(57)【要約】本発明は、哺乳類の被検体におけるホスファチジルセリンの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態を検出するための方法及びキットに関する。この方法は、タンパク質のＣ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物を投与すること、及び放射線放出の画像を得るために、被検体において放射性核種からの放射線放出を測定することを含み、細胞死又は上記状態の部位は画像から判定することができる。このキットは、Ｃ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物、及び哺乳類の被検体にこの化合物を投与して、細胞死又は上記状態を画像化することに関する取り扱い説明書を含み得る。
2008521013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでの哺乳類の被検体におけるホスファチジルセリンの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態を検出する方法であって、
（ａ）タンパク質のホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物を投与するステップと、
（ｂ）放射線放出の画像を得るために、前記被検体において前記放射性核種からの放射線放出を測定するステップと
を含み、前記細胞死又は前記状態の部位を前記画像から判定することができる、細胞死又は別の状態を検出する方法。
【請求項２】
心筋梗塞、血管血栓症、関節硬化性プラーク、または腫瘍細胞死を検出するためのものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
急性の心筋梗塞を検出するためのものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記被検体が、ヒト、ブタ、ラット、及びマウスから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記被検体がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記細胞死がアポトーシス性細胞死又は壊死性細胞死である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
放射性核種が、炭素１１、フッ素１８、ガリウム６７、ガリウム６８、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２２、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、窒素１３、酸素１５、テクネチウム９９ｍ、及びタリウム２０１から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記放射性核種がテクネチウム９９ｍである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃ２ドメインが、テクネチウム９９ｍの標識化のためにチオール化される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ２ドメインが、ヒトのシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメイン、ブタのシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメイン、ラットのシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメイン、及びマウスのシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメインから成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃ２ドメインが、ラットのシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記活性変異型が、ホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメインと少なくとも６０％相同性がある、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記活性変異型が、ホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメインと少なくとも７０％相同性がある、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記活性変異型が、ホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメインと少なくとも８０％相同性がある、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記活性変異型が、ホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメインと少なくとも９０％相同性がある、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線検出器がγ線検出器であり、前記放射線放出がγ線放出である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記放射線が陽電子放出断層撮影法又は単光子放出コンピュータ断続撮影法によって検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記放射性核種で標識化した化合物が静脈内で投与される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
選択した間隔で前記ステップ（ｂ）を繰り返すステップをさらに含み、該繰り返すステップが、前記被検体における放射線放出の強度の変化を経時的に追跡記録して、細胞死する細胞の位置又は数のいずれかの変化を検出するのに効果的である、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質のホスファチジルセリンと結合するＣ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物と、
哺乳類の被検体に前記化合物を投与して、ホスファチジルセリンの細胞外レベルの増大により特徴づけられる細胞死又は別の状態を画像化することに関する取り扱い説明書と
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００４年１１月１９日に出願された、米国仮特許出願第６０／６２９，６０７号の利益を主張しており、これはその全体が参照により本明細書に援用される。
【連邦政府により援助を受けた研究又は開発に関する記述】
【０００２】
該当なし。
【発明の背景】
【０００３】
細胞死の非侵襲的な画像化は、重要な診断及び予後の予測可能性を有している。まとめると、構造的損失及び機能的損失あるいは健常組織の損失の病理学的原因は、異なる形態の細胞死の相互作用によるものであり得る。一方では、治療処置後の腫瘍の細胞死は、患者の生存率と正の相関関係がある（Kostin  S.他，Circ．Res.，92：715-24，2003、及びSelivanova  G.著，Current  Cancer  Drug  Targets，4：385-402，2004）。２つの主要な形態の細胞死の中で、その調節解除が引き起こすおそれのある有害な結果のためだけではなく、治療的介入の機会としても、現代医学においてアポトーシスには多大な注目が集まっている（Kerr  JF他，Br  J  Cancer，26：239-57，1972、Kerr，J.F.，Toxicology，181-182，471-4，2002、Huang  P.他，Curr  Opin  Oncol，9：94-100，1997、及びGourley  M他，Curr  Pharm  Des，6：417-39，2000）。細胞膜の破壊を特徴とする消極的な性質を有する壊死に対して、アポトーシスは細胞内のエネルギー依存性プロセスである（Song  Z他，Trends．Cell．Biol.，9：M49-52，1999、及びWyllie  AH，Br  Med  Bull，53：451-65，1997）。一回実行されると、アポトーシスの実施段階は、カスパーゼによって触媒されるタンパク質分解カスケードを伴い、別個の分子マーカーの発生と共に起こる（Grutter  MG，Curr  Opin  Struct  Biol，10：649-55，2000、Green  DR，Cell，94：695-98，1998、Thornberry  NA他，Science，281：1312-16，1998、及びCohen  GM.，Biochem  J，326：1-16，1997）。
【０００４】
