(57)【要約】  本発明は遺伝子発現解析用組成物及び方法に関する。所定態様では、本発明は分解核酸サンプル中のターゲットの増幅用組成物及び方法を提供する。所定態様では、本発明は核酸サンプル中の核酸の品質（例えば分解度）の測定方法を提供する。本発明は更に分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成するための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分解核酸集団のメンバーの増幅方法であって、
ａ）前記分解核酸集団を含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）ターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）分解核酸集団の少なくとも１個のメンバーのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解核酸にアニールさせる段階と；
ｄ）前記コグネイト分解核酸のサブ配列に対応する複数の産物を酵素生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、複数のターゲットアンプリコンを生成することにより、分解核酸集団のメンバーを増幅する段階を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が１，０００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が６００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が約４５０ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が約３００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項６】
分解核酸集団の前記メンバーが約２〜約１００個のメンバーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分解核酸集団の前記メンバーが約１０〜約４０個のメンバーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分解核酸集団の前記メンバーが発現遺伝子ヌクレオチド配列に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１個の発現遺伝子ヌクレオチド配列が構成的に発現された参照遺伝子配列である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１個の発現遺伝子配列の発現レベルを少なくとも１個の他の発現遺伝子配列の発現レベルに比較する段階を更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現遺伝子ヌクレオチド配列が組織特異的遺伝子配列を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分解核酸集団がＲＮＡ又はＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分解核酸集団がＲＮＡを含み、複数の産物を生成する段階が逆転写を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが２８Ｓ及び１８Ｓ  ＲＮＡ種を含む哺乳動物ＲＮＡを含み、１８Ｓ  ＲＮＡに対する２８Ｓ  ＲＮＡの量的比が２．０：１以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが２８Ｓ及び１８Ｓ  ＲＮＡ種を含む哺乳動物ＲＮＡを含み、１８Ｓ  ＲＮＡに対する２８Ｓ  ＲＮＡの量的比が１．８：１以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが全細胞ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルがポリアデニル化ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが固定処理を施した組織サンプルに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルがパラフィン包埋組織サンプルに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する１００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する８０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する６０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
複数の産物を酵素生成する前記段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＣＲが多重ＰＣＲである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多重ＰＣＲが約２〜約１００個のターゲットプライマー対を利用する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記多重ＰＣＲが約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を利用する請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１個のターゲットプライマーが更に前記ターゲット特異的配列と前記ユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
ターゲットプライマー対における各ターゲットプライマーの濃度が前記少なくとも１個のユニバーサルプライマーの濃度よりも低い請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ユニバーサルプライマーの濃度に対する各ターゲットプライマー対の濃度の比が約１：２〜１：１０００である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ユニバーサルプライマーの濃度に対する各ターゲットプライマー対の濃度の比が約１：１０〜１：１００である請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の産物を酵素増幅する段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
１個のターゲットアンプリコンの長さが少なくとも第２のターゲットアンプリコンの長さと相違する請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ターゲットプライマー対の各プライマーが３’末端を含み、前記ターゲットプライマーをコグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、前記フォワードプライマーの前記３’末端が前記リバースプライマーの前記３’末端から２０塩基対以内である請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１個のターゲットアンプリコンがラベルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
複数の前記ターゲットアンプリコンが各々異なるラベルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数のターゲットアンプリコンを検出する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出段階がキャピラリー電気泳動分析により実施される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出段階がハイブリダイゼーション分析により実施される請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ハイブリダイゼーション分析がアレーハイブリダイゼーションを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ハイブリダイゼーション分析がビーズシステムハイブリダイゼーションを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
核酸サンプル中の核酸品質の測定方法であって、
ａ）核酸サンプルを提供する段階と；
ｂ）少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々前記サンプル中の少なくとも１個の核酸のサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト核酸にアニールさせる段階と；
ｄ）前記コグネイト核酸の各々異なる長さのヌクレオチドサブ配列に対応する少なくとも２個の産物を酵素生成する段階と；
ｅ）前記産物を酵素増幅し、少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量する段階と；
ｇ）前記ターゲットアンプリコンの量を比較することにより、前記サンプル中の核酸品質を測定する段階を含む前記方法。
【請求項４３】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が各々同一核酸にアニールする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも２個の産物がオーバーラップするヌクレオチドサブ配列を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも２個の産物がオーバーラップするヌクレオチドサブ配列を含まない請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーが各々更に少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列がターゲット特異的配列に対して５’側に位置しており；前記産物を酵素増幅する段階が少なくとも１個のユニバーサルプライマーを添加して少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階を含み、前記ユニバーサルプライマーが前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１個のターゲットプライマーが更に前記ターゲット特異的配列と前記ユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が異なる核酸にアニールする請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の任意産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が２個のターゲットプライマー対から構成される請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が３個のターゲットプライマー対から構成される請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の２個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ターゲットアンプリコンの量を比較する前記段階が前記ターゲットアンプリコンの相対モル濃度を比較する段階を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
１個のターゲットアンプリコンの相対モル濃度が少なくとも第２のターゲットアンプリコンの相対モル濃度よりも低いことにより、分解核酸を示す請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、
ａ）発現遺伝子に対応する分解ＲＮＡを含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個の分解ＲＮＡのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解ＲＮＡにアニールさせる段階と；
ｄ）前記コグネイト分解ＲＮＡのサブ配列に対応する複数の産物を酵素生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、複数のターゲットアンプリコンを生成することにより、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する段階を含む前記方法。
【請求項５６】
前記複数のターゲットプライマー対が約２〜約１００個のターゲットプライマー対を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数のターゲットプライマー対が約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１個のターゲットアンプリコンがラベルを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
複数の前記ターゲットアンプリコンが各々異なるラベルを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数のターゲットアンプリコンを検出する段階を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記検出段階がキャピラリー電気泳動分析により実施される請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記検出段階がハイブリダイゼーション分析により実施される請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記ハイブリダイゼーション分析がアレーハイブリダイゼーションを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
前記ハイブリダイゼーション分析がビーズシステムハイブリダイゼーションを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
分解核酸を含むサンプルの分析用キットであって、
ａ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個の分解核酸のヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み；
ｉｉｉ）ターゲットプライマー対の各プライマーは３’末端を含み、前記ターゲットプライマーをコグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、前記フォワードプライマーの前記３’末端は前記リバースプライマーの前記３’末端から２０塩基対以内である）と；
ｂ）分解核酸を含むサンプルを分析するための説明書を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／６７７，６１８号（出願日２００５年５月３日）の優先権を主張し、その明細書の開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は遺伝子発現解析の分野に関する。本発明は核酸サンプルの分析用組成物及び方法、より特定的には分解核酸の分析方法と、核酸サンプルの分解度の測定方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子発現解析は広範な生体プロセスの解析に基本的な役割を担っている。遺伝子発現解析の鍵は発現した遺伝子産物（例えば全細胞ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の収集にある。核酸サンプルの完全性は遺伝子発現データの獲得と収集最適化に不可欠である。皮肉にも、組織から単離したＲＮＡサンプルは非常に分解し安く、現行分析法では使用できないことが多い。
【０００４】
遺伝子発現プロファイリングは広範な生体プロセス（例えば腫瘍形成及び腫瘍進行）の解明の鍵になる可能性がある。このような分析は癌診断及び予後診断分野に効果を上げている。即ち、腫瘍進行経過に伴う遺伝子発現プロファイルの変化を観察することにより、初期腫瘍形成、腫瘍進行、各種治療レジームに対する予想応答、及び最終転帰を見通すことができる。従来、臨床病理学者らは数十年間にわたって数百万個の癌特異的組織検体を収集保存している。これらの組織検体は一般に固定とパラフィン包埋により処理されている。
【０００５】
この固定処理は細胞構造を維持するが、残念ながら検体に含まれるＲＮＡを分解し、非常に多くの場合には単離したＲＮＡを一般遺伝子プロファイリング解析に使用できなくなる。発現プロファイリング（又は他の任意アッセイもしくは操作）におけるサンプル有用性を予測する目的でこれらのサンプル中（又は実際に任意ＲＮＡサンプル中）のＲＮＡ品質を測定する技術があるならば、研究界に有益であろう。更に、メッセージ増幅及び発現解析のために分解ＲＮＡサンプルを利用できる改善型高感度技術も有用である。
【０００６】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプル
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルを遺伝子発現解析に使用する際の主要な技術的問題の１つはＲＮＡ品質である。外科処置から固定までの時間、特定固定包埋法、保存時間及び保存条件等の多数の因子に依存して、サンプル内のＲＮＡは各種程度の分解を受ける。ＲＮＡの分解度が高くなるほど、有用な遺伝子発現情報を抽出することは困難になる。
【０００７】
ＦＦＰＥサンプルを使用して癌における遺伝子発現研究を進めようとする場合には、ＦＦＰＥサンプルから抽出したＲＮＡの品質を評価するための一連の堅牢な標準化方法と、定性的及び定量的測定法を確立することが必要になろう。実質的な核酸（例えばＲＮＡ）分解が生じている場合でもこれらのツールは定量的ＲＮＡ（又は他の核酸）分析が可能でなろう。
【０００８】
ＤＮＡマイクロアレーを使用する包括的遺伝子発現解析は癌研究における必須ツールとなっており、多数の腫瘍形成ステージに関連する遺伝子応答、関連する臨床診断及び予後診断、並びに化学療法効力に関する詳細な情報を提供している（例えばｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，（２００２）“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６；Ｖａｓｓｅｌｌｉら，（２００３）“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ，”  ＰＮＡＳ  １００：６９５８−６８６３；Ｂｅｓｔら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−ａｎｄ  Ｍｏｄｅｒａｔｅ−Ｇｒａｄｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”  Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ，１２：６３−７０；及びＯｋｕｔｓｕら，（２００２）“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ２８  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１：１０３５−１０４２参照）。多数の画期的研究が着手されているが、これらの研究アプローチは特に長期予後及び生存に関する詳細な見通しを可能にする長期前向き研究の実施に関して、費用と適切な臨床サンプルの入手しにくさにより制限されていることが多い。
【０００９】
現在進行中の前向き研究の重要な代替アプローチは、例えば過去十年間にわたって保存されてきた癌組織サンプルを利用する後向き研究の実施である。これらのサンプルは既に獲得されており、入手し易いため、長期後向き研究は新規前向き研究の費用のごく一部で実施することができ、重要な臨床転帰関係を将来十年間ではなく、現時点で確認することができる。
【００１０】
臨床病理学者らは各種固定及びパラフィン包埋プロトコールを使用して数十年間に数百万個の癌特異的組織検体を収集保存している。最近のＲＡＮＤ報告によると、米国では１７８，０００，０００人以上の患者に由来する３０７，０００，０００個以上の組織検体が保存されており、毎年２０，０００，０００個の割合でサンプルが追加されていると推定している（Ｅｉｓｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｇａ，（２００１）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｕｒｃｅｓ：Ａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ，Ｒａｎｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＲ９５４）。数千万個のこれらの臨床サンプルは過去１５年間に収集されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。これらのサンプルは大規模後向き研究の膨大な潜在データソースである。しかし、このデータソースを利用する鍵はこれらのサンプルから抽出した様々な品質の核酸、多くの場合には低品質の核酸で実施することができる堅牢で有効な方法の開発にある。
【００１１】
後期顕微鏡分析に備えて組織構造を維持しながらサンプルを周囲環境で長期間保存できるように、ＦＦＰＥサンプルの各種固定及び包埋プロトコールが従来開発されている。これらのプロトコールは遺伝子発現解析に備えてＲＮＡ完全性を維持することを考慮して開発されていない。従って、ＦＦＰＥサンプルから単離したＲＮＡは通常は分解しており、現状ではこれらのサンプルから遺伝子発現情報を確実に抽出することは非常に困難である。従って、ＦＦＰＥサンプルから有用な遺伝子発現データを抽出するためには、（ａ）メッセージ集団の分解度に関する各ＲＮＡサンプルの品質の明瞭で詳細な測定法と、（ｂ）分解度が遺伝子発現測定の正確さにどのように影響するかの詳細な情報を提供することが必要である。
【００１２】
ＦＦＰＥ組織に由来するサンプル中の遺伝子発現レベルの分析は試みられているが、リアルタイムＰＣＲ法を使用した場合には成功が限られている。これらの方法は一般に７０塩基対以上のアンプリコンの作製に限られている。Ｇｏｄｆｒｅｙら（“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ５’  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２（２）：８４−９１（２０００））によるサンプルソース比較試験では、ＦＦＰＥに由来するＲＮＡは新鮮な未固定組織中のＲＮＡレベルを正確に反映できることが分かった。同著者らは新鮮な組織から抽出したＲＮＡとＰＢＳ予備固定時間を変動させたＦＦＰＥサンプルから抽出したＲＮＡを比較し、サンプルの相対発現レベルに有意影響がないことを見出した。これは、予備固定時間が不明の保存組織でも後向き研究の有用なＲＮＡソースになり得るという見解を裏付けるものである。この試験によると、ＦＦＰＥサンプルに由来するＲＮＡは高度に分解しており、短いアンプリコン（例えば９０塩基対）を標的にした場合にはリアルタイム反応のＣｔ値が減少することも分かった。他のＰＣＲ試験もこの知見を裏付けている（Ｓｐｅｃｈｔら，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  Ａｒｃｈｉｖａｌ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ，”  Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５８（２）：４１９−４２９（２００１）；及びＣｒｏｎｉｎら，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ９２−ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，”  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４（１）：３５−４２（２００４））。
【００１３】
別の試験では、黒色腫患者のリンパ節に由来するＦＦＰＥ組織からＲＮＡを抽出し、アンプリコンサイズ以外に固定前の時間、固定時間等の所定変数の影響を分析している。新鮮組織に比較してＦＦＰＥサンプルから抽出した全ＲＮＡの量は著しく減少していることが分かったが、短いアンプリコン（例えば９９塩基対）を増幅することにより、これらの低品質サンプルからのシグナルを１００倍も増加することができた（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，“Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ５（１）：３４−４１（２００３））。
【００１４】
リアルタイムＰＣＲ法を核酸検出に使用してＦＦＰＥサンプルから単離したＲＮＡを分析するこれらの上記試験はＴａｑＭａｎ（登録商標）型プローブによるリアルタイム検出に十分な大きさのアンプリコンを必要とするためにその適用可能性の限界に直面している。例えば、４０〜６０ヌクレオチド範囲でアンプリコンを作製することはできず、更にＴａｑＭａｎ（登録商標）型プローブのスペースが加わる。
【００１５】
適切な方法を利用できるならば、例えば、複数癌兆候、長期疾患予後、及び腫瘍形成メカニズムと化学療法の効果に関する詳細な研究を可能にするための各種ＲＮＡバイオマーカーを得るために、分解核酸（例えば分解ＲＮＡ）のＦＦＰＥサンプルを調査することができる。これらの効果を実現するためには、当分野で現在使用されている方法に存在する多数の技術的限界を解決しなければならない。
【００１６】
ＲＮＡ品質評価
従来、ＲＮＡ品質は少数の主要マーカーを観察することにより測定されている。ＯＤ２６０／２８０比は蛋白及び他の細胞破片による汚染に関する品質尺度となるが、ＲＮＡ完全性については何も示さない。ＲＮＡ完全性は一般に電気泳動法を使用して核酸スミアを観察することにより評価されている。このアプローチの最新のものはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（例えばｔｈｅ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００）等の高感度キャピラリー電気泳動システムを使用している。これらのシステムは一定範囲の分子サイズで存在するＲＮＡの相対量に関する定量的データを提供する。データは一般に図１Ａに示すような電気泳動図として表され、ＲＮＡ品質は主に全ＲＮＡサンプル中の顕著な１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）バンドの相対サイズにより判断される。高品質ＲＮＡサンプルは２．０付近の２８Ｓ／１８Ｓ比をもつが、低品質サンプルは比が低下し、低分子量のＲＮＡフラグメントを含む（図１Ａ及び１Ｂ参照）。最近、数人の研究者がＲＮＡサンプルの品質を採点するためのより複雑な代替方法及びソフトウェアを開発している（Ａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｌｙｉａｎａｒａｃｈｃｈｉ（２００３）“Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  ａｗａｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｈｉｐ  ｂｉａｓ：ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５（４）：２９２−２９３；及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたＲＮＡ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）参照；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，“Ｔｈｅ  ＲＩＮ：ａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，”  ＢＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３（２００６）、及び同社ウェブサイトで閲覧可能な他の技術文書参照）。これらの方法は一般に小フラグメントのサイズと個数に基づいて分解係数又はＲＩＮを計算する。
【００１７】
固定条件により、ＦＦＰＥサンプルに由来する全ＲＮＡサンプルは一般に分解していると思われ、リボソームバンドは殆ど検出されない。フラグメントの平均サイズは一般に数百の範囲であり（図１Ｃ参照）、従って、一貫して低いＲＩＮスコアである。しかし、（例えば図１２に示すようなＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プラットフォーム技術を使用する）マイクロアレー分析に十分なｃＲＮＡターゲットがＦＦＰＥサンプルの非常に小さなフラクションから得られる場合がある。だが、残念ながら、リボソームバンドと小さい分解フラグメントの検出によりＲＮＡ完全性を判断する現行方法では有用なＦＦＰＥサンプルのこのフラクションを識別することができない。更に、サンプル当たりのデータ収率が低く、コストが高いため、ＲＮＡ品質の何らかの事前認定なしにＤＮＡマイクロアレープラットフォームで全サンプルを試験するのは非現実的である。
