(57)【要約】  本発明は、例えばＰｏｌＩ及び／又はＰｏｌＩＩプロモーターを含むタンデム転写カセットを含むベクターを用いて、ヘルパーウイルスの非存在下でインフルエンザウイルスを調製するために有用な組成物を提供する。
2008520248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれるｖＲＮＡ産生用の２以上の転写カセットを含む少なくとも１のプラスミド；並びに
ｂ)  以下の：
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれるｍＲＮＡ産生用の１以上の転写カセットを含む少なくとも１のプラスミド
を含む組成物であって、ここで当該組成物がｖＲＮＡについての８個の転写カセットを含み、そして当該組成物を用いた細胞のトランスフェクションが、少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターを産生する、前記組成物。
【請求項２】
８個未満のプラスミドからインフルエンザウイルスを産生するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１のプラスミドがｖＲＮＡ産生のための８個の転写カセットを有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
１のプラスミドがｍＲＮＡ産生用の１個の転写カセットを有し、そして別のプラスミドがｍＲＮＡ産生用の３個の転写カセットを有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ｍＲＮＡ産生用の４個のプラスミドを有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
１のプラスミドがｖＲＮＡ産生用の６個の転写カセットを有し、そして別のプラスミドがｖＲＮＡ産生用の２個の転写カセットを有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
１のプラスミドがｍＲＮＡ産生用の１の転写カセットを有し、そして別のプラスミドがｍＲＮＡ産生用の３個の転写カセットを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ｍＲＮＡ産生用の４個のプラスミドを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
１個のプラスミドが、ｍＲＮＡ産生用の１の転写カセットを有し、そして別のプラスミドがｍＲＮＡ産生用の３個の転写カセットを有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項１０】
ｍＲＮＡ産生用の４個のプラスミドを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
転写終結配列に結合された３'インフルエンザウイルス非コード配列を含む３'インフルエンザウイルス配列に結合された関心のＤＮＡに結合された５'インフルエンザウイルス非コード配列を含む５'インフルエンザウイルス配列に結合されたプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｖＲＮＡ産生用の転写カセットとは異なるプラスミド上に存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｍＲＮＡ産生用の転写カセットとは異なるプラスミド上に存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｖＲＮＡ産生用の転写カセットのうちの一つを有するプラスミド上に存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｍＲＮＡ産生用の転写カセットのうちの一つを有するプラスミド上に存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれるｖＲＮＡ産生用の２以上の転写カセットを含む少なくとも１のプラスミドを含む組成物であって、当該組成物がｖＲＮＡ用の少くとも６個の転写カセットを含み、当該組成物がｖＲＮＡ用の８個の転写カセットを含み、そして、当該組成物を用いた細胞のトランスフェクションが少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす、前記組成物。
【請求項１７】
８個未満のプラスミドからインフルエンザウイルスを産生するための、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
１のプラスミドがｖＲＮＡ産生用の８個の転写カセットを有する、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１のプラスミドがｖＲＮＡ産生用の６個の転写カセットを有し、そして別のプラスミドがｖＲＮＡ産生用の２個の転写カセットを有する、請求項１６又は１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ｍＲＮＡ産生用の１個の転写カセットを有する１のプラスミド、及びｍＲＮＡ産生用の３個の転写カセットを有する別のプラスミドをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ｍＲＮＡ産生用の４個のプラスミドをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
ｍＲＮＡ産生用の１の転写カセットを有するプラスミド、及びｍＲＮＡ産生用の３個の転写カセットを有する別のプラスミドをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
ｍＲＮＡ産生用の４個のプラスミドをさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２４】
転写終結配列に結合された３'インフルエンザウイルス非コード配列を含む３'インフルエンザウイルス配列に結合された関心のＤＮＡに結合された５'インフルエンザウイルス非コード配列を含む５'インフルエンザウイルス配列に結合されたプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｖＲＮＡ産生用の転写カセットとは異なるプラスミド上に存在する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記関心のＤＮＡを含む転写カセットが、ｖＲＮＡ産生用の転写カセットのうちの一つを有するプラスミド上に存在する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＨＡがＡ型ＨＡである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＨＡがＢ型ＨＡである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
感染性インフルエンザウイルスを産生するために十分な量で、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物を細胞と接触させることを含む、インフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項３０】
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれるｖＲＮＡ産生用の２以上の転写カセットを含むプラスミド、並びに
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡについてのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１についてのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２についてのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰについてのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれるｍＲＮＡ産生用の１以上の転写カセットを含むプラスミドと細胞を接触させることを含む、インフルエンザウイルスの製造方法であって、当該細胞がｖＲＮＡ用の８個の転写カセットと接触され、そして当該細胞が少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす、前記方法。
【請求項３１】
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
を含むｖＲＮＡ産生用の転写カセットを含むプラスミドと細胞を接触させることを含む、インフルエンザウイルスの製造方法であって、当該細胞をｖＲＮＡ産生用の８個の転写カセットと接触させ、そして当該細胞が少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターを産生する、前記方法。
【請求項３２】
細胞を２個のプラスミドと接触させることを含むインフルエンザウイルスの製造方法であって、当該２個のプラスミドが、一緒になって以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
を含み、当該細胞がｖＲＮＡ用の８個の転写カセットと接触され、そして当該細胞が少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターを産生する、前記方法。
【請求項３３】
前記細胞が高度にトランスフェクション可能な細胞である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がＶｅｒｏ細胞である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＨＡがＡ型ＨＡである、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＨＡがＢ型ＨＡである、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスを単離することをさらに含む、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
転写終結配列に結合された３'インフルエンザウイルス非コード配列を含む３'インフルエンザウイルス配列に結合された関心のＤＮＡに結合された５'インフルエンザウイルス非コード配列を含む５'インフルエンザウイルス配列に結合されるプロモーターを含む転写カセットをさらに含む、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記関心のＤＮＡがプラスセンス方向である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記関心のＤＮＡがマイナスセンス方向である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記関心のＤＮＡが、病原体の免疫原性ポリペプチド若しくはペプチド又は治療用ポリペプチド若しくはペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ウイルスを単離することをさらに含む、請求項３０〜３６及び３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物と接触された細胞。
【請求項４４】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
を含むインフルエンザウイルス産生用のプラスミドであって、当該プラスミドで細胞をトランスフェクションすることが、少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす、前記プラスミド。
【請求項４５】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
を含むｖＲＮＡ産生用のプラスミドであって、当該プラスミド並びにＨＡ及びＮＡのｖＲＮＡ産生用の転写カセットで細胞をトランスフェクションすることが、少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす、前記プラスミド。
【請求項４６】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
を含む、ｖＲＮＡ産生用のプラスミドであって、当該プラスミドと、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡ産生用の転写カセットで細胞をトランスフェクションすることが、少なくとも１×１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす、前記プラスミド。
【請求項４７】
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
を含むｍＲＮＡ産生用のプラスミドであって、ＮＰをコードしない、前記プラスミド。
【請求項４８】
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡ分節にそれぞれ作用可能なように結合された、ＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡ分節にそれぞれ作用可能なように結合された、ＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡ分節にそれぞれ作用可能なように結合された、ＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡ分節にそれぞれ作用可能なように結合された、ＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
を含むインフルエンザウイルス産生用のプラスミド。
【請求項４９】
請求項４４又は４８に記載のプラスミドを、感染性インフルエンザウイルスを産生するために十分な量で細胞と接触させることを含む、インフルエンザウイルスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(i)ＲＮＡポリメラーゼＩ(ＰｏｌＩ)に基づく転写カセット、及び/又は(ｉｉ)ＲＮＡポリメラーゼＩＩ(ＰｏｌＩＩ)に基づく転写カセット、及び/又は(ｉｉｉ)ＲＮＡ ＰｏｌＩ/ＩＩに基づく転写カセットを１以上のベクター、例えばプラスミド、又は他の直線状の核酸デリバリービヒクル上に含む、タンデム転写ユニット(転写カセット)を含む単離ベクター(ポリヌクレオチド)を提供する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００４年１１月１９日に出願された米国特許出願第60/629,665号の出願日の利益を主張する。当該開示を本明細書に援用する。
【０００３】
政府の権利についての供述
本発明は、米国政府の助成金を用いてなされた(国立アレルギー感染症研究所公衆衛生局の助成金AI047446号)。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザの流行及び蔓延は、人命を奪い続け、そして国際経済に影響を与え続けている。合衆国単独でも、インフルエンザにより毎年推定で５００００人が死亡し(Thompsonら、2003)、一方で国際的な流行が数百万人ものインフルエンザに関連する死者をもたらしうる。過去の例として、１９１８〜１９１９年に全世界で推定４０００万〜５０００万人の死者を出したいわゆる「スペイン風邪」が挙げられる(Potter、1998)。インフルエンザにより与えられる脅威は、近年トリインフルエンザウイルスが人間集団に感染したことに伴いさらに増加した。トリインフルエンザは、ヒトに直接感染することはなく、そして致死的な結果をもたらさないと長らく考えられていた。しかしながら、この認識は、１８人の香港の住人が、Ｈ５Ｎ１亜型の完全トリインフルエンザウイルスに感染し、６人の死者を出した１９９７年に変わった(Subbaraoら、1998；Classら1998)。次の数年にわたり、トリからヒトへの直接的な幾つかの他の感染ケースが報告され(Peirisら、2004；Fouchierら、2004；Koopsmanら、2004)、幾つかのアジアの国における高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの現在進行性の発生を含み、２００５年１月２６日時点で５４人の感染者のうちの４１人の命を奪った(WHO,2004)。高い死亡率及びヒトからヒトへの感染の可能性を伴うヒトのＨ５Ｎ１ウイルスへの感染の増加により、これらのウイルスに対するワクチンの開発が必須となっている。
