(57)【要約】心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を投与することを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患の治療を必要とする患者における該心血管疾患を治療する方法であって、ＬＤＬの減少、アポＣＩＩＩの減少、ＨＤＬの増加、又はアディポネクチンの増加のうち少なくとも１つの変化を達成するのに十分な治療的有効量のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を該患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
該変化がＬＤＬの減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該変化がアポＣＩＩＩの減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該変化がＨＤＬの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該変化がアディポネクチンの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
心血管疾患患者の治療用医薬を製造するための治療的有効量のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物の使用であって、該治療的有効量が、ＬＤＬの減少、アポＣＩＩＩの減少、ＨＤＬの増加、又はアディポネクチンの増加のうち少なくとも１つの変化を達成するのに十分である使用。
【請求項７】
該変化がＬＤＬの減少である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
該変化がアポＣＩＩＩの減少である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
該変化がＨＤＬの増加である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
該変化がアディポネクチンの増加である、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管疾患を治療するための線維芽細胞成長因子２１又はその化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国内の全ての人種及び民族群の男女に関わらず、心血管疾患（ＣＶＤ）は主な死亡原因である。ＣＶＤは、心臓の構造又は機能に影響する多くの条件を含む。これらの症状には、動脈硬化症及びアテローム硬化症、脳梗塞、不整脈又は不整脈、心筋疾患、腹大動脈疾患、心不全、並びに血管疾患を含むことができる。
【０００３】
立証されているＣＶＤの危険因子は、低密度リポタンパク質レベル（ＬＤＬ）コレステロールの増加、トリグリセリドレベルの増加及び高密度リポタンパク質レベル（ＨＤＬ）コレステロールの低下である（Ｗ． Ｂ． Ｋａｎｎｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １４８（１）： １６−２６， （２００４）； Ｃ． Ｍ． Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １４６（２）： ２２７−２３３ （２００３））。更に、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（アポＣＩＩＩ）は、ＣＶＤの主な危険因子として明らかである。アポＣＩＩＩレベルが増加すると、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの持続期間が延びるだけでなく、トリグリセリドの分解が抑止され、ＣＶＤの促進に影響を与える。実際、ある研究において、アポＣＩＩＩの増加に起因するトリグリセリドが増加すると、有害作用が殆んど示される（Ｓｕｎｇ−Ｊｏｏｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ， ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３；２３：８５３）。また、脂質を低下させる薬物投与された個体のアポＣＩＩＩレベルが増加すると、脂質プロファイルが全体的に改良するにも関わらずＣＶＤの危険性が存在し続ける。
【０００４】
アディポネクチン、脂肪細胞によって主に分泌されるポリペプチドは、上記の心血管の危険因子とは負に関連し、ＨＤＬコレステロール値に正に関連する（Ｓｃｈｅｒｅｒ ＰＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０：２６７４６−２６７４９， （１９９５）； ２０：１５９５−１５９９， （２０００））。アディポネクチンレベルは、２型糖尿病及び冠状動脈疾患等の肥満症に関連する疾患のうちのいくつかに罹患している患者だけでなく（Ｎ． Ｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００：２４７３−２４７６， １９９９）、肥満の被験者においても有意に減少する（Ｙ． Ａｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２５７：７９−８３， １９９９）。このように、アディポネクチンレベルが低いことは、ＣＶＤに関連する他の危険因子であると考えることができる。
