(57)【要約】本発明は、ＲＳＶおよびＰＩＶがＲＮＡｉ薬の鼻腔内投与ならびに非経口投与により抑制されうることを示したｉｎ  ｖｉｖｏでの証明に基づいている。さらに、２以上のウイルスが同時に治療される場合も、ウイルスの効果的減少が達成されうることが示されている。これらの所見に基づき、本発明は、ヒトなどの哺乳動物などの被検体において、ＲＳＶまたはＰＩＶのｍＲＮＡレベル、ＲＳＶまたはＰＩＶのタンパク質レベルおよびウイルス価を減少させるうえで有用な、一般的ならびに特定の組成物および方法を提供する。これらの所見は他の呼吸器系ウイルスにも適用することができる。
2008517940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の細胞中のウイルスタンパク質、ウイルスｍＲＮＡまたはウイルス価のレベルを減少させる方法であって、該被検体にｉＲＮＡ薬を投与するステップを包含し、該ｉＲＮＡ薬が、第１の哺乳動物呼吸器系ウイルスからの遺伝子と相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記哺乳動物呼吸器系ウイルスがＰＩＶおよびＲＳＶからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＳＶからの前記遺伝子がＰタンパク質遺伝子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｉＲＮＡ薬が表１のｉＲＮＡ薬のうちの１つから選択される１５ヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｉＲＮＡ薬が被検体の鼻腔内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｉＲＮＡ薬が吸入または噴霧により被検体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｉＲＮＡ薬が前記被検体のウイルス価を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記被検体に第２のｉＲＮＡ薬を共投与することをさらに包含し、該第２のｉＲＮＡ薬が、第２の哺乳動物呼吸器系ウイルスからの遺伝子と相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被検体がウイルス感染を有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の哺乳動物呼吸器系ウイルスがＲＳＶであり、前記第２の呼吸器系ウイルスがＰＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記被検体が前記第１および第２の哺乳動物呼吸器系ウイルスによるウイルス感染を有すると診断されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
被検体の細胞中の第１および第２のウイルスからのウイルスタンパク質のレベルを減少させる方法であって、該被検体に第１および第２のｉＲＮＡ薬を共投与するステップを包含し、該第１のｉＲＮＡ薬が、第１の哺乳動物呼吸器系ウイルスからの遺伝子と相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなり、該第２のｉＲＮＡ薬が、第２の哺乳動物呼吸器系ウイルスからの遺伝子と相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、該センス鎖に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記第１の哺乳動物呼吸器系ウイルスがＲＳＶであり、前記第２の哺乳動物呼吸器系ウイルスがＰＩＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＲＮＡ薬が鼻腔内に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉＲＮＡ薬が吸入または噴霧により投与される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器系ウイルス治療法と、ウイルスの複製を調節するための組成物および方法の分野に関するものであり、特に、オリゴヌクレオチドを吸入により肺および鼻腔内に局所的に投与／鼻腔内投与することにより、または注射により全身的／静脈内に投与することにより、ＲＮＡ干渉を介して呼吸器系ウイルスの遺伝子をダウンレギュレーションすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
気道は、その本来の機能ゆえに、さまざまな呼吸器疾患を引き起こす空気中の大量の病原体に曝されている。先進国では、乳児の入院原因として最も多いのが気道のウイルス感染であり、米国では年間の入院件数が９１，０００件、そのコストは３億ドルと推定されている。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は呼吸器疾患の２つの主要な原因物質であり、両ウイルスが共に上気道および下気道に感染すると、クループ、肺炎および細気管支炎を引き起こす（非特許文献１および２）。ＲＳＶ単独では、出生後１年以内の乳児の最大６５％が感染し、２年以内では基本的に全員が感染する。高齢者においても罹患および死亡の重大な原因となっている。ＲＳＶ感染後の免疫は、不完全で永続性がなく、このため、あらゆる年齢群で反復感染が生じる。ＲＳＶ細気管支炎を経験した乳児は、後年、喘鳴および喘息を発現する可能性が高い。ＲＳＶに対する有効な治療およびワクチンを求めた研究が４０年近く続けられているが、成果は少ない（非特許文献１および３）。現在のところ、ＲＳＶおよびＰＩＶのいずれにも臨床的に認可されたワクチンは存在しない。両ウイルスの株は、ウシ、ヤギ、ブタおよびヒツジなどヒト以外の動物に関しても存在し、農業および酪農食肉産業に損害を引き起こしている（非特許文献２）。
【０００３】
ＲＳＶおよびＰＩＶはいずれも非分節性マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有し、パラミクソウイルス科に属する。これらのウイルスの多数の特徴が、予防および治療の難しさに寄与している。当該ウイルスのゲノムは、ＲＮＡゲノムの複製校正機構がないために高率で変異し、信頼性の高いワクチンまたは抗ウイルス薬を設計するうえで重要な課題を提示している（非特許文献４）。有望なＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）阻害薬は、一つには該ウイルスがＦ遺伝子に位置づけられた耐性変異を発現したことが原因で、途中で断念された（非特許文献５および６）。両ウイルスは細胞タンパク質と結び付くため、ワクチン接種のための無細胞ウイルス材料を得ることも困難である（非特許文献７〜９）。また、両ウイルス、特にＲＳＶの免疫学はきわめて複雑である（非特許文献１０および１１）。変性したＲＳＶタンパク質をワクチンとして使用すると、「免疫強化」またはワクチンによる疾患の増強を招くが（非特許文献１２）、この現象はＰＩＶについては検討されておらず、起こる可能性も除外されていない。最近になって多数の抗ＲＳＶバイオ医薬プログラムが閉鎖されたことにより、全体的な問題が強調されている。
【０００４】
ＲＳＶゲノムは、１５，２２２ヌクレオチド長の一本鎖マイナスセンスＲＮＡからなり、主に１１のタンパク質を産生する（非特許文献１３）。これらのタンパク質のうちの２つはＦ（融合）およびＧ（接着）糖タンパク質であり、これらは主要な表面タンパク質であり、防御免疫を誘導するために最も重要である。ＳＨ（小型疎水性）タンパク質、Ｍ（マトリックス）タンパク質およびＭ２（２２ｋＤａ）タンパク質は、ウイルスのエンベロープに関連しているが、防御免疫反応を誘導しない。Ｎタンパク質（主要なヌクレオキャプシド会合タンパク質）、Ｐタンパク質（リンタンパク質）およびＬタンパク質（主要なポリメラーゼタンパク質）は、ビリオンＲＮＡと関連していることが見出されている。２つの非構造タンパク質であるＮＳ１およびＮＳ２は、おそらく宿主とウイルスとの相互作
用に関与していると思われるが、感染性ビリオンには存在しない。
【０００５】
ヒトＲＳＶ株は、主要な２つの群であるＡおよびＢに分類されている。Ｇ糖タンパク質はＲＳＶタンパク質のうち最も分岐していることが示されている。２つのＲＳＶ群間および群内にみられるＲＳＶのＧ糖タンパク質の多様性が、疾患を毎年大発生させるＲＳＶの能力に重要であると考えられている。Ｇ糖タンパク質は２８９〜２９９アミノ酸からなり（ＲＳＶ株によって異なる）、細胞内の膜貫通型の高度にグリコシル化された９０ｋＤａのストーク構造と、ヘパリン結合ドメインを有する。この糖タンパク質は分泌型および膜結合型で存在する。
【０００６】
ＲＳＶ感染の治療に有効な方法は、現在のところ利用可能となっていない（非特許文献３）。ＲＳＶによる下気道の感染は、ほとんどの場合、自己限定性の疾患である。当該疾患を有する乳児および小児の治療方法または入院もしくは退院時期に関して、決定的なガイドラインや基準が存在しない。ＲＳＶ感染に関連して発生することがある低酸素症は、鼻カニューレを介して酸素で治療することができる。呼吸不全、ショックまたは再発性無呼吸の小児に対する機械的人工呼吸は、死亡率を低下させうる。ステロイド薬を処方する医師もいる。しかし、いくつかの研究から、ステロイド療法は細気管支炎で入院した乳児および小児の臨床経過に影響を及ぼさないことが示されている。このため、当該疾患以外は健康で人工呼吸を施されていない患者では、副腎皮質ステロイド薬の単独投与、または気管支拡張薬との併用投与は細気管支炎の管理に有用ではないと考えられる。気管支肺異形成および喘息などの心肺疾患が内在する乳児および小児には、ステロイド薬も使用されている。
【０００７】
１９８０年代中期から、抗ウイルス活性を有するグアノシン類似体であるリバビリンが、ＲＳＶ細気管支炎の乳児および小児の治療に使用されてきたが、その使用を評価した多くの試験は相反する結果を示している。現在ではほとんどの施設で、リバビリンの使用は免疫無防備状態の患者および重症患者に制限されている。
【０００８】
ＲＳＶ細気管支炎の重症度は、低い血清レチノール濃度と関連しているが、ＲＳＶ細気管支炎で入院した小児を対象とした臨床試験から、ビタミンＡの補給は有益な効果をまったく提供しないことが示された。ＲＳＶ下気道感染に対するＲＳＶ免疫グロブリン１５００ｍｇ／ｋｇの静脈投与および免疫グロブリン１００ｍｇ／ｋｇの吸入による治験も、実質的に有益な効果を示すことができなかった。
【０００９】
先進国では、ＲＳＶ下気道感染の治療は一般に対症療法に限定されている。抗ウイルス療法は、コストが高く、有効性に関してコンセンサスが得られていないことから、通常、生命にかかわる状況に使用が制限されている。発展途上国では酸素が主要な治療法であり（利用可能な場合）、死亡率を低下させる唯一の方法は予防することである。
【００１０】
ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫に導入されると遺伝子発現を妨げうるという観察所見を説明するために、ファイア（Ｆｉｒｅ）らが最初に作り出した用語である（非特許文献１４）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導くことから、遺伝子機能を研究するための新たなツールを提供してきた。ＲＮＡｉは、新たな種類の治療薬を開発する方法として提案されてきた。しかし、現在までのところ、たいていは提案にすぎず、ＲＮＡｉを治療的に使用できることを示した証拠は存在しない。
【非特許文献１】Openshaw, P.J.M.. Respir. Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002)
【非特許文献２】Easton, AJ., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004)
【非特許文献３】Maggon, K. et al, Rev. Med. Virol. 14, 149-168 (2004)
【非特許文献４】Sullender, W.M. Clin. Microbiol. Rev. 13, 1-15(2000)
【非特許文献５】Razinkov, V, et. al., Antivir. Res. 55, 189-200 (2002)
【非特許文献６】Morton, CJ. et al. Virology 311, 275-288 (2003)
【非特許文献７】Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998)
【非特許文献８】Burke, E., et al., J. Virol. 74, 669-675 (2000)
【非特許文献９】Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998)
【非特許文献１０】Peebles, R.S., Jr., et al.,Viral. Immunol. 16, 25-34 (2003)
【非特許文献１１】Haynes, L.M., et al., J. ytrol 11, 9831-9844 (2003)
【非特許文献１２】Polack, F.P. et al. J. Exp. Med. 196, 859-865 (2002)
【非特許文献１３】Falsey, A. R., and E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84
【非特許文献１４】Fire et al, Nature 391:806-811, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＲＳＶに対する安全かつ有効なワクチンが、特に乳児および小児のために必要である。また、あらゆる年齢層および免疫無防備状態の個体のＲＳＶ感染を治療する治療薬および治療方法も必要である。ＲＳＶに対する防御免疫反応を特徴付けるための科学的方法も必要であり、該方法により、該疾患の発生機序を研究でき、治療薬およびワクチンのためのスクリーニングを促進することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＲＳＶおよびＰＩＶ感染の調節または予防に有効な方法および組成物を提供することにより、当該技術分野のこれまでの欠点を克服し、他の呼吸器系ウイルスにも拡大適用される。特に、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＳＶおよびＰＩＶレベルを低下させることが示された、すなわち当該分子種の治療活性が示されたｉＲＮＡ薬を提供することにより、当技術分野を進歩させる。さらに、２つ以上のウイルスを同時に治療できることも実証する。
【００１３】
（要約）
本発明は、ＲＳＶおよびＰＩＶをＲＮＡｉ薬の鼻腔内投与ならびに非経口投与により抑制可能であることを示したｉｎ  ｖｉｖｏの証明に基づいている。さらに、異なる２つのｉＲＮＡ薬を用いて２つ以上のウイルスが同時に治療される場合も、ウイルス価の効果的減少が達成されうることが示されている。これらの所見に基づき、本発明は、ヒトなどの哺乳動物などの被検体において、ＲＳＶまたはＰＩＶのｍＲＮＡレベル、ＲＳＶまたはＰＩＶのタンパク質レベルおよびウイルス価を減少させるうえで有用な、一般的ならびに特定の組成物および方法を提供する。これらの所見は他の呼吸器系ウイルスにも適用することができる。
【００１４】
本発明は、ＲＳＶ、ＰＩＶまたは他の呼吸器系ウイルスの遺伝子の１つ、特にＲＳＶまたはＰＩＶのＰ遺伝子ならびにＲＳＶのＮ、Ｇ、Ｆ、ＳＨ、ＭおよびＬ遺伝子の、１５個連続したヌクレオチドからなる、または少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含んでなるｉＲＮＡ薬を具体的に提供する。当該ｉＲＮＡ薬は、鎖あたり３０個未満のヌクレオチド、たとえば２１〜２３個のヌクレオチドを含んでなることが好ましい。二本鎖ｉＲＮＡ薬は、平滑末端か、あるいは、より好ましくは当該ｉＲＮＡ薬の一方または両方の３’末端に１〜４ヌクレオチドの突出部を有することができる。
【００１５】
さらに上記ｉＲＮＡ薬は、天然に存在するリボヌクレオチド・サブユニットのみを含んでもよいし、あるいは、当該薬に含まれる１つ以上のリボヌクレオチド・サブユニットの
糖または塩基に対し１つ以上の修飾が含まれるように合成されてもよい。該ｉＲＮＡ薬は、当該薬の安定性、分布または細胞への取込みを改善するために選択されるコレステロールなどのリガンドに接続されるように、さらに修飾することができる。該ｉＲＮＡ薬はさらに、単離された形態でもよいし、あるいは、本明細書に記述する方法に使用される医薬組成物、特に肺もしくは鼻腔内に送達するために製剤された、または非経口投与のために製剤された医薬組成物の一部であってもよい。該医薬組成物は１つ以上のｉＲＮＡ薬を含有することができ、一部の実施形態では、各々がＲＳＶおよびＰＩＶなどの異なる呼吸器系ウイルスを標的とした２つ以上のｉＲＮＡ薬を含有することができる。
【００１６】
本発明はさらに、細胞中のＲＳＶ、ＰＩＶまたは他の呼吸器系ウイルスのｍＲＮＡレベルを低下させるための方法も提供する。当該方法は、ＲＮＡ干渉に関与する細胞機構を利用して細胞中のウイルスｍＲＮＡを選択的に分解するものであり、本発明の抗ウイルスｉＲＮＡ薬の１つと細胞を接触させるステップを含んでなる。当該方法は、細胞に対して直接行うこともできるし、あるいは、本発明の１つのｉＲＮＡ薬／医薬組成物を被検体に投与することにより哺乳動物被検体で行なうこともできる。細胞中のウイルスｍＲＮＡが減少すると、産生されるウイルスタンパク質の量が減少し、生物体においては複製ウイルス価が減少する。実施例はＰＩＶおよびＲＳＶを用いてこれを実証しており、これは他の呼吸器系ウイルスにも拡大適用することができる。
【００１７】
本発明はさらに、細胞中に存在する、各々が異なるウイルスに由来する２つ以上の呼吸器系ウイルスｍＲＮＡのレベルを低下させるための方法も提供する。当該方法は、ＲＮＡ干渉に関与する細胞機構を利用して細胞中の異なる２つのウイルスに由来するウイルスｍＲＮＡを選択的に分解するものであり、本発明の２つの抗ウイルスｉＲＮＡ薬と細胞を接触させるステップを含んでなる。当該方法は、細胞に対して直接行うこともできるし、あるいは、本発明の２つのｉＲＮＡ薬を被検体に投与することにより、哺乳動物被検体で行なうこともできる。細胞中の異なる２つのウイルス由来のウイルスｍＲＮＡが減少すると、産生される両ウイルスタンパク質の量が減少し、生物体においては両ウイルスの複製ウイルス価が減少する。実施例は、ＰＩＶおよびＲＳＶを用いて、ｉＲＮＡ薬の同時投与でこれを実証している。本発明の当該実施形態は、任意の２つの呼吸器系ウイルスに適用することができる。
【００１８】
