(57)【要約】  本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１のアンタゴニストを投与することを含んでなる、炎症性疾患（例えば、慢性の炎症性疾患）を治療する方法を提供する。本発明はまた、腫瘍壊死因子レセプター１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ドメイン抗体、dAb）単量体を含むリガンド、ならびに該リガンドの使用方法を提供する。さらに、該リガンドをコードする核酸、組換え宿主細胞、および該リガンドの調製方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドであって、表面プラズモン共鳴により測定したとき、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離する、上記dAb単量体リガンド。
【請求項２】
前記dAb単量体が腫瘍壊死因子α（TNFα）とTNFR1との結合を500 nM〜50 pMのIC50で阻害する、請求項1に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項３】
前記単量体が標準的L929細胞アッセイにおいて500 nM〜50 pMのND50でヒトTNFR1を中和する、請求項1または2に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項４】
前記dAbが標準的細胞アッセイにおいて＜100 nMのND50でTNFR1の活性に対しアンタゴニスト作用を持ち、＜10μMの濃度では前記dAbが該アッセイにおいて＜5％だけTNFR1の活性に対しアゴニスト作用を持つ、請求項1〜3のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項５】
普遍的なフレームワークを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項６】
普遍的なフレームワークがDPK9 VLフレームワーク、またはDP47、DP45およびDP38からなる群より選択されるVHフレームワークを含む、請求項5に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項７】
ジェネリックなリガンドの結合部位を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項８】
ジェネリックなリガンドがプロテインA、プロテインLおよびプロテインGからなる群より選択される、請求項7に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項９】
dAb単量体リガンドが、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列からなる1以上のフレームワーク領域を有する抗体可変ドメインを含むか、または前記1以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる前記対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、まとめて5個までのアミノ酸の相違を含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１０】
dAb単量体リガンドが抗体可変ドメインを含み、ここで、FWl、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFWl、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は、前記ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、まとめて10個までのアミノ酸の相違を含んでなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１１】
dAb単量体リガンドがFWl、FW2およびFW3領域を含む抗体可変ドメインを含み、かつFWl、FW2およびFW3のアミノ酸配列がヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１２】
前記ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントがDP47、DP45、DP48およびDPK9からなる群より選択される、請求項9〜11のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１３】
ラクダ科動物（Camelid）免疫グロブリン可変ドメインではないVHドメインを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１４】
ヒトVHドメインと比較してラクダ科動物免疫グロブリン可変ドメインに特有のアミノ酸を1個以上含まないVHドメインを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１５】
dAb単量体リガンドが末端Cys残基を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項１６】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体リガンドを含む二重特異性リガンド。
【請求項１７】
前記二重特異性リガンドが二量体である、請求項16に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドであって、dAbがTAR2-10のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、上記dAb単量体リガンド。
【請求項１９】
dAbがTAR2-10のアミノ酸配列またはそれに少なくとも90％相同な配列を含む、請求項18に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項２０】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドであって、dAbがTAR2-5のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、上記dAb単量体リガンド。
【請求項２１】
dAbがTAR2-5のアミノ酸配列またはそれに少なくとも90％相同な配列を含む、請求項20に記載のdAb単量体リガンド。
【請求項２２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドをコードする単離された核酸であって、前記dAb単量体リガンドが、表面プラズモン共鳴により測定したとき、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離する、上記単離された核酸。
【請求項２３】
dAb単量体リガンドがTAR2-10のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、請求項22に記載の単離された核酸。
【請求項２４】
dAb単量体リガンドがTAR2-5のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、請求項22に記載の単離された核酸。
【請求項２５】
請求項16に記載の二重特異性リガンドをコードする単離された核酸。
【請求項２６】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドをコードする組換え核酸であって、前記dAb単量体リガンドが、表面プラズモン共鳴により測定したとき、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離する、上記組換え核酸。
【請求項２７】
dAb単量体リガンドがTAR2-10のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、請求項26に記載の組換え核酸。
【請求項２８】
dAb単量体リガンドがTAR2-5のアミノ酸配列またはそれに少なくとも80％相同な配列を含む、請求項26に記載の組換え核酸。
【請求項２９】
請求項16に記載の二重特異性リガンドをコードする組換え核酸。
【請求項３０】
請求項26〜28のいずれか1項に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項３１】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項30に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項30に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項32に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それによりdAb単量体リガンドを産生させることを含んでなる、dAb単量体リガンドの産生方法。
【請求項３４】
dAb単量体リガンドを単離することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
請求項29に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項３６】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項35に記載のベクター。
【請求項３７】
請求項36に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項37に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それにより二重特異性リガンドを産生させることを含んでなる、二重特異性リガンドの産生方法。
【請求項３９】
二重特異性リガンドを単離することをさらに含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
自己免疫疾患の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなり、前記dAb単量体リガンドが、表面プラズモン共鳴により測定したとき、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離するものである、上記方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1；p55）に特異的なdAb単量体リガンドを含む二重特異性リガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなり、前記dAb単量体リガンドが、表面プラズモン共鳴により測定したとき、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離するものである、上記方法。
【請求項４２】
前記自己免疫疾患がI型糖尿病、喘息、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、および重症筋無力症からなる群より選択される、請求項35または36に記載の方法。
【請求項４３】
請求項1〜15のいずれか1項に記載のdAb単量体および薬理学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項４４】
請求項16に記載の二重特異性リガンドおよび薬理学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項４５】
腫瘍壊死因子レセプター２（TNFR2）に対し実質的にアンタゴニスト作用を持たず、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のアンタゴニスト。
【請求項４６】
前記アンタゴニストが、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、および慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項45に記載のアンタゴニスト。
【請求項４７】
前記アンタゴニストが一価である、請求項45または46に記載のアンタゴニスト。
【請求項４８】
前記アンタゴニストが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項45〜47のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項４９】
前記アンタゴニストが抗体の一価の抗原結合フラグメントである、請求項48に記載のアンタゴニスト。
【請求項５０】
前記アンタゴニストがドメイン抗体単量体である、請求項45〜47のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５１】
前記アンタゴニストが300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合する、請求項45〜50のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、上記dAb単量体。
【請求項５３】
前記dAbが、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、および慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項52に記載のdAb単量体。
【請求項５４】
前記dAb単量体が腫瘍壊死因子レセプター２（TNFR2）に対し実質的にアンタゴニスト作用を持たない、請求項52または53に記載のdAb単量体。
【請求項５５】
前記dAb単量体が、10μMまでの濃度で存在するとき、標準的L929細胞アッセイにおいてTNFR1に対し実質的にアゴニスト作用を持たない、請求項52〜54のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項５６】
前記dAb単量体が腫瘍壊死因子α（TNFα）とTNFR1との結合を500 nM〜50 pMのIC50で阻害する、請求項52〜55のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項５７】
前記dAb単量体が、大腸菌に発現させたとき、少なくとも約0.5 mg/Lの量で分泌される、請求項52〜56のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項５８】
前記dAb単量体が、ある温度(Ts)に加熱してある温度(Tc)に冷却すると、可逆的にアンフォールディングするが、ここで、TsはdAb単量体の融解温度(Tm)より高い温度であり、TcはdAb単量体の融解温度(Tm)より低い温度である、請求項52〜57のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項５９】
Tsが約80℃であり、Tcが室温付近である、請求項58に記載のdAb単量体。
【請求項６０】
前記TNFRlがヒトTNFRlである、請求項52〜59のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６１】
前記TNFαがヒトTNFαであり、前記TNFRlがヒトTNFRlである、請求項56に記載のdAb単量体。
【請求項６２】
前記dAb単量体がヒトVHまたはヒトVLを含む、請求項52〜61のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６３】
前記dAb単量体のフレームワーク領域FWl、FW2、FW3およびFW4の1以上のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、または前記フレームワーク領域の1以上のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる前記対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、まとめて5個までのアミノ酸の相違を含んでなる、請求項52〜62のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６４】
前記dAb単量体のFWl、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであるか、またはFWl、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列が、前記ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、まとめて10個までのアミノ酸の相違を含んでなる、請求項52〜62のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６５】
前記dAb単量体がFWl、FW2およびFW3領域を含み、前記FWl、FW2およびFW3領域のアミノ酸配列がヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである、請求項52〜62のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６６】
ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントがDP47、DP45、DP48およびDPK9からなる群より選択される、請求項63〜65のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６７】
前記dAb単量体がラクダ科動物免疫グロブリン可変ドメインを含まない、請求項52〜61のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６８】
前記dAb単量体が、ラクダ科動物生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに特有の1個以上のフレームワークアミノ酸を含まない、請求項52〜61のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項６９】
前記dAb単量体が末端システイン残基を含む、請求項52〜68のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項７０】
前記dAb単量体がポリアルキレングリコール成分をさらに含む、請求項52〜69のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項７１】
ポリアルキレングリコール成分がポリエチレングリコール成分である、請求項70に記載のdAb単量体。
【請求項７２】
請求項52〜71のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含む多特異性リガンド。
【請求項７３】
前記多特異性リガンドがTNFR1と結合しない少なくとも1つのdAb単量体を含む、請求項72に記載の多特異性リガンド。
【請求項７４】
前記多特異性リガンドが血清アルブミンと特異的に結合する少なくとも1つのdAb単量体を含む、請求項72に記載の多特異性リガンド。
【請求項７５】
請求項52〜71のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含む抗体フォーマット。
【請求項７６】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードする単離された核酸であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、上記単離された核酸。
【請求項７７】
前記dAb単量体が、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、および慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項76に記載の単離された核酸。
【請求項７８】
請求項72に記載の多特異性リガンドをコードする、単離された核酸。
【請求項７９】
請求項75に記載の抗体フォーマットをコードする、単離された核酸。
【請求項８０】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードする組換え核酸であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、上記組換え核酸。
【請求項８１】
前記dAb単量体が、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、および慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項80に記載の組換え核酸。
【請求項８２】
請求項72に記載の多特異性リガンドをコードする組換え核酸。
【請求項８３】
請求項75に記載の抗体フォーマットをコードする組換え核酸。
【請求項８４】
請求項80に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項８５】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項84に記載のベクター。
【請求項８６】
請求項85に記載のベクターまたは請求項80に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項８７】
請求項86に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それによりdAb単量体を産生させることを含んでなる、dAb単量体の産生方法。
【請求項８８】
dAb単量体を単離することをさらに含む、請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
請求項82に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項９０】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項89に記載のベクター。
【請求項９１】
請求項90に記載のベクターまたは請求項82に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項９２】
請求項91に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それにより多特異性リガンドを産生させることを含んでなる、多特異性リガンドの産生方法。
【請求項９３】
多特異性リガンドを単離することをさらに含む、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
請求項83に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項９５】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項94に記載のベクター。
【請求項９６】
請求項95に記載のベクターまたは請求項83に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項９７】
請求項96に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それにより抗体フォーマットを産生させることを含んでなる、抗体フォーマットの産生方法。
【請求項９８】
抗体フォーマットを単離することをさらに含む、請求項97に記載の方法。
【請求項９９】
請求項52〜71のいずれか1項に記載のdAb単量体および薬理学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項１００】
請求項72に記載の多特異性リガンドおよび薬理学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項１０１】
請求項75に記載の抗体フォーマットおよび薬理学的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項１０２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつTAR2h-12 (配列番号32)、TAR2h-l3 (配列番号33)、TAR2h-14 (配列番号34)、TAR2h-16 (配列番号35)、TAR2h-17 (配列番号36)、TAR2h-18 (配列番号37)、TAR2h-19 (配列番号38)、TAR2h-20 (配列番号39)、TAR2h-21 (配列番号40)、TAR2h-22 (配列番号41)、TAR2h-23 (配列番号42)、TAR2h-24 (配列番号43)、TAR2h-25 (配列番号44)、TAR2h-26 (配列番号45)、TAR2h-27 (配列番号46)、TAR2h-29 (配列番号47)、TAR2h-30 (配列番号48)、TAR2h-32 (配列番号49)、TAR2h-33 (配列番号50)、TAR2h-10-l (配列番号51)、TAR2h-10-2 (配列番号52)、TAR2h-10-3 (配列番号53)、TAR2h-10-4 (配列番号54)、TAR2h-10-5 (配列番号55)、TAR2h-10-6 (配列番号56)、TAR2h-10-7 (配列番号57)、TAR2h-10-8 (配列番号58)、TAR2h-10-9 (配列番号59)、TAR2h-10-10 (配列番号60)、TAR2h-10-l1 (配列番号61)、TAR2h-10-12 (配列番号62)、TAR2h-10-13 (配列番号63)、TAR2h-10-14 (配列番号64)、TAR2h-10-15 (配列番号65)、TAR2h-10-16 (配列番号66)、TAR2h-10-17 (配列番号67)、TAR2h-10-18 (配列番号68)、TAR2h-10-19 (配列番号69)、TAR2h-10-20 (配列番号70)、TAR2h-10-21 (配列番号71)、TAR2h-10-22 (配列番号72)、TAR2h-10-27 (配列番号73)、TAR2h-10-29 (配列番号74)、TAR2h-10-31 (配列番号75)、TAR2h-10-35 (配列番号76)、TAR2h-10-36 (配列番号77)、TAR2h-10-37 (配列番号78)、TAR2h-10-38 (配列番号79)、TAR2h-10-45 (配列番号80)、TAR2h-10-47 (配列番号81)、TAR2h-10-48 (配列番号82)、TAR2h-10-57 (配列番号83)、TAR2h-10-56 (配列番号84)、TAR2h-10-58 (配列番号85)、TAR2h-10-66 (配列番号86)、TAR2h-10-64 (配列番号87)、TAR2h-10-65 (配列番号88)、TAR2h-10-68 (配列番号89)、TAR2h-10-69 (配列番号90)、TAR2h-10-67 (配列番号91)、TAR2h-10-61 (配列番号92)、TAR2h-10-62 (配列番号93)、TAR2h-10-63 (配列番号94)、TAR2h-10-60 (配列番号95)、TAR2h-10-55 (配列番号96)、TAR2h-10-59 (配列番号97)、TAR2h-10-70 (配列番号98)、TAR2h-34 (配列番号373)、TAR2h-35 (配列番号374)、TAR2h-36 (配列番号375)、TAR2h-37 (配列番号376)、TAR2h-38 (配列番号377)、TAR2h-39 (配列番号378)、TAR2h-40 (配列番号379)、TAR2h-41 (配列番号380)、TAR2h-42 (配列番号381)、TAR2h-43 (配列番号382)、TAR2h-44 (配列番号383)、TAR2h-45 (配列番号384)、TAR2h-47 (配列番号385)、TAR2h-48 (配列番号386)、TAR2h-50 (配列番号387)、TAR2h-51 (配列番号388)、TAR2h-66 (配列番号389)、TAR2h-67 (配列番号390)、TAR2h-68 (配列番号391)、TAR2h-70 (配列番号392)、TAR2h-71 (配列番号393)、TAR2h-72 (配列番号394)、TAR2h-73 (配列番号395)、TAR2h-74 (配列番号396)、TAR2h-75 (配列番号397)、TAR2h-76 (配列番号398)、TAR2h-77 (配列番号399)、TAR2h-78 (配列番号400)、TAR2h-79 (配列番号401)、およびTAR2h-15 (配列番号431)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約90％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１０３】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1、p55、CD120a）と特異的に結合し、TAR2m-14 (配列番号167)、TAR2M-15 (配列番号168)、TAR2m-19 (配列番号169)、TAR2m-20 (配列番号 170)、TAR2m-21 (配列番号171)、TAR2m-24 (配列番号172)、TAR2m-21-23 (配列番号173)、TAR2m-21-07 (配列番号174)、TAR2m-21-43 (配列番号175)、TAR2m-21-48 (配列番号176)、TAR2m-21-10 (配列番号177)、TAR2m-21-06 (配列番号178)、TAR2m-21-17 (配列番号179) からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約90％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１０４】
前記リガンドがポリアルキレングリコール成分をさらに含む、請求項102に記載のdAb単量体。
【請求項１０５】
ポリアルキレングリコール成分がポリエチレングリコール成分である、請求項104に記載のdAb単量体。
【請求項１０６】
請求項102に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含む多特異性リガンド。
【請求項１０７】
前記多特異性リガンドがTNFR1と結合しない少なくとも1つのdAb単量体を含む、請求項106に記載の多特異性リガンド。
【請求項１０８】
前記多特異性リガンドが血清アルブミンと特異的に結合する少なくとも1つのdAb単量体を含む、請求項106に記載の多特異性リガンド。
【請求項１０９】
請求項102に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含む抗体フォーマット。
【請求項１１０】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、前記ヌクレオチド配列がTAR2h-12 (配列番号32)、TAR2h-l3 (配列番号33)、TAR2h-14 (配列番号34)、TAR2h-16 (配列番号35)、TAR2h-17 (配列番号36)、TAR2h-18 (配列番号37)、TAR2h-19 (配列番号38)、TAR2h-20 (配列番号39)、TAR2h-21 (配列番号40)、TAR2h-22 (配列番号41)、TAR2h-23 (配列番号42)、TAR2h-24 (配列番号43)、TAR2h-25 (配列番号44)、TAR2h-26 (配列番号45)、TAR2h-27 (配列番号46)、TAR2h-29 (配列番号47)、TAR2h-30 (配列番号48)、TAR2h-32 (配列番号49)、TAR2h-33 (配列番号50)、TAR2h-10-l (配列番号51)、TAR2h-10-2 (配列番号52)、TAR2h-10-3 (配列番号53)、TAR2h-10-4 (配列番号54)、TAR2h-10-5 (配列番号55)、TAR2h-10-6 (配列番号56)、TAR2h-10-7 (配列番号57)、TAR2h-10-8 (配列番号58)、TAR2h-10-9 (配列番号59)、TAR2h-10-10 (配列番号60)、TAR2h-10-l1 (配列番号61)、TAR2h-10-12 (配列番号62)、TAR2h-10-13 (配列番号63)、TAR2h-10-14 (配列番号64)、TAR2h-10-15 (配列番号65)、TAR2h-10-16 (配列番号66)、TAR2h-10-17 (配列番号67)、TAR2h-10-18 (配列番号68)、TAR2h-10-19 (配列番号69)、TAR2h-10-20 (配列番号70)、TAR2h-10-21 (配列番号71)、TAR2h-10-22 (配列番号72)、TAR2h-10-27 (配列番号73)、TAR2h-10-29 (配列番号74)、TAR2h-10-31 (配列番号75)、TAR2h-10-35 (配列番号76)、TAR2h-10-36 (配列番号77)、TAR2h-10-37 (配列番号78)、TAR2h-10-38 (配列番号79)、TAR2h-10-45 (配列番号80)、TAR2h-10-47 (配列番号81)、TAR2h-10-48 (配列番号82)、TAR2h-10-57 (配列番号83)、TAR2h-10-56 (配列番号84)、TAR2h-10-58 (配列番号85)、TAR2h-10-66 (配列番号86)、TAR2h-10-64 (配列番号87)、TAR2h-10-65 (配列番号88)、TAR2h-10-68 (配列番号89)、TAR2h-10-69 (配列番号90)、TAR2h-10-67 (配列番号91)、TAR2h-10-61 (配列番号92)、TAR2h-10-62 (配列番号93)、TAR2h-10-63 (配列番号94)、TAR2h-10-60 (配列番号95)、TAR2h-10-55 (配列番号96)、TAR2h-10-59 (配列番号97)、TAR2h-10-70 (配列番号98)、TAR2h-34 (配列番号402)、TAR2h-35 (配列番号403)、TAR2h-36 (配列番号404)、TAR2h-37 (配列番号405)、TAR2h-38 (配列番号406)、TAR2h-39 (配列番号407)、TAR2h-40 (配列番号408)、TAR2h-41 (配列番号409)、TAR2h-42 (配列番号410)、TAR2h-43 (配列番号411)、TAR2h-44 (配列番号412)、TAR2h-45 (配列番号413)、TAR2h-47 (配列番号414)、TAR2h-48 (配列番号415)、TAR2h-50 (配列番号416)、TAR2h-51 (配列番号417)、TAR2h-66 (配列番号418)、TAR2h-67 (配列番号419)、TAR2h-68 (配列番号420)、TAR2h-70 (配列番号421)、TAR2h-71 (配列番号422)、TAR2h-72 (配列番号423)、TAR2h-73 (配列番号424)、TAR2h-74 (配列番号425)、TAR2h-75 (配列番号426)、TAR2h-76 (配列番号427)、TAR2h-77 (配列番号428)、TAR2h-78 (配列番号429)、TAR2h-79 (配列番号430)、およびTAR2h-15 (配列番号432)からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約90％相同である、上記組換え核酸。
【請求項１１１】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、前記ヌクレオチド配列がTAR2m-14 (配列番号180)、TAR2m-15 (配列番号181)、TAR2m-19 (配列番号182)、TAR2m-20 (配列番号183)、TAR2m-21 (配列番号184)、TAR2m-24 (配列番号185)、TAR2m-21-23 (配列番号186)、TAR2m-21-07 (配列番号187)、TAR2m-21-43 (配列番号188)、TAR2m-21-48 (配列番号189)、TAR2m-21-10 (配列番号190)、TAR2m-21-06 (配列番号191)、およびTAR2m-21-17 (配列番号192) からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約90％相同である、上記組換え核酸。
【請求項１１２】
請求項110に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項１１３】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項112に記載のベクター。
【請求項１１４】
請求項113に記載のベクターまたは請求項110に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項１１５】
請求項114に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それによりdAb単量体を産生させることを含んでなる、dAb単量体の産生方法。
【請求項１１６】
慢性炎症性疾患を治療、抑制または予防する方法であって、それを必要とする被験者に、腫瘍壊死因子レセプター２（TNFR2）に対し実質的にアンタゴニスト作用を持たない、腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のアンタゴニストを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１１７】
前記アンタゴニストが一価である、請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
前記アンタゴニストが抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項116または117に記載の方法。
【請求項１１９】
前記アンタゴニストが抗体の一価の抗原結合フラグメントである、請求項118に記載の方法。
【請求項１２０】
前記アンタゴニストがドメイン抗体単量体である、請求項116〜119のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記アンタゴニストが300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合する、請求項116〜120のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記慢性炎症性疾患が関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、および慢性閉塞性肺疾患からなる群より選択される、請求項116〜121のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２３】
炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２４】
関節炎を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２５】
前記関節炎が慢性関節リウマチまたは若年性関節リウマチである、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
多発性硬化症を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２７】
炎症性腸疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１２８】
前記炎症性腸疾患がクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項127に記載の方法。
【請求項１２９】
慢性閉塞性肺疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１３０】
前記慢性閉塞性肺疾患が慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、および気腫からなる群より選択される、請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
肺炎を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１３２】
前記肺炎が細菌性肺炎である、請求項131に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細菌性肺炎が肺炎球菌（Staphylococcal pneumonia）である、請求項132に記載の方法。
【請求項１３４】
敗血症性ショックを治療する方法であって、それを必要とする被験者に、請求項1〜15、18〜21、52〜71、および102〜105のいずれか1項に記載のdAb単量体を含むリガンドを治療に有効な量で投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１３５】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含んでなるポリペプチドであって、300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、上記ポリペプチド。
【請求項１３６】
前記ポリペプチドが、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、および慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項135に記載のポリペプチド。
【請求項１３７】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症性ショックモデルにおける致死性を抑制する、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１３８】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードする単離された核酸であって、該dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症性ショックモデルにおける致死性を抑制する、上記単離された核酸。
【請求項１３９】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードする組換え核酸であって、該dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症性ショックモデルにおける致死性を抑制する、上記組換え核酸。
【請求項１４０】
請求項139に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項１４１】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項140に記載のベクター。
【請求項１４２】
請求項141に記載のベクターまたは請求項139に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項１４３】
請求項142に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それによりdAb単量体を産生させることを含んでなる、dAb単量体の産生方法。
【請求項１４４】
dAb単量体を単離することをさらに含む、請求項143に記載の方法。
【請求項１４５】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつTNFRl媒介シグナル伝達を抑制するが、TNFαとTNFRlとの結合を実質的に阻害しない、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１４６】
前記dAb単量体がTNFRlのTNFα誘導架橋を阻害する、請求項145に記載のdAb単量体。
【請求項１４７】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントであって、300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつ被験者の慢性炎症性疾患を治療するのに有効である、上記抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４８】
前記抗体または抗原結合フラグメントが一価の抗原結合フラグメントである、請求項147に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４９】
前記一価の抗原結合フラグメントがdAb単量体である、請求項148に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５０】
前記抗体または抗原結合フラグメントがマウスコラーゲン誘導関節炎モデルおよび関節炎のマウスΔAREモデルからなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である、請求項147に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５１】
前記慢性炎症性疾患が慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、乾癬、および乾癬性関節炎からなる群より選択される、請求項147に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合し、かつTNFR1を介したシグナル伝達を阻害する腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のアンタゴニストであって、TNFαとTNFR1との結合は阻害しない、上記TNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５３】
前記TNFR1のアンタゴニストが、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項152に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５４】
前記TNFR1のアンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項152または153に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５５】
前記TNFR1のアンタゴニストが、マウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項154に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５６】
前記TNFR1のアンタゴニストが、ヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項154に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５７】
前記TNFR1のアンタゴニストがTNFR1のドメイン2または3と結合する、請求項152または153に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５８】
前記TNFR1のアンタゴニストがTNFR1のドメイン4と結合する、請求項152または153に記載のTNFR1のアンタゴニスト。
【請求項１５９】
第1のドメイン抗体（dAb）単量体と第2のdAb単量体を含む腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のアンタゴニストであって、第1のdAb単量体がドメイン1、ドメイン2、ドメイン3およびドメイン4からなる群より選択されるTNFRlのドメインと結合し、第2のdAb単量体がドメイン1、ドメイン2、ドメイン3およびドメイン4からなる群より選択されるTNFRlのドメインと結合し、該アンタゴニストが、標準的L929細胞毒性アッセイまたは標準的HeLa IL-8アッセイにおいて約1μMの濃度で存在するときTNFR1に対しアゴニスト作用を持たない、上記TNFRlのアンタゴニスト。
【請求項１６０】
第1のdAbがTNFRlのドメイン1と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン1と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン1と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン2と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン1と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン3と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン1と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン4と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン2と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン2と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン2と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン3と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン2と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン4と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン3と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン3と結合する、
第1のdAbがTNFRlのドメイン3と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン4と結合する、または
第1のdAbがTNFRlのドメイン4と結合し、かつ第2のdAbがTNFRlのドメイン4と結合する、
請求項159に記載のTNFRlのアンタゴニスト。
【請求項１６１】
前記アンタゴニストが第1のdAbと第2のdAbからなる二量体である、請求項159または160に記載のアンタゴニスト。
【請求項１６２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合し、かつTNFRlを介したシグナル伝達を抑制するが、TNFαとTNFRlとの結合を阻害しない、ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１６３】
前記dAb単量体が、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項162に記載のdAb単量体。
【請求項１６４】
前記dAb単量体がTNFRlのドメイン1と結合する、請求項162または163に記載のdAb単量体。
【請求項１６５】
前記dAb単量体が、マウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項164に記載のdAb単量体。
【請求項１６６】
前記dAb単量体が、ヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項164に記載のdAb単量体。
【請求項１６７】
前記dAb単量体がTNFR1のドメイン2または3と結合する、請求項162または163に記載のdAb単量体。
【請求項１６８】
前記dAb単量体がTNFR1のドメイン4と結合する、請求項162または163に記載のdAb単量体。
【請求項１６９】
前記dAb単量体が末端Cys残基を含む、請求項162〜168のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項１７０】
請求項162〜169のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含むリガンド。
【請求項１７１】
前記リガンドが2つのdAb単量体からなるホモ二量体であり、2つのdAb単量体のそれぞれが請求項162に記載のdAb単量体である、請求項170に記載のリガンド。
【請求項１７２】
前記リガンドが2つの異なるdAb単量体からなるヘテロ二量体である、請求項170に記載のリガンド。
【請求項１７３】
前記リガンドが、標準的L929細胞毒性アッセイまたは標準的HeLa IL-8アッセイにおいて約1μMの濃度で存在するとき、TNFR1に対しアゴニスト作用を持たない、請求項170〜172のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項１７４】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、TNFRlのドメイン1と結合し、かつマウスTNFRlとの結合についてTAR2m-21-23と競合する、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１７５】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、TNFRlのドメイン1と結合し、かつヒトTNFRlとの結合についてTAR2h-205と競合する、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１７６】
前記dAbがヒトTNFR1のドメイン1と結合する、請求項174または175に記載のdAb単量体。
【請求項１７７】
前記dAb単量体が、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項174〜176のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項１７８】
前記dAb単量体が末端Cys残基を含む、請求項174〜177のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項１７９】
前記dAb単量体がTNFαとTNFR1との結合を阻害しない、請求項174〜178のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項１８０】
請求項174〜179のいずれか1項に記載のdAb単量体を含んでなるリガンド。
【請求項１８１】
前記リガンドが2つ以上の前記dAb単量体を含んでなる、請求項180に記載のリガンド。
【請求項１８２】
前記リガンドが2つの前記dAb単量体からなるホモ二量体であり、前記dAb単量体のそれぞれが請求項174に記載のdAb単量体である、請求項180または181に記載のリガンド。
【請求項１８３】
請求項174〜179のいずれか1項に記載のdAb単量体を少なくとも1つ含んでなる二重特異性リガンド。
【請求項１８４】
請求項174〜179のいずれか1項に記載の第1のdAb単量体および第2のdAb単量体を含んでなり、第2のdAb単量体がTNFR1のドメイン1、ドメイン2、ドメイン3またはドメイン4と結合する、請求項183に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８５】
前記二重特異性リガンドが前記第1のdAbと前記第2のdAbからなるヘテロ二量体である、請求項184に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８６】
前記第2のdAbがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項184または185に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８７】
前記第2のdAbがTNFR1のドメイン3と結合する、請求項184または185に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８８】
前記第2のdAbがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-l54-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する、請求項187に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８９】
前記リガンドまたは二重特異性リガンドが、標準的L929細胞毒性アッセイまたは標準的HeLa IL-8アッセイにおいて約1μMの濃度で存在するときTNFR1に対しアゴニスト作用を持たない、請求項181〜188のいずれか1項に記載のリガンドまたは二重特異性リガンド。
【請求項１９０】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、TNFRlのドメイン3と結合し、かつヒトTNFRlとの結合についてTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-lOまたはTAR2h-185-25と競合する、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項１９１】
前記dAbがヒトTNFR1のドメイン3と結合する、請求項190に記載のdAb単量体。
【請求項１９２】
前記dAb単量体が、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項190または191に記載のdAb単量体。
【請求項１９３】
前記dAb単量体が末端Cys残基を含む、請求項190〜192のいずれか1項に記載のdAb単量体。
【請求項１９４】
請求項190〜193のいずれか1項に記載のdAb単量体を含んでなるリガンド。
【請求項１９５】
前記リガンドが2つ以上の前記dAb単量体を含んでなる、請求項194に記載のリガンド。
【請求項１９６】
前記リガンドが2つの前記dAb単量体からなるホモ二量体であり、前記dAb単量体のそれぞれが請求項190に記載のdAb単量体である、請求項194または195に記載のリガンド。
【請求項１９７】
請求項190〜193のいずれか1項に記載のdAb単量体を少なくとも1つ含んでなる二重特異性リガンド。
【請求項１９８】
請求項190〜193のいずれか1項に記載の第1のdAb単量体および第2のdAb単量体を含んでなり、第2のdAb単量体がTNFR1のドメイン1、ドメイン2、ドメイン3またはドメイン4と結合する、請求項197に記載の二重特異性リガンド。
【請求項１９９】
前記二重特異性リガンドが前記第1のdAbと前記第2のdAbからなるヘテロ二量体である、請求項198に記載の二重特異性リガンド。
【請求項２００】
前記第2のdAbがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項198または199に記載の二重特異性リガンド。
【請求項２０１】
前記第2のdAbがTNFR1のドメイン3と結合する、請求項198または199に記載の二重特異性リガンド。
【請求項２０２】
前記リガンドまたは二重特異性リガンドが、標準的L929細胞毒性アッセイまたは標準的HeLa IL-8アッセイにおいて約1μMの濃度で存在するときTNFR1に対しアゴニスト作用を持たない、請求項194〜201のいずれか1項に記載のリガンドまたは二重特異性リガンド。
【請求項２０３】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつTAR2h-131-8 (配列番号433)、TAR2h-131-24 (配列番号434)、TAR2h-15-8 (配列番号435)、TAR2h-15-8-l (配列番号436)、TAR2h-l5-8-2 (配列番号437)、TAR2h-l85-23 (配列番号438)、TAR2h-154-10-5 (配列番号439)、TAR2h-14-2 (配列番号440)、TAR2h-151-8 (配列番号441)、TAR2h-152-7 (配列番号442)、TAR2h-35-4 (配列番号443)、TAR2h-154-7 (配列番号444)、TAR2h-80 (配列番号445)、TAR2h-81 (配列番号446)、TAR2h-82 (配列番号447)、TAR2h-83 (配列番号448)、TAR2h-84 (配列番号449)、TAR2h-85 (配列番号450)、TAR2h-86 (配列番号451)、TAR2h-87 (配列番号452)、TAR2h-88 (配列番号453)、TAR2h-89 (配列番号454)、TAR2h-90 (配列番号455)、TAR2h-91 (配列番号456)、TAR2h-92 (配列番号457)、TAR2h-93 (配列番号458)、TAR2h-94 (配列番号459)、TAR2h-95 (配列番号460)、TAR2h-96 (配列番号461)、TAR2h-97 (配列番号462)、TAR2h-99 (配列番号463)、TAR2h-100 (配列番号464)、TAR2h-101 (配列番号465)、TAR2h-102 (配列番号466)、TAR2h-103 (配列番号467)、TAR2h-104 (配列番号468)、TAR2h-105 (配列番号469)、TAR2h-106 (配列番号470)、TAR2h-107 (配列番号471)、TAR2h-108 (配列番号472)、TAR2h-109 (配列番号473)、TAR2h-l10 (配列番号474)、TAR2h-l11 (配列番号475)、TAR2h-l12 (配列番号476)、TAR2h-l13 (配列番号477)、TAR2h-l14 (配列番号478)、TAR2h-l15 (配列番号479)、TAR2h-116 (配列番号480)、TAR2h-117 (配列番号481)、TAR2h-118 (配列番号482)、TAR2h-l19 (配列番号483)、TAR2h-120 (配列番号484)、TAR2h-121 (配列番号485)、TAR2h-122 (配列番号486)、TAR2h-123 (配列番号487)、TAR2h-124 (配列番号488)、TAR2h-125 (配列番号489)、TAR2h-126 (配列番号490)、TAR2h-127 (配列番号491)、TAR2h-128 (配列番号492)、TAR2h-129 (配列番号493)、TAR2h-130 (配列番号494)、TAR2h-131 (配列番号495)、TAR2h-132 (配列番号496)、TAR2h-133 (配列番号497)、TAR2h-151 (配列番号498)、TAR2h-152 (配列番号499)、TAR2h-153 (配列番号500)、TAR2h-154 (配列番号501)、TAR2h-159 (配列番号502)、TAR2h-165 (配列番号503)、TAR2h-166 (配列番号504)、TAR2h-168 (配列番号505)、TAR2h-171 (配列番号506)、TAR2h-172 (配列番号507)、TAR2h-173 (配列番号508)、TAR2h-174 (配列番号509)、TAR2h-176 (配列番号510)、TAR2h-178 (配列番号511)、TAR2h-201 (配列番号512)、TAR2h-202 (配列番号513)、TAR2h-203 (配列番号514)、TAR2h-204 (配列番号515)、TAR2h-185-25 (配列番号516)、TAR2h-154-10 (配列番号517)、およびTAR2h-205 (配列番号627)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約90％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項２０４】
ポリアルキレングリコール成分をさらに含む、請求項203に記載のdAb単量体。
【請求項２０５】
前記ポリアルキレングリコール成分がポリエチレングリコール成分である、請求項204に記載のdAb単量体。
【請求項２０６】
請求項203〜205のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含んでなるリガンド。
【請求項２０７】
前記リガンドが二重特異性リガンドまたは多重特異性リガンドである、請求項206に記載のリガンド。
【請求項２０８】
請求項203〜205のいずれか1項に記載の少なくとも1つのdAb単量体を含んでなる抗体フォーマット。
【請求項２０９】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、前記ヌクレオチド配列がTAR2h-131-8 (配列番号518)、TAR2h-131-24 (配列番号519)、TAR2h-15-8 (配列番号520)、TAR2h-15-8-l (配列番号521)、TAR2h-l5-8-2 (配列番号522)、TAR2h-l85-23 (配列番号523)、TAR2h-154-10-5 (配列番号524)、TAR2h-14-2 (配列番号525)、TAR2h-151-8 (配列番号526)、TAR2h-152-7 (配列番号527)、TAR2h-35-4 (配列番号528)、TAR2h-154-7 (配列番号529)、TAR2h-80 (配列番号530)、TAR2h-81 (配列番号531)、TAR2h-82 (配列番号532)、TAR2h-83 (配列番号533)、TAR2h-84 (配列番号534)、TAR2h-85 (配列番号535)、TAR2h-86 (配列番号536)、TAR2h-87 (配列番号537)、TAR2h-88 (配列番号538)、TAR2h-89 (配列番号539)、TAR2h-90 (配列番号540)、TAR2h-91 (配列番号541)、TAR2h-92 (配列番号542)、TAR2h-93 (配列番号543)、TAR2h-94 (配列番号544)、TAR2h-95 (配列番号545)、TAR2h-96 (配列番号546)、TAR2h-97 (配列番号547)、TAR2h-99 (配列番号548)、TAR2h-100 (配列番号549)、TAR2h-101 (配列番号550)、TAR2h-102 (配列番号551)、TAR2h-103 (配列番号552)、TAR2h-104 (配列番号553)、TAR2h-105 (配列番号554)、TAR2h-106 (配列番号555)、TAR2h-107 (配列番号556)、TAR2h-108 (配列番号557)、TAR2h-109 (配列番号558)、TAR2h-110 (配列番号559)、TAR2h-111 (配列番号560)、TAR2h-112 (配列番号561)、TAR2h-113 (配列番号562)、TAR2h-114 (配列番号563)、TAR2h-115 (配列番号564)、TAR2h-116 (配列番号565)、TAR2h-117 (配列番号566)、TAR2h-118 (配列番号567)、TAR2h-119 (配列番号568)、TAR2h-120 (配列番号569)、TAR2h-121 (配列番号570)、TAR2h-122 (配列番号571)、TAR2h-123 (配列番号572)、TAR2h-12 (配列番号573)、TAR2h-125 (配列番号574)、TAR2h-126 (配列番号575)、TAR2h-127 (配列番号576)、TAR2h-128 (配列番号577)、TAR2h-129 (配列番号578)、TAR2h-130 (配列番号579)、TAR2h-131 (配列番号580)、TAR2h-132 (配列番号581)、TAR2h-133 (配列番号582)、TAR2h-151 (配列番号583)、TAR2h-152 (配列番号584)、TAR2h-153 (配列番号585)、TAR2h-154 (配列番号586)、TAR2h-159 (配列番号587)、TAR2h-165 (配列番号588)、TAR2h-166 (配列番号589)、TAR2h-168 (配列番号590)、TAR2h-171 (配列番号591)、TAR2h-172 (配列番号592)、TAR2h-173 (配列番号593)、TAR2h-174 (配列番号594)、TAR2h-176 (配列番号595)、TAR2h-178 (配列番号596)、TAR2h-201 (配列番号597)、TAR2h-202 (配列番号598)、TAR2h-203 (配列番号599)、TAR2h-204 (配列番号600)、TAR2h-185-25 (配列番号601)、TAR2h-154-10 (配列番号602)、およびTAR2h-205 (配列番号628)からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約90％相同である、上記組換え核酸。
【請求項２１０】
請求項209に記載の組換え核酸を含有するベクター。
【請求項２１１】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項210に記載のベクター。
【請求項２１２】
請求項211に記載のベクターまたは請求項209に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項２１３】
請求項212に記載の宿主細胞を、組換え核酸の発現を可能にする条件下で維持し、それによりdAb単量体を産生させることを含んでなる、dAb単量体の産生方法。
【請求項２１４】
可溶性TNFR1および膜貫通TNFR1のドメイン1と結合するが、TNFαと可溶性TNFRlまたは膜貫通TNFR1との結合を阻害しない、リガンド。
【請求項２１５】
前記リガンドがTNFR1のアンタゴニストである、請求項214に記載のリガンド。
【請求項２１６】
前記リガンドがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項214または215に記載のリガンド。
【請求項２１７】
前記リガンドがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項214または215に記載のリガンド。
【請求項２１８】
前記リガンドがTNFR1結合成分と半減期延長成分とを含む、請求項214〜217のいずれか1項に記載のリガンド。
【請求項２１９】
半減期延長成分がポリエチレングリコール成分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリンレセプターもしくはそのトランスフェリン結合部分、またはin vivoで半減期を高めるポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項218に記載のリガンド。
【請求項２２０】
半減期延長成分が、血清アルブミンまたは新生児Fcレセプターに対する結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである、請求項219に記載のリガンド。
【請求項２２１】
半減期延長成分がdAbである、請求項220に記載のリガンド。
【請求項２２２】
ヒトTNFR1およびマウスTNFR1と結合するリガンド。
【請求項２２３】
前記リガンドが、ヒトTNFR1およびマウスTNFR1のドメイン1と結合するTNFR1結合成分を含む、請求項222に記載のリガンド。
【請求項２２４】
前記結合成分が抗体または抗体フラグメントである、請求項223に記載のリガンド。
【請求項２２５】
前記結合成分がdAbである、請求項224に記載のリガンド。
【請求項２２６】
炎症性疾患を治療、抑制または予防する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２２７】
前記炎症性疾患が慢性の炎症性疾患である、請求項226に記載の方法。
【請求項２２８】
関節炎を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２２９】
前記関節炎が慢性関節リウマチまたは若年性慢性関節リウマチである、請求項228に記載の方法。
【請求項２３０】
多発性硬化症を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３１】
炎症性腸疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３２】
前記炎症性腸疾患がクローン病および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項231に記載の方法。
【請求項２３３】
慢性閉塞性肺疾患を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３４】
肺炎を治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３５】
前記肺炎が細菌性肺炎である、請求項234に記載の方法。
【請求項２３６】
前記細菌性肺炎がブドウ球菌性肺炎である、請求項235に記載の方法。
【請求項２３７】
敗血症性ショックを治療する方法であって、それを必要とする被験者に、治療に有効な量の、請求項152〜161のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項162〜169、174〜179、190〜193、および203〜205のいずれか1項に記載のdAb単量体、請求項170〜173、180〜189、194〜202、206、207、および214〜225のいずれか1項に記載のリガンドもしくは二重特異性リガンド、または請求項208に記載の抗体フォーマットを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３８】
TNFR1へのTNFαの結合を阻止するための医薬の製造における、TNFR1のドメイン3と結合するアンタゴニストの使用であって、該アンタゴニストは、ヒトTNFR1との結合についてTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、およびTAR2h-185-25からなる群より選択されるdAb単量体と競合する、上記使用。
【請求項２３９】
TNFR1へのTNFαの結合によって媒介される疾患を治療および/または予防する方法であって、患者に、TNFR1のドメイン3と結合するアンタゴニストを投与することを含んでなり、該アンタゴニストは、ヒトTNFR1との結合についてTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、およびTAR2h-185-25からなる群より選択されるdAb単量体とin vitroで競合する、上記方法。
【請求項２４０】
前記アンタゴニスト、dAb、リガンドもしくは二重特異性リガンド、または抗体フォーマットが肺投与により投与される、請求項40〜42、116〜134、226〜237および239のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記アンタゴニスト、dAb、リガンドもしくは二重特異性リガンド、または抗体フォーマットが全身投与により投与される、請求項40〜42、116〜134、226〜237および239のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１のアンタゴニストを投与することを含んでなる、炎症性疾患（例えば、慢性の炎症性疾患）を治療する方法を提供する。本発明はまた、腫瘍壊死因子レセプター１と結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ドメイン抗体、dAb）単量体を含むリガンド、ならびに該リガンドの使用方法を提供する。さらに、該リガンドをコードする核酸、組換え宿主細胞、および該リガンドの調製方法も提供する。
【０００２】
関連出願
本出願は、2004年11月10日付の米国特許出願第10/985,847号の一部継続出願であり、前記継続出願は、
1)  米国を指定した2004年10月8日付の国際出願PCT/GB2004/004253号の一部継続出願であり、また
2)  2002年12月27付の英国出願第GB 0230202.4号および2003年11月28付の英国出願第GB 0327706.8号（これは、米国を指定した2002年6月28日付の国際出願PCT/GB02/03014号の一部継続出願である、2002年12月27日付の英国出願第GB 0230202.4号の優先権を主張して、米国を指定した2003年6月30日付の国際出願PCT/GB2003/002804号の一部継続出願である）の優先権を主張して、米国を指定した2003年12月24日付の国際出願PCT/GB2003/005646号の一部継続出願である。
【０００３】
上記出願の全教示内容は参照によって本明細書に組み入れるものとする。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
