(57)【要約】本発明は、バイオディーゼル生産中の副産物である粗製グリセロールを、それ以上処理せずに、1,3-プロパンジオールを産生するための基質として用いる段階；バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に、1,3-プロパンジオール産生菌株を接種する段階；バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて発酵させる段階；pHを6.8から8.0の範囲に維持する段階；ならびに発酵の終わりに、1,3-プロパンジオールを単離および精製する段階を含む、1,3-プロパンジオールの産生方法を開示する。2008541738.tif 000004
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを用いた1,3-プロパンジオールの産生方法であって、下記の段階を含む方法：
（a）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に、1,3-プロパンジオール産生細菌株を接種する段階、
（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて発酵させる段階、ならびに
（c）1,3-プロパンジオールを単離および精製する段階。
【請求項２】
バイオディーゼル生産からの粗製グリセロールが、バイオディーゼル生産中に生成される副産物である粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階（a）における1,3-プロパンジオール産生細菌株が肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、およびクロストリジウム-パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階（a）において、細菌株を30℃から37℃で16から20時間培養することを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
段階（b）における発酵培地が、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを10から30g/L含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階（b）における発酵中のpHを6.8から8.0の範囲に維持することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項７】
3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアを用いてpHを維持することを特徴とする、請求項6記載の方法。
【請求項８】
段階（b）における発酵を嫌気性または好気性条件下、30℃から37℃で実施することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項９】
段階（b）において、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール、または粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給し、かつ発酵ブロス中のグリセロール濃度を10から40g/Lに維持することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
混合物中のグルコースとグリセロールの濃度比が5〜10：1であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留（vacuum rectification）により単離および精製することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
同時生成物である2,3-ブタンジオール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸を生成することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
バイオディーゼル生産において生成される副産物である粗製グリセロールを、いかなるそれ以上の処理もせずに、流加発酵中の供給基質として供給することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
1,3-プロパンジオールを発酵産生するための基質粗製グリセロールが、化学的方法、生物学的方法、または超臨界法によるバイオディーゼル生産において生成される副産物で、それ以上処理されていない、粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを、1,3-プロパンジオールを発酵産生するための基質として用いることを特徴とし、下記の段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法：
（a）肺炎桿菌、酪酸菌、およびクロストリジウム-パストゥリアヌムからなる群より選択される菌株を、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に接種して、30℃から37℃で16時間から20時間インキュベートする段階、
（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて、嫌気性または好気性発酵のために30℃から37℃でインキュベートし、ここで粗製グリセロールまたは粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給し、かつ発酵ブロス中のグリセロール濃度を10〜40g/Lに維持し、ここで混合物中のグルコース対グリセロールの濃度比は5〜10：1であり、かつ3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアを用いてpHを6.8から8.0の範囲に維持する段階、ならびに
