(57)【要約】  本発明は、HIV感染を阻害する薬剤を同定するための新規方法を提供する。抗HIV剤を、PAK3分子のキナーゼ活性または発現を下方制御する能力に関して、試験化合物をスクリーニングすることにより同定する。そのようなPAK3モジュレーターを、さらに、HIV感染を阻害する活性に関して調べる。これらの新規抗HIV剤は、HIV感染およびHIV感染に関連した病気の予防または処置において有用である。
2008530533.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の存在下で、p21-活性化キナーゼ3(PAK3)分子またはその断片の生物学的活性をアッセイし、PAK3分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定する(それにより、HIV感染を阻害する薬剤を同定する)ことを含む、HIV感染を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項２】
HIV感染を阻害する能力に関して同定した化合物をさらに試験することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
生物学的活性が、PAK3分子のキナーゼ活性またはPAK3分子をコードしている遺伝子の発現である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
PAK3分子が、ほ乳類細胞由来である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
PAK3分子が、ヒトPAK3である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
化合物によるHIV感染を阻害する能力を、HIV感染細胞でHIV LTRプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現をモニタリングすることにより調べる、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、HeLa-CD4-Bgalである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
レポーター遺伝子が、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子である、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
化合物によるHIV感染を阻害する能力を、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製をモニタリングすることにより調べる、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
HIV複製が、p24抗原ELISAアッセイまたは逆転写酵素アッセイによりモニタリングされる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、初代培養マクロファージ細胞である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
(a)PAK3分子のキナーゼ活性または細胞内レベルを下方制御するPAK3調節化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングし、(b)同定したPAK3調節化合物を、HIV感染を阻害する能力に関して試験することを含む、HIV感染を阻害する薬剤を同定する方法。
【請求項１３】
PAK3分子が、ほ乳類細胞由来である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
PAK3分子が、ヒトPAK3である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
化合物によるHIV感染を阻害する能力を、HIV感染細胞でHIV LTRプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現をモニタリングすることにより調べる、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、HeLa-CD4-Bgalである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
レポーター遺伝子が、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
化合物によるHIV感染を阻害する能力を、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製をモニタリングすることにより調べる、請求項12に記載の方法。
【請求項１９】
HIV複製が、p24抗原ELISAアッセイまたは逆転写酵素アッセイによりモニタリングされる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が、初代培養マクロファージ細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
対象におけるHIV感染を処置する方法であって、p21-活性化キナーゼ3(PAK3)のキナーゼ活性または発現を下方制御する、PAK3調節化合物の有効量を含む医薬組成物を該対象に投与し、それにより、該対象のHIV感染を処置する方法。
【請求項２２】
PAK3が、ヒトPAK3である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
PAK3調節化合物が、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製を阻害する、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が、HeLa-CD4-Bgalである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
PAK3調節化合物を、既知の抗HIV薬と共に対象に投与する、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年2月7日に出願した米国仮特許出願第60/650789号に対して、35 U.S.C. §119(e)のもとで優先権の利益を主張している。該優先権出願の開示は、引用により、その全体を、あらゆる目的のために本明細書の一部とする。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に、HIV感染を阻害する化合物を同定する方法およびそのような化合物の治療適用に関する。より特には、本発明は、PAK3キナーゼ阻害剤のスクリーニング、およびHIV感染の処置または予防におけるそのような阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、レトロウイルス科のファミリーに属するレンチウイルスである。性的接触を介して、および妊娠中のHIV感染が、世界中のAIDSケースの90%までを占めると見積もられた。この感染は、精液、膣分泌物、または血液のような感染体液に曝されたとき、HIVが生殖器または胎盤の粘膜関門を通過することにより開始される。残りのAIDSケースは、HIV汚染血液の輸血、静脈麻薬使用者間の注射針の使い回し、侵襲的処置の間のHIV汚染体液への偶発的暴露、および、感染ウイルスが、感染しやすいヒト組織と直接接触できる他の状況による。
【０００４】
AIDSを予防および/または処置するのに使用可能な、抗HIV活性を有する有効な化合物は、まだ不足している。HIV感染を処置するための通常の薬物、例えば、AZTもしくはHIVプロテアーゼ阻害剤の毒性または望まない副作用は、有効な薬物濃度で使用するとき、それらの抗ウイルス活性と相容れない。AIDSおよびHIV感染を予防ならびに処置するためのより有効な他の化合物が、当分野でまだ必要である。本発明はこのおよび他の要求に対処する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
1つの局面では、本発明は、HIV感染を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。該方法は、試験化合物の存在下で、p21-活性化キナーゼ3(PAK3)分子の生物学的活性をアッセイし、PAK3分子の生物学的活性を阻害する化合物を同定することを伴う。これらの方法は、さらに、HIV感染を阻害する能力に関して同定した化合物を試験することを含む。ある方法では、アッセイした生物学的活性は、PAK3分子のキナーゼ活性である。それはまた、PAK3分子をコードした遺伝子の発現であることもできる。典型的には、スクリーニングで使用したPAK3分子は、ほ乳類細胞由来である。ある好ましい態様では、ヒトPAK3分子を使用する。