本発明の方法および組成物、たとえば、当該方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記述したどの用量および／または製剤でも使用することができ、本明細書に記述したどの投与経路でも使用することができる。本明細書で示している特に重要なことは、ｉＲＮＡ薬の鼻腔内投与と、呼吸器組織においてウイルス複製を抑制できる当該薬の能力である。この所見は、実施例に示すＰＩＶのような他の呼吸器系ウイルスや、吸入／噴霧など肺に局所的に送達する他の投与経路にも適用できる。
【００１９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記述に示す。本発明のその他の特徴、目的および利点はこの記述、図面および特許請求の範囲から明らかになるはずである。本出願は、引用したすべての参考文献、特許および特許出願を、あらゆる目的に対してその全体を参照することにより組み込んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書では説明を簡略化するために、ＲＮＡ薬の１つ以上の単量体サブユニットについて「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」という用語を使用する場合がある。当然のことながら、本明細書における用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物の場合には、以下にさらに記述するように、１つ以上の位置における、修飾ヌクレオチドまたは代替物置換部分を指すこともできる。
【００２１】
本明細書で使用している「ＲＮＡ薬」とは、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡまたはヌクレオシド代替物を指し、これらはいずれも本明細書に記述しているか、またはＲＮＡ合成技術分野で周知のものである。修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代替物が多数記述されているが、好適な例には、修飾されていないＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対する耐性が強いものが含まれる。好適な実施例には、２’糖修飾、一本鎖突出部における修飾、好ましくは３’一本鎖突出部における修飾、または、特に一本鎖である場合に、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基類似体を含む５’修飾を有するものが含まれる。
【００２２】
「ｉＲＮＡ薬」は、本明細書で使用しているように「ＲＮＡｉ薬」とも呼ばれ（「干渉ＲＮＡ薬」の略語）、ＲＳＶなどの標的遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるＲＮＡ薬である。理論に拘束されることを望むものではないが、ｉＲＮＡ薬は多数の機構のうちの１つ以上によって作用すると考えられ、これらの機構には、当技術分野でＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後開裂、または転写前もしくは翻訳前機構などがある。ｉＲＮＡ薬は一本鎖を有していてもよいし、または２つ以上の鎖をしていてもよく、たとえば、二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ薬であってもよい。ｉＲＮＡ薬が一本鎖である場合は、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基類似体を含む５’修飾を有することが特に好ましい。
【００２３】
本明細書で使用しているように「一本鎖ｉＲＮＡ薬」とは、単一分子から作製されるｉＲＮＡ薬である。該ｉＲＮＡ薬は、鎖内のペアリングにより形成された二重鎖領域を含んでもよく、たとえば、ヘアピン構造もしくはパンハンドル構造であっても、これらの構造を含んでいてもよい。一本鎖ｉＲＮＡ薬は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。
【００２４】
本明細書で使用しているように「ｄｓ  ｉＲＮＡ薬」（「二本鎖ｉＲＮＡ薬」の略語）は、２本以上の鎖、好ましくは２本の鎖を有し、鎖間のハイブリダイゼーションにより二重鎖構造の領域が形成されうるｉＲＮＡ薬である。
【００２５】
本明細書に記述するｄｓ  ｉＲＮＡ薬およびｓｉＲＮＡ薬を含めた単離されたｉＲＮＡ薬は、標的遺伝子のサイレンシングを、たとえばＲＮＡ分解により仲介することができる。便宜上、本明細書ではこのようなＲＮＡをサイレンシングされるＲＮＡとも呼ぶ。また、このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。好ましくは、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性ＲＳＶ遺伝子の遺伝子産物である。
【００２６】
本明細書で使用しているように、「ＲＮＡｉを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で標的遺伝子をサイレンシングする作用物質の能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、該作用物質と接触していないときには標的遺伝子の特定の産物を含有および／または分泌する細胞が、該作用物質と接触したときに、該作用物質と接触していない同様の細胞に比べて当該遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％少なく含有および／または分泌することになるプロセスを意味する。標的遺伝子のこのような産物とは、たとえば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でも、タンパク質または調節要素でもよい。
【００２７】
本発明の抗ウイルス使用では、標的遺伝子のサイレンシングは細胞中の「ウイルス価」を減少させることになる。本明細書で使用しているように、「ウイルス価の減少」とは、ウイルス標的遺伝子のサイレンシングを受けている生物において、細胞により産生される、または当該生物に見出される生存可能なウイルスの数が減少することを指す。産生される細胞中ウイルスの量の減少が、治療を受ける被検体の組織において産生される測定可能なウイルス量を減少させ、かつウイルス感染症状の重症度を軽減させることが好ましい。
本発明のｉＲＮＡ薬を「抗ウイルスｉＲＮＡ薬」とも呼ぶ。
【００２８】
本明細書で使用しているように、「ＲＳＶ遺伝子」とは、ＲＳＶウイルスゲノムにおいて同定された遺伝子のうちの任意の１つを指す（Falsey, A. R., and E. E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371- 84 を参照）。これらの遺伝子は当技術分野ですでに周知であり、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子がある。
【００２９】
本明細書で使用しているように、「ＰＩＶ遺伝子」とは、ＰＩＶウイルスゲノムにおいて同定された遺伝子のうちの任意の１つを指す（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１７９６を参照) 。これらの遺伝子は当技術分野ですでに周知であり、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｄ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子がある。
【００３０】
本明細書で使用しているように、「呼吸器系ウイルス」とは呼吸器系の細胞中で複製するウイルスを指す。このようなウイルスには、ＲＳＶ、ＰＩＶ、インフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、アデノウイルスおよびコロナウイルス（ＳＡＲＳなど）があるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用しているように、「相補的」という用語は、本発明の化合物と、標的ＲＮＡ分子、たとえばＲＳＶ、ＰＩＶまたは他の呼吸器系ウイルスのｍＲＮＡ分子との間に安定かつ特異的な結合が生じるほど十分な程度の相補性があることを示すために使用している。特異的な結合には、特異的な結合が望まれる条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ測定法もしくは治療的処置の場合には生理学的条件下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定法の場合には該測定法が行われる条件下で、上記オリゴマー化合物と非標的配列との非特異的結合が回避されるのに十分な程度の相補性が必要である。非標的配列は、典型的には少なくとも４個のヌクレオチドが異なっている。
【００３２】
本明細書で使用しているように、ｉＲＮＡ薬が細胞中の標的ＲＮＡにコードされるタンパク質の産生を低下させる場合に、当該ｉＲＮＡ薬は標的ＲＮＡ、たとえば標的ｍＲＮＡ（たとえば標的ＲＳＶまたはＰＩＶのｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。ｉＲＮＡ薬が標的ＲＮＡと「厳密に相補的」（ＳＲＭＳ含有サブユニットを除く）で、たとえば標的ＲＮＡとｉＲＮＡ薬が、好ましくは厳密な相補性を有する領域においてワトソンクリック型塩基対だけからなるハイブリッドを形成するようにアニーリングしてもよい。「十分に相補的」なｉＲＮＡ薬は、標的ウイルスＲＮＡと厳密に相補的な内部領域（たとえば、少なくとも１０個のヌクレオチドの領域）を有することができる。さらに、一部の実施形態では、当該ｉＲＮＡ薬は単一ヌクレオチドの相違を明確に識別する。この場合、該ｉＲＮＡ薬は、当該単一ヌクレオチドの相違の領域（たとえば７ヌクレオチドの範囲内）に厳密な相補性が見出される場合に限って、ＲＮＡｉを仲介する。好適なｉＲＮＡ薬は、実施例に提供するセンス配列およびアンチセンス配列に基づく、またはこれらの配列で構成される、またはこれらの配列を包含するものである。
【００３３】
本明細書で使用しているように、「本質的に同一」とは、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列との比較において指す場合に使用するとき、第１のヌクレオチド配列が、最大１個、２個または３個のヌクレオチド置換（たとえばアデノシンのウラシルへの置換）を除けば第２のヌクレオチド配列と同一であることを意味する。
【００３４】
本明細書で使用しているように、「被検体」とは、ＲＳＶまたはＰＩＶ感染などのウイルス発現により仲介される障害の治療を受ける哺乳動物、あるいはウイルス感染を防ぐ予防的治療を受ける哺乳動物を指す。当該被検体は、霊長類、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギなど、どのような哺乳動物でもよい。好適な実施形態では、当該被検体はヒトである。
【００３５】
本明細書で使用しているように、ＲＳＶ感染、ＰＩＶ感染または他の呼吸器系ウイルス感染を治療するとは、１）被検体にウイルスが存在することにより部分的に仲介され、２）存在するウイルスタンパク質のレベルを低下させることによりその転帰が影響を受けうる、任意の生物学的または病理学的エンドポイントを改善することを指す。
【００３６】
本明細書で使用しているように、「共投与」とは被検体に２つ以上の薬剤、特に２つ以上のｉＲＮＡ薬を投与することを指す。複数の薬剤を単一の医薬組成物に包含させて同時に投与してもよいし、あるいは、別々の製剤に包含させて被検体に連続的に投与してもよい。２つの薬剤が被検体において同時に検出できる限り、その２つの薬剤は共投与されたと言う。
【００３７】
ｉＲＮＡ薬により仲介されたサイレンシングは、当該ｉＲＮＡ薬組成物の投与後数日間は存続しうるため、多くの場合、１日１回より少ない頻度で該組成物を投与することが可能であり、あるいは場合によっては、治療処方全体で１回だけ投与することも可能である。
【００３８】
ｉＲＮＡ薬の設計および選択
本発明は、鼻腔内投与／吸入のいずれかによりｉＲＮＡ薬を肺および鼻腔内に局所投与することにより、または注射による全身的／非経口投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて呼吸器系ウイルス遺伝子の標的遺伝子サイレンシングを行い、その結果としてウイルス感染を治療できるという実証結果に基づいている。本発明はさらに、２つ以上の呼吸器系ウイルスにｉＲＮＡ薬を使用することと、２つ以上のｉＲＮＡ薬を共投与して両ウイルス感染を治療することにも適用を広げている。
【００３９】
これらの結果に基づいて、本発明は、ウイルス感染、特に呼吸器系ウイルス感染、特にＲＳＶまたはＰＩＶ感染の治療に使用できるｉＲＮＡ薬を、単離された形態で、また以降に記述する医薬組成物としても具体的に提供する。当該薬は、ウイルス遺伝子に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、該センス鎖配列に相補的な少なくとも１５個連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含む。ＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質遺伝子に由来するヌクレオチド配列を有するｉＲＮＡ薬が特に有用である。ＲＳＶのこのほかの標的遺伝子には、Ｆ、Ｇ、ＳＨ、Ｍ、ＮおよびＬ遺伝子がある。ＰＩＶのこのほかの標的遺伝子には、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｄ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子がある。例示するｉＲＮＡ薬を表１に記載する。
【００４０】
ｉＲＮＡ薬の候補は、たとえば、ｉＲＮＡ標的としての役目を果たすウイルス遺伝子の遺伝子歩行解析を行うことにより設計することができる。転写される領域の全部または一部に対応する重複した、隣接した、または近接した候補薬を作製してテストすることができる。標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする能力について、各ｉＲＮＡ薬をテストして評価することができる（以下の「ｉＲＮＡ薬候補の評価」を参照）。
【００４１】
ｉＲＮＡ薬は、配列情報および望ましい特徴に基づいて合理的に設計することができる。たとえば、ｉＲＮＡ薬は、候補二本鎖の相対的融解温度に従って設計することができる。一般に、当該二本鎖は、アンチセンス鎖の５’末端ではアンチセンス鎖の３’末端よりも低い融解温度を有するべきである。
【００４２】
したがって、本発明は、各々が少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３ヌクレオチドの配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなるｉＲＮＡ薬を提供し、当該ヌクレオチド配列は、上に定義したように、呼吸器系ウイルスの遺伝子、特にＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質遺伝子の一部と本質的に同一である。例示
するｉＲＮＡ薬には、表１に記載した薬剤のうちの１つに由来する１５個連続したヌクレオチドを包含するものが含まれる。
【００４３】
ｉＲＮＡ薬のアンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド長に等しいか、あるいは少なくともこれらの長さであるべきである。さらに、５０、４０または３０ヌクレオチド長以下であるべきである。好適な範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ薬は、表１の薬剤のうちの１つに由来する１５個のヌクレオチドを包含する。
【００４４】
ｉＲＮＡ薬のセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド長に等しいか、あるいは少なくともこれらの長さであるべきである。さらに、５０、４０または３０ヌクレオチド長以下であるべきである。好適な範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ薬は、表１の薬剤のうちの１つに由来する１５個のヌクレオチドを包含する。
【００４５】
ｉＲＮＡ薬の二本鎖部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対の長さに等しいか、あるいは少なくともこれらの長さであるべきである。また、５０、４０または３０ヌクレオチド対の長さ以下であるべきである。好適な範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
【００４６】
表１に記載した薬剤は、各鎖が２１ヌクレオチド長である。当該ｉＲＮＡ薬は、１９ヌクレオチドの二本鎖領域と、当該薬の各３’末端にある２ヌクレオチドの突出部とを有する。当該薬は、本明細書に記述しているように修飾して、当該配列の少なくとも一部、および／または当該オリゴヌクレオチドの塩基および結合の修飾を包含する同等のｉＲＮＡ薬を得ることができる。
【００４７】
一般に、本発明のｉＲＮＡ薬は、ウイルス遺伝子、たとえばＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質遺伝子に十分に相補的な領域を含み、さらに、当該ｉＲＮＡ薬またはその断片がその特定のウイルス遺伝子のダウンレギュレーションを仲介できる十分な長さのヌクレオチド長を有する。本発明のｉＲＮＡ薬のアンチセンス鎖は、本明細書でＲＳＶおよびＰＩＶのＰタンパク質について記述しているように、ウイルス遺伝子のｍＲＮＡ配列に十分に相補的であることが好ましい。しかし、当該ｉＲＮＡ薬と標的との間に完全な相補性が存在する必要はない。ただし、当該ｉＲＮＡ薬またはその開裂産物がたとえばＲＳＶ  ｍＲＮＡのＲＮＡｉ開裂により配列特異的サイレンシングを誘導することが可能な程度に、十分に一致していなければならない。
【００４８】
したがって、本発明のｉＲＮＡ薬には、ウイルス遺伝子、特にＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質遺伝子の配列のうちの１つと以下に定義するように本質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列をそれぞれ有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなるｉＲＮＡ薬が含まれ、ただし、各鎖あたり１、２または３個以下のヌクレオチドは他のヌクレオチドによって置換される（たとえばアデノシンがウラシルに置換される）と同時に、以下に定義するようにヒト培養細胞においてＲＳＶ発現を抑制する能力は本質的に残存している。したがって、当該薬は、ウイルス遺伝子、特にＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質遺伝子の配列のうちの１つと同一な少なくとも１５個のヌクレオチドを有するが、標的ウイルスｍＲＮＡ配列に関して、またはセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、１、２または３個の塩基のミスマッチが導入されている。標的ウイルスｍＲＮＡ配列に対するミスマッチ、特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域におい