【０００５】
合衆国において、２個のインフルエンザワクチン：不活性型ワクチン及び弱毒化生ワクチンウイルスがヒト用に認可されている。インフルエンザウイルスワクチンの製品は、ヘマググルチニン(ＨＡ)及びノイラミニダーゼ(ＮＡ)分節を提供する蔓延野生型株と、Ａ／ＰＲ/８/３４(ＰＲ８)ウイルス(卵中で高い増殖性質を提供する弱毒化ヒトウイルス)又は弱毒化表現系を提供する弱毒化生ウイルスのいずれかとを細胞に共感染させることを必要とする再集合に頼っている(Gerdil、2003)。所望される「６+２」再集合体(ＰＲ８又は生弱毒化ウイルスの遺伝的背景において蔓延野生型株のＨＡ及びＮＡ遺伝子分節を含むもの)の選別は、時間がかかり、そして面倒なものである。さらに、再集合及び選別の必要性、並びに幾つかの再集合ウイルスが高タイターになるまで増殖できないことは、ワクチン生産における遅れとなった。
【０００６】
Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルスでは、クローン化されたｃＤＮＡからのこれらのウイルスの生成を可能にする高効率の逆遺伝学システムが現在行われている(Neumannら、1999；Hoffmannら、2002；Fodorら、1999；Hoffmannら、2000)。１のシステム(Neumannら、1999)では、ＲＮＡポリメラーゼＩ(ＰｏｌＩ)プロモーター及びターミネーター配列の制御下における８個のインフルエンザウイルスＲＮＡ分節をコードする８個のプラスミドを、３個のウイルスポリメラーゼ・サブユニットと核タンパク質ＮＰの発現用の４個のＲＮＡポリメラーゼＩＩ(ＰｏｌＩＩ)駆動性プラスミドと共に真核細胞へとトランスフェクションする。これらの４個のタンパク質は、ウイルス複製及び転写の開始に必要とされる。ウイルスｃＤＮＡが一の部位においてＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターに繋がれ、そしてもう一方でＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに繋がれ、同じテンプレートからｖＲＮＡ及びｍＲＮＡが生成されることを可能にする８個のプラスミドに頼る別のシステムが開発された(Hoffmannら、2000）。これらのシステムは、再集合及びスクリーニングの手順を必要とすることなく６＋２再集合体を遺伝子操作により作ることを可能にした。
【０００７】
インフルエンザウイルスワクチンの製造に利用できる哺乳動物細胞系列の数は限られていた。当該細胞系列は、Ｍａｄｉｎ-Ｄａｒｂｙイヌ腎臓(ＭＤＣＫ)細胞(Brandsら、1999；Palacheら、1999；Halperinら、2002) 及びアフリカミドリザル腎臓(Ｖｅｒｏ)細胞(Kistnerら、1998；Kistnerら、1999a；Kistnerら、1999b；Bruhlら、2000) を含む。これらの細胞系列を高い効率でトランスフェクションすることができず、このことはしばしば、インフルエンザウイルスワクチン製品について逆遺伝学システムにおける使用を制限してきたが；Ｖｅｒｏ細胞におけるインフルエンザウイルスの生成が示された(Fodorら、1999；Nicolsonら、2005)。
こうして、インフルエンザウイルスを調製する改善された方法が必要とされる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、(i)ＲＮＡポリメラーゼＩ(ＰｏｌＩ)に基づく転写カセット、及び/又は(ｉｉ)ＲＮＡポリメラーゼＩＩ(ＰｏｌＩＩ)に基づく転写カセット、及び/又は(ｉｉｉ)ＲＮＡ ＰｏｌＩ/ＩＩに基づく転写カセットを１以上のベクター、例えばプラスミド、又は他の直線状の核酸デリバリービヒクル上に含む、タンデム転写ユニット(転写カセット)を含む単離ベクター(ポリヌクレオチド)を提供する。特に、本発明は、感染性マイナス鎖分節ＲＮＡウイルスの調製用組成物であって、ウイルス産生用のウイルス遺伝子を含む８未満のプラスミドを有する組成物に有用なプラスミドを提供する。例えば、本発明の組成物は、インフルエンザウイルス遺伝子を有する１、２、３、４、５、６、７個のプラスミドを含み、当該組成物はひとたび細胞に導入されると、感染性のインフルエンザウイルスを産生する。こうして、一の実施態様では、ウイルス生成用のプラスミドの数を低減する逆遺伝学的システムを提供するために、それぞれインフルエンザウイルスＲＮＡの合成のための最大８個のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを１のプラスミド上に組合せ、そして３個のインフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニット用の最大３個の転写カセットを１のプラスミド上に組み立てた。以下に記載される様に、本アプローチはＶｅｒｏ細胞中でＡ型インフルエンザウイルスの十分かつ多くの生成を可能にした。
【０００９】
例えば、本発明は、以下のカセット：
(ｉ)  ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター、インフルエンザウイルスＲＮＡについてのｃＤＮＡ(マイナス又はプラスセンスの向き)、及びＲＮＡ ＰｏｌＩターミネーター；
(ｉｉ)  ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター、インフルエンザウイルスＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及び／又はＮＰタンパク質についてのＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナル(ＲＮＡ ＰｏｌＩＩ転写終結配列)、及び／又は
(ｉｉｉ)  ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡ ＰｏｌＩ転写終結配列、インフルエンザウイルスＲＮＡについてのｃＤＮＡ(プラスセンスの向き)、ＲＮＡポリメラーゼＰｏｌＩプロモーター、及びＲＮＡ ＰｏｌＩＩ転写終結配列
のうちの１以上といったタンデム転写カセットを含むプラスミドなどのベクターを含む。効率的にトランスフェクションされる細胞系列において、これらのアプローチは、トランスフェクションされた細胞から得られた上清１ｍｌあたり１０8のウイルスを産生した。
【００１０】
本明細書に記載されるベクター及び/又は転写カセットの組合せは、例えば現在蔓延しているウイルス由来のＨＡ及びＮＡと組み合わせたいわゆる「内部遺伝子(internal gene)」(つまり、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ)を利用して、弱毒化インフルエンザ生ワクチンウイルスを生成するのに有用である。例えば、Ｈ５Ｎ１ウイルスは卵中で増殖することができず、そうしてこれらの遺伝子を含む転写カセットはＨ５Ｎ１ワクチンウイルスを生成するのに特に有用である。一の実施態様では、転写カセット内のＨＡはＡ型ＨＡである。別の実施態様では、転写カセット内のＨＡはＢ型ＨＡである。さらに別の実施態様では、Ｃ型インフルエンザウイルス由来の遺伝子が使用される。一の実施態様では、ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターはヒトＲＮＡＰｏｌＩプロモーターである。一の実施態様では、ＮＡ ｃＤＮＡは、ＮＢ配列をさらに含む。一の実施態様では、組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＢＭ２ ｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットをさらに含む。
【００１１】
一の実施態様では、一のプラスミド上にインフルエンザウイルスの生成用の８個全てのＲＮＡ ＰｏｌＩ転写カセットを組み合わせることにより、ウイルスは５個のプラスミド、つまり８個全てのｖＲＮＡの合成用の１個のプラスミド及びポリメラーゼタンパク質及びＮＰタンパク質の合成用の４個のプラスミド、から生成することができる。別の実施態様では、ポリメラーゼ及びＮＰタンパク質の合成用の４個のＲＮＡ ＰｏｌＩＩ転写カセットを１のプラスミド上に組み合わせることにより、ウイルスは、２個のプラスミド、つまり、８個のｖＲＮＡ合成用の１個のプラスミド並びにポリメラーゼタンパク質及びＮＰタンパク質の合成用の１個のプラスミドから生成することができる。さらなる実施態様では、ポリメラーゼタンパク質の合成用の３個のＲＮＡ ＰｏｌＩＩ転写カセットを１個のプラスミド上に組み合わせ、１個のプラスミド上のＮＰタンパク質用のＲＮＡ ＰｏｌＩＩ転写カセット、及び８個全てのｖＲＮＡの合成用のプラスミドを用いて、ウイルスは３個のプラスミドから生成することができる。別の実施態様では、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡ生成用の４個のＲＮＡ ＰｏｌＩ転写カセット並びにＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの生成用の４個のＲＮＡ ＰｏｌＩ/ＩＩ転写カセットを１のプラスミド上に組み立てることにより、インフルエンザウイルスは１個のプラスミドから生成することができる。
【００１２】
任意の適切なプロモーター又は転写終結配列が、タンパク質、例えばウイルスタンパク質、非ウイルス病原体タンパク質、又は治療用タンパク質、或いはｖＲＮＡを発現するために使用されてもよい。こうして、一の実施態様では、単離及び精製されたベクター、例えばプラスミドであって、インフルエンザウイルスタンパク質を発現するかコードし、又はインフルエンザｖＲＮＡ（天然型及び組換え型ｖＲＮＡの両方）を発現するかコードするものを提供する。好ましくは、当該プロモーターは、特定の宿主細胞、例えばトリ又は哺乳動物宿主細胞、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、又は霊長類の細胞、例えばヒト細胞において発現するのに、又は好ましくは１より多くの宿主において発現するのに適している。
【００１３】
一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生用の１以上のベクターは、非限定的に、ＲＮＡ ＰｏｌＩ プロモーター、例えばヒトＲＮＡ ＰｏｌＩ プロモーターなど、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモーターなどのプロモーターを含む。ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーターを含むｖＲＮＡ用のベクターでは、当該ベクターは場合によりリボザイム配列を含む(PCT/US04/016649を参照のこと。当該文献の開示は本明細書に援用される)。ｖＲＮＡベクター用の好ましい転写終結配列は、非限定的にＲＮＡ ＰｏｌＩ転写終結配列、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩ転写終結配列、又はリボザイムを含む。１のプラスミドにおける又は一緒に使用されるプラスミドの組み合わせにおける各ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーターは、同じであるか又は異なっていてもよい。１のプラスミドにおける又は一緒に使用されるプラスミドの組み合わせにおける各ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターは、同じであるか又は異なってもよい。同様に、プラスミド又は一緒に使用されるプラスミドの組み合わせにおける各ＲＮＡ ＰｏｌＩ転写終結配列は、同じであるか又は異なってもよい。さらにプラスミド又は一緒に使用されるプラスミドの組み合わせにおける各ＲＮＡ ＰｏｌＩ転写終結配列は同じであるか又は異なってもよい。１２未満のプラスミド、例えば１０未満のプラスミドを使用することは、１０2ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０3ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０4ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０5ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０6ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０7ＴＣＩＤ50／ｍＬ、１０8ＴＣＩＤ50／ｍＬ又はそれ以上のタイターをもたらすことができる。
【００１４】
一の実施態様では、１以上、例えば２、３、４、５、６、７、又は８個のウイルス分節についてのｃＤＮＡは、各々ＲＮＡ ＰｏｌＩ終結配列及びプロモーター配列に繋げられており、そして当該転写カセットは次に、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター及びＲＮＡ ＰｏｌＩＩポリアデニル化シグナルにより繋がれている(図４のＮＰ遺伝子について例示される)。このアプローチは、ｖＲＮＡ(ＲＮＡ ＰｏｌＩにより合成される)及びｍＲＮＡ(ＲＮＡ ＰｏｌＩＩにより合成される)の両方を同じテンプレートから産生する。こうして、ウイルスタンパク質の合成用のさらなるプラスミドは、もはや必要ではなく、インフルエンザウイルス生成に必要とされる転写カセット数を低減する。各ｖＲＮＡ／タンパク質コードカセットにおけるＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター及び／又はＲＮＡ ＰｏｌＩ転写終結配列並びに／或いはＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター及び／又はＲＮＡＰｏｌＩＩ終結配列は、他のカセットと同じであっても又は異なってもよい。
【００１５】
さらに別の実施態様では、本発明は、２個のプラスミド、ＨＡ ｖＲＮＡ及びＮＡ ｖＲＮＡの生成用の１のプラスミドとＭ ｖＲＮＡ及びＮＳ ｖＲＮＡの生成用の１のプラスミド、の組み合わせ、並びに４個のＲＮＡ ＰｏｌＩ／ＩＩ転写カセット(ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの合成用)を含む１のプラスミドを含み、３個のプラスミドからのウイルス生成を可能にするか、或いはＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡ用の１のプラスミド、ＨＡ ｖＲＮＡ用の１のプラスミド、ＮＡ ｖＲＮＡ用の１のプラスミド、及びポリメラーゼ及びＮＰタンパク質の合成用の１のプラスミドを含み、４個のプラスミドからのウイルス生成を可能にする。別の実施態様では、本発明は、６個のｖＲＮＡ、例えば、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡ、の生成用の１のプラスミドを含み、２個のｖＲＮＡ、例えばＨＡ及びＮＡのｖＲＮＡ、の生成用の１のプラスミド、並びにＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰについてのタンパク質産生用の４個のプラスミドを含み、６個のプラスミドからのウイルス生成を可能にする。さらなる実施態様では、本発明は、６個のｖＲＮＡ、例えばＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡの生成用の１のプラスミド、２個のｖＲＮＡ、例えばＨＡ及びＮＡ ｖＲＮＡの生成用の１のプラスミド、及びＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡのタンパク質の産生用の１のプラスミド、並びにＮＰのタンパク質の産生用の１のプラスミドを含み、４個のプラスミドからのウイルス産生を可能にする。
【００１６】