【０００６】
ある方法では、PAK3調節化合物によるHIV感染を阻害する能力を、HIV感染細胞でHIV LTRプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現をモニタリングすることにより調べる。該方法のいくつかでは、使用する細胞は、HeLa-CD4-Bgalである。該方法のいくつかでは、使用するレポーター遺伝子は、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子である。
【０００７】
ある他の方法では、PAK3調節化合物によるHIV感染を阻害する能力を、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製をモニタリングすることにより調べる。これらの方法のいくつかでは、HIV複製は、p24抗原ELISAアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによりモニタリングする。該方法のいくつかでは、初代培養マクロファージ細胞を使用する。
【０００８】
関連する局面では、本発明は、HIV感染を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。これらの方法は、(a)PAK3分子のキナーゼ活性または細胞内レベルを下方制御するPAK3調節化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングし、(b)同定したPAK3調節化合物を、HIV感染を阻害する能力に関して試験することを含む。好ましくは、該方法で使用するPAK3分子は、ほ乳類細胞由来である。ある方法では、ヒトPAK3分子を使用する。
【０００９】
これらの方法のいくつかでは、PAK3調節化合物によるHIV感染を阻害する能力を、HIV感染細胞でHIV LTRプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現をモニタリングすることにより調べる。該方法のいくつかでは、該方法で使用する細胞は、例えば、HeLa-CD4-Bgal細胞である。ある方法では、レポーター遺伝子は、ベータ-ガラクトシダーゼ遺伝子である。
【００１０】
ある他の方法では、PAK3調節化合物によるHIV感染を阻害する能力を、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製をモニタリングすることにより調べる。例えば、HIV複製は、p24抗原ELISAアッセイまたは逆転写酵素活性アッセイによりモニタリングできる。ある方法では、初代培養マクロファージ細胞をスクリーニングで使用する。
【００１１】
他の局面では、本発明は、対象のHIV感染を処置する方法を提供する。該方法は、PAK3調節化合物の有効量を含む医薬組成物を対象に投与することを伴う。PAK3調節化合物は、PAK3分子のキナーゼ活性または発現を下方制御できる。これらの方法のいくつかでは、PAK3調節化合物は、ヒトPAK3の活性を下方制御する。ある方法では、使用するPAK3調節化合物は、インビトロでPAK3発現細胞におけるHIV複製を阻害できる。該方法のいくつかでは、PAK3調節化合物を、既知の抗HIV薬と共に対象に投与する。
【００１２】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および請求項を参照することにより、実現し得る。
【００１３】
図の簡単な説明
図1は、PAK3がHIV感染において役割を果たすことを同定したsiRNAスクリーニングを、図式化して示す。
【００１４】
図2は、特定のsiRNAによるPAK3のノックダウンが、独立して、HeLa-T4-Bgal細胞株におけるHIVIIIb感染を阻害することを示す。
【００１５】
詳細な説明
I.概説
本発明は、p21-活性化キナーゼ3(PAK3)がHIV感染に関与しているという、本発明者らの発見に一部基礎を置く。本発明者らは、HeLaCD4Bgal細胞でHIV LTRプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子の発現をモニタリングすることにより、HIV感染に関与している宿主タンパク質に対する、サブゲノムsiRNAスクリーニングを行った。データは、PAK3発現の阻害が、HIV感染にマイナスの影響を与えることを示した。本発明者らは、有効なsiRNAを利用して、siRNAを用いたPAK3またはPAK1発現の阻害が、顕著にHIV感染を阻害し、一方で、PAK2欠損は効果を示さないことを観察した。これらの結果は、PAK1に加えてPAK3もまた、HIV感染を高めるのに重要な役割を果たしていることを示している。
【００１６】
これらの発見を踏まえて、本発明は、HIV感染を阻害する新規薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。試験化合物を、最初に、PAK3分子の生物学的活性、例えば、該発現または該キナーゼ活性を調節する能力に関してスクリーニングする。よって、同定した薬剤を、その後、典型的にはさらに、HIV感染またはHIV感染を示す活性を調節する能力に関して試験する。さまざまなPAK3分子を、スクリーニングアッセイで使用することができる。例えば、ヒト、ラットまたはマウスからのPAK3を、モジュレーターに関するスクリーニングのために使用できる。ある好ましい態様では、ヒトPAK3分子を使用する。
【００１７】
本発明の方法はまた、治療適用を発見している。PAK3の薬理学的阻害は、HIV感染に関連する病気を処置または予防するための新規方法を提供する。典型的には、該方法は、本発明に従って同定できるPAK3阻害剤を、対象に投与することを伴う。
【００１８】
下記のセクションでは、本発明の組成物の製造および使用、ならびに本発明の方法を実施するための手引きを提供する。
【００１９】
II.定義
別に定義がなければ、本明細書で使用するあらゆる技術的および科学的用語は、発明が関連する分野における当業者により、通常理解されているのと同じ意味を有する。下記の文献により、本発明で使用する多くの用語の一般的な定義を、当業者に提供する。Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (revised ed., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley ＆ Sons (3rd ed., 2002);およびA Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000)。さらに、下記の定義を、読者が本発明を実施するのを助けるために提供する。
【００２０】
“薬剤”または“試験剤”なる用語は、あらゆる物質、分子、要素、化合物、実体、またはその組合せを含む。それは、非限定的に、例えば、タンパク質、ポリペプチド、有機小分子、多糖、ポリヌクレオチドなどを含む。それは、天然産物、合成化合物、または化学化合物、もしくは、2個またはそれ以上の物質の組合せであり得る。別段、特記がなければ、“薬剤”、“物質”および“化合物”なる用語は、交換して使用可能である。
【００２１】
“アナログ”なる用語は、構造的に参照分子と似ているが、参照分子の特定の置換基を別の置換基で置き換えることにより、標的とし、かつ制御された方法で修飾した分子のことを言うために、本明細書で使用する。参照分子と比較してアナログは、同様の、類似の、または改良された有用性を示すことが、当業者により予期される。改良された特色(例えば、標的分子に対するより高い結合親和性)を有する既知化合物の変異型を同定するための、アナログの合成およびスクリーニングは、薬化学で既知の方法である。
【００２２】
HIVは、レトロウイルスのヒト免疫不全ウイルス(HIV)ファミリーのことを言う。これらのウイルスは、非限定的に、HIV-I、HIV-II、HIV-III(また、HTLV-II、LAV-1、LAV-2として知られている)などを含む。本明細書で使用するとき、HIVは、HIVファミリーのあらゆる系統、形態、サブタイプ、分岐群および変異体であり得る。
【００２３】