て最も許容され、ミスマッチが存在する場合は、末端領域すなわち、５’および／または３’末端の６、５、４もしくは３ヌクレオチドの範囲内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチドの範囲内にあることが最も好ましい。センス鎖は、当該分子の全体的な二本鎖の特徴を維持できる程度にアンチセンス鎖と相補的であれば十分である。
【００４９】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、ｉＲＮＡ薬が表１に例示したｉＲＮＡ薬のように該分子の一端または両端に一本鎖すなわち対をなさない領域を有するように選択されることが好ましい。したがってｉＲＮＡ薬は、突出部、たとえば１つまたは２つの５’もしくは３’突出部、好適には２〜３ヌクレオチドの３’突出部を含むように対をなしたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことが好ましい。ほとんどの実施形態は、３’突出部を有する。好適なｓｉＲＮＡ薬は、当該薬の一端または両端に、１〜４ヌクレオチド長、または好ましくは２〜３ヌクレオチド長の一本鎖突出部、好ましくは３’突出部を有する。該突出部は、一方の鎖が他方の鎖より長い結果であってもよいし、あるいは、同一の長さの２本の鎖がずれた結果であってもよい。５’末端はリン酸化されていることが好ましい。
【００５０】
二本鎖領域の好適な長さは、たとえば上に述べたｓｉＲＮＡ薬の範囲では、１５〜３０ヌクレオチド長、最も好適には１８、１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチド長である。当該ｓｉＲＮＡ薬の２つの鎖が、たとえば共有結合などで連結している実施形態も含まれる。必要な二本鎖領域と、好ましくは３’突出部とを提供するヘアピン構造または他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。
【００５１】
ｉＲＮＡ薬候補の評価
標的遺伝子の発現をダウンレギュレートする能力についてｉＲＮＡ薬候補を評価することができる。たとえば、ｉＲＮＡ薬候補を提供し、たとえば標的遺伝子を含有するウイルスなどの目的のウイルスにすでに感染している、または感染させるヒト細胞などの細胞と接触させることができる。別例として、当該細胞を、標的ウイルス遺伝子を発現する構築物でトランスフェクトし、ウイルス感染性モデルの必要をなくすことができる。ｉＲＮＡ薬候補と接触させる前後の標的遺伝子発現レベルを、たとえばｍＲＮＡレベルもしくはタンパク質レベルで、またはウイルス価などについて比較することができる。標的遺伝子から発現されるＲＮＡ、タンパク質またはウイルスの量が、ｉＲＮＡ薬との接触後では低いと判断されれば、当該ｉＲＮＡ薬は標的遺伝子発現をダウンレギュレートすると結論することができる。細胞中の標的ウイルスＲＮＡまたはウイルスタンパク質のレベル、あるいは、細胞または組織中のウイルス価は、任意の方法で測定することができる。たとえば、標的ＲＮＡレベルは、ノーザンブロット分析、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応の組み合わせ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｂＤＮＡ分析、またはＲＮＡｓｅプロテクション法により測定することができる。タンパク質レベルは、たとえば、ウェスタンブロット法または免疫蛍光法により測定することができる。ウイルス価は、プラーク形成法で検出することができる。
【００５２】
ｉＲＮＡ薬の安定性試験、修飾および再試験
たとえば、ｉＲＮＡ薬候補が被検体の体内に導入される場合のように、エンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる開裂に対する感受性などの安定性に関してｉＲＮＡ薬候補を評価することができる。たとえば被検体の体内に見出される成分による開裂など、特に開裂による修飾を受け易い部位を同定するための方法を用いることができる。
【００５３】
開裂し易い部位が同定されると、開裂の可能性のある該部位を、例えば、その開裂部位に２’−Ｏ−メチル基などの２’修飾を導入することにより開裂に対して耐性とした、さらなるｉＲＮＡ薬を設計および／または合成することができる。このさらなるｉＲＮＡ薬を安定性について再試験することができ、望ましい安定性を示すｉＲＮＡ薬が見つかるまでこのプロセスを繰り返せばよい。
【００５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＲＳＶ遺伝子発現を抑制できることが確認されたｉＲＮＡ薬は、実施例に示すように、動物モデル（たとえばマウスまたはラットなどの哺乳動物）でｉｎ  ｖｉｖｏでの機能性について試験することができる。たとえば、当該ｉＲＮＡ薬を動物に投与し、その分布および安定性のほか、ＲＳＶまたはＰＩＶなどのウイルスの遺伝子発現を抑制する能力またはウイルス価を減少させる能力について評価することができる。
【００５５】
ｉＲＮＡ薬は、注射などにより標的組織に直接投与されてもよいし、あるいは、ヒトに投与される場合と同じ様式で動物モデルに投与されてもよい。本明細書に示すように、当該薬はウイルス感染を治療する手段として、吸入により投与できることが好ましい。
【００５６】
ｉＲＮＡ薬を、細胞内分布について評価することもできる。この評価には、当該ｉＲＮＡ薬が該細胞に取り込まれたかどうか測定することを含めることができる。さらにこの評価には、当該ｉＲＮＡ薬の安定性（たとえば半減期）を測定することも含めることができる。ｉＲＮＡ薬のｉｎ  ｖｉｖｏでの評価は、追跡可能なマーカー（たとえば、フルオレセインなどの蛍光マーカー、35Ｓ、32Ｐ、33Ｐまたは3 Ｈなどの放射性標識、金粒子、あるいは免疫組織化学検査のための抗原粒子）と結合させたｉＲＮＡ薬を使用することにより、容易に行なうことができる。
【００５７】
生体内分布をモニターするのに有用なｉＲＮＡ薬は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子サイレンシング活性を欠いていてもよい。たとえば、当該ｉＲＮＡ薬はその動物には存在しない遺伝子を標的としてもよいし（たとえば、マウスに注射するｉＲＮＡ薬がルシフェラーゼを標的としていてもよい）、あるいは、ｉＲＮＡ薬は、いかなる遺伝子も（たとえば任意の内在遺伝子を）標的としないナンセンス配列を有していてもよい。たとえば、上に記述した追跡可能な物質などのｉＲＮＡ薬に取り付けた追跡可能な標識により、当該ｉＲＮＡの局在性／生体内分布をモニターすることができる。
【００５８】
ウイルス遺伝子発現をダウンレギュレートする能力に関してｉＲＮＡ薬を評価することができる。たとえば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、またはｉＲＮＡ薬に曝露する前後の組織からＲＮＡを単離することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス遺伝子発現レベルを測定することができる。組織を回収するために動物を屠殺する必要がある場合は、未治療の対照動物が比較の役割を果たす。標的ウイルスｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分枝ＤＮＡ法、またはＲＮＡｓｅプロテクション法などの望ましい任意の方法で検出できるが、これらの方法に限定されない。もう１つの方法として、もしくは、これらに加える方法として、ｉＲＮＡ薬で治療した組織抽出物についてウェスタンブロット分析を行うことにより、ウイルス遺伝子発現をモニターすることができる。ウイルス価は、ｐｆｕ法を用いて測定することができる。
【００５９】
ｉＲＮＡの化学
本明細書に記述している単離されたｉＲＮＡ薬は、たとえば、ＲＮＡｉを仲介して、ＲＳＶまたはＰＩＶのＰタンパク質などのウイルス遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ分子（二本鎖、一本鎖）である。
【００６０】
本明細書で述べているＲＮＡ薬には、その他の非修飾ＲＮＡのほか、たとえば有効性を改善するため修飾されたＲＮＡ、ならびにヌクレオシド代替物のポリマーが含まれる。非修飾ＲＮＡとは、核酸の構成要素、すなわち、糖、塩基およびリン酸部分が、天然に生じるもの、好適にはヒトの体内で天然に生じるものと同一または本質的に同一である分子を指す。当技術分野では、稀または例外的ではあるが天然に生じるＲＮＡを、修飾ＲＮＡと呼んでいる。たとえば、Limbach et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196 を
参照されたい。修飾ＲＮＡと呼ばれることが多い（当該ＲＮＡが概して転写後修飾の結果であるからだと思われる）このような稀または例外的なＲＮＡは、本明細書で使用している非修飾ＲＮＡという用語の範囲内に含まれる。本明細書で使用している修飾ＲＮＡとは、核酸の構成要素、すなわち、糖、塩基およびリン酸部分のうち１つ以上が、天然に生じるものとは異なっている分子、好適にはヒトの体内で天然に生じるものとは異なっている分子を指す。該分子は修飾された「ＲＮＡ」と呼ばれるが、その修飾により、ＲＮＡではない分子も当然含まれることになる。ヌクレオシド代替物は、糖リン酸（ｒｉｂｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）骨格が非糖リン酸構築物で置換されている分子であり、当該非糖リン酸構築物は塩基を空間的に正しい関係において提示することができるためハイブリダイゼーションは糖リン酸骨格でみられるものとほぼ同じである。当該非糖リン酸構築物はたとえば糖リン酸骨格の非帯電模倣物が挙げられる。上記のそれぞれについての実施例を、本明細書で説明する。
【００６１】
本明細書に記述している修飾は、ｉＲＮＡ薬など、本明細書に記述している任意の二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子に組み込むことができる。ｉＲＮＡ薬のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましいと考えられる。核酸はサブユニットまたは単量体の重合体であるため、下記の修飾の多くは核酸内の反復される位置においてなされる。たとえば、塩基もしくはリン酸部分の修飾、またはリン酸部分の結合に関与していないＯの修飾などである。場合によっては、核酸における対象位置のすべてが修飾されるが、多くの場合、実際にはほとんどの場合、すべての対象位置が修飾されることはない。一例として、修飾は３’または５’末端位置にだけ生じる場合もあるし、末端領域例えば末端ヌクレオチドの位置または鎖の端から２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドに生じてもよい。修飾は二本鎖領域、一本鎖領域、または両方になされてよい。たとえば、結合に関与していないＯ位のホスホロチオエート修飾が、一端または両端だけになされてもよいし、末端領域例えば末端ヌクレオチドの位置または鎖の端から２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドだけになされてもよいし、あるいは二本鎖および一本鎖領域の特に末端になされてもよい。同じように、修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方になされてよい。一部の場合では、センス鎖とアンチセンス鎖が同一の修飾または同種の修飾を有することがあるが、他の場合では、センス鎖とアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、たとえば一部の場合では、１つの鎖だけ、例えばセンス鎖だけを修飾することが望ましいこともある。
【００６２】
ｉＲＮＡ薬に修飾を導入する２つの主な目的は、生物学的環境における分解に対する安定化と、薬力学的特性などの薬理学的特性の改善であり、これらについては下にさらに述べる。ｉＲＮＡ薬の糖、塩基または骨格に対するこのほかの適切な修飾は、２００４年１月１６日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３０号に記述されている。ｉＲＮＡ薬は、２００４年４月１６日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号に記述されている塩基のような、非天然型の塩基を含むことができる。ｉＲＮＡ薬は、非炭水化物の環状担体分子のような、非天然型の糖を含むことができる。ｉＲＮＡ薬に使用するための非天然型の糖の模範的特徴は、２００３年４月１６日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９号に記述されている。
【００６３】
ｉＲＮＡ薬は、ヌクレアーゼ耐性を増強するのに有用なヌクレオチド間結合（たとえばキラルなホスホロチオエート結合）を含むことができる。これに加えて、あるいはこれとは別に、ｉＲＮＡ薬はヌクレアーゼ耐性を増強するためのリボース模倣物を含むことができる。ヌクレアーゼ耐性を増強するための模範的なヌクレオチド間結合およびリボース模倣物は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７号に記述されている。
【００６４】
ｉＲＮＡ薬は、リガンドを結合させた単量体サブユニットと、オリゴヌクレオチド合成のための単量体とを含むことができる。模範的な単量体は、２００４年８月１０日出願の共願の米国特許出願番号第１０／９１６，１８５号明細書に記述されている。
【００６５】
ｉＲＮＡ薬は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記述されているようなＺＸＹ構造を有することができる。
ｉＲＮＡ薬は、両親媒性の化学部分と複合体を形成することができる。ｉＲＮＡ薬に使用するための模範的な両親媒性部分は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記述されている。
【００６６】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ薬は、モジュラー複合体を特徴とする送達物質との複合体を形成することができる。該モジュラー複合体は、（ａ）縮合剤（例えばイオン相互作用または静電的相互作用を介して核酸を誘引、例えば結合させることができる物質など）、（ｂ）融合誘導因子（例えば細胞膜を通じて融合および／または輸送する能力のある物質）、（ｃ）標的決定基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質もしくはタンパク質、例えば特定のタイプの細胞と結合する抗体など、のうち１つ以上（好適には２つ以上、より好適には３つすべて）と連結された担体物質を含むことができる。送達物質と複合体を形成するｉＲＮＡ薬は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記述されている。
【００６７】
ｉＲＮＡ薬は、ｉＲＮＡ二本鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、標準的ではないペアリングを有することができる。標準的ではないｉＲＮＡ薬の模範的特徴は、２００４年３月８日出願の共願のＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記述されている。
【００６８】
増強されたヌクレアーゼ耐性
ｉＲＮＡ薬、たとえばＲＳＶを標的とするｉＲＮＡ薬は、増強されたヌクレアーゼ耐性を有することができる。耐性を増強する１つの方法は、開裂部位を同定して、開裂を妨げるように当該部位を修飾することである。たとえば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’−ＵＧ−３’、５’−ＣＡ−３’、５’−ＵＵ−３’または５’−ＣＣ−３’は、開裂部位としての機能を果たしうる。
【００６９】
ヌクレアーゼ耐性または標的との結合親和性のうち少なくともいずれか一方を増強するため、ｉＲＮＡ薬、たとえば当該ｉＲＮＡ薬のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、たとえば２’を修飾したリボースユニットおよび／またはホスホロチオエート結合を含むことができる。たとえば、２’水酸基（ＯＨ）はさまざまな「オキシ」もしくは「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。
【００７０】
「オキシ」−２’水酸基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、たとえばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）ｎＣＨ2 ＣＨ2 ＯＲ；たとえば同一のリボース糖の４’炭素に例えばメチレン架橋により２’水酸基が接続されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2 ；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ2 ）ｎＡＭＩＮＥ、（たとえば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2 ；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ2 ＣＨ2 ＯＣＨ3 、ＰＥＧ誘導体）だけを有するオリゴヌクレオチドが、頑丈なホスホロチオエート修飾で修
飾したオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。
