(57)【要約】本発明の目的は下記式（I）で表されるベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤を提供することである。（上記式において、R1は水素であり、R2はCF3であり、 R3はCOOHであり、R4は水素であり、R5は水素または塩素であり、R6は水素または塩素である。）2008533001.tif 000015
2008533001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（I）で表されるベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤：
【化１】
2008533001.tif 000010
（上記式において、R1は水素であり、R2はCF3であり、R3はCOOHであり、R4は水素であり
、R5は水素または塩素であり、R6は水素または塩素である。）。
【請求項２】
R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOHであり、R4が水素であり、R5が水素であり
、R6が水素である、請求項１に記載のベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤。
【請求項３】
R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOHであり、R4が水素であり、R5が水素であり
、R6が塩素である、請求項１に記載のベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤。
【請求項４】
R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOHであり、R4が水素であり、R5が塩素であり
、R6が水素である、請求項１に記載のベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤。
【請求項５】
下記工程を含む、下記式（I）で表されるベンゾフロインドール骨格を有するカリウム
チャネル開口剤の製造方法：
i)原料として式（II）で表されるサリチル酸誘導体を硫酸添加メタノール溶媒の存在下、エチルブロモアセテートと反応させて臭化水素を遊離させ、ついで水酸化ナトリウム水溶液によりエチル基を遊離させて縮合させることにより式（III）の化合物を製造する工程、
【化２】
2008533001.tif 000011
【化３】
2008533001.tif 000012
ii)無水酢酸または酢酸ナトリウムの存在下、式（III）の化合物を還流により環化反応させて式（IV）の化合物を製造する工程、
【化４】
2008533001.tif 000013
iii)エタノールまたは水酸化ｐ−トシル溶媒の存在下、置換フェニルヒドラジンをカップリングさせフィッシャー−インドール反応により式（I）の化合物を製造する工程、
【化５】
2008533001.tif 000014
（上記式において、R1は4−CF3または4−Hであり、R2は1−COOH、1−Cl、3−Clまたは4−Clである。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤に関する。より詳しくは、本発明は置換基を置換することにより製造できるベンゾフロインドール骨格を有する新規カリウムチャネル開口剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カリウムチャネルは遍在性の不均一タンパク質ファミリーに属し、選択的にカリウムイオンを細胞膜を通過させることができる。これらのチャネルはカリウムイオンおよびその膜電位および膜抵抗に対する様々な効果の最適条件を維持することにより、細胞の興奮調節において重要な役割を果たす。人体には様々な種類のK+チャネルが存在し、それらは異なった機構で活性化される。異なった種類のK+チャネル活性に影響を与える様々な要因を考慮すると、カルシウムにより活性化されるカリウムチャネルは、その開口が細胞内カルシウム濃度の上昇により決定され、そして膜貫通電位およびリン酸化状態により制御されるものである。
【０００３】
カルシウムにより活性化されるカリウムチャネルは更に三つの主要なタイプに分類され、単一チャネルコンダクタンスの違いにより電気生理学的に区別できる。
BKca(別名Maxi−K)チャネルは高い単一チャネルコンダクタンス（１００〜２５０ｐＳ
）という特別な機能を有しており、これに対し他の二つの主要タイプのカルシウム依存性カリウムチャネルは低いコンダクタンス（９２〜２５ｐＳ、SKCa）および中間のコンダクタンス（２５〜１００ｐＳ、IKCa）を有するグループである。これら３種類のチャネルの中でもBKcaチャネルはその高い単一チャネルコンダクタンスのために大量のK+流出をおこし、細胞膜の過分極を引き起こし、そして神経細胞および筋肉を含む非興奮性および興奮性の細胞に発現していることから、特に注目される。特に、BKca チャネルは活動電位の
形成、神経細胞興奮の制御および神経系における神経伝達物質の放出に関係している。
【０００４】
BKcaチャネルの医薬への適用可能性は、過剰のCa2+流入により誘導される潜在的な神経毒性カスケードなどの病的状態においてより明らかである。前記の病的状態はBKcaチャネル活性化剤またはその開口剤により抑制され、または一時的に遮断される。このように、BKcaチャネルの化学開口剤を設計することは、外傷および虚血の事態または神経変性の過程から生ずる神経損傷の治療薬を開発する戦略となるのである。
【０００５】
また、BKcaチャネル開口剤の血管弛緩効果は、心血管疾患もしくは高血圧、喘息などの気道平滑筋に関連する疾患、または勃起不全の治療薬を開発するのに使用しうる。
BKcaチャネルは２つの異なったサブユニットで構成されている：孔を形成するαサブユニットおよび補助的なβサブユニットである。４つのαサブユニットのみから形成されるチャネルは機能を有しているが、βサブユニットはCa2+および電位の感受性およびゲート開閉速度などのホモマーチャネルの生物物理学的および薬学的特性を変化させる。
