害剤を添加した後の活性とを比較することによって、酵素阻害剤または活性化剤の効果を容易に測定することも可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
それらの一例は、チオペプトリドの、Ｒ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｙ−Ｚ−Ｇｌｙ−Ｒ1（ＥＰ０１４９５９３）であり、これは脊椎動物のコラゲナーゼによって切断され、さらにアセチル−プロリル−ロイシル−グリシル−［２−メルカプト−４−メチル−ペンタノイル］−ロイシル−グリシル−エチルエステル（ＵＳ２００２／０１４２３６２）であり、これはある種のマトリキシンによって切断され、既知の方法（例えばＤＴＮＢとの反応）によって定量することができる遊離のＳＨ基を形成する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、式（Ｉ）のＲ−（Ｘａａ）n−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｓ−Ｙ−Ｚ−Ｇｌｙ−（Ｘａａ）m−Ｒ1で示されるチオペプトリドは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼによって、特にＡＤＡＭ−ＴＳ１、ＡＤＡＭ−ＴＳ４、ＡＤＡＭ−ＴＳ５、ＡＤＡＭ−ＴＳ１１および／またはＡＤＡＭ−ＴＳ１３、とりわけＡＤＡＭ−ＴＳ１、ＡＤＡＭ−ＴＳ４またはＡＤＡＭ−ＴＳ５によって切断されるため、遊離のＳＨ基を介して容易に検出することができることが今や見出された。これは、ＡＤＡＭ−ＴＳが、１６個未満のアミノ酸単位しか含まないペプチドでは切断できないという従来技術の報告からすれば、なおさら驚くべきことである。
【００１８】
従って本発明の一形態は、式：
R−(Xaa)n−Pro−X−Gly−S−Y−Z−Gly−(Xaa)m−R1      (Ｉ)
［式中、
Ｒは、Ｈ、またはＮ保護基であり、好ましくはカルボキシルの基であり、特にＣ1〜Ｃ5−アルキルの、とりわけＣ1〜Ｃ3−アルキルのものであり、特に好ましくはアセチル基であり、
Ｘａａは、任意の天然に存在するアミノ酸であり、
ｎ、ｍは、同一または異なって、０〜２４１５の整数、好ましくは０〜３５の整数、特に０〜１４の整数、とりわけ０〜１１の整数であり、格別好ましくは０であり、
Ｘは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｌａであり、
Ｚは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ａｌａであり、
Ｒ1は、末端のアミド、カルボキシルまたはエステル基、好ましくはＣ1〜Ｃ5−アルキルの、特にＣ1〜Ｃ3−アルキルのものであり、とりわけエチルエステルであり、
Ｓ−Ｙは、式
【化１】
2008543273.tif 000002
（式中、Ｒ2は、天然に存在するアミノ酸の側鎖であり、特に、
−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、
−ＣＨ（ＣＨ3）Ｃ2Ｈ5、
−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、
−ＣＨ（ＣＨ3）2、または
−ＣＨ3である）である］
で示されるチオペプトリドまたはその塩、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの基質としての使用に関する。
【００１９】
適切なＮ保護基は、通常、慣用のアミノ酸保護基のいずれのものであってよく、例えば、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）、Ｍｔｔ（４−メチルトリチル）、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、ｔＢｕ（ｔ−ブチル）、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｍｂｚｌ（４−メチルベンジル）、Ｂｏｍ（ベンジルオキシメチル）、２−クロロ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）またはＦｏｒ（ホルミル）が挙げられ、これらは、例えばベイケム配送サービス社（Ｂａｃｈｅｍ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ＧｍｂＨ，ヴァイル・アム・ライン）から得ることができる。
【００２０】
特に好ましい式（Ｉ）で示されるチオペプトリドは、
Ｘは、ＬｅｕまたはＡｌａであり、
Ｚは、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＰｈｅであり、そして
Ｒ2は、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であるものである。
【００２１】
その他の好ましい実施態様において、（Ｘａａ）nおよび／または（Ｘａａ）mは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に相当し、これはヒトアグリカンのアミノ酸配列を示す。
【００２２】
さらなる好ましいチオペプトリドは、以下の構造：
Ac−Pro−Leu−Gly−S−Y−Leu−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2であり、Ａｃは、一般的に、アセチル基である）、または、
Ac−Pro−Leu−Gly−S−Y−Phe−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である）、または、
Ac−Pro−Ala−Gly−S−Y−Phe−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である）、または、