【０００５】
繊維芽細胞増殖因子は、発達中の組織及び成人ヒト組織で幅広く発現するポリペプチドであり（Ｂａｉｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ、３：２３９−２４３、１９９１）、血管新生、有糸分裂誘発、パターン形成、細胞分化、代謝調節及び組織損傷の修復を含む多数の生理学的機能において重要な役割を果たしている（ＭｃＫｅｅｈａｎら、Ｐｒｏｇ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６、１９９８）。刊行物によれば、ＦＧＦファミリーは、現在、２３種類のメンバーから構成されている（Ｒｅｕｓｓら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７（２００３））。
【０００６】
研究において、線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１、ＧＦ−２、ＦＧＦ−４、及びＦＧＦ−５）によって治療的血管形成を引き起こすことが示され、引き起こされた血管の成長及び増殖によって血流不全を軽減する複雑な試みが示されている（Ｒｉｓｓａｎｅｎ ｅｔ ａｌ， ＦＡＳＥＢ Ｊ， １７（１）： １００−２， （２００３））。ＣＶＤにおいて、難治性の狭心症及び下肢間欠性跛行の患者は、初期検査における治療的血管形成に対して最も敏感に応答するようである（ＲＪ Ａｖｉｌｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １４０：６３７−６４６， （２００３））。これらの研究の結果によって、様々な虚血性疾患の新規な治療戦略に対して将来性が得られ、様々なＦＧＦポリペプチドの使用を治療的血管形成の複雑性を再考するように研究者及び臨床医らに促している（Ｎｇ ＹＳ， ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ． ２（６）： ２７８−２８５， ２００１）。
【０００７】
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓内で選択的に発現することが報告されており（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、１４９２：２０３−２０６，（２０００）、国際公開第０１／３６６４０号パンフレット、及び国際公開第０１／１８１７２号パンフレット）、虚血性血管疾患、創傷治癒、並びに肺、気管支、又は肺胞細胞機能の損失及びその他多くの障害に関連する疾患の治療として記載されている。更に、ＦＧＦ−２１は、用量依存的にマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース摂取を刺激し、ｏｂ／ｏｂ及びｄＢ／ｄＢマウスの摂食及び空腹時血糖を減少させることが示され、糖尿病及び肥満症の治療法として、ＦＧＦ−２１の使用の根拠を与えている（国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット）。
【０００８】
上記のＦＧＦ様ポリペプチドの主な血管形成作用とは対照的に、ＦＧＦ−２１は、何匹かの脂質プロファイル及び糖尿病のアカゲザルの心血管性の危険因子を有意に向上させることを示し、これにより、ＦＧＦ−２１によるＣＶＤの新規な治療法を確立する。現在、多くの薬理学的な治療が、様々な態様のＣＶＤの治療に対して利用可能であるにもかかわらず、この疾患の罹患率及び死亡率を減少させる更に有効な治療法が必要とされる。このように、ＦＧＦ−２１は、そのような治療を必要とする患者のＬＤＬ、アポＣＩＩＩ、又はトリグリセリドレベルを減少させ、ＨＤＬ又はアディポネクチンを増加させ、結果的には、ＣＶＤの罹患率及び死亡率を減少させることによって、ＣＶＤを治療する必要性を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、心血管疾患患者を治療する方法であって、以下の変化、ＬＤＬの減少、アポＣＩＩＩの減少、ＨＤＬの増加、又はアディポネクチンの増加のうち少なくとも１つの変化を達成するのに十分な治療的有効量のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を該患者に投与することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本願明細書において開示及び主張される本発明の目的のために、以下の用語が定義される。
【００１１】
ＦＧＦ−２１は、２７アミノ酸リーダー配列を含む２０８アミノ酸のポリペプチドである。ヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１と約７９％のアミノ酸相同性を示し、ラットＦＧＦ−２１と約８０％のアミノ酸相同性を示す。本願明細書において記載される使用のために、ヒトＦＧＦ−２１及び類似体、突然変異タンパク質、或いはヒトＦＧＦ−２１の誘導体又は他の哺乳類のＦＧＦ−２１ポリペプチド配列を、簡単に用いることができる。
【００１２】
成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドは以下の通りである（配列番号１）。
