(57)【要約】  本願では、カルボジイミド縮合化学反応を用いる、糖類−タンパク質コンジュゲート化反応の実施のための改良された方法が開示される。含有される糖類またはタンパク質キャリアの性質に応じて、反応成分の１つを反応混合物へとゆっくりと加えることで、コンジュゲートの品質が向上しうる。開示された方法により作製される糖類−タンパク質コンジュゲートを含んでなる免疫原性組成物も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）において、時間が５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、時間が１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボジイミドがＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）またはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートが、０．０１〜３ｍｇ／ｍｇ糖類、０．０５〜２ｍｇ／ｍｇ糖類または０．０９〜１ｍｇ／ｍｇ糖類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類および／もしくはタンパク質キャリアが、アミノ基またはカルボキシル基を含むように誘導体化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、２つの反応性アミノ基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが、２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導体化が、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖類が、ＣＤＡＰ化学を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖類が、カルボジイミド縮合化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基を介して部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖類が、カルボジイミド化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートをポンプを用いて一定速度で添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートを前記の時間にわたって段階的に添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アリコート「ａ」を４〜１００の段階「ｓ」において添加する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アリコートのａ／ｓを各段階において添加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖類が、ステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質キャリアと前記糖類との当初比率が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）において存在する塩、例えばＮａＣｌの濃度が、０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質キャリアが、ステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）において反応ｐＨがｐＨ４．５〜６．５、ｐＨ４．７〜６．０またはｐＨ５〜５．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の反応中にＮ−ヒドロキシスクシンイミドも存在し、かつステップ（ｂ）での反応ｐＨがｐＨ４．５〜７．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）での反応温度が４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃または２２〜２７℃に維持される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）において前記アリコートがすべて添加された後に、反応がさらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間または１〜３時間維持される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
反応が完了すると、ｐＨが７．５〜９に調整される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
糖類−タンパク質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製する次なるステップ（ｃ）を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
糖類−タンパク質コンジュゲートを滅菌濾過する次なるステップ（ｄ）を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
有効用量の糖類−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化し、免疫原性組成物またはワクチンを製造する次なるステップ（ｅ）を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖類が細菌莢膜糖類であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖類の重量平均分子量が１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖類が天然の（native）多糖であるか、または×１０倍以下にサイズ分類されている（sized）（例えばマイクロ流動化により）、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖類が細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来するものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質キャリアが１以上のＴヘルパーエピトープを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質キャリアが、以下のもの：ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート。
【請求項４５】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４６】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における、請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンの使用。
【請求項４７】
有効用量の請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法。
【請求項４８】
前記疾患が、以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものである、請求項４６または４７に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカルボジイミド縮合反応を行う改良法に関する。具体的には、本発明はカルボジイミド縮合を用いた糖類およびタンパク質のコンジュゲート化に関する。本発明は同様に、本発明の糖類−タンパク質コンジュゲートを含むように作製できる免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌莢膜多糖の使用は、細菌性疾患の予防のため、長年にわたり免疫学において広く使われてきた。しかしながら、そのような使用に関連する問題は、免疫応答のＴ非依存性の性質である。これらの抗原はすなわち、幼児において免疫抗原性が低い。この問題は多糖抗原をタンパク質キャリア（Ｔヘルパーエピトープの供給源）にコンジュゲート化することによって克服されており、これを用いて、生後１年でさえも、Ｔ依存性免疫応答を誘発することができる。
【０００３】
さまざまなコンジュゲート化技術は当技術分野において公知である。コンジュゲートは米国特許第４３６５１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４６７３５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記述の直接還元的アミノ化法によって調製することができる。その他の方法は欧州特許第０−１６１−１８８号、欧州特許第２０８３７５号および欧州特許第０−４７７５０８号に記述されている。または、コンジュゲート化法は１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）を用いた糖類のヒドロキシル基の活性化に依って、シアン酸エステルを形成させてもよい。活性化糖類をこのように直接的にまたはスペーサー（リンカー）基を介してキャリアタンパク質のアミノ基にカップリングさせることができる。例えば、シアン酸エステルをヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨまたはＡＨ）とカップリングさせることができ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質キャリアのカルボキシル基を介したカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応によってキャリアタンパク質にコンジュゲート化する。そのようなコンジュゲートはＰＣＴ公開出願の国際公開公報第９３／１５７６０号（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ならびに国際公開公報第９５／０８３４８号および国際公開公報第９６／２９０９４号に記述されている。Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256も参照されたい。
【０００４】
一般に、以下のタイプのタンパク質キャリアの化学基を、カップリング／コンジュゲート化に使用することができる：
（Ａ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたアミノ基にコンジュゲート化できる、カルボキシル（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸による）；
（Ｂ）カルボジイミド化学反応を用いて糖類成分の天然のまたは誘導体化されたカルボキシル基にコンジュゲート化できる、アミノ基（例えばリジンによる）；
（Ｃ）スルフヒドリル（例えばシステインによる）；
（Ｄ）ヒドロキシル基（例えばチロシンによる）；
（Ｅ）イミダゾリル基（例えばヒスチジンによる）；
（Ｆ）グアニジル基（例えばアルギニンによる）；および
（Ｇ）インドリル基（例えばトリプトファンによる）。
【０００５】
糖類では、一般に以下の基：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２をカップリングに使用することができる。アルデヒド基は過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などのような当技術分野において公知の異なる処理の後に作出することができる。
【０００６】
直接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−タンパク質 −−−−＞ シッフ塩基 ＋ ＮａＣＮＢＨ３ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＮＨ２−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−＞ コンジュゲート。
【０００７】
スペーサー（リンカー）を介した間接的カップリング法：
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２ −−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−−ＮＨ２ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 ＋ ＥＤＡＣ −−−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる） −−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＯＨ ＋ ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ −−−＞ シアン酸エステル ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾） −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−＞ 糖類−−−−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ ＳＨ−タンパク質（露出したシステインを有する天然タンパク質または例えばＳＰＤＰによるタンパク質のアミノ基の修飾後に得られる） −−−−−＞ 糖類−Ｓ−Ｓ−タンパク質
