(57)【要約】本発明は、一般的に、被験体においてナイセリア属(Neisseria)の種の細菌に対する、特に、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)血清群B株に対する免疫応答を誘発するための方法および組成物を提供する。2008528597.tif 000011
2008528597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを第1のナイセリア属(Neisseria)の種の細菌が産生する、第1のナイセリア属の種の細菌から調製された、単離された抗原性小胞;および
薬学的に許容される担体
を含む、組成物。
【請求項２】
小胞が、外膜小胞(OMV)、微小胞(MV)、またはOMVおよびMVの混合物である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
ナイセリア属の種の細菌が天然のものである、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
GNA1870ポリペプチドが、ナイセリア属の種の細菌に対して内因性のものである、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
ナイセリア属の種の細菌が、GNA1870ポリペプチド産生に関して遺伝子改変されている、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
ナイセリア属の種の細菌が、異種プロモーターからのGNA1870ポリペプチドの発現を提供するように遺伝子改変されている、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
ナイセリア属の種の細菌が、外因性GNA1870ポリペプチドをコードする核酸を含有するように遺伝子改変されている、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
ナイセリア属の種の細菌が、内因性GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
ナイセリア属の種の細菌が莢膜多糖を欠損している、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを第2のナイセリア属の種の細菌が産生し、第2のナイセリア属の種の細菌は第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる、第2のナイセリア属の種の細菌から調製された、単離された抗原性小胞をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
第1のナイセリア属の種の細菌および第2のナイセリア属の種の細菌が、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある点で遺伝的に異なる、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドが第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドと異なる、請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞を産生するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを第2のナイセリア属の種の細菌が産生し、第3のナイセリア属の種の細菌は第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる、第3のナイセリア属の種の細菌から調製された、単離された抗原性小胞をさらに含む、請求項10記載の組成物。
【請求項１４】
第1のナイセリア属の種の細菌、第2のナイセリア属の種の細菌、および第3のナイセリア属の種の細菌が、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある点で遺伝的に異なる、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、および第3のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドが異なる、請求項12記載の組成物。
【請求項１６】
第1のナイセリア属の種の細菌が、少なくとも2種類の異なるGNA1870ポリペプチドを産生するように遺伝子改変されている、請求項1記載の組成物。
【請求項１７】
GNA1870ポリペプチドが異なるGNA1870ポリペプチド変種群のGNA1870ポリペプチドであり、変種群がv.1、v.2、およびv.3である、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルでGNA1870ポリペプチドが産生される、GNA1870ポリペプチドを産生するナイセリア属の種の細菌を培養する工程;
培養された細菌から小胞を調製する工程;および
小胞と薬学的に許容される担体を組み合わせて、被験体への投与に適した抗原性組成物を生成する工程
を含む、抗原性組成物を生成するための方法。
【請求項１９】
小胞が外膜小胞(OMV)または微小胞(MV)である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ナイセリア属の種の細菌が天然のものである、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
GNA1870ポリペプチドが、ナイセリア属の種の細菌に対して内因性のものである、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
ナイセリア属の種の細菌が、GNA1870ポリペプチド産生に関して遺伝子改変されている、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
ナイセリア属の種の細菌が、異種プロモーターからのGNA1870ポリペプチドの発現を提供するように遺伝子改変されている、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ナイセリア属の種の細菌が、外因性GNA1870ポリペプチドをコードする核酸を含有するように遺伝子改変されている、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
ナイセリア属の種の細菌が、内因性完全長GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
ナイセリア属の種の細菌が、少なくとも2種類の異なるGNA1870ポリペプチドを産生するように遺伝子改変されている、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
GNA1870ポリペプチドが、異なるGNA1870ポリペプチド変種群のGNA1870ポリペプチドであり、変種群がv.1、v.2、およびv.3である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
ナイセリア属の種の細菌が莢膜多糖を欠損している、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを第1のナイセリア属の種の細菌が産生する、第1のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む第1の抗原性調製物を含む免疫学的有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、
該投与する工程は、小胞に存在するGNA1870ポリペプチドに対する免疫応答を誘発するのに十分である、ナイセリア属に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項３０】
小胞が、外膜小胞(OMV)、微小胞(MV)、またはOMVおよびMVの混合物である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ナイセリア属の種の細菌が天然のものであるか、またはGNA1870ポリペプチド産生に関して遺伝子改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
GNA1870ポリペプチドが、ナイセリア属の種の細菌に対して内因性のものである、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
ナイセリア属の種の細菌が、異種プロモーターからのGNA1870ポリペプチドの発現を提供するように遺伝子改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項３４】
ナイセリア属の種の細菌が、外因性GNA1870ポリペプチドをコードする核酸を含有するように遺伝子改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項３５】
ナイセリア属の種の細菌が、内因性GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項３６】
組成物が、第2のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む免疫学的有効量の第2の抗原性調製物をさらに含み、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第2のナイセリア属の種の細菌は第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる、請求項29記載の方法。
【請求項３７】
第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドが、第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドと異なる、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
組成物が、第3のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む第3の単離された抗原性調製物をさらに含み、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第3のナイセリア属の種の細菌は、第1のナイセリア属の種の細菌または第2のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
第1のナイセリア属の種の細菌、第2のナイセリア属の種の細菌、および第3のナイセリア属の種の細菌が、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある点で遺伝的に異なる、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、および第3のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドが異なる、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
第1のナイセリア属の種の細菌が、少なくとも2種類の異なるGNA1870ポリペプチドを産生するように遺伝子改変されている、請求項29記載の方法。
【請求項４２】
GNA1870ポリペプチドが、異なるGNA1870ポリペプチド変種群のGNA1870ポリペプチドであり、変種群がv.1、v.2、およびv.3である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
投与する工程が、被験体において1種類を超える髄膜炎菌株に対する防御免疫応答を誘発する、請求項29記載の方法。
【請求項４４】
ナイセリア属の種の細菌が血清群Bの髄膜炎菌である、請求項29記載の方法。
【請求項４５】
多量のGNA1870を天然に発現するナイセリア属の種の細菌の株、またはGNA1870を過剰発現するように操作されているナイセリア属の種の細菌の株から調製された小胞を含む調製物を含む免疫学的有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、
該投与する工程は、小胞に存在するGNA1870ポリペプチドに対する免疫応答を誘発するのに十分である、ナイセリア属に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項４６】
小胞が、外膜小胞(OMV)、微小胞(MV)、またはOMVおよびMVの混合物である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
ナイセリア属の種の細菌の株がH44/76である、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
多量のGNA1870を天然に発現するナイセリア属の種の細菌の株、またはGNA1870を過剰発現するように操作されているナイセリア属の種の細菌の株から調製された抗原性小胞;および
薬学的に許容される担体
を含む組成物。
【請求項４９】
ナイセリア属の種の細菌の株がH44/76である、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第1の髄膜炎菌細菌から調製された第1の抗原性小胞;
GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第2の髄膜炎菌細菌から調製された第2の抗原性小胞;および
薬学的に許容される担体
を含み、
第1の細菌のGNA1870ポリペプチドおよび第2の細菌のGNA1870ポリペプチドは異なるGNA1870ポリペプチド変種群であり、第1の細菌および第2の細菌は異なるPorAポリペプチドを産生する、組成物。
【請求項５１】
第3の細菌のGNA1870ポリペプチドが、第1の細菌および第2の細菌のGNA1870ポリペプチド変種群とは異なるGNA1870ポリペプチド変種群のGNA1870ポリペプチドであり、第3の細菌は、第1の細菌および第2の細菌のPorAポリペプチドとは異なるPorAポリペプチドを産生する、GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第3の髄膜炎菌細菌から調製された第3の抗原性小胞をさらに含む、請求項50記載の組成物。
【請求項５２】
界面活性剤を用いることなく、第1の抗原性小胞および第2の抗原性小胞が調製される、請求項50記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)に起因する疾患を予防するための広域(broad-spectrum)ワクチンに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、2005年1月27日に出願された米国特許仮出願第60/647,911号の優先権恩典を主張する。米国特許仮出願第60/647,911号は、その全体が参照により組み入れられる。
【０００３】
政府の支援による研究に関する記載
本発明は、米国立衛生研究所の米国立アレルギー・感染症研究所による公衆衛生総局助成金番号RO1 AI46464、R21 AI061533、および米国立衛生研究所の米国立心臓・肺・血液研究所によるT32-HL007951の下で政府の支援によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
髄膜炎菌は、ヒトの上気道にコロニー形成するグラム陰性細菌であり、特に、髄膜炎および敗血症の世界的な散発的流行および周期的流行の原因である。発病率および罹患率は2歳未満の小児で最も高い。他のグラム陰性細菌と同様に、髄膜炎菌は、典型的には、細胞膜、ペプチドグリカン層、莢膜多糖と共に細胞壁を構成する外膜、および外環境に突き出ている線毛を有する。髄膜炎菌の被包性株は、小児および若年成人における細菌性髄膜炎および敗血症の主因である(Rosenstein et al. J Infect Dis 1999;180:1894-901)。
【０００５】
ヒトは、髄膜炎菌の種の唯一知られているレザバーである。従って、ナイセリア属の種は、ヒト免疫系を回避するために多種多様で極めて有効な戦略を進化させてきた。これらの戦略には、宿主ポリシアル酸と構造が同一の多糖莢膜(すなわち、血清群B)の発現、および免疫優性非莢膜エピトープ(すなわち、比較的多量に表面に存在し、抗体に接近可能であり、強い抗体反応を誘発する抗原のエピトープ)の高い抗原変異性が含まれる。
【０００６】
侵襲性髄膜炎菌感染症の流行および経済的重要性のために、血清型、特に、B群血清型または血清亜型の全体にわたって免疫を付与することができる有効なワクチンの探索が促された。しかしながら、広域ワクチンを開発する多くの取り組みは、ナイセリア属の種がヒト免疫系を回避するために用いる多種多様で極めて有効な戦略によって妨げられてきた。
【０００７】
A群、C群、Y群、およびW-135株に起因する疾患を予防するために、莢膜を基にしたワクチンを使用することができる(Granoff et al. Meningococcal Vaccines. In: Plotkin SA, Orenstein WA, eds. Vaccines. 4th ed. Philadelphia: W. B. Saunders Company, 2003において概説されている)。しかしながら、B群株に起因する疾患を予防するために、米国および欧州での使用に認可されたワクチンは無い。B群株に起因する疾患は北米における疾患の約30％を占め(Lingappa et al. Vaccine 2001;19:4566-75; Raghunathan et al. Annu Rev Med 2004;55:333-5)、欧州における症例の2/3超を占める(Cartwright et al. Vaccine 2001;19:4347-56; Trotter et al. Lancet 2004;364:365-7)。B群莢膜を基にしたワクチンが無い理由の1つは、B群莢膜がヒトにおいて自己抗体反応を誘発することができ(Finne et al. Lancet 1983;2:355-7)、この多糖が担体タンパク質に結合した時でも免疫原性が不十分なことである(Jennings et al. J Immunol 1981;127:1011-8)。自己反応性B群抗莢膜抗体を誘発可能な、莢膜を基にしたB群ワクチンには潜在的な安全性問題もある。従って、最近のB群髄膜炎菌ワクチンの研究は非莢膜抗原の使用に的を絞っている。
【０００８】
外膜小胞(OMV)ワクチンは、ヒトにおいてB群髄膜炎菌性疾患に対する防御免疫を誘発することが分かっている(Jodar et al. Lancet 2002;359:1499-1508において概説されている)。最近、OMVワクチンは、10年超続いているB群流行を止める公衆衛生的介入に応じてニュージーランドにおいてライセンス供与および導入された(Thomas et al. N Z Med J 2004;117:U1016; Desmond et al. Nurs N Z 2004;10:2; Baker et al. J Paediatr Child Health 2001;37:S13-9)。他の小胞を基にした免疫化法が説明されている(例えば、Cartwright K et al, 1999, Vaccine; 17:2612-2619; de Kleinjn et al, 2000, Vaccine, 18:1456-1466; Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343; Tappero et al., 1999, JAMA 281:1520; Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343;米国特許第2002/0110569号;国際公開公報第02/09643号を参照されたい)。
【０００９】
髄膜炎菌外膜小胞(OMV)ワクチンによって小児および成人を免疫化すると、疾患に対する防御の血清学的相関物である血清殺菌抗体が誘導される(Goldschneider et al,1969, J. Exp. Med. 129:1307)。OMVワクチンが髄膜炎菌B疾患を予防する効力はまた、年長小児および成人のランダム化前え向き臨床試験および後ろ向き症例対照試験においても直接証明されている。従って、外膜小胞ワクチンの臨床有効性は論争されていない。このようなワクチンは、ニュージーランドでは小児に使用するためにライセンス供与され、ノルウェーでは年長小児および成人に使用するためのライセンス付与が間近であり、他の欧州の国々ではライセンス付与のための臨床開発の後期段階にある。キューバのFinley Instituteによって調製されたOMVワクチンも市販されており、南米において数百万人の小児に与えられている。
【００１０】
しかしながら、OMVワクチンに対する血清殺菌抗体反応は株特異的な傾向がある(Tappero et al., 1999, JAMA 281:1520;およびRouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343)。さらに、現在利用可能なOMVワクチンはまた、殺菌抗体反応が、主に、主要なポーリンタンパク質であるPorAの表面露出ループに対して生じる点で限定されており(Tappero et al. JAMA 1999;281:1520-7)、PorAは抗原的に変化する(Sacchi et al. J Infect Dis 2000;182:1169-76)。PorAの免疫優性のために、誘導される免疫は、主に、膜小胞を得るのに用いられた株に特異的である(Tappero et al., 1999, JAMA 281:1520; Martin SL et al, 2000, Vaccine, 18:2476-2481)。従って、OMVワクチンは、1種類のPorA血清亜型を有する優勢な髄膜炎菌株、例えば、ニュージーランドのP1.4流行株(Baker et al. 2001, 前記)により引き起こされる流行において疾患を予防するのに有用である。しかしながら、米国において発見された株など、風土病を引き起こす株の中にはかなりのPorA多様性がある(Sacchi et al. 2000, 前記)。さらに、マイナーなアミノ酸多型でも、抗PorA抗体の殺菌活性に対する株の感受性が弱まることがある(Martin et al. Vaccine 2000;18:2476-81)。
【００１１】
いくつかの髄膜炎菌株のゲノム配列決定プロジェクトの完了によって、可能性のある全ての髄膜炎菌タンパク質抗原のカタログが得られた。バイオインフォマティクス、マイクロアレイ技術、プロテオミクス、および免疫学的スクリーニングを組み合わせることによって、多数の新規な髄膜炎菌ワクチン候補が特定されている(Pizza et al. Science 2000;287:1816-20; De Groot et al. Expert Rev Vaccines 2004;3:59-76)。これらの非常に多くの候補の中にゲノム由来ナイセリア抗原(GNA1870)がある。GNA1870は、NMB1870(国際公開公報第2004/048404号)またはLP2086(例えば、Fletcher et al. Infect Immun 2004 72:2088-2100を参照されたい)とも知られており、試験した全ての髄膜炎菌株において発現していた約27kDaリポタンパク質である(Masignani et al. J Exp Med 2003;197:789-99; Giuliani et al. Infect. Immun 2005; 73:1151-60; Welsch et al. J Immunol 2004; 172:5606-15)。
【００１２】
髄膜炎菌株は、アミノ酸配列可変性および免疫交差反応性に基づいて3つのGNA1870変種群(v.1、v.2、およびv.3)にさらに分けることができる(Masignani et al. J Exp Med 2003;197:789-99)。変種1株は、疾患を生じさせるB群分離菌の約60％を占める(Masignani et al. 2003, 前記)。それぞれの変種群の中で、アミノ酸配列はおおよそ約92％またはそれ以上保存されている。
【００１３】
組換えGNA1870で免疫化されたマウスは、相同の変種群のGNA1870タンパク質を発現する株に対して高い血清殺菌抗体反応を生じた(Masignani et al. 2003, 前記; Welsch et al. 2004, 前記)。しかしながら、それぞれのGNA1870タンパク質の亜変種(sub-variant)を発現する多くの株は、抗GNA1870補体を介した溶菌に対して耐性であった。この現象の原因は分かっていないが、おそらく、マイナーなGNA1870多型によるもの、すなわち、抗GNA1870抗体による結合および/または補体活性化の低下をもたらす、細菌表面上の重要なGNA1870エピトープの接近性の株間の違いによるものであるかもしれない。前記の免疫原性試験に使用した組換えGNA1870タンパク質ワクチンは、リーダーペプチドを欠くHis-タグタンパク質として大腸菌において発現された。この組換えタンパク質は翻訳後脂質化に必要なモチーフも無く、このために免疫原性が低い可能性がある(Fletcher et al. Infect Immun 2004;72:2088-100)。
【００１４】
