(57)【要約】組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLOPAP)を単量体の形態で取得するための方法；組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLOPAP)及びそのアミノ酸配列；デフィブリノゲナーゼ剤としての該プロテアーゼの使用および異常プロトロンビン血症のための診断キット本発明は、組換え型のプロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLopap)の単量体型、組換え型のプロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLopap)、同様にそのアミノ酸配列を取得する方法に関する。それに加えて、本発明は、本プロテアーゼの血液フィブリノーゲンを枯渇させるための使用、およびプロトロンビン減少の診断キットにも関する。本発明は、rLopap(Lonomia obliqua プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ)と命名された21kDaのプロトロンビンアクチベータプロテアーゼの組換え型の取得および特性決定を記載する。該酵素は、セリンプロテアーゼの特性を有するが、リポカリンファミリーにおけるような保存されたアミノ酸の配列を示す。前記タンパク質は、凝固促進活性を呈示し、血液フィブリノーゲンを枯渇させ、ヒトの血液／血漿の凝固時間を延長させる。rLopapを組換え型で得ることと臨床上の薬理学的アッセイを許容する適切な活性を示していることが、本発明において記載される。
2008517585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から構成されていることを特徴とする、組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)を取得するためのヌクレオチド配列：
【化１】
2008517585.tif 000006
。
【請求項２】
以下の配列番号２のペプチドを有していることを特徴とする、請求項1に記載の組換え型プロトロンビン（rLOPAP）のアクチベータ配列：
【化２】
2008517585.tif 000007
。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドP1(7〜29)およびP2(67〜86)、終止コドン(562〜564)およびポリアデニル化部位(630以上)の配列で特徴づけられる、請求項1に記載の配列。
【請求項４】
化学的なシークエンシングによって取得されたアミノ酸の配列で特徴づけられる、請求項2に記載の配列。
【請求項５】
制限部位に関連している最初の２つのアミノ酸の配列で特徴づけられる、請求項2に記載の配列。
【請求項６】
リポカリンファミリーの幾つかのタンパク質と30%付近の同一性を示すことを特徴とする、請求項1〜3の何れか１項に記載の配列。
【請求項７】
リポカリンに特徴的な三次構造に重要な領域に高度な類似性を呈示することを特徴とする、請求項1〜3の何れか１項に記載の配列。
【請求項８】
リポカリンファミリーのタンパク質に特徴的な三次構造を呈示することを特徴とする、単量体型の組換えプロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項９】
リポカリンファミリーの円二色性のスペクトルを呈示することを特徴とする、請求項8に記載のプロテアーゼ。
【請求項１０】
約21kDaの分子量を呈示することを特徴とする、請求項8および9に記載のプロテアーゼ。
【請求項１１】
組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)を取得するための方法であって、以下を備える方法：
(a)mRNAを取得することと；
(b)cDNAライブラリを作出することと；
(c)前記cDNAをアダプターに結合させることと；
(d)前記cDNAを、T7ＲＮＡポリメラーゼおよびオペロンLacZ開始配列の転写開始部位を含んでいるクローニングベクターと結合させることと；
(e)原核生物細胞に形質転換することと；
(f)プロトロンビン活性化タンパク質をコードするcDNAを増幅させることと；
(g)DNAを、アンピシリン耐性遺伝子の配列を含んでいるサブクローニングベクター（sub-clonage vector）と結合させることと；
(h)組換え型プラスミドをスクリーニングすることと；
(i)前記cDNAを増幅させることと；
(j)プラスミドDNAの制限酵素での消化；
(l)DNAシークエンシング、および
(m)組換えタンパク質の発現。
【請求項１２】
mRNAが上記の処理にしたがって取得されることを特徴とする、請求項11に記載の方法：
(a)L.obliquaの小棘を回収することと、それらを非常に低い温度で凍結することと、
(b)前記小棘を、RNAaseを排除する適切な道具を用いて、十分な量のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの溶液が添加される微細な粉末が得られるまですりつぶすことと、
(c)前記RNAを通常の技術で抽出すること。
【請求項１３】
全RNAの電気泳動プロフィールがトレース（traced）されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項12に記載の方法であって、前記mRNAが、NaOHで洗浄し、Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDSを中性のpHで含有している結合緩衝液で平衡化したオリゴdTセルロースのアフィニティーカラムにおいて精製され、前記カラムの排液は、重力で行われ、mRNAではない全てのRNAを排除するために、結合緩衝液で洗浄されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項14に記載の方法であって、前記mRNAが、260および280nmで石英キュベット中で記録される光学濃度で定量されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
cDNAライブラリを取得するための以下の工程を備えることを特徴とする、請求項11に記載の方法：
(a)特異的なアダプターを添加され、RNAaseを排除するために処理されたH2O中でmRNAを希釈することと、それを70゜Cで10分間加温することと、それを氷浴中で冷却することと、それを即座に遠心分離することと、
(b)第1のcDNAライブラリ系列を得ることと；
(c)第2のcDNAライブラリ系列を得ること。
【請求項１７】
前記cDNAをRT-PCR技術で取得することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項16に記載の方法であって、取得されたcDNAsが、400および800pbの低分子量(BA)の断片および800pbを超える高分子量(BB)の断片を有することを特徴とする方法。
【請求項１９】
第1の断片サイズのスクリーニングがアガロースゲルにおいて得られることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
請求項16に記載の方法であって、高および低分子量の断片が、アガロースゲルに適用され、電気泳動法後にバンドが前記ゲルから切除され、高および低量のcDNAsが精製され、溶出されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
cDNAが、60および70゜Cの間で加熱され、バキュームで濃縮されることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
優先的にEcoRIアダプターを用いることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項２３】
前記cDNAのクローニングベクターとの結合が、一方向性で、16゜Cを18時間で生じることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項２４】
前記クローニングベクターが、EcoRIおよびNOTI酵素で優先的に消化されることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
適用された細胞が優先的にE.coliのものであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌がInoue法で形質転換されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項２７】
形質転換された細菌を抗生物質でスクリーニングすることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
アンピシリンが使用される抗生物質であることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
cDNAライブラリを分析するために、クローニングベクター消化を、EcoRIおよびHindIIIで優先的に行い、取得された断片が臭化エチジウムで分析されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項３０】
分析される全てのプラスミドがシークエンシング処理に供試されることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライブラリを増幅するために以下の処置を備えることを特徴とする、請求項11に記載の方法：