（c）発酵後、1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留により単離および精製し、かつ好ましくは2,3-ブチレングリコール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸などの他の副産物を得る段階。
【請求項１６】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを流加発酵中の供給基質として供給することを特徴とする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
1,3-プロパンジオールを産生するための発酵基質が、化学的方法、生物学的方法、または超臨界法によるバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項15記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生化学工学の分野に関する。特に、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを用いた1,3-プロパンジオールの産生方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
バイオディーゼルは再生可能なエネルギー源の一つで、図1に示すとおり、調理油などの植物油、動物脂肪、または廃油から作られる。
【０００３】
バイオディーゼルはクリーンな再生可能エネルギーとして、米国、欧州、および日本などの多くの国や地域で広く用いられている。今日まで、バイオディーゼルは中国では工業化されていなかった。バイオディーゼル生産のための方法には主に下記が含まれる：
（1）化学的方法、現在は主に工業において用いられ、酸性または塩基性触媒存在下でのエステル交換により、植物油または動物油のグリセロール基をメタノールまたはエタノールなどの低炭素アルコールで置換して対応する脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルを生成する（Ma F, Hanna M A. Biodiesel production: a review. Bioresource Technology, 1999, 70:1-15(非特許文献1)）。
（2）生物学的方法、エステル交換反応を触媒するために生物酵素または細胞を用い、対応する脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルを生成する（Ma F, Hanna M A. Biodiesel production: a review. Bioresource Technology, 1999, 70:1-15(非特許文献1)）。
（3）超臨界法、エステル交換反応をいかなる触媒も用いずに超臨界溶媒系で実施する。（Saka S, Kusdiana D. Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol. Fuel, 2001, 80(2):225-231(非特許文献2); Kusdiana D, Saka S. Kinetics of transesterification in rapeseed oil to biodiesel fuel as treated in supercritical methanol. Fuel, 2001, 80(5):693-698(非特許文献3); Miao Xiao-ling, Wu Qing-yu, Exploitation of biomass renewable energy sources of microalgae. Renewable Energy, 2003, No.3:13-16(非特許文献4)）。
【０００４】
前述の方法を用いたバイオディーゼル生産中に、副産物であるグリセロールが得られる。バイオディーゼル生産がますます発展するにつれて、グリセロール生成も対応して増大する。バイオディーゼル生産からの副産物であるグリセロールをいかに効率よく利用するかは、バイオディーゼル大量生産にとって普遍的問題となる。
【０００５】
有機溶媒として、1,3-プロパンジオール（PDO）は、印刷インク、染色、コーティング、滑沢剤、および不凍剤の分野などの工業における重要な化学原料である。1,3-プロパンジオールは主にポリエステルおよびポリウレタンの合成、特にテレフタル酸および1,3-プロパンジオールの重合によるポリ(トリメチレンテレフタレート)（PTT）の合成におけるモノマーとして用いられ、モノマーとして1,2-プロパンジオール、ブタンジオール、またはエタンジオールの重合により得られる伝統的ポリマーよりも有益な特徴を示す。毎年何千万トンものポリ(エチレンテレフタレート)（PET）が世界中で消費されている。PTTはPETに匹敵する化学的安定性および生物分解性を有するが、汚染抵抗性、延性、および弾性ならびに紫外線抵抗性に関してより好都合である。加えて、PTT繊維は摩耗抵抗性、低い水吸収性および弱い静電気という利点を有し、カーペット産業においてナイロンと競合しうる。また、不織布、エンジニアリングプラスチック、衣類、家庭用装飾、詰め物および布においても用いることができる。PTTは米国における1998年の6つの新しい石油化学製品（1998's Six New Petrochemical Products in the US）の一つとして評価され、PETの代替品と考えられた。
【０００６】
PTTの優れた性能および商業的可能性は早くも50年前に認識されていた。1,3-プロパンジオール生成が難しく、コストが高いことから、工業スケールでPTTを生成することは非常に困難である。現在、DuPontおよびShellだけが原材料としてオキサンまたはプロペンを用いて大規模でのPTT生成のために1,3-プロパンジオールを合成することができる。化学的方法の欠点には、例えば、副産物が多い、選択性が低い、操作に高温高圧が必要、装置への過度の投資、再生不可能な原材料、ならびにオキサンおよびもう一つの合成経路の中間体であるアクロレインの引火性、爆発性、または極度の毒性が含まれる。発酵による1,3-プロパンジオールの産生は選択性が高く、操作条件が緩和であるため、近年注目を集めている。ここで、発酵によるグリセロールから1,3-プロパンジオール産生の主な経路には下記が含まれる：
