(57)【要約】  本発明は、レプチンポリペプチド配列における位置３９〜４２の疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩ／Ｓの少なくとも２個のアミノ酸残基において、当該部位がより低い疎水性になるように異なるアミノ酸残基で置換された合成レプチン拮抗薬及び前記レプチン拮抗薬の断片に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レプチンのポリペプチド配列の位置３９〜４２における疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩ／Ｓの少なくとも２つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換され、当該部位がより低い疎水性となる合成レプチン拮抗薬及び前記レプチン拮抗薬の断片。
【請求項２】
位置３９〜４２のアミノ酸残基の少なくとも２つが、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基で置換されている、請求項１のレプチン拮抗薬。
【請求項３】
前記アミノ酸残基がアラニンである、請求項２のレプチン拮抗薬。
【請求項４】
哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２のいずれかにおけるアミノ酸残基の２つがアラニンで置換されている、請求項１のレプチン拮抗薬。
【請求項５】
前記哺乳類レプチンがヒトレプチンである、請求項４のレプチン拮抗薬。
【請求項６】
前記ヒトレプチン拮抗薬がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列である、請求項５のレプチン拮抗薬。
【請求項７】
前記哺乳類レプチンがヒツジレプチンである、請求項４のレプチン拮抗薬。
【請求項８】
前記ヒツジレプチン拮抗薬がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列である、請求項７のレプチン拮抗薬。
【請求項９】
哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２のいずれかにおけるアミノ酸残基の３つがアラニンで置換されている、請求項１のレプチン拮抗薬。
【請求項１０】
前記哺乳類レプチンがヒトレプチンである、請求項９のレプチン拮抗薬。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のポリペプチドからなる、請求項１０のレプチン拮抗薬。
【請求項１２】
前記哺乳類レプチンがヒツジレプチンである、請求項９のレプチン拮抗薬。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のポリペプチドからなる、請求項１２のレプチン拮抗薬。
【請求項１４】
当該ヒトレプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２における４つのアミノ酸残基がアラニンで置換され、前記レプチン拮抗薬はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のポリペプチドからなる、請求項１のレプチン拮抗薬。
【請求項１５】
当該ヒツジレプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２における４つのアミノ酸残基がアラニンで置換され、前記レプチン拮抗薬はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のポリペプチドからなる、請求項１のレプチン拮抗薬。
【請求項１６】
請求項１のレプチン拮抗薬をコードしている単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：９、１０、１１，１２，１３，１４，１５及び１６のＤＮＡ配列からなる群より選ばれる請求項１６のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２における疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩ／Ｓの少なくとも２つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されて当該部位がより低い疎水性となる、前記断片がレプチン拮抗薬である、請求項１の合成レプチン断片。
【請求項１９】
ペグ化された形態である請求項１の合成レプチン拮抗薬。
【請求項２０】
請求項１の合成レプチン拮抗薬又はその断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
ペグ化された形態である合成レプチン拮抗薬を含む請求項２０の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明はレプチン拮抗薬、特にレプチン変異体及びそれらを含んでいる医薬組成物類に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
ｏｂ遺伝子の産物であるレプチンはＯＢ−Ｒとよばれる受容体を通して脳の満腹中枢の活性を制御して食欲を抑制し、体重に影響を及ぼすと言われている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌａａｓ，１９９８）。しかしながら、更なる研究ではレプチン受容体類は多くの他の組織類で発現されることを示し（Ｃｉｏｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｅｍｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈｏｇｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  １９９７；Ｇｌａｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、そしてレプチンは以前予想されたより異なる生物的機能に関与していることを示唆していた。
【０００３】
全身的研究では、種々な肥満の動物モデル群におけるように肥満状態のヒトではレプチンの血清レベルが上昇していることを示した（Ｄａｇｏｇｏ−Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。当該ＯＢポリペプチド又は“レプチン”は遺伝的肥満なｏｂ／ｏｂマウスにおいて、血清のインスリン及びグルコースのレベルの両方を低下させることが報告されていた。当該ｏｂ遺伝子における突然変異がヒトにおける肥満の頻繁な発生に関与の恐れがあることは今まで指摘がなかった。
【０００４】
米国特許第６，３０９，８５３号はＯＢポリペプチド類とそれらの断片類及び体重抑制へのそれらの利用を開示している。
【０００５】
非インスリン依存糖尿病（ＮＩＤＤＭ）又はＩＩ型糖尿病は、特に骨格筋、脂肪組織及び肝臓におけるインスリン抵抗性によって引き起こされる。それゆえ、高インスリン血症であってもインスリン抵抗性を補い、血糖を望ましい範囲で維持するのに不十分なインスリンしか存在しない。米国特許第６，３９９，７４５号はヒト又はげっ歯類のレプチンの断片類であるレプチン拮抗薬をＩＩ型糖尿病及び糖尿病患者におけるインスリン抵抗性を治療する際における使用を開示している。米国特許出願第２００４／００４８７７３ではインスリン分泌の不足から生じる疾患類及び高血糖の治療に対してレプチンの拮抗薬の使用を開示しているが、この出願では特定のレプチン拮抗薬は開示されていない。
【０００６】
米国特許出願第２００４／００７２２１９はヒトレプチンの生物活性を有していて実質的に非免疫性であるか、インビボで使用するとき同じ生物活性を有するいずれの非修飾分子より低免疫性の修飾分子を開示している。開示された変異体レプチンタンパク質類はコンピュータモデル化で設計されたが、合成はされておらず試験も行われていない。これらの変異体はＴ細胞エピトープ類を変化させているが、好ましくはただ１つのアミノ酸を置換してレプチンの生物活性を維持しながら免疫性部位を少なくするか除去する。当該配列の中で開示されたのは１３アミノ酸長で、その中で生来のヒトレプチンのアミノ酸残基３９，４１又は４２がアラニンで置換されていた。
【０００７】
肥満は多くのガンに関して危険性があると考えられている。血清レプチンレベルはしばしば肥満の人々では上昇している。レプチンは多くの組織中で分裂促進剤として作用する；そこでレプチンはガン細胞増殖を促進する作用をするであろう。事実、レプチンはインビトロで前立腺ガン細胞に対して成長因子として作用し、前立腺ガン細胞の遊走増加及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１）と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のような成長因子の発現を誘導し、前立腺ガン成長を増進することが示されている（Ｓｏｍａｓｕｎｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００８】
食物摂取及び脳でのエネルギー消費の調節にて重要な役割を果たしているほか、レプチンは正常及び新生物の乳ガン細胞において潜在性成長刺激剤としても作用する。最近インビトロにて卵巣ガン細胞における細胞増殖を誘導することも示された（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００９】
レプチンは最近Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）−細胞の分化を促進し、病気の動物モデルの幾つかにおいて自己免疫反応の開始及び進行を調節することが示された（Ｌａ  Ｃａｖａ  ａｎｄ  Ｍａｔａｒｅｓｅ，２００４）。レプチンの役割がＴｈ１介在自己免疫症又は炎症性腸症候群のような炎症性疾患において基本的であれば、末梢的レプチン作用を抑制することによる治療効果が予期される（Ｍａｔａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。レプチンは関節リウマチの発病及び多発性硬化症に関するマウスモデル（Ｐｅｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）での実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行に関与することも示された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（本発明の要旨）