(a)DH5αコンピテント細菌と高または低分子量の前記DNAに結合させたクローニングベクターとの混合物を、氷中で25〜35min、40゜Cで、45゜Cで2〜3min、再び氷中で更に5minインキュベートすることと、
(b)アンピシリンを含有している2YT培地を、10および200g/mlの間の濃度で添加し、溶液を均質化することと、
(c)それを脱気したチュウブに分注し、37゜Cで16〜20hインキュベートすることと、
(d)プラスミドDNAを抽出すること。
【請求項３２】
PCR技術がプロトロンビンアクチベータタンパク質をコードするcDNAを増幅させるために使用されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項３３】
94゜Cの変性温度；50゜Cのアニーリング温度および72゜Cの伸張温度で、30の増幅サイクルが使用されることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
サブクローニングのために、言及されたクローニングベクターの消化が、サブクローニングベクターに結合されるＤＮＡ断片の遊離を伴って実施されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項３５】
前記クローニングベクターおよび前記サブクローニングベクターが市場から利用可能であり、前記発現ベクターがタンパク質精製のためのマーカーを示す、請求項11に記載の方法。
【請求項３６】
前記クローニングベクターが優先的にpGEM11zf(+)であることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記サブクローニングベクターが優先的に"easy"pGEM-Tであることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記クローニングベクターが優先的にHindIII、BamHI、およびEcoRIで消化されることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
抽出され、精製される、言及されたクローニングベクターのDNA遊離が存在することを特徴とする、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
rLopapをコードするDNAのサブクローニングベクターへの結合反応が、優先的にE.coliのDH5α細菌で生じることを特徴とする、請求項35に記載の方法。
【請求項４１】
前記発現ベクターが優先的にpAEであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項４２】
優先的に自動シークエンシング法を適用することを特徴とする、請求項30に記載の方法。
【請求項４３】
タンパク質のＮ末端配列から得られた、開始オリゴヌクレオチド「センス」P1およびP2を適用することを特徴とする、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
オリゴヌクレオチド「センス」T7および「アンチセンス」SP6も使用されることを特徴とする、請求項42に記載の方法。
【請求項４５】
タンパク質発現が原核生物細胞において発生する、請求項11に記載の方法。
【請求項４６】
請求項45に記載の方法であって、組換えタンパク質および多量の可溶性の組換えタンパク質の高性能品（high performance）を取得するために、BL21(DE3)株を適用することを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項46に記載の方法であって、組換えタンパク質発現に使用される株が、溶原性であり、翻訳後修飾系を呈示せず、速く成長し、容易に培養され、維持されることを特徴とする方法。
【請求項４８】
前記組換えタンパク質がクロマトグラフィー技術を使用することによって精製されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項４９】
以下を特徴とする、請求項48に記載の方法：
クロマトグラフィーカラムが、ニッケル-セファロースおよびベンザミジン-セファロースのカラムであり；
前記ニッケル-セファロースカラムが、NaH2PO4 50mM, NaCl 300mM, イミダゾール 10mMで平衡化され、緩衝液Tris-HCl 50mM pH7.0において、9,0, イミダゾール 1M, NaCl 100 mMにおいて溶出される。
【請求項５０】
請求項48に記載の方法であって、前記ベンザミジン-セファロースカラムが、塩基性のpHで平衡化され、酸性のpHで溶出されることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項50に記載の方法であって、前記塩基性のpHが7,5および9,0の間であり、前記酸性のpHが2,0および4,0であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
溶出緩衝液がグリシンを含有することを特徴とする、請求項49に記載の方法。
【請求項５３】
rLopapが正しい又は変性された構造で取得することができることを特徴とする、請求項48に記載の方法。
【請求項５４】
精製されたタンパク質を、Bradford法(1976)で定量し、SDS-PAGEで分析することを特徴とする、請求項48に記載の方法。
【請求項５５】
請求項48〜54の何れか１項に記載の方法であって、取得される組換えタンパク質が、そのプロトロンビン活性能に関して、優先的にS-2238色素生産性基質を用いて試験されることを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項11〜55に記載の方法にしたがって取得されることを特徴とする、組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項５７】
前記組換え型タンパク質の二次構造が円二色性分光測定法で評価されることを特徴とする、組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項５８】
前記スペクトル(CD)が、分光旋光計で25゜Cで190および300nmの間の波長で実施されることを特徴とする、請求項57に記載の組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項５９】
前記スペクトルが解像度1nmで速度200nm/minで8回蓄積されることを特徴とする、請求項58に記載の組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項６０】
7,8および8,5の間のpHのTris/HCl緩衝液で希釈され、データがタンパク質濃度に基づくモル濃度で表されることを特徴とする、請求項48〜55の何れか１項に記載の組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)。
【請求項６１】
請求項11〜55の何れか１項に記載の方法にしたがって取得される組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)の使用であって、出血に問題がある患者の血漿におけるプロトロンビン診断キットを取得するために、適用することが可能であることを特徴とする使用。
【請求項６２】
血漿フィブリノーゲンを消費または枯渇させるタンパク質としての、請求項11〜55の何れか１項に記載の方法にしたがって取得される組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)の使用。
【請求項６３】
プロトロンビンアクチベータとしての、請求項11〜55の何れか１項に記載の方法にしたがって取得される組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)の使用。
【請求項６４】
臨床的な薬理学的アッセイにおける、請求項11〜55の何れか１項に記載の方法にしたがって取得される組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)の使用。
【請求項６５】
長期間持続する凝固時間（CT）延長因子としての、請求項11〜55の何れか１項に記載の方法にしたがって取得される組換え型プロトロンビンアクチベータプロテアーゼ(rLOPAP)の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の課題の記載］
本発明は、組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLOPAP)を単量体の形態で取得するための方法；組換え型プロトロンビン活性化プロテアーゼ(rLOPAP)及びそのアミノ酸配列；血液フィブリノゲナーゼを枯渇させるための本プロテアーゼの使用および異常プロトロンビン血症のための診断キットに関する。
【０００２】
[発明の背景]
Lonomia属は、全身性の毒物注入を、その毒が皮膚をとおして接種される結果として生じさせることが知られている。これによって、様々な程度の出血徴候が現れ、ときおり暴露された対象に死をもたらす（Lorini, 1999）。Walker Lonomia obliqua種(Lemaire, 1972)によって、ブラジル南部の限定地域において１９８９年から流行が発生している(Rio Grande do Sul, Santa Catarina and Parana) (BRAZIL, 1998)。