【００７１】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわちデオキシリボース糖、特に部分的ｄｓＲＮＡの突出部と関連性のあるもの）；ハロ（たとえばフルオロ）；アミノ（たとえばＮＨ2 ；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ）ｎＣＨ2 ＣＨ2 −ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ2 ；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル‐チオ‐アルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられ、これらは、任意選択でたとえばアミノ官能基で置換されてもよい。好適な置換基は２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【００７２】
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、上記２’修飾を、１つ以上のリン酸リンカー修飾（たとえばホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラな」オリゴヌクレオチドとは、２つ以上の異なる修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
【００７３】
特定の実施形態では、ｉＲＮＡ薬のすべてのピリミジンが２’−修飾を有し、このため当該ｉＲＮＡ薬は増強されたエンドヌクレアーゼ耐性を有する。ヌクレアーゼ耐性の増強は、５’ヌクレオチドの修飾によっても達成することができ、この場合は、たとえば少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチドのウリジンが２’−修飾されたヌクレオチドになるか、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチドの５’−ウリジンが２’−修飾されたヌクレオチドになるか、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチドの５’−シチジンが２’−修飾されたヌクレオチドになるか、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチドの５’−ウリジンが２’−修飾されたヌクレオチドになるか、あるいは、少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチドの５’−シチジンが２’−修飾されたヌクレオチドになる。ｉＲＮＡ薬は、このようなジヌクレオチドを少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つ含むことができる。
【００７４】
オリゴヌクレオチド骨格にフラノース糖を組み入れても、エンドヌクレアーゼによる開裂を減少させることができる。ｉＲＮＡ薬はさらに、３’カチオン基を含めることにより、または３’末端のヌクレオシドを３’−３’結合で反転させることにより、修飾することもできる。また別の実施形態では、３’末端を、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴなどのアミノアルキル基でブロックすることができる。他の３’結合体は３’−５’エクソヌクレアーゼによる開裂を妨げることができる。理論に拘束されるわけではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端と結合するのを立体的に妨害することにより、エクソヌクレアーゼによる開裂を妨げると考えられる。さらに小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環の結合体あるいは修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）は３’−５’エクソヌクレアーゼを妨害することができる。
【００７５】
同じように、５’結合体も５’−３’エクソヌクレアーゼによる開裂を妨げることができる。理論に拘束されるわけではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端と結合するのを立体的に
妨害することにより、エクソヌクレアーゼによる開裂を妨げると考えられる。さらに小さいアルキル鎖、アリール基、または複素環の結合体あるいは修飾された糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）は５’−３’エクソヌクレアーゼを妨害することができる。
【００７６】
ｉＲＮＡ薬は、二本鎖ｉＲＮＡ薬が少なくとも一端に一本鎖ヌクレオチド突出部を含む場合に、増強したヌクレアーゼ耐性を有することができる。好適な実施形態では、当該ヌクレオチド突出部は１〜４個の、好ましくは２〜３個の非対合（対をなさない）ヌクレオチドを含む。好適な実施形態では、一番端のヌクレオチド対のすぐ隣の一本鎖突出部の非対合ヌクレオチドはプリン塩基を有し、かつ前記一番端のヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であるか、あるいは端から４組の相補的ヌクレオチド対のうち少なくとも２つがＧ−Ｃ対である。さらなる実施形態では、ヌクレオチド突出部は１つまたは２つの非対合ヌクレオチドを有していてもよく、例示的な実施形態では、ヌクレオチド突出部は５’−ＧＣ−３’である。好適な実施形態では、ヌクレオチド突出部はアンチセンス鎖の３’末端にある。１つの実施形態では、ｉＲＮＡ薬はアンチセンス鎖の３’末端にモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を有することよって２ヌクレオチドの突出部５’−ＧＣ−３’が形成される。
【００７７】
このようにｉＲＮＡ薬は、たとえば、被検体の体内に見出されるエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによる分解を妨げることができるように修飾された単量体を含むことができる。当該単量体を、本明細書ではＮＲＭ、すなわちヌクレアーゼ耐性促進単量体またはヌクレアーゼ耐性促進修飾と呼ぶ。多くの場合、当該修飾はｉＲＮＡ薬の他の特性も調節することになり、たとえば該特性は、血清アルブミンなどの輸送タンパク質またはＲＩＳＣのメンバーなどのタンパク質と相互作用する能力、あるいは第１および第２の配列が相互に二本鎖を形成する能力、または標的分子などの別の配列と二本鎖を形成する能力などである。
【００７８】
上に述べた好適なヌクレアーゼ耐性の基準に適合するｉＲＮＡ薬を作製するために有用な可能性のある修飾には、次に示す糖、塩基および／またはリン酸骨格の化学的および／または立体化学的修飾のうち１つ以上を含めることができる。
【００７９】
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオエート。従って、好適なＮＲＭは、非架橋位置にヘテロ原子を含有する修飾リン酸基の特定のキラル型、たとえば、通常は酸素が占める位置であるＸ位置におけるＳｐまたはＲｐ、について豊富な、または純粋なヌクレオチド二量体を含む。Ｘ位置の原子はＳ、Ｓｅ、Ｎｒ2 またはＢｒ3 でもよい。ＸがＳであるとき、豊富な、またはキラル的に純粋なＳｐ結合が好ましい。豊富とは、好適な形態が少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％であることを意味する。当該ＮＲＭについては、以降にさらに詳しく述べる。
【００８０】
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸骨格部分もしくは修飾されたリン酸骨格部分のリン原子に１つ以上のカチオン基を取り付けること。従って、好適なＮＲＭとしては、カチオン基で誘導体化した末端位置の単量体が挙げられる。アンチセンス配列の５’末端は末端に‐ＯＨまたはリン酸基を有する必要があるため、当該ＮＲＭはアンチセンス配列の５’末端には使用しないことが好ましい。該カチオン基は、Ｈ結合形成およびハイブリダイゼーションへの妨害を最小限に抑える塩基上の位置に取り付けるべきであり、たとえば、他方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置、たとえばピリミジンの５’位またはプリンの７位が挙げられる。これらについて、以下にさらに詳しく述べる。
【００８１】
（ｉｉｉ）末端における非リン酸結合。この場合、好適なＮＲＭは非リン酸結合を含み、たとえば、リン酸結合よりも開裂に対し大きい耐性を与える４つの原子の結合を含む。例として、３’ＣＨ2 −ＮＣＨ3 −Ｏ−ＣＨ2 −５’および３’ＣＨ2 −ＮＨ−（Ｏ＝）
−ＣＨ2 −５’が挙げられる。
【００８２】
（ｉｖ）３’−架橋チオリン酸および５’−架橋チオリン酸。従って、好適なＮＲＭはこれらの構造を含むことができる。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、反転した結合、α−ヌクレオシド。従って、他の好適なＮＲＭは、Ｌ−ヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシドから誘導された二量体ヌクレオチド；２’−５’リン酸結合、非リン酸結合および修飾リン酸結合（たとえばチオリン酸、ホスホルアミデートおよびホウ素リン酸）；反転した結合を有する二量体、たとえば３’−３’または５’−５’結合；糖の１’位にアルファ結合を有する単量体、たとえば本明細書で記述するアルファ結合を有する構造体、を含む。
【００８３】
（ｖｉ）コンジュゲート基（結合基）。従って、好適なＮＲＭは、たとえば、本明細書に記載のターゲティング（標的決定）部分または結合リガンドであって、例えば糖、塩基または骨格などを介して単量体と結合させたものを含むことができる。
【００８４】
（ｖｉｉ）無塩基結合。従って、好適なＮＲＭは無塩基単量体を含むことができ、たとえば、本明細書に記述している無塩基単量体（たとえば核酸塩基を含まない単量体) ；本明細書に記述している芳香族単量体または複素環単量体または複素多環芳香族（polyheterocyclic aromatic ）単量体が挙げられる。
【００８５】
（ｖｉｉｉ）５’−ホスホン酸および５’−リン酸プロドラッグ。従って、好適なＮＲＭは好適には末端位置、たとえば５’位の単量体であって、リン酸基の１つ以上の原子が保護基で誘導体化されており、１つまたは複数の該保護基は、カルボキシエステラーゼまたは被検体の体内に存在する酵素など被検体の体内にある構成要素の作用の結果として除去される。たとえばリン酸プロドラッグであって、カルボキシエステラーゼがこの保護された分子を開裂させ、リン酸のＯに隣接する炭素を攻撃するチオエートアニオンを産生し、その結果、保護されていないリン酸が産生されるもの。
【００８６】
１つ以上の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ薬またはｉＲＮＡ薬の配列に導入することができる。ＮＲＭ修飾を配列またはｉＲＮＡ薬に２回以上使用することができる。一部のＮＲＭはハイブリダイゼーションを妨害するため、組み込む総数は、許容可能なレベルのｉＲＮＡ薬二本鎖形成が維持されるようにあるべきである。
【００８７】
一部の実施形態では、ＮＲＭ修飾は、被検体の所望の配列または遺伝子を標的としない配列（センス鎖またはセンス配列）の末端開裂部位または開裂領域に導入される。これにより、的外れのサイレンシングを減少させることができる。
【００８８】
ヌクレアーゼ耐性修飾は、末端だけに配置可能なものと、任意の位置に行なえるものがある。一般に、ハイブリダイゼーションを阻害しうる修飾は末端領域のみに使用し、被検体の配列または遺伝子を標的とする配列の開裂部位または開裂領域には使用しないことが好ましい。当該修飾は、ｉＲＮＡ薬の２つの配列間で十分なハイブリダイゼーションが維持されるという条件であれば、センス鎖の任意の位置に使用することができる。一部の実施形態では、的外れのサイレンシングを最小限に抑えることができるように、被検体の配列または遺伝子を標的としない配列の開裂部位または開裂領域にＮＲＭを置くことが望ましい。
【００８９】
ほとんどの場合、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、配列が被検体の配列を標的とする（アンチセンス配列と呼ばれることが多い）か、被検体の配列を標的としない（センス配列と呼ばれることが多い）かによって分布が異なることになる。配列が被検体の配列を標的とするものである場合は、エンドヌクレアーゼによる開裂を妨害または阻害する修飾
を、ＲＩＳＣ仲介性開裂の対象となる領域、たとえば該開裂部位または該開裂領域に挿入すべきではない（参照により本明細書に組み込まれるElbashir et ah, 2001 , Genes and
Dev. 15: 188 に記載のとおり）。標的の開裂は、２０または２１ｎｔのガイドＲＮＡの中ほどで、あるいは当該ガイド配列と相補的な最初のヌクレオチドの約１０または１１ヌクレオチド上流で生じる。本明細書で使用しているように、開裂部位とは、標的または標的とハイブリダイズするｉＲＮＡ薬鎖の、開裂部位の両側のヌクレオチドを指す。開裂領域とは、該開裂部位に加えて両方向に１、２または３ヌクレオチドを意味する。
【００９０】
以上の修飾は、末端領域に導入することができ、たとえば、被検体の配列を標的とする配列あるいは標的としない配列の末端位置または末端の２、３、４もしくは５位に導入することができる。
【００９１】
連結されたリガンド
薬理学的特性などのｉＲＮＡ薬の特性は、たとえば、連結されたリガンド（tethered ligands）などのリガンドを導入することにより影響を受けうるため、リガンドの導入等によって調整することができる。
【００９２】
リガンドなどの種々の実体物をｉＲＮＡ薬に連結することができ、たとえば、リガンド結合性単量体サブユニットの担体に連結することができる。リガンド結合性単量体サブユニットとの関連で以下に実施例を記述しているが、好適な例を示しているにすぎず、実体物はｉＲＮＡ薬の他の部位にも結合することができる。
【００９３】
好適な化学成分は、担体と直接的または介在連結部（intervening tether）を介して間接的に結合される、好適には共有結合されるリガンドである。好適な実施形態では、該リガンドは介在連結部を介して担体に取り付けられている。該リガンドまたは連結されたリガンドは、リガンド結合性単量体を伸長する鎖に組み込むときに、該リガンド結合性単量体上に存在していてもよい。一部の実施形態では、該リガンドは、リガンド結合性単量体サブユニット「前駆物質」を伸長する鎖に組み込んだ後に、当該前駆物質に組み込まれてもよい。たとえば、ＴＡＰ−（ＣＨ2)ｎＮＨ2 などのアミノ基終端連結部を有する単量体を、伸長しているセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込んでもよい。その後の操作では、すなわち単量体サブユニット前駆物質を組み込んだ後は、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基などの求電子基を有するリガンドを、該リガンドの求電子とリガンド結合性単量体サブユニット前駆物質連結部の末端求核基とを結合させることにより、該リガンド結合性単量体前駆物質に取り付けることができる。
【００９４】
好適な実施形態では、リガンドは、該リガンドが組み込まれるｉＲＮＡ薬の分布、ターゲティングまたは寿命を変化させる。好適な実施形態では、リガンドは、選択された標的（例えば分子、細胞もしくは細胞種）、コンパートメント（例えば細胞もしくは臓器のコンパートメント）、組織、臓器、または身体の領域に対し、当該リガンドのないものに比べ、増強された親和性を提供する。
【００９５】
好適なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性を改善することができ、結果として生じた天然型または修飾型オリゴリボヌクレオチドや、本明細書に記述している単量体および／または天然型もしくは修飾型リボヌクレオチドの任意の組み合わせからなる重合体分子の、ヌクレアーゼ耐性も改善しうる。
【００９６】
一般にリガンドには、例えば取込みを促進するための治療的修飾因子、例えば分布をモニターするための診断的化合物または受容体基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与する化学部分、および天然型もしくは例外的な核酸塩基を含めることができる。一般的な例として、脂質親和体、脂質、ステロイド類（たとえばウバオール、ヘシゲニン（hecigenin ）
、ジオスゲニン）、テルペン類（たとえば、サルササポゲニン、フリーデリンおよびエピフリーデラノール誘導体化リトコール酸などのトリテルペン）、ビタミン類（たとえば葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンを標的とする分子、ポリカチオン体、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物が挙げられる。
【００９７】
リガンドには、天然に生じる物質（たとえば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（たとえば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、アミノ酸、または脂質が含まれうる。該リガンドは、組換え分子でも合成ポリマーなどの合成分子でもよく、たとえば合成ポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミノ酸の例として、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコライド）共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド擬似ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性の化学部分、たとえば陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファ螺旋ペプチドが挙げられる。
【００９８】
リガンドには標的決定基も含めることができ、標的決定基は例えば細胞または組織を標的とする因子、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質もしくはタンパク質などで、例えば肝細胞または空腸の細胞などの特定のタイプの細胞と結合する抗体が挙げられる。標的決定基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、糖化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣物であることができる。
【００９９】
