(57)【要約】本発明は、より速い増殖速度およびより高い細胞密度に増殖する能力などの特性が強化された哺乳動物細胞を産生する方法に関する。本発明はまた、インスリンおよびインスリン代替物などの成分を欠く培地中で増殖する能力を有する細胞を産生する方法に関する。本発明はまた、インスリンおよびインスリン代替物などの成分を欠く培地中での増殖特性および／または増殖能力が改良された単離哺乳動物細胞に関する。ポリペプチドを産生するための方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖特性が強化された１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生するための方法であって、前記方法が、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含み、前記各選択サイクルが、
（ａ）（ｉ）出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、該出発細胞集団の７０％未満が生存可能なままの選択条件に供する工程であって、但し、前記選択条件が、前記細胞を外因的に添加したアンモニウムを含む培養培地と接触させる工程を含まない、工程と、
（ｂ）該選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程と、
を包含し、ここで、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および該出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞は、該出発細胞集団の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す、方法。
【請求項２】
前記選択条件が、前記細胞をバイオリアクター中でインキュベートする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択条件が、約１〜１００日間バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択条件が、約５〜５０日間バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択条件が、約５〜３０日間バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記選択条件が、約５〜２０日間バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記選択条件が、前記出発細胞集団の６０％未満が生存可能なままのような期間、バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記選択条件が、前記出発細胞集団の５０％未満が生存可能なままのような期間、バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記選択条件が、前記出発細胞集団の４０％未満が生存可能なままのような期間、バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクターを、流加培養条件下で運転する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオリアクターを、回分培養モード条件下で運転する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記選択条件が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記出発細胞集団を、１〜２０回の前記選択サイクルに供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記出発細胞集団を、１〜１０回の前記選択サイクルに供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記出発細胞集団を、１〜５回の前記選択サイクルに供する、請求１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記出発細胞集団を、１〜４回の前記選択サイクルに供する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記出発細胞集団を、３回または４回の前記選択サイクルに供する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択条件が、前記出発細胞集団のうちの５％と５０％との間の細胞が前記１回または複数回の選択サイクル後に生存可能なままの条件である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択条件が、前記出発細胞集団のうちの１０％と５０％との間の細胞が前記１回または複数回の選択サイクル後に生存可能なままの条件である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択条件が、前記出発細胞集団のうちの２０％と５０％との間の細胞が前記１回または複数回の選択サイクル後に生存可能なままの条件である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択条件が、前記出発細胞集団のうちの３０％と５０％との間の細胞が前記１回または複数回の選択サイクル後に生存可能なままの条件である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記出発細胞集団が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記出発細胞集団が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記出発細胞集団が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、構成性プロモーターの調節下にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、誘導性プロモーターの調節下にある、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドのうちの１つまたは複数が、抗体またはそのフラグメントである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記出発細胞集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＨＯ細胞が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＨＯ細胞が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、構成性プロモーターの調節下にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つまたは複数の外因性核酸分子が、誘導性プロモーターの調節下にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択サイクルの間に、（ｂ）で得た細胞を、前記選択条件の非存在下で該細胞をインキュベートする工程を含む回復期に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項１に記載の方法によって得た１つまたは複数の細胞に該ポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、
（ｂ）該核酸分子を含む細胞を、該ポリペプチドが該核酸分子から発現される条件下で培養する工程と
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および前記出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、該出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも５０％大きいＩＣＡを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および前記出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、該出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも７０％大きいＩＣＡを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞の増殖速度が、少なくとも０．３０／日である、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞をサブクローニングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生するための方法であって、前記方法が、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含み、前記各選択サイクルが、
（ａ）（ｉ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での０．２０／日未満の増殖速度を示す出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、
（ｂ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程と、
を包含し、ここで、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、少なくとも０．３０／日である増殖速度を有する、方法。
【請求項４４】
前記出発細胞集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＣＨＯ細胞が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記出発細胞集団が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記工程（ａ）中の細胞を、前記培養培地に１〜１０日間接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記工程（ａ）中の細胞を、前記培養培地に２〜５日間接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記工程（ａ）中の細胞を、前記培養培地に３または４日間接触させる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記出発細胞集団を、前記選択サイクルのうちの１〜２０回に供する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記出発細胞集団を、前記選択サイクルのうちの１〜１０回に供する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記出発細胞集団を、前記選択サイクルのうちの１〜５回に供する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記出発細胞集団を、前記選択サイクルのうちの１〜４回に供する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記出発細胞集団を、前記選択サイクルのうちの３回または４回に供する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で少なくとも０．４０／日の増殖速度を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で少なくとも０．５０／日の増殖速度を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で少なくとも０．６５／日の増殖速度を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で少なくとも０．７５／日の増殖速度を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記選択サイクルの間に、（ｂ）で得た細胞を、インスリンおよびインスリン代替物を含む培養培地中で前記細胞をインキュベートする工程を含む回復期に供する、請求項４３に記載の方法。
【請求項６３】
ポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、
（ａ）請求項４３に記載の方法によって得た１つまたは複数の細胞にポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、
（ｂ）該核酸分子を含む細胞を、該ポリペプチドが該核酸分子から発現される条件下で培養する工程と
を包含する、方法。
【請求項６４】
インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生するための方法であって、該方法が、
（ａ）１回または複数回の選択サイクルを含む第１ラウンドの選択を実施する工程であって、該第１ラウンドの各選択サイクルが、
（ｉ）（Ａ）出発哺乳動物細胞集団、または（Ｂ）工程（ｉｉ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、該出発細胞集団の７０％未満が生存可能なままの選択条件に供する工程と、
（ｉｉ）該選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程と
を含む、工程と、
（ｂ）１回または複数回の選択サイクルを含む第２ラウンドの選択を実施する工程であって、該第２ラウンドの各選択サイクルが、
（ｉｉｉ）（Ｃ）該第１ラウンドの選択サイクルから得た１つまたは複数の細胞、または（Ｄ）工程（ｉｖ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、