【００１８】
他のＲＮＡ品質アッセイの開発も試みられている。Ｂｒｏｏｋｓら（２００５；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＧＣ−ＵＲＭＣ）；同Ｃｅｎｔｅｒウェブサイト参照）によると、従来のＲＮＡ品質評価はマイクロアレーハイブリダイゼーションの成績が低いサンプルを必ずしも識別しないことが判明した。ＢｒｏｏｋｓらはｃＤＮＡに逆転写後にＲＮＡサンプルを評価するアッセイを開発した。複数濃度（低、中及び高）の入力ＲＮＡ中に存在することが分かっている３個１組の転写産物に由来する３領域（５’、中間又は３’）からプライマーセットを設計する。リアルタイムＰＣＲを使用して９個のプライマーセットでｃＤＮＡサンプルを個々にアッセイする。（定量的Ｃｔ値ではなく）増幅産物の有無をプライマーセット毎に記録する。増幅産物を生成したプライマーセット数と全遺伝子が検出されたか否かに基づいてサンプル毎にＱＣスコアを計算する。異なるレベルで発現された遺伝子と異なる遺伝子位置からのプライマーに照会することにより、この型のｃＤＮＡメトリックは発現解析での利用についてサンプルを事前認定するために使用されている。この方法は電気泳動分析よりも多少有利であるが、このアプローチは非常に少数のデータセット（約９データ点）しか観察せず、一般に分解したＦＦＰＥサンプル由来ＲＮＡでは実施できない。このアッセイはアンプリコンサイズの関数としての増幅効率に関する情報も考慮しない。
【非特許文献１】ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒら，（２００２）“Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：５３０−５３６
【非特許文献２】Ｖａｓｓｅｌｌｉら，（２００３）“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ，”  ＰＮＡＳ  １００：６９５８−６８６３
【非特許文献３】Ｂｅｓｔら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−ａｎｄ  Ｍｏｄｅｒａｔｅ−Ｇｒａｄｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｃＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”  Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ，１２：６３−７０
【非特許文献４】Ｏｋｕｔｓｕら，（２００２）“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ２８  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，１：１０３５−１０４２
【非特許文献５】Ｅｉｓｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｇａ，（２００１）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｕｒｃｅｓ：Ａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ，Ｒａｎｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＲ９５４
【非特許文献６】Ｇｏｄｆｒｅｙら（“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ５’  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２（２）：８４−９１（２０００）
【非特許文献７】Ｓｐｅｃｈｔら，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  Ａｒｃｈｉｖａｌ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ  ａｎｄ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ，”  Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５８（２）：４１９−４２９（２００１）
【非特許文献８】Ｃｒｏｎｉｎら，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ９２−ｇｅｎｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，”  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６４（１）：３５−４２（２００４）
【非特許文献９】Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら，“Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，”  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ５（１）：３４−４１（２００３）
【非特許文献１０】Ａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｌｙｉａｎａｒａｃｈｃｈｉ（２００３）“Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  ａｗａｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｈｉｐ  ｂｉａｓ：ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５（４）：２９２−２９３
【非特許文献１１】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，“Ｔｈｅ  ＲＩＮ：ａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｆｏｒ  ａｓｓｉｇｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｖａｌｕｅｓ  ｔｏ  ＲＮＡ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，”  ＢＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３（２００６）
【非特許文献１２】Ｂｒｏｏｋｓら（２００５；Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＦＧＣ−ＵＲＭＣ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
（例えば包括的発現プロファイリング用として）マイクロアレーとＰＣＲ試験の両者で使用するＲＮＡの品質を評価する新規改良型アプローチが当分野で必要とされている。ＲＮＡ転写産物のサンプリングの完全性を評価するためのＰＣＲ法；例えば、高度多重ＰＣＲ増幅を利用する方法が必要とされている。例えば、マイクロアレー分析用としての核酸（例えばＲＮＡ）品質及び適性を評価するための革新的なＰＣＲ法が当分野で必要とされている。これらの技術により、膨大な保存ＦＦＰＥサンプルから日常的にデータを抽出することが可能になろう。例えば、複数癌兆候、長期疾患予後、更には腫瘍形成メカニズム、化学療法の効果及び他の因子に関する詳細な研究を可能にするための各種ＲＮＡバイオマーカーを得るために、これらのＦＦＰＥサンプルを調査することができる。
【００２０】
高度分解ＲＮＡサンプルを部分的分解ＲＮＡサンプルから区別することができる分解メトリックを作成する新規方法が切望され続けている。理想的には、所与閾値未満の分解値をもつサンプルを後続遺伝子発現試験から除外し、所与閾値を上回る分解値をもつサンプルを後続遺伝子発現試験に加えるべきである。更に、サンプルがマイクロアレーデータを作成できるか否かの判定に止まらない分解メトリックアッセイが当分野で必要とされている。品質メトリックは更に理想的には所与サンプルから得られる確度と精度に関する品質の潜在レベルに関する情報を提供することが好ましい。
【００２１】
本発明は本明細書に記載するように、当分野のこれらの必要を満たし、他の利点も提供する組成物と方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は分解核酸を増幅し、核酸集団（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）内の分解度を正確に直接測定する新規ＰＣＲ法を提供し、核酸（例えばＲＮＡ）品質の遺伝子レベルメトリックを提供し、更に、分解ＲＮＡ出発材料を使用して遺伝子発現プロファイルを作成する方法を提供する。本発明は従来技術を改善する新規方法を提供し、核酸品質を評価するためのシステムを提供し、更に、分解したホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルを遺伝子発現解析に使用できるようにする方法を提供する。
【００２３】
所定側面では、本発明はサンプル中の分解核酸集団のメンバーの増幅方法として、
【００２４】
ａ）前記分解核酸集団を含むサンプルを提供する段階と；
【００２５】
ｂ）ターゲットプライマー対（但し、ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）分解核酸集団の少なくとも１個のメンバーのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
【００２６】
ｃ）ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解核酸にアニールさせる段階と；
【００２７】
ｄ）コグネイト分解核酸のサブ配列に対応する複数の産物を酵素生成する段階と；
【００２８】
ｅ）ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して複数の産物を酵素増幅して複数のターゲットアンプリコンを生成することにより、分解核酸集団のメンバーを増幅する段階を含む方法を提供する。
【００２９】
所定態様では、分解核酸はＤＮＡであり、サンプルは１，０００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ。他の態様では、核酸はＲＮＡであり、集団は約６００ヌクレオチド以下、４５０ヌクレオチド以下、約３００ヌクレオチド以下のいずれかの平均サイズをもつ。
【００３０】
増幅集団メンバー数は限定されない。例えば、増幅されるメンバー数は約２〜約１００個、約１０〜約４０個とすることができる。所定側面では、分解核酸集団は発現遺伝子ヌクレオチド配列（例えばｍＲＮＡ分子）である。所定側面では、発現遺伝子ヌクレオチド配列は構成的に発現された参照遺伝子である。所定側面では、前記方法は少なくとも１個の発現遺伝子配列の発現レベルを少なくとも１個の他の発現遺伝子配列の発現レベルに比較する段階を更に含む。あるいは、発現遺伝子ヌクレオチド配列は組織特異的遺伝子配列とすることができる。
【００３１】
これらの方法では、分解核酸集団はＲＮＡ又はＤＮＡとすることができる。核酸がＲＮＡである場合には、複数の産物を生成する段階は逆転写を使用することができる。分解哺乳動物ＲＮＡを使用する場合には、１８Ｓ  ＲＮＡに対する２８Ｓ  ＲＮＡの量的比は２．０：１以下、あるいは１．８：１以下である。所定側面では、サンプルは全細胞ＲＮＡ、あるいはポリアデニル化ＲＮＡを含む。所定側面では、サンプルはパラフィン包埋組織サンプル等の固定処理を施した組織サンプルに由来する。
【００３２】
所定態様では、前記方法により生成された複数の産物中の少なくとも１個のメンバーは分解核酸ターゲットに対応する２００塩基対以下、あるいは１００塩基対以下、８０塩基対以下、又は６０塩基対以下のヌクレオチド配列をもつ。本発明の方法では、複数の産物を酵素生成する段階はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、多重ＰＣＲによる酵素核酸重合を使用することができる。所定側面では、多重ＰＣＲは約２〜約１００個のターゲットプライマー対、あるいは約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を使用する。
【００３３】
前記方法の所定態様では、少なくとも１個のターゲットプライマーは更にターゲット特異的配列とユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含むことができる。これらの方法では、ターゲットプライマー対中の各ターゲットプライマーの濃度は少なくとも１個のユニバーサルプライマーの濃度よりも低くすることができる。ユニバーサルプライマーの濃度に対する各ターゲットプライマー対の濃度の比は約１：２〜１：１０００、あるいは約１：１０〜１：１００とすることができる。
【００３４】
これらの方法では、複数の産物を酵素増幅する段階はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を使用することができる。これらの方法では、１個のターゲットアンプリコンの長さは少なくとも第２のターゲットアンプリコンと異なる長さにすることができる。他の側面では、ターゲットプライマーをコグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、フォワードプライマーの３’末端はリバースプライマーの３’末端から２０塩基対以内である。少なくとも１個のターゲットアンプリコンはラベルを含むことができ、更に、複数のターゲットアンプリコンは各々異なるラベルを含むことができる。
【００３５】
これらの方法では、例えば、キャピラリー電気泳動分析、あるいはハイブリダイゼーション分析、例えば、アレーハイブリダイゼーション又はビーズシステムハイブリダイゼーションにより複数のターゲットアンプリコンを検出することができる。
【００３６】
他の側面では、本発明は核酸サンプル中の核酸品質の測定方法（即ち、核酸品質メトリック）を提供する。本方法は、
【００３７】
ａ）核酸を提供する段階と；
【００３８】
ｂ）少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；ｉｉ）フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々サンプル中の少なくとも１個の核酸のサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列を含む）を提供する段階と；
【００３９】
ｃ）ターゲットプライマー対をそのコグネイト核酸にアニールさせる段階と；
【００４０】
ｄ）コグネイト核酸のヌクレオチドサブ配列（各ヌクレオチドサブ配列は長さが異なる）に対応する少なくとも２個の産物を酵素生成する段階と；
【００４１】
ｅ）産物を酵素増幅して少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
【００４２】
ｆ）少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量する段階と；
【００４３】
ｇ）ターゲットアンプリコンの量を比較することにより、サンプル中の核酸品質を測定する段階を含む。
【００４４】
これらの方法の所定側面では、少なくとも２個のターゲットプライマー対は各々同一核酸にアニールする。少なくとも２個の産物はオーバーラップするか又はオーバーラップしないヌクレオチドサブ配列を含むことができる。これらの方法の所定態様では、フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々更に少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、ユニバーサルプライミング配列はターゲット特異的配列に対して５’側に位置しており；産物を酵素増幅する段階は少なくとも１個のユニバーサルプライマーを添加して少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階を含み、ユニバーサルプライマーはユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。更に、少なくとも１個のターゲットプライマーは更にターゲット特異的配列とユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含むことができる。所定側面では、少なくとも２個のターゲットプライマー対は異なる核酸にアニールする。
これらの方法では、各産物はコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は約（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲は他の任意産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と異なる。所定側面では、２個のターゲットプライマー対のみを使用し、あるいは、３個のターゲットプライマー対を使用する。
【００４５】
これらの方法の所定態様では、各産物はコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は約（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲は他の２個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と異なる。
【００４６】
所定態様では、ターゲットアンプリコンの量を比較する段階はターゲットアンプリコンの相対モル濃度を比較する段階を含む。所定側面では、１個のターゲットアンプリコンの相対モル濃度は少なくとも第２のターゲットアンプリコンの相対モル濃度よりも低いことにより、分解核酸を示す。
【００４７】
本発明は分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する方法を提供し、本方法は、
【００４８】
ａ）発現遺伝子に対応する分解ＲＮＡを含むサンプルを提供する段階と；
【００４９】
ｂ）複数のターゲットプライマー対（但し、ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；ｉｉ）フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）サンプル中の少なくとも１個の分解ＲＮＡのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
【００５０】
ｃ）ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解ＲＮＡにアニールさせる段階と；
【００５１】
ｄ）コグネイト分解ＲＮＡのサブ配列に対応する複数の産物を酵素生成する段階と；
【００５２】
ｅ）ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して複数の産物を酵素増幅し、複数のターゲットアンプリコンを生成することにより、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する段階を含む。
【００５３】
これらの方法では、複数のターゲットプライマー対は約２〜約１００個のターゲットプライマー対、あるいは、約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を含むことができる。所定側面では、少なくとも１個のターゲットアンプリコンはラベルを含む。他の側面では、複数のターゲットアンプリコンは各々異なるラベルを含む。本方法では、例えば、キャピラリー電気泳動分析、又はアレーハイブリダイゼーションやビーズシステムハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション分析により複数のターゲットアンプリコンを検出することができる。
【００５４】
所定態様では、本発明は分解核酸を含むサンプルの分析用キットを提供し、前記キットは、
【００５５】
ａ）複数のターゲットプライマー対（但し、ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；ｉｉ）フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）サンプル中の少なくとも１個の分解核酸のヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み；ｉｉｉ）ターゲットプライマー対の各プライマーは３’末端を含み、ターゲットプライマーをコグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、フォワードプライマーの３’末端はリバースプライマーの３’末端から２０塩基対以内である）と；（ｂ）分解核酸を含むサンプルを分析するための説明書を含む。
【００５６】
（定義）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。また、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題としてそのポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
【００５７】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用する。
【００５８】
塩基：本明細書で使用する「塩基」なる用語は相補的塩基又は塩基アナログとの対合においてワトソン・クリック型水素結合を形成することが可能な任意窒素含有複素環部分を意味する。多数の天然及び合成（非天然）塩基、塩基アナログ及び塩基誘導体が公知である。塩基の例としてはプリン及びピリミジンとその修飾物が挙げられる。天然塩基としては限定されないがアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）及びチミン（Ｔ）が挙げられる。本発明で利用される多数の非天然（天然に存在しない）塩基と夫々の非天然ヌクレオチドが当業者に公知であるので、本明細書でこの用語を使用するとき、本発明は天然塩基に限定されない。このような非天然塩基の例は以下に挙げる。
【００５９】
ヌクレオシド：「ヌクレオシド」なる用語は糖（例えばリボースやデオキシリボース）のＣ−１’に塩基が結合した化合物を意味する。
【００６０】
ヌクレオチド：「ヌクレオチド」なる用語は一般にモノマー単位として又はポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。「ヌクレオチド５’−三リン酸」とは糖５’−炭素位置に三リン酸エステル基が結合したヌクレオチドを意味し、「ＮＴＰ」、又は「ｄＮＴＰ」及び「ｄｄＮＴＰ」と言う場合もある。修飾ヌクレオチドは一般に塩基部分の修飾により化学的に修飾された任意ヌクレオチド（例えばＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰ又はＣＴＰ）である。修飾ヌクレオチドとしては、限定されないが、例えばメチルシトシン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウリジン及び６−チオグアニンが挙げられる。本明細書で使用する「ヌクレオチドアナログ」なる用語は天然に存在しない任意ヌクレオチドを意味する。
【００６１】
ポリヌクレオチド又は核酸：本明細書で使用する「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」等の用語はヌクレオチド塩基に対応し得るモノマーサブユニットポリマーを意味し、例えば、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、小核内ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ／ＤＮＡコポリマー、その任意アナログ等が挙げられる。ポリヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖でもよく、遺伝子配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のどちらに相補的でもよい。ポリヌクレオチドはターゲットポリヌクレオチドの相補部分とハイブリダイズしてホモ２本鎖でもヘテロ２本鎖でもよい２本鎖を形成することができる。ポリヌクレオチドの長さは全く限定されない。ヌクレオチド間の結合はヌクレオチド間型ホスホジエステル結合、又は他の任意型の結合とすることができる。「ポリヌクレオチド配列」とは複数のヌクレオチドモノマーのポリマーとしての配列を意味する。「ポリヌクレオチド」なる用語は任意長のヌクレオチドのポリマー形態を含むので、「ポリヌクレオチド」は特定長又は範囲のヌクレオチド配列に限定されない。ポリヌクレオチドは生物学的手段（例えば核酸ポリメラーゼ酵素、例えば、ＰＣＲ反応中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる酵素反応）により作製することもできるし、無酵素システムを使用して合成することもできる。ポリヌクレオチドは酵素により伸長可能でもよいし、酵素により伸長不能でもよい。特に指定しない限り、本発明の特定ポリヌクレオチド配列は明示する配列以外に、場合により相補配列を含む。核酸は任意ソース（例えば細胞抽出液、ゲノムもしくはゲノム外ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡ、又は人工的／化学的に合成された分子）から得ることができる。特に指定しない限り、特定ポリヌクレオチド配列は明示する配列以外に相補配列を含む。更に、任意核酸はこの核酸の任意部分を含むヌクレオチドサブ配列を含むことができ、サブ配列は元の核酸よりも少なくとも１ヌクレオチド短い。
【００６２】
３’−５’ホスホジエステル結合により形成されるポリヌクレオチドは５’末端と３’末端をもつと言うが、これはポリヌクレオチドを形成するために反応させるヌクレオチドモノマーを相互に繋げるときに、モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸をホスホジエステル結合により１方向にその隣接ペントース環の３’酸素（ヒドロキシル）と結合するからである。従って、ポリヌクレオチド分子の５’末端はヌクレオチドの５’位置に遊離リン酸基又はヒドロキシルをもち、ポリヌクレオチド分子の３’末端はペントース環の３’位置に遊離リン酸又はヒドロキシル基をもつ。ポリヌクレオチド分子内で、別の位置又は配列に対して５’側の位置又は配列を「上流」に位置すると言い、別の位置に対して３’側の位置を「下流」と言う。この用語はポリメラーゼが鋳型鎖に沿って５’→３’の方向に進行し、ポリヌクレオチドを伸長するという事実を反映している。特に指定しない限り、ポリヌクレオチド配列を記載する場合には常にヌクレオチドは左から右に向かって５’→３’の方向である。
【００６３】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」なる用語は天然ポリヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド構造、天然主鎖又は天然ヌクレオチド間結合に限定されない。本発明で利用される多様なポリヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド、非天然ホスホジエステル結合及びヌクレオチド間アナログが当業者に周知である。このような非天然構造の非限定的な例としては非リボース糖主鎖、３’−５’及び２’−５’ホスホジエステル結合、ヌクレオチド間逆結合（例えば３’−３’及び５’−５’）、分岐構造、並びにヌクレオチド間アナログ（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、固定化核酸（ＬＮＡ）、Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート結合（例えばメチルホスホネート）、ホスホロアミデート、Ｃ１−Ｃ６アルキルホスホトリエステル、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートヌクレオチド間結合が挙げられる。更に、ポリヌクレオチドは単一型のモノマーサブユニットと単一型の結合のみから構成されるものでもよいし、異なる型のサブユニットと異なる型の結合の混合又は組合わせから構成されるものでもよい（ポリヌクレオチドはキメラ分子でもよい）。本明細書で使用するポリヌクレオチドアナログは天然ポリヌクレオチドと同様に１本鎖核酸ターゲットとハイブリダイズするという点で天然ポリヌクレオチドの本質的性質を保持する。
【００６４】
