(57)【要約】  本発明は、酵素または酵素−化合物複合体を特徴付けるための方法であって、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性リガンドを活用して、酵素をタンパク質調製物から得て、そして、該酵素を質量分析によって特徴付ける、前記方法に関する。これらの方法は、非固定化化合物ライブラリのスクリーニング、リード化合物の選択性プロファイリング、および生細胞における作用機序研究に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  該酵素を含有するタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にあるタンパク質調製物を、該酵素と広範囲性酵素リガンド（broad spectrum enzyme ligand）との結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  該酵素を溶出させ；そして、
ｄ）  溶出した酵素を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
工程ａ）におけるタンパク質調製物の提供が、該酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  該酵素を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含んでなる二つのアリコットを提供し；
ｂ）  一方のアリコットを所与の化合物とともにインキュベートし；
ｃ）  細胞を回収し；
ｄ）  細胞を溶解させ；
ｅ）  本質的に生理学的な条件下にある細胞溶解物を、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｆ）  酵素を溶出させ；そして、
ｇ）  溶出した酵素を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項４】
酵素を特徴付けることによって、化合物の投与が酵素の差次的発現または活性化状態をもたらすかどうかが決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  該酵素を含有する二つのアリコットのタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にある一方のアリコットを、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  本質的に生理学的な条件下にあるもう一方のアリコットを、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと、ならびに所与の化合物と接触させ；
ｄ）  該酵素（単数または複数）を溶出させ；そして、
ｅ）  溶出した酵素（単数または複数）を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項６】
工程ａ）におけるタンパク質調製物の提供が、該酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物とともにインキュベートされたアリコットにおける酵素の検出低下が、該酵素が化合物の直接的な標的であることを示す、請求項５または６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも一つの酵素−化合物複合体を特徴付けるための方法であって、
ａ）  該酵素を含有するタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にあるタンパク質調製物を、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  結合した該酵素を化合物と接触させて、少なくとも一つの結合した該酵素を遊離させ；そして、
ｄ）  遊離した酵素（単数もしくは複数）を質量分析によって特徴付ける；かまたは、
ｅ）  該酵素（単数もしくは複数）をリガンドから溶出させ、そして該酵素（単数もしくは複数）を質量分析によって特徴付けることによって、該化合物の１またはそれより多くの結合パートナーを同定する；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９】
工程ａ）におけるタンパク質調製物の提供が、酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ミディアムもしくはハイスループットスクリーニングとして行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、合成化合物、または有機合成薬物、より好ましくは小分子有機薬物、および天然小分子化合物からなる群より選択される、請求項３〜１０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１２】
酵素が、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ＧＴＰアーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼおよびヘリカーゼからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１３】
リガンドが、所与の酵素クラスの酵素の１０〜５０％、好ましくは３０〜５０％と結合する、請求項１〜１２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１４】
リガンドが阻害剤である、請求項１〜１３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１５】
酵素がキナーゼであって、かつ、リガンドが、ビスインドールマレイミドVIII、プルバラノールＢ、CZC00007324（連結可能なPD173955）およびCZC00008004からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酵素の特徴付けを、共溶出した酵素の結合パートナー、酵素サブユニット、または酵素の翻訳後修飾を特徴付けることによって行う、請求項１〜１５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１７】
特徴付けを、酵素または酵素の結合パートナーのプロテオタイピックペプチドの同定によって行う、請求項１〜１６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１８】
特徴付けを、酵素または結合パートナーに対して得られるプロテオタイピックペプチドを、公知のプロテオタイピックペプチドと比較することによって行う、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
固体担体が、アガロース、修飾アガロース、セファロースビーズ（例えば、ＮＨＳ活性化セファロース）、ラテックス、セルロース、および強磁性もしくはフェリ磁性粒子からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２０】
広範囲性酵素リガンドを、固体担体に共有的連結させる、請求項１〜１９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２１】
１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４の異なるリガンドを用いる、請求項１〜２０のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２２】
１より多くのリガンドを用いる場合、各リガンドが異なる固体担体上に存在する、請求項１〜２１のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２３】
一またはそれより多くのリガンドを用いる場合、少なくとも二つの異なるリガンドが一つの固体担体上に存在する、請求項１〜２１のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２４】
酵素または化合物−酵素複合体を特徴付けることにより、細胞内の酵素クラスのすべてまたは一部のメンバーの同一性を決定する、請求項１〜２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２５】
化合物がリガンドと異なる、請求項３〜２４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２６】
リガンドと酵素との結合が非共有結合である、請求項１〜２５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２７】
医薬組成物を作出するための方法であって、
ａ）  請求項６〜１７のいずれかの項にしたがって、酵素−化合物複合体を同定し；そして、
ｂ）  該化合物を、医薬組成物へと処方物化する；
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２８】
酵素に対する化合物の結合親和性を調節する工程をさらに含んでなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドの使用であって、少なくとも一つの酵素を特徴付けるため、または少なくとも一つの酵素−化合物複合体を特徴付けるための、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体担体に結合させた酵素リガンドを用いた、酵素または酵素−化合物複合体を特徴付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグディスカバリーの目的は、有効かつ安全な薬剤を開発することである。この目的を達成するために、医薬研究は、目的とする疾患の原因であることが公知の薬物標的に対する、好ましくは小分子薬物を同定することを、目指す。
【０００３】
従来、小分子薬物の大部分は、受容体タンパク質（Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）などの細胞膜受容体または核内ホルモン受容体）、イオンチャネルおよび酵素に対するものである。特に目的とする酵素は、例えば、プロテアーゼ、ホスホジエステラーゼおよびキナーゼである（総説：Drews, 2000, “Drug discovery: a historical perspective”, Science 287, 1960-1964）。
【０００４】
プロテアーゼは、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤によるＡＩＤＳの有効な管理、または高血圧を治療するためのアンギオテンシン変換酵素阻害剤の使用によって実証されるように、扱いやすい薬物標的と考えられている。癌の治療に関しては、マトリックスメタロプロテイナーゼおよびカスパーゼに対するプロテアーゼ阻害剤が、開発中である（Docherty et al., 2003, “Proteases as drug targets”, Biochemical Society Symposia 70, 147-161）。
【０００５】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの加水分解を触媒する酵素ファミリーを含んでなり、かつ、種々の疾患に関与する。ＰＤＥ５阻害剤であるシルデナフィル（バイアグラ）は、勃起不全に対して有効な治療を提供する。現在、ＰＤＥ４阻害剤（例えば、cilomastおよびroflumast）は、抗炎症治療剤として臨床試験中である。この分野における大きな課題は、副作用に関与する交差反応性を避けるための、ＰＤＥアイソタイプ特異的阻害剤の開発である（Card et al., 2004, “Structural basis for the activity of drugs that inhibit phosphodiesterases”, Structure 12, 2233-2247）。
【０００６】
キナーゼは、タンパク質、脂質、糖、ヌクレオシドおよび他の細胞代謝物のリン酸化を触媒し、かつ、真核細胞の生理学のすべての側面において重要な役割を果たしている。タンパク質のリン酸化は、よく知られたタンパク質の翻訳後修飾であって、かつ、多くの経路においてタンパク質の構造および機能に影響を及ぼす。
【０００７】
ドラッグディスカバリーの最近の焦点となったあるキナーゼクラスは、プロテインキナーゼを含んでなるが、これは、それらが、シグナル伝達経路の調節異常を介して、腫瘍の開始および進行に重要な役割を果たすことが示されたためである（EGF receptor in lung cancer; overexpression of the ErbB2/Her-2 receptor in breast cancer; BCR-ABL fusion protein in leukemia；総説：Blume-Jensen and Hunter, 2001, “Oncogenic kinase signaling”, Nature 411, 355-365）。
【０００８】
ヒトゲノム中にコードされるプロテインキナーゼの補完物（complement）は、配列類似性によっていくつかのサブファミリーに分類されることが可能な５１８のファミリーメンバー（キノーム）を含んでなる（総説：Manning et al., 2002, The Protein Kinase Complement of the Human Genome, Science 298, 1912-1934）。いずれの所与の細胞もしくは組織においても、１サブセットのみのキノームが発現する。キナーゼは、リン酸基をＡＴＰから基質分子へと移行させることによって、それらの標的の安定性、活性および機能に影響を及ぼす。異なるキナーゼのＡＴＰ結合ポケットは構造的に類似し、そしてしたがって、選択的なＡＴＰ競合的阻害剤を開発することは難しいと考えられる。
【０００９】
キナーゼファミリーは、（例えばホスホジエステラーゼなどの、薬物標的として関連がある他の酵素クラスと比較して）非常に大きな酵素ファミリーであって、ドラッグディスカバリーに多くの機会を提供するが、しかしユニークな課題（大きなサイズのファミリー；ＡＴＰ結合ポケットの構造的類似性；高濃度の細胞内ＡＴＰ）もまた提供する（総説：Cohen, P., 2002, Protein kinases - the major drug targets of the twenty-first century? Nature Reviews Drug Discovery、第1巻、309-315）。
【００１０】
目的とする別のキナーゼクラスは、脂質キナーゼである。脂質キナーゼは、γ−リン酸基をヌクレオシド三リン酸から脂質基質へと移行させる。
ホスホイノシチド  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ファミリーメンバーなどの脂質キナーゼは、成長因子、ホルモンおよび神経伝達物質のモジュレーターであることが公知であり、かつ、癌、糖尿病および他の疾患に関与する（Fruman et al., 1998. Phosphoinositide kinases. Annual Review Biochemistry 67, 481-507；Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657）。
【００１１】
例えば酵素などのタンパク質と相互作用する化合物を同定するための、ある必須条件は、あるクラスのタンパク質をできる限り多く高純度にて含有するタンパク質調製物の提供である。特に、あるクラスの多くのタンパク質（例えば、キナーゼ）の提供は、このことがタンパク質ファミリーの多くのメンバーに対して潜在的、医薬的に興味深い化合物のスクリーニングを可能にすることから、重要である（いわゆる、ヒット同定）。このようなタンパク質調製物の他の実行可能な使用には、化学的に最適化された化合物の検査（リード最適化）、所与の化合物の選択性の決定（選択性プロファイリング）、ならびに所与の化合物の作用機序の確認が含まれる。
【００１２】
当該技術分野において、いくつかのストラテジーが、この場合を評価するために提案されている。
キナーゼなどのＡＴＰ結合タンパク質、および他のヌクレオチド結合タンパク質を細胞抽出物から濃縮するための一つのアプローチは、アフィニティ試薬として固定化したＡＴＰ、すなわち、潜在的にすべてのＡＴＰ結合酵素を結合するリガンドの使用に依存する。この場合、ＡＴＰは、γ−リン酸基をリンカーを介してレジンと連結させることによって、ＡＴＰを共有結合により固定化する（Graves et al., 2002, Molecular Pharmacology 62, No. 6 1364-1372; US 5536822）。このアプローチは、コンビナトリアル化合物ライブラリのうちの一つの化合物を連結させることへと、さらに広げられた（WO00/63694）。
【００１３】
固定化したＡＴＰの一つの不利点は、キナーゼに対する親和性がやや低く、キナーゼの不十分な捕捉、または高い解離速度による急速な溶出をもたらすことである。別の不利点は、キナーゼが選択的に捕捉されず、細胞内にかなり高いレベルで発現している可能性のある他のクラスのＡＴＰ結合タンパク質もまた捕捉されることである。より豊富なＡＴＰ結合タンパク質は、競合による不十分な捕捉をもたらす可能性があり、あるいは、分析の深さが十分でないならば、結合したタンパク質の質量分析解析中に問題をもたらす可能性がある。
【００１４】
当該技術分野において記載される別のアプローチは、個々の酵素に特異的なリガンド、すなわち、高親和性かつ高選択性のキナーゼ阻害剤またはそれに近い誘導体（例えば、最適化された薬物）の使用である。これらは、キナーゼを細胞溶解物から濃縮するために用いられ、そして、同じ非修飾化合物は、細胞薬物標的（単数もしくは複数）を同定するための特異的溶出に用いられる（Godl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 15434-15439；WO 2004/013633）。このアプローチは、構造−親和性相関（ＳＡＲ）が薬物の化学的修飾を介して壊されない場合にのみ成功するが、しかし、ＳＡＲが損なわれる場合には失敗する。加えて、望ましくない副作用を媒介する標的を同定することは、対応する薬物標的と副作用標的とのＳＡＲが異なる可能性があり、かつ後者のＳＡＲは通常は公知でないために、難しい。
【００１５】
別のストラテジーは、所与のクラスの酵素、例えばキナーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現である。Fabianら（Fabian et al., 2005, Nature Biotechnology 23(3), 329-336；WO 03084981）は、細胞溶解物に含有される内因性キナーゼの捕捉に依存せず、バクテリオファージＴ７上に提示されるキナーゼを使用する、キナーゼプロファイリング方法について記載している。このアッセイに用いられるキナーゼ（またはキナーゼドメイン）は、発現、精製および検出を可能にするためにタグを付けた融合タンパク質である。競合的結合アッセイにおいて、これらのファージタグ付きキナーゼを、固定化したキナーゼ阻害剤に結合させ、固定化していない試験化合物で処理し、そして、結合したタグ付きキナーゼを、ファージＤＮＡを鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲにより定量する。この方法の不利点は、キナーゼをクローニングしなければならず、そして、ごく一部のファージタグ付きキナーゼのみが正しい天然状態にて折り畳まれることである。さらに、このようなタンパク質調製物は、細胞内での自然状況を全く反映しない。
【００１６】
さらに別のアプローチは、標的酵素と共有結合を形成する、活性部位特異的プローブ（いわゆる活性ベースのプローブ）を用いる。この方法は、セリンヒドロラーゼの発現を高選択性プローブを用いてプロファイリングするために用いられ（Liu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 14694-14699、WO 01/77668）、そして、ローダミンおよびビオチンタグ付き蛍光スルホン酸エステルの非特異的な活性ベースのプローブライブラリからなるより無差別のプローブを用いることによって、他の酵素ファミリーへとさらに拡充される（Adam et al., 2002, Nature Biotechnology 20, 805-809、WO 01/77684、WO 03/047509）。しかしながら、どの構造および／または触媒特性がこれらのスルホン酸を標的とする酵素によって共有されるのかは、はっきりしないままである。このアプローチを限定する別のものは、酵素との特異的相互作用と、プローブの固有の反応性によって引き起こされる非特異的相互作用とを、区別することの難しさである。
【００１７】
最後に、チロシン特異的抗体によってチロシンがリン酸化されているタンパク質を濃縮することが、試みられた（Blogoev et al., 2004, Nature Biotechnology 9, 1139-1145）。Blogoevらは、上皮成長因子（ＥＧＦ）などの化合物がホスホチロシン依存性シグナル伝達経路に及ぼす影響を研究するために用いられることが可能な方法について、記載している。ＥＧＦにより刺激された細胞を溶解後、ホスホチロシン含有タンパク質を、ホスホチロシンに対する抗体を用いた免疫沈降によって濃縮する。第二の工程において、これらの濃縮されたタンパク質を、質量分析解析によって分析および同定する。このアプローチを大きく限定する一つのものは、チロシンがリン酸化されているタンパク質のみが捕捉可能なことである。
【００１８】
このことを考慮して、細胞内に発現している所与のクラスのそれらの酵素を特徴付けるための方法を改良する必要性がある。さらに、所与の化合物の結合パートナーである酵素を同定するための方法を改良する必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、これらの必要性を満たす。本発明の文脈において、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンド（broad spectrum enzyme ligand）の使用は、タンパク質調製物、好ましくは細胞溶解物からの酵素の効率的な単離を可能にする。この単離後に、有効な方法を、広範囲性酵素リガンドに結合した酵素の特徴付け、あるいは化合物と酵素との相互作用の同定に適用することが可能である。酵素は好ましくは質量分析法によって同定される。したがって、本発明は、酵素の特徴付け、あるいは所与の化合物との結合パートナーの同定のための、有効な方法を提供する。
【００２０】
第一の側面では、本発明は、少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  好ましくは、該酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させることによって、該酵素を含有するタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にあるタンパク質調製物を、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  該酵素を溶出させ；そして、
ｄ）  溶出した酵素を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる前記方法を、提供する。
【００２１】
第二の側面では、本発明は、少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  該酵素を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含んでなる二つのアリコットを提供し；
ｂ）  一方のアリコットを所与の化合物とともにインキュベートし；
ｃ）  細胞を回収し；
ｄ）  細胞を溶解させ；
ｅ）  本質的に生理学的な条件下にあるタンパク質調製物を、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｆ）  該酵素（単数もしくは複数）を溶出させ；そして、
ｇ）  溶出した酵素（単数もしくは複数）を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる前記方法を、提供する。
【００２２】
本発明の第三の側面によると、本発明は、少なくとも一つの酵素を特徴付けるための方法であって、
ａ）  好ましくは、該酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させることによって、該酵素を含有する二つのアリコットのタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にある一方のアリコットを、酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  本質的に生理学的な条件下にあるもう一方のアリコットを、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと、ならびに所与の化合物と接触させ；
ｄ）  該酵素（単数もしくは複数）を溶出させ；そして、
ｅ）  溶出した酵素を質量分析によって特徴付ける；
工程を含んでなる前記方法を、提供する。
【００２３】
本発明の第四の側面によると、酵素−化合物複合体を特徴付けるための方法であって、