（ｉｖ）該インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得る工程と
を含む、工程と、
を包含し、ここで、該第２ラウンドの選択から得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で少なくとも０．３０／日の増殖速度を有する、方法。
【請求項６５】
前記選択条件が、前記細胞をバイオリアクター中でインキュベートする工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記選択条件が、約１〜５０日間バイオリアクター中で前記細胞をインキュベートする工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記出発細胞集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
単離ＣＨＯ細胞およびＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、該ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す、１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項７２】
前記単離ＣＨＯ細胞および前記ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、該細胞が、該ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも５０％大きいＩＣＡを示す、請求項７１に記載の単離細胞。
【請求項７３】
前記単離ＣＨＯ細胞および前記ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、該細胞が、該ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも７０％大きいＩＣＡを示す、請求項７２に記載の単離細胞。
【請求項７４】
前記細胞が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項７１に記載の単離細胞。
【請求項７５】
前記細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項７１に記載の単離細胞。
【請求項７６】
前記細胞が、血清を欠くか実質的に欠き、且つインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項７１に記載の単離細胞。
【請求項７７】
前記細胞が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む、請求項７１に記載の単離細胞。
【請求項７８】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、構成性プロモーターの調節下にある、請求項７７に記載の単離細胞。
【請求項７９】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、誘導性プロモーターの調節下にある、請求項７７に記載の単離細胞。
【請求項８０】
前記ポリペプチドのうちの１つまたは複数が、抗体またはそのフラグメントである、請求項７７に記載の単離細胞。
【請求項８１】
ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、
（ａ）請求項７１に記載の１つまたは複数の単離細胞にポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、
（ｂ）該核酸分子を含む細胞を、該ポリペプチドが該核酸分子から発現される条件下で培養する工程と
を包含する、方法。
【請求項８２】
増殖特性が強化された１つまたは複数の単離哺乳動物細胞であって、前記細胞が、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含む方法によって産生され、前記各選択サイクルが、
（ａ）（ｉ）出発細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、該出発細胞集団の７０％未満の細胞が生存可能なままの選択条件に供する工程であって、但し、該選択条件が、該細胞を外因的に添加したアンモニウムを含む培養培地と接触させる工程を含まない、工程と、
（ｂ）該選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を単離する工程と、
を包含し、ここで、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および該出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、該１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、前記出発細胞集団の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す、１つまたは複数の単離哺乳動物細胞。
【請求項８３】
インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートした場合、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートしたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す、１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８４】
前記細胞が、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる、請求項８３に記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８５】
前記細胞が、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む、請求項８３に記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８６】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、構成性プロモーターの調節下にある、請求項８５に記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８７】
前記外因性核酸分子のうちの１つまたは複数が、誘導性プロモーターの調節下にある、請求項８５に記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８８】
前記ポリペプチドのうちの１つまたは複数が、抗体またはそのフラグメントである、請求項８５に記載の単離ＣＨＯ細胞。
【請求項８９】
ポリペプチドを産生するための方法であって、該方法が、
（ａ）請求項８３に記載の１つまたは複数の単離細胞に該ポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、
（ｂ）該核酸分子を含む細胞を、該ポリペプチドが該核酸分子から発現される条件下で培養する工程と
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、組換えタンパク質および他の細胞生成物の高レベル産生のために使用することができる増殖特性が強化された哺乳動物細胞株の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
組換えタンパク質産生のための宿主として哺乳動物細胞がしばしば使用されている。産業面での目的は、費用を最小にしながら最短時間で最大量の組換えタンパク質を産生することである。種々の一般的ストラテジーを使用して、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の収率を増加させることができる。一般に、総タンパク質収率を、所与の期間で増殖するタンパク質産生細胞の数を増加させることによって増加させることができる。得られる細胞数を増加させるための１つのストラテジーは、培養サイズを増加させることである。産業面でのバイオリアクターの使用により、通常の実験規模での培養条件と比較して、培養体積を実質的に増加させることが可能である。しかし、培養体積の増加により、装置および培地の費用の相当な増加を伴う。
【０００３】
哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の収率を改良するための別のストラテジーは、タンパク質を産生するために使用される細胞の増殖特性を改良することである。例えば、産業的タンパク質産生で一般に使用される哺乳動物宿主細胞と比較して、培養でより迅速に増殖し、かつ／またはより高い密度で増殖し、かつ／または培養でより長い生存期間を維持する細胞は、タンパク質収率をより高くすることが容易であろう。使用される培養培地の至適化により、細胞増殖を潜在的に改良することができる。しかし、培養培地の至適化は高価であり、培地を改良とは無関係に、固有の細胞の特性では、得ることができる細胞量には限度があり得る。
【０００４】
産業規模の組換えタンパク質産生の費用は、培養培地で使用される成分に非常に依存する。血清は、細胞培養培地の処方で伝統的に含まれる成分である。血清によって培養における細胞増殖に必要な因子を得ることができるが、血清は高価であり、不明確な成分である。血清で見出されたタンパク質および他の物質は、血清含有培地で増殖した細胞によって産生されるタンパク質の単離および精製を妨げ得る。さらに、生物医薬品製造のための培養培地中の血清の使用は、いくつかの安全面および規制面での問題が懸念される。血清の使用により、ウイルスおよび伝染性タンパク質因子などの汚染因子が培養培地に導入される可能性が増加する。したがって、血清の使用は、規制当局によって抑制されている。したがって、無血清培養条件が非常に好ましく、時折、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の産生に必要である。
【０００５】
しかし、無血清条件下で哺乳動物細胞を増殖させるために、培養培地における血清の代わりとなる種々の成分を含める必要がある。無血清培地における最も高価な成分は、典型的には、インスリンである。インスリン代替物（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）が公知且つ利用可能であるにもかかわらず、このような代替物も高価であり、もしかするとインスリン自体よりも高価である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記要因および検討材料を考慮して、適切な費用での哺乳動物細胞からのタンパク質収率の改良が当該分野で必要であることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、増殖特性が強化され、かつ／またはインスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中で増殖する能力を有する哺乳動物細胞を産生する方法を提供することによって、当該分野における上記必要性に取り組む。
【０００８】
本発明の１つの態様によれば、増殖特性が強化された１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、（ａ）（ｉ）出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｂ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含む。選択サイクルから得た細胞は、選択サイクルから得た細胞および出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、出発細胞集団の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す。選択条件の例は、本発明のこの態様によれば、細胞（出発細胞集団または選択サイクルから得た細胞のいずれか）をバイオリアクター中でインキュベートする工程を含む。
【０００９】
