(57)【要約】薬学的ポリペプチド組成物は、心臓細胞の生存を促進し、心臓細胞を心臓領域に補充し、心臓細胞の分化を刺激し、心臓細胞の増殖を刺激し、そして心臓細胞の活性を促進することによって、心臓の状態を処置する。心臓領域へこれらの組成物を提供する方法としては、カテーテル法および直接注入が挙げられる。本発明において使用され得る組成物は、薬学的組成物を含み、そして心臓の状態を処置し得る１つ以上の治療薬を含む。本発明の治療薬は、少なくとも２つの過程に作用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１の治療薬を含む、心臓の状態を処置するための、ヒト被験体の心臓への局所送達のための薬学的組成物であって、該第１の治療薬は、少なくとも第１の単離されたポリペプチドを含み、該第１の単離されたポリペプチドは、単独でか、または少なくとも第２の治療薬と組み合わせて、所望の生物学的活性を生じ、ここで、該所望の生物学的活性は：
（ａ）心臓細胞の生存を促進すること；および／または
（ｂ）心臓細胞の分化を促進すること；および／または
（ｃ）心臓細胞の増殖を促進すること；
を含み、そして
ここで、該第１の治療薬が、該組成物における唯一の治療薬であるとき、該第１の治療薬がＦＧＦ１またはＦＧＦ２以外である場合、該組成物は、冠状動脈に送達されず、該第１または第２の治療薬は、ＦＧＦファミリーのメンバー、ＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＩＧＦファミリーのメンバー、エンドセリンファミリーのメンバー、ＬＩＦファミリーのメンバー、ＥＧＦファミリーのメンバー、ＰＤＧＦファミリーのメンバー、ＴＧＦファミリーのメンバー、ＩＬ−１１ファミリーのメンバー、ＴＮＦファミリーのメンバー、インターフェロンファミリーのメンバー、仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６あるいはｃｈｒｏｌ０ｏｒｆ５８またはスプライスバリアントまたはそれらの活性なフラグメントの１つ以上を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記組成物が、さらに第２の治療薬を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１または第２の治療薬が、心臓細胞の生存および／または増殖を促進する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１または第２の治療薬が、ＦＧＦ５、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ニューレグリン１−β１またはベータセルリンを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２の治療薬が、ＰＤＧＦファミリーのメンバー、ＩＧＦファミリーのメンバーおよび／またはサイモシンβ４を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、カテーテルによる送達に適応されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、直接注入による送達に適応されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの治療薬が、心筋細胞死を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の治療薬が、唯一の治療薬であるとき、該第１の治療薬が、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ以外である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記心臓細胞が、心臓の幹細胞または心臓の前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、さらに少なくとも第３の治療薬を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第３の治療薬が、ＥＧＦファミリー、ＩＧＦファミリーまたはＰＤＧＦファミリーのメンバーを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、さらに少なくとも第４の治療薬を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第４の治療薬が、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーまたはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１、第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＦＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６またはＦＧＦ−１７である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第１、第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＥＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＥＧＦファミリーのメンバーが、アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリン、前記ニューレグリンファミリーのメンバーまたはそれらのスプライスバリアントである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ベータセルリンのスプライスバリアントが、配列番号１８０を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ニューレグリンファミリーのメンバーが、ＮＲＧ１−αまたはＮＲＧ１−β１である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１、第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、ＰＤＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＤＧＦファミリーのメンバーが、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢまたはＰＤＧＦ−ＡＢである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１、第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、ＩＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＩＧＦファミリーのメンバーが、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１の治療薬が、前記ＴＮＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＴＮＦファミリーのメンバーが、ＴＮＦ−βまたはその活性なフラグメントである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１の治療薬が、前記ＴＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＴＧＦファミリーのメンバーが、ＴＧＦ−αである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＴＧＦファミリーのメンバーが、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＴＧＦ−βファミリーのメンバーが、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１の治療薬が、前記インターロイキンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記インターロイキンファミリーメンバーが、ＩＬ−１１である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記インターロイキンファミリーメンバーが、オンコスタチンＭである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第１の治療薬が、インターフェロンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
前記インターフェロンファミリーのメンバーが、インターフェロン−α１である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１の治療薬が、配列番号２０またはその活性なフラグメントを含むポリペプチドであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記第１の治療薬が、前記ＶＥＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３、のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＶＥＧＦファミリーメンバーが、ＶＥＧＦ−Ｃである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第１の治療薬が、前記エンドセリンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
前記エンドセリンファミリーのメンバーが、エンドセリン−１またはその活性なフラグメントである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第１の治療薬が、前記ＬＩＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり、そして前記第２、第３または第４の治療薬が、もしあれば、前記ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択される、ポリペプチドまたはその活性なフラグメントである、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＬＩＦファミリーのメンバーが、ＬＩＦまたはその活性なフラグメントである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記治療薬の少なくとも１つが、融合分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記融合分子が、融合パートナーを含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記融合パートナーが、該融合パートナーが存在しない被験体における前記治療薬の半減期よりも該被験体において長い半減期を該治療薬に与える、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記治療薬の半減期が、少なくとも半時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間または前記融合パートナーが存在しない場合の該治療薬の半減期より前記被験体において長い時間である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記融合パートナーが、ポリマー、免疫グロブリン分子、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、アルブミン、ロイシンジッパードメイン、オリゴマー形成ドメイン、マンノース結合タンパク質、マクロファージスカベンジャータンパク質、Ｆｃ領域またはこれらのいずれかの活性なフラグメントを含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール部分であって；前記免疫グロブリン分子が、Ｆｃ領域の少なくとも一部を含み；前記オリゴマー形成ドメインが、テトラネクチン三量体形成ドメイン、コイルドコイルドメイン、コラーゲンドメイン、コラーゲン様ドメインまたは二量体の免疫グロブリンドメインを含み；前記アルブミンが、アルブミン分子、アルブミンの１つ以上のフラグメント、アルブミンに結合するペプチド、脂質と結合体化するアルブミン分子または別の分子に結合するアルブミン分子を含む、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ポリエチレングリコール部分が、分枝状または直鎖状のポリマーであるか、または前記治療薬のアミノ基を介して該治療薬に結合し；前記コイルドコイルドメインが、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマー基質タンパク質において見出されるコイルドコイルドメイン、アンジオポエチンコイルドコイルドメインまたはロイシンジッパードメインを含み；前記コラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメインが、コラーゲンにおいて見出されるコラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメイン、マンノース結合レクチン、肺サーファクタントプロテインＡ、肺サーファクタントプロテインＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャーレセプターまたはエミリンを含み；そして前記二量体の免疫グロブリンドメインが、抗体ＣＨ３ドメインを含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記融合分子が、リソソームにおいて改善されたレセプター結合性を有する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項５１】
前記治療薬の少なくとも１つが前記危険にさらされている部分の心筋細胞においてβ−カテニンを安定化する、請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５２】
生分解性の担体を含む薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記生分解性の担体が、多糖を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記多糖が、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはアルギネートを含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５６】
前記細胞外マトリックスが、コラーゲンを含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記組成物が、生物学的マーカーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５８】
前記生物学的マーカーを追跡することが、前記被験体における前記治療薬の位置を追跡する、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記組成物が、ゲル組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６０】
前記心臓の状態が、虚血、虚血性心臓外傷、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈疾患および／または心筋症である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６１】
前記第１の治療薬が、インビトロにおけるカルディオスフィア（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）生存アッセイおよび／またはインビトロにおけるカルディオスフィア増殖アッセイにおいて細胞の生存率を増加させる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
請求項１、２、１１または１３のいずれかに記載の組成物、心臓へ該組成物を送達するためのデバイスおよび冠状動脈以外の心臓へ該組成物を注入するための指示書を備える、被験体において心臓の状態を処置するためのキット。
【請求項６３】
前記デバイスが、カテーテルである、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記デバイスが、危険にさらされている部分へ前記組成物を送達する、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
被験体において心臓の状態を処置する方法であって、該方法は：
（ａ）請求項１、２、１１または１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を提供する工程；および
（ｂ）該被験体の冠状動脈以外の該被験体の心臓への局所投与によって該組成物を該被験体に投与する工程
を含む、方法。
【請求項６６】
前記組成物を投与する工程が、危険にさらされている部分に該組成物を投与する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物を投与する工程が、デバイスによって該組成物を送達する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記デバイスが、カテーテルである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記組成物を投与する工程が、該組成物を注入する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記被験体に前記組成物を投与する工程が、少なくとも２回、３回、４回もしくは４回以上の注入；または２用量、３用量、４用量または４用量以上を投与する工程を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記被験体へ前記組成物を投与する工程が、心臓の前駆細胞または心臓の幹細胞を投与範囲に補充し；心臓の前駆細胞または心臓の幹細胞の分化を刺激し；心臓の前駆細胞の増殖を刺激し；そして／または心臓の前駆細胞または心臓の幹細胞の活性を促進する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記被験体へ前記組成物を投与する工程が、１回のセッション中に、虚血範囲または被験体の心臓もしくは心筋層の危険にさらされている部分の端の周辺の１、２、３、４箇所または４箇所以上かつ最大１０箇所までの部位に該組成物を注入する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記被験体へ前記組成物を投与する工程が、１回以上のセッションにおいて、該組成物を注入する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記組成物を全身的に投与する工程をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物を、前記被験体に１日に１回または１日おきに１回、１、２、３、４もしくは５回までか、または５回以上投与する、請求項６５または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物を、前記被験体に１日に１回、１週間に１、２、３、４または５回まで投与する、請求項６５または７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物を、前記被験体に１週間に１回で、１、２、３、４、５週間まで、または５週間以上に亘って投与する、請求項６５または７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記組成物を、前記被験体に１週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月おきに１回、３ヶ月おきに１回、６ヶ月おきに１回または１年に１回投与する、請求項６５または７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記被験体が、約１ｎｇ〜約１０ｍｇの範囲の用量を投与される、請求項６５または７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１の治療薬が、約１ｎｇ〜約５０ｍｇの量で前記組成物中に存在する、請求項６５または７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年１月２５日に出願された、米国仮特許出願第６０／６４６，５２０号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｎｊｕｒｙ」；２００５年４月２７日に出願された、米国仮特許出願第６０／６７５，０８６号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｎｊｕｒｙ」；２００５年４月２９日に出願された、米国仮特許出願第６０／６７５，８５９号「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｉｎｊｕｒｙ」；２００５年７月２２日に出願された、米国仮特許出願第６０／７０１，４７４号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」；２００５年９月１４日に出願された、米国仮特許出願第６０／７１６，４９１号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」；および２００５年１１月２５日に出願された、米国仮特許出願第６０／７３９，８１５号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」に対する優先権の利益を主張する。これらの開示は、全て、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、本願は、２００５年４月２９日に特許協力条約の下で出願された、ＰＣＴ／ＵＳ０５／１４９６３「Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ−１  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」；および２００５年６月３日に特許協力条約の下で出願された、ＰＣＴ／ＵＳ０５／１９４９１「Ｎｏｖｅｌ  Ｇ−ＣＳＦ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ，ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」に関連する。これらの開示は、いずれも、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本願は、一般に１つ以上の治療薬を心臓に送達することによって心臓の状態を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
心虚血
心虚血は、冠状動脈内の血流が制限されるときに生じる。制限された血流は、動脈の内壁または内層における斑の蓄積が原因であることが最も通常である。制限された血流のために、最適な量の酸素および栄養分を得ることができない心筋細胞は、最適なレベル以下で機能し、死滅し得る。最終的に心臓は、血液を効率的に送り込むことができなくなる。心虚血のエピソードは、異常な心拍リズム（不整脈）を引き起こし得、失神または心拍停止のいずれかおよび心臓性突然死につながり得る。心筋の衰弱（心筋症）もまた生じ得る。血餅が斑によってすでに狭められた動脈を通過する血流を完全に妨害するとき、心臓発作が起き得る。
【０００４】
心虚血を処置するための多くの選択肢が有効である。いくつかの選択肢は、減少した血流のために心臓が受け取る酸素および栄養分の低下に比例して心臓が必要とする酸素を減少させることに基づく。これらの処置の選択肢は、心拍数を遅くし、血圧を低下し、そして血管を弛緩する薬剤を与えることを含む。このような薬剤としては、β遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬および硝酸塩が挙げられる。β遮断薬は、体のβレセプター上のアドレナリンの作用を遮断する。結果として、心臓は、少ししか血液および酸素を必要としないので、それほど激しく働かなくてもよい。カルシウムチャネル遮断薬は、心臓細胞へのカルシウムイオンの移動を遮断するので、動脈を弛緩および拡張させる。このメカニズムによって、カルシウムチャネル遮断薬は、血圧を降下させる。トリニトログリセリン（ＧＴＮ）、イソソルビドジニトレートおよびイソソルビドモノニトレートを含む硝酸塩薬はまた、冠状動脈を弛緩および拡張させる。アスピリンおよび他の抗血小板薬のような他の薬剤は、すでに狭まっている動脈における血餅形成の機会を減少させ得る。運動および／またはストレス管理技術がまた、推薦される。バルーン血管形成術またはバイパス手術などのより侵襲的な手技は、冠状動脈における封鎖を解決するために使用され得る。薬物コーティングされたステントは、血管形成術後に動脈が再び狭くなること（再狭窄）の確率を減じ得る。
【０００５】
遺伝子治療は、心臓への血液の供給を改善し、そして心虚血を有する患者におけるアンギナを軽減するための選択肢としての見込みを示している。治療的な血管新生の分野において、新しい血管の創造を促進する実験的な処置が開発されている。Ａｄ５ＦＧＦ−４という、線維芽細胞成長因子−４についての遺伝子を含む複製欠損性血清型５型アデノウイルスの注入は、心臓の虚血範囲を改善することが見出され、かなりの数の患者が、アンギナの症状が軽減したと報告されている（非特許文献１；非特許文献２）。しかしながら、心臓への成長因子遺伝子の導入の構想および導入された遺伝子が害を及ぼす可能性が、懸念されている。
【０００６】
虚血性心臓外傷
虚血性心臓外傷は、心虚血の結果として、心筋層によって維持される。細胞レベルにおいて、虚血性心臓外傷は、境界域または細胞が典型的に遅延性の死滅を起こしている「危険にさらされている部分（ｖｏｌｕｍｅ  ａｔ  ｒｉｓｋ）」（ＶＡＲ）によって囲まれる細胞壊死の中心の領域によって特徴付けられる。心筋梗塞および再灌流後の心筋細胞喪失の実質的な部分は、この領域内のアポトーシスから生じることが示されている。さらに、梗塞した領域への炎症細胞の補充の結果として、さらなる外傷が起きる。炎症細胞は、走化性サイトカインおよび細胞傷害性サイトカインならびに他の炎症分子を放出するので、外傷の部分を拡大する（非特許文献３）。細胞死および外傷のこれらの形成は、最終的に心不全につながり得る。
【０００７】
虚血後の遺伝子発現の変化が、観察されている。ｃＤＮＡアレイアプローチを使用して、非特許文献４において、心筋層の虚血が、アポトーシス制御因子ＢＡＸ遺伝子、初期増殖応答因子Ｅｇｒ−１およびＥｇｒ−３遺伝子および心筋発生に関連する遺伝子（例えば、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）および胎児性ミオシンアルカリ軽鎖（ＭＬＣ）をコードする遺伝子）の転写を誘導することが示された。他方では、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子転写が、虚血に応答して減少した。
【０００８】
明らかな危険性、制限および不利点を有する心臓移植を除いて、喪失した心筋細胞を置換する治療法が現在のところ有用ではない。心臓移植は、心不全の問題を解決することができ、そして患者の症状を軽減することができるが、その有用性は、適切なドナー臓器の入手可能性および臓器の拒絶の問題によって厳しく制限される（非特許文献５）。さらに、心機能を改善するための薬理学的物質の能力は、現在まで、これらの物質が、細胞喪失に関する基本的な問題に立ち向かわないために制限される。従って、虚血性心臓外傷のための代替の処置の選択肢の必要性が残っている。
【０００９】
うっ血性心不全
うっ血性心不全は、最も重篤な心臓の状態の結果である。この病理学的状態は、心臓が、組織を代謝するのに必要な量に比例した速度で血液を送り込むことをできなくする異常な心筋層の機能によって特徴付けられる。その状態は、心筋への一次損傷または慢性的に過剰な仕事量に起因する心筋への二次損傷によって生じ得る。いずれの場合においても、うっ血性心不全の根拠は、不完全な心筋層の収縮である。
【００１０】
心虚血、それによって生じる外傷およびうっ血性心不全などの他の心臓の状態の処置は、工業化世界における主な国際的な健康上の難題として残されている。心臓の状態は、アテローム性動脈硬化症の合併症であり、先進国における死および障害の主な原因である。心筋細胞死を予防するか、または死滅した心筋細胞を置換する治療法は、現在、厳しく制限されている。幹細胞移植および遺伝子導入に基づいた処置は、未だ研究中である（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。成長因子の送達に基づいた処置は、成長因子誘導性の腫瘍形成の副作用の可能性をまだ克服していない。心機能を改善する方法において増殖または分化させるために、損傷した心筋細胞の機能を復元することまたは心筋層の細胞を刺激することによって心不全を効果的に治療する方法は、まだ確立されていない。従って、心臓の状態を処置するための新しい方法、組成物および薬剤を開発する必要性が残っている。
【非特許文献１】Ｇｒｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００３）４２：１３３９−１３４７
【非特許文献２】Ｇｒｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００３）９２：２４Ｎ−３１Ｎ
【非特許文献３】Ｃａｌｖｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：４８０２−４８０６
【非特許文献４】Ｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０００）２：９３−１００
【非特許文献５】Ｌｏｖｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｕｒ，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．（２００４）３７：６７−８７
【非特許文献６】Ｄａｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００５）１０２（１０）：３７６６−３７７１
【非特許文献７】Ｍａｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｔａｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．（２００４）５：３４０−３４２
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｉ＆Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｃｕｒｒ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｒｅｐ．（２００３）５：１９１−１９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
表の簡単な説明
表１は、本発明の分子に対する配列番号を示す（配列番号：１〜３４８）。欄１は、内部の名称識別番号（ＦＰ  ＩＤ）を示す。欄２は、核酸配列のオープンリーディングフレームに対するヌクレオチド配別番号を示す（配列番号：Ｎ１）。欄３は、ポリペプチド配列に対するアミノ酸配列識別番号を示す（配列番号：Ｐ１）。欄４は、供給源のクローンまたは配列のポリペプチド識別番号を示す（供給源  ＩＤ）。
【００１２】
表２は、本発明の分子のＰｆａｍ座標を示す。欄１は、ポリペプチドの内部の名称識別番号を示す（ＦＰ  ＩＤ）。欄２は、ポリペプチドの供給源識別番号を示す（供給源ＩＤ）。欄３は、Ｐｆａｍドメインが存在するときその名称を示し、そして欄４は、ドメインの座標を示す。
【００１３】
表３は、本発明のポリペプチドの特性を示す。欄１は、ポリペプチドの内部の名称識別番号を示す（ＦＰ  ＩＤ）。欄２は、予測されるタンパク質の長さを示す。欄３は、ポリペプチドが分泌されるか否かを表す内部のパラメータ（ツリーボート（ｔｒｅｅ  ｖｏｔｅ））を示す。１のツリーボートは、ポリペプチドが分泌される可能性が高いことを表し、そして０のツリーボートは、ポリペプチドが分泌される可能性が低いことを表す。欄４は、シグナルペプチド座標を示す。欄５は、成熟タンパク質座標を示す。欄６は、別のシグナルペプチド座標を示す。欄７は、成熟タンパク質座標の別の予測を示す。欄８は、疎水性座標を示す。欄９は、膜貫通型ドメイン（ＴＭ）の数を示す。欄１０は、ＴＭ座標を示す。欄１１は、非ＴＭ座標を示す。
【００１４】
表４は、本発明のポリペプチド配列の一般のアノテーションを示す。欄１は、ポリペプチドの内部の名称識別番号（ＦＰ  ＩＤ）またはそのポリペプチドの商業的供給源のいずれかを示す。欄２は、ｐＡｋｔアッセイにおいて確認されたポリペプチドを示す。欄３は、ｐＥＲＫアッセイにおいて確認されたポリペプチドを示す。欄４は、ｐＳＴＡＴ３アッセイにおいて確認されたポリペプチドを示す。欄５は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＩＤを示す。欄６は、ＷＴ（野生型）タンパク質ＩＤを示す。欄７は、アッセイされたクローンＩＤを示す。欄８は、クローンの代表的なタンパク質を示す。欄９は、クラスターＩＤ番号を示す。欄１０は、クラスターアノテーションを示す。
【００１５】
表５は、心筋細胞スクリーニングにおいて試験され、同定された３群のクローンを示す。第１の群のクローンは、２つの異なるトランスフェクションにおいて試験され、同定され、第２の群のクローンは、１つのトランスフェクションにおいて試験され、同定され、そして第３の群のクローンは、組換えタンパク質を用いて試験された。欄１は、発現されたタンパク質ＩＤを示す。欄２は、クローンＩＤを示す。欄３は、タンパク質の代表的なアノテーションを示す。欄４は、各シグナルについての中央値からのシグマを示す。欄５は、活性パーセントを示す。欄６は、タンパク質の（９６ウェルプレートにおける）ウェルの位置を示す。欄７は、解読カテゴリー、すなわち、ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫまたはｐＳＴＡＴ３を示す。１０番染色体のオープンリーディングフレーム５８（ｃｈｒｏ１０ｏｒｆ５８）、ｓｕｓｈｉ反復配列を含むタンパク質−Ｘ連鎖２およびＧ−ＣＳＦスプライスバリアント（配列番号１８３）を含むいくつかのタンパク質は、１つ以上の読み取り（例えば、Ｇ−ＣＳＦスプライスバリアントについてｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ３）で示した。
【００１６】
産業上の利用可能性
本発明の組成物および方法およびキットは、心臓の状態の処置に有用であり、これらの状態としては、虚血、虚血性心臓外傷、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈疾患および心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。これらはまた、細胞の生存、分化、増殖および再生の促進に有用である。
【００１７】
発明の概要
本発明は、心臓の状態を処置するための組成物および心臓の外傷の部位へ１つ以上の治療薬を含む組成物を送達することによって心臓の状態を処置するための方法を提供する。送達は、心臓領域に局所的であってもよいし、または静脈内であってもよい。局所送達と静脈内送達との両方は、治療的に有効な濃度の薬剤を治療的な作用が必要である部位へ提供し得る。いくつかの実施形態において、局所送達は、可能性のある望ましくない全身性副作用を回避し得る。
【００１８】
本発明は、損傷した心筋細胞の機能を回復し得る外傷部位の危険にさらされている部分（ＶＡＲ）領域へ治療薬を正確に送達する方法を提供し、それによって、望ましくない心臓の状態、例えば、虚血性心臓外傷または他の心臓の筋障害に対する治療または治癒を提供する。１つの実施形態において、送達方法は、心臓カテーテル法を使用する。これは、例えば、虚血性心臓外傷の間またはその後のその領域における心筋細胞死を予防し得るか、または心筋細胞再生を刺激し得る、薬剤を（ＶＡＲ）領域へ送達するためのカテーテルの使用を含む。他の局所送達方法としては、例えば、適切なデバイスまたは手段によって導かれる直接注入が挙げられる。
【００１９】
本発明において使用され得る組成物は、薬学的組成物を含み、そして心臓の状態を処置し得る１つ以上の治療薬を含む。本発明の治療薬は、少なくとも２つの過程に作用し得る。本治療薬は、ＶＡＲ領域または推定的なＶＡＲ領域における心筋細胞の細胞死を予防する生存因子であり得る。あるいは、本治療薬は、死んでいるかまたは死にかかっている心筋細胞を交換するために前駆細胞（例えば、心臓の幹細胞）を動員および／または刺激し得る。両方のタイプの治療薬が、心臓機能を増大させ、そして心臓の状態に対する予防薬、処置または治癒を提供する。本発明の薬剤としては、治療的なポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明はまた、心臓の前駆細胞を補充し、そして／または心筋細胞もしくは心筋細胞の先祖の生存、分化および／または増殖を促進する能力を有し、そして心臓の状態を処置するのに有用である一定のタンパク質またはそれらのフラグメントを提供する。その心臓の状態としては、虚血性心臓外傷、心筋梗塞、心不全、冠状動脈疾患、他の心臓の筋障害などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本願は、心臓の状態を処置するための被験体の冠状動脈以外の被験体の心臓への局所送達のための、少なくとも第１の治療薬を含む薬学的組成物に関し、ここで第１の治療薬は、少なくとも第１の単離されたポリペプチドを含み、その第１の単離されたポリペプチドは、所望の生物学的活性を生じるときに単独か、または少なくとも第２の治療薬と組み合わせて有効であり、所望の生物学的活性は、心臓細胞の生存を促進すること；心臓細胞の分化を促進すること；および／または心臓細胞の増殖を促進することを含む。薬学的組成物はさらに、順番にサイモシンβ４を含み得る第２の治療薬を含み得る。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態において、第１の治療薬は、心臓細胞の生存および／または増殖を促進するときに有効である。第１の治療薬は、ＦＧＦファミリーメンバー、ＰＤＧＦファミリーのメンバー、ＥＧＦファミリーのメンバー、ＩＧＦファミリーのメンバー、ＴＮＦファミリーのメンバー、ＴＧＦファミリーのメンバー、インターフェロン（ＩＦＮ）ファミリーのメンバー、トレフォイルファクター（ＴＴＦ）ファミリーのメンバー、ＩＬ−６ファミリーのメンバー、エンドセリンファミリーのメンバー、ＩＬ−１ファミリーのメンバー、ＩＬ−１１ファミリーのメンバー、ＶＥＧＦファミリーのメンバー、Ｇ−ＣＳＦファミリーのスプライスバリアント、ＬＩＦファミリーのメンバー、配列番号１８０を含むポリペプチド、配列番号１８３を含むポリペプチド、配列番号２０を含むポリペプチドもしくはそのスプライスバリアント、またはそれらの活性なフラグメントの任意の１つ以上を含み得る。