【０００３】
暴露された患者は、（他の症状の中でも）主に血液疾患（blood dyscrasia）の徴候（血液因子の比率の変化）を、ある期間（１〜４８時間で変化しえる）の後に示し（続いて、出血徴候が現れる可能性がある）、死に至る可能性がある（Kelen et al, 1995; Brazil, 1998）。
【０００４】
最近、Zannin等は、１０５患者の凝固パラメータを決定し、血漿フィブリン溶解を見出し、発症が凝固およびフィブリン溶解の機構に影響することを、幾つかの存在するデータを共に考慮して、確認した。これらの結果は、毛虫（Lonomia obliqua）の剛毛に存在する毒の成分に起因し、強い凝血促進性の作用（procoagulant action）とフィブリン溶解の二次的な活性化とを有する、重度の消費性凝固を指摘している（Zannin et. al., 2002）。
【０００５】
毛虫（Lonomia obliqua）の毒は、凝固系に干渉する幾つかの成分を呈示する。L.obliquaの剛毛の抽出物における、プロトロンビンアクチベータ及びＸ因子の存在が既に報告されている（Donato et. al., 1998; Kelen et. al., 1995）。
【０００６】
本発明の発明者らは、Lopap（Lonomia obliqua prothrombin activator protease）と命名された、69kDaのプロトロンビンアクチベータプロテアーゼを分離し、特性付けを行った。その酵素は、セリンプロテアーゼ特性とマウスにおいて凝血促進性活性（procoagulant activity）とを有しており、血液のフィブリノーゲンを枯渇させ、血小板数を僅か３０％に変化させ、PGI2レベルを増加させるためのコラーゲンによって誘導される血小板の凝集機能を完全に阻害する。
【０００７】
腹腔内投与でラットに注射された場合、Lopapは静脈および動脈に血栓を発生させ、多形核白血球の肺および腎臓への遊走を生じる（Reis et. al., 1999, Reis et al, 2001 a, b）。
【０００８】
最近、次の事項を確認することができた；その事項とは、Lopapが内皮細胞（HUVECs）中で、ICAM-1およびE-セレクチンなどの接着分子発現の誘導因子として作用するが、VCAMは発現させないことである。また、IL-8の及びPGI2の増加をも誘導する。VCAMの非発現は、次の事項を示唆している；その事項とは、Lopapの炎症促進性作用が、内皮細胞でのTNF-αと又はトロンビンと比較できないことである。高濃度のPGI2は、血小板抗凝集因子（platelet anti-aggregating）としても作用することができる。
【０００９】
次の事項も検証された；その事項とは、Lopapによって産生されたトロンビンが機能的であり、抗トロンビンIII(AT)によって阻害されること及び血小板を凝集させること同様に血漿およびフィブリノーゲンを凝固させることができることであり、α-トロンビンと類似することを示唆している(Chudzinski - Tavassi et al, 2001)。
【００１０】
L.obliquaの剛毛抽出物は、ラットにおいて毒液の血栓の実験的な阻止に効果的であることが示され（Prezoto et. al, 2002）、本効果の機構を解明するために、毒液の画分を用いる試験が行われた。
【００１１】
この研究の間に、pGEM11zf+プラスミド中のcDNAライブラリーが構築された。本来（native）のタンパク質のＮ末端部分から得られた、特定の縮重させた開始オリゴヌクレオチドを使用することによって、Lopapに相当するクローンが分離され、その配列が決定された。cDNAから推測されたアミノ酸の配列を、「GenBank」からの他の配列とCLUSTAL  Wプログラムで整列させた。
【００１２】
Lopapは、Pieris brassicaeのBBP BILIN-結合タンパク質と37%；ヒトのApoD-アポリポタンパク質Ｄ前駆体と34%；Manduca sextaのINS-A - INSECTICYANIN Aと35%；Homarus gammarusのCC-A2 - A2 CRUSTACYANIN A2 SUB-UNITYと22%；Homarus gammarusのCC-C1.- C1 CRUSTACYANIN C1 SUB-UNITYと26%；およびGallus gallusのPURP.- PURPURIN PRECURSOR（gi 131549）と27%の同一性を示した。
【００１３】
リポカリン(ギリシャ語に由来する、「lipos」=脂肪および「calyx」=杯)は、大きなグループの一部であり、幾つかの種において呈示され、多大な機能的及び構造的な多様性が常に拡大され、示されている。通常、彼等は、160および180アミノ酸の間で変動している小タンパク質であり、共通の特性を呈示している（Flower et. al, 2000）。
【００１４】
これらのタンパク質は、互いに若干の類似性を示すが（２０％付近）、彼等は２つの高度に保存されたドメイン（「βバレル」領域への水素結合によって結合される、８つのアミノ酸残基）を含有することから、彼等はリポカリンとして分類される。これらの領域が、その二次および三次構造の高度の類似性を担っている。
【００１５】
リポカリンは、疎水性の「β-バレル」―カインド領域（内側の腔および外側のループから構成され、異なるリガンドへの結合部位を含有している）を呈示するために、分子（特に、レチノールのような疎水性のもの）に結合することができる。これらの腔および「ループ」の多様性によって、各タンパク質に、異なるサイズ、形態、および化学的特性のリガンドに適応する可能性がもたらされる。
【００１６】
cDNAによって取得される配列から、Swiss PDB Viewer 3.7(b2)プログラムおよびSwiss Model Serverを用いて、Lopap構造モデルを研究するアプローチが実施された。これによって、典型的なリポカリンファミリー構造が、発見された。しかしながら、これは本モデリングによってセリンプロテアーゼ部位を視覚化することができなかった。
【００１７】
リポカリン  ファミリーメンバータンパク質は、プロトロンビン活性化プロテアーゼの機能を有していると文献に記載されていなかった。動物毒の他のアクチベーターとは異なり、rLopapはプロトロンビンを加水分解し、そのプロトロンビナーゼ複合体成分とは独立に、断片（プレトロンビン 2, トロンビンおよび断片1.2および断片1および2）を生じる。この種類の断片化によって、トロンビンの緩徐な形成が促進され、良好なコントロールが可能となり、その作用が妨げられる。そのうえ、NO、PGI2の発現として、内皮レベルに関連する細胞応答を促進することに関して、rLopapは他の既知のアクチベーターとは異なっている；というのも、それは血小板凝集反応を変調（modulate）することができるからである。その他に、本タンパク質は、他の毒のプロトロンビンアクチベーターと比較した際に、その組換え型を容易に取得することができるとの利点を有している。
【００１８】
プロトロンビンを活性化するrLopapの能力に基づいて、血漿中にこれらの因子の濃縮物の用量キット（a dosage kit）を調製することができる。rLopapを希釈したヒト血漿でインキュベーション後に、形成されたトロンビンは、特異的な色素生産性および蛍光生産性の基質（市場において、例えば、配列  H-D-フェニルアラニル-L-ピペコリル-L-アルギニル-p-ニトロアニリドを呈示するChromogenixのS2238又はAbz-FFNPRTFGSGQ-EDDnpのケースとして合成することができる）の加水分解によって決定される。色素生産性基質の吸光度（405nmで測定される）を参照するさいに、サンプルのプロトロンビン活性と比例され、市場のヒト血漿の標準曲線と比較することができる。
【００１９】
血小板数を変化させることのないタンパク質活性化活性のデフィブリノゲナーゼ潜在性（defibrinogenase potential）並びにLopapを新規のプロトロンビンアクチベータとして考慮することを容認する構造的な差異に基づく、本タンパク質に関連する特許出願が同じ著者によって出願された（PI02002698）。
【００２０】
前記PI0200269-8は、一般的に、プロトロンビン活性化活性（prothrombin activating activity）を有する毛虫（Lonomia obliqua）の剛毛から可溶性タンパク質を精製する方法、参照されたプロトロンビンアクチベータのアミノ酸配列を部分的に決定する方法、画分ＩＩ同様にプロトロンビンアクチベータの本プロトロンビン活性化活性を決定する方法並びに本アクチベータの使用を記載している。
【００２１】
上記で言及したタンパク質に関して同じ研究アプローチにしたがって、発明者は本発明において臨床的な薬理学的なアッセイを許容する適度な活性を有する組換え型でLopapを提供する。
【００２２】
本発明にしたがって、Lopapを発現ベクターにサブクローンし、大腸菌で発現させた。
【００２３】
これを実施するために、以下に記載するものが使用された：
系統：大腸菌（Escherichia coli）;
1)系統DH5α:φ80 dlacZ△M15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk-, mk+) SupE44, relA1, deoR △(lac ZYA - arg I) u169。
【００２４】
2)系統 BL21 (DE3): F', ampT, hsdSB(r8-, m8-), dcm, gal (DE3)。DE3バクテリオファージは、イソプロピル-チオ-β-ガラクトシド(IPTG)によって誘導されるLac UV5プロモーターの制御下で、T7ファージのRNAポリメラーゼ遺伝子を含有している。