【０００６】
数種類の化合物が開発され、それらがBKca チャネル開口剤であることが報告されてい
る（例えばデヒドロソヤサポニン−I、マキシケージオール（maxikdiol）、NS−1619、BMS−204352、17−β−エストラジオール、臭化エチルタモキシフェン、ピマル酸およびエポキシエイコサトリエン酸である）。NS−1619およびBMS−204352のような数種類の合成活性化剤はαサブユニットに作用するが、デヒドロソヤサポニン−Iおよび17−β−エストラジオールを含む他のBKcaチャネル開口剤は、それらが作用するためにβサブユニットを必要とする。デヒドロソヤサポニン−Iのような天然物由来の数種の活性化剤は細胞膜非透過性であり、BKcaチャネルの細胞内側にのみ作用する。
【０００７】
米国特許6,288,099号において、ベンゾフロインドール骨格およびその誘導体がカルシ
ウムチャネル開口剤として開示されている。しかしながら、この明細書に開示されているのは、ベンゾフロインドール骨格およびその広範な誘導体全体が選択的な置換基を特定することなく示唆されているのみである。
【０００８】
原型的なBKcaチャネル開口剤1(BMS−204352)の中で、キノリノンアナログ2および置換
ベンゾフロインドールアナログ3、化合物1が、選択的に、そして用量依存的にBKcaチャネルの作用曲線を正の膜電位が小さくなる方向にシフトさせると報告され、それらは現在、急性虚血性発作を対象として臨床試験が行われている。
【０００９】
ベンゾフロインドールアナログ3はBKcaチャネル開口剤として研究され、摘出ラット膀
胱平滑筋細胞の電圧固定実験において、膀胱平滑筋を選択的に弛緩させる効果を有し、外向き電流を増加させることが示された。しかしながら、二つ組のBKcaチャネルにおける構造活性または生物学的特性について、他には何ら結果は報告がなされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、下記式(I)で表されるベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチ
ャネル開口剤を提供することである。
【００１１】
【化１】
2008533001.tif 000003
【００１２】
上記式において、R1は水素であり、R2はCF3であり、R3はCOOHであり、R4は水素であり、R5は水素または塩素であり、R6は水素または塩素である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
さらに本発明は、R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOHであり、R4が水素であり
、R5が水素であり、R6が水素である化合物；R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOH
であり、R4が水素であり、R5が水素であり、R6が塩素である化合物；R1が水素であり、R2がCF3であり、R3がCOOHであり、R4が水素であり、R5が塩素であり、R6が水素である化合
物を提供する。
【００１４】
さらに本発明は、下記式（I）で表されるベンゾフロインドール骨格を有するカリウム
チャネル開口剤の製造方法も提供する。その製造方法は以下の工程からなる。
i)原料として式（II）で表されるサリチル酸誘導体を硫酸添加メタノール溶媒の存在下、エチルブロモアセテートと反応させて臭化水素を遊離させ、ついで水酸化ナトリウム水
溶液によりエチル基を遊離させて縮合させることにより式（III）の化合物を製造する工
程、
【００１５】
【化２】
2008533001.tif 000004
【００１６】
【化３】
2008533001.tif 000005
【００１７】
ii)無水酢酸または酢酸ナトリウムの存在下、式（III）の化合物を還流により環化反応させて式（IV）の化合物を製造する工程、
【００１８】
【化４】
2008533001.tif 000006
【００１９】
iii)エタノールまたは水酸化ｐ−トシル溶媒の存在下、置換フェニルヒドラジンをカップリングさせフィッシャー−インドール反応により式（I）の化合物を製造する工程。
【００２０】
【化５】
2008533001.tif 000007
【００２１】
上記式において、R1は4−CF3または4−Hであり、R2は1−COOH、1−Cl、3−Clまたは4−Clである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は次のように詳細に記載することができる。
適切な官能基を位置決めするアイデアが、効能あるBKcaチャネル開口剤1(BMS−204352)の低エネルギー配座異性体およびベンゾフロインドール骨格を比較したことにより得られた。この比較は、重ねられた構造が示されているとおりで(図2)、これはＭＯＰＡＣ2002
プロトコルを使用した半経験的な計算により行われた。
【００２３】
上記の比較によりトリフルオロメチル基およびクロロ基が、ベンゾフロインドール基の、それぞれ７位および４位の置換基として選ばれた。また、構造活性相関を決定するために、以下のスキーム１に概要を示すように、異なった官能基を有するほかのベンゾフロインドール化合物群の合成も行った。
【００２４】
【化６】
2008533001.tif 000008
【００２５】
(a)メタノール、硫酸、還流、12時間、収率95−98%、
(b)エチルブロモアセテート、炭酸カリウム、アセトン、還流,、24時間、収率70−76%、
(c)メタノールに溶解した10%水酸化ナトリウム水溶液、25℃、5時間、収率80−87%、
(d)無水酢酸、酢酸、酢酸ナトリウム、還流、8時間、収率70−75%,
(e)1N塩酸、水、メタノール、還流、7時間、収率55−65%,
(f)置換フェニルヒドラジン、エタノール、水、25℃、5時間、収率22−35%、
