(57)【要約】  組換えタンパク質（例えば、抗体）の発現を増強し、そして／あるいは誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副産物を減少または除去するように改変された核酸分子が開示される。本発明はまた、組換えタンパク質発現に適切な細胞培養条件下での、宿主細胞におけるそのようなベクターの使用によって、誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー副産物を含まないタンパク質を産生する方法を提供する。
2008515438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ゲノム配列と比較して少なくとも１つのイントロン配列が欠失されて、誤スプライシングまたはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副産物が減少される、１つ以上のイントロンおよびエキソン配列を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
天然ゲノム配列と比較して少なくとも１つのイントロン配列が欠失されて、タンパク質発現が増強される、１つ以上のイントロンおよびエキソン配列を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３】
少なくとも３つのイントロン配列が欠失される、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
ヌクレオチド配列が抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードする、請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸分子。
【請求項５】
抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントが、ヒト免疫グロブリンＧサブタイプのＨ鎖可変領域、ヒンジ領域、第１定常領域（ＣＨ１）、第２定常領域（ＣＨ２）および第３定常領域（ＣＨ３）を含む、請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】
免疫グロブリンＧサブタイプがヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４である、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４が変異している、請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】
免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ２領域とＣＨ３領域との間のイントロンが欠失される、請求項５記載の核酸分子。
【請求項９】
ＣＨ１領域とヒンジ領域との間のイントロンの欠失をさらに含む、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１０】
ヒンジ領域とＣＨ２領域との間のイントロンの欠失をさらに含む、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１１】
Ｈ鎖可変領域とＣＨ１領域との間の１つのイントロンを含むＨ鎖を有する、請求項５記載の核酸分子。
【請求項１２】
Ｈ鎖ヒンジ領域ならびに第１、第２および第３定常領域をコードするヌクレオチド配列が、図８に示すヌクレオチド配列（配列番号１）と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項１３】
Ｈ鎖ヒンジ領域ならびに第１、第２および第３定常領域をコードするヌクレオチド配列が、図９に示すヌクレオチド配列（配列番号３）と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項５記載の核酸分子。
【請求項１４】
ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンの欠失が、図８に示すヒトＩｇＧ１（配列番号１）のおよそヌクレオチド１４０９〜１５０５に対応する、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１５】
ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンの欠失が、図９に示すヒトＩｇＧ４（配列番号３）のおよそヌクレオチド１４０１〜１４９７に対応する、請求項８記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロンの欠失が、図８に示すヒトＩｇＧ１（配列番号１）のおよそヌクレオチド５２５〜９１５に対応する、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１７】
ＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロンの欠失が、図９に示すヒトＩｇＧ４（配列番号３）のおよそヌクレオチド５２５〜９１６に対応する、請求項９記載の核酸分子。
【請求項１８】
ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロンの欠失が、図８に示すヒトＩｇＧ１（配列番号１）のおよそヌクレオチド９６１〜１０７８に対応する、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項１９】
ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロンの欠失が、図９に示すヒトＩｇＧ４（配列番号３）のおよそヌクレオチド９５３〜１０７０に対応する、請求項１０記載の核酸分子。
【請求項２０】
ヒトＩｇＧ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ヌクレオチド配列が図１０に示す配列（配列番号５）と少なくとも９０％同一である、核酸分子。
【請求項２１】
ヒトＩｇＧ４をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ヌクレオチド配列が図１１に示す配列（配列番号６）と少なくとも９０％同一である、核酸分子。
【請求項２２】
ヒトＨ鎖定常領域またはその変異形態をコードするゲノムヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が天然ゲノム配列に存在する少なくとも１つのイントロンを欠いており、イントロンがイントロンリードスルーを促進する、ゲノムヌクレオチド配列。
【請求項２３】
ヒトＩｇＧ１またはその変異体をコードするゲノムヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が天然のゲノム配列に存在する少なくとも１つのイントロンを欠いており、イントロンがイントロンリードスルーを促進する、ゲノムヌクレオチド配列。
【請求項２４】
少なくとも１つのイントロンが定常領域のＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンである、請求項２２または２３記載のヌクレオチド配列。
【請求項２５】
天然ゲノム配列に存在する３つのイントロンを欠く、ヒトＩｇＧ４またはその変異形態をコードするゲノムヌクレオチド配列。
【請求項２６】
イントロンがＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンである、請求項２５記載のヌクレオチド配列。
【請求項２７】
以下の式によって示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−ＣＨ３、
ここで、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列であり；そして
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３は、Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンである。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリンＧ  Ｈ鎖をコードする、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項２９】
以下の式によって示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３、
ここで、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列であり；そして
Ｉｎｔ１は、Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンである。
【請求項３０】
ヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリンＧ  Ｈ鎖をコードする、請求項２９記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項５記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項３２】
請求項５記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項３３】
宿主細胞における複製、選択、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質発現またはタンパク質分泌を増強する１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３２記載の発現ベクター。
【請求項３４】
請求項５記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３１記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３２記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３７】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３６記載の宿主細胞。
【請求項３８】
以下の工程を包含する、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）産物を実質的に含まない組換え抗体またはそのフラグメントの発現方法：
哺乳動物宿主細胞中に請求項５記載の核酸分子を導入する工程；
組換え抗体またはそのフラグメントの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それにより宿主細胞の培養物を産生する工程；および
組換え抗体またはそのフラグメントを、宿主細胞の培養物から得る工程。
【請求項３９】
宿主細胞由来の核酸サンプルにおけるＩＲＴ産物を同定する工程をさらに包含する、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
同定する工程が以下を含む、請求項３９記載の方法：
宿主細胞の培養物から核酸サンプルを得ること；
核酸サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと、核酸サンプルとプローブとの間のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させること；および
生じる複合体を検出すること、ここでイントロン配列に相補的な核酸プローブを使用した複合体のサンプルにおける検出がＩＲＴ産物の存在を示す。
【請求項４１】
宿主細胞がＬ鎖可変領域および定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
以下の工程を包含する、組換え抗体またはそのフラグメントの発現を増強する方法：
哺乳動物宿主細胞中に請求項５記載の核酸分子を導入する工程；
組換え抗体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それにより宿主細胞の培養物を産生する工程；および
組換え抗体を宿主細胞の培養物から得る工程。
【請求項４３】
宿主細胞がＬ鎖可変領域および定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
Ｈ鎖およびＬ鎖が発現されるような条件下で、請求項５記載の核酸分子および抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含む哺乳動物宿主細胞を培養する工程を包含する、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副産物を実質的に含まない組換え抗体またはそのフラグメントの産生方法。
【請求項４５】
培養物からＨ鎖およびＬ鎖を精製する工程をさらに包含する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
Ｈ鎖およびＬ鎖が発現されるような条件下で、請求項５記載の核酸分子および抗体Ｌ鎖をコードする核酸を含む哺乳動物宿主細胞を培養する工程を包含する、組換え抗体またはそのフラグメントの発現の増強方法。
【請求項４７】
培養物からＨ鎖およびＬ鎖を精製する工程をさらに包含する、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
以下の工程を包含する、サンプルにおけるＩＲＴ産物の検出方法：
組換え細胞から核酸サンプルを得る工程；
核酸サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと、核酸サンプルおよびプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させる工程；および
生じる複合体を検出する方法、ここでイントロン配列に相補的な核酸プローブを使用した、複合体のサンプルにおける検出がＩＲＴ産物の存在を示す。
【請求項４９】
抗体またはそのフラグメントの発現および組立てを可能にする適切な条件下で、請求項３８または４０記載の工程を包含する方法によって作製される、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたはインビトロ生成抗体である、請求項４９記載の抗体。
【請求項５１】
ヒト化抗体である、請求項５０記載の抗体。
【請求項５２】
ヒト５Ｔ４に結合する、請求項５１記載の抗体。
【請求項５３】
請求項４９記載の抗体、および医薬上許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２００４年１０月５日に出願された米国特許出願第６０／６１６，４７４号に対して優先権を主張し、その特許の全ての内容を出典明示で援用する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えタンパク質産生用発現ベクターは、少なくとも１９８０年代半ばから存在している。代表的には、タンパク質調製物の絶対的な純度が重要ではない基礎研究においておよび小規模な実験のためには、組換えタンパク質発現のためのベクターに基づくストラテジーが広く用いられている。対照的に、治療適用のために組換えタンパク質を使用する場合、少量の混入物、例えば誤スプライシング（ｍｉｓ−ｓｐｌｉｃｅｄ）またはイントロンリードスルー（ｉｎｔｒｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）副産物の存在でさえ、生じる治療タンパク質の活性および収量を減少させ得る。誤スプライシングまたはリードスルータンパク質配列を有する治療タンパク質の患者への投与は、所望されない副作用の可能性を増加させ得る。
【０００３】
