(57)【要約】  本発明は、血栓塞栓障害の治療のためのMstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングの使用およびMstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングのモジュレーターをスクリーニングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓塞栓障害の治療のための医薬の製造のための、MstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングの使用。
【請求項２】
MstタンパクがMst 1および／またはMst 2から選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
MstタンパクがヒトMstタンパクである、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
ヒトMst 1タンパクのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列であり、そしてヒトMst 2タンパクのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
ヒトMst 1のヌクレオチド配列コーディングが配列番号２のヌクレオチド配列であり、そしてヒトMst 2のヌクレオチド配列コーディングが配列番号４のヌクレオチド配列である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
血栓塞栓障害の治療のための医薬としてのMstタンパクモジュレーターの発見のための、MstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングの使用。
【請求項７】
MstタンパクがMst 1および／またはMst 2から選択される、請求項６記載の使用。
【請求項８】
MstタンパクがヒトMstタンパクである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
ヒトMst 1タンパクのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列であり、そしてヒトMst 2タンパクのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列である、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ヒトMst 1のヌクレオチド配列コーディングが配列番号２のヌクレオチド配列であり、そしてヒトMst 2のヌクレオチド配列コーディングが配列番号４のヌクレオチド配列である、請求項６記載の使用。
【請求項１１】
MstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングを試験化合物と接触させ、そしてMstタンパクに対する試験化合物の影響を測定または検出する、請求項６〜１０のいずれか１項記載の使用。
【請求項１２】
血栓塞栓障害が血小板の活性化および／または凝集により引き起こされる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
血栓塞栓障害は心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠症候群、冠動脈疾患、再狭窄、卒中、一過性脳虚血発作、肺塞栓、左心室機能障害、心血管および／または脳血管疾患の患者における臨床的血管合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化および／または血管インターベンションに対する同時治療、特に発作、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化および／または再狭窄から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
(ａ) 血栓症−関連アッセイ、キナーゼアッセイおよび／またはレポーターに基づく細胞系アッセイから選択されるアッセイにおいて、MstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングを試験化合物と接触させる工程、および
(ｂ) Mstタンパクに対する試験化合物の影響を測定または検出する工程
を含む、MstタンパクのモジュレーターまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングをスクリーニングする方法。
【請求項１５】
血栓症−関連アッセイが血小板凝集アッセイである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
(ｃ) 試験化合物の存在および不存在におけるアッセイ中の変化を比較することにより、血栓塞栓障害に対する活性を有する試験化合物を選択する工程
をさらに含む、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
MstタンパクがMst 1および／またはMst 2から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
MstタンパクがヒトMstタンパクである、請求項１４〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
ヒトMst 1タンパクのアミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列であり、そしてヒトMst 2タンパクのアミノ酸配列が配列番号３のアミノ酸配列である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ヒトMst 1のヌクレオチド配列コーディングが配列番号２のヌクレオチド配列であり、そしてヒトMst 2のヌクレオチド配列コーディングが配列番号４のヌクレオチド配列である、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
試験化合物が化合物ライブラリーの形で提供される、請求項１４〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
方法がアレイで実施される、請求項１４〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
方法が自動化システムで実施される、請求項１４〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
方法が試験化合物のハイスループットスクリーニングの方法である、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
検出された試験化合物が血小板活性化および／または血小板凝集の阻害剤である、請求項１４〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
検出された試験化合物が血栓形成および／または血液凝固の危険を低減させる、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項２７】
(ａ) 請求項１４〜２６のいずれか１項記載の方法を実施する工程、
(ｂ) 血栓塞栓障害の治療に適当な検出された試験化合物を単離する工程、および
(ｃ) 検出された試験化合物を１またはそれ以上の製薬上許容される担体または補助物質と共に製剤化する工程
を含む、血栓塞栓障害の治療のための医薬の製造方法。
【請求項２８】
血栓塞栓障害が血小板の活性化および／または凝集により引き起こされる、請求項１４〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
血栓塞栓障害が心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠症候群、冠動脈疾患、再狭窄、発作、一過性脳虚血発作、肺塞栓、左心室機能障害、心血管および／または脳血管疾患の患者における臨床的血管合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化および／または血管インターベンションに対する同時治療、特に発作、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化および／または再狭窄から選択される、請求項１４〜２８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓塞栓障害の治療のためのMstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングの使用、およびMstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングのモジュレーターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アスピリンからチクロピジンおよびクロピドロゲル(clopidrogel)にわたるいくつかの抗血小板療剤が導入されており、そしてそれらの利点が十分立証されている。しかし、これら全ての種々の治療は、血栓塞栓障害の治療に付加的な利点を加えるが、それらはしばしば望ましくない副作用とも関連し、そしてさらに組み合わせた治療の有効性もまだ不十分である。したがって、血栓塞栓障害の治療のための新規なアプローチが緊急に必要とされている。
【０００３】
STE20−関連キナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼの進化論的に保存されたファミリーを構成する。このキナーゼファミリーの創始のキナーゼであるSte20pは、発芽酵母のフェロモン応答経路に関与するMEKキナーゼキナーゼキナーゼ(MAP4K)である(Leberer, E他 (1992) EMBO J. 11, 4815−4824)。近年にいたって、Ste20の多数の哺乳動物および酵母のホモログが同定された。それらは２つのクラスすなわち：Cdc42および／またはRac1 (p21−活性化キナーゼまたはPAKs)を結合するもの、およびこの様式では規定されないように思われるもの (胚中心キナーゼまたはGCKs) (Dan, C他 (2001) J. Biol. Chem. 276,
32115−32121を参照)に分けられる。Mst1は後者のクラスの一員であること、すなわち：キナーゼドメイン全体が酵母Ste20および哺乳動物Pak酵素のホモログであることが示されているが、p21 GTPアーゼ−結合ドメインを含まず、キナーゼドメインの外側にSte20またはPakとは少しの顕著なホモロジーも共有しない。
【０００４】