我々は今回、本発明により位置３９〜４２の哺乳類レプチン−結合部位の疎水性を低下させることによりレプチン拮抗薬であるレプチン変異体が得られることを見出した。
【００１１】
そこで、１つの態様では、本発明は天然のレプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２における疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩ／Ｓの少なくとも２つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換され、当該部位がより低い疎水性になっている合成レプチン拮抗薬及び前記レプチン拮抗薬の断片を提供する。
【００１２】
他の態様においては、本発明は前記レプチン拮抗薬をコードしている単離ＤＮＡ分子を提供する。
【００１３】
更なる態様においては、本発明は前記合成レプチン拮抗薬又はその断片及び薬学的に許容される担体を含んでいる医薬組成物を提供する。
【００１４】
（本発明の詳細な説明）
当該レプチンの三次元構造解析は長鎖サイトカインスーパーファミリーへのその関連性を示した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。当該レプチン受容体の三次元構造は決定されたが、そのアミノ酸配列分析は、成長ホルモン（ＧＨ）、顆粒コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体のようなクラスＩ型サイトカイン受容体ファミリーの受容体に極めて類似することを示した。このファミリーから得た受容体はそれらの細胞外部分にＣ２、ＣＫ及びＦ３のような複数の同様な領域を共有している。当該Ｇ−ＣＳＦＲのように、レプチン受容体はＣＫ−Ｆ３領域の２回繰返しを有し、それはリガンド結合部位であることを示唆した（Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ，１９９６；Ｌｉｖｎａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ａｒｉｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｆｏｎｇ及び共同研究者はレプチン結合領域（ＬＢＤ）を当該レプチン受容体細胞外領域（ＥＣＤ）中の膜隣接ＣＫ−Ｆ３領域（〜２００アミノ酸）と突き止めた（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。しかしながら、最近のデータは、レプチンのその受容体への結合はＩＬ−６のその受容体への相互作用により似ており（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｅｎ  ２００３）、先端及び隣接ＣＫ−Ｆ３間に位置している免疫グロブリン様領域（ＩＧＤ）が当該レプチン受容体の増殖的二量体化に不可欠なものであることを示している（Ｚａｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１５】
レプチン受容体の３Ｄ構造の構造的情報がないので、２種類の可能性あるモデルが考えられる。１つはＧＨ／ＧＨＲ又はプロラクチン（ＰＲＬ）／ＰＲＬＲ又はＥＰＯ／ＥＰＯＲに特徴的で、それは並列するＪａｋ２を相互トランスリン酸化をもたらすホルモン誘導受容体のホモ二量化で特徴づけられ（Ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、もう一方はＩＬ−６を示唆した（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｅｎ，２００３）。後者モデルでは次第に六量体の複合体が形成されるが、最初はＩＬ−６Ｒ−アルファと相互作用したＩＬ−６分子がその後ｇｐ１３０と相互作用して非活性な三量体を形成し、それが次いで二量体化して活性な六量体を形成する。当該六量体の形成は１つの三量体に結合したＩＬ−６（その部位ＩＩＩを通じて）と他の三量体のｇｐ１３０のＩＧＤと相互作用をして達成される（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｅｎ，２００３）。推定されるレプチンの結合部位ＩＩＩとＩＧＤの可能性ある相互作用部位を判断するために、我々は３Ｄ構造が入手できるｇｐ１３０との配列比較に基づいてレプチン受容体をモデル化した。次いで、レプチンをＩＬ−６／ｇｐ１３０複合体のｖＩＬ−６と合わせ（４種の保存ブロックの重ね合わせに基づき）、当該レプチン受容体ＩＧＤをｇｐ１３０ＩＧＤに合わせた。ＡＢループについての情報は失われているが、我々はレプチンのアミノ酸３９〜４２を同定し（ブタを除く全ての哺乳類でのＬＤＦＩ及びブタにおけるＬＤＦＳ）、それは全てのレプチン種においてＩＧＤと相互作用する主なる想定される配列として保存されている。この仮説を証明し、その普遍性を試験する際に我々はこの域の４種のヒツジ及び４種のヒト組換えレプチンのアラニン変異体を調製して均一に精製し、本明細書でそれらが競合性拮抗薬として作用することを示す。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、生来の哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２である疎水性結合部位の配列ＬＤＦＩ／Ｓのすくなくとも２種類のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換して、当該部位をより低い疎水性とした合成レプチン拮抗薬及び前記レプチン拮抗薬の断片をこうして提供する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、“哺乳類”という用語には哺乳類のヒトとともにヒト以外の哺乳類も含まれる。そこで、本発明によれば天然のレプチンはヒトのレプチン又はこれだけに限らないがヒツジ、ラット、マウス、ウマとブタレプチンのようなヒト以外の哺乳類のレプチンであってもよく、当該ＬＤＦＩ／Ｓ配列はヒトレプチン又はブタを除くヒトでない哺乳類のレプチンの３９〜４２ＬＤＦＩ配列、ブタレプチンの３９〜４２ＬＤＦＳ配列を表わす。１つの好ましい実施形態では、当該レプチンはヒトレプチンである。他の好ましい実施形態では、当該レプチンはヒツジレプチンである。
【００１８】
本明細書で使用する場合、“レプチン拮抗薬”及び“レプチン変異体”という用語は野生株のヒト又はヒトではないレプチン配列の位置３９〜４２のアミノ酸の少なくとも２個が他のアミノ酸で置換されていて当該部位がより低い疎水性になった哺乳類レプチンポリペプチドを称するのに互換的に用いる。“哺乳類レプチンポリペプチド”という用語は天然に生じる哺乳類レプチンポリペプチド類及びそれの生物的活性な変異体とともに天然発生レプチンの生物活性断片及びその変異体を包含する。“変異体”とはヒトレプチンポリペプチドと異なるが、その重要な性質は保持されているポリペプチドを称する。
【００１９】
本発明によれば、野生型哺乳類レプチンの位置３９〜４２であるアミノ酸残基の少なくとも２個はアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群より選ばれる１個以上のアミノ酸で置換さる。大層好ましい実施形態では、前記アミノ酸残基はアラニンである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２のいずれかにおいていずれか２個のアミノ酸残基、例えば３９、４０又は３９、４１又は３９、４２又は４０、４１又は４０、４２又は４１、４２の位置はアラニンで置換されている。
【００２１】
１つの実施形態では、２個のアラニン置換基を伴う当該レプチン拮抗薬はヒトレプチンから由来したものである。好ましい実施形態では、当該ヒトレプチン拮抗薬は３９と４０の位置において２個のＡｌａ突然変異を起こしているヒト組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒトレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）としてある。他の好ましい実施形態では、当該ヒトレプチン拮抗薬は位置４１及び４２にて２個のＡｌａ突然変異を起こしているヒト組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒトレプチンＦ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体としてある（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【００２２】
本発明の他の実施形態では、２個のアラニン置換を伴うレプチン拮抗薬はヒツジのレプチンからの由来である。好ましい実施形態では、当該ヒツジレプチン拮抗薬は位置３９と４０にて２つのＡｌａ突然変異を起こしているヒツジ組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒツジレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ変異体とされている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）。他の好ましい実施形態では、当該レプチン拮抗薬は位置４１と４２で２つのＡｌａ突然変異を起こしているヒツジ組換えレプチンポリペプチドであり、本明細書ではヒツジレプチンＦ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）とされている。
【００２３】
本発明の他の好ましい実施形態では、レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２のいずれかにおいてアミノ酸残基のいずれか３つが、例えば位置３９、４０、４１又は３９、４０、４２又は３９、４１、４２又は４０、４１，４２においてアラニンで置換されている。
【００２４】
本発明の１つの好ましい実施形態では、３個のアラニン置換を伴うレプチン拮抗薬はヒトレプチンに由来する。より好ましい実施形態では、当該ヒトレプチン拮抗薬は位置３９，４０と４１に３つのＡｌａ突然変異を伴うヒト組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒトレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ変異体とされている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