1）腸内細菌を用いる嫌気性条件下での発酵によるグリセロールの1,3-プロパンジオールへの変換（USP5254467(特許文献1)、EP0373230A1(特許文献2)）。
2）クレブシエラ属（Klebsiella）などの嫌気性菌を用いる嫌気性条件下での発酵による1,3-プロパンジオールの産生（Ruch et al. Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes. J Bacteriol. 1974, 119(1):50-56(非特許文献5); Streekstra et al. Overflow metabolism during anaeric growth of Klebsiella pneumoniae NCTC418 on glycerol and dihydroxyacetone in chemostat culture. Arch Microbiol. 1987, 147:268-275(非特許文献6); Zeng et al. Pathway analysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniae: Regulation of reducing equivalent balance and product formation. Enzyme Microbiol Technol. 1993, 15:770-779(非特許文献7)）。
3）クレブシエラ属を用いる微好気性条件下での発酵による1,3-プロパンジオールの産生（Wang Jian-feng et al, Study on microaerobic conversion of glycerol to 1,3-propanediol by Klebsielle pneumoniae. Modern Chemical Industry, 2001, 21(5):28-31(非特許文献8). Xiu Zhi-long et al, A method of producing of 1,3-propanediol by fermentation using microbes under microaerobic condition, 中国特許公開番号（Chinese Patent Publication No.）:CN1348007(特許文献3)）。
4）クレブシエラ属を用いる嫌気性条件下での発酵による1,3-プロパンジオールおよび2,3-ブタンジオールの産生（Biebl et al. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50:24-29(非特許文献9)）。
【０００７】
前述の経路で用いる原材料はすべて試薬グリセロールまたはグリセロールを含む発酵ブロスからである。これまでのところ、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールの発酵による1,3-プロパンジオール産生について報告はない。Xiu Zhi-longら（Xiu Zhi-long et al, A linked method of production of biodiesel and 1,3-propanediol, 中国特許公開番号:CN1648207A(特許文献4)）は、バイオディーゼル生産からの副産物を膜でろ過してグリセロールを単離し、発酵により1,3-プロパンジオールを産生するために用いうると提唱したが、この方法は膜フィルターのコストおよび膜の洗浄・再生の難しさゆえに実施が困難である。さらに、特に大規模生産では、両方の工程を同時に行うことは非常に難しい。
【０００８】
【特許文献１】USP5254467
【特許文献２】EP0373230A1
【特許文献３】Xiu Zhi-long et al, A method of producing of 1,3-propanediol by fermentation using microbes under microaerobic condition, 中国特許公開番号（Chinese Patent Publication No.）:CN1348007
【特許文献４】Xiu Zhi-long et al, A linked method of production of biodiesel and 1,3-propanediol, 中国特許公開番号:CN1648207A
【非特許文献１】Ma F, Hanna M A. Biodiesel production: a review. Bioresource Technology, 1999, 70:1-15
【非特許文献２】Saka S, Kusdiana D. Biodiesel fuel from rapeseed oil as prepared in supercritical methanol. Fuel, 2001, 80(2):225-231
【非特許文献３】Kusdiana D, Saka S. Kinetics of transesterification in rapeseed oil to biodiesel fuel as treated in supercritical methanol. Fuel, 2001, 80(5):693-698
【非特許文献４】Miao Xiao-ling, Wu Qing-yu, Exploitation of biomass renewable energy sources of microalgae. Renewable Energy, 2003, No.3:13-16
【非特許文献５】Ruch et al. Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes. J Bacteriol. 1974, 119(1):50-56
【非特許文献６】Streekstra et al. Overflow metabolism during anaeric growth of Klebsiella pneumoniae NCTC418 on glycerol and dihydroxyacetone in chemostat culture. Arch Microbiol. 1987, 147:268-275