ヒトMst1 (Mammalian Sterile Twenty−様)は、セリン／スレオニンキナーゼの触媒ドメインを増幅するために設計された変性プライマーを用いた、ヒトリンパ球cDNAライブラリーのPCRスクリーニングによりもともとは単離された (Creasy, C. L他 (1995) J. Biol. Chem. 270, 21695−21700; Creasy, C. L他 (1995) Gene 167, 303−306)。Mst1の近いホモログのMst2が、同じ著者によりそのすぐ後に同定された。１つの初期の研究において、両方、Mst1およびMst2は、ストレス条件およびアポトーシス薬剤に反応して活性化されることが示され、したがって代わりにストレス応答キナーゼ(Kinase Responsive to Stress)(Krs) １および２と名前が付けられた。
【０００５】
最近の刊行物は、アポトーシスにおけるMst1およびMst2の役割を示唆する。Mst1およびMst2の両方は、アポトーシス刺激、例えばCD95/Fasのライゲーションまたはスタウロスポリン(staurosporine)による処置に応答したカスパーゼ(caspase)−仲介タンパク分解を行う(Graves, J. D他 (1998) EMBO J 17, 2224−2234; Lee, K. K他 (1998) Oncogene 16, 3029−3037)。しかし、Mst1は、２つの生化学的に異なる触媒断片を生成する２つの異なるカスパーゼ−切断部位を有する一方、Mst2についてただ１つのカスパーゼ−切断部位が報告されている。Mst1およびMst2のＣ−末端ドメインの負の調節効果に起因して、カスパーゼ−切断によるそれらの除去により、インビトロおよびインビボで、生じた形態のキナーゼ活性を活性化し、そして細胞転位(cellular translocation)を引き起こす(Creasy, C. L他 (1996) J. Biol. Chem. 271, 21049−21053; Deng, Y他 (2003) J. Biol. Chem. 278, 11760−11767; Graves, J. D他 (2001) J. Biol. Chem. 276, 14909−14915; Graves, J. D他 (1998) 前出; Lee, K. K他 (1998) 前出)。さらに、Mst1の過剰発現は、ヒトBリンパ腫細胞においてアポトーシスの特徴を示す形態的変化を誘導する (Graves, J. D他 (2001), 前出)。マウスおよび線虫におけるMSTホモログのcDNAクローニングは、カスパーゼ−切断配列が進化論的に保存されていることを示す。
【０００６】
Mst1の過剰発現は、JNKおよびp38 MAPキナーゼ経路を、それぞれMKK4／MKK7およびMKK3／MKK6により活性化する(Graves, J. D他 (2001) 前出; Ura, S他 (2001)Genes Cells 6,
519−530)。Mst1の発現はカスパーゼ−３活性化を生じるので、Mst1はカスパーゼの標的であるばかりでなく、カスパーゼのアクチベータでもある。JNKのドミナントネガティブ突然変異体の共発現は、カスパーゼ活性化に加えてMst1誘導性形態変化を阻害したことから、このカスパーゼ活性化およびアポトーシス変化はJNKを介して生じる(Ura, S他 (2001) 前出)。最近の論文(Khokhlatchev, A他 (2002) Curr. Biol. 12, 253−265)において、細胞生存に影響する新規のRasエフェクター経路の存在に関する強力な裏づけが示された。このモデルに続いて、活性化されたRasはNoreおよびMst1からなる複合体に結合することができ、そして後に下流のシグナル経路に効果をもたらす(Khokhlatchev, A他 (2002) 前出)。しかし、Mst1の可能性のある生理学上の直接的な基質は、現在まで同定されていない。Mst1は血小板の前駆細胞である巨核球において発現される(Sun, S他 (1999) J. Cell Biochem. 76, 44−60)。巨核球ではそれらの成熟過程の一部として核内分裂細胞周期(endomitotic cell cycle)が起こる。倍数体形成のみならず、一組の遺伝子、例えば血小板因子4 (PF4)、アセチルコリンエステラーゼ、およびグリコ−プロテインIIb (GPIIb)が成熟巨核球において発現する。巨核球の分化はc−Mpl受容体リガンドとしてサイトカイントロンボポイエチン(TPO)により促進される。TPOはJanusキナーゼファミリーメンバーJAK2およびTyk2、Shc、Stat−タンパク３および５を介して、および細胞外シグナル調節キナーゼ２を介して、DNAレベル調節に対してシグナル伝達する。Mst1発現およびMst1キナーゼ活性は、培養骨髄細胞において、およびマウス巨核球細胞系Y10／L8057において、Mplリガンドによりアップレギュレートされる。さらに、Mst1の誘導発現は種々の分化マーカーの発現を増強し、そしてPMAに応答して倍数体形成を増大させた(Sun, S他 (1999) 前出)。
【０００７】
Mst2がRaf−1シグナル伝達経路に関与し：血清飢餓において、Mst2が、未トランスフェクション細胞に加えてFlag−tagged Raf−1でトランスフェクトされたCOS−1細胞においてRaf−1と共沈することが最近報告された(O'Neill, E他 (2004) Science 306, 2267−2270)。Mst2は、活性がホモ二量体化およびリン酸転移を介してアポトーシス誘導剤により増大するキナーゼである(Deng, Y他 (2003) 前出; Lee, K. K他 (1998) 前出)。O'Neillおよび同僚は、これらの過程の両方がRaf−1キナーゼ活性によらないが、おそらくまだ同定されていないMst2ホスファターゼの補充による機構を介して、Raf−1により阻害されることを示した(O'Neill, E他 (2004) 前出)。
【０００８】
プロテオミクスアプローチにより、本発明者らはMst1およびMst2がヒト血小板において発現されることを見出した。これらの発見は他の研究者によっても確認されていること、すなわち：古典的2D−ゲルをベースとする血小板細胞抽出物のプロテオミクス分析を用いることにより、O'Neillらは血小板におけるMst2の発現を確認している(O'Neill, E. (2002) Proteomics 2, 288−305)。さらに、Kris Gevaertおよび同僚は、組み合わせた分別ダイアゴナルクロマトグラフィー(Combined Fractional Diagonal Chromatography）(Gevaert, K他 (2003) Nat. Biotechnol. 21, 566−569)を用いて、血小板においてMst1およびMst2リンタンパクを同定した(Gevaert, K他 「Novel Strategies and Applications for Non−gel Proteomics」, Proteomic Forum Muenchen 2003 − International Meeting on Proteome Analysis, Sept. 14−17, 2003, Munich, Germany)。しかし、血小板においてMst1および／またはMst2を同定したが、これらの研究によっては、血小板におけるMstキナーゼの潜在的機能に関するデータは全く得られなかった。したがって、現在まで、血小板シグナル伝達および血小板活性化におけるMstファミリーキナーゼの潜在的役割は説明されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、Mstタンパクが血小板活性化および凝集を最終的にもたらすシグナルトランスダクション事象に関与するという発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、血栓塞栓性疾患の治療のため、特に血栓塞栓性疾患の治療のための医薬の製造のための、Mstタンパク、特にMst 1および／またはMst 2、またはMstタンパク、特にMst 1またはMst 2のヌクレオチド配列コーディングの使用に関する。好ましくは、Mstタンパク、特にMst 1および／またはMst 2 タンパクはヒトMstタンパクである。一般的に、ヒトMst1およびヒトMst2はアミノ酸レベルにおいて77.6％の同一性を有することが知られている。ゼブラダニオ（Zebrafish）ゲノムは、Mst1およびMst2の両方を示し、それぞれ76.8％および88.8％のアミノ酸同一性を有するただ一つのホモログを含む。ヒトおよびラットMST2配列は、アミノ酸レベルで96.7％の同一性の百分率を有する。
【００１１】
好ましい実施形態において、ヒトMst 1タンパクまたはそのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のヌクレオチド配列により特徴づけられ、そしてヒトMst 2タンパクまたはそのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３のアミノ酸配列または配列番号４のヌクレオチド配列により特徴づけられる。
【００１２】
本発明において、用語Mstタンパクは一般的に、生物学的に活性なMst突然変異体のみならず、任意の天然に存在するMstタンパクを意味する。天然に存在するMstタンパクは、生物学的に活性なスプライス変異体のみならず、様々な種、例えばゼブラダニオ、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物のMstタンパクを含む。もっとも好ましいMstタンパクはすでに上で述べられている。
【００１３】
用語「生物学的に活性なMst突然変異体」は、Mstタンパクに由来し、そして生物学的活性、すなわちキナーゼ活性を保持するタンパクを意味する。したがって、この場合は、用語「生物学的に活性な」は任意の一般的に公知のキナーゼアッセイ、例えば本明細書中に記載のアッセイ、特に実施例に記載されるATP消費アッセイで測定され得るMstキナーゼ活性を意味する。手短いに言えば、ATP消費アッセイはATPおよびMg2+−イオンまたはMn2+−イオンを含むキナーゼ緩衝溶液および試験されるキナーゼ、ここではMst突然変異体を含むインビトロキナーゼアッセイを意味する。このATP消費および、したがって、キナーゼ活性は、一般的に生体発光により測定される。
【００１４】
特に、用語「生物学的に活性なMst突然変異体」は、１またはそれ以上のアミノ酸において天然に存在するMst配列とは異なるが、そのキナーゼ活性を保持するアミノ酸配列を意味する。上記突然変異体は１またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失において野生型ポリペプチドとは異なる。好ましくは、半保存的、より好ましくは保存的アミノ酸置換である。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸中に、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸中に、酸性残基を有するアミノ酸中に、アミド誘導体中に、塩基性残基を有するアミノ酸中に、または芳香族残基を有するアミノ酸中にある。典型的な半保存的および保存的置換は以下である:
【表１】
2008533978.tif 000002
【００１５】
さらに、A、F、H、I、L、M、P、V、WまたはYからCへの変化は、新しいシステインが遊離のチオールとして残る場合、半保存的である。さらに、当業者は、立体的に必要な位置のグリシンは置換されず、そしてＰはα−ヘリカルまたはβ−シート構造を有するタンパクの部分には導入されないことを理解するであろう。
【００１６】
