(57)【要約】  本発明は、ＣＴＣ樹脂上の固相合成により、式Ｉのペプチド誘導体又はその塩を製造する方法を含む。
2008515940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2008515940.tif 000008
（式中、Ｔｏｓはｐ−トルエンスルホニルを意味する）のペプチド誘導体又はその塩の製造方法であって、
ａ）カップリング剤／添加剤系の存在下における固相担体上のアミノ酸であるアルギニン、プロリン及びグリシンの連続カップリング、
ｂ）グリシン部分のＮ−α−アミノ基のトシル化、
ｃ）トシル化したペプチド又はアミノ側鎖が保護されたその誘導体の、固相担体からの開裂、
ｄ）カップリング剤／添加剤系の存在下における、式III
Ｒ−ＮＨ2                          III
（ここで、Ｒはｐ−アミノフェニルを意味し、１つのアミノ基はアミノ保護基で保護される）のアニリンとの、式II
【化２】
2008515940.tif 000009
のペプチド中間体又はアミノ側鎖が保護されたその誘導体の反応
を含む、方法。
【請求項２】
固相担体が、２−クロロトリチルクロリド−ポリスチレン樹脂であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルギニンが、Ｐｂｆ又はＰｍｃ保護基で保護された側鎖であることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
プロリンを、ＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、ＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＳｕ及びＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＢｔより選択される活性化誘導体、又はＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＨ（ここで、ＰＧはアミノ保護基を意味する）の非活性化誘導体の形態で適用することを特徴とする、請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
プロリンを、Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ＯＨの形態で適用することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
グリシンを、ＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、ＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＳｕ及びＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＢｔより選択される活性化誘導体、又はＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ここで、ＰＧはアミノ保護基を意味する）の非活性化誘導体の形態で適用することを特徴とする、請求項１〜４記載の方法。
【請求項７】
グリシンを、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの形態で適用することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｆｍｏｃ保護基を、ピペリジンでの処置により除去することを特徴とする、請求項５及び７記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）におけるアミノ酸の連続カップリングのためのカップリング剤／添加剤系が、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ、ＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔ、ＰｙＢｏＰ／Ｃｌ−ＨＯＢｔより選択されることを特徴とする、請求項１〜８記載の方法。
【請求項１０】
カップリング剤／添加剤系が、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔであることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
式IIIのアニリンを用いる、式IIのペプチド中間体の反応のためのカップリング剤／添加剤系が、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ／Ｃｌ−ＨＯＢｔ及びＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔから選択されることを特徴とする、請求項１〜１０記載の方法。
【請求項１２】