(g) p−水酸化トシル、エタノール、80℃、18時間またはマイクロ波1−2分、収率64−77%。
【００２６】
商業的に入手可能な置換サリチル酸のフィッシャーエステル化により得られたサリチルエステルは、エチルブロモアセテートでアルキル化され、ついで置換基２箇所の加水分解により5a−eが得られた。無水酢酸、酢酸ナトリウムおよび酢酸の存在下、還流条件のも
とで環化し、ついで酸性化してエノール−アセテート中間体からアセテート基を除いてベンゾフラノン6a−eを得た。このベンゾフラノンは種々の置換フェニルヒドラジンとカッ
プリングして対応するヒドラゾンを与えた。それらのヒドラゾンは、還流条件または酸触媒を用いたマイクロ波反応におけるフィッシャー−インドール反応により、ベンゾフロインドール誘導体7−23に変換された。表1に上記方法により得られた種々のベンゾフロインドール誘導体を示す。
【００２７】
【表１】
2008533001.tif 000009
【００２８】
化合物7−23のBKca チャネルを開口させる生物学的活性およびBKcaチャネルの電流を増加させる生物学的活性が、クローニングされたラットBKcaチャネルのαサブユニット、すなわちγSlo、を発現しているアフリカツメガエルの卵母細胞から摘出されたアウトサイ
ドアウトの電圧固定記録法を使用することにより測定された。
【００２９】
本発明の有利な効果は、ベンゾフロインドール骨格を有するカリウムチャネル開口剤を提供することである。本発明者らは種々の置換ベンゾフロインドール誘導体の合成およびCa2+非依存的な様式の電気生理学的特性から、BKcaチャネル開口活性についてベンゾフロ
インドール骨格におけるファーマコフォア（pharmacophore）の最適化を報告する。
【００３０】
本発明は以下の実施例によってより具体的に説明することができる。しかしながら、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるべきではない。
【実施例】
【００３１】
(調製例1)
7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(
化合物8)
2−カルボキシメトキシ−4−トリフルオロメチル安息香酸(生成物5a)：メタノール(80ml)、濃硫酸(6.7ml)および2−ヒドロキシ−4−トリフルオロメチル−安息香酸(31.2g)の混合液を撹拌しながら、１２時間還流した状態で加熱した。室温に冷却した後、その混合液を炭酸水素ナトリウムおよび酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層から2−ヒドロキシ−4−トリフルオロメチル安息香酸メチルエステルを回収し、それをクロマトグラフィー(ヘキサン：EA=10：1)により精製した。
【００３２】
乾燥アセトン(100ml)にヒドロキシ−4−トリフルオロメチル安息香酸メチルエステル(32.5g)が溶解した溶液に、無水炭酸カリウム（29g）を撹拌しながら加えた。その後エチルブロモアセテート(25ml)を滴下して加え、混合溶液を還流した状態で１４時間加熱した。室温に冷却した後、その溶液を水および酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層から2−エトキシカルボニルメトキシ−4−トリフルオロメチル安息香酸メチルエステルを回収し、その後クロマトグラフィー(ヘキサン：EA = 15：1)で精製した。
【００３３】
2−エトキシカルボニルメトキシ−4−トリフルオロメチル安息香酸メチルエステル(34g)、10%水酸化ナトリウム(132.5g)およびメタノール(45 ml)の混合液を一口丸底フラスコ内で混合した。その混合液は室温で５時間混合された。１Ｎ塩酸でｐＨ２に酸性化した後、減圧下で留去した。ろ過し、水で洗浄して生成物5aを得た。
【００３４】
6−トリフルオロメチルベンゾフラン−3−オン(生成物6a)：無水酢酸(95ml)、酢酸(14ml)、無水酢酸ナトリウム(10.7g)および5aの混合液をよく撹拌しながら加熱して７時間還流させた。その混合液を室温に冷却し、水および酢酸エチルで抽出した。残存した無水酢酸は酢酸エチルとともに共沸留去した。そして、粗生成物はクロマトグラフィー(ヘキサン：EA=10：1)で精製して6−トリフルオロメチルベンゾフラン−3−イル酢酸エステルを得た。
【００３５】
6−トリフルオロメチルベンゾフラン−3−イル酢酸エステル(15g)、メタノール(100ml)、水(53.8ml)および1N塩酸(18.8ml)の混合液を還流した状態で６時間加熱した。混合液を室温に冷却した。粗生成物を減圧下で濃縮し、クロマトグラフィー(ヘキサン：EA=18：1)で精製して生成物6aを得た。
【００３６】
7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(
化合物 8)：150mgの6aをエタノール(5.2ml)に溶解し、 2−ヒドラジノ安息香酸を水(10.3ml)に溶解した。これら二つの均一混合液を一緒に混合し、室温で４時間撹拌した。沈殿物をろ過し、最初に水で、次にエタノールで洗浄した。ろ取物を４時間真空オーブンに入れ、完全に留去した。2−[N'−(6−トリフルオロメチルベンゾフラン−3−イル−インデン)−ヒドラジノ]−安息香酸(120mg)、水酸化ｐ−トシル(1〜2当量)およびエタノール(5ml)の混合液を３０時間還流させた。室温に冷却し、減圧下で濃縮した。得られた混合液をクロマトグラフィー(CHCl3：MeOH =30：1)で精製し、化合物8を得た。
収率64.4% (3.94g)  1H NMR(300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.80 (s, 1H), 8.29 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.11 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.71 (d, 