【００２５】
本発明の他の好ましい実施形態では、３つのアラニン置換を伴うレプチン拮抗薬はヒツジレプチン由来のものである。より好ましい実施形態では、当該ヒツジレプチン拮抗薬は位置３９，４０と４１に３個のＡｌａ突然変異を持っているヒツジ組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒツジレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ変異体としている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施形態では、レプチンポリペプチド配列の位置３９〜４２の４個のアミノ酸残基がアラニンで置換されている。１つのより好ましい実施形態では、４個のアラニン置換を伴うレプチン拮抗薬はヒトレプチン由来で、位置３９、４０、４１及び４２にて４個のＡｌａ突然変異を持つヒト組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではヒトレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体と呼んでいる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。他のより好ましい実施形態では、４個のアラニン置換を伴うレプチン拮抗薬はヒツジレプチン由来で、位置３９、４０、４１及び４２にて４個のＡｌａ突然変異を持つヒツジ組換えレプチンポリペプチドで、本明細書ではＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体と呼んでいる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【００２７】
他の態様では、本発明は本発明のレプチン拮抗薬をコードしている単離ＤＮＡ分子に関する。
【００２８】
１つの好ましい実施形態では、当該単離したＤＮＡ分子はヒトレプチン由来のレプチン拮抗薬をコードしている。１つの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列であり、ヒトレプチンの二重変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａをコードしている。他の好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列であり、ヒトレプチンの二重変異体Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードしている。
【００２９】
他の実施形態では、単離したＤＮＡ分子はヒツジレプチン由来のレプチン拮抗薬をコードしている。１つの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の配列であり、ヒツジレプチンの二重変異体Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａをコードしている。他の好ましい実施形態では当該ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２の配列であり、ヒツジレプチンの二重変異体Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードしている。
【００３０】
本発明のより好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の配列であり、ヒトレプチンの三重突然変異Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａをコードしている。他のより好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４の配列であり、ヒツジレプチンの三重突然変異Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａをコードしている。
【００３１】
他のより好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５の配列であり、ヒトレプチンの四重突然変異Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードしている。
【００３２】
更により好ましい実施形態では、当該ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の配列であり、ヒツジレプチンの四重突然変異Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａをコードしている。
【００３３】
本発明のレプチン変異体の調製に関して、ｏｂ遺伝子の部位特異的突然変異は、例えば市販で入手できるキットを用いて、当技術分野でよく知られている手順で実施される。当該変異体は選別され、当該正確な突然変異を確認するために配列決定し、当該変異したプラスミドを単離し、当該プラスミドで形質転換受容性細胞をトランスフォームして、当該レプチン変異体の発現に使用する。
【００３４】
他の実施形態では、本発明は合成レプチン拮抗薬断片に関するが、前記断片は全長レプチンポリペプチド拮抗薬に関して記述したように位置３９〜４２に突然変異部位を含み、前記断片はそれ自身がレプチン拮抗薬である。
【００３５】
更なる実施形態では、本発明の合成レプチン拮抗薬はペグ化され、それに付着しているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子類は種々な数を有している。４．６ｋＤａ又は４０ｋＤａの分子量のＰＥＧがこの目的に適している。本発明のレプチン拮抗薬のペグ化は、それらの安定性、それらの血清半減期及び薬物動態学を上昇させる。
【００３６】
そのうえ更なる実施形態では、本発明の合成レプチン拮抗薬をＳＰ１植物タンパク質で標識し（Ｄｇａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、オリゴマー化すると、より高い分子量と当該受容体へのより高い結合性を有する生成物を得る。当該キメラなＳＰ−１レプチン拮抗薬タンパク質は自然に集合して１つの安定なオリゴマー形状となり、最大十二量体となる。
【００３７】
他の態様では、本発明は本発明の合成レプチン拮抗薬及び薬学的に許容されうる担体を含んでいる医薬組成物を提供する。当該本発明の医薬組成物は、例えばＩＩ型糖尿病、拒食症、ガン及び多発性硬化症、炎症性腸症候群、関節リウマチのような自己免疫症におけるような内因性レプチンの望まない又は有害な活性が係わるいずれかの障害を治療するのに有用である。
【００３８】
そこで好ましい実施形態では、本発明はＩＩ型糖尿病の治療用及び、特にヒト又はヒトではない哺乳類における糖尿病に係わるインスリン抵抗性の治療用の医薬組成物を提供する。
【００３９】
他の好ましい実施形態では、当該医薬組成物は悪性細胞増殖の抑制に使うことができ、これだけに限らないが乳、大腸、子宮及び前立腺ガンのようなガンの治療に有用でありうる。
【００４０】
本発明に従って使用する医薬組成物は１種類以上の生理的に許容できる担体類又は添加物類を使用する従来のやり方で処方される。当該担体（類）は当該組成物の他の成分と共存でき、その添加物に悪影響を及ぼさないという意味での“許容することができる”ものでなければならない。
【００４１】
本発明の医薬組成物類の投与方法には、これだけに限らないが静注、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻腔、口腔、膣内、直腸、眼内）、髄腔内、局所及び皮内経路が含まれる。投与は全身又は局所でありうる。
【００４２】
他の態様では、本発明はＩＩ型糖尿病の治療方法に関し、それには本発明のレプチン拮抗薬又はその断片の効果量を糖尿病患者に投与することを含む。
【００４３】
更なる態様では、本発明はガンの治療法に関し、そこには本発明のレプチン拮抗薬又はその断片の効果量をガン患者に投与することを含む。
【００４４】
それらの見込みある薬剤的使用のほかに、本発明のレプチン拮抗薬はレプチンホルモンの生物的活性の研究に際して研究用手段として有用である。
【００４５】
当該発明は以下の非制限的例示によりここで説明されるであろう。
【実施例】
【００４６】
材料及び方法
（ｉ）材料。ヒツジ及びヒトのレプチンは我々の研究室で以前記述したように調製した（Ｇｅｒｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。組換えニワトリレプチン結合領域（ｃｈＬＢＤ）をヒトＬＢＤの調製と同様に調製した（Ｓａｎｄｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。分子生物実験で使用した制限酵素類はＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）及びＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からのものである。高純度ＤＮＡプライマーはＳｉｇｍａ  Ｃｏ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ  Ｉｓｒａｅｌ）から得られた。ＲＰＭＩ−１６４０培地、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、ナリジクス酸及び臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（チアゾリルブルー、ＭＴＴ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、牛胎仔血清（ＦＣＳ）はＢｉｏｌａｂ  Ｃｏ．（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｌａｅｌ）から、そしてｐＴｒｃ  ９９Ａ発現ベクター、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ  １０／３０カラム、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅはＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。研究級ＣＭ５センサーチップ、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド（ＮＨＳ）、塩酸Ｎ−エチル−Ｎ'（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、エタノールアミン−ＨＣｌ及びＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０をｐＨ７．４にて）はＢｉａｃｏｒｅ，ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。全てのほかの試薬類は分析級のものである。