【非特許文献７】Zeng et al. Pathway analysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniae: Regulation of reducing equivalent balance and product formation. Enzyme Microbiol Technol. 1993, 15:770-779
【非特許文献８】Wang Jian-feng et al, Study on microaerobic conversion of glycerol to 1,3-propanediol by Klebsielle pneumoniae. Modern Chemical Industry, 2001, 21(5):28-31
【非特許文献９】Biebl et al. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 50:24-29
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを直接用いることによる1,3-プロパンジオールの産生方法であって、グリセロールの単離・精製の費用を節約し、コストを有効に削減する方法を提供する。この方法はバイオディーゼルおよび1,3-プロパンジオールの統合生産において有用である。
【００１０】
本発明は、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを直接用いた1,3-プロパンジオールの産生方法であって、バイオディーゼル生産中の副産物である粗製グリセロールを1,3-プロパンジオールにさらに変換し、したがって、グリセロールの単離・精製の費用を節約し、生産コストを有効に削減する方法を提供する。この方法は、バイオディーゼルおよび1,3-プロパンジオールの両方を安価な原材料から製造する、バイオディーゼルおよび1,3-プロパンジオールの統合生産において用いることができる。原材料およびグリセロールの利用率は増大し、生産コストは低下する。
【００１１】
本発明は、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを直接用いた1,3-プロパンジオールの産生方法を提供する。本発明の方法を用いて、1,3-プロパンジオールを産生するために、粗製グリセロールをいかなるそれ以上の処理もせずに直接用いることができる。粗製グリセロールは化学的方法、生物学的方法、または超臨界法によるバイオディーゼル生産からの副産物である。
【００１２】
本発明の一つの態様において、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを基質として用いることを特徴とする、1,3-プロパンジオールの産生方法が提供される。この方法は
（a）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に、1,3-プロパンジオール産生細菌株を接種する段階、
（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて発酵させる段階、ならびに
（c）1,3-プロパンジオールを単離および精製する段階
を含む。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを直接用いた1,3-プロパンジオールの産生方法を提供する。本発明の方法に従い、1,3-プロパンジオールを産生するために、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールをいかなるそれ以上の処理もせずに直接用いることができる。粗製グリセロールは化学的方法、生物学的方法、または超臨界法を用いたバイオディーゼル生産からの副産物でありうる。
【００１４】
一つの態様において、本発明は、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを基質として用いることを特徴とする、1,3-プロパンジオールの産生方法であって、（a）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に、1,3-プロパンジオール産生細菌株を接種する段階、（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて発酵させる段階、ならびに（c）1,3-プロパンジオールを単離および精製する段階を含む方法を提供する。
【００１５】
一つの態様において、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールは、バイオディーゼル生産中に生成される副産物である粗製グリセロールである。
【００１６】
一つの態様において、1,3-プロパンジオール産生菌株は肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、およびクロストリジウム-パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）からなる群より選択することができる。
【００１７】
一つの態様において、流加発酵中の基質として、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールをいかなるそれ以上の処理もせずに直接用いることができる。
【００１８】
一つの態様において、1,3-プロパンジオール産生細菌株を30℃から37℃で16から20時間培養する。
【００１９】
一つの態様において、発酵培地に含まれるグリセロールは、バイオディーゼル生産からの副産物である、濃度が10から30g/Lの粗製グリセロールである。
【００２０】
一つの態様において、発酵中の段階（b）におけるpHは、好ましくは3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアにより、6.8から8.0の範囲に維持する。
【００２１】
一つの態様において、段階（b）における発酵は嫌気性または好気性条件下、30℃から37℃で実施する。
【００２２】
一つの態様において、段階（b）における発酵ブロス中のグリセロール濃度は、粗製グリセロールまたは粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給することにより10から40g/Lに維持し、好ましくは混合物中のグルコース対グリセロールの濃度比は5〜10：1である。
