(57)【要約】【課題】過分極１３Ｃ−ピルビン酸を造影剤として用いて腫瘍組織と健常組織とを識別できるＭＲ腫瘍イメージングの方法の提供。【解決手段】健常組織と腫瘍組織とを識別する方法であって、方法は、  （ａ）過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物が予め投与された被験者から、１３Ｃ−ピルビン酸塩と、その１３Ｃ−含有代謝物質であるアラニン、乳酸塩及び任意の炭酸水素塩との１３Ｃ−ＭＲ直接画像を得ることと、  （ｂ）ピルビン酸塩及び／又はアラニンの量に関する乳酸塩の信号を任意に補正して、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の画像を得ることと、を含み、 １３Ｃ−ＭＲ直接画像の腫瘍組織が、最も高い強度の乳酸塩の信号及び／又は、工程（ｂ）で補正が行なわれる場合には、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の信号によって示される方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常組織と腫瘍組織とを識別する方法であって、当該方法が、
（ａ）過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物が予め投与された被験者から、１３Ｃ−ピルビン酸塩と、その１３Ｃ−含有代謝物質であるアラニン、乳酸塩及び任意の炭酸水素塩との１３Ｃ−ＭＲ直接画像を得ることと、
（ｂ）ピルビン酸塩及び／又はアラニンの量に関する乳酸塩の信号を任意に補正して、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の画像を得ることと、を含み、
１３Ｃ−ＭＲ直接画像の腫瘍組織が、最も高い強度の乳酸塩の信号及び／又は、工程（ｂ）で補正が行なわれる場合には、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の信号によって示される方法。
【請求項２】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩が、ＤＮＰの方法によって１３Ｃ−ピルビン酸及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸塩を過分極することによって得られる請求項１記載の方法。
【請求項３】
１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物が、リン酸塩緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４）、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール／ＨＣｌ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＰＳ及びＴＲＩＣＩＮからなる群から選択される１種以上の緩衝液をさらに含む請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）における１３Ｃ−ＭＲ直接画像を得るために、多重エコーを用いて周波数情報を符号化するイメージングシークエンスを使用する請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）における１３Ｃ−ＭＲ直接画像が、１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物の投与後４００秒以内で得られる請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
プロトン画像が、プロトンＭＲＩ造影剤を用いて又は、用いずに取り込まれる請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）が、炭酸水素塩の量に関する乳酸塩の信号を補正して、炭酸水素塩に対して存在比率が高い乳酸塩の画像を得ることをさらに含み、工程（ｂ）で補正が行なわれる場合、１３Ｃ−画像の腫瘍組織が、最も高い強度の乳酸塩の信号によって、ピルビン酸塩及び／又はアラニン及び／又は炭酸水素塩に対して存在比率が高い乳酸塩の信号によって示される請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）が必須である請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
補正が、
（ｉ）乳酸塩の画像と、ピルビン酸及び／又はアラニン及び／又は炭酸水素の画像とを、個々の画像における最大値へと正規化することと、
（ｉｉ）正規化した乳酸塩の画像を、反転したピルビン酸塩及び／又はアラニン及び／又は炭酸水素塩の画像で掛け合わせることと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の結果を最初の乳酸塩の画像で掛け合わせることと、を含む請求項８記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍が、脳腫瘍、乳ガン、大腸／結腸直腸ガン、肺ガン、腎ガン、頭部及び頚部腫瘍、筋腫、胃ガン、食道ガン、卵巣腫瘍、膵臓ガン又は前立腺ガンである請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
生体内でのＭＲ腫瘍治療のモニタリング及び／又は腫瘍のステージの判定するための請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＲ造影剤として１３Ｃ−ピルビン酸塩を使用する腫瘍イメージングの方法であって、腫瘍組織と健常組織とを識別できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴（ＭＲ）イメージング（ＭＲＩ）は、非侵襲的に、かつ患者及び医療従事者をＸ線等の有害なおそれのある放射線に暴露することなく患者の身体又はその一部の画像を得ることができるため、医師にとって特に魅力的なイメージング技法である。高画質の画像が得られるため、ＭＲＩは、軟組織及び器官に対して好適なイメージング技法であり、正常組織と、腫瘍や病巣等の病的組織との識別が可能になる。
【０００３】
ＭＲ腫瘍イメージングは、ＭＲ造影剤の使用の有無を問わず行うことができる。ＭＲ造影剤を用いずに撮像したＭＲ画像で、大きさが約１〜２ｃｍ以上の腫瘍は、かなり明瞭に現れる。しかし、コントラストが強調されるＭＲＩでは、はるかに微小な組織病変、例えば、はるかに小さな腫瘍等の発見が可能であり、そのためコントラスト強調ＭＲイメージングは、初期の腫瘍の発見や転移の発見のための強力なツールである。
【０００４】
数種類の造影剤がＭＲ腫瘍イメージングに用いられている。水溶性の常磁性金属キレート剤、例えば、Ｏｍｎｉｓｃａｎ（商品名）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｅａｌｔｈ社）等のガドリニウムキレート剤は、広く用いられているＭＲ造影剤である。低分子量であるため、それらの常磁性金属キレート剤は、血管内に投与されると速やかに細胞外空間（血液及び間質）に到達し、さらに、比較的速やかに体外に排出される。ガドリニウムキレート剤は、転移及び微小な腫瘍の発見率を増大させ、生きた腫瘍組織（血流が十分に潅流され、かつ／又は、脳血液関門が障害を受けている）と、中心壊死及び周辺浮腫又は巨視的に浸潤のない組織（例えば、Ｃ．Ｃｌａｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ１９８５；２７：１６４−１７１を参照）との識別を可能にすることにより腫瘍の分類を改善する点で、特に有用であることが見出されている。
【０００５】
一方、血液プールＭＲ造影剤、例えば、超常磁性酸化鉄粒子は、血管系の内部に長時間残留する。肝臓内でのコントラストの強調、さらには、腫瘍内の脈管形成等に起因する「漏出性の」毛細血管壁等といった毛細血管の透過性異常の発見が非常に有用であることが実証されている。
【０００６】
上述の造影剤が優れた性質を有することは明白であるが、使用時に全く危険を伴わないわけではない。常磁性金属のキレート錯体は通常高い安定度定数を有するが、投与後に体内で有害な金属イオンが放出されるおそれがある。さらに、これらの造影剤は特異性が低い。
【０００７】