アポトーシスと壊死との両方及び他の型の細胞死に関する共通の分子マーカーは、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ）の曝露であり、その同定は細胞死の標的特異的な画像化を容易にすることが可能である。生存細胞において、ＰｔｄＳは細胞膜の内葉の構成成分であり、細胞表面上には実質的に存在しない。アミノリン脂質トランスロカーゼ及びフロッパーゼを含む、エネルギー依存性の酵素の作用により、脂質二重層の非対称性が維持される（Williamson  P他，Biochim  Biophys  Acta，1585：53-63，2002）。アポトーシスの間、スクランブラーゼの活性化と共にトランスロカーゼ及びフロッパーゼの阻害が起こり、二重層を通るリン脂質の再分布が容易になる（Williamson  P他，Biochim  Biophys  Acta，1585：53-63，2002）。結果として、ＰｔｄＳは細胞表面上に曝露されることになる。しかし、壊死性細胞では、細胞内成分が細胞外環境へアクセスできるようにする細胞膜の破壊のため、ＰｔｄＳの曝露はかなり消極的な影響を及ぼす。細胞膜の主要なリン脂質成分の１つであるＰｔｄＳは、一回アクセスできるようになると、十分な分子マーカーを供給する。
【０００５】
アネキシンＶは高い親和性でＰｔｄＳと結合する。色原体又は放射性核種（例えばテクネチウム９９すなわち99mＴｃ）によって標識化したアネキシンＶ及びその類似体は、インビトロ及びインビボの両方でアポトーシス性細胞を同定するために用いられている（例えばBlankenberg他，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，95：6349-6354，1998、Vriens他，J．Thorac．Cardiovasc．Surg.，116：844-853，1998、Ohtsuki  K他，Eur  J  Nucl  Med，26：1251-58，1999、Petrovsky  A他，Cancer  Res，63：1936-42，2003、及びLahorte  CMM他，Eur  J  Nucl  Med，31：887-919，2004を参照されたい）。特に、放射性核種で標識化したアネキシンＶは、ヒト患者における心筋の細胞死を検出するのに用いられている（Hosstra  L他，Lancet，356：209-12，2000）。しかし、注射後１７時間〜２２時間までは検出を成功させることができず、このことが心臓に急性の梗塞を患う患者への使用を不可能にしている。
【０００６】
別のタンパク質であるシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインは、カルシウム依存性様式で曝露したＰｔｄＳと結合することによって、壊死性細胞及びアポトーシス性細胞の両方を認識することが示されている（Davletov  BA他，J  Biol  Chem，268：26386-90，1993）。蛍光色素又は超常磁性微粒子で標識化したシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインは、それぞれ蛍光画像化技術又は磁気共鳴画像化技術を使用した細胞死の検出を可能にしている（Zhao  M他，Nat．Med.，7：1241-1244，2001、Jung  HI他，Bioconjugate  Chem，15：983-7，2004、及び米国特許出願公開第２００４／００２２７３１号）。しかし、特に急性虚血及び再灌流等の疾患又は状態の発症後の早い時間内での細胞死を画像化するための放射性核種で標識したＣ２ドメインの使用の実行可能性は明らかではない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、哺乳類の被検体におけるＰｔｄＳの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態を検出するための方法及びキットに関する。この方法は、タンパク質のＣ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物を投与すること、及び放射線放出の画像を得るために、被検体において放射性核種からの放射線放出を測定することを含み、細胞死又は上記状態の部位は画像から判定することができる。このキットは、Ｃ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物、及び哺乳類の被検体にこの化合物を投与して、細胞死又は上記状態を画像化することに関する取り扱い説明書を含み得る。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本発明は、哺乳類の被検体におけるＰｔｄＳの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態を画像化するか又は検出する非侵襲的な方法に関する。この方法は、タンパク質のＣ２ドメイン又は当該Ｃ２ドメインの活性変異型を含む効果的な量の放射性核種で標識化した化合物、好ましくは放射性核種で標識化したポリペプチドを被検体に投与すること、及び放射線放出の画像を得るために被検体において放射性核種からの放射線放出を測定することを含む。細胞死又は上記状態の部位を画像から判定することができる。被検体からの放射線放出を選択された間隔で二回以上測定し、経時的に放出強度の変化を追跡記録することができ、これによって細胞死する細胞の数又は分布等の変化を判定することができる。
【０００９】
ＰｔｄＳの細胞外レベルの増大を特徴とするアポトーシス、壊死、及び別の型の細胞死、並びに他の状態を本発明の方法により検出することができる。本発明は、心臓の梗塞、血管血栓症、及びアテローム硬化性プラーク(atherosclerotic  plaques)を、例えば、これらの状態の１つを患っている疑いのある哺乳類の被検体において判定するのに特に有用であり、これはこれらの状態が細胞外の結合に関するＰｔｄＳのレベルの増大に関連することが示されているためである。心臓の梗塞は、血栓又は塞栓による等、局所での血液供給の閉塞の結果として、心臓組織の壊死を特徴とする。血管血栓は、たとえ発現したとしてもほとんどＰｔｄＳが発現しない不活性な血小板よりもはるかに多くの量のＰｔｄＳを発現する活性化血小板を含む。アテローム硬化性プラークに関しては、細胞のかなりの割合が細胞死している（例えばCrisby  M他，Atherosclerosis，130：17-27，1997を参照されたい）。
【００１０】
以下の実施例は、放射性核種で標識化したＣ２ドメインの使用が、放射性核種で標識化したアネキシンＶを使用するよりも注射後の非常に早い時点での画像の取得を可能にし、このことによりＣ２ドメインは、特に治療の成功が適時の診断に依存する疾患及び状態（例えば急性の心筋梗塞）に関して、アネキシンＶよりも好都合なイメージング剤であるとされることを実証する。既存の放射性標識化したアネキシンＶによるアポトーシスの画像化技術では、放射性トレーサーの比較的ゆっくりしたクリアランス(clearance)により、注射の１５〜２２時間後にしか画像の取得が可能ではない。99mＴｃの放射能の半減期の約３倍の時点では、このような画像化プロトコルは高い線量の投与及び長期的な患者の待機時間を要求する。これに対して、本明細書（以下の実施例２）において、放射性標識化したＣ２ドメインが非常に早い時点での画像の取得を可能にすることを示している。このことは、シンチレーション計測、フローサイトメトリー、及び電子顕微鏡法を含む解剖分析によって確認された。
【００１１】
本発明の方法は、腫瘍において細胞死を引き起こすように設計した治療（例えば化学療法）を受けている哺乳動物（例えば癌患者）の腫瘍の細胞死を画像化するために使用することもでき、それによって治療が成功する可能性があるか否かという情報を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様において、本発明はブタ、ラット、又はマウスである哺乳類の被検体において実施される。より好ましい実施態様では、哺乳類の被検体はヒトである。ＰｔｄＳの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態は、例えば哺乳類の被検体の組織若しくは腫瘍又はそれらの一部で、画像化又は検出することができる。
【００１３】
様々なタンパク質由来のＣ２ドメインが当該技術分野で既知である。幾つかのタンパク質（例えばタンパク質キナーゼＣα）は唯一のＣ２ドメインを有するが、他のタンパク質（例えばシナプトタグミンＩ）は２つ以上のＣ２ドメインを有する。２つ以上のＣ２ドメインを含むタンパク質に関して、このドメインはその名称の後ろに文字を（アルファベット順で）付け加えることにより、当該技術分野で便宜上区別される（例えばＣ２Ａ及びＣ２Ｂ等）。唯一のＣ２ドメインを含むタンパク質に関して、このドメインは単にＣ２ドメインと表される。本発明のために、「Ｃ２ドメイン」という用語は、それらがタンパク質における唯一のＣ２ドメインであるか、又は複数のＣ２ドメインの１つであるかどうかに関わらず、全てのＣ２ドメインを包含するのに使用される。以下の実施例で、本発明を実証するための代表例としてラットのシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインが使用されるが、ＰｔｄＳ結合活性を有する全てのＣ２ドメインを本発明のために使用することができる。全てのＣ２ドメインで共有される共通の構造的特徴は、可変ループで連結した８本鎖の逆平行βサンドイッチ構造である（Brose  N.他，J．Biol．Chem.，270：25273-80，1995、Davletov  B.A.他，J．Biol．Chem.，268：26386-90，1993、Rizo  J.他，J．Biol．Chem.，273：15879-15882，1998、Sutton  R.B.他，Cell，80：929-38，1995、これらは全てその全体が参照により本明細書中に援用される）。Ｃ２ドメインを含むタンパク質の例としては、シナプトタグミン１〜１３、セリン／スレオニンキナーゼのタンパク質キナーゼＣファミリー成員、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼδ１、第Ｖ因子及び第VIII因子を含む凝固カスケードの補因子、並びにコピンファミリーの成員が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトのシナプトタグミンとしては、シナプトタグミン１〜７、１２、及び１３が挙げられる。
