(57)【要約】本発明は、動物、特に、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類のための、NTを作る種々の方法論に向けられる。さらに、本発明の方法による該方法及び分子成分は、所望の特性を有する胚を生成する実際的な手段を提供する。具体的な態様において、本発明の方法論は、所望の特性を有する核を、一以上の分子成分と共に、除核卵へ導入すること、それにより、核移植構築物を作成すること、該卵を培養して生胚を生成すること、該胚を雌性の卵管に移すこと、及びクローン動物を生成することを含む。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法：
核と一以上の分子成分と共に押出除核卵中に導入し、このようにして核移植構築物を作成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；
前記胚を雌性の卵管に移すこと；及び
クローン動物を生成すること。
【請求項２】
前記除核卵が卵丘を有さない卵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記除核卵が、分裂中期IIの停止直前に除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記押出が、前記卵を保持マイクロピペットで保持すること；前記卵の透明帯を、前記卵の第一極体付近にスリットを作ることによって針で部分的に切り裂くこと；およそ分裂終期-Iからおよそ前分裂中期-IIにわたって、前記針で搾ることによって、第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む隣接する細胞質を押出すこと；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記保持マイクロピペットが約110 μmの内部直径を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記針がガラス針である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記卵が、BSA及びサイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記卵が約0.3% BSA及び約7.5 μg/ml サイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核が体細胞核ドナー源に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記体細胞核ドナー源に由来する前記核が、分離された卵丘細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離された卵丘細胞が異種性のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のもの及び異種性のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記核が初期のアカゲザル線維芽細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記核がドナー割球に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核が前記除核された卵の卵黄周囲腔中に移される(transfer)、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記核移植構築物がマンニトール溶液で平衡化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記マンニトール溶液が、約0.5 mM Hepes、約0.1 mM CaCl2、及び約0.1 mM MgCl2を含有する約0.3 Mのマンニトール溶液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で約4分間、平衡化される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記チャンバーが前記マンニトール溶液で薄く覆われた二つの電極を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核と前記卵が、２つのDCパルスによって融合される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記DCパルスが約2.7 kK/cmを構成する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記DCパルスの持続時間が約15 μsである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記核移植構築物が培養培地中で発達される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養培地がG1、G2、及び改変された合成卵管液（mSOF）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記核移植構築物が前記培養培地中で経時的に発達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1中で発達される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法であって、前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1培地中で発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達される方法。
【請求項３２】
請求項２７に記載の方法であって、前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1培地中で発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達され、及び桑実胚期のあたりで前記核移植構築物が胚盤胞期に達するまで、mSOFに移されることを特徴とする方法。
【請求項３３】
前記mSOF培地がさらにフルクトースを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記核が所望の特性を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３５】
前記所望の特性が、特異的な疾病又は疾患と関連する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記特異的な疾病又は疾患が、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化から成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記導入工程が、SCNTを行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
SCNT後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記SCNT後に第二の核移植を行う工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記導入工程がさらに、減数分裂の紡錘体の崩壊を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記導入工程に続いて、卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記卵細胞質の補充が、除核された卵母細胞（ooplast）の電気融合によって行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記卵細胞質の補充がマイクロインジェクションによって行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記一以上の分子成分が、精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記一以上の分子成分が、有糸分裂モータータンパク質及び中心体タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記有糸分裂モータータンパク質がキネシンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記動物が霊長類である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記動物が非ヒト霊長類である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記非ヒト霊長類がサルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記霊長類がヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記生胚が遺伝子組換えである、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記生胚から胚性幹細胞を生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記胚性幹細胞がヒトであり、前記生胚がヒトである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の方法により生成された動物。
【請求項５７】
前記動物が霊長類である、請求項５６に記載の動物。
【請求項５８】
前記霊長類が非ヒト霊長類である、請求項５７に記載の動物。
【請求項５９】
前記霊長類がヒトである、請求項５７に記載の動物。
【請求項６０】
核を、一以上の分子成分と共に、押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；
前記胚から割球を分離すること；及び
前記割球を培養して幹細胞を生成すること；
の工程を含む方法。
【請求項６１】
前記除核卵が卵丘を有さない卵母細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記除核卵が、分裂中期IIの停止直前に除核される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記押出が、前記卵を保持マイクロピペットで保持すること；前記卵の透明帯を、前記卵の第一極体付近にスリットを作ることによって針で部分的に切り裂くこと；およそ分裂終期-Iからおよそ前分裂中期-IIにわたって、前記針で搾ることによって、第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む隣接する細胞質を押出すこと；を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記保持マイクロピペットが約110 μmの内部直径を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記針がガラス針である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記卵がBSA及びサイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記卵が、約0.3% BSA及び約7.5 μg/ml サイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記核が体細胞核ドナー源に由来する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記体細胞核ドナー源に由来する前記核が、分離された卵丘細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のものである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記分離された卵丘細胞が異種性のものである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のもの及び異種性のものである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記核が初期のアカゲザル線維芽細胞株に由来する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７５】
前記核がドナー割球に由来する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
前記核が前記除核卵の卵黄周囲腔中に移される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
前記核移植構築物がマンニトール溶液で平衡化される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記マンニトール溶液が、約0.5 mM Hepes、約0.1 mM CaCl2、及び約0.1 mM MgCl2を含む約0.3 M マンニトール溶液を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で約4分間、平衡化される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記チャンバーが前記マンニトール溶液で薄くおおわれた２つの電極を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記核と前記卵が、２つのDCパルスで融合される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８４】
前記DCパルスが約2.7 kK/cmを構成する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記DCパルスの持続時間が約15 μsである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記核移植構築物が培養培地中で発達される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
前記培養培地がG1、G2、及び改変された合成卵管液（mSOF）を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記核移植構築物が前記培養培地で経時的に発達される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記核移植構築物が核移植後、G1中で約48時間発達される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記核移植構築物が、核移植後G1培地中で約48時間発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記核移植構築物が、核移植後G1培地中で約48時間発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達され、及び桑実胚期のあたりで、前記核移植構築物が胚盤胞期に達するまで、mSOFに移される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記mSOF培地がさらにフルクトースを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記核が所望の特性を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項９４】
前記所望の特性が、特異的な疾病又は疾患に関連する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記特異的な疾病又は疾患が、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化から成る群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９７】
前記SCNT後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記SCNTに続いて第二の核移植を行う工程をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記導入工程がさらに、減数分裂の紡錘体の崩壊を行うことを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項１００】
前記導入工程に続いて、卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記卵細胞質補充が除核された卵母細胞（ooplast）の電気融合によって行われる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記卵細胞質の補充がマイクロインジェクションによって行われる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記一以上の分子成分が、精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項１０４】
前記一以上の分子成分が有糸分裂モータータンパク質及び中心体タンパク質を含む、請求項６０に記載の方法
【請求項１０５】
前記有糸分裂モータータンパク質がキネシンを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記幹細胞が霊長類の胚性幹細胞である、請求項６０の方法。
【請求項１０９】
前記胚性幹細胞が遺伝子組換え霊長類胚性幹細胞である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記遺伝子組換え胚性幹細胞が遺伝子組換え非ヒト霊長類胚性幹細胞である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