リガンドは、糖タンパク質などのタンパク質、コリガンドに対し特異的な親和性を有する分子などのペプチド、あるいはがん細胞、内皮細胞または骨細胞などの特定のタイプの細胞と結合する抗体などの抗体であることができる。リガンドには、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれうる。リガンドには、非ペプチド性の分子種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン類、コファクター、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースなども含めることができる。リガンドは、たとえば、リポポリサッカライド、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であってもよい。
【０１００】
リガンドは、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントを崩壊させることにより細胞の細胞骨格を崩壊させることなどによって、ｉＲＮＡ薬の細胞への取込みを増大させることができる薬剤などの物質であることができる。該薬剤は、たとえば、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン、またはミオサービン（myoservin ）であることができる。
【０１０１】
１つの態様では、リガンドは脂質または脂質系分子である。当該脂質または脂質系分子
は、好適にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質を結合する。ＨＳＡを結合したリガンドは、肝臓の実質細胞を含めた肝臓組織などの標的組織に当該結合体を分布させることができる。ＨＳＡを結合することができる他の分子も、リガンドとして使用することができる。たとえば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質系のリガンドは、（ａ）結合体の分解耐性を増強させることができ、（ｂ）標的の細胞もしくは細胞膜を標的とする能力、または同細胞もしくは細胞膜への輸送を向上させることができ、かつ／または（ｃ）ＨＳＡなどの血清タンパク質との結合を調整するために使用することができる。
【０１０２】
脂質系リガンドは、結合体の標的組織への結合をコントロールするなど、調節のために使用することができる。たとえば、ＨＳＡとより強力に結合する脂質または脂質系のリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低くなるため、体内から消失する可能性が低くなる。ＨＳＡとの結合が弱い脂質または脂質系のリガンドは、結合体の標的を腎臓にするために使用することができる。
【０１０３】
好適な実施形態では、脂質系のリガンドはＨＳＡと結合する。好適には、該リガンドは、結合体が非腎臓組織に好適に分布するように十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし、親和性はＨＳＡとリガンドとの結合が不可逆的なほど強くはないことが好ましい。
【０１０４】
別の態様では、リガンドは、増殖細胞などの標的細胞により取り込まれるビタミンなどの化学部分である。当該リガンドは、がん細胞など悪性または非悪性型の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有用である。模範的なビタミンにはビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。このほかの模範的なビタミンとしては、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのビタミンＢ群、がん細胞により取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
【０１０５】
別の態様では、リガンドは細胞透過因子であり、好適には螺旋状の細胞透過因子である。好適には、該因子は両親媒性である。模範的な因子はｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａなどのペプチドである。該因子がペプチドである場合は、ペプチジル模倣体、インバートマー（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用などにより修飾することができる。螺旋状の因子は好適にはアルファ螺旋因子であり、親油性相と疎油性相を有することが好ましい。
【０１０６】
５’−リン酸修飾
好適な実施形態では、ｉＲＮＡ薬は５’リン酸化されているか、または５’末端にホスホリル類似体を有する。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ仲介遺伝子サイレンシングと両立する修飾が含まれる。適切な修飾として、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５‘）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾のヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート、（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート、（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）、酸素／イオウの任意のさらなる組み合わせで置換された一リン酸、二リン酸および三リン酸（５’−アルファ−チオ三リン酸、５’−ガンマ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）
（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、たとえばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、たとえばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が挙げられる。
【０１０７】
センス鎖を不活化して活性なＲＩＳＣの形成を防ぐためにセンス鎖を修飾することにより、的外れの作用を減少させることができる。これは、センス鎖の５’−リン酸化反応を防ぐ修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いた修飾により、達成することができる（Nykaenen et al, (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321を参照）。リン酸化反応を防ぐ他の修飾も使用することができ、例えば、５’−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨで単純に置換する修飾がある。あるいは、大きく嵩高い基を５’−リン酸に付加してホスホジエステル結合に変えてもよい。
【０１０８】
ｉＲＮＡ薬の組織および細胞への送達
製剤
本明細書に記述しているｉＲＮＡ薬は、被検体に投与するため、好適には、吸入または鼻腔内投与を介した肺および鼻腔への局所投与のため、あるいは注射などによる非経口投与のために製剤することができる。
【０１０９】
説明を簡略化するため、この項では主に、修飾していないｉＲＮＡ薬に関して、その製剤、組成物および方法を述べる。しかし、これらの製剤、組成物および方法は、修飾ｉＲＮＡ薬など、他のｉＲＮＡ薬についても実行することができ、そのような実行は本発明の範囲内にある。
【０１１０】
製剤化されたｉＲＮＡ組成物については、さまざまな状態を想定できる。一部の実施例では、該組成物は少なくとも部分的に結晶質、均一な結晶質、および／または無水物（たとえば水分が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。別の実施例では、ｉＲＮＡは水を含む溶液中などの水相中にあり、この剤形は吸入を介した投与に好適な剤形である。
【０１１１】
水相または結晶質の組成物は、リポソームなどの送達ビヒクル（特に水相用）または粒子（結晶質組成物に適切である可能性のある微粒子など) に組み込むことができる。一般に、ｉＲＮＡ組成物は、意図された投与方法と適合する様態で製剤する。
【０１１２】
ｉＲＮＡ製剤は、別の治療薬や、ｉＲＮＡと複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質などのｉＲＮＡを安定化させる物質など、別の作用物質と組み合わせて製剤することができる。このほかの作用物質には、ＥＤＴＡなどのキレート化剤（たとえばＭｇ2+などの二価カチオンを除去するため）、塩類、ＲＮＡｓｅ阻害薬（ＲＮＡｓｉｎなどの広特異性ＲＮＡｓｅ阻害薬など）などがある。
【０１１３】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡ製剤は、第２の遺伝子に関してＲＮＡi を仲介できる第２のｉＲＮＡ薬など、別のｉＲＮＡ薬を含有する。さらに別の製剤は、少なくとも３、５、１０、２０、５０または１００種以上の異なるｉＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、当該ｉＲＮＡ薬は同一のウイルスではあるが異なる標的配列を対象とするものである。別の実施形態では、各ｉＲＮＡ薬は異なるウイルスを対象とする。実施例に示すように、２以上のウイルスについて、該ウイルスのうち１つをそれぞれ対象とする２つのｉＲＮＡ薬を同時に、または接近した時間間隔で共投与することにより阻害することができる。
【０１１４】
治療方法および送達経路
本発明のｉＲＮＡ薬、たとえばＲＳＶまたはＰＩＶを標的とするｉＲＮＡ薬を含む組成物は、さまざまな経路で被検体に送達することができる。例示的経路には、吸入、髄腔内、実質内、静脈内、鼻腔内、経口および点眼による送達が挙げられる。本発明のｉＲＮＡ薬を投与する好適な手段は、肺および鼻腔への直接的投与、または非経口投与による全身的投与である。
【０１１５】
ｉＲＮＡ薬は、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。たとえば組成物には、１つ以上のｉＲＮＡ薬および製薬学的に許容可能な担体が含まれうる。本明細書で使用しているように、「製薬学的に許容可能な担体」という用語は、医薬の投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれることを意図している。医薬として活性な物質に対するこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である。いかなる慣用の媒体および作用物質も活性化合物と不適合でない限り、該組成物に使用されることが意図される。補助的な活性化合物も該組成物に組み込むことができる。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、局所治療が望ましいか、全身治療が望ましいかに応じて、かつ治療する領域に応じて、複数の方法で投与してもよい。投与は、局所（点眼、鼻腔内、経皮、肺内）、経口または非経口であってもよい。非経口投与には、点滴静注、皮下、腹腔内または筋肉内注射、または髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。
【０１１７】
一般に、本発明のｉＲＮＡ薬の送達は、被検体の感染部位への送達を達成するために行なわれる。これを達成する好適な手段は、吸入もしくは鼻腔内投与を介した呼吸器組織への投与など、肺もしくは鼻腔内への局所投与か、または、非経口投与などの全身投与のいずれかによるものである。
【０１１８】
吸入または非経口投与のための製剤は、当技術分野で周知である。このような製剤には滅菌水溶液が含まれてよく、滅菌水溶液は緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含有してよい。静脈内使用のためには、該製剤を等張にするために溶質の総濃度を調整する必要がある。
【０１１９】
本明細書で開示している活性化合物は、好適には、任意の適切な手段により被検体の肺または鼻腔に投与される。活性化合物は、１または複数の活性化合物からなる呼吸吸入可能な粒子のエアロゾル懸濁液の投与により投与してよく、被検体がこれを吸入する。該活性化合物は、さまざまな剤形でエアロゾル化でき、たとえば、乾燥粉末吸入剤、定量吸入剤、または液体／液体懸濁液があるが、これらに限定されない。呼吸吸入可能な粒子は、液体でも固体でもよい。該粒子は、米国特許第４，５０１，７２９号明細書に記載されているように、気道粘液分泌物からの水分の再吸収を阻害するのに有効な量の選択化合物とともに、アミロリド、ベンザミルまたはフェナミルなどの他の治療成分を任意に含有してよい。
【０１２０】
粒子状の医薬組成物を、任意選択で、分散または輸送に役立つように担体と結合させてもよい。糖（すなわち、乳糖、ショ糖、トレハロース、マンニトール）などの適切な担体を、適切な割合（たとえば重量比で１：１）で１または複数の活性化合物と混合すればよい。
【０１２１】
本発明を実行するための活性化合物からなる粒子は、呼吸吸入可能なサイズの粒子、すなわち、吸入時に口または鼻および喉頭を通り、気管支および肺胞に入るほど十分に小さいサイズの粒子を含む必要がある。一般に、約１〜１０ミクロン（特に約５ミクロン未満
）のサイズの粒子が呼吸吸入可能である。呼吸吸入不可能なサイズの粒子がエアロゾルに含まれていると、咽喉に沈着して飲み込まれる傾向があるため、エアロゾルに含まれる呼吸吸入不可能な粒子の量を最小限に抑えることが好ましい。鼻腔内投与の場合には、鼻腔での保持を確実なものとするために、１０〜５００μＭの範囲の粒子サイズが好ましい。
【０１２２】
エアロゾルを産生するための活性化合物の液体医薬組成物は、発熱物質を含まない滅菌水などの適切なビヒクルと活性化合物を混合することにより調製可能である。本発明を実施するために使用する高張生理食塩水は、生理学的に許容可能な塩を１〜１５パーセント（重量比）含有する、発熱物質を含まない滅菌水溶液であることが好ましく、生理学的に許容可能な塩を重量比で３〜７パーセント含有することがさらに好ましい。
【０１２３】
活性化合物を含有する液体粒子のエアロゾルは、圧力駆動式ジェットネブライザまたは超音波ネブライザなどの任意の適切な手段で産生してよい。たとえば、米国特許第４，５０１，７２９号明細書を参照されたい。ネブライザは、典型的には空気または酸素の圧縮ガスを狭いベンチュリ管開口部を通して加速する手段、または超音波撹拌の手段のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療用エアロゾルミストへと変換する器具である。
【０１２４】
ネブライザに使用するための適切な製剤は、液体担体中の活性成分で構成され、該活性成分は製剤の最大４０％（ｗ／ｗ）を構成するが、好適には２０％（ｗ／ｗ）未満である。担体は、典型的には水（および最も好適には発熱物質を含まない滅菌水）または希釈した水性アルコール溶液であり、等張にしたものが好ましいが、たとえば塩化ナトリウムを加えることにより、体液より高張であってもよい。任意の添加剤には、製剤が滅菌されていない場合にメチルヒドロキシ安息香酸などの保存料、抗酸化剤、着香料、精油類、緩衝剤および界面活性剤が含まれる。
【０１２５】
活性化合物を含有する固体粒子のエアロゾルは、同様に、任意の治療用固体粒子エアロゾル発生器で産生すればよい。固体粒子治療薬を被検体に投与するためのエアロゾル発生器は、呼吸吸入可能な粒子を産生し、所定の一定量の治療薬を含有する容積のエアロゾルをヒトへの投与に適した速度で発生させる。固体粒子用エアロゾル発生器の種類の１例は、インサフレータである。吸入による投与に適した製剤には、インサフレータの手段により送達できる、または鼻から吸い込む様式で鼻腔内に取り入れ可能な微細粉砕粉末が含まれる。インサフレータ内では、該粉末（たとえば、本明細書に記述している治療を実施するのに有効な定量粉末）は、一般にゼラチンまたはプラスチックで作られたカプセルまたはカートリッジに充填されており、該カプセルまたはカートリッジがその場で穿孔または開封されて、粉末が、吸入時に器具を通して空気が吸込まれることにより、または手動操作ポンプの手段により送達される。インサフレータに使用される粉末は、活性成分のみで構成されるか、または活性成分と、乳糖などの適切な粉末希釈剤と、任意選択の界面活性剤とを含む粉末混合物から構成される。活性成分は、典型的には製剤の０．１〜１００（ｗ／ｗ）を構成する。
【０１２６】
エアロゾル発生器の種類の第２の例は、定量吸入器である。定量吸入器は、加圧型のエアロゾルディスペンサであり、典型的には液化高圧ガス中に活性成分の懸濁製剤または溶液製剤を含有する。使用時に当該器具は、活性成分を含有する微粒子スプレーを産生するために一定の容積、典型的には１０〜２００μｌを送達するようになされたバルブを通して製剤を放出する。適切な高圧ガスとして、特定のクロロフルオロカーボン化合物、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびこれらの混合物が挙げられる。該製剤はさらに、１つ以上の共溶媒、たとえばエタノール、オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタンなどの界面活性剤、抗酸化剤および適切な着香料も含有してよい。
【０１２７】
投与は、被検体が行ってもよいし、または介護者などの別の人が行ってもよい。介護者とは、その人へのケアを提供することに関わる任意の存在であってよく、たとえば、病院、ホスピス、医院、外来患者向け診療所；医師、看護師または他の開業医などの医療従事者；あるいは配偶者または親などの保護者が挙げられる。投薬は、用量を計量して、または定量を送達するディスペンサで提供することができる。
【０１２８】
「治療的有効量」という用語は、治療される被検体に望ましいレベルの薬物が提供されて期待される生理学的反応を得るのに必要な組成物に存在する量をいう。１つの実施形態では、ＲＳＶおよびＰＩＶなどの異なる呼吸器系ウイルスをそれぞれ対象とする２以上のｉＲＮＡ薬の治療的有効量が、被検体に同時に投与される。
【０１２９】
「生理学的有効量」という用語は、被検体に送達されて、望ましい緩和効果または治療効果を与える量をいう。
「製薬学的に許容可能な担体」という用語は、該担体が肺に対して顕著な有害毒性作用を及ぼさずに肺に取り込まれうることを意味する。
【０１３０】
担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤；炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの増量剤；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩などがある。これらの担体は、結晶質または非晶質の形状であってよく、または両者の混合物であってもよい。
【０１３１】