本発明のこの態様の基本は、回分バイオリアクターまたは流加バイオリアクターで増殖した細胞の細胞生存率の低下を観察することである。したがって、バイオリアクターの環境により、増殖特性が強化された細胞を産生する選択圧を得ることができる。増殖特性が強化された細胞を選択するためのバイオリアクターの使用を、本明細書中で一般に、「バイオリアクターの進化（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」ということができる。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、（ａ）（ｉ）無インスリン培地で増殖することができない出発哺乳動物細胞集団（例えば、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での平均増殖速度が０．２０／日未満の哺乳動物細胞）、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地に接触させる工程と、（ｂ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得る工程とを含む。インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中の選択サイクルから得た細胞の増殖速度は、少なくとも０．３０／日である。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、２つの個別の連続的選択手順（各選択手順は、１回または複数回の選択サイクルを含む）を実施する工程を含む。第１の選択手順は、１回または複数回の第１の選択サイクルであって、各第１の選択サイクルが、（ａ）（ｉ）出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｂ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含む、第１の選択サイクルを含む。第２の選択手順は、１回または複数回の第２の選択サイクルであって、各第２の選択サイクルが、（ｃ）（ｉ）１回または複数回の第１の選択サイクルから得た１つまたは複数の細胞、または（ｉｉ）工程（ｄ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、（ｄ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得る工程とを含む、第２の選択サイクルを含む。第２の選択サイクルから得た細胞のインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地での増殖速度は、少なくとも０．３０／日である。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、増殖特性が強化された哺乳動物細胞を提供する。例えば、本発明のこの態様は、単離ＣＨＯ細胞およびコントロール細胞（例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞など）を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合、コントロール細胞の対応する積分細胞面積（ＩＣＡ）よりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞を提供する。本発明のこの態様はまた、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートした場合、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートしたコントロール細胞（例えば、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞など）の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞を提供する。本発明のこの態様はまた、本明細書中のいずれかに記載の本発明の任意の方法を使用して得られる、細胞特性が強化された哺乳動物細胞を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、ポリペプチドを産生する方法を提供する。本発明のこの態様の方法は、（ａ）１つまたは複数の単離細胞にポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、（ｂ）核酸分子を含む細胞を、ポリペプチドが核酸分子から発現される条件下で培養する工程とを含む。本発明のこの態様の方法では、核酸分子が導入される細胞は、（１）本明細書中に記載の本発明の任意の細胞、および（２）本明細書中に記載の本発明の任意の方法を使用して得た任意の細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（増殖特性の強化）
本発明は、増殖特性が強化された１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生する方法を含む。本発明はまた、増殖特性が強化された哺乳動物細胞を含む。本明細書中で使用される、表現「増殖特性が強化された哺乳動物細胞」は、（ｉ）より速い増殖速度、および／または（ｉｉ）より高い細胞密度を達成する能力、および／または（ｉｉｉ）実質的に同一の培養条件に供した基準細胞または基準細胞集団と比較して長期間生存可能なままの能力を示す哺乳動物細胞を意味する。
【００１５】
本発明の特定の態様は、出発細胞集団を１回または複数回の選択サイクルに供する工程を含む。選択サイクルは、特定の例では、細胞を選択条件（例えば、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの条件）に供する工程を含む。選択サイクルから得た細胞は、基準細胞または基準細胞集団と比較して１つまたは複数の増殖特性を強化することができる。基準細胞または基準細胞集団は、本発明の方法で使用される出発細胞集団であり得る。
【００１６】
他の態様では、本発明の細胞は、当該分野で公知の基準細胞または基準細胞株と比較して、増殖特性が強化されている。当該分野で公知の例示的基準細胞株は、ＤＧ４４と指定されたＣＨＯ細胞株である（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５５５−５６６（１９６８））。ＤＧ４４細胞は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから市販されている。他の公知且つ利用可能な細胞を、本発明の文脈において、基準細胞として使用することができる。
【００１７】
当業者は、この用語を本発明の文脈で使用する場合、所与の細胞の増殖特性が強化されたか否かを決定する方法を容易に認識するであろう。例えば、所与の細胞（例えば、本発明の方法によって産生された細胞）の増殖特性が強化されたかどうかを決定するために、当業者は、細胞を定義された培養条件組に供した場合に得られた増殖速度および／または細胞密度を測定し、これらの値を同一または実質的に同一の定義された培養条件組に供した基準細胞を使用して得た増殖速度および／または細胞密度と比較することができる。特定の例では、基準細胞と比較して所与の細胞の増殖特性が強化されたかどうかを決定するために、細胞および基準細胞を、選択条件の非存在下（例えば、本発明の方法の選択サイクルで使用した選択条件の非存在下）で増殖させる。本発明の方法によって産生された細胞から得た値が基準細胞から得た値より高い場合、本発明の方法によって産生された細胞は、「増殖特性が強化されている」。
【００１８】
表現「増殖特性が強化された」を、用語「積分細胞面積」（ＩＣＡ）でも表現することができる。ＩＣＡを、以下のように計算する。
【００１９】
ＩＣＡ＝日数×［（最終細胞密度−初期細胞密度）／ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）］。
【００２０】
上記式では、「日数」は、細胞が培養でインキュベートされた日数をいい、その時点で、「最終細胞密度」を測定する。「初期細胞密度」は、培養開始時の培養における細胞密度である。ＩＣＡを、用語「Ｘ日ＩＣＡ」で示すことができる。例えば、細胞を１０日間培養でインキュベートする場合、ＩＣＡを、「１０日ＩＣＡ」と示すことができる。「試験」細胞のＩＣＡが、同一または実質的に同一の培養条件下で培養された基準細胞のＩＣＡより高い場合、「試験」細胞を、「増殖特性が強化された」と見なす。
【００２１】
（増殖特性が強化された哺乳動物細胞を産生する方法）
本発明は、増殖特性が強化された１つまたは複数の哺乳動物細胞を産生する方法を含む。本発明のこの態様の方法は、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含み、各選択サイクルが、（ａ）（ｉ）出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｂ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含む。
【００２２】
本発明のこの態様によれば、選択サイクルから得た細胞が、好ましくは、選択サイクルから得た細胞および出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％大きいＩＣＡを示す。
【００２３】
ＩＣＡを、用語「Ｘ日ＩＣＡ」で示すことができる。例えば、細胞を、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間培養でインキュベートする場合、ＩＣＡを、それぞれ、２日ＩＣＡ、３日ＩＣＡ、４日ＩＣＡ、５日ＩＣＡ、６日ＩＣＡ、７日ＩＣＡ、８日ＩＣＡ、９日ＩＣＡ、または１０日ＩＣＡと示すことができる。「出発細胞集団の対応するＩＣＡ」は、選択サイクルから得た細胞のＩＣＡを計算するために使用された同一の「日数」パラメーターを使用して計算した出発細胞集団のＩＣＡである。例えば、選択サイクルから得た細胞のＩＣＡを、用語「１０日ＩＣＡ」で示す場合、出発細胞集団の対応するＩＣＡは、出発細胞集団の１０日ＩＣＡである。同様に、選択サイクルから得た細胞のＩＣＡを、用語「５日ＩＣＡ」で示す場合、出発細胞集団の対応するＩＣＡは、出発細胞集団の５日ＩＣＡである。
【００２４】
７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件には、出発細胞数の７０％未満である生存可能な細胞の数を産生する任意の培養条件、選択圧、または操作が含まれる。このような条件は、当業者に認識されており、本明細書中で考察している。
【００２５】
所与の選択条件が７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままのようなものであるかどうかを決定するために、当業者は、例えば、一定数の細胞を培養培地に接種し、細胞の生存率が低下すると考えられる条件に培養物を供し、長期間の培養における生存可能な細胞の数をモニタリングすることができる。７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件を同定するために操作することができる例示的パラメーターには、以下が含まれる：温度（例えば、高温または低温）、培地組成（例えば、細胞の生存率に悪影響を及ぼす成分（例えば、有毒化合物）の存在または最適な細胞生存率に必要な成分の非存在）、大気圧、酸素、および、ＣＯ２濃度、ｐＨ、浸透圧、培養サイズ（例えば、非常に巨大または非常に小さい培養体積）、培養容器の型、細胞が培養でインキュベートされた時間、ならびに任意の上記パラメーターの組み合わせ。
【００２６】
したがって、例示的な選択条件には、以下が含まれるが、これらに限定されない：（ａ）約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、またはそれを超える温度での培養培地中での細胞のインキュベーション、（ｂ）約２０℃、約１８℃、約１６℃、約１４℃、約１２℃、約１０℃、約８℃、またはそれ未満の温度での培養培地中での細胞のインキュベーション、（ｃ）長期間（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０日、またはそれを超える日数）の培養での細胞のインキュベーション、（ｄ）培地の補給（ｒｅｆｒｅｓｈｉｎｇ）または交換を行わない長期間（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０日、またはそれを超える）の培養での細胞のインキュベーション、（ｅ）１つまたは複数の外因性または内因性の有毒成分を含む培地中での細胞のインキュベーション、（ｆ）動物由来成分（例えば、血清、ＢＳＡ、加水分解物など）を欠く培地での細胞のインキュベーション、および（ｇ）培養における細胞増殖に至適なｐＨ範囲外のｐＨ（例えば、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、８．０、８．５、９．０、９．５、またはそれを超えるｐＨ）の培地での細胞のインキュベーション。
【００２７】
バイオリアクターでインキュベートした細胞の生存率が経時的に減少することが認められた（実施例１および３を参照のこと）。したがって、本発明の特定の態様では、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件は、バイオリアクター中で細胞をインキュベートする工程を含む。例えば、本発明の特定の実施形態は、出発哺乳動物細胞集団を、約１〜２０日間バイオリアクターで細胞をインキュベートする工程を含む１回または複数回の選択サイクルに供する工程を含む。任意のバイオリアクター操作条件組での７０％未満の生存率を達成するためにかかる時間を、定期的なバイオリアクターでの細胞生存率のモニタリングによって容易に決定することができる。いくつかのバイオリアクター型が当該分野で公知であり、且つ利用可能である。バイオリアクターは、いくつかの供給元（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ，ＰＡ）、Ａｐｐｌｉｋｏｎ（Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＬＣ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、Ｄａｓｇｉｐ  ＡＧ（Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）などが含まれる）から市販されている。当該分野で公知且つ利用可能であるか、公知の方法および構成要素を使用して構築された任意のバイオリアクターを、本発明の実施に際して使用することができる。
【００２８】
「バイオリアクターでの細胞のインキュベーション」には、標準的な操作パラメーター（実施例１を参照のこと）またはこのようなパラメーターから逸脱した条件でのバイオリアクターにおける細胞のインキュベーションが含まれる。バイオリアクターを、回分培養モード（ｂａｔｃｈ−ｍｏｄｅ）（栄養素（ｆｅｅｄ）を添加しない）または流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）（運転時に栄養処方物（ｆｅｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を添加する）で運転することができる。本発明の方法で改変することができるバイオリアクターのパラメーターには、例えば、使用される培地型、温度、ｐＨ、溶存Ｏ２、攪拌、供給時間、栄養処方物、運転の長さ（時間）が含まれる。
【００２９】
バイオリアクターで細胞をインキュベーションする場合に用いられる培地は、増殖特性が強化された細胞の選択が可能な任意の培地であり得る。特定の実施形態では、使用される培地は、選択した特定の細胞株の培養に最適な培地である。哺乳動物細胞の培養培地は当該分野で周知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅ．Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）などから市販されている。
