(57)【要約】本発明は、輸送配列を含む少なくとも一つの第一部分（Ｉ）と、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の全長ＢＨ３ドメイン配列または部分的ＢＨ３ドメイン配列を含む少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）とを含む、融合タンパク質に関し、上記融合タンパク質は、その第一部分（Ｉ）においてｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序でＤ−鏡像異性アミノ酸を含む。さらに、本発明は、上記融合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびに上記融合タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
輸送配列を含む少なくとも一つの第一部分（Ｉ）と、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）とを含む、融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、その第一部分（Ｉ）においてｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序でＤ-鏡像異性アミノ酸を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記少なくとも一つの第一部分（Ｉ）および前記少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）は、共有結合により連結されている、融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または請求項２のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（Ｉ）は、該融合タンパク質を規定された細胞位置へと方向付ける輸送配列を含む、融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（Ｉ）は、該融合タンパク質の細胞取込みを、特に細胞透過性を高めることにより促進する輸送配列を含む、融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜請求項４に記載の融合タンパク質であって、部分（Ｉ）は、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴタンパク質のＤ−ＴＡＴ配列である輸送配列を含む、融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（Ｉ）は、図１Ａのアミノ酸配列（Ｄ−ＴＡＴのアミノ酸配列：ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ）または図１Ｂのアミノ酸配列（Ｄ−ＴＡＴの一般的アミノ酸配列：Ｘｎ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘｎ）を含む、融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、アポトーシスを誘導する部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、少なくとも一つのＢｃｌ−２ファミリータンパク質と反応する部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む、融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、前記Ｂｃｌ−２ファミリーの少なくとも一つのアポトーシス促進性メンバーを活性化するかもしくは感受性にする部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｍｆ、ＤＰ５／ＨｒｋおよびＢｏｋからなる群から選択されるＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質に由来する部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む、融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を、Ｌ−アミノ酸から構成されているその天然型またはＤ−アミノ酸から構成されているその反転された型の状態で含む、融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のうちのいずれかに記載の融合タンパク質であって、部分（ＩＩ）は、図２Ａのアミノ酸配列、図２Ｂのアミノ酸配列、図２Ｃのアミノ酸配列、図２Ｅのアミノ酸配列、もしくは図２Ｆのアミノ酸配列（Ｂｉｄのアミノ酸配列、Ｂａｄのアミノ酸配列、Ｎｏｘａのアミノ酸配列、Ｐｕｍａのアミノ酸配列、Ｂｉｍのアミノ酸配列、およびＢｉｋのアミノ酸配列）、または部分的ＢＨ３ドメイン配列もしくは全長ＢＨ３ドメイン配列を含む該アミノ酸配列のフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１２のうちのいずれかに記載の融合タンパク質、ならびに、必要であれば、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクルを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
不完全なアポトーシスにより引き起こされる疾患である、癌ならびに乾癬、ベーチェット症候群、尋常天疱瘡の処置および／または予防のための、請求項１〜請求項１２のうちのいずれかに記載の融合タンパク質の使用であって、該癌は、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；組織球リンパ腫；脳の癌（グリア芽細胞腫）；卵巣癌；尿生殖器路の癌；結腸癌；肝臓癌；結腸直腸管の癌；膵臓癌；乳癌；前立腺癌；リンパ系癌；胃癌；喉頭癌；ならびに肺腺癌および小細胞肺癌を包含する、肺癌；ならびに／または皮膚癌、例えば、基底細胞癌および扁平上皮癌を包含する、メラノーマまたは非メラノーマ皮膚癌；である、使用。
【請求項１５】
不完全なアポトーシスにより引き起こされる疾患である、癌ならびに乾癬、ベーチェット症候群、尋常天疱瘡の処置および／または予防のための薬学的組成物の製造のための、請求項１〜請求項１２のうちのいずれかに記載の融合タンパク質の使用であって、該癌は、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；組織球リンパ腫；脳の癌（グリア芽細胞腫）；卵巣癌；尿生殖器路の癌；結腸癌；肝臓癌；結腸直腸管の癌；膵臓癌；乳癌；前立腺癌；リンパ系癌；胃癌；喉頭癌；ならびに肺腺癌および小細胞肺癌を包含する、肺癌；ならびに／または皮膚癌、例えば、基底細胞癌および扁平上皮癌を包含する、メラノーマまたは非メラノーマ皮膚癌；である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、輸送配列を含む少なくとも一つの第一部分（Ｉ）と、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の全長ＢＨ３ドメイン配列または部分的ＢＨ３ドメイン配列を含む少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）とを含む、融合タンパク質に関し、上記融合タンパク質は、その第一部分（Ｉ）においてｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序でＤ−鏡像異性アミノ酸を含む。さらに、本発明は、上記融合タンパク質を含む薬学的組成物、ならびに上記融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物の細胞は、高度に組織化された共同体のメンバーである。この共同体における細胞の数は、細胞分裂の速度を制御することによってのみならず、細胞死の速度を制御することによってもまた、厳密に調節される。細胞がもはや必要ではない場合、その細胞は、細胞内の死のプログラムを活性化することにより自殺をする。この重要なプロセスはアポトーシスと呼ばれる。アポトーシスはまた、プログラムされた細胞死としても公知であり、タンパク質のカスケードによりシグナル伝達される。この正常なプログラムされた細胞死を妨げる変化（例えば、関係するタンパク質の変異）は、多くの疾患（特に癌）において、重要な役割を果たす。従って、癌細胞の増殖はしばしば、細胞死の不完全な制御に起因する。さらに、アポトーシスに対する抵抗は、悪性細胞の主要な特徴であり、この特徴は、その細胞が数を増やして生存することを可能にする。
【０００３】
ミトコンドリア依存性のアポトーシスの経路は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質によって支配されている。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｋおよび多くの他のＢｃｌ−２ファミリーメンバーは、ミトコンドリア外膜においてこれらのタンパク質を固定するそのアミノ酸Ｃ末端の近傍に、アミノ酸の疎水性区間を有する。反対に、Ｂｉｄ、ＢｉｍおよびＢａｄのような他のＢｃｌ−２ファミリーメンバーは、これらの膜固定ドメインを欠くが、特定の刺激に応答してミトコンドリアを標的とする。さらに他のものは、上記膜固定ドメインを有するが、刺激されて上記膜固定ドメインを露出するまで、上記膜固定ドメインが上記タンパク質の本体に接して保持された状態を保持する（例えば、Ｂａｘ）。
【０００４】
Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、後生動物亜界の進化を通じて保存されており、脊椎動物種および無脊椎動物種において相同体が見られる。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のような癌関連のヘルペス単純ウイルスを含む数個の型の動物ウイルスも、それらのゲノム内にＢｃｌ−２ファミリー遺伝子を含む。アポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質および抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の両者が、叙述されている。抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質とアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質との相対的な比率は、増殖因子の欠乏、低酸素、放射能、抗癌剤、酸化剤およびＣａ２＋の過剰負荷を含む様々な、アポトーシス性刺激に対する、細胞の最終的な感受性または抵抗性を規定する。
【０００５】
アポトーシスの間、Ｂｃｌ−２ファリミータンパク質は特に、チトクロムｃ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、アポトーシス誘導因子、ＨｔｒＡ２、およびエンドヌクレアーゼＧのようなタンパク質のミトコンドリアからの放出を調節（促進または阻害）する。ある一定のＢｃｌ−２ファミリータンパク質（アポトーシス促進性メンバー）は、プログラムされた細胞死の遂行の主要な調節因子、ならびにミトコンドリアにおける死のシグナルの実行役である。要約すると、Ｂｃｌ−２ファミリーは、ミトコンドリアのタンパク質の放出を引き起こすアポトーシス促進性メンバーと、ミトコンドリアのタンパク質の放出を阻害する抗アポトーシス性メンバーとからなる。さらに、上記ファミリーは、三つの主要なサブクラス[（ａ）、（ｂ）および（ｃ）]に分けられ得る。サブクラス（ａ）および（ｂ）は、構造の点で、コリシンおよびジフテリア毒素のような細菌毒素の孔形成ドメインに類似し得る。これらのらせん状の孔様のタンパク質は、抗アポトーシス性タンパク質（サブクラス（ａ））、ならびにマルチドメインアポトーシス促進性タンパク質（サブクラス（ｂ））の両者を含む。抗アポトーシス性メンバー（ａ）（例えば、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ）は、四つすべてのＢｃｌ−２相同（ＢＨ）ドメイン（ＢＨ１〜ＢＨ４、「マルチドメイン抗アポトーシス性タンパク質」とも呼ばれる）を通じての保存を表す。アポトーシス促進性メンバー（ｂ）のうちの一部（例えば、ＢａｘおよびＢａｋ）は、ＢＨ１〜ＢＨ３ドメイン（ＢＨ１〜ＢＨ３、「マルチドメインアポトーシス促進性タンパク質」とも呼ばれる）において配列相同性を所有する。反対に、サブクラス（ｃ）のアポトーシス促進性メンバーのうちの一部（例えば、Ｂｉｄ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｍｆ、ＤＰ５／ＨｒｋおよびＢｏｋ）は、ただ一つのドメイン（即ち、α−へリックス状のＢＨ３ドメイン（「ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質」と呼ばれる））において配列相同性を所有する。上記ＢＨ３ドメインは、典型的には、約１５アミノ酸長〜約２０アミノ酸長（代表的には、１６アミノ酸）の両親媒性α−へリックスからなる。
【０００６】
ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質（サブクラス（ｃ））は、様々なアポトーシス促進性シグナルおよび抗アポトーシス性シグナルの求心性エフェクターとして作用する（非特許文献１）。全てのＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に結合しそしてそのタンパク質と機能的に拮抗する能力を有する（非特許文献１）。それらのＢＨ３ドメインは、Ｂｃｌ−ＸＬのような抗アポトーシス性タンパク質の表面上における疎水性の割れ目に挿入する。上記ＢＨ３ドメインは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質と相互作用することにより、ミトコンドリアへと複数の死のシグナルを伝達し、そして、マルチドメインアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質であるＢａｘまたはＢａｋのうちの少なくとも一つの存在を必要とする機構により、アポトーシスを誘導する。さらに、全てではないが一部のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、マルチドメインアポトーシス促進性メンバーであるＢａｘまたはＢａｋに結合する能力を有する。
【０００７】
ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢｉｄは、例えば、ＢａｘおよびＢａｋにおけるアポトーシス促進性のアセンブリおよび機能を独力で促進し得るが、他のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質はそのように機能しない。ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢｉｄのα−へリックス状のＢＨ３ドメインに相当する短いペプチドを用いることにより、上記「Ｂｉｄ−ペプチド」はＢａｘおよびＢａｋのオリゴマー形成を誘導してチトクロムｃを放出する能力を有することが示された。この性質は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢｉｍに因るものである（非特許文献２）。要約すると、Ｂｉｄは、（マルチドメイン）アポトーシス促進性のＢａｘおよびＢａｋ、ならびに（マルチドメイン）抗アポトーシス性のＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬに結合し、そして、ＢａｘおよびＢａｋを直接的に活性化する能力を有する。
