(57)【要約】  本発明は、一般構造式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）のホスホノ桂皮酸化合物のリン原子を特異的にフッ化するための方法に関するものであり、式中、Ｘは酸素原子又は硫黄原子から選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、アルキル基、アリール基、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ2、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）2の中から選択され、Ｒ7は、Ｈ、アルキル基、アリール基、シリル基の中から選択され、Ｒ8は、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、ＴＢＤＰＳはｔ−ブチルジフェニルシリル基を表しており、前記方法において、第三アミンとフッ化水素との間で形成された錯体を含むフッ化剤と前記化合物とを反応させる。本発明は、かくして調製された新規なフッ化化合物、ならびにかかるフッ化化合物を含む治療用組成物にまで及ぶ。2008515788.tif 0000252008515788.tif 000026
2008515788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  Ｘが、酸素原子又は硫黄原子から選択され、
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が、Ｈ、アルキル基、アリール基、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ2、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）2の中から選択され、
−  Ｒ7が、Ｈ、アルキル基、アリール基、シリル基の中から選択され、
−  Ｒ8が、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、
前記アルキル基及びアリール基がおよそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有している、
【化１】
2008515788.tif 000017
という一般構造式のフルオロホスホノ桂皮酸化合物の合成方法であり、
この化合物は、
−  Ｘが、酸素原子又は硫黄原子から選択され、
−  Ｒ’が、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリール基、Ｓ−アミン基、Ｓ−アミド基、ＮＨ−アルキル基、ＮＨ−アリール基、Ｎ−（アルキル）2基、Ｎ−（アリール）2基の中から選択され、
−  Ｒ7’が、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、
前記アルキル基及びアリール基が、およそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有している、
【化２】
2008515788.tif 000018
という一般構造式のホスホノ桂皮酸化合物、又は、
ＴＢＤＰＳが、ｔ−ブチルジフェニルシリル基を表す、
【化３】
2008515788.tif 000019
という一般構造式のホスホノ桂皮酸化合物をフッ化したものであり、
当該フッ化が、−２０℃〜８５℃の間に含まれる温度でホスホノ桂皮酸化合物を、Ｒ3Ｎで表される第三アミンとフッ化水素との間で形成された錯体を含む少なくとも一つのフッ化剤と反応させることによって実施され、前記第三アミンがおよそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を含むアルキル基により置換されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第三アミンがトリエチルアミンＥｔ3Ｎであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フッ化剤として、Ｒ3Ｎ・ＨＦと表される約１：１の第三アミン／フッ化水素のモル比をもつ錯体を用いることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
構造式（ＩＩ）のホスホノ桂皮酸化合物が溶解可能である溶媒の中で液相反応を実施することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフランの中から選択される溶媒を用いることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
およそ１．２〜２０のモル比で、構造式（ＩＩ）のホスホノ桂皮酸化合物とフッ化剤との間の反応を実施することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
一般構造式（ＩＩ）のホスホノ桂皮酸化合物のＲ8基が、−ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ3、−ＮＨＣＨ2Ｐｈの脱離基から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
一般構造式（ＩＩ）の出発化合物であるホスホノ桂皮酸化合物において、
−  Ｒが、−Ｈ又は−ＣＨ3から選択される基を表し、
−  Ｒ1及びＲ2が、−Ｈ又は−ＯＣＨ3から選択される基を表すこと
を特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
−  Ｘが、酸素原子又は硫黄原子から選択され、
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6が、Ｈ、アルキル基、アリール基、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ2、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）2の中から選択され、
−  Ｒ7が、Ｈ、アルキル基、アリール基、シリル基の中から選択され、
−  Ｒ8が、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、
前記アルキル基及びアリール基が１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有する、
【化４】
2008515788.tif 000020
という一般構造式のフルオロホスホノ桂皮酸化合物。
【請求項１０】
【化５】
2008515788.tif 000021
という構造式の（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチルであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
【化６】
2008515788.tif 000022
という構造式の（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチルであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
【化７】
2008515788.tif 000023
という構造式の（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチルであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
【化８】
2008515788.tif 000024
という構造式の（Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチルであることを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一つに記載の化合物を少なくとも一つ含むことを特徴とする、治療用組成物。
【請求項１５】
酸化的ストレスにより引き起こされる生理的障害の治療のための請求項１４に記載の治療用組成物。
【請求項１６】
アテローム性動脈硬化症の治療のための請求項１４又は１５に記載の治療用組成物。
【請求項１７】
アテローム性動脈硬化症の治療的処置を目的とする薬剤の調製のための、請求項９〜１３のいずれか一つに記載の化合物の利用方法。
【請求項１８】
請求項９〜１３のいずれか一つに記載の少なくとも一つの化合物とＬＤＬを接触させる、インビトロでのＬＤＬの酸化の保護方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機フルオロリン酸化合物の調製方法に関する。本発明は、より厳密には、有機リン酸化合物のフッ化の新規な方法ならびにフルオロホスホノ桂皮酸化合物の合成に関する。それ自体新規のものであるこれらのフルオロホスホノ桂皮酸化合物は、特にその抗酸化活性により、特に医療及び／又は美容の分野で際立った産業的利点を有する。
