(57)【要約】  分泌組換えタンパク質の濃縮調製物を得ることに関係する方法及び組成物を記述する。このタンパク質は、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）との融合タンパク質の形態で発現される。融合タンパク質は、キチンの存在下で濃縮することができる。改変ＬＡＣ４プロモーターを含むシャトルベクター、キチナーゼ陰性宿主細胞、非変性条件下でキチンから溶出可能なＣＢＤ、及び組換えタンパク質の回収を容易にするために磁化されていてもよい滅菌キチンも記述する。
2008515427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）と標的タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて、宿主発現細胞を形質転換すること、
（ｂ）前記融合タンパク質を、前記宿主発現細胞中に発現させ、該宿主発現細胞から分泌させること、及び
（ｃ）分泌組換えタンパク質の濃縮調製物が得られるように非変性条件下で所望の緩衝剤体積中に溶出可能である、分泌された前記融合タンパク質を前記ＣＢＤによってキチン調製物に結合させること、
を含む、分泌組換えタンパク質の濃縮調製物を得る方法。
【請求項２】
段階（ａ）のベクターがシャトルベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的タンパク質をコードする、ベクター中の前記ＤＮＡが、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中で転写的に休止状態であり、前記宿主発現細胞中で転写的に活性である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シャトルベクターが改変ＬＡＣ４プロモーターを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記シャトルベクターがｐＫｌＡＣ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主発現細胞がキチナーゼ欠乏細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主発現細胞が酵母細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記酵母細胞が、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種から選択される単一種である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主発現細胞がクルイベロミセスである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
クルイベロミセスがクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）変種フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）又はラクチス（ｌａｃｔｉｓ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主発現細胞が、前記融合タンパク質が培地中に分泌されるように培養物中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
培養中に培地にキチンを添加することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
キチンが無菌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
キチンが培養後に混合物に添加される、請求項１又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
キチンが、被膜、コロイド、ビーズ、カラム、マトリックス、シート及び膜から選択される形態である、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
キチンがキチンビーズであり、該ビーズが多孔質又は非多孔質である、請求項１又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記キチンビーズが磁化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ｄ）においてキチンに結合した融合タンパク質の回収が、磁力をかけることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キチンに対する融合タンパク質の結合が、結合条件とは異なる非変性条件下で前記融合タンパク質がキチンから遊離し得るように、可逆的である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）シャトルベクターを用意すること（該シャトルベクターは（ｉ）酵母宿主のゲノム中に組込まれることが可能であり、および（ｉｉ）キチン結合ドメインと標的タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。）、
（ｂ）酵母宿主発現細胞中に融合タンパク質を発現する前記シャトルベクターを用いてキチナーゼ欠乏宿主発現細胞を形質転換し、該キチナーゼ欠乏宿主発現細胞から融合タンパク質を分泌させること、及び
（ｃ）分泌されたタンパク質の濃縮調製物が得られるように、分泌融合タンパク質をＣＢＤによってキチン調製物に結合させること
を含む、分泌組換えタンパク質の濃縮調製物を得る方法。
【請求項２１】
分泌キチナーゼを発現するキチナーゼ遺伝子の変異の結果であるキチナーゼネガティブ表現型を特徴とし、野生型クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）細胞と類似の細胞密度にまで増殖することが可能である、クルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２２】
組換えタンパク質を発現し及び分泌することがさらに可能である、請求項２１に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２３】
発現がＬＡＣ４プロモーター又はその改変体によって調節される、請求項２２に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２４】
クルイベロミセス中でタンパク質を発現するが、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中ではタンパク質を実質的に発現しない、改変Ｌａｃ４プロモーターを有するシャトルベクターを含む、請求項２１に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２５】
シャトルベクターがｐＫＬＡＣＩである、請求項２２に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２６】
クルイベロミセスの増殖及び維持の少なくとも一方が可能であり、滅菌キチンをさらに含む培地をさらに含む、請求項２１に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２７】
前記滅菌キチンが磁気ビーズの形である、請求項２６に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【請求項２８】
該調製物が、キチンビーズを可逆的に結びつける磁石を含んでいてもよい容器又は該磁石と接触していてもよい容器に入れられている、請求項２１に記載のクルイベロミセス細胞調製物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ−１，４−連結非分岐ポリマーであるキチンは、セルロースに次いで地球上で２番目に豊富なポリマーである。キチンは、昆虫の外骨格（Ｍｅｒｚｅｎｄｏｒｆｅｒ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐｔｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０６：４３９３−４４１２（２００３）、無脊椎動物甲殻類の殻及び真菌細胞壁（Ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ，  ｅｄ．  Ｐ．  Ｊｏｌｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ａ．  Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，  ｐｕｂ．  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９９）中のＲｉｃｃａｒｄｏ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｎａｔｉｖｅ，  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｆｏｓｓｉｌ  ｃｈｉｔｉｎｓ”）の主成分である。キチナーゼは、キチンのβ−１，４−グリコシド結合を加水分解し、原核生物、真核生物及びウイルス中に存在する。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、キチナーゼは、効率的細胞分離において形態学的役割を果たしている（Ｋｕｒａｎｄａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １９７５８−１９７６７（１９９１））。また、植物は、キチン含有病原体に対する防御としてキチナーゼを発現する。実際、トランスジェニック植物におけるキチナーゼ遺伝子の異種発現は、ある種の植物病原体に対する耐性を高めることが判明した（Ｃａｒｓｔｅｎｓ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒｅｓ．  １２：４９７−５０８（２００３）；  Ｉｔｏｈ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６７：８４７−８５５（２００３）；  Ｋｉｍ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒｅｓ．  １２：４７５−４８４（２００３））。キチナーゼは、アミノ酸配列の類似性に基づいてグリコシル加水分解酵素のファミリー１８又はファミリー１９に属する（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２９３：７８１−７８８（１９９３））。キチナーゼ触媒ドメイン配列のファミリー間の相違は、生成物のアノマー配置の保持（ファミリー１８）又は反転（ファミリー１９）をもたらす異なるキチン加水分解機序を反映している（Ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ，  ｅｄ．  Ｐ．  Ｊｏｌｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ａ．  Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，  ｐｕｂ．  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９９）中のＲｏｂｅｒｔｕｓ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ”）。
【０００２】
大部分のキチナーゼは、互いに独立に機能する別個の触媒ドメインと非触媒ドメインとを含むモジュールドメイン構造を有する。Ｏ−グリコシル化Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富む領域は、これら２個のドメインをしばしば分離して、タンパク質分解の防止に役立ち、又はキチナーゼの分泌を助けることができる（Ａｒａｋａｎｅ，  Ｙ．，Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３：６３１−４８（２００３））。非触媒キチン結合ドメイン（ＣＢＤ。ＣｈＢＤとも称される。）は、タンパク質配列類似性に基づく３つの構造クラス（タイプ１、２又は３）の１つに属する（Ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ，  ｅｄ．  Ｐ．  Ｊｏｌｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ａ．  Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，  ｐｕｂ．  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ：  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１９９９）中のＨｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．  “Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｉｎａｓｅｓ  ｍｏｄｕｌｅｓ”）。個々のキチナーゼに応じて、ＣＢＤの存在は、触媒ドメインによるキチン加水分解を促進（Ｋｕｒａｎｄａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １９７５８−１９７６７（１９９１））又は阻害（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：３０４５−３０５４（２０００））する。
