(57)【要約】  本発明は、マイコバクテリウム・アヴィウム・亜種パラチュバキュローシス(MPT)に対する免疫反応を刺激するための組成物および方法を提供する。この組成物は少なくとも5つの組換え免疫原性成分を含む。この免疫原性成分はMPT抗原、またはMPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドまたはその組合せであり得る。本発明に用いられるMPT抗原には、MPT 85A、85B、85C、35kDa、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、MptC、MptDおよびESAT-6タンパク質が含まれる。前記方法は、前記組成物を動物に、MPT細菌に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含む。前記方法は、MPT感染に罹りやすいあらゆる動物にとって有益であるが、特に反芻動物のために有益である。
2008530140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも5つの免疫原性成分を含む組成物の有効量を投与することを含む、動物において免疫反応を刺激するための方法であって、前記免疫原性成分が、
ａ）MPT抗原をコードする単離DNA配列；
ｂ）組換えMPT抗原；または、
ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ
から成る群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記MPT抗原が、85A、85B、85C、35kDa、35kDa(Li)、SOD、MptC、MptDおよびESAT-6から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
MPT抗原をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptDおよびESAT-6から成る群から選択されるMPT抗原をコードすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、MPT抗原85A、85B、85C、MPT 35kDaタンパク質およびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)をコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が反芻動物に投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカまたはヘラジカであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反芻動物がウシであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反芻動物がMPTで感染していない動物であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記反芻動物がMPTで感染している動物であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウシがヨーネ病を有する動物であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が医薬上許容されるキャリアをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物が妊娠している動物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物がアジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
動物においてMPTに対する免疫反応を刺激するのに使用するための組成物であって、少なくとも5つの免疫原性成分を含み、前記免疫原性成分が、
ａ）組換えMPT抗原；
ｂ）MPT抗原をコードする単離ポリヌクレオチド配列；または、
ｃ）ａ）およびｂ）の組合せ
から成る群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
前記MPT抗原が、85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptDおよびESAT-6から成る群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
MPT抗原をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptDおよびESAT-6から成る群から選択されるMPT抗原をコードすることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物がMPT抗原85A、85B、85C、MPT 35kDaタンパク質、およびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)をコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬上許容されるキャリアをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2005年2月16日に出願された米国仮特許出願第60/653,536号に対する優先権を主張し、その開示内容を全て、本明細書中に引用により組み込む。
本発明は概して免疫反応の刺激、およびより詳しくは、マイコバクテリウム・アヴィウム・亜種パラチュバキュローシス(Mycobacterium avium Subspecies paratuberculosis)に対する予防的または治療的免疫反応を刺激するための組成物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・アヴィウム・亜種パラチュバキュローシス(MPT)は、反芻動物に慢性肉芽種性腸炎を引き起こすヨーネ病(JD)の原因因子である。臨床的に罹患した動物は慢性の下痢や、遂には死に至る進行性の体重減少を生じ、他方、無症状的に感染した動物は主に、ミルクの生産高が低下する。JDは、世界中の酪農産業にとって経済上非常に重大であり、低下する生産高や動物の早期の選別除去による主要な損失並びに米国乳牛群の20%が罹患するとの評価と、酪農産業に対する1年当たり2億2千万ドルのコストを生じる（Wells等、2000. J. Am. Vet. Med. Assoc. 216 :1450-1457)。ウシは、生涯の最初の6ヶ月の間にこの微生物での感染を最も受け易いが、疾患は典型的には、3〜5歳までは明らかにならない。感染は、汚染した肥料、感染した雌牛からの初乳またはミルクの経口摂取により生じる(Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. Food  Anim. Pract. 12 :305-312)。特に、進行した疾患を有する妊娠した雌牛において胎児感染も生じる（Sweeney等、1992. Am. J. Vet. Res. 53 :477-480)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