【０００２】
現在、Ｒ1及びＲ2がアルキル、アリール、アルキル（ａｌｃｏｙｌｅ）、アミド、アニリドなどといったきわめて多様なラジカルを表し得る、
【化１】
2008515788.tif 000003
という構造式により一般化することができる、数多くの有機フルオロ（チオ）リン酸エステルが知られている。
【０００３】
これらのエステルは、アセチルコリンエステラーゼに対し特に有効である、酵素的なアシル化反応の阻害物質として一般に記載されている。さらに、その殺菌力及び抗真菌力から、これらのエステルは、殺虫及び／又は消毒用組成物の開発において従来用いられている。
【０００４】
Ｃｈｗｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４０：９３３７−９３４０）は、Ｒ1及びＲ2がフェニル、メトキシ、エトキシ及び／又はテルブチルメトキシ型のラジカルを表している特定の有機フルオロリン酸エステルの調製を記載している。
【０００５】
これらの化合物の調製は、ホスフィノ（チオ）セレノアート型化合物、ホスフィノ（チオ）クロリド型化合物又はそのホスホノ類似体もしくはホスホロ類似体とフッ化銀（ＡｇＦ）との間の反応から成る。その反応は溶液中（好ましくはトリクロロメタン又はメチルニトリル中）で実施され、常温で行うことができる。目的の生成物は、暗灰色の不溶性沈殿物の形で得られる。これは、ジクロロメタン中で混合物を希釈し、続いてブラインで洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥した後、回収される。
【０００６】
Ｃｈｗｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９により記載されたフッ化方法は、実施が容易かつ迅速であるものの、二つの主要な欠点を有する。第一の欠点は、用いれる試薬、つまり特に高価な試薬であるフッ化銀にある。もう一つの欠点は、この方法によると、唯一フルオロリン酸型の化合物が得られるが、フルオロチオリン酸型の化合物の獲得が不可能であるという点にある。実際、チオホスホン酸型の化合物から出発する場合であっても、フッ化銀によるフッ化はチオホスホン酸基からホスホン酸基への変換も伴い、最終的にはフルオロリン酸化合物が形成されることになる。
【０００７】
米国特許第２９６２５１７号明細書は、有機フルオロリン酸エステル及び有機フルオロチオリン酸エステル、特に、Ｒがアルキル型のラジカルを表す、
【化２】
2008515788.tif 000004
という一般構造式を満たす化合物の、別の調製方法を記載している。
【０００８】
このために、無水アルコール及びベンゼン、トルエン又はクロロベンゼン型の溶媒の存在下で、β−アルコキシメルカプトビニルホスホン酸ジクロリド又はβ−アルキル（ａｌｃｏｙｌ）メルカプトビニルホスホン酸ジクロリドとアルカリフッ化物との間で反応が実施される。アルカリフッ化物（特にフッ化ナトリウム）は、好ましくは無水物であり、かつ細かく分割された状態になくてはならない。反応温度は約６０〜９０℃である。
【０００９】
問題の方法は、ベンゼン、トルエン又はクロロベンゼン、すなわちとりわけ揮発性が高く、引火性で発癌性を有し、かつ特に吸入及び皮膚接触によって有毒である溶媒の取扱いを必要とするばかりでなく、反応媒質を加熱すること、ひいてはその危険性が常温でも明確に指摘されているこれらの物質を加熱することが定められている。
【特許文献１】米国特許第２９６２５１７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような背景において、方法を実施する通常の条件下で、健康に対する重大な危険性又は何らかの取扱い危険性のあるいかなる物質の使用もその実施に必要としない、有機チオリン酸化合物を含む有機リン酸化合物を対応するフルオロ（チオ）リン酸化合物へとフッ化するための方法を提案することを目的としている。
【００１１】
特に、本発明は、実施が簡単かつ迅速である方法に従って、特定の有機（チオ）リン酸化合物、すなわちこの場合は現在までフッ化の試みがほとんどさらには全く考慮されてこなかった（チオ）ホスホノ桂皮酸化合物のフッ化を可能にすることを目的としている。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、きわめて有利な産業上の利用性を有し、かつフッ化されていない対応する又は類似の化合物に比べて著しく改善された潜在的能力をもつ、このように合成された新規の化合物を提案できるようにすることにある。
【００１３】
以下の本文では、文脈に従って、「リン酸」、「ホスホリル」、「ホスホニル」などといった用語は、リン原子が二重結合で酸素原子に結合したリン酸基を表すための特定の形で用いられるか、又はより一般的な形で、前記リン原子が二重結合で酸素原子にではなく硫黄原子に結合できる可能性をも同様に含むように用いられる（換言すると、「リン酸」、「ホスホリル」、「ホスホニル」などは同様にかつ場合によってはそれぞれ「チオリン酸」、「チオホスホリル」、「チオホスホニル」としても理解され得る）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、
【化３】
2008515788.tif 000005
という一般構造式のフルオロホスホノ桂皮酸化合物に関するものであり、式中、
−  Ｘは、酸素原子又は硫黄原子から選択され、
−  Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ、アルキル基、アリール基、ＯＨ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ2、ＮＨ−アルキル、Ｎ−（アルキル）2の中から選択され、
−  Ｒ7は、Ｈ、アルキル基、アリール基、シリル基の中から選択され、
−  Ｒ8は、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、
前記アルキル基及びアリール基はおよそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有する。
【００１５】
本発明に従うと、一般構造式（Ｉ）のこれらのフルオロホスホノ桂皮酸化合物は、
【化４】
2008515788.tif 000006
という一般構造式のホスホノ桂皮酸化合物のフッ化により得ることができ、式中、
−  Ｘは、酸素原子又は硫黄原子から選択され、
−  Ｒ’は、Ｓ−アルキル基、Ｓ−アリール基、Ｓ−アミン基、Ｓ−アミド基、ＮＨ−アルキル基、ＮＨ−アリール基、ＮＨ−ベンジル基、Ｎ−（アルキル）2基、Ｎ−（アリール）2基の中から選択され、
−  Ｒ7’は、Ｈ、アルキル基、アリール基の中から選択され、
前記アルキル基及びアリール基は、およそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有する。
【００１６】
同様に、本発明に従った一般構造式（Ｉ）のこれらのフルオロホスホノ桂皮酸化合物は
【化５】
2008515788.tif 000007
という一般構造式を満たす、一般構造式（ＩＩ）の化合物の類似体であるホスホノ桂皮酸化合物のフッ化によっても得ることができ、式中、ＴＢＤＰＳは、ｔ−ブチルジフェニルシリル基を表す。
【００１７】
本発明に従った方法において出発物質として使用可能である一般構造式（ＩＩ）及び（ＩＩ’）の（フッ化されていない）ホスホノ桂皮酸化合物は、技術現状で既知である。その調製の例は、特にＫｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９（Ｊ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，  １４：２１７−２３７）及びＬａｐｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４４：２４４５−２４４７）といったような刊行物で見ることができる。
【００１８】
本発明に従うと、一般構造式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）を満たすホスホノ桂皮酸化合物を特にリン原子上でフッ化させるためには、−２０℃と８５℃の間に含まれる温度、そして有利には常温で、Ｒ3Ｎと表される第三アミンとフッ化水素（ＨＦ）との間で形成された錯体を含むフッ化剤と、このホスホノ桂皮酸化合物とを反応させる。ここで前記第三アミン（Ｒ3Ｎ）は、およそ１〜６個の直鎖状に結合した炭素原子を有するアルキル基によって置換されている。
【００１９】
かくして、本発明は、第三アミンとフッ化水素との間で形成された錯体が、リン原子上で特異的にホスホノ桂皮酸化合物をフッ化するための優れた作用物質を構成するという事実に基づいている。
【００２０】
