(57)【要約】本発明は、サンプル、例えば、霊長類、げっ歯類、ウマまたはウシサンプルなどの哺乳類サンプル中の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の量を測定するための組成物および方法を開示する。本明細書において、本組成物および方法はまた、ＡＭＨのタンパク質分解に対して安定であるＡＭＨ上のエピトープと結合する抗体を提供する（図ＩＡ）。１つの実施形態において、本発明は、第１の抗体および第２の抗体を含む組成物を提供する。この組成物は、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において、第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する。
2008542723.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗体および第２の抗体を含む組成物であって、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において、第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する組成物。
【請求項２】
前記第１の抗体および前記第２の抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の抗体と結合している固体支持体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および高分子ビーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
標識と結合している前記第２の抗体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記標識が、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗ミュラー管ホルモンが霊長類、げっ歯類、ウマおよびウシの抗ミュラー管ホルモンからなる群から選択される哺乳類抗ミュラー管ホルモンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記霊長類抗ミュラー管ホルモンがヒト抗ミュラー管ホルモンを含み、前記げっ歯類抗ミュラー管ホルモンがマウスまたはラットの抗ミュラー管ホルモンを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法であって、
（ａ）抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプルを、既知量の標識抗ミュラー管ホルモンと混合して、スパイクサンプルを作製するステップと、
（ｂ）該スパイクサンプル中の該抗ミュラー管ホルモンおよび該標識抗ミュラー管ホルモンを抗体と結合させるステップであって、該抗体が、該抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して複合体を生じ、そして該標識抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して標識複合体が生じるステップと、
（ｄ）該標識複合体の量を測定するステップと、
（ｅ）該サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記抗体と結合している固体支持体をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体がマイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および高分子ビーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識抗ミュラー管ホルモンが、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤および放射性同位元素からなる群から選択される標識を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ミュラー管ホルモンが、霊長類、げっ歯類、ウマおよびウシの抗ミュラー管ホルモンからなる群から選択される哺乳類抗ミュラー管ホルモンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法であって、
（ａ）第１の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、該第１の抗体が該抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第１のエピトープと結合するステップと、
（ｂ）第２の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、該第２の抗体が該抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第２のエピトープと結合し、それによって、結合している第２の抗体の量が生じるステップと、
（ｃ）結合している該第２の抗体の量を測定するステップと、
（ｄ）該サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記第１の抗体と結合している固体支持体をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および高分子ビーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の抗体と結合している標識をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識が化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ミュラー管ホルモンが、霊長類、げっ歯類、ウマおよびウシの抗ミュラー管ホルモンからなる群から選択される哺乳類抗ミュラー管ホルモンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合する、第１の抗体および第２の抗体
であって、該抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において、該第１の抗体が第１のエピトープと結合し、該第２の抗体が第２のエピトープと結合する、第１の抗体および第２の抗体と、
（ｂ）該第１の抗体と結合している固体支持体と、
（ｃ）該第２の抗体と結合している標識と、
を含む、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定するための組成物。
【請求項２１】
前記抗ミュラー管ホルモンが霊長類、げっ歯類、ウマおよびウシの抗ミュラー管ホルモンからなる群から選択される哺乳類抗ミュラー管ホルモンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子および高分子ビーズからなる群から選択されるタンパク質結合表面を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記標識が、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、生体化合物を測定する免疫アッセイおよび方法に関する。詳しくは、本発明は、サンプル、例えば、ヒト、マウスまたはラットサンプルなどの哺乳類サンプル中の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を測定する新規方法に関する。特に、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合する抗体を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の詳細）
抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）は、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）としても知られ、ＴＧＦ−βおよび種々のインヒビンおよびアクチビン糖タンパク質を含むトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する１４０キロダルトン（ｋＤａ）の二量体の糖タンパク質ホルモンである（Ｔｅｉｘｅｉｒａら、２００１年）。このスーパーファミリーのすべてのメンバーが二量体の糖タンパク質であり、すべてが組織増殖および分化の調節に関与している。ＡＭＨはその他のＴＧＦ−βタンパク質と共通して、短いシグナル配列と、それに続くホモ二量体を形成するプレプロホルモンを含む大きな前駆体として合成される。分泌前に、成熟ホルモンがグリコシル化および二量体化を受けて、ジスルフィド結合している同一の７０ｋＤａの単量体サブユニットからなる１４０ｋＤａの二量体を生じ、各単量体は、Ｎ末端ドメイン（「プロ」領域とも呼ばれる）およびＣ末端ドメイン（「成熟」領域とも呼ばれる）を含む。その他のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーとは対照的に、ＡＭＨは全生体活性に達するようＣ末端ドメインの活性を増強するために、Ｎ末端ドメインを必要とすると考えられている（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９３年）。次いで、細胞質移行の間に、５〜２０％の間のＡＭＨが、７０ｋＤａの単量体のＮ末端ドメイン（プロ領域）とＣ末端ドメイン（成熟領域）の間の特定の部位で切断され、５８ｋＤａ（プロ領域）および１２ｋＤａ（成熟領域）の２つのポリペプチドを形成する。単量体のこれら２つの部分は非共有結合を保つ。ＡＭＨをコードするヒト遺伝子は配列決定され、単離されており、染色体１９の短腕に位置する（Ｐｉｃａｒｄら、１９８６年）。ＡＭＨの特異的受容体の構造も、単離され、特性決定されている（ｄｉ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅら、１９９４年；Ｂａｒｒｅｎｄｓら、１９９５年）。ＡＭＨは、種を超えて、１１〜１２個の保存シスチン残基を保持し、そのうち７個は成熟領域に位置する。この領域は種間で最大程度のアミノ酸配列相同性を示し、最後の１１２個の残基のうち１０８個がラットとヒト配列間で保存されている（Ｌｅｅら、１９９３年）。
【０００３】
ＡＭＨは、発達の際に性分化において重要な役割を有している。ＡＭＨは、男性では精巣のセルトリ細胞によって、女性では卵巣の顆粒膜細胞によって産生される。男性では、胎児発達の間、睾丸のセルトリ細胞からのＡＭＨの分泌がミュラー管の退化、ひいては、男性生殖器官の正常な発達にとって不可欠である（Ｐｉｃｏｎら、１９６９年）。ミュラー管は、女性では、子宮、卵管および膣の上部の原基である。男性では、セルトリ細胞によるＡＭＨの分泌は、胚発生の間に始まり、一生を通じて継続する。レベルは、思春期後に低下し、比較的低い思春期後の値までゆっくりと低下する（Ｔｅｉｘｅｉｒａら、２００１年）。女性では、血清ＡＭＨは、男性と比較して比較的低いレベルで維持される。思春期後、月経周期が始まると、循環ＡＭＨは一生を通じてゆっくりと低下し、閉経期には検出不能となる。マウスでは、ＡＭＨ機能の消失が、卵胞の喪失の増大および卵巣周期の早期停止を引き起こす（Ｄｕｒｌｉｎｇｅｒら、１９９９年）。
【０００４】
ヒトにおける血清ＡＭＨを測定するためのいくつかの臨床適用が同定されている。これらの中に、小児における半陰陽障害（Ｌｅｅら、２００３年）、早発思春期および遅発性思春期、停留睾丸、無睾丸症の診断ならびに男性生殖腺機能の評価（Ｔｅｉｘｅｉｒａら、２００１年）がある。その他の可能性がある適用として、女性における閉経前後の推移の調査および顆粒膜細胞癌患者の検出およびモニタリングが挙げられる（Ｌｏｎｇら、２０００年）。最近の研究によって、ＡＭＨは女性における卵巣予備能力および生殖能力の評価の循環マーカーとして可能性を有することがわかった（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、２００２年；ｔｅ  Ｖｅｌｄｅら、２００２年；Ｇｒｕｉｊｔｅｒｓら、２００３年）。ＡＭＨは、長い年月、難解な分析物として記載されることがあったが、今では通常の臨床マーカーとしてのその可能性に相当な関心がある。
【０００５】
ほとんどすべてのこれまでのＡＭＨ調査研究は、２種のイムノアッセイのうち一方を用いて実施されてきた。Ｈｕｄｓｏｎらによって開発された一方のアッセイ（Ｈｕｄｓｏｎら、１９９０年）は、ヒト組換えＡＭＨに対する２種のモノクローナル抗体を用い、これらは双方とも分子のプロ領域中のエピトープを対象とする。幼児から成人期のヒトにおいてＡＭＨを測定するためのこのアッセイの使用は、Ｌｅｅら（１９９６年）によって報告されている。Ｌｅｅら（１９９６年）はまた、−２０℃で保存した場合に最大２年間または最高３回の凍結融解サイクルの間安定であるが、２年の保存を超えると、測定される値は２〜３倍高まり、３回の凍結融解サイクルの後は５０％以上減少すると報告している。さらに、Ｌｅｅら（１９９６年）は、Ｈｕｄｓｏｎアッセイに用いた抗体はＡＭＨのカルボキシ末端断片（成熟領域）を認識せず、全長のプロセシングされていないヒトＡＭＨに高度に特異的であるが（プロセシングされていないとは、７０ｋＤａの単量体のプロおよび成熟領域間で切断されていないことを意味する）、プロセシングされていないタンパク質に対してよりもアミノ末端断片（プロ領域）に対してかなり低い親和性を有すると報告している。したがって、Ｌｅｅら（１９９６年）によって報告されたＡＭＨ濃度の個々の変動のいくらかは、ｉｎ  ｖｉｖｏで生じるＡＭＨタンパク質のプロセシング度の相違に起因する可能性がある。Ｌｅｅら（１９９６年）はまた、Ｈｕｄｓｏｎアッセイ抗体は非ヒト霊長類ならびにヒトＡＭＨを認識するが、ウシまたはげっ歯類ＡＭＨを認識しないと報告している。ＡＭＨ調査研究に用いられる第２のアッセイは、一対のモノクローナル抗体を用い、その一方はヒトＡＭＨのプロ領域中のエピトープに対するものであり、もう一方は成熟領域中のエピトープに対するものである（Ｌｏｎｇら、２０００年）。第３の、より最近記載されたアッセイでは、プロ領域に対する２種のモノクローナル抗体を用いる（Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉら、２００５年）。
【０００６】
現在利用可能なアッセイを用いて測定されるサンプル中のＡＭＨのタンパク質分解も報告されており、その結果、信頼性のある結果を得るには、サンプル収集および保存に特に細心の注意が必要であり得る。ＡＭＨのプロ領域は溶液中でのインキュベーションの間のタンパク質分解切断の対象である（Ｃａｔｅら、特許文献１）。ＡＭＨの成熟領域は、１つにはその複数のシスチン残基のためにプロ領域と比較してタンパク質分解に対してより安定である。
【０００７】
先のＡＭＨアッセイでは、ヒトＡＭＨを測定するが、おそらくはプロ領域のアミノ酸配列が種間で相当異なるために、げっ歯類サンプル中のＡＭＨを測定するためには使用できない。マウス、ラット、ヒト、ウシおよびニワトリＡＭＨにおけるプロ領域間のアミノ酸配列全体の相同性は、３７〜８９％とさまざまである（ＧｅｎＢａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄａｔａｂａｓｅ）。複数の種、例えば、マウスおよびラットならびにヒトなどの哺乳類種においてＡＭＨを測定するために使用できるアッセイは、当技術分野ではまだ利用可能でない。臨床適用の他に、このようなアッセイは、ＡＭＨ測定の種々の臨床およびその他の適用に関連する研究において有用な適用を有する。さらに、ＡＭＨの測定の適用は、サンプル中のＡＭＨの安定かつ正確な測定された値、例えば、ＡＭＨのタンパク質分解によって影響を受けないＡＭＨ測定値を提供するアッセイから恩恵を受ける。
【０００８】
本発明は、サンプル中のＡＭＨを測定するための組成物および方法、ならびにＡＭＨの成熟領域と結合する抗体を提供する。本発明はまた、生体サンプル、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシおよびウマサンプルなどの哺乳類サンプル中のＡＭＨを測定するための組成物および方法を提供する。さらに、本発明は、測定されるＡＭＨの量がサンプルにおけるＡＭＨのタンパク質分解によって影響を受けない、サンプル中のＡＭＨを測定するための組成物および方法を提供する。したがって、本発明は当技術分野におけるこれらの長年の必要性および念願を満たす。
【特許文献１】米国特許第５，３５９，０３３号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、サンプル中の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を測定するための組成物および方法を開示する。
【００１０】
本発明の一実施形態は、第１の抗体および第２の抗体を含む組成物であって、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において、第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する組成物を開示する。
【００１１】
