(57)【要約】乳癌予後診断方法およびキット  本発明は、乳癌予後診断のための、方法およびキット、ならびにその一部に関する。特に、方法は、乳癌患者の生存可能性、および／または癌治療中または治療後の患者における疾病の再発の可能性、および／または患者が転移型癌を有する可能性の指標となる遺伝子発現パターンまたは分子サインを同定することを包含する。所与の乳癌の予後を判定する際に関連する１２群／組の分子マーカーからなる６つの分子サインを同定した。各分子サインは、複数の遺伝的マーカーからなり、それらマーカーの発現が、正常組織について高いまたは低ければ、それが生存または再発などの所与の結果の指標となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類乳癌の予後の判定方法であって、
（ａ）分子マーカーであるＡＭＦ、ＡＴＦ４、Ｃｙｒ６１、ＥＲ、マトリプターゼ２、ＭＥＴ、ＭＬＮ６４、ＭＭＰ７、ネクチン４、ＰＡＲ１Ａ、Ｐｓｏｒｉａｓｏｎ、Ｐｔｔｇ１、Ｒｈｏ−Ｃ、Ｓｃｏｔｉｎ、ＳＤＦ１、ＳＥＭＰ１、ＳＰＦ４５、ＳＳＴ１、ＳＴ１５、ＴＡＣＣ２、ＴＢＤ１０、ＴＣＦ２、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒ、ＺＯ−３をコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した前記個体の生存可能性が低いと結論づけることとを含む方法。
【請求項２】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるバシジン、ベータカテニン、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、カルパインラージ、ＣＤ４４、ＣＸ４３、サイクリンＤ２、ＥＨＭＳ、ＦＡＫ、ＦＡＰ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、アイソトポ３、ＪＡＫ１、ＬＯＸ１２、ＮＥＴ−２、ＰＡＲ１Ａ２、ＰＴＨｒＰ、Ｒｈｏ−Ｇ、Ｓ１００Ａ４、ＳＰＡＲＣ、ＴＣＦ３、ＶＥＣＡＤ、Ｖｉｌｉｐ、Ｗａｖｅ２のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるＡＲＰ２、Ａｔｆ−３、ＨｕＲ、ＭＥＮ１、パラセリン、ＰＴＰ−ＲＫラディキシンおよびＲＨＯ８／ｇｄｉＧ−Ｒａｔｉｏをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含み、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した個体の生存可能性が低いと結論づける、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるａＭＯＴ、Ａｔｆ−１、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＩＬ２２Ｒ、Ｒｏｃｋ２、Ｖｅｇ１のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳類乳癌の予後の判定方法であって、
（ａ）分子マーカーであるＡＡＭＰ、ＡＭＦＲ、Ｂｍｐ８、ＢＭＰ９、ベータカテニン、ＣＡＲ、Ｃｒｅｂ１２、ＤＲＩＭ、ＥＨＭＳ、エンドムスチン２、ＦＡＫ、ＦＡＰ、アイソトポ１、Ｋｉｓｓ１／ｃｋ１９、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＡＲ１Ａ、Ｐａｒ１Ａ２、ＰＬＣ−デルタ、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ、ＰＴＴＧ１、ＲｈｏＣ、Ｒｏｃｋ１、ＳＤＦ１、ＳＳＴ１、ＳＴ１５、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した前記個体の癌再発可能性が高いと結論づけることを含む方法。
【請求項６】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるアンジオテンシン２Ｒ１、ＡＴＦ４、Ｂｍｐ１０、ＣＡＳＭ、カセプシンＳ、ＣＸ４３、エラスターゼＰＭＮ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、ＨＩＮ、アイソトポ３、Ｋｉｓｓ１、ＬＯＸ１２、ＮＯＳ３、ＰＭＳＡ、Ｓ１００Ａ４、ＳＥＭＰ１、ＴＡＣＣ２、ユビキチン、ＷＩＳＰ２のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）の部分は、分子マーカーであるＢｍｐ３、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２４、ＪＡＫ１、ＰＴＰ−ＲＫ、Ｒｈｏ８／ＧｄｉＧ、Ｓｎａｉｌ、ＷＡＳＰをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含み、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した個体の癌再発可能性が高いと結論づける、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるＡＴＦ３、Ｂｍｐ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＥＮ１、パラセリンのうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類乳癌の予後の判定方法であって、
（ａ）分子マーカーであるＢＡＦ５７、ＢＮＤＦ、ＣＡＲ１、ＣＡＳＭ、カセプシン−Ｌ、Ｃｒｅｂ１／２、ＣＸＣＲ１０、ＤＲＩＭ、ＨＥＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ−１１、Ｋｉｓｓ１、ＭＫＫ１、ＰＭＮエラスターゼ、ＰＴＴＰ１、ＳＤＦ５、ＴＡＣＣ２、ユビキチン、ＶＩＰＲ１、ＶＵＤＰをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した前記個体が転移型の癌を有すると結論づけることを含む方法。
【請求項１０】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるアンジオモチン、ＢＭＰ７、サイクリンＤ１、ＤＮＡリガーゼ−１、ＩＧＦＢＰ７、ＬＹＶＥ１、ＮＥＴ２、ＲＨＯ８、ＳＲＢＣ、Ｓｔａｔｈ４、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＡｓｅ）−３、ビンクリン、ＷＡＶＥ２のうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるパラセリンをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含み、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）前記組織の試料を採取した前記個体が転移型の癌を有すると結論づける、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）の部分は、分子マーカーであるＡＬＣＡＭ、Ｅｐｌｉｎ、ＥＲベータ、Ｇｌｙｐｉｃ３、ＪＡＫ１、ＭＡＧＩ−１、ＰＥＤＦ、ＰＫＣ−イータ、Ｓｔａｔｈｌｉｎ、ＷＷＯＸのうちの少なくとも１つをコードする遺伝子の発現レベルを測定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌組織はヒト由来である、請求項１から１２のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
前記癌組織は女性由来である、請求項１から１３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