第三アミンとの錯体の形でのフッ化水素は、適切な脱離基をフッ素原子で置換することを可能にするものとしてすでに知られている（ＭｃＣｌｉｎｔｏｎ，  １９９５，  Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，  ２８（２）：３１−３５）。なお、これらの錯体の反応性ひいてはフッ化力がそれらの求核性に依存することは充分に立証済みである。この求核性は主に、一般に約１：１、１：２又は１：３であり得る第三アミンとフッ化水素との間のモル比に依存する。このとき、それぞれ前述したモル比に対応するＲ3Ｎ・ＨＦ、Ｒ3Ｎ・２ＨＦ及びＲ3Ｎ・３ＨＦと表される三つのタイプの錯体が区別される。これらの異なる錯体の求核性は、Ｒ3Ｎ・２ＨＦ＞Ｒ3Ｎ・３ＨＦ＞Ｒ3Ｎ・ＨＦという順である。
【００２１】
しかしながら、今日までは、かかる錯体が介在する置換は、必ず炭素原子により担持されていると考えられる脱離基のみに関するものであった。リン原子の部分で有機（チオ）リン酸化合物をフッ化するためには、結果として不都合をもたらす米国特許第２９６２５１７号明細書又はＣｈｗｏｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４０：  ９３３７−９３４０）により記載されたもののような方法が優先的にさらには排他的に用いられていた。
【００２２】
本発明に従った方法は、一般構造式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）の有機リン酸化合物のリン原子を特異的に、しかも単一の段階で、優れた収量でかつ完全な選択性を伴って、単純な方法でフッ化することを可能にする。このように合成されたフルオロホスホノ桂皮酸化合物を回収するためには、単純な従来の精製段階で充分である。
【００２３】
その上、本発明に従った方法は、容易に入手でき（すなわち、すでに市販で入手可能でありしかも価格が適正であるか、又はそれらの合成方法が文献中ですでに記載されているため）、本発明に従った方法の通常の実施条件においてその危険性がわずかである出発物質及び試薬を用いて実施可能であるという利点を有する。特に、本発明に従ったフッ化反応は有利にも、常温又はそれよりはるかに低い温度で実施可能である。
【００２４】
本発明に従った第三アミンとしては、一例として、トリメチルアミン（Ｍｅ3Ｎ）、トリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、さらにはトリペンチルアミンを挙げることができる。好ましくはトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）を用いる。
【００２５】
有利には、かつ本発明に従うと、フッ化剤として、Ｒ3Ｎ・ＨＦ、特にＥｔ3Ｎ・ＨＦ型の錯体、すなわち約１：１の第三アミン／フッ化水素のモル比をもつ錯体を用いる。
【００２６】
本発明者らは同様に、Ｒ3Ｎ・２ＨＦ又はＲ3Ｎ・３ＨＦ型の錯体に比べて著しく低い求核性をもつＲ3Ｎ・ＨＦ錯体（特に本発明に従った第三アミンがトリエチルアミンのもの）が、それでもなお顕著な反応性を示すということを確認した。
【００２７】
好ましくは液相で反応が行なわれる。このとき、有機化合物を溶解させることのできる溶媒、例えばジクロロメタン、アセトニトリルさらにはテトラヒドロフランを用いることが可能である。
【００２８】
有利には、かつ本発明に従うと、過剰なフッ化剤で反応が実施される。特に、構造式（ＩＩ）の出発化合物とフッ化剤との間で約１．２〜２０というモル比を用いる。好ましくは、このモル比は少なくともおよそ５である。
【００２９】
有利には、かつ本発明に従うと、一般構造式（ＩＩ）の出発化合物であるホスホノ桂皮酸化合物のＲ8基は、−ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ3、−ＮＨＣＨ2Ｐｈ（Ｐｈはフェニルラジカルを表す）という脱離基から選択される。
【００３０】
有利には、かつ本発明に従うと、出発化合物の一般構造式（ＩＩ）において、
−  Ｒ7’は、−Ｈ又は−ＣＨ3から選択された基を表し、
−  Ｒ1及びＲ4は、−Ｈ又は−ＯＣＨ3から選択された基を表す。
【００３１】
例えば、一般構造式（ＩＩ）を満たす出発化合物であるホスホノ桂皮酸化合物として、刊行物Ｌａｐｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４４：  ２４４５−２４４７）においてその調製手順が記載されているホスホノ桂皮酸チオエステル又はその類似体化合物を用いて本発明を実施することができる。この実施例では、脱離基はＳ−アミン型のもの、特にＮ−アセチルシステアミン（−ＳＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ3）である。
【００３２】
非常に類似した要領で、一般構造式（ＩＩ’）のホスホン酸クロリド化合物を用いて、特に前掲のＬａｐｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３の方法でホスホノ桂皮酸チオエステルの合成反応の中間生成物として記載されているものに基づいて、本発明に従った一般構造式（Ｉ）のフルオロホスホノ桂皮酸化合物の合成を実施することもできる。
【００３３】
一般構造式（ＩＩ）を満たす他の出発化合物として、刊行物Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（Ｊ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，  １４：  ２１７−２３７）において調製手順が記載されているエチル−２−Ｎ−ベンジル−２−（３，４−ジメトキシフェニル）エテンホスホンアミド又は類似体化合物又は等価物を挙げることもできる。この実施例では、脱離基は第二アミン型のもの、特に−ＮＨＣＨ2Ｐｈである。
【００３４】
本発明は同様に、新規な生成物としての一般構造式（Ｉ）のフルオロホスホノ桂皮酸化合物にも関する。
【００３５】
桂皮酸型の多くの化合物、特に構造式（ＩＩ）又は（ＩＩ’）のフッ化していないホスホノ桂皮酸化合物に従って、本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物は、酸化的ストレスによって引き起こされる生理的障害の治療的又は美容的処置の枠内で特に有利な抗酸化活性を示す。実際、本発明者の研究作業により、ＬＤＬの酸化に対する本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物の保護効果が、有利にも、対応するフッ化していない化合物で見られるものにかなり匹敵するものであることを示すことができた。しかしながら、これらのフッ化していない化合物とは異なり、本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物は、驚くべきことに４−ＨＮＥに関連する毒性に対する保護効果も示し、しかもそれはそのフッ素原子によるものである可能性がきわめて高い。
【００３６】
４−ＨＮＥの毒性に対するその細胞保護効果に加え、酸化に対するそのＬＤＬ保護効果により、本発明に従った化合物は、アテローム性動脈硬化症及びその心臓血管又は神経血管の合併症の治療において主たる応用利点を示す。
【００３７】
アテローム性動脈硬化症は、その他の遺伝的又は栄養的因子と並んで脂質が重要な役割を果たしている多因子病変である。プラークの発生及び成長に関与する代謝因子の中で、（血中コレステロールを末梢組織に向かって輸送する）ＬＤＬは、血管壁内での酸化修飾の後アテローム形成性となる。ＬＤＬで誘発された酸化は、それ自体ＬＤＬを酸化することのできるアルデヒド（特に４−ＨＮＥ）の形成をｉｎ  ｓｉｔｕで引き起こす。酸化ＬＤＬは、脂肪線条に蓄積することがアテローム性動脈硬化症の初期病変の原因となる泡沫細胞の形成において主要な役割を果たす。これらの酸化ＬＤＬは、同様に、より進行した病期へのプラークの成長、さらには心臓血管の傷害の原因である破裂及び血栓症の現象の進行に関与している可能性のある、前炎症性、細胞増殖性、凝血促進性及びプロアポトーシスの特性も示す。
【００３８】
従って、ＬＤＬの酸化過程を遮断する能力をもつ分子は、プラークの成長を阻害するためにきわめて有効である。この背景において、本発明はここで、新規なＬＤＬ酸化経路遮断剤を提供するのだが、その効力は、この経路の少なくとも二つの異なるレベル（ＬＤＬに対する直接的作用と４−ＨＮＥを介した作用）で働くというなおさら傑出したものである。
【００３９】
従って、本発明は同様に、特にそのＬＤＬ酸化経路の遮断効果のため、本発明に従った少なくとも一つのフルオロホスホノ桂皮酸化合物を含むことを特徴とする美容用又は治療用組成物にも及んでいる。
【００４０】
