(57)【要約】  メラノコルチン受容体結合ミメティボディポリペプチドが開示される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含んでなるか若しくは該ミメティボディを発現する細胞、ならびに前述の作成および使用方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
（Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
［式中、Ｍｐはメラノコルチン受容体結合性分子であり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域であり、そして、ＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１から１０までの整数である］
で表されるポリペプチド。
【請求項２】
Ｍが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８の生物学的に活性のフラグメントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｍが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは１８に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが最低１種のメラノコルチン受容体に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
メラノコルチン受容体がメラノコルチン４受容体である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号６０若しくは６２を含んでなるポリペプチド。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５９若しくは配列番号６１を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号５９若しくは配列番号６１に相補的なポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号６０若しくは配列番号６２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８若しくは９に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１１】
配列番号６３を含んでなる、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし６のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する細胞。
【請求項１３】
請求項１０に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項１４】
細胞がＨＥＫ２９３由来細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の細胞を培養する段階、および発現されたポリペプチドを精製する段階を含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１ないし６のいずれか１つに記載の最低１種のポリペプチド、および製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の製薬学的組成物を細胞、組織若しくは器官と接触させることを含んでなる、細胞、組織若しくは器官中のメラノコルチン受容体の生物学的活性の改変方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のメラントコルチン受容体に媒介される状態の調節方法。
【請求項１９】
メラノコルチン受容体に媒介される状態が肥満である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノコルチン受容体結合性ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、これらをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくは該ミメティボディを発現する細胞、ならびに前記の作成および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、身体サイズに比例しての体脂肪量の過剰により明らかになる慢性疾患である。今日、米国人の３人に１人は太りすぎ（ボディマス指数（ＢＭＩ）＞２５ｋｇ／ｍ２）とみなされ、従って、米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）が、肥満は流行病の比率に達しつつあると宣言することを促進している（非特許文献１）。肥満処置の重要性は、この疾患が、とりわけ２型糖尿病、うっ血性心不全、変形性関節症および睡眠時無呼吸のような疾患の発症の根底にある原因若しくは危険因子のいずれかであるという事実により強調される。
【０００３】
加えて、肥満は、肥満、アテローム生成性脂質代謝異常、高血圧およびインスリン抵抗性を特徴とする医学的状態である「メタボリックシンドローム」に結びつけられている。メタボリックシンドロームは米国で増大する数の人々を冒している。重要なことには、体重の適度の減少（初期体重の５〜１０％）でさえ、メタボリックシンドロームの状態を有意に改善しかつ肥満関連疾患の発症の危険因子を減少させうることが示された（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。加えて、肥満の処置は、いくつかの文化において肥満の個体にしばしば付随される社会的不名誉により、精神保健の観点から重要でありうる。
【０００４】
メラノコルチン受容体は、ヒトおよびげっ歯類の双方において全体的なエネルギーバランスおよび肥満の調節で主要な役割を演じている。α−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）は、メラノコルチン系の重要な１成分である１３アミノ酸のペプチドホルモンである。α−ＭＳＨは、脳下垂体により放出されるプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）のタンパク質分解性プロセシングにより産生される。α−ＭＳＨはメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）に高親和性で結合するが、しかしまた、メラノコルチン受容体３（ＭＣ３Ｒ）およびメラノコルチン受容体５（ＭＣ５Ｒ）も低親和性で結合する。ＭＣ４Ｒは脳中で見出されるＧ共役型タンパク質受容体であり、α−ＭＳＨ結合により刺激される場合に低下された食物摂取および増大された脂肪酸化を引き起こす。最終的には、ＭＣ４Ｒのようなメラノコルチン受容体の刺激は減量をもたらす。
【０００５】
