(57)【要約】  本発明は、被検核酸分子のライブラリーから、ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を選択するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選ばれたホスファターゼ活性をコードする核酸分子を被検核酸分子の群から選択する方法であって、以下のステップ：
ａ）被検核酸分子を用意するステップ、
ｂ）被検核酸分子をホスファターゼ欠損宿主細胞に導入するステップ、
ｃ）選ばれたホスファターゼ活性の基質を唯一のリン酸塩源として十分な量で含む無機リン酸塩欠損培地で宿主細胞を培養するステップ、
ｄ）培地中での宿主細胞の増殖を検出するステップであって、その際増殖が選ばれたホスファターゼ活性をコードする核酸分子の存在を示すものであること
を含む、上記方法。
【請求項２】
ステップｂ）が以下の部分ステップ：
ｂ１）核酸分子の発現ベクターへのクローニング
ｂ２）発現ベクターによる宿主細胞の形質転換
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）で、さらにλファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子をホスファターゼ欠損宿主細胞に導入する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
λファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子が２８７ｂｐの長さを有し、λファージのゲノムＤＮＡを配列番号１および配列番号２のプライマーペアでＰＣＲ増幅することによって得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ホスファターゼ欠損宿主細胞が大腸菌細胞、特に大腸菌のｐｈｏＢ株である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
欠損培地が０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１５〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度の基質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞を欠損培地中で２〜４日、好ましくは３日間培養する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
宿主細胞を欠損培地で２８〜３２℃、好ましくは３０℃で培養する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
選ばれたホスファターゼがグラム陰性細菌のホスファターゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
選ばれたホスファターゼが細胞内ホスファターゼ、特にペリプラズム・ホスファターゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
選ばれたホスファターゼがフィターゼであり、選ばれたホスファターゼの基質がフィチン酸および／またはフィチン酸塩である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
特に請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法でホスファターゼ活性をコードする核酸分子を選択するための、λファージＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を被検核酸分子のライブラリーから選択するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファターゼはホスファターゼ活性を有するタンパク質である。タンパク質がリン酸塩含有基質から無機リン酸塩を分解することができるならば、ホスファターゼでありまたはホスファターゼ活性を有する。周知の経済的に興味深いホスファターゼは例えば植物性フィターゼである。
【０００３】
植物起源の食物中のリンの８０％までが動物、特に単胃動物、例えばブタおよび家禽によって代謝的に利用されない。このため何百万トンものリンが環境に入りこみ、例えば藻の繁茂、酸素の減少や食物連鎖の崩壊をもたらすことにより、大きな問題を引き起こす。他方では、一部の場合、在来の飼料でこれらの動物のリン需要を充足することは困難である。そこで、リン成分がほぼ代謝されるような飼料が必要である。
【０００４】
飼料中の代謝可能なリンの割合を高めるための１つの可能性は、飼料にフィターゼを添加することである。フィターゼは、植物性食物に含まれる含リン成分、フィチン酸またはフィチン酸塩（フィチン酸の塩）を加水分解して無機リン酸塩を遊離する酵素である。フィチン酸／フィチン酸塩はリン酸ミオイノシトール−１，２，３，４，５，６−ヘキサキス二水素塩であり、およそ１４〜１８％のリンと通常１２〜２０％のカルシウムを含む。
【０００５】
フィチン酸塩／フィチン酸は通常、強負荷電分子として存在する。このため生体膜の通過が困難である。フィチン酸塩／フィチン酸の周囲に水和物包膜が形成され、それがやはり分子の生体膜または細孔の通過を妨げる。例えば水化フィチン酸塩分子はグラム陰性細菌のペリプラズム膜を通過することができない。
【０００６】
フィターゼは、フィチン酸塩のイノシトール環の炭素原子１、３または６で連続的なリン酸塩加水分解を開始することができる唯一既知の酵素である。６−フィターゼ（例えばＡｐｐＡ）は６番目の炭素原子、３−フィターゼ（グルコース−１−ホスファターゼ；オルトリン酸塩基だけを遊離させる）は同様に３番目の炭素原子で始まるリン酸塩加水分解を触媒する。フィターゼによるリン酸塩基の分解は２価の金属イオン（例えばカルシウム、鉄、亜鉛等）の遊離を生じる。
【０００７】
フィターゼは多数の様々な微生物および植物ならびに一部の動物の組織に見られる。グラム陰性細菌のフィターゼは、多くの場合でペリプラズムに局在する細胞内タンパク質である。これに対してグラム陽性細菌および真菌のフィターゼは細胞外タンパク質である。Aspergillius nigerのフィターゼＢ（ＰｈｙＢ）を除き、すべての既知のフィターゼは単量体タンパク質であり、ＰｈｙＢは四量体である。この酵素の分子量はすこぶる可変的であり、通常３８〜１００ｋＤａである。真菌または酵母のフィターゼはグリコシル化に基づき高い分子量を有する。しかしグリコシル化はフィターゼの比活性および熱安定性に影響しない。
【０００８】
周知のフィターゼは構造的にあまり似ていないし、無機リン酸塩を分解する機構も同じでない。フィターゼはその酵素活性のｐＨ依存性に基づき３つの主要グループ、すなわち酸性、中性およびアルカリ性ホスファターゼに分けられる。単胃動物用の飼料のリン酸塩代謝を促進するために、まず第一に考えられるのは酸性ホスファターゼのグループのフィターゼである。
【０００９】
種々のフィターゼのアミノ酸配列の系統発生的分析は、やはり３つの主要分類をもたらず。この区分は生化学的性質または触媒的性質による区分とよく一致する。
【００１０】
クラスＩ−ヒスチジン酸性ホスファターゼ−フィターゼ（ＨＡＰ）
主要クラスの１つはＨＡＰファミリーである。その構成員はとりわけAspergillus nigerのＰｈｙＡおよびＰｈｙＢならびに大腸菌のＡｐｐＡである。これらは広範な基質特異性を有する。無金属のフィチン酸塩を酸性ｐＨ領域で加水分解することができる。これらに共通するのは高度に保存された配列パターンであるＲＨＧＸＲＸＰである。
【００１１】
このクラスはさらにアミノ酸配列の相同性および生化学的性質、例えばｐＨ最適値またはフィチン酸塩加水分解の位置特異性に従って３つの小分類ＰｈｙＡ、ＰｈｙＢおよびＰｈｙＣに分類される。
【００１２】
クラスＩＩ−β−プロペラ（β-propeller）フィターゼ（ＢＰＰ）またはアルカリ性フィターゼ