【００２３】
薬学的組成物は、カテーテルまたは直接注入による送達に適応され得る。薬学的組成物は、例えば、危険にさらされている部分における心筋細胞死を阻害する少なくとも１つの治療薬を含み得る。
【００２４】
本発明に記載の心臓の状態は、虚血であり得る。他の実施形態において、心臓の状態は、虚血性心臓外傷、心不全、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈疾患または心筋症であり得る。本発明に記載の心臓細胞は、心臓の幹細胞または心臓の前駆細胞であり得る。被験体は、ヒトであり得る。
【００２５】
薬学的組成物はさらに、少なくとも第２の治療薬、少なくとも第３の治療薬または少なくとも第４の治療薬を含み得る。薬学的組成物における第１、第２、第３および／または第４の治療薬は、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。薬学的組成物における第１、第２、第３および／または第４の治療薬は、ＦＧＦファミリーのメンバー（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６またはＦＧＦ−１７が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。
【００２６】
第１、第２、第３および／または第４の治療薬は、ＥＧＦファミリーのメンバー（アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリンまたはベータセルリンのスプライスバリアントが挙げられるがこれらに限定されない）またはそれらの活性なフラグメントであり得る。ベータセルリンのスプライスバリアントは、配列番号１８０を含み得る。他の実施形態において、ＥＧＦファミリーのメンバーは、ニューレグリンファミリーのメンバー（ＮＲＧ１−αまたはＮＲＧ１−βが挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。
【００２７】
第１、第２、第３および／または第４の治療薬は、ＰＤＧＦファミリーのメンバー（ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣまたはＰＤＧＦ−Ｄが挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１、第２、第３および／または第４の治療薬はまた、ＩＧＦファミリーのメンバー（ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。
【００２８】
第１の治療薬は、ＴＮＦファミリーのメンバー（ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βが挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬はまた、ＴＧＦファミリーのメンバー（ＴＧＦ−αが挙げられるが、これに限定されない）もしくはＴＧＦ−βファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得る。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３であり得る。第１の治療薬は、ＩＬ−１ファミリーのメンバー（ＩＬ−１αが挙げられるが、これに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。他の実施形態において、第１の治療薬は、ＩＬ−６ファミリーのメンバー（オンコスタチンＭまたはＩＬ−６が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬はまた、配列番号１８３を含むＧ−ＣＳＦのスプライスバリアントまたはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬は、インターフェロン（ＩＦＮ）ファミリーのメンバー（インターフェロン−α１が挙げられるが、これに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬は、トレフォイルファクターファミリーのメンバー（トレフォイルファクター２が挙げられるが、これに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬はまた、配列番号２０を含むポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬は、ＶＥＧＦファミリーのメンバー（ＶＥＧＦ−Ｃが挙げられるが、これに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬は、エンドセリンファミリーのメンバー（エンドセリン−１またはエンドセリン−２が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１の治療薬はまた、ＬＩＦファミリーのメンバー（ＬＩＦが挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。
【００２９】
治療薬の少なくとも１つは、融合分子であり得る。融合分子は、融合パートナーを含み得る。融合パートナーは、融合パートナーが存在しない被験体における治療薬の半減期よりも被験体において長い半減期を治療薬に与え得る。治療薬の半減期は、少なくとも半時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間または被験体において融合パートナーが存在しない治療薬の半減期よりも長い時間であり得る。融合パートナーは、ポリマー、免疫グロブリン分子、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、アルブミン、ロイシンジッパードメイン、テトラネクチン三量体形成ドメイン、マンノース結合タンパク質、マクロファージスカベンジャータンパク質、Ｆｃ領域またはこれらのいずれかのフラグメントを含み得る。ポリマーは、ポリエチレングリコール部分であり得る。ポリエチレングリコール部分は、治療薬のアミノ基を介して治療薬に結合され得る。ポリエチレングリコール部分は、分枝状ポリマーまたは直鎖状ポリマーであり得る。免疫グロブリン分子は、少なくともＦｃ領域の一部を含み得る。アルブミンは、アルブミン分子、アルブミンの１つ以上のフラグメント、アルブミンに結合するペプチド、脂質と結合体化するアルブミン分子または別の分子に結合するアルブミン分子を含み得る。
【００３０】
他の実施形態において、融合パートナーは、オリゴマー形成ドメインを含み得る。オリゴマー形成ドメインは、コイルドコイルドメイン、コラーゲンドメイン、コラーゲン様ドメインまたは二量体の免疫グロブリンドメインを含み得る。コイルドコイルドメインは、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマー基質タンパク質中に見られるコイルドコイルドメイン、アンジオポエチンコイルドコイルドメインまたはロイシンジッパードメインを含み得る。コラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメインは、コラーゲン中に見られるコラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメイン、マンノース結合レクチン、肺サーファクタントプロテインＡ、肺サーファクタントプロテインＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャーレセプターまたはエミリンを含み得る。二量体の免疫グロブリンドメインは、抗体ＣＨ３ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、融合分子は、リソソームにおける改善されたレセプター結合性を有する。
【００３１】
組成物における薬学的に許容可能な担体は、生分解性の担体を含み得る。生分解性の担体は、入れ替わりにヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはアルギネートを含み得る多糖を含み得る。本発明の薬学的組成物はまた、さらにコラーゲンを含み得る細胞外マトリックスを含み得る。
【００３２】
組成物は、本発明のいくつかの実施形態において生物学的マーカーを含み得る。生物学的マーカーは、被験体における治療薬の位置を追跡またはモニターするために追跡され得る。本発明に記載の組成物は、ゲル組成物であり得る。
【００３３】
本発明の特定の実施形態において、薬学的組成物における第１の治療薬は、インビトロにおけるカルディオスフィア（ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ）生存アッセイにおける細胞の生存率を増加させ得る。いくつかの実施形態において、第１の治療薬は、インビトロカルディオスフィア増殖アッセイにおける細胞の生存率を増加させ得る。他の実施形態において、治療薬の少なくとも１つは、危険にさらされている部分の心筋細胞におけるβ−カテニンを安定化し得る。
【００３４】
本発明はまた、被験体における心臓の状態を処置するためのキットに関し、本キットは、上述の組成物の任意の１つを備え、さらにその組成物を心臓に送達するためのデバイスを備える。デバイスは、カテーテルであり得、そして／または組成物を危険にさらされている部分に送達し得る。
【００３５】
本発明は、被験体における心臓の状態を処置する方法を提供し：本方法は、上述の薬学的組成物の任意の１つを提供する工程；およびその組成物を被験体に投与する工程を含む。組成物を投与する工程は、いくつかの実施形態において、組成物を危険にさらされている部分に投与する工程を含み得る。組成物を投与する工程はまた、カテーテルであり得るデバイスによって組成物を送達する工程を含み得る。  
【００３６】
組成物を投与する工程は、組成物を注入する工程を含み得る。被験体に組成物を投与する工程は、少なくとも２回の注入または２用量；少なくとも３回の注入または３用量；少なくとも４回の注入または４用量；または４回以上の注入または４用量以上を投与する工程を含み得る。注入は、危険にさらされている部分の周縁に与え得る。組成物の心臓内注入は、所望の結果に達するまで１週間に１回実施され得る。全身性注入（例えば、皮下、腹腔内、尾静脈注入）は、所望の結果に達するまで１日に１回実施され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、被験体に組成物を投与する工程は、投与範囲に心臓の前駆細胞または心臓の幹細胞を補充し得る。他の実施形態において、被験体に組成物を投与する工程は、心臓の前駆細胞または心臓の幹細胞の分化を刺激し得る。なおも他の実施形態において、被験体に組成物を投与する工程は、１回以上投与するとき心臓の前駆細胞の増殖を刺激し得、そして／または心臓の前駆細胞もしくは心臓の幹細胞の活性を促進し得る。
【００３８】
薬学的組成物としてはまた、以下の組み合わせの少なくともいずれかが挙げられ得る：（１）ＦＧＦファミリーのメンバーおよびＥＧＦファミリーのメンバー；（２）ＦＧＦファミリーのメンバーおよびＰＤＧＦファミリーのメンバー；（３）ＦＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー；（４）ＥＧＦファミリーのメンバーおよびＰＤＧＦファミリーのメンバー；（５）ＥＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー；（６）ＰＤＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー；（７）ＦＧＦファミリーのメンバー、ＥＧＦファミリーのメンバーおよびＰＤＧＦファミリーのメンバー；（８）ＦＧＦファミリーのメンバー、ＥＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー；（９）ＦＧＦファミリーのメンバー、ＰＤＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー；（１０）ＥＧＦファミリーのメンバー、ＰＤＧＦファミリーのメンバーおよびＩＧＦファミリーのメンバー。
【００３９】
本発明はまた、少なくとも第１の治療薬を含む心臓の状態を処置するためのヒト被験体の心臓への局所送達のための薬学的組成物を提供し、ここで、第１の治療薬は、少なくとも第１の単離されたポリペプチドを含み、第１の単離されたポリペプチドは、単独または少なくとも第２の治療薬と組み合わせて、所望の生物学的活性を生じ、所望の生物学的活性は、心臓細胞の生存を促進すること；および／または心臓細胞の分化を促進すること；および／または心臓細胞の増殖を促進することを含み；そして組成物は、冠状動脈には送達されず、第１の治療薬が、組成物における唯一の治療薬であるときに、第１の治療薬が、ＦＧＦ１またはＦＧＦ２以外である場合、第１または第２の治療薬は、ＦＧＦファミリーのメンバー、ＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＩＧＦファミリーのメンバー、エンドセリンファミリーのメンバー、ＬＩＦファミリーのメンバー、ＥＧＦファミリーのメンバー、ＰＤＧＦファミリーのメンバー、ＴＧＦファミリーのメンバー、ＩＬ−１１ファミリーのメンバー、ＴＮＦファミリーのメンバー、インターフェロンファミリーのメンバー、仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６もしくはｃｈｒｏ１０ｏｒｆ５８またはスプライスバリアントあるいはそれらの活性なフラグメントの１つ以上を含む。薬学的組成物はさらに、第２の治療薬を含み得る。組成物は、第１または第２の治療薬が心臓細胞の生存および／または増殖を促進する組成物であり得る。別の実施形態において、少なくとも１つの治療薬は、心筋細胞死を阻害し得る。第１または第２の治療薬は、ＦＧＦ５、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６、ニューレグリン１−β１またはベータセルリンを含み得る。組成物中に第２の治療薬が存在する場合、第２の治療薬は、ＰＤＧＦファミリーのメンバー、ＩＧＦファミリーのメンバーおよび／またはサイモシンβ４を含み得る。
【００４０】
本発明の薬学的組成物は、カテーテルによる送達に適応され得る。別の実施形態において、組成物は、直接注入による送達に適応され得る。
【００４１】
本発明の組成物は、第１の治療薬が、唯一の治療薬である場合、ＶＥＧＦまたはＰＤＧＦ以外の第１の治療薬を有し得る。
【００４２】
心臓細胞は、心臓の幹細胞または心臓の前駆細胞であり得る。心臓の状態は、虚血、虚血性心臓外傷、うっ血性心不全、心筋梗塞、冠状動脈疾患および／または心筋症であり得る。
【００４３】
組成物はさらに、少なくとも第３の治療薬を含み得る。第３の治療薬は、ＥＧＦファミリー、ＩＧＦファミリーまたはＰＤＧＦファミリーのメンバーを含み得る。組成物はまた、少なくとも第４の治療薬をさらに含み得る。第４の治療薬は、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーまたはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。
【００４４】
第１、第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＦＧＦファミリーのメンバー（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６およびＦＧＦ−１７が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１、第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＥＧＦファミリーのメンバー（アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリン、ニューレグリンファミリーのメンバー（例えば、ＮＲＧ１−αまたはＮＲＧ１−β１）が挙げられるが、これらに限定されない）およびそのスプライスバリアント；またはその活性なフラグメントであり得る。ベータセルリンのスプライスバリアントは、配列番号１８０を含み得る。
【００４５】
第１、第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＰＤＧＦファミリーのメンバー（ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢが挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。第１、第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリーのメンバー（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が挙げられるが、これらに限定されない）またはその活性なフラグメントであり得る。
【００４６】
第１の治療薬は、ＴＮＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ＴＮＦ−βまたはその活性なフラグメントであり得る。
【００４７】
第１の治療薬は、ＴＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントである。ＴＧＦファミリーメンバーは、ＴＧＦ−αであり得る。別の実施形態において、ＴＧＦファミリーメンバーは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。
【００４８】
第１の治療薬は、インターロイキンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。インターロイキンファミリーのメンバーは、ＩＬ−１１またはオンコスタチンＭであり得る。
【００４９】
第１の治療薬は、インターフェロンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。インターフェロンファミリーのメンバーは、インターフェロン−α１であり得る。
【００５０】
第１の治療薬は、配列番号２０を含むポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントである。
【００５１】
第１の治療薬は、ＶＥＧＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントである。ＶＥＧＦファミリーメンバーは、ＶＥＧＦ−Ｃであり得る。
【００５２】
第１の治療薬は、エンドセリンファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリーおよび／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。エンドセリンファミリーのメンバーは、エンドセリン−１またはその活性なフラグメントであり得る。
【００５３】
第１の治療薬は、ＬＩＦファミリーのメンバーまたはその活性なフラグメントであり得、そして第２、第３または第４の治療薬は、もしあれば、ＩＧＦファミリー、ＦＧＦファミリー、ＥＧＦファミリー、および／またはＰＤＧＦファミリーから選択されるポリペプチドまたはその活性なフラグメントであり得る。ＬＩＦファミリーのメンバーは、ＬＩＦまたはその活性なフラグメントであり得る。
【００５４】
本発明の組成物における治療薬の少なくとも１つは、融合分子であり得る。融合分子は、融合パートナーを含み得る。融合パートナーは、融合パートナーが存在しない被験体における治療薬の半減期よりも被験体において長い半減期を治療薬に与え得る。治療薬の半減期は、少なくとも半時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間または融合パートナーが存在しないときの治療薬の半減期よりも被験体において長い半減期であり得る。融合パートナーは、ポリマー、免疫グロブリン分子、スクシニル基、フェチュインＡ、フェチュインＢ、アルブミン、ロイシンジッパードメイン、オリゴマー形成ドメイン、マンノース結合タンパク質、マクロファージスカベンジャータンパク質、Ｆｃ領域またはこれらの任意の活性なフラグメントを含み得る。ポリマーは、ポリエチレングリコール部分であり得；免疫グロブリン分子は、少なくともＦｃ領域の一部を含み得；オリゴマー形成ドメインは、テトラネクチン三量体形成ドメイン、コイルドコイルドメイン、コラーゲンドメイン、コラーゲン様ドメインまたは二量体の免疫グロブリンドメインを含み得；アルブミンは、アルブミン分子、アルブミンの１つ以上のフラグメント、アルブミンに結合するペプチド、脂質と結合体化するアルブミン分子または別の分子に結合するアルブミン分子を含み得る。ポリエチレングリコール部分は、分枝状ポリマーまたは直鎖状ポリマーであり得るか、または治療薬のアミノ基を介して治療薬に結合し；コイルドコイルドメインは、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマー基質タンパク質に見られるコイルドコイルドメイン、アンジオポエチンコイルドコイルドメインまたはロイシンジッパードメインを含み得；コラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメインは、コラーゲンに見られるコラーゲンドメインまたはコラーゲン様ドメイン、マンノース結合レクチン、肺サーファクタントプロテインＡ、肺サーファクタントプロテインＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャーレセプターまたはエミリンを含み得；そして二量体の免疫グロブリンドメインは、抗体ＣＨ３ドメインを含み得る。融合分子は、リソソームにおける改善されたレセプター結合性を有し得る。
【００５５】
治療薬の少なくとも１つは、危険にさらされている部分の心筋細胞においてβ−カテニンを安定化し得る。
【００５６】
本発明の組成物はさらに、生分解性の担体を含む薬学的に許容可能な担体を含み得る。生分解性の担体は、多糖を含み得る。この多糖は、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはアルギネートを含み得る。別の実施形態において、本発明の組成物は、細胞外マトリックスをさらに含み得る。細胞外マトリックスは、コラーゲンを含み得る。
【００５７】
本発明の組成物はまた、生物学的マーカーを含み得、ここで、生物学的マーカーの追跡は、被験体における治療薬の位置を追跡する。組成物はまた、ゲル組成物であり得る。
【００５８】
組成物における第１の治療薬は、インビトロにおけるカルディオスフィア生存アッセイおよび／またはインビトロにおけるカルディオスフィア増殖アッセイにおける細胞の生存率を増加し得る。
【００５９】
本発明はまた、被験体における心臓の状態を処置するためのキットを提供し、本キットは、本発明の組成物、その組成物を心臓に送達するためのデバイスおよび冠状動脈以外の心臓にその組成物を注入するための指示書を備える。デバイスは、カテーテルであり得る。デバイスは、組成物を危険にさらされている部分に送達し得る。
【００６０】
別の局面において、本発明は、被験体における心臓の状態を処置する方法に関し、本方法は：（ａ）本明細書中に記載するように本発明の薬学的組成物を提供する工程；および（ｂ）被験体の冠状動脈以外の被験体の心臓に局所投与によって被験体に組成物を投与する工程を含む。組成物を投与する工程は、組成物を危険にさらされている部分に投与する工程を含み得る。組成物を投与する工程は、カテーテルであり得るデバイスによって組成物を送達する工程を含み得る。組成物を投与する工程はまた、組成物を注入する工程を含み得る。被験体に組成物を投与する工程は、少なくとも２、３、４回または４回以上の注入；または２、３、４用量または４用量以上を投与する工程を含み得る。被験体に組成物を投与する工程は、心臓の前駆細胞もしくは心臓の幹細胞を投与の範囲に補充し得；心臓の前駆細胞もしくは心臓の幹細胞の分化を刺激し得；心臓の前駆細胞の増殖を刺激し得；そして／または心臓の前駆細胞もしくは心臓の幹細胞の活性を促進し得る。被験体に組成物を投与する工程は、１回のセッション中に、被験体の心臓または心筋層の虚血範囲または危険にさらされている部分の端の周辺の１、２、３、４箇所または４箇所以上かつ最高１０箇所の部位に組成物を注入する工程を含み得る。被験体に組成物を投与する工程は、１回以上のセッションにおいて組成物を注入する工程を含み得る。
【００６１】
本発明に記載の被験体における心臓の状態を処置する方法は、全身的に組成物を投与する工程をさらに含み得る。組成物は、被験体に１日に１回または１日おきに１回、１、２、３、４、５回までかまたは５回以上投与され得る。組成物は、被験体に１日に１回、１週間に１、２、３、４または５回まで投与され得る。組成物は、被験体に１週間に１回を１、２、３、４、５週間までかまたは５週間に亘って投与され得る。組成物は、被験体に１週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月おきに１回、３ヶ月おきに１回、６ヶ月おきに１回または１年に１回投与され得る。
【００６２】
本発明に記載の被験体における心臓の状態を処置する方法において、被験体は、約１ナノグラム〜約１０ミリグラムの範囲の用量を投与され得る。第１の治療薬は、約１ナノグラム〜約５０ミリグラムの量で組成物中に存在し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
発明の詳細な説明
定義
「心臓の状態」とは、健常な状態もしくは正常な状態と異なる症状または他の同定因子によって同定され得る心臓の状態のことである。用語「心臓の状態」は、心臓に影響を及ぼす、障害、症候群、疾患および損傷を含む。心臓の状態としては、心不全、例えば、うっ血性心不全；虚血状態、例えば、心筋梗塞；高血圧性状態；先天性の状態；感染性状態、例えば、心内膜炎；良性腫瘍および悪性腫瘍を含む増殖性疾患；ならびに冠状動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。心臓の状態としてはまた、心筋層の疾患、例えば、心筋炎、心筋症および線維症；心臓周囲の疾患、例えば、心膜炎；ならびに内心膜性疾患および弁の疾患、例えば、狭窄症および脱出症が挙げられる。
【００６４】
「虚血性心臓外傷」とは、酸素の欠乏により生じる心臓への損傷である。これは、例えば、冠状動脈の閉塞または狭窄に起因する心筋への血液の供給の欠乏の結果として起こり得る。
【００６５】
「心筋細胞」とは、心臓の筋細胞のことである。
【００６６】
「心臓の前駆細胞」とは、心臓領域に見られる任意の細胞タイプに対する前駆体のことである。心臓の前駆細胞には、幹細胞を含む。心臓の前駆細胞としてはまた、結合組織細胞、神経細胞および心臓領域に存在する細胞の他のすべてのタイプに対する前駆体が挙げられる。
【００６７】
「心臓の幹細胞」とは、出生前または出生後の心臓に見られる、心筋細胞に分化する能力を有する未分化な細胞のことである。
【００６８】
「心臓領域」とは、心臓の解剖学的および機能的な領域のことをいう。心臓領域としては、冠循環を含む心臓の解剖学的領域における心筋層、心膜、伝導系および血管が挙げられる。
【００６９】
「危険にさらされている部分」（ＶＡＲ）とは、虚血性心臓外傷の結果として死滅する細胞によって形成される細胞壊死の領域に隣接する心筋層の領域のことである。ＶＡＲにおける細胞は、代表的には虚血の期間の後に遅延性死滅を起こす。
【００７０】
「成長因子」とは、生育または増殖するように細胞を刺激する、細胞外のホルモンまたはポリペプチドシグナル伝達分子のことである。タンパク質ホルモンおよびステロイドホルモンを含む多くのタイプの成長因子が存在する。本発明の成長因子は、改変体およびムテインを含む。成長因子の例としては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が挙げられる。これらとしては、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−９、ＩＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、アンフィレグリン、エピレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびベータセルリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
「ＥＧＦファミリーのメンバー」とは、代表的には６つの保存されたシステイン残基によって特徴付けられるＥＧＦモチーフとして知られる保存されたドメインを有する成長因子のことである。ＥＧＦファミリーのメンバーについては、以下でより詳細に説明する。
【００７２】
「ＦＧＦファミリーのメンバー」とは、ヘパリン硫酸塩グリコサミノグリカンとＦＧＦ細胞表面レセプター（ＦＧＦＲ）の細胞外のドメインとを相互作用させる成長因子のことであり、例えば、Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８（３６）：３４，２２６−３４，２３６およびＯｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００１  ２：３００５．１−３００５．１２に記載されているようなレセプターの活性化および生物学的応答を引き起こす。ＦＧＦファミリーのメンバーについては、以下でより詳細に説明する。
【００７３】
「ＰＤＧＦファミリーのメンバー」とは、ＰＤＧＦレセプターに結合する成長因子のことである。ＰＤＧＦファミリーメンバーの例としては、２つのポリペプチドＢ鎖およびＤ鎖からそれぞれ構成されるＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤが挙げられる。ＰＤＧＦファミリーのメンバーについては、以下でより詳細に説明する。例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦαレセプタータンパク質とＰＤＧＦβレセプタータンパク質との両方の高い合成を誘導し、そしてＰＤＧＦβレセプターと高い親和性で結合する（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：２１１３８−２１１４４）。
【００７４】
「ＩＧＦファミリーのメンバー」とは、ＩＧＦレセプターに結合し、そしてＩＧＦファミリーの他のメンバーと高い配列相同性の程度を示す成長因子のことである。ＩＧＦファミリーメンバーの例としては、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２が挙げられる。ＩＧＦファミリーのメンバーについては、以下でより詳細に説明する。
【００７５】
「ゲル組成物」とは、生体適合性のポリマーおよびそのポリマーを溶解する溶媒を含むゲルのことである。ゲル組成物の粘度は、ゲル組成物中の治療薬の所望の放出動力学を適応させ、そしてその放出を持続または制御するように調節され得る。温度感受性ポリマーを用いる場合、ゲル組成物は、患者への投与前は、液体であり得、そして患者内ではゲルになり得る。
【００７６】
「生分解性の担体」は、細菌などの生物学的物質によって分解されることが可能な組成物を含む。
【００７７】
「生物学的マーカー」とは、患者内のその存在が、任意の種々の方法によって可視化または検出され得る生物学的に適合した物質である。これらの方法としては、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、分子像およびポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
タンパク質の「改変体」とは、天然に存在するタンパク質と野生型タンパク質とは異なる人工的に生成されたタンパク質（例えば、遺伝的に操作されたタンパク質）との両方を含む。野生型タンパク質との差としては、置換、切断、欠失、挿入および反復が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらは、保存的または非保存的であり得る。
【００７９】
「融合分子」とは、１つ以上の遺伝子の全部または部分の連結を示す分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他のポリマーのことである。例えば、融合タンパク質は、組換えＤＮＡの鎖をスプライシングすることおよびハイブリッド遺伝子を発現することによる産物であり得る。融合分子は、遺伝子操作、例えば、第１のタンパク質のＤＮＡ配列から終止コドンを除去し、次いで第２のタンパク質のＤＮＡ配列をインフレームで付加することによってなされ得る。そしてこのＤＮＡ配列は、単一のタンパク質として細胞によって発現され得る。代表的にはこれは、存在する遺伝子とともにインフレームで発現ベクターにｃＤＮＡをクローニングすることによって達成される。
【００８０】
「融合パートナー」とは、治療的または予防的ポリペプチドに融合された分子のことである。融合パートナーはまた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他のポリマーであり得る。例えば、ポリペプチドは、治療的または予防的ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端においてか、またはその内部においてインフレームで融合され得る。  例えば、融合パートナーは、アルブミン、アルブミンの任意の改変体またはそれらの任意のフラグメントであり得る。別の融合パートナーは、フェチュインの任意の改変体またはその任意のフラグメントであり得る。なおも別の融合パートナーは、Ｆｃドメインまたはその改変体であり得る。例えば、米国特許第５，１１６，９６４号；同５，２２５，５３８号；同５，４２８，１３０号；同５，４５５，１６５号；同５，５１４，５８２号；同５，７１４，１４７号；および同６，４０６，６９７号を参照のこと。
【００８１】
用語「薬剤」、「物質」、「調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」および「化合物」は、本明細書中において交換可能に使用される。これらの用語は、ポリペプチドのレベルもしくは活性またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡもしくは核酸のレベルに結合し、そして／もしくはそれらを調節するか、またはポリペプチドもしくは核酸を含む細胞の活性を調節する物質のことをいう。これらの用語はまた、虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置するために使用され得る物質を含む。薬剤が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを調節する場合、薬剤は、リボザイム、アンチセンスおよびＲＮＡｉ分子を含む。薬剤が、ポリペプチドの活性のレベルを調節する物質である場合、薬剤は、ポリペプチド、ペプチドアプタマー、低分子薬物、ポリペプチド内のリガンド結合部位に結合する薬剤、天然のリガンド、可溶性レセプター、アゴニスト、アンタゴニストなどに対して特異的な抗体を含む。抗体薬剤は、シグナル伝達を開始するレセプター−リガンド結合などの、対象ポリペプチドに特異的に結合し、そのポリペプチドを活性化する抗体；対象ポリペプチドに特異的に結合し、そのポリペプチドへの別の分子の結合を阻害することによって、シグナル伝達経路の活性化を阻止する抗体；転写を調節する対象ポリペプチドに結合する抗体；翻訳を調節する対象ポリペプチドに結合する抗体；ならびに抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を開始するか、または細胞殺滅または細胞増殖を開始する細胞の表面上の対象ポリペプチドに結合する抗体を含む。低分子薬物調節因子はまた、ポリペプチドまたはそのポリペプチドを含む細胞の活性を調節するポリペプチドに結合するものを含む。
【００８２】
「長時間作用型治療薬」とは、改変されていない薬剤よりもインビボにおいて長い半減期を有するように改変された治療薬のことをいう。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、「処置」とは、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療薬の任意の投与または適用を包含し、疾患を阻害すること、その発症を抑止すること、または例えば、後退を引き起こすことまたは喪失したか、欠損したかもしくは不完全な機能を回復するかもしくは修復することによって疾患を軽減すること；または非効率的なプロセスを刺激することを含む。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、「予防」とは、疾患に罹患しやすくし得るが、現在のところ症候性でない疾患が被験体において発生または再発することを予防することを含む。処置および予防は、生物体または細胞にインビボ、インビトロまたはエキソビボにおいて投与され得、続いてその細胞は被験体に投与される。
【００８５】
「治療有効量」とは、特定の状態または疾患、例えば、心臓の状態を処置することができる治療薬の用量のことをいう。治療有効量は、第１の投与において効果的であり得るか、または治療的な効果を達成するために１回以上の投与が必要であり得る。
【００８６】