国際公開第９９／３５５０８号には、過分極した高濃度のＴ１造影剤の溶液をＭＲ造影剤として用いる、患者のＭＲ検査法が開示されている。「過分極」という用語は、高濃度のＴ１造影剤中のＮＭＲ活性核種、すなわちスピンがゼロでない核種、好ましくは１３Ｃ−又は１５Ｎ−核種の核分極を増大させることを意味する。ＮＭＲ活性核種の核分極を増大させると、核スピンが励起状態にある核種と基底状態にある核種の分布差が顕著に増大し、ＭＲ信号の強度が１００倍以上に増強される。１３Ｃ−及び／又は１５Ｎ−が濃縮された高濃度のＴ１造影剤を用いると、１３Ｃ及び／又は１５Ｎの天然存在比は無視できるほど低いのでバックグラウンド信号の影響がほぼなくなり、画像のコントラストが好都合に高くなる。過分極させる多くの高濃度のＴ１造影剤及びそのＭＲ造影剤としての使用について開示されており、それらの例としては、非内在性化合物及び内在性化合物に限定されず及び酢酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩又はグルコン酸塩、グルコース又はフルクトース等の糖、尿素、アミド、グルタミン酸塩、グリシン、システイン又はアルパラギン酸塩等のアミノ酸、ヌクレオチド、アスコルビン酸等のビタミン、ペニシリン誘導体及びスルホンアミド等が挙げられる。
【０００８】
さらに、クエン酸回路のような通常の代謝サイクルの中間体であるフマル酸やピルビン酸等は、代謝活性のイメージングにおける好ましい造影剤であることが示されている。過分極造影剤の信号は、緩和によって、さらに患者の身体への投与後の希釈によっても減衰することが強調されるべきである。従って、体液（血液等）中での造影剤のＴ１値が十分に高く、薬剤が、患者の体内で高度に過分極した状態で標的部位に到達できるものでなければならない。
【特許文献１】国際公開第９９／３５５０８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９８／５８２７２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／９６８９５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第８８／１０４１９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９０／００９０４号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９１／１２０２４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第９３／０２７１１号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９６／３９３６７号パンフレット
【非特許文献１】Ｃ．Ｃｌａｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ１９８５；２７：１６４−１７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明者らは、過分極１３Ｃ−ピルビン酸を造影剤として用いて腫瘍組織と健常組織とを識別できるＭＲ腫瘍イメージングの方法を見い出した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は、健常組織と腫瘍組織とを識別する方法であって、当該方法が、
（ａ）過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物が予め投与された被験者から、１３Ｃ−ピルビン酸塩と、その１３Ｃ−含有代謝物質であるアラニン、乳酸塩及び任意の炭酸水素塩との１３Ｃ−ＭＲ直接画像を得ることと、
（ｂ）ピルビン酸塩及び／又はアラニンの量に関する乳酸塩の信号を任意に補正して、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の画像を得ることと、を含み、
１３Ｃ−ＭＲ直接画像の腫瘍組織が、最も高い強度の乳酸塩の信号及び／又は、工程（ｂ）で補正が行なわれる場合には、ピルビン酸塩及び／又はアラニンに対して存在比率が高い乳酸塩の信号によって示される方法が提供される。
【００１１】
ＮＭＲ活性化された１３Ｃ−核種の過分極は、様々な方法（例えば、国際公開第９９／３５５０８号）によって行なわれてもよく、好ましい方法は、希ガス「強力」スピン冷凍及びＤＮＰからの分極の移動である。過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るため、１３Ｃ−ピルビン酸塩に直接分極を与えるか又は、１３Ｃ−ピルビン酸に分極を与えて、分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を分極１３Ｃ−ピルビン酸塩に変換するかのいずれかが好ましい。
【００１２】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得る好ましい方法は、過分極希ガスからの分極の移動である。核スピンがゼロでない希ガスは、過分極される。つまり、平衡状態の分極で、例えば、円偏波光を使用して分極化を促進させることができる。過分極希ガス、好ましくはＨｅ又はＸｅ又はこのようなガスの混合物を用いて、１３Ｃ−核種を過分極させてもよい。また、過分極は、同位濃縮され、過分極した希ガス、好ましくは３Ｈｅ又は１２９Ｘｅを用いて行なってもよい。過分極ガスは、気相に存在していてもよく、液体／溶媒で溶解されていてもよく又は、分極ガス自体を溶媒として使用してもよい。或いは、ガスは、冷却した固体面上へ凝結され、この形態で用いられてもよく又は、昇華させることもできる。過分極ガスと分極される化合物との均質混合が好ましい。従って、１３Ｃ−ピルビン酸が分極され、室温で液体である場合、過分極ガスは、液体／溶媒に溶解又は、溶媒として用いられるのが好ましい。１３Ｃピルビン酸塩が分極される場合、過分極ガスは、ピルビン酸塩もまた溶解する液体／溶媒で溶解されるのが好ましい。
【００１３】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得る別の好ましい方法は、超低温及び超高磁場における熱力学平衡によってＮＭＲ活性核種に分極を与えることである。ＮＭＲ分光計の動作磁場及び動作温度と比較して、過分極は、超高磁場及び超低温（強力）によってもたらされる。使用される磁場強度は、できるだけ高い強度が好ましく、１Ｔを超える強度が適しており、５Ｔを超える強度が好ましく、１５Ｔ以上の強度がさらに好ましく及び、２０Ｔ以上の強度が特に好ましい。温度は、超低温である必要があり、例えば、４．２Ｋ以下、好ましくは１．５Ｋ以下、さらに好ましくは１．０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下である。
【００１４】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得る別の好ましい方法は、スピン冷凍方法である。この方法には、スピン冷凍における分極による固体の化合物又は固体系のスピン分極が含まれる。その系は、例えば３回以上の回転軸を有する結晶形における、Ｎｉ２＋、ランタニド又はアクチニドイオン等の適切な常磁性体に添加されるか又は、緊密に混合される。共振励磁場が印加されないため、計測は、均質な磁場の必要としないＤＮＰに対する要件より単純なものである。処理は、磁場の方向に対して垂直な軸の周囲で試料を物理的に回転させて行なわれる。この方法の必要条件は、常磁性種が非常に異方性のｇ因子を有するということである。試料回転の結果、電子常磁性共鳴は核スピンと接触してもたらされ、核スピン温度の低下を導く。核スピン分極が新たな平衡に達するまで、試料回転は行われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