【０００３】
ＣＢＤはサイズが小さく（約５−７ｋＤａ）、キチンに対して基質結合特異性及び高結合力を有することから、キチン表面へのタンパク質の固定用親和性タグとして利用されている（Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｍ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２７：２７８−２８３（２００４）；  Ｆｅｒｒａｎｄｏｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １６２１：  ３１−４０（２００３））。例えば、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）キチナーゼＡ１タイプ３  ＣＢＤは、細菌中で発現された融合タンパク質のキチンビーズ上の固定化に使用され、インテインによって媒介されるタンパク質スプライシング（Ｆｅｒｒａｎｄｏｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １６２１：  ３１−４０（２００３））及びキチン被覆マイクロタイター皿（Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｍ．  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３２７：２７８−２８３（２００４））の基盤をなしている。真核生物タンパク質発現系は、細菌系では不可能な生物学的プロセス（例えばタンパク質グリコシル化、シャペロンによって媒介されるタンパク質折りたたみなど）が可能であるので、ＣＢＤ標識タンパク質を真核細胞から分泌させることが望ましい。しかし、多数の真核細胞、特に真菌は、キチン結合部位についてＣＢＤ標識タンパク質と競合することによって、キチン固定化処理中にＣＢＤ標識タンパク質と同時に精製されることによって、また、標的キチン被覆表面を劣化させることによって、ＣＢＤ標識タンパク質のキチンへの固定化を複雑にする内因性キチナーゼを分泌する。
【０００４】
宿主細胞から周囲の培地に分泌されたタンパク質は実質的に希釈されるので、多量に精製することになり、費用がかかり、厄介である。分泌された培地からタンパク質を分離する費用を削減し、分離を容易にすることが望ましい。
【０００５】
多量の培地からタンパク質を精製するには様々な手法がある。これらの手法は、精製に要する費用、効率及び時間が様々である。例えば、分泌培養物中のタンパク質は、沈殿によって収集することができる。この手法は、硫酸アンモニウム、アセトン、トリクロロ酢酸などの多量の沈殿剤の添加と、それに続く遠心分離又はろ過が必要である。これらの沈殿剤の多くは有毒又は揮発性であり、全ての沈殿剤でタンパク質収集にかなりの追加費用がかかる。さらに、沈殿によって、タンパク質機能がかなり失われる恐れがある。
【０００６】
別の手法は、陰イオン／陽イオン交換樹脂、疎水的相互作用樹脂、サイズ排除ゲルなどの様々な樹脂を用いたクロマトグラフィーである。クロマトグラフィーによってタンパク質を収集するには、使用した培地全てを樹脂に低流量（典型的には、１−１０ｍｌ／ｍｉｎ）で通過させる必要がある。これは、多量の培地を処理しなければならない場合には、きわめて時間がかかる恐れがある。例えば、使用培地１００リットルを流量５ｍｌ／ｍｉｎで樹脂に通すには３３３時間の処理時間がかかる。さらに、これらのタイプのクロマトグラフィー樹脂は、標的タンパク質のみを選択的に精製せず、多段階精製プロセスにおいて他の方法と併用しなければならないことが多い。
【０００７】
タンパク質構造中に組み込まれたペプチド配列と特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、標的タンパク質を選択的に精製することができるのでしばしば使用される。典型的な戦略において、ペプチド配列（例えば、ペプチド抗体エピトープ又はヘキサヒスチジン配列）を操作して所望のタンパク質配列に入れる。これらの標識と一緒に発現されるタンパク質は、対応する樹脂（例えば、固定化抗体を有する樹脂又はヘキサヒスチジン結合用ニッケル樹脂）と特異的に相互作用する。これらの方法は、少量から高度に精製されたタンパク質を生成することが多いが、大量プロセスでの実用性においてはその費用及び性能面で限界がある。例えば、抗体親和性樹脂はきわめて高価である。ニッケル樹脂は、ヒスチジン残基配列を偶然に含む望ましくないタンパク質と一緒に精製される恐れがある。
【０００８】
ビーズを含めて、磁性担体を使用する磁性技術は、培養物からタンパク質を精製するのに使用されてきた（Ｓａｆａｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：７（２００４））。この手法の問題は、個々の分泌タンパク質に結合するように各磁気ビーズ試薬をカスタマイズする必要があることである。これは、親和性リガンドをビーズに付着させる複雑な化学反応を必要とし得る。これも効率及び費用の面で障害になっている。
【０００９】
分泌タンパク質と基質との天然の親和性を利用する場合もある。例えば、リゾチームはキチンとの結合親和性を有する。その結果、ニワトリ卵白酵素をキチンに曝すと、それを精製することができる（Ｓａｆａｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：３２７−３３０（１９９３））。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の一実施形態においては、分泌組換えタンパク質の濃縮調製物を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）ＣＢＤと標的タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを用いて宿主発現細胞を形質転換すること、（ｂ）融合タンパク質を、宿主発現細胞中に発現させ、該宿主発現細胞から分泌させること、及び（ｃ）分泌組換えタンパク質の濃縮調製物が得られるように非変性条件下で所望の緩衝剤体積中に溶出可能である分泌された融合タンパク質をＣＢＤによってキチン調製物に結合させること、の各段階を含む。
【００１１】
本発明の別の実施形態においては、分泌組換えタンパク質の濃縮調製物を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）シャトルベクターを用意すること（該シャトルベクターは（ｉ）Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）中のプラスミドであり及び酵母発現細胞のゲノム中に組み込まれており、および（ｉｉ）ＣＢＤと標的タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。）、（ｂ）酵母宿主発現細胞中に融合タンパク質を発現させるシャトルベクターを用いてキチナーゼ欠乏宿主発現細胞を形質転換し、該キチナーゼ欠乏宿主発現細胞から融合タンパク質を分泌させること、及び（ｃ）分泌タンパク質の濃縮調製物が得られるように、分泌融合タンパク質をＣＢＤによってキチン調製物に結合させることの各段階を含む。
【００１２】
両方の実施形態は、シャトルベクターを用いて例示される。シャトルベクターは、ある実施形態においては、クローン化することができるが、Ｅ．コリ中では発現されず、宿主発現細胞中で発現させることができる。シャトルベクターのこのタイプの例は、改変ＬＡＣ４プロモーターを含むシャトルベクターであり、さらにｐＫＬＡＣ１によって例示される。
【００１３】
両方の実施形態は、キチナーゼが欠乏した宿主発現細胞を用いても例示される。宿主発現系は、酵母細胞、例えば、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種から選択される単一酵母種とすることができる。酵母細胞がクルイベロミセス種である場合には、酵母細胞はクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）変種フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）又はラクチス（ｌａｃｔｉｓ）から選択することができる。
【００１４】
上記実施形態の例においては、キチンは、培養中に、又は培養の最後に、培地中の酵母細胞に添加することができる。さらに培養する場合には、キチンは無菌にすべきである。キチンは、被膜、コロイド、ビーズ、カラム、マトリックス、シート又は膜とすることができる。キチンがビーズである場合には、ビーズは多孔質でも非多孔質でもよい。キチンビーズを磁化することもできる。
【００１５】
融合タンパク質は、磁力をかけることによって、磁化されたキチンに結合すると回収することができる。結合条件とは異なる非変性条件下で融合タンパク質がキチンから遊離し得るように、キチンに対する融合タンパク質の結合が可逆的であってもよい。
【００１６】
本発明の一実施形態においては、クルイベロミセス細胞調製物は、分泌キチナーゼを発現するキチナーゼ遺伝子中の変異の結果であるキチナーゼネガティブ表現型を特徴とし、野生型クルイベロミセス細胞と類似の細胞密度にまで増殖可能である。細胞密度とは、培養４８時間における細胞の乾燥重量を指す（Ｃｏｌｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１：２８６２−２８６９（２００５））。
【００１７】
好ましくは、クルイベロミセス細胞調製物は、組換え融合タンパク質を発現し、分泌することができる。発現は、ＬＡＣ４プロモーター又はその改変体によって調節することができ、例えば、クルイベロミセス中でタンパク質を発現するが、Ｅ．コリ中ではタンパク質を実質的に発現しない、改変ＬＡＣ４プロモーターを有するシャトルベクターを用いて調節することができる。シャトルベクターの例はｐＫＬＡＣ１である。
【００１８】
上記クルイベロミセス細胞調製物は、クルイベロミセスの増殖及び維持の少なくとも一方が可能である培地を含むことができる。培地は滅菌キチンを含むこともできる。滅菌キチンは、培地中に配置された磁石に、又は培地を含む容器と接触している磁石に、結合可能である磁気ビーズの形とすることができる。
【００１９】
タンパク質を産生する宿主細胞からタンパク質が培地中に分泌された後、タンパク質を濃縮する方法を本明細書に記載する。本方法は、キチンに対するＣＢＤの結合親和性を利用し、キチナーゼを分泌しない細胞を使用することによって促進することができる。キチナーゼ陰性細胞は遺伝子改変の結果として作製することができ、又は天然に存在し得る。これらのキチナーゼ欠乏改変細胞は、野生型細胞と類似の密度に、野生型細胞に匹敵する収率で増殖し得ることが望ましい。宿主細胞は、比較的多量の標的タンパク質が宿主細胞によって産生培地中に分泌されるように、適切なプロモーターの下でＣＢＤを発現するＤＮＡと融合した標的遺伝子をコードするベクターで形質転換することができる。キチン基質は、産生培地中に、又は標的タンパク質を混合物から抜き出す別個の反応器中に、存在することができる。ＣＢＤ融合タンパク質が結合すると、分泌組換えタンパク質がキチン表面に濃縮される。タンパク質は、幾つかの手法のいずれかを用いてさらに濃縮することができる。例えば、一実施形態においては、キチンを磁化し、磁場を産生培地にかけ、磁性表面に隣接するキチンビーズを濃縮する。他の実施形態は、遠心分離によるキチンビーズの沈殿を含む。次いで、標的タンパク質を濃縮キチン基質から回収することができる。
【００２０】
「濃縮」という用語は、手順を実行した後の重量と体積の比が手順前よりも大きいことを指す。
【００２１】
キチナーゼ発現をノックアウトする宿主細胞の改変
組換えＣＢＤ標識タンパク質の分泌に好ましい宿主細胞環境は、（ｉ）ＣＢＤを含む分泌融合タンパク質の調製物を汚染するキチン結合タンパク質もキチン分解活性も生じない環境、（ｉｉ）培養において高細胞密度を得ることができる環境及び（ｉｉｉ）組換えタンパク質を効率的に分泌することができる環境である。キチナーゼを分泌しない宿主細胞の利点としては、（ｉ）キチン結合部位に対するＣＢＤ標識タンパク質と内因性キチナーゼとの競合の排除、（ｉｉ）内因性キチナーゼによる、キチンに固定された融合タンパク質の汚染リスクの排除、（ｉｉｉ）内因性キチナーゼによる標的キチンマトリックスの分解の排除などが挙げられる。
【００２２】
適切な宿主細胞としては、様々な昆虫細胞培養物の産生系、哺乳動物細胞系、酵母産生系統、細菌細胞などが挙げられる。
【００２３】
