(57)【要約】  α−メラノコルチン刺激ホルモン（αＭＳＨ）類似物であり、改良されたメラノコルチン−４受容体アゴニスト活性を有する新規骨格環化ペプチドが開示されている。開示されている前記骨格環化ペプチド類似物は、代謝安定性、増大した経口生体利用能、改良された腸透過性、及び薬理活性インビボなどの、他に類のない他の類似物よりも優れた特性を有している。前記骨格環化αＭＳＨ類似物を含む薬剤組成物、及び肥満を含む代謝障害の治療のために当該薬剤組成物を使用する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの構成単位を組み込んでいるアミノ酸４〜１２個のペプチド配列を含む、骨格環化αＭＳＨ類似物であって、前記構成単位が、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合されたペプチド骨格の窒素原子１個を含有し、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基からなる群から選択される部分と前記架橋原子団を介して結合されることにより、環状構造を形成している骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項２】
前記架橋原子団が、一般式（ＶＩＩ）：
−Ｚ−（ＣＨ２）ｍ−Ｍ−（ＣＨ２）ｎ−
式（ＶＩＩ）
を有する化学的リンカーであって、式中、ｍ及びｎはそれぞれ独立に１〜８の整数であり、Ｍはジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋からなる群から選択され、Ｚは存在しないか又は２つのカルボキシル基を含む分子の残基である、請求項１に記載のαＭＳＨ類似物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）（配列番号２）：
【化１】
2008542358.tif 000012
を有し、式中、Ｒはアミノ酸の側鎖、ＸはＯＨ、ＮＨ２又はエステル、ｍは１〜８の整数を表し、ｎは１〜８の整数を表す、請求項１に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項４】
ｍは２〜５の整数を表し、ｎは２〜６の整数を表す請求項３に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項５】
一般式（ＩＩ）（配列番号３）：
【化２】
2008542358.tif 000013
を有し、式中、ｍは１〜８の整数を表し、ｎは１〜８の整数を表す、請求項３に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項６】
ｍは２〜５の整数を表し、ｎは２〜６の整数を表す請求項５に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項７】
前記類似物が、
ｎ＝２、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝３である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝５である式（ＩＩ）のペプチド、及び
ｎ＝２、ｍ＝４である式（ＩＩ）のペプチド
からなる群から選択される、請求項６に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項８】
ｎ＝２及びｍ＝２である請求項７に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項９】
一般式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008542358.tif 000014
を有し、式中ｎが１〜８の整数を表す、請求項１に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１０】
ｎが２〜６の整数を表す請求項９に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１１】
ｎが２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項１０に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１２】
一般式（ＩＶ）：
【化４】
2008542358.tif 000015
を有し、式中ｎが１〜８の整数を表す、請求項１に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１３】
ｎが２〜６までの整数を表す請求項１２に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１４】
ｎが２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項１３に記載の骨格環化αＭＳＨ類似物。
【請求項１５】
少なくとも１つの構成単位を組み込んでいるアミノ酸４〜１２個のαＭＳＨ類似物を含む骨格環状ペプチドを、活性成分として含む薬剤組成物であって、前記構成単位が、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合されたペプチド骨格窒素原子１個を含有し、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基からなる群から選択される部分と前記架橋原子団を介して結合されることにより、環状構造を形成しており、さらに薬剤として受容可能な担体を含む薬剤組成物。
【請求項１６】
架橋原子団が一般式（ＶＩＩ）：
−Ｚ−（ＣＨ２）ｍ−Ｍ−（ＣＨ２）ｎ−
式（ＶＩＩ）
を有する化学的リンカーであり、式中、ｍ及びｎはそれぞれ独立に１〜８の整数であり、Ｍはジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋からなる群から選択され、Ｚは存在しないか又は２つのカルボキシル基を含む分子の残基である、請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
ペプチドが一般式（Ｉ）（配列番号２）：
【化５】
2008542358.tif 000016
であり、式中、Ｒはアミノ酸の側鎖であり、ＸはＯＨ、ＮＨ２又はエステルであり、ｍは１〜８の整数を表し、ｎは１〜８の整数を表す、請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
ｍは２〜５の整数を表し、ｎは２〜６の整数を表す請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
ペプチドが一般式（ＩＩ）（配列番号３）：
【化６】
2008542358.tif 000017
であり、式中、ｍは１〜８の整数を表し、ｎは１〜８の整数を表す、請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
ｍは２〜５の整数を表し、ｎは２〜６の整数を表す請求項１９に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドが、
ｎ＝２、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝３である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝５である式（ＩＩ）のペプチド、及び
ｎ＝２、ｍ＝４である式（ＩＩ）のペプチド
からなる群から選択される、請求項２０に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
ｎ＝２、ｍ＝２である請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
ペプチドが一般式（ＩＩＩ）：
【化７】
2008542358.tif 000018
であり、式中ｎは１〜８の整数を表す、請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
ｎは２〜６の整数である請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
ｎが２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項２４に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
ペプチドが一般式（ＩＶ）：
【化８】
2008542358.tif 000019
であり、式中ｎは１〜８の整数を表す、請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
ｎは２〜６の整数を表す請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
ｎが２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項２７に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
経口投与のために処方されている請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
メラノコルチン−４−受容体活性に付随する疾病又は障害を治療又は予防する方法において、少なくとも１つの構成単位を組み込んでいるアミノ酸４〜１２個のαＭＳＨ類似物を含む骨格環状ペプチドを、活性成分として含む薬剤組成物であって、前記構成単位が、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合されたペプチド骨格窒素原子１個を含有し、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基からなる群から選択される部分と前記架橋原子団を介して結合されることにより、環状構造を形成している、前記薬剤組成物の治療有効量をそれを必要とする被験者に投与することを含む方法。
【請求項３１】
架橋原子団が一般式（ＶＩＩ）：
−Ｚ−（ＣＨ２）ｍ−Ｍ−（ＣＨ２）ｎ−
式（ＶＩＩ）
を有する化学的リンカーであり、式中、ｍ及びｎはそれぞれ無関係に１〜８の整数であり、Ｍはジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋からなる群から選択され、Ｚは存在しないか又は２つのカルボキシル基を含む分子の残基である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ペプチドが一般式（Ｉ）（配列番号２）：
【化９】
2008542358.tif 000020
であり、式中、Ｒはアミノ酸の側鎖であり、ＸはＯＨ、ＮＨ２又はエステルであり、ｍは１〜８の整数を表し、ｎは１〜８の整数を表す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ｍは２〜５の整数を表し、ｎは２〜６の整数を表す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドが一般式（ＩＩ）（配列番号３）：