2個の核酸配列またはアミノ酸配列のコンテクストにおいて、“同一の”または“配列同一性”なる用語は、特定の比較ウインドウにわたって最大限の一致のために並べたとき、同じである2個の配列の残基のことを言う。本明細書で使用する“比較ウインドウ”は、2個の配列を最適に並べた後、同じ数の連続した位置の参照配列と比較し得る、少なくとも約20個、通常は、約50個から約200個、より通常は、約100個から約150個の連続した位置の部分のことを言う。比較のために配列を並べる方法は、当業者に既知である。比較のための最適な配列の整列は、Smith and Waterman(1981)の局所ホモロジーアルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2:482);Needleman and Wunsch(1970)のアラインメントアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443); Pearson and Lipman(1988)の類似性の探究法(Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 85:2444);これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施(非限定的に、IntelligenticsによるPC/GeneプログラムのCLUSTAL(Mountain View, CA);およびGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、またはWisconsin Genetics Software PackageのFASTA(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.)を含む)により行い得る。CLUSTALプログラムは、Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-165;およびPearson et al. (1994) Methods in Molecular Biology 24:307-331に十分記載されている。アラインメントはまた、しばしば、インスペクションおよびマニュアルアラインメントにより行われる。あるクラスの態様では、本明細書のポリペプチドは、既定値パラメーターを用いたBLASTP(またはCLUSTAL、もしくは、任意の他の利用できるアラインメントソフトウェア)により測定したとおり、少なくとも70%、一般には、少なくとも75%、所望により、少なくとも80%、85%、90%、95%または99%もしくはそれ以上同一である。同様に、核酸はまた出発核酸に準拠して記載することができ、例えば、それらは、デフォルトのパラメーターを用いたBLASTN(またはCLUSTAL、もしくは、任意の他の利用できるアラインメントソフトウェア)により測定して、参照核酸と50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上同一であり得る。
【００２４】
“実質的に同一な”核酸またはアミノ酸配列なる用語は、上記記載のプログラム(好ましくは、BLAST)で標準的なパラメーターを用いた参照配列との比較により、核酸またはアミノ酸配列が、少なくとも90%の配列同一性またはそれ以上、好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは、少なくとも98%、および最も好ましくは、99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、(ヌクレオチド配列のための)BLASTNプログラムは、既定値として、11の語長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、既定値として、3の語長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62採点マトリクス(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照のこと)を使用する。配列同一性の割合は、比較ウインドウにわたる、2個の所望による整列配列を比較することにより決定し、ここで、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、2個の配列の最適アラインメントに関して参照配列(付加または欠失を含まない)と比較したとき、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定し、マッチした位置の数を決め、マッチした位置の数を比較ウインドウの全位置の数で割り、そして、その結果に100を掛け、配列同一性の割合を算出することにより計算する。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約50残基である配列の領域、より好ましくは、少なくとも約100残基の領域、および最も好ましくは、配列は、実質的に、少なくとも約150残基にわたって同一である。最も好ましい態様では、配列は、実質的に、コード領域の全長にわたって同一である。
【００２５】
PAK3分子の生物学的活性に関して“調節する”なる用語は、細胞内レベル、細胞内局在またはPAK3の他の生物学的活性(例えば、そのキナーゼ活性)における変化のことを言う。PAK3活性の調節は、上方制御(すなわち、活性化または刺激)または下方制御(すなわち、阻害または抑制)であり得る。例えば、調節は、PAK3の細胞内レベルまたは酵素修飾(例えば、リン酸化)、結合特性(例えば、基質またはATPへの結合)、またはPAK3タンパク質の任意の他の生物学的、機能的、もしくは免疫学的特性の変化を生じ得る。活性変化は、例えば、PAK3コード遺伝子の発現の増加または減少、PAK3タンパク質をコードしているmRNAの安定性、翻訳効率、またはPAK3酵素の他の生物活性(例えば、そのキナーゼ活性)の変化から生じ得る。PAK3モジュレーターの作用様式は、直接、例えば、PAK3タンパク質またはPAK3タンパク質をコードしている遺伝子への結合を介したものであり得る。変化はまた、間接的、例えば、別のPAK3を調節する他の分子への結合および/または修飾(例えば、酵素的に)を介したものであり得る。
【００２６】
“対象”なる用語は、ほ乳類、特に、ヒトのことを言う。それは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルのような、他の非ヒト動物も包含する。
【００２７】
PAK3のような分子の“変異型”は、実質的に、構造および生物学的活性が、全体の分子またはその断片と類似している分子を言うことを意味する。よって、2個の分子が類似の活性を持っているならば、それらは、その組成、またはその分子の一方の二次構造、三次構造もしくは四次構造が、他方で見られるそれと同一ではないか、またはアミノ酸残基の配列が同一ではなかったとしてもその用語が本明細書で使用されるため、変異型であると考えられる。
【００２８】
III.スクリーニング計画
PAK3キナーゼは、活性を妨害するタンパク質の自己阻害ドメインを有しており、不活性な状態ではホモ二量体として存在する。インビトロでは、PAKは、Rhoファミリー、Cdc42およびRacの小分子GTP結合タンパク質に結合し、活性化される。これらのGTPaseは、PAKのN末端制御ドメイン領域(p21結合ドメインまたはCdc42およびRac相互作用結合モチーフ)に結合する。結合の結果として、PAKは、N末端阻害ドメインをリリースし、自己リン酸化が可能となり、その結果、十分なキナーゼ活性を生じる。少なくとも7個のp21-活性化タンパク質キナーゼが存在する。PAK3は、グループI PAKキナーゼのメンバーであり、それはまた、PAK1およびPAK2を含む。PAK1、PAK2およびPAK3は、また、それぞれ、p68PAK1/αPAK、p62PAK2/γPAKおよびp65PAK3/βPAKと呼ばれる。これらの3個のキナーゼは、キナーゼドメインで93%の相同性を有しており、主に、組織分布が異なる。PAK2が普遍的に発現している一方、PAK1はより制限され、PAK3は主に脳で見られる。キナーゼカスケードに加えて、グループI PAKは、細胞骨格構築、細胞形態および運動性、神経発生、癌転移、およびアポトーシスに関与していることが示された。
【００２９】
本発明に従って、HIV感染の新規阻害剤を、最初に、PAK3の生物学的活性を調節する(例えば、阻害する)能力に関して、試験化合物をスクリーニングすることによって同定した。スクリーニングアッセイでモニタリングするPAK3の生物学的活性は、キナーゼ活性であり得る。それはまた、該発現、該細胞内レベル、および試験化合物へのPAK3の特異的結合であり得る。ある方法では、試験化合物を、他のPAKキナーゼ(例えば、PAK3-7)の1個またはそれ以上に対して重要な活性を有しない、PAK3選択的モジュレーターを同定するためにスクリーニングする。PAK3の生物学的活性を調節する試験化合物を同定した後、それらを、典型的にはさらに、HIV感染またはHIV感染を示す活性を調節する能力に関して調べる。この段階は、PAK3の生物学的活性を調節することにより、最初の段階で同定した化合物が、確かに、HIV感染を制御できる(例えば、阻害する)ことを確認するのに有用である。これらの方法は、またさらに、PAK3を発現していない細胞でのHIV感染に関する化合物の効果を調べるための制御段階を含み得る。