【００４７】
（ｉｉ）純度及びモノマー含量の測定。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）に従って還元条件下で１５％ポリアクリルアミドゲルにて実施した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒで染色した。ゲルろ過クロマトグラフィーはＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ７５  ＨＲ  １０／３０カラムにて、ＴＮ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８）を用いてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出画分の０．２ｍｌ部について行った。逆相クロマトグラフィーはＶｙｄａｘカラムを用い、水中０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）及びＭｅＣＮ中０．１％ＴＦＡ（溶液Ｂ）のグラジエントにて展開した。
【００４８】
（ｉｉｉ）ＣＤスペクトルの測定。０．０２０−ｃｍ角型ＱＳ  Ｈｅｌｌｍａキュベットを用いるＡＶＩＶモデル６２Ａ  ＤＳ  円偏光二色性分光計（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）によりミリ度でＣＤスペクトルを測定した。当該分光計はカンファースルホン酸で較正した。当該吸光スペクトルは１．０００ｃｍのＱＳキュベット及び光散乱についての補正を用いてＡＶＩＶモデル１７ＤＳ  ＵＶ−可視ＩＲ分光光度計で測定した。Ｑセファロース溶出濃縮ｃｈＬＢＤをｐＨ７．５の２０ｍＭリン酸緩衝液に対して２４時間透析し、その後１１，０００ｇで１５分の遠心分離した。当該ＣＤ測定は熱電ペルチェ素子により０．１度の精度で調節し、２５℃で測定して実施した。当該ＣＤスペクトルは５回繰返しで測定し、平均スペクトルとした。２２２ｎｍでの平均ＣＤ信号の標準偏差は５％の範囲であった。当該二次構造測定に関し、当該ＣＤデータは、Ｎ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ結合は発現の過程で加水分解されることが知られているので（未公表データ）、１４７個のアミノ酸からなるタンパク質につき計算した約１６ｋＤａの各分子量に基づき平均残基当たりのｄｅｇｒｅｅ  ｃｍ２／ｄｍｏｌで表した。レプチン及びレプチン変異体の二次構造は当該手順とコンピュータプログラムＣＯＮＴＩＮ（Ｐｒｏｖｅｎｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｇｌｏｃｋｎｅｒ，１９８１）を応用して計算した。当該プログラムは、これらの秩序形態に関与しているアミノ酸残基のパーセントとしてα−らせん体、β−鎖及びβ−ターンを決定する。無秩序な立体構造は単一体から当該二次構造の全ての要素の合計を差し引いたものとして測定された（Ｖｅｎｙａｍｉｎｏｖ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，１９９６）。この研究では、ＣＯＮＴＩＮプログラムにより計算するために１７種類のタンパク質の標準ＣＤスペクトルのセットを使用した（Ｓｒｅｅｒａｍａ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ，１９９３）。
【００４９】
（ｉｖ）複合体化学量論の測定。ｃｈＬＢＤとヒト又はヒツジレプチン又はそれらの変異体間の複合体はＴＮ緩衝液中で種々なモル濃度にて調製された。１：１比率におけるタンパク質の最終濃度は１０μＭであった。室温での２０分間の温置後、２００μｌの一定分量をＴＮ緩衝液で前もって平衡としたＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ７５ＨＲ  １０／３０カラムに適用した。当該複合体の分子量を測定するために、当該カラムは幾つかの純粋タンパク質で較正した。
【００５０】
（ｖ）ｃｈＬＢＤとレプチン及びレプチン変異体の相互作用の反応速度測定。全ての実験は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法論を用いて２５℃で実施した。ヒト及びニワトリ組換えＬＢＤとニワトリ及びｈＬｅｐの間の相互作用に関する速度論及び平衡定数はＢｉａｃｏｒｅ  ３０００システム（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定した。レプチン（ヒト、ヒツジ又はニワトリ）を研究用ＣＭ５（カルボキシメチルデキストラン）センサーチップのフローセル中にアミノ結合化学反応（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）を用いて固定化した。当該固定化工程はＨＢＳ−ＥＢ緩衝液中にて５μｌ／分の流速で実施した。当該表面は０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．２Ｍの塩酸Ｎ−エチル−Ｎ'（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの混合物で７分間活性化した。レプチンを望ましいレベル（１０００共鳴単位）が到達するまで１０ｍＭ酢酸、ｐＨ３．５の中において５０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５を７分間注入して残存活性化基を遮断した。対照表面はカルボキシル基を活性化し、そののち記述したように活性化基をエタノールアミンで遮断して調製した。結合の研究に関しては、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中に再懸濁したｃｈＬＢＤを異なる濃度（１５．６２，３１．２５，６２．５，１２５及び２５０ｎＭ）で３つのフローセル（ヒト又はヒツジのレプチン又は対照を有している）を３０μｌ／分の流速で通過させた。当該表面の各相互作用の後における再生は１０ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２の１０μｌパルスを用いて実施した。当該実験はＢｉａｃｏｒｅ制御ソフトウェアの速度論ウィザードで調節したが、これは屈折率変化及び非特異的結合についてはＬＢＤとレプチンの間の相互作用について得たデータから対照表面に関して得た反応を差し引くことで自動的に補正する。当該得られた結合曲線を全てのＬＢＤ濃度における会合と解離相に同時にＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて合致させた。全ての例において、最も良い合致は簡易二分子相互作用（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｍｏｄｅｌ）に関して得られた。
【００５１】
（ｖｉ）結合試験。放射標識したヒツジ１２５Ｉ−レプチンはリガンドとして、全ての他の非標識レプチン又はそれらの変異体は競合体として供された。当該実験はヒトレプチン受容体のロングフォームを安定的に形質移入したＢＡＦ／３細胞群のホモジネートで実施した。当該細胞群はＩＬ−３の存在下、５％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で培養し、１０６細胞／ｍｌの濃度が達成されるまでレプチン受容体類下方制御を最小限とした。そののち当該細胞群を遠心分離し、−７０℃で保存した。各実験に先んじて当該細胞群を解凍し、１．７５×１０６細胞／反応緩衝液１５０μｌ（０．１％ウシ血清アルブミンを含む１２．５ｍＭバルビツール酸Ｎａ、ｐＨ８．６、７．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００）で懸濁し、氷上にてＰｏｌｙｔｒｏｎｅで３０秒間１０，０００ｒｐｍにてホモジナイズした。各試験管は１５０μｌの反応緩衝液、１００μｌの１２５Ｉ−ヒトレプチン（７００，０００〜８００，０００ｃｐｍ）及び反応緩衝液中１００μｌの異なったレプチン溶液類（０〜５０００ｎｇ／試験管を供する）を含有し、当該反応は１５０μｌのホモジネートを加えて開始した。当該試験管類は１８時間室温で温置した。そののち、当該レプチン−受容体複合体は２５０μｌの１％（ｗ／ｖ）ウシ免疫グロブリン及び５００μｌの２０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを加えて沈殿させた。当該試験管群は完全に攪拌し、４℃で３０分間培養し、４℃にて１５分間１２，０００ｇで遠心分離した。そののち上澄液を注意深く吸引し、当該沈殿物をγカウンター中で計数した。ヒトレプチンをｈＧＨのヨード化に関して以前説明したプロトコール（Ｇｅｒｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）に従ってヨード化した。
【００５２】
（ｖｉｉ）ＢＡＦ／３増殖試験。ヒトレプチン受容体のロングフォームを形質移入したレプチン感受性ＢＡＦ／３  １４４２−ＣＩ４細胞群の増殖速度を用いてレプチン変異体の自己作用と拮抗作用につき、前に説明したようなＭＴＴ（テトラゾリウム塩である臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）法（Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）で測定した。レプチン変異体の拮抗作用を測定するのに、６．２５×１０−１１Ｍの野生型相同レプチンを変異させたレプチンの異なる濃度を同様に含んでいる各ウエルに加えた。レプチンの存在しない（ネガティブ対照）ウエル中の平均吸光度はブランク値として使用し、他の吸光度から差し引いて補正吸光度値を得た。ネガティブ対照を差し引いた後の野生型レプチンを伴うウエル中の平均吸光度をポジティブ対照として使用してパーセント阻止を計算した。阻止曲線をＰｒｉｚｍａ非線形回帰シグモイド片側阻止プログラム（Ｐｒｉｚｍａ，２００３）を用いて描き、ＩＣ５０値を計算した。