ａ）  好ましくは、該酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解させることによって、該酵素を含有するタンパク質調製物を提供し；
ｂ）  本質的に生理学的な条件下にあるタンパク質調製物を、該酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させ；
ｃ）  結合した該酵素を化合物と接触させて、少なくとも一つの結合した該酵素を遊離させ；そして、
ｄ）  遊離した該酵素（単数もしくは複数）を質量分析によって特徴付ける；かまたは、
ｅ）  該酵素（単数もしくは複数）をリガンドから溶出させ、そして該酵素（単数もしくは複数）を質量分析によって特徴付けることによって、該化合物の１またはそれより多くの結合パートナーを同定する；
工程を含んでなる前記方法が、提供される。
【００２４】
上記のアプローチ、特に第四の側面による発明の方法は、以下の利点を有する：
−  酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現を必要とせず、細胞溶解物由来の内因性酵素を用いる。
−  意外にも、広域特異性キナーゼリガンドは、非常に効率的にキナーゼを捕捉することが見いだされた。
−  試験化合物は、連結または固定化される必要がない（非標識アッセイ方法）。
【００２５】
競合的結合もしくは溶出は、目的とするいずれの化合物（非修飾、非固定化）を用いても可能である。
−  （生化学的酵素アッセイにように）酵素基質を必要としない。
−  シグナル伝達経路上での化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を特徴付けることが可能である（第二の側面を参照されたい）。
−  直接的および間接的な標的の同定が可能である。
【００２６】
発明全体にわたり、「酵素」の語には、トランスポーター、イオンチャネル、およびペプチド相互作用ドメイン（例えば、ＳＨ２、ＳＨ３およびＰＤＺドメイン）を含有するアダプタータンパク質などの酵素と相互作用するタンパク質などのリガンドと結合することが可能な、細胞内のすべてのタンパク質またはペプチドもまた含まれる。
【００２７】
しかしながら、好ましくは、「酵素」の語は、通常は、細胞内の生体触媒であると解釈される。
発明全体にわたり、「広範囲性酵素リガンド」の語は、タンパク質調製物中に存在する一部の、しかしすべてではない酵素と結合することが可能なリガンドを指す。
【００２８】
本発明は、好ましくは、酵素の特徴付け、または所与の化合物との結合パートナーの同定のための方法であって、酵素または結合パートナーが細胞溶解物内に含まれる該方法を、提供する。しかしながら、本発明の方法は、タンパク質（単数もしくは複数）が調製物中で可溶化されているならば、出発材料として任意のタンパク質調製物を用いて行うこともまた可能である。その例には、複数のタンパク質の液体混合物、元の細胞内に存在するすべてのタンパク質を含有するわけではない部分的な細胞溶解物、または複数の細胞溶解物の組み合わせが、含まれる。
【００２９】
部分的な細胞溶解物を、まず細胞小器官（例えば、核、ミトコンドリア、リボソーム、ゴルジ等）を単離することによって得て、そして次いで、これらの小器官由来のタンパク質調製物を調製することが可能である。細胞小器官を単離するための方法は、当該技術分野において公知である（第4.2章、Purification of Organelles from Mammalian Cells、”Current Protocols in Protein Science” 編者：John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8）。
【００３０】
加えて、タンパク質試料を、細胞抽出物の分画によって調製し、それにより、細胞質タンパク質または膜タンパク質などの特定の型のタンパク質を濃縮することが可能である（第4.3章、Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells、”Current Protocols in Protein Science” 編者：John.E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8）。
【００３１】
さらに、体液由来のタンパク質調製物を用いることが可能である（例えば、血液、脳脊髄液、腹腔液および尿）。
本発明全体にわたり、「固体担体」の語は、広範囲性酵素リガンドをその表面上に固定化することが可能な、すべての溶解されない担体に関する。
【００３２】
第二の側面による本発明の方法は、最初の工程として、酵素を含有する少なくとも一つの細胞をそれぞれ含んでなる二つのアリコットを提供し、そして一方のアリコットを所与の化合物とともにインキュベートすることを、包含する。好ましい実施態様において、少なくとも一つの細胞は、少なくとも二つのアリコットに分割される細胞培養系の一部である。次いで、細胞の一方のアリコットを、所与の化合物とともにインキュベートする。細胞培養系を化合物とともにインキュベートするための方法は、当該技術分野において公知である（Giuliano et al., 2004, “High-content screening with siRNA optimizes a cell biological approach to drug discovery: defining the role of p53 activation in the cellular response to anticancer drugs”. Journal of Biomolecular Screening 9(7), 557-568）。
【００３３】
しかしながら、各アリコットの少なくとも一つの細胞が、例えばマウス系または下等脊椎動物系などのｉｎ  ｖｉｖｏ系の一部であることもまた、本発明内に含まれる。
例えば、線虫（C. elegans）などのモデル生物体の規定の発達期または成虫期に由来する全胚溶解物を用いることが可能である。加えて、マウスから解剖された心臓などの全器官は、タンパク質調製物の源であることが可能である。これらの器官を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで灌流し、そして目的とする試験化合物または薬物で処理することもまた可能である。
【００３４】
少なくとも好ましい実施態様において、本発明のすべての方法には、酵素を含有する少なくとも一つの細胞を回収し、そして細胞を溶解する工程が、含まれる。
好ましい実施態様において、細胞は、細胞培養系の一部であり、そして、細胞培養系から細胞を回収するための方法は、当該技術分野において公知である（同上文献）。
【００３５】
細胞の選択は、主に、解析される酵素クラスによるであろうが、これは、その酵素クラスが選択された細胞内に主として存在することが保証されなければならないためである。所与の細胞が、本発明の方法に適した出発系であるかどうかを決定するために、ウエスタンブロット、ＰＣＲベースの核酸検出法、ノーザンブロットおよびＤＮＡマイクロアレイ法（「ＤＮＡチップ」）のような方法が、所与の酵素クラスが細胞内に存在するかどうかを決定するために適している可能性がある。
【００３６】
細胞の選択は、研究目的によっても影響を受けるであろう。所与の薬物に対するｉｎ  ｖｉｖｏ標的を同定する必要があるならば、所望の治療効果が生じる細胞または組織を選択することになる（例えば、抗癌剤に対しては乳癌組織）。対照的に、望ましくない副作用を媒介するタンパク質標的を解明するためには、副作用が認められる細胞または組織を解析することになる（例えば、ＣＮＳ副作用に対しては脳組織）。
【００３７】
さらに、酵素を含有する細胞を、例えば生検によって生物体から得てもよいことが、本発明内に想定される。対応する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、生検は、少量の組織を得るために用いられる診断手順であって、該組織は、次いで、顕微鏡または生化学的方法により検査可能である。生検は、疾患を診断、分類および病期分類するために重要であり、さらに、薬物治療を評価およびモニターするためにも重要である。乳癌生検は、以前は外科的手順として行われていたが、しかし今日では、針生検が好ましい（Oyama et al., 2004, Breast Cancer 11(4), 339-342）。
【００３８】
記載された本発明の方法により、酵素クラスの存在について組織試料をプロファイルすることが可能となる。例えば、疾患の原因となる変異酵素を同定することが可能である（例えば、発癌性キナーゼを活性化する点変異）。加えて、治療中に生じ、かつ治療耐性に関与する変異酵素を、明らかにするすることが可能である（例えば、抗癌剤に対する耐性を引き起こすＥＧＦ受容体変異）。
【００３９】
肝生検は、例えば、肝酵素活性の上昇に起因する肥大肝または異常肝との試験結果をもたらす慢性肝疾患の原因を診断するために、用いられる（Rocken et al., 2001, Liver 21(6), 391-396）。
【００４０】
少なくとも一つの細胞の回収と同時に溶解を行うことが、本発明内に包含される。しかしながら、細胞を、まず回収し、そして次いで別々に溶解することも、同様に好ましい。
細胞の溶解方法は、当該技術分野において公知である（Karwa and Mitra: Sample preparation for the extraction, isolation, and purification of Nuclei Acids；”Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry” 第8章、Wiley 2003、編者：Somenath Mitra、印刷物ISBN: 0471328456；オンラインISBN: 0471457817）。異なる細胞型および組織の溶解を、ホモジナイザー（例えば、ポッターホモジナイザー）、超音波ディスインテグレーター、酵素溶解、界面活性剤（例えば、NP-40、Triton X-100、CHAPS、SDS）、浸透圧ショック、冷解凍の繰り返し、またはこれらの方法の組み合わせによって成し遂げることが可能である。
【００４１】
さらに、本発明のすべての方法は、本質的に生理学的な条件下にある細胞調製物または細胞溶解物を、酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドと接触させる工程を、含有する。
【００４２】
本質的に生理学的な条件下での接触は、リガンド、細胞調製物（すなわち、特徴付ける酵素）、および所望により化合物の間の相互作用が可能な限り自然条件を反映するという利点を、有する。「本質的に生理学的な条件」は、とりわけ、元の未処理の試料材料において存在するそれらの条件である。それらには、生理学的タンパク質濃度、ｐＨ、塩濃度、バッファー容量および関与するタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。「本質的に生理学的な条件」の語は、試料が由来する元の生物体におけるものと同一の条件を必要としないが、しかし、基本的には細胞様条件または細胞条件に近い条件を必要とする。当業者は、特定の制限が、最終的にはより細胞様条件でなくなるであろう実験セットアップによって生じる可能性があることを、当然ながら認識するであろう。例えば、生物体から試料を採取し、そして処理するときの細胞壁もしくは細胞膜の最終的に必要な破壊には、生物体に見いだされる生理学的条件と同一でない条件が必要とされる可能性がある。本発明の方法を実行するための生理学的条件の適切なバリエーションは、当業者には明らかであろうし、かつ、本明細書では「本質的に生理学的な条件」の語により包含される。要約すれば、「本質的に生理学的な条件」の語は、例えば自然細胞に見いだされるような、生理学的条件に近い条件に関連するが、しかし、これらの条件が同一であることを必ずしも必要としないことが、理解されよう。
【００４３】
好ましくは、「本質的に生理学的な条件」は、５０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ  ６．５〜８．５、２０〜４５℃、および０．００１〜１０ｍＭ  二価陽イオン（たとえば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）；より好ましくは、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ、ｐＨ  ７．２〜７．６、５ｍＭ  二価陽イオンであり、かつ、０．０１〜１．０％非特異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含んでいてよい。非イオン性界面活性剤（Tween、NP-40、Triton-X100）は、多くの場合、通常は約０．００１〜２％、典型的には０．０５〜０．２％（容積／容積）にて存在することが可能である。一般的なガイダンスとして、以下の緩衝水性条件を適用してもよい：１０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ５〜８、所望により、二価陽イオンおよび／または金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤を添加。
【００４４】
好ましくは、「本質的に生理学的な条件」は、６．５〜７．５、好ましくは７．０〜７．５のｐＨ、および／または、１０〜５０ｍＭ、好ましくは２５〜５０ｍＭのバッファー濃度、および／または、１２０〜１７０ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭの一価塩（例えば、ＮａまたはＫ）を意味する。さらに、二価塩（例えば、ＭｇまたはＣａ）は、１〜５ｍＭ、好ましくは１〜２ｍＭの濃度にて存在してもよく、ここで、より好ましくは、バッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＨＥＰＥＳからなる群より選択される。
【００４５】
本発明の文脈において、「酵素と広範囲性酵素リガンドとの結合を可能にする条件下で」の語には、このような結合が可能であるすべての条件が含まれる。これには、固体担体を固定化された相上に有し、そして溶解物をその上に流し込む可能性が含まれる。別の好ましい実施態様では、固体担体が、粒子状であって、かつ細胞溶解物と混合されることもまた、含まれる。
【００４６】
好ましい実施態様において、リガンドと酵素との結合は、非共有性の可逆性結合であって、例えば、塩橋、水素結合、疎水性相互作用またはそれらの組み合わせである。
さらに、本発明の方法には、酵素（単数もしくは複数）を固体担体上に固定化したリガンドから溶出させる工程が、含まれる。
【００４７】
このような方法は、主として当該技術分野において公知であり、かつ、リガンド酵素相互作用の性質に依存する。主として、イオン強度、ｐＨ値、温度の変化または界面活性剤とのインキュベーションは、標的酵素を固定化したリガンドから解離させるのに適した方法である。溶出バッファーの適用により、ｐＨ値の極端化（高または低ｐＨ；例えば、０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２〜３を用いることにより、ｐＨを下げる）、イオン強度の変化（例えば、ＮａＩ、ＫＩ、ＭｇＣｌ２またはＫＣｌを用いた高塩濃度）、疎水性相互作用を壊す極性低下剤（例えば、ジオキサンまたはエチレングリコール）、あるいは変性剤（例えば、カオトロピック塩、または、硫酸ドデシルナトリウム、ＳＤＳなどの界面活性剤；総説：Subramanian A., 2002, Immunoaffinity chromatography. Mol. Biotechnol. 20(1), 41-47）によって、結合パートナーを解離することが可能である。
【００４８】
これらのやや非特異的な方法によって、ほとんどまたはすべての結合したタンパク質を遊離することとなり、そして次いで、質量分析によって（あるいは、抗体を用いた検出により、以下を参照されたい）分析される必要がある。
【００４９】
本発明の第四の側面による方法には、少なくとも一つの結合した酵素を遊離させるために、結合した酵素を化合物と接触させる工程が、さらに含まれる。この接触は、好ましくは、本質的に生理学的な条件下でも行われる。
【００５０】
溶出のために、上述の非特異的試薬ではなく目的とする化合物を用いることの一つの利点は、すべての結合したタンパク質が遊離するわけではなく、副画分、好ましくは目的とする酵素クラスのみが遊離することである。結論として、質量分析による同定に必要なタンパク質がより少なく、目的とする酵素クラスに対して、より迅速な分析およびより深い分析（感度）が得られる。
【００５１】
当業者は、本発明の方法の個々の工程間で、洗浄工程が必要である可能性があることを、理解するであろう。このような洗浄は、当業者の知識の一部である。洗浄は、細胞溶解物の結合していないコンポーネントを固体担体から除去する働きをする。非特異的（例えば、単純イオン）結合相互作用を、低レベルの界面活性剤を加えるか、または洗浄バッファー中の塩濃度を中程度に調整することによって、最小限にすることが可能である。
【００５２】
一部の場合においては、溶出または接触後に、固体担体を、好ましくは、遊離した材料から分離しなければならない。これに関する個々の方法は、固体担体の性質に依存し、かつ、当該技術分野において公知である。担体材料がカラム内に含有されるならば、遊離材料を、カラムのフロースルーとして収集することが可能である。担体材料が、溶解物コンポーネントと混合されている場合（いわゆる、バッチ手順）、穏やかな遠心分離などのさらなる分離工程が必要な可能性があり、そして、遊離した材料を上清として収集する。あるいは、磁気装置を用いることによってビーズを試料から除去できるよう、電磁ビーズを固体担体として用いることが可能である。
【００５３】
本発明によると、溶出した酵素（単数もしくは複数）、または共溶出した結合パートナー（以下を参照されたい）、ならびに、本発明の第四の側面の方法による遊離した酵素を、好ましくは、質量分析によって特徴付ける。あるいは、各々の酵素または共溶出した結合パートナーに対する特異抗体を用いてこの特徴付けを行うこともまた、本発明全体にわたり可能である。
【００５４】
質量分析解析（質量分析）は、当該技術分野において公知であり（Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858, Mann et al., 2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual Review of Biochemistry 70, 437-473）、そして、これを実施例の区分でさらに例示する。
【００５５】
質量分析解析に代わるものとして、溶出した酵素（単数もしくは複数）（例えば、酵素サブユニットまたは足場タンパク質などの、共溶出した結合パートナーを含む）を、目的とするタンパク質に対する特異抗体を用いることによって、検出することが可能である。
【００５６】
さらに、別の好ましい実施態様では、溶出した酵素（単数もしくは複数）の同定が質量分析解析によって確立されているならば、目的とするそれぞれの酵素を、その酵素に対する特異抗体を用いて検出することが可能である。
【００５７】
適切な抗体ベースのアッセイには、これに限定されないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイおよび抗体アレイ、またはそれらの組み合わせが含まれる。このようなアッセイの確立は、当該技術分野において公知である（Chapter 11, Immunology、"Short Protocols in Molecular Biology  第4版" 11-1〜11-30頁、F.M. Ausubel et al.による編集、Wiley、ニューヨーク州、1999）。
【００５８】
複数のアッセイを、例えば酵素ファミリーの多くのメンバーに対する、いくつかの抗体を並行して用いて行うことが可能である（Pelch et al., Kinetworks Protein Kinase Multiblot analysis. "Cancer Cell Signalling" 第8章、99〜112頁, Methods and Protocols. 編者：David M. Terrian. Humana Press, Totowa、米国、2002）。
【００５９】
これらのアッセイを、目的とする酵素を検出および定量するためのみならず、リン酸化などの翻訳後修飾のパターンを分析するための方法においても、設定することが可能である。例えば、キナーゼの活性化状態を、そのリン酸化状態を抗ホスホチロシン、抗ホスホセリンまたは抗ホスホスレオニン特異抗体でプローブすることによって決定することが可能である。このような抗ホスホ抗体をどのように選択し、そして用いるかは、当該技術分野において公知である（Zhang et al., 2002. Journal of Biological Chemistry 277, 43648-43658）。
【００６０】
第二の側面による本発明の方法の好ましい実施態様によると、酵素を特徴付けることによって、化合物の投与が酵素の差次的発現または活性化状態をもたらすかどうかが決定される。したがって、化合物の投与により、酵素の発現が変化する可能性があり、あるいは、酵素の活性化状態が変化する可能性がある。
【００６１】
この文脈において、酵素の発現の変化とは、好ましくは、より多いかまたはより少ない酵素が細胞内で産生されることを、意味してもよい。
活性化状態の変化とは、化合物の投与後に酵素がより活性となるか、または化合物の投与後により活性でなくなるかのいずれかを、好ましくは意味する。これはまた、固定化したリガンドに対する酵素の親和性が増加または減少することも、意味する（例えば、上流のキナーゼによるリン酸化を介したキナーゼの活性化状態の変化；または、酵素のアロステリック調節面に化合物が結合することによる、ＡＴＰ結合酵素のＡＴＰ結合ポケットのコンフォメーション変化）。
【００６２】
第一の側面による本発明の方法の好ましい実施態様によると、タンパク質調製物を、好ましくは本質的に生理学的な条件下で、以下に定義する化合物とともにインキュベートする。結論としては、化合物に結合していない酵素のみが、続いて、リガンドと結合し、溶出され、そして特徴付けられる。
【００６３】
本発明の第三の側面による方法の好ましい実施態様によると、工程ｃ）において、アリコットを、好ましくは本質的に生理学的な条件下で、リガンドとともにインキュベートする前に、化合物と接触させる。結論としては、化合物に結合していない酵素のみが、続いて、リガンドと結合し、溶出され、そして特徴付けられる。
【００６４】
第三の側面による本発明の方法の好ましい実施態様において、化合物とともにインキュベートされたアリコットにおける酵素の検出低下は、該酵素が化合物の直接的な標的であることを示唆する。このことは、本発明の本方法の工程ｃ）において、化合物が、酵素の結合に関してリガンドと競合することに起因する。化合物とともにインキュベートされたアリコットにおいて酵素がより少なく検出される可能性があるならば、このことは、該化合物が該酵素との相互作用に関して阻害剤と競合しており、そしてしたがって、該酵素の直接的な標的であり、かつ、逆の場合もまた同様であることを、好ましくは意味する。
【００６５】
第四の側面による本発明の方法の好ましい実施態様によると、本方法を、ミディアムもしくはハイスループットスクリーニングとして行う。このようなアッセイは、当業者に公知である（Mallari et al., 2003, A generic high-throughput screeing assay for kinases: protein kinase A as an example, Journal of Biomolecular Screeing 8, 198-204；Rodems et al., 2002, A FRET-based assay platform for ultra-high density screening of protein kinases and phosphatases, Assay and Drug Development Technologies 1 (1PT1), 9-19）。
【００６６】
本発明の第二、第三および第四の側面による方法に必要不可欠なのは、酵素と相互作用すると考えられる化合物の提供である。主として、本発明によると、このような化合物は、酵素と相互作用することが可能なすべての分子であることが可能である。好ましくは、化合物は、例えば刺激もしくは阻害効果などの、酵素に対する効果を有する。
【００６７】
好ましくは、前記化合物は、合成もしくは天然化合物または有機合成薬物、より好ましくは、小分子、有機薬物または天然小分子化合物からなる群より選択される。好ましくは、前記化合物を、このような化合物を含有するライブラリから出発して、同定する。次いで、本発明の過程において、このようなライブラリをスクリーニングする。
【００６８】
このような小分子は、好ましくは、タンパク質または核酸ではない。好ましくは、小分子は、分子量５０００Ｄａ未満、より好ましくは２０００Ｄａ未満、よりいっそう好ましくは１０００Ｄａ未満、そして最も好ましくは５００Ｄａ未満を示す。
【００６９】
本発明による「ライブラリ」は、異なる個々の物質の迅速な機能解析（スクリーニング）を可能し、そして同時に、ライブラリを形成する個々の物質の迅速な同定を提供する分類された様式にて提供される、（多数の）異なる化学物質の（たいていは大きな）コレクションに関する。その例としては、相互作用する可能性のある１またはそれより多くの定義されたパートナーとの反応にハイスループット様式にて加えることが可能な化合物を含有する、チューブもしくはウェルもしくは表面上のスポットのコレクションである。双方のパートナーの所望の「正の」相互作用の同定後に、各々の化合物を、ライブラリ構築によって迅速に同定することが可能である。合成および天然起源のライブラリを、当業者が購入あるいは設計することが可能である。