そのような副産物はまた、製造工業にとっても問題になる。副産物の存在は、精製プロセスを悪化させ得る。なぜならそのような副産物は代表的には、大きさ、親和性または生物活性に関して所望のタンパク質と類似しているからである。さらに、組換え宿主細胞を使用した、タンパク質発現のスケールアップは、代表的には、特に細胞を至適を下回る細胞培養条件下で培養した場合、所望の産物と比較して、副産物の量を増加させる。そのような至適を下回る細胞培養条件は、例えばバイオファーメンター（ｂｉｏｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）操作の終り、またはその他の理由により大規模培養の状態が悪化した場合に、大規模のタンパク質産生において頻繁に生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、組換えタンパク質産生、特に治療タンパク質の大規模産生を改善する方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、組換えタンパク質またはペプチドの発現および／または産生を改善するための方法および組成物を提供する。１つの実施態様において、改変されて、誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー副産物が減少または除去され、そして／あるいは組換えタンパク質発現が増強された核酸分子が提供される。特定の実施態様において、核酸は組換え抗体（本明細書において、免疫グロブリンともいう）またはそのフラグメントをコードする。本発明はさらに、改変されて、誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー副産物が減少または除去され、そして／あるいは組換えタンパク質発現が増強されたベクター（例えば、発現ベクター）；そのような核酸分子およびベクターを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）；ならびにそのような細胞を培養して、組換えタンパク質またはペプチドを産生する（例えば、大規模に）方法を含む。誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー産物を実質的に含まない組換えタンパク質またはペプチド（例えば、抗体）の組成物（例えば、医薬組成物））もまた開示される。これら組成物は、例えば神経変性障害および悪性障害の処置を含む、治療用途に適切である。
【０００６】
従って、１つの態様において、本発明は、１つ以上のイントロンおよびエキソン配列を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子（例えば、改変または組換え核酸分子）を特徴とする。ここで、少なくとも１つのイントロン配列が天然配列に比較して改変されて、タンパク質発現が増強され、そして／あるいは誤スプライシングまたはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副産物が減少または除去される。１つの実施態様において、核酸分子は、天然配列（例えば、ゲノム配列）と比較して所望のタンパク質またはペプチド、例えば抗体またはそのフラグメント（例えば、免疫グロブリンＨ鎖）の発現の増強を指令し、そして／あるいはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副産物を減少または除去する。タンパク質またはペプチドは、哺乳動物起源、例えばヒトまたはマウス、代表的にはヒト起源であり得る。本明細書に記載する核酸分子は、天然配列からの改変形態をいうと理解される。いくつかの実施態様において、核酸分子は単離または精製されている。他の実施態様において、核酸分子は組換え分子である。
【０００７】
１つの実施態様において、核酸分子は、天然配列（例えば、ゲノム配列）に比較して、少なくとも１つ、２つ、３つのイントロンまたは１つを除いた全てまでのイントロンを欠失している。例えば、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）を促進するイントロンが、天然配列から欠失され得る。他の実施態様において、核酸分子は下記の１つ以上によって改変され、その結果、タンパク質発現の増強、および／または誤スプライシングもしくはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）副産物の減少もしくは除去が生じる：イントロン／エキソン配置の再配列（例えば、イントロン／エキソンの５’から３’への順序）；１つ以上のイントロンの部分の欠失；または、イントロンもしくはその部分の異種イントロン配列での置換。
【０００８】
関連する実施態様において、核酸分子は抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトゲノム配列）を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、免疫グロブリンサブタイプ、例えば免疫グロブリンＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体サブタイプ）のＨ鎖可変領域、ヒンジ領域ならびに第１、第２および第３定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）をコードする１つ以上のヌクレオチド（例えば、エキソン）配列を含む。代表的には、免疫グロブリンサブタイプは、哺乳動物起源（例えば、マウスまたはヒト）由来である。１つの実施態様において、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４、またはそれらの変異型が選択される。例えば、免疫グロブリンの定常領域が変異されて、以下の１つ以上を生じ得る：安定性の向上、エフェクター機能の低下、または補体固定の低下。１つの実施態様において、ヒトＩｇＧ４が変異されて、安定性が向上する。例えば、残基２４１におけるセリンからプロリンへの置換を有して、ヒンジ領域の安定性が向上する。他の実施態様において、定常領域が変異されて、グリコシル化が減少する。
【０００９】
１つの実施態様において、核酸分子は、配列のイントロンリードスルーを促進する少なくとも１つのイントロンが欠失されるように改変される。例えば、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンが欠失され得る。独立してまたは組み合わせて欠失され得る他の免疫グロブリンＨ鎖イントロンの例は、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＨ鎖可変領域とＣＨ１との間のイントロン、ＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、およびヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロンを含む。前記のイントロンの２つ、３つのイントロン、または１つを除く全てまでのイントロンの組み合わせを含む、前記のイントロンの任意の組み合わせも欠失され得る。いくつかの実施態様において、Ｈ鎖定常領域の３つのイントロン、例えばＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンが欠失される。以下の例示的な免疫グロブリンＨ鎖のイントロン欠失の組み合わせも、本発明の範囲内である：免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン；ＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン；ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン。
【００１０】
いくつかの実施態様において、核酸分子は以下の式によって示されるヌクレオチド配列を含む：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−Ｉｎｔ４−ＣＨ３、
ここで、ＶＨは、Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然、または変異形態）であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然または変異形態）であり；そして
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンである。１つの実施態様において、ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン（本明細書においてＩｎｔ４と表す）が欠失される。他の実施態様において、ＣＨ１とヒンジ領域との間、ヒンジ領域とＣＨ２との間、および／またはＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン（本明細書においてＩｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４と表す）の１つ、２つまたは代表的には３つが欠失される。Ｈ鎖ゲノム配列のイントロン／エキソン配列のさらなる模式図を、図１、図５および図７に示す。
【００１１】
代表的には、核酸分子中には少なくとも１つのイントロン、例えばＨ鎖可変領域とＣＨ１との間のイントロン（本明細書においてＩｎｔ１と表す）が存在する。独立してまたは組み合わせて存在し得る他の免疫グロブリンＨ鎖イントロンの例は、免疫グロブリンＨ鎖定常領域のＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン；ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン；および、ＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンを含む。改変核酸分子中に、少なくとも１つのイントロンを含めることが、しばしば所望される。理論によって拘束されるわけではないが、イントロンは転写速度、ポリアデニル化、ｍＲＮＡ輸送、翻訳効率およびｍＲＮＡ分解を含むタンパク質産生プロセスにおけるいくつかの事象に影響を及ぼすと信じられている。
【００１２】
１つの実施態様において、核酸分子は以下の式によって示されるヌクレオチド配列を含む：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｉｎｔ２−Ｈｉｎｇｅ−Ｉｎｔ３−ＣＨ２−ＣＨ３、
ここで、ＶＨはＨ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然または変異形態）であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然または変異形態）であり；そして
Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２およびＩｎｔ３は、Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンである。１つの実施態様において、ヌクレオチド配列は、本質的に上記構成成分からなる（例えば、構造または機能を変化させる介在配列なしに）。
【００１３】
他の実施態様において、核酸分子は以下の式によって示されるヌクレオチド配列を含む：
ＶＨ−Ｉｎｔ１−ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３、
ここで、ＶＨは、Ｈ鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であり；
ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３は、対応するＨ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然または変異形態）であり；
Ｈｉｎｇｅは、Ｈ鎖定常領域のヒンジ領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４  Ｈ鎖遺伝子の天然または変異形態）であり；そして
Ｉｎｔ１は、Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンである。１つの実施態様において、ヌクレオチド配列は本質的に上記構成成分からなる（例えば、構造または機能を変化させる介在配列なしに）。
【００１４】
ヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を図８に示す（それぞれ配列番号１および２）。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれ図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド２３１〜５２４、９１６〜９６０、１０７９〜１４０８および１５０６〜１８２９に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれ図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド１〜２３０、およそヌクレオチド５２５〜９１５、およそヌクレオチド９６１〜１０７８およびおよそヌクレオチド１４０９〜１５０５に位置するヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンに対応する。
【００１５】
変異ヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を、図９に示す（それぞれ配列番号３および４）。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれ図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド２３１〜５２４、９１６〜９５２、１０７１〜１４００、および１４９８〜１８２０に位置する。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれ図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド１〜２３０、およそヌクレオチド５２５〜９１６、およそヌクレオチド９５３〜１０７０、およびおよそヌクレオチド１４０１〜１４９７に位置するヒトＩｇＧ４  Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンに対応する。
【００１６】
本発明の改変核酸分子の例は、図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド１４０９〜１５０５に対応するヒトＩｇＧ１の、または図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド１４０１〜１４９７に対応する変異ヒトＩｇＧ４のＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンの欠失を有するヒトゲノムＨ鎖定常領域配列を含む。独立してまたは組み合わせて欠失され得る他のＨ鎖免疫グロブリンイントロンの例は、図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド１〜２３０に対応するヒトＩｇＧ１、または図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド１〜２３０に対応する変異ヒトＩｇＧ４のＨ鎖可変領域とＣＨ１との間のイントロン；図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド５２５〜９１５に対応するヒトＩｇＧ１、または図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド５２５〜９１６に対応する変異ヒトＩｇＧ４のＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン；および図８（配列番号１）のおよそヌクレオチド９６１〜１０７８に対応するヒトＩｇＧ１、または図９（配列番号３）のおよそヌクレオチド９５３〜１０７０に対応する変異ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロンを含む。上記イントロンの２つ、３つ、４つのイントロンまたは１つを除く全てまでのイントロンの組み合わせを含む、上記イントロンの任意の組み合わせが欠失され得る。いくつかの実施態様において、Ｈ鎖定常領域の３つのイントロン、例えば、ＣＨ１とヒンジ領域との間、ヒンジ領域とＣＨ２との間、およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンが欠失される。いくつかの実施態様において、核酸分子は、本明細書において開示するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の、１つ以上のエキソンヌクレオチド配列、および１つ以上（しかし、全てではない）のイントロンヌクレオチド配列、または実質的にそれと同一の配列を含む。関連する実施態様において、核酸分子は、本明細書において開示するヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の、１つ以上（しかし、全てではない）のイントロンヌクレオチド配列、または実質的にそれと同一の配列における欠失を有する。
【００１７】
１つの実施態様において、改変核酸分子は、図１０（配列番号５）に示すヒトＩｇＧ１をコードするヌクレオチド配列、あるいは実質的にそれと同一の配列（例えば、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一の配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と比較して、１、５、１０、５０もしくはそれ以上のヌクレオチドの変化を有する配列）を含む。
【００１８】
別の実施態様において、改変核酸分子は、図１１（配列番号６）に示す改変ヒトＩｇＧ４のヌクレオチド配列、あるいは実質的にそれと同一の配列（例えば、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一の配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と比較して、１、５、１０、５０またはそれ以上のヌクレオチドの変化を有する配列）を含む。