さらなる実施形態は、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプルを、既知量の標識抗ミュラー管ホルモンと混合してスパイクサンプルを作製するステップと、スパイクサンプル中の抗ミュラー管ホルモンと標識抗ミュラー管ホルモンを抗体と結合させるステップであって、抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して複合体を生じ、また、標識抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して標識複合体を生じるステップと、標識複合体の量を測定するステップと、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップとを含む、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法を開示する。
【００１２】
もう１つの実施形態は、第１の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、第１の抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第１のエピトープと結合するステップと、第２の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、第２の抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第２のエピトープと結合し、それによって結合している第２の抗体の量が生じるステップと、結合している第２の抗体の量を測定するステップと、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップとを含む、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法を開示する。
【００１３】
さらにもう１つの実施形態は、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合する第１の抗体および第２の抗体であって、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する第１の抗体および第２の抗体と、第１の抗体と結合している固体支持体と、第２の抗体と結合している標識とを含む、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する組成物を開示する。
【００１４】
本発明のその他のおよびさらなる態様、特徴および利点は、以下の本発明の目下のところ好ましい実施形態の説明から明らかとなる。これらの実施形態は、開示目的で示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
上記で列挙された本発明の特徴、利点および目的ならびに明らかとなるその他のものが得られ、詳細に理解され得るよう、上記で短く要約された本発明のより詳しい説明を、添付の図面中に示されるような特定の実施形態を参照することによって行うことができる。これらの図面は、本明細書の一部を形成する。しかし、添付の図面は本発明の好ましい実施形態を示すものであり、したがって、その範囲の制限と考えられるべきではないということは留意するべきである。
【００１６】
本発明は、サンプル中の抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）を測定するための組成物および方法を対象とする。
【００１７】
本発明は、第１の抗体および第２の抗体を含む組成物であって、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する組成物を開示する。このような抗体は、サンプル中のＡＭＨの量を測定するイムノアッセイにおいて有用である。第１の抗体および第２の抗体はモノクローナル抗体であり得る。このような抗体はＡＭＨの成熟領域中のエピトープと、または一部はＡＭＨの成熟領域中に位置し、一部はＡＭＨのプロ領域中にするエピトープと結合できる。一方の抗体の、そのエピトープとの結合がもう一方の抗体の結合を干渉しないよう、第１の抗体が結合する第１のエピトープは、第２の抗体が結合する第２のエピトープとは異なっていてもよい。第１の抗体および第２の抗体はまた抗体フラグメントを含み得る。
【００１８】
一態様では、固体支持体を第１の抗体と結合させることができる。抗体は、当技術分野で公知の技術を用いてこのような固体支持体と結合させるか、その上にコーティングすることができる。固体支持体、あるいは、固相粒子の例として、タンパク質結合表面、例えば、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子、高分子ビーズが挙げられる。固体支持体または固相粒子のその他の例として、常磁性ビーズ、セルロース、アガロース、デキストランコーティング炭、フィコール、セファデックス、ガラスビーズ、セラミックビーズまたはタンパク質結合に適した当技術分野で公知のその他の不活性表面が挙げられる。
【００１９】
もう１つの態様では、第２の抗体は標識と結合させることができるが、あるいは、第１の抗体および第２の抗体の双方を異なる標識と結合させることができる。このような標識は、当技術分野で公知の技術を用いて、抗体と結合またはコンジュゲートさせることができる。標識の代表的な種類として、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素が挙げられる。このような薬剤により、当技術分野で公知の方法を用いて測定される検出可能なシグナルが生じ、次いで、測定値を用い、標準技術を用いてサンプル中の分析物の量を算出する。化学発光剤の例として、酵素と反応した場合に化学発光エネルギーを生じる基質の存在下で化学発光シグナルを生じる酵素が挙げられる。このような酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。化学発光剤のその他の例として、非酵素的直接化学発光標識、例えば、アクリジニウムエステル系が挙げられる。比色分析剤の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）などの酵素が挙げられる。エネルギー移動剤の一例として、蛍光ランタニドキレートがあり、蛍光色素は蛍光剤として使用できる。代表的な放射性同位元素として、１２５Ｉ、１４Ｃおよび３Ｈが挙げられる。
【００２０】
本発明のもう１つの実施形態では、本明細書において開示される組成物および方法は、哺乳類サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定するために有用であり、これとしては、霊長類、げっ歯類、ウマまたはウシ抗ミュラー管ホルモンが挙げられる。霊長類抗ミュラー管ホルモンとしては、ヒト抗ミュラー管ホルモンが挙げられ、げっ歯類抗ミュラー管ホルモンとしては、マウスまたはラット抗ミュラー管ホルモンが挙げられる。測定される抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプルは細胞溶解物もしくは培養培地などの生体サンプルまたは血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、乳汁、精液もしくはその他の体液などの体液であり得る。
【００２１】
もう１つの実施形態は、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプルを、既知量の標識抗ミュラー管ホルモンと混合してスパイクサンプルを作製するステップと、スパイクサンプル中の抗ミュラー管ホルモンと標識抗ミュラー管ホルモンを抗体と結合させるステップであって、抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して複合体を生じ、また、標識抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合して標識複合体を生じるステップと、標識複合体の量を測定するステップと、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップとを含む、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法を開示する。一実施形態では、このような方法は抗体と結合している固体支持体をさらに含み、固体支持体はタンパク質結合表面、例えば、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子または高分子ビーズを含み得る。標識抗ミュラー管ホルモンは、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素などの標識を含み得る。
【００２２】
測定される抗ミュラー管ホルモンは、哺乳類抗ミュラー管ホルモン、例えば、ヒト抗ミュラー管ホルモンなどの霊長類抗ミュラー管ホルモン、ラットまたはマウス抗ミュラー管ホルモンなどのげっ歯類抗ミュラー管ホルモン、ウマおよびウシ抗ミュラー管ホルモンを含み得る。
【００２３】