「心筋症」とは、本明細書中において、心筋の任意の異常な状態として定義される。心筋症は、ポンプ能力に乏しい拡張した心臓として明白であり得る。心筋症としては、不整脈、塞栓および／または弁閉鎖不全の症状が挙げられ得る。心筋症は、供給する心臓の能力を制限し得、そして損ない得る。心筋症はまた、肥大性（拡張した心臓）であり得る。
【００８７】
「心不全」とは、心筋が衰弱していて、効率的に血液を送り出すことができない状態のことである。
【００８８】
「心筋梗塞」とは、心筋への血液の供給の障害に起因する心臓組織の破壊のことをいう。
【００８９】
「冠状動脈疾患」とは、心筋への不十分な血流を生じる冠状動脈の狭小化または狭窄によって特徴付けられる。
【００９０】
「半減期」とは、体液中の外来性物質の濃度が最初の値の半分に減少するために必要な時間のことである。
【００９１】
「Ｆｃ分子」とは、抗体の抗原結合部位を占めているか、または抗体が凝集しているときに細胞に結合する免疫グロブリン分子中の領域のことをいう。
【００９２】
「抗体ＣＨ３ドメイン」とは、免疫グロブリン分子の重鎖のＣ末端免疫グロブリンドメインのことをいう。抗体ＣＨ３ドメインによって形成される非共有結合性ホモ二量体の折りたたみおよび集合が、研究されている。Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９３：６７−７９を参照のこと。
【００９３】
「薬学的に許容可能な担体」とは、非毒性の固体、半固体または液体の、任意の従来型の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料または処方物補助剤のことをいう。「薬学的に許容可能な担体」とは、使用される用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性である。例えば、ポリペプチドを含む処方物に対する担体は、ポリペプチドに有害であると知られている酸化剤および他の化合物を適切に含まない。適切な担体としては、水、デキストロース、グリセリン、食塩水、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体は、追加の薬剤（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤または処方物の有効性を促進する補助薬）を含み得る。局所的な担体としては、液体の石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、モノラウリン酸ポリオキシエチレン（５％）水溶液またはラウリル硫酸ナトリウム（５％）水溶液が挙げられる。他の材料（例えば、抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定剤および同様の薬剤）が、必要に応じて添加され得る。Ａｚｏｎｅなどの経皮的浸透促進剤もまた、含まれ得る。
【００９４】
「デバイス」とは、特別な目的のために働くか、または特別な機能を実施するために設計された、器具または装置の一部、例えば、機械的または電気的な器具のことである。
【００９５】
「カテーテル」とは、血管または体腔へ、またはそれらから流体が通過するのを可能にする管状の器具のことである。
【００９６】
「注入」とは、身体への物質の導入のことである。注入は、筋組織、例えば、心筋；皮下組織；血管腔、例えば、静脈または動脈；または体の他の腔または管へ物質を導入し得る。用語「注入」とは、導入を実施する任意の適切なデバイスの使用を含む。この用語は、例えば、カテーテルによる導入を含む。この用語はまた、例えば、心臓領域への物質の直接注入を含む。
【００９７】
本明細書中で交換可能に使用される用語「被験体」、「宿主」、「個体」、「動物」および「患者」とは、ヒトを含む哺乳動物のことをいい、そしてそれらとしては、マウス、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、哺乳動物の家畜、哺乳動物の変種動物および哺乳動物の愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。多くの実施形態において、宿主は、ヒトであり得る。動物モデルは、ヒト疾患の処置に対するモデルを提供する実験的研究として興味深い。
【００９８】
例えば、被験体におけるＡＭＩおよびＣＨＦを含む心臓の状態を処置する際に有用である、心筋細胞の生存を補助し、そして虚血性損傷に応答する心筋細胞のアポトーシス／ネクローシスを減少し、それによって心筋層および心臓のポンプ機能の保存を援助する組成物および方法が、本明細書中に記載される。本発明の分子は、いくつかのインビトロにおける細胞に基づくアッセイを使用することによって同定された。Ａｋｔ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のリン酸化は、心筋細胞における細胞の生存経路に関連することが知られているので、リン光体−Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）、リン光体−ＳＴＡＴ３およびリン光体−ＥＲＫｌ／２を、タンパク質上清を用いて処置された新生仔ラット心筋細胞におけるｐＡｋｔ、ｐＳＴＡＴ３およびｐＥＲＫを検出するために、多様なルミネックス技術（例えば、Ｒｈｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００３）３５（３）：６２４−９を参照のこと）を使用して細胞の生存に対する代理のマーカーとして使用した。
【００９９】
薬学的組成物
本発明は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび本発明の他の治療薬を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。この組成物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の治療薬の所望の用途に従って選択される緩衝液を含み得、そしてまた意図される用途に適切な他の物質を含み得る。当業者は、意図される用途に適した、当該分野で公知の適切な種々の緩衝液を容易に選択し得る。いくつかの場合において、組成物は、当該分野で公知であり、本明細書中に詳細に議論される必要がない種々の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含み得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ．２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．，Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃを含む種々の出版物中に十分に説明されている。
【０１００】
薬学的に許容可能な賦形剤（例えば、ビヒクル、補助剤、担体および希釈剤）は、当該業界から容易に入手され得る。さらに、薬学的に許容可能な補助的な物質（例えば、ｐＨ調節剤およびｐＨ緩衝剤、張度調節剤、安定剤、湿潤剤など）は、当該業界から容易に入手され得る。
【０１０１】
治療薬は、天然に存在する供給源から入手され得るか、または合成的に生成され得る。天然に存在する供給源から入手される場合、選択される供給源は、一般にそのタンパク質が、由来すべき種に依存し得る。対象のタンパク質はまた、合成的な手段、例えば、適切な宿主において目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子を発現することによって入手され得る。任意の好都合なタンパク質精製方法が、使用され得る。適切なタンパク質精製方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｄｅｕｔｈｓｅｒ  ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０）に記載されている。例えば、可溶化液は、本来の供給源から調製され得、そしてＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィなどを使用して精製され得る。
【０１０２】
本発明の治療的な組成物は、ポリペプチド、有機低分子、炭水化物および脂質を含み得る。適切な環境においてこれらは、モノマーまたはポリマーの形態で入手され得る。
【０１０３】
候補の薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。例えば、数多くの手段が、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為な合成および管理された合成に利用可能である。あるいは、細菌、真菌類、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、利用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然のライブラリーまたは合成的に生成されたライブラリーおよび天然の化合物または合成的に生成された化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を介して容易に改変され、そしてコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。公知の薬理学的物質は、構造的なアナログを生成するために管理された化学的改変かまたは無作為の化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供され得る。
【０１０４】
候補薬剤は、心虚血によって生じる遺伝子発現プロファイルにおける変化の研究から得られ得る。遺伝子発現プロファイリングは、種々の技術によって達成され得る。それらの技術としては、ディファレンシャルディスプレイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよび遺伝子マイクロアレイ（遺伝子チップ）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子発現プロファイリングは、Ｓｉｍｋｈｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００３）１２：１８０−１８５によって説明されているように心筋層の虚血の研究において使用され得る。遺伝子発現マイクロアレイおよびＤＮＡチップは、多くの出版物、例えば、Ｈａｒｄｉｍａｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００４）５：４８７−５０２において議論されている。これらの技術は、その発現レベルが心虚血によって影響される遺伝子の迅速な同定を可能にする。このような遺伝子およびこれらの遺伝子産物は、虚血性心臓外傷および他の心臓の状態を処置するための候補薬剤である。
【０１０５】
候補薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイが、結合アッセイである場合に、標識が、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供し得る場合、１つ以上の分子が標識に結合され得る。種々の標識としては、放射性同位体、蛍光剤、ケミルミネッサ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、特定の結合分子、粒子（例えば、磁性粒子）などが挙げられる。特定の結合分子としては、ビオチンとストレプトアビジンとの対、ジゴキシンと抗ジゴキシンとの対などを含む。特定の結合メンバーに対して、相補的なメンバーは、公知の手順に従って通常、検出を提供する分子で標識され得る。
【０１０６】
種々の他の試薬は、スクリーニングアッセイに含まれ得る。これらとしては、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、そして／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される、塩、界面活性剤、中性タンパク質（例えば、アルブミンなど）のような試薬が挙げられる。アッセイの効率を改善する試薬（例えば、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤など）が使用され得る。構成要素の混合物は、必要な結合を提供する任意の順序で添加される。インキュベーションは、代表的には４℃〜４０℃の任意の適切な温度で実施される。インキュベーション時間は、最適な活性に対して選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化もされ得る。代表的には０．１〜１時間で十分であり得る。
【０１０７】
カルディオスフィアアッセイは、心筋細胞に影響を及ぼす因子、例えば、その生存および／または増殖を刺激または阻害する因子を同定するために使用され得る。終末的に分化した細胞として長く考えられてきた心筋細胞は、動物モデルおよび心臓移植患者において増殖する能力を有する。例えば、心不全患者における心筋細胞の中程度の増殖は、内在する心臓の幹細胞の増殖および分化に起因するが、これは、心筋細胞破壊を克服するのに十分でない。従って、一定の成長因子または他のポリペプチドが、インビトロとインビボとの両方において心臓の再生を促進するのを助け得る。カルディオスフィアアッセイは、このようなポリペプチドを同定し得、そして心筋細胞の生物学的活性に対する成長因子または他のポリペプチドの効果を評価するために使用され得る。カルディオスフィアアッセイに適した生物学的活性としては、心臓細胞の生存、心臓領域への心臓の前駆細胞を補充すること、心臓の前駆細胞の分化を刺激すること、心臓の前駆細胞の増殖を刺激することおよび心臓の前駆細胞の１つ以上の活性を促進することが挙げられるが、これらに限定されない。それは、実施例およびＬａｕｇｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３３：６４７−６５３；Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５：９１１−９２１；Ｌｏｖｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｕｒ，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．（２００４）３７：６７−８７）；Ｂｅｌｔｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００３）１１４：７６３−７７６；およびＯｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００：１２，３１３−１２，３１８によってさらに説明されるように、心臓の組織、例えば、成体マウスの心臓の組織を解離することならびに幹細胞および／またはカルディオスフィアを生成することによって一般に実施される。
【０１０８】
薬剤は、水性溶媒または非水溶媒（例えば、植物油または他の類似の油）中に、合成の脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール中に；そして所望であれば、従来の添加剤（例えば、可溶化剤、等張性剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および保存剤）とともに溶解、懸濁または乳化することによって注入のための調製物に処方され得る。
【０１０９】
薬剤は、単位剤形、すなわち、ヒトおよび動物被験体のための単位用量として適切な物理的に別個の単位で提供され得、その各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の効果を生成するのに十分な量と計算された本発明の化合物の事前に決定された量を含む。本発明の新規の単位剤形についての特定化は、使用される特定の化合物および達成されるべき効果ならびに宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【０１１０】
有効量の活性な薬剤（例えば、低分子、対象ポリペプチドに対して特異的な抗体または対象ポリペプチド）は、所望の結果を生じるのに十分な用量で宿主に投与される。いくつかの実施形態において、所望の結果は、コントロールと比較して、対象ポリペプチドの所与の生物学的活性の少なくとも減少である。他の実施形態において、所望の結果は、コントロールと比較して、（個体においてか、または個体における局在化された解剖学的部位において）活性な対象ポリペプチドのレベルの増加である。いくつかの実施形態において、所望の結果は、コントロールと比較して、対象ポリペプチドの酵素的な活性の少なくとも減少である。他の実施形態において、所望の結果は、コントロールと比較して、（個体においてか、または個体における局在化された解剖学的部位において）酵素的に活性な対象ポリペプチドのレベルの増加である。なおも他の実施形態において、所望の結果は、コントロールと比較して、虚血性心臓外傷または心臓の状態の重症度の減少である。虚血性心臓外傷または心臓の状態の重症度の減少は、当該分野で公知か、または本明細書中に記載される種々の徴候（例えば、心筋細胞の喪失／死滅の減少）によって示唆され得る。
【０１１１】
代表的には、本発明の組成物は、活性な成分の１％未満〜約９５％を含み得、いくつかの実施形態において、約１０％〜約５０％を含み得る。一般に、約１００ｍｇ〜５００ｍｇの組成物は、小児に投与され得、そして約５００ｍｇ〜５グラムは、成体に投与され得る。投与は、一般に注入によってであり、局在化された範囲への注入によるものが多い。投与の頻度は、患者の応答性に基づいて与えられる治療によって決定され得る。他の有効量は、用量反応曲線を確立する治験を通じて当業者によって容易に決定され得る。
【０１１２】
投与されるべき治療薬の量を計算するために、当業者は、所望の効果を有するのに必要な薬剤の量に関する容易に入手可能な情報を使用し得る。活性な対象ポリペプチドのレベルを増加するのに必要な薬剤の量は、インビトロの実験から計算され得る。当然ながら薬剤の量は、使用される特定の薬剤に依存して変化し得る。
【０１１３】
薬学的剤形に関して、薬剤は、薬学的に許容可能な塩の形態で投与され得るか、または単独かもしくは適切に関連して、ならびに他の薬学的に活性な化合物または処置手順と組み合わせて使用され得る。以下の方法および賦形剤は、単なる例示であって、決して限定するものではない。
【０１１４】
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ビヒクルは、少量の補助剤（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤）を含み得る。このような剤形を調製する実際の方法は、公知であるか、または当業者に明らかであり得る。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ．２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと。投与される組成物または処方物は、いずれにしても、処置される被験体における所望の状態を達成するのに適切な治療薬の量を含み得る。
【０１１５】
本発明のポリペプチド組成物は、個別の被験体の臨床状態、ポリペプチド組成物の送達の部位、投与の方法、投与の日程計画および当業者に公知の他の因子を考慮して、良好な医療行為と一致する様式において処方され得、そして投薬され得る。従って、本明細書中の目的のための有効量のポリペプチドは、このような考慮によって決定される。
【０１１６】
治療的なポリヌクレオチド
本発明は、治療的なポリペプチドまたはそれらのフラグメントをコードする核酸組成物を包含する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本明細書中に記載されるように、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＩＧＦをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１７】
核酸組成物とは、治療的なポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有し、そして適切な条件下で、本発明の治療的なポリペプチドの１つとして発現されることができる配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡの配列を含む組成物を意味する。しかしながら、この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、１つ以上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むＤＮＡおよび対象の核酸配列を含むベクターを包含する。また、この用語に包含されるのは、治療的なタンパク質をコードする核酸と相同かまたは実質的に類似かもしくは同一である核酸である。従って、本発明は、対象のタンパク質およびそのホモログをコードする遺伝子を提供する。
【０１１８】
本発明のポリヌクレオチドまたは核酸とは、任意の長さのヌクレオチドの多量体型のことをいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログもしくは誘導体を含み得る。例えば、核酸は、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡであり得るか、または当該分野で公知の合成アナログであり得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡ、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、制御配列または制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、開始領域および終止領域）、他の制御領域、発現調節因子および発現コントロール；１つ以上の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含むＤＮＡ、対立遺伝子改変体、任意の配列の単離されたＤＮＡおよびｃＤＮＡ；ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、スプライスバリアント、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンス結合体、ＲＮＡｉおよび任意の配列の単離されたＲＮＡ；組換えポリヌクレオチド、異種ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、標識されたポリヌクレオチド、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ、ポリヌクレオチド構築物、対象の核酸を含むベクター、核酸プローブ、プライマーおよびプライマー対を含む。
【０１１９】
本発明のポリヌクレオチドは、骨格、糖または複素環式塩基において変更を伴う改変された核酸分子（例えば、メチル化された核酸分子、ペプチド核酸および核酸分子アナログ）を包含し、それらが、アッセイ条件下で優れた安定性および／または結合親和性を示す場合、例えば、プローブとして適切であり得る。それらはまた、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡのいずれかであり、そして全長遺伝子またはその生物学的に活性なフラグメントをコードし得る一本鎖分子、二本鎖分子および三重らせん分子を包含する。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドは、単一ヌクレオチド多型を含む。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、真核生物のゲノムにおいて多く存在する。Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４０９：８６０−９２１。ある種の１つの個体から決定されたヌクレオチド配列は、その集団内に存在する他の対立遺伝子の形態と異なり得る。本発明は、このようなＳＮＰを含む。
【０１２１】
対象のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドの改変体をコードするものを含む。従って、いくつかの実施形態において、対象のポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドと比較して挿入、欠失または置換を含む改変体ポリペプチドをコードする。保存的アミノ酸置換としては、セリン／トレオニン、バリン／ロイシン／イソロイシン、アスパラギン／ヒスチジン／グルタミン、グルタミン酸／アスパラギン酸などが挙げられる。例えば、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５を参照のこと。
【０１２２】
本発明のタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはそれらのフラグメントであり得る。用語「遺伝子」とは、本発明の特定のタンパク質およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよびイントロンを意味すると意図され得、ならびにコード領域を超えて約２０ｋｂまでであるが、いずれかの方向にさらに長い可能性もある、発現の制御に関連する５’および３’非コードヌクレオチド配列に隣接すると意図され得る。遺伝子は、染色体外の維持または宿主ゲノムへの組み込みに適したベクターに導入され得る。
【０１２３】
対象のポリヌクレオチドは、一般に無処置の染色体以外として実質的に純粋な状態で単離され、入手される。通常、そのＤＮＡは、対象の遺伝子のそれらの配列またはフラグメントを含まない他の核酸配列を実質的に含まずに入手され得、一般に少なくとも約５０％、通常少なくとも約９０％純粋であり、そして代表的には「組換え」であり、すなわち、天然に存在する染色体に通常は結合していない１つ以上のヌクレオチドによって隣接される。
【０１２４】
本発明は、プラスミド、すなわち、本発明の治療的なポリヌクレオチドを含む、１つの生物体から別の生物体へ移行され得る染色体外の細胞質のＤＮＡの独立に複製する小片を提供する。プラスミドは、宿主のゲノムに組み込まれ得るか、または独立して残存し得る。人工的に構築されたプラスミドは、通常、クローニングベクターとして使用される。本発明はまた、ベクター、すなわち、１つの生物体から別の生物体へＤＮＡ配列を移行するために使用され得るプラスミドを提供する。発現ベクターは、本発明の治療的な遺伝子産物を発現するために使用され得、そして代表的には、異種のタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする核酸配列の挿入を提供する制限酵素認識部位を含む。
【０１２５】
対象の遺伝子および遺伝子フラグメントは、虚血性心臓外傷および他の心臓の状態を処置するための治療法に有用である。発現ベクターは、細胞に遺伝子を導入するために使用され得る。このようなベクターは、一般に核酸配列の挿入を提供するプロモーター配列付近に位置する好都合な制限酵素認識部位を有する。転写カセットは、転写開始領域、対象の遺伝子またはそれらのフラグメントおよび転写終結領域を含むように調製され得る。転写カセットは、ベクターが、通常、少なくとも約１日の期間、より通常には、少なくともおよそ数日から数週間の期間、細胞内に一時的にか、または安定的に維持されることができる場合、種々のベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えば、レンチウイルス；アデノウイルスなどに導入され得る。
【０１２６】
アデノウイルスのベクター調製物は、２００３年８月７日に公開された公開番号ＵＳ２００３／０１４８９６８Ａ１および１９９９年８月１９日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／４０９４５に記載されているように、遺伝子送達を促進するために血管作用性の薬剤と組み合わせて投与され得る。ベクターは、血管作用性の薬剤を事前に注入され、そして／または血管作用性の薬剤と同時注入される動脈などの血管または組織に送達され得る。本明細書中で使用されるとき、血管作用性の薬剤とは、高い血管透過性を誘導し、そして／または血管から、例えば、毛細血管内皮を横切って、遺伝子送達ベクターなどの高分子の移行を促進する天然または合成の物質のことをいう。脈管系を、高分子に対してより透過性にするか、またはそうではなく、動脈によって灌流される毛細血管床に高分子を移行することをより受け入れられるようにすることによって、血管作用性の薬剤は、これらのベクターの標的化された部位への送達を促進し得、従って、標的組織における導入遺伝子のすべての発現を効率的に促進し得る。本発明において使用され得る血管作用性の薬剤は、ヒスタミン；ヒスタミン誘導体およびアゴニスト、例えば、ヒスタミンＨレセプターと相互作用するものを含み、それらとしては、例えば、２−メチルヒスタミン、２−ピリジルエチルアミン、ベタヒスチンおよびチアゾリルエチルアミン；（本明細書中および列挙された参考文献に記載されているような）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦアゴニスト；およびニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）などの一酸化窒素供与体が挙げられる。本発明において使用され得るヒスタミンアゴニストは、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１９９０）Ａ．Ｇ．Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（ｐｐ．５７５−５８２）および他の薬理学的論文に記載されている。
【０１２７】
心臓に導入される薬剤が、ポリヌクレオチドであり、そしてそのポリヌクレオチドの遺伝子産物が、虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置するように作用する場合、そのポリヌクレオチドの最適な発現が望まれる。適切なプロモーターの使用は、ポリヌクレオチドの発現を駆動し得る。発現が望ましいときに、その薬剤が、心臓の範囲に局所的に送達される場合、サイトメガロウイルスプロモーターなどの構成的プロモーターが、使用され得る。さらに、心臓特異的プロモーターは、心臓細胞におけるポリヌクレオチドの限定的な発現を保証するために使用され得る。このことは、使用される送達の様式が、治療的なポリヌクレオチドと心臓の組織以外の組織との相互作用に関連する場合、重要であり得る。心筋細胞に独占的に限定される発現については、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ−２）遺伝子内の組織特異的転写制御配列が、使用され得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１５８７５−１５８８５；公開番号ＵＳ２００４／０１３２１９０Ａ１）。他の心臓特異的プロモーターセグメントは、当該分野で公知であり、それらとしては、心房性ナトリウム利尿因子遺伝子、心臓のトロポニンＴ遺伝子およびその近位のヒト脳ナトリウム利尿ペプチド遺伝子のプロモーターにおいて見られるものが挙げられる（ＬａＰｏｉｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００２）２８３：Ｈ１４３９−１４４５；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００４）２８６：Ｃ５５６−５６４；Ｐｌａｇｅｍａｎ＆Ｙｕｔｚｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：１９０２６−１９０３４；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００２）１１０：７１３−７２３）。心臓血管の遺伝子導入についての細胞特異的制御エレメントを使用した効率的かつ強力なベクターの開発は、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２００４）４：４５７−４６７に記載されている。
【０１２８】
詳細には、本発明は、治療的なポリヌクレオチドまたはその生物学的に活性なフラグメントを含む組成物を提供することおよび例えば、虚血性心臓外傷を処置するためにＶＡＲに特異的に組成物を送達するためにカテーテルを用いて患者へ組成物を投与することによって、患者における心臓の状態、例えば、虚血性心臓外傷を処置するための組成物および方法を提供する。その治療的なポリヌクレオチドは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６およびＦＧＦ−１７）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ１ｅおよびＭＧＦ）；ＶＥＧＦ−Ｃなどの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ニューレグリン（ＮＲＧ）などの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーメンバー（例えば、ＮＲＧ−１α、ＮＲＧ−１β、アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリンおよびベータセルリンスプライスバリアント（配列番号１８０））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−ＤおよびＡ、Ｂ、ＣまたはＤポリペプチドの２つのポリペプチドから構成されるＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤおよびＰＤＧＦ−ＡＢ）；オンコスタチンＭ；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）；エンドセリン−１；仮説タンパク質ＸＰ−０９８９１６（配列番号２０）；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦβ；インターフェロン−α１；トレフォイルファクター２などのトレフォイルファクターファミリーのメンバー；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１１）；Ｇ−ＣＳＦスプライスバリアント（配列番号１８３）；ｃｈｒｏ１０ｏｒｆ５８；ｓｕｓｈｉ反復配列含有タンパク質−Ｘ連鎖２；サイモシンβ４；および／またはアンギオテンシン−ＩＩをコードする。
【０１２９】
治療的なポリペプチド
本発明は、心臓の状態を処置するのに有用であるポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸、コードされるアミノ酸およびコードされないアミノ酸、化学的または生化学的に改変されたか、誘導体化されたか、または特製のアミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチド模倣物およびデプシペプチドならびに改変されたペプチド骨格か、環状ペプチド骨格か、二環式ペプチド骨格か、環状デプシペプチド（ｄｅｐｓｉｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）骨格または二環式のデプシペプチド（ｄｅｐｓｉｂｉｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）骨格を有するポリペプチドを含み得る任意の長さのアミノ酸の多量体型を含む。それらは、一本鎖タンパク質ならびに多量体を含む。それらはまた、結合体化タンパク質、融合タンパク質（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、異種のアミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種のリーダー配列および相同なリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端のメチオニン残基を有するかまたは有さない融合タンパク質、ペグ化された（ｐｅｇｏｌｙａｔｅｄ）タンパク質および免疫学的に標識されたか、またはｈｉｓ標識されたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。天然に存在するタンパク質の変形がまた、天然に存在するタンパク質と相同かまたは実質的に類似であり、ならびに、様々な種由来のホモログと一致する場合、このような変形が、本発明のポリペプチドに含まれる。ポリペプチド配列の改変体は、対象ポリペプチドと比較して挿入、付加、欠失または置換を含む。本発明のポリペプチドはまた、ペプチドアプタマーを含む。
【０１３０】
本発明に従って使用され得る、虚血性心臓外傷および他の心臓の状態を処置するのに有用なポリペプチドは、成長因子を含む。いくつかの成長因子は、広範な特異性を有し、そしていくつかは、狭小な特異性を有する。広範な特異性を有する成長因子の例としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、トランスフォーミング成長因子βおよび線維芽細胞成長因子が挙げられ、これらは、多くの種類の細胞において作用する。狭小な特異性を有する成長因子の例は、赤血球の前駆体の増殖を誘導するエリトロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｔｉｎ）；活性化されたＴリンパ球の増殖を刺激するインターロイキン−２；種々のタイプの血液細胞前駆体の増殖および生存を刺激するインターロイキン−３；ならびに特定の種類のニューロンからの神経プロセスの生存および増殖を促進する神経成長因子が挙げられる。成長因子の他の例としては、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。
【０１３１】
分子オンコスタチンＭもまた、本発明において有用である。オンコスタチンＭは、活性化されたヒトＴリンパ球、マクロファージおよび好中球を含むいくつかの細胞タイプによって発現されるインターロイキン−６ファミリーに属する多面発現性サイトカインである。オンコスタチンＭが、インビトロにおいて乳癌細胞の増殖を抑制し得る一方で、最近の研究では、オンコスタチンＭが、血管新生および転移を促進することによって腫瘍進行を促進し得ると示唆されている（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００５）６５（１９）：８８９６−９０４）。さらに、乳癌細胞によって産生される顆粒球マクロファージコロニー刺激因子および細胞−細胞接触は、その両方が好中球からのオンコスタチンＭの放出に必要であり得る。重要なことには、好中球由来オンコスタチンＭは、共培養において乳癌細胞からの血管内皮成長因子を誘導し、そして乳癌細胞の解離および侵襲性の能力を増大させる。このことから、好中球およびオンコスタチンＭが、インビボにおける腫瘍進行を促進し得ることが示唆される。