【００３０】
当業者に既知のさまざまな生化学的および分子生物学的技術またはアッセイを、PAK3モジュレーターをスクリーニングするために使用できる。そのような技術は、例えば、Handbook of Drug Screening, Seethala et al. (eds.), Marcel Dekker (1st ed., 2001); High Throughput Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, 190), Janzen (ed.), Humana Press (1st ed., 2002); Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Ed.), John Wiley & Sons Inc (2002); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (3rd ed., 2001);およびBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)に記載されている。
【００３１】
さまざまな種からのPAK3を、本発明のPAK3モジュレーターをスクリーニングするのに使用できる。好ましくは、ほ乳類細胞由来PAK3分子を使用する。例は、受託番号NM_002578、AF068864およびAB102659(ヒト);AB102660およびAB102661(チンパンジーまたは類人猿);NM_008778、AJ496262およびAJ496263(マウス);およびNM_019210(ラット)のポリヌクレオチドによってコードされたPAK3分子を含む。好ましくは、ヒトPAK3分子を使用する。PAK3ポリペプチド配列の例は、受託番号NP_002569、Q75914、AAF67008、AAC36097、AAC52354、およびBAC81128(ヒトPAK3);受託番号BAC81129およびBAC81130(チンパンジーまたは類人猿);受託番号AAH53403、I49376、CAD42791、CAD42790およびQ61036(マウスPAK3);および受託番号Q62829(ラットPAK3)のアミノ酸配列を含む。これらの分子はすべて、当分野で生化学的に特徴づけられている。あらゆるこれらのPAK3配列またはその実質的に同一の配列を、本発明においてPAK3モジュレーターを同定するためのスクリーニングアッセイで使用できる。同様に、ヒトおよび他の種からの他のPAK酵素(PAK4-7)の配列もまた、当分野で既知である(例えば、受託番号NM_005884、NM_027470、AB040812、AJ277826、NM_020168、XM_111790、NM_020341、およびNM_172858)。
【００３２】
PAK3配列および他のPAK配列を単離する方法、および、これらの酵素を発現および精製する方法はまた、当分野で記載されている。例えば、McPhie et al., J Neurosci. 23(17):6914-27, 2003; Rousseau et al., J Biol Chem. 278(6):3912-20, 2003;およびHashimoto et al., J Biol Chem. 276(8):6037-45, 2001; Sells et al., Curr Biol. 7(3):202-10, 1997;およびGoeckeler et al., J Biol Chem. 275(24):18366-74, 2000; Cau et al., J. Cell Biol. 155:1029-1042, 2001; Pandey et al., Oncogene 21:3939-3948, 2002; Lu et al.,  J. Biol. Chem. 278:10374-10380, 2003;およびBarac et al., J. Biol. Chem. 279:6182-6189, 2004を参照のこと。
【００３３】
インタクトPAK3分子またはインタクトPAK3分子をコードしている核酸に加えて、PAK3断片(例えば、キナーゼドメイン)、アナログ、または機能的誘導体もまた、使用できる。これらのアッセイで使用できるPAK3断片は、通常、PAK3分子の1個またはそれ以上の生物学的活性(典型的には、そのキナーゼ活性)を保持する。上記したとおり、異種からのPAK3はすでに配列決定されており、よく特徴づけられている。したがって、それらの断片、アナログ、誘導体、または融合タンパク質を、当業者に既知の方法を用いて容易に取得できる。例えば、PAK3の機能的誘導体をタンパク質分解的切断、次いで、当業者に既知の慣用的な精製手順により、自然に生じるタンパク質または組み換えにより発現されたタンパク質から製造できる。あるいは、機能的な誘導体を、キナーゼ活性を保持するPAK3の断片のみを発現することによる、リコンビナントDNA技術により産生できる。
【００３４】
IV.試験化合物
本発明の方法を用いてスクリーニングできる試験剤は、ポリペプチド、ベータ-ターン模倣剤、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族性化合物、ヘテロ環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN置換グリシン、オリゴカルバメート、ポリペプチド、単糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造アナログまたはその組合せを含む。試験剤は、合成分子のものもあれば、天然分子のものもある。
【００３５】
試験剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、広くさまざまな起源から取得する。コンビナトリアルライブラリーは、ステップ-バイ-ステップ法で合成できる、多くの型の化合物について製造できる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、WO95/12608、WO93/06121、WO94/08051、WO95/35503およびWO95/30642に記載されたコード化された合成ライブラリー(encoded synthetic libraries)(ESL)法により構築できる。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法により作製できる(例えば、Devlin、WO91/18980を参照のこと)。細菌、微生物、植物および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーは、商業的な起源から取得するか、または野外で収集できる。既知の薬理学的薬剤は、構造アナログを産生するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような管理されたまたはランダムの化学修飾を受けることができる。
【００３６】
ペプチドまたは他の化合物のコンビナトリアルライブラリーは、任意の位置での配列優先性および不変性を有さず、完全に無作為である。あるいは、ライブラリーは、偏って、すなわち、その配列内のある位置は一定であるか、または、限られた数の可能性から選択されるものであり得る。例えば、ある場合には、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、限定された、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小さいか、または大きい)残基のクラス内で、架橋のためのシステインを作製するため、SH-3ドメインのためにプロリンで、リン酸化サイトのためにセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジン、または、プリンへランダムである。
【００３７】
試験剤は、自然に生じるタンパク質またはそれらの断片であり得る。そのような試験剤は、天然起源、例えば、細胞または組織ライセートから取得できる。ポリペプチド剤のライブラリーはまた、例えば、商業的に利用できるcDNAライブラリーから調製でき、または、日常的な方法で作製できる。試験剤はまた、ペプチド、例えば、約5から約30アミノ酸のペプチド、好ましくは、約5から約20アミノ酸のペプチド、特に好ましくは、約7から約15アミノ酸のペプチドであり得る。ペプチドは、自然に生じるタンパク質の消化物、ランダムペプチド、または“偏った”ランダムペプチドであり得る。ある方法では、試験剤は、ポリペプチドまたはタンパク質である。