組換えPorAおよび組換えGNA1870の組み合わせのワクチンの可能性が探られてきた(Fletcher et al. Infect Immun 2004, 72:2088-1200)。この組み合わせワクチンがマウスに与えられた時に、2種類の抗原に対する抗体反応において明らかな妨害は無かった。しかしながら、組換え組み合わせには、抗PorA殺菌抗体の誘発に必要なPorA高次構造エピトープの再生が必要であった(例えば、Christodoulides et al, Microbiology, 1998;144: 3027-37およびMuttilainen et al, Microb Pathog 1995;18:423-36を参照されたい)。また、組み合わせ組換えワクチンは、ワクチンに使用したGNA1870タンパク質の亜変種を発現する髄膜炎菌株に対して抗GNA1870殺菌抗体を増強することが示されなかった。
【００１５】
O'Dwyerら(Infect Immun 2004;72:6511-80)は、ナイセリア表面タンパク質A(NspA)を発現するように遺伝子操作された片利共生ナイセリア-フラベッセンス(N. flavescens)株からの外膜小胞(OMV)ワクチンの調製について述べている。ナイセリア表面タンパク質A(NspA)は、ナイセリア-フラベッセンスが天然で発現しない、高度に保存された髄膜炎菌膜タンパク質ワクチン候補である。免疫化マウスは、NspAに特異的な血清オプソニン食作用活性を生じた。また、OMVに抗体が吸収された後に、残りの抗NspA抗体は、致死量の被包性髄膜炎菌株が与えられたマウスに受動防御を付与した。しかしながら、この研究において改変ナイセリア-フラベッセンスOMVワクチンによって誘発された抗体は、異種抗原を発現しないナイセリア-フラベッセンスに由来するOMVによって誘発された抗体を上回る防御を生じることが示されなかった。また、改変ナイセリア-フラベッセンスOMVは血清殺菌抗体反応を誘発しなかったのに対して、以前の研究では、大腸菌小胞中に発現させた組換えNspA(Moe et al. Infect Immun 1999;67:5664-75; Moe et al. Infect Immun 2001;69:3762-71)、またはリポソーム中に再構成された組換えNspA(Martin et al. In: Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference. Oslo: Nordberg Aksidenstrykkeri AS, 2002)で免疫化したマウスは血清殺菌抗体を生じた。PCT国際公開公報第02/09746号および米国特許公報第20040126389号もまた、ナイセリア抗原を過剰発現するように操作された株から調製されたOMVについて述べている。このような抗原の具体例として、NspA、Omp85、pili(PilQ、PilC)、PorA、PorB、Opa、Tbp2、TbpA、TbpB、Hsf、PldA、HasR、FrpA/C、FrpB、Hap、LbpA/LbpB、FhaB、lipo02、MltA、およびctrAiが列挙されている。
【００１６】
本発明は先行技術ワクチン接種法の不利点を克服し、特に、血清群Bに属する株を含む(が、これに限定されない)広範囲の髄膜炎菌株に対して防御免疫を誘発する。
【００１７】
文献
Bjune et al. NIPH Ann 1991;14:125-30; discussion 130-2; Chen et al. In: Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference Nordberg Aksidenstrykkeri AS, 2002; Christodoulides et al. Microbiology 1998;144 (Pt 11):3027-37; Claassen et al. Vaccine 1996;14:1001-8; de Kleijn et al. Vaccine 2000;18:1456-66.; Frasch et al. Meningococcal vaccines: methods and protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2001:81-107; Fukasawa et al. FEMS Immunol Med Microbiol 2004;41:205-10; Holst et al. Vaccine 2003;21:734-7; Humphries Vaccine 2004;22:1564-9; Jansen et al. FEMS Immunol Med Microbiol 2000;27:227-33; Kijet et al. In: Thirteen international Pathogenic Neisseria Conference Nordberg Aksidenstrykkeri, 2002; Martin et al. Vaccine 2000;18:2476-81; McGuinness et al. Lancet 1991;337:514-7.; Morley et al. Vaccine 2001;20:666-87; Muttilainen et al. Microb Pathog 1995;18:423-36; Parmar et al. Biochim Biophys Acta 1999;1421:77-90; Newcombe et al. Infect Immun 2004;72:338-44; O'Dwyer et al. Infect Immun 2004;72:6511-8; Oliver et al. Infect Immun 2002;70:3621-6 Peeters et al. Vaccine 1996;14:1009-15.; Peeters et al. Vaccine 1999;17:2702-12; Rouppe van der Voort et al. Vaccine 2000;18:1334-43; Sanchez et al. Vaccine 2002;20:2964-71; Steeghs et al. EMBO J 2001;20:6937-45; Steeghs et al. J Endotoxin Res 2004;10:113-9; Troncoso et al. FEMS Immunol Med Microbiol 2000;27:103-9; Vandeputte et al. J Biol Chem 2003; van der Ley P et al. Vaccine 1995;13:401-7; Claassen et al. Vaccine 1996;14:1001-8; Peeters et al. Vaccine 1996; 14:1009-15; Cantini et al. J Biol Chem. 2005 Dec 31;[出版前の電子版]。
【発明の開示】
【００１８】
発明の概要
本発明は、一般的に、被験体においてナイセリア属(Neisseria)の種の細菌に対する免疫応答、特に、髄膜炎菌血清群B株に対する免疫応答を誘発するための方法および組成物を提供する。
【００１９】
1つの局面において、本発明は、第1のナイセリア属の種の細菌から調製された抗原性小胞、および薬学的に許容される担体を含む組成物を特徴とし、ナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生する。小胞は、外膜小胞(OMV)、微小胞(MV)、またはOMVおよびMVの混合物でもよい。ナイセリア属の種の細菌は天然細菌でもよく、GNA1870ポリペプチド産生に関して(例えば、異種プロモーターからGNA1870ポリペプチドを発現するように、外因性GNA1870ポリペプチドを発現するようになど)遺伝子改変されていてもよい。GNA1870ポリペプチドは宿主細菌に対して内因性のものでもよい。ある態様では、ナイセリア属の種の細菌は、内因性GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されており、宿主細胞に対して外因性の核酸からGNA1870ポリペプチドを産生するように遺伝子改変されている。他の態様において、ナイセリア属の種の細菌は、少なくとも2種類のGNA1870ポリペプチド(例えば、異なる変種群(v.1、v.2、およびv.3)のGNA1870ポリペプチド)を産生するように遺伝子改変されている。さらに関連する態様において、ナイセリア属の種の細菌は莢膜多糖の産生において異なる。
【００２０】
1つの態様において、組成物は、第2のナイセリア属の種の細菌から調製された抗原性小胞をさらに含む。ここで、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる(例えば、第1の細菌および第2の細菌は、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある)。さらに関連する態様において、第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドは、第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドとは異なる。
【００２１】
別の態様において、組成物は、第3のナイセリア属の種の細菌から調製された抗原性小胞をさらに含む。ここで、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第3のナイセリア属の種の細菌は、第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる(例えば、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある)。関連する態様において、第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチド、および第3のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドは異なる。
【００２２】
特に関心対象の態様において、組成物は、GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第1の髄膜炎菌細菌から調製された第1の抗原性小胞;GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第2の髄膜炎菌細菌から調製された第2の抗原性小胞;および薬学的に許容される担体を含む。ここで、第1の細菌のGNA1870ポリペプチドおよび第2の細菌のGNA1870ポリペプチドは異なるGNA1870ポリペプチド変種群であり、第1の細菌および第2の細菌は異なるPorAポリペプチドを産生する。関連する態様において、組成物は、GNA1870ポリペプチドを過剰発現するように遺伝子改変されている第3の髄膜炎菌細菌から調製された第3の抗原性小胞をさらに含む。ここで、第3の細菌のGNA1870ポリペプチドは、第1の細菌および第2の細菌のGNA1870ポリペプチド変種群とは異なるGNA1870ポリペプチド変種群のGNA1870ポリペプチドであり、第3の細菌は、第1の細菌および第2の細菌のPorAポリペプチドとは異なるPorAポリペプチドを産生する。さらに関連する態様において、小胞は、界面活性剤を用いることなく調製される。
【００２３】
別の局面において、本発明は、GNA1870ポリペプチドを産生するナイセリア属の種の細菌を培養する工程であって、GNA1870ポリペプチドは、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルで産生される、工程;培養された細菌から小胞を調製する工程;および小胞と薬学的に許容される担体を組み合わせて、被験体への投与に適した抗原性組成物を生成する工程によって、抗原性組成物を生成する方法を特徴とする。第1の小胞および第2の小胞は、独立して、外膜小胞(OMV)または微小胞(MV)でもよい。ナイセリア属の種の細菌は天然細菌でもよく、従って、内因性GNA1870を発現してもよく、GNA1870ポリペプチド産生に関して(例えば、異種プロモーターからGNA1870ポリペプチドを発現するように、外因性GNA1870ポリペプチドを発現するようになど)遺伝子改変されてもよい。GNA1870ポリペプチドは宿主細菌に対して内因性のものでもよい。ある態様では、ナイセリア属の種の細菌は、内因性GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている。他の態様において、ナイセリア属の種の細菌は、少なくとも2種類のGNA1870ポリペプチド(例えば、異なる変種群(v.1、v.2、およびv.3)のGNA1870ポリペプチド)を産生するように遺伝子改変されている。他の態様において、ナイセリア属の種の細菌は、内因性完全長GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されており、宿主細胞に対して外因性の核酸からGNA1870ポリペプチドを産生する。さらに関連する態様において、ナイセリア属の種の細菌は莢膜多糖の産生が欠損している。
【００２４】
別の局面において、本発明は、第1のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む第1の抗原性調製物を含む免疫学的有効量の組成物を哺乳動物に投与する工程によって、ナイセリア属に対する免疫応答を誘発する方法を特徴とする。ここで、ナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、投与する工程は、小胞に存在するGNA1870ポリペプチドに対する免疫応答を誘発するのに十分である。小胞は、外膜小胞(OMV)、微小胞(MV)、またはOMVおよびMVの混合物でもよい。ナイセリア属の種の細菌は天然細菌でもよく、従って、内因性GNA1870を発現してもよく、GNA1870ポリペプチド産生に関して(例えば、異種プロモーターからGNA1870ポリペプチドを発現するように、外因性GNA1870ポリペプチドを発現するようになど)遺伝子改変されていてもよい。GNA1870ポリペプチドは宿主細菌に対して内因性のものでもよい。ある態様では、ナイセリア属の種の細菌は、内因性GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変されている。他の態様において、ナイセリア属の種の細菌はGNA1870を過剰発現するように操作されている。なおさらなる態様において、GNA1870ポリペプチドはキメラタンパク質(融合タンパク質)である。ここで、キメラタンパク質は、小胞(例えば、OMV、MV)上での提示のために少なくともGNA1870抗原性部分を含有する。さらに関連する態様において、ナイセリア属の種の細菌は莢膜多糖の産生が欠損している。
【００２５】
他の態様において、ナイセリア属の種の細菌は、少なくとも2種類のGNA1870ポリペプチド(例えば、異なる変種群(v.1、v.2、およびv.3)のGNA1870ポリペプチド)を産生するように遺伝子改変されている。他の態様において、ナイセリア属の種の細菌は、内因性完全長GNA1870ポリペプチドの産生を破壊するように遺伝子改変され、宿主細胞に対して外因性の核酸からGNA1870ポリペプチドを産生する。
【００２６】
関連する態様において、前記の方法において投与される組成物は、第2のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む免疫学的有効量の第2の抗原性調製物を含む。ここで、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第1のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる(例えば、第1の細菌および第2の細菌は、異なる血清群、血清型、または血清亜型の細菌である)。第2のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドは、第1のナイセリア属の種の細菌のGNA1870ポリペプチドと異なってもよい。
【００２７】
さらに関連する態様において、組成物は、第3のナイセリア属の種の細菌から調製された小胞を含む、第3の単離された抗原性調製物をさらに含む。ここで、第2のナイセリア属の種の細菌は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体を誘発する小胞の産生を提供するのに十分なレベルのGNA1870ポリペプチドを産生し、第3のナイセリア属の種の細菌は、第1のナイセリア属の種の細菌または第2のナイセリア属の種の細菌と遺伝的に異なる(例えば、第1のナイセリア属の種の細菌、第2のナイセリア属の種の細菌、および第3のナイセリア属の種の細菌は、血清群、血清型、または血清亜型の少なくとも1つに相違がある点で遺伝的に異なる)。第1のナイセリア属の種の細菌、第2のナイセリア属の種の細菌、および第3のナイセリア属のGNA1870ポリペプチドは異なってもよい。
【００２８】
前記の方法は、被験体において1種類を超えるナイセリア属の株、特に、髄膜炎菌の株、より具体的には、髄膜炎菌血清群B株に対する防御免疫応答の誘発を提供してもよい。
【００２９】
本明細書に記載の抗原性組成物は、最適な抗GNA1870殺菌抗体反応、抗PorA殺菌抗体反応、および/または抗OpC殺菌抗体反応の組み合わせを誘発し、それによって、髄膜炎菌性疾患に対する広範囲の防御を付与することができる。
【００３０】
本明細書に記載のGNA1870過剰発現株から調製されたワクチンは、小胞の調製に用いられた株のGNA1870変種および/またはPorAを共有するナイセリア株に対して殺菌性の抗体反応、ならびにGNA1870亜変種を有し、小胞産生株に対して異種のPorAを有するナイセリア株に対して殺菌性の抗体反応を誘発することができる。
【００３１】
GNA1870過剰発現株から調製されたワクチンはまた、PorA低発現集団における疾患起因髄膜炎菌株の選択および出現の可能性を下げることもできる。これらの変異体は、従来のOMVワクチンが前記集団において広く用いられる場合に特に懸念される。PorAの発現は相によって変化するので (van der Ende et al, J. Bacteriology 1995:177:2475-2480)、PorA発現欠損変異体は比較的よくみられ、髄膜炎菌を抗PorA抗体および補体を用いて死滅させることによって容易に選択され得る。PorA欠損株も毒性があり、疾患を引き起こすことができる。
【００３２】
本開示はまた、有効なワクチン組成物の調製のし易さに関して、組換えポリペプチドを含むワクチン、または複数の個々の抗原を取り込んでいる組み合わせワクチン製剤、または殺菌抗体を誘発するために高次構造エピトープの再生を必要とするPorAなどの組換えタンパク質の調製と比較して有利であり得る方法も提供する。
【００３３】
本発明の局面、特徴、および利点は、本開示を読めば当業者に容易に明らかであろう。
【００３４】
本発明および本発明の特定の例示的な態様が説明される前に、本発明は、説明される特定の態様に限定されず、もちろん変更してもよいことが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は特定の態様だけを説明する目的で用いられ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本発明を限定すると意図されないことも理解されるべきである。
【００３５】
値の範囲が定められている場合、その範囲の上限と下限との間の、間のそれぞれの値、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り下限の単位の1/10まで、および述べられた範囲内の他の任意の述べられた値または間の値が本発明に含まれることが理解される。これらの狭い範囲の上限および下限は独立してこの狭い範囲に含まれてもよく、また、述べられた範囲において具体的に排除される任意の限界に応じて本発明に含まれる。述べられた範囲が限界の一方または両方を含む場合、含まれる限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００３６】
特別の定義のない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書において説明されるものと同様のまたは均等な任意の方法および材料も使用することができるが、好ましい方法および材料を今から説明する。本明細書において述べられる全ての刊行物は、方法および/または材料を、引用された刊行物とからめて開示および説明するために参照により本明細書に組み入れられる。
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる、単数形「a」、「and」、および「the」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「1個の抗原」についての言及は複数のこのような抗原を含み、「特定の小胞」についての言及は、1つまたは複数の小胞および当業者に周知のその均等物などについての言及を含む。
【００３８】
本明細書で述べられる刊行物は、本願の出願日前の刊行物の開示のためだけに提供される。本明細書から、先行発明によって本発明がこのような刊行物に先行する権利がないことが認められると解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の日付は実際の発行日とは異なる場合があり、実際の発行日を別途に確認する必要があり得る。
【００３９】
発明の詳細な説明
本発明は、GNA1870を過剰発現するように操作されている髄膜炎菌変異株から調製されたOMVワクチンが、マウスにおいて、組換えGNA1870(rGNA1870)タンパク質ワクチンもしくは天然株から調製されたOMVまたは組換えタンパク質ワクチンとOMVワクチンの組み合わせより広い殺菌抗体反応を誘発するという発見に基づいている。
【００４０】
OMVワクチンは数百万人の人間に安全に投与されており、髄膜炎菌性疾患の発症に対して有効であることが分かっている。序文の項において言及したように、OMVワクチンの主な限界は、OMVワクチンが株特異的な殺菌抗体反応を誘発することである。OMVワクチンが集団において広く用いられる場合、免疫応答が髄膜炎菌株の「escape変異体」(すなわち、表面接近可能ループのPorAアミノ酸配列に変異のある株またはPorA低発現株)の出現を選択し得るという懸念もある。簡単に言うと、本発明は、優勢なPorA血清亜型を選択し、GNA1870を過剰発現する変異体を調製することによって、最適な抗GNA1870殺菌抗体反応と抗PorA殺菌抗体反応の組み合わせを誘発し、それによって、髄膜炎菌性疾患に対する広範囲の防御を付与する小胞を基にしたワクチン(例えば、OMV、MV)を調製できることを提供する。また、このようなワクチンの使用によって、疾患を生じさせるPorA欠損変異株が集団において選択される危険性は従来のOMVワクチンより低い。
【００４１】
さらに、GNA1870過剰発現株から調製された小胞のタンパク質プロファイルは、相対的に低レベルのGNA1870を発現する株から調製された小胞と比較して変化している。実施例においてさらに詳細に述べるように、GNA1870過剰発現株から調製されたOMVは、他の多数の細胞エンベロープタンパク質の発現が、野生型RM1090ワクチン株またはRM1090ΔGNA1870ノックアウト株から調製されたOMVと比較して低いことを示した。GNA1870過剰発現OMVで免疫したマウスからの抗血清がCu385株に対する殺菌抗体を誘発する、またはNZ98/294株におけるC3b沈着を活性化する能力は、GNA1870によって誘発された抗体の結果であるが、これらの他の外側にある細胞エンベロープタンパク質の減少は、免疫原性およびGNA1870過剰発現株から調製された小胞によって誘発される防御免疫応答を(例えば、小胞における他の抗原の「アンマスキング」によって)さらに増強するように働くのかもしれない。
【００４２】
本明細書において提供される実施例は、GNA1870を過剰発現する髄膜炎菌株(例えば、GNA1870を過剰発現するように遺伝子操作された髄膜炎菌株)から調製されたOMVワクチンを用いた免疫化によって誘発される防御が広いことを示す。GNA1870を過剰発現するOMVワクチンによって誘発された抗GNA1870抗体の機能活性は、組換えGNA1870ワクチン、または組換えGNA1870と野生型株から調製されたOMVの組み合わせによって誘発された抗体の機能活性より大きかった。例えば、ELISAによって測定したように抗GNA1870抗体反応の大きさが小さかったのにもかかわらず(表2)、GNA1870を過剰発現するように操作された株から調製されたOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清のZ1092株に対する殺菌活性は、組換えタンパク質GNA1870ワクチンで免疫化したマウスからの血清、または野生型もしくはGNA1870ノックアウトRM1090株から調製されたOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清、または組換えGNA1870タンパク質ワクチンと混合したOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清のZ1092株に対する殺菌活性より高い(図3)。
【００４３】