抗体の抗原結合ドメインは2つの別個の領域からなり、すなわち、重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖可変ドメイン(VL；これはVκまたはVλのいずれかでありうる)からなる。抗原結合部位それ自体は6個のポリペプチドループによって形成され、すなわち、VHドメイン由来の3ループ(H1、H2、およびH3)とVLドメイン由来の3ループ(L1、L2、およびL3)から形成される。VHおよびVLドメインをコードするV遺伝子の多様な一次レパートリーは、遺伝子セグメントの組合せ再配列によって作製される。VH遺伝子は3種の遺伝子セグメントVH、DおよびJHの組換えによって作製される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、およそ51種の機能性VHセグメント (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237)、25種の機能性Dセグメント (Corbettら (1997) J. MoI. Biol, 268: 69)、および6種の機能性JHセグメント (Ravetchら (1981) Cell, 27: 583)が存在する。VHセグメントはVHドメインの第1および第2の抗原結合ループ（H1およびH2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方VH、DおよびJHセグメントは一緒になってVHドメインの第3の抗原結合ループ（H3）を形成する。VL遺伝子は2種の遺伝子セグメントVLおよびJLのみの組換えによって作製される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、およそ40種の機能性Vκセグメント (Schable and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001)、31種の機能性Vλセグメント (Williamsら (1996) J. MoI. Biol., 264: 220; Kawasakiら (1997) Genome Res., 7: 250)、5種の機能性Jκセグメント (Hieterら (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516)、および4種の機能性Jλセグメント (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med., 172: 609)が存在する。VLセグメントはVLドメインの第1および第2の抗原結合ループ（L1およびL2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方VLおよびJLセグメントは一緒になってVLドメインの第3の抗原結合ループ（L3）を形成する。この一次レパートリーから選択される抗体は、少なくとも中程度の親和性で、ほぼあらゆる抗原と結合するのに十分多様であると考えられる。高親和性の抗体は再配列された遺伝子の「親和性成熟」（affinity maturation）によって得られるが、その場合には、点変異が生じ、向上した結合に基づいて免疫系によって点変異が選別される。
【０００５】
抗体の構造と配列の解析によって、6個の抗原結合ループのうち5個（Hl、H2、Ll、L2、L3）は限られた数の主鎖コンフォメーションまたはカノニカル構造を保有することがわかっている (Chothia and Lesk (1987) J. MoI. Biol, 196: 901 ; Chothiaら (1989) Nature, 342: 877)。主鎖コンフォメーションは、(i) 抗原結合ループの長さ、ならびに(ii) 抗原結合ループおよび抗体フレームワークのキーとなる位置の特定残基（つまり残基のタイプ）、によって決定される。ループ長とキー残基の解析によって、大多数のヒト抗体配列によりコードされるHl、H2、Ll、L2、およびL3の主鎖コンフォメーションを予測することが可能になった (Chothiaら (1992) J. MoI Biol, 227: 799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14: 4628; Williamsら (1996) J. MoI Biol, 264: 220)。H3領域は配列、長さおよび構造の点で（Dセグメントの使用のため）より一層多様であるが、これも短いループ長のために限られた数の主鎖コンフォメーションを形成し、かかるコンフォメーションはループの長さ、ならびに該ループおよび抗体フレームワークのキーとなる位置の特定残基（つまり残基のタイプ）の存在によって決まる (Martinら (1996) J. MoI Biol, 263: 800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399: 1)。
【０００６】
相補的対のVHおよびVL領域を含む二重特異性抗体は当技術分野で公知である。こうした二重特異性抗体は2対のVHおよびVLを含まねばならず、各VH/VL対が単一の抗原またはエピトープと結合する。記載された方法はハイブリッドハイブリドーマ (Milstein & Cuello AC, Nature 305:537-40)、ミニボディ(minibodies) (Huら, (1996) Cancer Res 56:3055-3061;)、ダイアボディ(diabodies) (Holligerら, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804)、キレート性組換え抗体 (CRAbs; (Neriら, (1995) J. MoI. Biol. 246, 367-373)、ビスcFv (例えば、Atwellら, (1996) MoI. Immunol. 33, 1301-1312)、"knobs in holes" 安定化抗体 (Carterら, (1997) Protein Sci. 6, 781-788)に関係する。それぞれの場合に、各抗体種は2つの抗原結合部位を含み、それぞれが相補的対のVHおよびVLドメインによって形作られる。それにより各抗体は2つの異なる抗原またはエピトープと同時に結合することができ、その際、各抗原またはエピトープとの結合はVHドメインとその相補的VLドメインによって媒介される。こうした技術のそれぞれにはそれ特有の難点があり、例えば、ハイブリッドハイブリドーマの場合には、不活性VH/VL対が二重特異性IgGの画分を大いに減じることがある。さらに、大部分の二重特異性アプローチは、2つの異なるVH/VL結合部位を再形成させるために、異なるVH/VL対の会合またはVH鎖とVL鎖の会合に依存している。したがって、組み立てた分子において各抗原またはエピトープに対する結合部位の比率を制御することは不可能であり、それゆえ、組み立てた分子の多くは一方の抗原またはエピトープと結合するが、他方とは結合しないだろう。いくつかの場合には、両方の抗原またはエピトープに対する結合部位を有する分子の数を改善するために、サブユニット境界面で重鎖または軽鎖を操作する(Carterら, 1997)ことが可能となったが、これによって全ての分子が両方の抗原またはエピトープと結合するようには決してならない。
【０００７】
2つの異なる抗体結合特異性を同じ結合部位に組み込むことができるという証拠がいくつか存在するが、これらは一般に、構造的に関連した抗原またはエピトープに対応するか、あるいは広く交差反応する抗体に対応する2以上の特異性に相当する。例えば、交差反応性の抗体が記載されており、通常それは、ニワトリ卵白リゾチームとシチメンチョウリゾチーム(McCaffertyら, WO 92/01047)、または遊離のハプテンとキャリアーにコンジュゲートされたハプテン(Griffiths ADら EMBO J 1994 13:14 3245-60)のように、2つの抗原が配列および構造において関連する場合である。さらなる例として、WO 02/02773 (Abbott Laboratories)には「二重特異性」を有する抗体分子が記載されている。そこに記載された抗体分子は、その特異性が単一の抗原より多くに及ぶように、複数の抗原に対して誘導または選択された抗体である。WO 02/02773に記載の抗体の各相補的VH/VL対は、構造的に関連した2つ以上の抗原に対する単一の結合特異性を示し、このような相補的対のVHおよびVLドメインがそれぞれ別個の特異性をもつことはない。こうして、かかる抗体は構造的に関連する2つの抗原を取り巻く広範な単一特異性を有する。さらに、多反応性である天然の自己抗体が記載されており(Casali & Notions, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531)、これは構造的に無関係の少なくとも2つ（通常はそれ以上）の異なる抗原またはエピトープと反応する。さらに、あるモノクローナル抗体に対するファージディスプレイ法を用いたランダムペプチドレパートリーの選択は、その抗原結合部位にうまくはまり込む、ある範囲のペプチド配列を同定することが示されている。これらの配列の一部は共通の配列を有して高度に関連しているものの、その他は非常に相違していて、ミモトープ（mimotope）と呼ばれている (Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271)。したがって、会合した相補的VHおよびVLドメインを含む天然の4本鎖抗体が既知抗原の大集団からの多くの異なる抗原と結合する能力を有することは明らかである。同
一の抗体中に2つの所定の抗原（特に、必ずしも構造的に関連のない抗原）に対する1つの結合部位を形成する方法はあまり分かっていない。
【０００８】
これに関係しうるタンパク質工学的方法が提唱されている。例えば、触媒抗体（catalytic antibody）を生成しうることが提案されており、かかる触媒抗体は、1つの可変ドメインを介して金属イオンと結合する活性を有し、また、金属イオンとの接触および相補的可変ドメインを介してハプテン（基質）と結合する活性を有する (Barbasら, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6385-6389)。しかし、この場合には、基質（第1抗原）の結合および触媒作用は金属イオン（第2抗原）の結合を必要とすると提唱されている。かくして、VH/VL対との結合は単一だが多成分の抗原に関係する。
【０００９】
二重特異性抗体をラクダ抗体重鎖単一ドメインから生成する方法が記載されており、そこでは、1つの抗原についての結合接点が1つの可変ドメインに作られ、第2の抗原についての結合接点が第2の可変ドメインに作られる。しかしながら、これらの可変ドメインは相補的ではなかった。かくして、第1の重鎖可変ドメインを第1の抗原に対して選択し、第2の重鎖可変ドメインを第2の抗原に対して選択し、その後両ドメインを同一鎖上に連結させると、二重特異性抗体フラグメントが得られる (Conrathら, J. Biol. Chem. 270, 27589-27594)。しかしながら、ラクダ重鎖単一ドメインは、それらが軽鎖をもたない天然のラクダ抗体に由来するものであるという点で普通ではなく、実際、重鎖単一ドメインは相補的VH/VL対を形成するようにラクダ軽鎖と会合することができない。
【００１０】
単一重鎖可変ドメインはまた、軽鎖と通常会合している天然の抗体から誘導されたものも記載されている（モノクローナル抗体から、またはドメインのレパートリーから；EP-A-0368684を参照のこと）。これらの重鎖可変ドメインは1つ以上の関連抗原と特異的に相互作用することが示されているが、2つ以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを生成するために、他の重鎖または軽鎖可変ドメインと組み合わされたことはない。さらに、これらの単一ドメインは非常に短いin vivo半減期をもつことが分かっている。したがって、このようなドメインの治療上の価値は限られたものとなる。
【００１１】
異なる特異性の重鎖可変ドメインを（上記のように）一緒に連結させることによって二重特異性抗体フラグメントを作製することが提案されている。このアプローチに伴う欠点は、単離された抗体可変ドメインが疎水性の界面（通常は軽鎖と相互作用し、溶媒にさらされる）を有し、かつ「粘着性」(sticky)であって単一ドメインを疎水性表面に結合させることである。さらに、パートナーである軽鎖の不在下では、2つ以上の異なる重鎖可変ドメインの組合せおよびそれらの会合（おそらくは、その疎水性界面を介しての会合）により、それらが単独では結合できるリガンドの両方どころか一方にも結合するのを妨げる可能性がある。その上、この場合に、重鎖可変ドメインは相補的な軽鎖可変ドメインと会合しないと考えられるので、安定性に乏しく、容易にアンフォールディングしてしまう (Worn & Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7)。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1、p55、CD120a、P60、TNFレセプタースーパーファミリーメンバー1A、TNFRSF1A)のアンタゴニスト、ならびに該アンタゴニストの使用方法に関する。好ましいアンタゴニストは慢性炎症性疾患を治療し、抑制し、または予防するのに有効であり、かつ腫瘍壊死因子レセプター２(TNFR2、P75、P80、CD120b、TNFレセプタースーパーファミリーメンバー1B、TNFRSF1B)に対するアンタゴニスト作用を実質的に示さない。ある実施形態において、前記アンタゴニストは一価である。
【００１３】
他の実施形態において、前記アンタゴニストは抗体またはその抗原結合フラグメントであり、例えば、TNFR1に対する結合特異性を有する一価の抗原結合フラグメント（例えば、scFv、Fab、Fab'、dAb）である。
【００１４】
その他の好ましいアンタゴニストは、TNFR1と結合する本明細書に記載のリガンドである。かかるリガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはドメイン抗体(dAb)、または適当なフォーマットでのそのようなdAbの相補性決定領域を含む。ある実施形態では、リガンドはTNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはdAbから本質的に成る（またはから成る）dAb単量体である。他の実施形態では、リガンドは適当なフォーマット（例えば、抗体フォーマット）でdAb（またはdAbのCDR）を含むポリペプチドである。
【００１５】
特定の実施形態において、リガンドは、TNFR1と結合する第1のdAbおよび該第1のdAbとは異なる結合特異性を有する第2のdAbを含む二重特異性リガンドである。一例として、二重特異性リガンドは、TNFR1上の第1のエピトープと結合する第1のdAbおよび異なる標的上のエピトープと結合する第2のdAbを含む。もう一つの例として、第2のdAbは血清アルブミン上のエピトープと結合する。
【００１６】
他の実施形態において、リガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する第1のエピトープ結合ドメイン、および該第1のエピトープ結合ドメインとは異なる結合特異性を有する少なくとも1つの他のエピトープ結合ドメインを含む多重特異性リガンドである。例えば、第1のエピトープ結合ドメインは、TNFR1と結合するdAbとすることができ、または、TNFR1と結合するdAbのCDRを含むドメイン（例えば、affibody、SpA足場、LDLレセプタークラスAドメインまたはEGFドメインのような適当なタンパク質足場または骨組にグラフトされたCDR）とすることができ、または、TNFR1と結合するドメイン（該ドメインはaffibody、SpAドメイン、LDLレセプタークラスAドメインまたはEGFドメインから選択される）とすることができる。
【００１７】
特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は以下の1以上によって特徴づけられる：1) 50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離する；2) 腫瘍壊死因子α（TNFα）とTNFR1との結合を500 nM〜50 pMのIC50で阻害する；3) 標準的L929細胞アッセイにおいて500 nM〜50 pMのND50でヒトTNFR1を中和する；4) 標準的細胞アッセイにおいて＜100 nMのND50でTNFR1の活性に対しアンタゴニスト作用を持ち、＜10μMの濃度では前記dAbが該アッセイにおいて＜5％だけTNFR1の活性に対しアゴニスト作用を持つ；5) マウスLPS/D-ガラクトサミン誘導敗血症性ショックモデルにおける致死性を抑制する；6) 凝集に抵抗する；7) 大腸菌またはPichia種(例：P. pastoris)において発現させたとき少なくとも約0.5 mg/Lの量で分泌される；8) 可逆的にアンフォールディングする；9) マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデル、および適当な霊長類モデル（例えば、霊長類コラーゲン誘導関節炎モデル）からなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である；および/または10) 慢性炎症性疾患の治療、抑制または予防に有効である。
【００１８】
特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離し；腫瘍壊死因子α（TNFα）とTNFR1との結合を500 nM〜50 pMのIC50で阻害し；そして、標準的L929細胞アッセイにおいて500 nM〜50 pMのND50でヒトTNFR1を中和する。他の特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離し；腫瘍壊死因子α（TNFα）とTNFR1との結合を500 nM〜50 pMのIC50で阻害し；そして、マウスコラーゲン誘導関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸ナトリウム誘導モデル、慢性閉塞性肺疾患のマウスタバコ煙モデル、および適当な霊長類モデル（例えば、霊長類コラーゲン誘導関節炎モデル）からなる群より選択される慢性炎症性疾患のモデルにおいて有効である。他の特定の実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、50 nM〜20 pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 s-1のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離し；標準的L929細胞アッセイにおいて500 nM〜50 pMのND50でヒトTNFR1を中和し；そして、標準的細胞アッセイにおいて＜100 nMのND50でTNFR1の活性に対しアンタゴニスト作用を持ち、＜10μMの濃度では前記dAbが該アッセイにおいて＜5％だけTNFR1の活性に対しアゴニスト作用を持つ。
【００１９】
さらに特定した実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、TAR2h-12 (配列番号32)、TAR2h-l3 (配列番号33)、TAR2h-14 (配列番号34)、TAR2h-16 (配列番号35)、TAR2h-17 (配列番号36)、TAR2h-18 (配列番号37)、TAR2h-19 (配列番号38)、TAR2h-20 (配列番号39)、TAR2h-21 (配列番号40)、TAR2h-22 (配列番号41)、TAR2h-23 (配列番号42)、TAR2h-24 (配列番号43)、TAR2h-25 (配列番号44)、TAR2h-26 (配列番号45)、TAR2h-27 (配列番号46)、TAR2h-29 (配列番号47)、TAR2h-30 (配列番号48)、TAR2h-32 (配列番号49)、TAR2h-33 (配列番号50)、TAR2h-10-l (配列番号51)、TAR2h-10-2 (配列番号52)、TAR2h-10-3 (配列番号53)、TAR2h-10-4 (配列番号54)、TAR2h-10-5 (配列番号55)、TAR2h-10-6 (配列番号56)、TAR2h-10-7 (配列番号57)、TAR2h-10-8 (配列番号58)、TAR2h-10-9 (配列番号59)、TAR2h-10-10 (配列番号60)、TAR2h-10-l1 (配列番号61)、TAR2h-10-12 (配列番号62)、TAR2h-10-13 (配列番号63)、TAR2h-10-14 (配列番号64)、TAR2h-10-15 (配列番号65)、TAR2h-10-16 (配列番号66)、TAR2h-10-17 (配列番号67)、TAR2h-10-18 (配列番号68)、TAR2h-10-19 (配列番号69)、TAR2h-10-20 (配列番号70)、TAR2h-10-21 (配列番号71)、TAR2h-10-22 (配列番号72)、TAR2h-10-27 (配列番号73)、TAR2h-10-29 (配列番号74)、TAR2h-10-31 (配列番号75)、TAR2h-10-35 (配列番号76)、TAR2h-10-36 (配列番号77)、TAR2h-10-37 (配列番号78)、TAR2h-10-38 (配列番号79)、TAR2h-10-45 (配列番号80)、TAR2h-10-47 (配列番号81)、TAR2h-10-48 (配列番号82)、TAR2h-10-57 (配列番号83)、TAR2h-10-56 (配列番号84)、TAR2h-10-58 (配列番号85)、TAR2h-10-66 (配列番号86)、TAR2h-10-64 (配列番号87)、TAR2h-10-65 (配列番号88)、TAR2h-10-68 (配列番号89)、TAR2h-10-69 (配列番号90)、TAR2h-10-67 (配列番号91)、TAR2h-10-61 (配列番号92)、TAR2h-10-62 (配列番号93)、TAR2h-10-63 (配列番号94)、TAR2h-10-60 (配列番号95)、TAR2h-10-55 (配列番号96)、TAR2h-10-59 (配列番号97)、TAR2h-10-70 (配列番号98)、TAR2h-34 (配列番号373)、TAR2h-35 (配列番号374)、TAR2h-36 (配列番号375)、TAR2h-37 (配列番号376)、TAR2h-38 (配列番号377)、TAR2h-39 (配列番号378)、TAR2h-40 (配列番号379)、TAR2h-41 (配列番号380)、TAR2h-42 (配列番号381)、TAR2h-43 (配列番号382)、TAR2h-44 (配列番号383)、TAR2h-45 (配列番号384)、TAR2h-47 (配列番号385)、TAR2h-48 (配列番号386)、TAR2h-50 (配列番号387)、TAR2h-51 (配列番号388)、TAR2h-66 (配列番号389)、TAR2h-67 (配列番号390)、TAR2h-68 (配列番号391)、TAR2h-70 (配列番号392)、TAR2h-71 (配列番号393)、TAR2h-72 (配列番号394)、TAR2h-73 (配列番号395)、TAR2h-74 (配列番号396)、TAR2h-75 (配列番号397)、TAR2h-76 (配列番号398)、TAR2h-77 (配列番号399)、TAR2h-78 (配列番号400)、TAR2h-79 (配列番号401)、およびTAR2h-15 (配列番号431)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約90％相同であるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２０】
さらなる実施形態において、リガンドまたはdAb単量体は、TAR2h-131-8 (配列番号433)、TAR2h-131-24 (配列番号434)、TAR2h-15-8 (配列番号435)、TAR2h-15-8-l (配列番号436)、TAR2h-l5-8-2 (配列番号437)、TAR2h-l85-23 (配列番号438)、TAR2h-154-10-5 (配列番号439)、TAR2h-14-2 (配列番号440)、TAR2h-151-8 (配列番号441)、TAR2h-152-7 (配列番号442)、TAR2h-35-4 (配列番号443)、TAR2h-154-7 (配列番号444)、TAR2h-80 (配列番号445)、TAR2h-81 (配列番号446)、TAR2h-82 (配列番号447)、TAR2h-83 (配列番号448)、TAR2h-84 (配列番号449)、TAR2h-85 (配列番号450)、TAR2h-86 (配列番号451)、TAR2h-87 (配列番号452)、TAR2h-88 (配列番号453)、TAR2h-89 (配列番号454)、TAR2h-90 (配列番号455)、TAR2h-91 (配列番号456)、TAR2h-92 (配列番号457)、TAR2h-93 (配列番号458)、TAR2h-94 (配列番号459)、TAR2h-95 (配列番号460)、TAR2h-96 (配列番号461)、TAR2h-97 (配列番号462)、TAR2h-99 (配列番号463)、TAR2h-100 (配列番号464)、TAR2h-101 (配列番号465)、TAR2h-102 (配列番号466)、TAR2h-103 (配列番号467)、TAR2h-104 (配列番号468)、TAR2h-105 (配列番号469)、TAR2h-106 (配列番号470)、TAR2h-107 (配列番号471)、TAR2h-108 (配列番号472)、TAR2h-109 (配列番号473)、TAR2h-l10 (配列番号474)、TAR2h-l11 (配列番号475)、TAR2h-l12 (配列番号476)、TAR2h-l13 (配列番号477)、TAR2h-l14 (配列番号478)、TAR2h-l15 (配列番号479)、TAR2h-116 (配列番号480)、TAR2h-117 (配列番号481)、TAR2h-118 (配列番号482)、TAR2h-l19 (配列番号483)、TAR2h-120 (配列番号484)、TAR2h-121 (配列番号485)、TAR2h-122 (配列番号486)、TAR2h-123 (配列番号487)、TAR2h-124 (配列番号488)、TAR2h-125 (配列番号489)、TAR2h-126 (配列番号490)、TAR2h-127 (配列番号491)、TAR2h-128 (配列番号492)、TAR2h-129 (配列番号493)、TAR2h-130 (配列番号494)、TAR2h-131 (配列番号495)、TAR2h-132 (配列番号496)、TAR2h-133 (配列番号497)、TAR2h-151 (配列番号498)、TAR2h-152 (配列番号499)、TAR2h-153 (配列番号500)、TAR2h-154 (配列番号501)、TAR2h-159 (配列番号502)、TAR2h-165 (配列番号503)、TAR2h-166 (配列番号504)、TAR2h-168 (配列番号505)、TAR2h-171 (配列番号506)、TAR2h-172 (配列番号507)、TAR2h-173 (配列番号508)、TAR2h-174 (配列番号509)、TAR2h-176 (配列番号510)、TAR2h-178 (配列番号511)、TAR2h-201 (配列番号512)、TAR2h-202 (配列番号513)、TAR2h-203 (配列番号514)、TAR2h-204 (配列番号515)、TAR2h-185-25 (配列番号516)、TAR2h-154-10 (配列番号517)、およびTAR2h-205 (配列番号627)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約90％相同であるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２１】
本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1)と結合してTNFR1からのシグナル伝達を阻害する腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1)のアンタゴニストに関し、該アンタゴニストはTNFαのTNFR1への結合を阻害しないものである。ある実施形態において、前記アンタゴニストは第1のドメイン抗体(dAb)単量体と第2のdAb単量体を含んでなり、第1のdAb単量体はドメイン1、ドメイン2、ドメイン3およびドメイン4からなる群より選択されるTNFR1のドメインと結合し、第2のdAb単量体はドメイン1、ドメイン2、ドメイン3およびドメイン4からなる群より選択されるTNFR1のドメインと結合し、また、前記アンタゴニストは標準的L929細胞毒性アッセイまたは標準的HeLa IL-8アッセイにおいて約1μMの濃度で存在するときTNFR1に対しアゴニスト作用を持たない。
【００２２】
ある実施形態において、本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1)と結合してTNFR1からのシグナル伝達を阻害するドメイン抗体(dAb)単量体またはdAbを含むリガンドであり、該dAb単量体はTNFαのTNFR1への結合を阻害しないものである。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1)と結合するドメイン抗体(dAb)単量体またはdAbを含むリガンドであり、該dAbはTNFR1のドメイン1と結合し、かつマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合するか、またはヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合するものである。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、腫瘍壊死因子レセプター１(TNFR1)と結合するドメイン抗体(dAb)単量体またはdAbを含むリガンドであり、該dAbはTNFR1のドメイン3と結合し、かつヒトTNFR1との結合についてTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合するものである。
【００２５】
本発明はまた、慢性炎症性疾患を治療し、抑制し、または予防するのに有効である、TNFR1に対する結合特異性を有する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。ある実施形態では、該抗体またはその抗原結合フラグメントが一価の抗原結合フラグメントである。
【００２６】
本発明はまた、TNFR1に対する結合特異性を有して、TNFR1介在シグナル伝達を阻害するが、TNFαのTNFR1への結合を実質的に阻害しないdAb単量体、およびdAb単量体を含むリガンドを提供する。ある実施形態では、dAb単量体が細胞表面上にあるTNFR1のTNFα誘導架橋またはクラスター化を阻害する。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のリガンドをコードする単離されたおよび/または組換え核酸分子、ならびに該組換え核酸分子を含むベクターを提供する。また、本発明の組換え核酸分子またはベクターを含む宿主細胞、ならびにリガンドの生産方法も提供される。
【００２８】
本発明はまた、本発明のアンタゴニストまたはリガンド、および薬理的に、生理的に、もしくは製薬上許容される担体を含有する医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明はまた、疾患または障害（例えば、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、敗血症性ショック）を治療し、抑制し、または予防する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療に有効な量または用量の本発明のアンタゴニストまたはリガンドを投与することを含んでなる上記方法に関する。
【００３０】
本発明はまた、治療または診断に使用するための本発明のアンタゴニストまたはリガンド、ならびに本明細書に記載の疾患または障害（例えば、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、敗血症性ショック）を治療し、抑制し、または予防する医薬の製造における、本発明のアンタゴニストまたはリガンドの使用に関する。その他の実施形態では、前記疾患が嚢胞性線維症または重症ステロイド抵抗性喘息でありうる。
【００３１】
本発明はさらに、活性成分として本発明のアンタゴニストまたはリガンドを含有する、本明細書に記載の疾患または障害（例えば、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、敗血症性ショックであり、他の実施形態では、前記疾患が嚢胞性線維症または重症ステロイド抵抗性喘息である）を治療し、抑制し、または予防するための医薬組成物に関する。
【００３２】
TNFR1に対する結合特異性を有する単一可変ドメインまたはドメイン抗体(dAb)、ならびにこれらの単一可変ドメインまたはdAbを含むリガンドはいくつかの利点を有する。例えば、本明細書に記載する、TNFR1に対する結合特異性を有する単一可変ドメインまたはdAbは、TNFR1に対しアンタゴニスト作用を持つ。したがって、本発明の抗TNFR1免疫グロブリン単一可変ドメインまたはdAbを含む治療剤は、TNFR2と結合しかつ/またはそれに拮抗することにより引き起こされる副作用（例えば、免疫抑制）のリスクを実質的に低下させて、（治療、診断または予防のために）投与することができる。ENBREL（登録商標）(entarecept; Immunex Corporation)のような、TNFαを標的とする治療剤はTNFR1とTNFR2に対してアンタゴニスト作用を持ち、そのような薬剤を投与すると、免疫抑制や関連した副作用（例えば、重症の感染症）が生じることがある。こうした副作用は、特にそのような薬剤の長期投与を必要とする慢性疾患での、該薬剤の使用を制限しうる(Kollias G. および Kontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev., 73(4-5):315-321 (2002))。これに対して、本発明のリガンドはTNFR1に特異的なアンタゴニスト作用を持つので、副作用のリスクを低減させながら長期にわたって常習的にそれらを投与することができ、炎症性症状および慢性の炎症性症状（炎症性腸疾患や関節炎のような、炎症の静止期と活動期により特徴づけられる長期持続疾患を含む）の治療に効果がある。
【００３３】
発明の詳細な説明
本明細書においては、明瞭かつ簡潔な説明を可能にする様態で実施形態が記載されているが、本発明から逸脱することなく実施形態を種々に組合せ又は分離することが可能であると意図され、そのように理解されるであろう。
【００３４】
定義
「相補的」
2つの免疫グロブリンドメインが「相補的」であるのは、それらが、コグネイトペアまたは群を形成する構造のファミリーに属する場合、またはそのようなファミリーに由来しこの特徴を保持する場合である。例えば、抗体のVHドメインおよびVLドメインは相補的であり、2つのVHドメインは相補的ではなく、2つのVLドメインは相補的ではない。相補的ドメインは、T細胞レセプターのVαおよびVβ（またはγおよびδ）ドメインのような、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーにおいても見出されうる。本発明の第2の形態においては、非相補的ドメインは標的分子に協同的には結合せず、同一または異なる分子上に存在しうる異なる標的エピトープに独立して作用する。人工的なドメイン、例えば、エピトープに結合するよう操作しない限りエピトープに結合しないタンパク質スカフォールドに基づくドメインは、非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメインに基づく2つのドメインは相補的ではない。
【００３５】
「免疫グロブリン」
これは、2つのβシートと通常は保存ジスルフィド結合とを含有する、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを保有するポリペプチドのファミリーを意味する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、in vivoにおける細胞および非細胞相互作用の多数の態様、例えば、免疫系における広範な役割（例えば、抗体、T細胞レセプター分子など）、細胞接着への関与（例えば、ICAM分子）および分子内シグナリング（例えば、PDGFレセプターなどのレセプター分子）に関与している。本発明は、結合ドメインを有する全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。好ましくは、本発明は抗体に関する。
【００３６】
「組合せ（合体）」
本発明の可変ドメインは、ドメイン群を形成するよう組合される。例えば、相補的ドメインを組合せる（合体させる）ことが可能であり、例えば、VLドメインをVHドメインと組合せることが可能である。非相補的ドメインを組合せることも可能である。ドメインは、共有的または非共有的手段によるドメインの連結を含む多数の方法で組合せることが可能である。
【００３７】
「ドメイン」
ドメインは、折りたたまれたタンパク質構造体であり、該タンパク質の残部に無関係にその三次元構造を保有する。一般には、ドメインは、タンパク質の、分離した機能特性をもたらし、多くの場合、該タンパク質の残部および／または該ドメインの機能の喪失を伴うことなく付加され、除去され、または他のタンパク質に移されうる。単一抗体可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、それは、完全な抗体可変ドメイン、および修飾された可変ドメイン（この場合、例えば、1以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により、あるいは末端切断型の又はNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメインにより置換されている）、ならびに完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも部分的に保有する、可変ドメインの折りたたまれた断片を含む。
【００３８】
「レパートリー」
多様な変異体（例えば、一次配列において異なるポリペプチド変異体）の集団。本発明で使用するライブラリーは、少なくとも1000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを含む。
【００３９】
「ライブラリー」
ライブラリーなる語は、不均一なポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリーは、各メンバーが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有する複数のメンバーから構成される。この範囲においては、ライブラリーはレパートリーと同義である。ライブラリーメンバー間の配列相違は、ライブラリーに存在する多様性をもたらす。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとることが可能であり、あるいは核酸のライブラリーで形質転換された生物または細胞の形態（例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞など）でありうる。好ましくは、各個の生物または細胞は、ただ1つの又は限られた数のライブラリーメンバーを含有する。有利には、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、該核酸を発現ベクター内に組込む。したがって、好ましい態様においては、ライブラリーは、宿主生物（各生物は、対応するポリペプチドメンバーを産生するように発現されうる核酸形態のライブラリーの単一メンバーを含有する発現ベクターのコピーの1以上を含有する）の集団の形態をとりうる。したがって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有する。
【００４０】
「閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンド」は、本明細書中で定義されている少なくとも2つのエピトープ結合ドメインを含む、本明細書中で定義されている多重特異性リガンドを示す。「閉じたコンフォメーション」（の多重特異性リガンド）は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合がもう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合するよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが配置されていることを意味する。すなわち、コグネイトエピトープは、各エピトープ結合ドメインによって、同時にではなく、個別に結合されうる。該リガンドの閉じたコンフォメーションは、本明細書に記載の方法を用いて得ることが可能である。
【００４１】
「抗体」
抗体（例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE）またはフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、閉じたコンフォメーションの多重特異性抗体、ジスルフィド連結scFv、ジアボディ）であり、抗体を天然で産生する種に由来するのか、組換えDNA技術により作製されたかには無関係であり、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌のいずれから単離されたかにも無関係である。
【００４２】
「二重特異性リガンド」
本明細書中で定義されている第1免疫グロブリン単一可変ドメインと第2免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むリガンドであり、それらの可変領域は、2つの異なる抗原へ、または単一特異性免疫グロブリンによっては通常は結合されない、同一抗原上の2つのエピトープへ結合しうる。例えば、それらの2つのエピトープは同一ハプテン上に存在しうるが、同一エピトープではなく、単一特異性リガンドによって結合されるのに十分な程度には接近し合っていない。本発明の二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する可変ドメインから構成され、同一特異性を有する相互相補的可変ドメインペアを含有しない。
【００４３】
「抗原」
本発明のリガンドにより結合される分子。典型的には、抗原は抗体リガンドにより結合され、in vivoで抗体応答を引き起こしうる。それはポリペプチド、タンパク質、核酸または他の分子でありうる。一般に、本発明の二重特異性リガンドは特定の抗原に対する標的特異性に関して選択される。通常の抗体およびそのフラグメントの場合には、可変ループ（L1、L2、L3およびH1、H2、H3）により定められる抗体結合部位が抗原に結合しうる。
【００４４】
「エピトープ」
免疫グロブリンVH/VLペアにより通常結合される構造単位。エピトープは抗体に対する最小結合部位を定め、したがって、抗体の特異性の標的に相当する。単一ドメイン抗体の場合には、エピトープは、分離した可変ドメインにより結合される構造単位に相当する。
【００４５】
「ジェネリック（generic）リガンド」
レパートリーの全てのメンバーに結合するリガンド。一般には、前記の抗原結合部位を介して結合するものではない。非限定的な具体例には、プロテインA、プロテインLおよびプロテインGが含まれる。
【００４６】
「選択」
スクリーニングにより誘導されるか、あるいはダーウィン的淘汰過程により誘導され、この場合、ドメインと抗原またはエピトープとの間で、あるいは抗体と抗原またはエピトープとの間で結合相互作用が生じる。したがって、第1可変ドメインは、相補的可変ドメインの存在下または非存在下の抗原またはエピトープへの結合に関して選択されうる。
【００４７】
「普遍的（universal）フレームワーク」
Kabat（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）により定められた配列において保存された抗体の領域に対応する、あるいはChothiaおよびLesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917により定められたヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列。本発明は、超可変領域のみにおける変異により実質的に任意の結合特異性の誘導を可能にすることが判明している単一フレームワークまたはそのようなフレームワークのセットの使用を提供する。
【００４８】
「半減期」
リガンドの血清中濃度が、例えば、自然メカニズムによるリガンドのクリアランスもしくは隔離および／またはリガンドの分解により、in vivoにおいて50％減少するのに要する時間。本発明のリガンドはin vivoにおいて安定化され、その半減期は、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抗する分子への結合により延長される。典型的には、そのような分子は、それ自体がin vivoにおいて長い半減期を有する天然に存在するタンパク質である。リガンドの機能活性が、該半減期延長性分子に特異的ではない同様のリガンドより長時間にわたりin vivoにおいて持続した場合、リガンドの半減期が延長されたといえる。したがって、HSAおよび標的分子に特異的なリガンドを、HSAに対する特異性が存在せずHSAに結合しないが別の分子には結合する同じリガンドと比較する。例えば、それは、標的分子上のもう1つのエピトープに結合しうる。典型的には、半減期は、10％、20％、30％、40％、50％またはそれ以上延長される。2×、3×、4×、5×、10×、20×、30×、40×、50×またはそれ以上の範囲の半減期の延長が可能である。その代わりに又はそれに加えて、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、150×までの範囲の半減期の延長が可能である。
【００４９】
「均一イムノアッセイ」
結合した又は未結合の試薬を分離する工程を要することなくアナライトを検出するイムノアッセイ。
【００５０】
「実質的に同一（または「実質的に相同」）」
第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一の又は同等（例えば、類似の側鎖、例えば、保存されたアミノ酸置換を有するもの）の十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含有していて、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が類似活性を有すること。抗体の場合、第2の抗体は、同じ結合特異性を有し、その親和性の少なくとも50％を有する。
【００５１】
本明細書中で用いる「低いストリンジェンシー」、「中等度のストリンジェンシー」、「高いストリンジェンシー」または「非常に高いストリンジェンシーの条件」なる語は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を示す。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。その参考文献には水性および非水性方法が記載されており、いずれを使用することも可能である。本明細書中で言及する特定のハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：（1）約45℃で、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中の低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、少なくとも50℃（低いストリンジェンシーの条件では、該洗浄の温度を55℃まで上昇させることが可能である）で、0.2×SSC、0.1％ SDS中の2回の洗浄；（2）約45℃で、6×SSC中の中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、60℃で、0.2×SSC、0.1％ SDS中の1回以上の洗浄；（3）約45℃で、6×SSC中の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、65℃で、0.2×SSC、0.1％ SDS中の1回以上の洗浄；ならびに好ましくは（4）約65℃で、0.5M リン酸ナトリウム、7％ SDS中の非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、65℃で0.2×SSC、1％ SDS中の1回以上の洗浄。非常に高いストリンジェンシー条件（4）が、好ましい条件であり、特に示さない限り用いるべき条件である。
【００５２】
本明細書中で定義されている「閉じたコンフォメーション」（の多重特異性リガンド）は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合が、もう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合するよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが、場合によってはタンパク質骨格により、互いに結合または会合していることを意味する。すなわち、コグネイトエピトープは、各エピトープ結合ドメインによって、同時にではなく、個別に結合されうる。該リガンドの、閉じたコンフォメーションは、本明細書に記載の方法を用いて得ることが可能である。
【００５３】
「開いたコンフォメーション」は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合が、もう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合しないよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが、場合によってはタンパク質骨格により、互いに結合または会合していることを意味する。
【００５４】
本明細書で用いる「競合」なる語は、1つのエピトープのそのコグネイトエピトープ結合ドメインへの結合が、もう1つのエピトープがそのコグネイトエピトープ結合ドメインに結合した場合に抑制されることを意味する。例えば、結合は、立体的に、例えば結合ドメインの物理的遮断により、あるいは結合ドメインの構造または環境の変化により抑制されて、エピトープに対するその親和性または結合活性が減少しうる。
【００５５】
「免疫グロブリン単一可変ドメイン」なる語は、他のV領域またはドメインには無関係に、抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体可変領域（VH, VHH, VL）を意味する。しかし、本明細書中でこの語を用いる場合、免疫グロブリン単一可変ドメインは、他の可変領域または可変ドメインを伴うフォーマット（例えば、ホモ-またはヘテロ-多量体）で存在することが可能であり、この場合、その、他の領域またはドメインは、該単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合には要求されない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは、追加的な可変ドメインには無関係に、抗原に結合する）。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチド配列の単量体の1以上を含む、より大きなポリペプチドをも包含する。「ドメイン抗体」または「dAb」は、本明細書中で用いる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」ポリペプチドと同じである。本明細書中で用いる免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドは哺乳類（好ましくはヒト）免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドを意味するが、げっ歯類（例えば、WO 00/29004（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているもの）またはラクダ科動物VHH dAbをも含む。ラクダ科動物dAbは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドであり、天然では軽鎖を欠く重鎖抗体VHHを含む。VHH分子はIgG分子より約10倍小さく、単一ポリペプチドとして、それは非常に安定であり、極端なpHおよび温度条件に耐える。
【００５６】
本明細書中で用いる「腫瘍壊死因子レセプター1（TNFR1）のアンタゴニスト」なる語は、TNFR1に結合しTNFR1の機能の1以上を抑制しうる物質（例えば、分子、化合物）を意味する。例えば、TNFR1のアンタゴニストはTNFR1へのTNFαの結合を抑制し、および／または、TNFR1により媒介されるシグナル伝達を抑制しうる。したがって、TNFR1媒介過程および細胞性応答（例えば、標準的なL929細胞毒性アッセイにおけるTNFα誘導性細胞死）がTNFR1のアンタゴニストで抑制されうる。TNFR1のアンタゴニストは、例えば、小さな有機分子、天然物、タンパク質、ペプチドまたはペプチド類似体でありうる。TNFR1のアンタゴニストは、例えば、Chemical Repository of the National Cancer Instituteのような、分子のライブラリーまたは集合体を、本明細書に記載のようにあるいは他の適当な方法を用いてスクリーニングすることにより特定されうる。好ましいTNFR1アンタゴニストは、抗体、抗体の抗原結合性フラグメント、リガンドおよびdAb単量体（本明細書に記載されているもの）である。
【００５７】
本明細書に開示されている配列に類似した又は相同な（例えば、少なくとも約70％の配列同一性の）配列も本発明の一部である。いくつかの実施形態においては、アミノ酸レベルでの配列同一性は約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。核酸レベルでは、配列同一性は約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。あるいは、核酸断片が選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下で該鎖の相補体にハイブリダイズする場合に、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞、細胞ライセート、または部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態中に存在しうる。
【００５８】
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（これらの用語は本明細書中では互換的に用いられる）の計算は以下のとおりに行う。それらの配列を、最適な比較を目的として整列（アライン）させる（例えば、最適なアライメントのために、第1および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較のために非相同配列を無視することが可能である）。好ましい実施形態においては、比較のために整列させる参照配列の長さは該参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。ついで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列内の或る位置が第2配列内の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、それらの分子はその位置において同一である（本明細書中で用いるアミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同意義である）。それらの2つの配列間の同一性（％）は、それらの2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００５９】
有利には、配列アライメントには、デフォルト値に設定されたパラメーターでBLASTアルゴリズム（バージョン2.0）を使用する。BLASTアルゴリズムは、ワールド・ワイド・ウェブ・サイト（“www”）National Center for Biotechnology Information（“.ncbi”）National Institutes of Health（“nih”）米国政府（“.gov”）の“/Blast/”ディレクトリーの“blast_help.html”ファイルに詳細に記載されている。検索パラメーターは以下のとおりに定められ、有利には、定められているデフォルトパラメーターに設定される。
【００６０】
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8（前記の“blast_help.html”ファイルを参照されたい）の統計的方法を若干改善させて用いて、それらが発見したもに対して有意性を割り当てる。BLASTプログラムは、例えば問合せ配列のホモログを特定するための配列類似性検索に応用された。それらのプログラムは、一般には、モチーフ形態の検索には有用でない。配列データベースの類似性検索における基本的問題の考察には、Altschulら (1994)を参照されたい。National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトにおいて入手可能なそれらの5つのBLASTプログラムは以下のタスクを実行する。
【００６１】
「blastp」はタンパク質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較する。「blastn」はヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列を比較する。「blastx」はタンパク質配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列（両鎖）の6フレームの概念上の翻訳産物を比較する。「tblastn」は、全6リーディングフレーム（両鎖）における動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質問合せ配列を比較する。「tblastx」はヌクレオチド配列データベースの6フレームの翻訳に対してヌクレオチド問合せ配列の6フレームの翻訳を比較する。
【００６２】
BLASTは以下の検索パラメーターを使用する。HISTOGRAMは、各検索に関するスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトはyesである（BLASTマニュアル中のパラメーターHを参照されたい）。
【００６３】
DESCRIPTIONSは、報告されたマッチ配列の短い記述の数を、指定された数に限定する；デフォルト限界は100の記述である（該マニュアルベージのパラメーターVを参照されたい）。EXPECTおよびCUTOFFも参照されたい。
【００６４】
ALIGNMENTSは、データベース配列を、ハイスコアリングセグメントペア（HSP）が報告されている指定された数に限定する；デフォルト限界は50である。これを超えるデータベース配列がたまたま、報告に関する統計的有意性閾値を満たす場合には（後記のEXPECTおよびCUTOFFを参照されたい）、最大統計的有意性に帰されるマッチのみが報告される（BLASTマニュアルのパラメーターBを参照されたい）。
【００６５】
EXPECTは、データベース配列に対するマッチの報告に関する統計的有意性閾値であり、デフォルト値は10であり、これはKarlinおよびAltschul (1990)の確率論的モデルによると10個のマッチが単に偶然見出されると予想されるというものである。マッチに帰される統計的有意性がEXPECT閾値より大きい場合には、該マッチは報告されない。より低いEXPECT閾値は、よりストリンジェントであり、より少ない偶然のマッチの報告につながる。分数（fractional）値は許容される（BLASTマニュアル中のパラメーターEを参照されたい）。
【００６６】
CUTOFFは、ハイスコアリングセグメントペアの報告に関するスコアをカットオフする。デフォルト値はEXPECT値（前記を参照されたい）から計算される。HSPは、それに帰される統計的有意性が、CUTOFF値に等しいスコアを有する単独のHSPに帰されるものと少なくとも同等に高い場合にのみ、データベース配列に関して報告される。より高いCUTOFF値は、よりストリンジェントであり、より少ない偶然のマッチの報告につながる（BLASTマニュアル中のパラメーターSを参照されたい）。典型的には、有意性閾値は、EXPECTを使用して、より直観的に処理されうる。
【００６７】
MATRIXは、BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXのための代替的（alternate）スコアリングマトリックスを指定する。デフォルトマトリックスはBLOSUM62（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22):10915-9）である。妥当な代替的選択には、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが含まれる。BLASTNには、代替的スコアリングマトリックスは利用できない。BLASTN要求において指示的なMATRIXを指定すると、エラー応答が返ってくる。
【００６８】
STRANDは、TBLASTN検索をデータベース配列の最上または最下鎖のみに限定し、あるいはBLASTN、BLASTXまたはTBLASTX検索を問合せ配列の最上または最下鎖上のリーディングフレームのみに限定する。
【００６９】
FILTERは、Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のSEGプログラムにより測定した場合に低い組成複雑性を有する問合せ配列のセグメント、あるいはClaverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201のXNUプログラムにより測定した場合またはBLASTNではTatusovおよびLipman（NCBIのワールド・ワイド・ウェブ・サイトを参照されたい）のDUSTプログラムにより測定した場合に短周期性内部反復よりなるセグメントをマスクする。フィルタリングは、統計的には有意だが生物学的には関心の無い報告（例えば、一般的な酸性、塩基性またはプロリンリッチ領域に対するヒット）をblast出力から排除して、データベース配列に対する特異的マッチに関して、問合せ配列のより生物学的に関心のある領域を利用可能なように残しうる。
【００７０】
フィルタープログラムにより見出された低い複雑性の配列は、ヌクレオチド配列においては「N」の文字（例えば、13回反復する「N」）およびタンパク質配列においては「X」の文字（例えば、9回反復する「X」）を使用して置換される。
【００７１】
フィルタリングは問合せ配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTNではDUST、他のプログラムではSEGである。
【００７２】
SWISS-PROTにおける配列への適用では、SEG、XNUまたはそれらの両方により何も全くマスクされないことは珍しいことではない。したがって、フィルタリングが常に有効であると期待すべきではない。さらに、場合によっては、配列の全体がマスクされ、これは、フィルターされていない問合せ配列に対して報告されたいずれかのマッチの統計的有意性が疑わしいことを示している。
【００７３】
NCBI-giは、アクセッションおよび／または遺伝子座名に加えてNCBI gi識別子が出力中に示されるようにする。
【００７４】
最も好ましくは、配列比較は、前記のNCBIワールド・ワイド・ウェブ・サイトの“/BLAST”ディレクトリにおいて提供される簡便なBLAST検索アルゴリズムを使用して行う。
【００７５】
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における当業者）により一般に理解されているのと同じ意義を有する。分子的、遺伝的および生化学的方法（全般的には、参照により本明細書に組み入れるSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）ならびに化学的方法には、標準的な技術を用いる。
【００７６】
TNFR1は、リガンドに結合する細胞外領域と、内因性シグナル伝達活性を欠くがシグナル伝達分子に結合しうる細胞内ドメインとを含有する膜貫通型レセプターである。TNFR1と結合TNFとの複合体は3本のTNFR1鎖および3本のTNF鎖を含有する（Bannerら, Cell, 73(3) 431-445 (1993)）。TNFリガンドは三量体として存在し、それは3本のTNFR1鎖に結合する（同誌）。その3本のTNFR1鎖は、レセプター-リガンド複合体において互いに密接にクラスター化され、このクラスタリングはTNFR1媒介シグナル伝達の前提条件である。実際、TNFR1に結合する多価物質（例えば、抗TNFR1抗体）は、TNFの非存在下、TNFR1クラスタリングおよびシグナル伝達を誘導することが可能であり、一般にはTNFR1アゴニストとして使用される（例えば、Belkaら, EMBO, 14(6):1156-1165 (1995); Mandik-Nayakら, J. Immunol, 167:1920-1928 (2001)を参照されたい）。したがって、TNFR1に結合する多価物質は一般には、それがTNFR1へのTNFαの結合を遮断する場合であっても、TNFR1の有効なアンタゴニストではない。
【００７７】
TNFR1の細胞外領域は13アミノ酸のアミノ末端セグメント（配列番号603のアミノ酸1-13（ヒト）、配列番号604のアミノ酸1-13（マウス））、ドメイン1（配列番号603のアミノ酸14-53（ヒト））、配列番号604のアミノ酸14-53（マウス）、ドメイン2（配列番号603のアミノ酸54-97（ヒト）、配列番号604のアミノ酸54-97（マウス））、ドメイン3（配列番号603のアミノ酸98-138（ヒト）、配列番号604のアミノ酸98-138（マウス））、およびドメイン4（配列番号603のアミノ酸139-167（ヒト）、配列番号604のアミノ酸139-167（マウス））およびそれに続く膜近位領域（配列番号603のアミノ酸168-182（ヒト）、配列番号604のアミノ酸168-183（マウス））を含む（Bannerら, Cell 73(3) 431-445 (1993)およびLoetscherら, Cell 61(2) 351-359 (1990)を参照されたい）。ドメイン2および3は結合リガンド（TNFβ、TNFα）と接触する（Bannerら, Cell, 73(3) 431-445 (1993)）。TNFR1の細胞外領域は、プレリガンド結合アセンブリードメインまたはPLADドメインと称される領域（配列番号603のアミノ酸1-53（ヒト）、配列番号604のアミノ酸1-53（マウス））をも含有する（The Government of the USA, WO 01/58953; Dengら, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm1304 (2005)）。
【００７８】
TNFR1は、ドメイン4における又は膜近位領域（配列番号603のアミノ酸168-182、配列番号604のアミノ酸168-183）におけるTNFR1のタンパク質分解を含む過程によりin vivoで細胞の表面から遊離して、TNFR1の可溶性形態を与える。可溶性TNFR1はTNFαへの結合能を保有し、それにより、TNFαの活性の内因性インヒビターとして機能する。
【００７９】
本発明は、TNFR1に結合するがTNFR1への結合に関してTNFとは競合しない抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドに関する。例えば、該抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドはTNFR1のドメイン1またはTNFR1のドメイン4に結合しうる。そのような抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドは診断剤としての利点を有することがあり、サンプル中のTNFR1に結合させ該TNFR1を検出し、定量し、または測定するために使用することが可能であるが、TNFR1への結合に関してサンプル中のTNFと競合しないであろう。したがって、TNFR1がサンプル中に存在するかどうか又はサンプル中のTNFR1の量の正確な測定を行うことが可能である。いくつかの実施形態においては、TNFR1に結合するがTNFR1への結合に関してTNFと競合しない抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドは、本明細書に記載のTNFR1のアンタゴニストである。
【００８０】
本発明はまた、TNFR1に結合するがTNFR1への結合に関してTNFと競合しない抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドと、使用のための（例えば、サンプル中のTNFR1の存在および／または量を測定するための）説明書とを含んでなる、サンプル中にTNFR1が存在するかどうか又はサンプル中のTNFR1の存在量を測定するための診断用キットに関する。いくつかの実施形態においては、該キットは更に、1以上の補助試薬、例えば、適当なバッファーまたは適当な検出試薬（例えば、TNFR1に結合するがTNFR1への結合に関してTNFと競合しない抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドに結合する、検出可能な様態で標識された抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。
【００８１】
本発明はまた、TNFR1に結合するがTNFR1への結合に関してTNFと競合しない抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドが固体表面上に固定化されていて、該固定化抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドがTNFR1に結合するようにされている該固体表面を含んでなる装置に関する。抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドが固体化されうる任意の適当な固体表面、例えばガラス、プラスチック、炭水化物（例えば、アガロースビーズ）を使用することが可能である。所望により、該支持体は、該抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、dAb）またはリガンドの固定化を促進する所望の官能基を含有し又は含有するよう修飾されうる。該装置および／または支持体は任意の適当な形状、例えばシート、ロッド、ストリップ、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、ゲル、チューブ、球体、チップ、プレートまたはディッシュなどを有しうる。いくつかの実施形態においては、該装置はディップスティックである。
【００８２】
本発明は、腫瘍壊死因子レセプター1（TNFR1、p55、CD120a）に対する結合特異性を有する、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、本明細書に記載のリガンド）に関する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは腫瘍壊死因子2（TNFR2）に対する結合特異性を有さず、あるいは実質的にTNFR2に対しアンタゴニスト作用をもたない。TNFR1のアンタゴニストが実質的にTNFR2に対しアンタゴニスト作用をもたないのは、該アンタゴニスト（1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μMまたは100μM）が、標準的な細胞アッセイにおいてTNFα（100pg/ml）により誘導されるTNFR2媒介活性の、せいぜい約5％の抑制を引き起こすに過ぎない場合である。TNFR1の特に好ましいアンタゴニストは、慢性炎症疾患を治療するのに有効である（効果的である、治療効力を有する）治療物質である。例えば、いくつかの実施形態においては、TNFR1のアンタゴニストは、慢性炎症疾患のモデル、例えばマウスコラーゲン誘発性関節炎モデル、関節炎のマウスΔAREモデル、炎症性腸疾患のマウスデキストラン硫酸誘発性モデル、炎症性腸疾患のマウスΔAREモデル、慢性閉塞性肺疾患のマウス煙草煙モデルまたは適当な霊長類モデル（例えば、霊長類コラーゲン誘発性関節炎）において有効である。
【００８３】
TNFR1のアンタゴニストは一価または多価でありうる。いくつかの実施形態においては、該アンタゴニストは一価であり、TNFR1と相互作用する1つの結合部位を含有する。一価アンタゴニストは1つのTNFR1に結合するものであり、レセプター活性化およびシグナル伝達を引き起こしうる細胞表面上のTNFR1の架橋またはクラスタリングを誘導しない。特定の実施形態においては、TNFR1の一価アンタゴニストはTNFR1のドメイン1に結合する。より特定の実施形態においては、TNFR1の一価アンタゴニストはTNFR1のドメイン1に結合し、マウスTNFR1への結合に関してTAR2m-21-23と競合するか又はヒトTNFR1への結合に関してTAR2h-205と競合する。
【００８４】
他の実施形態においては、TNFR1のアンタゴニストは多価である。TNFR1の多価アンタゴニストはTNFR1に対する特定の結合部位のコピーの2以上を含有するか、またはTNFR1に結合する2以上の異なる結合部位を含有しうる。例えば、本明細書に記載されているとおり、TNFR1のアンタゴニストは、TNFR1に結合する特定のdAbのコピーの2以上、またはTNFR1に結合する2以上の異なるdAbを含む二量体、三量体または多量体でありうる。好ましくは、TNFR1の多価アンタゴニストは標準的な細胞アッセイにおいて実質的にTNFR1に対しアゴニスト作用をもたない（すなわち、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM、100μM、1000μMまたは5,000μMの濃度で存在する場合に、該アッセイにおいてTNFα（100pg/ml）により誘導されるTNFR1媒介活性のせいぜい約5％をもたらすに過ぎない）。
【００８５】
ある実施形態においては、TNFR1の多価アンタゴニストはTNFR1の所望のエピトープまたはドメインに対する2以上の結合部位を含有する。例えば、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1内の同じエピトープに結合する2以上の結合部位を含みうる。
【００８６】
他の実施形態においては、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1の異なるエピトープまたはドメインに結合する2以上の結合部位を含有する。1つの例においては、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1内の第1エピトープに結合する第1結合部位と、ドメイン1内の第2の異なるエピトープに結合する第2結合部位とを含む。他の例においては、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1の所望のエピトープまたはドメインの2以上に結合する結合部位を含みうる。例えば、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1および2、ドメイン1および3、ドメイン1および4、ドメイン2および3、ドメイン2および4、またはドメイン3および4に対する結合部位を含みうる。例えば、TNFR1の多価アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1、2および3に対する結合部位、ドメイン1、2および4に対する結合部位、またはドメイン1、3および4に対する結合部位を含みうる。ある実施形態においては、TNFR1のアンタゴニストは、TNFR1のドメイン1に結合するdAbおよびTNFR1のドメイン3に結合するdAbを含む二重特異性リガンドである。好ましくは、そのような多価アンタゴニストは、約1nMまたは約10nMまたは約100nMまたは約1μMまたは約10μMの濃度で存在する場合に、標準的なL929細胞毒性アッセイまたは標準的なHeLa IL-8アッセイ（本明細書に記載のもの）において、TNFR1に対しアゴニスト作用をもたない。
【００８７】
TNFR1のアンタゴニストのいくつかはTNFR1に結合し、TNFR1へのTNFαの結合を抑制する。ある実施形態においては、そのようなTNFR1アンタゴニストはTNFR1のドメイン2および／またはドメイン3に結合する。特定の実施形態においては、該アンタゴニストはTNFR1への結合に関してTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する。
【００８８】
他のリガンド（好ましい実施形態においてはTNFR1のアンタゴニストであるもの）はTNFR1へのTNFαの結合を抑制しない。そのようなリガンド（およびアンタゴニスト）は診断剤としての利点を有する。なぜなら、それらは、サンプル中のTNFR1に結合させ該TNFR1を検出し、定量し、または測定するために使用することが可能であり、TNFR1への結合に関してサンプル中のTNFと競合しないからである。したがって、サンプル中のTNFR1の存在の有無および存在量の正確な測定を行うことが可能である。
【００８９】
TNFR1のアンタゴニストのいくつかはTNFR1へのTNFαの結合を抑制しないが、TNFR1により媒介されるシグナル伝達を抑制する。例えば、TNFR1のアンタゴニストは、TNFR1を介したシグナル伝達に先行するTNFR1のTNFα誘導性クラスタリングを抑制しうる。そのようなアンタゴニストはいくつかの利点を有する。例えば、そのようなアンタゴニストの存在下では、TNFαは、細胞表面上で発現されたTNFR1に結合し、細胞環境から除去されうるが、TNFR1媒介シグナル伝達は活性化されない。したがって、追加的なTNFαおよび他の炎症メディエーターのTNFR1シグナル誘導性産生が抑制されるであろう。同様に、TNFR1に結合しTNFR1媒介シグナル伝達を抑制するがTNFR1へのTNFαの結合を抑制しないTNFR1アンタゴニストは、内因的に産生された可溶性TNFR1のTNFα結合および抑制活性を抑制しないであろう。したがって、そのようなアンタゴニストの投与を要する哺乳動物への該アンタゴニストの投与は、in vivoにおいてTNFαの活性およびTNFR1の活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。本発明はまた、（i）TNFR1（例えば、ドメイン1内のもの）に結合し、（ii）TNFR1媒介シグナル伝達の活性化に拮抗(antagonize)せず、（iii）TNFR1へのTNFαの結合を抑制しないリガンドに関する。そのようなリガンドは可溶性TNFR1に結合し、TNFαへの該可溶性レセプターの結合を妨げず、したがって、そのようなアンタゴニストの投与を要する哺乳動物への該アンタゴニストの投与は、血清中の該可溶性レセプターの半減期を延長させることにより、in vivoにおいてTNFαの活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。これらの利点は、例えばPEG基、血清アルブミン、トランスフェリン、トランスフェリンレセプターもしくは少なくともそのトランスフェリン結合部分、抗体Fc領域の結合により又は抗体ドメインへのコンジュゲートにより、より大きな流体力学サイズを有するようフォーマット化（構成）されたリガンドに関して特に重要である。例えば、i）TNFR1（例えば、ドメイン1内のもの）に結合し、（ii）TNFR1媒介シグナル伝達の活性化に拮抗(antagonize)せず、（iii）TNFR1へのTNFαの