JDは反芻動物の重大な感染性疾患であるが、この疾患に対して有効なワクチンはない。合衆国で唯一現在入手できるワクチンは、オイルアジュバント中の死滅エム・アヴィウム・亜種パラチュバキュローシスから成る(Kormendy, B. 1992. Acta  Vet. Hung. 40 :171-184; Larsen等、1978. Am. J. Vet. Res. 39 :65-69)。しかし、そのようなワクチン注射プログラムは、重大な公衆の健康上の懸念を高めた。例えば、少なくとも1人の獣医が、動物のワクチン注射中に手に事故的に接種した(Patterson等、(1988) J. Am. Vet. Med. Assoc. 192 :1197-1199)。さらに、この死滅細菌でのワクチン注射後に、注射部位で強い反応があることが、研究により示された(Kormendy, B. 1992. Avta Vet. Hung. 40 :171-184; Larsen等、1978. Am. J. Vet. Res. 39 :65-69)。このワクチンの他の欠点は、ワクチン注射された動物がツベルクリン皮膚試験陽性となることである(Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40 :171-184; Larsen等、1978. Am. J. Vet. Res. 39 :65-69)。つまり、MPT感染のための安全かつ有効な予防的および/または治療的組成物として使用できる、JDに対するより有効なワクチンの開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は、動物におけるMPTに対する免疫反応を刺激するための組成物および方法を提供する。この組成物は、免疫原性成分−これは、MPT抗原またはMPT抗原をコードするポリヌクレオチドまたはその組合せであり得る−を含む。一態様では、この組成物は少なくとも5つの組換え免疫原性成分を含む。典型的なMPT抗原には、MPT 85A、85B、85C、35kDa、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、MptC、MptDおよびESAT-6様タンパク質が含まれる。
前記方法は、前記組成物を動物に、MPT細菌に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含む。この方法はMPT感染に罹り易いあらゆる動物に対して有益であるが、特に反芻動物にとって有益である。
【０００５】
組換えMPTタンパク質抗原、MPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドまたはこれらの組合せを含む組成物は、標準的な医薬キャリアを用いて処方され得、あらゆる種々の常套の経路により投与され得る。前記組成物は、MPT感染に罹り易い動物またはMPTで感染している動物に、あらゆる時期に投与され得る。しかし、予防的免疫組成物をその新生児に初乳により移し得る妊娠した動物に対する投与や、生後1〜5週の期間中の投与による等、MPT感染の前に本発明の組成物を投与することが好ましい。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明により、動物においてMPTに対する免疫反応を刺激するための組成物および方法が提供される。この組成物はMPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチド、MPT抗原またはこれらの組合せを含む。一態様では、少なくとも5つの免疫原性成分が組換えMPT抗原およびDNAポリヌクレオチドから選択される。前記方法は、前記組成物を動物に、MPT細菌に対する免疫反応を刺激するのに有効な量で投与することを含む。
【０００７】
本明細書中に用いられる「免疫成分」は、前記組成物の成分であって、免疫反応を直接的にまたは間接的に刺激し得るものである。従って、動物に導入された場合、MPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターが動物の細胞に入り、MPT抗原を発現する。発現されたMPT抗原が次いで免疫反応を刺激する。つまり、MPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドは、免疫反応を間接的に刺激する免疫原性成分と考えられる。投与されるMPTタンパク質抗原に関して、この抗原は免疫システムにより直接的に認識されるので、この抗原は免疫反応を直接的に刺激する免疫原性成分と考えられる。
【０００８】
前記方法は、MPT感染を受けやすいあらゆる動物に利益を提供でき、ここで、感染はMPTによる動物の腸粘膜のコロニー形成を意味すると考えられる。しかし、前記組成物および方法は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカおよびヘラジカ、レイヨウおよびバッファローを含む反芻動物のMPT感染のための予防または治療のために特によく適しているが、これらに制限されるものではない。
【０００９】
つまり、前記組成物は、あらゆるMPT感染または非感染動物に投与され得る。前記組成物の感染動物への本発明の方法による投与は、治療的免疫反応を刺激すると考えられる。しかし、予防的反応を刺激するために、MPT感染前に前記組成物を投与することが好ましい。例えば、前記組成物は、その感染していない新生児に初乳により予防的免疫成分を移し得る妊娠した動物に投与され得る。別法として、前記組成物は、誕生後1〜5週の期間中に投与されて、感染を防ぎ得るないしは、もし感染が生じたなら疾患の重篤度を減じ得る予防的効果を提供することができる。つまり、一態様では、本発明の方法はMPT感染の予防であり、また、他の態様では、前記方法はMPT感染のための治療である。前記方法はまた、ヨーネ病の予防または治療のために用いることができる。
【００１０】