糖類−ＣＯＯＨ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−＞ 糖類−−−−ＳＨ ＋ マレイミド−タンパク質（アミノ基の修飾） −−−−＞ コンジュゲート
糖類−アルデヒド ＋ ＮＨ２−−−−−ＮＨ２ −−−−＞ 糖類−−−ＮＨ２ ＋ ＥＤＡＣ ＋ ＣＯＯＨ−タンパク質 −−−−＞ コンジュゲート。
【０００８】
見て分かるとおり、カルボジイミド化学反応（例えば、ＥＤＡＣを用いる）は、天然に存在しうるかまたは誘導体化によって容易に挿入されうる糖類および／またはタンパク質の基を利用するので、コンジュゲート化反応にとって非常に都合が良い。それはまた、好都合なことに、ペプチド結合を通じて成分を連結する。
【０００９】
カルボジイミド（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）は、アレン構造を有する不飽和化合物である(Nakajima and Ikada 1995 Bioconjugate Chem. 6 :123-130; Hoare and Koshland 1967 JBC 242:2447-2453)。この化合物はその反応ｐＨ（４．５〜６．５）で比較的不安定であり、それ故に糖類／タンパク質／カルボジイミドコンジュゲート化反応の全成分は当技術分野において一緒に加えられる傾向がある。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者らは、コンジュゲート化の対象となる糖類およびタンパク質の性質に応じ、ある種の反応成分を混合物にゆっくり加えることで、ワクチン用に最終コンジュゲートの良好な特性を達成できることに気付いた。そうすることで、コンジュゲート中の糖類収量、コンジュゲートの滅菌濾過性、コンジュゲートの良好な制御、再現性の容易さ、および／または成分内架橋の阻止などの、１以上の利益／改善を実現することができる。
【００１１】
したがって、１つの実施形態ではカルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化する方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
水性媒体中で糖類およびタンパク質をコンジュゲート化できる限り、任意の適切なカルボジイミドを使用することができる。１つの実施形態では、カルボジイミドはＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）［ＥＤＣとしても知られる］とすることができ、またはそれはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドとすることができる。
【００１３】
本明細書の全体を通して「糖類」という用語は、多糖またはオリゴ糖を示すことができ、この両者を含む。それはリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を示すことができる。使用前に、多糖（細菌多糖などの）を供給源の菌株（例えば、細菌の）から単離してもよく、または供給源の菌株から単離し、公知の方法（例えば欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号；Shousun Chen Szu et al. - Carbohydrate Research Vol 152 p7-20 (1986)を参照のこと）により、例えばマイクロ流動化によりある程度までサイズ分類（sized）してもよい。多糖は多糖サンプルの粘性を低減するためおよび／またはコンジュゲート化生成物の濾過性を向上するためサイズ分類されてもよい。オリゴ糖は反復単位の数が少なく（典型的には５〜３０の反復単位）、典型的には加水分解された多糖である。
【００１４】
「タンパク質キャリア」という用語は、小さなペプチドと大きなポリペプチド（＞１０ｋＤａ）の両者を網羅するよう意図される。明らかに大きなポリペプチドは、何の修飾もなしに反応性アミノ基と反応性カルボキシル基の両者を含む可能性がいっそう高い。
【００１５】
本発明の目的で、「天然の（native）多糖」とは、糖類のサイズを低減することが目的のプロセスに供されていない糖類をいう。多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減るようになることがある。そのような糖類は依然として天然である。多糖がサイズ分類技術に供されている場合に限り、多糖は天然であると見なされないであろう。
【００１６】
本発明の目的で、「×２倍以下にサイズ分類される」とは、糖類のサイズを減らすようしかし天然多糖のサイズの半分以上のサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供されることを意味する。×３、×４などは同じように解釈されるべきである。すなわち、多糖のサイズを減らすようしかし天然多糖のサイズの３分の１以上、４分の１以上などのサイズを保持するよう意図される工程に、糖類が供される。
【００１７】
最終成分の全アリコートの添加のための方法ステップ（ｂ）における３５秒間〜６時間は、５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間とすることができる。それは１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、３０分間〜２時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間であってもよい。この時間は、コンジュゲート化される正確な糖類およびタンパク質に準じて調整することができる。
【００１８】
１つの実施形態では、（例えば、カルボジイミド、糖類またはタンパク質の）最終成分のアリコートを前記時間の間に一定速度で反応混合物に添加する（これは一定速度で作動するポンプを用いて達成されることが好都合である）。または、それは前記時間にわたって段階的に添加されてもよい。これはさまざまな形で行うことができるが、一般にアリコートの一部分が前記時間の全体を通して添加されるべきである。例えば、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加してもよい。例えば、ｍＬまたはｍｇで測定されるアリコート「ａ」の総量が前記時間の全体を通して４〜１００の段階（「ｓ」）において添加されてもよい。１つの実施形態では、均一な量（ａ／ｓ）が全ての段階で導入されるように、前記段階は設定される。１つの実施形態では、前記段階は前記時間「ｐ」の全体を通して（秒で）均一に間隔をあけられる。すなわち、１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われうる。ステップ（ｂ）において添加される最終成分のアリコートの量は、所望の時間内での反応物へのアリコートの添加の容易さという観点で調整することができる。カルボジイミドは水溶液（反応物に添加される前に典型的にはｐＨ７．５に緩衝化されている）としてまたは固体粉末（ＥＤＡＣは例えば、水媒体に高溶解性である）として添加されてもよい。もちろん、カルボジイミドが反応物に添加される最後の成分である場合（状況ＩＩＩ、ステップ（ｂ））、ゆっくりと溶解するカルボジイミドが使用されてもよく、したがって粉末のアリコート全体が反応物に一度に添加されるが、しかしそれは、アリコートが反応に利用可能とされる所望の時間と一致する速度で溶解する。
【００１９】
タンパク質および／または糖類がアミノまたはカルボキシル基を持っていない（あるいはこれらのうちの一方を持っているにすぎない）場合、それを誘導体化して、一方をそれに与えても（またはそれがまだ持っていないもう一方をそれに与えても）よい。例えば、反応性ヒドロキシル基を含むにすぎない糖類（例えば、髄膜炎菌（meningococcal）血清型Ａ莢膜糖類）の場合、そのような基はＥＤＡＣ縮合を実行できるように、アミノまたはカルボキシル基に対する誘導体化に使用されるはずである。これは反復サブユニット内で行われてもよく、または糖類分子の末端に存在するにすぎない基であってもよい。
【００２０】
誘導体化が行われる場合、その成分を部分的にだけ誘導体化することが有益でありうることに留意されたい。反復サブユニットを有する糖類の場合、標的エピトープは各反復の中に存在しうる。それ故に、部分的誘導体化が行われる場合（この場合、標的とされる反応性基の０．５〜２０、１〜１５、３〜１２、または５〜１０％が実際に誘導体化されることを意味する）、これにはエピトープの大部分を保存しているという利点、および過度の架橋結合を阻止するという利点がありうる。
【００２１】
糖類またはタンパク質がアミノまたはカルボキシル基だけを既に持っている場合（例えば、生来、カルボキシル基を持っているが、アミノ基を持っていないチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類）、誘導体化を行って、もう一方の種の基（すなわち、Ｖｉの場合にはアミノ基）をそれに与えることができる。しかしながら、誘導体化は部分的でありうるので、この行為はＩ型からＩＩＩ型までの本発明の好ましい反応を変えうることに留意されたい。例えば、Ｖｉ糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含んだタンパク質キャリアにコンジュゲート化される場合、状況Ｉではステップ（ｂ）においてゆっくりタンパク質のアリコートを添加する。Ｖｉ糖類のカルボキシル基がアミノ基で部分的に誘導体化されている場合、それはカルボキシル基とアミノ基の両者を持っているはずであり、したがってステップ（ｂ）においてゆっくりカルボジイミドのアリコートを添加する状況ＩＩＩが最も適切になる。
【００２２】
誘導体化はヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介して行われてもよい。それは糖類−タンパク質コンジュゲート化ステップについて上述したのと同様の化学反応（例えば、ＣＤＡＰまたはカルボジイミド化学反応）によって行われてもよい。リンカーは４〜２０、４〜１２、または５〜１０炭素原子を有することができる。それは２つの反応性アミノ基、２つの反応性カルボキシル基、または各々の１つ（例えば、ヘキサンジアミン、６−アミノカプロン酸、またはアジピン酸ジヒドラジド）を有することができる。典型的には、誘導体化は、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる。これにより最小限の成分内架橋結合で誘導体化が行われることが可能になる（これはそれ以外には、例えば、糖類のカルボキシル基がカルボジイミド縮合によってアミノ基で誘導体化されている場合に可能であるかもしれない）。過剰なリンカーはダイアフィルトレーション法などの技術を用いて容易に除去される。
【００２３】
１つの実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、ＣＤＡＰ化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。別の実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。さらなる実施形態では、糖類はその反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により（例えば、カルボジイミド化学反応を用いて）部分的に誘導体化されている。
【００２４】
コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートは（本発明の反応のステップ（ａ）または（ｂ）にあろうとも）、０．０１〜３、０．０５〜２、または０．０９〜１ｍｇカルボジイミド／ｍｇ糖類である。これらの数はカルボジイミドであるＥＤＡＣに関して計算されるが、これらの数はその他任意のカルボジイミドが使用される場合、その範囲の数に（その他のカルボジイミドの分子量）／（ＥＤＡＣの分子量）を乗じることによって調整されてもよい。
【００２５】
一般に、糖類は本発明の方法のなかでステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。例えば、オリゴ糖の場合にはいっそう高い濃度が必要とされるが、大きな多糖の場合にはずっと低い濃度がいっそう適しているであろう。それがアミノまたはカルボキシル基で誘導体化されているうちの高い側（high end）に向けられるならば、任意の架橋結合の可能性を減らすため、いっそう低い濃度が適しているかもしれない。タンパク質キャリアはステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在することができる。
【００２６】
本発明の方法のなかでタンパク質キャリアと糖類との当初比率は、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）とすることができる。この場合もやはり、これは糖類のサイズおよび性質、ならびに任意の誘導体化の程度に依るであろう。
【００２７】
塩条件（例えば、ＮａＣｌ）も糖類／タンパク質の性質によって変えられてもよい。通常、およそ０．２Ｍ ＮａＣｌが本発明の方法のステップ（ｂ）において存在してもよいが、これは０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍであってもよい。