【００１３】
2008528487.tif 000002
【００１４】
成熟ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、以下の配列番号２である。
【００１５】
2008528487.tif 000003
【００１６】
本発明の方法における有用なＦＧＦ−２１は、好ましくはヒトＦＧＦ−２１である。更に、本発明の方法は、ＦＧＦ−２１類似体、ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質、及びＦＧＦ−２１誘導体を含み、本願明細書において、ひとまとめにＦＧＦ−２１化合物と称される。ＦＧＦ−２１化合物が、ＦＧＦ−２１と十分相同的であるため、化合物が、ＦＧＦ−２１受容体に結合し、グルコース摂取刺激作用につながる細胞情報伝達経路を誘導し、ＬＤＬ、トリグリセリド又はアポＣＩＩＩレベルを減少させ、ＨＤＬ又はアディポネクチンを増加させる能力を有する。例えば、ＦＧＦ−２１化合物によって、実施例１に記載される細胞ベースのアッセイを使用してグルコース摂取活性が検定され、また、実施例２に記載されるように、ｏｂ／ｏｂマウスアッセイの脂質プロファイルにおける効果が検定される。
【００１７】
ヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、野生型成熟タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸が、別のアミノ酸と置換されたヒトＦＧＦ−２１を含むと定義される。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、米国特許出願公開第６０／５２８，０６，８３０号に記載されており、これらは参照することにより本願明細書に援用される。一般的に、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質のいくつかの修飾特性、修飾構造、又は修飾機能を有する。例えば、突然変異タンパク質は、有利な生理活性プロフィールを維持しながら、濃縮溶液（例えば、非疎水性の媒介された凝集）中における物理安定度を強化又は改善することができる。突然変異タンパク質は、薬理学的な防腐剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコール）と高い親和性を有することから、貯蔵におけるタンパク質の物理化学的特質及び生物活性を維持する保存製剤の調製が可能である。酵母において発現する場合、突然変異タンパク質は、Ｏ型グリコシル化の程度を減少させることができる。突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、脱アミド化を減少させることができる。本願明細書に使用されるこれらの用語は、限定するものではなく、得られる突然変異タンパク質が野生型タンパク質の１種類以上の修飾された特質を専ら有するとされる。
【００１８】
また、ＦＧＦ−２１化合物は、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１類似体、或いは突然変異タンパク質のアミノ酸配列を有するが、それらの１個以上のアミノ酸側鎖基、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基の化学修飾を更に有する分子として定義される「ＦＧＦ−２１誘導体」を含む。化学修飾は、限定されないが、化学的な部分の追加、新たな結合の構築、化学的な部分の除去を含む。ＦＧＦ−２１誘導体の例は、米国特許出願公開第６０／５２８，５８２号、米国特許出願公開第６０／６０６，８０５号、及び米国特許出願公開第６０／６０６，８３０号に記載されており、これらは参照することにより本願明細書に援用される。
【００１９】
アミノ酸側鎖基の修飾としては、リシンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギンのカルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミド化が挙げられる。末端アミノ基の修飾としては、限定されないが、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、及びＮ−アシルの修飾が挙げられる。末端のカルボキシ基の修飾としては、限定されないが、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド、及び低級アルキルエステルの修飾が挙げられる。更にまた、１個以上の側鎖基又は末端基を保護基で保護してもよいことは、当業者であるタンパク質化学者に理解されている。アミノ酸のα−炭素を、モノ−又はジ−エチレン化してもよい。
【００２０】
「アディポネクチン」（別名Ａｃｒｐ３０又はＡｄｉｐｏＱ）は、脂質及びグルコースの代謝を調節する脂肪細胞によって生成され、分泌されるタンパク質ホルモンである。アディポネクチンは、インスリンに対する身体応答に影響を与える。また、アディポネクチンは、血管壁に沿って存在する細胞に対する抗炎症効果がある。血液濃度中のアディポネクチンの増加は、心臓発作のリスクの減少に関連している。
【００２１】