【化１０】
2008542358.tif 000021
であり、式中、ｍは１〜８の整数を表し、式中、ｎは１〜８の整数を表す、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ｍは２〜５の整数を表し、式中ｎは２〜６の整数を表す、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドが、
ｎ＝２、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝３である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド、
ｎ＝３、ｍ＝５である式（ＩＩ）のペプチド、及び
ｎ＝２、ｍ＝４である式（ＩＩ）のペプチド
からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｎ＝２、ｍ＝２である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ペプチドが一般式（ＩＩＩ）：
【化１１】
2008542358.tif 000022
であり、式中ｎは１〜８の整数を表す、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
ｎは２〜６の整数を表す請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｎは２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ペプチドが一般式（ＩＶ）：
【化１２】
2008542358.tif 000023
であり、式中ｎは１〜８の整数を表す、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
ｎが２〜６の整数を表す請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｎが２、３、４、及び６から選択される整数を表す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
障害が代謝障害である請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
代謝障害が肥満である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
代謝障害が糖尿病である請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
糖尿病が２型糖尿病である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記薬剤組成物が経口投与のために処方されている請求項３０に記載の方法。
【請求項４９】
前記活性成分の量が約１０〜１０００μｇ／ｋｇの範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
メラノコルチン−４−受容体活性に付随する疾病又は障害を治療又は予防する薬剤を調製するための、少なくとも１つの構成単位を組み込んでいるアミノ酸４〜１２個のペプチド配列を含む、骨格環化αＭＳＨ類似物の使用であって、前記構成単位が、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合されたペプチド骨格窒素原子１個を含有し、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基からなる群から選択される部分と前記架橋原子団を介して結合されることにより、環状構造を形成している、骨格環化αＭＳＨ類似物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノコルチン刺激ホルモン（αＭＳＨ）類似物、前記類似物を含有する薬剤組成物、及び肥満を含む代謝障害の治療のために当該化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満の治療
全世界の肥満率は増大しており、現在では２１世紀の西洋世界の中心的流行と考えられている。米国人口の５０％超が過体重と考えられ、＞２５％が臨床学的に肥満と診断されている。統計資料によれば、肥満はすでに幼齢で始まっており、児童及び青少年の１５％が肥満を患い、２５年前の報告の３倍になっていることが明らかにされている。したがって、肥満を予防する治療法を開発するための明白な経済上及び医療上の根拠が存在する。世界中の多くの科学者と製薬会社が、この問題に取り組むための適切な薬理学上の解決策を現在探求中である。
【０００３】
上体肥満は、知られているなかで最も強力な２型糖尿病の危険因子であり、心臓血管疾患の強力な危険因子である。肥満は、高血圧、アテローム性動脈硬化、うっ血性心不全、心発作、胆嚢疾患、変形性関節炎、睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群などの生殖障害、乳癌、前立腺癌、結腸癌、及び全身麻酔合併症の発生率の増加について認識されている危険因子である（たとえば、Ｋｏｐｅｌｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３５−４３，２０００を参照されたい）。肥満は寿命を縮め、上記のような合併症（ｃｏ−ｍｏｒｂｉｄｉｔｉｅｓ）の重大な危険性、並びに、感染症、静脈瘤、黒色表皮症、湿疹、運動不耐性、インスリン抵抗性、高血圧高コレステロール血症、胆石症、整形傷害、及び血栓塞栓症などの障害をもたらす（Ｒｉｓｓａｎｅｎら，ＢＭＪ３０１：８３５−７，１９９０）。肥満はインスリン抵抗性症候群と呼ばれる一連の症状、すなわち「シンドロームＸ」の危険因子でもある。
【０００４】
肥満は、身体に入るカロリー量と利用されると同時に浪費されたエネルギーの間の慢性的不均衡から生じる。したがって、高カロリーの食物を摂取し身体活動が制限されれば肥満になる。
【０００５】
食物利用度及び身体活動に大きなばらつきはあるが、哺乳動物ではエネルギー貯蔵量は比較的一定に維持されている。この厳格な調節はレプチンにより開始される内分泌フィードバックループにより実現されている。レプチンは、脂肪細胞により産生されるが、栄養状態を視床下部に伝える。血漿中のレプチン濃度は脂肪組織量と相関関係があり、断食中は減少する。レプチンシグナルは、食欲及びエネルギー消費を調節する神経ペプチドが関与する神経内分泌応答を引き起こす。神経ペプチドの一部は下垂体分泌にも影響し、したがって、食物欠乏に付随する適応ホルモン応答、甲状腺ホルモン循環濃度の変化、生殖能力及び線形成長の抑制を媒介する。食欲促進ペプチド（神経ペプチドＹ、オキセリン等）はレプチンにより抑制され、食欲抑制シグナルは促進される。
【０００６】
現在、肥満の治療のために入手可能な薬剤はいずれも最適とはいえない。肥満の現在入手可能な治療には、オルリスタット及びシブトラミンが含まれる。
【０００７】
オルリスタット（テトラヒドロリプスタチン）は、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｌｄｓ）が産生する天然に存在するリパーゼ阻害剤から誘導された合成薬である。オルリスタットは、食事性脂肪の９９％を占めるトリグリセリドの加水分解を司っている主酵素である膵リパーゼの活性部位と共有結合し、他の腸及び腸外リパーゼも阻害するが、オルリスタットが本質的に非吸収性であるために、その作用は腸管内腔に制限されている。薬用量のオルリスタット（１２０ｍｇ１日３回）は食事性脂肪の約３０％の消化及び吸収を妨げ、これは減量効果の全てではないが一部を占めている。残りの効果は被験者が胃腸の副作用を誘発することができる高脂肪食品を回避することを選択するためであろう。
【０００８】
シブトラミンは軽度の発熱性も有する中枢作用性食欲抑制剤である。シブトラミンは、視床下部及び他の脳の領域で作用し負のエネルギー欠損を誘発する２種類のモノアミン、すなわちセロトニン（５−ＨＴ）及びノルアドレナリンの作用を増強することによって作用する。げっ歯動物及び下等霊長類に中枢的に注入すると、５−ＨＴもノルアドレナリンも発熱組織への交感神経の流出を刺激することによって摂食を阻害しエネルギー消費を増大させる。シブトラミンは両方のモノアミンの再摂取を妨げ、したがってシナプス間隙におけるその利用可能性を増大させる。フェンフルラミンと相違して、シブトラミンはセロトニン神経末端からの５−ＨＴの放出を促進しない。ノルアドレナリン再摂取が阻害されると交感神経系の緊張が高まり、その結果には望ましい熱発生作用も、血圧と脈拍数の上昇という望ましくない心血管系副作用もある。シブトラミンは、両モノアミンに対するその作用のために、「ＳＮＲＩ」（セロトニン／ノルアドレナリン再摂取阻害剤）と呼ばれている。
【０００９】
新規抗肥満薬に対する潜在的ＣＮＳ標的物には、食物摂取及びエネルギー調節に関与している多種のペプチドがある。これらのペプチドは、経口で有効な抗肥満薬への変換をめざす集中的研究の主題である。これらのペプチドには、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、オレキシン及びメラノコルチンがある。これらのペプチド類似物は腸壁を通過せず、したがって経口的に生体利用能がないことを強調すべきである。
【００１０】
メラノコルチンアゴニストペプチド
この重大な健康問題の薬物療法に対して提唱されている解決策の１つは、身体内での食物消費及び代謝平衡を制御している生化学的経路を調節することである。
【００１１】
「メラノコルチン経路」はエネルギー収支の重要な内分泌調節系である（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ２０００、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２６（１）：８−９）。カロリー摂取を制御する薬理学的研究の最先端は「メラノコルチン経路」フィードバックカスケードプロセスの後期段階に集中している。このプロセスは、異化内因性神経ペプチドメラノコルチン刺激ホルモン（αＭＳＨ）のそのメラノコルチンサブタイプ４（ＭＣ４）受容体への結合を含み、アゴニスト作用を引き起こす。このサブタイプのメラノコルチン（ＭＣ）受容体は脂肪の燃焼速度を調節し、したがって体重恒常性に影響を及ぼす（Ｌｕｅｖａｎｏ、Ｃ．Ｈ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１．４０：ｐ．６１６４−６１７９）。前記ＭＣ４受容体は、摂食行動へ直接関与するために、肥満を治療する選択的強力アゴニスト治療法の設計、及び拒食症を治療する選択的アンタゴニストの設計のための標的である。
【００１２】