さらに好ましい実施形態では、ＤＮＰ（動的核分極）の方法は、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るために使用される。分極は、常磁性化合物、いわゆる常磁性試薬又はＤＮＰ試薬によってもたらされる。ＤＮＰ処理で、エネルギーは通常マイクロ波として供給され、まず常磁性試薬を励起する。基底状態に緩和する際に、常磁性試薬の不対電子から試料のＮＭＲ活性核種への分極の移動が起こる。通常、ＤＮＰ処理では、中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が用いられており、例えば、液体ヘリウム及び約１Ｔ又はそれ以上の磁場中でＤＮＰ処理を実行する。或いは、中程度の磁場及び十分な分極の増大が達成できる任意の温度の下で実行してもよい。ＤＮＰ技法については、例えば国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に記載されており、これらは共に参照として本願明細書に組み込まれる。ＤＮＰの方法によって過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るために、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸が分極される化合物として使用される。
【００１６】
１３Ｃピルビン酸及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸塩の使用は、主に、ＤＮＰ処理で使用される常磁性試薬に依存する。常磁性試薬が１３Ｃ−ピルビン酸に対して可溶性である場合、１３Ｃ−ピルビン酸が好ましく使用され、液体混合物、好ましくは液体溶液が、常磁性試薬及び１３Ｃ−ピルビン酸によって形成される。常磁性試薬が１３Ｃ−ピルビン酸対して可溶性でない場合、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸と、少なくとも１つの共溶媒とを使用して液体混合物、好ましくは液体溶液を形成する。ＤＮＰがうまくいくか及びその場合における分極のレベルは、分極される化合物と常磁性化合物が互いに緊密に接触できるかに依存することが明らかである。従って、共溶媒は、好ましくは、常磁性試薬と１３Ｃ−ピルビン酸及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸塩とを溶解するの又は共溶媒の混合物である。１３Ｃ−ピルビン酸塩に対しては、水が共溶媒として好ましく用いられる。
【００１７】
さらに、より高い分極レベルは、冷却／冷凍時のサンプル混合物が、結晶化した試料よりもむしろガラスを形成する場合、ＤＮＰの方法によって達成されることが見出されている。また、ガラスの形成によって、常磁性試薬と分極される化合物とをより緊密に接触させることができる。常磁性試薬が１３Ｃ−ピルビン酸に対して可溶性である以上、１３Ｃ−ピルビン酸は、好適なガラス形成剤あるため、ＤＮＰ処理で好ましくは使用される。１３Ｃ−ピルビン酸塩は塩であり、１３Ｃ−ピルビン酸塩の水溶液及び常磁性試薬の液体混合物は、凍結する時に結晶化した試料となる。これを防ぐには、グリセロール、プロパンジオール又はグリコール等のガラス形成能の高い共溶媒をさらに追加することが好ましい。
【００１８】
従って、一実施形態では、１３Ｃ−ピルビン酸塩を水に溶解して水溶液を得て、常磁性試薬、グリセリン及び、任意の共溶媒を添加して液体混合物を形成する。好ましい実施形態では、１３Ｃ−ピルビン酸、常磁性薬剤及び共溶媒を混合して液体混合物を形成する。最も好ましい実施形態では、１３Ｃ−ピルビン酸及び常磁性試薬を形成して液体混合物を形成する。化合物の均質混合は、撹拌、ボルテックス又は超音波照射等の数種類の周知の方法で行うことができる。
【００１９】
次に、ＤＮＰ処理が行われる前に、液体混合物は凍結される。液体混合物の冷却／凍結は、液体混合物を液体窒素で凍結する等の周知の方法で行うこともできるが、単に液体混合物を分極装置に入れておくだけでも、液体ヘリウムにより試料は凍結する。
【００２０】
上記のように、動的核分極（ＤＮＰ）は、分極される化合物の分極が、常磁性試薬／化合物等のＤＮＰ試薬によりもたらされる分極方法である。
【００２１】
多くの周知の常磁性化合物が、ＤＮＰ試薬、例えば、クロム（Ｖ）イオン等遷移金属、ニトロキシド基、トリチル基又は磁性粒子等の有機フリーラジカル等として使用できる。このようなＤＮＰ試薬は、例えば、国際公開第９９／３５５０８号、同第８８／１０４１９号、同第９０／００９０４号、同第９１／１２０２４号、同第９３／０２７１１号又は同第９６／３９３６７号に記載されている。
【００２２】
好ましい実施形態では、式（Ｉ）のトリチルラジカルは、常磁性試薬として使用され、ＤＮＰの方法によって１３Ｃ−ピルビン酸塩を得る。
【００２３】
【化１】
2008508023.tif 000002
式中、Ｍは、水素又は１当量の陽イオンを表し、Ｒ１は同一又は異なる直鎖又は枝分れ任意に水酸化されるＣ１〜Ｃ６アルキル基又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−Ｒ２基であって、ｎは１、２又は３であり、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ２は直鎖又は枝分れＣ１〜Ｃ４アルキル基である基を表す。
【００２４】
好ましい実施形態では、Ｍは、水素又は生理学的に許容できる１価の陽イオンを表す。「生理学的に許容できる陽イオン」という用語は、ヒト又は非ヒト動物に影響しない陽イオンを表す。好ましくは、Ｍは、水素又はアルカリ陽イオン、アンモニウムイオン又はメグルミン等の有機アミンイオンを表す。最も好ましくは、Ｍは、水素又はナトリウムを表す。
【００２５】
さらに好ましい実施形態では、Ｒ１は同一又は異なるもので好ましくは同一の直鎖又は枝分れ任意に水酸化されるＣ１〜Ｃ４アルキル基、最も好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基を表す。
【００２６】
さらに好ましい実施形態では、Ｒ１は同一又は異なるもので好ましくは同一のＣＨ２−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）、−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）、−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ３、−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｓ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ２Ｈ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ２Ｈ４ＯＨ又は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ３、最も好ましくは、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨを表す。
【００２７】
さらに好ましい実施形態では、Ｍは、水素又はナトリウムを表し、Ｒ１は同一の−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＣＨ３を表す。
【００２８】
式（Ｉ）のトリチル基は、特許文献６、特許文献８、国際公開第９７／０９６３３号パンフレット及び国際公開第９８／３９２７７号パンフレットで詳細に記載されるように合成される。要約すると、ラジカルは、３当量のメタル化された単量体アリール化合物と、１当量の適当な保護基を有するカルボン酸誘導体とを反応させ、３量化した中間体を生成させることにより合成できる。この中間体をメタル化し、次いで、例えば、二酸化炭素と反応させると、トリチルカルビノールトリカルボン酸が得られ、さらに強酸で処理すると、トリアリールメチル陽イオンが生成する。その後、この陽イオンを還元すると、安定なトリチルラジカルが生成する。
【００２９】
１３Ｃ−ピルビン酸塩及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸と、任意の溶媒を含む液体混合物は、好ましくは５〜１００ｍＭ、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭ、特に好ましくは１２〜１８ｍＭ、最も好ましくは１３〜１７ｍＭを含む。本発明の方法のＤＮＰ処理で、より高濃度のラジカルを用いると分極の立ち上げに要する時間は短くなるが、達成される分極レベルは低くなることが見出された。従って、これらの２つの効果を互いにバランスさせなければならない。
【００３０】