【００１４】
Ｃ２ドメインを含むタンパク質の幾つかの具体的な例としては、（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ登録名の後に丸括弧内の寄託番号）：
【化１】
2008521013.tif 000003
【化２】
2008521013.tif 000004
【化３】
2008521013.tif 000005
が挙げられるが、これらに限定されない。スイス・バイオインフォマティックス研究所（ＳＩＢ）のＥｘＰＡＳｙ（エキスパートタンパク質分析システム）プロテオミクス・サーバでのus.expasy.org/cgi-bin/prosite-search-ac?PS50004を参照されたい。
【００１５】
Ｃ２ドメインを含むタンパク質の他の幾つかの具体的な例としては、（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ登録名の後に丸括弧内の寄託番号）：
【化４】
2008521013.tif 000006
が挙げられるが、これらに限定されない。スイス・バイオインフォマティックス研究所（ＳＩＢ）のＥｘＰＡＳｙ（エキスパートタンパク質分析システム）プロテオミクス・サーバでのus.expasy.org/cgi-bin/prosite-search-ac?PS50004を参照されたい。
【００１６】
好ましい実施態様では、ヒト、ラット、又はマウス由来のシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインを本発明の実施に使用する。ヒトのシナプトタグミンＩのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（このｃＤＮＡ配列は配列番号１で示され、このアミノ酸配列は配列番号２で示される）、ラットのシナプトタグミンＩのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（このｃＤＮＡ配列は配列番号３で示され、このアミノ酸配列は配列番号４で示される）、並びにマウスのシナプトタグミンＩのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（このｃＤＮＡ配列は配列番号５で示され、このアミノ酸配列は配列番号６で示される）を、それぞれＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ５５０４７、ＮＭ＿００１０３３６８０、及びＮＭ＿００９３０６で見出すことができる。ヒト、ラット、及びマウスのシナプトタグミンＩに関して、そのＣ２Ａドメインが、それぞれアミノ酸１４０〜２７０、アミノ酸１４０〜２６６、及びアミノ酸１４０〜２７０に及ぶ。
【００１７】
本明細書中で使用されるように、野生型のＣ２ドメインの活性変異型は、（例えば欠失、挿入、又は置換により）１つ又は複数の残基が前記特定の野生型のＣ２ドメインと異なるポリペプチドを示し、これは当該野生型のＣ２ドメインの全長にわたって当該特定の野生型のＣ２ドメインと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％相同性であり、固有のＰｔｄＳ結合活性を有する。多くの場合、野生型のＣ２ドメインの活性変異型は自然発生したペプチドではないが、この変異型は、異なる種の異なるタンパク質又はこれに対応するタンパク質由来の別の野生型のＣ２ドメインであり得る。活性変異型が野生型のＣ２ドメインの断片である場合、この断片は当該野生型ドメインの全長の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％であることが好ましい。好ましい実施態様では、野生型のＣ２ドメインの活性変異型は、同じ長さの当該野生型のＣ２ドメインである。別の好ましい実施態様では、活性変異型は、１つ又は複数の保存的置換を伴う野生型のＣ２ドメインである。同じ保存的な群の中のアミノ酸は、一般的にタンパク質の機能に実質的な影響を与えることなく、互いに置換することができることが当該技術分野で既知である。本発明のために、共有の特性に基づきこのような保存的な群を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2008521013.tif 000007
【００１９】
別の実施態様では、Ｃ２ドメイン又はこの活性変異型は、タンパク質の単離又は他の目的を容易にするために加えられたＧＳＴタグ等のペプチドタグを有する。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、アミノ酸配列とヌクレオチド配列との間の「同一性％」とは「相同性％」と同義語であり、このことはKarlin及びAltschulによって修正された（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，5873-5877，1993）、Karlin及びAltschulのアルゴリズム（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87，2264-2268，1990）及び他の方法を使用して決定することができる。上記のアルゴリズムは、Altschul他のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている（J．Mol．Biol.，215，403-410，1990）。ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）でＢＬＡＳＴヌクレオチドの検索を行い、本発明のポリヌクレオチドに対して相同性であるヌクレオチド配列を得る。ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）でＢＬＡＳＴタンパク質の検索を行い、参照のポリペプチドに対して相同性であるアミノ酸配列を得る。比較目的でギャップ化アラインメントを得るために、Altschul他（Nucleic  Acids  Res.，25，3389-3402，1997）で記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びギャプ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定のパラメーターを使用する。
【００２１】
既知のＣ２ドメイン（例えばシナプトタグミンのＣ２ドメイン）の核酸配列及びアミノ酸配列を「問い合わせ配列」として使用して、野生型のＣ２ドメインの相同型、イソ型、又は変異型を同定するために公開データベースに対して検索を行うことができる。ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムを使用して、このような検索を行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）でＢＬＡＳＴヌクレオチドの検索を行い、参照の核酸分子に対して相同性であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）でＢＬＡＳＴタンパク質の検索を行い、参照のタンパク質に対して相同性であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ化アラインメントを得るために、Altschul他（Nucleic  Acids  Res.，25：3389-3402，1997）で記載されるように、ギャップ化ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定のパラメーターを使用することができる。
【００２２】
ポリペプチド又はタンパク質が特異的にＰｔｄＳと結合するか否かは、定量アッセイ、半定量アッセイ、又は定性アッセイを使用して、当業者によって容易に決定することができる。一般的にこれらのアッセイはＰｔｄＳを含む結合標的を伴い、これは人工のリン脂質小胞、（例えば溶解細菌又は赤血球由来の）リン脂質細胞膜の調製物、細胞表面上に外面化したＰｔｄＳを発現する全細胞（例えば化学物質又は活性化した赤血球及び血小板を使用して、アポトーシスを誘導するために刺激した哺乳類の細胞）、又はアポトーシス性細胞集団を含むことで知られているインビボモデル（例えば化学療法又は放射線治療後の反応性腫瘍並びに肝臓、胸腺、心臓、及び筋肉を含むが、これらに限定されない他の組織で誘導されたアポトーシス）であり得る。
【００２３】
結合の検出又は定量のために、（例えば蛍光色素又は放射性同位体によって）標識化した研究タンパク質又はその誘導体を使用することができる。結合定数（Ｋａ）又は解離定数（Ｋｄ）で結合親和性を記録することができる。別の方法として、このタンパク質自体は非標識であり、蛍光消光、表面プラズモン共鳴解析、又はＣ２ドメイン上、すなわちＣ２ドメイン誘導体の一部として、エピトープを認識する抗体による免疫化学を使用してこの結合を定量する。別の方法として、ＰｔｄＳ含有脂質小胞又は濾過若しくは遠心分離によって水性相から容易に分離することができるＰｔｄＳでコーティングした固体材料を使用して、非標識の研究タンパク質を「破壊する」ことができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫化学染色、光学的検出法、又は放射性崩壊の検出を使用して、上清若しくは水性相における研究タンパク質の減少又は非存在と共に起こる、ＰｔｄＳ含有材料に関連する研究タンパク質の存在を評価することができる。