さらに、強力な殺菌活性の非存在下でも、GNA1870を過剰発現するOMVワクチンによって誘発された抗体は、NZ98/254株またはM1390株の表面上に、他のワクチンに対して産生された抗体より多くC3b沈着をもたらし(図4A、6列)、前者は、NZ98/254株が投与された新生仔ラットにおける菌血症に対して大きな受動防御も付与した(図6,パネルA〜B)。NZ98/254株においてC3b沈着を活性化する能力は抗GNA1870抗体の吸収後に失われた(表3)。簡単に言うと、改変OMVワクチンは、ワクチン株と相同なPorA分子を発現する株に対する血清亜型特異的殺菌活性を誘発する能力、およびGNA1870変種1タンパク質の亜変種を発現する株に対する機能活性が組換えGNA1870ワクチンによって誘発されるものより大きな抗GNA1870抗体を誘発する能力の結果として、GNA1870組換えタンパク質または野生型ワクチン株からのOMVワクチンより広範囲の防御活性を付与した。
【００４４】
GNA1870過剰発現株から調製された改変OMVワクチンは、変種1 GNA1870タンパク質の亜変種を発現する、および/または相同なPorA血清亜型を発現する株に対して、組換えGNA1870より有利であった。興味深いことに、NspAを過剰発現するように操作された髄膜炎菌株(RM1090)から調製された小胞ワクチンで免疫化したマウスのELISA抗NspA抗体価は、NspAをコードする遺伝子が不活化されているRM1090株から調製された対照小胞ワクチンで免疫化した対照マウスより10倍高かったが、Cu385またはZ1092などの一部の髄膜炎菌株に対する血清殺菌力価は低かった(表5)。O'Dwyerらも、NspAを過剰発現するように操作されたナイセリア-フラベッセンス株から調製されたOMVワクチンを接種したマウスにおいて血清殺菌活性が無いことを観察した(Infect. Imun. 2004;72:6511-80)。従って、GNA1870過剰発現OMVワクチンに対する殺菌および防御抗体反応が高いことを示す本知見は驚くべきことである。
【００４５】
H44/76株においてGNA1870 v.1を過剰発現させると、H44176野生型株から調製されたOMVにある天然量のGNA1870と比較して〜3倍のGNA1870がOMV中に得られた。本発明者らの以前の、野生型RM1090株からのOMVで免疫化したマウスの研究とは対照的に、野生型H44/76から調製されたOMVで免疫化したマウスは、ELISAによって測定したように抗GNA1870抗体反応を生じた(図5)。しかしながら、過剰発現GNA1870を有する株からのOMVを与えたマウス群は〜10倍高い力価を有した。ELISAによって測定した力価は、抗体の機能活性とあまり相関しなかった。例えば、最も高い血清抗GNA1870力価は、組換えGNA1870ワクチンで免疫化したマウスにおいて認められたが、組換えタンパク質で免疫化したマウスからの血清の殺菌活性およびC3b沈着活性はH44/76株に限定された。この株の感受性は、ET5遺伝子系列を有する実質的に全ての髄膜炎菌株が標準(canonical)GNA1870 v.1タンパク質(MC58のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列)の高発現体であり、補体を介した抗GNA1870抗体殺菌活性に対して高感受性であるので予想されたものであった(Masignani et al. 2003, 前記; Welsch et al. 2004, 前記)。本発明者らの研究において、残りの5種類の髄膜炎菌試験株は、H44/76株より少ない量のGNA1870を発現し、それぞれのタンパク質はGNA1870 v.1の亜変種である。5種類の株は、H44/76ワクチン株に対して異種のPorA分子も有する。これらの5種類の株は、組換えGNA1870ワクチンによって誘発された抗体、またはOMVワクチンによって誘発された抗PorA抗体による殺菌活性および補体活性化に対して耐性であった。対照的に、5種類の株のうち4種類は、過剰発現GNA1870を有するH44/76OMVワクチンで免疫化したマウスからの血清の殺菌活性および/または補体沈着活性に対して感受性であった。生細菌の表面上でのC3b活性化は、予想されたように、髄膜炎菌性菌血症に対する新生仔ラットの受動防御につながった(Welsch et al. J Infect Dis 2003;188:1730-40; Welsch et al J Immunol 2004;172:5606-15; Hou et al. J Infect Dis 2005;192:580-90; Moe et al. Infect Immun 2002;70:6021-31)。過剰発現GNA1870を有するOMVワクチンは抗原の複合混合物からなり、多数の抗原標的に対する抗体を誘発することが予想される。しかしながら、吸収実験において、これらの株に対する抗体機能活性はGNA1870に対するものであった(表3)。
【００４６】
注目すべきことには、GNA1870レベルが中程度にしか増加しなかった変異株から調製されたOMVワクチンは、比較的高いGNA1870発現を有するように選択された野生型株から調製されたOMVワクチンより高くかつ広いGNA1870特異的殺菌抗体反応を誘発し、および/または大きなC3沈着を誘発した。従って、OMVワクチン調製物におけるGNA1870と総タンパク質の比のわずかな変化でさえも、GNA1870に対する抗体反応の有無を決めるように見える。さらに、過剰発現GNA1870を有するOMVワクチンによって誘発された抗体の品質は、組換えGNA1870ワクチンによって誘発された抗体の品質より優れている。例えば、組換えワクチンは、過剰発現GNA1870を有するOMVワクチンによって誘発されたELISA抗体結合力価より高いELISA抗体結合力価を誘発したが、組換えタンパク質に対する抗体の殺菌活性および補体活性化活性は低かった。改変GNA1870-OMVワクチンが、組換えタンパク質ワクチンまたは対照OMVワクチンより機能活性が広い血清抗体を誘発する機構を明らかにするには、さらなる研究が必要であろう。
【００４７】
従って、本発明は、疾患を生じさせる多様な髄膜炎菌株と広範囲に反応する免疫応答を誘発するための方法および組成物を提供する。本発明は、GNA1870に対する抗体反応を増強することによって、恐らく、ワクチン株の他のよくある抗原に対する抗体反応を増強することによって、小胞を基にしたワクチンまたはPorAを基にしたワクチンにおける抗原的に変化するPorAドメインの免疫優性問題を回避する。重要なことには、本発明の方法は、ワクチン調製において用いられなかった血清亜型エピトープを発現するナイセリア属の株に対して、ヒトにおける防御の血清学的相関物であると唯一分かっている血清殺菌抗体を誘発する(Goldschneider et al. 1969, 前記)。さらに、本発明の方法は、髄膜炎菌ワクチン候補であるナイセリア表面タンパク質Aなどの保存タンパク質に対する抗体によって死滅しない株に対して血清殺菌抗体を誘発する(Martin et al., 2000. J. Biotechnol. 83:27-31; Moe et al. (1999 Infect. Immun. 67: 5664; Moe et al. Infect Immun. 2001 69:3762)。理論に固執することなく、本発明のワクチンおよび免疫化法は、保存抗原および非保存抗原の両方に特異的な抗体を誘発することによって、広域防御免疫において思いもよらなかった利益をもたらす。
【００４８】
定義
用語「防御免疫」は、哺乳動物に投与されるワクチンまたは免疫化計画が、髄膜炎菌によって引き起こされる疾患を予防する、疾患の発症を遅らせる、もしくは疾患の重篤度を下げるか、または疾患の症状を軽減する、もしくは完全に無くす免疫応答を誘導することを意味する。
【００４９】
句「髄膜炎菌血清群Bの株によって引き起こされる疾患」は、髄膜炎菌血清群Bのメンバーによる感染において存在する任意の臨床症状または臨床症状の組み合わせを含む。これらの症状には、上気道(例えば、鼻咽頭の粘膜および扁桃腺)への髄膜炎菌血清群Bの病原性株のコロニー形成、粘膜および粘膜下血管床への細菌の侵入、敗血症、敗血症ショック、炎症、出血性皮膚病変、繊維素溶解および血液凝固の活性化、腎不全、肺不全、および心不全などの臓器機能不全、副腎出血および筋肉梗塞、毛細血管漏出、浮腫、末梢四肢虚血、呼吸窮迫症候群、心外膜炎および髄膜炎が含まれるが、これに限定されない。
【００５０】
句「広域防御免疫」は、ワクチンまたは免疫化計画が、髄膜炎菌の少なくとも1種類もしくは複数の種類の株(または少なくとも2種類、少なくとも3種類、少なくとも4種類、少なくとも5種類、少なくとも8種類、もしくは少なくとも8種類超の株)に対して「防御免疫」を誘発することを意味する。ここで、これらの株はそれぞれ、ワクチンを調製するのに使用した株と異なる血清亜型に属する。本発明は、具体的には、髄膜炎菌血清群Bのメンバーによって引き起こされる疾患に対する防御を付与し、他の血清群、特に、血清群A、C、Y、およびW-135に対する防御も付与するワクチンまたはワクチン接種法を意図し、かつ含む。
【００５１】
句「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応する」は、多糖、リン脂質、タンパク質、またはペプチドなどの抗原について言及している場合、他の分子の不均一集団も含み得る試料中の抗原の存在に基づく、および/または試料中の抗原の存在を証明する結合反応を意味する。従って、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は試料中の特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量で結合しない。このような条件下での抗体との特異的結合は、特定の抗原に対する特異性について選択された抗体または抗血清を必要とする場合がある。
【００５２】
句「調製物に存在するエピトープに対する免疫応答を誘発するのに十分な量の」は、特定の抗原調製物を投与する前に測定した免疫応答指標と、特定の抗原調製物を投与した後に測定した免疫応答指標の間で検出可能な差異があることを意味する。免疫応答指標には、酵素結合免疫測定法(ELISA)、殺菌アッセイ法、フローサイトメトリー、免疫沈降、Ouchter-Lowny免疫拡散法;例えば、スポット、ウエスタンブロットまたは抗原アレイの結合検出アッセイ法;細胞傷害アッセイ法などのアッセイ法によって検出されるような、抗体価または特異性が含まれるが、これに限定されない。
【００５３】
「表面抗原」は、髄膜炎菌の表面構造(例えば、外膜、内膜、細胞周辺腔、莢膜、線毛など)に存在する抗原である。
【００５４】
髄膜炎菌の遺伝的に異なる株に関して用いられる句「遺伝的に異なる」は、少なくとも1種類、通常、少なくとも2種類、より通常は、少なくとも3種類のポリペプチド、特に、抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列が互いに異なる株を意味する。株の遺伝的多様性は、少なくとも1種類または複数の種類、好ましくは少なくとも2種類またはそれ以上の血清群、血清型、または血清亜型が異なる株を選択することによって達成することができる(例えば、外膜より選択されるタンパク質、PorAおよびPorBタンパク質の少なくとも1つが異なる2種類の株は互いに対して遺伝的に異なると言われる)。遺伝的多様性はまた、例えば、多座配列タイピングおよび/または多座酵素タイピング(例えば、Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci USA 95:3140; Pizza et al. 2000 Science 287:1816を参照されたい)、多座酵素電気泳動、および当技術分野において公知の他の方法によって定義することもできる。
【００５５】
本明細書で使用する「血清群」は、免疫学的に検出可能な莢膜多糖変化による髄膜炎菌の分類を意味する。約12種類の血清群:A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K、およびLが公知である。いずれか1つの血清群が複数の血清型および複数の血清亜型を含むことがある。
【００５６】
本明細書で使用する「血清型」は、モノクローナル抗体によって規定される、外膜タンパク質ポーリンBの抗原性の違いに基づく髄膜炎菌株の分類を意味する。ある1つの血清型が、複数の血清群および複数の血清亜型において見られることがある。
【００５７】
本明細書で使用する「血清亜型」は、抗体によって規定される、ポーリンAと呼ばれる外膜タンパク質の抗原性の変化、またはDNA配列決定から推定されたアミノ酸配列のVRタイピングに基づく髄膜炎菌株の分類を意味する(Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169; Multi Locus Sequence Typingウエブサイトを参照されたい)。PorAタンパク質間の大部分の変化は、8つの推定表面露出ループの2つ(ループIおよびIV)において生じる。可変ループIおよびIVは、それぞれ、VR1およびVR2と指定されている。ある1つの血清型が、複数の血清群および複数の血清型において見られることがある。
【００５８】
「濃縮した」は、抗原組成物中の抗原が、抗原組成物を得るのに用いられた株における抗原の濃度より、総重量比で少なくとも3倍の濃度、通常、少なくとも5倍の濃度、より好ましくは少なくとも10倍の濃度、より通常には、少なくとも100倍の濃度で存在するように、実験者または医師によって操作されたことを意味する。従って、ある特定の抗原の濃度が総細菌調製物(または総細菌タンパク質)1グラム当たり1マイクログラムであれば、濃縮された調製物は、総細菌調製物(または総細菌タンパク質)1グラム当たり少なくとも3マイクログラムを含有するだろう。
【００５９】
用語「異種」は、天然では一緒に見られない2種類の生物学的成分を意味する。これらの成分は、宿主細胞、遺伝子、またはプロモーターなどの調節領域でもよい。異種成分は天然では一緒に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターが遺伝子に機能的に連結された時のように一緒に機能することができる。別の例は、ナイセリア配列が、異なる株のナイセリア宿主に対して異種である場合である。2種類の異なる細菌株において発現されたタンパク質、例えば、「異種PorA」または「異種GNA1870」に関して本明細書で使用する「異種」は、問題になっているタンパク質がアミノ酸配列の点で異なることを示している。例えば、PorA 1.5-2,10を発現する第1のナイセリア株およびPorA 7-2,4を発現する第2のナイセリア株は「異種PorAタンパク質」を有する、または「PorAに関して異種」であると言われる。
【００６０】
用語「髄膜炎菌に関して免疫学的にナイーブな」は、(感染または投与によって)防御免疫を誘発するのに十分な量の髄膜炎菌もしくは髄膜炎菌に由来する抗原組成物に曝露されたことがない個体(例えば、ヒト患者などの哺乳動物)、または曝露されていても、防御免疫応答を展開しなかった個体を指す(後者の一例は、防御免疫応答が起こらない可能性のある若すぎる年齢で曝露された個体であろう)(Molages et al., 1994, Infect. Immun. 62: 4419-4424))。さらに、「免疫学的にナイーブな」個体は、髄膜炎菌以外のナイセリア種(またはナイセリア種から調製された抗原組成物)にも曝露されていない、特に、ナイセリア種の交差反応株(または抗原組成物)にも曝露されていないことが望ましい(が、必要ではない)。(感染または投与によって)ナイセリア種またはそのナイセリア種に由来する抗原組成物に、その種によって示されるエピトープに対する免疫応答を誘発するのに十分な量で曝露されている個体は、その種によって示されるエピトープに免疫応答するように「刺激」を受ける。
【００６１】
小胞生成において使用するためのGNA1870発現ナイセリア株
一般的に、本発明は、被験体に投与されると血清抗GNA1870抗体を惹起する小胞を提供するのに十分なレベルのGNA1870タンパク質を産生する天然ナイセリア株または遺伝子改変ナイセリア株からの小胞(微小胞または外膜小胞)生成を伴う。生成された抗GNA1870抗体は、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、10種類、またはそれ以上のナイセリア株に対する免疫防御を促進し、これらの株は、例えば、血清群、血清型、血清亜型(例えば、PorAタンパク質によって決定される)、配列型、電気泳動型、GNA1870変種、および/もしくはGNA1870亜変種に関して遺伝的に異なってもよい(または「異種」でもよい)。
【００６２】
GNA1870を産生する、またはGNA1870を産生するように改変することができ、任意に、PorAなどの関心対象の他の抗原を産生する、または産生するように改変することができる様々なナイセリア属の種の任意の株を、本発明の方法において使用することができる。GNA1870産生に関して適切な株の特徴は、以下でさらに詳細に述べる。
【００６３】
病原性ナイセリア属の種または病原性ナイセリア属の種に由来する株、特に、ヒトに対して病原性の株またはヒトに対して病原性もしくは片利共生の株に由来する株が特に関心対象である。例示的なナイセリア種には、髄膜炎菌、ナイセリア-フラベッセンス、ナイセリア-ゴノレエ(N.gonorrhoeae)、ナイセリア-ラクタミカ(N. lactamica)、ナイセリア-ポリサッカレア(N. polysaccharea)、ナイセリア-シネレア(N. cinerea)、ナイセリア-ムコーサ(N. mucosa)、ナイセリア-サブフラバ(N. subflava)、ナイセリア-シッカ(N. sicca)、ナイセリア-エロンガタ(N. elongata)などが含まれる。細菌株に関して「に由来する」は、株が親株のインビボでの継代によって、もしくはインビトロ培養において得られたことを、および/または親株の改変によって得られた組換え細胞であることを示すことが意図される。
【００６４】
髄膜炎菌株が本発明において特に関心対象である。髄膜炎菌株は、異なる表面抗原と相互作用するポリクローナル抗体(Frasch, C. E. and Chapman、1973, J. Infect. Dis. 127: 149-154)またはモノクローナル抗体との反応に基づいて、血清学的グループ、血清型、および血清亜型に分けることができる。血清群分類は、免疫学的に検出可能な莢膜多糖変化に基づいている。約12種類の血清群(A、B、C、X、Y、Z、29-E、およびW-135)が公知である。血清群A、B、C、Y、およびW-135の株はほとんど全ての髄膜炎菌性疾患の原因となる。
【００６５】
血清型分類は、モノクローナル抗体によって規定される、ポーリンB(PorB)と呼ばれる外膜タンパク質の抗原性の違いに基づいている。約21種類の血清型を規定する抗体が現在公知である(Sacchi et al, 1998、Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348)。血清亜型分類は、抗体によって規定される、ポーリンA(PorA)と呼ばれる外膜タンパク質の抗原性の変化に基づいている。約18種類の血清亜型を規定する抗体が現在公知である。血清亜型分類は、特に、免疫が血清亜型特異的であり得る髄膜炎菌株において重要である。PorAタンパク質間の大部分の変化は、8つの推定表面露出ループの2つ(ループIおよびIV)において生じる。可変ループIおよびIVは、それぞれ、VR1およびVR2と指定されている。特異的抗体によって規定されていないPorA VR1配列変種およびVR2配列変種が存在するので、DNA配列決定から推定されるアミノ酸配列のVRタイピングに基づく別の命名法が提案されている(Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169;Multi Locus Sequence Typingウエブサイトも参照されたい)。いわゆる、免疫型L1、L2などを生じるリポ多糖もタイピング抗原として使用することができる。
【００６６】
髄膜炎菌はまた、細菌ゲノムを直接的または間接的に特徴付ける様々な技法を用いて、クローン群またはクローン亜群に分けることもできる。これらの技法には、酵素の電気泳動移動度の変化に基づく多座酵素電気泳動(MLEE)が含まれる。酵素の電気泳動移動度の変化は、特定の遺伝子座の基礎となる多型を反映している。多数のこのようなタンパク質の変種を特徴付けることによって、ミスマッチ比から、2つの株間の遺伝的「距離」を推測することができる。同様に、2つの分離菌が、多数の遺伝子座において同一の電気泳動変種パターンを有すれば、2つの分離菌間のクローン性を推測することができる。つい最近、微生物を特徴付けるえり抜きの方法として、多座配列タイピング(MLST)がMLEEに取って代わった。MLSTを使用すると、髄膜炎菌株にある11のハウスキービング遺伝子のDNA配列のミスマッチ比から、2つの分離菌間の遺伝的距離すなわちクローン性が推測される(Maiden et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140)。
【００６７】
小胞生成に用いられる株は、望ましい可能性のある多数の異なる特徴に従って選択することができる。例えば、GNA1870産生レベルによる選択に加えて、株は、望ましいPorA型(前記の「血清亜型」)、血清群、血清型など;低い莢膜多糖産生などに従って選択されてもよい。
【００６８】
例えば、生成株は、任意の望ましいPorAポリペプチドを産生してもよく、1種類または複数の種類PorAポリペプチドを(天然に、または遺伝子工学により)発現してもよい。例示的な株には、血清亜型P1.7,16;P1.19,15;P1.7,1;P1.5,2;P1.22a,14;P1.14;P1.5,10;P1.7,4;P1.12,13を付与するPorAポリペプチドを産生する株、ならびに血清亜型分類において用いられる従来の血清学試薬との反応性を保持してもよく、保持しなくてもよい、このようなPorAポリペプチドの変種を産生する株が含まれる。
【００６９】
PorA可変領域(VR)タイピングに従って特徴付けられるPorAポリペプチドも関心対象である(例えば、Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678; Sacchi CT, et al, Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:845-55; Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182:1169-1176を参照されたい)。かなりの数の別個のVR型が特定されており、VR1およびVR2ファミリー「プロトタイプ」に分類することができる。この命名法およびこの命名法と以前のタイピング手法との関係について説明しているウエブアクセス可能なデータベースはneisseria.org/nm/typing/poraにおいて見られる。例示的なPorA VR1型およびVR2型のアラインメントはRussell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678で示されており、読者の便宜のために図9に示した。
【００７０】
PorA血清亜型によって特徴付けられる例示的なPorAポリペプチドは、
2008528597.tif 000003
を含む。
【００７１】
例示的なPorAポリペプチドのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号
2008528597.tif 000004
で見られる。
【００７２】
または、もしくはさらに、生成株は莢膜欠損株でもよい。莢膜欠損株は、ワクチンが投与される被験体において重大な自己抗体反応を(例えば、宿主細胞表面上のシアル酸と交差反応する抗体が生じることにより)誘発するリスクの低い小胞を基にしたワクチンを提供することができる。本明細書で使用する「莢膜欠損の」または「莢膜多糖が欠損した」は、天然株より低い、または株が遺伝子改変されている場合には、莢膜欠損株を得るのに用いられた親株より低い、細菌表面上の莢膜多糖レベルを意味する。莢膜欠損株には、表面莢膜多糖の産生が少なくとも10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、またはそれ以上少ない株、および莢膜多糖が細菌表面上で検出できない株(例えば、抗莢膜多糖抗体を用いた全細胞ELISAによって検出できない株)が含まれる。
【００７３】
莢膜欠損株には、天然の遺伝子改変または組換えによる遺伝子組み換えによって莢膜欠損になった株が含まれる。天然の莢膜欠損株(例えば、Dolan-Livengood et al. J. Infect. Dis. (2003) 187(10):1616-28)を参照されたい)、ならびに莢膜欠損株を特定および/または作成する方法(例えば、Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73(7):4070-4080; Stephens et al. (1991) Infect Immun 59(11):4097-102; Frosch et al. (1990) Mol Microbiol. 1990 4(7):1215-1218を参照されたい)は当技術分野において公知である。
【００７４】
莢膜多糖の産生を低下させるようなナイセリア宿主細胞の改変は、莢膜合成に関与する1種類または複数の種類の遺伝子の改変を含んでもよい。このような改変によって、例えば、改変前の親細胞と比較して莢膜多糖レベルが下がる。このような遺伝子改変は、株を莢膜欠損にする、1種類または複数の種類の莢膜生合成遺伝子のヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の変化(例えば、1種類または複数の種類の莢膜生合成遺伝子における1つまたは複数の挿入、欠失、置換などによる変化)を含んでもよい。莢膜欠損株は、1種類または複数の種類の莢膜遺伝子を欠いてもよく、1種類または複数の種類の莢膜遺伝子が機能しなくてもよい。