【００２５】
プラスミド：
1)pGEM-11Zf(+)：  プラスミドライブラリ構築に使用されるEcoRI e Not Iで消化されたベクター。PROMEGA技術マニュアル, 1999。
【００２６】
2)"easy" pGEM-T：  "easy"pGEM-Tプラスミドは、ＰＣＲ産物をサブクローニングするためのMCS (「マルチプルクローニングサイト」)領域を囲むT7およびSP6プロモーターを含有する。PROMEGA技術マニュアル, 1999。
【００２７】
3)pAE:  pRSETA (Invitrogen)に及びButantan研究所のMolecular Biotechnology Laboratoryで構築されたpET3-His (Chen, 1994)に由来する発現ベクター(Ramos et. al, 2003)。
【００２８】
pAEは、T7プロモーターの効率とpRSETAプラスミドコピーの多コピー数の特性をあわせ持ち、pET3-Hisから非除去性の６つのヒスチジンのＮ末端融合物と組合せた高発現ベクターであり、組換えタンパク質の精製をIMAC(「Immobilized Metal Affinity Chromatography」)を通じて可能とするものである。この小さい融合物の付加によって、研究された組換えタンパク質の多くの活性は干渉されない。
【００２９】
PCR反応における開始オリゴヌクレオチド（initiator oligonucleotides）の合成のために、以下のように実施した：
「センス」オリゴヌクレオチド(P1およびP2)を、前記タンパク質のＮ末端配列から取得した(図1)。引き続く、一方向性のクローニング（unidirectional cloning）のためのBamHI制限部位を、これらのオリゴヌクレオチドに差別的に付加した。また、「センス」および「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを使用した。それら全てを、TE(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM)緩衝液で希釈し、終濃度10-pmol/μl(100μM)とした。
【００３０】
mRNA調製に関して、処置は以下の通り:
剛毛の抽出および調製
前記毛虫を、CO2(ドライアイス)で麻酔した。そして、彼等の小棘（spicules）を切断し（2,7g）、事前に秤量した無菌のプラスチックチュウブに静置し、液体窒素に浸漬した。前記小棘を、RNAsesを排除するために、DEPC(ジエチルピロカルボネート)で処理した後に、微細な粉状に変化するまでドライアイスおよび液体窒素を用いて、乳鉢ですりつぶした。
【００３１】
全RNAの抽出
小棘粉末を全RNA（total RNA）を取得するために使用した（製造者のマニュアルに記載された方法にしたがい、好ましくはトリアゾール法を用いた）。
【００３２】
全RNAの電気泳動のプロフィール
電気泳動法システムの部品を、RNAsesを排除するために過酸化水素(H2O2)3%で処理し、滅菌したDEPC処理水で洗浄した。1,5%アガロースゲルを10mM, pH7,0のリン酸ナトリウム緩衝液に含有するものを、標準システムに満たす。10または15μlの全RNA(16,7ng/μl)を含有している２つのサンプル、5μlのサンプル緩衝剤およびDEPC処理したH2Oで最終容量25μlにしたものを、ゲルに適用した。サンプル泳動を、5V/cmでブロモフェノールブルーがゲルの２／３に達するまで行った。
【００３３】
オリゴ(dT)セルロース アフィニティーカラムでのmRNAの精製
mRNAを、NaOH 0,1Nで洗浄し、1mlのTris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 300mM, SDS 0,1%, pH7,0緩衝液で平衡化したオリゴdTセルロースアフィニティーカラムで精製した。
【００３４】
3mlの本緩衝液を、全RNAに添加し、70゜Cで5分間インキュベーションし、氷上で更に5分間冷却し、前記アフィニティーカラムに適用した。前記カラムを、重力で排出させ、mRNAではない全てのRNAを排除するために、さらに4mlの緩衝液を用いて洗浄した。前記mRNAを、1,5 mlのTris-HCl 10mM, EDTA 1mM, SDS 0,1%, pH7,0 緩衝液で溶出し、清浄なチュウブに収集し、70゜Cで5分間温め、氷上でさらに5分間冷却した。試料を室温で20分間インキュベーション後、90μlのNaCl  5Mをその試料に添加し、そして前記緩衝液で再平衡化されたカラムに再度適用した。4mlの前記緩衝液を用いてさらに洗浄し、1,5mlの溶出緩衝液で試料を溶出させた後に取得されたものを、90μlのNaCl  5Mおよび3mlの無水エチルアルコールで-80゜Cで「一晩」沈殿させた。試料を、次に7000gで20分間4゜Cで遠心分離し、上清を除去した。前記mRNAを、1mlのエチルアルコール75%で洗浄し、7000gで2分間4゜Cで遠心分離した。
【００３５】
試料を乾燥させた後に、沈殿mRNAを20μlのDEPC処理H2Oに再懸濁し、-80゜Cで維持した。
【００３６】
mRNAの定量
500μlの最終的な容量に対し、498μlの滅菌H2O milli-Qに2μlのmRNAを含有するものを試料に添加した。光学濃度の記録を、260および280nmで500μlの石英キュベット中で行った。mRNA濃度は、下記の式を用いて計算された：
[RNA]=A260 x D x 40μg/ml
式中のD=希釈因子
cDNAライブラリの構築に関して、以下の処置を行った：
cDNAライブラリを、4,0μgの単離されたmRNAから、優先的にcDNA合成のためのSuperScriptTM プラスミドシステムおよびプラスミドクローニング（Life Technologies）修飾キットを用いて構築した。
【００３７】
第1系列の合成
4,0μgのmRNAを6μlのDEPC処理H2Oに希釈した（該溶液中には、1,5μlのNotI適合プライマーが添加され、次に70゜Cで10分間温められ、氷浴で冷却され、直ちに遠心分離された）。4μlの第1系列の緩衝液５ｘ、2μlのDTT 0,1M、1μlのdNTP混合物10mM、および0,5μlのH2Oを、チュウブに添加した。反応を均質化し、直ちに遠心分離し、44゜Cで2分間平衡させた。5μlのSuper Script II RT酵素を添加し、混合物を44゜Cでさらに90分間インキュベートした。4゜C冷却プロセスで反応を中断した。
【００３８】
第2系列の合成
試料を、第1系列反応の混合物、91μlのH2O, 30μlの第2系統の緩衝液, 3μlのdNTP 10mM混合物, 1μlのE. coli DNAリガーゼ 10U/μl, 4μlの大腸菌DNAポリメラーゼ I 10U/mlおよび1μlのE coli RNAase H(2U/μl)に添加した。前記混合物を緩やかに撹拌した後、16゜Cで2時間インキュベートし、2μlのT4ＤＮＡポリメラーゼIを添加し、さらに5分間のインキュベーションを同じ温度で行った。反応を、氷中での冷却プロセスによって及び10μlのEDTA 0,5Mを添加することによって中断させた。
【００３９】
アガロースゲル中での断片サイズのスクリーニング
17μlのフィコールキシレンシアノールフリー（Ficoll xylene cyanol free）を添加された第2系列での全ての反応物を、アガロースゲル1%に供試し、電気泳動システム中で80Ｖで1cmのサンプル移動後に、２つのバンドをゲルから摘出した。一方は400および800pb(低分子量  -  BA)間の断片を含有しているものであり、他方は800pb(高分子量  -  BB)を超える断片を有しているものである。
【００４０】
DNAをゲルから優先的にConcert Gel Extraction Systems(Life Technologies)キットを用いて精製し、cDNAを50μlのH2Oで溶出し、65゜Cで温め、濃縮法を用いて30μlに減少させた。
【００４１】
cDNAのEcoRIアダプターへの結合
試料を、反応チュウブ〔10μlのT4 DNAリガーゼ 5X緩衝剤, 5μlのEcoRI(アマシャム)アダプターおよび5μlのT4DNAリガーゼ〕に添加し、事後に16゜Cで16時間インキュベーションした。直後に、反応を65゜Cで10分間温め、氷中で冷却した。2μlのATP溶液および2μlのT4ポリメラーゼキナーゼを添加後に、反応を37゜Cで30分間インキュベートした。
【００４２】
cDNAを、55μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を用いて抽出し、撹拌し、14000gで5分間室温で遠心分離した。上の水相を、別のチュウブに移し、２容量の無水エタノールおよび1容量の3-M酢酸ナトリウムを添加し、-80゜Cで1時間冷却した。14000gで20分間遠心分離した後、500μlのエタノール70%で洗浄した。cDNAをフロー中で約５分間乾燥させた。
【００４３】
NotIでの消化
41μlのH2O, 5μlのREact反応緩衝剤, 4μlのNotIを沈殿物に添加し、緩やかに均質化し、37゜Cで2時間インキュベーションした。
【００４４】
アガロースゲル中での第2のサイズスクリーニング
50μlの反応物（高および低分子量の断片の）を、アガロースゲル1%に適用した。そして電気泳動後に、バンドをゲルから切り出した。高および低分子量の断片のcDNAsを、最初のサイズスクリーニングで記載したとおり（アガロースゲル中での断片サイズのスクリーニング）、精製し、50μlのH2Oで溶出した。