【００７０】
ライブラリ構築の例は、例えば、Breinbauer R, Manger M, Scheck M, Waldmann H. Natural product guided compound library development. Curr Med Chem. 2002 Dec;9(23):2129-45に提供され、該文献では、証明された生物学的関連性の記録を有することから、コンビナトリアルライブラリの設計に関して生物学的にバリデートされた出発点である、天然産物について、記載されている。医薬化学および生物化学における天然産物のこの特別な役割を、構造生物学およびバイオインフォマティクスによって得られるタンパク質のドメイン構造についての新たな洞察の観点から解釈することが可能である。ドメインファミリー内の個々の結合ポケットの特定要件を満たすためには、化学的バリエーションによって、天然産物の構造を最適化することが必要な可能性がある。固相化学は、この最適化の方法に効率的なツールとなると言われており、そして、この分野における最近の進歩は、この総説論文において強調されている。他の関連参考文献には、Edwards PJ, Morrell AI. Solid-phase compound library synthesis in drug design and development. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Jul;5(4):594-605.; Merlot C, Domine D, Church DJ. Fragment analysis in small molecule discovery. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 May;5(3):391-9. 総説：Goodnow RA Jr. Current practices in generation of small molecule new leads. J Cell Biochem Suppl. 2001;Suppl 37:13-21が含まれ；後者文献は、多くの製薬会社における現在のドラッグディスカバリーの方法が、ハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用のための高品質のリード構造の大きく、かつ増え続けるコレクションを必要とすることを、記載している。多様な構造および「薬物様」特性を伴う小分子のコレクションは、過去においては、いくつかの手段：以前の内部でのリード最適化への努力の達成、化合物供給元からの購入、および会社合併に続く別々のコレクションの統合によって、獲得されてきた。ハイスループット／コンビナトリアル化学が、新たなリード創出の方法において重要なコンポーネントであると記載されるにもかかわらず、合成のためのライブラリ設計の選択およびそれに続くライブラリメンバーの設計は、新たなレベルの課題および重要性へと発展している。複数の生物学的標的に対する複数の小分子化合物ライブラリ設計をスクリーニングすることの潜在的な利点は、新たなリード構造を発見する実質的な機会を提供する。
【００７１】
固定化したリガンドから標的酵素を溶出させることが可能な試験化合物（本発明の第四の側面）を、慣用の酵素アッセイにて試験してもよい。以下に、これらの化合物をさらに特徴付けるために用いることが可能な典型的なアッセイを、記載することとする。これらのアッセイについての記載が本発明の範囲を限定することは、意図されない。
【００７２】
プロテアーゼアッセイ
典型的なプロテアーゼアッセイは、プロテアーゼを、fluor（例えば、ＥＤＡＮＳ）と消光剤発色団（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）とで二重標識したペプチド基質と適切な条件下で接触させ、そして、開裂後の蛍光の増加を検出することによって、行うことが可能である。
【００７３】
該基質は、ペプチドの一方の端近くに蛍光ドナー、そして、もう一方の端近くにアクセプター基を含有する。この型の基質の蛍光は、最初は、ドナーとアクセプターの間の分子内蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を介して消光される。プロテアーゼが基質を開裂するとき、該産物は、消光を解除され、そして、ドナーの蛍光が明瞭になる。蛍光シグナルの増加は、加水分解される基質の量に正比例する（Taliani, M. et al, 1996, Methods 240: 60-7）。
【００７４】
ホスホジエステラーゼアッセイ
ヒト白血球（Ｕ９３７）細胞の細胞溶解物を、適切なバッファー中に調製し、ＰＤＥ酵素の源としてもよい。２５℃にてインキュベーションバッファー（50 mM Tris-HCl、ph 7.5、5 mM MgCl2）中で、基質としての[3H]cAMPとともに２０分間インキュベートした後、[3H]アデノシンを定量する（Cortijo et al., 1993, British Journal of Pharmacology 108, 562-568）。
【００７５】
プロテインキナーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性アッセイ
簡潔に言えば、蛍光標識したペプチド基質を、チロシンキナーゼ（例えば、Lck）、ＡＴＰおよび抗ホスホチロシン抗体とともにインキュベートしてもよい。反応が進行するにつれて、リン酸化されたペプチドは抗ホスホチロシン抗体に結合して、極性化シグナルの増加を生じる。キナーゼを阻害する化合物は、低い極性化シグナルを生じる。
【００７６】
あるいは、該アッセイを、修飾された間接的な形式にて設定することが可能である。蛍光ホスホペプチドを、高い極性化シグナルをもたらす抗ホスホチロシン抗体との複合体形成に対するトレーサーとして用いる。非標識の基質がキナーゼによってリン酸化されると、該産物は、該抗体について蛍光リン酸化ペプチドと競合する。次いで、蛍光ペプチドは、抗体から溶液へと遊離して、極性化シグナルの消失を生じる。直接的アッセイと間接的アッセイの双方とも、プロテインチロシンキナーゼ活性の阻害剤を同定するために用いることが可能である（Seethala, 2000, Methods 22, 61-70；Seethala and Menzel, 1997, Anal. Biochem. 253, 210-218；Seethala and Menzel, 1998, Anal. Biochem. 255, 257-262）。
【００７７】
この蛍光極性化アッセイを、抗ホスホチロシン抗体を抗ホスホセリンもしくは抗ホスホスレオニン抗体に置き換えることによって、プロテインセリン／スレオニンキナーゼを用いた使用に適用することが可能である（Turek et al., 2001, Anal. Biochem. 299, 45-53, PMID 11726183；Wu et al., 2000, J. Biomol. Screen. 5, 23-30, PMID 10841597）。
【００７８】
本発明の第四の側面による方法にて同定された化合物を、さらに最適化してもよい（リード最適化）。このような化合物の、この続いての最適化は、これらのリード創出ライブラリにコードされる構造−活性相関（ＳＡＲ）情報のために拍車がかかる場合が多い。リード最適化は、フォローアップ合成に対するハイスループット化学（ＨＴＣ）法の即時の適用性によって容易となる場合が多い。
【００７９】
好ましくは、リード最適化は、本発明の第二、第三および第四の側面による方法によって、より好ましくは第四の側面による方法によって、支持される。これらの方法の結果は、医薬化学者または別の当業者に対して、例えば選択性に関して、どのように化合物をさらに最適化するのか、ガイダンスを提供してもよい。
【００８０】
このようなライブラリのある使用については、例えば、Wakeling AE, Barker AJ, Davies DH, Brown DS, Green LR, Cartlidge SA, Woodburn JR. Specific inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by 4-anilinoquinazolines. Breast Cancer Res Treat. 1996;38(1):67-73に、最終的に記載されている。
【００８１】
本発明にしたがって特徴付けられてもよい酵素は、好ましくは、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、ＧＴＰアーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼおよびヘリカーゼからなる群より選択される。
【００８２】
好ましくは、タンパク質は、キナーゼであり、そしてより好ましくは、プロテインキナーゼである。同様に好ましくは、タンパク質は、脂質キナーゼである。
すでに上記に示したように、リガンドが、所与の酵素クラスの種々の、しかしすべてではない酵素と結合することが可能な、広範囲性リガンドであることが、本発明に必要不可欠である。好ましくは、リガンドは、所与の酵素クラスの酵素の１０〜５０％、より好ましくは３０〜５０％と結合する。
【００８３】
好ましくは、リガンドは、酵素の阻害剤である。
より好ましい実施態様において、酵素はキナーゼであり、かつ、リガンドはキナーゼ阻害剤である。
好ましくは、このキナーゼ阻害剤は、ビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ、プルバラノールＢ、CZC00007324（連結可能なPD173955）、CZC00008004からなる群より選択される。
【００８４】
さらなるリガンドには、インドールリガンド９１、キナゾリンリガンド32および修飾スタウロスポリンが含まれる（実施例５〜７を参照されたい）。
インドールリガンド９１（５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸  （３−アミノ−プロピル）−アミド）の構造を、図３に供する。この化合物は、キナーゼ阻害剤スーテント（SU11248; Sun et al., 2003. J. Med. Chem. 46, 1116-1119）と構造的に類似する分子である。インドールリガンド９１は、第１級アミノ基を介して適切な固体担体材料と共有的連結することが可能であり、そして、結合しているタンパク質を単離するために用いられることが可能である。インドールリガンド９１の合成については、実施例１に記載する。本発明によると、「インドールリガンド９１」との表現には、同一の中心を含んでなるが、しかし、環状構造の一部ではないＮＨ基に好ましくは連結した別のリンカーを、固体担体に連結させるために有する化合物も、含まれる。典型的には、リンカーは、８、９または１０原子の骨格を有する。該リンカーは、カルボキシもしくはアミノ活性基を含有する。
【００８５】
さらなる好ましい実施態様によると、酵素の特徴付けを、共溶出した酵素の結合パートナー、酵素サブユニット、または酵素の翻訳後修飾を特徴付けることによって行う。
この好ましい実施態様の基本は、リガンドと酵素の結合中における本質的に生理学的な条件の使用によって、結合パートナー、酵素サブユニットまたは翻訳後修飾の存在を含む、酵素の自然条件を保つことが、好ましくは可能であるということである。質量分析（ＭＳ）を活用して、酵素のみならず、共溶出した結合パートナー、酵素サブユニットまたは前記翻訳後修飾も同定することが可能である。
【００８６】
本発明のさらなる好ましい実施態様によると、質量分析（ＭＳ）による特徴付けを、酵素または酵素の結合パートナーのプロテオタイピックペプチドの同定によって行う。プロテオタイピックペプチドの概念を、実施例の区分において詳細に記載する。この概念は、溶出した酵素または結合パートナーをプロテアーゼで消化し、そして生じたペプチドを、ＭＳによって測定することである。結果として、同じ源のタンパク質から得たペプチドに対するペプチド頻度が、非常に異なるが、ここで、このタンパク質の同定に「典型的に」貢献する、最も頻度が高く認められるペプチドは、「プロテオタイピックペプチド」と称される。したがって、本発明において用いられるプロテオタイピックペプチドは、特定のタンパク質またはタンパク質アイソフォームを一意的に同定する、実験により多く認められるペプチドである。
【００８７】
好ましい実施態様によると、特徴付けを、酵素または結合パートナーに対して得られるプロテオタイピックペプチドを、公知のプロテオタイピックペプチドと比較することによって行う。ＭＳにてタンパク質を同定するためにプロテアーゼ消化によって調製されたフラグメントを用いる場合、通常は、同じプロテオタイピックペプチドが、所与の酵素に対して認められることから、所与の試料に対して得られたプロテオタイピックペプチドを、所与の酵素クラスの酵素に対してすでに公知のプロテオタイピックペプチドと比較することによって、試料中に存在している酵素を同定することが可能である。
【００８８】
好ましくは、質量分析解析を、例えばiTRAQテクノロジー（相対的および絶対的定量のための同重体タグ）またはcICAT（開裂可能な同位体でコードされたアフィニティタグ）を用いることによって、定量的に行う（Wu et al., 2006. J. Proteome Res. 5, 651-658）。
【００８９】
さらなる好ましい実施態様によると、固体担体は、アガロース、修飾アガロース、セファロースビーズ（例えば、ＮＨＳ活性化セファロース）、ラテックス、セルロース、およびフェリ磁性もしくは強磁性粒子からなる群より選択される。
【００９０】
広範囲性酵素リガンドを、固体担体に共有的または非共有的に連結させてもよい。非共有結合には、ストレプトアビジンマトリクスと結合するビオチンアフィニティリガンドを介した結合が、含まれる。
【００９１】
好ましくは、広範囲性リガンドを、固体担体に共有的連結させる。
連結前に、マトリックスは、化合物との連結反応を可能にするため、ＮＨＳ、カルボジイミド等などの活性基を含有することが可能である。該化合物は、（例えば、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基およびケトン基などの官能基を用いた）直接的連結および（例えば、ビオチン、化合物と共有的連結しているビオチン、および、固体担体に直接結合しているストレプトアビジンへのビオチンの非共有結合を介した）間接的連結によって、固体担体に連結可能である。
【００９２】
固体担体材料との連関は、開裂可能なリンカーおよび開裂可能でないリンカーを伴ってもよい。開裂は、酵素的開裂または適切な化学的方法を用いた処理によって成し遂げてもよい。
【００９３】
目的とする化合物と固体担体材料との結合に対する好ましい結合界面は、Ｃ原子骨格を伴うリンカーである。典型的には、リンカーは、８、９または１０原子の骨格を有する。リンカーは、連結する化合物に応じて、カルボキシまたはアミノ活性基のいずれかを含有する。
【００９４】
酵素クラスのより完全な網羅を、広範囲性リガンドの組み合わせを用いて達成することが可能である。
好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、よりいっそう好ましくは１〜４の異なるリガンドを、用いる。最も好ましくは、３または４の異なるリガンドを用いる。
１より多くのリガンドを用いる場合、各リガンドは、好ましくは、異なる担体上にある。
【００９５】
しかしながら、１より多くのリガンドを用いる場合、少なくとも２またはすべての異なるリガンドが一つの固体担体上に存在することも、同様に好ましい。
１より多くのリガンドを用いる場合、各個々のリガンドが結合可能である範囲（spectrum）スペクトルは、酵素クラスの最大限の網羅を達成することが可能なよう、異なることが好ましい。
【００９６】
好ましくは、各リガンドは、所与の酵素クラスの酵素の１０〜５０％、より好ましくは３０〜５０％と結合する。
さらなる好ましい実施態様によると、酵素または化合物酵素複合体を特徴付けることにより、細胞内の酵素クラスのすべてまたは複数のメンバーの同一性を決定する。これは、リガンドを細胞溶解物とともにインキュベートすることによって、リガンドと結合可能である潜在的にすべての酵素を単離し、そして後に特徴付けるという事実による。酵素の発現プロファイルに応じて、リガンドは、酵素クラスのメンバーのすべてまたは一部に結合可能であり、したがって、同定されることが可能である。キナーゼの場合、本発明の方法は、当業者が、所与の細胞内に発現したキノームを同定し、そして特徴付けることを可能にする。
【００９７】
本発明全体にわたり、化合物はリガンドと異なることが好ましいが、同一であることは除外されない。
さらに、本発明は、医薬組成物を作出するための方法であって、
ａ）  本発明の第四の側面の方法にしたがって、酵素化合物複合体を同定し；そして、
ｂ）  該化合物を、医薬組成物へと処方物化する；
工程を含んでなる前記方法に関する。
【００９８】
したがって、本発明は、対象に有効量を投与されてもよい医薬組成物を調製するための方法を、提供する。好ましい側面において、治療剤は、実質的に精製される。治療される対象は、好ましくは、これに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等などの動物を含む動物であり、より好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。特定の実施態様では、非ヒト哺乳動物が対象である。
【００９９】
一般に、本発明の医薬組成物は、治療有効量の治療剤、および医薬的に許容可能なキャリアーを含んでなる。特定の実施態様において、「医薬的に許容可能な」の語は、連邦もしくは州政府の規制当局に認可されているか、あるいは、米国薬局方、または、動物および、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般に認められた薬局方に掲載されていることを、意味する。「キャリアー」の語は、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような医薬キャリアーは、水、および、石油、動物、植物または合成が源のものを含む油、などの無菌の液体であることが可能であり、これに限定されないが、ピーナツ油、大豆油、鉱油、胡麻油等が含まれる。水は、医薬組成物を経口投与する場合の、好ましいキャリアーである。生理食塩液およびデキストロース水溶液は、該医薬組成物が静脈内投与される場合の、好ましいキャリアーである。生理食塩溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール溶液は、好ましくは、注射溶液用の液体キャリアーとして使用される。適切な医薬賦形剤には、スターチ、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽（malt）、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤も含有することが可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性処方物等の形態を取ることが可能である。該組成物は、慣用の結合剤、およびトリグリセリドなどのキャリアーとともに、坐剤として処方物化されることが可能である。経口処方物は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等などの標準的なキャリアーを含むことが可能である。適切な医薬キャリアーの例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物は、好ましくは精製された形状の、治療有効量の治療剤を、患者への適切な投与のための形状を提供するような適切な量のキャリアーとともに、含有するであろう。処方物は、投与方法に適合すべきである。
【０１００】
好ましい実施態様において、組成物は、所定の手順にしたがって、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として処方物化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水溶性バッファーに溶解した溶液である。必要な場合に、組成物は、可溶化剤、および、注射部位における疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤もまた含んでよい。一般には、成分は、別々に、あるいは単位剤形中に併せて混合されて、例えば、活性剤の量が表示されるアンプルまたはサシェなどの密封された容器内に乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、供給される。組成物を点滴により投与する場合、無菌の医薬グレードの水または生理食塩液を含有する点滴ボトルを用いて投薬することが可能である。組成物を注射により投与する場合、注射用の無菌の水または生理食塩液のアンプルを、成分が投与前に混合されてもよいように提供することが可能である。
【０１０１】
本発明の治療剤を、中性もしくは塩の形態にて処方物化することが可能である。医薬的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来のものなどの遊離カルボキシル基と形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来のものなどの遊離アミン基と形成されるもの、ならびに、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムおよび第二鉄の水酸化物等由来のものなどが、含まれる。
【０１０２】
特定の障害または状態の治療において有効であろう本発明の治療剤の量は、該障害または状態の性質によって決まるであろうし、かつ、標準的な臨床技術により決定されることが可能である。加えて、所望により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、最適な投与量範囲の同定を助けるために用いてもよい。処方物において用いられる正確な用量は、投与経路、および疾患もしくは障害の重症度によっても決まるであろうし、かつ、専門家の判断および各患者の環境にしたがって決定されるべきである。しかしながら、静脈内投与に対する適切な投与量範囲は、一般には、活性化合物約２０〜５００μg／ｋｇ体重である。経鼻投与に対する適切な投与量範囲は、一般には、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系に由来する用量−反応曲線から外挿してもよい。一般には、坐剤は、０．５重量％〜１０重量％の範囲で活性成分を含有してもよく；経口処方物は、好ましくは、活性成分を１０％〜９５％含有する。
【０１０３】
種々の送達システムが、公知であり、かつ、本発明の治療剤を投与するために用いられることが可能であって、これらは、例えば、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセルへの封入；治療剤を発現可能な組換え細胞の使用、受容体を介したエンドサイトーシスの使用（例えば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432）；レトロウイルスもしくはその他のベクターの一部としての治療用核酸の構築等である。導入方法には、これに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれる。化合物を、例えば、点滴、ボーラス注射、表皮もしくは粘膜層（例えば、口腔、直腸、小腸粘膜等）を介した吸収によるなどの任意の好都合な経路によって投与してもよく、そして、他の生物学的活性剤と併せて投与してもよい。投与は、全身性または局所性であることが可能である。加えて、本発明の医薬組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって、中枢神経系に導入することが望ましい場合もあり；脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバーなどのリザーバーを取り付けた、脳室内カテーテルによって、容易となってもよい。肺内投与を、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を用いた処方物の使用によっても、用いることが可能である。
【０１０４】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物を、治療の必要な部分に局所的に投与することが望ましい場合もある。これは、例えば、そしてこれに限定されないが、外科手術中の局所点滴によって、例えば外科手術後の創傷包帯と併せた、局所適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または移植物を用いて達成されてもよく、ここで、前記移植物は、サイラスティック膜などの膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン質の材料からなる。一実施態様において、投与を、悪性腫瘍または新生物もしくは前新生物組織の部位（または元の部位）に、直接注射により行うことが可能である。
【０１０５】
別の実施態様において、治療剤を、ベジクル、具体的にはリポソーム内に入れて送達することが可能である（Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989, "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer"、Lopez-Berestein and Fidler編集、Liss、ニューヨーク州、353〜365頁；Lopez-Berestein、同書、317〜327頁；概して同書を参照されたい）。