中枢メラノコルチン系はエネルギー恒常性の調節に極めて重要な役割を果たしている。メラノコルチンペプチド（α、β、γ−メラニン細胞刺激ホルモン及びアドレノコルチコトロピンホルモンＡＣＴＨ）はメラノコルチン受容体に対する内因性アゴニストリガンドであり、プロオピオメラニコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子転写物の翻訳後プロセシングにより誘導される。
【００１３】
メラノコルチンペプチドアゴニストの全てが、メラノコルチン受容体のリガンド選択性及び刺激に起因すると考えられている中核テトラペプチドＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを含有している。したがって、テトラペプチドＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを肥満の治療薬を設計するための指標として利用することができる（Ｈａｓｋｅｌｌ−Ｌｕｅｖａｎｏ、Ｌｉｍ．ら，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２１（１）：４９−５７）。
【００１４】
メラノコルチンファミリーは、現在までに同定された５つの受容体（ＭＣ１Ｒ〜ＭＣ５Ｒ）を含有しており、これらの受容体はｃＡＭＰ二次メッセンジャーシグナル伝達経路を刺激する。
【００１５】
メラノコルチンファミリーメンバー間の配列相同性は３５から６０％の範囲である（Ｃｏｎｅら，Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓ．１９９６，５１：２８７−３１８）が、これらの受容体はその機能が相違している。たとえば、ＭＣ１−Ｒは、αＭＳＨに応答して色素沈着を調節するＧ蛋白質共役型受容体であり、αＭＳＨはＭＣ１−Ｒの強力なアゴニストである。ＭＣ１−Ｒ受容体のアゴニズムの結果、メラニン細胞が刺激され、ユーメラニンを引き起こして皮膚癌に対する危険性を増大させる。ＭＣ１−Ｒのアゴニズムは神経学的効果も及ぼすことができる。ＭＣ２−Ｒ活性が促進されると、副腎組織の癌腫が発生し得る。ＭＣ３−Ｒ及びＭＣ５−Ｒのアゴニズムの効果はまだ分かっていない。メラノコルチン受容体の全てが、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のペプチドホルモンクラスに応答する。その機能が相違するために、複数のメラノコルチン受容体の活性の同時アゴニズムは好ましからざる副作用を引き起こす潜在力を有する。したがって、受容体選択的アゴニストを獲得するのが望ましい。
【００１６】
経口剤投与は依然として、特に肥満などの慢性疾患の治療のための化学物質の全身投与の最も好ましい経路である。しかし、広範囲の腸代謝低下及び不十分な腸透過性の結果、ペプチドは不十分な経口生体利用能が欠点である。腸管内腔及び刷子縁におけるペプチドの酵素的安定性は、これらの領域では蛋白質分解酵素が富んでいるので、ペプチドの経口生体利用能を支配する主要因子である。したがって、蛋白質分解酵素は、完全なペプチドが経口投与の後、体循環に到達する能力をかなり低下させる。テトラ（及びそれより大きな）ペプチドでは、蛋白質分解活性の９０％余りが刷子縁膜に結合した酵素によるものである。ペプチドの不十分な透過性は通常、低い細胞透過をもたらす不適合な物理化学的性質の組合せのためである。したがって、ペプチドの経口送達の成功は、これらの潜在的薬物の物理化学的特徴を、その薬理活性に影響することなく代謝安定性と腸透過性の両方を改良するために改変することを目的とする戦略に依存しよう。
【００１７】
内因性αＭＳＨのペプチド類似物は血液中でも胃腸（ＧＩ）管内でも代謝安定性が低く（半減期が非常に短い）、したがって、肥満に対する治療化合物として使用することはできない。
【００１８】
脳の第３脳室又は腹腔内に注入すると、ＭＣ４−Ｒアゴニスト活性を有するαＭＳＨの環状へプタペプチド類似物はマウスに食物摂取の長期にわたる阻害を引き起こしたことが実証されている。この効果は、ＭＣ４−Ｒアンタゴニストと同時投与すると、可逆的であった（Ｆａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９７  ３８５：１６５−１６８）。したがって、ＭＣ４−Ｒ活性のアゴニストは肥満の治療又は予防に有用であると考えられる。
【００１９】
米国特許出願公開第２００１／００５６１７９号はメラノコルチン−４−受容体（ＭＣ４−Ｒ）アゴニスト活性を有する選択的直鎖ペプチドを開示している。国際公開第２００３／０９５４７４号はメラノコルチン−４−受容体アゴニスト活性を有する特異的なペプチド誘導体を開示している。国際公開第２００５／００９９５０号はヒトメラノコルチン−４−受容体の選択的アゴニストであるピペリジン誘導体を開示している。
【００２０】
米国特許出願公開第２００２／０１４３１４１号はＭＣ４−Ｒアゴニスト活性を有する選択的ラクタム架橋環状ペプチドを開示している。国際公開第０２／１８４３７号は肥満の治療に有用なＭＣ４−Ｒアゴニスト活性を有し、ジスルフィド又はラクタム架橋を介して環化したペプチドを開示している。国際公開第２００３／００６６０４号は強力で選択的なメラノコルチン−４−受容体アゴニストとして環状ペプチドを開示している。国際公開第２００５／０３０７９７号は７〜１２アミノ酸残基を含み、ＭＣ４−Ｒアゴニスト活性を有する環状ペプチドを開示している。しかし、これらのペプチド類似物は腸壁を通過せず、したがって経口生体利用能がない。
【００２１】
改良されたペプチド類似物
有機化学及び分子生物学における大きな進歩の結果として、今や多くの生物活性ペプチドが薬理学的及び臨床的利用に十分な量で調製することができる。したがって、ペプチドが関与する疾病の治療及び診断のための新規の方法がこの数年で確立してきた。
【００２２】
しかし、治療薬及び診断用薬としてのペプチドの使用は以下の要因によって制限されている。ａ）低い組織透過性、ｂ）胃腸管及び血清中での蛋白質分解に対する低い代謝安定性、ｃ）特に比較的大きな分子量又は特定の輸送系の欠如又はその両方に起因する経口摂取後の不十分な吸収、ｄ）肝臓と腎臓を通じた急速な排泄、及びｅ）ペプチド受容体が生物内に広範囲に分布することができるための非標的臓器系における望ましくない副作用である。
【００２３】
より大きな特異性を有するペプチド類似物を獲得し、それによって増強された臨床的選択性を獲得するのが望ましいであろう。天然のペプチド分子の欠点を克服する立体配座的に制約されたペプチド類似物を作製し、それによって改良された治療的性質を提供することが最も有益であると考えられる。
【００２４】
ペプチドの立体配座的制約への新規の概念的研究方法が、ペプチドの骨格環化を提唱するＧｉｌｏｎら（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９１，３１，７４５）によって導入された。骨格環化はペプチドに立体配座的制約を課す一般的方法である。骨格環化において、ペプチド骨格中の原子（Ｎ及び／又はＣ）は共有結合的に相互に連結されて環を形成する。
【００２５】
この戦略の理論的利点には、所与のペプチドの特異的な受容体との相互作用にとって極めて重大である可能性のある側鎖を妨げることなく、ペプチド骨格の炭素又は窒素を介して環化を達成できることがある。Ｇｉｌｏｎ及び共同研究者による追加開示（国際公開第９５／３３７６５号、国際公開第９７／０９３４４号、米国特許第５７２３５７５号、米国特許第５８１１３９２号、米国特許第５８８３２９３号、米国特許第６２６５３７５号、及び米国特許第６４０７０５９号）により、骨格環化ペプチド類似物の合成に必要な構成単位の作製方法が提供された。ブラジキニン類似物の骨格環化ペプチド類似物（米国特許第５８７４５２９号）、及びソマトスタチン活性を有する骨格環化ペプチド類似物（国際公開第９８／０４５８３号、国際公開第９９／６５５０８号、米国特許第５７７０６８７号、米国特許第６０５１５５４号、及び米国特許第６３５５６１３号）を作製するためのこれらの方法の成功した使用も開示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
代謝障害、たとえば肥満の治療のために使用する、インビボ安定性が増大した、経口で生体利用可能な合成αＭＳＨペプチド模倣類似物に対する必要性がなお存在する。ＭＣ４受容体に対するより大きな親和性及び選択性を有するαＭＳＨペプチド類似物を実現し、それによって代謝障害の治療のための薬剤化合物を実現すれば、望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
したがって、本発明は骨格環状ペプチド類似物である治療的に有用なαＭＳＨ類似物、これらのαＭＳＨ類似物を含む薬剤組成物及びその使用方法を提供する。特に、本発明は代謝障害の治療に有用な受容体特異的αＭＳＨ骨格環化類似物を提供する。肥満に付随しているメラノコルチン−４−受容体（ＭＣ−４Ｒ）に対するアゴニスト活性を有する本発明に従った新規類似物は、肥満を含む代謝障害の治療に使用される可能性がある。本発明に従って提供される前記類似物は、インビボで長期にわたる代謝安定性、高度な腸透過性、経口利用度、及び薬理活性を有している。
【００２８】
本発明の一態様に従えば、アミノ酸４〜１２個のペプチド配列を含む骨格環化αＭＳＨ類似物であって、少なくとも１つの構成単位、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合された前記ペプチド骨格の窒素原子１個を含有する前記構成単位を組み込んでいる骨格環化αＭＳＨ類似物であり、少なくとも１つの前記構成単位が、第２の構成単位、前記ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基からなる群から選択される部分と前記架橋原子団を介して結合して、環状構造を形成している骨格環化αＭＳＨ類似物が提供される。好ましくは、前記ペプチド配列はアミノ酸５〜８個を組み込んでいる。
【００２９】
いくつかの実施形態に従えば、前記架橋原子団は一般式（ＶＩＩ）：
Ｚ−（ＣＨ２）ｍ−Ｍ−（ＣＨ２）ｎ：
式（ＶＩＩ）
を有する化学的リンカーであり、ｍとｎはそれぞれ独立に１〜８までの整数であり、Ｍはジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋からなる群から選択され、Ｚは存在しないか又は２つのカルボキシル基を含む分子である。
【００３０】
本発明の一実施形態は、一般式（Ｉ）（配列番号２）
【化１】
2008542358.tif 000002
の骨格環状ペプチド類似物であって、Ｒはアミノ酸の側鎖、ＸはＯＨ、ＮＨ２又はエステル、ｍは１〜８までの整数を表し、ｎは１〜８までの整数を表す骨格環状ペプチド類似物である。
【００３１】
いくつかの実施形態に従えば、ｍは２〜５までの整数を表し、ｎは２〜６までの整数を表す。
【００３２】
本発明に従った別の実施形態は、一般式（ＩＩ）（配列番号３）
【化２】
2008542358.tif 000003
の骨格環状ペプチド類似物であって、ｍは１〜８までの整数を表し、ｎは１〜８までの整数を表す骨格環状ペプチド類似物である。
【００３３】
いくつかの実施形態に従えば、ｍは２〜５までの整数を表し、ｎは２〜６までの整数を表す。
【００３４】