【００２８】
本発明の方法のステップ（ｂ）におけるｐＨという観点で、反応ｐＨは、カルボジイミドが活性化される任意のｐＨ、例えば、ｐＨ ４．５〜６．５、ｐＨ ４．７〜６．０、またはｐＨ ５〜５．５であってよい。このｐＨは典型的には、必要に応じて酸／塩基の添加により反応の全体を通して維持される。ＥＤＡＣは、通常、ｐＨ ７．５で安定であるけれども、コンジュゲート化がさらに高いｐＨで行われる必要がある場合、反応中間体を安定に保つことが知られている化合物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの）がステップ（ｂ）において反応物の中に存在してもよく、その場合にはステップ（ｂ）における反応ｐＨはｐＨ ４．５〜７．５に維持されることができる。
【００２９】
本発明の方法のステップ（ｂ）の間の反応温度は、４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃、または２２〜２７℃とすることができ、典型的には反応の全体を通して維持される。
【００３０】
本発明の方法のなかで、ステップ（ｂ）においてアリコート全体が添加されたら、反応は典型的には、さらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間、または１〜３時間維持される。反応が完了したら、ｐＨを７．５〜９に（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが存在する場合にはこの高い方の側に）調整して、カルボジイミドの安定なｐＨ域に戻す。
【００３１】
コンジュゲート化されたら、糖質−タンパク質コンジュゲートを未反応成分、遊離糖類などから、そのコンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラム（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入することによって精製することができる。これは典型的には、２〜８℃で行われる。コンジュゲートを滅菌濾過し、その後で保存してもよい。最終的に、有効用量（例えば１〜２０、２〜１５、または３〜１０μｇ糖類／用量）の糖質−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤（例えば塩またはアジュバント）とともに製剤化して、免疫原性組成物またはワクチンを製造することができる。
【００３２】
本発明の糖類に関して、ウイルス、真菌、細菌または真核生物供給源のいずれの糖類が本発明の方法を用いてコンジュゲート化されてもよい。それはチフス菌（Salmonella typhi）由来のＶｉ糖類、またはＶｉ以外の糖類であってもよい。それはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型由来の莢膜糖類Ｈｉｂであってもよく、またはＨｉｂ以外の糖類であってもよい。１つの実施形態では、糖類は細菌莢膜糖類であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ（ＭｅｎＡ）、Ｂ（ＭｅｎＢ）、Ｃ（ＭｅｎＣ）、Ｗ１３５（ＭｅｎＷ）もしくはＹ（ＭｅｎＹ）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである。
【００３３】
糖類の重量平均分子量は１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００とすることができる。本明細書において糖類の分子量または平均分子量は、コンジュゲート化の前に測定された糖類の重量平均分子量（Ｍｗ）をいい、ＭＡＬＬＳによって測定される。ＭＡＬＬＳ技術は当技術分野において周知であり、典型的には、実施例２に記述されているように行われる。糖類のＭＡＬＬＳ分析の場合、２つのカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）が併せて使用されてもよく、糖類は水の中に溶出される。糖類は光散乱検出器（例えば４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（例えばＰ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。１つの実施形態では、糖類の多分散性は１〜１．５、１〜１．３、１〜１．２、１〜１．１または１〜１．０５であり、キャリアタンパク質とのコンジュゲート化の後、コンジュゲートの多分散性は１．０〜２．５、１．０〜２．０、１．０〜１．５、１．０〜１．２、１．５〜２．５、１．７〜２．２または１．５〜２．０である。多分散性測定は全てＭＡＬＬＳによる。
【００３４】
糖類は天然の多糖であっても、または２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍もしくは２０倍以下にサイズ分類されてもよい（例えばマイクロ流動化により［例えばＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器により］もしくはその他公知の技術［例えば加熱法、化学法、酸化法、超音波処理法］により）。オリゴ糖がさらに実質的にサイズ分類されていてもよい［例えば公知の加熱法、化学法、または酸化法により］。
【００３５】
これらの糖類の大部分の構造は公知である（それ故にそれらがカルボジイミド化学反応のための任意のアミノもしくはカルボキシル基、またはアミノもしくはカルボキシル基で誘導体化できるその他任意の反応性基をもともと有するかどうかは公知である）（下記表参照）。
【表１】
2008543909.tif 000002
【００３６】
糖類は細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖（上記表参照）であっても、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitides）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来してもよい。ＬＯＳは髄膜炎菌（meningococcal）免疫型Ｌ２、Ｌ３またはＬ１０であってもよい。ＬＯＳはその脂質Ａ成分のアルカリ処理によって解毒されてもよい。
【００３７】
１つの実施形態では、ＭｅｎＡ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−３の位置に少なくとも存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＣ莢膜糖類は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の（α２→９）−連結ＮｅｕＮＡｃ反復単位が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−８の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＷ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は、例えば、反復単位の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％のＯ−７および／またはＯ−９の位置に存在している。１つの実施形態では、ＭｅｎＹ莢膜糖類は、反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％が少なくとも１つまたは２つの位置でＯ−アセチル化されているように、少なくとも部分的にＯ−アセチル化されている。Ｏ−アセチル化は反復単位の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の７位および／または９位に存在している。Ｏ−アセチル化の割合は、Ｏ−アセチル化を有する反復単位の割合をいう。これはコンジュゲート化する前におよび／またはコンジュゲート化後に糖類において測定することができる。
【００３８】
タンパク質キャリアは任意のペプチドまたはタンパク質とすることができる。それは１以上のＴヘルパーエピトープを含んでもよい。本発明の１つの実施形態では、タンパク質キャリアは以下のもの：ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される。タンパク質キャリアは、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドフラグメントＣ、破傷風毒素の無毒性突然変異体［ＴＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい］、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素の他の無毒性突然変異体［例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ １９７、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ ４５（Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973）；ＣＲＭ ９、ＣＲＭ ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ １０３およびＣＲＭ１０７ならびにNicholls and YouleによりGenetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992のなかで記述されている他の突然変異；欠失あるいは１４８位のＧｌｕ（Ｇｌｕ−１４８）のＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの突然変異および／または１５８位のＡｌａ（Ａｌａ １５８）のＧｌｙへの突然変異ならびに米国特許第４７０９０１７号もしくは米国特許第４９５０７４０号に開示されている他の突然変異；少なくとも１以上の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／またはＬｙｓ ５３４の突然変異ならびに米国特許第５９１７０１７号または米国特許第６４５５６７３号に開示されている他の突然変異；あるいは米国特許第５８４３７１１号に開示されているフラグメント］（ＤＴのそのような全ての変種は、本発明の目的では同種のキャリアタンパク質であると見なされることに留意されたい）、肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ（Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13）、ＯＭＰＣ（髄膜炎菌（meningococcal）外膜タンパク質−通常は髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂから抽出される−欧州特許
第０３７２５０１号）、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（国際公開公報第９３／１７７１２号、国際公開公報第９４／０３２０８号）、百日咳タンパク質（国際公開公報第９８／５８６６８号、欧州特許第０４７１１７７号）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子もしくはホルモン（国際公開公報第９１／０１１４６号）、Ｎ１９タンパク質（Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7）のような種々の病原体由来抗原の複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824）、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ（国際公開公報第０２／０９１９９８号）、鉄取込みタンパク質（iron uptake proteins）（国際公開公報第０１／７２３３７号）、偏性嫌気性有芽胞グラム陽性桿菌（C. difficile）の毒素ＡもしくはＢ（国際公開公報第００／６１７６１号）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（欧州特許第５９４６１０号および国際公開公報第００／５６３６０号）、肺炎球菌のＰｈｔＡ（国際公開公報第９８／１８９３０号、Ｓｐ３６ともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＤ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄともいわれる）、肺炎球菌のＰｈｔＢ（国際公開公報第００／３７１０５号に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂともいわれる）、またはＰｈｔＥ（国際公開公報第００／３０２９９号に開示されており、ＢＶＨ−３といわれる）であってもよい。
【００３９】
本発明のさらなる態様では、本発明の方法により取得することができるまたは取得された糖類−タンパク質キャリアコンジュゲート（または免疫原性組成物もしくはワクチン）が提供される。
【００４０】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用、および有効用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法がさらに提供される。前記の使用または方法は、疾患が以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものでありうる。