ＤＮＰ技法については、例えば国際公開第９８／５８２７２号及び同第０１／９６８９５号に記載されており、これらは共に参照として本願明細書に組み込まれる。通常、ＤＮＰ処理では、中程度の又は高い磁場及び非常に低い温度が用いられており、例えば、液体ヘリウム及び約１Ｔ又はそれ以上の磁場中でＤＮＰ処理を実行する。或いは、中程度の磁場及び十分な分極の増大が達成できる任意の温度の下で実行してもよい。本発明の方法の好ましい実施形態では、ＤＮＰ過程は液体ヘリウム及び約１Ｔ又はそれ以上の磁場中で行われる。好適な分極装置は、例えば国際公開第０２／３７１３２号パンフレットに記載されている。好ましい実施形態では、分極装置は、低温保持装置（クライオスタット）及び、超電導磁石等の磁場発生手段に取り囲まれた中央のボア内に設置され、導波路によって、マイクロ波源に接続されたマイクロ波チャンバー等の分極手段を備えている。ボアは、垂直方向に、少なくとも、磁場強度が１３Ｃ核種への分極を引き起こすのに十分な高さ（例えば１〜２５Ｔ）を有する超電導磁石付近の領域Ｐの高さまで延在している。試料用のボアは、好ましくは密封可能であり、例えば１ミリバールオーダー以下の低圧まで減圧可能である。取り外し可能な試料導入管等の試料（常磁性試料と、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む混合物）導入手段をボアの内側に有していてもよく、この試料導入管はボアの頂部から領域Ｐに位置するマイクロ波チャンバーの内側の位置まで挿入されていてもよい。領域Ｐは、液体ヘリウムにより分極が起こるのに十分な低温、好ましくは０．１〜１００Ｋ程度の温度、好ましくは０．５〜１０Ｋ、最も好ましくは１〜５Ｋに冷却されている。試料導入手段は、好ましくは、その上端が、ボア内部の部分的減圧状態を保持するのに好適な任意の手段により密封可能である。試料保持カップ等の試料保持容器が、試料導入手段の下端の内側に取り外し可能なように取り付けされていてもよい。試料保持容器は、好ましくは、比熱容量が低く低温特性に優れた、ＫｅｌＦ（登録商標：ポリクロロトリフルオロエチレン）又はＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）等の軽量材料により作られている。試料容器は、分極される１種以上の試料を保持することができる。
【００３１】
試料は、試料保持容器中に挿入され、液体ヘリウム中に浸漬され、好ましくは、周波数約９４ＧＨｚ、出力２００ｍＷのマイクロ波の照射を受ける。分極のレベルは、マイクロ波の照射を行いながら固体１３Ｃ−ＮＭＲ信号の取り込みを行うことによりモニターすることができるので、工程ｂ）で、固体１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの取り込みを行う手段を備えた分極装置を用いることが好ましい。通常、１３Ｃ−ＮＭＲ信号と時間との関係を示すグラフで飽和曲線が得られる。従って、最適な分極レベルに到達した時点を決定できる。
【００３２】
過分極が、試料を固体状態であることを必要とする方法、例えばＤＮＰ方法によって行われる場合、本発明の方法で使用するためには、固体の試料を液体状態に遷移させる必要がある。固体の分極混合物は、例えば国際公開第０２／３７１３２号パンフレットに記載されているように溶解又は、国際公開第０２／３６００５号パンフレットに記載されているように融解される。固体の過分極試料を、さらに好ましくは緩衝液（好ましくは生理的に許容できる緩衝液）に溶解して液組成物を得ることが好ましい。「緩衝液」という用語は、本願明細書中で用いられる場合に、１種以上の緩衝液、すなわち、緩衝液の混合物を表す。
【００３３】
好ましい緩衝液は、生理学的に許容できる緩衝液であり、さらに好ましくは、例えば、リン酸緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４）、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール／塩酸、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＰＳ又はＴＲＩＣＩＮ等のｐＨが約７〜８の範囲内である緩衝液である。さらに好ましい緩衝液は、リン酸緩衝液及びＴＲＩＳであり、最も好ましくはＴＲＩＳである。他の実施形態では、２種類以上の上述の好ましい緩衝液、すなわち緩衝液の混合物が用いられる。
【００３４】
分極される化合物として１３Ｃ−ピルビン酸が用いられる場合には、１３Ｃ−ピルビン酸の１３Ｃ−ピルビン酸塩への変換もまた溶解に含まれる。このことを達成するために、１３Ｃ−ピルビン酸を塩基と反応させる。一実施形態では、１３Ｃ−ピルビン酸を塩基と反応させ、１３Ｃ−ピルビン酸塩に変換した後に、緩衝液を加える。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、緩衝液と塩基を混合して１つの溶液とし、この溶液を１３Ｃ−ピルビン酸に加え、溶解し、同時に１３Ｃ−ピルビン酸に変換する。好ましい実施形態では、塩基は、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３又はＮａＨＣＯ３の水溶液であり、最も好ましい塩基はＮａＯＨである。特に好ましい実施形態では、ＮａＯＨを含むＴＲＩＳバッファーの溶液で１３Ｃ−ピルビン酸を溶解し、１３Ｃ−ピルビン酸のナトリウム塩に変換する。他の好ましい実施形態では、緩衝液又は適用可能である場合には緩衝液／塩基の混合溶液は、錯形成していない常磁性イオンと結合することができる１種以上の化合物、例えば、ＤＴＰＡやＥＤＴＡ等のキレート剤をさらに含んでいる。遊離の常磁性イオンは、過分極化合物のＴ１の短縮を引き起こすおそれがあることが見出されているが、これは避けることが好ましい。
【００３６】
溶解は、好ましくは、国際公開第０２／３７１３２号パンフレットに開示された方法及び／又は装置を用いて行うことができる。過分極がＤＮＰの方法によって行なわれる場合、分極装置とは物理的に別個の又は分極装置及び溶解装置を備える装置の一部である溶解装置のいずれかが用いられる。好ましい実施形態では、溶解は、緩和を改善し、過分極の最大値を維持するために高磁場中で実施される。磁場の節点は避けるべきであり、磁場強度が低いと上記のような対策を講じても緩和が増大するおそれがある。
【００３７】
過分極がＤＮＰの方法によって行われる場合、常磁性試薬及び／又はその反応生成物は溶液を含む１３Ｃ−ピルビン酸塩から除去されるのが好ましい。常磁性試薬及び／又は反応生成物は、部分的に、或いはほぼ完全に、理想的には完全に除去されていればよく、完全に除去されることが好ましい。例えば、式（Ｉ）のトリチル基の反応生成物は、ピルビン酸と、ヒドロキシル基を含む式（Ｉ）のラジカルとの反応で形成されるエステルである可能性がある。常磁性試薬及び／又はラジカルの反応生成物の除去に使用される方法は周知である。通常、その方法の適用可能性は、常磁性試薬及び／又はその反応生成物の性質に依存する。固体の過分極試料が溶解されると、ラジカルが沈殿する場合は、濾過して液体組成物から容易に除去することができる。常磁性試薬として磁性粒子を使用する場合、これらの粒子もまた濾過により容易に除去される。沈殿が生成しない場合には、常磁性試薬は、逆相、順相又はイオン交換クロマトグラフィー等の液相クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー分離法又は抽出により分離できる。
【００３８】
式（Ｉ）のトリチル基は、紫外／可視部に特徴的な吸収スペクトルを有するため、ラジカルの除去後に、液体組成物中にラジカルが存在するか否か確認する方法として紫外／可視吸光測定を用いることができる。定量的な結果（溶解した過分極試料中に存在するラジカルの濃度）を得るために、試料における特定の波長の吸光度から、試料中の対応するラジカルの濃度が得られる様に分光光度計を校正してもよい。
【００３９】