一般的に、突然変異体は一次構造(アミノ酸配列)で異なるが、天然に存在するタンパクと比較して、二次または三次構造において、またはその機能(キナーゼ活性)において、有意に異なっていてもまたは異なっていなくてもよい。いかなる場合でも、突然変異体は、少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも95％およびもっとも好ましくは少なくとも99％の野生型Mst 1タンパクまたはMst 2タンパクに対する同一性を示す。
【００１７】
点突然変異による生物学的に活性なMst1突然変異体の例は以下である:
DEMD326Sにおいてプロテアーゼ、すなわちカスパーゼ切断に抵抗性のD326N、TMTD349Gにおいてプロテアーゼ切断に抵抗性のD349E、およびダブルプロテアーゼ−耐性型であるD326N−D349E (Graves J. D他 (2001), 前出)。
【００１８】
D326N、S327AおよびS327Eのみならず、MST活性化ループの突然変異体であるT183E、T175E、T175A、T177EおよびT177A (Glantschnig, H他 (2202) J. Biol. Chem., 277, 42987−42996)。
【００１９】
MST 活性化ループの突然変異体でもあるT175AおよびT177A、T120Aのみならず、ダイマー欠損変異体であるL444Pならびに二重変異体S438A−T440A (Praskova, M他 (2004) Biochem. J., 381, 453−462)。
【００２０】
点変異を伴う生物学的に活性なMst2突然変異体の例は以下である：
T117AおよびT384A  (Deng, Y他 (2003), 前出)。
【００２１】
この突然変異体もまたそのキナーゼ活性に十分なMstタンパクの部分であり得る。この部分は、Mst1について少なくとも30アミノ酸、好ましくは少なくとも100アミノ酸、より好ましくは少なくとも300アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも450アミノ酸、およびもっとも好ましくは少なくとも482アミノ酸ならびにMst2について少なくとも486アミノ酸を含む。アナログのこの部分は野生型ポリペプチド部分とは上記の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失で異なり得る。一実施形態において、Mstタンパクまたはその生物学的に活性なMst突然変異体は、別の分子、例えばタンパクおよび／またはマーカー、例えばグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)に融合され得る。
【００２２】
生物学的に活性なMst1断片の例は以下である:
Mst1の２つの触媒活性カスパーゼ切断産物であるΔ327−487およびΔ350−487(Graves,
J. D他 (2001), 前出; Lee, K. K他 (2001) J. Biol. Chem. 276, 19276−19285; Glantschnig, H他 (2002), 前出)、ならびに短縮Mst1型アミノ酸1−455、1−430、1−360および1−330、欠失Δ331−360およびΔ331−394 (Creasy, C. L他 (1996), 前出)、ならびに図１２に示されるMst1キナーゼドメイン。
【００２３】
生物学的に活性なMst2 断片の例は以下である:
Mst2の触媒活性カスパーゼ切断産物であるΔ323−491 (Deng, Y他 (2003), 前出)。
【００２４】
さらに、本発明は、血栓塞栓障害の治療のための医薬としての、Mstタンパクモジュレーター、特に阻害剤の発見のための、Mstタンパク、特にMst 1および／またはMst 2、またはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングの使用に関する。好ましくは、Mstタンパク、特にMst 1および／またはMst 2タンパクは、先でも特定されるように、ヒトMstタンパクである。
【００２５】
一般的に、上述のMstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングを試験化合物と接触させ、そしてMstタンパクに対する試験化合物の影響を測定または検出する。
【００２６】
本発明において、用語「Mstタンパクモジュレーター」は、Mstタンパクの生物学的活性の調節分子 (「モジュレーター」)を意味し、特に阻害または活性化分子 (「阻害剤」または「アクチベータ」)、特に本発明のアッセイにしたがって同定可能なMstタンパクの阻害剤を意味する。一般的に、阻害剤は、好ましくは上で詳細に説明されるMstタンパクの少なくとも１つ、特にヒトMst 1タンパクの活性または発現を部分的または完全にブロックするか、活性化を減少、防止、遅延させるか、不活性化するか、減感するか、またはダウンレギュレートするために、例えば結合する化合物である。一般的に、アクチベータは、例えば、活性化を増大、開始、活発化、増強するか、好ましくは上で詳細に説明されるMstタンパクの少なくとも１つ、特にヒトMst 1タンパクの活性または発現を増感、アゴナイズ(agonize)、またはアップレギュレートする化合物である。このようなモジュレーターは天然に存在するかまたは合成の、リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、ペプチド、環状ペプチド、核酸、抗体、アンチセンス分子、リボザイム、有機小分子等を含む。
【００２７】
好ましい本発明の実施形態において、上述の血栓塞栓障害は血小板の活性化および／または凝集により引き起こされる。本発明において、血栓塞栓障害は心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠症候群、冠動脈疾患、再狭窄、卒中、一過性脳虚血発作、肺塞栓、左心室機能障害、心血管および／または脳血管疾患の患者における臨床的血管合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化および／または血管インターベンションに対する同時治療、特に卒中、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化および／または再狭窄から選択される。
【００２８】
本発明はまた、MstタンパクのモジュレーターまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングをスクリーニングする方法に関し、ここで該方法は以下の工程を含む:
(ａ) 血栓症−関連アッセイ、キナーゼアッセイおよび／またはレポーターに基づく細胞系アッセイから選択されるアッセイにおいて、MstタンパクまたはMstタンパクのヌクレオチド配列コーディングを試験化合物と接触させる工程、および
(ｂ) Mstタンパクの活性に対する試験化合物の影響を測定または検出する工程。
【００２９】
１つの好ましい実施形態において、血栓症−関連アッセイは血小板凝集アッセイであり、ここで血小板凝集は誘導因子、例えばADP、トロンビン、TRAP、コラーゲン、コンバルキシン(convulxin)、カルシウムイオノフォアおよび／またはリストセチンにより誘導される。
【００３０】
特に、先におよび実施例において記載されるインビトロキナーゼアッセイ、例えばATP消費アッセイを使用することが好ましい。好ましいアッセイ条件は、MnCl2の存在下、特に２mM MnCl2の濃度である。最適バッファーは例えば、pH 7.5の40mM Hepesである。
【００３１】
別の好ましいアッセイは均質蛍光偏光(FP)−ベースアッセイである。FP−べースアッセイは、溶液中の蛍光基質ペプチドを励起する偏光を用いるアッセイである。これらの蛍光ペプチドは溶液中で遊離し、そしてタンブル(tumble)し、放射光を生じて消極する。基質ペプチドがより大きい分子、しかしながら、例えば(P)−Tyrに結合する場合、そのタンブリング速度は大きく減少し、そして放出された光は高度に偏向したままである。キナーゼアッセイについて、一般的に２つの選択がある:
(ａ) 蛍光ホスホペプチドトレーサを(Ｐ)−特異的抗体に結合させる。リン酸化生成物は高から低への分極の変化を生じる抗体からの蛍光ホスホペプチドと競合する。
(ｂ) リン酸化基質ペプチドは高から低への分極の変化を生じるホスホ特異的抗体に結合する。
【００３２】
また、リン酸化生成物への蛍光ペプチド基質の変換を測定するため、マイクロ流体チップを用いるオフチップインキュベーション移動度シフトアッセイが好ましい。このアッセイにおいて、マイクロタイタープレートからの反応混合物を、チップ上に毛細管を介してスリップさせ、ここでペプチド基質およびリン酸化生成物を電気泳動により分離し、そしてレーザー誘導性蛍光を介して検出する。これにより、蛍光シグナルの痕跡が反応の程度を示す。このようなアッセイは、例えば、Mst2のLabChip(R)アッセイという名称によりCaliper LifeSciences, Hopkinton, MA, USAから市販される。
【００３３】
二次スクリーニングに好ましい別のアッセイはレポーターベースの細胞系アッセイであり、ここで天然に存在するかまたは突然変異体Mst1遺伝子の過剰発現後、活性化または不活性化内因性経路の混乱の影響が、下流のレポーター遺伝子の遺伝子発現の影響を測定することにより検出され得る。このようなレポーター遺伝子は、例えば、NFκB, AP1,またはp53のような転写因子により誘導されるプロモーターエレメントの制御下のルシフェラーゼであり得る。レポーター遺伝子およびＭst1は、細胞系、例えばHelaまたはHEK293細胞において共発現し得る。好ましくは、細胞はマルチウェル試験プレートのウェル上に播種される。類似の細胞ベースアッセイの例は、Hill, S. J他 (2001) Curr. Opin. Pharmacol.,1, 526−532 and Hexdall, L他 (2001) Biotechniques, 1134−8, 1140に記載されている。最も頻繁に使用されるレポーター遺伝子の概要および検出方法がBronstein, I他 (1994) Anal. Biochem., 219, 169−181で見出され得る。
【００３４】
上記キナーゼアッセイに加え、次の異種および同種アッセイもまた、MstタンパクまたはMst突然変異体のキナーゼ活性の測定のために使用され得る:
この異種アッセイは例えば、ELISA (酵素結合免疫吸着アッセイ)、DELFIA (解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ)、SPA (シンチレーション近接アッセイ)およびフラッシュプレートアッセイを包含する。
【００３５】
ELISA (酵素結合免疫吸着アッセイ)−べースアッセイは種々の会社により提供される。このアッセイは、キナーゼ、例えばMstによりリン酸化され得るランダムペプチドが使用される。キナーゼ含有試料は、通常、例えばATPおよび必要なカチオンを含む反応緩衝液中で希釈され、次いでプレートウェルに添加される。反応は混合物を単に除去することにより停止される。その後、プレートは洗浄される。反応は、例えばビオチニル化基質をキナーゼに添加することにより開始される。反応後、特異的抗体を添加される。試料は通常、予めブロックされたタンパク−Ｇプレートに移され、そして洗浄後、例えばストレプトアビジン−HRPが添加される。その後、未結合ストレプトアビジン−HRP (ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ)を除去し、ペルオキシダーゼ呈色反応をペルオキシダーゼ基質の添加により開始し、そして光学密度は適当な濃度計で測定される。