【００２３】
一つの態様において、1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留（vacuum rectification）により単離および精製する。
【００２４】
一つの態様において、2,3-ブタンジオール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸などの他の副産物が得られる。
【００２５】
好ましい態様において、本発明は、バイオディーゼル生産の発酵中の副産物である粗製グリセロールを直接用いた1,3-プロパンジオールの産生方法であって、発酵により1,3-プロパンジオールを産生するための発酵基質として、および流加発酵中の供給基質として、粗製グリセロールを直接用いることを特徴とし、下記の段階を含む方法を提供する：
（a）一般に用いられる肺炎桿菌、酪酸菌、およびクロストリジウム-パストゥリアヌムからなる群より選択される1,3-プロパンジオール産生細菌株を、粗製グリセロールを含む種培地に接種して、好ましくは30℃から37℃で16から20時間培養する段階；
（b）粗製グリセロールを含む発酵培地に種培養物を加えて、好ましくは嫌気性または好気性条件下、30℃から37℃で発酵させ；流加発酵中、粗製グリセロールまたは粗製グリセロールとグルコースの混合物（グリセロール対グルコースの濃度比は5〜10：1である）を供給し、かつ発酵ブロス中のグリセロール濃度を10から40g/Lの範囲に維持し；かつpHを、好ましくは3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアにより、6.8から8.0の範囲に制御する段階；ならびに
（c）発酵後、1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留により単離および精製し、その間に2,3-ブタンジオール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸などの他の副産物を回収する段階。
【００２６】
1,3-プロパンジオールを産生するための前述の発酵における基質は、化学的方法、生物学的方法、または超臨界法を用いたバイオディーゼル生産において生成される副産物である粗製グリセロールである。
【００２７】
本発明において、粗製グリセロールをそれ以上処理せずに直接用いる。そのような粗製グリセロールの一部を発酵基質として用い、他を流加発酵中の供給基質として用いる。
【００２８】
本発明の方法は、バイオディーゼルおよび1,3-プロパンジオールの統合生産において有用である。
【００２９】
本発明の方法の利点は、1,3-プロパンジオールをバイオディーゼル生産における副産物である粗製グリセロールにより産生し、2,3-ブタンジオール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸などの他の広く用いられる化学物質が発酵中の同時生成物として生じることにある。本発明の方法に従い、グリセロールの精製コストが節約され、1,3-プロパンジオールの生産コストが効率的に削減される。この方法をバイオディーゼルおよび1,3-プロパンジオールの統合生産において用いれば、原材料の利用効率およびバイオディーゼルの生産効率が改善されることになり、生産コストが大きく削減されることになる。
【００３０】
定義
本明細書において用いられる「バイオディーゼル」なる用語は、植物油、動物脂肪、および廃油から作られる再生可能なエネルギー源を意味する。
【００３１】
本明細書において用いられる「バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール」なる用語は、バイオディーゼル生産中に得られる副産物である未精製のグリセロールを意味する。
【００３２】
実施例
本発明は、下記の実施例によってさらに例示することになる。下記の実施例において、グリセロールはバイオディーゼル生産中に生成される副産物である粗製グリセロールである。酵母抽出物はWenzhou Jinju Condiment Companyから購入した。K2HPO4はChanghsha Yutai Industry Companyから購入した。KH2PO4はChangsha Gaosheng Techniqure Chemical Companyから購入した。MgSO4はTianjin Changle Chemical Companyから購入した。(NH4)2SO4はSinopec Baling Branch Companyから購入した。泡止め剤はChemical Plant of Zhejiang Universityから購入した。グルコースはShijiazhuang Huaying UnionGlucose Companyから購入した。他の試薬はVAS Chemical Company (China)から購入した。
【００３３】
実施例1：
（1）流加発酵中の発酵および供給のための基質：バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール。
（2）菌株：Institute of Microbiology, Chinese Academy of Scienceから購入した肺炎桿菌（ACCC10082）。
（3）培地：
2008541738.tif 000003
（3）培養：
A.  種培養：バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール20g/Lを含む種培地（培地100mlを含む500mlフラスコ）に肺炎桿菌を接種し、好気性条件下、30℃、150rpmで20時間インキュベートした。
B.  発酵：作業容積4Lの5L発酵槽（Biostat B, Germany）を37℃での発酵に用いた。pH6.8に維持するためにKOHを用いた。バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール30g/Lを含む発酵培地に種培養物を接種した。流加発酵中、グルコースおよびバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを供給し、ここでグリセロール対グルコースの濃度比は8：1であり、発酵ブロス中のグリセロール濃度を30g/Lに維持するために流速を調節した。発酵を0.2vvm窒素通気による嫌気性条件下で行った。