【００５３】
（ｖｉｉｉ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞生物学検定法。ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞を５％ＣＯ２雰囲気中、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地中、３７℃で増殖させた；ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分化はレチノイン酸（ＲＡ）の処理で行った。分化した細胞群はＲＡ処理の１５日後に使用して、高パーセントで明らかな形態的分化を示した細胞を得た。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞群を１６時間、血清無しのダルベッコ変法イーグル培地中で飢餓状態とし、レプチン拮抗薬（６．２５から３２０ｎＭ）の種々な濃度の存在又は非存在で１５分間前処理し、そののちヒトレプチン（６．２５ｎＭ）で１０分間刺激した。刺激後、細胞群は氷冷却ＰＢＳ中で洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、１０％  グリセロール、プロテアーゼ阻害剤（０．３５ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ  アプロチニン及び１０ｍＭ  ベンズアミジン）及びホスファターゼ阻害剤（１０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルソバナジウム酸ナトリウム及び２０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム）を含有する細胞溶解緩衝液中に取り込む事により回収した。氷中で３０分間細胞溶解したのち、非溶解物を遠心分離（４℃にて３０分間、１５，０００ｒｐｍ）で除去し、得られた溶解物のタンパク質濃度をタンパク質生物的検定法キット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて測定した。タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）。免疫ブロットは脱脂粉乳で遮断し、抗−ホスホ−ＭＡＰキナーゼ又は抗−Ｔｏｔａｌ  ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ  ４１／４２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇより）の存在下で温置し、次いでＨＲＰに結合した適当な二次抗体の存在下で温置し、ニトロセルロース膜を洗浄し、目的のタンパク質を増強化学発光試薬（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。
【００５４】
（ｉｘ）ルシフェラーゼレポーティング遺伝子を活性化することによる生物活性の測定。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を１０％ＦＣＳを含むＨＡＭ−Ｆ１２培地中で増殖させ、９５％空気、５％ＣＯ２でガス化した湿潤雰囲気中にて３７℃で保持した。ホルモン誘導実験の前に使用したＧＣ３最小培地はＤＭＥＭ−Ｆ１２で構成され、グルタミン、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸類、トランスフェリン及びインスリンを補充した。ＣＨＯ細胞群はｐＣＨ１１０とともにＳＴＡＴ３−反応性ｐＡＨ３２ルシフェラーゼ及びマウスＬＥＰＲｂコードプラスミドで共形質移入した。全ての形質移入はＥｘＧｅｎ  ５００（Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ，Ｓｏｕｆｆｅｌｗｅｙｅｒｓｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）を用い、製造業者のプロトコールに従って行った。生物活性を試験するのに、形質移入した細胞群は次に異なる濃度のヒト及びヒツジレプチンの存在下、各レプチン変異体の存在下又は非存在下のＧＣ３培地中で２４時間温置した。当該プレートはリン酸緩衝食塩水で洗浄し、当該酵素活性は以前記述したように測定した（Ｂｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｕｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。当該結果は前に説明したようにβ−ガラクトシダーゼ活性に関して補正してルシフェラーゼ活性を規格化した後、発光量（Ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）として表した。
【００５５】
実施例１．レプチン変異体の調製。
本発明のレプチン変異体を調製する際に、出発原料として野生型（ＷＴ）ヒツジ又はヒトレプチンをコードしたｐＭｏｎ３４０１発現プラスミドを用いた。当該レプチン挿入断片を製造業者の取扱説明書に従い２つの相補プライマーを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  突然変異キット（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で改変した（表１）。当該プライマー群は塩基変化（太字で記した）を含み、各突然変異を獲得するが適切なアミノ酸配列を保持し、コロニー選別用に特定のＢｓｈＴＩ制限部位（下線部）を改変するように設計されていた。当該手順にはＰｆｕポリメラーゼを用いる１２ＰＣＲ周期が含まれていた。当該鋳型を消化し、合成ＤＮＡを含む突然変異を選別するために、当該突然変異した構造はそののちメチル化又は半メチル化ＤＮＡ（目標配列：５'−Ｇｍ６ＡＴＣ−３'）に特異的なＤｐｎＩ制限酵素で消化した。当該プラスミド類をそののちＸＬ１形質転換受容性細胞群に形質移入した。設計した特異的制限部位を使用して各変異体の５個のコロニーを突然変異用に選別したが、少なくとも効率は８０％を示した。各変異体の２つのコロニーを配列決定し、当該突然変異が含まれていることを確認したが、不要なヌクレオチド類の誤取り込みはなかった。ＸＬ−１形質転換受容性細胞は突然変異プラスミドで形質転換され、５〜１０ｍＬのＬＢ培地中で成長させ、当該プラスミドを単離した。Ｍｏｎ１０５形質転換受容性細胞群はそののち当該プラスミドで形質転換され、発現に用いられた。
【００５６】
当該レプチン変異体をコードしているＤＮＡ分子の調製用の本実験で使用したＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．１７〜３２のプライマーを表１で示す。当該改変した制限部位（下線部）はヒトレプチンについてはＢｓｈＴＩ（−）で、ヒツジレプチンについてはＢｓｈＴＩである。
【００５７】
表１．レプチン変異体の調製用に使用するプライマー
【表１】
2008521795.tif 000002
【００５８】
実施例２．ヒト及びヒツジレプチン及びそれらの変異体の発現及び再折りたたみ。
組換え野生型（ＷＴ）又はＮ−末端での追加のメチオニン−アラニンを伴う突然変異ヒトレプチンを、ＭＯＮ１０５細胞の２．５ｌ培養中でナリジクス酸誘導（５０μｇ／ｍｌ）で発現させ、適した発現プラスミドで形質転換させた。形質転換した細菌を最初にＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地を入れた５×５００ｍｌの２．５リットルフラスコ中で２００ｒｐｍの一定振盪にてＡ６００が０．９になるまで増殖させた。ナリジクス酸の添加後４時間で、当該細胞は１０分間の１０，０００ｇの遠心分離で回収し、−２０℃で凍結させた。２．５ｌの細菌培養からの細菌ペレットを氷上で解凍し、細胞溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）中に再懸濁した。封入体（ＩＢｓ）をそののち前記（Ｇｅｒｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｒａｖｅｒ  ｅｔａｌ．，２００２）のように調製し、凍結した。そののち、２．５ｌの細菌培養から得たＩＢｓについて１０ｍＭシステインを含む４．５Ｍ尿素、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓの３００ｍｌに溶解した。ヒツジレプチン又はその変異体の場合、１．０ｌの細菌培養から得たＩＢｓを同じやり方で２００ｍｌに溶解した。当該溶液のｐＨはＮａＯＨで１１．５に調整した。４℃で２時間攪拌した後、最終濃度が０．５Ｍになるまで０．６７Ｍアルギニンの３分量を加え、一夜攪拌した。翌日当該溶液を透析管に移し、ｐＨ９の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ヒトレプチン変異体の場合）又はｐＨ８の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ヒツジレプチン変異体の場合）５×１０ｌに対して６０時間透析したが、外部の溶液交換は６〜１０時間毎であった。
【００５９】
実施例３：レプチン変異体の精製と化学的特性
実施例２のヒトレプチン変異体の再折りたたみ及び透析した画分をｐＨ９の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡とし、最大流速（４００〜５００ｍｌ／時間）のＱ−セファローズアニオン交換カラム（３０ｍｌビーズ容積）にて、非連続的ＮａＣｌ勾配（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中でＮａＣｌ５０、１００，１５０及び４００ｍＭ）で精製した。画分５０ｍｌを集め、タンパク質濃度を吸光度２８０ｎｍで測定した。
【００６０】
５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した、９５％より多くの純粋単量体からなる画分を集め、タンパク質：塩（ｗ／ｗ）比４：１においてｐＨ８のＮａＨＣＯ３に対して透析し、凍結乾燥した。ヒツジレプチン変異体はｐＨ８のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて同じやり方で精製した。ヒト及びヒツジレプチン変異体の収量は２．５リットルの細菌培養から１６０から２２０ｍｇの間、１．０ｌの細菌培養からは８０から１２０ｍｇｓの間でそれぞれ変動した。