特に価値のある増量剤には、適合可能な炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはこれらの組み合わせが挙げられる。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；乳糖、トレハロースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン類；ラフィノース、麦芽デキストリン、デキストランなどの多糖類；マンニトール、キシリトールなどのアルジトール類が挙げられる。好適な炭水化物群には、乳糖、トレハロース、ラフィノース、麦芽デキストリンおよびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドにはアスパルテームが挙げられる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０１３２】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなど有機酸および有機塩基から調製した有機塩が挙げられ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０１３３】
用量。ｉＲＮＡ薬は、体重１ｋｇあたり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇあたり約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１もしくは０．０００５ｍｇ未満、および体重１ｋｇあたりＲＮＡ薬２００ｎｍｏｌｅ（たとえば約４．４×１０16コピー）未満、または体重１ｋｇあたりＲＮＡ薬１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌｅ未満の単位用量で投与することができる。単位用量は、たとえば、注射（静脈内もしくは筋肉内、髄腔内、または臓器への直接注射）、吸入、または局所適用により投与することができる。
【０１３４】
ｉＲＮＡ薬の臓器への直接的な送達（たとえば肝臓への直接的送達）は、１回の投与量として１臓器あたり約０．００００１〜約３ｍｇのオーダーとすることができ、好適には、１臓器あたり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、１臓器あたり約０．０３〜３．０ｍｇ、片眼あたり約０．１〜３．０ｍｇまたは１臓器あたり約０．３〜３．０ｍｇとすることができる。
【０１３５】
用量は、疾患または障害を治療もしくは予防するのに有効な量であることができる。
１つの実施形態では、単位用量を１日１回より少ない頻度、たとえば２、４、８または３０日に１回より少ない頻度で投与する。別の実施形態では、単位用量を頻度で投与しない（たとえば一定の頻度では投与しない）。たとえば、単位用量を単回で投与してもよい。
【０１３６】
１つの実施形態では、他の伝統的な治療様式で有効量を投与する。
１つの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ薬またはｓｉＲＮＡ薬などのｉＲＮＡ薬（たとえばプロセシングされてｓｉＲＮＡ薬になりうる大きなｉＲＮＡ薬などの前駆物質、二本鎖ｉＲＮＡ薬またはｓｉＲＮＡ薬などのｉＲＮＡ薬をコードするＤＮＡ、あるいはそれらの前駆物質）の初回用量と、１回以上の維持用量とを被検体に投与する。１回または複数回の維持用量は、一般に初回用量より少なく、たとえば初回用量の半分未満である。維持処方には、１日に体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜７５ｍｇの範囲、たとえば、１日に体重１ｋｇあたり７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇの１回または複数回用量を用いて被検体を治療することを含みうる。維持用量は、５、１０または３０日に１回を超えない頻度で投与することが好ましい。さらに、治療処方は一定の期間にわたって続けてよいが、この期間の長さは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全身状態に応じて変わることになる。好適な実施形態では、１日１回以下の頻度で用量を送達することができ、たとえば、２４、３６、４８時間またはそれ以上の時間に１回以下、たとえば、５日または８日に１回以下で送達してよい。治療後、患者の状態の変化および疾患状態の症状の緩和について、患者をモニターすることができる。該化合物の用量は、患者が現在の用量レベルに著明な反応を示さない場合は増量してよく、疾患状態の症状の緩和が観察される場合、疾患状態が取り除かれた場合、または望ましくない副作用が観察される場合は、用量を減量してもよい。
【０１３７】
特定の状況下で望ましい場合、または適切とみなされる場合は、単回または２回以上で有効量を投与することができる。反復注入または頻回注入を容易にすることが望ましい場合は、ポンプ、半永久的ステント（たとえば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節包内ステント）、またはリザーバーなどの送達デバイスの埋め込みが賢明と考えられる。
【０１３８】
１つの実施形態では、ｉＲＮＡ薬の医薬組成物は複数種のｉＲＮＡ薬を含有する。これらのｉＲＮＡ薬は、例えばＲＳＶ遺伝子の標的配列などの天然に存在する標的配列とは重複も隣接もしない配列を有することができる。別の実施形態では、複数種のｉＲＮＡ薬は天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。たとえば、ＲＳＶのＰタンパク質遺伝子を標的とするｉＲＮＡ薬が、Ｎタンパク質遺伝子などの異なる遺伝子を標的とするｉＲＮＡ薬と同一の医薬組成物中に存在することができる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ薬はＲＳＶおよびＰＩＶなどの異なるウイルスに特異的である。
治療が奏効した後は、患者に維持療法を行なって疾患状態の再発を予防することが望ましいと考えられ、その場合、本発明の化合物を体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与する（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照）。
【０１３９】
ｉＲＮＡ薬組成物の濃度は、障害の治療または予防に有効である十分な量か、あるいはヒトの生理学的状態を調節するのに十分な量である。投与されるｉＲＮＡ薬の濃度または量は、当該薬について測定したパラメータのほか、鼻腔内、口腔内または肺内投与などの投与方法によって決まることになる。たとえば、鼻腔用製剤は、鼻腔内の刺激または熱傷を避けるため、一部の成分の濃度をかなり低くする必要がある傾向がある。適切な鼻腔用製剤を提供するために、経口用製剤を最大１０〜１００倍に希釈することが望ましい場合もある。
【０１４０】
特定の要因が被検体を効果的に治療するために必要な用量に影響を及ぼすことが考えられ、こうした要因には疾患または障害の重症度、以前の治療、被検体の全身の健康状態および／または年齢、ならびに他の疾患の存在が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、二本鎖ｉＲＮＡ薬またはｓｉＲＮＡ薬などのｉＲＮＡ薬（たとえばプロセシングされてｓｉＲＮＡ薬になりうる大きなｉＲＮＡ薬などの前駆物質、二本鎖ｉＲＮＡ薬またはｓｉＲＮＡ薬などのｉＲＮＡ薬をコードするＤＮＡ、あるいはそれらの前駆物質）の治療的有効量を用いた被検体の治療は、単回治療を含んでもよいし、または好適には一連の治療を含んでもよい。当然ながら、治療のために使用するｓｉＲＮＡ薬などのｉＲＮＡ薬の有効量は、特定の治療の期間中に増減可能である。用量の変更は、本明細書に記述したような診断的測定法の結果を基に行い、これらの結果から明らかになると考えられる。たとえば、ｉＲＮＡ薬組成物を投与した後に、被検体をモニターすることができる。このモニタリングの情報に基づいて、ｉＲＮＡ薬組成物の追加量を投与することができる。
【０１４１】
投薬は治療される疾患状態の重症度および反応性に依存し、治療期間は数日間から数カ月間、あるいは治癒が達成されるまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積量を測定することから算出できる。通常の技術を有する人であれば、最適な用量、投与方法および反復速度を容易に判断することができる。最適な用量は、個々の化合物の相対的効力によって異なると考えられ、一般には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一部の実施形態では、該動物モデルには、標的のＲＳＶ  ＲＮＡを産生する遺伝子など、ヒト遺伝子を発現する遺伝子導入動物が含まれる。該遺伝子導入動物は、対応する内在ＲＮＡが欠損していてもよい。別の実施形態では、検査する組成物は、動物モデルの標的ＲＳＶ  ＲＮＡとヒトにおける標的ＲＳＶ  ＲＮＡとの間で保存されている配列に、少なくとも内部領域において相補的であるｉＲＮＡ薬を含んでいる。
【０１４２】
以下に示す実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明をさらに制限するものとして解釈すべきではない。
（実施例）
ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３リンタンパク質ｍＲＮＡに対する抗ウイルスｓｉＲＮＡの設計
ＲＳＶ  Ｐに対するｓｉＲＮＡおよびＨＰＩＶ３  Ｐ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを化学的に合成し（Bitko, V. and Bank, placeS. BMC Microbiol. 1, 34 (2001)）、その
ｅｘ  ｖｉｖｏでのＩＣ５０（標的の５０％減少を引き起こすｓｉＲＮＡの濃度）を測定した（図１ａ）。該ｓｉＲＮＡ配列およびＩＣ５０値を列記する（表１）。ＲＳＶ−Ｐに対する２つのｓｉＲＮＡ（＃１、＃２）およびＨＰＩＶ３に対する１つのｓｉＲＮＡ（＃４）は明らかな抑制活性を示したため、さらなる試験のために選択した。標的ｍＲＮＡとタンパク質との相関は、ｓｉＲＮＡ＃１で実証しているように（図１ａ）、ＲＮＡi 機構と一致しており、以下に示すように、ｓｉＲＮＡのｅｘ  ｖｉｖｏノックダウン活性も動物における（ｉｎ  ｖｉｖｏ）活性と一致していた。したがって、このｅｘ  ｖｉｖｏアッセイは、抗ウイルスｓｉＲＮＡ薬のための、信頼性が高く安価で迅速かつ簡便な初期スクリーニング法を提供する。
【０１４３】
鼻腔内（ＩＮ）ｓｉＲＮＡは、マウス肺においてＲＳＶおよびＨＰＩＶ３の複製を抑制する
ｅｘ  ｖｉｖｏで活性なｓｉＲＮＡが実際の感染期間に有効であるかどうか判断するために、動物モデルを使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＲＳＶ感染の進行、病理学および免疫学を研究するための十分に確立された実験モデルである（Graham, B.S., et al., J.
Med. Virol. 26, 153-162 (1988), van Schaik, S.M., et al, J. Infect. Dis. 177, 269- 276 (1998), Haeberle, H. A. et al. J. Virol. 75, 878-890 (2001) ）。Ｔｒａｎ
ｓＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）試薬と複合体を形成させたｓｉＲＮＡを用いてマウスの鼻腔内を処理し、４時間後に各動物に１０7 ｐｆｕのＲＳＶまたはＨＰＩＶ３を鼻腔内に接種した。マウス肺におけるＲＳＶの最大増殖が感染後約５〜６日で観察でき、この時間点をさらなる試験に用いた。ｅｘ  ｖｉｖｏで有効であったｓｉＲＮＡ（図１ａ）は、動物において高い抗ウイルス活性を示した（図１ｂ、ｃ）。マウス１匹あたりＩＮ  ｓｉＲＮＡ
５ナノモル用量（二本鎖ｓｉＲＮＡでは平均約７０μｇ）で、ｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃４はそれぞれ肺のＲＳＶおよびＨＰＩＶ３のウイルス価を個々の感染において約５，０００倍および１００倍減少させた（図１ｂ、ｃ）。重要なことは、トランスフェクション試薬を含有しないｓｉＲＮＡも有意に肺のウイルス価を抑制したことである（図１ｄ）。これは、ｉＲＮＡ薬を含有する単純な医薬組成物を用いて、吸入ベースの抗ウイルス療法が可能であることを実証している。ＨＰＩＶ３は、ＲＳＶほど容易にはマウスに感染しないことに注目すべきであり（Durbin, A.P., Elkins, W.R. and Murphy, B.R. Vaccine 18, 2462-2469 (2000)）、これはマウス肺におけるＨＰＩＶ３の複製が比較的低いためである（図１ｃ）。ショ糖精製高力価ＨＰＩＶ３を接種材料として用いたところ、マウス肺において測定可能な感染を達成することができた。
【０１４４】
該実施例のこのほかのいくつかの特徴は、本発明のさまざまな実施形態に適用できる。第１に、上記の結果はｓｉＲＮＡのウイルス特異的作用を実証している（図１）。最も効力の高い抗ＲＳＶ  ｓｉＲＮＡ（＃１）でさえ、ＨＰＩＶ３ではなくＲＳＶだけを抑制し、またこの逆も同様であったことから、ＩＮ  ｓｉＲＮＡの非特異的抗ウイルス作用に反論するものである。第２は、抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（Elbashir, S.M. et al. Nature 411, 494-498 (2001)）は、試験した最高用量（５０ナノモルまたは７００μｇ／マウス）でさえ、いずれのウイルスをも抑制しなかったことである（図１ｂ〜ｄ）。最後に、ＩＮ  ｓｉＲＮＡはＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ試薬を用いた場合も用いなかった場合も、未感染マウスに明らかな不快症状を引き起こさなかった（正常な被毛、活動、食欲および体重増加ならびに呼吸困難の欠如により判断）ことから、可能性のある医薬品の開発にとって有利な薬理学的特性が示唆される点である。
【０１４５】
本明細書に記述しているすべての実験において、ウイルスタンパク質免疫ブロット法の結果は常にウイルス価と一致していたことから、所定の実験では、各結果が他の結果の重複するマーカーとしての機能を果たすことができるため、補足的データをすべて提示しているわけでないことに注意すべきである。
【０１４６】
ＩＮ  ｓｉＲＮＡの特異的抗ウイルス作用は肺感染を予防する
上に提示した結果はウイルス複製の抑制を実証したが、肺組織の感染の破棄を直接証明するものではなかった。したがって、適切なウイルスに特異的な抗体を使用して、感染後５日時点で両肺のさまざまな切片を精査した。マウス１匹あたり１０7 ｐｆｕを吹き込んだ結果、いずれのウイルスも頑強な肺感染を引き起こした。代表的な結果（図２ａ）をみると、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯとの複合体を形成させた抗ＲＳＶ  ｓｉＲＮＡ＃１を５ナノモル（７０μｇ）用いて前処理したマウスでは、感染は明らかに消滅していた。抗ＨＰＩＶ３  ｓｉＲＮＡ＃４を５ナノモル用いた場合も、ＨＰＩＶ３感染が同様に退行していた。ウイルス価と同様に、トランスフェクション試薬を用いなかったｓｉＲＮＡも、ＲＳＶについ提示したように、感染の有意な退行を示した。ｓｉＲＮＡが同量である場合、試薬を含まないｓｉＲＮＡは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯと複合体を形成させたｓｉＲＮＡのおよそ７０〜８０％の効果を示したと我々は推定している。本論文の残りの部分には、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯと複合体を形成させたｓｉＲＮＡについてのデータのみを提示したが、これらの結果は、他の化学物質を含まない純粋な裸のｓｉＲＮＡのＩＮ送達が、呼吸器系病原体に対して実質的な予防を提供する可能性があることを指摘している。これは、トランスフェクション試薬自体が副作用を有するかもしれないので、特に重要である。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、インフルエンザウイルスに対するｓｉＲＮＡおよびＤＮ
Ａの静脈内（ＩＶ）ならびに気管内（ＩＴ）送達の担体として有効に使用されていることを、ここで述べておきたい（Ge, Q., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8676-8681 (2004)）。しかし、我々の経験では、ＰＥＩの直接ＩＮ投与は、ｓｉＲＮＡを使用した場合も使用しない場合も、マウスに明らかな疾病および／または死亡を引き起こすことが多かった。
【０１４７】
ＩＮ  ｓｉＲＮＡは肺に局在し、インターフェロンを活性化しない
肺に観察されたウイルス抑制が鼻腔内に適用したｓｉＲＮＡの直接的かつ特異的作用であったという証拠をさらに提供するため、２種類の実験を行なった。第１に、特異的なノーザン分析により肺組織中にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を検出することができた（図２ｂ）。第２に、ｓｉＲＮＡの抗ウイルス作用がインターフェロン（ＩＦＮ）の活性化によるものである可能性が、以下のことにより除外された。パラミクソウイルスは一般に、ＩＦＮの影響を弱める種々の機構をコードし、特にＲＳＶはＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−α／β）に大部分が耐性であるが、ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）には感受性である（Schlender, J., et al., J. Virol. 74, 8234- 8242 (2000), Ramaswamy, M., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 893-900 (2004)）。本発明者らの初期の研究では、Ｉ型ＩＦＮ遺伝子が欠失しているＶｅｒｏ細胞においてｓｉＲＮＡがＲＳＶおよびＨＰＩＶ３に対し活性であることが示された（データ省略）。それでもなお、種々のｓｉＲＮＡによる治療から経過日数がさまざまに異なる時点でネズミ肺組織のＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを測定したところ、いずれのタイプのＩＦＮにも活性化は見出されなかった（図２ｃ）。
【０１４８】
混合感染ではｓｉＲＮＡはＲＳＶおよびＨＰＩＶ３を競合的に防御する
