(57)【要約】  本発明は生物材料の遺伝子発現の定量及び定性分析のための改善された方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法であって、
第１の処理工程ａ）で生物材料からＲＮＡ、特に全ＲＮＡ又は少なくとも１つのｍＲＮＡ集団を単離すること、
第２の処理工程ｂ）でＲＮＡ、特に全ＲＮＡ又は少なくとも１つのｍＲＮＡ集団から標識二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも１つの集団を取得すること、
第３の処理工程ｃ）で１つの分離系で少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の多次元分離を行うこと、及び、
第４の処理工程ｄ）で少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの定性的及び／又は定量的評価を行うこと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
多次元分離が二次元分離である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのｃＤＮＡ集団をその分子量に従って一次元で分離する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分子量による分離がＤＮＡゲル電気泳動系によって行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのｃＤＮＡ集団をそのＧＣ含量に従って一次元で分離する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＧＣ含量による分離が変性剤濃度勾配ゲル電気泳動で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
処理工程ｄ）に続いて、分離系で得られ、それから単離された少なくとも１つのｃＤＮＡスポットからＤＮＡ分子の配列決定を行う、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
二本鎖ｃＤＮＡ集団を挿入色素で、又は放射性もしくは蛍光により標識する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法であって、
第１の処理工程ａ）で生物材料から少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団を単離すること、
第２の処理工程ｂ）で少なくとも２つの異なるＲＮＡ、特に少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団から特に逆転写により二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも２つの異なる集団を取得し、この処理工程中に二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも２つの異なる集団をそれぞれ別様に標識すること、
第３の処理工程ｃ）で１つの分離系で少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ集団を共同で多次元分画すること、及び、
第４の処理工程ｄ）で少なくとも２つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの定性的及び／又は定量的評価を行うこと、
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析のための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子を包括的機能的に特徴づけることは、今日生物科学又は医学、さらには食品工学の分野で中心的役割を果たす。その場合いわゆる「遺伝子発現研究」、即ち生物の遺伝子活性の決定のための定性及び定量分析が重要な意義を有する。現在遺伝子発現分析はいわゆる「マイクロアレイ技術」によって行われる。ところがマイクロアレイ技術に基づく方法は重大な欠点がある。マイクロアレイは通常数千に及ぶ様々なＤＮＡ断片を包含し、これが特異的プローブの役割をする。このプローブの作製は極めて手数がかかり、従って費用がかさむ。さらにこのプローブを生成するには、分析しようとする遺伝子の配列情報が前提となる。こうしてこれまでゲノムの全域に及ぶ発現研究は、完全に配列決定された生物に限られている。多数の経済的に重要な複雑な生物、例えば作物植物又は有用動物では包括的な遺伝子発現研究を行うことができない。目下のところごく少数の選ばれた高等モデル生物、例えばヒト又はマウスの完全なゲノム配列しかないからである。