【００３６】
DELFIA (解離促進ランタニド蛍光免疫アッセイ)−ベースアッセイは固相アッセイである。この抗体は通常、ユウロピウムまたは別のランタニドで標識され、そしてユウロピウム蛍光は、未結合ユウロピウム−標識抗体を洗い流した後、検出される。
【００３７】
SPA (シンチレーション近接アッセイ)およびフラッシュプレートアッセイは、通常放射標識された基質を捕捉するためにビオチン／アビジン相互作用を利用する。一般的に、反応混合物はキナーゼ、ビオチニル化ペプチド基質およびγ−[P33]ATPを含む。反応後、ビオチニル化ペプチドはストレプトアビジンで捕捉される。SPA検出において、ストレプトアビジンはシンチラントを含むビーズ上に結合されるが、一方フラッシュプレート検出において、ストレプトアビジンはシンチラントを含むマイクロプレートのウェルの内部に結合される。一旦固定されると、放射標識基質は光の放射を刺激するのに十分シンチラントに接近する。
【００３８】
同種アッセイは例えばTR−FRET (時間分解蛍光共鳴エネルギー転移)アッセイ、すでに上に記載したFP (蛍光偏光)アッセイ、ALPHA (化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセイ)、EFC (酵素断片相補)アッセイを包含する。
【００３９】
TR−FRET (時間分解蛍光共鳴エネルギー転移)−ベースアッセイは、ユウロピウムとAPCとの間の蛍光共鳴エネルギー転移、修飾されたアロフィコシアニンまたはCy3／Cy5またはCy5／Cy7のようなオーバーラップスペクトルを伴う他の色素 (Schobel, U他 (1999) Bioconjugate Chem. 10, 1107−1114)を通常利用するアッセイである。例えば337nmの光によるEuropiumの励起後、この分子は620nmで蛍光を発光する。しかし、フルオロフォアがAPCに十分接近する場合、ユウロピウムはその励起エネルギーをAPCに移し、これは665nmで蛍光を発する。このキナーゼ基質は通常ビオチン標識基質である。キナーゼ反応後、ユウロピウム−標識−(Ｐ)−特異的抗体は、ストレプトアビジン−APCと共に添加される。このリン酸化ペプチドがユウロピウム−標識抗体およびストレプトアビジン−APCを密接に接触させる。APCのユウロピウムfluorophoreへの密接な近接は、APC蛍光のためにユウロピウム蛍光の消光を生じる(FRET)。
【００４０】
ALPHA (増幅発光近接ホモジニアス)−ベースアッセイは、リン酸化ペプチドによって近接するようになるドナーとアクセプタービーズ間の一重項酸素の転移に基づくアッセイである。680nmでの励起によって、ドナービーズ中のフォトセンシタイザーは周囲酸素を一重項状態の酸素に変換し、これが200nmの距離に拡散する。アクセプタービーズ中の化学発光基は、エネルギーをビーズ内の蛍光アクセプターに移し、次いでこれはおよそ600nmで発光する。
【００４１】
EFC (酵素断片捕捉)−ベースアッセイまたは同等のアッセイは、特に化合物のハイスループットスクリーニングのために使用され得る。EFCアッセイは２つの断片 − 酵素アクセプター(EA)および酵素ドナー(ED)からなる操作されたβ−ガラクトシダーゼ酵素に基づく。断片が分離されている場合、β−ガラクトシダーゼ活性はないが、断片を一緒にする場合、それらは結合（相補）し、活性酵素を形成する。このEFCアッセイはED−検体複合体を利用し、ここでこの検体は特異的な結合タンパク、例えば抗体または受容体により認識され得る。特異的結合タンパクの不存在下において、ED−検体複合体はEAと相補することができ、活性β−ガラクトシダーゼを形成し、陽性発光シグナルを生じる。ED−検体複合体が特異的結合タンパクと結合する場合、EAとの相補が妨げられ、そしてシグナルは生じない。遊離の検体が（サンプル中）提供される場合、特異的結合タンパクに結合するためにED−検体複合体と競合する。遊離検体はEAとの相補性のためにED−検体複合体を放出し、試料中に存在する遊離の検体の量に依存してシグナルを生じる。
【００４２】
好ましい実施形態において、上記アッセイは試験化合物の存在および不存在におけるアッセイ中の変化を比較することにより、血栓塞栓障害に対する活性を有する試験化合物を選択するさらに別の工程を含む。
【００４３】
すでに上記のとおり、Mstタンパク、特にMst 1および／またはMst 2タンパクはヒトMstタンパクである。
【００４４】
一般的に、試験化合物は化合物ライブラリーの形態で提供される。化合物ライブラリーのスクリーニングについて、ハイスループットアッセイの使用が好ましく、これは当業者に公知であるか、または商業的に利用可能である。本発明によれば、用語「化合物ライブラリー」は化学合成された分子および天然生成物またはコンビナトリアル化学ライブラリーを含む複数ソースのいずれかから集められた複数の化合物を意味する。有利に、本発明の方法はアレイでおよび／または自動化システム、例えば自動化プレイティングおよび自動化液体運搬系であって、例えばマイクロ流体工学、すなわちチャンネルになった構造を使用したもので実施される。
【００４５】
好ましくは、検出される試験化合物は血小板活性化および／または血小板凝集の阻害剤であり、特に検出される試験化合物は血栓形成および／または血液凝固の危険を低減させる。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、血栓塞栓障害の治療のための医薬の製造方法に関し、ここでこの方法は以下の工程を含む。
(ａ) 上記方法を実施する工程、
(ｂ) 血栓塞栓障害の治療に適当な検出された試験化合物を単離する工程、および
(ｃ) 検出された試験化合物を１またはそれ以上の製薬上許容される担体または補助物質と共に製剤化する工程。
【００４７】
好ましくは、上記血栓塞栓障害は血小板の活性化および／または凝集により生じ、そして特に上記血栓塞栓障害から選択される。
【００４８】
医薬の製造のために、製薬上活性な化合物またはその製薬上許容される塩は、製薬上活性な化合物と共に所望の特性を提供するために組み合わされた製薬上許容される担体または補助物質のような成分の混合物から一般的になる医薬剤形である。
【００４９】
一般的に、製剤は少なくとも１つの適当な製薬上許容される担体または補助物質を含む。上記物質の例は、脱塩水、等張性食塩水、リンゲル溶液、バッファ、有機または無機酸および塩基ならびにそれらの塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、プロピレングリコールのようなグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル、ブドウ糖、蔗糖およびラクトースのような糖、トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉のような澱粉、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドのような可溶化剤および乳化剤、落花生類油、綿実油、トウモロコシ油、大豆油、ヒマシ油のような油脂、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルのような合成脂肪酸エステル、ゼラチン、デキストラン、セルロースおよびその誘導体のようなポリマーアジュバント（adjuvans)、アルブミン、有機溶媒、クエン酸塩および尿素のような錯化剤、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンＡのような安定化剤、ベンジルアルコールのような防腐剤、亜硫酸ナトリウムのような酸化防止剤、ワックスおよびEDTAのような安定化剤である。着色剤、放出剤（releasing agents）、コーティング剤、甘味料、風味剤および香料、保存料ならびに酸化防止剤もまた、組成物中にあってよい。生理学的緩衝溶液は、好ましくは、約6.0−8.0のpH、特に約6.8−7.8のpH、特に約7.4のpH、および／または約200−400ミリオスモル／リッターの、好ましくは約290−310ミリオスモル／リッターのオスモル濃度を有する。医薬のpHは適当な有機または無機緩衝液を使用して、例えば、好ましくはリン酸緩衝液、トリス緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES緩衝液 ([4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはMOPS緩衝液 (3−モルホリノ−1−プロパンスルホン酸)を使用して、一般的に調整される。一般的に、それぞれの緩衝液の選択は、所望の緩衝液モル濃度に依存する。リン酸緩衝液は適当な、例えば注射および輸液溶液に好適なものである。医薬ならびに適当な製薬上許容される担体または補助物質を製剤化する方法は、当業者に周知である。製薬上許容される担体および補助物質は、一般的な剤形および同定された化合物にしたがって選択される（a. o. chosen）。
【００５０】
医薬組成物は、例えば経口、鼻腔、非経口または局所投与のために製造され得る。非経口としては、皮下、皮内、筋内、静脈内または腹腔内投与が挙げられる。
【００５１】
医薬は種々の剤形、例えば経口投与のための固形剤形、例えばカプセル、タブレット、錠剤、粉剤および顆粒剤、経口投与のための液体剤形、例えば製薬上許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル、注射用製剤、例えば滅菌注射用水性または油性懸濁液、および局所または経皮的投与のための剤形、例えば軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤またはパッチとして製剤化され得る。
【００５２】
任意の特定の患者にとって特定の治療的に有効な用量レベルは、種々の因子、例えば特定される化合物の活性、剤形、患者の年齢、体重および性別、治療期間、および医療分野で周知の同様の因子に依存する。
【００５３】
ヒトまたは他の哺乳動物に、単回投与または分割量で投与される本発明の化合物の合計の日用量は、例えば約0.01〜約100mg／kg体重またはより好ましくは約50〜約75mg／kg体重の量であり得る。単回投与組成物は日用量を構成する上記量またはその約数分を含み得る。一般的に、本発明による治療計画は、単回投与または分割量での１日あたりの本発明の化合物約10mg〜約1000mgの、上記治療の必要な患者への投与を含む。
【００５４】
以下の図、表、配列および実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を説明する。
図１はリン酸化タンパクの濃縮された画分のゲル分析を示す。
レーンＡ: 静止血小板; 
レーンＢ: トロンビン−刺激血小板;
矢印はMstホモログがLC−MS/MS同定により見出された位置を示す。バンドＡおよびＢにおいて、Sok1が検出され、一方Mst1およびMst2のペプチドは上方および下方のバンドＣにおいて同定された(表１も参照)。