ＲＮＡ：「ＲＮＡ」なる用語はリボ核酸の頭文字であり、リボヌクレオチドの任意ポリマーを意味する。「ＲＮＡ」なる用語は天然、非天然もしくは修飾ポリヌクレオチド、又はその任意組合わせ（即ち、キメラＲＮＡ分子）を含むポリマーを意味することができる。「ＲＮＡ」なる用語は全生物学的形態のＲＮＡを含み、例えば、ｍＲＮＡ（一般にポリＡ  ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、及び低分子核内ＲＮＡに加え、ｃＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、及び細胞系に内在しない任意型の人工（例えば組換え）転写産物等の非天然形態のＲＮＡが挙げられる。「全細胞ＲＮＡ」なる用語は一般に細胞中の各種ＲＮＡを区別しない単離技術を使用して細胞から単離されたＲＮＡを意味する。従って、全細胞ＲＮＡサンプルはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び他の型のＲＮＡを含む。ポリアデニル化ＲＮＡなる用語はポリＡテールをもつＲＮＡを意味し、一般に「ｍＲＮＡ」と同義に使用される。
【００６５】
ＲＮＡなる用語は２−Ｏ−メチル化リボヌクレオチド等の非天然リボヌクレオチドアナログを含むＲＮＡ分子も意味する。ＲＮＡは酵素合成法や人工（化学）合成法等の任意方法により作製することができる。酵素合成法としては無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系や、例えば原核細胞や真核細胞における細胞系が挙げられる。
【００６６】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」なる用語は「相補的」又は「コピー」ＤＮＡを意味する。一般に、ｃＤＮＡは任意型のＲＮＡ分子（例えば一般にｍＲＮＡ）を鋳型として使用して逆転写酵素活性をもつＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば相補的ＤＮＡ分子を作製するためにＲＮＡ鋳型を使用する核酸ポリメラーゼ）により合成される。あるいは、ｃＤＮＡは特異的化学合成により得られる。
【００６７】
分解−核酸分子に関して本明細書で使用する「分解」なる用語は分子の長さが生細胞中のそのｉｎ  ｖｉｖｏ環境における該当分子の予想全長よりも短い分子の状態を意味する。あるいは、分解なる用語は分子の長さが分子完全性を維持するために当分野で公知の技術を使用してサンプル単離の該当分子の実測長よりも短い単一核酸分子の状態を意味する場合もある。
【００６８】
本明細書で使用する単数形の「核酸分子」等に関する記載は該当分子の複数コピーを含む。実際問題として、核酸分子を可視化、検出、単離又は他の方法で操作するための大半の方法が複数の該当分子に適用される。例えば、ノーザンブロット上の単一バンドはＲＮＡ分子１個のサイズを示すものではなく、特定ＲＮＡ種の大部分の転写産物のサイズを表す。
【００６９】
「分解」なる用語の適用を以下の例により表すことができる。特定発現遺伝子Ｘは（そのクローン化ｃＤＮＡ及び／又はゲノム配列から）２，０００塩基対ｍＲＮＡをコードすると予想される。１側面では、任意サンプル中の２，０００塩基対よりも短い任意遺伝子Ｘ  ｍＲＮＡが分解ｍＲＮＡである。
【００７０】
別の側面では、ＲＮＡ品質を維持する方法（例えばＤＥＰＣ、ＲＮアーゼ又はＤＮアーゼ阻害剤、低剪断力等を使用する方法）を使用して核酸サンプル（例えばポリＡ−ＲＮＡサンプル）を単離することができる。例えばノーザンブロットにより遺伝子Ｘ  ｍＲＮＡ発現をこれらのＲＮＡサンプルで分析する場合には、約１，９５０塩基対長の主要バンドが観察される。１側面では、１，９５０塩基対長よりも短い任意Ｘ  ｍＲＮＡが分解遺伝子Ｘ  ｍＲＮＡである。
【００７１】
別の側面では、哺乳動物全ＲＮＡを含むサンプルが分解しているか否かの判断は２８ＳリボソームＲＮＡと１８ＳリボソームＲＮＡの定量比を観察することにより行われる。この技術は定着しており、当分野で広く使用されている。所定態様では、２．０：１の２８Ｓ：１８Ｓ比が未分解ＲＮＡサンプルを定義するための適切な基準であり、２．０：１未満の任意比を分解とみなす。他の態様では、特にＲＮＡサンプルが生体からの組織サンプルに由来する場合には、１．８：１が未分解ＲＮＡサンプルを定義するための適切な基準とみなされ、１．８：１未満の２８Ｓ：１８Ｓ比をもつ任意サンプルが分解しているとみなされる。
【００７２】
所定態様では、全細胞ＲＮＡ又はポリＡ−ＲＮＡのサンプルはサンプルの平均核酸サイズが約６００ヌクレオチド以下の場合に分解している。あるいは、全細胞ＲＮＡ又はポリＡ−ＲＮＡのサンプルはサンプルの平均核酸サイズが約４５０ヌクレオチド以下の場合に分解している。あるいは、全細胞ＲＮＡ又はポリＡ−ＲＮＡのサンプルはサンプルの平均核酸サイズが約３００ヌクレオチド以下の場合に分解している。サンプル中の核酸の平均サイズは適切な任意方法により測定することができ、例えばアガロースゲル電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動と適切な染色／可視化プロトコールを併用する。あるいは、サンプル中の核酸の平均サイズは当分野で公知のクロマトグラフィー、各種サイズ分別マイクロ及びナノフルイディック法、又は顕微鏡及び質量分析法により測定することができる。なお、ＲＮＡ分解はＲＮＡの直接観察又は潜在分解ＲＮＡに由来するｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ産物の観察により判定することができる。
【００７３】
他の側面では、本発明で使用されるサンプルは分解ゲノムＤＮＡサンプルである。ゲノムＤＮＡ分解状態を評価するための各種標準が当分野で公知である。これらの標準及び技術は分解ＲＮＡを判断するために使用される基準と異なる場合もある。広義な意味でｉｎ  ｖｉｖｏでは、無傷全長染色体の長さよりも短い任意ＤＮＡ断片を分解ＤＮＡ分子とみなすことができる。しかし、実際問題として、実験室操作を可能にするためにはゲノムＤＮＡをある程度まで断片化する必要がある。この意図的断片化は適切な任意手段により実施することができ、限定されないが、機械的剪断や、酵素又は化学的消化が挙げられる。ゲノムＤＮＡ分解状態は断片化後の平均フラグメントサイズを可視化することにより判定することができる。例えば、大半の実験室分析の目的には、約１０，０００ヌクレオチド以上の平均フラグメントサイズをもつゲノムＤＮＡのサンプルを無傷とみなすことができる。他の態様では、約５，０００ヌクレオチド以上の平均フラグメントサイズをもつゲノムＤＮＡのサンプルを無傷（即ち未分解）とみなすことができる。他の態様では、約２，０００ヌクレオチド以上の平均フラグメントサイズをもつゲノムＤＮＡのサンプルを無傷（即ち未分解）とみなすことができる。（例えば特異的酵素消化又は剪断により）意図的に作製したものであるか又は（例えば不適切なサンプル保存、固定処理等の組織処理、又はアポトーシスもしくは壊死等の細胞メカニズムにより）非意図的に生じたかに関係なく、多くの場合には上記よりも小さい平均フラグメントサイズ（本明細書で「分解」と言う）が観察される。所定態様では、分解ゲノムＤＮＡサンプルは約１，０００ヌクレオチド以下の平均フラグメントサイズをもつＤＮＡサンプルであると定義することができる。ＤＮＡのサイズと分解の程度を測定するためには電気泳動（例えばアガロースゲル電気泳動）と染色を使用することができる。
【００７４】
増幅：本明細書で使用する「増幅」、「増幅する」等の用語は一般に分子又は関連分子セットのコピー数の増加をもたらす任意プロセスを意味する。ポリヌクレオチド分子に関して増幅とは、一般に少量のポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）から出発してポリヌクレオチド分子、又はポリヌクレオチド分子の一部の複数コピーを生産することを意味し、増幅された材料（例えばｃＤＮＡ）は一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は各種化学的及び酵素プロセスを含む。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応、転写介在増幅（ＴＭＡ）反応、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）反応、又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）中に鋳型ＤＮＡ分子の１又は少数コピーから複数のＤＮＡが生成されることが各種形態の増幅である。増幅は出発分子の厳密な複製に限定されない。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用してサンプル中の少量のウイルスＲＮＡから複数のｃＤＮＡ分子を作製することも増幅の１形態である。更に、転写プロセス中にＤＮＡ分子１個から複数のＲＮＡ分子が生成されることも増幅の１形態である。
【００７５】
所定態様では、場合により、増幅後に付加段階を実施し、限定されないが、例えば標識、配列決定、精製、単離、ハイブリダイゼーション、サイズ分解、発現、検出及び／又はクローニングが挙げられる。
【００７６】
ポリメラーゼ連鎖反応：本明細書で使用する「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）なる用語はサンプル中のターゲットポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加するための当分野で周知の増幅法を意味し、サンプルは単一ポリヌクレオチド種でも複数ポリヌクレオチドでもよい。一般に、ＰＣＲ法は所望ターゲット配列を含む反応混合物にモル過剰の２個以上の伸長可能なオリゴヌクレオチドプライマーを導入することから構成され、プライマーは２本鎖ターゲット配列の相互に逆向きの鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼの存在下で反応混合物を熱サイクルプログラムに付すと、ＤＮＡプライマーに挟まれた所望ターゲット配列が増幅する。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）はＲＮＡ鋳型と逆転写酵素、又は逆転写酵素活性をもつ酵素を使用してまず１本鎖ＤＮＡ分子を作製した後にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼプライマー伸長を複数サイクル実施するＰＣＲ反応である。多様なＰＣＲ増幅法が当分野で広く知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）等の多くの文献に記載されている。
【００７７】
多重ＰＣＲ：「多重ＰＣＲ」又は「多重反応」なる用語は、一般に１回の反応で３個以上のプライマーを使用することにより、単一反応混合物中に２個以上の増幅産物を生産するＰＣＲ反応を意味する。「多重増幅」なる用語は単一反応混合物中で同時に実施される複数の増幅反応を意味する。本発明に関して、「同時」なる用語は２以上の反応（例えば複数のハイブリダイゼーション反応）が実質的に同時に実施されることを意味する。例えば、ハイブリダイズしようとする試薬（例えば３個以上のプライマー）を同時に及び／又は同一溶液中でターゲット核酸と接触させる。
【００７８】
ターゲット：本明細書で使用する「ターゲット」、「ターゲットポリヌクレオチド」、「ターゲット配列」等は相補的ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡポリメラーゼプライマー）とのハイブリダイゼーションの対象である特定ポリヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドとそのターゲットとのアニールの結果として形成されるハイブリダイゼーション複合体を「ターゲットハイブリダイゼーション複合体」と言う。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で形成することもできるし（従って可溶性）、ハイブリダイゼーション複合体の１個以上の成分を固相（例えばターゲットハイブリダイゼーション複合体の分離もしくは単離を容易にするためにビーズシステムに固定するか、又はマイクロアレーに配置したドットブロット）に結合することもできる。ターゲット配列の構造は限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そのアナログ、又はその組合わせから構成することができ、１本鎖でも２本鎖でもよい。ターゲットポリヌクレオチドは任意ソースに由来することができ、限定されないが、例えば原核生物、真核生物、植物、動物、及びウイルス等の任意生体又はかつての生体に加え、合成及び／又は組換えターゲット配列が挙げられる。所定側面では、「ターゲット」の存在、不在又は存在量を測定する。あるいは、ターゲットを増幅することができる。
【００７９】
鋳型：一般に、「鋳型」なる用語は例えばポリメラーゼ酵素の作用により相補配列にコピーすることが可能な配列として機能することができる任意核酸ポリマーを意味する。所定側面では、ハイブリダイゼーション複合体中のターゲットポリヌクレオチドは「鋳型」として機能し、伸長可能なポリヌクレオチドプライマーが鋳型と結合し、鋳型の塩基配列を相補的ポリヌクレオチドの合成用パターンとして使用してヌクレオチド重合を開始する。
【００８０】
プライマー又はターゲットプライマー又はターゲット特異的プライマー：本明細書で使用する「プライマー」又は「ターゲットプライマー」等の用語は一般にターゲット配列の相補的（又は部分相補的）プライマー特異的部分とアンチパラレルにハイブリダイズするように設計された規定配列をもつ３’側に酵素伸長可能なオリゴヌクレオチドを意味し、即ち、プライマーは少なくとも１個のコグネイトターゲット核酸をもつ。更に、プライマーは鋳型依存的にヌクレオチド重合を開始し、ターゲットポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを生成することができる。ターゲットにアニールしたプライマーを伸長させるには適切な反応条件では適切なＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを使用する。当業者に周知の通り、重合反応条件及び試薬は当分野で定着しており、各種文献に記載されている。
【００８１】
プライマー伸長を生じるためにプライマー核酸がその鋳型サブ配列に対して１００％の相補性をもつ必要はなく、ハイブリダイゼーションとポリメラーゼ伸長が生じるためには１００％未満の相補性のプライマーで十分である。場合により、プライマー核酸を必要に応じて標識してもよい。プライマーで使用される標識は適切な任意標識とすることができ、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の検出手段により検出することができる。
【００８２】
ユニバーサルプライマー：「ユニバーサルプライマー」なる用語は多重反応で全部又はほぼ全部の潜在ターゲット配列とハイブリダイズすることが可能なユニバーサル配列を含むプライマーを意味する。「セミユニバーサルプライマー」なる用語は多重反応で潜在ターゲットの全部ではないが、２個以上（例えばサブセット）とハイブリダイズすることが可能なプライマーを意味する。「ユニバーサル配列」、「ユニバーサルプライミング配列」又は「ユニバーサルプライマー配列」等の用語は複数のプライマーに含まれる配列を意味し、ターゲットに存在するユニバーサルプライミング配列はユニバーサルプライマーに相補的である。
【００８３】
プライマー対又は増幅プライマー対：本明細書で使用する「プライマー対」又は「増幅プライマー対」なる用語は一般にそのターゲットポリヌクレオチド配列に対してモル過剰で存在しており、一緒になってターゲット配列の鋳型依存性酵素ＤＮＡ合成及び増幅を開始し、２本鎖アンプリコンを生成する２個のプライマーのセットを意味する。プライマー対は「フォワードプライマー」と「リバースプライマー」（又は左プライマーと右プライマー）から構成されると言う場合があり、ターゲット２本鎖の異なる鎖から逆方向に核酸重合を開始していることを示す。
【００８４】
アンプリコン：本明細書で使用する「アンプリコン」なる用語は特定ターゲット核酸の増幅後に生成されるポリヌクレオチド分子（又は集合的に複数の分子）を意味する。アンプリコンを作製するために使用される増幅法は適切な任意方法とすることができ、最も一般的には、例えばＰＣＲ法を使用する。アンプリコンは必ずしもそうでない場合もあるが、一般にＤＮＡアンプリコンである。アンプリコンは１本鎖でも２本鎖でもよいし、任意濃度比のその混合物でもよい。
【００８５】
リアルタイムＰＣＲ：本明細書で使用する「リアルタイムＰＣＲ」なる用語は増幅の完了後に検出又は定量段階を必要とせずに、特定アンプリコンがＰＣＲにより生成されるにつれてアンプリコンの検出、一般にはその定量が行われることを意味する。アンプリコン蓄積の一般的なリアルタイム検出法は５’−ヌクレアーゼアッセイ（別称蛍光５’−ヌクレアーゼアッセイ）、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）分析により実施される（Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０（１９９１）；及びＨｅｉｄら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）参照）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法では、２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ反応に特異的なアンプリコンを生成する。２個のＰＣＲプライマー間に位置するアンプリコン中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするように第３のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を設計する。このプローブはＰＣＲ反応で使用されるＤＮＡポリメラーゼにより伸長できない構造にすることができ、（必ずしもそうでない場合もあるが）一般に相互に密接に近接する蛍光レポーター色素とクエンチャー部分で同時標識する。蛍光色素とクエンチャーはプローブ上にあるので、両者が密接に近接している場合には、レポーター色素からの発光はクエンチャー部分により消光される。場合により、蛍光レポーター色素又は別の検出可能な部分のみでプローブを標識してもよい。
【００８６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ反応は５’−３’ヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。ＰＣＲ増幅反応中に、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は鋳型依存的にアンプリコンとハイブリダイズした標識プローブを開裂する。得られたプローブフラグメントはプライマー／鋳型複合体から解離するので、レポーター色素はクエンチャー部分の消光効果から解放される。合成される新規アンプリコン分子１個当たりレポーター色素約１分子が遊離し、消光されていないレポーター色素を検出すると、遊離した蛍光レポーター色素の量はアンプリコン鋳型の量に正比例するといったデータの定量的解釈の基礎が得られる。
【００８７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイデータの１つの尺度は一般に閾値サイクル（ＣＴ）として表され、蛍光シグナルが最初に統計的に有意であると記録されるとき又は蛍光シグナルが他の何らかの任意レベル（例えば任意蛍光レベルないしＡＦＬ）を上回るときのＰＣＲサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。
【００８８】
５’−ヌクレアーゼアッセイのプロトコールと試薬は当業者に周知であり、各種文献に記載されている。例えば、５’−ヌクレアーゼ反応はいずれも参考資料として本明細書に組込む米国特許第６，２１４，９７９号、発明の名称「均一アッセイシステム（ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ）」、発行日２００１年４月１０日、発明者Ｇｅｌｆａｎｄら；米国特許第５，８０４，３７５号、発明の名称「ターゲット核酸の検出用反応混合物（ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＡＲＧＥＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ）」、発行日１９９８年９月８日、発明者Ｇｅｌｆａｎｄら；米国特許第５，４８７，９７２号、発明の名称「隣接してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに作用するポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性による核酸検出（ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＢＹ  ＴＨＥ  ５’−３’  ＥＸＯＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ  ＡＣＴＩＮＧ  ＯＮ  ＡＤＪＡＣＥＮＴＬＹ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＥＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ）」、発行日１９９６年１月３０日、発明者Ｇｅｌｆａｎｄら；及び米国特許第５，２１０，０１５号、発明の名称「核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を使用する均一アッセイシステム（ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ  ＡＳＳＡＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＵＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＮＵＣＬＥＡＳＥ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＯＦ  Ａ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ）」、発行日１９９３年５月１１日、発明者Ｇｅｌｆａｎｄらに記載されている。リアルタイムＰＣＲ法の各種変法も周知である。
【００８９】
相補的：「相補的」又は「相補性」なる用語は標準ワトソン・クリック相補性原理に従って塩基対合することができるか、又は比較的ストリンジェントな条件下で特定核酸セグメントとハイブリダイズすることができる核酸配列を意味する。場合により、核酸ポリマーは場合によりその完全配列の一部のみで相補的である。本明細書で使用する「相補的」なる用語はワトソン・クリック（及び場合によりフーグスティーン型）塩基対合原理によるポリヌクレオチドのアンチパラレル鎖に関して使用される。例えば、配列５’−ＡＧＴＴＣ−３’は配列５’−ＧＡＡＣＴ−３’に相補的である。「完全に相補的」又は「１００％相補的」等の用語はアンチパラレル鎖間に完全なワトソン・クリック塩基対合をもつ相補配列（ポリヌクレオチド２本鎖にミスマッチが存在しない）を意味する。「部分的相補性」、「部分的に相補的」、「不完全相補性」又は「不完全に相補的」等の用語はアンチパラレルポリヌクレオチド鎖間の１００％未満の任意塩基アラインメント（例えばポリヌクレオチド２本鎖に少なくとも１個のミスマッチが存在する）を意味する。更に、そのアラインメントに１個以上のミスマッチ、ギャップ又は挿入が存在する場合に、２個の配列はその長さの一部で相補的であると言う。１本鎖核酸「相補体」とは１本の所与核酸鎖に相補的又は部分的に相補的な１本の核酸鎖を意味する。
【００９０】
更に、ターゲットポリヌクレオチドの「相補体」とはターゲットポリヌクレオチドの少なくとも一部とアンチパラレルの関係で結合（例えばハイブリダイズ）することが可能なポリヌクレオチドを意味する。アンチパラレルな関係は分子内（例えば核酸分子内のヘアピンループの形態）でもよいし、分子間（例えば２個以上の１本鎖核酸分子が相互にハイブリダイズする場合）でもよい。
【００９１】
ハイブリダイズ又はアニール：本明細書で使用する場合、２個の核酸が一般に溶液中で一般にアンチパラレル核酸分子間の塩基対合現象により相互に会合し、２本鎖又は他の高次構造（一般にハイブリダイゼーション複合体と言う）を形成するときにこれらの核酸は「ハイブリダイズ」又は「アニール」又は「結合」すると言う。２個の相補性領域がハイブリダイズする能力は相補性領域の長さ及び連続性と、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。２個の任意核酸間（例えばアレープローブとｃＤＮＡ等の増幅ＲＮＡターゲットの間）のハイブリダイゼーションについて記載するとき、ハイブリダイゼーションはターゲット又はプローブの一部のみを言う場合がある。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の詳細に特徴付けられている各種物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは参考資料として本明細書に組込むＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ（Ｅｄ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ，ＩＩ，ａｎｄ  ＩＩＩ，１９９７に記載されている。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はＤＮＡ及びＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出及び定量について詳述している。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２は参考資料として本明細書に組込む。
【００９２】
アンチパラレルポリヌクレオチド分子間の主要な相互作用は一般にワトソン・クリック及び／又はフーグスティーン型水素結合により塩基特異的（例えばＡ／Ｔ及びＧ／Ｃ）である。２個のポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを達成するためにその全長にわたって１００％の相補性をもつ必要はない。所定側面では、ハイブリダイゼーション複合体は分子間相互作用から形成することができ、あるいは分子内相互作用から形成することができる。
【００９３】
特異的にハイブリダイズする：本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」等の用語はアニール対が相補性を示し、ハイブリダイゼーション反応で他の潜在結合パートナーを退けて相互に優先的に結合する複合体を生じるハイブリダイゼーションを意味する。なお、「特異的にハイブリダイズする」なる用語は得られるハイブリダイゼーション複合体が１００％の相補性をもつ必要はなく、ミスマッチをもつハイブリダイゼーション複合体も特異的にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。
【００９４】
ストリンジェントハイブリダイゼーション：核酸ハイブリダイゼーションに関して本明細書で使用する「ストリンジェントハイブリダイゼーション」条件又は「ストリンジェント条件」は配列依存性であり、環境パラメーターにより異なる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出に記載されている。一般に、「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は規定イオン強度及びｐＨで特定配列の熱融点（Ｔｍ）よりも少なくとも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）ターゲット配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。超ストリンジェントは本発明の特定核酸のＴｍと等しくなるように選択され、これは、例えば遺伝コードにより許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、状況により異なる。配列が長いほど高温で特異的にハイブリダイズする。
【００９５】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。高ストリンジェント洗浄条件の１例は７２℃、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで約１５分間洗浄する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣバッファーについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。例えば１００ヌクレオチドを上回る２本鎖の中ストリンジェンシー洗浄の１例は４５℃、１×ＳＳＣで１５分間である。例えば１００ヌクレオチドを上回る２本鎖の低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、４−６×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで対照プローブに観測される比の２倍（又はそれ以上、例えば、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又はそれ以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたと判断する。例えば、対照プローブは本明細書に記載するような該当核酸に対して相同のものとすることができる。ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