【００３８】
試験剤はまた、核酸であり得る。核酸試験剤は、自然に発生する核酸、ランダムな核酸、または“偏った”ランダムな核酸であり得る。例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物も同様に、タンパク質について上記したとおり、使用できる。
【００３９】
ある好ましい方法では、試験剤は、小分子、例えば、最高で約500または約1000の分子量を有する分子である。好ましくは、ハイスループットアッセイを、そのような小分子のスクリーニングのために適用および使用する。ある方法では、上記したとおり、小分子試験剤のコンビナトリアルライブラリーを、PAK3の小分子モジュレーターをスクリーニングするために容易に使用できる。例えば、Schultz et al., Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414, 1998; Weller et al., Mol Divers. 3:61-70, 1997; Fernandes et al., Curr Opin Chem Biol 2:597-603, 1998;およびSittampalam et al., Curr Opin Chem Biol 1:384-91, 1997に記載したような多くのアッセイが、そのようなスクリーニングのために利用できる。
【００４０】
請求項に記載の方法でスクリーニングする試験剤のライブラリーは、また、PAK3ポリペプチド、それらの断片またはアナログの構造解析に基づいて作製できる。そのような構造解析により、よりPAK3に結合しやすい試験剤の同定が可能となる。PAK3ポリペプチドの3次元解析は、多くの方法、例えば、結晶構造および分子モデリングで研究できる。X腺結晶学を用いてタンパク質構造を研究する方法は、文献で公知である。Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221-239,およびPhysical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg & D. C. Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979)を参照のこと。PAK3ポリペプチド構造のコンピューターモデリングは、PAK3モジュレーターをスクリーニングするための試験剤を設計する他の手段を提供する。分子モデリングの方法は、文献、例えば、米国特許第5,612,894号(標題“System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor”)、および米国特許第5,583,973号(標題“Molecular modeling method and system”)に記載されている。さらに、タンパク質構造はまた、中性子回折および核磁気共鳴(NMR)により決定できる。例えば、Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J. (Prentice-Hall, New Jersey 1972)およびNMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interscience, New York 1986)を参照のこと。
【００４１】
本発明のモジュレーターはまた、PAK3ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。そのような抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、当業者に既知の方法を用いて作製できる。例えば、非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウスまたはラットのモノクローナル抗体の産生は、例えば、PAK3ポリペプチドまたはその断片を用いて動物を免疫することにより達成できる(Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988を参照のこと)。そのような免疫原は、自然起源、ペプチド合成または組み換え発現により取得できる。
【００４２】
マウス抗体のヒト化型は、組み換えDNA技術により、非ヒト抗体のCDR領域をヒト定常領域と結合することにより作製できる。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)およびWO 90/07861を参照のこと。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を用いて取得できる。例えば、Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047を参照のこと。これらの方法では、メンバーが、外面に異なった抗体を示すファージのライブラリーを産生する。抗体は、通常、FvまたはFab断片として示される。望む特異性を有する抗体を示すファージを、本発明のPAK3ポリペプチドに対する親和性富化により選択する。
【００４３】
PAK3ポリペプチドに対するヒト抗体は、また、少なくとも、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の切片および不活性な内在的免疫グロブリン遺伝子座をコードするトランスジーンを有する、非ヒトトランスジェニックほ乳類から産生できる。例えば、Lonberg et al., WO93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)を参照のこと。ヒト抗体は、特定のマウス抗体に対する同じエピトープ特異性を有することについての競合的結合実験、または別の方法により選択できる。そのような抗体は特に、マウス抗体の有用な機能的特性を共有する傾向がある。ヒトポリクローナル抗体は、また、免疫原を用いて免役したヒトから血清の形で提供できる。所望により、そのようなポリクローナル抗体は、PAK3ポリペプチドまたはその断片を用いた親和性精製により濃縮できる。
【００４４】
V.PAK3モジュレーターに関する試験化合物のスクリーニング
HIV感染を阻害する新規化合物を同定するために、試験化合物を、最初に、本明細書で記載したとおりPAK3の生物学的活性を調節する能力に関してスクリーニングする。ある好ましい態様では、試験化合物を、PAK3のキナーゼ活性を調節する(例えば、阻害する)能力に関して調べる。PAK3および他のPAK(PAK4-7)のキナーゼ活性に対する試験化合物の効果は、当業者に既知のキナーゼアッセイを用いてモニタリングできる。例えば、King et al., Nature 396:180-3, 1998; Joneson et al., J Biol Chem 273: 7743-7749, 1998; Chiloeches et al., Mol Cell Biol. 21(7):2423-34, 2001; Hashimoto et al., J Biol Chem. 276(8):6037-45, 2001; Rousseau et al., J Biol Chem. 278(6):3912-20, 2003; McPhie et al., J Neurosci. 23(17):6914-27, 2003; Rashid et al., J Biol Chem. 276(52):49043-52, 2001;およびGoeckeler et al., J Biol Chem. 275(24):18366-74, 2000を参照のこと。例えば、PAK分子(例えば、PAK3)のキナーゼ活性を、精製したPAKポリペプチドまたは細胞ライセート(例えば、神経細胞のライセート)から沈殿したPAKタンパク質の自己リン酸化を測定することにより、インビトロで調べることができる。あるいは、その自己リン酸化をモニタリングする他に、試験化合物をまた、PAKキナーゼによる他の基質のリン酸化を調節する能力に関してスクリーニングできる。PAK3基質の例は、当分野で記載したとおりの(例えば、Rousseau et al., J Biol Chem. 278:3912-20, 2003;およびKing et al., Nature 396:180-3, 1998)Raf-1、H2BまたはMBP(ミエリン塩基性タンパク質)を含む。
【００４５】