【００５５】
図２は表１に列挙されたMst1/2特異的ペプチドAGNILLNTEGHAKのMS/MSスペクトルの実施例を示す;
【００５６】
図３は個々のドナーからの精巣およびヒト血小板の抽出物中のMst1の発現を示す。
レーンＡ: 精巣; 
レーンＢ: 静止血小板; 
レーンＣ: トロンビン−活性化血小板;
30μgの総タンパクに対応する精巣およびヒト血小板の抽出物をSDS−PAGEにより分離し、そしてタンパクをウェスタンブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。Mst1を特異的抗体を用いることにより検出した。
【００５７】
図４はヒト血小板および精巣の抽出物中のMst2の発現を示す。
レーンＡ: 精巣; 
レーンＢ: 静止血小板; 
レーンＣ: トロンビン−活性化血小板;
30μgの総タンパクに対応する精巣およびヒト血小板の抽出物をSDS−PAGEにより分離し、そしてタンパクをウェスタンブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。Mst2を特異的抗体を用いることにより検出した。
【００５８】
図５は種々のヒト組織の抽出物中のMst1の発現を示す。血小板、脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、骨格筋、皮膚、精巣および胸腺からの30μgの総タンパクをSDS−PAGEにより分離し、そしてタンパクをウェスタンブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。Mst1を特異的抗体を用いることにより検出した。
【００５９】
図６は種々のヒト組織の抽出物中のMst2の発現を示す。血小板、脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、骨格筋、皮膚、精巣および胸腺からの30μgの総タンパクをSDS−PAGEにより分離し、そしてタンパクをウェスタンブロッティングによりニトロセルロース膜に移した。Mst2を特異的抗体を用いることにより検出した。
【００６０】
図７はインビボトランスジェニックゼブラフィッシュ血栓症アッセイの結果を要約し、そしてBC048033 (Mst1/Mst2)のノックダウンがADP−誘導性血小板凝集に影響することを示す。したがって、BC048033 (Mst1/Mst2)はゼブラフィッシュにおける血栓症に重要である。
このアッセイは、グリーンさんご礁色（green reef coral）の蛍光タンパクで血小板を特異的に標識するZygogenが独占所有するZ−TagTM技術を用いる、Zygogenにより製造されたトランスジェニック血小板−特異的蛍光ゼブラフィッシュ系列を利用する。アンチセンスモルホリンの無作為化、盲検化された試料を、一細胞期のホモ接合型Z3胚に注入した。全ての試料を等量(４nL)でZ3受精卵に注入し、ここでコントロールは0.2％フェノールレッドであり、GPIIbは1.7 ng, P2Y12であり、ADP−受容体は1.7ngであり、DAT (ドーパミントランスポーター)は1.7ngであり、そしてMst1/2は16.6ngであった。胚を28℃インキュベータに置いた。６dpf (受精後の日数)に、発生した幼生の心臓腔にADP (約90pmol)を注入した。幼生は、血小板の運動の有無のいずれかとして記録された。このデータをプールし、そして平均化した。少なくとも６個の独立実験において、少なくとも60個の幼生を各条件について分析した。各条件を、ADPで処理した偽薬（mock）を注入された幼生と比較した。統計的有意性(*＝ｐ＜0.01, **＝ｐ＜0.001)を、DATを除くコントロールに関して全ての試料について観察した。
【００６１】
図８は、リストセチン−刺激CD−血小板のFACS分析: GFP (「Mst1」)またはGFP (「GFP (コントロール)」)のみに融合したドミナントネガティブMst1突然変異体 Mst1K59Rのいずれかを発現する、組み換えレトロウイルス感染CD−血小板のFACS測定の例を示す。基底値に対する平均蛍光値の相対的増大(％)を示す。この図はCD41、CD62P (Ｐ−セレクチン)、およびCD40Lそれぞれのアゴニスト依存表面発現を示す。この図は、標準偏差を用い、巨核球の４つの独立した単離からのCD−血小板を用いた12の独立した実験による結果を示す。*ｐ＜0.05。
【００６２】
図９はトロンビンにより誘導された凝集の元々の記録を示す。0.5 U／mL トロンビンに応答する、GFP (「DN−変異体」)またはGFPコントロール(「GFP」)のみに融合したドミナントネガティブMst1突然変異体 Mst1K59Rのいずれかを発現する、組み換えレトロウイルス感染CD−血小板の代表的凝集追跡。
【００６３】
図１０は、異なる緩衝液条件におけるGST−Mst1キナーゼアッセイを示す。GST−コントロールと比較して、ATP消費として測定されるGST−Mst1の最も高いキナーゼ活性を、２mM MnCl2の存在下で得た。
【００６４】
図１１は、MST1キナーゼ活性におけるスタウロスポリンのＳ字状用量応答曲線を示す。各用量の効果を、３つの試料で試験した。スタウロスポリンは、MST1キナーゼ活性に起因して、インビトロアッセイにおいて、ATP消費を完全に阻害し得る。ベストフィット値から得たEC50は608.1pMであった。
【００６５】
図１２は、配列番号１、ヒトMst 1のアミノ酸配列を示し、ここで太字で、Mst 1キナーゼドメインを示す。下線を引かれたアミノ酸はカスパーゼ切断部位を示し、そして数字はMst1キナーゼ活性を排除しない点変異の例を示す。
配列の記載
配列番号１はヒトMst 1のアミノ酸配列を示す(SwissprotエントリーQ13043);
配列番号２ はヒトMst 1についてのヌクレオチド配列コーディングを示す(GenbankエントリーNM#006282);
配列番号３はヒトMst 2のアミノ酸配列(SwissprotエントリーQ13188)を示す;
配列番号４はヒトMst 2のヌクレオチド配列コーディング(GenbankエントリーNM#006281)を示す;
配列番号５はヒトドミナント−ネガティブMst1: Mst1K59Rを示す。
配列番号６はゼブラフィッシュのMst1 & Mst2ホモログを示す (NCBIエントリーAAH48033; BC048033に対応するヌクレオチド配列)
配列番号７−１０は表１に示されたSOK−1およびMst−特異的ペプチドを示す。
【００６６】
【表２】
2008533978.tif 000003
【００６７】
種々のヒト組織中のヒトMst1 mRNAおよびMst2 mRNAの発現パターン
Mst1およびMst2 mRNAを特異的プライマーを用いて、定量RT−PCR (Taqman)により検出した。
【表３】
2008533978.tif 000004
【実施例】
【００６８】
材料および方法
試薬：
HEPES (pH7.9)、MgCl2、KCl、EDTA、スクロース、グリセロール、デオキシコール酸ナトリウム、NP−40、およびプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む緩衝液中で用意される組織ホモジェネートは、「BioCat GmbH, Heidelberg」から購入した。Mst1およびMst2に対する抗体は「Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, USA」, 「Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA」、および「Upstate (distributed by Biomol GmbH, Hamburg) 」から得た。
【００６９】
ウェスタンブロット分析のための血小板の単離および活性化:
健康なドナーから新鮮に採取された血液を、酸性クエン酸・デキストロース製剤Ａ (ACD−A)溶液(Fresenius Hemocare, Redmond, USA)中に集めた。この血液を150gで20分間、室温で遠心分離し、そして血小板−濃縮血漿(PRP)を回収した。１容量のACD−A溶液を９容量のPRPに添加した。15分間、120ｇでさらに遠心後、PRPを0.5ug／ml PgE1 (SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)で処理し、そして血小板を360ｇで15分間遠心することによりペレット化した。タイロード溶液(137mM NaCl、2.7mM KCl、12mM NaHCO3、0.36mM NaH2PO4、１mM MgCl2、10mM Hepes、5.5mM Glucose、0.1％BSA、pH7.4)中に再懸濁後、血小板を未処理のまま残すかまたは１U／ml ヒトトロンビン (SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)で１〜５分間室温で処理するのいずれかとし、そして360ｇで15分間ペレット化した。
【００７０】
ウェスタンブロット分析:
ウェスタンブロッティングによるタンパク発現分析のための、血小板トータルSDS溶解物を以下のように調製した: 上記で得られた血小板ペレットを、20mM Hepes、100mM NaCl、１％ SDS、１mM Na3VO4、10mM NaF pH7.4、５mM EDTAを含む氷冷溶解緩衝液中に懸濁し、コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)を補充した。溶解物を20分を越えて４℃で転がし、卓上用マイクロ遠心分離機で４℃、13000RPMで20分間遠心分離した。上清のタンパク濃度を測定し、そして30ugタンパクを4−12％ NuPAGE(R) (組織分布分析の場合)または10％ NuPAGE(R)ゲル(Invitrogen GmbH, Karlsruhe)のいずれかにより分離し、そしてニトロセルロース膜に移した(Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg)。Mst1の検出のために、ウサギポリクローナル抗体の抗−Mst1 (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, USA)またはウサギポリクローナル抗体の抗−Mst1/Krs−2 (Upstate/Biomol GmbH, Hamburgにより配布されている)を用いた。Mst2の検出のために、ヤギポリクローナル抗体Krs−1 (N−19) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA) を用いた。手短かに云えば、ブロットを、o/n、４℃で、５％の無脂肪粉乳を含むTBS−T (20mM Tris−Cl pH7.6、137mM NaCl、0.1％ Tween 20 (SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen))中でブロックし、そして５％の無脂肪粉乳を含むTBS−T中のウサギポリクローナル抗体の抗−Mst1の１つでまたはヤギポリクローナル抗体Krs−1(N−19)でプローブ化した。ペルオキシダーゼ−結合２次抗体 (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK and SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)とインキュベーション後、検出を、メーカーの使用説明書 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim)にしたがって、Lumi−Lightウェスタンブロッティング基質と共に膜をインキュベートすることにより実施した。