複数の病因による気道の同時感染は常に起こりうることであり、一部の研究ではＲＳＶとＨＰＩＶ３による関節感染が診断されている（Coiras, M.T., et al, J. Med. Virol. 72, 484-495 (2004)）。実際に、ＲＳＶ抗原のほかＨＰＩＶ３抗原をも組み込んだキメラウイルスや組換え型ワクチンが、両ウイルスからの同時防御を提供するという期待を込めて構築されている（Schmidt, A.C., et al., J. Virol. 75, 4594-4603 (2001), Bernhard, W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25, 725-731 (2001)）。ｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃４がそれぞれＲＳＶおよびＨＰＩＶ３に対し特異的抗ウイルス作用を示したことから、我々は、両ウイルスによるマウスの混合感染において両ｓｉＲＮＡをいっしょに（それぞれ５ナノモルまたは７０μｇ）試験することとした。対照マウスは一種類のｓｉＲＮＡ（＃１または＃４のいずれか）で治療した。両ウイルスの混合物において各ウイルスのｐｆｕを判断する簡単な方法がないため、上述の免疫蛍光顕微鏡検査法を用い、抗ＲＳＶ抗体および抗ＨＰＩＶ３抗体の混合物を使用して肺組織切片に二重染色法を行なった。実際にこの判定基準によって、肺組織の混合感染が達成された（図２ｄ）。ｓｉＲＮＡ＃１またはｓｉＲＮＡ＃４で前処理したマウスでは、緑または赤のいずれかの蛍光が喪失し、両方の喪失はないことからわかるように、それぞれＲＳＶおよびＨＰＩＶ３感染が予防された（図２ｄ）。２つのｓｉＲＮＡ（それぞれ５ナノモルすなわち７０μｇ）の組み合わせを用いた場合は、両タイプの蛍光が消失し、両ウイルスの抑制が立証された（図２ｄ）。以前と同じく、トランスフェクション試薬を含まない同一のｓｉＲＮＡ混合物も高い活性を示した（データ省略）。
【０１４９】
興味深いことに、１方のｓｉＲＮＡを過度に大量に使用すると、二重感染測定法において他方のｓｉＲＮＡの活性が阻害された（図３）。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる測定では、ｓｉＲＮＡ＃１（抗ＲＳＶ  Ｐ）の濃度が０、２０、２００ｎＭと上昇すると、ｓｉＲＮＡ＃４（抗ＨＰＩＶ３  Ｐ）のｅｘ  ｖｉｖｏでのＩＣ５０は１５、３５、１００ｎＭに増大した（図３ａ）。これらの結果は、免疫ブロット法によるＨＰＩＶ３  Ｐタンパク質の測定によって検証された（図３ｂ）。マウスの二重感染では、各ウイルスのＮタンパク質の免疫ブロット法による定量からも本質的に同じ結論が得られ、各ｓｉＲ
ＮＡが５ナノモル（７０μｇ）ではいずれのウイルスも効果的に抑制されたが、一方のｓｉＲＮＡが５０ナノモルの場合は他方の５ナノモルの作用が低下した（図３ｃ）。
【０１５０】
ＩＮ  ｓｉＲＮＡは肺の病理を予防する
ｓｉＲＮＡが感染を予防したことから、当然の疑問は、ｓｉＲＮＡが病理学的特徴の発現も予防したかどうかであった。目視検査では、ｓｉＲＮＡで治療したＲＳＶ曝露マウスは、正常な活動、艶のある被毛および全身的健康を示す非感染マウスと本質的に同様の行動および外見を示していた。そこで我々は、呼吸数、ロイコトリエンの誘導、および肺の炎症を測定した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの呼吸数は、ＲＳＶ感染に応答して増加することが知られている（Haeberle, H. A. et al. J. Virol. 75, 878-890 (2001), Volovitz, B.,
et al., Pediatr. Res. 24, 504-507 (1988) ）。リポキシゲナーゼ経路の産物であるロイコトリエンは、気管支平滑筋に存在するロイコトリエン受容体と結合し、喘息患者、ＲＳＶ感染を有する乳児、およびＲＳＶに感染したマウスの気道分泌物中に増加している（Volovitz, B., et al., Pediatr. Res. 24, 504-507 (1988), Welliver, R.C., 2nd, et al., J Infect. Dis. 187, 1773-1779 (2003) ）。これらの化合物は、気道の粘液分泌、気管支収縮および炎症細胞による気道浸潤を引き起こすが、これらの状態は重度のＲＳＶ疾患の重要な特徴である。ＲＳＶと同時に（またはＲＳＶの前に）抗ＲＳＶ  ｓｉＲＮＡ＃１を投与すると、呼吸数、肺の組織病理および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中のロイコトリエン蓄積量に有意な減少が観察された（図４）。これらの値はベースラインに近い値を維持し、偽感染マウスの値にほぼ匹敵するものであった。感染後少なくとも１４日時点ですべてのパラメータが低い値を維持していたことから、該ｓｉＲＮＡは真に疾患を予防し、単に先送りしたのではないことが実証された。実際に、ｓｉＲＮＡで治療したマウスは、最長で６週間の観察期間中に呼吸困難の明らかな徴候をまったく示さなかった。陰性対照ＲＮＡまたはｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ（表１）はすべての実験において軽減をまったく提供しなかった（データ省略）。
【０１５１】
ＩＮ  ｓｉＲＮＡは感染後に有効な抗ウイルス薬である
ｓｉＲＮＡは、感染前に投与すると呼吸器系ウイルス疾患を予防できることが示されたため、感染が確立された後では治療効果があるかどうかという疑問が生じる。これは小児医学において重要な目標であるからである。この一連の実験では、ＲＳＶ感染から種々の日数を経た時点でｓｉＲＮＡ＃１を投与し、マウスの体重を毎日計測した。マウスはＲＳＶ感染から最長で約８〜１０日後に体重が減少することが知られており、その後は、開始接種材料が高量すぎるかまたは中〜低量であるかによって、死亡するかまたは緩徐に体重を取り戻す（Haeberle, H.A. et al. J. Virol 75, 878-890 (2001) ）。類似コホートのマウスで、所定の日に肺の試料を採取し、感染性ウイルスについて分析した。予想どおり、ｓｉＲＮＡ未治療のマウスは感染後約４日間は体重を維持したが、その後は徐々に減少し、少なくとも最長９日間まで減少が続いた（図５ａ）。ＲＳＶの前（データ省略）またはＲＳＶと同時（第０日）にｓｉＲＮＡで治療したマウスは、本質的に感染していないように見え、間断なく体重が増加し続けた。第１日にｓｉＲＮＡを投与されたほとんどのマウスも、偽感染対照と区別するのがかなり困難であった。その後（第１〜４日）にｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、保護効果が次第に少なくなったが、いずれの治療群についてもすべての日において体重の改善が観察された。
【０１５２】
これらのマウスで第２、４、６、８、１０および１６日に肺のＲＳＶ価を測定したところ、同じような状況が現れた（図５ｂ）。ｓｉＲＮＡ未治療マウスでは、第４〜５日までウイルス価が上昇し、その後は徐々に低下して第１６日までには検出不能レベルまで低下した。ＲＳＶ感染の前または同時にｓｉＲＮＡ治療を行なった場合は、検査したすべての日においてウイルス価は５，０００倍低かった。感染の後にｓｉＲＮＡを投与した場合は、次第に効果が弱くなったが、ウイルス価は、検査したいずれの日にも未治療対照より常に低かった。ｓｉＲＮＡは、その投与時期にかかわらず、ウイルスの複製速度を減速させ
、その結果、ウイルス価の最高値を低くするようであった。その後、ウイルス価は検出可能レベル未満に低下するが、ｓｉＲＮＡの投与が早ければ早いほど、早い時期に検出可能レベル未満まで低下する。たとえば、未治療の感染マウスの肺では、感染後最長１６日時点でＲＳＶが検出できたが、第１日にｓｉＲＮＡで治療したマウスでは感染後１０日時点で検出できなかった。前述と同様、陰性対照ｓｉＲＮＡまたはルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（表１）は、すべての実験で何の作用も示さなかった（データ省略）。総合すると以上の結果は、ＲＳＶ  Ｐ  ｓｉＲＮＡは感染後に投与した場合でも治療効果を有し、マウスは未治療コホートよりも常に病状が軽く、早く回復したことを示していた。
【０１５３】
考察
本明細書の主な所見は、適切に設計され鼻腔内に適用されたｓｉＲＮＡは、呼吸器感染からの防御を提供するとともに、感染後に適用した場合も意味のある療法を提供する、ということにある。簡単な手持ち式の吸入器で小粒子エアロゾルにより送達されるｓｉＲＮＡを、肺感染の予防または治療に使用することができる。我々の原稿が準備中であった間に、ｓｉＲＮＡが別の重要な呼吸器系病原体であるインフルエンザウイルスをネズミモデルで抑制したことを示した２つの報告書が現れた（Ge, Q., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8676- 8681 (2004), Tompkins, S.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8682-8686 (2004) ）。一方の研究（Ge, Q., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101, 8676-8681 (2004)）では、合成ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡがＩＶ経路とＩＴ経路の組み合わせを介して投与された。他方の研究（Tompkins, S.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8682-8686 (2004)）では、まず、流体力学的ＩＶ送達によりｓｉＲＮＡを送達し、１６〜２４時間後に、マウスにＩＮ経路でインフルエンザウイルスを感染させ、液体担体中のｓｉＲＮＡの第２の投与をＩＮ経路で行なった。２日後に肺のウイルスの存在を検査した結果、種々の株のインフルエンザウイルスで１０〜５０倍の抑制が観察された。ＲＳＶおよびＰＩＶに対する本発明者らの研究は、これまでの研究を上回る次のような改善および単純化を提供する。すなわち、（ｉ）送達は鼻腔内だけであり、そのため比較的非侵襲性で痛みがなく、吸入器または噴霧ベースの療法に使用しやすい。（ｉｉ）いかなる担体も含まないｓｉＲＮＡが有意に有効であり、このため担体の副作用の潜在的なリスクが軽減される。（ｉｉｉ）約５ナノモルのｓｉＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ７０μg)の単回投与は感染の全期間にわたって有益であるようである。標的配列（たとえばＲＳＶ  Ｐ）のより包括的なスクリーニングと、より新しい化学手法の使用によって、有意に低いＩＣ５０と良好な薬物動態を有するｓｉＲＮＡがもたらされ、その結果、用量がさらに少なくなると考えられる。ｓｉＲＮＡは、特に高濃度で、さまざまな程度の非特異的作用すなわち的外れの作用を示す（Jackson, A.L. et al.
Nat. Biotechnol. 21, 635-637 (2003), Sledz, C.A., et al., Nat. Cell Biol. 5, 834-839 (2003), Persengiev, S.P., et al., RNA 10, 12-18 (2004), Bridge, A.J., et al., Nat. Genet. 34, 263-264 (2003)）。治療においてこれが懸念となることは明らかであり、ｓｉＲＮＡのＩＶ投与は全身性の副作用を招く可能性がある。対照的に、鼻腔内に送達したｓｉＲＮＡは、専ら局在化するのではないとしても、呼吸器組織に集中する可能性が高く、このため副作用は最小限に抑えられる。鼻腔内に送達された合成ｓｉＲＮＡによりＩＦＮが活性化されないことは、化学的に合成された５’リン酸を欠くｓｉＲＮＡが、細胞培養物でＩＦＮ経路を活性化しないことを示した以前の所見（Kim, D.H. et al. Nat. Biotechnol. 22, 321-325 (2004)）を裏付け、さらに拡大するものである。総合すると、抗ウイルス活性と特異的ｍＲＮＡのノックダウンとの相関（図１）、標的組織（肺）におけるｓｉＲＮＡの検出（図２ｂ）、ＩＦＮ活性化の欠如（図２ｃ）、およびｓｉＲＮＡのウイルス特異的作用（図１〜３）はすべて、抗ウイルス作用が特異的で直接的であり、かつＲＮＡｉにより仲介されていることを示す証拠を提供するものである。（ｉｉｉ）ＲＳＶおよびＰＩＶなどの呼吸器系ウイルスは、呼吸器組織を感染させるうえで組織親和性において高い選択性を示す。このため、ＩＮ送達は、ｓｉＲＮＡが感染部位を標的とすることを確実にしており、薬理学的に理想的な状態である。
【０１５４】
ＲＳＶとＨＰＩＶは共感染することがあるが、これらの相互作用は大部分が無視されてきた。１つのｓｉＲＮＡが別のｓｉＲＮＡにより阻害されたことを示した観察所見の背後にある正確な理由については、さらなる研究が必要である。可能性は除外できないものの、ｅｘ  ｖｉｖｏ（細胞培養物）でも起こるという事実から、インターフェロンなどの動物に存在する体液因子およびサイトカインが原因とは考えにくい。ＲＳＶは実際にインターフェロンの活性化を阻害し（Schlender, J., et al., J. Virol. 74, 8234-8242 (2000), Ramaswamy, M., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 893-900 (2004) ）、このためＰＩＶの増殖を抑制するのではなく促進するはずである。別の可能性として、一方のウイルスの増殖が、細胞内資源を求めた競合などの他の機構を通して、他方のウイルスを抑制することが考えられる。また一方では、細胞におけるＲＮＡｉ機構は飽和しうることが知られており、このため２つのｓｉＲＮＡがこの機構の一定のプールを求めて競合している可能性が考えられる（Barik, S. Virus Res. 102, 27-35 (2004), (Hutvagner, G, et al., PLoS Biol. 2, E98 (2004) ）。このような競合は、ｓｉＲＮＡの比較的高い用量、すなわち数十ないし数百ナノモルに限って感知できたことに注目すべきである（図３）。対照的に、我々のｓｉＲＮＡは、わずか数ナノモルでマウスにほぼ完全な防御を提供した。このため、観察された競合は、ＩＣ５０が低いナノモル範囲にあるｓｉＲＮＡでは実際的な懸念となる問題ではない。
【０１５５】
予防薬として使用したとき、該ｓｉＲＮＡは感染を予防しただけでなく、体重、肺病理、呼吸器パラメータおよびアレルギーマーカーで測定した疾患プロセスのさまざまな側面の出現も抑制した（図４）。マウスとヒトにおける疾患プロセスの動態は比較的類似しており、両種においてＲＳＶ感染後は急速に免疫病理学的変化が起こる。感染が起こった後に治療薬として使用する場合は、すでに生じた病理変化をｓｉＲＮＡが正すことは期待されない。しかし、その場合も、ウイルスのさらなる増殖は抑制され、より速い治癒および回復がもたらされる（図５）。このため、いかなる疾患においてもより早期の治療がより良い予後をもたらすはずではあるが、ＲＳＶ感染患者には治療の「絶好のタイミング」がいつの時点にも存在するようである。裸のｓｉＲＮＡの有効性については、今後明らかにしなければならない課題である。呼吸器組織、特に肺は、自然状態で小分子の交換に対して受容性が高い可能性があり、あるいは、感染するとそのようになる可能性も考えられる。
【０１５６】
最後に、ｓｉＲＮＡと標的との対合の厳密度（ストリンジェンシー）に応じて、ｓｉＲＮＡへの曝露がｓｉＲＮＡ耐性ウイルスの選択を引き起こす可能性があり、ＨＩＶではこれがすでに立証されている（Das, A.T. et al. J. Virol. 78, 2601-2605 (2004) ）。本明細書で試験したｓｉＲＮＡでは、この問題に直面していない。ｓｉＲＮＡで治療したネズミの肺から回収できたウイルスは、Ａ５４９細胞培養物中で増殖し、ｓｉＲＮＡに対し最初の接種材料と同じＩＣ５０を示すことが見出された（データ省略）。さらに、プラークから精製した６つほどのＲＳＶ分離株では、Ｐ遺伝子のｓｉＲＮＡ領域の配列は元の野生型配列であった（データ省略）。今後、時折発生する耐性に出くわすことがあるとしても、ＩＣ５０が低く、かつＰ  ｍＲＮＡの異なる領域または異なるウイルスｍＲＮＡを標的とする第２のｓｉＲＮＡを多剤処方で用いることができ、これにより、ウイルス耐性の可能性を低くすることができる。
【０１５７】
方法
ウイルス、ｓｉＲＮＡおよび他の試薬。ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株およびヒトＰＩＶタイプ３（ＨＰＩＶ３）ＪＳ株を、ＲＳＶについて記述されているようにＨＥｐ−２単層上で増殖させた（Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J. Virol. 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998) ）。ＲＳＶは約７０時間の時点、ＨＰＩＶ３は５０時間の時点で、放出された子孫ウイルスを
含有する細胞外培地を収集した。ＲＳＶについての記述とほぼ同じように（Ueba, O. Acta. Med. Okayama 32, 265-272 (1978)）、ポリエチレングリコール（ＭＷ８，０００）を用いた沈殿およびショ糖密度勾配遠心法により、ウイルスを精製し濃縮した。最終的な調製物は、１０8 〜１０9 ｐｆｕ／ｍｌの範囲の感染力価を有しており、小分けして−８０℃で凍結保存した。すべての感染性ウイルス価（ｐｆｕ）を、ニュートラルレッド染色を用い、ＨＥｐ−２単層上でアガロースプラーク測定法により測定した（Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J. Virol. 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998) ）。
【０１５８】
ｓｉＲＮＡはダーマコン（Dharmacon ）から購入し、同社の推奨どおり処理した（Bitko, V. and Barik, placeS. BMC Microbiol. 1, 34 (2001) ）。ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ
（登録商標）試薬は米国ウィスコンシン州マディソン所在のミラスバイオ社（Mirus Bio Corp）から入手した。ウサギで作製されたＲＳＶ−Ｐ抗体をすべての免疫組織学的染色に用いた（Bitko, V. and Barik, placeS. BMC Microbiol. 1, 34 (2001) ）。精製したビ
リオンに対してヤギで作製されたポリクローナルＲＳＶおよびＨＰＩＶ３抗体を、それぞれ米国カリフォルニア州テメキュラ所在のケミコン（Chemicon）および米国カリフォルニア州エメリービル所在のバイオスパシフィック（BiosPacific ）から購入したが、これらの抗体により免疫ブロット法で検出される主なウイルスのバンドはヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）である。プロフィリン抗体については以前に記述されている（Burke, E.,