請求項６０に記載の方法によって生成された胚性幹細胞。
【請求項１１２】
前記胚性幹細胞が遺伝子治療に用いられる、請求項１１１に記載の胚性幹細胞。
【請求項１１３】
前記胚性幹細胞がヒトの疾病の治療として用いられる、請求項１１１に記載の胚性幹細胞。
【請求項１１４】
核を、一以上の分子成分と共に、押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；
前記胚を雌性の卵管に移すこと；
の工程を含む方法。
【請求項１１５】
前記除核卵が卵丘を有さない卵母細胞である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記除核卵が，分裂中期IIの停止直前に除核される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記押出が、前記卵を保持マイクロピペットで保持すること；前記卵の透明帯を、前記卵の第一極体付近にスリットを作ることによって針で部分的に切り裂くこと；およそ分裂終期-Iからおよそ前分裂中期-IIにわたって、前記針で搾ることによって、第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む隣接する細胞質を押出すこと；を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記保持マイクロピペットが約110 μmの内部直径を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記針がガラス針である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記卵がBSA及びサイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記卵が、約0.3% BSA及び約7.5 μg/ml サイトカラシン B を補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
前記核が、体細胞核ドナー源に由来する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記体細胞核ドナー源に由来する前記核が、分離された卵丘細胞を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のものである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記分離された卵丘細胞が異種性のものである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のもの及び異種性のものである、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記核が初期のアカゲザル線維芽細胞株に由来する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２９】
前記核がドナー割球に由来する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３０】
前記核が前記除核卵の卵黄周囲腔に移される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３１】
前記核移植構築物が、マンニトール溶液で平衡化される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３２】
前記マンニトール溶液が、約0.5 mM Hepes、約0.1 mM CaCl2、及び約0.1 mM MgCl2を含有する約0.3 Mのマンニトール溶液を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で約4分間平衡化される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が、前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記マンニトール溶液による前記平衡化の後、前記核移植構築物が、前記マンニトール溶液で薄くおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記チャンバーが、前記マンニトール溶液でうすくおおわれた２つの電極を含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記核と前記卵が、２つのDCパルスによって融合される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１３８】
前記DCパルスが約2.7 kK/cmを構成する、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記DCパルスの持続時間が約15 μsである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記核移植構築物が培養培地中で発達される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１４１】
前記培養培地がG1、G2、及び改変された合成卵管液（mSOF）を含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記核移植構築物が、前記培養培地中で経時的に発達される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記核移植構築物が、核移植後約48時間、G1中で発達される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1培地中で発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項１４０に記載の方法であって、前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1培地中で発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達され、及び桑実胚期のあたりで前記核移植構築物が胚盤胞期に達するまで、mSOFに移されることを特徴とする方法。
【請求項１４６】
前記mSOF培地がさらにフルクトースを含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４７】
前記核が所望の特性を有する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１４８】
前記所望の特性が、特異的な疾病又は疾患と関連する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記特異的な疾病又は疾患が、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化から成る群から選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記導入工程が、SCNTを行うことを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１５１】
SCNT後に前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記SCNTに続いて、第二の核移植を行う工程をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
前記導入工程がさらに、減数分裂の紡錘体の崩壊を行うことを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１５４】
前記導入工程に続いて、卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１５５】
前記卵細胞質補充が除核された卵母細胞（ooplast）の電気融合によって行われる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記卵細胞質の補充がマイクロインジェクションによって行われる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記分子成分が精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記分子成分が有糸分裂モータータンパク質及び中心体タンパク質を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１５９】
前記有糸分裂モータータンパク質がキネシンを含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
前記生胚が遺伝子組換えである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１６３】
前記生胚から胚性幹細胞を生成する工程をさらに含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記胚性幹細胞がヒトであり、前記生胚がヒトである、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
請求項１１４に記載の方法によって生成された胚。
【請求項１６６】
核を、一以上の分子成分と共に、押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；及び
前記胚から割球を分離すること；
の工程を含む方法。
【請求項１６７】
前記除核卵が卵丘を有さない卵母細胞である、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記除核卵が、分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６９】
前記除核卵が、分裂中期IIの停止直前に除核される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７０】
前記押出が、前記卵を保持マイクロピペットで保持すること；前記卵の透明帯を、前記卵の第一極体付近にスリットを作ることによって針で部分的に切り裂くこと；およそ分裂終期-Iからおよそ前分裂中期-IIにわたって、前記針で搾ることによって、第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む隣接する細胞質を押出すこと；を含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７１】
前記保持マイクロピペットが約110 μmの内部直径を有する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記針がガラス針である、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記卵がBSA及びサイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７４】
前記卵が約0.3% BSA及び約7.5 μg/ml サイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７５】
前記核が体細胞核ドナー源に由来する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１７６】
前記体細胞核ドナー源に由来する前記核が、分離された卵丘細胞を含む、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のものである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
前記分離された卵丘細胞が異種性のものである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
前記分離された卵丘細胞が自己由来のもの及び異種性のものである、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８０】
前記核初期のアカゲザル線維芽細胞株に由来する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１８１】
前記核がドナー割球に由来する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１８２】
前記核が前記除核卵の卵黄周囲腔に移される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１８３】
前記核移植構築物がマンニトール溶液で平衡化される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１８４】
前記マンニトール溶液が、約0.5 mM Hepes、約0.1 mM CaCl2、及び約0.1 mM MgCl2を含有する約0.3 Mのマンニトール溶液を含む、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記核移植構築物が前記マンニトール溶液で約4分間平衡化される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８６】
前記マンニトール溶液による前記平衡化後、前記核移植構築物が前記マンニトール溶液でうすくおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８７】
前記マンニトール溶液による前記平衡化後、前記核移植構築物が、前記マンニトール溶液でうすくおおわれた電極を含むチャンバーに移される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８８】
前記チャンバーが前記マンニトール溶液でうすくおおわれた２つの電極を含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記核と前記卵が、２つのDCパルスによって融合される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１９０】
前記DCパルスが約2.7 kK/cmを構成する、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記DCパルスの持続時間が約15 μsである、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９２】
前記核移植構築物が培養培地中で発達される、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１９３】
前記培養培地がG1、G2、及び改変された合成卵管液（mSOF）を含む、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記核移植構築物が前記培養培地中で経時的に発達される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９５】
前記核移植構築物が核移植後G1中で約48 時間発達される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９６】
前記核移植構築物が、核移植後G1培地中で約48 時間発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時時間発達される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９７】
請求項１９２に記載の方法であって、前記核移植構築物が、核移植後約４８時間、G1培地中で発達され、次いで、G2培地中でさらに約48時間発達され、及び桑実胚期のあたりで前記核移植構築物が胚盤胞期に達するまで、mSOFに移されることを特徴とする方法。
【請求項１９８】
前記mSOF培地がさらにフルクトースを含む、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９９】
前記核が所望の特性を有する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２００】
前記所望の特性が、特異的な疾病又は疾患に関連する、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記特異的な疾病又は疾患が、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化から成る群から選択される、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記導入工程がSCNTを行うことを含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２０３】
前記SCNT後、前核の除去を行う工程をさらに含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記SCNTに続いて、第２の核移植を行う工程をさらに含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０５】
前記導入工程より前に、減数分裂の紡錘体の崩壊を行う、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２０６】
前記導入工程に続いて、卵細胞質の補充を行う工程をさらに含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２０７】
前記卵細胞質の補充が、除核された卵母細胞（ooplast）の電気融合によって行われる、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記卵細胞質の補充が、マイクロインジェクションによって行われる、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０９】
前記分子成分が、精子中心体に通常存在する中心体の成分を含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２１０】