結合を抑制しない物質（例えば、ポリペプチド）、（例えば、dAb単量体）が、抗体の、より大きな抗原結合フラグメントとして、および／または抗体としてフォーマット化（構成）されうる（例えば、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、IgG、scFvとしてフォーマット化されうる）。リガンドの流体力学サイズおよびその血清半減期は、本明細書に記載のとおり（付録1を参照されたい）、in vivoにおける半減期を延長させる抗原またはエピトープに結合する結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）にTNFR1結合物質をコンジュゲートまたは連結させることによっても延長さることが可能である。例えば、TNFR1結合物質（例えば、ポリペプチド）を、抗血清アルブミンまたは抗新生児Fcレセプター抗体または抗体フラグメント、例えば抗SAまたは抗新生児FcレセプターdAb、Fab、Fab'またはscFvに、あるいは抗SAアフィボディ（affibody）または抗新生児Fcレセプターアフィボディ（affibody）にコンジュゲートまたは連結させることが可能である。
【００９０】
本発明のTNFR1結合リガンドにおいて使用するための適当なアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体の具体例はWO 2005/077042A2（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。特に、本発明においては以下のアルブミン、アルブミン断片またはアルブミン変異体を使用することが可能である：
・配列番号1（WO 2005/077042A2に開示されているものであり、この配列を参照により明示的に本開示に組み入れることとする）、
・WO 2005/077042A2中の配列番号１のアミノ酸1-387を含む又はそれよりなるアルブミン断片または変異体、
・（a）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸54-61、（b）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸76-89、（c）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸92-100、（d）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸170-176、（e）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸247-252、（f）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸266-277、（g）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸280-288、（h）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸362-368、（i）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸439-447、（j）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸462-475、（k）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸478-486、および（l）WO 2005/077042A2中の配列番号1のアミノ酸560-566よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体。
【００９１】
本発明のTNFR1結合リガンドにおいて使用するための適当なアルブミン、断片および類似体の他の具体例はWO 03/076567A2（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。特に、本発明においては以下のアルブミン、断片または変異体を使用することが可能である：
・WO 03/076567A2（例えば、図3）に記載のヒト血清アルブミン（この配列情報を参照により明示的に本開示に組み入れることとする）、
・66,500の式分子量を有する585アミノ酸の単一非グリコシル化ポリペプチド鎖よりなるヒト血清アルブミン（HA）（Melounら, FEBS Letters 58:136 (1975); Behrensら, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawnら, Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghettiら, J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)を参照されたい）、
・Weitkampら, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)に記載のアルブミンの多型変異体または類似体または断片、
・EP 322094に記載のアルブミン断片または変異体、例えばHA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369) およびHA(1-419) ならびに1-369および1-419間の断片、
・EP 399666に記載のアルブミン断片または変異体、例えばHA(1-177)およびHA(1-200) ならびにHA(1-X)（ここで、178〜199のXは任意の数）間の断片。
【００９２】
本発明のTNFR1結合リガンドにおいて、1以上の半減期延長部分（例えば、アルブミン、トランスフェリンならびにそれらの断片および類似体）を使用する場合には、任意の適当な方法を用いて、それをコンジュゲートさせることが可能でり、例えば、TNFR1結合部分のNまたはC末端に位置する半減期延長部分を有する単一ポリペプチド鎖としてコードされる融合タンパク質をコードする単一ヌクレオチド構築物を使用することによる例えばTNFR1結合部分（例えば、抗TNFR1 dAbまたは抗体フラグメント）への直接的な融合により、該コンジュゲートさせることが可能である。あるいは、部分間のペプチドリンカー、例えば、WO 03/076567A2またはWO 2004/003019に記載のペプチドリンカー（本発明における使用のための具体例を示すために、これらのリンカーの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を使用することにより、コンジュゲーションを達成することが可能である。
【００９３】
より詳細な実施形態においては、TNFR1に結合しTNFR1媒介シグナル伝達を抑制するがTNFR1へのTNFαの結合を抑制しないTNFR1のアンタゴニストは、TNFR1のドメイン1またはTNFR1のドメイン4に結合する。ある実施形態においては、そのようなTNFR1アンタゴニストは、TNFR1のドメイン1またはTNFR1のドメイン4に結合するdAb単量体またはリガンドである。
【００９４】
特定の実施形態においては、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、dAb単量体またはリガンド）はTNFR1のドメイン1に結合し、TNFαの結合に際してTNFR1により媒介されるシグナル伝達を抑制する。そのようなアンタゴニストは、TNFR1を介したシグナル伝達を抑制しうるが、TNFR1へのTNFαの結合、および／または可溶性TNFR1を産生するTNFR1のシェディング（shedding）を抑制しない。したがって、そのようなアンタゴニストの投与を要する哺乳動物への該アンタゴニストの投与は、in vivoにおいてTNFαの活性およびTNFR1の活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。
【００９５】
TNFR1の他のアンタゴニストはTNFR1には結合するが、ドメイン4には結合しない。そのようなアンタゴニストはTNFR1の機能を抑制するが、可溶性TNFR1のシェディングを抑制しない。したがって、そのようなアンタゴニストの投与を要する哺乳動物への該アンタゴニストの投与は、in vivoにおいてTNFαの活性およびTNFR1の活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。
【００９６】
ある実施形態においては、該アンタゴニスト（例えば、化合物、新規化学的実体、dAb単量体、リガンド）はTNFR1のドメイン1に結合し、マウスTNFR1への結合に関してTAR2m-21-23と競合するか、またはヒトTNFR1への結合に関してTAR2h-205と競合する。他の実施形態においては、該アンタゴニスト（例えば、化合物、新規化学的実体、dAb単量体、リガンド）はTNFR1のドメイン2またはドメイン4に結合する。他の実施形態においては、該アンタゴニスト（例えば、化合物、新規化学的実体、dAb単量体、リガンド）はTNFR1のドメイン3に結合し、TNFR1（例えば、ヒトおよび／またはマウスTNFR1）への結合に関してTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10、TAR2h-185-25またはTAR2h-27-10と競合する。
【００９７】
いくつかのリガンド（好ましい実施形態においてはTNFR1のアンタゴニストであるもの）はヒトTNFR1およびマウスTNFR1に結合する。そのようなリガンド（例えば、アンタゴニスト、dAb単量体）は、同一リガンドを使用する前臨床および臨床研究を可能にし適当な代替（surrogate）リガンドを使用して前臨床研究を行う必要性を無くすという利点を有する。
【００９８】
他の実施形態においては、該アンタゴニストまたはリガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する抗体、またはその抗原結合フラグメント、例えばFabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメントまたはFvフラグメント（例えば、scFv）である。他の実施形態においては、該アンタゴニストまたはリガンドは一価抗体（例えば、dAb）または抗体の一価抗原結合フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメントまたはFvフラグメント）である。
【００９９】
本開示の全体にわたって記載されている本発明の他の実施形態においては、本発明のアンタゴニストまたはリガンドにおいて「dAb」を使用する代わりに、当業者は、TNFR1に結合するdAbのCDR（例えば、適当なタンパク質スカフォールドまたは骨格、例えばアフィボディ、SpAスカフォールド、LDLレセプタークラスAドメインまたはEGFドメイン上にグラフト化されたCDR）を含むドメインを使用することが可能であり、あるいはそれは、TNFR1に対する結合部位を含むタンパク質ドメイン（ここで、例えば、該ドメインはアフィボディ、SpAドメイン、LDLレセプタークラスAドメインまたはEGFドメインから選ばれる）でありうると予想される。したがって、該開示全体は、dAbの代わりにそのようなドメインを使用するアンタゴニスト、リガンドおよび方法の開示を示すものであると解釈されるべきである。
【０１００】
好ましくは、TNFR1のアンタゴニストは本明細書に記載のリガンドである。該リガンドは、TNFR1に対する結合特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはドメイン抗体（dAb）またはそのようなdAbの相補性決定領域を適当なフォーマット（形態）において含む。該リガンドは、そのようなdAbよりなる又はそのようなdAbより実質的になるポリペプチドでありうる。該リガンドはまた、dAb（またはdAbのCDR）を適当なフォーマット、例えば抗体フォーマット（例えば、IgG様フォーマット、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2）で含むポリペプチド、TNFR1に結合するdAbと別の標的タンパク質、抗原またはエピトープ（例えば、血清アルブミン）に結合する第2のdAbとを含む二重特異性リガンド、あるいは本明細書に記載の多重特異性リガンドでありうる。
【０１０１】
TNFR1のアンタゴニスト、例えば本発明の任意の態様のリガンド、およびそのようなリガンドの構築に有用なdAb単量体は、有利には、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、もしくは5nM〜200pM、もしくは1nM〜100pM、1×10-7 M以下、1×10-8 M以下、1×10-9 M以下、1×10-10 M以下、1×10-11 M以下のKd、および／または5×10-1 S-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2 S-1〜1×10-6 S-1、もしくは5×10-3 S-1〜1×10-5 S-1、もしくは5×10-1 S-1以下、もしくは1×10-2 S-1以下、もしくは1×10-3 S-1以下、もしくは1×10-4 S-1以下、もしくは1×10-5 S-1以下、もしくは1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数で、それらのコグネイト標的から解離しうる。Kd速度定数はKoff/Konとして定義される。
【０１０２】
他の実施形態においては、該アンタゴニストはTNFR1に結合し、TNFR1の機能（例えば、レセプタークラスタリング、レセプターシグナリングまたはTNFR1へのTNFαの結合）の1以上を抑制し、TNFレセプタースーパーファミリーのもう1つのメンバーにも結合する。好ましくは、このタイプのアンタゴニストは、該TNFレセプタースーパーファミリーのそのもう1つのメンバーの機能（例えば、メンバーのクラスタリング、シグナリングまたは該メンバーのそのコグネイトリガンドへの結合）をも抑制する。該TNFレセプタースーパーファミリーは、以下のものを含む、当技術分野において認識されているタンパク質群である：TNFR1 (p55, CD120a, p60, TNFレセプタースーパーファミリーメンバー1A, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, TNFレセプタースーパーファミリーメンバー1B, TNFRSF1B), CD18 (TNFRSF3, LTBR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-III), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGP1L), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-1, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1 (TNFRSF10A, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF10B, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF10C, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF10D, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TR1), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TAC1 (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB (THFRSF23, Tnfrh1)。いくつかの実施形態においては、該アンタゴニストは、TNFR1に結合しTNFR1の機能を抑制する第1 dAbと、TNFレセプタースーパーファミリーのもう1つのメンバー（例えば、前記のTNFR2 (CD120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMAなど）に結合する第2 dAbとを含む。もう1つの実施形態においては、該アンタゴニストは、TNFR1に結合しTNFR1の機能（例えば、レセプタークラスタリング、レセプターシグナリングまたはTNFR1へのTNFαの結合）を抑制しTNFレセプタースーパーファミリーのもう1つのメンバー（例えば、前記のTNFR2 (CD120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMAなど）にも結合するdAb単量体を含む。
【０１０３】
TNFR1に結合するリガンドおよびdAb単量体
本発明は、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは50nM〜20pM、より好ましくは5nM〜200pM、最も好ましくは1nM〜100pM、例えば1×10-7 M以下、好ましくは1×10-8 M以下、より好ましくは1×10-9 M以下、有利には1×10-10 M以下、最も好ましくは1×10-11 M以下のKd、および／または5×10-1 S-1〜1×10-7 S-1、好ましくは1×10-2 S-1〜1×10-6 S-1、より好ましくは5×10-3 S-1〜1×10-5 S-1、例えば5×10-1 S-1以下、好ましくは1×10-2 S-1以下、有利には1×10-3 S-1以下、より好ましくは1×10-4 S-1以下、より一層好ましくは1×10-5 S-1以下、最も好ましくは1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数でTNFレセプターIに結合する抗TNFRI dAb単量体を含むリガンド（例えば、そのようなdAbを含む二重特異性リガンド）を提供する。
【０１０４】
好ましくは、該リガンドまたはdAb単量体は、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、より好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM、例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、より好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、最も好ましくは100pM以下の抑制濃度50（IC50）でTNFαレセプターI（p55レセプター）へのTNFαの結合を抑制する。好ましくは、TNFレセプターI標的はヒトTNFαである。
【０１０５】
好ましくは、該リガンドまたはdAbはヒトTNFR1に結合し、ヒトTNFR1へのヒトTNFαの結合を抑制し、またはTNFα結合に応答したTNFR1を介するシグナリングを抑制する。例えば、ある実施形態においては、リガンドまたはdAb単量体はTNFR1に結合し、TNFR1媒介シグナリングを抑制するが、TNFR1へのTNFαの結合を実質的に抑制しない。いくつかの実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は細胞表面上でのTNFR1のTNFα誘導性架橋またはクラスタリングを抑制する。そのようなリガンドまたはdAb（例えば、本明細書に記載のTAR2m-21-23）は、細胞表面TNFR1に対しアンタゴニスト作用をもちうるが内因性可溶性TNFR1の抑制活性を実質的に低下させないため、好都合である。例えば、該リガンドまたはdAbはTNFR1に結合しうるが、レセプター結合アッセイにおいて、TNFR1へのTNFαの結合をせいぜい約10％、せいぜい約5％、せいぜい約4％、せいぜい約3％、せいぜい約2％、またはせいぜい約1％抑制するに過ぎない。また、これらの実施形態においては、該リガンドまたはdAbは、標準的な細胞アッセイにおいて、TNFR1のTNFα誘導性架橋および／またはTNFR1媒介シグナリングを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％または少なくとも約99％抑制する。
【０１０６】
本明細書に記載されているとおり、該リガンドは一価（例えば、dAb単量体）または多価（例えば、二重特異性、多重特異性）でありうる。特定の実施形態においては、該リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合するdAb単量体である。TNFR1のドメイン1に結合するドメイン抗体単量体は、例えばモノクローナル抗体のような他の結合フォーマットと比較すると小さなフットプリントを有する。したがって、そのようなdAb単量体はドメイン1を選択的に遮断しうるが、TNFR1の他のドメインの機能を妨げ得ない。例えば、TNFR1のドメイン1に結合するdAb単量体はTNFR1に対しアンタゴニスト作用をもちうるが、TNFR1へのTNFαの結合またはTNFR1のシェディングを抑制し得ない。
【０１０７】
より詳細な実施形態においては、該リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合しマウスTNFR1への結合に関してTAR2m-21-23と競合する又はヒトTNFR1への結合に関してTAR2h-205と競合するdAb単量体である。
【０１０８】
他の実施形態においては、該リガンドは多価であり、TNFR1に結合する2以上のdAb単量体を含む。多価リガンドは、TNFR1に結合する特定のdAbのコピーの2以上を含有するか、またはTNFR1に結合する2以上のdAbを含有しうる。例えば、本明細書に記載されているとおり、該リガンドは、TNFR1に結合する特定のdAbのコピーの2以上、またはTNFR1に結合する2以上の異なるdAbを含む二量体、三量体または多量体でありうる。いくつかの実施形態においては、該リガンドは、TNFR1に結合する特定のdAbのそれぞれ2または3個のコピーを含むホモ二量体またはホモ三量体である。好ましくは、多価リガンドは標準的な細胞アッセイにおいて実質的にTNFR1に対しアゴニスト作用をもたない（すなわち、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM、100μM、1000μMまたは5,000μMの濃度で存在する場合に、該アッセイにおいてTNFα（100pg/ml）により誘導されるTNFR1媒介活性のせいぜい約5％をもたらすに過ぎない）。
【０１０９】
ある実施形態においては、該多価リガンドはTNFR1の所望のエピトープまたはドメインに結合する2以上のdAbを含有する。例えば、該多価リガンドは、TNFR1のドメイン1内の所望のエピトープに結合するdAbのコピーの2以上を含みうる。
【０１１０】
他の実施形態においては、該多価リガンドは、TNFR1の異なるエピトープまたはドメインに結合する2以上のdAbを含有する。1つの例においては、該多価リガンドは、TNFR1のドメイン1内の第1エピトープに結合する第1 dAbと、ドメイン1内の第2の異なるエピトープに結合する第2 dAbとを含む。他の例においては、該多価リガンドは、TNFR1の所望のエピトープまたはドメインの2以上に結合するdAbを含みうる。例えば、該多価リガンドは、TNFR1のドメイン1および2、ドメイン1および3、ドメイン1および4、ドメイン2および3、ドメイン2および4、またはドメイン3および4に結合するdAbを含みうる。
【０１１１】
ある実施形態においては、該多価リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合するdAbおよびTNFR1のドメイン3に結合するdAbを含む二重特異性リガンドである。このタイプのリガンドは高い結合活性でTNFR1に結合することが可能であり、TNFR1を過剰発現する又は細胞表面上で高密度でTNFR1を発現する細胞への結合に対して、dAb単量体のような他のリガンドフォーマットより選択的でありうる。
【０１１２】
他の特定の実施形態においては、該多価リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合する2以上のdAbまたは特定のdAbのコピーの2以上を含む。このタイプの多価リガンドはTNFR1単量体には低いアフィニティで結合しうるが、レセプター多量体には高い結合活性で結合しうる。したがって、このフォーマットのリガンドは、TNFR1媒介シグナル伝達に必要なリガンド（例えば、TNFα）および／またはお互いと会合またはクラスター化したレセプターに有効に標的化するために投与されうる。
【０１１３】
いくつかのリガンドまたはdAb単量体はTNFR1に結合し、TNFR1へのTNFαの結合を抑制する。ある実施形態においては、そのようなリガンドまたはdAb単量体はTNFR1のドメイン2および／またはドメイン3に結合する。特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFR1のドメイン3に結合する。より詳細な実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFR1のドメイン3に結合し、TNFR1への結合に関してTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する。
【０１１４】
他のリガンドまたはdAb単量体はTNFR1へのTNFαの結合を抑制しない。そのようなアンタゴニストは診断剤としての利点を有する。なぜなら、それらは、サンプル中のTNFR1に結合させ該TNFR1を検出し、定量し、または測定するために使用することが可能であり、TNFR1への結合に関してサンプル中のTNFと競合しないからである。したがって、サンプル中のTNFR1の存在の有無および存在量の正確な測定を行うことが可能である。
【０１１５】
いくつかのリガンドおよびdAb単量体はTNFR1へのTNFαの結合を抑制しないが、TNFR1により媒介されるシグナル伝達を抑制する。例えば、リガンドまたはdAb単量体は、TNFR1を介したシグナル伝達に先行するTNFR1のTNFα誘導性クラスタリングを抑制しうる。そのようなリガンドまたはdAb単量体は、これらの特性を有するアンタゴニストに関して本明細書に記載されているとおり、いくつかの利点を有する。特に、このタイプのリガンドまたはdAb単量体はTNFR1のドメイン1またはTNFR1のドメイン4に結合する。ある実施形態においては、該リガンドは、TNFR1のドメイン1またはTNFR1のドメイン4に結合するdAb単量体である。
【０１１６】
特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFR1のドメイン1に結合し、TNFRαの結合に際してTNFR1を介して媒介されるシグナル伝達を抑制する。そのようなリガンドまたはdAb単量体はTNFR1を介するシグナル伝達を抑制しうるが、TNFR1へのTNFαの結合および／または可溶性TNFR1を産生するTNFR1のシェディングを抑制し得ない。したがって、そのようなリガンドまたはdAb単量体の投与を要する哺乳動物への該リガンドまたはdAb単量体の投与は、in vivoにおいてTNFαの活性およびTNFR1の活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。
【０１１７】
他のリガンドまたはdAb単量体はTNFR1には結合するが、ドメイン4には結合しない。そのようなリガンドまたはdAb単量体はTNFR1の機能を抑制するが、可溶性TNFR1のシェディングを抑制しない。したがって、そのようなアンタゴニストの投与を要する哺乳動物への該アンタゴニストの投与は、in vivoにおいてTNFαの活性およびTNFR1の活性を抑制する内因性調節経路を相補しうる。
【０１１８】
好ましくは、該リガンドまたはdAb単量体は、標準的なアッセイ（例えば、本明細書に記載の標準的なL929または標準的なHeLa IL-8アッセイ）において、500nM〜50pM、好ましくは100nM〜50pM、より好ましくは10nM〜100pM、有利には1nM〜100pM、例えば50nM以下、好ましくは5nM以下、より好ましくは500pM以下、有利には200pM以下、最も好ましくは100pM以下の中和用量50（ND50）でTNFαまたはTNFR1を中和する。
【０１１９】
ある実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はヒト腫瘍壊死因子レセプター1（TNFR1; p55）に特異的に結合し、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5×10-1 S-1〜1×10-7 S-1（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数でヒトTNFR1から解離する。
【０１２０】
他の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は、本明細書に記載されているKdでTNFR1に特異的に結合し、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導性敗血症性ショックモデルにおける死亡率を低下させる（すなわち、致死を予防し、あるいは適当な対照と比較して、死亡率を少なくとも約10％低下させる）。好ましくは、該dAb単量体は、標準的なマウスLPS/D-ガラクトサミン誘導性敗血症性ショックモデルにおいて、約5mg/kg、より好ましくは約1mg/kgの投与で、適当な対照と比較して死亡率を少なくとも約25％または少なくとも約50％低下させる。
【０１２１】
他の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFRIに結合し、標準的な細胞アッセイにおいて100nM以下のND50でTNFR1の活性に拮抗(antagonize)し10μM以下の濃度で該dAbは該アッセイにおいてTNFR1の活性を5％以下活性化(agonize)させる。
【０１２２】
特定の実施形態においては、リガンドまたはdAb単量体は標準的な細胞アッセイにおいて実質的にTNFR1に対しアゴニスト作用をもたない（すなわち、1 nM、10 nM、100 nM、1μM、10μM、100μM、1000μMまたは5,000μMの濃度で存在する場合に、該アッセイにおいてTNFα（100pg/ml）により誘導されるTNFR1媒介活性のせいぜい約5％をもたらすに過ぎない）。
【０１２３】
ある実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は凝集に実質的に抵抗性である。例えば、いくつかの実施形態においては、薬品製剤化に通常使用される溶媒、例えば食塩水、緩衝食塩水、クエン酸緩衝食塩水、水、エマルションおよび許容される賦形剤（例えば、FDAにより承認されているもの）を含有するこれらの任意の溶媒中のリガンドまたはdAbの1〜5mg/ml、5〜10mg/ml、10〜20mg/ml、20〜50mg/ml、50〜100mg/ml、100〜200mg/mlまたは200〜500mg/ml溶液を約22℃、22〜25℃、25〜30℃、30〜37℃、37〜40℃、40〜50℃、50〜60℃、60〜70℃、70〜80℃、15〜20℃、10〜15℃、5〜10℃、2〜5℃、0〜2℃、-10℃〜0℃、-20℃〜-10℃、-40℃〜-20℃、-60℃〜-40℃または-80℃〜-60℃で例えば約10分間、1時間、8時間、24時間、2日間、3日間、4日間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、6ヶ月間、1年間または2年間のおよその期間にわたって維持した場合、該リガンドまたはdAb単量体の約10％未満、約9％未満、約8％未満、約7％未満、約6％未満、約5％未満、約4％未満、約3％未満、約2％未満または約1％未満が凝集するに過ぎない。
【０１２４】
凝集は、任意の適当な方法、例えば顕微鏡検査により、あるいは目視検査または分光法または任意の他の適当な方法による溶液の濁度の評価により評価されうる。好ましくは、凝集は動的光散乱により評価される。凝集に抵抗性であるリガンドまたはdAb単量体はいくつかの利点を有する。例えば、そのようなリガンドまたはdAb単量体は、適当な生物学的生産系（例えば、大腸菌（E. coli））を使用する発現により、可溶性タンパク質として高収率で容易に製造されることが可能であり、通常のポリペプチドより高い濃度およびより低い凝集度および活性喪失度で製剤化および／または保存されうる。
【０１２５】
また、凝集に対して抵抗性であるリガンドまたはdAb単量体は、他の抗原結合性またはエピトープ結合性ポリペプチド（例えば、通常の抗体）より経済的に製造されうる。例えば、一般に、in vivo用途に意図される抗原結合性またはエピトープ結合性ポリペプチドの製造は、凝集ポリペプチドを除去する工程（例えば、ゲル濾過）を含む。そのような凝集物の除去ができなければ、in vivo用途に適さない調製物が生じうる。なぜなら、例えば、アンタゴニストとして作用するよう意図された抗原結合性ポリペプチドの凝集物は、標的抗原の架橋またはクラスター化を誘導することによりアゴニストとして機能しうるからである。タンパク質凝集物は、それが投与された対象において免疫応答を誘導することにより、治療用ポリペプチドの効力を低下させうる。
【０１２６】
これとは対照的に、本発明の凝集抵抗性リガンドまたはdAb単量体は、凝集物を除去する工程を含む必要無しにin vivo用途用に製造されることが可能であり、ポリペプチド凝集物によって生じる前記欠点を伴うことなくin vivo用途に使用されうる。
【０１２７】
いくつかの実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は、温度Tsに加熱され温度Tcに冷却されると（ここで、TsはdAbの融解温度Tmより高く、TcはdAbの融解温度より低い）可逆的にアンフォールディングする。例えば、dAb単量体は、80℃に加熱されほぼ室温に冷却されると可逆的にアンフォールディングしうる。可逆的にアンフォールディングするポリペプチドは、アンフォールディングの際には機能を喪失するが、リフォールディングの際には機能を回復する。そのようなポリペプチドは、アンフォールディングの際に凝集するポリペプチドまたは不適切にリフォールディングするポリペプチド（ミスフォールディングしたポリペプチド）（すなわち、機能を回復しないポリペプチド）とは区別される。
【０１２８】
ポリペプチドのアンフォールディングおよびリフォールディングは、例えば、任意の適当な方法を用いてポリペプチド構造を直接的または間接的に検出することにより評価されうる。例えば、円二色性（CD）（例えば、遠UV CD、近UV CD）、蛍光（例えば、トリプトファン側鎖の蛍光）、タンパク質分解に対する感受性、核磁気共鳴（NMR）により、あるいは適切なフォールディングに依存的なポリペプチド機能（例えば、標的リガンドへの結合、ジェネリックリガンドへの結合）を検出または測定することにより、ポリペプチド構造を検出することが可能である。1つの例においては、結合機能（例えば、ジェネリックリガンドおよび／または標的リガンドへの結合、基質への結合）の喪失がポリペプチドのアンフォールディングを示す機能アッセイを用いて、ポリペプチドのアンフォールディングを評価する。
【０１２９】
リガンドまたはdAb単量体のアンフォールディングおよびリフォールディングの度合は、アンフォールディングまたは変性曲線を用いて決定されうる。アンフォールディング曲線は、温度を縦軸に、フォールディングしたポリペプチドの相対濃度を横軸にプロットすることにより作成されうる。フォールディングしたリガンドまたはdAb単量体の相対濃度は、任意の適当な方法（例えば、CD、蛍光、結合アッセイ）を用いて直接的または間接的に決定されうる。例えば、リガンドまたはdAb単量体溶液を製造し、該溶液の楕円率をCDにより測定することが可能である。得られた楕円率値は、フォールディングしたリガンドまたはdAb単量体の、100％の相対濃度を表す。ついで該溶液中のリガンドまたはdAb単量体を、該溶液の温度を段階的に上昇させることによりアンフォールディングさせ、適当な増加量（例えば、1℃の各増加後）における楕円率を測定する。ついで溶液状態のリガンドまたはdAbを、溶液温度を段階的に低下させることによりリフォールディングさせ、適当な増減量における楕円率を測定する。そのデータをプロットしてアンフォールディング曲線およびリフォールディング曲線を得ることが可能である。該アンフォールディングおよびリフォールディング曲線は、該リガンドまたはdAb単量体分子がフォールディングしている部分、リガンドまたはdAb単量体分子が種々の度合でアンフォールディングしているアンフォールディング／リフォールディング移行部分、およびリガンドまたはdAb単量体分子がアンフォールディングしている部分を含む特徴的なS字形を有する。リフォールディング曲線のy軸切片は、回収されたリフォールディングしたリガンドまたはdAb単量体の相対量である。少なくとも約50％または少なくとも約60％または少なくとも約70％または少なくとも約75％または少なくとも約80％または少なくとも約85％または少なくとも約90％または少なくとも約95％の回収は、該リガンドまたはdAb単量体が可逆的にアンフォールディングすることを示す。
【０１３０】
好ましい実施形態においては、リガンドまたはdAb単量体溶液を調製し、熱アンフォールディングおよびリフォールディング曲線を作成することにより、該リガンドまたはdAb単量体のアンフォールディングの可逆性を判定する。該リガンドまたはdAb単量体溶液は、任意の適当な溶媒、例えば、該リガンドまたはdAb単量体を溶解させるのに適したpH（例えば、等電点（pI）より約3単位高い又は低いpH）を有する水性バッファー中で調製することが可能である。該リガンドまたはdAb単量体溶液を、アンフォールディング／フォールディングの検出を可能にするのに十分な程度に濃縮する。例えば、該リガンドまたはdAb単量体溶液は約0.1μM〜約100μM、好ましくは約1μM〜約10μMでありうる。
【０１３１】
該リガンドまたはdAb単量体の融解温度（Tm）が既知の場合には、該溶液をTmの約10℃低い温度（Tm-10）まで加熱し、フォールディングを楕円率または蛍光（例えば、200nmから250nmまでの遠UV CDスキャン、235nmまたは225nmでの定波長CD; 298nmでの励起による300〜450nmでのトリプトファン発蛍光スペクトル）により評価して、100％相対フォールディングリガンドまたはdAb単量体を得ることが可能である。ついで該溶液を、所定の増加量（例えば、約0.1〜約1℃の増加）で、Tmより少なくとも10℃高い温度（Tm+10）まで加熱し、各増加量における楕円率または蛍光を測定する。ついで、所定の増減量で少なくともTm-10まで冷却することにより該リガンドまたはdAb単量体をリフォールディングさせ、各増減量における楕円率または蛍光を測定する。該リガンドまたはdAb単量体の融解温度が分からない場合には、該溶液を、約25℃から約100℃まで段階的に加熱することによりアンフォールディングさせ、ついで少なくとも約25℃まで段階的に冷却することによりリフォールディングさせ、各加熱および冷却増減量における楕円率または蛍光を測定する。得られたデータをプロットしてアンフォールディング曲線およびリフォールディング曲線を得ることが可能であり、ここで、リフォールディング曲線のy軸切片は、回収されたリフォールディングしたタンパク質の相対量である。
【０１３２】
ある実施形態においては、本発明のリガンドまたはdAb単量体は、有効量が投与された場合、慢性炎症疾患のモデルにおいて有効である。一般には、有効量は約1mg/kg〜約10mg/kg（例えば、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kgまたは約10mg/kg）である。本明細書に記載の慢性炎症疾患のモデルはヒトにおける治療効力を予測するものであると当業者により認識される。先行技術は、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、本明細書に記載の一価アンタゴニスト、リガンド）をこれらのモデルにおいて使用することを示唆しておらず、また、それらが有効であることも示唆していない。
【０１３３】
特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は標準的なマウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて有効である（実施例15A）。例えば、該リガンドの有効量の投与は、標準的なマウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおける四肢の累積の平均関節炎スコアを、適当な対照と比較して例えば約1〜約16、約3〜約16、約6〜約16、約9〜約16、または約12〜約16減少させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、標準的なマウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおける関節炎の症状の発現を、適当な対照と比較して例えば約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日または約28日遅延させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、標準的なマウスコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて、0〜約3、約3〜約5、約5〜約7、約7〜約15、約9〜約15、約10〜約15、約12〜約15、または約14〜約15の、四肢の累積の平均関節炎スコアを与えうる。
【０１３４】
他の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は関節炎のマウスΔAREモデルにおいて有効である（実施例15B）。例えば、該リガンドの有効量の投与は、関節炎のマウスΔAREモデルにおける平均関節炎スコアを、適当な対照と比較して例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5減少させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、関節炎のマウスΔAREモデルにおける関節炎の症状の発現を、適当な対照と比較して例えば約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日または約28日遅延させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、関節炎のマウスΔAREモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均関節炎スコアを与えうる。
【０１３５】
他の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は炎症性腸疾患（IBD）のマウスΔAREモデルにおいて有効である（実施例15B）。例えば、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスΔAREモデルにおける平均急性および／または慢性炎症スコアを、適当な対照と比較して例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5減少させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスΔAREモデルにおけるIBDの症状の発現を、適当な対照と比較して例えば約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日または約28日遅延させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスΔAREモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均急性および／または慢性炎症スコアを与えうる。
【０１３６】
他の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はIBDのマウスデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発モデルにおいて有効である（実施例15C）。例えば、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスDSSモデルにおける平均重症度スコアを、適当な対照と比較して例えば約0.1〜約2.5、約0.5〜約2.5、約1〜約2.5、約1.5〜約2.5、または約2〜約2.5減少させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスDSSモデルにおけるIBDの症状の発現を、適当な対照と比較して例えば約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約10日、約14日、約21日または約28日延長させうる。もう1つの例では、該リガンドの有効量の投与は、IBDのマウスDSSモデルにおいて、0〜約0.5、約0.5〜約1、約1〜約1.5、約1.5〜約2、または約2〜約2.5の平均重症度スコアを与えうる。
【０１３７】
特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体は慢性閉塞性肺疾患（COPD）のマウス煙草煙モデルにおいて有効である（実施例15D）。例えば、該リガンドの有効量の投与は、適当な対照と比較してCOPDの症状の発現を軽減または遅延させうる。
【０１３８】
特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFR1に特異的に結合し、TAR2-10のアミノ酸配列（配列番号31）、またはそれに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％相同である配列を含む。
【０１３９】
特定の実施形態においては、該リガンドまたはdAb単量体はTNFR1に特異的に結合し、TAR2-5のアミノ酸配列（配列番号195）、またはそれに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％相同である配列を含む。
【０１４０】
他の実施形態においては、該リガンドは、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFR1、p55、CD120a）に300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、TAR2h-12 (配列番号32), TAR2h-13 (配列番号33), TAR2h-14 (配列番号34), TAR2h-16 (配列番号35), TAR2h-17 (配列番号36), TAR2h-18 (配列番号37), TAR2h-19 (配列番号38), TAR2h-20 (配列番号39), TAR2h-21 (配列番号40), TAR2h-22 (配列番号41), TAR2h-23 (配列番号42), TAR2h-24 (配列番号43), TAR2h-25 (配列番号44), TAR2h-26 (配列番号45), TAR2h-27 (配列番号46), TAR2h-29 (配列番号47), TAR2h-30 (配列番号48), TAR2h-32 (配列番号49), TAR2h-33 (配列番号50), TAR2h-10-1 (配列番号51), TAR2h-10-2 (配列番号52), TAR2h-10-3 (配列番号53), TAR2h-10-4 (配列番号54), TAR2h-10-5 (配列番号55), TAR2h-10-6 (配列番号56), TAR2h-10-7 (配列番号57), TAR2h-10-8 (配列番号58), TAR2h-10-9 (配列番号59), TAR2h-10-10 (配列番号60), TAR2h-10-11 (配列番号61), TAR2h-10-12 (配列番号62), TAR2h-10-13 (配列番号63), TAR2h-10-14 (配列番号64), TAR2h-10-15 (配列番号65), TAR2h-10-16 (配列番号66), TAR2h-10-17 (配列番号67), TAR2h-10-18 (配列番号68), TAR2h-10-19 (配列番号69), TAR2h-10-20 (配列番号70), TAR2h-10-21 (配列番号71), TAR2h-10-22 (配列番号72), TAR2h-10-27 (配列番号73), TAR2h-10-29 (配列番号74), TAR2h-10-31 (配列番号75), TAR2h-10
-35 (配列番号76), TAR2h-10-36 (配列番号77), TAR2h-10-37 (配列番号78), TAR2h-10-38 (配列番号79), TAR2h-10-45 (配列番号80), TAR2h-10-47 (配列番号81), TAR2h-10-48 (配列番号82), TAR2h-10-57 (配列番号83), TAR2h-10-56 (配列番号84), TAR2h-10-58 (配列番号85), TAR2h-10-66 (配列番号86), TAR2h-10-64 (配列番号87), TAR2h-10-65 (配列番号88), TAR2h-10-68 (配列番号89), TAR2h-10-69 (配列番号90), TAR2h-10-67 (配列番号91), TAR2h-10-61 (配列番号92), TAR2h-10-62 (配列番号93), TAR2h-10-63 (配列番号94), TAR2h-10-60 (配列番号95), TAR2h-10-55 (配列番号96), TAR2h-10-59 (配列番号97), TAR2h-10-70 (配列番号98), TAR2h-34  (配列番号373), TAR2h-35 (配列番号374), TAR2h-36 (配列番号375), TAR2h-37 (配列番号376), TAR2h-38 (配列番号377), TAR2h-39 (配列番号378), TAR2h-40 (配列番号379), TAR2h-41 (配列番号380), TAR2h-42 (配列番号381), TAR2h-43 (配列番号382), TAR2h-44 (配列番号383), TAR2h-45 (配列番号384), TAR2h-47 (配列番号385), TAR2h-48 (配列番号386), TAR2h-50 (配列番号387), TAR2h-51 (配列番号388), TAR2h-66 (配列番号389), TAR2h-67 (配列番号390), TAR2h-68 (配列番号391), TAR2h-70 (配列番号392), TAR2h-71 (配列番号393), TAR2h-72 (配列番号394), TAR2h-73 (配列番号395), TAR2h-74 (配列番号396), TAR2h-75 (配列番号397), TA
R2h-76 (配列番号398), TAR2h-77 (配列番号399), TAR2h-78 (配列番号400), TAR2h-79 (配列番号401)およびTAR2h-15 (配列番号431)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列またはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
更なる実施形態においては、該リガンドは、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFR1、p55、CD120a）に300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、TAR2h-131-8 (配列番号433), TAR2h-131-24 (配列番号434), TAR2h-15-8 (配列番号435), TAR2h-15-8-1 配列番号436), TAR2h-15-8-2 (配列番号437), TAR2h-185-23 (配列番号438), TAR2h-154-10-5 (配列番号439), TAR2h-14-2 (配列番号440), TAR2h-151-8 (配列番号441), TAR2h-152-7 (配列番号442), TAR2h-35-4 (配列番号443), TAR2h-154-7 (配列番号444), TAR2h-80 (配列番号445), TAR2h-81 (配列番号446), TAR2h-82 (配列番号447), TAR2h-83 (配列番号448), TAR2h-84 (配列番号449), TAR2h-85 (配列番号450), TAR2h-86 (配列番号451), TAR2h-87 (配列番号452), TAR2h-88 (配列番号453), TAR2h-89 (配列番号454), TAR2h-90 (配列番号455), TAR2h-91 (配列番号456), TAR2h-92 (配列番号457), TAR2h-93 (配列番号458), TAR2h-94 (配列番号459), TAR2h-95 (配列番号460), TAR2h-96 (配列番号461), TAR2h-97 (配列番号462), TAR2h-99 (配列番号463), TAR2h-100 (配列番号464), TAR2h-101 (配列番号465), TAR2h-102 (配列番号466), TAR2h-103 (配列番号467), TAR2h-104 (配列番号468), TAR2h-105 (配列番号469), TAR2h-106 (配列番号470), TAR2h-107 (配列番号471), TAR2h-108 (配列番号472), TAR2h-109 (配列番号473), TAR2h-110 (配列番号474), TAR2h-111 (配列番号475)
, TAR2h-112 (配列番号476), TAR2h-113 (配列番号477), TAR2h-114 (配列番号478), TAR2h-115 (配列番号479), TAR2h-116 (配列番号480), TAR2h-117 (配列番号481), TAR2h-118 (配列番号482), TAR2h-119 (配列番号483), TAR2h-120 (配列番号484), TAR2h-121 (配列番号485), TAR2h-122 (配列番号486), TAR2h-123 (配列番号487), TAR2h-124 (配列番号488), TAR2h-125 (配列番号489), TAR2h-126 (配列番号490), TAR2h-127 (配列番号490), TAR2h-128 (配列番号492), TAR2h-129 (配列番号493), TAR2h-130 (配列番号494), TAR2h-131 (配列番号495), TAR2h-132 (配列番号496), TAR2h-133 (配列番号497), TAR2h-151 (配列番号498), TAR2h-152 (配列番号499), TAR2h-153 (配列番号500), TAR2h-154 (配列番号501), TAR2h-159 (配列番号502), TAR2h-165 (配列番号503), TAR2h-166 (配列番号504), TAR2h-168 (配列番号505), TAR2h-171 (配列番号506), TAR2h-172 (配列番号507), TAR2h-173 (配列番号508), TAR2h-174 (配列番号509), TAR2h-176 (配列番号510), TAR2h-178 (配列番号511), TAR2h-201 (配列番号512), TAR2h-202 (配列番号513), TAR2h-203 (配列番号514), TAR2h-204 (配列番号515), TAR2h-185-25 (配列番号516), TAR2h-154-10 (配列番号517)およびTAR2h-205 (配列番号627)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列またはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
好ましい実施形態においては、該リガンドまたはdAbは、TAR2h-10-27 (配列番号73), TAR2h-10-57 (配列番号83), TAR2h-10-56 (配列番号84), TAR2h-10-58 (配列番号85), TAR2h-10-66 (配列番号86), TAR2h-10-64 (配列番号87), TAR2h-10-65 (配列番号88), TAR2h-10-68 (配列番号89), TAR2h-10-69 (配列番号90), TAR2h-10-67 (配列番号91), TAR2h-10-61 (配列番号92), TAR2h-10-62 (配列番号93), TAR2h-10-63 (配列番号94), TAR2h-10-60 (配列番号95), TAR2h-10-55 (配列番号96), TAR2h-10-59 (配列番号97)およびTAR2h-10-70 (配列番号98)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列またはdAbに対して少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
特に好ましいリガンドまたはdAbは、配列番号73のアミノ酸配列に対して少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
他の実施形態においては、該リガンドは、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFR1、p55、CD120a）に300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、TAR2m-14 (配列番号167), TAR2m-15 (配列番号168), TAR2m-19 (配列番号169), TAR2m-20 (配列番号170), TAR2m-21 (配列番号171), TAR2m-24 (配列番号172), TAR2m-21-23 (配列番号173), TAR2m-21-07 (配列番号174), TAR2m-21-43 (配列番号175), TAR2m-21-48 (配列番号176), TAR2m-21-10 (配列番号177), TAR2m-21-06 (配列番号178), TAR2m-21-17 (配列番号179)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列またはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態においては、該リガンドは、TNFR1に結合し本明細書に開示のdAbのいずれかとTNFR1（例えば、マウスおよび／またはヒトTNFR1）への結合に関して競合するdAb単量体を含む。
【０１４６】
好ましくは、該リガンドまたはdAb単量体は、大腸菌（E. coli）またはピチア（Pichia）種（例えば、P. pastoris）において発現された場合、少なくとも約0.5mg/Lの量で分泌される。他の好ましい実施形態においては、該dAb単量体は、大腸菌（E. coli）またはピチア（Pichia）種（例えば、P. pastoris）において発現された場合、少なくとも約0.75 mg/L、少なくとも約1 mg/L、少なくとも約4 mg/L、少なくとも約5 mg/L、少なくとも約10 mg/L、少なくとも約15 mg/L、少なくとも約20 mg/L、少なくとも約25 mg/L、少なくとも約30 mg/L、少なくとも約35 mg/L、少なくとも約40 mg/L、少なくとも約45 mg/L、または少なくとも約50 mg/L、または少なくとも約100 mg/L、または少なくとも約200 mg/L、または少なくとも約300 mg/L、または少なくとも約400 mg/L、または少なくとも約500 mg/L、または少なくとも約600 mg/L、または少なくとも約700 mg/L、または少なくとも約800 mg/L、少なくとも約900 mg/L、または少なくとも約1g/Lの量で分泌される。他の好ましい実施形態においては、該dAb単量体は、大腸菌（E. coli）またはピチア（Pichia）種（例えば、P. pastoris）において発現された場合、少なくとも約1 mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約1 mg/L〜少なくとも約750 mg/L、少なくとも約100 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約200 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約300 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約400 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約500 mg/L〜少なくとも約1g/L、少なくとも約600 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約700 mg/L〜少なくとも約1 g/L、少なくとも約800 mg/L〜少なくとも約1g/L、または少なくとも約900 mg/L〜少なくとも約1g/Lの量で分泌される。本明細書に記載されているリガンドおよびdAb単量体は、大腸菌（E. coli）またはピチア（Pichia）種（例えば、P. pastoris）において発現された場合に分泌されうるが、それらは、大腸菌（E. coli）またはピチア（Pichia）種を使用しない合成化学的方法または生物学的製造方法のような任意の適当な方法を用いて製造することが可能である。
【０１４７】
該dAb単量体は任意の適当な免疫グロブリン可変ドメインを含むことが可能であり、好ましくは、ヒト可変ドメイン、またはヒトフレームワーク領域を含む可変ドメインを含む。ある実施形態においては、該dAb単量体は、本明細書に記載のとおり、普遍的（universal）フレームワークを含む。
【０１４８】
該普遍的フレームワークは、VLフレームワーク（VγまたはVκ）、例えば、ヒト生殖系列DPK1, DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21, DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26またはDPK 28免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークでありうる。所望により、VLフレームワークは更に、ヒト生殖系列Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4またはJκ5免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含みうる。
【０１４９】
他の実施形態においては、該普遍的フレームワークは、VHフレームワーク、例えば、ヒト生殖系列DP4, DP7, DP8, DP9, DP10, DP31, DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51, DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68またはDP69免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含むフレームワークでありうる。所望により、VHフレームワークは更に、ヒト生殖系列JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5およびJH6免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされるフレームワークアミノ酸配列を含みうる。
【０１５０】
特定の実施形態においては、該dAb単量体リガンドは、DPK9 VLフレームワーク、またはDP47, DP45およびDP38よりなる群から選ばれるVHフレームワークを含む。
【０１５１】
該dAb単量体は、ジェネリックリガンド、例えばプロテインA、プロテインLおよびプロテインGに対する結合部位を含みうる。
【０１５２】
ある実施形態においては、該dAb単量体は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む1以上のフレームワーク領域を含み、あるいは、該フレームワーク領域の1以上のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる該対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して合わせて5個までのアミノ酸相違を含む。
【０１５３】
他の実施形態においては、該dAb単量体のFW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じであり、あるいはFW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列は、該ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して合わせて10個までのアミノ酸相違を含有する。
【０１５４】
他の実施形態においては、該dAb単量体はFW1、FW2およびFW3領域を含み、該FW1、FW2およびFW3領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである。
【０１５５】
いくつかの実施形態においては、該dAb単量体は、ラクダ科動物（Camelid）免疫グロブリン可変ドメインも、ラクダ科動物生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリン可変ドメインに特有な1以上のフレームワークアミノ酸も含まない。
【０１５６】
血清アルブミンに結合するリガンドおよびdAb単量体
本発明は、1nM〜500μM（すなわち、×10-9〜5×10-4)、好ましくは100nM〜10μMのKdで血清アルブミン（SA）に結合するリガンドまたはdAb単量体（例えば、そのようなdAbを含む二重特異性リガンド）を提供する。好ましくは、第1抗SA dAbと別の標的に対する第2 dAbとを含む二重特異性リガンドの場合、第2 dAbのその標的に対する親和性（例えば、例えばBiaCoreを使用する表面プラズモン共鳴により測定されたKdおよび／またはKoff）は、SAに対する第1 dAbの親和性の1〜100000倍（好ましくは100〜100000、より好ましくは1000〜100000、または10000〜100000倍）である。例えば、第1 dAbは約10μMの親和性でSAに結合し、一方、第2 dAbは、100pMの親和性で、その標的に結合する。好ましくは、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（HSA）である。1つの実施形態においては、第1 dAb（またはdAb単量体）は、約50、好ましくは約70、より好ましくは100、150または200nMのKdでSA（例えば、HSA）に結合する。
【０１５７】
ある実施形態においては、SAに特異的なdAb単量体はMSA-16のアミノ酸配列（配列番号28）、またはそれに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％相同な配列を含む。
【０１５８】
他の実施形態においては、SAに特異的なdAb単量体はMSA-26のアミノ酸配列（配列番号30）、またはそれに対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％または少なくとも99％相同な配列を含む。
【０１５９】
ある実施形態においては、SAに結合するdAb単量体は凝集に抵抗性であり、可逆的にアンフォールディングし、および／または、TNFR1に結合するdAb単量体に関して前記で説明したフレームワーク領域を含む。
【０１６０】
核酸分子、ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載のリガンドおよびdAb単量体をコードする単離された及び／又は組換え核酸分子を提供する。ある実施形態においては、単離された及び／又は組換え核酸は、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFRI）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、TAR2h-12 (配列番号32), TAR2h-13 (配列番号33), TAR2h-14 (配列番号34), TAR2h-16 (配列番号35), TAR2h-17 (配列番号36), TAR2h-18 (配列番号37), TAR2h-19 (配列番号38), TAR2h-20 (配列番号39), TAR2h-21 (配列番号40), TAR2h-22 (配列番号41), TAR2h-23 (配列番号42), TAR2h-24 (配列番号43), TAR2h-25 (配列番号44), TAR2h-26 (配列番号45), TAR2h-27 (配列番号46), TAR2h-29 (配列番号47), TAR2h-30 (配列番号48), TAR2h-32 (配列番号49), TAR2h-33 (配列番号50), TAR2h-10-1 (配列番号51), TAR2h-10-2 (配列番号52), TAR2h-10-3 (配列番号53), TAR2h-10-4 (配列番号54), TAR2h-10-5 (配列番号55), TAR2h-10-6 (配列番号56), TAR2h-10-7 (配列番号57), TAR2h-10-8 (配列番号58), TAR2h-10-9 (配列番号59), TAR2h-10-10 (配列番号60), TAR2h-10-11 (配列番号61), TAR2h-10-12 (配列番号62), TAR2h-10-13 (配列番号63), TAR2h-10-14 (配列番号64), TAR2h-10-15 (配列番号65), TAR2h-10-16 (配列番号66), TAR2h-10-17 (配列番号67), TAR2h-10-18 (配列番号68), TAR2h-10-19 (配列番号69), TAR2h-10-20 (配列番号70), TAR2h-10-21 (配列番号71), TAR2h-10-22 (配列番号72), TAR2h-10-27 (配列番号73), TAR2h-10-29 (配列番号74), TAR2h-10-31 (配列番号75), TAR2h-10-35 (配列番号76), TAR2h-10-36 (配列番号77), TAR2h-10-37 (配列番号78), TAR2h-10-38 (配列番号79), TAR2h-10-45 (配列番号80), TAR2h-10-47 (配列番号81), TAR2h-10-48 (配列番号82), TAR2h-10-57 (配列番号83), TAR2h-10-56 (配列番号84), TAR2h-10-58 (配列番号85), TAR2h-10-66 (配列番号86), TAR2h-10-64 (配列番号87), TAR2h-10-65 (配列番号88), TAR2h-10-68 (配列番号89), TAR2h-10-69 (配列番号90), TAR2h-10-67 (配列番号91), TAR2h-10-61 (配列番号92), TAR2h-10-62 (配列番号93), TAR2h-10-63 (配列番号94), TAR2h-10-60 (配列番号95), TAR2h-10-55 (配列番号96), TAR2h-10-59 (配列番号97), TAR2h-10-70 (配列番号98), TAR2h-34 (配列番号402), TAR2h -35 (配列番号403), TAR2h -36 (配列番号404), TAR2h -37 (配列番号405), TAR2h -38 (配列番号406), TAR2h -39 (配列番号407), TAR2h -40 (配列番号408), TAR2h -41 (配列番号409), TAR2h -42 (配列番号410), TAR2h-43 (配列番号411), TAR2h -44 (配列番号412), TAR2h -45 (配列番号413), TAR2h -47 (配列番号414), TAR2h -48 (配列番号415), TAR2h -50 (配列番号416), TAR2h -51 (配列番号417), TAR2h -66 (配列番号418), TAR2h -67 (配列番号419), TAR2h -68 (配列番号420), TAR2h -70 (配列番号421), TAR2h -71 (配
列番号422), TAR2h -72 (配列番号423), TAR2h -73 (配列番号424), TAR2h -74 (配列番号425), TAR2h -75 (配列番号426), TAR2h -76 (配列番号427), TAR2h -77 (配列番号428), TAR2h -78 (配列番号429), TAR2h-79 (配列番号430)およびTAR2h-15 (配列番号432)よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同である。
【０１６１】
他の実施形態においては、単離された及び／又は組換え核酸は、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFRI）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、TAR2h-131-8 (配列番号518), TAR2h-131-24 (配列番号519), TAR2h-15-8 (配列番号520), TAR2h-15-8-1 (配列番号521), TAR2h-15-8-2 (配列番号522), TAR2h-185-23 (配列番号523), TAR2h-154-10-5 (配列番号524), TAR2h-14-2 (配列番号525), TAR2h-151-8 (配列番号526), TAR2h-152-7 (配列番号527), TAR2h-35-4 (配列番号528), TAR2h-154-7 (配列番号529), TAR2h-80 (配列番号530), TAR2h-81 (配列番号531), TAR2h-82 (配列番号532), TAR2h-83 (配列番号533), TAR2h-84 (配列番号534), TAR2h-85 (配列番号535), TAR2h-86 (配列番号536), TAR2h-87 (配列番号537), TAR2h-88 (配列番号538), TAR2h-89 (配列番号539), TAR2h-90 (配列番号540), TAR2h-91 (配列番号541), TAR2h-92 (配列番号542), TAR2h-93 (配列番号543), TAR2h-94 (配列番号544), TAR2h-95 (配列番号545), TAR2h-96(配列番号546), TAR2h-97 (配列番号547), TAR2h-99 (配列番号548), TAR2h-100 (配列番号549), TAR2h-101 (配列番号550), TAR2h-102 (配列番号551), TAR2h-103 (配列番号552), TAR2h-104 (配列番号553), TAR2h-105 (配列番号554), TAR2h-106 (配列番号555), TAR2h-107 (配列番号556), TAR2h-108 (配列番号557), TAR2h-109 (配列番号558), TAR2h-110 (配列番号559), TAR2h-111 (配列番号560), TAR2h-112 (配列番号561), TAR2h-113 (配列番号562), TAR2h-114 (配列番号563), TAR2h-115 (配列番号564), TAR2h-116 (配列番号565), TAR2h-117 (配列番号566), TAR2h-118 (配列番号567), TAR2h-119 (配列番号568), TAR2h-120 (配列番号569), TAR2h-121 (配列番号570), TAR2h-122 (配列番号571), TAR2h-123 (配列番号572), TAR2h-12 (配列番号573), TAR2h-125 (配列番号574), TAR2h-126 (配列番号575), TAR2h-127 (配列番号576), TAR2h-128 (配列番号577), TAR2h-129 (配列番号578), TAR2h-130 (配列番号579), TAR2h-131 (配列番号580), TAR2h-132 (配列番号581), TAR2h-133 (配列番号582), TAR2h-151 (配列番号583), TAR2h-152 (配列番号584), TAR2h-153 (配列番号585), TAR2h-154 (配列番号586), TAR2h-159 (配列番号587), TAR2h-165 (配列番号588), TAR2h-166 (配列番号589), TAR2h-168 (配列番号590), TAR2h-171 (配列番号591), TAR2h-172 (配列番号592), TAR2h-173 (配列番号593), TAR2h-174 (配列番号594), TAR2h-176 (配列番号595), TAR2h-178 (配列番号596), TAR2h-201 (配列番号597), TAR2h-202 (配列番号598), TAR2h-203 (配列番号599), TAR2h-204 (配列番号600), TAR2h-185-25 (配列番号601), TAR2h-154-10 (配列番号602)およびTAR2h-205 (配列番号628)よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同である。