【００４１】
本発明の免疫原性組成物はＤＴＰａまたはＤＴＰｗワクチン（例えばＤＴ、ＴＴ、および全細胞百日咳（Ｐｗ）ワクチンまたは無細胞百日咳（Ｐａ）ワクチン（例えば百日咳トキソイド、ＦＨＡ、ペルタクチン、ならびに任意で、アグルチノギン（agglutinogins）２および３を含む）のいずれかを含有するもの）を含んでもよい。そのような組合せにはＢ型肝炎に対するワクチンが含まれてもよい（例えばそれには、任意でリン酸アルミニウムに吸着されていてもよいＢ型肝炎表面抗原［ＨｅｐＢ］が含まれてもよい）。１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つ、２つもしくは全ての糖類コンジュゲートが本発明の方法によって作製されているＨｉｂ、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖類コンジュゲート、またはＨｉｂ、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲート、またはＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ糖類コンジュゲートを含む。
【００４２】
本発明の免疫原性組成物は任意で、麻疹および／または流行性耳下腺炎および／または風疹および／または水痘により引き起こされる疾患に対する防御を与えるウイルス抗原をさらに含んでもよい。例えば、本発明の免疫原性組成物は、麻疹、流行性耳下腺炎および風疹（ＭＭＲ）または麻疹、流行性耳下腺炎、風疹および水痘（ＭＭＲＶ）の抗原を含有する。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は、組成物の中に存在している髄膜炎菌（meningococcal）のおよび／またはＨｉｂの糖類コンジュゲートと同じ容器の中に存在していてもよい。１つの実施形態では、これらのウイルス抗原は凍結乾燥されている。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの抗原をさらに含む。この抗原は任意で、欧州特許第３０１９９２号、国際公開公報第０１／０９３５０号、国際公開公報第０４／１４４１７号、国際公開公報第０４／１４４１８号および国際公開公報第０４／１４４１９号に記述の髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ｂの外膜小胞調製物であってもよい。
【００４４】
一般に、本発明の免疫原性組成物は、糖類０．１〜２０μｇ、２〜１０μｇ、２〜６μｇまたは４〜７μｇの各糖類コンジュゲートの用量を含むことができる。
【００４５】
「およそ」または「約」は、本発明の目的で所与の数量の１０％くらいの範囲内と定義される。
【００４６】
１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はｐＨ ７．０〜８．０、ｐＨ ７．２〜７．６またはおよそもしくは正確にｐＨ ７．４に調整されもしくはそれらのｐＨで緩衝化され、またはそれらのｐＨに調整されている。
【００４７】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは任意で、安定化剤、例えばスクロースまたはトレハロースなどの多価アルコールの存在下で凍結乾燥されてもよい。
【００４８】
任意で、本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、免疫原に対する免疫応答を増強するのに十分な量のアジュバントを含んでもよい。適当なアジュバントはアルミニウム塩（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、スクアレン混合物（ＳＡＦ−１）、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリウム細胞壁調製物、モノホスホリル脂質Ａ、ミコール酸誘導体、非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、Ｑｕｉｌ Ａ、コレラ毒素Ｂサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、ならびにTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875によって記述されているものなどの免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭｓ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
髄膜炎菌（N. meningitidis）またはＨｉｂＭｅｎの組合せの場合、どのアルミニウム塩アジュバントもまたはどのアジュバントも全く使用しないことが好都合であるかもしれない。
【００５０】
全ての免疫原性組成物またはワクチンと同様に、免疫学的に有効な量の免疫原は実験的に決定されなければならない。考慮されるべき要因としては、免疫原性、免疫原がアジュバントまたはキャリアタンパク質もしくはその他のキャリアと複合体形成されうるか、またはそれらに共有結合されうるか否か、投与経路および投与される、免疫量の数が挙げられる。
【００５１】
本発明の医薬組成物またはワクチンの中にさまざまな濃度で活性な作用物質が存在していてもよい。典型的には、この物質の最小濃度はその目的の用途を達成するのに必要な量であり、その一方で最大濃度は、溶解状態のままでいられるか、または最初の混合物のなかで均一に懸濁されていられる最大量である。例えば、治療薬の最小量は任意で、単回の治療的に有効な投与量を与えられるものであってもよい。生物活性物質の場合、最小濃度は再調製時の生物活性に必要な量であり、最大濃度は均一な懸濁液を維持することができないポイントである。単回用量単位の場合には、その量は単回の治療的投与のものである。一般に、各用量はタンパク質抗原を１〜１００μｇ、任意で５〜５０μｇまたは５〜２５μｇ含むものと予想される。例えば、細菌糖類の用量はコンジュゲート中にて糖類１０〜２０μｇ、５〜１０μｇ、２．５〜５μｇまたは１〜２．５μｇである。
【００５２】
本発明のワクチン調製物は、全身経路または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することによって、感染を受けやすい哺乳動物（例えばヒト患者）を防御するためにまたは治療するために使用することができる。ヒト患者は任意で、乳児（月齢１２ヵ月未満の）、幼児（月齢１２〜２４ヵ月、１２〜１６ヵ月もしくは１２−１４ヵ月）、小児（２〜１０歳、３〜８歳もしくは３〜５歳）、青年（１２〜２１歳、１４〜２０歳もしくは１５〜１９歳）または成人であってもよい。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下の経路による注入、または口腔／消化管、気道、尿生殖路への粘膜投与による注入を挙げることができる。肺炎または中耳炎の治療のためのワクチンの鼻腔内投与が好ましい（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をいっそう効果的に予防し、したがってその最も初期段階で感染を弱められるからである）。本発明のワクチンは単回用量として投与することができるが、その成分を同時にまたは異なった時間に共投与することもできる（例えば、ワクチンの中に糖類が存在する場合、相互に免疫応答の最適な協調性を得るため、これらを同時にまたは細菌タンパク質ワクチンの投与から１〜２週間後に別々に投与することができよう）。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を使用することができる。例えば、ウイルス抗原をＩＤ（皮内）投与することができ、一方で細菌タンパク質をＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻腔内）投与することができる。糖類が存在する場合、それらをＩＭ（またはＩＤ）投与することができ、細菌タンパク質をＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。さらに、本発明のワクチンを初回投与ではＩＭ投与、および追加投与ではＩＮ投与することができる。
【００５３】
ワクチン調製物はVaccine Design (The subunit and adjuvant approach (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)に広く記述されている。リポソーム内の封入はFullerton、米国特許第４，２３５，８７７号に記述されている。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって作製された本発明のＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ糖類を、本発明によって作製されていないＭｅｎＷおよびＭｅｎＹと、ならびに製薬上許容される賦形剤と混合するステップを含む、本発明の免疫原性組成物またはワクチンを作製する方法である。
【００５５】
本明細書において「含む（comprising）」、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」という用語は本発明者らによれば、あらゆる場合において、それぞれ「からなる（consisting of）」、「からなる（consist of）」および「からなる（consists of）」という用語と任意で置き換え可能であると意図される。
【００５６】
この特許明細書のなかで引用される参考文献または特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５７】
本発明を添付の実施例のなかで例示する。以下の実施例は、他に詳細に記述されている場合を除き、当業者には周知であり日常的である標準的な技術を用いて行われる。これらの実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【００５８】
実施例１−多糖コンジュゲートの調製
実施例１ａ−本発明による髄膜炎菌（meningococcal）ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣ莢膜多糖コンジュゲートの調製
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【００５９】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＡ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じ反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【００６０】
１０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＡ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＡ比率０．７５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＡ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、このｐＨを維持しながら（温度を２５℃に保持して）２時間反応を進めた。
【００６１】
ＰＳＡＡＨ溶液をその当初容量の４分の１に濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーション（diafilter）し、保持物（retentate）を濾過した。
【００６２】
コンジュゲート化（カルボジイミド縮合）反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＡＡＨ溶液をＰＳＡＡＨの場合１０ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合１０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう希釈した。
【００６３】
最終比率０．９ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）をＰＳＡＨ溶液（糖類２ｇ）に添加した。ｐＨを５．０に調整した。２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＡＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドを蠕動ポンプにより（６０分で）添加した。得られた溶液を撹拌しながら＋２５℃で６０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【００６４】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）、０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約６６０ｍＬ）をカラムにアプライした（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．３０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【００６５】