ある態様では、試験化合物を、最初に、PAK3分子に結合する能力に関してスクリーニングできる。このようにして同定した化合物をさらに、上記したとおりのPAK3キナーゼ活性を調節する(例えば、阻害する)能力に関してアッセイできる。PAK3ポリペプチドへの試験剤の結合は、例えば、標識インビトロタンパク質-タンパク質結合アッセイ、ゲルシフトアッセイ、タンパク質結合免疫アッセイ、機能的アッセイ(リン酸化アッセイなど)などを含む多くの方法によりアッセイできる。例えば、米国特許第4,366,241号;第4,376,110号;第4,517,288号;および第4,837,168号;ならびにまたは、Bevan et al., Trends in Biotechnology 13:115-122, 1995; Ecker et al., Bio/Technology 13:351-360, 1995; and Hodgson, Bio/Technology 10:973-980, 1992を参照のこと。試験剤は、PAK3ポリペプチドへの直接的な結合を検出する(例えば、PAK3ポリペプチドに対する抗体による、PAK3ポリペプチドの共沈)ことによって同定できる。試験剤はまた、薬剤がPAK3ポリペプチドに結合することを示すシグナル、例えば、蛍光クエンチング、蛍光偏光を検出することにより同定できる。
【００４６】
ある他の方法では、試験剤を、PAK3の発現または細胞内レベル、例えば、転写、翻訳、または翻訳後修飾を調節する能力に関してアッセイする。当業者に既知のさまざまな生化学的および分子生物学的技術を、本発明を実施するのに使用できる。そのような技術は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second (1989)およびThird (2000) Editions; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1999)に記載されている。ある態様では、内在性PAK3キナーゼのレベルは、通常のPAK3を発現している細胞で(例えば、神経細胞)、直接モニタリングできる。ある態様では、PAK3の発現または細胞内レベルを、クローン化したcDNAまたはPAK3をコードしているゲノム配列を用いた発現系で調べることができる。
【００４７】
あるいは、PAK3遺伝子の発現調節を、培養細胞株への発現ベクターの一過的または安定的なトランスフェクションによる細胞を基礎にした系で調べることができる。レポーター遺伝子と操作可能に結合させたPAK3遺伝子の転写制御配列(例えば、プロモーター)を有するアッセイベクターを、プロモーターアッセイのために、任意のほ乳類宿主細胞株にトランスフェクションすることができる。レポーター遺伝子と操作可能に結合させたPAK3遺伝子(または、PAK3遺伝子の転写制御エレメント)を含むコンストラクトを、日常実施される分子生物学の技術および方法のみを用いて調製できる(例えば、上記のSambrook et al.およびAusubel et al.を参照のこと)。細胞培養、トランスフェクション、およびレポーター遺伝子アッセイの一般的な方法は、例えば、上記のAusubel;およびTransfection Guide, Promega Corporation, Madison, WI (1998)に記載されている。任意の容易にトランスフェクション可能なほ乳類細胞株を、PAK3プロモーター機能をアッセイするためか、またはPAK3を発現するために使用し得、CHO、COS、HCT116、HEK 293、MCF-7およびHepG2はすべて、適当な細胞株である。
【００４８】
適当な宿主細胞に挿入するとき、発現ベクターの転写制御エレメントは、宿主RNAポリメラーゼによりレポーター遺伝子の転写を誘導する。レポーター遺伝子は、典型的には、容易にアッセイされる酵素活性を有するポリペプチドをコードしており、当然、宿主細胞には存在しないものである。真核生物プロモーターのための典型的なレポーターポリペプチドは、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ホタルまたはウミシイタケルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む。
【００４９】
これらのスクリーニング方法のいくつかは、1個またはそれ以上の他のPAKキナーゼ(例えば、PAK1、PAK2、およびPAK4-7)に対して、選択的にPAK3を調節する薬剤を同定するのに向けられる。例えば、ある方法では、試験化合物を、PAK4またはPAK7のキナーゼ活性には重要な影響を及ぼさない、PAK3モジュレーターに関してスクリーニングする。これらの方法では、PAK3調節化合物(例えば、PAK3キナーゼ活性を調節する化合物)を同定後、同定した化合物をさらにPAK4またはPAK7のキナーゼ活性に対する任意の影響に関して調べる。PAKキナーゼの発現またはキナーゼ活性を阻害する能力により測定すると、PAK3選択的化合物は、典型的には、ある種(例えば、ヒト、マウスまたはラット)由来のPAK3分子について、同種由来のPAK4のIC50(最大阻害の50%をもたらす有効濃度)および/またはPAK7のIC50よりも、少なくとも、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍または1000倍低いIC50を有する。選択性をPAK酵素への結合により測定すると、PAK3選択的化合物は、通常、PAK4またはPAK7の結合親和性よりも、少なくとも、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍または100倍高い結合特異性を有する。
【００５０】
VI.HIV阻害化合物に関するスクリーニング
HIV感染の新規阻害剤を同定するために、上記したPAK3モジュレーターを、典型的にはさらに、HIV感染を阻害する能力を確認するために試験する。多くのアッセイおよび方法を、PAK3調節化合物のHIV阻害活性を調べるために利用できる。これは、通常、インビトロでのHIVウイルス複製またはHIV感染を示す生化学的活性を阻害する能力に関して、化合物を試験することを含む。例えば、HIV感染に対するPAK3調節化合物の効果は、インビトロでPAK3発現細胞を用いてモニタリングできる。典型的には、細胞、例えば、下記の実施例で例示したとおりのHeLa-CD4-Bgal細胞が、内在的にPAK3を発現している。
【００５１】
ある方法では、HIV感染に対するPAK3調節化合物の潜在的な阻害活性を、インビトロで培養細胞株のHIV感染に対する効果を調べることにより試験する。例えば、Seddiki et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 15:381-90, 1999に記載したとおり、初代培養マクロファージ細胞のHIV感染に対して試験できる。それらはまた、Fujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004が報告したとおり、T細胞および単球細胞株のHIV感染に対して調べることができる。HIV感染をモニタリングするための、さらなるインビトロ系は、当分野で記載されている。例えば、Li et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003; Steinberg et al., Virol. 193:524-7, 1993; Hansen et al., Antiviral Res. 16:233-42, 1991;およびPiedimonte et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 6:251-60, 1990を参照のこと。
【００５２】
これらのアッセイでは、細胞のHIV感染を、例えば、微視的(microscopic)細胞変性効果アッセイ(例えば、Fujii et al., J Vet Med Sci. 66:115-21, 2004を参照のこと)により、形態学的にモニタリングできる。それはまた、例えば、細胞培養上清中のHIV逆転写酵素(RT)活性をアッセイすることにより、酵素学的に評価できる。そのようなアッセイは、当分野で、例えば、Reynolds et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100:1615-20, 2003;およびLi et al., Pediatr Res. 54:282-8, 2003に記載している。他のアッセイは、ウイルス核酸またはウイルス抗原の蓄積を定量することにより、HIV感染をモニタリングする。例えば、Winters et al. (PCR Methods Appl. 1:257-62, 1992) は、HIV感染細胞培養からのHIV gag RNAおよびDNAをアッセイする方法を記載した。Vanitharani et al.は、ウイルスp24抗原の産生を測定するHIV感染アッセイを記載した(Virology 289:334-42, 2001)。ウイルス複製はまた、例えば、Chargelegue et al., J Virol Methods. 38(3):323-32, 1992;およびKlein et al., J Virol Methods. 107(2):169-75, 2003に記載したとおり、p24抗原ELISAアッセイによりインビトロでモニタリングできる。これらのすべてのアッセイを、本発明のPAK3調節化合物の抗HIV活性を評価するために、使用および改変できる。