「アポリポタンパク質ＣＩＩＩ」又はアポＣＩＩＩは、トリグリセリド濃縮型のリポタンパク質のマーカーである。アポＣＩＩＩは肝臓で合成される。アポＣＩＩＩは、リポタンパク質リパーゼを阻害し、ＬＤＬ受容体関連のタンパク質により、トリグリセリドが濃縮した粒子の摂取を調整する。ＣＶＤ患者のアポＣＩＩＩの濃度は、対照患者と比較して高い。
【００２２】
「ＬＤＬ」は、「低密度リポタンパク質」を表す。血液の大部分のコレステロールは、ＬＤＬ由来である。ＬＤＬコレステロールレベルの増加は、ＣＶＤの主要な危険因子である。
【００２３】
「ＶＬＤＬ」は、「超低密度リポタンパク質」を表し、主にコレステロールからなり、タンパク質をほとんど有さない。ＶＬＤＬは、動脈壁にコレステロールを蓄積させることから、「悪玉コレステロール」と称される場合がある。ＣＶＤは、ＶＬＤＬレベルの増加に関連する。
【００２４】
「ＨＤＬ」は、「高密度リポタンパク質」を表す。ＨＤＬコレステロール値が増加すると、ＣＶＤの危険性が低下する。
【００２５】
「トリグリセリド」は、大部分の脂肪が身体だけでなく食品にも存在する化学形態である。トリグリセリドは血漿中にも存在し、コレステロールに関連して血漿脂質を形成する。血漿中の過剰量のトリグリセリドは、過トリグリセリド血症と称される。過トリグリセリド血症はＣＶＤの発症を導く。
【００２６】
線維芽細胞成長因子は、虚血性血管疾患、創傷治癒及び肺欠損に関連する疾患、気管支又は肺胞性細胞機能、及び類似の障害の治療として、科学文献において報告されている。線維芽細胞成長因子による虚血性血管疾患の治療は、血管形成に重点を置き、血管形成は、虚血組織の成長因子を放出することによって引き起こされる一連の一致したイベントによって発生する。換言すれば、線維芽細胞成長因子によって誘発される血管形成によって、虚血性冠状動脈疾患及び末梢血管疾患のために血管が形成される。
【００２７】
対照的に、本発明は、虚血性疾患に関連する血管形成ではなく、ＣＶＤに関連する様々な危険因子に関するＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１の化合物の作用に典拠を示す。予想外に、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物は、ＬＤＬレベル、トリグリセリドレベル、及び／又はアポＣＩＩＩレベルの減少、並びにＨＤＬ及び／又はアディポネクチンレベル、ＣＶＤに関連する全てのバイオマーカーに比べて血管形成を誘発しない。このように、本発明は、ＣＶＤの治療を必要とする患者を治療するためのＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物の新規的な使用を確立する。
【００２８】
本発明に従って投与されるＦＧＦ−２１は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ （１９８９）等の当技術分野において周知の手段によって生成及び／又は単離されてもよい。
【００２９】
多様なタンパク質精製法を用いることができ、このような方法は当該技術分野にて周知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：８３−９（１９９０）及びＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）に記載されている。選択される精製工程は、例えばＦＧＦ−２１に使用される生産プロセスの性質に依存する。
【００３０】
ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を周知の方法に従って調製し、薬理学的に有用な組成物を調製することができる。所望の製剤は、任意の薬剤的に許容される担体、防腐剤、賦形剤、又は安定剤と共に、適切な希釈剤又は高純度の水溶液で再構成された安定性のある凍結乾燥された産物である［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８０）］。本発明のＦＧＦ−２１は、及び安定性及び投与性を許容できるように調整されたｐＨの薬理学的に許容できる緩衝液と組み合わせてもよい。
【００３１】
非経口投与のために、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物は、単位剤形注射の形態（溶液、懸濁液、又はエマルジョン）で、薬学的に許容できる担体と共に一般的に調製される。好ましくは、１種類以上の薬理学的に許容できる抗菌性薬剤を添加してもよい。フェノール、ｍ−クレゾール、及びベンジルアルコールは、好ましい薬理学的に許容できる抗菌性薬剤である。
【００３２】
任意的に、イオン強度又は等張力を調整するために、１種類以上の薬理学的に許容できる塩を添加してもよい。製剤の等張力を調整するために、１種類以上の賦形剤を更に添加してもよい。グリセリン、塩化ナトリウム、及びマンニトールは、等張力を調整する賦形剤の例である。
【００３３】
「薬理学的に許容できる」は、ヒトに対する投与に適していることを意味する。薬理学的に許容できる製剤は、毒性元素、望ましくない汚染菌等を含有せず、製剤中の活性化合物の活性を妨げない。
【００３４】
皮下又は他の種類の投与が使用される場合、作用の遅延プロファイルを有するように、ＦＧＦ−２１化合物を誘導体化又は調製することができる。
【００３５】