【００２４】
また、アネキシンＶ又はシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメイン等の既知のＰｔｄＳ結合特性のあるタンパク質に対する競合アッセイによって、ＰｔｄＳ結合特異性及び親和力を評価することができる。人工のリン脂質膜、細胞膜調製物、全細胞、又は曝露したＰｔｄＳを有するインビボの標的を使用して、このようなアッセイを行うことができる。このアッセイは研究タンパク質の能力を試験し、従来のＰｔｄＳ結合タンパク質の結合と競合するか、又はこの結合を阻害するかを試験する。タンパク質の一方又は両方を検出目的のために標識化し、阻害濃度（ＩＣ50）値によって、相対的な結合親和力を評価することができる。
【００２５】
哺乳動物、好ましくはヒトへの投与(injection)に有用であると認識されている、放射性画像化のための任意の放射性核種（これは「放射性同位体」という用語と同じ意味で使用される）を使用して、Ｃ２ドメイン又はこの活性変異型を標識化することができる。このような放射性核種の例としては、炭素１１、フッ素１８、ガリウム６７、ガリウム６８、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ヨウ素１２２、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、窒素１３、酸素１５、テクネチウム９９ｍ（99mＴｃ）、及びタリウム２０１が挙げられるが、これらに限定されない。99mＴｃは、本発明に好ましい放射性核種である。放射性同位体でポリペプチドを標識化することは、十分に当業者の能力の範囲内である。99mＴｃでポリペプチドを標識化する場合、ポリペプチドを最初にチオール化させて、標識化を高めることが好ましい。
【００２６】
薬学的に許容可能な担体及び媒体を使用して、本明細書に記載の放射性核種で標識化した化合物を含む組成物又は処方製剤を形成することができる。この組成物を所望の画像化の結果を達成するのに必要な用量及び期間で、効果的な量を被検体に投与することができる。本発明の組成物の効果的な量は、動物の種類、年齢、体重、及び投与経路等の要因によって変わり得る。また効果的な量とは、この組成物の診断に有益な効果が毒性効果又は有害な効果（例えば副作用）を上回っている量のことである。一般的に、この用量には注射したポリペプチドの量並びに注射した放射性核種の量及びタイプを考慮に入れる。本発明の組成物は、例えばポリペプチド１〜１０００μｇ／ｋｇ（体重）、ポリペプチド１〜９００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜８００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜７００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜６００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜５００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜４００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜３００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜２００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド１〜１００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド５〜１００μｇ／ｋｇ、ポリペプチド５〜８０μｇ／ｋｇ、ポリペプチド５〜６０μｇ／ｋｇ、ポリペプチド５〜４０μｇ／ｋｇ、又はポリペプチド５〜２０μｇ／ｋｇの濃度で投与することができる。
【００２７】
最大約２０ｍＣｉの用量で成人のヒトに99mＴｃを投与することができる。99mＴｃ単独投与に関して好ましい用量は、約３ｍＣｉ〜約２０ｍＣｉである。
【００２８】
放射性画像化のための放射標識化したタンパク質の投与に効果的であるとして知られている任意の幾つかの全身経路及び局所経路によって、放射性核種で標識化したＣ２ドメイン又はこの活性変異型を投与することができる。例えば、経口、非経口、吸入、局所、直腸内、鼻腔内、口腔内、経膣、又は移植容器を介して、本発明の組成物を投与することができる。「非経口投与」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内、腹腔内、胸膜内、リンパ管内、肝内、病巣内、及び頭蓋内の注射技術又は注入技術を含む。また、任意の組織にカテーテルを介して、又は針によって、この組成物を投与することができる。上記の投与形態を行う方法は、当該技術分野で既知である。
【００２９】
好ましい投与方法は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射である。これは、心臓、血管、及び腫瘍等の十分に血管新生した臓器の画像化に特に好適である。放射性医薬品の静脈内注射の方法は既知である。例えば、一般的にオルデンドルフ／ターニケット法(Oldendorf/Tourniquet  method)又は静注法のいずれかを使用した急速静注法(bolus  injection)として、放射性標識化した薬剤を投与することが認められている（例えばMettler及びGuierbteau著「核医学画像化の要点(Essentials  Of  Nuclear  Medicine  Imaging)」（第２版，W.B．Saunders  Company，Philadelphia，Pa.，1985）を参照されたい）。
【００３０】
脳の腫瘍を画像化するために、本発明の組成物を髄腔内に投与することができる。髄腔内投与によって、脳脊髄液（ＣＳＦ）を含むくも膜下腔に直接、化合物を送出する。
【００３１】
γ線検出器等の任意の好適な画像化装置（例えばγ線シンチレーションカメラ又は三次元画像化カメラ）を使用して、又は陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）若しくは単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）によって、画像化を行うことができる。得られた画像の解釈を容易にするために、この画像をデジタル処理して、バックグラウンド、ノイズ、及び／又は非特異的な局在化をフィルター除去することができる。好ましい実施態様では、放射性核種で標識化した化合物の投与後、約０．５時間〜約２４時間、約０．５時間〜約１５時間、約０．５時間〜約８時間、約０．５時間〜約５時間、約２時間〜約２４時間、約２時間〜約１５時間、約２時間〜約８時間、約２時間〜約４時間、約３時間〜約２４時間、約３時間〜約１５時間、約３時間〜約１０時間、約３時間〜約８時間、約３時間〜約６時間、又は約３時間で、画像化を行うことができる。
【００３２】
本発明において、哺乳類におけるＰｔｄＳの細胞外レベルの増大を特徴とする細胞死又は別の状態をインビボで画像化するためのキットを提供することができる。このキットは、本明細書に記載のＣ２ドメイン又はこの活性変異型を含む放射性核種で標識化した化合物、並びに細胞死又は上記状態を画像化するために、哺乳類にこの化合物を投与することに関する取り扱い説明書を含み得る。
【００３３】
本発明は、以下の非限定的な実施例を検討して、より完全な理解が為されるであろう。
【実施例１】
【００３４】
アポトーシス性細胞死及び壊死性細胞死に対する分子プローブとしてのシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの99mＴｃ標識化
この実施例によって、Ｃ２Ａ−ＧＳＴがアポトーシス性細胞及び壊死性細胞を特異的に認識することが実証される。99mＴｃで標識化した場合、放射性トレーサーは、十分に保存されたＣ２ＡのＰｔｄＳ結合活性と共に相対的に高い放射化学的収率及び純度を有する。またこの実施例は、上記の分子プローブを使用した細胞死の非侵襲的な視覚化を示す。
【００３５】
［材料及び方法］