従って上記の欠点のない、既存のマイクロアレイ技術の有利な代替法の必要が増していることは明らかである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明の根底にあるのは、特に配列情報がこれまで全く又は不完全にしか存在しない複雑な生物材料でも遺伝子発現研究をなるべく安価かつ簡単に行うことを可能にする生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法を提供する技術問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、第１の処理工程ａ）で生物材料からＲＮＡを単離すること、第２の処理工程ｂ）でＲＮＡから標識二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも１つの集団を取得すること、第３の処理工程ｃ）で１つの分離系で少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の多次元分離を行うこと、及び第４の処理工程ｄ）で少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの定性的及び／又は定量的評価を行うこと、を含む生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法を提供することによって、発明の基礎をなす技術問題を解決する。
【０００５】
また本発明は、第１の処理工程ａ）で生物材料から少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団を単離すること、第２の処理工程ｂ）で少なくとも２つの異なるＲＮＡ、特に少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団から特に逆転写により二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも２つの異なる集団を取得し、場合によってはこれを増幅し、この処理工程ｂ）中に、得た少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ集団をそれぞれ別様に標識すること、第３の処理工程ｃ）で１つの分離系で少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ集団の多次元分画を行うこと、及び第４の処理工程ｄ）で少なくとも２つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの定性的及び／又は定量的評価を行い、その際少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ集団を１つの分離系で共に分離すること、を含む生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明に関連してＲＮＡとはｍＲＮＡも全ＲＮＡも意味する。従って本発明は出発材料としてｍＲＮＡ、特に少なくとも１つのｍＲＮＡ集団の使用も、全ＲＮＡの使用も予定している。ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ集団を使用する場合、これは通常、単離工程を行った後の全ＲＮＡに由来するものである。
【０００７】
本発明に関連してＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡとの用語は、別に指示しなければ、必ず当該のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。
【０００８】
そこで本発明は第１工程で生物材料のＲＮＡ、即ち全ＲＮＡ又は少なくとも１つのｍＲＮＡ集団を用意し、続いてこのＲＮＡから特に逆転写により少なくとも１つのｃＤＮＡ集団を作製し、その際逆転写中に又はそれに続いてこのｃＤＮＡ集団を標識するものとする。本発明の好ましい実施形態では逆転写に続いて、即ちｃＤＮＡ合成に続いて、得たｃＤＮＡの増幅を例えばＰＣＲにより行うように構成することができる。好ましい実施形態では特定の遺伝子又は特定のヌクレオチド配列に対して特異性をもたない、即ち配列、遺伝子及び／又は生物に対して非特異的なプライマーをｃＤＮＡ合成にも、場合によって行われるｃＤＮＡ増幅にも使用することができる。その場合プライマーを標識し、特に蛍光標識することができる。
【０００９】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ切断酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、とりわけ配列特異性制限エンドヌクレアーゼによって、得たｃＤＮＡ集団の分子、即ちｃＤＮＡ断片を切断して、とりわけｃＤＮＡ集団の平均分子量を確定する。
【００１０】