【０１３２】
本発明において有用である別の分子は、白血病抑制因子または「ＬＩＦ」である。オンコスタチンＭおよびＩＬ−６と類似のＬＩＦは、種々の生理応答（例えば、細胞増殖、分化および炎症）に関係付けられている。１つの研究において、ＯＳＭとＬＩＦとの両方が、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＡＴＳＣ）の増殖を刺激したが、しかしながら、ＩＬ−６は、細胞増殖には影響を及ぼさなかったことが示された（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００５）３７（１１）：２３５７−６５）。ＬＩＦはまた、子宮において重要な役割を果たすことが示されており、これが存在しない場合には、胚は、着床しない。しかしながら、ＬＩＦに対する標的についての知見識およびＬＩＦ非存在の結果は、まだ非常に不完全である（Ｆｏｕｌａｄｉ−Ｎａｓｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．（２００５）２８１（１）：１−２１）。
【０１３３】
本発明における別の有用な分子は、トレフォイルファクター２または「ＴＦＦ２」である。消化器系のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＴＦＦ３）は、粘膜の完全性を維持するのに重要な役割を果たすと考えられている。１つの研究において、消化管の保護におけるトレフォイルファクター２（ＴＦＦ２）の生理学的役割は、ＴＦＦ２欠損において研究され、そして重要な腸管殺菌性タンパク質をコードするいくつかのマウスディフェンシン（クリプトジン）遺伝子が、ＴＦＦ２欠乏の結果としてアップレギュレートされたことが観察された（Ｂａｕｓ−Ｌｏｎｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００５）１６（ｌ−３）：３１−４２）。  ＴＦＦ２の細胞遊走促進（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）作用は、ＥＲＫｌ／２およびタンパク質キナーゼＣ活性化に依存することが証明されている；他方では、ＥＧＦによって引き起こされる細胞遊走促進応答は、ＥＲＫ１／２の活性化から完全に独立すると示されたが、ホスホイノシチド３−キナーゼ、ｐ３８、タンパク質キナーゼＣまたは核内因子κＢの阻害に感受性であることが示された（Ｃｈｗｉｅｒａｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（２００４）３１（５）：５２８−３７）。しかしながら、ＥＧＦおよびＴＦＦ２の細胞遊走促進作用は、相加的である。これらのデータから、管腔のＥＧＦおよびＴＦＦペプチドが、ぜん息などの疾患の過程において迅速な修復プロセスを促進するためにヒト気道上皮において相乗的に作用し得ることが示唆される。
【０１３４】
本発明に従って使用され得る他の成長因子は、種々の線維芽細胞成長因子である。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００３）２７８（３６）：３４２２６−３４２３６（Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｊｕｎ）に説明されているように、ヘパリン硫酸塩グリコサミノグリカンおよびＦＧＦ細胞表面レセプター（ＦＧＦＲ）の細胞外のドメインと相互作用するタンパク質のファミリーであり、レセプターの活性化および生物学的応答を引き起こす。ＦＧＦ相同因子として知られる他の因子（ＦＧＦ−１１〜ＦＧＦ−１４としても知られるＦＨＦ１〜ＦＨＦ４）は、実質的な配列相同性によって、そして高い親和性でヘパリンと結合する能力によってＦＧＦと関連しているが、７つの主要なＦＧＦＲのいずれも活性化させない。ＦＧＦは、ヘパリン結合性成長因子（ＨＢＧＦ）とも呼ばれる。これらのタンパク質の様々なメンバーの発現は、種々の組織において見られ、そして特定の時間的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、一般に種々の細胞タイプ（例えば、中胚葉起源、外胚葉起源および内胚葉起源の細胞タイプ、例えば、線維芽細胞、角膜細胞および血管内皮細胞、顆粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、水晶体上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、乏突起膠細胞、アストロサイト、骨芽細胞および造血細胞が挙げられる）に対して強力なマイトジェンである。
【０１３５】
ＦＧＦ遺伝子ファミリーおよびその進化の概要は、Ｉｔｏｈ  ａｎｄ  Ｏｒｎｉｔｚ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００４）２０：５６３−５６９およびＯｒｎｉｔｚ  ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）２：１−１２によって提供される。ＦＧＦファミリーの各メンバーは、独特の範囲の機能ならびにこのファミリーの他のメンバーと重複するか、またはこのファミリーの他のメンバーとの相互作用を必要とする機能を有する。例えば、ファミリーメンバーのうちの２つ、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は、多くの名称によって特徴付けられるが、それぞれ酸性線維芽細胞成長因子および塩基性線維芽細胞成長因子としてが最も多い。通常の遺伝子産物は、中胚葉由来細胞および神経外胚葉由来細胞の大部分の通常の増殖性能力に影響する。これらは、Ｂｕｒｇｅｓｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｉａｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９）５８：５７５−６０６に記載されているように、インビボにおける血管新生を誘導することができ、そして発生初期において重要な役割を果たし得る。さらに、ＦＧＦ−１とＦＧＦ−２との両方が、血管内皮細胞の増殖および走化性を刺激する能力を有する。さらに、ＦＧＦ−２の心筋内の投与は、虚血に誘導される心筋層の細胞死および不整脈を予防することが報告されている（Ｎｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｊ．（２００３）６７：３３４−９）。次のいくつかの段落において、細胞増殖、遊走、分化、組織修復、外傷に対する応答およびシグナル伝達における様々なＦＧＦの多様な役割について説明する。
【０１３６】
ＦＧＦファミリーの他の多くのメンバーは、血管新生および創傷治癒を促進するなどのＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２と同様の活性を共有する。さらに、一定のＦＧＦは、それらの発現が調節解除されているとき、腫瘍の血管新生を促進することによってそしてトランスフォーミングタンパク質として癌腫および肉腫における腫瘍形成の促進と関連付けられる。例えば、Ｐｉｃｋｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈｉｒ，Ａｕｄｉｏｌ．Ｎｅｕｒｏｏｔｏｌ．（２００２）７（１）：３６−３９では、内耳の発生におけるＦＧＦの活性が説明された。その活性としては：耳胞を誘導する際のＦＧＦ−１９の活性、そして、その後の耳胞のさらなる発生を誘導する際のＦＧＦ−３の活性；蝸牛の神経線維を発生するための栄養素として作用するＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の活性；および蝸牛の腔の壁の発生におけるＦＧＦ−３およびＦＧＦ−１０の活性が挙げられる。ＦＧＦ−３分子は、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２と比較して、ＦＧＦ−１とＦＧＦ−２との両方より長く、５ヶ所のアミノ酸挿入を伴うことが記載されている（Ｄｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２６：８３３）。
【０１３７】
ＦＧＦ−４は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−３と約４０％相同性を共有する分子のＣ末端半分におけるその中に２０６アミノ酸を含むことがＹｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７３０５−７３０９（１９８７））によって報告された。ＦＧＦ−４は、トロフォブラスト幹細胞を維持するときにインビトロにおいて活性であることが報告されており、そしてＧｏｌｄｉｎ  ａｎｄ  Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ、Ｇｅｎｅｓｉｓ（２００３）３６（１）：４０−４７に記載されているように着床周辺期のマウス発生に絶対的に必要であることが見出された。
【０１３８】
ＦＧＦ−５ｃＤＮＡ、ＦＧＦ−５の推定されるアミノ酸配列、その発現のための方法ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３およびＦＧＦ−４との配列比較が、Ｚｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８７）８：３４８７−３４９５．Ｃｌａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．（２０００）２１９（３）：３６８−３８０によって報告され、異所的にＦＧＦ−５を発現し、そして後肢を発生する間ずっと、テネイシンを発現する、結合組織線維芽細胞系列の増殖および膨張を有意に刺激したことが分かった。
【０１３９】
ＦＧＦ−６ｃＤＮＡ、ＦＧＦ−６の推定されるアミノ酸配列および発現のための方法は、Ｃｏｕｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（１９９１）６：１４３７−１４４４によって報告された。ＦＧＦ−６は、筋原性の系列においてほぼ独占的に蓄積することが分かった。組換えＦＧＦ−６の単一用量の注入は、Ａｒｍａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００３）１６４２（１−２）：９７−１０５に記載されているように、サイクリンＤ１ｍＲＮＡの発現をアップレギュレートさせること、分化マーカー（例えば、ＣｄｋＩｓ、ＭＨＣＩおよびＴｎＩ）の発現を増加させることおよび細胞の分化を加速することが分かった。
【０１４０】
ＦＧＦ−７のアミノ酸配列は、Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９３）１３：４２５１−４２５９によって開示されており、そして本明細書中でＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−６の配列と比較される。ＦＧＦ−７は、Ｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００３）５５２（２−３）：１５０−４．Ｋｉｎｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３（１）：３９−５３に記載されているように、ＦＧＦＲファミリーの１つのアイソフォームである、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ特有のエキソンとＦＧＦ−７のβ４／β５ループとの間の相互作用を介してＦＧＦＲ２ＩＩＩｂと独占的に相互作用することが分かり、成体の哺乳動物の網膜神経節細胞（「ＲＧＣ」）の生存および神経突起伸長に対するＦＧＦＲ−３およびその好ましいリガンドであるＦＧＦ−９の効果を調査し、そしてリガンド−レセプター対が、成体の哺乳動物の網膜神経節細胞の生存を促進するように機能し得ることが示唆された。
【０１４１】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−８を作製する方法は、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９（１９）：８９２８−８９３２によって報告された。ＡＩＧＦとしても知られているＦＧＦ−８は、テストステロンで刺激されたマウス乳癌細胞（ＳＣ−３）の条件化された培地から精製された。ＦＧＦ−８は、推定上シグナルペプチドを有し、そしてＦＧＦファミリーの公知のメンバーと３０〜４０％相同性を共有する、特徴的なＦＧＦ様成長因子である。ＦＧＦ−８は、腫瘍細胞自体によって分泌されるので、ＳＣ−３細胞およびおそらく他の細胞のアンドロゲンに誘導される増殖を媒介する（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９（１９）：８９２８−８９３２）。
【０１４２】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−９を作製する方法は、Ｓａｎｔｏｓ−Ｏｃａｍｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：１７２６−１７３１；米国特許第５，１５５，２１４号によって報告された。ＦＧＦ−９は、ＦＧＦファミリーの他のメンバーに対して約３０％の配列類似性を有する。ファミリーメンバーにおける２つのシステイン残基および他のコンセンサス配列は、ＦＧＦ−９配列においてよく保存されていた。ＦＧＦ−９は、そのＮ末端に酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦにおいて観察された配列などの代表的なシグナル配列を有さないことが分かった。しかしながら、ＦＧＦ−９は、合成後に細胞から分泌されることが観察された（Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９３）１３：４２５１−４２５９）。他のＦＧＦと同様にＦＧＦ−９は、細胞の同調的な集団の世代において、例えば、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９またはＦＧＦ−４の存在下で胚様体を神経幹細胞の同調的な集団に成長する際における適用を見出し得る（ＷＯ０５／０２１７２０）。
【０１４３】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−１０を作製する方法は、Ｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２（３７）：２３、１９１−２３，１９４．Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．（２００３）２２８（２）：１８５−１９３によって報告されており、膵臓の細胞増殖および分化の制御におけるＦＧＦ−１０およびＦＧＦＲ−２ｂシグナル伝達についての役割が示唆された。
【０１４４】
ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３およびＦＧＦ−１４は、それぞれＦＨＦ−３、ＦＨＦ−１、ＦＨＦ−２およびＦＨＦ−４としても知られており、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：４４６８によって記載されているようにクローニングされ、そしてそれらの推定されるアミノ酸配列は、Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（１９９６）９３：９８５０−９８５７によって報告された。Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．はまた、これらのＦＧＦが発生中および成体の神経系において発現されると報告した。ＦＧＦ−１２およびＦＧＦ−１３ＲＮＡは、マウスの増殖している上衣層の外側の細胞において中枢神経系を発生するときに検出された。ＦＧＦ−１３ＲＮＡは、末梢神経系のいたるところで見られた。ＦＧＦ−１２は、マウスの肢の骨格の結合軟組織を発生するときに発現されていることが分かった。
【０１４５】
ＦＧＦ−１２とＦＧＦ−１３との両方が、Ｈａｒｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．（１９９７）６４（１−２）：３１−３９に記載されているように、心筋層において発現されることが報告され、ＦＧＦ−１２  ＲＮＡは、心房においてのみ見られ、そしてＦＧＦ−１３  ＲＮＡは、心房と心室との両方において検出された。さらに、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２５０（１）：１３７−１４２では、ＦＧＦ−１３は、ヒト肺線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の細胞増殖を誘導するが、皮膚の血管内皮細胞に対しては影響を及ぼさないことが見出された。対照的に、ＦＧＦ−２は、３つの細胞タイプすべてにおいて細胞増殖を誘導した。
【０１４６】
ＦＧＦ−１５に対応するｃＤＮＡクローンおよびその推定されるアミノ酸配列は、ＭｃＷｈｉｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９７）１２４：３２２１−３２３２によって報告された。最近では、ＦＧＦ−１５は、マウス心臓の流出路の適切な形態形成に必要とされることが見出された（Ｖｉｎｃｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ（２００５）４１：１９２−２０１）。
【０１４７】
ＦＧＦ−１６は、２０７アミノ酸を含むポリペプチドとして同定され（Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２４３（１）：１４８−１５２）、そして約７３％のアミノ酸同一性を有するＦＧＦ−９にいくらかの類似性を有するようだ。ヒト胚性癌腫由来細胞株Ｔｅｒａ−２におけるＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＦＧＦ−１８の活性の比較において、これらの４つすべてのＦＧＦが、約１〜１０ｎｇ／ｍｌの間隔の濃度でアポトーシスを妨げることによってＴｅｒａ−２細胞の生存率を増加させたことが観察された（Ｇｒａｎｅｒｕｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０００）２０（５Ｂ）：３５２７−３５３１）。より高い濃度のこれらの４つすべてのＦＧＦは、細胞運動性に対して優先的な効果を示した。
【０１４８】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−１７を作製する方法は、Ｈｏｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２４４（１）：１８７−１９１によって報告された。ＦＧＦ−１７は、Ｐｏｌｎａｓｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ（２００４）Ｊｕｎ  ６０（１）：１８−２４によって前立腺癌および良性の前立腺肥大において過剰発現されることが報告されている。また、大血管の成長において役割を果たすことが見出された（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．（１９９９）８３（１−２）：１６５−１７８）。
【０１４９】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列およびＦＧＦ−９８としても知られる組換えＦＧＦ−１８を作製する方法は、ＷＯ２００１／１３０３１において報告された。これは、発生中の組織および成体の肺において顕著に発現される（Ｏｈｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（２９）：１８，１６１−１８，１６４）。
【０１５０】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−１９を作製する方法は、Ｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（１９９９）１１（１０）：７２９−７３５によって報告された。ヒトＦＧＦ−１９は、オルソロガス遺伝子であり得る（Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．（２００１）２：３００５．１−３００５．１２）。
【０１５１】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−２０を作製する方法は、Ｋｉｒｉｋｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７４（２）：３３７−３４３によって報告された。ＦＧＦ−２０は、心内膜および心外膜において発現されていることが見出され（Ｌａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００５）８：８５−９５）、そして別の研究において、ＥＳ細胞由来のニューロスフェアにおいてドーパミン作動性ニューロンの数を増加させるようにＦＧＦ−２と相乗的に作用することが見出された（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００５）１１５：２３−２５）。
【０１５２】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−２１を作製する方法は、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００）１４９２：２０３−２０６によって報告された。ＦＧＦ−２１は、肝臓において最も大量に発現されると当初特徴付けられ、そしてＦＧＦ−１９に対して最もよく似ている（約３５％アミノ酸同一性）（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００）１４９２：２０３−２０６）。
【０１５３】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−２２を作製する方法は、Ｎａｋｅｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００１）によって報告され、ＦＧＦ−７およびＦＧＦ−１０のホモログとして特徴付けられた。ＦＧＦ−２２は、その活性を制御する線維芽細胞成長因子結合タンパク質（ＦＧＦ−ＢＰ）と相互作用することが観察されている（Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４（３４）：５２６９−５２７７）。ＦＧＦ−ＢＰは、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２と結合し、そしてそれらを活性化することが知られており、それによって腫瘍の血管新生に寄与する（Ｂｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４（３４）：５２６９−５２７７）。ＦＧＦ−２２はまた、哺乳動物の脳におけるシナプス前部の組織化分子として作用することが報告されている（Ｕｍｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００４）１１８：２５７−２７０）。
【０１５４】
ｃＤＮＡ、推定されるアミノ酸配列および組換えＦＧＦ−２３を作製する方法は、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７７：４９４−４９８）によって報告されている。ＦＧＦ−２３は、脳の視床腹外側核において優先的に発現されることが見出され、この特定の位置におけるＦＧＦ−２３についての役割が示唆される（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７７：４９４−４９８）。
【０１５５】
ＥＧＦはまた、本発明に記載の心臓の状態を処置するために使用され得る。実施例においてより詳細に説明されるように、ＥＧＦファミリーメンバーのアンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびベータセルリンは、カルディオスフィア発生を促進する。従って、ＥＧＦファミリーメンバーは、心筋細胞の前駆細胞の増殖を刺激するためおよび患者における虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置するために使用され得る。上皮成長因子（ＥＧＦ）は、正常および悪性のげっ歯類乳腺上皮およびヒト乳腺上皮細胞ならびに線維腺腫を含む種々の組織をインビトロにおいて刺激する（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：２３６１−２３６６；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０３：７２２−７２５）。アンフィレグリンは、いくつかのヒト癌腫細胞の増殖を阻害することならびにヒト線維芽細胞および一定の腫瘍細胞の増殖を刺激することが示されている糖タンパク質である（Ｓｈｏｙａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：６５２８−６５３２）。Ｅｐｉｇｅｎは、上皮細胞の増殖を促進することができ、上皮細胞におけるｃ−ｅｒｂＢ−１およびＭＡＰキナーゼタンパク質のリン酸化を刺激することができる（Ｓｔｒａｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６：１８，２６５−１８，２７１）。エピレグリンは、いくつかの上皮腫瘍細胞の増殖を阻害し、そして線維芽細胞および様々な他のタイプの細胞の増殖を刺激する（Ｔｏｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：７４９５−７５００；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００３）１０８：２５２４−２５２９）。ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）は、ＢＡＬＢ−３Ｔ３線維芽細胞および平滑筋細胞について分裂促進的であるが、上皮細胞についてはそうではない（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：９３６−９３９）。トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）は、正常な哺乳動物細胞の可逆的な表現型の形質転換を誘導し得る５０残基ポリペプチドである（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３，８３８−１３，８４３；Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３８：２８７−２９７）。ＴＧＦαおよび関連ポリペプチドは、細胞の集団を増殖するときの適用を見出し得る（米国特許出願２００２  ０１６９１１９および同２００２  ０１９３３０１）。ベータセルリンは、網膜色素上皮細胞および血管平滑筋細胞に対する強力なマイトジェンである（Ｓｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２５９：１６０４−１６０７）。
【０１５６】
ＩＧＦはまた、本発明に記載の心臓の状態を処置するために使用され得る。ＩＧＦファミリーのメンバーは、様々な組織への広範な作用を有することが報告されている。その作用としては、同化を刺激すること、急性的な代謝的効果を刺激すること、細胞増殖および分化を促進することならびにアポトーシスから細胞を保護することが挙げられる。心臓の成長、構造および機能を制御するときの成長ホルモン（ＧＨ）ＩＧＦ−Ｉ軸の役割は、Ｉｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．（１９９９）３１（２−３）：５０−５４によって概説されている。心筋細胞におけるＩＧＦファミリーの作用のメカニズムは、再生の効果および抗アポトーシス効果ならびに熱ショックタンパク質とＩＧＦ−Ｉレセプターシグナル伝達との間の相互作用を含む（Ｓａｅｔｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ．ＩＧＦ  Ｒｅｓ．（２００５）１５（２）：８９−９４）。
【０１５７】
ＰＤＧＦファミリーのメンバーは、本発明に記載の心臓の状態を処置するために使用され得る。ＰＤＧＦシグナル伝達経路を促進することは、心臓保護を提供し、冠状動脈閉塞後の心筋層の外傷の程度を低減させることが報告されている（Ｅｄｅｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２００３）３（１）：２７−３５）。ＰＤＧＦ−ＡＡは、心筋細胞に対する分裂促進的な効果を有することが報告されている（Ｓｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９９８）９３  Ｓｕｐｐｌ  ３：４０−４３）。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦαレセプタータンパク質とＰＤＧＦβレセプタータンパク質との両方の高い合成を誘導し、高い親和性でＰＤＧＦβレセプターと結合する（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：２１１３８−２１１４４）。ＰＤＧＦ−ＢＢと共に培養された新生仔ラット心筋細胞を刺激することは、自然発症高血圧ラットにおいて心筋層の肥大化を誘導することが報告され、このことから、ＰＤＧＦ−ＢＢが、心筋細胞増殖を媒介するときに役割を果たすことが示唆される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｅｎｇ  Ｌｉ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．（２００２）５４（２）：１５９−１６４。ＰＤＧＦ−ＤＤは、細胞外のプロテアーゼによって活性化される潜在性の活性によってジスルフィド結合したホモ二量体として分泌される（Ｂｅｒｇｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００１）３（５）：５１２−５１６）。ＰＤＧＦ−ＤＤは、ＰＤＧＦレセプターβアイソフォームに特異的である（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２００４）１５（４）：１９７−２０４）。しかしながら、Ｒａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．（２００４）１５（４）：２３７−２５４によって記載されるように、ＰＤＧＦは、一定の条件下で、心臓血管疾患に寄与し得る。
【０１５８】
ほとんどの成長因子は、細胞成長または増殖を誘導することに加えて他の作用を有する。例えば、それらは、生存、分化、遊走または他の細胞の機能に影響を及ぼし得る。成長因子は、これらの標的に対する複雑な効果を有し得る、例えば、いくつかの細胞に対しては細胞分裂を刺激するように作用し得、そして他の細胞に対しては細胞分裂を阻害するように作用し得る。これらは、１つの濃度において増殖を刺激し得、そして別の濃度においては増殖を阻害し得る。
【０１５９】
本発明の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、肝細胞成長因子、エンドセリン−１およびトランスフォーミング成長因子）は、酸化ストレスに対して心臓を保護し得る（Ｓｕｚｕｋｉ、Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．（２００３）５：７４１−７４９）。本発明において使用され得る他の治療的なポリペプチドは、筋細胞増殖を刺激するアンギオテンシンＩＩ（Ｓｅｎ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（１９９７）３０：２０９−２１６を参照のこと）および虚血の前またはその間に投与されるとき、組織喪失および機能不全から心筋層を保護するＦＧＦ−２（Ｄｅｔｉｌｌｉｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（２００３）５７：８−１９；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（２００４）６２：１５４−１６６）である。
【０１６０】
サイモシンβ４は、胚性および出生後の心筋細胞の生存および修復を促進すると報告されている多様な範囲の活性を有する低分子タンパク質である（Ｂｏｃｋ−Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２：４６６−７２）。サイモシンβ４は、成長因子シグナル伝達カスケードによってアクチン細胞骨格を統合すると仮定されている（Ｂｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．（２００３）６６：２９７−３１６）。サイモシンβ４は、心筋、脾臓、胸腺、脳、肺および肝臓を含む多くの組織に存在する（Ｈａｎｎａｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９：２１７２）。
【０１６１】
本発明はまた、生存因子（例えば、ＩＧＦ１およびカルジオトロピン−１）での処置を提供する。これらの因子は、単独でか、または他の因子と組み合わせて、成体の心筋細胞および新生仔の心筋細胞ならびに他のタイプの細胞（例えば、腎細胞および神経細胞）に対する保護を提供し得る。本発明はまた、相乗的効果を有する成長因子の組み合わせを提供する。例えば、１つ以上のＦＧＦは、相乗的効果を有する、１つ以上のＩＧＦ、ＨＧＦ、Ｗｎｔ（「縮れた」遺伝子ファミリーを含む７回膜貫通領域を有するレセプターに対するリガンド）または骨形態形成タンパク質と組み合され得る。
【０１６２】
心筋細胞がストレスなどの刺激に応答するメカニズムは、複雑である。心筋細胞は、種々の刺激に応答し、そしてそれらの応答は、多くの因子に依存し、その因子としては、関連する刺激および発生の段階が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、増殖刺激に応答して、成体の心筋層の心筋細胞は、未分化の心筋細胞とは対照的に、それらの細胞の塊を増大させるが、増殖しない。出生後の心筋細胞は、成体の心筋細胞では機能しない、アンギオテンシンＩＩメカニズムおよびエンドセリンメカニズムを介して機械的伸長に応答する（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｉｐｅｒ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９９）１３  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１７−２２）。これらの応答の後ろのシグナル伝達メカニズムは、異なるシグナル伝達経路に関連し、その各々は、すべての応答に構成要素を与える。例えば、マイトジェンによって活性化されたタンパク質キナーゼを含む経路の活性化は、胎児の遺伝子の再発現を導き得、他方で、ＰＩ３−キナーゼおよびｐ７０ｓ６ｋを含む経路の活性化は、タンパク質合成および細胞増殖の通常の活性化を導き得る（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｉｐｅｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９９）１３  Ｓｕｐｐｌ．：Ｓ１７−２２）。これらの経路についての理解、それらのタイミングならびに関連する工程および構成要素は、虚血性心臓外傷および他の心臓の状態を含むストレスから生じる外傷を処置するために効果的なストラテジに導き得る。
【０１６３】
本明細書中に記載される成長因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−９）は、心筋細胞の前駆細胞（例えば、心臓の幹細胞）の増殖を刺激して、それによって患者における虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置するために使用され得る。実施例においてより詳細に記載されるように、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−９およびＥＧＦは、心筋細胞に分化し得る心臓検体の継代培養から生じた未分化な細胞の集団であるカルディオスフィアの数を増加させることが見出されている（Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５：９１１−９２１）。心臓に存在するのは、心筋細胞に分化し得る幹細胞である（Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５：９１１−９２１；Ｂｅｌｔｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００３）１１４：７６３−７７６；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００：１２，３１３−１２，３１８；Ｌａｕｇｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３３：６４７−６５３）ので、心筋層の修復および虚血性心臓外傷および他の心臓の状態の処置は、これらの幹細胞の増殖および分化を引き起こす物質を局所的に投与することによって達成され得る。このストラテジは、Ｌｏｖｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｈｕｒ，Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．（２００４）３７：６７−８７によって説明されているように難題を伴う手技である細胞の移植に関連しない。
【０１６４】