有利には、かつ本発明に従うと、酸化的ストレスによって引き起こされる生理的障害、特にアテローム性動脈硬化症及びその心臓血管又は神経血管の合併症の治療を目的とした治療用組成物を目的としている。本発明は同様に、アテローム性動脈硬化症の治療的処置を目的とした薬剤の調製のための、本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物の利用にも及んでいる。
【００４１】
本発明は同様に、本発明に従った少なくとも一つのフルオロホスホノ桂皮酸化合物とＬＤＬを接触させる、酸化に対するＬＤＬのインビトロでの保護方法にも関する。
【００４２】
有利には、かつ本発明に従うと、本発明に従った化合物として特に次のものを挙げることができる。
【化６】
2008515788.tif 000008
という構造式の、（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル、
【化７】
2008515788.tif 000009
という構造式の、（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル、
【化８】
2008515788.tif 000010
という構造式の、（Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル、
【化９】
2008515788.tif 000011
という構造式の、（Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル。
【００４３】
本発明は同様に、以上又は以下に記されている特徴の全て又は一部を組み合わせて特徴とするフルオロホスホノ桂皮酸化合物の調製方法、フルオロホスホノ桂皮酸化合物、治療用組成物、ならびに酸化からＬＤＬを保護するための方法にも関する。
【００４４】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、一方では本発明に従った特定のフルオロホスホノ桂皮酸化合物（５〜８で表される構造式のもの）の合成、又他方ではこれらの化合物の生物学的なアテローム形成防止効果の研究について言及する、以下に詳述する説明を読むことにより明らかになる。実験結果は特に以下の添付の図面を参照している。
−図１Ａ、図１Ｂ及び図２は、本発明に従った特定の化合物の全体的な抗酸化効果、ならびに酸化的ストレスに付された細胞の保護についてのその効果の統計的な棒グラフである。
−図３及び図４は、本発明に従った特定の化合物の培地内濃度に応じた、酸化ＬＤＬ又は４−ＨＮＥの存在下での細胞の生存の推移を示す。
【実施例】
【００４５】
化学合成と分析
・  合成
１）  第一の実施様式によると、本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物の合成は、構造式（ＩＩ）の出発化合物を用いて実施することができる。このとき、反応方程式の概要は以下である。
【化１０】
2008515788.tif 000012
【００４６】
脱離基Ｒ’がＮ−アセチルシステアミン基である、１〜４で表されるホスホン酸チオエステルは、刊行物Ｌａｐｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ４４：  ２４４５−２４４７）において記載されている方法に従って予め合成することができる。
【００４７】
脱離基Ｒ’が第二アミンである４’で表されるホスホン酸アミドは、刊行物Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９（Ｊ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，  １４：  ２１７−２３７）において記載された方法に従って予め合成することができる。
【００４８】
Ａｖｏｃａｄｏ社のトリエチルアミン（純度９９％）及びＡｌｄｒｉｃｈ社のＥｔ３Ｎ・３ＨＦ錯体（純度９８％）を、Ｅｔ３Ｎ・ＨＦ錯体の生成に用いる。
【００４９】
無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（純度９９．７％）及び分取ＨＰＬＣ用の酢酸エチル（純度９９．８％）は、フランスのＳＤＳ社により提供される。
【００５０】
２）  第２の実施様式によると、一般構造式（ＩＩ’）のホスホン酸クロリドから本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物の合成を実施することができる。この場合、反応方程式の概要は以下である。
【化１１】
2008515788.tif 000013
【００５１】
これらのホスホン酸クロリド化合物Ａ〜Ｃは、Ｌａｐｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３ではホスホン酸チオエステル１〜４の合成の中間生成物であるものとして記載されている。本発明の枠内では、本発明に従った方法の実施における出発物質として用いられるこれらのホスホン酸クロリドＡ〜Ｃは、以下で記載される方法に従って、対応するホスホン酸ジエステルから予め量的に得ることができる。
【００５２】
窒素気流下に置いた、９．７ｍＬのジクロロメタン中に溶解したシリル化したホスホン酸ジエステル溶液（１．９ｍｍｏｌ）に、常温で、蒸留したばかりの塩化オキサリル（８．６ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２０時間常温で攪拌する。減圧下で、ジクロロメタン及び過剰な塩化オキサリルを除去する。わずかに残った塩化オキサリルを取り除くため、数ミリリットルのジクロロメタンを添加し、これを次に蒸発させる。この作業を三回くり返す。反応の進捗は、31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：Ｄ2Ｏ、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）により追跡可能である。
【００５３】
【化１２】
2008515788.tif 000014
【００５４】
・  精製：
適切な溶離剤系を用いて、シリカ１５〜４０μｍ（ＭＥＲＣＫ  Ｆｒａｎｃｅ）が充てんされた直径２０又は４０ｍｍのカラムを有する軸方向圧縮式の装置ＪＯＢＩＮ−ＹＶＯＮで、シリカゲル上での中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）により、生成物全体を精製する。
【００５５】
・  分析：
シリカプレートＭＥＲＣＫ６０−Ｆ254を用いて、薄層クロマトグラフィーを実施する。
【００５６】
ＢＵＣＨＩ装置で融点を測定した。
【００５７】
ＩＲスペクトルを、ＦＴ−ＩＲ分光光度計１７２５Ｘ型のフーリエ変換式のパーキン−エルマー社の分光光度計で記録する。
【００５８】
四重極分光計ＮＥＲＭＡＧ  Ｒ１０−１０で、質量スペクトル（化学イオン化ＤＣＩ又は電子衝撃ＥＩ）を実施する。
【００５９】
紫外線スペクトルを、ＨＥＷＬＥＴＴ  ＰＡＣＫＡＲＤ  ８４５３計器で記録する。
【００６０】
ＮＭＲスペクトルを、次のＢＲＵＣＫＥＲ装置で記録する。
1Ｈ核については２５０ＭＨｚ、13Ｃ核については６２．５ＭＨｚで作動するＡＣ−２５０、
31Ｐ核については８１ＭＨｚ、19Ｆ核については１８８．５ＭＨｚで作動するＡＣ−２００。
【００６１】
化学シフト（δ）は、1Ｈ核及び13Ｃ核についての基準としてテトラメチルシランのシグナルを、31Ｐ核の基準としてリン酸のシグナルを、19Ｆ核の基準としてフッ化水素酸のシグナルを用い、ｐｐｍ単位で示す。結合定数Ｊはヘルツ単位で示され、シグナルの多重度は小文字で示される。すなわちｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｍ（多重項）。
【００６２】
・  出発物質としてホスホン酸チオエステルを用いる合成の実施例
【００６３】
１）  （Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル
【００６４】
ａ）  合成手順：
２５ｍＬの二口フラスコ内で、４ｍＬのＴＨＦ中に、シリル化したホスホン酸チオエステル１（０．６４ｍｍｏｌ）を窒素下で溶解させる。２．１ｍｍｏｌのトリエチルアミン、そしてその後１．１ｍｍｏｌのＥｔ3Ｎ・３ＨＦ錯体を、マイクロシリンジで添加する。かくして得られた溶液を２時間２０℃で攪拌する。反応粗製物を減圧下で濃縮し、かくして得られた化合物５をＭＰＬＣ（溶離剤ＡｃＯＥｔ）によって精製する。
【００６５】
ｂ）  解析
外観：白色固体。
収率：６４％。
Ｒf：０．６７（ＡｃＯＥｔ）。
Ｐf：９２〜９３℃。
ＩＲ：（ＫＢｒ錠剤、ＣＨＣｌ3）ν（３２４２ｃｍ-1、Ｏ−Ｈ）、ν（３００６ｃｍ-1、アルケンのＣ−Ｈ）、ν（１６１７ｃｍ-1、芳香環のＣ＝Ｃ）、ν（１５９８、１５１６ｃｍ-1、芳香環のＣ＝Ｃ）、ν（１２７１ｃｍ-1、Ｐ＝Ｏ）、ν（１１６２ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）、δ（９８２ｃｍ-1、トランス型Ｃ＝Ｃ）、δ（８８１、８００ｃｍ-1、芳香環）、δ（７５６ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｒ）。