【００４５】
cDNAからpGEM11Zf(+)ベクターへの一方向性の結合
高および低分子量の２つの画分（14μl）に、4μlのT4 DNAリガーゼ緩衝剤, 1μlのクローニングベクター（clonage vector）, 優先的にpGEM11Zf(+)(前にEcoRI-NotI酵素で消化した)(図2)および1μlのT4 DNAリガーゼを添加し、16゜Cで18時間インキュベートした。
【００４６】
本発明の細菌形質転換法は、以下に記載の処置に従う：
コンピテント E. coli DH5αの形質転換
高および低分子量のDNAs(2μl)を、Inoue et al.(1990)の方法にしたがって、-80゜Cで維持し、事前に氷中で１５分間融解させて調製した、50μlのカルシウムコンピテント細菌(DH5α)に添加した。溶液を、氷中で３０分間インキュベートし、そして42゜Cで2分間のヒートショックに供試し、再度氷中に５分間おいた。
【００４７】
350μlのSOC培地を、形質転換した細菌に添加し、37゜Cでインキュベートされている通気されたチュウブに移した〔撹拌条件（220rpm/min）で90分間〕。200μlの高および低分子量のcDNAを、2YT-アンピシリン培地を有するプレートにおいた。これらのプレートを37゜Cで18時間インキュベートした。高分子量の挿入物を含有している２０コロニーおよび低分子量の挿入物を含有している２０コロニーを、２つのプレートで2,5mlの2YT-アンピシリン  100μg/ml培地中で37゜Cで200rpmの撹拌条件下で18時間インキュベートした。cDNAsを、優先的にmini-prep - Concert Rapid Plasmid (Life Technologies)キットを用いて精製し、50μlのTEで65゜Cで溶出した。
【００４８】
前記プラスミドに関連するライブラリを分析するために、以下の処置を行った：
前記プラスミド(4μl)を、1μlの特異的な反応緩衝剤, 4μlの水, 0,5μlのEcoRI(10U/μl)酵素の存在下で、37゜Cで2時間消化した。0,5μlのHindIII(10U/μl)および生じた断片を、アガロースゲル1%に臭化エチジウムを有するもので分析した。全ての分析したプラスミドを、シークエンシング法に供試した。
【００４９】
ライブラリの増幅物を取得する目的で、50μlのDH5αカルシウム-コンピテント細菌並びにクローニングベクターに結合された5μlの高または低分子量(BAまたはBB)のDNAを含有している混合物を、30min氷中で2min、42゜Cでインキュベートした。その後、試料を、氷中に更に５分間戻した。その後、10mlの2YT/アンピシリン  100μg/ml培地を試料に添加した。これらの溶液を穏やかに均質化した。そして、2,5mlのアリコートを、ピペットで脱気したチュウブに移し、37゜Cで18hインキュベートした。その後、プラスミドDNAを、ミニプレップカラム（mini-preps columns）を用いて抽出し、50μlのH2Oで65゜Cで溶出し、-20゜Cで維持した。
【００５０】
ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)
50-μl最終容量のために調製されたPCRs「ポリメラーゼ連鎖反応法」に、1μlのdNTPs 10mM, 5μlの緩衝剤（Taq ＤＮＡポリメラーゼに関する） 10x, 1,5μlのMgSO4 50mMおよび0,5μlのTaqDNAポリメラーゼ 2,5Uを含有させた。プロトロンビン活性化タンパク質をコードするcDNAを増幅させるために、4μlのオリゴヌクレオチドP1 10pMおよび2μlのオリゴヌクレオチド SP6 10pMを使用した。反応を、サーモサイクル装置（thermocycling device）で行った。その際、変性プログラムを、最初に94゜Cで3min, 30の変性サイクル(94゜Cで45秒間), アニーリング(50゜Cで25秒間), 伸長(72゜Cで4min)および最終的な伸長を72゜Cで15min行った。その後、試料を、アガロースゲル1%に適用した。電気泳動法による８０Ｖでの泳動の２ｈ後、産物の期待された増幅物に相当するバンドを、ゲルから切り出した。DNAを、クローニングベクター〔好ましくは、「pGEM-T Easy Vector Systems」(PROMEGA)〕へ結合させるために、抽出し、30μlのH2Oで溶出した。
【００５１】
DNAを"easy"pGEM-Tへと結合させることを実施するために、以下の方法を選択した：
結合は、最終的な容量の10μlに、6μlのPCR産物(1700pb), 1μlのpGEM-Ｔベクター(図3), 2μlのT4  DNAリガーゼ 5x緩衝剤および1μlのT4 DNAリガーゼ1U/μlを含有しているもので、16゜Cで18時間実施された。
【００５２】
ベクター:挿入物の関係を、以下の式にしたがって計算した：
X x I x R = Y
V
式中で：
X=ベクターのng；I=挿入物のKb；R=挿入物/ベクターのモル濃度；Y=挿入物のng；V=ベクターのKb。
【００５３】
DH5α  E. coliの株を、5μlのベクター挿入物結合反応物とインキュベートし、プレートに配置した。形成されたコロニーから４０を、DH5α-コンピテント  E. coliの形質転換のためのプロトコールに記載のとおり正確に、前移植物（pre-inoculum）および「ミニプレップ（mini-prep）」のために収集した。
【００５４】
アガロースゲル中での組換え型プラスミドの選択
ミニプレップ反応物を処理する前に、300μlの各々の前移植物を、Beuken等(1998)に記載の方法にしたがったフェノール：クロロフォルム精製の簡易法に供試した。その後、20μlの各サンプルを、アガロースゲル1%（TAE 1X緩衝液中）に適用した。電気泳動法を実施後に、ゲルを0,1μg/mlの臭化エチジウム溶液で染色し、より大きな組換え型プラスミドの選抜のために、ＵＶライトで処理した（Sambrook, 1989）。前の処理の陽性クローンを、ミニプレップに供試し、60μlの水で溶出した。
【００５５】
プライマー2(P2)を用いたPCR
PCR反応物を10μlの最終容量に、0,2μlのdNTPs 10mM, 1,0μlの緩衝剤（Taq ＤＮＡポリメラーゼに関する）10x, 0,3μlのMgSO4 50mM, 0,1μlのTaq  ＤＮＡポリメラーゼ5U/μlを含有させて調製した。cDNA増幅に関して、前の処理で精製された2μlの陽性クローン精製物を1/50の希釈で鋳型として使用し、0,8μlのオリゴヌクレオチドP2 10pMおよび0,4μlのSP6 10pMをプライマーとして使用した。反応は、Perkin-Elmerサーモサイクル装置モデル9600中で、初期変性プログラムを94゜Cで3min, 30サイクルの変性(94゜Cで45秒間), アニーリング(50゜Cで25秒間), 伸長(72゜Cで4min)および最終的な伸展を72゜Cで15minで行った。その後に、サンプルをアガロースゲル1%に適用した。
【００５６】
制限酵素でのプラスミドDNA消化
プライマーP1およびP2を用いたPCRによって増幅された精製クローンのDNAsを、5μlのプラスミドDNA, 2μlの特異反応緩衝剤, 0,5μlのHindIII(10U/μl), 0,5のBamHI(10U/μl)および12μlのH2Oを最終的な容量の20μlに含有している溶液で37゜Cで2h消化した。
【００５７】
同じプラスミドDNAs(5μl)を、1μlの特異反応緩衝剤, 1μlのEcoRI(10U/μl)および12μlの水で同じ条件下でインキュベートした。
【００５８】
消化産物を、アガロースゲル1%で分析した。ライブラリのクローンおよび"easy"pGEM-TにサブクローニングしたDNAsをシークエンスした。
【００５９】
DNAsのシークエンシングを実施するために、ジデオキシヌクレオチドによるチェーンターミネーション法を選択した。DNAsを自動シークエンシング法に適用した。400ngのプラスミドDNAを、ミニプレップによる精製で調製し、これをシークエンシング反応での鋳型（molds）として使用した。T7およびSP6を、記載されたオリゴヌクレオチド反応において使用した。サーモサイクリング後に、増幅産物を、36cm長(4,25%アクリルアミド:ビス-アクリルアミドを19:1の比率で、1X TBEおよび7M Urea中）のDNAゲルシークエンシング中で分離した。本装置の検出系は、レーザー光源および蛍光検出器をシークエンスゲルの下部に供えるものである。各dNTPは、検出器によって認識される特異的な蛍光を放射する；検出器は、電気泳動図（electropherogram）中のヌクレオチドの位置を自動的に登録するコンピュータにメッセージを送る。泳動を、7時間実施した。全てのシークエンスされたDNAsを、サイト（www.ncbi.nlm.nih.gov/）でBLASTxおよびBLASTnプログラムのアルゴリズムに基づいて或いはFASTAプログラムに関してサイト（www.ebi.ac.uk/）で「GenBank」配列と比較した。
【００６０】
本発明に使用される組換えタンパク質の発現方法〔好ましくは、E.coli系統BL21(DES)〕は、以下にリストされる処理ラインにしたがう：
pAEベクターへの結合
シークエンスされた挿入物がLopap配列であることが確認された陽性クローンを、7mlのLB/アンピシリンで37゜Cで18時間インキュベートし、その後にミニプレップに供試し、50μlの水で溶出する。
【００６１】
精製DNAsを、20μlのプラスミドDNA、5μlの特異反応緩衝剤、1,0μlのEcoRI(10U/μl)、1,0μlのBamHI(10U/μl)および23μlのH2Oを最終的な容量の50μlに含有している溶液で37゜Cで5h消化した。