（4）結果：
発酵後、発酵ブロス中の1,3-プロパンジオール濃度は44g/lに達した。1,3-プロパンジオールのモル収率は0.45で、生産性は0.8g/l/hであった。（発酵生成物の測定法はLiu, Dehua et al., Substrate inhibition in fermentation of 1,3-propandiol and countermeasures to it, Modern Chemical Industry, 2002 (7):34-38に記載された。）
【００３４】
実施例2：
（1）流加発酵中の発酵および供給のための基質：バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール。
（2）菌株および培地は実施例1のものと同じであった。
（3）培養：
A.  種培養：肺炎桿菌をバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール20g/Lを含む種培地（培地100mlを含む500mlフラスコ）に接種し、好気性条件下、37℃、150rpmで16時間インキュベートした。
B.  発酵：作業容積4Lの5L発酵槽を37℃での発酵に用いた。pH8.0に維持するためにKOHを用いた。種溶液をバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール30g/Lを含む発酵培地に接種した。流加発酵中、グルコースおよびバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを供給し、ここでグリセロール対グルコースの濃度比は10：1であり、発酵ブロス中のグリセロール濃度を30g/Lに維持するために流速を調節した。発酵開始後32時間は、発酵を0.2vvm窒素通気による嫌気性条件下で行った。32時間後、発酵を0.2vvm空気通気による好気性条件下で行った。
（4）結果：
発酵後、発酵ブロス中の1,3-プロパンジオール濃度は64g/lに達した。1,3-プロパンジオールのモル収率は0.51で、生産性は0.95g/l/hであった。
【００３５】
実施例3：
（1）流加発酵中の発酵および供給のための基質：バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール。
（2）菌株および培地は実施例1のものと同じであった。
（3）培養：
A.  種培養：肺炎桿菌をバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール20g/Lを含む種培地（溶液100mlを含む500mlフラスコ）に接種し、好気性条件下、30℃、150rpmで16時間インキュベートした。
B.  発酵：作業容積40Lの50L発酵槽（Biostat B, Germany）を37℃での発酵に用いた。pH7.0に維持するためにKOHを用いた。種溶液をバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール10g/Lを含む発酵培地に接種した。流加発酵中、グルコースおよびバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを供給し、ここでグリセロール対グルコースの濃度比は10：1であり、発酵ブロス中のグリセロール濃度を最初の10〜16時間は10g/L、16時間経過後は30g/Lに維持するために流速を制御した。発酵中、0.5vvm空気を通気した。
（4）結果：
発酵後、発酵ブロス中の1,3-プロパンジオール濃度は67g/lであった。1,3-プロパンジオールのモル収率は0.59で、生産性は1g/l/hであった。
【００３６】
実施例4：
（1）流加発酵中の発酵および供給のための基質：バイオディーゼル生産中の副産物である粗製グリセロール。
（2）菌株および培地は実施例1のものと同じであった。
（3）培養：
A.  種培養：バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール20g/Lを含む種培地（溶液100mlを含む500mlフラスコ）に肺炎桿菌を接種し、好気性条件下、30℃、150rpmで16時間インキュベートした。
B.  発酵：作業容積350Lの500L発酵槽を37℃での発酵に用いた。pH7.0に維持するためにKOHを用いた。バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール20g/Lを含む発酵培地に種培養物を接種した。流加発酵中、グルコースおよびバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを供給し、ここでグリセロール対グルコースの濃度比は10：1であり、発酵ブロス中のグリセロール濃度を最初の10〜16時間は10g/L、16時間経過後は30g/Lに維持するために流速を制御した。発酵中、0.5vvm空気を通気した。
（4）結果：
発酵後、発酵ブロス中の1,3-プロパンジオール濃度は63.2g/lであった。1,3-プロパンジオールのモル収率は0.60で、生産性は1.1g/l/hであった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】植物油および動物脂肪からのエステル交換によるバイオディーゼル生産のスキームを例示する。
【図１】
2008541738.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月1日(2008.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを用いた1,3-プロパンジオールの産生法であって、下記の段階を含む方法：
（a）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に、1,3-プロパンジオール産生細菌株を接種する段階、
（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて発酵させる段階、ならびに