【００１９】
改変核酸分子は、Ｌ鎖およびＨ鎖抗体または免疫グロブリン配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのような配列は、同じ核酸分子（例えば、同じ発現ベクター）中に存在し得るか、あるいは別の核酸分子（例えば、別の発現ベクター）から発現され得る。代表的には、コードされる抗体もしくは免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、少なくとも１つ、好ましくは２つの全長Ｈ鎖および少なくとも１つ、好ましくは２つのＬ鎖を含み得る。あるいは、コードされる免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、１つの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖフラグメント）のみを含み得る。抗体またはそのフラグメントは、モノクローナルまたは単一特異性抗体であり得る。抗体またはそのフラグメントはまた、ヒト、ヒト化、キメラ、ＣＤＲグラフト（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）またはインビトロ生成抗体であり得る。さらに他の実施態様において、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥから選択される、より特定すると、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択されるＨ鎖定常領域を有する。別の実施態様において、抗体は、例えばκまたはλから選択されるＬ鎖を有する。
【００２０】
別の実施態様において、核酸分子は、可変領域、例えばヒト化、キメラ、ＣＤＲグラフトまたはインビトロ生成可変領域を含む。代表的には、可変領域は、事前に決定された抗原、例えば障害（例えば神経変性障害または悪性障害）に関連する抗原に特異的に結合する。
【００２１】
１つの実施態様において、障害は神経変性障害であり、抗体はアミロイドタンパク質、例えばＡβペプチド（例えば、ヒトＡβペプチド）に結合する。例えば、抗体はマウス抗体（例えば、マウス抗Ａβ３Ｄ６抗体）由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＨ鎖およびＬ鎖可変領域を有するＡβペプチドに対するヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体の可変領域は、代表的には、ヒトまたは実質的にヒトのフレームワーク領域を含む。１つの実施態様において、核酸分子は、ヒト化抗Ａβペプチド抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域を含む。
【００２２】
別の実施態様において、障害は悪性またはガン障害であり、抗体は悪性細胞（例えば、固形ガン細胞）に関連する細胞表面タンパク質、例えば５Ｔ４タンパク質に結合する。５Ｔ４タンパク質は、ガン腫、特に直腸結腸および胃の転移ガンにおいて広く発現している７２ｋＤａの糖タンパク質である。いくつかの実施態様において、抗体は、マウス抗体由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＨ鎖およびＬ鎖可変領域を有する５Ｔ４タンパク質に対するヒト化抗体である。１つの実施態様において、核酸分子は、ヒト化抗５Ｔ４抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域を含む。
【００２３】
別の態様において、本発明は１つ以上の上記改変核酸分子を含むベクター（例えば、発現ベクター）を特徴とする。ベクターは、以下の１つ以上を増強するヌクレオチド配列をさらに含み得る：宿主細胞における複製、選択、ｍＲＮＡ転写、ｍＲＮＡ安定性、タンパク質発現またはタンパク質分泌。例えば、ベクターは、複製またはエンハンサー発現を担うヌクレオチド配列、エンハンサープロモーターエレメント、リーダー配列をコードするヌクレオチド配列、選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、配列内リボソーム進入部位配列（ＩＲＥＳ）およびポリアデニル化配列を含み得る。
【００２４】
別の態様において、本発明は、上記核酸分子および／またはベクター（例えば、発現ベクター）の１つを含む、細胞、例えば真核生物宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を提供する。細胞は、本発明の核酸配列を用いて一過性にまたは安定にトランスフェクトされ得る。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、参照、例えば、天然ゲノム配列と比較して減少したレベル（例えば、実質的に含まない）の誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー産物を有する組換えタンパク質またはペプチド（例えば、抗体）の発現の増強方法、あるいは組換えタンパク質またはペプチド（例えば、抗体）の発現方法を提供する。この方法は、宿主細胞、例えば哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中に、本明細書に記載の核酸分子を導入する工程；組換えタンパク質またはペプチドの発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養して、宿主細胞の培養物を産生する工程；および所望により宿主細胞の培養物（例えば、宿主細胞上清）から組換えタンパク質またはペプチドを得る（例えば、精製する）工程を包含する。
【００２６】
方法は、核酸サンプルおよびプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、サンプルを、イントロン配列および隣接エキソン配列に相補的な、あるいは隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと、接触させ；生じた複合体（例えば、プローブ配列のＰＣＲ増幅による）を検出することによる、核酸サンプル（例えば、宿主細胞由来のｍＲＮＡサンプル）におけるＩＲＴまたはＩＲＴ産物を同定する（例えば、検出および／またはそのレベルを決定する）工程をさらに包含し得る。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含むサンプルにおける複合体（例えば、ＰＣＲ増幅産物）の検出は、ＩＲＴまたはＩＲＴ産物の出現を示す。ＩＲＴ産物のレベルは、例えば実施例１に記載のように定量し得る。
【００２７】
別の態様において、標準参照（例えば、天然ゲノム配列）と比較して減少した（例えば、実質的に含まない）イントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副産物を有する抗体またはそのフラグメントの産生方法が提供される。この方法は、本明細書に記載の核酸分子および所望により抗体Ｌ鎖をコードする核酸分子を含む細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を、Ｈ鎖およびＬ鎖が発現され、所望により作動的に関連するような条件下で培養する工程を包含する。抗体またはそのフラグメントは、所望により、細胞培養物から精製される。代表的には、抗体またはそのフラグメントは、減少した誤スプライシングまたはイントロンリードスルー（ＩＲＴ）Ｈ鎖副産物を有する。
【００２８】
方法は、サンプル（例えば、宿主細胞由来のｍＲＮＡサンプル）におけるＩＲＴまたはＩＲＴ産物のレベルを検出および／または決定する工程；核酸サンプルおよびプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な、あるいは隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと接触させる工程；生じた複合体（例えば、プローブ配列のＰＣＲ増幅による）を検出する工程をさらに包含し得る。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含むサンプルにおける複合体（例えば、ＰＣＲ増幅産物）の検出は、ＩＲＴまたはＩＲＴ産物の出現を示す。ＩＲＴ産物のレベルは、例えば実施例１に記載のように定量され得る。
【００２９】
別の態様において、本発明は、配列から少なくとも１つのイントロンを欠失させることにより、ゲノムＨ鎖配列から発現されるイントロンリードスルー（ＩＲＴ）抗体Ｈ鎖副産物を減少させる方法を提供する。ここで、イントロンはＩＲＴを促進する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、サンプル、例えば核酸サンプルにおけるＩＲＴまたはＩＲＴ産物を同定（例えば、検出および／またはそのレベルを決定）する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：核酸サンプル、例えば細胞（例えば、組換え細胞（例えば、本明細書に記載の宿主細胞）由来のｍＲＮＡサンプル）を得る工程；核酸サンプルおよびプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、核酸サンプルを、イントロンおよび隣接エキソン配列に相補的な、あるいは隣接エキソン配列に相補的な核酸プローブと接触させる工程；生じた複合体（例えば、プローブ配列のＰＣＲ増幅による）を検出する工程をさらに包含し得る。イントロン配列に相補的な核酸プローブを含むサンプルにおける複合体（例えば、ＰＣＲ増幅産物）の検出は、ＩＲＴまたはＩＲＴ産物の出現を示す。ＩＲＴ産物のレベルは、例えば実施例１に記載のように定量がされ得る。
【００３１】
別の態様において、本発明は、本明細書に開示する方法により産生される、参照（例えば、天然ゲノム配列）と比較して、減少した（例えば、実質的に含まない）誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー産物を有する抗体（例えば、組換え抗体）、またはそのフラグメントを特徴とする。１つの実施態様において、抗体またはそのフラグメントは、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフトまたはインビトロ生成抗体である。代表的には、抗体またはそのフラグメントは、事前に決定された抗原、例えば障害（例えば、神経変性障害または悪性障害に関連する抗原に、特異的に結合する可変領域を有する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、参照（例えば、天然ゲノム配列）と比較して、減少した（例えば、実質的に含まない）誤スプライシングおよび／またはイントロンリードスルー産物を有する組換えタンパク質またはペプチド（例えば、抗体）および医薬上許容される担体を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。これら組成物は、治療用途（例えば、神経変性障害および悪性障害の処置を含む）に適切である。
【００３３】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
発現ベクターの設計および構築において、いくつかのアプローチを取り得、合理的なレベルのタンパク質が産生される前に、プロセスは代表的には実質的な試行錯誤実験を必要とする。設計プロセスにおける重大な考慮は、ベクターの構築におけるイントロン配列の使用に関する。１つのアプローチにおいて、イントロン配列およびエキソン配列両方の完全な相補物を含んで、遺伝子配列全体を、天然のままに利用し得る。そのような場合、細胞内の転写後スプライシング機構がイントロン配列を切り出して、遺伝子のエキソン配列のみを含む成熟ｍＲＮＡを生じることが予想される。第２のアプローチは、遺伝子のｃＤＮＡに対応する配列のみを利用することである。この場合、スプライシング事象は起こらず、そしてプレｍＲＮＡ配列はタンパク質コード内容においてｍＲＮＡ配列と実質的に同じであることが予測される。さらなる第３の場合に、ベクター構築は、通常はもとの遺伝子配列と関連しないイントロンの選択および配置を含む。
【００３５】
ベクターの関連での遺伝子の発現に対するイントロン配列の効果は、完全には理解されていない。イントロンが、転写速度、ポリアデニル化、ｍＲＮＡ輸送、翻訳効率およびｍＲＮＡ分解を含むタンパク質産生のプロセスにおけるいくつかの事象をもたらし得ることが報告されている（Ｎｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  （２００３）  ＲＮＡ  ９：６０７−６１７）。ｍＲＮＡ発現の関連では、ベクターからのタンパク質の収量についてのイントロンの結果に関する予測可能性の明るい道筋はない。例えば、種々のイントロン配列を含めることが、ｍＲＮＡ発現の大きな増加を引き起こす、効果を有しない、または減少させる可能性があることが様々に報告されている（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８：４３９５−４４０５；  Ｂｏｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．  ２：３９４−３９８）。大部分の高等真核生物遺伝子はイントロンを含むので、高レベルで、および望まれないリードスルー副産物の非存在下で遺伝子のエキソン配列に対する密接な忠実度を有してイントロン含有遺伝子を予測可能に発現するために使用され得る系の開発は、明らかにタンパク質発現系の予測可能な開発の助けとなる。
【００３６】
イントロン配列に関係した予測不可能性が信頼性のある発現ベクターの設計に対する障害となっているが、目的のタンパク質が遺伝子工学技術に馴染みやすいモジュール形態を有する場合に、重大な設計の利益が実現され得る。抗体は、イントロン配列を含めることが発現ベクターの設計を容易にする１つのそのような例を提供する。
【００３７】
本明細書および請求の範囲において使用する特定の用語を以下に定義する。
【００３８】
用語「イントロンリードスルー」（「ＩＲＴ」）は、それによってプレｍＲＮＡ転写物の異常なスプライシングが異なる大きさまたはアミノ酸構成のタンパク質またはペプチドを生じるプロセスを示す。誤スプイライシング転写物から産生される最終的なタンパク質に関して種々の結果が生じ得る。例えば、予測より大きなタンパク質または不正確な終止コドンを有するタンパク質が生じ得る。この場合、タンパク質はそれぞれ予測より長くまたは短くあり得る。さらに、タンパク質はまた、グリコシル化、ミリストイル化、リン酸化、ユビキチン化または他の翻訳後修飾のためのタンパク質修飾を促進する不正確なまたはさらなる残基を有し得る。
【００３９】
用語「イントロンリードスルー副産物」は、イントロンリードスルーから生じる異常にスプライスされたｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質またはペプチド（例えば、予測されない大きさまたはアミノ酸構成のタンパク質）をいう。イントロンリードスルー副産物は、遺伝子の既知のアミノ酸配列によって予測される、および／または遺伝子のｃＤＮＡによって予測されるポリペプチドより短くまたは長くあり得る。イントロンリードスルー副産物はまた、遺伝子の正確にスプライスされたｍＲＮＡから生じるタンパク質の認められた分子量とは異なる見かけの分子量を有し得る。さらに、用語「イントロンリードスルー副産物」は、目的のタンパク質と通常は関連しないタンパク質分解プロセシング事象から生じるタンパク質を含み、タンパク質分解プロセシングはイントロン−エキソンジャンクションのリード−スルーに起因するフレームシフトタンパク質産物から潜在的に生じる。
【００４０】
用語「Ｈ鎖副産物」は、イントロンリードスルーから生じる異常にスプライスされた免疫グロブリンＨ鎖ｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド（例えば、予測されない大きさまたはアミノ酸構成のＨ鎖タンパク質）をいう。Ｈ鎖副産物は、免疫グロブリン遺伝子の既知のアミノ酸配列によって予測される、および／または遺伝子のｃＤＮＡによって予測されるポリペプチドより短くまたは長くあり得る。Ｈ鎖副産物はまた、Ｈ鎖遺伝子の正確にスプライスされたｍＲＮＡから生じるタンパク質の認められた分子量とは異なる見かけの分子量を有し得る。さらに、用語「Ｈ鎖副産物」は、タンパク質と通常は関連しないタンパク質分解プロセシング事象から生じるポリペプチドを含む。
【００４１】
用語「天然配列」または「天然ゲノム配列」は、その天然のまたは未変性の状態で見出される遺伝子のイントロンおよびエキソンの構成をいう。天然配列は、配列のイントロンおよびエキソンの構成が保持される限り、例えばその天然の染色体位置で、またはベクター中にクローン化されて見出され得る。
【００４２】