【００７１】
リン酸化タンパク濃縮:
選択的濃縮のために、Qiagen'sリン酸化タンパク精製キットを以下のように用いた: 血小板堆積物(静止／トロンビン−活性化)を３ml Qiagen溶解緩衝液(QLB)中に再懸濁し、そして遠心した(30分, 13000xg)。上清のタンパク濃度をBCA−Kit (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn)を用いて測定し、そしてタンパク濃度をQLB中2,5 mg／25mlに調整した。
QLB(４ml)でリン酸タンパク精製カラムを平衡化した後、血小板溶液を２ポーションでカラムの表面に加えた。流通画分（flow−through fraction)を回収し、そしてさらにQLB (６ml）を加えてカラムを洗浄した。その後、500 ul Qiagen溶出緩衝液を加え、そして溶出画分を回収した。溶出を４回繰り返し、５つの溶出画分を得た。タンパク測定を全ての回収された画分について行い、画分３に最も高いタンパク量を示した。
TCA−沈殿後、画分３についてそれぞれ30ug(静止／トロンビン−活性化)を1D−ゲル(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Nupage(R) 10％)に装填した。コロイドクマシーブルー染色を、Roth (Carl Roth GmbH ＋ Co., Karlsruhe)にしたがって行った。
【００７２】
タンパク同定
In−gelタンパク消化：クマシーブルー染色タンパクバンドを切り取り、そして直径約１−２mm3の小片に切った。脱染を100μl洗浄溶液(50％アセトニトリル／25mM NH4HCO3、pH 8.0)中で15−30分間、３回洗浄することにより行った。ゲル片を50μlアセトニトリルの添加により乾燥し；過剰の溶液を約10分後に除去した。次いで、ゲル片を15μlトリプシン溶液 (５μg／ml) (リコンビナント, プロテオミクスグレード, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim m)中で再水和し、そして対流式オーブンで終夜37℃でインキュベートした。次いで、ペプチドを30μl 50％アセトニトリル／５％ TFA (３回)とのインキュベーションにより抽出した。ペプチド 抽出物をプールし、真空遠心分離で凍結乾燥し、そして13μl 0.1％ TFA中に再構成した。
【００７３】
ナノ−LC−MS/MS分析：ペプチド試料の分析をLCQ Deka XP質量分析計(Thermo Finnigan, San Jose)と連結されたUltimate HPLC系(LC Packings, Amsterdam)からなるナノ−ESI−LC−MS/MS系で実施した。Famosオートローダ(LC Packings, Amsterdam)を用いて、13μlの試料容量を注入した。試料をSwitchos module (LC Packings, Amsterdam)を用いてC18プレカラム(PepMap, i.d. 300μm, ５mm長)において脱塩した; ２％アセトニトリル／0.1％トリフルオロ酢酸を含む試料の装填および洗浄を、30μL／分の流速で、10分間行った。C18ナノカラム(PepMap, i.d 75μm, 150mm長, LC Packings, Amsterdam)を用い、200nL／分の流速でペプチドを分離した。移動相は２％アセトニトリル／0.1 ％ギ酸(溶媒Ａ)および98％アセトニトリル／0.1 ％ギ酸(溶媒Ｂ)からなった。45分で５％ Ｂ〜35％ Ｂの線形勾配、その後10分で100 ％ Ｂまでの線形増加により、ペプチド溶出を達成した。
【００７４】
ナノ−LCの毛細管チュービングをMicroTee(Upchurch Scientific, Inc., Oak Harbor, USA)を備えたエレクトロスプレーニードルに連結し、ここで1.2 kVの電圧を加えた。ナノ−エレクトロスプレーニードルは、溶融石英シリカキャピラリー(i.d. 25μm, o.d. 280μm, Grom Chromatography GmbH, Rottenburg−Hailfingen)からの実験室で引き延したもの（laboratory−pulled)(Sutter Instruments Co., Novato, USA, Model P−2000)で、直径およそ３μmのニードルオリフィスが得られたものである。
【００７５】
質量分析は、陽イオンモードのデータデペンダントアクイジションを用いて、XCaliburソフトウェア(Thermo Finnigan, San Jose)により制御した。移送キャピラリー温度は常に180℃に保持し、キャピラリー電圧および管レンズはそれぞれ46Ｖおよび55Ｖにオフセットした。カラムから溶出したペプチドをMSモード(m/z 500−2000, ３マイクロスキャン, 最大注入時間50ms)の第１スキャンイベントで検出し、引き続き35％の相対的衝突エネルギーを用い(XCaliburソフトウェアセッティングに対応)、３つの最も豊富なイオン（５×105カウントを超える）について３回連続のデータデペンダントMS/MSスキャンイベント(分離幅３Da, ４マイクロスキャン, 最大注入時間400ms, 活性化時間30ms)で検出した。動的排除パラメーター(dynamic exclusion parameter)を以下のように設定した: 「リピートカウント」 ２、「リピート持続時間」 0.5分、「排除リストサイズ」 25、「排除質量幅」 ＋/− 1.5Da、「排除持続時間」 1.50分、拒絶なし。
【００７６】
質量分析： 質量データをSpectrumMillで処理した。以下のパラメータを用い、生データを.pkl−ファイルに変換した: 「システイン修飾」無し、「最小配列タグ」＞ １、「スキャン範囲」1−9999 (全て)、「[M+H]+」500−4000 Da、「親チャージアサインメント(parent charge assignment)」ファインドフォース(find force) １〜４／ファインドマックス(z) ７／分 MS S/N 25、「同じ親とのマージスキャン」m/z ＋/−1スキャン(スペクトルのマージング無し)に変換した。タンパク同定をSwissProtデータベースを検索することにより得る一方、分類を哺乳動物に限定した。検索を親および断片集団についてそれぞれ、＋/− 1.5Daおよび＋/− 0.7Daのマッチング誤差(matching tolerance)を用いて行った。２つの失敗したトリプシン切断の最大数が許容された。同定が認証フィルタで設定された以下のパラメータと合致する場合、ペプチド配列タグが確かなものとみなした: 「タンパクスコア」 ＞８、「ペプチドスコア」 ＞８、「％ SPI」 ＞70; さらに全てのスペクトルを手動で調べた。
【００７７】
セブラフィッシュ分析:
Z−Tag血栓症アッセイにおける標的認証について、翻訳開始部位で始まる最初の25ヌクレオチドを認識するために設計されたアンチセンスモルホリンを用いた。モルホリンをGene Tools, Inc. Philomath, USAからオーダーし、そしてZ−Tag 血栓症アッセイで試験した。モルホリノの有効濃度を、Z3胚の一細胞期に、0.83ng−33.2ngの範囲の数種の濃度の各モルホリノ構築物を注入することによって評価した。使用された濃度に対して発生における不利な変化を全く示さなかった６dpf幼生を、ADPに対するそれらの応答について試験した。注入された胚を、血栓症アッセイにおいて試験されるまで28℃に置いた。ADPのおよそ90pmolをモルホリノ−注入幼生の心臓腔に注入した。このADP−注入幼生を蛍光実体顕微鏡下で、その後５分間観察し、そして血小板移動の有無を評価し、そして記録した。
【００７８】
CD−血小板の生成:
Mst1のドミナントネガティブ突然変異を発現するトランスジェニックマウス血小板を、Ungerer, M他 (2004) Circ. Res. 95, e36−e44にしたがって生成した。
要するに、マウス骨髄細胞をマウスの大腿骨および脛骨からフラッシュすることにより得た。新たに単離した骨髄からの巨核球前駆体細胞を、大多数の細胞が巨核球に分化する条件下で培養した。Mst1のドミナントネガティブ突然変異体についてのcDNA、Mst1K59RをClontech, Heidelberg, Germanyから得られたプラスミドpLEGFP−C1にクローン化した。ヒトGP2−293、汎親和性レトロウイルスパッケージング細胞株を、10％ウシ胎仔血清(PAA, Colbe, Germany)、1％ピルビン酸ナトリウム、100mmol／L (Biochrom AG, Berlin)、１％ pen／strep (Biochrom AG, Berlin)を補充したGlutamaxを含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM) (Invitrogen GmbH, Karlsruhe)中で増殖させた。NIH 3T3細胞を５％ウシ胎仔血清を補充したDMEM／Glutamax中に維持した。トランスフェクションの24時間前、細胞を150mm皿に１：２で分けた。トランスフェクションを、クロロキン(50mmol／L, SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)を用いてClontechにより利用可能なリン酸カルシウム共沈殿により行った。トランスフェクションの30時間後、ウイルスを少なくとも３日間、24時間ごとに回収した。
【００７９】
ウイルスを得て、そしてウイルス価の測定後、巨核球前駆体を、幹細胞因子のみを含むIMDMにおいて48−ウェルプレートで培養した。単離の２日後、細胞をポリブレン (８μg／mL)およびDEAEデキストラン(１mg／mL)の存在下で、MOI(２−５cfu／細胞)により感染させた。共培養実験について、６×106トランスフェクトGP2−293前駆体細胞を、10mL IMDM、10mL DMEM、ポリブレンおよびDEAEデキストランの存在下、1.5×106の単離した巨核球 (それらの単離の２日後)とインキュベートした。この共培養物を、24時間、37℃でインキュベートし、そして巨核球を含む培地を、４−６週間かけて培養するために6−ウェルプレートに移した。感染後または共培養の開始36時間後、細胞をそれらの完全培地(Ungerer, M他 (2004) 前出) およびジェネティシン(380μg／mL)に入れ、非感染細胞から感染細胞を選択した。
【００８０】
