(57)【要約】本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体および任意の種々の送達因子を含む組成物を提供する。本発明は、インフルエンザウイルスの生物学的活性を阻害するためおよび／またはインフルエンザの処置もしくは予防のための組成物の使用方法をさらに包含する。本発明は、ヒト宿主および／または鳥類宿主から単離された複数種のインフルエンザウイルスＡ株にわたりＲＮＡｉに対して好ましく保存された標的部分配列およびこのような好ましく保存された標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体を提供する。本発明は、１つ以上のこれらの好ましく保存された標的部分配列の少なくとも一部と同一または相補的である配列を含む種々の核酸を提供する。本発明は、ＲＮＡｉ誘導性物質を哺乳動物被験体の器官または組織（例えば、肺）に送達するための方法および組成物をさらに提供する。
2008533990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質であって、該ＲＮＡｉ誘導性物質は、その配列が配列番号２７２〜３８０、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される配列を含む核酸部分を含む、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２】
前記配列が、配列番号２７４、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２９２、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１９、配列番号３２４、配列番号３２７、配列番号３３４、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６４、および配列番号３６６、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項３】
前記配列は、配列番号２９７、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６４、および配列番号３６６、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項４】
請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質であって、個々の核酸鎖を含み、その一方または両方が３’に位置する一本鎖突出部を含むｓｉＲＮＡである、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項５】
請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質であって、二重鎖を形成する単一核酸の第１の核酸部分と第２の核酸部分とを含むｓｈＲＮＡであり、該第１の核酸部分および第２の核酸部分は、一本鎖核酸部分によって一緒に連結され、そして該二重鎖は、一本鎖突出部をさらに含む、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項６】
前記核酸部分の配列が前記ＲＮＡｉ誘導性物質の核酸部分に関して１個または２個の位置で異なることを除いて請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質と同一である、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項７】
請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートを含むベクターであって、該テンプレートが、プロモーターに作動可能に連結される、ベクター。
【請求項８】
インフルエンザウイルス感染を処置または予防する方法であって、インフルエンザウイルス感染を処置または予防する必要がある被験体に請求項７に記載のＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質および送達因子を含む、組成物。
【請求項１０】
前記送達因子は、カチオン性ポリマーである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記カチオン性ポリマーは、ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＰＬＡ、およびポリ（β）アミノエステルからなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
インフルエンザウイルス感染を処置または予防する方法であって、インフルエンザウイルス感染を処置または予防する必要がある被験体に請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
インフルエンザの診断のための方法であって、被験体が請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導性物質による阻害に感受性であるインフルエンザウイルスに感染しているか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ遺伝子、および核タンパク質ＮＰ遺伝子からなる群より選択されるインフルエンザウイルス遺伝子にターゲティングされる、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項１６】
前記遺伝子は、ＰＢ１である、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項１７】
前記遺伝子は、ＰＢ２である、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項１８】
前記遺伝子は、ＰＡである、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項１９】
前記遺伝子は、ＮＰである、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２０】
前記物質は、ＲＮＡｉのための機能的に好ましい標的部分である遺伝子の標的部分にターゲティングされる、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２１】
前記物質は、前記遺伝子の好ましく保存された標的部分にターゲティングされる、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２２】
前記物質は、前記遺伝子の高度に保存された標的部分にターゲティングされる、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２３】
前記ＲＮＡｉ誘導性物質は、少なくとも１５個を上回る連続したヌクレオチドのインフルエンザウイルス遺伝子の標的部分に１００％相補的である核酸部分を含み、該標的部分は、ＲＮＡのための機能的に好ましい標的である、請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２４】
前記核酸部分が前記ＲＮＡｉ誘導性物質の核酸部分に関して１個または２個の位置で異なることを除いて請求項２３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質と同一である、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項２５】
請求項１５に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートを含む、ベクター。
【請求項２６】
単離された核酸またはその相補体であって、その配列が、配列番号２７２〜３８０からなる群より選択される配列を含むか、または少なくとも１６ヌクレオチドの長さを有する配列番号２７２〜３８０からなる群より選択される配列のフラグメントを含み、該核酸が、１００ヌクレオチド以下の長さを有する、単離された核酸またはその相補体。
【請求項２７】
前記配列は、配列番号２７４、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２９２、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１９、配列番号３２４、配列番号３２７、配列番号３３４、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６４、および配列番号３６６からなる群より選択される配列を含むか、または少なくとも１６ヌクレオチドの長さを有する配列番号２７４、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２９２、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１９、配列番号３２４、配列番号３２７、配列番号３３４、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６４、および配列番号３６６からなる群より選択される配列のフラグメントを含み、該核酸は、１００ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
前記配列は、配列番号２９７、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６４、および配列番号３６６からなる群より選択される配列を含むか、または少なくとも１６ヌクレオチドの長さを有する配列番号２９７、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３６４、および配列番号３６６からなる群より選択される配列のフラグメントを含み、該核酸は、１００ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２９】
前記配列は、配列番号２７２〜配列番号３８０からなる群より選択される配列を含む、請求項２６に記載の核酸。
【請求項３０】
前記核酸に結合する検出可能な部分をさらに含む、請求項２６に記載の単離された核酸。
【請求項３１】
請求項２６に記載の核酸を含む、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項３２】
請求項２６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートを含む、ベクター。
【請求項３３】
配列ｎ１−ｎ２−ｎ３−ｎ４−ｎ５−ｎ６−ｎ７−ｎ８−ｎ９−ｎ１０−ｎ１１−ｎ１２−ｎ１３−ｎ１４−ｎ１５−ｎ１６−ｎ１７−ｎ１８−ｎ１９（Ｎ１９）を有する単離された核酸であって、該配列は、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ遺伝子、および核タンパク質ＮＰ遺伝子からなる群より選択されるインフルエンザウイルス遺伝子の一部と同一であるか、または、
ＡからＧへの変化またはＣからＵへの変化が、任意の位置において許容され；ＧからＡへの変化またはＣからＡへの変化が、位置ｎ１、ｎ１８においてのみ許容され、そして／またはＮ１９と前記インフルエンザとの間に０個、１個、２個、もしくは３個の変化が存在し、かつ２個より多く連続した変化が存在せず；そしてＮ１９と前記インフルエンザウイルスとの間に多くとも１個の変化が存在する；
という点で異なる、単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３に記載の核酸にターゲティングされる、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項３５】
請求項３３に記載の核酸を含む、ＲＮＡｉ誘導性物質。
【請求項３６】
請求項３３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートを含む、ベクター。
【請求項３７】
被験体においてインフルエンザを診断する方法であって、該被験体がＲＮＡｉ誘導性実体による阻害に感受性であるインフルエンザウイルス株に感染しているか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡｉ誘導性実体を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記決定する工程は、核酸ベースの診断アッセイを行なう工程を包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
ＲＮＡｉのための好ましく保存された標的部分である標的部分の少なくとも一部にわたってインフルエンザウイルス遺伝子を検出するプライマーまたはプローブを備える、診断キット。
【請求項４１】
前記好ましく保存された標的部分は、配列番号２７２〜配列番号３８０からなる群より選択される配列を含む、請求項４０に記載の診断キット。
【請求項４２】
哺乳動物被験体の組織または器官における遺伝子の発現を阻害する方法であって、該遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物をハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに該被験体の脈管系に対して直接的に導入する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
前記器官は、肺である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子は、気道上皮細胞に感染するウイルスの遺伝子である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記有効量は、前記遺伝子の発現を少なくとも１／２に減少させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
哺乳動物被験体の呼吸系においてウイルスの産生を阻害する方法であって、該ウイルスは、気道上皮細胞に感染し、該方法が、該ウイルスの遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物を、ハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに注射によって該被験体の脈管系に導入する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物は、前記ウイルスに感染していない被験体に対して、該被験体の感染前に投与され、そして該組成物は、該被験体がその後に感染した場合、該ウイルスの産生を阻害するのに有効である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳動物被験体の肺において遺伝子の発現を阻害する方法であって、該遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量および送達因子を含む組成物を、該被験体の呼吸系に対して直接的に導入する工程を包含する、方法。
【請求項５５】
前記組成物は、鼻腔内に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記組成物は、吸入によって投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記遺伝子は、気道上皮細胞に感染するウイルスの遺伝子である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記有効量は、前記遺伝子の発現を少なくとも１／２に減少させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物は、送達増強性ポリマーおよび脂質を本質的に含まない、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
哺乳動物被験体の呼吸系においてウイルスの産生を阻害する方法であって、該ウイルスは、気道上皮細胞に感染し、該方法は、該ウイルスの遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物を、該被験体の呼吸系に対して直接的に導入する工程を包含する、方法。
【請求項６４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記組成物は、鼻腔内に投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記組成物は、吸入によって投与される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記有効量は、前記ウイルスの産生を少なくとも２５％減少させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物は、送達増強性ポリマーおよび脂質を本質的に含まない、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物は、前記ウイルスに感染していない被験体に対して、該被験体の感染前に投与され、そして該組成物は、該被験体がその後に感染した場合、該ウイルスの産生を阻害するのに有効である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を発現する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７３】
前記動物は、鳥類である、請求項７２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７４】
インフルエンザウイルス感染を処置または予防するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、インフルエンザウイルス感染を処置または予防する必要がある被験体に、該ＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含し、該ＲＮＡｉ誘導性物質は、配列番号２７２〜配列番号３８０、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される配列を含む核酸部分を含み、そしてテンプレートは、プロモーターに作動可能に連結される、使用。
【請求項７５】
インフルエンザウイルス感染を処置または予防するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、インフルエンザウイルス感染を処置または予防する必要がある被験体に、該ＲＮＡｉ誘導性物質を投与する工程を包含し、該ＲＮＡｉ誘導性物質は、配列番号２７２〜配列番号３８０、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される配列を含む核酸部分を含む、使用。
【請求項７６】
哺乳動物被験体の組織または器官において遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、該遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物をハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに該被験体の脈管系に対して直接的に導入する工程を包含する、使用。
【請求項７７】
前記器官は、肺である、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項７８】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項７９】
前記遺伝子は、気道上皮細胞に感染するウイルスの遺伝子である、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８０】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８１】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８２】
前記有効量は、前記遺伝子の発現を少なくとも１／２に減少させる、請求項７６に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８３】
哺乳動物被験体の呼吸系においてウイルスの産生を阻害するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、該ウイルスは、気道上皮細胞に感染し、該使用が、該ウイルスの遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物をハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに注射によって該被験体の脈管系に導入する工程を包含する、使用。
【請求項８４】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項８３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８５】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項８３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８６】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項８３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８７】
前記組成物は、前記ウイルスに感染していない被験体に対して、該被験体の感染前に投与され、そして該組成物は、該被験体がその後に感染した場合、該ウイルスの産生を阻害するのに有効である、請求項８３に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項８８】
哺乳動物被験体の肺において遺伝子の発現を阻害するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、該遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量および送達因子を含む組成物を、該被験体の呼吸系に対して直接的に導入する工程を包含する、使用。
【請求項８９】
前記組成物は、鼻腔内に投与される、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９０】
前記組成物は、吸入によって投与される、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９１】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９２】
前記遺伝子は、気道上皮細胞に感染するウイルスの遺伝子である、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９３】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項９２に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９４】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９５】
前記有効量は、前記遺伝子の発現を少なくとも１／２に減少させる、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９６】
前記組成物は、送達増強性ポリマーおよび脂質を本質的に含まない、請求項８８に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９７】
哺乳動物被験体の呼吸系においてウイルスの産生を阻害するための医薬の製造におけるＲＮＡｉ誘導性物質の使用であって、該ウイルスは、気道上皮細胞に感染し、該使用が、該ウイルスの遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を該被験体の呼吸系に対して直接的に導入する工程を包含する、使用。
【請求項９８】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項９７に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項９９】
前記組成物は、鼻腔内に投与される、請求項９７に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項１００】
前記組成物は、吸入によって投与される、請求項９７に記載のＲＮＡｉ誘導性物質の使用。
【請求項１０１】
前記組成物は、カチオン性ポリマーを含む、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０２】
前記有効量は、前記被験体の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇと５ｍｇとの間である、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０３】
前記有効量は、前記ウイルスの産生を少なくとも２５％減少させる、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０４】
前記組成物は、送達増強性ポリマーおよび脂質を本質的に含まない、請求項９７に記載の使用。
【請求項１０５】
前記組成物は、前記ウイルスに感染していない被験体に対して、該被験体の感染前に投与され、そして該組成物は、該被験体がその後に感染した場合、該ウイルスの産生を阻害するのに有効である、請求項９７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／６６４，５８０号（２００５年３月２２日出願）、および表題「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ」の米国特許出願第１１／１０２，０９７号（２００５年４月８日出願）（これらは、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（政府援助）
合衆国政府は、本発明の開発で使用した助成金を支給した。特に、国立衛生研究所助成金番号５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７７，５−ＲＯ１−ＡＩ４４４７８，５−ＲＯ１−ＣＡ６０６８６、および１−ＲＯｌ−ＡＩ５０６３１で本発明の開発を補助した。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザは世界中で最も蔓延している感染症の１つである。米国では、２万人〜４万人がインフルエンザＡウイルス感染またはその合併症により死亡している。命にかかわる感染症であり、１９１８年インフルエンザＡウイルス流行時には２０００万人〜４０００万人が死亡したと推定されている。流行時のインフルエンザに関連する入院は、冬季のみで３００，０００人超に達し得る。
【０００４】
いくつかの性質がインフルエンザウイルスの疫学的な蔓延の原因になっている。第１に、エアゾールによってヒトからヒトに容易に伝播する（飛沫感染）。第２に、インフルエンザウイルス抗原の小規模の変化（抗原連続変異）が頻繁であるため、ウイルスは異なるウイルス変異型に対する以前の曝露によって誘導された防御免疫を容易に回避する。第３に、異なる株間での遺伝物質の再集合および混合（抗原不連続変異）によって新規のインフルエンザウイルス株を容易に作製することができる。インフルエンザＡウイルスの場合、このような混合は、異なる種に影響を与えるサブタイプまたは株の間で起こり得る。１９１８年の流行は、ブタおよびヒトでのインフルエンザＡウイルスの間の再集合に由来するハイブリッド株によって引き起こされたと考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
集中的な取り組みにもかかわらず、インフルエンザウイルス感染に対する有効な治療方法は依然として存在せず、上記の抗原不連続変異および抗原連続変異により部分的に既存のワクチンの効果が制限される。これらの理由のために、インフルエンザＡウイルスの世界的調査が長年に及んでおり、国立衛生研究所は、生物兵器防御の最優先病原体の１つに指定している。不活性化ウイルスに基づいた現在のワクチンは６５歳未満の健常な個体において約７０〜８０％の疾患を防止することができるにもかかわらず、この比率は高齢者または免疫無防備状態の個体ではさらに低い。さらに、ワクチン投与に関連する費用および潜在的な副作用により、このアプローチは決して最適ではない。米国ではインフルエンザの治療および／または予防用の現在承認された４つの抗ウイルス薬が有益であるが、副作用、服薬遵守、および耐性株出現の可能性が懸念されるためにその用途は制限される。従って、インフルエンザ感染の治療および防止のための有効な治療方法の開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、呼吸器ウイルス感染（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、および／またはインフルエンザウイルスＣ型に起因するインフルエンザ感染）の処置のための、新規の組成物および方法を提供する。上記組成物および方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく。ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡと相補的である部分を含む二本鎖ＲＮＡの存在が標的ＲＮＡの発現を配列特異的様式で阻害する保存された細胞プロセスである。阻害は、標的の切断またはその翻訳の阻害によって引き起こされ得る。現在利用可能なインフルエンザ治療剤とは対照的に、本発明のＲＮＡｉ誘導性実体は、インフルエンザウイルス転写物の発現を阻害し、したがってウイルスタンパク質の合成を妨げる。これは、インフルエンザウイルス感染を制御する基本的に新規なアプローチを示す。
【０００７】
本発明は、ウイルスの産生、複製、感染、および／またはウイルスＲＮＡの転写などに関与する１つ以上の標的転写物ターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子）を提供する。さらに、本発明は、細胞内での存在が１つ以上のＲＮＡの転写をもたらし、そのＲＮＡがウイルス産生、ウイルス感染、ウイルス複製、および／またはウイルスｍＲＮＡの転写などに関与する少なくとも１つの標的転写物の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成するために、互いにハイブリッド形成するか、または自己ハイブリッド形成する、ベクターを提供する。好ましくは、上記ウイルスは、呼吸器ウイルスである。好ましいウイルスは、ＲＮＡウイルスである。ＲＮＡウイルスは、＋鎖ＲＮＡウイルスおよび−鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）を含む。そのウイルスゲノムは、分節されても、分節されなくてもよい。本発明の特定の実施形態に従って、上記標的転写物は、以下からなる群より選択されるタンパク質をコードする：ポリメラーゼ、ヌクレオカプシドタンパク質、ノイラミニダーゼ、血球凝集素、基質タンパク質、および非構造タンパク質。特定の実施形態において、上記標的転写物は、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、膜タンパク質１、膜タンパク質２、非構造タンパク質１、非構造タンパク質２、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ、核タンパク質ＮＰからなる群より選択されるインフルエンザウイルスタンパク質をコードする。
【０００８】
本発明はまた、ＲＮＡｉ誘導性物質および／またはベクター（例えば、上記ＲＮＡｉ誘導性物質および／または本明細書中に記載されるベクター）を含む組成物を提供し、その組成物は、そのＲＮＡｉ誘導性物質またはベクターの送達を容易にする送達因子をさらに含む。好ましい送達因子としては、カチオン性ポリマーが挙げられる。
【０００９】
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性実体を含む本発明の組成物を、そのウイルスへの曝露前、曝露が生じている間、もしくは曝露後、または被験体がそのウイルスによって引き起こされた症状を示す間の任意の時点において、適切な期間内に被験体に投与することによって、ウイルス疾患（特に、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザ）によって引き起こされる疾患）を処置または予防する方法をさらに提供する。上記組成物は、種々の経路で投与され得る。好ましい経路は、静脈内経路、またはエアロゾルとしての吸入（鼻腔内）による呼吸系への直接的な経路などを含む。
【００１０】
本発明は、ＲＮＡｉのための好ましい標的であるインフルエンザウイルス転写物の部分を示す核酸配列を提供する。特定の好ましい標的部分は、ＲＮＡｉに対する機能的に好ましい標的である。特定の好ましい標的部分は、複数の変異型の間で好ましく保存され、その結果、特定の変異型の配列に基づいて設計されたＲＮＡｉ誘導性物質が、対応する標的部分が配列において異なる変異型も阻害する。特定の好ましい標的部分は、複数の変異型の間で高度に保存される。
【００１１】
本発明は、１つ以上の好ましい標的部分を含む核酸、その相補体を含む核酸、およびそれらいずれかのフラグメントを含む核酸を提供する。本発明は、これらの標的部分の１つ以上にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質およびＲＮＡｉ誘導性ベクター）である核酸をさらに提供する。好ましい実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、ＮＰ遺伝子、ＰＡ遺伝子、ＰＢ１遺伝子、またはＰＢ２遺伝子にターゲティングされる。本発明は、特定の好ましい標的部分にターゲティングされる非常に有効なＲＮＡｉ誘導性実体を提供する。このような非常に有効なＲＮＡｉ誘導性実体は、インフルエンザウイルス感染の処置または予防に特に有用であり得る。
【００１２】
特に、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を提供し、そのＲＮＡｉ誘導性物質は、配列が配列番号２７２〜３８０、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択される配列を含む核酸部分を含む。本発明は、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ１遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＢ２遺伝子、ポリメラーゼタンパク質ＰＡ遺伝子、および核タンパク質ＮＰ遺伝子からなる群より選択されるインフルエンザウイルス遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質をさらに提供する。
【００１３】
本発明はまた、単離された核酸、またはその相補体を提供し、それらの配列は、配列番号２７２〜３８０からなる群より選択される配列を含むか、または少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する配列番号２７２〜３８０からなる群より選択される配列のフラグメントを含み、その核酸は、１００ヌクレオチド以下の長さを有する。特定の実施形態において、上記長さは、少なくとも１６ヌクレオチドである。
【００１４】
本発明は、ウイルス感染の診断のための方法、およびウイルス感染を有すると疑われる被験体が特定の型、株などのウイルスに感染しているか否かを決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、被験体が本発明のＲＮＡｉ誘導性実体の１つ以上による阻害に感受性であるインフルエンザウイルスに感染しているか否かを決定することを包含する。好ましい実施形態において、患者は、インフルエンザ感染と診断され、そしてその被験体に感染している特定のインフルエンザ株にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体が、投与される。したがって、本発明は、インフルエンザの診断と処置との統合された方法を提供する。特定の診断方法は、本発明の１つ以上の核酸を使用する。
【００１５】
本発明はまた、インフルエンザウイルス感染を検出し、そして／またはインフルエンザウイルスがＲＮＡｉ誘導性物質による阻害に感受性であるか否かを決定する診断キットを提供する。上記キットは、本発明の１つ以上の核酸および／またはインフルエンザウイルス転写物の好ましい標的部分を検出するためのプローブもしくはプライマーを備え得る。
【００１６】
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性実体を哺乳動物被験体の気道に送達する方法をさらに提供する。本発明者らは、ＲＮＡｉ誘導性実体が、哺乳動物被験体の気道に直接送達される場合、肺において遺伝子発現を有効にサイレンシングし得ることを見出した。本発明者らは、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ）が従来の容量および投与方法を使用して哺乳動物被験体の脈管系に対して直接的に投与され得ること、およびそのＲＮＡｉ誘導性物質が呼吸系（例えば、肺）において遺伝子発現を有効にサイレンシングし得ることを、さらに見出した。例えば、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、静脈内経路または吸入経路のいずれかによってマウスに送達された場合、肺においてインフルエンザ産生を阻害し、これは、呼吸系における遺伝子発現の治療的に有効な阻害がいずれかの方法によって達成され得ることを示した。さらに、ルシフェラーゼ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、ルシフェラーゼを発現したマウスに吸入経路または静脈内経路のいずれかによって投与した場合、肺においてルシフェラーゼ発現をサイレンシングし、これは、本質的に任意の遺伝子の発現が、これらの方法のいずれかを使用して阻害され得る。内因性遺伝子にターゲティングされるｓｉＲＮＡはまた、吸入によって送達された場合、肺において発現を阻害するのに有効であった。したがって、本発明は、呼吸系に影響する広範の疾患を処置するためのＲＮＡｉの使用を可能にする方法を提供し、その疾患としては、呼吸器ウイルスによって引き起こされる感染が挙げられる。脈管内送達の方法はまた、ＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を肺以外の器官または組織に送達するために使用され得る。
【００１７】
１つの局面において、本発明は、哺乳動物被験体の器官または組織において転写物の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、ＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、その転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質）をその被験体の呼吸系に対して直接的に導入することを包含する。好ましい実施形態において、上記器官または組織は、気道の一部（例えば、肺）である。したがって、本発明は、哺乳動物被験体の呼吸系において転写物の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、ＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、その転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質）をその被験体の呼吸系に対して直接的に導入することを包含する。他の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、呼吸系に対して直接的に送達され、脈管に進入し、そして脈管系を介して呼吸系以外の活性部位に輸送される（すなわち、呼吸性経路は、全身送達のために使用される）。
【００１８】
本発明は、哺乳動物被験体の呼吸系において転写物の発現を阻害する方法をさらに提供し、その方法は、その転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質をその哺乳動物被験体の脈管系に対して直接的に導入することを包含する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、哺乳動物被験体の器官または組織において転写物の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、その転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を哺乳動物被験体の脈管系に対して直接的に導入することを包含する。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物被験体の実質器官または実質組織において転写物の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、ＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、その転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質）をその被験体の呼吸系に導入することを包含し、そのＲＮＡｉ誘導性物質は、その脈管系に進入し、そして身体の他の位置に輸送される。任意の上述の方法の特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、脂質または送達増強性ポリマーを本質的に含まない水性媒体において投与される。本発明の他の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、カチオン性ポリマーを含む組成物において投与される。
【００２０】
本発明は、呼吸系に送達するのに適している組成物を提供する。特に、本発明は、液体粒子または固体粒子（例えば、乾燥粉末）を含む呼吸用エアロゾル処方物を提供し、その粒子は、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質および／またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの１つ以上を含む。上記処方物は、送達因子および／または賦形剤を含み得る。本発明はまた、ＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターを含む鼻腔用スプレーを提供する。本発明は、本発明の組成物を送達するためのデバイス（例えば、呼吸系への乾燥エアロゾル処方物または液体エアロゾル処方物の送達のための吸入器または噴霧器などのデバイス）をさらに提供する。上記デバイスは、単一用量または複数用量の上記組成物を送達し得る。本発明の組成物は、上記デバイスの内部に提供され得、そして／または本発明の組成物は、別個に提供され得る（例えば、詰め替えとして）。上記デバイスは、使い捨て可能であり得る。
【００２１】
別の局面において、本発明は、インフルエンザ遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２２】
本願は、種々の特許、学術論文、および他の刊行物（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）を参照する。さらに、以下の標準的な参考資料は、本明細書中に参考として援用される：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、２００２年７月の版；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ、ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版．ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、２００１。
【００２３】
他で定義しない限り、本明細書中で使用した全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと類似するか等価な方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。要素がマーカッシュ群形式で記載される場合、これらの要素のそれぞれの部分群もまた開示されること、および任意の要素がその群から除外され得ることが、理解され得る。範囲が与えられた場合、終点は、他に示されないかまたは文脈から明らかでない限りその範囲に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（略語）
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸
ｖＲＮＡ：インフルエンザウイルスゲノム中のビリオンＲＮＡ（マイナス鎖）
ｃＲＮＡ：相補的ＲＮＡ（ｖＲＮＡの直接的転写物、プラス鎖）
ｍＲＮＡ：ｖＲＮＡまたは細胞遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（タンパク質合成のテンプレート）
ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ：短干渉ＲＮＡ
ｓｈＲＮＡ：短ヘアピンＲＮＡ
ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ
ＲＮＡｉ：ＲＮＡ干渉
ｂｐ：塩基対
ｎｔ：ヌクレオチド。
【００２５】
（定義）
本明細書中で使用される場合、数に関する用語「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」は、一般に、他で記載するか文脈から明らかでない限り、いずれかの方向（超えるまたは未満）で５％の範囲内の数字を含むこととする（このような数字は可能性のある値の１００％を超えない）。範囲が示されている場合、他で記載するか文脈から明らかでない限り、終点は範囲内に含まれる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「鳥類」は、分類学の鳥類網（ｃｌａｓｓ  ａｖａ）の生物体のあらゆる種、亜種または品種（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、およびカラス）をいうことを意図する。この用語は、種々の公知であるＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、またはニワトリの系統（例えば、Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｇｈｏｒｎ、Ｂａｒｒｅｄ−Ｒｏｃｋ、Ｓｕｓｓｅｘ、Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ、Ａｕｓｓｔｒａｌｏｒｐ、Ｍｉｎｏｒｃａ、Ａｍｒｏｘ、Ｃａｌｉｆ．Ｇｒａｙ、Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐａｒｔｉｄｇｅ−ｃｏｌｏｒｅｄ）、ならびにシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウおよび一般的に飼育されている他の家禽の系統を含む。
【００２７】
用語「相補的」とは、特定の塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸の間の正確な対形成の能力をいうために当該分野で受け入れられている意味に従って本明細書中で使用される。例えば、アデニン（Ａ）とウリジン（Ｕ）とは相補的であり、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）とは相補的であり、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とは相補的であり、それらは、当該分野でワトソン−クリック塩基対形成と称される。第１の核酸配列の一定の位置でのヌクレオチドが、鎖が逆平行の方向で整列されるときの第２の核酸配列中の反対に位置するヌクレオチドと相補的である場合、そのヌクレオチドは相補塩基対を形成し、その核酸はその位置で相補的である。第１の核酸の第２の核酸に対する％相補性は、第２の核酸に沿った評価窓にわたる相補性が最大になるように逆平行の方向でそれらを整列し、その窓内で相補塩基対を形成する両方の鎖のｎｔの総数を決定し、その窓内のｎｔの総数によって除算し、そして１００を乗算することによって評価され得る。例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡおよびＴＴＴＧＴＴＡＴは、塩基対中の全部で１６個のうちの１２個のヌクレオチドが相補的であるため、７５％相補的である。評価枠にわたり少なくとも７０％相補的である核酸を、この枠にわたって実質的に相補的であると見なす。特定の％相補性を達成するために必要とされる相補的ｎｔの数を計算する場合、分数は、小数点第１位で四捨五入して整数にされる。非相補ヌクレオチドによって占められる位置は、ミスマッチを構成する（すなわち、その位置は、非相補塩基対によって占められる）。最大の相補性を達成するために、ギャップは、評価窓内の核酸のいずれかまたは両方に導入され得る。ギャップに向かい合うヌクレオチドは、対形成せず、そしてバルジを構成する（すなわち、他の核酸において向かい合って位置するヌクレオチドが存在しない）。代表的に、％相補性は、少なくとも１５ｎｔ（例えば、１９ｎｔ）長の評価窓にわたって決定され、その長さは、ギャップを含まない。％相補性を決定するために、１ｎｔのバルジは、単一の非相補的ｎｔであると見なされ；２ｎｔと５ｎｔとの間のバルジは、２個の非相補的ｎｔと見なされる；６ｎｔと１０ｎｔとの間のバルジは、３個の非相補的ｎｔと見なされる。長さがＫｎｔのバルジ（ここで、Ｋは、１０より大きい）は、３＋（Ｋ−１０）個の非相補的ｎｔであると見なされる。
【００２８】
「呼吸系に直接的に」とは、組成物中の活性因子の顕著な分画（例えば、１０重量％より多い活性因子、好ましくは２５重量％より多い活性）が上気道および／または下気道に進入するように鼻、口、または気管（好ましくは、鼻または口）を介して投与することをいう。
【００２９】
「脈管系に直接的に」とは、脈管系に身体の外部から入れられる注射もしくはカテーテルまたは任意の他の方法による脈管（例えば、動脈または静脈）への投与をいい、それは、脈管の壁を貫通することを含む。「脈管系に間接的に」とは、脈管系が貫通されない投与の様式をいう。脈管系に対する皮下の間接送達の好ましい例は、呼吸系に物質が直接送達され、次いで脈管壁をその物質が横切って通過することである。次いでこの物質は、身体の他の標的組織または標的器官に輸送され得る（そして、肺に戻り得る）。
【００３０】
活性因子の「有効量」とは、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な活性因子の量をいう。当業者によって認識されるように、有効な特定の因子の絶対量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される因子、標的組織などのような因子に依存して変動し得る。「有効量」は、単数用量または複数用量において投与され得る。例えば、ＲＮＡｉ誘導性実体の有効量は、以下のうちの１つ以上を達成するのに十分な量であり得る：（ｉ）標的転写物の発現を少なくとも２０％（好ましくは、少なくとも４０％）減少させる；（ｉｉ）ウイルス力価を少なくとも２５％減少させる；（ｉｉｉ）ウイルス力価を少なくとも２分の１に減少させる；（ｉｖ）臨床的に顕著なウイルス感染の発症を遅延させるかまたは予防する；（ｖ）ウイルス感染の少なくとも１つの症状の持続期間または重篤度を減少させるなど。
【００３１】
組成物が１重量％、好ましくは、０．５重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満の物質を含む場合、その組成物は、その物質を「本質的に含まない」。より好ましくは、その物質は、その組成物から完全に欠けている。組成物は、送達増強性ポリマーまたは脂質がその組成物に意図的に含まれていない場合、送達増強性ポリマーまたは脂質を本質的に含まない。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリッド形成する」とは、目的とする特定の条件（例えば、真核生物細胞、ドロソフィア溶解物など）の下で安定な二重鎖構造が形成されるような、相補部分を含むかまたは相補部分からなる２つの核酸配列の間の相互作用をいう。代表的に、第１の核酸は、第１の核酸と第２の核酸とによって形成される二重鎖のＴｍが、第２の核酸と、第２の核酸と同じ長さでありかつ１００％相補的であり、そして同じ型のヌクレオシドおよびヌクレオシド間結合を含む第３の核酸とによって形成される二重鎖のＴｍを１５℃未満（好ましくは、１０℃未満）下回っている場合、第２の核酸にハイブリッド形成すると考えられる。種々の用途に適したハイブリッド形成条件は、当該分野において公知であり、そして／または標準的な参考資料（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、前出）において見出される。例示の実施形態において、ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、完全に相補的な二重鎖のＴｍを１０〜１５℃下回る温度での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）および０．１％  ＳＤＳ、その後の完全に相補的な二重鎖のＴｍを２５℃下回る温度で２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおいて３０分間にわたって１〜２回洗浄することを含む。
【００３３】
「同一性」とは、２個以上の核酸の配列が同じである程度をいう。評価窓にわたる第１の核酸と第２の核酸との間の％同一性は、平行の方向で核酸を整列し、同一のヌクレオチドが向かい合う評価窓内のヌクレオチドの数を決定し、その窓内のヌクレオチドの総数で除算し、そして１００を乗算することによって計算され得る。特定の％同一性を達成するために必要とされる同一のヌクレオチドの数を計算する場合、分数は、小数点第１位で四捨五入して整数にされる。評価窓にわたって少なくとも７０％（例えば、少なくとも８０％、少なくとも９０％）以上同一である核酸が、その窓にわたって実質的に同一であると見なされる。代表的に、上記評価窓は、第２の核酸に沿って少なくとも１５ｎｔ長（例えば、１９ｎｔ長）であり、その長さは、ギャップを含まない。％同一性を決定するために、１ｎｔギャップは、同一のｎｔに向かい合わない単一のｎｔであると見なされる；２ｎｔと５ｎｔとの間のギャップは、同一のｎｔに向かい合わない２ｎｔと見なされる；６ｎｔと１０ｎｔとの間のギャップは、同一のｎｔに向かい合わない３ｎｔと見なされる。長さがＫｎｔのギャップ（ここで、Ｋは、１０より大きい）は、同一のｎｔに向かい合わない３＋（Ｋ−１０）ｎｔであると見なされる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「インフルエンザウイルス」は、動物またはヒト被験体で疾患を引き起こすことができるか実験分析のための興味深い候補である任意のインフルエンザウイルス株をいう。インフルエンザウイルスは、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．，ら，Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ．ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ；ＩＳＢＮ：０７８１７１８３２５，２００１に記載されている。特に、この用語は、動物またはヒト被験体で疾患を引き起こすことができるか実験分析のための興味深い候補である任意のインフルエンザＡウイルス株を含む。非常に多数のインフルエンザＡ単離物が部分的または完全に配列決定されている。付録Ａは、公的データベース（Ｔｈｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＩＳＤ）（Ｍａｃｋｅｎ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｈ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．，＆  Ｂｏｙｋｉｎ，Ｌ．，’’Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．’’ｉｎ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＩＶ  Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ｎ．Ｃｏｘ  ＆  Ａ．Ｗ．Ｈａｍｐｓｏｎ（Ｅｄｓ．）Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，１０３−１０６）を参照のこと）に示されているインフルエンザＡゲノムセグメントの完全な配列表の一部のみを示す。このデータベースは、インフルエンザＢおよびＣゲノムセグメントの完全な配列も含む。ユーザーがゲノムセグメント、ウイルスに感染した種、および単離年によって検索可能な便利な検索エンジンと共に、ＵＲＬがｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／を有するウェブサイトにおいてワールドワイドウェブ上でこのデータベースが利用可能である。Ｇｅｎｂａｎｋのインフルエンザ配列も利用可能である。従って、インフルエンザの遺伝子配列は、当業者が容易に利用可能であるか、または当業者が容易に決定可能である。
【００３５】
ＲＮＡｉ誘導性物質の合成、プロセシング、または活性に関して本明細書中で使用される場合、用語「インビボ」は、一般に、無細胞系において起きる事象とは対照的に、細菌内で起きる事象をいう。一般に、その細胞は、組織培養において維持され得るか、またはインタクトな器官の一部であり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、１）通常天然で会合している成分の少なくとも一部から分離されること、２）人の手を含むプロセスによって調製または精製されること、および／または３）天然に存在しないことを意味する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「リガンド」は、抗原−抗体相互作用以外の機構によって第２の分子に特異的に結合する分子を意味する。この用語は、例えば、天然に存在するか合成された、ポリペプチド、ペプチド、および低分子（その構造が人によって発明された構造を有する分子を含む）を含む。
【００３８】
「核酸ベースのアッセイ」とは、核酸の存在が検出され、そして／または核酸が同定される任意のアッセイまたは方法をいう。そのアッセイは、定性的であっても定量的であってもよい。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログとの対形成において水素結合（好ましくは、ワトソン−クリック水素結合）を形成し得る窒素含有ヘテロ環式部分（例えば、プリンまたはピリミジン）を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、および天然に存在する核酸塩基のアナログ（Ｆａｓｍａｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ．３８５−３９４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．、１９８９）である。用語「核酸塩基」および「塩基」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４０】
「ヌクレオチド」は、窒素性塩基、糖分子、およびリン酸基を含む。ヌクレオシドは、糖分子に連結された窒素性塩基（核酸塩基）を含む。天然に存在する核酸において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドに共有結合してポリマーを形成する。核酸は、天然に存在するヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）、改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含み得る。ヌクレオシドは、ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）（すなわち、二重鎖で核酸が向かい合う場合に核酸において一般的に見出される１つ（または好ましくは、任意）の天然の塩基を置換し得る塩基（例えば、１４２〜１４９を参照のこと））を含み得る。本発明の特定の実施形態において、核酸は、無塩基性残基を有する。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」は、１つの核酸配列の発現が他の核酸配列によって調節、制御、調整などが行われる２つの核酸配列間の関係をいう。例えば、作動可能に連結されたプロモーター配列によって核酸配列の転写が指示される；作動可能に連結されたプロセシング配列によって核酸の転写後プロセシングが指示される；作動可能に連結された翻訳調節配列によって核酸配列の翻訳が指示される；作動可能に連結された輸送配列または局在化配列によって核酸またはポリペプチドの輸送または局在化が指示される；および、作動可能に連結されたプロセシング配列によってポリペプチドの翻訳後プロセシングが指示される。好ましくは、第２の核酸配列に作動可能に連結された核酸配列はこのような配列と直接または間接的に共有結合するが、任意の有効な三次元会合が許容可能である。
【００４２】
用語「器官」とは、当該分野において使用される場合、生物体の形態学的かつ機能的に異なる部分を構成する組織または組織の群をいう。例としては、肺、心臓、肝臓、膵臓、乳、腎臓、腸、膀胱、骨、皮膚などが挙げられる。用語「組織」とは、当該分野において使用される場合、通常、類似の構造（代表的に、１つ以上の同一かまたは関連する機能を行なうように組織化されている）細胞の群をいう。赤血球、白血球、および血小板は、個々の細胞または細胞フラグメントを含む循環する組織であると見なされる。
【００４３】
「予防する」とは、疾患、障害、病態、もしくは症状またはそれらの発現の発生、あるいはそれらの重篤度の悪化が起こらないようにすることをいう。予防することは、疾患、障害、病態、もしくは症状またはそれらの発現の発生、あるいはそれらの重篤度の悪化が起きる危険性を減少させることを含む。したがって、組成物または方法が、個体または集団ベースで、疾患、障害、病態、もしくは症状またはそれらの発現の発生、あるいはそれらの重篤度の悪化が起きる危険性を減少させる場合、その組成物または方法は、疾患、障害、病態、もしくは症状またはそれらの発現、あるいはそれらの重篤度の悪化を予防するといわれる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、天然であるか合成であるかにかかわらず、プライマー伸長（例えば、ポリメラーゼ触媒性プライマー伸長）が開始される条件下で核酸テンプレートにハイブリッド形成した場合に、核酸合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの意図された用途に依存するが、代表的には１５ｎｔ〜３５ｎｔの範囲である。いくつかの場合において、プライマーは、より長いものであり得る（例えば、約６０ｎｔ長まで）。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーが、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリッド形成してプライマー伸長を生じるために十分に相補的でなければならない。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」とは、核酸について言及する場合、相補的核酸とハイブリッド形成し、それによって相補的核酸の存在を検出し得る核酸をいう。プローブは、特異的なハイブリッド形成が使用されるハイブリッド形成ストリンジェンシー条件下で起こり得るように、検出される核酸に十分に相補的であるべきである。プローブは、標識（例えば、蛍光部分、ビオチンなど）によって改変され得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「精製された」は、多数の他の化合物または物質から分離したことを意味する。化合物または物質は、部分的に精製されているか、実質的に精製されているか、純粋であり得る（実質的に全ての他の化合物または物質から取り出された場合、純粋であり得る（すなわち、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超えて純粋である））。
【００４７】