ヒトおよびげっ歯類において、メラノコルチン系の多様な成分の機能喪失突然変異は、肥満および関連する状態と緊密に相関する。マウスにおいて、ＰＯＭＣ、若しくはＭＣ４ＲおよびＭＣ３Ｒ内の突然変異は肥満、インスリン抵抗性および過食を生じる（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ヒトにおいて、ＰＯＭＣ若しくはＭＣ４Ｒ内の突然変異は、増大された食物摂取と関連する肥満の発生につながる（非特許文献９：非特許文献１０：非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００６】
減量は、メラノコルチン系の活動の薬理学的刺激から生じ得る。げっ歯類において、ＭＣ４Ｒのようなメラノコルチン受容体の薬理学的刺激は、減少された食物摂取、増大されたエネルギー消費および減量につながる（非特許文献１４）。ヒトにおいて、非肥満のヒトでのＭＣ４Ｒを刺激するためのα−ＭＳＨの鼻内投与は、体脂肪量（しかし徐脂肪体重ではない）の喪失による低下された体重をもたらす（非特許文献１５）。
【０００７】
肥満は現在、制限された成功のみを伴い、数種の異なる戦略により処置される。これらの戦略は、主として、「生活習慣」の変更（例えば食餌および運動）、小分子に基づく製薬学的療法、若しくは胃の一部分の外科的除去（胃バイパス手術）を伴う。加えて、α−ＭＳＨのような減量を刺激するメラノコルチン受容体結合ペプチドは、こうしたペプチドの極めて短い血清半減期により、医薬品として制限された使用のものである。従って、付加的な肥満処置、およびとりわけα−ＭＳＨのようなメラノコルチン受容体結合ペプチドの短い血清半減期を克服するメラノコルチン受容体結合性分子に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】ＣｕｍｍｉｎｇｓとＳｃｈｗａｒｔｚ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５４：４５３−４７１（（２００３））
【非特許文献２】Ｗｉｎｇら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４７：１７４９−１７５３（１９８７）
【非特許文献３】Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１３４３−１３５０（２００１）
【非特許文献４】Ｋｎｏｗｌｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：３９３−４０３（２００２）
【非特許文献５】Ｆｒａｎｚら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２５：１４８−１９８（２００２）
【非特許文献６】ＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗとＳａｕｎｄｅｒｓ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：８５５−８８３（２００３）
【非特許文献７】Ｈｕｓｚａｒら、Ｃｅｌｌ  ８８：１３１−１４１（１９９７）
【非特許文献８】Ｙａｓｗｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１０６６−１０７０（１９９９）
【非特許文献９】Ｋｒｕｄｅら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：１５５−１５７（１９９８）
【非特許文献１０】Ｙｅｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：１１１−１１２（１９９８）
【非特許文献１１】Ｂｒａｎｓｏｎら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１０９６−１１０３（２００３）
【非特許文献１２】Ｖａｉｓｓｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６）：２５３−２６２（２０００）
【非特許文献１３】ＨｏとＭａｃＫｅｎｚｉｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３５８１６−３５８２２（１９９９）
【非特許文献１４】Ｐｉｅｒｒｏｚら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１３３７−１３４５（２００２）
【非特許文献１５】Ｆｅｈｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂｏｌ．８６：１１４４−１１４８（２００１）
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明の一局面は、式（Ｉ）：
（Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
［式中、Ｍｐはメラノコルチン受容体結合性分子であり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域であり、および、ＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１から１０までの整数である］
のポリペプチドである。
【０００９】
本発明の別の局面は、配列番号６０若しくは６２を含んでなるポリペプチドである。
【００１０】
本発明の別の局面は、配列番号５９若しくは配列番号６１を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号５９若しくは配列番号６１に相補的なポリヌクレオチドである。
【００１１】
本発明の別の局面は、配列番号６０若しくは配列番号６２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。
【００１２】
本発明の別の局面は、本発明のミメティボディ組成物を細胞、組織若しくは器官と接触させることを含んでなる、細胞、組織若しくは器官中のメラノコルチン受容体の生物学的活性の改変方法である。
【００１３】
本発明の別の局面は、本発明のミメティボディ組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のメラノコルチン受容体に媒介される状態の調節方法である。［発明の詳細な記述］
本出願で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全部の刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明は、メラノコルチン受容体を結合する特性を有しかつＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭのような異なるアイソタイプの抗体免疫グロブリン分子、およびＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のようなそれらのいずれかのサブクラス、またはそれらの組合せを模倣するポリペプチド（下で一般に「ミメティボディ」と称される）を提供する。いくつかの態様において、本発明のミメティボディポリペプチドは、α−メラノサイト刺激ホルモンペプチド（α−ＭＳＨ）配列を含有し、そしてメラノコルチン受容体結合性α−ＭＳＨミメティボディと呼称される。こうしたα−ＭＳＨミメティボディポリペプチドは、メラノコルチン受容体４（ＭＣ４Ｒ）を、ならびにＭＣ３ＲおよびＭＣ５Ｒについてそれぞれ等しいおよびより低い親和性で結合し得る。こうしたメラノコルチン受容体結合の一結果は、メラノコルチン受容体活性の刺激若しくは阻害であり得る。刺激は減量を引き起こし得る一方、阻害は体重増加を引き起こしうる。