本発明に用いるための適当なMPT抗原には、MPTタンパク質85A、85B、85C、35kDa、SOD、MptC、MptDおよびESAT-6様タンパク質が含まれるが、これらには限定されない。組換えMPTタンパク質抗原は、常套の組換えクローニング法による等、当業者に公知の技術により本発明における使用のために得られ得る。適当なDNAクローニング法、および組換えタンパク質を発現および精製するための方法は公知である。（例えば、Sambrook等、2001、モレキュラークローニング;研究室マニュアル、第三版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NYを参照されたい。）概して、組換えMPTタンパク質抗原を得るために、MPTゲノムDNAを、周知のアルカリ溶解法による等、標準的な方法に従いMPT培養物から得ることができる。抗原をコードするDNAは、ポリメラーゼ鎖反応による等、ゲノムDNAから増幅され得、増幅産物は個々にまたは種々の組合せで、1種以上の適当な発現ベクターにクローン化され得る。適当な宿主細胞は、この発現ベクターでトランスフェクトされ得、トランスフェクトされた細胞は、前記抗原を発現するための適当な条件下に培養され得る。抗原は次いで、標準的な技術により培養物から抽出および精製され得る。
【００１１】
動物への投与のために、適当に精製された組換えMPT抗原を標準的な医薬キャリアと組み合わせることができる。タンパク質との使用のための適当な医薬キャリアは、レミントンの医薬科学(第18版、A. R. Gennaro等、Eds., Mack  Publishing Co., Easton, Pa., 1990)に記載されている。さらに、抗原は常套のリポソームまたはミクロソーム処方にて提供されてよい。
【００１２】
免疫反応を刺激するのに使用するためのMPT抗原を含む組成物は、あらゆる適切な経路により投与され得る。投与の適切な経路には、経口、粘膜および非経口（例えば、静脈内、筋肉内および皮下注射）が含まれる。当業者は、投与される抗原の量が投与の経路および動物のサイズ、身体的状態およびMPTの段階等の多くのファクターに依存することを認識するであろう。処方中の各抗原の相対量は、抗原のモル当量または他の比率を提供するような公知のパラメータにより調整され得る。さらに、前記組成物は単一投与または、MPT抗原に対する免疫反応をブーストするための一連の投与にて用いられ得る。概して、10〜200μgのタンパク質のトータル投与量を投与できる。MPT抗原をコードするDNAを投与する場合、概して30〜500μgのDNAを投与できる。
【００１３】
一態様では、本発明の方法は、少なくとも5つの組換えMPT抗原を含む組成物の投与を含む。例えば、MPT抗原85A、85B、85C、35kDa抗原およびスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)を単一処方にて投与できる。85A、85Bおよび85Cはフィブロネクチン-結合タンパク質であり、35KdaおよびSODタンパク質は外部表面タンパク質である。MTP 85A遺伝子をコードするDNA配列および85A遺伝子のアミノ酸配列は、GenBank受諾番号AF280067(2003年10月10日エントリー）にて提供される。MTP 85B遺伝子をコードするDNA配列および85A遺伝子のアミノ酸配列は、GenBank受諾番号第AF21912185B遺伝子（2002年11月21日エントリー）にて提供される。MTP 85C遺伝子をコードするDNA配列および85C遺伝子のアミノ酸配列は、GenBank受諾番号第AF280068(2002年11月21日エントリー）にて提供される。MTP SOD遺伝子をコードするDNA配列およびSOD遺伝子のアミノ酸配列は、GenBank受諾番号第AF180816(2001年11月30日エントリー）にて提供される。35kDaタンパク質をコードするDNA配列は、本明細書中配列番号１にて提供される。35kDaタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中配列番号２として提供される。さらなるMPTには、MptC、MptDおよびESAT-6様タンパク質が含まれる。MptCタンパク質をコードするDNA配列は本明細書中配列番号３として提供される。MptCタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中配列番号４として提供される。ESAT-6様タンパク質をコードするDNA配列は、本明細書中配列番号５として提供される。ESAT-6様タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書中配列番号６として提供される。MptD配列をコードするDNA配列は、本明細書中配列番号７として提供される。MptDアミノ酸配列をコードするDNA配列は、本明細書中配列番号８として提供される。
【００１４】
本明細書中で使用されるMPT抗原をコードするDNAをゲノムMPT DNAから増幅するために使用されるプライマーのDNA配列を表１に示す。
【００１５】
【表１】
2008530140.tif 000003
【００１６】
他の態様では、5種以上のMPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドを含む組成物を調製できる。MPT抗原をコードする配列は、適当なプライマーを用いるMPTゲノムDNAの増幅、および、組換え抗原タンパク質の調製に関して記載される方法と同じ方法で発現ベクターに増幅産物を挿入することにより、得ることができる。
【００１７】
適当な発現ベクターは、適当な真核生物転写および翻訳シグナルを含み、ポリアデニル化および/またはタンパク質輸送シグナル等の付加的エレメントを含んでよい。適当な発現ベクターの一例は、pVR1020（Vical, Inc., San Diego, Calif.から入手可能）であり、これは、真核生物宿主における有効な発現を促進するための前初期サイトメガロウイルスプロモーター並びに、真核細胞宿主の細胞からの抗原の分泌を促すためのプラスミノゲン・アクチベーター・分泌シグナルを含む。
【００１８】
1種以上の異なる発現ベクター−そのコードするMPT抗原によりおよび/またはその調節エレメントまたは、ポリクローニングサイト等の他のエレメントにより互いに区別されるもの−が、本方法に使用されることが当業者により認識されよう。つまり、少なくとも5つのMPT抗原をコードする単一の発現ベクター、または、各々が異なるMPT抗原をコードする少なくとも5つの発現ベクター、または各々が少なくとも1つのMPT抗原をコードする発現ベクターの組合せを、本発明において、少なくとも5つのMPT抗原をコードするポリヌクレオチドを送達するために用いることができる。
【００１９】
一態様では、MPT抗原85A、85B、85C、SOD、MptC、MptD、35kDaおよびESAT6-様タンパク質をコードするDNAポリヌクレオチド配列が、タンパク質の発現および精製のために、および、免疫反応を刺激するための種々の組合せでの動物への投与のために用いられ得る別個の発現ベクター中に提供され得る。
【００２０】