【００７５】
特に関心対象であるものは、シアル酸生合成が欠損している株である。このような株は、ヒトシアル酸抗原と交差反応する抗シアル酸抗体を誘発するリスクの低い小胞を産生することができ、さらに、改善した製造安全性を提供することができる。(天然改変または操作された改変により)シアル酸生合成に欠損を有する株は、シアル酸生合成経路の多数の異なるどの遺伝子に欠損があってもよい。特に関心対象であるものは、N-アセチルグルコサミン-6-リン酸2-エピメラーゼ遺伝子(synX AAF40537.1またはsiaA AAA20475として知られる)によってコードされる遺伝子産物に欠損のある株であり、この遺伝子が不活化されている株は特別の関心対象である。例えば、1つの態様では、莢膜欠損株は、機能的synX遺伝子産物の産生を破壊することによって作成される(例えば、Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176(5):1530-4を参照されたい)。
【００７６】
莢膜欠損株は、非組換え法を用いて、例えば、殺菌性抗莢膜抗体を用いて、莢膜多糖が少ない株を選択することによって、天然株から作成することもできる。
【００７７】
本発明は、(例えば、以下でさらに詳細に述べるように、異なる株からの小胞の抗原性組成物を生成するために)2種類またはそれ以上の株の使用を伴う場合、1つまたは複数の株の特徴が異なるように、例えば、PorA型および/またはGNA1870変種群が異なる小胞をもたらすように、株を選択することができる。
【００７８】
ナイセリア宿主細胞におけるGNA1870産生
一般的に前記のように、小胞は、被験体に投与されると抗GNA1870抗体の産生を提供する十分なGNA1870タンパク質を有する小胞を産生する天然ナイセリア株または改変された非天然ナイセリア株を用いて、本発明に従って生成することができる。
【００７９】
1つの態様では、本発明に従って小胞の生成に用いられるナイセリア株は、検出可能なレベルのGNA1870を発現しない株または低レベルのGNA1870を発現する株と比較して、多レベルのGNA1870を発現する天然株でもよい。RM1090が低レベルのGNA1870を産生する株の一例である。RM1090などのGNA1870低産生株におけるGNA1870産生より1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、もしくは10倍、またはそれ以上のレベルでGNA1870を産生する天然株が特に関心対象である。高レベルのGNA1870を発現する天然株の例には、H44/76、Cu385、およびMC58などのET-5株が含まれる。低レベルのGNA1870を発現する株もしくは検出可能なレベルのGNA1870を発現しない株、中間レベルのGNA1870を発現する株、または高レベルのGNA1870を発現する株の説明については、Masignani et al. 2003、J Exp Med 197:789-199を参照されたい。特定の態様において、これらの株は、RM1090において産生されるGNA1870レベルより高く、RM1090において産生されるGNA1870レベルより少なくとも1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、もしくは10倍、またはそれ以上であり得るレベルのGNA1870を産生する。
【００８０】
別の態様において、ナイセリア株は、十分に高いレベルのGNA1870産生をもたらすように、組換え法または非組換え法によって改変される。このような改変株は、一般的に、非改変親細胞におけるGNA1870産生またはRM1090株のGNA1870産生より、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、もしくは10倍、またはそれ以上のGNA1870産生増加をもたらすように作成される。この態様では、改変前に低レベルのGNA1870を産生する株または検出可能なレベルのGNA1870を産生しない株、および検出可能なレベルを発現しない株または低レベルのGNA1870を発現する株と比較して高レベルのGNA1870を天然に産生する株を含む、任意の適切な株を使用することができる。
【００８１】
改変株は、非組換え法、例えば、化学物質、放射線、または他のDNA修飾剤もしくはDNA損傷剤などへの曝露によって作成することができる。望ましいタンパク質発現プロファイル、特に、GNA1870産生に関して望ましいタンパク質発現プロファイルを有する改変株は、望ましいレベルのGNA1870 (例えば、非改変親株もしくはGNA1870低産生株(例えば、RM1090)と比較して高レベルのGNA1870、または許容可能に高いレベルのGNA1870を産生する株のレベルと同様のレベル)を産生する株のスクリーニングによって特定することができる。
【００８２】
または、およびさらに通常は、改変株は、組換え法を用いて、通常、GNA1870ポリペプチドをコードする核酸を導入することによって、または内因性GNA1870を高発現させるように内因性GNA1870遺伝子を操作することによって作成される。
【００８３】
GNA1870産生レベルを確かめる方法は当技術分野において公知である。このような方法には、例えば、ウエスタンブロット(任意に、デンシトメトリースキャンによって支援される分析を伴う)、抗GNA1870抗体を用いたフローサイトメトリー(例えば、FACS)分析、GNA1870 RNAレベルの検出などが含まれる。天然に、または遺伝子改変により高レベルのGNA1870産生を有する株は、本明細書では時としてGNA1870「過剰発現株」と呼ばれ、GNA1870を「過剰発現」すると言われる。
【００８４】
遺伝子改変ナイセリア株の作成
前記のように、GNA1870ポリペプチドをコードする核酸を導入することによって、または内因性GNA1870を高発現させるように内因性GNA1870遺伝子をを操作することによる。
【００８５】
内因性GNA1870を高発現させるように遺伝子改変されたナイセリア宿主細胞
内因性GNA1870の発現は、GNA1870の発現を制御する調節領域をインサイチューで変えることによって高めることができる。内因性ナイセリア遺伝子を高発現させる方法は当技術分野において公知である(例えば、国際公開公報第02/09746号を参照されたい)。さらに、ゲノムGNA1870変種および亜変種をコードする遺伝子の核酸配列は公知であり、このために、内因性GNA1870発現のアップレギュレーションにおいて、このような方法を容易に合わせることができる。
【００８６】
内因性GNA1870は任意の望ましい変種群(例えば、v.1、v.2、v.3など)のものでもよく、GNA1870亜変種でもよい。MC58株の「標準」v.1 GNA1870ポリペプチドが特に関心対象である。NZ98/294株の亜変種 GNA1870ポリペプチドおよび2996株v.2 GNA1870ポリペプチドも関心対象である。
【００８７】
内因性GNA1870を高発現させるようなナイセリア宿主細胞の改変は、GNA1870発現を制御する内因性遺伝子の全てまたは一部の部分置換または全置換を含んでもよい。この場合、改変は、例えば、非改変親株と比較して高い転写活性をもたらす。高い転写活性は、内因性制御領域の変種(点変異、欠失、および/または挿入)によって、天然プロモーターもしくは改変異種プロモーターによって、または両方の組み合わせによって付与されてもよい。一般的に、遺伝子改変は、改変されていない内因性転写活性より大きな転写活性を(例えば、強力プロモーターを導入することによって)付与し、GNA1870を高発現させる。
【００８８】
GNA1870転写産生の増大に有用であり得る典型的な強力プロモーターは、例えば、porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、Opa、p110、1st、およびhpuABを含んでもよい。PorA、RMp、およびPorBは、強力な構成的プロモーターとして特に関心対象である。PorBプロモーター活性は、porBの開始コドンの-1〜-250上流にあるヌクレオチドに対応する断片に含まれる。
【００８９】
プロモーターを内因性GNA1870コード核酸に機能的に連結するように、プロモーターを宿主細胞ゲノムに導入する方法が当技術分野において利用可能である。例えば、アップレギュレーションを行うための、コード配列の上流領域、例えば、GNA1870コード核酸配列のATG開始コドンの上流(5'側)の約1000bp、約30〜970bp、約200〜600bp、約300〜500bp、または約400bpにあるプロモーターを導入するダブルクロスオーバー相同組換え技術。プロモーターの最適な配置は、当技術分野において利用可能な方法を日常的に用いることによって決定することができる。
【００９０】
例えば、標的遺伝子の上流にある高活性プロモーター(例えば、PorAプロモーター、PorBプロモーター、またはRmpプロモーター)。一例として、van der Ende et al. Infect Immun 2000;68:6685-90に記載のように、発現のためにPorAプロモーターを最適化することができる。このプロモーターの挿入は、例えば、標的GNA1870遺伝子の上流セグメントをPCR増幅し、上流セグメントをベクターにクローニングし、PCR増幅中に適切な制限部位を挿入するか、または天然の制限部位を用いて、PorAプロモーターセグメントを挿入することによって達成することができる。例えば、GNA1870遺伝子の約700bp上流セグメントをクローニングすることができる。このクローニングされたセグメント内にある、GNA1870プロモーター上流の適切な距離(例えば、約400bp)に位置する天然制限酵素部位を用いて、PorAプロモーターセグメントを挿入する。PorAプロモーターからさらに上流にあるセグメント内に、抗生物質(例えば、エリスロマイシン)耐性カセットを挿入することができる。この構築物を用いて、相同組換えによって野生型上流GNA1870セグメントを置換した。
【００９１】
別のアプローチは、宿主細胞ゲノムにおいて強力な転写活性を示す内因性プロモーターの下流にGNA1870ポリペプチドコード配列を導入することを伴う。例えば、Rmp遺伝子のコード領域を、GNA1870ポリペプチドコード配列で置換することができる。このアプローチは、発現を駆動するために高活性構成的Rmpプロモーターを利用する。
【００９２】
外因性GNA1870を発現するように遺伝子改変されたナイセリア宿主細胞
ナイセリア株は、GNA1870ポリペプチドをコードする構築物をナイセリア宿主細胞に導入することによって、GNA1870を過剰発現するように遺伝子改変することができる。発現のために導入されたGNA1870は、本明細書において「外因性」GNA1870と呼ばれる。宿主細胞は内因性GNA1870を産生し、外因性GNA1870は、内因性GNA1870と比較して同じアミノ酸配列を有してもよく、異なるアミノ酸配列を有してもよい。
【００９３】
この態様において宿主細胞として用いられる株は、任意のレベルのGNA1870を産生することができる(例えば、高レベル、中間レベル、または低レベルのGNA1870産生)。特に関心対象であるものは、低レベルのGNA1870産生もしくは検出不可能なGNA1870産生について選択された株、または検出不可能なレベルもしくは低レベルのGNA1870産生を示すように改変された株の使用である。例えば、宿主細胞は、GNA1870が産生されないように、または細胞エンベロープに存在しないように(従って、このような改変細胞から調製された小胞中に検出可能なレベルで存在しないように)、内因性GNA1870遺伝子が破壊されるように遺伝子改変されてもよい。他の態様において、宿主細胞は、(例えば、GNA1870レベル、例えば、RM1090によって産生されたGNA1870レベルと比較して)中間レベルまたは高レベルのGNA1870を産生する。
【００９４】
GNA1870ポリペプチド
宿主細胞は、GNA1870変種または亜変種を含む任意の適切なGNA1870ポリペプチドを発現するように遺伝子改変することができる。以下でさらに詳細に説明するように、多くのGNA1870ポリペプチドのアミノ酸配列は公知である。これらの配列のアラインメントによって、変種間で保存されている残基に関する指針、従って、作成可能なアミノ酸改変(例えば、置換、挿入、欠失)に関する指針が得られる。
【００９５】
従って、本明細書で使用する「GNA1870ポリペプチド」は、天然GNA1870ポリペプチドと、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上の配列同一性を共有し、かつ全細胞ナイセリア細菌に存在する天然GNA1870ポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発することができる、天然ポリペプチドおよび合成(非天然)ポリペプチドを含む。「GNA1870ポリペプチド」はまた、融合タンパク質、例えば、N末端および/またはC末端に異種ポリペプチドを有するGNA1870ポリペプチドも含む。
【００９６】
宿主細胞は、少なくとも1種類のGNA1870ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されてもよく、同じ宿主細胞において2種類、3種類、4種類、またはそれ以上のGNA1870ポリペプチドを発現するように改変されてもよい。例えば、1つの宿主細胞が、少なくとも1種類の変種1 GNA1870ポリペプチド、少なくとも1種類の変種2 GNA1870ポリペプチド、および少なくとも1種類の変種3 GNA1870ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されてもよい。
【００９７】
複数のGNA1870ポリペプチドの発現が宿主への毒性のために難局に当たる場合、広範囲の発現が可能になるように、異なるGNA1870ポリペプチドを異なるプロモーターから発現させることができる。例えば、PorAプロモーターの-10〜-35領域の塩基組成および塩基数を変えると、望ましい組換えタンパク質の広範囲の発現が得られるはずである(van der Ende et al. Infect Immun 2000;68:6685-90)。
【００９８】
本発明における使用のためのGNA1870ポリペプチドをコードする核酸は当技術分野において公知である。適切なGNA1870ポリペプチドは、例えば、国際公開公報第2004/048404号; Masignani et al. 2003 J Exp Med 197:789-799; Fletcher et al. Infect Immun 2004 2088-2100; Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615;および国際公開公報第99/57280号に記載されている。GNA1870変種および亜変種の核酸(およびアミノ酸配列)もGenBankにアクセッション番号:NC_003112,GeneID:904318(NCBI Ref.NP_274866)(髄膜炎菌MC58株から);AY548371(AAT01290.1)(髄膜炎菌CU385株から);AY548370(AAT01289.1)(髄膜炎菌H44/76株から);AY548377(AAS56920.1)(髄膜炎菌M4105株から);AY548376(AAS56919.1)(ナイセリア属M1390株から);AY548375(AAS56918.1)(髄膜炎菌N98/254株から);AY548374(AAS56917.1)(髄膜炎菌M6190株から);AY548373(AAS56916.1)(髄膜炎菌4243株から);およびAY548372(AAS56915.1)(髄膜炎菌BZ83株から)として提供されている。
【００９９】
図7は、髄膜炎菌MC58株からのGNA1870変種1、髄膜炎菌951-5945株からのGNA1870変種2、および髄膜炎菌M1239株からのGNA1870変種3の例示的なアミノ酸配列のアラインメントである(国際公開公報第2004/048404号)。未熟なGNA1870タンパク質は約19残基のリーダー配列を含み、それぞれの変種は、通常、脂質部分が共有結合することができるN末端システインを含有する。このシステイン残基は、天然タンパク質では通常、脂質化されている。「1」は成熟タンパク質の最初のアミノ酸を示し、負の数で示されるアミノ酸はリーダー配列の部分である。灰色および黒色のバックグラウンドは、それぞれ、保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を示す。非天然変種を含むGNA1870ポリペプチドのさらなるアミノ酸配列を図8A〜8Hおよび図9に示す。
【０１００】
GNA1870は脂質化されていてもよく、脂質化されてなくてもよい。一般的に、GNA1870は、このポリペプチドが膜に位置するように脂質化されていることが好ましい。脂質化GNA1870は、ジアシルグリセリルトランスフェラーゼによる脂質化を方向付けるN末端シグナルペプチドを有するGNA1870ポリペプチドを発現させ、その後に、リポタンパク質特異的(II型)シグナルペプチダーゼによる切断を行うことによって調製することができる。
【０１０１】
本発明において有用なGNA1870ポリペプチドには、アミノ酸配列の点で天然GNA1870ポリペプチドと異なるが、宿主から調製された小胞が関心対象のエピトープ、好ましくは、殺菌性エピトープを提示する形でGNA1870を含有し、抗GNA1870抗体反応をもたらすようにナイセリア宿主の膜に存在する、非天然(人工または変異体)GNA1870ポリペプチドが含まれる。1つの態様では、GNA1870ポリペプチドは、変種1(v.1)または変種2(v.2)または変種3(v.3)GNA1870ポリペプチドであり、v.1の亜変種を含む、v.1、v.2、およびv.3の亜変種が関心対象である(例えば、Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615を参照されたい)。1つの態様では、GNA1870ポリペプチドは、ワクチン接種しようとする集団に固有の株の中で最も流行しているGNA1870ポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
本発明において有用なGNA1870ポリペプチドには、N末端またはC末端に融合パートナーを有するGNA1870ポリペプチドを含む融合タンパク質も含まれる。関心対象の融合パートナーには、例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質(MBP)、Hisタグなど、ならびに他のタンパク質、特に、リポタンパク質からのリーダーペプチドが含まれる(例えば、N末端システインの前にあるアミノ酸配列が、関心対象の別のリーダーペプチドで置換されてもよい)。
【０１０３】
他のGNA1870ポリペプチドコード核酸は当技術分野において周知の技法を用いて特定することができる。ここで、GNA1870ポリペプチドは、公知のGNA1870ポリペプチドとのアミノ酸配列類似性に基づいて特定することができる。このようなGNA1870ポリペプチドは、一般的に、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで、少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上の配列同一性を共有する。配列同一性は、当技術分野において周知の、核酸配列またはアミノ酸配列をアラインメントまたは比較する方法を用いて決定することができる。長い配列の比較には、2つの配列の最適アラインメントを実現するためにより高度な方法が必要とされる場合がある。比較ウィンドウをアラインメントするための最適な配列アラインメントは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 85:2444の類似性手法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または検査によって行うことができ、様々な方法によって作成された最良のアラインメント(すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い配列類似性パーセントをもたらすアラインメント)が選択される。
【０１０４】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関する用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたは目視検査によって測定されるように最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、同じであるか、特定のパーセントの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。関心対象のポリペプチドには、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてもしくは目視検査によって測定されるように最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有するポリペプチドが含まれる。好ましくは、配列同一性を共有する配列は、長さが少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、もしくは100連続残基である配列の領域にわたって存在する。最も好ましい態様において、配列の同一性は、参照ポリペプチドのコード領域の全長にわたって配列を比較することによって決定される。
【０１０５】
配列比較のために、典型的に、1つの配列が参照配列(例えば、天然GNA1870ポリペプチド配列)として働き、参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１０６】
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性手法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または目視検査によって行うことができる(一般的には、Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業, (1995 Supplement)(Ausubel)を参照されたい)。
【０１０７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例はBLASTおよびBLAST 2.0 アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschuel et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手することができる。このアルゴリズムは、まず最初に、データベース配列中の長さWのワードとアラインメントした時に正の値の閾値スコアTにマッチまたは適合する、クエリー配列中の長さWの短いワードを特定することによって、高スコア配列対(high scoring sequence pair)(HSP)を特定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)(Altschul et al, 前出)と呼ばれる。
【０１０８】
これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いHSPを発見する検索を開始するための種配列(seed)として働く。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM(一対のマッチ残基のリワードスコア(reward score);常に、>0)およびN(ミスマッチ残基のペナルティースコア(penalty score);常に、<0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが用いられる。累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Xだけ減少した時に;1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0もしくはそれ以下になった時に;またはいずれかの配列の末端に到達した時に、各方向でのワードヒットの延長は止まる。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照のこと)。
【０１０９】
BLASTアルゴリズムはまた、パーセント配列同一性を計算することに加えて、2つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin & Altschul, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の1つの尺度は最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸を比較した時の最小合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【０１１０】