本明細書に記載される実施形態は、競合型のイムノアッセイを含み得る種々の型のイムノアッセイに使用できる。競合であり得るイムノアッセイの例として、酵素イムノアッセイもしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡもしくはＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ、ラジオメトリックもしくはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、磁気分離アッセイ（ＭＳＡ）、ラテラルフローアッセイ、拡散イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、固体支持体と結合している分析物を用いる免疫吸着もしくは「抗原ダウン」アッセイまたは凝集アッセイが挙げられる。１つのこのようなアッセイでは、サンプルは未知量の測定されようとする分析物を含み、これは抗ミュラー管ホルモンなどのタンパク質であり得る。分析物はまた抗原とも呼ぶこともできる。サンプルは既知量または固定量の標識分析物を用いてスパイクできる。次いで、スパイクサンプルを、分析物と結合する抗体とともにインキュベートし、その結果、サンプル中の分析物およびサンプルに加えられた標識分析物が、利用可能な抗体結合部位との結合について競合する。標識分析物は、サンプル中に存在する未標識分析物の相対濃度に応じて、程度の差はあるが、抗体結合部位と結合できる。したがって、抗体と結合している標識分析物の量を測定すると、サンプル中の未標識分析物の量に反比例する。次いで、当技術分野における標準技術を用いて、測定された標識分析物の量に基づいて最初のサンプル中の分析物の量を算出できる。
【００２４】
もう１つの種類の競合イムノアッセイでは、分析物と結合する抗体は、リガンドと結合またはコンジュゲートでき、リガンドはサンプル中に添加されたさらなる抗体と結合する。このようなリガンドの一例としてフルオレセインが挙げられる。さらなる抗体は固体支持体と結合できる。さらなる抗体は、抗体と結合しているリガンドと結合し、この抗体が次いで分析物と、あるいは、標識分析物と結合し、大量複合体を形成し、これによって標識分析物と結合している標識によって生じるシグナルの単離および測定が可能となる。もう１つの種類の競合イムノアッセイでは、測定される分析物を固体支持体と結合させることができ、分析物と結合する抗体と、測定される分析物を含有しているサンプルの双方とともにインキュベートすることができる。抗体は、サンプル中の分析物の濃度に応じて、固体支持体と結合している分析物、またはサンプル中の分析物のいずれかと相対的比率で結合する。次いで、固体支持体と結合している分析物と結合する抗体を、標識と結合している別の抗体、例えば、抗マウスＩｇＧと結合させる。次いで、標識から生じたシグナルの量を検出して、固体支持体と結合している分析物と結合している抗体の量を測定する。このような測定値は、サンプル中に存在する分析物の量と反比例する。このようなアッセイは、マイクロタイタープレート形式で使用できる。競合的であり得るもう１つのイムノアッセイとして、凝集アッセイが挙げられる。このようなアッセイでは、サンプル中の測定される分析物は、第１の固体支持体粒子、例えば、フィコールと結合している分析物と、抗分析物抗体の結合部位について競合する。抗体は、第２の固体支持体粒子と結合させるか、またはその上にコーティングすることができる。粒子間の架橋結合または凝集は、第１の固体支持体粒子と結合している分析物分子が、第２の固体支持体粒子と結合している抗体分子と結合して、共同凝集反応格子の固まりを形成すると生じる。あるいは、抗体分子は、サンプル中の遊離分析物と結合し、その結果、凝集量はサンプル中の分析物の量に反比例する。凝集量は標準技術、例えば、分光光度法を用いて測定できる。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、第１の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、第１の抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第１のエピトープと結合するステップと、第２の抗体を抗ミュラー管ホルモンと結合させるステップであって、第２の抗体が抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の第２のエピトープと結合し、それによって結合している第２の抗体の量を作製するステップと、結合している第２の抗体の量を測定するステップと、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を算出するステップとを含む、抗ミュラー管ホルモンを含有するサンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定する方法を開示する。一態様では、固体支持体を第１の抗体と結合させることができる。固体支持体はタンパク質結合表面、例えば、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子または高分子ビーズを含み得る。もう１つの態様では、標識を第２の抗体と結合させることができる。可能性のある標識として、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素が挙げられる。
【００２６】
本明細書に開示される本発明の実施形態を用いて、分析物を、分析物上の種々のエピトープと結合する抗体の間に結合させるか、サンドイッチできる、イムノメトリック、「ツーサイト」または「サンドイッチ」イムノアッセイと呼ばれるイムノアッセイを実施できる。このようなイムノアッセイの代表的な例として、酵素イムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）、蛍光イムノアッセイ、ラテラルフローアッセイ、拡散イムノアッセイ、免疫沈降アッセイおよび磁気分離アッセイ（ＭＳＡ）が挙げられる。１つのこのようなアッセイでは、「捕捉」抗体として記載できる第１の抗体を、固体支持体、例えば、タンパク質結合表面、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子または高分子ビーズと結合させることができる。捕捉抗体は、当技術分野で公知の手順を用いて固体支持体と結合させるか、その上にコーティングすることができる。あるいは、捕捉抗体を、固体支持体と結合しているか、その上にコーディングされているさらなる抗体によって認識されるリガンドと結合させることができる。捕捉抗体の、リガンドを介したさらなる抗体との結合が、ひいては、間接的に、捕捉抗体を固体支持体上に固定する。このようなリガンドの例として、フルオレセインがある。「検出」抗体として記載できる第２の抗体は、標識と結合させることができ、標識は化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤または放射性同位元素を含み得る。検出抗体は、当技術分野で公知の手順を用いて標識と結合またはコンジュゲートさせることができる。標識は、第１のタンパク質、例えば、第２の抗体と結合しているビオチンおよび第２のタンパク質、例えば、酵素と結合しているストレプトアビジンを含み得る。第２のタンパク質は、第１のタンパク質と結合する。酵素は、基質とともに提供されると、測定されるシグナルの量が分析物と結合している第２の抗体の量と対応するよう検出可能なシグナルを生じる。西洋ワサビペルオキシダーゼはこのような酵素の一例であり、可能性のある基質として、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）およびＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）が挙げられる。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域において、第１の抗体が第１のエピトープと結合し、第２の抗体が第２のエピトープと結合する、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域と結合する第１の抗体および第２の抗体と、第１の抗体と結合している固体支持体と、第２の抗体と結合している標識とを含む、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンの量を測定するための組成物を開示する。測定される抗ミュラー管ホルモンは、哺乳類抗ミュラー管ホルモン、例えば、霊長類、げっ歯類、ウマおよびウシの抗ミュラー管ホルモンを含み得る。このような組成物を用いて、ヒト、ラットまたはマウス抗ミュラー管ホルモン、ならびにその他の種の抗ミュラー管ホルモン、例えば、ウマ、ウシおよびサル抗ミュラー管ホルモンを測定できる。一態様では、固体支持体は、タンパク質結合表面を含み、これとしては、マイクロタイタープレート、コロイド状金属粒子、酸化鉄粒子、ラテックス粒子または高分子ビーズが挙げられる。標識は、化学発光剤、比色分析剤、エネルギー移動剤、酵素、蛍光剤もしくは放射性同位元素または当技術分野で公知のその他の種類の標識を含み得る。本発明において開示されるこのような組成物は、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンを測定するのに有用なキットを含み得る。