本発明の方法で使用する１３Ｃ−ピルビン酸塩及び／又はＤＮＰの方法で分極した１３Ｃ−ピルビン酸塩を得るために好ましく使用される１３Ｃ−ピルビン酸の同位体濃縮率は、好ましくは、少なくとも７５％、さらに好ましくは、少なくとも８０％及び特に好ましくは、少なくとも９０％であり、同位体濃縮率が９０％を上回っていることが最も好ましい。理想的には、濃縮率は１００％である。１３Ｃ−ピルビン酸及び／又は１３Ｃ−ピルビン酸塩は、Ｃ１−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ１−ピルビン酸及び１３Ｃ１−ピルビン酸塩という）、Ｃ２−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ２−ピルビン酸及び１３Ｃ２−ピルビン酸塩という）、Ｃ３−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ３−ピルビン酸及び１３Ｃ３−ピルビン酸塩という）、Ｃ１−位及びＣ２−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ１，２−ピルビン酸及び１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩という）、Ｃ１−位及びＣ３−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ１，３−ピルビン酸及び１３Ｃ１，３−ピルビン酸塩という）、Ｃ２−位及びＣ３−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ２，３−ピルビン酸及び１３Ｃ２，３−ピルビン酸塩という）又はＣ１−位、Ｃ２−位及びＣ３−位で同位体濃縮がなされているもの（以下、１３Ｃ１，２，３−ピルビン酸及び１３Ｃ１，２，３−ピルビン酸塩という）のいずれであってもよいが、Ｃ１−位で同位体濃縮がなされているものが好ましい。
【００４０】
１３Ｃ１−ピルビン酸及び１３Ｃ１−ピルビン酸塩の合成法としては数種類のものが周知である。要約すると、Ｓｅｅｂａｃｈ他、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２），１９７５，２３１−２３７では、例えば、１，３−ジチアン又は２−メチル−１，３−ジチアン等のＳ，Ｓ−アセタール（ジチオアセタール）に変換することにより、カルボニル基を含む出発物質の保護及び活性化を行う合成経路が述べられている。ジチアンはメタル化され、メチル基を含む化合物及び／又は１３ＣＯ２と反応する。本文献中で概説されているような適当な同位体濃縮された１３Ｃ−成分を用いることにより、１３Ｃ１−ピルビン酸塩、１３Ｃ２−ピルビン酸塩又は１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩を得ることができる。その後、文献記載の常法を用いて、カルボニル基を遊離させる。別の合成経路では、酢酸を出発物質とし、まず臭化アセチルに変換し、次いでＣｕ１３ＣＮと反応させる。得られたニトリルを、アミドを経てピルビン酸に変換する（例えば、Ｓ．Ｈ．Ａｎｋｅｒ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７６（１９４８），１３３３又はＪ．Ｅ．Ｔｈｉｒｋｅｔｔｌｅ，ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ．（１９９７），１０２５を参照）。さらに、市販の１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムを、例えば、米国特許第６２３２４９７号に記載の方法でプロトン化することによって、１３Ｃ−ピルビン酸を得ることもできる。
【００４１】
本発明の方法で使用されるように、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩は、ヒト又はヒト以外の動物身体への投与に適切な組成物として提供される。好ましくは、組成物には、緩衝液又は上記の緩衝液の混合物含まれている。組成物は、従来薬理学的に許容できる担体、賦形剤及び、製剤補助剤をさらに含んでもよい。従って、組成物は、例えば、安定化剤、オスモル濃度を調整する薬剤、溶解補助剤を含んでもよい。ピルビン酸塩は、高濃度であっても人体に対して高い耐性を有する内在性の化合物である。
【００４２】
クエン酸回路の前駆体として、ピルビン酸塩は人体内で代謝上重要な役割を果たしている。ピルビン酸塩は数種の化合物に変換され、アミノ基転移によってアラニンを生成し、酸化的脱炭酸によりピルビン酸塩はアセチル−ＣｏＡに変換され、ピルビン酸塩の還元によって乳酸が生成し、カルボキシル化によりオキサロ酢酸塩が生成する。
【００４３】
過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩から過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−炭酸水素塩（１３Ｃ１−ピルビン酸塩、１３Ｃ１，２−ピルビン酸塩及び１３Ｃ１，２，３−ピルビン酸塩の場合のみ）及び過分極１３Ｃ−アラニンへの変換によって、生体内でのＭＲイメージングで使用して腫瘍組織と健常組織との識別に用られることが見出された。通常、過分極化合物のＴ１が緩和及び希釈により減少することに照らすと、これは驚くべきことである。ヒトの全血中３７℃で、１３Ｃ１−ピルビン酸塩のＴ１緩和時間は約４２秒であるが、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩から過分極１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−炭酸水素塩及び過分極１３Ｃ−アラニンへの変換は速く、１３Ｃ−ピルビン酸塩及びその代謝産物に由来する信号の検出は十分可能である。アラニン、炭酸水素塩及び乳酸塩の量は、研究対象である組織の代謝状態に依存する。１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−炭酸水素塩及び過分極１３Ｃ−アラニンのＭＲ信号強度は、これらの化合物の量及び検出時における分極の残存率に関連しているため、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の１３Ｃ−乳酸塩、過分極１３Ｃ−炭酸水素塩及び過分極１３Ｃ−アラニンへの変換を観測することにより、非侵襲的なＭＲイメージングを用いた、ヒト又はヒト以外の動物体内における生体内での代謝プロセスの検討を行うことができる。
【００４４】
異なるピルビン酸代謝物に由来するＭＲ信号強度は、組織の型によって異なることが見出された。アラニン、乳酸塩、炭酸水素塩及びピルビン酸塩による特有のピークパターンは、検討対象である組織の代謝状態に対する明確な特徴として用いることができ、従って、健常組織と腫瘍組織との識別が可能になる。これにより、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物は、生体内でのＭＲイメージングにとって優れた薬剤となる。
【００４５】
通常、検査対象である、患者又は動物等の被験者をＭＲマグネットに入れる。１３Ｃ−ＭＲ専用のラジオ波コイルが、観測対象となる部位をカバーするように配置される。
【００４６】
１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物は、非経口投与、好ましくは、血管内投与、関節内投与又は目的の部位或いは器官に直接投与される。本発明の組成物の用量及び濃度は、毒性、臓器への標的能及び投与経路等の因子の程度に依存する。通常、組成物は、ピルビン酸塩濃度が体重１ｋｇあたり１ｍｍｏｌ以下、好ましくは０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｋｇ、さらに好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの濃度で投与される。投与速度は、好ましくは１０ｍｌ／秒未満、さらに好ましくは６ｍｌ／秒未満、最も好ましくは５ｍｌ／秒〜０．１ｍｌ／秒である。投与後４００秒以内、好ましくは１２０秒以内、さらに好ましくは６０秒以内、特に好ましくは投与後２０〜５０秒後、最も好ましくは投与後３０〜４０秒後に、関心体積を周波数及び空間選択的にエンコーディングするＭＲイメージングシークエンスが適用される。これにより、１３Ｃ−乳酸塩、１３Ｃ−アラニン及び１３Ｃ−ピルビン酸塩の代謝イメージ、好ましくは、１３Ｃ−乳酸塩、１３Ｃ−アラニン、１３Ｃ−炭酸水素塩及び１３Ｃ−ピルビン酸塩の代謝イメージが得られる。同時に、プロトンＭＲＩ造影剤を用いて、或いは用いずにプロトン画像の取り込みを行い、解剖学的画像及び／又は組織灌流画像を得る。
【００４７】
関心体積のエンコーディングは、例えば、Ｔ．Ｒ．Ｂｒｏｗｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９，３５２３−３５２６（１９８２）；Ａ．Ａ．Ｍａｕｄｓｌｅｙ他，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓ５１，１４７−１５２（１９８３）に記載の、いわゆる分光イメージングシークエンスによって達成することができる。