前記発現のレベルは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの存在を分析することにより決定される、請求項１から１４のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１６】
前記発現のレベルは、分子マーカーによってコードされるタンパク質に対しての分析によって決定される、請求項１から１５のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、関連タンパク質に結合し、該タンパク質を同定する物質を使用することを伴う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記物質は抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
部分（ａ）の実施前に、選択されたマーカーを増幅する、請求項１から１４のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２０】
前記マーカーはＰＣＲによって増幅されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
所与の分子マーカーの発現レベルは、対照試料を考慮して決定されるとともに、前記対照試料は、癌を有しない乳房組織の試料、癌が存在しない個体から採取した乳房組織の試料、または、正常な個体における各関連分子マーカーの発現の、認識されている標準のいずれかである、請求項１から２０のいずれか1つに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）請求項１〜２１の方法に記載される少なくとも１つの分子マーカーの組を検出する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記プローブの使用に関する試薬および説明書とを含むキット。
【請求項２３】
哺乳類の乳癌の予後を判定するキットであって、
（ａ）ＡＭＦ、ＡＴＦ４、Ｃｙｒ６１、ＥＲ、マトリプターゼ２、ＭＥＴ、ＭＬＮ６４、ＭＭＰ７、ネクチン４、ＰＡＲ１Ａ、Ｐｓｏｒｉａｓｏｎ、Ｐｔｔｇ１、Ｒｈｏ−Ｃ、Ｓｃｏｔｉｎ、ＳＤＦ１、ＳＥＭＰ１、ＳＰＦ４５、ＳＳＴ１、ＳＴ１５、ＴＡＣＣ２、ＴＢＤ１０、ＴＣＦ２、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒ、ＺＯ−３からなるマーカー組内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または測定方法を示す、試薬および説明書とを含むキット。
【請求項２４】
前記キットは、
（ａ）バシジン、ベータカテニン、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、カルパインラージ、ＣＤ４４、ＣＸ４３、サイクリンＤ２、ＥＨＭＳ、ＦＡＫ、ＦＡＰ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、アイソトポ３、ＪＡＫ１、ＬＯＸ１２、ＮＥＴ−２、ＰＡＲ１Ａ２、ＰＴＨｒＰ、Ｒｈｏ−Ｇ、Ｓ１００Ａ４、ＳＰＡＲＣ、ＴＣＦ３、ＶＥＣＡＤ、Ｖｉｌｉｐ、Ｗａｖｅ２からなるマーカー組内の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／またはＡＲＰ２、Ａｔｆ−３、ＨｕＲ、ＭＥＮ１、パラセリン、ＰＴＰ−ＲＫラディキシンおよびＲＨＯ８／ｇｄｉＧ−Ｒａｔｉｏからなるマーカー組内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／またはａＭＯＴ、Ａｔｆ−１、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＩＬ２２Ｒ、Ｒｏｃｋ２からなるマーカー組内の少なくとも１つからの少なくとも1つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定する試薬および説明書とを含むことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
哺乳類の乳癌の予後を判定するキットであって、
（ａ）ＡＭＦＲ、ＡＡＭＰ、ベータカテニン、Ｂｍｐ８、ＢＭＰ９、ＣＡＲ、Ｃｒｅｂ１２、ＤＲＩＭ、ＥＨＭＳ、エンドムスチン２、ＦＡＫ、ＦＡＰ、アイソトポ１、Ｋｉｓｓ１／ｃｋ１９、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＡＲ１Ａ、Ｐａｒ１Ａ２、ＰＬＣ−デルタ、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ、ＰＴＴＧ１、ＲｈｏＣ、Ｒｏｃｋ１、ＳＤＦ１、ＳＴ１５、ＳＳＴ１、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒからなるマーカー組内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または測定方法を示す、試薬および説明書とを含むキット。
【請求項２６】
前記キットは、
（ａ）アンジオテンシン２Ｒ１、ＡＴＦ４、Ｂｍｐ１０、ＣＡＳＭ、カセプシンＳ、ＣＸ４３、エラスターゼＰＭＮ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、ＨＩＮ、アイソトポ３、Ｋｉｓｓ１、ＬＯＸ１２、ＮＯＳ３、ＰＭＳＡ、Ｓ１００Ａ４、ＳＥＭＰ１、ＴＡＣＣ２、ユビキチン、ＷＩＳＰ２からなるマーカー組内の少なくとも１つの遺伝子による少なくとも１つの転写産物、および／またはＢｍｐ３、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２４、ＪＡＫ１、ＰＴＰ−ＲＫ、Ｒｈｏ８／ＧｄｉＧ、Ｓｎａｉｌ、およびＷＡＳＰからなるマーカー組内の各遺伝子による少なくとも１つの転写産物、および／またはＡＴＦ３、Ｂｍｐ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＥＮ１、パラセリンからなるマーカー組内の少なくとも1つからの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または測定方法を示す、試薬および説明書とをさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
哺乳類の乳癌の予後を判定するキットであって、
（ａ）ＢＡＦ５７、ＢＮＤＦ、ＣＡＲ１、ＣＡＳＭ、カセプシン−Ｌ、Ｃｒｅｂ１／２、ＣＸＣＲ１０、ＤＲＩＭ、ＨＥＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ−１１、Ｋｉｓｓ１、ＭＫＫ１、ＰＭＮエラスターゼ、ＰＴＴＰ１、ＳＤＦ５、ＴＡＣＣ２、ＶＩＰＲ１、ＶＵＤＰ、ユビキチンからなるマーカー組内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または測定方法を示す、試薬および説明書とを含むキット。
【請求項２８】
前記キットは、
（ａ）アンジオモチン、ＢＭＰ７、サイクリンＤ１、ＤＮＡリガーゼ−１、ＩＧＦＢＰ７、ＬＹＶＥ１、ＮＥＴ２、ＲＨＯ８、ＳＲＢＣ、Ｓｔａｔｈ４、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＡｓｅ）−３、ビンクリン、ＷＡＶＥ２からなるマーカー組内、および／またはパラセリンからなるマーカー組内の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／またはＡＬＣＡＭ、Ｅｐｌｉｎ、ＥＲベータ、Ｇｌｙｐｉｃ３、ＪＡＫ１、ＭＡＧＩ−１、ＰＥＤＦ、ＰＫＣ−イータ、Ｓｔａｔｈｌｉｎ、ＷＷＯＸからなるマーカー組内の少なくとも１つからの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または測定方法を示す、試薬および説明書とをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項２２〜２８に記載の分子サインを含む分子マーカー組を同定するための少なくとも１組のプローブからなるマイクロアレイ。