【００１５】
一態様において、本発明のポリペプチドは、一般式（Ｉ）：
（Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（Ｉ）
［式中、Ｍｐはメラノコルチン受容体結合性分子であり、Ｌｋはポリペプチド若しくは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変領域のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ領域の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域であり、および、ＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域であり、ならびにｔは独立に１から１０までの整数である］
を有する。
【００１６】
本明細書で使用されるところの「メラノコルチン受容体結合性分子」は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＭＣ４Ｒ（配列番号７７）のような最低１種のメラノコルチン受容体を結合し得る分子を意味している。他のヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）メラノコルチン受容体の例は、ＭＣＲ１（配列番号７１）、ＭＣＲ２（配列番号７３）、ＭＣＲ３（配列番号７５）およびＭＣＲ５（配列番号７９）を包含する。所定のペプチド鎖は、それが既知のメラノコルチン受容体配列若しくは成熟形態の既知のメラノコルチン受容体に対する最低８５％のアミノ酸配列同一性を有しかつＧタンパク質共役受容体として機能し得る場合に、「メラノコルチン受容体」である。２種のペプチド鎖間の同一性パ―セントは
、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用しての対にした整列により決定し得る。例示的メラノコルチン受容体結合性分子は、（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有する１３アミノ酸のα−ＭＳＨペプチドである。他のメラノコルチン受容体結合性分子は、配列番号２の生物学的に活性のフラグメント、およびメラノコルチン受容体を結合し得る他のアミノ酸配列を包含する。本明細書で使用されるところの「生物学的に活性のフラグメント」という用語は、ＭＣ４Ｒのようなメラノコルチン受容体に結合し得るα−ＭＳＨペプチドの一部分を指す。ペプチド配列ＨＦＲＷ（配列番号８１）は、α−ＭＳＨペプチド配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号２）の１例示的「生物学的に活性のフラグメント」である。ＨＦＲＷフラグメントは、合成のメラノコルチン受容体活性化分子メラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ）の構造に組み込まれている（Ｆａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１６５−１６８（１９９７））。
【００１７】
本発明のミメティボディポリペプチド中へのメラノコルチン受容体結合性分子の組み込みは、広範囲の親和性でのメラノコルチン受容体への結合を提供する。本発明のミメティボディポリペプチドは、約１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１若しくは１０−１２Ｍ未満若しくはこれらに等しいＫｄでメラノコルチン受容体を結合しうる。ａＭＳＨペプチド、ＭＴＩＩペプチドおよびａＭＳＨＭＭＢの得られたＩＣ５０値の範囲は、それぞれ２６０〜４００ｎＭ、５〜３０ｎＭおよび２００〜３００ｎＭであった。メラノコルチン受容体に対するミメティボディポリペプチドの親和性は、いずれかの適する方法を使用して実験的に決定し得る。こうした方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ若しくはＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＳＡまたは競合結合アッセイを利用しうる。所望の親和性で特定のメラノコルチン受容体を結合するミメティボディポリペプチドは、バリアント若しくはフラグメントのライブラリーから当業者に既知の技術により選択し得る。
【００１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するα−ＭＳＨペプチドを改変して、他のメラノコルチン受容体結合性分子を得ることができる。こうした改変は、ジスルフィド結合の形成により該ペプチドをコンホメーション的にゆがませるための該ペプチドへのＣ−［Ｘ］ｎ−Ｃモチーフの組み込みを含みうる。Ｃ−［Ｘ］ｎ−Ｃモチーフ中で、Ｃはシステイン残基であり、Ｘはアミノ酸残基であり、そしてｎは必要とされるコンホメーションの歪みを達成するのに必要な整数である。この例において、ｎは約１残基および約５０であることができる。例示的なＣ−［Ｘ］ｎ−Ｃの改変されたペプチド配列を配列番号４、６、８および１０に示す。
【００１９】
改変はまた、トリプトファンジッパーの形成により該ペプチドをコンホメーション的にゆがませるための該ペプチド中へのＷａ−［Ｘ］ｎ−Ｗａモチーフの組み込みも含みうる。Ｗａ−［Ｘ］ｎ−Ｗａモチーフ中で、Ｗはトリプトファン残基であり、Ｘはアミノ酸であり、ａは通常２の整数であるがしかし１から１０までであり得、そしてｎは必要とされるコンホメーションの歪みを達成するのに必要な整数である。この例では、ｎは約１残基および約５０であることができる。例示的Ｗａ−［Ｘ］ｎ−Ｗａペプチドを配列番号１２、１４、１６および１８に示す。さらに、α−ＭＳＨペプチド中に存在する配列ＨＦＲＷ（配列番号８１）は、この配列中のいずれかの残基をＦ、Ｈ、ＷおよびＭのいずれか１つで置換することによってもまた改変することができ；例えば、ＨＦＲＷ（配列番号８１）はＦＨＷＭ（配列番号８３）に置換し得る。
【００２０】
本発明のポリペプチド中で、リンカー部分（Ｌｋ）は、該ミメティボディが代替の向きおよび結合特性を有することを可能にすることにより構造的柔軟性を提供する。例示的リンカーは、非ペプチド化学結合、若しくはペプチド結合により連結された１ないし２０アミノ酸（該アミノ酸は２０種の天然に存在するアミノ酸または他のアミノ酸（例えばＤ−アミノ酸、天然に存在しないアミノ酸若しくはまれに天然に存在するアミノ酸）から選択
される）を包含する。リンカー部分は、グリシン、アラニンおよびセリンのような立体的に障害されない大多数のアミノ酸を包含し得、そして、ＧＳ、ポリＧＳ（例えばＧＳＧＳ（配列番号２０））、ＧＧＳＧ（配列番号２２）、ＧＳＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号２６）、ＧＳＳＧ（配列番号２８）若しくはＧＳＧＧＧＳ（配列番号３０）またはＧＧＧＳ（配列番号８５）、あるいはそれらのいずれかの組合せ若しくはポリマーを包含し得る。本発明の範囲内の他の例示的リンカーは２０残基より長いことができ、そしてグリシン、アラニンおよびセリン以外の残基を包含しうる。