【００２８】
本発明のもう１つの可能性のある実施形態は、抗ミュラー管ホルモンの成熟領域中の、タンパク質分解に対して安定であるエピトープと結合する抗体を開示する。結果として、サンプル中の測定される抗ミュラー管ホルモンの量は、サンプル中の抗ミュラー管ホルモンのタンパク質分解によって影響を受けない。抗体エピトープがタンパク質分解によって破壊されないので、そのために、当技術分野で標準のアッセイ条件、例えば、延長されたインキュベーション時間を用いてサンプル中の抗ミュラー管ホルモンを正確に測定することが可能となる。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を示す目的で示され、本発明をどのようにも制限しようとするものではない。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
抗体作製
Ｃ５７Ｂ１／６Ｊバックグラウンドの雌のＡＭＨヌルマウスを、先に記載されるように調製した組換えヒトＡＭＨを用いて免疫化した（Ｈｕｄｓｏｎら、１９９０年）。５０μｇの組換えヒトＡＭＨの最初の注射を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｍ６５３６）中で皮下に与え、４週間の間隔で、各動物に２回の同様のブースター注射を行った。３回目のブーストの４日後、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために各動物から５μｌの血液を採取した。各サンプルを、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）および保存料として０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含有する２ｍｌのＰＢＳで希釈し、以下のようにスクリーニングした。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（ＳＬＳ、ＵＫ）を、０．２Ｍ炭酸ナトリウム−重炭酸バッファー、ｐＨ９．４（Ｐｅｒｂｉｏ）中０．１μｇ／ｍｌの、Ｄｒ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｔｅ（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．ＵＳＡ）によって提供された組換えヒトＡＭＨを用いて一晩コーティングした（５０μｌ／ウェル）。吸着後、プレートを吸引し、ウェルあたり１００μｌの、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用いて１時間ブロッキングした。次いで、このプレートを洗浄バッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー）を用いて洗浄し、その後、動物の血清を、Ｔｒｉｓコンジュゲートバッファー（０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ））で希釈したプレートに全体わたって滴定し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーで十分に洗浄し、Ｔｒｉｓコンジュゲートバッファー中１：２０００希釈の、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ、Ｄａｋｏ）５０μｌを各ウェルに添加した。３０分のインキュベーション期間の後、プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ））を添加した。適したレベルの色に到達した時点（約１０〜１５分）で、５０μｌの６％（ｖ／ｖ）オルト−リン酸（ＢＤＨ）を各ウェルに添加することによって反応を停止させた。Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。最高の反応をする動物を選択し、脾臓過剰刺激のために処理し、その後、屠殺した。最終ブーストは、５０μｇの滅菌ＡＭＨを静脈内注射することによって実施した。脾臓を無菌的に採取し、アリコートに分け、液体窒素中で保存し、その後融合した。
【００３１】
（実施例２）
抗体スクリーニング。脾細胞の１アリコートを、ポリエチレングリコール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の存在下、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｌｅｅら、１９９６年）に従ってＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。融合物は、まず、ヒト成熟領域のみの大腸菌発現版であるＡＭＨに対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。第２ラウンドのスクリーニングは、Ｗｅｅｎｅｎら（Ｗｅｅｎｅｎら、Ｍｏｌ  Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２００４年）によって記載されるとおり、無傷のラットＡＭＨの調製物でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で実施した。高反応クローンをメチルセルロース培地（Ｃｌｏｎａｃｅｌｌ  ＨＹ）上で再クローニングし、細胞株を低濃度のＩｇＧを含有する増殖培地で増殖させた。抗体をプロテインＧクロマトグラフィーによって精製し、水溶性ＬＣビオチンエステル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてビオチン化した。用いた手順は標準プロトコール（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）に由来するものであった。このように、イムノアッセイ研究のために選択したこれらのクローンをスクリーニングして、少なくとも一部はＡＭＨの成熟領域中にあり、ラットおよびヒトＡＭＨに共通するＡＭＨ中のエピトープを提供した。以下のクローンをさらなる分析のために選択した：Ｆ２／Ａ４、Ｆ２／Ａ２、Ｆ２Ｂ／１２Ｆ、Ｆ２Ｂ／７Ｈ、Ｆ２Ｂ／７Ａ、Ｆ２Ｂ／１２Ｈ、Ｆ２Ｂ／６Ｌ、Ｆ２Ｂ／７Ｃ、Ｆ２Ｂ／５ＢおよびＦ２Ａ／２３。
【００３２】
（実施例３）
ウエスタンブロッティング。マウスモノクローナル抗体５／６Ａ、９／６、２／６、Ｆ２Ｂ１２Ｈ（抗体１２Ｈ）およびＦ２Ｂ７Ａ（抗体７Ａ）を用いてウエスタンブロット解析を実施した。５／６Ａ、９／６および２／６抗体は、これまでに記載されたヒトＡＭＨに対する抗体であり（Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉら、２００５年）、これらの抗体を用いて得られた結果が、１２Ｈおよび７Ａ抗体の特徴と比較する目的で本明細書に示されている。５／６Ａ抗体はヒトＡＭＨの成熟領域と結合し、２／６および９／６抗体はヒトＡＭＨのプロ領域と結合する。組換えラットおよびヒトＡＭＨは、還元および非還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離した。タンパク質はニトロセルロースメンブレンに移し、１：１０００希釈の抗体、続いて、１：１００００希釈の二次ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体とともにインキュベートした。タンパク質はＥＣＬおよびウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって可視化した。
【００３３】
図１（Ａ〜Ｂ）は、ＡＭＨ抗体Ｆ２Ｂ７Ａ（抗体７Ａ）が、還元および非還元条件下でラットおよびヒトＡＭＨと結合することを実証するウエスタンブロットを示す。図１Ａ中、１分曝露は、抗体７Ａ（ＡＢ７Ａ）が、還元および非還元条件下双方で、ラットおよび組換えヒトＡＭＨのプロ領域を認識することを示す（５８ｋＤａバンド）。還元および非還元条件下で、ヒトＡＭＨのプロ領域内に存在する「さらなる切断部位」の切断後にさらなるバンド（約２５ｋＤａ）が見られる（レーン「Ｈ」および図３参照のこと）。図１Ｂでは、同じブロットの４分曝露が、より長い曝露の後には、抗体７Ａが、非還元条件下でラットおよび組換えヒトＡＭＨ双方の成熟領域を認識することを示す（１２ｋＤａバンド）。
【００３４】