【請求項３０】
生存可能性および／または乳癌の再発および／または患者内の癌の転移性を判定するキットであって、
（ａ）請求項１〜２１に記載の分子マーカーを含む分子マーカーの組を同定するための少なくとも１組のプローブからなる少なくとも１つのマイクロアレイと、随意で、
（ｂ）癌を有しない個体または穏やかな予後を有する患者のいずれかにおける前記マーカーの発現レベルを示す内部標準において、同じ分子マーカーの組を同定するための複数のプローブからなる第２のマイクロアレイとを含むキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のマイクロアレイ。
【請求項３２】
請求項２２から２８に記載のプローブ組。
【請求項３３】
実質的に本願に記載される方法、キットまたは部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の予後診断のための方法およびキット、またはその一部に関する。特に、本方法は、乳癌患者の生存可能性および／または乳癌の治療中またはすでに治療を受けた患者における疾病の再発の可能性および／または癌の転移特性を示す遺伝子発現パターンを同定することを包含する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、英国、米国およびデンマークにおいて最も一般的に見られる女性の癌である。また、工業化された世界において、女性に影響を与える最も一般的な癌の形態でもある。乳癌の発生率は徐々に増加してきており、米国においては、癌による二番目に多い死亡原因ともなっている。実際のところ、１９９７年には、米国においては推定１８１，０００件の新しい報告がされており、毎年、４０，０００人が乳癌で死亡していると推定される。この状態に対抗するために行われてきた世界的な努力にも拘わらず、早期の検出と新しい治療法により生存率はここ２０〜３０年のあいだに辛うじて向上してきているが、乳癌の発生率には僅かな変化しか見られない。
【０００３】
殆どの乳癌について腫瘍発生機構はあまり知られていないが、女性を進行性乳癌にかかりやすくする要因は多く存在する。そうした要因としては、出産歴、月経状態、腫瘍の異型度、ＥＲ状態、腫瘍の大きさおよび診断および手術のときのリンパ節の障害が挙げられる。さらに、予後は、マンモグラフィまたは他のＸ線撮影法を用いて、様々な程度まで判定することができる。しかしながら、マンモグラムに危険を伴わないわけではなく、検査中に用いられる放射線のイオン化特性により、乳腫瘍が誘起されることもある。加えて、このような方法は費用が高く、また、技術者によって結果の解釈が異なることもある。たとえば、ある研究では、放射線技師のグループによって解釈された一連のマンモグラムの約３分の１において、大きな臨床的な意見の相違が認められた。さらに、多くの女性が、マンモグラムを受けることを痛い経験として感じている。
【０００４】
疾病の予後診断の臨床的実施は、その後に行うべき治療を決定することから、重要である。正確な予後診断により、癌専門医は、たとえば、ホルモン療法または化学療法のいずれを行った方がよいかを選んだり、癌の最も侵攻性の高い場合にのみ手術を勧めることができるようになる。
【０００５】
しかしながら、非常に早期の段階の疾病を示す患者 (patient)の数は増えてきているため、乳癌においては、早期診断が通常的な特徴となってきている。そのため、癌の結果を評価する従来の方法がより困難となってきており、患者の反応の良し悪しには、癌の種類だけではなく、治療のタイミングも鍵となることは、ますます明白になってきている。たとえば、多くの患者が、現在、しばしば毒性のある副作用を引き起こす不要な治療を受けていたり、癌が実際は予測よりも進んでいるにもかかわらず、温存治療の方針が示されていたりする。したがって、適切かつ正確な予後診断を早期に行うことが極めて肝要であると考えられる。
【０００６】
これまで、臨床情報だけに基づいた予後診断のための満足な予測セットは同定されていなかった。その結果、研究の方向性は、癌を診断および予後診断できることよりも、分子サインの考察に変わってきた。ＷＯ０２／１０３３２０は、その発現が臨床予後診断に関連づけられた何千もの遺伝的マーカーを開示しており、それらの遺伝マーカーは、予後の良い患者と予後の良くない患者とを見分けるために用いることができる。発現の判定方法には、患者から採取した組織の試験試料の発現パターンを、良好な予後を示す患者から採取した組織の試料の発現パターン、および既知の予後の良くない患者から採取した試料の発現パターンと比較することと、試験試料が、これらの試料のいずれに、より類似しているかを判定することとが含まれる。
【０００７】
この方法は、予後診断の伝統的な臨床方法よりも進歩したものではあるが、多くの欠点も有している。たとえば、何百もの遺伝子マーカーを解析するには相当の時間がかかり、本質的に実用的ではない。さらに、良好な予後マーカーのいくつかと不良な予後マーカーのいくつかを発現する試料が、一方または他方のいずれの選択肢の予後診断を与えるかが明確でない。このような方法の複雑さ故に、他方の群よりも一方の群に属する遺伝子を多く発現するために患者が間違った予後群に入れられてしまうという意味で不正確となるか、または、明確な答えを提供することができないことがある。前述したように、適切かつ有効な治療のためには、早期かつ正確な予後診断が極めて重要である。したがって、より簡単で、より明確な分子サインが必要であることは明らかである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、我々は、比較的容易に実施でき、効率的に実行でき、疾病の起こりそうな結果を正確に示す、所与の乳癌の予後を判定するための方法を開発した。我々の方法は、少ないが高い指示性を有し、したがって所与の癌の起こりうる結果を判定する際に特に正確なマーカー試料を使用する。さらに、我々の方法は、次の３つの要素に分割することができる。第１の要素は、乳癌の診察に来た個体の生存可能性を予測することであり、第２の要素は、乳癌の診察に来た個体における癌の再発の可能性を予測することであり、第３の要素は、癌の転移特性を予測することである。当業者には明らかであるように、第２の要素は、乳癌の診察に来た患者(patient)の無発症生存可能性を示し、第３の要素は、疾病の侵攻性を示す。まとめると、我々は、所与の乳癌の予後の判定するときに関連性を有する複数の分子サインを同定した。各分子サインは、その発現レベルが穏やかな予後（後述）の患者からの組織に関して高いか低いかのいずれかであり、所与の結果を示す、複数の遺伝的マーカーからなる。これに加えて、我々は、どの遺伝マーカーが所与の疾病の結果に対して最良の指標となるか、すなわち、分子サインの予測能力に最も寄与するかを同定するために、各分子サインについて分析した。このマーカーのサブセットは、正確な分子サインとして、まとめて知られる。
【０００９】