【００９６】
所定態様では、ストリンジェントハイブリダイゼーションとしては、例えば、温度５５℃及びｐＨ７．４で２．０×ＳＳＰＥ（０．３６Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）及び０．５％ＳＤＳが挙げられる。最適ＳＳＰＥ範囲としては例えば、１．８（高ストリンジェンシー）〜２．２×（低ストリンジェンシー）が挙げられる。ＳＤＳの添加百分率を変えてもストリンジェンシーに影響しないと思われる。最適温度範囲としては例えば５４〜５６℃が挙げられる。アッセイ結果としては一般に高ストリンジェンシー条件（例えば５７℃以上）で淡／低シグナルが発生し、低ストリンジェンシー条件（例えば５３℃以下）で一般に付加的な非特異的シグナル（及び濃いシグナル）が発生する。最適ｐＨ範囲としては例えば７．２〜７．６が挙げられる。例えばｐＨ８．０以上の高ストリンジェンシー条件では一般に淡いシグナルが発生し、例えばｐＨ６．５以下の低ストリンジェンシー条件では一般に交差ハイブリダイゼーションレベルの増加と共に濃いシグナルが発生する。
【００９７】
他方、本明細書で使用する「低ストリンジェンシー」なる用語は一般に高イオン強度と低温のハイブリダイゼーション条件を意味する。低ストリンジェンシー条件下では、不完全な相補性をもつポリヌクレオチドでも容易にハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。
【００９８】
遺伝子：本明細書で使用する「遺伝子」なる用語は最も一般には、天然又は組換えにより機能的に連結しているときに所定産物又は機能を提供するポリヌクレオチドエレメントの組合わせを意味する。「遺伝子」なる用語は本明細書では遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ形態を含めて広義に解釈する。所定側面では、遺伝子はポリペプチドの産生に必要なコーディング配列（例えば「オープンリーディングフレーム」又は「コーディング領域」）を含み、他の側面では、遺伝子はポリペプチドをコードしない。ポリペプチドをコードしない遺伝子の例としてはリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）と転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子が挙げられる。
【００９９】
「遺伝子」なる用語は場合により遺伝子座に存在する非コーディング調節領域を意味する場合がある。例えば、核酸のコーディング領域に加え、「遺伝子」なる用語はコーディング領域の５’及び３’末端に隣接する全長ｍＲＮＡの転写ヌクレオチド配列も意味する。これらの非コーディング領域はサイズが可変であり、一般にコーディング領域の５’及び３’末端の両方に伸びる。コーディング領域の５’及び３’に位置し、ｍＲＮＡ上に含まれる配列を５’及び３’非翻訳配列（５’ＵＴ及び３’ＵＴ）と言う。５’及び３’ＵＴのどちらも翻訳開始、転写後開裂及びポリアデニル化等の調節機能を果たすことができる。「遺伝子」なる用語は遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びゲノム形態を含む。
【０１００】
所定側面では、遺伝子のゲノム形態又はゲノムクローンは転写ｍＲＮＡの配列と、転写産物の外側に位置する他の非転写配列を含む。ｍＲＮＡ転写単位の外側に位置する調節領域を「５’又は３’フランキング配列」と言う場合がある。遺伝子の機能的ゲノム形態は一般に転写調節に必要な調節因子を含む。
【０１０１】
「発現産物」はゲノム又は他の遺伝子エレメントから夫々転写又は翻訳されたリボ核酸（ＲＮＡ）又はポリペプチド産物である。一般に、発現産物は遺伝子、場合により生物学的性質をもつ遺伝子と結合している。従って、「遺伝子」なる用語は生物学的性質に関連する（例えば生理的性質をもつ遺伝子産物をコードする）核酸配列を意味する場合がある。遺伝子は場合により遺伝子の発現に必要な配列情報（例えばプロモーター、エンハンサー等）を含む。
【０１０２】
遺伝子発現：「遺伝子発現」なる用語は（一般に内在遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏプロセスに関して）ＲＮＡ産物への遺伝子転写を意味し、場合により１個以上のポリペプチド配列への翻訳を意味する。「転写」なる用語は遺伝子のＤＮＡ配列をＲＮＡ産物にコピーするプロセスを意味し、一般にＤＮＡを鋳型として使用してＤＮＡ特異的ＲＮＡポリメラーゼにより実施される。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、遺伝子は可変発現パターンを示すことが多く、即ち、全遺伝子が全細胞型で常に発現されるわけではなく、更に、任意２個の遺伝子は異なる遺伝子発現パターンをもつことが多い。例えば、「構成的に活性な」又は「構成的に発現される」遺伝子は一般に多数又は大半の細胞型で一般に時間的に独立して発現される遺伝子である。他方、「組織限定的」又は「組織特異的」発現を示す遺伝子もあり、その場合には遺伝子の発現は特定細胞型又は細胞型のサブセットに限定される。
【０１０３】
「参照配列」又は「参照遺伝子」なる用語はサンプル中の増幅ターゲットとして機能し、アッセイの対照となる核酸配列を意味する。参照はサンプルソースに対して内部のもの（即ち内在）でもよいし、サンプルに外部から付加したもの（即ち外来）でもよい。構成的に発現される遺伝子を参照遺伝子として使用することが多い。
【０１０４】
「遺伝子発現プロファイル」なる用語は遺伝子発現の各種側面に関する情報を含む１個以上のデータセットを意味する。データセットは場合により細胞又は細胞由来サンプル中のターゲット転写産物の存在；ターゲット転写産物の相対及び絶対存在量レベル；各種処理が特定遺伝子の発現を誘導する能力；及び各種処理が特定遺伝子の発現を異なるレベルに変化させる能力に関する情報を含む。
【０１０５】
「遺伝子発現プロファイル」なる用語は所与時点で複数の遺伝子について収集した遺伝子発現データ（上記定義による）を意味する。所定態様では、「遺伝子発現プロファイル」は特定転写状態、例えば所与セットの生理的条件下の細胞又は組織の「転写」を意味する。例えば、遺伝子発現プロファイルは特定細胞型又は特定生理的状態の特徴を示す。遺伝子発現プロファイルは比較の性格をもち、例えば、処理細胞と未処理細胞の遺伝子発現プロファイルを比較したり、癌細胞と正常又は前癌細胞の遺伝子発現プロファイルを比較する。
【０１０６】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生成を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【０１０７】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生成を誘導するために第１の分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を利用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスの場合のようにポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、当然のことながら、この場合に使用する「コードする」とは転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【０１０８】
単離：核酸、蛋白質又は他の成分はこの成分が通常会合している成分（他の蛋白質、核酸、細胞、合成試薬等）から部分的又は完全に分離されているときに「単離」されている。
【０１０９】
濃縮：本明細書で使用する場合、核酸、蛋白質又は他の成分は処理後の不均一混合物中のその相対比率（即ち割合）が処理前（例えば精製段階前）の不均一混合物中のその相対比率に比較して増加しているときに処理後の不均一混合物中で「濃縮」されている。
【０１１０】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物を使用するか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【０１１１】
同様に、「から誘導」なる用語はポリヌクレオチドにも適用することができる。ソースポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドはソースヌクレオチド配列と同一又は実質的に同様のヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドの場合には、誘導種は例えば突然変異誘発により得ることができる。所定側面では、誘導ポリヌクレオチドはソースポリヌクレオチドを異種環境（即ちその天然又は内在環境と異なる環境）に置くことにより作製される。例えば、内在プロモータードメインを取り出し、通常では関連していない別のヌクレオチド配列と機能的に組合わせて配置することにより内在遺伝子プロモーターから遺伝子プロモーターを誘導することができる。
【０１１２】
に対応：本明細書で使用する「に対応」又は「に対応する」なる用語又は同様の表現はある成分が所定の重要な性質において別の成分と関連していることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドの場合、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが同一又はほぼ同一（又は相補的）のヌクレオチド塩基一次配列をもつならば、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対応する。所定側面では、第２のポリヌクレオチドから誘導されるポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対応する。例えば、ＰＣＴアンプリコンはその増幅源である鋳型核酸に対応する。また、例えば、ＲＮＡ転写産物はその転写源であるゲノム配列に対応すると言える。
【０１１３】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」又は同等の用語は一般的な意味では、レポーターの検出が所定の他の分子又は性質の有無に相関する被験系で容易に検出することができる任意成分、あるいは該当系でターゲットを同定、選択及び／又はスクリーニングするために使用することができる任意成分を意味する。特定用途に使用するために最適なレポーターの選択は所期用途と当業者に公知の他の変数により異なる。所定側面では、レポーターはレポーター遺伝子である。
【０１１４】
多様なレポーター分子及び遺伝子が当分野で公知である。レポーター毎にこのレポーターを検出する特定アッセイがある。レポーター検出アッセイは酵素アッセイでもよいし、免疫的性格のアッセイ又は比色アッセイでもよい。更に、レポーターとしては例えば蛍光マーカー（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等の緑色蛍光蛋白質、又は非蛋白蛍光分子）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又は酵素活性が挙げられる。
【０１１５】
発現：「発現」なる用語はポリヌクレオチドから誘導されるセンスｍＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの転写と蓄積を意味する。発現はｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を意味する場合もある。
【０１１６】
プローブ：本明細書で使用する「プローブ」なる用語は一般に該当ターゲット核酸とハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドを意味する。必ずしもそうでない場合もあるが、一般に、プローブはプローブ（従ってそのターゲット）を検出、可視化、測定及び／又は定量できるように適切なラベル又はレポーター部分と結合している。標識プローブの検出システムとしては限定されないが、蛍光、蛍光消光（例えばＦＲＥＴ対検出システムを使用する場合）、酵素活性、吸光度、分子量、放射能、発光又はレポーターの特異的結合を可能にする結合特性（例えばレポーターが抗体の場合）の検出が挙げられる。所定態様では、プローブはポリヌクレオチドではなく、該当核酸ヌクレオチド配列に対する結合特異性をもつ抗体とすることができる。本発明は特定プローブラベル又はプローブ検出システムに限定するものではない。プローブで使用されるポリヌクレオチドソースは限定されず、非酵素システムで合成により作製することもできるし、（例えば細菌細胞中で）生物（例えば酵素）系を使用して産生されるポリヌクレオチド（又はポリヌクレオチドの一部）でもよい。
【０１１７】
一般に、プローブは選択されたハイブリダイゼーション条件（限定されないが、例えばストリンジェントハイブリダイゼーション条件）下でターゲット配列と安定なハイブリダイゼーション複合体を形成するために核酸に含まれる特定ターゲット配列と十分に相補的である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブを使用してハイブリダイゼーションアッセイを実施すると、特定ターゲット配列を選択的に検出することができる。
【０１１８】
ラベル又はレポーター：本明細書で使用する「ラベル」又は「レポーター」なる用語はその最も広義な意味において、検出可能な任意部分又は特性、あるいはこれと関連する部分又は特性の検出を可能にする任意部分又は特性を意味する。例えば、ラベルを含むポリヌクレオチドは検出可能である（所定側面では、プローブと言う）。理想的には、標識ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする。所定側面では、例えば、ポリヌクレオチドにラベルを（共有又は非共有的に）結合する。各種側面で、ラベルは（ｉ）検出可能なシグナルを発生する；（ｉｉ）第２のラベルと相互作用して第２のラベルにより発生される検出可能なシグナルを変化させる（例えばＦＲＥＴ）；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションを安定化する（例えば２本鎖形成）；（ｉｖ）捕獲機能（例えば疎水性相互作用、抗体／抗原、イオン錯形成）を付与する；又は（ｖ）電気泳動度、疎水性、親水性、溶解度、もしくはクロマトグラフィー挙動等の物性を変化させることのうちのいずれか１種又は２種以上の機能を発揮することができる。ラベルはその構造とその作用メカニズムが多様である。
【０１１９】
ラベルの例としては限定されないが、蛍光ラベル（例えば消光剤又は吸光剤）、非蛍光ラベル、比色ラベル、化学発光ラベル、生物発光ラベル、放射性ラベル、質量調節基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えばペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等）等が挙げられる。更に具体的に例を挙げると、蛍光ラベルとしては負電荷をもつ色素（例えばフルオレセインファミリーの色素）、中性電荷をもつ色素（例えばローダミンファミリーの色素）、又は正電荷をもつ色素（例えばシアニンファミリーの色素）が挙げられる。フルオレセインファミリーの色素としては例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては例えばテキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡは例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されており、テキサスレッドは例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から市販されている。シアニンファミリーの色素としては例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が挙げられ、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から市販されている。蛍光プローブシステムの使用に関する一般論については、例えばＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ著，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  １，１９９９）及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ著，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９６）参照。
【０１２０】
定量：「定量」なる用語は例えばハイブリダイゼーションシグナル蛍光強度や転写産物濃度に数値を割り当てることを意味する。一般に、定量はシグナルの強度を測定する段階と、対応値を線形又は指数スケールに割り当てる段階を含む。
【０１２１】
相対存在量：「相対存在量」又は「相対遺伝子発現レベル」なる用語は第２の種に対する所与特定種の存在量を意味する。絶対存在量（例えば定量した濃度）を知る必要はない。場合により、第２の種は参照配列である。
【０１２２】
相関：本明細書で使用する「相関」なる用語は２個以上の変数、値又は要素間に関係を形成することを意味する。２個の変数が相関する場合には、これらの変数の一方が分かれば、これを使用して他方の変数を決定することができる。
【０１２３】
サンプル：本明細書で使用する「サンプル」なる用語はその最も広義の意味で使用し、分析する任意材料を意味する。「サンプル」なる用語は一般に生物由来の任意型の材料、例えば動物や植物から得られる任意型の材料を意味する。サンプルは例えば血液や血清等の任意体液又は組織から得ることができ、更にヒト血液やヒト血清でもよい。サンプルは培養細胞もしくは組織、（原核又は真核）微生物培養物、又は生物材料（生体又はかつての生体）から生産もしくは誘導される任意フラクションもしくは生産物とすることができる。場合により、サンプルは精製物、部分精製物、未精製物、濃縮物又は増幅物とすることができる。サンプルが精製物又は濃縮物の場合には、サンプルは主に１成分（例えば核酸）から構成することができる。より具体的には、例えば、精製サンプル又は増幅サンプルは全細胞ＲＮＡ、全細胞ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、又はそれらから誘導される増幅産物から構成することができる。所定側面では、サンプルは分解ＲＮＡサンプル、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織に由来するＲＮＡサンプルとすることができる。
【０１２４】
本発明の方法で使用されるサンプルは任意起源に由来することができ、限定されない。このようなサンプルは１個以上の個体から単離された所定量の組織又は体液とすることができ、限定されないが、例えば皮膚、血漿、血清、全血、血液製剤、髄液、唾液、腹水、リンパ液、房水又は硝子体液、滑液、尿、涙、血球、血液製剤、精液、膣液、肺水、漿液、臓器、気管支肺胞洗浄液、腫瘍、パラフィン包埋組織等が挙げられる。サンプルは更にｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液の成分でもよく、限定されないが、細胞培養培地中の細胞、組換え細胞、細胞成分等の増殖により得られる馴化培地が挙げられる。
【０１２５】
キット：本明細書で使用する「キット」なる用語はサンプルの処理、方法、アッセイ、分析又は操作を容易にする物品の組合わせについて使用される。キットはキットの使用法を記載した説明書（例えば本発明の方法について記載した説明書）、方法に必要な化学的試薬又は酵素、プライマー及びプローブ、並びに他の任意成分を含むことができる。所定態様では、本発明はサンプル中の分解核酸集団のメンバーを増幅し、核酸サンプル中の核酸品質を測定し、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成し、分解ＲＮＡサンプル内の遺伝子発現値を測定し、相対増幅効率の関数としてＤＮＡ又はＲＮＡ分解を測定するためのキットを提供する。これらのキットは、例えば限定されないが、サンプル採取用試薬、ＲＮＡ採取及び精製用試薬、逆転写酵素、ターゲットアンプリコンを作製するために逆転写と第１鎖及び第２鎖合成に適したプライマー、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ並びに遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含むことができる。所定態様では、逆転写酵素活性と熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素は同一酵素である（例えばＴｈｅｒｍｕｓ種ＺＯ５ポリメラーゼやＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓポリメラーゼ）。
【０１２６】
固体支持体：本明細書で使用する「固体支持体」なる用語はポリヌクレオチドの合成、結合又は固相化を直接又は間接的に可能にするように官能化することができる実質的に固定配置の材料マトリックスを意味する。「固体支持体」なる用語は「樹脂」又は「固相」等の用語も含む。固体支持体はポリマー（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミド等の有機ポリマー、並びにそのコポリマー及びグラフト）から構成することができる。固体支持体はガラス、シリカ、シリコン、微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、又は適切な任意金属等の無機物でもよい。本明細書に記載するものに加え、「固体支持体」なる用語は任意型のコーティング又は他の任意型の二次処理を施した任意固体支持体（例えばラングミュア・ブロジェットフィルム、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ゾルゲル等）も含むものとする。
【０１２７】
アレー：本明細書で使用する「アレー」又は「マイクロアレー」とは例えば固体支持体上及び／又は容器配列中に存在するエレメント（例えばポリヌクレオチド）の配列である。アレーは特定空間物理的関係をもつ物理的エレメントと考えられることが非常に多いが、本発明は直接的空間構成をもたない「論理」アレーも利用することができる。例えば、コンピューターシステムを使用して物理的に異なる成分中又は成分上に位置する１又は数個の該当成分の位置を追跡することができる。コンピューターシステムはアレーメンバーの物理的位置の「ルックアップ」テーブルを提供することにより論理アレーを作製する。従って、アレーのメンバーを特定及び位置決定することができる限り、運動中の成分でも論理アレーを構成することができる。これは例えば本発明のアレーが流動マイクロスケールシステムに存在する場合や、１個以上のマイクロタイタートレーに存在する場合に該当する。
【０１２８】
所定アレーフォーマットを「チップ」又は「バイオチップ」と言う場合がある。アレーは低密度数（例えば２〜約１０）、中密度数（例えば約１００以上）、又は高密度数（例えば１０００以上）のアドレス可能位置を含むことができる。一般に、チップアレーフォーマットは作製、操作、配置、堆積、試薬導入、検出、及び保存し易いように、幾何学的に規則的な形状である。但し、不規則な形状でもよい。典型的な１フォーマットでは、アレーはアレー上のメンバーセットの各位置間の間隔を均等にした行列フォーマットで構成される。あるいは、処理又はサンプリングを均等にするために位置を一まとめにするか、混合するか、又は均質にブレンドしてもよい。アレーは試薬の高スループット操作、ロボット送達、マスキング、又はサンプリングのために各位置に空間的にアドレス可能となるように構成された複数のアドレス可能位置を含むことができる。アレーは任意特定手段による検出又は定量を容易にするように構成することもでき、このような手段としては限定されないが、レーザー光走査、共焦点光又は偏光集光、ＣＣＤ検出、及び化学発光が挙げられる。本明細書に記載する「アレー」フォーマットとしては限定されないが、アレー（即ち複数チップのアレー）、マイクロチップ、マイクロアレー、シングルチップに組み立てたマイクロアレー、マイクロウェルプレートに結合した生体分子のアレー、又は該当システムで使用するのに適した他の任意フォーマットが挙げられる。
【０１２９】
高スループット：「高スループット」なる用語は一般に分析の比較的迅速な完了を意味する。
【０１３０】
高度並列：「高度並列」なる用語は多数のサンプルの同時処理及び／又は分析を意味する。
【０１３１】
プラットフォーム：「プラットフォーム」なる用語はサンプル調製、増幅、生成物分離、生成物検出、又はサンプルから得られたデータの分析に使用される計測法を意味する。「小型フォーマット」なる用語はマイクロリットルよりも小容量で実施される手順又は手法を意味し、マイクロフルイディック及びナノフルイディックプラットフォームの両者で実施されるものが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３２】
本発明は分解核酸を増幅し、核酸集団（例えばｍＲＮＡ又は全細胞ＤＮＡ）内の分解度を正確に直接測定する新規ＰＣＲ法を提供し、核酸（例えばＲＮＡ）品質の遺伝子レベルメトリックを提供し、分解ＲＮＡ出発材料を使用して遺伝子発現プロファイルを作成する方法を提供する。本発明はＤＮＡサンプルの分析に適用することもできる。本発明は従来技術を改善する新規方法を提供し、（ｉ）例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルに由来する核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）の品質を評価するためのシステムを提供し、更に、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレー（図１２参照）を使用するマイクロアレー実験システム用としての核酸サンプルの適性を確認するためにこの評価を使用し；（ｉｉ）選択された遺伝子測定値を測定、確認及び／又は検証するためにプロキシマルプライマー多重ＰＣＲ（ＰＰＭ−ＰＣＲ）によるツールを使用するという目的を達成する。
【０１３３】
所定側面では、本発明は癌及び他の疾患の診断及び予後診断を改良する新規遺伝子発現バイオマーカーを発見するために既存ＦＦＰＥサンプルの膨大なコレクションの探索を可能にするツールセットを研究者に提供する。例えば、このアプローチを使用すると、例えば新鮮凍結前立腺癌関連組織サンプルと以前に保存された固定サンプルからのデータを比較する癌遺伝学の分析における有益な情報が得られる。保存組織サンプルは例えば６カ月から１５歳までの任意年齢とすることができる。このような試験としては主要な前立腺特異的癌遺伝子の分析が挙げられる。
【０１３４】
本発明はマイクロアレー試験とＰＣＲ試験の両者で使用するＲＮＡの品質を評価する革新的改良アプローチを提供する。所定態様では、このアプローチはＲＮＡ転写産物のサンプリングの完全性を評価するためのＰＣＲ法に関する。本明細書に記載する方法は、（ａ）反応数を低減しながらサンプリングする遺伝子数を増加するために高度多重ＰＣＲ増幅を利用し、（ｂ）転写産物長完全性情報をデータセットに提供するために遺伝子毎に各種サイズ（例えば小、中及び大）のアンプリコンを作製するように複数のプライマーセットを利用し、（ｃ）複数の組織型に広く適用できる構成的に発現された遺伝子を分析し、（ｄ）各遺伝子について遺伝子セットマイクロアレー（例えば図１２に示すようなＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブセット）でプローブ配列との相対近接性に基づいて標的アンプリコン配列を選択する、等の数種の側面で当分野の公知方法を改善する。所定側面では、本発明の方法は転写産物のサブセットを直接試験することによりＲＮＡサンプル品質を評価及び測定することができ、本発明の方法は有用なＲＮＡサンプル（例えば包括的発現解析で使用することができるＦＦＰＥ組織に由来するＲＮＡサンプル）を同定することができる。
【０１３５】
ユニバーサルプライマー多重ＲＴ−ＰＣＲ（ＵＰＭ−ＰＣＲ）
本発明の実施には新規な高度多重ＰＣＲ増幅法の開発が不可欠である。これらの方法は高度に予測可能且つ再現可能な方法で遺伝子ターゲットを選択的に増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応の基本的長所を基盤とし、定量的遺伝子発現解析法を実現するためにユニバーサルプライマーをＲＴ−ＰＣＲと組合わせた新規ストラテジー（ＵＰＭ−ＰＣＲ）を使用する。更に、所定側面では、これらの方法は１回の多重反応で多数のプライマー対を利用できる。しかし、ＵＰＭ−ＰＣＲ分析の標的転写産物数は特に限定されない。例えば、２〜約１００個のプライマー対を使用して１個のサンプルで各種転写産物を標的とすることができる。あるいは、約１０〜約１００個のプライマー対を使用して各種転写産物を標的とすることができる。所定態様では、約３５個のプライマー対を使用して各種転写産物を標的とする。