例えば枯草菌（Bacillus subtilis）のＰｈｙＣおよびBacillus amyloliquefaciens FZB45のＰｈｙＡがこれに数えられる。バシラス属フィターゼ（β-プロペラ）は２価の元素、例えばカルシウム、鉄または亜鉛の存在下でフィチン酸のイノシトールおよびオルトリン酸塩への加水分解を触媒する。このクラスは一連の側面、例えばｐＨ最適値、分子量、三次構造、基質特異性および加水分解時にカルシウムイオンの存在が必要であることがＨＡＰクラスと相違する。バシラス属または植物種子のアルカリ性フィターゼは、これらの生化学的相違および系統発生的データに基づき別のグループＰｈｙＤに分類される。
【００１３】
クラスＩＩＩ−紅色酸性ホスファターゼ（purple acid phosphatase）（ＰＡＰ）
このクラスに属するのは例えば大豆Glycine max LのＧｍＰｈｙである。ＧｍＰｈｙは最近、発芽する大豆の子葉から単離された。ＧｍＰｈｙの活性部分は紅色酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の配列パターンを有する。推定分子量は、他の植物ＰＡＰと同様に７０〜７２ｋＤａである。しかしＧｍＰｈｙは顕著なフィターゼ活性を有する唯一の既知のＰＡＰである。アミノ酸配列の比較はＧｍＰｈｙとインゲン豆のＰＡＰの間に３３％の相同性を明らかにした。
【００１４】
フィターゼが不消化のフィチン酸から無機リン酸塩を遊離することによって、飼料からリン酸塩を吸収することができる。それによってリン酸塩廃棄物が減少されるだけでなく、このような飼料に代謝可能なリン酸塩を別途に補充する必要がなくなる。
【００１５】
しかし飼料中のフィチン酸またはフィチン酸塩の分解は、代謝可能なリン酸塩の供給に役立つだけでない。穀粒の周縁層にあるものなどのフィチン酸またはフィチン酸塩は金属イオンに対するキレート物質とみなされ、従って飼料からの重要な金属イオン、例えばカルシウム、鉄、マグネシウム、リンまたは亜鉛の吸収を減少させる。ヒトの場合は特定の全粒製品によって誘起されるミネラル不足とこの全粒製品中のフィチン酸またはフィチン酸塩の存在との関連が論議されている。従って全粒製品中のフィチン酸またはフィチン酸塩の割合を減少させることが望ましい。これは全粒製品の製造の際にフィターゼを適当に使用するか、または全粒製品にフィターゼを添加することによって行うことができる。
【００１６】
他方では、フィターゼの調製の費用が高いため、飼料での既知のフィターゼの使用は限られている。また飼料のペレット化のために使用される高い温度（通常８０℃以上）で不活性化されるため、既知のフィターゼを飼料に応用する可能性は限られている。さらに既知のフィターゼは飼料の貯蔵中にその活性の大部分を失う。多数の既知のフィターゼは、消化管で通常存在しない狭いｐＨ範囲でのみ安定であり、かつ／または活性を有するという理由からすでに不適当である。一連の既知のフィターゼは消化管に存在するプロテアーゼによる分解に対して耐性がない。さらにリンの供給源であるフィチン酸またはフィチン酸塩は、この動物の消化管内で主としてカルシウム・フィチン酸塩錯体として存在する。特に飼料が高いカルシウム含量（約３〜４０ｇ／ｋｇ）を有する場合がそうである。ところがこのカルシウム・フィチン酸塩錯体は多数の既知のフィターゼに対して基質の役割をすることができない。
【００１７】
そこで、改善された生化学的性質および触媒的性質を有し、それによって飼料および食品製造業での使用に好適な新規なホスファターゼ、特にフィターゼが必要である。フィターゼ活性を有するタンパク質は多数の様々な生物で発現されている。天然に存在するフィターゼがこれまですべて特徴づけられまたは単離されてはいないし、フィターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子がすべて知られているわけでもない。そこで特定の選ばれたホスファターゼ活性、特にフィターゼ活性をコードする遺伝子を特に効率よく検出し、選択することができる選択方法を提供することが必要である。
【００１８】
特定の機能、例えば酵素活性をコードする新しい遺伝子を発見するという目標を追求する既知の選択方法は通常、水相中の液体アプローチ、いわゆる「液体アッセイ」に基づいている。ホスファターゼ、特にフィターゼをコードする遺伝子の選択のためのアッセイは、例えばリン・モリブデン錯体の形成およびそれに伴う呈色反応に基づく。Hoenigら（J. Biochem. Biophys. Methods, 1989, 19(2-3): 249-251）はマラカイトグリーンに基づくアッセイを記述する。Greinerら（Arch. Biochem. Biophys, 1997, 341(2): 201-206）は七モリブデン酸塩／バナジウム酸アンモニウムを含む試薬溶液によるフィターゼ活性の決定を記述する。HeinonenおよびLathi（Anal. Biochem. 1981, 113(2): 313-317）によれば、形成されたリンモリブデン酸錯体の還元によってフィターゼ活性を検出することができる。この既知の検出法は少数の被検試料に対しては十分であるかもしれないが、数百万の異なるクローンの使用を必要とする完全なライブラリーを調べるということになれば、既知のアッセイは不適当である。これは多数の異なるクローンの場合には極めて時間がかかるかまたはまったく無秩序に行われることになる。そこで多数の被検試料でも実施でき、特に自動化用途にも使用できる選択方法が必要である。それは迅速かつ簡単な選択アッセイでなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
このことから出発して、本発明の根底にある技術的課題はおおむね、選ばれたホスファターゼ活性をコードする核酸分子の選択方法を提供することである。特にこの方法は周知の手段によって簡単に行われ、多数の被検試料でも特に良好かつ迅速な選択を可能にするものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
根底にある技術的課題は、選ばれたホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の選択方法において、上記の核酸分子を被検核酸分子の群から選択する方法によって解決される。好ましくはこの群はバンクまたはライブラリーである。本発明に基づく方法は次のステップを含み、特にこれらのステップからなる。すなわち
ａ）被検核酸分子を用意するステップ、
ｂ）ホスファターゼ欠損を有しているかまたはホスファターゼ活性が発現されない宿主細胞のゲノムに、被検核酸分子および好ましくはラムダ（λ）ファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子をさらに導入するステップ、
ｃ）被検核酸分子および好ましくはλファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子が導入された宿主細胞を無機リン酸塩欠損培地で培養するステップであって、その際欠損培地が好ましくは唯一のリン酸塩源として、選ばれたホスファターゼ活性の基質を含み、選ばれたホスファターゼ活性の基質が、原則として宿主細胞培養の増殖を可能にしまたは宿主細胞のリン酸塩需要を充足するのに好ましくは十分な量で欠損培地に存在すること、
ｄ）培地中での宿主細胞の増殖を検出するステップであって、その際選ばれたホスファターゼ活性をコードする核酸分子の存在下で宿主細胞の増殖が起こり、この増殖が選ばれたホスファターゼをコードする核酸分子の存在を示す。
【００２１】
こうして本発明は特定のホスファターゼ活性をコードする遺伝子を多数の様々な生物から見い出すことができる方法を提供する。その場合、本発明に基づく方法は、宿主細胞に被検核酸分子と、さらにλファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子とを導入し、好ましくは導入された２つの核酸分子が宿主細胞で発現されるようにする。被検核酸分子は、選ばれたホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするならば、宿主細胞で発現される。それとともに、すなわちそれと並行して、好ましくは同時におよび／または同じ条件で、本発明に基づき好ましいＫｉｌタンパク質が発現される。タンパク質を発現する宿主細胞を本発明に基づく欠損培地で培養すれば、宿主細胞の増殖は選ばれたフィターゼ活性をコードする核酸分子の存在を特に明瞭に、すなわち特に敏感かつ選択的に示す。従って本発明に基づく方法のステップ、特にステップｃ）およびｄ）を自動化して、例えば特に宿主細胞の増殖の自動検出を可能にする自動細胞培養装置で行うことができることが特に有利である。