たとえば、高発現が低生存率と相関する２組の分子マーカーからなる第１の分子サインが提供され、第１の組は、本願においては、第１の一次分子サイン［組（Ａ）］（ＡＭＦ、ＡＴＦ４、Ｃｙｒ６１、ＥＲ、マトリプターゼ（Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）２、ＭＥＴ、ＭＬＮ６４、ＭＭＰ７、ネクチン（Ｎｅｃｔｉｎ）４、ＰＡＲ１Ａ、Ｐｓｏｒｉａｓｏｎ、Ｐｔｔｇ１、Ｒｈｏ−Ｃ、Ｓｃｏｔｉｎ、ＳＤＦ１、ＳＥＭＰ１、ＳＰＦ４５、ＳＳＴ１、ＳＴ１５、ＴＡＣＣ２、ＴＢＤ１０、ＴＣＦ２、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒ、ＺＯ−３）と総称される、低生存率の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第１の二次分子サイン［組（Ｂ）］（バシジン（Ｂａｓｉｇｉｎ）、ベータカテニン（Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）、ＢＭＰ１、ＢＭＰ１０、カルパイン・ラージ（Ｃａｌｐａｉｎ  ｌａｒｇｅ）、ＣＤ４４、ＣＸ４３、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ２、ＥＨＭＳ、ＦＡＫ、ＦＡＰ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、アイソトポ（Ｉｓｏｔｏｐｏ）３、ＪＡＫ１、ＬＯＸ１２、ＮＥＴ−２、ＰＡＲ１Ａ２、ＰＴＨｒＰ、Ｒｈｏ−Ｇ、Ｓ１００Ａ４、ＳＰＡＲＣ、ＴＣＦ３、ＶＥＣＡＤ、Ｖｉｌｉｐ、Ｗａｖｅ２）と総称される分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１０】
上記および下記を参照願う。マーカーは、ｗｗｗ．ＮＣＢＩ．ＬＭ．ＮＩＨ．ｇｏｖデータベース上で完全な素性が入手できる命名済タンパク質が参照されるか、または当業者に周知である。
【００１１】
本文中で用いる高または低発現とは、穏やかな予後を示すと推定される患者、すなわち標準予後指数であるノッティンガム予後指数（ＮＰＩ）が３．４〜５．４である患者における同一マーカーの発現レベルのことをいうが、ここで、ＮＰＩ＝０．２×腫瘍サイズ＋腫瘍グレード＋結節状態であり、ＮＰＩ（低）は、３．４未満であり、８６％の患者が１５年間生き延び、ＮＰＩ（中）は、３．４〜５．４であり、４２％の患者が１５年間生き延び、ＮＰＩ（高）は、５．４を超えるものであり、１３％の患者しか１５年間生き延びられない。
【００１２】
さらに、低発現が低生存率と相関する２組の分子マーカーからなる第２の分子サインが提供され、その第１の組は、本願においては、第２の一次分子サイン［組（Ｃ）］（ＡＲＰ２、Ａｔｆ−３、ＨｕＲ、ＭＥＮ１、パラセリン（Ｐａｒａｃｅｌｌｉｎ）、ＰＴＰ−ＲＫラディキシン（Ｒａｄｉｘｉｎ）、ＲＨＯ８／ｇｄｉＧ−Ｒａｔｉｏ）と総称される低生存率の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第２の二次分子サイン［組（Ｄ）］（ａＭＯＴ、Ａｔｆ−１、Ｃｌａｕｄｉｎ−１、ＩＬ２２Ｒ、Ｒｏｃｋ２、Ｖｅｇ１）と総称される分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１３】
さらに、高発現が低い癌無発症生存率と相関する２組の分子マーカーからなる第３の分子サインが提供され、その第１の組は、本願においては、第３の一次分子サイン［組（Ｅ）］（ＡＡＭＰ、ＡＭＦＲ、Ｂｍｐ８、ＢＭＰ９、ベータカテニン（Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ）、ＣＡＲ、Ｃｒｅｂ１２、ＤＲＩＭ、ＥＨＭＳ、エンドムスチン（Ｅｎｄｏｍｕｓｃｉｎ）２、ＦＡＫ、ＦＡＰ、アイソトポ（Ｉｓｏｔｏｐｏ）１、Ｋｉｓｓ１／ｃｋ１９、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＡＲ１Ａ、Ｐａｒ１Ａ２、ＰＬＣ−デルタ（ｄｅｌｔａ）、Ｐｓｏｒｉａｓｉｎ、ＰＴＴＧ１、ＲｈｏＣ、Ｒｏｃｋ１、ＳＤＦ１、ＳＳＴ１、ＳＴ１５、ＴＥＭ６、ＴＥＭ７Ｒ）と総称される、低い癌無発症生存率の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第３の二次分子サイン［組（Ｆ）］（アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）２Ｒ１、ＡＴＦ４、Ｂｍｐ１０、ＣＡＳＭ、カセプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）Ｓ、ＣＸ４３、エラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ）ＰＭＮ、ＧＩＲＫ、ＨＡＶＲ１、ＨＩＮ、アイソトポ（Ｉｓｏｔｏｐｏ）３、Ｋｉｓｓ１、ＬＯＸ１２、ＮＯＳ３、ＰＭＳＡ、Ｓ１００Ａ４、ＳＥＭＰ１、ＴＡＣＣ２、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＷＩＳＰ２）と総称される分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１４】
さらに、低発現が低い癌無発症生存率と相関する２組の分子マーカーからなる第４の分子サインが提供され、その第１の組は、本願においては、第４の一次分子サイン［組（Ｇ）］（Ｂｍｐ３、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２４、ＪＡＫ１、ＰＴＰ−ＲＫ、Ｒｈｏ８／ＧｄｉＧ、Ｓｎａｉｌ、ＷＡＳＰ）と総称される、低い癌無発症生存率の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第４の二次分子サイン［組（Ｈ）］（ＡＴＦ３、Ｂｍｐ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＭＥＮ１、パラセリン（Ｐａｒａｃｅｌｌｉｎ））と総称される、分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１５】
さらに、高発現が転移性癌と相関する２組の分子マーカーからなる第５の分子サインが提供され、その第１の組は、本願においては、第５の一次分子サイン［組（Ｉ）］（ＢＡＦ５７、ＢＮＤＦ、ＣＡＲ１、ＣＡＳＭ、カセプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）−Ｌ、Ｃｒｅｂ１／２、ＣＸＣＲ１０、ＤＲＩＭ、ＨＥＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ−１１、Ｋｉｓｓ１、ＭＫＫ１、ＰＭＮエラスターゼ（ｅｌａｓｔａｓｅ）、ＰＴＴＰ１、ＳＤＦ５、ＴＡＣＣ２、ユビキチン（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ＶＩＰＲ１、ＶＵＤＰ）と総称される、転移性癌の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第５の二次分子サイン［組（Ｊ）］（アンジオモチン（Ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ）、ＢＭＰ７、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）Ｄ１、ＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）−１、ＩＧＦＢＰ７、ＬＹＶＥ１、ＮＥＴ２、ＲＨＯ８、ＳＲＢＣ、Ｓｔａｔｈ４、トランスグルタミナーゼ（ＴＧＡｓｅ）−３、ビンクリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、ＷＡＶＥ２）と総称される、分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１６】