J=8.4 Hz, 1H), 7.30 (t, J=8.4 Hz, 1H),   MS(ESI)m/z : 319.23 ([M+H]+)、
(調製例2)
以下の化合物を調製例１で示したのと同様の方法で調製した。得られた化合物の化学名、収率、ＮＭＲピークデータおよびMS(質量分析)により測定した分子量を以下に記載する。
【００３７】
8−ブロモ−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(化合物7)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.8(s, 1H), 8.28 (s, 1H), 8.09 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.93 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.72 (d, J=9 Hz, 1H), 7.53 (d, J=9 Hz, 1H), 7.31 (t, J=7.8 Hz, 1H),   MS(ESI) m/z : 330.13 ([M+H]+)、
3,7−ビス−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(化合物9)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.44 (s, 1H), 7.97 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.84 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.63 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.53 (d, J=7.8 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 343.22 ([M+H]+)、
4,7−ビス−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(化合物10)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.47 (s, 1H), 8.00 (s, 1H),
7.8 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.72 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.64 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.57 (d,
J=7.5 Hz, 1H), 7.44 (t, J=7.5, 1H),   MS (ESI) m/z : 343.22 ([M+H]+)、
1−クロロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(化合
物11)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.46 (s, 1H), 7.90 (s, 1H),
7.81 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.80 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.62 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.20 (t, J=7.8 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 309.67([MH−H]+)、
1,7−ビス−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール (化合物12)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.63 (s, 1H), 8.09 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.88 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.66 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.63 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.37 (t, J=7.5 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 343.22 ([M+H]+)、
10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(化合物13)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.65 (s, 1H), 8.19 (t, J=4.5 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.9 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.71 (t, J=4.5 Hz, 1H), 7.38 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J=4.5 Hz, 1H), 7.26(t, J=7.5 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 251.24([M+H]+)、
1−メトキシ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4/5]フロ[3,2−b]インドール(化