【００２２】
本発明に基づく方法の好ましい実施形態では、被検核酸分子と、好ましいλファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子とを、まず発現ベクターにクローニングする（ステップｂ１）。続いて宿主細胞を発現ベクターで形質転換する（ステップｂ２）。特に好ましい変法では、λファージのゲノムＤＮＡのｋｉｌ遺伝子を担持する断片を増幅し、ベクター（プラスミド）に導入し、特にクローニングする。別のステップで例えばホスファターゼ活性を発現する生物、特に細胞から単離し、適切なプライマーで増幅することによって、被検核酸分子が準備される。次に増幅された被検核酸分子を第２のベクター（プラスミド）に導入し、特にクローニングする。導入された核酸分子または遺伝子断片はベクターの中で誘導プロモーターにより制御される。続いて第１のベクターのｋｉｌ遺伝子を担持する部分が特に完全発現カセットとして、好ましくは制限酵素切断により第２のベクターに導入される。発現可能な被検核酸分子と、好ましくはλファージのＫｉｌタンパク質をコードする発現可能な核酸分子も担持する発現ベクターが得られる。
【００２３】
特に本発明に基づき提供される宿主細胞で被検核酸分子だけでなく、λバクテリオファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子も、特に同時に、発現されるならば、本発明の方法は特によく実行され、根底にある課題を解決する。
【００２４】
また本発明は、上記の宿主細胞ならびに上記の本発明に基づく核酸および／またはベクターにより形質転換された宿主細胞に由来する細胞に関する。
【００２５】
本発明によれば、本発明に基づく被検核酸分子はこうして発現系中に存在し、その発現は誘導プロモーターにより制御されることが好ましい。本発明によれば、λファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子も発現系中に存在し、その発現が好ましくは誘導プロモーターにより制御されることが特に好ましい。誘導プロモーターの代わりに構成プロモーターを使用することもでき、もちろん本発明の教示内容を逸脱しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
好ましい実施形態では、λファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１および配列番号２のプライマーペアによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することによって得られる。この核酸分子は２８７塩基対（ｂｐ）の長さを有する。もちろんＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子を別の方法、例えば合成、クローニング、調製等によって得ることもできる。
【００２７】
本発明によれば、宿主細胞でＫｉｌ遺伝子を好ましくは並行的に発現することによって、「bacterial release」タンパク質が合成される。このタンパク質は細胞内媒体、特にペリプラズムから細胞外領域へのタンパク質の通過を可能にする。ｋｉｌ遺伝子を有するこのような発現カセットはおそらく誘導分泌系または溶菌系である。
【００２８】
理論に拘束されず、特に意外なのは、ｋｉｌ遺伝子の発現がホスファターゼ活性を有する細胞内局在タンパク質の細胞外媒体への分泌を可能にすることである。そこで特に好ましい変法では、ホスファターゼおよび好ましくはｋｉｌ遺伝子を発現する第１の細胞と、第２の、特に別のホスファターゼ欠損細胞またはホスファターゼ活性を発現しない細胞との共存培養が考えられる。本発明による陽性試験の場合には、生じる細胞外ホスファターゼ活性によって、第２の、特に別のホスファターゼ欠損細胞にも無機リン酸塩が供給され、同じく増殖することができる。
【００２９】
特に好ましい実施形態ではホスファターゼ欠損細胞はグラム陰性原核細胞、特に好ましくは腸内細菌細胞である。特に本発明に基づく宿主細胞は大腸菌細胞（E. coli）であることが好ましい。細胞、特に大腸菌細胞のＰＨＯレギュロン（PHO regulon）の転写を阻止することによって、ホスファターゼ欠損を生じることが好ましい。これは本発明によれば好ましくはｐｈｏＢ遺伝子の欠失によって起こる。特に意外なことに、こうして生じたホスファターゼ欠損変異体でＰＨＯレギュロンの全体的なダウンレギュレーションが実現できる。その結果、好都合なことに、こうして生じたホスファターゼ欠損変異体がホスファターゼ活性をもはや持たず、十分な量の無機オルトリン酸塩を有する培地でのみ増殖することができる。この現象はこの場合「ホスファターゼ欠損」に包含される。
【００３０】
好ましい実施形態では、所定のホスファターゼ活性、すなわちグラム陰性細菌のホスファターゼ活性を選択するために、本発明の方法が使用される。選ばれたホスファターゼは細胞内ホスファターゼ、特に細胞質またはペリプラズムホスファターゼであることが好ましい。理論に拘束されることなく、発現プラスミドはシグナル配列（例えばｓｅｃ系によるホスファターゼのペリプラズムへの移動を可能にするＯｍｐＡのシグナルペプチド）をコードする。好ましい変法では選ばれたホスファターゼはフィターゼである。その場合、本発明によれば、方法のステップｃ）で基質としてフィチン酸および／またはフィチン酸塩を含む欠損培地が選ばれる。従ってこの好ましい実施形態では、本発明に基づく方法は、被検核酸分子の群、特に核酸分子のライブラリーまたはバンクからの、フィターゼ活性をコードする核酸分子の特に簡単な自動化可能な選択を可能にする。
【００３１】
特に意外なことに、本発明の方法によって、選ばれたホスファターゼ活性の直接的検出ができるだけでなく、選ばれたフィターゼ活性の準定量的決定も可能になる。フィターゼ活性を発現する宿主細胞の観察される増殖度は、発現したホスファターゼの活性について直接的な情報を与える。高い酵素活性は宿主細胞の急速な増殖または高い増殖率に反映される。
【００３２】
本発明に基づく方法のステップｃ）では、唯一のリン酸塩源としてホスファターゼ基質を含む欠損培地で宿主細胞を培養する。基質は０．１〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１５〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で欠損培地に含まれることが好ましい。宿主細胞を欠損培地で２〜４日、特に好ましくは３日の期間のあいだ培養することが好ましい。この培養期間の後に被検宿主細胞の増殖に明瞭な相違が検出される。培養温度は好ましくは２８〜３２℃、特に好ましくは３０℃である。
【００３３】
最後に、本発明のもう一つの目的は、特に上記の本発明の方法が行われる選択方法で所定のホスファターゼ活性をコードする核酸分子を見出すための、λファージのＫｉｌタンパク質をコードする核酸分子の使用である。
【実施例】
【００３４】
添付の図面および実施例により本発明を詳述する。但しこれを限定的と解すべきではない。
【００３５】
実施例１：λバクテリオファージのｋｉｌ遺伝子のプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺへの導入
Ｋｉｌタンパク質の誘導発現を実現するために、プラスミドを構築した。それによってグラム陰性宿主細胞、例えば大腸菌の高度かつ制御可能な細胞溶解が得られる。
【００３６】
λバクテリオファージの調製したゲノムＤＮＡから、Ｋｉｌタンパク質をコードする２８７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。そのためにプライマー配列番号１および配列番号２（表１）を使用した。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ  ｋｉｌ（図１）を得るために、ＰＣＲ断片を切断して、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ（図４）にクローニングした。ＰＣＲ条件は以下のとおりとした。（温度（℃）／時間（ｍｉｎ））：（９８／１０）、（９６／０．７５；５５／０．５０；７２／１．５）３５、（７２／１０）；酵素：ヘルクラーゼ（herculase）。