それに続いて、得た少なくとも１つのｃＤＮＡ集団を１つの分離系、特に電気泳動分離系、とりわけゲル電気泳動分離系で少なくとも２つの異なる次元、例えば二次元又は三次元で分離し、少なくとも１つのｃＤＮＡ集団から空間的に互いに分離されたスポットの多次元パターンを生じさせ、このパターンを定性的及び／又は定量的に評価することができる。本方法は、在来のマイクロアレイ技術で使用された、特異的遺伝子プローブでの相補的ＤＮＡのハイブリダイゼーションの原理に関係なく、二本鎖ＤＮＡを高い分離度で分離することができるので好都合である。本方法は配列情報がまだないか又は不完全な生物材料の分析、さらには同定、特に遺伝子発現分析を可能にし、かつそのために利用され、この分析は被検生物材料又は特定の遺伝子の配列データの知識を前提としない。本発明によれば本発明に基づき設けられた例えば二次元ゲル系によってｃＤＮＡ集団の核酸が分離され、こうして複合スポットパターンの形で表示される。定性的及び定量的評価によって種々のスポットパターン及び種々のＤＮＡ試料又はｍＲＮＡ集団を互いに比較し、同定することができ、事前に配列情報が知られていなくてもよい。本発明に基づきさらに個々のスポットを分離系から分離して、配列決定を行うことも可能である。
【００１１】
本発明に関連して生物材料とは、遺伝情報を含み、それ自体が再生し、又はある生物系で再生することができる材料を意味する。このような生物材料の例は生体即ちウイルス、細胞、酵母、細菌、細胞系、組織等である。本発明の特に好ましい実施形態は遺伝情報が不明の、即ち遺伝子材料の配列情報がまったく又は不完全な断片でしか存在しない生物材料を出発材料とする。特に好ましい実施形態では生物材料として例えば有用動物、例えばヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ等が取り上げられる。もちろん本発明は植物、特に作物植物、例えばライムギ、オオムギ、ライコムギ、トウモロコシ、コムギ、カラスムギ、キビ、サトウキビ、飼料用カブラ、テンサイ、イネ等も包含する。
【００１２】
本発明に関連してスポットとは、ｃＤＮＡ集団の分離を行った後に得られる、多次元の場で同様に振舞い、従って分離系で本質的に同じ位置を有する、空間的に集束されたｃＤＮＡ分子の局部的集合を意味する。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態が定めるところでは、第１の処理工程で生物材料から単離したＲＮＡ、即ち全ＲＮＡ又は少なくとも１つのｍＲＮＡ集団を二本鎖ｃＤＮＡの集団への逆転写の時又は後に標識するが、標識は例えば放射性標識又は蛍光標識である。また本発明は特に複数の、とりわけ２つ又は３つの挿入色素、例えばCyber Green、SYBR-Green又はSYBR-Goldによる標識を行う。
【００１４】
本発明の特に好ましい実施形態が定めるところでは、少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の多次元分離は二次元又は三次元分離である。本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１つのｃＤＮＡ集団を分子量に従って一次元で分離するように構成することができ、さらに別の好ましい実施形態では、例えばポリアクリルアミドゲルを用いた高分離度のＤＮＡゲル電気泳動を使用する。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の分離をそのＧＣ含量に従って一次元で行い、別の好ましい実施形態ではＧＣ含量による分離を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動で行うものとする。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＧＣ含量による分離を温度勾配ゲル電気泳動によって行うことができる。
【００１７】
特に好ましい実施形態では複合集団又は混合物からのｃＤＮＡ分子の二次元高分離度分離が行われ、１つの次元では分子量により、第２の次元ではＧＣ含量により分離が行われる。
【００１８】
分離系で多次元分離の後に得たスポットパターンの定量的及び／又は定性的評価は、例えば市販のスキャナーで行うことができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、単数個又は複数個の得たスポットを慣用の方法により分離系から分離し、続いて常法による配列決定分析に供するように構成されている。
【００２０】
また本発明の好ましい実施形態では、もちろん本発明の方法により複数の異なる全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ集団、例えば２つの異なるｍＲＮＡ集団を同時に複数の異なるｃＤＮＡ集団に逆転写し、場合によっては増幅し、続いて１つの分離系で共に多次元分離を行う。この実施形態では、得た異なるｃＤＮＡ集団を別様に標識することが好ましい。