【０００８】
対照的に、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢａｄまたはＢｉｋのＢＨ３ドメインに相当するペプチドは、ＢａｘおよびＢａｋを直接的に活性化する能力を欠くが、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に結合する能力を保持する（非特許文献３）。このことは、Ｂｃｌ−ＸＬ存在下でのみＢａｘの活性を刺激する、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質であるＢａｄのＢＨ３ドメイン由来のペプチドを用いたもう一つの研究によっても、示されている（非特許文献４）。従って、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメイン群は、異なる機能を所有する。「Ｂｉｄ様」ＢＨ３ドメインは、アポトーシス促進性のＢａｘおよびＢａｋを「活性化する」が、「Ｂａｄ様」ＢＨ３ドメインは、抗アポトーシス性）Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのポケットを占有することにより、アポトーシス促進性のＢａｘおよびＢａｋを「感受性にする」。要約すると、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメイン群は、遺伝的に規定された経路を用いて細胞死を開始する、二つのクラスのツール化合物に相当する（非特許文献３）。
【０００９】
上記の通り、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は様々な研究において特徴づけをされ、そして、それらの機能および作用機構が解析された。上記の結果は、それらのＢＨ３ドメインが、上記の抗アポトーシス性タンパク質からの活性なマルチドメインアポトーシス促進性タンパク質の放出を引き起こすことにより、高レベルの抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを発現する細胞内において効率的にアポトーシスを誘導し得ることを示す。
【００１０】
従って、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメインは興味深い主題であり、そして、プログラムされた細胞死の不完全な制御により引き起こされる様々な疾患の処置における効率的な手段を形成する。しかしながら、先行技術は、上記タンパク質またはそれらのＢＨ３ドメインを各々、生物または細胞中の望ましい位置へ直接的に輸送する方法を示唆していない。主要な問題のうちの一つは、細胞の内膜を透過することである。いくつかの研究は、初期のポリアルギニン伝達アプローチを含む（非特許文献５、非特許文献６）。しかしながら、様々な両親媒性のαへリックス状のペプチド（特に陽イオン性のペプチド）は、負に荷電した膜（ミトコンドリアの膜を含む）に誘引され得、ここで、上記ペプチドは、脂質マトリックスおよび膜の障壁機能を非特異的に破壊し得る（非特許文献７、非特許文献８）。内在化部分としてのアンテナペディア（ＡＮＴ）と、ＢＡＤのそれらのＢＨ３ドメインとを組み合わせた構築物ＡＮＴ−ＢＨ３ＢＡＤを用いる別のアプローチは、毒性であった。しかしながら、毒性は、Ｂｃｌ−２経路と相関しなかった（非特許文献９、非特許文献１０）。
【非特許文献１】Ｈｕｎｔ  Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、第２９３巻、ｐ．１７８４−１７８５
【非特許文献２】Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ、２０００年、第７巻、ｐ．１１６６−１１７３
【非特許文献３】Ｌｅｔａｉ  Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、２００２年、第２巻、ｐ．１８３−１９２
【非特許文献４】Ｍｏｒｅａｕ  Ｐ．−Ｆ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７８巻、第２１号、ｐ．１９４２６−１９４３５
【非特許文献５】Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００年、第６０巻、ｐ．１４９８−１５０２）
【非特許文献６】Ｈｏｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第２７４巻、ｐ．１３２９８−１３３０４
【非特許文献７】Ｍａｔｓｕｚａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、２００１年、第２９巻、ｐ．５９８−６０１
【非特許文献８】Ｅｌｌｅｒｂｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９９年、第５巻、ｐ．１０３２−１０３８
【非特許文献９】Ｖｉｅｉｒａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００２年、第２１巻、ｐ．１９６３−１９７７
【非特許文献１０】Ｓｃｈｉｍｍｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、２００１年、第８巻、ｐ．７２５−７３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメインを生物中の望ましい位置へ直接的に輸送する能力を有するシステムを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によって、輸送配列を含む少なくとも一つの第一部分（Ｉ）と、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の部分的ＢＨ３−ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）とを含む、融合タンパク質が提供され、上記融合タンパク質は、その第一部分（Ｉ）において、ならびに必要であれば第二部分（ＩＩ）においてｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序でＤ−鏡像異性アミノ酸を含む。
【００１３】
本発明の融合タンパク質は、（少なくともその第一部分（Ｉ）において）ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序でＤ−鏡像異性アミノ酸を含む（「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型」タンパク質または「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型」融合タンパク質とも呼ばれる）。「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型」は鎖状のペプチドの異性体に関し、上記異性体において、通常または天然のＬ−アミノ酸配列の向きが逆にされ、かつ、各アミノ酸残基のキラリティ（天然に存在するＬ−アミノ酸と反対のＤ−アミノ酸のキラリティに起因する）が反転されている。本発明による用語「融合タンパク質」および「タンパク質」は、同一の意味を有することが意図される。本発明によるｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型融合タンパク質は、例えば、対応する天然のＬ−アミノ酸配列について逆向きのアミノ酸配列を合成することにより、構築され得る。Ｄ−ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型鏡像異性（融合）タンパク質において、各アミド一重結合内のカルボキシル基およびアミノ基の位置が、通常のＬ−アミノ酸ペプチド配列と比較された場合に反転されており、その結果、各α炭素における側鎖基の位置が、保存されることを保証する。本発明のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型融合タンパク質は、多様な有用な性質を所有する。例えば、本発明のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型融合タンパク質は、対応するＬ−アミノ酸融合タンパク質よりも、効率的に細胞に侵入し、それよりも安定であり（特にインビボにおいて）、それよりも低い免疫原性を示す。天然に存在するタンパク質はＬ−アミノ酸を含むので、プロテアーゼまたはペプチダーゼのようなほとんど全ての分解酵素が、隣接するＬ−アミノ酸の間にあるペプチド結合を切断する。従って、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ−鏡像異性アミノ酸から構成されるタンパク質は、大部分は、タンパク質分解による分解に対して抵抗性である。明らかに、細胞中の保持時間は、本発明の融合タンパク質について、それらの通常の反転されていないＬ−アミノ酸アナログと比較して増加される。
【００１４】
本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）は、キャリアー配列または輸送配列として働く。（本発明の融合タンパク質の一部分としての）「キャリアー配列または輸送配列」は、融合タンパク質または上記融合タンパク質の部分（ＩＩ）を各々細胞の細胞質へかさらには特定の細胞性目的地へと方向付ける、任意のアミノ酸配列である。上記輸送配列は、例えば、上記融合タンパク質を、細胞内における望ましい位置（例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソーム、またはペルオキシソーム）へと方向付け得る。その結果、好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質の輸送配列は、上記融合タンパク質を、規定された細胞位置へと方向付ける。いずれにしても、上記輸送配列は、本発明の融合タンパク質を、細胞膜を通過して（例えば、細胞外細胞環境から細胞膜を通過して細胞質へと）方向付け、それによって、上記融合タンパク質またはその薬物部分（ＩＩ）（積荷部分）各々の細胞内取込みを、特に、その細胞透過性を促進することによってか、または、その細胞内の保持時間を促進することにより、促進させ得る。
【００１５】
一般的に、上記輸送配列を含む本発明の融合タンパク質の機能的に有効な部分（Ｉ）は、少なくとも４つの（連続した）Ｄ−アミノ酸を含むアミノ酸配列として規定される。部分（Ｉ）に含まれるような機能的に有効なアミノ酸配列は、強塩基性の性質を示す。好ましくは、上記の機能的に有効なアミノ酸配列は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、なお一層より好ましくは少なくとも７５％、なお一層より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９６％の塩基性アミノ酸（好ましくはアルギニンおよび／またはリジン）を含む。本発明の融合タンパク質の機能的に有効な部分（Ｉ）は、好ましくは、４個のＤ−アミノ酸〜５０個のＤ−アミノ酸、より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜４０個のＤ−アミノ酸、なお一層より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜３０個のＤ−アミノ酸、なお一層より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜約２０個のＤ−アミノ酸、および最も好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜約１０個のＤ−アミノ酸の範囲にわたる、アミノ酸配列を含む。
【００１６】
好ましくは、本発明による輸送配列は、例えば、公知の膜移行配列に由来し得る。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質の輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴタンパク質の、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序であるＤ−鏡像異性アミノ酸配列である。ＴＡＴは、上記ＨＩＶの感染周期に欠くことのできないウイルス性タンパク質である。このタンパク質は、例えば、国際公開第９４／０４６８６号、米国特許第５，８０４，６０４号および米国特許第５，６７４，９８０号（各々は本明細書中に参考文献として援用される）に記載されている。本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）は、部分（ＩＩ）に連結され、それによって、部分（Ｉ）は、上記Ｔａｔの全長配列の８６アミノ酸のうちのいくつかまたは全てを含むが、そのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ型で含む。特に、８６個未満のアミノ酸を有する本発明の融合タンパク質の機能的に有効な部分（Ｉ）が、用いられ得、この機能的に有効な部分（Ｉ）は、依然として、改善された細胞内取込み活性を表し、そして必要に応じて、細胞の核への侵入のためのさらなる位置情報を有する。細胞への侵入および取込みを仲介することを担うＴａｔ配列断片は、公知技術を用いて規定され得る（例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、１９８９年、第８６巻、ｐ．７３９７−７４０１を参照）。好ましくは、本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）は、ＴＡＴの塩基性領域（アミノ酸４８位〜５７位またはアミノ酸４９位〜５７位各々）を含み、そして、ＴＡＴのシステインリッチ領域（アミノ酸２２位〜アミノ酸３６位）、ならびに天然に存在するＴＡＴタンパク質のエキソン２によりコードされているＣ末端ドメイン（アミノ酸７３位〜アミノ酸８６位）を含まない。Ｔａｔの塩基性領域の逆向きのもの（Ｄ−アミノ酸から構成されている、アミノ酸５７位〜アミノ酸４８位またはアミノ酸５７位〜アミノ酸４９位）は、本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）または部分（Ｉ）の一部分として用いられ得る。Ｔａｔの塩基性領域の逆向きのものを含むかまたは上記の逆向きのものからなる配列は、本明細書中で、Ｄ−Ｔａｔ配列と呼ばれる。
【００１７】