用語「調節配列」は、作動可能に連結された配列の発現（特に、転写であるが、いくつかの場合、スプライシングまたは他のプロセスなどの他の事象）を指示、強化、または阻害する核酸配列領域を記載するために本明細書中で使用される。この用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節エレメントが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、調節配列は、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示することができ、他の実施形態では、調節配列は、組織特異的および／または誘導性発現を指示することができる。調節配列は、感染性因子に感染した細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示することができる。例えば、調節配列は、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスポリメラーゼ、転写因子など）によって認識されるウイルス特異的プロモーターまたはエンハンサーなどのプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。あるいは、調節配列は、上皮細胞（例えば、肺上皮細胞）において活性なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含み得る。例えば、サーファクタントタンパク質をコードする遺伝子に対するプロモーターが、使用され得る。
【００４８】
「呼吸系」とは、上気道（例えば、鼻腔路（ｎａｓａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）、鼻咽頭、口腔咽頭部）または下気道（例えば、気管、気管支、細気管支、および／または肺胞）の任意の構成要素をいう。咽頭は、上気道または下気道のいずれかの構成要素と見なされ得る。用語「呼吸系」および「気道」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００４９】
「呼吸器ウイルス」は、被験体の上気道および／または下気道に存在する細胞に感染するウイルスである。好ましくは、そのウイルスは、気道上皮細胞に感染する。感染され得る他の細胞としては、気管支肺胞マクロファージ、樹状細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。呼吸器ウイルスの例としては、以下が挙げられる：インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、肺炎ウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、レオウイルス、ヘルペスウイルス、およびハンタウイルス。
【００５０】
用語「ＲＮＡｉ誘導性物質」は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびプロセシングされてｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたはＲＮＡ干渉によって標的転写物の発現を阻害する他の小さいＲＮＡ種を生じ得る他の二本鎖構造物（例えば、ｄｓＲＮＡ）をいうために使用される。本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質は、翻訳の抑制を含むＲＮＡ干渉経路を介して標的ＲＮＡの発現を阻害する。
【００５１】
用語「ＲＮＡｉ誘導性実体」、細胞内におけるその存在が、ＲＮＡｉをもたらし、そしてＲＮＡｉ誘導性実体がターゲティングされる転写物の発現の減少を生じるＲＮＡ分子およびベクターを包含する。ＲＮＡｉ誘導性実体は、例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、またはＲＮＡｉ誘導性ベクターであり得る。用語「ＲＮＡｉ誘導性実体」、「ＲＮＡｉ誘導性物質」、または「ＲＮＡｉ誘導性ベクター」の使用は、実体、物質、またはベクターが、一般に、ＲＮＡｉをアップレギュレートまたは活性化することを意味すること意図するが、ＲＮＡｉ誘導性ベクターがそのようにし得るにもかかわらず、細胞内での実体、物質、またはベクターの存在が標的転写物の発現におけるＲＮＡｉ媒介性の減少をもたらすことを単に示すことを意図する。本明細書中で使用される場合、「ＲＮＡｉ誘導性実体」は、例えば、内因性ＲＮＡ種またはウイルス感染の自然の過程の間に細胞中で産生されるＲＮＡ種とは異なる、人の手によって改変もしくは産出され、そして／または細胞におけるその存在が人の介入の結果である実体である。
【００５２】
「ＲＮＡｉ誘導性ベクター」は、細胞内での存在により１つ以上のＲＮＡが転写され、互いにハイブリッド形成するか、または自己ハイブリッド形成してｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質を形成するベクターである。本発明の種々の実施形態では、この用語は、細胞内での存在により１つ以上のＲＮＡが産生され、自己ハイブリッド形成または互いにハイブリッド形成してＲＮＡｉ誘導性物質を形成するプラスミドを含む。一般に、ベクターは、ベクターが細胞内に存在する場合にハイブリッド形成または自己ハイブリッド形成してＲＮＡｉ誘導性物質を形成する１つ以上のＲＮＡ分子が転写されるように発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含む。したがって、ベクターは、ＲＮＡｉ誘導性物質の細胞内合成のためのテンプレートを提供する。ＲＮＡｉの誘導のために、細胞内のウイルスゲノムの存在は、細胞内でのウイルスの存在を構成する。細胞内に移入されるか、細胞に侵入するか、親細胞から遺伝した場合、その後細胞内で改変またはプロセシングするかに関係なく、ベクターは細胞内に存在すると見なされる。ＲＮＡｉ誘導性ベクターは、そのベクターがＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートを含む場合、転写物にターゲティングされるものと見なされる。このようなベクターは、細胞中の転写阻害に加えて、多くの他の用途を有する。例えば、それらのベクターは、ＲＮＡｉ誘導性物質のインビトロ産生において使用され得、および／またはベクターがターゲティングされる転写物を含んでも含まなくてもよい細胞におけるＲＮＡｉ誘導性物質の産生に使用され得る。
【００５３】
「短干渉ＲＮＡ」は、１５ヌクレオチド長と約２９ヌクレオチド長との間であるか、または１５と２９との間の間隔内にある任意の他の部分的範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅ）もしくは特定の値（例えば、１６〜１８ｎｔ長、１７〜１９ｎｔ長、２１〜２３ｎｔ長、２４〜２７ｎｔ長、２７〜２９ｎｔ長）である二本鎖（二重鎖）ＲＮＡを含み、そして必要に応じて、一方または両方の鎖上に１つまたは２つの一本鎖突出部（例えば、３’突出部）をさらに含む。特定の実施形態において、上記二重鎖は、約１９ｎｔ長である。上記突出部は、例えば、１〜６残基長（例えば、２ｎｔ）であり得る。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子から形成され得るか、または代替的に、ｓｈＲＮＡから産出され得る。本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの５’末端の一方または両方は、リン酸基を有するが、他の実施形態において、その５’末端の１つ以上は、リン酸基を欠く。本発明の特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの３’末端の一方または両方は、水酸基を有するが、他の実施形態において、それらの３’末端は、水酸基を有さない。「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ  ｓｔｒａｎｄ）」と称されるｓｉＲＮＡの一方の鎖は、標的転写物とハイブリッド形成する部分を含む。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、上記標的転写物の領域と１００％相補的である（すなわち、それは、１５ｎｔ長と約２９ｎｔ長との間（好ましくは少なくとも１６ｎｔ長、より好ましくは１８〜２０ｎｔ長（例えば、１９ｎｔ長））の標的領域にわたってミスマッチまたはバルジを１つも含まずにその標的転写物にハイブリッド形成する）。相補性の領域は、１７と２９との間の間隔内にある任意の部分的範囲または特定の値（例えば、１７〜１８、１９〜２１、２１〜２３、１９〜２３、２４〜２７、２７〜２９）であり得る。他の実施形態において、上記アンチセンス鎖は、標的領域と実質的に相補的である（すなわち、１つ以上のミスマッチおよび／またはバルジは、上記アンチセンス鎖と標的転写物とによって形成される二重鎖に存在する）。ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、二重鎖部分内で実質的に相補的（好ましくは、互いと１００％相補的）である。
【００５４】
用語「短ヘアピンＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡ二重鎖について記載されるような）を媒介するのに十分な長さである二本鎖（二重鎖）構造、および上記二重鎖を形成するｓｈＲＮＡの領域を接続するループを形成する少なくとも１つの一本鎖部分を形成するようにハイブリッド形成するか、またはハイブリッド形成し得る少なくとも２つの相補部分を含むＲＮＡ分子である。上記構造はまた、二重鎖部分であるステムを有するステム／ループ構造を称する。上記構造は、５’末端または３’末端において突出部（例えば、ｓｉＲＮＡについて記載されるような）をさらに含み得る。好ましくは、上記ループは、約１〜２０ｎｔ長、より好ましくは約４〜１０ｎｔ長、そして最も好ましくは約６〜９ｎｔ長であり、そして／または上記突出部は、約１〜２０ｎｔ長、そしてより好ましくは約２〜１５ｎｔ長である。上記ループは、阻害が所望される標的転写物と相補的である領域（すなわち、ｓｈＲＮＡのアンチセンス部分）の５’末端または３’末端のいずれかに位置し得る。特定の実施形態において、上記突出部は、１つ以上のＵ残基（例えば、１と５との間のＵ）を含む。下でさらに記載されるように、ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機構によってｓｉＲＮＡへとプロセシングされる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり、そしてｓｈＲＮＡは、一般に、ｓｈＲＮＡの一部（ｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖と称される）と相補的である標的転写物の発現を同様に阻害し得る。一般に、ｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖と標的転写物との間に形成される二重鎖の形状は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と標的転写物との間に形成される二重鎖の形状と類似する。本発明の特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡの５’末端は、リン酸基を有するが、他の実施形態において、ｓｈＲＮＡの５’末端は、リン酸基を有さない。本発明の特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡの３’末端は、水酸基を有するが、他の実施形態において、ｓｈＲＮＡの３’末端は、水酸基を有さない。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に感染しやすい個体をいう。この用語には、トリおよび動物（例えば、ニワトリおよび哺乳動物（ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど）などが含まれる）、ならびに野生動物、非ヒト霊長類、およびヒト）が含まれる。
【００５６】
ＲＮＡｉ誘導性物質は、（１）そのＲＮＡｉ誘導性物質が、少なくとも約１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１７ヌクレオチド長、よりさらに好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド長または１９ヌクレオチド長から約２１〜２３ヌクレオチド長、または２４〜２９ヌクレオチド長のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたって、標的転写物と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相補的である鎖を含む場合；および／あるいは（２）そのＲＮＡｉ誘導性物質の１つの鎖が、標的転写物にハイブリッド形成する場合に、本明細書中に記載される目的のために標的転写物に「ターゲティングされる」と見なされる。適切なハイブリッド形成条件は、代表的に、例えば、米国公開第２００２００８６３５６号および同第２００４０２２９２６６号ならびに参考文献２１および参考文献２８に記載されるような、哺乳動物細胞の細胞質もしくは核および／またはドロソフィア溶解物において見出されるものである。本発明の特定の実施形態において、アンチセンス鎖と標的転写物とによって形成される二重鎖中のＧＵ塩基対またはＵＧ塩基対は、ＲＮＡｉ誘導性物質がその転写物にターゲティングされるか否かを決定する目的に関してミスマッチと見なされない。細胞内に存在するＲＮＡ誘導性ベクターは、転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の産生をもたらし、そしてまた、そのＲＮＡ誘導性ベクターは、転写物にターゲティングされると見なされる。転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質はまた、その転写物の合成を指揮する遺伝子をターゲティングすると見なされる。ウイルスの産生、ウイルスの複製、ウイルスの病原性および／またはウイルスによる感染に関連する標的転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ誘導性物質は、そのウイルスを阻害するといわれる。
【００５７】
「標的部分」は、ＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖とハイブリッド形成する標的転写物の領域である。
【００５８】
用語「標的転写物」とは、ＲＮＡｉについての標的である任意のＲＮＡをいう。メッセンジャーＲＮＡが、好ましい標的である。用語「標的ＲＮＡ」および「標的転写物」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「処置する」には、疾患、障害、もしくはこのような用語が適用される病態、またはこのような疾患、障害、もしくは病態の１つ以上の徴候もしくは発症の進行の逆転、緩和、および／または阻害が含まれる。
【００６０】
一般に、用語「ベクター」とは、細胞への第２の核酸分子の侵入（例えば、導入、輸送など）を媒介することができる核酸分子をいう。導入される核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結される（例えば、挿入される）。ベクターは、自律複製を指示する配列を含み得るか、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに十分な配列を含み得る。有用なベクターには、例えば、プラスミド（代表的にはＤＮＡ分子であるが、ＲＮＡプラスミドも公知である）、コスミド、およびウイルスベクターが含まれる。当該分野で周知なように、用語「ウイルスベクター」は、代表的には核酸分子の導入もしくは組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、プラスミド）（例はレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを含む）または核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子（例は、レトロウイルスまたはレンチウイルスを含む）のいずれかをいうことができる。当業者に自明なように、ウイルスベクターは、核酸に加えて種々のウイルス構成要素を含み得る。
【００６１】
（本発明の一定の好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．インフルエンザウイルスの生活環および特徴）
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科のエンベロープで包まれたマイナス鎖のＲＮＡウイルスである。これらは、インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型に分類され、インフルエンザＡは病原性が最も高く、動物株内で再集合を受けることができる唯一の型と考えられている。インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型を、その核タンパク質および基質タンパク質の相違によって区別することができる（図１を参照のこと）。以下でさらに考察されるように、インフルエンザＡサブタイプは、その血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子の変化によって定義され、通常、対応するタンパク質に結合する抗体によって区別される。
【００６２】
インフルエンザＡウイルスゲノムは、８つのＲＮＡセグメント中に分布した１０個の遺伝子からなる。遺伝子は、以下の１０個のタンパク質をコードする：エンベロープ糖タンパク質血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、基質タンパク質（Ｍ１）、核タンパク質（ＮＰ）、本明細書中でポリメラーゼまたはポリメラーゼ複合体とも呼ばれるＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写酵素の構成要素である３つのポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ）、イオンチャネルタンパク質（Ｍ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）。インフルエンザＡウイルスおよびその分子病原性についてのさらなる詳細については、Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．，ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２：１７１−１８０，２００１を参照のこと。Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．，ら，Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ．ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；ＩＳＢＮ：０７８１７１８３２５，２００１も参照のこと。インフルエンザＢウイルスゲノムの組織化は、インフルエンザＡのそれと非常に類似しているが、インフルエンザＣウイルスゲノムは、７個のＲＮＡセグメントを含み、ＮＡ遺伝子を欠く。
【００６３】
インフルエンザＡウイルス分類は、血球凝集素（Ｈ１〜Ｈ１５）およびノイラミニダーゼ（Ｎ１〜Ｎ９）遺伝子に基づく。世界保健機関（ＷＨＯ）の命名法により、各ウイルス株は各株をその起源となる動物宿主（ヒトでない場合に指定する）、地理的起源、株数、単離年、ならびにＨＡおよびＮＡの抗原についての説明によって定義される。例えば、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、１９３４にプエルトリコでヒトで発生し、且つＨＡおよびＮＡの抗原のサブタイプ１を有するＡ株の単離物８を示す。別の例として、Ａ／Ｃｈｉｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）は、１９９７年にホンコンでニワトリで発生し、且つＨＡのサブタイプ５およびＮＡのサブタイプ１を有するＡ株の単離物２５８を示す。ヒトでの流行は、ＨＡのＨ１、Ｈ２、およびＨ３型およびＮＡのＮ１型およびＮ２型を有するウイルスに起因した。
【００６４】
上記のように、インフルエンザウイルスＡにおいて２つの主な機構によって遺伝子が変化する。点変異を介して遺伝的浮動が起こり、これは、宿主免疫応答による選択圧および遺伝的シフト（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｈｉｆｔ）（再集合ともいう）（これは、１つのサブタイプの全ウイルスゲノムセグメントから別のものへの置換を含む）によって抗原的に重要な位置でしばしば起こる。多数の異なる動物種型（ヒト、ブタ、トリ、ウマ、水生動物などが含まれる）が、インフルエンザＡウイルスで感染されるようになり得る。いくつかのインフルエンザＡウイルスは、特定の種に限定され、通常、他の種に感染しない。しかし、いくつかのインフルエンザＡウイルスは、いくつかの異なる動物種（主にトリ、ブタ、およびヒト）に感染し得る。この能力は、インフルエンザＡウイルスの主な抗原不連続変異を担うと考えられる。例えば、ブタがヒト由来のインフルエンザＡウイルスに感染し、同時にアヒル由来の異なるインフルエンザＡウイルスに感染したとする。２つの異なるウイルスがブタ細胞で再生される場合、ヒト株およびアヒル株の遺伝子が「混合」されて、ＲＮＡセグメントの固有の組み合わせを有する新規のウイルスが得られることとなり得る。このプロセスは、遺伝子の再集合と呼ばれる。
【００６５】
他のウイルスと同様に、インフルエンザウイルスは細胞内で複製される。インフルエンザＡウイルスは、気道の上皮細胞で複製される。しかし、単球／マクロファージおよび他の白血球にも感染することができる。シアル酸含有細胞表面糖タンパク質を含む多数の他の細胞型は、ウイルスが受容体としてこれらの分子を使用するため、インビトロで感染しやすい。
【００６６】
インフルエンザＡ感染／複製サイクルを、概略的に図１に示す。図１Ａに示すように、インフルエンザＡビリオン１００は、以下の８つのマイナス鎖ＲＮＡセグメントからなるゲノム１０１を含む：ＰＢ２（１０２）、ＰＢ１（１０３）、ＰＡ（１０４）、ＨＡ（１０５）、ＮＰ（１０６）、ＮＡ（１０７）、Ｍ（１０８）、およびＮＳ（１０９）。従来は以下のように１〜８の番号を付けている：ＰＢ２＝１、ＰＢ１＝２、ＰＡ＝３、ＨＡ＝４、ＮＰ＝５、ＮＡ＝６、Ｍ＝７、およびＮＳ＝８。ゲノムＲＮＡセグメントは、エンベロープ糖タンパク質ＨＡ（１４０）およびＮＡ（１５０）の細胞外ドメインならびにイオンチャネルＭ２（１６０）が突き出した脂質二重層１３０に囲まれた膜タンパク質Ｍ１（１２０）の膜内にパッケージングされている。ＲＮＡセグメント（１０２〜１０８）は、核タンパク質ＭＰ（１７０）で覆われており、ポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡからなるウイルスポリメラーゼ複合体１８０を含む。非構造タンパク質ＮＳ１（示さず）は、感染細胞内で発見される。非構造タンパク質ＮＳ２  １９０もまた、ビリオン内で発見される。
【００６７】
図１Ｂは、インフルエンザウイルスのゲノム構造およびインフルエンザゲノムから作製した転写物を示す（一定の比率では描いていない）。８個のゲノムＲＮＡセグメントのうちの６個（ＰＢ１（１０２）、ＰＢ２（１０３）、ＰＡ（１０４）、ＨＡ（１０５）、ＮＰ（１０６）、ＮＡ（１０７））はそれぞれ対応するタンパク質をコードする１つの非スプライシング転写物のテンプレートとして作用する。以下の３つのｍＲＮＡ転写物は、インフルエンザウイルスＡセグメントＭ（１０８）に由来すると同定された：Ｍ１タンパク質をコードする共線的（ｃｏｌｉｎｅａｒ）転写物１９１、Ｍ２タンパク質をコードし、且つ６８９個のヌクレオチドイントロンを含むスプライシングｍＲＮＡ（１９２）、およびウイルス感染細胞で検出されなかった９アミノ酸ペプチド（Ｍ３）をコードする能力を有する別の選択的にスプライシングされたｍＲＮＡ（１９３）。以下の２つのｍＲＮＡ転写物は、インフルエンザウイルスＡセグメントＮＳに由来する：ＮＳ１タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡ（１９４）およびＮＳ２タンパク質をコードし、且つ４７３ヌクレオチドイントロンを含むスプライシングｍＲＮＡ（１９５）。
【００６８】
感染サイクル（図２）は、ビリオン１００がその血球凝集素を介してシアル酸含有細胞表面タンパク質との相互作用によって感染しやすい細胞の表面に付着する場合に開始される。付着したウイルスは、クラスリン依存性エンドサイトーシスを介して被覆小胞２００にエンドサイトーシスされる。エンドソームの低ｐＨにより、ウイルスとエンドソーム膜との融合が誘発され、それによりウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）複合体（ヌクレオキャプシド）２１０が細胞質に遊離する。ウイルスヌクレオキャプシドが細胞核にインポートされ、その後ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡポリメラーゼからなるウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体によって一次ウイルスｍＲＮＡ合成が開始される。宿主細胞前ｍＲＮＡに対するＰＢ２タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性によって産生されたプライマーを使用して、テンプレートとしてウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）２２０を使用したウイルスｍＲＮＡ合成が開始される。ＰＢ１タンパク質は、細胞質に輸送されて翻訳されるウイルス特異的ｍＲＮＡ２３０の合成を触媒する。
【００６９】
新規に合成されたポリメラーゼは核に輸送され、複製および二次ウイルスｍＲＮＡ合成を調節する。ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）由来の相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（２４０）の合成は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰによって開始され、その後新規のｖＲＮＡ分子（２５０）が合成される。ウイルスポリメラーゼ複合体は、二次ｍＲＮＡ（２６０）の合成のためのテンプレートとしてこれらのｖＲＮＡを使用する。したがって、ウイルスコード転写酵素によるｖＲＮＡの転写により、ウイルスタンパク質合成のためのテンプレートとして作用するｍＲＮＡが産生され、５’キャップおよび３’ポリＡテールの欠如がｍＲＮＡと異なり、且つ新規のビリオン産生のためにより多くのｖＲＮＡを合成するためのテンプレートとして作用する相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）も産生される。感染後期では、ＮＳ１タンパク質は、ＭおよびＮＳのｍＲＮＡのスプライシングを調節し、それによりＭ２およびＮＳ２のｍＲＮＡが産生される。ウイルスｍＲＮＡが細胞質に輸送され、ウイルス構造タンパク質２７０が産生される。タンパク質ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、およびＮＰが核（ｖＲＮＰ複合体（ヌクレオキャプシド）２８０のアセンブリ部位）に輸送される。Ｍ１およびＮＳ２タンパク質は核にも輸送されるため、これらはｖＲＮＰと相互作用してその核輸送を調節する。ウイルスｖＲＮＡ−Ｍ１タンパク質複合体は、原形質膜でＨＡおよびＮＡ分子の細胞質部分と相互作用し、成熟ビリオンが出芽し、ウイルス粒子が放出される。ウイルス粒子の出芽および放出は、原形質膜にて生じる。
【００７０】
インフルエンザＡウイルスは細胞内で急速に複製され、細胞溶解効果またはアポトーシスによって宿主細胞が死滅する。感染により広範な種々の細胞活動およびプロセスが変化する（宿主細胞遺伝子発現の阻害が含まれる）。ウイルスポリメラーゼ複合体は、核内で新規に合成された細胞ポリメラーゼＩＩ転写物に結合して、これを切断する。ＮＳ１タンパク質は、細胞前ｍＲＮＡスプライシングを遮断し、宿主ｍＲＮＡの核輸送を阻害する。細胞ｍＲＮＡの翻訳が非常に阻害されるのに対して、ウイルスｍＲＮＡは有効に翻訳される。細胞インターフェロン（ＩＦＮ）応答（代表的にはウイルス感染細胞における翻訳を阻害するように作用する宿主応答）のウイルス下方制御によってウイルスｍＲＮＡの有効な翻訳が一部維持される。特に、ウイルスＮＳ１タンパク質は、ＩＦＮ誘導性ＰＫＲに結合し、その活性を阻害する。したがって、インフルエンザウイルスの感染により細胞生合成において著しく変化する（細胞ｍＲＮＡのプロセシングおよび翻訳の変化が含まれる）ことが明らかである。
【００７１】
（ＩＩ．ＲＮＡｉ誘導性実体のｓｉＲＮＡの選択、設計、および合成）
（Ａ．ＲＮＡｉ誘導性実体の選択および設計）
本発明は、１つ以上のインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物を提供する。上記のインフルエンザウイルス複製サイクルの説明は、種々のウイルスＲＮＡ転写物（一次および二次ｖＲＮＡ、一次および二次ウイルスｍＲＮＡ、ならびにウイルスのｃＲＮＡ）がインフルエンザウイルスに感染された細胞内に存在し、ウイルスの生活環で重要な役割を果たすことを証明する。任意のこれらの転写物は、本発明の直接的かまたは間接的な機構のいずれかによるＲＮＡｉ媒介阻害の適切な標的である。任意のウイルスｍＲＮＡ転写物をターゲティングするＲＮＡｉ誘導性実体により、直接的様式で（例えば、転写物の分解によって）転写物自体のレベルが特異的に減少する。さらに、以下で考察するように、一定のインフルエンザウイルス転写物（例えば、ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１）をターゲティングするＲＮＡｉ誘導性物質により、特異的にターゲティングされないインフルエンザウイルス転写物のレベルが間接的に減少する。別のスプライシングが可能な状況では、Ｍ１およびＭ２をコードするｍＲＮＡならびにＮＳ１およびＮＳ２をコードするｍＲＮＡに関して、非スプライシング転写物またはスプライシング転写物は、標的転写物として作用し得る。
【００７２】
本発明のＲＮＡｉベースの治療のための標的として作用し得る潜在的なウイルス転写物には、例えば、１）任意のインフルエンザウイルスゲノムセグメント、２）タンパク質ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１、Ｍ２、ＨＡ、またはＮＡをコードする転写物を含む任意のウイルスタンパク質をコードする転写物が含まれる。転写物を、１つのＲＮＡｉ誘導性物質によってそのｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡ形態にターゲティングすることができるが、本発明者らは、ウイルスｍＲＮＡが唯一または主なＲＮＡｉの標的であることが示唆されるデータを得た。特に好ましい実施形態において、標的転写物は、インフルエンザウイルスタンパク質ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、またはＰＢ２をコードする。
【００７３】
ＲＮＡｉ誘導性物質の一般的な特徴は、当該分野において公知である。ＲＮＡ干渉は、最初に、細胞中の長いｄｓＲＮＡ（代表的に、数百のｎｔ）の存在がｄｓＲＮＡの１つの鎖と相補的な領域を含むｍＲＮＡの配列特異的分解を生じる現象として認識された（米国特許第６，５０６，５５９号）。ｓｉＲＮＡは、ＷＯ  ０１／７５１６４ならびに米国公開第２００２００８６３５６号および同第２００３０１０８９２３号に記載されるようなドロソフィア中のＲＮＡｉの研究において最初に見出された。特に、ドロソフィアにおいて、長いｄｓＲＮＡｓは、２ｎｔ〜３’突出部によって隣接（ｆｌａｎｋ）される１９ｎｔの二重鎖領域が存在するように、Ｄｉｃｅｒと称されるＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様酵素（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３、２００１）によって、２つの２１ｎｔの鎖（それぞれが５’リン酸基および３’水酸基を有し、そして他の鎖と正確に相補的な１９ｎｔの領域を含む）から構成されるより小さいｄｓＲＮＡへとプロセシングされる。図３は、ドロソフィアにおいて見出されるｓｉＲＮＡの概略図を示す。その構造は、センス鎖３１０およびアンチセンス鎖３１５を含む１９ヌクレオチドの二本鎖（ＤＳ）部分３００を含む。各鎖は、２ｎｔの３’突出部３２０を有する。
【００７４】
これらの短ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、そのｄｓＲＮＡ鎖の１つと相補的な領域を含むあらゆる遺伝子の発現をサイレンシングするように作用する。なぜならば、おそらくヘリカーゼ活性は、そのｓｉＲＮＡ中の１９ｂｐの二重鎖をほどき、代替的な二重鎖をｓｉＲＮＡの１つの鎖（「アンチセンス」鎖または「ガイド」鎖）とその標的転写物との間に形成させるからである。上記アンチセンス鎖は、相補的な標的ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。ＲＩＳＣに存在する酵素活性は、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）にガイドし、１個の位置で切断（「スライス」）して細胞機構によって即座に分解される非保護ＲＮＡ末端が得られる（図４）。下記のように、短いＲＮＡ種（ミクロＲＮＡ）によって媒介されるさらなるサイレンシング機構も公知である（例えば、Ｒｕｖｋｕｎ，Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，７９７−７９９，２００１；Ｚｅｎｇ，Ｙ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，９，１−２０，２００２を参照のこと）。機構およびこれらを示した図の考察は、本発明において使用されるＲＮＡ干渉の機構にいかなる制限も与えないことを意図することに留意すること。
【００７５】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからヒトまでの範囲の種々の種でＤＩＣＥＲ酵素のホモログが見出されており（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５；４８５，２００１；Ｚａｍｏｒｅ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：７４６，２００１）、ＲＮＡｉ様機構が種々の異なる細胞型（哺乳動物細胞、さらにはヒト細胞）での遺伝子発現をサイレンシングすることができる可能性が高まっている。しかし、長ｄｓＲＮＡ（例えば、約３０〜５０ヌクレオチドより長い二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡ）は、哺乳動物細胞中でインターフェロン応答を活性化することが公知である。したがって、ドロソフィラＲＮＡｉ機構を使用して認められた特異的遺伝子サイレンシングの達成よりもむしろ、哺乳動物細胞中の長ｄｓＲＮＡの存在により、インターフェロンに媒介されて非特異的に翻訳が抑制され、おそらく細胞が死滅する。したがって、長ｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞における特定の遺伝子発現の阻害に有用であると考えられない。
【００７６】
しかし、本発明者らおよび他は、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物に移入した場合、標的遺伝子（ウイルス遺伝子が含まれる）の発現を有効に減少させることができることを見出した。本発明者らは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡに含まれ、そして以下および同時係属中の特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／６７４，１５９において記載される通りに試験された場合に、本明細書中に記載される設計パラメータの第１のセットを使用して選択される配列の著しい割合が、効率的に抑制する配列であると判明したことを見出した。最初に設計したセット由来の約１５％のｓｉＲＮＡ（実施例１）は、強力な効果を示し、そしてインフルエンザウイルスのＰＲ８株またはＷＳＮ株のいずれかに感染した細胞においてウイルス産生を強力に阻害した；約４０％が、有意な効果を示した（すなわち、ＰＲ８に感染した細胞および／またはＷＳＮに感染した細胞におけるｓｉＲＮＡの存在下  対  非存在下の間でのウイルス産生の統計学的な有意差（ｐ≦０．０５））；約４５％は、全く効果を示さないか、または最小限の効果を示した。
【００７７】
特に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ転写酵素および核タンパク質ＮＰをコードする遺伝子にターゲティングされるＲＮＡは、感染した哺乳動物細胞において産生されるウイルスのレベルを劇的に減少させた（実施例２、４、５、６）。本発明者らはまた、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがインタクトな生物体（すなわちインフルエンザウイルスに感染したニワトリ胚）におけるインビボでのインフルエンザウイルス複製を阻害し得ることを示した（実施例３）。さらに、本発明者らは、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがウイルス感染の前または後のいずれかに投与した場合にマウスにおけるウイルス産生を阻害し得ることを示した（実施例１２、１４、１６、２３〜２６など）。さらに、本発明者らは、マウスにおけるｓｉＲＮＡ前駆体（ｓｈＲＮＡ）が発現され得るＤＮＡベクターの投与がインフルエンザウイルス産生を阻害することを示した。さらなる有効なＲＮＡｉ誘導性物質（細胞および／またはマウスにおいてインフルエンザウイルス産生を阻害するの能力について試験した場合に非常に有効であった多くのｓｉＲＮＡを含む）は、設計基準の第２のセットを使用して設計された。したがって、本発明は、ＲＮＡｉ物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、または細胞内における存在がこのような物質の発現を生じるベクターによる処理が呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）の感染および／または複製を阻害するのに有効なストラテジーであることを示す。次いで、非常に有効なｓｉＲＮＡのうちの２つは、高度に病原性の鳥類インフルエンザウイルス株に対して試験され、そしてそれらのｓｉＲＮＡは、そのインフルエンザウイルス株を阻害することが示され、これは、広範なインフルエンザウイルス株を阻害する能力を確認した（Ｔｏｍｐｋｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１０１（２３）：８６８２−６、２００４）。したがって、本発明は、任意の複数の異なるインフルエンザウイルス株に感染した細胞においてウイルス産生を阻害するＲＮＡｉ誘導性物質を提供する。
【００７８】
任意の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、これらの知見がインフルエンザウイルスの感染の際に生じる細胞活性（例えば、代謝活性および生合成活性）の顕著な変化に関して特に著しいことを示唆する。インフルエンザウイルスによる感染は、細胞のｍＲＮＡスプライシング、輸送、および翻訳のような基本的な細胞プロセスを阻害し、そして細胞のタンパク質合成の阻害をもたらす。これらの変化にかかわらず、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質がウイルス複製を阻害するという知見は、遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介性阻害の基礎をなす細胞機構がインフルエンザウイルスに感染した細胞をインフルエンザ遺伝子発現を阻害するのに十分なレベルにて機能し続けることを示唆する。
【００７９】
選択される任意の特定の遺伝子標的に関して、本発明に従って使用するためのＲＮＡｉ誘導性物質の設計は、好ましくは、特定の指針に従う。一般に、ウイルスに特異的（宿主と比較した場合）であり、そして好ましくは、ウイルスの機能に重要であるか、または必須である配列をターゲティングすることが、望ましい。したがって、分解が望まれない他の転写物によって共有され得る標的転写物の切断を回避することが、望ましい。データデース検索は、いずれかの鎖が上記ＲＮＡｉ誘導性物質が送達される生物体（例えば、ヒト）のゲノム中の任意の配列と実質的に相補的であるか否かを決定するために行なわれ得、そしてこのような配列は、回避され得る。本明細書中に記載される場合、複数の変異型の間で保存されるウイルス転写物の部分が、好ましい標的である。
【００８０】
本発明で使用するための好ましいＲＮＡｉ誘導性物質は、１５ｎｔ長と約２９ｎｔ長（例えば、約１９ｎｔ長）との間の塩基対合領域を含み、必要に応じて１つ以上の遊離またはループ状の末端を有し得る。図５は、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質として使用することができる種々の構造を示す。図５Ａは、上記のドロソフィラ系、および哺乳動物細胞中で活性であることが見出された構造を示し得る。本発明は、インフルエンザ感染を治療または防止するための哺乳動物細胞への図５Ａに記載の構造を有するｓｉＲＮＡの投与を含む。しかし、投与した因子がこの構造を有する必要はない。例えば、投与した因子がインターフェロン応答の誘導などの望ましくないまたは有害な事象を引き起こさない限り、投与した組成物はインビボで図５Ａの構造にプロセシングすることができる任意の構造を含み得る。例えば、本発明はまた、このような物質の投与が十分に本明細書中で考察されるようなウイルス転写物レベルを減少させる限り、図５Ａに示される構造に正確にプロセシングされない物質の投与を含み得る。いくつかの場合において、本発明に従う細胞に送達される物質は、活性な抑制物質になる前に１つ以上のプロセシング工程を受け得る（さらなる考察については下を参照のこと）；このような場合において、当業者は、関連する物質が好ましくはそのプロセシングに必要であり得る配列を含む設計であることを認識する。
【００８１】
図５Ｂおよび５Ｃは、ＲＮＡｉを媒介するために使用することができるさらなる構造を示す。これらのヘアピン（ステム−ループ）構造は、阻害ＲＮＡとして直接機能することができるか、細胞内でプロセシング（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）されて、図５Ａに示されるｓｉＲＮＡ構造などのｓｉＲＮＡ構造を生じることができる。図５Ｂは、互いにハイブリッド形成してステム４００として示される二重鎖領域、ループ４１０、および突出部３２０を形成する、２つの相補領域を含むＲＮＡ分子を含む因子を示す。このような分子を自己ハイブリッド形成するといい、この種の構造をｓｈＲＮＡという。ｓｈＲＮＡ構造の例については図２０および２１も参照のこと。図５Ｃは、約１９ｂｐ長のステム４００の形成に十分な相補エレメントを含むＲＮＡサークルを含む因子を示す。このような因子は、本明細書中に記載の種々の他のｓｉＲＮＡと比較して改良された安定性を示すことができる。
【００８２】
ＲＮＡｉ誘導性物質およびそれらの活性を記載することにおいて、ｓｉＲＮＡの場合における通り、２つの鎖を有するような物質をいうことは、頻繁に都合がよい。一般に、上記ＲＮＡｉ誘導性物質の一方の鎖の二重鎖部分の配列は、この領域において標的転写物と実質的に相補的である。そのＲＮＡｉ誘導性物質の他方の鎖の二重鎖部分の配列は、代表的に、標的転写物のターゲティング部分と実質的に同一である。上記標的と相補的な部分を含む鎖が、「アンチセンス鎖」と称される一方で、他方の鎖は、しばしば、「センス鎖」と称される。上記標的と相補的であるアンチセンス鎖の部分は、「阻害性領域」と称され得る。
【００８３】
ｓｈＲＮＡの二重鎖構造は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含むことが考慮され得、そのアンチセンス鎖は、その分子の第２部分と二重鎖を形成するか、または形成できるその分子の第１部分であり、上記標的転写物のターゲティング部分と相補的である。上記センス鎖は、上記第１部分と二重鎖を形成するか、または形成できる上記分子の部分である。当業者は、−鎖ＲＮＡウイルス由来のｖＲＮＡ鎖をターゲティングする「アンチセンス鎖」がそのｖＲＮＡに対してアンチセンスであるが、そのウイルスｃＲＮＡに対する「センス鎖」であることを、認識する。同様に、−鎖ＲＮＡウイルス由来のｃＲＮＡ鎖をターゲティングする「アンチセンス鎖」は、そのｃＲＮＡに対してアンチセンスであるが、そのｖＲＮＡ配列に対して「センス鎖」である。
【００８４】
説明のために、以下の考察では、ｓｉＲＮＡをいうことが多い。しかし、当業者に明らかなように、ｓｉＲＮＡの２つの鎖に関連する教示は、一般に、任意のＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを生じ得る対応するｓｈＲＮＡ）のステム部分のセンス部分およびアンチセンス部分に適用可能である。したがって、一般に以下の検討材料を、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、細胞内で切断されて標的の切断または翻訳の抑制を媒介するＲＮＡを生じるｓｈＲＮＡ）の設計、選択、および送達にも適用する。
【００８５】
一般に、好ましいｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は、標的転写物中のエキソン配列を構成する標的部位または標的転写物中のエキソン配列からなる標的部位と、ハイブリッド形成する。本発明の特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖は、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域にハイブリッド形成する。一般に、上記転写物のスライスおよび分解ならびに／または翻訳の抑制をもたらすアンチセンス鎖とのハイブリッド形成に利用可能である任意の部位が、利用され得る。
【００８６】
ＲＮＡｉ誘導性物質は、種々のアプローチに従って選択され得る。一般に、上述の通り、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質は、好ましくは、領域（「二重鎖領域」）（その一方の鎖は標的転写物（「標的部分」）の一部と十分に相補的である１５〜２９ｎｔ長の間の阻害性領域を含む）を含み、その結果、ハイブリッドがインビボでこの鎖と標的転写物との間に形成し得る。「コア領域」とも称されるこの二重鎖領域は、突出部を含まないと理解される。突出部は、存在する場合、標的転写物と相補的であり得るが、標的転写物と相補的である必要はない。好ましくは、この二重鎖領域は、図３、４、および５に示される二本鎖構造の大部分または全てを含む。
【００８７】
好ましくは、上記阻害性領域は、標的と１００％相補的である。しかし、当業者は、ミスマッチおよびバルジがアンチセンス鎖と標的とによって形成される二重鎖に存在し得ることを認識する。したがって、上記阻害性領域は、ハイブリッド形成が、例えば、細胞および／またはＲＮＡｉを支援するインビトロ系（例えば、上述のドロソフィア抽出物系）で生理学的条件下において起こり得るように、標的と十分に相補的であることのみを必要とする。好ましくは、上記阻害性領域および上記標的は、互いに少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは１００％と相補的である。好ましくは、この領域中のアンチセンス鎖残基のうちの６残基より少ない残基あるいは約２０％（例えば、１、２、３、４）が、１５〜２９ｎｔ（例えば、１９ｎｔ）の窓にわたって標的とミスマッチである。好ましくは、この領域中のアンチセンス鎖残基のうちの４残基より少ない残基あるいは約１５％が、標的とミスマッチである。好ましくは、１個または２個だけのミスマッチが、存在する。そのミスマッチの１個以上（または全て）は、Ｕ−Ｇミスマッチであり得る。例えば、上記阻害性領域が１５〜１６ｎｔ長である場合、０〜３個のミスマッチが存在し得る；上記阻害性領域が１７ｎｔ長である場合、０〜４個のミスマッチが存在し得る；上記阻害性領域が１８ｎｔ長である場合、０〜５個のミスマッチが存在し得る；上記阻害性領域が１９ｎｔ長である場合、０〜６個のミスマッチが存在し得る。許容され得るミスマッチの数は、最大でＲＮＡｉ誘導性物質の阻害性領域の上限（例えば、約３０ｎｔの長さ）の阻害性領域中に存在する１個のさらなるｎｔに対して１ｎｔで、増加する。特定の実施形態において、上記ミスマッチは、連続した位置に存在しない。特定の実施形態において、２ｎｔ長より長いミスマッチのストレッチは、存在しない。好ましい実施形態において、１５〜１９ｎｔの評価窓は、０〜１個のミスマッチ（好ましくは、０個）を含み、そして２０〜２９ｎｔの評価窓は、０〜２個のミスマッチ（好ましくは、０〜１個、より好ましくは、０個）を含む。当業者は、バルジによって分断される二重鎖構造が、代表的に、より多い数の対形成していないｎｔを許容することを認識する。当業者はまた、アンチセンス鎖／標的ＲＮＡ二重鎖の中心部分においてミスマッチを回避することが好まれ得ることを認識する（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７、２００１を参照のこと）。例えば、上記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’ヌクレオチドは、しばしば、標的認識の特異性に著しく寄与せず、そして標的の切断にあまり重要ではない可能性がある。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖および上記標的は、上記アンチセンス鎖の阻害性領域の１０位において相補的である。他の実施形態において、それらは、上記アンチセンス鎖の阻害性領域の１０位において相補的ではない。
【００８８】
特定のＲＮＡｉ誘導性物質は、３’ＵＴＲ配列を含むか、全体的に３’ＵＴＲ配列からなる標的部位にハイブリッド形成する鎖を含む。当業者は、得られた二重鎖が、有効なサイレンシングを依然としてもたらしつつ、上記二重鎖の中心領域内により大きい数のミスマッチおよび／またはバルジ（特に、ミスマッチ）を許容し得ることを認識する。例えば、一方または両方の鎖は、図６に示されるように、バルジを形成する１つ以上の「特別な（ｅｘｔｒａ）」ヌクレオチドを含み得る。例えば、５〜１０ｎｔ長の１個以上のバルジが、存在し得る。代表的に、完全に相補性のストレッチは、少なくとも５ｎｔ長（例えば、６、７、またはそれ以上のｎｔ）である一方で、ミスマッチの領域は、例えば、１、２、３、または４ｎｔ長であり得る。上記二重鎖は、頻繁に、ミスマッチの領域によって隔てられる完全に相補性の２つのストレッチを含む。種々の構造が、可能である。例えば、ミスマッチの複数の領域が存在し得る。
【００８９】
３’ＵＴＲまたは他の場所における二重鎖形成が、転写物によってコードされるタンパク質の発現を、古典的なＲＮＡ阻害の特徴である切断に関連するが、それとは異なる機構によって阻害し得る場合、いくつかのミスマッチが、望まれ得る。図６に示されるように、上で考察されるドロソフィアおよびまた種々の生物体におけるｓｉＲＮＡを産生するＤｉｃｅｒ酵素は、小さな一時的ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）基質を標的転写物の３’ＵＴＲ内に結合される場合にその転写物の翻訳をブロックする阻害物質へとプロセシングすることも公知である（Ｇｒｉｓｈｏｋ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １０６、２３−２４、２００１；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３、８３４−８３８、２００１；Ｋｅｔｔｉｎｇ，Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１５、２６５４−２６５９を参照のこと）。その後の知見は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ〜哺乳動物の範囲の生物体のゲノムが、それらが部分的に相補的である内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として公知である短い（約１９〜２５ヌクレオチド）ＲＮＡのクラスをコードすることを示した。マイクロＲＮＡは、Ｂａｒｔｅｌ，ＤＰ．、Ｃｅｌｌ、１１６（２）：２８１−９７、２００４；Ｎｏｖｉｎａ，Ｃ．およびＳｈａｒｐ，ＰＡ、Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１６１−１６４、２００４；ならびに米国公開第２００５００５９００５号において考察される。ｍｉＲＮＡは、部分的に相補的な部位においてｍＲＮＡ転写物をターゲティングし、そしてそれらの翻訳を妨げるように結合する。ｓｉＲＮＡの構造（互いにハイブリッド形成した２つの個別の短い鎖）を有するＲＮＡｉ誘導性物質は、ｍｉＲＮＡと同様の様式（すなわち、その安定性を低下させることよりもむしろ転写物の翻訳を減少させること）で作用し得る（Ｄｏｅｎｃｈ、ＪＧら  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１７：４３８−４４２、２００３）。このようなｓｉＲＮＡは細胞内でプロセシングされてｍｉＲＮＡ翻訳抑制経路を介して作用する一本鎖ＲＮＡを生じると、考えられる。本発明の目的のために、本明細書中に記載されるような任意の部分的かまたは完全に二本鎖の短いＲＮＡ（その一方の鎖は、標的転写物に結合し、そしてその発現を減少させる（すなわち、その転写物のレベルを減少させ、かつ／またはその転写物によってコードされるポリペプチドの合成を減少させる））は、それが、分解を誘発することよって作用するか、翻訳を阻害することよって作用するか、または他の手段によって作用するかにかかわらず、ＲＮＡｉ誘導性物質であると見なされる。さらに、インビボ（すなわち、細胞内または生物体内）でプロセシングされてこのようなＲＮＡｉ誘導性物質を生じ得る任意の前駆体ＲＮＡ構造が、本発明において有用である。
【００９０】
いくつかの場合において、ＲＮＡｉ誘導性物質の配列は、アンチセンス鎖全体（存在する場合、３’突出部を含む）が標的転写物と完全に相補的であるように選択される。しかし、それは、突出部が標的転写物と相補的であるかまたは同一であるかのいずれかであることを必要としない。任意の所望の配列（例えば、ＵＵ）は、単純にアンチセンスコア領域および／またはセンスコア領域の３’末端に付加されて３’突出部を産生し得る。一般に、１つ以上のピリミジン（通常は、Ｕ、Ｔ、またはｄＴ）を含む突出部が、使用される。ＲＮＡｉ誘導性物質を合成する場合、上記突出部においてＵよりもむしろＴを使用することが、より好都合であり得る。ＴよりもむしろｄＴの使用が、増大した安定性を与え得る。
【００９１】
好ましくは、ＲＮＡｉ誘導性物質の鎖は、上記コア領域内で互いと１００％相補的である。しかし、当業者は、ミスマッチおよびバルジがアンチセンス鎖とセンス鎖とによって形成される二重鎖に存在し得ることを認識する。その鎖は、ハイブリッド形成が、例えば、細胞および／またはＲＮＡｉを支援するインビトロ系（例えば、上述のドロソフィア抽出物系）で生理学的条件下において起こり得るように、互いに十分に相補的であることのみを必要とする。好ましくは、ＲＮＡｉ誘導性物質の２つの鎖は、上記コア領域内で互いに少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは１００％相補的である。例えば、１５〜１６ｎｔ長のコア領域は、０〜３個のミスマッチを含み得る；１７ｎｔ長のコア領域は、０〜４個のミスマッチを含み得る；１８ｎｔ長のコア領域は、０〜５個のミスマッチを含み得る；１９ｎｔ長のコア領域は、０〜６個のミスマッチを含み得る。許容され得るミスマッチの数は、最大でＲＮＡｉ誘導性物質のコア領域の上限（例えば、約３０ｎｔの長さ）の阻害性領域中に存在する１個のさらなるｎｔに対して１ｎｔで、増加する。好ましい実施形態において、１５〜１９ｎｔのコア領域は、０〜１個のミスマッチ（好ましくは、０個）を含み、そして２０〜２９ｎｔのコア領域は、０〜２個のミスマッチ（好ましくは、０〜１個、より好ましくは、０個）を含む。当業者は、バルジによって分断される二重鎖構造が、代表的に、より多い数の対形成していないｎｔを許容することを認識する。
【００９２】
まとめると、ＲＮＡｉ誘導性物質は、標的部分を選択し、配列が標的とハイブリッド形成するために１５〜２９ヌクレオチドにわたる（例えば、１９ヌクレオチド）標的転写物と十分に相補的（例えば、実質的に相補的または１００％相補的）であるアンチセンス鎖、およびその配列とハイブリッド形成するためにそのアンチセンス鎖と十分に相補的（例えば、そのアンチセンス鎖と実質的か、または好ましくは、１００％相補的）であるセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性物質を設計することによって設計され得る。３’突出部（例えば、上に記載されるもの）は、次いで、これらの配列に付加されてｓｉＲＮＡ構造を生じ得る。
【００９３】
当業者は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質が上述の原理に従って融解温度（Ｔｍ）の範囲を示し得ることを認識する。Ｔｍは、核酸およびその完全な相補体の５０％が溶液中で二重鎖である温度として定義される。受容可能なＴｍの代表例は、本明細書中の実施例において開示されるｓｉＲＮＡ配列に基づいて、当該分野において周知である方法を使用して、実験によってかあるいは適切な経験または理論から誘導された方程式を使用するかのいずれかで、容易に決定され得る。本発明の特定の実施形態において、アンチセンス鎖と標的転写物とによって形成された二重鎖の計算Ｔｍは、標的とその標的と完全に相補的である阻害性領域を有するアンチセンス鎖との間に形成される二重鎖の計算Ｔｍよりも５℃、１０℃、または１５℃低い。本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖とセンス鎖とによって形成された二重鎖の計算Ｔｍは、完全に相補的であるアンチセンス鎖とセンス鎖との間に形成される二重鎖（必要に応じて突出部を除外する）の計算Ｔｍよりも５℃、１０℃、または１５℃低い。
【００９４】
当業者は、Ｔｍ値を計算し得る。いくつかの研究は、最近接の相互作用について熱力学的基底関数（ｂａｓｉｓ  ｓｅｔ）を使用して、Ｔｍについての的確な方程式を誘導した。熱力学的パラメータについての値は、文献において入手可能である。ＲＮＡについては、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３、９３７３−９３７７、１９８６．Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（２１）、６４０９−６４１２、１９９０を参照のこと。好ましくは、Ｗａｌｔｅｒ，Ａ．Ｅ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９１、９２１８−９２２２、１９９４におけるより最近の値および方法、またはより好ましくはＭａｔｈｅｗｓ，ＤＨ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８８、９１１−９４０、１９９９におけるより最近の値および方法が、使用される。Ｔｍを計算するためのコンピュータープログラムは、広範に利用可能である。例えば、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌを有するウェブサイトを参照のこと。好ましくは、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３１（１３）、２００３に記載されるような、ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄにおけるｍｆｏｌｄウェブサーバー上で利用可能である関連するパラメータ（例えば、ΔＧおよびＴｍ）を計算するためのプログラムが、使用される。
【００９５】
本発明の１つの態様は、ゲノム配列が異なる感染性因子の複数の株、サブタイプなど（集合的に変異型という）が存在する場合、異なる変異型の間で高度に保存された領域をターゲティングするＲＮＡｉ誘導性物質を選択および／または設計することがしばしば望ましいという認識である。十分な数の配列の比較および高度に保存された領域の選択により、このような高度に保存された領域にターゲティングされる１つのＲＮＡｉ誘導性物質によって複数の変異型をターゲティングすることが可能である（例えば、その物質のアンチセンス鎖は、ＲＮＡｉ誘導性物質がＲＮＡｉを媒介するように、十分な長さにわたって高度に保存された領域に対して実質的に相補的である）。本発明の一定の実施形態によれば、ある領域が、変異型の間で同一の場合、その領域は複数の変異型の間で高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、ＲＮＡｉ誘導性物質によってターゲティングされる領域（例えば、１５〜２９ヌクレオチド（好ましくは、１９ヌクレオチド）の領域）が、変異型の間で多くとも１つのヌクレオチド（すなわち、０または１ヌクレオチド位置）によって異なる場合、その領域は高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、このような領域が、変異型の間で多くとも２つのヌクレオチド（すなわち、０、１、または２ヌクレオチド位置）によって異なる場合、このような領域は複数の変異型の間で高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、ある領域が、変異型の間で多くとも３つのヌクレオチド（すなわち、０、１、２、または３ヌクレオチド位置）によって異なる場合、この領域は複数の変異型の間で高度に保存されている。本発明の一定の実施形態によれば、ＲＮＡｉ誘導性物質は、少なくとも５個の変異型、少なくとも１０個の変異型、少なくとも１５個の変異型、少なくとも２０個の変異型、少なくとも２５個の変異型、少なくとも３０個の変異型、少なくとも４０個の変異型、もしくは少なくとも５０個またはそれ以上の変異型の間で高度に保存されている領域をターゲティングする。
【００９６】
ある領域が複数の変異型組の間で高度に保存されているかどうかを判定するために、以下の手順を使用することができる。配列組の１つのメンバーを基本配列（すなわち、他の配列と比較する配列）として選択する。本発明の異なる実施形態によれば、基本配列は、比較される組の配列の１つであり得るか、例えば、各位置について組中の配列の間のその位置で最も頻繁に見出されるヌクレオチドの判定に由来するコンセンサス配列であり得る。
【００９７】
基本配列が選択されると、複数の変異型組の各メンバーの配列を基本配列と比較する。基本配列とその配列の領域（例えば、１５〜２９ヌクレオチド（例えば、１９ヌクレオチド）の領域）にわたる複数の変異型組の任意のメンバーとの間の相違数を使用して、その基本配列およびそのメンバーが目的の特定の領域にわたって高度に保存されているかどうかを判定する。上記のように、本発明の種々の実施形態では、２つの領域の間の配列相違数が０；０もしくは１、０、１、もしくは２；または０、１、２、もしくは３である場合、配列は高度に保存されていると見なす。上記ＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス配列は、１５〜２９ヌクレオチド（例えば、１９ヌクレオチド）の高度に保存された領域にわたって基本配列と相補的であるように選択されても、高度に保存された領域にわたって他の配列のうちの１つと相補的であるように選択されてもよい。代表的に、上記センス鎖配列は、高度に保存された領域にわたって基本配列または他の配列のうちの１つと同一であるように選択され、その結果、上記アンチセンス鎖および上記センス鎖は、上記ＲＮＡｉ誘導性物質の二重鎖部分内で互いに１００％相補的である。
【００９８】
一般に、上記アンチセンス鎖配列は、上に記載されるように、基本配列を参照して選択される。しかし、本発明の特定の実施形態において、特に、比較される組における第２の配列中の特定の位置に存在するヌクレオチドが、比較される配列において、基本配列中の対応して位置付けられるヌクレオチドより多く見出される場合、上記アンチセンス鎖配列は、その第２の配列を参照して選択され得る（例えば、その第２の配列に存在する高度に保存された領域と１００％相補的）。さらに、本発明の特定の実施形態にしたがって、違いが生じる位置におけるコンセンサスヌクレオチド（最も共通して存在するヌクレオチド）が、基本配列中に見出されるものと異なる場合、そのコンセンサスヌクレオチドが、使用され得る。これは任意の比較される配列と同一でない配列を生じ得る（基本配列としてコンセンサス配列を使用し得る場合）ことに留意すること。
【００９９】
実施例１は、ヒト宿主起源の６つのインフルエンザＡ株由来の配列組の比較および異なる動物宿主起源（ヒトが含まれる）由来の７つのインフルエンザＡ株由来の配列組の比較に基づく高度に保存された標的位置の選択を記載する。高度に保存された領域の異なる選択方法を使用することができる。本発明は、どのようにして高度に保存された領域を選択するかに関係なく、その二重鎖領域（および必要に応じて、任意の突出部）が本明細書中に提供された基準を満たす高度に保存された領域に基づいて選択される、ＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明は、本明細書中に記載の高度に保存された領域の基準を満たさないインフルエンザウイルス転写物の一部にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を含むことも理解すべきである。例えば、高度に保存された標的部分または好ましく保存された標的部分にターゲティングされないＲＮＡｉ誘導性物質は、特定の株に対するインフルエンザウイルス産生の有効なインヒビターであり得る。あまり有効ではないＲＮＡｉ誘導性実体はまた、標的特異性を評価するため、ＲＮＡｉ効力の決定因子を同定するため、ＲＮＡｉ設計を改良するためなどに使用され得る。
