(57)【要約】心筋梗塞に関与する遺伝子多型を提供する。さらに詳細には、心筋梗塞に関与するＳＮＰもしくはハプロタイプを含むポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチド、それらにハイブリダイズするポリヌクレオチド、それらによりコードされるポリペプチド、前記ポリペプチドに結合する抗体、前記ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及びキット、心筋梗塞の診断方法、ＳＮＰ検出方法、心筋梗塞治療用薬剤のスクリーニング方法、並びに遺伝子発現調節方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、並びに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで、各ヌクレオチド配列は、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド。
【請求項３】
８〜７０個のコンティグヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
８〜７０個のコンティグヌクレオチドを含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
対立遺伝子特異的なプローブである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
対立遺伝子特異的なプライマーである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項１、２または４に記載のポリヌクレオチドを含むＳＮＰ、請求項１、２または４に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいはそのｃＤＮＡのいずれかを検出するための、マイクロアレイ。
【請求項１２】
請求項１、２または４に記載のポリヌクレオチドを含むＳＮＰ、請求項１、２または４に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいはそのｃＤＮＡのいずれかを検出するための、キット。
【請求項１３】
心筋梗塞の発症の危険度が変化した被検者を同定する方法であって、
前記被検者から核酸試料を単離すること、及び
配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択される一以上のポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの多型性部位における対立遺伝子を決定することを含む、方法：
ここで、前記多型性部位は、前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【請求項１４】
前記対立遺伝子を決定することは、対立遺伝子特異的なプローブのハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的な増幅、シークエンシング、５’ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析及び一本鎖高次構造多型よりなる群から選択される方法により行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記危険度の変化は、危険度の増大である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記危険度の変化は、危険度の減少である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択される一以上のポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのいずれかの多型性部位における対立遺伝子がリスク対立遺伝子である場合に、前記被検者が心筋梗塞を発症する危険度が増大するということを判定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
核酸分子中のＳＮＰまたはハプロタイプを検出する方法であって、
配列番号１〜７、９、１０、及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列がそれぞれ少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチドまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする試薬と、核酸分子を含む試験用試料とを接触させること、並びに
ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出することを含む、方法。、
【請求項１９】
前記ハイブリダイズした二本鎖の形成を検出することは、対立遺伝子特異的なプローブのハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的な増幅、シークエンシング、５’ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、サイズ分析及び一本鎖高次構造多型よりなる群から選択される方法により行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
心筋梗塞のための薬剤組成をスクリーニングする方法であって、
配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、結合複合体の形成に適当な条件下で候補物質を接触させること、並びに、
前記ポリペプチド及び前記候補物質の間での前記結合複合体の形成を検出することを含む、方法。
【請求項２１】
前記結合複合体の形成を検出することは、免疫共沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング及び蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）よりなる群から選択される方法により行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子発現を調整する方法であって、