合物14)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.35 (s, 1H), 7.87 (s, 1H),
7.77 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.58 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.48 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.17 (t, J=7.8 Hz, 1H), 6.8(d, J=7.8 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H),   MS (ESI) m/z : 305.25([M+H]+)、
7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸メチルエステル(化合物15)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 10.11 (s, 1H), 8.1 (d, J=7.5 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.85 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.62(d,
J=8.1 Hz, 1H), 7.30 (t, J=8.1 Hz, 1H), 4.05(s, 3H),   MS (ESI) m/z : 333.26 ([M+H]+)、
7−メトキシ−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(化合物16)：収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.54 (s, 1H), 7.99 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.96(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.83 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.22 (t,
J=7.5 Hz, 1H), 7.00(d, J=7.5 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 281.26([M+H]+)、
7−クロロ−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−カルボン酸(化合物17)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.82 (s, 1H), 8.09 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.04 (d, J=7.2 Hz, 1H), 7.91(d, J=7.8 Hz, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.44 (d,
J=7.8 Hz, 1H), 7.29 (t, J=7.8 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 285.68([M+H]+)、
1,2−ジクロロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(
化合物18)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.46 (s, 1H), 7.89 (s, 1H),
7.82 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.71 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.35(d,
J=8.4 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 344.11 ([M+H]+)、
2,4−ジクロロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(
化合物19)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.31 (s, 1H), 7.95 (s, 1H),
7.79 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.62 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.26 (s, 1H),   MS (ESI) m/z : 344.11([M+H]+)、
4−フルオロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(化
合物20)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.15 (s, 1H), 7.87 (s, 1H),
7.79 (d, J=9.00 Hz, 1H), 7.75 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.59 (d, J=8.7 Hz, 1H), 7.21 (d, J=9.00 Hz, 1H), 7.03 (t, J=9.00 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 293.22([MH−H]+)、
2−フルオロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール(化