【００４８】
スペクトルイメージデータは、多数の体積要素からなり、個々の体積要素は完全な１３Ｃ−ＭＲスペクトルを含んでいる。１３Ｃ−ピルビン酸塩及びその１３Ｃ−代謝産物は、全て１３Ｃ−ＭＲスペクトルで固有の位置にピークを有しており、それらの同定に用いることができる。その共鳴周波数におけるピークの積分強度は、それぞれ、１３Ｃ−ピルビン酸塩及びその１３Ｃ−代謝産物の量に直接関係している。１３Ｃ−ピルビン酸塩及び個々の１３Ｃ−代謝産物の量を、例えば、Ｌ．Ｖａｎｈａｍｍｅ他，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１２９，３５−４３（１９９７）に記載の時間領域フィッティング法を用いて評価する場合には、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び個々の１３Ｃ−代謝産物について、カラー表示又はグレイ表示により、測定された１３Ｃ−ピルビン酸塩及び個々の１３Ｃ−代謝産物の量を表す画像を生成することができる。
【００４９】
分光イメージング法は、１Ｈ、３１Ｐ、２３Ｎａ等の全種類のＭＲ核種を用いて代謝画像を生成することができる点で有用であることが実証されたが、スペクトルイメージを完全にエンコードするために多数回の繰返しが必要であるため、この方法は過分極１３Ｃにはあまり適していない。ＭＲ信号の取り込みの間中、過分極１３Ｃの信号が確実に受信されるよう注意を払う必要がある。これは、信号対雑音比は低下するが、位相エンコーディングの全ステップで照射されるＲＦパルス角を小さくすることにより達成される。マトリックスのサイズを大きくすると、必要な位相エンコーディングのステップ数及びスキャン回数は増大する。
【００５０】
Ｐ．Ｃ．Ｌａｕｔｅｒｂｕｒ（Ｎａｔｕｒｅ，２４２，１９０−１９１，（１９７３）及びＰ．Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃ．６，Ｌ４２２−Ｌ４２６（１９７３））の先駆的な研究に基づくイメージング法は、データ取り込みの際に読み出し用の勾配磁場（グラジエント）を印加することを含み、信号対雑音比の高い画像又は同等物、空間分解能の高い画像が得られる。しかし、これらのイメージング方法の基本形を用いても、１３Ｃ−ピルビン酸塩及びその１３Ｃ−代謝産物を分離して画像化することはできず、１３Ｃ−ピルビン酸塩及び全ての１３Ｃ−代謝産物の信号を含む画像しか得られないため、個々の代謝産物を同定することはできない。
【００５１】
好ましい実施形態では、周波数をコードするために多重エコーを用いたイメージングシークエンスが用いられる。水と脂質が分離した１Ｈ画像を生成することができるシークエンスは、例えば、Ｇ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ１９９１；１：５２１−５３０及びＳ．Ｂ．Ｒｅｅｄｅｒ他，ＭＲＭ５１３５−４５（２００４）に記載されている。測定する代謝産物及びそのＭＲ周波数は既知であるため、上記参考文献に記載の方法を、１３Ｃ−ピルビン酸塩、１３Ｃ−アラニン及び１３Ｃ−乳酸塩、好ましくは１３Ｃ−ピルビン酸塩、１３Ｃ−アラニン、１３Ｃ−乳酸塩及び１３Ｃ−炭酸水素塩の画像化に直接適用すると、古典的なスペクトル画像化技法よりも高品質な信号、空間分解能がより高い信号及び短い取り込み時間が与えられ、過分極１３Ｃ−ＭＲ信号をより有効に使用することができる。
【００５２】
腫瘍組織は、灌流が増大し代謝活性が向上するという特徴を示すことが多い。代謝の要求が高く、かつ／又は毛細血管からより離れた細胞によって誘導される血管床の増加、血管新生という過程によっても、エネルギーの恒常性を維持するために必要とされるエネルギーを供給するに足るだけの物質の確保は不可能である。このような領域内では、細胞が十分なエネルギーを産生する点で問題が生じており、代謝パターンに顕著な変化が生じていることが期待される。問題が生じているがエネルギーの恒常性を維持している組織は、特に乳酸の産生量が増加しているという点でエネルギー代謝が変化する。驚くべきことに、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を用いると、ＭＲイメージングで用いることのできる短い時間窓内で、この代謝の変化を可視化でき、すなわち、腫瘍領域内で強度が高い１３Ｃ−乳酸塩の信号を用いて腫瘍を健常組織と識別することが可能である。灌流は、腫瘍組織内では不均一であるため、１３Ｃ−乳酸塩の信号を、同一領域内に存在するピルビン酸塩の量（１３Ｃ−ピルビン酸塩の信号）で補正することが好ましい。この補正によって、ピルビン酸塩に対して存在比率が高い乳酸塩の画像が得られる。この補正により、ピルビン酸塩の信号に対して乳酸塩の信号強度が高い組織の領域を強調することができ、腫瘍組織と正常組織の識別が改善される。
【００５３】
ピルビン酸塩の信号による補正を行うためには、個々の画像中で乳酸塩及びピルビン酸塩の画像における最大値へと正規化する。次に、正規化した乳酸塩の画像に反転したピルビン酸塩の画像、例えば、画像内のピルビン酸塩の信号の最大強度とピクセル毎のピルビン酸塩の信号強度との差をかけ合わせる。最終段階として、上記の操作により得られた中間結果に元の乳酸塩の画像をかけ合わせる。
【００５４】
代謝が変化している領域を強調するために、１３Ｃ−アラニンの信号強度の減少と関連のある強度の高い１３Ｃ−乳酸塩の信号を、上の段落で述べたような操作に用いることができ、これによりアラニンに対して存在比率の高い乳酸塩の画像が得られる。驚くべきことに、腫瘍領域の同定、すなわち、腫瘍組織と正常組織の識別は、この補正によっても改善される。アラニンの信号による補正を行うためには、個々の画像で乳酸塩及びアラニンの画像にける最大値へと正規化する。次に、正規化した乳酸塩の画像に反転したアラニンの画像、例えば、画像内のアラニンの信号の最大強度とピクセル毎のアラニンの信号強度との差をかけ合わせる。最終段階として、上記の操作により得られた中間結果に元の乳酸塩の画像をかけ合わせる。同様に、１３Ｃ−炭酸水素塩の信号も、解析に用いることができる。さらに、プロトンＭＲＩ造影剤を用いて、或いは用いずに取り込みを行ったプロトン画像を解析に用いて、解剖学的画像及び／又は組織灌流画像を得ることもできる。
【００５５】
他の好ましい実施形態では、過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物を繰り返し投与することにより、動的検査を行うことができる。この点は、患者の体内を比較的長時間循環するために動的検査を行うことができない他のＭＲ造影剤と比較した場合の本発明の方法のさらなる利点である。
【００５６】
本発明の方法は、生体内でのＭＲによる腫瘍のステージ判定のためにさらに用いられてもよい。上の段落で述べたような代謝画像及び／又は代謝比の高い存在率の画像は、腫瘍のサイズや代謝活性によって定義された、適切に区分された分類を用いれば、この目的に用いることができる。
【００５７】
さらに、本発明の方法は、生体内における腫瘍の治療効果のＭＲによるモニタリング、例えば、治療用抗ガン剤及び／又は放射線治療による治療又は任意の除去法、すなわち、ラジオ波、マイクロ波若しくは超音波と組み合わせた化学的除去法を用いた、或いは用いない任意の治療を行った場合における代謝パターンの直接的な変化のモニタリングに用いられてもよい。
【００５８】
患者又は動物に対する前処理によってタンパク質代謝、脂質代謝又はエネルギー代謝全般を乱すことにより、本発明の方法による腫瘍のＭＲイメージングに影響を与え、改善することができる。これらを達成する手段は周知であり、絶食（例えば一晩）、グルコース投与等が例として挙げられる。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、脳腫瘍、乳ガン、大腸／結腸直腸ガン、肺ガン、腎ガン、頭部及び頚部腫瘍、筋腫、胃ガン、食道ガン、卵巣腫瘍、膵臓ガン及び前立腺ガンに対する、生体内におけるＭＲ腫瘍イメージング、腫瘍の治療効果のモニタリング及び腫瘍のステージの判定に使用できる。さらに、本発明の方法は、特に生体内における前立腺ガンのＭＲイメージング、すなわち、生体内での前立腺ガンの診断及び／又は前立腺ガンのステージの判定及び／又は前立腺ガンの治療効果のモニタリングのためのＭＲ造影剤として特に有用であることが見出された。
【００６０】