【００６２】
調製用のアガロースゲル1%中で電気泳動した後に、600pb周囲のバンドをゲルから精製し、30μlのH2Oで溶出し、バキュームで45゜Cで1h乾燥させた。
【００６３】
プラスミドを、10μlのH2O中に再懸濁した。そして、その3,5μlを、3,5μlのpAE発現ベクター(図4), 2μlの緩衝剤5x（DNAリガーゼに対する）および1μlのDNAリガーゼで16゜Cで18hインキュベートした。pAEベクターにサブクローニングされたクローンも、シークエンスされた。
【００６４】
Lopap発現の誘導
多量の可溶性の組換えタンパク質を取得する目的で、大腸菌のBL21(DE3)株が、本タンパク質の発現に好適に使用される。この株は、成長が早く、容易に培養および維持され、多量の組換え型タンパク質を提供する。このE. coli系統は、溶原性（lysogenic）であり、翻訳後修飾システムが存在しない。
【００６５】
好ましくは組換え型発現ベクター（pAE-クローン14.16）（図4）によって形質転換されたE.coli培養物を、3mlのLB/アンピシリン(100μg/μl)培地に播種し、0,5のDO600 nmが得られるまで37゜Cでインキュベートした。非誘導性のコントロールに関して、1mlの前移植物を4゜Cで維持した。IPTG  0,5mMを、残りの容量に添加した。そしてインキュベーションを、さらに３ｈ維持した。全ての40μlの培養物に対して、10μlのSDS-PAGEアプリケーション緩衝液にβ-メルカプトエタノール0,1Mを有するものを添加した。サンプルを、12min沸騰させ、ポリアクリルアミドゲル12,5%に適用した。その後、ゲルを、0,25%の「クーマシーブルー（Coomassie Blue Brillant）」を50%メタノール中に含有するもので１８ｈ染色し、酢酸１０％水溶液で３ｈ室温で脱染色した。
【００６６】
本発明のタンパク質（Lopap）の発現を得るために、以下の処置を行った：
前記発現ベクターで形質転換したE.coli培養物を、100mlのLB/アンピシリン(100μg/μl)培地に播種し、37゜Cで0,5のDO600 nmが得られるまでインキュベートした。25mlのアリコートを、500mlのLB/アンピシリン(100μg/μl)を有する４つの異なるボトル中で37゜Cで90minインキュベートした。IPTGを、1mMの終濃度に達するまで添加した。そして、インキュベーションをさらに４ｈ維持した。培地を、12000rpmで遠心分離し、-70゜Cで18hrs凍結した。4ボトルの細胞を、70mlの溶解緩衝剤 NaH2PO4 50mM, NaCl 300mM, イミダゾール 10mMに再懸濁し、フレンチプレスを2000GAGEで３回行い、5000rpmで15min.4゜Cで遠心分離した。
【００６７】
可溶性の発現タンパク質を含有している上清を、清澄化のために15000rpmで30minで遠心分離し、溶解緩衝液で事前に平衡化したニッケル-セファロースアフィニティーカラムに適用した。前記カラムを、緩衝剤イミダゾール  80mM, β-メルカプトエタノール 5mM, NaCl 500mM, Tris HCl 50mM pH6,8で洗浄し、洗浄したボリュームを収集した。タンパク質を、Tris-HCl 50mM pH8.0, イミダゾール 1M, NaCl 100mMを用いて流速1ml/5minで溶出した。
【００６８】
培地の「ペレット」〔小体（corpuscles）〕を、フレンチプレスに供試し、遠心分離し、疎水性の成分を排除するために20mlの緩衝液（Tris-HCl 50mM, Urea 1M, Triton X-100 1%, pH8,0）に再懸濁し、5000rpm、4゜Cで15min遠心分離した。分離された沈殿物を、10mlの緩衝液（Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, 尿素 8M, β-メルカプトエタノール 10mM pH8,0）で小体（corpuscles）の可溶化のために、室温で25゜Cでインキュベーションした。この物質を、再度4000rpmで4゜Cで20min遠心分離した。そして、上清をTris-HCl 50mM, NaCl 500mM, イミダゾール 5mMおよびβ-メルカプトエタノール 5mM pH8,0の「リフォールディング（refolding）」緩衝液に、滴下して添加（正しい構造を有するタンパク質を取得するための代替として。この段階に達するための別のアプローチは、CaCl2 100mMを添加された緩衝液を用いて実施された）すると共に、室温で１８ｈ恒常的に撹拌を行った。前記物質を、濾過し、前記溶解緩衝液で事前に平衡化されたニッケルセファロースカラムに７２ｈ適用した。カラムを、180mlの緩衝液（Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, イミダゾール 20mM pH6,8）で洗浄し、Tris-HCl 50mM pH 8.0, イミダゾール 1M, NaCl 100mMで溶出した（流速  1ml/5 min）。
【００６９】
全てのrLopapを正しい形態で単離するために、可溶性タンパク質および小体に由来する溶出されたものの双方を、Tris-HCl 20mM, NaCl 500mM, pH8,0の媒体中のベンザミジン（benzamidine）-セファロースカラムに供試し、グリシン50mM, pH3,0で溶出した。溶出したタンパク質を、NaCl 3mMに対して48h徹底的に透析した。
【００７０】
溶出したタンパク質および精製法の中間フェーズのアリコートを、Bradford法(1976)で定量（dosed）し、SDS-PAGEで分析した。
【００７１】
得られた組換えタンパク質を、精製されたプロトロンビン及び好ましくはS-2238色素生産性基質（Chromogenix）を用いて、そのプロトロンビン活性能に関して試験した。
【００７２】
Lopapの三次構造モデル
cDNAによって取得された配列に基づいて、Lopapモデル研究のアプローチが、Swiss PDB Viewer 3.7(b2)プログラムおよびSwiss Model Serverを用いて実施された。
【００７３】
組換え型Lopapの二次構造の分析
組換えタンパク質の「フォールディング」を評価するために、その二次構造を円二色性分光測定法で分析した。
【００７４】
スペクトル(CD)を、分光偏光計（spectropolarimeter）中で、190および300nmの間の波長で25゜Cで実施した。スペクトルを、8回、1nmの解像度で、200nm/minの速度で集めた。
【００７５】
組換え型のLopapを、Tris/HCl 20mM pH=8,0緩衝剤で1,2mg/mlの濃度で希釈した。データを、タンパク質濃度に基づいて、モルとして表した。
【００７６】
［例1］
mRNAの調製
7,0μgのmRNAを得た。そこから4μgを、DNAライブラリの構築に使用した。
【００７７】
得られたmRNAは、良好な品質を有していることが示された（1,5:1のタンパク比）。そして、アガロースゲル中での分析によって、mRNAに対応するスメア（smir）が示された（図５）。
【００７８】
［例2］
プラスミドでのcDNAのライブラリの構築
アガロースゲル中でのスクリーニングで、プラスミドライブラリは、タイトルの105プラスミド/μgを呈示した。２つのライブラリーをプラスミドに構築した：１つは400および800pb(BA)の間のインサートを有し、他は800pb(BB)より大きなインサートを有していた。
【００７９】
各ライブラリから、300クローンをランダムに選択した、これはEcoRIおよびHindIIIで消化した後に、異なるサイズの様々なインサートを呈示した。これらのインサートの幾つかは、制限酵素で消化され、アガロースゲル中で２つの断片を産生した(図6)。cDNA  BAおよびBBライブラリーにおいてランダムに選択された300クローンがシークエンスされ、これらは「GenBank」で利用可能なタンパク質との有意な同一性を呈示した。
【００８０】
［例3］
LopapコードcDNAの増幅
BAライブラリ(400〜800pb)のオリゴヌクレオチドP1およびSP6で増幅された産物は、約600pbと別の800pb付近のバンドを示し、BBライブラリ(800pbを超える)は800pb付近のバンドを示した（図７）。600pbのバンド(C1と命名された)および800pbのバンド(C2と命名された)を、ゲルから摘出し、精製した。精製されたcDNAを、好適には"easy"pGEM-Tにサブクローン化した。そして、DH5αコンピテント細菌を形質転換し、プレートに配置した。
【００８１】
［例4］
組換え型プラスミドのスクリーニング
40クローンを収集した(例3)。このうち20は、C1バンドと称され(C1-1からC1-20と命名された)。他の20クローンは、C2バンドと称された(C2-1からC2-20と命名された)。そして、これらは、ミニプレップでプラスミドDNAを精製する前に、インサートのサイズに関連するスクリーニング方法に供試された。図8で実証されたとおり、大きなインサートを呈示しているプラスミドを、精製し、プライマーP2を用いたＰＣＲアッセイに供試した。
【００８２】
［例5］
プライマーP2でのPCRによる増幅
前の試料からの陽性クローンを、P2およびSP6で増幅した。そして、C1のクローン2および3のみ(C1-2およびC-1-3)が陽性であり（図９）、制限およびシークエンシングアッセイに供試された。C2バンドと称しているクローンが、全て陰性クローンであることは示されていなかった。
【００８３】
［例6］
制限酵素プラスミドDNAsの消化