【０１６２】
好ましい実施形態においては、単離された及び／又は組換え核酸は、TAR2h-10-27 (配列番号141), TAR2h-10-57 (配列番号151), TAR2h-10-56 (配列番号152), TAR2h-10-58 (配列番号153), TAR2h-10-66 (配列番号154), TAR2h-10-64 (配列番号155), TAR2h-10-65 (配列番号156), TAR2h-10-68 (配列番号157), TAR2h-10-69 (配列番号158), TAR2h-10-67 (配列番号159), TAR2h-10-61 (配列番号160), TAR2h-10-62 (配列番号161), TAR2h-10-63 (配列番号162), TAR2h-10-60 (配列番号163), TAR2h-10-55 (配列番号164), TAR2h-10-59 (配列番号165)およびTAR2h-10-70 (配列番号166)よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同なヌクレオチド配列を含む。
【０１６３】
他の実施形態においては、単離された及び／又は組換え核酸は、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFRI）に特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、TAR2m-14 (配列番号180), TAR2m-15 (配列番号181), TAR2m-19 (配列番号182), TAR2m-20 (配列番号183), TAR2m-21 (配列番号184), TAR2m-24 (配列番号185), TAR2m-21-23 (配列番号186), TAR2m-21-07 (配列番号187), TAR2m-21-43 (配列番号188), TAR2m-21-48 (配列番号189), TAR2m-21-10 (配列番号190), TAR2m-21-06 (配列番号191), TAR2m-21-17 (配列番号192)およびTAR2m-21-23a (配列番号626)よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％相同である。
【０１６４】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子を含んでなるベクターを提供する。ある実施形態においては、該ベクターは、機能しうる形で本発明の組換え核酸に連結された1以上の発現制御要素または配列を含む発現ベクターである。適当なベクター（例えば、プラスミド、ファージミド）および発現制御要素については、後記で更に詳しく説明する。
【０１６５】
本発明はまた、本発明の組換え核酸分子またはベクターを含んでなる組換え宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞、および本発明の組換え宿主細胞の製造方法については、後記で更に詳しく説明する。
【０１６６】
本発明はまた、本発明の組換え核酸を含む組換え宿主細胞を、該組換え核酸の発現のための適当な条件下で維持し、それにより、該組換え核酸を発現させ、リガンドを得ることを含んでなる、本発明のリガンド（例えば、dAb単量体、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド）の製造方法を提供する。いくつかの実施形態においては、該方法は更に、該リガンドを単離することを含む。
【０１６７】
リガンドフォーマット
本発明のリガンドは、単一もしくは多重特異性抗体または抗体フラグメントとして、あるいは単一もしくは多重特異性非免疫グロブリン構造内にフォーマット化（構成）されうる。適当なフォーマット（format（形態））には、抗原に対する結合特異性をポリペプチド構造に付与するよう抗体可変ドメインまたはそのCDRが組込まれうる任意の適当な該ポリペプチド構造が含まれる。種々の適当な抗体フォーマットが当技術分野で公知であり、例えば、IgG様フォーマット、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体およびヘテロ二量体、前記の任意のものの抗原結合フラグメント（例えば、Fvフラグメント（例えば、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv）、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、VH、VL）、dAbならびに前記の任意のものの修飾形態（例えば、ポリアルキレングリコールの共有結合による修飾形態（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）または他の適当な重合体）が挙げられる。単一可変ドメインおよびdAbのPEG化、その適当な製造方法、PEG化単一可変ドメインおよびdAb単量体および多量体のin vivo半減期の延長、適当なPEG、PEGの好ましい流体力学サイズ、ならびにPEG化単一可変ドメインおよびdAb単量体および多量体の好ましい流体力学サイズに関しては、米国を指定している2003年6月30日付け出願のPCT/GB03/002804（WO 2004/081026）を参照されたい。前記について言及している部分を含め、PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026)の全教示を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１６８】
特定の実施形態においては、該リガンド（例えば、dAb単量体、二量体または多量体、二重特異性フォーマット、多重特異性フォーマット）はPEG化されており（PEGylated）、TNFR1のドメイン1に結合し、場合によってはTNFR1の機能を抑制する。好ましくは、該PEG化リガンドはTNFR1を介したシグナリングを抑制する。好ましくは、該PEG化リガンドは、PEG化されていない同じリガンドと実質的に同じ親和性でTNFR1のドメイン1に結合する。例えば、1つの実施形態においては、該リガンドは、TNFR1のドメイン1に結合するPEG化dAb単量体であり、TNFR1を介したシグナリングを抑制し、ここで、該PEG化dAb単量体は、未PEG化形態のdAbの親和性とせいぜい約1000倍、好ましくはせいぜい約100倍、より好ましくはせいぜい約10倍異なる親和性で、または未PEG化形態と比較して実質的に不変の親和性でTNFR1に結合する。
【０１６９】
膜結合（膜貫通）形態および可溶性形態のTNFR1のドメイン1に結合するが該レセプター形態へのTNFαの結合を抑制しない本発明のリガンドは、膜結合レセプター上のドメイン1の遮断（例えば、レセプタークラスタリングの抑制および／またはシグナリングの抑制）に、そしてまた、半減期を延長させるための可溶性形態への結合（特に、PEGに結合している場合またはそれ以外の前記の場合）に有用でありうる。好ましい実施形態においては、該リガンドは膜結合（膜貫通）形態および可溶性形態のTNFR1のドメイン2には結合しない。もう1つの好ましい実施形態においては、該リガンドは膜結合（膜貫通）形態および可溶性形態のTNFR1のドメイン3には結合しない。もう1つの好ましい実施形態においては、該リガンドは膜結合（膜貫通）形態および可溶性形態のTNFR1のドメイン2にもドメイン3にも結合しない。
【０１７０】
いくつかの実施形態においては、該リガンドはIgG様フォーマットである。そのようなフォーマットはIgG分子の通常の4本鎖構造（2本の重鎖および2本の軽鎖）を有し、ここで、可変領域（VHおよび／またはVL）の1以上は所望の特異性のdAbまたは単一可変ドメインにより置換されている。好ましくは、可変領域のそれぞれ（2本のVH領域および2本のVL領域）はdAbまたは単一可変ドメインにより置換されている。IgG様フォーマット内に含まれるdAbまたは単一可変ドメインは、同じ特異性または異なる特異性を有しうる。いくつかの実施形態においては、該IgG様フォーマットは四価であり、1、2、3または4つの特異性を有しうる。例えば、該IgG様フォーマットは単一特異性であり、同じ特異性を有する4つのdAbを含み；あるいは二重特異性であり、同じ特異性を有する3つのdAb、および異なる特異性を有するもう1つのdAbを含み；あるいは二重特異性であり、同じ特異性を有する2つのdAb、および前記特異性とは異なるが共通する特異性を有する2つのdAbを含み；あるいは三重特異性であり、同じ特異性を有する第1および第2 dAb、異なる特異性を有する第3 dAb、ならびに第1、第2および第3 dAbとは異なる特異性を有する第4 dAbを含み；あるいは四重特異性であり、異なる特異性をそれぞれが有する4つのdAbを含む。IgG様フォーマットの抗原結合フラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、scFv）を製造することが可能である。好ましくは、該IgG様フォーマットまたはその抗原結合フラグメントはTNFR1を架橋しない。
【０１７１】
dAb単量体、二量体および三量体を含む本発明のリガンドは、CH2およびCH3ドメインの一方または両方ならびに場合によってはヒンジ領域を含む抗体Fc領域に連結されうる。例えば、そのようなポリペプチドを製造するために、Fc領域に連結されたリガンドを単一ヌクレオチド配列としてコードするベクターを使用することが可能である。
【０１７２】
本発明は更に、本発明の以下の態様において、前記dAb単量体の二量体、三量体および多量体を提供する。
【０１７３】
本発明のリガンドは、より優れた結合活性をもたらすよう同一抗原を有する標的分子に結合する多価複合体を形成させるために、非免疫グロブリン多リガンド構造へと組合され及び／又はフォーマット化（構成）されうる。いくつかの実施形態においては、少なくとも1つの可変ドメインが抗原に結合して該多量体の半減期を延長させる。例えば、1以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製するためのCDRのグラフティングのためのスカフォールドとして、SpAのような天然細菌レセプターが使用されている。この方法の詳細はUS 5,831,012に記載されている。他の適当なスカフォールドには、フィブロネクチンおよびアフィボディ（affibody）に基づくものが含まれる。適当な方法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適当なスカフォールドには、van den Beukenら, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601に記載されているリポカリン（lipocallin）およびCTLA4、ならびにWO0069907（Medical Research Council）に記載されているようなスカフォールド（これは、例えば、細菌GroELまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づくものである）が含まれる。
【０１７４】
タンパク質スカフォールドを組合せることが可能であり、例えば、CDRをCTLA4スカフォールドにグラフティングし、免疫グロブリンVHまたはVLドメインと共に使用してリガンドを形成させることが可能である。同様に、フィブロネクチン、リポカリンおよび他のスカフォールドを組合せることが可能である。
【０１７５】
二重および多重特異性リガンド
本発明者らは、その同時係属国際特許出願WO 03/002609および未公開の同時係属英国特許出願0230203.2において、それぞれが異なる特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二重特異性免疫グロブリンリガンドを記載している。該ドメインは、標的分子上の抗原またはエピトープに結合するよう、お互いに競合して又は独立して、作用しうる。
【０１７６】
本発明の二重特異性リガンドは、好ましくは、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの組合せを含む。例えば、該二重特異性リガンドはVHドメインおよびVLドメインを含むことが可能であり、これらはscFvの形態で互いに連結されうる。また、該リガンドは1以上のCHまたはCLドメインを含みうる。例えば、該リガンドはCH 1ドメイン、CH 2もしくはCH 3ドメイン、および／またはCLドメイン、Cμ1、Cμ2、Cμ3もしくはCμ4ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含みうる。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。他の構造体、例えば、VH、VL、CH1およびCLドメインを含むIgG分子の単一アームも予想される。
【０１７７】
本発明の好ましい実施形態においては、可変領域を単一ドメインV遺伝子レパートリーから選択する。一般には、単一抗体ドメインのレパートリーは線維状バクテリオファージの表面上に提示される。好ましい実施形態においては、各単一抗体ドメインを、抗原へのファージレパートリーの結合により選択する。
【０１７８】
本発明の好ましい実施形態においては、各単一可変ドメインを、相補的可変領域の非存在下でのその標的抗原またはエピトープへの結合に関して選択することが可能である。もう1つの実施形態においては、該単一可変ドメインを、相補的可変領域の存在下でのその標的抗原またはエピトープへの結合に関して選択することが可能である。したがって、第1単一可変ドメインを第3相補的可変ドメインの存在下で選択し、第2可変ドメインを第4相補的可変ドメインの存在下で選択することが可能である。該相補的第3または第4可変ドメインは、試験される単一ドメインと同じ特異性を有する天然コグネイト可変ドメイン、または非コグネイト相補的ドメイン、例えば「ダミー（dummy）」可変ドメインでありうる。
【０１７９】
好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは、2つの可変ドメインしか含まないが、いくつかのそのようなリガンドが一緒に同一タンパク質に組み込まれることも可能であり、例えば、2つのそのようなリガンドがIgGまたは多量体免疫グロブリン、例えばIgMに組み込まれうる。あるいは、もう1つの実施形態においては、多量体を形成させるために複数の二重特異性リガンドを組合せる。例えば、四重特異性分子を作製するために2つの異なる二重特異性リガンドを組合せる。
【０１８０】
本発明の方法により製造された二重特異性リガンドの軽鎖および重鎖可変領域は同一ポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に位置しうると当業者に理解されるであろう。それらの可変領域が、異なるポリペプチド鎖上に位置する場合には、それらは、リンカー、一般には、柔軟（flexible）なリンカー（例えば、ポリペプチド鎖）、化学的連結基または当技術分野で公知の任意の他の方法により連結されうる。
【０１８１】
第1の形態において、本発明は、本発明者らにより開発された二重特異性リガンドにおける更なる改良を提供するものであり、ここで、該リガンドの特異性の1つは、リガンドと結合することにより該リガンドの半減期を延長させるよう作用しうる、生物内にin vivoで存在するタンパク質またはポリペプチド標的に対するものである。
【０１８２】
したがって、もう1つの態様において、第1抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する第1免疫グロブリン単一可変ドメインと、第2抗原またはエピトープに対する結合活性を有する第2相補的免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む二重特異性リガンドを提供し、ここで、該抗原またはエピトープの一方または両方は、該リガンドのin vivo半減期を延長するように作用し、該第1および第2ドメインは、同じ特異性を共有する相互相補的ドメインを欠いており、ただし、該二重特異性リガンドは、抗HSA VHドメインおよび抗βガラクトシダーゼVκドメインよりなるものではない。好ましくは、第1または第2可変ドメインはいずれも、ヒト血清アルブミン（HSA）には結合しない。
【０１８３】
本明細書に記載のリガンドの半減期を延長する抗原またはエピトープは、有利には、in vivoで生物において見出されるタンパク質またはポリペプチド上に存在する。具体例には、細胞外マトリックスタンパク質、血液タンパク質、および生物の種々の組織内に存在するタンパク質が含まれる。該タンパク質は、例えば、増量剤として作用することにより又はリガンドを所望の作用部位に繋ぎとめることにより、血液からのリガンドのクリアランスの速度を減少させるように作用する。in vivo半減期を延長する抗原／エピトープの具体例を、後記の付録1に記載する。
【０１８４】
半減期の延長は、免疫グロブリン、特に、小さいサイズの抗体、さらに詳しくは、抗体フラグメントのin vivoでの適用において有用である。そのようなフラグメント（Fv、ジスルフィド結合Fv、Fab、scFv、dAb）は体内からの迅速なクリアランスを受ける。したがって、それらがほとんどの身体部分に迅速に到達可能であり即座に製造され容易に取り扱えるにもかかわらず、それらのin vivo適用は、それらがin vivoで短時間しか存続しないために制限されている。本発明は、リガンドのin vivo半減期の延長、およびそれによる、該リガンドの機能活性の体内持続時間の延長をもたらすことにより、この問題を解決するものである。
【０１８５】
薬物動力学的解析およびリガンド半減期の測定のための方法は当業者に良く知られているであろう。詳細は、Kenneth, Aら: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)に記載されている。tαおよびtβ半減期ならびに血中濃度-時間曲線下面積（AUC）のような薬物動力学パラメーターを記載している“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker発行, 第2 再版および増補版 (1982)も参照されたい。
【０１８６】
半減期（t1/2 αおよびt1/2 β）およびAUCは、時間に対する血清中リガンド濃度の曲線から決定されうる。WinNonlin解析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）を使用して、例えば、該曲線をモデル化することが可能である。第1相（α相）においては、リガンドは、いくらかの消失を伴いながら、主として、患者の体内に分布しつつある。第2相（β相）は終末相であり、この時、該リガンドは既に分布しており、リガンドが患者から消失するにつれて、血清濃度が減少する。tα半減期は第1相の半減期であり、tβ半減期は第2相の半減期である。したがって、有利には、本発明は、15分以上の範囲のtα半減期を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は、12時間まで（12時間を含む）の範囲のtα半減期を有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は11、10、9、8、7、6または5時間である。適当な範囲の例としては、1〜6時間、2〜5時間または3〜4時間が挙げられる。
【０１８７】
有利には、本発明は、2.5時間以上の範囲のtβ半減期を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は、21日まで（21日を含む）の範囲のtβ半減期を有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は12時間、24時間、2日、3日、5日、10日、15日または20日である。有利には、本発明のリガンドまたは組成物は12〜60時間の範囲のtβ半減期を有する。もう1つの実施形態においては、それは12〜48時間の範囲である。さらにもう1つの実施形態においては、それは12〜26時間の範囲である。
【０１８８】
前記の基準に加えて又はその代わりに、本発明は、1mg.分/ml以上の範囲のAUC（血中濃度-時間曲線下面積）値を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は5、10、15、20、30、100、200または300mg.分/mlである。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は600mg.分/mlまでの範囲のAUCを有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は500、400、300、200、150、100、75または50mg.分/mlである。有利には、本発明のリガンドは、15〜150mg.分/ml、15〜100mg.分/ml、15〜75mg.分/ml、および15〜50mg.分/mlよりなる群から選ばれる範囲のAUCを有する。
【０１８９】
第1の実施形態においては、該二重特異性リガンドは、2つの相補的可変ドメイン（すなわち、それらの天然環境において、コグネイトペアまたは群として一緒になって機能しうる2つの可変ドメインであり、これらは、本発明の場合においてそれらがそれらのコグネイトエピトープに別々に結合する場合であっても、そのように機能しうる）を含む。例えば、相補的可変ドメインは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメイン（VHおよびVL）でありうる。VHおよびVLドメインは、有利には、scFvまたはFab抗体フラグメントにより与えられる。可変ドメインは互いに連結されて多価リガンドを形成しうる。これは、例えば、各VドメインのC末端にヒンジ領域を及び該ヒンジ領域内のシステイン間にジスルフィド結合を設けることにより、あるいは、各dAbにおいて、該ドメインのC末端にシステイン（該システインは互いにジスルフィド結合している）を設けることにより、あるいは、V-CHおよびV-CLを産生させてFabフォーマットを得ることにより、あるいは、ペプチドリンカー（例えば、後記のGly4Serリンカー）を使用して二量体、三量体および更には多量体を得ることにより達成されうる。
【０１９０】
本発明者らは、相補的可変ドメインの使用が、それらの2つのドメイン表面が互いに固まって（pack）溶媒から隔離されることを可能にすることを見出した。さらに、該相補的ドメインはお互いを安定化しうる。また、それは、先行技術において使用されたハイブリッドハイブリドーマの欠点やサブユニット境界面における重鎖または軽鎖の改変操作の必要性を伴うことなく、二重特異性IgG抗体の作製を可能にする。本発明の第1の態様の二重特異性リガンドは少なくとも1つのVH/VLペアを有する。したがって、本発明の二重特異性IgGは2つのそのようなペアを含み、1つのペアはY形分子の各アーム上に存在する。したがって、使用する鎖の比率がその製造の成功のための決定因子であり実施上の問題を招く通常の二重特異性抗体またはジアボディ（diabody）とは異なり、本発明の二重特異性リガンドは鎖の均衡の問題を伴わない。通常の二重特異性抗体における鎖の不均衡は2つの異なるVL鎖と2つの異なるVH鎖との会合から生じ、ここで、VL鎖1はVH鎖1と共に抗原またはエピトープ1に結合することが可能であり、VL鎖2はVH鎖2と共に抗原またはエピトープ2に結合することが可能であり、それらの2つの正しいペアが何らかの方法で互いに連結される。したがって、単一分子内でVL鎖1がVH鎖1とペア形成しVL鎖2がVH鎖2とペア形成した場合にのみ、二重特異性が生じる。そのような二重特異性分子は、2つの異なる様態で生じうる。第1に、それらは、それぞれ異なる抗原またはエピトープに結合する2つの既存のVH/VLペアの会合により生じうる（例えば、二重特異性IgGの場合）。この場合、すべてが二重特異性である分子集団が生じるためには、VH/VLペアは1:1の比で会合しなければならない。これは、（相補的CHドメインが「ノブ・イントゥー・ホール（knobs into holes）」操作により増強された場合であっても）決して生じるものではなく、二重特異性分子と、一方の抗原またはエピトープのみには結合しうるが他方には結合し得ない分子との混合物が生じる。二重特異性抗体が生じる第2の様態は、2つの異なるVH鎖と、2つの異なるVL鎖との同時会合によるものである（例えば、二重特異性ジアボディの場合）。この場合、VL鎖1はVH鎖1とペア形成しVL鎖2はVH鎖2とペア形成する傾向にあるが（これはVLおよびVHドメインの「ノブ・イントゥー・ホール（knobs into holes）」操作により増強されうる）、このペア形成は全ての分子において達成されるわけではなく、混合物が生じて、いずれの抗原またはエピトープにも結合し得ない誤ったペアが生じる。
【０１９１】
本発明の第1の態様の二重特異性リガンドアプローチにより構築された二重特異性抗体はこれらの問題の全てを克服する。なぜなら、抗原またはエピトープ1への結合はVHまたはVLドメインにおいて生じ、抗原またはエピトープ2への結合は相補的VLまたはVHドメインにおいて生じるからである。VHドメインとVLドメインとは1:1でペア形成するため、すべてのVH/VLペアは二重特異性であり、したがって、これらのVH/VLペアを使用して構築された全てのフォーマット（Fv、scFv、Fab、小型化抗体(minibodies)、IgGなど）は100％二重特異性活性を有する。
【０１９２】
本発明の場合には、第1および第2「エピトープ」は、単一の単一特異性リガンドには結合しない同じではないエピトープであると理解される。本発明の第1の形態においては、それらは、有利には、異なる抗原上に存在し、それらのうちの1つは、in vivoにおけるリガンドの半減期を延長させるように作用する。同様に、第1および第2抗原は、有利には、同じではない。
【０１９３】
本発明の二重特異性リガンドは、WO 02/02773に記載のリガンドを含まない。したがって、本発明のリガンドは、任意の1以上の抗原またはエピトープに協同的に結合する相補的VH/VLペアを含まない。その代わりに、本発明の第1の態様のリガンドは、異なる特異性をVドメインが有するVH/VL相補的ペアを含む。さらに、本発明の第1の態様のリガンドは、非構造的関連エピトープまたは抗原に対する異なる特異性を有するVH/VL相補的ペアを含む。構造的に関連したエピトープまたは抗原は、抗原またはエピトープに結合するよう協同的に作用する通常のVH/VL相補的ペアに結合するのに十分な構造類似性を有するエピトープまたは抗原である。構造的に関連したエピトープの場合には、該エピトープは、VH/VL二量体の抗原結合部位に形成される同一結合ポケット内に「嵌る（フィットする）」よう構造において十分に類似している。
【０１９４】
第2の態様においては、本発明は、第1抗原またはエピトープ結合特異性を有する第1免疫グロブリン可変ドメインと、第2抗原またはエピトープ結合特異性を有する第2免疫グロブリン可変ドメインとを含むリガンドであって、該第1および第2可変ドメインの一方または両方が、in vivoでの該リガンドの半減期を延長させる抗原に結合し、該可変ドメインが互いに相補的ではない、リガンドを提供する。
【０１９５】
1つの実施形態においては、1つの可変ドメインを介した結合が第2の可変ドメインへの該リガンドの結合をモジュレートする。
【０１９６】
この実施形態においては、該可変ドメインは、例えば、VHドメインのペアまたはVLドメインのペアでありうる。第1の部位における抗原の結合は第2の部位における該抗原の結合をモジュレート（例えば、増強または抑制）しうる。例えば、第1の部位における結合は第2の部位における抗原の結合を少なくとも部分的に抑制する。そのような実施形態においては、該リガンドは、例えば、該リガンドの半減期を延長させるタンパク質への結合を介して、それが第2の標的抗原に結合し該半減期延長性タンパク質から解離する時まで、対象生物の体内でin vivoで維持されうる。
【０１９７】
前記の場合における結合のモジュレーションは、抗原結合部位が互いに構造的に接近する結果として達成される。そのような構造的接近は、それらの2以上の抗原結合部位を連結する構造的成分の性質により達成されることが可能であり、例えば、密接に接近した状態で抗原結合部位を保持する比較的強固な構造を有するリガンドを設けることにより達成されうる。有利には、それらの2以上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子内のコンフォメーション変化および／または立体障害が関わる過程により1つの部位がもう1つの部位における抗原の結合をモジュレートするよう、お互いに物理的に密接に接近している。
【０１９８】
第1および第2抗原結合ドメインは共有結合または非共有結合により結合しうる。それらのドメインが共有結合する場合には、該結合は、例えば、ジスルフィド結合により、またはポリペプチドリンカー、例えば(Gly4Ser)n（ここで、n = 1〜8、例えば2、3、4、5または7）によりもたらされうる。
【０１９９】
可変ドメインが、例えば本明細書に記載のファージディスプレイ技術を用いて選択されるV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、それらが本明細書に記載の特定のジェネリックリガンドにより認識されうるよう、普遍的フレームワーク領域を含みうる。普遍的フレームワーク、ジェネリックリガンドなどの使用はWO99/20749に記載されている。本発明においては、ファージディスプレイに対する言及はファージおよび／またはファージミドの両方の使用を含む。
【０２００】
V遺伝子レパートリーを使用する場合には、ポリペプチド配列における変異が、好ましくは、可変ドメインの構造ループ内に位置する。各可変ドメインとその相補的ペアとの相互作用を増強するために突然変異により又はDNAシャフリングにより、いずれかの可変ドメインのポリペプチド配列が改変されうる。DNAシャフリングは当技術分野において公知であり、例えばStemmer, 1994, Nature 370: 389-391および米国特許第6,297,053号（それらを共に、参照により本明細書に組み入れることとする）に教示されている。突然変異誘発のための他の方法は当業者によく知られている。
【０２０１】
本発明の好ましい実施形態においては、「二重特異性リガンド」は単一鎖Fvフラグメントである。本発明のもう1つの実施形態においては、「二重特異性リガンド」は抗体のFab領域よりなる。「Fab領域」なる語は、2つのVHまたは2つのVLドメインが用いられているFab様領域を含む。
【０２０２】
該可変領域は標的抗原またはエピトープに対する抗体から誘導されうる。あるいは、それは単一抗体ドメイン（例えば、線維状バクテリオファージの表面上で発現されるもの）のレパートリーから誘導されうる。選択は、後記のとおりに行うことが可能である。
【０２０３】
もう1つの実施形態においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の二重特異性リガンドをコードする1以上の核酸分子を提供する。該二重特異性リガンドは単一核酸分子上でコードされうる。あるいは、各ドメインは別々の核酸分子によりコードされうる。該リガンドが単一核酸分子によりコードされる場合には、該ドメインはscFv分子の形態の融合ポリペプチドとして発現されることが可能であり、あるいは別々に発現され、ついで例えば化学的連結剤を使用して互いに連結されうる。別々の核酸から発現されたリガンドは、適当な手段により互いに連結される。
【０２０４】
該核酸は更に、発現後に宿主細胞からポリペプチドを輸出するためのシグナル配列をコードすることが可能であり、発現後に線維状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選択提示系の他の成分）に融合されうる。
【０２０５】
もう1つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【０２０６】
さらにもう1つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性リガンドをコードするベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０２０７】
そのようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上に選択用可変ドメインを産生するように操作されうる。これは、本発明の方法を用いて、提示された可変領域を選択すること、したがって「二重特異性リガンド」を選択することを可能にする。
【０２０８】
本発明は更に、少なくとも本発明の二重特異性リガンドを含むキットを提供する。
【０２０９】
第3の態様においては、本発明は、第1の結合特異性を有する第1免疫グロブリン単一可変ドメインと、第2の（異なる）結合特異性を有する第2単一免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むリガンドの製造方法を提供し、ここで、該結合特異性の一方または両方は、in vivoにおける該リガンドの半減期を延長させる抗原に特異的であり、該製造方法は、
a）第1可変ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
b）第2可変領域を、第2エピトープへのその結合能により選択し、
c）それらの可変ドメインを組合せ、
d）該リガンドを、第1エピトープへの及び第2エピトープへのその結合能により選択する工程を含む。
【０２１０】
該リガンドは第1および第2エピトープに同時に結合することが可能であり、あるいは、エピトープ結合に関して該結合ドメイン間で競合が生じる場合には、1つのドメインの結合は、そのコグネイトエピトープへのもう1つのドメインの結合を排除しうる。したがって、1つの実施形態においては、前記工程（d）は、第1および第2（そして恐らくは他の）エピトープの両方への同時結合を要し、もう1つの実施形態においては、第1および第2エピトープへの結合は同時ではない。
【０２１１】
それらのエピトープは、好ましくは、別々の抗原上に存在する。
【０２１２】
リガンドは、有利には、前記の免疫グロブリン可変ドメインの組合せVH/VL、または組合せVH/VHもしくはVL/VLを含む。in vivoにおける該リガンドの半減期を延長させる抗原に特異的であるVHHドメインが鶏卵白リゾチーム（HEL）、ブタ膵αアミラーゼまたはNmC-A；hcg、BSA結合RR6アゾ色素またはエス・ミュータンス（S. mutans）HG982細胞［Conrathら, (2001) JBC 276:7346-7350およびWO99/23221（これらはいずれも、in vivoにおける該リガンドの半減期を延長させるための、半減期を延長させる抗原に対する特異性の利用を記載していない）に記載されている］に結合しない限り、該リガンドは更に、ラクダ科動物VHHドメインを含みうる。
【０２１３】
1つの実施形態においては、第1可変ドメインを、相補的可変ドメインの非存在下の第1エピトープへの結合に関して選択する。もう1つの実施形態においては、第1可変ドメインを、第3可変ドメインの存在下の第1エピトープ／抗原への結合に関して選択し、ここで、第3可変ドメインは第2可変ドメインとは異なるものであり、第1ドメインに相補的である。同様に、第2ドメインは、相補的可変ドメインの非存在下または存在下で選択することが可能である。
【０２１４】
本発明のリガンドにより標的化される抗原またはエピトープは、半減期延長性タンパク質に加えて、任意の抗原またはエピトープでありうるが、有利には、治療利益を伴って標的化される抗原またはエピトープである。本発明は、任意のそのような標的（特に、本明細書中で更に特定される標的）に特異的である、開いたコンフォメーション、閉じたコンフォメーションおよび単離されたdAb単量体リガンドを含むリガンドを提供する。そのような標的は、天然に存在するもの若しくは合成体でありうるポリペプチド、タンパク質もしくは核酸またはそれらの一部でありうる。この場合、本発明のリガンドは該エピトープまたは抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、EPOレセプターアゴニスト）として作用しうる。その選択は多種多様であると当業者は理解するであろう。それらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカインレセプター、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質でありうる。適当なサイトカインおよび増殖因子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン（Cardiotrophin）-1、EGF、EGFレセプター、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エクソダス（Exodus）-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNFレセプターI、TNFレセプターII、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGFレセプター1、VEGFレセプター2、VEGFレセプター3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4。サイトカインレセプターには、前記サイトカインのレセプターが含まれる。この一覧は網羅的なものではないと理解されるであろう。
【０２１５】
本発明の1つの実施形態においては、該可変ドメインは該抗原またはエピトープに対するそれぞれの抗体から誘導される。好ましい実施形態においては、該可変ドメインは単一可変抗体ドメインのレパートリーから誘導される。
【０２１６】
第2の形態において、本発明は多重特異性リガンドを提供する。本発明においては、「多重特異性リガンド」なる語は、本明細書中に定義されているとおりの2以上のエピトープ結合特異性を有するリガンドを意味する。一般には、多重特異性リガンドは2以上のエピトープ結合ドメインを含む。
【０２１７】
本発明のエピトープ結合ドメインはタンパク質スカフォールドおよびエピトープ相互作用部位（これは、有利には、タンパク質スカフォールドの表面上に位置する）を含む。本発明においては、有利には、各エピトープ結合ドメインは、異なるエピトープ結合特異性のものである。
【０２１８】
本発明においては、第1および第2「エピトープ」は、単一の単一特異性リガンドに結合しない、同一ではないエピトープであると理解される。それらは、異なる抗原上に存在したり、あるいは同一抗原上に存在しうるが、通常の抗体の単一の単一特異性VH/VL結合ペアに結合しうる単一体をそれらが形成しない程度に十分な距離を隔てて分離している。経験的には、単一鎖抗体形態（ドメイン抗体またはdAb）内の個々の可変ドメインの両方が、2つのエピトープに対して単一特異性VH/VLリガンドにより別々に競合される場合には、それらの2つのエピトープは、本発明における分離したエピトープとみなされるのに十分な程度には離れていない。
【０２１９】
本発明においては、有利には、各エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン可変ドメインを含む。より有利には、各免疫グロブリン可変ドメインは可変軽鎖ドメイン（VL）または可変重鎖ドメインVHである。本発明の第2の形態においては、免疫グロブリンドメインは、本発明のリガンド上に存在する場合には、非相補的である。すなわち、それらは、VH/VL抗原結合部位を形成するよう会合しない。したがって、本発明の第2の形態において特定される多重特異性リガンドは、可変軽鎖ドメイン（VL）または可変重鎖ドメイン（VH）である同一サブタイプの免疫グロブリンドメインを含む。さらに、本発明のリガンドが、閉じたコンフォメーションを有する場合には、免疫グロブリンドメインはラクダ科動物VHH型のものでありうる。
【０２２０】
もう1つの実施形態においては、本発明のリガンドはラクダ科動物VHHドメインを含まない。より詳しくは、本発明のリガンドは、ヒトVHドメインと比較してラクダ科動物VHHドメインに特異的である1以上のアミノ酸残基を含まない。
【０２２１】
有利には、単一可変ドメインは、異なる抗原またはエピトープに対する結合活性に関して選択された抗体から誘導される。例えば、該可変ドメインは、少なくとも部分的には、ヒトへの免疫化により単離されうる。ヒト抗体ライブラリーからの単離および人工抗体遺伝子の合成を含む他の方法も当技術分野において公知である。
【０２２２】
該可変ドメインは、有利には、スーパー抗原、例えばプロテインAまたはプロテインLに結合する。スーパー抗原への結合は、正しくフォールディングした抗体可変ドメインの特性であり、そのようなドメインが例えば組換え又は突然変異ドメインのライブラリーから単離されるのを可能にする。
【０２２３】
また、エピトープ結合ドメインは、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スカフォールドまたは骨格に基づくものでありうる。例えば、1以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製するためのCDRのグラフティングのためのスカフォールドとして、SpAのような天然細菌レセプターが使用されている。この方法の詳細は米国特許第5,831,012号に記載されている。他の適当なスカフォールドには、フィブロネクチンおよびアフィボディ（affibody）に基づくものが含まれる。適当な方法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適当なスカフォールドには、van den Beukenら, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601に記載されているリポカリン（lipocallin）およびCTLA4、ならびにWO0069907（Medical Research Council）に記載されているようなスカフォールド（これは、例えば、細菌GroELまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づくものである）が含まれる。
【０２２４】
タンパク質スカフォールドを組合せることが可能であり、例えば、CDRをCTLA4スカフォールドにグラフティングし、免疫グロブリンVHまたはVLドメインと共に使用して多価リガンドを形成させることが可能である。同様に、フィブロネクチン、リポカリンおよび他のスカフォールドを組合せることが可能である。
【０２２５】
1つの実施形態においては、該多重特異性リガンドは、適当なタンパク質スカフォールドまたは骨格にグラフティングされた本明細書に記載のTNFR1に結合する単一免疫グロブリンドメイン（dAb）のCDRを含むエピトープ結合ドメインを含む。
【０２２６】
本発明の方法により製造された閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドのエピトープ結合ドメインは同一ポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に位置しうると当業者に理解されるであろう。それらの可変領域が、異なるポリペプチド鎖上に位置する場合には、それらは、リンカー、有利には、柔軟（flexible）なリンカー（例えば、ポリペプチド鎖）、化学的連結基または当技術分野で公知の任意の他の方法により連結されうる。
【０２２７】
第1および第2エピトープ結合ドメインは共有結合または非共有結合により結合しうる。該ドメインが共有結合する場合には、該結合は例えばジスルフィド結合によりもたらされうる。
【０２２８】
本発明の第2の形態の或る実施形態においては、該エピトープは、結合の際に互いに置換されうる。例えば、第1エピトープが、そのコグネイト第1結合ドメインへの結合の際に、第2結合ドメインの立体障害またはそれにおけるコンフォメーション変化を引き起こす抗原上に存在することがあり、このため、第2結合ドメインに結合しているエピトープが脱離しうる。
【０２２９】
有利には、結合は25％またはそれ以上、有利には40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上、好ましくは、100％まで又はほぼ100％減弱されて、結合が完全に抑制される。エピトープの結合は、通常の抗原結合アッセイ、例えばELISAにより、または蛍光に基づく技術、例えばFRETにより、または分子の質量を測定する表面プラズモン共鳴のような技術により測定することが可能である。
【０２３０】
さらに、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを提供し、ここで、第1結合特異性と第2結合特異性とが、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時に結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合しうる。
【０２３１】
本発明の閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、WO 02/02773に記載のリガンドを含まない。したがって、本発明のリガンドは、任意の1以上の抗原またはエピトープに協同的に結合する相補的VH/VLペアを含まない。その代わりに、本発明のリガンドは、好ましくは、非相補的VH-VHまたはVL-VLペアを含む。有利には、各VH-VHまたはVL-VLペアにおける各VHまたはVLドメインは、異なるエピトープ結合特異性を有し、該エピトープ結合部位は、1つの部位におけるエピトープの結合が別の部位におけるエピトープの結合と競合するよう配置されている。
【０２３２】
有利には、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、標的分子に結合しうる第1ドメインと、該リガンドの半減期を延長する分子または基に結合しうる第2ドメインとを含みうる。例えば、該分子または基は、嵩張った（bulky）物質、例えばHSAまたは細胞マトリックスタンパク質でありうる。本明細書中で用いる「リガンドの半減期を延長する分子または基」なる表現は、本明細書に記載の二重特異性リガンドにより結合された場合に、動物に投与されたそのような二重特異性リガンドのin vivo半減期を、その分子または基に結合しないリガンドと比較して増加させる分子または化学基を意味する。リガンドの半減期を延長する分子または基の具体例は後記に記載されている。好ましい実施形態においては、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、半減期延長性分子または基の脱離に際してのみ標的分子に結合しうるであろう。したがって、例えば、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、HSAのような嵩張った物質により、対象の血流循環中に維持される。標的分子との遭遇が生じると、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの結合ドメイン間の競合がHSAの離脱および該標的の結合を引き起こす。
【０２３３】
本発明の第2の形態の好ましい実施形態においては、エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン可変領域であり、単一ドメインV遺伝子レパートリーから選択される。一般には、単一抗体ドメインのレパートリーは線維状バクテリオファージの表面上に提示される。好ましい実施形態においては、各単一抗体ドメインは抗原へのファージレパートリーの結合により選択される。本発明の第2の形態の好ましい実施形態においては、エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン可変領域であり、単一ドメインV遺伝子レパートリーから選択される。一般には、単一抗体ドメインのレパートリーは線維状バクテリオファージの表面上に提示される。好ましい実施形態においては、各単一抗体ドメインは抗原へのファージレパートリーの結合により選択される。
【０２３４】
1つの態様においては、該多重特異性リガンドは少なくとも2つの非相補的可変ドメインを含む。例えば、該リガンドはVHドメインのペアまたはVLドメインのペアを含みうる。有利には、該ドメインは非ラクダ科動物由来であり、好ましくは、それらはヒトドメインであり、またはヒトフレームワーク領域（FW）および1以上の異種CDRを含む。CDRおよびフレームワーク領域は、Sequences of Proteins of Immunological InterestのKabatデータベース内で特定されている免疫グロブリン可変ドメインの領域である。
【０２３５】
好ましいヒトフレームワーク領域は、生殖系列遺伝子セグメントDP47およびDPK9によりコードされるものである。有利には、VHまたはVLドメインのFW1、FW2およびFW3はDP47またはDPK9からのFW1、FW2またはFW3の配列を有する。該ヒトフレームワークは、所望により、突然変異を含有することが可能であり、例えば、本発明のリガンドにおいて使用するヒトフレームワーク内に合わせて約5個までのアミノ酸の変化または約10個までのアミノ酸の変化を含有しうる。
【０２３６】
本発明の第2の形態の多重特異性リガンド内の可変ドメインは、開いた又は閉じたコンフォメーションで配置されうる。すなわち、該可変ドメインがそれらのコグネイトリガンドに、独立して及び同時に結合しうるように、または該可変ドメインの1つだけがそのコグネイトリガンドに任意の一時点で結合しうるように、該可変ドメインが配置されうる。
【０２３７】
本発明者らは、ある構造条件下、非相補的可変ドメイン（例えば、2つの軽鎖可変ドメインまたは2つの重鎖可変ドメイン）がコグネイトペアとして一緒に作用しない場合であっても、第1可変ドメインへの第1エピトープの結合が第2可変ドメインへの第2エピトープの結合を抑制するよう該非相補的可変ドメインがリガンド内に存在しうることを見出した。
【０２３８】
有利には、該リガンドは可変ドメインのペアの2以上を含む。すなわち、それは少なくとも4つの可変ドメインを含む。有利には、それらの4つの可変ドメインはヒト由来のフレームワークを含む。
【０２３９】
好ましい実施形態においては、ヒトフレームワークはヒト生殖系列配列のものと同一である。
【０２４０】
そのような抗体は治療用途および他の用途のためのリガンド結合アッセイにおいて特に有用である、と本発明者らは考えている。
【０２４１】
本発明の第2の形態の1つの実施形態においては、該可変ドメインは第1および／または第2抗原またはエピトープに対する抗体から誘導される。好ましい実施形態においては、該可変ドメインは単一可変抗体ドメインのレパートリーから誘導される。1つの例においては、該レパートリーは、動物においては生じないレパートリー、または合成レパートリーである。もう1つの例においては、該単一変異ドメインは、動物への免疫化により（少なくとも部分的に）単離されるものではない。したがって、該単一ドメインはナイーブライブラリーから単離されうる。
【０２４２】
本発明の第2の形態は、もう1つの態様において、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む多重特異性リガンドを提供する。第1結合特異性と第2結合特異性とは同一または異なりうる。
【０２４３】
もう1つの態様において、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを提供し、ここで、第1結合特異性と第2結合特異性とが、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時に結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合しうる。
【０２４４】
さらにもう1つの態様において、本発明は、非相補的結合ドメインを含む開いたコンフォメーションのリガンドを提供し、ここで、該ドメインは同一標的上の異なるエピトープに特異的である。そのようなリガンドは、増加した結合活性で標的に結合する。同様に、本発明は、同一エピトープに特異的でありかつ該エピトープの多重コピーを含む標的(例えばIL-5、PDGF-AA、PDGF-BB、TGFβ、TGFβ2、TGFβ3およびTNFα、例えばヒトTNFレセプター1およびヒトTNFαなど)に対する、非相補的結合ドメインを含む多価リガンドを提供する。
【０２４５】
類似した態様においては、本発明のリガンドを、個々のエピトープに低い親和性で結合するよう操作して、個々のエピトープへの結合は治療的に重要ではないものの、2つのエピトープへの結合から生じる結合活性の増加が治療利益をもたらすようにすることができる。特定の例においては、正常な細胞型上には個別に存在するが異常または病的細胞（例えば、腫瘍細胞）上においてのみ一緒になって存在するエピトープを標的化することが可能である。そのような場合には、異常または病的細胞のみが本発明の二重特異性リガンドにより有効に標的化される。
【０２４６】
また、同一エピトープの多重コピーまたは隣接エピトープ（同一標的上のもの）に特異的なリガンド（キレート化dAbとして公知である）は、3個、4個またはそれ以上の非相補的結合ドメインを含む三量体または多量体（四量体またはそれ以上）リガンドでありうる。例えば、3個または4個のVHドメインまたはVLドメインを含むリガンドを構築することが可能である。
【０２４７】
さらに、多サブユニット標的に結合し、各結合ドメインが該標的のサブユニットに特異的であるリガンドを提供する。該リガンドは二量体、三量体または多量体でありうる。
【０２４８】
好ましくは、本発明の前記態様の多重特異性リガンドは本発明の第1の態様の方法により入手可能である。
【０２４９】
本発明の第2の形態の前記態様においては、有利には、第1エピトープ結合ドメインおよび第2エピトープ結合ドメインは、本明細書に定義されているとおりの非相補的免疫グロブリン可変ドメインである。すなわちVH-VHまたはVL-VL可変ドメインである。
【０２５０】
特にキレート化dAbは、本発明の好ましい態様に従い、すなわち、アンカーdAbを使用することにより製造することが可能であり、この場合、リンカー配列の上流または下流に定常（constant）dAbを含むベクター（該リンカーのもう一方の側には第2、第3およびさらなるdAbのレパートリーが挿入される）を使用して二量体、三量体または多量体dAbのライブラリーが構築される。例えば、アンカーまたはガイディング（guiding）dAbはTAR1-5（Vκ）、TAR1-27（Vκ）、TAR2h-5（VH）またはTAR2h-6（Vκ）でありうる。
【０２５１】
もう1つの方法においては、例えば、VHおよびVκのような結合ドメイン間に天然親和性または非共有結合を用いることにより、リンカーの使用を避けることが可能である。したがって、本発明は、
（a）標的上の第1エピトープに特異的な単一結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを準備し、
（b）該標的上の第2エピトープに特異的な第2結合ドメインを含むレパートリーをコードするベクターを準備し、ここで、該エピトープは第1エピトープと同一であっても異なっていてもよく、第2エピトープは第1エピトープに隣接しており、
（c）第1および第2結合ドメインを発現させ、
（d）一緒になって標的結合性二量体を形成する第1および第2結合ドメインの組合せを単離する工程を含む、キレート化多量体リガンドの製造方法を提供する。
【０２５２】
第1エピトープと第2エピトープとは隣接しており、そのため、多量体リガンドは両方のエピトープに同時に結合しうる。これは、結合する場合の結合活性の増加という利点を該リガンドに与える。それらのエピトープが同一である場合には、結合活性の増加は、結合活性増強効果を得るために少なくとも2つのコピーの同時結合を可能にする該標的上の該エピトープの多重コピーの存在により得られる。
【０２５３】
該結合ドメインは、いくつかの方法またはリンカーの使用により会合させることが可能である。例えば、該結合ドメインは、cys残基、アビジンおよびストレプトアビジン基、または合成後の非共有結合のための他の手段を含みうる。標的に効率的に結合する組合せ体が単離されるであろう。あるいは、第1および第2結合ドメイン間にリンカーが存在してもよく、該リンカーは、第1結合ドメイン、リンカーおよび第2結合ドメインのレパートリー（例えば、前記のとおり）を含む単一ポリペプチドとして単一ベクターから発現される。
【０２５４】
好ましい態様においては、第1結合ドメインと第2結合ドメインとは、抗原に結合している場合には、自然に会合する。例えば、VHドメインとVκドメインとは、隣接エピトープに結合している場合には、3通りの相互作用により自然に会合して、安定な二量体を形成するであろう。そのような会合タンパク質は標的結合アッセイで単離されうる。この方法の利点は、密接に隣接したエピトープに正しいコンフォメーションで結合する結合ドメインのみが会合し、標的に対する結合活性の増加の結果として単離されることである。
【０２５５】
本発明の第2の形態の前記態様のもう1つの実施形態においては、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインは非免疫グロブリン「タンパク質スカフォールド」または「タンパク質骨格」（本明細書中で定義されているとおり）を含む。適当な非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドには、SpA、フィブロネクチン、GroELおよび他のシャペロン、リポカリン、CCTLA4ならびにアフィボディ（前記のとおり）よりなる群から選ばれるもののいずれかが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２５６】
本発明の第2の形態の前記態様においては、有利には、エピトープ結合ドメインはタンパク質骨格に結合している。有利には、本発明のタンパク質骨格は免疫グロブリン骨格である。
【０２５７】
本発明において、「免疫グロブリン骨格」なる語は、少なくとも1つの免疫グロブリンフォールドを含み1以上のエピトープ結合ドメイン（本明細書中で定義されているとおり）のための核として作用するタンパク質を意味する。
【０２５８】
本明細書中で定義されている好ましい免疫グロブリン骨格には、以下のものから選ばれる任意の1以上が含まれる：少なくとも（i）抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインまたは（ii）抗体重鎖のCH1ドメイン；抗体重鎖のCH1およびCH2ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；あるいは抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインと一緒になったサブセット（ii）のいずれか。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。この一覧は網羅的なものではないと当業者は認識するであろう。
【０２５９】
本明細書に定義されているとおりのエピトープ結合ドメインへの該骨格の連結は、ポリペプチドレベルで（すなわち、該骨格および／または該エピトープ結合ドメインをコードする核酸の発現後に）達成されうる。あるいは、該連結工程は、核酸レベルで行うことが可能である。本発明のタンパク質骨格を1以上のエピトープ結合ドメインに連結するための方法は、当業者によく知られており本明細書に記載されているタンパク質化学および／または分子生物学的技術の利用を含む。
【０２６０】
有利には、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、標的分子に結合しうる第1ドメインと、該リガンドの半減期を延長する分子または基に結合しうる第2ドメインとを含みうる。例えば、該分子または基は、嵩張った（bulky）物質、例えばHSAまたは細胞マトリックスタンパク質でありうる。本明細書中で用いる「リガンドの半減期を延長する分子または基」なる表現は、本明細書に記載の二重特異性リガンドにより結合された場合に、動物に投与されたそのような二重特異性リガンドのin vivo半減期を、その分子または基に結合しないリガンドと比較して延長する分子または化学基を意味する。リガンドの半減期を延長する分子または基の具体例は後記に記載されている。好ましい実施形態においては、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、半減期延長性分子または基の脱離に際してのみ標的分子に結合しうるであろう。したがって、例えば、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、HSAのような嵩張った物質により、対象の血流循環中に維持される。標的分子との遭遇が生じると、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの結合ドメイン間の競合がHSAの脱離および該標的の結合を引き起こす。
【０２６１】
本発明の第2の形態のもう1つの態様において、本発明は、少なくとも本明細書に記載の多重特異性リガンドをコードする1以上の核酸分子を提供する。1つの実施形態においては、該リガンドは、閉じたコンフォメーションのリガンドである。もう1つの実施形態においては、それは、開いたコンフォメーションのリガンドである。該多重特異性リガンドは単一核酸分子上でコードされうる。あるいは、各エピトープ結合ドメインは別々の核酸分子によりコードされうる。該リガンドが単一核酸分子によりコードされる場合には、該ドメインは融合ポリペプチドとして発現されることが可能であり、あるいは別々に発現され、ついで、例えば化学的連結剤を使用して互いに連結されうる。別々の核酸から発現されたリガンドは、適当な手段により互いに連結される。
【０２６２】
該核酸は更に、発現後に宿主細胞からポリペプチドを輸出するためのシグナル配列をコードすることが可能であり、発現後に線維状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選択提示系の他の成分）に融合されうる。細菌発現および／またはファージもしくはファージミド提示において使用しうるリーダー配列には、pelB、stII、ompA、phoA、blaおよびpelAが含まれる。
【０２６３】
本発明の第2の形態のもう1つの態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【０２６４】
さらにもう1つの態様において、本発明は、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０２６５】
そのようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上に選択用エピトープ結合ドメインを産生するように操作されうる。これは、本発明の方法を用いて、提示されたドメインを選択すること、したがって「多重特異性リガンド」を選択することを可能にする。
【０２６６】
本発明は更に、開いたコンフォメーションまたは閉じたコンフォメーションのリガンドでありうる本発明の多重特異性リガンドを少なくとも含むキットを提供する。本発明のキットは、例えば診断用キット、治療用キット、化学的または生物学的種の検出のためのキットなどでありうる。
【０２６７】
本発明は、
a）第1エピトープ結合ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
b）第2エピトープ結合ドメインを、第2エピトープへのその結合能により選択し、
c）それらのエピトープ結合ドメインを組合せ、
d）閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを、第1エピトープおよび第2エピトープへのその結合能により選択する工程を含む、多重特異性リガンドの製造方法を提供する。
【０２６８】
第2の態様のもう1つの態様において、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの製造方法を提供し、ここで、第1結合特異性と第2結合特異性とが、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時に結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合する。該製造方法は、
a）第1エピトープ結合ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
b）第2エピトープ結合ドメインを、第2エピトープへのその結合能により選択し、
c）それらのエピトープ結合ドメインを、該ドメインが、閉じたコンフォメーションとなるよう組合せ、
d）閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを、第1エピトープおよび第2エピトープへのその結合能（ただし、第1および第2エピトープの両方に同時に結合する場合は除く）により選択する工程を含む。
【０２６９】
本発明の第2の形態の前記態様のもう1つの実施形態は、所望により、第3または第4エピトープ結合ドメインを選択することを含む追加的工程（b1）を含みうる。この場合、製造される多重特異性リガンドは、開いたコンフォメーションであるか閉じたコンフォメーションであるかには無関係に、3以上のエピトープ結合特異性を含む。本発明の第2の形態の好ましい態様においては、該多重特異性リガンドが3以上のエピトープ結合ドメインを含む場合には、該ドメインの少なくとも2つは、閉じたコンフォメーションであり、結合に関して競合し、他のドメインは結合に関して競合することが可能であり、あるいは、独立してそれらのコグネイトエピトープと自由に会合しうる。
【０２７０】
本発明の第2の形態においては、第1エピトープと第2エピトープとは、好ましくは、異なる。それらは、天然に存在するもの若しくは合成体でありうるポリペプチド、タンパク質もしくは核酸またはそれらの一部でありうる。この場合、本発明のリガンドはエピトープまたは抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、EPOレセプターアゴニスト）として作用しうる。1つの実施形態におけるリガンドのエピトープ結合ドメインは、同じエピトープ特異性を有し、例えば、該エピトープの多重コピーが同一抗原上に存在する場合には、それらのエピトープに同時に結合しうる。もう1つの実施形態においては、これらのエピトープは、該リガンドが該エピトープに結合し該抗原を架橋しうるよう、異なる抗原上に設けられている。エピトープおよび抗原の選択は多種多様であると当業者は理解するであろう。それらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカインレセプター、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質でありうる。適当なサイトカインおよび増殖因子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カルジオトロフィン（Cardiotrophin）-1、EGF、EGFレセプター、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エクソダス（Exodus）-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67 a.a.）、MDC（69 a.a.）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNFレセプターI、TNFレセプターII、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGFレセプター1、VEGFレセプター2、VEGFレセプター3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、TACE認識部位、TNF BP-IおよびTNF BP-II、ならびに本明細書の付録2または付録3に開示されている任意の標的（該付録に記載されているとおりの組合せで、または異なる組合せで、または個々に使用することが可能である）。サイトカインレセプターには、前記サイトカインのレセプター、例えばIL-1 R1、IL-6R、IL-10R、IL-18R、ならびに付録2または付録3に記載のサイトカインのレセプター、さらには、付録2および3に開示されているレセプターが含まれる。この一覧は網羅的なものではないと理解されるであろう。該多重特異性リガンドが（同一または異なる抗原上の）2つのエピトープに結合する場合、該抗原はこの一覧から選ばれうる。特定の実施形態においては、該リガンドは、TNFR1に結合するdAbと、これらの抗原のいずれかに結合する第2 dAbまたはエピトープ結合ドメインとを含む。そのよう���実施形態においては、該多重特異性リガンドは免疫グロブリン可変ドメインの任意の組合せ（例えば、VHVH、VHVL、VLVL）を含みうる。
【０２７１】
免疫グロブリンに基づく多重特異性リガンドの製造
本発明の二重特異性リガンドは、本発明の所望の形態による開いたコンフォメーションであるか閉じたコンフォメーションであるかにかかわらず、scFv、「ファージ」抗体および他の遺伝子操作抗体分子の製造のための、抗体工学の分野において用いられる既に確立された技術により製造することが可能である。抗体、特に二重特異性抗体の製造のための技術は、例えば、以下の総説およびそれに引用されている参考文献に記載されている：Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wrightら, (1992) Crti. Rev. Immunol.12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carterら, (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130。
【０２７２】
本発明は、2つの異なる抗原またはエピトープに対する可変ドメインの選択、およびそれに続く、該可変ドメインの合体（組合せ）を提供する。
【０２７３】
該可変ドメインの選択に用いる技術は、当技術分野で公知のライブラリーおよび選択方法を用いる。ヒトB細胞から集められた再構成V遺伝子を使用する天然ライブラリー（Marksら, (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughanら, (1996) Nature Biotech., 14:309）が当業者によく知られている。合成ライブラリー（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）は、通常はPCRを用いて免疫グロブリンV遺伝子をクローニングすることにより製造される。PCR過程におけるエラーが高度のランダム化を招きうる。VHおよび／またはVLライブラリーは、別々に（この場合、単一ドメイン結合が直接的に選択される）または一緒に、標的抗原またはエピトープに対して選択されうる。
【０２７４】
本発明の二重特異性リガンドを製造するための好ましい方法は、第1抗原またはエピトープへの結合に関して可変ドメインのレパートリーが選択され第2抗原またはエピトープへの結合に関して可変ドメインのレパートリーが選択される選択系を使用することを含む。ついで、選択された第1可変ドメインと第2可変ドメインとを組合せ、第1および第2抗原またはエピトープの両方への結合に関して二重特異性リガンドを選択する。閉じたコンフォメーションのリガンドは、第1および第2抗原またはエピトープの両方への分離した同時ではない結合に関して選択される。
【０２７５】
A．ライブラリーベクター系
本発明での使用に適した種々の選択系が当技術分野において公知である。そのような系の具体例を以下に説明する。
【０２７６】
バクテリオファージλ発現系は、バクテリオファージプラークとして又は溶原体のコロニーとして、どちらも既に記載されているとおりに（Huseら (1989) Science, 246:1275; CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8095; Perssonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:2432）、直接的にスクリーニングすることが可能であり、本発明において有用である。そのような発現系は、106個までの異なるライブラリーメンバーをスクリーニングするのに使用することが可能であるが、それらは実際には、より多数（106個を超えるメンバー）のスクリーニングには適していない。
【０２７７】
ライブラリーの構築において特に関心が持たれるのは、選択提示系であり、これは、核酸を、それが発現するポリペプチドに関連づけることを可能にする。本明細書中で用いる選択提示系は、適当な提示手段により、ジェネリックリガンドおよび／または標的リガンドへの結合により個々のライブラリーメンバーの選択を可能にする系である。
【０２７８】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは当技術分野で公知であり、代表例としてファージ提示（ファージディスプレイ）技術が挙げられる。そのような系は、多様なペプチド配列を線維状バクテリオファージの表面上に提示させるものであり（ScottおよびSmith (1990) Science, 249: 386）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であることが判明している（McCaffertyら, WO 92/01047）。VHおよびVL領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌（E. coli）の細胞周辺腔に導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果、生じた抗体フラグメントはバクテリオファージの表面上に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、pIIIまたはpVIII）との融合体として提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージカプシド（ファージボディー（phagebodies））上に外的に提示される。ファージに基づく提示系の利点は、それらが生物学的系であるため、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを細菌細胞内で増殖させることにより、選択されたライブラリーメンバーが簡便に増幅されうることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列はファージまたはファージミドベクター上に含有されているため、配列決定、発現およびそれに続く遺伝子操作が比較的容易である。
【０２７９】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当技術分野でよく知られている（参照により次の文献を本明細書に組み入れる：McCaffertyら (1990) Nature, 348: 552; Kangら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Lowmanら (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burtonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Changら (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitlingら (1991) Gene, 104: 147; Marksら (1991) 前掲; Barbasら (1992) 前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marksら, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lernerら (1992) Science, 258: 1313）。
【０２８０】
特に有利な1つのアプローチはscFvファージライブラリーの使用である（Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acid. Sci U.S.A., 85:5879-5883; Chaudharyら (1990) Proc. Natl. Acid. Sci U.S.A., 87:1066-1070; McCaffertyら (1990) 前掲; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswellら (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marksら (1992) J. Biol. Chem., 267）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるscFvライブラリーの種々の具体例が記載されている。改良されたファージディスプレイアプローチも公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れるWO96/06213およびWO92/01047（Medical Research Councilら）およびWO97/08320（Morphosys）に記載されている。
【０２８１】
ポリペプチドのライブラリーを作製するための他の系は、該ライブラリーメンバーのin vitro合成のための無細胞酵素装置の使用を含むものである。1つの方法においては、標的リガンドに対する選択とPCR増幅との交互のラウンドによりRNA分子を選択する（TuerkおよびGold (1990) Science, 249:505; EllingtonおよびSzostak (1990) Nature, 346:818）。所定のヒト転写因子に結合するDNA配列を同定するために、同様の技術を用いることができる（ThiesenおよびBach (1990) Nucleic Acids Res., 18:3203; BeaudryおよびJoyce (1992) Science, 257:635; WO92/05258およびWO92/14843）。同様にして、大きなライブラリーを作製するための方法として、ポリペプチドを合成するために、in vitro翻訳を用いることが可能である。安定化ポリソーム複合体を一般に含むこれらの方法は更にWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058およびWO92/02536に記載されている。ファージに基づくものではない別の提示系（例えば、WO95/22625およびWO95/11922（Affymax）に開示されているもの）は、選択のためにポリペプチドを提示させるためにポリソームを使用する。