【００３７】
得られた１２個のクローンをＢｓａＡＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺでは７５３２ｂｐ、ｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺ  ｋｉｌでは１８９４ｂｐおよび２７３８ｂｐであった。１２個の被検クローンのうち３個は正しい展開パターンを示す。
【表１】
2008543320.tif 000002
【００３８】
実施例２：大腸菌のａｐｐＡ遺伝子およびａｇｐ遺伝子のクローニング
ＡｐｐＡ（フィターゼＩ）およびＡｇｐ（グルコース−１−ホスファターゼまたはフィターゼＩＩ）の大量かつ制御された発現を得るために、プラスミドを構築した。
【００３９】
ａ）ａｐｐＡのクローニング
大腸菌株ＭＧ１６５５から調製したゲノムＤＮＡから１３１６ｂｐのＤＮＡ断片、すなわち酸性ホスファターゼ（フィターゼＩ）をコードするａｐｐＡ遺伝子をを増幅した。そのためにプライマー配列番号３および配列番号４（表１）を使用した。プラスミドｐａｐｐＡ（図５）を得るために、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてクローニングした。
【００４０】
得られた２個のクローンをＳａｌＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＭＣＳで５４０３ｂｐ、ｐａｇｐで１０８１ｂｐおよび５５４６ｂｐであった。２つの被検クローンのうちの１つは正しい展開パターンを示した。
【００４１】
ｂ）ａｇｐのクローニング
大腸菌株ＭＧ１６５５から調製したゲノムＤＮＡから１２５８ｂｐのＤＮＡ断片、すなわち酸性ホスファターゼ（フィターゼＩＩ）をコードするａｇｐ遺伝子をクローニングした。そのために配列番号５および配列番号６（表１）のプライマーを使用した。プラスミドｐａｇｐ（図５）を得るために、ＰＣＲ断片を切断して、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片としてクローニングした。
【００４２】
得られた１１個のクローンをＳａｌＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＭＣＳで５４０３ｂｐ、ｐａｇｐで９７５ｂｐおよび５７１３ｂｐであった。１１個の被検クローンのうち３個は正しい展開パターンを示した。
【００４３】
実施例３：プラスミドｐＭＣＳ、ｐａｐｐＡ、ｐａｇｐへのＰｔｒｃｋｉｌの導入
ａ）プラスミドｐＭＣＳへのＰｔｒｃｋｉｌの導入
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌ（実施例１を参照）を制限酵素ＰｍｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、１１２６ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐＭＣＳを制限酵素ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｔ１１０７１で切断し、４４７７ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐｋｉｌ（図６Ａ）を得るために、これらの断片をクローニングした。
【００４４】
得られた１２個のクローンをＮｃｏＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌで４６３２ｂｐ、ｐＭＣＳで５４０８ｂｐ、ｐｋｉｌで１６０６ｂｐおよび３９９３ｂｐであった。１２個のすべての被検クローンが正しい展開パターンを示した。
【００４５】
ｂ）プラスミドｐａｐｐＡへのＰｔｒｃｋｉｌの導入
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌ（実施例１を参照）を制限酵素ＰｍｅＩおよびＭｌｕＩで切断し、１５３７ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐａｐｐＡを制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｓｔ１０７１で切断し、５５１９ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐｋｉｌａｐｐＡ（図６Ｂ）を得るために、これらのＰＣＲ断片をクローニングした。
【００４６】
得られた１２個のクローンをＮｃｏＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌで４６３２ｂｐ、ｐａｐｐＡで６６８８ｂｐ、ｐｋｉｌａｇｐで１６０６ｂｐおよび５２７８ｂｐであった。１２個の被検クローンのうち７個は正しい展開パターンを示した。
【００４７】
ｃ）プラスミドｐａｇｐへのＰｔｒｃｋｉｌの導入
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌ（実施例１を参照）を制限酵素ＰｍｅＩおよびＭｌｕＩで切断し、１５３７ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐａｇｐを制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｓｔ１０７１で切断し、５３５１ｂｐのＤＮＡ断片が単離された。プラスミドｐｋｉｌａｇｐ（図６Ｃ）を得るために、これらのＰＣＲ断片をクローニングした。
【００４８】
得られた１２個のクローンをＮｃｏＩでの制限切断により分析した。予想断片長はｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃｚ  ｋｉｌで４６３２ｂｐ、ｐａｇｐで６６３０ｂｐ、ｐｋｉｌａｇｐで１６０６ｂｐおよび５２２０ｂｐであった。１２個の被検クローンのうち８個は正しい展開パターンを示した。
【００４９】
実施例４：Bacillus amyloliquefaciens FZB45のｐｈｙＡ遺伝子のプラスミドｐＭＣＳへの導入
プラスミドｐＭＣＳはプロモーターＰｔａｃにより強力で制御可能な発現を可能にする。その中に存在するＣ末端Ｆｌａｇタグは、抗Ｆｌａｇ抗体により、発現した標的タンパク質の精製と検出を容易にする。ところがここで選ばれた例ではＣ末端がフィターゼタンパク質ＰｈｙＡの中心に向けられており、タンパク質は非常に複雑に折りたたまれたβ−プロペラ構造を有する。ｐｈｙＡ遺伝子とプラスミドによりコードされるＦｌａｇタグとの融合がタンパク質の正しい折りたたみまたは酵素活性の抑制に影響しないようにするために、２つのクローニング戦略を開発した。一方ではｐｈｙＡ遺伝子をＦｌａｇタグの発現フレームでクローニングした。第２の手法では停止コドンをｐｈｙＡ遺伝子とＦｌａｇタグの間に挿入した。
【００５０】
それに対応して、宿主細胞（例えば大腸菌）でBacillus amyloliquefaciens FZB45のフィターゼ（ＰｈｙＡ）の大量かつ制御可能な発現を可能にするプラスミドを構築した。
【００５１】
ａ）Ｆｌａｇタグ発現フレームのＰｈｙＡの検定
Bacillus amyloliquefaciens FZB45から調製したゲノムＤＮＡから、ＰｈｙＡをコードする１０８２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。そのためにプライマー配列番号７および配列番号８（表１）を使用した。プラスミドｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰ（図７）を得るために、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片の形でプラスミドｐＭＣＳにクローニングした。ＰＣＲ条件は次のとおりとした。（温度（℃）／時間（ｍｉｎ））：（９５／５）、（９５／０．５；５８／０．５；７２／１．５）３５、（７２／１０）；酵素：ヘルクラーゼ。
【００５２】