本発明の組成物及び／又は方法において有用な他のベクターは、関心のＤＮＡ、例えば予防又は治療用タンパク質についての関心の遺伝子又はオープンリーディングフレーム(コード領域)であって、ウイルス配列及び場合によりＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列に、及び／又はＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列に繋がれているＤＮＡを含む。関心のＤＮＡは、プロモーターに対してプラスセンス又はマイナスセンスの向きであってもよい。関心のＤＮＡは、ｖＲＮＡ産生又はタンパク質産生用のベクターの中であろうとなかろうと、癌の治療又はワクチン又は遺伝子治療において有用なエピトープなどの免疫原性エピトープをコードしうる。一の実施態様では、関心のＤＮＡは全長インフルエンザウイルスｃＤＮＡ又はインフルエンザウイルスＤＮＡのコード領域であり、例えば、Ａ型インフルエンザ(例えば１５個のＨＡ又は９個のＮＡのうちのいずれかを含む任意のＡ型インフルエンザ遺伝子)、Ｂ型又はＣ型のＤＮＡである(Fields Virology (Fieldsら編), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)の４５章及び４６章を参照のこと。当該文献は特異的に本明細書に援用される)が、任意の起源、例えば任意のウイルス由来の遺伝子が本発明のベクター又は方法において使用されうるということが想定される。こうして、本発明の組成物は、転写終結配列に結合された３’インフルエンザウイルス非コード配列を含む３’インフルエンザウイルス配列に結合された関心の異種ＤＮＡ、つまり、自然においてインフルエンザ配列に結合されることが見られないか、又は自然界において見られる結合とは異なる結合で結合されたＤＮＡ、に結合された５’インフルエンザウイルス非コード配列を含む５’インフルエンザウイルス配列に結合されたプロモーターを含む転写カセットもさらに含む。一の実施態様では、関心のＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼ転写終結配列に作用可能なように結合される。
【００１７】
一の実施態様では、関心のＤＮＡは、病原体の免疫原性ポリペプチド又はペプチド、或いは治療用ポリペプチド又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。一の実施態様では、当該関心のＤＮＡは、ＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列に作用可能なように結合される一方、別の実施態様では、関心のＤＮＡは、ＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列に作用可能なように結合される。さらに別の実施態様では、関心のＤＮＡはＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列に、並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列に作用可能なように結合される。関心のＤＮＡを含む転写カセットは、少なくとも１の他の転写カセットと同じプラスミド上に存在してもよく、又は他の転写カセットとは異なるプラスミド上に存在してもよい。ウイルス調製にあたり、関心ＤＮＡは、インフルエンザウイルスのオープンリーディングフレーム又はその一部と置き換えられてもよく、又は全てのインフルエンザウイルスのオープンリーディングフレームに加えて存在してもよい。
【００１８】
本発明はまた、関心の異種ＤＮＡをインフルエンザウイルスベクターに導入することによりウイルス、例えばインフルエンザウイルスを調製又は遺伝子をデリバリーする方法を提供する。例えば、当該方法は、細胞を本発明の複数の転写カセットと連続的に又は同時に接触させることを含み、例えば本発明の組成物を、感染性インフルエンザウイルスを産生するために効果的な量で使用することを含む。本発明はまた、組成物と接触させた細胞からウイルスを単離することも含む。こうして、本発明はさらに、本発明の組成物又はウイルスと接触された宿主細胞を提供する。他の実施態様では、本発明は、細胞を１以上のベクター、ｖＲＮＡ又はタンパク質産生ベクターのいずれか、と接触させることを含む。
【００１９】
本発明の方法は、例えば弱毒化突然変異をウイルスゲノム中に導入することにより、マイナス鎖ウイルス、例えばインフルエンザウイルスの簡単な取り扱いを可能にする。さらに、インフルエンザウイルスが強力な液性及び細胞性免疫を導入するので、本発明は、連続的に使用でき、遺伝子治療について繰り返しの使用を可能にするワクチンベクターとして、特に当該ウイルスの天然のバリアントの利用性の点でこれらのウイルスを極めて優れたものとする。
【００２０】
ヘルパーウイルスの感染を必要としない本明細書に記載されるウイルスの製造方法は、ウイルス突然変異誘導試験において、及び(例えば、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペス、及び口蹄病用の)ワクチンの生成において、及び(癌、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチン・トランスカルバミラーゼ欠損症、及び中枢神経系の腫瘍用の)遺伝子治療ベクターに有用である。こうして、薬物療法において使用するため (例えば、ワクチン又は遺伝子治療用)のウイルスが提供される。
【００２１】
本発明は、病原体、例えば細菌、ウイルス、又は寄生虫、又は悪性腫瘍に対して個体を免疫化する方法も提供する。本方法は、本発明の少なくとも１の単離ウイルスの量であって、個体を免疫化するために有効な量を、場合によりアジュバントと組み合わせて投与することを含む。当該ウイルスは、病原体又は腫瘍特異的ポリペプチドによりコードされるポリペプチドの配列を含むｖＲＮＡを含む。
【００２２】
内在性タンパク質の量の低下又は欠乏により特徴付けられる疾患又は適応症を患う哺乳動物において内在性タンパク質の発現を増加又は増大させる方法を提供する。当該方法は、哺乳動物において内在性タンパク質の量を増加又は増大させるために有効な本発明の単離ウイルスの量を当該哺乳動物に投与することを含む。当該ウイルスは、内在性タンパク質の量を増大又は増加させるポリペプチドについてのｖＲＮＡを含む。好ましくは、当該哺乳動物はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
定義
本明細書に使用されるとき「単離及び／又は精製」は、本発明のプラスミド、又は本発明のウイルスなどの核酸分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製、単離、及び／又は精製を指し、ｉｎ ｖｉｖｏ物質を伴わないか、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ物質から実質的に精製されている。単離されたウイルス調製品は、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養及び増殖により取得され、そして実質的に他の感染性物質を含まない。本明細書に使用される場合、「実質的に含まない」は、特定の感染性物質についての標準検出方法を用いて当該物質を検出するレベル以下であることを意味する。 「組換え」ウイルスは、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて、ウイルスゲノムに変異を誘導するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されるか、又はそうでなければ人工的に生成されたウイルスである。本明細書に使用されるとき、「組換え核酸」又は「組換えＤＮＡ配列又は断片」という用語は、ソースから得られるか又は単離された核酸、例えばＤＮＡであって、次にｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的に変異され、その結果その配列が自然のものではないか、又は本来のゲノム中に配置されるようには配置されていない天然配列に相当するＤＮＡを指す。ソース「由来の」ＤＮＡの例は、有用な断片として同定される配列であり、そして実質的に純粋な形態で化学的に合成された配列であろう。ソースから単離されたこのようなＤＮＡの例として、化学的方法、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用、により当該ソースから切除又は取り出され、そうして当該ＤＮＡが遺伝子工学の方法論により、本発明に用いるためにさらに操作、例えば増幅、されうるＤＮＡが挙げられる。
【００２４】
本明細書に使用される「高度にトランスフェクション可能な細胞」は、例えば、トランスフェクションされた細胞におけるタンパク質発現により計測される場合、１のプラスミドを用いたトランスフェクション効率が約９５％に達する細胞、及び／又は非弱毒化インフルエンザのウイルス産生用のインフルエンザウイルス遺伝子を有する５より多いプラスミドを用いたトランスフェクションが、トランスフェクションの２日後に少なくとも約１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌのウイルスタイターを産生するか、又は弱毒化ウイルスが約１０2ＴＣＩＤ50／ｍｌのウイルスタイターをもたらす細胞である。代表的な高度にトランスフェクション可能な細胞は、非限定的に２９３Ｔ細胞を含む。対照的に、本明細書に使用される「低いトランスフェクション効率の細胞」は、一のプラスミドを用いた転写効率が約５０％未満である細胞、及び／又は非弱毒化インフルエンザウイルスのウイルス産生用のインフルエンザウイルス遺伝子を有する５超のプラスミドを用いたトランスフェクションが、トランスフェクションの２日後に約３×１０5ＴＣＩＤ50／ｍｌ未満のウイルスタイターを産生する細胞である。低いトランスフェクション効率を有する代表的な細胞は、非限定的に、Ｖｅｒｏ細胞及びＭＤＣＫ細胞を含む。
【００２５】
マイナスセンスＲＮＡウイルス
マイナスセンスＲＮＡウイルスは、一般的なヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、及びエボラウイルス、並びに家禽及び畜牛産業に大きな経済的影響を与える動物ウイルス(例えば、ニューキャッスル病ウイルス及び牛疫ウイルス)を含む７種の科(ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、及びアレナウイルス科)に分類される。最初の４科は、分節がないゲノムにより特徴付けられ、一方後者の３科は、それぞれ、６〜８個、３個、又は２個のマイナスセンスＲＮＡ分節から構成されるゲノムを有する。マイナスセンスＲＮＡウイルスの一般的な特徴は、そのＲＮＡゲノムのマイナス極性(negative polarity)にあり、つまり、ウイルスＲＮＡ(ｖＲＮＡ)がｍＲＮＡに相補し、その結果それ自身では感染性がない。ウイルス転写及び複製を開始するために、ｖＲＮＡは、それぞれウイルスポリメラーゼ複合体及び核タンパク質によりプラスセンスｍＲＮＡ又はｃＲＮＡに転写させなければならず、Ａ型インフルエンザウイルスでは、当該ウイルスポリメラーゼ複合体は３種のポリメラーゼタンパク質：ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡから構成される。ウイルス複製の間、ｃＲＮＡは新たなｖＲＮＡ分子の合成のためのテンプレートとしての役割を果たす。全てのマイナス鎖ＲＮＡウイルスでは、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの５'及び３'末端の両方における非コード領域は、ウイルスゲノムの転写及び複製に決定的である。細胞性又はウイルス性ｍＲＮＡ転写産物とは異なって、ｃＲＮＡ及びｖＲＮＡの両者は、５'末端でキャップ化されていないし、３'末端でポリアデニル化されていない。
【００２６】
多くのウイルスタンパク質の基礎的機能は、生物化学的に及び／又はウイルス感染の観点で解明されてきている。しかしながら、逆遺伝学的システムは、そのウイルス複製及び病原性に関して、並びに生弱毒化ウイルスワクチンの開発に関して、マイナス鎖分節性及び非分節性ＲＮＡウイルスについての我々の知識を劇的に増大させた。逆遺伝学という用語が分子ウイルス学において使用される場合、逆遺伝学はクローン化されたｃＤＮＡに由来するゲノムを有するウイルスを生成することとして定義される(参考として、Neumannら、2002を参照のこと)。
【００２７】
インフルエンザウイルス
Ａ型インフルエンザウイルスは、全体で１０〜１１個のタンパク質をコードする８個の一本鎖マイナスセンスウイルスＲＮＡ(ｖＲＮＡ)のゲノムを有する。インフルエンザウイルスの生活環は、宿主細胞表面上のシアル酸含有受容体にヘマググルチニン(ＨＡ)を結合させ、続いて受容体媒介性のエンドサイトーシスを起こすことから始まる。後期エンドソーム内の低いｐＨが、ＨＡの立体構造の変化を引き起こし、それによりＨＡ２サブユニット(いわゆる融合ペプチド)のＮ末端が外に晒される。当該融合ペプチドは、ウイルス及びエンドソーム膜の融合を開始し、そしてマトリックスタンパク質(Ｍ１)及びＲＮＰ複合体が細胞質中に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシドで包み込む核タンパク質(ＮＰ)、及びＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２タンパク質により形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。ＲＮＰは核内に輸送され、ここで転写及び複製が行われる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３種の異なる反応：５'キャップ及び３'ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補的ＲＮＡ(ｃＲＮＡ)の合成、及びｃＤＮＡをテンプレートとして用いたゲノムｖＲＮＡの合成を触媒した。新たに合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ、及びポリメラーゼタンパク質は、次にＲＮＰに組み立てられ、核から輸送され、そして細胞質膜へと輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の出芽が生じる。ノイラミニダーゼ(ＮＡ)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を取り除き、そうして新たに集まったビリオンを細胞膜から放出し、そしてウイルス粒子の自己凝集を予防することにより感染において重大な役割を果たす。ウイルス集合は、タンパク質-タンパク質及びタンパク質-ｖＲＮＡ相互作用に関与するが、これらの相互作用の性質は大部分知られていない。
【００２８】
Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスは、構造的及び機能的にＡ型インフルエンザウイルスに類似しているが、いくらかの違いが存在する。例えば、Ｂ型インフルエンザのＭ分節は、２個のタンパク質Ｍ１及びＢＭ２を、タンデム・シストロンの終結-再開スキームを介してコードしており、そしてＮＡ分節は、２シストロン(bicistronic)のｍＲＮＡからＮＡ及びＮＢタンパク質をコードしている。７個のｖＲＮＡ分節を有するＣ型インフルエンザウイルスは、Ｍ１タンパク質を産生するスプライシングされた転写産物に頼り、スプライシングされていないｍＲＮＡの産物は、タンパク質分解により切断されてＣＭ２タンパク質を産生する。さらにＣ型インフルエンザウイルスは、個々のＨＡ及びＮＡタンパク質ではなくＨＡエステラーゼをコードする。
【００２９】
トゴトウイルス
トゴトウイルス(ＴＨＯＶ)は、オルソミクソウイルス科の新たな属を代表する。当該ウイルスはダニにより伝播され、そして家畜動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、及びウシにおいて見つかっている。結果として、ＴＨＯＶはダニ及び脊椎動物細胞中で複製することができる。ＴＨＯＶゲノムは、一本鎖、マイナス-センスＲＮＡの６個の分節を含む。大きい方から３個の分節によりコードされるタンパク質は、インフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡに対しかなりの相同性を示す。第５分節は、インフルエンザウイルスＮＰに関するタンパク質をコードする。第４分節によりコードされるＴＨＯＶ糖タンパク質は、インフルエンザウイルスＨＡ又はＮＡのいずれにも相同しないが、バキュロウイルス糖タンパク質に対し配列類似性を示す。最小の分節は、マトリックスタンパク質をコードすると考えられ、そしてインフルエンザウイルスタンパク質のいずれにも類似しない。インフルエンザウイルスと同様に、ｖＲＮＡの３'及び５'末端の両方が、プロモーター活性に必須であり、そして当該活性はそれぞれｖＲＮＡの３'及び５'末端の１４及び１５個の末端ヌクレオチドに位置する。
【００３０】