【０１００】
表１Ａは、各ウイルス遺伝子セグメントの各々について、インフルエンザウイルス配列組の間で高度に保存された２１ヌクレオチド領域を列挙している。表１Ａに列挙した各配列は、１９ｎｔ領域（ｎｔ３〜２１）および対応するｓｉＲＮＡのセンス鎖中に存在しないがｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’突出部と相補的な最初の２ｎｔ配列を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれかまたは両方に異なる３’突出部を有する種々のｓｉＲＮＡ分子を設計するために、１９ｎｔ領域をセンス鎖として使用することができると認識される。したがって、種々のセンスｓｉＲＮＡ配列およびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列は、表１Ａに列挙される各配列から得られ得る。２０種のこのようなｓｉＲＮＡ配列を、表２に列挙する。
【０１０１】
表１Ｂは、インフルエンザウイルスの高度に保存された領域に基づいて設計したさらなるｓｉＲＮＡを列挙する。両方の鎖を、５’→３’方向で示す。ｄＴｄＴ３’突出部を各鎖に付加する。表１Ｂに列挙した各センス鎖配列中のヌクレオチド１〜１９は、インフルエンザウイルス転写物の高度に保存された領域と同一の配列を有する。対応するアンチセンス配列は、センス鎖と相補的である。本発明の特定の実施形態において、「高度に保存された領域」は、表１Ａに列挙した任意の配列中のｎｔ３〜２１または表１Ｂに列挙した任意のセンス鎖のｎｔ１〜１９をいう。これらの領域は、本発明の特定のＲＮＡｉ誘導性物質において二本鎖形態で存在し、その結果、そのＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖は、高度に保存された部分にターゲティングされる。これらの領域の配列は、「高度に保存された配列」または「高度に保存された標的部分」と称される。
【０１０２】
高度に保存された標的部分の選択は、複数の異なるインフルエンザウイルス株を首尾よく阻害するＲＮＡｉ誘導性実体の設計に対する１つのアプローチを示す。しかし、本発明はまた、標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質が複数種の異なる株（標的部分内の配列において異なる）において標的転写物の発現を阻害する可能性を向上させるために、好ましく保存される好ましい標的部分を選択するための代替的な方法を提供する。本発明に従って、標的部分が好ましく保存される場合、アンチセンス鎖が１つ以上の株（例えば、ＰＲ８）において見出されるような標的部分と１００％相補的である阻害性領域を含むＲＮＡｉ誘導性物質は、好ましくは、対応する標的部分がそのアンチセンス鎖の阻害性領域と１００％未満相補的である１種以上の他の株に存在する対応する転写物の発現を阻害する。
【０１０３】
本発明は、インフルエンザＡウイルス転写物の好ましく保存された部分をターゲティングする種々のＲＮＡｉ誘導性物質を提供し、その好ましく保存された標的部分は、本発明の方法に従って選択される。本発明の特定の実施形態において、上記標的部分は、ヒトから単離された複数種のインフルエンザＡウイルス株にわたって好ましく保存される。本発明の特定の実施形態において、上記部分は、ヒト以外の動物（例えば、鳥類）から単離された複数種のインフルエンザＡウイルス株わたって好ましく保存される。本発明の特定の実施形態において、上記部分は、ヒトから単離された複数種のインフルエンザＡウイルス株およびヒト以外の動物（例えば、鳥類）から単離された複数種のインフルエンザＡウイルス株わたって好ましく保存される。例えば、上記部分は、ヒトおよび／または動物起源の少なくとも５、１０、１５、２０、またはそれ以上の変異型の間で好ましく保存され得る。本発明の特定の実施形態において、標的部分は、好ましくかつ高度に保存される。
【０１０４】
任意のウイルスに関して、好ましく保存された標的部分は、最初に複数種の変異型由来の転写物配列を整列し、そしてそれらを違い（すなわち、配列の１つ以上におけるヌクレオチドの同一性が基本配列におけるものと異なる位置）を同定するために選択された基本配列と比較することによって同定され得る。上記の違いの性質は、それが有意であるか否かを決定するために評価される。保存された領域を選択するために整列かつ比較される配列の組を考察する場合、「違い」とは、多くの配列がどのようにして基本配列と異なっているかにかかわらず、１つ以上の配列が基本配列と異なっている位置をいう。基本配列は、種々の方法で選択され得る。例えば、非常に流行しているかまたは実験室環境で容易に使用可能である株由来の配列を選択することが、好都合であり得る。
【０１０５】
好ましく保存された標的部分は、上記組における変異型中に存在する対応する標的部分が比較される場合、以下の判定基準を満たす：（１）基本配列と対応する配列との間のＡからＧへの変化またはＣからＵへの変化が任意の位置において許容される；（２）基本配列と対応する配列との間のＧからＡへの変化またはＣからＡへの変化が１位、１８位、および１９位の１つ以上においてのみ許容される；（３）１位と９位との間での基本配列と対応する配列との間に０、１、２、または３個の違いが存在する；（４）基本配列と対応する配列との間の２つ以下の連続した変化が存在する；ならびに（５）１１位と１７位との間での基本配列と対応する配列との間に最大で１つの変化が存在する。任意の株は、基本株として選択され得る。好ましくは、少なくとも５種の変異型は、好ましく保存された標的部分を同定するために比較される。
【０１０６】
鳥類および／または他の動物宿主において循環するインフルエンザウイルスは、ときとして、ヒトに感染する能力を獲得する。このような株は、頻繁に、おそらくヒトの間の免疫力の欠如に部分的に起因して、高い死亡率をもたらす。例としては、１９１８年の流行ならびに香港（１９９７）およびベトナム（２００４）において鳥類インフルエンザによるヒトの感染によって引き起こされた死亡が挙げられる。起源の鳥類または他の動物宿主による株のヒト集団への潜在的な伝播に関する懸念が、増しており、そして存在するワクチンは、鳥インフルエンザウイルス感染または豚インフルエンザウイルス感染からヒトを保護することができない。本発明は、複数種のヒトから最初に単離された株（ヒト由来株）および鳥類などの非ヒト動物から最初に単離された株（鳥類由来株）にわたって好ましくかつ／または高度に保存された標的部分を同定し、そしてこのような標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を提供する。このようなＲＮＡｉ誘導性物質は、広範な種々のインフルエンザウイルス株（ヒト由来株および非ヒト動物宿主に由来する株の両方が挙げられる）から保護し得る。
【０１０７】
実施例１７は、ＲＮＡｉのために好ましく保存された標的であるインフルエンザ転写物標的部分の同定を記載する。第１の工程は、全ての可能性のある１９ヌクレオチドのインフルエンザウイルス標的部分を同定することである。ＰＲ８または表１５Ａ〜１５Ｈまたは表１９Ａ〜１９Ｆに列挙される別のインフルエンザウイルス株において見出されるような各１９ヌクレオチドの可能性のある標的部分の配列は、本明細書中に列挙されると見なされるが、それらは、具体的に示されない。それらは、図３２Ａ〜３２Ｊ中のインフルエンザウイルスセグメントの配列への参照によって容易に同定され得る。
【０１０８】
次の工程は、ＲＮＡｉのための好ましい機能性標的部分（すなわち、配列の特徴は標的にハイブリッド形成するアンチセンス鎖を有するＲＮＡｉ誘導性物質が標的の発現を有効に阻害することを示唆する遺伝子の領域）を同定することであった。上記好ましい機能性標的部分は、ＧＣ含量およびＧ残基またはＣ残基の連続したストレッチの非存在に関する種々の判定基準を満たす。表１７（図３３）は、基本株ＰＲ８に存在するような好ましい機能性標的部分の配列を列挙する。
【０１０９】
好ましく保存された標的部分を同定するために、多数のヒト由来のインフルエンザウイルス株において見出されるような対応する機能性標的部分は、その後整列された。一般に、異なる株における「対応する標的部分」は、一般に、ゲノム配列が最大の同一性を達成するように整列されそして／または相同（例えば、異なる株において少なくとも５０％同一である）である場合に、異なる株のゲノム中のほぼ同じ部分に存在する。代表的に、２つの株を比較する場合、対応する標的部分の同一性の程度は、少なくとも６０％、７０％、８０％、またはそれ以上である。例えば、対応する標的部分は、１、２、３、または４個の位置において基本株中に見出される標的部分と異なり得る。これらの好ましい相同性標的部分は正確な配列、データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）中の関係するインフルエンザウイルスセグメント配列にアクセスし、それを基本株配列と整列し、そして基本株（例えば、ＰＲ８）において見出される標的部分とほぼ同じヌクレオチド位置および／または少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも９０％同一である位置を見出すことによって容易に同定される。相同性標的部分は、本発明の局面である。上記の判定基準は、好ましく保存された標的部分を選択するために使用された。表１８（図３４）は、基本株ＰＲ８中に存在するようなヒトに由来するインフルエンザ株の間で好ましく保存される標的部分の配列を列挙する。
【０１１０】
ヒト宿主から単離された株を考慮することに加えて、鳥類宿主から単離された株は、ヒト宿主由来の単離物および鳥類宿主由来の単離物の両方の間で好ましくかつ／または高度に保存された標的部分を同定するために、整列および比較された。１つ以上の他の動物宿主由来の単離物もまた、このような比較のために使用され得た。基本配列の好ましく保存された標的部分は、整列された鳥類配列と比較され、そして好ましく保存された標的部分は、ヒト単離物の間で好ましく保存された標的部分を同定するために使用された同じ判定基準を使用して選択された。表２０（図３５）は、基本株ＰＲ８に存在するようなヒトおよび鳥類に由来するインフルエンザ株の間で好ましく保存される標的部分の配列を列挙する。
【０１１１】
ＰＲ８または表１５Ａ〜１５Ｈまたは表１９Ａ〜１９Ｆに列挙される別のインフルエンザウイルス株において見出されるようなそれぞれの１９ヌクレオチドの可能性のある標的部分は、本発明の局面である。ＰＲ８または表１５Ａ〜１５Ｈまたは表１９Ａ〜１９Ｆに列挙される別のインフルエンザウイルス株において見出されるようなそれぞれの好ましい機能性標的部分は、本発明の局面である。ＰＲ８または表１５Ａ〜１５Ｈまたは表１９Ａ〜１９Ｆに列挙される別のインフルエンザウイルス株において見出されるようなそれぞれの好ましくかつ／または高度に保存された標的部分は、本発明の局面である。それぞれのこのような配列（すなわち、潜在的であり、好ましく機能的であり、ヒト由来株の間で好ましく保存され、ヒト由来株および鳥類由来株の間で好ましく保存され、ならびに／またはヒトまたは鳥類あるいはその両方の間で高度に保存される）の相補体は、標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖の阻害性領域についての配列として機能し得る。これらの配列の各々、または少なくとも１５ヌクレオチド長のそれらのフラグメントを含むアンチセンス鎖を有するＲＮＡｉ誘導性物質は、本発明の局面である。しかし、標的部分に対して完全より低い相補性を示すアンチセンス鎖あるいはより短いかまたはより長いアンチセンス鎖を含む種々のＲＮＡｉ誘導性物質がまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。標的部分の配列は、ＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖として機能し得る。アンチセンス鎖と完全に相補的でないセンス鎖はまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０１１２】
上述されるように、表１７、１８、および２０に列挙される標的部分は、インフルエンザＡウイルスＰＲ８転写物の部分と同一である。各転写物に対して対応する標的部分（表１７、１８、および２０に列挙される標的部分と同一または高度に相同的のいずれかである）は、他のインフルエンザウイルスＡ株において見出される。本発明の特定の実施形態において、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１７、１８、または２０に列挙される標的部分）にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質アンチセンス鎖の阻害性領域は、ＰＲ８配列と１００％相補的ではないが、表１５Ａ〜１５Ｈまたは表１９Ａ〜１９Ｆに列挙される他の株の１つ以上において見出される対応する標的部分と１００％相補的である。本発明は、本明細書中に記載される可能性のある標的部分、機能性標的部分、好ましく保存された部分、および高度に保存された標的部分の各々にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載される可能性のある標的部分、機能性標的部分、好ましく保存された部分、または高度に保存された標的部分のうちの少なくとも１５個連続したｎｔを含む標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質）を提供する。本発明はまた、本明細書中に記載される可能性のある標的部分、機能性標的部分、好ましく保存された部分、または高度に保存された標的部分を含む約２９ｎｔ長までの標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性物質）を提供する。上記標的部分のさらなるヌクレオチドは、好ましくは、本明細書に列挙される１９ｎｔの標的部分の５’および／または３’の直近に位置する。いいかえると、これらのより長い標的部分のならなる約１０ｎｔのいくつかは、１９ｎｔの標的部分の上流であり得、そしていくつかは、その１９ｎｔの標的部分の下流であり得る。正確な配列は、任意の株由来の列挙される標的部分または対応する標的部分を含むゲノムセグメントについての適切な進入にアクセスし、列挙されるかもしくは対応する標的部分の５’および／または３’の直近にあるヌクレオチドを同定することによって容易に同定され得る。図３２Ａ〜３２Ｊは、ＰＲ８（プラス鎖形態）についてのゲノムセグメント配列を示す。
【０１１３】
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性物質の有効性を検証するため、および非常に有効な様式でターゲティングされ得るインフルエンザウイルス転写物を同定する細胞培養物および／または動物モデルにおいて試験されたＲＮＡｉ誘導性物質を提供する。実施例１８は、ターゲティングされるインフルエンザウイルス転写物のレベルを有効に減少させるｓｉＲＮＡを同定するために使用されたハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を記載する。実施例１９〜２２は、細胞においてインフルエンザウイルス産生を有効に減少させるｓｉＲＮＡを同定するために使用されたハイスループットスクリーニングを記載する。特定の好ましい有効なｓｉＲＮＡは、１００ｎＭの濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも４分の１に減少させた。特定の好ましい非常に有効なｓｉＲＮＡは、１００ｎＭの濃度にて細胞と接触させた場合に少なくとも８分の１、またはそれより大きい程度までにもインフルエンザウイルス力価を減少させた。特定の好ましい有効なｓｉＲＮＡは、１ｎＭの濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも４分の１を減少させた。特定の好ましい有効なｓｉＲＮＡは、１００ｎＭの濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも４分の１、少なくとも８分の１、または少なくとも１６分の１に減少させた。特定の非常に有効なｓｉＲＮＡは、５ｎＭ以下の濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも２分の１に減少させた。特定のよりさらに非常に有効なｓｉＲＮＡは、１ｎＭ以下の濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも２分の１に減少させた。さらになお非常に有効なｓｉＲＮＡは、０．８ｐＭ以下の濃度にて細胞と接触させた場合にインフルエンザＡウイルス力価を少なくとも２分の１の減少させる。濃度とは、上記ｓｉＲＮＡが導入の時間において細胞外部の媒体に存在した濃度をいう。
【０１１４】
特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質は、遺伝子（例えば、ＮＰ遺伝子、ＰＡ遺伝子、ＰＢ１遺伝子、またはＰＢ２遺伝子）の３’末端から２００ｎｔ内の標的部分にターゲティングされる。７種の非常に有効なｓｉＲＮＡは、この領域内の標的部分に対して見出された。本発明者らは、インフルエンザ遺伝子セグメントの５’末端および３’末端が異なる遺伝子セグメントおよび異なるインフルエンザウイルス株の両方にわたって高度に保存される約１０塩基を含むことを観察した。とりわけ、ＰＢ１転写物の５’ＵＴＲをターゲティングする３種のｓｉＲＮＡは、１００ｎＭにてウイルス力価の４分の１の減少を示した。
【０１１５】
（Ｂ．ＲＮＡｉ誘導性実体の合成）
本発明のＲＮＡｉ誘導性物質は、任意の利用可能な技術によって調製され得、その技術としては、化学合成、インビボもしくはインビトロでの酵素的切断もしくは化学的切断、またはインビボもしくはインビトロでのテンプレートの転写が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＲＮＡは、酵素的にか、または部分的／完全な有機合成によって産生され得、そして改変ヌクレオチドは、インビトロでの酵素的合成または有機合成によって導入され得る。１つの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、化学的に調製される。ＲＮＡ分子を合成する方法は、当該分野において公知である（特に、ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎａ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７：９９−１３４（１９９８）に記載されるような化学合成法）。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、酵素的に調製される。例えば、ｓｉＲＮＡは、所望の標的ＲＮＡに対する十分な相補性を有する長ｄｓＲＮＡの酵素的プロセシングによって調製され得る。長ｄｓＲＮＡのプロセシングは、例えば、適切な細胞溶解物を使用してインビトロで達成され得、次いでｓｉＲＮＡは、ゲル電気泳動またはゲル濾過によって精製され得る。例えば、ＲＮＡは、溶媒または樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、あるいはそれらの組み合わせによって混合物から精製され得る。あるいは、ＲＮＡは、サンプルのプロセシングに起因する損失を回避するために、精製せずにか、または最小限の精製を伴って使用され得る。
【０１１６】
本発明のＲＮＡｉ誘導性物質は、単一のｓｈＲＮＡ分子または互いにハイブリッド形成される２つの鎖として送達され得る。例えば、２つの別個の２１ｎｔのＲＮＡ鎖が、産生され得、それらの各々は、他方と相補的な１９ｎｔの領域を含み、そして個々の鎖は、一緒にハイブリッド形成されて構造物（例えば、図５Ａに示されるもの）を産生し得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの各鎖は、インビトロまたはインビボのいずれかでのプロモーターからの転写によって産生される。例えば、構築物は、２つの別個の転写可能な領域を含み得、それらの各々は、他方と相補的な１９ｎｔの領域を含む２１ｎｔの転写物を産生する。あるいは、対向する配置されたプロモーターＰ１およびＰ２ならびにターミネーターｔ１およびｔ２を含む単一の構築物が、利用され得、２つの異なる転写物（それらの各々は、他方と少なくとも部分的に相補的である）が、産生される（図７）。別の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、例えば、自己相補領域をコードする単一の転写単位の転写によって単一の転写物として産生される。図８は、１つのこのような実施形態を示す。示される通り、第１の相補領域および第２の相補領域を含み、そして必要に応じてループ領域を含むテンプレートが、利用される。本発明は、１つ以上のｓｉＲＮＡ鎖および／またはｓｈＲＮＡ鎖をコードする構築物を包含する。プロモーターに加えて、上記構築物は、必要に応じて、１つ以上の他の調節エレメント（例えば、ターミネーター）を含む。
【０１１８】
インビトロ転写は、Ｔ７プロモーター／ポリメラーゼシステム、ＳＰ６プロモーター／ポリメラーゼシステム、およびＴ３プロモーター／ポリメラーゼシステム（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓなどから入手可能なもの）を含む種々の種々の入手可能なシステムを使用して行われ得る。ｓｉＲＮＡは、インビトロで合成される、それらは、被験体へのトランスフェクションまたは送達前にハイブリッド形成させられ得る。本発明のｓｉＲＮＡ組成物が全体的に二本鎖（ハイブリッド形成した）分子からなることを必要としないことが、認識される。例えば、ｓｉＲＮＡ組成物は、小さい割合の一本鎖ＲＮＡを含み得る。一般に、好ましい組成物は、少なくとも約８０％のｄｓＲＮＡ、少なくとも約９０％のｄｓＲＮＡ、少なくとも約９５％のｄｓＲＮＡ、または少なくとも約９９−１００％ものｄｓＲＮＡを含む。しかし、上記ｓｉＲＮＡ組成物は、８０％未満のハイブリッド形成したＲＮＡを含み得るが、但しそれらは、有効であるために十分なｄｓＲＮＡを含む。
【０１１９】
当業者は、本発明のｓｉＲＮＡ物質またはｓｈＲＮＡ物質がインビボで産生される場合、それらが１つ以上の転写単位の転写によって産生されることが一般に好ましいことを認識する。一次転写物は、必要に応じて、遺伝子阻害を達成する最終物質を産生するために、（例えば、１種以上の細胞酵素によって）プロセシングされる。適切なプロモーターおよび／または調節エレメントが哺乳動物細胞における関連する転写単位の発現を可能にするように容易に選択され得ることが、さらに認識される。本発明のいくつかの実施形態において、調節可能なプロモーターを利用することが、所望され得る；他の実施形態において、構成的発現が、所望され得る。本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ前駆体の合成（転写）への言及において、転写されたＲＮＡの翻訳を意味しない。
【０１２０】
本発明の特定の好ましい実施形態において、１つ以上のｓｉＲＮＡ転写単位またはｓｈＲＮＡ転写単位のインビボ発現を指揮するために使用されるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）についてのプロモーターである。Ｐｏｌ  ＩＩＩは、テンプレート中の４〜５個のＴ残基のストレッチに直面する際に終結する小さい転写物の合成を指揮する。特定のＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーター）は、転写された領域内でｃｉｓ作用性調節エレメント（最初に転写されたｎｔ以外）を必要とせず、したがって、本発明の特定の実施形態よって好まれる。なぜならば、それらは、所望のｓｉＲＮＡ配列の選択を容易に可能にするからである。例えば、Ｙｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９９（９）、６０４７−６０５２（２００２）；Ｓｕｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、９９（８）、５５１５−５５２０（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．ら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．、１６、９４８−９５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６、５５０−５５３（２００２）；Ｍｉｙａｇａｓｈｉ，Ｍ．およびＴａｉｒａ，Ｋ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０、４９７−５００（２００２）；Ｐａｕｌ，Ｃら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０、５０５−５０８（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０、４４６−４４８（２００２）を参照のこと。Ｐｏｌ  ＩＩについてのプロモーターはまた、例えば、Ｘｉａ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０、ｐｐ．１００６−１０１０、２００２に記載される通りに使用され得る。それに記載される通り、ヘアピン配列が転写開始部位およびそれに続くポリＡカセットに隣接した範囲内に並置される構築物（転写されたヘアピンにおいて最小限の突出部を生じるか、突出部をまったく生じない）が、使用され得る。本発明の特定の実施形態において、組織特異的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、細胞特異的Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、または誘導性Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが、上述の必要条件が満たされる限り使用され得る。Ｐｏｌ  Ｉプロモーターはまた、種々の実施形態において使用され得る（ＭｃＣｏｗｎ  ２００３）。
【０１２１】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートを提供する構築物（例えば、図７および８に示されるもの）のインビボ発現は、例えば、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターにその構築物を導入し、そしてそのベクターを哺乳動物細胞を導入することによって望ましく達成され得ることが、認識される。任意の種々のベクターが、選択され得るが、特定の実施形態において、上記構築物をインフルエンザウイルス感染に感受性である１種以上の細胞に送達し得るベクターを選択することが、望まれ得る。本発明は、ｓｉＲＮＡ転写単位および／またはｓｈＲＮＡ転写単位を含むベクター、ならびにこのようなベクターを含むか、または１種以上のｓｉＲＮＡ鎖もしくはｓｈＲＮＡ鎖をコードする転写単位を含むように操作された細胞を包含する。本発明の特定の好ましい実施形態において、本発明のベクターは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現する構築物を哺乳動物細胞（最も好ましくは、ヒト細胞）を送達するのに適した遺伝子治療ベクターである。このようなベクターは、インフルエンザウイルスに対する曝露の前後に、そのウイルスによる感染によって引き起こされる疾患および病態に対する予防または処置を提供するために被験体に投与され得る。
【０１２２】
したがって、本発明は、細胞内におけるその存在が細胞において少なくとも１種のインフルエンザウイルス転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ物質を形成するために自己ハイブリッド形成するかまたは互いにハイブリッド形成する１種以上のＲＮＡの転写をもたらす種々のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを提供する。本発明の特定の実施形態において、２つの別個の相補ｓｉＲＮＡ鎖は、２つのプロモーターを含む単一のベクターを使用して転写され、それらのプロモーターの各々は、単一のｓｉＲＮＡ鎖の転写を指揮する（すなわち、転写が起こるようにｓｉＲＮＡについてのテンプレートに作動可能に連結される）。上記２つのプロモーターは、同じ方向であり得、この場合において、それらの各々は、ｓｉＲＮＡ鎖の１つについてのテンプレートに作動可能に連結される。あるいは、上記プロモーターは、プロモーターからの転写が２つの相補ＲＮＡ鎖の合成を生じるように単一のテンプレートに隣接（ｆｌａｎｋ）する反対の方向であり得る
本発明の他の実施形態において、２つの相補領域を含む単一のＲＮＡ分子（例えば、ｓｈＲＮＡ）の転写を駆動するプロモーターを含むベクターが、使用される。本発明の特定の実施形態において、複数のプロモーターを含むベクター（それらのプロモーターの各々は、２つの相補領域を含む単一のＲＮＡ分子の転写を駆動する）が、使用される。あるいは、複数の異なるｓｈＲＮＡが、単一のプロモーターまたは複数のプロモーターのいずれかから転写され得る。種々の構成が、可能である。例えば、単一のプロモーターは、複数の自己相補領域を含む単一のＲＮＡ転写物の合成を指揮し得、それらの領域の各々は、ハイブリッド形成して複数のステム−ループ構造物を生じ得る。これらの構造物は、例えば、Ｄｉｃｅｒによってインビボで切断されて、複数の異なるｓｈＲＮＡを生じ得る。このような転写物は好ましくはその転写物の３’末端にて終結シグナルを含むが、個々のｓｈＲＮＡ単位の間には含まないことが、認識される。本発明の別の実施形態において、上記ベクターは、複数のプロモーターを含み、それらのプロモーターの各々は、ハイブリッド形成してｓｈＲＮＡを形成する自己相補ＲＮＡ分子の合成を指揮する。複数のｓｈＲＮＡは全て、同じ転写物をターゲティングし得るか、またはそれらは、異なる転写物をターゲティングし得る。ウイルス転写物のあらゆる組み合わせが、ターゲティングされ得る。実施例１１および図２１を参照のこと。
【０１２３】
当業者は、本発明に従うＲＮＡｉ誘導性物質のインビボ発現が長時間（例えば、数日間より長い、好ましくは少なくとも数週間〜数ヶ月、より好ましくは少なくとも１年間以上、おそらく生存期間）にわたってその物質を産生する細胞の産生を可能にし得ることをさらに認識する。このような細胞は、インフルエンザウイルスから不確定に保護され得る。
【０１２４】
ＲＮＡｉ誘導性物質の細胞内発現を提供する組成物において使用するための好ましいウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられる。例えば、フィロウイルスエンベロープタンパク質−偽型ＨＩＶベクターに基づくベクター（これは、頂端表面由来のインタクトな気道上皮を効率的に形質導入する）を記載するＫｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９（３）：２２５−３０、２００１を参照のこと。Ｌｏｉｓ，Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５：８６８−８７２、Ｆｅｂ．１、２００２年２月１日（ＦＵＧＷレンチウイルスベクターを記載する）；Ｓｏｍｉａ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（９）：４４２０−４４２４、２０００；Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：６８２−６８６、１９９９；および米国特許第６，０１３，５１６号もまた参照のこと。
【０１２５】
ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、本明細書中に記載される核酸（図５に記載される任意の構造を有する核酸、もしくは本明細書中に記載される任意の他の有効な構造を有する核酸が挙げられるが、これらに限定されない））は、全体的にヌクレオチド（例えば、天然に存在する核酸において見出されるヌクレオチド）から構成され得るか、またはこのようなヌクレオチドの１つ以上のアナログを代わりに含み得るか、またはそうでなければ天然に存在する核酸とは異なり得ることが、当業者によって認識される。改変骨格または天然に存在しないヌクレオシド間連結を含む核酸が、本発明において使用され得る。
【０１２６】
改変核酸は、上記分子の全長にわたって均一に改変される必要はない。例えば、異なるヌクレオチド改変および／または骨格構造は、上記核酸中の種々の位置に存在し得る。本発明の特定の実施形態において、上記ｓｉＲＮＡ構造を、例えば、消化（例えば、エンドヌクレアーゼによる）を減少させるために１つ以上の自由な鎖の末端にヌクレオチドアナログを含むことによって安定化することが、望まれ得る。１つ以上の自由な末端においてデオキシヌクレオチド（例えば、ピリミジン（例えば、デオキシチミジン））を含むことは、この目的を果たし得る。代替的または追加的に、特に、ＲＮＡｉ物質の一方に鎖と標的転写物との相互作用によって形成される任意のハイブリッドと比較した場合１９ｂｐのステムの安定性を増大または減少させるために１つ以上のヌクレオチドアナログを含むことが、望まれ得る。当業者は、上記ヌクレオチドアナログは、標的特異的活性（例えば、ＲＮＡｉ媒介活性）が実質的に影響されない任意の位置（例えば、上記ＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端における領域）にあり得ることを認識する。例えば、特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ鎖またはｓｈＲＮＡ鎖の５’末端および／または３’末端における１〜５個の間の残基が、ヌクレオチドアナログである。本発明の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質中の核酸の１つ以上は、少なくとも５０％の改変されていないＲＮＡ、少なくとも８０％の改変ＲＮＡ、少なくとも９０％改変されていないＲＮＡ、または１００％の改変されていないＲＮＡを含む。本発明の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質中の核酸の１つ以上は、ＲＮＡｉ誘導性物質中の二重鎖形成に関与する部分内に１００％の改変されていないＲＮＡを含む。
【０１２７】
本発明の特定の実施形態に従って、種々のヌクレオチド改変は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡの前駆体のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいて選択的に使用される（例えば、そのセンス鎖中のいくつかもしくは全ての位置において改変リボヌクレオチドおよび／または改変されたか、もしくは改変されていないデオキシリボヌクレオチドを使用しつつそのアンチセンス鎖において改変されていないリボヌクレオチド利用することが、好まれ得る）。本発明の特定の実施形態に従って、唯一の改変されていないリボヌクレオチドが、上記アンチセンス鎖および／または上記センス鎖の二重鎖部分において使用される一方で、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の突出部は、改変リボヌクレオチドおよび／または改変デオキシリボヌクレオチドを含み得る。本発明の特定の実施形態において、一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖は、１つ以上のＯ−メチル化リボヌクレオチドを含む。
【０１２８】
多くのヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド改変は、当該分野において公知であり、そしてハイブリッド形成およびヌクレアーゼ抵抗性などの特性に対するそれらの効果が、探索されている。多くの改変は、上記オリゴヌクレオチドの１つ以上の局面（例えば、相補核酸にハイブリッド形成するその能力、その安定性、バイオアベイラビリティー、ヌクレアーゼ抵抗性など）を変化させることが示されている。例えば、２’−改変としては、ハロ基、アルコキシ基およびアリルオキシ基が挙げられる。いくつかの実施形態において、２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基によって置換され、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニルまたはＣ１〜Ｃ６アルキニルであり、そしてハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。改変された連結の例としては、ホスホロチオエート連結および５’−Ｎ−ホスホラミダイト連結が挙げられる。米国特許第６，４０３，７７９号；同第６，３９９，７５４号；同第６，２２５，４６０号；同第６，１２７，５３３号；同第６，０３１，０８６号；同第６，００５，０８７号；同第５，９７７，０８９号、およびその中の参考文献は、本発明の実施において使用され得る広範な種々のヌクレオチドアナログおよびヌクレオチド改変を開示する。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（編）「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（第１版）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；第１版（２００１）およびその中の参考文献もまた参照のこと。本発明の目的のために、上記化学的エレメントは、元素周期表、ＣＡＳバージョン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版（内表紙）にしたがって同定され、そして特定の官能基は、その中に記載されるような一般に定義されれる。アナログおよび改変は、ウイルス遺伝子の発現を有効に減少させるものを選択するために、例えば、本明細書中に記載されるアッセイまたは他の適切なアッセイを使用して試験され得る。特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、糖、ヌクレオシド、またはヌクレオシド間連結に対する１つ以上の改変（例えば、米国公開第２００３０１７５９５０号、同第２００４０１９２６２６号、同第２００４００９２４７０号、同第２００５００２０５２５号、同第２００５００３２７３３号および／または参考文献１３７〜１３９において記載されるもののいずれか）を含む。
【０１２９】
本発明の特定の実施形態において、上記改変は、増大した吸収性（例えば、粘膜層を横切る増大した吸収性、増大した経口吸収など）、血流中または細胞内での増大した安定性、腎臓系を介する低下したクリアランス、細胞膜を横切る増大した能力、細胞内区画（例えば、エンドソームなど）から回避する増大した能力を有する核酸をもたらす。当業者によって認識されるように、アナログまたは改変は、変化したＴｍをもたらし得、そのＴｍは、有効な抑制を依然として達成しつつガイド配列と標的との間のミスマッチの増大した許容性を生じ得るか、あるいは所望の標的転写物に対する増大または減少した特異性を生じ得る。
【０１３０】
本発明に従う使用に有効なＲＮＡｉ誘導性物質がヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログではない１つ以上の部分を含み得ることが、当業者によってさらに認識される。特定の実施形態において、上記核酸は、主にヌクレオチド残基を含むが、ヌクレオチドではない１つ以上の残基を含む。例えば、特定の実施形態において、有効なサイレンシング物質のいずれかの鎖中の残基の１、２、３、４、５、またはそれ以上は、ヌクレオシドではない。特定の実施形態において、二重鎖形成に関与するそして／または標的転写物と相補的であるＲＮＡｉ誘導性物質の部分は、ヌクレオシドからなるが、上記突出部は、非ヌクレオシド残基からなる。本発明の特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、リンカーを含む非ヌクレオシドによって互いに結合される。
【０１３１】
（ＩＩＩ．好ましいインフルエンザウイルス標的部分の同定に基づくＲＮＡｉ誘導性物質および他の核酸）
本発明は、可能性のある標的部分、機能性標的部分、好ましく保存された標的部分、および高度に保存された標的部分の同定に基づく種々の核酸を提供する。特に、本発明は、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に記載されるインフルエンザ配列あるいは少なくとも１５ヌクレオチド長であるそれらの下位配列（フラグメント）を含む、その配列が任意の上に記載される可能性のある標的部分を構成するかまたはそれからなる核酸を提供する。特定の標的部分にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、予想外に高い効力をを示した。効力を評価するために、ｓｉＲＮＡは、インフルエンザウイルスによる感染の６時間前に細胞に投与され、そしてインフルエンザウイルス産生は、感染の２４時間後に試験された。特定の実施形態において、上記配列は、配列番号２７２〜３８０から選択される。これらの標的部分にターゲティングされるｓｉＲＮＡ（上記標的部分と１００％相補的なアンチセンス鎖を含む）は、１００ｎＭにてウイルス産生の４分の１の減少（７５％の減少）を示した。特定の実施形態において、上記配列は、配列番号２７４、２８６、２８７、２９２、２９７、２９８、３０４、３０５、３０９、３１０、３１１、３１９、３２４、３２７、３３４、３４６、３４７、３６０、３６１、３６４、および３６６から選択される。これらの標的部分にターゲティングされるｓｉＲＮＡ（上記標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含む）は、５ｎＭにてウイルス産生の２分の１の減少（５０％の減少）を示した。特定の実施形態において、上記配列は、配列番号２９７、３０９、３１０、３１１、３４６、３４７、３６４、および３６６から選択される。これらの標的部分にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、標的部分が２個までの位置においてＰＲ８中の対応する標的部分と異なった場合（すなわち、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖とその標的部分との間に２つまでのミスマッチが存在する）でさえ、５ｎＭにてウイルス産生の２分の１の減少（５０％の減少）を示した。これらの核酸の相補体およびフラグメントもまた、提供される。いくつかの実施形態において、上記フラグメントは、１６ｎｔ長、１７ｎｔ長、または１８ｎｔ長である。上記核酸は、単一鎖または二本鎖であり得、そして改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはそれらの改変バージョンであり得る。上記配列は、３’突出部（例えば、ｄＴｄＴ突出部）をさらに含み得る。本発明はまた、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される任意の配列あるいは少なくとも１５ヌクレオチド長であるそれらの下位配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、１００％同一）、１００％相補的、または実質的に相補的（例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、１００％同一）である核酸を提供する。本発明はさらに、上述の核酸の１つ以上を含むベクターをさらに提供する。
【０１３２】
上記核酸としては、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、（ｉ）ｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ；（ｉｉｉ）相補的な一本鎖ＲＮＡとハイブリッド形成してｓｉＲＮＡを形成する一本鎖ＲＮＡ；および（ｉｖ）任意の前述の核酸の転写のためのテンプレートを含むベクター）が挙げられる。配列がＲＮＡとして提示される場合、対応するＤＮＡ配列はまた、本発明（およびその逆も同様）によって提供される。配列が本明細書中に提示される場合、本発明は、その配列およびその相補体を含む二本鎖核酸を包含する。本発明の任意の核酸は、サイズが限定され得る。例えば、核酸の長さは、１９ｎｔ以下、２９ｎｔまたは３０ｎｔ以下、３５ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、あるいは１００ｎｔ以下であり得る。
【０１３３】
本発明は、任意の核酸塩基含有構造を包含し、ここで残基（例えば、ヌクレオチド）は、核酸塩基配列がその構造に割り当てられ得るように、順序付けられた様式（代表的に、線形様式）で１つに連結され、その配列は、本明細書中に開示される任意の配列である。種々の核酸塩基および改変ヌクレオチドおよび改変骨格は上に記載され、それらのうちの任意のものが、使用され得る。本発明の種々の実施形態において、上記構造物は、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）、またはキメラ分子などである。例えば、ＷＯ９２／２０７０２、米国特許第６，３１６，２３０号、およびその中の参考文献を参照のこと。本発明はまた、同じ塩基対形成特異性を有するか、またはそうでなければ上記配列中に存在する核酸塩基を置換し得る代替的な核酸塩基を含む構造物を包含する。
【０１３４】
上記一本鎖核酸は、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ（必要に応じて、突出部を形成する３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加を有する））のアンチセンス鎖またはセンス鎖として使用され得る。本発明の核酸はまた、例えば、従来のアンチセンス試薬、プローブ（例えば、インフルエンザウイルス感染を検出するための）などとして使用され得る。「従来のアンチセンス」とは、インビトロで一本鎖オリゴヌクレオチドを投与するか、または被験体に一本鎖オリゴヌクレオチドを投与することによって転写物の発現を阻害する方法をいう。このような阻害は、ＲＮＡｉのものと異なる機構によって行われ、そして二本鎖ＲＮＡ分子（上記アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的転写物との間に形成される二重鎖以外）を必要としないと考えられる。例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．、前出を参照のこと。
【０１３５】
したがって、本発明は、インフルエンザＡウイルス転写物の標的部分を含む核酸を提供し、その核酸の配列は、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および３４の１つ以上に列挙される配列の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、または１９個連続したｎｔを含む。特定の実施形態において、上記配列は、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および３４の１つ以上に列強される配列からなるかまたはその配列内に含まれる。本発明は、インフルエンザＡウイルスｍＲＮＡ転写物の標的部分を含む核酸をさらに提供し、その核酸の配列は、任意の可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、または１９個連続したヌクレオチドを含む。５’末端および３’末端におけるヌクレオチドは、配列内に含まれると見なされる。特定の実施形態において、上記配列の長さは、３０ｎｔ以下、３５ｎｔ以下、５０ｎｔ以下、または１００ｎｔ以下である。
【０１３６】
本発明は、その配列が任意の可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、任意の表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０および／または３４に列挙される標的部分）に実質的に同一（少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または少なくとも９９％同一）である部分を含む核酸をさらに提供する。特定のこれらの位置は、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、任意の表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される標的部分）に関して１、２、３、４、または５個の位置にて違いを含む。本発明の特定の実施形態において、１、２、３、４、または５個の位置における違いは、実質的に同一である配列中のＵによる標的部分中のＣの置換、または実質的に同一である配列中のＧによる標的部分中のＡの置換である。本発明の特定の核酸の配列は、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される標的部分）に隣接する標的転写物において見出される配列を含む（すなわち、その標的部分の５’または３’に位置する）。
【０１３７】
本発明は、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６、少なくとも１７ｎｔ、少なくとも１８ｎｔ（好ましくは、１９ｎｔ）の窓にわたって可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０および／または３４に列挙される標的部分）と相補的であるアンチセンス鎖を有するＲＮＡｉ誘導性物質を提供する。例えば、上記アンチセンス鎖は、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、または１９ｎｔにわたって上記列挙された高度に保存された標的部分と１００％相補的であり得るか、あるいは実質的に相補的であり得る（例えば、その標的部分に関して１個と５個との間のミスマッチを有する）。特定の実施形態において、１つ以上（例えば、全て）、アンチセンス鎖の阻害性領域と標的との間のミスマッチは、Ｕ−Ｇミスマッチである。ＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖は、アンチセンス鎖と１００％相補的であっても、アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよい。本発明はまた、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、または１９ｎｔにわたって表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４１つ以上に列挙される高度かつ／または好ましく保存された配列と１００％同一または実質的に同一である配列を含むセンス鎖を有するＲＮＡｉ誘導性物質を提供する。
【０１３８】
例えば、本発明は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を提供し、そのＲＮＡｉ誘導性物質は、以下を含む：配列が配列番号２７２〜３８０、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらいずれかのフラグメントからなる群より選択されるからなる群より選択される配列を含む核酸部分。上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、好ましくは、上記第１の核酸部分と二重鎖構造を形成する第２の核酸部分を含む。特定の実施形態において、上記第１の核酸部分および第２の核酸部分は、それぞれ５０ｎｔ長以下（例えば、３５ｎｔ長以下（例えば、２１〜２３ｎｔ長など））である。特定の実施形態において、上記配列は、以下からなる群より選択される：配列番号２７４、２８６、２８７、２９２、２９７、２９８、３０４、３０５、３０９、３１０、３１１、３１９、３２４、３２７、３３４、３４６、３４７、３６０、３６１、３６４、および３６６、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらいずれかのフラグメント。特定の実施形態において、上記配列は、以下からなる群より選択される：配列番号２９７、３０９、３１０、３１１、３４６、３４７、３６４、および３６６、その相補体、または少なくとも１５ヌクレオチドを有するそれらいずれかのフラグメント。本発明の特定の実施形態において、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、配列が表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される標的部分）に基づいて設計されたＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖の配列は、その列挙される配列と１００％相補的である少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１７個、または少なくとも１９個連続したｎｔを含む。このようなＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖は、上記アンチセンス鎖と１００％相補的であっても、上記アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよい。本発明の特定の実施形態において、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０および／または３４に提示される配列）に基づいて設計されたＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖の配列は、列挙される配列の少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１７個、および／または少なくとも１９個連続したｎｔを含む。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態において、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、２０および／または３４に提示される配列）に基づいて設計されたＲＮＡｉ誘導性物質のアンチセンス鎖の配列は、１個または２個のミスマッチが存在し得ることを除いてその列挙される配列と１００％相補的である少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１７個、および／または少なくとも１９個連続したｎｔを含む。このようなＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖は、上記アンチセンス鎖と１００％相補的であっても、上記アンチセンス鎖と実質的に相補的であってもよい。本発明の特定の実施形態において、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０および／または３４に列挙される配列）に基づいて設計されたＲＮＡｉ誘導性物質のセンス鎖の配列は、１個または２個のｎｔが列挙される配列と異なり得ることを除いて、列挙される配列の少なくとも１０個連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個連続したｎｔ、より好ましくは少なくとも１５個連続したｎｔ、より好ましくは少なくとも１７個連続したｎｔ、およびよりなお好ましくは１９個連続したｎｔを含む。
【０１４０】
アンチセンス鎖が１９ｎｔ未満にわたって上記配列と実質的に相補的であるかまたは１００％相補的である本発明の実施形態において、アンチセンス鎖の残りの部分は、列挙される標的部分の外側にあり、そして列挙される標的部分に隣接するインフルエンザ配列と実質的に相補的であっても、１００％相補的であってもよく、そして好ましくは、実質的に相補的であるか、または１００％相補的である。したがって、本発明は、配列が表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０および／または３４中の配列から１ｎｔ以上（例えば、９ｎｔまで）「シフトされる（ｓｈｉｆｔｅｄ）」インフルエンザ配列と相補的であるアンチセンス鎖を有するＲＮＡｉ誘導性物質を包含する。隣接する配列は、図３２に見出される。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態に従って、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、少なくとも２、３、４、５、または以上の異なる種の生物体に天然に感染するインフルエンザ変異型の間で好ましくかつ／または高度に保存される領域にターゲティングされる。上記種としては、ヒト、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（ウマ（ｈｏｒｓｅ））、鳥類、豚およびその他が挙げられ得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記種としては、ヒトが挙げられる。
【０１４２】
本発明はまた、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質が転写され得るベクター、そのベクターを含む細胞、ならびにインフルエンザＡウイルス感染の処置および／または予防のために使用する方法を提供する。
【０１４３】
本発明は、可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分の変異型（例えば、表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される核酸の任意の変異型）、およびこのような変異型を含む核酸（例えば、このような変異型を含むＲＮＡｉ誘導性物質）を提供し、変異型の配列は、その列挙される配列と、１、２、３、４、５、または６個の位置にて異なる。本発明の特定の好ましい実施形態において、列挙される配列の変異型は、ＰＲ８以外のインフルエンザウイルス株（例えば、任意の表１５Ａ〜１５Ｈおよび／または表１９Ａ〜１９Ｆに列挙されるインフルエンザＡウイルス株）由来の転写物の配列の一部と同一または実質的に同一である。さらに、本明細書中に開示される種々の配列の下位配列もまた、包含される。好ましい下位配列は、１５ｎｔ長〜１８ｎｔ長の間（例えば、１５ｎｔ長、１６ｎｔ長、１７ｎｔ長、または１８ｎｔ長）である。ヌクレオチドの欠失および／または付加によって本明細書中に列挙される特定の配列に関連する配列もまた、包含される。例えば、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、または６ｎｔが任意の本明細書中に列挙される配列から欠失するかまたはその配列に付加される核酸配列が、包含される。さらに、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、または６ｎｔが任意の本明細書中に列挙される配列の変異型（上に記載されるような）から欠失するかまたはその変異型に付加される配列は、包含される。欠失するかまたは付加されるヌクレオチドは、最初の配列に対して近接してか、または近接せずに位置し得る。それらは、内部かあるいは一方または両方の末端に位置し得る。付加されるヌクレオチドは、配列内の任意の位置に配置され得るか、一方または両方の末端に結合され得る。
【０１４４】
本発明の核酸（例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクター）は、任意の利用可能な方法によって細胞に導入され得る。例えば、核酸またはそれらをコードするベクターは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に導入するための種々の当該分野で認識される技術をいい、その技術としては、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、インジェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。送達因子（例えば、下に記載されるもの）が、使用され得る。
【０１４５】
本発明は、本発明の核酸（例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の合成のためのテンプレートを提供するベクター））を含むように操作された任意の細胞を包含する。上記細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞）または非哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、上記細胞は、哺乳動物被験体の鼻腔および／または気道あるいは肺において見出されるものであり、そしてインフルエンザウイルスによる感染に感受性である。最も好ましくは、上記細胞は、気道上皮細胞である。必要に応じて、このような細胞はまた、インフルエンザウイルスＲＮＡを含む。
【０１４６】
（ＩＶ．診断方法および診断キット）
本発明は、感染症（例えば、呼吸器ウイルスによって引き起こされる感染）のＲＮＡｉベースの治療が、処置の必要がある被験体が１つ以上のＲＮＡｉ誘導性実体による阻害に感受性である感染因子に感染しているか否かを決定する診断工程を望ましく組み込み得るという認識を包含する。「阻害に感受性」によって、感染因子の１つ以上の生物学的活性被験体に対するＲＮＡｉ誘導性実体の投与によって有効に阻害され得ることが意味される。好ましくは、感染因子の複製、病原性、伝播、および／または産生は、阻害される。例えば、好ましくは、感染因子の複製、病原性、伝播、および／または産生は、ＲＮＡｉ誘導性実体が被験体に耐量にて投与される場合に少なくとも２５％阻害される。好ましくは、上記阻害は、治療的に有用な効果をもたらすのに十分である。
【０１４７】
インフルエンザウイルスは、本発明の診断方法を例示するために例として使用される、その方法は、感染に罹患する被験体に適したＲＮＡｉ誘導性実体の選択を可能にするように調節（ｔａｉｌｏｒ）される。当然に、選択されたＲＮＡｉ誘導性実体はまた、例えば、個体が感染の症状を発症しているか否かにかかわらず、感染した個体との接触に至った個体に対して、予防のために投与され得る
したがって、本発明は、インフルエンザウイルス感染を診断するための方法および被験体がインフルエンザウイルスに感染しているか否かを決定するための方法を提供する．特定の実施形態において、この方法は、本発明のＲＮＡｉ誘導性実体の１つ以上によって阻害されるインフルエンザウイルスに感染しているか否かを決定することを包含する。例えば、サンプル（例えば、痰、唾液、鼻洗浄液、鼻腔スワブ、咽頭スワブ、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体、生検標本など）は、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）を有すると疑われ得る被験体から得られる。上記サンプルは、１つ以上の処理工程に供され得る。任意のこのような処理されるサンプルは、上記被験体から得られることが考慮される。上記サンプルは、それがインフルエンザウイルス特異的核酸を含むか否かを決定するために分析される。「インフルエンザウイルス特異的核酸」は、インフルエンザウイルスが起源であるかまたはインフルエンザウイルスに由来する任意の核酸、またはその相補体であり、そしてサンプル中のインフルエンザウイルスの存在の指標として機能し得、必要に応じて、インフルエンザ株および／またはインフルエンザ遺伝子の配列を同定するために使用され得る。上記核酸は、処理工程に供され得、次いでその核酸が、単離され得る。例えば、それは、逆転写、増幅、切断などされ得る。好ましくは、上記配列は、少なくとも１５ｎｔ長（例えば、２０〜２５ｎｔ、２５〜３０ｎｔ、またはそれ以上）である。特定の実施形態において、上記配列は、他のウイルスにおいて見出される配列とは異なり、その結果その存在が、インフルエンザウイルスの存在を特異的に示す。
【０１４８】
特定の実施形態において、上記サンプル中に存在するインフルエンザウイルス特異的核酸配列、またはその相補体は、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）のアンチセンス鎖またはセンス鎖の配列と比較される。単語「比較」は、配列が評価され得る任意の方法をいうために広義に使用され、例えば、それは、その配列が１個以上の位置において参照配列と同じであるかまたは異なるか、あるいは違いの程度が評価され得ることによってを決定され得る。
【０１４９】
任意の広範な種々の核酸ベースのアッセイが、使用され得る。特定の実施形態において、上記診断アッセイは、好ましくかつ／もしくは高度に保存された標的部分、またはその相補体、あるいはその好ましくかつ／もしくは高度に保存された部分のフラグメントまたはその相補体を含む核酸を利用する。特定の実施形態において、上記核酸は、例えば、アッセイ（例えば、下に記載されるアッセイ）において増幅プライマーまたはハイブリッド形成プローブとして機能する。
【０１５０】