プライマー配列番号７および配列番号８を使用したＰＣＲにより、得られた３０個のクローンを分析した。６個の陽性クローンをさらにＥｃｏ４７ＩＩＩでの制限切断により検査した。予想断片長はｐＭＣＳで５４０３ｂｐ、ｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰで５３８８ｂｐおよび１０７７ｂｐであった。６個の被検クローンのうち４個は正しい展開パターンを示した。
【００５３】
ｂ）停止コドンによる検定
Bacillus amyloliquefaciens FZB45から調製したゲノムＤＮＡから、ＰｈｙＡをコードする１０７９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。そのためにプライマー配列番号７および配列番号８（表１）を使用した。プラスミドｐｐｈｙ４５Ｆｌａｇ（図７）を得るために、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片の形でプラスミドｐＭＣＳにクローニングした。ＰＣＲ条件は次のとおりとした。（温度（℃）／時間（ｍｉｎ））：（９５／５）、（９５／０．５；５８／０．５；７２／１．５）３５、（７２／１０）；酵素：ヘルクラーゼ。
【００５４】
プライマー配列番号７および配列番号９を使用したＰＣＲにより、得られた３８個のクローンを分析した。６個の陽性クローンをさらにＥｃｏ４７ＩＩＩでの制限切断により検査した。予想断片長はｐＭＣＳで５４０３ｂｐ、ｐｐｈｙ４５Ｆｌａｇで５３８５ｂｐおよび１０７７ｂｐであった。６個のすべての被検クローンが正しい展開パターンを示した。
【００５５】
実施例５：Bacillus amyloliquefaciens FZB45のｐｈｙＡ遺伝子のプラスミドｐｋｉｌへの導入
宿主細胞（例えば大腸菌）でBacillus amyloliquefaciens FZB45のフィターゼ（ＰｈｙＡ）の大量かつ制御可能な発現を得るために、プラスミドを構築した。これらのプラスミドは発現酵素の細胞外領域への制御された放出を可能にする。Ｆｌａｇタグの影響を遮断するために（実施例４を参照）、２つの別のクローニング戦略を開発した。
【００５６】
ａ）Ｆｌａｇタグ発現フレームのＰｈｙＡの検定
Bacillus amyloliquefaciens FZB45から調製したゲノムＤＮＡから、ＰｈｙＡをコードする１０８２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。そのためにプライマー配列番号７および配列番号８（表１）を使用した。プラスミドｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ（図８）を得るために、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片の形でプラスミドｐＭＣＳにクローニングした。ＰＣＲ条件は次のとおりとした。（温度（℃）／時間（ｍｉｎ））：（９５／５）、（９５／０．５；５８／０．５；７２／１．５）３５、（７２／１０）；酵素：ヘルクラーゼ。
【００５７】
プライマー配列番号７および配列番号８を使用したＰＣＲにより、得られた８個のクローンを分析した。５個の陽性クローンをさらにＥｃｏ４７ＩＩＩでの制限切断により検査した。予想断片長はｐｋｉｌで５５９９ｂｐ、ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰで５５８４ｂｐおよび１０７７ｂｐであった。５個のすべての被検クローンが正しい展開パターンを示した。
【００５８】
ｂ）停止コドンによるＰｈｙＡ検定
Bacillus amyloliquefaciens FZB45から調製したゲノムＤＮＡから、ＰｈｙＡをコードする１０７９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。そのためにプライマー配列番号７および配列番号９（表１）を使用した。プラスミドｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ（図８）を得るために、ＰＣＲ断片を切断し、ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片の形でプラスミドｐＭＣＳにクローニングした。ＰＣＲ条件は次のとおりとした。（温度（℃）／時間（ｍｉｎ））：（９５／５）、（９５／０．５；５８／０．５；７２／１．５）３５、（７２／１０）；酵素：ヘルクラーゼ。
【００５９】
プライマー配列番号７および配列番号９を使用したＰＣＲにより、得られた５個のクローンを分析した。１個の陽性クローンをさらにＥｃｏ４７ＩＩＩでの制限切断により検査した。予想断片長はｐｋｉｌで５５９９ｂｐ、ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇで５５８１ｂｐおよび１０７７ｂｐであった。被検クローンは正しい展開パターンを示した。
【００６０】
実施例６：宿主細胞でのａｇｐおよびａｐｐＡの翻訳
ａ）培養
細菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ｐＭＣＳ、ＭＧ１６５５ｐｋｉｌ、ＭＧ１６５５ｐａｐｐＡ、ＭＧ１６５５ｐｋｉｌａｐｐＡ、ＭＧ１６５５ｐａｇｐおよびＭＧ１６５５ｐａｇｐｋｉｌ（表２を参照）のそれぞれ１０μＬの一晩培養物を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に３７℃で接種した。平均対数期（ＯＤ６００：０．４−０．７）の間に最終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えた。それによってＡｐｐＡおよびＡｇｐの発現がプロモーターＰｔａｃにより、Ｋｉｌの発現がプロモーターＰｔｒｃにより誘導された。続いて細胞を３７℃で２．５時間振とうした。次に細胞培養物を遠心し、細胞ペレットと上清（培地）を−２０℃で保存した。
【００６１】
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）
細胞溶解のために試料ペレットを２００μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁した。次に（抽出のために）２０μＬのＣＨＣｌ３を加えた。抽出のために試料をボルテックスにかけ、遠心し、水相の上清をサンプルバッファーと混合した。細胞培養物の上清（培地）もサンプルバッファーと混合した。抽出物試料と細胞培養上清の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で１回の電気泳動により展開した。
【００６２】
ｃ）ウエスタンブロッティング分析
２５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ８．３）、１９２ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンおよび２０容積％のメタノールを含むトランスファーバッファーを使用して、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした（１００Ｖおよび４℃で１時間〜１．５時間）。メンブレンを取り出し、５％粉末ミルクを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２０分間ブロッキングし、水で洗浄し、続いて３％粉末ミルクを混合したＰＢＳ中でモノクローナル抗Ｆｌａｇ  ＡＰコンジュゲート抗体（希釈率１：２０００；Sigma）とともに室温で一晩インキュベートした。メンブレンをさらに０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳで１５分ずつ３回洗浄した。次にメンブレンをＰＢＳでもう一度１０分間洗浄し、BIO-RADの「アルカリホスファターゼコンジュゲート基質キット」で処理した（図９Ａおよび図９Ｂを参照）。
【００６３】
ｄ）結果
いずれの場合も標的タンパク質の強い発現が観察された。さらに２つのタンパク質の細胞外領域への効率のよい分泌が得られた（図９Ａおよび９Ｂ）。
【００６４】
実施例７：宿主細胞でのｐｈｙＡの翻訳
ａ）培養