ＴＨＯＶのｍＲＮＡ合成は、宿主細胞由来のキャップ構造により刺激される。しかしながら、インフルエンザウイルスとは対照的に、(さらなるヌクレオチドを伴わない)キャップ構造のみが、細胞性ｍＲＮＡから切断される(Alboら、1996；Leahyら、1997；Weberら、1996)。ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより、ｖＲＮＡの５'及び３'末端の両方が、エンドヌクレアーゼ活性に必須であるということが明らかにされた(Leahyら、1998)が、インフルエンザウイルスについて示されたように(Hagenら、1994)、モデルｃＲＮＡプロモーターを加えることはエンドヌクレアーゼ活性を刺激しない。インフルエンザウイルスについて提示されたコークスクリュー構造に類似する「フック」構造が、ＴＨＯＶについて提示された(Leahyら、1997；Weberら、1997)。しかしながら、当該フック構造は、ＴＨＯＶ ｖＲＮＡプロモーターにおいてのみ見られる。ｃＲＮＡプロモーター配列は、ｃＲＮＡの５'末端における２位と９位との間及び３位と８位との間の塩基対の形成を許容しない。これらのヌクレオチド間の塩基対形成を許容する３位又は８位における変異は、エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、このことは、提示された「フック」構造についての証拠をつよく支持する(Leahyら、1998)。さらに、当該構造は、ＴＨＯＶ生活環の制御に重要であるようであり；「フック」構造を形成するｖＲＮＡプロモーターは、ＰＢ２エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、それにより転写を可能にする。対照的に、ｃＲＮＡプロモーターは、「フック」構造を形成せず、そしてその結果エンドヌクレアーゼ活性を刺激できず、そうして複製がもたらされる。
【００３１】
ブンヤウイルス
ブンヤウイルス科は、ヒトにおいて出血性又は脳炎性の熱(例えば、リフトバレー熱、ハンタ熱、ラクロス熱(La Crosse)、及びクリミア-コンゴ出血熱)を引き起こす幾つかのウイルスを含む。球状かつエンベロープされたビリオンは、一本鎖マイナスセンスＲＮＡの３つの分節を含む。最も大きい分節(Ｌ)は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼタンパク質(Ｌタンパク質)をコードする一方、Ｍ分節は２個のウイルス糖タンパク質Ｇ１及びＧ２、並びに非構造タンパク質(ＮＳｍ)をコードする。最小の分節（Ｓ）は、ヌクレオキャプシドタンパク質及び第二非構造タンパク質(ＮＳｓ）をコードする。ウイルス複製及び転写は、細胞質で行われ、そして新たに集まったビリオンがゴルジ体の膜から出芽する。
【００３２】
Bridgen＆Elliott(1996)は、クローン化されたｃＤＮＡから感染性ブニヤンベラウイルスを完全に生成する逆遺伝学システムを確立させた。彼らは、Schnellら(1994)によりラビエスウイルスについて最初に記載された戦略：つまり、ウイルスポリメラーゼ及び核タンパク質を発現する細胞内で、プラスセンス・アンチゲノムＲＮＡ(マイナスセンスゲノムＲＮＡではない)をコードするｃＤＮＡを細胞内転写させる戦略に従った。Bridgen & Elliott(1996)は、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスをＨｅＬａＴ４＋細胞に感染させ、そしてＳ、Ｍ、及びＬ分節によりコードされるタンパク質を発現するプラスミドをこれらの細胞にトランスフェクションさせた。彼らは次に、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター及びデルタ肝炎ウイルスリボザイムに繋がれた全長アンチゲノムｃＤＮＡをコードする３個のプラスミドを細胞にトランスフェクションさせた。ワクシニアウイルス粒子の数に対するブンヤウイルス粒子の数を増大させるために、この著者は、ブニヤンベラウイルスは複製できるが、ワクシニアウイルスは複製できない蚊の細胞を用いた。このプロトコルは、一般的にブニヤンベラ株を生成するためだけではなく、異なるブニヤンベラ株と細胞を共感染させることにより容易に取得することができない再集合体ウイルスを生成するためにも使用することができる。
【００３３】
ブンヤウイルスプロモーターエレメント及び転写及び複製に必要とされるウイルスタンパク質を研究するために、Dunnら、(1995)は、ブニヤンベラＳ ＲＮＡ分節の５'と３'の非翻訳領域とのあいだにマイナスセンスの向きにＣＡＴをクローン化した。Ｌ及びＳ分節によりコードされるタンパク質を発現する構築物を細胞にトランスフェクションし、次にＣＡＴ活性をもたらすｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡをトランスフェクションした。ブンヤウイルスＳ断片は、２つのタンパク質、Ｎ及びＮＳｓを、重なり合うリーディングフレーム内にコードする。これらの両方のタンパク質が転写及び複製に必要とされるのかを決定するために、Ｎ又はＮＳｓのみを発現する構築物をＣＡＴ活性について試験した。Ｌタンパク質と共にＮタンパク質を発現することは、ＣＡＴ活性をもたらした一方、ＮＳｓ発現構築物ではＣＡＴ活性が検出されなかった。こうして、Ｌ及びＮタンパク質は、ブンヤウイルス様ＲＮＡの転写及び複製に十分である。
【００３４】
インフルエンザ・ウイルスと同様に、ブンヤウイルスＲＮＡの末端配列は、相補的であり、そして高度に保存されている。これらの配列エレメントが、ブンヤウイルスプロモーターを規定し、そしてプロモーター活性に必須であるということがさらに想定される。ウイルスＲＮＡの３'末端において５個のヌクレオチドの欠失は、ＣＡＴ発現を劇的に低下させた(Dunnら、1995)。対照的に、２個のヌクレオチドを５'末端に加え、又は１１又は３５個のヌクレオチドを３'末端に加えることは、ＣＡＴ発現をなくすことはない(Dunnら、1995)。その結果、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体と同様に、ブンヤウイルスポリメラーゼタンパク質は、明らかに内因的に転写及び／又は複製を開始することができる。
【００３５】
本発明の組換えインルフエンザウイルスベクター
本明細書に記載されるベクターの使用は、インフルエンザウイルスなどの分節ウイルスの生成に必要とされるプラスミドの数を低減させ、高効率でトランスフェクションできる細胞系列中のインフルエンザウイルスのレスキュー効率を増加させて、極度に弱毒化されたウイルスの生成を可能にし、及び／又は高効率でトランスフェクションすることができない細胞系列、例えばヒトワクチンの産生用の細胞系列(例えば、Vero細胞)でのインフルエンザウイルスの生成を可能にする。従って、本発明のベクターの使用は、ウイルス生成についての変数の数を低下させ、インフルエンザウイルスのより一定した生成をもたらし、そしてプラスミドの履歴(history)、純度、及び毒性について適切な文書を提供する労力を低減した。これらの利点は、特に流行病に対するワクチンウイルスの迅速な生成を可能にする。さらに、本明細書に開示される発明は、インフルエンザウイルスに限られず、任意の他のアンチセンスＲＮＡウイルス、例えばパラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、レオウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤンベラウイルス科に適用することができる。
【００３６】
本発明は、１以上のベクター及び／又は２以上の転写カセットを含む以下の単離され及び／又は精製されたベクター又は組成物のうちの少なくとも１を提供する：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢＩのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列及びＰｏｌＩＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列及びＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット。
【００３７】
本発明のベクターは、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢｌのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長ＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含んでもよい。
【００３８】
一の実施態様では、本発明のベクターは、以下の：
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれる２以上の転写カセットを含む。
【００３９】
別の実施態様では、本発明のベクターは、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる少なくとも２個の転写カセットを含む。
【００４０】
本発明は、以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
から選ばれる少なくとも２の転写カセットを有するベクターをさらに含む。
【００４１】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含むベクターがさらに提供される。
【００４２】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含むベクターが提供される。
【００４３】
一の実施態様では、本発明は以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢｌのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢｌのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡ分節、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
を含む１以上の転写カセットを含む単離及び／又は精製ベクターを提供する。
【００４４】
本発明の典型的な組成物
本発明は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれるｖＲＮＡ産生用の２以上の転写カセットを含む少なくとも１のプラスミド；並びに、以下の：
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれるｍＲＮＡ産生用の１以上の転写カセットを含む少なくとも１のプラスミド
を含む組成物を提供する。一の実施態様では、各ＰｏｌＩプロモーターは同じである。一の実施態様では、各ＰｏｌＩＩプロモーターは同じである。一の実施態様では各ＰｏｌＩ転写終結配列は同じである。一の実施態様では、各ＰｏｌＩＩ転写終結配列は同じである。
【００４５】
一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、インフルエンザウイルスＨＡ、インフルエンザウイルスＮＰ、インフルエンザウイルスＮＡ、インフルエンザウイルスＭ、及びインフルエンザウイルスＮＳ分節用の転写カセットを含む。一の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、又はインフルエンザウイルスＮＰ用の２以上の転写カセットを含み、例えば当該ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、及びインフルエンザウイルスＮＰ用のカセットを含む。一の実施態様では、当該ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドが、３個のカセットを含み、ここで当該組成物はさらにＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザ遺伝子のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを有するｍＲＮＡ産生用の第３のプラスミドをさらに含み、ここで第３プラスミドにおけるＤＮＡコード領域は、３個のカセットを含むプラスミド上に存在しないインフルエンザウイルス遺伝子のためのものであり、例えば、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドがインフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２用のカセットを含み、そして第３のプラスミドがインフルエンザウイルスＮＰ用のカセットを含む。別の実施態様では、ｖＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、インフルエンザウイルスＮＰ、インフルエンザウイルスＭ、及びインフルエンザウイルスＮＳ用の転写カセットを含む。ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及びＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、を含むｖＲＮＡ産生用のプラスミドも含まれ、例えば、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、及びインフルエンザウイルスＮＰ用のカセットを含む。他の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、３個のカセットを含み、ここで当該組成物は、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルス遺伝子のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを有するｍＲＮＡ産生用の第３プラスミドをさらに含み、ここで、当該第３プラスミド中のＤＮＡコード領域は、３個のカセットを含むプラスミド上に存在しないインフルエンザウイルス遺伝子のためのものであり、例えば当該ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２用のカセットを含み、そして第３プラスミドはインフルエンザウイルスＮＰ用のカセットを含む。
【００４６】
一の実施態様では、本発明の組成物は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
を含むプラスミドを含む。一の実施態様では、転写カセット内のＨＡはＡ型ＨＡである。別の実施態様では、転写カセット内のＨＡはＢ型ＨＡである。一の実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。一の実施態様では、転写カセット内のＮＡ分節は、Ｂ型ＮＡ分節、つまりＢ型インフルエンザウイルスのＮＡ及びＮＢタンパク質の両者についての１の分節、である。一の実施態様では、当該組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えばＭ１及びＢＭ２の両者のうちの一のｃＤＮＡ、に作用可能なように結合されるＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットをさらに含む。
【００４７】
以下の：
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれる２以上の転写カセットを含むプラスミドを含む組成物も提供される。
【００４８】
他の実施態様では、本発明は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセット；並びに以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されるＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、並びにＰｏｌＩ! プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び
インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを含むプラスミドを含む組成物を提供する。一の実施態様では、転写カセット内のＨＡは、Ａ型ＨＡである。別の実施態様では、転写カセット内のＨＡは、Ｂ型ＨＡである。一の実施態様では、ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターは、ヒトＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターである。一の実施態様では、転写カセット中のＮＡのｃＤＮＡは、Ｂ型ＮＡのｃＤＮＡ、つまり、ＮＡ及びＮＢを有するｃＤＮＡである。一の実施態様では、当該組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えばＭ１及びＢＭ２を有するｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットをさらに含む。
【００４９】
インフルエンザウイルスＰＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、並びに
インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
を含むプラスミドを含む組成物がさらに提供される。
【００５０】
以下の：ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含むｖＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミド；並びに以下の：
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを含むｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドを含む組成物も含まれる。
【００５１】
一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、インフルエンザウイルスＨＥＦ、インフルエンザウイルスＮＰ、インフルエンザウイルスＭ、及びインフルエンザウイルスＮＳ分節についての転写カセットを含む。一の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、又はインフルエンザウイルスＮＰについての２以上の転写カセット、例えば、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、及びインフルエンザウイルスＮＰについてのカセットを含む。一の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、３個のカセットを含み、ここで当該組成物はさらに、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスについてのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを有するｍＲＮＡ産生用第３プラスミドを含み、ここで当該第３プラスミド内のＤＮＡコード領域は、３個のカセットを含むプラスミド上に存在しないインフルエンザウイルス遺伝子のためのものであり、例えば当該ｍＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２についてのカセットを含み、そして第３プラスミドはインフルエンザウイルスＮＰについてのカセットを含む。一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生用の少なくとも１のプラスミドは、インフルエンザウイルスＰＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１、インフルエンザウイルスＰＢ２、インフルエンザウイルスＮＰ、インフルエンザウイルスＭ、及びインフルエンザウイルスＮＳ分節についての転写カセットを含む。例えば、組成物は、ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されるＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセットを含むｖＲＮＡ産生用のプラスミドを含む。
【００５２】
以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含むプラスミドを含む組成物も提供される。一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生についての各転写カセットは１のプラスミド上に存在する。一の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の各転写カセットは、１のプラスミドである。一の実施態様では、各転写カセットは、１のプラスミド上に存在する。一の実施態様では、ＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターは、ヒトＲＮＡＰｏｌＩプロモーターである。
【００５３】
本発明は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたプロモーターを含むＰｏｌＩ転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセット；並びに以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、並びに
インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列、及びＰｏｌＩＩプロモーター及び／又はＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを含むプラスミドを含む組成物も含む。一の実施態様では、ｖＲＮＡ産生についての各転写カセットは、１のプラスミド上に存在する。一の実施態様では、ｍＲＮＡ産生用の各転写カセットは、１のプラスミド上に存在する。一の実施態様では、各転写カセットは、１のプラスミド上に存在する。一の実施態様では、ＲＮＡＰｏｌＩプロモーターは、ヒトＲＮＡＰｏｌＩプロモーターである。
【００５４】
一の実施態様では、場合により２９３Ｔ細胞又はＶｅｒｏ細胞である細胞と接触させた場合に、当該組成物は、検出できる量のインフルエンザウイルス、例えば少なくとも１０2〜少なくとも１０3ＴＣＩＤ50／ｍｌのタイターをもたらす。
【００５５】
典型的な方法
本発明は、インフルエンザウイルスを調製する方法を提供する。当該方法は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれる２以上の転写カセットを含むプラスミド；並びに以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
から選ばれる１以上の転写カセットを含むプラスミドを、細胞と接触させることを含む。
【００５６】
一の実施態様では、インフルエンザウイルスを調製する方法は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
を含み、そして場合により以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを場合により含むプラスミドを細胞と接触させることを含む。
【００５７】
別の実施態様では、本発明は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる２以上の転写カセットを含むプラスミド；並びに以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に作用可能なように結合されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを含むプラスミドと細胞を接触させることを含むインフルエンザウイルスの調製方法を提供する。
【００５８】
インフルエンザウイルスの調製方法がさらに提供される。当該方法は、以下の：
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＨＥＦのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターターを含む転写カセット、
ＰｏｌＩ転写終結配列に結合されたインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡに作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、
を含み、そして場合により、以下の：
インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩプロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、
インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩ プロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット、及び／又は
インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡ、例えば全長インフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡにそれぞれ作用可能なように結合されたＰｏｌＩ プロモーター及びＰｏｌＩ転写終結配列並びにＰｏｌＩＩプロモーター及びＰｏｌＩＩ転写終結配列を含む転写カセット
から選ばれる１以上の転写カセットを含むプラスミドと細胞を接触させることを含む。
【００５９】
一の実施態様では、本発明の方法は、プロモーターであって、５'インフルエンザウイルス非コード配列及び場合によりコード配列の隣接部分を含む５'インフルエンザウイルスに結合され(PCT/US03/04233号を参照のこと、当該文献は本明細書に援用される)、次に３'インフルエンザウイルス非コード配列及び場合によりコード配列の隣接部分を含む３'インフルエンザウイルス配列に結合された関心のＤＮＡに結合され、次に転写終結配列(PCT/US03/04233号)に結合されたプロモーターを含む転写カセットを含むベクターと細胞を接触させることを含む。一の実施態様では、関心のＤＮＡはセンスの向きで存在する。他の実施態様では、関心のＤＮＡはマイナスセンスの向きで存在する。関心のＤＮＡは、病原体又は治療ポリペプチド又はペプチドの免疫原性ポリペプチド又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでもよい。関心のＤＮＡは、ＰｏｌＩプロモーターとＰｏｌＩ転写終結配列に作用可能なように結合されてもよく、及び/又は当該関心のＤＮＡはＰｏｌＩＩプロモーターとＰｏｌＩＩ転写終結配列に作用可能なように結合される。
【００６０】
本発明において使用されうる細胞系列及びウイルス
本発明によると、インフルエンザウイルスの効率的な複製を支持する任意の細胞が本発明において使用することができ、インフルエンザウイルスに対するレセプターである１以上のシアル酸を低いレベルしか発現しない突然変異細胞を含む。当該方法により獲得されるウイルスを再集合体ウイルスにすることができる。
【００６１】
好ましくは、当該細胞はＷＨＯ認定又は保証の連続継代細胞系列である。そのような細胞系列を保証するための要件は、系統、増殖特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍原性、及び貯蔵条件のうちの少なくとも１つに関する特徴決定、並びに、動物、卵、及び細胞培養における試験を含む。このような特徴決定は、細胞が検出可能な外来物質を伴わないということを確認するために使用される。幾つかの国では、核学が要求されることもある。さらに、腫瘍原性は、好ましくはワクチン生産に使用される細胞と同じ継代レベルの細胞において試験される。ワクチンウイルスは、好ましくは、一定の結果を与えることが示された方法により精製される(例えば、世界保健機構、1982を参照のこと)。
【００６２】
最終生産物の純度についての適切な試験が含められるように、使用される細胞系列の完全な特徴決定を確立することが好ましい。本発明において使用される細胞の特徴決定に使用することができるデーターは、以下の：(ａ)その起源、誘導、及び継代履歴についての情報；(ｂ)増殖及び形態学的特徴についての情報；(ｃ)外来物質についての試験結果；(ｄ)生化学、免疫学、及び細胞遺伝学的パターンなどの特徴的特性であって、当該細胞を他の細胞系列のなかから明らかに認識することを可能にする特性；及び(ｅ)腫瘍原性についての試験結果を含む。使用される宿主細胞の継代レベル、つまり集団倍化数は、可能な限り低いことが好ましい。
【００６３】
細胞内で産生されるウイルスをワクチン又は遺伝子治療製剤とする前に高度に精製することが好ましい。一般的に、精製方法は、細胞性ＤＮＡ、他の細胞成分、及び外来物質を高度に取り除くことをもたらすであろう。ＤＮＡを大規模に分解又は変性する方法が使用されうる。例えば、Mizrahi、1990を参照のこと。
【００６４】
ワクチン
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば１以上の細菌、ウイルス、酵母、又は真菌由来の免疫原性タンパク質を含んでもよい。こうして、一の実施態様では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス、或いはＨＩＶなどのレンチウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＣＭＶ又はＨＳＶなどのヘルペスウイルス、又は口蹄病ウイルスを非限定的に含む他のウイルス病原体に対するワクチンベクターでありうる。
【００６５】
完全なビリオンワクチンは、限外ろ過により濃縮され、次にゾーン遠心分離法又はクロマトグラフィーにより精製される。当該ワクチンは、例えばホルマリン又はベータ-プロピオラクトンを用いて精製前又は精製後に不活性化される。
【００６６】
サブユニットワクチンは、精製された糖タンパク質を含む。かかるワクチンは、以下に記載されるように精製されうる：界面活性剤で処理することにより断片化されたウイルス懸濁物を用い、例えば超遠心により表面抗原を精製する。こうして、サブユニットワクチンは、ＨＡタンパク質を主に含み、そしてＮＡも含む。使用される界面活性剤は、例えば、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(Bachmeyer、1975)などのカチオン性界面活性剤、アンモニウムデオキシコレート(Laver ＆ Webster, 1976)などのアニオン性界面活性剤；又はＴＲＩＴＯＮ Ｘ１００の商品名で市販されている界面活性剤などの非イオン性界面活性剤であってもよい。ヘマググルチニンは、ブロメリンなどのプロテアーゼでビリオンを処理後に単離し、次にGrand及びSkehel(1972）により記載される方法などの方法により精製されてもよい。
【００６７】
スプリットワクチン(split vaccine）は、脂質を溶解する薬剤を用いる処理に欠けたビリオンを含む。スプリットワクチンは、以下のように調製した：上記のようにして得られた精製ウイルス（不活性化されているか又はされていない）の懸濁水溶液を、攪拌しながら、界面活性剤を伴ったエチルエーテル又はクロロホルムなどの脂質溶媒で処理する。ウイルスエンベロープ脂質が溶解することにより、ウイルス粒子の崩壊が生じる。主にヘマググルチニン及びノイラミニダーゼから構成され、ウイルス粒子の元の脂質外皮が取り除かれたスピリットワクチン、及びコア又はその分解産物を含む水相が取得される。次に、残存する感染性粒子の不活性化をすでに行っていない場合、当該操作を行う。
【００６８】
不活性化ワクチン
本発明の不活性化インフルエンザウイルスワクチンを、既知の方法、例えば非限定的にホルマリン又はβ-プロピオラクトン処理を用いて、本発明の複製されたウイルスを不活性化することにより提供する。本発明に使用されうる不活性化ワクチンのタイプは、全ウイルス(ＷＶ)ワクチン又はサブビリオン(ＳＶ)(スプリット)ワクチンを含んでもよい。ＷＶワクチンは、無傷の、不活性型ウイルスを含み、一方ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する界面活性剤で破壊し、続いて残存するウイルスを化学的に不活性化した精製ウイルスを含む。
【００６９】
さらに、使用可能なワクチンは、表面抗原又はサブユニットワクチンと呼ばれる単離ＨＡ及びＮＡ表面タンパク質を含むワクチンを含む。一般的に、ＳＶ及び表面抗原(つまり、精製ＨＡ又はＮＡ)ワクチンへの応答は類似している。流行中のウイルスに免疫学的に関連したＮＡ抗原及び関連しないＨＡ抗原を含む実験的不活性化ＷＶは、慣用のワクチンより効果的でないことが分かった(Ograら、1977)。両方の関連表面抗原を含む不活性ワクチンが好ましい。
【００７０】
弱毒化生ウイルスワクチン
弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンは、既知の方法のステップに従って、インフルエンザウイルス感染を予防又は治療するために使用することができる。弱毒化は好ましくは、既知の方法に従って、複製単離されるか又は再集合化されたウイルスに弱毒化ドナーウイルスから弱毒化遺伝子を移すことにより１ステップで達成される(例えば、Muprhy、1993を参照のこと)。Ａ型インフルエンザウイルスへの抵抗性が、ＨＡ及びＮＡ糖タンパク質に対する免役応答の発達により媒介されるので、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、流行する野生型株に由来しなければならない。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親株から得られる。このアプローチにおいて、弱毒性を付与する遺伝子は、好ましくはＨＡ及びＮＡ糖タンパク質をコードすることはない。そうでなければ、臨床ウイルス単離体の表面抗原を有する再集合体にこれらの遺伝子を導入することができないからである。