製造目的でタンパク質を分泌する細胞の例としては、Ｅ．コリ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種など）、植物細胞（例えば、シロイヌナズナ種、イチイ種、ニチニチソウ種、タバコ種、イネ種、ダイズ、アルファルファ、トマトなど）、真菌細胞（例えば、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、サッカロミセス種、ピキア種、ハンゼヌラ種、ヤロウィア種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）種、ウスチラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種など）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆｌ２細胞、イラクサギンウワバ細胞、ショウジョウバエ種など）又は哺乳動物細胞（例えば、一次細胞系、ＨｅＬａ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞など）が挙げられる。これらの細胞は、マイクロリットル体積からリットル体積の培養で増殖させることができる。
【００２４】
ここでは、クルイベロミセス種を用いて、ＣＢＤと融合した分泌タンパク質を混合物から迅速かつ容易に分離することができる方法を説明する。本発明の実施形態によるクルイベロミセス属の酵母としては、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，  ｅｄ．  Ｎ．Ｊ．Ｗ．  Ｋｒｅｇｅｒｖａｎ  Ｒｉｊ：  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐ．２２４（１９８７）に規定されている酵母などが挙げられ、Ｋ．マルキシアヌス変種ラクチス（Ｋ．ラクチス）、Ｋ．マルキシアヌス変種マルキシアヌス（Ｋ．フラギリス）、Ｋ．マルキシアヌス変種ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（Ｋ．ドロソフィラルム）、Ｋ．ワルチ（ｗａｌｔｉｉ）、当分野でクルイベロミセスに分類される他の系統などが挙げられる。
【００２５】
１種類以上のキチナーゼを天然に分泌する宿主細胞においては、キチナーゼ欠失変異体は遺伝子改変によって作製することができる。遺伝子改変とは、標的遺伝子中の１個以上の塩基の抑制、置換、欠失又は付加のいずれかを指す。かかる改変は、インビトロで（単離ＤＮＡ上で）又は生体内原位置で、例えば、遺伝子工学技術によって、或いは宿主細胞を放射（Ｘ線、ガンマ線、紫外線など）又はＤＮＡの塩基の様々な官能基と反応可能な化学薬品及び例えばアルキル化剤：エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−ニトロキノリン１−オキシド（ＮＱＯ）、ビアルキル化剤、挿入剤などの変異誘発物質に暴露することによって、得ることができる。また、標的遺伝子の発現は、キチナーゼをコードする領域の一部及び／又は転写プロモーター領域の全部若しくは一部を改変することによって抑制することができる。
【００２６】
遺伝子改変は、遺伝子破壊によって得ることもできる。キチナーゼの遺伝子破壊の例を実施例１でクルイベロミセス  ラクチスについて示す。実施例に記載の方法は、あらゆるクルイベロミセス種に広範に適用することができる。
【００２７】
実施例１では、ＫｌＣｔｓ１ｐをコードするキチナーゼ遺伝子を、Ｋ．ラクチスキラープラスミドを好ましくは欠く工業用Ｋ．ラクチス系統（ＧＧ７９９）において破壊した。破壊は、キチナーゼ遺伝子の一部、例えば、Ｇ４１８耐性カセットなどの選択マーカー遺伝子を有する天然のＫ．ラクチスキチナーゼ遺伝子の最初の１６８個のアミノ酸を置換することによって起こった。
【００２８】
Ｋ．ラクチスＧＧ７９９  Δｃｔｓ１細胞は、野生型細胞と同じ高細胞密度を培養で得ることができ（実施例２）、検出可能なキチンに結合する又はキチンを分解する活性を有するタンパク質を産生せず（図３Ａ）、組換えタンパク質を豊富に分泌することができた（図６）。この系統は、組換えＣＢＤ標識タンパク質の産生用宿主として十分適していることが判明した。
【００２９】
産生目的のためには、キチナーゼ陰性変異体宿主細胞は、検出可能なキチンに結合する又はキチンを分解する活性を有する分泌タンパク質が欠乏しているにもかかわらず、野生型細胞と類似の高細胞密度を培養で実現することが望ましく、これらの細胞は組換えタンパク質を豊富に分泌できることが望ましい。従って、キチナーゼ陰性宿主細胞は、直接的に、又は産業上の有用性を有するリンカーペプチド若しくは連結化学基を介して、ＣＢＤと連結された精製組換えタンパク質を効率的に製造する発酵に使用することができる。
【００３０】
高レベルのタンパク質を酵母中で発現させ、分泌させるためのベクターの設計及び使用
様々な酵母用発現ベクターの例は、クルイベロミセスについては、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｙｅａｓｔ  １４：  １２６７−１２８３（１９９８）並びに米国特許第４，８５９，５９６号、同５，２１７，８９１号、同５，８７６，９８８号、同６，０５１，４３１号、同６，２６５，１８６号、同６，５４８，２８５号、同５，６７９，５４４号及び米国特許出願第１１／１０２，４７５号に記載されている。
【００３１】
発現ベクターは外来性とすることができる。例えば、ＹＥｐ２４は、サッカロミセス  セレビシエ中での遺伝子過剰発現に使用されるエピソームシャトルベクターである（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。サッカロミセス  セレビシエ用エピソームシャトルベクターの他の例はｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５及びｐＲＳ４１６である。クルイベロミセス中の自己複製ベクターとしては、ｐＫＤ１（Ｆａｌｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  １５：２４８（１９８６）；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：４４７１（１９８６））、ｐＥＷ１（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３８：３３７（１９９２））などが挙げられる。完全なｐＫＤ１ベクターに加えて、ｐＫＤ１複製開始点とシス作用性安定部位（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ）（ＣＳＬ）とを含むより小さなベクターが構築され、Ｋ．ラクチス中での異種タンパク質発現に使用された（Ｈｓｉｅｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４：４１１−４１６（１９９８））。他のエピソームベクターもＫ．ラクチス中で複製される。動原体（ｃｅｎ）と自己複製配列（ａｒｓ）の両方を有するプラスミドは、Ｋ．ラクチス中での真菌ｃＤＮＡの発現クローニングに使用された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇ−Ｂｅｒｇｍａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８７−９２（１９９９））。さらに、Ｋ．ラクチスＡＲＳ配列（ＫＡＲＳ）を含むベクターは、真菌α−ガラクトシダーゼ（Ｂｅｒｇｋａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．  ２１：３６５−７０（１９９２））及び植物α−アミラーゼ（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８４：６９９−７０６（１９８９））の発現に使用された。
【００３２】
他のベクターも宿主ゲノムに組み込むことができる。例えば、クルイベロミセスのゲノムに組み込まれたプラスミドについては米国特許第６，６０２，６８２号、同６，２６５，１８６号及び米国特許出願第１１／１０２，４７５号。
【００３３】
ベクターは、（ｉ）強力な酵母プロモーター、（ｉｉ）（培地中へのタンパク質の分泌が所望の場合）分泌リーダー配列をコードするＤＮＡ、（ｉｉｉ）発現されるタンパク質をコードする遺伝子、（ｉｖ）転写ターミネーター配列及び（ｖ）酵母選択マーカー遺伝子の少なくとも１つを含むべきである。これらの配列成分は、典型的には、Ｅ．コリ中のプラスミドベクター中で組み立てられ、次いで酵母細胞に移されてタンパク質を産生する。このタイプのベクターはシャトルベクターと呼ばれる。
【００３４】
シャトルベクターは、宿主細胞を形質転換する前にＥ．コリ中で調製することができるので好ましいが、本発明の実施形態はシャトルベクターに限定されない。
【００３５】
例えば、酵母ゲノムに組み込むことができるＤＮＡ断片を、ＰＣＲ又はヘリカーゼ依存性増幅（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＨＤＡ）によって構築し、酵母細胞に直接導入することができる。或いは、発現ベクターは、Ｅ．コリ以外の細菌中で、又は直接酵母細胞中で、クローニング段階によって組み立てることができる。
【００３６】
クルイベロミセス中での、より一般的には酵母中でのタンパク質の過剰発現には、酵母宿主に導入すると目的遺伝子の高レベル転写をもたらすのに適切な配列を有するＤＮＡ断片を含むシャトルベクターの構築が必要である。例えば、ＰＬＡＣ４は、ｐＫＤ１系ベクター、２ミクロン含有ベクター、動原体性ベクターなどの組み込みプラスミド又はエピソームプラスミド上に存在すると、酵母中でのタンパク質発現の強力なプロモーターとして機能し得る。（培地中へのタンパク質の分泌が所望の場合）分泌リーダー配列としては、Ｓ．セレビシエα−ＭＦプレプロ分泌リーダーペプチドなどを挙げることができる。他の原核生物又は真核生物の分泌シグナルペプチド（例えばクルイベロミセスα−接合因子プレプロ分泌シグナルペプチド、クルイベロミセスキラー毒素シグナルペプチド）又は合成分泌シグナルペプチドを使用することもできる。或いは、分泌リーダーは、所望のタンパク質の細胞発現を得るために、ベクターから全く取り除くことができる。
【００３７】
シャトルベクターは、発現のために酵母細胞に導入する前に、細菌中のクローン遺伝子を増殖させることができる。しかし、野生型ＰＬＡＣ４を利用する酵母発現系は、Ｅ．コリなどの細菌宿主細胞中でＰＬＡＣ４の制御下にある遺伝子からタンパク質の偶然の発現による悪影響を受ける恐れがある。このプロモーター活性は、翻訳産物が細菌に有害である遺伝子のクローニング効率を低下させ得る。
【００３８】
これだけに限定されないが、Ｋ．ラクチスによって例示されるクルイベロミセス種中で強力なプロモーターとして機能する能力を実質的に保持した、変異プリブナウボックス様配列を有するＰＬＡＣ４変異体を、部位特異的変異誘発によって作製することができる。これらの変異プロモーターは、野生型ＰＬＡＣ４中の未変異プリブナウボックス様配列と実質的に同様に、又はそれ以上に機能する。
【００３９】
本明細書では「変異」という用語は、野生型ＤＮＡ配列中の１個以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加のいずれかを含むものとする。
【００４０】
本発明の一実施形態においては、真菌発現宿主は酵母クルイベロミセス種であり、細菌宿主はＥ．コリであり、および一連のＰＬＡＣ４変異体は、（ａ）プロモーターの−１９８から−２１２領域、例えば位置−２０１、−２０３、−２０４、−２０７、−２０９及び−２１０は、Ｋ．ラクチス中で強力なプロモーターとして機能するプロモーターの能力を実質的に妨害しないことを特徴とし、（ｂ）プロモーターの−１３３から−１４６領域、例えば位置−１３９、−１４０、−１４１、−１４２及び−１４４は、強力なプロモーター活性を実質的に妨害しないことを特徴とし、又は（ｃ）−１９８から−２１２及び−１３３から−１４６の領域を組み込むことができることを特徴とし、（ｄ）Ｋ．ラクチスＰＬＡＣ４の−１から−２８３領域を置換する、Ｓ．セレビシエ（Ｓｃ）ＰＧＫプロモーターの２８３ｂｐ（−１から−２８３）からなるハイブリッドプロモーターが作製されたことを特徴とする。これらの置換は、米国特許出願第１１／１０２，４７５号に詳述されている。
【００４１】
転写ターミネーター配列の例はＴＴＬＡＣ４である。
【００４２】
酵母選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢなど）に対する耐性を付与する遺伝子、株の栄養要求性を補う遺伝子（例えば、ｕｒａ３、ｔｒｐ１、ｈｉｓ３、ｌｙｓ２など）又はアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子とすることができる。形質転換酵母細胞中でのアセトアミダーゼの発現によって、単純な窒素源を欠くがアセトアミドを含む培地上で増殖することが可能になる。アセトアミダーゼは、アセトアミドをアンモニアに分解する。アンモニアは窒素源として細胞が利用することができる。この選択方法の利点は、ｐＫＬＡＣ１系発現ベクターの複数の直列組込みを取り込んだ細胞の形質転換体数が増加し、単一の組込みよりも多量の組換えタンパク質が産生されることである（図５）。
【００４３】
ＰＬＡＣ４の変異体を含む上記ベクターは、Ｅ．コリ／クルイベロミセス組込みシャトルベクター、例えば、ｐＧＢＮ１及びｐＫＬＡＣ１中に挿入される（米国特許出願第１１／１０２，４７５号）。ｐＧＢＮ１及びｐＫＬＡＣ１はそれぞれコンピテントな宿主細胞の形質転換後にクルイベロミセスゲノム中に組み込まれ、続いてタンパク質の発現をもたらす。