最後に、さらに、低発現が転移性癌と相関する２組の分子マーカーからなる第６の分子サインが提供され、第１の組は、本願においては、第６の一次分子サイン［組（Ｋ）］（パラセリン（Ｐａｒａｃｅｌｌｉｎ））と総称される、転移性癌の最も統計的に有意な指標である分子マーカーを含み、第２の組は、前記のものに加えて、第６の二次分子サイン［組（Ｌ）］（ＡＬＣＡＭ、Ｅｐｌｉｎ、ＥＲベータ（ｂｅｔａ）、Ｇｌｙｐｉｃ３、ＪＡＫ１、ＭＡＧＩ−１、ＰＥＤＦ、ＰＫＣ−イータ（ｅｔａ）、Ｓｔａｔｈｌｉｎ、ＷＷＯＸ）と総称される分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む。
【００１７】
したがって、我々は、乳癌の予後診断における用途を有する、１２組の（６組の一次と６組の二次）分子マーカーからなる少なくとも６つの分子サインを決定した。これらのサインの解明には、１０年以上の研究が伴い、この間に我々は数百の乳癌組織の試料とさらに数百単位の遺伝的分子マーカーを体系的かつ注意深く調べてきた。しかしながら、この大きな労力を要する作業を終えたところで、我々は驚くべきことに、所与の乳癌組織の試料に対する正確な予後診断を行うためには、少数の遺伝子しか調べる必要はないことを見いだした。さらに驚くべきことに、我々の分子サインの予測結果に最も寄与する分子マーカーを同定することにより、この数をさらに減らすことができた。たとえば、転移性癌に関連する分子サインの場合、２０または２１遺伝子しか調べる必要がない。このことは、我々の方法が迅速な適用性をもち、臨床状況において迅速かつ常套的に実施可能であることを意味する。実際、我々が提案するのは、我々の方法が乳癌患者の標準的な治療形態の一部を成すことにより、関係する癌専門医が早期段階において特定の疾病の結果を判断し、それに応じた治療を行えるようにすることである。このように、たとえば、低生存率または結節転移の指標となるサインを示す個体の場合（すなわち、癌が広がっている可能性のある）、迅速かつ攻撃的な形の治療を処方する必要がある。同様に、個体が低い無病生存率の指標となるサインを示す場合、したがって、疾病の再発の可能性がより高い場合には、より頻繁な追跡訪問と検査が必要となる場合もある。反対に、個体が、転移が無いことの指標となるサインを示す場合には、癌専門医は、侵襲性と攻撃性のより少ない治療を処方して、患者を、不要な苦痛と望ましくない副作用から救うようにすることができる。したがって、我々の方法は、個体が各々の遺伝的構成に合わせられた治療を受けられるようにするだけでなく、必要な状態にある者だけに攻撃的な治療を処方することにより、治療中の患者の生活の質を改善することもできる。
【００１８】
したがって、本発明の１つの態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ａ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体の生存可能性が低いと結論づけることを含む。
【００１９】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が高い発現レベルを有するかどうかを判定するために、組（Ｂ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、および／または当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｃ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、および／または、当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｄ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、上記発現パターンが確認された場合に、当該個体の生存可能性が低いと結論づけることをさらに含む。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ｃ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体の生存可能性が低いと結論づけることを含む。
【００２１】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が抑制発現されているか否かを判定するために、組（Ｄ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体の生存可能性が低いと結論づけることを、付加的にまたは代替的に含む。
【００２２】
本発明の本態様のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が過剰発現されているか否かを判定するために、組（Ａ）内の遺伝子および／または組（Ｂ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体の生存可能性が低いと結論づけることをさらに含む。
【００２３】
本発明のさらなる態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ｅ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体の癌再発可能性が高いと結論づけることを含む。
【００２４】
本文中で用いる癌再発という用語は、胸部内での局所的または遠隔部位における癌の再発、または転移を含む。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が高い発現レベルを有するかどうかを判定するために、組（Ｆ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、および／または当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｇ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および／または、当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｈ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、上記発現パターンが確認された場合に、当該個体の癌再発可能性が高いと結論づけることをさらに含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ｇ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体の癌再発可能性が高いと結論づけることを含む。
【００２７】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が抑制発現されているか否かを判定するために、組（Ｈ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体の癌再発可能性が高いと結論づけることを、付加的にまたは代替的に含む。
【００２８】
本発明の本態様のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が過剰発現されているか否かを判定するために、組（Ｅ）内の遺伝子および／または組（Ｆ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体の癌再発可能性が高いと結論づけることをさらに含む。
【００２９】