MPT抗原をコードする発現ベクターは、動物への投与のためのあらゆる医薬的に有効な調製物中に処方されてよい。そのような処方は、例えば、リン酸緩衝塩水(PBS)等の塩溶液であってよい。DNAの長期安定性をも提供する医薬上許容される処方を利用することが好ましい。つまり、DNAが保存される処方バッファーまたはバイアルおよび封入物から微量金属イオンを除去および/またはキレート化して、保存中のDNAを安定化および保護することが好ましい。加えて、エタノールまたはグリセロールなどの非還元フリーラジカルスカベンジャーを含めることは、明らかに脱金属化された溶液においてすら生じる可能性のあるフリーラジカルの産生からのDNAのダメージを防ぐために有用である。さらに、DNAは常套のリポソームまたはミクロソーム処方にて提供されてよい。
【００２１】
本発明のDNAポリヌクレオチドを送達できる経路は、その送達が受容動物においてMPTに対する免疫反応を刺激する限り、制限はない。従って、本発明のDNAポリヌクレオチドは、腸および非経口経路等の当該分野で公知のあらゆる手段により動物に投与され得る。送達に関するこれらの経路は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射および経口送達を含むがこれらには限定されない。好ましい経路は筋肉内である。
【００２２】
他の態様では、本発明の組成物は、MPTタンパク質抗原およびMPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドの組合せとして提供される少なくとも5つの免疫原性成分を含む。そのような組成物は、本明細書中に記載される組換えMPT抗原および本明細書中に記載されるMPTタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組合せることにより得ることができる。これに関して、ポリヌクレオチド配列は1種以上の発現ベクター中に存在でき、MPT抗原は組換えタンパク質として提供され得る。組換えMPT抗原およびMPT抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、常套の医薬キャリアと組み合わせられ得、本明細書中に記載されるようにおよび/または標準的な方法に従い投与され得る。組換えMPT抗原およびMPT抗原をコードするポリヌクレオチドの常套のリポソームまたはミクロソーム調製物が提供され得る。さらに、当業者により認識されるように、組成物が組換え抗原のみを免疫原性成分として、DNAポリヌクレオチドのみを免疫原性成分として、または組換え抗原と組換え抗原をコードするDNAポリヌクレオチドの組合せを免疫原性成分として含もうと含むまいと、本発明の前記組成物は適当なアジュバントをさらに含んでよい。
【００２３】
つまり、あらゆる特定の理論により拘束されることを意図せずに、組換えMPT抗原、組換え抗原をコードするポリヌクレオチドおよび/またはこれらの組合せの本発明の方法による投与は、MPT感染に対する予防または治療たり得る免疫反応を刺激すると考えられる。
以下の実施例は本発明の種々の態様を記載するものである。これらの実施例は説明のためのものであり、限定を意図するものではない。
【００２４】
[実施例１]
本実施例は、個々の抗原での刺激に応じて異なるリンパ球増殖効果の比較を提供するものである。
リンパ球増殖反応を試験するために、5つのMPT組換え抗原、85A、85B、85C、35kDa抗原およびスーパーオキシド・ジスムターゼ(SOD)を、異なるMPT排泄レベルを有する雌牛から得たPBMCsにおいて増殖反応を誘発するその能力に関して分析した。本明細書中に示される本実施例および他の実施例のために、トータル38頭の、2〜3歳のホルスタイン雌牛を3群に分けた。健康な対照(n=18)は、ネガティブ糞便培養およびネガティブIS900PCR試験により決定されるように、MPT感染に関してネガティブであった。健康な対照は、過去10年間糞便培養およびIS900PCRネガティブであった農場由来のものである。ポジティブ動物を、コロニー形成ユニット(CFU)/排泄物1gの数に基づき低排泄群(n=16)および中排泄群(n=4)に分けた。1〜30CFU/排泄物1gを有する動物を低排泄群とする。31〜300CFU/排泄物1gを有する動物を中排泄群とする。重度の排泄群(>300CFU/排泄物1g）は、それらは一度同定されると農場からすぐに選別除去されるので、入手できなかった。MPT感染段階を決定するための糞便培養およびIS900PCR試験は、既に記載されているように(Shin等、(2004) J.Vet. Diagn. Invest. 16: 116-120)行った。
【００２５】
リンパ球増殖アッセイにおける使用のために、組換え抗原85A、85B、85C、35kDa抗原およびSODを、標準的な方法を用いておよび既に記載されているように(Dheenadhayalan等、(2002) DNA Seq.13:287-294; Shin等、(2004) J.Vet.Sci.5: 111-117)、クローン化および発現させ 、次いで既に記載されているように(Skeikyet等、(1998) J. Immunol. 161: 6171-6179)精製した。これら実施例で用いた抗原は、リムルス血球アッセイにて無視し得る程度の(10pg/ml)エンドトキシンを有した。
【００２６】
ウシ末梢血単核細胞の単離および培養のために、全雌牛の末梢血(20ml)をヘパリン化した真空チューブを用いて尾の血管から収集した。ヘパリン化された血液からのリンパ球の単離を、ヒストパック1.077(Sigma)を用いて分画遠心法により行った。20mlのヘパリン化全血を、50mlの無菌ポリプロピレンチューブ(Falcon)中15mlのヒストパック上に載せ、次いで1000×gで30分間室温で遠心分離した。血漿層を捨て、単核細胞層を注意深く回収し、3回リン酸緩衝塩水(PBS、pH7.2)で洗浄した。混入している赤血球細胞を0.87%のアンモニウムKClバッファーを用いて、2分間室温で反転させ、次いですぐに30mLのPBSを添加することにより、溶菌した。
【００２７】
洗浄された細胞ペレットをPBS中に懸濁し、ヘマサイトメーターおよびトリパン・ブルーを用いて数え、生存率を決定した。細胞分画百分率は一貫して、細胞懸濁液中、96%を越すリンパ球、1%単核細胞および3%未満の顆粒球を示した。
【００２８】
リンパ球を、10%エンドトキシン不含FCS(Cellect Gold; ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA)、2mMのL-グルタミン、10mMのHEPES、100IU/mlのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシンおよび50μg/mLのゲンタマイシン(Sigma)を含むRPMI 1640中に2×106/mlで再懸濁し、次いで250μlを、試験の目的により96ウェルの丸底プレートまたは平底プレートのいずれかに添加した。