Ac−Pro−Ala−Gly−S−Y−Ala−Gly−OC2H5
（式中、Ｒ2は、ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2である）
を有する。
【００２３】
本発明において、あらゆる既知のＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼが適切であり、例えばＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０である。好ましくは、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、４、５、１１および／または１３であり、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ１、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ４またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ５である。
【００２４】
本発明に係る使用は、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を測定するため、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼを精製するため、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列のファンクショナルクローニングのため、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を発現するため、または損傷した組織マトリックスに関連する病気、特に変形性関節症、リウマチ、がん、炎症、血管形成、細胞移動、血液凝固および／もしくは血液凝集、とりわけ変形性関節症、リウマチもしくはがんの、発病または進行を観察するために、特に適している。これら全ての方法において、例えばＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの酵素的精製の間に、またはＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼをコードする遺伝子を一般的に既知の発現ベクターにクローニングした後に、最終的にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を、本明細書で記載したチオペプトリドを用いて計測する。
【００２５】
それゆえに、本発明はまた、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性を定量する方法であって、本方法は次：
（ａ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼと、式Ｉで示される、または上記で詳述されたチオペプトリド基質とをインキュベートすること、および
（ｂ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性計測または測定を行うこと、
の工程を含む方法に関する。
【００２６】
適切で好ましいＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、上記で詳述されたＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼである。好ましくは、活性計測または測定は、分光測光法で行われる。
【００２７】
分光測光法による測定において、通常、検出試薬が用いられるが、この場合チオール基の検出試薬が用いられる。この点について有利であることが証明されているものは、４，４’−ジチオジピリジン、またはエルマン試薬としても知られている特に５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）である。けれども、その他のあらゆる適切なチオール反応性試薬も使用可能であり、ヨードアセトアミド、例えば５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（５−ＩＡＦ）、マレイミド、例えばフルオレセイン−５−マレイミド、またはその他のチオール−反応性試薬、例えばＮ，Ｎ’−ジダンシル−Ｌ−シスチンもしくは５−（ブロモメチル）フルオレセインなどである。これらのタイプの試薬は、例えばインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ，カールスルーエ）から入手することができる。
【００２８】
前記チオペプトリドを用いて、適切な分析系で、特に簡単にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子を発現することが可能である。調節因子は、本発明によれば、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ活性化剤及び特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を意味する。
【００２９】
それゆえに、本発明のさらなる形態は、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤を発現する方法であって、該方法が以下：
（ａ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼと、式Ｉで示される、または上記で詳述されるチオペプトリド基質とを、試験化合物の存在下でインキュベートすること、および
（ｂ）ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの活性に対する該試験化合物の影響を計測または測定すること、