従って、本発明の融合タンパク質の好ましい機能的に有効な部分（Ｉ）は、Ｄ−ＴＡＴ配列（例えば、ＮＨ２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−ＣＯＯＨ（この両方が、上に規定した天然に存在するＴａｔの塩基性領域のｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型配列である））を含むか、またはＤ−ＴＡＴの一般式ＮＨ２−ＸＸＸＡＸＸＸＸＸ−ＣＯＯＨに従う配列改変体を含み、この式において、「Ｘ」は、アミノ酸であるアルギニンまたはリジンに関し、「Ａ」は、任意の非塩基性アミノ酸に関する。「Ａ」は、好ましくは、上に与えられた一般式の４位に位置する。しかしながら、「Ａ」は、代替的に、別の任意の配列内の位置（例えば、４位の代わりに、２位、３位、５位、６位、７位または８位）に位置し得る。さらに、上に与えられた一般式は、その一般式のうちの１〜４個の塩基性残基を非塩基性残基で置換することにより、さらなる非塩基性残基を導入して改変され得る。上の記載に従って、部分（Ｉ）の配列は、Ｌ−アミノ酸から構成される、対応する反転されていない配列と同一の構造側鎖パターンを表すために、Ｄ−アミノ酸のみから構成される。
【００１８】
本発明の特に好ましい実施形態では、部分Ｉは、図１Ａまたは図１Ｂのアミノ酸を有する輸送配列を含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の機能的に有効な部分（Ｉ）は、以下の一般式の一般的なアミノ酸配列を含む：ＮＨ２−ＡｍＸＡｏＸＡｎ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＡｍＸＸＸＡｎ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＡｍＸＸＡＸＡｎ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＡｍＸＡＸＸＡｎ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＸＡＡＸ−ＣＯＯＨ。この式において、「Ｘ」は、アミノ酸であるアルギニンまたはリジンに関し、「Ａ」は、任意の非塩基性アミノ酸に関し、「ｍ」は、０〜１４の整数であり、「ｎ」は、ｍとは独立した、０と１４との間の整数であり、「ｏ」は、ｍおよびｎとは独立した、０と５との間の整数である。本発明に従う、上記の輸送配列の一般式が、Ｄ−鏡像異性アミノ酸のみから構成されることが、注意されなければならない。
【００２０】
本発明の融合タンパク質の機能的に有効な部分（Ｉ）のための特定の例は、強塩基性の性質を示す以下の配列を含むかまたは以下の配列からなり得る：
ＮＨ２−ＫＴＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＬＫＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＰＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＲＦＱＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＧＲＩＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＮＩＧＲＲＲＮ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＡＧＲＮＧＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＰＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＧＫＲＲＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＲＲＥ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＱＫＲＧＧＳ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＫＳＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＧＳＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＲＱＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＡＲＫＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＧＲＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＲＲＬＳ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＰＲＲＬＳＰ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＧＲＫＹ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＰＫＲＧＭＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＧＶＲＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＧＹＫＫＶＧＦＳＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＦＳＲＬＳＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＲＶＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＲＳＲＰ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＲＲＭ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＳＭＡＬＴＲＫＧＧＹ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＲＳＲＲＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−ＫＭＮＰＬＰＹ−ＣＯＯＨ。本発明に従う上記の輸送配列は、Ｄ−鏡像異性アミノ酸のみから構成されることが、注意されなければならない。
【００２１】
部分（Ｉ）は、対応する（天然に存在する）移行配列（例えば、上に開示されたＤ−Ｔａｔ配列）に対して類似する唯一つの（即ち、連続的な）塩基性の細胞膜移行配列（Ｄ−ｒｅｔｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型）を含み得る。代替的に、部分（Ｉ）は、強塩基性の性質を有する同一または異なる移行配列に対応する、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の二つ以上のアミノ酸配列を含み得る。これらのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＤ型の移行モチーフは、天然に存在するタンパク質に基づいて、Ｄ−アミノ酸を用いることにより、ならびにそのアミノ酸配列の順序を逆にすることにより合成される。換言すると、本発明の融合タンパク質は、（例えば、その部分（Ｉ）において）二つ以上の移行配列の組合せを含み得、それらの配列の全てが、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＤ型配列として合成されている。典型的に、この移行モチーフの組合せは、いかなる天然のタンパク質配列においても（Ｌ型として）存在しない。部分（Ｉ）のこれらの二つ以上の移行配列は、リンカー配列と共に連結され得るかまたはリンカー配列がなしで連結され得る。リンカー配列が望ましい場合、その長さは、好ましくは、２アミノ酸〜２０アミノ酸の範囲にわたり得る。
【００２２】
上に開示されている通り、部分（Ｉ）は、（一つ以上の）Ｄ−鏡像異性アミノ酸移行配列モチーフを（天然の配列と比較してｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型で）含み得、それらのモチーフは、その対応する天然に存在するＬ型アナログに基づいて提供される。代替的に、部分（Ｉ）は、Ｌ型配列の（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型での）一連のＤ−アミノ酸を含み得、それらの一連のＤ−アミノ酸は、引き続いて、上記の天然に存在するタンパク質配列と比較して改変される（本明細書中で「誘導体」とも規定される）。これらの部分（Ｉ）誘導体（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＤ型で提供される。換言すると、誘導体であるＤ型は、誘導体であるＬ型のアナログである）は、典型的に、細胞への（またはさらに、好ましくは、細胞核への）取込み活性を有するキャリアの性質を所有し、その取込み活性は、たとえ、それらの配列が天然に存在するタンパク質配列と同一でなくとも、対応する天然に存在するタンパク質の取込み活性と実質的に類似する。
【００２３】
これに加えて、糖部分および／または脂質部分（例えば、コレステロールまたは他の脂質）が、さらにその融合タンパク質の膜の溶解性を増加させるために本発明の融合タンパク質（特に、本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）に、または最終的には任意の他の部分に（例えば、一端または両端に局所的な脂質親和性を提供するために部分（Ｉ）の一端または両端に））付加され得る。代替的に、または付加的に、糖または脂質の部分が、アミノ酸側鎖（特に、水酸基およびアミノ基を有する側鎖）に連結され得る。
【００２４】
本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）は、その細胞透過性および／またはその細胞内保持機能を保持しなければならない。しかしながら、他の機能が、部分（Ｉ）に導入される改変により付加され得る。従って、部分（Ｉ）は、例えば、本発明の融合タンパク質を特定の細胞内標的位置へ効率的に方向づけるために、改変され得る。対応して、部分（Ｉ）は、その増強された細胞透過性の性質を喪失することなく、特定の細胞内位置が部分（Ｉ）へ与えられるように、改変される。典型的に、本発明の融合タンパク質を特定の細胞区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置(ｇｌｏｏｍ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）、リソソーム小胞）へ導くための経路を定める配列が、部分（Ｉ）に導入され得る。一方、本発明の融合タンパク質の細胞質への局在化を保証する特定の配列が、付加され得る。例えば、部分（Ｉ）は、本発明の融合タンパク質を細胞質中で保持するために、一つ以上の細胞質の構造物と結合する少なくとも一つのさらなる配列を含み得る。代替的に、核への局在化に重要であると考えられる塩基性領域（例えば、ＤａｎｇおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９年、第２６４巻、ｐ．１８０１９−１８０２３；Ｈａｕｂｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８９年、第６３巻、ｐ．１１８１−１１８７；Ｒｕｂｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８９年、第６３巻、ｐ．１−８を参照）の変化は、部分（Ｉ）の細胞への局在または部分的な細胞質への局在、それゆえに本発明の融合タンパク質の細胞質への局在または部分的な細胞質への局在を生じ得る。従って、部分（Ｉ）は、変化した核局在化シグナルを含み得、これらのシグナルが、本発明の融合タンパク質の細胞質への局在化を引き起こす。
【００２５】
上記の通り、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーであり、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバーと相互作用することによりアポトーシスの調節因子を代表している。本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質（Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のサブクラスとして規定されている）の一つ以上の部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含むアミノ酸配列である。部分（ＩＩ）は、天然に存在する（全長または部分的）ＢＨ３ドメイン配列のＤ−ｒｅｔｏｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型を含み、その結果、そのＤ−アミノ酸の側鎖が、天然の全てＬ型のアミノ酸配列中で位置する通りに位置することを保証し得るか、または二者択一的に、天然の全てＬ型のアミノ酸配列を含み得るかのいずれかである。それらの両者とも、少なくとも一つのＢｃｌ−２ファミリータンパク質と反応することによるか、またはＢｃｌ−２ファミリーの少なくとも一つのアポトーシス促進性メンバーを活性化もしくは感受性にすることにより、アポトーシスを誘導する。
【００２６】
本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）が、部分的ＢＨ３ドメイン配列を含む場合、上記の部分（ＩＩ）は、（機能的に有効であるために）少なくとも４個の（連続する）Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸を天然型またはｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のうちのいずれかの順序で（ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメイン配列の少なくとも４個のＬ−アミノ酸の個別のフラグメントを反映して）有するべきである。好ましい実施形態では、部分（ＩＩ）は、Ｄ−アミノ酸のみを含む。本発明の融合タンパク質の好ましい機能的に有効な部分（ＩＩ）は、４個のＤ−アミノ酸〜２０個のＤ−アミノ酸、より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜１８個のＤ−アミノ酸、より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜１５個のＤ−アミノ酸、なお一層より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜１３個のＤ−アミノ酸、より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜約１０個のＤ−アミノ酸、およびなお一層より好ましくは４個のＤ−アミノ酸〜８個のＤ−アミノ酸の範囲にわたる、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ−アミノ酸から構成される全長ＢＨ３ドメイン配列または部分的ＢＨ３ドメイン配列を含む。部分的ＢＨ３ドメイン配列が、部分（ＩＩ）または部分（ＩＩ）の一部分として用いられる場合、上記ＢＨ３ドメイン配列は、機能的なままでなければならない。即ち、上記ＢＨ３ドメイン配列は、それらのアポトーシス促進性の活性を保持することを期待されている。それらの機能的活性は、適切なアッセイ法により（例えば、結合アッセイ（本発明の融合タンパク質の部分ＩＩまたは本発明の融合タンパク質自体をその天然の結合相手に結合すること）によるか、またはアポトーシスアッセイによりそのアポトーシス促進性の活性をアッセイすることにより）試験され得る。