用語「免疫グロブリン」または「抗体」（本明細書において互換的に使用される）は、２つのＨ鎖および２つのＬ鎖からなる４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質をいい、鎖は、例えば鎖間ジスルフィド結合により安定化され、ここで免疫グロブリンまたは抗体は抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００４３】
用語「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される）は、Ｈ鎖およびＬ鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質をいい、鎖は、例えば鎖間ペプチドリンカーによって安定化され、ここで免疫グロブリンまたは抗体は抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００４４】
用語「免疫グロブリンまたは抗体ドメイン」は、例えばβプリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば、３〜４個のペプチドループを含む）Ｈ鎖またはＬ鎖ポリペプチド内の球状領域をいう。ドメインをさらに本明細書において「定常」または「可変」という。ここで、用語「定常」は、「定常」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内での配列多様性の相対的欠如をいい、用語「可変」は、「可変」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内の有意な多様性をいう。抗体またはポリペプチドの「ドメイン」は、抗体またはポリペプチドの「領域」と当該分野においてしばしば互換的に言及される。抗体Ｌ鎖の「定常」ドメインは、「Ｌ鎖定常領域」、「Ｌ鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に言及される。抗体Ｈ鎖の「定常」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に言及される。抗体Ｌ鎖の「可変」ドメインは、「Ｌ鎖可変領域」、「Ｌ鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に言及される。抗体Ｈ鎖の「可変」ドメインは、「Ｈ鎖定常領域」、「Ｈ鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に言及される。
【００４５】
用語「領域」もまた、抗体鎖または抗体鎖ドメインの一部または部分（例えば、本明細書において定義するＨ鎖もしくはＬ鎖の一部もしくは部分、または定常もしくは可変領域の一部もしくは部分）、ならびに上記鎖またはドメインのより分離した一部または部分をいう。例えば、Ｌ鎖およびＨ鎖またはＬ鎖およびＨ鎖可変ドメインは、本明細書において定義する「フレームワーク領域」または「ＦＲ］に散在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」を含む。
【００４６】
免疫グロブリンまたは抗体は、単量体または重合体形態で存在し得る。例えば、ＩｇＭ抗体は五量体形態で存在し、そして／あるいはＩｇＡ抗体は単量体、二量体または多量体形態で存在する。用語「フラグメント」は、インタクトなまたは完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分をいう。フラグメントは、インタクトなまたは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントはまた、組換え手段により得ることができる。例示的なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃおよび／またはＦｖフラグメントを含む。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原と結合するかまたはインタクトな抗体と（すなわち、フラグメントが由来するインタクトな抗体と）抗原結合（すなわち、特異的結合）について競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントをいう。
【００４７】
用語「立体構造」は、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、抗体鎖、そのドメインまたは領域）の三次構造をいう。例えば、用語「Ｌ鎖（またはＨ鎖）立体構造」は、Ｌ鎖（またはＨ鎖）可変領域の三次構造をいい、そして用語「抗体立体構造」または「抗体フラグメント立体構造」は、抗体またはそのフラグメントの三次構造をいう。用語「立体構造」はまた、１つまたはいくつかのタンパク質またはペプチド鎖の三次元関係から生じる四次構造をいってもよい。抗原決定基との関係において、用語「立体構造エピトープ」は、近接して存在する１つまたはいくつかのタンパク質内のアミノ酸の特異的な空間的配置を含む抗原決定基をいう。抗体の多機能性質（すなわち、ＩｇＧ分子が１つより多いタンパク質分子上のいくつかのエピトープに同時に結合する能力）を考慮すると、抗体は、いくつかのアミノ酸鎖によって構成される立体構造エピトープに結合する本来的能力を有していると考えられ得る。例えば、斑を形成するＡβの沈着は、１つの抗体がいくつかの近接して配置されたＡβペプチドに結合し得る立体構造エピトープを提供する。
【００４８】
結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって産生される。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単鎖および単鎖抗体を含む。「二重特異性」または「二機能性」免疫グロブリンまたは抗体以外では、免疫グロブリンまたは抗体は、その結合部位の各々を同一にしていると理解される。「二重特異性」または「二機能性抗体」は、２つの異なるＨ鎖／Ｌ鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む、種々の方法によって産生し得る。例えば、以下を参照のこと、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５−３２１  （１９９０）；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８，  １５４７−１５５３  （１９９２）。
【００４９】
用語「有意な同一性」は、２つの配列（例えば、２つのポリペプチド配列）をデフォルトギャップウェイト（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって至適に整列させた場合に、少なくとも５０〜６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０〜７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０〜８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０〜９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性（例えば、９９％以上の配列同一性）を共有することを意味する。用語「実質的な同一性」または「実質的に同一」は、２つの配列（例えば、２つのポリペプチド配列）が、例えばデフォルトギャップウェイトを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって至適に整列させた場合に、少なくとも８０〜９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％以上の配列同一性（例えば、９９％以上の配列同一性）を共有することを意味する。配列比較のために、代表的には１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列はコンピューターに入力され、配列座標が指定され（必要であれば）、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比較しての試験配列についての配列同一性の割合を算出する。
【００５０】
比較のための配列の至適アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ    ８５：２４４４  （１９８８）の類似性探索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化インプリメンテーション（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、  ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視の精査（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照のこと）により行われ得る。配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３  （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのプログラムは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮＣＢＩインターネットサーバーを通じて公にアクセス可能である）を通じて、公に利用可能である。代表的には、デフォルトプログラムパラメーターを使用して配列比較を実行し得るが、カスタマイズされたパラメーターも使用し得る。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  （１９８９）を参照のこと）。
【００５１】
好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換で異なる。アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的で、アミノ酸は以下のようにグループ分けされる：グループＩ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を及ぼす残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス中のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを構成する。
【００５２】
抗体
本発明の方法は、望ましくないまたは所望されない副産物が検出される種々の抗体産生プロセスにおいて適用可能である。特に、この方法は産生される抗体の配列が既知である組換え抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）の産生において適用可能である。
【００５３】
用語「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのヒト化免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、少なくとも１つのヒト化Ｌ鎖またはＨ鎖）を含む免疫グロブリンまたは抗体をいう。用語「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリンＬ鎖」または「ヒト化免疫グロブリンＨ鎖」）は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の可変フレームワーク領域および実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）を含み、そして定常領域（例えば、Ｌ鎖の場合は少なくとも１つの定常領域またはその部分、そしてＨ鎖の場合は好ましくは３つの定常領域）をさらに含む可変領域を有する免疫グロブリンまたは抗体鎖（すなわち、それぞれＬ鎖またはＨ鎖）をいう。用語「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化Ｌ鎖可変領域」または「ヒト化Ｈ鎖可変領域」）は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の可変フレームワーク領域、および実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域をいう。
【００５４】
用語「実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体由来」あるいは「実質的にヒト」は、比較目的のためにヒト免疫グロブリンまたは抗体アミノ酸配列に対して整列させた場合に、領域がヒトフレームワークまたは定常領域配列と少なくとも８０〜９０％、９０〜９５％または９５〜９９％の同一性（すなわち、局所配列同一性）を共有することを意味する（例えば、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などを考慮して）。保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換、逆突然変異などを、しばしばヒト化抗体または鎖の「至適化」という。用語「実質的に非ヒト免疫グロブリンまたは抗体由来」あるいは「実質的に非ヒト」は、非ヒト生物（例えば、非ヒト哺乳動物）の配列と少なくとも８０〜９５％、好ましくは少なくとも９０〜９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％同一の免疫グロブリンまたは抗体配列を有すること意味する。
【００５５】
従って、ヒト化免疫グロブリンもしくは抗体の、またはヒト化免疫グロブリンもしくは抗体鎖の全ての領域または残基は、おそらくＣＤＲを除いて、１つ以上の天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する領域または残基と実質的に同一である。用語「対応する領域」または「対応する残基」は、第１および第２の配列が比較目的のために至適に整列された場合、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基と同じ（すなわち、等価な）位置を占める第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列上の領域または残基をいう。
【００５６】
好ましくは、ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は、対応する非ヒト化抗体の親和性の３、４または５の係数以内の親和性で抗原と結合する。例えば、非ヒト化抗体が１０９Ｍ−１の結合親和性を有する場合、ヒト化抗体は少なくとも３×１０９Ｍ−１、４×１０９Ｍ−１または５×１０９Ｍ−１の結合親和性を有する。免疫グロブリンまたは抗体鎖の結合特性を記載する場合、鎖はその「直接抗原（例えば、Ａβまたは５Ｔ４）結合」の能力に基づいて記載され得る。インタクトな免疫グロブリンもしくは抗体（またはその抗原結合フラグメント）に特異的結合特性または結合親和性を与える場合に、鎖は「直接抗原結合」といわれる。変異を欠く等価の鎖を含む抗体（またはその抗原結合フラグメント）の結合親和性と比較して、その鎖を含むインタクトな免疫グロブリンもしくは抗体（またはその抗原結合フラグメント）の結合親和性に少なくとも１桁の影響を及ぼす（例えば、減少させる）場合に、変異（例えば、逆突然変異）はＨ鎖またはＬ鎖の直接抗原結合の能力に実質的に影響を及ぼすといわれる。変異を欠く等価の鎖を含む抗体（またはその抗原結合フラグメント）の結合親和性の２、３または４の係数のみで、その鎖を含むインタクトな免疫グロブリンもしくは抗体（またはその抗原結合フラグメント）の結合親和性に影響を及ぼす（例えば、減少させる）場合に、変異は「実質的に鎖の直接抗原結合の能力に影響を及ぼさない（例えば、減少させない）」。
【００５７】
用語「キメラ免疫グロブリン」または抗体は、その可変領域が第１の種に由来し、その定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体をいう。キメラ免疫グロブリンまたは抗体を、例えば遺伝子工学によって、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築することができる。用語「ヒト化免疫グロブリン」または「ヒト化抗体」は、本明細書において定義するキメラ免疫グロブリンまたは抗体を含むことは意図されない。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体は、その構築においてキメラである（すなわち、１つより多い種のタンパク質由来の領域を含む）が、これらは本明細書において定義するキメラ免疫グロブリンまたは抗体においては見出されないさらなる特徴（すなわち、ドナーＣＤＲ残基およびアクセプターフレームワーク残基を含む可変領域）を含む。
【００５８】
そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において公知の組換えＤＮＡ技術によって、例えば以下に記載される方法を使用して産生することができる：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；  Ａｋｉｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  欧州特許出願第１８４，１８７号；  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．，  欧州特許出願第１７１，４９６号；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  欧州特許出願第１７３，４９４号；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ８６／０１５３３号；  Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許第４，８１６，５６７号；  Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  欧州特許出願第１２５，０２３号；  Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１−３５２６；  Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｃａｎｃ．  Ｒｅｓ．  ４７：９９９−１００５；  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；  Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３−１５５９）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，    Ｓ．  Ｌ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；  Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；  Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号；  Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；  Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：４０５３−４０６０。
【００５９】
改変された（例えば、抗体の他の部分（例えば、定常領域）を欠失、付加または置換することにより）モノクローナル、キメラおよびヒト化抗体もまた本発明の範囲内にある。例えば、抗体は以下のように改変され得る：（ｉ）定常領域を別の定常領域（例えば、抗体の半減期、安定性または親和性を増加させることが意図される定常領域、または別の種もしくは抗体クラス由来の定常領域）に置換することによる；あるいは（ｉｉ）改変のため、定常領域中の１つ以上のアミノ酸を改変して、例えば、とりわけグリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、補体固定を変化させることによる。抗体の定常領域を変化させる方法は当該分野において公知である。変化した機能（例えば、エフェクターリガンド（例えば、細胞上のＦｃＲ）、または補体のＣ１成分に対する変化した親和性）を有する抗体は、抗体の定常部分中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基に置換することにより産生され得る（例えば、ＥＰ  ３８８，１５１  Ａ１、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６２４，８２１およびＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６４８，２６０（その全ての内容を出典明示で援用する）を参照のこと）。マウスまたは他の種の免疫グロブリンに適用した場合にその機能を低下または除去する類似型の変化が記載され得る。
【００６０】
例えば、抗体（例えば、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ））のＦｃ領域のＦｃＲ（例えば、ＦｃγＲ１）に対する、またはＣ１ｑ結合に対する親和性を、特定の残基を適切な官能性をその側鎖上に有する残基で置換することにより、あるいは荷電した官能基（例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸）、またはおそらく芳香族非極性残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンもしくはアラニン）を導入することにより変化させることが出来る（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，６２４，８２１を参照のこと）。
【００６１】
トランスジェニック動物およびファージディスプレイ由来のヒト抗体
あるいは、免疫に際して、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体Ｈ鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖系列変異マウス中の移入は、抗原チャレンジに際してのヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．  ６，１５０，５８４；  ６，１１４，５９８；および５，７７０，４２９を参照のこと。
【００６２】
完全ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来し得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１  （１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１−５９７  （１９９１））。
【００６３】
二重特異性抗体、抗体融合ポリペプチドおよび単鎖抗体
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。そのような抗体は、全長抗体または抗体フラグメントに由来し得る（例えば、Ｆ（ａｂ）’２二重特異性抗体）。二重特異性抗体の作製方法は、当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の同時発現に基づき、ここで２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：５３７−５３９  （１９８３））。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する（ＷＯ  ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：３６５５−３６５９  （１９９１）を参照のこと）。
【００６４】
二重特異性抗体はまた、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、へヘテロコンジュゲート中の抗体の１つはアビジンと結合され得、他方はビオチンまたはその他のペイロードと結合され得る。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好適な架橋法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，６７６，９８０中にいくつかの架橋技術とともに開示されている。
【００６５】
さらに別の実施態様において、抗体はペイロードドメイン（例えば、免疫毒素）に化学的または遺伝子的に融合され、抗体融合ポリペプチドを産生し得る。そのようなペイロードは、例えば免疫毒素、化学療法剤および放射性同位体を含み、その全ては当該分野において周知である。
【００６６】
単鎖抗体もまた本発明による安定化に適切である。フラグメントは、Ｌ鎖可変ドメイン（ＶＬ）にリンカーを用いて連結されたＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、リンカーは、各可変領域が互いに連係し、ＶＬおよびＶＨ領域が由来する親抗体の抗原結合ポケットを再生することを可能にする。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５２：５３６８  （１９９４）を参照のこと。
【００６７】
抗Ａβ抗体
一般に、本発明の抗体は、Ａβペプチドを標的化することにより、アミロイド形成疾患、特にアルツハイマー病を処置するための抗体を含む。
【００６８】
用語「アミロイド形成疾患」は、不溶性アミロイド線維の形成または沈着に関係する（またはそれにより引き起こされる）任意の疾患を含む。例示的なアミロイド形成疾患は、限定するものではないが、全身性アミロイド症、アルツハイマー病、成人発症型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症およびプリオン関連感染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールーおよびクロイツフェルト・ヤコブ病、ならびにそれぞれヒツジおよびウシにおけるスクレイピーおよびＢＳＥ）を含む。異なるアミロイド形成疾患は、沈着した線維のポリペプチド成分の性質によって定義または特徴付けされる。例えば、アルツハイマー病を有する対象または患者において、βアミロイドタンパク質（例えば、野生型、改変体または切断型βアミロイドタンパク質）は、特徴的なアミロイド沈着のポリペプチド成分である。従って、アルツハイマー病は、例えば対象または患者の脳における、「Ａβの沈着によって特徴づけられる疾患」または「Ａβの沈着に関連する疾患」の例である。用語「βアミロイドタンパク質」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」および「Ａβペプチド」は、本明細書において互換的に使用される。
【００６９】
「免疫原性因子」または「免疫原」は、哺乳動物への投与に際して（所望によりアジュバンドと組み合わせて）それ自体に対する免疫応答を誘発し得る。
【００７０】
用語「Ａβ抗体」、「抗Ａβ抗体」および「抗Ａβ」は本明細書において互換的に使用され、ＡＰＰ、Ａβタンパク質またはその両方の１つ以上のエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体をいう。例示的なエピトープまたは抗原決定基は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内に見出され得るが、好ましくはＡＰＰのＡβペプチド内に見出される。ＡＰＰの複数のアイソフォーム、例えばＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰ内のアミノ酸には、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号が割り当てられている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｐ０５０６７を参照のこと）。Ａβ（本明細書においてβアミロイドペプチドおよびＡβとも言う）ペプチドは、ＡＰＰの３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内部フラグメントである（Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３）。例えば、Ａβ４０はＡＰＰの残基６７２〜７１１からなり、そしてＡβ４２はＡＰＰの残基６７２〜７１３からなる。インビボまたはインサイチュにおける異なるセクレターゼ酵素によるＡＰＰのタンパク質分解プロセシングの結果、Ａβは「短形態」（長さ４０アミノ酸）、および「長形態」（長さ４２〜４３アミノ酸の範囲）の両方で見出される。エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＮ末端内に位置し得、Ａβのアミノ酸１〜１０内、好ましくはＡβ４２の残基１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、２〜７、３〜６もしくは３〜７由来またはＡβの残基２〜４、５、６、７もしくは８、Ａβの残基３〜５、６、７、８もしくは９、またはＡβ４２の残基４〜７、８、９もしくは１０内の残基を含む。「中央」エピトープまたは抗原決定基は、Ａβペプチドの中央または中部内に位置し、Ａβのアミノ酸１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３または１９〜２４内の残基を含む。「Ｃ末端」エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＣ末端内に位置し、Ａβのアミノ酸３３〜４０、３３〜４１または３３〜４２内の残基を含む。
【００７１】
種々の実施態様において、Ａβ抗体は末端特異的である。本明細書において使用する用語「末端特異的」は、ＡβペプチドのＮ末端またはＣ末端残基に特異的に結合するが、この残基を含むより長いＡβ種またはＡＰＰ中に存在する場合は、同じ残基を認識しない抗体をいう。
【００７２】
種々の実施態様において、Ａβ抗体は「Ｃ末端特異的」である。本明細書において使用する用語「Ｃ末端特異的」は、Ａβペプチドの遊離Ｃ末端を特異的に認識する抗体を意味する。Ｃ末端特異的Ａβ抗体の例は以下を含む：残基４０で終結したＡβペプチドを認識するが、残基４１、４２および／または４３で終結したＡβペプチドは認識しない抗体；残基４２で終結したＡβペプチドは認識するが、残基４０、４１および／または４３で終結したＡβペプチドは認識しない抗体；など。
【００７３】
１つの実施態様において、抗体は３Ｄ６抗体もしくはその改変体、または１０Ｄ５抗体もしくはその改変体であり、その両方が米国特許公開２００３／０１６５４９６Ａ１、米国特許公開２００４／００８７７７７Ａ１、国際特許公開ＷＯ０２／４６２３７Ａ３に記載されている。３Ｄ６および１０Ｄ５の記載は、例えば、国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０６Ａ２および国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０７Ａ２においても見出され得る。３Ｄ６は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、詳細には残基１〜５に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。これに比較して、１０Ｄ５は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、詳細には残基３〜６に特異的に結合するｍＡｂである。別の実施態様において、抗体は、米国特許公開２００４００８２７６２Ａ１および国際特許公開ＷＯ０３／０７７８５８Ａ２に記載の１２Ｂ４抗体またはその変異体であり得る。１２Ｂ４は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、詳細には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。さらに別の実施態様において、抗体は、米国特許出願１０／８５８，８５５および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７５１４に記載の１２Ａ１１抗体またはその変異体であり得る。１２Ａ１１は、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＮ末端エピトープ、詳細には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。さらに別の実施態様において、抗体は、米国特許出願１０／７８９，２７３および国際特許出願ＷＯ０１／６２８０１Ａ２に記載の２６６抗体であり得る。本発明における使用のために、ヒトβアミロイドペプチド中に位置するＣ末端エピトープに特異的に結合するよう設計された抗体は、限定するものではないが、米国特許５，７８６，１６０に記載の３６９．２Ｂを含む。
【００７４】
例示的な実施態様において、抗体は、選択的にＡβペプチドに結合するヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体である。より詳細には、ヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体は、脳中の斑沈着物において（例えば、アルツハイマー病に罹患している患者において）見出されるヒトβアミロイド１〜４０または１〜４２ペプチド中に位置するＮＨ２末端エピトープに特異的に結合するよう設計されている。
【００７５】
抗５Ｔ４抗体
５Ｔ４抗原は以前に特徴付けられている（例えば、ＷＯ  ８９／０７９４７を参照のこと）。ヒト５Ｔ４の全核酸配列は公知である（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １６９：  ９３１９−２４およびＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｚ２９０８３）。他の種由来の５Ｔ４抗原の配列もまた公知である（例えば、マウス５Ｔ４（ＷＯ００／２９４２８）、イヌ５Ｔ４（ＷＯ０１／３６４８６）またはネコ５Ｔ４（ＵＳ  ０５／０１００９５８））。