【００５３】
ある他の態様では、HIV感染を、HIV感染細胞でHIV-LTRの制御下にあるレポーター遺伝子の発現を調べることによってモニタリングする。下記の実施例で例示したとおり、レポータータンパク質(例えば、ベータガラクトシダーゼ)の発現を測定することにより、そのようなアッセイは、HIV感染に対する何らかの調節活性をモニタリングできる。類似のアッセイは、当分野で記載している。例えば、Gervaix et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 94:4653-8, 1997) は、HIV-I LTRプロモーターの制御下にヒト化緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードしたプラスミドを発現する、安定的T細胞株を開発した。HIV-Iを用いた感染で、感染細胞は非感染細胞と比較して、100倍から1000倍の蛍光の増加が観察できる。これらのインビトロ系により、HIV感染に対するPAK3調節化合物の効果を、リアルタイムでモニタリングすること、および感染細胞の定量が可能となり、そしてまた、化合物に対する感受性の容易かつ正確な決定を可能にする。
【００５４】
VII.治療適用
HIV感染を阻害することにより、上記に記載したPAK3調節化合物は、本発明の有用な治療適用を提供する。それらは、さまざまな対象でHIV感染およびHIV感染に関連した疾患または状態(例えば、AIDS)を、予防または処置するために、容易に使用できる。本発明のPAK3調節化合物を用いた処置に適したHIV感染は、レトロウイルスHIVファミリーのいずれか(例えば、HIV-I、HIV-II、またはHIV-III)による、対象、特にヒト対象の感染を包含する。PAK3調節化合物は、レトロウイルスHIVファミリーのメンバーのいずれかのキャリアである対象を治療するのに有用である。それらは、活動性のAIDSの診断を受けた対象を処置するのに使用できる。その化合物はまた、そのような対象でAIDS関連状態の処置または予防に有用である。HIV感染を有していると診断されていないが、HIVによる感染の危険があると考えられている対象は、また、本発明のPAK3調節化合物を用いた処置に適している。
【００５５】
AIDS関連状態のいずれかに罹患している対象は、PAK3調節化合物を用いた処置に適している。そのような状態は、AIDS関連複合体(ARC)、進行性全身性リンパ節症(progressive generalized lymphadenopathy)(PGL)、抗HIV抗体陽性状態、AIDS関連神経学的状態(例えば、認知症または局所(tropical)麻痺)、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病(thrombocytopenia purpurea)、および関連した日和見感染、例えば、ニューモシスティス・カリニ肺炎、マイコバクテリア結核、食道カンジダ症、脳のトキソプラズマ症、CMV網膜炎、HIV関連脳障害、HIV関連衰弱症候群などを含む。
【００５６】
インビボでのHIV感染およびAIDSの進行を測定するための標準的な方法を、対象が本発明のPAK3調節化合物を用いた処置に対して正の応答を示すか否かを決定するのに使用できる。例えば、本発明のPAK3調節化合物を用いた処置の後、対象のCD4＋ T細胞数をモニタリングできる。CD4＋ T細胞の上昇は、対象が、抗ウイルス治療の投与により利益を享受していることを示す。この方法および当業者に既知の他の方法は、本発明の化合物が対象でのHIV感染およびAIDSを処置するのに効果的である範囲を決定するために使用し得る。
【００５７】
本発明のPAK3調節モジュレーターは、処置すべき対象に、直接、滅菌条件下で投与できる。モジュレーターは、単独でまたは医薬組成物の有効成分として投与できる。本発明の治療組成物は、他の治療剤と混合して、またはそれらと共に使用できる。ある適用では、1個のPAK3モジュレーターを個々に使用するときには達成できない程の大きな程度までHIV感染を阻害するために、第1のPAK3モジュレーターを第2のPAK3モジュレーターと組み合わせて使用する。ある他の適用では、本発明のPAK3調節化合物を、AZTのような既知の抗HIV薬物と併用して使用し得る。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、典型的には、少なくとも1個の有効成分を、1個またはそれ以上の許容される担体と共に含み得る。薬学的に許容される担体は、組成物を強化するか、または安定化し、もしくは、組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物(例えば、核酸、タンパク質または調節化合物)および組成物を投与するために使用する特定の方法により、部分的に決定される。それらはまた、他の成分と適合し、そして対象に対して有害ではないという意味で、薬学的にも生理学的にも許容されるべきである。この担体は、投与のために望む調製形態(例えば、経口、舌下、直腸、経鼻、静脈、または非経腸)に依存して、広くさまざまな形態をとり得る。例えば、PAK3調節化合物は、安定性または薬理学的特性を高めるために、投与前に、担体タンパク質、例えば、オボアルブミンまたは血清アルブミンとの複合体の形態をとり得る。
【００５９】
医薬組成物をさまざまな形態、例えば、顆粒、錠剤、丸薬、座薬、カプセルなどで調製できる。製剤中の治療上活性な化合物の濃度は、約0.1重量%から100重量%まで変わり得る。治療製剤は、薬学の当業者に既知の任意の方法で調製される。治療製剤は、処置のために必要とされる任意の効果的な手段により送達され得る。例えば、Goodman & Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics, Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional (10th ed., 2001); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Lippincott Williams & Wilkins (20th ed., 2003);およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ansel et al. (eds.), Lippincott Williams & Wilkins (7th ed., 1999)を参照のこと。
【００６０】
治療製剤は、便利には、単位用量型で提供でき、適当な治療用量で投与され得る。適当な治療用量は、任意の既知の方法、例えば、最大耐性用量を決定するためのほ乳類種での臨床試験、および安全な用量を決定するための標準的なヒト対象での臨床試験により決定できる。より高い用量が必要とされ得るある状況下を除いて、通常、PAK3モジュレーターの好ましい用量は、1日につき約0.001から約1000mg、より通常は、約0.01から約500mgの範囲内にある。
【００６１】
PAK3モジュレーターの好ましい投与量および投与形態は、処置する医師により個々に検討され得る因子、例えば、処置される1個の状態または複数の状態、特定のPAK3モジュレーターを含む投与する組成物の選択、個々の対象の年齢、体重、および応答、対象の症状の重篤度、ならびに選択する投与経路に依存して、対象毎に変わり得る。一般原則として、投与するPAK3モジュレーターの量は、効果的にそして確実に、対象の状態を予防または最小化する最低用量である。したがって、上記用量範囲は、一般的的手引きおよび本明細書に記載の教示の支持を提供することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６２】
下記の実施例は、例示を提供するものであって、本発明を限定するものではない。
【００６３】
実施例1  PAK3はHIV感染に関与している