の工程を含む、上記方法に関する。
【００３０】
適切で好ましいＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼは、上記で詳述されたＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼである。好ましくは、活性計測または測定は、上記で詳述されているように分光測光法で行われる。その結果、上述の化合物はチオール基の検出試薬として適切であり、特に４，４’−ジチオジピリジンまたは５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）が適切である。
【００３１】
試験化合物は、化学的な、生化学的に、天然に存在するまたは合成の、高または低分子量の、考えられるあらゆる化合物が可能である。試験化合物は、化学物質ライブラリーの形態で利用可能にするのが特に有利であり、このようなライブラリーから、本発明の方法を用いて、望ましい化合物、例えば試験されるＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼの阻害剤を発現することができる。
【００３２】
さらなる好ましい実施態様において、本発明の方法は、所望の化合物の発現および単離を特に容易にするアレイ上で行われる。同様に、本発明の方法を実施するためにロボットを使用することによって、さらに便利になり、かつスループット性が向上するため、特に有利である。必要に応じて小型のプレートの凹所（「ウェル」）と組み合せたマイクロフルイディック技術を用いて、分析系を小型化し、さらに自動化することも可能であり、その結果これは特に有利である。本方法は、一般的に、ＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ調節因子、特にＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼ阻害剤に関するハイスループットスクリーニングで用いられる。
【００３３】
本発明の方法に基づく本発明のその他の形態は、医薬の製造であって、これは以下：
（ａ）上述のＡＤＡＭ−ＴＳ調節因子、特に阻害剤を発現するための方法を行うこと、
（ｂ）工程（ａ）において適切であることが見出された試験物質を単離すること、および
（ｃ）工程（ｂ）で単離した試験物質を、１種またはそれ以上の製薬上許容できるキャリアーまたはアジュバントを用いて製剤化すること、
の工程を含む、上記製造に関する。
【００３４】
本発明の方法を用いて見出された医薬的に活性な化合物、好ましくは阻害剤は、損傷した組織マトリックスに関連する疾患、特に変形性関節症、リウマチ、がん、炎症、血管形成、細胞移動、血液凝固および／または血液凝集、とりわけ変形性関節症、リウマチまたはがんを治療するのに特に適している。
【００３５】
製薬上許容できるキャリアーまたはアジュバントとしては、医薬製剤に一般的に用いられるあらゆる既知の物質が適切である。
【００３６】
キャリアーまたはアジュバントの例としては、投与様式に応じて、塩化ナトリウム溶液、具体的には生理食塩液（０.９％濃度の塩化ナトリウム溶液）、脱塩水、安定剤、例えばプロテアーゼ阻害剤もしくはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸もしくはペプスタチンＡ、またはマスキング剤、例えばＥＤＴＡ、ゲル調合物、例えば白色ワセリン、低粘度パラフィンおよび／もしくは黄蝋が挙げられる。
【００３７】
さらなる適切な添加剤は、例えば洗浄剤、例えばトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）またはデオキシコール酸ナトリウムであり、さらにポリオール、例えばポリエチレングリコールもしくはグリセロール、糖類、例えばスクロースもしくはグルコース、両性イオン性化合物、例えばアミノ酸、例えばグリシン、もしくは特に、タウリンもしくはベタイン、および／またはタンパク質、例えばウシ血清アルブミンもしくはヒト血清アルブミンも挙げられる。特に好ましくは、洗浄剤、ポリオール、および／または両性イオン性化合物である。
【００３８】
好ましくは、生理学的な緩衝溶液は、約６.０〜８.０のｐＨを有し、特に約６.８〜７.８のｐＨを有し、とりわけ約７.４のｐＨを有し、および／または約２００〜４００ミリオスモル／リットルの容量オスモル濃度、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルの容量オスモル濃度を有する。医薬のｐＨは、一般的に、適切な有機または無機緩衝液、例えば好ましくはリン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシ−エチル）ピペラジノ］メタンスルホン酸）またはＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）を用いて調整される。一般的に、適切な緩衝液の選択は、所望の緩衝液のモル濃度に応じてなされる。注射および注入用の溶液としては、例えばリン酸緩衝液が適切である。
【００３９】
本発明のさらなる形態はキットであり、本キットは、式Ｉで示される、または上記で詳述された本発明のチオペプトリド基質、および上述のようなＡＤＡＭ−ＴＳプロテアーゼに基づき、必要に応じて、１またはそれ以上の緩衝液、例えばＴＮＣＢ緩衝液を含む（実施例を参照）。緩衝液は、安定化するか、または本発明の方法を行うための反応媒質としての機能を果す。好ましくは、本キットは、チオール基の検出試薬をさらに含み、例えば少なくとも１種の上述の検出試薬、特に４，４’−ジチオジピリジンおよび／または５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）をさらに含む。本キットのさらなる構成要素は、本発明の方法、特に活性分析を行うための使用に関する説明書であってもよい。
【００４０】