培養誘導された血小板を遠心分離により回収し、そして洗浄した。それぞれのプロトコルによって、それらをコラーゲン、トロンビンまたはリストセチンを用いて、10分間活性化した。マウスCD41、CD−40L、CD61およびCD62Pについての抗体はPharmingen, Leiden, The Netherlandsのものである。これらの抗原の発現を記載のFACS分析により評価した。凝集実験について、Chrono−Log 500 VS血小板凝集計を300μL 血小板−濃縮血漿またはフィブリノゲン(480μg／mL)およびCaCl2 (2.5mmol／L)を含む修飾タイロード緩衝液中の107 CD−血小板／mLミックスで満たした。それぞれのアゴニストを添加後、光透過率をその後20分間連続して記録した。トロンビンによりもたらされる曲線を２mmol／Lプラスミン阻害ペプチド (GPRP)の存在下で検出した。
【００８１】
バクテリアにおけるGST−Mstタンパクの発現およびMstキナーゼアッセイ:
ヒトMst1およびMst2の全長配列を、HeLa細胞のRNAから始めるRT−PCRにより増幅した。Invitrogen Gateway(R)技術マニュアルにしたがって、生成されたPCR生成物を、エントリークローンを得るためにBP組み換え反応において用いた。その後、この配列をバクテリア発現のためにpDEST15に移した。pDEST15−MSTベクターでE.Coli BL21−AI株を形質転換し、そして関心のあるDNAを運ぶ形質転換体の選択のため、アンピシリン上で増殖させた。単一のコロニーを、それらが適当な細胞密度に届くまで100μg／mlアンピシリンを含むLB培地に接種した。次いで、それらを、0.2％アラビノース(SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)を用い、37℃で2.5時間誘導した。誘導の最後に、バクテリアを氷冷PBS中で洗浄し、溶解緩衝液 (137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、５mM NaF、３mM EDTA、pH7.5、以下を補充: 0.25％ Triton X−100、0.25％ CHAPS、１mM Na3VO4およびプロテアーゼ阻害剤)中に再懸濁した。バクテリアをFrench pressにより首尾よく溶解した後、この溶解物を、20000ｇ、４℃で30分遠心分離することにより透明にした。
【００８２】
GST組み換えタンパクを、製造者プロトコルに従って、MagneGSTタンパク精製システム (Promega GmbH, Mannheim)を用いて、透明溶解物から精製した。
【００８３】
インビトロキナーゼアッセイ (ATP消費アッセイ)についての最適条件を決定するため、１μg GST (グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)−Mstタンパクを、10mM MgCl2または２mM MnCl2のいずれかを補充した40mM Hepes pH7.5を含むキナーゼ緩衝液中のMBP(Myelin Basic Protein) (２μg)およびATP(２μM)とインキュベートした。さらに、本発明者らは、１mM DTTおよび／または0.02％ BSAのキナーゼ活性に対する効果を評価した。この反応を30分間、32℃で行い、そしてGST コントロールと比較したATP消費の生物発光測定のため、ATPモニタリング試薬(Cambrex Bio Science Nottingham Ltd, Nottingham, UK)中の１μMスタウロスポリンの添加により停止した。
【００８４】
Mst1キナーゼ活性における非特異的キナーゼ阻害剤スタウロスポリン (SIGMA−ALDRICH, Taufkirchen)の効果を評価するため、１μg GST−Mst1タンパクをスタウロスポリンの連続希釈により、30分間、32℃でプレインキュベートした。その後、このキナーゼアッセイを上記のとおり行った。各測定を３回行った。処理の成功を非処理サンプルと比較したATP消費の減少に基づいて決定した。
【００８５】
結果
血小板におけるMst2の初期同定
Mst2を、いわゆるPST技術を実験的バイオインフォマティクスアサインメント手順と組み合わせて濃縮された血小板膜に適用することにより同定し(Kuhn, K. (2003) J. Proteome Res 2, 598−609)、Mst2をこのLC−MSに基づく分析を用いて同定した。Mst2を高い確かさを伴う6 PST'sにより同定した。
【００８６】
ホスホプロテオミクスアプローチによるMstキナーゼの同定
シグナル伝達関連タンパクを同定するために、リン酸化タンパクを、QiagenのIMACアフィニティー培地を用いて静止またはトロンビン−刺激血小板のいずれかから濃縮した。溶出タンパクの大部分を含む画分をさらに1Dゲルで分離した。次いで、レーン全体を切ってストリップとし、そして含まれたタンパクを、in−gelトリプシン消化とその後のLC−MS/MS分析により同定した。Mstキナーゼを、図１および表１に例示されるゲル中のいくつかの位置に見出した。Mst1およびMst2に加え、Mst1および2の別のホモログとしてのSOK1も検出した(図１および表１)。これは、SOK1が血小板で同定された最初である。SOK1はSOK1のタンパク分解におそらく起因した、異なるMWで移動する２つのバンドで同定された。
【００８７】
Mst1およびMst2のペプチドはトロンビン−活性化血小板抽出物においてのみ見いだされ、これはMst1および／またはMst2の刺激誘導性特異的リン酸化を示すことから、MSデータは機能情報についてのいくつかの最初のヒントを与える。これらの実験において、主に、〜35kDaの明らかな分子量を有するMst1およびMst2のプロテアーゼ−切断形態を同定した。
【００８８】
ヒト組織におけるMst1およびMst2の発現パターン
異なるヒト組織におけるMst1およびMst2の組織分布が、Taqman分析により最初に調査された。
Taqman分析によると、Mst1 mRNAは、ヒト脳、胎仔脳および精巣において高レベルで発現する（表２）。中程度の発現レベルは、骨髄、胎仔肝臓、および胸腺で見られる。全ての他の組織において、Mst1 mRNAは検出限界を下回り、したがって発現されないかまたは低レベルでしか発現されない。したがって、Mst1はほとんどの組織で発現されない。Mst1と比較して、Mst2 mRNAは精巣においてのみ、高い発現レベルで検出される。Mst1について観察されたのと同様に、全ての他の組織において、Mst2 mRNAは検出限界を下回り、したがって発現されないかまたは低レベルでしか発現されない(表２)。
【００８９】
無核血小板は核のある細胞と比較してごく少量のmRNAしか含まない。さらに、しばしば血小板から単離されるmRNAは、核のある細胞から得られるmRNAと比較してさらに分解されて見出される。したがって、血小板mRNAは本発明者らのTaqmanパネルに含まれていないが、タンパク抽出物およびウェスタンブロット分析を、血小板および他の組織におけるMst1およびMst2のタンパク発現を評価するために用いた。
Mst1およびMst2はヒト血小板で発現する。
【００９０】
ヒト血小板におけるMst1およびMst2の発現を確認するため、個々のドナーの全血からの血小板を、数回の工程で精製した(Material & Methods参照)。結果的に、血清成分のみならず、他の細胞タイプの混入は回避され得る。次いで、血小板ペレットの全細胞抽出物を、SDS−含有緩衝液における溶解により得た。
【００９１】
アミノ酸レベルにおいて、Mst1およびMst2は77.6％の同一性を有する。ウェスタンブロッティングによりそれらを区別するため、特異性が組み換えタンパクにおいて試験される抗体を用いた。
【００９２】
Taqman分析が精巣におけるMst1 mRNAの非常に高い発現レベルを示すことから、ヒト精巣の抽出物を、ウェスタンブロッティングによるMst1タンパク発現の分析のため、陽性コントロールとして用いた。
【００９３】
図３に示されるように、タンパクレベルにおいて、Mst1は精巣でも弱く発現し、したがって、Taqman分析の結果を部分的に確認される。Mst1は、精巣での発現レベルより、ずっと高い発現レベルでヒト血小板においてはっきりと検出される。この結果はいくつかのドナーで確認された。
【００９４】
Taqmanの結果により示されるとおり、Mst2 mRNAもまた精巣で高く発現される事実を考慮して(表２)、ヒト精巣の抽出物を、ウェスタンブロッティングによるMst2タンパク発現の分析のため、陽性コントロールとして用いた。図４に示されるように、Mst2はタンパクレベルで精巣において発現され、それによってTaqman分析の結果を確認される。さらに、Mst2は精巣で観察されるレベルに匹敵するレベルでヒト血小板においても発現されるが、その量において、いくらかドナーに依存した可変性を示す。
【００９５】
Mst1およびMst2の組織分布
血小板を含む種々のヒト組織抽出物におけるMst1およびMst2の組織分布を調査した。
タンパクレベルにおいて、Mst1は明らかに、血小板、精巣および胸腺で発現し、最も高い発現レベルが常に血小板で見いだされた。調べた他の組織において、Mst1は発現していない(図５)。サンプルのいくつかにおいて、および特に結腸、心臓、腎臓および皮膚において、およそ50kDaでさらなるバンドが検出された。このシグナルの非特異的性質は、異なるMst1−特異的抗体 (Upstate (distributed by Biomol GmbH, Hamburg)を用いて同じサンプルを探索することにより、確証した：図５に示される結果と一致して、Mst1発現が血小板、精巣および胸腺において確認されたが、一方、シグナルは他の組織では検出されなかった(データは示されない)。Taqmanの結果と比較して(表２)、Mst1はタンパクレベルにおいて脳では検出されない。
【００９６】
タンパクレベルにおいて、Mst2は精巣、胸腺、および皮膚を含む数種の組織で強く発現される（図６）。中程度〜強い発現が、血小板、腎臓および心臓で検出される。低いレベルの発現が結腸、膵臓および肝臓で観察された(図６)。
【００９７】
Mst2についてのこれらの組織分布分析の別の重要な発見は、タンパクレベルにおいて見出された結果が、明らかにmRNAレベルで見出された結果と異なり、ここでMst2 mRNAの発現は精巣でのみ検出されたことである(表２)。
【００９８】
ゼブラフィッシュにおけるMst1およびMst2の機能的検証
化合物スクリーニングについて、および標的同定および検証についてのインビボトランスジェニックゼブラフィッシュ血栓症アッセイが開発された。このアッセイにおいて、蛍光タンパクを含む血小板 (血小板のゼブラフィッシュ等価物)を、特異的に標識した。血小板アゴニストとしてADPを用いた血栓症−関連アッセイは、蛍光血小板と共に、TG(GPIIb:G−RCFP)Z3ゼブラフィッシュ系列におけるZ−Tag胚の心臓腔に、関連アゴニストを注射することにより、Z−Tag (Zygogen, LLC)を用いて開発された。２種の公知の有効な血小板標的、GPIIb受容体およびP2Y12受容体が、ゼブラフィッシュにおいて保存され、そしてADP−誘導性血小板凝集におけるそれらの役割が、迅速なアンチセンスモルホリノ技術を用いて示され、それによってゼブラフィッシュモデル系を検証した。
【００９９】