【０１３６】
所定態様では、ＵＰＭ−ＰＣＲ法は多重反応における遺伝子の相対比を増幅に伴って確定するためにユニバーサルプライマースキームを利用する。異なるプライマーセットの各々（例えば３５個の異なるプライマーセットの各々）が異なるサイズの増幅産物を決定する。アンプリコンセットは適当な任意方法（例えば蛍光キャピラリー電気泳動）により分解及び定量することができる。この方法、特に蛍光キャピラリー電気泳動法の利点としては、（ａ）多重度が高く、例えば１回のＰＣＲ反応当たり少なくとも２個、少なくとも１０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、又は少なくとも１００個の遺伝子を標的とし；（ｂ）実用ダイナミックレンジが３＋ｌｏｇとなり；（ｃ）再現性が良好であり、平均変動係数（ＣＶ）が１０％を下回り；（ｄ）感度が高く、１回の反応当たり５ｎｇといった少量の全ＲＮＡを使用して細胞転写産物当たりシングルコピーを検出することができ；（ｅ）標準市販試薬及び装置の使用によりアッセイ当たりのコストが低く；（ｆ）９６及び３８４ウェルフォーマットと１日当たりサンプル数百個のスループットで実施されるアッセイに適合可能であり；（ｇ）アッセイ開発サイクルが速い等の点が挙げられる。アッセイプラットフォームの汎用性は、所与遺伝子セットの新規アッセイを非常に短期間に迅速に開発できることを意味する。
【０１３７】
本発明のＵＰＭ−ＰＣＲ法は分析終点としてのキャピラリー電気泳動に限定されない。他のＰＣＲ及び非ＰＣＲ増幅ストラテジーと同様に、核酸（例えばＤＮＡ）フラグメントを検出及び定量するための他の種々の分析技術が当業者に公知であり、フローサイトメトリー又は共焦点スキャンによるビーズモニター法等の複数種のハイブリダイゼーション及びキャプチャーシステム、一、二及び三次元核酸マイクロアレーシステム、ＰＣＲアンプリコンの他の分離検出用クロマトグラフィー法（例えばＨＰＬＣ）、マイクロ及びナノフルイディック核酸分離装置、並びに質量分析法が挙げられる。あるいは、多重反応を分割し、複数のプローブ法を使用して溶液中又は固相上の両者で特定核酸を検出することもできる。
【０１３８】
標準多重ＲＴ−ＰＣＲは一般に非定量的であり、特にＲＮＡ濃度が非常に低い場合にはそうである。指数増幅中には有意バイアスが導入される可能性があり、データは変動し、非再現性になる。これらのバイアスはプライマー−プライマー相互作用、プライマー−産物交差反応、及び濃度と配列に依存的な増幅効率の変動に起因し、熱サイクルの後半又はプラトー期に最も顕著に見られる。（全部ではないが）所定態様では、本発明のＵＰＭ−ＰＣＲ法はこれらの問題を解決するためにユニバーサルプライマーによるユニバーサルプライミングストラテジーを使用して多重ＰＣＲ反応を２プライマー法に転換する。
【０１３９】
ユニバーサルプライマー多重システムへの転換法の鍵は図２及び３に要約するようなキメラ遺伝子特異的プライマーの使用である。反応は各ターゲットｍＲＮＡを特異的に検出することが可能な遺伝子特異的プライマーセットを使用することにより開始する。図２に示すように、これらの遺伝子特異的プライマーはその３’末端に遺伝子特異的ターゲット配列をもち、その５’末端にコンセンサス又はユニバーサルプライマー配列をもつ。フォワードプライマーとリバースプライマーの両者に同一のユニバーサルプライミング配列が存在していてもよいし、あるいは左右異なるユニバーサルプライミング配列を使用してもよい。最初の数回の増幅サイクル中に特異的ｍＲＮＡターゲットはこれらのキメラプライマーによりコピーされ、ユニバーサルプライミング配列を付加（追加）した２本鎖ｃＤＮＡ産物を生成する。全反応産物は有意高濃度（例えばキメラ遺伝子特異的プライマーとユニバーサルプライマーの比（キメラ遺伝子特異的：ユニバーサル比）が約１：２〜約１：１００、あるいは約１：１０〜約１：１００、あるいは約１：５０（０．０２μＭ遺伝子特異的対１μＭユニバーサル））で存在するユニバーサルプライマー対を含む。従って、ＰＣＲが進行するにつれて、増幅は迅速に単一対のユニバーサルプライマーにより占有される。実際に、キメラ遺伝子特異的プライマーが有意に存在するのは逆転写段階と第２鎖ｃＤＮＡ合成段階中のみである。多数のプライマーの使用から２個のみのプライマーへのこの移行により、反応の複雑度は有効に低下し、各種遺伝子ターゲットの相対濃度が確定する。ユニバーサルプライマー増幅反応では、全産物は事実上同一化学種であり、増幅に差異がなく、反応がプラトー期付近に近づいても相対遺伝子比を維持することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）等のリアルタイムＰＣＲ法と異なり、ＵＰＭ−ＰＣＲは必ずしもプローブを使用する必要がない。その結果、３’末端間が僅か数塩基となるようにＰＣＲプライマーを配置することができるので、４０塩基程度の短いメッセージ配列を使用してアンプリコンが得られる。これに対して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）は少なくとも７０塩基を必要とし、この短い長さでも設計の観点から見ると非常に難しい。本発明は分解ＲＮＡを増幅するために短いアンプリコンを使用できるというこの効果を明白に利用する。
【０１４０】
図２に示す反応は多数のＲＮＡターゲットに同時に利用することができ、即ち図３に示すような多重逆転写酵素ＰＣＲ反応が確立する。最初に作製した遺伝子特異的配列をユニバーサルプライマーの使用により増幅する。図３は例証の目的で４個の転写産物（Ａ〜Ｄ）を示すが、実際の数は著しく多くすることができ、例えば少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個以上のＲＮＡターゲットを多重ＰＣＲ反応で同時に増幅することができる。
【０１４１】
所定態様では、ＵＭＰ−ＰＣＲ反応後に複数のアンプリコンを検出するためにキャピラリー電気泳動を使用する。この場合には、その長さにより相互に区別できるようにアンプリコンを作製することができる。これは種々の方法で実施することができる。
【０１４２】
所定態様では、ターゲットアンプリコン長はキメラ遺伝子特異的プライマーにより増幅されるターゲット配列（例えば分解核酸）の量により決定される。所定態様では、アンプリコンのサブセット又はアンプリコンのほぼ全部が小サイズであることが好ましい。例えば、アンプリコンはターゲット分子に対応する約２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む。更に他の態様では、アンプリコンはターゲット分子に対応する約１００塩基対以下、又は約８０塩基対以下、又は約約６０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む。これらのサイズはユニバーサルプライミング配列からアンプリコンに付加されるヌクレオチドを含まない。
【０１４３】
他の態様では、ターゲットアンプリコン長はキメラプライマーのターゲット特異的部分とキメラプライマーにおけるユニバーサル配列の間の少なくとも１個の「スペーサー」ヌクレオチドの付加により制御される。このようにアンプリコンに付加されるヌクレオチド数は限定されず、その結果、多重ＰＣＲ反応（ＵＭＰ−ＰＣＲ）で生成される複数のアンプリコンは（例えばキャピラリー電気泳動で分解されることにより）相互に区別可能な異なる長さをもつことができる。これらのスペーサーヌクレオチドの付加は分解可能なサイズ差をもつアンプリコンを得るために必要な微調整における有用なツールである。
【０１４４】
遺伝子特異的プライマーの濃度は低く維持されるので、交差反応と誤反応におけるその影響は制限される。従って、増幅の成功の確率が高くなり、アーチファクトが生じる確率が著しく低下する。プライマーデザインの初回成功率は９０％を越えることができる。
【０１４５】
フォワードユニバーサルプライマーに単一ラベルを使用すると、蛍光キャピラリー電気泳動システム（例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＣＥＱ（登録商標）８８００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用してＰＣＲ産物を分析することができる。各遺伝子特異的プライマー対が異なるサイズのＰＣＲ産物を作製するようにデザインされているので、増幅後に、異なる遺伝子アンプリコン産物を電気泳動により区別及び定量することができる。
【０１４６】
多重ＰＣＲ反応を最適化するために調節することができる試薬、器具、及び変数は当業者に周知である。多重反応条件及び試薬（遺伝子ターゲット、遺伝子特異的プライマー、及びユニバーサルプライミング配列を含む）の詳細は当業者に周知である。実際に、１，０００を上回るターゲット遺伝子と１００を上回る異なる多重反応が文献に報告されている。限定されないが、例えば、Ｆｅｒｒｅら，（１９９６）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＴ−ＰＣＲ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＲＮＡ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｅｄ．Ｋｒｉｅｇ）１７５−１９０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ）；Ｋｒａｍｅｒら，（２００３）“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒｓ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ，”  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ３１：４１７−４３１；及びＪｏｈｎｓｏｎら，（２００２）“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １：１２９３−１３０４参照。本発明の多重反応は特定型の器具もしくは試薬、特定遺伝子ターゲット配列、特定プライマー配列、又は特定アンプリコン同定もしくは検出もしくは同定方法に限定されない。本明細書に開示する方法及び試薬以外に当分野で公知の方法及び試薬も本発明の範囲に含むものとする。
【０１４７】
ＵＰＭ−ＰＣＲアプローチは発現変化を測定するために広い実用ダイナミックレンジを示す。ＲＮＡ検出のダイナミックレンジをアッセイにより評価するためには、外部対照としても使用する精製カナマイシン耐性ｍＲＮＡを培養ＨｅｐＧ２細胞に由来する全ＲＮＡ２０ｎｇに１８，０００〜３８，０００，０００分子（０．０３〜６４アトモル）の範囲でスパイクする。結果は３ｌｏｇを上回る範囲で平滑な応答を示す（図４参照）。この範囲では１回の多重ＰＣＲ反応で高コピー数と低コピー数の両者の転写産物を同時に測定することが可能になる。更にこの実験によると、ゼロから区別可能なスパイクＫａｎＲ  ｍＲＮＡの検出可能な最低レベルは３０ゼプトモル、ないし１８，０００分子であった。従って、アッセイは例えば前立腺針生検中に一般に存在する細胞の１％未満である１０４個の細胞を使用して細胞１個当たり１転写産物コピーのオーダーで検出することができる。この感度レベルにより、非常に少量の全ＲＮＡを使用して多数の多重反応を実施することが可能になり、数百個の遺伝子の発現値を測定することが可能になる。従って、ＵＰＭ−ＰＣＲプロトコールはＲＮＡ濃度の広い変動（例えば５〜５０ｎｇ）を有効に利用しながら同等データを提供することができる。
【０１４８】
本発明の方法は本発明を実施するために特定ソフトウェア又はハードウェアに限定するものではない。各種ソフトウェアツールを利用して本発明の方法を実施することができる。例えば、有用なソフトウェアツールとしては（限定されないが）９６ウェル及び３８４ウェルフォーマットでの遺伝子発現試験の実施に関連するアッセイデザイン及びデータフロー管理用ソフトウェアが挙げられる。例えば、本発明の任意方法のソフトウェアツールを利用して、（ａ）最も重要な点として全産物が異なる長さをもち、キャピラリー電気泳動により分解可能となるようなプライマーデザイン／選択及び多重アセンブリ、（ｂ）プロジェクト及び反応プレート構成、（ｃ）データ収集及びサンプルマッピング、（ｄ）データチェック、並びに（ｅ）初回データ分析を自動化することができる。本発明で使用される所定のソフトウェア（例えばＪＡＶＡコードツール）はＯｒａｃｌｅ（登録商標）データベース及びミドルウェアによりデータを伝達及び保存する。ソフトウェアはプラットフォーム非依存性であり、Ｌｉｎｕｘ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ及び／又はＡｐｐｌｅシステム環境で動作する。本発明と併用することができる多様なソフトウェア製品が当業者に周知である。
【０１４９】
ＵＭＰ−ＰＣＲとマイクロアレーの一致
ＵＰＭ−ＰＣＲとマイクロアレーの比較が実施され、両者の方法の間に良好な相関が立証されている。例えば、Ａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｌｙｉａｎａｒａｃｈｃｈｉ，２００３“Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  ａｗａｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｈｉｐ  ｂｉａｓ：ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５（４）：２９２−２９３参照。この実験では、雄ラット３匹にクロフィブラート２００（低用量）、４００（中用量）及び８００（高用量）ｍｇ／ｋｇ／日を５日間投与した。クロフィブラートはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ−α）のアゴニストとして作用する。全ＲＮＡを単離し、ラットｃＤＮＡマイクロアレーとのハイブリダイゼーション又はＵＰＭ−ＰＣＲ用試料に調製した。図１５は両者アッセイで試験した選択遺伝子セットのＡｕｅｒ  ａｎｄ  Ｌｙｉａｎａｒａｃｈｃｈｉ応用データテーブルを示す。ＵＰＭ−ＰＣＲでは、これらの遺伝子を２１遺伝子多重反応（即ち、２１−ｐｌｅｘ）の一部として試験した。表示値は対照ＲＮＡプールに対する倍率変化である。変化の方向と強度の両面で良好な相関がある。傾き１．１でＲ２計算値は０．８９であり、２種のプラットフォームの間に８９％の一致があったことを示す。更に、カタラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）はマイクロアレーでは検出できなかったが、ＵＰＭ−ＰＣＲ法では検出でき、ほとんど変化しないことが分かった。
【０１５０】
実施例１及び２にＵＭＰ−ＰＣＲ法の２種の実証例を示す。
【０１５１】
プロキシマルプライマー多重ＰＣＲ（ＰＰＭ−ＰＣＲ）
分解ＲＮＡからのＲＮＡ遺伝子発現レベルを完全に分析するための方法の開発に当たっては、作製及び分解可能な最小ＰＣＲアンプリコンを目指して多重ＰＣＲ法を操作することが必要である。標準２プライマーＰＣＲ反応では、実用限界は約４０塩基対長までのアンプリコンである。これはＴａｑＭａｎ（登録商標）等のリアルタイムＰＣＲ法を使用して達成可能な限界よりも優に低い。ＴａｑＭａｎ（登録商標）はアンプリコンに標識プローブのスペースを加える必要があるので、アンプリコンのサイズに少なくとも更に３０塩基対の配列を付加し、最低７０塩基対のアンプリコンを作製する必要がある。リアルタイム検出法では最小アンプリコンサイズが一般に遺伝子に応じて８０〜１２０塩基対であるため、この７０塩基対限界を達成することは非常に困難である。
【０１５２】
本明細書に記載するＵＰＭ−ＰＣＲ法はプローブを使用する必要がないため、４０〜６０塩基対アンプリコン範囲で極めて容易に実施できるという点でＴａｑＭａｎ（登録商標）よりも有利である。なお、最終アンプリコンサイズはユニバーサル配列の４０塩基対が加わるが、この配列は非常に小さいｍＲＮＡ配列から増幅できるという点に影響しない。所定態様では、ＵＰＭ−ＰＣＲ法は全産物をキャピラリー電気泳動により分離検出できるように各遺伝子のアンプリコンのサイズが異なることを必要とする。このサイズ差の必要を満たし、アンプリコンを４０〜６０塩基対範囲に維持できるようにするために、本発明はプロキシマルプライマー多重ＰＣＲ（ＰＰＭ−ＰＣＲ）と呼ぶＵＰＭ−ＰＣＲの新規変法を提供する。
【０１５３】
ＰＰＭ−ＰＣＲ法の目的は各プライマー対のフォワードプライマーとリバースプライマーの３’末端が相互に密接に近接するように（例えば相互間が２０塩基以内となるように）多重ＰＣＲを実施することである。これを達成するためには、場合によりフォワードプライマーとリバースプライマーにユニバーサルプライマー配列（及び場合によりスペーサーヌクレオチド）として付加配列を付加すればよい。キメラプライマーを使用すると、場合によりキメラプライマーの遺伝子特異的プライマー領域とユニバーサルプライマー領域の間に付加介在スペーサー配列を付加することが可能になる。図９はＰＰＭ−ＰＣＲストラテジーの概要を模式的に示し、合計１１５〜１４２塩基対サイズの１０−ｐｌｅｘを比較的簡単に組み立てられることが明らかである。図１０は表１に示すような１０種の異なる参照遺伝子を含むマルチプレクスからのキャピラリー電気泳動トレースを示す。
【表１】
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【０１５４】
これらのターゲットプライマー対の各々は６０塩基以下のターゲットｍＲＮＡ配列を増幅する。ＰＣＲ産物は全て隣接産物から４塩基対分離するように設計され、全産物を容易に基線まで分解することができる。初期試験では、約８０塩基対までの低バックグラウンド及び最小増幅アーチファクトが観察された。多重フラグメント間の距離の減少と８０塩基対までのフラグメントを検出できることが明白なことから、このフォーマットは２０個以上の多重遺伝子に対応できると考えられる。多重化を更に拡大するためには、増幅中に２種の異なる色素を使用し、産物の２分の１を第１の色素で標識し、残りの２分の１を第２の色素で標識する。２種の色素システムは２種の異なる色素をもつ２種の異なるフォワードユニバーサルプライマーを使用する３ユニバーサルプライマーストラテジーを使用する。例えば、このストラテジーによると、遺伝子４０個まで又はそれ以上のマルチプレクスの開発が可能になり、全遺伝子が６０塩基以下のターゲット配列を使用して増幅される。
【０１５５】
本明細書には１又は２色素システムについて記載するが、本発明は１又は２色素検出システムに限定されるものではない。実際に、任意多数の色素を多重反応で使用することができる。実際に、多重反応で同時に分析されるターゲット遺伝子数が増加するにつれて、例えばキャピラリー電気泳動により多数のアンプリコンを識別できるようにアンプリコンを標識するために複数の色素を利用すると有利である。このような方法で使用することができる多様な色素（蛍光色素）及び他の型のラベルが当業者に周知である。
【０１５６】
多重ＲＴ−ＰＣＲ  ＲＮＡ  ＱＣアッセイの開発
本発明はサンプル（例えば発現遺伝子のｍＲＮＡサンプル）中のＲＮＡ品質の評価方法（「ＲＮＡ  ＱＣアッセイ」）を提供する。これらの方法は同一ターゲット遺伝子から複数の分解可能な（例えば異なるサイズの）アンプリコンを生成し、更に、場合により複数のターゲット遺伝子からこれを実施する多重ＰＣＲアッセイを実現する。このような反応により生成されたアンプリコンは核酸（例えばＲＮＡ）完全性の定量的又は定性的測定基準として使用することができる。
【０１５７】
ＲＮＡ  ＱＣアッセイにおけるＲＮＡターゲット遺伝子の各々は短い産物（例えばスペーサー、ユニバーサルプライマー又は他の非ターゲット配列に由来する塩基対を加えずに約４０塩基対程度の短いターゲット配列）又は比較的長い産物（例えばスペーサー、ユニバーサルプライマー又は他の非ターゲット配列に由来する塩基対を加えずに２００塩基対程度の長いターゲット配列の産物）を生成する少なくとも２個のプライマー対で増幅された少なくとも２個の別個の選択領域をもつ。所定態様では、中間長の第３の産物を生成する第３のプライマー対も使用することができる。同一転写産物から３個のアンプリコンを生成するために３個のプライマー対を使用する所定態様では、３個のアンプリコンは例えば約４０〜６０塩基対、約１００〜１２０塩基対、及び約１８０〜２００塩基対のサイズ範囲をもつことができる。同一転写産物からのアンプリコンはオーバーラップする配列を含んでいてもよいし、あるいは、該当ターゲット転写産物の非オーバーラップ領域に由来するものでもよい。所定態様では、一方のプライマー（例えばフォワードプライマー）の３’末端は他方のプライマー（例えばリバースプライマー）の３’末端から２０塩基対以内である。こうして生成されたアンプリコンは一般に６０塩基対以下のターゲットヌクレオチド配列を含み、２０塩基対のターゲット配列は各ＰＣＲプライマーに由来し、他の２０塩基対以下はプライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせるときに２個のプライマーの３’末端間に存在するヌクレオチド配列に由来する。
【０１５８】
本発明のこれらのＲＮＡ  ＱＣ法では、１回の多重反応でプライマーセットを併用してもよいし、あるいは複数の反応で使用してもよい。所定態様では、ＲＮＡ  ＱＣ法における多重反応は増幅アーチファクトを最小限にしながら１回の反応当たり複数の遺伝子（例えば２０〜３０個の遺伝子）を定量的に分析することができるユニバーサルプライマー多重ＲＴ−ＰＣＲ法（ＵＰＭ−ＰＣＲ）を利用することができる。
【０１５９】
ＲＮＡ  ＱＣアッセイ多重反応で増幅される遺伝子ターゲット数は特に限定されない。所定側面では、増幅されるターゲット数は使用する任意読取り方法（例えばキャピラリー電気泳動）により分解可能なアンプリコン数のみにより限定される。所定態様では、多重増幅反応でただ１個のターゲット転写産物から２個のアンプリコンしか生成されない。所定態様では、３個以上、例えば、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、５０個以上、７５個以上、又は１００以上のターゲット転写産物を使用する。所定態様では、約２〜１００個のターゲット転写産物を多重反応で使用するか、又は約１０〜４０個のターゲット、又は２０〜３０個のターゲット、又は３０〜４０個のターゲットを使用する。
【０１６０】
更に、多重反応の増幅の特定遺伝子ターゲットは全く限定されない。例えば、多重反応は任意該当転写産物をターゲットとすることができる。本発明の方法では、ターゲット転写産物としては参照インバリアント経路関連遺伝子、細胞型関連遺伝子、組織型関連遺伝子、疾患関連遺伝子、及び薬剤応答遺伝子が挙げられる。参照遺伝子ないしインバリアント遺伝子は例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子及び／又は低、中及び／又は高レベルで発現される組織特異的遺伝子とすることができる。
【０１６１】
多重ＰＣＲ  ＲＮＡ  ＱＣアッセイの開発における１側面は遺伝子ターゲットの選択である。一般に、ターゲットサンプル内のレベルの範囲で発現される遺伝子を使用する。本発明のＲＮＡ  ＱＣアッセイの所定態様では、ターゲット遺伝子は構成的に発現される「参照」遺伝子及び／又は組織特異的遺伝子から選択することができる。
【０１６２】
複数の組織型で十分に発現されることに加え、参照遺伝子はサンプル間及び個体間で非常に一貫した発現レベルを維持する傾向がある。この構成的な安定的発現の結果、ＲＮＡの完全性を採点するためのアルゴリズムの一部として使用することができ、ＲＮＡ分解の遺伝子特異的メカニズムと全般的メカニズムの相対効果を理解し易くする相対遺伝子比としての基線が得られる。場合により存在する第２の型の遺伝子は細胞、組織又は生物特異的転写産物である。参照遺伝子を使用すると、広範な用途と組織型における広い適用性の利点が得られる。多様な参照遺伝子が当分野で公知であり、本発明の方法で利用される。参照遺伝子の代表的なリストを表２に示す。
【表２】
2008541699.tif 000003
【０１６３】
本発明の方法で使用される参照遺伝子（即ち表２に示す遺伝子）は従来通りに参照遺伝子として使用される遺伝子（例えばβ−アクチン及びＧＡＰＤＨ）であるか、又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マイクロアレー（例えば、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら（２０００）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  Ｆｅｔａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５３５  Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ／Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｇｅｎｅｓ，”  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：１４３−１４７参照）を使用するもの等の包括的ＲＮＡ調査を使用する組織調査により同定されている。
【０１６４】
本発明の方法で使用される参照遺伝子は表２に示す参照遺伝子に限定されず、当業者に自明の通り、他の参照遺伝子も使用することができる。更に、本発明のＲＮＡ  ＱＣアッセイで使用される遺伝子は構成的に発現される参照遺伝子に限定されず、他の遺伝子型も使用できる。
【０１６５】
アッセイデザイン
所定態様では、本発明のＲＮＡ  ＱＣアッセイは生成する特定サイズ範囲（例えば長短）のアンプリコンと、増幅する転写産物の選択領域（例えば５’、中間、及び／又は３’領域）に着目する。生成されたアンプリコンはＵＰＭ−ＰＣＲ及びＰＰＭ−ＰＣＲ法を利用し、全アンプリコンが例えば約４０〜６０塩基のターゲット配列を必要とし、長いアンプリコンが長いターゲット配列（例えば約１８０〜２００塩基のターゲット配列）又は短いアンプリコンから分離可能な任意長さを必要とするようにする。例えば約１００〜１２０塩基対のターゲットを必要とする中間長のアンプリコンも作製することができる。実施例３に記載する実験タイプ１及びタイプ２ＲＮＡを使用してアッセイデザインを試験及び確認することができる。
【０１６６】
増幅するターゲット領域を選択する際には、例えば各遺伝子について市販プローブ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）プローブ）のメッセージ長と位置等の各種因子を考慮する。遺伝子に応じて、全長転写産物は何千塩基もサイズが変動する場合がある。他方、例えば所定のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）マイクロアレーシステムでは、全プローブが３’末端側にバイアスされる。ｐｏｌｙＴプライマーアプローチを使用してｃＤＮＡを作製することにより１種以上の一般増幅及び標識法を開始する場合には、これは意外ではない。これらの２つの多少矛盾する因子のバランスをとるためには、「中間領域」を増幅に選択することができ、この場合、増幅する「中間領域」は（転写産物の中間ではなく）この遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）プローブセットに対する位置である。原則的に、３’アンプリコンと中間アンプリコンを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）配列を挟み、例えば夫々プローブセットから１００〜２００塩基上流と下流に配置することができる。例えば５’末端から２００〜３００塩基を中心とするように５’−アンプリコンを標的とすることができる。
【０１６７】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデザイン段階後に、５’末端にユニバーサルプライマー配列テールを使用して場合により全遺伝子特異的プライマー配列を合成することができる。試験方法は場合によりＲＮＡプール（例えば、実施例３及び図１１参照）と組織特異的ＲＮＡ単離物パネル（例えば前立腺及び各種組織滴定ＲＮＡを含む多数の異なるヒトＲＮＡ）でプライマー対を個々に試験する第１段階を含む。個々のプライマー対試験後に、完全に組合わせたマルチプレクスを試験する第２段階を場合により実施することができる。第１段階では典型的な不成功が認められ、ＰＣＲ産物は検出されない。一般に、初回では最初にデザインした遺伝子の＞９０％が一重項としてマルチプレクス内で検出可能である。初回に成功しなかった遺伝子を含むように２回目を実施することができる。この方法は場合により適切なサイズの産物（即ちマルチプレクスを含む既存ＰＣＲ産物とサイズがオーバーラップしない）を生成するプライマーの２回目のプライマーデザインと選択を含むことができる。時間の百分率が低いと、１個以上の遺伝子をマルチプレクス内で機能させることができない。これはＰＣＲ法では稀であり、一般に不良な配列情報、異常な配列構造又は試験サンプル内のｍＲＮＡの発現不在の結果である。幸運にも、本発明の方法で一般に使用される参照遺伝子の配列は十分な資料があるので、この型の不成功は本発明の方法では起こりそうにない。
【０１６８】