前記分子成分が有糸分裂モータータンパク質及び中心体タンパク質を含む、請求項１６６に記載の方法。
【請求項２１１】
前記有糸分裂モータータンパク質がキネシンを含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記キネシンがHSETキネシンを含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記中心体タンパク質がNuMAを含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１４】
請求項１６６に記載の方法によって生成された、分離された割球。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊長類を含む動物のクローン増殖のための方法に関する。また本発明は、ヒトを含む霊長類から胚性幹細胞、遺伝子組換え胚性幹細胞、及び免疫が一致した（immune-matched）胚性幹細胞を生成する方法に関する。さらに、本発明は、有糸分裂紡錘体欠損を直し、また、核移植に付随する移植前の胚の発達速度を最適にするために用いられ得る、種々の方法論及び分子成分を提供する。
【背景技術】
【０００２】
同一の霊長類は、分子医薬のために限りない重要性を有しており、並びに、絶滅寸前の種の保存及び不妊症のために意味を有する。クローン動物の間の遺伝的な多様性の欠如は、実験上の正確さにおける比例的な上昇をもたらし、それ故、統計的に有意なデータを得るために必要な、薬物、遺伝子治療、及びワクチン治験、並びに、老化、環境、又は他の影響に起因する疾病及び疾患の完全なコントロールを有する動物の数を減少させる。母系性の環境又は健康及び振る舞いにおける後成的な影響を含む、遺伝対環境に関する「氏と育ち」問題も解答され得る。結果的に、異なる誕生データを有していても遺伝的に同一の子孫が調査され得る（例えば、動物生成に先立つ表現型の分析のような研究において；及び最初の子孫の平均余命を超えた細胞老化に取り組むための胚系統細胞（雄性の胚細胞のような）の連続的な導入（Brinster et al., 9 SEMIN. CELL DEV. BIOL. 401-09 (1998)）において；及び同時の遡及的な(老年の双子（older twin）において)及び予期される治療的なプロトコルを試験するため）。後成的な調査は、例えば、低い出生時体重又は他の胎児発達の側面が、一生の結果を有し得る(Leese et al., 13 HUM. REPROD. 184-202 (1998))ことを証明するために、同一の代理に連続的に移植された本発明の同一の胚を用いて試験されてよく、子供のIQにおける減少は、妊娠の間の母系性の甲状腺機能低下症(Haddow et al., 341 N. ENGL. J. MED. 549-55 (1999))、又は子宮の拒絶反応をもたらす免疫遺伝(Gerard et al., 23 NAT. GENET. 199-202 (1999); Clark et al., 41 AM. J. REPROD. IMMUNOL. 5-22 (1999);及びHiby et al., 53 TISSUE ANTIGENS 1-13 (1999))に関連する。
【０００３】
成体の体細胞核移植による動物のクローニングは、ヒツジ(Wilmut et al., 385 NATURE 810-13 (1997))、ウシ(Kato et al., 282 SCIENCE 2095-98 (1998))、マウス(Wakayama et al., 394 NATURE 369-74 (1998))、ブタ、ネコ、ウサギ及びヤギ(Baguisi et al., 17 NATURE BIOTECH. 456-61 (1999))の創造をもたらした。クローニングのための科学的な理論的根拠を強要するほとんどが疾病モデルの生成である。疾病のためのモデルとしてのクローン動物は、各クローンの遺伝子が一定であるために、大きな見込みを示す。
【０００４】
幹細胞株は、ヒト及びサルの胚から生成された(Shamblott et al., 95 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 13726-31 (1999)及びThomson et al., 282 SCIENCE 1145-47 (1999))。ヒト又は霊長類の完全に非近交系の集団からの幹細胞が、遺伝的に一定な、選択された近交系のマウスの株からのものの完全な全能性を有するかどうかは未だ不明である。これは例えば、多発性の後に試験されるものから治療的幹細胞を生成することによって、その同一の同胞において及び幹細胞が癌様テラトカルシノーマを生成し得るか否かを知るためにそのようにすることにおいて、本発明の文脈内で評価されることができる。
【０００５】
理論的に、体細胞核移植(SCNT)は、無制限の同一の子孫を生成する可能性を有している；しかしながら、遺伝的なキメラ化、胎児及び新生児の死亡率（Wilmut et al., 419 NATURE 583-7 (2002); Humpherys et al., 99 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 12889-94 (2002); Cibelli et al., 20 NAT. BIOTECHNOL. 13-4 (2002);及びKato et al., 282 SCIENCE 2095-8 (1998)）、短くなったテロメア（Shields et al., 399 NATURE 316-7 (1999)）、及び一定しない成功率は、その当面の有用性を妨げる。マカクにおけるSCNTは、割球核で成功したが(Wolf et al., 60 BIOL. REPROD. 199-204 (1999))、しかし、成体、胎児、又は胚性幹(ES)細胞では未だ成功していない。それらはSCNTによって生じる矛盾及びパラドックスに関係しているにもかかわらず、SCNTによる哺乳類のクローニングの分子的な制御を新たに研究させる。
【０００６】
図１は、SCNTの間の操作及び活性化された除核卵母細胞内で体細胞性の核になる発達現象を図解する。それらの工程は、これらに限定されないが、
除核又は分裂中期-II停止減数分裂の紡錘体除去、体細胞の選択及び調製、核移植又は細胞質内への核注入（ICNI）、創傷治癒及び紡錘体除去及び核導入の双方からの薬物回復、及び卵母細胞の活性化を含む。それらは、しかしながら、それらの工程と付随した制限である。例えば、霊長類の卵母細胞における減数分裂の紡錘体除去（非-ヒト及びヒト様）は、今現在除核された卵母細胞において予期しない結果を有する。マウスの飼い慣らされた種からの卵母細胞と異なって、重大な微小管モーター(キネシン)及び中心体分子(NuMA)は、met-II 紡錘体においてほとんど独占的に濃縮される。卵DNAのこの紡錘体と一緒の除去は、該SCNT再構成された卵母細胞がもはや、最初の有糸分裂において機能的な双極性の有糸分裂紡錘体を形成する能力を有さないように、それらのモーター及び紡錘体極タンパク質の大多数を排除する。
【０００７】
さらに、それらの工程のいくつかに関する基礎的な科学的知識も欠如している。例えば、体細胞の調製及び選択（Wilmut et al., 385 NATURE 810-3 (1997)；Wilmut et al., 419 NATURE, 583-7 (2002)；及びWakayama et al., 394 NATURE 369-74 (1998)）は、少数の種においてしか調査されておらず、電気融合対直接注入（細胞質内核注入(ICNI))の比較は完全には調査されておらず、マイクロインジェクション、細胞融合及び「除核」後の創傷治癒は未だ調査されていない。
【０００８】
核移植（NT；「ドーリー」アプローチ）によるSCNT（Wilmut et al., 419 NATURE 583-7 (2002)；Polejaeva et al., 407 NATURE 86-90 (2000)；及びCampbell et al., 380 NATURE 64-6 (1996)）及びICNIによるSCNT（ホノルル方法）（Wakayama et al., 394 NATURE 369-74 (1998)及びDominko et al., 1 CLONING 143-152 (1999)）はいずれも、同じ霊長類を増殖するための見込みを保持するが、霊長類においてのみ発見された、予め予期されない生物学的なハードルが存在する。さらに、ヒト胚性幹細胞ポテンシャルに関する重大な研究が非ヒト霊長類で調査されている。遺伝的に同一の霊長類の子孫のセットは、生物医学的な調査及び行動上の調査のために貴重であるが、未だ誕生していない。それ故、本発明は、同一の遺伝子組換え動物、及び特に霊長類を繁殖するための、信頼できる有効な方法を提供する。さらにその上、本発明はまた、有糸分裂紡錘体欠損を直し、NTに付随する移植前の胚の発達速度を最適化するために用いられ得る種々の方法論及び分子成分を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
［連邦政府によって後援された研究に関する記載］
本発明は、少なくとも一部は、NIHにより与えられた助成金ナンバーNIH R37 HD 12913及び2 R24 RR013632-06の下で、米国政府の支援により成された。米国政府は、本発明におけるある権利を有し得る。
【００１０】
［関連出願に対するクロスリファレンス］
本願は、出願番号第10/821,200号の一部継続出願であり、2003年４月９日に出願された米国暫定的特許出願連続番号60/461,139の、35 U.S.C. § 119の下での利益を主張し、その内容は参照によって本明細書中に援用される。
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、動物及び特に霊長類のための、ＮＴの実際的な方法を行うための種々の方法論に向けられる。さらに、本発明によって提供される該方法及び分子成分は、所望の特性を有する胚を生成するための実用的な手段を提供する。一つの態様において、本発明の方法論は、核を押出し除核卵（extrusion enucleated egg）に導入すること、そのように核移植構築物を作成すること、該核移植構築物を培養して生胚を生成すること、該胚を雌性の卵管に移すこと、及びクローン動物を生じさせることを含み得る。
【００１２】
本発明の一つの態様において、該方法は、核を一以上の分子成分と共に、押出し除核卵中に導入し、核移植構築物を作成すること；前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；前記胚を雌性の卵管に移すこと；及びクローン動物を生じさせることの工程を含み得る。本発明の方法の一つの態様において、該除核卵は卵丘のない卵母細胞を含み得る。他の特定の態様において、該方法は、分裂中期IIの前に除核された除核卵を利用し得る。本発明の他の特定の態様において、該方法は、分裂中期II停止直前に除核された除核卵を利用し得る。
【００１３】
本発明の方法の他の態様において、押出しは、保持マイクロピペットにより卵を保持すること；特に、前記卵の第一極体近くスリットを作成することによって針で該卵の透明帯を解体すること；第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む近くの細胞質を、およそ分裂終期-Iからおよそ前分裂中期-IIにわたって、針によって搾る（squeezing）ことによって押出すことを含み得る。本発明の他の態様において、該方法は、約110 μmの内側直径を有する保持マイクロピペットを利用し得る。他の特定の態様において、本発明の方法は、卵の核を押出すためにガラス針を利用することができる。
【００１４】
本発明の方法の一つの態様において、該卵は、BSA及びサイトカラシンBを補充されたHepes緩衝TALP中で除核され得る。本発明の方法の他の態様において、該卵は、約0.3% BSA及び約7.5 μg/ml サイトカラシン Bを補充されたHepes緩衝TALP中で除核され得る。
【００１５】
異なる発明の方法の導入された核は、異なる源に由来し得る。例えば、これに限定されないが、本発明の方法の一つの態様において、該核は、体細胞核ドナー源に由来し得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該核は、分離された卵丘細胞を含み得る体細胞核ドナー源に由来し得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該分離された卵丘細胞は、自己由来のものであり得る。他の特定の態様において、該分離された卵丘細胞は異種性のものであり得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該分離された卵丘細胞は自己由来のもの及び異種性のものであり得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該核は、初期の（primary）アカゲザル線維芽細胞株に由来し得る。他の特定の態様において、本発明の方法は、ドナー割球に由来し得る核を利用することができる。
【００１６】
本発明の方法の一つの具体的な態様において、核移植構築物を作成するために、該核は、除核卵の卵黄周囲腔に移され得る。一つの具体的な態様において、該核移植構築物は、マンニトール溶液により平衡化される。本発明の他の特定の態様において、該方法は、約0.5 mM Hepes、約0.1 mM CaCl2、及び約0.1 mM MgCl2を含有する約0.3 M マンニトール溶液を含むマンニトール溶液を利用し得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該方法は、約４分間、マンニトール溶液により該核移植構築物を平衡化し得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該核移植構築物は、マンニトール溶液による該構築物の平衡化の後に、該マンニトール溶液でうすくおおわれた電極（electrode overlaid with the mannnitol solution）を備えるチャンバー中に移されて良い。他の特定の態様において、該チャンバーは、二以上の電極を備え得る。他の特定の態様において、本発明の方法は、２つの電極を含み得るチャンバーを利用することができる。本発明の一つの態様において、該方法は、２つのＤＣパルスによって核と卵を融合し得る。他の特定の態様において、本発明の方法は、約2.7 kK/cmから成るＤＣパルスにより該核と卵を融合し得る。他の特定の態様において、該ＤＣパルスは、約15 μsの持続時間であってよい。
【００１７】
本発明の方法の一つの態様において、該核移植構築物は、培養培地中で発達され得る。一つの態様において、該培養培地は、G1、G2、及び改変された合成卵管液(mSOF)を含み得る。他の特定の態様において、本発明の方法は、該核移植構築物を前記培養培地中で連続的に発達させ得る。他の特定の態様において、該核移植構築物は、G1中で、核移植後約４８時間発達され、次いで、G2培地中で、さらに約48時間発達され、続いて、該核移植構築物が胚盤胞期に達するまで、桑実胚期のあたりでmSOFに移され得る。本発明の方法の他の特定の態様において、該mSOF培地は、さらにフルクトースを含み得る。
【００１８】
一つの具体的な態様において、所望の特性を有する核は、選択することによって、或いは、卵、例えば除核卵を設計し及びその中に導入することによって得られる。一つの特定の態様において、正常に生じる核は、宿主に対する遺伝的適合性又は相補性について選択され、或いは、所望の特性を有するドナーに由来するかそれから設計されてよい。本発明の他の態様において、該所望の特性は、特異的な疾病又は疾患に関連し得る。特に、該疾病又は疾患は、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化を含み得る。選択された核は、通常は精子中心体に存在する中心体の成分を含む分子成分と共に卵中に導入され得る。他の態様において、該分子成分は、それぞれ、キネシン（例えばHSET）及びNuMAのような、有糸分裂モータータンパク質及び中心体タンパク質を含む。
【００１９】
特に、本発明の方法は、二重核移植；減数分裂の紡錘体崩壊、母系DNAの除去、及び回復；ＮＴ及び受精又は人工的な活性化後の前核の除去；及び細胞質移植又は卵細胞質補充を含み得る。
【００２０】
本発明の他の態様において、前記動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類であってよい。この方法の他の側面において、該動物は、非ヒト霊長類であってよく、特にサルであってよい。この方法の代替側面において、該動物は、霊長類であってよく、特にヒトであってよい。本発明の特定の態様において、該動物は、遺伝子組換えであってよい。他の態様において、本発明は、本発明の方法によって生成されたクローン動物を提供する。
【００２１】
本発明の特異的な態様において、移植前遺伝子診断は、代理の雌性の卵管に移される前に胚から単離された割球において行われ得る。この移植前遺伝子診断のための方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション（PCR）、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、一本鎖高次構造多型（SSCP）、制限断片長多型（RFLP）、プライム化インサイチュー標識（PRINS）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）、単細胞ゲル電気泳動（COMET）分析、ヘテロ二重鎖分析、サザン分析及び変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）分析を含む。
【００２２】
また、本発明の方法を用いた、胚性幹細胞及び遺伝子組換え胚性幹細胞のような胚及び幹細胞の生成も、本発明の範囲内である。特定の態様において、SCNT胚は、クローンの子孫を生成するために用いられ、該単離された割球は、胚性幹細胞株を生成するために用いられる。さらなる態様において、該SCNT胚は遺伝子組換えであり、それらのSCNT遺伝子組換え胚は、クローンの遺伝子組換え子孫を生成するために用いられ、該単離された遺伝子組換え割球は、遺伝子組換え胚性幹細胞株を生成するために用いられる。