2つの核酸配列またはポリペプチドが配列同一性を共有することをさらに示すものは、下記のように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが第2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、ポリペプチドと第2のポリペプチドが保存的置換でしか異ならない場合、典型的に、ポリペプチドは第2のポリペプチドと配列同一性を共有する。2つの核酸配列が配列同一性を共有することを示す別のものは、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。特定のハイブリダイゼーション条件セットの選択は、当技術分野における標準的な方法に従って選択される(例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい)。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、50℃またはそれ以上、0.1×SSC(15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、50％ホルムアミド、5×SSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10％デキストラン硫酸、および20mg/ml変性破砕サケ精子DNAの溶液中で、42℃、一晩のインキュベーション、それに続く、約65℃で0.1×SSCによるフィルターの洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、前記の代表的な条件と少なくとも同じくらいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。ここで、条件が前記の特定のストリンジェントな条件の少なくとも約80％のストリンジェンシーである場合、典型的に、少なくとも約90％のストリンジェンシーである場合に、少なくともストリンジェントであるとみなされる。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当技術分野において周知であり、本発明のこの特定の態様の核酸を特定するのに使用することもできる。
【０１１１】
好ましくは、同一でない残基位置はアミノ酸の保存的置換によって異なる。アミノ酸保存的置換は、類似する側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンである。アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンである。芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである。硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましいアミノ酸保存的置換グループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。
【０１１２】
遺伝物質をナイセリア宿主細胞に導入するためのベクターおよび方法
外因性GNA1870ポリペプチドを発現させるためにナイセリア宿主細胞を遺伝子改変するように容易に合わせることができる方法および組成物は当技術分野において公知である。例示的なベクターおよび方法は、国際公開公報第02/09746号およびO'Dwyer et al. Infect Immun 2004;72:6511-80に示されている。
【０１１３】
遺伝物質をナイセリア宿主に導入するための方法には、例えば、接合、形質転換、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法などが含まれる。これらの導入方法は、導入されたGNA1870コード核酸を安定して発現させるはずである。GNA1870コード核酸は、遺伝性のエピソームエレメント(例えば、プラスミド)として提供されてもよく、ゲノムに組み込まれてもよい。
【０１１４】
適切なベクターは、どのような種類の組換え事象を実施しようとするのかに応じて組成が異なる。組込みベクターは、条件によって複製するプラスミドまたは自殺プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、または制限加水分解もしくはPCR増幅によって得られた線状DNA断片でもよい。組換え事象の選択は、抗生物質（カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、もしくはゲンタマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子、重金属耐性および/もしくは毒性化合物耐性を付与する遺伝子、または栄養要求性変異を補う遺伝子(例えば、pur、leu、met、aro)などの選択可能な遺伝子マーカーによって達成することができる。
【０１１５】
1つの態様では、ベクターは、選択可能な薬物耐性マーカーを含有し、大腸菌および髄膜炎菌の両方において自律複製するエピソームプラスミドに基づく発現ベクターである。このような「シャトルベクター」の一例がプラスミドpFP10(Pagotto et al. Gene 2000 244:13-19)である。
【０１１６】
髄膜炎菌小胞の調製
一般的に、本発明において使用するための抗原性組成物は、天然に、または遺伝子改変によって(例えば、組換えGNA1870の発現によって)許容可能なレベルのGNA1870を発現するナイセリア細胞から調製された小胞を含む。本明細書において言及する「小胞」は、外膜小胞ならびに微小胞(泡状突起とも呼ばれる)を含むことが意図される。
【０１１７】
1つの態様では、抗原性組成物は、髄膜炎菌種の培養株の外膜から調製された外膜小胞(OMV)を含む。OMVは、好ましくは、(例えば、濾過もしくは細胞をペレット化する低速遠心分離などによって)細菌細胞を培地から分離し、(例えば、界面活性剤の添加、浸透圧衝撃、超音波処理、キャビテーション、ホモジナイゼーションなどによって)細胞を溶解し、(例えば、濾過;または外膜および/もしくは外膜小胞の分画沈殿(differential precipitation)もしくは凝集;または外膜分子を特異的に認識するリガンドを用いた親和性分離法;または外膜および/もしくは外膜小胞をペレット化する高速遠心分離などによって)外膜画分を細胞質分子から分離することによって、ブロスまたは固形培地において増殖された髄膜炎菌から得ることができる。外膜画分は、OMVを生成するのに使用することができる。
【０１１８】
別の態様において、抗原性組成物は、髄膜炎菌種の培養中に放出された微小胞(MV)または泡状突起を含む。MVは、髄膜炎菌株をブロス培地において培養し、(例えば、濾過、または細胞のみをペレット化し、細胞より小さな泡状突起をペレット化しない低速遠心分離などによって)ブロス培地から全細胞を分離し、次いで、(例えば、濾過によって、MVの分画沈殿もしくは凝集、または泡状突起をペレット化する高速遠心分離などによって)無細胞培地に存在するMVを収集することによって得ることができる。MVの生成に使用する株は、一般的に、培養において産生された泡状突起の量に基づいて選択することができる(例えば、細菌は、本明細書に記載の方法における単離および投与に適した泡状突起を産生するように妥当な数で培養することができる)。高レベルの泡状突起を産生する例示的な株はPCT国際公開公報第01/34642号に記載されている。泡状突起の産生に加えて、MV生成において使用する株は、高レベルのNspAを産生する株が好ましいことがある場合、NspA産生に基づいて選択することもできる(異なるNspA産生レベルを有する髄膜炎菌(N. meningitides)の例については、例えば、Moe et al.(1999 Infect. Immun. 67: 5664)を参照されたい)。
【０１１９】
別の態様において、抗原性組成物は、1種類の株、または2種類、3種類、4種類、5種類、もしくはそれ以上の株からの小胞を含む。これらの株は、GNA1870またはPorAの1つまたは両方に関して互いに相同でも異種でもよく、通常、異種である。1つの態様では、小胞は、1種類、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類、もしくは10種類、またはそれ以上のGNA1870タンパク質を発現する株から調製される。これらのGNA1870タンパク質は、異なる変種(v.1、v.2、v.3)または亜変種(例えば、v.1、v.2、もしくはv.3の亜変種)でもよい。別の態様において、抗原性組成物はOMVおよびMVの混合物を含み、OMVおよびMVは同じ株または異なる株からのものでもよい。このような態様において、異なる株からの小胞は混合物として投与することができる。さらに、同じ株または異なる株からのOMVおよびMVは混合物として投与することができる。小胞(OMVおよび/またはMV)に加えて、単離された抗原または抗原の特定の組み合わせが本発明の抗原性組成物に含まれてもよい。
【０１２０】
脂質毒性の低下
所望であれば(例えば、小胞の生成に用いられる株がエンドトキシンまたは特定の高レベルのエンドトキシンと関連する場合)、任意に、小胞は、エンドトキシンを減らすように、例えば、投与後の毒性を低下させるように処理される。下記のように、あまり望ましくないが、エンドトキシンは、適切な界面活性剤(例えば、BRIJ-96、デオキシコール酸ナトリウム、ナトリウムラウオイルサルコシネート(sodium lauoylsarcosinate)、Empigen BB、TritonX-100、TWEEN20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)、TWEEN80、0.1〜10％、好ましくは、0.5〜2％の濃度、およびSDS)を用いた抽出によって減らすことができる。界面活性剤抽出が用いられる場合、デオキシコール酸塩以外の界面活性剤を使用することが好ましい。ある態様では、小胞は、界面活性剤を用いることなく、例えば、デオキシコール酸塩または他の界面活性剤を用いることなく生成される。
【０１２１】
特に関心対象の態様において、抗原性組成物の小胞は、界面活性剤なしで調製される。界面活性剤処理はエンドトキシン活性を除去するのに有用であるが、小胞生成中に抽出によって、ネイティブなGNA1870リポタンパク質を欠乏させることがある。従って、界面活性剤を必要としない技術を用いてエンドトキシン活性を下げることが特に望ましい場合がある。1つのアプローチでは、ヒトに使用する前の最終調製物からエンドトキシンを除去する必要を無くすために、エンドトキシン(リポ多糖、LPS)の比較的低い産生株である株が用いられる。例えば、小胞は、ワクチンに望ましくない可能性があるリポオリゴ糖または他の抗原(例えば、Rmp)が少ない、または無いナイセリア属変異体から調製することができる。
【０１２２】
例えば、小胞は、リピドA毒性活性を下げる、または検出不可能にする遺伝子改変を含む髄膜炎菌株から調製することができる。例えば、このような株は、リピドA生合成に関して遺伝子改変することができる(Steeghs et al. Infect Immun 1999;67:4988-93; van der Ley et al. Infect Immun 2001;69:5981-90; Steeghs et al. J Endotoxin Res 2004;10:113-9)。末端修飾段階を担う遺伝子の変異は温度感受性(htrB)または温度許容性(msbB)の表現型につながる。これらの遺伝子の発現を低下させる(もしくは無くす)(またはこれらの遺伝子の産物の活性を低下させる、もしくは無くす)変異があると、リピドAの毒性活性が変化する。非ラウロイル化(htrB変異体)リピドAまたは非ミルストイル化(msbB変異体)リピドAは、野生型リピドAより毒性が低い。リピドA 4'-キナーゼをコードする遺伝子(lpxK)の変異もリピドAの毒性活性を下げる。
【０１２３】
LPS毒性活性はまた、ポリミキシンB耐性に関与する遺伝子/遺伝子座に変異を導入することによって変えることもできる(このような耐性は、リピドAの4'リン酸へのアミノアラビノース付加と相関付けられている)。これらの遺伝子/遺伝子座は、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼをコードするpmrEでもよく、アミノアラビノースの合成および転移に関与する可能性のある、多くの腸内細菌科(enterobacteriaciae)に共通の抗菌性ペプチド耐性遺伝子の一領域でもよい。この領域に存在する遺伝子pmrFは、ドリコール(dolicol)リン酸マノシル(manosyl)トランスフェラーゼをコードする(Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182)。
【０１２４】
リン酸リレー2成分調節系であるPhoP-PhoQ調節系の変異(例えば、PhoP構成的表現型、PhoPc)、または低いMg＋＋環境条件もしくは培養条件(PhoP-PhoQ調節系を活性化する)は、4'リン酸へのアミノアラビノースの付加、およびミリスチン酸の2-ヒドロキシミリスチン酸による置換(ミリスチン酸のヒドロキシル化)につながる。この修飾リピドAは、ヒト内皮細胞によるEセレクチン発現およびヒト単球からのTNF-α分泌を刺激する能力が低い。
【０１２５】
ポリミキシンB耐性株、例えば、LPS毒性が低いことが示されている株も本発明における使用に適している(例えば、van der Ley et al. 1994. In: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, Englandを参照されたい)。または、LPS毒性活性を下げるために、ポリミキシンBの結合活性を模倣する合成ペプチドが抗原性組成物に添加されてもよい(例えば、Rustici et al. 1993, Science 259:361-365; Porro et al. Prog Clin Biol Res. 1998;397:315-25を参照されたい)。
【０１２６】
エンドトキシンはまた培養条件の選択によっても減らすことができる。例えば、増殖培地1リットル当たり0.1mg〜100mgのアミノアラビノースを含有する増殖培地中で株を培養することによって、脂質毒性が低下する(例えば、国際公開公報第02/097646号を参照されたい)。
【０１２７】
製剤
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原、特に、免疫学的有効量のGNA1870、ならびに、必要に応じて、他の任意の適合成分を含む。「免疫学的有効量」とは、1回量または一連の投与の一部である免疫学的有効量を個体に投与することが治療または予防のための誘発に有効であることを意味する。この量は、治療しようとする個体の健康状態および身体状態、年齢、治療しようとする個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類、ヒトなど)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい防御の程度、ワクチンの処方、治療を行っている医師による医学的状態の評価、ならびに他の関連要因に応じて変化する。この量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲の中に入ると予想される。
【０１２８】
投与計画は単回投与計画でもよく、抗原性組成物の単位剤形が異なる時間に投与される複数回投与計画(例えば、追加免疫投与を含む)でもよい。本明細書で使用する用語「単位剤形」は、ヒト被験者および動物被験体への単位投与として適切な物理的に別個の単位を意味し、それぞれの単位は、望ましい効果を生じるのに十分な量で、所定量の本発明の抗原性組成物を含有し、組成物は、薬学的に許容される賦形剤(例えば、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクル)と共に提供される。ワクチンは、他の免疫調節剤と共に投与されてもよい。
【０１２９】
投与しようとする抗原性組成物は、水溶液、多くの場合、食塩水などの薬学的に許容される希釈剤に入れて、半固体(例えば、ゲル)の形で、または粉末の形で提供される。このような希釈剤は不活性でもよいが、本発明の組成物はアジュバントも含んでよい。ヒトにおいて使用することができる適切な公知のアジュバントの例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、MF59(4.3％ w/vスクアレン、0.5％ w/v Tween80、0.5％w/v Span85)、CpG含有核酸(シトシンはメチル化されていない)、QS21、MPL、3DMPL、Aquillaからの抽出物、ISCOMS、LT/CT変異体、ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)(PLG)微小粒子、Quil A、インターロイキンなどが含まれるが、必ずしも、これに限定されるとは限らない。実験動物の場合、フロイントアジュバント、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP11637、ノルMDPと呼ばれる)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(CGP19835A、MTP-PEと呼ばれる)、およびRIBIを使用することができる。RIBIは、2％スクアレン/Tween80エマルジョン中に、細菌から抽出された3種類の成分、モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格(MPL＋TDM＋CWS)を含有する。
【０１３０】
組成物の有効性を高める、さらに例示的なアジュバントには、(1)水中油型エマルジョン製剤(ムラミルペプチド(以下を参照されたい)または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫賦活剤を含む、または含まない)、例えば(a)5％スクアレン、0.5％Tween80、および0.5％Span85を含有し(任意に、MTP-PEを含有し)、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方された、MF59(商標)(国際公開公報第90/14837号; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995)、(b)10％スクアラン、0.4％Tween80、5％プルロニック-ブロックドポリマーL121、およびthr-MDPを含有し、サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズ(microfluidize)されるか、またはより大きな粒径のエマルジョンを生じるまでボルテックスされた、SAF、ならびに(c)2％スクアレン、0.2％Tween80、ならびにモノホスホリリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくは、MPL＋CWS(DETOX(商標))などの1種類または複数の種類の細菌細胞壁成分を含有する、RIBI(商標)アジュバントシステム(RAS)(Ribi Immunochem, Hamilton, MT);(2)サポニンアジュバント、例えば、QS21またはSTIMULON(商標)(Cambridge Bioscience, Worcester, MA)が用いられてもよく、これらから、ISCOM(免疫賦活複合体)などの粒子が作成されてもよい。ISCOMSはさらなる界面活性剤が無くてもよい。例えば、国際公開公報第00/07621号;(3)フロイント完全アジュバント(CFA)およびフロイント不完全アジュバント(IFA);(4)サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(国際公開公報第99/44636号)など)、インターフェロン(例えば、γインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)など;(5)モノホスホリルリピドA(MPL)または3-O-脱アシルMPL(3dMPL)、例えば、GB-2220221、EP-A-0689454、肺炎球菌糖類と共に使用する場合、ミョウバンを実質的に含まなくてもよい、例えば、国際公開公報第00/56358号;(6)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油型エマルジョンとの組み合わせ、例えば、EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231;(7)シトシンがメチル化されていない、CpGモチーフ[Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3:15-24; Roman et al, Nat. Med, 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al, Ear. J. Immunol, 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami et al, Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al, Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al, PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al, J. Immunol, 1996, 157,2116-2122; Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925; Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402; Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761;および Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 5898-5906;国際特許出願の国際公開公報第96/02555号、国際公開公報第98/16247号、国際公開公報第98/18810号、国際公開公報第98/40100号、国際公開公報第98/55495号、国際公開公報第98/37919号、および国際公開公報第98/52581号]を含む、すなわち、少なくとも1つのCGジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド;(8)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、国際公開公報第99/52549号;(9)オクトキシノールと組み���わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤(国際公開公報第01/21207号)、またはオクトキシノールなどの少なくとも1種類のさらなる非イオン界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤(国際公開公報第01/21152号);(10)サポニンおよび免疫賦活オリゴヌクレオチド(例えば、CpGオリゴヌクレオチド)(国際公開公報第00/62800号);(11)免疫賦活薬および金属塩の粒子、例えば、国際公開公報第00/23105号;(12)サポニンおよび水中油型エマルジョン、例えば、国際公開公報第99/11241号;(13)サポニン(例えば、QS21)＋3dMPL＋IM2(任意で＋ステロール)、例えば、国際公開公報第98/57659号; (14)組成物の効力を高める免疫賦活剤として作用する他の物質が含まれるが、これに限定されない。ムラミルペプチドには、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-25アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(ノルMDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミンMTP-PE)などが含まれる。
【０１３１】
抗原性組成物は、従来の薬学的に許容される賦形剤、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などと組み合わされてもよい。組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、pH調節剤および緩衝剤、毒性調節剤などの薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤における抗原の濃度は多種多様であってもよく、選択された特定の投与方法および患者の要望に応じて、主に、液体の体積、粘度、体重などに基づいて選択される。結果として生じる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション剤、軟膏、エアロゾルなどの形をとってもよい。
【０１３２】
薬学的製剤における本発明の抗原性組成物のタンパク質濃度は多種多様であってもよく、すなわち、約0.1重量％未満、通常は、約2重量％または少なくとも約2重量％から、20重量％〜50重量％程度またはそれ以上まででもよく、選択された特定の投与方法に応じて、主に、液体の体積、粘度などによって選択される。
【０１３３】
免疫化