【００２１】
本方法は特に薬物探索及び基礎研究の分野で分析、診断に使用するのに適している。さらに本方法は植物栽培又は獣医学の分野で都合よく使用することができる。上記のすべての分野で重要なのは、標的生物及び／又は標的遺伝子に関する配列情報が不明でも、生物材料の遺伝子発現に関するデータと知見を得ること、即ち例えば生物材料、特に生物の遺伝子の位置又は時間又は発生特異的活性に関する知見を得ることである。本発明に基づく方法は、生物材料についての配列情報をあらかじめ知り又は使用することなく、この生物材料の発現遺伝子の迅速かつ効率的な分析及び同定を行うことができ、使用する分離系、例えば二次元ゲルの分離度によっては分離系当り実に１０００に及ぶ様々なスポットのパターンが得られ、これによって遺伝子発現の明確な特徴づけと分析が可能になる。また本方法は続いて行われる配列決定分析によって配列情報を提供することも保証する。
【００２２】
本発明に基づく方法はとりわけ遺伝子発現研究の枠内で微生物、例えば酵母、特にカンジダ(Candida)、とりわけカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の潜在的ビルレンス因子の同定のために都合よく使用することが好ましい。
【００２３】
その他の有利な実施形態は従属請求項で明らかである。
【実施例】
【００２４】
下記の実施例に基づき本発明を詳述する。
【００２５】
添付の図１は二次元ＤＮＡゲル電気泳動の結果、即ちカンジダ・アルビカンスのｃＤＮＡの代表的なスポットパターンを示す。
【００２６】
実施例１
ブタの肉質の重要な性質は本質的に筋組織の筋繊維の組成及び構造特性で決まる。その場合好ましい性質の発現は遺伝的、素因的因子に大いに左右される。このような因子の確認のために高い肉質をもつブタの筋組織も、低い繊維品質をもつブタの組織試料も採取する。２つの試料からそれぞれ全ＲＮＡを単離し、続いてそれに含まれるｍＲＮＡを様々に標識したプライマー又はヌクレオチドの存在下で逆転写によって二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ−ｃＤＮＡ）に転写する。所定の長さのｄｓ−ＤＮＡ断片を作るために、このｃＤＮＡを配列特異性制限エンドヌクレアーゼで切断する。様々に標識したｄｓ−ｃＤＮＡプールを組合わせ、多次元ゲル電気泳動により同時に高分離度で分離する。その場合第１の次元では様々な断片をポリアクリルアミドゲルでそれぞれの特定の分子量に従って分離する。続いて第２の次元で断片をそれぞれの特定のＧＣ含量に従って、さらに第１の次元の分離に対して直角に分離する。ＤＮＡ断片は、変化するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの連続的勾配に沿って移動し、その際ゲル中のホルムアミド及び尿素濃度が連続的に増加する。標識ＤＮＡ断片の二次元分離の後に複合スポットパターンを蛍光スキャナーで可視化し、続いて定量的及び定性的に分析する。もっぱら高い肉質の試料で検出され、従って潜在的マーカーをなすスポットをゲルから切り取り、ＤＮＡ配列決定によって同定する。
【００２７】
実施例２
ヒト病原性酵母は、当該の宿主である組織に定着して感染を引き起こす能力を持つために、特異的な毒性機構を発展させた。例えばカンジダ・アルビカンスは高い死亡率を伴う全身感染を引き起こす。カンジダ・アルビカンスの潜在的ビルレント因子の同定のために、種々の条件下でカンジダ・アルビカンスの臨床的分離株で遺伝子発現研究を行う。そのためにカンジダ・アルビカンス細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、続いて周知のように逆転写によって対応のｃＤＮＡを作製する。こうして作られたｃＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼにより消化し、続いて所定のアダプターをこうして断片化したｃＤＮＡに連結する。このアダプター連結ｃＤＮＡを次にＰＣＲにより増幅し、二次元ＤＮＡゲル電気泳動により分離する。こうして得たスポットパターンを次に定性的及び定量的に評価し、個々のスポットを切り取り、ＰＣＲで増幅し、続いて配列決定することができる。個々の実験工程を以下で詳しく列挙する。
【００２８】
Ｉ．カンジダ・アルビカンス細胞の培養と細胞ペレットの作製
全ＲＮＡの単離のために、前培養として１１ｍｌのＹＰＤ培地にカンジダ・アルビカンス細胞（臨床分離株ＳＣ５３１４）を接種し、培養物を３０℃で一晩振とうする。続いて５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種して、一晩培養で０．１５〜０．２０のＯＤ６００とする。この培養物を振とう装置（１８０ｒｐｍ）で３０℃でＯＤが０．８〜１．０になるまで増殖させる。細胞ペレットの作製のために細胞懸濁液を３０００×ｇで４分間遠心分離し、残りの１．０〜１．５ｍｌの培地にペレットを再懸濁し、液体窒素を満たした５０ｍｌ試験管にピペットで懸濁液を滴下する。こうして凍結した試料を−８０℃で単離まで保存することができる。