カップリング剤／添加剤系が、ＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔであることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
４−トルエンスルホニルクロリドによりトシル化が行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
トリフルオロ酢酸を用いて固相担体からの開裂を行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄ）における式IIIのアニリンとの反応を、式IIのペプチド中間体のアミノ側鎖が保護された誘導体としてＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨと行うことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５記載の方法により得られる、式Ｉのペプチド誘導体又はその塩。
【請求項１７】
請求項１〜１５記載の方法により製造される式Ｉのペプチド誘導体の、タンパク質分解酵素の定量のための使用。
【請求項１８】
毛細管血中のトロンビンの定量測定のための、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
本明細書に記載した発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉ
【０００２】
【化３】
2008515940.tif 000003
【０００３】
（式中、Ｔｏｓはｐ−トルエンスルホニルを意味する）
のペプチド誘導体の製造方法に関する。
【０００４】
本発明の方法は、固相合成に基づく。固相合成中に、出発物質は不活性固体担体に結合させながら、アミノ酸を目的配列のペプチドに構成する（すなわち、組み合わせる）。反応剤を溶液に加えると、出発物質が固体に結合するため、出発物質からのいかなる生成物も同様に結合したままとなる。目的配列が担体に連結すると、ペプチドを担体から分離する（すなわち、開裂する）。
【０００５】
本発明に従って製造されたペプチド誘導体は、分類ＥＣ  ３．４．４（ＥＣは、国際生化学連合の「Enzyme Committee」の略語である）の特定のタンパク質分解酵素、特にトロンビンの定量に適している。
【０００６】
これに関連するペプチドの合成方法は、例えば、米国特許第4,428,874号（1984）、第4,070,245号（1978）及び第4,629,695号（1986）に記載されている。これらの方法は、異なるアミノ酸誘導体を用いる液相合成に基づく。
【０００７】
しかし、従来技術に記載されている方法は、目的異性体の光学純度に関して満足のいくものではなく、それぞれのペプチドの精製作業を必要とする。
【０００８】
従って、本発明の目的は、良好な収率で高い光学純度の式Ｉのペプチド誘導体を製造するための、より経済的な方法を提供することである。
【０００９】
この目的は、請求項１記載の本発明の方法を用いて達成される。
【００１０】
この方法は、
ａ）カップリング剤／添加剤系の存在下における固相担体上のアミノ酸であるアルギニン、プロリン及びグリシンの連続カップリング、
ｂ）グリシン部分のＮ−α−アミノ基のトシル化、
ｃ）トシル化したペプチド又はアミノ側鎖が保護されたその誘導体の、固相担体からの開裂、
ｄ）カップリング剤／添加剤系の存在下における、式III
Ｒ−ＮＨ2                          III
（ここで、Ｒはｐ−アミノフェニルを意味し、１つのアミノ基はアミノ保護基で保護される）のアニリンとの、式II
【化４】
2008515940.tif 000004
のペプチド中間体又はアミノ側鎖が保護されたその誘導体の反応、
を含む。
【００１１】
本明細書及び特許請求の範囲に使用される略語の意味を、下記の表に概説する。
【００１２】
【表１】
2008515940.tif 000005
【００１３】
更に、アミノ酸であるアルギニン及びプロリンを、そのＬ体又はＤ体のいずれをもラセミ化合物として、あるいはその異性体の種々の混合物で使用できることが理解される。好ましくは、アミノ酸はそのＬ体で使用される。
【００１４】
本発明の工程ａ）における連続カップリングは、第１工程として、好ましく保護されたアルギニンの固相担体への結合を含む。
【００１５】
アルギニンのα−アミノ基を、当業者に既知の一般的なアミノ保護基で保護できる。Ｆｍｏｃは、アルギニンの好ましいα−アミノ保護基である。
【００１６】
一般に、側鎖（例えば、アルギニン分子のグアニジン部分）を、当業者に既知のアルギニン側鎖保護基で保護する。好ましいアルギニン側鎖保護基は、Ｐｍｃ又はＰｂｆであり、更に好ましくはＰｂｆである。
【００１７】