アッセイの最終定量は場合により組織滴定ＲＮＡサンプル（例えば２種の組織ソースに由来するＲＮＡの滴定液）の完全系列を分析することにより実施することができる。従来記載されているように、各サンプル対は遺伝子の各々を異なるレベルで発現するので、２種のＲＮＡの滴定により１００％サンプルＡから１００％サンプルＢまで各遺伝子の発現レベルの線形推移を明らかにすることができる。インバリアント参照遺伝子では、これらのレベルは非常に低いか又はゼロの発現から比較的高い発現まで変化すると予想される。他の参照遺伝子では漸進的変化はより小さいが、適切な組織対では依然として検出可能である。この種の試験は例えば時間の＜１％で問題遺伝子を検出する場合があり、この遺伝子は別の遺伝子に交換するか、マルチプレクスから除去するか、又は再設計すればよい。
【０１６９】
一般に、同一遺伝子に由来する短いアンプリコンと長いアンプリコン（及び場合により同一遺伝子に由来する１個以上の中間サイズアンプリコン）の生成の相対効率を観測することにより、分解度を定量的に観測することができ、生成された短いアンプリコンと長いアンプリコンのモル濃度の差を殆ど又は全く示さない遺伝子はサンプル中に分解が殆ど又は全くなく；あるいは、短いアンプリコンが長いアンプリコンに対して相対モル過剰で存在する場合には、サンプル中の核酸の分解を予想することができる。この分析は複数遺伝子ターゲットを使用して実施することが好ましい。遺伝子内の複数のアンプリコンターゲット（即ち、少なくとも短いアンプリコンと長いアンプリコン）をデザインし、ゲノムＤＮＡサンプルから増幅後のアンプリコンの相対増加を測定するゲノムＤＮＡの分析にもこのアプローチを適用することができる。
【０１７０】
核酸ＱＣメトリック
本発明は核酸品質の評価（例えば定量）方法を提供する。この品質評価を「品質メトリック」又は「ＱＣメトリック」と言う。所定態様では、品質メトリックはＲＮＡ品質メトリックである。この測定値はＦＦＰＥ由来ＲＮＡを完全に評価するだけでなく、品質アッセイの幅広い使用により、通常の生検やレーザーキャプチャーマイクロダイセクションに由来するサンプルを含む全種核酸サンプル（例えばＲＮＡ）を評価することが可能になる。
【０１７１】
異なる遺伝子、増幅領域及びＲＮＡの品質の漸次低下に伴うアンプリコンサイズに関連する増幅効率の相対差異はＱＣメトリックの獲得におけるコア情報となる。増幅効率の観測傾向から、例えばマイクロアレー実験におけるＲＮＡ完全性、可変性、及び可用性のレベルに関する情報が得られる。所定態様では、品質メトリック測定（品質メトリックスコア又は相対品質メトリック比較）に基づき、使用者は各種下流用途でどのサンプルを有効に使用できるかを判断することができる。
【０１７２】
この品質メトリック情報は単に下流用途（例えばＰＣＲ分析、マイクロアレー分析、ｃＤＮＡライブラリー構築、ノーザン分析、サザンブロット分析）における成功の十分な可能性の有無を予測する鍵に止まらず、真の遺伝子発現レベルの正確な予測におけるデータの良好度の評価を与える鍵でもある。同一ターゲット遺伝子に由来する異なるサイズのアンプリコンを使用することにより、増幅効率の差から計算される平均転写産物長の直接測定値が測定される。ＲＮＡ転写産物長にわたって複数のアンプリコンを使用することにより、転写産物の異なる部分の相対利用可能性及び安定性を評価することができ、この核酸サンプルが下流分析で如何に良好に機能するかを評価することができる（例えば遺伝子チップ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）上の複数のプローブによるデータ収集、特にＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブではそのチップの多くで転写産物３’末端側へのバイアスを生じる）。複数の構成的遺伝子間のシグナル相対比を分析することにより、ＲＮＡの分解による遺伝子発現レベルの変動を評価することができる。
【０１７３】
ＲＮＡ品質メトリックを測定する主要アプローチは短いアンプリコン（ＳＡＭＰ）と長い（ＬＡＭＰ）アンプリコンの対の各々の相対増幅効率をＲＮＡ完全性の主要尺度として使用する方法である。核酸品質メトリックの測定を図１４に模式的に示す。同図から明らかなように、同一遺伝子に由来する異なるサイズのアンプリコンは所与サンプル内の分解度を反映する（異なるモル濃度を反映する）異なる絶対レベルを示す。即ち、次第にサイズを増すアンプリコンの増幅効率はサンプルが分解するにつれてシグナル強度（例えばＲｆｕ）の低下を示し、大きな核酸（例えばＲＮＡ転写産物）の増幅に及ぼす分解の影響が増すことを示す。同図から明らかなように、ヌクレオチド数（Ｎｔ）で表したアンプリコンサイズの差に対する相対蛍光単位（Ｒｆｕ）で測定した増幅効率の差は傾き： 
傾き＝ΔＲｆｕ／ΔＮｔ
として表すことができ、
式中、ΔＲｆｕ＝Ｒｆｕ（ＳＡＭＰ）−Ｒｆｕ（ＬＡＭＰ）；ＳＡＭＰ＝短いアンプリコン，ＬＡＭＰ＝長いアンプリコン；
ΔＮｔ＝Ｎｔ（ＳＡＭＰ）−Ｎｔ（ＬＡＭＰ）；
ｙ−切片＝ＲｆｕＭＡＸ及び
ｘ−切片＝ＬＯＤＮｔである。
【０１７４】
これらの値のうちで、ＲＮＡ分解の評価には傾きが最も有用であるが、切片値も使用することができる。ＱＣメトリックを測定するためには、異なるサイズのアンプリコンを使用するＰＣＲにより既知分解度のＲＮＡサンプルを分析する。これらのＰＣＲデータから複数の遺伝子（例えば表２のリストから選択される複数の遺伝子、例えば少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、又は少なくとも３０個以上の遺伝子）の各々について１、２、３個以上の遺伝子位置の傾きの値を計算し、ＲＮＡ品質の分析に使用するための有意数のデータ点（例えば７５データ点）を得る。基本的ＱＣメトリックは傾きデータを個々に使用して測定することもできるし、あるいは複数の傾きを使用し、平均及び／又は標準偏差よりもロバストなこれらの傾き値の中央値、７５％値、９０％値又は四分位範囲を計算することにより一括して測定することもできる。実験分布も集団全体に観察される分解度のダイバーシティを理解するのに役立つ。
【０１７５】
所定態様では、傾向分析を実施し、転写産物分解の特異的パターンと、下流分析での利用の成功確率（例えばマイクロアレー分析による良好なデータ生成の成功）との相関を評価する。これらの詳細な分析に基づき、十分に未劣化（例えばマイクロアレー分析を可能にするために十分に未劣化）の分析データセット内の情報の特定サブセット（又は複数のサブセット）を識別する。こうして予測品質スコアを得ることができ、閾値以上のスコアは任意特定所望用途（例えばマイクロアレー分析）での使用の成功を予測し、閾値未満のスコアは分析の不成功を予測する。品質メトリックの作成に有用なアルゴリズムも容易に導くことができる。
【０１７６】
１態様では、核酸品質メトリックを以下のように説明することができる。２４個の異なる遺伝子の各々で合計６回の測定を実施する。６回の測定値を分割し、各遺伝子の３個の異なる領域の２個の異なるデータ点を測定する。各領域の２個の異なるデータ点はアンプリコンサイズの関数として増幅効率の指標となるという点で相互に関連している。具体的には、ヌクレオチド長（Ｎｔ）で表した固定及び規定サイズをもつ短いアンプリコン（ＳＡＭＰ）は例えば相対蛍光単位（Ｒｆｕ）又は他の増幅効率尺度で表した第１の増幅効率値を提供し、ＳＡＭＰよりも長いヌクレオチド長で表した固定及び規定サイズをもつ長いアンプリコン（ＬＡＭＰ）は例えばＲｆｕで表した第２の増幅効率値を提供する。Ｒｆｕ値はヌクレオチド数（Ｎｔ）として測定したアンプリコンのサイズと、ＲＮＡの分解度に本質的に関連する。これらのデータを使用し、傾きと切片を計算し、ＱＣメトリック値を決定する。
【０１７７】
核酸品質メトリックの使用はゲノムＤＮＡにも適用される。ゲノムＤＮＡを使用するこれらの方法では、少なくとも２個のプライマー対（例えば短いアンプリコンと長いアンプリコンを生成するための２個のプライマー対）、より好ましくは３個のプライマー対を使用してＤＮＡ上の特定部位に異なる長さのアンプリコンを生成する。アンプリコンの長さは絶対値ではないが、好ましい態様では、分解したターゲットを検出できるように最短アンプリコン長を最小限（例えば４０〜６０塩基対）に維持する。長いアンプリコンに対する短いアンプリコンの相対存在量は、図１４に示すようにＤＮＡ分解の存在量を観測し、所定態様では定量するための基礎となる。ＲＮＡの場合と同様に、ゲノムＤＮＡ内の複数の配列領域を増幅ターゲットとすることができ、これらの領域は例えば傾き又は切片の測定により個々に分解をモニターすることもできるし、ＲＮＡ  ＱＣメトリックの計算に使用する場合と同様に平均を計算又は傾向を測定することにより分解の累積尺度として使用することもできる。
【０１７８】
キット
本発明は製品（例えばキット）を提供する。本発明のキットは本発明の任意方法に必要であるか又は前記方法を容易にする任意集合コンポーネントを含むことができる。本発明のキットのコンポーネントは特に限定又は制限されない。本発明のキットは場合によりキットの使用方法及び／又は本発明の方法の実施方法を記載した説明書を含むことができる。
【０１７９】
本発明のキットは本明細書に記載する方法で使用される全合成オリゴヌクレオチドを提供することができる。例えば、本発明のキットは限定されないが、逆転写と第１及び第２鎖ｃＤＮＡ合成に適したプライマー、任意遺伝子に特異的なプライマー（例えば任意数のターゲットプライマー対）、該当ＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば表２の参照遺伝子の任意のもの）、任意遺伝子に特異的なプライマー対、該当ＲＮＡ又はＤＮＡ部位、ユニバーサルプライマー及び／又はセミユニバーサルプライマーを含むことができる。所定態様では、ターゲットプライマー対を提供する場合には、ターゲットプライマーをそのコグネイト核酸ターゲットとハイブリヂイズさせるとき、フォワードプライマーの３’末端はリバースプライマーの３’末端から２０塩基対以内である。当然のことながら、本発明は他の適切な任意遺伝子に特異的な他のプローブの使用の手引きにもなるので、本発明のキットは表１及び２に記載する遺伝子に特異的なプライマーに限定されない。
【０１８０】
本発明のキットは限定されないが、サンプル採取用器具及び／又は容器、サンプル採取用装置及び／又は試薬、任意ソース（例えば血液又はＦＦＰＥサンプル）からのＲＮＡの精製／単離用装置及び／又は試薬、逆転写酵素、ＰＣＲでの使用に適した熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、及び／又は遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸を含むことができる。所定態様では、逆転写酵素活性と熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をもつ酵素は同一酵素である（例えばＴｈｅｒｍｕｓ種ＺＯ５ポリメラーゼやＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓポリメラーゼ）。
【０１８１】
本発明のキットは更に場合によりキットの全コンポーネント又はコンポーネントの任意サブセットを保持するための１又は複数の容器を含むことができる。本発明のキットは保存及び／又は輸送を簡便にするようにパッケージングすることができる。キットのコンポーネントはキット内の１個以上の容器に提供してもよいし、コンポーネントは別の容器にパッケージングしてもよいし、任意方法で組合わせてもよい。所定態様では、本発明のキットは複数のサンプルの高スループット分析を容易にするための材料を提供することができる。
【０１８２】
本発明のキットは更に場合によりキットの生化学的コンポーネントを使用して生成されたデータの分析を補助するためのソフトウェアを含むことができる。ソフトウェアとしてはプライマーとマルチプレクスをデザインするための方法、生成されたデータの分析（例えば核酸ＱＣメトリックの計算、分解の測定と定量、並びに特定ＤＮＡ及びＲＮＡ配列及び分子の検出と定量）のための方法及びアルゴリズムが挙げられる。
【０１８３】
統合システム
所定態様では、本発明は本発明の方法を実行するための統合システムを提供する。例えば、本発明はサンプル中の分解核酸集団のメンバーを増幅するためのシステム、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成するためのシステム、及び核酸サンプル中の核酸品質を測定するため（即ち核酸品質メトリックを作成するため）のシステムを提供する。
【０１８４】
前記システムは収集したデータを解釈及び分析するための計器及び手段を含むことができ、特に核酸ＱＣメトリック又は遺伝子発現プロファイルの測定手段はアルゴリズム及び／又は電子保存情報（例えば収集蛍光値等）を含む。統合システムの各部分は機能的に相互接続され、場合により物理的に接続される。所定態様では、統合システムは自動化され、分析の開始後にオペレーターはサンプル又は計器を全く操作する必要がない。
【０１８５】
本発明のシステムは計器を含むことができる。例えば、本発明は蛍光検出器（例えば蛍光分光光度計）等の検出器を含むことができる。例えば蛍光値をモニター／測定するために１個以上の検出器を本発明と併用することができる。例えば、検出器は統合キャピラリー電気泳動装置、又は高スループット機能を助長するためにマルチウェルプレートリーダーの形態とすることができる。所定態様では、統合システムは例えばＲＴ−ＰＣＲ反応段階中に反応温度を制御する目的で熱サイクル装置、又はサーモサイクラーを含む。
【０１８６】
分光光度計操作パラメーター（例えば励起波長及び／又は検出発光波長）を制御するため及び／又は検出器から収集したデータ（例えば融解曲線分析中の蛍光測定値）を保存するために検出器（例えば蛍光分光光度計）をコンピューターに接続することができる。コンピューターはシステムの温度、タイミング、及び／又は温度変化速度を制御するために熱サイクル装置に制御可能に接続してもよい。統合コンピューターは更に、検出器から収集したデータを分析し、核酸メトリック値又は発現プロファイルを電子的に誘導する「相関モジュール」を含むことができる。所定態様では、相関モジュールは検出器からキャピラリー電気泳動蛍光読み値を収集し、更に分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成及び／又は蛍光データに基づいて核酸サンプルの品質メトリックを誘導するコンピュータープログラムを含む。
【０１８７】
本発明の典型的なシステムは１個以上の遺伝子特異的キメラプライマー対と、１個以上のユニバーサルプライマーと、適切な検出器（統合熱サイクル装置を備えるか又は備えない）と、相関モジュールを備えるコンピューターと、システム使用者のための説明書（電子版又は印刷版）を含むことができる。一般に、システムは１個以上のシグナル出力（シグナルはＰＣＲアンプリコンに対応する）を検出するように構成された検出器を含む。所定態様では、システムは更にターゲット増幅法で使用される試薬を含むことができる。これらの試薬としては限定されないが、ＲＴ活性をもつＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、安定剤、色素又は染色剤、ｄＮＴＰ等の１種以上が挙げられる。キットは本発明の１個以上のシステムと共に機能するように供給することができる。
【０１８８】
光電子増倍管、分光光度計、ＣＣＤアレー、走査型検出器、光電管及び光ダイオード、顕微鏡ステーション、ガルバノスキャナー、マイクロフルイディック核酸増幅検出装置等の多様なシグナル検出装置が入手可能である。検出器の厳密な構成はアンプリコン生成／検出に使用されるラベルの型にも依存する。蛍光、燐光、放射能、ｐＨ、電荷、吸光度、発光、温度、磁気等を検出する検出器を使用することができる。典型的な検出器態様としては光（例えば蛍光）検出器や放射能検出器が挙げられる。例えば、発光（例えば蛍光発光）又は他のプローブラベルの検出はマーカー対立遺伝子の有無を表す。増幅核酸の検出には一般に蛍光検出を使用する（但し、他の検出法も含めて上流及び／又は下流操作をアンプリコンに実施してもよい）。一般に、検出器はプローブラベルからの１個以上のラベル（例えば光）発生を検出する。検出器は場合により増幅反応からの１又は複数のシグナルをモニターする。
【０１８９】
検出さたれシグナルを遺伝子発現プロファイル又は核酸ＱＣメトリックと相関するシステム命令も本発明の特徴である。例えば、命令は検出されたシグナルと核酸メトリックの相関を含む少なくとも１個のルックアップテーブルを含むことができる。命令の厳密な形態はシステムのコンポーネントにより異なり、例えば、システムの１個以上統合装置（例えばマイクロプロセッサー、コンピューター又はコンピューター読取り可能な媒体）にシステムソフトウェアとして存在していてもよいし、検出器と制御可能に接続された１個以上の装置（例えばコンピューター又はコンピューター読取り可能な媒体）に存在していてもよい。上記のように、典型的な１態様では、システム命令は検出されたシグナルとＲＮＡメトリックの相関を含む少なくとも１個のルックアップテーブルを含む。命令は更に一般に、例えば、使用者がサンプル分析の結果を閲覧してパラメーターをシステムに入力できるように、システムとのユーザーインターフェースを提供する命令を含む。
【０１９０】
システムは一般に、例えば自動システムで本発明の方法により検出されたコンピューター読取り可能なデータを保存又は伝送するためのコンポーネントを含む。コンピューター読取り可能な媒体としてはキャッシュメモリ、メインメモリ、格納メモリ及び／又は他のコンピューターコード格納用電子データ記憶コンポーネント（ハードドライブ、フロッピードライブ、格納ドライブ等）が挙げられる。遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックを表すデータは更にイントラネット又はインターネット又はその組合わせ等のネットワーク上を伝送媒体で具体化されるコンピューターデータシグナルとして電子的、光学的又は磁気的に伝送することもできる。システムは上記に加えるか又は上記の代わりにワイヤレス、ＩＲ、又は他の利用可能な代替伝送媒体によりデータを伝送することもできる。
【０１９１】
動作中に、システムは一般に分析しようとする核酸サンプルを含む。各種側面で、サンプルはＲＮＡ、ポリＡ  ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ｃＤＮＡ等を含む。
【０１９２】
本発明に関して「相関するシステム」なる用語はコンピューターに入力するデータがコンピューターの外部の物理的対象又はプロセス又は性質（例えばアンプリコン生成）に対応するシステムと、コンピューター内で入力シグナルから別の出力シグナル（例えば遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリック）への変換を生じるプロセスを意味する。換言するならば、入力データ（例えば、アンプリコン生成後の蛍光読取り値）は出力データ（例えば、遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリック）に変換される。コンピューター内のプロセスはアンプリコンシグナルを統合システムにより認識させ、遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックに帰属させる１組の命令、又は「プログラム」である。更に、多数の計算プログラム（例えば、ＧＵＩインターフェース用Ｃ／Ｃ＋＋、Ｄｅｌｐｈｉ及び／又はＪａｖａプログラム）や、核酸品質メトリックデータのルックアップテーブルを作図又は作成するための生産性向上ツール（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及び／又はＳｉｇｍａＰｌｏｔ）が存在する。本発明の統合システムに関して有用な他のソフトウェアツールとしてはＳＡＳ、Ｇｅｎｓｔａｔ、Ｍａｔｌａｂ、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ、及びＳ−Ｐｌｕｓ等の統計パッケージや、ＱＵ−ＧＥＮＥ等のモデリングパッケージが挙げられる。更に、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ等の他のプログラミング言語も本発明の統合システムで利用すると適切である。
【０１９３】
例えば、遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックをコンピューター読取り可能な媒体に記録することにより、データベースを作成することができる。コンピューター読取り可能な媒体にデータを記録するのに適した注文品又は市販品（例えばＯｒａｃｌｅ又はＳｙｂａｓｅ製品）の任意ファイル又はフォルダーが本発明に関するデータベースとして許容可能である。本明細書に記載するような遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックに関するデータも同様にコンピューターアクセス可能なデータベースに記録することができる。場合により、遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックを測定するために使用される１種以上のアッセイの１種以上の側面を自動化する統合システムを使用して遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックを得ることができる。このようなシステムでは、アンプリコン検出に対応する入力データを検出器（例えばアレー、スキャナー、ＣＣＤ、又は他の検出装置）から中央処理装置にアクセス可能なコンピューター読取り可能な媒体のファイルに直接伝送することができる。その後、アンプリコン検出と遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックの相関をコードする（一般に１個以上のプログラムとして具体化された）１組のシステム命令をコンピューター装置により実行することができる。
【０１９４】
一般に、システムは更に例えばファイルを選択し、データを検索抽出し、アンプリコン検出値のテーブルを再表示等するためのユーザー入力装置（例えばキーボード、マウス、タッチスクリーン等）と、統計分析の結果を表示又は再生するための出力装置（例えばモニター、プリンター等）を含む。
【０１９５】
従って、１側面では、本発明は予め設定された値又は実験値に対応する少なくとも１個のデータセットを含むファイルセット及び／又はデータベースを含むコンピューター又はコンピューター読取り可能な媒体を含む統合システムを提供する。システムは更に使用者がこれらのデータベースの１個以上を選択的に閲覧できるようにするユーザーインターフェースを含む。更に、ワードプロセシングソフトウェア（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ（登録商標）又はＣｏｒｅｌ  ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（登録商標））やデータベース又はスプレッドシートソフトウェア（例えばＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、Ｃｏｒｅｌ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（登録商標）等のスプレッドシートソフトウェアや、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）又はＳｅｑｕｅｌ（登録商標）等のデータベースプログラム）等の標準テキスト操作ソフトウェアをユーザーインターフェース（例えばＷｉｎｄｏｗｓ、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ、Ｕｎｉｘ又はＬｉｎｕｘシステム等の標準オペレーティングシステムのＧＵＩ）と併用し、データベースの検出されたアンプリコン又は他の特性に対応する文字列情報を操作することができる。
【０１９６】
システムは場合により、例えばロボット装置を組込んだサンプル操作用コンポーネントを含む。例えば、供給元から移送先（例えばマイクロタイタープレートからアレー基板）に溶液（例えばサンプル）を移送するためのロボット液体制御機構を場合によりディジタルコンピューター（又は統合システムの別のコンピューター）に制御可能に接続する。ロボット液体制御機構による高スループット液体移送を制御し、場合により、前記機構による固体支持体への移送を制御するためにデータをディジタルコンピューターに入力するための入力装置も統合システムの特徴とすることができる。多数のこのような自動ロボット流体操作システムが市販されている。例えば、一般に例えばロボットと流体操作モジュールを含む各種Ｚｙｍａｔｅシステムを利用する各種自動システムがＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。同様に、例えばマイクロタイタートレー操作のために各種実験室システムで使用されている一般的なＯＲＣＡ（登録商標）ロボットも例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から市販されている。従来のロボットの代用として、流体操作及び検出を実施するためのマイクロフルイディックシステムは現在広く市販されており、例えばＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）やＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から市販されている。
【０１９７】
従って、本発明の遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックを作成するためのシステムは、高スループット液体制御ソフトウェア、サーモサイクラー制御ソフトウェア、マーカーラベルからのデータを分析するための画像分析ソフトウェア、データ解釈ソフトウェア、ディジタルコンピューターに制御可能に接続され、供給元から移送先へ溶液を移送するためのロボット液体制御機構、ロボット液体制御機構による高スループット液体移送を制御するためにデータをディジタルコンピューターに入力するための入力装置（例えばコンピューターキーボード）、及び場合により、標識プローブからのラベルシグナルをディジタル化するためのイメージスキャナーの１種以上を含むことができる。イメージスキャナーは画像分析ソフトウェアとインターフェースし、例えばアンプリコン強度の測定を行い、データ解釈ソフトウェアによりラベル強度測定を解釈し、アンプリコンの有無とどの程度まで存在しているかを示す。こうして誘導されたデータを次に遺伝子発現プロファイル又は核酸品質メトリックと相関させる。
【０１９８】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【実施例１】
【０１９９】
毒性多重ＵＰＭ−ＰＣＲアッセイ
本実施例は培養細胞の薬剤処理後の多数の従来の毒性応答終点に関する２４遺伝子パネルを使用する多重ＵＰＭ−ＰＣＲについて記載する。
【０２００】
分析で使用したこれらの遺伝子発現終点は多数の異なる誘導性シトクロムと、酸化ストレス、ＤＮＡ損傷、細胞増殖、アポトーシス及び多数の他の重要な毒性関連経路に関連する遺伝子を含む。毒性パネルで使用した遺伝子セットを表３に示す。
【表３】
2008541699.tif 000004
【０２０１】
この特定アッセイ遺伝子パネルは複数のグリタゾンの試験を含む多数の実験プログラムに適用されている。グリタゾン（別称チアゾリジンジオン）はインスリン抵抗性を低減し、インスリン感受性を増加し、血清トリグリセリド及び遊離脂肪酸値を低減し、血清ＨＤＬ値を上昇させ、グルコース取り込みを促進することにより２型糖尿病患者の生理機能を改善する薬剤類である。チアゾリジンジオンの効果はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲ−γ）の活性化により媒介される。Ｒｉｂｏｎら，（１９９８）“Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＰ  ｇｅｎｅ，”  ＰＮＡＳ  ９５：１４７５１−１４７５６参照。
【０２０２】
肝毒性の２４遺伝子パネルを使用してピオグリタゾン、ロシグリタゾン及びトログリタゾンの３種の異なるグリタゾンの遺伝子発現レベルを分析した。全３種の薬剤はＦＤＡの完全認可を受けたが、トログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）はその後、重度特異体質性肝細胞障害が報告されたため、市場から撤退した。他方、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）とピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）の臨床試験は薬剤誘導肝毒性の徴候を報告していない。
【０２０３】
この毒性マルチプレクスを使用して一次ラット肝細胞（図５及び６）と不死化クローン９肝細胞株（図７）にグリタゾン化合物を投与して実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験からの代表的データを図５〜７に示す。試験を実施した結果、多数の毒性関連遺伝子でピオグリタゾン及びロシグリタゾンと毒性の高いトログリタゾンの間に有意差が認められたので、遺伝子発現を使用して３種の化合物を区別できることが判明した。
【０２０４】