【００２７】
好ましくは、部分（ＩＩ）は、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｍｆ、ＤＰ５／ＨｒｋおよびＢｏｋからなる群から選択されたＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を、その天然のＬ型またはそのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ型のうちのいずれかで含む。上記の（全長または部分的）ＢＨ３配列は、例えば、任意の哺乳動物のＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質から（特に、上記のヒト異性体から）選択され得る。従って、本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）は、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅまたは２Ｆのアミノ酸配列を含む（図２Ａ〜２Ｆに示される通りのＬ−アミノ酸から構成されるその天然型またはそのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ型（Ｄ−アミノ酸から構成される）のうちのいずれかで含む。このことは、図２Ａ〜２Ｆの配列がその末端を逆にすることにより反転されなければならないこと：天然のＣ末端は反転された型のＮ末端であり、かつその天然のＮ末端は反転された型のＣ末端であることを、意味する）。本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）は、上記の天然の全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列のフラグメント（例えば、５０個アミノ酸未満、好ましくは、４０個アミノ酸未満、なお一層より好ましくは、３０個アミノ酸未満のフラグメント）を（Ｌ型またはＤ型のうちのいずれかで）含み得る。上記の天然の配列のこれらのフラグメントは、典型的にＢＨ３ドメイン配列を含むか、または少なくとも部分的にＢＨ３ドメイン配列（上記のＢＨ３ドメイン配列の少なくとも７アミノ酸）を含む。
【００２８】
本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）の配列は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の一つ以上の部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３−ドメイン配列を、その／それらの天然のＬ−アミノ酸型またはＤ−アミノ酸から構成されているその／それらの反転された型のうちのいずれかで含み得る。部分（ＩＩ）がＬ−アミノ酸から構成される場合、部分（ＩＩ）は、当業者に公知の組換え方法またはペプチド合成方法（例えば、固相合成）のうちのいずれかにより、合成されるべきである。部分（ＩＩ）のＬ−アミノ酸配列は、その後（二番目の工程により）部分（Ｉ）のＤ−アミノ酸配列に連結される。代替的に、化学合成は、直接的に（二番目の連結工程を導入することなく）、その部分（Ｉ）においてＤ−アミノ酸から構成されかつその部分（ＩＩ）においてＬ−アミノ酸から構成される本発明の融合タンパク質を合成することを許容し得る。しかしながら、部分（ＩＩ）もＤ−アミノ酸から構成される場合、本発明の融合タンパク質は、上記の天然に存在する部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列、ならびに上記の例えば、天然に存在する輸送配列（例えば、上記の天然に存在する塩基性のＴａｔ配列）を反転させるために、（Ｌ−アミノ酸配列の合成に用いるのと同じ方法に従って）Ｄ−鏡像異性アミノ酸をｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序で用いることにより化学的に合成される。
【００２９】
天然に存在するＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のアミノ酸配列または上記ＢＨ３ドメインを含むそれらのフラグメント、ならびに、対応して、部分（ＩＩ）の一部としてＤ−鏡像異性アミノ酸から構成されているそれらのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型アナログは、例えば、上記の天然に存在するタンパク質のうちの少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換により改変されて、改変された非天然配列を提供し得る。改変（特に、保存的改変）は、例えば、部分（ＩＩ）の結合特性を改変するために、またはその安定性を改変する（例えば、その安定性を増加または減少させる）ために、所望され得る。（天然に存在するＢＨ３ドメインまたはＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の配列と比較して）改変された一次配列を有する部分（ＩＩ）は、改変されていないＬ−アミノ酸配列または改変されていないＤ−アミノ酸配列の合成に用いるのと同じ技術を用いて産生され得る。
【００３０】
本発明の融合タンパク質は、少なくとも部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）から構成される。さらに、本発明による融合タンパク質は、さらなる部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）を含み得る。これらの必要に応じたさらなる部分は、本発明の融合タンパク質に、付加的な機能を与え得る。上記の少なくとも一つのさらなる部分は、アミノ酸、オリゴペプチドもしくはポリペプチドまたは低分子有機化合物であり得、そして、本発明の融合タンパク質へ適切な位置（例えば、そのＮ末端、そのＣ末端）において連結されるかまたは内部でアミノ酸側鎖へ連結され得る。さらなる部分（例えば、ＨＡ、ＨＳＶタグ、Ｈｉｓ６）は、本発明の融合タンパク質を精製および／または単離しやすくし得る。所望される場合、上記の融合パートナーは、その後、上記の産生プロセスの最後に、本発明の融合タンパク質から（例えば、タンパク質分解による切断または当該分野で公知の他の方法によって）除去され得る。代替的に、特定の細胞区画のためのさらなる輸送配列または他の機能的な配列が、付加的な部分を付加することにより本発明の分子に融合され得るか、または部分（Ｉ）もしくは部分（ＩＩ）に組み込まれ得る。好ましくは、付加的な部分（例えば、部分（ＩＩＩ））は、本発明の融合タンパク質が特定の細胞型（例えば、免疫細胞、肝細胞（特に、器官（例えば、リンパ球、ニューロンなど）の腫瘍細胞）に結合することを許容する。特異性は、リガンド（例えば、膜タンパク質（例えば、レセプター）の細胞外部分に対するリガンド、または膜タンパク質である腫瘍細胞マーカーの細胞外部分に対する抗体であって、これらの細胞マーカーに結合する抗体）を本発明の融合タンパク質に融合することにより達成される。それによって、本発明の融合タンパク質は、処置されるべき動物の標的細胞または標的組織へ特異的に方向付けられ得る。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、一つよりも多くの（好ましくは、二つもしくは三つの）同一であるかもしくは同一でない、部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列が、本発明の融合タンパク質に、部分（ＩＩ）の一部分または付加的な部分（例えば、（ＩＩＩ））のうちのいずれかとして組み込まれ得る。特に、異なるＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列が、本発明の融合タンパク質内で組み合わされ得る（例えば、ＢｉｄおよびＢａｄ、ＢｉｍおよびＢａｄ、ＢｉｋおよびＢａｄ、ＰｕｍａおよびＢａｄ、ＮｏｘａおよびＢａｄ、ＢｍｆおよびＢａｄ、ＤＰ５／ＨｒｋおよびＢａｄ、ＢｏｋおよびＢａｄ、ＢｉｋおよびＢｉｍ、ＢｉｋおよびＢｉｄ、ＢｉｋおよびＰｕｍａ、ＢｉｋおよびＮｏｘａ、ＢｉｋおよびＢｍｆ、ＢｉｋおよびＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｋおよびＢｏｋ、ＢｉｄおよびＰｕｍａ、ＢｉｄおよびＮｏｘａ、ＢｉｄおよびＢｉｍ、ＢｉｄおよびＢｍｆ、ＢｉｄおよびＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｄおよびＢｏｋ、ＢｉｍおよびＮｏｘａ、ＢｉｍおよびＰｕｍａ、ＢｉｍおよびＢｍｆ、ＢｉｍおよびＤＰ５／Ｈｒｋ、ＢｉｍおよびＢｏｋ、ＰｕｍａおよびＮｏｘａ、ＰｕｍａおよびＢｍｆ、ＰｕｍａおよびＤＰ５／Ｈｒｋ、ＰｕｍａおよびＢｏｋ、ＮｏｘａおよびＢｍｆ、ＮｏｘａおよびＤＰ５／Ｈｒｋ、ならびにＮｏｘａおよびＢｏｋ）。好ましくは、本発明の融合タンパク質が一つより多くのＢＨ３ドメインを有する場合、本発明の融合タンパク質は、「Ｂｉｄ」様ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質および「Ｂａｄ」様ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の（部分的または全長）ＢＨ３ドメインを含む。典型的に、一つよりも多くのＢＨ３ドメインが本発明の融合タンパク質内に存在する場合、それらの両方または全てが、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型のＤ型または通常の天然型のＬ型のうちのいずれかを表し得る。代替的に、本発明の融合タンパク質は、Ｄ型のＢＨ３ドメインとＬ型のＢＨ３ドメインとを組み合わせ得る。
【００３２】
結果として、本発明による融合タンパク質は、典型的に、（付加的な部分および／または部分（ＩＩ）の長さに依存して）少なくとも１２アミノ酸〜約２００アミノ酸以上、好ましくは、１２アミノ酸〜約１５０アミノ酸、より好ましくは、約２０アミノ酸〜約１００アミノ酸、なお一層より好ましくは、約２０アミノ酸〜約７５アミノ酸、なお一層より好ましくは、約２０アミノ酸〜約５０アミノ酸の範囲にわたる長さを有する。部分（ＩＩ）がＬ−アミノ酸から構成される場合、本発明による融合タンパク質は、好ましくは、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅまたは図３Ｆによる配列を有する。代替的に、本融合タンパク質は、これらの図に示されている（部分（Ｉ）により含まれている）輸送配列、およびこれらの図に示されている全長ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列のうちの典型的には５０個未満連続するアミノ酸の（部分（Ｉ）により含まれている）フラグメント（このフラグメントは、少なくとも部分的にＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質のＢＨ３ドメイン配列を含む）を有し得る。本発明の別の実施形態では、これらの図に示されている各部分（ＩＩ）の配列は、Ｄ−アミノ酸から構成され得、そして、その末端を逆にすることにより反転されて、その結果、部分（ＩＩ）の全てＤ−アミノ酸であるｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型配列を生じる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質の少なくとも一つの第一部分（Ｉ）と少なくとも一つの第二部分（ＩＩ）とは、共有結合により結合されている。「共有結合」は、一つ以上の電子対を共有することにより生成される、二つの原子間の安定した化学結合に関する。存在する場合、上記のようなさらなる部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）などもまた、部分（Ｉ）または部分（ＩＩ）のうちのいずれかに共有結合により結合され得る。
【００３４】
一般的に、部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）は、リンカーを介してかまたは（リンカーなしで）直接的に、部分（Ｉ）のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸と、部分（ＩＩ）のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸との間に形成されるアミド架橋により結合され得る。部分（Ｉ）のＣ末端アミノ酸が部分（ＩＩ）のＮ末端アミノ酸に結合され得るか、または部分（Ｉ）のＮ末端アミノ酸が部分（ＩＩ）のＣ末端アミノ酸に結合され得る。従って、本発明の融合タンパク質は、例えば、部分（Ｉ）のどの末端が共有結合により部分（ＩＩ）に結合されるかに依存して、Ｃ末端輸送配列（部分（Ｉ））またはＮ末端輸送配列（部分（Ｉ））を有し得、その結果、リンカーが、部分（Ｉ）（例えば、Ｄ−ＴＡＴを含む配列）と、部分的ＢＨ３ドメイン配列または全長ＢＨ３ドメイン配列を含む部分としての部分（ＩＩ）との間に、付加され得る。
【００３５】
存在する場合、上記の通りのさらなる部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）などは、部分（Ｉ）もしくは部分（ＩＩ）と類似の様式で結合され得るか、または必要であれば互いに結合され得る。リンカー配列もまた、本発明の融合タンパク質を下記の少なくとも一つの他の部分／複数の部分と融合するために用いられ得る。必要に応じた部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）などが、本発明の融合タンパク質にそのＤアミノ酸の側鎖を介して結合され得るか、または部分（Ｉ）もしくは部分（ＩＩ）のいずれかの末端に結合され得る。側鎖を介した結合は、好ましくは、側鎖のアミノ基またはヒドロキシル基に基づく（例えば、エステル結合またはエーテル結合を介する）。本発明によると、（部分（Ｉ）、部分（ＩＩ）、部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）などのうちのどれについても）全てのアミノ酸は、Ｄ−鏡像異性アミノ酸であり、これらのアミノ酸が、ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の順序で結合されることによりその最終的に天然に存在するアナログを模倣することは、注意されなければならない。
【００３６】
リンカー配列が、部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）を融合するためかまたは別の部分（例えば、（ＩＩＩ））を部分（Ｉ）および／または部分（ＩＩ）に融合するために用いられる場合、上記リンカー配列は、好ましくは、５残基〜５０残基、より好ましくは、５残基〜１５残基の可変配列を形成する。好ましい実施形態では、上記リンカー配列（全てＤ型のアミノ酸配列か全てＬ型のアミノ酸配列のうちのいずれか）は、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも４０％、およびなお一層より好ましくは、少なくとも５０％のＧｌｙ残基を含む。適切なリンカー配列は、当業者により容易に選択され得かつ調製され得る。