Ｃ２Ａ−ＧＳＴタンパク質の過剰発現：ｐＧＥＸプラスミドでコードされたＣ２Ａ−ＧＳＴの融合タンパク質は大腸菌（ＢＬ２１株）を過剰発現させ、最小限の変更を加えてZhao  M他（Nat．Med.，7：1241-1244，2001）に記載されているように精製した。一晩培養物(overnight  culture)５０ｍｌを使用して、アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌの存在下で、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  １リットルに接種した。この培養物を３７℃で１時間培養し、最終濃度０．１ｍＭまでイソプロピルチオガラクトシド原液１ｍｌを加えることによって、タンパク質発現を誘導した。３７℃でさらに３時間培養後、４℃で１０分間、５０００ｇでの遠心分離により、細菌性細胞を回収した。溶解緩衝液１０ｍｌ（トリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ、５％グリセロール、ｐＨ７．４）でこの細菌性細胞の沈殿物を再懸濁し、１サイクルの凍結融解でこの細胞を処理した。細菌性細胞壁を分解するために、最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌまでリゾチームを加えて、室温で４０分間、インキュベートした。それから、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌまでＤＮアーゼを加えて、室温で３０分間、インキュベートを続けた。細菌性溶解物を４℃で１５分間、１００００ｇで遠心分離し、不溶性材料を除去した。この上清を、トリスＨＣｌ  ２０ｍＭ及びＮａＣｌ  １００ｍＭによってｐＨ７．４で前平衡化した総容積５ｍｌのグルタチオンアガロース（Sigma）のアフィニティクロマトグラフィカラム上に充填した。同じ緩衝液でさらに洗浄した後、溶出物の吸光度が２８０ｎｍで０．０２未満になるまで、１５ｍＭ還元型遊離グルタチオン含有同緩衝液４０ｍｌでＣ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質を溶出させた。融合タンパク質を含んだ溶出画分（それぞれ５ｍｌ）をプールし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）において、分子量が１０ｋＤａのカットオフ膜で一晩透析し、凍結乾燥して−２０℃で保存した。１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でタンパク質純度を評価して、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質は、目視検査により、１本のバンドとして観測された。典型的収率は、細菌培養物１Ｌ当たり融合タンパク質４０〜５０ｍｇであった。
【００３６】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴタンパク質の蛍光標識化：Ｃ２Ａ−ＧＳＴ（２ｍｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ溶液３００μｌに、ＦＩＴＣ原液（１２ｍｇ／ｍｌ）含有ＤＭＳＯ溶液２．３３μｌを加えること、及び室温で３時間ゆっくりと混合することによって、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣを生成させた。１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．９）１００μｌを加えることで、この反応を停止させた。ＰＢＳで平衡化したゲル濾過カラムクロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ、総容積１０ｍｌ）を使用して、蛍光標識化したタンパク質を精製した。分光光度計（モデルＵＶ１６０１ＰＣ）を使用して、２８０ｎｍ及び４９５ｎｍにおいてそれぞれ溶出分画のタンパク質及びＦＩＴＣ濃度をモニタリングした。ブラッドフォード法を用い、ＢＳＡを標準としてタンパク質濃度を測定した。精製した生成物のＦＩＴＣとタンパク質とのモル比は０．９よりも大きいと算出された。
【００３７】
室温で３時間、ホウ酸緩衝液（ホウ酸塩２５ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８．２）中でゆっくりと混合しながらＣ２Ａ−ＧＳＴ（２ｍｇ／ｍｌ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（Molecular  Probes、６２．５μｇ／ｍｌ）をインキュベーションすることによって、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０複合体を合成した。上記のように、ゲル濾過によって、蛍光タンパク質生成物を精製した。この共役法を使用して、色素とタンパク質とのモル比は０．８よりも大きいと測定された。
【００３８】
フローサイトメトリー：３７℃、５％ＣＯ2の湿潤環境で、１０％ウシ胎児血清（Gibco）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（Invitrogen）において、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ATCC，USA）を培養した。トリパンブルー色素を使用して細胞生存率を測定し、この生存率が９５％を超えることが見出された。最終濃度が３．５μｍｏｌ／Ｌのカンプトセシン(Sigma)で５時間、５×１０6細胞数／ｍｌをインキュベートすることによって、アポトーシスを誘導した。インキュベート期間の終了までに、細胞収縮、ブレブ形成、及び幾つかのアポトーシス小体形成を含む、形態学的なアポトーシスの発生が明らかになっている。
【００３９】
フローサイトメトリー分析に関して、５分間、６００ｇでの遠心分離によって、処理細胞及び未処理細胞を回収し、冷ＲＰＭＩ  １６４０培地で３回洗浄して、冷結合緩衝液（ＣａＣｌ2  ２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １５ｍＭ、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、ｐＨ７．４）で１０6／ｍｌまで細胞濃度を調整した。Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣ  ３μｌ及びヨウ化プロピジウム（５０ｍＭ）３μｌを細胞懸濁液５００μｌに加えて、５分間インキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（San  Jose，CA）ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータを使用して、サンプルを分析した。ＦＩＴＣ−アネキシンＶ（Molecular  Probes）を使用して同定手順を繰り返した。
【００４０】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴとアネキシンＶとの間の細胞結合活性における直接的な比較のために、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（赤色、励起６８０ｎｍ、放出７１０ｎｍ）及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（緑色、励起４９０ｎｍ、放出５１５ｎｍ）での処理細胞の共インキュベート(co-incubating)によって、二重標識化(double-labeling)を行った。それぞれのフローサイトメトリー分析のために、１０，０００個の細胞を計測した。
【００４１】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴの99mＴｃ標識化：以下のように99mＴｃで標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴを調製した。Ｃ２Ａ−ＧＳＴ（２ｍｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ溶液２００μｌを２−イミノチオラン（１０ｍｇ／ｍｌ、Sigma）含有ＤＭＳＯ（Fisher）溶液２．９６μｌと混合した。この混合物を室温で５分間ゆっくりと振盪し、３７℃で１時間静置した。９９ｍＴｃＯ4-で標識化したタンパク質に関して、スズ（ＩＩ）グルコヘプトネート(stannous  glucoheptonate)（ＧＨ）混合物（塩化スズ（ＩＩ）８０μｇ及びナトリウムグルコヘプトネート８ｍｇ）に９９ｍＴｃＯ4-（約５ｍｃｉ）含有０．９％ＮａＣｌ溶液５００μｌを加えて、窒素下、室温で１０分間、この反応を維持させた。99mＴｃ−ＧＨ溶液４００μｌを２−ＩＴ修飾したＣ２Ａ−ＧＳＴと混合し、室温で３０分間インキュベートした。移動相として生理食塩水を用いたＩＴＬＣ−ＳＧクロマトグラフィ・ストリップ（Gelman  Sciences）を使用して、生成物の放射化学的純度を分析した。
【００４２】
エルマン試薬を使用して、２−イミノチオラン修飾後のチオール化の程度を予測した。特に、（上記の）チオール化したＣ２Ａ−ＧＳＴ  １００μｌを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｆｉｎｅ総容積５ｍｌを使用したゲル濾過により精製して、未処理の２−イミノチオランを除去した。分画２００μｌをＰＢＳで溶出し、２８０ｎｍでの吸光度で、タンパク質の存在をモニタリングした。タンパク質ピークを含む分画をプールした。タンパク質溶液５０μｌを、０．０１Ｍエルマン試薬含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）溶液５０μｌと混合した。室温で１５分間インキュベートした後、４１２ｎｍでの吸光度を測定した。スルフヒドリル標準として、Ｌ−Ｃｙｓを使用して得られた吸光値を使用して、検量線を作成した。同時に、この製品（BioRad）で規定されているように、ブラッドフォード法を使用して、溶液中のタンパク質濃度を測定した。
【００４３】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したゲル濾過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、カラムＰＤ−１０、Amersham  Biosciences，Sweden）を行い、遊離過テクネチウム酸塩９９ｍＴｃから９９ｍＴｃで標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴを分離した。標識化したタンパク質を１ｍｌ／分の流量でＰＢＳで溶出させた。５１２ｎｍの吸光度で、ブラッドフォード法（BioRad、製造業者のプロトコルに従って）を使用して、タンパク質濃度を測定した。室温で生理食塩水中の９９ｍＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴのアリコート(aliquots)を放置すること及びインスタント薄層クロマトグラフィにより、１、２、４、６、及び８時間に設定した時間間隔後の遊離過テクネチウム酸塩の存在を測定することによって、標識化したタンパク質の安定性を測定した。対照のために、ウシ血清アルブミンを上記のように同一のプロトコルにおいて99mＴｃで標識化した。