【００２３】
また、本発明は、胚性幹細胞を生成する方法に関し、これによって、割球が胚から分離し、それらの細胞は次いで培養されて幹細胞株を生じる。特異的な態様において、本明細書に記載された方法は、霊長類胚性幹細胞を生成するために用いられる。本発明の他の側面において、本明細書に記載された該方法は、例えば遺伝子組換え霊長類胚性幹細胞を含む遺伝子組換え胚性幹細胞を生成するために用いられる。
【００２４】
本発明は、ここで記載された方法によって生成された胚性幹細胞にも向けられる。特定の態様において、該胚性幹細胞は霊長類の胚性幹細胞である。さらなる態様において、該胚性幹細胞は、例えば遺伝子組換え霊長類胚性幹細胞を含む遺伝子組換えである。さらに他の態様において、該遺伝子組換え胚性幹細胞はヒト遺伝子組換え胚性幹細胞である。
【００２５】
本発明はまた、胚の移植前遺伝子診断の方法にも関する。特定の態様において、割球は胚から分離され、遺伝子分析は、一つの割球において行われる。本発明のさらに他の態様において、該残った割球は、胚性期まで培養され、続いて雌性の代理に移植される。該割球の遺伝子分析のために用いられる方法は、PCR、FISH、SSCP、RFLP、PRINS、CGH、COMET 分析、ヘテロ二重鎖分析、サザン分析、及びDGGE分析を含む。
【発明の詳細な説明】
【００２６】
本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されず、それらは変更し得るものであることは理解されるであろう。ここで用いられる用語が特定の態様を記述するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定するよう意図されないものであることも理解されるであろう。明細書及び付属の態様で用いられるように、単数形「一つの」及び「その」は、文脈が明らかに他の状態を指示しない限り、複数を含むものであることに留意されたい。
【００２７】
他に定義しない限り、全ての技術及びここで用いられる科学的な用語は、本発明が属する分野における通常の技術者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法、デバイス及び材料が記載されるが、ここに記載されたものと類似であるか又は等価である任意の方法及び材料を、本発明の実行又は試験において用いることができる。ここで挙げられた全ての参考文献は、それらの全てが本明細書に参照によって援用される。
【００２８】
［定義］
便宜のために、詳細な説明、実施例及び付属の態様において用いられる用語及び句の意味を下記に提供する。
【００２９】
用語「動物」は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス及びラット）、霊長類（例えば、サル、類人猿、及びヒト）、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ、両生類、爬虫類、魚、及び鳥類のような全ての脊椎動物を含む。胚性期及び胎性期を含む、全ての発達時期における個々の動物をも含む。
【００３０】
用語「霊長類」はここで用いられるように、これらに限定されないが、サル、類人猿、及びヒトを含む、哺乳類群の任意の動物を指す。
【００３１】
用語「全能性の」はここで用いられるように、胚、胎児、及び動物のような、発達中の細胞塊における全ての細胞の元となる細胞を指す。特異的な態様において、用語「全能性の」は、動物の全ての細胞の元になる細胞をも指す。全能性細胞は、一以上の核移植工程から胚を作成するための方法において用いられるときに、発達中の細胞塊の全ての細胞の元になることができる。動物は、子宮外（ex utero）で機能する動物であってよい。動物は、例えば、生きて生まれた動物として存在することができる。全能性の細胞は、器官収集のために有用であるような、相同異質形成遺伝子の操作によってのような、例えば頭部又は他の器官の成長を排除するための遺伝的改変を有する、不完全な動物を産生するために用いられ得る。
【００３２】
用語「全能性の」は、本明細書で用いられるように、用語「多能性の」と区別されるべきである。後者の用語は、発達中の細胞塊内で細胞の分塊に分化する細胞を称するが、しかし、発達中の細胞塊における細胞の全ての元とはならない細胞である。よって、用語「多能性の」は、生きて生まれた動物における細胞の全ての元とはなり得ない細胞を指すことができる。
【００３３】
用語「全能性の」はまた、本明細書で用いられるように、用語「キメラの」又は「キメラ」と区別される。後者の用語は、その細胞塊において、他の細胞の核のDNAと著しく異なるヌクレオチド塩基配列を有する核のDNAを抱く細胞のサブグループを含む、発達中の細胞塊を称する。該発達中の細胞塊は、例えば、胚、胎児、及び/又は動物として存在する。
【００３４】
用語「胚性幹細胞」は、本明細書で用いられるように、例えばインビトロ細胞培養物において維持され得る、胚から単離された多能性の細胞を含む。胚性幹細胞は、フィーダー細胞と共に又はフィーダー細胞なしで培養され得る。胚性幹細胞は、胚盤胞期胚及び前胚盤胞期胚を含む任意の発達期において、胚から単離された胚性細胞から確立されることができる。胚性幹細胞及びそれらの使用は、当該分野の技術者には周知である。例えば、米国特許第6,011,197号及びWO 97/37009、表題「Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derived from Ungulate Embryos」Stice及びGolueke（その双方は、参照によって、全図、表、線図を含むそれらの全てが本明細書に援用される）及び「Yang＆Anderson, 38 THERIOGENOL. 315-35 (1992)」を参照されたい。
【００３５】
本発明の目的のために、用語「胚」又は「胚性」は、本明細書で用いられるように、母系性の宿主の子宮膜中に移植されていない発達中の細胞塊を含む。それ故、用語「胚」は、本明細書で用いられるように、受精した卵母細胞、細胞質雑種、前-胚盤胞期の発達細胞塊、及び/又は母系性の宿主の子宮膜に移植される前の発達段階にある任意の他の発達細胞塊を指すことができる。本発明の胚は、生殖隆起を示さない。それ故、「胚性細胞」は、胚から単離され、及び／又は、胚から発生する。
【００３６】
胚は、細胞発達の複数の段階を表す。例えば、一つの細胞胚は、接合体（zygote）として称されることもでき、切断された胚から得られる固体の球状の細胞塊は、桑実胚として称されることができ、及び、胞胚腔を有する胚は、胚盤胞とも称されることができる。
【００３７】
用語「胎児」は、本明細書で用いられるように、母系性の宿主の子宮膜に移植された発達中の細胞塊を称する。胎児は、例えば生殖隆起として定義されるような特性を含むことができる。生殖隆起は、当該分野の通常の技術者によって容易に確認される特徴であり、ほとんどの動物種の胎児に認められる特徴である。用語「胎児性細胞」は、本明細書で用いられるように、胎児から単離され、及び／又は、胎児から発生したか、或いは、胎児に由来する、任意の細胞を称することができる。用語「非胎児性細胞」は、胎児に由来しないか又は胎児から単離されない細胞である。
【００３８】
用語「内部細胞塊」は、本明細書で用いられるように、胚特有の元となる細胞を称する。胚盤胞の外側に並ぶ細胞は、胚の栄養芽層と称される。胚から内部細胞塊細胞を単離するための方法は、当該分野の通常の技術者には周知である。「Sims＆First, 91 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 6143-47 (1994)」及び「Keefer et al., 38 MOL. REPROD. DEV. 264-268 (1994)」を参照されたい。用語「前-胚盤胞」は、当該分野では周知である。
【００３９】
「遺伝子組換え胚」は、一以上の細胞がヒトの介入によって導入された異種性の核酸を含有する胚を称する。導入遺伝子は、細胞の前駆体への導入によって、計画的な遺伝手操作によって、又は組換えウイルスの感染によって、接又は間接的に細胞中に導入され得る。本明細書に記載される遺伝子組換え胚において、該導入遺伝子は、関心のある構造遺伝子を細胞に発現させる。しかしながら、導入遺伝子が無変化である遺伝子組換え胚も含まれる。
【００４０】
用語「遺伝子組換え細胞」は、導入遺伝子を含有する細胞を称する。
【００４１】
用語「生殖細胞（germ cell）株遺伝子組換え動物」は、遺伝的な変化又は遺伝的な情報が生殖細胞系列の細胞中に導入され、それにより、該遺伝的な情報を子孫に伝える能力を与えられた、遺伝子組換え動物を称する。そのような子孫が実際に遺伝的な情報の変化のいくらか又は全てを有する場合、それらは同様に遺伝子組換え動物である。
【００４２】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド又は前駆体の生産のために必要な制御配列及びコーディング配列を含むDNA配列を称する。該ポリペプチドは、全長コーディング配列によってコードされることができ、或いは、所望の酵素活性が保持される限り、コーディング配列の任意の部分によってコードされることができる。
【００４３】
用語「導入遺伝子」は広く、これに限定されないが、恐らくゲノム中に正常には存在しない配列、与えられたゲノム中に存在するが正常に転写及び翻訳（「発現」）されない遺伝子、或いは、任意の他の遺伝子又は人がゲノム中に導入したいと望むＤＮＡを有する遺伝子又はＤＮＡを含む、動物のゲノムに導入される任意の核酸を称する。これは、非遺伝子組換えゲノムに正常に存在し得るが、発現において変化させたいもの、或いは、変化した又は異なる形態に導入することを望む遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、定義された遺伝子座を特異的に標的にすることができ、染色体内にランダムに組み込むことができ、或いは、それは染色体外複製DNAであってよい。導入遺伝子は、一以上の転写制御配列及びイントロンのような、選択された核酸の最適な発現のために必要である、任意の他の核酸を含み得る。導入遺伝子は、コーディング配列又は非コーディング配列、或いはそれらの組合せであることができる。導入遺伝子は、適切な条件下で一以上の導入遺伝子を発現させることができる制御要素を含み得る。
【００４４】
「関心のある構造遺伝子」という句は、関心のある生物学的に活性なタンパク質又はアンチセンスＲＮＡを例えば発現する構造遺伝子を指す。構造遺伝子は、植物、菌類、動物、細菌のゲノム又はエピソーム、真核生物の、核又はプラスミドのDNA、cDNA、ウイルスのDNA、又は化学的に合成されたDNAを含む、当該分野で既知の任意の源から全部又は一部が由来するものであってよい。構造遺伝子配列は、ポリペプチド、例えば、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、成長因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞信号タンパク質、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、又はレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）をコードし得る。さらに、構造遺伝子は、循環器病、神経学的疾病、生殖疾患、癌、眼病、内分泌疾患、肺病、代謝疾患、自己免疫疾患、及び老化のような特異的な疾病又は疾患に関連する遺伝子であってよい。
【００４５】
構造遺伝子は、生物学的活性又は発現産物の化学的構造、発現率、又は発現制御の方法に影響し得る、コーディング領域又は非翻訳領域の何れかにおける一以上の改変を含み得る。そのような改変は、これに限定されないが、突然変異、挿入、欠失、及び一以上のヌクレオチドの置換を含む。該構造遺伝子は、連続したコーディング配列を構成することができ、或いは、それは、適切なスプライス接合部によって結合した、一以上のイントロンを含むことができる。また、構造遺伝子は、融合タンパク質をコードし得る。
【００４６】
核及び細胞質成分の両方において同一である霊長類は、例えば遺伝的及び後成的な疾病の根拠における前臨床的な調査のための、理想的な科学的モデルを代表する。ここで、本発明は、SCNTを用いて遺伝的に同じ霊長類を双子及びより大きい複数として生産することに関する。さらに、本発明は、ヒト及び非ヒト霊長類における機能障害性の生殖能を修正するための幾つかの方法、及び、ＮＴ技術の適用後の胚に由来する細胞及び組織の治療的価値を考慮している。ＮＴを効果的にするために、体細胞性又は胚性の核から導入された二倍体核は、最初の有糸分裂時に、機能性の双極性紡錘体器官におけるそれらの複製された染色体を、濃縮及び整列することが可能である。これに続いて、第一の分裂の終わりにおいて、整列した染色体が正確に分離する。機能性の双極性紡錘体の集合は、順に、二つの決定的な現象に依存する：(i) 核膜破壊後、紡錘体微小管を核とする核導入の間、細胞の微小管器官中心（即ち、体細胞性又は胚性の中心体）が導入される；及び、(ii) 構造成分（即ち、核の有糸分裂組織タンパク質（例えば、NuMA）及び分子のモータータンパク質（キネシンモータータンパク質を含む）を含む）のセットの作用、これは、卵細胞により大きく寄与され、重複染色体の整列及び分離のための、双極性の紡錘体機構を架橋し、組織化し、形づくる。各移植後の双極性の紡錘体集合における中心体又は構造的／分子モータータンパク質の役割の評価は、以前にされていなかった。本発明は、機能障害性の中心体並びにNuMA及びHSETキネシンの紛失が、核移植後に、誤整列した染色体及び異数体の胚を有する有糸分裂多極性の紡錘体をもたらすことを説明する。
【００４７】
本発明の以下の態様は、ＮＴに関連して有糸分裂紡錘体欠損を収集するための種々の技術に関する。本発明によって提供される該方法論は、従来は効率的な検出が見つかり難かった、第一の有糸分裂エラーに関する潜在的な核移植の失敗についての機構を評価することができる。
【００４８】
複製と双極性の有糸分裂紡錘体を集合する能力の間には直接的な関係があり、それは、重複染色体の正確及び忠実な分離の原因となる。一般に、霊長類において、精子は中心小体に寄与し、それは、機能的な中心体の集合にとって重大な意味を持つ。中心体の集合に続いて、該中心体は、第一の有糸分裂の紡錘体の集合に関与する。卵母細胞は反対に、キネシンスーパーファミリーのメンバー及びダイニンのような、種々のモータータンパク質に寄与し、これは、有糸分裂の紡錘体の微小管に合体する。種々のモータータンパク質の機能は、双極性の有糸分裂の紡錘体の集合に関与しそれを維持する。
【００４９】
有糸分裂紡錘体は、生存可能なヒト及び非-ヒト霊長類の胚の生産に必須である。紡錘体の組織化及び染色体の正確な分離が、それらの分子に依存することは予期されなかった。それらの成分についての必要性は、精子中心体からの構造又は運動性分子を欠損したＮＴによって調製された生存不可能な胚によって証明されている。それ故、精子中に存在する紡錘体形成原理は、ＮＴの有用な成功率を生じるため、及び、選択された特性を有する細胞、組織、又は動物を生産するために意図された胚の実際的な生産のために必要である。
【００５０】
本発明は、中心体の成分の導入がＮＴに関わる有糸分裂紡錘体欠損を矯正し得ることを考慮する。さらにその上、本発明は、有糸分裂紡錘体欠損の矯正に必要な鍵となる成分のいくつかを提供する。特に、それらの成分は、これらに限定されないが、NuMA及びHSET キネシンを含み得る。
【００５１】
本発明はまた、ＮＴに動物、及び特にはヒト又は非-ヒト霊長類を実際的に生産させる種々の方法論を考慮している。特に、所望の特性を有する核は、選択によるか又は設計及び卵への導入によって得られる。正常に生じる核は、宿主に対する遺伝的な適合性又は相補性から選択されることができ、或いは、所望の特性を有するドナーに由来するか又はそれから操作され得る。選択された核は、精子中心体に正常に存在する成分と共に卵中に導入される。中身体の成分の追加が、生胚の生産のために必要である。本発明によって提供されるそれらの方法及び分子の使用は、所望の特性を有する胚を生産するための実用的な方法を創造する。
【００５２】
本発明の特異的な態様は、SCNT及び受精(ICS/NI-2PN)後の前核の除去に関する。図2A-2Gは、SCNT及び受精(ICS/NI-2PN)後の、前核の除去の可能性及び利点を実証している。前の卵母細胞除核なしのICNIは続いて受精される。体細胞は、雌性の前核及び二倍体核の間の地理的な分離を許す第一曲体から遠位に導入され得る。精子は、例えば、重要な色素ミトトラクター（MitoTracker）によるそのミトコンドリアの前標識によって、或いは、取り込まれた精子尾部を映像化することによって、確認され得る。第一の静止期において、二つの前核が抽出され、該再プログラミングされ改造された体細胞の核は、第二の減数分裂の完了後に回復した卵細胞質のタンパク質の完全な補体と共に、精子-活性化された卵母細胞中に存在する。核プログラミングの考察については、一般に、「Wakayama et al., 5(3) CLONING AND STEM CELLS 181-89 (2003)」；「Dinnyes et al., 4(1) CLONING AND STEM CELLS 81-90 (2002)」；及び「Jaenisch et al., 4(4) CLONING AND STEM CELLS 389-96 (2002)」を参照されたい。
【００５３】
さらに、本発明はまた、ＮＴ（二重ＮＴ）の間に、該体細胞の核が再プログラミングされ再造形されるように、第二のＮＴを考慮する。しかしながら、該核は、翌日に前もって細胞質内の精子注入（ＩＣＳＩ）によって受精された他の卵に導入され得る。雄性及び雌性の前核（それぞれ精子及び卵の核）の接合体は、顕微操作によって取り除かれ得る。第一の静止期ＮＴから現在の除核された接合体への第二の核移植は、再プログラミングされた体細胞の二倍体の核を、精子によって活性化され、減数分裂の紡錘体で前もって隔絶された卵細胞質の構成物を含む静止期の細胞質に挿入する。標準的に、紡錘体に関連するモーターは、第二の極体形成の後に、卵細胞質に戻され、二重のＮＴストラテジーによって、それらは完全な補体になる。二重のＮＴは、ブタにおけるＳＣＮＴの間の、その成功した適用を含む、幾つかの利点を与える。しかしながら、それは、２倍の卵の数を必要とし、静止期の核移植によって連関する前核の抽出を含む、複雑な方法をより多く要求する。