【００７６】
ヒト５Ｔ４は、ガン腫において広く発現されているが、正常成人組織においては高度に制限された発現パターンを有する約７２ｋＤａの糖タンパク質である。これは、結腸直腸ガンおよび胃ガンにおける転移と強く相関しているようである。５Ｔ４抗原の発現はまた、高頻度で乳ガンおよび卵巣ガンにおいて見出される（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  １０：４７９−８４；  Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６９：８９９−９０２；  Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６６：８６７−９）。５Ｔ４は、可能な機構的関与を有して、腫瘍の進行および転移潜在能力のマーカーとして提案されている（Ｃａｒｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６８：８４−９２）。５Ｔ４はまた、免疫療法剤としての使用が提案されている（ＷＯ  ００／２９４２８を参照のこと）。５Ｔ４の抗原ペプチドは、例えばＵＳ  ０５／０１００９５８（その内容を出典明示で援用する）に開示されている。
【００７７】
いくつかの係属中の出願は、一般に、抗５Ｔ４モノクローナル抗体をコードする核酸、そのベクターおよび宿主細胞に関する（例えば、米国出願公開２００３／００１８００４および２００５／００３２２１６、ならびに米国出願１０／０１６，６８６）。一般に、ヒト化抗５Ｔ４  Ｈ８モノクローナル抗体およびそのカリチアマイシンコンジュゲートならびにこれらのカリチアマイシンコンジュゲートを使用した処置方法に関係する仮特許出願が出願されている（米国出願６０／６０８，４９４）。これら全出願の全ての内容を、出典明示で援用する。
【００７８】
Ｆｃ融合物
いくつかの実施態様において、本発明の核酸分子は、融合またはキメラタンパク質をコードする。融合タンパク質は、標的化部分（例えば、可溶性レセプターフラグメントまたはリガンド）、ならびに免疫グロブリン鎖、Ｆｃフラグメント（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む種々のアイソタイプのＨ鎖定常領域）を含む。例えば、融合タンパク質は、レセプターの細胞外領域、および例えばそれに融合して、ヒト免疫グロブリンＦｃ鎖（例えば、ヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４、またはその変異形態）を含み得る。１つの実施態様において、ヒトＦｃ配列は１つ以上のアミノ酸において変異される（例えば、野生型配列から残基２５４および２５７において変異されて、Ｆｃレセプター結合が低下される）。融合タンパク質は、第１の部分を第２の部分（例えば、免疫グロブリンフラグメント）に連結するリンカー配列をさらに含み得る。例えば、融合タンパク質は、例えば、約４〜２０、より好ましくは５〜１０アミノ酸長のペプチドリンカーを含み得る；ペプチドリンカーは８アミノ酸長である。例えば、融合タンパク質は、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（ここでｙは１、２、３、４、５、６、７または８である）を有するペプチドリンカーを含み得る。他の実施態様において、さらなるアミノ酸配列を融合タンパク質のＮまたはＣ末端に付加して、発現、立体的可撓性、検出および／または単離もしくは精製を容易にし得る。
【００７９】
本発明のキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば以下を用いることにより従来技術に従ってインフレームで一緒に結合する：ライゲーションのための平滑末端またはねじれ型末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、適切な付着末端のフィルイン、所望されない連結を回避するアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーション。別の実施態様において、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって融合遺伝子を合成し得る。あるいは、２つの連続した遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じ、この遺伝子フラグメントが次いでアニールされ、そして再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生じ得るアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行い得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （編）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリンＨ鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当該分野において公知であり、例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ５，５１６，９６４；  ５，２２５，５３８；  ５，４２８，１３０；  ５，５１４，５８２；  ５，７１４，１４７；および５，４５５，１６５に記載されている。
【００８０】
核酸分子、構築物およびベクター
本発明の例示的な実施態様は、望ましくないまたは所望されない副産物、特に、望ましくないまたは所望されない抗体（または免疫グロブリン）副産物を除去するよう設計された、加工された構築物を特徴とする。特定の態様において、構築物は天然抗体遺伝子配列の成分を含み、ここでこの成分は、得られる構築物が望ましくないまたは所望されない副産物の非存在下で目的の所望のタンパク質（例えば、抗体）を発現するように、遺伝子的に変化、改変または加工（例えば、遺伝子操作）されている。構築物は、下記で詳細に記載するような、組換え核酸分子（例えば、免疫グロブリン鎖遺伝子の成分を含む）を産生するための当該分野で認識されている技術を使用して生成し得る。
【００８１】
抗体遺伝子配列は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤまたはＩｇＥを含む種々のアイソタイプの抗体をコードする。好ましくは、抗体遺伝子配列は、ＩｇＧアイソタイプである抗体をコードする。コードされる免疫グロブリンまたは抗体分子は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４免疫グロブリン）を含み得、あるいはフラグメント（例えば、Ｆｃフラグメント）のみを含み得る。
【００８２】
本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列が、遺伝コードおよび標準的な分子生物学技術を使用して、本願中に記載されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列に、または当該分野において公知の免疫グロブリン遺伝子の配列のさらなる供給源に由来し得ることが当業者によって理解される。本発明の核酸組成物は公知の免疫グロブリンＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ配列）に由来し得る。特に、ヌクレオチド配列は、天然Ｖ、Ｄ、Ｊまたは定常ｃＤＮＡ配列と実質的に同一であるかまたはそれに由来し得る。Ｈ鎖およびＬ鎖定常領域遺伝子の配列は、当該分野において公知である。好ましくは、定常領域はヒトであるが、他の種、例えば齧歯類（例えば、マウスもしくはラット）、霊長類（マカク）、ラクダまたはウサギ由来の定常領域も使用され得る。これらの種由来の定常領域は当該分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２を参照のこと）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。Ｈ鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｈ鎖定常領域の配列は当該分野において公知であり、例えば、ＮＣＢＩ  ＮＧ＿００１０１９において見出され得る。代表的な実施態様において、定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。ＦｃフラグメントＨ鎖遺伝子については、ＦｃをコードするＤＮＡを直接発現のためにＨ鎖リーダー配列（例えば、Ｈ鎖可変鎖リーダー配列）に作動可能に連結し得る。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）免疫グロブリンＤＮＡカセット配列を含む。組み立てられた免疫グロブリンカセット配列は、免疫グロブリンＤＮＡカセットヌクレオチド配列によってコードされるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。
【００８４】
例示的なヒトＩｇＧ１定常領域ゲノム配列を以下に提供する：
ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＴＣＣＣＧＧＣＴＡＴＧＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＡＧＧＴＧＣＣＣＣＴＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＣＣＧＴＧＧＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ  （配列番号１）
【００８５】
例示的なＩｇＧ４定常領域ゲノム配列を以下に提供する：
ＧＴＧＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＡＡＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＡＣＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＴＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＧＡＧＴＡＧＣＣＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＧＧＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＣＴＣＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ  （配列番号３）
【００８６】
抗体産生
本発明の抗体は、代表的には、組換え発現により産生される。Ｌ鎖およびＨ鎖をコードする核酸は、発現ベクター中に挿入され得る。Ｌ鎖およびＨ鎖は、同じまたは異なる発現ベクター中にクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に作動可能に連結される。発現制御配列は、限定するものではないが、プロモーター（例えば、天然に関連したまたは異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメントおよび転写終結配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクトし得るベクター中の真核生物プロモーター系である。
【００８７】
上記のような本発明のポリペプチドを提供するための単離された遺伝子材料の操作の後に、遺伝子は代表的には、宿主細胞中への導入のために発現ベクター中に挿入される。この宿主細胞を使用して所望の量の改変抗体を産生し得、この抗体は次いで本発明のポリペプチドを提供する。用語「ベクター」は、しばしば核酸（例えば、遺伝子）を含み、そしてさらに核酸の複製、転写、安定性および／または宿主細胞からのタンパク質の発現もしくは分泌に必要な最小エレメントを含む核酸構築物を含む。このような構築物は、染色体外エレメントとして存在し得るか、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
【００８８】
用語「発現ベクター」は、核酸構築物が所望のタンパク質産物の高レベル発現のために至適化されている特定の型のベクターを含む。発現ベクターは、特定の細胞型における高レベルの転写のために至適化され、そして／または特定の誘発剤の使用に基づいて発現が構成性であるよう至適化されている転写調節因子（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメント）をしばしば有する。発現ベクターはさらに、タンパク質の適正なおよび／または増強された翻訳をもたらす配列を有する。当業者に公知であるように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群より容易に選択され得る。用語「発現カセット」は、遺伝子を含み、そして遺伝子に加えて宿主細胞における遺伝子の適正なおよび／または増強された発現を可能にするエレメントを有する核酸構築物を含む。
【００８９】
用語「作動可能に連結」は、成分が、それらに意図されるように機能することを可能にする関係にある（例えば、機能的に連結される）近位を含む。例えば、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結しているプロモーター／エンハンサーは、プロモーター／エンハンサーによって指令される発現を活性化する条件下で、目的のポリヌクレオチドの発現が達成されるように、ポリヌクレオチドに結合されている。本明細書に記載する発明に関しては、作動可能な連結はまた、目的の遺伝子の１次転写産物（プレｍＲＮＡ）に見出されるスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の関係を含む。通常、スプライスアクセプターおよびドナー部位は、スプライシング事象が起こって成熟メッセンジャーＲＮＡが生じるために、２つの配列が一緒に必要とされそして機能するという点で、作動可能に連結されている。
【００９０】
発現ベクターは、代表的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた部分としてのいずれかで宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含んで、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にする（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第．  ４，７０４，３６２号を参照のこと）。免疫グロブリンＤＮＡカセット配列、挿入配列および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子のようなさらなる配列を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏｓ．  ４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７（全てＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ）を参照のこと）。例えば、代表的には、選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入された宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ宿主細胞において、メトトレキセート選択／増幅とともに使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【００９１】
一旦ベクターが適切な宿主中に取り込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに所望の抗体の収集および精製に適切な条件下で維持される。哺乳動物細胞は、本発明の抗体の発現および産生のために好ましい。例えば、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｎ．Ｙ．  （１９８７）を参照のこと。異種タンパク質（例えば、インタクトな免疫グロブリン）を分泌し得るいくつかの適切な宿主細胞株が当該分野において開発されているので真核生物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞株、またはトランスフォームＢ細胞もしくはハイブリドーマを含む。好ましくは、細胞は非ヒトである。本発明の抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５９：６０１−６２１に記載）とともに使用されるｄｈｆｒ  ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ  （１９８０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載）を含む）、リンパ球系細胞株（例えば、ＮＳＯミエローマ細胞およびＳＰ２細胞）、ＣＯＳ細胞、ならびにトランスジェニック動物由来の細胞（例えば、乳腺上皮細胞）を含む。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００９２】