特定の実施形態において、上記サンプル中のインフルエンザ特異的核酸は、増幅される。任意の適切な増幅方法が使用され得、その増幅方法としては、指数関数的増幅、連鎖型線形（ｌｉｎｋｅｄ  ｌｉｎｅａｒ）増幅、ライゲーションベースの増幅、および転写ベースの増幅が挙げられる。指数関数的な核酸増幅方法の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それは、例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、第６７巻（１９９８）；Ｍｕｌｌｉｓ、ＥＰ  ２０１，１８４；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，５８２，７８８号および同第４，６８３，１９５号；Ｅｒｌｉｃｈら、ＥＰ  ５０，４２４、ＥＰ  ８４，７９６、ＥＰ  ２５８，０１７、ＥＰ  ２３７，３６２；ならびにＳａｉｋｉ  Ｒ．ら、米国特許第４，６８３，１９４号に記載される。連鎖型線形増幅は、米国特許第６，０２７，９２３号においてＷａｌｌａｃｅらによって開示される。ライゲーションベースの増幅の例は、ライゲーション増幅反応（ＬＡＲ）（Ｗｕら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９））によって教示される）およびリガーゼ連鎖反応（欧州特許出願第０３２０３０８  Ｂ１号）である。Ｈａｍｐｓｏｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（２３）：４８３２−４８３５、１９９６）は、方向性ランダムオリゴヌクレオチド初回刺激（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｒａｎｄｏｍ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｄ）（ＤＲＯＰ）法を記載する。
【０１５１】
等温性標的増幅方法としては、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、およびそれらのバリエーション（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８（１９９０）；米国特許第５，７６６，８４９号（ＴＭＡ）；および同第５，６５４，１４２号（ＮＡＳＢＡ）を参照のこと）、ならびに他のもの（例えば、Ｍａｌｅｋら、米国特許第５，１３０，２３８号；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０号において記載されるような）が挙げられる。
【０１５２】
検出または比較は、当該分野において公知である任意の種々の方法を使用して行われ得る（例えば、増幅ベースのアッセイ、ハイブリッド形成アッセイ、プライマー伸長アッセイ（例えば、異なるインフルエンザウイルス株の対応する標的部分が遺伝子の異なる対立遺伝子に類似する対立遺伝子特異的プライマー伸長）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（米国特許第５，１８５，２４３号、同第５，６７９，５２４号および同第５，５７３，９０７号）、切断アッセイ、ヘテロ二重鎖追跡分析（ＨＴＡ）アッセイなど）。例としては、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国特許第５，７２３，５９１号）が挙げられる。このアッセイにおいて、２つのＰＣＲプライマーは、中心プローブオリゴヌクレオチドに隣接（ｆｌａｎｋ）する。プローブオリゴヌクレオチドは、２つの蛍光部分を含む。ＰＣＲプロセスの重合工程の間に、ポリメラーゼは、上記プローブオリゴヌクレオチドを切断する。上記切断は、上記２つの蛍光部分物理的に分離させ、これは、蛍光放出の波長の変化をもたらす。より多くのＰＣＲ産物が作製される場合、新規の波長の強度が、増大する。標的の増幅よりもむしろシグナルまたはプローブの増幅に基づく核酸検出システム（米国特許第５，０１１，７６９号、同第５，４０３，７１１号、同第５，６６０，９８８号、および同第４，８７６，１８７号）であるサイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）もまた、利用され得た。侵襲的切断（Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）アッセイ（例えば、Ｅｉｓ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３、２００１に記載されるＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））もまた、インフルエンザ特異的核酸を検出するために使用され得る。分子ビーコン（米国特許第６，２７７，６０７号；同第６，１５０，０９７号；同第６，０３７，１３０号）または蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくアッセイが、使用され得る。分子ビーコンは、完全に一致したテンプレートに対する結合の際にコンホメーションの変化を受けるオリゴヌクレオチドヘアピンである。上記オリゴヌクレオチドのコンホメーションの変化は、そのオリゴヌクレオチド上に存在するフルオロフォア部分とクエンチャー部分との間の物理的距離を増大させる。この物理的距離の増大は、減少される上記クエンチャーの効果をもたらし、したがってフルオロフォアに由来するシグナルを増大させる。米国公開第２００５００６９９０８号およびその中の参考文献は、核酸の検出のために使用され得る種々の他の方法を記載する。本発明のプローブは、したがって、インフルエンザ特異的配列にハイブリッド形成する１つ以上の部分および特定のアッセイによって設計された１つ以上の部分を含み得る。米国特許第５，８５４，０３３号、同第６，１４３，４９５号、および同第６，２３９，１５０号は、ローリングサークル複製を含む目的の分子の増幅および多重検出のための組成物および方法を記載する。この方法は、サンプル中の複数の特定の核酸を同時に検出するのに有用である。例えば、それは、サンプル中の１つ以上のインフルエンザ特異的核酸の存在を���定するために使用され得る。必要に応じて、上記核酸は、配列決定される。米国公開第２００５００２６１８０号は、核酸反応を多重化するための方法を記載し、その方法としては、増幅、検出および遺伝子型決定が挙げられる、その方法は、ＲＮＡｉ誘導性実体に対する感受性を決定するために、インフルエンザ特異的配列の検出、および目的とする特定の位置における配列を決定するのに適し得る。
【０１５３】
特定の実施形態において、上記アッセイは、上記サンプル中のインフルエンザ特異的核酸がＲＮＡｉ誘導性実体のセンス鎖またはアンチセンス鎖と同一である部分を含むかまたは異なる部分を含むかを決定する。必要に応じて、正確な違い（存在する場合）は、同定される。この情報は、インフルエンザウイルスが上記ＲＮＡｉ誘導性実体による阻害に感受性であるか否かを決定するために使用される。上で考察されるものに加えて、感染因子の検出および／または遺伝子型決定のための適切なアッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄ．Ｈ．ら（編）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、２００４に記載される。任意の上記アッセイは、自動化されたシステムを使用して行われ得る。核酸ベースの診断アッセイを行うための多くのシステムは、当該分野において公知であり、そして本発明の目的に容易に適合し得る。１つの実施形態において、サンプル由来の核酸は、種々の異なるインフルエンザウイルス転写物またはその部分と相補的である核酸の多重度が加えられるマイクロアレイ（「チップ」とも称される）に適用される。上記ハイブリッド形成パターンは、検出される、およびそのハイブリッド形成パターンは、上記インフルエンザウイルスがＲＮＡｉ誘導性実体による阻害に感受性であるか否かを決定するのに十分な情報を提供する。特定の実施形態において、上記サンプル中のインフルエンザ特異的核酸は、配列決定される（代表的に、増幅の後）。複数の異なるアッセイが、使用され得る。
【０１５４】
上記診断アッセイは、第ＩＩＩ説に記載される任意の核酸を使用し得る。本発明の特定の実施形態において、上記核酸は、インフルエンザウイルス転写物と実質的に相補的でないか、または実質的に同一でない核酸部分を含む。例えば、上記核酸は、プライマー結合部位（例えば、ユニバーサル配列決定プライマーまたはユニバーサル増幅プライマーに対する結合部位）、ハイブリッド形成タグ（それは、例えば、他の核酸を含むサンプル由来の核酸を単離するために使用され得る）などを含み得る。本発明の特定の実施形態において、上記核酸は、非ヌクレオチド部分を含む。上記非ヌクレオチド部分は、上記核酸の末端ヌクレオチド（例えば、３’末端）に結合され得る。上記部分は、分解から上記核酸を保護し得る。特定の実施形態において、上記非ヌクレオチド部分は、検出可能な部分（例えば、蛍光色素、放射性原子、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対のメンバー、クエンチャーなど）である。特定の実施形態において、上記非ヌクレオチド部分は、結合部分（例えば、ビオチンまたはアビジン）である。特定の実施形態において、上記非ヌクレオチド部分は、ハプテン（例えば、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニル（ＴＥＧ）など）である。特定の実施形態において、上記非ヌクレオチド部分は、上記核酸の単離に使用可能なタグである。
【０１５５】
本発明の特定の実施形態において、核酸は、支持体（例えば、ビーズ（必要に応じて、磁性である）などの微粒子）に結合される。本発明は、本発明の核酸の多重度（例えば、少なくとも１０、２０、５０など）を含むアレイをさらに提供する。上記核酸は、支持体（例えば、ガラス製スライドなどの実質的に平らな支持体）に共有結合または非共有結合される。例えば、米国特許第５，７４４，３０５号；同第５，８００，９９２号；同第６，６４６，２４３号を参照のこと。
【０１５６】
特定の株のインフルエンザウイルスまたは標的部分内の特定の配列を有するインフルエンザウイルスが特定の配列を含むアンチセンス鎖を有する特定のＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）による阻害に感受性であるか否かに関する情報は、「感受性情報」と称される。感受性情報は、感受性の程度に関する定量的情報を含み得る。本発明の目的に関して、インフルエンザウイルスは、ＲＮＡｉ誘導性実体が、細胞と接触させるか、または耐量にて被験体に投与した場合に感染した細胞におけるウイルス産生を少なくとも２５％減少させる場合、ＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）による阻害に感受性であると見なされる。
【０１５７】
好ましい実施形態において、インフルエンザウイルス転写物は、配列番号２７２〜３８０のいずれかと１００％同一（好ましくは、配列番号２７４、２８６、２８７、２９２、２９７、２９８、３０４、３０５、３０９、３１０、３１１、３１９、３２４、３２７、３３４、３４６、３４７、３６０、３６１、３６４、および３６６のいずれかと１００％同一、よりなお好ましくは配列番号２９７、３０９、３１０、３１１、３４６、３４７、３６４、および３６６のいずれかと１００％同一）である標的部分を含み、上記インフルエンザウイルスは、上記標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性実体に感受性であると見なされる。他の実施形態において、インフルエンザウイルス転写物が、１、２、または３個の位置（好ましくは、１または２個の位置、より好ましくは、１個だけの位置）にて配列番号２７２〜３８０のいずれかと異なる標的部分を有する場合、そのインフルエンザウイルスは、その標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性実体に感受性であると見なされる。他の実施形態において、インフルエンザウイルス転写物が、１、２、または３個の位置（好ましくは、１または２個の位置、より好ましくは、１個だけの位置）にて、配列番号２７４、２８６、２８７、２９２、２９７、２９８、３０４、３０５、３０９、３１０、３１１、３１９、３２４、３２７、３３４、３４６、３４７、３６０、３６１、３６４、または３６６のいずれかと異なる標的部分を含む場合、そのインフルエンザウイルスは、その標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性実体に感受性であると見なされる。他の実施形態において、インフルエンザウイルス転写物が、１、２、または３個の位置（好ましくは、１または２個の位置、より好ましくは、１個だけの位置）にて配列番号２９７、３０９、３１０、３１１、３４６、３４７、３６４、および３６６のいずれかと異なる標的部分を含む場合、その標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性実体に感受性であると見なされる。
【０１５８】
上記標的部分内に特定の配列を含むインフルエンザウイルスの処置における実験または以前の経験から得られる情報はまた、ウイルスが所与のＲＮＡｉ誘導性実体またはその組み合わせによる阻害に感受性であるか否かを決定するために使用され得る。感受性情報はまた、例えば、上記インフルエンザウイルス配列と阻害物質のアンチセンス鎖との間に存在する任意のミスマッチの予想される効果に基づく理論的予測を含み得る。
【０１５９】
感受性情報は、コンピューターで読み取り可能な媒体上のコンピューターで読み取り可能な形式（例えば、データベースにおける組織化された様式）で保存され得る。被験体から得られたサンプルにおいて行われる診断試験の結果は、情報を評価し、そして被験体に感染するインフルエンザウイルスの感受性プロフィールを決定するコンピューター化されたシステムに提供される。特定の実施形態において、上記システムは、特定のＲＮＡｉ誘導性物質もしくはその組み合わせおよび／または用量を推奨する。したがって、本発明は、ＲＮＡｉ誘導性実体に対するウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）の感受性を決定するためのコンピューター化されたシステムに提供する。本発明は、感受性情報を含むデータベースをさらに提供する。上記アッセイを行うためのコンピューター化されたシステムおよび自動化されたシステムは、１つに統合された自動化システムの一部であり得るか、または別個に提供され得る。
【０１６０】
本発明は、インフルエンザウイルス感染を検出するための診断キットを提供する。特定のキットは、本発明の１つ以上の核酸を含む。特定のキットは、ＲＮＡｉのための好ましい標的部分を含むインフルエンザウイルス転写物の部分を検出するために使用され得る１つ以上の核酸を含む。．上記キットは、以下からなる群より選択される１つ以上の物品を含み得る：プローブ、プライマー、配列特異的オリゴヌクレオチド、酵素、基質、抗体、ヌクレオチドの集団、緩衝液、ポジティブコントロール、およびネガティブコントロール。上記ヌクレオチドは、標識され得る。例えば、蛍光標識されたヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰなど）の１つ以上の集団が、提供され得る。
【０１６１】
上記プローブは、標的部分（例えば、高度かもしくは好ましく保存された標的部分、またはその相補体）の全部または一部を含む核酸であり得るか、あるいは標的部分と少なくとも８０％同一または８０％相補的（例えば、１００％同一または１００％相補的）である。特定の実施形態において、複数のプローブが、提供される。上記プローブは、１つ以上の位置にて異なり、そしてこのような位置におけるインフルエンザウイルス転写物の正確な配列を決定するためにあ使用され得る。例えば、上記プローブは、上記転写物に差次的にハイブリッド形成し得る（例えば、ハイブリッド形成が上記プローブがその転写物の標的部分と１００％相補的である場合にのみ生じる）。
【０１６２】
上記プライマーは、標的部分の上流および下流に位置する部位と相補的であり得、そして上記標的部分を含むインフルエンザウイルス核酸の領域を増幅するために使用され得、次いでそれは、配列決定され得るか、またはさらなるプロセスに供され得る。上記増幅された領域の長さは、例えば、１００〜２００ｎｔ、２００〜３００ｎｔまたはそれ以上であり得る。所望の長さの領域を増幅するために上記標的部分から十分に離れた距離で部位に結合するプライマーが、選択される。増幅プライマーを選択するための方法は、当該分野において周知である。上記キットは、配列特異的オリゴヌクレオチドを含み得る。上記オリゴヌクレオチドは、実質的に相補的（そのオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドがその核酸と完全にと相補的）である核酸（例えば、インフルエンザウイルス特異的核酸）にハイブリッド形成した場合にそれらがポリメラーゼ媒介性伸長またはポリメラーゼ媒介性ライゲーションを支援するだけであるという点で配列特異的である。好ましくは、複数の配列特異的オリゴヌクレオチドが、提供される。上記オリゴヌクレオチドは、３’末端位置において異なり、したがって上記オリゴヌクレオチドが目的の核酸（例えば、インフルエンザウイルス特異的核酸）にハイブリッド形成される場合に、その位置に対向して位置するヌクレオチドの同一性を確立するために使用され得る。
【０１６３】
本発明のキットは、標本回収材料（例えば、スワブ、チューブなど）を含み得る。上記キットの構成要素は、一般に、そのキットの使用についての指示書と一緒に容器（例えば、市販に適したプラスチック容器または発泡スチレン容器）中に提供される個々の管またはチューブにパッケージ化され得る。
【０１６４】
（Ｖ．トランスジェニック動物）
本発明は、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を含むか、または発現するように操作されたトランスジェニック動物を包含する。このような動物は、本発明のＲＮＡｉ物質の機能および／または活性を研究するために有用であり、そして／あるいはインフルエンザウイルス感染／複製系を研究するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞の１つ以上が好ましくはその細胞の大部分および全部が導入遺伝子を含む非ヒト動物である。導入遺伝子は、好ましくは、トランスジェニック動物の細胞のゲノムに組み込まれるか、その細胞において生じる、外因性ＤＮＡまたは再配列（例えば、内因性染色体ＤＮＡの欠失）である。好ましくは、上記導入遺伝子は、核酸の発現が上記細胞において生じるように核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【０１６５】
導入遺伝子は、上記トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織におけるＲＮＡｉ誘導性物質の発現を指揮し得る。特定の好ましいトランスジェニック動物は、非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス））である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、トリ（例えば、ニワトリ）、両生類などが挙げられる。本発明の特定の実施形態に従って、上記トランスジェニック動物は、可能性のあるインフルエンザ治療薬を試験するための動物モデル（例えば、マウス、フェレット、または霊長類）として広範に使用される。本発明内で企図される他の非ヒト動物は、示された動物を含み、その動物としては、家畜およびペット、または利益のために使用されるかもしくは維持される任意の動物が挙げられる。このような動物は、インフルエンザウイルス感染に対して部分的かまたは完全に抵抗性である。上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであり得る。上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、任意の可能性のあるインフルエンザウイルス標的部分（例えば、任意の表１Ａ、１Ｂ、１７、１８、２０、および／または３４に列挙される標的部分）にターゲティングされ得る。特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、配列が配列番号２７４、２８６、２８７、２９２、２９７、２９８、３０４、３０５、３０９、３１０、３１１、３１９、３２４、３２７、３３４、３４６、３４７、３６０、３６１、３６４、および３６６（例えば、配列番号２９７、３０９、３１０、３１１、３４６、３４７、３６４、および３６６のいずれか）から選択される標的部分にターゲティングされる。例えば、好ましい実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、任意の上述の標的部分と相補的であるアンチセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する二重鎖を形成するセンス鎖を有する。
【０１６６】
トランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法は、当該分野において公知である。簡単にいうと、これらの方法は、以下を包含する：（ｉ）上記導入遺伝子を含む適切なベクターをマイクロインジェクションによって受精卵の核に導入し、次いで偽妊娠の雌の生殖器に卵を移すこと；および（ｉｉ）導入遺伝子を含む適切なベクターを（例えば、任意の従来の技術（例えば、トランスセクション、エレクトロポレーションなど）を使用して）培養された幹細胞に導入し、その導入遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれた細胞を選択し、必要に応じて、インビトロで卵胞細胞または接合体を胞胚（ｂｌａｓｔｕｌａ）期または胞胚（ｅｍｂｒｙｏ）期へと培養し、そして胚をレシピエントの雌に移すこと。他の方法に従って、上記導入遺伝子を含むレトロウイルスベクターが、使用される。上記レトロウイルスベクターは、感染によってＤＮＡプラスミドまたはウイルス粒子のいずれかとして細胞に導入される。卵胞細胞または胚細胞への適切なベクターのの細胞質マイクロインジェクションもまた、使用され得る。精子媒介性遺伝子導入もまた、包含される。これらの方法を使用して得られたヘテロ接合動物またはキメラ動物は、ホモ接合体を産生するために同定および採血される。
【０１６７】
上記ベクターは、好ましくは、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性ベクターである。好ましい実施形態において、上記ベクターは、トランスジェニック動物の種の生物体に由来するインフルエンザウイルスの間、および必要に応じて別の種（例えば、ヒト）に由来するインフルエンザウイルスの間でも好ましくかつ／または高度に保存される標的部分にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の転写のためのテンプレートを含む。上記ベクターは、ＲＮＡｉ誘導性物質の転写のためのテンプレートに作動可能に連結されるプロモーターを含む。上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、上に記載されるように、相補部分を含む単一のＲＮＡ分子または細胞内でハイブリッド形成する２つのＲＮＡ分子として産生され得る。上記プロモーターは、トランスジェニック動物の種に由来し得るが、そうである必要はない。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉプロモーター、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、使用され得る。上記プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。
【０１６８】
好ましい実施形態において、上記トランスジェニック動物は、鳥類（例えば、ニワトリ）である。トランスジェニック鳥類を作製するための方法は、当該分野において公知であり、そしてそれとしては、上に記載されるものおよびそれらの改変体が挙げられる。トランスジェニック鳥類および他のトランスジェニック動物の産生に適したベクターおよび方法は、例えば、米国特許第６，７３０，８２２号、米国公開第２００２０１０８１３２号および同第２００３０１２６６２９号、ならびにこれらの中の参考文献に記載される。特定の実施形態において、上記トランスジェニック鳥類は、レトロウイルスベクター（例えば、トリ白血病ウイルスベクター）を使用して産生される。他の実施形態において、上記トランスジェニック鳥類は、レトロウイルスベクター以外の真核生物ベクターを使用して産生されるが、上記ベクターは、レトロウイルスに由来する１つ以上の配列を含み得る。特定の実施形態において、上記トランスジェニック鳥類は、異なる阻害性領域配列を含むアンチセンス鎖をそれぞれ有する複数種のＲＮＡｉ誘導性物質を発現する。上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、異なるインフルエンザウイルス株にそれぞれターゲティングされる得る。
【０１６９】
本発明は、トランスジェニック鳥類の一団を提供し、その一団の異なるメンバーは、異なる阻害性領域配列を含むアンチセンス鎖をそれぞれ有する１つ以上の異なるＲＮＡｉ誘導性物質発現する。例えば、上記一団の第１の分画は、第１の鳥類インフルエンザ株の標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ誘導性物質を発現し、その一団の第２の分画は、第２の鳥類インフルエンザ株の標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含む第１のＲＮＡｉ誘導性物質を発現し、そして上記一団の第３の分画は、標的部分と１００％相補的であるアンチセンス鎖を含む第３のＲＮＡｉ誘導性物質を発現するなど。メンバーが第３の鳥類インフルエンザ株の異なるＲＮＡｉ誘導性物質を発現する一団は、全てのメンバーが同一のＲＮＡｉ誘導性物質を発現する場合よりも耐性インフルエンザウイルス株の出現に対して低い感受性であり得る。
【０１７０】
別の好ましい実施形態において、上記トランスジェニック動物は、哺乳動物（例えば、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｓｗｉｎｅ））、ウシなど）である。トランスジェニック哺乳動物を作製するのに適した方法としては、上に記載されるものが挙げられ、その局面は、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７：７３８０−７３８４、１９８０（生殖系列が１細胞の胚へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって移入する）、Ｈｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３２６：２９２−２９５、１９８７；Ｋｕｅｈｎ  ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２６：２９５−２９８、１９８７（一般に操作された胚性幹細胞の胚盤胞への移入）、およびＣａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４−６６、１９９６（除核した卵母細胞への操作された細胞由来の核の移入）にさらに記載される。さらなる参考文献は、ブタ（米国特許第６，５５８，６６３号；Ｍａｃｈａｔｙ，Ｚら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、４（１）：２１−７、２００２；Ｗａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：１６９６−１７００、１９９１）、ヒツジ（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８３０−８３４、１９９１）、ヤギ（Ｗａｎｇ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ．、６３（４）：４３７−４３、２００２）、およびウシ（Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：８４４−８４７、１９９１；Ｇａｌｌｉら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、５９（２）：５９９−６１６、２００３）に対するトランスジェニック技術の適用を記載する。
【０１７１】
別の好ましい実施形態において、上記トランスジェニック動物は、げっ歯類（例えば、マウス）である。ＲＮＡｉ誘導性物質を発現するマウスおよびラットは、種々の異なるアプローチを使用して産生された（例えば、Ｈａｓｕｗａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２年１２月４日；５３２（１−２）：２２７−３０．Ｘｉａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０（１０）：１００６−１０、２００２；Ｒｕｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３３（３）：４０１−６、２００３を参照のこと）。
【０１７２】
（ＶＩ．ＲＮＡｉ誘導性実体の送達のための組成物および方法）
ＲＮＡｉ誘導性実体は、種々のアプローチに従って投与され得る。本発明の１つの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質の単一の種が、被験体に投与される。非限定的な例は、種々のインフルエンザウイルス株由来の好ましくかつ／または高度に保存された標的部分と相補的であるアンチセンス鎖を含む単一のｓｉＲＮＡ種である。関連する実施形態において、２つ以上の異なるＲＮＡｉ誘導性物質の集団は、被験体に投与される。１つの実施形態において、２つ以上の異なるＲＮＡｉ誘導性物質の集団は、配列が特定のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）の種々の株由来の同じ好ましくかつ／または高度に保存された領域と実質的に相補的（好ましくは、１００％相補的）であるアンチセンス鎖を含む物質を含む。別の実施形態において、２つ以上のＲＮＡｉ誘導性物質の集団は、配列が同じウイルス株由来の異なる保存された領域と実質的に相補的（好ましくは１００％相補的）であるアンチセンス鎖を含む物質を含む。なお別の実施形態において、２つ以上のＲＮＡｉ誘導性物質の集団は、配列が特定のウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）の種々の株由来の同じ好ましくかつ／または高度に保存された領域と実質的に相補的（好ましくは、１００％相補的）であるアンチセンス鎖を含む物質を含み、そしてＲＮＡｉ誘導性物質は、配列が同じウイルス株由来の異なる高度に保存された領域と実質的に相補的（好ましくは１００％相補的）であるアンチセンス鎖を含む物質を含む。
【０１７３】
本発明者らは、インフルエンザウイルス感染の予防および治療を含む有効なＲＮＡｉ治療が、一般に、インタクトな生物体中の細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質および／またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの効率的な送達によって増強されることを、認識している。インフルエンザウイルスの場合において、このような物質は、インフルエンザ感染が通常生じる気道中の細胞に導入されなくてはならない。ヒトにおいて使用するために、ＲＮＡｉ誘導性物質の細胞内への取り込みを容易にする非ウイルス性の方法を使用することが、好まれ得る。したがって、本発明は、インタクトな生物体（例えば、哺乳動物および鳥類）中の細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質および／またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの増強した送達のための任意の種々の非ウイルス性送達因子を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、「送達」の概念は、身体への進入の部位から細胞の位置へのＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの輸送を含み、それは、機能、細胞の取り込み、および／またはその物質の作製に関する任意のその後の工程のためのものであるか、あるいは細胞内ＲＮＡｉ機構（例えば、エンドソームからのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの放出）に利用可能である。ＲＮＡｉ誘導性物質を安定化する成分（一旦それが、身体中にあるか、または送達のための因子を処方するプロセスの間にあると、その分解を阻害する）（例えば、ＲｎａｓｉｎなどのＲｎａｓｅ阻害物質）はまた、本発明の組成物中に含まれ得る。一般に、完全または部分的のいずれかでＲｎａｓｅの活性を阻害する任意の物質が、使用され得る。例としては、ヒト胎盤から精製されたＲｎａｓｅインヒビターまたはその組換えバージョンが挙げられる。上記送達因子が、主に、ＲＮＡｉ誘導性物質の送達を増強するために使用される一方で、それらはまた、ＲＮＡｉ誘導性ベクターの送達を増強するために使用され得る。
【０１７４】
本発明の特定の実施形態において、上記送達因子は、安定性を増強するか、クリアランスを阻害するか、上記組成物の細胞取り込みを促進するか、細胞内でのＲＮＡｉ誘導性実体の放出を促進するか、細胞毒性を減少させるか、または上記組成物を特定の細胞型、組織、または器官に指向させる。「クリアランスを阻害する」とは、腎臓系による身体からの上記組成物の除去の速度を減少させることを意味する。上記送達因子は、網内皮系（例えば、マクロファージ）の細胞による取り込みを阻害し得る。上記ＲＮＡｉ誘導性実体自体は、安定性を増強するか、クリアランスを阻害するか、細胞取り込みを促進するか、細胞内区画（例えば、エンドソーム）からのＲＮＡｉ物質および／またはＲＮＡｉベクターの放出を促進するか、細胞毒性を減少させるか、または上記組成物を特定の細胞型、組織、または器官に指向させるために改変（例えば、共有結合的に改変）され得る。例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質は、ペグ化され得、そして／またはアルギニンが豊富なペプチドは、上記ＲＮＡｉ誘導性物質に結合体化され得る。
【０１７５】
したがって、本発明は、以下を含む組成物を包含する：（ｉ）転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質、および／または細胞内での存在が転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の産生をもたらすＲＮＡｉ誘導性ベクター；ならびに（ｉｉ）任意の種々の送達因子（カチオン性ポリマー、改変カチオン性ポリマー、ペプチド分子輸送体（アルギニンが豊富なペプチドまたはヒスチジンが豊富なペプチドを含む）、炭水化物、脂質（カチオン性脂質、中性脂質、およびそれらの組み合わせを含む）、リポソーム、リポポリプレックス（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘ）、非カチオン性ポリマー、肺への導入に適した界面活性剤、またはそれらの任意の混合物などが挙げられるが、これらに限定されない）。特定の上記送達因子は、送達を増大させるか、あるいはＲＮＡｉ上記転写物を阻害することが望まれる細胞への誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの選択的送達を増大させる部分を組み込む。特定の実施形態において、上記転写物は、呼吸器ウイルス転写物（例えば、インフルエンザウイルス転写物）である。
【０１７６】
特定の送達因子の使用が、本発明の特定の実施形態において好ましい一方で、他の好ましい実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性実体（例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質）は、「むき出しの（ｎａｋｅｄ）」形態（すなわち、トランスフェクション、細胞への進入などを増強する任意の送達因子の非存在下）で投与される。例えば、ＲＮＡｉ誘導性物質は、脂質を本質的に含まずそして送達増強性ポリマー（例えば、カチオン性ポリマーまたは非カチオン性ポリマー（例えば、下に記載されるポリマー））を本質的に含まない水性媒体で投与され得る。ＲＮＡｉ誘導性物質は、むき出しの形態を静脈内かまたは呼吸系に直接（例えば、鼻または口を介し、かつ肺への吸入によって）投与し得る。特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、血液への最小限の吸収を生じ、したがってそのＲＮＡｉ誘導性物質の全身送達を最小化しつつ呼吸器ウイルス感染を処置または予防するのに有効な量で投与される。
【０１７７】
（Ａ．送達方法）
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物を哺乳動物被験体に送達するための種々の方法を提供する。特定の実施形態において、上記組成物は、脈管系に直接送達され、そして被験体の器官または組織（例えば、肺）において標的転写物の阻害を達成する。他の実施形態において、上記組成物は、呼吸系に直接送達される。特定の方法は、実施例１６、２２、２３、および２４において利用され、ここでインフルエンザウイルス産生およびルシフェラーゼまたはシクロフィリンＢの発現が、その方法を使用して哺乳動物被験体の標的器官において阻害される。これらの結果は、上記方法が実質的に任意の所望の標的転写物の阻害に広範に適用可能であることを示す。
【０１７８】
特に、本発明は、哺乳動物被験体の組織または器官において遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、以下の工程を包含する：上記遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物をハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに上記被験体の脈管系に直接的に導入する工程。好ましくは、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、肺において標的転写物の発現を阻害する。上記組織は、非循環組織（すなわち、血液以外の組織）であり得る。関連する実施形態において、本発明はさらに、哺乳動物被験体の呼吸系においてウイルスの産生を阻害する方法をさらに提供し、そのウイルスは、気道上皮細胞に感染し、その方法は、以下の工程を包含する：ウイルスの遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を含む組成物を、ハイドロダイナミックトランスフェクション技術を使用せずに注射によって上記被験体の脈管系に導入する工程。
【０１７９】
本発明は、哺乳動物被験体の肺において遺伝子の発現を阻害する方法をさらに提供し、その方法は、以下の工程を包含する：上記遺伝子にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の有効量および送達因子を含む組成物を、上記被験体の呼吸系に対して直接的に導入する工程。好ましい実施形態において、上記遺伝子は、呼吸器ウイルス遺伝子（例えば、インフルエンザウイルス遺伝子）である。好ましくは、上記有効量は、上記被験体の呼吸系においてインフルエンザウイルスの産生を阻害する。本方法の特定の実施形態または本発明の任意の他の局面において、上記ウイルスは、ＲＳＶ以外の呼吸器ウイルスである。
【０１８０】
上記組成物は、例えば、鼻または口を介し、代表的に、次いで吸入によって投与され得る。上記組成物は、代表的には鼻腔内スプレーまたは口腔内スプレーにおけるように、上気道（例えば、鼻腔、咽頭など）において主に残存する粒子を含み得る。他の実施形態において、上記粒子は、下気道に吸入される。組成物を呼吸系に直接的に送達するために使用され得る呼吸用処方物は、下で考察される。特定の実施形態において、呼吸系への直接的な送達は、全身送達をもたらす（例えば、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、肺から脈管系に進入し、そして身体の他の場所の標的器官または組織に輸送される）。
【０１８１】
ＲＮＡｉ誘導性物質の有効量を哺乳動物被験体の呼吸系に送達するための方法は、広範な種々の用途を有し、その用途としては、呼吸器ウイルス感染を予防または処置することが挙げられるが、これらに限定されない。適切な転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質はまた、呼吸系に影響する種々の他の疾患および病態の予防および／または処置のために本発明の方法を使用して投与され得る。例としては、癌（例えば、肺癌）、嚢胞性線維症（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／２００，６０７を参照のこと）、喘息（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１１／０６９，６１１を参照のこと）、肺高血圧症、肺線維症、気腫などが挙げられる。適切な標的遺伝子としては、例えば、オンコジーン、血管新生促進分子および／または増殖因子（例えば、血管内皮増殖因子、炎症促進分子など）をコードする遺伝子が挙げられる。当然に、身体の任意の部分に影響する疾患において役割を果たす転写物は、上記ＲＮＡｉ誘導性物質が全身に送達される場合に、ターゲティングされ得る。
【０１８２】
本発明の特定の実施形態において、上記有効量は、上記被験体の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと５ｍｇとの間である。他の実施形態において、上記有効量は、上記被験体の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと１０ｍｇとの間であるか、または上記被験体の体重１ｋｇあたり０．５ｍｇと２０ｍｇとの間である。
【０１８３】
ＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物は、送達因子を含んでも含まなくてもよい。本発明において使用するのに適した送達因子としては、下および同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／６７４，０８７に記載されるものが挙げられる。上記送達因子は、組み合わせて使用され得る。
【０１８４】
（Ｂ．カチオン性ポリマーおよび改変カチオン性ポリマー）
本発明者らは、多くの異なる経路によるＲＮＡｉ誘導性物質の送達が任意の種々のカチオン性ポリマーおよび改変カチオン性ポリマーによって増強されることを決定した。したがって、本発明は、いかを含む組成物を提供する：（ｉ）標的転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性実体および（ｉｉ）カチオン性ポリマー。本発明は、標的遺伝子発現を阻害する方法をさらに提供し、その方法は、標的転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を含む組成物を哺乳動物被験体に投与することを包含する。特に、本発明は、インフルエンザウイルス感染を処置および／または予防する方法を提供し、その方法は、インフルエンザウイルス転写物をターゲティングするＲＮＡｉ誘導性物質およびカチオン性ポリマーを含む組成物を哺乳動物被験体に投与することを包含する。
【０１８５】
一般に、カチオン性ポリマーは、ほぼ生理学的なｐＨ（例えば、約７．０〜７．６の範囲のｐＨ、好ましくは約７．２〜７．６の範囲のｐＨ、より好ましくは約７．４のｐＨ）にて正に荷電されるポリマーである。このようなカチオン性ポリマーとしては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン（ＰＬＡ）、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（３７）（例えば、（７６）に記載されるような直鎖状ＰＥＩまたは分枝状ＰＥＩおよび低分子量ＰＥＩ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（３８）、キトサン（３９、４０）、プロタミン、ポリホスフェート、ポリホスホエステル（例えば、米国公開第２００２００４５２６３号に記載されるもの）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などが挙げられるが、これらに限定されない。特定のこれらのポリマーは、第１級アミン基、イミン基、グアニジン基、および／またはイミダゾール基を含む。好ましいカチオン性ポリマーは、比較的低い毒性を有する。参考文献８５〜８７；Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６，０１３，２４０；ＷＯ９６０２６５５；ならびに米国公開第２００４０１６７０８７号および同第２００３０１５７０３０号は、本発明の実施において有用なＰＥＩおよび他のポリマーについてのさらなる情報を提供する。市販のＰＥＩ試薬は、ｊｅｔＰＥＩＴＭ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）として公知であり、ＰＥＩの直鎖形態（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６，０１３，２４０）が、使用され得る。
【０１８６】
適切なカチオン性ポリマーとしてはまた、異なる分子量のポリマーのブレンド、任意の上述のポリマー（または他のポリマー）のサブユニットを含むコポリマー（例えば、リジン−ヒスチジンコポリマー）などが挙げられる。種々のサブユニットの％は、コポリマーにおいて等しい必要はないが、例えば、細胞毒性を最小限にしつつ核酸との複合体を形成する能力のような特性を最適にするために選択され得る。さらに、上記サブユニットは、規則的な様式で交互にある必要はない。所望の特性に関して種々のポリマーを評価するのに適したアッセイは、実施例において記載される。好ましいカチオン性ポリマーとしてはまた、任意の種々の改変をさらに組み込む上述などのポリマーが挙げられる。適切な改変は、下で考察され、そしてそれらとしては、アセチル基、スクシニル基、アシル基、またはイミダゾール基による改変（３２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
カチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡ分子およびｓｈＲＮＡ分子とＤＮＡプラスミドとの間の構造およびサイズにおけるかなりの違いを前提として、ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを容易にすることが示されている一方で、カチオン性ポリマーがｓｉＲＮＡの取り込みを増強するのに有用であるか否かは、非常に不明確であった。しかし、実施例１２に記載されるように、本発明者らは、ＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡおよびインフルエンザウイルスＲＮＡをターゲティングするｓｉＲＮＡを含む組成物が、インフルエンザウイルス感染の前または後のいずれかに静脈内に投与した場合、マウスにおいてインフルエンザウイルスの産生を顕著に阻害することを示した。上記阻害は、用量依存的であり、そして異なるインフルエンザウイルスＲＮＡにターゲティングされる２種のｓｉＲＮＡを使用した場合、相加効果を示す。したがって、ｓｉＲＮＡは、カチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ、またはＰＬＡ）と組み合わせた場合、肺に到達し得、細胞に進入し得、そしてウイルス複製サイクルを有効に阻害し得る。ＰＥＩの存在は、肺への送達を顕著に増強したが、有効な送達は、その非存在下においてさえ生じ（実施例１２；図２２Ｃ）、これは、呼吸系への有効なｓｉＲＮＡ送達が、「むき出しの」ｓｉＲＮＡを使用して達成され得ることを示した。これらの知見が、ｓｉＲＮＡを使用した哺乳動物における感染性ウイルスの産生の阻害（例えば、ウイルス複製サイクルにおいてウイルス転写物またはウイルス中間体の産生の阻害とは対照的）における効力の最初の報告を示すと考えられる。実施例１６に記載されるように、ｓｉＲＮＡとカチオン性ポリマーとの混合物の肺投与は、肺細胞において標的転写物を有効に阻害した。実施例２３および２４ならびに図３１は、哺乳動物被験体の呼吸系に送達されたむき出しのｓｉＲＮＡがそこでの標的転写物の発現を有効に阻害するというさらなる証拠を提供する。
【０１８８】
ｓｉＲＮＡを身体内の実質器官および実質組織に対して静脈内送達する他の試み（例えば、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ２００２；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ２００３；Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｌ．、２００２を参照のこと）は、ハイドロダイナミックトランスフェクションとして公知である技術を使用し、それは、マウスの尾静脈に対する多量の流体の迅速な送達を含み、そして実質器官（例えば、肝臓）において有意な量のプラスミドＤＮＡの蓄積を生じることが示されている（Ｌｉｕ  １９９９；Ｚｈａｎｇ  １９９９；Ｚｈａｎｇ  ２０００）。この技術は、約２００μｌの流体の注射を含む従来の技術（Ｌｉｕ  １９９９）とは対照的に、動物の全血液容量にほぼ等しい流体容量（例えば、１８〜２０グラムの体重を有するマウスに対して１．６ｍｌ（体重の約８〜１２％と等しい））の送達を含む。さらに、ハイドロダイナミックトランスフェクションアプローチを使用した注射は、短い時間間隔（例えば、５秒間）にわたって行われ、それは、注射した導入遺伝子の効率的な発現に必要である（Ｌｉｕ  １９９９）。ｓｉＲＮＡはまた、ヌードマウスにおいて皮下に移植された腫瘍細胞に対して静脈内送達された（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ２００３）が、ネイティブな器官および組織に対するＲＮＡｉ誘導性物質の静脈内送達についてのこの知見の関連性は、このシステムに特有の特徴を考慮して明確ではない。さらに、本発明は、被験体の体重１ｋｇあたり５ｍｇ以下（例えば、０．１〜５ｍｇ）の用量にてＲＮＡｉ誘導性物質の有効な静脈内送達を示す。
【０１８９】
ハイドロダイナミックトランスフェクションが肝臓において注射した導入遺伝子の移入および高レベル発現を達成する機構が、完全に明確でない一方で、一過性の心臓性うっ血に起因した肝静脈を介する肝臓へのＤＮＡ溶液の逆流に起因すると、考えられる（Ｚｈａｎｇ  ２０００）。ヒトにおける治療のための匹敵するアプローチは、実行できないであろうと考えられる。本発明者らは、対照的に、従来の容量の流体（例えば、２００μｌ）を使用し、そして肝臓（発現がハイドロダイナミックトランスフェクションを使用して最も迅速に達成される部位）においてでさえ注射した導入遺伝子の最小限の発現を生じることが予想される条件下において、肺へのｓｉＲＮＡの有効な送達を示した。
【０１９０】
したがって、本発明は、哺乳動物被験体内の細胞において転写物（例えば、インフルエンザウイルス転写物などのウイルス転写物）の発現を阻害する方法を提供し、その方法は、ＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、標的転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を含む組成物を、従来の注射技術（例えば、従来の圧力および／または従来の容量の流体を使用した技術）を使用して被験体の脈管系に導入する工程を包含する。本発明の好ましい実施形態において、静脈内投与は、標的器官（例えば、肺）内でＲＮＡｉ誘導性物質の治療有効量をもたらす。本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、カチオン性ポリマーを含む。本発明の好ましい実施形態において、上記組成物は、被験体の体重の１０％未満に等しい流体容量で導入される。本発明の特定の実施形態において、上記流体容量は、被験体の体重の５％未満、２％未満、１％未満、または０．１％未満に等しい。本発明の特定の実施形態において、その方法は、肝臓以外の身体組織または身体器官（例えば、肺）中の細胞においてＲＮＡｉ誘導性物質の有効量の送達を達成する。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記組成物は、例えば、静脈内注射によって静脈に導入される。しかし、上記組成物はまた、動脈に投与され得、カテーテル、留置する静脈内ラインなどのようなデバイスを使用して送達され得る。本発明の特定の好ましい実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、例えば、肺においてウイルスの産生を阻害する。
【０１９１】
実施例１５に記載のように、本発明者らは、カチオン性ポリマーＰＬＬおよびＰＬＡはｓｉＲＮＡと複合体を形成し、培養細胞中の機能的ｓｉＲＮＡの取り込みを促進することができることも示した。ＰＬＬとＮＰ−１４９６との複合体またはＰＬＡとＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡとの複合体でのトランスフェクションにより、細胞中のインフルエンザウイルスの産生を阻害した。これらの結果および上記で考察したマウスでの結果は、被験体の体内の哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達のためのカチオン性ポリマーとｓｉＲＮＡとの混合物の使用の利点を証明する。実施例１５に記載のアプローチを使用して、細胞傷害性を減少させ、最初に有効なものを至適化させるさらなるポリマー（例えば、基（アシル基、スクシニル基、アセチル基、またはイミダゾール基）の付加によって改変されたポリマー）について試験を行うことができる。一定の好ましい改変により、カチオン性ポリマーの正電荷が減少する。一定の好ましい改変により、第１級アミンが第２級アミンに変換される。このようなさらなる基を組み込むためのカチオン性ポリマーの改変方法は、当該分野で周知である（例えば、引用文献３２を参照のこと）。例えば、種々の残基のε−アミノ基を、例えば、結合体化によってポリマー合成後の所望の改変基と置換することができる。一般に、ポリマーがＲＮＡｉ誘導性物質の送達を強化する能力を非常に大きく減少させることなく非置換ポリマーと比較して細胞傷害性が適切に減少するのに十分な置換率を選択することが望ましい。したがって、本発明の一定の実施形態では、ポリマー中の残基の５％と７５％（例えば、約５０％）との間の残基を置換する。同様の効果が、適切に選択されたモノマーサブユニット（すなわち、そのいくつかが所望の改変を既に組み込むサブユニット）のコポリマーを最初に形成することによって達成され得る。ＲＮＡｉ誘導性物質の送達を容易にするために使用するカチオン性ポリマーは、それらがそのポリマーに含まれる主要なモノマーサブユニット以外の１つ以上の残基を組み込むように改変され得る。例えば、１つ以上の代替的な残基は、ポリマーの末端に付加され得るか、またはポリマーは、そのポリマーに含まれる主要なモノマー以外の残基によって連結され得る。
【０１９２】
種々のさらなるカチオン性ポリマーもまた、使用され得る。例としては、ポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマー（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／９６９，４３１；同１０／４４６，４４４；米国公開第２００２０１３１９５１号ならびに参考文献３４および９３に記載されるもの）が挙げられる。いくつかのポリ（β−アミノエステル）（ＰＡＥ）ポリマーは、ｓｉＲＮＡ分子およびｓｈＲＮＡ分子とＤＮＡプラスミドとの間の構造およびサイズにおけるかなりの違いを前提として、ＤＮＡプラスミドトランスフェクションを容易にすることが示されている一方で、カチオン性ポリマーがｓｉＲＮＡの取り込みを増強するのに有用であるか否かは、非常に不明確であった。しかし、実施例１２に記載されるように、本発明者らは、ＮＰ（ＮＰ−１４９６）にターゲティングされるｓｉＲＮＡがポリ（βアミノエステル）と一緒に静脈内に投与した場合、マウスにおいてインフルエンザウイルス産生を阻害したことを示した。さらに、このｓｉＲＮＡは、第２のポリ（βアミノエステル）と一緒に腹腔内に投与した場合、マウスにおいてインフルエンザウイルス産生を阻害した。
【０１９３】
本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の送達を強化するために使用することもできるさらなるカチオン性ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリ（２−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）およびその第４級アミンアナログであるポリ（２−トリメチルアミノ（ｔｒｉｅｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ））エチルメタクリレート（ｐＴＭＡＥＭＡ）、ポリ［ａ−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸（ＰＡＧＡ）、およびポリ（４−ヒドロキシ−１−プロリンエステル）が含まれる。これらの薬剤のさらなる説明についてはＨａｎ（２０００）を参照のこと。
【０１９４】
改変カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）−グラフト−ポリ（Ｌ−リジン）ポリマー（Ｂｅｎｎｓ  ２０００）、ポリヒスチジン−ＰＥＧ（Ｐｕｔｎａｍ  ２００３）、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）−ＰＥＧ−グラフト−ポリエチレンイミン（Ｂｅｎｎｓ  ２００２）、ポリエチレンイミン−デキストランサルフェート（Ｔｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ  ２００３）など）が、使用され得る。上記ポリマーは、分枝状であっても直鎖状であってもよく、そしてグラフトされてもグラフトされなくてもよい。特定の実施形態において、ポリマーは、本発明のＲＮＡｉ誘導性実体と複合体を形成し、それは、次いで被験体に投与される。任意の上記ポリマーは、ＰＥＧまたは他の親水性ポリマーを組み込むために改変され得る。カチオン性ポリマーは、多重に改変され得る。
【０１９５】
本発明は、細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質の送達を増強しそして／または特定の細胞へのＲＮＡｉ誘導性物質の選択的送達を増強する部分を組み込むための本明細書中に記載される任意の送達因子の改変を包含する。任意の種々の部分が、使用され得る（例えば、（ｉ）阻害が所望される細胞（例えば、気道上皮細胞）によって発現される分子に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；（ｉｉ）阻害が所望される細胞によって発現される分子に特異的に結合するリガンド）。抗体、リガンド、および／または送達因子を核酸または本明細書中に記載される種々の送達因子に結合体化するための方法は、当該分野において周知である。例えば、「Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍを有するウェブサイトにて利用可能であり、そして１９９４−９５  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｉｔｅｄ  ｔｈｅｒｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ  ＳＳ、Ｃｈｅｍｉｓｔｉｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９１において最初に公開された）；およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５を参照のこと。
【０１９６】
（Ｃ．ＲＮＡｉ誘導性実体を呼吸系に送達するためのさらなる因子）
本発明は、任意の種々のさらなる因子およびＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物を包含し、その因子は、例えば、気道上皮細胞への上記ＲＮＡｉ誘導性実体の送達を増強する。
【０１９７】
特定の実施形態において、細胞表面から原形質膜に透通し得るペプチドであるペプチド分子輸送体は、組成物に含まれる。それらは、一般に、１１〜３４アミノ酸残基からなり、ａｒｅアルギニンについて高度に濃縮され、そしてしばしばアルギニンが豊富なペプチド（ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＲＰ）またはペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）と称される（参考文献４２〜５１、１２０、１３４〜３６を参照のこと）。
【０１９８】
他の実施形態において、組成物は、肺への導入に適した界面活性剤を含む。例としては、以下が挙げられる：市販の処方物であるＩｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ＯＮＹ，Ｉｎｃ．、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）；Ｓｕｒｖａｎｔａ（登録商標）（Ｒｏｓｓ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、およびＥｘｏｓｕｒｆ  Ｎｅｏｎａｔａｌ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、ＮＣ）。米国特許第４，３３８，３０１号；同第４，３９７，８３９号；同第４，３１２，８６０号；同第４，８２６，８２１号；同第５，１１０，８０６号。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．４，３１２，８６０；同４，８２６，８２１；および同５，１１０，８０６は、さらなる界面活性剤組成物を記載する。一般に、肺に対して実質的な傷害を引き起こさずに任意の脂質含有材料が、界面活性剤として使用され得る。
【０１９９】
洗浄剤および揺変性溶液を伴う投与もまた、使用され得る。全フッ素置換化合物液（例えば、ヘプタコサフルオロトリブチルアミン（Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ）、および関連する分子）もまた、使用され得る。さらなる考察については、（７４、１２６、１５０）および米国特許第６，６３８，７６７号を参照のこと。さらに、本発明は、例えば、呼吸系（例えば、肺）への送達のために本発明のＲＮＡｉ誘導性実体を組み込むタンパク質／ポリエチレンイミン複合体の使用を包含する。使用され得る他の送達因子としては、天然のシクロデキストリンおよび合成のシクロデキストリンならびに他の送達因子を含むこれらの混合物が挙げられる。さらなる情報については、Ｓｉｎｇｈ，Ｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．２０（５−６）：３４１−５９、２００２；Ｅａｓｔｂｕｒｎ，ＳＤおよびＴａｏ，ＢＹ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ．、１２（２）：３２５−３９、１９９４）ならびに米国公開第２００３０１５７０３０号を参照のこと。種々の非カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧ）、およびポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）（Ｐａｎｙａｍ  ２００２）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ポリ（エーテル−無水物））が、使用され得る。カチオン性ポリマーと非カチオン性ポリマーとの間の組み合わせ（ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）−グラフトポリ（Ｌ−リジン）（Ｊｅｏｎｇ  ２００２））、ならびにＰＬＡ、ＰＬＧ、またはＰＬＧＡおよび任意のカチオン性ポリマーまたは改変カチオン性ポリマーを含む他の組み合わせ（上で考察されるもの）が、特定の実施形態において使用される。カチオン性モノマーおよび／または非カチオン性モノマーを含み得るブロックコポリマーもまた、使用され得る。例は、米国特許第６，８００，６６３号；同第６，６９２，７７０号；同第６，６６９，９５９号；同第６，６１６，９４１号；同第６，５９２，８９９号および同第６，５１７，８６９号に記載される。
【０２００】
（ＶＩＩ．ＲＮＡｉ誘導性実体の吸入送達のための組成物）
本発明は、吸入による投与のためのＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物を提供する。好ましくは、上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ誘導性実体である。上述されるように、ＲＮＡｉ誘導性物質は、むき出しの形態かあるいは鼻または口を介し、そして肺に達する吸入によって送達因子と一緒にかのいずれかで呼吸系に直接的に投与され得る。特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、血液への最小限の吸収を生じ、したがってそのＲＮＡｉ誘導性物質の全身送達を最小化しつつ呼吸系に影響する病態（例えば、呼吸器ウイルス感染）を処置または予防するのに有効な量で投与される。本発明の特定の実施形態において、血液への吸収の程度は、臨床的に有意な効果は、上記ＲＮＡｉ物質が肺において有効である用量にて投与される場合に呼吸系外部の器官または組織において観察されないようなものである。