【００６１】
当該精製した変異体の純度と均一性については３種の別々の方法で実証した。自然の条件下、ｐＨ８でのゲルろ過では分子量約１６ｋＤａに相当する単量体９５％より多い単一のピークを生じた（図１Ａ）。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約１６ｋＤａのピークが唯一検出され（図１Ｂ）、逆相クロマトグラフィーでも単一ピーク（図１Ｃ）が生じた。ＣＤスペクトルから算出したヒト及びヒツジレプチン及びそれらの変異体の二次構造を表２に示した。α−らせんが５２〜６３％の高含有、β−シートが８〜１１％及びβ−ターンが１４〜１８％の含量であることは全てのタンパク質について明らかに特徴的で、適切な再折りたたみを示している。唯一の例外はヒツジＦ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）で、その中では適切な再折りたたみが幾らか阻害されているのが見られた。Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）により計算したモル吸光係数を使用して、Ｎ末端に追加のアラニンを想定した０．１％溶液につき２８０ｎｍで比吸光係数を算出した。ＷＴヒトレプチン及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）、Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ．２）、Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ・Ｆ４１Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）変異体の各々の値は０．８８５、０．８９０、０．８９２、０．８９５及び０．８９７であり、ヒツジ種についての相当する値は０．２０１、０．２０２、０．２０２、０．２０３及び０．２０３であった。溶液におけるヒト及びヒツジレプチン及びそれらの変異体の安定性は４℃及び３７℃で試験をした。野生型（ＷＴ）レプチン及びそれらの変異体の双方は両温度にて無菌０．１ｍＭ溶液としてｐＨ６又は８で少なくとも２０日保存でき、それらの単量体含量及びＢａｆ／３生物検定法におけるそれらの活性保持に変化が無かった。
【００６２】
実施例４．ｃｈＬＢＤ−レプチン又はｃｈＬＢＤ変異体−レプチン複合体のゲルろ過による検出
ヒト又はヒツジレプチン又はそれらの変異体とｃｈＬＢＤとの間の結合化学量論の特性を明らかにするために、それぞれのリガンド及びｃｈＬＢＤを異なるモル比で混合し、分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを用いるゲルろ過で分離し、非変性条件下における結合複合体の分子量を測定した。当該実験はそれぞれのリガンドは５μＭの一定濃度、ｃｈＬＢＤは２．５、５又は１０μＭを用いて行った。ｃｈＬＢＤ：ＷＴレプチン相互作用の結果は図２に示す。当該結果はレプチンの両種がｃｈＬＢＤと１：１のモル比で結合することを示している。この化学量論は当該成分を同じモル比で混合するときに単一ピークが出現し、１つを過剰にすると他のピークが出現することのいずれかにより決定された。ピーク保持時間に基づいた当該複合体の分子量計算は全ての場合で予想値４０．５ｋＤａに近い約４１ｋＤａであった。殆ど同一の相互作用パターンが全ての８変異体（示されていない）につき観察され、突然変異が当該変異体のｃｈＬＢＤと１：１複合体形成の能力に影響を与えないことを示した。
【００６３】
実施例５．
ｃｈＬＢＤ又はその変異体とレプチン間の相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定
ｃｈＬＢＤのヒト又はヒツジレプチン及びそれらの変異体との結合能の特性をさらに明らかにするために、可溶化ｃｈＬＢＤのアミン結合法及び結合によりセンサーチップ上に固定化したそれぞれのレプチン（又はレプチン変異体）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）手法を使用した。結果ではχ２分析法を用いての１：１理論モデルとの比較から最も条件を満たした相互作用が得られたことを示している。当該算出したデータ（２回の実験の平均）を表３に示した。最大３倍までの差の速度定数が観測されたが、各Ｋｄ値はより小さな変化をし、当該差異は統計的に有意ではなかった。
【００６４】
実施例６．結合実験
全ての競合的実験においてヨウ素化ヒトレプチンは当該リガンドとして、個々の野生型（ＷＴ）ヒトとヒツジレプチン及びそれらのアラニン変異体は競合体として供された。安定的にヒトレプチン受容体のロングフォームを形質移入されたＢＡＦ／３細胞類の新しく調製されたホモジネートは受容体の源として供された。１試験管当たり１．７５×１０６細胞群から得たホモジネートを使いると、６〜７％の特異結合を生じた。当該抑制曲線（２回の実験の平均）を図３に示し、これらの曲線から算出したＷＴヒトレプチン及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）、Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）、Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）変異体についての各ＩＣ５０値は、５．３３、４．１６、６．８２、５．２１及び５．４３ｎＭであった。ＷＴヒツジの個々の変異体についての対応するＩＣ５０値は、１．４７、１．８３、３．４４、２．２０及び１．８３ｎＭであった。当該レプチン及びそれら個々の変異体間の僅かな違いは、僅かに低い親和性（統計的に有意の境界線にある）を有したＦ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）変異体を除いては有意（Ｐ＞０．０５）ではない。
【００６５】
実施例７．インビトロでの生物的活性
ヒト及びヒツジのレプチンはＢａｆ／３生物的検定において以前発表された（Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）結果と同様に、それらの個々のＥＣ５０値２２と３７ｐＭという殆ど同じ活性を示した。これに対して全ての４種のヒト又はヒツジレプチン変異体はいかなる作動性活性にも欠けていた。拮抗性活性を測定するのに、各々の変異体の存在（１〜１２５ｎＭ）又は非存在下で６２．５ｐＭのヒト又はヒツジレプチンでＢＡＦ／３細胞群を刺激した。当該実験は２〜７回繰返して平均ＩＣ５０を計算した（表４）。８種類の変異体全てが拮抗活性を示し、ヒト及びヒツジレプチン変異体の間では有意な差は見られなかった。Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）変異体はＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）及びＦ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）と比べると、より強力であった。抑制の特異性を確かめるために、Ｂａｆ／３細胞群の増殖をヒト及びヒツジレプチン変異体の非存在又は存在においてＩＬ−３（５５ｐＭ）で刺激した。８種類の全ての場合において、当該変異体の濃度１２５μＭでも抑制は認められなかった。幾種類かのレプチン変異体は同じようにＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞生物検定法及びレプチン受容体を一時的に形質移入したＣＨＯ細胞におけるルシフェラーゼレポーティング遺伝子のトランス活性化により試験を行った。図４Ａで示したようにヒトＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）レプチン拮抗薬での前処理は、次なるＭＡＰＫのレプチン誘導活性化を完全に阻止し、ヒトＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）レプチン変異体はルシフェラーゼのレプチン誘導活性化を徐々に低減させた（図４Ｂ）。５０パーセント抑制は作動薬に対して約１０倍の拮抗薬過剰で達成された。
【００６６】
実施例８．ペグ化したレプチン拮抗薬の調製
インビボにおけるいずれか個々のタンパク質の生物効果を引き出す能力はその受容体に対する親和性だけでなく、それが血液から排除される速度を含む多くの因子に依存する。例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドのような幾つかのホルモンはプロテアーゼ介在の事象で非常に速く（ｔ０．５＝０．５分）排除されるが、レプチン（未発表の観察）、成長ホルモン（ＧＨ），プロラクチン及びＰＬｓのような１５〜２５ｋＤａの分子量を有する他のものは主に腎臓を経由して（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７９；Ｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９４）よりゆっくり排除される（ｔ０．５＝８〜３０分）。腎臓介在の排除は主に分子量に依存し、７０〜８０ｋＤａより大きなタンパク質類は相当低い速度で排除されるので、当該効果についてはその大きさを増してホルモンの生体半減期の延長を目指すべきである。これはペグ化でその活性に影響しないで当該ホルモンの大きさを増大させて達成できる。幾つかのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の付着は当該タンパク質の流体力学的容積を増し、それによりその排除を遅らせる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．；１９７７）。ペグ化したヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）について最も驚いた結果の１つは、５００分の１まで親和性及びインビトロ活性の低下にもかかわらず、当該ペグ化ｈＧＨのインビボでの有効性が主に血液での半減期が最大２５倍増加することで顕著に増加したことである。そこで、向上した血液での半減期が受容体結合親和性の損失を補うことができると結論された（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００６７】