【００２９】
ＩＩ．全ＲＮＡの単離
カンジダ・アルビカンス及び真核細胞から全ＲＮＡを単離するためにRNeasy-Midi-Kit（Qiagen）を使用することができる。但しガラスビーズでなく、例えばRetsh社のボールミルで細胞を破壊する。
【００３０】
その場合、得た細胞ペレットをあらかじめ液体窒素で冷却したテフロン容器の中で炭化タングステン球で粉砕して微粉末とし（振とう数＝３０／ｓｅｃ、時間＝２分）、続いてキットのＬｙｓｅ緩衝液（ＲＬＴ緩衝液＋０．０１容積％メルカプトエタノール）に移す。均質化のために試料を１分間渦動させ、すなわち激しく振とうする。続いて溶解物の固形分をまず３５００×ｇで５分間遠心分離し、上清に１容積の７０％エタノールを加えてよく混合する。次にこの溶液を全体として４ｍｌ刻みでＲＮｅａｓｙ−Ｍｉｄｉカラムに入れ、３５００×ｇでそれぞれ５分間遠心分離する。続いて製造業者の指示書に従って、膜に結合したＲＮＡをまず４ｍｌのＲＷ１緩衝液で、次にそれぞれ２．５ｍｌのＲＰＥ緩衝液で２回洗浄する。ＲＮＡの溶出のためにＲＮアーゼを含まない２５０μｌの水をピペットで膜に加え、カラムを室温で１分間インキュベートし、続いて３５００×ｇで３分間遠心分離する。最終容積が５００μｌとなるように、この工程を１回繰り返す。
【００３１】
ＩＩＩ．全ＲＮＡの沈降
全ＲＮＡの沈降のためにそれぞれ２５０μｌの溶出液を２つの１．５ｍｌ反応容器に移し、２５μｌの３ｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３及び６２５μｌの１００％エタノール（−２０℃）を加えて、−２０℃で１晩沈降させる。４℃、１３０００×ｇで３０分の遠心分離によって、沈降した核酸をペレット化し、なお存在する残留塩を除去するために続いて１ｍｌの７０％ＥｔＯＨ−ＤＥＰＣ（−２０℃）で２回洗浄する。
【００３２】
全ＲＮＡ沈殿物を３７℃で乾燥した後、ＲＮＡを１０〜５０μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏに受け、紫外線分光法により濃度と純度の決定を行う。
【００３３】
ＩＶ．ポリＡ＋又は全ＲＮＡからのｄｓ−ｃＤＮＡの作製
SMART cDNA Library Construction Kit（BD Bioscience）の修正プロトコルにより０．５〜１μｇのポリＡ＋又は全ＲＮＡから完全長ｄｓ−ｃＤＮＡの合成を行う。
【００３４】
使用するプライマー（それぞれ１０ｍｏｌ／ｌ）：
SMART IV オリゴヌクレオチド：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’（配列番号１）
ODD_T_all：
5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号２）
ODD-TA：
5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTTA-3’（配列番号３）
ODD-TG：
5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTTG-3’（配列番号４）
ODD-TC：
5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTTC-3’（配列番号５）
A2-Sau3a：
5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’（配列番号６）
【００３５】
第１鎖ｃＤＮＡ合成のために、ＲＮアーゼを含まない反応容器で１〜３μｌのＲＮＡ（０．５〜１．０μｇのポリＡ＋又は全ＲＮＡ）とそれぞれ１μｌの１０μmol／ｌ SMART IV オリゴヌクレオチド及びODD_T_allプライマー（代案としてODD-TA、ODD-TG及びODD-TCの１０μmol/l混合物）を混合し、全容積が５μｌになるまでDEPC-H2Oを補充する。
【００３６】
ＲＮＡ二次構造の変性のために反応混合物をまず７２℃で２分、次いで氷で２分インキュベートする。続いて２μｌの５×第１鎖緩衝液（250mmol/l Tris、pH8.3；30mmol/l MgCl2；375mmol/l KCl）、１μｌの20mmol/l DTT、１μｌの10mmol/l dNTP混合物及び１μｌのPowerScript 逆転写酵素を加え、ピペットで入念に加減して成分を混合する。逆転写酵素反応を４２℃で１時間行い、氷上に移すことによって停止する。この第１鎖ｃＤＮＡは二本鎖合成に直接使用するか、又は−２０℃で３ヶ月まで貯蔵することができる。