合物21)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 8.25 (s, 1H), 7.92 (s, 1H),
7.78 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.61 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J=6.6 Hz, 1H), 7.20(s,
1H), 6.95 (d, J=6.6 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 293.22([M+H]+)、
4−クロロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−
カルボン酸(化合物22)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 12.08 (s, 1H), 8.32 (d, J=8.4 Hz, 1H), 8.4(s, 1H), 7.92 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J=8.1 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 353.68([M+H]+)、
3−クロロ−7−トリフルオロメチル−10H−ベンゾ[4,5]フロ[3,2−b]インドール−1−
カルボン酸(化合物23)：
収率64.4% (3.94g)   1H NMR (300 MHz, DMSO) δ (ppm) 11.97 (s, 1H), 8.30 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.76 (d, J=8.1 Hz, 1H),   MS (ESI) m/z : 353.68([M+H]+)。
【００３８】
(実施例1)
本発明化合物のカリウムチャネル電流の測定
合成された化合物によるBKcaチャネル電流の相対的な増加量（倍率）を図３に示した。化合物７,８,１３,１６および１７のチャネル開口活性を比較することにより、７,８位をブロモ、トリフルオロメチルまたはクロロ基で置換したものはチャネル電流を３倍を超える増加を示し、一方７位を置換しないかまたはメトキシ基のような電子供与基により置換した場合には非常に効力が低いことがわかった。
【００３９】
従って、該活性にはベンゾフラノン側に電子吸引性の置換基が必須であると思われる。これらの官能基の中でも、図２に示されたBMS−204352と重なるトリフルオロメチル基が
、最も高い開口活性を示した。１位の置換基としては、化合物８を化合物１１（クロロ基）、化合物１２（トリフルオロメチル基）、化合物１４（メトキシ基）および化合物１５（メチルエステル基）と比較した場合に、カルボン酸基が活性にきわめて重要であることが判明した。
【００４０】
化合物９,１０および１２などのインドール環側の種々の位置がトリフルオロメチル基
で置換されている場合には、最も活性の高い位置は４位（化合物１０）であった。このことは、図２のBMS−204352と重なる構造が活性を向上させる鍵となることを示唆している
。クロロ基やフルオロ基を置換基として有するほかの誘導体、すなわち化合物１８,１９,２０および２１は基準レベルに近い活性を示した。
【００４１】
化合物22は、１位にカルボン酸基を、BMS−204352と重なる４位に塩素基を有するもの
であるが、６倍を超えるチャネル開口活性の増加を示した。これは１位および４位の二つの位置に適切な置換がなされたことによる相乗効果によると帰結できる。３位に塩素基を有する化合物２３は化合物２２に近いチャネル開口活性を示したが、化合物２２を上回りはしなかった。
【００４２】
BMS−204352および化合物2を同じ濃度(20μM)で類似の測定系で測定したところ、それ
ぞれBMS−204352は約１.５倍、化合物2は約３.７倍の増加を示したという報告を考慮すると、化合物２２および２３の効力は注目すべきである。
【００４３】
(実施例2)
本発明化合物の、クローニングされたベクターにより発現されたBKca (γSlo)チャネルに対する活性の測定
種々の細胞内Ca2+濃度における化合物22のγSloチャネルに対する増強効果を測定する
ために、γSloチャネルは異なった細胞内Ca2+濃度で活性化された。
【００４４】
卵母細胞をピペットで吸引して膜を破裂させ、ギガオームシール（gigaohm seal）を作ることにより、摘出されたアウトサイドアウトパッチコンフィギュレーションを得た。バスおよびピペットの両方が１２４ｍＭという同一のK+イオンを含有していた。γSloチャ
ネル電流を−120mVから140mVに10 mVずつ増加させる電圧パルスをかけ、そしてγSloチャネルを活性化させるため細胞内側のCa2+濃度は0(Ca2+−フリーの溶液は5mMのEGTAでキレ
ートされた)〜2 μMとした。
【００４５】
膜電位および細胞内Ca2+により活性化されたγSloチャネルの代表的な生データ(図4)。20μMの化合物22を添加する前と後のγSloチャネルの電流を記録した。化合物22は種々の細胞内Ca2+濃度において、20μMの濃度で、γSloチャネル電流に対して顕著に有意な効果を示した。
【００４６】
化合物22によるγSlo電流の増強効果は洗浄により除去された。図４は化合物２２を細
胞外から投与したことにより強力に誘起されたγSloチャネル電流を示しており、そして
それは測定された全ての細胞内Ca2+濃度において、洗浄後に回復した。これらの結果は細胞内Ca2+濃度は化合物22のγSloチャネルに対する増強効果に影響を与えないことを示唆
している。
【００４７】
これらの結果から、神経BKcaチャネルは約−60〜−80mVの静止膜電位の状態であっても、100nM未満という僅少の遊離Ca2+濃度が存在する状態で、化合物22により活性化されることができるとわれわれは考える。
【００４８】
(実施例3)
本発明化合物のアフリカツメガエル卵母細胞に対する活性の測定