細菌株ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐＭＣＳ、ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰ、ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５Ｆｌａｇ、ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ、ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰおよびＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ（表２を参照）のそれぞれ１０μＬの一晩培養物を、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む１０ｍＬのＬＢ培地に３７℃で接種した。平均対数期（ＯＤ６００：０．７）の間に最終濃度１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを加えた。それによってＰｈｙＡの発現がプロモーターＰｔａｃにより、Ｋｉｌの発現がプロモーターＰｔｒｃにより誘導された。続いて細胞を３７℃で２時間振とうした。次に細胞培養物を遠心し、細胞ペレットと上清（培地）を−２０℃で保存した。
【００６５】
ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
細胞溶解のために試料ペレットを２００μＬの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁した。次に（抽出のために）２０μＬのＣＨＣｌ３を加えた。抽出のために試料をボルテックスにかけ、遠心し、水相の上清をサンプルバッファーと混合した。細胞培養物の上清（培地）もサンプルバッファーと混合した。抽出物試料と細胞培養上清の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）で展開した。
【００６６】
ｃ）ウエスタンブロッティング分析
２５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ８．３）、１９２ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンおよび２０容積％のメタノールを含むトランスファーバッファーを使用して、タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした（１００Ｖおよび４℃で１時間）。メンブレンを取り出し、５％粉末ミルクを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングし、水で洗浄し、続いて１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を混合したＴＢＳ中で一次ポリクローナル抗ＰｈｙＡ抗体（希釈率１：３０００）またはモノクローナルＡＰコンジュゲート抗Ｆｌａｇ抗体（希釈率１：２０００；Sigma）とともに室温で一晩インキュベートした。メンブレンを１％ＢＳＡを含むＴＢＳで５分ずつ３回洗浄した。二次抗体が必要な場合、１％ＢＳＡを混合したＴＢＳ中の抗ウサギＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート抗体（希釈率１：１０００；cell signaling）とともにメンブレンをインキュベートした。次に０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＴＢＳでメンブレンを１５分ずつ３回洗浄し、続いてＴＢＳで洗浄し、BIO-RADの「アルカリホスファターゼコンジュゲート基質キット」で処理した（図１０Ａおよび図１０Ｂを参照）。
【００６７】
ｄ）結果
試験したプラスミドはBacillus amyloliquefaciens FZB45のタンパク質ＰｈｙＡを発現していた。抗ＰｈｙＡ抗体も抗Ｆｌａｇ抗体も融合タンパク質ＰｈｙＡ−Ｆｌａｇを認識することができる（図１０Ａ、レーン１、２、１１および１２を参照）。ＰｈｙＡタンパク質の発現は抗ＰｈｙＡ抗体によって検出することができる（図１０Ａ、レーン３および４を参照）。さらにＩＰＴＧの存在下でタンパク質の強い発現が検出された。
【００６８】
ｐＫｉｌから誘導された被検プラスミドはBacillus amyloliquefaciens FZB45のタンパク質ＰｈｙＡを発現する。抗ＰｈｙＡ抗体も抗Ｆｌａｇ抗体も融合タンパク質ＰｈｙＡ−Ｆｌａｇを認識することができる（図１０Ｂ、レーン１、２、３、１５および１６を参照）。タグペプチドを持たないＰｈｙＡタンパク質の抗ＰｈｙＡ抗体による認識はあまり明瞭でない（図１０Ｂ、レーン４、５および６を参照）。
【００６９】
実施例８：ｐｈｏＢ欠失変異体の構築
ａ）Ｐ１ｖｉｒライセートの調製
細菌株ＨＡ１５からＰ１ｖｉｒライセートを調製するために、菌株の一晩培養物１０μＬを５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を含む１０ｍＬのＬＢ培地に３７℃で接種した。指数増殖期の間に、野生型ＭＧ１６５５から調製したＰ１ｖｉｒライセートを細菌細胞に感染させた。
【００７０】
感染した培養物を、細胞溶解が観察されるまで、さらに３７℃で４時間インキュベートした。抽出のためにＣＨＣｌ３を加え、ライセートを遠心し、上清をＣＨＣｌ３入りの新しい試験管に移し、４℃で保存した。
【００７１】
ｂ）Ｐ１トランスダクション
レシピエント菌株ＢＬ２１、ＴＧ１、ＩＳ５６８、ＥＳ１５６８、ＪＭ１１０、ＭＧ１６５５  ｍｕｔＬ：：Ｔｎ５の５０μＬの一晩培養物を３７℃でＬＢ培地に、指数増殖期に到達するまで接種した。それぞれ９００μＬのこれらの細胞を２．５μＬのＣａＣｌ２（１ｍｏｌ／Ｌ）および細菌株ＨＡ１５（ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０）の１００μＬのＰ１ｖｉｒライセートと混合した。５ｍｍｏｌ／ｍＬのクエン酸ナトリウムをＬＢに加えることによって、３７℃で３８分間行われたファージ吸収を停止した。
【００７２】
表現型発現のために細胞を３７℃で１時間、振とうせずにインキュベートした。細菌培養物を遠心し、１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを混合した選択平板で平板培養した。得られた個々のコロニーを単離し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００７３】
実施例９：コンピテントセルの形質転換
菌株ＭＧ１６５５、ＭＧ１６５５ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＭＧ１６５５ｍｕｔＬ：：Ｔｎ５、ＭＧ１６５５ｍｕｔＬ：：Ｔｎ１０ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＢＬ２１、ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＴＧ１、ＴＧ１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＥＳ５６８、ＥＳ５６８ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＥＳ１５７８、ＥＳ１５７８ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＪＭ１１０、ＪＭ１１０ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０およびＤＨ５α（ｐｈｏＡ−）のコンピテントセルを塩化ルビジウム・プロトコル（Promega）により調製した。最後に試験管ごとに２００μＬを分取し、−８０℃で保存した。
【００７４】