【００２９】
個々の抗原に対するリンパ球の増殖を調べるために、幼若化アッセイを行った。簡単には、PBMCsをまず96ウェルの平底マイクロプレートに3日間37℃で、5%CO2を含む湿った雰囲気中で培養した。培養物を次いでConA(10μg/mL)、精製タンパク質誘導体(PPD)(各々ポジティブ対照）(10μg/mL)または各精製組換えタンパク質(10μg/mL)で刺激し、次いで培養培地中40μl(1.0μCi)のメチル-3H-チミジン(PerkinElmer Life Science Inc, MA, USA)を各ウェルに添加した。細胞をさらに18時間同じ条件で培養し、次いで細胞を半自動細胞回収機(Skatronas Liter Norway)を用いて回収した。幼若化活性を、液体シンチレーション計測に基づく放射能活性の1分間当たりの計数 (cpm)として記録した。結果を、以下のごとく算出される刺激指標(SI)として表現した。
【００３０】
【数１】
2008530140.tif 000004
【００３１】
本明細書中の本実施例および他の実施例に関して、データの統計学的分析はExcelおよびGraPad Prismソフトウェア・パッケージ・バージョン2.0にて行った。個々の群、抗原およびサイトカイン遺伝子発現の間の差は、スチューデントt試験で分析した。差は、P<0.05の確率値が得られた場合、有意とみなした。
【００３２】
図１に示すように、全組換えタンパク質および2つのポジティブ対照に対する反応において中排泄雌牛からのウシPBMCsの増殖活性は、個々の雌牛の間で変動があるものの、他の群よりも高かった(P<0.05)。85A、85Bおよび35-kDaタンパク質抗原で処置した中排泄雌牛からのPBMCsは、他の組換え抗原で処置したPBMCsのものよりも有意に高い(P<0.005)刺激指標(SI)を示した。加えて、低排泄群における35kDaタンパク質に対する増殖反応は、85CおよびSODに対する中排泄群のものよりもいっそう大きかった(図１)。つまり、本実施例は、85A、85Bおよび35-kDaタンパク質抗原が、MPTに予め曝された動物においてリンパ球増殖に作用するのに重要である可能性があることを示す。
【００３３】
[実施例２]
本実施例は、IFN-γ産生における組換え抗原の効果を示すものである。IFN-γ産生を分析するために、IFN-γレベルを培養上清中で、ウシIFN-γに特効の市販のキットを、製造業者(Biosource Int. Camerillo, CA)の指示に従って用いて測定した。プレートをBio-Tek312E ELISAリーダー(BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT05404-0998)にて450nmにて、630nm〜750nmのいずれかの基準フィルターを用いて読んだ。結果を、ネガティブおよびポジティブコントロール光学密度(O.D.)の比較に基づいて計測した。結果は、製造業者の指示によるカット-オフ値に対してネガティブ(<ポジティブ対照のOD)またはポジティブ(>ポジティブ対照のOD)のいずれかとして決定した。
【００３４】
5つの組換え抗原または2つのポジティブ対照での刺激後のIFN-γ産生を、感染および非感染対照雌牛からのPBMCsにて測定した。結果を、修正OD値(刺激された抗原のOD−対照のOD)として図２に示し、これは種々の抗原によるINF-γ産生の上昇を示す。
図２から認め得るように、試験した全組換え抗原は、非感染対照と比較して、感染したウシからのウシPBMCsの培養物にて、INF-γの有意な放出を誘導し(P<0.05)、IFN-gレベルは、低排泄群におけるよりも中排泄群において一貫して高かった(P<0.05)。組換え抗原85Aおよび85Bは、試験した他の組換え抗原よりも、および2つのポジティブな対照と比較して、低排泄群においてIFN-γの有意に高いレベルを誘導した(P<0.05)。つまり、本実施例は、組換え抗原85Aおよび85Bが、MPTに対する細胞媒介性反応を刺激するのに重要である可能性があることを示す。
【００３５】
[実施例３]
本実施例は、本発明の組換え抗原を認識する、非感染および感染雌牛から単離した血清中の抗体の比較を提供するものである。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、組換え抗原の血清反応性を評価するために、既に記載されているステップに従い (Shin等、(2004) J.Vet.Sci.5:111-117)行った。簡単には、間接ELISAは、2.5、5または10μg/mLの各抗原および1:100に希釈された血清を用いて、チェッカーボード滴定により最適化した。平底96ウェルプレート(Maxisorp, Nunc, Denmark)を炭酸-重炭酸バッファー(14.2mM Na2CO3、35.9mM NaHCO3、3.1mM NaN3、pH9.5)中100μLの各抗原で4℃にて一晩コートし、次いで3回0.05%Tween20を含むPBS(PBST、洗浄バッファー）で、マイクロウェルプレート・ウォッシャーBio-Tek ELx405(BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT)を用いて洗浄した。ウェルにおける非コート部位をPBST中5%のスキムミルクで37℃で1時間ブロックした。プレートを2回PBSTで洗浄し、100μLの最適に希釈した(1:25,000)結合抗-ウシIgG-HRP(Sigma)を全ウェルに添加し、37℃にて1時間培養した。プレートを3回PBSTにて洗浄し、200μLの2,2'-アジノ-ビス-チアゾリン-6-スルホン酸(Sigma)を各ウェルに添加した。プレートを37℃で暗中で培養した。30分の培養後、停止溶液(1M HCl)を添加し、プレートを3回405nmで2分間隔でBio-Tek312ELISAリーダー(BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT05404-0998)にて読んだ。ポジティブおよびネガティブ血清と抗原および抗体対照が各プレート中に含まれた。
【００３６】
両排泄群及び健康な対照からの血清における組換え抗原に対するIgG抗体の測定レベルからの結果を図３に示す。個々の雌牛からの血清における抗体含量に広い変動があったが、全組換え抗原に対する平均IgG抗体反応は、低排泄群および中排泄群の両方において有意に増加した。試験した抗原のいずれかに対する低排泄群の抗体の平均レベルの間に有意な差は観察されなかった(図３）。明らかに、35-kDaタンパク質に対する抗体反応が、中排泄群において、他の抗原に対するものよりも有意に高かった(P<0.05)が、これは、35-kDaタンパク質がリンパ球増殖を刺激するのにも有効であり、つまり、細胞媒介性および体液性免疫反応の両方を刺激する可能性があるので、重要である可能性がある。