式（ＩＩ）による好ましいペプチドは環の大きさが約２０から約２７原子であるペプチドである。さらに好ましいペプチドは、
ｎ＝２、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド
ｎ＝３、ｍ＝３である式（ＩＩ）のペプチド
ｎ＝３、ｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチド
ｎ＝３、ｍ＝５である式（ＩＩ）のペプチド
及び、ｎ＝２、ｍ＝４である式（ＩＩ）のペプチド
からなる群から選択される。
【００３５】
１つの現在好ましい実施形態は、本明細書でＢＢＣ−１と表されるｎ＝２及びｍ＝２である式（ＩＩ）のペプチドである。
【００３６】
本発明に従ったもう１つの実施形態は、式（ＩＩＩ）の骨格環状ペプチド類似物であり、
【化３】
2008542358.tif 000004
ｎは１〜８までの整数を表す。
【００３７】
いくつかの実施形態に従えば、ｎは２〜６までの整数を表す。
【００３８】
式（ＩＩＩ）に従った好ましいペプチドは、
ｎ＝２である式（ＩＩＩ）のペプチド
ｎ＝３である式（ＩＩＩ）のペプチド
ｎ＝４である式（ＩＩＩ）のペプチド
ｎ＝６である式（ＩＩＩ）のペプチド
からなる群から選択される。
【００３９】
本発明に従った別の実施形態は、式ＩＶの骨格環状ペプチド類似物であり、
【化４】
2008542358.tif 000005
ｎは１〜８までの整数を表す。
【００４０】
いくつかの実施形態に従えば、ｎは２〜６までの整数を表す。
【００４１】
式ＩＶに従った好ましいペプチドは、
ｎ＝２である式ＩＶのペプチド
ｎ＝３である式ＩＶのペプチド
ｎ＝４である式ＩＶのペプチド
ｎ＝６である式ＩＶのペプチド
からなる群から選択される。
【００４２】
別の態様に従えば、本発明は活性成分としてαＭＳＨの骨格環状ペプチド類似物を含む薬剤組成物を提供する。一態様に従えば、前記薬剤組成物は経口投与によって処方される。
【００４３】
さらに一態様に従えば、本発明は、メラノコルチン−４−受容体活性に付随する疾病又は障害の治療又は予防方法であって、αＭＳＨの骨格環状ペプチド類似物を活性成分として含む薬剤組成物の治療有効量をそれを必要とする被験者に投与することを含む治療又は予防方法を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態に従えば、前記障害は代謝障害である。一実施形態に従えば、前記代謝障害は糖尿病である。好ましい一実施形態に従えば、前記代謝障害は肥満である。
【００４５】
別の実施形態に従えば、前記活性成分の量は約１０から１０００μｇ／ｋｇの範囲にある。
【００４６】
さらに別の実施形態に従えば、本発明は、メラノコルチン−４−受容体活性に付随する疾病又は障害の治療又は予防のための薬剤の調製のためのαＭＳＨの骨格環状ペプチド類似物の使用を提供する。
【００４７】
本発明のこれらの及び他の実施形態は、本明細書に記載の図、説明、及び特許請求の範囲と併せると明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
骨格環状ペプチド模倣物研究法によって、メラノコルチン−４−受容体に対してアゴニスト活性を有する骨格環状ペプチドαＭＳＨ類似物が発見されたことを今や開示する。前記αＭＳＨ類似物は、好ましくは経口投与によって、肥満を含む代謝障害の治療に有用である。
【００４９】
本発明に従えば、インビボで高度な腸透過性、長期にわたる代謝安定性、経口利用度、及び薬理活性を有する、αＭＳＨの骨格環状ペプチド類似物を骨格環化ペプチド類似物のライブラリーから選択した。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「骨格環状ペプチド類似物」とは、ペプチド骨格の少なくとも１つの窒素若しくは炭素が、別のそのような窒素若しくは炭素から選択した部分、側鎖、又は前記ペプチドの末端の一方に結合しているアミノ酸残基の配列のことである。さらに、前記配列のペプチド結合の１つ又は複数が、還元されていてもよいし、非ペプチド結合によって置換されていてもよい。
【００５１】
用語「アミノ酸」とは、アミノ基及びカルボン酸基を、好ましくは炭素骨格上の１，２−、１，３−、又は１，４−置換パターンで有する化合物のことである。α−アミノ酸が最も推奨され、これには蛋白質に含まれる２０種類の天然アミノ酸（グリシンを除いてＬ−アミノ酸である）、対応するＤ−アミノ酸、対応するＮ−メチルアミノ酸、側鎖改変アミノ酸、蛋白質に含まれない生合成的に入手可能なアミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシ−プロリン、５−ヒドロキシ−リシン、シトルリン、オルニチン、カナバニン、ジエンコル酸、β−シアノラニン）、及びアミノ−イソ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、ホモシステイン、ホモセリンなどの合成的に誘導されるα−アミノ酸がある。β−アラニンとγ−アミノ酪酸は、それぞれ１，３及び１，４−アミノ酸の実例であり、他にも多数が当技術分野では周知である。スタチン様アイソスター（２つのアミノ酸を含み、ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨで置換されているジペプチド）、ヒドロキシエチレンアイソスター（２つのアミノ酸を含み、ＣＯＮＨ結合がＣＨＯＨＣＨ２で置換されているジペプチド）、還元アミドアイソスター（２つのアミノ酸を含み、ＣＯＮＨ結合がＣＨ２ＮＨ結合で置換されているジペプチド）、及びチオアミドアイソスター（２つのアミノ酸を含み、ＣＯＮＨ結合がＣＳＮＨ結合で置換されているジペプチド）も本発明にとって有用な残基である。
【００５２】
本発明において使用するアミノ酸は、市販されているか又は通例の合成方法により入手可能であるアミノ酸である。ある種の残基はペプチドに取り込むためには特別な方法が必要な場合があり、本発明においては前記ペプチド配列への逐次的、分岐的、又は収束的合成方法が有用である。天然のコード化されているアミノ酸及びその誘導体は、ＩＵＰＡＣ協約に従って３文字コードで表す。特に指示がない場合には、Ｌ型異性体を用いた。Ｄ型異性体は残基略称の前に“Ｄ”を置いて示している。
【００５３】
当業者には公知のアミノ酸の保存的置換は本発明の範囲内である。同類アミノ酸置換には、１つのアミノ酸を同種の官能基又は側鎖（たとえば、脂肪族、芳香族、正電荷を帯びた、負電荷を帯びたもの）を有する別のアミノ酸で置換することがある。これらの置換は、経口生体利用能、中枢神経系への浸透、特定の細胞集団へのターゲティング等を増強する可能性がある。ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は蛋白質配列に対して、前記コード化された配列中の単一のアミノ酸若しくはわずかな割合のアミノ酸を改変したり、付加したり、又は欠失させる個別の置換、欠失、又は付加は、改変によってアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換されている「同類改変変異体」であることを、当業者は理解するであろう。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野では周知である。
【００５４】
以下の６グループにはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸が含まれる。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
【００５５】
本明細書で使用する際、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の配列のことである。本発明に従ったペプチドは４〜１２アミノ酸残基、好ましくは５〜８残基の配列を含んでいる。本発明に従ったペプチド類似物は、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、又はその他のあらゆる共有結合などのアミド置換結合である少なくとも１つの結合を随意に含んでいてよい。
【００５６】
本発明のペプチドの塩及びエステルは本発明の範囲に含まれている。本発明のペプチドの塩は、生理学的に受容可能な有機及び無機塩である。本発明のペプチドの官能性誘導体は、残基又はＮ−若しくはＣ−末端基の側鎖として存在する官能基から当技術分野で公知の手段によって調製することができる誘導体を網羅しており、さらに、薬剤として受容可能なままである、すなわちペプチドの活性を無効にせずペプチドに含まれる組成物に毒性を与えない限り、本発明に含まれる。これらの誘導体としては、たとえば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとの又は１級若しくは２級アミンとの反応によって生成するカルボキシル基のアミド、アシル部分との反応によって形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえば、アルカノイル又は炭素環式アロイル基）、又はアシル部分との反応によって形成される遊離ヒドロキシル基（たとえば、セリル又はスレオニル残基の遊離ヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体がある。
【００５７】
用語「類似物」とは、１つ又は複数のアミノ酸変化を除いて本発明に従ったアミノ酸配列を有する分子のことである。適切な「類似物」の設計にはコンピュータを使用してもよい。本発明に従ったペプチド類似物は、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、又はその他のあらゆる共有結合などのアミド置換結合である少なくとも１つの結合を随意に含んでいてよい。
【００５８】
用語「ペプチド模倣物」とは、本発明に従ったペプチドが少なくとも１つのコード化されていない残基又は非ペプチド結合を含むように改変されていることを意味する。当該改変には、たとえば、１つ又は複数の残基のアルキル化、さらに具体的にはメチル化、天然アミノ酸の非天然アミノ酸による挿入又は置換、アミド結合の他の共有結合による置換がある。本発明に従ったペプチド模倣物は、尿素結合、カルバメート結合、スルホンアミド結合、ヒドラジン結合、又はその他のあらゆる共有結合などのアミド置換結合である少なくとも１つの結合を随意に含んでいてよい。適切な「ペプチド模倣物」の設計にはコンピュータを使用してもよい。
【００５９】
「安定な化合物」又は「安定な構造」とは、本明細書においては、反応混合物からの有用な程度の純度への分離、及び効果的な治療薬への製剤ができるだけの十分に堅牢な化合物を意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合の用語「置換された」とは、指定された原子の通常の原子価を超えず、置換によって安定な化合物が得られるという条件で、指定された原子上のどれか１つの又は複数の水素原子が指定された原子団から選択されたもので置換されていることを意味する。
【００６１】