「治療的有効量」のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物は、被検者に投与される場合、許容できない副作用を引き起こさない所期の効果が得られる量である。所期の効果は、疾患又は症状に関連する症候、疾患に関連する症状発現の遅延又は症状の回復を含むことができ、未治療の場合と比較して寿命を増加させることができる。特に、所期の効果とは、ＣＶＤに関連するＬＤＬ、アポＣＩＩＩ及び／又はトリグリセリドレベルの減少、並びにＨＤＬ及び／又はアディポネクチンレベルの増加である。
【００３６】
本発明におけるＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物の薬理学的組成物は、ＣＶＤを治療する一般的に意図される目的を達成するいずれの手段によって投与することができる。例えば、経口的又は非経口的に投与することができる。本明細書に使用される「非経口的」という用語は、経静脈、筋肉内、腹腔内、系内、皮下、並びに関節内の注射及び注入を含む投与の様式を意味する。投与用量は、レシピエントの年齢、健康、及び重量に、平行治療の種類（存在する場合）、治療頻度、及び要求される効果の性質に依存する。本発明の範囲内の組成物は、ＦＧＦ−２１が、ＣＶＤの治療において所望の医学的効果が得られる量で存在する全ての組成物を含む。個々の必要性は患者によるが、本成分の全ての有効量の最適範囲の決定は、当業者である臨床医の能力の範囲内にある。
【００３７】
当業者であれば、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を含む治療用組成物の薬理学的な有効量及び投与計画を、優れた医療及び個々の患者の病態に応じて容易に最適化することができる。ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物の一般的な用量は、成人に対して約０．０１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日である。好ましくは、用量は、約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは、約１．０ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の範囲である。最も好ましくは、用量は、約１〜５ｍｇ／日である。投与されるＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物は、ＣＶＤに関連するＬＤＬ、アポＣＩＩＩ及び／又はトリグリセリドレベルの減少、並びにＨＤＬ及び／又はアディポネクチンレベルの増加をもたらす。
【００３８】
或いは、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を、成人に対して約０．０１ｍｇ／投与〜約１０００ｍｇ／投与で毎週２回投与することができる。好ましくは、約０．１ｍｇ／投与〜約１００ｍｇ／投与、より好ましくは、約１．０ｍｇ／投与〜約１０ｍｇ／投与である。最も好ましくは、投薬量は、１〜５ｍｇ／投与である。
【００３９】
或いは、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を、成人に対して約０．０１ｍｇ／投与〜約１０００ｍｇ／投与で毎週１回投与することができる。好ましくは、約０．１ｍｇ／投与〜約１００ｍｇ／投与、より好ましくは、約１．０ｍｇ／投与〜約１０ｍｇ／投与である。最も好ましくは、投薬量は、１〜５ｍｇ／投与である。
【００４０】
本発明の別の態様において、ＣＶＤの治療用医薬として使用するためのＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物が想定される。
【００４１】
本発明を詳細に説明するため、以下の実施例を参照することにより明確に理解されるが、これらの実施例は、例示目的のみにおいて本願明細書に含まれ、本発明が限定されることを意図しない。
【００４２】
本願明細書で言及される特許及び刊行物の全てが、参照として明白に組み入れられる。
【００４３】
調製１
酵母におけるＦＧＦ−２１の発現及び精製ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を産生する発現系は、ピチア・パストリス、ピチア・メタノリカ又はサッカロマイセス・セレビジエなどの酵母である。ピキア・パストリスにおける産生には、市販されているシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、組換えタンパク質の高レベルな発現を促進する強力なＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターを有するベクターを使用する。また、高レベルな構成的発現のために、ＧＡＰ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）由来プロモーターを使用するベクターも利用できる。ピキアの多コピー型の発現ベクターにより、ゲノムに組み込まれる対象の遺伝子の複数のコピーをもつ株を得ることができる。組換えピキア株において対象となる遺伝子のコピーの数を増加させることにより、タンパク質発現レベルを増加させることができる。
【実施例】
【００４４】
実施例１
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース摂取