【００３７】
[実施例４]
本実施例は、組換え抗原での刺激に対する、非感染雌牛、低排泄雌牛および中排泄雌牛から得られたPBMCsにおけるリンパ球部分集団分布の変化を示す。
この分析を行うために、単色フローサイトメトリー分析を、ウシリンパ球マーカーに対するモノクローナル抗体を用いて行った（表２）。簡単には、細胞を3回、FACSバッファー中で洗浄し、第一の抗体（表１）と共に30分間4℃で培養し、3回洗浄し、次いで蛍光イソチオシアネート-標識ウマ抗-マウス免疫グロブリン抗体(ベクター)と共に30分間4℃で培養し、2回洗浄し、次いで200μlのFACS固定バッファー中に分析前に収集した。分析はフローサイトメーター(FACS Calibur; Becton Dickson)にて為した。前方-散乱-側方-散乱ライブゲートを用いて、サンプル当たり5,000〜10,000リンパ球を測定した。リンパ球の蛍光データに基づき、結果を、ポジティブ染色を有する細胞の、無関係なアイソタイプの対照抗体で染色されたサンプルに対する百分率として表した。
【００３８】
【表２】
2008530140.tif 000005
【００３９】
図４Ａ〜４Ｄに示すように、抗原刺激されたT細胞および/またはB細胞部分集団を、単色フローサイトメトリーにより、各組換え抗原で刺激後の両排泄群および健康な対照からのPBMC培養物中のCD4＋、CD8＋、CD3＋(CD3＋は図５に示す）、CD21＋およびCD25＋リンパ球部分集団並びにγδ＋T細胞の百分率の差に関して試験した(図４および５）。本試験で調べた全リンパ球の部分集団は増加したが、細菌排泄レベルに依存して、僅かな差(P<0.05)が、組換え抗原により非感染ウシと低排泄群の間に、あった(P<0.05)。
【００４０】
CD3は、CD4＋およびCD8＋細胞並びにγδ＋T細胞により発現される全T細胞マーカーである。CD25＋T細胞の割合は、使用した組換え抗原に関わらず培養物中で増加した(P<0.05)(図４Ｃ)。これらの結果は、本試験で用いた全抗原が感作されたT細胞を刺激することができることを示唆する。
【００４１】
試験した全組換え抗原は、非感染対照に比して感染ウシからのウシPBMCsの培養物中でCD4＋細胞の割合を増したが(P<0.05)、85Aおよび85Bは、85C、35-kDaタンパク質およびSODよりも有意に高いレベルまで、CD4＋T細胞の割合を増した(P<0.05)(図４Ａ）。CD4＋T細胞の割合は、低排泄群からよりも中排泄群からのPBMCs間で、85Aおよび85Bで処置された培養物において、大きかった(P<0.05)(図４Ａ）。さらに、85Aおよび85Bは非感染ウシにおいてCD4＋T細胞を増さなかった。あらゆる特定の理論により拘束されることを意図せずに、これらの結果は、85Aおよび85B抗原がMTPにより特異的に感作されるCD4＋T細胞を誘導し、初期感染段階、即ち、MPTによる粘膜コロニー化が最初に生じる時点において、循環CD4＋T細胞集団を維持することによりMTP感染に対する保護免疫を提供することを示唆し得る。
【００４２】
非感染対照に比して全抗原により誘導されるCD4＋細胞の増加と対称的に、CD8＋T細胞の割合の有意な増加が、85A、85Bおよび85Cで処置された培養物においてのみ見出され、また、CD8＋細胞の割合は、低排泄群からよりも中排泄群からのPBMCs間で、85Aおよび85Bで処置された培養物において大きかった(P<0.05)(図４Ｂ）。つまり、これら抗原は細胞媒介性反応を選択的に刺激する可能性がある。
【００４３】
SODのみが、中排泄群の培養物においてγδ＋T細胞の割合を有意に増し得た(P<0.05)（図４Ｄ）。しかし、非感染ウシおよび両排泄群において、SODで処置したPBMC培養物中のγδ＋T細胞の数が有意に高かったのでγδ＋Tリンパ球を除いて、SODは、試験した他の抗原もより低い程度に、リンパ球を刺激した（図４Ｄ）。つまり、SODは他の抗原に比してγδ＋Tリンパ球を選択的に刺激し得る。さらに、γδ＋T細胞は、マイコバクテリア病原の入口である粘膜組織において多かったので、SOD抗原は、γδ＋T細胞のその選択的刺激により、感染の初期段階において重要である可能性がある。
【００４４】
試験した全組換え抗原は、非感染対照に比して低排泄群および中排泄群の両方からのウシPBMCsの培養物において、CD21＋B細胞の割合を有意に増した（P0.05)(図６）。興味深いことに、CD21＋B細胞の割合は、中排泄群からのウシPBMCsの培養物において、試験した他の組換え抗原のものよりも有意に高かった(P<0.05)。
【００４５】
[実施例５]
本実施例は、組換え抗原での刺激後のウシPBMCsにおけるサイトカインmRNA産生の刺激の比較を提供するものである。
RNAの調製および細胞のDNase I処置のために、PBMC細胞ペレットを得、50mLリン酸緩衝塩水(PBS)中で2回洗浄し、ペレット化し、5×106細胞を350μL溶菌バッファーを製造業者の指示により(RNeasyミニ・キット、Qiagen, CA)用いて溶菌し、-80℃にてRNAの抽出および相捕DNA(cDNA)の合成まで保存した。トータルのRNA(tRNA)を溶菌された細胞またはPMBCsからRNeasyミニ・キット(Qiagen)を用いて抽出した。抽出したtRNAを10U/μlのRNase-不含DNase Iで37℃で10分間処理した後95℃で5分間不活性化し、次いで氷上で冷やした。
【００４６】
cDNAの合成のために、逆転写(RT)を、1.6μLのトータルRNA、200UのスーパースクリプトII RT(GibcoBRL)、50mMのトリス-Hcl(pH8.3)、75mMのKCl、3mMのMgCl2、0.01MのDTTおよび0.5mMのdNTPsを含む20μLの最終体積中にて行った。反応混合物は42℃にて50分間に供し、70℃にて15分間不活性化した。cDNAをすぐに分析するか、または使用まで-20℃にて保存した。
【００４７】