【０２０１】
特に、本発明は、ＲＮＡｉ誘導性実体（好ましくは、ＲＮＡｉ誘導性物質）を含む乾燥粉末組成物を提供する。本発明の物質は、好ましくは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素などの気体）、または噴霧器を含む加圧された容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。特定の実施形態において、上記送達システムは、被験体の主要な気道（気管および気管支）および／またはより深く肺（細気管支および／または肺胞）に組成物を送達するのに適している。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物は、鼻腔用スプレーを使用して送達される。送達因子は、上記薬学的組成物に含まれ得る。しかし、本発明者らはまた、ＲＮＡｉ誘導性物質が、特定の送達因子の非存在下において呼吸経路を介して呼吸系に送達した場合にインフルエンザウイルスを有効に阻害し得ることを見出した（実施例２３）。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性物質は、乾燥形態（例えば、乾燥粉末）で本質的にそのＲＮＡｉ誘導性物質からなる組成物、あるいは本質的に水からなる水性媒体（必要に応じてまた、塩（例えば、ＮａＣｌ、リン酸塩）、緩衝液、および／またはアルコールを含む）で本質的にそのＲＮＡｉ誘導性物質からなる組成物（例えば、むき出しのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）として肺に送達される。
【０２０２】
気道および肺への送達のためのエアロゾル処方物は、種々の寸法および特性の液体粒子または乾燥粒子を含み得る。直径約１ｍｍよりも小さい粒子を含む乾燥粒子組成物はまた、本明細書中で乾燥粉末と称される。「乾燥」によって、粒子がエアロゾルまたはスプレーを形成するために、例えば、乾燥粉末吸入デバイスにおいて容易に分散可能であるように、上記組成物が比較的低い液体含量を有することを意味する。「粉末」によって、比較的自由に流動し、かつ吸入デバイス中に容易に分散され得、ついで被験体（例えば、患者）によって吸入され、その結果好ましくは、粒子が肺の肺胞に到達し得る微細に分散した固体粒子（すなわち、それらが肺送達に適している）から大部分または全体がなる組成物を意味する。粉末組成物は、種々のパラメータ（例えば、細粒分（ＦＰＦ）、放出される用量、平均粒子密度、および空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ））に基づいて特徴付けられ得る。適切な方法は、当該分野において公知であり、そして例えば、参考文献３１および５８ならびに米国公開第２００２０１４６３７３号、同第２００３００１２７４２号、および同第２００４００９２４７０号に見出される。本発明の特定の実施形態において、１μｍと２５μｍとの間（好ましくは、１μｍと１０μｍとの間）の空気動力学的中央粒子径を有する粒子が、使用される。特定の実施形態において、３μｍと１５μｍとの間の範囲の平均幾何学粒径（ｍｅａｎ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）および０．０４ｇ／ｃｍ３と０．６ｇ／ｃｍ３との間のタップ密度を有する大きな多孔性粒子が、使用される（３１、５８）。
【０２０３】
乾燥粒子を作製するための方法は、当該分野において公知である。適切な方法としては、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、相分離、単一または二重のエマルション溶媒エバポレーション（ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、溶媒抽出、ならびに単純コアセルベーションおよび複合コアセルベーションが挙げられる。粒子組成物はまた、顆粒化、押し出し、および／または球形化を使用して作製され得る。乾燥粉末オリゴヌクレオチド処方物を調製するのに適した方法は、当該分野において公知である。例えば、米国公開第２００４００９２４７０号を参照のこと。使用される方法は、好ましくは、標的転写物を阻害するための核酸の物理的完全性および能力を大きく減少させない。核酸の著しい分解をもたらすことが公知である極端な温度またはｐＨを回避することが、望ましい。一般に、分解の程度が、特定の条件および上記核酸が上記条件に曝される時間の両方の関数であり得、その結果、曝露の持続時間を最小化することが、望まれ得、そしてより極端な条件が使用されることを可能にすることが、認識される。組成物は、選択された方法が残りの十分な効力に関して適切であるか否かを決定するために試験され得る。好ましくは、選択された処方方法は、核酸からなる部分が少なくとも１０％（好ましくは少なくとも２０％、５０％、またはそれ以上）の投入核酸の活性のレベルを有する組成物をもたらす。
【０２０４】
上記粒子の調製に使用される条件は、所望のサイズまたは特性（例えば、疎水性、親水性、外部形態（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、「粘性（ｓｔｉｃｋｉｎｅｓｓ）」、形状など）の粒子をもたらすために選択され得る。上記粒子を調製する方法および使用される条件（例えば、溶媒、温度、濃度、気流速度など）はまた、特定の活性因子および上記組成物に含まれる他の成分に依存し得る。任意の上記方法よって調製された粒子が、所望の範囲外のサイズ範囲を有する、その粒子は、例えば、ふるいを使用して、ミリングなどによってサイジングされ得る。方法の組み合わせが、使用され得る。
【０２０５】
上記乾燥粉末は、本質的に１つ以上のＲＮＡｉ誘導性物質からなり得る。特定の実施形態において、上記処方物は、１つ以上のさらなる因子（例えば、安定化剤、送達増強性因子（上に記載されるもの）、賦形剤など）を含む。本明細書中で使用される場合、用語「賦形剤」とは、活性因子または送達増強性因子以外の本発明の処方物中に存在する物質をいう。肺送達のための適切な賦形剤は、当該分野において公知である。任意の多数の当該分野で認識された化合物は、本発明の処方物中に含まれ得る。一般に、０．１重量％と１００重量％との間の濃度の活性因子（すなわち、ＲＮＡｉ誘導性物質）を有する組成物が、使用され得る。
【０２０６】
粒子を（例えば、標的転写物レベルを減少させそして／またはインフルエンザウイルス産生を阻害する能力について）試験するための方法は、実施例１０において記載される。同様の方法は、任意の本発明のエアロゾル処方物のために使用され得る。乾燥粒子組成物は、適切な溶媒に溶解され得、液体エアロゾルとしてか、または他の適切な送達手段によって送達される得る。
【０２０７】
液体粒子はまた、例えば、エアロゾル処方物として送達され得る。一般に、このような粒子のサイズ範囲は、乾燥粒子について上に記載されるものと同様であり得る。特定の実施形態において、上記液体粒子は、呼吸性送達のために約０．５μｍ〜５μｍとの間であるが、より小さい粒子またはより大きい粒子もまた、使用され得る。適切な水性ビヒクルとしては、水または生理食塩水（必要に応じて、アルコールを含む）が挙げられる。
【０２０８】
肺送達についてのさらなる検討は、「Ｌｕｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００２中のＢｉｓｇａａｒｄ，Ｈ．ら（編）、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ、第２６巻において考察される。
【０２０９】
本発明のＲＮＡｉ誘導性物質を含む粒子はまた、所望される場合、静脈内に投与され得る。静脈内送達に関して、約１０ｎｍ〜５０μｍのサイズは、一般に、好ましい。
【０２１０】
（ＶＩＩｌ．治療適用）
本発明のＲＮＡｉ誘導性実体を含む組成物は、呼吸器ウイルスの感染または複製を阻害するか、または減少させるために使用され得る。このような適用において、本発明の組成物の有効量は、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に対する曝露の前、その曝露と同時、またはその曝露の後に、細胞または器官に送達される。好ましくは、上記ＲＮＡｉ誘導性実体の量は、感染の１つ以上の症状を減少または遅延させるのに十分である。説明のために、この節は、しばしば、本発明のｓｉＲＮＡｓをいうが、本発明は、ウイルス転写物にターゲティングされる他のＲＮＡｉ誘導性実体に関して同様の適用を包含する。インフルエンザウイルスは、例として本明細書中で使用されるが、本方法は、任意の広範な他の呼吸器ウイルスに適用され得ることもまた、認識される。
【０２１１】
本発明の組成物は、単一のインフルエンザ転写物中の単一の部位にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質の単一の種を含み得るが、または１つ以上のインフルエンザ転写物中の１つ以上の部位にターゲティングされる複数の異なる種を含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、異なるインフルエンザ遺伝子にターゲティングされる複数のＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、複数の異なるｓｉＲＮＡ）のコレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を含む組成物を利用することが、望ましい。例えば、異なるウイルス転写物に対する種々のｓｉＲＮＡを使用してウイルスの生活環における複数の時点にてウイルスを攻撃することが、望ましい。本発明の特定の実施形態に従って、上記組成物は、各セグメントにターゲティングされるｓｉＲＮＡｉを含む。
【０２１２】
特定の実施形態において、上記組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なるＲＮＡｉ誘導性物質種（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種の異なるｓｉＲＮＡ）を含む。本発明の特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、配列番号２７２〜３８０からなる群より選択される配列を有するインフルエンザウイルスゲノムの部分にターゲティングされる。本発明の特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、配列番号２７２〜３８０の任意の選択されたサブセットからなる群より選択される配列を有するインフルエンザウイルスゲノムのターゲティング部分である。全てのこのようなサブセットは、明確に示されない場合でさえ、任意の目的および全ての目的のために本明細書中に含まれる。
【０２１３】
本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、ＰＡにターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質および別のインフルエンザウイルス遺伝子（例えば、ＮＰ、ＰＢ１、またはＰＢ２）にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、ＰＢ１にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質および別のインフルエンザウイルス遺伝子（例えば、ＮＰ、ＰＡ、またはＰＢ２）にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、ＰＢ２にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質および別のインフルエンザウイルス遺伝子（例えば、ＮＰ、ＰＢ１、またはＰＡ）にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明の特定の実施形態において、上記組成物は、ＮＰにターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ物質および別のインフルエンザウイルス遺伝子（例えば、ＰＡ、ＰＢ１、またはＰＢ２）にターゲティングされる少なくとも１つのＲＮＡｉ誘導性物質を含む。
【０２１４】
本発明の特定の実施形態、本発明のｓｉＲＮＡ組成物は、単一の転写物にターゲティングされる１つより多いｓｉＲＮＡ種を含み得る。一例を挙げると、標的転写物のコーディング領域にターゲティングされる少なくとも１つのｓｉＲＮＡおよび３’ＵＴＲにターゲティングされる少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含むことが、所望され得る。このストラテジーは、関連する転写物によってコードされる産物は産生されない正確な保証を提供し得る。なぜならば、上記組成物中の少なくとも１つのｓｉＲＮＡが、分解のために転写物をターゲティングする一方で、少なくとも１つの他のｓｉＲＮＡが、分解を回避する任意の転写物の翻訳を阻害するからである。
【０２１５】
したがって、本発明は、本発明のＲＮＡｉ誘導性実体の組み合わせを包含し、それとしては、複数のＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、複数のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）が投与されるアプローチ、および単一のベクターが、複数のインフルエンザウイルス転写物を阻害するｓｉＲＮＡまたは複数種のｓｉＲＮＡをもたらすようにプロセシングされる得るＲＮＡの合成を指揮するアプローチが挙げられるが、これに限定されない。さらなる詳細については、実施例１１を参照のこと。本発明の特定の実施形態に従って、上記組成物は、少なくとも１つのインフルエンザウイルスＡ転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質および少なくとも１つのインフルエンザウイルスＢ転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を含む。特定の実施形態において、上記組成物は、インフルエンザＡウイルス転写物およびインフルエンザＢウイルス転写物の両方にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を含む。本発明の特定の実施形態に従って、上記組成物は、特定のセグメントの同じ部分をターゲティングする異なる配列を有する複数のｓｉＲＮＡを含む。本発明の特定の実施形態に従って、上記組成物は、異なるインフルエンザウイルス株またはインフルエンザウイルスサブタイプを阻害する複数のＲＮＡｉ誘導性物質を含む。
【０２１６】
インフルエンザウイルスは、抗原不連続変異および抗原ドリフトの両方を受け、そして治療用抗体に対する抵抗性が、生じ得る。本発明の組成物がいくつかの時間に対して使用された後に、変異および／または再集合が、生じ得、その結果、提供された特定のＲＮＡｉ誘導性物質によって阻害されない変異型が出現し得ることが、予想され得る。したがって、本発明は、治療レジメンを進化させることを企図する。例えば、１つ以上の新規ＲＮＡｉ誘導性物質は、特定の変異または再集合に応じて特定の場合に選択され得る。例えば、変異が発生したものをなんでも組み込むことまたは新規に獲得されたＲＮＡセグメントをターゲティングすることを除いて最初のものと同一である新規のＲＮＡｉ誘導性物質を設計することが、しばしば、可能である；他の場合において、同じ転写物内で新規の配列をターゲティングすることが、望ましい；なお他の場合において、完全に新規の転写物をターゲティングすることが、所望される。
【０２１７】
感染の１つ以上の症状または特徴を阻害するか、減少させるか、または予防するために、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質の投与を１つ以上の他の抗ウイルス剤と組み合わせることが、しばしば、所望される。本発明の特定の好ましい実施形態において、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質は、１つ以上の他の抗ウイルス剤（例えば、ＮＡインヒビター、Ｍインヒビターなど）と組み合わされる。例としては、アマンダジンもしくはリマンタジンおよび／またはザミナビル、オセルタミビル、ペラミビル（ｐｅｒａｍｉｖｉｒ）（ＢＣＸ−１８１２、ＲＷＪ−２７０２０１）、Ｒｏ６４−０７９６（ＧＳ  ４１０４）もしくはＲＷＪ−２７０２０１が挙げられる。しかし、本発明のＲＮＡｉ誘導性物質組成物の投与はまた、任意の種々の薬剤の１つ以上と組み合され得、その薬剤としては、例えば、多くが公知であるインフルエンザワクチン（例えば、インフルエンザウイルスを使用する従来のワクチンまたはウイルス抗原およびＤＮＡワクチン）が挙げられる。さらなる情報については、Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．およびＧａｒｃｆａ−Ｓａｓｔｒｅ、２００２；ＣｈｅｕｎｇおよびＬｉｅｂｅｒｍａｎ、２００２、Ｌｅｕｓｃｈｅｒ−Ｍａｔｔｌｉ、２０００；ならびにＳｔｉｖｅｒ、２００３を参照のこと。
【０２１８】
本発明の異なる実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、他の薬剤と同じ混合物中に存在するか、または個体にたいする処置レジメンは、必ずしも同じ混合物または同時に送達されない、ＲＮＡｉ誘導性物質および他の薬剤の両方を含む、したがって、本明細書中で使用される場合、用語「組み合わせ」は、化合物が、物質の単一の組成物（例えば、同じ投薬単位の一部として（例えば、同じエアロゾル処方物、粒子組成物、錠剤、カプセル、丸剤、溶液などにおいて）（それらは可能性がある））で存在するか、または物質の単一の組成として被験体に投与されなければならないことを示すことを意図しない。代わりに、本発明の特定の実施形態において、上記ＲＮＡｉ誘導性物質は、個別であるが同時に投与される。本明細書中で使用される場合、２種以上の化合物の用語「共投与」または「同時投与」は、それらの化合物が厳密に同時に投与されるべきであることを示すことを意図しない。一般に、化合物は、それらが僅少な量未満で同時に身体内に存在する場合、共投与または同時に投与される。したがって、上記化合物は、単一の組成物の一部として一緒に投与され得るが、そうである必要はない。さらに、上記化合物は、同時（例えば、５分未満、または１分未満）か、または互いに短い時間内（例えば、１時間未満、３０分未満、１０分未満、約５分の間隔を空けて）で投与され得るが、そうである必要はない。本発明の種々の実施形態にしたがって、このような時間間隔内で投与される化合物は、実質的に同時に投与されるとみなされ得る。当業者は、上記化合物の投与の間の適切な時間間隔を容易に決定し得、その結果、それらの化合物が、各々、身体内で僅少より大きいレベル、好ましくは、身体内で有効な濃度にて存在する。
【０２１９】
本発明のＲＮＡｉ誘導性物質およびＲＮＡｉ誘導性ベクターは、ワクチン接種に対する補完的ストラテジーを提供し、任意の現在利用可能かまたは開発中である種々のワクチン（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．およびＧａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ａ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１０（１）：９−１３、２００２）を用いてワクチン接種されたかまたはワクチン接種されていない個体に投与され得る。米国における現在のワクチン処方物は、不活化ウイルスを含み、そして筋肉内注射によって投与されるなければならない。上記ワクチンは、三つ組であり、そしてインフルエンザＢ型に加えて、現在流行しているインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１）の両方のサブタイプ由来の代表的な株を含む。それぞれの季節に特異的な推奨は、その季節のワクチンにおいて使用するための特定の株を同定する。他のワクチンアプローチとしては、以下が挙げられる：鼻腔用スプレーによって投与され得る低温に適応した生インフルエンザウイルス；ウイルスゲノムにおいて欠失または他の変異を含む遺伝的に操作された生インフルエンザウイルスワクチン；複製欠損インフルエンザウイルス、およびＤＮＡワクチン、ここで１種以上のウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡが筋肉内かまたは局所のいずれかで投与される（例えば、Ｍａｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２（２）：１４９１−６、１９９８；Ｉｌｌｉｕｍ，Ｌ．ら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、５１（ｌ−３）：８１−９６、２００１；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０：Ｓ７４−Ｓ７６、２００２を参照のこと）。免疫無防備状態の患者および高齢の個体は、ＲＮＡｉベースの治療薬から特定の利益を獲得し得る。なぜならば、それらは、インフルエンザウイルス  ワクチンの効力の減少を経験し得る。
【０２２０】
本発明のいくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスに感染した細胞、または少なくともインフルエンザウイルス感染に感受性の細胞（例えば、シアル酸含有レセプターを発現する細胞）に対する本発明の組成物の投与をターゲティングすることが、望まれ得る。他の実施形態において、最も広い幅の送達選択肢を利用可能であることが、望ましい。
【０２２１】
上に記載される通り、本発明の治療プロトコルは、ＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの有効量を、インフルエンザウイルスに対する曝露の前、その曝露と同時、またはその曝露の後に投与することを含む。例えば、感染していない個体は、インフルエンザに対する曝露前に本発明の組成物によって「免疫化される」；危険性のある患者（例えば、高齢者、免疫無防備状態の個体、インフルエンザウイルスに感染したことが疑われるか、インフルエンザウイルスに感染した可能性があるか、またはインフルエンザウイルスに感染したことが知られる者と最近接触した者など）は、実質的に曝露と同時（例えば、曝露後２時間以内）に処置され得る。他の実施形態において、被験体は、より遅い時間（例えば、疑われるか、または知られた曝露の後２〜１２時間、１２〜２４時間、２４〜３６時間、または３６〜４８時間）にて処置される。上記被験体は、症候性であっても無症候性であってもよい。特定の実施形態において、上記被験体は、曝露前の４８時間、２４時間、１２時間、３時間などまでのＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターの投与によって保護される。当然に、感染が疑われるか、または感染が知られる個体は、任意の時間において本発明の処置を受容し得る。
【０２２２】
特定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターは、複製のレベルが、そのインヒビターを含まないコントロール細胞よりもそのインヒビターを含む細胞において、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約８倍、１６倍、６４倍、１００倍、２００倍、またはより大きい程度で低いように、ウイルス複製を阻害する。特定の好ましいインフルエンザウイルスインヒビターは、ＲＮＡｉ誘導性物質の投与および／または感染の後に少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または約６０時間にわたって、ウイルス複製を妨害する（例えば、検出不可能なレベルまで減少させる）か、または顕著に減少させる（例えば、上記ＲＮＡｉ誘導性物質の非存在下において生じるレベルと比較して１０％以下、２５％以下、５０％以下、７５％以下）。
【０２２３】
本発明の特定の実施形態において、持続放出調製物は、予防目的のために使用される（例えば、インフルエンザウイルス感染から被験体を保護するか、このような感染の症状を一定期間にわたって和らげるために十分量の活性因子を放出する処方物）。例えば、上記調製物は、数日間、１週間、１〜２週間以上の期間にわたって有効量の因子を放出し得る。ＲＮＡｉ誘導性物質またはＲＮＡｉ誘導性ベクターを含む生分解性ポリマー送達システムが、使用され得る。
【０２２４】
したがって、本発明のＲＮＡｉ誘導性実体は、以下の少なくとも３つの異なる状況において治療的に有用である：（ｉ）ＲＮＡｉ誘導性実体は、インフルエンザウイルスに曝露されたと疑われていないか、またはそれが知られていない被験体に投与され得る。このような状況において、上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、好ましくは、臨床的に顕著な感染の発症を妨害するか、またはその重篤度を減らす；（ｉｉ）ＲＮＡｉ誘導性実体は、例えば、１週間までの先行する時間間隔内にインフルエンザウイルスに曝露されたと疑われるか、またはそれが知られる被験体に投与され得る。上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、好ましくは、臨床的に顕著な感染の発症を妨害するか、またはその重篤度を減らし；（ｉｉｉ）ＲＮＡｉ誘導性実体は、臨床的に病気になっている被験体に投与され得る。上記ＲＮＡｉ誘導性実体は、インフルエンザウイルス複製を阻害し、そして好ましくは、インフルエンザウイルス感染の重篤度および／または少なくとも１つの症状の持続期間を減らす。上気道、下気道、またはその両方の感染を有する被験体が、処置され得る。本発明の特定の実施形態において、上記被験体は、インフルエンザウイルス感染の結果としてウイルス性肺炎を有する。
【０２２５】
本発明の特定の実施形態において、遺伝子治療は、インフルエンザを予防するためか、または既に病気である個体を処置するために使用される。遺伝子治療プロトコルは、阻害性ＲＮＡｉ誘導性物質の発現を指揮し得る遺伝子治療ベクターの有効量を、インフルエンザウイルス感染の前、その感染と実質的に同時、またはその感染の後に、被験体に投与することを含み得る。
【０２２６】
上記のように、インフルエンザウイルスは、ヒトに加えて、広範な種々の種に感染する。本発明は、非ヒト種、特にニワトリ、ブタ、およびウマなどの種の処置のための本発明の組成物の使用を含む。
【０２２７】
（ＩＸ．薬学的処方物）
上で考察されるように、上記ＲＮＡｉ誘導性実体の吸入送達が、本発明の特定の実施形態において好ましい一方で、静脈内送達は、本発明の他の実施形態において好ましい。吸入送達が、比較的良好に健康である患者に対してより適切であり得る一方で、静脈内送達は、十分な吸息の試みを始められず、そして／もしくは呼吸経路による有効な送達を妨げ得る病態（例えば、過剰な粘液産生；肺の部分が、細菌感染に起因して硬化するか、または瘢痕組織などによって閉塞される状況）に罹患する個体、またはＲＮＡｉ誘導性物質の比較的一定の濃度を維持することが、必要とされる個体に対してより適切であり得る。
【０２２８】
しかし、本発明の組成物を、任意の利用可能な経路（非経口（例えば、静脈内）経路、皮内経路、皮下経路、経口経路、鼻腔内経路、気管支経路、眼内経路、経皮（局所）経路、経粘膜経路、直腸経路、および膣内経路が含まれるが、これらに限定されない）による送達のために処方することができる。好ましい送達経路には、非経口、経粘膜、鼻腔内、気管支、および経口が含まれる。本発明の薬学的組成物は、代表的には、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせたＲＮＡｉ誘導性物質または送達後にｓｉＲＮＡを産生するベクターなどを含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに等張化剤および吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物を、組成物に組み込むことがもできる。
【０２２９】
薬学的組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。非経口（例えば、静脈内）適用、筋肉内適用、皮内適用、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストランなどの張度を調整するための因子。塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基でｐＨを調整することができる。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）によって調整され得る。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル中に封入することができる。
【０２３０】
注射可能物に使用するために適切な薬学的組成物は、代表的には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与については、適切なキャリアには、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合、組成物は滅菌されているべきであり、容易な注入可能性が存在する範囲の流動物であるべきである。好ましい薬学的処方物は、製造および保存条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。一般に、関連するキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。種々の抗菌薬および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなど）によって微生物作用を防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウム））を含めることが好ましい。組成物に吸収を遅延させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることにより、注射用組成物を長期吸収させることができる。
【０２３１】
上で列挙した成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、必要な場合、その後濾過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。好ましくは、注射用溶液は、内毒素を含まない。一般に、基本分散媒および上記由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルの中に活性化合物を組み込むことよって分散液を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分およびその予め濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２３２】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態で使用することができる。うがい薬として使用するための流動物キャリアを使用して、経口組成物を調製することもできる。組成物の一部として薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料を含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の任意の成分または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；あるいはペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジフレーバーなどの嬌味嬌臭薬。経口送達用の処方物は、胃腸管内の安定性を改善し、そして／または吸収を強化するための薬剤を有利に組み込むことができる。
【０２３３】
本発明のＲＮＡｉ誘導性実体の任意の全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過すべき障壁に適切な浸透剤を処方物で使用する。このような浸透剤は、一般に、当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。鼻腔用スプレー、または坐剤の使用によって経粘膜投与を行うことができる。経皮投与のために、活性化合物を、当該分野で一般に公知の軟膏、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームの中に処方する。直腸送達のために、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤）または残留浣腸剤の形態で化合物を調製することもできる。
【０２３４】
上記の送達因子に加えて、本発明の一定の実施形態では、徐放性の処方物（移植片およびマイクロカプセル化送達系が含まれる）などの体内からの急速な排除から化合物を保護するキャリアを使用して、活性実体を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。時間、日、週またはそれより長い期間にわたってでさえ活性剤を放出し得る持続放出性の処方物は、予防目的のために特に有用であり得る。そのような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかである。材料を、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  および  Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を使用して感染細胞にターゲティングされるリポソームが含まれる）を、薬学的に受容可能なキャリアとして使用することもできる。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法にしたがって、これらを調製することができる。
【０２３５】
投与の容易さおよび投薬量の均一性の点から、投薬単位形態で経口組成物または非経口組成物を処方することが有利である。本明細書中で使用される投薬単位形態とは、処置すべき被験体のための単位投薬量として適切な物理的に個別の単位（各単位は、必要な薬学的キャリアとともに、所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含む）をいう。
【０２３６】
例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって、このような化合物の毒性および治療有効性を判定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小にし、それにより副作用を軽減するために、罹患組織部位へとこのような化合物をターゲティングする送達系を設計するように注意すべきである。
【０２３７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための一定の投薬範囲の処方で使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む体循環濃度範囲内である。投薬量は、使用される投与形態および使用される投与経路に依存してこの範囲内で変化することができる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、細胞培養アッセイからの治療有効量を最初に評価することができる。細胞培養物において判定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に判定することができる。例えば、高速液体クロマトグラフィーによって血漿レベルを測定することができる。
【０２３８】
薬学的組成物の治療有効量は、代表的には、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ体重、または５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。薬学的組成物を、必要に応じて種々の間隔および異なる期間（例えば、１日に複数回、毎日、隔日、約１週間〜１０週間の間、２週間〜８週間の間、３週間〜７週間の間（約４、５、または６週間など）に１回）投与することができる。当業者は、一定の因子（疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、被験体の身体全体の健康および／または年齢ならびに存在する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない）が被験体を有効に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を与えることができると認識する。一般に、本明細書中に記載のＲＮＡｉ誘導性実体での被験体の処置は、１回の治療を含み得るか、多数の場合、一連の処置を含み得る。
【０２３９】
例示的な用量としては、被験体またはサンプル重量の１ｋｇあたり本発明の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）のミリグラム量またはマイクログラム量（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）が挙げられる。局所投与（例えば、鼻腔内）では、これらよりもはるかに少ない用量を使用することができる。
【０２４０】
ＲＮＡｉ誘導性物質の適切な用量はＲＮＡｉ誘導性物質の効力に依存し、（例えば、予め選択した所望の応答を達成するまでの漸増用量の投与によって）必要に応じて特定のレシピエントに合わせることができることがさらに理解される。任意の特定の動物被験体のための特定の用量レベルは、種々の要因（使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、身体全体の健康、性別、および食事、投与期間、投与経路、排泄率、任意の薬物の組み合わせ、ならびに調節すべき発現または活性の程度が挙げられる）に依存し得ると理解される。
【０２４１】
本発明は、非ヒト動物（ウマ、ブタ、およびトリが含まれるが、これらに限定されない）の処置のための本発明の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ含有組成物）の使用を含む。したがって、獣医学に関する薬理学および医学の公知の原理にしたがって、投与量および投与方法を選択することができる。指針を、例えば、Ａｄａｍｓ，Ｒ．（ｅｄ．），Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８１３８１７４３９；２００１に見出すことができる。
【０２４２】
本発明の薬学的組成物を、投与についての説明書と共に、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【実施例】
【０２４３】
（実施例１：インフルエンザＡウイルスを阻害するためのｓｉＲＮＡの設計）
インフルエンザウイルス株組由来のゲノム配列を＋センス形態において比較し、最も保存された各セグメントの領域を同定した。このウイルス群は、トリ、ブタ、ウマ、およびヒト由来のウイルスを含んでいた。比較するために、異なる年に単離した異なる動物（非ヒト）種由来のインフルエンザＡウイルスの１２〜１５株由来の個々のセグメントの配列と異なる年において単離したヒト由来のインフルエンザＡウイルスの１２〜１５株由来の個々のセグメントとを整列させた。広範な種々のＨＡおよびＮＡサブタイプを含むように株を選択した。異なる株の間で０、１、または２個のいずれかのヌクレオチドが異なる領域を選択した。例えば、ＮＰ転写物をターゲティングするｓｉＲＮＡの選択のために以下の株を使用し、各株の名前の前のアクセッション番号はＮＰ配列のアクセッション番号をいい、比較した配列の長さをヌクレオチド数によって示す。
【０２４４】
以下のリスト中のエントリーの順番は、アクセッション番号、株名、比較した配列の長さ、年数、サブタイプである。他のゲノムセグメントのアクセッション番号は異なるが、上記データベースで容易に見出すことができる。以下の株を比較した。
【０２４５】
【表１】
2008533990.tif 000003
図９は、６つのインフルエンザＡ変異型（その全てがヒト宿主起源）の間で高度に保存されている一定のＰＡ転写物領域の選択の例を示し、これらの領域が０、１、または２個のいずれかのヌクレオチドによって異なる場合に、これらの領域は高度に保存されているものと見なされる。（配列をＲＮＡではなくてＤＮＡとして列挙しているため、ＵではなくてＴを含むことに留意のこと）。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株の配列を、基本配列（すなわち、他の配列と比較した配列）として選択した。他の組のメンバーは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／６８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８１／９７（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）であった。図は、コンピュータプログラムＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．４）によって作成された複数の配列アラインメントを示す。基本配列と異なるヌクレオチドに影をつけている。
【０２４６】
図１０は、５つのインフルエンザＡ変異型（その全てが異なる動物宿主起源）の間およびヒト宿主起源の２つの株の間でも高度に保存されている一定のＰＡ転写領域の選択の例を示し、これらの領域が０、１、または２個のいずれかのヌクレオチドにより異なる場合に、これらの領域は高度に保存されているものと見なされる。（配列をＲＮＡではなくてＤＮＡとして列挙しているため、ＵではなくてＴを含むことに留意のこと）。Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株の配列を、基本配列（すなわち、他の配列と比較した配列）として選択した。他の組のメンバーは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／ＦＰＶ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４（Ｈ７Ｎ１）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／１８９／６６（Ｈ９Ｍ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｌｏｎｄｏｎ／１４１６／７３（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／９／９８（Ｈ９Ｎ２）であった。基本配列と異なるヌクレオチドに影をつけている。
【０２４７】
図９および１０中の配列比較では、配列の大部分が高度に保存されたという基準を満たすため、多数の異なる高度に保存された領域を選択することができることに留意のこと。しかし、５’末端にＡＡを有する配列により、相補（アンチセンス）ｓｉＲＮＡ鎖中に１９ヌクレオチドのコア配列および２ヌクレオチドの３’ＵＵ突出部が得られる。したがって、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖中に存在する相補ヌクレオチドがＵＵであるように、その５’末端にＡＡを有する２１ヌクレオチド部分を同定するために高度に保存された領域をスキャニングした。例えば、それぞれ影をつけた配列はその５’末端にＡＡを有する。表２に示すように、得られたｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖中のＵＵ３’突出部をＴＴまたはｄＴｄＴに置換することができることに留意のこと。しかし、アンチセンス鎖の２ｎｔの３’突出部はＵＵである必要はない。
【０２４８】
方法のさらなる例示のために、図１２は、ヒト宿主または動物宿主のいずれかを起源とする１２種のインフルエンザＡウイルスサブタイプまたは単離物の間のＮＰ配列の３’領域部分の間の配列比較を示す。下線を引いた配列および下線を引いた配列の下の対応する配列部分を使用して、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６を設計した（以下を参照のこと）。これらの配列を図１２に示す。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【０２４９】
表１Ａは、ウイルス遺伝子セグメントの各々に対するインフルエンザウイルス配列組の間で高度に保存される２１ヌクレオチド領域を列挙する。表１Ａ中の配列は、ＴをＵの代わりに使用することを除いてウイルスｍＲＮＡに存在する配列に従って、５’から３’の方向で列挙される。数は、ウイルスゲノム中の配列の位置を示す。例えば、ＰＢ２−１１７／１３７は、セグメントＰＢ２中の１１７位から１３７位まで伸びる配列を示す。上記配列の多くは、相補鎖中の３’ＵＵ突出部を生じるために、それらが５’末端にＡＡを有するというさらなる判定基準を満たす。ＰＡセグメントについて、１個または２個のヌクレオチドの違いが存在した場合において、上記ｓｉＲＮＡの配列は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）株に基づいた配列ＰＡ−２０８７／２１０７  ＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡ（配列番号３０）を除いて、Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１）株に基づいた。２０位において、６種の配列のうちの５種が、Ｇを含む一方で、基本配列（アクセッション番号ＮＣ＿００２０１９）が、Ａを含むことに留意すること。したがって、この場合において、基本配列の配列を、ｓｉＲＮＡ設計に使用しなかった。用語ＰＡ−２０８７およびＰＡ−２０８７（Ｇ）を、本明細書中で交換可能に使用する。
【０２５０】
表１Ａに列挙した配列に基づいたｓｉＲＮＡを設計するために、ｓｉＲＮＡセンス鎖配列のコア領域としてヌクレオチド３〜２１を選択し、ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を得られた各配列に付加した。各配列のヌクレオチド１〜２１と相補的な配列を、対応するアンチセンス鎖として選択した。例えば、高度に保存された配列ＰＡ−４４／６４（すなわち、ＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号２２））に基づいてｓｉＲＮＡを設計するために、配列ＴＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧ（配列番号１０９）を有する１９ｎｔのコア領域を選択した。ｄＴｄＴからなる２ｎｔの３’突出部を付加し、（ＴのＵへの置換後に）ｓｉＲＮＡセンス鎖配列である配列５’−ＵＧＣＵＵＣＡＡＵＣＣＧＡＵＧＡＵＵＧｄＴｄＴ−３’（配列番号７９）を得た。対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖配列は、配列番号２２と相補的である（すなわち、ＣＡＡＵＣＡＵＣＧＧＡＵＵＧＡＡＧＣＡｄＴｄＴ（配列番号８０）（２ｎｔの３’突出部以外はＴがＵに置換されている））。
【０２５１】
表１Ｂは、インフルエンザウイルス転写物のさらなる高度に保存された領域に基づいて設計したｓｉＲＮＡを列挙する。表１Ｂで「センス鎖」として示した配列の最初の１９ｎｔ配列は、高度に保存された領域の配列である。インフルエンザウイルス配列に対応せず、ｓｉＲＮＡの選択的特徴である、３’末端にｄＴｄＴ突出部を有するセンス鎖ｓｉＲＮＡ配列を示す。選択的特徴として３’末端にｄＴｄＴ突出部も組み込まれた対応するアンチセンス鎖も示す。名称は、表１Ｂのとおりである。例えば、ＰＢ２−４／２２センスは、センス鎖がＰＢ２転写物のヌクレオチド４〜２２の配列を有するｓｉＲＮＡを示す。ＰＢ２−４／２２アンチセンスは、ＰＢ２−４／２２センスに対応する相補アンチセンス鎖を示す。スプライス部位にわたる転写物中の部位をターゲティングするｓｉＲＮＡについて、非スプライシング転写物内の位置を示す。例えば、Ｍ−４４−５２／７４１−７５０は、ゲノム配列の４４〜５２および７４１〜７５０に対応するヌクレオチドをスプライシングされたｍＲＮＡ中にターゲティングすることを示す。
【０２５２】
図９および１０の影をつけた領域は、高度に保存されるという基準を満たすいくつかの２１ヌクレオチド領域を示す。上記のこれらの配列に基づいて、ｓｉＲＮＡを設計した。試験した実際のｓｉＲＮＡ配列を、表２に列挙する。
【０２５３】
【表１−Ａ１】
2008533990.tif 000004
【０２５４】
【表１−Ａ２】
2008533990.tif 000005
【０２５５】
【表１−Ｂ１】
2008533990.tif 000006
【０２５６】
【表１−Ｂ２】
2008533990.tif 000007
【０２５７】
【表１−Ｂ３】
2008533990.tif 000008
（実施例２：ウイルスＲＮＡポリメラーゼまたは核タンパク質をターゲティングするｓｉＲＮＡはインフルエンザＡウイルス産生を阻害する）
（材料および方法）
細胞培養。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｌｅｓｅ，Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹからの好意的な贈呈）を、１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。エレクトロポレーションのために、細胞を、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。感染培地（ＤＭＥＭ、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中でウイルス感染を行った。
【０２５８】
ウイルス。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）およびＡ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ）（サブタイプＨ１Ｎ１、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｐａｌｅｓｅ，Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからの好意的な贈呈）を、１０日齢の胚含有ニワトリ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）中、３７℃で４８時間成長させた。ウイルス接種から４８時間後に尿膜腔液を回収し、−８０℃で保存した。同じウイルス株および方法を、本明細書中に記載した実施例全体を通して使用した。
【０２５９】
ｓｉＲＮＡ。ｓｉＲＮＡを上記のように設計した。実施例１に記載の選択基準に従うことに加えて、ｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ  ８００２６（ＲＮＡ試薬の販売業者）から、一般に利用可能な技術告示番号００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｂ，「ｓｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡｉ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」に記載の原理に従って設計した。Ｄｈａｒｍａｃｏｎの技術告示番号００３（ワールドワイドウェブ  ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００３Ｂ．ｈｔｍｌからアクセス可能）およびｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ／ｔｅｃｈ００４．ｈｔｍｌから利用可能な＃００４は、ｓｉＲＮＡ設計パラメーター、合成などに関連する種々の情報を含み、本明細書中で参考として援用される。試験したセンスおよびアンチセンス配列を表２に列記する。
【０２６０】
【表２】
2008533990.tif 000009
２’ＡＣＥ保護化学を使用して、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって全てのｓｉＲＮＡを合成した。製造者の説明書に従ってｓｉＲＮＡ鎖を脱保護し、等モル比で混合し、９５℃での加熱および３５℃までの３０秒毎に１℃ずつならびに５℃までの１分毎に１℃ずつの温度のゆっくりとした低下によってアニーリングした。
【０２６１】
ｓｉＲＮＡエレクトロポレーション。ＭＤＣＫ細胞の対数期培養物をトリプシン処理し、洗浄し、無血清ＲＰＭＩ１６４０中に２×１０７細胞／ｍｌにて再懸濁した。０．５ｍｌの細胞を０．４ｃｍキュベットに入れ、２．５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを含むＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して４００Ｖ、９７５μＦでエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション効率は、約３０〜４０％の生存細胞であった。エレクトロポレーションを行った細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で６ウェルプレートを３ウェルに分割し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０２６２】
ウイルス感染。エレクトロポレーションから６〜８時間後、血清含有培地を洗浄し、適切な感染多重度の１００μｌのＰＲ８またはＷＳＮウイルスを、それぞれ約１０６細胞を含むウェルに接種した。細胞を、１，０００ＰＦＵ（１，０００個の細胞あたり１個のウイルス；ＭＯＩ＝０．００１）または１０，０００ＰＦＵ（１００個の細胞あたり１個のウイルス；ＭＯＩ＝０．０１）のウイルスのいずれかに感染させた。室温で１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む２ｍｌの感染培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。示した時間においては、感染培養物から上清を回収し、ウイルス力価をニワトリ赤血球の血球凝集素（５０μｌ、０．５％、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）によって判定した。
【０２６３】
ウイルス力価の測定。感染から２４、３６、４８、および６０時間後に上清を回収した。Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ，ＰＭ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ３４−３５に記載の標準的な血球凝集素アッセイを使用して、ウイルス力価を測定した。Ｖ底９６ウェルプレートで血球凝集素アッセイを行った。各サンプルの連続２倍希釈物を、同体積のニワトリ赤血球（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の０．５％懸濁液とともに氷上で１時間インキュベートした。接着性の均一な赤血球層を含むウェルを正として記録した。プラークアッセイのために、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３２（本明細書中で参考として援用される）に記載され、且つ当該分野で周知の各サンプルの連続１０倍希釈物のウイルス力価を測定した。
【０２６４】
（結果）
インフルエンザウイルス複製を抑制するためのｓｉＲＮＡ使用の可能性を調査するために、種々のインフルエンザウイルスＡのＲＮＡをターゲティングした。具体的には、容易に感染し、インフルエンザウイルスを研究するために広範に使用されているＭＤＣＫ細胞株を使用した。各ｓｉＲＮＡを、エレクトロポレーションによってそれぞれＭＤＣＫ細胞の集団に組み込んだ。ＧＦＰにターゲティングされたｓｉＲＮＡ（センス：５’−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＵＵ−３’（配列番号１１０）；アンチセンス：５’−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣＵＵ−３’（配列番号１１１））をコントロールとして使用した。このｓｉＲＮＡを、ＧＦＰ−９４９という。その後の実験（以下の実施例に記載）では、両鎖の３’末端のＵＵ突出部をｄＴｄＴと置換したが、結果として効果はなかった。コントロールとして偽エレクトロポレーションも行った。エレクトロポレーションから８時間後、細胞を０．１または０．０１のいずれかのＭＯＩにてインフルエンザＡウイルスＰＲ８またはＷＳＮのいずれかを感染させ、種々の測定点（２４、３６、４８、６０時間）で、標準的な血球凝集素アッセイを使用してウイルス産生について分析した。標準的な方法を使用したフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現をアッセイした。
【０２６５】
図１１Ａおよび１１Ｂは、個々のｓｉＲＮＡがインフルエンザウイルスＡ株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ａ）またはインフルエンザウイルスＡ株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ｂ）の複製を阻害する能力をＨＡ力価の測定によって判定した実験結果を比較している。したがって、高ＨＡ力価は阻害の欠如を示すが、低ＨＡ力価は有効な阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞を０．０１のＭＯＩで感染させた。これらの実験のために、ＰＢ１セグメント（ＰＢ１−２２５７／２２７７）をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ＰＢ２セグメント（ＰＢ２−２２４０／２２６０）をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ＰＡセグメント（ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ））をターゲティングする１つのｓｉＲＮＡ、ならびにＮＰゲノムおよび転写物をターゲティングする３つの異なるｓｉＲＮＡ（ＮＰ−２３１／２５１、ＮＰ−３９０／４１０、およびＮＰ−１４９６／１５１６）を試験した。図１１Ａおよび１１Ｂは、ｓｉＲＮＡの５’ヌクレオチドのみを列挙することに留意のこと。
【０２６６】
図１１Ａおよび１１Ｂ中の記号は、以下を示す：黒塗りの四角はｓｉＲＮＡを投与していないコントロール細胞を示す。白抜きの四角は、ＧＦＰコントロールｓｉＲＮＡを投与した細胞を示す。黒塗りの円は、ｓｉＲＮＡ  ＰＢ１−２２５７／２２７７を投与した細胞を示す。白抜きの円は、ｓｉＲＮＡ  ＰＢ２−２２４０／２２６０を投与した細胞を示す。白抜きの三角は、ｓｉＲＮＡ  ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ）を投与した細胞を示す。Ｘ記号は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−２３１／２５１を投与した細胞を示す。＋記号は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−３９０／４１０を投与した細胞を示す。黒塗りの三角は、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６／１５１６を投与した細胞を示す。グラフ中の一定の記号は重なっている場合があることに留意のこと。例えば、図１１Ｂでは、白抜きおよび黒塗りの三角が重なっている。各測定点で数値を列挙した表３および４を、明らかにするために参考にすることができる。
【０２６７】
図１１Ａおよび１１Ｂ（表３および４）に示すように、ｓｉＲＮＡの非存在下（偽ＴＦ）またはコントロール（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡの存在下で、ウイルス力価が長期間増加し、感染から約４８〜６０時間後にピークに達する。対照的に、６０時間後のウイルス力価は、任意のｓｉＲＮＡの存在下で有意に低かった。例えば、ＷＳＮ株では、ＨＡ力価（ウイルスレベルを反映する）は、ｓｉＲＮＡ  ＰＢ２−２２４０またはｓｉＲＮＡ  ＮＰ−２３１の存在下ではコントロールの約半分であった。特に、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６の存在下でのウイルスレベルは、両株で検出限界（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）未満であった。これは、ＰＲ８株での１／６０未満への減少およびＷＳＮ株での１／１２０未満への減少を示す。ウイルスレベルはまた、ＷＳＮ株においてｓｉＲＮＡ  ＰＡ−２０８７（Ｇ）の存在下で検出限界（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）未満であり、ＰＲ８株では極めて低い。ｓｉＲＮＡによるウイルス産生の抑制は、最も初期の測定点でさえも明らかであった。感染から７２時間後ほどの有効な抑制（検出不可能レベル（ＨＡ力価による測定）へのウイルス産生の抑制が含まれる）が測定点で認められた。
【０２６８】
表５は、阻害倍率に関して示したＭＤＣＫ細胞における６０時間のｓｉＲＮＡ阻害アッセイの結果をまとめている。したがって、低い値は阻害の欠如を示し、高い値は有効な阻害を示す。ウイルス遺伝子内のｓｉＲＮＡの位置を、遺伝子名の後に数字で示す。本明細書中の他のところのように、数字は、遺伝子中のｓｉＲＮＡの出発ヌクレオチドを示す。例えば、ＮＰ−１４９６は、ＮＰに特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＰ配列のヌクレオチド１４９６から出発する第１のヌクレオチド）を示す。示した値（阻害倍率）は、偽トランスフェクション由来の血球凝集素単位を、示したｓｉＲＮＡでのトランスフェクション由来の血球凝集素単位で割ることによって計算され、値１は阻害無しを意味する。
【０２６９】
インフルエンザウイルスゲノムの６つのセグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ）にターゲティングされた全部で２０個のｓｉＲＮＡを、ＭＤＣＫ細胞株系で試験した（表５）。約１５％の試験したｓｉＲＮＡ（ＰＢ１−２２５７、ＰＡ−２０８７Ｇ、およびＮＰ−１４９６）は、ＰＲ８ウイルスまたはＷＳＮウイルスのいずれを使用したかとは無関係に、ほとんどの場合ＭＯＩ＝０．００１で１／１００未満およびＭＯＩ＝０．０１で１／１６〜１／６４にウイルス産生を阻害する高い効果を示した。特に、ｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６またはＰＡ−２０８７を使用した場合、阻害は、培養上清が検出可能な血球凝集素活性をもたらさないことが非常に明白であった。これらの強力なｓｉＲＮＡが３つの異なるウイルス遺伝子セグメント（ＲＮＡ転写複合体に関与するＰＢ１およびＰＡならびに一本鎖ＲＮＡ結合核タンパク質であるＮＰ）をターゲティングする。他の系における所見と一致して、これらのｓｉＲＮＡによってターゲティングされた配列は全てコード領域の３’末端に比較的隣接させて配置させる（図１３）。
【０２７０】
約４０％のｓｉＲＮＡはウイルス産生を有意に阻害するが、阻害範囲は一定のパラメーターに依存して変化した。ＰＲ８またはＷＳＮウイルスのいずれを使用したかとは無関係に、約１５％のｓｉＲＮＡがウイルス産生を強力に阻害した。しかし、一定のｓｉＲＮＡの場合、阻害の程度はＰＲ８またはＷＳＮのいずれを使用するかに依存していくらか変化した。いくつかのｓｉＲＮＡは初期の測定点（感染から２４〜３６時間後）でのみまたはより低い感染量（ＭＯＩ＝０．００１）でのみ、ウイルス産生を阻害した（例えばＰＢ２−２２４０、ＰＢ１−１２９、ＮＰ−２３１、およびＭ３７など）。これらのｓｉＲＮＡは、異なるウイルス遺伝子セグメントをターゲティングし、対応する配列を、コード領域の３’末端または５’末端のいずれかに近接して位置付ける（図１３）。表５Ａおよび５Ｂは、そのアッセイの結果を提示する。約４５％のｓｉＲＮＡはウイルス力価に対する効果は認識できず、これらがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の干渉で有効でないことを示した。特に、ＮＳ遺伝子セグメントをターゲティングする４つのｓｉＲＮＡにおいて阻害効果を示したものはなかった。
【０２７１】
ウイルス力価をより正確に評価するために、偽トランスフェクションまたはＮＰ−１４９６でのトランスフェクションを行ったウイルス感染細胞から得た培養物上清由来の培養物上清を使用したプラークアッセイを行った（６０時間目）。偽上清において約６×１０５ｐｆｕ／ｍｌが検出されたのに対し、非希釈ＮＰ−１４９６上清においてはプラークは検出されなかった（図１１Ｃ）。プラークアッセイの検出限界が約２０ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌであるため、ＮＰ−１４９６によるウイルス産生を少なくとも約１／３０，０００に阻害する。０．１のＭＯＩでさえ、ＮＰ−１４９６はウイルス産生を約１／２００に阻害した。
【０２７２】