【０２８２】
さらにもう1つの範疇の技術は、人工的区画内でのレパートリーの選択を含むものであり、これは、遺伝子をその遺伝子産物に関連づけることを可能にする。例えば、所望の遺伝子産物をコードする核酸が、油中水型エマルションにより形成されたマイクロカプセル内で選択されうる選択系が、WO99/02671、WO00/40712およびTawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝的要素をマイクロカプセル内に区画化し、ついで転写および／または翻訳させて該マイクロカプセル内でそれらのそれぞれの遺伝子産物（RNAまたはタンパク質）を産生させる。ついで、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝的要素を選別する。このアプローチは、種々の手段により所望の活性を検出することにより、関心のある遺伝子産物を選択する。
【０２８３】
B．ライブラリーの構築
選択を意図されるライブラリーは、当技術分野で公知の技術（例えば、前記のもの）を用いて構築することが可能であり、あるいは商業的入手元から購入することが可能である。本発明において有用なライブラリーは、例えばWO99/20749に記載されている。ベクター系を選択し、関心のあるポリペプチドをコードする1以上の核酸配列を該ライブラリーベクター内にクローニングしたら、発現前に突然変異誘発を行なうことにより該クローン化分子内に多様性を生成させることができる。あるいは、前記のとおりに該コード化タンパク質を発現させ選択した後で突然変異誘発を行ない、追加的な選択ラウンドを行なう。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発を、標準的な分子的方法により行なう。特に有用なのは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちPCR（参照により本明細書に組み入れるMullisおよびFaloona (1987) Methods Enzymol., 155:335）である。PCRは、耐熱性DNA依存性DNAポリメラーゼの触媒により関心標的配列を増幅する複数サイクルのDNA複製を用いる方法であり、当技術分野でよく知られている。種々の抗体ライブラリーの構築が、Winterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびそこに引用されている参考文献において考察されている。
【０２８４】
鋳型DNA（少なくとも1fg、通常は1〜1000ng）および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRを行なう。プライマーのプールが非常に不均一である場合には、より大量のプライマーを使用するのが有利かもしれない。なぜなら、各配列は該プールの分子のごく一部により表されるにすぎず、後の増幅サイクルにおいて量が限定的になるからである。典型的な反応混合物は、2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10×PCRバッファー1（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl（または2.5単位）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、および合計容量を25μlにする脱イオン水を含む。鉱油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してPCRを行なう。PCRサイクルの各工程の時間および温度ならびにサイクル数は、実際のストリンジェンシー要件に応じて調節する。アニーリングの温度および時機は、プライマーが鋳型にアニーリングすると予想される際の効率および許容されるミスマッチの程度により決定される。核酸分子が同時に増幅され突然変異誘発される場合には、少なくとも合成の第1ラウンドにおいてミスマッチが要求されるのは明らかである。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化することは、通常の当業者の知見の範囲内に十分に含まれるものである。30℃〜72℃のアニーリング温度を用いる。鋳型分子の最初の変性を、通常、92℃〜99℃で4分間行ない、ついで変性（94〜99℃で15秒〜1分間）、アニーリング（前記のとおりに決定される温度、1〜2分間）および伸長（72℃、増幅産物の長さに応じて1〜5分間）よりなる20〜40サイクルを行なう。最終的な伸長は一般には72℃で4分間であり、ついで不確定（0〜24時間）な工程を4℃で行なってもよい。
【０２８５】
C．単一可変ドメインの組合せ
本発明において有用なドメインを選択したら、当技術分野で公知の種々の方法（例えば、共有的および非共有的方法）により、それらを組合せる（合体させる）ことが可能である。
【０２８６】
好ましい方法には、例えばscFv分子に関して記載されている（Birdら, (1988) Science 242:423-426）ポリペプチドリンカーの使用が含まれる。適当なリンカーの考察は、Birdら Science 242, 423-426; Hudsonら, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudsonら, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883に記載されている。リンカーは、好ましくは、柔軟（flexible）であり、それらの2つの単一ドメインが相互作用することが可能である。リンカーの一例として、リンカー(Gly4Ser)n（ここで、n = 1〜8、例えば2、3、4、5または7）が挙げられる。それほど柔軟ではない、ジアボディ（diabody）において使用されるリンカーを用いることも可能である（Holligerら, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448）。
【０２８７】
1つの実施形態においては、使用するリンカーは免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
【０２８８】
可変ドメインは、リンカー以外の方法を用いて組合せることも可能である。例えば、天然に存在する又は遺伝子操作されたシステイン残基によりもたらされるジスルフィド架橋を利用してVH-VH、VL-VL、またはVH-VL二量体を安定化することが可能であり（Reiterら, (1994) Protein Eng. 7:697-704）、あるいは可変ドメイン間の境界面を改造（remodel）することにより「嵌合い（fit）」を改善して相互作用の安定性を改善することが可能である（Ridgewayら, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhuら, (1997) Protein Science 6:781-788）。
【０２８９】
免疫グロブリンの可変ドメイン、特に抗体VHドメインを連結または安定化するための他の技術を適宜用いることが可能である。
【０２９０】
本発明においては、二重特異性リガンドは、溶液中で「閉じた」コンフォメーションを有しうる。「閉じた」配置は、抗体結合部位を形成する会合したVH-VLペアの場合のように2つのドメイン（例えば、VHおよびVL）が会合形態で存在している配置である。例えば、scFvは、VHドメインとVLドメインとを連結するのに使用するリンカーの配置に応じて、閉じたコンフォメーションを有しうる。これが、それらのドメインが会合するのに十分な程度に柔軟であるか、またはそれらを会合位置で強固に保持する場合には、それらのドメインは、閉じたコンフォメーションをとりうる。
【０２９１】
同様に、VHドメインペアおよびVLドメインペアは、閉じたコンフォメーションで存在しうる。一般に、これは、該リガンド分子における、例えば強固なリンカーによる、それらのドメインの密接な会合の結果であろう。閉じたコンフォメーションのリガンドは、リガンドの半減期を延長する分子および第2の標的分子の両方には結合し得ないであろう。したがって、該リガンドは、典型的には、該リガンドの半減期を延長する分子から解離する際に、第2の標的分子に結合するにすぎない。
【０２９２】
さらに、リンカーを伴わないVH/VH、VL/VL、またはVH/VL二量体の構築は、それらのドメイン間の競合を引き起こす。
【０２９３】
本発明のリガンドは更に、開いたコンフォメーションを有しうる。そのようなコンフォメーションにおいては、該リガンドは、該リガンドの半減期を延長する分子と第2の標的分子との両方に同時に結合しうるであろう。典型的には、開いた配置の可変ドメインは、（VH-VLペアの場合には）、それらのドメインが相互作用して抗体結合部位を形成することがなくそれらのそれぞれのエピトープへの結合に関して競合することがないのに十分な程度に遠く離れて保持される。VH/VHまたはVL/VL二量体の場合には、それらのドメインは、強固なリンカーによっては合体されない。もちろん、そのようなドメインペアは、抗原結合に関して競合せず、抗体結合部位を形成しない。
【０２９４】
開いた二重特異性リガンドおよび閉じた二重特異性リガンドは、種々の状況下、種々の平衡で存在しうると理解されるが、Fabフラグメントおよび全抗体は、主として、閉じたコンフォメーションで存在するであろう。標的への該リガンドの結合は、平衡のバランスを、開いた配置へ移動させるらしい。したがって、本発明の或るリガンドは、溶液中では2つのコンフォメーションで存在することが可能であり、そのうちの一方（開いた形態）は2つの抗原またはエピトープに、独立して結合することが可能であり、一方、もう1つのコンフォメーション（閉じた形態）は1つの抗原またはエピトープにしか結合できず、したがって、このコンフォメーションにおいては、抗原またはエピトープは該リガンドへの結合に関して競合する。
【０２９５】
したがって、開いた形態の二重特異性リガンドは、溶液中、閉じた形態との平衡状態で存在しうるが、該平衡は、閉じた形態へと傾くと予想され、さらに、開いた形態は、閉じたコンフォメーション内へ標的結合により隔離されうる。したがって、好ましくは、本発明の或る二重特異性リガンドは、2つの（開いた及び閉じた）コンフォメーション間の平衡状態で存在する。
【０２９６】
本発明の二重特異性リガンドを修飾して、開いた又は閉じたコンフォメーションに平衡が傾くようにすることが可能である。例えば、ジスルフィド結合によるVH-VL相互作用の安定化は、閉じたコンフォメーションを安定化しうる。さらに、ドメイン（VHドメインおよびVLドメインペアを含む）を連結するために使用するリンカーを、開いた形態に有利となるように構築することが可能である。例えば、該リンカーは、例えば、適切な位置の大きなアミノ酸残基の取り込みにより、またはそれらのドメイン間に物理的に間隔を維持する適当な強固な構造の設計により、それらのドメインの会合を立体的に妨げうる。
【０２９７】
D．二重特異性リガンドの特徴づけ
二重特異性リガンドのその特異的抗原またはエピトープへの結合は、当業者によく知られた方法（例えば、ELISA）により試験されうる。本発明の好ましい実施形態においては、結合は、モノクローナルファージELISAを用いて試験される。
【０２９８】
ファージELISAは、任意の適当な方法により行うことが可能であり、典型的なプロトコールを以下に記載する。
【０２９９】
各ラウンドの選択におけるファージ集団を、選択された抗原またはエピトープへの結合に関してELISAによりスクリーニングして、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定することが可能である。ついで、これらの集団の単一感染細菌コロニーからのファージをELISAによりスクリーニングして、「モノクローナル」ファージ抗体を特定することが可能である。抗原またはエピトープへの結合に関して可溶性抗体フラグメントをスクリーニングすることも望ましく、これもまた、例えばCまたはN末端タグに対する試薬を使用するELISAにより行うことが可能である（例えば、Winterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびこれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
【０３００】
また、選択されたファージモノクローナル抗体の多様性は、PCR産物のゲル電気泳動（Marksら 1991, 前掲; Nissimら 1994 前掲）、プロービング（Tomlinsonら, 1992 J. Mol. Biol. 227, 776）またはベクターDNAの配列決定により評価することが可能である。
【０３０１】
E．二重特異性リガンドの構造
前記のとおり、抗体は、本明細書中では、少なくとも1つの重鎖および軽鎖可変ドメイン、少なくとも2つの重鎖可変ドメインまたは少なくとも2つの軽鎖可変ドメインを含む抗体（例えば、IgG、IgM、IgA、IgA、IgE）またはフラグメント（Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、ジアボディ）と定義される。それは、少なくとも部分的には、抗体を天然で産生する任意の種に由来することが可能であり、あるいは組換えDNA技術により製造されうる（血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌のいずれから単離されたかには無関係である）。
【０３０２】
本発明の好ましい実施形態においては、該二重特異性リガンドは、抗体の単一重鎖可変ドメインの少なくとも1つおよび抗体の単一軽鎖可変ドメインの1つ、または2つの単一重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含む。例えば、該リガンドは、VH/VLペア、VHドメインのペア、またはVLドメインのペアを含みうる。
【０３０３】
そのようなリガンドの第1および第2可変ドメインは同一ポリペプチド鎖上に存在しうる。あるいは、それらは、別々のポリペプチド鎖上に存在しうる。それらが同一ポリペプチド鎖上に存在する場合には、それらはリンカー（前記のとおり、これは、好ましくはペプチド配列である）により連結されうる。
【０３０４】
第1および第2可変ドメインは共有的または非共有的に結合されうる。それらが共有結合している場合には、該共有結合はジスルフィド結合でありうる。
【０３０５】
可変ドメインが、例えば本明細書に記載のファージディスプレイ技術を用いる選択されるV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、それらが本明細書に記載の特定のジェネリックリガンドにより認識されうるよう、普遍的（universal）フレームワーク領域を含みうる。普遍的フレームワーク、ジェネリックリガンドなどの使用はWO99/20749に記載されている。
【０３０６】
V遺伝子レパートリーを使用する場合には、ポリペプチド配列における変異は、好ましくは、可変ドメインの構造ループ内に位置する。各可変ドメインとその相補的ペアとの相互作用を増強するために突然変異により又はDNAシャフリングにより、いずれかの可変ドメインのポリペプチド配列が改変されうる。DNAシャフリングは当技術分野において公知であり、例えばStemmer, 1994, Nature 370: 389-391および米国特許第6,297,053号（それらを共に、参照により本明細書に組み入れることとする）に教示されている。突然変異誘発のための他の方法は当業者によく知られている。
【０３０７】
本発明の好ましい実施形態においては、「二重特異性リガンド」は単一鎖Fvフラグメントである。本発明のもう1つの実施形態においては、「二重特異性リガンド」はFabフォーマットよりなる。
【０３０８】
もう1つの態様においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の「二重特異的リガンド」をコードする核酸を提供する。
【０３０９】
当業者は、本発明の態様に応じて、両方の抗原またはエピトープが同一抗体分子に同時に結合しうると理解するであろう。あるいは、それらは同一抗体分子への結合に関して競合しうる。例えば、両方のエピトープが同時に結合する場合には、二重特異性リガンドの両方の可変ドメインが、独立して、それらの標的エピトープに結合しうる。それらのドメインが競合する場合には、一方の可変ドメインはその標的に結合しうるが、もう一方の可変ドメインがそのコグネイト標的に結合するのとは同時には結合せず、あるいは第1可変ドメインはその標的に結合しうるが、第2可変ドメインがそのコグネイト標的に結合するのと同時には結合しない。
【０３１０】
該可変領域は標的抗原またはエピトープに対する抗体から誘導されうる。あるいは、それらは、単一抗体ドメインのレパートリー（例えば、線維状バクテリオファージの表面上で発現されるもの）から誘導されうる。選択は、後記のとおりに行うことが可能である。
【０３１１】
一般に、本発明の実施に要する核酸分子およびベクター構築物は、標準的な実験マニュアル、例えばSambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAに記載のとおりに構築し操作することが可能である。
【０３１２】
本発明において有用な核酸の操作は、典型的には、組換えベクターにおいて行う。
【０３１３】
したがって、もう1つの態様においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の「二重特異性リガンド」をコードする核酸を含むベクターを提供する。
【０３１４】
本明細書中で用いるベクターは、異種DNAの発現および／または複製のために該異種DNAを細胞内に導入するために使用する分離した要素を意味する。そのようなベクターを選択または構築し、ついで使用するための方法は、当業者によく知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソームベクターを含む多数のベクターが公に入手可能である。簡便なクローニングおよび突然変異誘発のために、そのようなベクターを使用することができる。あるいは、遺伝子発現ベクターを使用する。本発明において有用なベクターは、所望のサイズ（典型的には0.25キロベース（kb）〜40kb長以上）のポリペプチドコード配列を収容するように選択することができる。in vitroでのクローニング操作の後、適当な宿主細胞を該ベクターで形質転換する。各ベクターは、一般にはクローニング（すなわち「ポリリンカー」）部位、複製起点および少なくとも1つ選択マーカー遺伝子を含む種々の機能的成分を含有する。与えられたベクターが発現ベクターである場合、それは更にエンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結およびシグナル配列の1以上を有し、それらはそれぞれ、クローニング部位付近に位置し、本発明のリガンドをコードする遺伝子に機能しうる形で連結されている。
【０３１５】
一般に、クローニングベクターおよび発現ベクターは共に、選択された1以上の宿主細胞内で該ベクターが複製されるのを可能にする核酸配列を含有する。クローニングベクターにおいては典型的には、この配列は、該ベクターが宿主染色体DNAから独立して複製されるのを可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2ミクロンプラスミドの起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点（例えば、SV40、アデノウイルス）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点は、高レベルのDNAを複製しうる哺乳類細胞（例えばCOS細胞）内でこれらが使用されない限り、哺乳類発現ベクターには必ずしも必要でない。
【０３１６】
有利には、クローニングまたは発現ベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも称される）を含有する。この遺伝子は、選択培地内で増殖させる形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、該培地内で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与したり栄養要求性欠損を相補したり該増殖培地内に存在しない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０３１７】
本発明のリガンドをコードするベクターの複製は大腸菌（E. coli）内で最も簡便に行われるため、大腸菌（E. coli）選択マーカー（例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子）が有用である。これらは、大腸菌（E. coli）プラスミド（例えば、pBR322）またはpUCプラスミド（例えば、pUC18またはpUC19）から得ることができる。
【０３１８】
発現ベクターは、通常、宿主生物により認識され関心コード配列に機能しうる形で連結されたプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは誘導性または構成的でありうる。「機能しうる形で連結（された）」なる語は、記載されている成分がそれらの意図される様態で機能するのを可能にする関係で該成分が配置されていることを意味する。コード配列に「機能しうる形で連結」された制御配列は、該制御配列に適合した条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【０３１９】
原核宿主で使用するのに適したプロモーターには、例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが含まれる。また、細菌系内で使用するプロモーターは、一般には、機能しうる形でコード配列に連結されたシャイン・ダルガルノ配列を含有するであろう。
【０３２０】
好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、第1および／または第2抗原またはエピトープでの選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの、独立した増殖および発現により、あるいは任意の選択提示系を用いることにより行なうことができる。前記のとおり、好ましい選択提示系はバクテリオファージディスプレイである。したがって、ファージまたはファージミドベクター、例えばpIT1またはpIT2を使用することができる。本発明において有用なリーダー配列には、pelB、stII、ompA、phoA、blaおよびpelAが含まれる。一例として、大腸菌（E. coli）複製起点（二本鎖の複製用）、そしてまたファージ複製起点（一本鎖DNAの産生用）を有するファージミドベクターが挙げられる。そのようなベクターの操作および発現は当技術分野でよく知られている（HoogenboomおよびWinter (1992) 前掲; Nissimら (1994) 前掲）。簡潔に説明すると、該ベクターは、ファージミドに選択性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子およびlacプロモーターを発現カセットの上流に含有し、該発現カセットは（N末端からC末端方向に）、pelBリーダー配列（これは、発現されたポリペプチドを細胞周辺腔に導く）、マルチクローニング部位（該ライブラリーメンバーのヌクレオチド形態をクローニングするためのもの）、場合によっては、1以上のペプチドタグ（検出用）、場合によっては、1以上のTAG終止コドン、およびファージタンパク質pIIIよりなる。したがって、大腸菌（E. coli）の種々のサプレッサーおよび非サプレッサー株を使用し、グルコース、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）またはヘルパーファージ（例えば、VCS M13）を加えることにより、該ベクターは、発現されることなくプラスミドとして複製されて大量の該ポリペプチドライブラリーメンバーのみを産生したり、ポリペプチド-pIII融合体の少なくとも1コピーを表面に含有するファージを含むファージを産生しうる。
【０３２１】
本発明のリガンドをコードするベクターの構築においては、通常の連結技術を用いる。単離されたベクターまたはDNA断片を、必要なベクターを作製するのに望ましい形態で、切断し、修飾し、再連結する。所望により、構築したベクター内に正しい配列が存在することを確認するための分析を公知方法で行なうことができる。発現ベクターを構築し、in vitro転写産物を調製し、DNAを宿主細胞内に導入し、発現および機能の評価のための分析を行なうための適当な方法は当業者に公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在を検出し、またはその増幅および／または発現を常法（例えば、サザンまたはノーザン分析、ウエスタンブロット法、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロット法、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析）により定量する。所望によりこれらの方法が改変されうることは、当業者に容易に予想されるであろう。
【０３２２】
閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの構造
本発明の第2の形態の1つの態様においては、2以上の非相補的エピトープ結合ドメインが、本明細書中で定義されているとおりの閉じたコンフォメーションを有するよう、それらのドメインを連結する。有利には、それらは更に、本明細書に記載のリンカーの代わりに又はそれに加えて、お互いに対するエピトープ結合部位の閉じたコンフォメーションの形成および／または維持を促進しうる骨格に結合されうる。
【０３２３】
（I）骨格
骨格は、免疫グロブリン分子に基づくものであることが可能であり、あるいは、前記のとおり、非免疫グロブリン由来でありうる。本明細書中で定義されている好ましい免疫グロブリン骨格には、以下のものから選ばれる任意の1以上が含まれる：少なくとも（i）抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインまたは（ii）抗体重鎖のCH1ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1およびCH2ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；あるいは抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインと一緒になったサブセット（ii）のいずれか。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。当業者は、この列挙が網羅的なものではないと認識するであろう。
【０３２４】
（II）タンパク質スカフォールド
各エピトープ結合ドメインは、1以上のエピトープと該ドメインとの特異的相互作用に関与する1以上のCDRおよびタンパク質スカフォールドを含む。有利には、本発明のエピトープ結合ドメインは3つのCDRを含む。適当なタンパク質スカフォールドには、以下のものよりなる群から選ばれる任意のものが含まれる：免疫グロブリンドメインに基づくもの、フィブロネクチンに基づくもの、アフィボディ（affibody）に基づくもの、CTLA4に基づくもの、GroELのようなシャペロンに基づくもの、リポカリン（lipocallin）に基づくもの、および細菌FcレセプターSpAおよびSpDに基づくもの。当業者は、この列挙が網羅的なものではないと理解するであろう。
【０３２５】
F：二重特異性リガンドの構築に使用するためのスカフォールド
i．主鎖コンフォメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖に関して、類似したフォールドを有する。例えば、抗体はそれらの一次配列においては非常に多様であるが、予想に反して、抗体の抗原結合ループの6個中5個（H1、H2、L1、L2、L3）は、限られた数の主鎖コンフォメーションまたはカノニカル（canonical、規定）構造をとることが、配列および結晶構造の比較から示されている（ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothiaら (1989) Nature, 342: 877）。したがって、ループ長およびキー残基の分析は、ヒト抗体の大多数で見出されるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンフォメーションの予測を可能にした（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14: 4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264: 220）。H3領域は、配列、長さおよび構造の点で、より一層多様性であるが（Dセグメントを用いるため）、それはまた、該ループおよび抗体フレームワーク内のキー部位における特定の残基の存在および長さまたは残基のタイプに左右される短いループ長にわたり、限られた数の主鎖コンフォメーションを形成する（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399: 1）。
【０３２６】
本発明の二重特異性リガンドは、有利には、ドメインのライブラリー（例えば、VHドメインのライブラリーおよび／またはVLドメインのライブラリー）から組み立てられる。さらに、本発明の二重特異性リガンド自体がライブラリーの形態で提供されうる。本発明の1つの態様においては、メンバーの主鎖コンフォメーションが判明することが保証されるよう或るループ長およびキー残基が選択された二重特異性リガンドおよび／またはドメインのライブラリーを設計する。有利には、前記のとおりそれらが非機能的となる可能性を最小限に抑えるために、これらは、天然で見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の真のコンフォメーションである。生殖系列V遺伝子セグメントは、抗体またはT細胞レセプターライブラリーを構築するための1つの適当な基本的フレームワークとして有用である。他の配列も有用である。少数の機能的メンバーが、その機能に影響を及ぼさない改変された主鎖コンフォメーションを有しうるよう、変異が低頻度で生じうる。
【０３２７】
また、リガンドによりコードされる種々の主鎖コンフォメーションの数を評価したり、リガンドの配列に基づいて主鎖コンフォメーションを予想したり、カノニカル構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するためには、カノニカル構造理論が有用である。ヒトVκドメインにおいては、L1ループは4つのカノニカル構造のうちの1つをとることが可能であり、L2ループは単一のカノニカル構造を有し、ヒトVκドメインの90％はL3ループのカノニカル構造の4つまたは5つのうちの1つをとることが公知である（Tomlinsonら (1995) 前掲）。したがって、Vκドメイン単独で、異なるカノニカル構造を組合せて或る範囲の異なる主鎖コンフォメーションを得ることができる。VλドメインがL1、L2およびL3ループのカノニカル構造の異なる範囲をコードしており、VκおよびVλドメインが、H1およびH2ループのいくつかのカノニカル構造をコードしうる任意のVHドメインとペアになりうると仮定すると、これらの5つのループで認められるカノニカル構造の組合せの数は非常に大きくなる。このことは、主鎖コンフォメーションにおける多様性の生成が、広範な結合特異性の生成に必須でありうることを示唆している。しかしながら、単一の既知主鎖コンフォメーションに基づいて抗体ライブラリーを構築することにより、予想に反して、実質的にすべての抗原を標的化するのに十分な多様性を得るためには主鎖コンフォメーションにおける多様性は要求されないことが判明した。より一層驚くべきことに、単一の主鎖コンフォメーションは、必ずしもコンセンサス構造でなくてもよく、単一の天然に存在するコンフォメーションを全ライブラリーの基礎として用いることが可能である。したがって、好ましい態様において、本発明の二重特異性リガンドは、単一の既知主鎖コンフォメーションを有する。
【０３２８】
選択される単一主鎖コンフォメーションは、好ましくは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリーのタイプの分子の通常のものである。天然に存在する分子の相当数が或るコンフォメーションをとることが観察される場合には、そのコンフォメーションが通常のものである。したがって、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリンドメインの各結合ループの種々の主鎖コンフォメーションの自然発生を別々に検討し、ついで、それらの種々のループの主鎖コンフォメーションの所望の組合せを有する天然に存在する可変ドメインを選択する。いずれも利用できない場合には、最も近い等価体を選択することが可能である。所望の主鎖コンフォメーションをコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することにより、それらの種々のループの主鎖コンフォメーションの所望の組合せを得るのが好ましい。選択した生殖系列遺伝子セグメントが天然で頻繁に発現されることがより好ましく、それらが全ての天然生殖系列遺伝子セグメントのなかで最も頻繁に発現されるのが最も好ましい。
【０３２９】
二重特異性リガンドまたはそのライブラリーを設計する場合には、6個の抗原結合ループのそれぞれに関して種々の主鎖コンフォメーションの頻度を別々に検討することが可能である。H1、H2、L1、L2およびL3の場合には、天然に存在する分子の抗原結合ループの20％〜100％がとる与えられたコンフォメーションを選択する。典型的には、その観察される頻度は35％以上（すなわち、35％〜100％）、理想的には、50％以上、さらには65％以上である。H3ループの大多数はカノニカル構造を有さないため、カノニカル構造を示すループに一般的な主鎖コンフォメーションを選択するのが好ましい。したがって、該ループのそれぞれに関しては、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるコンフォメーションを選択する。ヒト抗体では、各ループの最も一般的なカノニカル構造（CS）は以下のとおりである：H1-CS1（発現されるレパートリーの79％）、H2-CS3（46％）、L1-VκのCS2（39％）、L2-CS1（100％）、L3-VκのCS（36%）（κ:λの比を70：30と仮定して計算している（Hoodら (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48:133））。カノニカル構造を有するH3ループでは、残基94から残基101に塩橋を有する7残基のCDR3長（Kabatら (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and human Services）が最も一般的であるらしい。EMBLデータのライブラリーには、このコンフォメーションを形成するのに必要なH3長およびキー残基を有する少なくとも16個のヒト抗体配列が存在し、該タンパク質データバンクには、抗体のモデル化の基礎として使用されうる少なくとも2個の結晶構造（2cgrおよび1tet）が存在する。カノニカル構造のこの組合せのなかで最も頻繁に発現される生殖系列遺伝子セグメントは、VHセグメント3-23（DP-47）、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12（DPK9）およびJκセグメントJκ1である。VHセグメントDP45およびDP38も適している。したがって、所望の単一の主鎖コンフォメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として、これらのセグメントを組合せて使用することができる。
【０３３０】
あるいは、分離した結合ループのそれぞれの種々の主鎖コンフォメーションの自然発生（natural occurrence）に基づいて単一主鎖コンフォメーションを選択する代わりに、主鎖コンフォメーションの組合せの自然発生を、単一主鎖コンフォメーションを選択するための基礎として用いる。例えば、抗体の場合には、抗原結合ループの任意の2、3、4、5または全6個のカノニカル構造の組合せの自然発生が決定されうる。本発明では、選択されるコンフォメーションが、天然に存在する抗体に一般的なものであることが好ましく、それが天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されることが最も好ましい。したがって、ヒト抗体においては、例えば、5個の抗原結合ループH1、H2、L1、L2およびL3の天然の組合せを検討する場合には、カノニカル構造の最も頻繁な組合せを決定し、ついで、単一主鎖コンフォメーションを選択するための基礎としての、H3ループの最も一般的なコンフォメーションと組合せる。
【０３３１】
ii．カノニカル配列の多様化
いくつかの既知主鎖コンフォメーション、好ましくは、単一の既知主鎖コンフォメーションを選択したら、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを作製するために分子の結合部位を変異させることにより、本発明の二重特異性リガンドまたは本発明で使用するライブラリーを構築することが可能である。これは、一定範囲の活性を付与しうるのに十分なそれらの構造および／またはそれらの機能における多様性を有する変異体が作製されることを意味する。
【０３３２】
所望の多様性は、典型的には、選択した分子を1以上の位置において変異させることにより作製する。変化させる位置はランダムに選択されることが可能であり、あるいは、好ましくは選択する。ついでランダム化により変異を達成することが可能であり、その際、存在するアミノ酸を任意のアミノ酸またはその類似体（天然体または合成体）により置換して非常に多数の変異体を得たり、あるいは、存在するアミノ酸を一定のアミノ酸サブセットの1以上により置換することにより、より限定された数の変異体を得る。
【０３３３】
そのような多様性を導入するための種々の方法が報告されている。エラープローンPCR（Hawkinsら (1992) J. Mol. Biol., 226:889）、化学的突然変異誘発（Dengら (1996) J. Mol. Biol., 269:9533）または細菌突然変異誘発株（Lowら (1996) J. Mol. Biol., 260:359）を用いて、該分子をコードする遺伝子内にランダム突然変異を導入することができる。また、選択した位置を突然変異させるための方法は当技術分野でよく知られており、PCRを用いて又は用いずに、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用することを含む。例えば、突然変異を抗原結合ループに標的化することにより、いくつかの合成抗体ライブラリーが作製されている。一定範囲の新規結合特異性を得るために、ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域がランダム化されている（Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457）。未突然変異フレームワーク領域を有する大きなライブラリーを得るために、ランダムまたは半ランダムH3およびL3領域が生殖系列V遺伝子セグメントに付加されている（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）。そのような多様化は、その他の抗原結合ループの一部または全部を含むように拡張されている（Crameriら (1996) Nature Med., 2:100; Riechmannら (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO97/08320, 前掲）。
【０３３４】
ループのランダム化は、H3単独の場合には約1015個以上の構造体を、そしてその他の5つのループの場合には同様に多数の変異体を与える可能性を有するが、すべての可能な組合せを表現するライブラリーを得ることは、現在の形質転換技術を用いても、あるいは更には無細胞系を用いても不可能である。例えば、現在までに構築されている最大のライブラリーの1つにおいては、6×1010個の異なる抗体が作製されているが、これは、この設計のライブラリーに可能な多様性の一部にすぎない（Griffithsら (1994) 前掲）。
【０３３５】
好ましい実施形態においては、該分子の所望の機能の生成または改変に直接関与する残基のみを多様化する。多くの分子の場合、その機能は標的に結合することであり、したがって該分子の全体的なパッキングまたは選択した主鎖コンフォメーションの維持に決定的に重要な残基の変化を回避しつつ、多様性を標的リガンド結合部位に集中させるべきである。
【０３３６】
抗体ドメインに適用される場合のカノニカル配列の多様化
抗体二重特異性リガンドの場合には、標的に対する結合部位は抗原結合部位であることが最も多い。したがって、非常に好ましい態様においては、本発明は、抗原結合部位内の残基のみが変異している抗体二重特異性リガンドのライブラリー、または該リガンドの組み立てのためのライブラリーを提供する。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいては非常に多様であり、高分解能抗体／抗原複合体において接触することが公知である。例えば、L2では、天然に存在する抗体においては50位および53位が多様であり抗原との接触が認められることが公知である。これに対して、通常のアプローチは、Kabatら (1991, 前掲)が定義している対応する相補性決定領域（CDR1）中のすべての残基（本発明で使用するライブラリーでは多様化されるのはそれらの2残基であるのに対して、この場合は約7残基である）を多様化することであった。これは、ある範囲の抗原結合特異性を得るのに必要な機能的多様性における顕著な改良に相当する。
【０３３７】
実際には、抗体多様性は、ナイーブ一次レパートリー（いわゆる生殖系列および結合（junctional）多様性）を与える生殖系列V、DおよびJ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、生じた再構成V遺伝子の体細胞超突然変異との2つの過程の結果である。一次レパートリーの多様性は抗原結合部位の中心部に集中しており、一方、体細胞超突然変異は、一次レパートリーにおいて高度に保存されている抗原結合部位の末梢領域にまで多様性を広げることが、ヒト抗体の配列の分析から示されている（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256: 813を参照されたい）。この相補性は、おそらく、配列空間（sequence space）を見出すための有効な戦略として進化したのであろう。それは、見掛け上は抗体に特有であるが、他のポリペプチドレパートリーに容易に適用されうる。変異させる残基は、標的に対する結合部位を形成する残基のサブセットである。所望により、標的結合部位内の異なる（重複を含む）サブセットの残基を、選択中の異なる段階で多様化させる。
【０３３８】
抗体レパートリーの場合、抗原結合部位内の残基のいくつか（必ずしもすべてではない）が多様化された初期「ナイーブ」レパートリーを作製する。本明細書中のこの文脈で用いる「ナイーブ」なる語は、所定の標的を有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、多種多様な抗原刺激により未だチャレンジされていない免疫系を有する胎児および新生児個体の場合のように、免疫多様化を経験していない個体の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分子に類似している。ついでこのレパートリーを或る範囲の抗原またはエピトープに対して選択する。ついで必要に応じて、該初期レパートリーにおいて多様化された領域以外に、さらなる多様性を導入することができる。この成熟レパートリーは、改変された機能、特異性または親和性に関して選択することが可能である。
【０３３９】
本発明は、抗原結合部位内の残基の一部または全部が変異している、二重特異性リガンドの構築のための結合ドメインの2つの異なるナイーブレパートリー、または二重特異性リガンドのナイーブライブラリーを提供する。「一次」ライブラリーは天然一次レパートリーを模擬したものであり、その多様性は、生殖系列V遺伝子セグメントにおいて多様性であるか（生殖系列多様性）または組換え過程中に多様化される（結合多様性）抗原結合部位の中心部の残基に限局している。多様化される残基には、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え過程中に多様化されるか（結合多様性）または高度に体細胞突然変異する残基に限局している。多様化される残基には、H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのライブラリーにおける多様化に適したものとして前記で挙げた残基はすべて、1以上の抗体-抗原複合体において接触することが公知である。どちらのライブラリーにおいても、抗原結合部位内の残基のすべてが変異するわけではないため、所望により、残りの残基を変異させることにより追加的な多様性を選択中に加える。これらの任意の残基（または抗原結合部位を含む追加的な残基）の任意のサブセットを抗原結合部位の初期および／または後続の多様化に用いることができることが、当業者に明らかであろう。
【０３４０】
本発明で使用するライブラリーの構築においては、選択された位置の多様化は、典型的には、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を改変して多数の可能なアミノ酸（全20個またはそれらのサブセット）がその位置に組込まれうるようにすることにより、核酸レベルで達成される。IUPAC命名法を用いると、最も汎用的なコドンは、すべてのアミノ酸およびTAG終止コドンをコードするNNKである。NNKコドンは、好ましくは、必要な多様性を導入するために使用される。同じ目的を達成する他のコドンも有用であり、それらには、追加的な終止コドンTGAおよびTAAの生成をもたらすNNNコドンが含まれる。
【０３４１】
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖多様性の特徴は、あるアミノ酸残基を優先する顕著な偏りである。VH、VκおよびVλの各領域内の最も多様性である10個の位置のアミノ酸組成を合計すると、側鎖多様性の76％以上が僅か7個の異なる残基（セリン（24％）、チロシン（14％）、アスパラギン（11％）、グリシン（9％）、アラニン（7％）、アスパラギン酸（6％）およびトレオニン（6％））に由来する。主鎖の柔軟性をもたらしうる小さな残基および親水性残基に対するこの偏りは、おそらく、広範な抗原またはエピトープに結合する傾向を有する表面の進化を反映しており、初期レパートリーにおいて必要とされる、抗体の無差別な混合の解明に役立つかもしれない。
【０３４２】
このアミノ酸分布を模擬することが好ましいため、変異させる位置のアミノ酸分布は、好ましくは、抗体の抗原結合部位に見られるアミノ酸分布を模擬する。ある範囲の標的抗原に対する或るポリペプチド（抗体ポリペプチドに限らない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変異させる位置のアミノ酸分布を偏らせるためには種々の方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発（WO97/08320を参照されたい）の使用を含む）、そのなかで好ましい方法は、合成の容易さのため、通常の縮重コドンの使用である。縮重コドンのすべての組合せ（各位置において等しい比率の一重、二重、三重および四重の縮重を有する）によりコードされるアミノ酸プロフィールを天然アミノ酸の使用と比較することにより、最も典型的なコドンを推定することが可能である。コドン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)Cおよび(AGT)(AGC)(CT)（すなわち、IUPAC命名法を用いるとそれぞれDVT、DVCおよびDVY）は、所望のアミノ酸プロフィールに最も近いコドンであり、それらは、22％のセリンおよび11％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステインをコードする。したがって、好ましくは、多様化される各位置でDVT、DVCまたはDVYのいずれかのコドンを使用して、ライブラリーを構築する。
【０３４３】
G：リガンドの半減期を延長しうる抗原
本発明の1つの形態における本発明の二重特異性リガンドは、in vivoにおける該リガンドの半減期を延長しうる1以上の分子に結合しうる。典型的には、そのような分子は、望ましくない物質を生物体内から除去する内因性メカニズムによる分解または除去に抗する、in vivoにおいて天然に存在するポリペプチドである。例えば、該生物の半減期を延長する分子は以下のものから選ばれうる：
細胞外マトリックス由来のタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリおよびフィブロネクチン。コラーゲンは細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約15種のコラーゲン分子が現在公知であり、種々の身体部分で見出される。例えば、I型コラーゲン（身体コラーゲンの90％を占める）は骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓で見出され、II型コラーゲンは軟骨、椎間円板、脊索、眼の硝子体で見出される。 
血液中で見出される、以下のものを含むタンパク質：
血漿タンパク質、例えばフィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB、血清アミロイドタンパク質A、ヘプタグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ-2-ミクログロブリン；
酵素およびインヒビター、例えばプラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシンおよび膵トリプシンインヒビター。プラスミノーゲンはトリプシン様セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。それは、通常、血流中を循環しているのが見出される。プラスミノーゲンが活性化されプラスミンに変換されると、それは、血餅中に血液細胞を絡まらせるフィブリノーゲン繊維を溶解する強力な酵素ドメインをアンフォールディングする。これは繊維素溶解と称される。 
免疫系タンパク質、例えばIgE、IgG、IgM。 
輸送タンパク質、例えばレチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン。 
デフェンシン、例えばβ-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、2および3。 
血液脳関門または神経組織に見出されるタンパク質、例えばメラノコルチンレセプター、ミエリン、アスコルビン酸輸送体。 
トランスフェリンレセプター特異的リガンド神経薬剤融合タンパク質（米国特許第5977307号を参照されたい）；
脳毛細血管内皮細胞レセプター、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、インスリン、インスリン様成長因子1（IGF1）レセプター、インスリン様成長因子2（IGF2）レセプター、インスリンレセプター。 
腎臓に限局しているタンパク質、例えばポリシスチン、IV型コラーゲン、有機陰イオン輸送体K1、ハイマン抗原。 
肝臓に限局しているタンパク質、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、G250。 
血液凝固因子X。 
α1アンチトリプシン。 
HNF1α。 
肺に限局しているタンパク質、例えば分泌成分（IgAに結合する）。 
心臓に限局しているタンパク質、例えばHSP27。これは拡張性心筋症に関連している。 
皮膚に限局しているタンパク質、例えばケラチン。 
骨特異的タンパク質、例えば、骨形成活性を示す、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである骨誘導因子（BMP）。具体例には、BMP-2、-4、-5、-6、-7（骨形成タンパク質（OP-1）とも称される）および-8（OP-2）が含まれる。 
腫瘍特異的タンパク質、例えばヒト栄養膜抗原、ヘルセプチン（herceptin）レセプター、エストロゲンレセプター、カテプシン、例えばカテプシンB（肝臓および脾臓に見出される）。 
疾患特異的タンパク質、例えば、活性化T細胞上のみで発現される抗原、例えばLAG-3（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテゲリン（osteoprotegerin）リガンド（OPGL）（例えば、Nature 402, 304-309;1999を参照されたい）、OX40（活性化T細胞上で発現されるTNFレセプターファミリーメンバーであり、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）産生細胞において特異的にアップレギュレーションされることが知られている唯一の共刺激T細胞分子）（J Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263-70を参照されたい）；メタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連している）、例えばCG6512ショウジョウバエ（Drosophila）、ヒトパラプレジン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsH；血管増殖因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（FGF-1）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（VEGF／VPF）、トランスフォーミング増殖因子-a（TGFa）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、アンギオゲニン、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-8（IL-8）、血小板由来内皮増殖因子（PD-ECGF）、胎盤増殖因子（PlGF）、ミッドカイン血小板由来増殖因子BB（PDGF）、フラクタルカイン（fractalkine）。 
ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）；HSPは、通常、細胞内に見出される。それが細胞外に見出される場合には、そのことは、細胞が死亡しその内容物を漏出したという指標である。このプログラムされていない細胞死（壊死）は外傷、疾患または損傷の結果としてのみ生じ、したがって、in vivoにおいて、細胞外HSPは、感染および疾患に対抗する免疫系からの応答を誘発する。細胞外HSPに結合する二重特異性タンパク質は疾患部位に局在化されうる。 
Fcの輸送に関与するタンパク質、
ブランベル（Brambell）レセプター（FcRBとしても公知である）；
このFcレセプターは2つの機能を有し、それらは共に、運搬に潜在的に有用である。その機能は以下のとおりである：
母から子への胎盤を経るIgGの輸送、
IgGを分解から防ぎ、それにより、IgGの血清中半減期を延長する。該レセプターはエンドソームからIgGをリサイクルすると考えられる。Holligerら, Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6を参照されたい。
【０３４４】
本発明のリガンドは、in vivoにおける半減期の延長を要することなく又はin vivoにおける半減期を延長することなく、前記標的に特異的となるよう設計されうる。例えば、本発明のリガンドは、半減期の延長とは無関係に（尤も、これが生じることはありうる）、組織特異的な治療的に重要な標的に結合するdAb単量体、または組織特異的でありそれにより該二重特異性リガンドの組織特異的標的化を可能にする前記のものから選ばれる標的に特異的でありうる。さらに、該リガンドまたはdAb単量体が腎臓または肝臓を標的化する場合には、これにより、該リガンドまたはdAb単量体はin vivoにおける別のクリアランス経路に再度導かれうる（例えば、該リガンドは肝クリアランスから離れて腎クリアランスに導かれうる）。
【０３４５】
H：本発明の第2の形態の多重特異性リガンドの用途
本発明の第2の形態の方法の多重特異性リガンドは、in vivoにおける治療および予防用途、in vitroおよびin vivoにおける診断用途、in vitroにおけるアッセイおよび試薬の用途などに使用することが可能である。例えば、抗体分子は、当業者に公知の方法に従い、抗体に基づくアッセイ技術、例えばELISA技術において使用することが可能である。
【０３４６】
前記で触れたとおり、本発明の多重特異性リガンドは診断、予防および治療方法において有用である。本発明の多重特異性抗体は、ウエスタン分析およびin situタンパク質検出（標準的な免疫組織化学的方法によるもの）において診断的に有用であり、これらの用途に使用する場合には、該リガンドを、当技術分野で公知の技術により標識することが可能である。また、そのような抗体ポリペプチドは、クロマトグラフィー担体（例えば、樹脂）と複合体を形成される場合に、アフィニティークロマトグラフィー法において分取的に使用されうる。すべてのそのような技術は当業者によく知られている。
【０３４７】
本発明の閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの診断用途には、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドが2つの標的に競合的に結合する（したがって、2つの標的は同時には結合し得ない）能力（閉じたコンフォメーション）または2つの標的に同時に結合する能力（開いたコンフォメーション）を利用する、アナライトに関する均一アッセイが含まれる。
【０３４８】
本発明の第2の形態のもう1つの態様においては、本発明は、本発明のリガンドを使用する均一系イムノアッセイを提供する。
【０３４９】
真の均一イムノアッセイ形態が、薬物の発見および開発に用いる研究アッセイ系および診断薬の製造業者により精力的に探し求められている。主な診断薬の需要には、病院、医院、診療所、商業的照会研究所、血液銀行および家庭におけるヒトに対する試験、ヒト以外に対する診断（例えば、食品の試験、水の試験、環境の試験、生物保護、および獣医学的試験）、そして最後に、研究（薬品開発、基礎研究および学術的研究を含む）が含まれる。
【０３５０】
現在、すべてのこれらの需要においては、化学発光、ELISA、蛍光、または少数の場合にはラジオイムノアッセイ技術に基づいて構築されたイムノアッセイ系が利用されている。これらのアッセイ形態のそれぞれは分離工程（結合した試薬を未結合試薬から分離するための工程）を必要とする。場合によっては、いくつかの分離工程が必要である。これらの追加的な工程の付加は試薬および自動化を付加し、必要時間を増し、最終的なアッセイ結果に影響を及ぼす。ヒトに対する診断では、該分離工程を自動化することが可能であり、それによりこの問題は回避されるが、排除されない。自動化、追加的な試薬、追加的なインキュベーション時間などは、相当な経費および複雑さを付加する。非常に低いレベルの試験分子に対して文字どおり数百万のサンプルが一度に試験されるハイスループットスクリーニングのような薬品開発においては、追加的な分離工程の付加はスクリーニングの実施能を排除しうる。一方、分離の回避は、読み出しにおける余りにも大きなノイズを生成する。したがって、現在のアッセイ形態から得られうる範囲の感度を与える真の均一形態が必要とされている。有利には、アッセイは、完全に定量的な読み取りを、高い感度および大きなダイナミックレンジで与える。感度は、必要サンプル量の減少と同様、重要な要件である。これらの特徴はどちらも、均一系がもたらす特徴である。これは、注意を要する試験においては、およびサンプルが貴重である薬品開発においては、非常に重要である。当技術分野で現在利用可能な不均一系は大量のサンプルおよび高価な試薬を要する。
【０３５１】
均一アッセイの用途には癌の試験が含まれ、その最も主要なアッセイは、前立腺癌に関する男性のスクリーニングに用いられる前立腺特異抗原に対するアッセイである。他の用途には生殖能の試験が含まれ、これは、妊娠に関するβhcgを含む、妊娠を試みている女性に対する一連の試験を提供する。感染症に関する試験には、肝炎、HIV、風疹、および他のウイルスおよび微生物および性感染症に関する試験が含まれる。試験、特にHIV、A型、B型、C型、非A非B型肝炎に関する試験が、血液銀行により利用される。治療薬モニタリング試験には、効力に関する及び毒性を避けるための、患者における処方薬のレベルのモニタリングが含まれる（例えば、不整脈に対するジゴキシン、精神病におけるフェノバルビタールレベル、喘息に対するテオフィリン）。診断試験は更に、乱用薬物の試験、例えばコカイン、マリファナなどに関する試験に有用である。甲状腺機能、貧血ならびに他の生理的障害および機能を測定するためには、代謝試験が用いられる。
【０３５２】
均一イムノアッセイ形態は更に、標準的な臨床化学アッセイの製造において有用である。イムノアッセイと化学アッセイとを同一装置に組み込むことは、診断試験において非常に好都合である。適当な化学アッセイには、グルコース、コレステロール、カリウムなどに関する試験が含まれる。
【０３５３】
均一イムノアッセイのもう1つの主な用途は薬物の発見および開発である。ハイスループットスクリーニングは、超大容量で、標的に対して組合せコンビナトリアル(combinatorial)化学ライブラリーを試験することを含む。シグナルを検出し、ついで陽性群を、より小さな群に分け、最終的には、細胞内で、ついで動物において試験する。これらの全てのタイプの試験において、均一アッセイを用いることが可能である。薬品開発、特に、動物研究および臨床試験においては、イムノアッセイが多用される。均一アッセイはこれらの操作処理を著しく促進し簡便化する。他の用途には、食品および飲料の試験；大腸菌（E. coli）、サルモネラなどに関する肉および他の食品の試験；水の試験、例えば、水関連施設における、大腸菌（E. coli）を含むあらゆるタイプの汚染物に関する試験；ならびに獣医学的試験が含まれる。
【０３５４】
広い実施形態において、本発明は、本発明の閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドに結合した検出可能な物質を含む結合アッセイを提供し、ここで、その検出可能な特性は、その閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドへのアナライトの結合により変化する。そのようなアッセイは、いくつかの異なる方法で設計することが可能であり、そのそれぞれにおいては、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドの前記特性を利用する。
【０３５５】
該アッセイは、物質がアナライトにより直接的または間接的に置換されて、該物質の検出可能な特性が変化することに基づく。例えば、該物質が、検出可能な終点を有する反応を触媒しうる酵素である場合には、該酵素は、例えばその活性部位を遮るように該リガンドにより結合され、そのため、該酵素は不活性化しうる。アナライトも、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドにより結合され、該酵素を脱離させ、活性部位を遊離させることにより該酵素を活性にする。ついで該酵素は基質と反応して、検出可能な事象を引き起こしうる。もう1つの実施形態においては、該リガンドは活性部位以外において酵素に結合し、該酵素のコンフォメーションに影響を及ぼしてその活性を改変する。例えば、活性部位の構造が該リガンドの結合により束縛され、あるいは、活性に必要な補因子の結合が妨げられうる。
【０３５６】
該アッセイの物理的手段は、当技術分野で公知の任意の形態をとりうる。例えば、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンド／酵素複合体が試験ストリップ上に提供されることが可能であり、該試験ストリップの別の領域に、基質が提供されることが可能であり、アナライトを含有する溶媒がリガンド／酵素複合体内を移動して、該酵素を脱離させ、それを該基質領域に運んでシグナルを生成させうる。あるいは試験スティックまたは他の固体相上に該リガンド／酵素複合体が提供され、アナライト／基質溶液中に浸され、アナライトの存在に応答して酵素を該溶液中に遊離しうる。
【０３５７】
アナライトの各分子は1つの酵素分子を潜在的に遊離するため、該アッセイは定量的であり、ある与えられた時間内に生成するシグナルの強度は溶液中のアナライトの濃度に依存する。
【０３５８】
閉じたコンフォメーションにおいてアナライトを利用する他の形態も可能である。例えば、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを、酵素のアロステリック部位に結合して該酵素を活性化するように設計することが可能である。そのような実施形態においては、該酵素はアナライトの非存在下では活性である。アナライトの添加は酵素を脱離させ、アロステリック活性化を消失させて該酵素を不活性化する。
【０３５９】
アナライトの濃度の尺度として酵素活性を利用する前記実施形態においては、該酵素の活性化または不活性化は、シグナル生成反応を該酵素が触媒する能力として測定される該酵素の活性の増加または減少を意味する。例えば、該酵素は、検出不可能な基質から、その検出可能な形態への変換を触媒しうる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは色素原性または化学発光性基質と共に当技術分野で広く使用されており、それらは商業的に入手可能である。酵素の活性の増加または減少のレベルは10％〜100％、例えば20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％であることが可能であり、活性の増加の場合には、該増加が100％を超えること、すなわち、200％、300％、500％またはそれ以上になることが可能であり、あるいは、阻害される酵素のベースライン活性が検出不能である場合には比率として測定できないこともある。
【０３６０】
もう1つの形態においては、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドは、酵素／基質ペアの酵素ではなく基質に結合しうる。したがって、アナライトの結合により、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドから該基質が遊離されるまでは、該基質は該酵素によっては利用されえない。この形態の実施は、酵素に結合する形態の場合と同様である。
【０３６１】
さらに、リガンドへの結合の際には蛍光が消光されるようなコンフォメーションで蛍光分子（例えば、フルオレセインまたは他の発蛍光団）に結合するよう、該アッセイを設計することが可能である。この場合、該リガンドへのアナライトの結合は蛍光分子を脱離させてシグナルを生成する。本発明において有用な、蛍光分子の代替物には、発光性物質、例えばルシフェリン／ルシフェラーゼ、および色素原性物質、例えば、イムノアッセイにおいて一般に使用される物質、例えばHRPが含まれる。
【０３６２】
治療用および診断用組成物および用途
本発明は、本発明のTNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド）（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）と製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物、ならびに本発明のリガンドまたは組成物を使用する治療および診断方法を提供する。本発明の方法におけるアンタゴニストおよびリガンド（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）は、in vivo治療および予防用途、in vivo診断用途などにおいて使用することが可能である。
【０３６３】
本発明のアンタゴニストおよびリガンド（例えば、多重特異性リガンド、二重特異性リガンド、dAb単量体）の治療および予防的使用は、本発明のアンタゴニストおよび／またはリガンドを受容哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。二重特異性および多重特異性リガンド（例えば、二重特異性抗体フォーマット）は、大きな結合活性で多量体抗原に結合する。二重または多重特異性リガンドは、例えば、腫瘍細胞系の殺細胞を媒介する細胞傷害性T細胞のリクルーティングにおいて、2つの抗原の架橋を可能にしうる。
【０３６４】
哺乳動物に対する投与には、少なくとも90〜95％の均質性の実質的に純粋なリガンドまたはその結合タンパク質（例えば、dAb単量体）が好ましく、医薬用途、特に、該哺乳動物がヒトである場合には、98〜99％以上の均質性が最も好ましい。該リガンドは、部分的に又は所望の均質性にまで精製した後、診断用または治療用（体外におけるものを含む）に、あるいはアッセイ法、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用することが可能である（LefkoviteおよびPernis, (1979および1981) Immunological Methods, Volumes IおよびII, Academic Press, NY）。
【０３６５】
例えば、本発明のリガンドまたはその結合性タンパク質、例えばdAb単量体は、典型的には、急性および慢性炎症疾患を含む炎症状態の予防、抑制または治療に有用である。例えば、該アンタゴニストおよび／またはリガンドは、慢性炎症疾患、アレルギー過敏症、癌、細菌またはウイルス感染、自己免疫障害、例えば限定的なものではないがI型糖尿病、喘息、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、若年性リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、重症筋無力症およびベーチェット症候群、乾癬、子宮内膜炎ならびに腹部癒着（例えば、腹部手術後）を含むが、これらに限定されるものではない）を治療、抑制または予防するために投与することが可能である。
【０３６６】
エンドサイトーシスに関与する細胞外標的（例えば、クラスリン）に結合しうる本発明のアンタゴニスト（例えば、リガンド）（例えば、二重特異性リガンド、多重特異性リガンド、dAb単量体）はエンドサイトーシスされることが可能であり、細胞内標的に接近しうる。また、二重または多重特異性リガンドは、細胞内標的に特異的に結合しうる結合ドメイン（例えば、dAb単量体）が細胞内環境に運搬されうる手段を提供する。この戦略は、例えば、細胞内での二重特異性リガンドの機能の維持を可能にする物理的特異性を有する二重特異性リガンドを要する。あるいは、最終目的部位の細胞内区画が酸化性である場合には、十分にフォールディングするリガンドはジスルフィド非含有である必要はないかもしれない。
【０３６７】
この用途における「予防」なる語は、疾患の誘発前に保護用組成物を投与することを含む。「抑制」は、疾患の誘発事象の後であって疾患の臨床的出現の前に、該組成物を投与することを意味する。「治療」は、疾患の症状が顕著になった後で保護用組成物を投与することを含む。
【０３６８】
有利には、治療場面において生物の体内で相乗的に協同作用するサイトカインおよび他の分子を標的化するために、二重または多重特異性リガンドを使用することが可能である。したがって、本発明は、サイトカインまたは他の分子に結合する2以上の結合ドメイン（例えば、dAb）の活性を相乗作用させるための方法であって、その2以上の分子（例えば、サイトカイン）に結合しうる二重または多重特異的リガンドを投与することを含む方法を提供する。本発明のこの態様においては、該二重または多重特異性リガンドは、任意の二重または多重特異性リガンド、例えば、相補的および／または非相補的ドメインから構成されるリガンド、開いたコンフォメーションのリガンド、および閉じたコンフォメーションのリガンドでありうる。例えば、本発明のこの態様は、VLドメインのみ、VHドメインのみ、ならびにVHドメインおよびVLドメインの組合せに関する。
【０３６９】
治療場面における相乗作用は多数の方法で達成されうる。例えば、標的の組合せは、両方の標的がリガンドにより標的化された場合にのみ、治療的に活性となりうる。一方、一方の標的のみの標的化は治療的に有効ではない。もう1つの実施形態においては、一方の標的のみでも幾らかの低い又は最低限度の治療効果をもたらしうるが、もう1つの標的と一緒の場合には、その組合せは治療効果における相乗的増強をもたらす。好ましくは、本発明のこの態様の二重または多重特異性リガンドにより結合されるサイトカインは、付録2に示す一覧から選ばれる。
【０３７０】
さらに、細胞傷害性細胞により発現されるCD89を一方の特異性が標的化し他方が腫瘍特異的である二重または多重特異性リガンドは、腫瘍学的用途において使用されうる。標的化されうる腫瘍抗原の例を付録3に示す。
【０３７１】
疾患に対する保護または疾患の治療におけるTNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、抗体またはその結合性タンパク質）の有効性をスクリーニングするために使用しうる動物モデル系が入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）の試験方法が当技術分野で公知である（Knightら (1978) J. Exp. Med., 147:1653; Reinerstenら (1978) New Eng. J. Med., 299:515）。重症筋無力症（MG）は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種に由来する可溶性AchRタンパク質で該疾患を誘発させることにより試験される（Lindstromら (1988) Adv. Immunol., 42:233）。関節炎は、II型コラーゲンの注射によりマウスの感受性系統において誘発される（Stuartら (1984) Ann. Rev. Immunol., 42:233）。マイコバクテリア熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットにおいてアジュバント関節炎を誘発させるモデルが記載されている（Van Edenら (1988) Nature, 331:171）。甲状腺炎は、文献記載（Maronら (1980) J. Exp. Med., 152:1115）のとおりにサイログロブリンを投与することによりマウスにおいて誘発される。インスリン依存性糖尿病（IDDM）は自然発生するか、または或る系統のマウス（例えば、Kanasawaら (1984) Diabetologia, 27:113に記載のもの）において誘発されうる。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSのモデルとして有用である。このモデルにおいては、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性疾患が誘発される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編, GruneおよびStratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら (1973) Science, 179:4778: およびSatohら (1987) J. Immunol, 138:179を参照されたい）。
【０３７２】
一般には、このアンタゴニスト（例えば、リガンド）は、薬理学的に適した担体と共に、精製形態で使用される。典型的には、これらの担体には、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（いずれも、塩類液および／または緩衝化媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲル液が含まれる。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁状態で維持するための生理的に許容される適当な補助剤が、増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギナートから選択されうる。
【０３７３】
静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤および電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが存在していてもよい（Mark (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。長期放出製剤を含む種々の適当な製剤を使用することが可能である。
【０３７４】
本発明のアンタゴニスト（例えば、リガンド）は、別々に投与される組成物として、あるいは他の物質と共に使用することが可能である。これらには、種々の免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチニウムおよびイムノトキシンが含まれうる。医薬組成物には、種々の細胞毒性剤または他の物質と本発明のアンタゴニスト（例えば、リガンド）との「カクテル」、あるいは更には、投与前にプールされるか否かには無関係に、例えば種々の標的抗原またはエピトープを使用して選択されたリガンドのような、種々の特異性を有する本発明のリガンドの組合せが含まれうる。