スペーサーを介して破傷風トキソイドにＭｅｎＣ莢膜多糖をコンジュゲート化するために、以下の方法を用いた。多糖およびスペーサー（ＡＤＨ）の共有結合は、多糖がシアニル化剤（cyanylating agent）の１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）により、制御された条件の下で活性化されるカップリング化学反応で行われる。スペーサーはシアニル化（cyanylated）ＰＳとそのヒドラジノ基を通じ反応して、スペーサーと多糖との間に安定なイソ尿素結合を形成する。
【００６６】
２０ｍｇ／ｍＬのＭｅｎＣ（ｐＨ ６．０）［３．５ｇ］溶液を新たに調製した１００ｍｇ／ｍＬのＣＤＡＰのアセトニトリル／水（５０／５０（ｖ／ｖ））溶液で処理して、ＣＤＡＰ／ＭｅｎＣ比率１．５（ｗ／ｗ）を得た。１．５分後に、ｐＨをｐＨ １０．０に上げた。活性化ｐＨで５Ｍ ＮａＣｌを添加して、最終濃度２ＭのＮａＣｌを達成した。３分後に、ＡＤＨを添加してＡＤＨ／ＭｅｎＣ比率８．９を得た。溶液のｐＨを８．７５に下げ、（２５℃に維持して）２時間反応を進めた。
【００６７】
ＰＳＣＡＨ溶液を最小限の１５０ｍＬに濃縮し、その後、カットオフ１０ｋＤａのＦｉｌｔｒｏｎ Ｏｍｅｇａメンブレンを用い３０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌでダイアフィルトレーションし、保持物を濾過した。
【００６８】
コンジュゲート化反応の前に、精製されたＴＴ溶液およびＰＳＣＡＨ溶液（２ｇスケール）をＰＳＣＡＨの場合１５ｍｇ／ｍＬおよびＴＴの場合２０ｍｇ／ｍＬの濃度に達するよう０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【００６９】
２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、精製された破傷風トキソイドをＰＳＣＡＨ溶液に添加した。ｐＨを５．０に調整した。最終比率０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＣＡＨに達するように、ＥＤＡＣ（Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ ｐＨ ７．５中にて１６．７ｍｇ／ｍＬ）を蠕動ポンプにより（１０分で）添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間放置して、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０（最終容量の１０分の１）の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間、次いで＋２℃〜＋８℃で終夜放置した。
【００７０】
コンジュゲートを１０μｍのフィルターによって清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。カラムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．０）、 ０．０７５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、コンジュゲート（約４６０ｍＬ）をカラムにアプライした（＋２℃〜＋８℃）。溶出プールを２８０ｎｍの光学密度に応じて選別した。吸光度が０．０５に増大した時点で回収を始めた。Ｋｄが０．２０に達するまで収集を続けた。コンジュゲートを＋２０℃で濾過滅菌し、その後＋２℃〜＋８℃で保存した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質比率が１：２〜１：４（ｗ／ｗ）であった。
【００７１】
ＥＤＡＣを１０〜４５分間かけて添加する種々の実験を行った。いずれの場合にも良質のＭｅｎＣコンジュゲートが得られた。しかしながら、ＴＴコンジュゲートをＭｅｎＣ−ＡＤＨ ＋ ＥＤＡＣ混合物に最後にゆっくりと添加した場合、これはゲル、つまり精製できないコンジュゲートをもたらした。
【００７２】
ＥＤＡＣを一度に反応物の中に添加する実験も行ったが、コンジュゲートのＴＴ／ＰＳ最終比率（２．７／１）（ｗ／ｗ）は、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって得られたコンジュゲートの場合（３．３／１）よりも低かった；さらに、αＴＴおよびαＰＳ抗原性はともに、ＥＤＡＣを１０分間かけて添加する反応によって作製されたコンジュゲートに関して測定されたものよりも低かった。
【００７３】
多糖の％誘導体化近似値に関する注記
ＭｅｎＣＡＨ：ＡＤＨでのＣＤＡＰ処理後、約３．４７％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復サブユニットあたり利用可能なヒドロキシル基は２つと推定される）。ＭｅｎＡの場合：約１１．５％のヒドロキシル基をＡＤＨで誘導体化した（反復単位あたり利用可能なヒドロキシル基は１つしかないと考えられる）。
【００７４】
実施例１ｂ−肺炎球菌の莢膜ＰＳ ３多糖コンジュゲートの調製
１）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３−ＴＴＡＨ２０８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１０％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度３ｍｇ／ｍＬで２Ｍ ＮａＣｌに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を５μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【００７５】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧（circuit pressure）、プランジャー補給圧（plunger alimentation pressure）に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することであった。
【００７６】
サイズ低減は６０００±５００ ｐｓｉで行い、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、２．０±０．２ ｃｐの目標に達した時点で止めた。
【００７７】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過した。
【００７８】
ＴＴ誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＴＴをＮａＣｌ ０．２Ｍに希釈して、ＴＴ最終濃度２５ｍｇ／ｍＬを得た。０．２Ｍの最終濃度に達するように、ＡＤＨをＴＴ溶液に固体形態で添加した。完全なＡＤＨ溶解の後、溶液をＨＣｌでｐＨ ６．２＋／−０．１に設定した。
【００７９】
その後、最終濃度０．０２Ｍに達するように、ＥＤＡＣをＴＴ／ＡＤＨ溶液に添加した。ｐＨをＨＣｌで６．２＋／−０．１に設定し、１時間の間ｐＨ調節下に保った。
【００８０】
誘導体化ステップの後、ｐＨをＮａＯＨにより最大ｐＨ９．５まで上げて、反応を停止した。ダイアフィルトレーション（diafiltration）ステップの前に溶液を２時間の間ｐＨ調節下に置いた。
【００８１】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＴＴＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【００８２】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物（permeate）におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【００８３】
０．２２μｍに対する濾過
ＴＴＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＴＴＡＨを−７０℃で保存した。
【００８４】
ＰＳ３−ＴＴＡＨコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【００８５】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴＡＨ／ＰＳ３当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【００８６】
ＰＳ３ ５０ｍｇを２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴＡＨ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【００８７】
このＰＳ３溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【００８８】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴＡＨを１１分間（アリコート／分）で手動により添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１０９分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【００８９】
２）ＰＳ０３−ＴＴＡＨプロセス：ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴ２１５
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【００９０】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【００９１】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＣＤＡＰ（０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、アセトニトリル／ＷＦＩ混合物中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にＰＳ溶液をｐＨ６．０に設定した。ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）の添加前にｐＨをＮａＯＨでｐＨ９．５に増加させた。ｐＨを９．５に保持し、６０分の間、調節した。誘導体化の割合は２．４％（２．４ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）に相当した。これは公知の技術で測定することができる：ＡＤＨの推定の場合にはＴＮＢＳ；およびＰＳ定量化の場合にはＤＭＡＢまたはレゾルシノール（Monsigny et al (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530）。この場合、ＴＮＢＳ投与量は２２８μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５２５０μｇ／ｍＬであった。
【００９２】
ＡＤＨのＭｗが１７４．２であり、ＰＳ３の反復単位のＭｗが３３８．２７である（１つのＣＯＯＨ基および４つのＯＨ基を有する）ことを考えれば、１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１５．５２μｍｏｌｅの反復単位、または１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／６２．０８μｍｏｌｅの反応性ヒドロキシル基が存在する。２．０９％のＰＳ３ヒドロキシル基がＡＤＨ修飾ヒドロキシル基であった。
【００９３】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＣＤＡＰ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【００９４】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【００９５】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【００９６】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【００９７】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【００９８】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【００９９】
このＰＳ３ＡＨ溶液をＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１００】
最終濃度０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣをＰＳ３ＡＨ溶液に固体形態で添加した。ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＴＴを蠕動ポンプにより１０分で添加した。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１０１】
３）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１７