ペグ化は、精製したレプチン変異体にポリエチレングリコール（ＭＷ  ４０ｋＤａ）をよく知られている手順（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）又は製造業者（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の取扱説明書により架橋結合して実施した。ヒツジレプチンを使用した我々の結果ではペグ化がレプチンの生物的活性を低下させないことを示した（Ｒａｖｅｒ  ａｎｄ  Ｇｅｒｔｌｅｒ，未公表結果）。これらの結果はレプチン変異体のペグ化がレプチン受容体に相互作用するそれらの能力及び次なるそれらの拮抗能力にも影響を与えないであろうことを予想させた。そこで、当該レプチン変異体の良き効果をペグ化又はいずれかの他の徐放処方によりインビボで長続きさせることができる。
【００６８】
実施例９．ＳＰ−１標識ヒトレプチンの調製
ヒトレプチン変異体−２９アミノ酸結合剤及びＳＰ１植物タンパク質からなるキメラタンパク質を調製した（Ｄｇａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。当該コンストラクトをｐＥＴ２９ａベクターにサブクローンし、ＩＰＴＧによる誘導で封入体（ＩＢｓ）として不溶タンパク質を発現させる。当該主なるタンパク質バンドは理論値３１４０２Ｄａに近い約３２ｋＤａを有していた。当該キメラタンパク質を溶解させ、再折りたたみさせ、そして精製して均一性とした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂにおけるゲルろ過実験では分子量は少なくとも１００ｋＤａ及びそれ以上らしいことを示唆した。キメラタンパク質のｃｈＬＢＤに結合する可能性を評価するために、当該２種類のタンパク質を異なるモル比で前温置（ＬＢＤの濃度は一定）し、そののちＳｕｐｅｒｄｅｘカラムで分離した。ｃｈＬＢＤピークの消失は複合体形成の目印として役立った。当該結果は３：１の比でのｃｈＬＢＤの全消失及び２：１比での殆ど全部の消失を示し、これは１個のキメラタンパク質が４〜６個のｃｈＬＢＤに結合することを示している。
【００６９】
結果の検討及び要約
Ｉ型サイトカインは保存結合部位（部位Ｉ及びＩＩ）を通してそれらの受容体と相互作用する。ＩＬ−６を含むｇｐ１３０ファミリーのＧ−ＣＳＦ及びサイトカインは更なる結合部位（部位ＩＩＩ）を有しており、それは最近ＩＬ−６−ｇｐ１３０複合体の結晶構造が受容体のＩｇ様領域（ＩＧＤ）と２：２配置で相互作用することが示された（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。複合体形成の同じような型は、配列の類似性及び当該２種の相互作用同士がホルモン及びＧ−ＣＳＦの受容体類やサイトカイン類のｇｐ１３０ファミリーと分かち合う全体構造によればレプチン／レプチン受容体相互作用でも予期される。我々はそこでｇｐ１３０ＩＧＤ構造（ｐｄｂ  ｃｏｄｅ  １ｉ１ｒ；Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に基づいてレプチン受容体ＩＧＤ領域をモデル化し、当該モデルをｇｐ１３０−ｖＩＬ−６複合体に合わせた。単離されたもの（ｐｄｂ  ｃｏｄｅ  ｌａｘ８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を観察したように、レプチンの実験的構造はα−ヘリックスに対応する４つの保存ブロックに基づいてｖＩＬ−６構造に合わせた。
【００７０】
図５における上図で示したｖＩＬ−６−ｇｐ１３０（ｐｄｂ  １ｉ１ｒ；Ｃｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）とＩＬ−６−ｇｐ１３０−ＩＬ−６Ｒ（ｐｄｂ  １ｐ９ｍ；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）複合体の構造で見られたように、部位ＩＩＩにはへリックスＤ（濃青）、ループＣ−Ｄ（淡青）及びループＡ−Ｂ（橙色）が含まれ、当該受容体（図の左側の灰色）のＩＧＤに接触している。部位ＩＩＩは当該サイトカイン類の中で最も変わり易い領域と見られる。とりわけ、当該Ａ−Ｂループ（図の橙色）は長さが可変しやすく、ヒトレプチン（ｐｄｂ  １ａｘ８；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）の単離した構造の中において、又はＩＬ−６−ｇｐ１３０−ＩＬ−６Ｒ（ｐｄｂ  １ｐ９ｍ；Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）中でさえも乱れており、電子濃度マップにおいて残基は見ることができない。ループＣ−Ｄは同じように可変性である（図５にて淡青）。注目すべきことに、ｖＩＬ−６−ｇｐ１３０複合体（ｐｄｂ  １ｉ１ｒ；Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）において、当該Ａ−Ｂループには短β−鎖が含まれ、それが主鎖Ｈ結合を通して受容体Ｄ１領域（図６、上図）の第一ベータ鎖とβ−シート様構造を形成する。更に加えて、ヘリックスＡのＣ末端とこのβ−鎖の間には広がったβ−鎖様構造を観察することができ、これは当該受容体Ｄ１領域の２つのβ−シートの１つを伴う比較的平坦な接触表面と導かれる（図６）。
【００７１】
ＬＥＰＲのＩＧＤとのレプチン部位ＩＩＩの相互作用がＩＬ−６のそれと類似すると仮定すると、配列相違が大きいけれど我々はレプチンＡＢループに存在すると思われる標準二次構造を予測するために疎水性クラスター分析（ＨＣＡ）を利用した。この二次元方法は単一配列の知見から二次構造の正確な予測をもたらす（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｃａｌｌｅｂａｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｈｅｎｎｅｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。図６はヒトレプチン及びウイルス性ＩＬ−６（１ＩＲ１）の２Ｄ表示を供する。最も重要な疎水性クラスターは主な想定タンパク質類の標準二次構造に相当する。２種類のタンパク質において、可変長のループはヘリックスＡをヘリックスＢから分けている。しかしながら、ＩＬ−６においてこのループには広がった（β−鎖）構造の典型であるクラスター類が含まれる。中央のものがβ−鎖に相当し、それはｇ１３０のＩＧＤと相互作用をする。当該ループはより短くただ１つのクラスターを含有するので状況はレプチンと異なり、より簡単でさえある（ＶＴＧＬＤＦＩ／Ｓ；クラスターは７７％β−鎖類と会合した（我々の未公開統計））。これはそれ故配列がＬＥＰＡＡＩＦであるＩＬ−６のＩＧＤ−相互作用β−鎖と一時的に整列することができる。
【００７２】
当該単離した分子（図５の橙色の線、下図）の結晶構造で部分的に失われているレプチン中の対応するインターフェースのモデル化は、しかしながら当該ＡＢループに関する適切な鋳型が欠けているとともに、受容体認識において隣接ＣＤループにおける立体構造の変化が多分起こっているであろう事実によりできない。
【００７３】
その一方では、ｇｐ１３０を伴い、ループＣＤを含んでいるウイルス性ＩＬ−６のインターフェースのコアは３つの芳香族アミノ酸、Ｔｙｒ１４３、Ｔｒｐ１４４及びＰｈｅ１４８で形成されている（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，図５、上図、紫色で強調した）。レプチンの中において厳密に同等な位置に芳香族残基は存在していないが、チロシン残基（Ｔｙｒ１１９，図６ではピンク、下図）はレプチン受容体との相互作用において同様な役割を果たしているのかもしれない。この仮説を試験するために、我々はこの残基をアラニンに変異させて、組換え変異体Ｙ１１９Ａを調製した。ＣＤスペクトルで示唆されたように正確な再折りたたみがあるにもかかわらず、この変異体は相当低い作動活性を示し、いずれの拮抗効果も全然なかった（未発表データ）。
【００７４】
そこで我々は当該受容体ＩＧＤのβ−シートの１つと分子間会合を形成すると考えられるレプチンＡＢループの保存β−鎖を目標と考え、ＬＤＦＩ／Ｓ（ａａ  ３９〜４２）を突然変異させた。Ｒ１２８Ｑレプチン変異体を調製したときに我々は以前突然変異の効果は種依存であろうと気が付いていたので（Ｒａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）全ての現突然変異をヒト及びヒツジレプチンにて同時に実施した。８つの変異体（４人のヒト及び４頭のヒツジ）を良好な収量で調製した。全ての変異体を精製し、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相クロマトグラフィー（図１）で確認したときに均一であり、＞９５％単量体からなっていた。当該二次構造の構造分析はヒツジＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）変異体を除いては適切な再折りたたみ状態を示した（表２）。全ての８種の変異体は、真の拮抗薬として作用、即ちそれらはＳＰＲとＲＲＡで示すように（表３、図３）野生型ホルモンと同じような親和性を伴うＬＥＰＲと相互作用をし、ＷＴレプチンと同様にｃｈＬＢＤと１：１の複合体を形成し、Ｂａｆ／３レプチン反応性生物検定法では生物活性に欠け、そして特異的にレプチン作用を抑制した（表４）。ヒトＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）変異体は他のインビトロ生物検定法においてレプチン誘導活性も抑制した（図４）。
【００７５】
表２．中性ｐＨにおけるヒト及びヒツジレプチンとそれらのアラニン変異体の二次構造
【表２】
2008521795.tif 000003
【００７６】
表３．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定したＷＴレプチンと固定化ｃｈＬＢＤを伴うそれらの変異体の相互作用に関する速度論的及び熱力学的定数類の算出
【表３】
2008521795.tif 000004
【００７７】
表４．ＬＥＰＲのロングフォームを安定的に形質移入したＢＡＦ／３細胞群におけるヒト及びヒツジレプチン変異体の拮抗活性
【表４】
2008521795.tif 000005
【００７８】