ｓｉＲＮＡの有効性を判定するために、段階的な量のＮＰ−１４９６を、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトし、その後ＰＲ８ウイルスを感染させた。血球凝集素アッセイによって培養上清のウイルス力価を測定した。図１１Ｄに示すように、ｓｉＲＮＡ量が減少するにつれて、培養物上清のウイルス力価が増加した。しかし、トランスフェクションのために２５ｐｍｏｌほどのｓｉＲＮＡしか使用しない場合でさえ、偽トランスフェクションと比較してウイルス産生を約１／４に阻害することが認められ、このことは、インフルエンザウイルス産生阻害におけるＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡの有効性を示す。
【０２７３】
治療に関して、ｓｉＲＮＡが既存のウイルス感染を有効に阻害することができることが望ましい。代表的なインフルエンザウイルス感染では、感染の約４時間後から新規のビリオンが放出され始める。ｓｉＲＮＡが既存の感染に反して新規に放出されたウイルスによって感染を減少または消失させることができるかを判定するために、ＭＤＣＫ細胞にＰＲ８ウイルスを２時間感染させ、その後、ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。図１１Ｅに示すように、偽トランスフェクション後長期間安定にウイルス力価が増大するのに対し、ＮＰ−１４９６トランスフェクト細胞では僅かに増加しただけであった。したがって、ウイルス感染後のｓｉＲＮＡの投与が有効である。
【０２７４】
まとめると、これらの結果は、（ｉ）一定のｓｉＲＮＡはインフルエンザウイルス産生を強力に阻害することができること、（ｉｉ）インフルエンザウイルス産生を、異なるウイルス遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ（ＮＰ、ＰＡ、およびＰＢ１タンパク質をコードするものが含まれる）によって阻害することができること、および（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡの投与と同時または投与後に感染させた細胞に加えて、以前に感染した細胞でｓｉＲＮＡ阻害が起こることを示す。
【０２７５】
【表３】
2008533990.tif 000010
【０２７６】
【表４】
2008533990.tif 000011
【０２７７】
【表５−Ａ】
2008533990.tif 000012
【０２７８】
【表５−Ｂ１】
2008533990.tif 000013
【０２７９】
【表５−Ｂ２】
2008533990.tif 000014
（実施例３：ウイルスＲＮＡポリメラーゼまたは核タンパク質をターゲティングするｓｉＲＮＡはニワトリ胚におけるインフルエンザＡウイルス産生を阻害する）
（材料および方法）
ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体の形成およびニワトリ胚接種。ｓｉＲＮＡを上記のように調製した。ニワトリの卵を標準的な条件下で保持した。３０μｌのオリゴフェクタミン（製品番号：１２２５２０１１。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｎｏｗ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を、３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。２．５ｎｍｏｌ（１０μｌ）のｓｉＲＮＡを３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉと混合し、希釈したオリゴフェクタミンに添加した。ｓｉＲＮＡおよびオリゴフェクタミンを、室温で３０分間インキュベートした。１０日齢のニワトリ卵に、１００μｌのＰＲ８ウイルス（５０００ｐｆｕ／ｍｌ）と共にｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体を接種した。卵を、３７℃で指示された時間インキュベートし、尿膜腔液を採取した。尿膜腔液におけるウイルス力価を、上記のＨＡアッセイによって試験した。
【０２８０】
（結果）
ＭＤＣＫ細胞が得られたか否かを確認するために、ｓｉＲＮＡがニワトリ受精卵中のインフルエンザウイルス産生を阻害する能力もアッセイした。卵にはエレクトロポレーションを使用することができないため、オリゴフェクタミン（ＤＮＡオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込みを容易にすることが示されている脂質ベースの薬剤）およびインビトロでｓｉＲＮＡを使用した（２５）。簡単に述べれば、図１４Ａに図示するように、ＰＲ８ウイルスのみ（５００ｐｆｕ）またはウイルス＋ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体を、１０日齢のニワトリ卵の尿膜腔に注射した。血球凝集素アッセイによるウイルス力価の測定のために、１７時間後に尿膜腔液を採取した。図１４Ｂに示すように、ウイルスを単独で注射した場合（オリゴフェクタミンの存在下）、高ウイルス力価が容易に検出された。ＧＦＰ−９４９の同時注射では、有意にはウイルス力価に影響を与えなかった（オリゴフェクタミンを省略した場合、ウイルス力価の有意な減少は認められなかった）。
【０２８１】
インフルエンザウイルスに特異的なｓｉＲＮＡの注射により、ＭＤＣＫ細胞で認められた結果と一致する結果が示された。ＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルス産生を阻害した同一のｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６、ＰＡ２０８７、およびＰＢ１−２２５７）もニワトリ卵におけるウイルス産生を阻害するのに対して、ＭＤＣＫ細胞では有効性の低いｓｉＲＮＡ（ＮＰ−２３１、Ｍ−３７、およびＰＢ１−１２９）は、ニワトリ受精卵で無効であった。したがって、ｓｉＲＮＡはまた、ニワトリ受精卵におけるインフルエンザウイルス産生の干渉に有効である。
【０２８２】
（実施例４：ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡレベルでインフルエンザウイルス産生を阻害する）
（材料および方法）
ｓｉＲＮＡ調製物を上記のように調製した。
【０２８３】
ＲＮＡの抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲ。１×１０７個のＭＤＣＫ細胞に対して、２．５ｎｍｏｌのＮＰ−１４９６を用いてエレクトロポレーションを行うか、偽エレクトロポレーション（ｓｉＲＮＡなし）を行った。８時間後、ＭＯＩ＝０．１のインフルエンザＡ  ＰＲ８ウイルスを細胞に接種した。感染から１、２、および３時間後の、上清を除去し、細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）で溶解した。製造者の説明書に従って、ＲＮＡを精製した。製造者の説明書に従って、２００ｎｇの総ＲＮＡ、特異的プライマー（以下を参照のこと）、およびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ）を含む２０μｌの反応混合物を使用して、３７℃で１時間逆転写（ＲＴ）を行った。ｍＲＮＡ、ＮＰｖＲＮＡ、ＮＰｃＲＮＡ、ＮＳｖＲＮＡ、またはＮＳｃＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを以下に示す。
【０２８４】
【化１】
2008533990.tif 000015
１μｌのＲＴ反応混合物（すなわち、逆転写の実施によって得られるサンプル）および配列特異的プライマーを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ二本鎖ＤＮＡ結合色素を含むＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したリアルタイムＰＣＲのために使用した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム（ＡＢ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲサイクルを実施し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  ＳＤＳソフトウェア（ＡＢ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。５０℃で２分間、９５℃で１０分間、その後９５℃で１５秒間および６０℃で１分間を５０サイクルでＰＣＲ反応を行った。０．２蛍光単位の読み取りでサイクル時間を分析した。全ての反応を二連で行った。二連の間で１．０を超えて変化するサイクル時間を捨てた。次いで二連のサイクル時間を平均し、正規化された値のために、これらからβ−アクチンのサイクル時間を引いた。
【０２８５】
ＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
【０２８６】
【化２】
2008533990.tif 000016
（結果）
上記のように、インフルエンザウイルスの複製時、ｖＲＮＡが転写されてｃＲＮＡ（より多くのｖＲＮＡ合成のためのテンプレートとして作用する）およびｍＲＮＡ（タンパク質合成のためのテンプレートとして作用する）を産生する（１）。ＲＮＡｉは配列特異的様式でｍＲＮＡの分解をターゲティングすることが公知であるが（１６〜１８）、インフルエンザＡウイルスのｖＲＮＡがヌクレアーゼに感受性を示すため、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡもｓｉＲＮＡの標的である可能性がある（１）。種々のＲＮＡ種の分解に対するｓｉＲＮＡの効果を調査するために、配列特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲを使用して、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｍＲＮＡのレベルを定量することができた。図１６は、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、およびｃＲＮＡとの間の関係を示す。図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、ｃＲＮＡはｖＲＮＡの正確な相補体であるが、ｍＲＮＡは、５’末端にキャップ構造および宿主細胞ｍＲＮＡ由来のさらなる１０〜１３ヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡは、ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド下流の部位に相補的な部位から始まるポリＡ配列を３’末端に含む。したがって、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡと比較すると、ｍＲＮＡは３’末端の１５〜２２ヌクレオチドを欠く。３つのウイルスＲＮＡ種を区別するために、第１の逆転写反応においてｖＲＮＡに特異的なプライマー、ｃＲＮＡに特異的なプライマー、およびｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用した（図１６Ｂ）。ｍＲＮＡについて、プライマーとしてポリｄＴ１８を使用した。ｃＲＮＡについて、ｍＲＮＡから失われたＲＮＡの３’末端に相補的なプライマーを使用した。ｖＲＮＡについて、ｖＲＮＡに相補的であり、且つ５’末端にあまり接近しない限り、プライマーは、ＲＮＡの間のほとんどどこでも良い。たった１つのＲＮＡから転写して得られたｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【０２８７】
インフルエンザウイルス感染後、新規のビリオンがパッケージングされ始め、約４時間までに放出される。ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡ転写の第１の波（ｗａｖｅ）に対するｓｉＲＮＡの効果を決定するために、ＲＮＡを感染後の早い時期に単離した。簡単に述べれば、ＮＰ−１４９６を、ＭＤＣＫ細胞にエレクトロポレーションした。偽エレクトロポレーション（ｓｉＲＮＡなし）も行った。６〜８時間後、細胞にＭＯＩ＝０．１にてＰＲ８ウイルスを感染させた。次いで、細胞を、感染から１、２、および３時間後に溶解し、ＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡのレベルを、各ＲＮＡ種のためのプライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによってアッセイした。
【０２８８】
図１７は、感染前に約６〜８時間偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトした細胞中のウイルスに感染後の種々の時間でのウイルスＮＰおよびＮＳ  ＲＮＡ種の量を示す。図１７に示すように、感染から１時間後、ＮＰ  ｓｉＲＮＡトランスフェクションを用いるか用いないサンプルの間のＮＰ  ｍＲＮＡの量に有意差はなかった。早ければ感染から２時間で、ＮＰ  ｍＲＮＡが偽トランスフェクション群で３８倍に増加するのに対して、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＮＰ  ｍＲＮＡレベルは増加しなかった（またはさらに僅かに減少した）。感染から３時間後、偽トランスフェクションにおいてｍＲＮＡ転写物レベルが増加しつづけるのに対して、ｓｉＲＮＡ処理を受けた細胞ではＮＰ  ｍＲＮＡ量が連続的に減少することが認められた。偽トランスフェクションにおけるｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの量の増加は感染から３時間後のみで有意であったこと以外は、ＮＰ  ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡは類似のパターンを示した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これはおそらくｃＲＮＡおよびさらなるｖＲＮＡの合成前に最初のｍＲＮＡ転写ラウンドが起こるインフルエンザウイルスの生活環に起因する。
【０２８９】
これらの結果は、血球凝集素アッセイまたはプラークアッセイによるインタクトな生ウイルスの測定結果と一致して、全てのＮＰ  ＲＮＡ種の量が、ＮＰ  ｓｉＲＮＡでの処理によっても有意に減少することを示す。ｓｉＲＮＡが主にｍＲＮＡの分解を媒介することが公知であるにもかかわらず、この実験によるデータは、ＮＰ  ｃＲＮＡおよびｖＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介分解の可能性を除外しないが、下記の結果により、ＮＰ  ｍＲＮＡ減少の結果としてのＮＰタンパク質レベルの減少によりＮＰ  ｃＲＮＡおよび／またはｖＲＮＡの安定性が減少することが示唆される。
【０２９０】
（実施例５：ＲＮＡ干渉の標的の同定）
（材料および方法）
未改変ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ調製物を上記のように調製した。センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方のいずれかの各ヌクレオチド残基の２’−水酸基が２’−Ｏ−メチル基に置換された改変ＲＮＡオリゴヌクレオチドもＤｈａｒｍａｃｏｎによって合成した。未改変オリゴヌクレオチドについて記載のように、改変オリゴヌクレオチドを脱保護し、相補鎖にアニーリングした。ゲル電気泳動によって二重鎖形成の完了についてｓｉＲＮＡ二重鎖を分析した。
【０２９１】
細胞培養、ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション、およびウイルスでの感染。これらを本質的に上記のように行った。簡単に述べれば、改変ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡに関する実験のために、ＭＤＣＫ細胞を最初に野生型（ｗｔ）鎖および改変（ｍ）鎖から形成されたＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトし、８時間後に０．１のＭＯＩにてＰＲ８ウイルスに感染させた。感染から２４時間後に培養上清のウイルス力価をアッセイした。Ｍ−３７ｓｉＲＮＡに関する実験のために、ＭＤＣＫ細胞を、Ｍ−３７  ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトし、０．０１のＭＯＩにてＰＲ８ウイルスに感染させ、感染から１、２、および３時間後にＲＮＡ単離のために回収した。Ｍ−３７センスおよびアンチセンス配列については、表２を参照のこと。
【０２９２】
本質的に上記のようにＲＮＡ抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲを行った。逆転写のために使用されるｍＲＮＡ、Ｍ特異的ｖＲＮＡ、およびＭ特異的ｃＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーは以下の通りであった：
【０２９３】
【化３】
2008533990.tif 000017
（結果）
ｍＲＮＡに加えてｓｉＲＮＡがｖＲＮＡおよび／またはｃＲＮＡを干渉する可能性を調査するために、センス（Ｓまたは＋）鎖またはアンチセンス（ＡＳまたは−）鎖のいずれかが改変されたＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを合成した。各ヌクレオチド残基中の２’−水酸基を２’−Ｏ−メチル基に置換する改変では、二重鎖形成のための塩基対合に影響を与えないが、改変ＲＮＡ鎖はもはやＲＮＡ干渉を補助していない。言い換えれば、センス鎖が改変されているがアンチセンス鎖が野生型であるｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｗｔＡＳ）は、アンチセンス鎖と相補的な配列を有するＲＮＡの分解を補助するが、センス鎖と相補的な配列はそうではない。逆に、センス鎖が野生型であるがアンチセンス鎖が改変されているｓｉＲＮＡ（ｗｔＳ：ｍＡＳ）は、センス鎖と相補的な配列を有するＲＮＡの分解を補助するが、センス鎖と相補的な配列を有するＲＮＡの分解は補助しない。
【０２９４】
ＭＤＣＫ細胞を、偽トランスフェクトしたか、あるいはセンス鎖（ｍＳ：ｗｔＡＳ）またはアンチセンス鎖（ｗｔＳ：ｍＡＳ）のいずれかの鎖が改変される一方で他の鎖が野生型であるＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。細胞を、両方の鎖が改変されたＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｍＡＳ）でもトランスフェクトした。次いで、細胞を、ＰＲ８ウイルスに感染させ、上清のウイルス力価を測定した。図１８Ａに示すように、偽トランスフェクションに供した培養物で高ウイルス力価が検出された。予想通り、野生型ｓｉＲＮＡ（ｗｔＳ：ｗｔＡＳ）でトランスフェクトした培養物で非常に低いウイルス力価が検出されたが、両方の鎖を改変したｓｉＲＮＡ（ｍｓ：ｍＡＳ）でトランスフェクトした培養物では高ウイルス力価が検出された。アンチセンス鎖が改変されたｓｉＲＮＡ（ｗｔＡＳ：ｍＡＳ）でトランスフェクトした培養物でウイルス力価が高かったのに対して、センス鎖のみが改変されたｓｉＲＮＡ（ｍＳ：ｗｔＡＳ）でトランスフェクトした培養物ではウイルス力価は低かった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、インフルエンザウイルスの産生を阻害するｓｉＲＮＡ二重鎖の野生型アンチセンス（−）鎖のための要件が、ＲＮＡ干渉の標的が、ｍＲＮＡ（＋）、ｃＲＮＡ（＋）、または両方のいずれかであることを示唆する。
【０２９５】
これらの可能性をさらに区別するために、対応するｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積に対するｓｉＲＮＡの効果を試験した。同時に感染した細胞のコホートにおける転写を追跡するために、感染から１、２、および３時間後（新規のビリオンの放出および再感染前）にＲＮＡ単離用のｓｉＲＮＡトランスフェクトＭＤＣＫ細胞を採取した。ウイルスｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡを、特異的プライマーを使用した逆転写によって最初に独立してｃＤＮＡに変換した。次いで、リアルタイムＰＣＲによって各ｃＤＮＡのレベルを定量した。図１８Ｂに示すように、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡ  Ｍ−３７を使用した場合、感染から１時間後または２時間後にＭ特異的ｍＲＮＡはほとんど検出されなかった。感染から３時間後、Ｍ−３７の非存在下でＭ特異的ｍＲＮＡが容易に検出された。Ｍ−３７でトランスフェクトされた細胞では、Ｍ特異的ｍＲＮＡのレベルは、約５０％減少した。対照的に、Ｍ特異的ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡのレベルは、Ｍ−３７の存在によって阻害されなかった。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、これらの結果は、ウイルスｍＲＮＡがおそらくｓｉＲＮＡ媒介性干渉の標的であることを示す。
【０２９６】
（実施例６：ウイルスＲＮＡ蓄積に対する一定のｓｉＲＮＡの広範な効果）
（結果）
上記のようにｓｉＲＮＡ調製物を調製した。
【０２９７】
実施例３に記載のように、ＲＮＡの抽出、逆転写、およびリアルタイムＰＣＲを行った。ｍＲＮＡ、ＮＰ  ｖＲＮＡ、ＮＰ  ｃＲＮＡ、ＮＳ  ｖＲＮＡ、ＮＳ  ｃＲＮＡ、Ｍｖ  ＲＮＡ、またはＭｃ  ＲＮＡのいずれかに特異的なプライマーを、実施例４および５に記載した。逆転写に使用するＰＢ１  ｖＲＮＡ、ＰＢ１  ｃＲＮＡ、ＰＢ２  ｖＲＮＡ、ＰＢ２  ｃＲＮＡ、ＰＡ  ｖＲＮＡ、またはＰＡ  ｃＲＮＡに特異的なプライマーは以下の通りであった。
【０２９８】
【化４】
2008533990.tif 000018
ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡ  ＲＮＡのＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
【０２９９】
【化５】
2008533990.tif 000019
（結果）
上記のように（実施例４）、ＮＰ−１４９６がＮＰ遺伝子セグメントの分解を特異的にターゲティングするかどうかまたはＮＰ以外のウイルスＲＮＡレベルも影響を受けるかどうかを決定するために、ＮＳに特異的なプライマーを、異なるＮＳ  ＲＮＡ種（ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ）の量を測定するためのＲＴおよびリアルタイムＰＣＲに使用した。図１９に示すように、ＮＳ  ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの変化は、ＮＰ  ＲＮＡについて認められたものと同一のパターンを示した。感染から３時間後、偽トランスフェクト細胞で全てのＮＳ  ＲＮＡ種の有意な増加が認められるのに対し、ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを投与された細胞でＮＳ  ＲＮＡレベルの有意な変化は認められなかった。この結果は、異なるウイルスＲＮＡの転写および複製が少なくともＮＰ  ＲＮＡに関して調和良く調節されることを示す。「調和良く調節された」とは、ある転写物レベルが別の転写物レベルに直接または間接的に影響を与えることを意味する。特別な機構は含まれていない。ＮＰ転写物がｓｉＲＮＡ処理によって分解された場合、他のウイルスＲＮＡレベルも減少する。
【０３００】
他のウイルスＲＮＡに対するＮＰ  ｓｉＲＮＡの効果をさらに調査するために、ＮＰ−１４９６で処理された細胞中の全てのウイルス遺伝子のｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積を測定した。図１９Ａ（上のパネル）に示すように、ＮＰ特異的ｍＲＮＡは、感染から１〜２時間後は低かった。感染から３時間後、ＮＰ−１４９６の非存在下でＮＰ  ｍＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＮＰ−１４９６の存在下では、ＮＰ  ｍＲＮＡレベルはバックグラウンドレベルを保持し、ｓｉＲＮＡが特定のｍＲＮＡの蓄積を阻害したことを示した。図１９Ａ（中央および下のパネル）に示すように、ＮＰ−１４９６の存在によってＮＰ特異的およびＮＳ特異的ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡのレベルは大幅に阻害された。これらの結果は、実施例４に記載の結果を確認するものである。さらに、ＮＰ−１４９６処理細胞では、Ｍ遺伝子、ＮＳ遺伝子、ＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、およびＰＡ遺伝子のｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害された（図１９Ｂ、１９Ｃ、および１９Ｈ）。さらに、ＰＡ−２０８７については広範な阻害効果も認められた。図１９Ｅ、１９Ｆ、および１９Ｇの左側の上、中央、および下のパネルは、ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡによるウイルスｍＲＮＡ転写ならびにｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ複製の阻害を示す図１９Ａ、１９Ｂ、および１９Ｃに示す結果と同一の結果を示す。図１９Ｅ、１９Ｆ、および１９Ｇの右側の上、中央、および下のパネルは、同一濃度でＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡを使用して行った同一の実験の結果を示す。図１９Ｅ（それぞれ右側の上、中央、および下のパネル）に示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｍＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在により、ＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｍＲＮＡの転写が阻害された。図１９Ｆ（それぞれ右側の上、中央、および下のパネル）に示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｖＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在によりＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｖＲＮＡの蓄積が阻害された。図１９Ｇ（それぞれ右側の上、中央、および下のパネル）に示すように、感染から３時間後、ＰＡ−２０８７の非存在下でＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｃＲＮＡが容易に検出されたのに対し、ＰＡ−２０８７の存在によりＰＡ、Ｍ、およびＮＳのｃＲＮＡの蓄積が阻害された。さらに、図１９Ｈは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＰＢ１特異的ｍＲＮＡ（上のパネル）、ＰＢ２特異的ｍＲＮＡ（中央のパネル）、およびＰＡ特異的ｍＲＮＡ（下のパネル）の蓄積を阻害することを示す。
【０３０１】
いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、ＮＰ  ｓｉＲＮＡの広範な効果は、おそらくｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの結合および安定化におけるＮＰの重要性の結果であり、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＲＮＡ分解を非特異的にターゲティングするためではないことを示唆する。インフルエンザウイルス中のＮＰ遺伝子セグメントは、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの両方に結合することができる一本鎖ＲＮＡ結合核タンパク質をコードする（図１５を参照のこと）。ウイルスの生活環では、ＮＰ  ｍＲＮＡは最初に転写され、翻訳される。ＮＰタンパク質の主な機能は、ＲＮＡの転写、複製、およびパッケージングのためにウイルスゲノムをキャプシドに包むことである。ＮＰタンパク質の非存在下では、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの両方の全長合成は強く損なわれる。ＮＰ  ｓｉＲＮＡがＮＰ  ＲＮＡの分解を誘導する場合、ＮＰタンパク質合成が損なわれ、それにより十分なＮＰタンパク質がないことが他のウイルス遺伝子セグメントの複製に影響を与える。この方法で、ＮＰ  ｓｉＲＮＡは、非常に初期の段階でウイルス産生を強力に阻害することができる。
【０３０２】
感染細胞中のＮＰタンパク質分子数は、ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡ）複製に対するｍＲＮＡ合成のレベルを調節すると仮定されている（１）。ＮＰタンパク質の温度感受性変異を使用して、以前の研究で、ｃＲＮＡの合成はインビトロおよびインビボの両方で温度感受性を示すが、ｍＲＮＡはそうではないことが示されている（７０、７１）。ＮＰタンパク質は、初期のｃＲＮＡおよびｖＲＮＡ転写物の伸長および抗終結のために必要であることが示された（７１、７２）。上記の結果は、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡが感染細胞中の全てのウイルスＲＮＡの蓄積を阻害したことを示す。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、おそらく、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡの存在下で、新規に転写されたＮＰｍＲＮＡが分解され、ウイルス感染後にＮＰタンパク質合成が阻害されるようである。新規に合成されたＮＰ、さらなるウイルス転写、および複製がなければ、新規のビリオン産生は阻害される。
【０３０３】
同様に、ＰＡ特異性の存在下で、新規に転写されたＰＡ  ｍＲＮＡが分解され、ＰＡタンパク質合成が阻害される。インフルエンザビリオンあたり３０〜６０コピーのＲＮＡ転写酵素が存在するにもかかわらず（１）、新規に合成されたＲＮＡ転写酵素がなければ、さらなるウイルスの転写および複製は同様に阻害される。ＰＢ１に特異的なｓｉＲＮＡを使用しても類似の結果が得られた。対照的に、ウイルス感染後期まで基質（Ｍ）タンパク質は必要ない（１）。したがって、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡはＭ特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害するが、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、または他のウイルスＲＮＡの蓄積は阻害しない。まとめると、これらの所見は、インフルエンザウイルスＲＮＡの転写および複製における新規に合成された核タンパク質およびポリメラーゼタンパク質についての重要な要件を証明する。ＮＰ、ＰＡ、およびＰＢ１特異的ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡ特異的機構の蓄積および他のウイルスＲＮＡ転写を干渉するｍＲＮＡ特異的機構およびウイルス特異的機構により、これらのｓｉＲＮＡはインフルエンザウイルス感染の特に強力なインヒビターであり得ることが示唆される。
【０３０４】
（実施例７：一定のｓｉＲＮＡによるウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は、インターフェロン応答にもウイルス誘導性ＲＮＡ分解にも起因しない）
（材料および方法）
ＲＮＡレベルの測定。標準的な条件下でＰＣＲを使用してＲＮＡレベルを測定した。γ−アクチンＲＮＡの測定のために以下のＰＣＲプライマーを使用した。
【０３０５】
【化６】
2008533990.tif 000020
以下に引用された引用文献に記載の標準的な技術にしたがって、ベロ細胞の培養およびリン酸化ＰＫＲの測定を行った。
【０３０６】
（結果）
ウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害についての１つの可能性のある理由は、ｓｉＲＮＡの存在下での感染細胞のインターフェロン応答である（２３、６５、６６）。したがって、全ＩＦＮ遺伝子座（全てのα、β、およびω遺伝子が含まれる）が欠失したベロ細胞において上記実験を繰り返した（６７、６８）（Ｑ．Ｇ．およびＪ．Ｃ．未公開データ）。ＭＤＣＫ細胞と同様に、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳ特異的ｍＲＮＡの蓄積の全てがＮＰ−１４９６によって阻害された（図１９Ｄ）。さらに、細胞遺伝子由来の転写物（β−アクチン、γ−アクチン、およびＧＡＰＤＨが含まれる）のレベルに対するｓｉＲＮＡの効果を、ＰＣＲを使用してアッセイした。ｓｉＲＮＡの非存在下または存在下で転写レベルの有意な相違は検出されず（γ−アクチンｍＲＮＡに対するＭ−３７  ｓｉＲＮＡの効果の欠如を示す図１８Ｃの下のパネル、データ示さず）、ｓｉＲＮＡの効果が、ウイルスＲＮＡに特異的であることを示唆している。一定のｓｉＲＮＡによるウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は細胞インターフェロン応答の結果ではないことが示唆される。
【０３０７】
インフルエンザウイルス感染後、ｄｓＲＮＡの存在は、ＲＮＡを分解のターゲットとする細胞経路も活性化させる（２３）。本経路の活性化に対するｓｉＲＮＡの効果について試験を行うために、本発明者らは、リン酸化プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）（経路の最も重要な成分）のレベルをアッセイした（２３）。ウイルス感染の非存在下におけるＮＰ−１４９６でのＭＤＣＫ細胞のトランスフェクションは、活性化ＰＫＲレベルに影響を与えなかった（データ示さず）。インフルエンザウイルスによる感染によってリン酸化ＰＫＲレベルが増加し、これは以前の研究と一致する（６５、６６、６９）。しかし、ＮＰ−１４９６の存在下または非存在下で増加は同一であった（データ示さず）。したがって、ウイルスＲＮＡ蓄積の広範な阻害は、ｓｉＲＮＡの存在下での強化されたウイルス誘導性分解の結果ではない。
【０３０８】
（実施例８：単独または組み合わせのいずれかでインフルエンザウイルス産生を阻害する優れた能力を有するｓｉＲＮＡの体系的同定）
ハイスループットスクリーニング（実施例１８）を、インフルエンザウイルス産生を阻害する優れた能力を有するｓｉＲＮＡを同定するために行なった。そのｓｉＲＮＡを、細胞培養物において個別に試験し、そしてその多くを、マウスにおいてさらに試験した。特定の組み合わせをまた、試験し、そしてそれらは、相加効果を示した。さらなる組み合わせの体系的試験を、相乗（すなわち、相加より大きい）効果を有する組み合わせを同定するために行なう。上記ｓｉＲＮＡ、および同じアンチセンス鎖を含む他のＲＮＡｉ誘導性実体を、主要なヒト病原体および鳥類病原体を含むさらなるインフルエンザウイルス株に対してさらに試験する。
【０３０９】
（実施例９：ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを容易にする非ウイルス送達因子の評価）
種々の非ウイルス送達因子を、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを増強するそれらの能力について試験した。その後の実施例は、多くのポリマーを用いた細胞培養物および動物の両方におけるポジティブな結果（例えば、インフルエンザウイルス産生の阻害）を示すデータを提供する。さらなる送達因子を、同様のアプローチを使用して試験する。
【０３１０】
（実施例１０：マウスにおけるＲＮＡｉ誘導性物質を含む組成物の試験）
インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるＲＮＡｉ誘導性物質を含む乾燥粒子を、記載（５８）されるように調製する。この手順において、水溶性賦形剤（すなわち、ラクトース、アルブミンなど）および治療剤を、蒸留水に溶解した。その溶液を、Ｎｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒ（Ｎｉｒｏ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｏｍｂｕｓ、ＭＤ）に供給して、３μｍと１５μｍとの間の範囲の平均幾何学粒径および０．０４ｇ／ｃｍ３と０．６ｇ／ｃｍ３との間のタップ密度を有する乾燥粉末を産生した。その乾燥粉末を、マウスの呼吸系に、吸入または気管内投与によって投与する。乾燥粉末エアロゾルの吸入送達を、麻酔したマウスにおける強制換気によって達成する。気管内投与のために、治療剤を含む溶液は、麻酔したマウスの肺へのチューブによって注入する（５４）。他の実験において、液体の送達のために、液体エアロゾルを、噴霧器によって密封したプラスチック製ケージ（マウスが置かれる場所）にもたらした（５２）。注入器（例えば、Ｐｅｒｍ  Ｃｅｎｔｕｒｙ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｐｅｎｎｃｅｎｔｕｒｙ．ｃｏｍ）から入手可能（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＩＡ−ＩＣ））を、小動物に対する乾燥粉末の肺送達に使用し得る。
【０３１１】
（実施例１１：ＤＮＡベクターまたはレンチウイルスによって提供されたテンプレートから転写されたｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス感染の阻害）
上に記載したアプローチの代替法として、ｓｉＲＮＡ前駆体が転写され、そして有効なｓｉＲＮＡへとプロセシングされ得るＤＮＡベクターの使用を、実施例１３および１４に記載したように探索した。図２０Ａ〜２０Ｃは、以前の研究（２７、５９）に使用したベクターを示し、その結果は、図２０Ｄにおいて示され、そして米国特許出願第１０／６７４，１５９号においてさらに記載される。図２１Ａ〜２１Ｃは、複数の異なるｓｉＲＮＡについての前駆体を含むヘアピン前駆体の効力を試験するために使用され得るさらなる構築物を示す。
【０３１２】
（実施例１２：ｓｉＲＮＡによるマウスにおけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
本実施例は、インフルエンザウイルスでの感染の前または後のいずれかで投与した場合、インフルエンザウイルスＮＰまたはＰＡ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡの投与によりマウスにおけるインフルエンザウイルスの産生を阻害することを示す実験を記載する。阻害は用量依存性であり、２つの異なるインフルエンザウイルス遺伝子から発現した転写物にターゲティングされる２つのｓｉＲＮＡを共に投与した場合、さらなる効果を示す。
【０３１３】
（材料および方法）
ｓｉＲＮＡの調製。上記のようにこれを行う。
【０３１４】
ｓｉＲＮＡ送達。ｓｉＲＮＡ（３０もしくは６０μｇのＧＦＰ−９４９、ＮＰ−１４９６、またはＰＡ−２０８７）を、オリゴヌクレオチドカチオン性ポリマートランスフェクション試薬Ｎ／Ｐ（比＝５）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＤＳＰ２０１３０；Ｎ／Ｐは、ｊｅｔＰＥＩ試薬中のリン酸ヌクレオチドあたりの窒素残基数をいう）のためのｊｅｔＰＥＩＴＭまたはポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ）（ｖｉｓ）５２，０００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）４１，８００、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）と５％グルコース中で室温にて２０分間インキュベートした。混合物をマウスに静脈内注射し、眼窩静脈に注射する（マウスあたり２００μｌ、群あたり４マウス）。２００μｌの５％グルコースをコントロール（未投与）マウスに注射した。マウスを２．５％Ａｖｅｒｔｉｎｓで麻酔し、その後ｓｉＲＮＡ注射または鼻腔内感染を行った。
【０３１５】
ウイルス感染。Ｂ６マウス（標準的な実験条件下で保持）に、ピペットを使用して３０μｌ（１２，０００ｐｆｕ）／マウスでマウスの鼻腔にウイルス含有緩衝液を滴下することによってＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染した。
【０３１６】
ウイルス力価の決定。マウスを、感染後の種々の時間で屠殺し、肺を採取した。肺をホモジナイズし、ホモジネートを２回凍結融解してウイルスを放出させた。感染肺中に存在するＰＲ８ウイルスを、ＭＤＣＫ細胞の感染によって力価測定した。平底９６ウェルプレートに、３×１０４ＭＤＣＫ細胞／ウェルを播種し、２４時間後に血清含有培地を除去した。２５μｌの肺ホモジネート（非希釈または１×１０−１〜１×１０−７に希釈のいずれか）を三つ組のウェルに接種した。１時間のインキュベーションの後、４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む１７５μｌの感染培地を、各ウェルに添加した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、感染細胞由来の上清によるニワトリＲＢＣの血球凝集反応によってウイルスの有無を決定した。Ｖ底９６ウェルプレート中で血球凝集反応アッセイを行った。上清の連続２倍希釈物を、同体積の０．５％懸濁液（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のニワトリ赤血球（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合し、氷上で１時間インキュベートした。接着性で均一な赤血球層を含むウェルを、正とスコアリングした。ウイルス力価を、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法（ＴＣＩＤ５０）による５０％のウェルが感染した希釈終点の内挿によって決定した（したがって、より低いＴＣＩＤ５０は、より低いウイルス力価を反映する）。任意の２つの群由来のデータを、有意性を評価するために本明細書中に記載の実験を通して使用したスチューデントｔ検定によって比較した。
【０３１７】
（結果）
図２２Ａは、感染前に投与した場合、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する実験結果を示す。上記の材料および方法に記載のように、３０または６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに、マウスあたり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。感染から２４時間後、肺を採取した。図２２Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ未処理（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ６０μｇ；白抜きの四角）を投与されたマウス肺についてのホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。ＮＰ（ＮＰ３０μｇ；白抜きの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされる３０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．９であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；黒塗りの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。未処理群と６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡを投与した群との間の肺ホモジネートにおけるウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．０００２で有意であった。各マウスについてのデータを、表６Ａ（ＮＴ＝未処理）に示す。
【０３１８】
図２２Ｂは、感染前にカチオン性ポリマーＰＬＬを含む組成物中で静脈内投与した場合、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する別の実験結果を示す。上記の材料および方法に記載のように、３０または６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、ＰＬＬとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに、マウスあたり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染した。感染から２４時間後、肺を採取した。図２２Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡ未処理（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ６０μｇ；白抜きの四角）を投与されたマウスについての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．１であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；黒塗りの円）およびＰＬＬにターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．０であった。６０μｇＧＦＰを投与した群と６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡを投与した群との間の肺ホモジネート中のウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．００１で有意であった。各マウスのデータを表６Ａに示す（ＮＴ＝未処理）。これらのデータは、インフルエンザＮＰ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、ウイルス感染前に投与した場合に肺のウイルス力価が減少することを示す。これらはまた、ｓｉＲＮＡとカチオン性ポリマーとの混合物は静脈内注射によって投与した場合に（ハイドロダイナミックトランスフェクションなどの技術は必要ない）肺のインフルエンザウイルスの阻害に有効な因子であることを示す。
【０３１９】
【表６−Ａ】
2008533990.tif 000021
図２２Ｃは、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡが感染前に投与された場合にマウスのインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明し、カチオン性ポリマーの存在はｓｉＲＮＡの阻害効果が有意に増加することを実証する第３の実験結果を示す。上記の材料および方法に記載のように、６０μｇのＧＦＰ−９４９またはＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはｊｅｔＰＥＩとインキュベートしｔ、マウスに静脈注射した。３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染した。注射から２４時間後、肺を採取した。図２２Ｃに示すように、ｓｉＲＮＡ処理を行っていないマウス（ＮＴ；白抜きの四角）についての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．１であるが、ＰＢＳ中のＧＦＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡを受けたマウス（ＧＦＰ  ＰＢＳ；白抜きの三角）についての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は、４．４であった。ＰＢＳ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＢＳ；白抜きの円）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であり、処理なしまたはＧＦＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡでの処理と比較して最も穏やかな有効性の上昇のみを示す。ｊｅｔＰＥＩ中のＧＦＰ（ＧＦＰ  ＰＥＩ；白抜きの円）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。しかし、ｊｅｔＰＥＩ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＥＩ；黒塗りの円）およびｊｅｔＰＥＩにターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．９であった。ｊｅｔＰＥＩ中のＮＰ（ＮＰ  ＰＥＩ；黒塗りの円）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡで事前処理されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを投与された群とＮＰ  ｓｉＲＮＡを含むＰＢＳを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．０４で有意であるが、ｊｅｔＰＥＩを含むＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを投与された群とｊｅｔＰＥＩを含むＮＰ  ｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、Ｐ＝０．００３であり高度に有意であった。各マウス由来のデータを、表６Ｂに示す（ＮＴ＝未処理）。
【０３２０】
（表６Ｂ．カチオン性ポリマーを用いて有効性の増加示すｓｉＲＮＡによるマウスにおけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
【０３２１】
【表６−Ｂ】
2008533990.tif 000022
さらなる実験を、感染の前後の種々の時点で投与した場合の、感染後の種々の時間におけるインフルエンザウイルス産生を阻害するｓｉＲＮＡの能力を評価するために行なった。
【０３２２】
ｓｉＲＮＡを、１２０ｕｇ  ｓｉＲＮＡをウイルス感染の１２時間前に投与したことを除いて、上で記載したように投与した。表６Ｃは、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０として表した結果を示す。ＮＰ−処理をコントロール群と比較したＰ値は、０．０４９であった。
【０３２３】
【表６−Ｃ】
2008533990.tif 000023
別の実験において、ｓｉＲＮＡ（６０ｕｇ）を、感染の３時間前に投与した。１５００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを、鼻腔内に投与した。その感染した肺を、感染の４８時間後に回収した。表６Ｄは、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０として表した結果を示す。ＮＰ−処理をコントロール群と比較したＰ値は、０．０３であった。
【０３２４】
【表６−Ｄ】
2008533990.tif 000024
別の実験において、ｓｉＲＮＡ（１２０ｕｇ）を、ＰＲ８（１５００ｐｆｕ）感染の２４時間後に投与した。感染の５２時間後、その肺を回収し、そしてウイルス力価を測定した。表６Ｄは、ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０として表した結果を示す。ＮＰ−処理をコントロール群と比較したＰ値は、０．０３であった。
【０３２５】
【表６−Ｅ】
2008533990.tif 000025
他のポリマーもまた、有効なｓｉＲＮＡ送達因子であることが示された。図２２Ｄは、ポリ（βアミノエステル）（Ｊ２８）と一緒に静脈内に投与した場合に、ＮＰ（ＮＰ−１４９６）にターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害すること示すプロットである。図２２Ｅは、ポリ（βアミノエステル）（Ｊ２８またはＣ３２）と一緒に腹腔内に投与した場合に、ＮＰ（ＮＰ−１４９６）にターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害する一方で、コントロールＲＮＡ（ＧＦＰ）が有意な効果を有さないことを示すプロットである。この実験を、ｓｉＲＮＡに対するポリマーの比が重量／重量比（例えば、６０：１  ｗ／ｗ）であったことを除いて、本質的に上に記載したように行った。ポリマーおよびｓｉＲＮＡを、混合し、そして１２，０００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスによる鼻腔内感染の３時間前に、静脈内または腹腔内のいずれかにマウスに対して投与した。肺を、２４時間後に回収し、そしてＨＡアッセイを、行なった。Ｊ２８およびＣ３２に存在するアミンモノマーおよびビス（アクリレートエステル）モノマーは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／４４６，４４４において記載および図示される。そのポリマーは、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｎｇｅｒからの寄贈であった。
【０３２６】
図２３は、異なるインフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがさらなる効果を示すことを証明する実験結果を示す。上記の材料および方法に記載するように、６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静脈内注射した。３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染した。感染から２４時間後に肺を採取した。図２３に示すように、ｓｉＲＮＡ処理を受けていない（ＮＴ；黒塗りの四角）マウスについての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は４．２であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；白抜きの円）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。ＰＡ（ＰＡ６０μｇ；白抜きの三角）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．４であった。ＮＰにターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡ＋ＰＡにターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡ（ＮＰ＋ＰＡ；黒塗りの円）を投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．４であった。未処理群と、６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、それぞれＰ＝０．００３、０．０１、および０．０００１で有意であった。６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡまたは６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡを投与された群と、６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートの相違は、Ｐ＝０．０１で有意であった。各マウスについてのデータを、表７に示す（ＮＴ＝未処理）。これらのデータは、インフルエンザＮＰまたはＰＡ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡでの事前処理によりインフルエンザウイルスにその後感染したマウス肺のウイルス力価が減少することを示す。データは、さらに、異なるウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡの組み合わせによりさらなる効果を示すことを示し、異なる転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡの組み合わせを使用した治療は、等価な有効性を達成するために必要な１つのｓｉＲＮＡの量と比較して各ｓｉＲＮＡの用量を減少させることができると示唆される。
【０３２７】
【表７】
2008533990.tif 000026
図２４は、ウイルスＮＰ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡが感染後に投与された場合にマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを証明する実験結果を示す。マウスに、５００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを鼻腔内感染させた。上記の材料および方法に記載のように、６０μｇのＧＦＰ−９４９ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡをｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、５時間後にマウスに静脈内注射した。ｓｉＲＮＡの投与から２８時間後に肺を採取した。図２４に示すように、ｓｉＲＮＡ処理なし（ＮＴ；黒塗りの四角）またはＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ  ＧＦＰ−９４９（ＧＦＰ；白抜きの四角）を投与されたマウスについての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．０であった。ＰＡ（ＰＡ６０μｇ；白抜きの三角）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．２であった。ＮＰ（ＮＰ６０μｇ；白抜きの円）にターゲティングされる６０μｇのｓｉＲＮＡを投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は２．２であった。６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡ（ＰＡ＋ＮＰ；黒塗りの円）を投与されたマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は１．８であった。未処理群と、６０μｇのＰＡ、ＮＰ  ｓｉＲＮＡ、または６０μｇのＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ  ｓｉＲＮＡを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、それぞれＰ＝０．０９、０．０２、および０．００３で有意であった。ＮＰ  ｓｉＲＮＡおよびＰＡ＋ＮＰ  ｓｉＲＮＡを投与された群の間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違は、Ｐ値が０．２であった。各マウスについてのデータを表８に示す（ＮＴ＝未処理）。これらのデータは、インフルエンザＮＰおよび／またはＰＡ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡによりウイルス感染後に投与された場合に肺のウイルス力価が減少することを示す。
【０３２８】
【表８】
2008533990.tif 000027
（実施例１３：ｓｈＲＮＡ産生のためのテンプレートを提供するレンチウイルス投与による細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
（材料および方法）
細胞培養。２４ウェルプレートに、４×１０５細胞／ウェルにて１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中でベロ細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【０３２９】
ｓｈＲＮＡ産生のためのテンプレートを提供するレンチウイルスの産生。図２５Ａに図示されるように、ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用するオリゴヌクレオチド（図２５Ａを参照のこと）を、レンチウイルスベクターのｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終結配列との間でクローニングした（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４０１−４０６，２００３）。オリゴヌクレオチドを、ｐＬＬ３．７のマルチクローニング部位内のＨｐａＩとＸｈｏＩ制限部位との間に挿入した。レンチウイルスベクターは、トランスフェクト／感染疾患のモニタリングを容易にするためにＥＧＦＰも発現する。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡ産生用のテンプレートを含むＤＮＡベクターの同時トランスフェクションおよび２９３Ｔ細胞へのベクターのパッケージングによってレンチウイルスが産生された。４８時間後、レンチウイルスを含む培養上清を回収し、４℃、２０００ｒｐｍで７分間スピンし、次いで０．４５μｍのフィルターで濾過した。１×１０５／ウェルにてベロ細胞を、２４ウェルプレートに播種した。一晩の培養後、インサート（０．２５ｍｌまたは１．０ｍｌのいずれか）を含む培養上清を、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でウェルに添加した。ついで、プレートを、２５００ｒｐｍにて室温で１時間遠心分離し、培養物に戻した。感染から２４時間後、得られたベロ細胞株（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）を、親（非感染）ベロ細胞とともにフローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ＮＰ−１４９６中の１９よりもむしろ２０ｎｔ長の二重鎖部分が得られる、センス部分の３’末端のさらなるヌクレオチド（Ａ）およびアンチセンス部分の５’末端の相補的ヌクレオチド（Ｕ）の偶発的封入によってＮＰ−１４９６ａがＮＰ−１４９６と異なることに留意のこと（表２を参照のこと）。本発明の他の実施形態によれば、ＮＰ−１４９６ａ配列よりもむしろＮＰ−１４９６配列を使用する。さらに、図２１に示すＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡループ部分は、ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡのそれと異なる。
【０３３０】
インフルエンザウイルス感染およびウイルス力価の決定。コントロールベロ細胞およびインサートを含むレンチウイルスで感染させたベロ細胞（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）に、０．０４、０．２、および１のＭＯＩにてＰＲ８ウイルスを感染させた。実施例１２に記載のように、上清中のインフルエンザウイルス力価を、感染から４８時間後のＨＡアッセイによって決定した。
【０３３１】
（結果）
ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡの産生のためのテンプレートを含むレンチウイルスを、ベロ細胞中のインフルエンザウイルス産生を阻害する能力について試験した。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡは、上記のＮＰ−１４９６ａ  ｓｉＲＮＡと同一の配列を有する二重鎖部分を含むステム−ループ構造を形成することができる２つの相補領域を含む。図２５Ｂに示すように、ベロ細胞と共にレンチウイルス含有上清の一晩のインキュベーションにより、ＥＧＦＰが発現され、レンチウイルスによるベロ細胞の感染が示される。影をつけた曲線は、コントロール細胞（非感染）の平均蛍光強度を示す。１ｍｌの上清を使用した場合、ほとんど全ての細胞がＥＧＦＰ陽性となり、平均蛍光強度は高かった（１８１８）（ベロ−ＮＰ−１．０）。０．２５ｍｌの上清を使用した場合、ほとんどの細胞（約９５％）はＥＧＦＰ陽性であり、平均蛍光強度は低かった（５０３）（ベロ−ＮＰ−０．２５）。
【０３３２】
次いで、親ベロ細胞およびレンチウイルス感染ベロ細胞に、０．０４、０．２、および０．１のＭＯＩにてインフルエンザウイルスを感染させ、インフルエンザウイルス感染から４８時間後にウイルス力価をアッセイした。ＭＯＩの増加につれて、親ベロ細胞培養物の上清のウイルス力価が増加した（図２５Ｃ）。対照的に、ベロ−ＮＰ−１．０細胞培養物上清のウイルス力価は非常に低値のままであり、インフルエンザウイルス産生がこれらの細胞中で阻害されることを示す。同様に、ベロ−ＮＰ−０．２５細胞培養物中のインフルエンザウイルス産生も部分的に阻害された。ウイルス力価を、表９に示す。これらの結果により、ベロ細胞中のインフルエンザウイルス産生を阻害するためにレンチウイルスベクターから発現されたＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡをｓｉＲＮＡにプロセシングすることができることが示唆される。阻害の程度は、細胞あたりのウイルス感染の程度に比例するようである（ＥＧＦＰレベルによって示される）。