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１０２】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１０３】
ＰＳ３誘導体化
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１０４】
ダイアフィルトレーション
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１０５】
０．２２μｍに対する濾過
２１５コンジュゲートの場合と同様である。
【０１０６】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１０７】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１０８】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１０９】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を混合し、ＨＣｌでｐＨ５に調整した。
【０１１０】
ＥＤＡＣをＴｒｉｓ １Ｍ ｐＨ ７．５緩衝液に溶解した。ＥＤＡＣ ４０μＬを毎分添加した（ＥＤＡＣ／ＰＳ比率（０．５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳ）に達するように１０分間）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１１１】
４）ＰＳ０３ＡＨ−ＴＴプロセス：ＰＳ３ＡＨ−ＴＴ２１８
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
上記と同様である。
【０１１２】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
上記と同様である。
【０１１３】
ＰＳ３誘導体化
誘導体化ステップはＴ°制御水浴内にて連続的に撹拌しながら２５℃で行った。ＰＳ３をＮａＣｌ ２Ｍに希釈して、ＰＳ最終濃度３ｍｇ／ｍＬを得た。ＥＤＡＣ／ＰＳ比率０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＥＤＡＣを固体形態で添加した。完全な溶解後、溶液のｐＨを５に設定した。その後、ＡＤＨ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ、０．２Ｍ ＮａＣｌ中にて１００ｍｇ／ｍＬで溶解）を蠕動ポンプにより４４分で添加した（したがって過剰のＡＤＨが存在していたが、直接的な添加も問題がなかった）。ｐＨを５．０＋／−０．１に保持し、１２０分（４４秒＋７６秒）の間、調節した。水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．５に上昇させることにより、反応を停止した。誘導体化の割合は３．７％（ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）に相当した。ＴＮＢＳ投与量は２２０μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は５９０２μｇ／ｍＬであった。すなわち１．２６μｍｏｌｅのＡＤＨ／１７．４４μｍｏｌｅの反復単位（＝μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基）が存在する。したがって、７．２２％のＰＳ３カルボキシル基がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０１１４】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳ３ＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはＵＦＰ−３０−Ｃ−Ｈ２４ＬＡメンブレン（４２ｃｍ２，カットオフ３０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２３容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１１５】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は５、１０、１５および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１１６】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。その後、濾過したＰＳ３ＡＨを４℃で保存した。
【０１１７】
ＰＳ３ＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１１８】
２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳ３ＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳ３ＡＨ当初比率１．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ、および０．１５Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１１９】
ＰＳ３ＡＨ ５０ｍｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１２０】
このＰＳ３ＡＨおよびＴＴ溶液を一緒に混合した。
【０１２１】
ｐＨをＨＣｌで５．０±０．０５に調整し、ＥＤＡＣを１０分間で手動により添加した（等量のアリコートを毎分添加した）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で１１０分間インキュベートして、１２０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。最後に、コンジュゲートを５μｍのメンブレンにて清澄化し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムに注入した。
【０１２２】
結論：
コンジュゲート化ステップのなかでカルボジイミド化学反応を用いて、異なるコンジュゲートを作製した。反応溶液に添加される最後の成分は、ＴＴタンパク質またはＥＤＡＣ試薬のいずれかとすることができる。添加の時間は、得られるコンジュゲートに影響を与えることがある。
【０１２３】
ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５および２１７コンジュゲート：
両コンジュゲートを調製するため、同じ成分および条件を使用した。最後の成分を添加した方法は異なっていた。ＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートは、インビトロ（in-vitro）での判定基準に合った生成物をもたらした。この生成物はＥＤＡＣを１０分で添加することにより作製された。
【０１２４】
しかしながら、ＰＳ３ＡＨＴＴ２１５コンジュゲートは、滅菌メンブレンに対して濾過することができなかった。このコンジュゲートの場合、反応媒体に添加された最後の成分はＴＴであった（１０分で）。
【０１２５】
ＴＴ／ＰＳ最終比率は両コンジュゲートでかなり異なっていた（０．９８／１に対して０．５０／１）。ＥＤＡＣがＰＳＡＨ（反応性アミノ基とカルボキシル基の両者を有する）に最初に添加される場合、これは多糖に存在するヒドラジンおよびカルボン酸基の分子内架橋結合をもたらしうるので、いっそう架橋結合されたコンジュゲートを生じさせることになり、１０分間でのＴＴの添加後の最終比率がずっと低くなるのかもしれない。
【０１２６】
この影響はＰＳ３ＡＨＴＴ２１７コンジュゲートでは認められていない。ＴＴ取込みは、おそらくいっそう低い分子内架橋結合や、ＰＳ３ＡＨのヒドラジン基と該タンパク質のカルボン酸基との間のいっそう良好な分子間架橋結合のため、１０分間でのＥＤＡＣの添加によっていっそう功を奏した。
【０１２７】
２１８コンジュゲートの場合、ＰＳ３ ＥＤＡＣ誘導体化は（多糖エピトープの大部分を保全するため）多糖を部分的に誘導体化するだけなので、反応性アミノ基とカルボキシル基の両者が存在しており、それ故に最終のコンジュゲート化ステップにおけるＥＤＡＣの緩徐な添加が有益である理由も先と同様である。
【０１２８】
（しかしながら）ＴＴはＡＤＨ誘導体化され（かつアミノ基およびカルボキシル基を含む）、その一方でＰＳ３はその反復サブユニットの一部としてその天然の反応性−ＯＨ基および−ＣＯＯＨ基が残された２０８コンジュゲートの場合、最終のコンジュゲート化ステップにおける緩徐なＴＴ添加が有益であった。ＰＳ ３へのＥＤＡＣの添加は上記の架橋結合の影響がなく、誘導体化されたＴＴの緩徐な添加によってインビトロでの特性の良好なコンジュゲートが得られた。下記を参照されたい。
【０１２９】
インビトロでの特性決定：
【表２】
2008543909.tif 000003
【表３】
2008543909.tif 000004
【表４】
2008543909.tif 000005
【０１３０】
実施例１ｃ−本発明のチフス菌（S. typhi）Ｖｉ多糖コンジュゲートの調製
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘによるサイズ分類
１５％の理論的含水率に基づいてＰＳを秤量した。天然のＰＳを当初濃度７ｍｇ／ｍＬでＷＦＩに終夜溶解した。サイズ分類の前に、天然のＰＳの溶液を流速５０ｍＬ／分で１０μｍのカットオフフィルターにて清澄化した。
【０１３１】
活性化ステップの前に多糖の分子量および粘性を低減するため、ホモジナイザーＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ Ｃ−５０機器を使用した。サイズ分類の効率は回路圧、プランジャー補給圧に依存し、総サイクル数に依存する。サイズ分類の効率を向上するため（その結果としてサイクル総数を減らすため）、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘのホモジナイジングセルを固定形状のセル（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｆ２０Ｙ−０．７５μｍの相互作用チャンバ）と交換した。サイズ分類の目的はＰＳの分子量および粘性を、その抗原性の重大な低下なくして低減することである。
【０１３２】
サイズ低減は１５０００±５００ ｐｓｉで達成し、その後に製造プロセスのなかで粘性の測定を行った。サイズ分類は、５．０±０．３ ｃｐの目標に達した時点で止める。
【０１３３】
サイズ分類されたＰＳの０．２２μｍに対する濾過
サイズ分類されたＰＳを流速１０ｍＬ／分でＭｉｌｌｉｐａｋ ４０メンブレン（カットオフ０．２２ｍｍ）に対して濾過する。濾過済のサイズ分類されたＰＳを−２０℃で保存する。
【０１３４】
多糖Ｖｉの誘導体化
サイズ分類されたＶｉ ＰＳ １．５ｇを撹拌しながらＥＰＩに２５℃で溶解した（５ｍｇ／ｍＬ）。このＰＳ溶液にＡＤＨ １３．３５ｇ（８．９ｍｇ ＡＤＨ／ｍｇ ＰＳ）を添加する。完全な溶解後、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ５．０±０．０５に調整した。ＥＤＡＣ（０．１ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を固体形態で添加した。この溶液を２５℃で６０分間放置した。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、２５℃で少なくとも３０分間放置した（最大２時間）。ＴＮＢＳ投与量（ｍｇ ＡＤＨ／１００ｍｇ ＰＳ）により、誘導体化のレベルは４．５５％であると推定された。ＴＮＢＳ投与量は２００μｇ／ｍＬで、ＰＳ投与量は４０３４μｇ／ｍＬであった；したがって０．０６９７μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反復単位（Ｍｗ２４５）であった。Ｖｉでの１．３μｍｏｌｅのＡＤＨ／１６．４６μｍｏｌｅの反応性ＣＯＯＨ基、したがってＶｉのＣＯＯＨ基の７％がＡＤＨ修飾ＣＯＯＨ基であった。
【０１３５】
ダイアフィルトレーション
未反応のＡＤＨおよびＥＤＡＣ副生成物を除去するため、ＰＳＶｉＡＨ誘導体をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションはｃｅｎｔｒａｍａｔｅメンブレン（０．０９ｍ２，カットオフ１０ｋＤａ）にて行った。その溶液を２０容量の０．２Ｍ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１３６】
ダイアフィルトレーションステップの追跡は３、５、１０および２０容量のダイアフィルトレーション後の透過物におけるＡＤＨの定量化（ＴＮＢＳアッセイ）によって行った。
【０１３７】
０．２２μｍに対する濾過
ＰＳＶｉＡＨを最後に、流速１０ｍＬ／分で０．２２μｍのカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ ４０）に対して濾過した。濾過したＰＳＶｉＡＨを最大４日間＋２／＋８℃で保存した。
【０１３８】
ＰＳＶｉＡＨ−ＴＴコンジュゲート
プロセスの条件は以下のとおりとした。
【０１３９】