我々の変異体を最近報告された拮抗活性を示したＳ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａレプチン変異体（Ｐｅｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）と比較するために、我々は２種類の更なるヒトレプチン変異体：Ｓ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａ及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ／Ｓ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａを調製し、均一までに精製した。両方の変異体はＷＴヒトレプチン（２．８８×１０−８Ｍ）の親和性に類似した２．９５×１０−８Ｍ及び２．６９×１０−８Ｍの各親和性でｃｈＬＢＤに結合した。しかしながら、Ｂａｆ／３生体検定では当該Ｓ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａ変異体は低い作動活性を示し、抑制に関するＩＣ５０はＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ又はＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ（表４に示したように１６５±８１ｎＭ，５回の実験の平均±ＳＥＭ、１０．０及び９．３ｎＭに対する）のいずれかと比較しても１５０より高く、より低い拮抗活性を示唆する。対照的にＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ／Ｓ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａ（１４．３±１．３４，２回の実験の平均±ＣＤ）に関するＩＣ５０値はＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ又はＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体と同程度であった。そこで我々は本発明の変異体はＳ１２０Ａ／Ｔ１２１Ａ変異体より優れていて、両変異体の組合せは利点がないと結論づけた。
【００７９】
結論として、本発明の変異体はレプチンに対して競争的拮抗薬として作用する。これらの変異体はグラム単位で用意に調製でき、それゆえインビトロ及びインビボでのレプチン機能を研究する新規な手段として供せられる。更に、レプチンに拮抗することは自己免疫疾患での可能性ある治療法が示唆され、アテローム性動脈硬化症にも利益ある効果を有するかもしれない。そこでレプチン拮抗薬は哺乳類の生理及び病理におけるレプチンの役割を証明する新規の手段を提供することになる。
【００８０】
参考文献
2008521795.tif 000006
2008521795.tif 000007
2008521795.tif 000008
2008521795.tif 000009
2008521795.tif 000010
2008521795.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００８１】
（図面の簡単な説明）
【図１Ａ】図１Ａから１Ｃは単離したヒト及びヒツジのレプチン変異体の純度測定を示す。（Ａ）ゲルろ過分析、（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１５％ゲル）で、レーン１〜５はヒト野生型（ＷＴ）レプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ、Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ、Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａレプチン変異体に相当し、レーン６−１０はＷＴヒツジレプチンとその変異体に相当し、（Ｃ）逆相クロマトグラフィーである。
【図１Ｂ】図１Ａから１Ｃは単離したヒト及びヒツジのレプチン変異体の純度定量を示す。（Ａ）ゲルろ過分析、（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１５％ゲル）で、レーン１〜５はヒト野生型（ＷＴ）レプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ、Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ、Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａレプチン変異体に相当し、レーン６−１０はＷＴヒツジレプチンとその変異体に相当し、（Ｃ）逆相クロマトグラフィーである。
【図１Ｃ】図１Ａから１Ｃは単離したヒト及びヒツジのレプチン変異体の純度定量を示す。（Ａ）ゲルろ過分析、（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（１５％ゲル）で、レーン１〜５はヒト野生型（ＷＴ）レプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ、Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ、Ｌ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ及びＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａレプチン変異体に相当し、レーン６−１０はＷＴヒツジレプチンとその変異体に相当し、（Ｃ）逆相クロマトグラフィーである。
【図２】図２はニワトリレプチン結合領域（ｃｈＬＢＤ）とヒト或いはヒツジレプチン間の複合体のＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ  ７５ＨＲ１０／３０カラムによるゲルろ過分析を示す。複合体の形成はＴＮ緩衝液中で種々なモル比にて２０分間温置して行い、そののち当該混合物の一定量（２００μｌ）を同じ緩衝液で前もって平衡としてあるカラムに適用した。全ての場合で当初のレプチン濃度を一定とした（１０μＭ）。当該カラムは０．８ｍｌ／分で展開し、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、ヒツジのプラセンタラクトゲン（２３ｋＤａ）とリゾチーム（１４ｋＤａ）により較正した。溶出液中のタンパク質濃度は２２０ｎｍの吸光度で観測した。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、ヒトレプチン受容体のロングフォームを安定に形質移入したＢＡＦ３細胞のホモジネートを用いた放射性受容体測定（ＲＲＡ）を示す。１２５Ｉ−ヒツジレプチンをリガンド及びヒト（Ａ）又はヒツジ（Ｂ）レプチンかそれらの類縁体類を競合体として使用した。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、ヒトレプチン受容体のロングフォームを安定に形質移入されたＢＡＦ３細胞のホモジネートを用いた放射性受容体測定（ＲＲＡ）を示す。１２５Ｉ−ヒツジレプチンをリガンド及びヒト（Ａ）又はヒツジ（Ｂ）レプチンかそれらの類縁体類を競合体として使用した。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体によるレプチン活性の抑制を示す。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞生物検定法におけるＭＡＰＫ（ｅｒｋ１／２）のレプチン誘導リン酸化の抑制（上位の図は増加させたレプチン用量の効果を示す）及び（Ｂ）一過性にレプチン受容体を形質移入し、６．２５ｎＭのヒトレプチンで刺激したＣＨＯ細胞におけるルシフェラーゼレポーティング遺伝子のレプチン誘導性トランス活性化の抑制である。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、ヒトレプチンＬ３９Ａ／Ｄ４０Ａ／Ｆ４１Ａ／Ｉ４２Ａ変異体によるレプチン活性の抑制を示す。（Ａ）ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞生物検定法におけるＭＡＰＫ（ｅｒｋ１／２）のレプチン誘導リン酸化の抑制（上位の図は増加させたレプチン用量の効果を示す）及び（Ｂ）一過性にレプチン受容体を形質移入し、６．２５ｎＭのヒトレプチンで刺激したＣＨＯ細胞におけるルシフェラーゼレポーティング遺伝子のレプチン誘導性トランス活性化の抑制である。
【図５】図５は疎水クラスター分析（ＨＣＡ）を示している。当該分析は当該レプチン部位ＩＩＩとレプチン受容体（ＬＥＰＲ）の免疫グロブリン様領域（ＩＧＤ）との相互作用はＩＬ−６とｇｐ−３０との相互作用と類似していると想定して行った。当該強調した疎水クラスターは主に図６で示したような想定されたタンパク質の標準二次構造に相当する。
【図６】図６はｇｐ１３０のＩＧＤ領域（上部）及び相当するヒトレプチン（下部）とウイルス性ＩＬ−６（ｖＩＬ−６）との相互作用の比較３Ｄモデルを示している：部位ＩＩＩ−ｇｐ１３０との複合で見たときのウイルス性ＩＬ−６の実験上の構造（上部−１つのｇｐ１３０分子のＤ１領域のみが左側にリボン表示を灰色で示してある）と単離したヒトレプチンの比較であるが、それに関し乱れたＡＢループについて電子密度では残基が見られない（下部−オレンジ色の点線）。当該２つの構造は構造的に保存されたらせん体に基づいて重ね合わせた（８９Ｃ±原子における重ね合わせで平均二乗偏差２．２）。レプチンのＴｙｒ１１９は図の下部に紫色で示した。
【図１Ａ】
2008521795.tif 000012
【図１Ｂ】
2008521795.tif 000013
【図１Ｃ】
2008521795.tif 000014
【図２】
2008521795.tif 000015
【図３Ａ】
2008521795.tif 000016
【図３Ｂ】
2008521795.tif 000017
【図４Ａ】
2008521795.tif 000018
【図４Ｂ】
2008521795.tif 000019
【図５】
2008521795.tif 000020
【図６】
2008521795.tif 000021
【配列表】
2008521795000001.app
【国際調査報告】
2008521795.tif 000022
2008521795.tif 000023
2008521795.tif 000024