配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列がそれぞれ少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと、アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡとを結合することを含む、方法：
ここで、前記アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年６月２３日及び２００６年３月３０日に韓国工業所有権庁に出願した、それぞれ韓国特許出願第１０−２００５−００５４３７１号及び韓国特許出願第１０−２００６−００２９０７１号の利益を主張し、そこでの開示は、参照により本願に引用される。
【０００２】
本発明は、心筋梗塞に関与する遺伝子多型、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノム塩基配列のうち９９．９％が同一である。しかし、残りのわずか０．１％の違いにより、個体間で、姿、行動、そして疾患感受性に差異が生じるのである。すなわち、ヒトゲノムのうち３百万個程度の塩基配列が異なっていることにより、個体間、一定集団の間や人種間及び民族間に差異が生じる。塩基配列の違いは、異なる人種間の皮膚色のような表現型の違いと同様に、疾患分布の違いの原因となる。約３０億の塩基対があり、個体によって多様な一塩基対がほぼ１．０ｋｂごとに現れる。個体によって多様な計３百万個程度の塩基対があり、これらの塩基対における違いを一塩基多型（ＳＮＰ）という。全ての塩基配列を分析しなくても、多型性を示すこれら３百万個の塩基配列を分析すれば、個体間や集団間における差異、または疾患群と正常群との差異を知ることが可能となる。
【０００４】
遺伝学の最大の目標は、人体の疾患のような表現型の違いをＤＮＡの多様性と関連付けることである。この目標達成に最も好ましい手段は、あらゆるゲノムに存在する多型マーカーの使用である。現在まで、個体を識別したり、遺伝的な疾患に関与する遺伝子の発見に主に使われてきた多型性マーカーは、マイクロサテライトマーカーであったが、ＤＮＡチップの発展とともに、ＳＮＰに関心が寄せられている。ＳＮＰは頻度が高く、使用に際し安定的であり、全てのゲノムを通じて均等に分布しているため、ラージスケールでの自動的なＳＮＰの検出が可能となる。ＳＮＰは、医学の新しい一分野となる予測医学に貢献するであろう。例えば、個体の疾患を予測し、任意の医学的な供給に対する個体の反応を研究するという革命的な方法は、ＤＮＡチップ技術や高速ＤＮＡシークエンシング技術のような最新の生命工学技術を提供することにより行われうる。
【０００５】
ＳＮＰの研究は、集団内で一定の頻度で分布する遺伝子型の解析を含む。従って、遺伝子型によって集団を識別でき、その際、遺伝子型によって疾患群が有意に分布すれば、当該遺伝子型と疾患とが関連付けられる。ほとんどのＳＮＰ研究の場合、単一の遺伝子型またはいくつかの遺伝子型が、疾患群と対照群とで有意に異なる分布を有するならば、有する遺伝子型によって疾患頻度に差異が生じることを解析できる。
【０００６】
ヒトゲノムに存在する３百万個余りのＳＮＰのうち、約１／６に該当する５１０，０００個余りのＳＮＰは遺伝子内に存在する。このようなＳＮＰは遺伝子の発現または蛋白質の機能と直接的に関係するため、このような遺伝子内のＳＮＰの分布を知っていることは非常に重要である。ある疾患に関与していると考えられる遺伝子型が、遺伝子の発現や蛋白質の機能の変異を誘発しうるならば、その遺伝子または蛋白質が疾病の原因である可能性は高い。その場合、当該遺伝子は、疾患の検出または治療の標的遺伝子となりうる。もちろん、該当するＳＮＰを分析することによって、疾患感受性を分析することもできる。
【０００７】
プロモーターのような、遺伝子配列のうち転写調節部位にあるＳＮＰは、発現される遺伝子の量を調節できる。稀なケースとして、ＲＮＡスプライシングに影響を与えるエクソン・イントロン境界にある配列または３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に分布して、ＲＮＡの安定性や翻訳効率に影響を与える場合もある。すなわち、コーディング領域または転写及び翻訳の調節領域に位置するＳＮＰは、疾患感受性を決定できる有用な指標となりうる。コーディング領域または転写及び翻訳の調節部位に位置するＳＮＰもあるが、蛋白質の発現及び／または機能に影響を及ぼすとは予想されないＳＮＰが疾病と相関性があることが明らかになることもある。ヒトの疾病において、かかるＳＮＰの役割を明らかにするために、国際的研究が進められている。
【０００８】
ハプロタイプはＳＮＰに比べて情報量が多く、結合の非平衡性についての情報を含んでいるために、ハプロタイプを用いた遺伝子型の解析はさらに正確な結果をもたらす。特に、一遺伝子にいくつかのＳＮＰが密集して分布している場合、隣接したＳＮＰに関する複合化した情報を有する、ハプロタイプを利用した遺伝子型解析が、遺伝子機能と疾病との相関性を明らかにするのに効果的である。例えば、５  リポ−オキシゲナーゼ  活性化ペプチド（ＦＬＡＰ）のハプロタイプは、心臓マヒについては、ＳＮＰよりもさらに正確なマーカーであることが明らかになっており、心臓マヒの重要な要因であると報告されている（Ｈｅｌｇａｄｏｔｉｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００４  Ｍａｒ；３６（３）：２３３−９）。これを機に、Ｄｅｃｏｄｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、そのハプロタイプに関する報告された結果に基づく、心臓マヒに対する予防薬としてのＦＬＡＰのハプロタイプを含む酵素の阻害剤の研究を行っており、すでに２次治験が始まっている。
【０００９】
一方、心血管疾患は、世界中の先進国において主要な死亡原因であり、韓国でも、１９７０年代から主要な死亡原因になっている。統計庁によれば、２００３年の１年間で韓国全体の死亡者（２４万６千人）のうち９．１％である２万２千人（１０万人当たり９，０８７人）が心臓疾患及び高血圧で死亡し、癌（１位）及び脳血管疾患（２位）に続いて死亡原因の順位が３位となっている。
【００１０】
心血管疾患の中でも順位の高い冠状動脈疾患は、大体動脈硬化によって心臓に血液を供給する冠状動脈が塞がったり、または狭くなって発症する。動脈硬化により冠状動脈が完全に塞がることを心筋梗塞、狭くなることを狭心症という。冠状動脈疾患の原因としては、高脂血症（高コレステロール血症）、高血圧、喫煙、糖尿、遺伝、肥満、運動不足、ストレス及び女性の閉経などが知られている。心血管疾患の要因を複合的に有するほど、発症の危険度が高まる。