【００３０】
本発明の特定の態様では、選択条件は、バイオリアクター中で細胞を、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、５〜１００日間、またはそれを超えてインキュベートする工程を含む。例えば、選択条件は、バイオリアクター中で細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００日間またはそれを超えてインキュベートする工程を含み得る。
【００３１】
他の実施形態では、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件は、血清ならびに／またはインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で細胞をインキュベートする工程を含む。用語「インスリン」には、ヒトおよび非ヒト動物由来のインスリンが含まれる。「インスリン」には、インスリン亜鉛（例えば、ヒトインスリン亜鉛）およびインスリン関連（またはインスリン様）増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）ならびに融合タンパク質およびその誘導体（例えば、ＬｏｎｇＲ３、ＩＧＦ−１由来の融合タンパク質）も含まれる（Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：６９３−６９７（２０００））。用語「インスリン代替物」には、細胞が化学的に定義されたインスリンを欠く培地で増殖することが可能な任意の亜鉛含有化合物が含まれる。インスリン代替物の例には、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれるが、これらに限定されない。（米国特許第６，７３３，７４６号）。他のインスリン代替物には、例えば、インスリンアゴニスト活性を有するインスリン受容体に対する抗体が含まれる。（米国特許第４，７６１，３７１号）。培地がインスリンおよびインスリン代替物を含まないか、培地中でのＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の増殖速度が０．２０／日またはそれ未満であるようなインスリンおよび／またはインスリン代替物の量を含む場合、培地は、インスリンおよびインスリン代替物を「実質的に」欠く。例えば、本発明のこの態様の方法は、出発細胞集団を、無インスリン培地で細胞をインキュベートする工程を含む１回または複数回の選択サイクルに供する工程を含む。
【００３２】
本発明の特定の態様では、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件は、細胞を、外因的に添加したアンモニアおよび／または乳酸を含む培養培地と接触させる工程を含まない。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「供する」には、特定の組成物（例えば、培養培地または他の固体、液体、もしくは半固体物質）への細胞の接触、細胞の物理的操作（例えば、バイオリアクターに細胞を入れること、遠心分離による細胞のペレット化、フィルターでの細胞の回収、細胞をある培養環境から別の培養環境に移すことなど）、および／または細胞を取り巻く環境の操作（例えば、細胞を取り巻く培養培地の温度または化学的組成の調整）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明のこの態様の方法は、出発細胞集団を１回の選択サイクルのみに供する工程を含み得る。例えば、出発細胞集団を、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの期間（例えば、１〜２０日間）バイオリアクター中で増殖させることができる。次いで、生存可能な細胞を得て（例えば、バイオリアクターから取り出す）、そのＩＣＡ（例えば、その１０日ＩＣＡ）を決定し、出発細胞集団の対応するＩＣＡ（例えば、出発細胞集団の１０日ＩＣＡ）と比較する。特定の例では、１回の選択サイクルにより、出発細胞集団の対応するＩＣＡより少なくとも２５％大きいＩＣＡを有する細胞が得られる。
【００３５】
他の例では、細胞を複数回の選択サイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれを超える選択サイクル）に供することが望ましいかもしれない。例えば、方法から得た細胞が出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも実質的に高い（例えば、５０〜１００％大きい）ＩＣＡを有することが望ましい場合、複数回の選択サイクルが適切であり得る。当業者は、１回よりもむしろ複数回の選択サイクルが適切であることを認識している。
【００３６】
複数回の選択サイクルの使用を例示する非限定的な例は、以下である。第１に、出発細胞集団を、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままのような時間（例えば、１〜２０日間）、バイオリアクター中でインキュベートする。次いで、生存可能な細胞を、例えば、第１のバイオリアクター運転と同一条件および同一時間、第２のバイオリアクターに供する。いくつかの例では、その後のバイオリアクター運転の操作パラメーターは、前の運転の操作パラメーターと異なる。次いで、生存可能な細胞を、さらなるバイオリアクター運転に供するか、得て（例えば、バイオリアクターから取り出し）、そのＩＣＡ（例えば、１０日ＩＣＡ）を決定する。
【００３７】
特定の実施形態では、選択サイクルの間に「回復期」を含めることができる。回復期では、前のサイクルから得た細胞を、７０％を超える出発細胞集団が生存可能なままの培養条件（例えば、選択圧を除去するか減少させる培養条件）に供する。いくつかの場合、回復期は、前のサイクルから得た細胞を、約８０％〜１００％の出発細胞集団が生存可能なままの培養条件に供する工程を含む。回復期後、細胞を別の選択サイクルに供するか、細胞を得て（例えば、バイオリアクターから取り出し）、そのＩＣＡ（例えば、１０日ＩＣＡ）を決定する。
【００３８】
「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件からの生存可能な細胞の取り出しおよび／または細胞からの選択圧の除去を意味する。例えば、濾過または遠心分離によって細胞を「得る」ことができる。「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、非生存可能な細胞からの生存可能な細胞の分離を含み得るが、非生存可能な細胞からの生存可能な細胞の分離は、本発明の方法の実施に不可欠ではない。
【００３９】
「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、初期培養容器（例えば、フラスコまたはバイオリアクター）からの細胞の取り出しおよび新規の培養容器または保存コンテナに細胞を入れることを含み得る。「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」はまた、初期培養容器からの細胞の取り出しおよび同一の培養容器に細胞を戻すことを含み得る。
【００４０】
特定の例では、「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、単純に、選択条件の変化を含む。例えば、元の選択条件が、長期間枯渇した成分を含む培地中で細胞をインキュベートする工程を含む場合、「１つまたは複数の細胞を得ること」を、この成分を培地に補給することによって簡単に達成することができる。このような場合、細胞は元の培養容器から物理的に決して取り出されないにもかかわらず、本発明の目的のために、培地への枯渇成分の補給は、「選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得ること」と見なされる。いくつかの場合、成分の補給後、細胞を、１回または複数回のさらなる選択サイクルに供する。
【００４１】
本発明のこの態様の方法から得た細胞は、好ましくは、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す。当業者は、本発明の方法から得た細胞が、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示すかどうかを容易に確認することができる。例えば、出発細胞集団を、１回または複数回の選択サイクルに供する前に、特定の培養条件組下（例えば、特定の培地組成、特定の培養温度など）で１０日間増殖させることができる。初期細胞密度および最終細胞密度を測定し、出発細胞集団の１０日ＩＣＡを、以下の式にしたがって計算する：ＩＣＡ＝日数×［（最終細胞密度−初期細胞密度）／ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）］。本発明の方法によって得た細胞の１０日ＩＣＡを、同一または類似の培養条件を使用した類似の方法で決定することができる。
【００４２】
本発明の方法から得た細胞のＩＣＡ（例えば、その１０日ＩＣＡ）を出発細胞集団の対応する（例えば、１０日）ＩＣＡと比較することにより（本発明の方法から得た細胞および出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させる場合）、当業者は、本発明の方法から得た細胞のＩＣＡが、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいかどうか決定することができる。
【００４３】
出発哺乳動物細胞集団は、２つまたはそれを超える哺乳動物細胞の任意の集団である。本発明の方法で使用することができる哺乳動物細胞型を、本明細書中で考察している。出発集団内の各細胞は、同一または実質的に同一の表現型特性および／または遺伝子型特性を有し得る。あるいは、出発集団内の各細胞は、互いに異なる表現型特性および／または遺伝子型特性を有し得る（すなわち、出発細胞集団は、混合細胞集団であり得る）。
【００４４】
出発細胞集団は、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる細胞であり得る。出発細胞集団は、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる細胞であり得る。培地が血清を含まないか、培地中でのＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の増殖速度が０．２０／日またはそれ未満であるような血清の量を含む場合、培地は、血清を「実質的に」欠く。いくつかの実施形態では、出発細胞集団は、インスリンおよびインスリン代替物ならびに血清の両方を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる細胞である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、出発細胞集団は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはその誘導体（例えば、無血清培地に適合したＣＨＯ細胞）である。例えば、出発細胞集団は、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、無血清培地に適合したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、および／またはインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地で増殖するように適合したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞であり得る。出発細胞集団は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞であり得る。本発明の文脈で使用することができる他の細胞は、本明細書中で考察している。
【００４６】
本発明の特定の実施形態によれば、出発細胞集団は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含み得る。外因性核酸分子から発現することができる例示的ポリペプチドを、本明細書中で考察している。外因性核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にあり得る。
【００４７】
本発明の方法から得た細胞は、クローン的に同一であり得る。あるいは、本発明の方法から得た細胞は、クローン的に異なり得る。例えば、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す本発明の方法から得た細胞のうち、本発明の方法によって得た他の細胞と比較して遺伝子型が変動した個別の細胞が存在し得る。本発明の方法から得た細胞は、これらがクローン的に同一であるかどうかを問わない多数の下流への適用に有用である。それにもかかわらず、本発明のいくつかの実施形態では、方法は、さらに、選択サイクルから得た細胞をサブクローニングする工程を含む。哺乳動物細胞をサブクローニングする方法は、当該分野で周知である。
【００４８】
（インスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中で増殖する能力を有する哺乳動物細胞を産生する方法）
本発明はまた、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る方法を含む。多数のインスリンが、当業者に公知である（Ｇｉｌｍａｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｉ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ．１４６３−１４９５）。用語「インスリン」には、インスリン亜鉛（例えば、ヒトインスリン亜鉛）およびインスリン関連（またはインスリン様）増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）が含まれる。用語「インスリン代替物」には、細胞が化学的に定義されたインスリンを欠く培地で増殖することが可能な任意の亜鉛含有化合物が含まれる。インスリン代替物の例には、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれるが、これらに限定されない。培地がインスリンおよびインスリン代替物を含まないか、培地中でのＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の増殖速度が０．２０／日またはそれ未満であるようなインスリンおよび／またはインスリン代替物の量を含む場合、培地は、インスリンおよびインスリン代替物を「実質的に」欠く。