【０３７５】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に公知の任意のものでありうる。療法（免疫療法が含まれるが、これに限定されるものではない）の場合には、本発明のその選択されたリガンドを、標準的な技術に従い任意の患者に投与することが可能である。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺経路を含む適当な任意の方法により行うことが可能であり、あるいは、適当な場合には、カテーテルによる直接注入によっても行うことが可能である。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌（counterindications）、および臨床家が考慮すべき他のパラメーターに左右されるであろう。投与は、適応に応じて、局所性（例えば、肺投与による肺への局所送達、例えば、鼻腔内投与）または全身性でありうる。
【０３７６】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥され、使用前に適当な担体で再調製（reconstitute）されうる。この技術は通常の免疫グロブリンでは有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再調製技術を用いることが可能である。凍結乾燥および再調製は種々の度合の抗体活性低下を招くことがあり（例えば、通常の免疫グロブリンの場合、IgM抗体は、IgG抗体より大きな活性低下を受ける傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方修正しなければならないことがある、と当業者に理解されるであろう。
【０３７７】
本アンタゴニスト（例えば、リガンド）またはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置において投与することが可能である。ある治療用途においては、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺細胞または他のいくつかの測定可能なパラメーターを達成するための適当な量が、「治療的に有効な量」と定義される。この用量を得るために必要な量は、疾患の重症度、および患者自身の免疫系の全身状態に左右されるが、一般には、体重1キログラム当たりリガンド（例えば、抗体、レセプター（例えば、T細胞レセプター）またはその結合タンパク質）0.005〜5.0mgであり、0.05〜2.0mg/kg/用量の投与量がより一般的に用いられる。また、予防的用途には、本リガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様の又はそれより若干低い投与量で投与して、疾患の発生を予防、抑制または遅延させる（例えば、寛解または休止状態を維持し、あるいは急性相を予防する）ことが可能である。当業者であれば、疾患を治療、抑制または予防するための適当な投与間隔を決定しうるであろう。慢性炎症疾患を治療、抑制または予防するためにTNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド）を投与する場合には、1日4回まで、週2回、週1回、2週間に1回、1ヶ月に1回または2ヶ月に1回、例えば約10μg/kg〜約80 mg/kg、約100μg/kg〜約80 mg/kg、約1 mg/kg〜約80 mg/kg、約1 mg/kg〜約70 mg/kg、約1 mg/kg〜約60mg/kg、約1 mg/kg〜約50 mg/kg、約1 mg/kg〜約40 mg/kg、約1 mg/kg〜約30 mg/kg、約1 mg/kg〜約20 mg/kg、約1 mg/kg〜約10 mg/kg、約10μg/kg〜約10 mg/kg、約10μg/kg〜約5 mg/kg、約10μg/kg〜約2.5 mg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kgまたは約10 mg/kgの用量で、それを投与することが可能である。特定の実施形態においては、慢性炎症疾患を治療、抑制または予防するために、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド）を、2週間に1回または1ヶ月に1回、約10μg/kg〜約10 mg/kg（例えば、約10μg/kg、約100μg/kg、約1 mg/kg、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kgまたは約10 mg/kg）の用量で投与する。
【０３７８】
本明細書に記載の組成物を使用して行う治療または療法は、治療前に存在したそのような症状と比較して、またはそのような組成物で治療されていない若しくは他の適当な対照で治療された個体（ヒトまたはモデル動物）におけるそのような症状と比較して、1以上の症状が（例えば、臨床評価尺度において少なくとも1ポイントまたは少なくとも10％）軽減した場合に、「有効」とみなされる。症状は、明らかに標的疾患または障害に応じて様々であるが、通常の技量を有する臨床家または技術者により評価されうる。そのような症状は、例えば、疾患または障害の1以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患に相関する酵素または代謝産物のレベル、罹患細胞数など）をモニタリングすることにより、あるいは物理的徴候（例えば、炎症、腫瘍サイズなど）をモニタリングすることにより、あるいは受け入れられている臨床評価尺度、例えばExpanded Disability Status Scale（多発性硬化症に関するもの）、Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire（32ポイントの評価により、腸機能、全身症状、社会的活動および情緒状態に関して生活の質を評価するものであり、スコア範囲は32〜224であり、より高いスコアが、より良好な生活の質を示す）、Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale、または当技術分野で公知の他の受け入れられている臨床評価尺度により測定されうる。与えられた臨床尺度で1以上のポイントまたは少なくとも10％の、疾患または障害の症状における持続的（例えば、1日以上、好ましくは、それより長期）な軽減が、「有効」な治療を示す。同様に、本明細書に記載の組成物を使用して行う予防は、該組成物で治療されていない同様の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるそのような症状と比較して、1以上の症状の発現または重症化が遅れた又は軽減した又は阻止された場合に、「有効」である。
【０３７９】
本発明のアンタゴニスト（例えば、リガンド）またはそのカクテルを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺細胞または除去を助けるために予防的および治療的状況で使用することができる。また、標的細胞集団を選択的に殺し、枯渇させ、あるいは不均一な細胞集団から有効に除去するために、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはin vitroで使用することが可能である。標準的な技術に従い、哺乳動物からの血液を、該リガンド、例えば抗体、細胞表面レセプターまたはそれらの結合性タンパク質と体外で一緒にし、それにより、望ましくない細胞を殺したり該血液から除去して該血液を該哺乳動物に戻すことが可能である。
【０３８０】
本発明のアンタゴニスト（例えば、リガンド）を含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺細胞または除去を助けるために予防的および治療的状況で使用することができる。
【０３８１】
TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）は、1以上の追加的な治療または活性物質と共に投与または製剤化することが可能である。TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）を、追加的な治療物質と共に投与する場合には、該追加的物質の投与の前、該投与と同時または該投与の後にTNFR1のアンタゴニストを投与することが可能である。一般には、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、リガンド、dAb単量体）および追加的物質を、治療効果の重複が得られるように投与する。
【０３８２】
1つの実施形態においては、本発明は、慢性炎症疾患の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８３】
1つの実施形態においては、本発明は、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、若年性リウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎）の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８４】
もう1つの実施形態においては、本発明は、乾癬の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８５】
もう1つの実施形態においては、本発明は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８６】
もう1つの実施形態においては、本発明は、慢性閉塞性肺疾患（例えば、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎、気腫）の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８７】
もう1つの実施形態においては、本発明は、肺炎（例えば、細菌性肺炎、例えばブドウ球菌性肺炎）の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８８】
本発明は、慢性閉塞性肺疾患および肺炎のほかの他の肺疾患の治療、抑制または予防方法を提供する。本発明により治療、抑制または予防されうる他の肺疾患には、例えば、嚢胞性線維症および喘息（例えば、ステロイド抵抗性喘息）が含まれる。したがって、もう1つの実施形態においては、本発明は、肺疾患（例えば、嚢胞性線維症、喘息）の治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３８９】
特定の実施形態においては、TNFR1のアンタゴニストを肺送達、例えば吸入（例えば、気管支内、鼻腔内または経口吸入、点鼻）により、または全身性送達（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）により投与する。
【０３９０】
もう1つの実施形態においては、本発明は、敗血症性ショックの治療、抑制または予防方法であって、それを要する哺乳動物に、TNFR1のアンタゴニスト（例えば、TNFR1に結合するdAb単量体を含むリガンド）の治療的に有効な用量または量を投与することを含む方法である。
【０３９１】
本発明の第2の形態の更にもう1つの態様においては、本発明は、本発明の方法により入手可能な、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドと、製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【０３９２】
さらに、本発明は、本発明の「閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンド」または組成物を使用する、疾患の治療方法を提供する。
【０３９３】
本発明の好ましい実施形態においては、該疾患は癌または炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、喘息またはクローン病である。
【０３９４】
本発明の第2の形態のもう1つの態様においては、本発明は、本発明の閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドまたは組成物を使用する診断（疾患の診断を含む）のための方法を提供する。したがって、一般には、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドへのアナライトの結合を利用して、脱離に際してシグナルの生成をもたらす物質を脱離させることが可能である。例えば、該酵素がその活性部位を介して該抗体に保持されている場合には特に、アナライト（第2抗原）の結合は、該抗体に結合した酵素（第1抗原）を脱離させて、イムノアッセイの基礎を与えうるであろう。
【０３９５】
したがって、本発明は、標的分子の存在を検出するための方法であって、
（a）物質に結合した、閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを準備し、ここで、該リガンドは該標的分子および該物質に特異的であり、該リガンドに結合した該物質は、該リガンドからの脱離に際して、検出可能なシグナルの生成を招き、
（b）その閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドを該標的分子にさらし、
（c）該物質の脱離の結果として生成したシグナルを検出することを含む方法を提供する。本発明の第2の形態の前記態様においては、有利には、該物質は酵素であり、これは、その閉じたコンフォメーションの多重特異性リガンドに結合している場合には不活性である。あるいは、該物質は、以下のものよりなる群から選ばれる任意の1以上のものでありうる：該リガンドに結合している場合には不活性であるか又は消光されている酵素基質および蛍光性、発光性または色素原性分子。
【０３９６】
また、標的細胞集団を選択的に殺し、枯渇させ、あるいは不均一な細胞集団から有効に除去するために、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはin vitroで使用することが可能である。標準的な技術に従い、哺乳動物からの血液を、該リガンド、例えば抗体、細胞表面レセプターまたはそれらの結合性タンパク質と体外で一緒にし、それにより、望ましくない細胞を殺したり該血液から除去して該血液を該哺乳動物に戻すことが可能である。
【実施例】
【０３９７】
以下の実施例において、単なる例示目的で、本発明を更に詳しく説明することとする。dAbの命名の目的においては、本明細書中で用いるヒトTNFαはTAR1と称され、ヒトTNFαレセプター1（p55レセプター）はTAR2と称される。
【０３９８】
実施例１  ヒト血清アルブミン（HSA）およびβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）に対する二重特異性scFv抗体（K8）の選択
本実施例では、生殖系列（ダミー）VHドメインに連結されたVκ可変ドメインのレパートリーがβ-galへの結合に関して選択され、生殖系列（ダミー）Vκドメインに連結されたVH可変ドメインのレパートリーがHSAへの結合に関して選択される、β-galおよびHSAに対する二重特異性抗体の製造方法を説明する。ついで、選択された可変VH HSAおよびVκβ-galドメインを組合せ、β-galおよびHSAへの結合に関して抗体を選択する。HSAは、ヒト血液内に見出される半減期延長性タンパク質である。
【０３９９】
この実験においては、4つのヒトファージ抗体ライブラリーを使用した。 
ライブラリー1      生殖系列Vκ/DVT VH      8.46×107
ライブラリー2      生殖系列Vκ/NNK VH      9.64×107
ライブラリー3      生殖系列VH/DVT Vκ      1.47×108
ライブラリー4      生殖系列VH/NNK Vκ      1.45×108。
【０４００】
すべてのライブラリーは、VH（V3-23/DP47およびJH4b）およびVκ（O12/O2/DPK9およびVκ1）の単一のヒトフレームワークに基づくものであり、側鎖多様性は相補性決定領域（CDR2およびCDR3）に含まれる。
【０４０１】
ライブラリー1およびライブラリー2はダミーVκ配列を含有し、一方、VHの配列はH50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97およびH98位において多様化されている（それぞれDVTまたはNNKによりコードされている）（図1）。ライブラリー3およびライブラリー4はダミーVH配列を含有し、一方、Vκの配列はL50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96位において多様化されている（それぞれDVTまたはNNKによりコードされている）（図1）。それらのライブラリーはファージミドpIT2/ScFvフォーマット（図2）であり、ジェネリックリガンド、すなわちプロテインAおよびプロテインLへの結合に関して予備選択されており、したがって、非選択ライブラリー内のクローンの大多数は機能的である。前記のライブラリーのサイズは予備選択後のサイズに対応する。ライブラリー1とライブラリーとを抗原上での選択前に混合して単一VH/ダミーVκライブラリーを得、ライブラリー3とライブラリー4とを混合して単一Vκ/ダミーVHライブラリーを得た。
【０４０２】
Vκ/ダミーVHライブラリーを使用してβ-galに関して3ラウンドの選択を行い、VH/ダミーVκライブラリーを使用してHASに関して3ラウンドの選択を行った。β-galの場合には、ファージ力価は第1ラウンドにおける1.1×106から第3ラウンドにおける2.0×108まで上昇した。HSAの場合には、ファージ力価は第1ラウンドにおける2×104から第3ラウンドにおける1.4×109まで上昇した。KM13ヘルパーファージ（これは、D2ドメインとD3ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を有するpIIIタンパク質を含有する）を使用しファージをPBS中の1mg/ml トリプシンで溶出した以外は、Griffithら, (1993)に記載されているとおりに、該選択を行った。トリプシンの添加はヘルパーファージ由来（ファージミド由来のものではない）のpIIIタンパク質を切断し、c-mycタグ内での切断により結合scFv-ファージ融合体を溶出して（図2）、機能的scFvを発現するファージの更なる富化およびバックグラウンドにおける対応する減少をもたらす（Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321-328, Jul 9, 1998）。選択は、100μg/mlの濃度のHSAまたはβ-galのいずれかでコーティングされたイムノチューブを使用して行った。
【０４０３】
結合を確認するために、各選択の第3ラウンドからの24個のコロニーをモノクローナルファージELISAによりスクリーニングした。ファージ粒子は、Harrisonら, Methods Enzymol. 1996;267:83-109に記載のとおりに産生させた。96ウェルELISAプレートをPBS中10μg/mlの濃度の100μlのHSAまたはβ-galで4℃で一晩コーティングした。抗M13-HRPコンジュゲートでの結合ファージの検出を用いる標準的なELISAプロトコールに従った（Hoogenboomら, 1991）。クローンの選択は、50μlの上清で、1.0を超えるELISAシグナルを与えた。
【０４０４】
つぎに、QIAprep Spin Miniprepキット（Qiagen）を使用して、HSA上で選択されたVH/ダミーVκライブラリーから及びβ-gal上で選択されたVκ/ダミーVHライブラリーから、DNA調製物を調製した。多様性のほとんどを得るために、DNA調製物を3つのラウンドの選択のそれぞれから調製し、ついで該抗原のそれぞれに関して一緒にした。ついでDNA調製物をSalI/NotIで37℃で一晩消化した。該断片のゲル精製の後、β-gal上で選択されたVκ/ダミーVHライブラリーからのVκ鎖を、HSA上で選択されたVH/ダミーVκライブラリーからのダミーVκ鎖の代わりに連結して、3.3×109個のクローンのライブラリーを作製した。
【０４０５】
ついでこのライブラリーをHSA（第1ラウンド）およびβ-gal（第2ラウンド）に関して（HSA/β-gal選択）、またはβ-gal（第1ラウンド）およびHSA（第2ラウンド）に関して（β-gal/HSA選択）で選択した。選択は、前記のとおりに行った。それぞれの場合に、第2ラウンド後、48個のクローンをモノクローナルファージELISA（前記のとおり）により及び可溶性scFvフラグメントのELISAにより、HSAおよびβ-galへの結合に関して試験した。可溶性抗体フラグメントはHarrisonら, (1996)に記載のとおりに産生させ、標準的なELISAプロトコールは、2％ Tween/PBSをブロッキングバッファーとして使用し結合scFvをプロテインL-HRPで検出すること以外はHoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133に従った。HSA/β-gal選択からの3個のクローン（E4、E5およびE8）およびβ-gal/HSA選択からの2個のクローン（K8およびK10）は両方の抗原に結合することが可能であった。これらのクローンからのscFvをPCR増幅し配列決定した（プライマーLMB3およびpHENseqを使用して、Ignatovichら, (1999) J Mol Biol 1999 Nov 26;294(2):457-65に記載のとおりに行った）。配列分析は、すべてのクローンが同一であることを示した。したがって、二重特異性抗体をコードする唯一のクローン（K8）を更なる研究に選択した（図3）。
【０４０６】
実施例２  K8抗体の結合特性の特徴づけ
まず、モノクローナルファージELISAによりK8抗体の結合特性を特徴づけした。96ウェルプレートをアルカリホスファターゼ（APS）、ウシ血清アルブミン（BSA）、ピーナッツ凝集素、リゾチームおよびシトクロムc（交差反応性の確認のため）の存在下の100μlのHSAおよびβ-gal(PBS中10μg/ml濃度)で4℃で一晩コーティングした。K8クローンからのファージミドを、Harrisonら, (1996)に記載のとおりにKM13でレスキュ−し、ファージ含有上清（50μl）を直接的にアッセイした。抗M13-HRPコンジュゲートでの結合ファージの検出を用いる標準的なELISAプロトコール（Hoogenboomら, 1991）に従った。二重特異性K8抗体は、該ファージの表面上に提示された場合、HSAおよびβ-galに結合することが判明し、このときの吸光シグナルは1.0より大きかった（図4）。BSAへの強力な結合も観察された（図4）。HSAとBSAとはアミノ酸レベルで76％相同であるため、K8抗体が、これらの構造的に関連したタンパク質の両方を認識したことは驚くべきことではない。他のタンパク質との交差反応性は検出されなかった（図4）。
【０４０７】
つぎに、K8抗体の結合特性を可溶性scFv ELISAにおいて試験した。可溶性scFvフラグメントの産生を、Harrisonら, (1996)に記載のとおりにIPTGにより誘導した。K8 scFvの発現レベルを測定するために、HarlowおよびLane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harborに記載のとおりにプロテインA-セファロースカラムを使用して、該可溶性抗体フラグメントを50mlの誘導物の上清から精製した。ついでOD280を測定し、Sambrookら, (1989)に記載のとおりにタンパク質濃度を計算した。K8 scFvは上清中に19mg/lで産生された。
【０４０８】
ついで、既知濃度のK8抗体フラグメントを使用して、可溶性scFv ELISAを行った。96ウェルプレートを100μlのHSA、BSAおよびβ-gal（10μg/ml）ならびに100μlのプロテインA（1μg/ml）でコーティングした。K8 scFvの系列希釈物50μlを適用し、結合抗体フラグメントをプロテインL-HRPで検出した。ELISAの結果はK8抗体の二重特異性を証明した（図5）。
【０４０９】
β-galへの結合がVκドメインにより決定され、HSA/BSAへの結合がK8 scFv抗体のVHドメインにより決定されることを確認するために、該VκドメインをSalI/NotI消化によりK8 scFv DNAから切り出し、ダミーVH鎖を含有しSalI/NotIで消化されたpIT2ベクター内に連結した（図1および2）。得られたクローンK8Vκ/ダミーVH鎖の結合特性を可溶性scFv ELISAにより分析した。可溶性scFvフラグメントの産生をHarrisonら, (1996)に記載のとおりにIPTGにより誘導し、scFvを含有する上清（50μl）を直接的にアッセイした。可溶性scFv ELISAを実施例1に記載のとおりに行い、結合scFvをプロテインL-HRPで検出した。このクローンはβ-galに尚も結合しうるが、BSAへの結合は消失したことが、そのELISAの結果から示された（図6）。
【０４１０】
実施例３  抗原AおよびBに対する単一VHドメイン抗体ならびに抗原CおよびDに対する単一Vκドメイン抗体の選択
本実施例では、抗原AおよびBに対する単一VHドメイン抗体ならびに抗原CおよびDに対する単一Vκドメイン抗体を、相補的可変ドメインの非存在下のこれらの抗原への結合に関してバージン単一抗体可変ドメインのレパートリーを選択することにより製造するための方法を説明する。
【０４１１】
結合性クローンの選択および特徴づけを、既に記載されているとおりに行う（PCT/GB 02/003014の実施例5を参照されたい）。さらなる研究に以下の4個のクローンを選択する：
VH1 - 抗AVH
VH2 - 抗BVH
VK1 - 抗CVκ
VK2 - 抗DVκ。
【０４１２】
前記実施例1〜3に記載の操作手順を、記載されているものと同様に用いて、VHドメインの組合せ（すなわち、VH-VHリガンド）およびVLドメインの組合せ（すなわち、VL-VLリガンド）を含む二量体分子を得ることが可能である。
【０４１３】
実施例４  二重特異性ScFv抗体（抗原AおよびBに対するVH1/VH2ならびに抗原CおよびDに対するVK1/VK2）の作製および特徴づけ
本実施例は、ScFvベクターにおいてそれぞれの抗原に対して選択されたVκおよびVH単一ドメインを組合せることにより二重特異性ScFv抗体（抗原AおよびBに対するVH1/VH2ならびに抗原CおよびDに対するVK1/VK2）が作製されうることを示す。
【０４１４】
二重特異性抗体VH1/VH2を作製するために、VH1単一ドメインを可変ドメインベクター1（図7）からNcoI/XhoI消化により切り出し、NcoI/XhoIで消化された可変ドメインベクター2（図7）内に連結して、VH1/可変ドメインベクター2を得る。5'末端にSalI制限部位を及び3'末端にNotI制限部位を導入するプライマーを使用して、VH2単一ドメインを可変ドメインベクター1からPCR増幅する。ついでPCR産物をSalI/NotIで消化し、SalI/NotIで消化されたVH1/可変ドメインベクター2内に連結して、VH1/VH2可変ドメインベクター2を得る。
【０４１５】
同様にして、VK1/VK2/可変ドメインベクター2を作製する。得られたVH1/VH2 ScFvおよびVK1/VK2 ScFvの二重特異性を、既に記載されているとおりに（PCT/GB 02/003014の実施例6を参照されたい）、可溶性ScFv ELISAにおいて試験する。競合ELISAを、既に記載されているとおりに（PCT/GB 02/003014の実施例8を参照されたい）行う。
【０４１６】
考えられうる結果：
・VH1/VH2 ScFvは抗原AおよびBに同時に結合しうる；
・VK1/VK2 ScFvは抗原CおよびDに同時に結合しうる；
・VH1/VH2 ScFv結合は競合的である（VH1/VH2 ScFvは、抗原Aに結合している場合には抗原Bには結合し得ない）；
・VK1/VK2 ScFv結合は競合的である（VK1/VK2 ScFvは、抗原Cに結合している場合には抗原Dには結合し得ない）。
【０４１７】
実施例５  二重特異性VH1/VH2 FabおよびVK1/VK2 Fabの構築ならびにそれらの結合特性の分析
VH1/VH2 Fabを作製するために、VH1単一ドメインを、NcoI/XhoIで消化されたCHベクター（図8）内に連結してVH1/CHを得、VH2単一ドメインを、SalI/NotIで消化されたCKベクター（図9）内に連結してVH2/CKを得る。VH1/CHおよびVH2/CKからのプラスミドDNAを使用して、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）コンピテント大腸菌（E. coli）細胞を共形質転換する。
【０４１８】
ついで、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）、VH1/CHおよびVH2/CKプラスミドを含有するクローンをIPTGにより誘導して可溶性VH1/VH2 Fabを得る。
【０４１９】
同様にして、VK1/VK2 Fabを得る。
【０４２０】
得られたFabの結合特性を、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）競合ELISAにより試験する。
【０４２１】
考えられうる結果：
・VH1/VH2 Fabは抗原AおよびBに同時に結合しうる；
・VK1/VK2 Fabは抗原CおよびDに同時に結合しうる；
・VH1/VH2 Fab結合は競合的である（VH1/VH2 Fabは、抗原Aに結合している場合には抗原Bには結合し得ない）；
・VK1/VK2 Fab結合は競合的である（VK1/VK2 Fabは、抗原Cに結合している場合には抗原Dには結合し得ない）。
【０４２２】
実施例６  キレート形成dAb二量体
概要
VHおよびVκホモ二量体は、dAb-リンカー-dAbフォーマットにおいて、柔軟性のポリペプチドリンカーを用いて作製する。ベクターは、dAb-リンカー-dAbフォーマットにおいて、種々の長さのグリシン-セリンリンカー3U：(Gly4Ser)3(配列番号199)、5U：(Gly4Ser)5(配列番号629)、7U：(Gly4Ser)7(配列番号630)を有するように作製した。二量体ライブラリーは、リンカーの上流のガイディングdAb(すなわちTAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、またはTAR2-6(VK))と、リンカーの後の対応する第２のdAbのライブラリーとを用いて作製した。この方法を用いて新規二量体型dAbを選択した。二量体化が抗原結合に及ぼす影響は、ELISAおよびBIAcore研究により、また、細胞中和アッセイおよびレセプター結合アッセイにおいて決定した。TAR1-5とTAR1-27の両方の二量体化は、結合親和性および中和レベルを著しく改善させた。
【０４２３】
1.0  方法
1.1  ライブラリー作製
1.1.1  ベクター
dAb-リンカー-dAbフォーマットに適合する種々の長さのリンカーを導入するために、pEDA3U、pEDA5UおよびpEDA7Uベクターを設計した。pEDA3Uについては、センスおよびアンチセンス73塩基対オリゴリンカーを、0.1M NaCl、10mM Tris-HCl pH7.4を含有するバッファー中で低速アニーリングプログラム(95℃-5分、80℃-10分、70℃-15分、56℃-15分、使用するまで42℃)を用いてアニーリングさせ、その後Xho1およびNot1制限部位を用いてクローニングした。リンカーは３つの(Gly4Ser)単位、およびSal1とNot1クローニング部位の間に収容されたスタッファー(stuffer)領域を包含した。ファージディスプレイにより単量体型dAbが選択される可能性を減少させるために、スタッファー領域に３つの終止コドン、Sac1制限部位およびフレームシフト突然変異（第２のdAbが存在しないときにはスタッファー領域を読み枠からずらす）を導入するように設計した。pEDA5UおよびpEDA7Uについては、必要なリンカーの長さ故に、各ベクター用に重複するオリゴリンカーを設計し、アニーリングさせ、その後クレノウを用いて伸長させた。次にこの断片を精製し、適当な酵素を用いて消化し、その後Xho1およびNot1制限部位を用いてクローニングを行った。
【０４２４】
2008515420.tif 000002
1.1.2  ライブラリー作製
ガイディングdAbに対応するN末端V遺伝子を、Nco1およびXho1制限部位を利用してリンカーの上流にクローニングした。VH遺伝子には適合可能な部位がすでに存在するが、Vκ遺伝子のクローニングには、適当な制限部位の導入が必要であった。これは、改変用PCRプライマー(VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat (配列番号377); VKXho1R: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3' (配列番号378))を用いて、SuperTaq (HTBiotechnology Ltd)とpfu turbo (Stratagene)の2:1混合物を用いる30サイクルのPCR増幅により行った。このことにより5'末端のNco1部位は維持されたが、隣接するSal1部位は破壊され、かつ3'末端にはXho1部位が導入された。5つのガイディングdAb、すなわちTAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK)およびTAR2-7(VK)を3種の二量体ベクターそれぞれにクローニングした。すべての構築物は配列解析により確認した。
【０４２５】
各種ベクター(pEDA3U、5Uおよび7U)中のリンカーの上流にガイディングdAb、すなわち TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)またはTAR2-6(VK)をクローニングした後に、対応する第２のdAbのライブラリーをリンカーの下流にクローニングした。このことを達成するために、ガイディングdAbがTAR1-5もしくはTAR1-27であるときは、ヒトTNFαに対するVκライブラリー(ラウンド１後の多様性は約1 x 106)の、またはガイディングdAbがそれぞれTAR2-5もしくはTAR2-6であるときには、ヒトp55 TNFレセプターに対するVHもしくはVκライブラリー(いずれもラウンド１後の多様性は約1 x 105)のラウンド１選択から回収されたファージから相補的dAbライブラリーをPCR増幅した。VκライブラリーについてはPCR増幅を、プライマーを用いてSuperTaqとpfu turboの2:1混合物を用いる30サイクルのPCR増幅により行った。VHライブラリーは、遺伝子の5'末端にSal1制限部位を導入するためにプライマーを用いてPCR増幅した。dAbライブラリーPCR産物を適当な制限酵素で消化し、Sal1/Not1制限部位を利用して対応するベクター中のリンカーの下流に連結し、その後新たに調製したコンピテントTG1細胞内にエレクトロポレーション導入した。
【０４２６】
各ライブラリーについて得られた力価(titer)は次のとおりである：
TAR1-5: pEDA3U = 4x108, pEDA5U = 8x107, pEDA7U = 1x108 
TAR1-27: pEDA3U = 6.2x108, pEDA5U = 1x108, pEDA7U = 1x109 
TAR2h-5: pEDA3U = 4x107, pEDA5U = 2 x 108, pEDA7U = 8x107
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4x108, pEDA5U = 1.2 x 108, pEDA7U = 2.2x108。
【０４２７】
1.2  選択
1.2.1  TNFα
選択は、イムノチューブに受動的にコーティングされたヒトTNFαを用いて行った。簡単に説明すると、1〜4mlの所定の抗原でイムノチューブを一晩コーティングした。次にイムノチューブをPBSで3回洗浄し、ついでPBS中2％粉乳で1〜2時間ブロッキングし、その後PBSでさらに3回洗浄した。ファージ溶液をPBS中2％粉乳で希釈し、室温で2時間インキュベートした。その後チューブをPBSで洗浄し、ついで1mg/ml トリプシン-PBSを用いてファージを溶離させた。TAR1-5二量体ライブラリーについては３種の選択ストラテジーを検討した。第１ラウンドの選択は、イムノチューブ内で、1μg/mlまたは20μg/mlでコーティングしたヒトTNFαを用いて、PBS 0.1％Tweenで20回洗浄して実施した。TG1細胞に溶離したファージを感染させ、その後力価を測定する(例えばMarksらJ Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97, RichmannらBiochemistry. 1993 Aug 31;32(34):8848-55)。
【０４２８】
得られた力価は次のとおりであった：
pEDA3U = 2.8x107 (1μg/ml TNF) 1.5x108 (20μg/ml TNF), 
pEDA5U = 1.8x107 (1μg/ml TNF), 1.6x108 (20μg/ml TNF) 
pEDA7U = 8x106 (1μg/ml TNF), 7x107 (20μg/ml TNF)。
【０４２９】
第２ラウンドの選択は、３種の異なる方法を用いて行った。 
1.  イムノチューブ内で、20回洗浄し、一晩インキュベートし、その後さらに10回洗浄する。 
2.  イムノチューブ内で、20回洗浄し、その後(1μg/ml TNFα)を有する洗浄バッファー中で室温にて1時間インキュベートし、さらに10回洗浄する。 
3.  33ピコモルのビオチン化ヒトTNFαを用いたストレプトアビジンビーズでの選択(Henderikxら, 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display : Methods and protocols, O'Brien and Atkin編, Humana Press)。ラウンド２選択からの単一クローンを96ウェルプレートにピッキングし、2mlの96ウェルプレートフォーマットで粗上清プレプを調製した。
【表１】
2008515420.tif 000003
【０４３０】
TAR1-27についての選択は、次の改変を加えつつ、上に記載のように行った。第１ラウンドの選択は、イムノチューブ内で、1μg/mlまたは20μg/mlでコーティングしたヒトTNFαを用いて、PBS 0.1％Tweenで20回洗浄することにより行った。第２ラウンドの選択は、イムノチューブ内で、20回洗浄し、一晩インキュベートし、その後さらに20回洗浄することにより行った。ラウンド２選択からの単一クローンを96ウェルプレートにピッキングし、粗上清プレプを2mlの96ウェルプレートフォーマットで調製した。
【０４３１】
TAR1-27力価は次のとおりである：
【表２】
2008515420.tif 000004
【０４３２】
1.2.2  TNFレセプター１(p55レセプター、TAR2)
TAR2h-5ライブラリーのみについて、上に記載したような選択を行った。3ラウンドの選択を、イムノチューブ内で1μg/mlのヒトp55 TNFレセプターまたは10μg/mlのヒトp55 TNFレセプターのいずれかを用いて、PBS 0.1％Tweenで20回洗浄し、一晩インキュベートし、その後さらに20回洗浄することにより行った。ラウンド2およびラウンド3選択からの単一クローンを96ウェルプレートにピッキングし、2mlの96ウェルプレートフォーマットで粗上清プレプを調製した。
【０４３３】
TAR2h-5力価は次のとおりである：
【表３】
2008515420.tif 000005
【０４３４】
1.3  スクリーニング
ラウンド2またはラウンド3選択からの単一クローンを、適宜、異なる選択方法により3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれからピッキングした。クローンを、100μg/mlアンピシリンおよび1％グルコースを含む2xTY中、37℃で一晩増殖させた。この培養物の1/100希釈物を、2mlの96ウェルプレートフォーマットで、100μg/mlアンピシリンおよび0.1％グルコースを含む2mlの2xTYに接種し、その後OD600が約0.9となるまで振とうしながら37℃で増殖させた。その後、培養物に1mM IPTGを加えて30℃で一晩誘導をかけた。上清をsorvalプレート遠心分離機で4000rpm×15分間の遠心分離により清澄化した。上清プレプを最初のスクリーニングに使用した。
【０４３５】
1.3.1  ELISA
プロテインA/L ELISAによりまたは抗原ELISAを用いて、二量体型組換えタンパク質の結合活性を単量体と比較した。簡単に説明すると、96ウェルプレートに抗原またはプロテインA/Lを４℃で一晩コーティングした。プレートを0.05％ Tween-PBSで洗浄し、2％ Tween-PBSで2時間ブロッキングした。サンプルをプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、２次試薬と室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、その後TMB基質で発色させた。２次試薬としてプロテインA/L-HRPまたはIndia-HRPを使用した。抗原ELISAについては、用いた抗原濃度を、ヒトTNFαおよびヒトTNFレセプター1についてPBS中1μg/mlとした。ガイディングdAbの存在に起因して、ほとんどの場合、二量体は陽性ELISAシグナルを生じ、そのためoff速度の測定はBIAcoreにより調べた。
【０４３６】
1.3.2  BIAcore
BIAcore分析をTAR1-5およびTAR2h-5クローンについて行った。スクリーニングのために、ヒトTNFαをCM5チップと高密度(約10000 RU)でカップリングさせた。50μlのヒトTNFα(50μg/ml)を酢酸バッファーpH5.5中でチップに5μl/分でカップリングさせた。解析後のチップの標準法を用いた再生は、ヒトTNFαの不安定性ゆえに不可能であり、そのため各サンプルの分析後に、チップをバッファーで10分間洗浄した。TAR1-5については、ラウンド2選択からのクローンの上清をBIAcoreを用いてスクリーニングした。
【０４３７】
得られた3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれから48個のクローンを次の選択方法によりスクリーニングした：
R1：1μg/mlヒトTNFαイムノチューブ、R2 1μg/mlヒトTNFαイムノチューブ、一晩洗浄。 
R1：20μg/mlヒトTNFαイムノチューブ、R2 20μg/mlヒトTNFαイムノチューブ、一晩洗浄。 
R1：1μg/mlヒトTNFαイムノチューブ、R2 ビーズ上の33ピコモルのビオチン化ヒトTNFα。 
R1：20μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、R2 ビーズ上の33ピコモルのビオチン化ヒトTNFα。
【０４３８】
スクリーニングするために、ヒトp55 TNFレセプターをCM5チップに高密度(約4000 RU)でカップリングさせた。100μlのヒトp55 TNFレセプター(10 μg/ml)を、酢酸バッファーpH5.5中でチップに5μl/分でカップリングさせた。標準再生条件(グリシンpH2またはpH3)を検討したが、いずれの場合にもTNFαの場合と同様に抗原はチップの表面から除かれ、そのため各サンプルの分析後に、チップをバッファーで10分間洗浄した。
【０４３９】
TAR2-5については、ラウンド2選択からのクローン上清をスクリーニングした。3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれから48個のクローンを、次の選択方法を用いてスクリーニングした：
R1：1μg/ml ヒトp55 TNFレセプターイムノチューブ、R2 1μg/ml ヒトp55 TNFレセプターイムノチューブ、一晩洗浄。 
R1：10μg/ml ヒトp55 TNFレセプターイムノチューブ、R2 10μg/ml ヒトp55 TNFレセプターイムノチューブ、一晩洗浄。
【０４４０】
1.3.3  レセプターアッセイおよび細胞アッセイ
レセプターアッセイにおける二量体の中和能力を次のようにアッセイした。
【０４４１】
レセプター結合
抗TNF dAbを、TNFと組換えTNFレセプター1(p55)との結合を阻害する能力について試験した。簡単に説明すると、Maxisorpプレートを30mg/ml 抗ヒトFcマウスモノクローナル抗体(Zymed, San Francisco, USA)とともに一晩インキュベートした。ウェルを0.05％ Tween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、その後PBS中1％ BSAでブロッキングし、その後100ng/ml TNFレセプター1 Fc融合タンパク質 (R&D Systems, Minneapolis, USA)とともにインキュベートした。抗TNF dAbを、最終濃度10ng/mlで洗浄済みウェルに加えたTNFと混合した。TNF結合を検出するために、0.2mg/mlビオチン化抗TNF抗体(HyCult biotechnology, Uben, Netherlands)を加え、その後1/500希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Amersham Biosciences, UK)を加え、ついでTMB基質(KPL, Gaithersburg, USA)とインキュベートした。この反応はHClの添加により停止させ、450nmの吸収を測定した。抗TNF dAb活性はTNF結合を低下させ、そのためTNFのみの対照と比べて吸収を減少させた。
【０４４２】
L929細胞毒性アッセイ
抗TNF dAbはまた、マウスL929線維芽細胞に対するTNFの細胞毒性活性を中和する能力について、試験された(Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248)。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートに播種したL929細胞を、抗TNF dAb、100pg/ml TNFおよび1mg/mlアクチノマイシンD (Sigma, Poole, UK)と共に一晩インキュベートした。細胞生存率は、[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(Promega, Madison, USA)とのインキュベーション後に490nmの吸収を読み取ることにより測定した。抗TNF dAb活性はTNF細胞毒性を低下させ、そのためTNFのみの対照と比較して吸収の増加をもたらした。
【０４４３】
最初のスクリーニングでは、上に説明したBIAcore分析用に調製した上清を、レセプターアッセイにも使用した。選択した二量体のさらなる分析は、レセプターアッセイおよび細胞アッセイにおいても、精製タンパク質を用いて実施した。
【０４４４】
HeLa IL-8アッセイ
抗TNFR1 dAbまたは抗TNFα dAbを、HeLa細胞におけるTNFによるIL-8分泌の誘導を中和する能力について試験した(HUVECにおけるIL-1によるIL-8の誘導を記載するAkeson, L.ら(1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523の方法を応用、本実施例ではヒトTNFαによる誘導を観察し、HUVEC細胞株の代わりにHeLa細胞を使用する)。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートに播種したHeLa細胞をdAbおよび300pg/ml TNFと共に一晩インキュベートした。インキュベート後、上清を細胞から吸引して取り出し、IL-8濃度をサンドイッチELISA (R&D Systems)により測定した。抗TNFR1 dAb活性は、TNFのみの対照と比べて、上清へのIL-8分泌を減少させた。
【０４４５】
以下の実験全般に渡りL929アッセイを用いた。しかし、抗TNFレセプター1 (p55)リガンドを測定するためにはHeLa IL-8 アッセイの使用が好ましい。L929アッセイにおけるマウスp55の存在は、その使用にいくつかの制限を提起する。
【０４４６】
1.4  配列解析
BIAcoreアッセイおよびレセプターアッセイスクリーニングで興味深い性質をもつことが判明した二量体の配列解析を行った。これらの配列は配列表に記載した。
【０４４７】
1.5  フォーマット化
1.5.1  TAR1-5-19二量体
良好な中和特性を示したTAR1-5二量体をリフォーマット化(re-formatted)し、その後細胞アッセイおよびレセプターアッセイにて分析した。TAR1-5ガイディングdAbを、親和性成熟(affinity matured)クローンTAR1-5-19で置換した。これを達成するために、個々の二量体ペアからTAR1-5をクローニングして取り出し(clone out)、PCR増幅したTAR1-5-19で置換した。さらに、TAR1-5-19ホモ二量体をも3U、5Uおよび7Uベクター中に構築した。該遺伝子のN末端コピーはPCR増幅して上記のようにクローニングし、C末端遺伝子断片は既存のSal1およびNot1制限部位を利用してクローニングした。
【０４４８】
1.5.2  突然変異誘発
TAR1-5二量体ペアのC末端dAbの１つであるdAb2に存在するアンバー終止コドンを、部位特異的突然変異誘発によりグルタミンへと変異させた。
【０４４９】
1.5.3  Fab
TAR1-5またはTAR1-5-19を含有する二量体をFab発現ベクター中にリフォーマット化した。dAbを、CκまたはCH遺伝子のいずれかを含有する発現ベクターに、Sfi1およびNot1制限部位を利用してクローニングし、その後配列解析により確認した。CκベクターはpUCに基づくアンピシリン耐性ベクターから誘導され、CHベクターはpACYCクロラムフェニコール耐性ベクターから誘導される。Fab発現のために、dAb-CH構築物およびdAb-Cκ構築物をHB2151細胞へと共形質転換し、0.1％グルコース、100μg/mlアンピシリンおよび10μg/mlクロラムフェニコールを含有する2xTY中で増殖させた。
【０４５０】
1.5.4  ヒンジ二量体化
システイン結合形成を介したdAbの二量体化を検討した。ヒトIgGC1ヒンジの改変型である短いアミノ酸配列EPKSGDKTHTCPPCP(配列番号379)をdAbのC末端領域に遺伝子操作して付加した(engineered)。この配列をコードするオリゴリンカーを、先に説明したように合成してアニーリングした。このリンカーを、Xho1およびNot1制限部位を利用して、TAR1-5-19を含有するpEDAベクターにクローニングした。二量体化は、ペリプラズムにおいてその場で(in situ)起こる。
【０４５１】
1.6  発現と精製
1.6.1  発現
最初のスクリーニングのために、先に記載したように、2mlの96ウェルプレートフォーマットで上清を調製した。最初のスクリーニング工程の後に、選択した二量体をさらに分析した。二量体構築物は、TOP10F'細胞またはHB2151細胞を用いて上清タンパク質として発現させた。簡単に説明すると、新しく画線植菌したプレートからの個々のコロニーを、100μg/mlアンピシリンおよび1％グルコースを含む2xTYで37℃一晩増殖させた。この培養物の1/100希釈物を、100μg/mlアンピシリンおよび0.1％グルコースを含む2xTYに接種し、OD600が約0.9となるまで振とうしながら37℃で増殖させた。その後、培養物に1mM IPTGを用いて30℃で一晩誘導をかけた。細胞を遠心分離により除き、上清をプロテインAまたはLアガロースにより精製した。
【０４５２】
Fabおよびシステインヒンジ二量体は、HB2152細胞においてペリプラズムタンパク質として発現させた。一晩の培養物の1/100希釈物を、0.1％グルコースおよび適当な抗生物質を含む2xTYに接種し、その後OD600が約0.9となるまで振とうしながら30℃で増殖させた。次に培養物に1mM IPTGを用いて25℃で3〜4時間誘導をかけた。細胞を遠心分離により回収し、ペレットをペリプラズム調製用バッファー(30mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA、20％スクロース)に再懸濁した。遠心分離の後に、上清を保管し、ペレットを5mM MgSO4に再懸濁した。再度遠心分離にかけて上清を回収し、プールして精製した。
【０４５３】
1.6.2  プロテインA/L精製
プロテインLアガロース(Affitech, Norway)またはプロテインAアガロース(Sigma, UK)からの二量体タンパク質の精製の最適化を検討した。ペリスタルティックポンプを用いてバッチまたはカラム溶出によりタンパク質を溶出させた。３種類のバッファー、すなわち0.1Mリン酸クエン酸バッファーpH2.6、0.2MグリシンpH2.5および0.1MグリシンpH2.5について調べた。最適条件は、ペリスタルティックポンプ条件下で10カラム容量にわたって0.1MグリシンpH2.5を用いることであると決定された。プロテインAからの精製は、ペリスタルティックポンプ条件で0.1MグリシンpH2.5を用いて行った。
【０４５４】
1.6.3  FPLC精製
さらなる精製を、AKTA Explorer 100 システム (Amersham Biosciences Ltd)を用いたFPLC分析により行った。TAR1-5およびTAR1-5-19二量体は、カチオン交換クロマトグラフィー(1ml Resource S - Amersham Biosciences Ltd)を用いて、50mM酢酸バッファーpH4中の0〜1M NaCl濃度勾配溶出により分画した。ヒンジ二量体は、イオン交換(1ml Resource Q Amersham Biosciences Ltd)を用いて、25mM Tris HCl pH8.0中の0〜1M NaCl濃度勾配溶出により精製した。Fabは、サイズ排除クロマトグラフィーにおいてsuperose 12 (Amersham Biosciences Ltd)カラムを、0.05％tweenを含むPBSを0.5ml/分の流量で運転することにより精製した。精製の後に、サンプルをvivaspin 5Kカットオフ濃縮器(Vivascience Ltd)を用いて濃縮した。
【０４５５】
2.0  結果
2.1  TAR1-5二量体
あらゆるライブラリーおよび選択条件を包含するラウンド２選択から6 x 96クローンをピッキングした。上清プレプを調製し、抗原ELISAおよびプロテインL ELISA、BIAcoreならびにレセプターアッセイによりアッセイした。ELISAでは、陽性結合クローンが各選択方法から同定され、3U、5Uおよび7Uライブラリーに分配された。しかし、ガイディングdAbが必ず存在することから、この方法では高親和性結合体と低親和性結合体を識別することはできず、そのためBIAcore分析を行った。
【０４５６】
BIAcore分析は2ml上清を用いて行った。BIAcore分析からは、二量体Koff速度が単量体型TAR1-5と比較して大幅に改善されたことが明らかにされた。単量体Koff速度は10-1Mの範囲であり、対する二量体Koff速度は10-3〜10-4Mの範囲であった。非常に遅いoff速度を有すると見られる16個のクローンを選択し(これらは3U、5UおよびTUライブラリー由来である)、配列決定した。さらに上清を、レセプターアッセイにおいてヒトTNFαを中和する能力について分析した。
【０４５７】
これらのアッセイで中和を示した6個のリード(lead)クローン(下記d1〜d6)を配列決定した。その結果、取得した6個のクローンのうち、第２のdAbは3種類 (dAb1、dAb2およびdAb3)しか存在しなかったが、第２のdAbが２回以上見られる場合にはそれが異なる長さのリンカーと連結されていることが示された。
【０４５８】
TAR1-5 d1: 3U リンカー2nd dAb=dAb1 - 1μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄
TAR1-5 d2: 3U リンカー2nd dAb=dAb2 - 1μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄
TAR1-5 d3: 5U リンカー2nd dAb=dAb2 - 1μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄
TAR1-5 d4: 5U リンカー2nd dAb=dAb3 - 20μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄
TAR1-5 d5: 5U リンカー2nd dAb=dAb1 - 20μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄
TAR1-5 d6: 7U リンカー2nd dAb=dAb1 - R1:1μg/ml Ag イムノチューブ一晩洗浄, 
R2:ビーズ。
【０４５９】
6個のリードクローンをさらに調べた。タンパク質をペリプラズムおよび上清から得て、プロテインLアガロースで精製し、その後細胞アッセイおよびレセプターアッセイで調べた。中和のレベルは変動した(表1)。タンパク質調製のための最適条件を決定した。HB2151細胞から上清タンパク質として産生されるタンパク質の収率が最も高かった(培養物1Lあたり約10mg)。上清をプロテインLアガロースと共に室温で2時間、または4℃で一晩インキュベートした。ビーズをPBS/NaClで洗浄し、ついでペリスタルティックポンプを用いてFPLCカラムに充填した。ビーズを10カラム容量のPBS/NaClで洗浄し、0.1MグリシンpH2.5を用いて溶出した。概して、二量体タンパク質は単量体の後に溶出する。
【０４６０】
TAR1-5 d1〜6二量体はFPLCにより精製した。FPLC精製により３種を回収し、これらをSDS PAGEにより同定した。１種が単量体に対応し、他の２種が異なる大きさの二量体に対応する。２種のうちの片方が大きいのは、C末端タグが存在するためであるかもしれない。これらのタンパク質をレセプターアッセイにより調べた。表1に示すデータは、２種の二量体から得られた最適結果を表す(図11)。
【０４６１】
二量体ペア由来の3種の第2 dAb(すなわちdAb1、dAb2およびdAb3)を、単量体としてクローニングし、ELISAならびに細胞アッセイおよびレセプターアッセイにより調べた。抗原ELISAによると、３種のdAbはいずれもTNFと特異的に結合し、プラスチックまたはBSAとは交差反応しない。単量体の状態では、いずれのdAbも細胞アッセイまたはレセプターアッセイにおいて中和を示さなかった。
【０４６２】
2.1.2  TAR1-5-19二量体
6個のリードクローンにおけるTAR1-5をTAR1-5-19に置換した。細胞アッセイおよびレセプターアッセイにおけるあらゆるTAR1-5-19二量体の分析は、特に断らない限り、全タンパク質(プロテインL精製のみを行った)を用いて行った(表2)。TAR1-5-19 d4およびTAR1-5-19 d3は、細胞アッセイにおいて最良のND50 (〜5nM)を示し、これはレセプターアッセイ結果と一致し、またTAR1-5-19単量体(ND50〜30nM)と比べて改善されている。精製TAR1-5二量体はレセプターアッセイおよび細胞アッセイにおいて変動する結果を示すが、TAR1-5-19二量体はより一定していた。変動は、タンパク質精製中に異なる溶出バッファーを用いた場合に見られた。0.1Mリン酸クエン酸バッファーpH2.6または0.2MグリシンpH2.5を用いる溶出は、プロテインLアガロースから全てのタンパク質を分離するものの、ほとんどの場合に該タンパク質の機能性を低下させた。
【０４６３】
TAR1-5-19 d4を発酵槽で発現させ、カチオン交換FPLCで精製して完全に純粋な二量体を得た。TAR1-5 d4と同様に、３種がFPLC精製により得られ、これは１つの単量体および２つの二量体種に対応する。この二量体をアミノ酸配列決定した。次にTAR1-5-19単量体およびTAR1-5-19 d4をレセプターアッセイで調べたところ、得られたIC50は、単量体についてが30nMであり、二量体についてが8nMであった。TAR1-5-19単量体、TAR1-5-19 d4およびTAR1-5 d4を比較したレセプターアッセイの結果を図10に示す。
【０４６４】
TAR1-5-19ホモ二量体を3U、5Uおよび7Uベクターにて作製し、発現させ、プロテインLで精製した。タンパク質を細胞アッセイおよびレセプターアッセイにより調べ、その結果生じるIC50 (レセプターアッセイの場合)およびND50(細胞アッセイの場合)を決定した(表3、図12)。
【０４６５】
2.2  Fab
TAR1-5およびTAR1-5-19二量体はまた、Fabフォーマットへとクローニングし、発現させ、プロテインLアガロースで精製した。Fabはレセプターアッセイで評価した(表4)。結果は、TAR1-5-19およびTAR1-5二量体の両方について、中和レベルが、それらの由来となった元のGly4Serリンカー二量体と類似することを示す。CHとCκの両方にTAR1-5-19が提示されたTAR1-5-19 Fabを発現させ、プロテインL精製し、レセプターアッセイにおいて評価した。得られたIC50は約1nMであった。
【０４６６】
2.3  TAR1-27二量体
3 x 96クローンを、あらゆるライブラリーと選択条件を包含するラウンド２選択からピッキングした。2ml上清プレプを、ELISAおよびバイオアッセイ分析用に調製した。抗原ELISAからは71個の陽性クローンが得られた。粗上清のレセプターアッセイからは、阻害特性 (TNF結合性0〜60％)を有する42個のクローンが得られた。ほとんどの場合、阻害特性は強力なELISAシグナルと相関した。42個のクローンを配列決定したところ、そのうち39個がユニークな第２のdAb配列を有した。最も強い阻害特性を示した12種の二量体をさらに分析した。
【０４６７】
12種の中和クローンを200ml上清プレプとして発現させ、プロテインLで精製した。これらをプロテインLおよび抗原ELISA、BIAcoreにより、およびレセプターアッセイにおいて評価した。いずれの場合についても強力な陽性ELISAシグナルが得られた。BIAcore分析からは、いずれのクローンも速いonおよびoff速度を有することが明らかになった。off速度は単量体型TAR1-27よりも改善されたが、しかしTAR1-27二量体のoff速度は、先に調べたTAR1-5二量体(Koffは約10-3〜10-4Mの範囲)よりも速かった(Koffは約10-1〜10-2Mの範囲)。精製済み二量体はその安定性が疑われたので、安定性を改善するために、2種のTAR1-27二量体(d2およびd16)の精製において、5％グリセロール、0.5％ Triton X100または0.5％NP40 (Sigma)の添加を含めた。NP40またはTriton X100TMの添加は、精製産物の収率を約2倍改善した。両方の二量体をレセプターアッセイにて評価した。TAR1-27 d2はあらゆる精製条件下で〜30nMのIC50を示した。TAR1-27 d16は安定化剤を使用せずに精製したときには中和作用を示さなかったが、安定化条件下で精製したときには〜50nMのIC50を示した。さらなる分析は行わなかった。
【０４６８】
2.4  TAR2-5二量体
あらゆるライブラリーと選択条件を包含する第２ラウンド選択から、3 x 96クローンをピッキングした。2ml上清プレプを分析用に調製した。プロテインAおよび抗原ELISAを各プレートについて実施した。BIAcoreを用いて、良好なoff速度(Koff範囲10-2〜10-3M)を有する30個の興味深いクローンを同定した。クローンを配列決定し、13個のユニークな二量体を配列解析から同定した。
【表４】
2008515420.tif 000006
【０４６９】
*注記。二量体2と二量体3は同じ第２dAb (dAb2と呼ぶ)を有するが、しかしリンカー長さ(d2 = (Gly4Ser)3、d3 = (Gly4Ser)3)は異なる。dAb1は二量体1、5および6に対するパートナーdAbである。dAb3は二量体4に対するパートナーdAbである。パートナーdAbはいずれも単独では中和を示さない。FPLC精製は特に断らない限りカチオン交換により行う。これらのアッセイにおいて、FPLCにより得られた各二量体についての最適な二量体種を決定した。
【表５】
2008515420.tif 000007
【表６】
2008515420.tif 000008
【表７】
2008515420.tif 000009
【０４７０】
実施例７  末端システイン連結によるdAb二量体化
概要
dAb二量体化のために、遊離のシステインをタンパク質のC末端に導入した。発現させると、該タンパク質は二量体を形成し、これは２段階精製法により精製することができる。
【０４７１】
TAR1-5-19CYS二量体のPCR構築
dAb三量体を記載する実施例８を参照されたい。三量体プロトコルは単量体、二量体および三量体の混合物を生じる。
【０４７２】
TAR1-5-19CYS二量体の発現と精製
二量体は、実施例８に示すように、プロテインLアガロースで捕捉することにより培養物の上清から精製した。
【０４７３】
TAR1-5-19CYS二量体からのTAR1-5-19CYS単量体の分離
カチオン交換分離の前に、単量体/二量体の混合サンプルを、PD-10カラム(Amersham Pharmacia)を製造業者の説明書に従って使用し、50 mM酢酸ナトリウムバッファーpH 4.0にバッファー交換した。次にサンプルを、50 mM酢酸ナトリウムpH 4.0で予め平衡化しておいた1mL Resource Sカチオン交換カラム (Amersham Pharmacia)にアプライした。単量体および二量体は、50 mM酢酸ナトリウムpH 4.0中で次の塩濃度勾配を用いて分離した：
15カラム容量にわたって150〜200 mM 塩化ナトリウム
10カラム容量にわたって200〜450 mM 塩化ナトリウム
15カラム容量にわたって450〜1000 mM 塩化ナトリウム。
【０４７４】
二量体のみを含有する画分をSDS-PAGEを用いて特定し、その後プールして、1/5容量の1M Tris pH 8.0を添加することによりpH 8に上昇させた。
【０４７５】
in vitro機能的結合アッセイ: TNFレセプターアッセイおよび細胞アッセイ
ヒトTNFαに対する二量体の親和性は、TNFレセプターアッセイおよび細胞アッセイを用いて決定した。レセプターアッセイにおけるIC50は約0.3〜0.8 nMであり、細胞アッセイにおけるND50は約3〜8 nMであった。
【０４７６】
他の可能なTAR1-5-19CYS二量体フォーマット
PEG二量体およびカスタム合成マレイミド二量体
Nektar (Shearwater)はある範囲のビ-マレイミドPEG [mPEG2-(MAL)2またはmPEG-(MAL)2]を提供しており、これは単量体を二量体（小さいリンカーがdAb同士を分離し、両方のdAbが5〜40 kDaの範囲のPEGに連結される）としてフォーマット化することを可能にする。5kDa mPEG-(MAL)2 (すなわち、[TAR1-5-19]-Cys-マレイミド-PEG x 2、この二量体ではマレイミド同士が一緒に連結される)はTNFレセプターアッセイにおいて〜1〜3 nMの親和性を有することが示された。また、この二量体はTMEA(トリス[2-マレイミドエチル]アミン) (Pierce Biotechnology)または他の二官能性リンカーを用いて作製することも可能である。
【０４７７】
ジスルフィド二量体は、化学的カップリング法において2,2’-ジチオジピリジン(Sigma Aldrich)および還元型単量体を用いることにより作製することも可能である。
【０４７８】
dAbのC末端へのポリペプチドリンカーまたはヒンジの付加
小さいリンカーである(Gly4Ser)n (式中n=1〜10、例えば1、2、3、4、5、6もしくは7)、または免疫グロブリン(例えば、IgGヒンジ領域またはランダムペプチド配列(例えばランダムペプチド配列のライブラリーから選択したもの))のいずれかを、dAbと末端システイン残基の間に遺伝子操作して付加することができる。次にこれを使用して、上記のように二量体を作製することができる。
【０４７９】
実施例８  dAb三量体化
概要
dAb三量体化のためには、タンパク質のC末端に遊離のシステインが必要である。システイン残基を一旦還元して遊離チオールとすると、その後これを用いてタンパク質を三量体型マレイミド分子(例えばTMEA(トリス[2-マレイミドエチル]アミン))と特異的にカップリングさせることができる。
【０４８０】
TAR1-5-19CYSのPCR構築
次のオリゴヌクレオチドを使用して、TAR1-5-19を特異的にPCRにかけて、クローニング用のSalIおよびBamHI部位を有するようにし、またC末端システイン残基を導入した：
2008515420.tif 000010
【０４８１】
(*TAR1-5-19CYS配列の開始位置; TAR1-5-19CYSアミノ酸配列(配列番号293; TAR1-5-19CYS ヌクレオチド配列 (配列番号294、コード鎖; 配列番号295、非コード鎖))
フォワードプライマー
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
(配列番号296)
リバースプライマー
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’
(配列番号297)
PCR反応 (50μL容量)は次のように設定した。すなわち、200μM dNTP、0.4μMの各プライマー、5μLの10x PfuTurbo バッファー(Stratagene)、100 ngの鋳型プラスミド(TAR1-5-19をコードする)、1μLのPfuTurbo酵素(Stratagene)、そして滅菌水を用いて容量を50μLに調整する。次のPCR条件を使用した:最初の変性ステップを94℃で2分行い、次に94℃で30秒、64℃で30秒および72℃で30秒を25サイクル行う。最後の伸長ステップも追加して72℃で5分行った。PCR産物を精製し、SalIおよびBamHIで消化し、同じ制限酵素で切断済みのベクターに連結した。クローンが正しいものであるかはDNA配列決定により確認した。
【０４８２】
TAR1-5-19CYSの発現と精製
TAR1-5-19CYSベクターを、BL21 (DE3) pLysS化学的コンピテント細胞(Novagen)に、製造業者のプロトコルに従い形質転換した。dAbプラスミドを保有する細胞は、100μg/mL カルベニシリンおよび37 μg/mL クロラムフェニコールを用いて選択した。培養のために、500 mLのterrific broth培地(Sigma-Aldrich)、100μg/mLカルベニシリンおよび37 μg/mLクロラムフェニコールを含有する2Lのバッフル付きフラスコを準備した。培養物を30℃、200rpmでO.D.600が1〜1.5となるまで増殖させ、次いで1mM IPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド, Melford Laboratoriesより)で誘導をかけた。dAbの発現を30℃で12〜16時間継続させた。dAbの大部分は培地中に存在することが見出された。そこで、細胞を遠心分離(8,000xgで30分)により培地から分離し、その後dAbを精製するために上清を使用した。上清のリットル当たり30 mLのプロテインLアガロース (Affitech)を添加し、２時間撹拌しながらdAbをバッチ結合させた。次に樹脂をさらに１時間重力により沈ませ、その後上清を吸い上げて移した。次にアガロースをXK 50カラム (Amersham Phamacia)に充填し、10カラム容量のPBSで洗浄した。結合したdAbを100 mMグリシンpH 2.0で溶出し、その後タンパク質含有画分を1/5容量の1 M Tris pH 8.0の添加により中和した。培養上清のリットル当たり20mgの純粋なタンパク質が単離され、これは50:50の比率の単量体と二量体を含有した。
【０４８３】
TAR1-5-19CYSの三量体化
2.5 mlの100μM TAR1-5-19CYSを5 mM ジチオトレイトールで還元し、20分間室温で静置した。次にサンプルを、PD-10カラム(Amersham Pharmacia)を用いてバッファー交換した。カラムは、製造業者のガイドラインに従い、5 mM EDTA、50 mMリン酸ナトリウムpH 6.5であらかじめ平衡化し、サンプルをアプライし、溶出させた。サンプルを必要となるまで氷上に置いた。TMEA (トリス[2-マレイミドエチル]アミン)はPierce Biotechnologyから購入した。TMEAの20 mMストック溶液を100％DMSO (ジメチルスルホキシド)で調製した。3:1 (dAb:TMEAのモル比)を超えるTMEAの濃度は、タンパク質の急激な沈降と架橋を引き起こすことが見出された。また、沈降と架橋の速度はpHが増加するにつれて大きくなった。従って、100μMの還元済みTAR1-5-19CYSを使用して、タンパク質を三量体化させるために25μM TMEAを添加し、反応を室温で２時間進行させた。グリセロールまたはエチレングリコールのような添加物を20％(v/v)まで添加すると、カップリング反応の進行に伴う三量体の沈降が著しく低減されることが見出された。カップリング後、SDS-PAGE分析は、溶液中の単量体、二量体および三量体の存在を示した。
【０４８４】
三量体型TAR1-5-19CYSの精製
TMEA-TAR1-5-19cys反応物のmL当たり40μLの40％氷酢酸を添加してpHを〜4へと低下させた。次にサンプルを、50 mM酢酸ナトリウムpH 4.0で予め平衡化しておいた1mL Resource Sカチオン交換カラム(Amersham Pharmacia)にアプライした。二量体と三量体は、30カラム容量にわたって340〜450 mM塩化ナトリウム、50 mM酢酸ナトリウムpH 4.0の塩濃度勾配を用いることにより、部分的に分離された。三量体のみを含有する画分をSDS-PAGEを用いて同定し、プールして、その後1/5容量の1M Tris pH 8.0を添加することによりpH 8へと上昇させた。濃縮工程(5KカットオフVivaスピン濃縮器; Vivascienceを使用)中の三量体の沈降を防ぐために、10％グリセロールをサンプルに添加した。
【０４８５】
in vitro機能的結合アッセイ: TNF レセプターアッセイおよび細胞アッセイ
ヒトTNFαに対する三量体の親和性を、TNFレセプターアッセイおよび細胞アッセイを用いて測定した。レセプターアッセイにおいてIC50は0.3nMであり、細胞アッセイにおいてND50は3〜10nM(例えば3nM)であった。
【０４８６】
他の可能なTAR1-5-19CYS三量体フォーマット
TAR1-5-19CYSはまた、次の試薬を用いて三量体へとフォーマット化することができる。
【０４８７】
PEG三量体およびカスタム合成マレイミド三量体
Nektar (Shearwater)はある範囲のマルチアームPEGを提供するが、これらはPEGの末端において化学的に修飾することができる。従って、各アームの末端にマレイミド官能基を有するPEG三量体を用いることにより、上に概説したTMEAを用いる方法と同様に、dAbを三量体化することができる。PEGはまた、三量体の溶解度を向上させ、それにより凝集の問題を防止するという利点を有しうる。このことから、各dAbがマレイミド官能基に連結されたC末端システイン残基を有し、該マレイミド官能基がPEG三量体に連結した、dAb三量体が作製可能である。
【０４８８】
dAbのC末端へのポリペプチドリンカーまたはヒンジの付加
小さいリンカーである、(Gly4Ser)n (式中n=1〜10、例えば1、2、3、4、5、6もしくは7)、または免疫グロブリン(例えば、IgGヒンジ領域またはランダムペプチド配列(例えばランダムペプチド配列のライブラリーから選択したもの))のいずれかを、dAbと末端システイン残基の間に遺伝子操作して付加することができる。多量体(例えば二量体または三量体)を作製するために用いる場合、これはやはり、個々の単量体の間に、より高度の柔軟性と距離を導入し、標的(例えばヒトTNFαのようなマルチサブユニット標的)への結合特性を向上させうる。
【０４８９】
実施例９  ヒト血清アルブミン(HSA)およびマウス血清アルブミン(MSA)に対する単一ドメイン抗体(dAb)のコレクションの選択
この実施例は、血清アルブミンに対する単一ドメイン抗体(dAb)の作製方法を説明する。マウス血清アルブミン(MSA)およびヒト血清アルブミン(HSA)の両方に対するdAbの選択を記載する。３種のヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーをこの実験に使用し、それぞれのライブラリーは、相補性決定領域(CDR1、CDR2およびCDR3)に組み込まれたNNKコドンによりコードされる側鎖多様性を有するVH(図13参照: V3-23/DP47およびJH4bに基づくダミーVHの配列)またはVκ(図15参照: o12/o2/DPK9およびJk1に基づくダミーVκの配列)に対する単一ヒトフレームワークに基づく。
【０４９０】
ライブラリー1 (VH):
多様性のある位置:  H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98
ライブラリー規模:  6.2 x 109
ライブラリー2 (VH): 
多様性のある位置:  H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b
ライブラリー規模:  4.3 x 109
ライブラリー3 (Vκ): 
多様性のある位置:  L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96
ライブラリー規模:  2 x 109。
【０４９１】
VH およびVκライブラリーは、ジェネリックリガンドであるプロテインAおよびプロテインLとの結合についてそれぞれ予備選択されており、そのため未選択ライブラリーのクローンの大半は機能性である。上に示したライブラリー規模は、予備選択後の規模に対応する。
【０４９２】