【発明の開示】
【００１１】
発明の開示
技術的課題
現在、心血管疾患の診断については、心臓及び冠状動脈の内部のＸ線及び超音波撮影が利用されている。しかし、他の検査技術を用いた、心筋梗塞を含む他の様々な心血管疾患や複雑な疾患についての診断または予後診断と同様、疾患がかなり進行した段階になってはじめて診断または予測を成し得る。
【００１２】
技術的解決
本発明者らは、心筋梗塞に関与するＳＮＰを見出すために研究を続けた結果、心筋梗塞の発症率及び遺伝的感受性を予測可能なＳＮＰ及びハプロタイプを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明の要旨
本発明は、心筋梗塞に関与する一塩基多型（ＳＮＰ）を含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明はまた、心筋梗塞に関与するハプロタイプを含むポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明はまた、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むＳＮＰを検出するためのマイクロアレイを提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むＳＮＰを検出するためのキットを提供する。
【００２０】
本発明はまた、心筋梗塞発症の危険度が変化した被検者を同定する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、核酸分子内のＳＮＰまたはハプロタイプを検出する方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、心筋梗塞用の薬剤組成をスクリーニングする方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、遺伝子発現を調節する方法を提供する。
【００２４】
本発明の一態様によれば、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、並びに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、本発明は、配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ここで、各ヌクレオチド配列は、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを提供する。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００２７】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供する。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むＳＮＰ、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいはそのｃＤＮＡのいずれかを検出するためのマイクロアレイを提供する。
【００３０】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含むＳＮＰ、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいはそのｃＤＮＡのいずれかを検出するためのキットを提供する。
【００３１】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、心筋梗塞の発症の危険度が変化した被検者を同定する方法であって、前記被検者から核酸試料を単離すること、及び配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択される一以上のポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの多型性部位における対立遺伝子を決定することを含む方法を提供し、ここで、前記多型性部位は、前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【００３２】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、核酸分子中のＳＮＰまたはハプロタイプを検出する方法であって、配列番号１〜７、９、１０、及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列がそれぞれ少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチドまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと厳しい条件下で特異的にハイブリダイズする試薬と、核酸分子を含む試験用試料とを接触させること、並びにハイブリダイズした二本鎖の形成を検出することを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、心筋梗塞のための薬剤組成をスクリーニングする方法であって、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、結合複合体の形成に適当な条件下で候補物質を接触させること、並びに、前記ポリペプチド及び前記候補物質の間での前記結合複合体の形成を検出することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明のさらに他の態様によれば、遺伝子発現を調整する方法であって、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列がそれぞれ少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと、アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡとを結合することを含む方法を提供し、ここで、前記アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である。
【００３５】
本発明の上記態様及び利点は、それらの例示的な実施形態を詳細に記載することによりさらに明白となるであろう。
【００３６】
本発明の詳細な説明