どの変数（たとえば、ｎ、ｍなど）が本明細書のどの構成成分又はどの化学式において複数回出現する場合でも、それぞれ出現した際の変数の定義は他のあらゆる出現時の変数の定義とは無関係である。その上、置換基及び／又は変数の組合せは、当該組合せから安定な化合物が得られる場合に限り許容される。
【００６２】
用語「受容体アゴニスト」とは、細胞上の受容体と結合して天然に存在する物質に典型的な生理的反応を引き起こすことができる分子のことである。
【００６３】
用語「ＭＣ−４受容体のアゴニスト」とは、好ましくは、前記分子がＭＣ受容体サブタイプ４によって媒介されるαＭＳＨの作用のうちの少なくとも１つを模倣することができることを意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、語句「治療有効量」とは、肥満などであるが、それだけに限らない本明細書に開示している適応症に対する所望の成果を達成するために宿主に投与する、新規の骨格環化ペプチド類似物又は前記類似物を含む組成物の量を意味する。
【００６５】
ペプチドの骨格環化
骨格環化類似物とは、新規の非ペプチド結合を許すアミノ酸のα窒素又はαカルボニルに結合している架橋原子団を介して環化されたペプチド類似物のことである。概して、当該ペプチド類似物をその構成単位から構築するために使用する手順は、ペプチド合成の既知の原理に依存している。最も都合がよいことには、前記手順は固相ペプチド合成の既知の原理に従って実行することができる。骨格環化ペプチドの固相合成中、保護された構成単位は、他のアミノ酸のカップリングに類似する方法でペプチド鎖のＮ末端に又はペプチドレジンにカップリングされる。ペプチド集合体（アセンブリー）の完成後、保護基は構成単位の官能基から取り除かれ、環化は前記構成単位の官能基と第２の構成単位、前記ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、及びＮ末端アミノ酸残基から選択された第２の官能基をカップリングすることによって実現される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「骨格環状ペプチド」又は「骨格環状類似物」とは、好ましくは３〜２４アミノ酸のペプチド配列を含む直鎖ペプチドの類似物であって、少なくとも１つの構成単位、アミド、チオエーテル、チオエステル、ジスルフィド、尿素、カルバメート、又はスルホンアミドを含む架橋原子団に結合している前記ペプチド骨格の窒素原子１個を含有する前記構成単位を組み込んでいる直鎖ペプチドの類似物であり、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、前記配列のアミノ酸残基の側鎖又は末端アミノ酸残基からなる群から選択された部分と、環状構造を形成することになる前記架橋原子団を介して結合している直鎖ペプチドの類似物のことである。
【００６７】
「構成単位（ＢＵ）」とは、Ｎα又はＣα誘導体化アミノ酸のことである。Ｎα誘導体化アミノ酸は一般式（Ｖ）
【化５】
2008542358.tif 000006
によって表され、Ｘはアルキレン、置換アルキレン、アリレーン、シクロアルキレン、及び置換シクロアルキレンからなる群から選択されたスペーサー基であり、Ｒ’は特定の保護基と随意に結合しているアミノ酸側鎖であり、Ｇはアミン、チオール、アルコール、カルボン酸、スルホン酸、エステル、及びハロゲン化アルキルからなる群から選択された官能基であり、前記Ｎα誘導体化アミノ酸は前記ペプチド配列に組み込まれ、その後官能基Ｇを介して、前記ペプチド配列内のアミノ酸側鎖の１つ、前記ペプチド末端の一方、又は別のω−官能性アミノ酸誘導体で選択的に環化される。
【００６８】
本発明は、一般式（ＶＩ）のＮα誘導体化グリシンを用いることによって例示され、
【化６】
2008542358.tif 000007
Ｘがアルキレン、Ｒ’が水素、Ｇがアミンであり、Ｎα誘導体化グリシンは前記ペプチド配列に組み込まれて、その後官能基Ｇを介して、前記ペプチド配列のＮ末端に結合しているカルボキシル基で選択的に環化される。
【００６９】
本発明における構成単位はその化学構造を前記ペプチド配列の一部として描かれるか、又は反応基の種類（アミンを表すＮ、カルボキシルを表すＣ）を前に付けた対応する改変アミノ酸の３文字コードによって略記されている。たとえば、Ｎ−Ｇｌｙは、アミン反応基を有する改変Ｇｌｙ残基を表しており、したがって、本発明に従えば、骨格環化ペプチドの配列内のＮ−ＧｌｙはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２に等しい。
【００７０】
前記構成単位作製のための方法論は、国際公開第９５／３３７６５号及び国際公開第９８／０４５８３号として公開された国際特許出願、並びに米国特許第５７７０６８７号及び第５８８３２９３号に記載されており、これらの文書は、その全体が本明細書に説明されているかのように、全て参照によって本明細書に明確に組み込まれている。
【００７１】
本発明に従った用語「架橋原子団」とは、前記ペプチド骨格の窒素原子を、第２の構成単位に、前記配列のアミノ酸残基の側鎖に、又は末端アミノ酸残基に結合させている化学的リンカー又はスペーサーのことである。いくつかの実施形態に従えば、前記化学的リンカー又はスペーサー基は、一般式ＶＩＩ
Ｚ−（ＣＨ２）ｍ−Ｍ−（ＣＨ２）ｎ
式（ＶＩＩ）
によって表され、ｍとｎがそれぞれ無関係に１〜８の整数であり、Ｍはジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋からなる群から選択され、Ｚは存在しないか又はジカルボン酸などの２つのカルボキシル基を含む分子である。本発明に従ったＺの非限定的な実例は、コハク酸残基及びフマル酸残基である。
【００７２】
本発明に従った骨格環化ペプチドは、ペプチド模倣物手法を含む、当技術分野で公知のいずれの方法を使用して合成してもよい。これらの方法には、固相並びに液相合成法がある。これらの方法の非限定的な実例は、本明細書に記載されている。本発明の化合物のような化合物を調製するための当技術分野で公知の他の方法は、利用することができるし、本発明の範囲に含まれる。
【００７３】
本発明に従った骨格環化ペプチド類似物の設計及び合成のための方法は、米国特許第５８１１３９２号、第５８７４５２９号、第５８８３２９３号、第６０５１５５４号、第６１１７９７４号、第６２６５３７５号、第６３５５６１３号、第６４０７０５９号、第６５１２０９２号、及び国際特許出願ＷＯ第９５／３３７６５号、ＷＯ第９７／０９３４４号、ＷＯ第９８／０４５８３号、ＷＯ第９９／３１１２１号、ＷＯ第９９／６５５０８号、ＷＯ第００／０２８９８号、ＷＯ第００／６５４６７号、ＷＯ第０２／０６２８１９号に開示されている。これらの方法は全て参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。
【００７４】
骨格環化の最も顕著な利点は、１）ペプチドの側鎖のどれも損なうことなく、したがって生物学的認識（たとえば、特異的な受容体に結合すること）及び機能に不可欠な官能基を犠牲にする可能性を減らして、ペプチド配列の環化が実現される、２）架橋長と、環内での結合の種類（たとえば、アミド、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、尿素、カルバメート、又はスルホンアミド等）、結合方向、及び結合位置を変更することによりペプチド立体配座の最適化が達成される、３）既知の活性の直鎖ペプチドの環化に適用された場合、架橋は、ペプチドの活性領域及びその同族受容体との相互作用を最小限に抑えるように設計することができることである。これにより、環化アームが認識及び機能を妨げる可能性が減少する。
【００７５】
「骨格環状ペプチド模倣物」手法の原理は以下の段階に基づいている。（ｉ）標的蛋白質の活性残基の解明、（ｉｉ）活性残基及びその立体配座を取り囲むプロトタイプ骨格環状ペプチドの集合体の設計及びモデル化は親蛋白質の設計及びモデル化に類似している、（ｉｉｉ）各骨格環状プロトタイプを指標化合物が発見されるまでサイクロスキャン（ｃｙｃｌｏｓｃａｎ）すること、（ｉｖ）最良の指標化合物の構造解析、及び（ｖ）反復による最適化。
【００７６】
「サイクロスキャン」とは、立体配座的に制約された骨格環状ペプチドライブラリーに基づく選別方法であって、所与の配列から誘導される最も活性の高い骨格環状ペプチドを迅速に検出することができる、国際公開第９７／０９３４４号に開示されている選別方法である。この開示の教示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。骨格環化の方式、環の位置、環の大きさ及び環の化学的性質を含むサイクロスキャンの多様性のために、その立体配座だけが徐々に離散する形で異なる多数の配列的に偏ったペプチドが生成される。
【００７７】
薬理学
他の考慮すべき事項は別として、前記発明の新規活性成分はペプチド、ペプチド類似物又はペプチド模倣物であるという事実は、前記処方がこれらの種類の化合物の送達に適していることを指示している。しかし、通常、ペプチドは胃酸又は腸内酵素による消化に対する感受性のために経口投与に比較的適していない。本発明に従えば、代謝的に安定で経口投与可能なペプチド模倣類似物を合成するために新規の骨格環化方法が用いられている。本発明の好ましいペプチド投与経路は経口投与である。
【００７８】
他の投与経路は、関節内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、又は髄腔内である。
【００７９】
本発明の薬剤組成物は当技術分野で周知の工程、たとえば、従来の混合、溶解、造粒、粉砕、微粉砕、糖衣作製、湿式粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥工程によって製造することができる。
【００８０】
したがって、本発明に従って使用するための薬剤組成物は、賦形剤及び助剤を含む担体であって、前記活性化合物を薬剤として利用することができる製剤に加工することを促進する１つ又は複数の生理的に受容可能な担体を使った従来の方式で処方してもよい。適切な処方は選択した投与経路に依存している。
【００８１】
経口的に使用することができる薬剤組成物には、ゼラチン製の押込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作製したソフト密封カプセルが含まれる。前記押込み型カプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び随意に安定剤と混合した前記活性成分を含有していてよい。ソフトカプセルでは、活性化合物は脂肪油、流動パラフィン、又は流動ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解していても懸濁していてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。
【００８２】