複数の経路が、心筋細胞を酸化ストレスに適応することができるか、または肥大性の（ｈｙｐｅｒｔｏｐｈｉｃ）応答を展開することができるように一斉に作用する。同様に、複雑な経路および多工程経路が、心筋細胞の分化および増殖を管理する。これらの経路に関連する成長因子、酵素、基質、転写因子および他の物質は、心筋細胞の生存、成長、増殖および分化についての経路が必要であれば作用することを保証することによって、患者における虚血性心臓外傷および他の心臓の状態を処置するために使用され得る。これらとしては、１８ｋＤａＦＧＦ−２、２１〜３４ｋＤａＦＧＦ−２（ｈｉ−ＦＧＦ−２）、活性化タンパク質−１（ＡＰ−１）、酸性線維芽細胞成長因子（またはＦＧＦ−１もしくはａＦＧＦ）、Ａｋｔ、アンギオテンシンＩＩレセプター、アキシン、β１インテグリン、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性キナーゼ、カルシニューリン、カルモジュリン、カタラーゼ、カテコールアミン、ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ、コネキシン４３、Ｃｓｘ／Ｎｋｘ−２．５転写因子、ジアシルグリセロール、Ｅｇｒ−１（初期増殖応答タンパク質）、Ｅ１Ｆ−４Ｅ（ペプチド鎖開始因子）、Ｅｌｋ−１転写因子、ＥｒｂＢ２レセプター、ＥｒｂＢ４レセプター、ＥＲＫ（細胞外のシグナルに制御されたキナーゼ）、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ−２、エストロゲン、細胞外のシグナルに制御されたキナーゼ、ＦＧＦＲ−１レセプター、ＦＧＦＲ−１チロシナーゼ、線維芽細胞成長因子８ｂ、ＦＯＧ−２（ＧＡＴＡ−２の仲間）、Ｆｒａｔ１、Ｆｙｎ、Ｇαｉタンパク質、Ｇαｑタンパク質、ＧＡＴＡ（メンバーＧＡＴＡ−１、−２、−３、−４、−５および−６を含む）、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−６、Ｇｉタンパク質、ｇｐｌ３０−シグナル伝達物質および転写の活性化因子、Ｇｑタンパク質、Ｇｒｂ２、グリア成長因子２、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３インヒビター、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、イノシトール−１，４，５−三リン酸、インスリン、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子ＩＩレセプター、インテグリン、Ｊａｎｕｓキナーゼ、ＭＡＰＫ（マイトジェンによって活性化されたタンパク質キナーゼ）、ＭＡＰＫホスファターゼ−１、ＭＧＦ（機械的成長因子）、ＭＥＦ２（筋細胞エンハンサー因子−２）、ＭＥＫ（マイトジェンで活性化されたタンパク質キナーゼキナーゼ）、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、マイトジェンで活性化されたタンパク質キナーゼ、ＭＫＫ（ＭＡＰＫキナーゼ）、ニューレグリン、ニューレグリン−１（ｎｅｕ分化因子、ヘレグリン、グリア成長因子およびアセチルコリンレセプターを誘導する活性としても知られる）、神経ペプチドＹ、ＮＦＡＴ（活性化されたＴ細胞の核因子）、ＮＦ−ＡＴ３（活性化されたＴ細胞３の核因子）、ＮＦ−κβ（核因子κβ）、一酸化窒素、オルニチンデカルボキシラーゼ、ｐ７０ｓ６ｋ、ＰＤ０９８０５９、フェニレフリン、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）、ホスホリパーゼＣ、ＰＫＣｅ、タンパク質キナーゼＢ、タンパク質キナーゼＣ、タンパク質ホスファターゼ２Ａ、タンパク質チロシナーゼ、タンパ���質チロシンホスファターゼ、ＲａｃＧＴＰアーゼ、Ｒａｆ／ＭＫＫＫ（ＭＡＰＫキナーゼキナーゼ）、ＲａｓＧＴＰアーゼ、ＲｈｏＡ  ＧＴＰアーゼ、Ｓｈｃ、Ｓｏｓ、Ｓｒｃ相同性ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１、ＳＲＦ（血清応答因子）、Ｓｔａｔ（シグナル伝達物質および転写の活性化因子）、ステロイドレセプターコアクチベーター−１、スーパーオキシドジスムターゼ、サイモシンβ４、トランスフォーミング成長因子β、トランスフォーミング成長因子β１、腫瘍壊死因子、Ｗｎｔ−３ａタンパク質、ＹＹ１転写因子、β−カテニンおよびそれらの改変体が挙げられる。本発明において使用され得る改変体は、恒常的に活性な形態および活性化された形態を含み、これらの改変体としては、恒常的に活性なＡｋｔ、恒常的に活性なＰＩ３−キナーゼ、活性化されたカルシニューリン改変体、機能獲得型のβ−カテニンおよび活性化されたβ−カテニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本発明において使用され得るさらなる改変体としては、ビオチン化された形態、例えば、ストレプトアビジンと結合体化されるビオチン化されたＩＧＦ−１およびビオチン化された自己集合性ペプチドナノ繊維（２００５年４月３〜８日にＳｔｅａｍｂｏａｔ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡで開催されたＫｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｄ２）において発表された、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＧＦ−１  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ”）および切断型、例えば、機械的成長因子（ＭＧＦ）のＥ−ドメイン（２００５年４月４日にＳｔｅａｍｂｏａｔ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡで開催されたＫｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｄ２）において発表された、Ｇｅｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＩＧＦ−Ｉ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ”）が挙げられる。また、ニューレグリン、ニューレグリン誘導体および関連化合物は、２０００年６月２９日に公開された、ＰＣＴ出願ＷＯ００／０３７０９５に記載の、心筋細胞の増殖および／または分化ならびに心臓疾患および心不全の処置または管理について使用され得る。
【０１６６】
β−カテニンを安定化する物質が、本発明において治療薬として使用され得る。β−カテニンの安定化に導く経路が、例えば、Ｈａｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：４６１０−４６１５によって研究されている。β−カテニンを安定化する物質は、当該分野で公知であり、それらとしては、インスリン、インスリン様成長因子−１、フェニレフリン、ｗｎｔタンパク質および肥大刺激物が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＫＢによるＳｅｒ−９のリン酸化を介するＧＳＫ−３βの阻害が、β−カテニンが安定化されるメカニズムであるようであるので、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）はまた、β−カテニンを安定化するために使用され得る（Ｈａｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３）１００：４６１０−４６１５）。
【０１６７】
本発明の治療的な方法は、生理学的および病理的プロセスを調節し得る。この調節は、適切なコントロールと比較して、計測された活性における増加もしくは減少、刺激、阻害または封鎖を包含し得る。発現レベルの調節は、試験される薬剤を欠くコントロールと比較して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる目的のｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルを上昇させることおよびそのレベルを低下させることを含む。いくつかの実施形態において、特定の目的の薬剤は、対象ポリペプチドの生物学的活性を阻害し、そして／または細胞における対象ポリペプチドのレベルを低下させ、そして／または細胞における被験体ｍＲＮＡのレベルを低下させ、そして／または真核細胞からの対象ポリペプチドの放出を減少させ、そして／または病状に関連する症状（例えば、細胞死および細胞損傷）を低減する薬剤である。他の実施形態において、目的の薬剤は、ポリペプチド活性を増加させる薬剤である。活性な対象ポリペプチドのレベルを調節することは、対象ポリペプチドの活性を増加または減少させること；活性なポリペプチドのレベルを上昇または低下させること；および活性な対象ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを上昇または低下させることを含み得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象ポリペプチド自体が、個体に投与される場合の対象ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、薬剤は、対象ポリペプチドに特異的な抗体である。
【０１６８】
詳細には、本発明は、治療的なポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントを含む組成物を提供することおよび例えば、虚血性心臓外傷を処置するためにＶＡＲに特異的に組成物を送達するためにカテーテルを用いて患者へ組成物を投与することによって、患者における心臓の状態、例えば、虚血性心臓外傷を処置するための組成物および方法を提供する。その治療的なポリヌクレオチドとしては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６およびＦＧＦ−１７）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ１ｅおよびＭＧＦ）；ＶＥＧＦ−Ｃなどの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ニューレグリン（ＮＲＧ）などの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーメンバー（例えば、ＮＲＧ−１α、ＮＲＧ−１β、アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリンおよびベータセルリンスプライスバリアント（配列番号１８０））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−ＤおよびＡ、Ｂ、ＣまたはＤポリペプチドの２つのポリペプチドから構成されるＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤおよびＰＤＧＦ−ＡＢ）；オンコスタチンＭ；肝細長因子（ＨＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）；エンドセリン−１；仮説タンパク質ＸＰ−０９８９１６（配列番号２０）；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β；インターフェロン−α１；トレフォイルファクター２などのトレフォイルファクターファミリーのメンバー；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１１）；Ｇ−ＣＳＦスプライスバリアント（配列番号１８３）；ｃｈｒｏ１０ｏｒｆ５８；ｓｕｓｈｉ反復配列含有タンパク質−Ｘ連鎖性２；サイモシンβ４；および／またはアンギオテンシン−ＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
改変体および変異ポリペプチド
本発明によって包含される治療的なポリペプチドには、上記で述べた成長因子およびタンパク質などのように明確に同定された治療的なポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよびアナログが含まれることが理解される。従って、例えば、ＥＧＦとの言及は、全長ＥＧＦだけでなく、ＥＧＦの生物学的に活性なフラグメントおよびアナログもまた包含する。生物学的に活性なフラグメントまたはアナログは、虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置することができる。特定の治療的なポリペプチドのアナログは、アミノ酸配列の差もしくは配列に影響を与えない改変（例えば、翻訳後修飾）またはその両方によって治療的なポリペプチドと異なり得る。本発明のアナログは、一般に、治療的なポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を示し得る。生物学的に活性なフラグメントおよびアナログが虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を処置する能力をアッセイするための方法は、当該分野で公知であり、例えば、本明細書中に記載される方法である。
【０１７０】
タンパク質工学が、本発明の治療的なポリペプチドの特性を改善または変更するために使用され得る。当業者に公知の組換えＤＮＡ技術は、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または融合タンパク質を含む新規の変異タンパク質または「ムテイン」を作製するために使用され得る。このような改変されたポリペプチドは、促進された活性または高い安定性などの望ましい特性を示し得る。さらに、それらは、より高い収率で精製され得、そして少なくとも一定の精製条件および貯蔵条件下で対応する天然のポリペプチドよりも良好な溶解性を示し得る。
【０１７１】
Ｎ末端およびＣ末端欠失変異体
例えば、膜関連タンパク質の細胞外のドメインまたは分泌タンパク質の成熟型を含む多くのタンパク質について、１つ以上のアミノ酸が、生物学的機能を実質的に喪失せずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ることは当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：２９８４−２９８８では、３、８または２７アミノ末端のアミノ酸残基を喪失してもヘパリン結合活性を有する改変ＫＧＦタンパク質について報告された。
【０１７２】
しかしながら、タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または喪失を生じても、他の生物学的活性が、なおも保持され得る。従って、完全なタンパク質または成熟タンパク質の決して大部分ではない残基がＮ末端から除去される場合、タンパク質の完全型または成熟型を認識する抗体を誘導および／または結合する短縮されたタンパク質の能力は、一般に保持され得る。完全なタンパク質のＮ末端の残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫性の活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される決まりきった方法および当該分野で公知である別の方法によって決定され得る。従って、本発明はさらに、配列表に示される分子のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失される１つ以上の残基を有するポリペプチドを提供する。
【０１７３】
同様に、生物学的に機能的なＣ末端の欠失ムテインの多くの例が、知られている。例えば、インターフェロンγは、８〜１０アミノ酸残基が、タンパク質のカルボキシ末端から欠失されるとき、活性が１０倍増加する。例えば、Ｄｏｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）７：１９９−２１６を参照のこと。
【０１７４】
しかしながら、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の喪失の改変を生じても、他の生物学的活性が、なおも保持され得る。従って、完全なタンパク質または成熟タンパク質の決して大部分ではない残基が、Ｃ末端から除去されるとき、タンパク質の完全型または成熟型を認識する抗体を誘導および／または結合する短縮されたタンパク質の能力は、一般に保持され得る。完全なタンパク質のＣ末端の残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫性の活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される決まりきった方法および当該分野で公知である別の方法によって決定され得る。
【０１７５】
他の変異体
上記で議論したタンパク質の末端の欠失型に加えて、本発明の治療的なポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、タンパク質の構造または機能に重大な影響を与えずに変更され得ることは、当業者によって理解され得る。配列中のこのような差が、企図される場合、その差は、活性を決定するタンパク質上の重要な範囲に存在し得ると念頭に置かれるべきである。
【０１７６】
従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示す本発明の治療的なポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は、活性に対してほとんど影響を及ぼさないような、当該分野で公知である通則に従って選択される、欠失、挿入、逆位、反復およびタイプ置換を含む。例えば、表現型的に静的なアミノ酸置換を実施する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７：１３０６−１３１０に提供され、ここで、この著者らは、変更に対するアミノ酸配列の許容度を研究するために２つの主なアプローチが存在することを示唆する。第１の方法は、変異が、自然淘汰によって受容されるか、または拒絶されるかのいずれかである進化のプロセスに依存する。第２のアプローチは、機能性を維持する配列を同定するために、クローニングされた遺伝子の特定の位置におけるアミノ酸の変更および選択またはスクリーニングを誘導する遺伝子操作を使用する。
【０１７７】
これらの研究は、タンパク質が、アミノ酸置換に対して驚くべき許容性であることを報告する。この著者らはさらに、アミノ酸の変更が、タンパク質の一定の位置において許容的である可能性があることを示唆する。例えば、ほとんどの埋め込まれたアミノ酸残基が、非極性側鎖を必要とする一方で、少ししか表面側鎖の特徴が、一般に保存されない。他のこのような表現型的に静的な置換は、Ｂｏｗｉｅ、ｅｔ  ａｌ．，前出および本明細書中に列挙される参考文献に記載されている。代表的に保存された置換として見られるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の互いの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間の置換である。
【０１７８】
従って、配列表のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログまたは配列表の核酸配列によってコードされるポリペプチドは、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基で置換されているもの；このような置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよいし、そうでなくてもよい；（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を含むもの；（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、別の化合物と融合されるもの、例えば、ポリペプチド（例えば、ポリエチレングリコール）の半減期を延長する化合物；または（ｉｖ）付加的なアミノ酸が、上記の形態のポリペプチドに融合されるもの、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、リーダー配列もしくは分泌配列、ポリペプチドの上記の形態を精製するために使用される配列またはプロタンパク質配列であり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると見なされる。
【０１７９】
従って、本発明の治療的なポリペプチドは、天然の変異または人間の操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含み得る。示されるように、これらの変化は、保存されたアミノ酸置換などのタンパク質の折りたたみまたは活性に重大な影響を及ぼさない軽微な性質であり得る。保存されたアミノ酸置換としては、芳香族置換Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ；疎水性置換Ｌｅｕ、ＩｓｏおよびＶａｌ；極性置換ＧｌｕおよびＡｓｐ；塩基性置換Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓ；酸性置換ＡｓｐおよびＧｌｕ；および低分子アミノ酸置換基Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙが挙げられる。
【０１８０】
本発明の治療的なポリペプチドの機能に不可欠なアミノ酸は、当該分野で公知である方法（例えば、部位特異的突然変異生成またはアラニンスキャニング突然変異生成（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ））によって同定され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：１０８１−１０８５を参照のこと。後者の手順は、単一アラニン変異を誘導する。次いで生じた変異体分子を、生物学的活性（例えば、レセプター結合性またはインビトロもしくはインビトロにおける増殖活性）について試験する。
【０１８１】
特別に興味深いのは、いっそう少ない凝集などの非常に望ましい改善された特性を有するタンパク質を生成し得る、荷電したアミノ酸と他の荷電したアミノ酸または中性アミノ酸との置換である。凝集は、例えば、凝集物が免疫原性であり得るので、薬学的処方物を調製するときに活性を低下させ得るだけでなく、問題があり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９６７）２：３３１−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９８７）３６：８３８−８４５；Ｃｌｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９３）１０：３０７−３７７）。
【０１８２】
アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変化し得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６１：２６６−２６８では、ＴＮＦレセプターの２つの公知のタイプのうちの１つだけに対してＴＮＦ−αの選択的な結合性を生じる変異について記載されている。リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識）によって決定され得る。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２４：８９９−９０４およびｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５５：３０６−３１２。
【０１８３】
本発明の成長因子の位置およびジスルフィド結合特性は、当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明は、セリンに変異導入したシステインセリンを有する変異体成長因子分子を含む組成物を提供する。これらの構築物は、当該分野で公知である、例えば、ｐＴＴ５−Ｇベクターのような任意の適切なベクターにクローニングされ得る。これらのムテインは、改善された治療的な特性を有する組成物を提供し得る。
【０１８４】
治療薬は、種々の手段（例えば、静脈内、心臓内および腹腔内に）を介して、そして例えば、心臓の幹細胞を含む一定の種類の幹細胞を有するかまたは有さない骨格として機能するマトリックス材を含むかまたは含まない、治療薬を緩徐に放出する材料を含むかまたは含まない種々の処方物中において患者に投与され得る。種々の材料は、マトリックス材として使用され得、これらの材料としては、コラーゲン（例えば、ラット尾部コラーゲン、Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃１１７９１７９）、ナノ繊維およびアルギネートが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療薬は、カテーテルなどのデバイスの使用を伴うかまたは伴わずに、そして例えば、心エコー検査を介するモニタリングを伴うかまたは伴わずに投与され得る。治療薬は、病的状態（心不全、心筋梗塞、冠状動脈疾患および心筋症が挙げられるが、これに限定されない）を有する患者（病的状態を有する患者が挙げられるが、これに限定されない）を処置するために使用され得る。
【０１８５】
治療的な融合分子
当業者が、認識し得るように、本発明の治療的なポリペプチドは、異種の分子、例えば、キメラポリペプチド分子を生じるポリペプチドと結合され得る。これらの融合分子は、精製を促進し得る。これらは、インビボにおいて長い半減期を提供する。この延長は、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの初めの２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質において報告されている。例えば、ＥＰ０３９４８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３１：８４−８６。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：３９５８−３９６４によって記載されているように、免疫グロブリン部分に起因するジスルフィド結合した二量体の構造を有する融合タンパク質はまた、治療的なタンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子を結合および中和するときにより効率的であり得る。異種のポリペプチドの誘導体化に適した化学的部分としては、本明細書中および米国特許第６，６８６，１７９号および米国特許出願第６０／５８９，７８８号および同第６０／６５４，２２９号にさらに記載されているように、例えば、水溶性ポリマーなどのポリマー、スクシニル基、免疫グロブリンの定常ドメイン、ヒト血清アルブミンの全部または一部；フェチュインＡ；フェチュインＢ；ロイシンジッパードメイン；テトラネクチン三量体形成ドメイン；マンノース結合タンパク質（マンノース結合レクチンとしても知られる）、例えば、マンノース結合タンパク質１；およびＦｃ領域が挙げられる。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。
【０１８６】
例えば、改変されていないインターフェロンαの短い血漿中の半減期は、ウイルスの障害および増殖性の障害を処置するために、延長された期間にわたる頻繁な投薬が必要になる。ＨＳＡと融合したインターフェロンαは、改変されていないインターフェロンαよりも長い半減期を有し、それよりも低い頻度の投薬ですむ；半減期は、１８倍長く、クリアランス速度は、約１４０倍遅かった（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００２）３０３：５４０−５４８）。ＨＳＡと融合したインターフェロンβはまた、好ましい薬物動態学的な特性を有する；その半減期は、改変されていないインターフェロンβの８時間と比較して、３６〜４０時間であると報告されている（Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２００３）２３：２５−３６）。ＨＳＡ−インターロイキン−２融合タンパク質は、改変されていないインターロイキン−２と比較して、より長い半減期と好ましい体内分布との両方を有すると報告されている。リンパ球が、改変されていないインターロイキン２よりも大きい程度で存在する場合に、この融合タンパク質は、標的組織に観察された。このことから、この融合タンパク質は、より大きな効力を発揮することが示唆される（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００４）５３：４０４−４１０）。
【０１８７】
ヒト免疫グロブリンＧサブクラス１のＦｃレセプターはまた、治療的な分子に対する融合パートナーとして使用されている。これは、２つの可溶性ｐ７５腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター分子に組換え的に連結されている。この融合タンパク質は、単量体の可溶性レセプターよりも長い循環半減期を有し、そして関節リウマチを有する患者の関節においてＴＮＦαによって誘導される炎症促進性の活性を阻害すると報告されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９９）２１：７５−８７）。この融合タンパク質は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎を処置するために臨床的に使用されている（Ｎａｎｄａ  ａｎｄ  Ｂａｔｈｏｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．（２００４）５：１１７５−１１８６）。
【０１８８】
各ポリマーが結合されるポリペプチドが、代表的には生理学的環境において見られるような水性の環境において沈殿しないとき、ポリマー、例えば、水溶性ポリマーが、本発明において有用である。本発明において使用されるポリマーは、治療的な生成物または組成物の沈殿に対して薬学的に許容可能であり得る。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が、治療的に使用され得るか否かというときこのような考察、そして使用され得る場合は、所望の用量、循環時間およびタンパク質分解に対する耐性に基づいて所望のポリマーを選択することができるだろう。
【０１８９】
適切な、臨床的に許容可能な水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）および他のポリアキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセリン）および他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコース、コロン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）または他の炭水化物ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌまたはデキストランおよびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
本明細書中で使用されるとき、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、モノ−（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されている形態のいずれかを包含すると意味される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水への溶解度に起因して作製されるときの利点を有し得る。
【０１９１】
詳細には、本発明の改変された異種のポリペプチドは、ポリアミノ酸またはポリペプチドへの分岐点アミノ酸を結合することによって調製され得る。例えば、ポリアミノ酸は、（融合分子を介して達成される利点に加えて）ポリペプチドの循環半減期を増大するように機能する担体タンパク質であり得る。本発明の治療的な目的のために、このようなポリアミノ酸は、理想的には、抗原性の応答または他の有害な応答を中和することを有するか、または引き起こさないものであるべきである。このようなポリアミノ酸は、血清アルバム（ａｌｂｕｍ）（例えば、ヒト血清アルブミン）、付加的な抗体またはその一部、例えば、Ｆｃ領域、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパー核因子赤血球誘導体２（ＮＦＥ２）、神経網膜ロイシンジッパー、テトラネクチンまたは他のポリアミノ酸、例えば、リシンから選択され得る。本明細書中に記載されるように、ポリアミノ酸の結合の位置は、Ｎ末端もしくはＣ末端または他の間の位置であり得、そして選択された分子への化学的なリンカー部分によって連結され得る。
【０１９２】
本明細書中において使用されるポリマー、例えば、水溶性ポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝していてもよく、分枝していなくてもよい。各ポリマーは、代表的には約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（用語「約」とは、ポリマーの調製の際、いくつかの分子が述べられた分子量よりも重く、いくつかの分子は軽いことを示唆する）の平均分子量を有する。各ポリマーの平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａまたは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａであり得る。一般に、分子量が大きいかまたは分枝が多いほど、ポリマー：タンパク質比が大きくなる。所望の治療的なプロファイル；例えば、徐放の持続時間；もしあれば、生物学的活性に対する効果；操作の簡易性；抗原性の程度または欠如；および本発明の改変された分子に対する他の公知のポリマーの効果に依存して他の大きさもまた使用され得る。
【０１９３】
本発明において使用されるポリマーは、代表的には、ポリペプチドの機能性ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮して異種のポリペプチドに結合される。一般に、化学的誘導体化は、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために使用される任意の適切な条件下で実施され得る。ポリマーを活性な部分に連結するために使用され得る活性化基としては、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジジリン（ａｚｉｄｉｒｉｎｅ）、オキシランおよび５−ピリジルが挙げられる。
【０１９４】
本発明のポリマーは、代表的にはアミノ酸のアルファ（α）アミノ基もしくはイプシロン（ε）アミノ基または反応性チオール基で異種のポリペプチドに結合されるが、また、ポリマー群は、適切な反応条件下でポリマー群に結合されるようになるのに十分反応性であるタンパク質の任意の反応基に結合され得ることが企図される。従って、ポリマーは、反応基（例えば、遊離アミノ基または遊離カルボキシル基）を介して異種のポリペプチドと共有結合され得る。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リシン残基およびＮ末端のアミノ酸残基を含み得る。遊離カルボキシル基を有するものは、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端のアミノ酸残基を含み得る。反応性チオール基を有するものは、システイン残基を含む。
【０１９５】
水溶性ポリマーなどのポリマーと結合体化された融合分子を調製するための方法は、一般に（ａ）ポリペプチドが、１つ以上のポリマーに結合されるようになる条件下で異種のポリペプチドをポリマーと反応させる工程および（ｂ）反応生成物を入手する工程のそれぞれを含み得る。各結合体についての反応条件は、当該分野で公知である任意の条件または続いて開発された条件から選択され得るが、改変されるタンパク質を不活性化し得る反応条件（例えば、温度、溶媒およびｐＨレベル）への曝露を回避するかまたは制限するために選択されるべきである。一般に、反応に対する最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定され得る。例えば、ポリマー：ポリペプチド結合体の比が大きくなるほど、結合体化生成物の割合が大きくなる。最適な比（過剰量の未反応のポリペプチドまたはポリマーが存在しない反応の効率の面から）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択されるポリマーの分子量、ポリマーが分枝しているか、または分枝していないかということおよび使用される反応条件などの因子によって決定され得る。ポリペプチドに対するポリマー（例えば、ＰＥＧ）の比は、一般に１：１〜１００：１に亘り得る。１つ以上の精製された結合体は、標準的な精製技術（他のもの、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィおよび電気泳動を含む）によって各混合物から調製され得る。
【０１９６】
当業者は、特にＮ末端を化学的に改変されたタンパク質を望み得る。当業者は、分子量、分枝など、反応混合物中におけるタンパク質（ポリペプチドまたはペプチド）分子に対するポリマーの比率、実施される反応のタイプおよび選択されたＮ末端を化学的に改変されたタンパク質を入手する方法によってポリマーを選択し得る。Ｎ末端を化学的に改変されたタンパク質調製物を入手する（必要であれば、他の一誘導体化された部分からこの部分を分離する）方法は、化学的に改変されたタンパク質分子の集団からのＮ末端を化学的に改変されたタンパク質材料の精製によってであり得る。
【０１９７】