これら細胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー）（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８９：４９  （１９８６））、ならびに必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列）を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。例えば、Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１１４９を参照のこと。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））ならびにポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメントを含む。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる記載については、ＳｔｉｎｓｋｉによるＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，１６８，０６２、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌによるＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，５１０，２４５およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌによるＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ．  Ｎｏ．  ４，９６８，６１５を参照のこと。例示的な実施態様において、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖遺伝子は、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントのようなＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する）に作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。本発明の例示的な実施態様において、構築物は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含んで、真核生物宿主細胞における本発明の相対的に高レベルのポリペプチドを提供する。適合性ＩＲＥＳ配列はＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，１９３，９８０（これもまた出典明示で援用する）に開示されている。
【００９３】
あるいは、抗体コード配列を、トランスジェニック動物のゲノム中への導入およびその後のトランスジェニック動物の乳汁における発現のためにトランスジーン中に組み込み得る（例えば、Ｄｅｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＳ  ５，７４１，９５７、Ｒｏｓｅｎ，  ＵＳ  ５，３０４，４８９およびＭｅａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＵＳ  ５，８４９，９９２を参照のこと）。適切なトランスジーンは、乳腺特異性遺伝子（例えば、カゼインまたはβラクトグロブリン）由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能に連結しているＬ鎖および／またはＨ鎖のコード配列を含む。
【００９４】
原核生物宿主細胞もまた、本発明の抗体を産生するために適切であり得る。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローン化するために特に有用な１つの原核生物宿主細胞である。使用に適切な他の微生物宿主は、桿菌（例えば、枯草菌）、腸内細菌科（例えば、大腸菌属、サルモネラおよびセラチア）ならびに種々のシュードモナス種を含む。これら原核生物宿主においても発現ベクターを作製し得、その発現ベクターは代表的には宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含む。さらに、任意のいくつかの種々の周知のプロモーター（例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系またはラムダファージ由来のプロモーター系）が存在する。プロモーターは代表的には発現を制御し（所望によりオペレーター配列とともに）、そして転写および翻訳を開始および完了するためにリボソーム結合部位配列などを有する。
【００９５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、大腸菌において、融合または非融合のいずれかのタンパク質の発現を指令する構成性または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて最もよく行われる。融合ベクターは、そこにコードされる抗体に、しばしば組換え抗体の定常領域に、抗体の特異性または抗原認識に影響を及ぼすことなく、いくつかのアミノ酸を付加する。融合ペプチドのアミノ酸の付加は、抗体にさらなる機能（例えば、マーカー（例えば、ミック（ｍｙｃ）またはフラッグ（ｆｌａｇ）のようなエピトープタグ）を付加し得る。
【００９６】
酵母のような他の微生物もまた発現のために有用である。サッカロミセスは好ましい酵母宿主であり、適切なベクターは発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終止配列などを所望により有する。代表的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖系酵素を含む。誘導性酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素に由来するプロモーターを含む。
【００９７】
あるいは、本発明の抗体は、トランスジェニック植物（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびアルファルファ）において産生され得る。改良された「プランチボディー（ｐｌａｎｔｉｂｏｄｙ）」ベクター（Ｈｅｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１３７−１４６）および精製ストラテジーは、形質転換可能な作物種の増加とともに、そのような方法を、組換え免疫グロブリン（ヒトおよび動物の治療用のみならず、産業適用用も（例えば、触媒抗体））の実用的かつ効率的な産生手段にする。さらに、植物産生抗体は安全および有効であることが示されており、動物由来の材料およびそれゆえ感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）因子の混入の危険性を回避する。さらに、植物および哺乳動物細胞産生抗体のグリコシル化パターンの差異は、抗原の結合もしくは特異性に対する影響をほとんどまたは全く有しない。さらに、植物由来分泌性二量体ＩｇＡ抗体の局所経口適用を受けた患者において、毒性またはＨＡＭＡの証拠は観察されていない（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４９：６０３−６０８を参照のこと）。
【００９８】
トランスジェニック植物において組換え抗体を発現させるために、種々の方法が用いられ得る。例えば、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖は独立して発現ベクター（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクター）中にクローン化され得、組換え細菌を用いるインビトロでの植物組織の形質転換、または、例えばベクターでコートされた粒子（これは次いで、例えば弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）を使用して植物組織中に物理的に導入される）を使用する直接的形質転換がそれに続く。次いで、個々の鎖を発現する全植物が再構成され、性的交配がそれに続き、最終的に完全に組み立てられた機能性の抗体の産生が得られる。同様のプロトコルが、タバコ植物において機能性抗体を発現させるために使用されている（例えば、Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６−８７を参照のこと）。種々の実施態様において、鎖を適切な植物環境（例えば、アポプラズム（ａｐｏｐｌａｓｍ）の水性環境または塊茎、果実もしくは種子を含む他の特異的な植物組織）に方向付けることにより、組み立てられていない抗体鎖の発現、結合および折りたたみを促進するためにシグナル配列が利用され得る（Ｆｉｅｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１０９０−１０９３を参照のこと）。植物バイオリアクターもまた、抗体収率を増加させるため、および有意にコストを低下させるために使用し得る。
【００９９】
適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．においてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロにおいて転写および翻訳され得る。
【０１００】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖コード配列ならびに発現制御配列）を含むベクターは周知の方法（細胞宿主の型に依存して変動する）により宿主細胞中に移入され得る。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核生物細胞のために一般に利用されており、一方、リン酸化カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃またはウイルスに基づくトランスフェクションが他の細胞宿主のために使用され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  １９８９を参照のこと）（その全体を全ての目的のために出典明示で援用する）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法は、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）を参照のこと）。トランスジェニック動物の作製のために、トランスジーンは、受精卵母細胞中へマイクロインジェクトされ得るか、または胚性幹細胞のゲノム中に組み込まれ得、そしてそのような細胞の核は、除核卵母細胞中へ移入される。
【０１０１】
Ｈ鎖およびＬ鎖が別の発現ベクターにクローン化される場合、ベクターはインタクトな免疫グロブリンの発現および組み立てを得るために同時トランスフェクトされる。一旦発現されると、抗体全体、その二量体、独立したＬ鎖およびＨ鎖または本発明の他の免疫グロブリン形態が、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む当該分野の標準的な手順に従って精製され得る（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．，  （１９８２）を参照のこと）。医薬用途のために少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。
【０１０２】
本発明よって産生された免疫グロブリンまたは抗体分子は、誘導体化され得るかまたは別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に結合され得る。従って、抗体および抗体の部分または本明細書に記載の本発明の抗体の他の改変形態は、研究、診断および／または治療の関連での使用のためにさらに誘導体化され得る。例えば、本発明の抗体または抗体の部分は、１つ以上の他の分子物体（例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出可能薬剤、細胞毒性薬剤、医薬薬剤および／または別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）と抗体または抗体の部分の会合を媒介し得るタンパク質またはペプチドと機能的に結合（化学結合、遺伝子融合、非共有性の会合またはその他により）され得る。
【０１０３】
誘導体化抗体の１つの型は、２つ以上の抗体（同一の型のまたは異なる型の、例えば、二重特異性抗体を作製するために）を架橋することにより産生される。適切な架橋剤は、適切なスペーサーによって分離された２つの異なる反応性基を有するヘテロ二機能性のもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二機能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）のものを含む。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬから入手可能である。
【０１０４】
例示的な蛍光検出可能薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどを含む。抗体はまた、検出可能な酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）とともに誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素とともに誘導化される場合、抗体は、酵素が使用して検出可能な反応産物を産生するさらなる試薬を添加することにより検出される。例えば、検出可能な薬剤である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、検出可能な呈色反応産物を導く。抗体はまた、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）とともに誘導体化され得る。例えば、抗体はビオチンとともに誘導体化され得、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出され得る。適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。抗体（またはそのフラグメント）はまた、治療用部分（例えば、細胞毒素または他の治療用タンパク質）に結合され得る。あるいは、Ｓｅｇａｌ、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のように、抗体は第２の抗体に結合されて、抗体ヘテロコンジュゲートを形成し得る。
【０１０５】
望ましくないポリペプチド副産物を減少または除去するための発現ベクター
治療用タンパク質のためのタンパク質発現系の開発の間に、精製された標的産物のＨＰＬＣ分析は、ペプチドの予想外の低分子量（ＬＭＷ）種を同定した。より詳細には、所望されないポリペプチド副産物が、３Ｄ６抗体を発現させるために開発されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株において観察された。この抗体は他所において記載されており、アルツハイマー病の処置に有用な免疫療法剤を開発する努力の結果である。この抗体は、Ａ−βペプチドに対する特異性を有しており、Ａ−β斑の浄化において有効であることが実証されている。ＣＨＯ細胞株は当該分野において許容された方法を使用して開発され、発現カセット含有細胞の選択的培養のための遺伝子に加えて、３Ｄ６抗体のＨ鎖およびＬ鎖のコピーを含んでいた。
【０１０６】
いくつかの細胞株のクローン単離物の検討は、ＬＭＶ種の産生が利用されクローンに特異的な現象ではない、すなわち試験された細胞株の全てにおいて産生された総タンパク質の微量な画分が予想外のＬＭＷ種のものであることを実証した。タンパク質発現が誘導されると、総タンパク質に対して相対的なＬＭＷ種の画分が増加することがさらに観察された。質量分析を使用したポリペプチドのさらなる評価は、ＬＭＷ種が、遺伝子のエキソン配列によっては予測されないアミノ酸を含むことを示した。
【０１０７】