原則として、固相ペプチド合成に有用であることが知られている全ての固相担体を、Peptides: Chemistry and Biology, N. Sewald, H.-D. Jakubke, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2002 及び Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis-A practical approach, W.C. Chan, P.D. White, Oxford University Press Inc. New York, 2000に記載の通り、本発明の合成に使用できる。
【００１８】
２−クロロトリチルクロリド−ポリスチレン樹脂（ＣＴＣ樹脂）が、固相担体として本発明のペプチド合成に最も適していることが見出された。ＣＴＣ樹脂は、例えばMerck Bioscienceから市販されている。
【００１９】
保護されたアルギニンを、好ましくは不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）に溶解する。
【００２０】
第３級アミンには、通常、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジン、好ましくはＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジンなどがある。
【００２１】
固相担体への結合は、一般に室温で行う。
【００２２】
有機溶媒での樹脂の洗浄、濾過、最後に穏和な温度での乾燥を含む、当業者に既知の技術に従って、担持した樹脂を処理する。
【００２３】
第１工程の好ましい態様において、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを担持したＣＴＣ樹脂を製造する。
【００２４】
続く工程において、保護されたプロリンとのカップリング、続いて保護されたグリシンとのカップリングを行う。
【００２５】
カップリングを起こす前に、アルギニンのα−アミノ基を、適切な溶媒（例えば、ＤＭＦ又はＮＭＰ、好ましくはＮＭＰ）との第２級アミン（例えば、モルホリン、ＤＢＵ又はピペリジン、好ましくはピペリジン）の５〜２０％溶液を用いて適切に脱保護する必要がある。
【００２６】
プロリン及びグリシン両方のα−アミノ基を、当業者に既知の一般的なアミノ保護基により保護できる。Ｆｍｏｃは、プロリン及びグリシン両方の好ましいα−アミノ基である。
【００２７】
プロリンを、ＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、ＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＳｕ及びＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＢｔより選択される活性化誘導体、又はＰＧ−Ｐｒｏ−ＯＨの非活性化誘導体（ここで、ＰＧはアミノ保護基を意味する）の形態で適用してもよい。
【００２８】
好ましくは、プロリンをＦｍｏｃ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ＯＨの形態で適用する。
【００２９】
グリシンを、ＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ及びＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＳｕの活性化誘導体、又はＰＧ−Ｇｌｙ−ＯＨの非活性化誘導体（ここで、ＰＧはアミノ保護基を意味する）の形態で適用してもよい。
【００３０】
好ましくは、グリシンをＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの形態で適用する。
【００３１】
本発明に従って、アミノ酸のカップリングを、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ、ＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔ、ＰｙＢｏＰ／Ｃｌ−ＨＯＢｔより選択されるカップリング剤／添加剤系を用いて行う。
【００３２】
好ましいカップリング剤／添加剤系は、ＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔ又はＨＢＴＵ／ＨＯＢｔであり、ここで、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔが最も好ましい。
【００３３】
各カップリングを、一般に、適切な溶媒（例えば、ＮＭＰ）中の第３級アミン（例えば、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジン、好ましくはＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジン）の存在下で行う。
【００３４】
カップリング反応は、撹拌しながら０℃〜４０℃の温度で行われるのが理想的である。
【００３５】
グリシンとのカップリング前のプロリンの脱保護及び最終的なグリシンの脱保護を、適切な溶媒（例えば、ＤＭＦ又はＮＭＰ、好ましくはＮＭＰ）との第２級アミン（例えば、モルホリン、ＤＢＵ又はピペリジン、好ましくはピペリジン）の５〜２０％溶液を用いて適切に行うことができる。