【００３７】
長距離（ＬＤ）ＰＣＲにBD Advantage TM 2ポリメラーゼ混合物を使用して二本鎖合成を行う。この混合物はBD TITANIUMTM Taq ＤＮＡポリメラーゼとBD TaqStartTM抗体及び少量のプルーフリーディング・ポリメラーゼを組み合わせたものである。
【００３８】
１００μｌの全容積に２μｌの第１鎖ｃＤＮＡ、８０μｌの分子生物学的Ｈ2Ｏ、１０μｌの１０×Advantage 2 PCR緩衝液（400mmol/l トリシン-KOH、pH8.7；150mmol/l KOAc；35mmol/l Mg(OAc)2；37.5μｇ/ml BSA；0.05% Tween 20；0.05% Nonidet-P40）、２μｌの５０×ｄＮＴＰ混合物（それぞれ10mmol/l）、２μｌのA2-Sau3Aプライマー、２μｌのODD_T_allプライマー（代案として：ODD-TA/TC/TGプライマー混合物）及び２μｌの５０×AdvantageTM 2 ポリメラーゼ混合物を一緒に加え、短時間渦動させ、即ち激しく攪拌し、続いて“Hot-Start-PCR”を２サイクル行う。
【００３９】
ＰＣＲプログラム：
９５℃ − ０：２０分
９５℃ − ０：０５分
６８℃ − ６：００分
９５℃ − ０：０５分
６８℃ − ６：００分
【００４０】
Ｖ．ｄｓ−ｃＤＮＡの精製
ｄｓ−ｃＤＮＡの精製はカラム精製法で行う（例えばQIAGEN QIAquick PCR 精製キット）。９０μｌのＥＢ緩衝液（10mmol/l Tris-Cl、pH8.5）を加えて溶出する。
【００４１】
ＶＩ．制限エンドヌクレアーゼ（例えばRsaI）によるｄｓ−ｃＤＮＡの制限消化
９０μｌの溶出液を１２０μｌの消化混合物中で１２μｌの１０×緩衝液１（100mmol/l Bis Tris プロパン−HCl、pH7.0；100mmol/l MgCl2；10mmol/l ジチオトレイトール）及び１２μｌの10mg/ml BSAと混合し、３０ＵのRsaIを加えた後、３７℃で２時間インキュベートする。さらに１５ＵのRsaIを加え、１時間インキュベートした後、切断されたｄｓ−ｃＤＮＡを沈降させることができる。
【００４２】
ＶＩＩ．ｄｓ−ｃＤＮＡ断片の沈降
０．１容の3mol/l 酢酸ナトリウム（pH 5.3）及び２．５容の１００％EtOHを制限消化物に直接加え、−２０℃で２時間インキュベートすることによってｃＤＮＡの沈降が起こる。冷却遠心装置で４℃で２５分遠心分離（１３０００×ｇ）することによりペレットが形成される。７０％エタノール（−２０℃）で洗浄した後、ペレットを１０μｌの分子生物学的水に受けることができる。そのうち５μｌをアダプター連結反応のために使用し、残量は−２０℃で冷凍する。
【００４３】
ＶＩＩＩ．アダプター合成
使用したオリゴヌクレオチド：
Long Oligo RsaI（100μmol/l）：
GCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT（配列番号７）
Short Oligo RsaI（100μmol/l）：
ACCGCCCTCCGC（配列番号８）
【００４４】
２０μmol/lアダプター・ストック（ODD_Adapter_RsaI）を作るために、それぞれ２０μｌのLong Oligo RsaIプライマーとShort Oligo RsaIプライマーを総容積１００μｌの50mmol/l Tris-HCl、pH7.5；10mmol/l MgCl2；10mmol/lジチオトレイトール；1mmol/l ATP；25μg/ml BSA中で混合する。９５℃で３分間変性し、続いて室温で徐々に（約８時間）冷却することによって、相補的ヌクレオチド配列がハイブリダイズすることで二本鎖アダプターを得て、これをRsaI消化ｄｓ−ｃＤＮＡの連結反応のために使用することができる。
【００４５】
ＩＸ．アダプター連結反応
RsaI消化の後に沈降した５μｌのｄｓ−ｃＤＮＡをアダプター連結反応のために使用する。
【００４６】
連結反応のために１μｌの20μmol/lアダプター・ストック溶液（ODD_Adapter_RsaI）、１μｌの10×T4-リガーゼ＿緩衝液（500mmol/l Tris-HCl、pH 7.5；100mmol/l MgCl2；100mmol/l ジチオトレイトール；10mmol/l ATP；250μg/ml BSA）、5μlのｄｓ−ｃＤＮＡ及び200ＵのT4-DNAリガーゼを混ぜ合わせて総容積１０μｌとし、１６℃で一晩インキュベートする。
【００４７】
翌日、熱不活性化（６５℃で１０分）によりリガーゼの活性を停止する。
【００４８】
続いて１０μｌの連結反応混合物に９０μｌの水を補充して１００μｌとし、カラム（QIAGEN PCR精製キット−プロトコル）により精製する。
【００４９】
Ｘ．アダプターＰＣＲ  Ｉ（ＲｓａＩ消化ｄｓ−ｃＤＮＡの３’末端の増幅）