男性が、医師に排尿時の苦痛及び不快感を訴える場合、前立腺ガンが疑われる。その男性が５０歳以上の場合には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）検査が行われる。ＰＳＡ値の上昇及び／又は直腸内触診での異常に基づいて、前立腺ガンの疑いが持たれる。ＰＳＡ検査の結果が陽性の場合、患者は、超音波による生体検査のために専門家（泌尿器科医）の下に送られる。米国及びヨーロッパでは、１年間に２００万件以上の生体検査が行われており、それぞれ、６例中５例及び３例中２例は陰性である。初期の段階で発見されれば、これらの患者の５年後生存率は１００％である。前立腺ガンは最も患者数の多いガンであり、男性のガンによる死亡原因の第２位であるため、前立腺ガンを早期の段階で発見することができ、生体検査の件数を低減させるのに有用な前立腺ガンの診断方法に対する医学上の強い要請が存在する。
【００６１】
前立腺の１３Ｃ−イメージングには、送受信用の１３Ｃ−ＲＦ体積コイルが必要であり、好ましくは送信用の１３Ｃ−ＲＦ体積コイルとＭＲ受信専用の直腸内ＲＦコイルとを組み合わせて用いられ、さらに好ましくは、送受信用のフェイズドアレイ１３Ｃ−ＲＦ体積コイルとＭＲ受信専用の直腸内ＲＦコイルとを組み合わせて用いられる。特に好ましくは、１３Ｃ−イメージングの後で１Ｈ−前立腺画像の取り込みが可能なコイルである。
【実施例】
【００６２】
実施例１：トリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（メトキシエチル）ベンゾ−［１，２、−４，５’］−ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩の合成
国際公開第９８／３９２７７号パンフレットの実施例７に従って合成したトリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシエチル）ベンゾ−［１，２、−４，５’］−ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩１０ｇ（７０ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下でジメチルアセタミド２８０ｍｌに懸濁した。水素化ナトリウム（２．７５ｇ）、次いでヨウ化メチル（５．２ｍｌ）を加え、わずかに発熱反応である反応を、３４℃の水浴中で６０分間行わせた。水素化ナトリウム及びヨウ化メチルを、それぞれ同量ずつ２回繰り返して加え、最後の添加後に、混合物を室温で６８時間撹拌し、５００ｍｌの水中に注いだ。１ＭＮａＯＨ（水溶液）４０ｍｌを用いてｐＨをｐＨ＞１３に調整し、混合物を室温で１５時間撹拌して生成したメチルエステルを加水分解した。その後、２ＭＨＣｌ（水溶液）５０ｍｌを用いて、混合物をｐＨが約２となるように酸性化し、酢酸エチル（５００ｍｌ及び２×２００ｍｌ）で抽出した。有機相をまとめてＮａ２ＳＯ４上で乾燥後、蒸発乾固させた。粗生成物（２４ｇ）を、アセトニトリル／水を溶離剤として分種ＨＰＬＣにより精製した。集めたフラクションを蒸発させ、アセトニトリルを除去した。残った水相を酢酸エチルで抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥後蒸発乾固した。水（２００ｍｌ）を残渣に加え、１ＭＮａＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを注意深く７に調整すると、この過程の間に残渣はゆっくり溶解した。中和後、水溶液を凍結乾燥した。
【００６３】
実施例２：１３Ｃ−ピルビン酸及び実施例１のトリチル基を用いたＤＮＰの方法による過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物の製造
実施例１のラジカル５．０ｍｇを１３Ｃ１−ピルビン酸（１６４μｌ）に溶解して、２０ｍＭ溶液を調製した。試料を均一になるまで混合し、溶液の一部（４１ｍｇ）を試料カップに入れ、ＤＮＰ分極装置内に挿入した。
【００６４】
ＤＮＰ条件下で、１．２Ｋで、３．３５Ｔの磁場中でマイクロ波（９３．９５０ＧＨｚ）を試料に照射した。２時間後、分極を終了し、国際公開第０２／３７１３２号パンフレットに記載の溶解装置を用いて、試料を水酸化ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）の水溶液に溶解し、過分極１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムの中性の溶液を得た。溶解した試料について、速やかに１３Ｃ−ＮＭＲによる分析を行い、分極の評価を行ったところ、１３Ｃの分極率が１９．０％という値が得られた。
【００６５】
実施例３：１３Ｃ−ピルビン酸及び実施例１のトリチル基を用いたＤＮＰの方法による過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の製造
実施例１のラジカル（２０９．１ｍｇ）を１３Ｃ１−ピルビン酸（５５３ｍｇ）及び未標識のピルビン酸（１０．５０５ｇ）に溶解して、１５ｍＭ溶液を調製した。試料を均一になるまで混合し、溶液の一部（２．０１５ｇ）を試料カップに入れ、ＤＮＰ分極装置内に挿入した。
【００６６】
ＤＮＰ条件下で、１．２Ｋで、３．３５Ｔの磁場中でマイクロ波（９３．９５０ＧＨｚ）を試料に照射した。４時間後、分極を終了し、国際公開第０２／３７１３２号パンフレットに記載の溶解装置を用いて、試料を水酸化ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン（ＴＲＩＳ）の水溶液に溶解し、１００ｍＭＴＲＩＳ緩衝液中のピルビン酸塩の全濃度が０．５Ｍである、過分極１３Ｃ−ピルビン酸ナトリウムの中性の溶液を得た。溶解装置と直列にクロマトグラフィー用カラムを接続した。カラムは、バリアン社（ＶａｒｉａｎＩｎｃ．）製で、疎水性充填材（Ｂｏｎｄｅｓｉｌ−Ｃ１８、４０μｍ、注文番号１２２１３０１２）を充填したカートリッジ（直径３８ｍｍ、高さ１０ｍｍ）よりなる。溶解した試料をカラムに通すと、ラジカルが選択的に吸着された。ろ液について、速やかに１３Ｃ−ＮＭＲによる分析を行い、分極の評価を行ったところ、１３Ｃの分極率が１６．５％という値が得られた。その後、ラジカルの残留濃度を、紫外分光計により測定波長４６９ｎｍで分析したところ、検出限界の０．１μＭ未満であった。
【００６７】
実施例４：１３Ｃ−ピルビン酸及び、トリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシ−エトキシ）メチル−ベンゾ［１，２−ｄ：４，５−ｄ’］ビス（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩を用いた、ＤＮＰの方法による過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩の製造
トリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシエトキシ）ベンゾ−［１，２、−４，５−ｄ’］−ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩を国際公開第９７／０９６３３号パンフレットの実施例２９に記載されるように合成した。
【００６８】
トリス（８−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ（ヒドロキシエトキシ）ベンゾ−［１，２、−４，５−ｄ’］−ビス−（１，３）ジチオール−４−イル）メチルナトリウム塩を１３Ｃ１−ピルビン酸（８３．１ｍｇ）に溶解して、２０ｍＭ溶液を調製した。試料を均一になるまで混合し、溶液の一部（４１ｍｇ）を試料カップに入れ、ＤＮＰ分極装置内に挿入した。ＤＮＰ条件下で、１．２Ｋで、３．３５Ｔの磁場中でマイクロ波（９３．９５０ＧＨｚ）を試料に照射した。試料からの１３Ｃ−ＮＭＲ信号の取り込みを、バリアン社製Ｉｎｏｖａ−２００ＮＭＲ分光計を用いて行った。ＤＮＰを介した分極の増大を、熱平衡下での１３Ｃ−ＮＭＲ信号及び増大したＮＭＲ信号の測定結果より計算した。１３Ｃの分極率として１６％という値が得られた。
【００６９】
実施例５：造影剤として過分極１３Ｃ−ピルビン酸塩を含む組成物を用いた腫瘍イメージング
５．１．腫瘍動物モデル及び腫瘍調製