各菌株をそれぞれ下記のプラスミドの１つで形質転換した：ｐＭＣＳ、ｐｋｉｌ、ｐａｐｐＡ、ｐｋｉｌａｐｐＡ、ｐａｇｐおよびｐｋｉｌａｇｐ。そのほか菌株ＭＧ１６５５ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０、ＴＧ１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０およびＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０をそれぞれプラスミドｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰ、ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＦｌａｇおよびｐｋｉｌｐｈｙＳＴＯＰで形質転換した。
【００７５】
それぞれ得られた個々のコロニーを単離し、ＬＢ寒天平板または１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む選択平板で３７℃で一晩インキュベートした。得られた細菌株およびそれから誘導されたプラスミドを担持する誘導体をグリセリンと混合して−８０℃で保存した。細菌株を表２に示す。
【００７６】
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐａｐｐＡを２００５年６月２０日にドイチェ・ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン・ゲーエムベーハー（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク、マシェローダー・ヴェーク１ｂ（ＤＳＭＺ）に寄託番号ＤＳＭ１７４０６で寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐａｇｐを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４０７でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐｐｈｙ４５ＦＬＡＧを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４０８でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４０９でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐＫｉｌａｐｐＡを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４１０でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐＫｉｌａｇｐを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４１１でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐＫｉｌｐｈｙ４５ＦＬＡＧを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４１２でＤＳＭＺに寄託した。  
菌株Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０ｐＫｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰを２００５年６月２０日に寄託番号ＤＳＭ１７４１３でＤＳＭＺに寄託した。
【表２】
2008543320.tif 000003
2008543320.tif 000004
【００７７】
実施例１０：フィターゼ活性の選択
ａ）増殖条件
表２（実施例９を参照）に挙げた細菌株を種々の最小培地の寒天平板で平板培養した。培地の組成はＭＯＰＳ緩衝液（表４）に基づく。Neidhardt、BlochおよびSmith, 1974, Culture medium for Enterobacteria（J. Bacteriol. 119:736-47）に従ってＭＯＰＳ緩衝液を調製した。一般的には、培地組成物に２２ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースと０．３ｍｍｏｌ／Ｌのチアミンを加えた。さらに表５に示す濃度のいわゆる微量栄養素を加えた。最小培地の組成によっては無機リン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４；Ｐｉ）および／またはフィチン酸塩（Ｎａ１２Ｃ６Ｐ６Ｏ２４）が含まれた（表３）。
【表３】
2008543320.tif 000005
【表４】
2008543320.tif 000006
【表５】
2008543320.tif 000007
【００７８】
増殖研究は温度２５℃〜３７℃で行った。寒天平板を２５℃または３０℃で７日間適宜にインキュベートした。細胞増殖を毎日チェックした。
【００７９】
ｂ）結果
結果のアベイラビリティー
使用した菌株に応じて３日または最大４日後にすでに明確な結果が得られた。従ってそれ以上のインキュベーションは不要であると思われた。
【００８０】
大腸菌でのＡｐｐＡの発現
プラスミドによりコードされたＡｐｐＡタンパク質（フィターゼＩ）またはグルコース−１−ホスファターゼ（フィターゼＩＩ）を発現した大腸菌ｐｈｏＢ株は、唯一のホスファターゼ源としてフィチン酸塩を含む最小培地（培地Ｄ）で増殖することができたことが示された。そのほか０．１〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸塩を含む別のフィチン酸塩限定培地でフィターゼ活性の選択を行った。理想的にはフィチン酸塩濃度は０．１５〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００８１】
Bacillus amyloliquefaciens FZB45のＰｈｙＡの発現
プラスミドによりコードされたBacillus amyloliquefaciens FZB45のＰｈｙＡタンパク質を発現する大腸菌ｐｈｏＢ株（ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０）も、唯一のホスファターゼ源としてフィチン酸塩を含む最小培地（培地Ｄ）で増殖することができた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄを参照）。そのほか０．１〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸塩を含む別のフィチン酸塩限定培地でフィターゼ活性の選択を行うことができた。理想的にはフィチン酸塩濃度は０．１５〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【００８２】
対照
これと比較して、形質転換していない宿主細胞またはプラスミドｐＭＣＳまたはｐｋｉｌで形質転換した宿主細胞では、同じ条件（培地Ｄ）で増殖が認められなかった（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄを参照）。これらの宿主細胞は天然に存在する染色体によりコードされるＡｐｐＡタンパク質だけを発現する。
【００８３】
活性の定量化
また、観察された増殖率が発現したホスファターゼの活性に直接相関することを確認することができた。並行して行われた発現強度の定量化のための定量的ウエスタンブロッティング分析および酵素活性の決定のための液相での定量的実験によって、このことを検証することができた。
【００８４】
転用可能性
これらの結果は調製した別の菌株（表２）または別の発現ベクターでも確かめることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ホスファターゼ活性の例を示す。フィターゼは２価元素の存在下でフィチン酸塩からイノシトールおよびオルトリン酸塩への加水分解を触媒した。
【図２】プロモーターＰｔａｃの制御下でホスファターゼ活性（この場合はフィターゼ活性）をコードする核酸分子（遺伝子）およびプロモーターＰｔｒｃの制御下でｋｉｌ遺伝子を担持する部分、ならびにＮ末端シグナルペプチドおよびＣ末端Ｆｌａｇタグ含む発現ベクターの概略図を示す。