本発明のさらなる態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ｉ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて高レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体が転移型の癌を有すると結論づけることを含む。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が高い発現レベルを有するかどうかを判定するために、組（Ｊ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、および／または当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｋ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、および／または、当該遺伝子が抑制発現されているかを判定するために、組（Ｌ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、上記発現パターンが確認された場合に、当該個体が転移型の癌を有すると結論づけることをさらに含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様において、哺乳類乳癌の予後の判定方法が提供され、該方法は、
（ａ）組（Ｋ）内の分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定するために、個体からの乳癌組織の試料を検査することと、
（ｂ）該マーカーについて低レベルの発現が測定される場合、
（ｃ）組織の試料を採取した個体が転移型の癌を有すると結論づけることを含む。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が抑制発現されているか否かを判定するために、組（Ｌ）内の少なくとも１つの分子マーカーをコードする遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体が転移型の癌を有すると結論づけることを付加的にまたは代替的に含む。
【００３３】
本発明の本態様のさらなる好ましい実施形態において、前記方法は、その（ａ）の部分において、当該遺伝子が過剰発現されているか否かを判定するために、組（Ｉ）内の遺伝子および／または組（Ｊ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを測定することと、されている場合、当該個体が転移型の癌を有すると結論づけることをさらに含む。
【００３４】
本発明のさらなる態様において、前記すべての方法の任意の組み合わせが提供される。
【００３５】
本発明の上記方法のそれぞれにおいて、分析は、理想的にはヒト乳癌組織、さらに好ましくは女性のヒト乳癌組織に対して行われる。
【００３６】
本発明の上記方法のそれぞれにおいて、分析される組織の試料は、理想的にはＲＮＡの存在、好ましくは全ＲＮＡ、さらにより好ましくはｍＲＮＡの量について分析される。ＲＮＡ含量を測定するために利用できる技術は周知であり、実際のところ、臨床診断分野の当業者によって常套的に実施されているものであることが当業者には明らかである。
【００３７】
本発明の代替実施形態において、本方法は、分子マーカーのそれぞれによってコードされるタンパク質を分析することを包含し、したがって、典型的には、限定されるものではないが、当該タンパク質に結合する物質を使用して該タンパク質を同定することを包含する。一般的な物質は抗体であり、特に理想的には、有益には適切なタグによって標識され、結合した抗体の存在を判定できるようにしたモノクローナル抗体である。タンパク質同定のための分析の技術は、当業者によって周知であり、実際のところ、臨床診断の分野の従事者によって日常的に使用されているものである。
【００３８】
さらに、本発明の方法は、選択されたマーカーをその同定前に増幅することを含んでもよく、この場合、典型的には、増幅は、該マーカーの存在と、増幅度を考慮した量とを決定する前に該マーカーを増幅させるために、関心のある分子マーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ反応によって行われる。
【００３９】
本発明を行うさらなる好ましい方法において、所与の分子マーカーの発現レベルは、対照試料を考慮して決定され、対照試料は、癌を有さない乳房組織の試料であるか、ここで同定されるように穏やかな予後を示す患者に由来する試料である。より理想的には、乳房組織のこの試料は、この疾病を示さない個体から採取される。あるいは、対照は、正常な個体における各関連遺伝子の発現の、認識されている標準である。
【００４０】
遺伝子発現のレベルは、Ｊｉａｎｇら２００３ａまたはＰａｒｒおよびＪｉａｎｇ、２００４に開示される方法を用いて、リアルタイム定量的ＰＣＲによって測定してもよい。
【００４１】
生存可能性は、患者が今後１０年間に生存するであろう可能性を意味する。再発可能性は、癌が１０年以内に再発する可能性を意味する。転移型癌とは、その癌が元の器官または組織から、体の他の部位に広がるであろうことを意味する。
【００４２】
本発明のさらなる態様によれば、前記方法の任意の１つ以上を実施するキットが提供され、前記キットは、
（ａ）前記方法において記載される分子マーカーの少なくとも１組を検出する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記プローブの使用に関する試薬および説明書とを含む。
【００４３】
本発明のさらなる好ましい態様において、哺乳類の乳癌の予後を判定するキットが提供され、該キットは、
（ａ）組（Ａ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とを含む。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態において、前記キットは、
（ａ）組（Ｃ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／または組（Ｂ）または（Ｄ）内の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とをさらに含む。
【００４５】
本発明のさらなる好ましい態様において、哺乳類の乳癌の予後を判定するキットが提供され、該キットは、
（ａ）組（Ｅ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とを含む。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態において、前記キットは、
（ａ）組（Ｇ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／または、組（Ｆ）または（Ｈ）内の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とをさらに含む。
【００４７】
本発明のさらなる好ましい態様において、哺乳類の乳癌の予後を判定するキットが提供され、該キットは、
（ａ）組（Ｉ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とを含む。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態において、前記キットは、
（ａ）組（Ｋ）内の各遺伝子からの少なくとも１つの転写産物、および／または、組（Ｊ）または（Ｌ）内の少なくとも１つの遺伝子からの少なくとも１つの転写産物を同定する複数のプローブと、
（ｂ）随意で、前記各遺伝子の発現レベルを測定するか、または決定方法を示す試薬および説明書とをさらに含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様によれば、前記分子マーカーを同定するために、前記プローブの組の任意の選択された組み合わせを含むキットが提供される。
【００５０】