【０３３３】
（表９．組織培養物中で発現したｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス産生の阻害）
【０３３４】
【表９】
2008533990.tif 000028
（実施例１４：ｓｉＲＮＡ前駆体を転写することができるＤＮＡベクターの鼻腔内投与によるマウスにおけるインフルエンザ産生の阻害）
（材料および方法）
ｓｈＲＮＡについてのテンプレートとして作用するプラスミドの構築。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡが発現するプラスミドの構築を実施例１３に記載する。実施例１３に記載のように、ＰＢ１−２２５７  ｓｈＲＮＡまたはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡの合成のためのテンプレートとして作用するオリゴヌクレオチドを、レンチウイルスベクターｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終結配列との間にクローニングし、ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡについて図２５Ａに図示する。オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りであった。
【０３３５】
【化７】
2008533990.tif 000029
上記オリゴヌクレオチドを含むベクターから発現したＲＳＶ  ｓｈＲＮＡを、インビボでプロセシングして、以下の配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを作製する。
【０３３６】
【化８】
2008533990.tif 000030
ＰＡ特異的ヘアピンを、以下のオリゴヌクレオチドを使用して同様に構築することができる。
【０３３７】
【化９】
2008533990.tif 000031
ウイルス感染およびウイルス力価の決定。実施例１２に記載のようにこれらを行った。
【０３３８】
ＤＮＡ送達。上記のように、ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡ、ＰＢ１−２２５７ｓｈＲＮＡ、またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡ（各６０μｇ）の発現についてのテンプレートとして作用することができるプラスミドＤＮＡを、４０μｌ  Ｉｎｆａｓｕｒｆ（登録商標）（ＯＮＹ，Ｉｎｃ．，Ａｍｈｅｒｓｔ  ＮＹ）および２０μｌの５％グルコースと個別に混合し、マウス群（各群あたり４匹）に鼻腔内投与した。４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと２０μｌの５％グルコースとの混合物を、未処理（ＮＴ）群においてマウスに投与した。上記のように、１３時間後にマウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを鼻腔内に感染させた。感染から２４時間後に肺を採取してウイルス力価を決定した。
【０３３９】
（結果）
ＤＮＡベクターから発現されたｓｈＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス感染を阻害する能力を試験した。これらの実験では、プラスミドＤＮＡを、Ｉｎｆａｓｕｒｆ（肺内の遺伝子導入を促進することが以前に示されたビヒクルに類似の子牛肺由来の天然サーファクタント抽出物）と混合した（７４）。ＤＮＡ／Ｉｎｆａｓｕｒｆ混合物を、ピペットを使用して鼻に混合物を滴下することによってマウスに点滴注入した。１３時間後、マウスに１２０００ｐｆｕ／マウスのＰＲ８ウイルスを感染させた。インフルエンザウイルス感染からの２４時間後、肺を採取し、ウイルス力価をＭＤＣＫ／血球凝集素アッセイによって測定した。
【０３４０】
図２６に記載のように、ウイルス力価は、いかなるプラスミドＤＮＡも投与していないか呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）特異的ｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを投与したマウスで高かった。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡまたはＰＢ１−２２５７  ｓｈＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドＤＮＡをマウスに投与した場合により低いウイルス力価が認められた。マウスに両インフルエンザ特異的プラスミドＤＮＡ（一方はＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡを発現し、他方はＰＢ１−２２５７  ｓｈＲＮＡを発現する）を一緒に投与した場合、ウイルス力価はより有意に減少した。未処理（ＮＴ；白抜きの四角）またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡ（ＲＳＶ；黒塗りの四角）をコードするプラスミドを投与したマウスについての肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は、それぞれ４．０または４．１であった。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡ（ＮＰ；白抜きの円）についてのテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．４であった。ＰＢ１−２２５７  ｓｈＲＮＡ（ＰＢ；白抜きの三角）についてのテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．８であった。ＮＰおよびＰＢ  ｓｈＲＮＡ（ＮＰ＋ＰＢ１；黒塗りの円）についてのテンプレートとして作用することができるプラスミドを投与したマウスでは、肺ホモジネートの平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０は３．２であった。未処理またはＲＳＶ特異的ｓｈＲＮＡプラスミドを投与された群とＮＰ  ｓｈＲＮＡプラスミド、ＰＢ１  ｓｈＲＮＡプラスミド、またはＮＰおよびＰＢ１  ｓｈＲＮＡプラスミドを投与された群との間の肺ホモジネートのウイルス力価の相違についてのＰ値は、それぞれ０．０４９、０．１２４、および０．００４であった。各マウスについてのデータを、表１０に示す（ＮＴ＝未処理）。これらの結果は、ＤＮＡベクターから発現したｓｈＲＮＡを、マウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害するためにｓｉＲＮＡにプロセシングすることができ、ＩｎｆａｓｕｒｆがｓｈＲＮＡを発現することができるプラスミドの送達のための適切なビヒクルであることが証明されることを示す。特に、これらのデータは、インフルエンザＮＰおよび／またはＰＢ１転写物にターゲティングされるｓｈＲＮＡにより、以下のウイルス感染を投与した場合に肺内ウイルス力価を減少することを示す。
【０３４１】
【表１０】
2008533990.tif 000032
（実施例１５：カチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進する）
（材料および方法）
試薬。２つの異なる平均分子量のポリ−Ｌ−リジン（ポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ（ｖｉｓ）５２，０００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）４１，８００，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）およびポリ−Ｌ−リジン（ＭＷ（ｖｉｓ）９，４００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）８，４００，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ２６３６）、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＭＷ  １５，０００−７０，０００  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ７７６２）、および３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をＳｉｇｍａから購入した。説明の目的で、ＬＡＬＬＳ法を使用して得られる分子量と仮定するが、ポリマーはいくらかサイズが異なることを示すため、分子量はおおよそであると理解すべきである。
び方法
ゲル遅延アッセイ。１０μｌのｓｉＲＮＡ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）中に１０ｐｍｏｌ）と種々の量のポリマーを含む１０μｌのポリマー溶液との混合によってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。室温で３０分間複合体を形成させ、その後２０μｌを４％アガロースゲルで泳動した。臭化エチジウム染色を使用して、バンドを視覚化した。
【０３４２】
細胞傷害性アッセイ。等量（５０ｐｍｏｌ）のｓｉＲＮＡを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）と種々の量のポリマーを含むポリマー溶液とを室温で３０分間混合することによってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。ＭＴＴアッセイによって細胞傷害性を評価した。細胞を、３０，０００細胞／ウェルにて１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む０．２ｍｌのＤＭＥＭを含む９６ウェルプレートに播種する。３７℃で一晩のインキュベーション後、培地を除去し、０．１８ｍｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）と置換した。ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を含む２０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液を細胞に添加した。３７℃で６時間のインキュベーション後、ポリマー含有培地を除去し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳに置き替えた。製造者の説明書に従って、ＭＴＴアッセイを使用して２４時間後に細胞の代謝活性を測定した。実験を三つ組で行い、データを平均した。
【０３４３】
細胞培養、トランスフェクション、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体形成、およびウイルス力価決定。１０％熱不活化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気にてベロ細胞を増殖させた。トランスフェクション実験のために、４×１０５細胞／ウェルにて対数期ベロ細胞を、１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを含む２４ウェルプレートに播種した。３７℃で一晩のインキュベーション後、５０μｌのｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ（約７００ｎｇ）を含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２））の５０μｌのポリマーボルテックスへの添加によってｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成した。ｓｉＲＮＡとポリマーとの間の完全な複合体形成を達成するために、異なる濃度のポリマーを使用した。複合体形成を完了するために混合物を室温で３０分間インキュベートした。細胞増殖培地を除去し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と置き替え、その直後に複合体を添加した。
【０３４４】
５％ＣＯ２下にて３７℃で６時間の細胞と複合体とのインキュベーション後、複合体含有培地を除去し、ＤＭＥＭ、０．３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンからなる感染培地中の２００μｌのＰＲ８ウイルス（ＭＯＩ＝０．０４）を、各ウェルに添加した。継続的に揺り動かしながら室温で１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌトリプシンを含む０．８ｍｌの感染培地を各ウェルに添加し、細胞を３７℃の５％ＣＯ２下で培養した。上記のように、感染から異なる時間後に、感染培養物から上清を回収し、血球凝集反応（ＨＡ）アッセイによってウイルス力価を決定した。
【０３４５】
接着性細胞株について製造者の説明書に従って、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によるｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った。簡単に述べれば、４×１０５細胞／ウェルにて対数期のベロ細胞を１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを含む２４ウェルプレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ２下にてインキュベートした。翌日、５０μｌの希釈リポフェクタミン２０００を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉを５０μｌのｓｉＲＮＡに添加して（４００ｐｍｏｌを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ）、複合体を形成させた。細胞を洗浄し、無血清培地でインキュベートした。上記のように、複合体を細胞に適用し、細胞を３７℃で６時間インキュベートし、その後洗浄してインフルエンザウイルスに感染させた。上記のように、感染から異なる時間にて、感染培養物から上清を回収し、ウイルス力価を、血球凝集反応（ＨＡ）アッセイによって決定した。
【０３４６】
（結果）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）およびポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）がｓｉＲＮＡと複合体を形成する能力および培養細胞によってｓｉＲＮＡの取り込みを促進する能力を試験した。ＰＬＬおよび／またはＰＬＡがｓｉＲＮＡと複合体を形成するかどうかを決定するために、定量のＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡを漸増量のポリマーと混合した。次いで、ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の形成を、４％アガロースゲルにおいて電気泳動によって視覚化した。ポリマーの量が漸増するにつれて、ｓｉＲＮＡの電気泳動移動度が遅延し（図２７Ａおよび２７Ｂ）、複合体形成が示される。図２７Ａおよび２７Ｂは、それぞれｓｉＲＮＡとＰＬＬ（４１．８Ｋ）またはＰＬＡとの間の複合体形成を示す。各パネルで使用したポリマーの量は、左から右に増加する。図２７Ａおよ２７Ｂでは、各ウェル中で、左側のレーンにバンドが認められ、複合体形成の欠如が示され、それにより、ｓｉＲＮＡがゲルに侵入し、その後移動する。右側に移動するにつれて、バンドは消滅し、これは、複合体形成と、複合体のゲル侵入および移動の失敗とを示す。
【０３４７】
ｓｉＲＮＡ／ポリマー複合体の細胞傷害性を調査するために、異なる比でのｓｉＲＮＡとＰＬＬまたはＰＬＡとの混合物を、９６ウェルプレート中のベロ細胞培養物に添加した。細胞の代謝活性をＭＴＴアッセイによって測定した（７４）。三つ組で実験を行い、データを平均にした。ＰＬＬ（ＭＷ約４２Ｋ）の量の増加に伴って細胞生存率が有意に減少するのに対して、ＰＬＬ（約８Ｋ）は、毒性を有意に低減させ、ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比が４：１もの高さでも毒性をほとんどまたは全く示さなかった（図２８Ａ；円＝ＰＬＬ（ＭＷ約８Ｋ）；四角＝ＰＬＬ（ＭＷ約４２Ｋ））。図２８Ｂに示すように、細胞生存率はＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が増大するほど減少するが、生存率は、ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が４．５：１もの高さで約８０％超に保持された。図２８Ａおよび２８Ｂにおいて、ポリマー／ｓｉＲＮＡ比をｘ軸に示す。図２８Ａおよび２８Ｂにプロットしたデータを、表１１および１２に示す。表１１では、数値は、未処理細胞の生存率（％）と比較したポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体での処理後の細胞の生存率（％）を示す。ＮＤ＝実施せず。表１２では、数値は、示したとおりのＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比、生存率（％）、および標準偏差を示す。
【０３４８】
【表１１】
2008533990.tif 000033
【０３４９】
【表１２】
2008533990.tif 000034
ＰＬＬまたはＰＬＡがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進するかどうかを決定するために、種々の量のポリマーおよびＮＰ−１４９６を、全てのｓｉＲＮＡがポリマーと複合体化する比で混合した。それぞれの場合において等量のｓｉＲＮＡを使用した。約４２Ｋ  ＰＬＬについては約８Ｋ  ＰＬＬよりも低いポリマー／ｓｉＲＮＡ比を使用した。前者の細胞毒性がより高いことが証明されたからである。ベロ細胞に複合体を添加し、６時間後に培養物にＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から異なる時間にて、培養上清を回収し、ＨＡアッセイによってウイルスについてアッセイした。図２９Ａは、種々のトランスフェクション処理（円＝未処理、四角＝リポフェクタミン；黒塗りの三角＝ＰＬＬ（ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比＝２において約４２Ｋ）；白抜きの三角＝ＰＬＬ（ＰＬＬ／ｓｉＲＮＡ比＝８において約８Ｋ））を受けた細胞における長期にわたるウイルス力価のプロットである。図２９Ａに示すように、ウイルス力価は、非トランスフェクト培養物で時間と共に増加した。ウイルス力価は、ＮＰ−１４９６／リポフェクタミンでトランスフェクトされた細胞で有意に低く、ＰＬＬ／ＮＰ−１４９６複合体で処理した培養物でさらに低かった。図２９Ａでプロットしたデータを、表１３に示す（ＮＴ＝未処理；ＬＦ２Ｋ＝リポフェクタミン）。ＰＬＬ：ｓｉＲＮＡ比を括弧で示す。
【０３５０】
一定範囲のポリマー／ｓｉＲＮＡ比にわたりＰＬＡを同様に試験した。図２９Ｂは、種々のトランスフェクション処理（黒塗りの四角＝偽トランスフェクション；黒塗りの円＝リポフェクタミン；白抜きの四角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝１でのＰＬＡ；白抜きの円＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比でのＰＬＡ＝２；白抜きの三角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝４でのＰＬＡ；黒塗りの三角＝ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比＝８でのＰＬＡ）を受けた細胞における長期にわたるウイルス力価のプロットである。図２９Ｂに示すように、ウイルス力価はコントロール（偽トランスフェクション）培養物およびＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が１：１で処理した培養物で時間と共に増加した。ウイルス力価は、ＮＰ−１４９６／リポフェクタミンでトランスフェクトした培養物で有意に低く、ＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ比が４：１またはそれ以上の複合体を含むＰＬＡ／ｓｉＲＮＡ複合体で処理した培養物でさらに低かった。ポリマーの量の増加により、ウイルス力価がより大きく減少した。図２９Ｂでプロットしたデータを、表１３Ｂに示す。
【０３５１】
（表１３Ａ．ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体によるインフルエンザウイルス産生の阻害）
【０３５２】
【表１３−Ａ】
2008533990.tif 000035
（表１３Ｂ．ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体によるインフルエンザウイルス産生の阻害）
【０３５３】
【表１３−Ｂ】
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したがって、カチオン性ポリマーは、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを促進し、かつ細胞株中のインフルエンザウイルス産生を阻害し、広範に使用されているトランスフェクション試薬であるリポフェクタミンより有効である。これらの結果はまた、ｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激し、その同定方法を記載するためにさらなるカチオン性ポリマーを容易に同定することができることが示唆される。ＰＬＬおよびＰＬＡは、このような試みのための正のコントロールとして作用することができる。
【０３５４】
（実施例１６Ａ：脈管系または気道に対するｓｉＲＮＡの送達による肺におけるルシフェラーゼ活性の阻害）
（材料および方法）
ｓｉＲＮＡを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから入手し、そして上に記載したように脱保護およびアニーリングした。ＮＰ（ＮＰ−１４９６）、ＰＡ（ＰＡ−２０８７）、ＰＢ１（ＰＢ１−２２５７）、およびＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ配列は、上で与えた通りであった。Ｌｕｃ特異的ｓｉＲＮＡは、（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ＡＰら、Ｎａｔｕｒｅ、４１８：３８−３９）に記載された通りであった。
【０３５５】
マウスにおけるＰＥＩ媒介性ＤＮＡトランスフェクション。ｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１０の窒素／リンモル比（Ｎ／Ｐ比）で室温に２０分間にわたってＰＥＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を混合した。ｉ．ｖ．投与に関して、６０μｇのＤＮＡを含む２００μｌの上記混合物を、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）に対して眼窩後に注射した。気管内（ｉ．ｔ．）投与に関して、３０μｇまたは６０μｇのＤＮＡを含む５０μｌの上記混合物を、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｍｏｄｅｌ  ＩＡ−ＩＣ注入器を使用して麻酔したマウスの肺に投与した。
【０３５６】
マウスにおけるＰＥＩ媒介性ｓｉＲＮＡ送達。ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ組成物を、６０μｇのｌｕｃ特異的ｓｉＲＮＡまたはＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡとｊｅｔＰＥＩとを、５のＮ／Ｐ比で室温にて２０分間混合することによって形成した。ｉ．ｖ．投与に関して、表示量のｓｉＲＮＡを含む２００μｌの混合物を、眼窩後に注射した。肺投与に関して、５０μｌを、気管内に送達した。
【０３５７】
Ｌｕｃアッセイ。ｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ＤＮＡ投与後の種々の時間にて、肺、脾臓、肝臓、心臓、および腎臓を、回収し、そして細胞溶解緩衝液（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）においてホモジネートした。発光を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって分析し、そしてＯｐｔｏｃｏｍｐ（登録商標）Ｉルミノメーター（ＭＧＭ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｎｉｄｅｎ、ＣＴ）によって測定した。ホモジネート中のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。
【０３５８】
（結果）
マウスにおけるＰＥＩ媒介性核酸送達の組織分布を決定するために、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を、ｉ．ｖ．に注射し、そして２４時間後、Ｌｕｃ活性を、種々の器官において測定した。活性は、肺において最も高く、Ｌｕｃ活性を、少なくとも４日間にわたって検出した（図３０Ａ）のに対して、心臓、肝臓、脾臓、および腎臓において、レベルは、１００分の１〜１，０００分の１低く、そして注射後により短い時間にわたって検出された。ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体をｉ．ｔ．に点滴注入した場合、有意なＬｕｃ活性をまた、肺において検出したが、ｉ．ｖ．投与後よりも低いレベルであった（図３０Ｂ）。
【０３５９】
ｉ．ｖ．投与後の肺によるｓｉＲＮＡの取り込みを促進するＰＥＩの能力を試験するために、マウスに、最初にｐＣＭＶ−ｌｕｃ  ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体をｉ．ｔ．に与え、次いでＰＥＩと複合体形成したＬｕｃ特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩと複合体形成したコントロールＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ、または同容量の５％グルコースのｉ．ｖ．注射を行なった。２４時間後、肺におけるＬｕｃ活性は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡを与えられたかまたは未処理のマウスよりもＬｕｃ  ｓｉＲＮＡを受容したマウスにおいて１７倍低かった（図３０Ｃ）。Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡが、上記ＤＮＡベクターによってトランスフェクトした同じ肺細胞においてのみＬｕｃ発現を阻害し得るので、これらの結果は、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ混合物のｉ．ｖ．注射が肺における標的転写物の有効な阻害を達成することを示す。
【０３６０】
肺投与後の肺によってｓｉＲＮＡの取り込みを促進するＰＥＩの能力を試験するために、マウスに、最初にｐＣＭＶＤＮＡ−ＰＥＩ複合体をｉ．ｖ．に与え、次いでＰＥＩと混合したＬｕｃ特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩと混合したコントロールＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡ、または同容量の５％グルコースのｉ．ｔ．投与を行なった。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を、肺ホモジネートにおいてアッセイした。図３０Ｄは、タンパク質量に対して正規化した、ルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡまたはＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡのいずれかを与えたマウス由来の肺ホモジネートにおけるルシフェラーゼ活性を示す。ルシフェラーゼ活性は、ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡによって処理したマウスよりもルシフェラーゼｓｉＲＮＡによって処理したマウスにおいて６．８倍低かった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ混合物の肺投与が肺細胞における標的転写物の有効な阻害を達成することを示す。
【０３６１】
（実施例１６Ｂ：呼吸系に対するｓｉＲＮＡの送達による肺におけるシクロフィリンＢの阻害）
シクロフィリンＢは、哺乳動物において広範に発現される内因性遺伝子である。呼吸系に直接的に送達されたｓｉＲＮＡの内因性遺伝子の発現を阻害する能力を評価するために、非近交系Ｂｌａｃｋｓｗｉｓｓマウス（約３０ｇ以上の体重）を、イソフルオラン／酸素によって麻酔し、そしてシクロフィリンＢにターゲティングされるｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ−００１１３６−０１−２０  ｓｉＣＯＮＴＲＯＬ  シクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ））またはコントロールＧＦＰ−９４９  ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を、各ｓｉＲＮＡについて２匹のマウスの群に対して鼻腔内に投与した。肺を、投与の２４時間後に回収した。ＲＮＡを、肺から抽出し、そして逆転写を、ランダムプライマーを使用して行なった。次いで、リアルタイムＰＣＲを、シクロフィリンＢを使用して行ない、そしてＧＡＰＤＨ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイを行なった（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。結果（表１４）を、シクロフィリンＢにターゲティングされるｓｉＲＮＡによるシクロフィリンＢの７０％のサイレンシングを示した。
【０３６２】
（表１４：肺におけるシクロフィリンＢの阻害）
【０３６３】
【表１４】
2008533990.tif 000037
（実施例１７：好ましく保存された標的部分の選択）
広範な種々の株において発現を阻害するために標的ＲＮＡｉ誘導性物質に対する標的部分として使用するための種々のインフルエンザウイルスＡ転写物の好ましく保存された領域を同定するために、ヒトから単離したウイルス株組由来のゲノムセグメントを、（それらの＋センス形態（すなわち、ｍＲＮＡにおいて見出される配列）において）整列した。それらの株は、実施例１に列挙したものに加えて多くの株を含んだ。表１５Ａ〜１５Ｈは、好ましく保存された領域を同定するために使用したインフルエンザＡウイルスゲノムセグメントのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号（左欄）、株名（中欄）、および血清型（右欄）を列挙する。各セグメントの配列全体を、イントロンを除外して、整列および比較した。５’非翻訳領域および３’非翻訳領域が、含まれた。整列した株組は、異なるセグメントに関して異なったが、各組は、１９３４年と２００４年との間にわたる種々の年において単離された少なくとも１９種の株を含んだ。それらの株は、全て、ヒトにおいて流行することが公知であるＨＡ型およびＮＡ型を含んだ（Ｈｌ、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ９、Ｎ１、Ｎ２）。
【０３６４】
（表１５Ａ：インフルエンザＡウイルスＮＰセグメント（ヒトから単離された株））
【０３６５】
【表１５−Ａ】
2008533990.tif 000038
（表１５Ｂ：インフルエンザＡウイルスＰＡ転写物（ヒトから単離された株））
【０３６６】
【表１５−Ｂ】
2008533990.tif 000039
（表１５Ｃ：インフルエンザＡウイルスＰＢ１転写物（ヒトから単離された株））
【０３６７】
【表１５−Ｃ】
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（表１５Ｄ：インフルエンザＡウイルスＰＢ２転写物（ヒトから単離された株））
【０３６８】
【表１５−Ｄ】
2008533990.tif 000041
（表１５Ｅ：インフルエンザＡウイルスＭ転写物（ヒトから単離された株））
【０３６９】
【表１５−Ｅ】
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（表１５Ｆ：インフルエンザＡウイルスＮＳ転写物（ヒトから単離された株））
【０３７０】
【表１５−Ｆ】
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（表１５Ｇ：インフルエンザＡウイルスＮＡ転写物（ヒトから単離された株））
【０３７１】
【表１５−Ｇ】
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（表１５Ｈ：インフルエンザＡウイルスＨＡ転写物（ヒトから単離された株））
【０３７２】
【表１５−Ｈ】
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広いインフルエンザＡウイルス株組の間の好ましい標的部分組を同定するために、本発明者らは、基本配列としてＰＲ８株の配列を選択した。本発明者らは、イントロンを除外して各セグメントの配列全体を使用した。それらの配列を、図３２Ａ〜３２Ｊ（配列番号３８３〜３９２）に示す。これらの配列を、以下の順序で連鎖させて単一の長い配列を形成した：ＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍｌ、Ｍ２、ＮＳｌ、ＮＳ２、ＨＡ、ＮＡ。１９ヌクレオチドの長さを有する配列の部分を、５’末端にて始める、１９ヌクレオチド「窓」を適用して第１の可能性のある標的部分を選択し、次いで次の可能性のある標的部分を選択するためにその窓を３’方向に１回に１ヌクレオチドシフトさせることによって同定した。このプロセスを、転写物の３’末端に到達するまで続けた。各１９ヌクレオチド領域は、可能性のある標的部分を示すと見なされたが、それは、より短い標的部分またはより長い標的部分もまた選択されたと認識された。２つの異なる転写物の部分を含んだ領域を、除外した。このプロセスから生じた１３，４７２種の可能な標的部分の配列が、図３２の配列番号３８３〜３９２を参照することによって容易に決定され得る。その標的部分は、例えば、各配列において１〜１９位、２〜２０位、３〜２１位、４〜２２位、５〜２３位、６〜２４位などに伸びる。ＮＰ転写物（配列番号３８３）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．１５４７〜１５６５である。ＰＢ２（配列番号３８４）転写物において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．２３２３〜２３４１である。ＰＢ１転写物（配列番号３８５）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．２３２３〜２３４１である。ＰＡ転写物（配列番号３８６）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．２２１５〜２２３３である。Ｍ１転写物（配列番号３８７）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．１００９〜１０２７である。Ｍ２転写物（配列番号３８８）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．３２１〜３３９である。ＮＳ１転写物（配列番号３８９）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．８７２〜８９０である。ＮＳ２転写物（配列番号３９０）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．４００〜４１８である。ＨＡ転写物（配列番号３９１）において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．１７６７〜１７７５である。ＮＡ転写物において、その標的部分は、１〜１９、２〜２０、３〜２１、４〜２２．．．１３９５〜１４１３（配列番号３９２）である。例示目的のために、ＮＰ転写物の最初の６個の標的部分を、表１６に列挙する。
【０３７３】
（表１６：ＮＰ遺伝子中の標的部分）
【０３７４】
【表１６】
2008533990.tif 000046
可能性のある標的部分を、ＲＮＡｉ誘導性物質による阻害についての好ましい特徴を有する標的部分を同定するために選択工程に供した。選択工程に適用した判定基準は、ＧＣ含量に基づくフィルター、および連続して伸びるＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドの存在または非存在に基づくフィルターを含んだ。例えば、好ましいＲＮＡｉ誘導性物質の阻害性領域は、好ましくは、７０％未満のＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドを含み、そして好ましくは、３個より多いＧヌクレオチド３個の連続的なストレッチまたはより多いＣヌクレオチドの連続的なストレッチを含まない。したがって、好ましい標的部分は、７０％未満のＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドを含み、そして好ましくは、３個より多いＧヌクレオチド３個の連続的なストレッチまたはより多いＣヌクレオチドの連続的なストレッチを含まない。そのフィルターの適用後に残った標的部分は、「機能性標的部分」と称される。２，２４４種の機能性標的部分を、表１７に列挙する。
【０３７５】
ＰＲ８由来の機能性標的部分の配列を、表１５Ａ〜１５Ｈに記載した他の株の対応する標的部分の配列と比較した。他の株中の対応する標的部分を、一般に、ＰＲ８中の標的部分と実質的に同一であった、そのセグメント中のそれらの位置およびそれらの配列に基づいて容易に同定した。
【０３７６】
本発明者らは、「ウォッブル則」に従ってＧＵ塩基対形成が生じ得ることを、認識した。本発明者らはまた、アンチセンス鎖と標的との間の相補性を維持することの重要性が、異なる位置において異なることを認識した。したがって、本発明者らは、ＰＲ８中の標的部分を、その株中の対応する標的部分と比較した（両方とも５’から３’の方向に整列した）場合に、その株の少なくとも８０％がＰＲ８と比較して以下の判定基準を満たした標的部分を同定した：（１）ＰＲ８配列と対応する配列との間のＡからＧへの変化またはＣからＵへの変化が、任意の位置で許容される；（２）ＰＲ８配列と対応する配列との間のＧからＡへの変化またはＣからＡへの変化が、１位、１８位、および１９位の１つ以上においてのみ許容される；（３）１位と９位との間でのＰＲ８配列と対応する配列との間に０、１、２、または３個の違いが存在する；（４）ＰＲ８配列と対応する配列との間の２つ以下の連続した変化が存在する；ならびに（５）１１位と１７位との間でのＰＲ８配列と対応する配列との間に最大で１つの変化が存在する。
【０３７７】
上述の判定基準を満たす標的部分を、「好ましく保存された標的部分」と称する。ヒトに由来するインフルエンザ株の間で好ましく保存される２２０種の標的部分の配列を、表１８に列挙する。それらの標的部分は、転写物ＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ、ＮＳ、およびＨＡ由来である。これらの好ましく保存された標的部分は、複数種の異なるヒト由来インフルエンザＡウイルス株の阻害のための本発明のＲＮＡｉ誘導性物質に対して好ましい標的であり、そして特定の好ましいアンチセンス鎖の阻害性領域と完全に相補的である。
【０３７８】
上記好ましく保存された標的部分の選択後、鳥類（アヒル、ニワトリ、カモメ、コガモ、アジサシ、ウズラ、キジ、シチメンチョウ、ガン、ハト、タカ、および種々の他のトリ）から単離されたインフルエンザＡウイルス株由来の対応する標的部分、または環境から単離されたインフルエンザＡウイルス株（鳥類起源であると推定される）由来の対応する標的部分を、ヒト由来株から同定した標的部分と整列および比較した。それらの株は、実施例１に列挙したものに加えて多くの株を含んだ。表１９Ａ〜１９Ｈは、好ましく保存された領域を同定するために使用（＋センス形態で）したインフルエンザＡウイルスゲノムセグメントのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号（左欄）、株名（中欄）、および血清型（右欄）を列挙する。整列した株組は、異なるセグメントに関して異なったが、各組は、１９３４年と２００４年とのにわたる種々の年において単離された少なくとも３０種の株を含んだ。ヒト由来株からの好ましく保存された標的部分の同定に使用した同じ選択判定基準を、適用した。この結果は、ヒト由来株および鳥類由来株の両方の間で好ましく保存される１３８種の標的部分であった。その標的部分は、転写物ＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ、およびＮＳ由来であった。これらの標的部分は、複数種の異なるヒト由来インフルエンザＡウイルス株および鳥類由来インフルエンザＡウイルス株の阻害のための本発明のＲＮＡｉ誘導性物質に対する好ましい標的であり、そして本発明のＲＮＡｉ誘導性物質特定の好ましいアンチセンス鎖の阻害性領域と完全に相補的である。
【０３７９】
（表１９Ａ：インフルエンザＡウイルスＰＡ転写物（鳥類から単離された株））
【０３８０】
【表１９−Ａ】
2008533990.tif 000047
（表１９Ｂ：インフルエンザＡウイルスＰＢ１転写物（鳥類から単離された株））
【０３８１】
【表１９−Ｂ】
2008533990.tif 000048
（表１９Ｃ：インフルエンザＡウイルスＰＢ２転写物（鳥類から単離された株））
【０３８２】
【表１９−Ｃ】
2008533990.tif 000049
（表１９Ｄ：インフルエンザＡウイルスＭ転写物（鳥類から単離された株））
【０３８３】
【表１９−Ｄ】
2008533990.tif 000050
（表１９Ｅ：インフルエンザＡウイルスＮＳ転写物（鳥類から単離された株））
【０３８４】
【表１９−Ｅ】
2008533990.tif 000051
（表１９Ｆ：インフルエンザＡウイルスＮＰ転写物（鳥類から単離された株））
【０３８５】
【表１９−Ｆ１】
2008533990.tif 000052
【０３８６】
【表１９−Ｆ２】
2008533990.tif 000053
【０３８７】
【表１９−Ｆ３】
2008533990.tif 000054
【０３８８】
【表１９−Ｆ４】
2008533990.tif 000055
【０３８９】
【表１９−Ｆ５】
2008533990.tif 000056
【０３９０】
【表１９−Ｆ６】
2008533990.tif 000057
【０３９１】
【表１９−Ｆ７】
2008533990.tif 000058
【０３９２】
【表１９−Ｆ８】
2008533990.tif 000059
【０３９３】
【表１９−Ｆ９】
2008533990.tif 000060
【０３９４】
【表１９−Ｆ１０】
2008533990.tif 000061
【０３９５】
【表１９−Ｆ１１】
2008533990.tif 000062
（実施例１８：非常に有効なｓｉＲＮＡを同定するためのハイスループットクスリーニング）
細胞培養。ヒト肺上皮細胞Ａ−５４９（ＡＴＣＣ）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。気道に由来する他の細胞株（例えば、Ｃａｌｕ−３細胞またはＨＢＥ細胞（ＡＴＣＣ））、または他の細胞株をまた、使用し得た。細胞を、加湿式インキュベーター中で３７℃にて５％  ＣＯ２で増殖させた。
【０３９６】
ｓｉＲＮＡ。表１６に列挙した高度に保存された標的部分と完全に相補的な１９ヌクレオチド阻害性領域を有するアンチセンス鎖およびそのアンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を各々が含む種々のｓｉＲＮＡを、設計および合成した。それらのｓｉＲＮＡは、両鎖上に３’ｄＴｄＴ突出部を含んだ。全てのｓｉＲＮＡは、２’ＡＣＥ保護化学を使用してＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）によって合成された。それらのｓｉＲＮＡは、製造業者によって脱保護され、脱塩され、そしてアニーリングされた。
【０３９７】
非常に有効なｓｉＲＮＡを同定するための二重ルシフェラーゼアッセイ。関連するインフルエンザウイルス転写物（すなわち、ＰＲ８ウイルス由来のＮＰ遺伝子、ＰＡ遺伝子、ＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、Ｍ遺伝子、ＮＳ遺伝子、ＮＡ遺伝子またはＨＡ遺伝子由来）に対応する完全長ｃＤＮＡを、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．３２９（ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｂｓ／ｔｂ３２９／ｔｂ３２９．ｐｄｆにて入手可能）を参照のこと）に従ってｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２ベクター（カタログ番号Ｃ８０２１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローニングした。それらのｃＤＮＡを、哺乳動物細胞中の発現について最適化された合成Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（ｈＬｕｃ）の３’ＵＴＲに挿入した。ｃＤＮＡ挿入物（または非特異的ｓｉｃｏｎｔｒｏｌ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）にターゲティングされるＤＮＡおよびｓｉＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＡ−５４９細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、Ｒｅｎｉｌｌａ遺伝子とインフルエンザウイルス遺伝子との融合体を、転写した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの２４時間後に各ｓｉＲＮＡの量の関数として測定した。このアッセイにおいて、融合転写物のターゲティング部分（すなわち、その融合転写物のインフルエンザ特異的部分）にハイブリッド形成するｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉは、減少したルシフェラーゼシグナルを生じる融合したＲｅｎｉｌｌａ：インフルエンザウイルス遺伝子転写物の分解を引き起こす。同じベクターから発現されるホタルルシフェラーゼを、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ３２９に記載されるように、トランスフェクションコントロールおよび特異性コントロールとして使用した。具体的に、トランスフェクションの２４時間後、溶解緩衝液および基質緩衝液（Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、細胞に添加し、そしてルシフェラーゼ活性を、読み取った。１０分後、ＲｅｎｉｌｌａについてのＳｔｏｐおよびＧｌｏを添加し、そしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を読み取った。三つ組の各サンプルを、行なった。各ウェルからのホタルルシフェラーゼ活性を、同じウェルにおいてｒｅｎｉｌｌａ対するトランスフェクションコントロールとして使用した。Ｒｅｎｉｌｌａ／ホタルルシフェラーゼ活性の比を、各ウェルからのルシフェラーゼ活性の最終値として使用した。インフルエンザｓｉＲＮＡの三つ組からの比の平均を、の三つ組の比の平均と比較した。サイレンシング％を、１００×（１−インフルエンザｓｉＲＮＡ／ｓｉｃｏｎｔｒｏｌ）として計算した。
【０３９８】
表２６は、上記スクリーニングにおいて同定された多くの非常に有効なｓｉＲＮＡについてのデータを提示する。この表は、標的遺伝子（ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ｓｉＲＮＡ濃度、またはｓｉＲＮＡのＩＤ番号を列挙する。試験した各濃度における平均サイレンシング％を、ｓｉＲＮＡ  ＩＤの下に列挙する。空白は、実験を行なわなかったことを示す。この結果は、多くのｓｉＲＮＡが、０．６ｎＭ程低い濃度にて、転写物発現を少なくとも８０％もサイレンシングした。
【０３９９】
（表２６）
【０４００】
【表２６】
2008533990.tif 000063
上記のスクリーニングを使用して非常に有効であるとして同定した特定のｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを、実施例１９に記載したような組織培養物および／または本明細書中の他の場所に記載したような動物モデルにおいてインフルエンザウイルスに対してさらに試験した。
【０４０１】
（実施例１９：ウイルス複製を阻害する非常に有効なｓｉＲＮＡを同定するためのスクリーニング）
細胞培養。ベロ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で増殖させた。細胞を、加湿式インキュベーター中で３７℃にて５％  ＣＯ２で増殖させた。ウイルス感染を、０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で行なった。
【０４０２】
ｓｉＲＮＡ。表１８に列挙した高度に保存された標的部分の各々と完全に相補的な１９ヌクレオチド阻害性領域を有するアンチセンス鎖およびそのアンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を各々が含む種々のｓｉＲＮＡを、設計および合成した。それらのｓｉＲＮＡは、両鎖上に３’ｄＴｄＴ突出部を含んだ。全てのｓｉＲＮＡは、２’ＡＣＥ保護化学を使用してＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）によって合成された。それらのｓｉＲＮＡは、製造業者によって脱保護され、脱塩され、そしてアニーリングされた。
【０４０３】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション。ベロ細胞の対数期培養物を、トリプシン処理し、洗浄し、そして９６ウェルプレートに１ウェルあたり２０，０００個の細胞にて播種し、そして加湿式インキュベーター中で３７℃にて５％  ＣＯ２で一晩インキュベートした。第１のスクリーニングに関して、１０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ（ｄＴｄＴ３’突出部を有する１９ｂｐの二重鎖領域）を、２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加した。０．７５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１９μｌのＳｕｐｅｒＲＮＡｓｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ）を、２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ中に希釈し、そして穏やかに混合した。希釈した脂質を、その希釈したｓｉＲＮＡと合わせ（総量は、５０μｌである）、そしてその混合物を、室温にて２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００複合体を形成させた。インキュベーションの終わりおいて、５０μｌのトランスフェクション複合体を、細胞および１０％  ＦＣＳを含む５０μｌ  ＤＭＥＭ培地を含む各ウェルにピペットで添加した。各ｓｉＲＮＡの最終濃度は、１００ｎＭであった。各ｓｉＲＮＡを三つ組で試験し、そして結果を平均した。ＮＰ−１４９６（１００ｎＭ）およびｓｉｃｏｎｔｒｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、それぞれ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションを、１ｎＭ  ｓｉＲＮＡの濃度を使用したことを除いて同じ方法で、第２のスクリーニングについて行なった。
【０４０４】
ウイルス感染。加湿式インキュベーター中で３７℃にて５％  ＣＯ２で６時間のインキュベーション後、その上清を除去し、そして各ウェル中の細胞に、０．３％  ＢＳＡを含む２５μｌのＰＢＳ中でＰＲ８ウイルスを感染させた。感染を、第１のスクリーニングおよび第２のスクリーニングについて０．１のＭＯＩにて行なった。そのプレートを、室温にて１時間穏やかに振動させ、その後、１０．３％  ＢＳＡ、４μｇトリプシン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む７５μｌのＤＭＥＭを、各ウェルに添加した。次いでそのプレートを、加湿式インキュベーター中で３７℃にて５％  ＣＯ２でインキュベートした。
【０４０５】
ウイルス力価の測定。上清を、感染の２４時間後に回収した。ウイルス力価を、上で記載したように測定した。
【０４０６】
（結果）
インフルエンザゲノムの高度に保存された標的部分にターゲティングされる２１５種の選択したｓｉＲＮＡ組の間から、より高い活性を有するｓｉＲＮＡを同定するために、本発明者らは、一連のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を行なった。上記ｓｉＲＮＡがその特定の標的遺伝子の発現を抑制し得るか否かを直接試験するよりもむしろ、本発明者らは、細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害するｓｉＲＮＡの能力の評価に集中することを決定した。したがって、本発明者らは、読み出しとしてウイルス力価を使用した一方で、ウイルス力価を有意に減少させることができない特定のｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡを分解する能力を依然として有し、したがって特定の目的のために使用され得ることを、認識する。
【０４０７】
第１のＨＴＳにおいて試験した２１５種のｓｉＲＮＡの間で、９０種が、未処理（ＮＴ）またはｓｉｃｏｎｔｒｏｌのいずれかと比較して、ベロ細胞培養物におけるＰＲ８ウイルス力価の少なくとも４倍の減少を示した。非特異的阻害は、ベロ細胞を１００ｎＭのｓｉｃｏｎｔｒｏｌによってトランスフェクトした場合に見られなかった。そのトランスフェクション効率は、約８０％であった。結果を、表２１に要約し、そしてウイルス力価のフォールド（ｆｏｌｄ）阻害に関して表す。阻害の正確な程度は、その表に提示されるよりも大きいようである。
【０４０８】
（表２１：ハイスループットスクリーニング＃１の結果）
【０４０９】
【表２１】
2008533990.tif 000064
本発明者らは、第１のＨＴＳにおいてウイルス力価の少なくとも４倍の減少を示したｓｉＲＮＡの間から非常に有効なｓｉＲＮＡをより正確に同定するために、より低い濃度のｓｉＲＮＡ（１ｎＭ）を使用して、第２のハイスループットスクリーニングを行なった。３０種のｓｉＲＮＡは、このより低い濃度にて試験した場合、ベロ細胞培養物においてＰＲ８ウイルス力価の約３倍〜４倍の減少を示した。第２のＨＴＳの結果を、表２２に提示する。
【０４１０】
（表２２：ハイスループットスクリーニング＃２の結果）
【０４１１】
【表２２】
2008533990.tif 000065
（実施例２０：確認ｓｉＲＮＡスクリーニング）
（材料および方法）
上記第２のＨＴＳから選択した３０種のｓｉＲＮＡおよび上記第１のＨＴＳからのいくつかのｓｉＲＮＡを、ＭＤＣＫ細胞において試験してその結果を確認した。無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中の１０００万個のＭＤＣＫ細胞を、１００ｎＭの最終濃度にてｓｉＲＮＡと混合し、そして４００Ｖおよび９７５μＦにてＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、６ウェルプレートの３個のウェルに分け、そして１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭにおいて６時間培養した。次いでその培養培地を除去し、そしてＤＭＥＭ、０．３％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンから構成される感染培地中の１００マイクロリットルのＰＲ８ウイルスを、各ウェルに添加した。感染を、その３個のウェルについて、それぞれ、０．２、０．０２および０．００２のＭＯＩにて行った。室温にて１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌトリプシンを含む２ｍｌの感染培地を、各ウェルに添加し、そしてその細胞を、５％  ＣＯ２の下で３７℃にて培養した。感染後の種々の時間において、上清を、感染した培養物から回収し、そしてそのウイルス力価を、血球凝集素アッセイによって決定した。
【０４１２】
（結果）
上記第１および第２のスクリーニングにおいて同定した非常に有効なｓｉＲＮＡのインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を確認するために、第３のスクリーニングを、ＭＤＣＫ細胞において行った。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルスの実験室株によるさらに小さい量の感染に対して、ベロ細胞よりも感受性である。そのビリオンは、ベロ細胞よりもＭＤＣＫ細胞においてずっと速く複製する。ＭＤＣＫ細胞におけるこの第３のスクリーニングは、ウイルス阻害におけるｓｉＲＮＡの効率をさらに比較し、そして約８５〜９０％の精度で上記最初の２つのスクリーニングの結果を確認した。
【０４１３】
ＭＯＩ＝０．２において、３種のＮＰ  ｓｉＲＮＡは、感染の２４時間後にウイルス力価を少なくとも１６倍減少させた。４種のＮＰ  ｓｉＲＮＡ（上記の３種のＮＰを含む）、２種のＰＢ２  ｓｉＲＮＡ、３種のＰＢ１  ｓｉＲＮＡ  および４種のＰＡ  ｓｉＲＮＡｓは、ウイルス力価を少なくとも８倍減少させた。以下のｓｉＲＮＡは、試験した１３種の最も有効なｓｉＲＮＡを示す：１５４、７５８、１１２１、１３１３、２３２７、３２７６、４２７６、５０１８、５４５７、７７３６、７８０３、８２８２、および８２８６。ＭＯＩ＝０．０２において、８種のＮＰ  ｓｉＲＮＡ、２種のＰＢ２  ｓｉＲＮＡ、３種のＰＢ１  ｓｉＲＮＡおよび８種のＰＡ  ｓｉＲＮＡ（ＭＯＩ＝Ｏ．２にて有効であった上記ｓｉＲＮＡを含む）は、感染の２４時間後にウイルス力価を少なくとも８倍減少させた。ＭＯＩ＝０．００２において、１０種のＮＰ  ｓｉＲＮＡ、８種のＰＢ２  ｓｉＲＮＡ、１１種のＰＢ１  ｓｉＲＮＡ、１０種のＰＡ  ｓｉＲＮＡ（ＭＯＩ＝０．０２にて有効である上記有効なｓｉＲＮＡを含む）は、感染の２４時間後にウイルス力価を少なくとも４倍減少させる。ウイルス阻害は、ｓｉｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡによっては観察されなかった。
【０４１４】
上記スクリーニングの結果を、表２３に提示する。その欄は、それぞれ、ＭＯＩ＝０．２／０．０２／０．００２における、感染の２４時間後、３６時間後、４８時間後、およびいくつかの場合において６０時間後でのＨＡ単位を示す。プレートを、組で試験し、そしてｓｉｃｏｎｔｒｏｌは、各組によって試験したコントロールｓｉＲＮＡを示す。ＮＴ＝未処理。最も有効なｓｉＲＮＡを、太線で示す。
【０４１５】
（表２３：ハイスループットスクリーニング＃３の結果）
【０４１６】
【表２３】
2008533990.tif 000066
（実施例２１；ｓｉＲＮＡ用量反応試験）
（材料および方法）
上記第３のＨＴＳから選択した１３種のｓｉＲＮＡおよび上記第２のＨＴＳからのいくつかのｓｉＲＮＡを、ＭＤＣＫ細胞において用量反応について試験した。無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中の１０００万個のＭＤＣＫ細胞を、０．８ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の種々のｓｉＲＮＡ濃度にてｓｉＲＮＡと混合した。ｓｉＲＮＡを、４００Ｖおよび９７５μＦにてＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用することによって細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、６ウェルプレートの３個のウェルに分け、そして１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭにおいて６時間培養した。次いでその培養培地を除去し、そしてＤＭＥＭ、０．３％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンから構成される感染培地中の１００マイクロリットルのＰＲ８ウイルスを、３個のウェルの各々に対して０．２、０．０２および０．００２のＭＯＩを達成するように各ウェルに添加した。室温にて１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌトリプシンを含む２ｍｌの感染培地を、各ウェルに添加し、そしてその細胞を、５％  ＣＯ２の下で３７℃にて培養した。感染後の異なる時間において、上清を、感染した培養物から回収し、そしてそのウイルス力価を、上に記載したように、血球凝集素アッセイによって決定した。
【０４１７】
結果：ＭＯＩ＝０．２およびＭＯＩ＝０．０２において、感染の２４時間後にウイルス産生を２分の１に阻害するｓｉＲＮＡの最小濃度は、以下の通りであり、アスタリスクは、実施例１に記載したように同定したｓｉＲＮＡを示す。
【０４１８】
【化１０】
2008533990.tif 000067
結果を、種々のｓｉＲＮＡ濃度に対する０．２／０．０２／０．００２のＭＯＩにおける、感染の２４時間後、３６時間後、または４８時間後でのＨＡ単位に関して表２４に示す。
【０４１９】
（表２４：用量反応スクリーニングの結果）
【０４２０】
【表２４−１】
2008533990.tif 000068
【０４２１】
【表２４−２】
2008533990.tif 000069
（実施例２２：ｓｉＲＮＡの組み合わせを使用したインフルエンザウイルスの有効な阻害）
上記第３のＨＴＳから選択した特定のｓｉＲＮＡおよび上記第２のＨＴＳからのいくつかのｓｉＲＮＡを、組み合わせにおけるそれらの抗インフルエンザ効果について試験した。トランスフェクション、感染、およびウイルス力価試験を、実施例２１に記載したように行った。１４９９と４２７６との同時のトランスフェクション（各ｓｉＲＮＡを１２．５ｎＭで含む）は、２５ｎＭの１４９９または４２７６のいずれか単独よりもわずかに有効にウイルス産生を抑制する。
【０４２２】
（表２５：組み合わせにおけるｓｉＲＮＡの効果）
【０４２３】
【表２５】
2008533990.tif 000070
（実施例２３：呼吸系に対するむき出しのｓｉＲＮＡの直接送達によるインフルエンザウイルスの阻害）
（材料および方法）
ｓｉＲＮＡの調製、ウイルスの感染、肺の回収、およびインフルエンザウイルス力価アッセイを、実施例１２に記載したように行った。マウスを、イソフルオラン（吸入によって投与した）を使用して麻酔した。ｓｉＲＮＡを、点鼻によって５０μｌの容量で送達し、ｐ値を、スチューデントｔ検定を使用して計算した。
【０４２４】
（結果）
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６）を、マウスの群（１群あたり５匹のマウス）に投与した。マウスに、ｓｉＲＮＡ投与の３時間後にインフルエンザウイルス（２０００ＰＦＵ）を感染させた。肺を感染の２４時間後に回収し、そしてウイルス力価を測定した。予備実験において、マウスを、アバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）によって麻酔し、そして２ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡを、点鼻によって投与した。コントロールに対するウイルス力価の減少を観察したが、統計的有意性に到達しなかった（データ示さず）。
【０４２５】