"easy"pGEM-Tにサブクローン化されたDNAs  C1-2およびC1-3は、BamHI部位およびHindIIIで切断後に、またEcoRI部位で切断後に整列された〔これによって600pb付近を有するインサートが遊離される（図10）〕。
【００８４】
［例7］  
cDNAシークエンシング
600pbのPCR産物のクローン（C1-2およびC1-3）と、同様に同じ切断プロファイルでpAE発現ベクターに結合したクローンとを、シークエンスした。開始オリゴヌクレオチドP1およびP2の配列並びに46残基のLopap  N-末端に関連する配列同様に前にシークエンスされた内部断片の配列を含有していた。561ヌクレオチドを、シークエンスした（前記タンパク質の全配列の187アミノ酸に対応している）（図１１）。
【００８５】
［例8］
発現
制限酵素BamHIおよびEcoRIで"easy"pGEM-Tから解放されるインサートを、本ベクターの６つのヒスチジンの終りの読み枠でpAEベクターにサブクローン化した。
【００８６】
21kDaの組換えタンパク質（pAEベクターによって付加された６つのヒスチジン残基を含んでいる）を、IPTGでの誘導前に発現させた。そして、その発現は、誘導によって増加した（図１２Ａ）。可溶性の発現されたタンパク質が認められたが、Lopapの主な部分は、封入小体（inclusion corpuscle）から構成されていた；これは、尿素およびβメルカプトエタノールでの可溶化及びそのニッケル-セファロースカラムでの精製（図１２Ｂ）の後に、それをベンザミジン-セファロースカラムに供試し、前記タンパク質を正しい構造で単離するためのｐＨ変化で溶出した。
【００８７】
rLopapをEDTA 3mMに対して透析した。そして、そのプロトロンビン活性化活性をS-2238色素生産性基質を用いて試験し、血小板の存在下でも試験した。
【００８８】
［例9］
Lopap配列の分析
Lopapから予測された配列は、リポカリンファミリーの幾つかのタンパク質と３０％付近（around 30%）の同一性を示した（図１３）。三次構造に重要な領域における高度な類似性（リポカリンの特徴）は、Leu118-Tyr128残基およびAsn149-Lys157残基の周囲に配置されていた。
【００８９】
［例10］
Lopapの三次構造モデル
Lopapの三次構造（モデリングに関して分析され、データバンクと比較された）は、リポカリンファミリータンパク質のものに正に特徴的な構造に類似性を示した（図１４）。そこには９つのセグメントのβシート種類（βバレル領域）および２つのαヘリックスが含まれ、１つはＮ末端に他はＣ末端領域に配置されている。そのうえ、２つの分子内ジスルフィド結合を形成している可能性も観察できた。
【００９０】
［例11］
円二色性による組換え型Lopapの二次構造の研究
ペプチドおよびタンパク質は、円二色性分光測定法（ＣＤ）によって評価することができる、二次構造の標準スペクトルを呈示した。最も重要で特徴的な標準は、αヘリックス（Holzawarth et al, 1965）によって代表される。この構造において、我々は、222および208nmに近接する匹敵する強度（comparable magnitude）の２つのネガティブバンドと、190nmに近接する１つのポジティブバンドとを観察することができる。
【００９１】
βシートによって呈示されるスペクトルは、217nmに近接するネガティブバンド、195nmに近接する１つのポジティブバンド、及び180nmに近接する別のネガティブバンドを示している低強度のものである（Brahms et al, 1977）。
【００９２】
リポカリンは、約7%のαヘリックス、47%のβシート、および45%のランダム構造を示している、特徴的な構造要素を有する（Flower, 1996）。Lopapの円二色性スペクトル(図15)は、6,2%のα-ヘリックス、52,9%のβシート、および28,9%のランダム構造を有する、リポカリンファミリーに典型的な特徴を示した。
【００９３】
［例12］  
プロトロンビンの加水分解
本来のLopapおよびrLopapは、プロトロンビンを活性化することができる（好適にはS-2238基質を用いる）。しかしながら、同じ濃度において、rLopapは効率が低い（図１６）。上記の２つのタンパク質は、直接的に色素生産性基質において加水分解を呈示することはできない。
【００９４】
［例13］
rLOPAPによるプロトロンビン活性化
プロトロンビン(10μM)を、5μMリン脂質(ホスファチジルセリン:ホスファチジルコリン  PS:PC)の有無の条件で、反応緩衝剤(Tris-HCl 0,02M, NaCl 0,15M pH8.0, CaCl2 15mM)中で、rLOPAP(2μM)で活性化した。10μlのアリコートを、反応の異なる時間（1min;1h30m;5hおよび18h）で収集し、SDS-PAGEs  10%で分析した（図１７）。
【００９５】
非還元条件下で、72kDa(プロトロンビン)、プロトロンビンの、52kDa（おそらくプロトロンビンF1.2に相当する）、36kDa（トロンビンに又はプロトロンビン2に相当する）、および24kDa〔プロトロンビンの断片1(F1)に相当する〕のバンドを、観察することができた。還元条件下で、52kDa(F1.2), 36kDa(プレトロンビン2), 32(プロトロンビンのB鎖)および27kDa(F1)のバンドが、観察された。
【００９６】
r-LOPAPでのプロトロンビン活性化活性における、プロトロンビナーゼ複合体成分の影響を確認するために、プロトロンビン(10μM)を、Va  200pM因子の有無の条件下で、r-LOPAP(2μM)およびPS:PC  5mMで活性化した。使用された反応緩衝剤は、Tris-HCl 0,02M, NaCl 0,15M pH8,0およびCaCl2 15mMであった。アリコート(10μl)を、インキュベーションの異なる時間（1min;1h30m;5hおよび18h）で収集し、SDS-PAGEで分析した（図１８）。同じ加水分解の標準を、Ｖａ因子の有無の条件下で得た。
【００９７】
［例14］
rLopapの脱繊維素能のインビボ試験
動物の体重を考慮して、125, 250および500μg/kgのrLopapを静脈内投与して処理されたマウスを、生きたまま維持したところ、処理の48時間後に良好な生命状態を示した。しかしながら、血液は、凝固不可能（unclotability）であった。また、Clauss検査で測定した血漿のフィブリノーゲンレベルは、rLopap投与の2および48時間後に検出不可能であった(表1)。500μg/kgの用量は、明らかな変更を伴うことなく継続された動物において、如何なる毒性効果も示さなかったが、少なくとも４８ｈ間持続する凝固期間の長期化のみを呈示した。
【００９８】
125μg/kg未満の用量での処理によって、微小循環における重篤な変化を引き起こすことなく、フィブリノーゲンの凝固時間を長くすることができる。
【表１】
2008517585.tif 000003
［例15］
プロトロンビンアクチベーター活性
本来のLopapの組換え型（rLopap）の、プロトロンビンを活性化することにおける能力を、トロンビン形成アッセイを介して間接的に決定した（プロトロンビンおよびS-2238色素生産性基質を考慮して）。前記タンパク質（15nM）のプロトロンビンアクチベーター活性を、最終用量100μlに対して、CaCl2 5mMの存在下で、プロトロンビン（90nM）で37゜Cで20min間のプレインキュベーション後に評価した。この反応は、Tris-HCl 50mM, NaCl 100mM, pH8,3にイミダゾール 150mMを含んでいる溶液中で発生した。Lopapによって形成されたトロンビンでのS-2238  40μMの加水分解（90nMのプロトロンビンを用いる）に続いて、分光光度的な測定を405nmで20分間37゜Cで行った。
【００９９】
［例16］
rLopapがプロトロンビン量（prothrombin dosage）に関する診断キットの構成要素として使用できるかどうかを確認する目的で、50μlのヒト血漿を1/40に緩衝剤 TRIS-HCl 20mM, NaCl 100mM, pH 8,0で希釈し、15μlのCaCl2 50mMおよび40μlのrLopap（終濃度  5μg/ml）で37゜Cで5minインキュベーションした。その後、20μlのS2238基質(Chromogenix)3mMを、それに添加した。そして、インキュベーションを、さらに37゜Cで5min行った。反応を、50μlの酢酸30%で中断した。そして、基質の加水分解を、分光光度法で405nmで測定した。
【０１００】
プロトロンビン濃度を、同じ処置を用いて調製された標準ヒト血漿(Dade-Behring)を1/30, 1/40, 1/80および1/160(それぞれ、150, 100, 50および25%の活性)希釈して得られた標準曲線にしたがって計算した。
【０１０１】
ヒト血漿サンプル中のプロトロンビン濃度は、93%の活性を示した。市場で入手可能なコントロール（正常および病的なもの - Dade-Behring）を、この結果を証明するために使用した。正常コントロール(70〜100%の活性)に関して86%が結果的に得られ、病的コントロール（35%〜50%）に関して41%の活性に達した。コントロールとして使用されたプロトロンビン欠乏血漿は、5%のプロトロンビン濃度を示した。これらのデータは、rLopapが患者の血漿中のプロトロンビンレベルの決定に使用できることを指摘している。
【参照文献１】
【０１０２】
2008517585.tif 000004
【参照文献２】
【０１０３】