本発明の一実施形態によれば、心筋梗塞に関与するＳＮＰは、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチドであって、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、並びに前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
前記配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列のうちの１つを含むポリヌクレオチドは、多型性配列である。多型性配列とは、ポリヌクレオチド配列のうちＳＮＰが存在する多型性部位を含むヌクレオチド配列である。前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００３８】
ここで、個体のＤＮＡにおいて、約１ｋｂごとにみられるＤＮＡ配列の多型のうち、ＳＮＰがもっとも一般的に見られる一塩基対変異でありうる。
【００３９】
本発明の一実施形態によるＳＮＰは、炎症反応の主要な転写調節遺伝子であるＮＦｋＢ１内に存在する。炎症反応関連遺伝子の遺伝的な変異が心血管疾患と相関性が高いという報告はなく（Ａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００３；３（５）：３１７−２８）、特に、ＮＦｋＢ１遺伝子内のＳＮＰが心血管疾患と相関性があるという報告はない。
【００４０】
本発明の実施例では、心筋梗塞との相関性が高いＳＮＰを見出すために、ＮＦｋＢ１遺伝子から一連の選別を行った。心筋梗塞患者及び正常人の血液からＤＮＡを単離及び増幅した。前記ＤＮＡのうちＮＦｋＢ１遺伝子内のＳＮＰ部位の配列を分析した後、心筋梗塞患者における出現頻度及び正常人における出現頻度が顕著に異なるＳＮＰ及びその遺伝子型を同定した。本発明の実施例で同定された１０個のＳＮＰ及びその遺伝子型を表１に表す。一方、心筋梗塞患者における配列番号８及び１２のＳＮＰの出現頻度と、正常人における配列番号８及び１２のＳＮＰの出現頻度とは顕著に異なっており、このことは、韓国特許出願２００５−４７１９５に開示されている。心筋梗塞患者における配列番号１１及び１３のＳＮＰの出現頻度、並びに正常人における配列番号１３及び１４のＳＮＰの出現頻度には、違いが見られなかった。
【００４１】
【表１】
2008543327.tif 000002
【００４２】
表１で、「ａｌｉａｓ＿ｉｄ」とは、本発明者らが任意に命名したＳＮＰの番号である。
【００４３】
「配列番号」とは、本発明の明細書に添付された、ＳＮＰを含むポリヌクレオチド配列の識別番号である。
【００４４】
Ａ１（対立遺伝子「１」）及びＡ２（対立遺伝子「２」）はそれぞれ、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）技術によるシークエンシング実験において、質量の小さい対立遺伝子及び質量の大きい対立遺伝子を示しており、実験の便宜上、任意に命名したものである。
【００４５】
「ＳＮＰの機能」とは、前記遺伝子内で前記ＳＮＰが果たす役割である。
【００４６】
「ｐ値」とは、フィッシャーの正確確率検定を用いて前記遺伝子を調査することにより得られたｐ値である。ｐ値が０．０５以下である場合、疾病群と正常群との遺伝子型が同じではない、すなわち有意であると判定した。
【００４７】
「ＯＲ」とは、遺伝子型に基づく、正常群における前記ＳＮＰを有する確率に対する、患者群における前記ＳＮＰを有する確率のオッズ比である。
【００４８】
「ＯＲ＿ＬＢ」及び「ＯＲ＿ＵＢ」とはそれぞれ、前記オッズ比の９５％信頼区間の下限及び上限を意味する。前記オッズ比が１を超える場合には、対立遺伝子「１」が心筋梗塞の危険因子である。前記信頼区間が１を含む場合には、前記遺伝子型と疾病との相関性が有意であると判定できない。
【００４９】
本発明の一実施形態によるポリヌクレオチドは、ＮＦｋＢ１遺伝子の特定のハプロタイプを含む。本発明の一実施形態による、心筋梗塞の診断用ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【００５０】
本実施形態のハプロタイプは、互いに密接な関連性があり、遺伝子組み換えの過程中に分離されない一群の対立遺伝子を示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
表２で、「ハプロタイプ」とは、配列番号１〜１４のＳＮＰの遺伝子型の配列を順番に示したものであり、「１」及び「２」はそれぞれ、各ＳＮＰの遺伝子型が対立遺伝子「１」及び対立遺伝子「２」を表す。例えば、ハプロタイプの２番は、配列番号１〜１４のヌクレオチド配列で、前記ＳＮＰの遺伝子型はそれぞれ、Ｔ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｃ、Ｃ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｔ、及びＣである。
【００５３】
「Ｈａｐ．Ｆｒｅｑ  ｔｏｔａｌ＿ｆｒｅｑ」とは、患者群及び正常群におけるハプロタイプの頻度を示す。
【００５４】
「ｐ値」とは、患者群と正常群との間のハプロタイプの頻度の違いについての統計分析の結果を示す。その際、分析に使用したソフトウェアは、市販の統計分析ソフトウェアである「ｈａｐｌｏ．ｓｃｏｒｅ」である。
【００５５】
「Ｈａｐ．Ｆｒｅｑ  ｔｏｔａｌ＿ｆｒｅｑ」が０．０５以上であって、「ｐ値」が０．０５以下である場合には、前記ハプロタイプと心筋梗塞の間の関係は有意であると判定した。この場合、前記ハプロタイプからなる配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの１０１番目の塩基におけるＳＮＰ部位は、リスク対立遺伝子でありうる。すなわち、表２のハプロタイプの２番及び９番が、前記集団中で高頻度を有する患者群と正常群とを識別するために用いられうる。
【００５６】
本発明の一実施形態において、ＳＮＰを含むポリヌクレオチドは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、好ましくは８〜７０個のコンティグヌクレオチドを含む。
【００５７】
本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチドは、前記ＳＮＰまたは前記ハプロタイプを含むポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。すなわち、前記ポリヌクレオチドは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド；あるいは、各ヌクレオチド配列が、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと、特異的にハイブリダイズする。前記ポリヌクレオチドは、対立遺伝子特異的でありうる。