【０１０６】
さらに別の実施態様において、治療剤を、放出制御システムを介して送達することが可能である。一実施態様においては、ポンプを用いてもよい（Langer、同上；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507-516；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574-579）。別の実施態様においては、ポリマー材料を用いることが可能である（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise編集、CRC Press, Boca Raton、フロリダ州、1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball編集、Wiley、ニューヨーク州、1984；Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61；Levy et al., 1985, Science 228:190-192；During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-356；Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:858-863）。さらに別の実施態様においては、放出制御システムを、治療標的、すなわち脳の近位に設置することが可能であり、したがって、ごく少量の全身用量のみが必要とされる（例えば、Goodson, 1984, "Medical Applications of Controlled Release"、同上、第2巻、115〜138頁）。他の放出制御システムについては、Langerによる総説（1990, Science 249:1527-1533）において論じられている。
【０１０７】
好ましい実施態様において、方法は、酵素に対する化合物の結合親和性を調節する工程を、さらに含んでなる。これは、例えば、化合物の種々の残基の化学的修飾、およびそれに続く化合物と酵素との結合親和性の解析によるなどの、当業者に公知の方法によって、遂行可能である。
【０１０８】
本発明は、固体担体上に固定化した少なくとも一つの広範囲性酵素リガンドの使用であって、少なくとも一つの酵素または酵素−化合物複合体を特徴付けるための前記使用に関する。本発明のこの使用に関して、本発明の方法について上述のすべての実施態様もまた、適用される。
【０１０９】
本発明を、以下の図および実施例によりさらに例示するが、これは、本出願の特許請求の範囲によって授与される保護の範囲を限定するものとみなされない。
【実施例】
【０１１０】
実施例
実施例１：キノビーズの調製
本実施例は、４つの異なるリガンドを伴うキノビーズの調製を示す。これらのキノビーズは、後に実施例２および実施例３で用いた。
広範囲性捕捉リガンド（Broad spectrum capturing ligands）を、適切な官能基（例えばアミノまたはカルボキシルまたは官能基）を用いて共有結合を介して、固体支持体上に共有結合的に固定した。適切な官能基を含有しない化合物は、そのような基を導入するために修飾した。必要な化学的方法は、製薬化学の文献において公知であり、そして下記に示される。
【０１１１】
１．リガンドの選択および合成
以下の４つの広い特異性のリガンド（キノビーズリガンド１ないし４；図１）を、以下に記載するように別個の反応でビーズに共有結合的にカップリングし、そして次いで、４つのタイプのビーズを混合して薬剤選抜実験（drug pulldown experiments）に用いた。
【０１１２】
キノビーズリガンド１：ビスインドリルマレイミド  ＶＩＩＩ−アセテート（化学式Ｃ２４Ｈ２２Ｎ４Ｏ２・ＣＨ３ＣＯＯＨ；ＭＷ  ３９８．５；ＣＡＳ番号138516-31-1; Alexis Biochemicals, AXXORA Deutschland GmbH, グリュンベルク; Cat- ALX-270-056）。
【０１１３】
キノビーズリガンド２：プルバラノールＢ（化学組成：Ｃ２０Ｈ２５ＣｌＮ６Ｏ３；ＭＷ  ４４１．９２；ＣＡＳ番号212844-54-7; Tocris Biochemicals Cat- 1581, BIOTREND Chemikalien GmbH ケルン、ドイツ）。 
【０１１４】
キノビーズリガンド３：CZC00007324；（７−（４−アミノメチル−フェニルアミノ）−３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−１Ｈ−［１，６］ナフチリジン−２−オン）。  
【０１１５】
キノビーズリガンド１の合成：  ７−（４−アミノメチル−フェニルアミノ）−３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−１Ｈ−［１，６］ナフチリジン−２−オン
CZC00007324の合成の最初の７工程は、Klutchko, S. R.ら、1998, Journal of Medicinal Chemistry 41, 3276-3292に記載されているように行った。残りの工程は以下に記載するように行った。
【０１１６】
工程１−７：  ６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−メタンスルホニル−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オンを、４−クロロ−２−メチルスルファニル−５−ピリミジンカルボキシレートエチルエステルから、J. Med. Chem. 1998, 41, 3276-3292の方法に従って合成した。
【０１１７】
工程８：  ｛４−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−［１，６］ナフチリジン−７イルアミノ］ベンジル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル
６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−メタンスルホニル−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン（０．１００ｇ，０．２ｍｍｏｌ）および３−（Ｎ−Ｂｏｃ−メチルアミノ）アニリン（０．４２１ｇ，２．０ｍｍｏｌ）を固体として混合し、そして１４０℃に３０分間加熱した。当該粗反応混合物をジクロロメタンに溶解し、そして２Ｎ  ＨＣｌ（水溶液）で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。当該粗生成物を熱酢酸エチルから再結晶して｛４−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−［１，６］ナフチリジン−７−イルアミノ］ベンジル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステルを黄色固体として得た（０．０３１ｇ−２５％）。
【０１１８】
【化１】
2008543296.tif 000002
【０１１９】
工程９：  ７−（４−アミノメチル−フェニルアミノ）−３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−１Ｈ−［１，６］ナフチリジン−２−オン
｛４−［３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−［１，６］ナフチリジン−７−イルアミノ］ベンジル｝−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０２６ｇ，０．０５ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍｌ）に溶解し、そして塩酸（ジオキサン中４Ｎ、１．２ｍｌ）を加えた。反応物を室温で１．５時間撹拌し、そのときＨＰＬＣは出発物質が残っていないことを示した。溶媒を真空で除いた。残渣を水に溶解し、そして溶液を炭酸ナトリウム（飽和、水溶液）で塩基性化した。得られた沈殿を集めて乾燥し、７−（４−アミノメチル−フェニルアミノ）−３−（２，６−ジクロロ−フェニル）−１−メチル−１Ｈ−［１，６］ナフチリジン−２−オン（０．０２１ｇ−１００％）を黄色固体として得た。
【０１２０】
【化２】
2008543296.tif 000003
【０１２１】
キノビーズリガンド４：  CZC00008004. ２−（４’−アミノメチルフェニルアミン）−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−フェニル−アミン。化学式Ｃ１７Ｈ１６Ｎ５Ｆ。ＭＷ  ３０９．３４。これはCZC00004919の類似体である。
【０１２２】
CZC00008004の合成 −  （２−（４’−アミノメチル  フェニルアミン）−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−フェニル−アミン
工程１：  ２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン
オキシ塩化リン（２ｍｌ）を５−フルオロウラシル（１ｇ，７．６８８ｍｍｏｌ）に加え、次いで、五塩化リン（３．２８ｇ，１５．７６ｍｍｏｌ）に加え、当該混合物を１１０℃で５時間加熱撹拌し、そして冷ました。過剰のオキシ塩化リンを、氷／水混合物（１０ｍｌ）の浴中でゆっくりと加水分解した。水性混合物をジエチルエーテルで抽出した（３×１０ｍｌ）。有機層を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム（１０ｍｌ）で洗浄し、次いで飽和塩化ナトリウム（１０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そしてろ過した。溶媒を３５０ｍｍＨｇでの蒸発により除去して、粘性のある油状物を残し、これをゆっくりと結晶化して表題化合物を得た（１．２２ｇ−９５％）。当該化合物は更なる解析をせずに次の工程に用いた。
【０１２３】
工程２：  （２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−フェニルアミン
ジメチルホルムアミド（１３ｍｌ）中の２，４−ジクロロ−５−フルオロ−ピリミジン（０．５５０ｇ，３．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、アニリン（０．３０１ｍｌ，３．３０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチルジイソプロピルアミン（０．６０２ｍｌ，３．６３ｍｍｏｌ）を加え、そして当該混合物を室温で１８時間撹拌した。当該混合物を酢酸エチル（２０ｍｌ）でクエンチし、そして飽和塩化アンモニウム（２０ｍｌ）で洗浄し、そして有機層を除去した。水層を酢酸エチル（２０ｍｌ）で洗浄し、そして合わせた有機層を水（２０ｍｌ）、飽和塩化ナトリウム  （１０ｍｌ）で洗浄し、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発により溶媒を除去し、そして結果として生じた固体をカラムクロマトグラフィーにかけて（シリカ、酢酸エチル（０から２０％）／石油エーテル）、表題化合物を得た（０．５３２ｇ−７２％）。ＬＣＭＳ：方法Ａ、ＲＴ＝４．６７分、［ＭＨ＋＝２２４］。
【０１２４】
工程３：  ［４−（５−フルオロ−４−フェニルアミノ−ピリミジン−２−イルアミノ）−ベンジル］−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル
（２−クロロ−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−フェニルアミン  （０．０８７ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）および４［Ｎ−Ｂｏｃアミノメチル］アニリン（０．０８７ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）を一緒に混合した。スターラーバーを加え、そしてフラスコを湯浴中に１１０℃で２０分間おいた。混合物を冷まし、残渣を３ｍｌのジクロロメタン／メタノール（９９：５）中に溶解し、そしてフラッシュクロマトグラフィーカートリッジにロードし、そして石油エーテル中の酢酸エチル（２０から６０％）を用いて精製し、目的の化合物を黄色固体として与えた（０．０５１ｇ−３２％）。
【０１２５】
【化３】
2008543296.tif 000004
【０１２６】
工程４：  （２−（４’−アミノメチル  フェニルアミン）−５−フルオロ−ピリミジン−４−イル）−フェニル−アミン
メタノール（５ｍｌ）中の［４−（５−フルオロ−４−フェニルアミノ−ピリミジン−２−イルアミノ）−ベンジル］−カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．０５５ｇ，０．１３４ｍｍｏｌ）の溶液にＨＣｌ（ジオキサン中４Ｎ）（２ｍｌ）、そして当該反応物を室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発により除去した。水（５ｍｌ）を加え、重炭酸ナトリウムの添加により溶液のｐＨを８に上げた。結果として生じた沈殿物をろ過し、そして乾燥させて表題化合物を得た（０．０３５ｇ−８４％）。
【０１２７】
【化４】
2008543296.tif 000005
【０１２８】
すべての反応は不活性な雰囲気下で行った。ＮＭＲスペクトルはBruker dpx400で得られた。ＬＣＭＳはアジレント１１００上でゾルバックスＳＢＣ−１８，４．６ｍｍ×１５０ｍｍ−５μカラムを用いて行った。カラム流量は１ｍｌ／分で、用いた溶媒は水およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で、インジェクション体積は１０μｌであった。波長は２５４および２１０ｎｍであった。方法は以下に示す。
【０１２９】
表１：分析方法
【０１３０】
【表１】
2008543296.tif 000006
【０１３１】
表２：化学プロトコルにおいて用いた略語
【０１３２】
【表２】
2008543296.tif 000007
【０１３３】
２．アミン基を含有するリガンドの固定
ＮＨＳ活性化セファロース４ファストフロー（Amersham Biosciences, 17-0906-01）を無水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド, Fluka, 41648, H20 <= 0.005%）で平衡化した。１ｍｌの確立したビーズ（settled beads）を１５ｍｌファルコンチューブ中におき、化合物ストック溶液 （通常、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中に１００ｍＭ）を加え（最終濃度０．２−２μｍｏｌ／ｍｌビーズ)、ならびに１５μｌのトリエチルアミン（SIGMA, T−0886, 純度９９％）を加えた。ビーズをエンド−オーバー−エンドシェーカー （Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.）上で室温、暗所で１６−２０時間インキュベートした。 カップリング効率はＨＰＬＣで決定した。反応していないＮＨＳ基は、アミノエタノールとの室温でのエンド−オーバー−エンドシェーカー上での一晩のインキュベーションによりブロッキングした。洗浄したビーズは、イソプロパノール中で保存するか、または結合反応にすぐに使用した。
【０１３４】
３．カルボキシル基を含有するリガンドの固定
化合物は、以下に概略を示すように、塩基性条件下で反転（reversed）ＮＨＳ−セファロースビーズへとカップリングした（ＰｙＢｒｏＰ化学）。
【０１３５】
ビーズの洗浄
工程１：標準的なカップリング反応のために１ｍｌ（確立した容積（settled volume））のＮＨＳ−セファロース／ビーズを用いる（イソプロパノール中で提供されるＮＨＳ活性化セファロース４ファストフロー、Amersham Biosciences, 17-0906-01）。
工程２：ビーズを１０ｍｌ  ＤＭＳＯで３回、無水ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド, Fluka, 41648, H20 <<= 0.005%）で１回洗浄する；遠心分離工程：１分、１２００ｒｐｍ、室温；上清を非ハロゲン性溶媒廃棄物へと捨てる。
工程３：最後の洗浄工程の後、一体積の無水ＤＭＳＯ中にビーズを再懸濁する。
【０１３６】
ＮＨＳビーズの反転
この工程は１ｍＬビーズについてデザインされており、他のいずれのビーズ体積については適宜調整する。ＮＨＳビーズは２０μｍｏｌ／ｍＬの容量（capacity）がある。したがって、２０％逆転ビーズは４μｍｏｌ／ｍＬの容量を有するべきである。
アミノエタノールとエチレンジアミンの４：１の比率の混合物を作成し、次いで当該混合物へトリエチルアミンを加える。
（全体で２００μｍｏｌ）（１ｍＬのＮＨＳビーズの１０倍の容量）
１：   ９．６６μＬの１６．５６Ｍ  アミノエタノール（２−アミノエタノール、Aldrich, 11.016-7）（全体で１６０μｍｏｌ）
２：  ２．６８μＬの１４．９２Ｍ   エチレンジアミン（Fluka, 03350）（全体で４０μｍｏｌ）．  
３：  １５μＬの７．２Ｍ  トリエチルアミン （TEA）（SIGMA, T−0886, 純度９９％）混合物は２つの相に分かれるが、それでよい。
混合物を洗浄／再懸濁ＮＨＳビーズへと加え、そして室温で１６時間（一晩）、エンド−オーバー−エンドシェーカー上でインキュベートする。
【０１３７】
ＰｙＰｒｏＢカップリング．  この方法は活性化前工程を必要とせず、活性化およびカップリングがｉｎ−ｓｉｔｕでおこる。
１．  ＰｙＢｒｏＰ（ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム  ヘキサフルオロフォスフェート；供給元：NOVABIOCHEM）を水不含ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に最終濃度１００ｍＭ（４６．６２ｍｇ／ｍＬ） に溶解する。当該溶液は１日まで使用することができる。
２．  １ｍＬの水不含ＤＭＦ中に３５μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を溶解する、最終濃度２００ｍＭ。
３．  １ｍＬの反転ビーズを１５ｍＬのＤＭＳＯで３回洗浄する。遠心分離工程：１２００ｒｐｍで1分間、室温。上清を捨てる。
４．  反転ビーズを１５ｍＬの水不含ＤＭＦで３回洗浄する。遠心分離工程：１分間、１２００ｒｐｍ、室温。上清を捨てる。
５．  反転セファロースビーズを１ｍＬの水不含ＤＭＦ中に懸濁する。
６．  １００μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）溶液を加える。
７．  ＤＭＦ溶液から化合物（１μｍｏｌ／ｍＬ反転セファロースビーズ；１０μＬ  １００ｍＭ化合物／ｍＬ反転セファロースビーズに相当）を、必要量ビーズに加える。
８．  均一な懸濁液が得られるまで混合する。
９．  室温で１２００ｒｐｍで１分間遠心分離し、２０μＬの上清を除去して、ＨＰＬＣ解析の開始値のために３０μＬメタノール（ＭｅＯＨ）に希釈する。
１０．  １００μＬのＰｙＢｒｏＰ溶液を懸濁液に加え、そして再度混合する。
１１．  室温でエンド−オーバー−エンドミキサー上で一晩インキュベートする。
１２．  室温で１２００ｒｐｍで１分間遠心分離し、２０μＬの上清を除去してＨＰＬＣ解析のカップリング値のために３０μＬメタノール（ＭｅＯＨ）に希釈する。
【０１３８】
ビーズのブロッキング
１．  １００μＬの１００ｍＭ  ＮＨＳ−アセテートを加えることによりビーズをブロッキングする（ブロッキングリガンドの作り方は下記を参照）。
２．  エンド−オーバー−エンドシェーカー上で、室温で一晩インキュベートする。
ブロッキング試薬（ＮＨＳ活性化酢酸）：
１．  アセトニトリル中のＤＣＣＤおよびＮＨＳの２００ｍＭ溶液を調製する（それぞれ、〜５ｍＬ）。
２．  ２０ｍＬ透明ガラスバイアル中で、等しい容積の２００ｍＭ  ＮＨＳおよびＤＣＣＤを混合する。
３．  ＮＨＳ／ＤＣＣＤ混合物の全量１ｍＬあたり、１１．４μＬの１７．４９Ｍ  酢酸（２倍モル過剰）（Merck, 1.00063.1000）を加える。
４．  徹底的に混合する。およそ２分後に沈殿が形成されるであろう（尿素誘導体の結晶）。
５．  反応物を、さらなる使用の前に、少なくとも一晩室温におく。
【０１３９】
ビーズの洗浄
１．  ビーズを、１４ｍｌのＤＭＳＯ（例えばFLUKA, 34869または同等物）で２回洗浄し、次いで１４ｍＬのイソプロパノール（Merck, 1.00983.1000, pro analysis）で２回洗浄する。遠心分離工程：1分間、１２００ｒｐｍ、室温。洗浄の間、上清を除去する。
２．  ビーズを、１ｍＬのイソプロパノールに再懸濁し、−２０℃での保管または細胞溶解物との結合実験にただちに使用するために、５０％スラリーを作成する。
【０１４０】
表３：カップリングプロトコルに使用した略語
【０１４１】
【表３】
2008543296.tif 000008
【０１４２】
実施例２：シグナロキノーム（Signalokinome）
本実施例は、化合物での細胞の処理を説明する（特に本発明の第二の側面を参照）。ＨｅＬａ細胞を上皮増殖因子（ＥＧＦ）で処理し、細胞溶解物を調製し、そしてキノビーズ（セクション２．１の実験プロトコル）および質量分析法を用いて解析した。キノビーズの調製は実施例１に記載する。
並行して、細胞溶解物を抗ホスホチロシン（phosphosphotyrosine）抗体で免疫沈降し（セクション２．２の実験プロトコル）、そして質量分析法により解析した。
結果（図２）は、免疫沈降の手法（表６）と比較して、キノビーズは有意により多くのキナーゼを同定した（表８）ことを示す。
【０１４３】
1．生物学的試料（細胞溶解物）の調製
１．１  細胞培養および細胞の処理
細胞培養．  ＨｅＬａ細胞（American Type Culture Collection - No CCL-2）をＭＥＭ培地（Ｌ−アルギニンを含まず、Ｌ−グルタミンを含まない；Promocell C-75280）、１０％透析仔ウシ血清（Gibco, 26400-044）、１％の１００×非必須アミノ酸（Cambrex, BE13-114E）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Gibco, 11360-039）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Gibco, 25030-032）、４０ｍｇ／ｍＬ  １２Ｃまたは１３Ｃ  Ｌ−アルギニン（１２Ｃアルギニン−Sigma, A6969）（１３Ｃアルギニン−Cambridge Isotope Laboratories Inc., CLM-2265）中で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
【０１４４】
細胞拡張（propagation）．  細胞が１５ｃｍディッシュ中でコンフルエントに達した後、細胞をさらなる増殖のために１ないし１０に分けた。最初に上清培地を除去し、次いで細胞を１５ｍＬ  ＰＢＳバッファー（Gibco, 14190-094）で軽く洗浄することにより、細胞を分けた。ＰＢＳを除去した後、１５ｃｍプレートあたり２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Gibco, 25300-054）を加えることにより細胞をプレートから剥がし、そしてプレートを３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を剥がした後、１５ｃｍプレートあたり８ｍＬのＭＥＭ増殖培地（上記参照）を加えた。この溶液の１ｍＬを、新しい１５ｃｍプレートにおき、そして２４ｍＬのＭＥＭ培地（上記参照）を加えた。プレートは再び３７℃、５％ＣＯ２で、細胞がコンフルエントになるまでインキュベートした（〜３−４日間）。
【０１４５】
細胞のＥＧＦ処理．  上皮増殖因子（ＥＧＦ）での細胞の処理の１日前に、細胞増殖培地を吸引により除去し、そして２０ｍＬの新しいＭＥＭ培地（上記参照）を加えた。ただし当該培地は１０％仔ウシ血清（ＦＢＳ）の代わりに０．１％ＦＢＳを補ってある。細胞はこの飢餓培地中で一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞飢餓の後、３μＬの１ｍｇ／ｍＬ組換えヒトＥＧＦ（Biomol, 50349-1）を各１５ｃｍプレートに加えた（最終ＥＧＦ濃度＝１５０ｎｇ／ｍＬ培地）。回収の前に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。
【０１４６】
細胞の回収．  ＥＧＦ含有培地を捨て、各１５ｃｍプレートを１０ｍＬの氷冷ＰＢＳバッファーで一度洗浄し、そして細胞を剥がすためにラバーポリスマンでプレートを擦り取ることにより、細胞を回収した。細胞を５０ｍＬファルコンチューブ（Becton Dickinson, 352070）に移し、そしてHeraeus Multifuge 3SR中で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離および上清の吸引後、細胞ペレットは液体窒素中ですばやく凍結し、−８０℃で保管した。