アッセイ性能に関して、２４遺伝子毒性マルチプレクスはグリタゾン試験で明らかなように実際の実験条件でアッセイのダイナミックレンジが広い。例えば図５及び６では、検出された発現値は発現レベルの低いＵＧＢＴ１（発現値０．０３２，１０．９％Ｃｖ）から過剰発現したＨＯ１（発現値２３．６，１３．６％Ｃｖ）までに及び、ほぼ３ｌｏｇの発現強度鎖に相当する。縦軸で使用する目盛が異なるため、Ｒｏ−ＨＯ１の発現は別に図６で分析する。なお、Ｃｖ値は９６ウェル培養一次肝細胞サンプル３個に化合物を投与した生体変動係数を表す。図７ではクローン９肝細胞株処理を使用した処、有意倍率変化が明らかになった。グリタゾン投与の差は一次ラット株細胞に対してこの細胞株で最も顕著であり、例えばＧＡＤＤ４５の誘導倍率は７．６倍であり、ＧＡＤＤ１５３の誘導倍率は１２倍であった。
【実施例２】
【０２０５】
腫瘍組織多重ＵＰＭ−ＰＣＲアッセイ
本実施例は４種の近縁腫瘍クラスを区別することができる３３遺伝子パネルを使用する多重ＵＰＭ−ＰＣＲについて記載する。
【０２０６】
小円形青色細胞腫瘍（ＳＲＢＣＴ）に分類される多形態の小児癌の分化及び診断用多重ＰＣＲアッセイの試験を実施した。ＳＲＢＣＴは重要な小児癌である神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、バーキットリンパ腫及びユーイングファミリー腫瘍の４種の腫瘍型を示す。名称からして分かりにくいように、ＳＲＢＣＴは通常の組織学では比較的区別しにくいが、Ｋｈａｎら（“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ７：６７３−６７９  ［２００１］）はその遺伝子発現パターンに有意差を確認できることを発見した。２００１年の試験では、合計６５６７種の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレーを使用し、これらの４種の腫瘍型の各々について組織と細胞株の両者を含む８８個のサンプルを分析した。このマイクロアレー試験により、４種のＳＲＢＣＴ型を区別することが可能な３３種の遺伝子が同定された。これらの遺伝子と４種の対照遺伝子を使用して３７遺伝子ＵＰＭ−ＰＣＲマルチプレクスを構築した。各種腫瘍型を示す２０個の腫瘍サンプルを分析するためにこのアッセイを使用して生成した予備データを図８に示す。基本的階層クラスタリングを使用してデータを視覚化すると、多重ＰＣＲアッセイからのデータは各種腫瘍型を区別できることが明らかである。この試験は遺伝子リストを改良することにより更に数百個の異なるＳＲＢＣＴサンプルを分析するように拡張されつつある。
【実施例３】
【０２０７】
試験ＲＮＡサンプルの作製
適正な対照はあらゆる科学試験の重要な要件である。本実施例は本発明の方法を開発及び試験する目的で各種ＲＮＡ分解度を含む試験対照分解ＲＮＡサンプルの作製について記載する。これらのサンプルを使用すると、遺伝子発現レベルとこれらの発現レベルに及ぼすＲＮＡ分解の影響を直接比較することが可能である。このアプローチにより、広範な分解と各種機械的分解の合成的実現が可能になり、多数レベル及び／又は型の分解を試験できるようになる。
【０２０８】
各々複数の方法で分解度が漸増するように２個のヒト試験ＲＮＡを作製する。タイプ１は化学薬品及び酵素滴定により分解させた数種の異なる組織型（組織混合物を含む）に由来する全ＲＮＡである。タイプ２は全て同一前立腺組織から作製した新鮮凍結ブロックとＦＦＰＥブロックに由来するＲＮＡである。前立腺組織ブロックをスライスし、特定時間間隔でＲＮＡを作製する。これらのＦＦＰＥサンプルサンプルもＦＦＰＥサンプル保存の一般プラクティスに相当する数種の異なる保存条件下におく。
【０２０９】
タイプ１ＲＮＡ対照
数種の異なるＲＮＡソースを使用してタイプ１ＲＮＡ対照を作製する。第１のソースは新鮮凍結組織（例えば前立腺癌組織等のＦＦＰＥブロックで分析しようとする組織型に相当する組織）から単離したＲＮＡである。これらの組織サンプルを分割し、各々の一部をタイプ１ＲＮＡの作製のために単離し、残りはタイプ２ＲＮＡ対照の一部としてのＦＦＰＥ組織ブロックを作製するために使用する。
【０２１０】
タイプ１ＲＮＡ対照を作製するための第２のＲＮＡソースは滴定組織プールである。ラットＲＮＡの２個のプールを利用したマイクロアレー性能を評価するためのシステムが最近開発されている（Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇら，（２００４）“Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＩＤ  １７０５，Ｔｈｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｓｔ  ＣＤ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７８：１−Ｓ）。プールは脳、腎臓、肝臓及び精巣の４種のラット組織に由来する異なる量のＲＮＡを混合することにより作製される（図１１）。２個のプールの複製ターゲットを作製し、ハイブリダイズさせる。組織特異的遺伝子で既知発現差を検出する能力により発現結果を比較する。例えば、プール１が４０％脳組織を含み、プール２が２０％脳組織を含むならば、脳特異的転写産物では２倍の発現変化が検出されるはずである。これらのサンプルはこのシステムで予備試験に利用されている。２回の同一試験における４種の遺伝子の典型的結果を図１６に示す。
【０２１１】
入力組織の１種のみで発現される約２００種の「インバリアント」遺伝子が既に同定されている。ヒトでも組織特異的なインバリアントラット遺伝子のサブセットの同定は現在進行中である。これらの遺伝子８種１組を選択し、アッセイで使用する。２〜４種の異なる組織滴定液を調製し、精巣の代わりに前立腺組織を混合物に加える。
【０２１２】
完全なセットＲＮＡが選択されたら、これを使用して順次分解した試験ＲＮＡを作製する。酵素及び化学（例えばＮａＯＨ処理）分解法を使用して滴定を実施する。２種の異なるリボヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅ  ＯＮＥ（登録商標）Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３８，Ａｕｇｕｓｔ  １９９２，ｐ．１参照）とＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して酵素分解を実施する。ＲＮａｓｅ  ＯＮＥ（登録商標）は塩基特異性をもたないが、２本鎖構造よりも１本鎖ＲＮＡに選択的な人工リボヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ  ＩＩＩは２本鎖ＲＮＡを分解する。２種の酵素を別々及び同時に使用して種々のＲＮＡ分解パターンを生成する。ＮａＯＨを使用する従来の塩基処理を第３のＲＮＡ分解法として使用する。塩基処理は比較的無差別であり、固定法に関連する分解メカニズムと多少似ている。例えばＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用する電気泳動等の各種方法によりまずＲＮＡ分解度を追跡し、分解が進行中であることを確認する。次に電気泳動図をＦＦＰＥサンプルに由来する電気泳動図と比較し、これらのサンプルに存在する分解範囲がＦＦＰＥサンプルにおける分解を含むことを確認する。
【０２１３】
タイプ２ＲＮＡ対照
タイプ２ＲＮＡ対照はホルマリン固定パラフィン包埋サンプルとその対応する新鮮凍結ＲＮＡである。実際に、タイプ１ＲＮＡで前立腺サンプルに使用する同一組織ソースを使用して組織ブロックを作製する。従って、酵素及び塩基処理で作製したＲＮＡとＦＦＰＥ組織ブロックから作製したＲＮＡの直接比較を行うことができる。
【０２１４】
既存ＦＦＰＥ組織ブロックに付随する重要な問題は保存である。ＲＮＡ及びＤＮＡ分解に及ぼす保存の影響を評価するために、この試験で作製した組織ブロックを数種の異なる条件下で保存し、周期的に切断し、ＲＮＡを単離する。１日目、１カ月目、３カ月目、６カ月目、１２カ月目、１８カ月目及び２４カ月目に各ブロックからＲＮＡを単離する。各組織サンプリングが組織構造及び細胞型の類似混合物に相当するようにサンプリングする。保存条件は−２０℃、４℃、室温、及び３７℃とする。保存条件を変えることにより、２年間の保存期間にわたって有意範囲の分解速度が得られる。単離後、この試験のタイプ１及びタイプ２ＲＮＡをすぐに分取した後、最大安定性を確保するように比較的高濃度で−８０℃で保存する。
【実施例４】
【０２１５】
腫瘍転移多重ＰＰＭ−ＰＣＲアッセイ
本実施例は正常及び癌乳房組織における遺伝子発現を分析する１８遺伝子パネルを使用する多重ＰＰＭ−ＰＣＲについて記載する。このＰＰＭ−ＰＣＲ分析はターゲット配列の使用量を８０ヌクレオチド未満に制限しながら多数の転写産物を分析する。分析で使用した遺伝子は文献に詳細に記載されており、広範な組織及び腫瘍型で転移細胞に差別的応答を示すことが知られている遺伝子である。マルチプレクスで使用した遺伝子を下表４に示す。同表はＰＰＭ−ＰＣＲ法を使用したターゲット配列の増幅量とその最終アンプリコンサイズを示す。
【表４】
2008541699.tif 000005
【０２１６】
多重反応後の電気泳動トレースを図１７に示す。分析した全１９種の遺伝子は良好なシグナルを示した。正常乳房組織と腺癌由来細胞株の分析を示す。反応はサンプル３個で実施し、誤差線を示す。
【実施例５】
【０２１７】
プロキシマルプライマー多重ＰＣＲ（ＰＰＭ−ＰＣＲ）を使用するＦＦＰＥサンプルの比較分析
本実施例は無傷組織由来ＲＮＡサンプルとＦＦＰＥ由来ＲＮＡサンプルを使用するＵＭＰ−ＰＣＲ法とＰＰＭ−ＰＣＲ法の比較分析について記載する。
【０２１８】
ＦＦＰＥ由来ＲＮＡサンプルの分析でＰＰＭ−ＰＣＲ法を使用する試験を実施した。ヒト参照遺伝子セットを標的とする２種の異なるマルチプレクスを開発した。第１のマルチプレクスはユニバーサルプライマー多重ＰＣＲ法（ＵＰＭ−ＰＣＲ）を利用して２４遺伝子参照マルチプレクスを作製した。このマルチプレクスの平均アンプリコンサイズは２５０塩基対であった。ユニバーサルプライマーテールを差し引くと、ｍＲＮＡから増幅したターゲット特異的配列の平均サイズは２１０塩基対であった。第２のマルチプレクスはｍＲＮＡ特異的配列（平均５０塩基対）の４０〜６０塩基対を標的とするＰＰＭ−ＰＣＲ法を利用したが、ユニバーサルプライマーとスペーサー配列の使用により８０〜１５０総塩基対長のアンプリコン産物を作製した。ＰＰＭ−ＰＣＲ法を使用する第２のマルチプレクスは１０種の異なるヒト参照遺伝子を標的とした。
【０２１９】
第１のＲＮＡサンプルはＦＦＰＥヒト前立腺ブロックに由来するものとした。ブロックの年齢は１４歳とし、室温で保存した。第２のサンプルはヒトニバーサル参照全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．６３６５３８）とした。分析では、２種の異なるマルチプレクスを使用して各サンプルに由来するＲＮＡ２０ｎｇを複数の複製物として試験した後、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＣＥＱ（登録商標）８８００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍで分析した。
【０２２０】
２種の異なるＲＮＡサンプルを使用する２種の方法の直接比較を実施した。この分析からのデータを図１３に示す。アンプリコンのサイズはＦＦＰＥサンプルからのシグナルを検出する能力に強く影響することがデータからすぐに分かる。大きいほうのアンプリコンを使用したＵＰＭ−ＰＣＲ法では無傷の参照ＲＮＡサンプルを使用すると強いアンプリコンシグナルを生じた（図１３Ｂ）が、分解ＦＦＰＥサンプルを使用した同一方法では非常に僅かなアンプリコンデータしか得られなかった（図１３Ｄ）。これに対して、小さいほうのアンプリコンを使用したＰＰＭ−ＰＣＲ法では、未分解参照ＲＮＡサンプル（図１３Ａ）と分解ＦＦＰＥ  ＲＮＡサンプル（図１３Ｃ）の両者で強い増幅シグナルを生じた。ＰＰＭ−ＰＣＲ法では未分解ユニバーサル参照ＲＮＡ（図１３Ａ）に比較して約２５％のシグナル強度で完全な相補遺伝子データが得られた。なお、サンプルは異なる起源の組織に由来するＲＮＡに相当するので、相対遺伝子比を直接比較することはできない。図１３Ｄの大きいピークはスパイク対照転写産物に由来する。
【０２２１】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０２２２】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは３個の順次分解した全ＲＮＡサンプルのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析を示す。電気泳動図としてデータを示す。これらのシステムは一定範囲の分子サイズで存在するＲＮＡの相対量に関する定量的データを提供する。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ反応ストラテジーで遺伝子特異的配列とユニバーサルプライマー配列を使用するキメラプライマーの説明図である。
【図３】多重ＲＴ−ＰＣＲ反応の説明図である。
【図４】ＫａｎＲ転写産物（×１０００）を使用する（蛍光による）ＲＮＡ検出のダイナミックレンジを示す棒グラフである。
【図５】３種の異なるグリタゾン投与に対する一次ラット肝細胞における２１個の異なる転写産物の相対遺伝子発現応答を示す棒グラフである。
【図６】３種の異なるグリタゾン投与に対する一次ラット肝細胞における相対ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ１）遺伝子発現応答を示す棒グラフである。
【図７】３種の異なるグリタゾン投与に対するクローン９ラット肝細胞における２１個の異なる転写産物の相対遺伝子発現応答を示す棒グラフである。
【図８】３３個の異なる遺伝子転写産物について２０種の異なる腫瘍サンプルにおけるＳＲＢＣＴのクラスターデータを示す。
【図９】プロキシマルプライマー多重ＰＣＲ（ＰＰＭ−ＰＣＲ）法ストラテジーの説明図であり、各種長さの遺伝子特異的配列と付加スペーサー配列を使用して各種長さの短いアンプリコンを作製できることを示す。
【図１０】図９に示す１０種の異なるターゲットアンプリコンを含む多重ＲＴ−ＰＣＲ反応からのキャピラリー電気泳動トレースを示す。
【図１１】実験ＲＮＡサンプルのプール比を示す。
【図１２】マイクロアレーを使用する発現解析のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールの概要図である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄは新鮮な組織とＦＦＰＥに由来するＲＮＡを使用したＰＰＭ−ＰＣＲ及びＵＰＭ−ＰＣＲ多重ＰＣＲフォーマットの性能分析結果を示す。
【図１４】アンプリコンサイズの関数としてＰＣＲシグナルに及ぼす分解ＲＮＡの影響を示すＲＮＡメトリック解析の説明図である。
【図１５】マイクロアレーとＵＭＰ−ＰＣＲの一致分析からのデータを示す表であり、雄ラットに各種用量のクロフィブレートを投与し、２種の異なる方法を使用して各種遺伝子の発現の相対変化を観察した。表はＡｕｅｒ  ａｎｄ  Ｌｙｉａｎａｒａｃｈｃｈｉ，２００３  “Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  ａｗａｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｈｉｐ  ｂｉａｓ：ＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３５（４）：２９２−２９３を応用した。
【図１６】組織特異的遺伝子の発現解析結果を示す表である。
【図１７】正常及び癌組織サンプルで１８種の異なる転写産物について実施した乳房組織のＰＰＭ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＧＡＰＤ参照遺伝子に対する正規化発現として結果を示す。
【図１】
2008541699.tif 000006
【図２】
2008541699.tif 000007
【図３】
2008541699.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008541699.tif 000012
【図８】
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【図９】
2008541699.tif 000014
【図１０】
2008541699.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
2008541699.tif 000017
【図１３】
2008541699.tif 000018
【図１４】
2008541699.tif 000019
【図１５】
2008541699.tif 000020
【図１６】
2008541699.tif 000021
【図１７】
2008541699.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月3日(2006.5.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の分解核酸集団のメンバーの検出方法であって、
ａ）前記分解核酸集団を含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）ターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）分解核酸集団の少なくとも１個のメンバーのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解核酸にアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト分解核酸のサブ配列に対応する複数の産物（但し、複数の産物中の少なくとも１個のメンバーは分解核酸に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、１個のターゲットアンプリコンの長さが少なくとも１個の他のターゲットアンプリコンの長さと相違する複数のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記複数のターゲットアンプリコンを検出することにより、サンプル中の分解核酸集団のメンバーを検出する段階を含む前記方法。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が１，０００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が６００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が約４５０ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がＲＮＡであり、前記サンプル中の前記分解核酸集団が約３００ヌクレオチド以下の平均サイズをもつ請求項１に記載の方法。
【請求項６】
分解核酸集団の前記メンバーが約２〜約１００個のメンバーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分解核酸集団の前記メンバーが約１０〜約４０個のメンバーを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分解核酸集団の前記メンバーが発現遺伝子ヌクレオチド配列に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１個の発現遺伝子ヌクレオチド配列が構成的に発現された参照遺伝子配列である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１個の発現遺伝子配列の発現レベルを少なくとも１個の他の発現遺伝子配列の発現レベルに比較する段階を更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現遺伝子ヌクレオチド配列が組織特異的遺伝子配列を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分解核酸集団がＲＮＡ又はＤＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分解核酸集団がＲＮＡを含み、複数の産物を生成する段階が逆転写を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが２８Ｓ及び１８Ｓ  ＲＮＡ種を含む哺乳動物ＲＮＡを含み、１８Ｓ  ＲＮＡに対する２８Ｓ  ＲＮＡの量的比が２．０：１以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが２８Ｓ及び１８Ｓ  ＲＮＡ種を含む哺乳動物ＲＮＡを含み、１８Ｓ  ＲＮＡに対する２８Ｓ  ＲＮＡの量的比が１．８：１以下である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが全細胞ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルがポリアデニル化ＲＮＡを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが固定処理を施した組織サンプルに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルがパラフィン包埋組織サンプルに由来する請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する１００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する８０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記分解核酸に対応する６０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
アニールしたターゲットプライマーを酵素伸長させ、複数の産物を生成する前記段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＣＲが多重ＰＣＲである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記多重ＰＣＲが約２〜約１００個のターゲットプライマー対を利用する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多重ＰＣＲが約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を利用する請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１個のターゲットプライマーが更に前記ターゲット特異的配列と前記ユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ターゲットプライマー対における各ターゲットプライマーの濃度が前記少なくとも１個のユニバーサルプライマーの濃度よりも低い請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
ユニバーサルプライマーの濃度に対する各ターゲットプライマー対の濃度の比が約１：２〜１：１０００である請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ユニバーサルプライマーの濃度に対する各ターゲットプライマー対の濃度の比が約１：１０〜１：１００である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の産物を酵素増幅する段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ターゲットプライマー対の各プライマーが３’末端を含み、前記ターゲットプライマー対をコグネイト分解核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、少なくとも１個のプライマー対の一方のプライマーの前記３’末端が前記プライマー対の他方のプライマーから２０塩基対以内である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１個のターゲットアンプリコンがラベルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
複数の前記ターゲットアンプリコンが各々異なるラベルを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出段階が複数のターゲットアンプリコンをサイズにより分離する段階を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出段階が電気泳動分析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出段階がキャピラリー電気泳動分析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出段階がハイブリダイゼーション分析を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出段階がアレーハイブリダイゼーションを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出段階がビーズシステムハイブリダイゼーションを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
核酸サンプル中に核酸分解が存在している場合にこれを識別する方法であって、
ａ）核酸分子を含む核酸サンプルを提供する段階と；
ｂ）少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）各プライマー対の前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列は前記サンプル中の同一コグネイト核酸分子のサブ配列に相補的である）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対を前記コグネイト核酸分子にアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個の産物（但し、（ｉ）前記少なくとも２個の産物は少なくとも４０塩基対長相違し、（ｉｉ）少なくとも１個の産物は前記コグネイト核酸分子に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を生成する段階と；
ｅ）前記産物を酵素増幅し、少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量する段階と；
ｇ）前記ターゲットアンプリコンの量を比較することにより、前記サンプル中に核酸分解が存在する場合にはこれをの識別する段階を含む前記方法。
【請求項４２】
前記少なくとも２個の産物がオーバーラップするヌクレオチドサブ配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも２個の産物がオーバーラップするヌクレオチドサブ配列を含まない請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーが各々更に少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列がターゲット特異的配列に対して５’側に位置しており；前記産物を酵素増幅する段階が少なくとも１個のユニバーサルプライマーを添加して少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階を含み、前記ユニバーサルプライマーが前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１個のターゲットプライマーが更に前記ターゲット特異的配列と前記ユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
段階（ｂ）が少なくとも１個の付加ターゲットプライマー対を提供する段階を含み、前記付加プライマーが段階（ｂ）（ｉｉ）のコグネイト核酸と異なるコグネイト核酸に相補的なターゲット特異的ヌクレオチドを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約
（ｉ）４０塩基対以上８０塩基対以下；
（ｉｉ）８０塩基対以上１２０塩基対以下；及び
（ｉｉｉ）１２０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の任意産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約
（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；
（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び
（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の任意産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が３個のターゲットプライマー対から構成される請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約
（ｉ）４０塩基対以上８０塩基対以下；
（ｉｉ）８０塩基対以上１２０塩基対以下；及び