質量：ＭＳ（ＣＩ  ＮＨ3、ＭＮＨ4+）２７８。
ＵＶ：（Ｎａ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ｐＨ６．２５）λ＝３１３ｎｍ、ε＝１８４００ｍｏｌ-1・Ｌ・ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、２５０ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１．３８（ｔ、３Ｈ、3ＪH-H＝７．１Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、３．８７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3Ｏ）、４．２７（ｑｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝3Ｊp-O-CH＝７．１Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、６．０４（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、2ＪP-CH＝１９．６Ｈｚ、Ｃ＝ＣＨ−Ｐ）、６．９２（ｍ、４Ｈ、ＯＨ＋Ｈ6＋Ｈ2＋Ｈ5）、７．５１（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、3ＪP-CH=CH＝２４．７Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、６２．５ＭＨｚ、δｐｐｍ）
１７．３８（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、５６．９８（ｓ、１Ｃ、ＣＨ3Ｏ）、６４．５８（ｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、１０６．８１（ｄｄ、１Ｃ、1ＪC-P＝２０７．３Ｈｚ、2ＪC-F＝３２．４Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１１０．６０（ｓ、１Ｃ、Ｃ6）、１１６．０９（ｓ、１Ｃ、Ｃ5）、１２４．１６（ｓ、１Ｃ、Ｃ2）、１２７．４５（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝２６．２Ｈｚ、Ｃ1）、１４８．２６（ｓ、１Ｃ、Ｃ4）、１５０．０８（ｓ、１Ｃ、Ｃ3）、１５２．８５（ｄｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝７．９Ｈｚ、3ＪC-F＝３．９Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）。
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１９．７９（ｄ、3ＪP-F＝１０２３Ｈｚ、Ｐ−Ｆ）。
19Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、１８８．３ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１１．７５（ｄ、3ＪF-P＝１０２３Ｈｚ、Ｆ−Ｐ）。
元素分析（理論値／実験値）：
炭素（５０．７８／５０．９３）
水素（５．４２／５．３６）
【００６６】
２）  （Ｅ）−２−（４−ヒドロキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル
【００６７】
ａ）  合成手順：
２５ｍＬの二口フラスコ内で、４ｍＬのＴＨＦの中にホスホン酸チオエステル２（０．６４ｍｍｏｌ）を窒素下で溶解させる。２．１ｍｍｏｌのトリエチルアミン、そしてその後１．１ｍｍｏｌのＥｔ3Ｎ・３ＨＦ錯体を、マイクロシリンジで添加する。かくして得られた溶液を３時間２０℃で攪拌する。反応粗製物を減圧下で濃縮し、かくして得られた化合物６をＭＰＬＣ（溶離剤ＡｃＯＥｔ）によって精製する。
【００６８】
ｂ）  解析
外観：透明な油。
収率：６６％。
Ｒf：０．６４（ＡｃＯＥｔ）。
ＩＲ：（ＫＢｒ錠剤、ＣＨＣｌ3）ν（３２３３ｃｍ-1、Ｏ−Ｈ）、ν（３０２０ｃｍ-1、アルケンのＣ−Ｈ）、ν（１６０４ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１５８５、１５１５ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１２３０ｃｍ-1、Ｐ＝Ｏ）、ν（１１７０ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）、δ（９８４ｃｍ-1、トランス型Ｃ＝Ｃ）、δ（８４３ｃｍ-1、芳香環）、δ（７５７ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）。
質量：ＭＳ（ＣＩ  ＮＨ3、ＭＮＨ4+）２４８。
ＵＶ：（Ｎａ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ｐＨ６．２５）λ＝２８５ｎｍ、ε＝２１２００ｍｏｌ-1・Ｌ・ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、２５０ＭＨｚ、δｐｐｍ）
１．４１（ｔ、３Ｈ、3ＪH-H＝７．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、４．３０（ｑｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝3ＪP-O-CH＝７．０Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、６．０３（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、2ＪP-CH＝２０．４Ｈｚ、Ｃ＝ＣＨ−Ｐ）、６．９２（ｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝８．７Ｈｚ、Ｈ2＋Ｈ6）、７．３７（ｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝８．７Ｈｚ、Ｈ3＋Ｈ5）、７．５４（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、3ＪP-CH=CH＝２５．０Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）、８．５４（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、６２．５ＭＨｚ、δｐｐｍ）
１７．４１（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、６５．００（ｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝６．２Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、１０５．５０（ｄｄ、１Ｃ、1ＪC-P＝２０８．４Ｈｚ、2ＪC-F＝３１．５Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１１７．２９（ｓ、２Ｃ、Ｃ2＋Ｃ6）、１２６．８８（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝２５．７Ｈｚ、Ｃ1）、１３１．２８（ｓ、２Ｃ、Ｃ3＋Ｃ5）、１５３．３３（ｄｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝７．８Ｈｚ、3ＪC-F＝４．７Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１６１．１２（ｓ、１Ｃ、Ｃ4）。
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）
２０．５３（ｄ、3ＪP-F＝１０２４Ｈｚ、Ｐ−Ｆ）。
19Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、１８８．３ＭＨｚ、δｐｐｍ）
１１．１７（ｄ、3ＪF-P＝１０２４Ｈｚ、Ｆ−Ｐ）。
【００６９】
３）  （Ｅ）−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル
【００７０】
ａ）  合成手順：
２５ｍＬの二口フラスコ内で、４ｍＬのＴＨＦ中にホスホン酸チオエステル３（０．６４ｍｍｏｌ）を窒素下で溶解させる。２．１ｍｍｏｌのトリエチルアミン、そしてその後１．１ｍｍｏｌのＥｔ3Ｎ・３ＨＦ錯体を、マイクロシリンジで添加する。かくして得られた溶液を３時間２０℃で攪拌する。反応粗製物を減圧下で濃縮し、かくして得られた化合物７をＭＰＬＣ（溶離剤ＡｃＯＥｔ）によって精製する。