【００５８】
前記ポリヌクレオチドは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド、好ましくは８〜７０個のコンティグヌクレオチドを含む。
【００５９】
前記対立遺伝子特異的なポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションを行うことにより、配列番号１〜１４の多型性配列のうち多型性部位の塩基を識別できる。ハイブリダイゼーションは、厳しい条件、例えば１Ｍ以下の塩濃度及び２５℃以上の温度下で行うことができる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び２５〜３０℃が、対立遺伝子特異的なプローブハイブリダイゼーションにとって適当な条件でありうる。
【００６０】
本発明の一実施形態において、前記対立遺伝子特異的なポリヌクレオチドは、プライマーであってもよい。プライマーとは、適当なバッファー中での適当な条件、例えば、適当な温度下での、４種の異なるヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合化剤の存在下で、鋳型指示ＤＮＡ合成を開始できる一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーの長さは使用目的によって変わりうるが、本発明の一実施形態では１５〜３０ヌクレオチドであることが好ましい。短いプライマー分子は、鋳型と安定してハイブリダイズされるために、さらに低い温度を要求しうる。プライマー配列は、必ずしも鋳型と完全に相補的である必要はないが、鋳型とハイブリダイズ可能な程度に十分相補的であることが好ましい。プライマーの３’末端は、配列番号１〜１４の多型性部位と一致するように配列されていることが好ましい。プライマーは、前記多型性部位を含む標的ＤＮＡとハイブリダイズされ、前記プライマーと完全な相同性を示す対立遺伝子の増幅を開始する。前記プライマーは、もう一方の対立遺伝子とハイブリダイズする別のプライマーとともに、プライマー対として用いられる。増幅は前記２つのプライマーから行われ、このことは、前記ポリヌクレオチド中に特異的な対立遺伝子が存在するということを示している。本発明の一実施形態によれば、前記プライマーはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）で用いられるポリヌクレオチド断片を含む。例えば、前記プライマーは、表３の配列番号１５〜５６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでありうる。
【００６１】
本発明の一実施形態において、対立遺伝子特異的なポリヌクレオチドは、プローブであってもよい。前記プローブは、ハイブリダイゼーションプローブのことであり、核酸の相補鎖に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドである。このようなプローブは、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）に記載されたペプチド核酸を含む。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは、対立遺伝子特異的なプローブである。同じ種における２つの個体から得られる核酸断片中に多型性部位が存在する場合には、一方の個体から得られるＤＮＡ断片にはハイブリダイズできるが、もう一方の個体から得られるＤＮＡ断片にはハイブリダイズできない。この場合、ハイブリダイゼーションの条件は、異なる対立遺伝子間でのハイブリダイゼーション強度の有意な差異を出すことを促進することによって、対立遺伝子のうち一方のみとハイブリダイズするよう適当なものであることが好ましい。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは、その中央部位が前記配列の多型性部位である、例えば、１５個のヌクレオチドからなるプローブにおいては７番目、１６個のヌクレオチドからなるプローブにおいては８または９番目となるように配列されることが好ましい。これにより、異なる対立遺伝子でのハイブリダイゼーションに差異が生じうる。本発明の一実施形態によれば、前記プローブは、対立遺伝子などを検出するための診断方法に用いられうる。前記診断方法は、核酸のハイブリダイゼーションを用いて検出するサザンブロッティング、または、プローブがあらかじめ結合したマイクロアレイを利用した方法であることが好ましい。
【００６２】
本発明の一実施形態によるポリペプチドは、前記ＳＮＰまたは前記ハプロタイプを含むポリヌクレオチドによりコードされる。前記ポリペプチドは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド、または、各ヌクレオチド配列が、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによりコードされる。
【００６３】
本発明の一実施形態による抗体は、前記ポリペプチドに特異的に結合する。前記抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００６４】
本発明の一実施形態によるマイクロアレイは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド、または、各ヌクレオチド配列が、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドのうちのいずれかによりコードされるポリペプチド、または、そのｃＤＮＡを含む。
【００６５】
前記マイクロアレイは、前記ポリヌクレオチド、プローブ、前記プローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドのうちのいずれかによりポリペプチド、またはそのｃＤＮＡを用いて、本技術分野の当業者に公知な一般的方法によって製造可能である。
【００６６】