【００４９】
本発明のこの態様の方法は、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含み、各選択サイクルが、（ａ）（ｉ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での増殖速度が０．２０／日未満の出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、（ｂ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含む。インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での選択サイクルから得た細胞の増殖速度は、少なくとも０．３０／日である。
【００５０】
本発明のこの態様の方法はまた、２つの個別の連続的選択手順（各選択手順は、１つまたは複数の選択サイクルを含む）を実施する工程を含む。第１の選択手順は、１回または複数回の第１の選択サイクルであって、各第１の選択サイクルが、（ａ）（ｉ）出発哺乳動物細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、出発細胞集団の７０％未満が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｂ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含む、第１の選択サイクルを含む。第２の選択手順は、１回または複数回の第２の選択サイクルであって、各第２の選択サイクルが、（ｃ）（ｉ）１回または複数回の第１の選択サイクルから得た１つまたは複数の細胞、または（ｉｉ）工程（ｄ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、（ｄ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得る工程とを含む、第２の選択サイクルを含む。第２の選択サイクルから得た細胞のインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地での増殖速度は、少なくとも０．３０／日である。
【００５１】
本明細書中で使用される、表現「増殖速度」を、以下の式によって定義する。
【００５２】
増殖速度＝ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）／日数。
【００５３】
本発明のこの態様の方法から得た細胞のインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地での増殖速度は、少なくとも０．３０／日、０．３５／日、０．４０／日、０．４５／日、または０．５０／日、０．５５／日、０．６０／日、０．６５／日、０．７０／日、０．７５／日、０．８０／日、０．８５／日、０．９０／日、またはこれを超え得る。
【００５４】
本発明のこの態様によれば、細胞を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と、細胞生存率がゼロに低下する任意の時間まで接触させる。いくつかの実施形態では、細胞を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、または４〜５日間接触させる。
【００５５】
本発明のこの態様の方法は、出発細胞集団を１回の選択サイクルのみに供する工程を含み得る。例えば、出発細胞集団を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と、例えば１０日間接触させることができる。次いで、生存可能な細胞を単離して（例えば、バイオリアクターから取り出す）、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でのその増殖速度を計算する。特定の例では、１回の選択サイクルにより、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での増殖速度が少なくとも０．２５／日の細胞が得られる。
【００５６】
他の例では、細胞を複数回の選択サイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれを超える選択サイクル）に供することが望ましいかもしれない。例えば、方法から得た細胞が、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でも０．２５／日を実質的に超える増殖速度を有する場合、複数回の選択サイクルが適切であり得る。当業者は、１回よりもむしろ複数回の選択サイクルが適切であることを認識している。複数回の選択サイクルの使用を例示する非限定的な例は、以下である。第１に、出発細胞集団を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地と一定期間（例えば、４〜５日間）接触させる。次いで、生存可能な細胞を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く新鮮な培地と、例えば、さらに４〜５日間接触させる。次いで、生存可能な細胞を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く新鮮な培地と接触させるか得て、増殖速度について試験する。
【００５７】
特定の実施形態では、選択サイクルの間または選択サイクルのラウンドの間に「回復期」を含めることができる。回周期では、前のサイクルから得た細胞を、インスリンおよび／またはインスリン代替物を含む培地中で一定期間（例えば、１〜１０日間）インキュベートする。回復期後、細胞を増殖速度について試験するか、別の選択サイクルに供する。
【００５８】
「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地からの生存可能な細胞の取り出しおよび／またはインスリンおよび／またはインスリン代替物を含むか欠く新規の培地との培地の置換を意味する。例えば、細胞を、濾過または遠心分離によって単離することができる。「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、非生存可能な細胞からの生存可能な細胞の分離を含み得るが、非生存可能な細胞からの生存可能な細胞の分離は、本発明の方法の実施に不可欠ではない。
【００５９】
「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、培養容器（例えば、フラスコまたはバイオリアクター）からの細胞の取り出しおよび新規の培養容器または保存コンテナに細胞を入れることを含み得る。「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」はまた、培養容器からの細胞の一時的な取り出しおよび、例えば、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く新鮮な培地を含む同一の培養容器に細胞を戻すことを含み得る。
【００６０】
特定の例では、「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、単純に、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地を、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く新鮮な培地またはインスリンおよび／またはインスリン代替物を含む新鮮な培地と置換することを含む。あるいは、「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を得ること」は、インスリンおよび／またはインスリン代替物を培養培地に添加することを含み得る。このような場合、細胞は元の培養容器から物理的に決して取り出されないにもかかわらず、本発明の目的のために、培地の置換またはインスリンおよび／もしくはインスリン代替物の培地への添加は、「インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得ること」と見なされる。
【００６１】
本発明のこの態様によって得た細胞は、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができるにもかかわらず、特定の実施形態では、インスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中での増殖特性と比較して、（ａ）インスリン、（ｂ）１つまたは複数のインスリン代替物、（ｃ）バナジン酸塩、および（ｄ）その組み合わせを補足した培地では改良された増殖特性を示す（実施例２）。
【００６２】
出発哺乳動物細胞集団は、２つまたはそれを超える哺乳動物細胞の任意の集団である。本発明の方法で使用することができる哺乳動物細胞型を、本明細書中で考察している。出発集団内の各細胞は、同一または実質的に同一の表現型特性および／または遺伝子型特性を有し得る。あるいは、出発集団内の各細胞は、互いに異なる表現型特性および／または遺伝子型特性を有し得る（すなわち、出発細胞集団は、混合細胞集団であり得る）。
【００６３】
出発細胞集団は、本明細書中に記載の任意の方法によって得た細胞であり得る。例えば、本発明のこの態様で使用される出発細胞集団は、出発細胞集団を７０％未満の出発細胞集団が生存可能なままの選択条件に供する工程と、選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の細胞を単離する工程と、選択サイクルから得た細胞が、出発細胞集団の対応するＩＣＡを少なくとも２５％大きいＩＣＡを示すこととを含む、１回または複数回の選択サイクルに供した細胞であり得る。本発明のこの目的のための出発細胞集団としてのこのような方法によって得た細胞の使用により、増殖特性が強化され（より速い増殖および／またはより高い細胞密度を達成する能力）、インスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中で増殖する能力を有する細胞を得ることができる（実施例２を参照のこと）。
【００６４】
本発明の特定の実施形態によれば、出発細胞集団は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含み得る。外因性核酸分子から発現することができる例示的ポリペプチドを、本明細書中で考察している。外因性核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にあり得る。
【００６５】
（インスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中で増殖特性が強化され、そして／または増殖能力を有する細胞）
本発明はまた、インスリンおよびインスリン代替物を欠く培地中で増殖特性が強化され、そして／または増殖能力を有する哺乳動物細胞を含む。
【００６６】
例えば、本発明は、単離ＣＨＯ細胞およびＤＧ４４  ＣＨＯ細胞を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応するＩＣＡを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％大きいＩＣＡを示す１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞を含む。特定の実施形態では、本発明のこの態様の単離ＣＨＯ細胞は、血清ならびに／またはインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる。
【００６７】
本発明はまた、インスリンまたはインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートした場合に、インスリンまたはインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートしたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞の対応するＩＣＡを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％大きいＩＣＡを示す１つまたは複数の単離ＣＨＯ細胞を含む。特定の実施形態では、本発明のこの態様の単離ＣＨＯ細胞は、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖することができる。
【００６８】
ＩＣＡを決定し、一方の細胞集団のＩＣＡを別の細胞集団の対応するＩＣＡと比較する方法を、本明細書中に記載する。
【００６９】
本発明はまた、インスリンまたはインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中でインキュベートした場合に、少なくとも０．２５／日、０．３０／日、０．３５／日、０．４０／日、０．４５／日、または０．５０／日、０．５５／日、０．６０／日、０．６５／日、０．７０／日、０．７５／日、０．８０／日、０．８５／日、０．９０／日、またはこれを超える増殖速度を示す１つまたは複数の単離細胞を含む。
【００７０】