図１の上部パネルは、３Ｄ６  Ｈ鎖発現カセットを模式的に示し、イントロンおよびエキソンの関係ならびに配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）選択マーカー遺伝子の位置を示す。示されるエキソンは、可変Ｈ鎖（ＶＨ１）、ヒンジおよび定常Ｈ鎖１、２および３（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）である。発現カセットのイントロンは、Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４と示されている。図１はさらに、発現カセットに由来するｍＲＮＡについての予測される適正なスプライシング事象を示す。中部パネルは、バイシストロン性転写物のイントロン配列のみを含む適正にスプライスされたｍＲＮＡを示す。
【０１０８】
発現ベクター中のイントロンおよびエキソン配列の精査ならびに質量分析データは、特異的スプライス部位ジャンクションのＲＮＡポリメラーゼイントロンリードスルー（ＩＲＴ）を示した。発現ベクター中に含まれるイントロンおよびエキソンならびにスプライスドナー部位およびアクセプター部位の構成は、遺伝子の本来のゲノム形態中に存在するものと実質的に同一であったので、誤スプライシング事象は予測可能でなかった。
【０１０９】
図１の下部パネルは、第４イントロンのイントロンリードスルーによって生じる予測産物を示す。図２は、３Ｄ６抗体発現ベクターのゲノム配列の第４イントロンの領域におけるＤＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス鎖を示す配列情報を提供する。スプライスジャンクション（スプライスドナーおよびアクセプター部位）は、核酸配列に対して垂直な垂直線によって示される。イントロン配列に対応するＤＮＡには下線を付し、斜体で示す。所望のリード−スルー副産物ポリペプチドについて予測されるアミノ酸は、ゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖の下に示される。適正にスプライスされたＲＮＡに由来するポリペプチドのアミノ酸配列は、太字の大文字で示し；不適正にスプライスされたＲＮＡに由来するポリペプチド副産物は、小文字で示す。
【０１１０】
本発明は、イントロンリードスルー（ＩＲＴ）および望ましくないポリペプチド副産物が実質的に減少されるかまたは完全に除去されるように、タンパク質発現カセットおよびベクターを設計するための材料および方法を記載する。一部では、本発明は新規なベクターの設計を提供する。ここで、目的のタンパク質をコードする単離された核酸におけるイントロンおよびエキソンの天然の作動的な関連が変化させられ、その結果ＩＲＴが減少または除去され、それにより望ましくないＩＲＴポリペプチド種が減少または除去される。特有の変化は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体に特に適切であるが、目的の遺伝子のいずれにも使用し得る。さらに、天然の作動的関連が変化させられたイントロンおよびエキソンを有する本発明のベクターは、減少または除去されたＩＲＴ副産物のみならず、標準的な当該分野で認識される技術を使用して設計されたベクターに比較して上昇したタンパク質発現レベルも示す。
【実施例】
【０１１１】
実施例
材料および方法
実施例を通じて、特に記載しない限り、下記文において例示される材料および方法を使用した。
【０１１２】
一般に、本発明の実施には、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学、特に例えば抗体技術における当該分野で認識される技術を用いる。例えば、下記を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  ５１０，  Ｐａｕｌ，  Ｓ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，  １６９），  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，  Ｅｄ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９９９）；および  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９９２）。
【０１１３】
実施例１．イントロンリードスルー転写の定量
イントロンリードスルーに起因して形成された異常転写物の相対的な量を定量するために、定量的ＰＣＲアッセイを設計した。ＩＲＴ転写を評価するためのアプローチを、図３に図式的に概説する。詳細には、定量的ＰＣＲアッセイを、ＰＣＲ増幅を用いて目的の核酸種を定量するＴａｑＭａｎ（登録商標）システムを使用して案出した。産生されたイントロンリードスルーｍＲＮＡの画分を決定するために、３つのプローブプライマーセットを設計した。第１のプローブプライマーセットを、目的のイントロンと天然の作動的関連にあるエキソンの配列の転写のレベルを定量するために設計した。３Ｄ６  Ｈ鎖発現カセットの場合、３Ｄ６第２定常Ｈ鎖（ＣＨ２）エキソンを含むｍＲＮＡ種を標的化した。これにより、総３Ｄ６  ｍＲＮＡ産生の尺度が提供された。第２のプローブプライマーセットは、作動的関連にあるイントロンおよびエキソン（ここでは３Ｄ６発現カセットのＣＨ２エキソン−第４イントロンの境界線）にまたがった。このプローブプライマーセット由来の増幅は、５’末端スプライスドナー配列ならびにＣＨ２エキソンおよびイントロン４にまたがる配列を含むイントロンリードスルー転写物の存在を示した。第３のプローブプライマーセットは、第４のイントロンの配列を標的化した。このプローブセットは、内部イントロン４配列を含む不適正にスプライスされたＲＮＡの画分の定量を提供した。
【０１１４】
図４は、記載したプローブプライマーセットを使用したＱ−ＰＣＲアッセイの結果を示す。簡潔に記載すると、安定に組み込まれた発現ベクターを含むＣＨＯ細胞を播種し、２週間培養物中に維持した。７日目に、タンパク質発現を増加させるために培養物を誘導した。実験の過程の間、細胞培養物のサンプルを溶解し、上記の段落に記載のＣＨ２エキソンに特異的なまたはイントロンに特異的なプローブおよびプライマーセットを使用したアッセイにおいてＲＮＡ含量を評価した。チャートは、誘導前の不適正にスプライスされたＲＮＡ産物の低いレベル、および誘導後経時的なイントロン４含有ＲＮＡの割合の増加を示す。ここに記載したＱ−ＰＣＲの方法は、天然に作動的関連にあるイントロンおよびエキソンを含む特定の発現カセットが、イントロンリードスルー副産物を生じる可能性を予測する。
【０１１５】
３Ｄ６抗体発現系のＩＲＴを定量するための詳細を明示的に提供したが、この技術は、ＩＲＴの潜在性が存在する任意のタンパク質発現系において実行され得る。この新規のアプローチは、それゆえ、本発明のベクター（以下で詳細に記載する）が望ましくないＩＲＴポリペプチド副産物の産生が回避されるように、特定の目的タンパク質のために採用されるべきかどうかを評価するために特に有用である。ＩＲＴ転写が約０．１％〜１％より多い量の場合、変化させた天然作動的関連を用いるベクターを、所望のタンパク質を発現させるために用い得る。イントロンリードスルーｍＲＮＡを検出し、そしてそれゆえイントロンリードスルーポリペプチドを予測するための方法が、スプライシング事象が生じる任意のタンパク質発現系に適用可能であることは、当業者に容易に明らかである。例えば、この系は任意の真核生物細胞系（例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、マウス、サル、ウサギ、ラットまたはヒト細胞に基づく系）で使用され得る。
【０１１６】
実施例２．改変された天然作動的関連を有するイントロンおよびエキソンを有するベクター
イントロンおよびエキソンの天然作動的関連が改変された発現ベクターを案出した。２つの例示的なベクター配列を図５に示す。この図は、イントロンリードスルー副産物の問題を解決するために開発された発現構築物を示す。上部パネルは、可変領域（ＶＨ）、３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）およびヒンジ領域のエキソンを含む一般的な抗体Ｈ鎖のゲノムイントロン−エキソン構成を図式的に示す。中部および下部の図は、イントロンリードスルーＨ鎖副産物を除去した発現ベクター中に組み込まれたゲノム配列への改変を記載する。
【０１１７】
３Ｄ６  Ｌ鎖を発現するＣＨＯ細胞を、３Ｄ６抗体の完全なゲノムＨ鎖配列を用いて形質転換するか、またはイントロンおよびエキソンの天然作動的関連が改変された改変３Ｄ６  Ｈ鎖発現ベクターを用いて形質転換した。材料および方法に記載したタンパク質発現の目的のための標準的な技術を使用して細胞を培養した。抗体を、馴化上清から精製し、次いで変性逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣを使用して分画した（図６）。抗体のＨ鎖およびＬ鎖構成成分が分離されるようにカラムを流した。
【０１１８】
上部の図（３Ｄ６ゲノムクローンタンパク質調製物の分画を表す）において、Ｈ鎖およびＬ鎖のピークは容易に明らかである。さらに、Ｈ鎖とＬ鎖との間に分画され、Ｈ鎖イントロンリードスルー産物に対応する小さなピークが見分けられ得る。
【０１１９】
下部の図は、イントロンリードスルーの問題が軽減された発現系の例である。上部の図におけるように、Ｌ鎖およびＨ鎖のピークは明らかに存在している。しかし、ＩＲＴのレベルは検出限界より下まで減少している。この知見は、エキソンおよびイントロンの天然作動的関連が変化させられた他のベクターに拡張されている。例えば、図５に記載したＨＣΔＩｎｔｒｏｎ４配列は、同様にＩＲＴを検出可能でないレベルまで減少させる。
【０１２０】
実施例３．抗５Ｔ４コード配列の起源および説明
抗５Ｔ４  Ｈ８を、可溶性５Ｔ４に対するマウスモノクローナル抗体として得た。抗５Ｔ４  Ｈ８抗体を、ＣＤＲグラフト（ＶＨ、ＤＰ７５生殖系列フレームワーク；ＶＬ  ＤＰＫ２４生殖系列フレームワーク）によってヒト化し、可変領域をヒトＩｇＧ４Ｈ鎖定常ドメイン（ＶＨドメインについては）、またはヒトκＬ鎖定常ドメイン（ＶＬドメイン）を含むベクター中に適切にサブクローン化した。ヒト化抗体はｈｕＨ８という。ヒンジを安定化させる変異（Ｓｅｒ  ２４１からＰｒｏ）をヒトＩｇＧ４中に導入した。ｈｕＨ８  Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする配列を、マウスＣＭＶエンハンサー／プロモーターにより駆動され、そして選択マーカー遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｈ鎖発現ベクター）またはネオマイシン耐性（Ｌ鎖発現ベクター）を含む発現ベクター中に連結した。
【０１２１】
実施例４．イントロンの除去はタンパク質発現を増加させる
抗体発現に対するイントロン除去の効果を決定するために、異なる数のイントロンを有するいくつかの抗体の発現構築物を作製した。ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および３つのイントロン（すなわち、ＣＨ１とヒンジ領域との間のイントロン、ヒンジ領域とＣＨ２との間のイントロン、およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン）が欠失されたゲノム配列を含む３つの定常領域発現構築物を用いて、３つの異なる抗体、１２Ａ１１ｖ３．１、３５６Ａ１１およびｈｕＨ８の可変領域をそれぞれＣＨＯ細胞中で安定に発現させた。１２Ａ１１ｖ３．１およびｈｕＨ８のように弱い発現を与えた構築物について、３つのイントロンの除去または全てのイントロンの除去（すなわち、ｃＤＮＡ）は抗体発現の有意な増加を与えた。より詳細には、３つのイントロンを欠失した１２Ａ１１ｖ３．１用の構築物において、ゲノム配列に比較して約５倍の発現の増加が検出された。ｃＤＮＡ配列を有する１２Ａ１１ｖ３．１構築物は、ゲノム配列に比較して６倍を上回る発現の増加を示した。ＣＨＯ細胞におけるｈｕＨ８抗体についての発現の増加は、ゲノム配列と比較して、３つのイントロンが欠失された構築物およびｃＤＮＡ構築物についてそれぞれおよそ４倍および９倍であった。代表的には、良好に発現される抗体は、イントロンを欠失した配列とゲノム配列との間でＣＨＯ細胞発現における有意な変化を示さなかった。
【０１２２】
上記の発明を、理解の明確さの目的のために詳細に記載したが、添付の請求の範囲内で特定の改変が行われ得ることは明らかである。本明細書において引例する全ての刊行物および特許文献ならびに図および配列表に見られる文を、それぞれが個別にそう示されているのと同じ程度まで全ての目的のためにその全体を出典明示で援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、３Ｄ６  ＩｇＧ遺伝子を含む発現ベクターから転写される、予想されるプレｍＲＮＡ（上部）ならびに正確にスプライスされたｍＲＮＡ（中部）およびイントロンリードスルーｍＲＮＡ（下部）を示す。
【図２】図２は、ゲノム５’および３’スプライスジャンクションを示す３Ｄ６  Ｈ鎖発現ベクターのＣＨ２およびＣＨ３定常領域（第４イントロンという）の間のイントロンにわたる核酸配列を示す（配列番号７）。正確（配列番号８）および不正確（配列番号９）にスプライスされたｍＲＮＡ由来のポリペプチドの予測される部分アミノ酸配列もまた示す。ＲＮＡスプライスジャンクションを二重実線により示す。
【図３】図３は、３Ｄ６  Ｈ鎖遺伝子転写の全レベル（ＣＨ２含有ｍＲＮＡ転写物のレベル）、およびイントロン４リードスルー転写のレベルを評価するために使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）プローブの模式図である。
【図４】図４は、培養時間およびタンパク質発現誘導に応答して増加した、イントロン４含有転写物の蓄積を示す棒グラフである。
【図５】図５は、３Ｄ６のイントロンおよびエキソンのゲノム配列、ならびにイントロンリードスルー転写を解決するために開発した発現ベクターにおいて使用される改変配列を示す。
【図６】図６は、改変発現ベクターを用いて形質転換された細胞株におけるイントロンリードスルーＨ鎖副産物の欠如を実証する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す。
【図７】図７は、Ｈ鎖ゲノム構築物におけるイントロンおよびエキソンの配列、構築物、最後の３つのイントロン配列が欠失された構築物ならびにイントロンを含まないｃＤＮＡ構築物を示す。
【図８】図８は、ヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列（それぞれ配列番号１および２）を示す。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれおよそヌクレオチド２３１〜５２４、９１６〜９６０、１０７９〜１４０８および１５０６〜１８２９に位置する（配列番号１）。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれおよそヌクレオチド１〜２３０、およそヌクレオチド５２５〜９１５、およそヌクレオチド９６１〜１０７８、およびおよそヌクレオチド１４０９〜１５０５に位置するヒトＩｇＧ１  Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンに対応する（配列番号１）。
【図９】図９は、ヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列（それぞれ配列番号３および４）を示す。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３をコードするエキソンは、それぞれおよそヌクレオチド２３１〜５２４、９１６〜９５２、１０７１〜１４００および１４９８〜１８２０に位置する（配列番号３）。Ｉｎｔ１、Ｉｎｔ２、Ｉｎｔ３およびＩｎｔ４は、それぞれおよそヌクレオチド１〜２３０、およそヌクレオチド５２５〜９１６、およそヌクレオチド９５３〜１０７０、およびおよそヌクレオチド１４０１〜１４９７に位置するヒトＩｇＧ４  Ｈ鎖ゲノム配列由来のイントロンに対応する（配列番号３）。
【図１０】図１０は、定常領域のＣＨ２とＣＨ３との間のイントロンが欠したヒトＩｇＧ１のゲノムヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図１１】図１１は、以下のイントロンが欠失した改変ヒトＩｇＧ４のゲノムヌクレオチド配列（配列番号６）を示す：ＣＨ１とヒンジとの間のイントロン；ヒンジとＣＨ２との間のイントロン；およびＣＨ２とＣＨ３との間のイントロン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008515438.tif 000010
【図９】
2008515438.tif 000011
【図１０】
2008515438.tif 000012
【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月6日(2007.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008515438000001.app
【国際調査報告】
2008515438.tif 000014
2008515438.tif 000015
2008515438.tif 000016