HIV感染に関与する新規宿主因子を発見するために、我々は、HeLa-CD4-Bgal細胞(Kimpton et al., J Virol 66:2232-2239, 1992)を用いて、focused siRNA library(Qiagen)のスクリーニングを行った。HeLa-CD4-Bgal細胞は、the AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIHを介して、Dr. Michael Emermanから取得した。siRNAライブラリーは、薬剤標的である可能性が最も高い5000個の異なる遺伝子に対して向けられた(それぞれの遺伝子は、2個の異なるsiRNAにより示される)。図1で例示したとおり、細胞を逆トランスフェクションプロトコールを用いて、ポジティブコントロールとして使用するTatに対するsiRNAでトランスフェクションし、トランスフェクションの24時間後、HIV-IIIbを用いて調べた(Huang et al., Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101:3456-61, 2004)。感染は、侵入から放出までの感染のすべての段階、および観察される培養を通した広がりにおける効果を見るために、3日間続行した。HeLa-CD4-Bgal細胞でのレポーター遺伝子発現をモニタリングすることにより、この系は、HIV感染に対するsiRNAの任意の調節効果を検出できるようになる。
【００６４】
表1:siRNAスクリーニング結果
【表１】
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【００６５】
感染は、化学発光物質を用いて、ウイルスLTRプロモーターから産生されるベータ-ガラクトシダーゼの量を測定することにより評価した。全体のスクリーニングは、2回行い、データは、調節した活性倍率(mfa)の標準偏差に対する平均活性倍率(afa)の割合として表現した(値は、それぞれのsiRNAの効果および複製間の偏差の両方を考慮に入れている)。afaが1未満である遺伝子(感染の阻害剤)に関しては、値を負の活性倍率に変換した。
【００６６】
表1に示したとおり、HIV感染に関与することが既知である遺伝子、例えば、CXCR4、TSG101およびfurinに対する多くのsiRNAは、スクリーニングにより阻害剤として同定され、それ故、内部コントロールとして使用した。TSG101およびfurinに関しては、該タンパク質を標的として設計した両方のsiRNAが効果的であった。さらに、2個のPAKキナーゼ、すなわちPAK3およびPAK5(または、PAK7として知られる)が、この系でHIV感染に関与しているものとして同定された。PAK5に関しては、ほとんど知られていないが、PAk3は、またPAK1およびPAK2を含むGroup I PAKキナーゼのメンバーである。PAK1およびPAK2の両方は、Nefと結合し、その結果、ウイルス産生を高めることができることが示されている(Fackler, et al., Mol. Cell. Biol.  20:2619-27, 2000;およびRenkema et al., Curr. Biol. 9:1407-10, 1999)。最も強い証拠は、PAK2が感染の増強に関与する優勢なPAKであることを示しているが、以前の研究は、生理的なHIV感染に、特に関与しているPAKキナーゼを決定するために、siRNAを使用していない。
【００６７】
このsiRNAスクリーニングでのPAK3の同定は、PAK3がHIV感染において重要な役割を果たすことを示している。HIV感染HeLa-CD4-Bgal細胞での減少したベータ-ガラクトシダーゼ活性は、HIV感染サイクルの何らかのステージ、例えば、ウイルス遺伝子発現、ウイルス侵入、逆転写、および統合のような上流での事象、またはウイルスRNAエクスポート、粒子形成、および粒子放出のような下流での事象の欠損によるものであろう。よって、いかにしてPAK3下方制御がHIV感染を負に制御するのかは、この系からは明らかでない。
【００６８】
実施例2  内在性PAK3のノックダウンは、HIV感染を阻害する
我々は、PAK1(PAK1-0およびPAK1-3)、PAK2(DharmaconからのsiGenomeプール)およびPAK3(PAK3-2およびPAK3-3)に対するsiRNAを取得した。それぞれのsiRNAの効果をウエスタンブロットによりHeLa-CD4-Bgal細胞で確認した。PAK1に対する両方のsiRNAが、効果的にそのタンパク質をノックダウンした(PAK1-0の方がPAK1-3よりもより効果的である)。PAK2に対する確認されたDharmaconプールsiRNAもまた、非常に効果的であった(ほとんど全タンパク質が、トランスフェクション後、72時間までにノックダウンされた)。PAK1 siRNAと同様に、両方のPAK3 siRNAが効果的であった(PAK3-2の方がPAK3-3よりも効果的である)。PAKアイソフォームsiRNA間で、交差反応はなかった。
【００６９】
HeLa-CD4-Bgal細胞でHIV感染に対するsiRNAの活性を、実施例1で記載したとおり調べた。図2に示すとおり、タンパク質ノックダウンでのPAK1およびPAK3 siRNAの相対的な効果は、HeLa-CD4-Bgal細胞でHIV感染を阻害する能力を反映していた。PAK1-0は、Tat siRNAコントロールとほとんど同じくらいHIVを妨害するのに効果的で70%まで阻害したのに対し、PAK1-3は、あまり効果的ではなく38%までしか妨害しなかった。スクリーニングで同定されたsiRNAであるPAK3-2は、50%まで感染を妨害し続け、PAK3-3が最少の阻害(〜38%)を示し、最も有効でなかった。最新の文献で示されたものとは対照的に、PAK2に対するsiRNAは、効果的にタンパク質レベルでノックダウンできるにもかかわらず、HIV感染に対してわずかしか効果を示さないか、全く示さなかった。試験したsiRNAのいずれも、HeLa細胞で重大な細胞毒性を示さず(図2)、感染阻害のメカニズムとして全体的な細胞毒性除外される。一緒にして、これらの結果は、HeLa-CD4-Bgal細胞のHIV感染におけるPAK1およびPAK3の重要な役割を示しており、PAK2の主要な役割とは反対である。
【００７０】
より生理学的な細胞株標的でGroup I PAK siRNAの効果を調べるために、それらをJurkat細胞で試験した。Jurkat細胞を、PAK1およびPAK3に対する最も効果的なsiRNAで、またはPAK2プールでエレクトロポレーションした。HeLa-CD4-Bgal細胞で見られたとおり、PAK1ノックダウンの結果、HIV感染を阻害し、一方で、PAK2ノックダウンは、タンパク質レベルの特異的ノックダウンにもかかわらず、わずかしか効果を示さないか、または全く示さなかった。HeLa-CD4-Bgal細胞と比較して、PAK1 siRNAを用いたJurkatでの低いレベルの阻害は、観察される低いレベルのタンパク質ノックダウンを反映している。siRNAのいずれも、Cell Titer Gloで示されたとおり、あらゆる細胞毒性を有さず、再び、阻害の理由として細胞毒性を除外できる。PAK3ノックダウンは感染に効果を示さず、この結果は、この細胞株でのPAK3の発現の欠如と一致している。これは、感染した組織型に依存したHIV感染における異なるPAKキナーゼの関与を明らかにし得る。PAK3発現の主要な部位は脳であり、ここでHIVは、血清変換後すぐに、活発に複製する(Bissel et al., Brain Pathol. 14:97-108, 2004;およびPomerantz et al., DNA Cell Biol. 23:227-38, 2004.)。これらの結果は、PAK1がT細胞感染に関与している優勢なPAKであり得るが、脳での感染はまた、PAK3も関与していることを示している。
【００７１】
本明細書に記載した実施例および態様は、単なる例示の目的であり、そのことを踏まえたさまざまな修飾または変化は、当業者に示されており、本出願の思想および視野ならびに添付した特許請求の範囲内に含まれるものと理解すべきである。本明細書に記載した類似または同等の任意の方法および材料は、本発明を実施または試験するのに使用できるが、好ましい方法および材料を記載している。
【００７２】
本明細書で引用したあらゆる出版物、GenBank配列、特許および特許出願は、まるで、それぞれが個々にそれを示しているかのように、それらの全体をあらゆる目的のために、引用により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図1は、PAK3がHIV感染において役割を果たすことを同定したsiRNAスクリーニングを、図式化して示す。
【００７４】
【図２】図2は、特定のsiRNAによるPAK3のノックダウンが、独立して、HeLa-T4-Bgal細胞株におけるHIVIIIb感染を阻害することを示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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