【００２１】
本発明のポリペプチド中で、Ｖ２はＨ鎖可変領域のような免疫グロブリン可変領域のカルボキシ末端ドメインの一部分である。例示的Ｖ２アミノ酸配列はＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）およびＴＬＶＡＶＳＳ（配列番号３２）である。
【００２２】
本発明のポリペプチド中で、ＨｇはＨ鎖可変領域のような免疫グロブリン可変領域のヒンジドメインの一部分である。例示的Ｈｇアミノ酸配列は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３６）、ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４０）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４２）、ＣＰＰＣＰ（配列番号４４）およびＣＰＳＣ（配列番号４６）を包含する。
【００２３】
本発明のポリペプチド中で、ＣＨ２は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ２定常領域である、例示的ＣＨ２アミノ酸配列は：
【００２４】
【化１】
2008517605.tif 000002
【００２５】
を包含する。
【００２６】
本発明のポリペプチド中で、ＣＨ３は免疫グロブリンＨ鎖ＣＨ３定常領域である。例示的ＣＨ３アミノ酸配列は：
【００２７】
【化２】
2008517605.tif 000003
【００２８】
を包含する。本発明のポリペプチドのＣＨ３領域は、ある種の組換え系で発現される場合にそのＣ末端アミノ酸が切断されうることが、当業者により認識されるであろう。
【００２９】
本発明のミメティボディポリペプチド中で、Ｈｇ、ＣＨ２若しくはＣＨ３はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラスのものでありうる。配列は、それがそれぞれγ１若しくはγ４
Ｈ鎖から形成若しくは発生される場合にＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラスのものである。所定のペプチド鎖は、それが所定の種の既知のγ１若しくはγ４  Ｈ鎖配列に最低８０％同一である場合に、γ１もしくはγ４  Ｈ鎖である。２種のペプチド鎖間の同一性パーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用しての対にした整列により決定し得る。
【００３０】
本発明のミメティボディポリペプチド中で、Ｈｇ、ＣＨ２若しくはＣＨ３は個別にＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４サブクラスのものでありうる。本発明のミメティボディはまた、各サブクラスからのＨｇ、ＣＨ２若しくはＣＨ３要素の組合せも含みうる。例えば、ＨｇはＩｇＧ４サブクラスのものでありうる一方、ＣＨ２およびＣＨ３はＩｇＧ１サブクラスのものである。あるいは、Ｈｇ、ＣＨ２およびＣＨ３は全部ＩｇＧ４若しくはＩｇＧ１サブクラスのものでありうる。ポリペプチド
【００３１】
【化３】
2008517605.tif 000004
【００３２】
は、Ｈｇ（配列番号６５の残基１−１５）、ＣＨ２（配列番号６５の残基１６−１２５）およびＣＨ３（配列番号６５の残基１２６−２３２）が全部ＩｇＧ１サブクラスのものであるポリペプチドを例示する。
【００３３】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスはヒンジ領域のシステインの数が異なる。ＩｇＧ１のような大部分のＩｇＧタイプの抗体は、典型的にＨ２Ｌ２と略称される、２個の同一のＨ鎖および２個の同一のＬ鎖から構成されるホモ二量体分子である。従って、これらの分子は、Ｈ鎖間ジスルフィド結合の形成により抗原結合に関して一般に二価であり、そしてＩｇＧ分子の双方の抗原結合（Ｆａｂ）アームは同一の結合特異性を有する。ＩｇＧ４アイソタイプのＨ鎖は、対照的に、Ｈ鎖間若しくは内いずれかのジスルフィド結合を形成することが可能な、それらのヒンジ領域中のＣＰＳＣ（配列番号４６）モチーフを含有する。すなわち、ＣＰＳＣモチーフ中の２個のＣｙｓ残基は、他方のＨ鎖の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合しうる（間）か、若しくは、所定のＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が相互とジスルフィド結合しうる（内）。ヒンジ領域中にＨ鎖内結合をもつＩｇＧ４分子中のＨＬ対は相互に共有結合していないため、それらはＨＬ単量体に解離することがあり、それらはその後他方のＩｇＧ４分子由来のＨＬ単量体と再会合して二特異性のヘテロ二量体ＩｇＧ４分子を形成する。ｉｎ  ｖｉｖｏ異性化酵素がこの過程を助長しうる。二特異性ＩｇＧ抗体中で、該抗体分子の２個のＦａｂ「アーム」は、それらが結合するエピトープが異なる。ＩｇＧ４のヒンジ領域中のＳｅｒ残基をＰｒｏで置換することは、「ＩｇＧ１様挙動」をもたらす。すなわち、該分子はＨ鎖間で安定なジスルフィド結合を形成し、そして従って他のＩｇＧ４分子とのＨＬ交換に対し感受性でない。
【００３４】
本発明のミメティボディポリペプチドは、ジスルフィド結合形成に関与しかつ該ミメティボディポリペプチドのＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に存在する部位の改変により、よりＩｇＧ４様若しくはＩｇＧ１様にしうる。こうした部位は、除去、欠失、挿入若しくは他のアミノ酸での置換により改変しうる。典型的には、ジスルフィド結合関連モチーフ中に存在するシステイン残基を除去若しくは置換する。これらの部位の除去は、ミメティボディＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインの非共有二量体化をなお見込む一方で、ミメティボディ産生宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との共有ジスルフィド結合、若しくはＩｇＧ４に基づく構築物中のＨ鎖内ジスルフィド結合を回避しうる。こうした部位の改変は、２種の異なるＭ部分をもつ二特異性ミメティボディポリペプチドの形成を可能にし得るか、若しくはこうした二特異性種の形成を予防し得る。
【００３５】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスはまた、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するそれらの能力も異なる。ＣＤＣは補体の存在下での標的細胞の溶解である。補体活性化経路は、同族の抗原と複合体形成した分子への補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。ＩｇＧ１は補体カスケードおよびその後のＣＤＣ活性の強力な誘発物質である一方、ＩｇＧ４は補体誘導活性をほとんど有しない。ＡＤＣＣは、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上の結合型抗体を認識しかつその後該標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性の過程である。ＩｇＧ１サブクラスは、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体に高親和性で結合しそしてＡＤＣＣに寄与する一方、ＩｇＧ４はこうした受容体に弱く結合するのみであり、かつＡＤＣＣ誘導活性をほとんど有しない。細胞の死滅を伴わずに細胞へのミメティボディポリペプチドの送達が可能であるため、ＡＤＣＣのようなエフェクター機能を活性化することのＩｇＧ４の比較的不能が望ましい。