【００４４】
Ｋd測定及び競合試験：飽和照射法を使用して、解離定数（Ｋd）に関して、アポトーシス性細胞に対する99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの結合親和力を評価した。健常なＪｕｒｋａｔ細胞及びカンプトセシンで５時間処理した細胞をそれぞれ使用して、非特異的な結合群及び特異的な結合群を調製した。フローサイトメトリー分析に従って、それぞれにおけるアポトーシス指数を測定した。細胞集合の２％未満が未処理細胞において生存不可能であったが、アポトーシス率は、カンポセシン(campothecin)処理サンプルの２５％であった。ゆっくりと撹拌しながら室温で１０分間、３．９８ｎＭ〜５１０ｎＭの漸増最終濃度の99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴで、１０7／ｍｌの濃度の細胞懸濁液５０μｌをインキュベートした。遊離タンパク質を結合タンパク質から分離するために、シリコン油１００μｌによって１０００ｇで反応混合物を１分間遠心分離し、これによりシリコン油層の上部に水溶液が残留し、細胞を底部で回収した。上清及び油層を除去した後、細胞沈殿物を含むチューブのチップを切断し、その放射能を測定した。結合チューブから非特異的な結合チューブの放射能を減算することにより、特異的な結合チューブの放射能値を得た。Ｙ軸が１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）における特異的な結合、及びＸ軸がｎＭにおける99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴのタンパク質濃度で散布図を得た。最良適合飽和曲線を作成し、最大結合能（Ｂmax）を決定した後に、最大結合能の半分（Ｂ1/2）での99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの濃度として、Ｋｄを推定した。標準偏差で３つの独立した測定値の平均として、最終的なＫdを算出した。
【００４５】
非標識のＣ２Ａ−ＧＳＴに関する99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの結合特異性を競合アッセイによって研究した。このアッセイでは、ゆっくりと撹拌しながら室温で１０分間、１５．９ｎＭ〜７８３０ｎＭに変化する漸増濃度の非標識のＣ２−ＧＳＴの存在下で、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴ  ２０μｌ（最終濃度７８ｎＭ）によって１０7／ｍｌのアポトーシス性細胞５０μｌをインキュベートした。上記のようにシリコン油を使用して、結合タンパク質及び遊離タンパク質を分離した。アポトーシス性細胞と結合した放射能の残存率を算出し、非標識のＣ２Ａ−ＧＳＴの濃度に対してプロットした。この特定の実験条件での阻害濃度（ＩＣ50）は、放射標識化したタンパク質の特異的な結合を５０％（Ｂ５０）まで低減することを要求する非標識のタンパク質濃度であると推定した。
【００４６】
ラットにおける急性心筋梗塞の特異的な取り込み：動物試験は、協会の承認を受けた実験動物の管理及び使用に関する協会及び国の指針に従った。３００〜３９０ｇの体重のスプレーグ−ドーリーラットを腹腔内にペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、齧歯類の人工呼吸器を使用して、呼吸を維持させた。手術時間及び画像化時間にわたって実時間の心電図（ＥＣＧ）をモニタリングした。開胸術を行い、第４肋間で胸を開き心臓を露出させた。心膜を鉗子で開き、肺動脈幹と左心房との間のレベルで、左冠動脈前下行枝の下部に６．０の縫合糸を通した。縫合糸を締めることで冠動脈閉塞を達成した。危険領域における血の気のない外観、並びにＱＲＳ群の顕著な拡大及びＳＴ部分の上昇を含むＥＣＧプロファイルの急激な変化により、冠動脈閉塞の成功を確認した。このモデルでは、一般的に７〜１５分の虚血で心室頻拍が起こり、全手順にわたってゆっくりとＱ波が低減した。３０分の虚血の後、縫合糸を切断することで、再灌流を開始させた。
【００４７】
再灌流後９０分で大腿静脈カテーテルを介して、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴ（１体のラット当たり０．２ｍＣｉ）を注射し、設定時点（０．５、１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、及び６０分）で側面上の大腿静脈から血液サンプルを採取した。１時間後、動物を麻酔し、心臓を除去して、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄した。梗塞した領域及び遠隔生存領域（remote  viable  regions：リモート生存可能な領域）から心筋組織の切片を取り出し、秤量して、γ線計測器（ＬＫＢ  ＷＡＬＬＡＣ  １２８２  ＣＯＭＰＵ  ＧＡＭＭＡ）を使用して放射能を計測した。対照として、酢酸ＮＨＳに不活性な99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴを使用して、このプロトコルを繰り返し、非特異的な取り込みを測定した。心筋における放射能の取り込みを％ＩＤ／ｇ組織で表した。
【００４８】
［結果］
ＦＩＴＣで標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴ及びフローサイトメトリー：ＦＩＴＣで標識化した後、精製した複合体の蛍光色素とタンパク質との平均モル比を１．２２±０．５３と推定した。図１ａは、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣ及びＰＩで標識化したカンプトセシンで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。蛍光強度の違いによって、４つの異なる細胞集団をはっきりと識別することができる。これらには、生存（Ｖ）、壊死（Ｎ）、アポトーシス（Ａ）及び早期アポトーシス（ＥＡ）が挙げられる。市販のアネキシンＶキットを使用したフローサイトメトリー分析では、処理Ｊｕｒｋａｔ細胞間でほとんど同一の分布が得られた。赤色蛍光のＣ２Ａ−ＧＳＴ−ＡＦ６８０及び緑色蛍光のアネキシンＶ−ＦＩＴＣを使用した二重標識化によって、二重陽性細胞又は二重陰性細胞のいずれかが生成され、これにより両方の分子プローブが全く同一の細胞を認識することが実証された（図１ｂ）。赤色蛍光強度及び緑色蛍光強度は、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＡＦ６８０とアネキシンＶ−ＦＩＴＣとの間の集積比によって変わる。
【００４９】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴの99mＴｃ標識化：Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質を比較的高い放射化学的収率及び純度まで99mＴｃで標識化し、その後２−イミノチオランでチオール化した。エルマン試薬を使用して測定した最適なチオール度は、タンパク質１分子当たり７つのスルフヒドリル基であった。この比で、サイズ排除精製の前後の99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの放射化学的純度はそれぞれ、８２．３％及び９５．５％であった。サイズ排除クロマトグラフィからの溶出プロファイルを図２に示す。このタンパク質ピークは、４分の保持時間で放射能のピークと共に検出する(co-resister)。遊離99mＴｃ−過テクネチウム酸塩は、６．５分のより長い保持時間を有する。シリカゲル上のインスタント薄層クロマトグラフィを使用して、標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴの放射化学的純度が９５％より大きかったことも確認された。ゲル濾過で精製した99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの比放射能を２０〜３０μＣｉ／μｇタンパク質と推定した。非チオール化Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質は、放射能の有意な取り込みを示さなかった（データ図示せず）。生理食塩水中の標識化したタンパク質の安定性を室温で試験した。インスタント薄層クロマトグラフィによって測定されるように、８時間にわたってタンパク質は放射標識を保持した（表２）。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
結合親和力及び特異性：飽和結合試験を使用して、アポトーシス性細胞に対する99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴのＫｄの推定値を得た。代表的な飽和曲線を図２に示し、これにより、放射標識化したタンパク質のこれらの細胞における有限数の結合部位との相互作用が実証された。最大結合の半分では、Ｋｄは７．１０±１．４８×１０-8Ｍであると測定された（図３）。現行の実験条件ではＩＣ50は１７．４±０．８４×１０-8Ｍであり、非標識化の競合Ｃ２Ａ−ＧＳＴの存在下において、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの結合は不可逆的であった（図４）。