et al., J. Virol. 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol. 72, 2655-2662 (1998)）。
【０１５９】
ウイルス感染およびｓｉＲＮＡ治療。単層培養で増殖したＡ５４９細胞の感染およびｓｉＲＮＡ処理を、記述どおりに行なった（Bitko, V. and Barik, placeS. BMC Microbiol. 1, 34 (2001) ）。マウスにおけるＲＳＶの鼻腔内投与は、確立された手順であり、細
気管支炎を引き起こす。体重が１６〜２０ｇで病原体未感染の８〜１０週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをチャールズリバー（Charles River Laboratories）から購入した。感染またはｓｉＲＮＡ投与のための麻酔は、ネンブタール０．２ｍｌ（５ｍｇ／ｍｌ）の腹腔内注射で達成された。安楽死は、ネンブタール０．３ｍｌで麻酔した後に頚椎脱臼法により行なった。ｓｉＲＮＡは、１μｌ中に所望量が含まれるように、製造業者から提供された希釈用緩衝液で適切に希釈した。これを実験の直前にＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（登録商標）試薬５μｌおよびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（米国カリフォルニア州カールズバッド所在ギブコ・インビトロゲン（（Gibco Life Technologies, Invitrogen ））３５μｌと混合し、総容量４１μｌとする。担体なしでｓｉＲＮＡを用いる場合は、トランスフェクション試薬５μｌの代わりにＯｐｔｉ−ＭＥＭ５μｌを使用した。ショ糖で精製したウイルスを、３０μｌ中に１０7 ｐｆｕのウイルスが含まれるように、冷やしたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で感染の直前に適切に希釈した。偽感染は、ウイルスを含まない同一容量のＰＢＳで行なった。ｓｉＲＮＡ混合物およびウイルスはいずれも２つの鼻孔に等しく分け、マイクロピペットで塗布した（すなわち、各鼻孔に２０．５μｌ中のｓｉＲＮＡ３５μｇと１５μｌ中のウイルス０．５×１０7 ｐｆｕを投与した）。マウスは自然の呼吸で液体をすべて吸入したため、特別な器具は必要なかった。二重感染については、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３株を希釈し、各ウイルス１０7 ｐｆｕの混合物と、すでに述べた容量と同じ各５ナノモル（７０μｇ）のｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃４の混合物を各マウスに与えた。動物実験は、所定のすべてのガイドラインに従い、ＩＡＣＵＣによって承認された。
【０１６０】
肺ウイルス測定法および臨床測定。動物を毎日チェックし、体重を測定した。鼻汁、うっ血および細気管支炎による呼吸数の増加、光沢のない被毛、しわくちゃの毛皮および／または脱毛、ならびに全体的無気力および倦怠を含めた標準のＲＳＶ症状を記録した。呼吸数（１分あたりの呼吸）は、ビデオ撮りによって測定した（Volovitz, B., et al., Pe
diatr. Res. 24, 504-507 (1988)）。くしゃみ、鼻すすりおよび溜息は集計から除外した。感染後（ｐ．ｉ．）種々の日数が経過した時点で肺を切除し、下に記述するように、感染性ウイルス測定法、免疫ブロット分析、または免疫染色法によるＲＳＶ検出に供した。
【０１６１】
ウイルス価を測定するため、２％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中で冷やした状態で肺をホモジナイズした（組織１００ｍｇあたりＤＭＥＭ２ｍｌ）。抽出物を２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清の連続希釈物を測定してｐｆｕを求めた。ウイルスタンパク質の免疫ブロット（Burke, E., et al., Virology 252, 137-148 (1998) ）では、ホモジナイズした（遠心分離前の）試料１０μｌを２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液１０μｌに加え、混合物を９８℃で５分間加熱し、微量遠心分離機で室温にて遠心分離することにより清澄化し、透明な上清１０μｌを、ヤギの抗ＲＳＶ抗体および抗ＨＰＩＶ３抗体を用いて免疫ブロット法により分析した。ＩＦＮを測定するため（Durbin, J.E. et al. J. Immunol. 168, 2944-2952 (2002) ）、肺をＰＢＳ中でホモジナイズし、上のように処理して、検出限界１０ｐｇ／ｍｌのＥＬＩＳＡキット（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のアール・アンド・ディー・システムズ（R and D Systems ））で連続希釈物を検定した。
【０１６２】
肺の病理組織検査については、肺を潅流して１０％緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィン包埋した。厚さ４μｍの複数の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、２名の別々の研究者が光学顕微鏡下で細胞の炎症について採点した。血管および細気管支の周囲の炎症細胞の層を数えることにより、炎症性浸潤を採点した。炎症細胞の層が０〜３である場合を正常とみなし、血管または細気管支の周囲の５０％以上を囲む炎症細胞が３層を超える場合を異常とみなした。血管周囲および細気管支周囲の異常なスペース数をスペース総数で割った数を、病理スコアとしてパーセンテージで報告した。各動物について、肺あたり合計約２０箇所のスペースについて集計した。１０7 のＲＳＶ（かつｓｉＲＮＡなし）では（Haeberle, H. A. et al. J. Virol. 75, 878-890 (2001) ）、早くも第１日に血管周囲および細気管支周囲のスペースの約３０〜３５％に異常を見出すことができ、第５日付近で最高値に達した。
【０１６３】
免疫組織検査については（Haeberle, H.A. et al. J. Virol. 75, 878-890 (2001)）、肺組織を１００％ＯＣＴ化合物で包埋し、−８０℃で凍結させた。切片を切り取ってスライド上に置き、風乾してアセトンで固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳで透過化処理し、１０％ヤギ血清含有ＰＢＳで室温にて２０分間ブロッキングした。ＰＢＳで複数回洗浄した後、１．５％ヤギ血清含有ＰＢＳで希釈した抗ＲＳＶ−Ｐ抗体または抗ＨＰＩＶ３抗体のいずれかとともに、組織を室温で２時間インキュベートした。該スライドを再びＰＢＳで複数回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ウサギおよびＴＲＩＴＣ結合抗ヤギ免疫グロブリンＧ抗体を用いて、２つの抗体を検出した。室温で１時間インキュベーション後、該スライドにＰＢＳで最後の洗浄を行い、ＤＡＢＣＯ−ＤＡＰＩ封入剤でマウントし、蛍光顕微鏡法で観察した（Bitko, V. and Barik, placeS. BMC Microbiol. 1, 34 (2001) ）。
【０１６４】
気管支および肺を５×１．０ｍｌの生理食塩水（１ｍｌあたりインドメタシン１０μｇ含有）で潅流することにより、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を収集し（Bernhard, W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 25, 725-731 (2001) ）、マウス１匹あたりのＢＡＬＦの総回収量は４．２〜４．４ｍｌであった。血液汚染の明らかな兆候を有する試料は破棄した。５，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによりＢＡＬＦから細胞を除去し、さらに分析を行うまで試料を−８０℃で保存した。ＥＬＩＳＡキット（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のアール・アンド・ディー・システムズ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＢＡＬＦ中のシステイニルロイコトリエン結合体の濃度を測定した。製品説明書によれば、種々のロイコトリエンに対する該キットの交差反応性は、ＬＴＣ４
１００％、ＬＴＤ４  １１５％、ＬＴＥ４  ６３％およびＬＴＢ４  １．２％であった
。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ実験については、ＨＰＩＶ３感染細胞からＲＮＡを単離し、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅキット（米国カリフォルニア州フォスター・シティ所在のパーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ（Perkin-Elmer Applied Biosystems ））を用いて第一鎖のｃＤＮＡを作製した。プレミアバイオソフト（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ）からのＢｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア  バージョン２．１３により、プライマーを設計した。次のプライマーをＨＰＩＶ３  Ｐ  ｍＲＮＡの増幅に使用した：５’−ＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＣＧＡＡＴＧＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１）および５’−ＣＴＴＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号２）。バイオラッド（BioRad Laboratories ）（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）のｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ｉＱ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲシステムで、ｉＱ（登録商標）Ｓｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘを使用して、リアルタイムＰＣＲを行なった。該製造会社のソフトウェアおよび内部対照としてＧＡＰＤＨを用いて、遺伝子発現測定値を算出した。
【０１６６】
32Ｐで末端を標識した相補的合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いて、本質的には記述されているように（Reinhart, B.J., et al., Genes and Dev. 16, 1616-1626 (2002) ）、肺組織のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を抽出し、ノーザンハイブリダイゼーションにより検出した。
【０１６７】
統計解析。治療群間またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験セット間の変化を、一元配置ＡＮＯＶＡで解析し、次にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いたＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で解析した。ロイコトリエン濃度の増大は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定で判定した。数値データはすべて、少なくとも３回の別個の実験から収集した。結果を平均値±ＳＥＭ（グラフのエラーバー）で表示した。差は、Ｐ＜０．０５で有意とみなした。
【０１６８】
【表１】
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【０１６９】
上記表において、ＲＳＶ−Ｐ、ＨＰＩＶ３−Ｐおよびルシフェラーゼ配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号はそれぞれＭ２２６４４、Ｚ１１５７５およびＸ６５３２４である。ｓｉＲＮＡ配列は、本発明者らの研究所で行なったウイルス株の実際の配列決定に基づいたものであり、このためｓｉＲＮＡ＃２は、ＧｅｎＢａｎｋの配列とは１ヌクレオチド異なっている（下線を引いたＣはＭ２２６４４ではＵである）ことに注意されたい。陰性対照のｓｉＲＮＡ配列はキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（米国カリフォルニア州バレンシア所在）から入手した。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】ｅｘ  ｖｉｖｏにおける抗ウイルスｓｉＲＮＡの力価測定を示す図。（ａ）内部対照としてプロフィリンを用いた、ＲＳＶ感染Ａ５４９細胞（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の総タンパク質の免疫ブロット分析。ボックス内の数値はｓｉＲＮＡ処理後の標的Ｐ  ｍＲＮＡのレベルを示しており、未処理のレベルに対する割合（％）で表している。次の３つのパネルでは、ｓｉＲＮＡから４時間後にウイルスを投与した。（ｂ）ＲＳＶ感染マウスにおける肺感染ウイルス（各データ点でｎ＝８）、（ｃ）ＨＰＩＶ３感染マウスにおける肺感染ウイルス（各データ点でｎ＝８）、（ｄ）いかなるトランスフェクション試薬も用いずに裸のｓｉＲＮＡを投与したこと以外は（ｂ）と同じ。星印は有意な抑制を示す（Ｐ＜０．０５）。ｓｉＲＮＡは表１に記載する。
【図２】ｓｉＲＮＡ治療ネズミ肺におけるＩＦＮ活性化を伴わないウイルス抗原のノックダウンを示す図。（ａ）ｓｉＲＮＡから４時間後にウイルスを投与し、感染から４日後に肺の間接的免疫組織検査によりウイルス抗原を検出した（緑、ＲＳＶ；赤、ＨＰＩＶ３）。（１）偽感染、ＲＳＶ  Ｐ抗体で精査；（２〜６）ＲＳＶ感染、ＲＳＶ  Ｐ抗体で精査；（７，８）ＨＰＩＶ３感染、ＨＰＩＶ３抗体で精査。次のｓｉＲＮＡ（５ナノモル、約７０μｇ）を用いた：（１，２）なし；（３）ｓｉＲＮＡ＃１＋ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬；（４）ｓｉＲＮＡ＃１、試薬なし；（５）陰性対照ｓｉＲＮＡ＋ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬  ；（６）ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ＋ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ；（７）なし；（８）ｓｉＲＮＡ＃４＋ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ。代表的な肺組織は感染から５日後のものとした。バー＝４００μｍ。（ｂ）標識したＲＳＶ  Ｐ  ＤＮＡをプローブとして用いて、ｓｉＲＮＡ投与から２日後の種々の量の肺の総ＲＮＡ量をノーザン分析で解析することにより、ｓｉＲＮＡ＃１のアンチセンス鎖を検出した。ＲＳＶ  ＮＳ１に対するプローブは反応しなかったことから検出の特異性が示された。（ｃ）ＩＮ  ｓｉＲＮＡ（マウス１匹あたり１０ナノモルまたは１４０μｇ）は、Ｉ型（ＩＦＮ−α）およびＩＩ型（ＩＮＦ−γ）のいずれの肺ＩＦＮをも検出域値（約１０ｐｇ／ｍｌ）を上回る状態に活性化しなかったが、対照の肺では、ＲＳＶ感染がＩＩ型を活性化し、Ｉ型を低レベルで活性化した。レーン１、ｓｉＲＮＡ＃１；レーン２、ｓｉＲＮＡ＃４；レーン３、Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ；レーン４、ＲＳＶ感染であるがｓｉＲＮＡなし（エラーバーも示した）。ｓｉＲＮＡ投与から２日後と感染から４日後に肺を得た（各グラフｎ＝４）。（ｄ）間接的免疫組織検査により測定した、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３による二重感染のｓｉＲＮＡによる抑制（緑、ＲＳＶ；赤、ＨＰＩＶ３）。（１，５）ｓｉＲＮＡなし；（２，６）ｓｉＲＮＡ＃１、５ナノモル（７０μｇ）；（３，７）ｓｉＲＮＡ＃４、５ナノモル（７０μｇ）；（４，８）ｓｉＲＮＡ＃１およびｓｉＲＮＡ＃４、各５ナノモル。（１〜４）ＲＳＶ  Ｐ抗体で精査；（５〜８）ＨＰＩＶ３抗体で精査。ｓｉＲＮＡから４時間後にウイルスを投与し、感染から４日後に肺組織を検査した。バー＝４００μｍ。
【図３】ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３による二重感染における高濃度ｓｉＲＮＡでの競合的ウイルス抑制を示す図。（ａ）リアルタイムＰＣＲ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）；（ｂ）免疫ブロット（ｅｘ  ｖｉｖｏ）；（ｃ）ヤギの抗ウイルス抗体を用いた肺免疫ブロット。それぞれのウイルスのＮタンパク質のバンド強度を定量し、ｓｉＲＮＡ未治療の肺試料に対する割合（％）で表した。ｓｉＲＮＡから４時間後にウイルスを投与し、肺組織は感染から５日後のものとした（各データ点でｎ＝４）。黒色バー、ＲＳＶ；白色バー、ＨＰＩＶ３。標準誤差は示すとおりである。
【図４】ｓｉＲＮＡ＃１治療マウスにおける肺病理の軽減および喘息マーカーの減少を示す図。（ａ）呼吸数；（ｂ）肺の病理組織；（ｃ）ロイコトリエン。すべての測定法においてＰ＜０．００２；すべてのデータ点でｎ＝４；標準誤差のバーを示す。ｓｉＲＮＡ（７０μｇ）から４時間後にウイルスを投与した。陰性対照のｓｉＲＮＡで治療したマウスはｓｉＲＮＡ未治療マウスと区別がつかなかった（データ省略）。
【図５】ＲＳＶ疾患におけるｓｉＲＮＡの治療効果を示す図。マウスのＲＳＶ感染期間中の（ａ）体重および（ｂ）肺のウイルス価の変化。標準誤差のバーを示す；各データ点につきｎ＝６。矢印はｓｉＲＮＡ（７０μｇ）の投与日を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008517940.tif 000010