【００５４】
本発明の他の態様は、紡錘体の微小管の減少又は排除のためにノコダゾール（nocodazole）又は冷却のいずれかによるか逆的な微小管分解を用いた、減数分裂の紡錘体の崩壊を考慮する。動力学的ＤＮＡイメージングは、モーター又は中心体分子を処分することなくそれらが抽出されることが可能なように、減数分裂の染色体を同定する。紡錘体の崩壊は、特に卵母細胞の回復が完全で迅速である場合に、有効な改善を約束する。
【００５５】
さらに、本発明の他の態様は、卵細胞質電気融合（SCNT+OF）又は微量注入（細胞質の移植及びICNI；CT+ICNI）の何れかにより補充された卵細胞質を用いてイメージされ、これは、ウシのクローニング及び臨床的なＡＲＴ（ＣＴ）のために用いられている（Barritt et al., 5 MOL. HUM. REPROD. 927-33 (1999)）。この点、同じクラッチ(clutch)の卵母細胞からの追加の卵細胞質は、除核の間に失われたものを補充する。代替の態様は、例えば、同じ卵母細胞内での完全な回復が困難であることが判明した場合に、冷却又はノコダゾール-回復（nocodazole-recovery）卵母細胞からの卵細胞質を使用し得る。卵細胞質の補充は、ヒト及びウシにおいて既に成功しており、ちょうど臨床的ICSI+CTのように、ICNIと組合せた場合に（即ち、ICNI+CT）特に簡単である。ICS/NI-2PN（即ち、ICNI、ICSI及び次いで前核の除去）は、二重ＮＴの卵母細胞の半分を使用する。それは二日目の除核を必要とするが、自然な活性化を使用し、サイトカラシン及び紡錘体の破壊の両方を回避する。
【００５６】
本発明は、医学的研究の共同体のための幾つかの重要な利点を有する。遺伝子組換え及びSCNTの可能性を含むように動物及び特に霊長類の複製を拡大することによって、基本的で至急の前臨床調査のための本モデルの有用性は大きく強められる。SCNTは、異常な処理を見つけられ、貴重な霊長類モデルを増殖するための信頼のおける日常的なアプローチとして発達した。それにもかかわらず、種々の疾病、多くの重篤なヒトの疾患のためのげっ歯類モデルを作成するのに日常的に利用できる技術は、それらの下等哺乳類において適切に調査されない。ヒトの疾病のための最も臨床的に関連のあるモデルとしての遺伝子組換え霊長類の生産は、臨床的研究共同体全体にとって重大な意味を有し得る。さらにその上、それらのアプローチの組合せは、研究モデルとしての貴重な遺伝子組換え霊長類を増殖するための信頼できる有効な処理をもたらす。最終的に、研究のための適用システムが、遺伝子組換えマウスと重篤に病んだ患者との間のギャップをうめることが見いだされるまで、安全で有効な遺伝子治療方法の保証は完全には現実化できない。結果的に、遺伝的に改変された霊長類、特にヒト及び非ヒト霊長類を生成するための信頼できる有効な方法を発達するための強力な理由がある。従って、本発明は、これらに限定されないが、細胞治療（神経、脳、及び髄幹細胞処理、肝臓幹細胞処理、膵臓幹細胞処理、心臓の幹細胞処理、腎臓の幹細胞処理、血液幹細胞処理、網膜幹細胞処理、糖尿病-幹細胞処理、整形の-幹細胞処理、研究のための等しい霊長類モデル、薬物発見、薬物発見のための胚性幹細胞）、薬学的及び医学的なデバイス（薬物発見及び検査のための疾病の動物モデル、薬理学的な標的同定、薬物発見、薬物有効性検査、医学的デバイスの生体適合性を含む）、農業、珍しい絶滅寸前の種、及び毒物学評価を含む、臨床的及び調査の適用を有し得る。
【００５７】
さらにその上、本発明はまた、ヒトの疾病を治療するために、胚性幹細胞及び遺伝子組換え胚性幹細胞を用いる方法に関する。特に、本発明において開示された、霊長類、特にヒト又は非-ヒト霊長類のクローン増殖のための方法は、胚性幹細胞及び遺伝子組換え胚性幹細胞を作成するために用いられ得る。
【００５８】
胚の内部細胞塊（即ち、胚盤胞）からの細胞は、胚性幹細胞株を引き出すために用いられることができ、及びそれらの細胞は組織培養において維持され得る（例えば、Schuldiner et al., 97 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 11307-12 (2000); Amit et al., 15 DEV. BIOL. 271-78 (2000)；米国特許第5,843,780号；及び米国特許第5,874,301号を参照）。一般に、幹細胞は、相対的に未分化型であり、しかし、分化型の機能性細胞の元になり得る。例えば、造血性の幹細胞は、赤血球及び白血球のような最終的に分化した血液細胞の元になり得る。
【００５９】
図3は、そのような方法の基本の概要を提供し、特に、胚性幹細胞は、脊髄の損傷のような、患者における損傷を治癒するための新しい神経に成長可能である（図３Ａ）。卵は、患者の卵巣から取り出され（図3B）、ペトリ皿に置かれる。卵に付着している細胞は除去される（図3C）。卵の内側には核があり（図3D）、これは、クローン胚を作るために除去される。例えば、卵は、微細な針又はピペットで穴をあけられ（図3E）、核を出すために、穏やかに搾り出されるか又は吸引され（図3F）、そして核が取り出される（図3G）。前もって卵から取り出された細胞の一つ（図3C）が、卵に注入される（図3H）。電流が卵を活性化する（図3I）。注入された細胞の遺伝的物質が、卵を発達に導く（図3J）。細胞分割が開始する（図3K）。特に、二つの新しい細胞の間でそれが等しく分けられるように、遺伝的物質が分割される。該細胞は再び分割されて、４細胞期になる（図3L）。幹細胞を含む、内部細胞塊と呼ばれるエリアの後期の多くの細胞分割は、目に見える(図3M)。幹細胞は除去され、増殖培地に置かれる(図3N)。幹細胞はコロニーに増殖し(図3O)、これは、分割と増殖を繰り返すことができ、数百万の幹細胞になる（図3P）。それらの細胞は、霊長類の身体の任意の組織、例えば、筋肉、神経、膵臓、及び骨細胞に成長することができる(図3Q)。特殊分化された細胞は、新しい、作用する細胞が増殖するように、ヒト患者の損傷又は疾病部位に戻される(図3R)。
【００６０】
本発明の方法を用いて、特定の疾病に関連する遺伝子を発現する遺伝子組換えの霊長類の胚性幹細胞が生成されることもできる。例えば、遺伝子組換えの霊長類の胚性細胞は、ドーパミンの生合成経路に関与する酵素である、チロシンヒドロキシラーゼを発現するよう設計されることができる。パーキンソン病において、この神経伝達物質は、脳の基底核領域において枯渇される。よって、チロシンヒドロキシラーゼを発現する遺伝子組換えの霊長類の胚性細胞は、パーキンソン病に罹患した患者の基底核の領域に移植されてよく、及びドーパミンの神経レベルを潜在的に回復する（例えばBankiewicz et al., 144 EXP. NEUROL. 147-56 (1997)を参照）。本発明に記載された方法は、それ故、多数のヒトの疾病及び疾患を治療するために用いられ得る（例えば、Rathjen et al., 10 REPROD. FERTIL. DEV. 31-47 (1998); Guan et al., 16 ALTEX 135-41 (1999); Rovira et al., 96 BLOOD 4111-117 (2000); Muller et al., 14 FASEB J. 2540-48 (2000)を参照）。
【００６１】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、次の具体的な実施例から明らかであろう。該実施例は、本発明の具体的な態様を示しているが、説明のためにのみ提供されるものである。従って、本発明は、本詳細な説明から当業者には明らかな本発明の精神及び範囲内でのそれらの種々の変化及び改変を含む。
【実施例】
【００６２】
実施例１：卵母細胞の収集と核移植
卵母細胞の時期の、アカゲザルの卵の受精を過度に刺激する方法は、「Hewitson et al. (77 FERTIL. STERIL. 794-801 (2002))」に開示されている。7.5 μg/mlのサイトカラシン D (CCD)及び1 μg/mlのヘキスト（Hoechst）33342 DNA染料(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含むTALP-Hepesに短時間曝露された、成熟した未受精卵母細胞の除核は、第二の有糸分裂紡錘体を含む基礎をなす、第一極体及び細胞質を吸引するために、30μmのIDピペット(Humagen, Charlottsville, VA)を用いて行った(Meng et al., 57 BIOL. REPROD. 454-9 (1997))。母系性のクロマチンの除去はヘキストイメージングにより確認した。胚性細胞核移植(ECNT)のために、ドナー割球を、0.5% プロナーゼ(Boehringer Mannheim)での透明帯除去後、4-〜32-細胞胚から単離し、それぞれ1 mMのEDTA及びEGTAを含む、Ca2+-及びMg2+-を含まないTALP-Hepes中で培養した。一つの割球は、除核された卵母細胞の卵黄周囲腔中にピペットで移され、30〜60分の回復後、0.3 Mのソルビトール、0.1 mM 酢酸カルシウム、0.1 mM 酢酸マグネシウム及び0.5 mg/mlのFFA-BSA (Sigma)中でのBTX細胞マニピュレーター2001 (Genentronics, Inc., San Diego, CA)を用いて、２つのDCパルス(1.2 kV/cm, 30 μsec)で融合した。ECNTは、2〜4時間後の割球融合より前の活性化、並びに、受取る細胞質体のための、熟成したか又は静止期の卵母細胞を用いて行った。SCNTのために除核された卵母細胞は、一つのドナー細胞を直接注入されたか、又は透明帯下におけるドナー細胞の移植後に融合されたかの何れかであった。細胞核ドナー源は、分離された顆粒層細胞、アカゲザルの臍のひもから収集した内皮細胞、単離され、培養されたアカゲザル胚盤胞（2〜3継代）に由来するICM細胞、及び初期のアカゲザル線維芽細胞株を含む。
【００６３】
活性化プロトコール。  NT構築物は細胞融合から１〜４時間後に活性化し、120 mM KCl、20 mM HEPES、100 μM EGTA、10 mM グリセロールリン酸ナトリウム(Wilmut et al., 419 Nature 583-87 (2002))中で調製され、0.22 μm SpinXフィルター(Costar, Cambridge, MA)で滅菌された、120-240 pg ml-1のアカゲザル精子抽出物のマイクロインジェクションによって、或いは、約5 μM〜約10 μMのイオノマイシン（５分；室温）及び1.9 mM DMAPで４時間(Chanet al., 287 SCIENCE 317-19 (2000))連続的に処理することによって、核の再プログラミングを可能にした。DMAP後、卵を広範に洗浄し、TALP中で培養した。フェルトクローン（FertClones）は、除去された母系性のクロマチンを含む細胞質体と除核された卵母細胞との融合によって調製し、次いで、ICSIにより２〜３時間後に受精した。全て、TALP中で24時間培養され、次いで、CMRL培地中のバッファローラット肝臓細胞(BRL)単層中で培養された。
【００６４】
マイクロインジェクション。  抗体阻害調査は、一次抗体を前面にロードした9-μmのマイクロピペット(Humagen)を用いて行った。卵容量（〜700 pl）の４〜６％が、抗体2-10 mg ml-1を微量注入された。最終的な抗体濃度は、卵母細胞あたり、70〜350 pgの総Igタンパク質であった。微量注入された卵母細胞及び卵のイメージングのために、一次抗体を取り除いた。
【００６５】
胚移植。胚移植のために、代理の雌性のアカゲザルは、血清エストラジオール及びプロゲステロンのレベルに基づいて選択した。妊娠は、内分泌学的なプロフィール及び、24〜30日の間に行った胎性の超音波により確認した(Wilmut et al., 385 NATURE  810-3 (1997))。
【００６６】
イメージング。  卵母細胞及びNTの固定化及び免疫細胞化学のための方法は、開示されたように行った（Mitalipov et al., 66 BIOL. REPROD. 1449-55 (2002)）。中心体は、g-チューブリン又はペリセントリン（pericentrin）ポリクローナルウサギ抗体（それぞれDr. T. Stearns [Stanford]及びS. Doxsey [U. of Mass]の寄贈品）により検出した（Thomson et al., 92 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 7844-48 (1995)及びThomson et al., 282 SCIENCE 1145-47 (1998)）。NuMA、HSET及びEg5は、記載されたようなウサギポリクローナル抗体を用いて検出した（Wilmut et al. (1997),及びHumpherys et al. (2002)）。微小管は、E7マウスモノクローナル抗体で免疫標識した（Wilmut et al., 385 NATURE 810-3 (1997)）。一次抗体は、共焦点の顕微鏡観察による観察のためのAlexa二次抗体（Alexa-546ヤギ抗マウスIgG；Alexa-488 ヤギ抗ウサギIgG；Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて検出した。一次及び二次抗体はそれぞれ、４０分、３７℃で適用し；PBS + 0.1% トリトンで漱ぎを行った。DNAは終わりから2番目のすすぎに加えられた5μg/mlのヘキスト33342（Sigma）及び1μMのToto-3 (Molecular Probes)によって蛍光で検出した。カバーガラスはベクタシールド・アンチフェード（Vectashield antifade）(Vector Labs, CA)でのせた。コントロールは、非免疫性の二次抗体を単独で含み、これは、紡錘体微小管又は中心体を検出しない。スライドは、従来の免疫蛍光法及びレーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて試験した。従来の蛍光顕微鏡は、多数の口径の対物レンズを備えるNikon Eclipse E1000 顕微鏡を最初に用いて行った。データは、冷却CCDカメラ（Hamamatsu Instruments Inc., Japan）を用いて、Metamorphソフトウェア（Universal Imaging, West Chester, PA)を用いて、デジタル方式で記録した。レーザースキャニング共焦点顕微鏡は、Alexa-抱合型の二次抗体及びToto-3 DNA染色の同時励起のための、アルゴン及びヘリウム-ネオンレーザーを備えたLeica SP-2を用いて行った。
【００６７】
免疫ブロット。  マウスの卵母細胞及びヒトの卵巣タンパク質抽出物（Clontech, Inc., Palo Alto, CA）を、「Humpherys et al. (2002)」に開示されたような、直線勾配SDS-PAGEゲル及びウェスタンブロットで分離した。
【００６８】
実施例２    胚性幹細胞の生成
ES細胞は、以下の方法により胚から確立した。SCNTに続いて、2〜4割球をマイクロウェル中で培養し、これは、マウスの胚性線維芽細胞(MEF)、又はヒト又は非-ヒトの何れかの、霊長類の胚性線維芽細胞(PEF)に由来するフィーダー細胞の単層を含む（Richards et al., 21(5) Stem 細胞546-56 (2003); Richards et al., 20 Nature Biotech. 933-36 (2002))。残った胚は、次いで、実施例１で記載したように再構築された胚の空の帯域に移植される。このES細胞株を単離及び培養するための共培養系は、当該分野で周知である（例えば、Thomson et al., 92 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7844-48 (1995); Ouhibi et al., 40 Mol. Reprod. Dev. 311-24 (1995)を参照）。フィーダー細胞が、幹細胞分化を阻害する成長因子様白血病阻害因子（LIF）を提供することが示唆されている。マイクロウェルは、5〜10 μlの培養培地（基本培地として80％ DMEM、20％ FBS、1mM β-メルカプトエタノール、1000 units/ml LIF、非必須アミノ酸、及びグルタミン）を含む。次いで、細胞は、37℃、５％ CO2で、鉱物油で覆われてインキュベートされた。新鮮な培地を毎日交換し、割球の生存を細胞分割により判定した。初期の培養の間、細胞のMEF単層への接着及びコロニー形成が観察されるまで、細胞凝集塊を機械的に分離させる。次いで、安定な細胞株が確立されるまで、培養を徐々に拡大するために、コロニーを4-ウェルプレートに、続いて、35 mm皿に継代培養する。分離された割球培養物に加えて、再構築された胚もまた、胚盤胞期に達するまで培養される。帯域（zonae）のない孵化（Hatch）胚盤胞又は胚盤胞は、上記したように、マイクロウェル中でMEF単層上で培養される。割球を分離する代わりに、胚盤胞をMEF単層に接着させる。一旦、胚盤胞がMEFに接着したら、そのICM細胞は機械的に単離され、新鮮な培養ウェルに移される。胚性細胞は、上記のように培養し、該細胞の増大は、個々のコロニーが観察されるまで継続される。個々のコロニーは、クローン増殖のため
に選択される。このクローン選択及び増殖プロセスは、クローン細胞株が確立されるまで継続される。
【００６９】
未受精卵母細胞の偽型のレトロウイルスベクターによる感染は、遺伝子組換えの非ヒト霊長類を生成するために上手く用いられてきた。それらの方法は、係属中の米国特許出願番号第09/736,271号及び同第09/754,276号に開示されており、それらは参照によって本明細書に明確に援用される。導入遺伝子の存在は、遺伝子組換えサルの全組織中で証明され、それは、初期の組み込み現象が、恐らく受精の前に母系性の染色体中に生じていることを示唆している。遺伝子組換え胚性幹細胞株を生成するために、偽型感染によって生成された遺伝子組換え胚は、クローン胚生成プロセスにおいて上記に記載されたように分離される。それらの分割胚は、次いで、クローン子孫を生成するために用いられ、その胚性対応物は遺伝子組換え胚性幹細胞株を生成するために用いられる。従って、該遺伝子組換え子孫及び遺伝子組換え胚性幹細胞株は、卵母細胞期において達成される同じ遺伝子改変を共有する。