選択的なＮ末端の化学的改変は、特定のタンパク質において誘導体化に利用可能である様々なタイプの第１級アミノ基（リシン  対  Ｎ末端）の差次的な反応を利用する還元性のアルキル化によって達成され得る。適切な反応条件下において、ポリマーを含むカルボニル基を有するＮ末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、当業者は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａの差を利用することを可能にするｐＨで反応を実施することによってタンパク質のＮ末端にポリマーを選択的に結合し得る。このような選択的誘導体化によって、タンパク質へのポリマーの結合が、制御され：ポリマーとの結合体化が、主にタンパク質のＮ末端において生じ、そしてリシン側鎖アミノ基などの他の反応基の重大な改変が起きない。還元性のアルキル化を使用して、ポリマーは、上記で説明されたタイプであり得、そしてタンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単一の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドがまた、使用され得る。
【０１９８】
１つの実施形態において、本発明は、モノ−またはポリ−（例えば、２−４）ＰＥＧ部分を含むように化学的に誘導体化されたポリペプチドを企図する。ペグ化は、当該分野で公知であるペグ化反応のいずれかによって実施され得る。ペグ化されたタンパク質生成物を調製するための方法は、一般に（ａ）タンパク質が１つ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で、ポリペプチドとポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程；および（ｂ）反応産物を入手する工程を含み得る。一般に、反応に対する最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて個別に決定され得る。
【０１９９】
当業者に利用可能な多くのＰＥＧ結合方法が存在する。例えば、ＥＰ０４０１３８４；Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９２）２０：１０２８−１０３５；Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（１９９２）３（２）：４−１０；ＥＰ０１５４３１６；ＥＰ０４０１３８４；ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９５／３４３２６；および他の本明細書中に列挙されるペグ化に関する出版物を参照のこと。
【０２００】
本明細書中に記載されるようなペグ化の工程は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。従って、本発明に記載のタンパク質生成物は、ペグ化されたタンパク質を含む。ここで、ＰＥＧ基は、アシル基またはアルキル基を介して結合される。このような生成物は、モノペグ化され得るか、またはポリペグ化され得る（例えば、２−６または２−５ＰＥＧ基を含む生成物）。ＰＥＧ基は、一般にアミノ酸のα−アミノ基またはε−アミノ基でタンパク質に結合されるが、ＰＥＧ基は、適切な反応条件下でＰＥＧ基に結合するようになるのに十分に反応性であるタンパク質に結合される任意のアミノ基に結合され得ることも企図される。
【０２０１】
アシル化によるペグ化は、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性なエステル誘導体と本発明のポリペプチドとの反応を含む。アシル化反応のために、選択されるポリマーは、代表的には単一の反応性エステル基を有する。任意の公知の反応性ＰＥＧ分子または続いて発見された反応性ＰＥＧ分子は、ペグ化反応を実施するために使用され得る。適切な活性化されたＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧである。本明細書中で使用されるとき、アシル化は、治療的なタンパク質とＰＥＧなどのポリマーとの間の以下のタイプの結合：アミド、カルバメート、ウレタンなどを含むと企図されるがこれらに限定されない。例えば、Ｃｈａｍｏｗ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９４）５：１３３−１４０を参照のこと。反応条件は、ペグ化技術または続いて開発された技術において公知の条件のいずれかから選択され得るが、改変されるポリペプチドを不活性化し得る条件（例えば、温度、溶媒およびｐＨ）を回避すべきである。
【０２０２】
アシル化によるペグ化は、一般にポリペグ化されたタンパク質を生じ得る。結合は、アミドであり得る。生じる生成物は、実質的に（例えば、＞９５％）モノペグ化、ジペグ化またはトリペグ化のみされ得る。しかしながら、高い程度のペグ化を有するいくつかの種は、使用される特定の反応条件に依存する量で形成され得る。所望であれば、より精製されたペグ化された種が、その他のもの、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィおよび電気泳動を含む標準的な精製技術によって混合物（特に未反応の種）から分離され得る。
【０２０３】
アルキル化によるペグ化は、一般に還元剤の存在下でＰＥＧの末端のアルデヒド誘導体とポリペプチドとを反応させる工程を含む。還元性のアルキル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性であるか、またはモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシまたはそれらのアリールオキシ誘導体であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドである。例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと。
【０２０４】
さらに、本明細書中に記載される、本発明の異種のポリペプチドおよびエピトープを有するそれらのフラグメントは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と結合され得、そしてキメラポリペプチドを生じる。これらの特定の融合分子は、精製を促進し、そしてインビボにおいて長い半減期を示す。このことは、例えば、ＥＰ０３９４８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３１：８４−８６などのように、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの初めの２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質において示されている。ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド結合した二量体の構造を有する融合分子はまた、例えば、単量体ポリペプチドまたはポリペプチドフラグメント単独よりも他の分子を結合および中和する際により効率的であり得る；例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：３９５８−３９６４を参照のこと。
【０２０５】
別の説明された実施形態において、ヒト血清アルブミン融合分子はまた、本明細書中に記載され、そして米国特許第６，６８６，１７９号にさらに説明されているように調製され得る。
【０２０６】
さらに、本発明のポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を促進するペプチドなどのマーカー配列に融合され得る。マーカーアミノ酸配列は、市販されているものの多くの中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり得る。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８６：８２１−８２４に説明されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである、赤血球凝集素ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８４）３７：７６７−７８）。任意のこれらの上記の融合は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して操作され得る。
【０２０７】
治療薬の送達
カテーテル法
心臓のカテーテル法は、心臓の右側または左側へのカテーテル（代表的には、細い可撓性の管）の通過を含む心臓への局所送達方法の一例である。一般にこの手順は、心臓またはその血管についての診断的情報を得るためか、または一定のタイプの心臓の状態においてバルーン血管形成術などの治療的な介入を提供するために実施される。心臓のカテーテル法は、心房（ｈｅａｒｔ’ｓ  ｃｈａｍｂｅｒ）における血圧および血流を測定するため、血液サンプルを心臓から回収するためおよび透視と呼ばれるＸ線技術を使用して心臓の動脈を調べるために使用され得る。心臓のカテーテル法は、先天性の心臓欠損症を検査または処置するために乳児および小児に対しても実施され得る。この技術は、本発明において開示されるように、心臓の状態を処置するための心筋層への治療薬の局所送達のための方法においては使用されてこなかった。
【０２０８】
治療薬は、静脈または動脈のいずれかにカテーテルを導入し、次いで心房および最終的には心筋層における患部、例えば、虚血性心臓外傷を維持している範囲へ前進させることによって送達され得る。本発明の１つの実施形態において、カテーテルは、大腿静脈に挿入され、次いで大腿静脈から右心房に、そして右心房から患部の心筋層に前進され得るか；または右心房から右心室に、そして患部の心筋層に前進され得る。別の実施形態において、カテーテルは、大腿動脈に導入され、そして大腿動脈から大動脈および左心室に、次いで患部の心筋層に前進され得るか；または左心室から左心房へ、患部の心筋層に前進され得る。
【０２０９】
心臓のカテーテル法は、他で、例えば、Ｂａｉｍ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ（２０００）Ｇｒｏｓｓｍａｎ’ｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．６ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓに詳細に説明されている。
【０２１０】
種々のカテーテルおよび送達経路は、当該分野で公知である冠内の送達を達成するように使用され得る（例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｅ．Ｊ．Ｔｏｐｏｌ，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．；Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９８９）Ｒ．Ｂ．Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ｅｄ．，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．；Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９２）Ｊ．Ｂ．Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．；およびＴｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９９１）Ｄ．Ｓａｂｉｓｔｏｎ，ｅｄ．，１４ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．を参照のこと）。直接冠内（または移植片脈管）注入は、透視下での標準的な経皮的なカテーテルに基づく方法を使用して実施され得る。任意の種々の冠状動脈カテーテルまたは例えばＳｔａｃｋ灌流カテーテルは、本発明において使用され得る。種々の通常の目的のカテーテルおよび改変カテーテルはまた、本発明において使用され得る。これらは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＣＳ）、Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄｉｓから商業的に入手可能である。心筋層への送達が、冠状動脈への直接的な注入によって達成される場合、当該分野で公知であるように多くのアプローチが、冠状動脈にカテーテルを導入するために使用され得る。例えば、カテーテルは、都合よく大腿動脈に導入され得、そして腸骨動脈および腹大動脈を通過して、そして冠状動脈に逆行して通され得る。あるいは、カテーテルは、まず上腕動脈または頚動脈に導入され得、そして冠状動脈に逆行して通され得る。心筋層の毛細血管床はまた、例えば、冠状静脈洞に置かれたカテーテルから逆行灌流によって到達され得る。このようなカテーテルは、逆行灌流を促進する手段として順方向の流れを阻止または減少するための近位のバルーンを含み得る。
【０２１１】
本発明の治療的な組成物は、カテーテルによる心臓領域への送達に適応され得る。
【０２１２】
治療薬は、心臓の発症を処置する場合か、または診断的な手順を実施する場合に、心臓手術のときに局所的に投与され得る。治療薬はまた、虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を生じ得る事象を見越して送達され得る。この点において、治療薬は、虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を予防するために機能する。例えば、治療薬は、心臓に対してではない手術、複雑な経皮的な血管再生または複雑な心臓手術の数日前に送達され得る。治療薬はまた、移植プロセス全体（説明、輸送、移植）の間に生じ得る任意の虚血性心臓外傷または他の心臓の状態を予防するために心臓の移植の前にドナー心臓に送達され得る。治療薬はまた、びまん性の血管再生できない冠状動脈疾患を有する患者に対する心筋層の保護を提供するのに有用であり得る。これらの患者に対しては、治療薬の生涯にわたるレジメンが必要であり得る。
【０２１３】
直接注入
治療的な組成物はまた、心筋（心筋層）への直接注入によって心臓に送達されている。直接注入は、開心術の間、実施され得る。心臓の手術の可視化は、心筋層への正確な移植を促進する。直接注入はまた、撮像法の使用によって導かれる、胸壁を通過して治療的な組成物を注入することによって心臓への外科的な接触なしに実施され得る。リアルタイムの情報を提供する任意の公知のイメージング技術は、本明細書中に開示される心筋層への本発明の治療的な組成物の注入の方法を用いる用途に適している。例えば、心エコー検査および他のリアルタイムイメージング技術は、直接注入を導くために使用され得る。
【０２１４】
１つの実施形態において、治療薬は、透視下で、標準的な経皮的なカテーテルに基づく方法を使用する直接的な冠内の注入によって心臓に送達される。注入は、冠状動脈または１つ以上の伏在静脈移植片または内胸動脈移植片または心筋層に血液を送達する他の導管の管腔に実質的（例えば、少なくとも１ｃｍ）になされ得る。任意の冠状動脈に、注入され得る。任意の適切な種々の冠状動脈カテーテルまたはＳｔａｃｋ灌流カテーテルが、本発明に従って使用され得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、心臓、例えば、ＶＡＲ領域、推定的ＶＡＲ領域、心膜腔、心筋層または心膜の特定の部分に治療薬を注入するのに適切なカテーテルを使用する。磁気共鳴（ＭＲ）は、梗塞内または心臓の他の場所において定義された位置への治療薬の送達を正確に導くために使用され得る。Ｋａｒｍａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００４）５１：１１６３−１１７２または米国特許第６，３０４，７６９号に記載されているようなカテーテルが、使用され得る。このようなカテーテルの構成要素は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって追跡することができるループのないＲＦアンテナ受信コイルを作るように配置され得る。様々なタイプのＲＦ受信アンテナ（例えば、ループ、ループなし、反（ｏｐｐｏｓｅｄ）ソレノイドなど）が、能動的な追跡を可能にするために使用され得る。心筋層の遅延造影（ＭＤＥ）イメージングは、梗塞した心筋層を同定し得、そしてリアルタイムＭＲＩは、カテーテル法を導くために使用され得る。カテーテルの遠位末端は、ＭＲＩ下においてカテーテルの遠位端における明るいシグナルで見られ得る。ＭＲＩトラッキングを使用して、カテーテルは、位置に導かれ得て、そしてその針が、治療薬を心筋内または心膜腔もしくは心臓における任意の他の所望の位置に注入するために前進され得る。
【０２１６】
他のシステム、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された「Ｎｏｇａ」システム；ＢｉｏＨｅａｒｔ、Ｉｎｃ．によって開発された「Ｍｙｏｃａｔｈ」デバイスおよびシステム；Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された「Ｓｔｉｌｌｅｔｏ」カテーテルデバイスおよびシステム；およびＢｉｏＣａｒｄｉａによって商業的に開発されたカテーテルデバイスおよびシステムなどは、治療薬の送達に適当であり得る。注入針を備えた偏向可能な血管内カテーテルが、一般に使用され得る。米国特許第６，２９７，２１９号；同第５，７９７，８７０号；同第５，６９８，５３１号；同第５，７０７，９６９号；同第５，３２８，４７０号；同第５，０４９，１３２号；およびＷＯ００／４４４４３に記載されている送達の方法およびカテーテルが、本発明における用途に適応され得る。
【０２１７】
本発明のカテーテル送達方法を使用して、治療薬は、心臓の特定の範囲に送達され得る。治療薬は、外傷部位、ＶＡＲ領域または推定的ＶＡＲ領域に送達され得る。他の実施形態において、治療薬は、心膜腔に送達される。心膜腔は、米国特許第  ６，７５９，３８６Ｂ２号に記載されているように心臓へ治療薬を投与するために使用され得る簡便、安全かつ効率的な薬物送達レザバとして潜在的に機能し得る。塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の心膜内送達は、Ｌａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２２（Ｓｕｐｐｌ．Ｉ）：Ｉ−６−Ｉ−９によって説明されている。心膜腔は、経胸郭的デバイス（例えば、針またはカテーテル）またはカテーテルを使用した経心室的アプローチによって接近され得る。心膜腔はまた、米国特許第５，２６９，３２６号および米国特許出願第２００４／０２１５１６８Ａ１号によって説明されているように、右心耳を介して経静脈的に接近され得る。
【０２１８】
本発明の治療的な組成物は、直接注入によって心臓領域に送達されるように適応され得る。
【０２１９】
他の送達方法
治療薬は、ゲル組成物中に送達され得る。ゲル組成物は、治療薬の時間をかけた制御された放出および徐放の利点を提供する。ゲル組成物は、ゲルを形成するポリマーを溶解する生体適合性のポリマーおよび溶媒を含み得る。ゲル組成物はまた、界面活性剤、粘性調節剤、錯化剤、酸化防止剤、他のポリマーなどを含む他の物質を含み得る。ゲルの粘性は、治療薬の所望の放出動態を調節するために、例えば、ポリマーの濃度を変更することによって改変され得る。温度感受性ポリマーを使用するとき、ゲル組成物は、患者への投与の前は液体であり得、そして患者の中でゲルになり得る。使用され得る生体適合性のポリマーは、生分解性であり得、そしてこれらとしては、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリアミン、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポロキサマー、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、スクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、キチン、キトサンおよび共重合体、ターポリマーならびにこれらの混合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０２２０】
生分解性の担体は、治療薬を送達するために使用され得る。１つの実施形態において、担体は、米国特許第６，３０３，５８５Ｂ１号によって説明されているような架橋結合した第１および第２の多糖を含む。第１および第２の多糖類は、それぞれ、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、硫酸ヘパリンおよびアルギネートからなる群から選択されるメンバーの誘導体である。酸化された糖環由来の第１の多糖のアルデヒド基は、アミン部位に第２の多糖アミン誘導体と共有結合性のイミン架橋を形成し得る。第１の多糖類と第２の多糖類との比は、担体の物理的特性と生物学的特性の両方を決定する。例えば、その比は、所望であれば、治療薬への共有結合のための、未反応であるが活性なアルデヒドを提供するために操作され得る。このような架橋された多糖薬物担体の利点としては、長い生分解速度、治療薬の制御された放出および所望の治療的な介入を調節するためのゲル様または海綿様の形態の処方物の柔軟性が挙げられる。本発明において使用され得る他の担体としては、Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９４）９４：６２３−６３０および本明細書中に列挙される参考文献に記載されているようなヘパリンアルギネートポリマーおよびアルギネートが挙げられる。
【０２２１】
患者内の治療薬の運命および位置の決定を補助するために、生物学的マーカーが、治療薬を含む組成物とともに同時投与され得る。１つの実施形態において、治療薬を含む組成物は、生物学的マーカーを含む。生物学的マーカーは、種々の方法によって可視化され得るか、または検出され得る。これらの方法としては、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、分子像またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）などの核医学技術が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用され得る生物学的マーカーならびにそれらを作製する方法およびそれらを使用する方法は、当該分野で公知である。
【０２２２】
治療薬は、マトリックス組成物中に送達され得る。マトリックス材は、骨格として機能し得る。マトリックス材は、心臓の幹細胞を含む心臓の前駆細胞を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。種々の材料が、マトリックス材として使用され得る。これらの材料としては、コラーゲン（例えば、ラット尾部コラーゲン、Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃１１７９１７９）、ナノ繊維およびアルギネートが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療薬は、カテーテルなどのデバイスの使用を伴うかまたは伴わずに、そして例えば、心エコー検査を介するモニタリングを伴うかまたは伴わずに投与され得る。
【０２２３】
虚血エピソードもしくは潜在的な虚血エピソードまたはそれらの予測に応じて、治療薬が、１回かまたは複数回送達され得る。処置の頻度および処置１回当たりに送達される治療薬の量は、多くの変化するものに依存し得る。その変化するものとしては、外傷の程度および性質；治療薬の効力、毒性、半減期、溶解度および副作用；ならびに所望の心筋細胞機能の程度が挙げられる。当業者は、用量レベルが、特定の化合物の機能、症状の重症度および副作用に対する被験体の感受性として変化し得ることを容易に理解し得る。過度の実験なしに当業者は、特定の状況に対する用途に合わせて治療薬の適切な頻度および量を決定することができるだろう。所与の化合物に対する適切な用量は、種々の手段によって当業者によって容易に決定することができる。例えば、本発明は、ヒト被験体にＦＧＦ２を提供する。本明細書中で述べられる用量範囲は、７０ｋｇの人間に基づき、そしてそれより重いかまたは軽い患者を処置するために調節され得る。本発明は、約２０マイクログラム〜約３ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。本発明は、約３０マイクログラム〜約３．５ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。本発明は、約４０マイクログラム〜約４ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。本発明は、約５０マイクログラム〜約４．５ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。本発明は、約１００マイクログラム〜約５ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。本発明は、約１３６マイクログラム〜約５．５ミリグラムの用量でＦＧＦ２を提供する。反復投与は、１つの容器（例えば、バイアルまたは注射器）に提供され得る。従って、本発明は、反復投与で提供されると意図される、例えば、容器１つあたり２用量または３用量で、上記に列挙した用量を多様に組み合わせた用量を提供する。
【０２２４】
用量は、種々の経路を介して投与され得る。その経路としては、心臓内、冠内、静脈内、皮下、筋肉内、肺内、吸入、鼻腔内、経皮的などが挙げられるが、これらに限定されない。投薬頻度は、１回、２回、３回、１ヶ月おきに１回、３ヶ月おきに１回、６ヶ月おきに１回、１年に１回、１ヶ月に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１日おきまたは毎日であり得る。用量は、所与のセッションにおいて１回の注入または複数の注入、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回の注入で与えられ得る。用量は、１ナノグラム〜１０ミリグラムに亘り得る。
【０２２５】
処置の効力を決定するために、種々のパラメータが、種々の技術を使用してモニターされ得る。例えば、磁気共鳴画像法は、梗塞の大きさ、壁運動および壁の厚さならびに心筋層の灌流における変化をモニターするために使用され得る（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９５）９２：２７２３−２７３９）。心エコー検査および顕微解析もまた使用され得る。アポトーシス細胞死は、Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９９９）６：５３１−５３９によって説明されているようにインビボにおいて検出され得る。
【０２２６】
治療薬は、ポンプによる時間にわたって送達され得る。この送達は、短時間の方法（例えば、カテーテル法、注入または手術）の前か、それと同時にか、またはその後に実施され得る。期間は、分、時間、日、週または月の範囲であり得る。ポンプは、例えば、浸透圧ポンプなどの任意の生体適合性のポンプであり得る。ポンプによる薬剤の送達は、治療法または補助的療法の主な様式を含み得る。
【０２２７】
虚血性心臓外傷または他の心臓の状態のための特定の処置の効力を評価するときに有用であり得る、ＤＮＡ損傷、細胞死またはアポトーシスを検出または計測するさらなる方法が、例えば、動物研究またはバイオプシー組織において使用され得る。ＤＮＡ損傷は、任意の公知の方法（損傷部位における不安定なＤＮＡのアルカリ溶解に基づくＣｏｍｅｔアッセイ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）が挙げられるが、これに限定されない）；および異常なＤＮＡ構造、例えば、８−ＯＨｄＧに特異的な抗体を使用する免疫学的アッセイを使用して検出され得る。
【０２２８】
細胞死は、任意の公知の方法を使用して計測され得、そして一般に細胞生存率を計測するために任意の種々の公知の方法を使用して計測される。このようなアッセイは、一般にその無傷の細胞膜によって正常な生細胞から正常に排除され得る検出可能な化合物（または細胞内の構成要素と相互作用して検出可能になるか、またはそれに作用されて検出可能になる化合物）のその細胞への流入に基づく。このような化合物は、細胞内の酵素に対する基質を含み、それらとしては、エステラーゼに対する蛍光基質；生細胞から排除される色素（トリパンブルーが挙げられるが、これに限定されない）；およびＤＮＡ結合化合物（エチジウム化合物（例えば、エチジウムブロマイドおよびエチジウムホモダイマー）およびヨウ化プロピジウムが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
アポトーシスは、任意の公知の方法を使用してアッセイされ得る。アッセイは、細胞集団または個別の細胞において実施され得、そして形態学的アッセイおよび生化学的アッセイを含む。細胞集団におけるアポトーシスのレベルを測定する方法の非限定的な例は、アポトーシスの間に産生されるＤＮＡフラグメントの３’−ＯＨ遊離端のＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰ断端標識）標識である（Ｇａｖｒｉｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１９：４９３）。ＴＵＮＥＬ法は、フラグメントを検出するために、１８０ｂｐ（塩基対）オリゴマーＤＮＡフラグメントの３’−ＯＨ端に、色素原系または蛍光タグに結合体化されたヌクレオチドを触媒作用的に添加することからなる。１８０ｂｐオリゴマーのＤＮＡラダーの存在は、アポトーシスを示唆する。ＴＵＮＥＬ法に基づく細胞死を検出する方法は、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｋｉｔ）およびＯｎｃｏｒ（Ａｐｏｐｔａｇ  Ｐｌｕｓ）から商業的に入手可能である。現在利用可能な別のマーカーは、登録商標ＡＰＯＰＴＥＳＴＴＭとして販売されているアネキシンである。このマーカーは、例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販もされている「アポトーシス検出キット」において使用される。アポトーシスの間、細胞膜のリン脂質の非対称性が、変化して、そのリン脂質が、外側の膜に曝露されるようになる。アネキシンは、カルシウムの存在下でリン脂質と結合するタンパク質の相同な群である。第２の試薬である、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、ＤＮＡ結合性蛍光色素である。細胞集団が、両方の試薬に曝露されるとき、アポトーシスの細胞は、アネキシンに対して陽性およびＰＩに対して陰性に染色され、ネクローシスの細胞は、両方に対して陽性に染色され、生細胞は、両方に対して陰性に染色される。例えば、米国特許第６，０４８，７０３号において開示された方法を含むアポトーシスを試験する他の方法は、当該分野で公知であり、使用され得る。
【０２３０】
治療薬は、単独か、または１つ以上の他の治療薬と組み合わせて送達され得る。正確な処方物および組み合わせは、多くの因子に依存し得る。その因子としては、外傷の程度および性質；治療薬の作用の様式；および治療薬間の任意の相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。過度の実験なしに当業者は、特定の状況に合わせて適切な組み合わせを決定することができるだろう。
【０２３１】
キット
本発明はさらに、本発明に記載の用途、例えば、虚血性心臓外傷を処置するための、心臓のカテーテル法または心筋層への治療薬の直接注入を含む局所送達に適したデバイスを備えるキットを提供する。デバイスは、使える状態である滅菌された容器に事前に包装され得る。キットはさらに、治療薬および心臓の状態を処置するために使用される最終的な組成物を調製するために必要な他の物質を含み得る。１つの実施形態において、キットは、注入可能な形態の単位用量の治療薬を含む。注入用の単位用量形態は、滅菌水、通常の食塩水または別の薬学的に許容可能な担体中の溶液として組成物中に治療薬を含み得る。１つの実施形態において、キットは、患者における心臓の状態を処置するための治療薬（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６およびＦＧＦ−１７）；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ１ｅおよびＭＧＦ）；ＶＥＧＦ−Ｃなどの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ニューレグリン（ＮＲＧ）などの上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーメンバー（例えば、ＮＲＧ−１α、ＮＲＧ−１β、アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦ、ベータセルリンおよびベータセルリンスプライスバリアント（配列番号１８０））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−ＤおよびＡ、Ｂ、ＣまたはＤポリペプチドの２つのポリペプチドから構成されるＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤおよびＰＤＧＦ−ＡＢ）；オンコスタチンＭ；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦα、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）；エンドセリン−１；仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６（配列番号２０）；ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β；インターフェロン−αｌ；トレフォイルファクター２などのトレフォイルファクターファミリーのメンバー；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１１）；Ｇ−ＣＳＦスプライスバリアント（配列番号１８３）；ｃｈｒｏ１０ｏｒｆ５８；ｓｕｓｈｉ反復配列含有タンパク質−Ｘ連鎖２；サイモシンβ４；アンギオテンシン−ＩＩならびに／またはそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体）の単位用量を含む。１つの実施形態において、キットは、その使用のための指示書を備える。これらの指示書は、心臓の状態を処置するときの治療薬の付随の利点を説明し得、そして種々の形態で提供され得る。適切な形態としては、印刷された情報、コンパクトディスクなどが挙げられる。カテーテルを含む適切なデバイス；治療薬；および単位用量は、本明細書中に記載されたものである。
【実施例】
【０２３２】
実施例は、本発明の純粋な例示として意図され、従って、決して本発明を限定すると考えられるべきではなく、また、上述された本発明の局面および実施形態を説明および詳述する。実施例は、以下の実験が、実施された実験のすべてであるわけでも、唯一のものであるわけでもないことが意図される。使用された数値（例えば、量、温度など）に関して正確を保証する努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が説明されるべきである。別の方法で示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、セルシウス度であり、そして圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【０２３３】
本発明が、その特定の実施形態に関して説明する一方で、種々の変更が、なされ得、そして等価物が、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに置換され得ることは、当業者によって理解されるはずである。さらに、多くの改変は、特定の状況、材料、問題の組成物、プロセス、プロセスの工程（単数または複数）が、本発明の目的、精神および範囲に適応するようになされ得る。このような改変のすべてが、本明細書に付属の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【０２３４】
実施例１：成体の心臓の幹細胞の単離および増殖
成体のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）の心臓の幹細胞を、Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５：９１１−９２１によって説明されている方法を使用して単離および増殖した。簡潔には、単離された心筋層の組織を、１〜２ｍｍ３片に切断し、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｃａｔ＃２１−０３１−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）で洗浄し、そしてトリプシン（ｃａｔ＃１５０９０−０４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびコラゲナーゼＩＶ（ｃａｔ＃Ｍ１９２７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で消化した。このようにして得られた細胞を、廃棄した。残った組織断片を、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ｃａｔ＃１２４４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｃａｔ＃３５−０１５−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（ｃａｔ＃１５１４０−１２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌ−グルタミン（ｃａｔ＃２５０３０−０８１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および２−メルカプトエタノール（ｍｅｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）（ｃａｔ＃Ｍ６２５０、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含んだ外植片完全培地（ＣＥＭ）で洗浄した。洗浄された組織断片を、ＣＥＭ中で外植片として培養した。数週間後、小さい、澄んだ相の細胞が、接着性外植片から発生した線維芽細胞様細胞の層に移動した。その澄んだ相の細胞を、Ｃａ２＋−Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳ、ヴェルセン（ｃａｔ＃１５０４０−０６６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、トリプシンおよびＥＤＴＡを使用して洗浄することにより回収した。