【０１４７】
１．２  細胞溶解物の調製
ＨｅＬａ細胞溶解物は、タンパク質の構造および機能を維持する温和な条件下で、溶解バッファー溶液中、機械的破壊により調製した。
以下の工程を行った：
・組織を室温または３７℃ですばやく解凍し、次いで組織を１×溶解バッファーを含有するガラス瓶（Polytron PT 3100ホモジナイザーとともに使用するのに十分な大きさのバイアルを使用する）に移す
・低温室で４℃で５０００−７０００ｒｐｍで１０秒パルスを４回かけて、器官／組織を溶解する
・ホモジネートを予め冷やした５０ｍｌファルコンチューブに移す
・ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートする
・細胞を６０００ｇで１０分間、４℃で遠心する（予め冷やしたSorvall SLA600中で６０００ｒｐｍ）
・上清をＵＺ−ポリカーボネートチューブ（Beckmann, 355654）へ移す
・上清を１４５０００ｇで１時間、４℃で遠心する（予め冷やしたTi50.2中で４００００ｒｐｍ）
・上清を保存し（可能であれば脂質層のほとんどを除去し捨てる）、上清をガラス瓶に移して氷上で保管する
・Bradfordアッセイ（BioRad）によりタンパク質濃度を決定する。典型的なタンパク質濃度は、５−１０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
・１５から５０ｍｌファルコンチューブ中にアリコットを調製する
・アリコットを液体窒素中で凍結し、それらを−８０℃で保管する
【０１４８】
０．８％ＮＰ４０を伴う１００ｍｌの１×溶解バッファーの調製
以下の溶液または試薬を合わせ、そして蒸留水を加えて１００ｍｌの最終容積にする：２０ｍｌの５×溶解バッファー（下記参照）、１００μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＦ、４ｍｌの２０％ＮＰ４０、４つの完全ＥＤＴＡ不含タブレット（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche Diagnostics, 1 873 580）、蒸留水を１００ｍｌまで加える。
【０１４９】
表４：５×溶解バッファーの調製
【０１５０】
【表４】
2008543296.tif 000009
【０１５１】
これらの溶液は以下の供給元から得た：
１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５：Sigma, T-2663；８７％グリセロール：Merck,  cat. no. 04091.2500；１Ｍ  ＭｇＣｌ２：Sigma, M-1028；５Ｍ  ＮａＣｌ：Sigma, S-5150．
５×濃縮溶解バッファーは０．２２μｍフィルターを通してろ過し、そして４０ｍｌアリコットで−８０℃で保管した。
【０１５２】
このプロトコルで使用されるストック溶液の調製：
１００ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４ストック溶液の調製：
９．２ｇの  Ｎａ３ＶＯ４を４００ｍｌの蒸留水に溶解する。
１）１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌのいずれかを用いてｐＨを１０．０に調整する。オルトバナジウム酸ナトリウム溶液の初期ｐＨはバッチごとに多様でありうる。ｐＨ１０．０において、溶液は黄色となるであろう。
２）溶液を、無色に変わるまで煮沸する（約１０分間）。
３）室温まで冷ます。
４）ｐＨを１０．０に再度調整し、そして、工程２および３を、溶液が無色を維持しおよびｐＨが１０．０で安定するまで繰り返す。
５）蒸留水で体積を５００ｍｌに調整する。
６）アリコットを−２０℃で凍結する。アリコットは数ヶ月間保管できる。
【０１５３】
５００ｍＭ  ＮａＦストック溶液の調製：
２１．０ｇのＮａＦ（Sigma, S7920）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして４℃で保管する。
【０１５４】
２０％  ＮＰ４０−溶液の調製：
４０．０ｇのＮＰ４０（Sigma, Igepal-CA630, カタログ番号13021）を量る。蒸留水を加えて２００ｇとする。完全に混合し、そして溶液を室温で保管する。
【０１５５】
１Ｍ  ＤＴＴ溶液の調製：
７．７ｇのＤＴＴ（Biomol, カタログ番号04010）を５０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０１５６】
２．結合反応
２．１  「キノビーズ」（固定化捕捉リガンド）の細胞溶解物との接触
キノビーズ（固定化捕捉リガンド）を、ＨｅＬａ細胞から調製した細胞溶解物と、溶解物中のタンパク質のリガンドへの結合を可能にする条件下で、接触させた。結合条件は、タンパク質の機能を保存する適切なバッファー条件を選ぶことにより生理学的条件に近かった。穏やかな洗浄手順により非捕捉タンパク質を除去した後、結合したタンパク質を、タンパク質の溶出に導く試験化合物と接触させた。
【０１５７】
２．１．１  ＤＰ−バッファーの調製
表５：  ５×−ＤＰバッファーの調製
【０１５８】
【表５】
2008543296.tif 000010
【０１５９】
５×ＤＰバッファーは０．２２μｍフィルターを通してろ過し、そして４０ｍｌ−アリコット中で−８０℃で保管した。これらの溶液は以下の供給元から得た。１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５ (Sigma, T-2663)、８７％グリセロール (Merck, カタログ番号04091.2500)；１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２ (Sigma, M-1028)；５．０Ｍ  ＮａＣｌ (Sigma, S-5150)。
【０１６０】
以下の１×ＤＰバッファーを調製した：
・１×ＤＰバッファー（ビーズ平衡化のための）
・１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（ビーズ平衡化およびビーズの第一洗浄工程のための）
・１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ４０（ビーズの第二洗浄工程のため、および化合物溶出のための）
・１×ＤＰバッファー／プロテアーゼ阻害剤（第一溶解物希釈工程のための）；２５ｍｌの溶解バッファーあたりプロテアーゼ阻害剤タブレットを１つ加える（ＥＤＴＡ不含タブレット、プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche Diagnostics, 1 873 580）
・１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０／プロテアーゼ阻害剤（第二溶解物希釈工程のための）
【０１６１】
１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（１００ｍｌ）の調製のための例：
以下の溶液および試薬を合わせ、そして蒸留水を１００ｍｌの終体積になるように加える：２０ｍｌの５×ＤＰバッファー、５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＦ、２ｍｌの２０％  ＮＰ４０、１００μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、そして、蒸留水を１００ｍｌまで加える。すべてのバッファーは終濃度１ｍＭ  ＤＴＴを含有する。
【０１６２】
２．１．２  ビーズの洗浄および平衡化
キノビーズ（実施例１）を、適切なバッファーによる洗浄および当該バッファーでの平衡化により、結合反応のために調製した。
以下の工程を行った：
１．  すべての洗浄工程のために１５ｍｌファルコンチューブを使用する。
２．  １実験あたり１００μｌのキノビーズを使用する（確立したビーズ体積）：以下の４つのリガンドとカップリングした（１μｍｏｌ／ｍｌのカップリング密度）それぞれのビーズの種類の等量（２５μｌ）を混合する：Bis VIII (CZC00001056)、プルバラノールＢ(CZC00007097)、PD173955誘導体(CZC00007324)、およびCZC00008004。
３．  ３ｍｌの１×ＤＰバッファーで２回、３ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０で１回、ビーズを洗浄する。各洗浄工程の間、チューブを３−５回ひっくり返し、Heraeus遠心分離機で１２００ｒｐｍで２分間、４℃で遠心分離した。上清を吸引し、上清を捨てる。最後の洗浄工程の後、１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０で１：１スラリー（体積／体積）を調製する。
【０１６３】
２．１．３  希釈した細胞溶解物の調製
セクション（１．２）で記載した細胞溶解物を、適切なバッファーによる希釈および遠心分離工程を通じた清澄化により、結合反応のために調製した。以下の工程を行った：
１．  １実験あたり５０ｍｇのタンパク質に対応する細胞溶解物の容積を使用する。
２．  ３７℃の水浴中で溶解物をすばやく解凍し、次いで試料を氷上に保持する。
３．  以下の方法で溶解物を希釈する：
１）１×ＤＰバッファー／プロテアーゼ阻害剤で溶解物を希釈して、界面活性剤濃度を０．８％から０．４％  ＮＰ４０に減少させる。
２）１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０／プロテアーゼ阻害剤で溶解物をさらに希釈して、５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。
４．  希釈した溶解物をＵＺ−ポリカーボネートチューブ（Beckmann, 355654）へと移す。
５．  超遠心を通して希釈した溶解物を清澄にする（２０分、４℃、１００，０００ｇ、TI50.2ローター、予め冷やした超遠心機）。
６．  上清を保存し、そして氷上で保持する。
【０１６４】
２．１．４  結合反応および洗浄
タンパク質のリガンドへの結合をさせるために、セクション（２．１．２）の洗浄し平衡化したビーズを、ステップ（２．１．３）からの希釈した細胞溶解物と接触させた。非特異的に結合したタンパク質は、バッググラウンド結合を減少させるために穏やかな洗浄によって除去した。
１．  希釈し清澄にした溶解物と１００μｌの洗浄したキノビーズを１５ｍｌまたは５０ｍｌファルコンチューブ中で合わせる。
２．  ４℃で２時間インキュベートし、低温室内のROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) 上で回転させる。
３．  インキュベーション後、４℃でHeraeus遠心分離機または同等物上で、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
４．  上清をビーズを失うことのないよう注意深く除去する。
５．  ビーズを、９０μｍフィルターを伴うMobicolカラムに移す（MoBiTec, ゲッティンゲン、カタログ番号：M1002-90）。
６．  ビーズを１０ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ−４０および５ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ−４０で洗浄する。
７．  次の工程に進む前に、洗浄バッファーがカラムを完全に流れ通るようにする。
８．  カラムをエッペンドルフチューブ中に置き、そしてそれらを８００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離する。カラムを底面リッドで閉じる。
【０１６５】
２．１．５  タンパク質の溶出
１．  ６０μｌの２×ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳサンプルバッファーを加える（Invitrogen, NP0007；使用前に４×バッファーを蒸留水で１：１に希釈する）。
２．  試料を５０℃で３０分間インキュベートする。
３．  カラムの底面リッドを開放し、MobiTecカラムを２０００ｒｐｍで１分間遠心分離してビーズから溶出物を分離する。
４．  １／１０体積の２００ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを加え、室温で３０分間インキュベートし、光から保護する。この反応は、質量分析解析のためのシステインのアルキル化を導く。
５．  ゲル上に試料をロードする前に、沈殿物を除去するために試料を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
６．  タンパク質分離のために、６０μｌの試料をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％ビス−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen, NP0335）へアプライする。
【０１６６】
２．１．６  このプロトコルで使用されるストック溶液の調製
１００ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４ストック溶液の調製：
１）９．２ｇの  Ｎａ３ＶＯ４を４００ｍｌの蒸留水に溶解する。
２）１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌのいずれかを用いてｐＨを１０．０に調整する。オルトバナジウム酸ナトリウム溶液の初期ｐＨはバッチごとに多様でありうる。ｐＨ１０．０において、溶液は黄色となるであろう。
３）溶液を、無色に変わるまで煮沸する（約１０分間）。
４）室温まで冷ます。
５）ｐＨを１０．０に再度調整し、そして、工程２および３を、溶液が無色を維持しおよびｐＨが１０．０で安定するまで繰り返す。
６）蒸留水で体積を５００ｍｌに調整する。
７）アリコットを−２０℃で凍結する。アリコットは数ヶ月間保管できる。
【０１６７】
５００ｍＭ  ＮａＦストック溶液の調製：
２１．０ｇのＮａＦ（Sigma, S7920）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして４℃で保管する。
【０１６８】
２０％  ＮＰ４０−溶液の調製：
４０．０ｇのＮＰ４０（Sigma, Igepal-CA630, カタログ番号13021）を量る。蒸留水を加えて２００ｇとする。完全に混合し、そして溶液を室温で保管する。
【０１６９】
１Ｍ  ＤＴＴ溶液の調製：
７．７ｇのＤＴＴ（Biomol, カタログ番号04010）を５０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０１７０】
ヨードアセトアミドストック溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）の調製：
２．０ｇのヨードアセトアミド（Sigma, I-6125）を１０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０１７１】
２．２  抗ホスホチロシン抗体ビーズを用いる免疫沈降
２．２．１  バッファーおよび抗ホスホチロシン抗体ビーズ
固定化抗ホスホチロシン抗体を伴う免疫沈降実験に使用するすべてのバッファーは、キノビーズ実験（上記参照）に使用したものと、ＤＴＴを加えないこと、および５０μＬの１ｍＭオカダ酸（Biomol, E1-181；ホスファターゼ阻害剤）を加えてオカダ酸の終濃度を５００ｎＭにすること、を除いて同一である。抗ホスホチロシン抗体ビーズ（共有結合的にカップリングした組換え４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体を伴うアガロースビーズ）はBiomol（カタログ番号16-199）から得た。
【０１７２】
２．２．２  抗ホスホチロシン抗体の洗浄および平衡化
抗ホスホチロシン抗体ビーズを、適切なバッファーによる洗浄および当該バッファー中での平衡化により結合反応のために調製した。
１．  すべての洗浄工程で１５ｍｌのファルコンチューブを使用する。
２．  １実験あたり１００μｌ抗ホスホチロシンビーズを使用する。
３．  ビーズを３ｍｌの１×ＤＰバッファー（−ＤＴＴ）で２回、３ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（−ＤＴＴ）で１回洗浄する。各洗浄工程の間にチューブを３−５回ひっくり返し、Heraeus遠心分離機中で、４℃で、１２００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を吸引し、捨てた。
最後の洗浄工程の後、１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（−ＤＴＴ）で１：１スラリー（体積／体積）を調製する。
【０１７３】
２．２．３  希釈した細胞溶解物の調製
細胞溶解物を、適切なバッファーによる希釈および遠心分離工程を通じた清澄化により、結合反応のために調製した。
１．  １実験あたり５０ｍｇのタンパク質に対応する細胞溶解物の容積を使用する。
２．  ３７℃の水浴中で溶解物をすばやく解凍し、次いで試料を氷上に保持する。
３．  以下の方法で溶解物を希釈する：
第一希釈工程：１×ＤＰバッファー／プロテアーゼ阻害剤／オカダ酸／ＤＴＴ不含、で溶解物を希釈して、界面活性剤濃度を０．８％から０．４％  ＮＰ−４０に減少させる。
第二希釈工程：１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０／プロテアーゼ阻害剤／オカダ酸／ＤＴＴ不含、で溶解物をさらに希釈して、５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。
（注：第二希釈工程は、第一希釈工程後の溶解物のタンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌよりも高いときにのみ必要である）。
４．  希釈した溶解物をＵＺ−ポリカーボネートチューブ（Beckmann, 355654）へと移す。
５．  超遠心を通して希釈した溶解物を清澄にする（２０分、４℃、１００，０００ｇ、TI50.2ローター、予め冷やした超遠心機）。
６．  上清を保存し、そして氷上で保持する。
【０１７４】
２．２．４  結合反応および洗浄工程
タンパク質を抗ホスホチロシンビーズへ結合させるために、洗浄し平衡化した抗ホスホチロシンビーズを、セクション（２．２．３）からの希釈した細胞溶解物と接触させた。非特異的に結合したタンパク質は、バッググラウンド結合を減少させるために穏やかな洗浄によって除去した。
１．  希釈し清澄にした溶解物と１００μｌの洗浄したキノビーズを１５ｍｌまたは５０ｍｌファルコンチューブ中で合わせる。
２．  ４℃で４時間インキュベートし、低温室内のROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) 上で回転させる。
３．  インキュベーション後、４℃でHeraeus遠心分離機または同等物上で、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
４．  上清をビーズを失うことのないよう注意深く除去する。
５．  ビーズを、９０μｍフィルターを伴うMobicolカラムに移す（MoBiTec, ゲッティンゲン、カタログ番号：M1002-90）。
６．  ビーズを１０ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ／ＤＴＴ不含、および５ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ−４０／ＤＴＴ不含、で洗浄する。
７．  次の工程に進む前に、洗浄バッファーがカラムを完全に流れ通るようにする。
８．  カラムをエッペンドルフチューブ中に置き、そしてそれらを８００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離する。カラムを底面リッドで閉じる。
【０１７５】
２．２．５  結合したタンパク質の溶出
１．  ６０μｌの２×ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳサンプルバッファーを加える（Invitrogen, NP0007；使用前に４×バッファーを蒸留水で１：１に希釈する）。
２．  試料を５０℃で３０分間インキュベートする。
３．  カラムの底面リッドを開放し、MobiTecカラムを２０００ｒｐｍで１分間遠心分離してビーズから溶出物を分離する。
４．  １／１０体積の２００ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを加え、室温で３０分間インキュベートし、光から保護する。この反応は、質量分析解析のためのシステインのアルキル化を導く。
５．  ゲル上に試料をロードする前に、沈殿物を除去するために試料を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
６．  タンパク質分離のために、６０μｌの試料をＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％ビス−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen, NP0335）へアプライする。
【０１７６】
３．溶出した酵素（例えば、キナーゼ）の質量分析解析
プロテオタイピック（proteotypic）ペプチドの説明
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質混合物のトリプシン消化は、各タンパク質について異なる物理化学的性質の多数の別個のペプチド断片を生じる。これらのペプチドは、タンパク質同定（ＩＤ）のために使用される質量分析法に基づく解析プラットフォーム、これはナノキャピラリー逆相液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＲＰ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）である、についての適合性が異なる。結果として、同じ源のタンパク質由来のペプチドについてのペプチド頻度が大きな度合いで異なり、もっとも頻繁に観察されるペプチドであってこのタンパク質の同定に「典型的に」寄与するものは、「プロテオタイピック（proteotypic）」ペプチドと名づけられる。よって、「プロテオタイピックペプチド」は実験的によく観察されるペプチドであって、特定のタンパク質やタンパク質アイソフォームを一意的に同定するものである。
【０１７７】
プロテオタイピックペプチドの利点
タンパク質同定のためのプロテオタイピックペプチドの使用は、情報の豊富なシグニチャーペプチドの存在についてのスクリーニングにおけるタンパク質同定工程に焦点をあてることによって、多数の公知の標的タンパク質の迅速で焦点を絞った同定および定量を可能にする。
【０１７８】
プロテオタイピックペプチドの実験的同定
プロテオタイピックペプチドのリストを生じる一つの戦略は、タンパク質同定データを実験的に集め、そしてタンパク質を一意的に同定する共通して観察されるペプチドのデータセットを調べることである。
【０１７９】
ＣＺデータセット（多重ペプチドＩＤまたは手動で立証した単一ペプチドＩＤ）における少なくとも１０の絶対的な同定を伴うＩＰＩデータベースタンパク質エントリーのそれぞれについて、寄与ペプチドについてのペプチド頻度を計算する。データベースサーチエンジンＭａｓｃｏｔＴＭ（Matrix Science）による特異的で最もよいペプチド対スペクトル適合のみが考慮される。
【０１８０】
特定のタンパク質についてのプロテオタイピックペプチドの定義づけのために、ペプチドをペプチド頻度が下がっていく方に並べ、そして累積ペプチドの存在が計算される：この値は各ペプチドについて、このペプチドまたはより高いペプチド頻度を伴ういずれかのペプチドが存在する、同定の比率を与える。プロテオタイピックペプチドは、９５％の累積存在のカットオフ、すなわち、このタンパク質についての少なくとも９５％の同定事象は少なくとも１のプロテオタイピックペプチドに基づく、を用いて定義される。
【０１８１】
３．１  質量分析解析前のタンパク質消化および試料調製
タンパク質は濃縮し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）  Ｎｏｖｅｘゲル（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）上で分離し、そしてコロイド状のクーマシーブルーで染色した。ゲルのレーンは体系的に全分離範囲を横方向に≦４８スライス（バンドおよびバンド間領域）に切断し、そして、本質的にShevchenkoら、1996, Analytical Chemistry 68: 850-858に記載されるようにゲル内トリプシン消化を行った。簡単には、ゲルプラグを５０％ＥｔＯＨ中の５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中で一晩脱染色し、５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の１２．５ｎｇ／μｌのトリプシンで４時間消化した。ペプチドを、１％ギ酸で抽出し、第二の９６ウェルプレートへと移して、そして真空下で乾燥させた。乾燥したペプチドを、１０μｌの水中の０．１％ギ酸に再懸濁し、そしてタンパク質同定のために５μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムにインジェクトした。