一般的に、本発明の方法は、ナイセリア属の種の細菌の1種類を超える株に対する防御免疫応答、従って、このような細菌によって引き起こされる疾患に対する防御を誘発するように、本発明の1種類または複数の種類の抗原性組成物を哺乳動物被験体(例えば、ヒト)に投与する。特に、本発明の方法は、血清群、血清型、血清亜型、またはGNA1870ポリペプチド(例えば、異なるGNA1870変種および/もしくは亜変種)の少なくとも1つが異なる、髄膜炎菌種の1種類、2種類、3種類、4種類、またはそれ以上の株に対する免疫防御免疫応答を提供することができる。特に関心対象であるものは、髄膜炎菌血清群Bの複数の種類の株に対する防御免疫応答の誘導、特に、これらの株が血清亜型において異なる(例えば、異種PorAを有する)場合の防御免疫応答の誘導である。PorAおよび/またはGNA1870の点で互いに異種の株に対する防御免疫応答の誘導も特に関心対象である。
【０１３４】
本発明の抗原性組成物は、添加賦形剤と共に、または伴わずに、経口投与、鼻投与、鼻咽頭投与、非経口投与、腸投与、胃投与、局部投与、経皮的投与、皮下投与、筋肉内投与、錠剤、固体、粉末、液体、エアロゾルの形での投与、局所投与または全身投与が可能である。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または明らかであり、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)のような刊行物において、さらに詳細に記載されている。
【０１３５】
経口投与には、組成物を消化から保護する必要があり得ることが認識されている。これは、典型的に、組成物と、組成物を酸加水分解耐性および酵素的加水分解耐性にする薬剤を会合することによって、または組成物を適切な耐性のある担体に入れることによって達成される。消化から保護する手段は当技術分野において周知である。
【０１３６】
組成物は、疾患およびその合併症を予防するために、または疾患およびその合併症の発症を少なくとも部分的にくいとめるために、ナイセリア疾患にかかるリスクのある動物に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療的有効量」と定義される。治療用途に有効な量は、例えば、抗原性組成物、投与方法、患者の体重および全般的な健康状態、ならびに処方を行っている医師の判断に左右される。患者に必要とされる、および忍容される投与量および頻度、ならびに投与経路に応じて、抗原性組成物の1回量または複数回量を投与することができる。
【０１３７】
本明細書に記載の抗原性組成物は、小胞(例えば、OMVおよびMV)の混合物を含んでもよい。小胞は、同じ株または異なる株からのものでもよい。別の態様において、抗原性組成物は、2種類、3種類、4種類、5種類またはそれ以上の株からの小胞の混合物を含んでもよく、株は、OMV、MV、またはその両方でもよい。
【０１３８】
抗原性組成物は、宿主において免疫応答、特に、体液性免疫応答を誘発するのに有効な量で投与される。免疫化のための混合物の量は、一般的に、約0.001mg〜約1.0mg/70キログラム患者であり、より一般的には、約0.001mg〜約0.2mg/70キログラム患者である。特に、抗原が隔離された部位に投与され、体腔または臓器内腔などに入らないなど血流に入らない場合、0.001〜約10mg/患者/日の投与量が用いられてもよい。口腔投与、鼻投与、または局部投与では、かなり高い投与量(例えば、10〜100mgまたはそれ以上)が可能である。混合物の初回投与の後に、同じ混合物または異なる混合物の追加免疫化を行ってもよく、少なくとも1回の追加免疫、より通常は、2回の追加免疫が好ましい。
【０１３９】
1つの態様において、抗原刺激および追加免疫に用いられる抗原性組成物は、変種免疫優性抗原(ナイセリア属に感染している異なる宿主動物からの抗血清によって日常的に検出される主要な抗原;代表的な例には、ポーリンA、ポーリンB、ピリン、NspA、リン脂質、多糖、リポ多糖、ピリン、OmpA、Opa、Opeなどが含まれる)および/または変種GNA1870タンパク質を有するナイセリア属の株から調製される。これらの株はまた、血清群によって反映される莢膜分子に関して異なってもよい。
【０１４０】
現在、血清型の分類および血清亜型の分類は、特定のポーリン分子を認識することが知られている公知のモノクローナルパネルのどれが未知株に結合するかを検出することによって、決定されている(Sacchi et al., 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348)。多分、他のこのようなモノクローナルが特定されるであろう。具体的には、新規の任意のモノクローナルによって規定され得る、新規の任意の血清型および血清亜型の使用が本発明によって意図される。さらに、血清型および血清亜型は、モノクローナル抗体との相互作用だけなく、構造的に、特定のペプチド残基およびペプチドエピトープの非存在および/または存在によっても規定されることがある(Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169)。(公知の、または後日、発見され得る)ポーリンの構造特徴に基づく血清型および血清亜型の分類法が本発明に具体的に含まれる。
【０１４１】
別の態様において、投与される抗原性組成物は、2種類、3種類、4種類、5種類またはそれ以上の株から調製される。これらの株は、GNA1870またはPorAの1つまたは両方に関して互いに相同でも異種でもよく、通常、異種である。1つの態様では、小胞は異なるGNA1870タンパク質を発現する株から調製され、GNA1870タンパク質は、異なる変種(v.1、v.2、v.3)または亜変種(例えば、v.1、v.2、もしくはv.3の亜変種)でもよい。別の態様において、小胞は、PorAに関して互いに異種の株から調製される。
【０１４２】
特に関心対象の態様において、小胞は、互いに遺伝的に異なるナイセリア株から調製される(例えば、これらの株は、異なる血清型および/もしくは血清亜型に属する;異なるPorAタンパク質を発現する;異なるGNA1870変種もしくは亜変種を発現する;ならびに/または任意に、異なる莢膜血清群に属してもよい)。小胞は、このような遺伝的に異なる株の少なくとも2種類、3種類、4種類、またはそれ以上から調製された小胞の混合物である抗原性組成物を調製するのに使用することができる。例えば、抗原性組成物の調製および投与に用いられた第2のナイセリア株のGNA1870タンパク質および/またはPorAは、小胞の産生に用いられた第1の株のものと異なる。
【０１４３】
投与される第2の抗原性組成物、第3の抗原性組成物、およびさらなる抗原性組成物は、任意に、第2の株と遺伝的に異なるナイセリア株から調製されてもよい(例えば、これらの株は、異なる血清型および/もしくは血清亜型に属する;異なるGNA1870タンパク質を発現する;異なるPorAタンパク質を発現する;ならびに/または異なる莢膜血清群に属する)。例えば、第3の抗原性組成物の調製に用いられた第3の株は、第1の抗原性組成物および第2の抗原性組成物の調製に用いられた第1の株および第2の株と遺伝的に異なってもよいが、ある態様では、第1の株に関して遺伝的に異ならなくてもよい。
【０１４４】
本発明はまた、抗原性組成物が、GNA1870をコードする1種類または複数の種類の核酸を発現するように公知の方法(例えば、米国特許第号6,013,267号を参照されたい)によって遺伝子操作された、ナイセリア属、特に、髄膜炎菌の1種類または複数の種類の株から得られてもよいことも意図する。宿主細胞は内因性GNA1870ポリペプチドを発現してもよく、検出可能な内因性GNA1870ポリペプチドを全く発現しないように改変または選択されてもよい。組換え法によって宿主細胞において発現されたGNA1870ポリペプチド(すなわち、外因性GNA1870ポリペプチド)は内因性GNA1870ポリペプチドと同じ変種型でもよく、異なる変種型でもよい。
【０１４５】
宿主細胞は、ポーリンA、ポーリンB、NspA、ピリン、または他のナイセリアタンパク質などの、関心対象のさらなる抗原を発現するようにさらに改変されてもよい。さらに、本発明の抗原組成物は、PCT国際公開公報第99/24578号、同第99/36544号、同第99/57280号、同第00/22430号、および同第00/66791号において例示される抗原などの、さらなるナイセリアナイセリア抗原、ならびにこのようなタンパク質の抗原性断片を含んでもよい。
【０１４６】
抗原組成物は、典型的に、ナイセリア属に関して、特に、髄膜炎菌に関して免疫学的にナイーブな哺乳動物に投与される。特定の態様において、哺乳動物は、約5歳またはそれより幼い、好ましくは、約2歳またはそれより幼いヒト小児である。抗原組成物は、以下の時期:誕生の2週後、1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後、4ヶ月後、5ヶ月後、6ヶ月後、7ヶ月後、8ヶ月後、9ヶ月後、10ヶ月後、もしくは11ヶ月後、または1年後、15ヶ月後、18ヶ月後、もしくは21ヶ月後、あるいは2歳、3歳、4歳、または5歳のいずれか1つまたは複数で投与される。
【０１４７】
一般的に、どの哺乳動物への投与も、好ましくは、疾患症状が初めて認めれられる前に、またはナイセリア属への可能性のある曝露もしくは実際の曝露が初めて認められた時に開始される。
【０１４８】
受動免疫
本発明はまた、本発明の抗原性組成物を用いた免疫化によって生じた免疫防御抗体および使用方法も意図する。このような抗体は、感染もしくは疾患が起こらないように、または確立した疾患を有する患者における臨床アウトカムを改善する(例えば、ショックなどの合併症率を下げる、死亡率を下げる、もしくは難聴などの罹患率を下げる)治療として、ナイセリア疾患に対する受動免疫をもたらすために個体(例えば、ヒト患者)に投与することができる。
【０１４９】
抗体産生種以外の種の被験体に投与された抗体は、多くの場合、免疫原性である。従って、例えば、ヒトに投与されたマウス抗体またはブタ抗体は、その抗体に対して免疫応答を誘導することが多い。抗体の免疫原性は、抗体の一部または全てを特徴的にヒトの配列に変え、それによって、それぞれキメラ抗体またはヒト抗体を生成することによって低下する。
【０１５０】
キメラ抗体は、ヒト部分および非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より具体的には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域(または可変領域)は非ヒト(例えば、マウス)に由来し、キメラ抗体の定常領域(生物学的エフェクター機能を免疫グロブリンに付与する)はヒトに由来する。キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびヒト抗体分子によって付与されるエフェクター機能を有するはずである。キメラ抗体を作成する多数の方法が当業者に周知である(例えば、米国特許第5,502,167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693号、同第5,354,847号、同第5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,169,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、および同第4,975,369号を参照されたい)。別のアプローチは、組換えDNA法による非ヒト抗体のCDR領域とヒト定常領域との連結によるヒト化抗体の作成である。Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)および国際公開公報第90/07861号を参照されたい。
【０１５１】
1つの態様では、本発明のペプチドに対する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために、組換えDNAベクターが用いられる。この新たな組換えDNAベクターは、細胞株において免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子の全てまたは一部を置換する「置換遺伝子」(例えば、置換遺伝子は、ヒト免疫グロブリンまたは特定の免疫グロブリンクラスの定常領域の全てまたは一部をコードしてもよい)、および抗体産生細胞内の免疫グロブリン配列との標的化相同組換えを可能にする「標的配列」を含む。
【０１５２】
別の態様において、望ましいエフェクター機能(例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域)を有する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために、組換えDNAベクターが用いられる。この場合、組換えベクターに含まれる置換遺伝子は抗体領域の全てまたは一部をコードしてもよく、組換えベクターに含まれる標的配列は、抗体産生細胞内での相同組換えおよび標的化遺伝子改変を可能にする。どちらの態様でも、可変領域または定常領域の一部しか置換されない場合、結果として生じるキメラ抗体は、キメラ抗体が高い抗原特異性、高い親和性結合定数、増大したエフェクター機能、またはトランスフェクトされた抗体産生細胞株による増大した分泌および産生などを示し得るように、変化も改変もなく、同じ抗原を規定する可能性がある、および/または同じエフェクター機能を有する可能性がある。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、完全ヒト抗体を提供する。ヒト抗体は、完全に、特徴がヒトのポリペプチド配列からなる。本発明のヒト抗体は多種多様な方法によって生成することができる(例えば、Larrick et al., 米国特許第5,001,065号を参照されたい)。1つの態様では、本発明のヒト抗体は、最初に、トリオーマ細胞(2種類がヒトおよび1種類がマウスの3種類の細胞に由来する)において産生される。次いで、抗体をコードする遺伝子がクローニングされ、他の細胞、特に、非ヒト哺乳動物細胞において発現される。トリオーマ技術によってヒト抗体を生成する一般的なアプローチは、Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367、Ostberg,米国特許第4,634,664号、およびEngelman et al.,米国特許第4,634,666号に記載されている。トリオーマは、ヒト細胞から作られた通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが分かっている。
【０１５４】
被験体(例えば、ヒト被験者)への投与に適した抗体を生成および処方するための方法は当技術分野において周知である。例えば、抗体は、有効量の抗体および薬学的賦形剤(例えば、食塩水)を含む薬学的組成物で提供することができる。薬学的組成物は、任意に、他の添加物(例えば、緩衝液、安定剤、防腐剤など)を含んでもよい。抗体の有効量は、一般的に、所望の期間、例えば、少なくとも約2日間〜10日間または1ヶ月間〜2ヶ月間)、ナイセリア疾患または症状を防御するのに有効な量である。
【０１５５】
診断アッセイ法
本発明の抗原性組成物、またはこのような組成物の投与によって生成された抗体は診断目的に使用することもできる。例えば、抗原性組成物は、ワクチン接種が有効であったことを保証するために、免疫前血清および免疫血清をスクリーニングするのに使用することができる。抗体はまた、ナイセリア疾患に関連する特定の抗体分子の存在を検出するためにイムノアッセイにおいて使用することもできる。
【０１５６】
実施例
本明細書に記載の実施例および態様は例示にすぎず、本明細書に記載の実施例および態様を考慮すれば、様々な変更または修正が当業者に示唆され、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の中に含まれることが理解される。本明細書において引用された全ての刊行物、特許、特許出願は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
材料および方法
以下の方法および材料を、以下の実施例において使用した。
【０１５８】
細菌株
本研究において使用した9種類の髄膜炎菌株(莢膜B群が6種類、莢膜A群が1種類、莢膜C群が2種類)を表1に列挙した。25年にわたって、キューバ、オランダ、ドイツ、ニュージーランド、または米国において入院患者から株を集めた。電気泳動クラスター分析および/または配列タイピングに基づいて、これらの株は遺伝的に異なる。
【０１５９】
（表１）髄膜炎菌株のまとめ
2008528597.tif 000005
aRussell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-8の提案されたPorA VR型命名法に基づく。
bSTタイピングは、(www.mlst.net)に記載のように多座配列決定によって行った。NT=分類できなかった。莢膜は血清学によって検出されなかった。
cMC58株と比較したアミノ酸同一性のパーセント。
dWelsch et al. J Immunol 2004; 172:5606-15、Hou et al. J. Infect Dis. (2005 Aug 15) 192 (4):580-90 (Epub 2005 Jul 15)において報告されたようにヒト補体を用いて測定した力価。図3Aおよび図3Bも参照のこと。
ND,測定されなかった。GNA1870過剰発現およびワクチン調製の宿主として使用した株。
【０１６０】
外膜小胞(OMV)ワクチンを調製するために、C群RM1090株(C:2a:5-1,2)およびこの株に由来する下記の変異体、ならびにB群H44/76株およびこの株に由来する変異体を使用した。RM1090株は、低レベルのGNA1870変種2タンパク質を天然に発現する。GNA1870変種1を過剰発現させるために、GNA1870遺伝子を不活化したRM1090株(RM1090ΔGNA1870,下記)を使用した。H44/76株は、GNA1870変種1の発現が比較的高い株である。残りの7種類の株は、GNA1870変種1タンパク質の亜変種を天然に発現し、ワクチンによって誘導された抗GNA1870変種1防御免疫の幅を確かめるための試験生物として選択した。これらの株は、電気泳動型および/または多座配列決定型によって規定されたように遺伝的に異なり、いくつかの異なるPorA VR配列型も発現する。変種1株は、疾患を生じさせるB群分離菌の約60％を占めるために選択した(Masignani et al. J Exp Med 2003;197:789-99)。
【０１６１】
Cu385株およびH44/76株は、MC58株のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するGNA1870変種1を発現し(Welsch et al. J Immunol 2004; 172:5606-15)、この遺伝子を、組換えGNA1870変種1タンパク質を大腸菌において発現させるために使用し、髄膜炎菌RM1090ワクチン株においてGNA1870を過剰発現させるためにシャトルベクターにも使用した(以下を参照されたい)。残りの7種類の株は、MC58株からの遺伝子によってコードされるGNA1870タンパク質変種とわずかに配列が異なる、GNA1870変種1の亜変種を発現する(Masignani et al. 2003, 前記)。以前の研究において、Cu385株は、組換えGNA1870タンパク質ワクチンで免疫化したマウスにおいて誘発された抗体の、補体を介した殺菌活性に対して高感受性であった(表1)。対照的に、髄膜炎菌BZ198株、M1390株、M6190株、およびNZ98/294株は、組換えGNA1870ワクチンに対して調製された抗血清の殺菌活性に対して耐性(殺菌力価<1:10)であったために選択した。
【０１６２】
pFP12-GNA1870シャトルベクター構築物
髄膜炎菌におけるGNA1870の過剰発現は、ナイセリア-ゴノレエにある天然プラスミドからの複製起点を有し、大腸菌および髄膜炎菌を安定して形質転換することが示されているシャトルベクターFP12を用いて達成した(Pagotto et al. Gene 2000;244:13-9)。髄膜炎菌MC58株からの推定FURボックスプロモーターを含む変種1 GNA1870遺伝子を、以下のプライマー
2008528597.tif 000006
を用いて、ゲノムDNAからPCR増幅した。次いで、PCR産物を、SphIおよびStuI制限エンドヌクレアーゼで消化し、SphIおよびStuIで消化され、GFP遺伝子が取り除かれたpFP12プラスミドに連結した。結果として生じたプラスミドpFP12-GNA1870を、大腸菌TOP10株コンピテント細胞(Invitrogen)において形質転換および増殖させ、この細胞を、Luria-Bertani培地においてクロラムフェニコール選択(50μg/ml)下、37℃で増殖させた。
【０１６３】
髄膜炎菌の形質転換
GNA1870遺伝子を不活化したRM1090株(RM1090ΔGNA1870)は、エリスロマイシン選択(5μg/ml)を用いて、プラスミドpBSUDGNA1870ERMを用いた形質転換による相同組換えによって作成した。GNA1870過剰発現変異体を調製するために、3〜4個のRM1090ΔGNA1870ノックアウト株コロニーを、一晩増殖させたチョコレート寒天プレートから選択した。細菌コロニーを、EB緩衝液(Qiagen)20μl中でプラスミドpFP12-GNA1870 3μgと混合し、チョコレート寒天プレートにプレートし、37℃で5時間インキュベートした。細菌の段階希釈液を、クロラムフェニコール(5μg/ml)を含有するチョコレート寒天プレート上で再培養した。培養プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーを、マウスポリクローナル抗rGNA1870抗体を用いたコロニーブロットアッセイ法によってGNA1870発現についてスクリーニングした。陽性コロニーを1つ1つ選択し、クロラムフェニコール含有チョコレート寒天プレート上で再培養した。髄膜炎菌細胞を2％スキムミルク(wt/vol)に溶解して凍結し、-80℃で保存した。
【０１６４】
同様の手順を用いて、H44/76株およびそのGNA1870過剰発現変異体を形質転換した。H44/76株の染色体gna1870を、pBSUDgna1870erm(Hou et al. Infect Immun 2003;71:6844-49)による形質転換によって不活化した。次いで、変異体(H44/76Δgna1870)を、MC58株からのGNA1870変種1をコードするプラスミドpFP12-GNA1870で形質転換した。形質転換体を、5μg/mlクロラムフェニコール含有チョコレート寒天プレート上で選択した。
【０１６５】
膜調製
髄膜炎菌を、凍結保存物からチョコレート寒天プレート(Remel, Laztakas, Kans.)上にサブクローニングした。37℃、5％CO2で一晩インキュベーションした後、いくつかのコロニーを選択し、5％CO2を含有する雰囲気中で、0.25％グルコースおよび0.02mM CMP-NANAを含有するMueller-Hintonブロス約6mlに、620nmでの光学密度(OD620)0.1まで接種した。導入されたpFP12-GNA1870シャトルベクターを含有する全ての株を、5μg/mLクロラムフェニコールの存在下で増殖させた。OD620が0.6〜0.7に達するまで(2〜3時間)、接種されたブロスを、振盪しながら37℃および5％CO2でインキュベートした。6つの6mlスターター培養物を用いて、Mueller-Hintonブロス1Lに接種した。さらに多量の培養物を、勢いよく振盪しながらOD6200.8〜1.0まで37℃で増殖させた。細菌を死滅させるために、フェノールを添加し(0.5％wt/vol)、ブロスを4℃で一晩静置した。細菌細胞を、遠心分離(10,000×g)によって4℃で30分間ペレット化し、凍結し、外膜小胞ワクチンの調製に使用するまで-20℃で保存した。
【０１６６】
H44/76株およびその変異体を含有する培養については、6つの7mlスターター培養物を使用した。細胞を、クロラムフェニコール非添加Mueller-Hintonブロス1Lに移し、勢いよく振盪しながらOD620が0.8〜1.0に達するまで増殖させた。細菌を死滅させるために、フェノールを添加し(0.5％wt/vol)、培養物を37℃で2時間静置し、4℃で一晩インキュベートした。細胞を、遠心分離(11,000×g)によって4℃で30分間ペレット化した。
【０１６７】
以前に述べられたように(Moe et al. 2002, 前記)、GNA1870リポタンパク質の抽出を避けるために界面活性剤を用いることなく、OMV用の髄膜炎菌膜画分を調製した。簡単に述べると、凍結細菌細胞をPBS 40mlに懸濁し、15秒4回破裂させるために、マイクロチップ付きソニフィアー(sonifier)(Branson, Danbury, Conn)を用いて氷上で超音波処理した。この超音波処理は、膜泡状突起を放出するのに十分であったが、細菌を完全に溶解するには不十分であった。破裂の間に、細菌懸濁液を氷上で冷却した。細胞破片を、5,000×g、15分間の遠心分離によって除去し、上清に残っている膜画分を、100,000×g、4℃、1時間の超遠心によって入手し、PBS 5mlに再懸濁した。これらの調製物をOMVと呼んだ。または、(Moe et al. 2002, 前記)に記載のように、細菌によって上清に放出された泡状突起から得られるMVを使用することができた。国際公開公報第02/09643号も参照されたい。
【０１６８】
H44/76(およびその変異体)については、凍結した細菌細胞をPBS緩衝液20mlに再懸濁し、15秒4回破裂させて超音波処理した。細胞破片を、4℃で30分間、遠心分離(16,000×g)することによって除去し、外膜タンパク質と共に濃縮された細胞膜を、2時間、遠心分離(100,000×g)することによって可溶性画分から集めた。