【０２３５】
実施例２：インビトロでのカルディオスフィア増殖に対する種々の成長因子の効果
カルディオスフィア増殖に対する種々の成長因子を含む様々な物質の効果を試験するために、実施例１において回収された小さい澄んだ相の細胞を、カルディオスフィア生育培地（ＣＧＭ）（Ｍｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５：９１１−９２１）を含むポリ−Ｄ−リシンがコートされた２４ウェル細胞培養プレート（ｃａｔ＃３５４４１４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）の１ウェルあたり１×１０５細胞の密度で播いた。培地ＣＧＭは、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｃａｔ＃１１３３０−０３２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｂ２７（ｃａｔ＃１７５０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２−メルカプトエタノール、上皮成長因子（ＥＧＦ）（ｃａｔ＃１３２４７−０５１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（ｃａｔ＃１３２５６−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、カルジオトロピン−１（ｃａｔ＃４３８−ＣＴ−０５０、Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびトロンビン（ｃａｔ＃１４７３−ＳＥ−０１０、Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を含んでいた。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションの後、ＣＧＭを、血清または成長因子を含まない（ネガティブコントロールとして使用される「基本培地」処置）または各々１００ｎｇ／ｍｌの個別の試験成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手したＥＧＦを除いてＲ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから入手）を含む、２％Ｂ２７を補充した、３５％ＩＭＤＭ／６５％ＤＭＥＭ  Ｈａｍ  Ｆ１２混合物を含む基本培地に置換した。ポジティブコントロールとして、いくつかの細胞をＣＧＭ中でインキュベートした。この細胞を、１０日間これらの様々な処置で維持した。１０日間のインキュベーションの５日目に、細胞を新鮮培地に移した。１０日間のインキュベーションの１０日目に、懸濁液中のカルディオスフィアの数を数え（図９）、そして培養物の写真を撮影した（図１０および１１）。
【０２３６】
カルディオスフィア増殖に対するヒトＦＧＦの種々のプールの効果もまた、測定した。ヒトＦＧＦの様々なプールを含む種々の条件化された培地（ＣＭ）を調製するために、ＦＧＦ含有上清を個別のヒトＦＧＦを発現する安定な２９３Ｅ細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を使用して得た。これらの細胞（１〜２×１０７個）を、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ中で集密になるまで生育増殖した（代表的には、１または２日間）。次いでそれらの細胞を、分割し、細胞の１０％を、無血清培地（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）中で、３日間３７℃でインキュベートし、目的のＦＧＦを含む上清を回収した。他の９０％の細胞は、上清回収の次の回まで、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ中で維持した。１つのＦＧＦの存在下で生育増殖した細胞由来の上清を、以下でより詳細に説明するように、多数のＦＧＦを含む上清を形成するために貯蔵した。
【０２３７】
培養物の写真を、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ３００  ３．０写真ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた光学顕微鏡に装着されたＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ  デジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して得た。カルディオスフィア生存アッセイを、製造者の指示書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  ＡＴＰアッセイを使用して生存可能な細胞の数を計測することによって実施した（例えば、Ｃｒｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９３）１６０：８１−８；Ｚｈｅｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００４）５３（３）：２６７−７５を参照のこと）。簡潔には、等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（ｃａｔ＃Ｇ７５７０、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、細胞溶解を誘導するように、単層の細胞を覆う培養培地と、細胞プレート（例えば、マルチウェルプレート）を２分間振とうすることによって混合した。次いでこのプレートを、ルミネセンスシグナルを安定化するために１０分間室温でインキュベートした。ルミネセンスを、Ｌｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して０．１秒の積分時間で読んだ。
【０２３８】
図９Ｂは、カルディオスフィア生存ＡＴＰアッセイの結果を示し、上記で説明したように示された処置後の相対的ルミネセンス単位に関して表された生存可能な細胞の総数を示している。「完全培地」とは、上記で説明したようにＣＧＭのことをいう。「基本培地」もまた、上記で説明した。「ＥＧＦ」、「ＦＧＦ１」、「ＦＧＦ２」、「ＦＧＦ３」、「ＦＧＦ４」、「ＦＧＦ５」、「ＦＧＦ７」、「ＦＧＦ９」および「ＦＧＦ１０」とは、上記で説明したように組換えで生成され、そして商業的に入手された、示された成長因子を補充した基本培地のことをいう。「Ｓ−コントロール」とは、２９３細胞由来の条件化された培地（ＣＭ）のことをいう。「Ｓ１」とは、ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプールのことをいう。「Ｓ２」とは、ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプールのことをいう。「Ｓ３」とは、ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプールのことをいう。「Ｓ４」とは、ＦＧＦ−１３ＳＶ２（スプライスバリアント２）、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＦＧＦ−１８を含む（ＦＧＦ−１５は含まない）ＣＭのプールのことをいう。「Ｓ５」とは、ヒトＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２およびＦＧＦ−２３を含むＣＭのプールのことをいう。図９に示されたネガティブコントロールはまた、空のベクター「ベクター」および関連性のないベクター「ＭＧＣ」を含む。
【０２３９】
図９Ａおよび９Ｃは、カルディオスフィア増殖についての懸濁液培養物アッセイの結果を示す。懸濁液培養物は、上記で説明したように生育した。処置の名称は、図９Ｂと同じである。図９Ａは、ＥＧＦ、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−９それぞれが、懸濁液中のカルディオスフィアの数を増加させたことを示す。さらに、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−９は、すべての細胞生存を促進した。「Ｓ１」および「Ｓ２」は、カルディオスフィア生存および総細胞生存率を「Ｓ−コントロール」より大きい程度に増加させた。「Ｓ１」および「Ｓ２」の生存を促進する効果は、それぞれＦＧＦ−４およびＦＧＦ−９の効果に起因し得る。図９Ｃは、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−９、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤそれぞれが、カルディオスフィア生存とカルディオスフィア増殖との両方を促進することを示す。
【０２４０】
図１０は、カルディオスフィア培養物の形態に対する示された処置の効果を示す。カルディオスフィアは、これらの写真において小さくて丸い澄んだ相の細胞の集団として観察される。基本培地（「基礎培地」）においてカルディオスフィアは、発生しなかった。対照的に、完全培地またはＦＧＦ−４、ＦＧＦ−９またはＥＧＦを補充した基本培地中で生育した培養物は、多数のカルディオスフィアを発生した。いくつかのカルディオスフィアにおいて、塊の内側に暗調域を見ることができる。図１０はまた、上清のプールコントロール（「Ｓ−コントロール」）および「Ｓ３」プール中で生育した培養物は、ほんのわずかな小さいカルディオスフィアを発生したことを示す。比較すると、「Ｓ１」および「Ｓ２」のプール中で生育した培養物は、より多く、かつより大きい大きさのカルディオスフィアを発生した。
【０２４１】
図に示され、そして本明細書中の実施例において説明されるカルディオスフィア生存アッセイおよびカルディオスフィア増殖アッセイの結果は、インビボにおける心筋細胞の生存および増殖を促進するこれらの成長因子の能力を示している。
【０２４２】
実施例３：インビトロでのカルディオスフィア増殖に対するＰＤＧＦ−ＢＢの効果
別個の実験において、インビトロでのカルディオスフィア増殖に対するＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の効果を、実施例２に記載した方法を使用して測定した。結果を、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール（それぞれ「完全培地」および「基本培地」）とともに図１１に示す。カルディオスフィアは、基本培地においては発生しなかったが、他方、完全培地中で生育した培養物は、多くのカルディオスフィアを発生した。ＰＤＧＦ−ＢＢの存在下で生育した培養物はまた、多くのカルディオスフィアを発生し、このことは、ＰＤＧＦ−ＢＢが、カルディオスフィア増殖を刺激したことを示唆する。
【０２４３】
実施例４：インビトロでのカルディオスフィア増殖に対するＥＧＦファミリーメンバーの効果
カルディオスフィア増殖に対する種々のＥＧＦファミリーメンバーの効果を調査した。実施例１における方法を使用して得られたカルディオスフィアを、トリプシンを用いて剥離および解離し、そして２％Ｂ２７を補充した３５％ＩＭＤＭ／６５％ＤＭＥＭ  Ｈａｍ  Ｆ１２混合物を含む基本培地（ＢＭ）を含むポリ−Ｄ−リシンでコートされた２４ウェル細胞培養プレート（ｃａｔ＃３５４４１４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に１ウェル当たり１〜２×１０５細胞の密度で播いた。あるいは、実施例１の方法によって得られたカルディオスフィアを、フィブロネクチンでコートされたプレート上で増殖させ、次いで基本培地（ＢＭ）を含むポリ−Ｄ−リシンでコートされた２４ウェル細胞培養プレート（ｃａｔ＃３５４４１４、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に１ウェルあたり１〜２×１０５細胞の密度で播いた。その培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩または２日間に亘ってインキュベートした。次いで試験されるＥＧＦファミリーメンバーの各々を、１００ｎｇ／ｍｌで別個の培養物に添加した。試験されたＥＧＦファミリーメンバーは、Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから入手され、それらとしては：アンフィレグリン（ｃａｔ＃２６２−ＡＲ）、Ｅｐｉｇｅｎ（ｃａｔ＃１１２７−ＥＰ）、エピレグリン（ｃａｔ＃１１９５−ＥＰ）、ＨＢ−ＥＧＦ（ｃａｔ＃２５９−ＨＥ）、ＴＧＦα（ｃａｔ＃２３９−Ａ）、ＥＧＦ（ｃａｔ＃２３６−ＥＧ）、ベータセルリン（ｃａｔ＃２６１−ＣＥ）、ヘレグリンα（ｃａｔ＃２９６−ＨＲ）およびＮＲＧ−１−β１−ＨＲＧ−β１（ｃａｔ＃３９６−ＨＢ）が挙げられる。ポジティブコントロールとして、いくつかの細胞をＣＧＭ中でインキュベートした。その培養物を５〜７日間インキュベートした。次いで各培養物中のカルディオスフィア集団を数えた。培養物の形態の写真は、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ３００  ３．０写真ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた光学顕微鏡に装着されたＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ  デジタルカメラ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して得た。
【０２４４】
示されたＥＧＦファミリーメンバーを用いた処置に応答して観察されたカルディオスフィアの数（「カルディオスフィア集団数」）をプロットする結果を図７に示す。実施例２および３において記載したように、基本培地中ではカルディオスフィアは、発生しないが、他方、完全培地中で生育した培養物は、多くのカルディオスフィアを発生した。アンフィレグリン、Ｅｐｉｇｅｎ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびベータセルリンは、カルディオスフィア増殖を促進した（図７）。比較して、ヘレグリンαおよびＮＲＧ−１−β１−ＨＲＧ−β１は、カルディオスフィアの発生を促進しなかった。試験されたヘレグリンαおよびＮＲＧ−１−β１−ＨＲＧ−β１調製物は、主にＥＦＧドメインのみを含んで全長タンパク質を含まなかった。
【０２４５】
実施例５：新生仔ラット心筋細胞の単離
生後１日のラット由来の心室の部分を回収した。Ｄ１、Ｄ２およびＤ３作用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を含む消化作用溶液を、Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｃａｔ＃ｎｃ−６０６３１、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）から販売されている新生仔ラット／マウス心筋細胞単離キットを使用して調製した。詳細には、Ｄ１作用溶液を、５ｍｌのＤ１原液および４５ｍｌの滅菌水を用いて調製した。２種類のＤ２作用溶液を調製した。各々のＤ２作用溶液は、２０ｍｌのＤ２原液、２８ｍｌの滅菌水、２ｍｌのＥＣ（酵素コラゲナーゼ）緩衝液を含み、混合し、そして０．２２マイクロメートル（μｍ）フィルターで濾過した。２種類のＤ３作用溶液を調製した。各々のＤ３作用溶液は、２５ｍｌのＮＳ（新生仔播種）培地、１（１）本の１５ｍｌのＤ３原液を含み、そして最終体積を４０ｍｌにした。
【０２４６】
一旦これらの溶液を調製したら、心臓部分を、Ｄ１作用溶液を含む培養皿に移し、そして１回または２回切断した。次いで切断された心臓片を、すべての心臓が切断されるまでＤ１溶液を含む別個の培養皿に移した。次いで切断された心臓片を、１２ｍｌのＤ２作用溶液を含むフラスコに移し、そして＃２〜３（約３００〜６００ｒｐｍ）（Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ｃａｔ＃１１５００４９Ｓ）の撹拌速度設定で、撹拌プレート上で１２分間撹拌した。次いで単離された細胞の上清を１５ｍｌチューブに移し、そして遠心機（Ｋｅｎｄｒｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃７５００４３７７）に置いた。上清を、室温にて１２００ｒｐｍで２分間遠心し、細胞ペレットを得た。細胞ペレットを５〜１０ｍｌのＤ３作用溶液に再懸濁し、そして単離手順の最後まで室温に放置した。Ｄ１、Ｄ２およびＤ３作用溶液を用いた上記で説明した工程を、処理された心臓組織のすべてが消化されるまで、それぞれ５〜１１回繰り返した。消化された細胞を、細胞濾過器を使用して濾過し、その細胞を、濾紙の表面上のまわりにピペットを動かすことによって濾紙の上からピペットで移した。
【０２４７】
続いてその細胞を、約１．５時間、３７℃、５％ＣＯ２で、８枚のコートされていない１００ｍｍＣｏｒｉｎｇ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ｃａｔ＃４３０１６７）に播くことによってインキュベートし、線維芽細胞を除去した。続いて新生仔心筋細胞を含む上清を回収し、そしてこのようにして得られた細胞を数えた。
【０２４８】
実施例６：新生仔ラット心筋細胞ｐＡｋｔ、ｐＳＴＡＴ３およびｐＥＲＫアッセイ
実施例５から回収された細胞を、０．１ミリモル（ｍＭ）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃Ｂ５００２−２５０ｍｇ）を補充したＮＳ（新生仔播種）培地（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＮＪ、ｃａｔ＃Ｍ−８０３１）中に６×１０５細胞／ｍｌの密度に希釈した。次いで希釈した細胞を、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａＴＭプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ｃａｔ＃３５３８７２）に１００マイクロリットル（μｌ）／ウェルの体積で播き、第１日目に一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２４９】
翌日（第２日目）に、培地を、１５０μｌ／ウェルで０．１ｍＭ  ＢｒｄＵを含む新鮮なＮＳ培地に交換し、その細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。第３日目に、培地を１５０μｌ／ウェルの飢餓培地に交換し、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。飢餓培地は：ＤＭＥＭ−ｇｌｃ−ｐｒｙ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋０．１％ＢＳＡ＋１×ペニシリン−ストレプトマイシンを含んだ。ＤＭＥＭ−ｇｌｃ−ｐｒｙは、グルコースおよびピルベート（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ｃａｔ＃１１９６６−０２５）を含まないＤＭＥＭを含んだ。ＨＥＰＥＳは、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ（ｃａｔ＃２５−０６０−Ｃ１、１Ｍ）から購入した。無脂肪酸ウシアルブミンＦｒ．Ｖ（ＢＳＡ）は、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ（ｃａｔ＃８２−００２−４）から購入し、そしてペニシリン−ストレプトマイシンは、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ（ｃａｔ＃３０−００２−ＣＩ、１００Ｘ）から購入した。
【０２５０】
一晩インキュベーション後の第４日目に、プレートの９６ウェルを吸引し、そして１５０μｌ／ウェルの新鮮飢餓培地で洗浄し、さらに５０μｌ／ウェルの新鮮飢餓培地を各ウェルに加えた。続いて９６ウェルプレートの縦列２〜１１の細胞を５０μｌのタンパク質馴化培地を加えることによって処置した。ポジティブコントロールである３００ナノグラム（ｎｇ）／ｍＬのｒｈＩＧＦ１を、縦列１のＡ〜Ｄのウェルに加え、ポジティブコントロールである２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＬＩＦを、縦列１２のＡ〜Ｈのウェルに加え、そしてネガティブコントロールであるベクターのみの馴化培地を、縦列１のＥ〜Ｈのウェルに加えた。
【０２５１】
続いてプレートを１５分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、ウェルの中の溶液を、吸引によって除去した。続いてウェルを、１５０μｌ／ウェルの氷冷１×ＰＢＳで洗浄し、そして４０μｌの１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃Ｐ７６２６）を含む氷冷溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ｃａｔ＃９８０３）を各ウェルに加えた。プレートを、１０分間氷上で維持した。次いでプレートを、ルミネックスリン光体タンパク質検出アッセイ（例えば、実施例７を参照のこと）に向けて準備した。
【０２５２】
新生仔ラット心筋細胞をまた、飢餓条件下で生存する能力についてアッセイした。第１日目に、新生仔ラット心筋細胞を、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａＴＭ組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ｃａｔ＃３５３８７２）中の０．１ｍＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃Ｂ５００２）を補充した１００μｌのＮＳ培地（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＮＪ、ｃａｔ＃Ｍ−８０３１）に１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で播いた。プレートを、Ｂｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｙ  Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｔａｐｅ（Ｅ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ｃａｔ＃１７９６２００）で密封し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。第２日目に、培地を、０．１ｍＭ  ＢｒｄＵを補充した１５０μｌの新鮮ＮＳ培地に交換し、プレートを密封テープで密封し、そして細胞をさらに２４〜４８時間インキュベートした。培地を、組換え試験タンパク質を含む１００μｌの飢餓培地に交換した。飢餓培地は、ＤＭＥＭ−ｇｌｃ−ｐｙｒ（グルコースまたはピルベートを含まないＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ｃａｔ＃１１９６６−０２５）中に、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、ｃａｔ＃２５−０６０−Ｃ１，１Ｍ）、０．１％無脂肪酸ウシアルブミン画分Ｖ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ、ｃａｔ＃８２−００２−４）、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、ｃａｔ＃２５−０６０−Ｃ１、１Ｍ）を含んだ。約４０時間のインキュベート後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｇ７５７３）を、各ウェル中の培地に加え、そしてプレートを、１０分間室温にて暗黒下で振とうした。各ウェルの含有量の一部（１００μｌ）を、９６ウェル１／２範囲アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ｃａｔ＃３６８８）に移し、そして発光シグナルを、Ｌｍａｘ発光プレートリーダーを使用して測定した。図４は、試験されたいくつかのタンパク質についての結果を示す。
【０２５３】
新生仔ラット心筋細胞をさらに、虚血条件下で生存する能力についてアッセイした。第１日目に、新生仔ラット心筋細胞を、９６ウェルＰｒｉｍａｒｉａＴＭ組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ｃａｔ＃３５３８７２）中の、０．１ｍＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃Ｂ５００２）を補充した１００μｌのＮＳ培地（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＮＪ、ｃａｔ＃Ｍ−８０３１）に１ウェル当たり２×１０４細胞の密度で播いた。プレートを、Ｂｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｙ  Ｓｅａｌｉｎｇ  Ｔａｐｅ（Ｅ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ｃａｔ＃１７９６２００）で密封し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。第２日目に、培地を、０．１ｍＭ  ＢｒｄＵを補充した１５０μｌの新鮮ＮＳ培地に交換し、プレートを密封テープで密封し、そして細胞を一晩インキュベートした。第３日目に、培地を上記で説明したように飢餓培地に交換し、プレートを密封テープで密封し、そして細胞を一晩インキュベートした。培地を、組換え試験タンパク質を含む１００μｌのＥｓｕｍｉ虚血緩衝液（ＥＩＢ）に交換した。ＥＩＢは、ｐＨ６．７で、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＫＣｌ、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  デオキシグルコース、２０ｍＭ  乳酸ナトリウムおよび０．４９ｍＭ  ＭＧＣｌ２を含んだ。約３時間のインキュベート後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｇ７５７３）を、各ウェルの培地に加え、そしてそのプレートを、１０分間、室温にて暗黒下で振とうした。各ウェルの含有量の一部（１００μｌ）を、９６ウェル１／２範囲アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ｃａｔ＃３６８８）に移し、そして発光シグナルを、Ｌｍａｘ発光プレートリーダーを使用して測定した。図５Ａおよび５Ｂは、試験されたいくつかのタンパク質についての結果を示す。
【０２５４】
実施例７：ルミネックスリン光体−タンパク質検出アッセイ
アッセイフィルタープレート（９６ウェル；ｃａｔ＃ＭＳＢＶＮ１２５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１００μｌのアッセイ緩衝液で洗浄し、次いで減圧した。アッセイ緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ、ｃａｔ＃２１−０３１−ＣＶ）および０．２％ＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｃ．Ｋａｎｋａｋｅｅ、ＩＬ、ｃａｔ＃８２−００２−４）を含んだ。
【０２５５】
αｐＡｋｔビーズ（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ｃａｔ＃４６−６０１）、αｐＥＲＫビーズ（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃４６−６０２）およびαｐＳｔａｔ３ビーズ（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃４６−６２３）のビーズ懸濁液を、αｐＡｋｔビーズに対して１：４０の希釈およびαｐＥＲＫビーズとαｐＳｔａｔ３ビーズとの両方に対して１：５０の希釈でアッセイ緩衝液に希釈した。３種類のビーズの混合物（２５μｌ）を、アッセイフィルタープレートの各ウェルに加えた。さらに、実施例６に記載したような溶解緩衝液を使用して調製された２５μｌの細胞可溶化物を、アッセイフィルタープレートの各ウェルに加えた。続いてプレートを、４℃で一晩、黒色のふたを備えて暗黒下にて振とう機上でインキュベートした。
【０２５６】
インキュベーション後、プレートをウェル内の液体を除去するために減圧し、次いで２００μｌのアッセイ緩衝液で２回洗浄した。αｐＡｋｔ（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ｃａｔ＃４６−６０１）、αｐＥＲＫ（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃４６−６０２）およびαｐＳｔａｔ３（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、ｃａｔ＃４６−６２３）に対するビオチン化レポーターを、αｐＡｋｔビオチン化レポーターについて１：４０希釈およびαｐＥＲＫビオチン化レポーターとαｐＳｔａｔ３ビオチン化レポーターとの両方について１：５０希釈に従ってアッセイ緩衝液で希釈した。この調製されたビオチン化レポーターを混合し、そして２５μｌの体積の混合されたレポーターを、プレートを減圧させた後に、プレートの各ウェルに加えた。次いでプレートを、室温で９０分間、暗黒下にて振とう機上でインキュベートした。９０分後、液体をウェルから吸引し、そして２００μｌのアッセイ緩衝液で２回洗浄した。続いてストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｃａｔ＃５５４０６１）を、１：２００希釈にアッセイ緩衝液を用いて調製し、そして２５μｌの希釈されたストレプトアビジン−ＰＥを各ウェルに加えた。次いでプレートを、室温で１５分間、暗黒下にて振とう機上でインキュベートした。エンハンサー溶液（ＵｐＳｔａｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ、ｃａｔ＃４３−０２４）を、アッセイ緩衝液（１：１）を用いて調製し、そしてその２５μｌを各ウェルに加えた。プレートを、３０分間、室温にて暗黒下、振とう機上でインキュベートした。液体を吸引し、そして２００μｌのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。最後に、１００μｌのアッセイ緩衝液を、各ウェルに加えて、ビーズを懸濁し、そしてプレートを、暗黒下、室温にて１０分間振とう機上に置いた。次いでプレートを、「ｐＡｋｔ、ｐＥＲＫ、ｐＳｔａｔ３」プログラムを使用してルミネックスリーダーで読み出すために準備した。
【０２５７】
実施例８：新生仔ラット心筋細胞における３Ｈ−デオキシグルコースの取り込み
第１日目に、新生仔ラット心筋細胞を、９６ウェル白色／透明底面組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ｃａｔ＃３５３９４７）中の１００μｌのＮＳ培地（Ｃｅｌｌｕｔｒｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｉｇｈｌａｎｄ  Ｐａｒｋ、ＮＪ、ｃａｔ＃Ｍ−８０３１）に１ウェル当たり３×１０４細胞の密度で播いた。播いた後、周縁効果を最小限にするためにプレートを３０分間組織培養フード中に残した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、恒温器内に置いた。第２日目に、培地を、１ウェル当たり９０μｌの飢餓培地（１％ＢＳＡの低グルコース（５ｍＭ）ＤＭＥＭ）に６時間交換した。飢餓培地を、１０μｌのネガティブコントロール培地、インスリンを含むポジティブコントロール培地または試験因子を含む試験培地に交換し、２０分間インキュベーションした。コントロール培地または試験培地を、５０μｌの標識培地中の１ｕＣｉ３Ｈ−デオキシグルコース（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｃａｔ＃ＮＥＴ−３３１Ａ）、１％ＢＳＡおよびグルコースを含まないＤＭＥＭ中の１０μＭの冷デオキシグルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｃａｔ＃Ｄ−３１７９）を含む５０μｌの３Ｈ標識培地で交換した。その細胞を、１５分間標識し、次いで細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含む氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄工程後、ＰＢＳを５０μｌの０．０５Ｎ  ＮａＯＨに交換し、各ウェルに適用して細胞を溶解させた。次いで１５０μｌのｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ４０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｃａｔ＃Ｄ−６０１３６４１）を、各ウェルにゆっくり加え、プレートを密封テープ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｃａｔ＃６００５１８５）で密封し、そしてプレートの底面を、白色の裏張りテープ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ｃａｔ＃６００５１９９）で覆った。各ウェルの放射能を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＸＰ（登録商標）に基づくオペレーティングソフト（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を備えたＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴを使用して計測した。結果を、図８Ｃに示す。
【０２５８】
実施例９：成体のマウスカルディオスフィア増殖に対する成長因子の効果
成体のマウス心臓の幹細胞（カルディオスフィア）を、Ｍｅｓｓｉｎａ  ａｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５（９）：９１１−９２１に従って実施例１において記載したように単離および増殖した。カルディオスフィア増殖に対するＦＧＦ９、エピレグリンおよびＰＤＧＦ−ＢＢの効果を、個別に、かつ組み合わせて、インビトロにおいて計測した。カルディオスフィアを、トリプシンを用いて剥離および解離し、次いで９６ウェルプレートに１ウェル当たり４×１０４細胞の密度または２４ウェルプレートに１ウェル当たり１〜２×１０５細胞の密度でポリ−Ｄ−リシンコートされた培養プレート上に播いた。カルディオスフィアを、２％Ｂ２７を補充した３５％ＩＭＤＭ／６５％ＤＭＥＭ  ＨａｍＦ１２混合物を含む基本培地（ＢＭ）中で維持した。あるいは、実施例１の方法によって得られたカルディオスフィアを、フィブロネクチンコートされたプレート上で増殖し、次いでポリ−Ｄ−リシンコートされた培養プレートに、９６ウェルプレートに１ウェル当たり４×１０４細胞の密度または２４ウェルプレートに１ウェル当たり１〜２×１０５細胞の密度で基本培地中に播いた。この培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩または２日間インキュベートした。図６に示すように、成長因子を、完全増殖培地（ＣＧＭ）（Ｍｅｓｓｉｎａ  ａｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２００４）９５（９）：９１１−９２１）中に０〜３００ｎｇ／ｍｌにわたる濃度で加え、そして５〜７日間インキュベートした。その培養物を、Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ３００  ３．０ソフトウェアを使用して光学顕微鏡に装着されたＡｘｉｏＣａｍ  ＨＲｃ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて写真撮影し、その形態を評価し、そしてカルディオスフィアの数を数えた。
【０２５９】
３．６７ｎｇ／ｍｌまたは１１ｎｇ／ｍｌの濃度では、組換え成長因子は、単独で加えた場合、カルディオスフィア増殖を促進しなかった（図６）。しかしながら、ＦＧＦ９、エピレグリンおよびＰＤＧＦ−ＢＢを、３．６７ｎｇ／ｍｌまたは１１ｎｇ／ｍｌの濃度でそれぞれ組み合わせたとき、組み合わせたものは、カルディオスフィア増殖を劇的に促進させた（図６）。従って、カルディオスフィア増殖に対するＦＧＦ９、エピレグリンおよびＰＤＧＦ−ＢＢの効果は、相乗的であった。
【０２６０】
より高いタンパク質濃度、３３ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍｌでは、ＦＧＦ９のみの効果は、３種類のタンパク質の組み合わせたものと類似しており（図６）、この徴候から、これらのより高いタンパク質濃度で飽和し得ることが示唆された。あるいは、集団数が、半定量的計測であり、各集団の大きさを示していないので、組み合わせの処置後に形成された集団は、１つのみの成長因子に応答して形成された集団よりも大きいかもしれない。
【０２６１】
実施例１０：成長因子を用いた心臓の状態の処置
心臓の状態を有する患者を、本発明の治療的な薬学的組成物および方法を用いて処置することができる。投与すべき薬学的組成物ならびに頻度および用量を決定するために、その薬学的組成物を提供し、種々の因子が考慮される。それらの因子としては、心臓の状態の重症度、心臓の状態の根元的な原因ならびに患者の身体的、代謝的および免疫学的特性が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物は、カテーテルを使用して、心筋層への直接注入によって、または全身性注入によって投与され得る。患者は、心臓の状態にいかなる変化についてもモニターされ、処置に使用された薬学的組成物および方法を、必要に応じて改変する。