【００３６】
本発明のミメティボディポリペプチドのＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性は、該ミメティボディポリペプチドのＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に存在するＣＤＣおよびＡＤＣＣに関与する部位を変えることにより改変しうる。こうした部位は、除去、欠失、挿入若しくは他のアミノ酸での置換により改変しうる。本発明のミメティボディ中で、Ｃ１ｑ結合部位のようなＣＤＣに関与する部位は、典型的に除去若しくはＣＤＣ活性を最小限にするように別の方法で改変される。加えて、ＡＤＣＣに関与するＦｃ受容体結合部位もまた、本発明のミメティボディ中で同様に改変し得る。一般に、こうした改変は、ＡＤＣＣ活性に関与するＦｃ受容体結合部位を本発明のミメティボディから除去することができる。本発明のポリペプチドのＣＨ２部分のＬｅｕ残基のＡｌａ残基での置換は、本発明のポリペプチド中のＡＤＣＣ活性を最小限にし得る改変の一例である。ＣＨ２アミノ酸配列
【００３７】
【化４】
2008517605.tif 000005
【００３８】
は、（上の配列中の）残基４および５でのこうしたＬｅｕからＡｌａへの置換を例示する。さらに、該ペプチドのＮ末端がシグナルペプチドの切断後に遊離でありかつアセチラーゼのような酵素に接近可能でありかつそれにより修飾され得るように、Ｖ１ドメインを除去し得る。
【００３９】
ＩｇＧ４およびＩｇＧ１双方のアイソタイプの抗体はＦｃＲｎ救助受容体結合部位を含有する。ＦｃＲｎ救助受容体は、体腔および血管の内側を内張りするもののような内皮細胞層を横断してＩｇＧタイプ抗体を再循環若しくは輸送することにより体内のＩｇＧ抗体レベルを維持するのを助ける。ＦｃＲｎ救助受容体は、非特異的飲作用により内皮細胞に進入したＩｇＧを結合すること、およびこれらのＩｇＧ抗体分子が細胞のリソソーム中で分解されることを予防することにより、これを行う。こうしたＦｃＲｎ受容体活性の結果は、ＦｃＲｎ結合部位をもつ分子の血清半減期が、こうした部位を欠くそれ以外は同一の分子に関して延長されることである。
【００４０】
本発明のミメティボディのＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３部分が、ＣＨ２およびＣＨ３領域の接合部にＦｃＲｎ結合部位を含有することが望ましい。こうしたＦｃＲｎ部位は、α−ＭＳＨ単独のようなメラノコルチン受容体結合性分子に関して、本発明のミメティボディの血清半減期を増大することができ、ならびに、他の薬物動態特性を改善することができることが期待される。本発明のミメティボディ中で、ＦｃＲｎ部位は、アミノ酸の除去、欠失、挿入若しくは置換により改変若しくは付加しうる。典型的には、こうした改変を使用して所定の部位のＦｃＲｎへの結合を改善する。ヒトＦｃＲｎ結合部位の一例は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４双方の抗体で見出される配列ＭＩＳＲＴＰＴＶＬＨＱＨＮＨＹ（配列番号６９）である。他のＦｃＲｎ結合部位は当業者に公知である。
【００４１】
ＩｇＧ４およびＩｇＧ１のような多様なアイソタイプをもつ抗体はグリコシル化部位を含有しうる。これらの部位のグリコシル化は抗体分子の特性および活性を変え得る。抗体分子はＮ−グリコシル化されることも若しくはＯ−グリコシル化されることもある。窒素原子を含有する抗体アミノ酸残基側鎖（例えばＡｓｎ）のＮ−グリコシル化は、Ｎ−グリコシル化された抗体分子に細胞溶解活性を賦与することによりＡＤＣＣのような抗体Ｆｃエフェクター機能を調節し得る。このＡＤＣＣに関連した細胞溶解活性は、こうしたＮ−グリコシル化された抗体により遂げられる細胞の溶解を引き起こす。あるいは、抗体分子は、酸素原子を含有するアミノ酸残基側鎖（例えばＳｅｒ若しくはＴｈｒ）の修飾によりＯ−グリコシル化されうる。Ｏ−グリコシル化は、血清からのＯ−グリコシル化された抗体分子の増大されたレクチン媒介性消失により抗体分子の血清半減期を減少させ得る。加えて、Ｏ−グリコシル化は、多様な抗体分子間のＯ−グリコシル化の異なる程度により、抗体の不均一性の望ましくない増大を引き起こし得る。最後に、Ｏ−グリコシル化およびＮ−グリコシル化の双方は、結合親和性および免疫原性のような抗体分子の構造依存性の特性を変え得る。
【００４２】
それらが模倣する抗体分子のように、本発明のミメティボディポリペプチドはまた、Ｎ−グリコシル化およびＯ−グリコシル化により翻訳後にも修飾されうる。大部分の場合に、細胞溶解活性を最小限にするように本発明のミメティボディのＮ−グリコシル化を制限することが望ましい。Ｎ−グリコシル化は、典型的にＮ−グリコシル化されるＡｓｎのようなアミノ酸残基の除去若しくは置換により制限し得る。レクチン媒介性消失、ミメティボディの不均一性、ならびに結合親和性および免疫原性のような構造依存性のミメティボディの特性の変化を最小限にするようにミメティボディのＯ−グリコシル化を制限することもまた望ましい。本発明のミメティボディ中のＯ−結合グリコシル化を最小限にするための一方法は、本発明のポリペプチドのＶ２部分のＴｈｒ残基の代わりにＡｌａ残基を用いることである。Ｖ２アミノ酸配列ＴＬＶＡＶＳＳ（配列番号３４）はこうしたＴｈｒからＡｌａへの置換を例示し；この特定のＶ２置換はまた、配列番号６２の位置４７のＴｈｒからＡｌａへの置換によっても得ることができる。当業者はまた、グリコシラーゼ酵素活性の調節を包含するＮ−結合およびＯ−結合グリコシル化の他の制御方法も認識するであろう。
【００４３】
本発明のミメティボディポリペプチドの単量体構造Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３は、「ｔ」個の他の単量体（ここでｔは１から１０までの整数である）に連結され得る。こうした連結は、非共有相互作用、若しくはＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合のような共有結合により起こり得る。こうして、本発明のポリペプチドの二量体およびより高次の多量体のような多量体構造が形成され得る。本発明のポリペプチドの二量体化が、ＭＣ４Ｒのようなメラノコルチン受容体に対するこれらのポリペプチドの親和性を増大させるであろうことが期待される。本明細書で使用されるところの「多量体」という用語は、四次構造を有しかつ２個若しくはそれ以上のサブユニットの会合により形成される分子を意味している。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、場合によっては、アミノ末端に、式ＩＩ：
（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）