【００３７】
部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）もまた、当該分野で公知の任意の適切な様式で、化学的結合により結合され得る。しかしながら、多くの公知の化学的架橋方法は非特異的であり、すなわち、それらは上記輸送タンパク質（またはペプチド）または積荷（ｃａｒｇｏ）部分上の任意の特定部位に対して結合点を方向付けないという事実に、注意が引きつけられる。従って、非特異的な架橋剤の使用は、機能的部位を攻撃し得るかまたは立体化学的に活性部位を塞ぎ得、上記融合タンパク質を生物学的に不活性にする。存在する場合、上記のようなさらなる部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）などは、互いに、あるいは部分（Ｉ）および／または部分（ＩＩ）に、類似の様式で結合され得る。
【００３８】
結合の特異性は、架橋されるべきタンパク質／ペプチド／ポリペプチドのうちの一方または両方において一回だけまたは少数回見出される官能基に対して直接的に化学結合することにより増加され得る。一例は、チオール基を含む唯一のアミノ酸であり、かつ、多くのタンパク質中に少数回しか存在しないシステインである。また、例えば、タンパク質／ペプチド／ポリペプチドがリジン残基を含まない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、そのタンパク質／ペプチド／ポリペプチドのアミノ末端に対して特異的であり得る。しかしながら、結合の特異性を増加させるためのこのアプローチの成功する利用には、上記のタンパク質／ペプチド／ポリペプチドが、その分子領域中に、その分子の生物学的活性を喪失することなく改変され得る上記の適切に希少かつ反応性の残基を有することを必要とする。
【００３９】
システイン残基が、タンパク質／ペプチド／ポリペプチド配列の部分中に存在し、そのシステイン残基が置換されない場合には架橋反応におけるその関与がおそらく生物学的活性を妨害する場合、上記システイン残基は、置換され得る。システイン残基が置換される場合、その結果生じるタンパク質（またはポリペプチド）のフォールディングにおける変化を最小にすることが、典型的に所望される。上記置換体が、化学的および立体化学的にシステインと類似する場合、タンパク質／ペプチド／ポリペプチドのフォールディングにおける変化は、最小化される。従って、セリンは、システインの置換体として好ましい。しかしながら、システイン残基は、導入され、Ｎ末端またはＣ末端での導入あるいはこれらの近傍での導入が、好ましい。関心のあるタンパク質／ペプチド／ポリペプチドが、化学合成により生成されようと組換えＤＮＡの発現により産生されようと、そのようなアミノ酸配列改変のための通常の方法が、利用できる。
【００４０】
二つの構成成分の結合（例えば、部分（Ｉ）のＤ型と部分（ＩＩ）Ｌ型との結合のために）は、連結剤または結合体化剤を介して達成され得る。数個の利用され得る分子間架橋試薬が、存在する。例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４年、ｐ．３９−４３を参照のこと。これらの試薬には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）、または６個の炭素〜１１個の炭素のメチレン架橋を有する他のそのような試薬；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンがある。この目的のために有用な他の架橋試薬としては、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン；ジメチルアジピミデート；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド；ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート；グルタルアルデヒドおよびジスジアゾベンジジンが挙げられる。架橋試薬は、ホモ二官能性であり得、すなわち、同一の反応を受ける二つの官能基を有し得る。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。ＢＭＨは、緩和な条件下（ｐＨ６．５〜７．７）で、スルフヒドリルを含む化合物と特異的に反応する、二つのマレイミド官能基を含む。上記の二つのマレイミド基は、炭化水素鎖により連結されている。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むタンパク質（またはポリペプチド）の不可逆的な架橋に有用である。架橋試薬はまた、ヘテロ二官能性であり得る。ヘテロ二官能性架橋試薬は、二つの異なる官能基（例えば、アミン反応性基およびチオール反応性基。これらは、遊離アミンおよび遊離チオールをそれぞれ有する二つのタンパク質を架橋する）を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例は、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、およびＭＢＳの伸張鎖アナログであるスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）である。これらの架橋試薬のスクシンイミジル基は、第一級アミンと反応し、そして、上記のチオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。架橋試薬はしばしば低い水溶性を有するので、スルホネート基などの親水性部分が、その水溶性を改良するために上記の架橋試薬に付加され得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性について改変された架橋試薬の例である。多くの架橋試薬は、細胞条件下で実質的に切断できない結合体を生じる。従って、ある架橋試薬は、細胞条件下で切断できるジスルフィドのような結合体を含む。例えば、トラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、およびＮ−スクシンイミジル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、周知の切断できる架橋試薬である。切断できる架橋試薬の使用は、上記の積荷部分が、上記標的細胞への送達の後に上記輸送ポリペプチドから分離することを許容する。この目的のため、直接的なジスルフィド結合もまた、有用であり得る。化学的架橋もまた、スペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、分子内加撓性を提供するかまたは結合部分の間の分子内距離を調節し、そして、その結果、生物学的活性を保存するのを助け得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸（例えば、プロリン）を含むタンパク質（またはポリペプチド）部分の形態であり得る。代替的に、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．、カタログ番号：２１６５１Ｈ）中のように架橋試薬の部分であり得る。上に議論されたものを含む多数の架橋試薬が、市販されている。これらの使用のための詳細な説明書は、市販元から容易に入手できる。タンパク質の架橋および結合体の調製に関する一般的な参考文献は、以下のものである：Ｗｒｏｇ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１年。
【００４１】
本発明はまた、天然の機能的配列またはそのＤ型アナログを模倣するが、連続して改変される、融合タンパク質を、包含する。これらの改変された改変体は、誘導体として規定され、かつ、これらの改変体もまた、本発明の融合タンパク質である。「誘導体」は、天然に存在するＬ−配列またはその対応するｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型であるＤ型の部分（Ｉ）および／または部分（ＩＩ）、ならびに（存在する場合には）部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）などの誘導体を含み得る。上記の天然のＬ-配列（またはそのＤ型アナログ）から、その特徴的な活性を保持する上記アミノ酸配列の一つ、二つ以上の部位での一つ以上のＬ−アミノ酸またはＤ-アミノ酸の置換、本発明のアミノ酸配列のいずれか一端もしくは両端かまたは上記アミノ酸配列の一つ以上の部位での一つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは本発明のアミノ酸配列の一つ以上の部位での一つ以上のアミノ酸の挿入により誘導される、融合タンパク質を示すことが意図される。好ましくは、アミノ酸の置換は、保存的置換に関する。保存的置換は、典型的に、以下のクラスの範囲内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。従って、好ましい保存的置換基は、アスパルテート−グルタメート；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシンおよびリジン−アルギニンである。部分（Ｉ）および／または部分（ＩＩ）（ならびに、存在する場合、部分（ＩＩＩ）、部分（ＩＶ）、部分（Ｖ）など）のこれらの配列の改変により、例えば、本発明の融合タンパク質の安定性および／または有効性が、改変され得、例えば、向上され得る。本発明の融合タンパク質であって、それらの天然のＬ型（またはそのＤ型アナログ；その天然の配列を反映するＬ型とＤ型の両者は、「親配列」とも呼ばれる）と比較して改変されている融合タンパク質は、例えば、配列、機能、および抗原の特徴または他の特徴について、その対応する親配列を有するタンパク質と相同な状態のままでなければならない。部分（Ｉ）に含まれている天然の輸送配列の誘導体は、機能的なままである（細胞透過部分としてのその特徴を維持する）一方で、部分（ＩＩ）に含まれている天然の（部分的または全長）ＢＨ３ドメイン配列の誘導体は、それらのアポトーシス促進性の性質を維持することが、特に、好ましい。天然の親配列に由来する本発明の融合タンパク質は、その親配列の性質よりも有利である改変された性質（例えば、上昇したｐＨ最適値、増加した温度安定性など）を所有する。例えば、本発明の融合タンパク質の部分（Ｉ）は、天然のＬ型アナログのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型であるＤ型を反映し得るか、または、配列の改変の導入により、そのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型であるＤ型（その天然のＬ型のアナログ）の誘導体を反映し得るかのいずれかであると理解される。
【００４２】
天然のＤ型配列またはＬ型配列の誘導体（本発明の融合タンパク質を形成している）は、典型的に、例えば、部分（ＩＩ）について図２Ａ〜２Ｆにより本明細書中に開示されている通り、その天然のアミノ酸配列と実質的な同一性を有する。特に好ましいのは、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の配列同一性、なお一層より好ましくは９０％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性をその天然のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列である。配列同一性は、例えば、その中に適切なデフォルトパラメーターとともに配列解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）を用いて、測定され得る。
【００４３】
組換え技術またはインビトロ翻訳による、Ｌ−アミノ酸から構成される天然のタンパク質の配列の産生は、周知であり、これは当業者によって周知である標準的方法（前出の、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ、１９８９年）に従って実行され得る。本発明の融合タンパク質が本発明の一実施形態による天然または誘導体のＬ型配列を含む場合、組換え技術は、本発明の融合タンパク質の特定の部分（例えば、部分（ＩＩ））を調製するために用いられ得る。これらのＬ型の部分（ＩＩ）は、その後、上に開示された通りの別途の工程により、Ｄ型の部分（Ｉ）に連結される。一般的に、本発明の融合タンパク質の部分の組換え調製は、その望ましい天然のＤＮＡ配列を選択するかまたは天然のＤＮＡ配列を改変するかのいずれかにより、適切な宿主へのそのＤＮＡ配列の形質転換、および、上記の（改変された）ＤＮＡ配列を発現させて上記の望ましいタンパク質の配列を形成することにより、実行される。望ましいタンパク質配列の単離は、必要な場合、上記細胞の破砕の後、遠心分離または濾過により上記（宿主）細胞をその培地から分離すること、その上澄みまたは濾液のタンパク質性構成成分を塩（例えば、硫酸アンモニウム）の手段により沈殿させること、次いで、多様なクロマトグラフィーの手順（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは当該分野で認識されている類似手順（例えば、前出の、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ、１９８９年、を参照）を用いた精製を含む、標準的方法を用いて実行され得る。
【００４４】
さらに詳細には、組換え方法は、適切な宿主細胞を、例えば、上記融合タンパク質の部分（ＩＩ）のＬ型をコードする本明細書中に提供される核酸またはベクターで形質転換すること、および生じた組換え微生物（好ましくはＥ．ｃｏｌｉ）を、宿主細胞の増殖および核酸の発現に適した条件下（例えば、誘導物質の存在下；適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補充物などが補充された適切な培地存在下）で培養することを含み、それによって、上記核酸が発現され、そして、上記のコードされた融合タンパク質が産生されることを含む。
【００４５】
本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）の天然のＬ型の核酸を含むベクターは、例えば、部分（ＩＩ）のＬ型配列の一つ以上の核酸配列を（他の配列は別として）含む核酸配列を規定する。ベクターは、適切な宿主細胞への形質転換において、上記核酸の発現を可能にするために用いられ得る。上記ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単純に潜在的なゲノム挿入物であり得る。いったん適切な宿主に形質転換されると、上記ベクターは、その宿主ゲノムとは独立して複製および機能し得るか、または適切な条件下で上記ゲノム自体に組み込み得る。本発明による好ましいベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦおよびｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドである。
【００４６】