それぞれのライブラリーを別々に使用して、血清アルブミンに対する２ラウンドの選択を行った。各選択について、イムノチューブ(nunc)に抗原を4mlのPBS中で100μg/mlの濃度でコーティングした。選択の第１ラウンドでは、３種のライブラリーをそれぞれ、HSA (Sigma)およびMSA (Sigma)に対して別々にパンニングした。選択の第２ラウンドでは、６回の第１ラウンド選択のそれぞれからのファージを、(i)再度同じ抗原に対して(例えば第1ラウンドMSA、第2ラウンドMSA)および(ii)逆の抗原(例えば第1ラウンドMSA、第2ラウンドHSA)に対してパンニングし、合計12の第２ラウンド選択を行った。それぞれの場合に、第２ラウンドの選択後、48個のクローンをHSAおよびMSAへの結合について試験した。可溶性dAb断片は、Harrisonら, Methods Enzymol. 1996;267:83-109にscFvフラグメントについて記載されるように作製し、標準ELISAプロトコル(Hoogenboomら. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133)を用いたが、ただしブロッキングバッファーとしては2％tween PBSを使用し、結合したdAbはプロテインL-HRP (Sigma) (Vκに対して)およびプロテインA-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (VHに対して)を用いて検出した。
【０４９３】
バックグランドよりも高いシグナルを示し、MSA、HSAまたはその両方への結合を示したdAbは、不溶性型ELISAにおいてプラスチックのみへの結合について試験したが、いずれも血清アルブミンに特異的であった。次にクローンを配列決定し(下の表を参照)、21種のユニークなdAb配列が同定されたことが明らかになった。選択したVκ dAbクローン同士の最小類似性(アミノ酸レベルで)は86.25％であった((69/80)x100; すべての多様化された残基が異なる、例えばクローン24と34の場合の結果)。選択したVH dAbクローン同士の最小類似性は94％((127/136)x100)であった。
【０４９４】
次に、血清アルブミン結合性dAbを、溶液からビオチン化抗原を捕捉する能力について試験した。ELISAプロトコル(上記のとおり)を用いたが、ただしELISAプレートを1μg/ml プロテインL(Vκクローンに対して)および1μg/ml プロテインA(VH クローンに対して)でコーティングした。プロトコルに記載のようにして可溶性dAbを溶液から捕捉し、検出はビオチン化MSAまたはHSAおよびストレプトアビジンHRPを用いて行った。ビオチン化MSAおよびHSAを製造業者の説明書に従い調製し、血清アルブミン分子当たり平均2個のビオチンを付加することを目的とした。ELISAにおいて溶液からビオチン化MSAを捕捉する24個のクローンを同定した。これらのクローンのうちの２個(クローン2および38、下記)はビオチン化HSAをも捕捉した。次に、dAbをCM5 biacoreチップ上にコーティングしたMSAと結合する能力について試験した。８個のクローンがbiacoreでMSAと結合することが見出された。
【表８】
2008515420.tif 000011
【０４９５】
2008515420.tif 000012
【０４９６】
すべての場合に、フレームワークは、対応するダミー配列中のフレームワークと同一であり、CDR中の多様性は上の表に示したとおりである。
【０４９７】
biacoreでMSAと結合した８個のクローンのうち、大腸菌(E. coli)中で高度に発現される２個のクローン(クローンMSA16およびMSA26)をさらに研究するために選択した(実施例１０を参照されたい)。MSA16および26についての完全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図16に示す。
【０４９８】
実施例10  MSA結合性dAbであるMSA16およびMSA26の親和性とマウスにおける血清半減期の測定
dAb MSA16およびMSA26を大腸菌(E. coli)のペリプラズムに発現させ、プロテインL-アガロースアフィニティー樹脂(Affitech, Norway)へのバッチ吸着と、その後のグリシンpH 2.2での溶出を利用して精製した。その後、精製dAbを阻害biacoreにより分析してKdを決定した。手短に説明すると、精製済みMSA16およびMSA26を試験して、高密度のMSAをコーティングしたbiacore CM5チップ上で200RUの応答を達成するために必要なdAb濃度を決定した。一旦必要なdAb濃度を決定したならば、予想されるKdの付近の濃度範囲のMSA抗原をdAbと予備混合し、一晩インキュベートした。次に、各予備混合物におけるdAbのMSAコーティングbiacoreチップへの結合を、30μl/分という高流量で測定した。得られた曲線を用いてKlotzプロットを作成し、そこから得られた推定Kd はMSA16についてが200nM、MSA 26についてが70nMであった(図17AおよびB)。
【０４９９】
次に、クローンMSA16およびMSA26を、HAタグ(核酸配列: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA (配列番号 373)およびアミノ酸配列: YPYDVPDYA (配列番号374))を有する発現ベクターにクローニングし、2〜10 mgの量を大腸菌(E. coli)で発現させ、上清からプロテインL-アガロースアフィニティー樹脂(Affitech, Norway)を用いて精製し、グリシンpH2.2で溶出させた。dAbのマウスにおける血清半減期を決定した。MSA26およびMSA16を約1.5mg/kgで１回の静脈(i.v.)注射としてCD1マウスに投与した。血清レベルの分析は、ヤギ抗HA(Abcam, UK)捕捉およびプロテインL-HRP(invitrogen)検出ELISA(4％Marvelでブロッキング)により行った。洗浄は0.05％tween PBSを用いて行った。既知濃度のdAbの標準曲線を、1xマウス血清の存在下で作成し、試験サンプルとの比較可能性を確実にした。2コンパートメントモデルを用いたモデル化は、MSA-26のt1/2αが0.16時間であり、t1/2βが14.5時間であり、曲線の下の面積(AUC)が465hr.mg/ml(データ未掲載)であること、およびMSA-16のt1/2αが0.98時間であり、t1/2βが36.5時間であり、AUCが913hr.mg/ml(図18)であることを示した。いずれの抗MSAクローンも、HEL4(抗ニワトリ卵白リゾチームdAb)(そのt1/2αは0.06時間であり、t1/2βは0.34時間である)と比較してかなり長い半減期を有していた。
【０５００】
実施例11  VH-VHおよびVκ-Vκ二重特異性Fab様フラグメントの作製
この実施例は、VH-VHおよびVκ-Vκ二重特異性抗体フラグメントをFab様フラグメントとして作製する方法について説明する。記載する各Fab様フラグメントを構築する前に、まず所望の標的に結合するdAbを、実施例９に記載のライブラリーと類似のdAbライブラリーから選択した。ニワトリ卵リゾチーム(Sigma)に結合するVH dAbであるHEL4を単離し、また、TNFαレセプター(R and D systems)に結合する第２のVH dAb (TAR2h-5)も単離した。これらの配列は配列表に記載した。TNFαに結合するVκ dAb (TAR1-5-19)は、選択および親和性成熟(affinity maturation)により単離し、その配列も配列表に記載した。実施例９に記載の第２Vκ dAb (MSA 26) (その配列は図17Bに示す）もまたこれらの実験に使用した。
【０５０１】
上記４種のdAbを含有する発現ベクター由来のDNAを酵素SalIとNotIで消化してdAbをコードするDNAを切り出した。消化物をアガロースゲルに流し、バンドを切り出し、Qiagenゲル精製キット(Qiagen, UK)を用いてゲル精製を行うことにより、予想される大きさ(300〜400bp)のバンドを精製した。次にdAbをコードするDNAを、下の表に示すように、CHまたはCκベクター(図8および9)のいずれかに挿入した。
【表９】
2008515420.tif 000013
【０５０２】
VH CHおよびVH Cκ構築物をHB2151細胞に共形質転換した。これとは別に、Vκ CHおよびVκ Cκ構築物をHB2151細胞に共形質転換した。各共形質転換細胞株の培養物を (CHおよびCκプラスミドの両方についての抗生物質選択を維持するために5％グルコース、10μg/ml クロラムフェニコールおよび100μg/ml アンピシリンを含有する2xTy中で) 一晩増殖させた。一晩増殖させた培養物を用いて新鮮な培地(2xTy、10μg/mlクロラムフェニコールおよび100μg/mlアンピシリン)に接種し、OD 0.7〜0.9まで増殖させてからIPTGを添加して誘導をかけ、そのCHおよびCκ構築物を発現させた。次に発現したFab様フラグメントを、ペリプラズムから、プロテインA精製(共形質転換したVH CH およびVH Cκについて)およびMSAアフィニティー樹脂精製(共形質転換したVκ CH およびVκ Cκについて)により精製した。
【０５０３】
VH-VH 二重特異性Fab様フラグメント
VH CHおよびVH Cκ二重特異性Fab様フラグメントの発現は、該タンパク質をゲルに流すことにより試験した。ゲルをブロッティングした後、Fabフラグメントについて期待される大きさのバンドを、mycタグおよびflagタグによるウェスタンブロットのどちらからも検出することができた。このことはFab様フラグメントのVH CHおよびVH Cκ部分が両方とも存在することを示している。次に、二重特異性Fab様フラグメントの２つの部分が同じFab様フラグメント中に存在するか否かを確認するために、ELISAプレートを、ウェル当たり100μlのニワトリ卵リゾチーム(HEL)(重炭酸ナトリウムバッファー中で3 mg/ml)を用いて4℃で一晩コーティングした。次にプレートを2％tween PBSで(実施例１に記載のように)ブロッキングし、その後VH CH /VH Cκ二重特異性Fab様フラグメントと共にインキュベートした。二重特異性Fab様フラグメントのHELへの結合の検出は、9e10 (mycタグに結合するモノクローナル抗体、Roche)および抗マウスIgG-HRP (Amersham Pharmacia Biotech)を用いて非コグネイト鎖を介して行った。VH CH /VH Cκ二重特異性Fab様フラグメントのシグナルは0.154であり、対する単独で発現されたVH Cκ鎖のバックグラウンドシグナルは0.069であった。このことは、Fab様フラグメントが標的抗原に対する結合特異性を有することを実証する。
【０５０４】
Vκ-Vκ二重特異性Fab様フラグメント
共形質転換されたVκ CH およびVκ Cκ 二重特異性Fab様フラグメントをMSAアフィニティー樹脂で精製した後、得られたタンパク質を用いて1μg/ml TNFαコーティング済みのELISAプレートおよび10μg/ml MSAコーティング済みのELISAプレートをプロービングした。予想通り、両方のELISAプレートについて、プロテインL-HRPで検出したときに、バックグラウンドを上回るシグナルが得られた(データ未掲載)。このことは、MSAに結合することのできる (それゆえMSAアフィニティーカラムで精製された) タンパク質の画分が、その後行ったELISAにおいてTNFαにも結合することができたことを示し、この抗体フラグメントの二重特異性が確認された。次にこのタンパク質画分を用いて２つの実験を行った。最初に、1μg/ml TNFαでコーティングしたELISAプレートを、二重特異性Vκ CH およびVκ Cκ Fab様フラグメントを用いて、また、ELISAにおいて類似のシグナルを示すように計算された濃度の対照TNFα結合性dAbを用いてプロービングした。二重特異性Fab様フラグメントおよび対照dAbの両方を使用して、2mg/ml MSAの存在下および不在下でELISAプレートをプロービングした。二重特異性Fab様フラグメントのウェルのシグナルは50％以上減少したがdAbのウェルのシグナルはまったく減少しなかった(図19aを参照のこと)。さらに、この同じタンパク質を用いてMSAの存在下または不在下でレセプターアッセイを行い、MSAによる競合も示した(図19cを参照されたい)。このことは、MSAの二重特異性Fab様フラグメントへの結合が、TNFαへの結合と競合することを実証する。
【０５０５】
実施例12  マウス血清アルブミンとTNFαに対する特異的を有するVκ-Vκ二重特異性cys結合型Fab様フラグメントの作製
この実施例では、マウス血清アルブミンとTNFαの両方に対して特異的な二重特異性抗体フラグメントを、ジスルフィド結合を介した化学的カップリングにより作製する方法について説明する。MSA16 (実施例１より)およびTAR1-5-19 dAbの両方を、C末端システインを有しかつタグのないpET系ベクターに再度クローニングした。２種のdAbを4〜10 mgのレベルで発現させ、プロテインL-アガロースアフィニティー樹脂(Affitiech, Norway)を用いて上清から精製した。システインタグ付きdAbを次にジチオトレイトールで還元した。その後TAR1-5-19 dAbをジチオピリジンとカップリングさせて、ジスルフィド結合の再形成(その結果PEP 1-5-19ホモ二量体が形成される)をブロッキングした。次に２種の異なるdAbをpH 6.5で混合して、ジスルフィド結合の形成およびTAR1-5-19、MSA16 cys結合型ヘテロ二量体の生成を促進させた。２種の異なるタンパク質のコンジュゲートを生成するためのこの方法は、Kingら (King TP, Li Y  Kochoumian L Biochemistry. 1978 vol17:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation) によって最初に記載された方法であった。ヘテロ二量体はカチオン交換により単量体のものから分離した。分離は、SDSゲル上の予想される大きさのバンドの存在により確認した。得られたヘテロ二量体をTNFレセプターアッセイで試験したところ、TNFを中和するIC50が約18 nMであることが見出された。次に、レセプターアッセイを、一定濃度のヘテロ二量体(18nM)および希釈系列のMSAとHSAを用いて繰り返した。ある範囲までの濃度(最大2 mg/ml)のHSAの存在は、TNFαを阻害する二量体の能力を減少させなかった。しかしながらMSAの添加は、TNFαを阻害する二量体の能力を用量依存的に減少させた(図20)。このことは、MSAとTNFαがcys結合型TAR1-5-19,MSA16二量体への結合について競合することを実証する。
【０５０６】
データ要約
上の実施例に記載の実験から得られたデータを付録４にまとめて示す。
【０５０７】
実施例13
抗マウスTNFR1 dAbおよび抗ヒトTNFR1 dAbの活性
【表１０】
2008515420.tif 000014
【表１１】
2008515420.tif 000015
【０５０８】
MRC-5 IL-8放出アッセイ
ヒトTNFR1に結合する特定のdAbの活性を次のMRC-5細胞アッセイにおいて評価した。このアッセイは、MRC-5細胞におけるTNFによるIL-8分泌の誘導に基づき、Alceson, L.ら Journal of Biological Chemistry 271:30517-30523 (1996)に記載の方法(HUVECにおけるIL-1によるIL-8誘導を記載する)から応用したものである。dAbの活性は、HUVEC細胞株の代わりにMRC-5細胞を用いてヒトTNFαによるIL-8誘導を評価することによりアッセイした。手短に説明すると、MRC-5細胞をマイクロタイタープレートに播種し、プレートにdAbとヒトTNFα(300 pg/ml)を添加して一晩インキュベートした。インキュベート後、培養上清を吸引し、上清中のIL-8濃度をサンドイッチELISA (R&D Systems)により測定した。抗TNFR1 dAb活性は、TNFαのみを添加してインキュベートした対照ウェルと比較して、上清へのIL-8分泌の減少をもたらした。
【０５０９】
実施例14  マウス敗血症性ショックモデル
抗TNFR1 dAbのin vivo効力は、敗血症性ショック症候群の広く確立された実験モデル (Rotheら, Circulatory Shock 44:51-56, (1995))により評価した。このモデルにおけるLPS誘発死は、TNFR-1(p55)活性化に依存する。このモデルでは、マウスをD-ガラクトサミン(D-GaIN)を用いてLPSの毒性に対して感作した。この研究において野生型動物のLPS致死量は約10 ngであった。
【０５１０】
LPS (サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis), Sigma, USA)およびD-ガラクトサミン(D-GaIN, Sigma, USA)を腹腔内注射した。D-Ga1N-感作(10 mg/マウス)対照マウスは、LPS (10 ng)を用いたチャレンジから18時間以内に死亡した。非感作マウスの死亡をチャレンジ後１日に渡り記録した。
【０５１１】
マウスに、マウスTNFR1およびマウス血清アルブミンに結合する二重特異性リガンド (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16; TAR7m-16は本明細書においてMSA16ともいう)、またはENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)を、LPS投与の４時間前に、腹腔内注射により投与した(表12を参照されたい)。生存は48時間に渡り、4〜6時間の間隔でモニタリングした。抗マウスTNFR1 dAbの効力は生存率により実証された。
【表１２】
2008515420.tif 000016
【０５１２】
TAR2m-21-23 3U TAR7m-16は、マウスTNFR1に結合するdAbと、ペプチドリンカーを介して連結された、マウス血清アルブミンに結合するdAbとを含有する二重特異性リガンドである。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16をコードするヌクレオチド配列および二重特異性リガンドのアミノ酸配列を、それぞれ下に配列番号375および配列番号376として示す。
【０５１３】
2008515420.tif 000017
【０５１４】
TAR2m-21-23 3U TAR7m-16処置群における生存体の存在は、抗TNFR1 dAbがin vivoで該レセプターの活性を阻害するのに有効であることを実証し、これらの結果からはその作用が用量依存的であることが示された。その上、TAR2m-21-23 3U TAR7m-16処置の効力は、ENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)の効力と比較して優っていた。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16のみを施した動物(5群、LPSチャレンジなし)の生存率はまた、TAR2m-21-23 3U TAR7m-16が有毒ではなく、レセプター架橋結合によりin vivoでレセプターに対しアゴニスト作用をもたないことを実証した。
【０５１５】
さらなる研究から、TNFαの不在下では抗TNFR1 dAbがTNFR1に対しアゴニスト作用をもたないことが確認された。L929細胞を、ある濃度範囲のTAR2m-21-23単量体、市販の抗myc抗体(9E10)と架橋したTAR2m-21-23単量体、TAR2m-21-23 3U TAR7m-16またはTAR2m-21-23 40K PEGのいずれかを含有する培地で培養した。抗myc抗体により架橋されたTAR2m-21-23単量体については、dAbと抗体を2:1の比で混合し、培養に先だって室温で１時間プレインキュベートすることにより、in vivo免疫架橋の影響をシミュレートした。TAR2m-21-23単量体を3000 nMの濃度で、L929細胞と共にインキュベートした。TAR2m-21-23単量体および抗Myc抗体は、dAb濃度3000 nMでインキュベートした。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16は、25 nM、83.3 nM、250 nM、833 nMおよび2500 nMの濃度で、細胞と共にインキュベートした。TAR2m-21-23 40K PEGは、158.25 nM、527.5 nM、1582.5 nM、5275 nMおよび15825 nMの濃度で細胞と共にインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞生存率をL929細胞の細胞毒性アッセイについて記載したように評価した。これらの結果からは、様々な量のdAbとのインキュベーションが、培養物中の非生存細胞数の増加をもたらさないことが明らかになった。L929細胞と10 nM、1 nMおよび0.1 nMの市販の抗TNFR1 IgG抗体とのインキュベーションは、非生存細胞の用量依存的増加をもたらし、そのことによりTNFR1仲介アゴニズム(agonism)に対するこれらの細胞の感受性が実証された(図26)。
【０５１６】
実施例15  慢性炎症性疾患のモデル
A.  マウスコラーゲン誘発型関節炎モデル
DBA/1マウスに、Arthrogen-CIAアジュバントとArthrogen-CIAコラーゲンのエマルジョン(MD-biosciences)を１回注射した。21日目に、関節炎スコアの高い動物を実験群から除き、残りの動物を、オスとメスの動物数を等しくして10の群に分けた。21日目から、生理食塩水、ENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)またはTAR2m-21-23 40k PEGのいずれかの腹腔内注射による処置を開始し、28日間継続した。臨床関節炎スコアを0〜4のスケールとして、動物の四肢それぞれについて測定した。正常の肢についてはスコア0を割り当て、複数の関節が関与した最大限に炎症を起こした肢にスコア4を割り当てた。
【０５１７】
四肢の関節炎スコアの合計が、最大値の16から、(a) 14-15、(b) 12-15、(c) 10-15、(d) 9-15、(e) 7-15、(f) 5-15、(g) 3-15、または(h) 1-15へと減少することは、このモデルにおいて有利な効果とされる。得られうる有利な効果は、四肢の関節炎スコアの合計値が0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15となる場合である。未処置の対照群と比べて、関節炎の発症が遅延されることも、このモデルにおける有利な効果である。
【０５１８】
臨床スコアは、TAR2m-21-23 40k PEGを用いた処置が、生理食塩水対照と比べたときに、関節炎の発症の抑制に非常に好ましい影響を及ぼし、その上、TAR2m-21-23 40k PEG処置は、ENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)と比較して優っていることを明確に実証した。このことは、慢性炎症性疾患モデルの治療において、TNFR1の阻害が有効であることの初めての実証である。
【０５１９】
B.  IBDおよび関節炎のマウスΔAREモデル
TNF mRNAの3’ AU-リッチエレメント(ARE)に標的化された欠失を有するマウス(TnfΔARE マウスという)は、TNFを過剰生成し、病理組織学的にクローン病に似た炎症性腸疾患を発症する(Kontoyiannisら, J Exp Med 196:1563-74 (2002).)。こうしたマウスにおいて、クローン様疾患は、4〜8週齢で発症し、動物は慢性関節リウマチの臨床的徴候をも示す。
【０５２０】
マウスTNFR-1に結合するdAbを、TnfΔARE マウスにおけるクローン様病理および関節炎の抑制効力について評価した。ENBREL(登録商標)(entarecept; Immunex Corporation)を陽性コントロールとして使用した。薬剤は表13に示す用量と投与計画に従い、腹腔内注射により投与した。
【０５２１】
調べたdAbは次のとおりである:
1)  １つの40 kD PEG部分でPEG化されたTAR2m-21-23;
2)  マウスTNFR-1およびマウス血清アルブミンに結合する二重特異性TAR2m-21-23 3U TAR7m-16。
【表１３】
2008515420.tif 000018
【０５２２】
投与期間の終わりに、マウスを犠牲にして遠位回腸と近位結腸を分析のために摘出した。
【０５２３】
組織学的分析のために、組織サンプルを切片にしてヘマトキシリンとエオシンで染色し、急性および慢性炎症を半定量的スコアリングシステムを用いて評価する。スコアは次のように割り当てる：急性炎症スコア0 = 強拡大視野当たり0〜1個の多形核(PMN)細胞(PMN/hpf); 1 ＝ 粘膜内に2〜10個のPMN/hpf; 2 ＝ 粘膜内に11〜20個のPMN/hpf; 3 ＝ 粘膜内に21〜30個のPMN/hpfまたは粘膜筋板の下に拡がった11〜20個のPMN/hpf; 4 ＝ 粘膜内に＞30個のPMN/hpfまたは粘膜筋板の下に拡がった＞20個のPMN/hpf; 慢性炎症スコア0 ＝ 粘膜内にhpf当たり0〜10個の単核白血球(ML) (ML/hpf); 1 ＝ 粘膜内に11〜20個のML/hpf; 2 ＝ 粘膜内に21〜30個のML/hpfまたは粘膜筋板の下に拡がった11〜20個のML/hpf; 3 ＝粘膜または濾胞過形成内に31〜40個のML/hpf;および4 ＝ 粘膜内に＞40個のML/hpfまたは粘膜筋板もしくは濾胞過形成の下に拡がった＞30個のML/hpf。
【０５２４】
関節炎のマクロな表現型徴候を、次のシステムに従い毎週スコアリングした：0 ＝ 関節炎なし(正常な外観と湾曲部); 1 ＝ 軽度の関節炎(関節歪曲); 2 ＝ 中程度の関節炎(腫れ、関節変形); 3 ＝ 重症の関節炎(重い障害のある動作)。
【０５２５】
TAR2m-21-23 dAbは、関節炎のΔAREマウスモデルにおいて、40 kD PEG化単量体(TAR2m21-23 40 kD PEG)としておよび二重特異性抗TNFR1/抗SAフォーマット (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16)として、良好なin vivo効力を示した。9週目に、TAR2m-21-23およびTAR2m-21-23 3U TAR7m-16処理群の両方の平均関節炎スコアは0.4未満であった。対照的に、生理食塩水対照群は中程度から重症の関節炎を示し、このときの平均関節炎スコアは＞1.0であった。ENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)処置群（週２回投与したTAR2m-21-23およびTAR2m-21-23 3U TAR7m-16に対して、週３回投与した）は、その平均スコアが0.5〜1.0であった。こうした結果は、TNFR1に結合するdAbフォーマットを用いた治療が非常に効力のある対関節炎治療であり、調べたPEG化および二重特異性のdAbフォーマットの両方が慢性炎症疾患に非常に有効な薬物であることを示す。その上、これらの結果はさらに、TNFR1に結合するdAbがアンタゴニスト的様式でのみレセプターとかみ合うことを実証した。
【０５２６】
C.  IBDのマウスDSSモデル
マウスにおけるIBDは、飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を投与することにより誘発させる。(例えばOkayasu I.ら, Gastroenterology 98:694-702 (1990); Podolsky K., J Gasteroenterol. 38 suppl XV:63-66 (2003)を参照されたい)。ヘリコバクター・ピロリ(H. pylori)フリーの成体BDF1マウスを２週間に渡り飼育して、そのサーカディアンリズムを安定化させる。全てのマウスは、特定病原体フリー(SPF)のバリア装置内の個別に換気されるケージに入れ、12時間の明：暗周期で飼育する。動物は、全期間に渡り食糧および水を自由に摂取できるようにする。
【０５２７】
実験は７日間行う。実験期間中、飲料水は5％DSSを含有するものにする。全ての動物を1〜7日の朝(0900〜1000)および夕方(1600〜1700)に処置する(表14を参照のこと)。１日目は、１回の予防的用量に相当する。全ての動物を毎日計量し、何らかの下痢の発生があれば記録する。全ての動物を最後の処置から24時間後に犠牲にするが、犠牲にする40分前にブロモデオキシウリジンのパルスを投与する。動物から遠位大腸を摘出する。遠位大腸の小さなサンプルを「RNAlater」にセットし、残りをカルノワ固定液で固定し、パラフィンに包埋し、切片化して(スライド当たり非連続切片)、その後ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。切片をIBD重症度について視覚的に評価し、重症度スコアを割り当てる。組織測定分析を行い、平均病巣面積(潰瘍面積)、平均上皮面積、および平均壁内炎症面積を測定する。
【０５２８】
大腸のH&E断面を使用し、面積の正確な定量を可能にするZeiss Axiohome顕微鏡を使用して一連の組織寸法を記録する。各断面について、上皮と粘膜固有層を合算した面積および結合組織の面積を測定する。次に上皮面積を別に測定し、差分が粘膜固有層の面積となる。正常組織において、この組織の該面積への相対的寄与は約10％であるが、これは炎症が増加するにつれて増大する。従って、上皮：粘膜固有層の相対的比率は変化する。
【０５２９】
重症度が増加するにつれて、この領域の深さは浅くなり(潰瘍形成の一因となる)、結腸の長さは短くなる。これらの現象は一緒になって、内腔の断面積を増加させる。従ってこのパラメーターも疾患重症度のための有用な測定値でありうる。
【０５３０】
組織サンプルを顕微鏡観察して、次の重症度スコアを割り当てる：0 ＝ 炎症なし; 1 ＝ 陰窩基部(crypt base)の周辺に軽度の炎症; 2 ＝ 大規模な炎症性浸潤と崩壊した粘膜構造; 3 ＝ 大規模な炎症浸潤と崩壊した粘膜構造に加えて潰瘍形成あり。
【０５３１】
このモデルにおいて有効性が示唆されるのは、処置が、生理食塩水対照群の重症度スコアと比較して重症度の減少をもたらすときである。例えば、処置群の重症度スコアは、0.1〜約1、1〜約2、または2〜約3だけ減少しうる。有効性は、約2未満、1〜約2、または1未満のスコアにより示される。
【０５３２】
1群6匹の動物の9群を次のように処置する:
【表１４】
2008515420.tif 000019
【０５３３】
D.  慢性閉塞性肺疾患(COPD)のマウスモデル
マウス亜慢性タバコ煙(TS)モデルにおける疾患の進行に対する抗TNFR1 dAbの効力を評価する(例えば、Wright JL and Churg A., Chest 122:306S-309S (2002)を参照のこと)。抗マウスTNFR1 dAbを48時間ごとに(TSへの最初の曝露の24時間前から開始して)腹腔内注射により投与し、延長された血清半減期フォーマット(例えば抗SA dAb を含むPEG化、二重特異性リガンド)として与える。
【０５３４】
あるいはまた、抗TNFR1 dAbを、単量体dAbとして、24時間ごとに(TSへの最初の曝露の4時間前から開始して)鼻腔内送達により投与する。ENBREL(登録商標) (entarecept; Immunex Corporation)を陽性対照として使用する。TS曝露は毎日行い、実験を1〜2週間に渡り継続する(例えば, Vitalisら, Eur. Respir. J., 11:664-669 (1998)を参照のこと)。最後のTS曝露の後に気管支肺胞洗浄液を分析して、全細胞数および好中球、好酸球、マクロファージおよびTリンパ球サブセットを含む細胞分画をカウンティングする。肺葉を10％緩衝化ホルマリン中で固定して、組織切片を、肺胞および肺胞管の拡大化、末梢気道壁の肥厚、ならびに好中球、好酸球、マクロファージおよびTリンパ球サブセットを含む細胞カウント数について分析する。有効性は、TS曝露により上昇していた好中球、好酸球、マクロファージおよびTリンパ球サブセットの数の減少、ならびに、TSにより誘発された肺胞と肺胞管の拡大化および末梢気道壁の肥厚の減少により裏付けられる。
【０５３５】
実施例16  組換えキメラTNFR1分子の構築と発現
この実施例は、異なるマウスTNFR1ドメインおよびヒトTNFR1ドメイン (, ら Cell, 73(3):431-45 (1993))から構成された分子の作製方法について記載する。この分子はTNFR1の４つの所定の細胞外ドメインを含有するが、これらは異なるマウスおよびヒトTNFR1タンパク質に由来する。作製されたキメラレセプターは、異なるドメインの役割と機能に従い、ヒトTNFR1とマウスTNFR1の両方の特性を共有する。この分子は、dAb、抗体およびその抗原結合フラグメント、ならびにヒトもしくはマウスTNFR1に結合する他の分子(例えば有機化合物、NCE;またはアフィボディー(affibodies)、LDLレセプタードメインもしくはEGFドメインなどのタンパク質ドメイン)のドメイン特異性を評価するための手段を提供する。
【０５３６】
方法
ヒトおよびマウスTNFR1配列は以前にPichia発現ベクターpPicZalpha (Invitrogen)にEcoR1およびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位を利用してクローニングされた。鋳型マウスTNFR1 DNA(および結果的にマウスドメイン4で終わるキメラレセプター構築物)は3’ 6xヒスチジンタグを含んでいた。ヒトTNFR1(および結果的にヒトドメイン4で終わるキメラレセプター構築物)は、3’末端にMycと6xヒスチジンタグの両方を順に含んでいた。
【０５３７】
最初のPCRは標準PCR条件に従い、RubyTaq DNAポリメラーゼ(USB Corporation, Cleveland, Ohio)、100 ngの鋳型DNA(全長mTNFR1またはhTNFR1 DNAのいずれかの関連するDNAミニプレプ鋳型を含む)を用いて行った。
【０５３８】
典型的PCR反応は次のように設定した： ポリメラーゼを含有する25μlの10X RubyTaq PCRバッファー; 2μlの第１プライマー(10μMストックより); 2μlの第２プライマー(10μMストックより); 1μl(100 ng)の完全長TNFR1鋳型DNA; 20μlのdH2O(最終容量50μlとする)。反応は薄壁のチューブで行うようにし、サーモサイクラーに配置して次のパラメーターに従い反応を行った。
【０５３９】
2008515420.tif 000020
【０５４０】
これらの最初のPCRから生成したPCR産物を、1％アガロースゲルから切り出し、ゲル精製キット(Qiagen)を用いて精製し、50μlのdH2Oへと溶出させた。
【０５４１】
2008515420.tif 000021
【０５４２】
SOE PCR
アセンブリPCR (「pull-through」またはオーバーラップ伸長によるスプライシング(Splicing by Overlap Extension: SOE)とも呼ぶ、Gene, 15:77(1):61-8 (1989)を参照のこと)は、一次PCR産物の相補的末端を利用して、消化または連結なしに一次PCR産物を一緒に集合させるものである。このプロセスにおいては、一次産物を一緒に合わせて変性させ、その後その相補的末端同士をTaq DNA ポリメラーゼおよびdNTPの存在下でアニーリングさせる。再アニーリングと伸長を数サイクル行うと、結果的に相補鎖がフィルインされて完全長鋳型が生成される。今や完全長となった構築物カセットの両側につくプライマーを添加し、慣用PCRを行うことでアセンブルされた産物を増幅した。上記の最初のPCRに由来する種々のTNFR1ドメインを一緒にアニーリングさせて増幅するためにSOE PCRを行った。アセンブリSOE PCRは次のように設定した:40μlの10 x PCRバッファー(MgCl2を含有する);〜2μl(100 ng)の最初のPCR 1の精製分離した産物; 〜2μl(100 ng)の最初のPCR 2の精製分離した産物; 36μlのdH2O (最終容量80μlとする)。SOEプライマー混合物をアセンブリステップの後に次のように添加した: 2μlの5’ フランキングプライマー(プライマー1); 2μlの3’フランキングプライマー(プライマー2); 10μlの10x PCRバッファー; 6μlのdH2O(最終容量20μlとする)。
【０５４３】
PCR反応は下に記載するプログラムを用いて行った。最初のアセンブリサイクルには約45分を要し、その後、サーモサイクラーを94℃で一時停止するように設定した。20μlのプライマー混合物を各反応に添加して混合した。
【０５４４】
2008515420.tif 000022
【０５４５】
PCR産物は、3〜5μlの各反応物を1％アガロースゲル上に流すことにより確認した。
【０５４６】
3)  アセンブリされたTNFR1キメラのPichia発現ベクターへのクローニング
pPicZalphaベクター(Invitrogen)をEcoRIおよびNotI酵素で順次消化し、その後Chromaspin TE-1000ゲル濾過カラム(Clontech, Mountain View, CA)で精製した。
【０５４７】
4)  TNFR1キメラ構築物の大腸菌(E. coli)への形質転換
連結させたキメラ構築物をHB2151エレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)細胞に形質転換し、低塩LB培地で１時間回復させ、その後0.25μg/ml ZEOCIN(フレオマイシンDを含有する抗生物質製剤)(Cayla, Toulouse, France)を含む低塩LB寒天に播種して37℃で24時間インキュベートした。次いで発現ベクター内に正しい配列のキメラ構築物があることを保証するために個別のコロニーを配列確認して、その後各キメラ構築物ベクターからラージスケールのMaxiprepプラスミド調製物を作製した。
【０５４８】
作製したキメラ構築物のヌクレオチド配列を下に示す。キメラ構築物は、そのドメインの起源に従い命名した(左側のドメイン1から右側のドメイン4へと読む)。例えばHMMMはヒトドメイン1およびマウスドメイン2〜4を含有する。マウスドメイン4を含有するキメラタンパク質はHisタグのみを有し、膜貫通領域とドメイン4の間のスペーサー領域を欠く。
【０５４９】
2008515420.tif 000023
【０５５０】
2008515420.tif 000024
【０５５１】
2008515420.tif 000025
【０５５２】
5)  TNFR1キメラ構築物の作製とピキア・パストリス(Pichia pastoris)への形質転換
各maxiprepにより生成したプラスミドDNAを、低頻度カッティング制限エンドヌクレアーゼPmeIで消化することにより、pichia形質転換前にDNAを線状化した。その後、線状化DNAをフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により分離してから、30μlのdH2Oに再懸濁した。10μlの線状化DNA溶液を80μlのエレクトロコンピテントKM71H Pichia細胞と5分に渡り混合し、その後1.5kV、200Ω、25μFでエレクトロポレーションを行った。YPDSを用いて細胞を直ちに回収し、2時間、30℃でインキュベートした後、100μg/ml ZEOCIN(フレオマイシンDを含有する抗生物質製剤)(Cayla, Toulouse, France)を含有するYPDS寒天プレートに播種し、２日間インキュベートした。
【０５５３】
6)  Pichiaにおける構築物の発現
各構築物について、個別の形質転換コロニーをスターター培養物として5 mlのBMGYに移し、30℃で24時間増殖させた。この培養物を使用して500 mlのBMGY培地に接種し、それを30℃で24時間増殖させてから、室温で5分、1500〜3000gで遠心分離することにより細胞を回収した。次に細胞を100 mlのBMMYに再懸濁し、メタノール濃度を日ごとに増加させながら４日間増殖させた(１日目0.5％、２日目1％、３日目1.5％および４日目2％)。発現の後に、上清を3300gで15分遠心分離後に回収した。
【０５５４】
7)  ニッケル樹脂を用いたTNFR1キメラ構築物の精製
培養上清をまず、最終濃度10 mMのイミダゾールおよび2x PBSの添加により緩衝化した。Hisタグ化タンパク質を、ニッケル-NTA樹脂の添加により室温で４時間(振とう)、バッチ吸着させた。その後上清/樹脂混合物をpoly-prepカラム(Biorad)に流し込んだ。次いで樹脂を10カラム容量の2xPBSで洗浄し、その後250 mM イミダゾール 1x PBSを用いて溶出させた。バッファー交換後、キメラ構築物の発現産物をEndoHデグリコシラーゼにより脱グリコシル化し、その後SDS-PAGEで確認した。
【０５５５】
PCRにおいて用いた鋳型DNA配列
ヒト(Homo sapiens) TNFR1(細胞外領域、Genbank登録番号33991418)
2008515420.tif 000026
【０５５６】
コードされたヒトTNFR1の細胞外領域は次のアミノ酸配列を有する：
2008515420.tif 000027
【０５５７】
マウス(Mus musculus) TNFR1(細胞外領域Genbank登録番号31560798)
2008515420.tif 000028
【０５５８】
コードされたマウス(Mus musculus)TNFR1の細胞外領域は次のアミノ酸配列を有する：
2008515420.tif 000029
【０５５９】
実施例17  抗TNFR1 dAbのドメイン特異性
この実施例では、TNFR1に結合するdAbのドメイン特異性を調べるために用いた方法を説明する。この方法は、表面プラズモン共鳴(SPR) ('Detection of immuno-complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings.' Biosensors. 1987-88;3(4):211-25.)を利用して、抗体を実施例16に記載のキメラ分子の過剰量とインキュベートして平衡化した後に、該抗体がSPRチップ表面に固定化された完全ヒトまたはマウスビオチン化TNFR1に結合する能力を測定する。このアッセイにおいては、TNFR1表面上の抗TNFR1 dAbの流れがSPRシグナルを発生し、これはSPRチップ上に固定化されたTNFR1と結合するdAbの量を示す。もしdAbが、TNFR1のドメイン（特定のdAbが結合するドメイン）を含むキメラ分子とプレインキュベートされて平衡化されるならば、TNFR1表面上のこの混合物の流れは、dAb単独と比較して小さいSPRシグナルを生じるだろう。しかし、もしdAbが、TNFR1のドメイン（特定のdAbが結合するドメイン）を含まないキメラ分子とプレインキュベートされて平衡化されるならば、TNFR1表面上のこの混合物の流れは、dAbのみを用いて得られるシグナルとほぼ同じSPRシグナルを生じるだろう。
【０５６０】
方法
1)  SPRチップTNFR1表面の作製
TNFR1表面の選択は、試験される抗TNFR1 dAbの種特異性によって決まる。したがって、抗ヒトTNFR1 dAbはヒトTNFR1でコーティングされた表面を用いて評価し、抗マウスTNFR1 dAbはマウスTNFR1でコーティングされたチップを用いて評価した。
【０５６１】
ビオチン化TNFR1を適当なSPR バッファーで希釈し、BIACORE 3000 SPR装置 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden)中のストレプトアビジン(SA)センサーチップに対して流した。ビオチン化 TNFR1とストレプトアビジン表面の接触時間を最大化するために、低流量(5〜10μl/分)を用いた。ストレプトアビジン表面がビオチン化物質で飽和されるまで流動を継続し、最大のTNFR1表面を有するチップを作製した。典型的にはチップに、数百〜数千のSPR応答単位のビオチン化物質が結合した。
【０５６２】
2) SPRチップ上の抗TNFR1応答の力価測定
競合実験を成功させるには、有意のSPRシグナルを生じる最小量のdAbが表面上を流れるように、抗TNFR1 dAb濃度を最初に最適化する必要がある。ある濃度範囲内において、dAbは用量依存的に表面に結合し、そのため結合型dAbのRU数はチップ表面を流れたdAb濃度を反映するようになる。
【０５６３】
この用量依存性の濃度範囲を確かめるために、抗TNFR1 dAbをBiacore バッファーの10倍希釈系列で、1:10希釈から1:1,000,000希釈までの範囲にて力価測定した。次に希釈物を個別に、順次TNFR1チップ表面上に、最高希釈サンプルから開始して、注入した。各希釈で達成された最大RU数を測定した。各注入後に、必要であれば適当なSPR再生バッファーを用いてTNFR1表面を再生させて、結合した抗TNFR1 dAbを除いた。この方法を用いて、約100RUに相当するシグナルを生じるために必要な抗TNFR1 dAbの最小濃度を決定した。
【０５６４】
3)  抗TNFR1 dAb/キメラ体の予備平衡化
最適な抗TNFR1 dAb濃度が決定されたならば、抗TNFR1 dAb/キメラTNFR1混合物を設定した。混合物は、抗TNFR1 dAbの最終濃度が、先に決定した最適濃度と同一になるように設定した。反応は典型的には、100μl容量中に、50μlの抗TNFR1 dAbの2 x濃縮物、40μlのBiacore バッファーおよび10μlの未希釈の精製済みキメラタンパク質を含有するように設定した。最終混合物の典型的濃度は約10〜100μMのキメラタンパク質および約10〜100 nMの抗TNFR1 dAbであった。混合物を室温で30分平衡化させた。
【０５６５】
4) 競合Biacore実験
平衡化の後に、それぞれの抗TNFR1 dAb/キメラTNFR1混合物を順次、TNFR1 SPR表面に流し、応答単位数を測定した。各混合物を注入した後、結合した抗TNFR1 dAbを除くために、次の混合物を注入する前に表面を再生させた。異なるキメラを用いて得た種々の応答は、特定のdAbによって結合されたTNFR1ドメインの決定を可能にした。
【０５６６】
これらの研究は、TAR2m-21-23 がマウスTNFR1のドメイン1に結合すること、TAR2h-205がヒトTNFR1のドメイン1に結合すること、ならびにTAR2h-10-27、TAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-154-7、TAR2h-154-10およびTAR2h-185-25がヒトTNFR1のドメイン3に結合することを明らかにした。
【０５６７】
実施例18  スクリーニング方法
実施例16に記載のこれらのキメラレセプタータンパク質は、TNFR1中の特定のドメインに結合する物質(例えば、抗体、dAb、化合物)を単離するためのアッセイまたはスクリーニングに用いることができる。手短に説明すると、これらの方法は、キメラタンパク質を粗抗体調製物に添加して、その後ELISAまたは表面プラズモン共鳴のいずれかを用いてTNFR1結合についてスクリーニングすることを記載している。さらに、これらの方法は、表面(例えば、ELISAプレートまたはSPR チップ)上にコーティングされたキメラタンパク質の使用、ならびにこの表面上のキメラタンパク質への抗体の結合を試験することによる抗体のスクリーニングについて記載する。
【０５６８】
1)  可溶性ELISAスクリーニング
この方法は、特異性が知られていない抗体または抗体フラグメントの大規模なレパートリーから、TNFR1の特定ドメインに結合する抗体または抗体フラグメント(例えば、dAb)を迅速に単離するために使用することができる。
【０５６９】
96ウェルアッセイプレートに、ウェル当たり100μlのキメラTNFR1を4℃で一晩コーティングする。ウェルを0.1％TPBS (濃度0.1％のTween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水)で３回洗浄する。ウェル当たり200μlの1％TPBSを添加してプレートをブロッキングし、プレートを室温で１〜２時間インキュベートする。次にウェルをPBSで３回洗浄した後、50μlの0.2％TPBS中に可溶性抗体または抗体フラグメント(c-Mycエピトープタグを含有)を含有する50μlの細菌性上清またはperiprepを添加する。次いでプレートを室温で１時間インキュベートする。その後、プレートを0.1％TPBS (PBS中の0.1％Tween-20)で５回洗浄する。次いで100μlの一次抗c-Mycマウスモノクローナル抗体を0.1％TPBS中で各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。この一次抗体溶液を廃棄し、その後プレートを0.1％TPBSで５回洗浄する。次に100μlの予め希釈したヤギ由来の抗マウスIgG (Fc特異的) HRPコンジュゲート(Sigma カタログ番号: A0168)を添加して、プレートを室温で１時間インキュベートする。次いで二次抗体を廃棄し、プレートを0.1％TPBSで６回洗浄し、次いでPBSで２回洗浄する。その後50μlのTMBペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で2〜60分放置する。反応を50μlの1M塩酸の添加により停止させる。プレートの450 nmのODを、酸の添加から30分以内に96-ウェルプレートリーダーで読み取る。キメラタンパク質中に存在するTNFR1のドメインに結合する、粗細菌性上清またはperiprep中の抗体は、結合しないものよりも強いELISAシグナルをもたらすだろう。
【０５７０】
2)  競合ELISAスクリーニング
この方法は、TNFR1に結合する抗体または抗体フラグメントの粗調製物の多様なセットを迅速にスクリーニングして、そのドメイン結合特異性を決定するために、使用することができる。
【０５７１】
96ウェルアッセイプレートに、ウェル当たり100μlのマウスまたはヒトTNFR1を一晩4℃でコーティングする。ウェルを0.1％TPBS (濃度0.1％のTween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水)で３回洗浄する。ウェル当たり200μlの1％TPBS (PBS中1％Tween-20)を添加してプレートをブロッキングし、プレートを室温で１〜２時間インキュベートする。その後ウェルをPBSで３回洗浄する。同時に細菌性上清またはperiprepを、溶液中の予め最適化した濃度のキメラTNFR1タンパク質により予備平衡化しておく。その後、可溶性抗体または抗体フラグメントを含有する50μlのこの粗細菌性調製物/キメラタンパク質混合物をELISAプレートに添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。次いでプレートを0.1％TPBS (PBS中の0.1％Tween-20)で５回洗浄し、その後、100μlの一次検出抗体(またはプロテインA-HRPもしくはプロテインL-HRP)を0.1％TPBS中で各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。この一次抗体溶液を廃棄し、次いでプレートを0.1％TPBSで５回洗浄する。必要であればその後100μlの予備希釈済みヤギ由来の二次抗体/HRPコンジュゲートを添加し、プレートを室温で１時間インキュベートする。次いで二次抗体を廃棄し、プレートを0.1％TPBSで６回洗浄し、その後PBSで２回洗浄する。50μlのTMBペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加し、次いでプレートを室温で2〜60分放置する。反応を50μlの1M塩酸の添加により停止させる。プレートの450 nmのODを、酸の添加から30分以内に96-ウェルプレートリーダーで読み取る。ELISAシグナルの減少は、抗体が、プレート上にコーティングされた完全TNFR1ではなくキメラTNFR1ドメインに結合していること、したがって、抗体がキメラタンパク質中のドメインの１つに結合することを示す。
【０５７２】
3)  TNFR1への結合について参照抗体または抗体フラグメントと競合する、抗体および抗体フラグメントについての競合ELISAスクリーニング
この方法は、TNFR1に結合する抗体または抗体フラグメントの粗調製物の多様なセットを、TNFR1への結合またはTNFR1の所望のドメイン(例えばドメイン1)への結合について参照抗体または抗体フラグメント(例えば、TAR2m-21-23)と競合する、抗体または抗体フラグメントを迅速にスクリーニングするために使用することができる。この方法は、種々の検出可能なタグ(エピトープタグ)を含有する、試験抗体または抗体フラグメント(例えばスクリーニングされる抗体の集団)、および参照抗体または抗体フラグメントを使用する。
【０５７３】
96ウェルアッセイプレートに、ウェル当たり100μlのマウスまたはヒトTNFR1を一晩4℃でコーティングする。ウェルを0.1％TPBS (濃度0.1％のTween-20を含有するリン酸緩衝生理食塩水)で３回洗浄する。ウェル当たり200μlの1％TPBS (PBS 中1％Tween-20)を添加してプレートをブロッキングし、プレートを室温で１〜２時間インキュベートする。その後ウェルをPBSで３回洗浄する。同時に、試験する粗抗体調製物を、溶液中のあらかじめ最適化した濃度の参照抗体または抗体フラグメント(例えばドメイン1結合性抗体; TAR2m-21-23)と混合する。先に記載したように、この抗体は、ドメイン結合特異性についてスクリーニングしている抗体中に存在する検出タグと同じ検出タグを含まないことが重要である。50μlのこの抗体/参照抗体混合物を、ELISAプレートに添加する。その後プレートを室温で１時間インキュベートする。次いでプレートを0.1％TPBSで５回洗浄し、その後100μlの一次検出抗体(スクリーニングされる抗体集団にのみ存在するタグに結合する)を0.1％TPBS中で各ウェルに添加して、プレートを室温で１時間インキュベートする。この一次抗体溶液を廃棄し、次いでプレートを0.1％TPBSで５回洗浄する。その後一次検出抗体を認識する予備希釈済みの二次抗体-HRPコンジュゲートを100μl添加し、次いでプレートを室温で１時間インキュベートする。次いで二次抗体を廃棄し、プレートを0.1％TPBSで６回洗浄し、PBSで２回洗浄する。その後50μlのTMBペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加し、次いでプレートを室温で2〜60分放置する。反応を50μlの1M塩酸の添加により停止させる。プレートの450 nmのODを、酸の添加から30分以内に96-ウェルプレートリーダーで読み取る。この方法を用いるが参照抗体または抗体フラグメントを添加しない別のELISAを並行して行う必要がある。参照抗体または抗体フラグメントの存在下でのELISAシグナルが、競合する参照抗体または抗体フラグメントを含まない同じ抗体調製物についてのELISAシグナルと比べて減少していることは、該特定の抗体または抗体フラグメントがTNFR1への結合において参照抗体または抗体フラグメントと競合し、参照抗体または抗体フラグメントが結合するのと同じTNFR1のドメインに結合することを示す。
【０５７４】
4)  SPRスクリーニング
上記ELISA方法は表面プラズモン共鳴を利用するフォーマット、例えばBIACORE 3000 SPR 装置 (Biacore International AB, Uppsala, Sweden)を用いるフォーマットに容易に応用することができる。一般には、キメラタンパク質をSPRチップ上に固定するか、またはキメラタンパク質を抗TNFR1抗体または抗体フラグメントを含有する粗細菌性上清と平衡化し、その後得られる混合物を、完全長ヒトTNFR1またはマウスTNFR1でコーティングしたSPRチップ上に流す。
【０５７５】
実施例19  TAR2m21-23二量体は高結合活性TNFR1アンタゴニストである
TAR2m21-23二量体は、実施例８に記載の方法を用いて、カルボキシ末端にcys残基を有する形態のTAR2m21-23を作製することにより調製した。このタンパク質 (TAR2m21-23CYS)をPichia中で発現させ、Streamline プロテインAを用いて精製した。非還元条件SDS-PAGE分析からは、タンパク質の約40〜50％が溶液中に二量体として存在することが示された。二量体をゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０５７６】
2 mgのタンパク質を約250μlまで濃縮し、PBSで先に平衡化しておいたSuperdex 75 HR ゲル濾過カラム(Amersham Bioscience)にアプライした。このカラムを0.5 ml/分の流量で運転し、0.5 ml画分を回収した。カラムからのタンパク質の溶出は280 nmでモニタリングし、その後、二量体を含有する画分を非還元条件SDS-PAGEにより同定した。二量体を含有しかつ単量体型TAR2m-21-23CYSを含有しない画分をプールした。一緒にした画分を濃縮し、二量体型dAbの能力を、L929 TNF細胞毒性アッセイ(実施例6)を用いて測定した。
【０５７７】
TAR2m21-23二量体の生物学的能力を、L929細胞毒性アッセイにおいて、単量体型TAR2m-21-23と比較した。このアッセイにおいては、TAR2m21-23単量体およびTAR2m21-23二量体によるマウスL929細胞のTNF-誘発細胞毒性の阻害を評価し、結果はアッセイにおいて細胞毒性を50％阻害するdAb単量体または二量体の濃度(中和用量50、ND50)として表した。
【０５７８】
単量体型dAbはこのアッセイにおいてND50が約600 pMであった。二量体化dAb (TAR2m21-23二量体)のND50はこのアッセイにおいて約10倍低かった (ND50 約60-70 pM)。こうした結果は、TAR2m21-23二量体の細胞表面TNFR1に対する親和性が、dAb単量体と比べて著しく改善されていることを示す。これらの結果は、TAR2m21-23二量体が細胞表面の２つの別のTNFR1分子に同時に結合し、多量体化後に生じる結合活性が向上したTNFR1阻害をもたらすことを示す。
【０５７９】
次に二量体型フォーマット(TAR2m21-23二量体)が、何らかのTNFR1アゴニズムサイン(すなわちTNFR1の架橋を引き起こし、細胞内シグナル伝達と細胞死を開始させる能力)を示すかどうかを調べるために、二量体型フォーマットを試験した。これは改変型L929細胞毒性アッセイを用いて達成されたが、このアッセイではTNF-αを添加することなく、抗TNFR1抗体またはdAbフォーマットがTNFR1に対してアゴニスト作用をもち、細胞死を誘発するかどうかを調べた。TNFR1の既知のアゴニストである抗TNFR1抗体AF-425-PB (R&D Systems)、TNFR1のアンタゴニストであると報告された抗TNFR1抗体MAB430 (R&D Systems)、TAR2m-21-23およびTAR2m21-23二量体をこのアッセイにおいて試験した。
【０５８０】
抗体AF-425-PBはTNFR1を活性化し、アッセイにおいて約100 pMのND50で細胞毒性を誘発した。報告されたアンタゴニスト抗体MAB430でさえも、アッセイにおいて約10nMのND50でレセプター架橋と細胞死を引き起こした。対照的に、TAR2m-21-23二量体はこのアッセイにおいて、非常に高濃度(＞1μM)で存在するときでさえ、どのような細胞死も引き起こさなかった。こうした結果は、TAR2m21-23二量体がTNFR1アゴニストではないことを示す。
【０５８１】
これらの結果は、TNFR1に結合するdAbの二量体、三量体または他の多量体が、細胞の表面に発現しているTNFR1に対して高い結合活性を有し、有効なTNFR1アンタゴニストであることを示す。その上、この研究の結果は、TNFR1のドメイン1に結合するdAbの多量体(TAR2m21-23二量体など)が、２つのTNFR1分子に結合することができ(アッセイでアゴニストとして作用した抗体も同様)、TNFR1上のドメインまたはエピトープ標的(ドメイン1)との結合、TNFR1シグナル伝達の開始に必要なレセプター鎖の近接会合を妨げることを示す。この性質は、細胞表面のTNFR1と架橋することができ、なおかつTNFR1シグナル伝達および細胞死を引き起こさない、という点で二価分子に特有のものである。
【０５８２】
実施例20  ヒトTNFR1およびマウスTNFR1に結合するdAbの単離
既知配列のdAbを大腸菌(E. coli)中に発現させ、プロテインA streamline樹脂で精製した。トリス-グリシンへの溶出後、ビオチン化ヒトTNFR1を固定化したSPRチップ(フローセル2)およびビオチン化マウスTNFR1を固定化したSPRチップ(フローセル4)上に、dAbを流した(SPRチップには同じような密度でヒトTNFR1およびマウスTNFR1をコーティングした)。フローセル1および3をブランクのままとし、非特異的結合の検出と減算のための抗原なしの参照表面として用いた。
【０５８３】
dAbを４つのフローセル上に順次流し(すなわちフローセル1、次いで2、3、最後に4)、このときフローセル2と1の応答差を測定し、またフローセル4と3の応答差も測定した。前者はヒトTNFR1への結合の、後者はマウスTNFR1への結合の指標である。ヒトTNFR1とマウスTNFR1の両方への結合についての特異的結合曲線が観察された。この曲線の性質は、マウスTNFR1よりもヒトTNFR1に対してより速いon速度が見られるようなものであった。off速度は大まかには類似していた。架橋反応性の評価は、各結合イベントにより最大限に達成された応答単位(response unit: RU)数として与えられる。本実施例では、ヒトビオチン化TNFR1表面は、フローセル2上に約900RUのTNFR1を含み、対するフローセル4は約1400RUのマウスTNFR1を含んでいた。対照として、ヒト特異的dAbであるTAR2h-154-7は、２マイクロモル濃度で、385RUの最大応答でヒト表面に結合し、マウス表面上ではわずか4.5RUの応答しか与えなかった。2マイクロモル濃度のTAR2h-205は、ヒト表面上で435RUの応答を、マウス表面上で266RUの応答をもたらした。
【０５８４】
本明細書に記載した全ての刊行物、および刊行物に引用されている参考文献を、参照により本明細書に組み入れる。記載した方法および本発明の系の種々の改変および変法は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求の範囲の本発明がかかる特定の実施形態に不当に限定されてはならないと理解すべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に自明の、本発明を実施するために記載した形態の種々の改変は、特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０５８５】
付録1; in vivo半減期を高めるポリペプチド
α-1 糖タンパク質 (オロソムコイド)(AAG)
α-1 アンチキモトリプシン(ACT)
α-1 アンチトリプシン(AAT)
α-1 ミクログロブリン(プロテインHC)(AIM)
α-2 マクログロブリン(A2M)
アンチトロンビンIII(AT III)
アポリポタンパク質A-1 (Apo A-1)
アポリポタンパク質B (Apo B)
β-2-ミクログロブリン(B2M)
セルロプラスミン(Cp)
補体成分 (C3)
補体成分 (C4)
C1エステラーゼ阻害剤 (C1 INH)
C-反応性タンパク質 (CRP)
シスタチンC (Cys C)
フェリチン(FER)
フィブリノーゲン(FIB)
フィブロネクチン(FN)
ハプトグロビン (Hp)
ヘモペキシン(HPX)
免疫グロブリンA (IgA)
免疫グロブリンD (IgD)
免疫グロブリンE (IgE)
免疫グロブリンG (IgG)
免疫グロブリンM (IgM)
免疫グロブリン軽鎖 (κ/λ)
リポタンパク質(a) [Lp(a)]
マンノース結合タンパク質 (MBP)
ミオグロビン(Myo)
プラスミノーゲン(PSM)
プレアルブミン(トランスサイレチン)(PAL)
レチノール結合タンパク質(RBP)
リウマトイド因子(RF)
血清アミロイドA(SAA)
可溶性トランスフェリンレセプター(sTfR)
トランスフェリン(Tf)
2008515420.tif 000030
【０５８６】
2008515420.tif 000031
【０５８７】
2008515420.tif 000032
【０５８８】
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【０５８９】
2008515420.tif 000034
【０５９０】
2008515420.tif 000035
【０５９１】
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【０５９２】
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【０５９３】
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【０５９４】
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【０５９５】
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【０５９６】
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【０５９７】
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【０５９８】
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【０５９９】
2008515420.tif 000044
【図面の簡単な説明】
【０６００】
【図１】VH HSAの抗原結合部位にある位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98での多様化（それぞれDVTまたはNNKによりコードされる）を示す。（配列番号1、ヌクレオチド配列；配列番号2、アミノ酸配列）。Vκの配列は位置L50、L53で多様化される。
【図２】一本鎖Fv（scFv）ライブラリーを作製するために用いたプラスミドpITl/pIT2の構造を示す概略図であり、発現制御およびクローニング領域にわたるプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号3）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号4）を示す。このプラスミドを用いて、        ライブラリー1：生殖系列 Vκ/DVT VH        ライブラリー2：生殖系列 Vκ/NNK VH        ライブラリー3：生殖系列 VH/DVT Vκ および        ライブラリー4：生殖系列 VH/NNK Vκをファージディスプレイ/ScFvフォーマットで作製した。これらのライブラリーは、クローンおよび選択したライブラリーの大多数が機能性であるように、ジェネリックなリガンドであるプロテインAおよびプロテインLとの結合について予備選択した。ライブラリーはHSA (第1ラウンド)およびβ-gal (第2ラウンド)すなわちHSA β-gal選択で、またはβ-gal (第1ラウンド)およびHSA (第2ラウンド)すなわちβ-gal HSA選択で選択した。PCRのこれらのクローンからの可溶性scFvを該配列で増幅させる。二重特異性抗体K8をコードする1個のクローンをさらなる研究のために選択した。
【図３】VH鎖（VHダミー(配列番号5)、K8 (配列番号6)、VH2 (配列番号7)、VH4 (配列番号8)、VHC11 (配列番号9)、VHAlOsd (配列番号10)、VHAlsd (配列番号11)、VHA5sd (配列番号12)、VHC5sd (配列番号13)、VHCllsd (配列番号14)、VHC11 sd (配列番号15)）およびVκ鎖（Vκダミー(配列番号16)、K8 (配列番号17)、E5sc (配列番号18)、C3 (配列番号19)）のアライメントを示す。
【図４】K8抗体の結合特性の特徴づけを示す。K8抗体の結合特性はモノクローナルファージELISAにより特徴づけられ、二重特異性K8抗体はHSAとβ-galに結合することが見出され、1.0を超える吸光度シグナルでファージの表面にディスプレイされた。他のタンパク質との交差反応性は検出されなかった。
【図５】既知濃度のK8抗体フラグメントを用いて実施した可溶性scFv ELISAを示す。96ウェルプレートにlOOμgのHSA、10μg/mlのBSAとβ-gal、および100μg/mlのプロテインAを1μg/mlの濃度でコーティングした。K8 scFvの連続希釈物50μgを添加し、結合した抗体フラグメントをプロテインL-HRPにより検出した。ELISAの結果からK8抗体の二重特異性の性質が確認される。
【図６】可溶性scFv ELISAを用いて分析したクローンK8 Vκ/ダミーVHの結合特性を示す。可溶性scFvフラグメントの産生をHarrisonら, Methods Enzymol. 1996; 267:83-109に記載されるようにIPTGで誘発し、scFvを含有する上清を直接アッセイした。可溶性scFv ELISAを実施例1に記載するとおりに実施し、結合したscFvをプロテインL-HRPにより検出した。ELISAの結果から、このクローンはまだβ-galと結合できるが、BSAとの結合は完全に失われたことが明らかになった。
【図７】可変ドメインベクター1および2の配列（配列番号2および配列番号3）を示す。
【図８】VH1/VH2多重特異性リガンドを構築するために用いたCHベクターの地図である。
【図９】Vκ1/Vκ2多重特異性リガンドを構築するために用いたCKベクターの地図である。
【図１０】TAR1-5二量体4、TAR1-5-19二量体4、およびTAR1-5-19単量体を比較したTNFレセプターアッセイを示す。
【図１１】TAR1-5二量体1〜6を比較したTNFレセプターアッセイを示す。全ての二量体はFPLC精製したものであり、最適な二量体種の結果を示してある。
【図１２】TAR1-5 19ホモ二量体の異なるフォーマット（すなわち、3U、5Uまたは7Uリンカーを含むdAb-リンカー-dAbフォーマット、Fabフォーマット、およびシステインヒンジリンカーフォーマット）でのTNFレセプターアッセイを示す。
【図１３】ライブラリー1のダミーVH配列を示す（アミノ酸配列(配列番号5); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号20)、非コード鎖(配列番号21)）。VHフレームワークの配列は生殖系列配列DP47-JH4bに基づく。ライブラリー1にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１４】ライブラリー2のダミーVH配列を示す（アミノ酸配列(配列番号22); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号23)、非コード鎖(配列番号24)）。VHフレームワークの配列は生殖系列配列DP47-JH4bに基づく。ライブラリー2にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１５】ライブラリー3のダミーVκ配列を示す（アミノ酸配列(配列番号16); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号25)、非コード鎖(配列番号26)）。Vκフレームワークの配列は生殖系列配列DPK9-JK1に基づく。ライブラリー3にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１６】抗MSA dAbであるMSA 16 (ヌクレオチド配列(配列番号27)、アミノ酸配列(配列番号28))およびMSA 26 (ヌクレオチド配列(配列番号29)、アミノ酸配列(配列番号30))のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
【図１７ａ】MSA 16の阻害Biacoreを示す。精製したdAb MSAl6を阻害Biacoreで分析してKdを決定した。簡単に説明すると、このdAbは、高密度のMSAをコーティングしたBiacore CM5チップ上で200RUの応答を達成するのに必要なdAbの濃度を決定するために試験された。必要なdAbの濃度が決定されたら、予想されるKd付近の濃度範囲のMSAをdAbと予備混合し、一晩インキュベートした。その後、予備混合物におけるdAbのMSAコーティングBiacoreチップへの結合を30μl/分の高流量で測定した。
【図１７ｂ】MSA 26の阻害Biacoreを示す。精製したdAb MSA26を阻害Biacoreで分析してKdを決定した。簡単に説明すると、このdAbは、高密度のMSAをコーティングしたBiacore CM5チップ上で200RUの応答を達成するのに必要なdAbの濃度を決定するために試験された。必要なdAbの濃度が決定されたら、予想されるKd付近の濃度範囲のMSAをdAbと予備混合し、一晩インキュベートした。その後、予備混合物におけるdAbのMSAコーティングBiacoreチップへの結合を30μl/分の高流量で測定した。
【図１８】注入後のMSA 16の血清レベルを示す。dAb MSA16の血清半減期をマウスで測定した。CD1マウスに約1.5 mg/kgで1回の静注を行うことによりMSA16を投与した。2コンパートメントモデルを用いたモデル化は、MSA16のt1/2αが0.98 hr、t1/2βが36.5 hr、AUCが913 hr.mg/mlであることを示した。MSA16がかなり長い半減期をもつのに対して、HEL4 (抗雌ニワトリ卵白リゾチームdAb)はt1/2αが0.06 hrで、t1/2βが0.34 hrであった。
【図１９】MSA26CκおよびTAR1-5-19CHを含むFab様フラグメントによるTNF結合の阻害を示すELISA (図19a)およびTNFレセプターアッセイ(図19b、19c)。Fab様フラグメントと共にMSAを添加すると、阻害のレベルが低下する。1μg/mlのTNFαをコーティングしたELISAプレートを、二重特異性Vκ CHおよびVκ Cκ Fab様フラグメントでプロービングし、また、対照のTNFα結合dAbでもプロービングした（その際、ELISAで同様のシグナルを与えるように計算されたdAb濃度を用いた）。二重特異性タンパク質と対照dAbの両方を用いて、2 mg/mlのMSAの存在下または不在下でELISAプレートをプロービングした。二重特異性ウェルでのシグナルは50％以上減少したが、dAbウェルでのシグナルはまったく減少しなかった（図19a参照）。この同じ二重特異性タンパク質をMSAの存在下または不在下でレセプターアッセイにも使用し、またMSAによる競合も示した（図19c参照）。このことは、MSAの二重特異性タンパク質への結合がTNFαへの結合と競合することを実証する。
【図２０】TAR1-5-19 dAbとMSA16 dAbのジスルフィド結合ヘテロ二量体によるTNF結合の阻害を示すTNFレセプターアッセイ。該二量体と共にMSAを添加すると、用量依存的に阻害レベルが低下する。TNFレセプターアッセイ（図19b）は一定濃度のヘテロ二量体(18nM)および希釈系列のMSAまたはHSAの存在下で行った。ある濃度範囲（最大2 mg/ml）のHSAの存在は、TNFαを阻害する該二量体の能力を低下させなかった。しかし、MSAを添加すると、TNFαを阻害する該二量体の能力が用量依存的に低下した（図19a）。このことは、MSAとTNFαとがcys結合TAR1-5-19, MSA16二量体への結合について競合することを実証する。MSAおよびHSAは単独ではこのアッセイにおいてTNF結合のレベルに影響を及ぼさなかった。
【図２１Ａ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号31〜38）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。記号〜は相補性決定領域（CDR）の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２１Ｂ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号39〜45）を示す。
【図２１Ｃ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号46〜52）を示す。
【図２１Ｄ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号53〜59）を示す。
【図２１Ｅ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号60〜67）を示す。
【図２１Ｆ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号68〜75）を示す。
【図２１Ｇ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号76〜83）を示す。
【図２１Ｈ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号84〜91）を示す。
【図２１Ｉ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号92〜98）を示す。
【図２１Ｊ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号373〜379）を示す。
【図２１Ｋ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号380〜387）を示す。
【図２１Ｌ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号388〜395）を示す。
【図２１Ｍ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号396〜401および431）を示す。