第２の実験において、Ｂｌａｃｋ  Ｓｗｉｓｓマウスを、イソフルオラン／Ｏ２を使用して麻酔した。ＰＢＳ中の種々の量のｓｉＲＮＡを、マウスに対して鼻腔内に投与した（各マウスにつき５０ｕｌ）。３つの異なる群（１群あたり５匹のマウス）は、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡを点鼻によって受容した。ＰＢＳのみを受容した第４の群は、コントロールとして機能した。３時間後、そのマウスを、イソフルオラン／Ｏ２を使用して再び麻酔した、３０ｕｌのＰＲ８ウイルス（２０００ｐｆｕ＝４×致死量）を、マウスに対して鼻腔内に投与した。感染の２４時間後、そのマウスの肺を、回収し、ホモジネートし、そしてウイルス力価を、上に記載したように、ＴＣＩＤ５０の評価によって測定した。１０倍希釈よりもむしろ、肺ホモジネートの連続５倍希釈を、行った。
【０４２６】
ウイルス力価における有意かつ用量依存性の変化を、３つの処理群の各々およびコントロールにおいてマウスの間で見た。コントロールに対するウイルス力価の減少は、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量を受容した群において、それぞれ、３．４５倍（ｐ＝０．０１２５）、４．１６倍（ｐ＝０．００６３）、および４．６２倍（ｐ＝０．００５７）であった。個々のマウスについてのデータ（ＴＣＩＤ５０）を、表２７に提示し、そして図３１Ａに示す。
【０４２７】
まとめると、これらの結果は、送達を増強する特定の因子の非存在下で水性媒体において呼吸系に送達したｓｉＲＮＡの効力を示した。
【０４２８】
（表２７：むき出しのｓｉＲＮＡの鼻腔内送達は、インフルエンザウイルス産生を阻害する）
【０４２９】
【表２７】
2008533990.tif 000071
実施例２４：呼吸系に対するむき出しのｓｉＲＮＡの直接送達によるマウスにおけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
この実施例は、実施例２３の結果を確認し、そして送達増強性因子の非存在下で水性媒体における呼吸系へのＮＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡの投与による肺におけるインフルエンザウイルス産生の阻害を示す。ＰＢＳ中の６μｇ、１５μｇ、３０μｇ、および６０μｇのＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳ中の６０μｇのＧＦＰ−９４９  ｓｉＲＮＡを、マウスにｓｉＲＮＡ送達の２時間後にＰＲ８ウイルス（マウス１匹あたり１０００ｐｆｕ）を鼻腔内に感染させたことを除いて本質的に実施例２３に記載したように、マウスに対して鼻腔内に点滴注入した。肺を、感染の２４時間後に回収した。表２８および図３１Ｂに示すように、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡは、送達増強性因子の非存在下で水性媒体における鼻腔内点滴注入法によって投与した場合、インフルエンザウイルスの阻害について有効であった。ウイルス力価における有意かつ用量依存性の変化を、３つの処理群の各々およびコントロールにおいてマウスの間で見た。
【０４３０】
（表２８：むき出しのｓｉＲＮＡを使用した肺におけるインフルエンザウイルス産生の阻害）
【０４３１】
【表２８】
2008533990.tif 000072
（実施例２５：インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡは、標的領域中にミスマッチを許容する）
この実施例は、アンチセンス鎖がその阻害性領域内（例えば、その標的転写物と相補的である１９塩基対領域内）においてターゲティングされる転写物と１００％未満相補的であるｓｉＲＮＡが、有効なサイレンシングを媒介するを示す。その結果は、本明細書中に記載したＲＮＡｉ物質が、配列が標的部分内においてＰＲ８の配列とは異なる広範なインフルエンザ株を有効に阻害することを示す。
【０４３２】
（材料および方法）
実施例１８に記載したように、二重ルシフェラーゼアッセイを、１９ヌクレオチドの阻害性領域内においてｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と１００％相補的ではないインフルエンザ遺伝子の発現を阻害する、ｓｉＲＮＡの能力を評価するために使用した。ヒトインフルエンザウイルス株と鳥類インフルエンザウイルス株（ＰＲ８を標準として使用する）とのアライメントから得られるミスマッチを、位置指定変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＤＮＡベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）に導入した（すなわち、そのインフルエンザ標的部位を、ＰＲ８配列に対して１個または２個のいずれかの違いを含むように、表１５に列挙したヒトインフルエンザ株または鳥類インフルエンザ株の１つ以上において見出される違いに対応する特定の違いによって改変した）。
【０４３３】
表２９は、ウイルスＮＰ標的（ＮＰ−１４９６に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証する実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置、あるいは中央に近い位置におけるミスマッチを、試験した。
【０４３４】
（表２９：ＮＰ−１４９６によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４３５】
【表２９】
2008533990.tif 000073
表３０は、ウイルスＰＡ標的（ＰＡ−２０８７またはＰＡ−８２４２に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証する実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。しかし、１５７種のヒトインフルエンザ株の間の７種において見出されたＧ１８からＡ１８への変異は、ＲＮＡ干渉活性に実質的に影響した（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置、あるいは中央に近い位置におけるミスマッチを、試験した。アンチセンス鎖阻害性領域と標的との間の２個のミスマッチの存在は、そのサイレンシングを約７０〜７５％を減少させたが、有効な程度のサイレンシングが、依然として観察された。
【０４３６】
（表３０：ＰＡ−２０８７またはＰＡ−８２４２によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４３７】
【表３０】
2008533990.tif 000074
表３１は、ウイルスＰＢ２標的（ＰＢ２−３８１７に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証する実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置、あるいは中央に近い位置におけるミスマッチを、試験した。
【０４３８】
（表３１：ＰＢ２−３８１７によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４３９】
【表３１】
2008533990.tif 000075
表３２Ａは、ウイルスＰＢ１標的（ＰＢ１−６１２４に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証する実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置、あるいは中央に近い位置におけるミスマッチを、試験した。アンチセンス鎖阻害性領域と標的との間の２個のミスマッチの存在は、そのサイレンシングを約７０〜７５％減少させたが、有効な程度のサイレンシングが、依然として観察された。
【０４４０】
（表３２Ａ：ＰＢ１−６１２４によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４４１】
【表３２−Ａ】
2008533990.tif 000076
表３２Ｂは、ウイルスＰＢ１標的（ＰＢ１−６１２４に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証するさらなる実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置におけるミスマッチを、試験した。アンチセンス鎖阻害性領域と標的との間の２個のミスマッチの存在は、ＲＮＡｉ活性を実質的に減少させなかった。
【０４４２】
（表３２Ｂ：ＰＢ１−６１２４によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４４３】
【表３２−Ｂ】
2008533990.tif 000077
表３２Ｃは、ウイルスＰＢ１標的（ＰＢ１−６１２９に対する標的）におけるバリエーションがＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを実証する実験の結果を示す（示されるデータは、三つ組の平均である）。アンチセンス鎖の５’末端または３’末端に近い位置、あるいは中央に近い位置におけるミスマッチを、試験した。１０位におけるＡミスマッチ（Ｇ：Ｕウォッブル）は、サイレンシングに対して比較的小さい効果のみを有し、これは、１０位におけるこのようなミスマッチがこの状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてＲＮＡｉ活性を実質的に減少させないことを示した。アンチセンス鎖阻害性領域と標的との間の２個のミスマッチの存在は、そのサイレンシングを中程度に減少させたが、オリジナルのサイレンシング効果の約６０〜７０％が、依然として観察された。
【０４４４】
（表３２Ｃ：ＰＢ１−６１２９によるサイレンシングに対するアンチセンス鎖と標的領域との間のミスマッチの効果）
【０４４５】
【表３２−Ｃ】
2008533990.tif 000078
（実施例２６：改変ＳｉＲＮＡは、有効なサイレンシングを媒介する）
改変ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡの潜在的なサイレンシングを探索するために、各鎖中の代替のリボヌクレオチドにおいて２’−Ｏ−メチル改変を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡを、合成し、そして未改変ＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡと比較して試験した。２’−Ｏ−メチル改変ＮＰ  １４９６  ｓｉＲＮＡ配列は、以下の通りである：（２’−Ｏ−メチルは、改変ヌクレオチドの前に「ｍ」として示される）：
【０４４６】
【化１１】
2008533990.tif 000079
２’−Ｏ−メチル改変ＮＰ１４９６  ｓｉＲＮＡおよび未改変ＮＰ１４９６  ｓｉＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して２４ウェルプレートにおいてベロ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、その培養培地を、吸引した。その細胞を、０．１のＭＯＩにおいて２００ｕｌのＰＲ８ウイルスによって接種した。その培養上清を、感染の２４時間後、３６２４時間後および４８２４時間後にて収集した。ウイルス力価を、上に記載したように決定した。２’−Ｏ−メチル改変ＮＰ  １４９６は、未改変ＮＰ  １４９６よりもウイルス増殖のわずかに大きい阻害を示した。結果を、表３３に示す。
【０４４７】
（表３３：改変ｓｉＲＮＡを使用したインフルエンザウイルス産生の有効な阻害
【０４４８】
【表３３】
2008533990.tif 000080
（実施例２７：非常に有効なｓｉＲＮＡを同定するためのスクリーニングおよび試験の要約）
上に記載したスクリーニングならびにインビトロおよびインビボでの試験の結果を、収集し、そして組み合わせて、双方で高度に保存され、非常に強力なｓｉＲＮＡの標的であるインフルエンザウイルス配列の総合的な一覧を作成した。標的部分の一覧を、表３４に提示する。これらの配列はまた、特定の非常に有効なＲＮＡｉ誘導性物質（例えば、ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖の阻害性領域の相補体を示す。
【０４４９】
（表３４：非常に有効なＲＮＡｉ誘導性実体に対する標的である高度に保存されたインフルエンザウイルス配列
【０４５０】
【表３４−１】
2008533990.tif 000081
【０４５１】
【表３４−２】
2008533990.tif 000082
【０４５２】
【表３４−３】
2008533990.tif 000083
（等価物）
当業者は、慣用実験にすぎないものを用いて、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、または確認することができる。本発明の範囲は、上記説明に制限されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０４５３】
（参考文献）
【０４５４】
【化１２】
2008533990.tif 000084
【０４５５】
【化１３】
2008533990.tif 000085
【０４５６】
【化１４】
2008533990.tif 000086
【０４５７】
【化１５】
2008533990.tif 000087
【０４５８】
【化１６】
2008533990.tif 000088
【０４５９】
【化１７】
2008533990.tif 000089
【０４６０】
【化１８】
2008533990.tif 000090
【０４６１】
【化１９】
2008533990.tif 000091
【０４６２】
【化２０】
2008533990.tif 000092
【０４６３】
【化２１】
2008533990.tif 000093
【０４６４】
【化２２】
2008533990.tif 000094
【図面の簡単な説明】
【０４６５】
【図１Ａ】図１Ａ（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．ら（前出）を適用）は、インフルエンザウイルスの略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂ（Ｆｉｅｌｄｓ’Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（前出）を適用）は、インフルエンザウイルスのゲノム構造およびインフルエンザゲノム由来の転写物を示す。ｍＲＮＡの５’末端および３’末端の細線は、非翻訳領域を示す。影をつけた領域または斜線の領域は、それぞれ０または＋１読み取り枠中のコード領域を示す。Ｖ型の線はイントロンを示す。ｍＲＮＡの５’末端の小さな四角は、ウイルス核酸に共有結合した異種細胞ＲＮＡを示す。Ａ（ｎ）は、ポリＡテールを示す。
【図２】図２（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｉ．ら（前出）を適用）は、インフルエンザウイルス複製サイクルを示す。
【図３】図３は、ドロソフィラ系で認められるｓｉＲＮＡの構造を示す。
【図４】図４は、ドロソフィラにおけるＲＮＡ干渉に関与する工程の略図を示す。
【図５】図５は、本発明で有用なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ構造の種々の例を示す。
【図６】図６は、ＤＩＣＥＲ酵素がステム中の塩基ミスマッチを有する基質を切断して標的転写物の３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する阻害産物を作製する別の阻害経路の図を示す。
【図７】図７は、本発明のｓｉＲＮＡの両方の鎖の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図８】図８は、ハイブリッド形成して本発明のｓｈＲＮＡを形成する１つのＲＮＡ分子の転写を指示するために使用することができる構築物の一例を示す。
【図９−Ａ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｂ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｃ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｄ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｅ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｆ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｇ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図９−Ｈ】図９は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの６つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ａ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｂ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｃ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｄ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｅ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｆ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｇ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｈ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１０−Ｉ】図１０は、ヒト宿主起源のインフルエンザウイルスＡの２つの株および動物宿主起源のインフルエンザウイルスＡの５つの株の間の配列比較を示す。濃く影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。薄く影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１１−Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ａは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）による感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１−Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｂは、種々のｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡの存在下または非存在下で０．０１のＭＯＩでインフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）での感染後の種々の時間での血球凝集素アッセイによって測定した培養上清中のウイルス力価を示す経時変化である。
【図１１−Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｃは、偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトしたウイルス感染細胞由来の培養上清中のウイルス力価を示すプラークアッセイを示す。
【図１１−Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｄは、異なる用量のｓｉＲＮＡでのインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞を、表示量のＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、その後０．０１のＭＯＩでＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から４８時間後にウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１１−Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ｓｉＲＮＡがＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示す実験結果を示す。種々のウイルス転写物をターゲティングする６つの異なるｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションによってＭＤＣＫ細胞に移入し、その後８時間細胞にウイルスを感染させた。図１１Ｅは、ウイルス感染後に投与したｓｉＲＮＡによるインフルエンザウイルス産生阻害を示す。ＭＤＣＫ細胞に０．０１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを２時間感染させ、その後ＮＰ−１４９６（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトした。感染後の表示の時間でウイルス力価を測定した。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１２】図１２は、ヒトまたは動物宿主起源の１２種のインフルエンザＡウイルスのサブタイプまたは単離物の間のＮＰ配列の３’領域部分の間の配列比較を示す。影をつけた領域を使用して、ｓｉＲＮＡを設計し、実施例２および３に記載のように試験した。基本配列は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株の配列である。影をつけた文字は、基本配列と異なるヌクレオチドを示す。
【図１３】図１３は、インフルエンザウイルス阻害の有効性と相関付けた、インフルエンザウイルス遺伝子セグメントと比較した種々のｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図１４−Ａ】図１４Ａは、ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／送達因子組成物の注射領域を示す発生中のニワトリ胚の略図である。
【図１４−Ｂ】図１４Ｂは、種々のｓｉＲＮＡの発生中のニワトリ胚におけるインフルエンザウイルス産生を阻害する能力を示す。
【図１５】図１５は、核タンパク質のウイルスＲＮＡ分子との相互作用を示す略図である。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、インフルエンザウイルスのｖＲＮＡと、ｍＲＮＡと、ｃＲＮＡ（テンプレートＲＮＡ）との間の相違およびこれらの間の関係を示す略図を示す。各インフルエンザＡウイルスｖＲＮＡセグメントの３’末端の保存された１２個のヌクレオチドおよび５’末端の１３個のヌクレオチドを図１６Ｂに示す。ｍＲＮＡは、７ＧｐｐｐＮｍキャップ構造および宿主細胞ＲＮＡのサブセット由来の平均して１０〜１３個のヌクレオチドを含む。ｖＲＮＡセグメントの５’末端から１５〜２２ヌクレオチド前の位置に対応するｍＲＮＡ中の部位でｍＲＮＡのポリアデニル化が起こる。矢印は、各ＲＮＡ種に特異的なプライマーの位置を示す（引用文献（１）の適用）。
【図１７】図１７は、感染の６〜８時間前に偽トランスフェクトするかｓｉＲＮＡ  ＮＰ−１４９６でトランスフェクトした細胞におけるウイルス感染後の種々の時間でのウイルスのＮＰ  ＲＮＡ種およびＮＳ  ＲＮＡ種の量を示す。
【図１８】図１８Ａは、インフルエンザウイルス産生の阻害には二重鎖ｓｉＲＮＡ中に野生型（ｗｔ）アンチセンス鎖が必要であることを示す。ＭＤＣＫ細胞を、最初にｗｔ鎖および改変（ｍ）鎖から形成されたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、８時間後に０．１ＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染から２４時間後に培養上清のウイルス力価をアッセイした。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。図１８Ｂは、Ｍ特異的ｓｉＲＮＡが特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞をＭ−３７でトランスフェクトし、０．０１のＭＯＩのＰＲ８を感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。Ｍ特異的ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡ（下のパネル）のレベルに正規化する。ＲＮＡの相対レベルを、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。２つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９−Ａ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。３つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９−Ｂ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。３つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９−Ｃ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。３つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９−Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＮＰだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ〜Ｃ）細胞およびベロ（Ｄ）細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＮＰ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。３つの実験のうちの１つに由来の代表的なデータを示す。
【図１９−Ｅ】図１９Ｅ〜Ｇ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９−Ｆ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９−Ｇ】図１９Ｇ〜Ｅ（各図の右側）は、ＰＡ特異的ｓｉＲＮＡがＰＡだけでなく、ＭおよびＮＳ特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、およびｃＲＮＡの蓄積も阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＰＡ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＡ、Ｍ、およびＮＳに特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、およびｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図１９−Ｈ】図１９Ｈは、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＰＢ１（上のパネル）、ＰＢ２（中央のパネル）、およびＰＡ（下のパネル）特異的ｍＲＮＡの蓄積を阻害することを示す。ＭＤＣＫ細胞を、ＮＰ−１４９６でトランスフェクトし、０．１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させ、感染から１時間、２時間、および３時間後にＲＮＡ単離物を回収した。ＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡのｍＲＮＡに特異的なｍＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーを使用した逆転写およびその後のリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウイルスＲＮＡ種のレベルを、同一サンプル中のγ−アクチンｍＲＮＡレベル（示さず）に正規化する。ＲＮＡの相対レベルを示す。
【図２０】図２０Ａは、ｓｉＲＮＡ  ＣＤ８−６１およびそのヘアピン誘導性ＣＤ８−６１Ｆの配列を示す。図２０Ｂは、ＣＤ８−６１およびＣＤ８−６１ＦによるＣＤ８α発現の阻害を示す。ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞株を、エレクトロポレーションによってＣＤ８−６１またはＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。ＣＤ８α発現を、４８時間後のフローサイトメトリーによってアッセイした。印をつけていない線は偽トランスフェクションを示す。図２０Ｃは、ＣＤ８−６１ＦヘアピンＲＮＡの発現がＨ１ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターによって駆動される、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターの略図を示す。Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒはシグナル配列の終結を示す。図２０Ｄは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩを使用したＨｅＬａ細胞中でのＣＤ８αのサイレンシングを示すプロットを示す。非トランスフェクト細胞は、ＣＤ８αを発現しなかった。細胞をＣＤ８α発現ベクターおよび無プロモーターｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆ構築物、合成ｓｉＲＮＡ、またはプロモーターを含むｐＳＬＯＯＰＩＩＩ−ＣＤ８−６１Ｆのいずれかでトランスフェクトした。
【図２１−Ａ】図２１Ａは、ＮＰ−１４９６およびＧＦＰ−９４９のｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。図２１Ｂは、２つの異なる順番でのＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。図２１Ｃは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体を、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターのみ（上）か、タンデムアレイ（中央）でか、または独立プロモーターおよび終結配列（下）と同時にクローニングする。
【図２１−Ｂ】図２１Ａは、ＮＰ−１４９６およびＧＦＰ−９４９のｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。図２１Ｂは、２つの異なる順番でのＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。図２１Ｃは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体を、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターのみ（上）か、タンデムアレイ（中央）でか、または独立プロモーターおよび終結配列（下）と同時にクローニングする。
【図２１−Ｃ】図２１Ａは、ＮＰ−１４９６およびＧＦＰ−９４９のｓｉＲＮＡならびにそのヘアピン誘導体／前駆体の略図を示す。図２１Ｂは、２つの異なる順番でのＮＰ−１４９６ＨおよびＧＦＰ−９４９Ｈのタンデムアレイを示す。図２１Ｃは、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩ発現ベクターを示す。ｓｉＲＮＡのヘアピン前駆体を、ｐＳＬＯＯＰＩＩＩベクターのみ（上）か、タンデムアレイ（中央）でか、または独立プロモーターおよび終結配列（下）と同時にクローニングする。
【図２２−Ａ】図２２Ａは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＥＩと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（３０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２−Ｂ】図２２Ｂは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーＰＬＬと共に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２−Ｃ】図２２Ｃは、インフルエンザウイルスでの感染前にカチオン性ポリマーｊｅｔＰＥＩと共に投与した場合に、ＰＢＳ中で投与した場合よりも有意により有効にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。白抜きの四角（未処理）、白抜きの三角（ＰＢＳ中のＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの三角（ＰＢＳ中のＮＰ  ｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（ｊｅｔＰＥＩを含むＮＰ  ｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２−Ｄ】図２２Ｄは、カチオン性ポリ（βアミノエステル）（Ｊ２８）と一緒に静脈内に投与した場合に、ＮＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。白抜きの円（未処理）、黒塗りの四角（Ｊ２８を含むＮＰ  ｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２２−Ｅ】図２２Ｅは、カチオン性ポリ（βアミノエステル）（Ｊ２８またはＣ３２）と一緒に腹腔内に投与した場合に、ＮＰにターゲティングされるｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害する一方で、コントロールＲＮＡ（ＧＦＰ）が有意な効果を有さないことを示すプロットである。白抜きの円（未処理）、白抜きの四角（Ｊ２８を含むＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの四角（Ｊ２８を含むＮＰ  ｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（Ｊ２８を含むＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの三角（Ｃ３２を含むＮＰ  ｓｉＲＮＡ）。コントロール群と処理群との間のｐ値を示す。
【図２３】図２３は、インフルエンザウイルスでの感染前に共に投与した場合にインフルエンザウイルスのＮＰ転写物およびＰＡ転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡがさらなる効果を示すことを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの円（６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡ＋６０μｇＰＡ  ｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２４】図２４は、インフルエンザウイルスでの感染後に投与した場合にｓｉＲＮＡがマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。黒塗りの四角（未処理）、白抜きの四角（６０μｇＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ）、白抜きの三角（６０μｇＰＡ  ｓｉＲＮＡ）、白抜きの円（６０μｇＮＰ  ｓｉＲＮＡ）、黒塗りの円（６０μｇＮＰ＋６０μｇＰＡ  ｓｉＲＮＡ）。各印は、各動物を示す。異なる群の間のｐ値を示す。
【図２５】図２５Ａは、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの略図である。ｓｈＲＮＡの転写は、Ｕ６プロモーターによって駆動される。ＥＧＦＰ発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＳＩＮ−ＬＴＲ、Ψ、ｃＰＰＴ、およびＷＲＥは、レンチウイルス構成要素である。ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡの配列を示す。図２５Ｂは、図２５Ｂに示すレンチウイルスに感染したベロ細胞が用量依存的にＥＧＦＰを発現することを証明するフローサイトメトリーの結果のプロットを示す。ＮＰ−１４９６ａ  ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターおよびパッケージングベクターの２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによってレンチウイルスを産生した。培養上清（０．２５ｍｌまたは１．０ｍｌ）を使用して、ベロ細胞を感染させた。得られたベロ細胞株（ベロ−ＮＰ−０．２５およびベロ−ＮＰ−１．０）ならびにコントロール（非感染）ベロ細胞を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現について分析した。ベロ−ＮＰ−０．２５（図の上部）およびベロ−ＮＰ−１．０（図の下部）細胞の平均蛍光強度を示す。影をつけた曲線は、コントロール（非感染）ベロ細胞の平均蛍光強度を示す。図２５Ｃは、ＮＰ−１４９６ｓｈＲＮＡを発現するベロ細胞におけるインフルエンザウイルス産生の阻害を示すプロットである。親ベロ細胞およびＮＰ−１４９６  ｓｈＲＮＡ発現ベロ細胞に、０．０４、０．２、および１のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。上清中のウイルス力価を、感染から４８時間後に血球凝集素（ＨＡ）アッセイによって判定した。
【図２６】図２６は、インフルエンザウイルス転写物にターゲティングされるｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクターの投与によってマウスにおけるインフルエンザウイルス産生が阻害されることを示すプロットである。６０μｇのＲＳＶ、ＮＰ−１４９６（ＮＰ）、またはＰＢ１−２２５７（ＰＢ１）ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを、４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと混合し、点滴注入法によってマウスに投与した。未処理（ＮＴ）群について、マウスに６０μｌの５％グルコースを点滴した。１３時間後、マウスにＰＲ８ウイルスを１２０００ｐｆｕ／マウスで鼻腔内感染させた。感染２４時間後にＭＤＣＫ／血球凝集素アッセイによって肺のウイルス力価を測定した。各データポイントは１匹のマウスを示す。群間のｐ値を示す。
【図２７−Ａ】図２７Ａは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２７−Ｂ】図２７Ｂは、ｓｉＲＮＡとポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＬＡ）との間の複合体形成を検出するための電気泳動移動度シフトアッセイの結果を示す。１５０ｎｇのＮＰ−１４９６  ｓｉＲＮＡと漸増量のポリマー（０〜１２００ｎｇ）との室温で３０分間の混合によって、ｓｉＲＮＡ−ポリマー複合体を形成させた。次いで、反応混合物を、４％アガロースゲルで泳動し、ｓｉＲＮＡを臭化エチジウム染色を使用して視覚化した。
【図２８】図２８Ａは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＬ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。四角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）、円＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、黒塗りの四角＝２５％、白抜きの三角＝５０％、黒塗りの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。三つ組の平均としてデータを示す。図２８Ｂは、ｓｉＲＮＡ／ＰＬＡ複合体の細胞傷害性を示すプロットである。９６ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体で６時間処理した。次いで、ポリマー含有培地を、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳと交換した。２４時間後にＭＴＴアッセイの使用によって細胞の代謝活性を測定した。三つ組の平均としてデータを示す。
【図２９】図２９Ａは、ＰＬＬがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、リポフェクタミン＋ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）またはｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染後、異なる時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。白抜きの円＝未処理、黒塗りの四角＝リポフェクタミン、黒塗りの三角＝ＰＬＬ（分子量約４２Ｋ）、白抜きの三角＝ＰＬＬ（分子量約８Ｋ）。図２９Ｂは、ポリ−Ｌ−アルギニンがｓｉＲＮＡの細胞取り込みを刺激することを示すプロットである。２４ウェルプレート中のベロ細胞を、ｓｉＲＮＡ（４００ｐｍｏｌ）／ポリマー複合体と６時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．０４のＭＯＩのＰＲ８ウイルスを感染させた。感染後、異なる時点での培養上清中のウイルス力価を、ＨＡアッセイによって測定した。ポリマー：ｓｉＲＮＡ比を示す。０，２５％、５０％、７５％、および９５％は、イミダゾールアセチル基に置換したＰＬＬ上のε−アミノ基の割合をいう。黒塗りの円＝非トランスフェクション、白抜きの円＝リポフェクタミン、白抜きおよび黒塗りの四角＝０％および２５％（０％と２５％のデータポイントは同一であることに留意のこと）、黒塗りの三角＝５０％、白抜きの三角＝７５％、Ｘ＝９５％。
【図３０−１】図３０Ａは、ＰＥＩが静脈内注射後に肺においてＤＮＡトランスフェクションを媒介することを示す棒グラフである。４日間にわたる異なる器官における０．５ｍｇのタンパク質の相対光単位でのＬｕｃ活性を示す。データは、２つの実験のうちの１つに由来する。図３０Ｂは、ＰＥＩが気管内投与後に肺においてＤＮＡトランスフェクションを媒介することを示す棒グラフである。この図は、ＤＮＡ投与の２４時間後における１群あたり３匹のマウスの表示の器官における０．５ｍｇのタンパク質の相対光単位での平均Ｌｕｃ活性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図３０−２】図３０Ｃは、ｓｉＲＮＡの静脈内送達による肺におけるルシフェラーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。この図は、ルシフェラーゼ構築物の投与の２４時間後における１群あたり３匹のマウスの表示の器官における０．５ｍｇのタンパク質の相対光単位での平均Ｌｕｃ活性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。図３０Ｄは、ｓｉＲＮＡの吸入送達による肺におけるルシフェラーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。この図は、ルシフェラーゼ構築物の投与の２４時間後におけるマウスの肺における０．５ｍｇのタンパク質の相対光単位での平均Ｌｕｃ活性を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。実験を、１群あたり３匹のマウスをを使用して二つ組で行い、そして同様の結果を得た。この実験のうちの１つの結果をここに示す。
【図３１−Ａ】図３１Ａおよび３１Ｂは、送達因子を伴わないｓｉＲＮＡの投与がマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。
【図３１−Ｂ】図３１Ａおよび３１Ｂは、送達因子を伴わないｓｉＲＮＡの投与がマウスにおけるインフルエンザウイルス産生を阻害することを示すプロットである。
【図３２−Ａ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｂ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｄ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｅ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｆ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｇ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｈ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｉ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３２−Ｊ】図３２Ａ〜３２Ｊは、ＲＮＡｉのための標的部分の選択に使用したインフルエンザウイルス株ＰＲ８転写物の配列を示す。
【図３３−１】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−５】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−６】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−７】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−８】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−９】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１０】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１１】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１２】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１３】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１４】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１５】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１６】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１７】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１８】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−１９】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２０】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２１】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２２】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２３】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２４】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２５】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２６】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２７】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２８】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−２９】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３０】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３１】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３２】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３３】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３４】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３５】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３６】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３７】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３８】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−３９】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４０】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４１】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４２】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４３】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４４】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４５】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３３−４６】図３３は、インフルエンザウイルスを阻害するＲＮＡｉのための機能性標的部分の配列を示す表１７である。
【図３４−１】図３４は、ヒトに由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表１８である。
【図３４−２】図３４は、ヒトに由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表１８である。
【図３４−３】図３４は、ヒトに由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表１８である。
【図３４−４】図３４は、ヒトに由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表１８である。
【図３４−５】図３４は、ヒトに由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表１８である。
【図３５−１】図３５は、ヒトおよび鳥類に由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表２０である。
【図３５−２】図３５は、ヒトおよび鳥類に由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表２０である。
【図３５−３】図３５は、ヒトおよび鳥類に由来するインフルエンザウイルス株の間でＲＮＡｉのための好ましく保存されたインフルエンザウイルス標的部分の配列を示す表２０である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2008533990.tif 000106
【図９−Ａ】
2008533990.tif 000107
【図９−Ｂ】
2008533990.tif 000108
【図９−Ｃ】
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【図９−Ｄ】
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【図９−Ｅ】
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【図９−Ｆ】
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【図９−Ｇ】
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【図９−Ｈ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１０−Ｃ】
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【図１０−Ｄ】
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【図１０−Ｅ】
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【図１０−Ｆ】
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【図１０−Ｇ】
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【図１０−Ｈ】
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【図１０−Ｉ】
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【図１１−Ａ】
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【図１１−Ｂ】
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【図１１−Ｃ】
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【図１１−Ｄ】
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【図１１−Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−Ａ】
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【図１４−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−Ａ】
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【図１９−Ｂ】
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【図１９−Ｃ】
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【図１９−Ｄ】
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【図１９−Ｅ】
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【図１９−Ｆ】
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【図１９−Ｇ】
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【図１９−Ｈ】
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【図２０】
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【図２１−Ａ】
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【図２１−Ｂ】
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【図２１−Ｃ】
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【図２２−Ａ】
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【図２２−Ｂ】
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【図２２−Ｃ】
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【図２２−Ｄ】
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【図２２−Ｅ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−Ａ】
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【図２７−Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−Ａ】
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【図３１−Ｂ】
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【図３２−Ａ】
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【図３２−Ｂ】
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【図３２−Ｃ】
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【図３２−Ｄ】
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【図３２−Ｅ】
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【図３２−Ｆ】
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【図３２−Ｇ】
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【図３２−Ｈ】
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【図３２−Ｉ】
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【図３２−Ｊ】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３３−４】
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【図３３−５】
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【図３３−６】
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【図３３−７】
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【図３３−８】
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【図３３−９】
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【図３３−１０】
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【図３３−１１】
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【図３３−１２】
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【図３３−１３】
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【図３３−１４】
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【図３３−１５】
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【図３３−１６】
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【図３３−１７】
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【図３３−１８】
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【図３３−１９】
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【図３３−２０】
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【図３３−２１】
2008533990.tif 000196
【図３３−２２】
2008533990.tif 000197
【図３３−２３】
2008533990.tif 000198
【図３３−２４】
2008533990.tif 000199
【図３３−２５】
2008533990.tif 000200
【図３３−２６】
2008533990.tif 000201
【図３３−２７】
2008533990.tif 000202
【図３３−２８】
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【図３３−２９】
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【図３３−３０】
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【図３３−３１】
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【図３３−３２】
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【図３３−３３】
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【図３３−３４】
2008533990.tif 000209
【図３３−３５】
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【図３３−３６】
2008533990.tif 000211
【図３３−３７】
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【図３３−３８】
2008533990.tif 000213
【図３３−３９】
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【図３３−４０】
2008533990.tif 000215
【図３３−４１】
2008533990.tif 000216
【図３３−４２】
2008533990.tif 000217
【図３３−４３】
2008533990.tif 000218
【図３３−４４】
2008533990.tif 000219
【図３３−４５】
2008533990.tif 000220
【図３３−４６】
2008533990.tif 000221
【図３４−１】
2008533990.tif 000222
【図３４−２】
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【図３４−３】
2008533990.tif 000224
【図３４−４】
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【図３４−５】
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【図３５−１】
2008533990.tif 000227
【図３５−２】
2008533990.tif 000228
【図３５−３】
2008533990.tif 000229
【国際調査報告】
2008533990.tif 000230
2008533990.tif 000231
2008533990.tif 000232
2008533990.tif 000233
2008533990.tif 000234
2008533990.tif 000235
2008533990.tif 000236
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