上記の用語ベクターの「他の配列」は、以下のものに関する：一般的に、適切なベクターは、複製起点（例えば、Ｏｒｉ  ｐ、ｃｏｌＥｌ  Ｏｒｉ）、上記の挿入された核酸が発現（転写および／もしくは翻訳）されることを可能にする配列ならびに／または選択可能な遺伝子マーカー（例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子、Ｔｎ３由来のｐ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｔｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子またはＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子のような、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を含む）を含む。
【００４７】
用語「プラスミド」は、通常自己複製する染色体外性遺伝的エレメントを意味する。プラスミドは、一般的に、文字および数字が前ならびに／または後ろにある小文字「ｐ」により示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販され、制限されずに公けに入手可能であるか、または上記の公開された手順に従って、入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されているプラスミドと均等なプラスミドは、当業者に公知である。本発明のベクターを調製するために使用される出発プラスミドは、例えば、これらのプラスミドを含む適切なＥ．ｃｏｌｉから、塩化セシウムＤＮＡ単離のような標準的な手順を用いて単離され得る。
【００４８】
適切なベクターはまた、（組換え型）ＤＮＡクローニングベクターならびに（組換え型）発現ベクターに関する。ＤＮＡクローニングベクターとは、ＤＮＡ分子を含むプラスミドおよびファージを含むがこれらに限定されない、自律的に複製する因子に関し、上記ＤＮＡ分子に、上記融合タンパク質における、例えば、その天然のＬ型の部分（ＩＩ）の一つ以上の付加的な核酸が、付加されている。発現ベクターとは、発現されるべき核酸配列を含む任意のＤＮＡクローニングベクター組換え型構築体に関し、上記核酸配列は、その発現を果たす能力を有しかつ適切な宿主内でその挿入された配列の転写を制御する、適切な制御配列に作動可能に連結されている。そのようなプラスミドはまた、様々な生物体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｆ９（バキュロウイルスの宿主として）、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが挙げられる）において望ましい配列を生じる発現ベクターを構築するために、容易に改変され得る。上記文献は、ＡＶ１２発現ベクターを構築するための技術およびＡＶ１２で宿主細胞を形質転換するための技術を含む。本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第４，９９２，３７３号は、これらの技術を説明している多くの参考文献のうちの一つである。
【００４９】
「作動可能に連結されている」とは、核酸配列が、その核酸配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を可能にする様式で、制御配列に連結されていることを意味する。「転写」とは、ＤＮＡの核酸配列に含まれる情報が相補的なＲＮＡ配列に転写されるプロセスを意味する。
【００５０】
「制御配列」は、当該分野において周知であり、そして、本発明のＬ型の融合タンパク質の核酸を発現するためかつその転写を制御するために選択される。そのような配列は、ポリアデニル化シグナル、プロモーター（例えば、天然または合成のプロモーター）または転写を果たすためのエンハンサー、転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、組織特異的な転写を可能にするための遺伝子座制御領域またはサイレンサー、そのｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、上記ｍＲＮＡを安定化する能力を有する配列、転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの制御配列は、例えば、一つ以上の核酸の欠失、付加、挿入または置換により改変され得るが、それらの制御機能を保持する。他の適切な制御配列は、当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡに記載されている。
【００５１】
特に、様々な生物体に関する多数の様々なプロモーターが、公知である。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ内で用いられるベクターのための好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターである；Ｅ．ｃｏｌｉ内で用いられる好ましいプロモーターはＴ７／Ｌａｃプロモーターである；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で用いられる好ましいプロモーターはＰＧＫ１である；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｒｉｇｅｒ内で用いられる好ましいプロモーターはｇｌａＡである；そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）内で用いられる好ましいプロモーターはｃｂｈＩである。原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、βラクタマーゼ（レプリコンおよびβラクタマーゼ遺伝子を含むベクターｐＧＸ２９０７（ＡＴＣＣ  ３９３４４））およびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、１９７８年、第２７５巻、ｐ．６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、１９７９年、第２８１巻、ｐ．５４４）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（上記ｔｒｐプロモーターの制御下でｔｒｐＥ融合タンパク質としてオープンリーディングフレームの発現を促進ことが示されている、ベクターｐＡＴＨ１（ＡＴＣＣ  ３７６９５））およびｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０  ＡＴＣＧ３７２８２から単離可能）のようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の機能的な細菌性プロモーターであって、そのヌクレオチド配列が一般的に公知のプロモーターは、当業者が、任意の必要な制限酵素部位を供給するリンカーまたはアダプターを用いて、望ましいタンパク質配列（例えば、本発明の融合タンパク質のＬ型の部分（ＩＩ））をコードするＤＮＡにそれらのプロモーターに連結することを可能にする。細菌のシステム内での使用のためのプロモーターはまた、本発明の融合タンパク質（の一部）として用いられる望ましいタンパク質配列をコードするＤＮＡに作動可能に連結された、シャイン−ダルガーノ配列を含む。
【００５２】
有用な発現ベクターは、例えば、以下のような染色体性ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列の断片からなり得る：ＳＶ４０の様々な公知の誘導体またはフラグメントおよび公知の細菌性プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｃｏｌ  Ｅ１、ｐＢＫ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ  １９およびそれらの誘導体が挙げられるプラスミド）、広い宿主領域を有するプラスミド（例えば、ＲＰ４）、ファージＤＮＡ（例えば、ラムダファージ（例えば、ＮＭ９８９）ならびに他のＤＮＡファージ（例えば、Ｍ１３および繊維状の一本鎖ＤＮＡファージ）の多数の誘導体）、酵母プラスミド、真核細胞内で有用なベクター（例えば、動物細胞内で有用なベクター、およびプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるために改変されたプラスミド））。上記の発現ベクターを用いた発現技術は、当該分野において公知であり、一般的に、例えば、前出の、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ、１９８９年に記載されている。
【００５３】
上記のベクター、または本発明の融合タンパク質における、例えば、Ｌ型の部分（ＩＩ）の核酸配列を含む、適切な「細胞」または「宿主細胞」は、発現される配列のための宿主および発現媒体として働き得る。上記宿主細胞は、例えば、原核生物細胞、真核生物細胞または古細菌細胞であり得る。宿主細胞は、（例えば、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入の結果として）本明細書中に記載されている通りのベクターまたは核酸を含み、上記宿主細胞としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：細菌細胞（例えば、Ｒ．  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｉｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅ、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）および糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）を含む真菌、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ）。好ましくは、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞を意味する。一般的に、挿入された関心のある配列の発現を調節するか、または上記配列によりコードされる発現されたタンパク質を望ましい特定の方法で改変またはプロセシングする、宿主細胞が、選択され得る。従って、適切な細胞または細胞株または宿主システムが、上記の外来タンパク質の望ましい改変およびプロセシングが達成されることを保証するように、選択され得る。例えば、細菌システム内のタンパク質発現は、グリコシル化されていないコアタンパク質を産生するために用いられ得るが、哺乳動物細胞内の発現は、異種タンパク質の「天然の」グリコシル化を保証する。
【００５４】
真核生物宿主細胞は、特定の真核生物宿主細胞における使用には限定されない。様々な真核生物宿主細胞が、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような寄託機関から入手可能であり、上記の通りのベクターを用いた使用に適切である。特定の宿主細胞の選択は、用いられる発現ベクターの性質に依存する。真核生物宿主細胞は、哺乳動物細胞ならびに酵母細胞を含む。多数の他の菌種が一般的に入手可能であるが、不完全真菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、最も一般的に用いられる真核生物の微生物である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．内での発現のため、例えば、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＧ４００５３）が、一般的に用いられる（例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９７９年、第２８２巻、ｐ．３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ、１９７９年、第７巻、ｐ．１４１；Ｓ．Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ、１９８０年、第１０巻、ｐ．１５７を参照）。このプラスミドは、すでに、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株のための選択マーカーを提供するｔｒｐ遺伝子を含んでいる。
【００５５】
酵母宿主を用いた使用のための適切なプロモーティング配列としては、３−ホスホグリセレートキナーゼについてのプロモーター（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤ（ＡＴＣＣ  ５３２３１）において見出され、そして、本明細書中に参考文献として援用されている、１９９０年６月１９日に発行された米国特許第４，９３５，３５０号に記載されている）、または他の解糖酵素（例えば、エノラーゼについてのプロモーター（プラスミドｐＡＣ１（ＡＴＣＣ  ３９５３２）において見出される）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについてのプロモーター（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１（ＡＴＣＣ  ５７０９０、５７０９１）に由来する）、ヘキソキナーゼについてのプロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼについてのプロモーター、ホスホフルクトキナーゼについてのプロモーター、グルコース−６−リン酸イソメラーゼについてのプロモーター、３−ホスホグリセレートムターゼについてのプロモーター、ピルビン酸キナーゼについてのプロモーター、トリオースホスフェートイソメラーゼについてのプロモーター、ホスホグルコースイソメラーゼについてのプロモーターおよびグルコキナーゼについてのプロモーター）、ならびにＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子についてのプロモーター（本明細書中に参考文献として援用されている、１９９１年３月１９日に発行された米国特許第５，０００，０００号）が挙げられる。その転写が種々の増殖条件により制御可能であるという付加的利点を有する誘導性のプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２のプロモーター領域、イソシトクロムＣのプロモーター領域、酸性ホスファターゼのプロモーター領域、窒素代謝と関連する分解酵素のプロモーター領域、メタロチオネイン（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ（ＡＴＣＣ  ３９４７５）上に含まれ、そして、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第４，８４０，８９６号に記載されている）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター領域、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のプロモーター領域（例えば、プラスミドｐＲＹ１２１（ＡＴＣＣ  ３７６５８）上に見出されるＧＡＬ１）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵＡＳ  Ｇａ１（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−ｈＩ１ｂｅｔａ（ＡＴＣＣ  ６７０２４）上にＣＹＣ１プロモーターと組み合わせて見出される）のような酵母エンハンサーも、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