（ＩＩ）
に示されるところのＶ１と呼称される免疫グロブリン可変領域のアミノ末端部分を含み得る。例示的Ｖ１アミノ酸配列はＱＩＱおよびＱＶＱを包含する。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、タンパク質分泌を助長するのに必要な分泌シグナル、若しくは細胞中でのタンパク質輸送に必要な他のシグナルもまた含みうる。例示的分泌シグナル配列はＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号６９）である。当業者は他の分泌シグナルを認識するであろう。
【００４６】
一態様において、本発明のポリペプチドは配列番号６０若しくは６２を含んでなる。配列番号６２は、そのアミノ末端に分泌シグナルＭＡＷＶＷＴＬＬＦＬＭＡＡＡＱＳＩＱＡ（配列番号６９）を融合させた包括的な式（ＩＩ）の（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）のメラノコルチン受容体に結合するα−ＭＳＨポリペプチドを表す。配列番号６０は、包括的な式（Ｉ）の（Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）のメラノコルチン受容体に結合するα―ＭＳＨポリペプチドを表す。分泌シグナルは配列番号６０中に存在しない。
【００４７】
本発明の別の局面は、最低１種のメラノコルチン受容体結合ミメティボディをコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、それに相補的か若しくはそれとの有意の同一性を有するポリヌクレオチドである。本発明の別の局面は、メラノコルチン受容体結合ミメティボディをコードする最低１種のポリヌクレオチド分子を含んでなるベクターを包含する。異なる一局面において、本発明は、本発明のベクターを含んでなる細胞、若しくは本発明のミメティボディポリペプチドを発現する細胞を提供する。該ポリヌクレオチド、ベクターおよび細胞を使用して、本発明のミメティボディポリペプチドを製造しうる。
【００４８】
一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５９若しくは配列番号６１、または配列番号５９若しくは配列番号６１に相補的なポリヌクレオチドを含んでなる。配列番号５９は、シグナル配列を欠く包括的な式（Ｉ）の（Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）のメラノコルチン受容体に結合するα−ＭＳＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡである。配列番号６１は、分泌シグナルをそのアミノ末端に融合させた、包括的な式（ＩＩ）の（Ｖ１−Ｍｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）のメラノコルチン受容体に結合するα−ＭＳＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡである。
【００４９】
一態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６０若しくは配列番号６２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。配列番号６０若しくは配列番号６２に示されるポリペプチド配列をコードする例示的核酸配列は、それぞれ配列番号５９若しくは配列番号６１に示される。上述されたポリヌクレオチドに実質的に同一であるポリヌクレオチドもまた提供される。
【００５０】
ポリヌクレオチドに関連して、「実質的に同一な」という用語は、所定のポリヌクレオチド配列が、該ヌクレオチドの最低６０％若しくは最低約７０％若しくは最低約８０％若しくは最低約９０％若しくは最低約９５〜９８％で本発明のポリヌクレオチド配列若しくはその部分に同一であることを意味している。２種のポリヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッド）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルトの設定を使用しての対にした整列により決定し得る。
【００５１】
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のミメティボディポリペプチドの製造のための発現ベクターで使用する。本発明の範囲内のベクターは、真核生物発現のための必要な要素を提供し、そして、ＣＭＶプロモーターに駆動されるベクターのようなウイルスプロモーターに駆動されるベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４、およびそれらの誘導体、バキュロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）発現ベクター、ならびにヒトＩｇ遺伝子プロモーターのような哺乳動物遺伝子プロモーターにより駆動される発現ベクターを包含する。他の例は、Ｔ７プロモーターに駆動されるベクター、例えばｐＥＴ４１、乳糖プロモーターに駆動されるベクター、およびアラビノース遺伝子プロモーターに駆動されるベクターのような原核生物発現ベクターを包含する。
【００５２】
本発明はまた、本発明のミメティボディを発現するか若しくは本発明のベクターを含んでなる細胞にも関する。こうした細胞は原核生物若しくは真核生物であり得る。例示的真核生物細胞は、限定されるものでないがＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞若しくはそれらのいずれかの誘導体を挙げることができる哺乳動物細胞である。最も好ましくは、真核生物細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０若しくはＣＨＯ細胞である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は例示的一原核生物細胞である。本発明の細胞は、トランスフェクション、細胞融合、不死化、若しくは当該技術分野で公知である他の手順により生成しうる。細胞にトランスフェクトされたポリヌクレオチドは、染色体外であることも、若しくは該細胞の染色体に安定に組込まれることもある。
【００５３】
本発明のミメティボディは、該ポリペプチドのＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３部分の改変により、所定の宿主細胞とより適合性にし得る。例えば、本発明のミメティボディを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞中で組換え的に発現させる場合、Ｈｇ要素中のＰｒｏ−Ａｌａ配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酵素プロリンイミノペプチダーゼにより消化を予防するように除去しうる。同様に、Ｈｇ要素の一部分を、選択された宿主細胞中で発現される産物の不均一性を予防するように、本発明のミメティボディ中で欠失若しくは他のアミノ酸で置換し得る。
【００５４】