プライマーODD_T_all及びプライマーAP1によるいわゆる「抑制ＰＣＲ」を、とりわけｃＤＮＡの３’末端の増幅のために利用する。
【００５０】
アダプター連結ＤＮＡの増幅のために次のＰＣＲを行う。
【００５１】
アダプター連結ｄｓ−ｃＤＮＡの１０μｌの溶出液を、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（200mmol/l Tris-HCl、pH 8.4；500mmol/l KCl）、０．６μｌの50mmol/l MgCl2、０．５μｌの5mmol/l dNTP、
０．２５μｌの10μmol/l AP1プライマー
（5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3’）（配列番号９）、
０．２５μｌのODD_T_allプライマー
（5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTT-3’）（配列番号２）、
１０．６５μｌの分子生物学的水及び２ＵのTaqポリメラーゼと混合し、続いて次のＰＣＲプログラムで増幅する。
【００５２】
ＰＣＲプログラム：
１．９５℃ − ０：０５分
２．６５℃ − ０：３０分
３．７２℃ − １：００分
工程２及び３を１９回繰り返す（総サイクル数：２０）。
【００５３】
こうして増幅したｃＤＮＡを続いて第２のＰＣＲ（アダプターＰＣＲ  ＩＩ）で特異的に増幅することができ、その際いわゆる「アンカープライマー」、即ち
プライマー１：
AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGTCCNN（配列番号１０）
（ここにＮはヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、従ってプライマー１の１６の変型が可能である）及び
プライマー２：
5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTTVN-3’（配列番号１１）
（ここにＶはヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣを、ＮはヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表し、従ってプライマー２の１２の変型が可能である）
が使用される。
【００５４】
ＸＩ．アダプターＰＣＲＩＩ
アダプターＰＣＲＩによる増幅ｃＤＮＡ断片の部分集団の特異的増幅のために次の手順を選ぶ。
【００５５】
アダプターＰＣＲＩの増幅ｃＤＮＡ断片を水で１：３０に希釈する。この希釈液１０μｌを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（200mmol/l Tris-HCL、pH 8.4；500mmol/l KCl）、３μｌの50mmol/l MgCl2、４μｌの5mmol/l dNTP、
２．５μｌの10μmol/l プライマー１
（5’-GGGCGTGGTGCGGAGGGCGGTCCNN-3’）（配列番号１０）、
２．５μｌの10μmol/l プライマー２
（5’-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTTVN-3’）（配列番号１１）、
６５．５μｌの分子生物学的水及び２０ＵのTaqポリメラーゼと混合し、続いて次のＰＣＲプログラムで増幅する。
【００５６】
ＰＣＲプログラム：
１．９５℃ − ０：０５分
２．６５℃ − ０：３０分
３．７２℃ − １：００分
工程２及び３を２０回繰り返す（総サイクル数：２１）。
【００５７】
ＸＩＩ．ｃＤＮＡの二次元分離
アダプターＰＣＲＩＩの増幅ｃＤＮＡ断片を、続いて二次元ゲル電気泳動により高分離度で分離する。そのために試料をまず第１の次元で非変性ポリアクリルアミドゲルにのせる。第１の次元（分子量による分離）のためのゲルの組成：１×ＴＡＥ（40mmol/l Tris；20mmol/l 氷酢酸；1mmol/l EDTA、pH 8.0）中の８％アクリルアミド（アクリルアミドとビスアクリルアミドの比３７．５：１）。試料を２００ボルトの定電圧で２〜４時間電気泳動する。続いて第１の次元のレーンを切り取り、第２の次元での分離のために、尿素及びホルムアミドの濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲルの上に置く。第２次元のポリアクリルアミドゲルはアクリルアミドの定濃度又は濃度勾配を有する。第２次元のためのゲルの組成：１×ＴＡＥ（40mmol/l Tris；20mmol/l 氷酢酸；1mmol/l EDTA、pH 8.0）中の８％アクリルアミド（アクリルアミドとビスアクリルアミドの比３７．５：１）、上側の0.7mol/l尿素、４％ホルムアミドから下側の2.8mol/l尿素、１６％ホルムアミドに至る連続的勾配。この第２次元で断片を６０℃の定温、１００ボルトの定電圧で１５時間電気泳動する。