【００５６】
上記のベクターは、任意の適切な方法（例えば、形質転換；エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション、感染；または形質導入）を使用して、宿主細胞に導入され得る。形質転換は、生物体へのＤＮＡを、そのＤＮＡが染色体外エレメントとしてかまたは染色体性組込みによるかのいずれかで複製可能であるように導入することに関する。細菌宿主および真核生物宿主の形質転換の方法は、当該分野において周知である。核注入、プロトプラスト融合、またはカルシウム処理による方法などの多数の方法が、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ、１９８９年に要約されている。トランスフェクションとは、何らかのコード配列が実際発現されるかとは無関係に、宿主細胞によるベクターの取込を指す。成功するトランスフェクションは、一般的に、何らかの指標、または上記操作またはベクターがその宿主細胞内に存在する場合に認識される。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ）は、天然のＬ型またはその誘導体には対応せず、Ｄ−アミノ酸から構成されかつその順序を逆にされたｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型であるＤ型配列に相当する。部分（ＩＩ）のこれらのＤ型配列は（部分（Ｉ）のＤ型配列と同様に）、典型的に、組換え技術により受け入れやすくなく、好ましくは、Ｄ-アミノ酸配列を得るためにＬ-アミノ酸の代わりにＤ-アミノ酸を用いたペプチド合成技術（例えば、固相合成）により合成される。しかしながら、上記のアミノ酸順序が、上記合成のために（上記Ｌ型アナログと比較して）逆にされなければならないことが、注意されなければならない。
【００５８】
対応して、本発明の全てのアミノ酸配列（Ｄ型配列またはＬ型配列のうちのいずれか）は、当該分野において周知の化学的方法（固相タンパク質合成を含む）、または組換え方法により構築され得る。両者の方法は、全体が本明細書中に参考文献として援用されている、米国特許第４，６１７，１４９号に記載されている。融合タンパク質の固相化学合成の原理は、当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｄｕｇａｓ  Ｈ．およびＰｅｎｎｅｙ  Ｃ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８１年、ｐ．５４−９２により説明されている。例えば、タンパク質およびペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給される合成サイクルを利用した固相方法により、合成され得る。ｔ−ブトキシカルボニル保護されたアミノ酸などの保護されたアミノ酸および他の試薬は、多くの化学物質供給会社から市販されている。二重カップリングプロトコールを用いる連続的ｔ−ブトキシカルボニル化学は、Ｃ末端のカルボキサミドの生成のため、その出発ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に適用される。Ｃ末端の酸の生成のため、その対応するピリジン−２−アルドキシムメチオジド樹脂が、用いられる。アスパラギン、グルタミンおよびアルギニンは、予め形成されたヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて結合される。以下の側鎖の保護が、用いられ得る：Ａｒｇ、トシル；Ａｓｐ、シクロヘキシル；Ｇｌｕ、シクロヘキシル；Ｓｅｒ、ベンジル；Ｔｈｒ、ベンジル；Ｔｙｒ、４−ブロモカルボベンズオキシ。
【００５９】
ｔ−ブトキシカルボニル部分の除去（脱保護）は、塩化メチレン中にあるトリフルオロ酢酸を用いて行われ得る。上記合成の完了後に、上記タンパク質またはペプチドは、１０％ｍ−クレゾールを含む無水フッ化水素を用いて、上記レジンから脱保護および開裂され得る。上記側鎖保護基および上記（融合）タンパク質の上記樹脂からの開裂は、０℃以下、好ましくは−２０℃で、３０分間、続いて３０分間０℃で行われる。上記フッ化水素の除去の後、上記（融合）タンパク質／樹脂は、エーテルで洗浄され、上記（融合）タンパク質は氷酢酸で抽出され、その後凍結乾燥される。精製は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で１０％酢酸中にて行われる。上記の通り、Ｌ−アミノ酸から構成されるペプチドまたはＤ-アミノ酸から構成されるペプチドは、同一の一般的技術により合成される。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、本発明の融合タンパク質と、必要であれば、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクルとを含む、薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、正常なプログラムされた細胞死（アポトーシス）における変化（例えば、変異）により少なくとも部分的には引き起こされる疾患の処置のために、意図されている。特に、そのような変化は、（全部または一部分の）正常なログラムされた細胞死（アポトーシス）を妨害する。好ましくは、このような疾患としては、癌（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、組織球リンパ腫、脳の癌（グリア芽細胞腫）、卵巣癌、尿生殖器路の癌、結腸癌、肝臓癌、結腸直腸管の癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、胃癌、喉頭癌、肺癌（肺腺癌および小細胞肺癌を含む）ならびに／または皮膚癌（例えば、メラノーマまたは非メラノーマ皮膚癌（基底細胞癌および扁平上皮癌を含む））、ならびに乾癬、ベーチェット症候群、尋常天疱瘡が挙げられる。
【００６１】
本発明による「薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクル」とは、これらと共に処方される本発明の融合タンパク質の薬理学的活性を破壊しない、毒性のないキャリア、アジュバントまたはビヒクルを示す。本発明の組成物中で用いられ得る、薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルとしては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなど血清タンパク質、緩衝物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づいた物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂。
【００６２】
本発明の薬学的組成物は、非経口的にまたは非腸管外に（例えば、経口的に）投与され得る。
【００６３】
本明細書中に用いられる場合の用語「非経口的」は、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への、注射または注入の技術を含む。好ましくは、上記薬学的組成物は、経口的、腹膜内または静脈内に投与される。本発明の薬学的組成物の滅菌した注射可能な形態は、水性懸濁物または油性懸濁物であり得る。これらの懸濁物は、当該分野において公知の技術に従って、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて処方され得る。上記の滅菌した注射可能な調製物は、毒性のない非経口的に受容可能な賦形剤または溶剤中の、滅菌した注射可能な溶液または懸濁物（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）でもあり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の不揮発性油は、通常、溶媒または懸濁媒体として使用される。
【００６４】
この目的のため、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激不揮発性油が、使用され得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、注射可能物質の調製に有用であるオリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に受容可能な油もまた、特にそれらのポリオキシエチル化された型において、同様である。これらの油の溶液または懸濁物は、カルボキシメチルセルロースなどの長鎖アルコールの希釈剤または分散剤、あるいは、薬学的に受容可能な投薬形態（エマルジョンおよび懸濁物を含む）の処方において一般に用いられる類似の分散剤をも含み得る。Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤などの他の一般に用いられる界面活性剤、または薬学的に受容可能な固体、液体または他の投薬形態の製造において一般に用いられるバイオアベイラビリティ強化剤もまた、処方目的のために、用いられ得る。
【００６５】
経口的に投与される場合、本発明の薬学的組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または溶液が挙げられるがこれらに限定されない、経口的に受容可能な任意の投薬形態において、経口的に投与され得る。経口的使用のための錠剤の場合、一般に用いられるキャリアとしては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も、典型的に添加される。カプセル形態における経口投与のため、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口的使用のため、水性懸濁剤が必要である場合、その活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。所望される場合、一定の甘味剤、香味剤または着色剤も、添加され得る。さらに、標準的な薬学的方法が、作用期間を制御するために使用され得る。これらは、当該分野において周知であり、制御放出調製物を含み、そして、適切な高分子（例えば、ポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）を含み得る。高分子の濃度ならびに組込みの方法は、放出を制御するために調節され得る。さらに、上記物質は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチルビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材料の粒子中に組み込まれ得る。組み込まれることに加えて、これらの物質は、マイクロカプセル中の上記化合物を捕捉するためにも用いられ得る。
【００６６】
さらなる投与形態は、例えば、吸入スプレーによる投与形態、局所投与形態、直腸投与形態、鼻投与形態、口腔内投与形態、膣投与形態、または移植されるレザバを介する投与形態であり、これらのうちのいくつかは、以下にさらに詳細に説明されている。
【００６７】
従って、本発明の薬学的組成物は、直腸投与のための座剤の形態において投与され得る。これらは、上記薬剤と非刺激性の適切な賦形剤とを混合することにより調製され得る。上記賦形剤は、室温では固体であるが、直腸の温度では液体であり、従って、直腸内で溶解し、上記薬物を放出し得る。そのような物質としては、カカオ脂、みつろう、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００６８】
本発明の薬学的組成物はまた、特に、処置の標的が局所的適用により容易に接近できる領域または器官を含む場合、局所的に投与され得る。上記の処置の標的としては、眼、皮膚または腸管下部の疾患が挙げられる。これらの領域または器官の各々のための適切な局所的処方物は、容易に調製される。腸管下部のための局所的適用は、直腸座剤処方物（上記を参照のこと）または適切な浣腸処方物として遂行され得る。局所的皮下パッチも、用いられ得る。局所的適用のため、上記薬学的組成物は、一つ以上のキャリア中に懸濁または溶解された上記活性成分を含む適切な軟膏剤として処方され得る。本発明の融合タンパク質の局所的投与のためのキャリアとしては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろうおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、上記薬学的組成物は、一つ以上の薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁または溶解された上記活性融合タンパク質を含む適切なローション剤または乳剤として処方され得る。適切なキャリアとしては、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
眼科的使用のため、上記薬学的組成物は、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤を含むかまたは含まないかのいずれかで、ｐＨ調整された等張な滅菌食塩水中の微細化された懸濁剤としてか、または、好ましくは、ｐＨ調整された等張な滅菌食塩水中の溶剤として処方され得る。
【００７０】
代替的に、眼科的使用のため、上記薬学的組成物は、ワセリンなどの軟膏剤として処方され得る。
【００７１】
本発明の薬学的組成物はまた、鼻用エアロゾルによるかまたは吸入により投与され得る。そのような薬学的組成物は、薬学的処方の分野において周知の技術に従って調製され、そして、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または他の通常の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、食塩水中の溶剤として調製され得る。
【００７２】
最も好ましくは、本発明の薬学的組成物は、経口投与のために処方される。
【００７３】
単一の投薬形態において薬学的組成物を生じるためにキャリア、アジュバントおよびビヒクルと組み合わされ得る本発明の融合タンパク質の量は、処置される宿主、特定の投与様式に依存して変化し得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の投与用量の上記インヒビターがこれらの組成物を受けている患者に投与され得るように、処方される。好ましい投与用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日、なお一層好ましい投与用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜５ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にわたる。
【００７４】