【００７０】
本発明の記載された実施例及び系の種々の改変及び変動は、本発明の範囲及び精神から外れることがないことは、当該分野の技術者には明白である。本発明が特定の態様と関連付けて記載されているとはいえ、請求された本発明がそのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際に、関連する分野の技術者には明らかな、本発明を実行するための記載された様式の種々の改変は、以下の態様の範囲内であることが意図される。
【００７１】
実施例３
卵母細胞収集。  卵母細胞の時期の、非ヒト霊長類の卵の細胞質内への精子注入(ICSI)受精を過度に刺激する方法は、「Hewitson, 13 HUM. REPROD. 3449-3455 (1998)」に開示されている。未成熟なウシ卵母細胞を、Bomed (Madison, WI)から入手し、先に記載したように、成熟した卵母細胞の収集のための改変TC199成熟培地で、一晩の発現をさせた（shipped）（Navara, 162 DEV. BIOL. 29-40 (1994)）。
【００７２】
除核。  減数分裂紡錘体及び染色体の除核は、2つの方法で達成された。分裂中期IIの前の紡錘体吸引のための「ぐしゃっとつぶす（squish）」除核方法(Hwang, 303 SCIENCE 1669-1674 (2004))を使用して、卵丘を有さない卵母細胞を保持マイクロピペット（110-μm 内部直径）で保持し、第一極体近くにスリットを作るため、微細なガラス針で透明帯を部分的に切り裂いた。第一極体及び減数分裂の紡錘体を含む隣接する細胞質は、分裂終期-Iから前分裂中期-IIにわたって、針で搾る（squeezing）ことによって押出される。卵母細胞は、0.3% BSA及び7.5 μg/ml サイトカラシンBを補充されたHepes緩衝TALP中で除核される（Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO）。或いは抽出による分裂中期-IIの紡錘体吸引のために、成熟した未受精卵母細胞は、第二減数分裂の紡錘体を含む、第一極体及び基礎をなす細胞質の吸引のために、22 μm I.Dピペット(Humagen, Charlottesville, VA)による吸引の適用を使用する前に、7.5 μg/ml サイトカラシン D を含むTALP-Hepes (CCD; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)に最初に曝露される。除核の後、カリオプラスト（karyoplasts）は、5 μg/mlのビスベンチアミン(Hoechst 33342, Sigma-Aldrich Corp.)で５分間染色され、落蛍光（epifluorescence）を備えた倒立顕微鏡下で観察された。ＤＮＡ物質をなおも含有する卵母細胞は、さらなる実験から除外された。
【００７３】
核移植。  体細胞核ドナー源は、分離された卵丘細胞（自己由来及び異種性源の両方）及び初期のアカゲザル線維芽細胞株を含む。滑らかな表面を示す集蜜的な線維芽細胞株又は卵丘細胞からの、トリプシン処理された単一細胞が倒立顕微鏡下で選択され、除核された卵母細胞の卵黄周囲腔中に移された。それらのカプレット（couplets）は、0.5 mM Hepes、0.1 mM CaCl2、及び0.1 mM MgCl2を含有する0.3 M マンニトール溶液で４分間、平衡化され、マンニトール溶液でうすくおおわれた（overlaid）2つの電極を含むチャンバーに移される。カプレットは、BTX Electro-Cell Manipulator 2001 (BTX, Inc., San Diego, CA)を用いて、2.7 kV/cmの15 μsecの２つのDCパルスで融合された。成功した融合は、卵黄周囲腔におけるドナー細胞の非存在によって、エレクトロポレーション後45〜60分間確認された。
【００７４】
ECNT（胚性割球細胞核移植）のために、ドナー割球は、0.5％のプロナーゼ(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN)による透明帯除去後、16-〜32-細胞期の胚から単離され、それぞれ1 mMのEDTA及びEGTAを含む、Ca++-及びMg++-を含まないTALP-Hepes中で培養された。一つの割球は、除核された卵母細胞の卵黄周囲腔中にピペットで移し、30〜60分の回復後、上記のように２つのDCパルスによって融合される。幾つかの卵丘SCNTのために、除核された卵母細胞に、9-μmのピペットを用いて一つのドナー細胞を直接注入し、続いて、細胞質内核注入(ICNI)のマウスSCNT方法（Simerly & Navara, 5 CLONING STEM CELLS 319-331 (2003); Wakayama & Perry, PRINCIPLES OF CLONING 301-341 (2002)）を行った。ウシSCNT及びECNTは、以前に「Navara, 162 DEV. BIOL. 29-40 (1994)」に開示されたように行った。
【００７５】
活性化プロトコール。  再構築された胚を、i. 同時の電気的な融合処置(EFA)；ii. 5 μMイオノマイシン(CalBiochem, La Jolla, CA)へ４分間曝露し、続いて、4時間、1.9 mMの6-ジメチルアミノプリン(EFIAD)中でインキュベートすることによる、NT 融合の2時間後の化学的活性化、又はiii. NHP 精子抽出物の注入 [EFSFA; 120-240 pg ml-1]（Simerly & Navara, supra.）により活性化した（表１）。活性化された卵母細胞は、4 mg/mlの脂肪酸を含まないBSA (Sigma-Aldrich Corp.)を補充されたTALP-HEPESで３回洗浄され(Bavister, 28 BIOL. REPROD. 983-999 (1983))、37℃、5％ CO2下で、G1.1 培養培地の25 μlの微小液滴（液滴あたり5-7 卵母細胞）中に置かれた(Vitrolife, Boulder, CO)。
【００７６】
模倣のクローニング方法による受精活性化。  SCNT自体の生物学的な不適合性からの、SCNTの多くの粗い物理的及び化学的方法（例えば、サイトカラシン、物理的除核、電気的融合、化学的活性化等）の有害な結果を分析するため、受精した卵を、クローニングの方法を用いて再構築した。それらのフェルトクローンを、ドナー核の無処置の卵母細胞への融合、続いて、2-3時間後のICSI 受精によって生成した。SCNT+met-II無処理構築物は、ドナー核を無処理の卵母細胞に融合し、続いて、精子因子又はイオノマイシン/DMAPで上記したように人工的に活性化することによって生成した。
【００７７】
インビトロ培養。全ての核移植構築物は、「Hwang et al., supra」（参照によって本明細書に援用される）に開示されているように、連続的にG1-G2-mSOF培地で発達された。G1培地は、NT後48時間用いられ、その後、G2培地に移され、さらに48時間発達された。桑実期のあたりで、胚を胚盤胞期までフルクトースを含むmSOFに移した。
【００７８】
胚導入。  胚導入（transfer）のために、代理の雌性のマカクを、血清エストラジール及びプロゲステロンレベルに基づいて選択した。妊娠は、内分泌学的なプロフィール及び16〜30日の間に行った胎性の超音波によって確認した（Hewitson, 5 NAT. MED. 431 433 (1999)）。
【００７９】
イメージング。  生きた卵母細胞のイメージングは、偏光光学（polarization optics）(紡錘体ViewTM; CRI, Cambridge, MA)及び３７℃に維持するための熱可塑性温度コントロールステージ(Tokai HIT Inc, Japan)を備えたニコン（Nikon）TE 2000倒立顕微鏡を用いて達成した。免疫細胞化学のための方法は、「Simerly＆Schatten, 225 METHODS ENZYMOL. 516-553 (1993)」に開示されたように行った。NuMA、HSET (ヒト脾臓胚性組織及び精巣)、及びEg5は、「Mountain, 147 J. 細胞BIOL. 351-366 (1999); Simerly et al., 300 SCIENCE, 297 (2003)」に開示されているように、ウサギポリクローナル抗体を用いて検出した。微小管は、E7マウスモノクローナル抗体を用いて免疫標識した（Simerly, 1 NAT. MED. 47-52 (1995)）。BrDU標識は、キットを以前に公表された製造者の指示に従って用いて行った（Hewitson, supra.）。一次抗体を、Alexa二次抗体を用いて検出した(Alexa-546ヤギ抗マウスIgG；Alexa-488ヤギ抗ウサギIgG; Molecular Probes, Eugene, OR)。一次及び二次の各抗体は、40分、37℃で適用された。PBS+0.1％トリトンですすぎを行った。DNAは、最後から２番目のすすぎに添加された10μg/ml ヘキスト33342 (Sigma)及び1μM Toto-3 (Molecular Probes)によって蛍光的に検出した。カバーガラスは、Vectashield antifade (Vector Labs, Burlingame, CA)でのせた。コントロールは、非免疫の二次抗体を単独で含み、これは、紡錘体微小管又は中心体を検出しない。スライドは、従来の免疫蛍光及び/又はレーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて検査した。従来の蛍光顕微鏡は、多数の口径の対物レンズを備えるNikon Eclipse E1000 顕微鏡を最初に用いて行った。データは、冷却CCDカメラ（Hamamatsu Instruments Inc., Japan）を用いて、Metamorphソフトウェア（Universal Imaging, West Chester, PA)を用いて、デジタル方式で記録した。レーザースキャニング共焦点顕微鏡は、Alexa-抱合型の二次抗体及びToto-3 DNA染色の同時励起のための、アルゴン及びヘリウム-ネオンレーザーを備えたLeica SP-2を用いて行った。
【００８０】
結果  「ぐしゃっとすぶす」除核及びインビトロでのSCNT NHP 構築物の発達。  生きた未受精NHP卵母細胞における紡錘体-染色体複合体(SCC)の、Spindle ViewTM偏光光学による動的イメージングは、除核の前の減数分裂の正確な評価のために有用である。第二減数分裂の紡錘体は、暗い細胞質に対して明るい複屈折の双極性の構造として見られる（図4A、矢印）。ほとんど完全な第一極体の押出しである、卵母細胞の「ぐしゃっとつぶす」除核は、しばしば、分裂終期-I期においてSCCを除去する（図4B)。この分裂中期-II期の前の押出しによる除核に続いて、通常の核型を示す一つのアカゲザル線維芽細胞が、構築物を同時に活性化するためにも役立つ、電気融合によって導入される（図4C、挿入図）。融合及び活性化の後８時間で、一つの非凝集（decondensed）核が1-細胞構築物の滑らかな細胞質中に見られた（図4C）。
【００８１】
広がった、孵化胚盤胞期への最初の卵割からインビトロ移植前発達を図4D-K及び表１に示した。SCNTに由来する構築物のインビトロでの発達は、ICSI 受精した胚の発達に比較して促進される（Hewitson, supra.）。活性化後24時間で、SCNT構築物は、第一の分割を受けて、各娘細胞における単一の見かけ上の核を有する等しい割球を示す（図4D）。活性化後３６時間で、第二の分割が開始する（図4E；上部左の割球において核が見える一つの娘細胞を有する3-細胞胚）。活性化後50時間において、等しいサイズ、滑らかな割球及び各細胞内に一つの核を有する8-細胞SCNT胚が観察される（図4F）。NHP 胚中に共通して出現するわずかな分裂が、幾つかの胚の卵黄周囲腔中に見られる（図4F、矢印）。16-細胞期への発達は、活性化後72時間及び96時間で観察され（図4G；各割球中の単一の核を示すために上部平面に焦点を合わせた)、平らにされた、見分けのつかない割球を有する固められた桑実胚が観察された（図4H）。はっきり見える胞胚腔（矢印）を含む初期胚盤胞（図4I)の第一の徴候は、活性化後110時間で発見され、及び大きく拡張した胞胚腔を有する広がった胚盤胞は活性化後125時間で観察された（図4J）。完全に広がった孵化胚盤胞は、活性化後154時間で観察され、該時期は典型的に、幹細胞を誘導するためにICMを単離するのに選択された（図4K）。
【００８２】
表Ｉは、新鮮な、相同的な卵丘細胞又は集蜜的な異種性のアカゲザル皮膚線維芽細胞の何れかによるNHP SCNTを提示する。極めて成功したNT融合、核再編成及び胚性発達が、卵丘細胞と比較したドナー源としての線維芽細胞を用いて観察された。さらにその上、電気融合強度が同時の線維芽細胞融合及び細胞質体活性化(EFA)を可能にする場合、著しくより拡大した胚盤胞が、化学的又は精子因子活性化の何れかと比較して、ＮＴ後２時間のインキュベーションで生成した。同時の融合/活性化によって生成した３つのSCNT 胚盤胞の２つは、NT-nhp-ES 細胞誘導のための免疫手術後同定可能な内部細胞塊[ICM]細胞を有する。４番目のキメラの胚盤胞は、SCNT桑実胚（電気融合され、続いて2時間のイオノマイシン/DMAP単離）と受精した桑実胚との再集合によって誘導される（図4L）。それらの推定上のNT-nhp-ES細胞の全てが、1週間後、インビトロで、増殖を停止された。
【００８３】
持続した妊娠の証拠は確認されなかった（表II）。早期妊娠指標、例えば、１６日目あたりの超音波検査及び血清nhpCG測定は、進行中の妊娠の決定的でない予報であると知られている（Munro, 41 AM. J. PRIMATOL. 307-322 (1997)）。表IIは、３０日目に写し出された胎児の心拍動によって立証された妊娠確定を報告している。
【００８４】
幾つかのSCNT胚（〜1％）は、胚盤胞期に発達する（Mitalipov, 66 BIOL. REPROD. 1367-1373 (2002)を参照されたい）。ここで、SCNT胚が形態学的に正常に見えるにもかかわらず（図4C-K；表Ｉ）、吸引除核によって作成された多くのNT構築物が、なお異数性を示している（図5）。DNAの誤った分離は、紡錘体の極におけるラギング染色体及びゆるく組織化されたＤＮＡによって証明されるように（図5A、青、DNA；矢：ラギングクロマチン)、最初の有糸分裂の分裂終期に流行する（図5A)。第二の分割（図5B）において、多くの娘割球(青)における核節（karyomeres）及び第二の有糸分裂紡錘体の異常な集合が観察された(緑)。4-細胞期までに（図5C）、DNA立体配置(青)は、各娘割球内で広く変動する。8-細胞期へ進む発達のように（図5D-5E）、単星状の（monastral）静止期微小管パターン(緑)は、DNA欠損か又は不適当な染色体を有する(青)ことが観察された。8-細胞期におけるコントロール単為生殖の胚は、典型的な微小管及びこの時期のDNA立体配置を示す（図5F）。
【００８５】
NHP SCNT又はECNT構築物における異常な最初の静止期の微小管組織化は、ウシのNTクローン又はNHP男系生殖とは異なる。体細胞の核DNA及び細胞質の成分[即ち、ミトコンドリア及び中心体、細胞の主要な微小管組織化中心(MTOC)]は、融合によるSCNT後に卵母細胞の細胞質に入る。SCNT構築物における微小管のパターンの分析は、成熟した分裂中期-II減数分裂の紡錘体の吸引によって行われ、該体細胞の中心体が、静止期の終わりまでに、取り込まれた体細胞の核の近くの細胞質微小管を全く集合しないことが示される（図6A及び6B：微小管、緑；DNA、青)。典型的には、皮層の混乱した微小管パターンは、SCNT構築物の活性化後に観察される（図6C：微小管、緑；DNA、青；Wu、55 BIOL. REPROD. 260-270 (1996)）。ECNT後、寄与した割球中心体は、一貫して細胞質の微小管を集合する（ECNT：図6D、矢印）。逆に、NTが、ドナーとしてICSI受精した接合体からの雄性の前核を用いて行われた場合、精子中心体から出る対称的な微小管アレイが観察される（図6E、MPn、矢印）。分裂中期-IIの無処置の卵母細胞へのSCNT及びICSI受精による活性化[Fert+SCNT]に続いて、非凝集の（decondensed）雄性及び雌性の前核でそれぞれ観察されたように、BrDU核標識は、移植された体細胞性の核におけるＤＮＡ合成の開始の成功及び細胞周期の進行を示した（図6F、BrDU、緑）。
【００８６】
種間のSCNT。  ウシのSCNTが、NHP SCNTよりも著しく高い率で成功したために、ウシの細胞質がNHP卵細胞質よりもNT-紡錘体形成により貢献するか否か、或いは、ウシの体細胞の中心体がNT-紡錘体組織化のためのNHP体細胞性中心体よりもより弾力がある（resilient）か否かという問題を解決するために、種間のSCNTが行われた。非-ヒト霊長類クローンと異なり、ウシＸウシSCNTは、受精の精子星状体と類似する、核に並列された一つの放射状に配列した星状体の形成をもたらす（SCNT：図6G；ECNT：図6H；微小管、緑)。ウシNT構築物は、最初の有糸分裂で整列した染色体を有する正常な双極性の紡錘体を生成する（図6I）。さらにその上、ウシの卵細胞質は、ウシの除核された細胞質体へのSCNT後の、再編成された線維芽細胞核に隣接する、焦点を合わせた微小管星状アレイによって明らかなように、NHP構築物よりもよく外来性の中心体移植を許容するように見える（図6J)。
【００８７】
雄核発生。  我々は、除核された卵母細胞のICSI受精に由来する、男系生殖における微小管及びDNAパターンを検討した（図7)。除核された細胞質体内における非凝集の導入された精子DNAのように、微小管星状アレイは、導入された父系性の中心体から構築された（図7A、矢印；矢印：組み込まれた精子軸糸)。細胞質内の、及び、後期静止期における、広がった微小管（図7B、緑)は、完全に形成された雄性の前核に隣接する、複製され分割された父性的に由来する中心体から放出されるのが観察された（図7C、矢印)。前分裂中期の後期において、各極に星状体(中心体)を有する双極性の紡錘体及び整列している分裂中期染色体が集合した（図7D, 矢印；矢印：精子軸糸)。雄核発生は典型的には、最初の有糸分裂を通して進行し、第一の細胞分割時の正確な染色体分離を完了する（図7E）。前核期において試験された男系生殖の80％[8/10]が、正常な微小管及び染色体のパターンであると証明されたが、24％[8/33]のみが正常な8-細胞期の胚を生成した。