【００４４】
米国特許出願第１１／１０２，４７５号は、酵母、より具体的にはＫ．ラクチスによって例示されるクルイベロミセス用の変異体ＰＬＡＣ４を含むシャトルベクターを記載しており、米国特許第４，８５９，５９６号、同５，２１７，８９１号、同５，８７６，９８８号、同６，０５１，４３１号、同６，２６５，１８６号、同６，５４８，２８５号、同５，６７９，５４４号に記載のベクターよりも改善されている。この改善は、改変ＬＡＣ４の酵母中での発現の有用性に起因し、また、Ｅ．コリ中でタンパク質を発現し得ず、従って細菌クローニング宿主細胞における毒性から生じる諸問題が回避されることに起因する。
【００４５】
宿主細胞中へのＤＮＡベクターの導入
ＤＮＡを宿主細胞中に導入する方法は、真核生物及び原核細胞に対して十分確立されている（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｆ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２３５：３７５−３８５（１９９４）；  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０４：６３−１１３（１９９１））。酵母では、ＤＮＡを細胞に導入する標準方法としては、遺伝的交雑、原形質体融合、リチウムを用いた形質転換、エレクトロポレーション、接合又は文献、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１（３）：  １７７−２１８（２００１），  Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０：  １５５−１６４（２０００），  Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３０：  １４７−１５３（２０００）に記載の任意の他の技術などが挙げられる。クルイベロミセス酵母の形質転換に関しては、確立された技術は、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３：  １６３（１９８３）），  Ｄｕｒｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ  １８：７（１９９０）），  Ｋａｒｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １８２：９０（１９８５））及び特許出願ＥＰ  ３６１  ９９１号に記載されている。
【００４６】
溶出性を含めたＣＢＤの諸性質
キチナーゼの成分としてのＣＢＤは、多数の異なる出所、例えば、真菌、細菌、植物及び昆虫から得ることができる。本発明ではキチナーゼに由来するあらゆるＣＢＤを使用することができるが、キチナーゼ触媒活性から分離されたＣＢＤが好ましい。結合を可能にする諸条件とは異なる非変性条件下でキチンから解離可能であるＣＢＤも好ましい。全てのＣＢＤが非変性条件下でキチンから解離可能であるとは限らない。例えば、米国特許第６，８９７，２８５号、米国特許公報第２００５−０１９６８０４号及び同２００５−０１９６８４１号に記載の通り、Ｂ．サーキュランスＣＢＤはキチンと堅固に結合するが、変異をタンパク質に導入しない限り可逆的ではない。これに対し、クルイベロミセス種は、キチンと堅固に結合するが、ＮａＯＨなど条件を変えると可逆的に解離することができる（実施例５及び６参照）。
【００４７】
クルイベロミセスは、親アルカリ性又は耐アルカリ性タンパク質の可逆的な固定化又は精製を可能にする有効な親和性タグであることが本明細書で例証された、多量に発現され、分泌されるエンドキチナーゼ（ＫＣＢＤ）を産生する。ＫＣＢＤは、触媒ドメインの非存在下でキチンに結合することができ（例えば図４Ｄ参照）、図４Ｄ及び６Ｂに示すように、クルイベロミセス中で異種発現されるタンパク質上の親和性タグとして機能することができ、約５ｍＭから５００ｍＭの範囲のＮａＯＨでキチンから解離することができる。これに対して、Ｂ．サーキュランス由来のＣＢＤ（ＢｃＣＢＤ）はこれらが不可能である。
【００４８】
ＣＢＤに結合するキチンの諸特性
合成又は天然のキチンはＣＢＤ融合タンパク質との結合に使用することができる。合成キチンの例は、アセチル化キトサン、重合Ｎ−アセチルグルコサミン単糖、多糖若しくはオリゴ糖又は重合グルコサミン単糖、オリゴ糖若しくは多糖である。グルコサミンは続いて化学的にアセチル化される。
【００４９】
天然キチンの例は、カニの甲羅、昆虫の外骨格又は真菌の細胞壁に由来するキチンや当分野で公知の出所に由来するキチンである。
【００５０】
キチンは、図７に示すように基体上に固定されていてもよい。基体の例は、プラスチックなどのポリマーである。或いは、キチンは集合して、例えば、懸濁液、コロイド、ビーズ、カラム、マトリックス、シート又は膜を形成することができる。キチンは、発酵中に発酵培地に添加するように滅菌することができ、発酵プロセスの最後に融合タンパク質と結合する、滅菌されていない形態で使用することができる。
【００５１】
ＣＢＤと融合した分泌タンパク質をキチン被覆磁気ビーズを用いて濃縮する一般に適用可能な手法
分泌ＣＢＤ融合タンパク質に結合するキチン基質は、標的タンパク質を培地から容易に取り出せるように磁化されていてもよい。磁化されたキチンは、キチンを磁性材料と組み合せることによって作製することができる。磁性材料は、鉄のやすり屑などの分散片とすることができる。好ましい実施形態においては、磁化キチンは、ビーズの形態であるが、不活性であってもよい追加の材料への被膜として使用することもできる。好ましい実施形態においては、磁化された材料は磁化キチンであるが、（ａ）標的タンパク質に結合することができ、又は標的タンパク質との融合体として発現させることができる特性及び（ｂ）磁化することができる材料に結合することができる特性を有する他の磁性材料も使用することができる。
【００５２】
一実施形態においては、磁化キチンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて分泌ＣＢＤ融合タンパク質を結合させる。ビーズのサイズは重要ではないが、直径２００ｎｍ未満のサイズから形成されるビーズは、滅菌フィルターを通過し、磁力がかけられるまで培地中でコロイドを形成する利点を有する（例えば５，１６０，７２６参照）。より大きなビーズを使用することもできる。キチンビーズは中実（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）又は多孔質（例えば、ＪＰ  ６２１５１４３０）とすることができる。さらに、ビーズは、様々な手段、例えば、鉄のやすり屑をビーズ全体に分散させることによって、又は（鉄にキチンを被覆することによって）鉄の核を有するビーズを形成することによって磁化することができる（例えば５，２６２，１７６参照）。本発明で使用する磁化キチンは好ましい実施形態においてはビーズの形態であるが、キチン表面の他の形状及びサイズを排除するものではない。
【００５３】
磁気キチンビーズは、細胞培養物の増殖中若しくは増殖後に、又は増殖細胞を培養物から除去した後に、増殖培地に添加することもできる（図９Ｂ）。従って、磁化キチンビーズは、その結合特性をさほど変化させずに滅菌できることが本発明では示された。キチンビーズを細胞増殖中に培地に添加するときには、ビーズを滅菌することが好ましい。
【００５４】
典型的には、キチンビーズに対するＣＢＤ標識タンパク質の最大結合量（図９Ｂ、段階４ａ及び４ｂ）は４℃で１時間以内に生じるが、他の温度及び時間枠も可能である。磁気キチンビーズに固定されたタンパク質を磁場中で収集し（図９Ｂ、段階５ａ及び５ｂ）、細胞、汚染タンパク質及び増殖培地をビーズから洗い流す（図９Ｂ、段階６）。次いで、キチンビーズ−タンパク質複合体を磁場から遊離させ（図１Ｂ、段階７）、収集したタンパク質は、キチン磁気ビーズ上に無期限に固定することができ（図９Ｂ、段階８ｂ）、又は溶出可能なＣＢＤを親和性タグとして用いた場合にはキチンから解離させることができる（図９Ｂ、段階８ａ）。
【００５５】
従って、磁化キチンビーズを発酵容器中の培地に添加することによって、標的タンパク質を回収するきわめて効率的な一段階プロセスを実現することができる。細胞は、磁化キチンビーズを含む培地中で増殖し、その結果、分泌ＣＢＤ標識タンパク質は、培養中にビーズに結合し、発酵容器外部の、又は所望の通りに、発酵容器内部の磁石から磁力をかける簡単な段階によって培地から直接収集することができる（図９−１１参照）。この手法は、磁化キチンビーズを滅菌する必要がある。発酵開始時又は発酵中に添加したサイズ５０−７０μｍの滅菌キチンビーズからの収率は、ビーズを発酵終了時に添加した時に得られるタンパク質の収率と類似していることがここに示された（図８）。
【００５６】
分泌タンパク質を大きな体積から濃縮する本手法の説得力のある特徴はその普遍性である。本方法は、追加のタンパク質と融合したときにキチンに結合するキチン結合ドメインの能力を利用する。追加のタンパク質の機能は、ＣＢＤの存在によって損なわれない。
【００５７】
融合タンパク質を分泌する細胞が、キチンに結合するタンパク質をそのままでは確実に産生しないことによって、競合的結合及び汚染が回避される。ＣＢＤは、キチンとかなりの結合力で結合する。所望のタンパク質ＣＢＤ融合タンパク質は、制御条件下で結合が消滅して融合タンパク質を遊離することができるようにＣＢＤを変異させることによって（米国特許第６，８９７，２８６号）、或いはインテイン切断システム又はプロテアーゼ切断を用いてタンパク質をＣＢＤ−キチン複合体から遊離させることによって（国際公開第２００４／０５３４６０号、米国特許第５，６４３，７５８号）、キチンビーズから回収することができる。さらに、タンパク質分解性切断部位がＣＢＤと所望のタンパク質との間に存在する場合には、ＣＢＤタグをプロテアーゼ（例えばエンテロキナーゼ、ｇｅｎｅｎａｓｅ、フューリン、第Ｘ因子など）による消化によって所望のタンパク質から遊離させることができる。
【００５８】
ＣＢＤ−キチン相互作用の堅牢な性質のために、ＣＢＤ標識タンパク質は、いかなる形態の磁化キチンにでも、例えばビーズにでも、迅速に固定化することができる。
【００５９】
磁化キチンがビーズ形態である場合には、結合ＣＢＤ標識タンパク質を含むキチンビーズを磁場中で数秒で収集することができる。必要に応じて、（溶出可能なＣＢＤを使用した場合）溶出緩衝剤中でインキュベートすることによって、ＣＢＤ標識タンパク質を磁化基質から解離することができる。この方法の利点としては、速度の改善、高い費用効果、簡易性などが挙げられる。
【００６０】
一般的な試験管（例えば、９６ウェルマイクロタイター皿、微量遠心管、１５ｍｌファルコンチューブ、５０ｍｌファルコンチューブ、２５０ｍｌナルゲンビンなど）に適合した磁気分離装置を使用して、ＣＢＤ標識タンパク質を数マイクロリットルから数リットルの培地から収集する（図３−６）。手順は、ＣＢＤ標識タンパク質をより多量の培地から収集できるように容易に拡大することができる。好ましい実施形態においては、磁石は希土類金属（例えばネオジム、サマリウム  コバルトなど）で構成されるが、他のタイプの磁石（例えばフェライト、セラミックス、電磁石など）を使用することもできる。
【００６１】
発現系の使用
混合物からの標的タンパク質の産生及び分離は、医薬品として、食物として、又は産業用に使用するタンパク質では必要である。発酵を主体とする製造が現在行われているタンパク質又は望ましいタンパク質の一覧は膨大である。少数の例としては、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、グリコシダーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、リグニナーゼ  キモシンなど、又はこれらの断片若しくは誘導体、血液製剤（血清アルブミン、アルファ−又はベータ−グロビン、凝固因子及び例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォンウィルブランド因子、フィブロネクチン、アルファ−１抗トリプシンなど、又はこれらの断片若しくは誘導体など）、インスリン及びその変異体、インターロイキンなどのリンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど）、ＴＮＦなど、又はこれらの断片若しくは誘導体、増殖因子（成長ホルモン、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦなど、又はこれらの断片若しくは誘導体など）、アポリポタンパク質及びその分子変異体、ワクチン製造用抗原性ポリペプチド（肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ヘルペスウイルスなど）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、或いは特に安定化部分に融合した生物活性部分を含む融合体などのポリペプチド融合体が挙げられる。
【００６２】
上記及び下記全ての参考文献並びに米国仮出願第６０／６１６，４２０号及び同６０／６９０，４７０号を参照により本明細書に組み入れる。
実施例
【実施例１】
【００６３】
以下の実施例用の材料及び方法
酵母株、培養条件及び形質転換条件