リアル-タイム定量(RT-PCR)を行うために、各処置群からの約1〜5μgのトータルRNAを、スーパースクリプト逆転写酵素、ランダム・ヘキサマー、および逆転写試薬(GibcoBRL)を用いることにより逆転写した。リアル-タイムプライマーおよびプローブは、プライマー・エクスプレス・ソフトウェア(Applied Biosystems)により、Genbankから入手したウシGAPDH、サイトカインおよび成長因子に関する配列を用いて設計した。内部プローブを、5'末端で蛍光レポーター色素5-カルボキシフルオレセイン(FAM)および3'末端でクエンチャー色素N',N',N',N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)で標識した。PCR混合物は、400nMのプライマー、80nMのタックマンプローブおよび、10mMのトリス-HCl(pH8.3)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、2.5mMのデオキシヌクレオチドトリホスフェート、反応毎0.625UのAmpliTaq Gold DNAポリメーラーゼ、反応毎0.25UのAmpErasw UNGおよび25μlの最終体積中10μlの希釈cDNAサンプルを含む市場入手可能なPCRマスターミックス(TaqMan Univeral PCR Mastermix, Applied Biosystems)から成る。サンプルを96ウェルのプレートに入れ、自動化されたフルオロメーター(ABI Prisim 7700シークエンス・ディテクション・システム、Applied Biosystems) にて増幅した。アンプリコン条件は50℃にて2分、95℃にて10分の後、95℃にて15秒間および60℃にて1分間を40サイクルであった。最終的な定量は、比較サイクルしきい値(the comparative cycle threshold)(CT)法を用いて行い、校正手段たるcDNAに対する相対的な転写またはn倍差として報告される。
【００４８】
図７から認めることができるように、全組換え抗原は、中排泄群のPBMCsから、高レベルのIL-2 mRNAを刺激し、抗原85複合体は35-kDaタンパク質またはSODのいずれよりもより大きな効果を有した(P<0.05)(図７)。85Aはまた、中排泄群において、高レベルのIFN-γ、IL-12p40およびTNF-αmRNAを誘導した(P<0.05)（各々図８Ａ、ＢおよびＣ）。顕著には、35-kDaタンパク質抗原で刺激されたPBMCsは低排泄群および中排泄群の両方において、IL-4mRNAを高程度に発現した(P<0.05)(図９)。35-kDaタンパク質によるIL-4mRNAのこの誘導は、排泄レベルに依存して有意に増した(P<0.001)。これに対し、他の抗原の間では有意な差は認められなかった(P>0.05)。本試験は実施例３に示された結果と一致し、フローサイトメトリー分析は、35-kDaタンパク質が、特に中排泄群においてBリンパ球の増殖を強く誘導したので(図３）、35-kDaタンパク質に対する免疫反応が、疾患の後の段階でより重要である可能性があることを示す。つまり、本実施例は、組換え抗原の全てが細胞媒介性免疫反応を刺激し得ることを示す。
【００４９】
[実施例６]
本実施例は、MPT抗原をコードするDNAポリヌクレオチドでマウスをワクチン注射し、次いでMPTでチャレンジする効果を示すものである。
DNA構築物の効果を示すために、特別な病原体不含C57/BL6雌マウスをHarlan Spraque Dawley Inc(Indianapolis, IN)から入手した。マウスはワクチン注射の時点で〜8週齢であった。5群のマウスを用い、この試験中、各ワクチン群は25匹の動物から成る。動物は、市販のマウス用食餌と水を随意に与えられ、12/12-時間光/暗サイクルに保たれた。
【００５０】
市場入手可能な真核生物発現プラスミドpVR1020(Vical, Inc., San diego, Calif.)をDNAワクチンのために用いた。このプラスミドは、真核生物宿主における効率的な発現を確保するための前初期サイトメガロウイルスプロモーターならびに真核生物細胞からの標的抗原の分泌を促進するためのヒト組織プラスミノゲン・アクチべーター(hTPA)分泌シグナル(Brandt等、2000. Infect. Immun. 68:791-795)を含む。MPT85A、85B、85C、SOD、35kDa、35kDa(li)、MptC、MptDおよびESAT-6様遺伝子をコードするDNAを、表１に列挙した遺伝子特異的プライマーを用いてMPTゲノムDNAからポリメラーゼ鎖反応により増幅した。簡単には、MPT85A、85Bおよび85Cコーティング配列各々の増幅のために使用されるプライマーはBamHI部位を含んだ。SOD、MptC、35kDaおよびESAT6-様コーディング配列の増幅のための一プライマーはBamHI部位を含み、他はBglII部位を含んだ。増幅産物を、指定された制限酵素を用いて消化し、市場入手可能なpCR2.1 TOPOクローニングベクター(Invitrogen, CA)に標準的な方法を用いてクローン化した。MPT遺伝子を次いで、pVR1020プラスミド(Vical, Inc., San Diego, Calif.)中に標準的な方法を用いて、および本質的に既に記載されているように(Dheenadhayalan等、(2002) DNA Seq.13:287-294; Shin等、(2004)J.Vet.Sci.5:111-117)(Skeiky等、(1998)J.Immunol. 161:6171-6179)、ヒト組織プラスミノゲンアクチべータ(hTPA)分泌シグナルの下流にサブクローン化した。これらの組換え構築物をHEK-293(ヒト胎児腎臓）細胞に、リポフェクタミン(登録商標)2000トランスフェクション試薬(Invitrogen, CA)を用いてトランスフェクトし、抗原遺伝子の発現をRP-PCRを用いて転写レベルで確認した。
【００５１】
【表３】
2008530140.tif 000006
【００５２】
免疫化およびMPTチャレンジのために、マウスを5つの異なる群に分けた(表３)。動物に、筋肉内注射による投与当たり、50μlのPBS中50μgの各DNAを投与した。マウスを3回3週間の間隔で免疫化した。IL-12遺伝子を次いで表３に示すように注入した。2回目のブースターの3週間後、動物を109CFUユニットの(MPT)の腹腔内注入によりチャレンジした。各群中の6匹の動物を、チャレンジ後第4週、第8週、第12週および第16週にて屠殺し、器官(肝臓、脾臓、腸間膜リンパ腺、肺)からの細菌の回収物を、マイコバクチンJおよび抗生物質を含むヘラルドの卵黄(Herald's Egg Yolk)(HEY)傾斜寒天上で、既に記載されているように(Kamath等、Infect. Immun. 67:1702-1707)、数えた。チャレンジ後、糞便をさらにマウスの飼育箱から各週毎に回収し、同じ寒天を用いて培養した。肝臓、脾臓、肺、腸および腸間膜リンパ腺を含む組織を、10%の緩衝化されたホルマリン中で浸漬により固定し、標準的な組織学的方法を用いて組織学的試験のために加工した。各マウスの肝臓および脾臓におけるMPT(抗酸菌）の存在をチール-ネールゼン染色により評価した。
【００５３】
図１０は、チャレンジ後4、8および12週での、対照に対するワクチン注射したマウスの肝臓および脾臓における低下したマイコバクテリア重量を示し、非免疫化対照と比較して、MPT DNAワクチンカクテルでワクチン注射されたマウスの脾臓および肝臓において、細菌重量に約90%の低下(1log10)を示す。チャレンジ後4、8および12週後の比較肝臓および脾臓組織学的データは、細菌の増殖結果とパラレルであった。非免疫化マウスと比較して、プラスミドカクテルで免疫化した動物から採取した肝臓および脾臓組織において、実質的な差が認められた（図１１）。MPTで感染した非ワクチン注射対照は、多数のランダムに分散した肉芽腫と、小さなリンパ球で囲まれた中央の類上皮マクロファージを有した。チール・ネールゼン染色は、多数の抗酸菌が認められることを示した（図１２Ａおよび挿入図）。これに対して、感染はMPT DNAワクチンカクテルでワクチン注射したマウスにおいて、より重篤度が少なかった（図１２Ｂ）。