以下の記述と実施例は、本発明を詳細に説明することを目的とし、本発明をそれらに制限するためではない：
配列表
配列番号１は、式（Ｉ）で示されるチオペプトリドに相当する。
配列番号２は、アグリカンのコアタンパク質前駆体（軟骨−特異的なプロテオグリカンのコアタンパク質、ＣＳＰＣＰまたはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質１）のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００４１】
実施例１（比較例）
分析条件
ヒト組換えＭＭＰ−３およびＭＭＰ−８タンパク質、ＭＭＰ−３ｃｄおよびＭＭＰ−８ｃｄの触媒ドメインを、例えばバイオモル・インターナショナルＬ．Ｐ．（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌ．Ｐ．，ペンシルベニア州，米国）から購入した（それぞれカタログ番号ＳＥ−１０９およびＳＥ−２５５）。同様に、ＡＤＡＭ−ＴＳ１およびＡＤＡＭ−ＴＳ４プロテアーゼのトランケーションされた形態も、例えばインヴィテック・バイオテクノロジー＆バイオデザイン社（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆuｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ＆Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｍｂＨ，ベルリン，ドイツ）から購入することができた（それぞれカタログ番号３０４００４０２および３０４００１０２）。
【００４２】
緩衝液および溶液の調製
ＴＮＣＢ緩衝液：
１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＨＣｌでｐＨ７.５に調整）
１００ｍＭのＮａＣｌ
１０ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ
０.０１５％のＢｒｉｊ３５。
【００４３】
基質溶液:
ＤＭＳＯ中１０ｍＭの基質（表を参照）。
使用直前に、基質ストック溶液（２μＬ）を、Ｈ2Ｏ（１３０μＬ）で希釈した。
【００４４】
酵素溶液：
ＭＭＰ−３ｃｄ（２.３μｇ／ｍＬ）、ＭＭＰ−８ｃｄ（０.６μｇ／ｍＬ）、ＡＤＡＭ−ＴＳ−１（２.３μｇ／ｍＬ）およびＡＤＡＭ−ＴＳ−４（３.３μｇ／ｍＬ）を、ＴＮＣＢ緩衝液で希釈した。
【００４５】
分析手順
酵素溶液（１０μＬ）をＨ2Ｏ（１０μＬ）と混合し、基質溶液（１０μＬ）を添加することによって反応を開始させた。
【００４６】
蛍光分析
テカン（ＴＥＣＡＮ）のスペクトラフルオロ・プラス（Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ）蛍光装置で蛍光の励起／発光を測定した（表を参照）。これは、それぞれの場合ごとに５分間の蛍光測定を必要とした。
【００４７】
【表１】
2008543273.tif 000003
【００４８】
予想通りに、かつ最先端の技術に従っても、ＡＤＡＭ−ＴＳはＭＭＰ基質を変換しなかった。
【００４９】
実施例２
緩衝液および溶液の調製
ＴＮＣＢ緩衝液（実施例１を参照）
酵素溶液：
ＡＤＡＭ−ＴＳ（インヴィテック・バイオテクノロジー＆バイオデザイン社，ベルリン，ドイツ）
ＡＤＡＭ−ＴＳ−１（５μｇ）を２２００μＬで希釈し、ＡＤＡＭ−ＴＳ−４（５μｇ）を、ＴＮＣＢ緩衝液（６００μｌ）で希釈した。
【００５０】
基質溶液
１）ＤＴＮＢ溶液（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）：
ＤＭＳＯ中の４０ｍＭのストック溶液を調製した：
その後、ＤＴＮＢストック溶液（２７.５μＬ）を、水（５２２μＬ）で希釈した。
２）チオペプトリド溶液：（ベイケム配送サービス社，ヴァイル・アム・ライン，ドイツ）：
ＤＭＳＯ中の１００ｍＭのストック溶液を調製した。使用するために、チオペプトリドストック溶液（５５μＬ）をＴＮＣＢ緩衝液（５００μＬ）で希釈した。使用直前に、ＤＴＮＢ（５５０μｌ）を、チオペプトリド（５５０μｌ）と混合した。
【００５１】
分析手順
測定は、９６−マルチウェルプレート（プレートの半分の領域、平底、透明、ポリスチレン製、番号３６９５）（コーニング・コースター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ，アクトン，米国））で行われた。
酵素溶液（１０μＬ）とＨ2Ｏ（１０μＬ）を混合し、基質溶液（１０μＬ）を添加することによって反応を開始させた。
【００５２】
比色分析
マイクロタイタープレート光度計：モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，サニーベール，米国）のスペクトラマックス１９０（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０）。４１５ｎｍの波長で５分間、吸収を観察した。
【００５３】
【表２】
2008543273.tif 000004
【００５４】
【表３】
2008543273.tif 000005
【００５５】
化合物１の構造式
【化２】
2008543273.tif 000006
【００５６】
化合物２の構造式（比較例）
【化３】
2008543273.tif 000007
【００５７】
化合物２は、ＡＤＡＭ−ＴＳで変換されなかった。しかしながら、驚くべきことに、化合物１は、ＡＤＡＭ−ＴＳで変換された。
【００５８】
【化４】
2008543273.tif 000008
【００５９】
【化５】
2008543273.tif 000009
【配列表】
2008543273000001.app
【国際調査報告】
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