０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＰＳＶｉＡＨ当初濃度２ｍｇ／ｍＬ、ＴＴ／ＰＳＶｉＡＨ当初比率２．５／１（ｗ／ｗ）、ＥＤＡＣ濃度０．２５ｍｇ／ｍｇ ＰＳおよび０．２Ｍ ＮａＣｌ中のＴＴ濃度１０ｍｇ／ｍＬ。
【０１４０】
ＰＳＶｉＡＨ １ｇを０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈して、ＰＳ最終濃度２ｍｇ／ｍＬを得た（ウロン酸投与量）。濃度１０ｍｇ／ｍＬに達するように、精製ＴＴ溶液を０．２Ｍ ＮａＣｌに希釈した。
【０１４１】
最終比率２．５ｍｇ ＴＴ／ｍｇ ＰＳに達するように、ＴＴをＰＳＶｉＡＨ溶液に添加した。ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで５．０±０．０５に調整する。その後、０．２５ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ ＰＳＶｉＡＨに達するように、ＥＤＡＣ溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５中にて７．５ ｍｇ／ｍＬ）を添加した（蠕動ポンプにより１０分で）。得られた溶液を撹拌およびｐＨ調節しながら＋２５℃で５０分間インキュベートして、６０分の最終カップリング時間を得た。その後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５の添加によって溶液を中和し、＋２５℃で３０分間放置した。クロマトグラフィーステップの前に、コンジュゲートを４℃に移し、連続的にゆっくり撹拌しながら終夜放置した。
【０１４２】
精製
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに対する溶出の前に、１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターを用いてコンジュゲートを清澄化した。流速は１００ｍＬ／分に固定した。その後、コンジュゲートをＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲに注入し、回収プールはＫｄ値に基づいた。以下の判定基準をプール回収に用いた：２８０ｎｍのＯＤ＝０．０５から収集を開始し、Ｋｄ＝０．２２の時点で終了した。
【０１４３】
滅菌濾過
濾過の前に、バルクを室温に戻した。その後、コンジュゲートをＯｐｔｉｃａｐ ４’’滅菌用メンブレンに対して濾過した。流速は３０ｍＬ／分に固定した。
【０１４４】
分析
得られたコンジュゲートはＴＴ／ＰＳ最終比率（ｗ／ｗ） ２．４４／１、遊離ＰＳ含有率３．７％およびαＰＳ／αＰＳ抗原性５８％であった。
【０１４５】
実施例１ｄ−その他の多糖コンジュゲートの調製
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）（Ｈｉｂ）ＰＲＰ多糖のＴＴとの共有結合は、Ｃｈｕら（Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256）により開発されたカップリング化学反応によって行った。ＣＮＢｒを添加し、ｐＨ １０．５で６分間インキュベートすることにより、Ｈｉｂ ＰＲＰ多糖を活性化した。ｐＨをｐＨ ８．７５に下げ、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、インキュベーションをさらに９０分間続けた。１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド縮合により、活性化されたＰＲＰを精製された破傷風トキソイドにカップリングした。最終比率０．６ｍｇ ＥＤＡＣ／ｍｇ 活性化ＰＲＰに達するように、活性化されたＰＲＰにＥＤＡＣを添加した。ｐＨを５．０に調整し、２ｍｇ ＴＴ／ｍｇ活性化ＰＲＰに達するように、精製された破傷風トキソイドを添加した。得られた溶液を穏やかに撹拌しながら３日間放置した。０．４５μｍのメンブレンを通した濾過の後、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化されたｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ５００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにてコンジュゲートを精製した。
【０１４６】
ＭｅｎＣ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖（ＭＡＬＬＳで測定したところ１５０ｋＤａ以上の）を用いて作出するか、またはわずかにマイクロ流動化するかした。ＭｅｎＡ−ＴＴコンジュゲートを、天然の多糖または実施例２のＭＡＬＬＳ法で測定したところ６０ｋＤａ以上のわずかにマイクロ流動化された多糖のいずれかを用いて作出した。ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹ−ＴＴコンジュゲートを、ＭＡＬＬＳで測定したところおよそ１００〜２００ｋＤａのサイズ分類された多糖を用いて作出した（実施例２参照）。サイズ分類はホモジナイザーＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ−５０機器を用いたマイクロ流動化によった。この多糖を次いで、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１４７】
活性化および直接的カップリングは、国際公開公報第９６／２９０９４号および国際公開公報第００／５６３６０号に記述されているように行った。手短に言えば、２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ５．５〜６．０中の濃度１０〜２０ｍｇ／ｍＬの多糖をＣＤＡＰ／多糖最終比率０．７５／１または１．５／１までＣＤＡＰ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、アセトニトリル／ＷＦＩ，５０／５０中にて新たに調製）と混合した。１．５分後に、ｐＨを水酸化ナトリウムによりｐＨ１０．０に上げた。３分後、ＭｅｎＷの場合１．５／１、ＭｅｎＹの場合１．２／１、ＭｅｎＡの場合１．５／１またはＭｅｎＣの場合１．５／１のタンパク質／多糖比率に達するように、破傷風トキソイドを添加した。反応を１〜２時間続けた。
【０１４８】
カップリングステップの後、グリシンをグリシン／ＰＳ（ｗ／ｗ）の最終比率７．５／１まで添加し、ｐＨをｐＨ９．０に調整した。この混合物を３０分間放置した。１０μｍ Ｋｌｅｅｎｐａｋフィルターによってコンジュゲートを清澄化し、次に１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭまたは５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５の溶出用緩衝液を用いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲカラムにアプライした。臨床用ロット（Clinical lots）をＯｐｔｉｃａｐ ４滅菌用メンブレンに対して濾過した。得られたコンジュゲートは多糖：タンパク質の平均比率が１：１〜１：５（ｗ／ｗ）であった。
【０１４９】
実施例２−ＭＡＬＬＳを用いた分子量の測定
サンプルが溶出されるＨＰＬＣサイズ排除カラムに検出器を連結した。一方では、レーザー光散乱検出器によって、高分子溶液により１６角度で散乱された光強度を測定し、他方では、オンラインで配置された干渉屈折計によって、溶出されたサンプル量の測定を可能にした。これらの強度から、溶液中の高分子のサイズおよび形状を測定することができる。
【０１５０】
重量平均分子量（Ｍｗ）は、全ての、種の重量×その各種分子量、の総和÷全ての種の重量の総和と定義される。
【０１５１】
ａ）重量平均分子量：−Ｍｗ−
【数１】
2008543909.tif 000006
【０１５２】
ｂ）数平均分子量：−Ｍｎ−
【数２】
2008543909.tif 000007
【０１５３】
ｃ）平方根平均二乗半径（Root mean square radius）：−Ｒｗ−およびＲ２ｗは以下により定義される二乗半径である：
【数３】
2008543909.tif 000008
【０１５４】
（−ｍｉ−は散乱中心ｉの質量であり、−ｒｉ−は散乱中心ｉと高分子の重心との間の距離である）。
【０１５５】
ｄ）多分散性は比率−Ｍｗ／Ｍｎ−と定義される。
【０１５６】
髄膜炎菌（meningococcal）多糖を、併用で用いた２本のＨＰＬＣカラム（ＴＳＫＧ６０００および５０００ＰＷｘｌ）にアプライすることによってＭＡＬＬＳで分析した。多糖２５μＬをカラムにアプライし、濾過水０．７５ｍＬで溶出した。糖類は光散乱検出器（４８８ｎｍの１０ｍＷアルゴンレーザーを備えたＷｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＤＳＰ）ならびに干渉屈折計（inferometric refractometer）（Ｐ１００セルおよび４９８ｎｍの赤色フィルターを備えたＷｙａｔｔ Ｏｔｉｌａｂ ＤＳＰ）を用いて検出される。
【０１５７】
全サンプルの分子量多分散性および回収率は、Ａｓｔｒａ ４．７２ソフトウェアにおいて多項式適合度１を用いＤｅｂｙｅ法によって計算した。
【０１５８】
実施例３−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡ中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨ（ＡＤＨ）スペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ４−任意のコンジュゲートにおいてスペーサーなしで破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０１５９】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０１６０】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−ワクチン接種前の抗体力価が＞４倍の抗体力価と定義された。
【０１６１】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＡコンジュゲートでのスペーサーの使用によってＭｅｎＡに対する免疫応答の増大がもたらされた。応答者の割合は、ＡＨスペーサーを付加した場合、６６％から９０〜９５％に上昇した。これはＳＢＡ ＧＭＴでの４３３５から１００００の増大およびＧＭＣでの５から２０〜４０の増大に反映されていた。意外にも、応答者の割合の増大およびＳＢＡ ＧＭＴでの増大から分かるとおり、ＡＨスペーサーの使用によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大も起こった。スペーサーが導入された場合、増大は同様にＳＢＡ−ＧＭＴにおいてＭｅｎＹ（６７４２〜７１２２）に対しておよびＭｅｎＷ（４６２１〜５４１８）に対して認めることができた。
【表５】
2008543909.tif 000009
【０１６２】
実施例４−ＭｅｎＡＣＷＹコンジュゲートワクチンにおけるＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲート中のリンカーの影響を評価する臨床試験
ＭｅｎＡＣＷＹワクチンの異なる製剤の単回用量を１：１：１：１：１の無作為化試験において被験者２５人からなる５群の１５〜１９歳の青年に投与した。試験した製剤は以下のものであった：
Ｆ１−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−２．５／２．５／２．５／２．５μｇ
Ｆ２−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／２．５／２．５μｇ
Ｆ３−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡおよびＭｅｎＣコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
Ｆ４−ＡＨスペーサーを有するＭｅｎＡコンジュゲートを用いて破傷風トキソイドにコンジュゲート化されているＭｅｎＡＣＷＹ（実施例１によって作製）−５／５／５／５μｇ
対照群−Ｍｅｎｃｅｖａｘ（商標） ＡＣＷＹ。
【０１６３】
接種後３０日目に、血液サンプルを患者から採血した。
【０１６４】
ワクチン投与から１ヵ月後のＳＢＡ−ＭｅｎＡ、ＳＢＡ−ＭｅｎＣ、ＳＢＡ−ＭｅｎＷ１３５およびＳＢＡ−ＭｅｎＹ応答者の割合を評価するため、血液サンプルを使用した。ワクチン応答は（１）初期に血清反応陰性の被験者の場合−ワクチン接種後の抗体力価＞１ヵ月時点で１／３２、または（２）初期に血清反応陽性の被験者の場合−ワクチン接種前の抗体力価が＞４倍の抗体力価と定義された。
【０１６５】
結果
下記表に示されるように、ＭｅｎＣコンジュゲートへのＡＨスペーサーの導入によってＭｅｎＣに対する免疫応答の増大がもたらされた。これはＳＢＡ ＧＭＴでの１９４３から４３２９の増大および抗ＰＳＣ ＧＭＣでの７．６５から１３．１３の増大によって実証される。ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷおよびＭｅｎＹに対する良好な免疫応答が維持されていた。
【表６】