【図３】ペトリ皿で平板培養したＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０株の大腸菌培養の増殖の分析を示す。図３Ａは適量の無機リン酸塩を含む最小培地でプラスミドｐＭＣＳにより菌株を形質転換した後の細胞およびこれから誘導された細胞を示す。図３Ｂは図３Ａと同じ生物の、唯一のリン源としてフィチン酸塩を含む最小培地での増殖を示す。図３Ｃはプラスミドｐｋｉｌにより形質転換した細胞およびこれから誘導された細胞の、適量の無機リン酸塩を含む最小培地での増殖を示す。図３Ｄは図３Ｃと同じ生物の、唯一のリン源としてフィチン酸塩を含む最小培地での増殖を示す。図中の説明：（１）対照：ｐｈｏＢ株、（２）対照：親プラスミドを含むｐｈｏＢ株、（３）プラスミドによりコードされた大腸菌のフィターゼＩＩを発現するｐｈｏＢ株、（４）プラスミドによりコードされた大腸菌のフィターゼＩを発現するｐｈｏＢ株、（５）プラスミドによりコードされたBacillus amyloliquefaciens FZB45のＰｈｙＡ（ｐｈｙＡとＣ末端Ｆｌａｇタグの間に停止コドンが挿入されている）をコードするｐｈｏＢ株、（６）プラスミドによりコードされたBacillus amyloliquefaciens FZB45のＰｈｙＡ（ｐｈｙＡのＣ末端にＦｌａｇタグが融合している）を発現するｐｈｏＢ株。
【図４】誘導可能Ｐｔｒｃプロモーターの制御下でのｋｉｌ遺伝子のプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２／ｌａｃＺへのクローニングを示す。
【図５】誘導可能Ｐｔａｃプロモーターの制御下でのａｐｐＡ遺伝子またはａｇｐ遺伝子のクローニングを示す。
【図６】ｐｋｉｌを得るためのプラスミドｐＭＣＳへの（図６Ａ）、ｐｋｉｌａｐｐＡを得るためのプラスミドｐａｐｐＡへの（図６Ｂ）およびｐｋｉｌａｇｐを得るためのプラスミドｐａｇｐへの（図６Ｃ）Ｐｔｒｃｋｉｌの導入を示す。
【図７】誘導プロモーターＰｔａｃの制御下でのｐｈｙＡ遺伝子のプラスミドｐＭＣＳへのクローニングを示す。
【図８】誘導プロモーターＰｔａｃの制御下でのｐｈｙＡ遺伝子のプラスミドｐｋｉｌへのクローニングを示す。
【図９】ウエスタンブロッティング分析：細胞抽出物試料の展開（図９Ａ）、上清培地の試料の展開（図９Ｂ）を示す。図中の説明：（１）ＭＧ１６５５（ｗｔ）；（２）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５；（３）マーカー；（４）ＭＧ１６５５  ｐＭＣＳ；（５）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐＭＣＳ；（６）ＭＧ１６５５  ｐｋｉｌ；（７）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｋｉｌ；（８）ＭＧ１６５５  ｐａｐｐＡ；（９）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐａｐｐＡ；（１０）ＭＧ１６５５  ｐｋｉｌａｐｐＡ；（１１）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｋｉｌａｐｐＡ；（１２）ＭＧ１６５５  ｐａｇｐ；（１３）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐａｇｐ；（１４）ＭＧ１６５５  ｐｋｉｌａｇｐ；（１５）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｋｉｌａｇｐ。
【図１０】一次ポリクローナル抗ｐｈｙＡ抗体および二次ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ  ＡＰコンジュゲート抗体（レーン１〜９）またはモノクローナル抗Ｆｌａｇタグ  Ｍ２抗体（図１０Ａのレーン１０〜１８、図１０Ｂのレーン１０〜２０）を使用したｐＭＣＳおよび誘導細胞の細胞抽出物試料のウエスタンブロッティング分析を示す。図１０Ａの図中の説明：（１）および（１１）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（２）および（１２）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（３）および（１３）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（４）および（１４）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（５）および（１０）マーカー；（６）および（１５）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐＭＣＳ；（７）および（１６）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐＭＣＳ；（８）および（１７）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０；（９）および（１８）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０；図１０Ｂの図中の説明：（１）ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（２）ラクトースで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（３）ＢＬ２１  ｐｈｏＢ  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（４）ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ  ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（５）ラクトースで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ  ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（６）ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：Ｔｎ１０    ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（７）マーカー；（８）ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（９）ラクトースで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（１０）マーカー；（１１）ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（１２）ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５ＳＴＯＰ；（１３）ＩＰＴＧで誘導したＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（１４）ＢＬ２１  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（１５）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（１６）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌｐｈｙ４５Ｆｌａｇ；（１７）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（１８）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０  ｐｋｉｌ；（１９）ＩＰＴＧで誘導したＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０；（２０）ＭＧ１６５５  ｐｈｏＢ：：Ｔｎ１０。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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