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から３Ｔ３−Ｌ１細胞を入手する。細胞をダルベッコ変法イーグル培地中に１０％ウシ胎児血清を含む増殖培地（ＧＭ）において培養する。標準的な脂肪細胞分化のため、細胞がコンフルエントとなった２日後（０日目と称す）に、細胞を、１０％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、及び０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含有する分化培地（ＤＭ）に４８時間、次いで１０％ウシ胎児血清を含む培地、５ｕｇ／ｍｌインスリンに４８時間曝露した。次いで、１０％のウシ胎児血清を含む再分化培地中に細胞を維持する。
【００４５】
グルコース輸送アッセイ
ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を、０、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０、又は５０．０ｎＭの分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ウェルプレートに加える。プレートを、３７℃で７２時間インキュベートする。
【００４６】
２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの蓄積によってアッセイされるヘキソース摂取は、以下のとおりに測定される。アッセイ前に２４時間、ウェルをＰＢＳで２回すすぎ、ＤＭＥＭ（高グルコース、１％抗菌／抗カビ溶液、２ｍＭグルタミン）、ＦＧＦ−２１含有０．１％ＢＳＡを加える。プレートを、３７℃で７２時間インキュベートする。次いで、細胞をＫＲＰバッファ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ  ７．４）で２回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＫＲＰバッファ、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、１００μＭ，  ０．１μＣｉ／ウェル  ２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースを加え、プレートを３７℃１時間インキュベートする。サイトカラシンＢを追加し、更なるグルコース摂取を停止する。摂取量をＭｉｃｒｏｂｅｔａプレートリーダーで測定する。
【００４７】
インビトロの効力は、野生型ＦＧＦ−２１のインビトロにおける活性に対して正規化して１．０と指定し、陽性対照として使用する。表１において、様々なＦＧＦ−２１化合物のインビトロの効力を野生型ＦＧＦ−２１と比較する。
【００４８】
表１
【表１】
2008528487.tif 000004
【００４９】
実施例２
ｏｂ／ｏｂマウスモデルＯｂ／ｏｂマウスモデルは、高血糖症、インスリン抵抗性及び肥満症用の動物モデルである。雄のｏｂ／ｏｂマウスを使用して、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物処置後、血漿中のグルコースレベル及びトリグリセリドレベルを監視する。雄のｏｂ／ｏｂマウス（生後７週間）を、５μｇ／日又は３ｕｇ／日でＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物で処置する。ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物を０．１ｍｌで皮下注射で投与し、ビヒクル対照群と比較する（０．９％ＮａＣｌ、０．１ｍｌ／マウス）。
【００５０】
動物に１４日間毎日投薬する。表２の標準プロトコルを用い、グルコースレベルを毎日投与１時間後に測定する。１４日目にトリグリセリドレベルを測定する。表３に示すように、ＦＧＦ−２１及び様々なＦＧＦ−２１化合物は、ｏｂ／ｏｂマウスのトリグリセリドレベルを有意に低下させる。
【００５１】
表２
【表２】
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【００５２】
表３
【表３】
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【００５３】
実施例３
糖尿病のアカゲザルの投与量逐次漸増試験
糖尿病のアカゲザルにおいて投与量逐次漸増試験を行い、ＦＧＦ−２１で処置後、血漿中のグルコースレベル、トリグリセリドレベル、ＬＤＬレベル、及びＨＤＬレベルのパラメータを監視する。投薬プロトコルは、以下の通りである。全てのサルのビヒクル投薬を、１日目から開始し、１４日間継続させる。１４〜２７日目において、ＦＧＦ−２１を皮下注射で３０μｇ／ｋｇ投与する。２９〜４２日目において、ＦＧＦ−２１を１００μｇ／ｋｇ皮下注射で投与する。４３〜５６日目において、ＦＧＦ−２１を３００μｇ／ｋｇ皮下注射で投与する。５７〜８４日目まで、動物には何も投与しない（ウォッシュアウト期間）。１４、２８、４２、５６、及び８４日目に、ＩＶＧＴＴ（静脈内ブドウ糖負荷試験）アッセイを行う。１、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、７０、及び８４日目に、採血し、上記のパラメータを検定する。１日目のパラメータ値を基線解析として使用する。７日目及び１４日目に測定されるパラメータ値を、媒体対照として平均化する。２１日目及び２８日目は、３０μｇ／ｋｇ服用レベルで平均化する。３５日目及び４２日目は、１００μｇ／ｋｇ服用レベルで平均化する。４８日目及び５６日目は、３００μｇ／ｋｇ服用レベルで平均化する。８４日目は、ウォッシュアウト値として使用される。測定される様々なパラメータを決定するために利用されるアッセイは、周知の技術である。