注射用には、本発明の化合物は水溶液、好ましくは、ハンク液、リンガー液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液で処方してもよい。経粘膜投与用には、通過すべき障壁に適合している浸透剤を処方に使用する。たとえば、ポリエチレングリコールなどの浸透剤が当技術分野では一般的に知られている。
【００８３】
糖衣錠用コアには適切な被膜が付いている。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液、及び適切な有機溶媒又は混合溶媒を随意に含有してもよい、濃厚な糖溶液を使用し得る。識別用に又は活性化合物量の異なる組合せを特徴付けるために、染料又は色素を錠剤又は糖衣錠被膜に添加してもよい。
【００８４】
口腔投与用には、前記組成物は従来の方式で処方された錠剤又はトローチ剤の形をとってもよい。
【００８５】
吸入による投与用には、本発明に従って使用するための変異形は、適切な推進剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を利用して加圧パック又は噴霧器からエアロゾルスプレー提示の形で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合は、用量単位は定量を送達するための弁を提供することにより決定してもよい。前記ペプチドの混合粉体、及び乳糖又はデンプンなどの適切な粉末基剤を含有する、吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）又はガス注入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するためのたとえばゼラチンのカプセル及びカートリッジを処方してもよい。
【００８６】
非経口投与のための薬剤組成物は、前記活性成分の水溶液を水溶性の形で含む。さらに、前記活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。適切な天然又は合成担体は当技術分野では周知である（Ｐｉｌｌａｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５，４４７，２００１）。随意に、前記懸濁液は、前記化合物の溶解性を増大させて高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は物質を含有してもよい。代案として、前記活性成分は、適切な媒体、たとえば発熱物質のない減菌水で使用前に液戻しするために粉末形態でもよい。
【００８７】
本発明の化合物は、たとえばココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使って、坐薬又は保持浣腸などの直腸組成物で処方してもよい。
【００８８】
本発明に照らして使用するに適切な薬剤組成物には、前記活性成分が所望の目的を達成するのに有効な量で含有される組成物がある。さらに具体的には、治療的有効量とは、治療中の被験者の疾患の症状を予防したり軽減したり又は改善するのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は当業者の能力の範囲内である。
【００８９】
本明細書に記載のペプチドの毒性及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物での標準的な薬学の手順によって、たとえば対象化合物に対するＩＣ５０（５０％抑制を提供する濃度）及びＬＤ５０（試験動物の５０％に死をもたらす致死量）を決定することによって、判断することができる。これらの細胞培養評価及び動物研究から得られる資料はヒトに使用するための用量の範囲を確定するために利用することができる。前記用量は用いる剤形及び利用する投与経路によって変化してよい。正確な処方、投与経路及び用量は被験者の容体を考慮して個々の医師が選択することができる（たとえば、Ｆｉｎｇｌ，ら、１９７５“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ｐ．１）。
【００９０】
当該薬剤組成物の好ましい投与量は、約０．１μｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。好ましくは、前記活性成分の量は約１０から１０００μｇ／ｋｇの範囲にある。
【００９１】
治療すべき容体の重症度及び反応性によって、投薬は、数日から数週間続く治療と共に、又は治癒するか、病状の減少が実現されるまで、除放組成物の単回投与でもよい。投与すべき組成物の量は、当然ではあるが、治療中の被験者、苦痛の重症度、投与方法、処方する医師の判断、及び他のあらゆる関連要因に依存するであろう。
【００９２】
αＭＳＨ類似物の一般スクリーニング
αＭＳＨ類似物をメラノコルチン−４（ＭＣ４）受容体に結合している天然ペプチド（アグーチ関連蛋白質）に対するその阻害を調べるためにインビトロで一般的に試験する。前記類似物はさらに環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルに対するその影響をインビトロで試験することができる。前記類似物の腸透過性及び代謝安定性をインビボで試験することができる。前記類似物は投与の最適方式及び適正量を特定し、これらの新しい潜在的治療薬の安全性及び有効性を立証するために前臨床モデルにおいてインビボでさらに試験することができる。
【００９３】
本発明を実行するための好ましい方式
本発明によれば、αアミノ酸のα窒素に結合している架橋原子団を有する新規の構成単位を組み込んでいることを特徴とする新規ペプチド類似物が開示される。具体的には、これらの化合物は、アミノ酸４〜１２個のペプチド配列を含む骨格環化αＭＳＨ類似物であって、少なくとも１つの構成単位、ジスルフィド、アミド、チオエーテル、チオエステル、イミン、エーテル、又はアルケンの架橋を含む架橋原子団に結合された前記ペプチド骨格の窒素原子１個を含有する前記構成単位を組み込んでいる骨格環化αＭＳＨ類似物であり、少なくとも１つの構成単位が、第２の構成単位、前記ペプチド配列のアミノ酸残基の側鎖、又はＮ末端アミノ酸残基と前記架橋原子団を介して結合して、環状構造を形成している骨格環化αＭＳＨ類似物である。好ましくは、前記ペプチド配列は４から１２残基を、さらに好ましくは５から８アミノ酸を組み込んでいる。
【００９４】
本発明の原則に従えば、ホルモンαＭＳＨの活性領域に基づく骨格環状ペプチドであって、前記ＭＣ４受容体を活性化する骨格環状ペプチドが提供される。この目的のために、前記ＭＣ４Ｒ活性親配列のＰｈｅ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号１）に基づく骨格環状ペプチドのライブラリーを合成した。前記ライブラリー中のペプチド全てが前記親配列を有する。前記ペプチドはその環の大きさ及び環の化学が互いに相違している。
【００９５】
全ペプチドの、ＭＣ４Ｒ機能性及び選択性、並びに、インビトロ腸内吸収及び腸内代謝低下を調査した。本明細書でＢＢＣ−１と示されている１つのペプチドは、高度な腸内代謝安定性及び透過性を有したまま高度に機能的で選択的であることが見出された。マウスのインビボ研究によって、経口的に投与すると２４時間にわたって食物消費が〜４０％低下することが明らかになった。
【００９６】
本発明に従った現在好ましい実施形態は、式ＩＩの骨格環状ペプチド類似物（配列番号３）である。
【００９７】
本発明の現在好まれるペプチドは、本明細書においてＢＢＣ−１と示されている（図６）。ＢＢＣ−１は、ＭＣ４Ｒの特異的活性化のために選択されたが、増強されたインビトロ腸透過性と共に酵素的に安定であることが見出された。マウスでのＢＢＣ−１の単回経口投与では２４時間の間食物消費が減少した。
【００９８】
本発明の骨格環状類似物は高親和性でＭＣ４受容体に結合する。この受容体選択性はインビボでの潜在的な生理的選択性を示している。さらに、本発明は、特異的ＭＣ４受容体選択性を有する骨格環化類似物のパネルを獲得する可能性を初めて提供している。これにより、肥満を含む代謝障害における治療的使用が可能になっている。
【００９９】
本発明の前記αＭＳＨ類似物は、肥満を治療し又は体重超過の予防に、食欲を調節し、満腹感を誘発し、体重の減量に成功した後の体重の再増加を防ぎ、エネルギー消費を増大させ、及び体重超過又は肥満に関連する疾病又は状態を治療するために用いることができる。
【０１００】
本発明の前記αＭＳＨ類似物を含有する前記薬剤組成物は、不快なほど増加した体重を、それだけで、又は２型糖尿病などの有害な病状又は疾病の一部として、経験しているヒト又は動物被験者への種々の方法による投与に有効な強度で処方してもよい。
【０１０１】
本発明のαＭＳＨ類似物は、２型糖尿病の治療用の、及び１型糖尿病の治療用の主要薬剤として有用である。本発明に従った前記αＭＳＨ類似物は、１型又は２型糖尿病の治療用の補助薬剤としても有用である。
【０１０２】
前記αＭＳＨ類似物は、異常なグルコース代謝によって引き起こされる、又は同期する疾病の治療法として使用することができる。前記αＭＳＨ類似物は、耐糖能障害（ＩＧＴ）から２型糖尿病への進行を遅延させる、及び２型糖尿病からインスリン要求性糖尿病への進行を遅延させるために使用することができる。
【０１０３】
この時点で、本発明を一般的に記載し終えたので、前記同一内容は以下の実施例を参照することによってさらに容易に理解されるであろう。以下の実施例は説明によって提供されるが、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
材料と方法
ペプチド合成
保護アミノ酸の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）、ブロモ−トリス−ピロリドン−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒｏｐ）、リンクアミドメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレンレジン、並びに固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）用の多くの有機の及び支持体はＮｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ラウフェルフィンゲン、スイス）より購入した。ビス（トリクロロメチル）カーボネート（ＢＴＣ）はＬａｎｃａｓｔｅｒ（ランカスター、英国）より購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の溶剤はＢｉｏ−Ｌａｂ（エルサレム、イスラエル）より購入した。グリオキシル酸、１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン、及び１，４−ジアミノブタンはＭｅｒｃｋ（ダルムシュタット、ドイツ）から購入し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）はＡＣＲＯＳ（ヘール、ベルギー）から購入した。
【０１０５】