【０１８２】
３．２  質量分析データ収集
ペプチド試料をナノＬＣシステム（CapLC, WatersまたはUltimate, Dionex）、これは四重極飛行時間質量分析器（QTOF2, QTOR Ultima, QTOF Micro MicromassまたはQSTAR Pulsar, Sciex）またはイオントラップ質量分析器（LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan）に直接接続された、へとインジェクトした。ペプチドはＬＣシステム上で、１５分および４５分の間の典型的なグラジエント時間を伴う水性溶媒および有機溶媒のグラジエントを用いて分離した。溶媒Ａは０．１％ギ酸中の５％アセトニトリルであり、そして溶媒Ｂは０．１％ギ酸中の７０％アセトニトリルであった。
【０１８３】
３．３  タンパク質同定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で得られたペプチド質量および断片化データは、企業内（in-house）で監督したバージョンのInternational Protein Index（ＩＰＩ）タンパク質配列データベース（ＥＢＩ）のクエリーに用いた。タンパク質は、測定されたペプチド質量および断片化データと、データベース内のエントリーから計算した同じデータとを、ソフトウェアツールＭａｓｃｏｔ（Matrix Science; Perkinsら、1991, Electrophoresis 20: 3551-3567）を用いて関連付けることにより同定した。サーチ基準は、分析にどの質量分析器を使用したかによって変化した。
【０１８４】
４．結果
シグナロキノーム実験の結果を図２に示す。この図は、キノビーズを使用した薬剤選抜（drug pulldown）（左の丸）および抗ホスホチロシン抗体ビーズでの伝統的な免疫沈降（右の丸）の比較を示す。キノビーズ実験においては全体で６２６のタンパク質が同定され、それらのうち１００がキナーゼであった。免疫沈降（ＩＰ）実験においては全体で５０３のタンパク質が同定され、そのうちの１２がキナーゼであった。両方の実験で同定されたキナーゼ（共通のキナーゼ）は重なり合うエリアに並べた。この結果は、抗ホスホチロシン抗体ビーズ（１２キナーゼ）と比較して、キノビーズは有意により多くのキナーゼを同定した（１００キナーゼ）ことを示す。
【０１８５】
両方の実験手法で同定されたキナーゼを以下の表に列挙する。加えて、当該キナーゼのプロテオタイピックペプチドの配列を、別の表に列挙する。
【０１８６】
表６：免疫沈降（ＩＰ）後に同定されたキナーゼ。キナーゼ名はヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）およびManningら、2002, Science 298, 1912-1934  補足的な資料に特定されているように）による。
【０１８７】
【表６−１】
2008543296.tif 000011
【０１８８】
【表６−２】
2008543296.tif 000012
【０１８９】
表７：免疫沈降（ＩＰ、図６参照）後に同定されたキナーゼについてのプロテオタイピックペプチドの配列。キナーゼ名はヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）およびManningら、2002, Science 298, 1912-1934  補足的な資料に特定されているように）による。
【０１９０】
【表７−１】
2008543296.tif 000013
【０１９１】
【表７−２】
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【０１９２】
表８：キノビーズでの薬物選抜後に同定されたキナーゼ。キナーゼ名はヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）およびManningら、2002, Science 298, 1912-1934  補足的な資料に特定されているように）による。
【０１９３】
【表８−１】
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【０１９４】
【表８−２】
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【０１９５】
【表８−３】
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【０１９６】
【表８−４】
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【０１９７】
【表８−５】
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【０１９８】
表９：キノビーズでの薬物選抜後に同定されたキナーゼについてのプロテオタイピックペプチドの配列。
【０１９９】
【表９−１】
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【０２００】
【表９−２】
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【０２０１】
【表９−３】
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【０２０２】
【表９−４】
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【０２０３】
【表９−５】
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【０２０４】
【表９−６】
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【０２０５】
【表９−７】
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【０２０６】
【表９−８】
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【０２０７】
【表９−９】
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【０２０８】
【表９−１０】
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【０２０９】
【表９−１１】
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【０２１０】
【表９−１２】
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【０２１１】
【表９−１３】
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【０２１２】
実施例３：タンパク質溶出のための試験化合物を用いたスクリーニングアッセイ
この実施例は、キノビーズに結合したタンパク質と非修飾試験化合物の競合溶出を説明する（特に本発明の第四の側面を参照）。キノビーズ（実施例１に記載）をマウス脳溶解物と接触させ、結合したタンパク質を種々の試験化合物で溶出し、そして放出されたタンパク質を質量分析法で解析した。
【０２１３】
１．生物学的試料（組織溶解物）の調製
１．１  溶解物の調製
マウス脳溶解物を、タンパク質の構造および機能を保持する穏やかな条件下で、溶解バッファー（マウス脳あたり５ｍｌのバッファー）中での機械的破壊により調製した。以下の工程を行った：
・組織を室温または３７℃ですばやく解凍し、次いで組織を１×溶解バッファーを含有するガラス瓶に移す（Polytron PT 3100ホモジナイザーを使用するのに十分な大きさのバイアルを使用する）
・器官／組織を、低温室中で４℃、５０００−７０００ｒｐｍでの１０秒パルスを４回で溶解する
・ホモジネートを予め冷やした５０ｍｌファルコンチューブに移す
・ホモジネートを氷上で３０分間インキュベートする
・６０００ｇで１０分間、４℃で細胞を遠心する（予め冷やしたS orvall SLA600で６０００ｒｐｍ）
・上清をＵＺ−ポリカーボネートチューブ（Beckmann, 355654）へ移す
・１４５，０００ｇで１時間、４℃で上清を遠心する（予め冷やしたTi50.2で４０，０００ｒｐｍ）
・上清を保存し（可能であれば脂質層のほとんどを除去し捨てる）、上清をガラス瓶に移し、そして氷上で保管する
・Bradfordアッセイ（BioRad）によりタンパク質濃度を決定する。典型的なタンパク質濃度は、５−１０ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
・１５ないし５０ｍｌファルコンチューブにアリコットを調製する
・液体窒素中でアリコットを凍結し、そして−８０℃でそれらを保管する
【０２１４】
１．２  溶解バッファーおよびストック溶液の調製
０．８％  ＮＰ４０を伴う１００ｍｌ  １×溶解バッファーの調製
以下の溶液または試薬を合わせ、そして蒸留水を１００ｍｌの終体積まで加える：２０ｍｌの５×溶解バッファー（下記参照）、１００μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＦ、４ｍｌの２０％  ＮＰ４０、４つのコンプリートＥＤＴＡ不含タブレット（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche Diagnostics、1 873 580）、蒸留水を１００ｍｌまで加える。
【０２１５】
表１０：  ５×溶解バッファーの調製
【０２１６】
【表１０】
2008543296.tif 000033
【０２１７】
これらの溶液は以下の供給元から得た：
１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５：Sigma, T-2663；８７％グリセロール：Merck，カタログ番号04091.2500；１Ｍ  ＭｇＣｌ２：Sigma, M-1028；５Ｍ  ＮａＣｌ：Sigma, S-5150。
５倍濃縮溶解バッファーは０．２２μｍフィルターでろ過し、そして４０ｍｌアリコットで−８０℃で保管した。
【０２１８】
ストック溶液の調製
１００ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４ストック溶液の調製：
９．２ｇのＮａ３ＶＯ４を４００ｍｌの蒸留水に溶解する。  
１）１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌのいずれかを用いてｐＨを１０．０に調整する。オルトバナジウム酸ナトリウム溶液の初期ｐＨはバッチごとに多様でありうる。ｐＨ１０．０において、溶液は黄色となるであろう。
２）溶液を、無色に変わるまで煮沸する（約１０分間）。
３）室温まで冷ます。
４）ｐＨを１０．０に再度調整し、そして、工程２および３を、溶液が無色を維持しおよびｐＨが１０．０で安定するまで繰り返す。
５）蒸留水で体積を５００ｍｌに調整する。
６）アリコットを−２０℃で凍結する。アリコットは数ヶ月間保管できる。
５００ｍＭ  ＮａＦストック溶液の調製：
２１．０ｇのＮａＦ（Sigma, S7920）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして４℃で保管する。
２０％  ＮＰ４０−溶液の調製：
４０．０ｇのＮＰ４０（Sigma, Igepal-CA630, カタログ番号13021）を量る。蒸留水を加えて２００ｇとする。完全に混合し、そして溶液を室温で保管する。
１Ｍ  ＤＴＴ溶液の調製：
７．７ｇのＤＴＴ（Biomol, カタログ番号04010）を５０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０２１９】
２．キノビーズの細胞溶解物との接触、および試験化合物による結合したタンパク質の溶出
キノビーズを、溶解物中のタンパク質のリガンドへの結合を可能にする条件下で、マウス脳溶解物と接触させた。結合条件は、タンパク質の機能を保存する適切なバッファー条件を選ぶことによって、生理学的条件に近かった。穏やかな洗浄工程を通して非捕捉タンパク質を除去した後、結合したタンパク質をタンパク質溶出のための試験化合物と接触させた。
【０２２０】
２．１  ＤＰ−バッファーの調製
表１１：  ５×−ＤＰバッファーの調製
【０２２１】
【表１１】
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【０２２２】
５×ＤＰバッファーは０．２２μｍフィルターを通してろ過し、そして４０ｍｌ−アリコット中で−８０℃で保管した。
（注：同じバッファーを全細胞溶解物の調製のためにも用いる）
これらの溶液は以下の供給元から得た。１．０Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５(Sigma, T-2663)、８７％グリセロール (Merck, カタログ番号04091.2500)；１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２ (Sigma, M-1028)；５．０Ｍ  ＮａＣｌ (Sigma, S-5150)。
【０２２３】
以下の１×ＤＰバッファーを調製した：
・１×ＤＰバッファー（ビーズ平衡化のための）
・１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（ビーズ平衡化およびビーズの第一洗浄工程のための）
・１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ４０（ビーズの第二洗浄工程のため、および化合物溶出のための）
・１×ＤＰバッファー／プロテアーゼ阻害剤（第一溶解物希釈工程のための）；２５ｍｌの溶解バッファーあたりプロテアーゼ阻害剤タブレットを１つ加える（ＥＤＴＡ不含タブレット、プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche Diagnostics, 1 873 580）
・１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０／プロテアーゼ阻害剤（第二溶解物希釈工程のための）
【０２２４】
１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０（１００ｍｌ）の調製のための例：
以下の溶液および試薬を合わせ、そして蒸留水を１００ｍｌの終体積になるように加える：２０ｍｌの５×ＤＰバッファー、５ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＦ、２ｍｌの２０％  ＮＰ４０、１００μｌの１Ｍ  ＤＴＴ、そして、蒸留水を１００ｍｌまで加える。すべてのバッファーは終濃度１ｍＭ  ＤＴＴを含有する。
【０２２５】
２．２  ビーズの洗浄および平衡化
キノビーズ（実施例１）を、適切なバッファーによる洗浄および当該バッファーでの平衡化により、結合反応のために調製した。
１．  すべての洗浄工程のために１５ｍｌファルコンチューブを使用する。
２．  １実験あたり１００μｌのキノビーズを使用する（確定したビーズ体積）：以下の４つのリガンドとカップリングした（１μｍｏｌ／ｍｌのカップリング密度）それぞれのビーズの種類の等量（２５μｌ）を混合する：Bis VIII (CZC00001056)、プルバラノールＢ(CZC00007097)、PD173955誘導体(CZC00007324)、およびCZC00008004。
３．  ３ｍｌの１×ＤＰバッファーで２回、３ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０で１回、ビーズを洗浄する。各洗浄工程の間、チューブを３−５回ひっくり返し、Heraeus遠心分離機で１２００ｒｐｍで２分間、４℃で遠心分離した。上清を吸引し、上清を捨てる。
最後の洗浄工程の後、１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０で１：１スラリー（体積／体積）を調製する。
【０２２６】
２．３  希釈した細胞溶解物の調製
マウス脳溶解物を、適切なバッファーによる希釈および遠心分離工程を通じた清澄化により、結合反応のために調製した。
１．  １実験あたり５０ｍｇのタンパク質に対応する細胞溶解物の容積を使用する。
２．  ３７℃の水浴中で溶解物をすばやく解凍し、次いで試料を氷上に保持する。
３．  以下の方法で溶解物を希釈する：
３）１×ＤＰバッファー／プロテアーゼ阻害剤で溶解物を希釈して、界面活性剤濃度を０．８％から０．４％  ＮＰ−４０に減少させる。
４）１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ４０／プロテアーゼ阻害剤で溶解物をさらに希釈して、５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度にする。
（注：第二希釈工程は、溶解物のタンパク質濃度が第一希釈工程後に５ｍｇ／ｍｌより高い場合にのみ必要である）
４．  希釈した溶解物をＵＺ−ポリカーボネートチューブ（Beckmann, 355654）へと移す。
５．  超遠心を通して希釈した溶解物を清澄にする（２０分、４℃、１００，０００ｇ、TI50.2ローター、予め冷やした超遠心機）。
６．  上清を保存し、そして氷上で保持する。
【０２２７】
２．４  結合反応および洗浄
タンパク質をリガンドへ結合させるために、洗浄し平衡化したビーズ（セクション２．２）を、希釈した細胞溶解物（セクション２．３）と接触させた。非特異的に結合したタンパク質は、バッググラウンド結合を減少させるために穏やかな洗浄によって除去した。
１．  希釈し清澄にした溶解物と１００μｌの洗浄したキノビーズを１５ｍｌまたは５０ｍｌファルコンチューブ中で合わせる。
２．  ４℃で２時間インキュベートし、低温室内のROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) 上で回転させる。
３．  インキュベーション後、４℃でHeraeus遠心分離機または同等物上で、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
４．  上清をビーズを失うことのないよう注意深く除去する。
５．  ビーズを、９０μｍフィルターを伴うMobicolカラムに移す（MoBiTec, ゲッティンゲン、カタログ番号：M1002-90）。
６．  ビーズを１０ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．４％  ＮＰ−４０および５ｍｌの１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ−４０で洗浄する。
７．  次の工程に進む前に、洗浄バッファーがカラムを完全に流れ通るようにする。
８．  カラムをエッペンドルフチューブ中に置き、そしてそれらを８００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離する。カラムを底面リッドで閉じる。
【０２２８】
２．５  結合したタンパク質の試験化合物での溶出
種々の試験化合物（セクション２．７を参照）を、これらの工程に従って結合したタンパク質を放出するのに用いた：
１．  結合したタンパク質を伴うビーズ（セクション２．４）を１×ＤＰバッファー／０．２％  ＮＰ−４０中で１：３のスラリー（体積／体積）として再懸濁する。
２．  当該１：３のスラリーの２０μｌをMoBiTechカラムに移す（５μｌのビーズに等しい）。
３．  当該カラムをエッペンドルフチューブ中に設置し、８００ｒｐｍで１５秒間、４℃で遠心分離する。底部リッドでカラムを閉じる。
４．  １．０ｍＭの試験化合物（０．１から１．０ｍＭの濃度範囲が適切である）を含有する１０μｌの溶出バッファーを加える。対照として、試験化合物を溶解するのに用いた溶媒に依存して、２％ＤＭＳＯまたは２％ＤＭＦを含有する溶出バッファーを用いる。
上部リッドでカラムを閉じる。
５．  エッペンドルフインキュベーター中、７００ｒｐｍで、４℃で３０分間インキュベートする。
６．  カラムを開け（最初に上部を、次いで底部を）、シリコン処理をしたチューブ（SafeSealミクロ遠心分離チューブ、カタログ番号11270、Sorenson BioScience, Inc）へとカラムを戻す。溶出物を回収するために、２０００ｒｐｍで２分間、卓上遠心分離機で室温で遠心分離する。溶出物の典型的な体積は約１５μｌである。
７．  １００ｍＭ  ＤＴＴを含有する、５μｌの４×NuPAGE SDS試料バッファー（Invitrogen, NP0007）を加える（ＤＴＴは使用する直前に加えなければならない）。
８．  ５０℃で３０分間インキュベートする。
９．  １／１０体積の２００ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを加え、室温で３０分間、遮光してインキュベートする。この反応は、質量分析法のためのシステインのアルキル化へと導く。
１０．  ゲル上に試料をロードする前に、沈殿物を除去するために１５０００ｒｐｍで５分間、試料を遠心分離する。
１１．  タンパク質分離のために、１０μｌの試料をNuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル（Invitrogen, NP0335）にアプライする。
【０２２９】
２．６  このプロトコルに使用するストック溶液の調製
１００ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４ストック溶液の調製：
１）９．２ｇの  Ｎａ３ＶＯ４を４００ｍｌの蒸留水に溶解する。
２）１Ｎ  ＮａＯＨまたは１Ｎ  ＨＣｌのいずれかを用いてｐＨを１０．０に調整する。オルトバナジウム酸ナトリウム溶液の初期ｐＨはバッチごとに多様でありうる。ｐＨ１０．０において、溶液は黄色となるであろう。
３）溶液を、無色に変わるまで煮沸する（約１０分間）。
４）室温まで冷ます。
５）ｐＨを１０．０に再度調整し、そして、工程２および３を、溶液が無色を維持しおよびｐＨが１０．０で安定するまで繰り返す。
６）蒸留水で体積を５００ｍｌに調整する。
７）アリコットを−２０℃で凍結する。アリコットは数ヶ月間保管できる。
【０２３０】
５００ｍＭ  ＮａＦストック溶液の調製：
２１．０ｇのＮａＦ（Sigma, S7920）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして４℃で保管する。
【０２３１】
２０％  ＮＰ４０−溶液の調製：
４０．０ｇのＮＰ４０（Sigma, Igepal-CA630, カタログ番号13021）を量る。蒸留水を加えて２００ｇとする。完全に混合し、そして溶液を室温で保管する。
【０２３２】
１Ｍ  ＤＴＴ溶液の調製：
７．７ｇのＤＴＴ（Biomol, カタログ番号04010）を５０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０２３３】
ヨードアセトアミドストック溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）の調製：
２．０ｇのヨードアセトアミド（Sigma, I-6125）を１０ｍｌの蒸留水に溶解する。溶液を０．２２μｍフィルターでろ過し、そして−２０℃で４００μｌのアリコットを凍結する。アリコットは数ヶ月間保管することができる。
【０２３４】
２．７  溶出のための試験化合物
下記に列挙する試験化合物を、下記に示すように希釈後の溶出実験に用いた。
【０２３５】
試験化合物ストックの調製：
典型的には、すべての化合物は１００ｍＭの濃度で、１００％ＤＭＳＯ（Fluka, カタログ番号41647）に溶解する。あるいは、ＤＭＳＯに溶解させることができない化合物については、１００％ＤＭＦ（Fluka, カタログ番号40228）を用いることができる。化合物は−２０℃で保管する。
【０２３６】
溶出実験のための試験化合物の希釈：
１００ｍＭストックを１００％ＤＭＳＯで１：１に希釈することにより、５０ｍＭストックを調製する。溶出実験のために、当該化合物を溶出バッファー（＝１×ＤＰ−バッファー／０．２％  ＮＰ４０）で１：５０にさらに希釈する。
【０２３７】
CZC1038：ビスインドリルマレイミドIII（供給元：Alexis Biochemicals；カタログ番号270-051-M005；化学式−C23H20N4O2；MW 384.4)。
CZC7097：プルバラノールＢ (供給元：Tocris Biochemicals、カタログ番号1581；化学組成C20H25ClN6O3；MW 441.92：CAS番号212844-54-7)。
CZC00007324（PD173955誘導体；合成は実施例１に記載される）。
CZC00008004：これはCZC00004919の類似体である（合成は実施例１に記載される）。
CZC00007098: SB202190（供給元：TOCRIS 1264 1A/46297；化学式C20H14N3OF；MW 331.34）。
CZC00009280: スタウロスポリン（供給元：SIGMA-ALDRICH：S4400；広範囲性キナーゼ阻害剤；化学式C28H26N4O3；MW 466.53）。
CZC00007449: SP600125（供給元：Merck Biosciences #420119, JNK1/2阻害剤；化学式C14H8N2O；MW 220.2）。
【０２３８】
３．溶出された酵素（例えば、キナーゼ）の質量分析解析