【００５４】
上記の通りに測定された血漿グルコースレベルを、表４に示す。血漿グルコースレベルは、投与量に依存する方法のＦＧＦ−２１処置により低下する。更に、２１日目のウォッシュアウト期間後、効果は更に明らかである。
【００５５】
表４
【表４】
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上記の通りに測定された血漿トリグリセリドレベルを、表５に示す。血漿トリグリセリドレベルは、投与量に依存する方法のＦＧＦ−２１の処置により低下する。更に、２１日目のウォッシュアウト期間後の効果は更に明らかである。上記の通りに測定された血漿ＨＤＬレベルを、表６に示す。
【００５６】
表５
【表５】
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上記の通りに測定された血漿ＨＤＬレベルを、表６に示す。血漿サンプルを、指示、検定日に採取し、平均値を算出する。血漿ＨＤＬレベルは、投与量に依存する方法のＦＧＦ−２１の処置により低下する。更に、２１日目のウォッシュアウト期間後の効果は更に明らかである。
【００５７】
表６
【表６】
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上記の通りに測定された血漿ＬＤＬレベルを、表７に示す。血漿サンプルを、指示、検定日に採取し、平均値を算出する。血漿ＬＤＬレベルは、投与量に依存する方法のＦＧＦ−２１の処置により低下する。更に、２１日目のウォッシュアウト期間後の効果は更に明らかである。
【００５８】
表７
【表７】
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【００５９】
実施例４
Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
Ｒｕｌｅｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＲＢＤ）（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）は、Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ（ＭＡＰ）検査を提供するサービス研究室である。ＭＡＰは、マウス、ネズミ、サル、及びヒトのための高密度の、定量的なイムノアッセイパネルであり、バイオマーカーパターンの改変を同定することができる。ＭＡにより、疾患、薬物及び環境に対する応答を表すタンパク質発現パターンの包括的な評価を行うことができる。実験の被検者のサンプルを対照と比較することによって、関連するパターンが明らかになる。
【００６０】
ＲＢＤ技術を用い、実施例３の糖尿病のアカゲザルから血漿サンプル中のＣＶＤバイオマーカーを検定する。基本的に、蛍光染料を含浸させたミクロスフェアを、血液中の標的物質に結合する試薬を用いて塗着させる。反応が起こると、レーザー及びコンピュータシステムが認識し、特定のタンパク質の存在及び濃度を示す。ＦＧＦ−２１で処置された糖尿病のアカゲザルの血漿サンプル中のＣＶＤバイオマーカーのＲＢＤ解析は、アポＣＩＩＩがほぼ５０％減少（基準値３９．８〜最終値２０．１）し、アネディポネクチン（基準値２．７〜最終値４．６）のほぼ２倍の増加を示し、これにより、ＣＶＤに関連するバイオマーカーにおいて、ＦＧＦ−２１の肯定的な影響が実証される。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月18日(2007.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月24日(2007.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管疾患患者の治療用医薬を製造するための治療的有効量のＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１化合物の使用であって、該治療的有効量が、ＬＤＬの減少、アポＣＩＩＩの減少、ＨＤＬの増加、又はアディポネクチンの増加のうち少なくとも１つの変化を達成するのに十分である使用。
【請求項２】
該変化がＬＤＬの減少である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該変化がアポＣＩＩＩの減少である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
該変化がＨＤＬの増加である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
該変化がアディポネクチンの増加である、請求項１に記載の使用。
【国際調査報告】
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