【００５２】
急性の心筋梗塞の動物モデルにおけるインビボでの研究：ラットの99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの薬物動態は、相応に急速な血液クリアランスを伴う二相性であると考えられる。急速相の血中半減期は、１５分であると推定される。投与後１時間で、投与量の約２０％が循環血液中に残存した。心筋梗塞領域の放射能は、非梗塞領域のものに比べて、約２３〜２７倍であった。しかし、不活性な99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴで注射した動物モデルにおいて、梗塞領域と非梗塞領域との間には２〜６倍の差しかなかった。
【００５３】
要約すると、本明細書中の結果によって、Ｃ２Ａを使用することでアポトーシス及び壊死を認識することができ、Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質は、上記の機能を大きく変えることなく、放射標識化できることが実証された。この結果により、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴ等の放射標識化したＣ２Ａドメインを画像化プローブとして使用して、急性の梗塞における心筋の細胞死等の細胞死を非侵襲的に検出することができる。
【００５４】
蛍光標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴは、細胞死の異なる方式及び段階の細胞と結合する。Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣの取り込みは、壊死性細胞とアポトーシス性細胞とでは異なる。また、中程度の集団を有意なＣ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣの取り込みで同定したが、ＰＩに関しては陰性であった。これらの個体は、ＰｔｄＳの外面化及び無傷の細胞膜の完全性を伴う完全に進行したアポトーシス及び壊死に対する遷移状態であると考えられる。また、蛍光標識化したアネキシンＶを使用して、この見解が確認された。蛍光Ｃ２Ａ−ＧＳＴ及びアネキシンＶを使用した二重染色実験の結果によって、２つのタンパク質が同じ群の細胞と相互作用することが示される。アネキシンＶの取り込みがＣ２Ａ−ＧＳＴの存在及び濃度に依存する事実（逆もまた同様）によって、２つのタンパク質が有限数の共通の結合部位に関して競合することが示される。
【００５５】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴの一次構造において、４つの野生型のシステイン残基が存在する。Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質のチオール化がタンパク質の放射標識化を大きく高めた。２−イミノチオラン修飾前のテクネチウム99mＴｃの組み込みの欠失によって、内因性のチオール基が放射同位体に対して有益なキレート部位を形成しないことが示される。チオール化後は、放射標識化手順を室温で３０分以内に終了させることができる。この標準的なプロトコルは、一般的な核画像化施設で標識化を行うことができることを意味している。現行の方法を使用すると、標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴは比較的高い放射化学的純度、収率、及び良好な放射安定性を有する。室温で行った８時間の安定性試験の終了時には、放射化学的純度は４％未満の減少であった。
【００５６】
ＰｔｄＳがアポトーシス及び壊死の両方に対する分子マーカーであるので、ＰｔｄＳの結合は細胞死を標的としたイメージング剤としての99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの有用性の鍵となる。この放射性トレーサーの結合活性をアポトーシス性細胞との結合親和力として定量的に評価し、Ｋｄは７．１×１０-8Ｍであると推定された。
【００５７】
放射標識化した後、非標識の競合Ｃ２Ａ−ＧＳＴの存在下では、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの結合が可逆的であったという事実から明らかなように、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴはその特異性を維持していたと考えられた。このような見解によって、Ｃ２Ａ−ＧＳＴの両方の形態が、アポトーシス性細胞内で同じ明確な結合標的と特異的に相互作用することが示唆される。
【００５８】
インビボでの画像化実験の結果によって、標的に特異的な分子プローブとしての99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴは、急性の心筋梗塞の非侵襲的な検出に効果的であることが示される。断層撮影画像における放射能の局在的(focal)な取り込みは、組織学的分析で同定されるように、損傷した冠状動脈領域内の高レベルの不可逆的な細胞損傷に正の相関があった。梗塞領域への放射標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴの集積は、曝露したＰｔｄＳの結合に寄与し得る。
【実施例２】
【００５９】
99mＴｃで標識化したシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインによる梗塞の急性相における心筋の細胞死の画像化
この実施例によって、急性の梗塞のブタモデルを使用して、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）による注射後３時間での心筋のアポトーシスの非侵襲的な画像化が実証される。
【００６０】
［材料及び方法］
急性の梗塞の誘導：ＮＩＨガイダンスに厳密に従って、協会の承認によって、動物の手順を行った。最初に、成体のブタ（２０ｋｇ、ｎ＝７）を塩酸ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔して、静脈内用量のプロポフォール（１％溶液、１時間当たり６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔状態を保った。それぞれの動物に挿管し、機械で空気を送り、その心拍数及びプロファイルを心電図法（ＥＫＧ）により常時モニタリングした。右大腿動脈のカテーテルシースの取り付け後、６Ｆカテーテルを冠動脈へ送った。カテーテルの局在性及び下流の冠動脈分岐の開通性をＸ線血管造影法によって確認した。以下の位置の１つで、血管形成バルーンを挿入すること及び膨らませることによって、動脈閉塞を開始した：左冠動脈下降枝の遠位末端（ｎ＝１）、回旋枝（ｎ＝５）、又は右冠動脈（ｎ＝１）。一般的に、虚血は２０〜３０分の間続け、血管形成バルーンの空気を抜くことによって再灌流を開始した。それぞれの動物における冠動脈閉塞及び続く再灌流をＸ線血管造影法によって確認した。その一方で、ＳＴ部分の上昇及び緩やかなＱ波形成を含む急性の梗塞に特有のＥＫＧプロファイルを記録した。
【００６１】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴの放射標識化：Ｃ２Ａ−ＧＳＴの融合タンパク質を大腸菌で過剰発現し、実施例１に記載されるように精製して、99mＴｃで標識化した。簡潔に述べると、最初に１つのタンパク質当たり平均７つのスルフヒドラル(sulfhydral)基まで２−イミノチオランでＣ２Ａ−ＧＳＴをチオール化した。ゲル濾過によって未反応の２−イミノチオランを取り除いた後、スズ（ＩＩ）グルコヘプトネート溶液を使用して99mＴｃでＣ２Ａ−ＧＳＴを標識化した。サイズ排除クロマトグラフィ及びインスタント薄層クロマトグラフィを使用して、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの放射化学的純度が９５％より大きいことを確認した。放射性トレーサーの比放射能は、大体２０〜３０μＣｉ／μｇタンパク質であった。溶解血液細胞膜を使用した結合試験によって、非標識のＣ２Ａ−ＧＳＴと比べて、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの結合親和力及び特異性が大きく変わらなかったことが示された。
【００６２】
生体内分布：ＮＩＨガイダンスに従って、協会の承認によって、動物手順を行った。健常な雄及び雌のＣ５７黒色マウス（総数６４、８〜１０週齢）を８つの群に無作為に分けた。尾静脈を介して、それぞれのマウスに99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴ（０．７４ＭＢｑ）で注射した。注射後、１、１５、３０、６０、１２０、及び２４０分のそれぞれの時点で、１つの群のマウスを頚椎脱臼によって屠殺した。エネルギーレベルを１２０〜１７０ｋｅＶに設定したγ線計測によって、血液、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃、腸、筋肉、及び骨に関する放射能の取り込みを測定した。データは、％投与量±標準偏差（ＩＤ％±Ｓｔｄｖ）で表した。
【００６３】