有機化学用の溶剤はＦｒｕｔａｒｏｍ（ハイファ、イスラエル）から購入した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒＡＭＸ−３００ＭＨｚ分光計により記録した。質量スペクトルはＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱＤＵＯイオントラップ質量分析計により実施した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＭｅｒｃｋ  Ｆ２４５６０シリカゲル平板（ダルムシュタット、ドイツ）により実施した。ＨＰＬＣ分析はＶｙｄａｃ分析用ＲＰカラム（Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ、カタログ番号２０１ＴＰ５４）を使って実施し、Ｍｅｒｃｋ−日立Ｌ−７１００ポンプ及び２１５ｎｍで作動するＭｅｒｃｋ−日立Ｌ−７４００可変波長検出器により実施した。移動相は、溶剤Ａが０．１％ＴＦＡ水溶液に相当し、溶剤Ｂが０．１％ＴＦＡのアセトニトリル（ＡＣＮ）に相当する勾配系から構成された。移動相は、９５％Ａを０から５分で開始し、続いて５から５５分で５％Ｂから９５％Ｂの直線的勾配により実施した。前記勾配は追加の５分間９５％Ｂのままにおき、その後９５％Ａと５％Ｂに６０から６５分で滴下した。前記勾配は追加の５分間９５％Ａのままにおき、カラム平衡を達成した。前記移動相の流量は１ｍＬ／分であった。ペプチド精製は逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（Ｌ−６２００Ａポンプ、Ｍｅｒｃｋ−日立、日本）により、Ｖｙｄａｃ調製用ＲＰカラム（Ｃ８、２２×２５０ｍｍ、カタログ番号２１８ＴＰ１０２２）を用いて実施した。調製用ＨＰＬＣは全て、溶剤Ａが０．１％ＴＦＡ水溶液に相当し、溶剤Ｂが０．１％ＴＦＡのＡＣＮに相当する勾配系を用いて実施した。
【０１０６】
（実施例１）
骨格環状αＭＳＨ類似物の固相ペプチド合成（図１）
前記合成は、一般Ｆｍｏｃ化学プロトコルに従って、焼結ガラス底を備えた反応容器内で実施した。リンクアミドメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）レジン（１ｇ、０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）をＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中で２時間前膨潤した。Ｆｍｏｃ脱保護段階は２０％ピペリジンのＮＭＰ（２×３０分）で実施し、続いてＮＭＰ（５×２分）及びＤＣＭ（２×２分）で洗浄した。前記構成単位であるＦｍｏｃ−Ｎα（エチルアミン−Ａｌｌｏｃ）Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＮ２）の前記レジンへのカップリング及びＦｍｏｃ−アミノ酸−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−Ａｘｘ−ＯＨ）の前記構成単位へのカップリングは以下の通りに実施した。Ｆｍｏｃ−ＧｌｙＮ２（３ｅｑ．、１．９８ｍｍｏｌ）及びビス−（トリクロロメチル）カーボネート（ＢＴＣ、トリホスゲン）（１ｅｑ．、０．６６ｍｍｏｌ）をＤＣＭに懸濁した。２，４，６−コリジン（１０ｅｑ．、６．６ｍｍｏｌ）を氷浴中で予め冷却した前記懸濁液に添加した。固体分を全て溶解させた後（約１分）、その溶液をレジン上に注ぎ、室温で３時間振盪した。このカップリングサイクルをもう１度繰り返した。２回目のカップリングサイクル終了時、前記ペプチド−レジンをＤＣＭで洗浄した（５×２分）。キャッピングは、最初のアミノ酸の後に実施し、前記ペプチド−レジンと、無水酢酸（１．１ｍＬ、０．５Ｍ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（０．５ｍＬ、０．１２５Ｍ）のジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）（２５ｍＬ）混合溶液の反応によって２度繰り返した。キャッピングに続きＤＭＦ（５×２分）、ＤＣＭ（２×２分）、及びＮＭＰ（２×２分）によるレジン洗浄を行った。Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨのカップリングをカップリング剤としてＢＴＣを使って上記と同じ方法で実施した。ペプチジル−レジン上の最後のアミノ酸（Ｐｈｅ）は、１ｅｑ．のＤＭＡＰ及び１０ｅｑ．のＤＩＥＡ存在の下、１０ｅｑ．の無水コハク酸（ｍ＝２）のＮＭＰにより室温で２時間アシル化した。
【０１０７】
前記レジンはＮＭＰ（２×５分）及びＤＣＭ（２×５分）で洗浄し、乾燥器で一晩乾燥させ、Ａｌｌｏｃ保護基の構成単位からの除去は、アルゴン下、酢酸（５％）及びＮ−メチルモルホリン（２．５％）を含有するＮＭＰ中テトラキス（トリフェニルホスフィン）Ｐｄ（０）（０．１ｅｑ．０．０６６ｍｍｏｌ）により実施した。この段階は暗所中４時間激しく振盪して実施した。洗浄段階はクロロホルム（８×２分）及び０．５％ＤＩＥＡのＮＭＰ（３×２分）により実施した。Ａｌｌｏｃ脱保護に続いて、前記ペプチドは６ｅｑ．ＰｙＢｏＰ及び１２ｅｑ．ＤＩＥＡのＮＭＰを添加して環化させた（２度繰り返す）。洗浄段階はＮＭＰ（５×２分）及びＤＣＭ（５×２分）により実施した。前記ペプチジル−レジンは真空の下一晩乾燥させた。
【０１０８】
前記レジンからの切断及び側鎖保護基の除去は、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＤＷ及び２．５％トリスイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の予め冷却した混合液を使って同時に実施した。前記レジンを添加後、その混合液を氷浴中で３０分攪拌し、その後室温で２時間半振盪した。結合したＴＦＡろ液は窒素の蒸気により蒸発乾固させた。油性残渣は冷エーテルを使って３回粉砕してそのスカベンジャーを除去し、エーテルは遠心分離によって除去した。前記乾燥粗ペプチドはＡＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）中に溶解し、凍結乾燥した。
【０１０９】
（実施例２）
構成単位の合成
（ｉ）グリシン誘導構成単位の合成は図２に従って実施した。
（ｉｉ）Ａｌｌｏｃ−ＮＨ（ＣＨ２）２−４ＮＨ２（１）の調製
１ｍｏｌの１，２−ジアミノエタン、１，３−ジアミノプロパン又は１，４−ジアミノブタン（それぞれ、１０ｅｑ．６６．８５ｍｌ、８２．４０ｍｌ、又は９８．０５ｍｌ）をクロロホルム（５００ｍＬ）に溶解し、氷浴中で冷却した。冷却した前記溶液に、０．１ｍｏｌアリルクロロホルメート（１ｅｑ．）のクロロホルム（２５０ｍＬ）を３時間かけて０℃で液滴により添加し、その後室温で一晩攪拌した。前記反応混合液を水（２００ｍＬ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させた。
（ｉｉｉ）Ａｌｌｏｃ−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（２）の合成
ＮａＣＮＢＨ３（１．１ｅｑ．０．０５２ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中に添加した。化合物（１）（０．０４５４ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解し、前記ＮａＣＮＢＨ３溶液に添加した。グリオキシル酸（０．９５ｅｑ．０．０４３４ｍｏｌ）を添加し、反応物は一晩攪拌した。前記ＭｅＯＨは減圧下で蒸発させた。
（ｉｖ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ（Ｎｎ）Ａｌｌｏｃ−ＯＨ（３）の合成
前記残留物を水（１１０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１１ｍＬ、０．０７９ｍｏｌ）を添加した。ＡｃＣＮ（１７０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（９．８２ｇ、０．０２９１ｍｏｌ）を添加し、反応物は４時間攪拌したがｐＨはトリエチルアミンによりアルカリ性に保った。前記反応混合液は石油エーテルＰＥ（１８０ｍＬ×３）及びエーテル：ＰＥ  ７：３（１８０ｍＬ×３）により洗浄した。前記水層は２Ｍ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）により冷却の下でｐＨ３〜４まで酸性にし、酢酸エチル（ＥＡ）（１５０ｍＬ×４）により抽出した。前記有機層は１Ｍ  ＨＣｌ（１００ｍＬ×２）及び飽和ＫＨＳＯ４（１００ｍＬ×２）により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空中で蒸発させ、５．５０ｇ、０．０１１５ｍｏｌ（３９．５％）の無色の油を生成し、後で凝固させた。前記生成物はさらに精製せずにＳＰＰＳに使用した。
【０１１０】
（実施例３）
ペプチド合成
前記骨格環状ペプチドの構造、並びにそのＭＳ及び純度を表１に示している。前記ペプチドは全て同一配列、すなわちＰｈｅ−Ｄｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＮＨ２並びに同一ラクタム環位置、つまりＧｌｙのＮαとアミノ末端の間、を有している。前記ライブラリー中のペプチドはその環の大きさと環の化学的性質が互いに相違している。環の大きさは２０原子（ペプチドＭＣＲ４−１）から２５原子（ペプチドＭＣ４−１４）までの範囲である。前記環の化学的性質の相違は、環の大きさは同一であるがラクタム環内のアミド結合の位置が相違するペプチドを生じるアルキル鎖の相対的大きさ、ｎとｍを変化させることによって実現される。たとえば、ペプチドＭＣＲ４−６、ＭＣＲ４−１０及びＭＣＲ４−１１全てが２２原子という環の大きさを有するが、互いにｎとｍが相違する。したがって、ペプチドＭＣＲ４−６はｎ＝３とｍ＝３を有するが、ペプチドＭＣＲ４−１０はｎ＝２とｍ＝４を有し、ペプチドＭＣＲ４−１１はｎ＝４とｍ＝２を有する。
【０１１１】
（実施例４）
腸透過性の評価
細胞の培養と維持：Ｃａｃｏ−２細胞をＡＴＣＣから入手し、次に７５ｃｍ２フラスコ内でおよそ０．５×１０６細胞／フラスコ、３７℃、５％ＣＯ２環境及び相対湿度９５％により培養する。培地は、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で構成されていた。前記培地は毎週２回取り替える。
【０１１２】
輸送研究のための細胞の調製：輸送研究のために、継代範囲が６０〜６６の細胞を２５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、０．４μｍ細孔及び１ｃｍ２の表面積を有するポリカーボネート膜の未処理培養挿入体上に播種する。Ｃａｃｏ−２単層を含有する前記培養挿入体を２４トランスウェルプレート１２ｍｍＣｏｓｔａｒ（商標）に置く。前記培地は１日おきに交換する。輸送研究は、前記細胞が完全に識別されＴＥＥＲ値が安定する（３００〜５００μｃｍ２）播種から２１〜２３日後に実施する。
【０１１３】