2008543909.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月19日(2007.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボジイミド縮合化学反応を用いてタンパク質キャリアに糖類をコンジュゲート化するステップを含む、免疫原性組成物の製造方法であって、該糖類が（例えばその反復単位の一部として）アミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該タンパク質キャリアがアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むか、またはアミノ基および／もしくはカルボキシル基を含むように誘導体化されており、該方法は以下のステップ：
（Ｉ）該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該糖類がアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該糖類と、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要なタンパク質キャリアのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと、コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートとを混合するステップ、および
（ｂ）必要な糖類のアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ；
（ＩＩＩ）該糖類がアミノ基とカルボキシル基の両者を含み、かつ該タンパク質キャリアがアミノ基とカルボキシル基の両者を含む場合、
（ａ）該タンパク質キャリアと該糖類とを混合するステップ、および
（ｂ）コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートを３５秒間〜６時間かけて添加するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）において、時間が５０秒間〜５時間、１分間〜４時間、２分間〜３時間、３分間〜２時間、４〜６０分間、５〜５０分間、６〜４０分間、７〜３０分間または８〜２０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、時間が１分間〜５時間、１０分間〜４時間、２０分間〜３時間、４０〜９０分間、または５０〜７０分間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カルボジイミドがＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）またはＥＤＡＣ以外のカルボジイミドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記コンジュゲート化を行うために必要なカルボジイミドのアリコートが、０．０１〜３ｍｇ／ｍｇ糖類、０．０５〜２ｍｇ／ｍｇ糖類または０．０９〜１ｍｇ／ｍｇ糖類である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖類および／もしくはタンパク質キャリアが、アミノ基またはカルボキシル基を含むように誘導体化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、ヘテロまたはホモ二官能性リンカーの付加を介するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが４〜１２炭素原子を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リンカーが、２つの反応性アミノ基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リンカーがＡＤＨである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが、２つの反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、一方の末端に反応性アミノ基を有し、他方の末端に反応性カルボン酸基を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導体化が、誘導体化の対象となる糖類および／またはタンパク質キャリアに大過剰のリンカーを反応させることにより行われる、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性ヒドロキシル基を有し、リンカー上のアミノ基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖類が、ＣＤＡＰ化学を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性アミノ基を有し、リンカー上のカルボキシル基により部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖類が、カルボジイミド縮合化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖類が、その反復単位の一部分として反応性カルボキシル基を有し、リンカー上のアミノ基を介して部分的に誘導体化されている、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖類が、カルボジイミド化学反応を用いて部分的に誘導体化されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートをポンプを用いて一定速度で添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）において、カルボジイミド、糖類またはタンパク質キャリアのアリコートを前記の時間にわたって段階的に添加する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の前半にわたって添加し、前記アリコートの少なくとも４分の１を前記時間の後半にわたって添加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アリコート「ａ」を４〜１００の段階「ｓ」において添加する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アリコートのａ／ｓを各段階において添加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つの段階が前記時間「ｐ」のゼロ時点に行われる場合、続く各段階はｐ／（ｓ−１）の時点で行われる、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖類が、ステップ（ｂ）において最終濃度０．５〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質キャリアと前記糖類との当初比率が、５：１〜１：５、４：１〜１：１、または３：１〜２：１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｂ）において存在する塩、例えばＮａＣｌの濃度が、０〜２Ｍ、０．１〜１Ｍまたは０．２〜０．５Ｍである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質キャリアが、ステップ（ｂ）において最終濃度１〜５０ｍｇ／ｍＬで存在する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）において反応ｐＨがｐＨ４．５〜６．５、ｐＨ４．７〜６．０またはｐＨ５〜５．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｂ）の反応中にＮ−ヒドロキシスクシンイミドも存在し、かつステップ（ｂ）での反応ｐＨがｐＨ４．５〜７．５に維持される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）での反応温度が４〜３７℃、１０〜３２℃、１７〜３０℃または２２〜２７℃に維持される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）において前記アリコートがすべて添加された後に、反応がさらに１０分間〜７２時間、２０分間〜４８時間、３０分間〜２４時間、４０分間〜１２時間、５０分間〜６時間または１〜３時間維持される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
反応が完了すると、ｐＨが７．５〜９に調整される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
糖類−タンパク質コンジュゲートをサイズ排除クロマトグラフィーカラムで精製する次なるステップ（ｃ）を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
糖類−タンパク質コンジュゲートを滅菌濾過する次なるステップ（ｄ）を含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
有効用量の糖類−タンパク質コンジュゲートを製薬上許容される賦形剤とともに製剤化し、免疫原性組成物またはワクチンを製造する次なるステップ（ｅ）を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記糖類が細菌莢膜糖類であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５もしくはＹ、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆもしくは３３Ｆ、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ型、Ｉｂ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型もしくはＶＩＩ型、黄色ブドウ球菌５型、黄色ブドウ球菌８型、チフス菌（Salmonella typhi）（Ｖｉ糖類）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、またはインフルエンザ菌（H. influenzae）ｂ型からなるリストより選択される細菌由来のものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記糖類の重量平均分子量が１０００〜２００００００、５０００〜１００００００、１００００〜５０００００、５００００〜４０００００、７５０００〜３０００００または１０００００〜２０００００である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖類が天然の（native）多糖であるか、または×１０倍以下にサイズ分類されている（sized）（例えばマイクロ流動化により）、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記糖類が細菌リポオリゴ糖またはリポ多糖であり、例えば以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、大腸菌、サルモネラ菌（Salmonella）またはカタラリス菌（M. catarrhalis）からなるリストより選択される細菌に由来するものである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質キャリアが１以上のＴヘルパーエピトープを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質キャリアが、以下のもの：ＴＴ、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、ＴＴのＣフラグメント、インフルエンザ菌のプロテインＤ、肺炎球菌のＰｈｔＤ、および肺炎球菌のＰｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎからなる群より選択される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法により取得することができる免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項４５】
疾患の予防もしくは治療のための医薬の製造における、請求項４４に記載の免疫原性組成物またはワクチンの使用。
【請求項４６】
有効用量の請求項４５に記載の免疫原性組成物またはワクチンを、そのような処置が必要な患者に投与するステップを含む、疾患の予防方法もしくは治療方法。
【請求項４７】
前記疾患が、以下のもの：髄膜炎菌（N. meningitidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、カタラリス菌（M. catarrhalis）、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、チフス菌（Salmonella typhi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、大腸菌およびインフルエンザ菌（H. influenzae）からなるリストより選択される細菌により引き起こされるものである、請求項４５または４６に記載の使用または方法。
【国際調査報告】
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