【０２６２】
本発明の前述の説明が、例示的であり、単なる説明のためのものであり、そして特許請求するように本発明を限定しないことが理解されるべきである。さらに、本発明が、記載された特定の実施形態に限定されず、当然ながら、それらは、変更されることが理解されなければならない。さらに、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特定の実施形態を説明するために使用された用語は、限定することを意図したものではない。
【０２６３】
値の範囲に関して、内容が別段明らかに示さない限り、本発明は、少なくとも下限の単位の１０分の１までの範囲の上限と下限との間のそれぞれの中間値を包含する。さらに、本発明は、他の任意の述べられた中間値も包含する。さらに、本発明はまた、述べられた範囲から詳細に排除されない限り、範囲の上限および下限のいずれかまたは両方を排除する範囲を包含する。
【０２６４】
他の方法で定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語の意味は、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものである。当業者はまた、本明細書中に記載されたものと類似かまたは等価ないかなる方法および材料がまた、本発明を実施または試験するために使用することができることを理解するであろう。さらに、本明細書中で言及されたすべての出版物は、参考により援用される。
【０２６５】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」「または」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が別段明示的に既定しない限り、複数の指示物を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「対象ポリペプチド」との言及は、複数のこのようなポリペプチドを含み、そして「その薬物」との言及は、１つ以上の薬物および当業者に公知のそれらの等価物などの言及を含む。
【０２６６】
さらに、本明細書中において使用される、構成要素の量、反応条件、純度％、ポリペプチド長およびポリヌクレオチド長などを表すすべての数値は、別段指示がない限り、用語「約」によって改変される。従って、本明細書中で説明される数値的なパラメータは、本発明の所望の性質に依存して変化し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対して均等論を適用することを妨げることを意図するわけではなく、数値パラメータの各々は、通常の丸めの技術を適用して報告された有効数字における数値に照らして少なくとも解釈されるべきものである。それでもなお、特定の実施例において説明された数値的値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、いかなる数値的値も、実験での測定値の標準偏差から一定の誤差を固有に含む。
【０２６７】
本明細書は、引用された特許および他の参考文献に照らして最も詳細に理解される。本明細書中において引用された特許および他の参考文献の開示は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２６８】
本明細書中で議論された出版物は、本願の出願日より前にそれらの開示が単独で提供される。本発明が、先願発明によってこのような出版物より前に起こるために権利が与えられないという承認として理解されるべきものは本明細書中にはない。さらに、提供された出版物の日付は、実際の出版日と異なり得るため、独立して確認される必要があり得る。
【０２６９】
【表１−Ａ】
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【０２７０】
【表１−Ｂ】
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【０２７１】
【表１−Ｃ】
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【０２７２】
【表１−Ｄ】
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【０２７３】
【表２−Ａ】
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【０２７４】
【表２−Ｂ】
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【０２７５】
【表２−Ｃ】
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【０２７６】
【表２−Ｄ】
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【０２７７】
【表２−Ｅ】
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【０２７８】
【表２−Ｆ】
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【０２７９】
【表３−Ａ】
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【０２８０】
【表３−Ｂ】
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【０２８１】
【表３−Ｃ】
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【０２８２】
【表３−Ｄ】
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【０２８３】
【表３−Ｅ】
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【０２８４】
【表３−Ｆ】
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【０２８５】
【表４−Ａ】
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【０２８６】
【表４−Ｂ】
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【０２８７】
【表４−Ｃ】
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【０２８８】
【表４−Ｄ】
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【０２８９】
【表４−Ｅ】
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【０２９０】
【表４−Ｆ】
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【０２９１】
【表４−Ｇ】
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【０２９２】
【表５−Ａ】
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【０２９３】
【表５−Ｂ】
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【０２９４】
【表５−Ｃ】
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【０２９５】
【表５−Ｄ】
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【０２９６】
【表５−Ｅ】
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（配列表）
配列表提出シートおよび紙形式の配列表は、本願に添付される。
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例６でさらに説明するように、タンパク質上清を用いて処置される新生仔ラット心筋細胞におけるｐＥＲＫ（図１Ａ）、ｐＡｋｔ（図１Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図１Ｃ）を含む３項目の（３−ｐｌｅｘ）ルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。３項目のルミネックススクリーニングからの結果に基づいて、２シグマ以上を示したクローンを同定した。続いてこれらのクローンを、フォーカス（ｆｏｃｕｓ）タンパク質プレート（７０２番）と呼ばれる２つ組のアッセイプレートにおいて、室内で生成されたタンパク質上清を使用して少なくとも１つのトランスフェクションから再試験された。７０２フォーカスプレートからのタンパク質上清は、アッセイプレート７０２ａおよび７０２ｂとして同定される２つ組のアッセイプレートに適用された。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいて、ｙ軸は、ｐＥＲＫ、ｐＡｋｔおよびｐＳＴＡＴ３の発光シグナルを示し、それらは、それぞれリン光体−ＥＲＫ、リン光体−Ａｋｔ１およびリン光体−ＳＴＡＴ３のタンパク質発現を表す。図１Ａ〜１Ｃにおいて、各縦棒は、１２個の縦列および８個の横列を有する９６ウェルプレート中の１つのウェルからのシグナルを表す。ｘ軸は、１２個の縦列を示し；そして各縦列における８本の棒線は、横列Ａ〜Ｈの８つのウェルを示す。ベクターのみのコントロールを、ウェルＥ１〜Ｈ１（縦列１の第２の４本）におけるネガティブコントロールとして使用し；ベクターコントロール中に希釈された３００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１を、ウェルＡ１〜Ｄ１（縦列１の第１の４本）におけるｐＡｋｔに対するポジティブコントロールとして使用し；そしてベクターコントロール中に希釈された２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＬＩＦ（組換えヒト白血病抑制因子）を、ウェルＡ１２〜Ｈ１２（縦列１２の最後の８本）においてｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ３に対するポジティブコントロールとして使用した。９６ウェルプレート（縦列２〜１１）の内側の８０ウェルにおいて、２シグマ値を超えるシグナルを生成する標識されたタンパク質（図中の標識された横線「２シグマ」によって示される）は、２つ組のアッセイプレートにおいて２シグマシグナルを超えて示されたものである。ウェルＧ１０は、仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６、配列番号２０を表し、ｐＥＲＫに対してほぼ２シグマシグナルを有する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例６でさらに説明するように、タンパク質上清を用いて処置される新生仔ラット心筋細胞におけるｐＥＲＫ（図１Ａ）、ｐＡｋｔ（図１Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図１Ｃ）を含む３項目の（３−ｐｌｅｘ）ルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。３項目のルミネックススクリーニングからの結果に基づいて、２シグマ以上を示したクローンを同定した。続いてこれらのクローンを、フォーカス（ｆｏｃｕｓ）タンパク質プレート（７０２番）と呼ばれる２つ組のアッセイプレートにおいて、室内で生成されたタンパク質上清を使用して少なくとも１つのトランスフェクションから再試験された。７０２フォーカスプレートからのタンパク質上清は、アッセイプレート７０２ａおよび７０２ｂとして同定される２つ組のアッセイプレートに適用された。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいて、ｙ軸は、ｐＥＲＫ、ｐＡｋｔおよびｐＳＴＡＴ３の発光シグナルを示し、それらは、それぞれリン光体−ＥＲＫ、リン光体−Ａｋｔ１およびリン光体−ＳＴＡＴ３のタンパク質発現を表す。図１Ａ〜１Ｃにおいて、各縦棒は、１２個の縦列および８個の横列を有する９６ウェルプレート中の１つのウェルからのシグナルを表す。ｘ軸は、１２個の縦列を示し；そして各縦列における８本の棒線は、横列Ａ〜Ｈの８つのウェルを示す。ベクターのみのコントロールを、ウェルＥ１〜Ｈ１（縦列１の第２の４本）におけるネガティブコントロールとして使用し；ベクターコントロール中に希釈された３００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１を、ウェルＡ１〜Ｄ１（縦列１の第１の４本）におけるｐＡｋｔに対するポジティブコントロールとして使用し；そしてベクターコントロール中に希釈された２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＬＩＦ（組換えヒト白血病抑制因子）を、ウェルＡ１２〜Ｈ１２（縦列１２の最後の８本）においてｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ３に対するポジティブコントロールとして使用した。９６ウェルプレート（縦列２〜１１）の内側の８０ウェルにおいて、２シグマ値を超えるシグナルを生成する標識されたタンパク質（図中の標識された横線「２シグマ」によって示される）は、２つ組のアッセイプレートにおいて２シグマシグナルを超えて示されたものである。ウェルＧ１０は、仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６、配列番号２０を表し、ｐＥＲＫに対してほぼ２シグマシグナルを有する。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃは、実施例６でさらに説明するように、タンパク質上清を用いて処置される新生仔ラット心筋細胞におけるｐＥＲＫ（図１Ａ）、ｐＡｋｔ（図１Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図１Ｃ）を含む３項目の（３−ｐｌｅｘ）ルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。３項目のルミネックススクリーニングからの結果に基づいて、２シグマ以上を示したクローンを同定した。続いてこれらのクローンを、フォーカス（ｆｏｃｕｓ）タンパク質プレート（７０２番）と呼ばれる２つ組のアッセイプレートにおいて、室内で生成されたタンパク質上清を使用して少なくとも１つのトランスフェクションから再試験された。７０２フォーカスプレートからのタンパク質上清は、アッセイプレート７０２ａおよび７０２ｂとして同定される２つ組のアッセイプレートに適用された。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにおいて、ｙ軸は、ｐＥＲＫ、ｐＡｋｔおよびｐＳＴＡＴ３の発光シグナルを示し、それらは、それぞれリン光体−ＥＲＫ、リン光体−Ａｋｔ１およびリン光体−ＳＴＡＴ３のタンパク質発現を表す。図１Ａ〜１Ｃにおいて、各縦棒は、１２個の縦列および８個の横列を有する９６ウェルプレート中の１つのウェルからのシグナルを表す。ｘ軸は、１２個の縦列を示し；そして各縦列における８本の棒線は、横列Ａ〜Ｈの８つのウェルを示す。ベクターのみのコントロールを、ウェルＥ１〜Ｈ１（縦列１の第２の４本）におけるネガティブコントロールとして使用し；ベクターコントロール中に希釈された３００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１を、ウェルＡ１〜Ｄ１（縦列１の第１の４本）におけるｐＡｋｔに対するポジティブコントロールとして使用し；そしてベクターコントロール中に希釈された２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＬＩＦ（組換えヒト白血病抑制因子）を、ウェルＡ１２〜Ｈ１２（縦列１２の最後の８本）においてｐＥＲＫおよびｐＳＴＡＴ３に対するポジティブコントロールとして使用した。９６ウェルプレート（縦列２〜１１）の内側の８０ウェルにおいて、２シグマ値を超えるシグナルを生成する標識されたタンパク質（図中の標識された横線「２シグマ」によって示される）は、２つ組のアッセイプレートにおいて２シグマシグナルを超えて示されたものである。ウェルＧ１０は、仮説タンパク質ＸＰ＿０９８９１６、配列番号２０を表し、ｐＥＲＫに対してほぼ２シグマシグナルを有する。
【図２】図２は、タンパク質プレート６５９番からの室内のタンパク質上清を用いて処置された新生仔ラット心筋細胞における３項目のルミネックススクリーニングにおけるリン光体−ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）発現を示す。上の２枚のパネルの２つ組のアッセイプレートは、ウェルＨ３におけるベータセルリンスプライスバリアント配列番号１８０（ベータセルリンＳＶ）が、ｐＳＴＡＴ３を劇的に７シグマ以上に増加していることを示す。下の２枚の２つ組のパネルは、ｙ軸のスケールの０〜１２００から０〜２００への改変を示す。ここで、ウェルＧ２に位置するＧ−ＣＳＦスプライスバリアント（Ｇ−ＣＳＦ  ＳＶ、配列番号１８３）は、２シグマを超えてｐＥＲＫを増加し（データ示さず）および２シグマを超えてｐＳＴＡＴ３を増加した（データを示す）。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、図１Ａ〜１Ｃに示したものと同じ用量の組換えタンパク質を用いて処置された新生仔ラット心筋細胞におけるｐＡｋｔ（図３Ａ）、ｐＥＲＫ（図３Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図３Ｃ）を含む３項目のルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。各組換えタンパク質の処置について、４本の棒が、様々なタンパク質濃度、左から１００ｎｇ／ｍｌ、３３ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌを表す。従って、明らかな陽性シグナルを示したタンパク質を標識した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、図１Ａ〜１Ｃに示したものと同じ用量の組換えタンパク質を用いて処置された新生仔ラット心筋細胞におけるｐＡｋｔ（図３Ａ）、ｐＥＲＫ（図３Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図３Ｃ）を含む３項目のルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。各組換えタンパク質の処置について、４本の棒が、様々なタンパク質濃度、左から１００ｎｇ／ｍｌ、３３ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌを表す。従って、明らかな陽性シグナルを示したタンパク質を標識した。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、図１Ａ〜１Ｃに示したものと同じ用量の組換えタンパク質を用いて処置された新生仔ラット心筋細胞におけるｐＡｋｔ（図３Ａ）、ｐＥＲＫ（図３Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３（図３Ｃ）を含む３項目のルミネックスリン光体−タンパク質発現を示す。各組換えタンパク質の処置について、４本の棒が、様々なタンパク質濃度、左から１００ｎｇ／ｍｌ、３３ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌおよび０ｎｇ／ｍｌを表す。従って、明らかな陽性シグナルを示したタンパク質を標識した。
【図４】図４は、実施例６においてさらに説明するように、飢餓培地における新生仔ラット心筋細胞の生存率に対する選択された組換えタンパク質の効果を示す。新生仔ラット心筋細胞を、約４０時間、飢餓培地中、１００ｎｇ／ｍｌの濃度の様々な組換えタンパク質を用いて処置した。各棒は、示される組換えタンパク質の６回反復の発光ＡＴＰアッセイの結果を表す。棒（ｙ軸）の高さは、コントロールに対するパーセントとして細胞生存率を示す。ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＩＬ−６およびＮＲＧ１−αではなく、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＴ−１、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＢＴＣ、ＮＲＧ１−β１、エピレグリン、ＴＮＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦおよびＥＧＦが、飢餓培地において心筋細胞生存を統計的に有意な程度に促進した；＊＊は、（ｐ＜０．００１）を表し、＊は、（ｐ＜０．０１）を示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、実施例６でさらに説明するように、虚血緩衝液中の新生仔ラット心筋細胞の生存率に対する選択された組換えタンパク質の効果を示す。新生仔ラット心筋細胞を、３時間、虚血緩衝液中に１００ｎｇ／ｍｌの濃度の様々な組換えタンパク質を用いて処置した。各棒は、示された組換えタンパク質の２４回反復の発光ＡＴＰアッセイの結果を表す。棒（ｙ軸）の高さは、コントロールに対するパーセントとして細胞生存率を示す。ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＩＧＦ−１は、それぞれ虚血緩衝液において心筋細胞の生存を統計的に有意な程度に促進した；＊＊は、（ｐ＜０．００１）を表し、＊は、（ｐ＜０．０１）を表す。
【図６】図６は、成体のマウスカルディオスフィアに対するＦＧＦ９、エピレグリン、およびＰＤＧＦ−ＢＢ単独および組み合わせの増殖の効果を示す。カルディオスフィアを、フィブロネクチンコートしたプレート上で調製し、次いで実施例１、２および９に記載するように単一細胞に解離し、次いで９６ウェルポリ−Ｄ−リシンコートした細胞培養プレートに４×１０４細胞／ウェルの密度で完全増殖培地中に播き、そして３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、基本培地中でＦＧＦ９、エピレグリンおよびＰＤＧＦ−ＢＢ単独または組み合わせて処置した。５日後、カルディオスフィア集団の数を、各ウェルについて数えた。各棒は、３回反復の実験の結果を示す。
【図７】図７は、実施例４でさらに説明するように、ＥＧＦファミリーメンバーを用いた処置から生じたカルディオスフィアの数のグラフを示す。比較される処置は：（１）アンフィレグリンを補充した基本培地（アンフィレグリン）；（２）Ｅｐｉｇｅｎを補充した基本培地（Ｅｐｉｇｅｎ）；（３）エピレグリンを補充した基本培地（エピレグリン）；（４）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子を補充した基本培地（ＨＢ−ＥＧＦ）；（５）切断型ヘレグリンαを補充した基本培地（ヘレグリンａ）；（６）切断型ニューレグリンＮＲＧ−１−β１−ＨＲＧ−β１を補充した基本培地（ＮＲＧ−１−ｂ１−ＨＲＧ−ｂ１）；（７）トランスフォーミング成長因子αを補充した基本培地（ＴＧＦａ）；（８）上皮成長因子を補充した基本培地（ＥＧＦ）；（９）ベータセルリンを補充した基本培地（ベータセルリン）；（１０）完全培地（すべてのＣＧＭ）；および（１１）基本培地（ＢＭ）である。
【図８】図８Ａは、リン酸−Ａｋｔ、リン酸−ＥＲＫ、リン酸−ＳＴＡＴ３およびカルディオスフィア増殖アッセイにおける治療薬ベータセルリンおよびニューレグリン−β１（ＮＲＧ１−β１）の結果の概要である。図８Ｂおよび８Ｃに示されるように、両方の薬剤が、インビトロにおける新生仔ラット心筋細胞において細胞の生存率およびグルコース取り込みを増加させた。虚血緩衝液における新生仔ラット心筋細胞生存率に対する組換えベータセルリンおよびＮＲＧ１−β１の効果が、実施例６でさらに説明するように実験され、そしてその結果を図８Ｂに示す。新生仔ラット心筋細胞を、コントロール虚血緩衝液または示される濃度の組換えベータセルリン（ＦＰＴ０３８）、組換えＮＲＧ１−β１（ＦＰＴ０４１）またはポジティブコントロール組換えＩＧＦ−１を含む虚血緩衝液を用いて３時間処置した。各棒は、示される組換えタンパク質の２４回反復の発光ＡＴＰアッセイの結果を表す。棒（ｙ軸）の高さは、コントロールに対するパーセントとして細胞生存率を示す。３つすべてのタンパク質が、虚血緩衝液において心筋細胞の生存を統計的に有意な程度に促進した；＊は、（ｐ＜０．００１）を表す。図８Ｃは、実施例８でさらに説明するように新生仔ラット心筋細胞のグルコース取り込みに対する組換えベータセルリンおよびＮＲＧ１−β１の効果を示す。新生仔ラット心筋細胞を、コントロール培地または示された濃度の組換えベータセルリン（ＦＰＴ０３８）、組換えＮＲＧ１−βｌ（ＦＰＴ０４１）またはポジティブコントロール組換えインスリンを含む培地を用いて２０分間処置した。棒（ｙ軸）の高さは、相対的なグルコース取り込みを表し、コントロールにおいて観察されたグルコース取り込みと比較した、処置において観察されたグルコース取り込みの比である。３つのすべてのタンパク質が、統計的に有意な程度にグルコース取り込みを増加させた；＊は、（ｐ＜０．０１）を表す。
【図９−１】図９は、実施例２でさらに説明するように、生存可能な細胞の総数に対するカルディオスフィア生存ＡＴＰアッセイの結果（図９Ａ）および懸濁液アッセイにおけるカルディオスフィア生存および増殖（図９Ｂおよび９Ｃ）を示す。カルディオスフィアの生存および増殖を、（１）完全培地；（２）基本培地；（３）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（４）ＦＧＦ−１を補充した基本培地（ＦＧＦ１）；（５）ＦＧＦ−２を補充した基本培地（ＦＧＦ２）；（６）ＦＧＦ−３を補充した基本培地（ＦＧＦ３）；（７）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（８）ＦＧＦ−５を補充した基本培地（ＦＧＦ５）；（９）ＦＧＦ−７を補充した基本培地（ＦＧＦ７）；（１０）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（１１）ＦＧＦ−１０を補充した基本培地（ＦＧＦ１０）；（１２）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（１３）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓ１）；（１４）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；（１５）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）；（１６）ヒトＦＧＦ−１３ＳＶ２（スプライスバリアント２）、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＦＧＦ−１８を含む（ＦＧＦ−１５は含まない）ＣＭのプール（Ｓ４）；（１７）ヒトＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２およびＦＧＦ−２３を含むＣＭのプール（Ｓ５）；（１８）空のベクターネガティブコントロール（ベクター）；および（１９）無関係のベクターネガティブコントロール（ＭＧＣ）の存在下で計測した。
【図９−２】図９は、実施例２でさらに説明するように、生存可能な細胞の総数に対するカルディオスフィア生存ＡＴＰアッセイの結果（図９Ａ）および懸濁液アッセイにおけるカルディオスフィア生存および増殖（図９Ｂおよび９Ｃ）を示す。カルディオスフィアの生存および増殖を、（１）完全培地；（２）基本培地；（３）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（４）ＦＧＦ−１を補充した基本培地（ＦＧＦ１）；（５）ＦＧＦ−２を補充した基本培地（ＦＧＦ２）；（６）ＦＧＦ−３を補充した基本培地（ＦＧＦ３）；（７）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（８）ＦＧＦ−５を補充した基本培地（ＦＧＦ５）；（９）ＦＧＦ−７を補充した基本培地（ＦＧＦ７）；（１０）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（１１）ＦＧＦ−１０を補充した基本培地（ＦＧＦ１０）；（１２）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（１３）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓ１）；（１４）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；（１５）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）；（１６）ヒトＦＧＦ−１３ＳＶ２（スプライスバリアント２）、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７およびＦＧＦ−１８を含む（ＦＧＦ−１５は含まない）ＣＭのプール（Ｓ４）；（１７）ヒトＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２およびＦＧＦ−２３を含むＣＭのプール（Ｓ５）；（１８）空のベクターネガティブコントロール（ベクター）；および（１９）無関係のベクターネガティブコントロール（ＭＧＣ）の存在下で計測した。
【図１０−１】図１０は、実施例２でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）完全培地；（２）基本培地（基礎培地）；（３）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（４）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（５）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（６）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（７）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓｌ）；（８）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；および（９）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）である。
【図１０−２】図１０は、実施例２でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）完全培地；（２）基本培地（基礎培地）；（３）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（４）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（５）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（６）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（７）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓｌ）；（８）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；および（９）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）である。
【図１０−３】図１０は、実施例２でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）完全培地；（２）基本培地（基礎培地）；（３）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（４）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（５）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（６）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（７）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓｌ）；（８）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；および（９）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）である。
【図１０−４】図１０は、実施例２でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）完全培地；（２）基本培地（基礎培地）；（３）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（４）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（５）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（６）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（７）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓｌ）；（８）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；および（９）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）である。
【図１０−５】図１０は、実施例２でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）完全培地；（２）基本培地（基礎培地）；（３）ＦＧＦ−４を補充した基本培地（ＦＧＦ４）；（４）ＥＧＦを補充した基本培地（ＥＧＦ）；（５）ＦＧＦ−９を補充した基本培地（ＦＧＦ９）；（６）２９３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）（Ｓ−コントロール）；（７）ヒトＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５を含むＣＭのプール（Ｓｌ）；（８）ヒトＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０を含むＣＭのプール（Ｓ２）；および（９）ヒトＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３−１Ａ、ＦＧＦ−１３−１ＢおよびＦＧＦ−１３ＳＶ１（スプライスバリアント１）を含むＣＭのプール（Ｓ３）である。
【図１１】図１１は、実施例３でさらに説明するように、１０日間の示された処置を伴うインキュベーションから生じる細胞培養物の一連の写真を示す。示される処置は：（１）基本培地；（２）完全培地；および（３）血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）である。
【図１２】図１２は、図１〜１１において説明したように実施された心筋細胞およびカルディオスフィアのアッセイの結果を要約する。インビトロにおける心筋細胞中のＡｋｔ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のリン酸化を増加させ、そのようにして心筋細胞の細胞生存を増加させ得る薬剤として同定される薬剤を、左の楕円の中に列挙する。インビトロにおけるカルディオスフィアの増殖を増加させた薬剤を、右の楕円の中に列挙する。１３個の薬剤が、両方、つまり心筋細胞におけるＡｋｔ、ＳＴＡＴ３およびＥＲＫ１／２のリン酸化を増加させ、そして心筋細胞の細胞生存率を増加させた。それらを、楕円の重複部分に列挙する。
【図１Ａ】
2008528511.tif 000088
【図１Ｂ】
2008528511.tif 000089
【図１Ｃ】
2008528511.tif 000090
【図２】
2008528511.tif 000091
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008528511.tif 000093
【図３Ｃ】
2008528511.tif 000094
【図４】
2008528511.tif 000095
【図５】
2008528511.tif 000096
【図６】
2008528511.tif 000097
【図７】
2008528511.tif 000098
【図８】
2008528511.tif 000099
【図９−１】
2008528511.tif 000100
【図９−２】
2008528511.tif 000101
【図１０−１】
2008528511.tif 000102
【図１０−２】
2008528511.tif 000103
【図１０−３】
2008528511.tif 000104
【図１０−４】
2008528511.tif 000105
【図１０−５】
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【図１１】
2008528511.tif 000107
【図１２】
2008528511.tif 000108
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月16日(2007.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008528511000001.app
【国際調査報告】
2008528511.tif 000167
2008528511.tif 000168
2008528511.tif 000169