実験手順：輸送研究は、前記単層の両側から培地を取り外し、頂端（ａｐｉｃａｌ）緩衝液（５５０μｌ）及び基底（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）緩衝液（１２００μｌ）で交換することにより開始し、両方を３７℃まで温める。前記細胞は３０分間３７℃で振盪（１００サイクル／分）しながらインキュベートする。インキュベーション期間後、前記緩衝液を除去し基底側では１２００μｌ基底緩衝液で交換する。試験液は予め３７℃まで温め、前記単層の頂端側に添加する（６００μｌ）。５０μｌ試料を実験開始時直ちに前記頂端側から採取し、実験中５５０μｌ頂端容積になる。前期実験期間の間、前記細胞は振盪しながら３７℃に保つ。予測時間（３０、６０、９０、１２０、１５０及び１８０分）に、２００μｌ試料を基底側から採取し、同容積の新しい基底緩衝液で交換し一定容積を維持する。
【０１１４】
（実施例５）
腸内代謝安定性の評価
刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）を、結合した十二指腸、空腸、及び上部回腸からＣａ＋＋沈殿法（ＰＥＥＲＣＥ）により調製した。５匹の雄性ウィスターラットの腸２００〜２５０ｇを氷冷０．９％ＮａＣｌですすぎ、粘膜を取り除き、前記粘膜は前記管腔表面からガラススライドを使って擦り取り、直ちに５０ｎＭ  ＫＣｌ及び１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５、４℃）を含有する緩衝液に入れ、前記混合物はＰｌｏｙｔｒｏｎ（ＰｌｏｙｔｒｏｎＰＴ１２００、ＫｉｎｅｍａｔｉｃａＡＧ、スイス）によりホモジネートした。ＣａＣｌを最終濃度１０ｍＭになるまで添加した。前記ホモジネートは３０分４℃で振盪したままにし、後に１００００ｇで１０分間遠心分離にかけ（遠心分離機）、その後前記上澄みを４８０００ｇで３０分遠心分離にかけ、前記沈殿物を３００ｍＭマンニトール及び１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に懸濁し２４０００ｇ／時で遠心分離にかけることによりさらに２回精製した。刷子縁膜の精製物は、刷子縁膜酵素マーカーＧＧＴ、ＬＡＰ及びアルカリホスファターゼを使って検定した。これらの研究中、刷子縁膜酵素の濃縮は１３から１８倍の間で変化した。
【０１１５】
（実施例６）
受容体結合検定
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を結合緩衝液８により洗浄し、９６ウェルプレート（おおよそ４００００細胞／ウェル）に播種した。次に、前記細胞をウェルごとに一定濃度の［１２５Ｉ］ＮＤＰ−α−ＭＳＨと適切な濃度の非標識リガンドを含有する０．０５ｍｌ結合緩衝液により３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、前記細胞を０．２ｍｌの氷冷結合緩衝液により洗浄し、０．２ｍｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨにより前記プレートから剥離する。放射能を計測し（Ｗａｌｌａｃ、Ｗｉｚａｒｄ自動ガンマ計測器）、データは一般にコンピュータモデリングと呼ばれる方法によって、データを質量作用の法則から導かれる式に当てはめることにより放射性リガンド結合分析用のソフトウェアパッケージ（Ｗａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ウーメオ、スウェーデン）により分析した。
【０１１６】
（実施例７）
受容体活性化の決定（プローブとしてのｃＡＭＰ検定）
ｃＡＭＰ蓄積検定：トランスフェクションの４８間後、ＣＨＯ細胞を一度ＰＢＳにより洗浄し、次に前記プレートより０．０２％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を使って剥離する。前記剥離された細胞を遠心分離によって採取し、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ及び２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（ＩＢＭＸ緩衝液）を含有するハンク平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁する。ＩＢＭＸ摂取を可能にするため３７℃で１５分間のインキュベート後、０．４ｍｌの細胞懸濁液（５×１０５細胞／ｍｌ）を種々の濃度のアゴニスト又は１０μＭホルスコリンを含有するＩＢＭＸ緩衝液０．１ｍｌに添加する。前記細胞は続いて、ｃＡＭＰ蓄積を可能にするために３７℃で１５分間インキュベートする。その活性は０．５ｍｌの５％トリクロロ酢酸を添加することにより終結させ、溶解細胞から放出されたｃＡＭＰを、ｃＡＭＰ１２５Ｉシンチレーション近接検定法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検定する。
【０１１７】
ＥＣ５０値は、グラフパッドプリズムソフトウェア（バリアブルスロープ付きシグモイド用量応答曲線が内蔵された非線形回帰分析を用いる）を使って９５％信頼区間で計算する。
【０１１８】
（実施例８）
３つの骨格環状ペプチドライブラリーの特性決定
【表１】
2008542358.tif 000008
【０１１９】
前記ＭＣ４受容体を活性化する前記ホルモンαＭＳＨの活性領域に基づく３つの骨格環状ペプチドライブラリー（図３を参照されたい）を合成し、その特性を決定した（表１〜表３を参照されたい）。ライブラリーＩの骨格環状ペプチドは既知標準と比較してその腸透過性を試験した。図４に示しように、ペプチドＢＢＣ１（図６）は高い腸透過性を有している。
【０１２０】
ＭＣ４Ｒに対するこれらのペプチドのＩＣ５０値を表４に示している。前記ペプチドは全て前記天然ホルモン（７０ｎＭ）に類似するＩＣ５０値を有しており、２つの類似物はより良好な親和性を有している。
【０１２１】
前記ペプチドの腸内代謝安定性を図５に示している。環状ペプチドは直鎖状類似物と比較して長期の代謝安定性を有している。
【０１２２】
前記ＢＢＣ１ペプチドの特性決定は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によって実施した（それぞれ図８Ａと図８Ｂ）。
【０１２３】
【表２】
2008542358.tif 000009
【０１２４】
【表３】
2008542358.tif 000010
【０１２５】
【表４】
2008542358.tif 000011
【０１２６】
（実施例９）
正常マウスにおける食物消費に対する経口的に投与されたＢＢＣ−１の効果を評価するインビボ研究
ＩＣＲ：Ｈｓｄ（ＣＤ−１）雄性マウス（７〜８週歳）を個別のケージで飼育し、２３±１℃、１２時間明１２時間暗サイクル（０７：００〜１９：００照明）で維持した。マウスには水と標準固形飼料を自由に利用させた。受け入れた際、マウスを１週間順応させた。１６時間の絶食に続いて、前記動物（ｎ＝８）はＢＢＣ１（１００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ）又は賦形剤（水）の１回の強制経口投与（ＰＯ、５ｍｌ／ｋｇ）を受けた。投与後直ちに、一定の飼料用量を与え、１、２、３、４、５、８、２４時間後に繰り返し体重測定した。
【０１２７】
前記マウスは、その後の２４時間、試験品目の投与後なんら特別な臨床的徴候は示さなかった。図７で明らかにしているように、ＢＢＣ−１は経口的に投与すると、２４時間にわたり〜４０％マウスの食物消費を減少させた。
【０１２８】
これらの結果は、骨格環化を利用することにより、腸環境で安定しており腸壁を通過する、したがって、その薬理活性を維持しつつ潜在的に良好な経口利用度を有する生物活性ペプチドを合成することが可能であることを示している。
【０１２９】
具体的な実施形態の前述の説明は本発明の一般的性質を十分に明らかにしているので、他者は、最新の知識を適用することにより、不適切な実験をしないで、さらに一般概念から逸脱することなく、種々の適用のために当該の具体的実施形態を容易に修正且つ／又は改作することができ、したがって、前記の改作物及び修正物は、前記開示された実施形態の意味及び同等物の範囲内に包含されるべきであり、そうであることが意図される。本発明はその具体的な実施形態と併せて説明されてきたが、多くの代替物、修正物及び変形物は当業者にとり明らかであることは明白である。したがって、本発明は、添付された請求項の精神及び広い範囲内に入る当該代替物、修正物及び変形物全てを包含することが意図される。
【０１３０】
本発明の精神及び範囲内の種々の変形物及び修正物はこの詳細な説明から当業者にとって明らかになるために、本発明の好ましい実施形態を示す一方で前記の詳細な説明及び具体例は例としてのみ与えられることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】本発明に従ったペプチドのライブラリーを合成するための基本構想を示した図である（ｍ＝２，３，４，５、ｎ＝２，３，４，６）。
【図２】保護グリシン誘導構成単位の合成を示した図である。
【図３】本発明に従って骨格環化（ＢＢＣ）ライブラリーの一般的構造を示した図である。
【図４】既知の腸透過性を有する標準的分子と比較してライブラリーＩのＭＣ−４ペプチドの透過係数値（Ｐａｐｐ）を示した図である。マンニトールは低い透過性を示し、テストステロン及びプロプラノロールは高い腸透過性を示す。
【図５】ラットの腸刷子縁膜における代謝安定性に対するペプチドの骨格環化の効果を示した図である。
【図６】骨格環状ペプチドＢＢＣ−１の化学構造を示した図である。
【図７】マウスにおける食物消費に対するＢＢＣ−１の効果を示した図である。データは平均値±ＳＥＭとして表している。統計分析はダネット事後調査を使った一元配置分散分析によって行った。：＊，Ｐ＜０．０５
【図８Ａ】逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（８Ａ）により行ったＢＢＣ１の特性決定を示した図である。
【図８Ｂ】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（８Ｂ）により行ったＢＢＣ１の特性決定を示した図である。
【図１】
2008542358.tif 000024
【図２】
2008542358.tif 000025
【図３】
2008542358.tif 000026
【図４】
2008542358.tif 000027
【図５】
2008542358.tif 000028
【図６】
2008542358.tif 000029
【図７】
2008542358.tif 000030
【図８Ａ】
2008542358.tif 000031
【図８Ｂ】
2008542358.tif 000032
【配列表】
2008542358000001.app
【国際調査報告】
2008542358.tif 000033
2008542358.tif 000034
2008542358.tif 000035
2008542358.tif 000036