Ｋ．ラクチス株及びＳ．セレビシエ株（表１）をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン及び２％グルコース）又はＹＰＧａｌ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン及び２％ガラクトース）中で３０℃で常法に従って培養した。
【００６４】
【表１】
2008515427.tif 000003
2008515427.tif 000004
【００６５】
Ｋ．ラクチス及びＳ．セレビシエの形質転換をエレクトロポレーションによって実施した。Ｋ．ラクチスの形質転換体を、２００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天上で増殖させることによって選択した。一方、Ｓ．セレビシエ形質転換体を、系統の栄養要求性を補うのに必要な適切な補助剤を含むＳＤ培地（０．６７％酵母窒素ベース、２％グルコース）又はＳＧａｌ培地（０．６７％酵母窒素ベース、２％ガラクトース）上で増殖させることによって得た。
【００６６】
分泌Ｋ．ラクチスキチン結合タンパク質の検出及び単離
ウエスタンブロット法によって、バチルスサーキュランスキチナーゼＡ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）由来のキチン結合ドメインに対するポリクローナル抗キチン結合ドメイン抗体（α−ＣＢＤ）と交差反応する分泌Ｋ．ラクチスタンパク質を検出した。
【００６７】
（ａ）４８−９６時間増殖後に使用培地をＫ．ラクチスＧＧ７９９培養物から４０００ｘｇで１０分間の遠心分離によって単離した。
【００６８】
遠心分離後、使用培地中のタンパク質を４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ）上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に移した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）及び５％脱脂乳（ｗ／ｖ）で４℃で膜を終夜ブロックし、α−ＣＢＤポリクローナル抗体（５％脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔで１：２０００希釈）、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化抗ウサギ二次抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、５％脱脂乳を含むＰＢＳ−Ｔで１：２０００希釈）でプローブした。タンパク質−抗体複合体をＬｕｍｉＧｌｏ（商標）検出試薬（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）によって可視化した。
【００６９】
（ｂ）キチンに結合した分泌タンパク質を単離するために、Ｋ．ラクチスＧＧ７９９細胞をＹＰＤ培地２０ｍｌ中で９６時間増殖させた。細胞を培養物から遠心分離によって除去し、使用培地を、水洗したキチンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１ｍｌを含む新しい管に移し、静かに回転させながら室温で１時間インキュベートした。キチンビーズを遠心分離によって収集し、水１０ｍｌで洗浄した。タンパク質が結合したキチンビーズ約５０μｌを取り出し、タンパク質ローディングバッファー中で２分間煮沸して結合タンパク質を溶出させ、その後、溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、α−ＣＢＤポリクローナル抗体を用いたウエスタン分析又はアミノ末端タンパク質配列決定に供した。
【００７０】
Ｋ．ラクチスキチナーゼ由来のキチン結合ドメイン（ＫｌＣｔｓ１ｐ  ＣＢＤ）のキチン結合特性の分析
Ｋ．ラクチスＧＧ７９９使用培地２０ｍｌから得られたＫｌＣｔｓ１ｐを、上述したようにキチンビーズ１ｍｌに結合させた。ＫｌＣｔｓ１ｐ結合ビーズを水１０ｍｌで洗浄し、水１．５ｍｌに再懸濁させた。１００μｌ一定分量のＫｌＣｔｓ１ｐ結合ビーズを個々の使い捨てカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に分配することによってミニカラムを調製した。１ｍｌ体積（約１０ベッド体積）の以下の各緩衝剤を別個のミニカラムに通過させた：５０ｍＭクエン酸Ｎａ  ｐＨ３．０、５０ｍＭクエン酸Ｎａ  ｐＨ５．０、１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ  ｐＨ１０．０、非緩衝２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ｐＨ１２．３、５Ｍ  ＮａＣｌ及び８Ｍ尿素。次いで、各カラムを水２ｍｌで洗浄し、その後ビーズを水２００μｌに再懸濁させ、微量遠心管に移し、短時間の遠心分離によって収集した。依然としてキチンに結合しているタンパク質を、ビーズを３×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）５０ｍｌ中で５分間煮沸することによって溶出させた。溶出したタンパク質を、上述したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ウエスタン分析によって検出した。
【００７１】
様々な濃度のＮａＯＨ（０−４０ｍＭ）を用いたＫｌＣｔｓ１ｐ溶出プロファイルを同様に実施した。キチンに結合したＫｌＣｔｓ１ｐの一定分量（１００μｌ）を上述したように調製し、１．５ｍｌ微量遠心管に挿入したマイクロフィルターカップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に分配してスピンカラムを作製した。流出物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を１５，８００ｘｇで１分間の微量遠心によって収集し、廃棄した。次いで、ビーズをＮａＯＨ  １００μｌに各所望の濃度（０−４０ｍＭ）で再懸濁させ、溶出物を１５，８００ｘｇで１分間の遠心分離によって収集した。各溶出物のキチナーゼ活性を以下に示すように測定した。
【００７２】
Ｋ．ラクチスキチナーゼ遺伝子（ＫｌＣＴＳ１）の破壊
ＰＣＲに基づく方法を用いて、一方の末端にＫｌＣＴＳ１  ＤＮＡの８０−８２ｂｐを有する、ＡＤＨ２プロモーター−Ｇ４１８耐性遺伝子カセットからなる線状ＤＮＡ破壊断片を構築した。この断片は、ＫｌＣＴＳ１部位に組み込まれると、ＫｌＣｔｓ１ｐの最初の１６８個のアミノ酸をコードするＤＮＡをＧ４１８耐性カセットで置換する。ＡＤＨ−Ｇ４１８配列とハイブリッドを形成するＤＮＡ（下線なし。）を含み、ＫｌＣＴＳ１  ＤＮＡ配列からなる末端（下線あり。）を有するプライマー、
【化１】
2008515427.tif 000005
を使用して、ＡＤＨ２−Ｇ４１８含有ベクターｐＧＢＮ２からの破壊ＤＮＡ断片をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。増幅産物を用いて、Ｋ．ラクチスＧＧ７９９細胞を形質転換し、２００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＹＰＤ寒天上でコロニーを選択した。ＫｌＣＴＳ１特異的順方向プライマー５’−ＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号３）（組込み部位の上流用）及びＧ４１８特異的逆方向プライマー５’−ＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣ−３’（配列番号４）を用いた細胞全体のＰＣＲによって、破壊ＤＮＡ断片をＫｌＣＴＳ１部位に正確に組み込んだ細胞からの約６００ｂｐの診断用ＤＮＡ断片を増幅した。このようにして試験した２０個の形質転換体のうち、２個のＤｃｔｓ１  Ｋ．ラクチス系統を特定し、さらに分析した。
【００７３】
Ｓ．セレビシエ中でのＫｌＣＴＳ１の異種発現
Ｓ．セレビシエ中でＫｌＣＴＳ１を発現させるために、
【化２】
2008515427.tif 000006
を用いて遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＭＷ２０（３１）のＢａｍＨ  Ｉ−Ｓｐｈ  Ｉ部位にクローン化して、ＫｌＣＴＳ１の発現をガラクトース誘導性／グルコース抑制性Ｓ．セレビシエＧＡＬ１０プロモーターの制御下に置いた。この発現構築体をＳ．セレビシエΔｃｔｓ１系統ＲＧ６９４７に形質転換によって導入した。ＫｌＣｔｓｐ１の産生を誘導するために、スターターカルチャー２ｍｌを、２０ｍｇ／ｍｌウラシルを含むＳＤ培地中で３０℃で終夜増殖させ、その後、各培養物１ｍｌを用いてＹＰＤ培養物２０ｍｌ及びＹＰＧａｌ培養物２０ｍｌを接種した。各培養物を振とうしながら３０℃で終夜増殖させた後、使用培地のキチナーゼ産生及び顕微鏡法による細胞形態学の分析を行った。
【００７４】
キチナーゼ活性測定
１−４ＧｌｃＮＡｃ残基のキチンオリゴ糖及び４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）で各々誘導体化した４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−キトトリオシド（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ）、４−メチルウンベリフェリルＮ，Ｎ’−ジアセチル−β−Ｄ−キトテトラオシド（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ２）、４−メチルウンベリフェリルＮ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチル−β−Ｄ−キトトリオシド（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ３）又は４−メチルウンベリフェリルＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラアセチル−β−Ｄ−キトテトラオシド（４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ４）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ａｎｄ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を基質として用いた。Ｇｅｎｉｏｓ蛍光マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及び３４０ｎｍ／４６５ｎｍ励起／発光フィルターを用いて３７℃で４−ＭＵの遊離を測定することによってキチナーゼ活性を求めた。９６ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェル中の反応混合物は１００ｍｌであり、５０ｍＭ基質、１×ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝剤（異なる実験におけるｐＨ４−７）及び試料５−１０ｍｌを含んだ。初期遊離速度を記録し、酵素単位を遊離４−ＭＵ  ｐｍｏｌ／ｍｉｎとして計算した。蛍光単位から変換するために、４−ＭＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の検量線を反応条件下で用意した。
【００７５】
顕微鏡法
細胞約１−２  ＯＤ６００単位を収集し、２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド１ｍｌを用いて氷上で１時間固定した。細胞を水で２回洗浄し、封入剤（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５％Ｎ−プロピルガラート、８０％グリセリン）約１００ｍｌに再懸濁させた。隔壁染色実験においては、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ｗｈｉｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を封入剤に最終濃度１００ｍｇ／ｍｌで添加した。ｌｉｇｈｔ  ｐｈａｓｅ  Ｎｏｒｍａｓｋｉ  ｉｍａｇｉｎｇ又は蛍光ＤＡＰＩフィルター設定を用いたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡によって細胞を検査した。
【００７６】
細胞のキチン測定
細胞をＫＯＨで抽出し、アルカリ不溶性材料中のキチンをキチナーゼによってＧｌｃＮＡｃに加水分解し、既報（Ｂｕｌｉｋ，  Ｄ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｋａｒｙｏｔ．  Ｃｅｌｌ  ２：８８６−９００（２００３））のｍｉｃｒｏ  Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎアッセイによって定量した。
【実施例２】
【００７７】
Ｋ．ラクチスキチナーゼ（ＫｌＣｔｓ１ｐ）の特定及び生化学的特性決定
Ｂ．サーキュランスＣｈｉ１Ａキチン結合ドメイン（α−ＣＢＤ）に対して産生されるポリクローナル抗体をＫ．ラクチスＧＧ７９９使用培地のウエスタンブロット分析に使用して、交差反応性キチン結合ドメインを含む未変性分泌Ｋ．ラクチスタンパク質を特定した（図１）。