つまり、本実施例は、少なくとも5つのMPT抗原をコードするDNA発現ベクターを用いる投与により、MPT感染からの有意な保護が提供され得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、5MPT組換えタンパク質でインビトロ刺激された、感染した雌牛および健康な対照雌牛からの末梢血単核細胞の増殖反応の分析からのデータを図示したものである。結果は刺激指標として表現し、エラーバーは平均からの標準偏差を示す。非感染雌牛からのPBMCSによっては、いずれの抗原に対しても有意な増殖はなかった（P>0.05)。低排泄群および中排泄群に関し、85Aおよび35-kDaタンパク質がそれぞれ最大の増殖活性を示した。
【図２】図２は、MPT排泄レベルに関する、個々の抗原に対するインターフェロン-γ産生の分析からのデータを図示したものである。この結果は、刺激されたウェルにおけるO.D.値−対照ウェルにおけるO.D.値(自然に産生されたIFN-γ)として与えられる。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。85Aおよび85Bは、両排泄群からのウシ末梢血単核細胞中でIFN-γを産生するために、最も誘発能力のある抗原であった。
【図３】図３は、MPT排泄レベルに関する、個々の抗原に対する抗体反応の分析からのデータを図示したものである。バーは405nmでの平均O.D.値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。全組換え抗原は、排泄レベルにより抗体反応の増加を示し、35-kDaタンパク質に対する抗体反応は、感染していない健康な雌牛および両排泄群の間でポジティブに分かれた(P<0.01)。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ−４Ｄは、FACS分析により決定される、組換え抗原での刺激後のウシ末梢血リンパ球におけるT細胞の部分集団の分布の変化の分析からのデータを図示したものである。[図４Ａ]CD4; Ag85AおよびAg85Bは、低排泄群と比較して中排泄群でCD4＋Tリンパ球のより高い割合を誘発したが、CD4＋Tリンパ球のパーセントは非感染対照ウシでは変化しなかった。[図４Ｂ]CD8;Ag85Aは、中排泄群でCD8＋Tリンパ球の割合を増したが、CD8＋リンパ球の増加パーセントは非感染ウシでは非常に低かった。[図４Ｃ]CD25;Ag85AおよびAg85Bは両排泄群においてCD25＋T細胞の割合を増したが、それらは非感染ウシでは殆ど影響を持たなかった。対照的に、Ag85Cおよび35-kDaタンパク質は中排泄群でのみCD25＋T細胞の割合を有意に増した(P<0.05)。[図４Ｄ]γδ＋T細胞;全抗原は、中排泄群におけるγδ＋T細胞に関するSODを除き、低排泄群および中排泄群の両方において全細胞部分集団の有意に低い増加を生じた。
【図５】図５は、組換えタンパク質および2つの対照(ConAおよびPPD)での刺激に対するCD3＋Tリンパ球の差異的変化の分析からのデータを図示したものである。データは、排泄レベルに関する各組換え抗原に対する反応において、CD3に関してポジティブな細胞染色の平均として示す(平均の1標準エラー）。
【図６】図６は、FACS分析により決定される、組換え抗原での刺激後のウシ末梢血リンパ球における増加したCD21＋Bリンパ球部分集団の分析からのデータを図示したものである。結果は、ポジティブ染色細胞における平均パーセント増加として示し、エラーバーは、平均の1標準エラー(SEM)を示す。組換え35-kDaタンパク質は中排泄群においてCD21＋Bリンパ球の最大の増加を誘発した。細菌の排泄レベルに関わらず、他の抗原に対しては、Bリンパ球の割合に有意な増加は観察されなかった(P>0.05)。
【図７】図７は、24時間組換え抗原で刺激後の非感染ウシ、低排泄群および中排泄群からのウシPBMCsのIL-2特性の分析からのデータを図示したものである。結果は、校正手段として用いた非刺激PBMCsを超えるIL-4の平均倍増を示す。Ags 85AおよびBは中排泄群で最も強く刺激されたが、35kDaタンパク質およびSODはより少ない効果を有した(p<0.05)。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは、24時間組換え抗原で刺激後の、非感染ウシ、低排泄群および中排泄群からのウシPBMCsのINF-γ(図８A)、IL-12p40(図８B)およびTNF-α(図８C）に関するサイトカインmRNA特性の比較の分析からのデータを図示したものである。結果は、校正手段として使用した非刺激PBMCsを超える平均倍増を示す。結果は似通っており、Ags85AおよびBが中排泄群を最も強く刺激したが、35kDaタンパク質およびSODはより少ない効果を有した。
【図９】図９は、24時間組換え抗原で刺激後の、非感染ウシ、低排泄群および中排泄群からのウシPBMCsのIL-4mRNA特性の分析からのデータを図示したものである。結果は、校正手段として使用した非刺激PBMCsを超えるIL-4の平均倍増を示す。35-kDaタンパク質は、低排泄群および中排泄群の両方において、IL-4 mRNAの発現を強く刺激した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｂは、指定のDNA構築物および対照の投与およびMPTでの次なるチャレンジ後の脾臓および肝臓からの細菌の回収を図示したものである。
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、指定のDNA構築物および対照の投与およびMPTでの次なるチャレンジ後の脾臓および肝臓での肉芽腫の平均数を図示したものである。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、組織のチール・ネールゼン染色を図示したものであり、図１２Ａは多数の抗酸菌を明らかにしているが、これとは対照的に、感染は全5つの抗原をコードするMPT DNA構築物でワクチン注射したマウスではより重篤度が低かった（図１２Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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