心筋細胞死のインビボの画像化：再灌流後１時間以内に、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴ（６〜７ｍＣｉ／動物）を静脈内注射して、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＶＧ  Ｈａｗｋｅｙｅ二重モダリティＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナー（General  Electric）によって、注射後３時間のＳＰＥＣＴ画像及びＣＴ画像を得た。胸腔を解析する(covering)ＣＴスキャン後（それぞれ４０個の軸位断で１５秒）、１４０ＫｅＶのエネルギーピーク、２０％のウィンドウ、１２８×１２８のマトリックスサイズ、及びそれぞれ４５秒間計数した６度で６０個の角度図(angle  view)によってＳＰＥＣＴデータを得た。３時間後、５つの動物の亜群を屠殺し、組織学分析のためにそれぞれの心臓を除去した。残った動物を、投与後６時間及び１７時間で再び画像化し、セスタミビ(sestamibi)で血流を画像化させた。血中半減期の測定のために、放射性トレーサーの投与後最初の３時間、１０分間隔でそれぞれの動物（ｎ＝７）から静脈血サンプル０．１ｍｌを採取した。シンチレーション計測によって全ての血液サンプルの放射能を測定し、放射能の減衰を補正した。
【００６４】
放射性トレーサーの取り込みのエクスビボでの測定：３時間の画像化(imaging  session)の終了後、動物を屠殺した。心臓を除去し、体液を排出して、余分な血液を除去するために生理食塩水で速やかに洗浄した。下流の閉塞処理した(affected)冠動脈分岐の目視検査時に血の気のない範囲を梗塞領域と同定することができる。梗塞領域及び健常な遠隔生存領域由来の組織サンプルを除去し、秤量して、シンチレーション計測によって放射能を測定した。平均値及び標準偏差で、組織１ｇ当たり、１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）として結果を表した。
【００６５】
心筋の細胞死のエクスビボでの評価：心筋の細胞死の特徴的な超微細構造の変化を同定するために、４℃で２４時間、４％のパラホルムアルデヒド及び０．５％のグルタルアルデヒドにおいて梗塞領域及び遠隔生存領域由来の代表的な心筋断片を固定した。組織を脱水し、切断して、炭素格子（carbon  grids：カーボングリッド）上に置いた。透過型電子顕微鏡写真を６４，０００倍の倍率で得た。
【００６６】
さらに、これらの組織標本上でフローサイトメトリー分析を行い、ｓｕｂ−Ｇ0ＤＮＡ量で細胞の存在を定量的に評価した。
【００６７】
［結果］
マウスの生体内分布：異なる組織の時間の関数として放射能の取り込みを図５で要約している。放射標識化したＣ２Ａ−ＧＳＴの注射後に、肝臓及び腎臓に迅速な取り込みがあった。１２０分で肝臓及び腎臓のＩＤ％は、それぞれ１３．２±４．３及び１１．７±２．５であり、これにより肝臓／胆管系及び泌尿器系によるクリアランスが示された。血液クリアランスはかなり迅速であり、注射後１２０分において最初の値の１５％未満であり、心筋における取り込みが低かった。骨格筋ではごくわずかであったのに対し、脾臓及び肺における放射能の存在は有意であった。全用量の99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴをブタ及びマウスで試験し、毒性又は有意な副作用は全く見られなかった。
【００６８】
ＳＰＥＣＴ画像化：左回旋枝及び左前下行枝で冠動脈閉塞である動物個体から、それぞれＳＰＥＣＴ画像及びＣＴ画像を得た。99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの注射後３時間で画像を得た。コレジスターを行ったＳＰＥＣＴ画像及びＣＴ画像において、左心室の後壁での放射性トレーサーの有意な焦点となる取り込みが見られた。また、左冠動脈前下行枝の閉塞により与えられる虚血／再灌流損傷と一致して、心尖領域で高レベルの放射能を検出した。全ての場合において、ＳＰＥＣＴ／ＣＴコレジスター(co-registration)によって、心室の血液プールよりも高い心筋における放射能の取り込みが明らかに解決した。梗塞した心筋と遠隔生存心筋との間の信号対バックグラウンド強度(signal-to-background)比は、３．３６±０．７４であった。６時間及び１７時間での後期の時点の画質によって、信号対バックグラウンド強度比がわずかに改善し続けて、１７時間までにプラトー(plateau)となった（データ図示せず）。高い放射能の取り込み位置は、経時的に変動しないが、信号はより拡散が少なくなり、より集まるようになると考えられた。血流の異常は、99ｍＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの高い取り込みと十分に相関のある99mＴｃ−セスタミビＳＰＥＣＴ画像で同定した。99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの血液クリアランスプロファイルは二相性であると考えられた。急速クリアランス相の血中半減期が約１５分であると算出した（ｎ＝７）。注射後わずか３時間で、血液サンプルを採取したので、緩徐クリアランス相の血中半減期を正確に導出するのに、より遅い時点のデータが必要であるだろう。それにも関わらず、数時間でこの値を推定することができる。梗塞領域に加えて、マウスのこれまでの生体内分布の研究と一致して、肝臓及び腎臓の有意な放射能集積が存在した。
【００６９】
組織分析：解剖分析によってもまた、放射能と損傷した心筋との間の共局在化が確認された：組織サンプルのシンチレーション計測では、遠隔生存心筋に比べて、梗塞領域での放射能の取り込みが１１．６８±４．０２倍の上昇を示した。梗塞組織のフローサイトメトリー分析によって、ＤＮＡ量が大幅に減少して、全細胞集団の８．９％がｓｕｂＧ0相であることが示された（図６）。一方で、遠隔の(remote)健常な心筋の細胞致死率は０．１％未満であった（図６）。透過顕微鏡によって、クロマチン凝縮及びミトコンドリア膨張をそれぞれ含む梗塞部位でのアポトーシス及び壊死の両方の発生が観察された（図７）。
【００７０】
本発明は、上記の実施例に対する限定を意図しないが、添付の請求項の範囲内にあるような全てのこのような修正及び変更を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】カンプトセシンで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びＣ２Ａ−ＧＳＴ−ＦＩＴＣ又はアネキシンＶ―ＦＩＴＣを使用した二重標識化を示す。
【図１ｂ】カンプトセシンで処理したＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。Ｃ２Ａ−ＧＳＴ−ＡＦ６８０及びアネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識化した二重プローブを示す。
【図２】γ計測によって得られた放射能（黒丸）及びブラッドフォード法で染色後、５１２ｎｍでの吸光を測定したタンパク質の相対濃度（白四角）に関する、Ｇ−２５  ｓｅｐｈａｄｅｘゲル濾過カラムクロマトグラフィによる99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの溶出プロファイルを示す図である。
【図３】カンプトセシンで処理したＪｕｒｋｅｔ細胞を使用した、99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴに関する飽和照射法による解離定数（Ｋｄ）測定を示す図である。Ｋｄは、最大結合能（Ｂmax）の半分（Ｂ1/2）での99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの濃度として測定する。
【図４】非標識のＣ２Ａ−ＧＳＴに対する99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴによる競合試験を示す図である。５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、結合した放射能の半分を置換する非標識のＣ２Ａ−ＧＳＴの濃度として測定する。
【図５】尾静脈注射後、１分、１５分、３０分、６０分、１２０分、及び２４０分における、マウスの99mＴｃ−Ｃ２Ａ−ＧＳＴの生体内分布を示す図である（それぞれの時点に対して、ｎ＝８）。各組織の投与量に対するパーセンテージが経時的に示される。
【図６】ＳＰＥＣＴ画像化の後に、梗塞領域及び遠隔生存領域から採取した心臓細胞のフローサイトメトリーを示す図である。ヨウ化プロピジウムを使用して染色して、相対的なＤＮＡの量に基づきこの細胞を分類した。
【図７】梗塞部位から採取した心臓組織の組織学分析を示す図である。これにより、急性の心筋梗塞に関するこれまでの超微細構造の変化が実証されている。透過型電子顕微鏡写真が上部に示され、組織切片のＨ＆Ｅ染色が下部に示されている。クロマチン凝縮／周縁化、ミトコンドリア異常、及び筋原線維の過剰収縮(hyper-contaction)は、それぞれアスタリスク、矢印、及び矢じりで示されている。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月3日(2007.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
心筋梗塞、血管血栓症、アテローム硬化性プラーク、または腫瘍細胞死を検出するためのものである、請求項１記載の方法。
【国際調査報告】
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