【００７８】
非濃縮Ｋ．ラクチスＧＧ７９９使用培地（９６時間増殖）１０ｍｌ中の分泌タンパク質を４−２０％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳゲルを用いて分離し、Ｂ．サーキュランスキチナーゼＡ１キチン結合ドメインに対して産生されたポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によってキチン結合ドメインの有無についてスクリーニングした（レーン１）。分泌タンパク質をキチンビーズに結合させ、２分間煮沸することによってＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中に直接溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した（レーン２）。
【００７９】
これらのタンパク質のいずれかがキチンに結合し得るかどうかを試験するために、使用培地をキチンビーズと混合し、室温で１時間回転させた。キチンビーズを水で洗浄し、煮沸することによって結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに直接溶出させた。ウエスタンブロット法によれば、８５ｋＤａ  ａ−ＣＢＤ交差反応性タンパク質のみがキチンに結合することができた（図１、レーン２）。このようにしてキチンビーズから直接精製したタンパク質をＮ末端タンパク質配列決定に供した。その結果、成熟タンパク質の最初の２０個のアミノ末端アミノ酸（ＦＤＩＮＡＫＤＮＶＡＶＹＷＧＱＡＳＡＡＴ）（配列番号７）が確認された。配列データベースをプローブするクエリーとしてこのアミノ酸配列を用いたｔＢＬＡＳＴｎ検索によって、問い合わせ配列に正確に一致する翻訳配列であって、Ｓ．セレビシエ細胞外キチナーゼＣｔｓ１ｐ（ＳｃＣｔｓ１ｐ）と有意な相同性を有する翻訳配列を含む、部分的に配列決定されたＫ．ラクチス遺伝子を特定した。
【００８０】
ＫｌＣＴＳ１のクローニングと配列解析
この研究の開始時には、Ｋ．ラクチスゲノムの配列はまだ報告されていなかった。従って、サザンブロット法とアンカーＰＣＲの組合せを用いて、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを用いたデータベース検索によって最初に特定した（上記）部分ＫｌＣＴＳ１配列の残部をクローン化した。ＫｌＣｔｓ１ｐ配列は、最近報告されたＫ．ラクチスゲノム配列中のＫ．ラクチスＯＲＦ  ＫＬＬＡ０Ｃ０４７３０ｇの翻訳産物と同一であった（Ｄｕｊｏｎ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３０：３５−４４（２００４））。
【００８１】
ＫｌＣＴＳ１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して８５ｋＤａの分子量を有する５５１個のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。ＫｌＣＴＳ１ｐはＳ．セレビシエＣｔｓ１ｐキチナーゼと５３％同一及び８２％類似であり、シグナルペプチド、触媒ドメイン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富むドメイン及びキチン結合ドメインからなる類似のモジュラードメイン構造を有する（図２Ａ）。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐソフトウエア（Ｎｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １０：  １−６（１９９７））によって、Ａ１９の後で開裂するシグナルペプチドの存在が予測された（図２Ａ）。これは、Ｆ２０で始まる、精製分泌ＫｌＣｔｓ１ｐから決定されるアミノ末端タンパク質配列と一致する。予測されたＫｌＣｔｓ１ｐ触媒ドメインと他のキチナーゼの触媒ドメインとのアミノ酸相同性によれば、ＫｌＣｔｓ１ｐはキチナーゼファミリー１８に属する（図２Ｂ）。さらに、ＳＭＡＲＴドメイン予測ソフトウエア（Ｌｅｔｕｎｉｃ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：  ２４２−２４４（２００２）及びＳｃｈｕｌｔｚ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ９５：  ５８５７−５８６４（１９９８））によって、６個の保存システイン残基を含むＣ末端タイプ２キチン結合ドメインの存在が示された（図２Ｃ）。
【００８２】
ＫｌＣｔｓ１ｐとＳ．セレビシエキチナーゼ（ＳｃＣｔｓ１ｐ）の触媒作用特性を比較した。Ｓ．セレビシエＣｔｓ１ｐは、酸性のｐＨが最適であるので（Ｋｕｒａｎｄａ、Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １９７５８−１９７６７（１９９１））、ＫｌＣｔｓ１ｐの基質優先度を規定するために最初にｐＨ４．５を選択した。図３Ｂに示すように、両方の酵母から得られたキチナーゼは４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ３と４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ４の両方の基質を加水分解した。しかし、Ｋ．ラクチスキチナーゼは、４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ３よりも４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ４を優先する程度がＳｃＣｔｓ１ｐとは異なる。Ｋ．ラクチス系統ＧＧ７９９の結果と類似した結果が系統ＣＢＳ２３５９及びＣＢＳ６８３から分泌されたキチナーゼに対しても得られた。さらに、ＫｌＣｔｓ１ｐは、ｐＨ４．５で最大活性を示し、ＳｃＣｔｓ１ｐよりも約０．５ｐＨ単位だけよりアルカリ性であった（図３Ｃ）。
【００８３】
ＫｌＣｔｓ１ｐ  ＣＢＤ−キチン親和性分析
ＫｌＣｔｓ１ｐとキチンビーズの会合をある条件範囲下で調べた。図４Ａによれば、ＫｌＣｔｓ１ｐのキチンとの会合は５Ｍ  ＮａＣｌ中並びにｐＨ３、ｐＨ５及びｐＨ１０の緩衝剤中で安定である。タンパク質を通常は変性させる条件である８Ｍ尿素中では、キチンに結合したＫｌＣｔｓ１ｐの約６０％しかキチンビーズから解離しなかった。しかし、ｐＨ１２．３の２０ｍＭ  ＮａＯＨ中では完全に解離した。キチンに結合したＫｌＣｔｓ１ｐの溶出プロファイルによれば、（空隙容量を含めて）最初の２つの画分では等量のタンパク質が溶出し、ＫｌＣｔｓ１ｐ−キチン会合が２０ｍＭ  ＮａＯＨ中ですぐに不安定になることが示唆された（図４Ｂ）。驚くべきことに、このようにして溶出したＫｌＣｔｓ１ｐはキチン分解活性を保持していた（図４Ｃ）。実際に、キチン結合前と２０ｍＭ  ＮａＯＨでの溶出後のキチナーゼ活性の測定によれば、キチナーゼ活性はほぼ１００％回復した。
【００８４】
ＫｌＣｔｓ１ｐ  ＣＢＤが、ｉ）ＫｌＣｔｓ１ｐ触媒ドメインとは独立して、ｉｉ）異種発現されたタンパク質に対する親和性タグとして、機能し得るかどうかを判定するために、ＫｌＣｔｓ１ｐのアミノ酸４７０−５５１由来のＣＢＤ（ＫｌＣＢＤ）とのＣ末端融合を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をＫ．ラクチスから分泌させた。比較のために、ＨＳＡを同様にＢ．サーキュランスキチナーゼＡ１タイプ３ＣＢＤ（ＢｃＣＢＤ）にも融合させ、Ｋ．ラクチスから分泌させた。ＣＢＤ融合タンパク質を実施例１に記載のようにキチンビーズに結合させ、２０ｍＭ  ＮａＯＨの存在下でそのキチン親和性を求めた。図４Ｄによれば、ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤ融合タンパク質は２０ｍＭ  ＮａＯＨ中でキチンビーズから完全に解離したのに対して、ＨＳＡ−ＢｃＣＢＤ融合タンパク質は２０ｍＭ  ＮａＯＨで徹底して洗浄してもキチンに結合したままであった。これらの結果は、ＫｌＣＢＤがＫｌＣｔｓ１ｐ触媒ドメインとは独立して機能し、２０ｍＭ  ＮａＯＨ中でのキチンからの解離は固有の特性であることを示している。また、これらのデータは、ＫｌＣＢＤを親アルカリ性若しくは耐アルカリ性タンパク質の精製又は可逆的なキチン固定化に対する溶出可能な親和性タグとして使用することができる可能性を提示している。
【００８５】
ＫｌＣＴＳ１の破壊
Ｋ．ラクチスにおけるＫｌＣｔｓ１ｐのインビボでの機能を調べるために、ＫｌＣＴＳ１対立遺伝子を分裂させて半数体細胞とした。ＰＣＲを用いた方法によって、「材料及び方法」に記載のように、カナマイシン選択マーカーカセットを含むＤＮＡ破壊断片を構築した。この断片を用いてＫ．ラクチス細胞を形質転換してＧ４１８耐性にした。形質転換体を、ＫｌＣＴＳ１部位に破壊ＤＮＡ断片が組み込まれた形質転換体について細胞全体のＰＣＲによってスクリーニングした。試験した２０個のコロニーのうち、２個は破壊ＤＮＡ断片が正確に組み込まれ（データ示さず）、ＫｌＣＴＳ１がＫ．ラクチスの生存に必須ではないことが示された。さらに、使用培地においてＫｌＣｔｓ１ｐ（図５Ａ）及びキチン分解活性（図３Ａ）が存在しないことによって示されるように、Ｋ．ラクチスＤｃｔｓ１細胞はキチナーゼを分泌しない。
【００８６】
Ｋ．ラクチス野生型（ＧＧ７９９）及びΔｃｔｓ１細胞の増殖及び細胞形態学を検討した。ＹＰＤ培地では、Δｃｔｓ１系統は、緩やかに凝集した細胞の小さなクラスターとして成長し、短時間の超音波処理によって容易に分散して単細胞になった。キチン結合色素Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ｗｈｉｔｅで染色した細胞の蛍光顕微鏡法によれば、Δｃｔｓ１細胞は隔壁を介して連結されており（図５Ｂ、右パネル）、Δｃｔｓ１細胞が細胞質分裂中に隔壁のキチンを分解できないことを示唆している。類似の表現型はＳ．セレビシエΔｃｔｓ１細胞でも認められた（Ｋｕｒａｎｄａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：  １９７５８−１９７６７（１９９１））。従って、ＫｌＣＴＳ１が正常な細胞分離をＳ．セレビシエΔｃｔｓ１細胞に回復させることができるかどうかを試験した。ＫｌＣＴＳ１をＳ．セレビシエ発現ベクター中のＧＡＬ１０ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に置いた。ＫｌＣＴＳ１を発現するＳ．セレビシエＤｃｔｓ１細胞は、ガラクトース含有培地中でＫｌＣｔｓ１ｐを分泌し（図６Ａ）、細胞凝集体を形成しない（図６Ｂ）。要約すると、これらのデータは、ＫｌＣＴＳ１とＳｃＣｔｓ１が、細胞分離に、おそらくは隔壁のキチンの分解を促進することによって、関与する機能上等価なタンパク質をコードすることを示唆している。
【００８７】
Ｋ．ラクチスキチナーゼ欠失変異体の特性決定
Δｃｔｓ１細胞が高い培養密度まで増殖し得るかどうかを調べた。Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞に付随する凝集表現型は、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）による細胞密度の測定値を野生型細胞の６５％未満にした。しかし、４８時間増殖させた野生型及びΔｃｔｓ１細胞の培養物はほぼ同一乾燥重量の細胞を産生した。さらに、細胞の全キチンは２つの系統間では有意差がなかった。細胞のキチンをＫＯＨで抽出し、キチナーゼによって加水分解すると、系統ＧＧ７９９はＧｌｃＮＡｃ  ２１．８±１．９ｎｍｏｌ／ｍｇ乾燥細胞を生成し、Δｃｔｓ１系統はＧｌｃＮＡｃ  ２０．８±１．０ｎｍｏｌ／ｍｇ乾燥細胞を生成した。従って、その穏和な成長表現型にもかかわらず、Δｃｔｓ１細胞は、培養によって野生型細胞と同じ細胞密度を依然として得ることができ、この系統（ｓｔｒａｉｎ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）がＣＢＤ標識タンパク質の商業生産に適切であることが示唆された。
【実施例３】
【００８８】
ｐＧＢＮ２−ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤの調製
ＫｌＣｔｓ１ｐのＣＢＤとヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との融合体を作製するために、
【化３】
2008515427.tif 000007
を使用して、ＫｌＣｔｓ１ｐのＣ末端の８１個のアミノ酸をコードするＤＮＡ断片をＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて増幅した。ＫｌＣｔｓ１ｐ−ＣＢＤ断片をＫ．ラクチス組み込み発現プラスミドｐＧＢＮ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）のＢｇｌ  ＩＩ−Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローン化してｐＧＢＮ２−ＫｌＣＢＤを作製した。ＨＳＡを
【化４】
2008515427.tif 000008