【００７１】
ｂ）  解析
外観：白色固体。
収率：６８％。
Ｒf：０．５９（ＡｃＯＥｔ）。
Ｐf：１５３〜１５５℃。
ＩＲ：（ＫＢｒ錠剤、ＣＨＣｌ3）ν（３２５５ｃｍ-1、Ｏ−Ｈ）、ν（３０１９ｃｍ-1、アルケンのＣ−Ｈ）、ν（１６１８ｃｍ-1、芳香環のＣ＝Ｃ）、ν（１５９７、１５１３ｃｍ-1、芳香環のＣ＝Ｃ）、ν（１２５１ｃｍ-1、Ｐ＝Ｏ）、ν（１１５８ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）、δ（９７５ｃｍ-1、トランス型Ｃ＝Ｃ）、ν（７５２ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｒ）。
質量：ＭＳ（ＣＩ  ＮＨ3、ＭＮＨ4+）３０８。
ＵＶ：（Ｎａ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ｐＨ６．２５）λ＝３１０ｎｍ、ε＝１８０００ｍｏｌ-1・Ｌ・ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、２５０ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１．４０（ｔ、３Ｈ、3ＪH-H＝７．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、３．９０（ｓ、６Ｈ、ＣＨ3Ｏ）、４．２９（ｑｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝3ＪP-O-CH＝７．０Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、６．００（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、６．０８（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、2ＪP-CH＝１９．２Ｈｚ、Ｃ＝ＣＨ−Ｐ）、６．７３（ｄ、２Ｈ、Ｈ2＋Ｈ6）、７．５０（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、3ＪP-CH=CH＝２４．５Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、６２．５ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１７．４５（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、５７．４４（ｓ、２Ｃ、ＣＨ3Ｏ）、６４．５４（ｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、１０６．１２（ｓ、２Ｃ、Ｃ2＋Ｃ6）、１０７．８１（ｄｄ、１Ｃ、1ＪC-P＝２０７．０Ｈｚ、2ＪC-F＝３２．９Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１２６．６０（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝２６．２Ｈｚ、Ｃ1）、１３８．８８（ｓ、２Ｃ、Ｃ3＋Ｃ5）、１４８．３９（ｓ、１Ｃ、Ｃ4）、１５２．８２（ｄｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝７．９Ｈｚ、3ＪC-F＝４．２Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）。
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１９．４３（ｄ、3ＪP-F＝１０２３Ｈｚ、Ｐ−Ｆ）。
19Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、１８８．３ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１１．９０（ｄ、3ＪF-P＝１０２３Ｈｚ、Ｆ−Ｐ）。
元素分析（理論値／実験値）：
炭素（４９．６６／４９．６０）
水素（５．５３／５．３７）
【００７２】
４）  （Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル−ホスホン酸フルオリドエチル
【００７３】
ａ）  合成手順：
２５ｍＬの二口フラスコ内で、４ｍＬのＴＨＦの中にホスホン酸チオエステル４（０．６４ｍｍｏｌ）を窒素下で溶解させる。２．１ｍｍｏｌのトリエチルアミン、そしてその後１．１ｍｍｏｌのＥｔ3Ｎ・３ＨＦ錯体を、マイクロシリンジで添加する。かくして得られた溶液を２時間２０℃で攪拌する。反応粗製物を減圧下で濃縮し、かくして得られた化合物８をＭＰＬＣ（溶離剤ＡｃＯＥｔ）によって精製する。
【００７４】
ｂ）  解析
外観：透明な油。
収率：６９％。
Ｒf：０．５９（ＡｃＯＥｔ）。
ＩＲ：（ＫＢｒ錠剤、ＣＨＣｌ3）ν（３０１９ｃｍ-1、アルケンのＣ−Ｈ）、ν（２９３８ｃｍ-1、アルカンのＣ−Ｈ）、ν（１６１６ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１５８３、１５１４ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１２７０ｃｍ-1、Ｐ＝Ｏ）、ν（１１６０ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）、δ（９８１ｃｍ-1、トランス型Ｃ＝Ｃ）、δ（８８０、８５２ｃｍ-1、芳香環）、δ（７５７ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｒ）。
質量：ＭＳ（ＣＩ、ＭＨ+）２７５
ＵＶ：（Ｎａ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ｐＨ６．２５）λ＝３１２ｎｍ、ε＝２５００ｍｏｌ-1・Ｌ・ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、２５０ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１．４２（ｔ、３Ｈ、3ＪH-H＝７．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、３．９２（ｓ、６Ｈ、ＣＨ3Ｏ）、４．３０（ｑｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝3ＪP-O-CH＝７．０Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、６．０９（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝2ＪP-CH＝１８．４Ｈｚ、Ｃ＝ＣＨ−Ｐ）、６．８８（ｄ、１Ｈ、2ＪH-H＝８．２Ｈｚ、Ｈ6）、７．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ2）、７．１０（ｄ、１Ｈ、2ＪH-H＝８．２Ｈｚ、Ｈ5）、７．５６（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．４Ｈｚ、3ＪP-CH=CH＝２４．４Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、６２．５ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１６．３４（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、５５．９４、５６．０２（ｓ、２Ｃ、ＣＨ3Ｏ）、６３．３８（ｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝６．８Ｈｚ、ＣＨ2Ｏ）、１０６．８５（ｄｄ、１Ｃ、1ＪC-P＝２０６．９Ｈｚ、2ＪC-F＝３３．２Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１０９．５１（ｓ、１Ｃ、Ｃ6）、１１１．０３（ｓ、１Ｃ、Ｃ2）、１２２．７５（ｓ、１Ｃ、Ｃ5）、１４９．３４（ｓ、１Ｃ、Ｃ1）、１５１．３２（ｄｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝８．３Ｈｚ、3ＪC-F＝４．５Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１５１．７３（ｓ、２Ｃ、Ｃ4＋Ｃ3）。
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１９．４９（ｄ、3ＪP-F＝１０２４Ｈｚ、Ｐ−Ｆ）。
19Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、１８８．３ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１１．９２（ｄ、3ＪF-P＝１０２４Ｈｚ、Ｆ−Ｐ）。
【００７５】
ｃ）  所見
出発化合物としての化合物８のもう一つの合成方法に従うと、（Ｅ）−エチル−２−Ｎ−ベンジル−２（３，４−ジメトキシフェニル）エテンホスホン酸アミドを用いることもできる。
【００７６】
・  出発物質としてホスホン酸クロリドＣを用いる合成例：
ホスホン酸クロリドＣが調製されたら、これ（０．４２ｍｍｏｌ：１当量）を、蒸留したばかりの４ｍＬのＴＨＦ中に不活性雰囲気下で溶解させる。トリエチルアミン（１９７μＬ、１３９ｍｍｏｌ、３．３３当量）及びＥｔ3Ｎ・３ＨＦ錯体（１１２μＬ、０．６９ｍｍｏｌ、１．６７当量）を加える。反応媒質を３０分間磁気攪拌しながら常温で放置する。反応の進捗は、31Ｐ−ＮＭＲで追跡する。ＡｃＯＥｔを添加して反応を停止させる。得られた沈殿物をＢＵＣＨＮＥＲ上でろ過し、その後、ろ過物を加水分解させる。ＡｃＯＥｔで三回水相を抽出する。有機相を集め、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次に真空下で濃縮させる。
【００７７】
ｂ）  解析
外観：白色粉末。
収率：７７％。
Ｒf：０．２３（ＡｃＯＥｔ／ＥＰ  ４／６）。
Ｐf：６９〜７０℃。
ＩＲ：（ＫＢｒ錠剤、ＣＨＣｌ3）ν（３２３３ｃｍ-1、Ｏ−Ｈ）、ν（３０２０ｃｍ-1、アルケンのＣ−Ｈ）、ν（１６０４ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１５８５ｃｍ-1、Ｃ＝Ｃ）、ν（１２３０ｃｍ-1、Ｐ＝Ｏ）、ν（１１７０ｃｍ-1、Ｐ−Ｏ−Ｃ）、（９８５ｃｍ-1、トランス型Ｃ＝Ｃ）、ν（８４３ｃｍ-1、芳香環のＣ＝Ｃ）。
質量：ＭＳ（ＣＩ  ＮＨ3、ＭＮＨ4+）３０８。
ＵＶ：（Ｎａ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4、１００ｍＭ  ｐＨ６．２５）λ＝３１０ｎｍ、ε＝１８０００ｍｏｌ-1・Ｌ・ｃｍ-1。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、２５０ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１．３８（ｔ、３Ｈ、3ＪH-H＝７．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2）、３．８８（ｓ、６Ｈ、ＣＨ3Ｏ）、４．２７（ｑｄ、２Ｈ、3ＪH-H＝3ＪH-H＝７．０Ｈｚ、3ＪH-P＝７．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2Ｏ）、５．８１（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、６．０７（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、2ＪH-P＝１９．２Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）、６．７２（ｓ、２Ｈ、Ｈ2＋Ｈ6）、７．４９（ｄｄ、１Ｈ、3ＪH-H＝１７．５Ｈｚ、3ＪH-P＝２４．５Ｈｚ、ＣＨ＝ＣＨ−Ｐ）。
13Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、６２．５ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１６．３０（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2Ｏ）、５６．３５（ｓ、２Ｃ、ＣＨ3Ｏ）、６３．４１（ｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝６．０Ｈｚ、ＣＨ3ＣＨ2Ｏ）、１０５．１１（ｓ、２Ｃ、Ｃ2＋Ｃ6）、１０６．７５（ｄｄ、１Ｃ、1ＪC-P＝２０７．０Ｈｚ、2ＪC-F＝３３．０Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）、１２５．５０（ｄ、１Ｃ、3ＪC-P＝２５．５Ｈｚ、Ｃ1）、１３７．８６（ｓ、１Ｃ、Ｃ4）、１４７．３２（ｓ、２Ｃ、Ｃ3＋Ｃ5）、１５１．６２（ｄｄ、１Ｃ、2ＪC-P＝７．５Ｈｚ、3ＪC-F＝３．８Ｈｚ、Ｃ＝Ｃ−Ｐ）。
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、８１ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１９．５０（ｄ、1ＪP-F＝１０２３Ｈｚ、Ｐ−Ｆ）。
19Ｆ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3、１８８．３ＭＨｚ、δｐｐｍ）：
１１．８８（ｄ、1ＪF-P＝１０２３Ｈｚ、Ｆ−Ｐ）。
ＭＳ（ＩＣ、ＮＨ3）ｍ／ｚ：２４８（ＭＮＨ4+、１００％）、２９１（ＭＨ+、３８％）。元素分析（理論値／実験値）：
炭素（７０．１３／７０．００）
水素（７．６５／７．７１）
【００７８】
合成した化合物のアテローム形成防止効果
【００７９】
１）  ＬＤＬの酸化についての合成化合物のインビトロでの効果の研究
【００８０】
ＫＢｒ勾配での分離用超遠心分離により、健康な被験者に由来する血清プールから未変性ＬＤＬを精製する。その後、ＫＢｒを除去するために等張ＮａＣｌ緩衝液（９ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）中でＬＤＬを透析し、次に滅菌し（０．２ｎｍのフィルター）、使用するまで窒素下で保存する（最大２週間）。
【００８１】
培養状態のヒト内皮細胞（ＨＭＥＣ又はＥＣＶ３０４系統）をマルチウェルプレートの中で培養し、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を含有するＲＰＭＩ１４６０培地の中でサブコンフルエントにする。
【００８２】
１μＭのＣｕＳＯ4（酸化を開始させるため）及び１００μｇ／ｍＬの未変性ＬＤＬ、ならびに様々な濃度の異なる試験対象化合物（５〜８で表される）を含有するＲＰＭＩ１６４０（１ｍＬ／ウェル）で、標準培地を置き換える。６時間の接触後、培地の一部分を採取してＬＤＬ酸化のパラメータ（ＴＢＡＲＳ）を測定する。２４時間の接触後、酸化したＬＤＬ（場合によってはＣＰＳにより酸化から保護されているもの）と接触させた細胞の生残率を測定する（ＭＴＴ試験）。
【００８３】
ＬＤＬは、培養状態の血管細胞によって急速に酸化される。予備研究から、この酸化は重金属（例えば銅又は鉄）の存在ひいてはＣｕＳＯ4の添加を必要とすることが示された。酸化反応速度は、当初、内因性の抗酸化剤（ビタミンＥ）により減速し、２４時間以上続く（水平域）。ＬＤＬの酸化は６時間の接触の後に測定するが、それは、それがそのとき対数期にあり、場合によって抗酸化剤の保護的効果がさらに顕著であるためである。酸化は、酸化現象の包括的、定量的かつ高感度の評価を可能にするＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応物質）の定量によって測定する。
【００８４】
それぞれ５〜８で表される、予め合成された化合物をＤＭＳＯ中に溶解させ、０．１〜１００μＭで変動する濃度（ＤＭＳＯ中での最終濃度は０．０５％を超えない）で試験する。この研究で用いた濃度では、細胞においてこれらの化合物５〜８のいかなる自己中毒も見られなかった（結果は提示せず）。
【００８５】
図１Ａに示した結果は、化合物５〜８の各々についての抗酸化効果を示しているが、化合物５についての抗酸化効果ははるかに顕著であり、１μＭからＬＤＬの酸化の著しい保護がみられ、濃度がより高くなるにつれてより大きくなる。
【００８６】
図１Ａでは、結果は、対照（酸化ＬＤＬのみを用いる場合など、合成化合物を用いない試験）に対する百分率として表されている。６時間で細胞により酸化されたＬＤＬ中のＴＢＡＲＳの比率は、１ｍｇのａｐｏＢあたり６〜１０ｎｍｏｌのＴＢＡＲＳである。化合物５〜８は、０．１〜１００μＭで変動する濃度で添加される。示した結果は、二度ずつ実施した別個の三回の実験の平均に対応する。
【００８７】
酸化されたＬＤＬは、培養中の血管細胞にとって有毒である。この毒性効果は、細胞の生存能力を測定する比色試験ＭＴＴによって研究可能である。図１Ｂに示された結果は、酸化ＬＤＬのみ（化合物５〜８の不存在下）と２４時間接触させた細胞について１５〜２０％の生残率を示している。ＴＢＡＲＳに対する効果と相関して、化合物５は、用いる用量に応じて、細胞によって酸化されたＬＤＬの毒性を予測するためにきわめて有効であることが判明している。その他の化合物の効果は、より限られたものである。