われわれはアフリカツメガエル卵母細胞に発現した巨視的なγSloチャネル活性に対す
る化合物22効果の濃度依存性を決定するために実験を行った。
【００４９】
化合物22の７種の濃度、０〜３００μMについて、化合物22を添加する前と後の摘出ア
ウトサイドアウトパッチの電流を記録した。2μMの細胞内Ca2+濃度を保った状態でパッチを切除した後にγSloチャネル活性が誘起され、化合物22の添加により急速に増加した。
膜電位は−120mVに保たれ、50ミリ秒かけて段階的に50mVに上昇させた。細胞内Ca2+濃度2μM、電圧50mVで活性化された対照電流から相対的な電流の差異を求め、それを対照電流
を使い正規化した。得られたデータはヒル式にあてはめられた（図５）。
【００５０】
50nMから300μMの範囲で化合物22を添加すると、濃度依存的にγSlo電流が増強された
。正規化された相対的な電流増加（倍率）はヒル式によく合致した。最もよく合致したものから得られたKd、すなわち化合物22の見かけの解離定数は4.01±0.75μMでn値、すなわちヒル係数は1.20±0.07(N = 5, p< 0.01)だった。これらの結果は化合物22がγSloチャ
ネルに１：１の比で結合することを示唆している。ベンゾフロインドール誘導体のチャネルに対する生物学的活性およびメカニズムの更なる詳細については、他で報告する予定である。
【００５１】
要約すると、組み入れるべきファーマコフォアを最適化するために、ベンゾフロインドール骨格を公知のBKcaチャネル開口剤、すなわちBMS−204352と比較した。アフリカツメガエルの卵母細胞に発現したγSloチャネルのアウトサイドアウトパッチを使用することによって、クローニングされたBKcaチャネルについて評価を行い、化合物22は細胞内カルシウム濃度から独立した機序で作用する強力で効果的なBKcaチャネル開口剤であることが確認された。BKcaチャネル開口剤はさらに脳卒中、喘息、高血圧、痙攣および外傷性脳障害における治療処置に適用できるかもしれない。
【００５２】
(実施例4)
本発明化合物のチャネル開口活性の濃度依存性の測定
われわれは次に本発明の化合物8の濃度依存性を測定した。パッチにされた膜の細胞外
側から投与される化合物8の濃度が増すにつれて、定常状態の電流レベルだけでなく活性
化速度も濃度依存的に上昇した(図6A)。化合物8の水への溶解性の理由からわれわれは300μMを超える濃度の化合物8を得ることができなかったが、濃度が約100μMのときに化合物8により誘起された電流の増加はプラトーに達することを発見した。化合物8のγSloチャネルについてのEC50の濃度は8.9 ±1.5μMであると決定された。われわれはまたインサイドアウトパッチコンフィギュレーションを用いて、化合物8は細胞内側からもチャネル活性に影響を与えるのかどうかを決定するために、この化合物の作用も測定した。γSloチャネルを活性化するために、細胞内Ca2+濃度は2μMに固定され、数種類の濃度の化合物8が膜の細胞内側に添加された。化合物8を細胞内に投与した場合にも同様の見かけの親和性でγSloチャネル電流を増加させたが、その増加量（倍率）は細胞外側から投与した場合に得られたものよりもはるかに少なかった。
【００５３】
BKcaチャネルの機能的な特徴は補助的なβサブユニットによって変えられ、βサブユニットの結合によりその効力が大きく影響される活性化剤や阻害剤もある。従って、われわれは化合物8の増強効果がβサブユニットの共発現により影響を受けるかどうかについて疑問を持った。われわれはアフリカツメガエルの卵母細胞にヒトβ１またはラットβ４サブユニットとともにγSloチャネルを発現させ、種々の濃度の化合物8が細胞外に存在する状態でチャネル電流を測定した。γSlo／ヒトβ１(図6B)およびγSlo／ラットβ４(図6C)の両者とも、マイクロモーラーの濃度の該化合物により濃度依存的にそれらの活性が増加した。しかしながら、これらの結果は、化合物8がβサブユニットの結合なしでBKcaチャネルを増強することができることを示唆し、化合物8の受容体部位はBKcaチャネルのメインサブユニット、すなわちSloタンパク質内に存在することを主張している。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図1は本発明のBKcaチャネル開口剤を示すものである。
【図２】図2は本発明のベンゾフロインドール化合物とBMS−2043552とを重ねた構造を示すものである。
【図３】図3は本発明のベンゾフロインドールアナログの細胞外からの投与によるBKcaチャネル活性の相対的増加量（倍率）を示す。棒グラフは20μＭの種々の化合物による細胞外処理により誘起されたBKcaチャネル電流の増加量（倍率）を表す。
【図４】図4は種々の細胞内Ca2+濃度において細胞外に投与された化合物２２の γSloチャネルに対する作用強度を示している。様々な細胞内Ca2+濃度において代表的な生データが示された。細胞内Ca2+濃度は、Ca2+フリー(A)から0.5μM(B)、1μM(C)そして2μM(D)へと増加していった。細胞外側の化合物22の濃度は20μＭだった。
【図５】図5はBKcaチャネルに対する化合物22の濃度依存性を示すものである。データの点はヒル（Hill）式に当てはめられた。最もヒル式に合致したデータから得られたKd、すなわち化合物22の見かけの解離定数は4.01±0.75μM、そしてｎ値、すなわちヒル係数は1.02±0.07 (N=5, p< 0.01)だった。
【図６】図6はBKcaチャネルに対する化合物8の濃度依存的な活性を示すものである。図6AはγSloチャネルの濃度依存的な活性を示すものである。図6Bはヒトβ１と結合したγSloチャネルの濃度依存的な活性を示すものである。図6Cはラットβ4サブユニットと結合したγSloチャネルの濃度依存的な活性を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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