を用いて増幅し、ｐＧＢＮ２−ＫｌＣＢＤのＸｈｏ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ部位にクローン化した。生成した発現構築体は、Ｋ．ラクチスゲノムに組み込むと、（ｐＧＢＮ２中に存在する）Ｓ．セレビシエａ−接合因子プレプロ分泌リーダー、ＨＳＡ及びＫｌＣＢＤからなる単一のポリペプチドを産生する。
【００８９】
Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）キチナーゼＡ１に由来するカルボキシ末端タイプ３ＣＢＤ（ＢｃＣＢＤ）を含むＨＳＡを産生する対照の構築体を同様に組み立てた。
【化５】
2008515427.tif 000009
を使用して、ｐＴＹＢｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得られるＢｃＣＢＤをＰＣＲ増幅した。増幅産物をｐＧＢＮ２のＢｇｌ  ＩＩ−Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローン化してｐＧＢＮ２−ＢｃＣＢＤを作製した。ＨＳＡを、上述したように、増幅し、ｐＧＢＮ２−ＢｃＣＢＤのＸｈｏ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ部位にクローン化した。
【実施例４】
【００９０】
Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞中でのＨＳＡ−ＣＢＤの産生及び分泌
ベクターｐＧＢＮ２−ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤ（５μｇ）を、ＳａｃＩＩを用いて直線化し、Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞をエレクトロポレーションによる形質転換に用いた。形質転換体を、５ｍＭアセトアミドを含む酵母炭素ベース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上で３０℃で４日間増殖させて選択した。個々の形質転換体を使用してＹＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）２ｍｌの培養を開始し、３０℃で終夜増殖させた。終夜培養物の１：１００希釈を使用してＹＰＧａｌ（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ガラクトース）培養物２ｍｌに接種した。培養物を振とうしながら３０℃で４８時間インキュベートした。培養物１ｍｌを１５，８００×ｇで２分間微量遠心して細胞を除去することによって、使用培地を調製した。細胞を除去した使用培地の２０ｍｌ一定分量を新しい管に移し、３×タンパク質ローディングバッファー１０ｍｌと混合し、９５℃で１０分間加熱した。２０ｍｌ一定分量を１０−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上で分離させ、分泌ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤ融合タンパク質をクーマシー染色によって検出した。
【実施例５】
【００９１】
キチンビーズを用いたＨＳＡ−ＫｌＣＢＤの精製
融合タンパク質をキチンに固定することによって分泌ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤを単離するために、組み込みＨＳＡ−ＫｌＣＢＤ発現断片を含むＫ．ラクチスＤｃｔｓ１細胞（上記）をＹＰＤ培地２０ｍｌ中で９６時間増殖させた。細胞を培養物から遠心分離によって除去し、使用培地を、水洗したキチンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）１ｍｌを含む新しい管に移し、静かに回転させながら室温で１時間インキュベートした。遠心分離によってキチンビーズを収集し、水１０ｍｌで洗浄し、水１ｍｌに再懸濁させた。タンパク質が結合したキチンビーズ約５０ｍｌをＳＤＳ試料緩衝剤中で２分間煮沸することによって、固定されたＨＳＡ−ＫｌＣＢＤを溶出させ、続いて２分間微量遠心してキチンビーズを除去した。上清中の溶出したＨＳＡ−ＫｌＣＢＤを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシー染色によって、又はａ−ＣＢＤ若しくはａ−ＨＳＡ抗体を用いたウエスタン分析によって、可視化した。さらに、２０ｍＭ  ＮａＯＨ  ５ｍｌをカラム全体に通すことによって、ＨＳＡ−ＫｌＣＢＤをキチンビーズから溶出させることができる。このようにして生成したＨＳＡは、キチンに偶然に結合する、又はキチンを分解する内因性Ｋ．ラクチスタンパク質を含まない。
【実施例６】
【００９２】
磁化キチンビーズを用いたＨＳＡ−ＫｌＣＢＤの濃縮
ＣＢＤ標識ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＣＢＤ）を用いて、培養増殖の様々な段階におけるＣＢＤ標識タンパク質と磁気キチンビーズとの会合を実証した（図８参照）。Ｋ．ラクチス系統ＧＧ７９９  Δｃｔｓ１ＰＣＫｌ３の４個のＹＰＧａｌ（１％酵母エキス、２％ペプトン及び２％ガラクトース）培養物２５ｍｌに、３０℃で２４時間増殖させた２ｍｌスターターカルチャーの１００ｍｌを接種した。
【００９３】
培養物１：接種前に、２０分間の高圧蒸気殺菌によって滅菌した沈降（ｓｅｔｔｌｅｄ）キチン磁気ビーズ１ｍｌを培地中に添加した。次いで、培養物を約３００ｒ．ｐ．ｍ．で振とうしながら３０℃で７２時間インキュベートした。
【００９４】
培養物２：増殖２４時間目に、無菌磁気キチンビーズ１ｍｌを培地に添加した。培養物を約３００ｒ．ｐ．ｍ．で振とうしながら３０℃でさらに４８時間（合計７２時間）インキュベートした。
【００９５】
培養物３：７２時間後、キチン磁気ビーズ１ｍｌを第３培養物に添加し、続いて室温で１時間静かに振とうした。
【００９６】
培養物４：第４培養物から５０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間の遠心分離によって細胞を除去し、細胞を除去した使用培地に磁気キチンビーズ１ｍｌを添加し、続いて室温で１時間静かに振とうした。
【００９７】
各培養物を標準５０ｍｌの蓋付き試験管にデカントした。試験管を５０ｍｌ磁気装置（図９）に３０秒間挿入し、続いて上清をデカントすることによって磁気ビーズを収集した。次いで、試験管を磁場から取り出し、磁気キチン粒子のペレットを水４０ｍｌで洗浄し、磁場中で再度単離した。この洗浄プロセスを合計３回繰り返した後、ビーズを４本のねじ蓋付き微量遠心管に移した。結合したＨＳＡ−ＣＢＤを溶出させるために、各遠心管のビーズをジチオスレイトールを含む３×タンパク質ローディングバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）２５０ｍｌ中に懸濁させ、９８℃で５分間加熱した。各試料５ｍｌ中の溶出タンパク質を１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、クーマシー染色によって可視化した（図８）。溶出したＨＳＡ−ＣＢＤが各試料で観察され、磁気キチンビーズが培養物の増殖中又は増殖後にＣＢＤ標識タンパク質を首尾よく捕捉したことが示された。各培養物において捕捉したＨＳＡ−ＣＢＤの収率は４ｍｇ／Ｌと推定された。
【実施例７】
【００９８】
分泌ＧｌｕＣ−ＣＢＤタンパク質を濃縮するための磁化キチンビーズの使用
磁化ビーズがＣＢＤ融合タンパク質を培地から濃縮できるかどうかを試験するために、融合タンパク質（ＧｌｕＣ−ＣＢＤ。ＧｌｕＣはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のエンドプロテインをコードするＤＮＡで形質転換されたバチルス・サーキュランスの終夜培養物２０ｍｌを１２５ｍｌフラスコ中で増殖させた。ＧｌｕＣをコードするＤＮＡを、Ｂ．サーキュランスＣＢＤを含むプラスミドｐＧＮＢ５に挿入した。コンピテント細胞の形質転換を標準技術（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ．３３−３５，  ６７，  １９９０）によって実施した。比較のために、４個の培養物を増殖させた。１個はＧｌｕＣエンドプロテアーゼを発現するプラスミドを含み、３個は融合タンパク質（ＧｌｕＣ−ＣＢＤ）用プラスミドを含む。全ての実験で、５％ビーズ体積を培養物に添加した。対照として、非特異的結合を調べるために、ＧｌｕＣ構築体を含む培養物を磁気ビーズの存在下で終夜増殖させた（図１２、レーン２）。磁気ビーズを３個のＧｌｕＣ−ＣＢＤ培養物に異なる時間で添加して、インキュベーション時間が結合能力をもたらすかどうかを検討した。培養物１を増殖サイクル全体にわたってビーズの存在下で振とうしながら３７℃で終夜増殖させた（図１２、レーン３）。培養物２の場合、３７℃で１６時間増殖させた後に磁気ビーズを添加し、振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした（図１２、レーン４）。培養物３を振とうしながら３７℃で終夜増殖させ、細胞を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ  １０分間）によって除去した。磁気ビーズを上清に添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした（図１２、レーン５）。いずれの場合においても、ビーズを磁気分離ラック（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて収集し、ＬＢブロス１０ｍｌで３回、次いで１Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄した。ビーズを１Ｍ  ＮａＣｌ  １ｍｌに懸濁させ、１．５ｍｌエッペンドルフ管に移し、１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して液体を除去した。ビーズを、ＤＴＴを含む３×ＳＤＳ試料緩衝剤１００ｍｌに懸濁させ、５分間煮沸してタンパク質を除去した。１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してビーズを緩衝剤から分離した。試料を１０−２０％トリシンゲル上で分析し、ウエスタンブロットによってＰＶＤＦ膜に移し、クーマシーブルーで染色した。溶出したタンパク質のアイデンティティをＮ末端配列決定によって確認した。その結果、分泌ＧｌｕＣ−ＣＢＤ融合タンパク質は、磁気キチンビーズに結合した主要なタンパク質であり、ＳＤＳ試料緩衝剤中で煮沸することによって効率的に溶出できることが示された。また、ビーズは実験中の任意の時点でその効率を変えずに添加できることも示された。
【実施例８】
【００９９】
ルシフェラーゼの産生及びキチンビーズからのその溶出
野生型Ｋ．ラクチスＣＢＤをコードする遺伝子をベクターｐＫＬＡＣ１のＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ制限酵素切断部位にクローン化してベクターｐＫＬＡＣ１−ＫｌＣＢＤを作製した。次いで、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードする遺伝子をベクターｐＫＬＡＣ１−ＫｌＣＢＤのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素切断部位にクローン化して、ベクター由来の分泌シグナルとのＮ末端融合体及びＫｌＣＢＤ遺伝子とのＣ末端融合体を作製した。この構築体を直線化し、Ｋ．ラクチスコンピテント細胞に形質転換した。ＧＬｕｃ−ＫｌＣＤＢを分泌するＫ．ラクチス細胞から得られた使用培地１リットルをベッド体積２０ｍｌのキチンビーズと室温で１時間混合した。キチンビーズをカラムに注ぎ、続いて１０カラム体積（２００ｍｌ）の水で洗浄した。結合タンパク質を２０ｍＭ  ＮａＯＨで溶出させた。溶出画分４ｍｌを１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５  １ｍｌを含む管に収集して、カラムから流出した溶離剤を中和した。各溶出画分の１／４０希釈物２５マイクロリットルのルシフェラーゼ活性を評価し、ＲＬＵ（相対光単位（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ））で表した。図１３によれば、活性なＧＬｕｃが画分２から１０で溶出し、最高活性は画分３、４及び５であった。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ウエスタンブロットを示す図である。Ｋ．ラクチスによって使用培地中に分泌された、おおよその質量が＞２００、８５及び５０ｋＤａである３種類のタンパク質が、Ｂ．サーキュランスＣｈｉ１Ａキチン結合ドメイン（α−ＣＢＤ）に対して産生されたポリクローナル抗体と交差反応している（レーン１）。８５ｋＤａタンパク質はキチンビーズに結合し、Ｋ．ラクチスキチナーゼに対応する（レーン２）。
【図２Ａ】図２（Ａ）は、シグナルペプチド（縞）、触媒ドメイン（灰色）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに富むドメイン（白色）及びキチン結合ドメイン（黒色）を有する複数ドメインＫｌＣｔｓ１ｐキチナーゼを示す図である。シグナルペプチドの開裂はＡ１９の後で起こる。