【００５８】
ＸＩＩＩ．ＤＮＡ断片の検出
ＤＮＡスポットの可視化のために二次元ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色する。アダプターＰＣＲＩＩで蛍光標識プライマー１及びプライマー２を使用する場合は、ＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄによる二次元ゲルの染色は行わない。ＤＮＡスポットの検出は市販の蛍光ドキュメンテーションシステムで行う。
【００５９】
図１は、二次元分離及びＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ染色後のカンジダ・アルビカンスのｃＤＮＡの代表的なスポットパターンを示す。
【００６０】
第１次元：８％ＴＡＥポリアクリルアミドゲル（分子量による分離）
第２次元：変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、８％アクリルアミド、４％ホルムアミド＋０．７ｍｏｌ／ｌ尿素から１６％ホルムアミド＋２．８ｍｏｌ／ｌ尿素への連続的変性剤濃度勾配（ＧＣ含量による分離）。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、二次元分離及びＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ染色後のカンジダ・アルビカンスのｃＤＮＡの代表的なスポットパターンを示す。
【図１】
2008514213.tif 000002
【配列表】
2008514213000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月31日(2007.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
生物材料からの全ＲＮＡの単離及び沈降、
全ＲＮＡからの二本鎖ｃＤＮＡの作製、
制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡの制限消化、
ｃＤＮＡ断片の沈降、
アダプターによるｃＤＮＡ断片の連結反応、
連結断片の３’末端の増幅及び場合によってはその部分集団の特異的増幅のための増幅反応、
増幅ｃＤＮＡの二次元分離であって、ｃＤＮＡ集団を第１次元で分子量により、第２次元でＧＣ含量により分離すること、及び、
少なくとも１つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの検出並びに定性的及び／又は定量的評価、
を含む、生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法。
【請求項２】
分子量による分離がＤＮＡゲル電気泳動系によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＣ含量による分離が変性剤濃度勾配ゲル電気泳動で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
更なる工程で、分離系で得られ、それから単離された少なくとも１つのｃＤＮＡスポットから、ＤＮＡ分子の配列決定を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
二本鎖ｃＤＮＡ集団を挿入色素で、又は放射性もしくは蛍光により標識する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生物材料の遺伝子発現の定量又は定性分析方法であって、
第１の処理工程ａ）で生物材料から少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団を単離すること、
第２の処理工程ｂ）で少なくとも２つの異なるＲＮＡ、特に少なくとも２つの異なる全ＲＮＡ又は少なくとも２つの異なるｍＲＮＡ集団から特に逆転写により二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも２つの異なる集団を取得し、この処理工程中に二本鎖ｃＤＮＡの少なくとも２つの異なる集団をそれぞれ別様に標識すること、
第３の処理工程ｃ）で少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ集団を１つの分離系で共同で多次元分画すること、及び、
第４の処理工程ｄ）で少なくとも２つのｃＤＮＡ集団の得た多次元分離スポットの定性的及び／又は定量的評価を行うこと、
を含む、前記方法。
【国際調査報告】
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