本発明のこの態様の単離細胞は、本発明の１つまたは複数の方法の実施によって得られた細胞であり得る。例えば、本発明は、増殖特性が強化された１つまたは複数の哺乳動物細胞であって、細胞が、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含む方法によって得られ、各選択サイクルが、（ａ）（ｉ）出発細胞集団、または（ｉｉ）工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、７０％未満の前記出発細胞集団が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｂ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程と、１回または複数回の選択サイクルから得た細胞が、１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示すこととを含む、１つまたは複数の哺乳動物細胞を含む。
【００７１】
本発明はまた、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力を有する１つまたは複数の哺乳動物細胞であって、細胞を、１回または複数回の選択サイクルを実施する工程を含む方法によって得て、各選択サイクルが、（ａ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での増殖速度が０．２０／日未満の出発細胞集団、または工程（ｂ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培養培地と接触させる工程と、（ｂ）インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程と、インスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中での１回または複数回の選択サイクルから得た細胞の増殖速度が、少なくとも０．２５／日であることとを含む、哺乳動物細胞を含む。
【００７２】
本発明のこの態様の単離細胞は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含み得る。外因性核酸分子から発現することができる例示的ポリペプチドを、本明細書中で考察している。外因性核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にあり得る。
【００７３】
（哺乳動物細胞）
本発明の哺乳動物細胞（本発明の方法で使用されるか得られる哺乳動物細胞が含まれる）は、培養で増殖することができる任意の哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例には、例えば、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４が含まれる）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓ；Ｃｏｓ−７が含まれる）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｃ１２７、骨髄腫細胞株（マウスが含まれる）、ＰＣ１２、ＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ−２９３ＴおよびＨＥＫ−２９３Ｅが含まれる）、ＰＥＲ  Ｃ６、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、およびＷ１３８細胞が含まれる。任意の上記細胞由来の哺乳動物細胞を使用することもできる。本発明の哺乳動物細胞は、接着細胞または懸濁液中で増殖することができる細胞であり得る。本発明の哺乳動物細胞は、１つまたは複数の所望の表現型を付与する１つまたは複数の変異（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ｄｈｆｒ））を含み得る。本発明の哺乳動物細胞は、一定の条件下で増殖するように適応した細胞（例えば、血清を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力および／またはインスリンおよびインスリン代替物を欠くかまたは実質的に欠く培地中で増殖する能力など）であり得る。
【００７４】
（本発明の細胞から発現したポリペプチド）
本発明の特定の実施形態は、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の外因性核酸分子を含む細胞および／または細胞の産生方法を含む。「外因性核酸分子」は、細胞に導入された核酸分子または細胞の祖先に導入された核酸分子である。
【００７５】
外因性核酸分子を、ベクター内に含めることができる。ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス、およびファージ核酸、または哺乳動物細胞中で自律複製可能な他の核酸分子が含まれる。典型的な発現ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および外因性核酸分子の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターはまた、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方でベクターを複製可能な配列（すなわち、シャトルベクター）、ならびに真核生物および原核生物の両方の選択マーカーを含む遺伝子発現カセットも含み得る。ベクターは、好ましくは、アンピシリンまたはネオマイシンなどの抗生物質に対する耐性の付与などの形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するマーカーを含む。
【００７６】
外因性核酸分子は、１つまたは複数のプロモーターの調節下にあり得る。例えば、外因性核酸分子は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にあり得る。例示的プルモーターには、ヒトサイトメガロウイルス、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、マウス乳腺腫ウイルスプロモーター、ラウス肉種ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞中での発現に有効であることが示されている他のプロモーターが含まれる。
【００７７】
外因性核酸分子によってコードすることができるポリペプチドには、薬学的価値、医学的価値、栄養学的価値、および／または産業的価値のあるポリペプチドが含まれる。本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１）、可溶性受容体分子（例えば、可溶性ＴＮＦ受容体分子）、神経伝達物質またはその前駆体、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、およびＮＴ５など）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩおよびＡｐｏＡＩＶなど）、ジストロフィンまたはミニジストロフィン、腫瘍抑制タンパク質（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、およびｋ−ｒｅｖなど）、凝固に関与する因子（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子など）、ニューブラスチン、または天然または人工の免疫グロブリンの全部または一部（例えば、ＦａｂおよびＳｃＦｖ、またはクローン化ＩｇＧの軽鎖または重鎖）をコードすることができる。
【００７８】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、Ｆｌｔ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、エリスロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｎ）、トロンボポイエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子のリガンド（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連するアポトーシス−誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＯＲＫ／Ｔｅｋ、胸腺間質由来リンホポイエチン（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、肥満細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、増殖ホルモン、インスリン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ）、神経増殖因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子、白血病抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、細胞表面分子ＥｌｋおよびＨｅｋの種々のリガンド（ｅｐｈ関連キナーゼのリガンド（すなわち、ＬＥＲＫＳ）など）、および抗体の軽鎖または重鎖をコードすることもできる。
【００７９】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、任意の上記ポリペプチドの受容体（両腫瘍壊死因子受容体型（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、インターロイキン−１受容体（１型および２型）、インターロイキン−４受容体、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病抑制因子の受容体、ＮＦ−κＢの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）、ＴＲＡＩＬの受容体、ＢＡＦＦ受容体、リンホトキシンβ受容体、ＴＧＦβ受容体Ｉ型およびＩＩ型、ならびにデスドメインを含む受容体（Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）など）が含まれる）をコードすることもできる。
【００８０】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、表面抗原分類中の抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）のポリペプチド（例えば、白血球分類ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＩｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．；Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）に開示のポリペプチドまたはその後のワークショップで開示のＣＤ分子）をコードすることもできる。このような分子の例には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそのリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、およびＣＤ４０リガンド）が含まれる。これらのいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー（４１ＢＢおよびＯＸ４０も含まれる）である。リガンドは、しばしば、ＴＮＦファミリーのメンバー（４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンド）である。
【００８１】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパクＡ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）、および多数の他の酵素をコードすることもできる。
【００８２】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、例えば、免疫グロブリン分子またはその一部およびキメラ抗体（例えば、マウス抗原結合領域にカップリングするヒト定常領域を有する抗体）またはそのフラグメントをコードすることもできる。免疫グロブリン分子をコードするＤＮＡを操作して単鎖抗体、親和性が強化された抗体、または他の抗体ベースのポリペプチドなどの組換えタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる種々の技術が公知である（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４−９３８（１９８９）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４（１９８７）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３９４−３９７（１９８９）を参照のこと）。クローン化ヒト化抗体には、リンホトキシンβ受容体およびインテグリン（ＶＬＡ−１およびＶＬＡ−４）に特異的に結合するものが含まれる。このような抗体は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００８３】
本発明の特定の実施形態の細胞内で見出される外因性核酸分子は、融合タンパク質をコードすることもできる。例示的融合タンパク質には、例えば、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現するタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されるタンパク質、ならびにサイトカインと増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３、ＭＧＦとＩＬ−３）との融合タンパク質などの新規の多機能性タンパク質が含まれる。ＷＯ９３／０８２０７号およびＷＯ９６／４０９１８号は、ＣＤ４０Ｌと呼ばれる分子の種々の可溶性オリゴマー形態（それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質およびジッパー融合タンパク質が含まれる）の調製を記載しており、これらで考察されている技術は、他のタンパク質に適用可能である。