【図２２Ａ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号99〜103）を示す。示したヌクレオチド配列はギャップのない連続配列である。記号〜はCDRをコードする配列の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1をコードする配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２２Ｂ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号104〜108）を示す。
【図２２Ｃ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号109〜113）を示す。
【図２２Ｄ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号114〜118）を示す。
【図２２Ｅ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号119〜123）を示す。
【図２２Ｆ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号124〜128）を示す。
【図２２Ｇ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号129〜133）を示す。
【図２２Ｈ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号134〜138）を示す。
【図２２Ｉ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号139〜143）を示す。
【図２２Ｊ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号144〜148）を示す。
【図２２Ｋ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号149〜153）を示す。
【図２２Ｌ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号154〜158）を示す。
【図２２Ｍ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号159〜163）を示す。
【図２２Ｎ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号164〜166および402〜403）を示す。
【図２２Ｏ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号404〜408）を示す。
【図２２Ｐ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号409〜413）を示す。
【図２２Ｑ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号414〜418）を示す。
【図２２Ｒ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号419〜423）を示す。
【図２２Ｓ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号424〜428）を示す。
【図２２Ｔ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号429〜430および432）を示す。
【図２３Ａ】マウスTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号167〜174）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。一部の配列には、相補性決定領域（CDR）の位置を示すために記号〜が挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２３Ｂ】マウスTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号175〜179）を示す。
【図２４Ａ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号180〜185）を示す。
【図２４Ｂ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号186〜190）を示す。
【図２４Ｃ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号191〜192および626）を示す。配列番号186および配列番号626は双方とも配列番号173のアミノ酸配列をコードする。CDR1をコードする配列番号626の配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２５Ａ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号193〜198）を示す。
【図２５Ｂ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号200〜205）を示す。
【図２５Ｃ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号206〜214）を示す。
【図２５Ｄ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号215〜223）を示す。
【図２５Ｅ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号224〜232）を示す。
【図２５Ｆ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号233〜241）を示す。
【図２５Ｇ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号242〜250）を示す。
【図２５Ｈ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号251〜259）を示す。
【図２５Ｉ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号260〜268）を示す。
【図２５Ｊ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号269〜277）を示す。
【図２５Ｋ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号278〜286）を示す。
【図２５Ｌ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号287〜295）を示す。
【図２６】抗TNFR1 dAbフォーマットがL929アッセイにおいてTNFR1に対しアゴニスト作用を実質的にもたないことを示すグラフである。L929細胞は以下の成分を含む培地中で培養した：ある濃度範囲の抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m-21-23)、市販の抗myc抗体(9E10)により架橋されたTAR2m-21-23単量体、二重特異性TNFR1 dAb/抗SA dAb (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16)、またはpeg化した抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m-21-23 4OK PEG)。抗myc抗体により架橋されたTAR2m-21-23単量体の場合には、dAbと抗体を2：1の割合で混合し、培養に先立ってin vivo免疫架橋の影響をシミュレートするために室温で1時間プレインキュベートした。（TAR2m-21-23単量体にはmycエピトープが含まれる。）TAR2m-21-23単量体は3,000 nMの濃度でL929細胞とインキュベートした。TAR2m-21-23単量体と抗Myc抗体は3,000 nMのdAb濃度でインキュベートした。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16は25 nM、83.3 nM、250 nM、833 nMおよび2,500 nMの濃度で該細胞とインキュベートした。TAR2m-21-23 40K PEGは158.25 nM、527.5 nM、1582.5 nM、5,275 nMおよび15,825 nMの濃度で該細胞とインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞の生存率を評価した。これらの結果は、L929細胞と10 nM、1 nMまたは0.1 nMの市販の抗TNFR1 IgG抗体（TNFR1と架橋して、TNFR1に対しアゴニスト作用をもつ）（カタログ番号AF-425-PB; R&D Systems, Minneapolis, MN）とのインキュベーションが生存不能の細胞の用量依存的増加をもたらすことを明らかにした。これにより、TNFR1のアゴニストに対するこれらの細胞の感受性が実証される。これに対して、様々な量の抗TNFR1フォーマットとのインキュベーションは、TNFR1に対しアゴニスト作用を示さず、たとえ市販の抗TNFR1 IgG抗体の濃度の1000倍を超える濃度で使用したときでさえ、培養物中の生存不能細胞の数を増加させなかった。
【図２７Ａ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号433〜442）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。記号〜は相補性決定領域（CDR）の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２７Ｂ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号443〜452）を示す。
【図２７Ｃ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号453〜462）を示す。
【図２７Ｄ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号463〜471）を示す。
【図２７Ｅ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号473〜481）を示す。
【図２７Ｆ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号482〜491）を示す。
【図２７Ｇ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号492〜501）を示す。
【図２７Ｈ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号502〜511）を示す。
【図２７Ｉ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号512〜517および627）を示す。
【図２８Ａ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号518〜523）を示す。示したヌクレオチド配列はギャップのない連続配列である。記号〜はCDRをコードする配列の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1をコードする配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２８Ｂ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号524〜529）を示す。
【図２８Ｃ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号530〜535）を示す。
【図２８Ｄ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号536〜541）を示す。
【図２８Ｅ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号542〜547）を示す。
【図２８Ｆ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号548〜552）を示す。
【図２８Ｇ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号553〜558）を示す。
【図２８Ｈ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号559〜564）を示す。
【図２８Ｉ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号565〜570）を示す。
【図２８Ｊ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号571〜576）を示す。
【図２８Ｋ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号577〜582）を示す。
【図２８Ｌ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号583〜588）を示す。
【図２８Ｍ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号589〜594）を示す。
【図２８Ｎ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号595〜600）を示す。
【図２８Ｏ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号601〜602および628）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008515420.tif 000051
【図８】
2008515420.tif 000052
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２１Ｉ】
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【図２１Ｊ】
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【図２１Ｋ】
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【図２１Ｌ】
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【図２１Ｍ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
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【図２２Ｊ】
2008515420.tif 000088
【図２２Ｋ】
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【図２２Ｌ】
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【図２２Ｍ】
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【図２２Ｎ】
2008515420.tif 000092
【図２２Ｏ】
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【図２２Ｐ】
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【図２２Ｑ】
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【図２２Ｒ】
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【図２２Ｓ】
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【図２２Ｔ】
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【図２３Ａ】
2008515420.tif 000099
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
2008515420.tif 000104
【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２５Ｉ】
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【図２５Ｊ】
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【図２５Ｋ】
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【図２５Ｌ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
2008515420.tif 000117
【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
2008515420.tif 000124
【図２７Ｉ】
2008515420.tif 000125
【図２８Ａ】
2008515420.tif 000126
【図２８Ｂ】
2008515420.tif 000127
【図２８Ｃ】
2008515420.tif 000128
【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
2008515420.tif 000130
【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
2008515420.tif 000132
【図２８Ｈ】
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【図２８Ｉ】
2008515420.tif 000134
【図２８Ｊ】
2008515420.tif 000135
【図２８Ｋ】
2008515420.tif 000136
【図２８Ｌ】
2008515420.tif 000137
【図２８Ｍ】
2008515420.tif 000138
【図２８Ｎ】
2008515420.tif 000139
【図２８Ｏ】
2008515420.tif 000140
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のアンタゴニストであって、該アンタゴニストはTNFR1のドメイン1と結合し、かつマウスTNFR1との結合についてTAR2m-23と競合するか、またはヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、上記アンタゴニスト。
【請求項２】
前記アンタゴニストが、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項1に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1のドメイン1と結合する、請求項1または2に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合し、かつマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合し、かつヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記アンタゴニストがヒトおよびマウスTNFR1と結合する、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
前記アンタゴニストがTNFR1のシェディング(shedding)を実質的に阻害しない、請求項1〜8のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と結合して、TNFR1を介したシグナル伝達を阻害するTNFR1のアンタゴニストであって、TNFαとTNFR1との結合を実質的に阻害しない、上記アンタゴニスト。
【請求項１１】
前記アンタゴニストが、標準的L929細胞毒性アッセイにおいてTNFα誘導細胞死を抑制するか、または標準的HeLa IL-8アッセイにおいてIL-8のTNFα誘導分泌を抑制する、請求項10に記載のアンタゴニスト。
【請求項１２】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1と結合する、請求項10または11に記載のアンタゴニスト。
【請求項１３】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項10〜12のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１４】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項10〜13のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１５】
前記アンタゴニストがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項10〜14のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１６】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項10〜14のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１７】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項10〜16のいずれか1項に記載のアンタゴニスト。
【請求項１８】
ヒトTNFR1およびマウスTNFR1と結合するリガンド。
【請求項１９】
前記リガンドがヒトTNFR1およびマウスTNFR1のドメイン1と結合するTNFR1結合成分を含む、請求項18に記載のリガンド。
【請求項２０】
前記結合成分が抗体または抗体フラグメントである。請求項19に記載のリガンド。
【請求項２１】
前記結合成分がdAbである、請求項20に記載のリガンド。
【請求項２２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつTAR2h-12 (配列番号32)、TAR2h-l3 (配列番号33)、TAR2h-14 (配列番号34)、TAR2h-16 (配列番号35)、TAR2h-17 (配列番号36)、TAR2h-18 (配列番号37)、TAR2h-19 (配列番号38)、TAR2h-20 (配列番号39)、TAR2h-21 (配列番号40)、TAR2h-22 (配列番号41)、TAR2h-23 (配列番号42)、TAR2h-24 (配列番号43)、TAR2h-25 (配列番号44)、TAR2h-26 (配列番号45)、TAR2h-27 (配列番号46)、TAR2h-29 (配列番号47)、TAR2h-30 (配列番号48)、TAR2h-32 (配列番号49)、TAR2h-33 (配列番号50)、TAR2h-10-l (配列番号51)、TAR2h-10-2 (配列番号52)、TAR2h-10-3 (配列番号53)、TAR2h-10-4 (配列番号54)、TAR2h-10-5 (配列番号55)、TAR2h-10-6 (配列番号56)、TAR2h-10-7 (配列番号57)、TAR2h-10-8 (配列番号58)、TAR2h-10-9 (配列番号59)、TAR2h-10-10 (配列番号60)、TAR2h-10-l1 (配列番号61)、TAR2h-10-12 (配列番号62)、TAR2h-10-13 (配列番号63)、TAR2h-10-14 (配列番号64)、TAR2h-10-15 (配列番号65)、TAR2h-10-16 (配列番号66)、TAR2h-10-17 (配列番号67)、TAR2h-10-18 (配列番号68)、TAR2h-10-19 (配列番号69)、TAR2h-10-20 (配列番号70)、TAR2h-10-21 (配列番号71)、TAR2h-10-22 (配列番号72)、TAR2h-10-29 (配列番号74)、TAR2h-10-31 (配列番号75)、TAR2h-10-35 (配列番号76)、TAR2h-10-36 (配列番号77)、TAR2h-10-37 (配列番号78)、TAR2h-10-38 (配列番号79)、TAR2h-10-45 (配列番号80)、TAR2h-10-47 (配列番号81)、TAR2h-10-48 (配列番号82)、TAR2h-10-57 (配列番号83)、TAR2h-10-56 (配列番号84)、TAR2h-10-58 (配列番号85)、TAR2h-10-66 (配列番号86)、TAR2h-10-64 (配列番号87)、TAR2h-10-65 (配列番号88)、TAR2h-10-68 (配列番号89)、TAR2h-10-69 (配列番号90)、TAR2h-10-67 (配列番号91)、TAR2h-10-61 (配列番号92)、TAR2h-10-62 (配列番号93)、TAR2h-10-63 (配列番号94)、TAR2h-10-60 (配列番号95)、TAR2h-10-55 (配列番号96)、TAR2h-10-59 (配列番号97)、TAR2h-10-70 (配列番号98)、TAR2h-34 (配列番号373)、TAR2h-35 (配列番号374)、TAR2h-36 (配列番号375)、TAR2h-37 (配列番号376)、TAR2h-38 (配列番号377)、TAR2h-39 (配列番号378)、TAR2h-40 (配列番号379)、TAR2h-41 (配列番号380)、TAR2h-42 (配列番号381)、TAR2h-43 (配列番号382)、TAR2h-44 (配列番号383)、TAR2h-45 (配列番号384)、TAR2h-47 (配列番号385)、TAR2h-48 (配列番号386)、TAR2h-50 (配列番号387)、TAR2h-51 (配列番号388)、TAR2h-66 (配列番号389)、TAR2h-67 (配列番号390)、TAR2h-68 (配列番号391)、TAR2h-70 (配列番号392)、TAR2h-71 (配列番号393)、TAR2h-72 (配列番号394)、TAR2h-73 (配列番号395)、TAR2h-74 (配列番号396)、TAR2h-75 (配列番号397)、TAR2h-76 (配列番号398)、TAR2h-77 (配列番号399)、TAR2h-78 (配列番号400)、TAR2h-79 (配列番号401)、およびTAR2h-15 (配列番号431)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約95％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項２３】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）と特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体であって、前記dAb単量体が300 nM〜5 pMのKdでTNFRlと結合し、かつTAR2h-131-8 (配列番号433)、TAR2h-131-24 (配列番号434)、TAR2h-15-8 (配列番号435)、TAR2h-15-8-l (配列番号436)、TAR2h-l5-8-2 (配列番号437)、TAR2h-l85-23 (配列番号438)、TAR2h-154-10-5 (配列番号439)、TAR2h-14-2 (配列番号440)、TAR2h-151-8 (配列番号441)、TAR2h-152-7 (配列番号442)、TAR2h-35-4 (配列番号443)、TAR2h-154-7 (配列番号444)、TAR2h-80 (配列番号445)、TAR2h-81 (配列番号446)、TAR2h-82 (配列番号447)、TAR2h-83 (配列番号448)、TAR2h-84 (配列番号449)、TAR2h-85 (配列番号450)、TAR2h-86 (配列番号451)、TAR2h-87 (配列番号452)、TAR2h-88 (配列番号453)、TAR2h-89 (配列番号454)、TAR2h-90 (配列番号455)、TAR2h-91 (配列番号456)、TAR2h-92 (配列番号457)、TAR2h-93 (配列番号458)、TAR2h-94 (配列番号459)、TAR2h-95 (配列番号460)、TAR2h-96 (配列番号461)、TAR2h-97 (配列番号462)、TAR2h-99 (配列番号463)、TAR2h-100 (配列番号464)、TAR2h-101 (配列番号465)、TAR2h-102 (配列番号466)、TAR2h-103 (配列番号467)、TAR2h-104 (配列番号468)、TAR2h-105 (配列番号469)、TAR2h-106 (配列番号470)、TAR2h-107 (配列番号471)、TAR2h-108 (配列番号472)、TAR2h-109 (配列番号473)、TAR2h-l10 (配列番号474)、TAR2h-l11 (配列番号475)、TAR2h-l12 (配列番号476)、TAR2h-l13 (配列番号477)、TAR2h-l14 (配列番号478)、TAR2h-l15 (配列番号479)、TAR2h-116 (配列番号480)、TAR2h-117 (配列番号481)、TAR2h-118 (配列番号482)、TAR2h-l19 (配列番号483)、TAR2h-120 (配列番号484)、TAR2h-121 (配列番号485)、TAR2h-122 (配列番号486)、TAR2h-123 (配列番号487)、TAR2h-124 (配列番号488)、TAR2h-125 (配列番号489)、TAR2h-126 (配列番号490)、TAR2h-127 (配列番号491)、TAR2h-128 (配列番号492)、TAR2h-129 (配列番号493)、TAR2h-130 (配列番号494)、TAR2h-131 (配列番号495)、TAR2h-132 (配列番号496)、TAR2h-133 (配列番号497)、TAR2h-151 (配列番号498)、TAR2h-152 (配列番号499)、TAR2h-153 (配列番号500)、TAR2h-154 (配列番号501)、TAR2h-159 (配列番号502)、TAR2h-165 (配列番号503)、TAR2h-166 (配列番号504)、TAR2h-168 (配列番号505)、TAR2h-171 (配列番号506)、TAR2h-172 (配列番号507)、TAR2h-173 (配列番号508)、TAR2h-174 (配列番号509)、TAR2h-176 (配列番号510)、TAR2h-178 (配列番号511)、TAR2h-201 (配列番号512)、TAR2h-202 (配列番号513)、TAR2h-203 (配列番号514)、TAR2h-204 (配列番号515)、TAR2h-185-25 (配列番号516)、TAR2h-154-10 (配列番号517)、およびTAR2h-205 (配列番号627)からなる群より選択されるdAbのアミノ酸配列に対して少なくとも約95％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、上記ドメイン抗体（dAb）単量体。
【請求項２４】
請求項8、17、および21〜23のいずれか1項に定義したdAbを含んでなるリガンド。
【請求項２５】
前記リガンドがTNFR1結合成分と半減期延長性成分とを含んでなる、請求項24に記載のリガンド。
【請求項２６】
半減期延長性成分がポリエチレングリコール成分、血清アルブミンもしくはその断片、トランスフェリンレセプターもしくはそのトランスフェリン結合部分、またはin vivoで半減期を長期化するポリペプチドに対する結合部位を含む抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項25に記載のリガンド。
【請求項２７】
半減期延長性成分が、血清アルブミンまたは新生児Fcレセプターに対する結合部位を含む抗体または抗体フラグメントである、請求項26に記載のリガンド。
【請求項２８】
半減期延長性成分がdAbである、請求項27に記載のリガンド。
【請求項２９】
請求項8、17、および21〜23のいずれか1項に定義したdAbをコードする単離された核酸。
【請求項３０】
請求項8、17、および21〜23のいずれか1項に定義したdAbをコードする組換え核酸。
【請求項３１】
請求項8、17、および21〜23のいずれか1項に定義したdAbをコードする組換え核酸を含有するベクター。
【請求項３２】
前記組換え核酸に機能的に連結された発現制御配列をさらに含む、請求項31に記載のベクター。
【請求項３３】
請求項31に記載のベクターまたは請求項30に記載の組換え核酸を含有する宿主細胞。
【請求項３４】
請求項33に記載の宿主細胞を、組換え核酸またはベクターの発現を可能にする条件下で維持し、それによりポリペプチドを産生させることを含んでなる、ポリペプチドの産生方法。
【請求項３５】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のアンタゴニスト、請求項18〜21および24〜28のいずれか1項に記載のリガンド、または請求項22もしくは23に記載のdAbと、薬理学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項３６】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）を介したシグナル伝達を阻害するが、TNFαとTNFR1との結合は実質的に阻害しない医薬を製造するための、TNFR1と結合するTNFR1のアンタゴニストの使用。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項36に記載の使用。
【請求項３８】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項36に記載の使用。
【請求項３９】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項36〜38のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４０】
前記アンタゴニストがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項39に記載の使用。
【請求項４１】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項39に記載の使用。
【請求項４２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）を介したシグナル伝達を阻害するが、TNFR1のシェディングは実質的に阻害しない医薬を製造するための、TNFR1と結合するがTNFR1のドメイン4とは結合しない、TNFR1のアンタゴニストの使用。
【請求項４３】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項42に記載の使用。
【請求項４４】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項42に記載の使用。
【請求項４５】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項42〜44のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４６】
前記アンタゴニストがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項45に記載の使用。
【請求項４７】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項45に記載の使用。
【請求項４８】
前記アンタゴニストがTNFαとTNFR1との結合を阻害する、請求項42〜44のいずれか1項に記載の使用。
【請求項４９】
アンタゴニストdAbがTNFR1のドメイン3と結合する、請求項42〜44および48のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５０】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-l54-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する、請求項42〜44、48および49のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５１】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のドメイン1と結合して、TNFR1を介したシグナル伝達を阻害する医薬を製造するための、TNFR1と結合するTNFR1のアンタゴニストの使用。
【請求項５２】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項51に記載の使用。
【請求項５３】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項51に記載の使用。
【請求項５４】
前記アンタゴニストがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項51〜53のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５５】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項51〜53のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５６】
前記アンタゴニストがTNFαとTNFR1との結合を実質的に阻害しない、請求項51〜55のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５７】
前記アンタゴニストがTNFR1のシェディングを実質的に阻害しない、請求項51〜56のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５８】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）のドメイン3と結合して、TNFR1を介したシグナル伝達を阻害する医薬を製造するための、TNFR1と結合するTNFR1のアンタゴニストの使用。
【請求項５９】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項58に記載の使用。
【請求項６０】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項58に記載の使用。
【請求項６１】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-l54-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する、請求項58〜60のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６２】
腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1）を介したシグナル伝達を阻害するが、内因性の可溶性TNFR1の調節活性は実質的に阻害しない医薬を製造するための、TNFR1と結合するがTNFR1のドメイン4とは結合しない、TNFR1のアンタゴニストの使用。
【請求項６３】
前記アンタゴニストが抗体または抗体フラグメントである、請求項62に記載の使用。
【請求項６４】
前記アンタゴニストがドメイン抗体（dAb）である、請求項62に記載の使用。
【請求項６５】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン1と結合する、請求項62〜64のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６６】
前記アンタゴニストがマウスTNFR1との結合についてTAR2m-21-23と競合する、請求項65に記載の使用。
【請求項６７】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-205と競合する、請求項65に記載の使用。
【請求項６８】
前記アンタゴニストがTNFR1のドメイン3と結合する、請求項62〜64のいずれか1項に記載の使用。
【請求項６９】
前記アンタゴニストがヒトTNFR1との結合についてTAR2h-131-8、TAR2h-15-8、TAR2h-35-4、TAR2h-l54-7、TAR2h-154-10またはTAR2h-185-25と競合する、請求項68に記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月12日(2007.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
更なる実施形態においては、該リガンドは、腫瘍壊死因子レセプターI（TNFR1、p55、CD120a）に300nM〜5pMのKdで特異的に結合するドメイン抗体（dAb）単量体を含み、TAR2h-131-8 (配列番号433), TAR2h-131-24 (配列番号434), TAR2h-15-8 (配列番号435), TAR2h-15-8-1 配列番号436), TAR2h-15-8-2 (配列番号437), TAR2h-185-23 (配列番号438), TAR2h-154-10-5 (配列番号439), TAR2h-14-2 (配列番号440), TAR2h-151-8 (配列番号441), TAR2h-152-7 (配列番号442), TAR2h-35-4 (配列番号443), TAR2h-154-7 (配列番号444), TAR2h-80 (配列番号445), TAR2h-81 (配列番号446), TAR2h-82 (配列番号447), TAR2h-83 (配列番号448), TAR2h-84 (配列番号449), TAR2h-85 (配列番号450), TAR2h-86 (配列番号451), TAR2h-87 (配列番号452), TAR2h-88 (配列番号453), TAR2h-89 (配列番号454), TAR2h-90 (配列番号455), TAR2h-91 (配列番号456), TAR2h-92 (配列番号457), TAR2h-93 (配列番号458), TAR2h-94 (配列番号459), TAR2h-95 (配列番号460), TAR2h-96 (配列番号461), TAR2h-97 (配列番号462), TAR2h-99 (配列番号463), TAR2h-100 (配列番号464), TAR2h-101 (配列番号465), TAR2h-102 (配列番号466), TAR2h-103 (配列番号467), TAR2h-104 (配列番号468), TAR2h-105 (配列番号469), TAR2h-106 (配列番号470), TAR2h-107 (配列番号471), TAR2h-108 (配列番号472), TAR2h-109 (配列番号473), TAR2h-110 (配列番号474), TAR2h-111 (配列番号475), TAR2h-112 (配列番号476), TAR2h-113 (配列番号477), TAR2h-114 (配列番号478), TAR2h-115 (配列番号479), TAR2h-116 (配列番号480), TAR2h-117 (配列番号481), TAR2h-118 (配列番号482), TAR2h-119 (配列番号483), TAR2h-120 (配列番号484), TAR2h-121 (配列番号485), TAR2h-122 (配列番号486), TAR2h-123 (配列番号487), TAR2h-124 (配列番号488), TAR2h-125 (配列番号489), TAR2h-126 (配列番号490), TAR2h-127 (配列番号491), TAR2h-128 (配列番号492), TAR2h-129 (配列番号493), TAR2h-130 (配列番号494), TAR2h-131 (配列番号495), TAR2h-132 (配列番号496), TAR2h-133 (配列番号497), TAR2h-151 (配列番号498), TAR2h-152 (配列番号499), TAR2h-153 (配列番号500), TAR2h-154 (配列番号501), TAR2h-159 (配列番号502), TAR2h-165 (配列番号503), TAR2h-166 (配列番号504), TAR2h-168 (配列番号505), TAR2h-171 (配列番号506), TAR2h-172 (配列番号507), TAR2h-173 (配列番号508), TAR2h-174 (配列番号509), TAR2h-176 (配列番号510), TAR2h-178 (配列番号511), TAR2h-201 (配列番号512), TAR2h-202 (配列番号513), TAR2h-203 (配列番号514), TAR2h-204 (配列番号515), TAR2h-185-25 (配列番号516), TAR2h-154-10 (配列番号517)およびTAR2h-205 (配列番号627)よりなる群から選ばれるアミノ酸配列またはdAbに対して少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％または少なくとも約99％相同であるアミノ酸配列を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２４】
2008515420.tif 000141
1.1.2  ライブラリー作製
ガイディングdAbに対応するN末端V遺伝子を、Nco1およびXho1制限部位を利用してリンカーの上流にクローニングした。VH遺伝子には適合可能な部位がすでに存在するが、Vκ遺伝子のクローニングには、適当な制限部位の導入が必要であった。これは、改変用PCRプライマー(VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat (配列番号638); VKXho1R: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3' (配列番号639))を用いて、SuperTaq (HTBiotechnology Ltd)とpfu turbo (Stratagene)の2:1混合物を用いる30サイクルのPCR増幅により行った。このことにより5'末端のNco1部位は維持されたが、隣接するSal1部位は破壊され、かつ3'末端にはXho1部位が導入された。5つのガイディングdAb、すなわちTAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK)およびTAR2-7(VK)を3種の二量体ベクターそれぞれにクローニングした。すべての構築物は配列解析により確認した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５０】
1.5.4  ヒンジ二量体化
システイン結合形成を介したdAbの二量体化を検討した。ヒトIgGC1ヒンジの改変型である短いアミノ酸配列EPKSGDKTHTCPPCP(配列番号15)をdAbのC末端領域に遺伝子操作して付加した(engineered)。この配列をコードするオリゴリンカーを、先に説明したように合成してアニーリングした。このリンカーを、Xho1およびNot1制限部位を利用して、TAR1-5-19を含有するpEDAベクターにクローニングした。二量体化は、ペリプラズムにおいてその場で(in situ)起こる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８１】
(*TAR1-5-19CYS配列の開始位置; TAR1-5-19CYSアミノ酸配列(配列番号633; TAR1-5-19CYS ヌクレオチド配列 (配列番号634、コード鎖; 配列番号635、非コード鎖))
フォワードプライマー
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
(配列番号296)
リバースプライマー
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’
(配列番号297)
PCR反応 (50μL容量)は次のように設定した。すなわち、200μM dNTP、0.4μMの各プライマー、5μLの10x PfuTurbo バッファー(Stratagene)、100 ngの鋳型プラスミド(TAR1-5-19をコードする)、1μLのPfuTurbo酵素(Stratagene)、そして滅菌水を用いて容量を50μLに調整する。次のPCR条件を使用した:最初の変性ステップを94℃で2分行い、次に94℃で30秒、64℃で30秒および72℃で30秒を25サイクル行う。最後の伸長ステップも追加して72℃で5分行った。PCR産物を精製し、SalIおよびBamHIで消化し、同じ制限酵素で切断済みのベクターに連結した。クローンが正しいものであるかはDNA配列決定により確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９９】
次に、クローンMSA16およびMSA26を、HAタグ(核酸配列: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA (配列番号 631)およびアミノ酸配列: YPYDVPDYA (配列番号632))を有する発現ベクターにクローニングし、2〜10 mgの量を大腸菌(E. coli)で発現させ、上清からプロテインL-アガロースアフィニティー樹脂(Affitech, Norway)を用いて精製し、グリシンpH2.2で溶出させた。dAbのマウスにおける血清半減期を決定した。MSA26およびMSA16を約1.5mg/kgで１回の静脈(i.v.)注射としてCD1マウスに投与した。血清レベルの分析は、ヤギ抗HA(Abcam, UK)捕捉およびプロテインL-HRP(invitrogen)検出ELISA(4％Marvelでブロッキング)により行った。洗浄は0.05％tween PBSを用いて行った。既知濃度のdAbの標準曲線を、1xマウス血清の存在下で作成し、試験サンプルとの比較可能性を確実にした。2コンパートメントモデルを用いたモデル化は、MSA-26のt1/2αが0.16時間であり、t1/2βが14.5時間であり、曲線の下の面積(AUC)が465hr.mg/ml(データ未掲載)であること、およびMSA-16のt1/2αが0.98時間であり、t1/2βが36.5時間であり、AUCが913hr.mg/ml(図18)であることを示した。いずれの抗MSAクローンも、HEL4(抗ニワトリ卵白リゾチームdAb)(そのt1/2αは0.06時間であり、t1/2βは0.34時間である)と比較してかなり長い半減期を有していた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１２】
TAR2m-21-23 3U TAR7m-16は、マウスTNFR1に結合するdAbと、ペプチドリンカーを介して連結された、マウス血清アルブミンに結合するdAbとを含有する二重特異性リガンドである。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16をコードするヌクレオチド配列および二重特異性リガンドのアミノ酸配列を、それぞれ下に配列番号636および配列番号637として示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１３】
2008515420.tif 000142
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６００】
【図１】VH HSAの抗原結合部位にある位置H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98での多様化（それぞれDVTまたはNNKによりコードされる）を示す。（配列番号1、ヌクレオチド配列；配列番号2、アミノ酸配列）。Vκの配列は位置L50、L53で多様化される。
【図２】一本鎖Fv（scFv）ライブラリーを作製するために用いたプラスミドpITl/pIT2の構造を示す概略図であり、発現制御およびクローニング領域にわたるプラスミドのヌクレオチド配列（配列番号3）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号4）を示す。このプラスミドを用いて、         ライブラリー1：生殖系列 Vκ/DVT VH        ライブラリー2：生殖系列 Vκ/NNK VH        ライブラリー3：生殖系列 VH/DVT Vκ および        ライブラリー4：生殖系列 VH/NNK Vκをファージディスプレイ/ScFvフォーマットで作製した。これらのライブラリーは、クローンおよび選択したライブラリーの大多数が機能性であるように、ジェネリックなリガンドであるプロテインAおよびプロテインLとの結合について予備選択した。ライブラリーはHSA (第1ラウンド)およびβ-gal (第2ラウンド)すなわちHSA β-gal選択で、またはβ-gal (第1ラウンド)およびHSA (第2ラウンド)すなわちβ-gal HSA選択で選択した。PCRのこれらのクローンからの可溶性scFvを該配列で増幅させる。二重特異性抗体K8をコードする1個のクローンをさらなる研究のために選択した。
【図３】VH鎖（VHダミー(配列番号5)、K8 (配列番号6)、VH2 (配列番号7)、VH4 (配列番号8)、VHC11 (配列番号9)、VHAlOsd (配列番号10)、VHAlsd (配列番号11)、VHA5sd (配列番号12)、VHC5sd (配列番号13)、VHCllsd (配列番号14)）およびVκ鎖（Vκダミー(配列番号16)、K8 (配列番号17)、E5sc (配列番号18)、C3 (配列番号19)）のアライメントを示す。
【図４】K8抗体の結合特性の特徴づけを示す。K8抗体の結合特性はモノクローナルファージELISAにより特徴づけられ、二重特異性K8抗体はHSAとβ-galに結合することが見出され、1.0を超える吸光度シグナルでファージの表面にディスプレイされた。他のタンパク質との交差反応性は検出されなかった。
【図５】既知濃度のK8抗体フラグメントを用いて実施した可溶性scFv ELISAを示す。96ウェルプレートにlOOμgのHSA、10μg/mlのBSAとβ-gal、および100μg/mlのプロテインAを1μg/mlの濃度でコーティングした。K8 scFvの連続希釈物50μgを添加し、結合した抗体フラグメントをプロテインL-HRPにより検出した。ELISAの結果からK8抗体の二重特異性の性質が確認される。
【図６】可溶性scFv ELISAを用いて分析したクローンK8 Vκ/ダミーVHの結合特性を示す。可溶性scFvフラグメントの産生をHarrisonら, Methods Enzymol. 1996; 267:83-109に記載されるようにIPTGで誘発し、scFvを含有する上清を直接アッセイした。可溶性scFv ELISAを実施例1に記載するとおりに実施し、結合したscFvをプロテインL-HRPにより検出した。ELISAの結果から、このクローンはまだβ-galと結合できるが、BSAとの結合は完全に失われたことが明らかになった。
【図７】可変ドメインベクター1および2の配列（配列番号2および配列番号3）を示す。
【図８】VH1/VH2多重特異性リガンドを構築するために用いたCHベクターの地図である。
【図９】Vκ1/Vκ2多重特異性リガンドを構築するために用いたCKベクターの地図である。
【図１０】TAR1-5二量体4、TAR1-5-19二量体4、およびTAR1-5-19単量体を比較したTNFレセプターアッセイを示す。
【図１１】TAR1-5二量体1〜6を比較したTNFレセプターアッセイを示す。全ての二量体はFPLC精製したものであり、最適な二量体種の結果を示してある。
【図１２】TAR1-5 19ホモ二量体の異なるフォーマット（すなわち、3U、5Uまたは7Uリンカーを含むdAb-リンカー-dAbフォーマット、Fabフォーマット、およびシステインヒンジリンカーフォーマット）でのTNFレセプターアッセイを示す。
【図１３】ライブラリー1のダミーVH配列を示す（アミノ酸配列(配列番号5); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号20)、非コード鎖(配列番号21)）。VHフレームワークの配列は生殖系列配列DP47-JH4bに基づく。ライブラリー1にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１４】ライブラリー2のダミーVH配列を示す（アミノ酸配列(配列番号22); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号23)、非コード鎖(配列番号24)）。VHフレームワークの配列は生殖系列配列DP47-JH4bに基づく。ライブラリー2にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１５】ライブラリー3のダミーVκ配列を示す（アミノ酸配列(配列番号16); ヌクレオチド配列: コード鎖(配列番号25)、非コード鎖(配列番号26)）。Vκフレームワークの配列は生殖系列配列DPK9-JK1に基づく。ライブラリー3にNNKランダム化（N＝AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K＝GまたはTヌクレオチド）が組み込まれた位置を下線で示してある。
【図１６】抗MSA dAbであるMSA 16 (ヌクレオチド配列(配列番号27)、アミノ酸配列(配列番号28))およびMSA 26 (ヌクレオチド配列(配列番号29)、アミノ酸配列(配列番号30))のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。
【図１７ａ】MSA 16の阻害Biacoreを示す。精製したdAb MSAl6を阻害Biacoreで分析してKdを決定した。簡単に説明すると、このdAbは、高密度のMSAをコーティングしたBiacore CM5チップ上で200RUの応答を達成するのに必要なdAbの濃度を決定するために試験された。必要なdAbの濃度が決定されたら、予想されるKd付近の濃度範囲のMSAをdAbと予備混合し、一晩インキュベートした。その後、予備混合物におけるdAbのMSAコーティングBiacoreチップへの結合を30μl/分の高流量で測定した。
【図１７ｂ】MSA 26の阻害Biacoreを示す。精製したdAb MSA26を阻害Biacoreで分析してKdを決定した。簡単に説明すると、このdAbは、高密度のMSAをコーティングしたBiacore CM5チップ上で200RUの応答を達成するのに必要なdAbの濃度を決定するために試験された。必要なdAbの濃度が決定されたら、予想されるKd付近の濃度範囲のMSAをdAbと予備混合し、一晩インキュベートした。その後、予備混合物におけるdAbのMSAコーティングBiacoreチップへの結合を30μl/分の高流量で測定した。
【図１８】注入後のMSA 16の血清レベルを示す。dAb MSA16の血清半減期をマウスで測定した。CD1マウスに約1.5 mg/kgで1回の静注を行うことによりMSA16を投与した。2コンパートメントモデルを用いたモデル化は、MSA16のt1/2αが0.98 hr、t1/2βが36.5 hr、AUCが913 hr.mg/mlであることを示した。MSA16がかなり長い半減期をもつのに対して、HEL4 (抗雌ニワトリ卵白リゾチームdAb)はt1/2αが0.06 hrで、t1/2βが0.34 hrであった。
【図１９】MSA26CκおよびTAR1-5-19CHを含むFab様フラグメントによるTNF結合の阻害を示すELISA (図19a)およびTNFレセプターアッセイ(図19b、19c)。Fab様フラグメントと共にMSAを添加すると、阻害のレベルが低下する。1μg/mlのTNFαをコーティングしたELISAプレートを、二重特異性Vκ CHおよびVκ Cκ Fab様フラグメントでプロービングし、また、対照のTNFα結合dAbでもプロービングした（その際、ELISAで同様のシグナルを与えるように計算されたdAb濃度を用いた）。二重特異性タンパク質と対照dAbの両方を用いて、2 mg/mlのMSAの存在下または不在下でELISAプレートをプロービングした。二重特異性ウェルでのシグナルは50％以上減少したが、dAbウェルでのシグナルはまったく減少しなかった（図19a参照）。この同じ二重特異性タンパク質をMSAの存在下または不在下でレセプターアッセイにも使用し、またMSAによる競合も示した（図19c参照）。このことは、MSAの二重特異性タンパク質への結合がTNFαへの結合と競合することを実証する。
【図２０】TAR1-5-19 dAbとMSA16 dAbのジスルフィド結合ヘテロ二量体によるTNF結合の阻害を示すTNFレセプターアッセイ。該二量体と共にMSAを添加すると、用量依存的に阻害レベルが低下する。TNFレセプターアッセイ（図19b）は一定濃度のヘテロ二量体(18nM)および希釈系列のMSAまたはHSAの存在下で行った。ある濃度範囲（最大2 mg/ml）のHSAの存在は、TNFαを阻害する該二量体の能力を低下させなかった。しかし、MSAを添加すると、TNFαを阻害する該二量体の能力が用量依存的に低下した（図19a）。このことは、MSAとTNFαとがcys結合TAR1-5-19, MSA16二量体への結合について競合することを実証する。MSAおよびHSAは単独ではこのアッセイにおいてTNF結合のレベルに影響を及ぼさなかった。
【図２１Ａ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号31〜38）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。記号〜は相補性決定領域（CDR）の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２１Ｂ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号39〜45）を示す。
【図２１Ｃ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号46〜52）を示す。
【図２１Ｄ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号53〜59）を示す。
【図２１Ｅ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号60〜67）を示す。
【図２１Ｆ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号68〜75）を示す。
【図２１Ｇ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号76〜83）を示す。
【図２１Ｈ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号84〜91）を示す。
【図２１Ｉ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号92〜98）を示す。
【図２１Ｊ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号373〜379）を示す。
【図２１Ｋ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号380〜387）を示す。
【図２１Ｌ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号388〜395）を示す。
【図２１Ｍ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号396〜401および431）を示す。
【図２２Ａ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号99〜103）を示す。示したヌクレオチド配列はギャップのない連続配列である。記号〜はCDRをコードする配列の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1をコードする配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２２Ｂ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号104〜108）を示す。
【図２２Ｃ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号109〜113）を示す。
【図２２Ｄ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号114〜118）を示す。
【図２２Ｅ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号119〜123）を示す。
【図２２Ｆ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号124〜128）を示す。
【図２２Ｇ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号129〜133）を示す。
【図２２Ｈ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号134〜138）を示す。
【図２２Ｉ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号139〜143）を示す。
【図２２Ｊ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号144〜148）を示す。
【図２２Ｋ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号149〜153）を示す。
【図２２Ｌ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号154〜158）を示す。
【図２２Ｍ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号159〜163）を示す。
【図２２Ｎ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号164〜166および402〜403）を示す。
【図２２Ｏ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号404〜408）を示す。
【図２２Ｐ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号409〜413）を示す。
【図２２Ｑ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号414〜418）を示す。
【図２２Ｒ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号419〜423）を示す。
【図２２Ｓ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号424〜428）を示す。
【図２２Ｔ】図21に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号429〜430および432）を示す。
【図２３Ａ】マウスTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号167〜174）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。一部の配列には、相補性決定領域（CDR）の位置を示すために記号〜が挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２３Ｂ】マウスTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号175〜179）を示す。
【図２４Ａ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号180〜185）を示す。
【図２４Ｂ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号186〜190）を示す。
【図２４Ｃ】図23に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号191〜192および626）を示す。配列番号186および配列番号626は双方とも配列番号173のアミノ酸配列をコードする。CDR1をコードする配列番号626の配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２５Ａ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号193〜198）を示す。
【図２５Ｂ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号200〜205）を示す。
【図２５Ｃ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号206〜214）を示す。
【図２５Ｄ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号215〜223）を示す。
【図２５Ｅ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号224〜232）を示す。
【図２５Ｆ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号233〜241）を示す。
【図２５Ｇ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号242〜250）を示す。
【図２５Ｈ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号251〜259）を示す。
【図２５Ｉ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号260〜268）を示す。
【図２５Ｊ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号269〜277）を示す。
【図２５Ｋ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号278〜286）を示す。
【図２５Ｌ】数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列およびコードされるヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号287〜295）を示す。
【図２６】抗TNFR1 dAbフォーマットがL929アッセイにおいてTNFR1に対しアゴニスト作用を実質的にもたないことを示すグラフである。L929細胞は以下の成分を含む培地中で培養した：ある濃度範囲の抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m-21-23)、市販の抗myc抗体(9E10)により架橋されたTAR2m-21-23単量体、二重特異性TNFR1 dAb/抗SA dAb (TAR2m-21-23 3U TAR7m-16)、またはpeg化した抗TNFR1 dAb単量体(TAR2m-21-23 4OK PEG)。抗myc抗体により架橋されたTAR2m-21-23単量体の場合には、dAbと抗体を2：1の割合で混合し、培養に先立ってin vivo免疫架橋の影響をシミュレートするために室温で1時間プレインキュベートした。（TAR2m-21-23単量体にはmycエピトープが含まれる。）TAR2m-21-23単量体は3,000 nMの濃度でL929細胞とインキュベートした。TAR2m-21-23単量体と抗Myc抗体は3,000 nMのdAb濃度でインキュベートした。TAR2m-21-23 3U TAR7m-16は25 nM、83.3 nM、250 nM、833 nMおよび2,500 nMの濃度で該細胞とインキュベートした。TAR2m-21-23 40K PEGは158.25 nM、527.5 nM、1582.5 nM、5,275 nMおよび15,825 nMの濃度で該細胞とインキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞の生存率を評価した。これらの結果は、L929細胞と10 nM、1 nMまたは0.1 nMの市販の抗TNFR1 IgG抗体（TNFR1と架橋して、TNFR1に対しアゴニスト作用をもつ）（カタログ番号AF-425-PB; R&D Systems, Minneapolis, MN）とのインキュベーションが生存不能の細胞の用量依存的増加をもたらすことを明らかにした。これにより、TNFR1のアゴニストに対するこれらの細胞の感受性が実証される。これに対して、様々な量の抗TNFR1フォーマットとのインキュベーションは、TNFR1に対しアゴニスト作用を示さず、たとえ市販の抗TNFR1 IgG抗体の濃度の1000倍を超える濃度で使用したときでさえ、培養物中の生存不能細胞の数を増加させなかった。
【図２７Ａ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号433〜442）を示す。示したアミノ酸配列はギャップのない連続配列である。記号〜は相補性決定領域（CDR）の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1は〜によって挟まれており、CDR2は〜〜によって挟まれており、CDR3は〜〜〜によって挟まれている。
【図２７Ｂ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号443〜452）を示す。
【図２７Ｃ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号453〜462）を示す。
【図２７Ｄ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号463〜471）を示す。
【図２７Ｅ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号473〜481）を示す。
【図２７Ｆ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号482〜491）を示す。
【図２７Ｇ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号492〜501）を示す。
【図２７Ｈ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号502〜511）を示す。
【図２７Ｉ】ヒトTNFR1に対し結合特異性を有する数種のヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号512〜517および627）を示す。
【図２８Ａ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号518〜523）を示す。示したヌクレオチド配列はギャップのない連続配列である。記号〜はCDRをコードする配列の位置を示すために配列に挿入されている。CDR1をコードする配列は〜によって挟まれており、CDR2をコードする配列は〜〜によって挟まれており、CDR3をコードする配列は〜〜〜によって挟まれている。
【図２８Ｂ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号524〜529）を示す。
【図２８Ｃ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号530〜535）を示す。
【図２８Ｄ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号536〜541）を示す。
【図２８Ｅ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号542〜547）を示す。
【図２８Ｆ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号548〜552）を示す。
【図２８Ｇ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号553〜558）を示す。
【図２８Ｈ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号559〜564）を示す。
【図２８Ｉ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号565〜570）を示す。
【図２８Ｊ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号571〜576）を示す。
【図２８Ｋ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号577〜582）を示す。
【図２８Ｌ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号583〜588）を示す。
【図２８Ｍ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号589〜594）を示す。
【図２８Ｎ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号595〜600）を示す。
【図２８Ｏ】図27に示したヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする数種の核酸のヌクレオチド配列（配列番号601〜602および628）を示す。
【国際調査報告】
2008515420.tif 000143
2008515420.tif 000144
2008515420.tif 000145
2008515420.tif 000146