プロテオタイピックペプチドの説明
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質混合物のトリプシン消化は、各々のタンパク質について、異なる物理化学的性質をもつ多数の別個のペプチド断片を生ずる。これらのペプチドは、タンパク質同定（ＩＤ）のために用いられる質量分析に基づく分析プラットフォーム、例えばナノキャピラリー逆相液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＲＰ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、における適合性が異なる。結果として、同じタンパク質源からのペプチド（複数）についてのペプチド頻度が、大きな度合いで異なり、このタンパク質の同定に「典型的に」寄与する最も高頻度で観察されたペプチドは、「プロテオタイピック」ペプチドと呼ばれる。よって、「プロテオタイピックペプチド」は、特定のタンパク質またはタンパク質アイソフォームを一意的に同定する、実験的によく観察されるペプチドである。
【０２３９】
プロテオタイピックペプチドの利点
タンパク質同定のためにプロテオタイピックペプチドを使用することは、情報に富んだシグネチャーペプチドの存在についてスクリーニングすることにタンパク質同定工程の焦点を当てることにより、複数の公知の標的タンパク質の迅速で焦点を合わせた同定および定量を可能にする。
【０２４０】
プロテオタイピックペプチドの実験的同定
プロテオタイピックペプチドのリストをつくる一つの戦略は、ペプチド同定データを実験的に収集し、そしてタンパク質を一意的に同定する共通して観察されるペプチドについてのデータセットを検索することである。
【０２４１】
ＣＺデータセット（マルチペプチドＩＤまたは手動で検証した単一ペプチドＩＤ）における少なくとも１０の明解な識別を伴うＩＰＩデータベースタンパク質エントリーの各々について、寄与ペプチドのペプチド頻度を計算する。データベースサーチエンジンであるＭａｓｃｏｔＴＭ（Matrix Science）による、特異的で、最も良いペプチド対スペクトル適合（peptide-to-spectrum matches）のみを考慮する。
【０２４２】
特定のタンパク質についてのプロテオタイピックペプチドの定義のために、ペプチドをペプチド頻度が下がっていく順序で並べ、そして累積的なペプチド存在を計算する：この値はそれぞれのペプチドに、このペプチドまたはより高いペプチド頻度を伴ういずれかのペプチドが存在する、同定の比率を与える。プロテオタイピックペプチドは、９５％の累積存在でのカットオフを用いて定義される、すなわち、このタンパク質についての少なくとも９５％の同定事象が、少なくとも１つのプロテオタイピックペプチドに基づいている。
【０２４３】
３．１  質量分析解析の前のタンパク質消化および試料調製
タンパク質を濃縮し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘゲル（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）上で分離し、そしてコロイド状のクーマシーブルーで染色した。ゲルのレーンは、全分離範囲にわたって≦４８スライスに体系的に切断し（バンドおよびバンド間領域）、そして、Shevchenkoら、1996, Analytical Chemistry 68: 850-858に本質的に記載されるようにゲル内トリプシン消化を行った。簡単には、ゲルプラグを５０％ＥｔＯＨ中の５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中で一晩脱染色し、５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の１２．５ｎｇ／μｌのトリプシンで４時間消化した。ペプチドを１％ギ酸で抽出し、第二の９６ウェルプレート中に移し、そして真空下で乾燥させた。乾燥ペプチドを１０μｌの水中の０．１％ギ酸で再懸濁し、そして５μｌをタンパク質同定のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムへとインジェクトした。
【０２４４】
３．２  質量分析データ収集
ペプチド試料を、四重極飛行時間型質量分析器（QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, MicromassまたはQSTAR Pulsar, Sciex）またはイオントラップ質量分析器（LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan）のいずれかに直接連結された、ナノＬＣシステム（CapLC, WatersまたはUltimate, Dionex）へとインジェクトした。ペプチドは、１５ないし４５分の間の典型的なグラジエント時間を伴う水性溶媒および有機溶媒のグラジエントを用いて、ＬＣシステム上で分離された。溶媒Ａは０．１％ギ酸中の５％アセトニトリルであり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸中の７０％アセトニトリルであった。
【０２４５】
３．３  タンパク質同定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で得られたペプチド質量およびフラグメンテーションデータは、International Protein Index（ＩＰＩ）タンパク質配列データベースの社内監督バージョンでクエリーを行うために用いた。タンパク質は、測定されたペプチド質量およびフラグメンテーションデータを、データベースのエントリーからソフトウェアツールであるMascot（Matrix Science; Perkinsら、1999, Electrophoresis 20:3551-3567）を用いて計算した同じデータと関連付けることにより同定した。分析のためにどの質量分析器が用いられたかにより、検索基準は変化した。
【０２４６】
４．結果
当該方法は、与えられたいずれかの試験化合物について溶出したキナーゼのプロファイルを確立することを可能にし、それにより試験化合物の選択性を評価することが可能になる。一つの制限は、細胞溶解物において含有されるすべてのキナーゼの細画分（subfraction）を代表するかもしれない、第一工程の間にキノビーズ上に捕捉されたキナーゼについてのみ評価できるということである。
【０２４７】
表１２：試験化合物による特異的溶出後に質量分析により同定された放出されたキナーゼ（数字は、質量分析スコア／同定されたペプチドの数を表す）。キナーゼ名は、ヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）および、補足の材料の項で特定されるようにManningら、2002, Science 298, 1912-1934による。表１２の最初の４つの化合物は、キノビーズリガンド１−４の非固定化バージョンである。
【０２４８】
【表１２−１】
2008543296.tif 000035
【０２４９】
【表１２−２】
2008543296.tif 000036
【０２５０】
【表１２−３】
2008543296.tif 000037
【０２５１】
表１３：試験化合物による特異的溶出後に質量分析により同定された放出されたキナーゼ（質量分析スコア／同定されたペプチドの数）。試験化合物は有機小分子（キナーゼ骨格化合物）のライブラリーから選択された。キナーゼ名は、ヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）および、補足の材料の項で特定されるようにManningら、2002, Science 298, 1912-1934による。
【０２５２】
【表１３−１】
2008543296.tif 000038
【０２５３】
【表１３−２】
2008543296.tif 000039
【０２５４】
【表１３−３】
2008543296.tif 000040
【０２５５】
実施例４：共固定されたリガンドと個別にカップリングされたリガンドの比較
この実験の目的は、一種類のリガンドを含有するビーズの混合物（個別にカップリングされたリガンド）が、共固定されたリガンド（同時カップリング）と比較して、同定されたキナーゼに関して同様の結果を生じるかどうか評価することであった。
【０２５６】
結果は、両方の実験において同定されたキナーゼの広範囲な重なりがあることを示し、両方のやり方が適していることを証明した。
二つのリガンドは、セファロースビーズに個別にまたは同時のいずれかでカップリングし、そしてＨｅＬａ細胞溶解物を用いた選抜実験（pulldown experiment）に用いた（リガンド１：BisVIII；リガンド２：CZC00008004；詳細は実施例１：キノビーズの調製、と同様）。化合物の個別のカップリングは実施例１に詳細を記載したように行った。二つのリガンドの同時カップリングもまた、標準的な１μｍｏｌ／ｍＬビーズの代わりに０．５μｍｏｌ／ｍＬの濃度で同じビーズ上に化合物がカップリングされたことを除いては、実施例１と同様に行った。個別にまたは同時に固定化された化合物についてのカップリングの成功は、ＨＰＬＣ分析を介して制御された。ビーズは、実施例１に記載されたように洗浄し、そして保存した。
【０２５７】
ＨｅＬａ細胞溶解物の調製、ビーズ洗浄、ビーズの溶解物との接触、洗浄および質量分析法による放出されたタンパク質の分析  薬物は実施例２に記載したように行った（シグナロキノーム実験）。
【０２５８】
表１４：  質量分析解析によって同定されたキナーゼ。二つの同時にカップリングされたリガンド（左部分）および個別にカップリングされた化合物（混合ビーズ；右部分）での実験の比較。キナーゼ名は、ヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）および、補足の材料の項で特定されるようにManningら、2002, Science 298, 1912-1934による。
【０２５９】
【表１４−１】
2008543296.tif 000041
【０２６０】
【表１４−２】
2008543296.tif 000042
【０２６１】
表１５：  同時カップリング実験において同定されたキナーゼおよびプロテオタイピックペプチドの配列
【０２６２】
【表１５−１】
2008543296.tif 000043
【０２６３】
【表１５−２】
2008543296.tif 000044
【０２６４】
【表１５−３】
2008543296.tif 000045
【０２６５】
表１６：混合実験（カップリング後に混合されたビーズ）において同定されたキナーゼおよびプロテオタイピックペプチドの配列
【０２６６】
【表１６−１】
2008543296.tif 000046
【０２６７】
【表１６−２】
2008543296.tif 000047
【０２６８】
【表１６−３】
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【０２６９】
【表１６−４】
2008543296.tif 000049
【０２７０】
実施例５：キノビーズリガンド５（インドールリガンド９１）の合成
インドールリガンド９１合成：  ５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−アミノ−プロピル）−アミド
工程１：  ５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン
ヒドラジン水和物（５５％、１０ｍｌ）中の５−フルオロイサチン（１ｇ）の溶液を１１０℃で３０分間加熱した。懸濁液が溶液になったら、反応物を１１０℃で４時間加熱し、そして０℃に冷却した。沈殿をろ過し、そして水で洗浄した。固体を水（１０ｍｌ）に懸濁し、濃ＨＣｌの添加によりｐＨをｐＨ２に下げ、そして溶液を室温で５時間撹拌した。沈殿を集め、固体を水（２×１５ｍｌ）で洗浄し、そして真空オーブンで４０℃で乾燥させた（０．２６ｇ、３０％）。
【０２７１】
【化５】
2008543296.tif 000050
【０２７２】
工程２：  ｛３−［（５−ホルミル−２，４−ジメチ−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル）−アミノ］−プロピル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中、５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸（０．３００ｇ、１．７９ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（０．５１６ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．３６４ｇ、２．６９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．５０２ｍｌ、３．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−Ｂｏｃ−１，３−ジアミノプロパン（０．３７５ｍｌ、２．１５ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１５時間撹拌した。ブライン（１．５ｍｌ）、水（１．５ｍｌ）および飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１．５ｍｌ）の混合物を加え、そして１０Ｎ水酸化ナトリウムの添加により溶液のｐＨを１２に調整した。溶液は、ジクロロメタン：メタノール（９：１）の混合物で３回抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を除去し、そして残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル（５０から１００％）で精製して、目的化合物を黄色固体として得た（０．３０ｇ、５２％）。
【０２７３】
【化６】
2008543296.tif 000051
【０２７４】
工程３：  ［３−（｛５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル｝−アミノ）−プロピル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
エタノール（２ｍｌ）中の｛３−［（５−ホルミル−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル）−アミノ］−プロピル｝−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．２００ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）および５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（０．０１１ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ピロリジン（０．００３ｍｌ）の溶液を７８℃で３時間加熱した。反応物を０℃に冷却し、そして得られた沈殿物をろ過し、冷エタノールで洗浄した。生成物をエタノール（４ｍｌ）中に懸濁させ、７２℃で３０分間撹拌した。反応物をろ過し、沈殿物を真空オーブン中で４０℃で乾燥し、目的化合物を固体として得た（０．２６５ｇ、９４％）。
【０２７５】
【化７】
2008543296.tif 000052
【０２７６】
工程４：  ５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（３−アミノ−プロピル）−アミド
［３−（｛５−［５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−（３Ｚ）−イリデンメチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボニル｝−アミノ）−プロピル］−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをメタノールに懸濁した。２ｍｌのジオキサン中のＨＣｌ（４Ｎ）を加え、そして反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去して目的化合物を得た（０．０９８ｇ、９１％）。
【０２７７】
【化８】
2008543296.tif 000053
【０２７８】
ＬＣＭＳ：  蛍光のため決定的ではなかった。
すべての反応は不活性な雰囲気下で行った。ＮＭＲスペクトルはBruker dpx400で得られた。ＬＣＭＳは、zorbax SBC-18, 4.6mm x 150mm - 5μカラムまたは小さなカラム：ZORBAX（登録商標）SB-C18, 4.6 x 75mm, 3.5ミクロン（“短いカラム”）を用いたAgilent 1100で行った。カラム流速は１ｍｌ／分であり、用いた溶媒は水およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で、１０μｌのインジェクション体積であった。波長は２５４および２１０ｎｍであった。方法は以下に示す。
【０２７９】
表１７：  分析方法
【０２８０】
【表１７】
2008543296.tif 000054
【０２８１】
表１８：  化学プロトコルで使用した略語
【０２８２】
【表１８】
2008543296.tif 000055
【０２８３】
実施例６：キノビーズリガンド６（キナゾリンリガンド３２）の合成
キナゾリンリガンド３２の合成：  ７−（４−アミノ）−ブチルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン
工程１：  ７−ベンジルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン
イソプロパノール（１０ｍｌ）中、７−ベンジルオキシ−４−クロロ−６−メトキシキナゾリン（０．２５０ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）および４−ブロモ−２−フルオロアニリン（１９０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に塩酸（ジオキサン中で４Ｍ、０．２３１ｍｌ、０．９２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を９０℃で２時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷ました。固体を濾別し、冷イソプロパノールおよびエーテルで洗浄し、そして最終的に５０℃で一晩乾燥させて、標題化合物を得た（０．２９７ｇ−７９％）。
【０２８４】
【化９】
2008543296.tif 000056
【０２８５】
工程２：  ７−ヒドロキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン
７−ベンジルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン（２９７ｍｇ、０．６５４ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸に溶解し、溶液を還流温度で1時間撹拌した。 反応混合物を室温まで冷まし、氷上に注いだ。固体を濾別し、メタノール中に取り出した（taken up）。溶液をアンモニア水を用いて塩基性（ｐＨ１１）にし、真空で還元した。固体をろ過により回収し、冷水およびエーテルで洗浄し、そして最終的に真空下５０℃で一晩乾燥させて、標題化合物を得た。（０．１６５ｇ−６９％）。
【０２８６】
【化１０】
2008543296.tif 000057
【０２８７】
工程３：  ７−（４−アミノ−フタルイミド）−ブチルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン
ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）中、７−ヒドロキシ−４−（２−フルオ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン（３６０ｍｇ、０．９８９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（４１０ｍｇ、２．９６７ｍｍｏｌ）の混合物にＮ−（４−ブロモブチル）−フタルイミド（０．３５５ｇ、０．１．１８７ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応混合物を６０℃で２時間撹拌し、次いで室温まで冷ました。水（１０ｍｌ）を加え、そして沈殿物を濾別した。固体を冷水およびメタノールで洗浄し、最終的に５０℃真空下で一晩乾燥させ、標題化合物を得た（０．３１７ｍｇ−５７％）。
【０２８８】
【化１１】
2008543296.tif 000058
【０２８９】
工程４：  ７−（４−アミノ）−ブチルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６−メトキシキナゾリン
ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）中の７−（４−アミノ−フタルイミド）−ブチルオキシ−４−（２−フルオロ−４−ブロモ−フェニル）−アミノ−６メトキシキナゾリン（１５０ｍｇ、０．２６５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、ヒドラジン一水和物で処理した。反応混合物を室温で２日以上撹拌し（数分後に可溶化が起こり、出発物質の完全消費が観察された）、次いで真空下で還元した。濃い黄色油状物を「キャッチ・アンド・リリース」法（最適化された放出法を伴うIsolute SCX-2カートリッジ）を用いて精製し、標題化合物を得た（６３ｍｇ、５１％）。
【０２９０】
【化１２】
2008543296.tif 000059
【０２９１】
すべての反応は不活性な雰囲気下で行った。ＮＭＲスペクトルはBruker dpx400で得られた。ＬＣＭＳはzprbax SBC-18, 4.6mm x 150mm-５μカラムまたは小さいカラム：ZORBAX（登録商標）SB-C18, 4.6 x 75 mm、３．５ミクロン（“短いカラム”）を用いたAgilent 1100で行った。カラム流速は１ｍｌ／分であり、使用した溶媒は水およびアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）で、インジェクション体積は１０μｌであった。波長は２５４および２１０ｎｍであった。方法は以下に記載する。
【０２９２】
表１９：  分析方法
【０２９３】
【表１９】
2008543296.tif 000060
【０２９４】
表２０：  化学プロトコルで用いた略語
【０２９５】
【表２０】
2008543296.tif 000061
【０２９６】
実施例７：キノビーズリガンド７（修飾スタウロスポリン）の合成
スタウロスポリンに基づくキノビーズリンガンド７は以下のプロトコルに従って合成した。
【０２９７】
工程１：  ジグリコール酸無水物によるスタウロスポリンの修飾
スタウロスポリン（典型的には１０ｍｇ、Iris-Biotech、ドイツ）を１ｍｌの水不含ＤＭＦに溶解し、５μＬのＴＥＡを加え、０℃に冷却する。ＬＣ−ＭＳシステム（AGILENT、ドイツ）を用いた相対初期量の決定のために、この溶液から５μｌを取り、そして５０μｌのＡＣＮと混合する。ＬＣ−ＭＳ分析のために、５μｌの反応混合物を５０μｌの１００％ＡＣＮへと希釈する。よく撹拌した後で、５μｌをオートサンプラーを用いてＨＰＬＣ分析にアプライする。分離は、溶媒Ａとして水中０．１％ギ酸および溶媒Ｂとして１００％ＡＣＮ中０．１％ギ酸で４５０μｌ／分の流速で、３ｘ５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（ZORBAX-Extended C18、AGILENT、ドイツ）を用いて行う。７５分で１０％Ａから９５％Ｂへのグラジエントを用いる。ＵＶ吸収は２５４ｎｍで観察し、化合物の分子量はシングルステージ四重極ＭＳシステム（ＭＳＤ、AGILENT、ドイツ）によりオンラインで決定する。記録したデータは手動で確認する。この最初の解析は、反応産物の収率の計算のための標準となる。ＵＶシグナルのピーク面積は、純粋なスタウロスポリンに基づいて、初期量として１００％にセットした。
【０２９８】
氷冷スタウロスポリン溶液に、ＤＭＦ中、１０倍過剰のジグリコール酸無水物（Merck、ドイツ）を加える。１００％収率に近い反応は１０分で終了し、５μｌの反応混合物を５０μｌ  ＡＣＮで混合することによりＨＰＬＣで確認し、そして上述したようにＬＣ−ＭＳで分析する。分子量は、一価に荷電した分子について、４６７．５Ｄａ（非修飾スタウロスポリン）から５４５．６Ｄａ（修飾スタウロスポリン）へとシフトする。反応が完了しない場合は、別の１０倍過剰のジグリコール酸無水物を加え、そして混合物を室温でさらに３０分維持する。反応混合物は上述したようにＬＣ−ＭＳで分析する。
【０２９９】
反応が完了した後、非修飾スタウロスポリンは検出することができない。５ｍＬの水を反応混合物に混合する、第一に酸無水物をクエンチし、第二に固相抽出のために希釈する。１０ｍｌメタノールでの活性化、および水中０．１％ＴＦＡでの平衡化により、５００ｍｇ  Ｃ１８固相抽出カートリッジ（Phenomenex、ドイツ）を調製する。膜真空ポンプを用いて約２から３ｍｌ／分の流速で、溶媒をカートリッジを流し通す。水性の反応混合物をカートリッジにアプライし、上記と同じ流速で流し通す。溶液が完全にカートリッジを通り抜けて、修飾スタウロスポリンがＣ１８材料に結合した後で、それを最初に５％ＡＣＭ  ０．１％ＴＦＡ、次いで１０％ＡＣＮ、そして最後に２０％ＡＣＮ、すべては水中０．１％ＴＦＡを伴う、で洗浄する。次いで、修飾スタウロスポリンは水中７０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ、続いて水中８０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡで溶出する。溶出物は合わせて、そして真空下で乾燥する。