本発明のさらなる態様によれば、前記分子マーカーの組の任意の１つ以上の発現レベルを同定するために、前記プローブの組の任意の１つ以上を含むマイクロアレイが提供される。
【００５１】
本発明の別の態様において、生存可能性、および／または、乳癌の再発、および／または、患者内の癌の転移性を判定するキットが提供され、該キットは、
（ａ）上記方法に記載の分子マーカーの少なくとも１組を同定するための複数のプローブを含む少なくとも１つのマイクロアレイと、随意で、
（ｂ）前記マーカーの正常な発現レベルを示す内部標準において、同じ分子マーカーの組を同定するための複数のプローブを含む第２のマイクロアレイとを含む。
【００５２】
本発明は、上述のようなマイクロアレイまたはプローブ組をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明は、表１〜３および図１〜４を参照して、以下の実施例によって説明する。
【００５４】
組織と細胞
乳房腫瘍組織および関連する正常組織は、外科手術後に迅速に回収し、使用まで冷凍した。これは、地元の倫理委員会の承認の下に、主に１９９１〜１９９４年の間に行い、限られた数のものについては、１９９５〜１９９６年の間に行った。本解析は、２００４年６月における１０年間の追跡の中央値(median)に基づいている。本研究では、乳癌組織（ｎ＝１２０）と正常なバックグラウンド組織（ｎ＝３２）とを用いた。ヒト乳癌細胞系列ＭＣＦ−７および  ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１、ヒト線維芽細胞系列ＭＲＣ−５は、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ, Salisbury, England）から購入した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、ＴＣＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Oxford, England）より購入した。外科手術の最中および後の病状についての情報、臨床情報、患者の臨床結果は、外科手術の直後または追跡のときに得た。
【００５５】
組織処理
乳房組織は凍結切片化した。切片は、常套的組織学に供する部分と、免疫組織化学に供する部分と、ＲＮＡの調製に供する部分との３つの部分に分割した。
【００５６】
細胞および組織からのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
組織の凍結切片は、５〜１０μｍの厚みに裁断し、免疫組織化学および常套的組織学のために保存した（Ｊｉａｎｇ et al, ２００３ａ）。さらに１５〜２０枚の切片を手持ち式ホモジナイザーを用いて氷冷ＲＮＡ抽出溶液中でホモジナイズした。ＲＮＡの濃度は、ＵＶ分光光度計を用いて決定した。逆転写は、ＡｂＧｅｎｅ（商標）によって供給されるアンカードオリゴｄｔプライマー付のＲＴキットを用いて、１μｇの全ＲＮＡを用いて、９６ウェルプレート中で行った。ｃＤＮＡの質は、β−アクチンプライマーを用いて確認した。ＲＮＡ抽出キットおよびＲＴキットは、ＡｂＧｅｎｅ  Ｌｔｄ（Surry, England, UK）より得た。ＰＣＲプライマーは、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（California, USA）を用いて設計し、合成はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｌｔｄ（Paisley, Scotland, UK）で行われた。分子生物学グレードアガロースおよびＤＮＡラダーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより得た。常套的なＰＣＲおよび定量的ＰＣＲ用のマスターミックスはＡｂＧｅｎｅより得た。
【００５７】
遺伝的マーカーの定量分析
上記調製したｃＤＮＡのＣＣＮファミリーメンバーの転写産物のレベルは、以前に報告された方法（Ｊｉａｎｇ et al, ２００３ａおよび２００３ｂ）に修正を加えたＡｍｐｌｉｆｕｏｒ（商標）技術（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ et al, １９９７）に基づいて、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて決定した。すなわち、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（バージョン２、California, USA）を用いてＰＣＲプライマー対を設計した。プライマーの１つに対して、（我々の研究室では常套的にアンチセンスプライマーに対して）、ユニバーサルＺプローブ（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ et al, １９９７）（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｉｎｃ．, England, UK）に相補的なＺ配列（５’ａｃｔｇａａｃｃｔｇａｃｃｇｔａｃａ’３）として知られる付加的配列を加えた。βアクチン検出用のＴａｑｍａｎ（商標）検出キットは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（商標）より購入した。
【００５８】
反応は、ホットスタートＱ−マスターミックス（Ａｂｇｅｎｅ）、１０ｐｍｏｌの特異的順方向プライマー、１ｐｍｏｌのＺ配列を有した逆方向プライマー、１０ｐｍｏｌのＦＡＭ−標識プローブ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、および約５０ｎｇ（ＲＴ反応における出発ＲＮＡから計算）ＲＮＡからのｃＤＮＡを用いて行った。反応は、９６反応のリアルタイム検出を可能にする光学ユニットを備えたＩｃｙｃｌｅｒＩＱ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標））を用いて、９４℃１２時間、９４℃１５秒間と５５℃４０秒間と７２℃２０秒間からなるサイクルを５０サイクル（Ｊｉａｎｇ et al, ２００３ｂ、２００３ｃ、ＰａｒｒおよびＪｉａｎｇ、２００４）の条件で行った。転写産物のレベルは、試料を用いて同時に増幅させた内部標準（Ｊｉａｎｇ et al, ２００３ａ）から得た。結果は、等量のＲＮＡに基づいた転写産物の濃度、または標的／ＣＫ１９比の二通りの方法で示す。
【００５９】
分子の適時免役組織化学的染色
乳房腫瘍およびバックグラウンド組織の凍結切片は、クリオスタットを用いて６μｍの厚みに裁断した（Ｊｉａｎｇ et al, ２００３ｃ）。切片をスーパーフロストプラス顕微鏡スライド上に載せ、風乾し、５０％アセトンと５０％メタノールの混合物中で固定した。次に切片を「Ｏｐｔｉｍａｘ」洗浄バッファ中に５〜１０分間放置して再水和させた。切片を０．６％ＢＳＡブロッキング溶液中で２０分間インキュベートし、一次抗体を用いて検証した。よく洗浄した後、切片を二次ビオチン化抗体（マルチリンクブタ抗ヤギ／マウス／ウサギ免疫グロブリン、Ｄａｋｏ  Ｉｎｃ．）中で３０分間インキュベートした。洗浄に続いて、Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を切片に塗布し、よく洗浄した。Diaminobenzidine chromogen（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を切片に加えて、５分間暗中でインキュベートした。その後切片をＧｉｌｌ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ中で対比染色して、キシレン中で洗浄する前にメタノールのグレードを上げながら再水和させて、カバースリップを被せた。それぞれのタンパク質の細胞質染色は、我々が以前に開示（Ｄａｖｉｅｓ et al, ２０００、Ｋｉｎｇ et al,２００４）したＯｐｔｉｍａｓ６．０ソフトウェアを用いて定量化し、本願では相対染色強度として示す。