【００８８】
紡錘体分子モーター及びマトリクスタンパク質のない（missing）SCNTクローンは、誤整列した染色体を有する多極性の紡錘体を形成した。第一有糸分裂において、成熟した分裂中期II減数分裂の紡錘体の吸引後に発生した、NT構築物は、誤整列した染色体を有する乱れた紡錘体を発達させた（図8A-8C；Simerly et al., supra.を参照）。割球NT後、MTOCの観察された核のある微小管は、点在する染色体を含む、集合した三極-又は四極の分裂中期紡錘体上で、明確に誤整列した（図8A及び8B、緑、矢印）。同様の異常な有糸分裂紡錘体集合及び染色体変態は、有糸分裂SCNTにおいて発見され、しかし、最終的な紡錘体極MTOCの核のある微小管は、通常欠いている（図8C、緑）。
【００８９】
鍵となる中心体及び分子モータータンパク質は、核移植と、無処置の卵母細胞（即ち、SCCの除核なし）の受精(Simerly et al., supra)又は人工的な活性化の何れかを組合せることによって生成した構築物中の紡錘体集合と比較して、核移植後に有糸分裂紡錘体が欠損している。哺乳類の卵母細胞中に発見されたNuMA、紡錘体極集合タンパク質(Lee, 62 BIOL. REPROD. 1184-1192 (2000); Tang, 11 J. BIOMED. SCI. 370-376 (2004))は、再構成された静止期SCNT又は活性化後のECNT核において濃縮した（図8D、緑)。しかしながら、第一有糸分裂によって、NuMAタンパク質は、検出されないか再構成する(Simerly et al., supra)、又は、NT有糸分裂紡錘体極上での濃縮がわずかに検出可能である（図8E; 緑)。逆に、SCNT（SCNT+Met-II）後に無処置の卵母細胞の活性化から生成された有糸分裂構築物は、極上でより整列した染色体及び大量のNuMAを有するが、さらに、誤整列したMTOCを有する、紡錘体を生じた（図8F、緑；矢印：中心体）。同様に、減数分裂及び有糸分裂紡錘体における微小管マイナス末端へ輸送（traffics）する(Simerly et al., supra)、有糸分裂キネシンHSETは、誤整列した染色体を示す有糸分裂核移植紡錘体中に検出されなかった（図8G；緑；挿入図：微小管、赤；DNA、青）。HSETタンパク質検出は、有糸分裂SCNT+Met-II構築物の紡錘体極において修復され（図8H、緑）、しかし、染色体は、微小管紡錘体格子において散らばったまま残る（図8H、青）。動原体において、及び数分裂及び有糸分裂の紡錘体における動原体-微小管束上で観察される、逆に向けられたキネシン有糸分裂微小管モータータンパク質Eg5 (Simerly et al., supra)は、有糸分裂核移植において誤整列した染色体を有する多極性の紡錘体上の姉妹動原体において対で残存する（図8I）。
【００９０】
除核されたカリオプラストにおける、及びSCCの除去後の残存する細胞質体における、HSET及びNuMA検出が調査された。SCCの除核の成功後(図9A、挿入図、DNA)、集合した微小管が細胞質体において観察されなかった（図9A、緑）。巨大な単星状の静止期微小管アレイは、除核された細胞質体の精子因子又はイオノマイシン/DMAP化学的活性化後に集合した（図9B、緑；挿入図：DNA）。活性化された細胞質体はまれに、第一有糸分裂においてDNAなしで、非定型の星状双極性の紡錘体様構造を生じる（図9C、緑；挿入図：DNA）。「ぐしゃっとつぶす」除核によって生成したSCC-含有カリオプラストは、紡錘体格子内に検出された HSETタンパク質（図9D, 緑)を有する無処置の分裂中期-II紡錘体（図9D；挿入図：赤、微小管；青、DNA)を保持する。卵丘及び線維芽細胞SCNTドナー細胞は、NTのために用いられる細胞周期において体細胞性のHSETを保持する（図9E及び9F、緑）。
【００９１】
タキソール-誘導微小管補充。  パクリタキセル、有効な微小管分解阻害剤は、SCCの存在下又は非存在下において、増大した微小管に対する細胞質のHSET補充を調査するために用いられた。無処置の卵母細胞のパクリタキセルへの曝露は、第二減数分裂の紡錘体極においてのみHSETタンパク質を増強する（図9G：矢印、HSET、緑：矢印：細胞質の微小管星状体）。SCCを欠く除核された細胞質体(図9H、青、DNA)がパクリタキセルで処理されたとき、多数の細胞質の微小管束が細胞質内で集合する（図9I、赤）が、HSETタンパク質は検出されない（図9J、緑）。
【００９２】
SCCの除去後の細胞質NuMA。  NuMAは、押出しによる除核後のSCCの紡錘体極に存した（図10A、緑）。残った除核された細胞質体は、集合した微小管（図10B、上部挿入図、赤）も、検出可能な細胞質のNuMA（図10B、緑；下部挿入図：DNA）も有さなかった。SCC-無処置卵母細胞のパクリタキセル処置は、組織崩壊した紡錘体極におけるNuMA局在化（図10C、緑、低い矢印）及び集合した細胞質の微小管星状体（図10C、緑、矢印）を示した。卵丘及び線維芽細胞SCNTドナー細胞の両方が、NTの前に核内のNuMAを示している（図10D及び10E、緑）。依然として、大量の母系性のNuMAタンパク質がSCC押出し後に残存し、核移入のために利用可能であった。さらにその上、融合時の線維芽細胞によって提供される体細胞性の核内のNuMAの量は、核移入のために利用できる母系性のタンパク質と比較して相対的に小さい（図10F；緑、矢印：非融合線維芽細胞）。それにもかかわらず、SCNT後のNuMAのNT紡錘体への補充は、損なわれるようにみえる。第二の減数分裂において堅固に静止したままである、活性化に失敗した（Failed-to-activate）SCNT+受精構築物は、しばしば、減数分裂の紡錘体極（図10G；矢印)及び凝集した精子頭部（図10G；矢印)の両方においてNuMAを示すが、移植された核を囲む無秩序な紡錘体から失われたNuMAを有する（図10G、NT）。逆に、引き続いて活性化に失敗した、熟成分裂中期-II無処置卵母細胞（図10H：上部矢印）と組合されたSCNTは、細胞質のNuMAをそれらの極に補充する、双極性のNT紡錘体を集合するが、染色体は適切に配列しない（図10H、下の矢印：緑、NuMA）。
【表１】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、SCNTの間の操作及びその間に生じる現象の模式的な説明を提供する。この工程は、除核又は分裂中期-II停止減数分裂紡錘体除去、体細胞選択及び調製、核移植(NT)又は細胞質内への核注入（ICNI）、紡錘体除去及び核導入の両者からの創傷治癒及び薬物回復、及び卵母細胞活性化を含む。
【図２Ａ】図2A-2Gは、霊長類のNT後の、異数体胚を生成する欠陥のある有糸分裂紡錘体を図解する。図2Aは、減数分裂において誤整列した（misaligned）染色体中心体NuMAを有する、欠陥NT有糸分裂紡錘体を図解する。
【図２Ｂ】図2Bは、有糸分裂において誤整列した染色体中心体NuMAを有する欠陥NT有糸分裂紡錘体を図解する。
【図２Ｃ】図2Cは、誤整列した染色体中心体NuMAを有する欠陥NT有糸分裂紡錘体がNT有糸分裂において生じていないことを図解する。
【図２Ｄ】図2Dは、中心体のキネシンHSETもNT後に喪失する（missing）ことを図解する。
【図２Ｅ】図2Eは、動原体性のEg5がNT後に喪失しないことを図解する。
【図２Ｆ】図2Fは、双極性の有糸分裂紡錘体が、受精卵へのNT後に、整列した(aligned)染色体及び中心体NuMAを有することを図解する。
【図２Ｇ】図2Gは、DNA微小管、NuMA、及びキネシンのイメージニングを提供する。
【図３Ａ】図3A-3Rは、治療的なクローニングの間に生じる操作及び現象の模式的な図解を提供する。それらの工程は、ここに記載されたように、一般に、卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む。
【図３Ｂ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｃ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｄ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｅ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｆ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｇ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｈ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｉ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｊ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｋ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｌ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｍ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｎ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｏ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｐ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｑ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図３Ｒ】卵母細胞収集、除核、核移植、活性化、細胞分裂及び分化、及び患者への移行を含む工程の一部。
【図４Ａ】図4A-4Lは、インビトロでのSCNT NHP胚移植前発達を示す。図4Aは、生NHP卵母細胞においてちょうど形成された分裂中期-II 紡錘体（矢印）のSpindle View(TM)イメージを示す。第一極体(Pb)は、双極性の紡錘体構造の真上に見える。
【図４Ｂ】図4Bは、極体押出しの直後の、卵母細胞の「ぐしゃっとつぶす」除核から形成されたカリオプラストを示す。分裂終期-I紡錘体は、それがHSET抗体（緑；挿入図：微小管、赤）により免疫標識され、及び減数分裂の染色体（青）のヘキストDNA染色後に目に見える。
【図４Ｃ】図4Cは、核移植に続く電気融合による活性化後８時間のSCNT構築物を示す。この図は、活性化された細胞質における単核を示す。図4Cの挿入図は、体細胞核移植(SCNT)に用いられるドナーのアカゲザル線維芽細胞株の正常な核型の代表である。
【図４Ｄ】図4D-4Kは、卵割期を通してのSCNT胚のインビトロでの発達を示す：２細胞(D)、３細胞(E)、８細胞(F；矢印：わずかな分裂）、１６細胞(G)、緊密桑実期(compacting morula stage)(H)、早期胚盤胞（I；矢印：早期胞胚腔）、拡大胚盤胞（J）、及び孵化した胚盤胞期（hatched blastocyst stage）（K）。
【図４Ｅ】３細胞。
【図４Ｆ】８細胞(F；矢印：わずかな分裂）。
【図４Ｇ】１６細胞。
【図４Ｈ】緊密桑実期。
【図４Ｉ】早期胚盤胞（I；矢印：早期胞胚腔）。
【図４Ｊ】拡大胚盤胞。
【図４Ｋ】孵化した胚盤胞期。
【図４Ｌ】図4Lは、非ヒト霊長類胚性フィーダー(nhpEF)細胞での成長の４日後のHMC光学による像として、NT×ICSI受精したキメラの胚盤胞に由来するNHP ES細胞を示す。図４における数字は全て、成長後の日を表す図４Ｌを除いて、活性化後の時間を表す。図４のバーは20μmを表す。
【図５Ａ】図5A-5Fは、ECNT-由来NHP胚の異常な移植前発達を示す。図5Aは、第一の有糸分裂の終わりにおける非定型の染色体分離（青）を示す第一の有糸分裂の分裂終期クローン（緑）を示す。矢印は、中間部の微小管（緑）内に位置するラギング（lagging）染色体（青）を指し示す。
【図５Ｂ】図5B-Fは、2細胞(B)、4細胞(C)、6細胞(D)、及び8細胞期(E)、で明らかな、ECNTクローン化胚における異常な染色体分離（青）及び微小管組織化（緑）を示し、ここで、胚性発達のほとんどが停止している。
【図５Ｃ】図5B-Fは、2細胞(B)、4細胞(C)、6細胞(D)、及び8細胞期(E)、で明らかな、ECNTクローン化胚における異常な染色体分離（青）及び微小管組織化（緑）を示す。
【図５Ｄ】図5B-Fは、2細胞(B)、4細胞(C)、6細胞(D)、及び8細胞期(E)、で明らかな、ECNTクローン化胚における異常な染色体分離（青）及び微小管組織化（緑）を示す。
【図５Ｅ】図5B-Fは、2細胞(B)、4細胞(C)、6細胞(D)、及び8細胞期(E)、で明らかな、ECNTクローン化胚における異常な染色体分離（青）及び微小管組織化（緑）を示す。
【図５Ｆ】図5Fは、正常な染色体（青）及び静止期の微小管パターン（緑）を実証するコントロールの8細胞期単為生殖生物を示す。全てのイメージは、微小管(緑)及びDNA(青)について二重標識されている。Pbは極体におかれ、各バーは20 μmを表す。
【図６Ａ】図6A-6Jは、NHPにおける核移植後の異常な微小管パターンを示すが、ウシの構築物は示さない。図6A及び6Bは、移植された体細胞核(青)の近くに集合した乱れた微小管(緑)を示し、これは、細胞質内核注入[ICNI]及び精子因子又はイオノマイシン/DMAPの何れかによる活性化後の、機能障害性の体細胞性の中心体を示す。
【図６Ｂ】図6A及び6Bは、移植された体細胞核(青)の近くに集合した乱れた微小管(緑)を示し、これは、細胞質内核注入[ICNI]及び精子因子又はイオノマイシン/DMAPの何れかによる活性化後の、機能障害性の体細胞性の中心体を示す。
【図６Ｃ】図6Cは、体細胞核移植(青)及び活性化後に観察される単為生殖的に活性化された卵母細胞に類似した皮層の微小管パターン(緑)を示す。
【図６Ｄ】図6Dは、分離された16-細胞期のアカゲザル割球を用いた胚性核移植によって誘導されたNHP NT構築物を示す。細胞質内の複数の微小管の組織化中心(緑、矢印)は、移植された割球核(青)の遠位に検出される。
【図６Ｅ】図6Eは、雄性の前核(MPn、青)の除核された卵母細胞への移植によって誘導されたNHP NT構築物を示す。微小管(緑)は、移植された核に密接に集中され、該細胞質中に放出される。再び、Pbは極体におかれ、一方FPnは雌性の前核におかれる。
【図６Ｆ】図6Fは、移植された体細胞核(sc、青)において発生したDNA合成、並びに、ICSI後20時間のBrDU取込み(緑)によって検出された雄性[MPN、青]及び雌性の[FPN、青]前核を示す。第一の極体も第二の極体も[Pb]、BrDUを取込まない。図6Fの挿入図は、微小管(赤)及びDNA(青)を示す。
【図６Ｇ】図6G-6Hは、体細胞又は胚性細胞核移植の何れかの後の活性化されたウシの除核された細胞質体における移植された核から放散する密接に集中した微小管アレイ（緑）を示す。
【図６Ｈ】図6G-6Hは、体細胞又は胚性細胞核移植の何れかの後の活性化されたウシの除核された細胞質体における移植された核から放散する密接に集中した微小管アレイ（緑）を示す。
【図６Ｉ】図6Iは、胚性核移植後、分裂中期(青)において集合した、整列した染色体を有する正常な無星状体の双極性の紡錘体(緑)を示す。同様の有糸分裂紡錘体の形態は、体細胞核移植後に観察された。
【図６Ｊ】図6Jは、ウシの除核された卵母細胞中に移植されたアカゲザル線維芽細胞(青)からの集中した微小管アレイ(緑)を示す。BrDU(緑)、微小管(赤)及びDNA(青)について三重標識された図6Fを除いて、全てのイメージは、微小管(緑)及びDNA(青)について二重標識される。バーは10μmを表す。
【図７Ａ】図7A-7Eは、NHP男系生殖中において、微小管パターンが正常であることを示す。図7A及び7Bは、除核されたアカゲザル卵母細胞に微量注入された成熟精子(青)が、ICSI後8時間以内の細胞質中に拡張する、精子中心小体(矢印:精子軸糸（axoneme）)から密接に集中した微小管アレイ(緑)を構成することを示す。
【図７Ｂ】図7A及び7Bは、除核されたアカゲザル卵母細胞に微量注入された成熟精子(青)が、ICSI後8時間以内の細胞質中に拡張する、精子中心小体(矢印:精子軸糸（axoneme）)から密接に集中した微小管アレイ(緑)を構成することを示す。
【図７Ｃ】図7Cは中心体の重複を示し、ここで、分割及び微小管集合(緑)は、ICSI後20時間で、雄性前核の反対側に観察される。
【図７Ｄ】図7Dは、男系生殖における分裂中期(青)において集合した紡錘体極における、小星状アレイ(緑、矢印)を有する双極性の紡錘体(緑)を示す。矢印は、取込まれた精子軸糸を示す。
【図７Ｅ】図7Eは、正常なDNA分離(青)及び細胞分割後の娘核に近い微小管集合(緑)を示す2-細胞期の男系生殖を示す。全てのイメージは、微小管(緑)及びDNA(青)について二重に標識されている。バーは20 μmを表す。
【図８Ａ】図8A-8Kは、機能障害性の体細胞中心体及び微小管に基づく分子モーターが、有糸分裂の分裂中期NHP構築物において明らかであることを示す。図8A及び8Bは、三極の紡錘体(緑)を有する有糸分裂の分裂中期ECNT構築物、極における異常な中心体の局在化(矢印)、及び赤道において誤整列した染色体(青)を示す。
【図８Ｂ】図8A及び8Bは、三極の紡錘体(緑)を有する有糸分裂の分裂中期ECNT構築物、極における異常な中心体の局在化(矢印)、及び赤道において誤整列した染色体(青)を示す。
【図８Ｃ】図8Cは、乏しい双極性の紡錘体形態(緑)を有し、紡錘体極において識別可能の体細胞中心体を有さず、及び赤道において誤整列した染色体(青)を有する、第一の有糸分裂の分裂中期SCNTのクローンを示す。
【図８Ｄ】図8D及び8Fは、静止期におけるNuMA検出及び有糸分裂NT構築物を示す。図8Dにおいて、NuMA(緑)は、後期静止期におけるECNT再構築された核において検出される。図8Dの挿入図は、ランダムな乱れた微小管パターン(赤)及びDNA(青)が、このECNTクローン中で観察されることを示す。同様の知見は、静止期SCNT構築物において観察された。