【０３００】
工程２：ＰｙＢｒｏＰ化学を用いる修飾スタウロスポリンの固相に結合したジアミンへのカップリング
水不含ＤＭＦ中に修飾スタウロスポリンを溶解し、そしてＤＭＦ中の予め膨潤させたビス−（アミノエチル）エチレングリコール−トリチルレジン（IRIS Biotech、ドイツ）へと加える。固相に結合したジアミンは２から３倍過剰で加える。そのスラリーに、１０μｌのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、FLUKA、ドイツ）、および、修飾スタウロスポリンに対して５倍過剰のＰｙＢｒｏＰを加える。反応を室温で１６時間、エンド−オーバー−エンドミキサー上での恒常的な混合の下で行う。非結合修飾スタウロスポリンについて、上述したようにＬＣ−ＭＳシステムを用いてＨＰＬＣにより、上清を確かめる。この工程は定量的ではなく、非結合修飾スタウロスポリンの消失のみを測定する。反応が完了した後（非結合修飾スタウロスポリンはもはや検出されなくなっている）、レジンを１０容積の水不含ＤＭＦ、および１０容積のＤＣＭで２度、洗浄する。
【０３０１】
工程３：切断反応
次いでレジンは５体積のＤＣＭ中に再懸濁し、０℃に冷却し、そして１ｍｌのＴＦＡを加える。先の淡黄色レジンは、反応を示してこの時点で暗赤色に変わるはずである。切断は０℃で２０分間、そして室温で２０分間行う。溶液を回収し、そしてレジンを１０容積のＤＣＭで２度洗浄する。すべての溶出物を合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて乾燥させる。残った油状のフィルムを０．５ｍｌ  ＤＭＦに溶解し、５ｍｌの水を加える。修飾スタウロスポリンは固相抽出により上述のように精製し、そして真空下で乾燥する。収率を、２５４ｎｍのＵＶ吸収を伴うＨＰＬＣで上述した初期の非修飾スタウロスポリンに対して、反応産物を１ｍｌのＤＭＦに溶解した後の非修飾スタウロスポリンの溶液に関連して、確認する。この溶液からの５μｌを５０μｌのＡＣＮに混合し、して５μｌをＬＣ−ＭＳで分析する。期待する産物の分子量は７２７．８Ｄａである。２５４ｎｍでのピーク面積は、記載したように１００％として分析した非修飾スタウロスポリンのピーク面積に関連する。
【０３０２】
修飾スタウロスポリンを、通常のようにそのアミノ基を介して、ＮＨＳ−活性化セファロースへのカップリングに用いる。カップリングの前に、１ｍｌのビーズを１２ｍｌの水不含ＤＭＳＯで３回洗浄し、そして１ｍｌの水不含ＤＭＳＯで再懸濁する。この懸濁液に２０μｌのＴＥＡを加え、そして等量のＤＭＦ中１μモルの修飾スタウロスポリン。添加およびウェル混合および１２００ｒｐｍで１分間の短い遠心分離の直後、２０μｌの上清を取り、５μｌをＬＣ−ＭＳで分析する。ロータリーミキサー上での１６時間の継続的な混合の後、懸濁液を再度遠心分離し、そして２０μｌを、上述したＬＣ−ＭＳによる５μｌの分析による残った非結合修飾スタウロスポリンの決定のために取る。通常、１００％の修飾スタウロスポリンが結合する。ビーズはその後１２ｍｌのＤＭＳＯで３回洗浄し、１ｍｌ  ＤＭＳＯに再び再懸濁し、そして５０μｌのエタノールアミン（MERCK、ドイツ）を未反応ＮＨＳ−活性化基をブロックするために加える。反応は、継続的な混合の下で１６時間行う。ブロッキング反応の後、ビーズは１２ｍｌのイソプロパノール（iso-propanole）（MERCK、ドイツ）で３回洗浄し、使用するまで１：１スラリーとして４℃で保管する。
【０３０３】
以下の試薬を用いた：
ＤＭＦ：  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＦＬＵＫＡ，４０２２８）；  
ＴＥＡ：  トリエチルアミン（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ０８８６）；
ＡＣＮ：  ＨＰＬＣのためのアセトニトリル（Ｍｅｒｃｋ，１．０００３０）；
ＴＦＡ：  トリフルオロ酢酸（ＦＬｕＫＡ，０９６５３）；
ＰｙＢｒｏＰ：  ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，０１−６２−００１７）；
ＤＣＭ：  ジクロロメタン（ＦＬＵＫＡ，６６７４９）；
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルホキシド（ＦＬＵＫＡ，４１６４８）。
【０３０４】
実施例８：  溶解物内競合結合および定量的タンパク質親和性プロファイル（ＰＡＰ）
本実施例は細胞溶解物（特に本発明の第三の側面を参照）における競合結合を示す。試験化合物、ビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ（ＢｉｓＶＩＩＩ、周知のキナーゼ阻害剤；Daviesら、2000．Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochemical Journal 351(Pt 1): 95-105）を細胞溶解物へと加え、それにより試験化合物が溶解物中の標的タンパク質に結合するのを可能にした。次いで、溶解物をキノビーズ親和性マトリクスと接触させ、残りの遊離標的タンパク質を捕捉した。次いで、キノビーズマトリクスに結合したタンパク質は、界面活性剤含有バッファーで溶出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、免疫検出（ウェスタンブロッティング）または質量分析検出により分析した。
【０３０５】
ウェスタンブロッティング分析のために、親和性マトリクスに結合したタンパク質を親和性マトリクスから溶出し、そしてその後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、そしてブロッティング膜に転写した。個々のキナーゼをＧＳＫ３アルファ、ＧＳＫ３ベータおよびＩＴＫに対する特異的な抗体で検出した（図４Ａ）。結果は、細胞溶解物をＢｉｓＶＩＩＩと予めインキュベーションすることは、標的タンパク質であるＧＳＫ３アルファおよびＧＳＫ３ベータのキノビーズマトリクスへの結合を、用量に依存した様式で妨げたことを示した。キナーゼ阻害剤ＢｉｓＶＩＩＩの増加する濃度は、ＩＴＫの結合は妨げなかったが、ＧＳＫ３アルファおよびＧＳＫ３ベータのキノビーズへの結合を特異的に妨げた。ＧＳＫ３ベータについて、シグナルを計数し、細胞溶解物へ加えたＢｉｓＶＩＩＩ濃度に対してプロットした（図４Ｂ）。
【０３０６】
質量分析法によるタンパク質の定量的検出のために、タンパク質を親和性マトリクスから溶出し、そしてその後ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。適切なゲル領域を切り出し、そしてトリプシンでのゲル内タンパク質分解消化にかけた。４つのトリプシン消化試料（溶解物における３つの異なるＢｉｓＶＩＩＩ濃度および１つのＤＭＳＯ対照に対応する）をｉＴＲＡＱ試薬で標識し、そして合わせた試料を単一ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析とそれに続くＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるピーク定量で分析した（Rossら、2004. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 3(12): 1154-1169）。結果は、異なるレベルの個々のタンパク質が検出され、そして相対強度値が計算されたことを示す（表２１）。個々のキナーゼについての結合曲線を示す（図５）。キナーゼ−化合物対の親和性を表す相対強度５０（ＲＩ５０）値は、キナーゼ酵素アッセイによって報告されるＩＣ５０値と同様である（Daviesら、2000. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochemical Journal 351(Pt 1): 95-105）。
【０３０７】
１．細胞培養
ジャーカット（Jurkat）細胞（ＡＴＣＣからのクローンＥ６−１、番号ＴＩＢ−１５２）は、１リットルスピナーフラスコ（Integra Biosciences、#182101）中で、１０％仔ウシ血清（Invitrogen）を添加したRPMI 1640培地（Invitrogen、#21875-034）中、懸濁液で、 ０．１５×１０６および１．２×１０６細胞／ｍｌの間の密度で増殖させ、そして遠心分離により回収した。細胞ペレットは液体窒素で凍結し、そしてその後−８０℃で保管した。
【０３０８】
２．細胞溶解物の調製
ジャーカット細胞を、溶解バッファー：５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、０．８％  ＮＰ４０、５％  グリセロール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ  ７．５、中、ポッターＳホモジナイザー中で、ホモジナイズした。２５ｍｌのバッファーあたり１の完全ＥＤＴＡ不含タブレット（プロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche Diagnostics、1 873 580）を加えた。材料は、機械化POTTER Sを用いて１０回ダウンスし、５０ｍｌファルコンチューブに移し、氷上で３０分間インキュベートし、そして４℃、２０，０００ｇで１０分間スピンダウンした（予め冷やしたS orvall SLA600中で１０，０００ｒｐｍ）。上清を超遠心（ＵＺ）−ポリカーボネートチューブ（Beckmann、355654）に移し、そして４℃で１００．０００ｇで１時間スピンした（予め冷やしたTi50.2中で３３，５００ｒｐｍ）。上清を新しい５０ｍｌファルコンチューブに再度移し、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ（BioRad）により決定し、そしてアリコットあたり５０ｍｇのタンパク質を含有する試料を調製した。試料はすぐに実験に用いるか、液体窒素で凍結して−８０℃で冷凍して保管した。
【０３０９】
３．溶解物と試験化合物のプレインキュベーション
ジャーカット溶解物のアリコット（１０ｍｇタンパク質）を異なるＢｉｓＶＩＩＩ濃度で４℃で１時間インキュベートした（ＢｉｓＶＩＩＩの最終濃度、０．０２５μＭ、０．０７４μＭ、０．２２μＭ、０．６７μＭ、２．０μＭ、および６．０μＭ）。この目的を達成するために、目的とする最終ＢｉｓＶＩＩＩ濃度の２００倍に対応するＢｉｓＶＩＩＩ溶液を、溶媒として１００％ＤＭＳＯ中で調製した（Alexix Biochemicalsカタログ番号ALX 270-056からのＢｉｓＶＩＩＩ）。５μｌのこれらの溶液を、示した最終濃度となるように１ｍｌの溶解物に加えた。対照実験のために、ＢｉｓＶＩＩＩを含まない５μｌのＤＭＳＯを用いた。
【０３１０】
４．キノビーズでのタンパク質捕捉
それぞれの予めインキュベートした溶解物試料に、４０μｌのキノビーズ（実施例１を参照）を加え、そして４℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの間、チューブはエンド−オーバー−エンドシェーカー （Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.）上で回転させた。ビーズは遠心分離により回収し、Mobicol−カラム（MoBiTech 10055）へと移し、そして０．４％  ＮＰ４０界面活性剤を含有する１×ＤＰバッファー  １０ｍｌで洗浄し、０．２％  ＮＰ４０界面活性剤を含有する１×ＤＰバッファー  ５ｍｌでの洗浄が続いた。結合したタンパク質を溶出するために、１００μｌの２×ＳＤＳ試料バッファーを添加し、カラムを５０℃で３０分間過熱し、そして溶出物を遠心分離により遠心チューブに移した。次いで、タンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。バッファーの組成および調製は実施例２に示した。
【０３１１】
５．ウエスタンブロット分析によるタンパク質検出
ウエスタンブロットは標準的な手順に従って行い、そして製造元の指示に従ってＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムを用いて現像した（Amersham Biosciences, #RPN2106）。AmershamからのＥＣＬウエスタンブロッティングシステムは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体での直接的または間接的な、特定の抗原の検出のための発光非放射性方法である。
【０３１２】
抗グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３ベータ）抗体は１：１０００の希釈率で使用した（ウサギポリクローナル抗ＧＳＫ３β、Stressgen Bioreagents、カナダビクトリア州、製品番号KAP-ST002）。この抗体はＧＳＫ３アルファもまた認識する。抗ＩＴＫ抗体もまた、１：１０００の希釈率で使用した（ウサギポリクローナル抗ＩＴＫ抗体、Upstate Lake Placid、ニューヨーク、カタログ番号06-546）。
【０３１３】
６．質量分析法によるタンパク質検出
６．１  質量分析解析の前のタンパク質消化
ゲルで分離したタンパク質は、Shevchenkoら、1996, Anal. Chem. 68:850-858に記載された工程に本質的に従って、ゲル内で還元し、アルキル化し、そして消化した。簡単には、ゲルで分離したタンパク質は清浄なメスを用いてゲルから切り出し、１０ｍＭ  ＤＴＴを用いて還元し（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中、５４℃、４５分間）、そしてその後５５ｍＭ  ヨードアセトアミド（５ｍＭ重炭酸アンモニウム中）で室温、暗所で３０分間アルキル化した。還元され、アルキル化されたタンパク質はゲル内でブタトリプシン（Promega）で、５ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）中、１０ｎｇ／μｌのプロテアーゼ濃度で、消化した。消化は３７℃で４時間進行させ、そしてその後反応は５μｌの５％ギ酸を用いて停止した。
【０３１４】
６．２  質量分析解析の前の試料調製
ゲルプラグを、水中１％ギ酸  ２０μｌで２度、水中０．１％ギ酸、６０％アセトニトリル  ２０μｌで１度抽出し、そして酸性化消化物上清とともにプールした。試料を真空で乾燥させた。
【０３１５】
６．３  ペプチド抽出物のｉＴＲＡＱ標識化
異なる濃度の試験化合物（０．０７４μＭ、０．２２μＭ、および０．６７μＭ  ＢｉｓＶＩＩＩ）および溶媒対照（０．５％ＤＭＳＯ）で処理した試料のペプチド抽出物を、異なる異性体の等圧タグ化試薬（iTRAQ Reagents Multiplex Kit、パート番号4352135、Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ）で処理した。ｉＴＲＡＱ試薬は、ペプチドの同時同定および定量を可能にする４つまでの異なる生物学的試料中のすべてのペプチドを標識できる、多発性の、アミン特異的な、安定同位体試薬である。ｉＴＲＡＱ試薬は、製造元が提供する指示に従って用いた。
【０３１６】
試料を１０μｌの５０ｍＭ  ＴＥＡＢ溶液、ｐＨ８．５に再懸濁し、そして１０μｌのエタノールを加えた。ｉＴＲＡＱ試薬は８５μｌのエタノールに溶解し、そして１０μｌの試薬溶液を試料に加えた。標識化反応は室温で１時間、水平シェーカー上で行い、水中の１０％ギ酸  １０μｌを加えることにより停止した。次いで４つの標識したサンプルを合わせ、真空遠心分離器で乾燥させ、水中０．１％ギ酸  １０μｌ中に再懸濁した。
【０３１７】
６．４  質量分析データ収集
ペプチド試料を、四重極ＴＯＦ（QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass）またはイオントラップ（LTQ Deca XP）質量分析計に直接つないだ、ナノＬＣシステム（CapLC, WatersまたはUltimate, Dionex）へとインジェクトした。ペプチドは、水性および有機溶媒を用いたグラジエントを用いてＬＣシステム上で分離した（以下を参照）。溶媒Ａは０．５％ギ酸中５％アセトニトリルであり、溶媒Ｂは０．５％ギ酸中７０％アセトニトリルであった。
【０３１８】
表３：  ＬＣシステムから溶出したペプチドは質量分析計で部分的に配列決定された。
【０３１９】
【表２１】
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【０３２０】
６．５  タンパク質同定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で生じたペプチド質量およびフラグメンテーションデータは、ＮＣＢＩ（NCBInr、dbESTならびにヒトおよびマウスゲノムについて）およびEuropean Bioinformatics Institute (EBI, ヒト、マウス、Ｄ．メラノガスターおよびＣ．エレガンス  プロテオームデータベースについて)で維持され定期的に更新される、ｆａｓｔａフォーマットされたタンパク質およびヌクレオチド配列データベースへのクエリーに用いた。タンパク質は、測定されたペプチド質量およびフラグメンテーションデータを、ソフトウェアツールMascot（Matrix Science; Perkinsら、1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.  Electrophoresis 20, 3551-3567）を用いて、データベースのエントリーから計算した同じデータを相関させることにより同定した。サーチ基準は、どの質量分析計を分析に用いたかに応じて変化した。
【０３２１】
６．６  タンパク質定量
相対的タンパク質定量は、本質的にRossおよびその同僚（Rossら、2004. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 3(12): 1154-1169)により記載されたように、ｉＴＲＡＱレポーターイオンシグナルのピーク面積を用いて行った。
【０３２２】
６．７  結合曲線およびＲＩ５０値の決定
同定されたキナーゼについての相対強度（ＲＩ）値は表２１に示す。試験化合物ＢｉｓＶＩＩＩは細胞溶解物において３つの異なる濃度で使用され、そしてＲＩ値はＤＭＳＯ対照について規格化した。選択されたキナーゼについて、ＲＩ値をＢｉｓＶＩＩＩの濃度に対してプロットし、そして双曲線平衡モデルを用いてＸｌｆｉｔプログラム（ID Busiess Solutions Ltd.）を用いてカーブフィッティングを行った（図５）。ＲＩ５０値は、キナーゼについてのＭＳシグナルの相対強度が、溶媒（ＤＭＳＯ）対照と比較して５０％となる試験化合物（ＢｉｓＶＩＩＩ）濃度に対応する。 
【０３２３】
表２１：  質量分析解析により同定されたタンパク質
試験化合物ＢｉｓＶＩＩＩは溶解物中で３つの異なる濃度で用い、そして得られたＲＩ値はＤＭＳＯ対照について規格化され、それは１．０に定められた。相対強度値を列挙する。代表は国際タンパク質インデックス（IPI、European Bioinformatics Institute）のデータベースアクセッション番号に関連し、タンパク質配列の編集はいくつかの高品質配列データベース（GenBank、EMBL、SwissProt、RefSeq、Ensemblを含む）に由来する。キナーゼ名は、ヒトキナーゼ命名法（http://kinase.com）および、補足の材料の項目で特定されるManning et al., 2002, Science 298, 1912-1934に従った。
【０３２４】
【表２２】
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【図面の簡単な説明】
【０３２５】
【図１】キノビーズ（kinobeads）リガンドの構造。リガンドの源および合成経路は、実施例１に記載される。図１ａ：キノビーズリガンド１（ビスインドリルマレイミドＶＩＩＩ）、図１ｂ：キノビーズリガンド２（プルバラノールＢ）、図１ｃ：キノビーズリガンド３（CZC00007324、（7-(4-アミノメチル-フェニルアミノ)-3-(2,6-ジクロロ-フェニル)-1-メチル-1H-[1,6]ナフチリジン-2-オン））、図１ｄ：キノビーズリガンド４（CZC00008004、2-(4'-アミノメチルフェニルアミン)-5-フルオロ-ピリミジン-4-イル)-フェニル-アミン）
【図２】シグナロキノーム（実施例２を参照されたい）。この図は、キノビーズを用いた薬剤選抜（drug pulldown）（左の円）と抗ホスホチロシン抗体ビーズを用いた慣用の免疫沈降（右の円）との比較を示す。キノビーズの実験では、合計６２６のタンパク質が同定され、これらのうち１００がキナーゼである。免疫沈降（ＩＰ）実験では、合計５０３のタンパク質が同定され、これらのうちの１２がキナーゼであった。双方の実験で同定されたキナーゼ（共通のキナーゼ）は、重なった部分に掲載される。結果は、キノビーズを用いると、抗ホスホチロシン抗体ビーズ（１２キナーゼ）と比較して、有意により多くのキナーゼが同定された（１００キナーゼ）ことを示す。
【図３】キノビーズリガンド５、６および７の構造。該リガンドの合成経路は、実施例５、６および７に記載される。図３ａ：キノビーズリガンド５（インドールリガンド９１）の構造、図３ｂ：キノビーズリガンド６（キナゾリンリガンド32）の構造、図３ｃ：キノビーズリガンド７（修飾スタウロスポリン）の構造
【図４】定量的タンパク質親和性プロファイル（ＰＡＰ）。この図は、溶解物の試験化合物Ｂｉｓ  ＶＩＩＩとの競合、およびウエスタンブロット解析を用いたタンパク質の検出を示す。選抜実験を、１０ｍｇのタンパク質を含有するジャーカット細胞溶解物試料を用いて、実施例８に記載のように行った。投入された溶解物（レーンＬ：５０μgタンパク質）およびキノビーズからのＳＤＳ溶出液（レーン１〜７）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、メンブレンに転写し、そして抗体でプローブした。図４Ａ：ウエスタンブロットを、まず、ＧＳＫ３βに対する抗体でプローブした。ペルオキシダーゼで標識した二次検出抗体を、化学発光検出に用いた。ローディング対照として、ブロットを、抗ＩＴＫ抗体でプローブした。レーンＬ：５０μｇのジャーカット溶解物；レーン１：６．０μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン２：２．０μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン３：０６７μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン４：０．２２μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン５：０．０７４μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン６：０．０２５μＭ  Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ；レーン７：：０．５％  ＤＭＳＯ（溶媒対照）、図４Ｂ：ＧＳＫ３βのキノビーズへの結合に対する、Ｂｉｓ  ＶＩＩＩによる濃度依存的競合。図２Ａに示したウエスタンブロット上のＧＳＫ３βのバンドを、定量し、そして溶解物に加えたＢｉｓ  ＶＩＩＩの濃度に対してプロットした。
【図５−１】キナーゼの定量的タンパク質親和性プロファイル。実施例８の定量的親和性プロファイル実験の結果を、四つのキナーゼについて示す。相対強度（ＲＩ）値を、化合物の濃度に対してプロットする（Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ）。ＲＩ５０値とは、ＤＭＳＯ対照と比較して所与のキナーゼに対するＭＳシグナルの相対強度が５０％であるときの、化合物の濃度を示す。図５Ａ：グリコーゲンシンターゼキナーゼ３αに対する曲線（GSKa；RI50＝72.7 nM）、図５Ｂ：グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βに対する曲線（GSKb；RI50＝95 nM）、
【図５−２】キナーゼの定量的タンパク質親和性プロファイル。実施例８の定量的親和性プロファイル実験の結果を、四つのキナーゼについて示す。相対強度（ＲＩ）値を、化合物の濃度に対してプロットする（Ｂｉｓ  ＶＩＩＩ）。ＲＩ５０値とは、ＤＭＳＯ対照と比較して所与のキナーゼに対するＭＳシグナルの相対強度が５０％であるときの、化合物の濃度を示す。図５Ｃ：プロテインキナーゼＣαに対する曲線（PKCa；RI50＝12.2 nM）、図５Ｄ：プロテインキナーゼＣβに対する曲線（PKCb；RI50＝21.5 nM）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【国際調査報告】
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2008543296.tif 000072
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