カプセル剤：カプセル剤は、標準的なツーピース式硬ゼラチンカプセル各々を、１００ミリグラムの粉末化された活性成分、１７５ミリグラムのラクトース、２４ミリグラムのタルクおよび６ミリグラムのステアリン酸マグネシウムで満たすことにより調製される。軟ゼラチンカプセル：ダイズ油中の活性成分の混合物が、調製され、そして、容積式ポンプによってゼラチンに注入されて、１００ミリグラムの上記活性成分を含む軟ゼラチンカプセルを形成する。上記カプセルは、その後、洗浄、乾燥される。錠剤：錠剤は、その用量単位が、１００ミリグラムの活性成分、０．２ミリグラムのコロイド状二酸化ケイ素、５ミリグラムのステアリン酸マグネシウム、２７５ミリグラムの微結晶性セルロース、１１ミリグラムのトウモロコシデンプン、９８．８ミリグラムのラクトースであるように、通常の手順により調製される。適切なコーティングが、味のよさを増すためまたは吸収を遅延させるために使用され得る。注射剤：注射による投与に適切な非経口の組成物が、１０容積％のプロピレングリコールおよび水中に、１．５重量％活性成分を攪拌することにより調製される。この溶液は、塩化ナトリウムで等張性にされ、そして滅菌される。懸濁剤：水性懸濁剤は、経口投与用に、各５ミリリットルが、１００ミリグラムの微細に分割された活性成分、２００ミリグラムのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５ミリグラムの安息香酸ナトリウム、１．０グラムのソルビトール溶液（Ｕ．Ｓ．Ｐ）および０．０２５ミリリットルのバニリンを含むように、調製される。
【００７５】
任意の特定の患者のための具体的な用量および処置レジメンは、以下のものを含む様々な要因に依存する：使用される具体的な融合タンパク質の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投薬期間、排出の速度、薬の組み合わせ、および処置している医師の判断、処置されている特定の疾患の重症度。上記薬学的組成物における、本発明の融合タンパク質の量はまた、上記組成物中のその特定の融合タンパク質にも依存する。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態は、疾患の処置のため、または疾患の処置および／もしくは予防のための薬学的組成物の調製のための、本発明の融合タンパク質の使用に関する。あるいは、本発明のさらなる実施形態は、不完全なアポトーシスにより引き起こされる状態である、癌ならびに乾癬、ベーチェット症候群、尋常天疱瘡の処置のための治療方法に関する。上記癌は、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、組織球リンパ腫、脳の癌（グリア芽細胞腫）、卵巣癌、尿生殖器路の癌、結腸癌、肝臓癌、結腸直腸管の癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、胃癌、喉頭癌ならびに肺癌（肺腺癌および小細胞肺癌を含む）、ならびに／または皮膚癌（例えば、メラノーマまたは非メラノーマ皮膚癌（基底細胞癌および扁平上皮癌を含む））である。
【００７７】
以下の図面および例は、本発明を例示すると考えられる。以下の図面および例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本出願の開示により引用される全ての参考文献は、本明細書により、参考として全体が援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｔａｔタンパク質の塩基性領域のアミノ酸配列を、そのｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型であるＤ型として示す。従って、示されている全てのアミノ酸は、Ｄ-鏡像異性アミノ酸である。図１Ａの配列は、Ｄ−ＴＡＴの例（配列番号１）である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、一般的なＤ−ＴＡＴのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。Ｄ−ＴＡＴは、図１Ａの説明に言及されている。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒト異性体である、Ｂｉｄ（ヒトアイソフォーム）（転写改変体１）天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｂａｄ（ヒトアイソフォーム）の天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号４）を示す；ＢＨ３ドメインに下線が引かれている。ＢＨ３ドメインは、下線を引かれた部分を、両方の末端に二つの付加的なアミノ酸も伴って含み得る。これらの四つの付加的なアミノ酸は、太字で示されている。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｎｏｘａ（ヒトアイソフォーム）の天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｐｕｍａ（ヒトアイソフォーム）の天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｂｉｍ（ヒトアイソフォーム）（転写改変体１）の天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、Ｂｉｋ（ヒトアイソフォーム）の天然のＬ-アミノ酸配列（配列番号８）を示す；ＢＨ３ドメインに下線が引かれている。ＢＨ３ドメインは、下線を引かれた部分を、両方の末端に二つの付加的なアミノ酸も伴って含み得る。これらの四つの付加的なアミノ酸は、太字で示されている。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｂｉｄのアミノ酸配列（転写改変体１、配列番号９）−本発明の融合タンパク質の例を示す。この配列において、Ｂｉｄ全長配列（本発明によると、本発明の融合タンパク質の部分（ＩＩ））は、（以下の図３Ｂ〜図３ＦのＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質配列と同様に）その天然のＬ型で表されており、部分（Ｉ）はＤ-アミノ酸から構成される、その反転された型で表されている（Ｄ−Ｔａｔ）。本発明の融合タンパク質をｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ型の全てＤ-アミノ酸である配列として表すためには、部分（ＩＩ）は、反転されなければならない。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｂａｄのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す；ＢＨ３ドメインに下線が引かれている。ＢＨ３ドメインは、下線を引かれた部分を、両方の末端に二つの付加的なアミノ酸も伴って含み得る。これらの四つの付加的なアミノ酸は、太字で示されている。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｎｏｘａのアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｐｕｍａのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｂｉｍ（転写改変体１）のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、Ｄ−ＴＡＴ−Ｂｉｋのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す；ＢＨ３ドメインに下線が引かれている。ＢＨ３ドメインは、下線を引かれた部分を、両方の末端に二つの付加的なアミノ酸も伴って含み得る。これらの四つの付加的なアミノ酸は、太字で示されている。
【図４Ａ】図４Ａは、ＢｉｋのＢＨ３ドメイン（Ｂｉｋ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＢａｄのＢＨ３ドメイン（Ｂａｄ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＢｉｄのＢＨ３ドメイン（Ｂｉｄ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＢｍｆのＢＨ３ドメイン（Ｂｍｆ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＤＰ５／ＨｒｋのＢＨ３ドメイン（ＤＰ５／Ｈｒｋ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＢｉｍのＢＨ３ドメイン（Ｂｉｍ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＮｏｘａのＢＨ３ドメイン（Ｎｏｘａ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｈ】図４Ｈは、ＰＵＭＡのＢＨ３ドメイン（ＰＵＭＡ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｉ】図４Ｉは、ＢａｘのＢＨ３ドメイン（Ｂａｘ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｊ】図４Ｊは、ＢａｋのＢＨ３ドメイン（Ｂａｋ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図４Ｋ】図４Ｋは、ＢｏｋのＢＨ３ドメイン（Ｂｏｋ  ＢＨ３）の天然のＬ-アミノ酸配列を示す；
【図５】図５は、ＨｅＬａ細胞のＢＨ３誘導性細胞死の結果を表すグラフを示す。用いられた本発明の融合ペプチドは、第一部分（Ｉ）として輸送配列Ｄ−ＴＡＴを含み、第二部分（ＩＩ）としてＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質（Ｂｉｍ、Ｂｏｋ、Ｂａｘ、ＤＰ５「Ｈｒｋ」、Ｂｉｄ、Ｎｏｘａ、ＰＵＭＡおよびＢａｋ）のＢＨ３ドメイン配列を、（図５に示されている通りに）それぞれ含む。融合ペプチドは、１μＭ、１０μＭ、５０μＭおよび１００μＭという濃度で、ＨｅＬａ細胞と共に培地中で２４時間インキュベートされた。対照は、処理を伴わない（すなわち、本発明の融合ペプチドと共にインキュベーションをしない）ＨｅＬａ細胞を含む。上記対照はまた、βＴＣ−３細胞と共に培地中で２４時間インキュベートされた。アポトーシス細胞は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）／ＰＩ染色（Ｂｏｎｎｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年、第２７５巻、ｐ．１６４６６−１６４７２）に従って計数された。アポトーシス細胞のパーセンテージが、図５中に、縦座標の軸上に、「細胞死％」として示されている。図５において見られ得る通り、Ｂｉｍ、ＢｏｋまたはＢａｘを含む融合ペプチドは、最もよい結果（すなわち、約９８％および約６８％という最も高い細胞死の割合）を示した。ＰＵＭＡを含む融合ペプチド（細胞死の割合約２３％）が次に続いた。Ｂｉｍを含む融合ペプチドは、ペプチド濃度５０μＭで、最もよい結果（すなわち、約９８％という細胞死の割合）を引き起こすが、ＢｏｋまたはＢａｘを含む融合ペプチドは、ペプチド濃度１００μＭで、約９８％および６８％という、示される細胞死の割合を引き起こすことが、注意されなければならない。
【図６】図６は、βＴＣ−３細胞の、ＢＨ３誘導性細胞死の結果を表すグラフを示す。用いられた本発明の融合ペプチドは、第一部分（Ｉ）として輸送配列Ｄ−ＴＡＴを含み、第二部分（ＩＩ）としてＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質（Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｏｋ、ＢａｘおよびＤＰ−５）のＢＨ３ドメイン配列を（図６に示されている通りに）それぞれ含む。融合ペプチドは、濃度１μＭおよび１０μＭそれぞれで（濃度１μＭについて「Ｐｕｍａ１」として、濃度１０μＭについて「Ｐｕｍａ１０」としてなどと示されている）、βＴＣ−３細胞と共に培地中で２４時間インキュベートされた。一つの試料は、輸送配列Ｌ−Ｔａｔを濃度１０μＭで含む。別の試料は、毒性対照として、タプシガルギンという物質を含む。上記対照は、処理を伴わない（すなわち、本発明の融合ペプチドと共にインキュベーションをしない）βＴＣ−３細胞を含む。上記Ｌ−Ｔａｔ試料および上記対照はまた、βＴＣ−３細胞と共に培地中で２４時間インキュベートされた。アポトーシス細胞は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）／ＰＩ染色（上記を参照のこと）に従って計数された。アポトーシス細胞のパーセンテージが、図６において、縦座標の軸上に、「細胞死％」として示されている。図６中に見られ得る通り、濃度１０μＭで、Ｂｉｍを含む融合ペプチド、Ｂｏｋを含む融合ペプチドが、最もよい結果（各々、約９９％および約８６％の細胞死）を示し、濃度１０μＭのＮｏｘａおよびＢａｘ（各々、約５２％および約４３％の細胞死）が次に続く。図５および図６に示されているようなヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）／ＰＩ染色は、Ｂｏｎｎｙ  Ｃ．ら、ＩＢ１  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、第２７５巻、ｐ．１６４６６−１６４７２に記載されている通りに行われた。両方の細胞株（ＨｅＬａ細胞株（ヒト子宮頸癌）（図５）およびインスリン分泌細胞株βＴＣ−３（Ｅｆｒａｔ  Ｓ．ら、Ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８８年、第８５巻、ｐ．９０３７−９０４１）（図６）は、１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１ｍｍｏｌ／ｌのピルビン酸ナトリウムおよび２ｍｍｏｌ／ｌのグルタミンを補充された、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養された。
【図７】図７は、本発明の全てＤ型の融合ペプチド（Ｂｉｄ、ＢａｘおよびＢａｄ由来のＤ−ＢＨ３−Ｄ−Ｔａｔ）について得られた結果を示す。Ｄ-アミノ酸から構成されるこれらのＢＨ３ドメイン配列は、図４で与えられる配列に対応するが、それらのアミノ酸配列は、反転されている。Ｃｉｓ−ＰＩを含む、用いられる全ての濃度は、１０μＭであった。細胞（ＨｅＬａ（上段）およびＣ３３Ａ（下段））のインキュベーションは、４８時間持続した。以下の条件が、適用された：１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１ｍｍｏｌ／ｌのピルビン酸ナトリウムおよび２ｍｍｏｌ／ｌのグルタミンを補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地が、調製された。染色は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて行われた（上記を参照のこと）（各々に１μｇ／ｍｌで５分間、その後、蛍光顕微鏡下で手動による細胞の計数、または写真撮影）。このアッセイでは、生細胞は青色に染まり、死細胞は暗赤色（暗色）に染まる。本発明の全てＤ型のペプチドは全て、上記細胞をアポトーシス性にすることが、明確に見える。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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