【０１６９】
ワクチンの特徴付け
タンパク質濃度は、DCタンパク質アッセイ法(Bio-Rad, Richmond, CA.)およびBCAタンパク質アッセイ法キット(Pierce, Rockford, IL)によって求めた。OMV調製物は、Mini-Protean II電気泳動装置(Bio-Rad)およびウエスタンブロットを用いたLaemmli (Nature 1970;227:680-5)に記載のように、15％SDS-PAGE(H44/76調製物の場合、12.5％SDS-PAGE)によって分析した。試料を、試料緩衝液(0.06M Tris・HCl,pH6.8、10％(v/v)グリセロール、2％(w/v)SDS、5％(v/v)2-メルカプトエタノール、10μg/mlブロモフェノールブルー)に懸濁し、5分間100℃に加熱した後に、ゲルに直接ロードした。
【０１７０】
ウエスタンブロットのために、ゲルを、緩衝液(48mM Tris・HCl、39mMグリシン[pH9.0]20％(v/v)メタノール)と平衡にし、Trans-Blot(商標)(Bio-Rad)セミドライ電気泳動トランスファーセルを用いてニトロセルロース膜(Bio-Rad)に転写した。ニトロセルロース膜を、PBCに溶解した2％(w/v)脱脂粉乳でブロックし、1％(w/v)BSAおよび1％(w/v)Tween-20を含有するPBSで1:20,000に希釈した抗rGNA1870抗血清と反応させた。結合した抗体は、ウサギ抗マウスIgG＋A＋M-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗体(Zymed, South San Francisco, CA)および「Western Lightning」化学ルミネセンス試薬(PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA)を用いて検出した。検出用抗GNA1870抗血清は、組換えGNA1870v.1(髄膜炎菌MC58株からの遺伝子)10μgを1回注射し、その後に、組換えv.3タンパク質(M1239株からの遺伝子)10μgを1回注射し、その後に、組換えv.2タンパク質(2996株からの遺伝子)10μgを1回注射することによって連続的に免疫化したマウスからのものであった。各注射は3〜4週間あけた。
【０１７１】
免疫化
組換えタンパク質ワクチンは、以前に述べたように、6つのCOOH末端ヒスチジン(Hisタグ)をコードし、推定リーダーペプチドをコードするN末端配列が無いGNA1870 DNA配列を用いて大腸菌において発現させた(Welsch et al. J Immunol 2004;172:5606-15)。この非脂質化HisTag GNA1870タンパク質は、組換えリポタンパクより調製がかなり簡単であり、以前の研究からのデータから、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバントと共に投与された非脂質化抗原がマウスにおいて試験株の大半に対して強力な殺菌抗体反応を誘発することが分かっていたので使用した。
【０１７２】
OMV調製物または組換えGNA1870タンパク質をPBSで希釈し、PBS緩衝液とインキュベートされている等量のリン酸アルミニウムアジュバント(1％Alhydrogel最終濃度[wt/vol; Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark])と共に吸着させた。4〜6週齢雌CD1マウス(Charles River Breeding Laboratories, Raleigh, NC)の群(N=10/群)を腹腔内(IP)において免疫化した。それぞれのマウスに、総タンパク質5μg(混合物群の場合、OMVおよびrGNA1870がそれぞれ2.5μg)を含有する1用量を投与した。合計3回の注射を行い、それぞれ3週間あけた。3回目の投与の2週間後に、マウスを心臓穿刺によって出血させ、屠殺した。血清を分離し、-20℃で凍結保存した。
【０１７３】
H44/76調製物の場合、それぞれのマウスに、OMVに存在する総タンパク質1.25μgおよびリン酸アルミニウム170μgの1用量を与えた。3回の注射を3週間あけて行った。3回目の投与の3週間後に、血液を心臓穿刺によって集めた。血清を遠心分離によって分離し、使用するまで-70℃で凍結保存した。
【０１７４】
抗GNA1870抗体の吸収
抗体機能活性への抗GNA1870抗体の寄与を試験するために、本発明者らは、抗GNA1870抗体を除去するように血清プールを吸収させた。簡単に述べると、10mMイミダゾールを含有するPBS緩衝液で1:2に希釈した血清プール100μlを、組換えGNA1870-HisTagタンパク質200μgと複合体化しているNi-NTA Sepharose(Qiagen, Valencia, CA)、または陰性対照として組換えNadA-HisTagタンパク質(Comanducci et al. J Exp Med 2002;195:1445-54; Hou et al. 2005, 前記)と複合体化しているNi-NTA Sepharose 250μlを含有するカラムに添加した。カラムを4℃で一晩インキュベートし、10mMイミダゾールを含有するPBS緩衝液500μlで洗浄した。カラムを通過した5つの画分(各100μl)を混合し、膜濾過(Microcon YM-10, 10,000 MWCO, Millipore Corp., Bedford, MA)によって元の50μl血清体積まで濃縮した。ELISAに基づいて、抗GNA1870抗体の98〜99％超がGNA1870カラムによって除去された。
【０１７５】
抗GNA1870抗体
ELISAを用いて、GNA1870に対する血清抗体価を測定した。これは、以前に述べられたように行った(Welsch et al. J Immunol 2004;172:5606-1)。固相抗原は、rGNA1870 v.1またはv.2タンパク質からなった。二次抗体は、1:2000希釈のアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウスIgM＋G＋A(Zymed)であった。血清力価は、基質と30分間インキュベーションした後にOD4050.5となる希釈として定義した。
【０１７６】
補体を介した殺菌抗体活性
殺菌アッセイ法は、0.25％グルコース添加Mueller Hintonブロス中で増殖させた対数期の中間部にある細菌を用いて、以前に述べられたように行った(Moe et al. 2002, 前記)。最終反応混合物は、異なる希釈の試験血清、20％(v/v)ヒト補体、および1％BSA含有Gey緩衝液を含有した。補体供給源は、内因性殺菌活性が検出不可能な健常成人からのヒト血清であった(Granoff et al. J Immunol 1998;160:5028-36; Welsch et al. 2003, 前記)。血清殺菌力価は、細菌を反応混合物中で60分間インキュベートした後に、0時の対照CFU/mlと比較してCFU/mlを50％下げる血清希釈として定義した。典型的に、陰性対照抗体および補体とインキュベートした細菌のCFU/mLは、60分間のインキュベート中に150〜200％増加した。
【０１７７】
生きた被包性髄膜炎菌の表面への抗体の結合
抗GNA1870抗体が生きた髄膜炎菌の表面に結合する能力は、以前に述べられたように行った(Granoff et al. J Immunol 2001;167:3487-3496)、間接蛍光アッセイ法のフローサイトメトリーによる検出によって確かめた。陽性対照は、C群多糖莢膜特異的マウスモノクローナル抗体(1076.1(Garcia-Ojeda et al. Infect Immun 2000;68:239-46))、PorA P1.2特異的マウスモノクローナル抗体(Granoff et al. J Immunol 2001;167:3487-3496)、およびGNA1870変種1特異的マウスモノクローナル抗体(JAR3)(Welsch et al. J Immunol 2004;172:5606-15)、ならびに1:300希釈のFITC結合ヤギ抗マウス(Fab')2 IgG(H＋L)(Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)を含んだ。
【０１７８】
生きた被包性髄膜炎菌の表面上でのヒト補体沈着の活性化
髄膜炎菌生細菌の細菌表面上でのC3bまたはiC3bの抗GNA1870抗体依存性沈着は、以前に述べられたように行った(Welsch et al. J Infect Dis 2003;188:1730-40)、フローサイトメトリーによって確かめた。洗浄された対数期細菌を、5％(v/v)ヒト補体およびベラノール(veranol)緩衝液に溶解した適切な血清希釈液を含有する反応混合物中でインキュベートした。補体沈着は、C3bおよびiC3bと反応するFITC結合ヒツジ抗ヒト補体C3c(BioDesign Intl., Saco, ME)を用いて検出した。補体供給源は、殺菌アッセイ法について前記で説明した同じヒト血清であった。
【０１７９】
新生仔ラットにおける受動防御
抗血清が髄膜炎菌B群菌血症に対する受動防御に付与する能力は、B群NZ98/254株をIP投与した新生仔ラットにおいて試験した(Welsch et al. 2003, 前記; Moe et al. Infect Immun 1999;67:5664-75; Moe et al. Infect Immun 2001;69:3762-71))。簡単に言うと、非近交系Wistarラット(Charles River, Hollister, CA)の同腹仔から4日齢新生仔を無作為に養母に再分配した。0時に、8匹の動物群に、1％BSA含有PBSで希釈した抗血清または抗体をIP投与した。2時間後、0.25％グルコースおよび10μM CMP-NANA(Sigma, St. Louis, MO)を添加したMueller-Hinton中で増殖させた約6×104CFUの洗浄済み対数期細菌を、動物にIP投与した。細菌を投与して4〜6時間後に、心臓穿刺によって血液標本を入手し、CFU/mlを確かめるために、血液の1μl、10μl、および100μlアリコートをチョコレート寒天上にプレートした。
【０１８０】
実施例1: 髄膜炎菌RM1090株におけるGNA1870の表面接近性
pFP12-GNA1870形質転換RM1090株から発現したGNA180タンパク質が外膜に一体化している部分で、細胞表面上に露出しているかどうか確かめるために、およびH44/76株の過剰発現GNA1870が外膜に固定され、表面に接近可能かどうか確かめるために、抗GNA1870および対照抗体と被包性細菌生細胞との結合をフローサイトメトリーによって測定した(図1)。
【０１８１】
図1Aに示したように、陽性対照であるC群莢膜多糖特異的mAb(列2)またはPorA特異的mAb(抗P1.2,列3)は、親RM1090株(行B)および2種類のRM1090変異株:GNA1870遺伝子を含まないシャトルベクターで形質転換したGNA1870ノックアウト(行A)およびGNA1870変種1タンパク質をコードするシャトルベクターで形質転換したノックアウト(行C)と強い結合を示した。3種類全ての株において、リン酸アルミニウムのみで免疫化したマウスからの陰性対照血清プールの1:10希釈液は有意に結合しなかった(列1)。抗GNA1870モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とGNA1870ノックアウト株も有意に結合しなかった(それぞれ、行A、列5および6)。野生型RM1090株は、低レベルのGNA1870 v.2タンパク質を天然に発現し、v.1タンパク質特異的抗GNA1870 mAbと検出可能に結合せず(行B,列4)、組換えv.1、v.2、およびv.3 GNA1870タンパク質に対して調製されたポリクローナルマウス抗血清(列5および列6)とバックグラウンドを上回る最小限の結合しか示さなかった(以下を参照されたい)。対照的に、GNA1870(変種1)をコードするシャトルベクターで形質転換した株は、ポリクローナル抗GNA1870抗体およびモノクローナル抗GNA1870抗体の両方と強力に結合した。従って、GNA1870は、pFP12-GNA1870シャトルベクターで形質転換したRM1090株の表面上に露出している。
【０１８２】
図1Bに示したように、陽性対照である抗莢膜モノクローナル抗体および抗PorA(P1.16)モノクローナル抗体は、H44/76野生型株およびH44/76株のGNA1870過剰発現変異体に結合した(両方とも行1に示した)。陽性対照抗体はH44/76ΔGNA1870にも結合した(行2に示した)。予想通り、抗GNA1870モノクローナル抗体も抗GNA1870ポリクローナル抗体も、GNA1870コード遺伝子が不活化されているH44/76変異株と結合しなかった(列D〜F)。野生型株を抗GNA1870抗体とインキュベートすると良好な結合が認められた。これは、H4476株における比較的高いレベルの天然GNA1870発現を反映した結果である。GNA1870を過剰発現するように操作された変異株との結合は、免疫蛍光のわずかな右側へのシフトによって証明されたように中程度に増加した。従って、GNA1870の過剰発現によって、外膜にあるタンパク質の量がわずかに増加した。このタンパク質は表面に露出している。
【０１８３】
実施例2. OMVワクチンの分析
RM1090株および各変異体からのOMV調製物中の主要タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、クマシーブルー染色によって視覚化した(図2A,パネルA)。髄膜炎菌から調製したOMVによくみられるように、29kDa(Opa/Opc)〜43kDa(PorA)の見かけの質量で分離する限られた数の主要タンパク質があった。野生型株から調製したOMV(レーン1)およびGNA1870ノックアウト株から調製したOMV(レーン3)は、これらの各々のタンパク質をそれぞれほぼ等量、発現していた。対照的に、GNA1870コード遺伝子を含有しないpFP12シャトルベクターで形質転換した株からのOMV(それぞれレーン2および4)において、38〜43kDaの見かけの質量で移動する3種類のタンパク質の相対発現が低下した。この結果は、増殖培地に5μg/mlクロラムフェニコールが存在することによる抗生物質選択によるポーリンタンパク質の低発現を部分的に反映している可能性が高い(Tommassen et al. Infect Immun 1990;58:1355-9)。レーン5は、GNA1870コードシャトルベクターで形質転換したRM1090株から調製したOMVを示す。タンパク質をさらに良好に視覚化するために、このレーンには、レーン1〜4の2倍量のタンパク質(約10μg)をロードした。他のOMV調製物と比較して、GNA1870遺伝子含有シャトルベクターで形質転換した株から調製したOMVは、29〜32kDa間で分離するタンパク質の発現が少なかった。SDS PAGEでは、GNA1870は、GNA1870過剰発現変異株から調製したOMV(レーン5)を含めて、OMV調製物のいずれにおいても容易に識別できなかった。(比較のために、レーン6に、1μgの組換えGNA1870変種タンパク質を示した)。
【０１８４】
図2Aでは、異なるワクチン調製物におけるGNA1870発現を評価するために、v.1、v.2、およびv.3 GNA1870組換えタンパク質に対して産生されたポリクローナルマウス抗血清を用いたウエスタンブロットを使用した。パネルBに示したように、この抗血清とrGNA1870 v.2タンパク質との反応性は、v.1組換えタンパク質との反応性よりわずかに高かった。この偏りがあっても、pFP12-GNA1870で形質転換したRM1090から調製したOMVは、v.2タンパク質を天然に発現する野生型RM1090株から調製したOMVと比較してウエスタンブロットによる高い反応性を示した(図2A,パネルC)。対照的に、GNA1870ノックアウト変異体(RM1090ΔGNA1870)からの陰性対照OMVの反応性は検出することができなかった。デンシトメトリー測定の結果から、シャトルベクターで形質転換した株におけるv.1 GNA1870タンパク質の発現は、野生型親RM1090株が天然に発現するv.2タンパク質の発現より約10倍高いことが分かった。
【０１８５】
H44/76 OMV調製物を、抗GNA1870ポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによって分析した(図2B)。ゲルにロードされたOMVの量は、調製物の総タンパク質含有量に基づいて標準化した。予想通り、GNA1870は、野生型株からの膜調製物おいて発現され、このタンパク質を過剰発現するように操作された変異体からの対応する調製物において増加していた。しかしながら、GNA1870の増加は中程度(約3倍)であった。
【０１８６】
実施例3:血清抗体反応の分析
表2および図5は、ELISAによって測定した、異なるマウス群の血清抗GNA1870抗体反応をまとめたものである。表2における変種1タンパク質に対する最も高い抗体反応は、組換えGNA1870 v.1ワクチンだけで免疫化したマウス、またはOMVワクチンとの混合物として与えた組換えGNA1870 v.1ワクチンで免疫化したマウスにあった(それぞれ、1:120,000および1:300,000の変種1タンパク質に対する力価)。変種1 GNA1870過剰発現RM1090株から調製したOMVで免疫化したマウスの抗GNA1870力価(1:32,000)は1/10〜1/4であった。興味深いことに、野生型RM1090株から調製したOMVで免疫化したマウスの抗GNA1870抗体反応は、変種1または変種2タンパク質に対して測定したように検出不可能であるか、またはごくわずかであった。この結果は、過剰発現の非存在下では、野生型株からのOMV中のGNA1870の免疫原性は不十分であることを示唆している。
【０１８７】
マウス群を、H44/76 OMV(1.25μgの総タンパク質)または5μgのrGNA1870とリン酸アルミニウムで免疫化した。3回目の投与の3週間後に血清試料を入手し、プールした(2プール/ワクチン群,各プールは、4〜5匹のマウスから調製した)。図5に示したように、アルミニウムアジュバントのみで免疫化した対照マウスの抗GNA1870抗体は検出することができなかったのに対して(GMT<1:10,バー1)、rGNA1870で免疫化したマウスの反応が最も高かった(GMT 1:23,500,バー2)。GNA1870過剰発現H44/76から調製したOMVで免疫化したマウスの抗GNA1870抗体反応は、野生型株からのOMVで免疫化した各群より〜10倍高かった(バー5およびバー3を比較)。H44/76ΔGNA1870から調製したOMVで免疫化したマウスの抗体反応はごくわずかしかなかった(GMT<1:10,バー4)。
【０１８８】
（表２）ELISAによって測定したマウスの抗GNA1870抗体反応
2008528597.tif 000007
aワクチンは、Al2 (PO4) 3と共に吸収された総タンパク質5μgからなった。OMV＋rGNA1870ワクチンは、OMV 2.5μgおよびrGNA1870(v.1)2.5μgの混合物からなった。
bELISAにおいて、基質と30分間インキュベーションした後にOD 0.5となる血清希釈。示したデータは、各ワクチン群からの2つの血清プールにおいて測定したそれぞれの力価の相乗平均である。各プールは、4〜5匹の免疫化マウスからの等量の血清を含有した。
【０１８９】
図3Aは、試験株のうち4種類に対して測定した、異なるマウス群の血清殺菌抗体反応をまとめたものである。組換えGNA1870タンパク質ワクチンのみで免疫化したマウス、または組換えGNA1870ワクチンとOMVワクチンを組み合わせて免疫化したマウス、またはGNA1870過剰発現OMVで免疫化したマウスはCu385株に対して高い殺菌力価を生じ、これらの殺菌力価は互いに有意な差異が無かった(上パネルのバー4、5、および6を比較)。対照的に、野生型RM1090またはGNA1870ノックアウト株から調製したOMVワクチンで免疫化した対照マウスからの血清において、Cu385株に対する殺菌活性を検出することができなかった(それぞれ、バー2および3;力価<1:10)。Cu385株は、標準 GNA1870 v.1タンパク質(MC58株のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、この遺伝子を用いて組換えGNA1870タンパク質を発現させた)を発現し、本発明者らの以前の研究から、マウスにおいて組換えGNA1870ワクチンによって誘発された抗体の殺菌活性に対して高感受性であることが公知であることに留意のこと(表1)。また、Cu385は、RM1090ワクチン株(P1.5,2)とは異種のPorA血清亜型(P1.19,15)を有し、従って、Cu385株は、GNA1870変種1を過剰発現しない対照OMVワクチンに対して産生された抗体の殺菌活性に対して耐性であると予想された(Tappero et al. JAMA 1999;281:1520-7; Moe et al. 2002, 前記)。
【０１９０】
図3Aはまた、操作ワクチン株の血清殺菌力価と比較した、v.1 GNA1870タンパク質の亜変種を発現するM6190株に対して測定した対応する血清殺菌力価(上から2番目のパネル)も示す。組換えGNA1870変種1タンパク質で免疫化したマウスからの血清において、殺菌活性を検出することができなかった(バー6,相乗平均力価<1:10)。これは、本発明者らの以前の研究の結果(表1)と同一の結果である。しかしながら、M6190株のPorA血清亜型(P1.5,2)はRM1090ワクチン株のものと相同であるので、OMV含有ワクチンのいずれかで免疫化したマウスからの血清は高殺菌性であった(バー2、バー3、バー4、またはバー5)。
【０１９１】
図3A(上から3番目および4番目のパネル)は、それぞれ、Z1092株およびNZ98/254株に対する、対応する殺菌応答を示す。両株とも、RM1090ワクチン株のPorA分子とは異種のPorA分子を発現し(表1)、RM1090野生型またはGNA1870ノックアウト株から調製したOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清によって死滅しなかった(バー2およびバー3,相乗平均力価<1:10)。しかしながら、GNA1870過剰発現RM1090株から調製したOMVワクチンで免疫化したマウスの、Z1092株に対する血清殺菌抗体価の相乗平均(バー5)は、組換えGNA1870で免疫化したマウスの血清殺菌抗体価の相乗平均(バー6,P<0.02)より有意に高く、または組換えGNA1870タンパク質およびOMVワクチンの混合物で免疫化したマウスの血清殺菌抗体価の相乗平均(バー4,P<0.04)より有意に高かった。NZ98/254株に対して測定したそれぞれの血清殺菌応答(下パネル)またはBZ198株およびM1390株に対して測定したそれぞれの血清殺菌応答(データ示さず)についても、同様の傾向が観察された。しかしながら、これらの最後の3つの株について、過剰発現GNA1870を有するOMVワクチンで免疫化したマウスの血清殺菌応答の大きさは、Z1092株に対して測定したものより低かった。また、GNA1870過剰発現OMVで免疫化したマウスのNZ98/294株、BZ198株、およびM1390株に対する血清殺菌力価の相乗平均は、他のワクチン群におけるマウスのそれぞれの力価の相乗平均と比較した時に統計的に有意な差はなかった(P>0.10)。
【０１９２】
図3Bは、OMVワクチンを調製するのに使用したH44/76を含む6種類の株に対する血清殺菌抗体反応をまとめたものである。6種類の株のうち5種類のPorA血清亜型はH44/76のPorAと異種である。H44/76株はまた、MC58株のGNA1870変種1タンパク質配列と同一のGNA1870変種1タンパク質配列も発現し、この配列は、組換えGNA1870タンパク質ワクチンをクローニングおよび発現するするのに使用した遺伝子を含有する。H44/76ワクチン株に対して測定した時には、陰性対照アルミニウムアジュバントを除く全てのワクチン調製物が高い血清殺菌抗体反応を誘発した(図3B、パネルA)。対照的に、異種4243株(パネルB)、Z1092株、NZ98/254株、およびBZ198株(パネルC)、またはM6190株(パネルD)に対して測定した時には、rGNA1870ワクチン、またはH44/76野生型もしくはH4476ΔGNA1870株から調製したOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清の殺菌力価は低いか、または検出不可能であった(それぞれ、バー2、バー3、およびバー4)。過剰発現GNA1870を有するOMVワクチンで免疫化したマウス(バー5)の4243株に対する殺菌抗体反応は高く、NZ98/254株、BZ198株、およびZ1092株に対する殺菌応答は検出可能であるが低く、M6190に対する殺菌活性は検出することができなかった(力価<1:10)。図3Bには示していないが、全ての株は、補体と、それぞれのPorAおよび/または多糖莢膜に対する陽性対照抗体によって容易に死滅した。
【０１９３】
実施例4:被包性髄膜炎菌生細胞の表面におけるC3B補体沈着の活性化