【００７１】
多くのドナーウイルスが、インフルエンザウイルスを再生可能なように弱毒化する能力について調べられた。非限定的な例として、Ａ/Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ(ＡＡ)/６/６０(Ｈ２Ｎ２)低温に適した(ｃａ)ドナーウイルスを弱毒化ワクチンの生産のために使用することができる(例えばEdwards, 1994；Murphy, 1993を参照のこと)。弱毒化Ａ／ＡＡ／６／６０(Ｈ２Ｎ２)ｃａドナーウイルスの表面抗原を有するウイルスの複製を阻害するＨ２Ｎ２抗血清の存在下で再集合体生成物を２５℃(伝染性の強いウイルスの複製を制限する温度)で選択した。
【００７２】
多くのＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２再集合体を、ヒトにおいて評価し、そして以下の：(ａ)感染性、(ｂ)血清反応陰性の小児及び免疫学的刺激を受けた成人に対する弱毒性、(ｃ)免疫原性、そして(ｄ)遺伝的安定性について満足いくものであることが分かった。ｃａ再集合体の免疫原性は、その複製レベルと平行する。こうして、新たな野生型ウイルスがｃａドナーの６個の転写可能な遺伝子を獲得することにより、ワクチン感染しやすい成人及び小児において用いるこれらのウイルスを再生可能なように弱毒化した。
【００７３】
他の弱毒化突然変異を部位特異的突然変異誘導によりインフルエンザウイルス遺伝子中に導入して、これらの突然変異遺伝子を有する感染性ウイルスをレスキューすることができる。弱毒化突然変異を、ゲノムの非コード領域並びにコード領域中に導入することができる。かかる弱毒化突然変異誘導は、例えば、ＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子(Subbaraoら、1993)又はＮＳ遺伝子に導入することができる。こうして、部位特異的突然変異誘導により導入された弱毒化突然変異を有するように作製され、そうして、Ａ/ＡＡ/６/６０ｃａドナーウイルスについて上で記載されたのと同じ様式で、新たなドナーウイルスを生弱毒化再集合体Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ワクチンの産生に使用することができる。
【００７４】
このような弱毒化ウイルスが元の臨床単離株の抗原決定基に実質的に類似する抗原決定基をコードするウイルス由来遺伝子を維持することが好ましい。これは、弱毒化ワクチンの目的が、当該ワクチンがウイルスの元の臨床単離株と同じ抗原性を実質的に提供し、同時に、ワクチン接種された哺乳動物において重篤な発病状態の誘導について微小変化しか引き起こさない程度にまで感染性を欠くことであるからである。
【００７５】
動物、例えば哺乳動物において免役応答を誘導するためのワクチンとして、既知の方法に従って、ウイルスを弱毒化若しくは不活性化し、剤形し、そして投与することができる。このような弱毒化又は不活性化ワクチンが、臨床単離株又はこれから得られた高増殖性株の抗原性と同様の抗原性を維持しているかを決定する方法は、当該技術分野に周知である。そのような既知の方法は、ドナーウイルスの抗原性決定基を発現するウイルスを除去する抗血清又は抗体を使用すること；化学選別(例えば、アマンタジン又はリマンチジン)；ＨＡ及びＮＡ活性及び阻害；並びにＤＮＡスクリーニング(例えば、プローブハイブリダイゼーション又はＰＣＲ)、を使用して、抗原決定基(例えばＨＡ又はＮＡ遺伝子)が、弱毒化ウイルス中に存在しないことを確認することを含む。例えば、Robertsonら、1998；Kilbourne、1969; Aymad-Hernyら、1985、Robertsonら1992を参照のこと。
【００７６】
医薬組成物
接種又は非経口若しくは経口投与に適した本発明の医薬組成物は、弱毒化又は不活性化インフルエンザウイルスを含み、場合によりさらに、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。組成物は、当該技術分野に知られている補助剤又は賦形剤をさらに含む。例えば、Berkowら、1987;Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980を参照のこと。本発明の組成物は、一般的に個々の用量(単位用量)形態で存在する。
【００７７】
慣用のワクチンは、その組成物中に入れられた各々の株由来の約０.１〜２００μg、好ましくは１０〜１５μｇのヘマググルチニンを一般的に含む。本発明のワクチン組成物の主要成分を形成するワクチンは、Ａ型、Ｂ型、又はＣ型のウイルスを含むか、又はそれらの任意の組み合わせ、例えば、３つの型のうちの少なくとも２つ、異なる亜型のうちの少なくとも２つ、同じ型のうちの少なくとも２つ、同じ亜型のうちの少なくとも２つ、又は異なる単離株若しくは再集合体を含んでもよい。ヒトＡ型インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、及びＨ３Ｎ２の亜型を含む。
【００７８】
非経口投与用の製剤は、滅菌水溶液又は非水溶液、懸濁液、及び/又は乳濁液を含み、当該製剤は、当該技術分野に知られている補助剤又は賦形剤を含んでもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。皮膚浸透性を増加させ、そして抗原吸収を高めるために、キャリア又は閉鎖包帯を使用することができる。経口投与のための液体投与形態は、一般的に液体投与形態を含むリポソーム溶液を一般的に含んでもよい。リポソームを懸濁するための適切な形態は、乳濁液、懸濁液、溶液、シロップ、及び賦形剤を含み、精製水などの当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤を含む。不活性希釈剤とは別に、このような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳濁剤、及び懸濁剤、又は甘味料、香味剤、又は香料を含んでもよい。例えば、Berkowら、1992；Avery's, 1987；及びOsol、1980を参照のこと。
【００７９】
本発明の組成物を個体に投与するために使用する場合、当該組成物は、塩、緩衝液、アジュバント、又は本組成物の効果を改善するために望ましい他の物質をさらに含むことができる。ワクチンについては、アジュバント、つまり特異的な免役応答を増大できる物質を使用することができる。通常、免疫系に提示する前に、アジュバントと組成物が混合されるか、又は免疫化される生物の同じ部位に別々に提示される。ワクチン組成物において使用するのに適した物質の例は、Osol(１９８０)において提供される。
【００８０】
ワクチンの不均質性は、少なくとも２個のインフルエンザウイルス株、例えば２〜５０の株、又はその中の任意の範囲若しくは数の株について複製されたインフルエンザウイルスを混合することにより提供されうる。最近の抗原組成を有するＡ型又はＢ型インフルエンザウイルス株が好ましい。本発明に従って、当業者に知られている技術を用いて、インフルエンザウイルスの単一株における変異に対するワクチンを提供することができる。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、さらに少なくとも１の化学療法化合物、例えば、遺伝子治療用に免疫抑制剤、抗炎症剤、又は免役促進剤、並びにワクチン用に、化学療法剤、例えば非限定的に、γグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、チオセミカルバゾン、メチサゾン、リファムピン、リバビリン、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、フォスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤、又はガンシクロビルを含む。
【００８２】
組成物は、不定量であるが少量のエンドトキシン-フリーのホルムアルデヒド、及び保存剤を含むことができ、これらは組成物が投与される生物体において安全であり、そして不所望な効果を与えないことが分かっている。
【００８３】
医薬目的
当該組成物(又は当該物質が誘発する抗血清)の投与は、「予防」又は「治療」目的のいずれかのためである。予防を提供する場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状が明らかになる前に提供され組成物の予防投与は、その後の任意の感染を予防又は弱毒化する役割を果たす。予防的に提供される場合、本発明の遺伝子治療用組成物は、疾患の任意の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防投与は、疾患に関連する１以上の症状を予防又は弱毒化するのに役に立つ。
【００８４】
治療的に提供される場合、弱毒化又は不活性型ウイルスワクチンは、実際の感染の症状が検出された際に与えられる。当該化合物の治療投与は、任意の実際の感染を軽減するのに役に立つ。例えば、Berkowら、1992；及びAvery, 1987を参照のこと。治療的に提供される場合、遺伝子治療組成物は、疾患の症状又は適応症の検出の際に提供される。化合物の治療用投与は、当該疾患の症状又は適応を軽減するのに役に立つ。
【００８５】
こうして、本発明の弱毒化又は不活性型ワクチン組成物は、感染の開始前(予期される感染を予防又は弱毒化するため)、又は実際の感染の開始後のいずれかにおいて与えられてもよい。同様に、遺伝子治療では、当該組成物は、障害又は疾患の任意の症状が現れる前に与えられてもよいし、又は１以上の症状が検出された後に与えられてもよい。
【００８６】
組成物は、その投与が患者に許容される場合、「医薬として許容される」と記載される。そのような薬剤は、投与される量が生理学的に有意である場合、「治療有効量」で投与されると記載される。本発明の組成物は、その存在が受容患者の生理機能において検出可能な変化をもたらす場合、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも１の株に対して一次的又は二次的液性又は細胞性免疫応答を亢進する場合、生理学的に有意である。
【００８７】
提供される「防御」は、絶対的であることを必要としない。つまり、インフルエンザ感染は、対照集合又は患者群と比較して統計的に有意な改善が存在する場合、完全に予防又は根絶される必要はない。防御は、インフルエンザウイルス感染の症状の開始の重篤度又は速度を和らげることに限定されてもよい。
【００８８】
医薬の投与
本発明の組成物は、受動免役又は能動免役のいずれかにより、１以上の病原体、例えば、１以上のインフルエンザウイルス株に対する抵抗性を与えうる。活性免疫化において、不活性化又は弱毒化生ワクチン組成物が、宿主(例えば、哺乳動物)に対して予防的に投与され、そして当該投与に対する宿主の免役反応は、感染及び/又は疾患に対し保護を与える。受動免役では、誘発された抗血清は、回収され、そして少なくとも１のインフルエンザウイルス株により引き起こされる感染を患うと疑われる受容者に投与することができる。本発明の遺伝子治療組成物は、能動免疫により所望される遺伝子産物の予防又は治療レベルをもたらしうる。
【００８９】
一の実施態様では、(胎盤又は母乳を通した抗体の受動取り込みを介して)メス及び胎児又は新生児の両者を保護するのに役に立つ免役応答の産生を引き起こすために十分な時間及び量の条件下で、当該ワクチンは、哺乳動物のメスに(妊娠又は出産時又はその前に)与えられる。
【００９０】
こうして、本発明は、疾病又は疾患、例えば、少なくとも１の病原体株による感染を予防又は弱毒化するための方法をさらに含む。本明細書に使用されるとき、ワクチンの投与が当該疾患の症状又は状態の完全又は部分的な弱毒化(つまり、抑制)、又は当該疾患に対する個体の完全又は部分的な免疫化のいずれかをもたらす場合、ワクチンは疾患を予防又は弱毒化すると記載される。本明細書に使用されるとき、遺伝子治療組成物は、当該疾患の症状又は状態の完全又は部分的な弱毒化(つまり、抑制)、又は当該疾患に対する個体の完全又は部分的な免役のいずれかをもたらす場合、疾患を予防又は弱毒化すると記載される。
【００９１】
本発明の少なくとも１の不活性化又は弱毒化インフルエンザウイルス、又はその組成物は、上記の医薬組成物を用いて、予期された目的を達成する任意の手段により投与されてもよい。
【００９２】
例えば、このような組成物の投与は、様々な非経口経路、例えば、皮下、静脈内、非内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経口、又は経皮経路によって行われてもよい。非経口投与は、ボーラス注射又は時間をかけた段階灌流により行われうる。本発明の医薬組成物を用いる好ましい様式は、筋肉内又は皮下適用によるものである。例えば、Berkowら、1992；及びAvery、1987を参照のこと。
【００９３】
インフルエンザウイルスに関連する病変を予防、抑制、又は治療するための典型的な治療計画は、本明細書に記載されるワクチン組成物の有効量を投与することを含み、一回の治療として投与されるか、又は亢進又はブースター投与として、１週〜２４月、又はその間の任意の範囲又は期間にわたり投与される。
【００９４】
本発明によると、組成物の「有効量」は、所望される生物学的効果を達成するために十分な量である。有効用量が、受容者の年齢、生物、健康状態、及び体重、もし行われているならば現在行われている治療の種類、治療の頻度、及び所望される効果の性質に依存するであろう。以下に与えられる有効量の範囲は、本発明を制限することを意図せず、そして好ましい用量範囲を示す。しかしながら、最も好ましい用量は、当業者により理解され、そして決定されるように、個々の対象に対し調整されよう。例えば、Berkowら、1992；Avery's、1987；及びEbadi,1985を参照のこと。
【００９５】
哺乳動物(例えば、ヒト)又は成鳥用の弱毒化ウイルスワクチンの用量は、約１０3〜１０7プラーク形成ユニット(ＰＦＵ)/ｋｇであってもよく、又はその中の任意の範囲又は数値でありうる。不活性化ワクチンの用量は、約０.１〜２００、例えば、５０μｇのヘマググルチニンタンパク質の範囲でありうる。しかしながら、当該用量は、現存するワクチンを開始点として用いて、慣用方法により測定される安全かつ有効な量であるべきである。
【００９６】
複製されたウイルスワクチンの各用量あたりの免役反応性ＨＡの用量が、適切な量、例えば１〜５０μｇ、又はその中の任意の範囲又は値の量、又は米国公衆衛生局(ＰＨＳ)により推奨される量を含むように標準化でき、この量は通常３歳の小児に対して１成分あたり１５μｇ、及び、３歳未満の小児に対して１成分あたり７.５μｇである。ＮＡの量は標準化できるが、糖タンパク質は、加工精製及び貯蔵の間に不安定でありうる。各０.５ｍｌの用量のワクチンは、好ましくは約１０〜５００億のウイルス粒子、そして好ましくは１００億の粒子を含む。
本発明は以下の非限定的な例によりさらに記載されよう。
【実施例】
【００９７】
実施例１
Ａ型又はＢ型ウイルスのゲノムは、８個に分節化された一本鎖マイナス鎖である(Ｃ型は７分節しか有さない)。ウイルス感染並びにインフルエンザに対するワクチンを開発するための戦略に決定的である２個の遺伝子は、ヘマググルチニン(ＨＡ)及びノイラミニダーゼ(ＮＡ)遺伝子である。宿主細胞内への侵入は、ＨＡスパイクをＮ-アセチル・ノイラミン酸(シアル酸)基を含むムコタンパク質へと結合させることにより促進される。従来のインフルエンザワクチンは、「無害」のマスター株から得た６個の他の遺伝子と、ＨＡ及びＮＡ遺伝子を融合することにより作製された。この方法は、かなり時間がかかるものであり、そしてワクチン開発の間に低タイターになる傾向が強い。逆遺伝学により合成インフルエンザウイルスを生成することを可能にする方法論が、ウイルスを調製するために使用されてきた。例えば、病原株由来のＨＡ及びＮＡ遺伝子、並びにマスター株由来の６の遺伝子を含む組換えウイルスが組み立てられる。特に、複製及び転写に必要とされるタンパク質(ポリメラーゼＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ)と共にクローン化された遺伝子であって、別のプラスミド中にコード化された遺伝子が、細胞系列中にトランスフェクションされた。次に生弱毒化ウイルスをワクチン製品用に回収する。
【００９８】
材料と方法