図２（Ａ〜Ｂ）は、ＡＭＨ抗体Ｆ２Ｂ１２Ｈ（抗体１２Ｈ）が、非還元条件下で、ヒトおよびラットＡＭＨ双方の成熟領域を認識することを実証するウエスタンブロットを示す。図２Ａは、抗体１２Ｈが、１分の曝露で、非還元条件下では組換えヒトおよびラットＡＭＨの成熟領域を認識するが、還元条件下では認識しないことを示す（１２ｋＤａバンド）。図２Ｂは、同一ブロットの４分の曝露で、抗体１２Ｈが非還元条件下では組換えヒトおよびラットＡＭＨ双方のプロ領域を認識するが、還元条件下では認識しないことを示す（５８ｋＤａバンド）。
【００３５】
（実施例４）
マウスイムノアッセイ研究のためのプレートのコーティング
以下のプロトコールを用いて、マウスサンプルにおいてＡＭＨを測定するための候補抗体のイムノアッセイ試験用のコーティングされたプレートを提供した。
【００３６】
１．Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｂプレートを、０．０５Ｍ重炭酸バッファーｐＨ９．４中、２μｇ／ｍｌの濃度の各抗体０．０５ｍｌを用いてコーティングした。
【００３７】
２．プレートを一晩コーティングしたままにした。
【００３８】
３．プレートを個々に吸引し、タオル上にたたきつけて乾燥させ、６％スクロースを含有する０．５％（ｗ／ｖ）カゼインバッファー２００μｌを添加した。カゼインバッファー（ＣＬＢ−Ｍ２０５２）はＭａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｕｐ、Ｄｅｒｂｙ  Ｒｏａｄ、Ｂｏｏｔｌｅ、Ｍｅｒｓｅｙｓｉｄｅ、Ｌ２０  １ＥＡ、ＵＫから入手した。カゼインバッファーは５％溶液として提供され、使用前にＰＢＳで１０倍に希釈する。
【００３９】
４．プラスチック上の過剰の部位をカゼインにブロッキングさせた１時間後、ウェルの内容物をペーパータオル上にたたきつけて完全に出し、プレートを、工業用加湿器からの強制空気流のある乾燥チャンバー（Ｍｕｎｔｅｒｓ）中に入れる。
【００４０】
５．一晩乾燥させた後、各プレートを、デシカント（ｄｅｓｓｉｃａｎｔ）バッグを含むアルミニウムポーチ中に密閉した。
【００４１】
（実施例５）
イムノアッセイのための抗体対の選択
種々の抗体対を、ツーサイトＥＬＩＳＡによってＡＭＨを測定するその能力について試験するために以下の標準アッセイプロトコールを適用した。すべてのプレートの洗浄は０．０５％（ｗ／ｖ）ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳを用いて行った。
【００４２】
１．標準およびサンプルは、Ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｕｐから入手したＨＰＥ一般的アッセイ希釈液（ＣＬＢ  Ｍ１９４０）で希釈した。これは、作用強度を得るために水で希釈される５×濃縮液として提供されている。
【００４３】
２．プレート上のウェルに、０．０５ｍｌの各サンプルまたは標準を２連で添加した。
【００４４】
３．プレートを、蓋をしてシェーカー上で２時間インキュベートした。
【００４５】
４．プレートを洗浄し（５×）、適当なビオチン化抗体を、作用強度カゼインバッファー中、最終濃度０．３μｇ／ｍｌで添加した。各ウェルに０．０５ｍｌのビオチン化抗体を加え、このプレートを室温で１時間振盪した。
【００４６】
５．プレートを洗浄し、ポリＨＲＰストレプトアビジンコンジュゲートの１０，０００中１希釈を加えた。ストックコンジュゲートはＭａｓｔ  ＧｒｏｕｐからＣＬＢ  Ｍ２０５１として入手した。使用まで−２０℃で保存する。コンジュゲートの希釈液は、作用強度カゼインバッファーで作製する。
【００４７】
６．プレートをシェーカー上で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄し、たたきつけて乾燥させ、０．１ｍｌのＫＰＬペルオキシダーゼ基質を加えた。
【００４８】
７．発色を進行させ、１０〜２０分後６％リン酸０．１ｍｌを添加することによってプレートを停止した。
【００４９】
８．６２０ｎｍブランクに対して４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。
【００５０】
（実施例６）
抗体イムノアッセイ。本明細書に記載されるように作製した抗体対を、ＥＬＩＳＡ手順で試験して、数種に由来するサンプル中のＡＭＨを検出するその能力を調べた。このような抗体対を用いるイムノアッセイの結果を、先に記載される、ＡＭＨに対して先に開発された抗体を用いる類似のイムノアッセイの結果（Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉら、２００５年）と比較した。結果は表１に示されている。
【００５１】
【表１−１】
2008542723.tif 000003
【００５２】
【表１−２】
2008542723.tif 000004
上記の表１において、「プレート」とは、プレート表面と結合している捕捉抗体を表し、「標識」とは標識と結合している検出抗体を表し、「ＵＤ」とは「検出不可能」を表す。表１の右端の列は、先に開発された（Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉら、２００５年）ＡＭＨに対する抗体９／６および２／６を用いて得られた結果（「既存のブルックスアッセイ」）を示す。９／６および２／６抗体は双方ともＡＭＨのプロ領域と結合する。表１中の結果は、Ｆ２Ｂ／１２Ｈ（抗体１２Ｈ）およびＦ２Ｂ／７Ａ（抗体７Ａ）抗体の使用が、ヒト、ラットおよびマウスサンプルにおいてＡＭＨを測定するアッセイにおいて有効であることを示す。捕捉のためにＦ２Ｂ／１２Ｈ抗体を、また検出のためにＦ２Ｂ／７Ａ抗体を用いることによって、マウス血清におけるＡＭＨの最高の推定値、ヒトＡＭＨに対する感受性アッセイおよび組換えラットＡＭＨとの良好な交差反応（２４％）が提供される。９／６および２／６抗体を用いるアッセイによって得られた値について、良好な相互関係が観察されるが、９／６および２／６抗体を用いて得られたものの約２倍の値である。
【００５３】
（実施例７）
イムノアッセイにおける組換えヒトＡＭＨ免疫反応性の安定性
図４（Ａ〜Ｃ）は、プローブとしてＡＭＨ抗体５／６、２／６および９／６を用いてプロービングされたラットおよびヒト組換えＡＭＨのウエスタンブロットアッセイを示し、これでは、ヒトＡＭＨ（ｈＡＭＨ）は種々の条件下で保存された。図４Ａは、抗体５／６はヒト組換えＡＭＨおよびラットＡＭＨの成熟領域（１２ｋＤａ）を認識することを示す。図４Ｂは、抗体２／６は、「さらなる切断部位」のタンパク質分解切断後に生じる両バンドを含むヒト組換えＡＭＨのプロ領域を認識することを示す（図３参照のこと）。したがって、２／６抗体エピトープは、抗体が両バンドを認識するのでタンパク質分解に対して安定である。抗体２／６はラットＡＭＨを認識しない。図４Ｃは、抗体９／６はラットおよびヒトＡＭＨのプロ領域を認識するが、ヒト組換えＡＭＨのプロ領域の、「さらなる切断部位」でのタンパク質分解切断後の小さな断片は認識しないことを示す。したがって、９／６抗体エピトープはタンパク質分解に対して安定でない。
【００５４】
表２は、先に記載された２／６および９／６抗体を用いる類似のアッセイ（Ａｌ−Ｑａｈｔａｎｉら、２００５年）と比較した、Ｆ２Ｂ／７ＡおよびＦ２Ｂ／１２Ｈ抗体を用いるＥＬＩＳＡイムノアッセイにおけるヒト組換えＡＭＨ免疫反応性の安定性を示す。
【００５５】
【表２】
2008542723.tif 000005
２／６および９／６抗体対を用いる最初のイムノアッセイでは、組換えヒトＡＭＨ調製物（Ｄｒ．  Ａｘｅｌ  Ｔｈｅｍｍｅｎから入手）は、Ｂｉｏｇｅｎヒト組換えＡＭＨと比較して、極めて低い濃度推定値を示すことがわかった。その後の研究により、これらの抗体のエピトープは双方とも、精製ＡＭＨ中に残存する酵素に対して不安定であることが示された。同じ組換えヒトＡＭＨ調製物を３７℃で６日間インキュベートした場合、見かけの免疫反応性量はさらに減少する。対照的に、同じ組換えヒトＡＭＨ調製物は、Ｆ２Ｂ／１２およびＦ２Ｂ／７Ａ抗体を用いて測定された場合には免疫反応性のわずかな減少を伴うのみで３７℃で６日間インキュベートできる。この結果は、両エピトープがタンパク質分解に対して、９／６および２／６抗体によって認識されるものよりもより安定であることを必要とする。インキュベートされたサンプルには、保存料として０．１％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジドが添加されていた。Ｂｉｏｇｅｎ組換えヒトＡＭＨはＤｒ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃａｔｅから提供された。
【００５６】
（実施例８）