以前の研究において、本発明者らは、殺菌活性の無い、ある特定のマウス抗髄膜炎菌抗体が殺菌活性の非存在下で髄膜炎菌性菌血症に対する受動防御を付与することを発見した(Welsch et al. J Immunol 2004; 172:5606-15; Welsch et al. 2003 前記)。フローサイトメトリーによって測定したように、生きた被包性髄膜炎菌の表面におけるC3補体成分の沈着を活性化する抗体の能力と、防御には相関関係があった。C3bが存在することによって、殺菌活性の非存在下で防御を付与する最も可能性の高い機構であるオプソニン化のためのリガンドが得られる。従って、異なるOMVワクチンで免疫化したマウスからの抗血清がヒトC3b沈着を活性化する能力を調べた(図4)。これらの実験には、2種類の試験髄膜炎菌NZ98/254株(図4A,行A)およびM1390株(図4A,行B)ならびに4種類の試験髄膜炎菌NZ98/254株、BZ198株、Z1092株、およびM6190株(図4B)を使用した。これらは、GNA1870を過剰発現するOMVワクチンで免疫化したマウスからの抗血清の殺菌力価が他のワクチン群より統計的に有意に高くない株であった。
【０１９４】
試験株の細菌細胞を、リン酸アルミニウムのみで免疫化したマウスからの陰性対照血清プールの1:40希釈液と一緒にヒト補体供給源とインキュベートした時に、補体が沈着する証拠は無かった(図4A,列1のパネルの塗りつぶした領域)。同様に、熱不活化補体＋5μg/ml抗GNA1870マウスモノクローナル抗体(JAR3)を用いてC3b沈着を検出することはできなかった(図4A,列2のパネルの塗りつぶした領域)。対照的に、活性補体を、25μg/ml陽性対照B群モノクローナル抗莢膜抗体(図4A,列1のパネルの白抜きの領域)または1μg/ml抗GNA1870モノクローナル抗体(図4A,列2のパネルの白抜きの領域)に添加すると、C3bおよびiC3biを両方とも認識する抗C3c抗体によって強い免疫蛍光を示す細菌のパーセントの増加によって証明されるように、両試験株の細胞表面上に強いC3b沈着が誘発された。
【０１９５】
図4Aの列3〜6のパネルは、異なるワクチンで免疫化したマウス群から得られた血清プール希釈液に補体を添加した効果を示す。組換えGNA1870で免疫化したマウスからの血清の1:100希釈液(列3)、またはRM1090野生型株から調製したOMVで免疫化したマウスからの血清の1:100希釈液(列4)、または組換えGNA1870と混合したOMVで免疫化したマウスからの血清の1:100希釈液(列5)に補体を添加しても、いずれの株でもC3b沈着は活性化されなかった。対照的に、GNA1870を過剰発現するRM1090株から調製したOMVで免疫化したマウスからの血清プールの1:100希釈液または1:400希釈液は両試験株に対して強いC3b沈着を活性化した(列6)。
【０１９６】
図4Bに示したように、陽性対照抗莢膜mAbは各株において補体沈着を誘発したが(列Aの白抜きの領域)、アルミニウムアジュバントのみで免疫化したマウスからの陰性対照抗血清の1:100希釈液は陰性であった(列Aの塗りつぶした領域)。rGNA1870ワクチンで免疫化したマウスからの血清の1:100希釈液(列Bの塗りつぶした領域)、または野生型株から調製したH44/76 OMVワクチンで免疫化したマウスからの血清の1:100希釈液(列Cの塗りつぶした領域)もまた、いずれの株においても有意な補体沈着を誘発しなかった。対照的に、抗rGNA1870 mAbは、NZ98/254株、BZ198株、およびZ1092株において補体沈着を誘発したが、M6190株では誘発しなかった(列Bの白抜きの領域)。同様に、GNA1870を過剰発現するH44/76ワクチンで免疫化したマウスからの抗血清の1:100希釈液は、Z1092株、NZ98/254株、およびBZ198株のC3沈着を活性化したが(列Dの白抜きの領域)、M6190株のC3沈着を活性化しなかった。
【０１９７】
実施例5.異種株において殺菌性であるか、またはC3B沈着を活性化する抗体の抗原標的を定める
過剰発現GNA1870を有するH44/76 OMVで免疫化したマウスから調製した血清プールから抗GNA1870抗体を吸収するために、Hisタグ化組換えGNA1870をロードしたNi-NTAアフィニティカラムを使用した。表3に示したように、ELISAによって、Ni-NTAマトリックスしか含まない陰性対照カラムを用いて吸収された血清と比較して、このカラムによって抗GNA1870抗体の98％が除去された。陰性対照カラムによって吸収された後に、4243株に対する殺菌活性は、最初の非吸収血清プールの殺菌活性とほぼ同じであったのに対して、抗GNA1870抗体が吸着されることによって殺菌活性は完全に消失した。
【０１９８】
C3沈着に及ぼす抗GNA1870抗体吸収の影響を、Z1092株、NZ98/254株、BZ198株、およびM6190株に対して分析した(表3および図4B、行4)。図4B、列Dに示したように、過剰発現GNA1870を有するH44/76 OMVで免疫化したマウスの血清から抗GNA1870抗体を除去すると、iC3b/C3bの活性化および沈着に対して感受性の3種類の株において、抗血清が補体沈着を活性化する能力が完全に消失した(図4Bの塗りつぶした領域)。これらの結果ならびに前記にまとめた吸収済み血清に関する殺菌データから、H44/76ワクチン株のPorAタンパク質とは異種のPorAタンパク質を有する株について、過剰発現GNA1870を含有するH44/76 OMVに対して調製した抗血清のC3沈着活性化および殺菌活性は抗GNA1870抗体によって媒介されることが分かる。
【０１９９】
（表３）抗GNA1870抗体吸収後の、過剰発現GNA1870を有するOMVで免疫化したマウスからの血清の活性
2008528597.tif 000008
【０２００】
過剰発現GNA1870を有するH44/76 OMVで免疫化したマウスからの血清から調製したプールを、50μg/ml組換えHisタグ化GNA1870と一晩インキュベートしたNi-NTAマトリックス(Qiagen)含有カラムにおいて吸着させた。フロースルーを集め、元の体積まで濃縮した。対照カラムは、Hisタグ化タンパク質の無いNi-NTAマトリックスを含有した。
【０２０１】
実施例6.機能活性における抗GNA1870抗体の役割
GNA1870を過剰発現するように操作された髄膜炎菌RM1090株から調製したOMVワクチンにおける、他のいくつかの細胞エンベロープタンパク質の発現は、野生型RM1090ワクチン株またはRM1090ΔGNA1870ノックアウト株から調製したOMVにおけるそれぞれのタンパク質と比較して少なかった(図2A,パネルA)。従って、GNA1870を過剰発現するOMVで免疫化したマウスからの抗血清の高機能活性は、GNA1870以外の抗原によって誘発される抗体に起因する可能性があった。この可能性を調べるために、抗GNA1870アフィニティカラムを用いて、GNA1870過剰発現RM1090 OMVで免疫化したマウスからの血清プールを吸収した。ELISAによって、抗GNA1870抗体の99％が除去された。結果として生じた吸収済み抗血清はまた、髄膜炎菌NZ98/294株においてヒトC3b沈着を活性化する能力をいっさい失った(表4)。対照的に、陰性対照として働く抗NadAアフィニティカラムで血清プールを吸収することによって、C3b沈着への影響は無かった(表4)。
【０２０２】
（表４）抗GNA1870抗体を枯渇させた後に、GNA1870を過剰発現するOMVで免疫化したマウスからの抗血清の機能活性a
2008528597.tif 000009
a血清プールは、GNA1870を過剰発現するように操作したRM1090株からのOMVワクチンで免疫化した5匹のマウスから調製した。この抗血清を、組換えGNA1870アフィニティカラム、または陰性対照として組換えNadA含有アフィニティカラムで吸収した(方法を参照)。通過した画分を混合し、膜濾過によって元の血清体積まで濃縮した(方法を参照)。
bフローサイトメトリーによる補体活性化アッセイ法において、陰性対照血清と比較して10倍の免疫蛍光増加を誘発した血清希釈(図4を参照)。
【０２０３】
表4は、Cu385株およびM6190株に対して測定した、吸収済み血清プールの殺菌力価もまとめている。抗GNA1870抗体の吸収は、Cu385株に対する殺菌活性を完全に取り除いたが、M6190株に対する力価に有意な影響を及ぼさなかった。この後者の結果は、M6190株が、RM1090ワクチン株が発現するPorAと相同な血清亜型を有するPorAを発現し、殺菌性抗PorA抗体が、GNA1870アフィニティカラムでもNadAアフィニティカラムでも除去されなかったためと予想された。
【０２０４】
実施例8;新生仔ラット髄膜炎菌性菌血症モデルにおける受動防御
新生仔ラットを、異なるマウス群からの血清プールを用いて前処置し、2時間後に、髄膜炎菌NZ98/254株を投与した。図6は、投与の4〜6時間後に得られた血液中のCFU/ml相乗平均を示す。リン酸アルミニウムのみで免疫化した陰性対照マウスからの血清プールの1:15希釈液で処置した10匹のラット全てが菌血症を有し、CFU/ml相乗平均は〜105であった(パネルA,バー1)。10μg/ラットの陽性対照B群抗莢膜抗体(バー2)または抗GNA1870モノクローナル抗体(バー3)による前処置によって、3〜4対数分少ないCFU/ml相乗平均が得られた(P<0.0001)。陰性対照血清で処置した動物と比較して、RM1090ΔGNA1870ノックアウト株から調製したOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プール(バー4)、または組換えGNA1870と混合したOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プール(バー5)による有意な受動防御活性は無かった。対照的に、GNA1870を過剰発現するOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プール(バー6)は防御を付与した(CFU/ml相乗平均が4対数分減少,P<0.0001)。組換えGNA1870ワクチンのみで免疫化したマウスからの血清プール(バー7)は中程度の防御を付与したが(〜2対数分減少,P<0.0001)、防御活性は、GNA1870を過剰発現するOMVで免疫化したマウスからの血清プールの防御活性より少なかった(P<0.0001,それぞれのCFU/ml相乗平均と比較)。
【０２０５】
図6、パネルBは、1:60希釈の血清プールで前処置したラットの対応するCFU/ml相乗平均を示す。この高い希釈では、GNA1870を過剰発現するOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プール(バー6)が防御を付与したが(P<0.0002,陰性対照血清の1:15希釈液で処置したラットの相乗平均と比較)、組換えGNA1870ワクチンを与えたマウスからの血清(バー7,P>0.10)を含む、他の3種類の試験ワクチン群で免疫化したマウスからの高希釈の血清プールによる有意な防御活性は無かった。
【０２０６】
実施例9.ナイセリア表面タンパク質A(NspA)を過剰発現するRM1090株から調製した小胞ワクチンによるマウスの免疫化は高い血清殺菌抗体反応と関連しない
GNA1870を過剰発現するように操作されたRM1090株から調製した小胞ワクチンによって誘導される高い防御がGNA1870特異的であるかどうか、または別のワクチン標的を過剰発現するように操作された株から調製した小胞ワクチンを用いても起こるかどうかを確かめることが関心対象であった。従って、野生型株にあるNspA遺伝子が不活化されているRM1090株から、微小胞ワクチンを調製した。8047株からのNspA遺伝子を含有するシャトルベクターpFP12で形質転換したRM1090 NspAノックアウト株から、第2の小胞ワクチンを調製した。SDS PAGEによって、結果として生じた、シャトルベクターで形質転換した株からの小胞は、RM1090野生型株と比較して10倍高いNspAタンパク質発現を含んだ(データは示さず)。
【０２０７】
マウス群を、リン酸アルミニウムと共に小胞ワクチンを3回投与して免疫化し、最後の免疫化の3週間後に、血清を集めた。NspA過剰発現ワクチンは、ELISAによって測定したように高い抗NspA抗体価を誘発した(1:19,000。NspAノックアウト株から調製した小胞ワクチンで免疫化したマウスにおける1:700の力価、およびリン酸アルミニウムのみで免疫化したマウスからの<1:50の力価と比較)。表5は、4種類の試験株BZ198、NZ98/254、Cu385、およびZ1090に対して測定した血清殺菌抗体反応をまとめたものである。
【０２０８】
（表５）ナイセリア表面タンパク質A(NspA)を過剰発現するように遺伝子操作されたRM1900変異株から調製した小胞ワクチンによるマウスの免疫化
2008528597.tif 000010
a微小胞は、Moe et al(Infection Immunity 2002:70:6021-6031)に記載のように、8047株からのNspA遺伝子を含有するシャトルベクターpFP12で形質転換したNspAノックアウト株から調製した。3回の注射によってマウスを免疫化し、最後の注射の〜3週間後に採血した。示した力価は、各ワクチン群において9〜10匹のマウスからプールした血清からのものである。ELISAによって測定した、それぞれの抗NspA抗体価は、<1:50(リン酸アルミニウム群)、1:700(RM1090 NspAノックアウト株からの小胞)、および1:19,000(NspA過剰発現RM1090株からの小胞)であった。
bヒト補体と1時間インキュベートした後に細菌を50％死滅させる、最小濃度。
cヒト補体と1時間インキュベートした後に細菌を50％死滅させる、血清の最高希釈。
dNspAノックアウトバックグラウンドにおける発現。
【０２０９】
4種類全ての株が、RM1090ワクチン株のPorAと比較して異種のPorAを発現した。大腸菌小胞において発現させた組換えNspAに対して調製した抗NspA抗血清の殺菌活性に対して高感受性を示した以前のデータに基づいて(Moe et al., Infection and Immunity 1999;67:5664-5675)、本実験において殺菌活性を試験するために選択したBZ198株については、NspA過剰発現株に由来する小胞ワクチンで免疫化したマウスからの抗血清において高い殺菌活性の証拠があった。しかしながら、NZ98/254株に対しては殺菌活性の増加はなく、Cu385株およびZ1090株については、NspAを過剰発現する小胞ワクチンによる免疫化によって誘導された血清殺菌抗体反応は、対応するNspAノックアウト株から調製した対照小胞ワクチンによって誘導された血清殺菌抗体反応の1/10〜1/3であるという証拠があった。従って、GNA1870を過剰発現する小胞ワクチンとは対照的に、NspAを過剰発現する小胞ワクチンは高い殺菌抗体反応を首尾一貫してもたらさず、一部の株に対して殺菌抗体反応が抑えられているように見える。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１Ａ】間接蛍光によって測定した、髄膜炎菌RM1090株およびRM1090変異株の被包性生細胞表面における抗GNA1870抗体の結合を測定したフローサイトメトリー実験の結果を示す。行A.RM1090ΔGNA1870株。行B.RM1090野生型株。行C.GNA1870遺伝子を含有するシャトルベクターpFP12で形質転換したRM1090株。列1.リン酸アルミニウムのみで免疫化したマウスからの陰性対照血清(1:10希釈)。列2.陽性対照抗C群多糖mAb(10μg/ml)。列3.陽性対照抗PorA mAb(抗P1.2、1:500希釈)。列4.抗GNA1870(v.1)mAb(2μg/ml)。列5.v.1、v.2、およびv.3組換えタンパク質に対して調製したポリクローナル抗GNA1870抗血清(1:10希釈)。列6.列5と同じであるが、1:250希釈の血清。
【図１Ｂ】間接蛍光細胞数測定によって測定した、B群髄膜炎菌生細胞の表面への抗体の結合を示す。行1:野生型H44/76株(灰色の領域);H44/76 GNA1870過剰発現変異体(黒色の領域)。行2.H44/76ΔGNA1870。パネルA,抗アジュバント陰性対照抗血清1:10希釈;パネルB,抗PorA mAb(P1.16)1:500希釈;パネルC,抗莢膜mAb 10μg/ml;パネルD,抗rGNA1870 mAb JAR3 10μg/ml;パネルE,抗rGNA1870ポリクローナル抗血清1:10希釈;パネルF,パネルEと同じ。1:250希釈。
【図２Ａ】OMVのSDS PAGEおよびウエスタンブロット分析の結果を示す。パネルAは、クマシー染色SDS PAGEの写真である。レーン1〜5,OMV調製物(10μgをロードしたレーン5を除き、各レーンに約5μgのタンパク質)。レーン1,野生型(WT)RM1090株;レーン2,GNA1870遺伝子を含まないシャトルベクターpFP12で形質転換したWT株;レーン3.RM1090ΔGNA1870ノックアウト(KO);レーン4,GNA1870遺伝子を含まないpFP12で形質転換したRM1090ΔGNA1870KO;レーン5,GNA1870遺伝子を含有するシャトルベクターpFP12-GNA1870で形質転換したRM1090ΔGNA1870KO;レーン6,rGNA1870(約1μg)。パネルBおよびCは、変種1、2、および3 rGNA1870タンパク質で免疫化したマウスからのポリクローナル抗GNA1870抗血清を用いたウエスタンブロットの写真である。パネルB:この抗血清の検出感度は、変種1組換えGNA1870タンパク質(v.1)と比較して変種2(v.2)組換えGNA1870タンパク質の方がわずかに高かった。パネルC:レーン1,組換えGNA1870 v.1;レーン2,WT RM1090からのOMV;レーン3,RM1090ΔGNA1870からのOMV;レーン4,GNA1870遺伝子を含有するpFP12シャトルベクターで形質転換したRM1090からのOMV。シャトルベクターで形質転換したRM1090ΔGNA1870株におけるGNA1870 v.1の過剰発現は、野生型株におけるネイティブなGNA1870発現レベルより大きい(レーン2)。
【図２Ｂ】抗rGNA1870ポリクローナル抗体でプローブしたOMVワクチンのウエスタンブロット分析の結果を示す。野生型,野生型H44/76株から調製したOMV;ΔGNA1870,GNA1870をコードする遺伝子が不活化されているH44/76変異体から調製したOMV;OE GNA1870,GNA1870を過剰発現するように操作したH44/76変異体からのOMV;rGNA1870,大腸菌において発現させた精製HisタグGNA1870。
【図３Ａ】4種類の代表的な被包性髄膜炎菌Cu385株、M6190株、Z109株、およびNZ98/254株に対して測定した、マウスの血清殺菌力価のグラフを示す。ワクチン群は、バー1,リン酸アルミニウムアジュバントのみ;バー2,RM1090野生型からのOMVワクチン;バー3,RM1090ΔGNA1870からのOMVワクチン;バー4,RM1090ΔGNA1870からのOMVワクチン＋組換えGNA1870タンパク質の混合物;バー5,GNA1870過剰発現RM1090からのOMVワクチン;バー6,組換えGNA1870タンパク質であった。相乗平均について95％信頼区間を示すバーは、9〜10匹の動物からの血清がアッセイされたワクチン群に相当する。星印(＊)付きのバーは、各ワクチン群からの2種類の血清プール(それぞれのプールは4〜5匹のマウスの血清からのものである)のアッセイによる結果の相乗平均に相当する。
【図３Ｂ】H44/76 OMVワクチンで免疫化したマウスからの血清の血清殺菌活性(1/GMT±SD)のグラフを示す。血清プールは、図3Aに対する説明文に記載のように調製した。(1)アジュバント、(2)rGNA1870、(3)H44/76野生型、(4)H44/76ΔGNA1870、(5)H44/76 OE GNA1870で免疫化したマウス群。パネルには示さなかったが、補体＋陽性対照である抗莢膜抗体および/または抗PorAモノクローナル抗体によって、全ての株が死滅した。
【図４Ａ】間接蛍光フローサイトメトリーによって測定した、被包性髄膜炎菌生細胞の表面におけるヒトC3bおよびiC3b補体沈着の活性化を示す一連のグラフである。行A.NZ98/254株。行B.M1390株。列1,補体＋陽性対照B群抗莢膜MAb,25μg/ml(白抜きの領域)、またはリン酸アルミニウムのみで免疫化した陰性対照マウスからの血清プールの1:40希釈液(塗りつぶした領域)。列2,補体＋抗GNA1870 MAb JAR3,1μg/ml(白抜きの領域)、または熱不活化補体＋抗GNA1870 MAb,5μg/ml(塗りつぶした領域)。列3、列4、および列5,補体＋列3(rGNA1870ワクチン)、列4(RM1090 WT株からのOMVワクチン)、または列5(rGNA1870ワクチンおよびRM1090株ΔGNA1870からのOMVワクチンの混合物)で免疫化したマウスからの血清プールの1:100希釈液。列6,補体＋GNA1870過剰発現RM1090株からのOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プールの希釈液(白抜きの領域,1:100希釈および灰色の領域,1:400希釈)。比較のために、列6のパネルは、補体＋RM1090株ΔGNA1870からのOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清プールの1:100希釈液(塗りつぶした領域)からのデータも示す。
【図４Ｂ】間接蛍光フローサイトメトリーによって測定した、被包性髄膜炎菌生細胞の表面におけるヒトC3bおよびiC3b補体沈着の活性化を示す一連のグラフである。NZ98/254株、BZ198株、Z1092株、およびM6190株。パネルA,白抜きの領域:補体＋抗莢膜mAb(B群NZ98/254株、BZ198株、およびM61903株については25μg/ml、ならびにA群Z1092株については1μg/m);塗りつぶした領域:補体＋抗アジュバント抗血清の1:100希釈液。パネルB,白抜きの領域:補体＋抗rGNA1870 mAb JAR3 25μg/ml;塗りつぶした領域:補体＋ポリクローナル抗rGNA1870抗血清の1:100希釈液。パネルC,補体＋野生型H44/76からのOMVに対する抗血清の1:100希釈液。パネルD,白抜きの領域:補体＋陰性対照カラム(Ni-NTAのみ)を用いて吸収された、過剰発現GNA1870を有するOMVに対して調製した抗血清の1:100希釈液;塗りつぶした領域:補体＋固相GNA1870カラムを用いた吸収後の、過剰発現GNA1870を有するOMVに対して調製した抗血清の1:25希釈液。
【図５】ELISAによって測定した、血清抗GNA1870抗体反応(GMT±SD)を示す棒グラフである。プレート上の抗原はrGNA1870変種1であった。二次抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG＋A＋Mであった。バーは、(1)アジュバント;(2)rGNA1870;(3)H44/76野生型OMV;(4)H44/76ΔGNA1870 OMV;(5)H44/76 OE GNA1870 OMVで免疫化したマウス群からの2つの抗血清プール(4〜5匹マウス/プール)のそれぞれの力価の相乗平均を示す。
【図６】新生仔ラット髄膜炎菌性菌血症モデルにおける受動防御の分析結果を示したグラフを示す。0時に、新生仔ラットの腹腔内(IP)を、免疫化マウスからの血清プール(N=9〜10匹の個体の血清/プール)で処置し、2時間後に、B群NZ98/294株を投与した(約60,000CFU/ラットをIP投与)。細菌投与の4〜6時間後に、血液定量培養物を得た。パネルA:1:15血清希釈。パネルB:1:60血清希釈。バー1:リン酸アルミニウムのみで免疫化したマウスからの血清;バー2:抗莢膜mAb(10μg/ラット);バー3:抗GNA1870 mAb(10μg/ラット);バー4:RM1090ΔGNA1870からのOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清;バー5:RM1090ΔGNAからのOMVワクチン＋組換えGNA1870タンパク質ワクチンの混合物で免疫化したマウスからの血清;バー6:GNA1870過剰発現RM1090からのOMVワクチンで免疫化したマウスからの血清;バー7:組換えGNA1870タンパク質ワクチンで免疫化したマウスからの血清。
【図７】GNA1870変種1、2、および3の例示的なアミノ酸配列のアラインメントである。GNA1870変種1、2、および3は、それぞれ、MC58株、951-5945株、M1239株からのものである。「1」は成熟タンパク質の最初のアミノ酸を示し、負の数で示されるアミノ酸はリーダー配列の部分である。灰色および黒色のバックグラウンドは、それぞれ、保存されているアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基を示す。
【図８】図8A〜8Hは、選択された例示的なGNA1870ポリペプチドのアミノ酸配列アラインメント(図8H)を含む、本発明において有用な例示的なGNA1870ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図９】例示的なPorA VR1ファミリープロトタイプのアミノ酸配列のアラインメント(パネルA)、および例示的なPorA VR2ファミリープロトタイプのアミノ酸配列のアラインメント(パネルB)を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月27日(2008.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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