細胞：  ヒト胚性腎臓細胞２９３Ｔ及びアフリカミドリザル腎臓 (Ｖｅｒｏ)細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で維持した。全ての実験において、以前、不活性化日本脳炎ワクチンを産生するために使用され、そして腫瘍原性及び外来性感染性物質を欠いていることについて選別されたＶｅｒｏＣＣＬ-８１細胞を使用した(Sugawaraら、2002)。Madin-Darbyイヌ腎臓(ＭＤＣＫ)細胞を５％ＮＣＳを含有するＭＥＭ中で維持した。全ての細胞を５％ＣＯ2中で３７℃にて維持した。
【００９９】
プラスミドの構築：  インフルエンザウイルスＲＮＡ分節の合成用のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを組み立てるために、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、マイナス鎖の向きのインフルエンザｃＤＮＡ、及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター(Neumannら、2002)を含む転写カセットを、ウイルスゲノム中には存在しない制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含むオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した。テンプレートとして、ｐＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２、-ＰＢ１、-ＰＡ、-ＨＡ、-ＮＰ、-ＮＡ、-Ｍ、-ＮＳ(これら全てはNeumannら、2002に記載された)であって、Ａ／ＷＳＮ／３３(Ｈ１Ｎ１)ウイルスのそれぞれのウイルスｃＤＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターと転写終結配列との間に配置ものを使用した。それぞれの制限部位を含み、かつ不所望の突然変異を有していないことを確認するためにシーケンスされた鎖状ベクター中にＰＣＲ産物をクローニングした。得られたプラスミドの機能を逆遺伝学により確認した。
【０１００】
繋げられた固有制限部位を有する改変ｐＴＭ１ベクター(Mossら、1990)を用いて、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを段階的に組み立てた(当該ベクターを以下にさらに詳細に記載する)。各クローニングステップにおいて、２〜７個のＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを含む得られたプラスミドの機能を逆遺伝学により確認した。最終的なプラスミド、ｐＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ(図３Ａ)は、８個全てのインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスＲＮＡを合成するための８個のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットを含んだ。当該プラスミドを、室温で大腸菌ＪＭ１０９細胞中で安定的に維持した。細菌カルチャーをTerrific Broth培地中で約３０時間増殖させた。
【０１０１】
同じ戦略を用いて、ＨＡ及びＮＡ分節、並びに残りの６個のウイルス分節(つまり、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ)用のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットをそれぞれ含んだ２個のプラスミド(ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ及びｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ)を作製した。
【０１０２】
ｐＣＡＷＳＰＢ２、ｐＣＡＷＳＰＢ１、及びｐＣＡＷＳＰＡは、ニワトリβ-アクチンプロモーター、Ａ／ＷＳＮ／３３ ＰＢ２、ＰＢ１、又はＰＡタンパク質のコード配列、及びポリアデニル化シグナルを含んだ。ＰＣＲにより、又は短いＤＮＡリンカーを挿入することにより、これらのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットは固有制限エンドヌクレアーゼの認識配列に繋げられた。ＰＣＲ増幅された転写カセットを、その全てについてシーケンスし、次に３個のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写カセットを、固有の制限部位を用いることにより組み立てた。得られたプラスミド(ｐＣ-ＰｏｌＩＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ、図３Ｃ)の機能を、逆遺伝学により確認した。
【０１０３】
プラスミドからのウイルスの生成：製品説明書に従ってＴｒａｎｓＩＴ-ＬＴ１(Mirus、Madison, WI)を用いて、２９３Ｔ細胞(１×１０6)又はＶｅｒｏ ＣＣＬ-８１細胞(５×１０5)をトランスフェクションした。簡潔に記載すると、トランスフェクション試薬(２９３Ｔ細胞のトランスフェクション用ＤＮＡ１μｇあたり２μｌのＴｒａｎｓＩｔ-ＬＴ；Ｖｅｒｏ細胞のトランスフェクション用のＤＮＡ１μｇあたり４μｌのＴｒａｎｓ ＩＴ-ＬＴ１)を、１００μｌのＯｐｔｉ-ＭＥＭ(GIBCO BRL)中に希釈し、室温で５分間インキュベーションし、そして予め混合されたＤＮＡに加えた。全てのトランスフェクション実験について、ウイルスＲＮＡの合成用のそれぞれ０.１μｇの「１ユニット」のプラスミド(つまり、Neumannら、(1999)に記載されるｐＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２、-ＰＢ１、-ＰＡ、-ＨＡ、-ＮＰ、-ＮＡ、-Ｍ、-ＮＳ)、１を超えるＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを含む１μｇのプラスミド(つまり、ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ、ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ、又はｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ)、並びに１μｇの各タンパク質発現プラスミドを使用した。トランスフェクション後の指定された時間において、ＭＤＣＫ細胞中での５０％組織培養感染量(ＴＣＩＤ50)を測定した。
【０１０４】
結果
複数のＲＮＡポリメラーゼＩ又はＩＩ転写カセットを含むプラスミド
８〜１２個未満のプラスミドからのインフルエンザウイルスの生成を可能にするために(Neumannら、1999；Hoffmannら、2000；Fodorら、1999)、ウイルスＲＮＡ(ｖＲＮＡ)合成用のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット、又はｍＲＮＡ合成用のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写カセットを１のプラスミド上で組み立てた。モデルとして、ウイルス生成効率及びパラメーターが確立されているＡ／ＷＳＮ／３３(ＷＳＮ)ウイルスを用いた。簡潔に記載すると、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、マイナス鎖の向きのインフルエンザｃＤＮＡ、及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含むＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセットをＰＣＲにより増幅し、クローニング及びシーケンスし、そして固有の制限部位を用いることにより段階的に繋げられた。ベクター骨格として、２０ｋｂのエボラウイルスｃＤＮＡを安定的に有し、その結果巨大ＤＮＡ断片の挿入に適した改変ｐＴＭ１ベクター(Ｍｏｓｓら、１９９０)を用いた。８個の個々のＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを含むｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ(図３Ａ；約２２.５ｋｂの長さ)の作製は、主要な障害とならなかったが、室温での大腸菌ＪＭ１０９株の増殖は、当該プラスミドの組換えを抑制することを必要とした。
【０１０５】
インフルエンザウイルスワクチンを毎年作製するために、２個のウイルスＲＮＡ分節、つまり、ヘマググルチニン(ＨＡ)及びノイラミニダーゼ(ＮＡ)表面糖タンパク質をコードする分節のみの複製を必要とする。このため、ＨＡ及びＮＡ分節の転写ユニットを組み合わせたプラスミド (ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ)(図３Ｂ) を作製する一方、内部タンパク質をコードする転写ユニットと組み合わせた第二プラスミド(ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ)(図３Ｂ)を作製した。これらのプラスミドの両者は、３７℃で大腸菌ＪＭ１０９株中での増幅されるあいだ安定であった。
【０１０６】
ウイルス生成のために必要とされるプラスミド数をさらに低減するために、ＷＳＮ ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡタンパク質に対する３個のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットを、ｖＲＮＡ合成用のＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを組み立てるのに許容されたのと同じ戦略を用いて、１のベクター骨格上で組み立てた。得られたプラスミドは、３７℃で、大腸菌ＪＭ１０９株中で安定であり、ｐＣ-ＰｏｌＩＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡと呼ばれた (図３Ｃ)。注目すべきことに、ポリメラーゼタンパク質及びＮＡ用にＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットを組み立てたプラスミドは、回収することができなかった。
【０１０７】
２９３Ｔ細胞における複数の転写カセットを含むプラスミドからのウイルスの生成
複数の転写カセットを含むプラスミドの機能を試験するために、２９３Ｔ細胞にｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ(８個全てのｖＲＮＡの転写用)(表１、２列目及び３列目)、又はｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ及びｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ(２個及び６個のｖＲＮＡの転写用)(表１、７列目及び８列目)をトランスフェクションした。別々のプラスミドからのＮＰ及びポリメラーゼサブユニットの発現用の４個のプラスミドで共感染する(表１、２列目及び７列目)か、又はＮＰ、又はＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡをそれぞれ発現する２個のプラスミドで共感染させた(表１、３列目及び８列目)。
【０１０８】
これらのプラスミドからウイルスを成功裏に生成し、それによりＲＮＡポリメラーゼＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユニットを組み合わせて、そうしてインフルエンザウイルスの人工生成のために必要とされるプラスミドの数を低減できるということが示される。感染後４８時間において、ウイルス生成効率は、２×１０7〜２.７×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌの範囲であった(表１、第２、３、７、８列目：平均＝１.１×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌ)。これらの効率は、インフルエンザｖＲＮＡの転写用の８の個別のプラスミド、ＮＰ及び３個のポリメラーゼサブユニットの合成用の４又は２個のプラスミドでトランスフェクションされた対照実験(表１、第９列目及び第１０列目、６.３×１０6〜１.３×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌ；平均５.５×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ)について得られた効率よりも少し高かった(ｐ＝０.１７)。
【０１０９】
モック-トランスフェクション(表１、１４列目)、タンパク質発現プラスミドのみでトランスフェクションされた細胞(表１、１１及び１２列目)、ｖＲＮＡ合成用の８個のプラスミドのみでトランスフェクションされた細胞(表１、１３列目)、又は２又は６個のｖＲＮＡの合成用のプラスミドでトランスフェクションされた細胞(表１、それぞれ４又は５列目)を含む多くの対照実験を行った。これらの対照のどれもウイルスを産生しなかった。しかしながら、感知できるウイルスタイターが、ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ(表１、１列目)、又はｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ及びｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳの組み合わせ(表１、６列目)でトランスフェクションされた細胞において一貫して検出された。これらのプラスミドは、マイナス鎖ウイルスＲＮＡの転写用に設計されており、そしてＮＰ及び３種のポリメラーゼタンパク質の合成を予定していなかった。こうして、これらのプラスミドのみを用いたウイルス生成が、いずれも予期されていなかった(考えられる理由については以下を参照のこと)。
【０１１０】
【表１】
2008520248.tif 000003
【０１１１】
Ｖｅｒｏ細胞における複数の転写カセットを含むプラスミドからのウイルス生成
次に、高効率でトランスフェクションするのが難しいＶｅｒｏ細胞において、ウイルス生成効率を試験した。トランスフェクション後４８時間において、１２個のプラスミドからのウイルスの生成が、２個の実験で無視できるものであり、そして１の実験で低かった(表２、９列目)一方、トランスフェクション後７２時間で、３回の実験すべてにおいてウイルスを検出した。ウイルスＲＮＡ合成用のたった１又は２個のみのプラスミドの使用が、特にｐＣ-ＰｏｌＩＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡと組み合わせた際にトランスフェクション後７２時間でウイルス生成の効率を増加させ、最大２.５×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌを産生した(表２、９列目対３列目：ｐ＝０.００１７；９列目対８列目：ｐ＝０.００６３)。結果として、プラスミド：ｐＣ-ＰｏｌＩＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡから生成される３種のポリメラーゼタンパク質の発現は、個別のプラスミドからタンパク質を提供することと比べて、より有効なウイルス生成をもたらした(表２、２列目と３列目の比較(ｐ＝０.００５４)、７列目及び８列目(ｐ＝０.０２８)、及び９列目及び１０列目(ｐ＝０.２))。ウイルスは、ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌのみから (表２、１列目)、又はｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ及びｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ(表２、６列目)から検出されたが、ウイルス生成は、一貫して観測されず、そして得られたウイルスタイターは低かった。これは、Ｖｅｒｏ細胞の低いトランスフェクション効率のため生じるようである。まとめると、これらの結果により、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ又はＩＩ転写ユニットを含むプラスミドが、Ｖｅｒｏ細胞でウイルスを生成するのに効率性が高いということが示される。
【０１１２】
【表２】
2008520248.tif 000004
【０１１３】
考察