本発明はさらに、本発明の細胞を培養する段階、および本発明の発現されたミメティボディポリペプチドを精製する段階を含んでなる、ミメティボディポリペプチドの製造方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳に必要なもののような細胞成分もまた、本発明のポリペプチドを発現させるのに使用しうる。本発明は、双方の方法により製造されるミメティボディを包含する。発現されたミメティボディポリペプチドは、限定されるものでないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアトパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを挙げることができる当該技術分野で公知の方法により、細胞若しくは細胞成分に基づく系から回収かつ精製し得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もまた精製に使用し得る。典型的には、精製は数種の異なる方法の組合せを必要とすることができる。
【００５５】
本発明の別の局面は、有効量の最低１種のミメティボディポリペプチドおよび製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤を含んでなる製薬学的組成物である。「有効量」という用語は、一般に、有効な治療、すなわち処置が探求された症状若しくは障害の部分的若しくは完全な軽減に必要なミメティボディの量を指す。該組成物は、場合によっては、肥満および下述される他の状態を処置するために有用な最低１種のさらなる化合物、タンパク質若しくは組成物を含み得る。組成物中の製薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤は、溶液、懸濁液、乳液、コロイド若しくは粉末であり得る。当業者は、他の製薬学的に許容
できる担体および希釈剤を認識するであろう。
【００５６】
本発明の別の局面は、本発明の製薬学的組成物を細胞、組織若しくは器官と接触させることを含んでなる、細胞、組織若しくは器官中のメラノコルチン受容体の生物学的活性の改変方法である。該方法は、脳、脳組織若しくは脳細胞中のメラノコルチン受容体活性を改変するのに使用しうる。あるいは、本発明の方法は、筋のような他の末梢細胞若しくは組織、または胃のような他の器官のメラノコルチン受容体活性を改変するのに使用しうる。当業者は、使用しうる他の細胞、組織若しくは器官を認識するであろう。
【００５７】
本発明の別の局面は、本発明の製薬学的組成物をそれの必要な患者に投与することを含んでなる、最低１種のメラノコルチン受容体に媒介される状態の調節方法である。本発明の製薬学的組成物はいずれの適する経路によっても投与し得る。こうした経路は、クモ膜下腔内、鼻内、末梢（例えば皮下、筋肉内、皮内、静脈内）、若しくは当該技術分野で既知のいずれの他の手段によってもよい。以前に記述されたとおり、異常なメラノコルチン受容体活性は、肥満および２型糖尿病のような多数の病理学的状態に関わっている。本発明のミメティボディポリペプチドはまた、男性および女性の性機能不全、炎症、うっ血性心不全、中枢神経系の障害、神経損傷、感染性疾患、肺疾患、皮膚疾患、発熱および疼痛のような、他のメラノコルチン受容体に媒介される状態を調節するのにも使用しうる。
【００５８】
本発明は以下の実施例に関してさらに記述される。これらの実施例は単に本発明の局面を具体的に説明するためであり、そして本発明の制限として意図していない。
［実施例］
【実施例１】
【００５９】
α−ＭＳＨミメティボディおよび発現ベクター構築
分泌シグナル配列、α−ＭＳＨペプチド配列、リンカー配列、ＶＨ配列、ヒンジ配列、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２配列およびヒトＩｇＧ１  ＣＨ３配列を含んでなるα−ＭＳＨミメティボディタンパク質を設計した（図３および配列番号６２）。分析データ、例えば質量分析は、成熟ポリペプチドが生成される（Ｇ１／Ｇ１形態について６１，３４４．６）ことを確認した。このα−ＭＳＨミメティボディタンパク質をコードする核酸配列（図３；配列番号６１）を、標準的分子生物学技術を使用して生成した。α−ＭＳＨミメティボディ配列をコードする核酸配列をｐ２３８９発現ベクターにサブクローニングして、α−ＭＳＨミメティボディ発現ベクター（配列番号６３）を生成した。
【実施例２】
【００６０】
α−ＭＳＨミメティボディ発現
α−ＭＳＨミメティボディをＨＥＫ２９３Ｅ細胞中で一過性に発現させた。細胞は標準的条件を使用して培養し、そして、製造元により指示されるとおりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用して、α−ＭＳＨミメティボディ発現ベクターで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に細胞を無血清培地処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に移し、そして５日間培養した。培地をその後取り出しかつ遠心分離して破片を除去した。澄明にした培地をプロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ
ＦＦ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）とともにインキュベートし、そして、タンパク質を製造元により指示されるとおりプロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ複合物から溶離した。溶離されたタンパク質溶液をその後、標準的方法を使用してＳｕｐｅｒｏｓｅＴＭ  １２サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  １０／３００  ＧＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を介しさらに精製した。カラム溶離液をその後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そして銀およびクマシーブルー染色により可視化した。ウエスタンブロットをその後調製し、そしてブロットをＦｃ特異的一次抗体若しくはα−ＭＳＨ特異的一次抗体いずれかでプロービングした。一緒に、ウエスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色の結果は、２本のポリペプチド鎖から構成される精製されたα−ＭＳＨミメティボディが、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られたことを示した。
【実施例３】
【００６１】
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒを結合する