例えば、前記ポリヌクレオチドは、アミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンまたはアルデヒドの活性基でコーティングされた基板に固定されうる。また、前記基板は、シリコンウェーハ、ガラス、石英、金属またはプラスチックで形成されうる。ポリヌクレオチドを基板に固定化させる方法としては、圧電法を利用したマイクロピペッティング、またはピン状のスポッターを利用した方法が挙げられる。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、キットは、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド、または、各ヌクレオチド配列が、少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含む配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、もしくは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド、または、前記ポリヌクレオチドのうちのいずれかによりコードされるポリペプチド、または、そのｃＤＮＡを含む。
【００６８】
前記キットは、診断を受ける被検者から前記ＳＮＰを含むＤＮＡを単離及び増幅するのに用いられるプライマーセットをさらに含んでもよい。適当な前記プライマーセットは、本技術分野の当業者であれば設計できるであろう。例えば、前記プライマーセットとして、表３に示されたものを利用できる。また、前記キットは、重合反応用試薬、例えばｄＮＴＰ、各種のポリメラーゼ及び発色剤をさらに含んでもよい。
【００６９】
本発明の一実施形態による同定方法は、前記ＳＮＰまたは前記ハプロタイプを用いて、心筋梗塞の発症の危険度が変化した被検者を同定することを含む。
【００７０】
前記同定方法は、前記被検者から核酸試料を単離すること、及び配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択される一以上のポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの多型性部位における対立遺伝子を決定することを含む方法を含み、ここで、前記多型性部位は、前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目のヌクレオチドに位置する。
【００７１】
本発明の一実施形態において、前記被検者からのＤＮＡの単離は、本技術分野の当業者に公知の方法により行うことができる。例えば、組織もしくは細胞からＤＮＡを直接精製することができ、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などにより特定の領域を特異的に増幅し、その後単離することもできる。本詳細な説明におけるＤＮＡとは、ＤＮＡだけでなく、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡも含む。ＰＣＲ増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，１０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，１１７３（１９８９））、自律維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，１８７４（１９９０））または核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）を用いて、被検者から核酸を得ることができる。
【００７２】
単離されたＤＮＡは、本技術分野の当業者に公知の多様な方法によって配列決定されうる。例えば、ジデオキシ法を用いて、核酸のヌクレオチドを直接配列決定してもよい。また、前記ＳＮＰ部位を有する配列を含むプローブ及びその相補的プローブと、前記ＤＮＡをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションの程度を測定することによって、前記多型性部位を有するヌクレオチドを配列決定することができる。前記ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、前記標的ＤＮＡについての検出可能な標識を表示し、ハイブリダイズされる標的を特異的に検出する方法、または電気的なシグナル検出方法を用いて測定できる。
【００７３】
ハイブリダイズされた二本鎖の形成の検出には、対立遺伝子特異的なプローブのハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的な増幅、配列分析法シークエンシング、５‘ヌクレアーゼ分解、分子ビーコンアッセイ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法、サイズ分析法または一本鎖構造多型一本鎖高次構造多型が用いられうる。
【００７４】
本発明の一実施形態による心筋梗塞用の薬剤組成をスクリーニングする方法は、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列が少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと、結合複合体の形成に適当な条件下で候補物質を接触させること、並びに、前記ポリペプチド及び前記候補物質の間での前記結合複合体の形成を検出することを含む。
【００７５】
前記結合複合体の形成を検出することは、免疫共沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ウエスタンブロッティングまたは蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）により行われうる。
【００７６】
本発明の一実施形態による遺伝子発現を調整する方法は、配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列よりなる群から選択されるポリヌクレオチド、または配列番号１〜１４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ヌクレオチド配列がそれぞれ少なくとも８個のコンティグヌクレオチド及び前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基を含むポリヌクレオチド、あるいは前記ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドと、アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡとを結合することを含み、ここで、前記アンチセンスヌクレオチドまたはＳｉ  ＲＮＡは前記ポリヌクレオチドに特異的である。