（c）1,3-プロパンジオールを単離および精製する段階。
【請求項２】
バイオディーゼル生産からの粗製グリセロールが、バイオディーゼル生産中に生成される副産物である粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階（a）における1,3-プロパンジオール産生細菌株が肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、酪酸菌（Clostridium butyricum）、およびクロストリジウム-パストゥリアヌム（Clostridium pasteurianum）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階（a）において、細菌株を30℃から37℃で16から20時間培養することを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
段階（b）における発酵培地が、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを10から30g/L含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階（b）における発酵中のpHを6.8から8.0の範囲に維持することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項７】
3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアを用いてpHを維持することを特徴とする、請求項6記載の方法。
【請求項８】
段階（b）における発酵を嫌気性または好気性条件下、30℃から37℃で実施することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項９】
段階（b）において、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロール、または粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給し、かつ発酵ブロス中のグリセロール濃度を10から40g/Lに維持することを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
混合物中のグリセロール対グルコースの濃度比が5〜10：1であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留（vacuum rectification）により単離および精製することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
同時生成物である2,3-ブタンジオール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸を生成することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
バイオディーゼル生産において生成される副産物である粗製グリセロールを、いかなるそれ以上の処理もせずに、流加発酵中の供給基質として供給することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
1,3-プロパンジオールを発酵産生するための基質粗製グリセロールが、化学的方法、生物学的方法、または超臨界法によるバイオディーゼル生産において生成される副産物で、それ以上処理されていない、粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを、1,3-プロパンジオールを発酵産生するための基質として用いることを特徴とし、下記の段階を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法：
（a）肺炎桿菌、酪酸菌、およびクロストリジウム-パストゥリアヌムからなる群より選択される菌株を、バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む種培地に接種して、30℃から37℃で16時間から20時間インキュベートする段階、
（b）バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを含む発酵培地に、種培養物を加えて、嫌気性または好気性発酵のために30℃から37℃でインキュベートし、ここで粗製グリセロールまたは粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給し、かつ発酵ブロス中のグリセロール濃度を10〜40g/Lに維持し、ここで混合物中のグリセロール対グルコースの濃度比は5〜10：1であり、かつ3から4Mのアルカリ溶液またはアンモニアを用いてpHを6.8から8.0の範囲に維持する段階、ならびに
（c）発酵後、1,3-プロパンジオールを脱塩、蒸留、および減圧精留により単離および精製し、かつ好ましくは2,3-ブチレングリコール、乳酸、酢酸、エタノール、またはコハク酸などの他の副産物を得る段階。
【請求項１６】
バイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールを流加発酵中の供給基質として供給することを特徴とする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
1,3-プロパンジオールを産生するための発酵基質が、化学的方法、生物学的方法、または超臨界法によるバイオディーゼル生産からの副産物である粗製グリセロールであることを特徴とする、請求項15記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
一つの態様において、段階（b）における発酵ブロス中のグリセロール濃度は、粗製グリセロールまたは粗製グリセロールとグルコースの混合物を供給することにより10から40g/Lに維持し、好ましくは混合物中のグリセロール対グルコースの濃度比は5〜10：1である。
【国際調査報告】
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