【図８Ｅ】図8Eは、誤整列した染色体(青)を有する多極性の紡錘体(赤)を示す、第一の有糸分裂の分裂中期におけるSCNT構築物、及び極(緑)における減少したNuMA検出を示す。
【図８Ｆ】図8Fは、SCNT[SCNT+Met-II]後の分裂中期-IIの紡錘体無処置卵母細胞の活性化から生じる第一の有糸分裂の分裂中期紡錘体を示す。４つの置き違えられた中心体(矢印)は、赤道(青)での染色体整列として四極性紡錘体(赤)内に存在する。NuMA(緑)は、中心体及び４つの紡錘体極において強く検出される。
【図８Ｇ】図8Gは、マイナス末端が向けられたキネシンHSET(緑)が、SCNT第一有糸分裂構築物において検出されないことを示す。図8Gの挿入図は、紡錘体微小管(赤)及び誤整列したDNA(青)を示す。
【図８Ｈ】図8Hは、SCNT+Met-II無処置構築物における第一有糸分裂の分裂中期の紡錘体を示す。HSETは、分裂中期紡錘体の極(緑)において強く検出される。図8Hの挿入図は、紡錘体微小管(赤)及びDNA(青)を示す。
【図８Ｉ】図8Iは、第一有糸分裂SCNT紡錘体におけるプラス末端が向けられたキネシンEg5検出を示す。多極分裂中期紡錘体(赤)は、誤整列した染色体(青)における中心体領域に存在するEg5を示す。
【図８Ｊ】図8J-8Kは、コントロールの単為生殖の胚における有糸分裂の分裂中期及び分裂終期紡錘体を示す。Eg5(緑)は、双極性の分裂中期紡錘体(赤)における整列した染色体(青)において検出されるが、中間部の微小管(K：赤)及び分裂終期 (K：青)により発達する中央体組織(midbody apparatus)へ転位置（translocate）する。
【図８Ｋ】図8J-8Kは、コントロールの単為生殖の胚における有糸分裂の分裂中期及び分裂終期紡錘体を示す。Eg5(緑)は、双極性の分裂中期紡錘体(赤)における整列した染色体(青)において検出されるが、中間部の微小管(K：赤)及び分裂終期 (K：青)により発達する中央体組織(midbody apparatus)へ転位置（translocate）する。図8A-8Cは、微小管(緑)及びDNA(青)について二重標識される。他の全てのイメージは、NuMA(図8D-8F)、HSETキネシン(図8G及び8H)又はEg5キネシン(図8I-8K)、微小管(赤)、及びDNA(青)について三重標識される。バーは10 μmを表す。
【図９Ａ】図9A-9Jは、マイナス末端が向けられたキネシンHSETが、NHPの及びタキソール誘導でない細胞質の微小管における第二の減数分裂の紡錘体で独占的に集合することを示す。図9A-9Cは、除核(図9A)後のアカゲザル細胞質体において観察される微小管パターン(緑)を示し、またその後のイオノマイシン/DMAP後24時間(図9B)又は48時間(図9C)での人工的な活性化を示す。除核後に、集合した細胞質の微小管(図9A: 緑)は観察されない。活性化後、大量の乱れた微小管(図9B：緑)が、DNAが少ない細胞質体において集合する。まれに、微小管が細胞質内の双極性の紡錘体(図9C: 緑)集合に似ている構造をとる。図9A-9Cの挿入図は、SCCの除去の成功を確認するDNAイメージングを示す。
【図９Ｂ】図9A-9Cは、除核(図9A)後のアカゲザル細胞質体において観察される微小管パターン(緑)を示し、またその後のイオノマイシン/DMAP後24時間(図9B)又は48時間(図9C)での人工的な活性化を示す。除核後に、集合した細胞質の微小管(図9A: 緑)は観察されない。活性化後、大量の乱れた微小管(図9B：緑)が、DNAが少ない細胞質体において集合する。まれに、微小管が細胞質内の双極性の紡錘体(図9C: 緑)集合に似ている構造をとる。図9A-9Cの挿入図は、SCCの除去の成功を確認するDNAイメージングを示す。
【図９Ｃ】図9A-9Cは、除核(図9A)後のアカゲザル細胞質体において観察される微小管パターン(緑)を示し、またその後のイオノマイシン/DMAP後24時間(図9B)又は48時間(図9C)での人工的な活性化を示す。除核後に、集合した細胞質の微小管(図9A: 緑)は観察されない。活性化後、大量の乱れた微小管(図9B：緑)が、DNAが少ない細胞質体において集合する。まれに、微小管が細胞質内の双極性の紡錘体(図9C: 緑)集合に似ている構造をとる。図9A-9Cの挿入図は、SCCの除去の成功を確認するDNAイメージングを示す。
【図９Ｄ】図9Dは、「ぐしゃっとつぶす」除核後のカリオプラスト中の無処置の減数分裂紡錘体及び染色体の、微小管(赤、挿入図)、HSET(緑)及びDNA(青)イメージングを示す。
【図９Ｅ】図9E及び9Fは、NHP卵丘(図9E中 緑;青、DNA)における細胞質のHSET(緑)の検出を示し、アカゲザル線維芽細胞（図9F 緑；赤、微小管；青、DNA)は、幾つかの体細胞HSETが、NTの間に移植され得ることを示す。
【図９Ｆ】図9E及び9Fは、NHP卵丘(図9E中 緑;青、DNA)における細胞質のHSET(緑)の検出を示し、アカゲザル線維芽細胞（図9F 緑；赤、微小管；青、DNA)は、幾つかの体細胞HSETが、NTの間に移植され得ることを示す。
【図９Ｇ】図9Gは、10μMのパクリタキセルで30分処理された成熟卵母細胞が、集合した細胞質の微小管束(矢印)ではそうではないが、紡錘体極微小管(赤)におけるHSET(緑)の局在化を証明することを示す。第二減数分裂の染色体は青である。
【図９Ｈ】図9H-9Jは、DNA (H、青)、微小管(I、赤)、及びHSET(J、緑)の固定及び検出の前の、10μMのパクリタキセルにより30分処理されたアカゲザルの除核された細胞質体を示す。集合した細胞質の微小管束は、HSET抗体によって標識されない。図9A-9C及び9Eは、微小管(緑)及びDNA(青)について二重標識されたイメージである。図9D、9F、及び9Gは、HSET(緑)、微小管(赤)及びDNA(青)についての三重標識されたイメージである。図9H-9Jは、DNA(青)、微小管(赤)、及びHSET(緑)についての一重標識されたイメージである。バーは10μmを表す。
【図９Ｉ】図9H-9Jは、DNA (H、青)、微小管(I、赤)、及びHSET(J、緑)の固定及び検出の前の、10μMのパクリタキセルにより30分処理されたアカゲザルの除核された細胞質体を示す。集合した細胞質の微小管束は、HSET抗体によって標識されない。
【図９Ｊ】図9H-9Jは、DNA (H、青)、微小管(I、赤)、及びHSET(J、緑)の固定及び検出の前の、10μMのパクリタキセルにより30分処理されたアカゲザルの除核された細胞質体を示す。集合した細胞質の微小管束は、HSET抗体によって標識されない。
【図１０Ａ】図10A-10Hは、紡錘体極マトリックスタンパク質NuMAは、第二の減数分裂の紡錘体に限定されないが、しかしSCC除核後のNHP卵母細胞の細胞質に存することを示す。図10Aは、「ぐしゃっとつぶす」除核によって除去された無処置の第二の減数分裂の紡錘体のNuMA(緑)、微小管(赤)及びDNA(青)検出を示す。
【図１０Ｂ】図10Bは、「ぐしゃっとつぶす」除核によるSCCの除去後に形成された、除核された細胞質体、及び、細胞質内のNuMA(緑)なし、又は微小管集合（上部挿入図：赤；下部挿入図：DNA、青）を示す。
【図１０Ｃ】図10Cは、10μMのパクリタキセルで20分間処置した成熟NHP卵母細胞を示し、第二の減数分裂の紡錘体（下方の矢印；赤、微小管；青、DNA）内でのNuMA (緑)蓄積及び細胞質の微小管束(上方矢印；赤、微小管；青、DNA)を示す。
【図１０Ｄ】図10D及び10Eは、卵丘の体細胞核(図10D：緑)及びアカゲザル線維芽細胞(図10E：緑；赤、微小管)中のNuMA検出を示す。
【図１０Ｅ】図10D及び10Eは、卵丘の体細胞核(図10D：緑)及びアカゲザル線維芽細胞(図10E：緑；赤、微小管)中のNuMA検出を示す。
【図１０Ｆ】図10Fは、電気融合(矢印)による線維芽細胞の核移植を失敗した、卵母細胞に由来する「フェルトクローン（FertClone）」失敗を示し、しかし、細胞質内の精子注入(ICSI)によって上手く活性化された。NuMA(緑)は、非凝集（decondensed）雄性前核(MPn)において強く検出され、しかし、卵母細胞表面に付着した失敗した線維芽細胞(矢印)において減少した。図10Fの上部挿入図において、赤は微小管を示し、青はDNAを示す。図10Fの下部挿入図において、精子中心体は、微小管星状アレイ(矢印)を非凝集雄性前核の近くに組織する。
【図１０Ｇ】図10Gは、ICSI後の活性化が失敗された、無処置の第二の減数分裂の分裂中期-II静止卵母細胞へのSCNTによって生成された、「フェルトクローン」失敗を示す(矢印)。NuMA(緑)は、整列した染色体(青)を有する無処置の分裂中期-II紡錘体(赤)上の極、並びに、凝集した（condensed）精子頭部(青、矢印)の基底（base）の双方において見出される。しかしながら、NuMA(緑)は、点在する体細胞染色体(青)の周囲に集合する無秩序な多極性のNT紡錘体微小管（赤）から失われる（missing）。
【図１０Ｈ】図10Hは、精子因子の微量注入によって連続的に活性化することに失敗した分裂中期-II無処置卵母細胞へのECNTを示す。NuMA(緑)は、NT紡錘体（下部矢印；赤、微小管；青、DNA)及び無処置の第二の減数分裂の分裂中期紡錘体（上部矢印；赤、微小管；青、DNA）の双方における極において検出される。NuMA(緑)について一重標識された図10D、及び、微小管(赤)及びNuMA(緑)について二重標識された図10Eを除いて、全ての図10のイメージは、NuMA(緑)、微小管(赤)及びDNA(青)について三重標識される。バーは、10μmを表す。但し、図10Dのバーは1μmを表す。
【図１１】図11は、霊長類の核移植(右)及び受精(左)の間の中心体の伝達を示す。NTは、「ぐしゃっとつぶす」除核(上部右)から始まり、未受精卵母細胞の分裂中期-II前の減数分裂の紡錘体-染色体複合体(SCC)の除去、卵細胞質中に残っている幾つかのNuMA(緑 クロスリンカー)及びHSET（赤パックマン(pacman)）分子モータータンパク質の残存（leaving）。減数分裂の紡錘体皮層における重要なタンパク質（即ち、ミオシン-II、フォドリン(fodrin)、Wave-1；アクチンフィラメント：細かい平行線）のよりよい保持率も「ぐしゃっとつぶす」除核後に予測される。図11の右のパネルにおいて、分裂中期-II前のSCCの除核は、より少ないマイナス末端が向けられた紡錘体タンパク質NuMA(緑 クロスリンカー)及びHSETモーター(赤パックマン)を除去する。図11の右パネルの中央におおよそ示すように、電気融合による核移植は(黄色の電光)、γ-チューブリン及びペリセントリン(赤 格子)を含有する胚性又は体細胞性の核及び中心小体(赤 直行性のシリンダー)を、除核された細胞質体に導入し、並びに、発達の開始に対する同時の活性化刺激を提供する。右下のパネルは、「ぐしゃっとつぶす」押出しによる除核が同時の融合/活性化と共に、より組織化された双極性の第一の有糸分裂紡錘体をもたらすことを示す。図11もまた、NT-有糸分裂紡錘体が、それらの中心体/動原体領域(黄色パックマン)においてEg5を有する最も整列された染色体対(青)を表示することを示す。NuMA(緑 クロスリンカー)及びHSET (赤パックマン)の双方を有する組織化された紡錘体中への微小管集合(緑)は、それらの紡錘体極に存在する。図11の左パネルは、IVF又はICSI（示した）の何れかによる精子侵入が、卵の代謝を活性化し、父系性の一倍体ゲノムを受精した接合体にするのに寄与することを示す。第二の分裂中期において停止した典型的な減数分裂の紡錘体(青 染色体)は、その極における中心小体の欠損のために異常である。プラス末端が向けられたキネシンモーター、Eg5は、セントロメア（黄色パックマン）において濃縮され、分極した微小管(緑)の増殖末端（+）において固定される。減数分裂の紡錘体組織化の原因である、中心体分子NuMA(緑 クロスリンカー)及びHSET(赤パックマン)は、収束する微小管(-)末端で濃縮され、この段階で除核の間に除去される。図11の左パネルの中央は、受精精子が、父系性のγ-チューブリン及びペリセントリン(赤 格子)を含有する、中心小体対(赤 直行性のシリンダー)に寄与することを示す。この精子中心体複合体は、精子星状体微小管集合(緑)からの母系性のγ-チューブリンを補充する。図11の左下のパネルは、受精後の第一の有糸分裂紡錘体集合を示す。精子中心体は、双極性の無星状体の紡錘体の一つの極において可視される精子尾部-中心小体複合体により、第一の静止期の間に複製する。双極性の有糸分裂紡錘体は、各動原体対(黄色パックマン)において、Eg5を有する整列した染色体(青)を含む。NuMA(緑 クロスリンカー)及びHSET(赤パックマン)は、紡錘体極において、中心小体及びγ-チューブリン/ペリセントリン（赤 格子)と共に発見される。他の紡錘体極（？マークによりマークされる）は、中心小体対なしで組織化されるか、又は、未知の由来の中心小体を含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2008521438.tif 000060
【図７Ｃ】
2008521438.tif 000061
【図７Ｄ】
2008521438.tif 000062
【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
2008521438.tif 000064
【図８Ｂ】
2008521438.tif 000065
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
2008521438.tif 000070
【図８Ｈ】
2008521438.tif 000071
【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図９Ａ】
2008521438.tif 000075
【図９Ｂ】
2008521438.tif 000076
【図９Ｃ】
2008521438.tif 000077
【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
2008521438.tif 000079
【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
2008521438.tif 000082
【図９Ｉ】
2008521438.tif 000083
【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
2008521438.tif 000085
【図１０Ｂ】
2008521438.tif 000086
【図１０Ｃ】
2008521438.tif 000087
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月2日(2007.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核を、一以上の分子成分と共に押出除核卵中に導入し、これによって核移植構築物を作成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；
前記胚を雌性の卵管に移すこと；及び
クローン動物を生成すること；
の工程を含む方法。
【請求項２】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核が体細胞核ドナー源に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核が所望の特性を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法により生成された動物。
【請求項６】
核を、一以上の分子成分と共に押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；
前記胚から割球を分離すること；及び
前記割球を培養して幹細胞を生成すること；
の工程を含む方法。
【請求項７】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核が体細胞核ドナー源に由来するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核が所望の特性を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法により生成された胚性幹細胞。
【請求項１１】
核を、一以上の分子成分と共に押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；及び
前記胚を雌性の卵管に移すこと；
の工程を含む方法。
【請求項１２】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核が体細胞核ドナー源に由来するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核が所望の特性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法により生成された胚。
【請求項１６】
核を、一以上の分子成分と共に押出除核卵に導入し、これによって核移植構築物を形成すること；
前記核移植構築物を培養して生胚を生成すること；及び
前記胚から割球を分離すること；
の工程を含む方法。
【請求項１７】
前記除核卵が分裂中期IIの前に（pre-metaphase II）除核される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核が体細胞核ドナー源に由来するものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記所望の特性が特異的な疾病又は疾患に関連する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法により生成された、分離された割球。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１１】
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【国際調査報告】
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