モルホリノに基づくアンチセンス技術を用い(Zygogen, LLC)、潜在的血栓症標的遺伝子としてMst1およびMst2を特徴化した。ヒトにおける状況と比較して、ゼブラフィッシュゲノムは、Mst1およびMst2の両方を示すホモログを１つだけ含む。遺伝子生成物BC048033 (ヒトMst1およびMst2に対してそれぞれ、76.8％および88.8％の同一性)は、完全なゼブラフィッシュオルソログを示した。ゼブラフィッシュ, BC045867における別の潜在的なホモログ遺伝子は、Mst3と呼ばれる、Mst1およびMst2のさらに別のヒトホモログに対してはるかに高い程度の同一性を示す(Schinkmann, K他 (1997) J. Biol. Chem. 272, 28695−28703)。BC045867はヒトMst3に対して〜76％まで保存されるが、それぞれヒトMst1およびMst2に対しては〜45％および〜47％までしか保存されていない。対照的に、BC048033はMst3に対して〜45％までしか保存されていない。Sanger Centerゼブラフィッシュゲノムデータベースにおける検索は、Mst1またはMst2について任意の他の潜在的なゼブラフィッシュ遺伝子を同定しなかったが、ヒトにおける２つのホモログ(Mst1およびMst2)の存在が遺伝子重複イベントを示すことを示唆した。したがって、ゼブラフィッシュBC048033の発現を排除するためのアンチセンス技術を用いることにより、ヒトにおける状況と比較する場合、Mst1およびMst2の発現を同時にノックダウンした。
【０１００】
Z−Tag血栓症アッセイにおける標的検証のために、翻訳出発部位で始まる最初の25ヌクレオチドを認識するために設計されたアンチセンスモルホリノが有効であることを示した。したがって、BC048033の５'末端を決定した。モルホリノをGene Tools, Inc. Philomath, USAから注文し、そしてZ−Tag 血栓症アッセイで試験した。このモルホリノ研究を２相で実施した。最初のパートは各モルホリノの有効濃度が評価される予備相であった。これを、Z3胚の一細胞期に、0.83ng−33.2ngの範囲の数種の濃度の各モルホリノ構築物を注入することによって決定した。Mst1/Mst2モルホリノについて、胚の発生に不利な副作用は、試験された濃度については観察されなかった。GPIIb受容体およびP2Y12受容体のノックダウンは、これらの試験ついて陽性コントロールとして使用した。
【０１０１】
盲検試験として行われたこれらの実験の結果は、Mst1/Mst2がADP−誘導性血小板凝集にとって重要であることを明らかに示唆する(図７)。さらに、陽性コントロールとしてのGPIIbおよびP2Y12モルホリノはこの盲検試験で有効であった(図７)。陰性コントロールとして、ドーパミントランスポーター (DAT)に対して指向されるモルホリノを用いた。このモルホリノは、神経変性疾患モデルにおいて有効であることを見出した(Zygogen未発表データ)。予想されたとおり、DATモルホリノはADP−誘導性血小板凝集に対して効果を全く有さない。
【０１０２】
ゼブラフィッシュにおけるBC048033、Mst1/Mst2ホモログは、この研究内の最も良い候補遺伝子であった。ADP−誘導性凝集におけるその効果の頻度は、GPIIbおよびP2Y12受容体を含む任意の他の遺伝子について観察されるより大きい。さらに、遺伝子のノックダウンは致死でなく、そしてゼブラフィッシュ幼生の発生の遅延を全く引き起こさない。これは、このタンパクを標的にする薬物の副作用が、あるとしてもほとんどないことを示し、それによって、抗血栓症薬物の開発のための標的遺伝子としてのその可能性を強く示唆し得る。
【０１０３】
培養誘導された血小板におけるMst1の機能的検証
トランスジェニックCD−血小板における標的遺伝子および突然変異体の過剰発現のために使用され得る、巨核球前駆体細胞からの培養誘導された(CD)−血小板の生成の系を使用した(Ungerer, M他 (2004) 前出)。この系を、マウス巨核球前駆体細胞誘導されたCD−血小板におけるMst1の検証のために用いた。Mst1のドミナントネガティブ突然変異体、Mst1K59Rを、ネイティブなMst1の活性により生じた干渉により引き起こされるこれらの血小板の機能の任意の変化を調べるために、培養誘導された血小板 (CD−血小板)において過剰発現させた。
【０１０４】
Mst1K59Rのレトロウイルスにより誘導された過剰発現は、GFPのみ発現する細胞または感染していないコントロール細胞と比較して、巨核球の形態も、減らされた(shedded)CD−血小板の形態も、巨核球−特異的マーカーの発現も変化させなかった。また、生じたCD−血小板の数は、他の血小板群の数と類似だった。生成した導入遺伝子発現CD−血小板を用いて、表面受容体の活性化−依存発現、凝集プロフィールおよび濃さおよびアルファ顆粒放出を調べた。
【０１０５】
アゴニスト刺激後のフィブリノゲン受容体の表面補充(surface recruitment)を、CD−血小板におけるCD41およびCD61の発現を調べることにより試験した。図８に示されるように、ドミナントネガティブ突然変異体によるMst1の阻害は、フィブリノゲン受容体活性化マーカーCD41のリストセチン−誘導性表面補充の際立った抑制を生じた。類似の結果がCD61の表面補充について観察された。CD40Lは血小板貯蔵(platelet store)および顆粒からの分泌のマーカーとして使用され、そしてアルファ脱顆粒(alpha degranulation)をＰ−セレクチン (CD62P)の表面転座を研究することによって試験した。Ｐ−セレクチンに加えてCD40Lの表面補充は、リストセチンに応答してドミナント−ネガティブMst1突然変異体 Mst1K59Rを発現するCD−血小板で顕著に減少した(図８)。
【０１０６】
さらに、トロンビン−誘導性凝集はMst1K59Rを発現するCD−血小板で阻害された(図９)。同様に、リストセチン−誘導性凝集 (0,8mg／ml リストセチン)はMst1K59Rを発現するCD−血小板で阻害された。
【０１０７】
結局、哺乳動物の培養誘導された血小板における結果は、ゼブラフィッシュで行われた実験ですでに示された機能的関連性を確証した。さらに、それらは血小板活性化および凝集を干渉するであろう薬物の開発のための新規な標的としてのMst1の役割を強調するものである。
【０１０８】
Mst1およびMst2のインビトロキナーゼアッセイ
モジュレーター同定に至るインビトロキナーゼアッセイに適当な条件を評価するために、バクテリアで発現される組み換えGST−Mstタンパクのインビトロ活性を、異なる緩衝液中で試験した。GST−Mst1について図１０で示されるように、２mM MnCl2を含む全ての試料中、そして独立して１mM DTTまたは0.02％ BSAの添加により、本発明者らは、最も高レベルのキナーゼ活性に対応したATP含量の最も高い減少を観察した。たとえ全ATP消費がGST−Mst1について観察される程度に達しないとしても、類似の結果がGST−Mst2について得られ、GST−Mst2組み換えタンパクの低いキナーゼ活性を示唆した。
【０１０９】
Mst1およびMst2の最適な緩衝液条件(40mM Hepes pH7.5, ２mM MnCl2)を確立した後、本発明者らはGST−Mst1キナーゼ活性の非特異的キナーゼ阻害剤スタウロスポリンの効果を調べた。このGST−Mst1キナーゼアッセイは、１μMから244pMの範囲の異なる濃度の阻害剤の存在下で行われた。図１１で示されるように、スタウロスポリンは、およそ600pMのIC50で、MST1 活性を完全に阻害した。
【０１１０】
これらの結果は、Mst1キナーゼアッセイの条件を最適化することが可能なことを示す。さらに、上記条件がキナーゼ阻害剤スタウロスポリンの効果を調べるために首尾よく適用され、それによって、本発明にしたがうMst1および／またはMst2活性のモジュレーターとして作用する化合物についてのインビトロスクリーニングアッセイとしての使用のためのアッセイの適用を支持した。
【０１１１】
レポーターに基づく経路マッピング
経路マッピングのためのレポーターに基づく細胞系を、異なる細胞株および刺激を用いて確立した。このアッセイは、内因性経路において関心のある過剰発現されるタンパクの効果を調べることを可能にする。発現が経路特異的プロモーターにより駆動される下流のレポーター遺伝子、ルシフェラーゼの誘導における混乱を測定することにより、特異的シグナルトランスダクション経路における関心のあるタンパクの関与を評価することができる。
非誘導性コントロールベクターと比較して、HEK293T細胞におけるMst1の過剰発現は、AP−1、NF−κBおよびp53プロモーターの顕著な活性化を引き起こすことが示された。したがって、そのような系を使用することができ、ここでMst1は過剰発現され、そしてそのような誘導性プロモーターはMst1活性のモジュレーターの細胞効果および能力について試験する読み出しのために使用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】リン酸化タンパクの濃縮された画分のゲル分析を示す。
【図２】表１に列挙されたMst1/2特異的ペプチドAGNILLNTEGHAKのMS/MSスペクトルの実施例を示す
【図３】個々のドナーからの精巣およびヒト血小板の抽出物中のMst1の発現を示す。
【図４】ヒト血小板および精巣の抽出物中のMst2の発現を示す。
【図５】種々のヒト組織の抽出物中のMst1の発現を示す。
【図６】種々のヒト組織の抽出物中のMst2の発現を示す。
【図７】インビボトランスジェニックゼブラフィッシュ血栓症アッセイの結果を要約し、そしてBC048033 (Mst1/Mst2)のノックダウンがADP−誘導性血小板凝集に影響することを示す。
【図８】リストセチン−刺激CD−血小板のFACS分析: GFP (「Mst1」)またはGFP (「GFP (コントロール)」)のみに融合したドミナントネガティブMst1突然変異体 Mst1K59Rのいずれかを発現する、組み換えレトロウイルス感染CD−血小板のFACS測定の例を示す。
【図９】トロンビンにより誘導された凝集の元々の記録を示す。
【図１０】異なる緩衝液条件におけるGST−Mst1キナーゼアッセイを示す。
【図１１】MST1キナーゼ活性におけるスタウロスポリンのＳ字状用量応答曲線を示す。
【図１２−１】配列番号１、ヒトMst 1のアミノ酸配列を示し、ここで太字で、Mst 1キナーゼドメインを示す。下線を引かれたアミノ酸はカスパーゼ切断部位を示し、そして数字はMst1キナーゼ活性を排除しない点変異の例を示す。
【図１２−２】配列番号１はヒトMst 1のアミノ酸配列を示す(SwissprotエントリーQ13043)。
【図１２−３】配列番号２ はヒトMst 1についてのヌクレオチド配列コーディングを示す(GenbankエントリーNM#006282)。
【図１２−４】配列番号３はヒトMst 2のアミノ酸配列(SwissprotエントリーQ13188)を示す。
【図１２−５】配列番号４はヒトMst 2のヌクレオチド配列コーディング(GenbankエントリーNM#006281)を示す。
【図１２−６】配列番号５はヒトドミナント−ネガティブMst1: Mst1K59Rを示す。
【図１２−７】配列番号６はゼブラフィッシュのMst1 & Mst2ホモログを示す (NCBIエントリーAAH48033; BC048033に対応するヌクレオチド配列)。
【図１２−８】配列番号７〜１０は表１に示されたSOK−1およびMst−特異的ペプチドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008533978.tif 000025
2008533978.tif 000026