【図２Ｂ】図２（Ｂ）は、ＫｌＣｔｓ１ｐがグリコシル加水分解酵素のファミリー１８に属することを示す図である。ＫｌＣｔｓ１ｐの予測触媒作用部位は、アミノ酸１５０−１５８の間にある。９個の位置の各々に対する代替アミノ酸を括弧内に示す。（「Ｘ」は任意のアミノ酸である。）
【図２Ｃ】図２（Ｃ）は、ＫｌＣｔｓ１ｐがタイプ２キチン結合ドメインを含むことを示す図である。ＫｌＣｔｓ１ｐ  ＣＢＤを、ＳＭＡＲＴ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）ソフトウエア（Ｌｅｔｕｎｉｃ，  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：２４２−２４４（２００２）；  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ９５：５８５７−５８６４（１９９８））によって予測されたタイプ２ＣＢＤコンセンサス配列（配列番号１４）と並列させた。ＫｌＣｔｓ１ｐ  ＣＢＤ（配列番号１５）と、真菌（クラドスポリウム・フルバム（配列番号１６）；種特異的誘発物Ａ４前駆体）、細菌（ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（配列番号１７）；Ｑ８ＸＺＬ０）、線虫（シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（配列番号１８）；推定エンドキチナーゼ）、哺乳動物（ホモ・サピエンス（配列番号１９）；キチナーゼ）及び昆虫（キイロショウジョウバエ（配列番号２０）；推定キチナーゼ３）由来の予測タイプ２ＣＢＤを含むタンパク質例とのアラインメントを示す。保存システイン残基を太字で示す。
【図３Ａ】Ｋ．ラクチスの欠失変異体は、キチナーゼ活性によって測定してＫｌＣｔｓ１ｐを分泌しないことを示す。図３（Ａ）は、ＹＰＤ培地中で３０℃で２２、４４及び６８時間の細胞増殖後に測定したキチナーゼ活性を示す図である。活性を、５０ｍＭ  ４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ３からのｐＨ４．５及び３７℃における遊離速度４−ＭＵ／ｍｉｎ（相対蛍光単位、ＲＦＵ／ｍｉｎ）として評価した。
【図３Ｂ】Ｋ．ラクチスの欠失変異体は、キチナーゼ活性によって測定してＫｌＣｔｓ１ｐを分泌しないことを示す。図３（Ｂ）は、ウエスタンブロットでは欠失変異体に対応する試料から分泌キチナーゼを検出できなかった（レーン１）のに対して、野生型ではキチナーゼを容易に検出した（レーン２）ことを示す図である。
【図４Ａ】図４（Ａ）は、α−ＣＢＤ抗体を用いたウエスタンブロット上のＫ．ラクチス由来の分泌キチナーゼ（ＫＬＣｔｓ１ｐ）の存在を示す図である。このアッセイは、分泌キチナーゼをキチンカラムに結合させ、次いで様々なｐＨの緩衝剤で溶出させる、又は２分間沸騰させる必要があった。
【図４Ｂ】図４（Ｂ）は、キチンからのキチナーゼ（ＫＬＣｔｓ１ｐ）の溶出が２０ｍＭ  ＮａＯＨを用いてほぼ即座に起こることを示す図である。キチンに結合したＫｌＣｔｓ１ｐを、５つの連続した２０ｍＭ  ＮａＯＨ  １ｍｌ画分（Ｅ０−Ｅ４、ここでＥ０はカラム空隙容量である。）として溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、α−ＣＢＤウエスタンブロット法によって検出した。
【図４Ｃ】図４（ｃ）は、２０ｍＭ  ＮａＯＨによって溶出したＫｌＣｔｓ１ｐがキチン分解活性を保持することを示すグラフである。キチンに結合したＫｌＣｔｓ１ｐを、様々な濃度のＮａＯＨを用いてキチンミニカラムから溶出させた。溶出物のキチナーゼ活性を、５０ｍＭ  ４ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ３からのｐＨ４．５及び３７℃における遊離速度４−ＭＵ／ｍｉｎを測定することによって評価した。
【図４Ｄ】図４（Ｄ）は、未変性ＫｌＣＢＤが溶出可能な親和性タグとして単独で、又は融合タンパク質の一部として機能し得ることを示す図である。ＣＢＤはＫ．ラクチスから得られ、融合タンパク質（ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−ＫｌＣＢＤ）はキチナーゼ欠乏Ｋ．ラクチス変異体（Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞）中で発現され、キチンビーズからの溶出条件は２０ｍＭ  ＮａＯＨである。これに対し、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）（ＨＳＡ−ＢｃＣＢＤ）由来のＣＢＤの融合タンパク質は、２０ｍＭ  ＮａＯＨによってキチンビーズから同様に溶出させることができない。対照（Ｂ−ＰＢ）は、キチンビーズを煮沸することによって溶出された融合タンパク質である。
【図５】ｐＧＢＮ１６（ｐＫＬＡＣ１）発現ベクターを示す図である。所望の遺伝子は、ベクター中に存在する接合因子アルファプレプロ分泌リーダー配列として同じ翻訳の読み枠中にクローン化される。特有の制限酵素切断部位を含むポリリンカーは、所望の遺伝子のクローニングを可能にするために存在する。
【図６Ａ】Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞由来の組換えタンパク質の分泌を示す。図６（Ａ）は、Δｃｔｓ１  Ｋ．ラクチス細胞由来のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の分泌を示す図である。収率は、野生型細胞由来のものと同等、又はそれ以上に良好である。
【図６Ｂ】Ｋ．ラクチスΔｃｔｓ１細胞由来の組換えタンパク質の分泌を示す。図６（Ｂ）は、Δｃｔｓ１  Ｋ．ラクチス細胞由来のＨＳＡ−ＫｌＣＢＤ融合タンパク質の分泌、及び２０ｍＭ  ＮａＯＨによるキチンからの融合タンパク質の溶出を示す図である。
【図７】Ｋ．ラクチス細胞由来のＣＢＤ標識タンパク質の分泌を概説する流れ図である。
【図８】培養増殖の様々な時点において増殖培地に添加した磁気キチンビーズを用いて培養物から単離したＣＢＤ標識ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＣＢＤ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離を示す図である。レーン１は分子量マーカーである。レーン２は、培地成分としてＫ．ラクチス培養物に７２時間添加した加圧滅菌キチン磁気ビーズから得たＨＳＡ−ＫｌＣＢＤである。レーン３は、Ｋ．ラクチス培養物に４８時間添加した加圧滅菌キチン磁気ビーズから得たＨＳＡ−ＫｌＣＢＤである。レーン４は、収集の１時間前にＫ．ラクチス培養物に添加したキチン磁気ビーズから得たＨＳＡ−ＫｌＣＢＤである。レーン５は、細胞培養上清に添加した磁気キチンビーズから得たＨＳＡ−ＫｌＣＢＤである。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、キチン磁気ビーズを用いて、希薄溶液からタンパク質を精製する方法を示す図である。  図９Ａ  段階１：磁気キチンビーズを滅菌する（例えば、高圧蒸気殺菌、紫外線、照射、化学処理など）。  段階２：滅菌キチンビーズを培地に添加した後、増殖培地に細胞を接種する。細胞培養物の増殖中に、細胞は、キチン結合ドメイン（黒円）で標識されたタンパク質（白丸）を分泌する。  段階３：分泌されたＣＢＤ標識タンパク質を増殖培地中の磁気キチンビーズに固定させる。  段階４：培養物増殖中のある時点において、結合ＣＢＤ標識タンパク質を含む磁気キチンビーズを、磁場にかけて固定することによって細胞及び増殖培地から分離する。  段階５：ビーズを所望の緩衝剤又は培地で洗浄する。  段階６：キチンビーズ−タンパク質複合体を磁場から遊離させる。  段階７ａ：キチンから解離させることができるＣＢＤを融合タンパク質の構築に使用した場合には、精製ＣＢＤ融合タンパク質を磁気キチンビーズから溶出させる。段階７ｂ：所望の用途に応じて、収集したタンパク質をキチン磁気ビーズ上に無期限に固定したままにする。
【図９Ｂ】図９Ａ及び９Ｂは、キチン磁気ビーズを用いて、希薄溶液からタンパク質を精製する方法を示す図である。  図９Ｂ  段階１：磁気キチンビーズを含まない培地に細胞を接種する。  段階２：増殖細胞は、キチン結合ドメイン（黒円）で標識されたタンパク質（白丸）を分泌する。  段階３：培養物から細胞を除去することができる（例えば、遠心分離、ろ過、凝集、重力による細胞の沈降など）。  段階４ａ：培養物の増殖中の任意の時点において、無菌磁気キチンビーズを培養物に直接添加することができる。  段階４ｂ：細胞を除去した使用培地に添加された磁気キチンビーズ。  段階５ａ及び５ｂ：ＣＢＤ標識タンパク質を、磁場にかけてビーズを固定することによって細胞及び／又は増殖培地から分離する。  段階６：ビーズを所望の緩衝剤又は培地で洗浄する。  段階７：キチンビーズ−タンパク質複合体を磁場から遊離させる。  段階８ａ：キチンから解離させることができるＣＢＤを融合タンパク質の構築に使用した場合には、精製タンパク質を磁気キチンビーズから溶出させる。  段階８ｂ：所望の用途に応じて、収集したタンパク質をキチン磁気ビーズ上に無期限に固定したままにする。
【図１０Ａ】図１０（ａ）は、マイクロタイター皿中の調製物から磁気ビーズを分離するのに適切な磁性ラックを示す図である。
【図１０Ｂ】図１０（ｂ）は、微量遠心管中の調製物から磁気ビーズを分離するのに適切な磁性ラックを示す図である。
【図１０Ｃ】図１０（ｃ）は、標準５０ｍｌ試験管中の調製物から磁気ビーズを分離するのに適切な磁性ラックを示す図である。
【図１０Ｄ】図１０（ｄ）は、標準２５０ｍｌ遠心分離ボトル中の調製物から磁気ビーズを分離するのに適切な磁性ラックを示す図である。
【図１１Ａ】図１１（ａ）は、増殖容器又は発酵槽中の調製物から磁気ビーズを分離するのに適切な、水中に投入可能な電磁石プローブを示す図である。  段階１及び２：磁気ビーズ（灰色）に固定されたタンパク質を含む増殖容器又は発酵槽に電磁石プローブ（暗灰色）を沈める。  段階３：電磁石をオンにすると、磁気ビーズがその表面に固定される。  段階４：電磁石（オン）を増殖容器又は発酵槽から取り出し、それによって磁気ビーズを単離する。
【図１１Ｂ】図１１（ｂ）は、発酵槽又は増殖容器の流出物から磁気ビーズを単離するのに適切な磁気装置を示す図である。  段階１：培地、細胞及び磁気ビーズ（灰色）に結合したタンパク質を含む発酵槽又は容器からの流出物は、発酵槽から磁気単離装置中に、又は磁気単離装置を通って、流出する。  段階２：電磁石又は着脱可能な永久磁石からなる磁気単離装置によって、残留流出物から磁気ビーズを分離する。  段階３：残余の流出物は、磁気分離装置を通過する。
【図１２】磁化キチンビーズを始めに、細胞培養中に、又は培養上清を収集した後に添加するかどうかにかかわらず、バチルス・サーキュランス由来の分泌ＧｌｕＣ−ＣＢＤ融合タンパク質を得ることができることを示す図である。ゲルは、ＳＤＳ試料緩衝剤中で煮沸することによって磁化キチンビーズから溶出後に得られたＧｌｕＣ−ＣＢＤ量を示している。  レーン１：対照−非染色標準（Ｍａｒｋ  １２−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；  レーン２：対照−ＧｌｕＣタンパク質；  レーン３：ＧｌｕＣ−ＣＢＤで形質転換されたＢ．サーキュランス細胞の終夜インキュベーション。磁化キチンビーズをインキュベーション開始時に培地に添加した；  レーン４：ＧｌｕＣ−ＣＢＤで形質転換されたＢ．サーキュランス細胞の終夜インキュベーション。磁化キチンビーズを培地収集の１時間前に培地に添加した；  レーン５：ＧｌｕＣ−ＣＢＤで形質転換されたＢ．サーキュランス細胞の終夜インキュベーション。培地を収集し、遠心分離した後に、磁化キチンビーズを上清に添加した。
【図１３】キチンカラムからの一連の画分中で得られたルシフェラーゼの量によって、ルシフェラーゼ−ＣＢＤが非変性条件下で画分２から１０として溶出し、画分３、４及び５で最も高活性であることを示したヒストグラムである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
2008515427.tif 000025
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2008515427.tif 000027
【図１０Ｂ】
2008515427.tif 000028
【図１０Ｃ】
2008515427.tif 000029
【図１０Ｄ】
2008515427.tif 000030
【図１１Ａ】
2008515427.tif 000031
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2008515427.tif 000033
【図１３】
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【配列表】
2008515427000001.app
【国際調査報告】
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2008515427.tif 000036
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