【００３６】
本カップリング反応の好ましい態様において、Ｈ２Ｎ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｄ／Ｌ）Ａｒｇ−（Ｐｂｆ）−ＯＨを担持したＣＴＣ樹脂を製造する。
【００３７】
グリシン部分のＮ−α−アミノ基のトシル化を、本発明の方法の工程ｂ）に従って、一般に第３級アミン（例えば、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジン、好ましくはＤＩＥＡ）の存在下で４−トルエンスルホニルクロリドにより実施する。
【００３８】
一般に、トシル化を不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）の存在下で０℃〜４０℃の温度で行う。
【００３９】
固相担体からの開裂を、当業者に既知の方法で行うことができる。
【００４０】
好ましくは、目的ペプチドのＴｏｓ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを、希釈酸性溶液、好ましくはジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸の０．１〜５％溶液で処理してＣＴＣ樹脂から開裂させる。
【００４１】
こうして得られたペプチドを、当該技術において既知の方法、好ましくは液相クロマトグラフィー精製技術により、更に精製できる。
【００４２】
工程ｄ）に従って、トシル化したペプチド誘導体を、カップリング剤／添加剤系の存在下において、式III
Ｒ−ＮＨ2                          III
（ここで、Ｒはｐ−アミノフェニルを意味し、１つのアミノ基を、α−アミノ保護基で保護する）のアニリンとカップリングする。
【００４３】
カップリングを、第３級アミン（例えば、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＥＡ又はｓｙｍ−コリジン、好ましくはＤＩＥＡ）の存在下、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＡｔ、ＰｙＢＯＰ／Ｃｌ−ＨＯＢｔ、ＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔ、好ましくはＤＥＰＢＴ／ＨＯＯＢｔから選択されるカップリング剤／添加剤系の存在下で行う。
【００４４】
反応を、好ましくは適切な溶媒（例えば、ＤＭＦ）中で０℃〜４０℃の温度範囲で撹拌しながら行う。
【００４５】
反応混合物を、当業者に周知の方法に従って処理し、希釈酸（例えば、希ＨＣｌ）で抽出してもよい。
【００４６】
こうして得られたペプチドを、当該技術において既知の方法、好ましくは液相クロマトグラフィー精製技術により、更に精製してもよい。
【００４７】
本発明の方法において、目的のペプチド異性体を、８５％以上の優れた収率で、９６％以上の光学純度で得ることができた。
【００４８】
実施例１
Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨのＣＴＣ樹脂への結合
Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）（Merck Biosciences Novobiochem）５００ｇ（０．７７mol）を、ジクロロメタン５．５Ｌ及びＤＩＥＡ  ８１２ml（４．７７mol）の撹拌溶液に溶解した。ＣＴＣ樹脂（Merck Biosciences GmbH、１００〜２００mesh、１％ＤＶＢ、担持：０．８〜１．６mmol／ｇ樹脂）１kgを加え、溶液を約２分間撹拌した。混合物を室温で３時間放置したが、１時間後及び２時間後にそれぞれ混合物を２分間撹拌した。３時間後、混合物を５〜１０℃まで冷却し、メタノール３００mlを加えた。懸濁液をこの温度で１時間放置した。次に混合物を吸引フィルタ上で濾過した。
【００４９】
次に、樹脂をジクロロメタン／メタノール／ＤＩＥＡ（８０：１５：５）の溶液に懸濁し、５分間撹拌し、３０分間放置した。濾過した後、樹脂をＤＭＦ  ５Ｌで４回、イソプロパノール２．５Ｌで４回、イソヘキサン２．５Ｌで３回洗浄した。樹脂は濡れたままであったので、樹脂を濾過する必要があった。次に樹脂を真空乾燥キャビネット内で３０℃で４０時間乾燥した。
ＨＰＬＣでの担持分析：０．４０５mmol／ｇ  Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＴＣ
ＨＰＬＣ法：カラム：Keystone Beta Basic C18；移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．０７５％ＴＦＡ、Ｔ＝３０℃、ｔ＝２２分、Ｒｔ＝１２．２分
【００５０】
実施例２
Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ
【００５１】
【化５】
2008515940.tif 000006