（ｉｉｉ）１２０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の２個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
各産物がコグネイト核酸に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が約
（ｉ）４０塩基対以上６０塩基対以下；
（ｉｉ）１００塩基対以上１２０塩基対以下；及び
（ｉｉｉ）１８０塩基対以上２００塩基対以下から選択されるサイズ範囲をもち、１個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲が他の２個の産物のヌクレオチド配列サイズ範囲と相違する請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
各ターゲットアンプリコンが異なる長さをもつ請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記定量段階が少なくとも２個のターゲットアンプリコンをサイズにより分離検出する段階を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
前記アンプリコンが電気泳動により分解することができる請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アンプリコンがキャピラリー電気泳動により分解することができる請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも５０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも６０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも８０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも１００塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも１２０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも１４０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも２個の産物が少なくとも１６０塩基対長相違する請求項４１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ターゲットアンプリコンの量を比較する前記段階が前記ターゲットアンプリコンの相対モル濃度を比較する段階を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項６４】
１個のターゲットアンプリコンの相対モル濃度が少なくとも１個の他のターゲットアンプリコンの相対モル濃度よりも低いことにより、分解核酸を示す請求項４１に記載の方法。
【請求項６５】
前記定量段階が電気泳動分析を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項６６】
前記定量段階がキャピラリー電気泳動分析を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項６７】
前記定量段階がハイブリダイゼーション分析を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項６８】
前記定量段階がアレーハイブリダイゼーションを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項６９】
前記定量段階がビーズシステムハイブリダイゼーションを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項７０】
分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、
ａ）発現遺伝子に対応する分解ＲＮＡを含むサンプルを提供する段階と；
ｂ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個の分解ＲＮＡのヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含む）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をそのコグネイト分解ＲＮＡにアニールさせる段階と；
ｄ）前記コグネイト分解ＲＮＡ分子のサブ配列に対応する複数の産物（但し、複数の産物中の少なくとも１個のメンバーは分解ＲＮＡ分子に対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）を酵素生成する段階と；
ｅ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーを使用して前記複数の産物を酵素増幅し、１個のターゲットアンプリコンの長さが少なくとも１個の他のターゲットアンプリコンの長さと相違する複数のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｆ）前記複数のターゲットアンプリコンを定量することにより、分解ＲＮＡサンプルから遺伝子発現プロファイルを作成する段階を含む前記方法。
【請求項７１】
前記複数のターゲットプライマー対が約２〜約１００個のターゲットプライマー対を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数のターゲットプライマー対が約１０〜約４０個のターゲットプライマー対を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
各ターゲットプライマー対の各プライマーが３’末端を含み、前記ターゲットプライマーをコグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、少なくとも１個のプライマー対の少なくとも１個のフォワードプライマーの前記３’末端が前記プライマー対の対応するリバースプライマーの前記３’末端から２０塩基対以内である請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
複数の産物を酵素生成する前記段階が逆転写を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも１個のターゲットアンプリコンがラベルを含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
複数の前記ターゲットアンプリコンが各々異なるラベルを含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記サンプル中の分解ＲＮＡ分子に対応する１００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記サンプル中の分解ＲＮＡ分子に対応する８０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
複数の産物中の少なくとも１個のメンバーが前記サンプル中の分解ＲＮＡ分子に対応する６０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
複数の産物を酵素生成する前記段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
前記定量段階が電気泳動分析を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８２】
前記定量段階がキャピラリー電気泳動分析を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記定量段階がハイブリダイゼーション分析を含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８４】
前記定量段階がアレーハイブリダイゼーションを含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８５】
前記定量段階がビーズシステムハイブリダイゼーションを含む請求項７０に記載の方法。
【請求項８６】
分解核酸を含むサンプルの分析用キットであって、
ａ）複数のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々（Ａ）前記サンプル中の少なくとも１個のコグネイト分解核酸のヌクレオチドサブ配列に相補的なターゲット特異的ヌクレオチド配列と、（Ｂ）ターゲット特異的配列に対して５’側に位置する少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み；
ｉｉｉ）ターゲットプライマー対の各プライマーは３’末端を含み、前記ターゲットプライマーを前記コグネイト分解核酸とハイブリダイズさせるとき、少なくとも１個のプライマー対の１個のプライマーの前記３’末端は前記プライマー対の第２のプライマーの３’末端から２０塩基対以内である）と；
ｂ）分解核酸を含むサンプルを分析するための説明書を含む前記キット。
【請求項８７】
核酸サンプルの核酸分解メトリックの誘導方法であって、
ａ）核酸分子集団を含む核酸サンプルを提供する段階と；
ｂ）前記サンプル中の１個のコグネイト核酸分子ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
ｉｉｉ）前記ターゲットプライマー対は異なる長さのターゲットヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成することができる）を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対をコグネイト核酸ターゲットにアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、前記コグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階と；
ｅ）前記少なくとも２個のターゲットアンプリコンを定量し、アンプリコン定量値を生成する段階と；
ｆ）アンプリコン長の変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを誘導することにより、前記核酸サンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する段階を含む前記方法。
【請求項８８】
前記サンプルが全細胞ＲＮＡを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記サンプルがポリアデニル化ＲＮＡを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記サンプルが固定処理を施した組織サンプルに由来する請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記サンプルがパラフィン包埋組織サンプルに由来する請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記核酸分子集団が発現遺伝子ヌクレオチド配列に対応する請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
前記核酸分子集団がＲＮＡ又はＤＮＡを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
前記核酸分子集団がＲＮＡを含み、少なくとも２個のターゲットアンプリコンを生成する段階が逆転写を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
少なくとも１個のフォワードターゲットプライマー又はリバースターゲットプライマーが更に少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列がターゲット特異的配列に対して５’側に位置する請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
各フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーが各々更に少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列がターゲット特異的配列に対して５’側に位置する請求項８７に記載の方法。
【請求項９７】
ターゲットプライマー対の各プライマーが３’末端を含み、前記ターゲットプライマー対をコグネイト核酸分子ターゲットとハイブリダイズさせるとき、少なくとも１個のプライマー対のフォワードプライマーの前記３’末端が対応するリバースプライマーの３’末端から２０塩基対以内である請求項８７に記載の方法。
【請求項９８】
前記コグネイト核酸分子が構成的に発現された遺伝子配列に対応する請求項８７に記載の方法。
【請求項９９】
前記コグネイト核酸分子がハウスキーピング遺伝子に対応する請求項８７に記載の方法。
【請求項１００】
前記コグネイト核酸分子が参照遺伝子に対応する請求項８７に記載の方法。
【請求項１０１】
少なくとも１個のターゲットプライマー対により生成された少なくとも１個のアンプリコンが２００塩基対以下のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１個のターゲットプライマー対により生成された少なくとも１個のアンプリコンが１００塩基対以下のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０３】
少なくとも１個のターゲットプライマー対により生成された少なくとも１個のアンプリコンが８０塩基対以下のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０４】
少なくとも１個のターゲットプライマー対により生成された少なくとも１個のアンプリコンが６０塩基対以下のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０５】
少なくとも１個のターゲットプライマー対により生成された少なくとも１個のアンプリコンが約４０〜約６０塩基対のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０６】
アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させる前記段階がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素核酸重合を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＣＲが多重ＰＣＲである請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が３個のターゲットプライマー対である請求項８７に記載の方法。
【請求項１０９】
少なくとも１個のターゲットアンプリコンがラベルを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１０】
複数の前記ターゲットアンプリコンが各々異なるラベルを含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記定量段階が電気泳動分析を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１２】
前記定量段階がキャピラリー電気泳動分析を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１３】
核酸分解メトリックを誘導する前記段階がアンプリコンサイズの変化の関数としてアンプリコン定量値の変化の比を誘導する段階を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１４】
アンプリコンサイズの変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを誘導する前記段階が傾き、Ｘ切片及びＹ切片により特徴付けられる線をグラフィックプロット又は電子的に誘導する段階を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１５】
前記線の前記傾き、Ｘ切片又はＹ切片が前記核酸分解メトリックである請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
請求項８７に記載の方法により核酸分解メトリック値を誘導する段階と、前記メトリックを規定閾値品質スコアと比較する段階を含む核酸サンプルの品質の評価方法。
【請求項１１７】
（ｇ）各々異なるコグネイト核酸分子ターゲットから段階（ａ）〜（ｆ）に従って前記サンプルの複数の核酸分解メトリック値を誘導する段階と；
（ｈ）複数の核酸分解メトリック値の平均値又は中央値を計算する段階を更に含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１１８】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも５個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも１０個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも１５個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも２０個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも２５個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記複数の核酸分解メトリック値が少なくとも３０個の核酸分解メトリック値を含む請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項１１７に記載の方法により核酸分解メトリック値の平均値又は中央値を誘導する段階と、メトリック値の前記平均値又は中央値を規定閾値品質スコアと比較する段階を含む核酸サンプルの品質の評価方法。
【請求項１２５】
更に前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子を定量するための方法であって、
（Ａ）（ｂ）のコグネイト核酸分子ターゲットと異なる前記サンプル中の少なくとも第２のコグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも１個の付加ターゲットプライマー対を提供する段階と；
（Ｂ）前記付加ターゲットプライマー対を第２のコグネイト核酸ターゲットにアニールさせる段階と；
（Ｃ）アニールした付加ターゲットプライマー対を酵素伸長させ、前記第２のコグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応するアンプリコンを生成する段階と；
（Ｄ）前記アンプリコンを定量することにより、前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子の発現を定量する段階を含む請求項８７に記載の方法。
【請求項１２６】
ＲＮＡサンプルのＲＮＡ分解メトリックを誘導し、前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子の発現を定量する方法であって、
ａ）ｉ）発現遺伝子に対応するＲＮＡ分子の集団を含むＲＮＡサンプルと；
ｉｉ）前記サンプル中の第１のコグネイト核酸分子ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
Ａ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
Ｂ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
Ｃ）前記ターゲットプライマー対は異なる長さのターゲットヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成することができる）と；
ｉｉｉ）（ｉｉ）の第１のコグネイト核酸分子ターゲットと異なる前記サンプル中の第２のコグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも１個の付加プライマー対を提供する段階と；
ｃ）前記ターゲットプライマー対を夫々のコグネイト核酸ターゲットにアニールさせる段階と；
ｄ）アニールした前記ターゲットプライマーを酵素伸長させ、（Ａ）前記第１のコグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する異なる長さの少なくとも２個のＲＮＡメトリックアンプリコンと、ｂ）前記第２のコグネイト核酸分子のヌクレオチドサブ配列に対応する少なくとも１個の付加アンプリコンを生成する段階と；
ｅ）前記アンプリコンを定量してアンプリコン定量値を生成することにより、前記サンプル中の少なくとも１個の発現遺伝子の発現を定量する段階と；
ｆ）アンプリコン長の変化の関数としてＲＮＡメトリックアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを誘導することにより、前記ＲＮＡサンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する段階を含む前記方法。
【請求項１２７】
核酸分子を含む核酸サンプルの核酸分解メトリックを誘導する統合システムであって、
ａ）前記サンプル中の同一核酸分子ターゲットから誘導され、少なくとも長いアンプリコンと２００塩基対以下の核酸分子ヌクレオチド配列を含む短いアンプリコンを含むアンプリコンに対応する少なくとも２個のシグナルと；
ｂ）長いアンプリコンと短いアンプリコンのアンプリコン定量値に相関する前記シグナルを検出するための検出器と；
ｃ）検出器に制御可能に接続されており、
ｉ）前記検出器から前記シグナルを受け取り、
ｉｉ）シグナルを長いアンプリコンと短いアンプリコンに対応するアンプリコン定量値と相関し、
ｉｉｉ）アンプリコン長の変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表すメトリックを計算することにより、前記核酸サンプルの前記核酸分解メトリックを誘導する相関モジュールを含む前記統合システム。
【請求項１２８】
前記少なくとも２個のシグナルが３個のシグナルから構成される請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１２９】
前記少なくとも２個のシグナルが電気泳動システムから発生される請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３０】
前記短いアンプリコンが１００塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３１】
前記短いアンプリコンが８０塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３２】
前記短いアンプリコンが６０塩基対以下の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３３】
前記短いアンプリコンが約４０〜約６０塩基対の核酸ターゲット分子ヌクレオチド配列を含む請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３４】
アンプリコンサイズの変化の関数としてアンプリコン定量値の変化を表す前記メトリックが特徴的傾き、Ｘ切片及びＹ切片をもつ一次方程式である請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３５】
前記検出器が蛍光検出器である請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３６】
前記相関モジュールが前記核酸分解メトリックの計算用の１個以上のアルゴリズムを含む請求項１２７に記載の統合システム。
【請求項１３７】
請求項１２７に記載の統合システムを使用して核酸分解メトリック値を誘導する段階と、前記メトリックを規定閾値品質スコアと比較する段階を含む核酸サンプルの品質の評価方法。
【請求項１３８】
ａ）分解核酸分子集団と；
ｂ）前記核酸分子集団のメンバーである同一コグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも２個のターゲットプライマー対（但し、
ｉ）各ターゲットプライマー対はフォワードターゲットプライマーとリバースターゲットプライマーを含み；
ｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々ターゲット特異的ヌクレオチド配列を含み、各ターゲット特異的ヌクレオチド配列はコグネイト核酸分子のサブ配列に相補的であり；
ｉｉｉ）前記フォワードターゲットプライマー及びリバースターゲットプライマーは各々少なくとも１個のユニバーサルプライミング配列を含み、前記ユニバーサルプライミング配列はターゲット特異的配列に対して５’側に位置しており；
ｉｖ）前記ターゲットプライマー対は前記コグネイト核酸分子に対応する異なる長さのヌクレオチド配列を含む少なくとも２個のアンプリコンを生成すると予想され、（Ａ）前記アンプリコンは前記コグネイト核酸分子に対応する少なくとも４０塩基対長のヌクレオチド配列が相違し、（Ｂ）少なくとも１個の予想アンプリコンは前記コグネイト核酸ターゲットに対応する２００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む）と；
ｃ）前記ユニバーサルプライミング配列に相補的なヌクレオチド配列を含む少なくとも１個のユニバーサルプライマーと；
ｄ）前記ターゲットプライマー対を酵素伸長させることが可能な核酸ポリメラーゼを含む反応混合物。
【請求項１３９】
前記核酸分子集団が全細胞ＲＮＡを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４０】
前記核酸分子集団がｍＲＮＡを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４１】
前記核酸分子集団がｃＲＮＡを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４２】
前記コグネイト核酸ターゲットが構成的に発現された参照遺伝子配列に対応する請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４３】
少なくとも１個の予想アンプリコンが前記コグネイト核酸ターゲットに対応する１００塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４４】
少なくとも１個の予想アンプリコンが前記コグネイト核酸ターゲットに対応する８０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４５】
少なくとも１個の予想アンプリコンが前記コグネイト核酸ターゲットに対応する６０塩基対以下のヌクレオチド配列を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４６】
少なくとも１個の予想アンプリコンが約４０〜６０塩基対のターゲットヌクレオチド配列を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４７】
少なくとも１個のプライマー対がこの対の各プライマーに３’末端を含むことを特徴とし、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを前記コグネイト核酸ターゲットとハイブリダイズさせるとき、フォワードプライマーの前記３’末端がリバースプライマーの３’末端から２０塩基対以内の距離にある請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４８】
前記核酸ポリメラーゼが逆転写酵素活性とＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１４９】
前記少なくとも２個のターゲットプライマー対が３個のターゲットプライマー対を含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１５０】
少なくとも１個のターゲットプライマーが更に前記ターゲット特異的配列と前記ユニバーサルプライミング配列の間に少なくとも１個のスペーサーヌクレオチドを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１５１】
少なくとも１個のターゲットプライマーがラベルを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１５２】
複数のターゲットプライマーが各々異なるラベルを含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【請求項１５３】
（ｅ）（ｂ）のコグネイト核酸ターゲットと異なる核酸集団中のコグネイト核酸ターゲットに特異的な少なくとも１個の付加プライマー対を更に含む請求項１３８に記載の反応混合物。
【国際調査報告】
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