【００８４】
本発明の細胞がポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む実施形態では、ポリペプチドを、いくつかの例では、当該分野で標準的な技術を使用して、細胞から単離および／または精製することができる。例えば、外因性核酸分子が精製タグを含む融合タンパク質をコードする場合、タグに特異的に結合する抗体または他の化合物を使用して、ポリペプチドを精製することができる。例えば、タグ分子をコードするオリゴヌクレオチドを、ポリペプチドをコードする外因性核酸分子の５’末端または３’末端にライゲーションすることができる。核酸分子は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）または他の「タグ」（ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）または市販の抗体またはタグに特異的に結合する他の化合物が公知であるｍｙｃなど）をコードすることができる。このタグは、典型的には、ポリペプチド発現の際にポリペプチドと融合し、宿主細胞からの所望のポリペプチドの親和性精製のための手段としての機能を果たし得る。親和性精製を、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を使用したカラムクロマトグラフィによって行うことができる。任意選択的に、次いで、タグを、タンパク質分解性切断などの種々の手段によって精製ポリペプチドから除去することができる。
【００８５】
（ポリペプチドの産生方法）
本発明はまた、１つまたは複数のポリペプチドの産生方法を含む。本発明のこの態様によれば、任意のポリペプチド（本明細書中に記載のポリペプチドが含まれる）を産生することができる。本発明のこの態様の方法は、（ａ）１回または複数回の選択サイクルを含む第１の選択ラウンドを実施する工程と、各選択サイクルが、（ｉ）（Ａ）出発哺乳動物細胞集団、または（Ｂ）工程（ｉｉ）で得た１つまたは複数の細胞のいずれかを、出発細胞集団の７０％未満が生存可能なままの選択条件に供する工程と、（ｉｉ）選択条件下で生存可能なままの１つまたは複数の哺乳動物細胞を得る工程とを含むことと、（ｂ）１回または複数回の選択サイクルから得た細胞にポリペプチドをコードする核酸分子を導入する工程と、（ｃ）（ｂ）で得た細胞を、ポリペプチドが核酸分子から発現される条件下で培養する工程とを含む。１回または複数回の選択サイクルから得た細胞は、好ましくは、１回または複数回の選択サイクルから得た細胞および出発細胞集団を実質的に同一の培養条件下で増殖させた場合に、出発細胞集団の対応するＩＣＡよりも少なくとも２５％大きいＩＣＡを示す。
【００８６】
細胞に核酸分子を導入する方法は、当業者に周知であり、例えば、感染、形質導入、エレクトロポレーション、トランスフェクション、および形質転換が含まれる。当業者はまた、ポリペプチドが核酸分子から発現されるように細胞を培養するために使用することができる条件型を認識している。多数の例では、ポリペプチドが核酸分子から発現される条件は、適切な培地中での核酸分子を含む細胞の簡潔な培養を含む。培養で細胞が増殖して数が増えるにつれてポリペプチドを産生する。これは、核酸分子が構成性プロモーターの調節下にある場合にあてはまる。核酸分子が誘導性プロモーターの調節下にある場合、ポリペプチドが発現される条件は、例えば、誘導性刺激の存在下での細胞の培養を含む。核酸分子は、特定の物質が細胞周囲の培地中に存在する場合に発現を阻害する遺伝子調節エレメントの調節下にあり得る。このような場合、ポリペプチドが発現される条件は、核酸分子からの発現を抑制する物質の非存在下での細胞の培養を含み得る。
【００８７】
本発明の方法は、さらに、ポリペプチドを細胞から放出させるための処理を含み得る。産生されたポリペプチドが細胞から放出されるような細胞の処理方法は、当該分野で周知であり、例えば、細胞の化学的破壊および細胞の物理的破壊（例えば、煮沸、凍結、粉砕が含まれる）ならびに細胞の化学的破壊と物理的破壊の組み合わせが含まれる。このような方法は、細胞からのタンパク質抽出物の産生を含む。
【００８８】
一旦細胞から放出されると、核酸分子からコードされたポリペプチドを、周知の技術を使用して精製することができる。ポリペプチドは、タグとタグを特異的に認識して結合する固定化合物との接触によってポリペプチドの精製を容易にするタグを含み得る。
【００８９】
本明細書中に記載の方法および適用の他の適切な修正および適応が明らかであり、本発明およびその任意の実施形態の範囲を逸脱することなく実施することができることが関連分野の当業者に容易に明らかである。ここに本発明を詳述しているが、本発明は、以下の実施例を参照してより明確に理解され、以下の実施例は、例示のみを目的として含まれ、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００９０】
（実施例１）
（バイオリアクターにおいてより高いピーク細胞密度およびＩＣＡが可能な進化型ＤＧ４４宿主細胞株（ＤＧ４４（Ｅ））の生成）
（序論）
宿主細胞から得られた産物の量を増加させる１つの方法は、宿主細胞のＩＣＡを増加させることである。増殖速度の増加、最大細胞密度の増加、または死滅期の遅延によってこれを行うことができる。培地、栄養素（ｆｅｅｄ）、および生理化学的パラメーターの至適化によってある程度までＩＣＡを増加させることができる。しかし、遺伝子選択アプローチの使用により、ＩＣＡをさらにより増加させることができる。
【００９１】
本実施例では、増殖特性が強化された細胞株を同定することを目的としてバイオリアクター過程の最終段階で見出された細胞死誘因に耐性を示す細胞を選択するアプローチを記載する。細胞は、流加培養バイオリアクター過程において増殖を停止し、死滅し始めることが見出された。生存率減少について考えられる原因には、栄養制限、代謝廃棄物の蓄積、および浸透圧または酸化還元電位の変化が含まれる。本実施例は、細胞をバイオリアクターの「有毒」環境に曝露して増殖特性が強化された細胞を選択する不偏の選択アプローチを示す。
【００９２】
無血清培地に適応したＤＧ４４  ＣＨＯ細胞株（「ＳＦ  ＤＧ４４」）から開始して、典型的な流加培養バイオリアクター運転の後期で見出される環境で生存することができる細胞を選択する過程を使用して、新規の宿主を誘導した。この新規の宿主を得るために、細胞をバイオリアクターに接種し、流加培養過程を使用して増殖させ、生存率が５０％未満に低下した後に回収し、回復させ、これを使用して次のラウンドに接種する、４回の反復バイオリアクター運転を行った。この過程から、異なる表現型を有する細胞が得られた。ＤＧ４４（Ｅ）と呼ばれるこの新規の細胞株は、元のＳＦ  ＤＧ４４宿主と比較した場合、より高いピーク細胞密度および積分細胞面積（ＩＣＡ）の８２％増加が可能であった。トランスフェクション効率および分泌能力について試験した場合、ＤＧ４４（Ｅ）は、元の無血清適応宿主に匹敵することが見出された。
【００９３】
（材料および方法）
（Ａ．細胞）
ＤＧ４４細胞株は、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５５５−５６６（１９８６）に記載されており、業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入することができる。本実施例で使用した細胞株は、無血清培地に適応したＤＧ４４誘導体（「ＳＦ  ＤＧ４４」）である。
【００９４】
（Ｂ．培地）
選択プロトコールで２つの培地を使用した。継代およびスケールアップには培地１を使用した。バイオリアクターにおける基礎培地として培地２を使用した。以下の表に示す日数にバイオリアクターに栄養素を添加した。
【００９５】
【表１Ａ】
2008520250.tif 000002
（Ｃ．選択プロトコール）
無血清培地に適応したＤＧ４４細胞株（ＳＦ  ＤＧ４４）を使用して、バイオリアクターを運転した。生存率が５０％未満に低下した時点から開始して、細胞を毎日滅菌的に回収した。増殖することができた最終日由来のサンプルを拡大し、これを使用して、次のバイオリアクターに接種した。ＩＣＡおよび増殖速度をモニタリングした。４ラウンドの完了後、ＤＧ４４（Ｅ）細胞の増殖特性を、元の無血清培地に適応したＤＧ４４細胞株と比較した。標準バイオリアクター操作パラメーターを以下に示す。
【００９６】
【表１Ｂ】
2008520250.tif 000003
（Ｄ．一過性トランスフェクションおよびＦＡＣＳ分析）
無添加ｐＵＣ１９（コントロール）、ｐＸ１０（試験タンパク質発現）、およびｐＥ−ＧＦＰ−Ｃ１（ＧＦＰ発現）を、それぞれ１μｇ／μＬ、１．８μｇ／μＬ、および２μｇ／μＬの濃度で、１×Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨｅＢＳ：２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース）中に無菌的に再懸濁した。プラスミドを、種々の濃度（以下を参照のこと）で、最終体積が８００μＬの１×ＨｅＢＳ中に混合した。
【００９７】
【表１Ｃ】
2008520250.tif 000004
遠心分離後、２×１０６個の細胞を、８００μＬのＤＮＡ／１×ＨｅＢＳ混合物に再懸濁し、Ｂｉｏｒａｄ０．４ｃｍギャップエレクトロポレーションキュベットに移した。Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒで使用した設定は、０．２８Ｋｖおよび９５０μＦｄ（容量拡張器（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）が必要である）であった。パルスした細胞を、キュベット中で１０分間静置し、その後に、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ番号ＳＨ３００７０．０３）を補足した１０ｍＬのα＋ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ番号１１９００−０２４）中でスピンした。各トランスフェクション物を、３ｍＬのα＋ＭＥＭ＋１０％血清を含む１０ｃｍの皿にプレートした。３日後、ＨＰＬＣ（試験タンパク質発現）によるアッセイのために上清を採取し、ＦＡＣＳ分析（ＧＦＰ発現）のために細胞を採取した。
【００９８】
（Ｅ．アッセイ）
一過性トランスフェクション実験由来の７２時間の馴化培地サンプルの分析のためにＨＰＬＣプロテインＡアッセイを使用した。
【００９９】
（Ｆ．計算）
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒによって総細胞密度を決定し、トリパンブルー排除および血球計による計数によって生存率を決定した。生存可能な細胞の密度、増殖速度、および積分細胞面積（ＩＣＡ）を、以下の式を使用して決定した。
【０１００】
生存可能な細胞／ｍＬ＝（総細胞／ｍＬ）（生存率％／１００）
増殖速度＝ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）／日数
ＩＣＡ＝日数×［（最終細胞密度−初期細胞密度）／ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）］。
【０１０１】
（結果および考察）
（Ａ．選択プロトコール）
無血清培地に適応したＤＧ４４宿主（「通常」とも呼ばれる）から開始して、反復バイオリアクター運転を行った。各ラウンドは、ピーク細胞密度の増加およびそれによるＩＣＡの増加を示した。４ラウンドのバイオリアクター選択後、ＤＧ４４（Ｅ）宿主は、２．７×１０６のピーク細胞密度および１．４×１０７の１０日ＩＣＡを達成した。出発細胞株は、１．３×１０６のピーク細胞密度および７．８×１０６の１０日ＩＣＡを達成した。これは、出発細胞株のピーク細胞密度の１０７％増加およびＩＣＡの８２％増加を示す（図１）。「進化型」細胞の生存率は、このプロセスを通して元の細胞に匹敵した（データ示さず）。
【０１０２】
【表１】
2008520250.tif 000005
（Ｂ．一過性トランスフェクションおよびＦＡＣＳ分析）
各選択運転後、進化型細胞は小さくなるようであった（血球計での観察による）。剪断耐性がより高いので、より小さい細胞がバイオリアクター中でより良好に整列されたのかもしれない。「進化型」細胞がその元の対応物よりもサイズが小さいことに留意していたので、分泌能力に注目した。しかし、一過性トランスフェクション実験の力価の結果から、ＤＧ４４（Ｅ）細胞株とＤＧ４４  ＳＦ宿主との間に分泌能力の相違は認められなかった（表Ｉ）。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で一過性にトランスフェクションした細胞についてのＦＡＣＳスキャンも、ＤＧ４４（Ｅ）細胞株と出発宿主細胞株との間に相違は認められなかった（表ＩＩ）。
【０１０３】
【表２】
2008520250.tif 000006
（実施例２）
（インスリン非依存性ＤＧ４４  ＣＨＯ宿主細胞株（ＤＧ４４−Ｉ）の生成）
（序論）
インスリンは、無血清ＣＨＯ培地処方物において最も一般的に使用されている増殖因子である。これは、これらの処方物で最も高価な培地成分でもあり、流加培養過程における培地／栄養素費用の５０％を超え得る。
【０１０４】
ＤＧ４４−Ｉと呼ばれる新規の宿主細胞は、無血清培地に適応したＤＧ４４（Ｅ）ＣＨＯ宿主細胞株に由来していた（実施例１を参照のこと）。ＤＧ４４−Ｉは、インスリンの非存在下で増殖することができる。この適応を、無インスリン培地を使用した４回の継代で達成した。新規の宿主の無インスリン培地中での増殖速度は、約０．６５／日である。ＤＧ４４−Ｉ宿主を、首尾よくトランスフェクションした。ＤＧ４４−Ｉ宿主は、インスリンへの曝露によって穏やかに増殖速度が増加するという点で、依然としてインスリンに応答する。
【０１０５】
（材料および方法）
（Ａ．細胞および培地）