【００６０】
統計的解析
統計的解析は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵテストとＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストとを用いて行った。生存率解析は、カプランマイヤー生存曲線と単変量解析（ＳＰＳＳ１１）を用いて行った。
【００６１】
結果
スクリーニング対象分子
我々は４５３の分子について、１０年間の追跡を含む完全な臨床情報に対しての定量化を行った。生存率および疾病の再発の発生に対する解析に続いて、我々は３つのサイン、すなわち生存分子サインおよび発症予測分子サインおよび転移性分子サインを開発した。
【００６２】
生存の分子サイン
表１に示すように、５１個の分子が低生存率との正相関を有し、１４個の分子が低生存率との逆相関を有することが判明した。図１は、本願で「良好なサイン」（表１の左列の分子に高い発現が見られず、表１の右列の分子に抑制発現が見られない）と称されるものを有する個体の９２．２％が、１４８．９ヶ月まで生き延びると予測されるが、本願で「不良なサイン」（表１の左列の分子に高い発現が見られ、表１の右列の分子に抑制発現が見られる）と呼ぶものを有する個体の８．３％しか、４０ヶ月まで生き延びられないと予測されることを示す。この結果は、ｐ値が０．００００１未満であり、統計的に有意である。
【００６３】
カプランマイヤー生存曲線と単変量解析を用いて、統計的精度に最も寄与する分子を同定することにより、我々は分子サインを絞り込んだ（表１において＊で識別される）。我々は、低生存率と正の相関性を有する２５個と、低生存率と負の相関性を有する８個との合計３３個の一次分子マーカーが、統計的有意性の大部分を占めることを発見した。図２は、第１の一次および第２の一次分子サインを用いた予測生存曲線を示しており、良好なサインを有する個体の９３．２％が、１４９．６９ヶ月まで生き延びると予測され、不良なサインを有する個体のわずか１４．４％しか、５２．３ヶ月まで生き延びないと予測される（ｐ＜０．０００００１）。
【００６４】
無発症予測分子サイン
表２に示すように、４８個の分子が発症の発生（再発および転移）との正相関を有し、１３個の分子が発症の発生との逆相関を有することが判明した。図３は、本願で「良好なサイン」（表２の左列の分子に高い発現が見られず、表２の右列の分子に抑制発現が見られない）と称されるものを有する個体のうちの９４．５％が、１５０．４ヶ月まで疾病の再発がない（すなわち、無疾病生存）と予測されるが、一方で、本願で「不良なサイン」（表２の左列の分子に高い発現が見られ、表２の右列の分子に抑制発現が見られる）と称されるものを有する個体のうち３４．５％だけしか、７２．４ヶ月まで無疾病で生きられないと予測されることを示す（ｐ＜０．００００１）。
【００６５】
上記生存率サインと同様に、我々は本サインについても絞り込みを行い、再発と正の相関性を有する２８個と、再発と負の相関性を有する８個との合計３６個の一次分子マーカー（表２において＊で識別）が、統計的有意性の大部分を占めることを発見した。図４は、本願で「良好なサイン」と称されるものを有する個体のうちの９１．７％が、１４８．４ヶ月まで疾病の再発がないと予測されるが、本願で「不良なサイン」と称されるものを有する個体のわずか５．８８％しか、４４．２ヶ月まで無疾病で生きられないと予測されることを示す。（ｐ＜０．０００００１）。
結節転移の分子サイン
表３に示すように、３７個の分子が結節転移との正相関を有し、１０個の分子が結節転移との逆相関を有することが判明した。これらの３７個の分子の組み合わせでは、不良なサインを示した（すなわち、表３の左列の分子に高い発現が見られ、表３の右列の分子に抑制発現が見られる）腫瘍の９１％が、結節転移に進展した。さらに、良好なサインを示した（すなわち、表３の左列の分子に高い発現が見られず、表３の右列の分子に抑制発現が見られない）腫瘍の８８．９％に、一切の結節転移が認められなかった。（ｐ＝０．０００２４）。
【００６６】
上述のように、我々は組み合わせを絞り込むことによりこのサインを修正し、結節転移と正の相関性を有する２０組と、結節転移と負の相関性を有する１組との合計２１組の一次遺伝子（表３において＊で識別）が、よく予測していたことを発見した。不良なサインを有する腫瘍の８９．１％が結節転移を有し、良好なサインを有する腫瘍の８６．８％が結節転移を全く有しなかった（ｐ＝０．００００２５）。
【００６７】
参考文献
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Ｊｉａｎｇら、２００３ａ：Ｊｉａｎｇ  ＷＧ，Ｗａｔｋｉｎｓ  Ｇ，Ｌａｎｅ  Ｊ，Ｄｏｕｇｌａｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ａ，Ｃｕｎｎｉｃｋ  ＧＨ，Ｍｏｋｂｅｌ  Ｍ，Ｍａｎｓｅｌ  ＲＥ．「Ｒｈｏファミリーの予後診断価値および乳癌におけるｒｈｏ−ＧＤＩ（Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｒｈｏ  ｆａｍｉｌｙ  ａｎｄ  ａｎｄ  ｒｈｏ−ＧＤＩｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，９（１７），６４３２〜６４４０頁。
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Ｊｉａｎｇら、２００３ｃ：Ｊｉａｎｇ  ＷＧ，Ｇｒｉｍｓｈａｗ  Ｄ，Ｌａｎｅ  Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ  ＴＡ，Ｐａｒｒ  Ｃ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｇ，Ｌａｔｅｒｒａ  Ｊ，およびＭａｎｓｅｌ  ＲＥ．「ｃＭＥＴへのレトロウィルスハンマーヘッド導入遺伝子および線維芽細胞によって誘導される乳房腫瘍のＨＧＦ／ＳＦ阻害増殖（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃＭＥＴ  ａｎｄ  ＨＧＦ／ＳＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒ，ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，９，４２７４〜４２８１頁。
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【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、表１中のすべてのマーカーに対するカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図２】図２は、表１において「＊」で示したマーカーに対するカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図３】図３は、表２中のすべてのマーカーに対するカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図４】図４は、表２において「＊」で示したマーカーに対するカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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