【００８８】
化合物５は、血管細胞による酸化からＬＤＬを保護するために非常に有効であり、続発するそれらの毒性は限られたものである。この効果は、カテキン又はケルセチンといったようなポリフェノールで見られるものに匹敵し、１００μＭ以上の濃度での（細胞に対する）毒性の効果はより低いものである。
【００８９】
２）  酸化されたＬＤＬについての化合物５の細胞保護効果のインビトロでの研究
【００９０】
他のすべての合成化合物（６〜８）又は抗酸化剤の不存在下での、すでに酸化されたＬＤＬの毒性に対する化合物５の細胞保護効果について研究した。これらの酸化ＬＤＬは、内皮細胞にとって毒性である（ＭＴＴ試験により評価された毒性）。ＥＣＶ３０４細胞を、化合物５（濃度０．１〜１００μＭ）の不存在下（０）又は存在下で２４時間、ＵＶ照射（２００μｇ／ｍＬ）により酸化されたＬＤＬと共にインキュベートする。最後にＭＴＴ試験を実施する。結果は、（ＬＤＬ及び化合物５の不存在下でインキュベートされた）ネガティブコントロールに対する百分率として表す。示した結果は、二度ずつ実施した別個の三回の実験の平均に対応する。
【００９１】
図２に示した通り、この化合物５の増大する用量が、内皮細胞ＥＣＶ３０４内の酸化されたＬＤＬの毒性に対する効果的な保護をもたらし、このことはこの化合物５が抗酸化及び細胞保護の両方の効果を同時に有することを示唆している。
【００９２】
３）  化合物５及び１（フッ化された基のない化合物５と同じ構造）の効果のインビトロでの比較研究
【００９３】
カルボニルの抗酸化／不活性化効果は、フッ素原子により増大される可能性がある。この仮定を確認するため、フッ素原子がないという点を除いて化合物５の構造と同一の構造をもつ化合物１の抗酸化及び細胞保護効果を研究した。
【００９４】
化合物１及び５のこの効果を、一方ではＥＣＶ３０４によるＬＤＬの酸化について、そして続発するそれらの毒性について研究した。
【００９５】
このために、異なる濃度の化合物１又は化合物５及びＣｕＳＯ4（１μＭ）の存在下で未変性ＬＤＬ（１００μｇ／ｍＬ）と共に６時間、ＥＣＶ３０４をインキュベートする。その後培地を回収し、ＴＢＡＲＳを定量するためにアリコートを採取し、残りの培地をその他のＥＣＶ３０４と再インキュベートして毒性効果を研究する。対照（ＬＤＬのみ）中のＴＢＡＲＳの比率は、１ｍｇのａｐｏＢにつき７．５ｎｍｏｌである。得られた結果は、以下の表１に示され、二度ずつ実施された別個の４回の実験の平均に対応する。
【００９６】
得られた結果は、ＬＤＬの酸化に対する効果及び続発するそれらの毒性が化合物１と化合物５との間で似通ったものであることを示している。従って、この効果は主として二つの分子上のフェニル基の存在と関連する。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
他方で、化合物１及び５の効果を、酸化ＬＤＬと４−ＨＮＥについてのそれらの細胞保護効果のレベルでも比較した。
【００９９】
このために、２００μｇ／ｍＬの酸化されたＬＤＬ又は２５μＭの４−ＨＮＥ及び増大する濃度の化合物１又は５と共に、内皮細胞をインキュベートする。２４時間後に、ＭＴＴ試験により毒性を評価する。
【０１００】
図３は、酸化されたＬＤＬで実施された試験において得られた結果を示している。その結果は、刺激を受けていない対照に対する百分率で表されている。
【０１０１】
図４は、４−ＨＮＥで実施された試験において得られる結果を示している。合成された化合物の、４−ＨＮＥにより誘発される毒性に対する保護効果は、カルボニルの不活性化効果だけに関連する。結果について、化合物５のみが、非常に低い濃度（１μＭ）から有効であり、かつより高い濃度でも持続し、一方で化合物１は効果が無く、それどころかさらに高い用量では毒性を示すということがわかる。従ってこれらの結果は、化合物５が、フッ素基と関連するカルボニルの不活性化効果を有し、ひいてはアルデヒドにより誘発される毒性に対する有効な保護を可能にするということを示している。
【０１０２】
これらの結果全体は、酸化されたＬＤＬの細胞毒性が単にカルボニル基の存在に関連するものではないこと、そして酸化的ストレスも関与していることを示している。このことが、フッ化されていない化合物１よりも化合物５でのはるかに有利な保護効果を説明している。
【０１０３】
４）  本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物のアテローム形成防止効果のインビボでの検証
【０１０４】
本発明に従ったフルオロホスホノ桂皮酸化合物、特に化合物７の潜在的なアテローム形成防止効果も同様に、ａｐｏＥ-/-マウスに代表されるアテローム性動脈硬化症の動物モデルで研究した。
【０１０５】
ａ）  動物モデル及び実験手順の説明
ａｐｏＥノックアウトマウスは、アポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）が欠損し、このことにより、ＬＤＬ及びＩＤＬ（中間密度リポタンパク質）の比率の増加に付随する血漿コレステロールの蓄積及び血漿ＨＤＬ率の減少が誘発される。これらのマウスは、アテローム性動脈硬化症のプラーク（初期病変を形成する脂肪線条の蓄積）の成長及びこれらの病変の形成を減速又は遮断することのできる分子についての研究の従来のモデルである。これらのマウスは、アテローム性動脈硬化症のプラークを（高脂肪飼料がない状態で）自発的に成長させる。
【０１０６】
４週齢の離乳したマウスを、標準飼料を給餌した１３頭から成る２つの群に分割する。
【０１０７】
第１群（処理対象）には、飲料水中で１０ｍｇ／ｋｇの化合物７を与えるが、ここで、この化合物７は予めエタノール中に溶解し、その後水で希釈して、化合物７は３０ｍｇ／Ｌ、エタノールは０．０５％の最終濃度としたものである。
【０１０８】
第２群（対照）には、０．０５％のエタノールを含有する飲料水を与える。化合物７の濃度は、６〜１０ｍＬ／日の水の量に対して、また体重３０ｇのマウス１頭あたりで計算した。
【０１０９】
化合物７は４日間、常温で安定している（安定性はＨＰＬＣで確認した）。給水瓶は一週間に２回交換する。
【０１１０】
処理の合計継続時間は４ヵ月である。
【０１１１】
４ヵ月後に動物を屠殺し、心臓をＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄し、凍結させ（Ｔｉｓｓｕｅ  ＴｅK）、−８０℃で保存する。アテローム性動脈硬化症の病変の分析を、大動脈洞の部分で、脂質に特異的な染料（オイルレッドＯ）で染色しヘマトキシリン／エオジンで対比染色した厚さ１０μｍの切片について実施し、その後、病変のサイズの形態学的評価により表面積を測定する（Ｂｉｏｃｏｍ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ，  ｌｏｇｉｃｉｅｌ  Ｃｙｂｅｒｖｉｅｗ  ３．０）。μｍ2単位で表示される病変の平均表面積を用いて、各動物の病変のサイズを評価する。
【０１１２】
ｂ）  結果
４週齢のａｐｏＥ-/-マウスについて、化合物７の保護効果を試験する。この段階で、アテローム性動脈硬化症の病変の成長はわずかであり、従って、アテローム形成防止の潜在能力をもつ分子の添加がプラークの自発的な成長を抑制する。病変は、４ヵ月の処理（又は非処理）の後に大動脈洞の部分で分析するが、これは、この段階においては大動脈の上行部分のところの病変がまだほとんど成長していないからである。対応する得られた数値的結果を、以下の表２に示す。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
研究は、化合物７を飲料水に補足することにより、大動脈洞の部分でのアテローム性動脈硬化症のプラークの表面積が著しく減少する（非処理の対照動物の表面積と比べ平均２７％の減少であり、標準偏差は大きいが二つの群において似通ったものである）ということを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１Ａ】本発明に従った特定の化合物の全体的な抗酸化効果ならびに酸化的ストレスに付された細胞の保護についてのその効果の統計的棒グラフ表示である。
【図１Ｂ】本発明に従った特定の化合物の全体的な抗酸化効果ならびに酸化的ストレスに付された細胞の保護についてのその効果の統計的棒グラフ表示である。
【図２】本発明に従った特定の化合物の全体的な抗酸化効果ならびに酸化的ストレスに付された細胞の保護についてのその効果の統計的棒グラフ表示である。
【図３】本発明に従った特定の化合物の培地内濃度に応じた、酸化ＬＤＬ又は４−ＨＮＥの存在下での細胞の生存の推移を示す。
【図４】本発明に従った特定の化合物の培地内濃度に応じた、酸化ＬＤＬ又は４−ＨＮＥの存在下での細胞の生存の推移を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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