ＤＧ４４細胞株は、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５５５−５６６（１９８６）に記載されており、業者（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入することができる。ＤＧ４４（Ｅ）細胞株を、実施例１に記載の方法によって得た。ＤＧ４４（Ｅ）細胞を、ヌクレオシドを補足した培地中で、１×１０５ｖｃ／ｍＬに日常的に継代することができる。ＤＧ４４−Ｉ宿主を、インスリンを含むか含まない同一の培地中で継代することができる。
【０１０６】
（Ｂ．バナジン酸塩）
正確に調製した場合、オルトバナジン酸ナトリウムは無色透明である。この溶液がわずかに橙黄色に変化した場合、これは、バナジン酸多価陰イオンの存在を示し、最適ではない。多価陰イオンの形成を回避するために、大きなｐＨの変化を回避すべきである。Ｋａｄｏｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８２５２−８２５６（１９８７）に記載の方法を以下に示す。ＨＣｌでｐＨ６．８に調整した重炭酸塩／ＨＥＰＥＳ緩衝液（１１８．５ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２４．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を調製した。この緩衝液にオルソバナジン酸ナトリウムを５ｍＭの濃度まで添加した。この時にｐＨはいくらか上昇した。次いで、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整し、溶液を濾過滅菌した。
【０１０７】
（Ｃ．選択プロトコール）
ＤＧ４４−Ｉ宿主は、インスリンを含まない無血清培地中での連続継代によってＤＧ４４（Ｅ）宿主に由来した。第１継代では、培地効果およびＰＢＳ洗浄によってインスリンを除去した。次の３継代のために、細胞を、３〜４日毎に完全な培地交換に供した。４継代後、細胞の増殖速度は、０．６／日を超え、３〜４日毎に１×１０５〜２×１０５生存可能細胞／ｍＬに分割することによって継代した。全部で８回の継代後、細胞を使用して、１６個のバイアルの小バンク（ｓｍａｌｌ  ｂａｎｋ）を生成した。
【０１０８】
（Ｄ．増殖速度）
以下の式を使用して、増殖速度を決定した。
【０１０９】
増殖速度＝ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）／日数。
【０１１０】
（結果および考察）
ＤＧ４４−Ｉ宿主を生成するために使用したアプローチは、１回の工程でインスリンを除去することであった。このアプローチの理論的根拠は、いくつかのトランスフェクタントがインスリン非依存性を示す以前の研究に基づいた。ＤＧ４４（Ｅ）宿主の実質的画分がインスリン非依存性である場合、句「コールドターキー（ｃｏｌｄ  ｔｕｒｋｅｙ）」アプローチは、ここで同様に作用し得る。５継代未満で０．６／日の増殖速度を達成したという事実は、この概念を支持する。
【０１１１】
（Ａ．選択）
第１の継代でインスリン非依存性増殖の多重経路（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｓ）が開始された。これらのうちの２つを、８回継代し、凍結した。系列Ｃは、最初に１．１×１０５ｖｃ／ｍＬで播種し、系列Ｅは、最初に３×１０５ｖｃ／ｍＬで播種した。第１の継代後、これらの２つの系列を、類似の様式で継代した。
【０１１２】
系列Ｃの生存率は、この８回の継代中に９０％未満に低下することは決してなかった。系列Ｅの生存率は、第１の継代後に７８％であり、第２の継代後に８９％であり、その後の全ての継代後に９０％を超えた。これらの結果により、ＤＧ４４（Ｅ）宿主がインスリンにあまり依存しないことが示唆される。
【０１１３】
両系列は、第１の継代で、増殖速度がわずかに低下した（図２）。その後の継代の間に、増殖速度は、インスリンを含む培地中のＤＧ４４（Ｅ）宿主に匹敵するレベルに増加した。第４の継代後、増殖速度は、０．６／日と０．７５／日との間に安定した。この増殖速度が宿主に十分であえるので、第８の継代後に細胞を使用して小バンクを生成した。
【０１１４】
（Ｂ．インスリンおよびバナジン酸塩に対する応答）
ＤＧ４４−Ｉ宿主がインスリンの非存在下で増殖することができるにもかかわらず、依然としてインスリンに応答性を示す。宿主はバナジン酸塩（Ｖ２Ｏ５）にも応答し、この物質は、動物および細胞培養物におけるインスリンの「増強」剤として作用することができるリン酸アナログである（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３：３９−４７（１９９５））。系列ＣおよびＥの両方由来の細胞を、０．５ｍｇ／Ｌレコムブリン亜鉛、０．５ｍｇ／Ｌ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎインスリン、５μＭバナジン酸塩のいずれかを含むか添加しない、ヌクレオシドを含み、且つインスリンを含まない無血清婆値に播種した（図３）。いずれの場合にも、インスリンまたはバナジン酸塩の添加により、最初の３日間の増殖速度は増加した。これらの培養を７日間実施した場合、明確な相違は認められなかった（データ示さず）。この増殖速度（「ターボブースト（ｔｕｒｂｏ  ｂｏｏｓｔ）」）は、いくつかの適用で有用であり得る。この効果が１継代を超えて持続するかどうかはわからない。
【０１１５】
（Ｃ．トランスフェクション）
多数のトランスフェクションのためにＤＧ４４−Ｉ宿主（系列Ｅ）を使用した。これらのトランスフェクションでは、スクリーニングした細胞株のトランスフェクション効率おび生産性のいずれにおいても顕著な相違は認められなかった。
【０１１６】
（実施例３）
（試験タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株のＩＣＡおよび処理量を増加させるための「バイオリアクター進化（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」の適用）
（序論）
試験タンパク質（ＣＨＯ／試験）を発現する新規のＣＨＯ細胞株を、「バイオリアクター進化」過程を使用して誘導した。バイオリアクター進化は、バイオリアクター過程の後期で見出される環境を生存することができる細胞を選択する過程である（実施例１を参照のこと）。この新規の細胞株を得るために、細胞をバイオリアクターに接種し、標準的なバイオリアクター条件下で増殖させ、生存率が４０％未満に低下した後に回収し、回復させ、これを使用して次のラウンドに接種する、反復バイオリアクター運転を行った。この方法から、新規の表現型を有する細胞株を得た。ＣＨＯ／試験（Ｅ）と呼ばれるこの新規の細胞株は、ＣＨＯ／試験細胞株と比較した場合、より高いピーク細胞密度、積分細胞面積（ＩＣＡ）の２９％増加、および処理量の３４％増加が可能であった（表ＩＶ）。産物の質を試験した場合、ＣＨＯ／試験（Ｅ）は、ＣＨＯ／試験細胞株に匹敵することが見出された。
【０１１７】
（材料および方法）
（Ａ．細胞）
ＣＨＯ／試験細胞株は、試験タンパク質を発現する導入遺伝子を含むＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１由来細胞株である。
【０１１８】
（Ｂ．培地）
選択プロトコールで２つの培地を使用した。継代およびスケールアップには培地３を使用した。バイオリアクターにおける基礎培地として培地４を使用した。以下の表に示す日数にバイオリアクターに栄養素を添加した。
【０１１９】
【表２Ａ】
2008520250.tif 000007
（Ｃ．選択プロトコール）
ＣＨＯ／試験細胞株を使用して、バイオリアクターを運転した。生存率が４０％未満に低下した時点から開始して、細胞を毎日滅菌的に回収した。増殖することができた最終日由来のサンプルを拡大し、これを使用して、次のバイオリアクターに接種した。ＩＣＡ、増殖速度、および比産生速度をモニタリングした。３ラウンドの完了後、ＣＨＯ／試験（Ｅ）細胞は、ＣＨＯ／試験コントロール細胞を逆転した。使用したバイオリアクターパラメーターを以下に示す。
【０１２０】
【表２Ｂ】
2008520250.tif 000008
（Ｄ．アッセイ）
総試験タンパク質力価の決定のために、ＨＰＬＣプロテインＡアッセイを使用した。ＨＰＬＣプロテインＡアッセイを使用して、凝集率および単量体力価を決定した。等電点電気泳動および炭水化物プロフィールによって、産物の質を評価した。
【０１２１】
（Ｅ．計算）
Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒによって総細胞密度を決定し、トリパンブルー排除および血球計による計数によって生存率を決定した。生存可能な細胞の密度、増殖速度、比産生速度およびＩＣＡを、以下の式を使用して決定した。
【０１２２】
生存可能な細胞／ｍＬ＝（総細胞／ｍＬ）（生存率％／１００）
増殖速度＝ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）／日数
ＩＣＡ＝日数×［（最終細胞密度−初期細胞密度）／ｌｎ（最終細胞密度／初期細胞密度）］
バイオリアクターの処理量＝（ｍｇ／Ｌ）（バイオリアクター過程の日数および応答時間）。
【０１２３】
（結果および考察）
（Ａ．選択プロトコール）
ＣＨＯ／試験細胞株から開始して、反復バイオリアクター運転を行った。各ラウンドは、ピーク細胞密度の増加およびそれによるＩＣＡの増加を示した（図４）。３ラウンドのバイオリアクター選択後、ＣＨＯ／試験との直接比較において、ＣＨＯ／試験（Ｅ）細胞株は、７．７×１０６ｖｃ／ｍＬのピーク細胞密度および２．６×１０７細胞／ｍＬ／日の７日ＩＣＡを達成した（図５）。これは、ＣＨＯ／試験細胞株コントロールと比較して、ピーク細胞密度の３８％増加、ＩＣＡの２９％増加および処理量の３４％増加を示す（表ＩＩＩ）。
【０１２４】
【表３】
2008520250.tif 000009
ＣＨＯ／試験（Ｅ）によって産生された試験タンパク質産物の質を試験した場合、ＣＨＯ／試験コントロールの質に匹敵することが見出された（表ＩＶ〜ＩＸ）。
【０１２５】
【表４】
2008520250.tif 000010
【０１２６】
【表５】
2008520250.tif 000011
【０１２７】
【表６】
2008520250.tif 000012
【０１２８】
【表７】
2008520250.tif 000013
【０１２９】
【表８】
2008520250.tif 000014
【０１３０】
【表９】
2008520250.tif 000015
（考察）
本実施例は、既にトランスフェクションされた細胞株を取り、発現したタンパク質の産物の質を損ねることなくバイオリアクター過程の処理量を増加させることが可能であることを証明する。培地の開発または他の過程の変更が好ましくない場合のバイオリアクターの進化は、ＩＣＡおよび処理量の増加への別のアプローチであり得る。「バイオリアクターの進化」の選択性により、生成されたＣＨＯ／試験（Ｅ）集団が均一な集団ではないであろう。「進化」後のサブクローニングは、進化により達成された処理量よりもさらに高い処理量を得ることが可能な細胞株の取り出しに有用であり得る。
【０１３１】
より明確な理解を目的として例示および実施例によってここに本発明をいくらか詳細に記載しているが、本発明およびその任意の特定の実施形態の範囲に影響を与えることなく、広範囲および等価な範囲の条件、処方物、および他のパラメーター内で本発明を修正または変更することによって本発明を実施することができ、このような修正形態または変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることが当業者に明らかである。
【０１３２】
本明細書中に記載の全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明に関連する当業者のレベルを示し、各刊行物、特許、または特許出願が本明細書中で参考として援用されるために具体的且つ個別に示されているのと同程度に本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は、流加培養過程における時間の関数として、コントロール細胞株（ＳＦ  ＤＧ４４＝「通常」）の生存可能な細胞の密度およびバイオリアクター進化過程から得た細胞株（ＤＧ４４（Ｅ）＝「進化型」）の生存可能な細胞の密度を示すグラフである。「通常」細胞の１０日ＩＣＡは、７．８４×１０６である。「進化型」細胞の１０日ＩＣＡは、１．４３×１０７である。「進化型」細胞は、「通常」細胞と比較して、ピーク細胞密度が１０７％増加し、ＩＣＡが８２％増加した。
【図２】図２は、インスリンを含むか含まない培地中での連続継代後のＤＧ４４（Ｅ）細胞の増殖速度を示す棒グラフである。２つのＤＧ４４−Ｉ系列（Ｃ系列およびＥ系列）について、インスリン除去時点から７継代を示す。Ｉシリーズは、５ｍｇ／ｍＬレコムブリン亜鉛（ｒｅｃｏｍｂｕｌｉｎ  Ｚｎ）を含む培地中で継代した同一の宿主である。
【図３】図３は、ＤＧ４４−Ｉ細胞（Ｃ系列およびＥ系列）の増殖速度に対するインスリン（レコムブリンＺｎまたはＩｎｔｅｒｇｅｎインスリン）およびバナジン酸塩の効果を示す棒グラフである。増殖速度は、継代開始時にインスリンまたはバナジン酸塩を添加した３日継代物に基づいた。コントロールは、インスリンまたはバナジン酸塩を含まない。
【図４】図４は、時間の関数として、３回の反復バイオリアクター運転（ラウンド１、２、および３）から得たＣＨＯ／試験細胞株の誘導体の生存可能な細胞の密度（ｖｃ／ｍＬ）を示すグラフである。各運転由来の２つのサンプル（ＡおよびＢ）を試験した。
【図５】図５は、回分培養過程における時間の関数として、ＣＨＯ／試験出発細胞株の生存可能な細胞の密度（ｖｃ／ｍＬ）をＣＨＯ／試験（Ｅ）細胞株（バイオリアクター進化過程から得た）の生存可能な細胞の密度と比較したグラフである。
【図１】
2008520250.tif 000016
【図２】
2008520250.tif 000017
【図３】
2008520250.tif 000018
【図４】
2008520250.tif 000019
【図５】
2008520250.tif 000020
【国際調査報告】
2008520250.tif 000021
2008520250.tif 000022
2008520250.tif 000023
2008520250.tif 000024
2008520250.tif 000025