2008517585.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図1は、Lopapに相当するクローンを増幅するための縮重プライマーを記載した図である。A=アデニン;C=シトシン;T=チミン;G=グアニン;M=CまたはA   Y=TまたはC   R=AまたはG   N=A, T, CまたはG
【図２】図2は、pGEM-11Zf(+)(Promega-TB075)のマップを記載した図である。
【図３】図3は、"easy"pGEM-T(Promega-A1360)のマップを記載した図である。
【図４】図4は、pAE(Biotechnology Center - Butantan Institute - Ramos et. al., 2003)のマップを記載した図である。
【図５】図5は、mRNAのアガロースゲル1%の電気泳動のプロフィールを記載した図である。1:  比較コントロールとして使用した分解したRNA；  2:  剛毛から抽出されたmRNA。
【図６】図6は、プラスミドライブラリのcDNAインサートを記載した図である。アガロースゲル1%での電気泳動法は、プラスミドライブラリからランダムに選択された４０クローンによって、EcoRIおよびHindIIIで２時間インキュベーション後に産生された断片を示している。(A)400〜800pbの範囲のcDNAライブラリ(BA)および(B)800pbを超えるインサートを有するcDNAライブラリ(BB)。
【０１０５】
1:HindIIIマーカー;2〜21:偶然のクローン（aleatory clones）の切断産物。
【図７】図7は、LopapをコードするcDNA増幅物の産物を記載した図である。アガロース ゲル1%。1:Lambda/HindIIIマーカー;2:BAのオリゴヌクレオチドP1およびSP6で増幅された産物；3:BBのオリゴヌクレオチドP1およびSP6で増幅された産物。C1およびC2は、600および800pbの増幅された断片である。
【図８】図8は、アガロースゲル1%中でサイズで選抜した組換え型プラスミドを記載した図である。(A) ゲノムDNA;(B)大きいインサートを有する組換え型プラスミド;(C)空のプラスミド又は小さいインサートを有するプラスミド;(D)RNA。
【０１０６】
プライマー1で増幅されたインサートを有する陽性クローン。
【図９】図9は、プライマーP2を用いたインサート増幅を記載した図である。陽性クローンは、P1で前に増幅されたバンドＣ１に関連する。クローン2および3のみが、陽性であった。
【図１０】図10は、PCR1産物切断の電気泳動プロフィールを記載した図である。Lambda/HindIIIマーカー;2:C1-2のプラスミドDNA;3:C1-2をBanHIおよびHindIIIで切断した後のベクター(3.000pb)および解放されたインサート（600pb）;4:C1-2をEcoRIで切断した後のベクターおよびインサート解放;5:C1-3のプラスミドDNA;6:C1-3をBanHIおよびHindIIIで切断した後の、ベクターおよび解放されたインサート;7:C1-3をEcoRIで切断した後の、ベクターおよび解放されたインサートを示す。
【図１１】図11は、rLopapに関して取得されたヌクレオチド配列と推定されたアミノ酸とを記載した図である。A)ヌクレオチド配列、配列番号１：太字でオリゴヌクレオチドP1(7〜29)およびP2(67〜86)の配列並びに終止コドン(562〜564)およびポリアデニル化部位(630など)を下線で記載した。B)アミノ酸配列（配列番号２）：太字で化学的なシークエンシングで得られたアミノ酸の配列が記載される。最初の２つのアミノ酸は、プライマーに付加されたBamHI部位に関連する。
【図１２】図12は、Lopap発現を記載した図である。IPTGで誘導後に大腸菌中で産生された組換えタンパク質は、ニッケル-セファロースカラムで精製された。1および4:標準;(A)rLopap発現 - 2:IPTGを添加する前の発現;3:IPTGを添加した後の発現;および(B)rLopap精製;5 a 9:精製で溶出された画分。
【図１３】図13は、Lopapの推定アミノ酸配列とリポカリンファミリーの他のメンバーとのアライメントを記載した図である。前記配列は、Lopapおよびリポカリンファミリーのタンパク質間の類似性を示している、"GenBank"データバンクで取得された〔(pfam00061)  スコア=49.3bitsおよびE-値  2e-07〕。BBP - BILIN-BINDING PROTEIN, Pieris brassicae (gi 1705433); MUP - MAIN PRECURSOR OF THE URINARY PROTEIN, Rattus norvegicus (gi 127533); Prot-1 - PROTEIN 1 OF THE VON EBNER'S GLAND, Rattus norvegicus (gi 12621114); ApoD PRECURSOR OF THE APOLIPOPROTEIN D, Homo sapiens (gi 4502163); INS-A - INSECTICYANIN A FORM Manduca sexta (gi 124151); CC-A2 - SUB-UNITY A2 OF THE CRUSTACYANIN A2 Homarus gammarus (gi 117330); CC-C1.- SUB-UNITY C1 OF THE CRUSTACYANIN Homarus gammarus (gi 117420); PURP.- PRECURSOR OF THE PURPURIN Gallus gallus (gi 131549)。高い類似度を、太字で示した。リポカリン特性と高い類似性を有する領域を強調した。
【図１４】図14は、Lopapの三次元構造を記載した図である。Swiss PDB Viewer 3.7(b2)およびSwiss Model Serverプログラムを用いた構造モデル。
【図１５】図15は、rLopapの円二色性のスペクトルを記載した図である。スペクトル(CD)を、25゜Cで波長190および300nmの間で分光旋光計で実施した。スペクトルを、8回にわたり解像度1nmで速度200nm/minで蓄積した。
【図１６】図16は、プロトロンビン活性化を記載した図である。100μlの最終的な容量に対して、90nMのプロトロンビンで5μgのアクチベータを37゜Cでインキュベーションした。
【０１０７】
FIIおよびアクチベータの非存在下の基質(白色)；黒四角  アクチベータなしのFIIコントロール；rLopapおよび  白三角  本来のLopap。
【図１７】図17は、rLopapによるプロトロンビン加水分解を記載した図である。SDS-PAGE  10%をクーマシーブルーで、非還元条件(図17a)および還元条件(図17b)で染色した。
【０１０８】
MWマーカー[ミオシン(200Kda), ホスホリラーゼB(97,4KDa), BSA(67KDa), オボアルブミン(43KDa), 炭酸脱水酵素(29KDa), b-ラクトグロブリン(18,4KDa), リゾチーム(14,3KDa);
プロトロンビン(PT);
1)PT+LOPAP(1min inc);2)PT+LOPAP+PS:PC(1min inc);3)PT+LOPAP(1h30min inc);4)PT+LOPAP+PS:PC(1h30min inc);5)PT+LOPAP(5h inc);6)PT+LOPAP+PS:PC(5h inc);7)PT+LOPAP(18h inc);8)PT+LOPAP+PS:PC(18h inc)
【図１８】図18は、プロトロンビナーゼ複合体因子の有無の条件でのプロトロンビン加水分解を記載した図である。SDS-PAGEをクーマシーブルーで染色。非還元条件(図18aおよび18c)および還元条件(図18bおよび18d)。
【０１０９】
MWマーカー[ミオシン(200Kda), ホスホリラーゼB(97,4KDa), BSA(67KDa), オボアルブミン(43KDa), 炭酸脱水酵素(29KDa), b-ラクトグロブリン(18,4KDa), リゾチーム(14,3KDa);
1)プロトロンビン(PT);2)PT+LOPAP+PS:PC+Va(1min inc);3)PT+LOPAP+PS:PC+Va(90min inc);4)PT+LOPAP+PS:PC+Va(5h inc);5)PT+LOPAP+PS:PC+Va(18h inc);6)トロンビン, 7)プロトロンビン(PT);8)PT+LOPAP+PS:PC(1min inc);9)PT+LOPAP+PS:PC(90min inc);10)PT+LOPAP+PS:PC(5h inc);11)PT+LOPAP+PS:PC(18h inc);12)トロンビン
【図１】
2008517585.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008517585.tif 000014
【図８】
2008517585.tif 000015
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2008517585.tif 000020
【図１４】
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【図１５】
2008517585.tif 000022
【図１６】
2008517585.tif 000023
【図１７】
2008517585.tif 000024
【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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