ワクチンウイルスの生成は、現在、逆遺伝学により達成することができる。実際、この方法は高病原性トリインフルエンザウイルスに対するワクチン株の産生のための唯一の効果的なアプローチである。これらのウイルスは、ヒト及び孵化卵に対し致死性であり(Shortridgeら、1998)；その結果、例えばそのＨＡ切断部位配列を変えることによる弱毒化(Horimotoら、1994；Subbaraoら、2003)は、孵化卵における高タイターになる増殖を保証するのに不可欠である一方、エアロゾル化されたウイルスに晒されたワクチン製造スタッフを保護する。ヒトにおいて使用するため、ワクチン株の生産は、腫瘍原性及び外来性感染物質が存在しないことが保証された細胞系列を必要とする。そのような細胞系列の一つは、Ｖｅｒｏ細胞系列であり、この細胞系列は狂犬病及びポリオワクチンの産生のために現在使用されている(Montagnonら、1999)。「１２個のプラスミド」アプローチを用いて、Fodorら、(1999)は、トランスフェクションの４日後における１０7Vero細胞から、１０〜２０プラーク形成ユニットの生成を報告した。Wood及びRobertson(2004)は、逆遺伝学によりＶｅｒｏ細胞におけるＨ５Ｎ１参照ワクチン株を作製したが、レスキュー効率を報告しておらず、一方、Ａ／ＰＲ／８／３４(Ｈ１Ｎ１)又はＡ／ＰＲ／８／３４-ベースのウイルスを、１０3ｐｆｕ／ｍｌ未満の効率で生成した(Ozakiら、2004)。ＲＮＡポリメラーゼＩ及び／又はＩＩ転写ユニットを組み合わせ、そうしてより少ないプラスミドからウイルスレスキューを達成することにより、我々は、トランスフェクションの３日後に５×１０5Ｖｅｒｏ細胞から約１０5〜１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌを産生することができた。それにより、「１２個のプラスミド」アプローチに比べて、より効率的なウイルス産生がＶｅｒｏ細胞において達成された(表２、３列目又は８列目と９列目を比較のこと)。その結果この高効率逆遺伝学システムは、流行中のワクチン株の迅速な調製の点で利点となりうる。
【０１１４】
インフルエンザウイルス生成は、ポリメラーゼ及びＮＰタンパク質の発現に依存する。一のプラスミド上にポリメラーゼサブユニットを組み立てることは、ウイルス生成効率を高めた。この発見は、ウイルスレスキューのために使用されるプラスミドの数を低下すること、又は３個の転写ユニットの組み合わせが感染細胞中に見られるポリメラーゼサブユニットの等モル比をより厳密に反映しうることにより説明されうる。
【０１１５】
一のプラスミド上に同一のプロモーター及びターミネーターユニットの組み合わせることは、組換えを引き起こすと考えられる。しかしながら、本明細書において、８個のＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター及びターミネーター配列又は３個のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター及びターミネーター配列が１のベクター骨格上で組み立てることができることが示された。Hoffmannら(2000)により、ＲＮＡポリメラーゼＩ及びＩＩプロモーターの組み合わせが１のテンプレートからのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの合成を可能にすることが示された。その結果、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの合成用の４個のポリメラーゼＩ／ＩＩ転写ユニットを含み、そしてＮＡ、ＨＡ、Ｍ、及びＮＳ・ｖＲＮＡの合成用の４個のＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを含むプラスミドを設計することができる。そのような構築物は、一のプラスミドからのインフルエンザウイルスの効率的な産生を可能にするであろう。さらに、一のプラスミド上に転写ユニットを組み立てる点での本明細書に記載される成功は、幾つかのプラスミドで細胞をコトランスフェクションすることに依存する他の逆遺伝学システムに当該戦略を適用し、又は１のプラスミドからの幾つかのタンパク質を同時発現させるためのベクターを設計する動機を提供しうる。
【０１１６】
驚くべきことに、ウイルス生成が、一のプラスミド、ｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌから観察された。当該プラスミドから生成されるインフルエンザウイルスタンパク質の発現によって、当該ベクター内に存在するか又はＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター若しくはターミネーター領域内に存在する(潜在(cryptic))ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターからのタンパク質合成が示唆される。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター配列が、上流の転写カセットからのタンパク質発現を潜在的に駆動できる反対方向のプロモーターを内在するかを決定するために、レポーター遺伝子の前に逆向きのＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターをクローン化したが；レポーター遺伝子発現の感知できるレベルは当該プラスミドから検出されなかった(データー未掲載)。インフルエンザウイルスの生成は、４種の異なるタンパク質(ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ)の発現に依存し、その結果、幾つかのリード-スルー事象を必要とする。或いは、タンパク質発現は、他のメカニズム、例えば翻訳の内部開始などから得られてもよい。改変されたｐＴＭ１(Ｍｏｌｌら、1990)ベクターは、ｆ１一本鎖ＤＮＡ複製起点、アンピシリン抵抗性遺伝子、マルチプルクローニングサイト、及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写ターミネーターを含む。強力なＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びＥＭＣＶ未翻訳領域の一部、及びチミジンキナーゼ配列の一部であって、元々のｐＴＭ１クローニングベクターに存在する配列は、この改変バージョンから除去された。当該ベクターからのポリメラーゼ及びＮＰタンパク質のタンパク質合成は、その結果予期されない。それにも関わらず、マイナス鎖ＲＮＡのみを産生するように設計されたプラスミドからのインフルエンザウイルスの生成は、興味深いものであり、そして更なる研究に値する。
【０１１７】
要約すると、Ｖｅｒｏ細胞においてワクチンウイルスの簡単かつ再現可能な産生を可能にするインフルエンザウイルスの生成用の改善されたシステムが本明細書に記載される。本システムの適用は、高病原性トリインフルエンザウイルスの発生状況において特に利点がありうる。
【０１１８】
実施例２
組換えウイルス産生を改善するため、アプローチの一つは、８種全てのウイルス遺伝子をコードするｃＤＮＡをプラスミド中にクローン化することである。こうして、８種のウイルスＲＮＡを８種のプラスミドから生成する代わりに、ウイルスＲＮＡの合成用の転写ユニットが、１のプラスミド上で組み立てられ；そうして８種全てのウイルスＲＮＡが１つのプラスミドから作製され、少ないプラスミドからウイルスをレスキューすることが可能になる。同様に、ウイルスタンパク質の合成用の転写ユニットは、より少ないプラスミド上で組み立てることができる。８種全てのウイルス遺伝子が、１のプラスミドにおいて同様に配置されるならば、インフルエンザウイルスの合成に必要とされるプラスミドの数は５である(全てのウイルス遺伝子について１個のプラスミド及びＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰをコードする遺伝子について４個のプラスミド)。或いは、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子を１のプラスミドにまとめることができ、各遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター及びポリアデニル化シグナルにより繋がれる。さらに、全てのウイルス遺伝子並びにＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰは１のプラスミドに組み立てることができる。他の組み合わせは、ＰｏｌＩプロモーターをそれぞれ有する６個のウイルス遺伝子を有する１のプラスミド、ＰｏｌＩＩプロモーターを各々有する３個のウイルス遺伝子を有する１のプラスミド、及びＰｏｌＩプロモーターを各々有する２個のウイルス遺伝子(ＨＡ及びＮＡ)を有する１のプラスミドを含みうる。
【０１１９】
ウイルス遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター及びターミネーター配列に繋がれて、転写ユニット(又はカセット)を形成し、そして幾つかの実施態様では、転写カセットがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター及び転写終結シグナル(ポリアデニル化シグナル)により繋がれる(図４)。当該アプローチは、ＲＮＡポリメラーゼＩにより合成されるゲノムマイナス鎖ＲＮＡ、及び同じ遺伝子から生成されるＲＮＡポリメラーゼＩＩにより合成されるｍＲＮＡを産生する。
【０１２０】
こうして、本発明は、トランスフェクション用のプラスミドの数を１２個から５又はそれ以下、例えば４、３、２、又は１へと減らし、細胞からのウイルスのレスキュー効率を増加させて、幾つかの弱毒化ウイルスの生成を可能にし、低トランスフェクション効率の細胞系列の使用を可能にし(例えばＶｅｒｏ細胞)、ワクチン産生用のインフルエンザウイルスの一貫した生成を可能にし、及び／又はプラスミドの履歴、純度、及び毒性に関するＦＤＡ規制問題を低減することを可能にする。
【０１２１】
参考文献
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【０１２２】
全ての文献、特許、及び特許出願を本明細書に援用する。前述の明細書において、本発明はその特定の好ましい実施態様に関して記載され、そして多くの詳細が、例示の目的のため記載されている一方、本明細書に記載される詳細の幾つかは、本発明の基本的な原理から逸脱することなく大幅に変更されうることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１Ａ−Ｂ】従来の逆遺伝学システムの模式図。ＲＮＰトランスフェクション法(Ａ)において、精製されたＮＰ、及びポリメラーゼタンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｖＲＮＡを用いてＲＮＰへと会合させる。細胞にＲＮＰをトランスフェクションし、続いてヘルパーウイルスを感染させた。ＲＮＡポリメラーゼＩ法(Ｂ)では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、レスキューされるｖＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクションする。ＲＮＡポリメラーゼＩによる細胞内転写は合成ｖＲＮＡを産生し、当該ｖＲＮＡはヘルパーウイルスで感染させた際に子孫ウイルス粒子にパッケージされる。Ａ)及びＢ)において、トランスフェクタント・ウイルス(つまりクローン化されたｃＤＮＡに由来するＲＮＡを含むウイルス)を、ヘルパーウイルス集合から選択する。
【図１Ｃ】(Ｃ)に示される方法では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、８種のウイルスＲＮＡ分節の各々についてのｃＤＮＡ、及びＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含むプラスミドを、タンパク質発現プラスミドと一緒に細胞にトランスフェクションする。感染性ウイルスが、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰを発現するプラスミドを用いて生成されうるが、残りの構造タンパク質(括弧で示される)の全てを発現させることは、生成されたウイルスに依存してウイルス産生効率を増加させる。
【図２】ＲＮＡポリメラーゼＩ構築物の作製の模式図。インフルエンザウイルスに由来するｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、ＢｓｍＢＩで切断し、そしてヒトポリメラーゼＩプロモーター(Ｐ)及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター(Ｔ)を含むＰＨＨ２１ベクター(E. Hoffmann、論文博士、Justus, Liebig-University, Giessen, Germany)のＢｓｍＢＩサイトにクローン化した。ターミネーター配列の上流のチミジンヌクレオチド(*Ｔ)は、インフルエンザウイルスＲＮＡの３'末端を表す。インフルエンザＡウイルス配列は、太文字で表される。
【図３】複数のインフルエンザウイルス遺伝子を有するプラスミドの模式図。Ａ)  １のテンプレートから得た８種のインフルエンザウイルスＲＮＡの全ての転写用のｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌ。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター(青色、ＰｏｌＩプロモーター)、マイナス鎖の向きにインフルエンザウイルス分節をコードするｃＤＮＡ(異なる色で示す)、及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター(黒色、ＰｏｌＩターミネーター)を含む転写ユニットを、制限エンドヌクレアーゼの固有認識部位を用いることにより１のプラスミド上で組み立てる。Ｂ)  ６種及び２種のインフルエンザウイルスＲＮＡを１のプラスミドから転写させるためのｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ-ＮＰ-Ｍ-ＮＳ及びｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-ＨＡ-ＮＡ。これらのプラスミドをｐＴＭ-ＰｏｌＩ-ＷＳＮ-Ａｌｌについて概説した様に生成し、そして命名した。Ｃ)  １のＰラスミドからＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡｍＲＮＡを転写するためのｐＣ-ＰｏｌＩＩ-ＷＳＮ-ＰＢ２-ＰＢ１-ＰＡ。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター(暗青色、ＰｏｌＩＩプロモーター)、つまり、ニワトリβ-アクチン・プロモーター、それぞれのウイルスタンパク質についてのコード領域(異なる色で示される)、及びポリアデニル化配列(金色、ポリＡ)を含む転写ユニットを、制限エンドヌクレアーゼについての固有認識部位を用いることにより、１のプラスミド上で組み立てた。
【図４】ＲＮＡポリメラーゼＩ／ＩＩ転写ユニット。ＮＰ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター(ＰｏｌＩ-ターミネーター)及びＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター(ＰｏｌＩ-プロモーター)配列に繋がれている。次に当該ユニットを、ＣＭＶプロモーター(ＣＭＶ Ｐｒ)などのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(ＢＧＨポリＡ)などのポリアデニル化シグナルとの間に挿入する。
【図５】ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの合成用の４個のＲＮＡポリメラーゼＩ／ＩＩ転写ユニット、並びにＨＡ、ＮＡ、Ｍ、及びＮＳのｖＲＮＡの合成用の４個のＲＮＡポリメラーゼＩ転写ユニットを含むプラスミド。ＰＩＩ：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター(灰色のボックス)、ｐＡ：ポリアデニル化シグナル(白色のボックス)；Ｐ：ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター(黒色大ボックス)、Ｔ：ＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター(黒色小ボックス)。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2008520248.tif 000012
2008520248.tif 000013
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