ペプチド反応容器に、Ｆｍｏｃ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＴＣ樹脂（担持：０．４０５mmol／ｇ；２．０７５mmol）５ｇを充填した。ジクロロメタン８７．５mlを加えた。樹脂を少なくとも３０分間ジクロロメタン中で膨張させ、溶媒をＮＭＰに交換した。こうして、ＮＭＰ  ８７．５ml（３回）で樹脂の洗浄を行った。ＮＭＰ中の５％ピペリジン溶液中で３０分以内に脱保護を行った。続いて、樹脂をＮＭＰ  ６２．５mlで６回洗浄した。
【００５２】
ＮＭＰ  ８．７５ml中のＦｍｏｃ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−ＯＨ  １．０５ｇ（３．１１mmol）、ＨＯＢｔ  ０．４７７ｇ（３．１１mmol）及びＤＩＥＡ  １．０９ml（６．２２mmol）の溶液を調製し、５分後にＮＭＰ  ７．５ml中のＨＢＴＵ  １．１８ｇ（３．１１mmol）を加えてカップリング処理を行った。１０分間の予備活性化の後、上記の溶液を樹脂に加え、懸濁液を３０℃で２時間注意深く撹拌した。カップリングを、ＮＭＰで十分に洗浄して続けた。
【００５３】
アミノ基の脱保護を、ＮＭＰ中の５％ピペリジン溶液中で３０分以内に行った。続いて、樹脂をＮＭＰで十分に洗浄した。カップリング処理を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ  ０．９２５ｇ（３．１１mmol）の溶液を調製して行った。
【００５４】
ＨＯＢｔ  ０．４７７ｇ（３．１１mmol）及び１．０９ml（６．２２mmol）、ＮＭＰ７．５mlを５分後に加えた。１０分間の予備活性化の後、上記の溶液を樹脂に加え、懸濁液を３０℃で２時間注意深く撹拌した。カップリングを、ＮＭＰで十分に洗浄して続けた。
【００５５】
アミノ基の最後の脱保護を、再度ＮＭＰ中の５％ピペリジン溶液中で３０分以内に行い、続いてＮＭＰ及びジクロロメタン（３回）で十分に洗浄した。次に、樹脂をジクロロメタン７５ml及び４−トルエンスルホニルクロリド（Ｔｏｓ−Ｃｌ）０．４７５ｇ（２．４９mmol）に懸濁し、ＤＩＥＡ  ０．４３ml（２．４９mmol）を加えた。ペプチドの最終開裂を、ＤＣＭ中の１％ＴＦＡ溶液で行った。濾液をトルエンで希釈し、真空下で蒸発した。
粗ペプチド（Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ）１．７ｇを得た。
ＨＰＬＣ：カラム：Keystone Beta Basic C18；移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ）、Ｔ＝３０℃、ｔ＝３４分、Ｒｔ＝１３．９分、Ａ％：８９．６％
ＮＭＲ：１Ｈ、１３Ｃ  合致
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＨ＋７３５．３、ＭＮａ＋７５７．３；［Ｍ−Ｈ］−７３３．３
【００５６】
実施例３
Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ｐ−Ｂｏｃ−アミノアニリド
【００５７】
【化６】
2008515940.tif 000007
反応容器に、ＤＭＦ  ９ml中のＴｏｓ−Ｇｌｙ−（Ｌ）−Ｐｒｏ−（Ｌ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ  ０．６１ｇ（０．８３mmol）を充填し、ＨＯＯＢｔ  ０．１３５ｇ（０．８３mmol）及びＤＩＥＡ  ０．２９ml（１．６６mmol）を加えた。予備活性化した混合物を、５分間撹拌し、次にＤＥＰＢＴ  ０．２４８ｇ（０．８３mmol）及びＮ−Ｂｏｃ−ｐ−フェニレンジアミン０．１５６ｇ（０．７５mmol）を加えた。室温で５時間撹拌した後、溶媒を真空下で留去した。残渣をＨＣｌ水溶液で抽出した。シリカのクロマトグラフィーによる精製の後、生成物０．３９ｇ（８５％）を得た。
【００５８】
ＨＰＬＣ  方法１：カラム：Keystone Beta Basic C18；１５０×４．６mm；勾配法
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ、移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、Ｔ＝３０℃、ｔ＝３４分、Ｒｔ＝１６．１１分、Ａ％：９１．１３％
ＨＰＬＣ  方法２：カラム：Chirobiotic T；１０ｍ、２５０×４．６mm；アイソクラティック法
移動相：（（アセトニトリル：ＭｅＯＨ；１：４）＋０．２％Ｅｔ３Ｎ＋０．２％ＡｃＯＨ）、Ｔ＝３０℃、ｔ＝３０分、Ｒｔ＝４．５３分、Ａ％：９５．４％
ＮＭＲ：１Ｈ及び１３Ｃ：合致
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＨ＋９２５．２、ＭＮａ＋９４７．２、［Ｍ−Ｈ］−９２３．２
【国際調査報告】
2008515940.tif 000010
2008515940.tif 000011