加齢に伴うマウスにおける血清ＡＭＨの減少の測定。本明細書に記載される１２Ｈおよび７Ａ抗体に基づくアッセイを用いて、老齢の雌のマウスから得たマウス血清中のＡＭＨのレベルを調べた（図５参照のこと）。マウスは、膣スミアに基づいて発情期の日に、種々の年齢で屠殺した。続いて、血清サンプルを、４１倍希釈後に、アッセイを用いるＡＭＨ分析に付した。４、６および８ヶ月齢の血清ＡＭＨレベルは異なっておらず、約２８．５ｎｇ／ｍｌヒト標準であった。１０および１２ヶ月齢のマウスはＡＭＨレベルの低下を示した（２２．０および２０．５ｎｇ／ｍｌヒト標準。より老齢のマウス、１４、１６および１８ヶ月齢は、さらにより低下したＡＭＨレベルを示した：それぞれ８．２、６．４および３．８ｎｇ／ｍｌヒト標準。
【００５７】
（実施例９）
マウスにおける発情周期を通じたＡＭＨレベル。４ヶ月齢の雌のマウスを、膣スメアおよび死後卵胞分析に基づいて発情周期の種々の段階に分類した。血清ＡＭＨレベルは抗体７Ａおよび１２Ｈに基づくＡＭＨアッセイを用いて調べた。血清ＡＭＨレベルは、より高いレベル、４０ｎｇ／ｍｌＡＭＨヒト標準が見られた発情期を除き、発情周期を通じて約２９ｎｇ／ｍｌヒト標準のレベルで安定であった（図６Ａを参照のこと）。予備分析から、ＡＭＨレベルと、これらの動物の卵巣中の前胞状卵胞および小胞状卵胞の数との相関が示された（図６Ｂ参照のこと）。
【００５８】
（実施例１０）
マウストランスジェニックバックグラウンドにおけるラットＡＭＨの測定。抗体７Ａおよび１２Ｈに基づくアッセイを用いて、マウストランスジェニックバックグラウンドにおいて産生されたラットＡＭＨのレベルを調べた。ＰＥＰＣＫプロモーターの制御下、組換えラットＡＭＨの発現を駆動する構築物を保持するトランスジェニックマウスを屠殺し、その血清中のＡＭＨを調べた。トランスジェニック系統の血清のウエスタンブロットに基づいて、２つの系統を先に同定しておいた：低発現系統２１および高発現系統３０。抗体７Ａおよび１２Ｈに基づくアッセイによって、これらの系統におけるＡＭＨレベルを以下のとおりに調べた：系統２１：９ｎｇ／ｍｌＡＭＨヒト標準、系統３０：７０ｎｇ／ｍｌＡＭＨヒト標準。両系統とも、その卵巣が、雌においてＡＭＨを産生する卵胞および顆粒膜細胞を欠くために、内因性マウスＡＭＨをわずかしか、または全く分泌しないと予想される。
【００５９】
（実施例１１）
サルおよび去勢されていないウシ由来サンプルにおける、本明細書に記載されるアッセイを用いるＡＭＨレベルの測定。表３に示されるように、種々の年齢の、および閉経期状態の雌のサルにおいて、血清ＡＭＨ値を調べた。
【００６０】
【表３】
2008542723.tif 000006
表４に示されるように、ウシ血清サンプルにおいても、血清ＡＭＨレベルを本明細書に記載されるアッセイを用いて測定した。
【００６１】
【表４】
2008542723.tif 000007
（実施例１２）
血清におけるＭＩＳ／ＡＭＨの定量測定のためのＥＬＩＳＡアッセイ。本明細書に開示されるＭＩＳ／ＡＭＨ  ＥＬＩＳＡは酵素増幅ツーサイトイムノアッセイである。このアッセイでは、標準、対照および未知血清サンプルを、抗ＭＩＳ／ＡＭＨ抗体を用いてコーティングしておいたマイクロタイトレーションウェル中でインキュベートする。インキュベーションおよび洗浄した後、ウェルを、ビオチンで標識した別の抗ＭＩＳ／ＡＭＨ検出抗体を用いて処理する。第２のインキュベートおよび洗浄ステップの後、ウェルをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とともにインキュベートする。第３のインキュベーションおよび洗浄ステップの後、ウェルを基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともにインキュベートする。次いで、酸性停止溶液を加え、４５０および６２０ｎｍでの二波長吸光度測定によって基質の酵素ターンオーバー度を調べる。測定された吸光度は、存在するＭＩＳ／ＡＭＨの濃度と正比例する。一連のＭＩＳ／ＡＭＨ標準を用いて、吸光度の標準曲線対ＭＩＳ／ＡＭＨ濃度をプロットし、これから未知のもののＭＩＳ／ＡＭＨ濃度を算出できる。
【００６２】
試薬
Ａ．抗ＭＩＳ／ＡＭＨコーティングマイクロタイトレーションストリップ：
抗ＭＩＳ／ＡＭＨ  ＩｇＧを各ウェルの内壁に固定化した、９６マイクロタイトレーションウェルを有するストリップホルダー。これらは、湿度から保護するために乾燥剤とともに２〜８℃で保存した。
【００６３】
Ｂ．ＭＩＳ／ＡＭＨサンプル希釈液：
非水銀保存料を含むタンパク質ベースのバッファー中、０ｎｇ／ｍＬという濃度のＭＩＳ／ＡＭＨを含有するサンプル希釈液。サンプル希釈液は２〜８℃で保存した。
【００６４】
Ｃ．ＭＩＳ／ＡＭＨ標準：
非水銀保存料を含むタンパク質ベースのバッファー中、約０．０２５、０．１０、０．２５、１．５、７．５および１５ｎｇ／ｍＬという濃度のＭＩＳ／ＡＭＨを含有する標準。標準は２〜８℃で保存した。
【００６５】
Ｄ．ＭＩＳ／ＡＭＨ対照：
対照は、非水銀保存料を含むタンパク質ベースのバッファー中、低および高濃度のＭＩＳ／ＡＭＨを含有する標識レベルＩおよびＩＩとした。対照は２〜８℃で保存した。
【００６６】
Ｅ．ＭＩＳ／ＡＭＨ抗体−ビオチンコンジュゲート−ＲＴＵ：
２〜８℃で保存された、非水銀保存料を含むタンパク質ベースのバッファー中のビオチン化ＭＩＳ／ＡＭＨ抗体。
【００６７】
Ｆ．ストレプトアビジン−酵素コンジュゲート−ＲＴＵ：
タンパク質ベースの（ＢＳＡ）バッファーおよび非水銀保存料中のストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、２〜８℃で希釈せずに保存。
【００６８】
Ｇ．ＭＩＳ／ＡＭＨアッセイバッファー：
２〜８℃で保存された、非水銀保存料を含むタンパク質ベースの（ＢＳＡ）−バッファー。
【００６９】
Ｈ．ＴＭＢ色素原溶液：
２〜８℃で保存された、過酸化水素を含むクエン酸バッファー中のテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の溶液。
【００７０】
Ｉ．洗浄濃縮物：
２〜８℃または室温（約２５℃）で保存された、非イオン性界面活性剤を含む緩衝生理食塩水。洗浄濃縮物は使用前に脱イオン水で１０倍希釈した。
【００７１】
Ｊ．停止溶液：
２〜８℃または室温（約２５℃）で保存された、０．２Ｍ硫酸の溶液。
【００７２】
すべての試薬およびサンプルは室温（約２５℃）に到達させ、使用前に穏やかに反転させることによって十分に混合した。
【００７３】
アッセイ手順
すべてのサンプルおよび試薬は室温（約２５℃）に到達させ、使用前に穏やかに反転させることによって十分に混合した。標準、対照および未知のものを二連でアッセイした。
【００７４】
プロトコール：
１．使用するマイクロタイトレーションストリップに印をつける。
【００７５】
２．標準、対照および未知のものを適当なウェルにピペットで２０μＬ入れる。
【００７６】
３．半自動ディスペンサーを用いて、各ウェルに１００μＬのＭＩＳ／ＡＭＨアッセイバッファーを加える。
【００７７】
４．オービタルマイクロプレートシェーカー上で速い速度（５００〜７００ｒｐｍ）で振盪しながら室温（約２５℃）で１時間ウェルをインキュベートする。
【００７８】
５．各ウェルを、自動マイクロプレートウォッシャーを用いて、または各ウェルから液体を吸引することと、各ウェルに０．３５ｍＬの洗浄溶液を分配することと、洗浄溶液を吸引することとによって洗浄溶液で５回吸引および洗浄する。吸湿剤上でプレートを反転することによってブロットを乾燥させる。
【００７９】
６．半自動ディスペンサーを用いて、各ウェルに１００μＬの抗体−ビオチンコンジュゲート−ＲＴＵを加える。
【００８０】
７．オービタルマイクロプレートシェーカー上で速い速度（５００〜７００ｒｐｍ）で振盪しながら室温（約２５℃）で１時間ウェルをインキュベートする。
【００８１】
８．各ウェルを、自動マイクロプレートウォッシャーを用いて、または各ウェルから液体を完全に吸引することと、各ウェルに０．３５ｍＬの洗浄溶液を分配することと、洗浄溶液を吸引することとによって洗浄溶液で５回吸引および洗浄する。吸湿剤上でプレートを反転することによってブロットを乾燥させる。
【００８２】
９．半自動ディスペンサーを用いて各ウェルに１００μＬのストレプトアビジン−酵素コンジュゲート−ＲＴＵを加える。
【００８３】
１０．オービタルマイクロプレートシェーカー上で速い速度（５００〜７００ｒｐｍ）で振盪しながら室温（約２５℃）で３０分間ウェルをインキュベートする。
【００８４】
１１．各ウェルを、自動マイクロプレートウォッシャーを用いて、または各ウェルから液体を完全に吸引することと、各ウェルに０．３５ｍＬの洗浄溶液を分配することと、洗浄溶液を吸引することとによって洗浄溶液で５回吸引および洗浄する。吸湿剤上でプレートを反転することによってブロットを乾燥させる。
【００８５】
１２．半自動ディスペンサーを用いて各ウェルに１００μＬのＴＭＢ色素原溶液を加える。
【００８６】
１３．オービタルマイクロプレートシェーカー上で速い速度（５００〜７００ｒｐｍ）で振盪しながら室温（約２５℃）で１５〜３０分間ウェルをインキュベートする。直射日光に対する曝露は避ける。
【００８７】
１４．半自動ディスペンサーを用いて各ウェルに１００μＬの停止溶液を加える。
【００８８】