【００７７】
有利な効果
本発明によれば、心筋梗塞に関連した前記ＳＮＰ及びハプロタイプは、心筋梗塞の診断及び治療、並びに遺伝子パターンの分析に用いることができる。本発明の前記ＳＮＰを含む前記マイクロアレイ及びキットを用いることにより、心筋梗塞を効果的に診断できる。本発明の心筋梗塞に関与するＳＮＰを解析する方法によれば、心筋梗塞の存在または危険性を効果的に診断できる。
【００７８】
最良の形態
本発明について、以下の実施例を参照しつつさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７９】
実施例１
ＳＮＰの選別
心血管疾患患者と診断され、治療中の患者群の血液からＤＮＡを単離し、心血管疾患症状のない正常群の血液からＤＮＡを単離し、その後、特異的なＳＮＰの出現頻度を解析した。双方の群とも韓国人からなる。本発明の実施例のＳＮＰは、公開されたデータベース（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）またはシーケノム社のｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ／）から選択した。前記選択されたＳＮＰの近傍の配列を利用したプライマーを用いてＳＮＰを解析した。
【００８０】
１−１．ＤＮＡ試料の調製
心筋梗塞患者と診断されて治療中である２２１人の韓国人男性患者からなる患者群の血液からＤＮＡを抽出し、心筋梗塞症状のない１９１人の韓国人男性からなる正常群の血液からＤＮＡを抽出した。染色体ＤＮＡ抽出は、公知の抽出方法（分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐ３９２，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）及び商業用キットのガイドライン（Ｇｅｎｔｒａｓｙｓｔｅｍ、Ｄ−５０Ｋ）に従って行った。前記抽出されたＤＮＡから、ＵＶ吸収率（２６０／２８０ｎｍ）が１．７以上になるもののみを選別し、使用した。
【００８１】
１−２．標的ＤＮＡの増幅
解析しようとするＳＮＰが含まれた一定のＤＮＡ領域を含む標的ＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは一般的な方法により行われ、その条件は以下の通りであった。まず、標的ゲノムＤＮＡを２．５ｎｇ／ｍｌ準備した。続いて、ＰＣＲ反応液を調製した。
【００８２】
水（ＨＰＬＣグレード）  ３．１４μｌ
１０×バッファー  ０．５μｌ
ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ  ０．２μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各）  ０．０４μｌ
Ｔａｑ  ｐｏｌ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）（５Ｕ／μｌ）  ０．０２μｌ
フォワード／リバース  プライマーミックス（１０μＭ）  ０．１μｌ
ＤＮＡ  １．００μｌ
総反応体積  ５．００μｌ
ここで、前記フォワード及びリバースのプライマーは、ＳＮＰの上流と下流のうち、適当な位置を選択した。前記プライマーのセットを表３に示す。
【００８３】
ＰＣＲのサーマルサイクルは、９５℃で１５分間維持した後、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、及び７２℃で１分を４５回反復し、７２℃で３分間維持した後、４℃に保管した。その結果、２００ヌクレオチド以下の長さを有する標的ＤＮＡ断片を得た。
【００８４】
１−３．増幅された標的ＤＮＡについてのＳＮＰの解析
標的ＤＮＡ断片についてのＳＮＰ解析には、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（ｈＭＥ）技術を利用した。前記ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ技術の原理は、次の通りである。まず、前記標的ＤＮＡ断片のうち、ＳＮＰ直前までの塩基に相補的なプライマー（伸長用プライマーともいう）を設計した。次に、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ＤＮＡの重合を促進させた。その際、前記被検者のＳＮＰ対立遺伝子のうち、第１対立遺伝子の塩基（例えば、Ａ）に、相補的な塩基を添加した後、反応を終止させるための試薬（終止ミックス：例えば、ｄｄＴＴＰ）を前記反応液中に添加した。その結果、前記標的ＤＮＡ断片が第１対立遺伝子塩基（例えば、Ａ）を含む場合には、前記第１対立遺伝子に相補的な一塩基（例えば、Ｔ）のみを有する産物が得られた。一方、前記標的ＤＮＡ断片が第２対立遺伝子（例えば、Ｇ）を含む場合には、前記第２対立遺伝子に相補的な一塩基（例えば、Ｃ）のみを有し、前記第１対立遺伝子塩基（例えば、Ａ）まで伸長した産物が得られた。前記プライマーから伸長した産物の長さは質量分析により決定され、前記標的ＤＮＡに存在する対立遺伝子の型を決定した。具体的な実験条件は、以下の通りであった。
【００８５】
まず、前記ＰＣＲ産物から遊離ｄＮＴＰを除去した。このために、純水１．５３μｌ、ｈＭＥバッファー０．１７μｌ、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）０．３０μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、ＳＡＰ酵素溶液を調製した。前記チューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液のチューブに入れ、密封した後、３７℃で２０分、８５℃で５分間維持した後、４℃に保管した。
【００８６】
次に、前記標的ＤＮＡ産物を鋳型として使用し、均質的伸長反応を実施した。反応液は、以下の通りであった。
【００８７】
水（ナノ級純水）  １．７２８μｌ
ｈＭＥ伸長ミックス（２．２５ｍＭ  ｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０×バッファー）  ０．２００μｌ
伸長プライマー（各１００μＭ）  ０．０５４μｌ
サーモシークエナーゼ（３２Ｕ／μｌ）  ０．０１８μｌ