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒを結合し、かつ、ＭＣ４Ｒ結合について放射標識［Ｎｌｅ（４）、Ｄ−Ｐｈｅ（７）］−α−ＭＳＨ（ＮＤＰ−α−ＭＳＨ）アゴニスト分子と競合し得る（図４）。ＭＣ４Ｒはα−ＭＳＨの受容体である。ＨＥＫ２９３細胞膜（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ボストン）中で一過性に発現されたＭＣ４Ｒへのα−ＭＳＨ結合を、図４に示されるとおり、増大する量の未標識ＭＣ４Ｒアゴニスト（陽性対照）およびヒト抗体のＦｃドメイン（陰性対照）を［１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨを含有するアッセイカクテルに添加した競合結合アッセイにより検査した。未標識ＭＣ４ＲアゴニストはメラノタンＩＩ（ＭＴＩＩ；α−ＭＳＨアナログ）、α−ＭＳＨおよびＮＤＰ−α−ＭＳＨであった。ＭＣ４Ｒへのα−ＭＳＨミメティボディ結合は、競合結合アッセイにより評価されたとおり、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）中４℃、−２０℃および−８０℃での２週間の貯蔵後に安定であった。
【００６２】
競合結合アッセイは、アッセイの製造元により指示されるとおり、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｒ）（シンチレーション近接アッセイ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して実施した。アッセイカクテルは、ＥＣ８０すなわち約０．５ｎＭの［１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨ、０．１μｇのＭＣ４Ｒ膜、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．２％  ＢＳＡ、１ｍＭ  １，１０−フェントロリン、アッセイ製造元推奨量のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．、インジアナ州インジアナポリス）およびＳＰＡビーズを含有した。Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｒ）ビーズからの発光を、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ボストン）を用いて５分間測定した。
【実施例４】
【００６３】
α−ＭＳＨミメティボディはＭＣ４Ｒを活性化する
α−ＭＳＨミメティボディは、ＭＣ４Ｒシグナル伝達を活性化して、ＭＣ４Ｒを発現するＣＨＯＫ１細胞でのｃＡＭＰ産生を増大させ得る（図５および図６）。ＭＣ４Ｒは７膜貫通（７ＴＭ）Ｇタンパク質共役受容体である。リガンド若しくはアゴニストによるＭＣ４Ｒの活性化は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルの増大をもたらす。
【００６４】
ＭＣ４Ｒ受容体活性化アッセイを、ＭＣ４Ｒ発現ベクターで安定にトランスフェクトされかつＭＣ４Ｒを発現する２種の異なるクローンＣＨＯＫ１細胞株を使用して実施した。クローン１（図５）はクローン２（図６）に関して高レベルでＭＣ４Ｒを発現した。クローン１およびクローン２細胞を、標準的培養条件を使用しておよそ１００，０００細胞／ウェルの密度まで単層として増殖させ、そしてその後、図５および図６に示されるとおり、増大する量（０〜１００μＭ）のα−ＭＳＨ、ＭＴＩＩ若しくはα−ＭＳＨミメティボディとともに１５分間インキュベートした。細胞をその後溶解し、そして、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ  ＤｉｒｅｃｔＴＭ化学発光イムノアッセイ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を製造元により指示されるとおり使用して、ｃＡＭＰアッセイを実施した。クローン１（図５）およびクローン２（図６）を使用するｃＡＭＰアッセイからのＥＣ５０値を下の表１に列挙する。
【００６５】
【表１】
2008517605.tif 000006
【実施例５】
【００６６】
α−ＭＳＨミメティボディ投与は動物の食物摂取および体重を減少させる
ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）脳室へのα−ＭＳＨミメティボディ投与は、動物の食物摂取（図７）および体重（図８）を減少させる。α−ＭＳＨミメティボディを、左側脳室に外科的に挿入したカニューレを介する脳室内注入（ＩＣＶ）により脳室に供給した。
【００６７】
カニューレを、体重２５０ｇないし３５０ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ若しくはＷｉｓｔａｒラットに外科的に挿入した。カニューレ設置座標は、後に続くとおり、すなわちブレグマから−０．８ｍｍ、腹側−４．５ｍｍおよび後前方向−１．５であった。動物は、ストレスを最小限にするため、連日の取扱いおよび擬似注入の双方により実験処置に馴化させた。加えて、動物に暗明周期の逆転を受けさせた。
【００６８】
適正なカニューレ設置をアンジオテンシンＩＩ試験により確認した。該試験は、カニューレを介しての１０ｎｇのアンジオテンシンＩＩのＩＣＶ投与がラットに３０分間で５〜１０ｍｌの水を飲ませた場合に、適正なカニューレ設置を確認した。このアンジオテンシンＩＩ試験に合格した動物のみを食物摂取実験で使用した。
【００６９】
動物を１８〜２４時間絶食させ、そして、α−ＭＳＨミメティボディ、α−ＭＳＨ（陽性対照）若しくはＰＢＳ（陰性対照）をその後、９μｌ／分の注入速度でカニューレを介し脳室に投与した。各処置群は最低７動物を有した。処置および投薬量は図７および図８に示されるとおりであった。
【００７０】
食物および水を注入後に動物に与えた。消費された食物および水の量を注入後０時間、４時間、２４時間、４８時間および７２時間（図７）に測定した。注入後７２時間の体重を図６に示されるとおり測定した。
【００７１】
本発明は今や完全に記述され、付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなく多くの変更および改変をそれに対し行い得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】メラノコルチン受容体結合ミメティボディポリペプチドの要素を示す。
【図２】メラノコルチン受容体結合ミメティボディの略画を示す。
【図３】メラノコルチン受容体に結合するα−ＭＳＨミメティボディのアミノ酸（配列番号６２）およびｃＤＮＡ（配列番号６１）配列を示す。個々のミメティボディ要素のアミノ末端部分に下線が付けられている。
【図４】競合結合アッセイにおけるＭＣ４Ｒへのα−ＭＳＨミメティボディ結合を示す。
【図５】高レベルのＭＣ４Ｒを発現する細胞におけるＭＣ４Ｒのα−ＭＳＨミメティボディ活性化を示す。
【図６】低レベルのＭＣ４Ｒを発現する細胞におけるＭＣ４Ｒのα−ＭＳＨミメティボディ活性化を示す。
【図７】動物の食物摂取のα−ＭＳＨミメティボディ媒介性の減少を示す。
【図８】動物の体重のα−ＭＳＨミメティボディ媒介性の減少を示す。
【図１】
2008517605.tif 000007
【図２】
2008517605.tif 000008
【図３Ａ】
2008517605.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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