１５．４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを用いて３０分以内のウェル中の溶液の吸光度を読み取る。マイクロタイトレーションウェルの吸光度を読み取る際には、ゼロ標準を「ブランク」として調整することが必要である。波長補正が利用可能な場合は、機器を、４５０ｎｍで二波長測定に設定し、バックグラウンド波長補正は６００ｎｍまたは６２０ｎｍに設定する。
【００８９】
結果の算出：
１．標準、対照または未知のもの各々の平均吸光度を算出する。
【００９０】
２．直線曲線適合を用いて、ｘ軸に沿ったｎｇ／ｍｌでのＭＩＳ／ＡＭＨ濃度のｌｏｇに対してｙ軸に沿った標準各々の平均吸光度読み取り値のｌｏｇをプロットする。あるいは、データは直線対直線をプロットしてもよく、平滑化スプライン曲線適合を使用できる。
【００９１】
３．２連の点の平均によって最良の適合曲線を描く。
【００９２】
４．標準曲線から、その平均吸光度読み取り値を対応するＭＩＳ／ＡＭＨ濃度とマッチさせることによって対照および未知のもののＭＩＳ／ＡＭＨ濃度を決定する。
【００９３】
（実施例１３）
ヒト血清中のＡＭＨのイムノアッセイ測定。１２Ｈおよび７Ａ抗体を用いる本明細書に記載されるＥＬＩＳＡアッセイによるヒト血清におけるＡＭＨ測定の性能特性を以下の表５および表６に示す。この実施例では、抗体１２Ｈを捕捉抗体として用い、抗体７Ａを検出抗体として用いた。０ｎｇ／ｍＬ  ＭＩＳ／ＡＭＨ標準の８の反復の平均および２つの標準偏差の補間によって算出される、理論上の感度または最低検出限界は０．００５８ｎｇ／ｍＬであった。
【００９４】
表５は、ヒト血清サンプル中のＡＭＨの測定される量の希釈物の直線性を示す。回収率は、予想濃度によって除した実測濃度のパーセントとして算出される。
【００９５】
【表５】
2008542723.tif 000008
表６は、アッセイ内およびアッセイ間の精度およびアッセイの回収特性を示す。アッセイ内の精度は、８の反復各々の平均から求めた。回収率は予想濃度によって除した実測濃度のパーセントとして算出される。
【００９６】
【表６−１】
2008542723.tif 000009
【００９７】
【表６−２】
2008542723.tif 000010
上記の表５および６では、「Ｎ」は、サンプルの反復測定の数を意味し、「ＳＤ」は標準偏差を意味し、「ＣＶ」は変動係数を意味し、「内因性」とは既知量のＡＭＨを添加する前のサンプルにおいて測定されたＡＭＨの量を意味し、「添加」はサンプルに添加されたさらなる既知量のＡＭＨを意味し、「予測」は、内因性および添加ＡＭＨの予測される測定される量を意味し、「実測」とは内因性および添加ＡＭＨの実際に測定された値を意味し、「回収率」はアッセイによって実際に測定された、添加された既知量のＡＭＨのパーセントを意味する。
【００９８】
（実施例１４）
ラット血清におけるＡＭＨのイムノアッセイ測定。１２Ｈおよび７Ａ抗体を用いて、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡアッセイを実施してラット血清中のＡＭＨを測定した。この実施例では、抗体１２Ｈを捕捉抗体として用い、抗体７Ａを検出抗体として用いた。このアッセイの性能特性を表７および８に示す。表７は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定された、ラットサンプル中のＡＭＨの測定された量の希釈物の直線性を示す。ラット血清サンプルはサンプル希釈液（０ｎｇ／ｍｌ  ＡＭＨ）を用いて希釈し、アッセイした。回収率は、予想濃度によって除した実測濃度のパーセントとして算出される。ラットＡＭＨのＥＬＩＳＡアッセイの理論上の感度は０．０１２ｎｇ／ｍｌであり、サンプル希釈物の１６の反復測定値の平均および２つの標準偏差の補間によって算出した。
【００９９】
【表７】
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表８は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるラットＡＭＨの測定された量の回収特性を示す。血清サンプルを、種々の既知量の高ＡＭＨストックサンプルを用いてスパイクし、アッセイした。回収率は予測濃度によって除した実測値のパーセントとして算出される。
【０１００】
【表８】
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本明細書に提供された実施例は、サンプル、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシおよびウマサンプルなどの生体サンプル中のＡＭＨを測定するために有効な組成物および方法を記載する。このような組成物および方法において有用な抗体が記載されている。本明細書に記載される抗体は、ＡＭＨの成熟領域と結合し、ＡＭＨのタンパク質分解に対して安定であるエピトープを認識し、その結果、測定されるＡＭＨの量が、ＡＭＨのタンパク質分解によって影響を受けない。
【０１０１】
次の参考文献が、本明細書中で引用される：
【０１０２】
【表９】
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【０１０３】
【表１０】
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【０１０４】
【表１１】
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本明細書において記載される特許または刊行物はいずれも、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示すものである。さらに、これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が参照により組み込まれるよう具体的および個々に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
当業者ならば、本発明は目的を実施するために、また、記載された結果および利点ならびに本明細書に特有の目的、結果および利点を得るためにうまく適合されることは容易に理解するであろう。本実施例は、本明細書に記載される方法、手順、処理、分子および特定の化合物とともに、好ましい実施形態の目下のところ代表的なものであり、例示的なものであって、本発明の範囲に関する制限として意図されるものではない。本明細書における変法およびその他の用途が当業者には生じるが、これは特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１（Ａ〜Ｂ）は、ＡＭＨ抗体Ｆ２Ｂ７Ａ（抗体７Ａ）が、還元および非還元条件下で、ラットおよびヒトＡＭＨと結合することを実証するウエスタンブロットを示す。
【図２】図２（Ａ〜Ｂ）は、ＡＭＨ抗体Ｆ２Ｂ１２Ｈ（抗体１２Ｈ）が、非還元条件下で、ヒトおよびラットＡＭＨ双方の成熟領域を認識することを実証するウエスタンブロットを示す。
【図３】図３は、組換えヒトＡＭＨの、プロおよび成熟領域へのタンパク質分解プロセシングを示す。組換えヒトＡＭＨのプロ領域内に存在する「さらなる切断部位」も示されている。
【図４】図４（Ａ〜Ｃ）は、プローブとしてＡＭＨ抗体５／６、２／６および９／６を用いてプロービングされたラットおよびヒト組換えＡＭＨのウエスタンブロットアッセイを示し、これでは、ヒトＡＭＨ（ｈＡＭＨ）は種々の条件下で保存された。図４Ａは抗体５／６はヒト組換えおよびラットＡＭＨの成熟領域（１２ｋＤａ）を認識することを示す。図４Ｂは、抗体２／６は「さらなる切断部位」のタンパク質分解切断後に生じる両バンドを含むヒト組換えＡＭＨのプロ領域を認識することを示す。したがって、抗体が両バンドを認識するために、２／６抗体エピトープはタンパク質分解に対して安定である。抗体２／６はラットＡＭＨを認識しない。図４Ｃは、抗体９／６はラットおよびヒトＡＭＨのプロ領域を認識するが、ヒト組換えＡＭＨのプロ領域の「さらなる切断部位」でのタンパク質分解切断後のより小さい断片は認識しないことを示す。したがって、９／６抗体エピトープはタンパク質分解に対して安定でない。
【図５】図５は、１２Ｈおよび７Ａ抗体を用いるイムノアッセイによる、雌マウスにおける一生を通じて測定されたＡＭＨレベルを示す。この結果は、雌マウスにおける血清ＡＭＨの加齢に伴う減少を示す。
【図６】図６（Ａ〜Ｂ）は、イムノアッセイにおいて１２Ｈおよび７Ａ抗体を用いた、雌マウスにおける発情周期の間のＡＭＨ血清レベルの測定値を示す。図６（Ａ）は、発情周期の種々の段階にあるマウスにおけるＡＭＨ測定値の棒グラフを示す。図６（Ｂ）は、発情周期中の種々の段階における小さな胞状卵胞の数の相関グラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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