総体積  ２．００μｌ
前記反応液を十分に混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応液の入ったチューブまたはプレートを十分に密封した後、９４℃で２分間維持し、９４℃で５秒、５２℃で５秒、及び７２℃で５秒を４０回反復した後、４℃に保管した。このようにして得られた均質的伸長反応産物を樹脂で洗浄して塩の量を減少させた（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ、シーケノム社、＃１００５３）。伸長反応に使われた伸長プライマーを表３に表した。
【００８８】
【表３】
2008543327.tif 000004
【００８９】
得られた伸長産物について質量分析を行い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により多型性部位の配列を分析した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは、分析しようとする物質がレーザービームを受け、イオン化されたマトリックス（３−ヒドロオキシピコリン酸）と共に真空状態で反対側にある検出器まで飛行した。質量を決定するために検出器までの飛行時間を計算した。質量の小さな物質は大きな物質よりも短い時間で検出器に達することができる。標的ＤＮＡ中のＳＮＰのヌクレオチド配列は、質量の差異、及び前記ＳＮＰの公知のヌクレオチド配列に基づいて決定できる。
【００９０】
１−４．本発明によるＳＮＰの選別
心筋梗塞患者と診断されて治療中の２２１人の韓国人男性患者からなる患者群と、まだ心筋梗塞症状のない１９２人の韓国人男性からなる正常群とにおける対立遺伝子頻度を比較した。相関性試験として、頻度に基づいてフィッシャーの正確確率検定を行った。前記ＳＮＰに関する対立遺伝子の相関性試験において、ｐ値が０．０５以下である場合、前記ＳＮＰは、顕著な遺伝的マーカーであるとみなした。
【００９１】
効果の大きさ（ｅｆｆｅｃｔ  ｓｉｚｅ）は、９５％信頼区間での対立遺伝子のオッズ比を用いて推定した。正常群の方が、患者群よりも所定の対立遺伝子について高い頻度で現れた場合、前記対立遺伝子は心筋梗塞の危険度の減少と相関性があり、もう一方の対立遺伝子は心筋梗塞のリスク対立遺伝子であると決定された。一方、患者群の方が、正常群よりも所定の対立遺伝子について高い頻度で現れた場合、前記対立遺伝子は心筋梗塞のリスク対立遺伝子であると決定された。
【００９２】
前記結果を表１に示した。表１に示されるように、ＮＦｋＢ１遺伝子において、心筋梗塞と相関性のある１０個のＳＮＰを新たに同定した。
【００９３】
１−５．本発明によるハプロタイプの選別
心筋梗塞症と診断されて治療中の２２１人の韓国人男性患者及び心筋梗塞症状のない１９１人の韓国人男性に対し、配列番号１〜１４の１４個のＳＮＰを含むハプロタイプの統計学的有意性を調べた。前記結果を表２に示した。表２に示されているように、０．０５以下のｐ値を有し、前記患者群と前記正常群との間で頻度に有意な差異を示したハプロタイプがいくつか見出された。そのうち、ハプロタイプの２番及び９番が比較的高い頻度で現れる主要なハプロタイプであると判定された。
【００９４】
実施例２
ＳＮＰの固定されたマイクロアレイの製作
前記選別されたＳＮＰを基板上に固定してマイクロアレイを製作した。すなわち、２０個のコンティグヌクレオチドを含む配列番号１〜７、９、１０及び１４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを基板上に固定し、ここで、各ＳＮＰ（前記ヌクレオチド配列のうち１０１番目の塩基）は、前記２０個のヌクレオチドのうち１１番目に位置していた。
【００９５】
まず、前記ポリヌクレオチドのＮ−末端をそれぞれアミン基で置換し、前記ポリヌクレオチドをシリル化スライド（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社）にスポットした。その際、スポッティングバッファーとして、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）を使用した。スポッティング後に乾燥器中で結合を誘発し、０．２％ＳＤＳで２分間の洗浄を１回、及び蒸留水で２分間の洗浄を３回行うことにより、遊離オリゴヌクレオチドを除去した。前記スライド温度を２分間で９５℃まで上げることにより変性を誘発し、ブロッキング溶液（１．０ｇ  ＮａＢＨ４、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３００ｍＬ、ＥｔＯＨ  １００ｍＬ）で１５分間の洗浄を１回、０．２％ＳＤＳ溶液で１分間の洗浄を１回、及び蒸溜水で２分間の洗浄を３回行った後、常温で乾燥させて、マイクロアレイを製作した。
【００９６】
実施例３
前記マイクロアレイを利用した心筋梗塞の診断
心筋梗塞の発症またはその可能性を診断するために、実施例１−１及び１−２で説明した方法を用いて、被検者の血液から標的ＤＮＡを単離し、蛍光物質で標識した。ＵｎｉＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（ＴｅｌｅＣｈｅｍ社）中で、４２℃で４時間、実施例２で製作したマイクロアレイと、蛍光標識された標的ＤＮＡをハイブリダイズした。前記スライドを、室温で５分間、２×ＳＳＣを用いて２回洗浄し、空気中で乾燥させた。乾燥したスライドをスキャンアレイ５０００（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）でスキャンした。スキャン結果をＱｕａｎｔＡｒｒａｙ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）及びＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒ社）を用いて分析した。前記被検者が本発明の一実施形態によるＳＮＰを有しているか否かを同定することによって、心筋梗塞の発症の可能性及びその感受性を測定した。
【００９７】
本発明について実施形態を用いて説明したが、それらは例示的なものに過ぎず、本技術分野の当業者ならば、本発明の範囲および趣旨から逸脱しない範囲で多様な変更および変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、本発明の範囲は、説明された実施形態によって限定されず、特許請求の範囲により定められねばならない。
【配列表】
2008543327000001.app