Ｒ３２３０ＡＣは、雌フィッシャー３４４ラットで維持されるラット乳腺癌である。動物の腫瘍モデルを確立するために、ＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ウシ体胎児血清（ＦＢＳ）及び１０％ＤＭＳＯを含むＲ３２０３０細胞の凍結したバイアルを３７℃で速やかに解凍した。その後、細胞の溶液をＦＢＳに移し、ＲＰＭＩ１６４０培地を追加した。最後に、細胞の懸濁液を２５ｃｍ２の培養フラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ中に入れた。培地は毎日交換した。ラットに投与する日に、機械的に又はトリプシンを用いて細胞を剥離した。カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝液で細胞を洗浄した。トリプシン（０．０５％トリプシンを０．０２％ＥＤＴＡ水溶液に溶解したもの）を２〜５分かけて加えた。その後、ＦＢＳ５ｍｌを加え、細胞を、ＦＣＳ及び抗生物質（ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００ＩＵ／ｍｌ及びアンフォテリシンＢ２．５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を入れたビーカーに移した。細胞溶液を遠心分離して、細胞ペレットを、ＦＢＳ及び抗生物質を含むＥＰＭＩ培地２０ｍｌに再懸濁し、遠心分離及び再懸濁を繰り返した。その後、細胞を、４×１０６個／ｍｌＲＰＭＩ１６４０培地となるようにバイアルに分注した。ドナー腫瘍を得るために、雌性フィッシャー３４４系ラット（チャールズ・リバー社、１８０〜２００ｇ）を麻酔し、０．３ｍｌの細胞懸濁液を、鼠径部両側に皮下注射した。１５日後及び２２日後に、Ｆ．Ａ．Ｂｕｒｇｅｎｅｒ他，ＩｎｖｅｓｔＲａｄｉｏｌ２２／６（１９８７），４７２−４７８；
Ｓ．Ｓａｉｎｉ他，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．１２９／１（１９９７），３５−４３に記載の方法で、腫瘍の切片を調製した。
【００７０】
レシピエントである雌性フィッシャーラットの腹側縁上を２箇所切開した。腫瘍の切片を開口内に挿入し、縫合した。腫瘍の移植から１２〜１４日後に、ラットのイメージングを行った。
【００７１】
５．２．ラットの調製及びプロトンＭＲイメージング
計量したラットをイソフルラン（２〜３％）で麻酔し、体温を３７℃以上に保つために加熱テーブル上に保持した。カテーテルを、尾静脈及び左総頚動脈に挿入した。ラットをＭＲ装置に移し、ＦＣ−１０４フルオリナートを循環させることにより約３７℃に加熱した自家製のパッド上に配置した。この液体は、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＭＲイメージングの際にバックグラウンド信号を生じない。開放型呼吸器に接続された長いチューブから０．４Ｌ／分の速度で供給される１〜２％イソフルランにより麻酔を継続した。動脈カテーテルを、Ｔ字管を介して圧力計及び生理食塩水供給ポンプ（流速０．１５ｍＬ／分）に接続して、カテーテルが血栓で詰まるのを防止した。ラットを、ラット用ＭＲコイル（ＲａｐｉｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社（ドイツ）製）に入れ、標準的なプロトンＭＲイメージングシークエンスによりイメージングを行い、解剖学的情報を得て腫瘍の位置を決定した。
【００７２】
５．３．１３Ｃ−ＭＲイメージング
ＭＲ装置により測定したプロトンの周波数に基づき、１３Ｃ−アラニンの共鳴周波数を下式により求めた。
【００７３】
１３Ｃ１−アラニンの周波数＝０．２５１４４×［（装置のプロトン共鳴周波数×１．０００２１）−０．０００３９７７０８］
計算により求められた周波数より、１３Ｃ１−アラニンに由来するＭＲ信号の位置は、１３Ｃ１−乳酸塩の共鳴信号がその左側に、１３Ｃ１−ピルビン酸塩の共鳴信号が１３Ｃ１−アラニンの右側の位置になる。非局所的なＭＲ分光シークエンスを用いて測定を行い、１３Ｃ−ＭＲコイル及び装置のＭＲ周波数が正しく設定されていることを確認した。腫瘍をカバーするよう１３Ｃ−画像の位置（スライス厚１０ｍｍ、平面ピクセルサイズ５×５ｍｍ２）を定めた。再構成段階で画像データにゼロフィリングを行い、２．５×２．５×１０ｍｍ３の分解能を得た。ＴＲＩＳ緩衝液（９０ｍＭ）に溶解した１３Ｃ１−ピルビン酸塩を、１０ｍｌ／ｋｇの用量で、１２秒間で、最小体積２ｍｌを尾静脈から注入し、注入開始から３０秒後（注入完了から１８秒後）に、化学シフト１３Ｃ−ＭＲシークエンスを開始した。
【００７４】
５．４．ＭＲイメージングデータの解析
ＭＲイメージングにより１６×１６要素のマトリックスが得られ、個々の要素又はピクセル／ボクセルは１３Ｃ−ＭＲスペクトルを含んでいる。再構成段階で、マトリックスに対し、空間分解能を増大するのに有用な数学的操作であるゼロフィリングを行い、３２×３２に拡大された。データセットは１０２４のスペクトルを含んでおり、さらに解析を行うために、Ｄｉｃｏｍフォーマットでエクスポートされた（ＤＩＣＯＭは、医療情報のデジタル通信に関する標準規格書を指定商品とする北米電子機器工業会の登録商標である）。これらのスペクトルのうち約半分は、ボクセルが動物の体外に位置していたので、ＭＲ信号を含んでいなかった。動物の体内では、ピルビン酸塩の信号強度が高く、乳酸塩及びアラニンがほとんど存在しないボクセル（血流プール）がある一方、他のボクセルはピルビン酸塩、アラニン及び乳酸塩がほぼ同量ずつ存在していた。
【００７５】
ピルビン酸塩、アラニン及び乳酸塩の強度は、以下の条件を含む時間領域フィッティング法を用いて求めた。ゼロ次の位相は、全データセットにわたって一定。
【００７６】
１次の位相は１．４ミリ秒。
【００７７】
時間領域の線幅又は減衰は、個々の代謝産物についてそれぞれ別個に、全データセットの平均線幅の０．５〜３倍の変動を許容。
【００７８】
周波数は、最も高いピーク（ユーザが定義する必要あり）について、全データセットにわたって観測された平均周波数に対して両方向に２０Ｈｚの変動を許容。
【００７９】
乳酸塩、アラニン及びピルビン酸塩の強度をマトリックス中で再配列し、再サンプリングを行い、プロトン解剖学的ＭＲ画像の分解能とのマッチングをとる。１３Ｃ−ＭＲ画像の解剖学的画像上への投影を自動的に行い、オペレータに依存しない結果を得る。結果は、ラットの腫瘍の解剖学的プロトン画像、解剖学的画像上に投影されたピルビン酸塩、乳酸塩及びアラニンに関する代謝１３Ｃ−画像を含む画像セットとして表示され、画像には、各ピクセルについて以下が表示される。
【００８０】
ａ）（［乳酸塩］ｎｏｒｍ×（［ピルビン酸塩］ｍａｘ−［ピルビン酸塩］）ｎｏｒｍ）×［乳酸塩］
ｂ）（［乳酸塩］ｎｏｒｍ×（［アラニン］ｍａｘ−［アラニン］）ｎｏｒｍ）×［乳酸塩］が表示されている。
【００８１】
ここで、「［・・・］ｎｏｒｍ」という用語は、正規化、すなわち、代謝画像における最大値へと調整された強度を表し、「［乳酸塩］」は、計算された強度を表す。
【００８２】
腫瘍領域に最も高い乳酸塩の信号がある状態又は腫瘍領域で乳酸塩のピルビン酸塩に対する比率が高く、かつ同じピクセル領域内で乳酸塩のアラニンに対する存在比率が高い状態が、１３Ｃ−ＭＲ画像における腫瘍組織と正常組織の識別が成功したと定義される。
【００８３】
５．５．生物学的分析
腫瘍部位には、目視による検査で出血の兆候が認められた。腫瘍をラットの身体から切り離し、秤量後半分に切断した。腫瘍の内部を目視により検査したところ、均質性、壊死及び出血が認められた。腫瘍組織を４％ホルマリン中に保存した。
【００８４】
腫瘍に罹ったラットのうち、以下の条件を満たすものが評価に適していると考えられる。
【００８５】
腫瘍の重量は１００ｍｇより多い。
【００８６】
腫瘍の内部に目視できる壊死や嚢胞が存在しない。
【００８７】
体温が３５℃以上である  ＭＲ検査の際に、動脈圧が６０ｍｍＨｇより高い。
【００８８】
５．６．結果
１８頭のラットについて、合計で３０の異なる腫瘍のイメージングを行った。１頭のラットについては失敗し、３つの腫瘍については、上の段落５．５に記載の生物学的条件を満たさなかった。残りの１７頭における２６の腫瘍は、均質であり、その内部は重量感があり壊死を起こしていない。注入時の１３Ｃ１−ピルビン酸塩の平均分極は２１．２±２．９％（平均±標準偏差）であり、ｐＨは８．０８±０．１４（平均±標準偏差）であった。
【００８９】
図１は、１頭のラットについて撮像した、（１）プロトンの参照画像で、図中の矢印は腫瘍の位置を示す、（２）１３Ｃ−ピルビン酸塩の画像、（３）１３Ｃ−乳酸塩の画像、（４）１３Ｃ−アラニンの画像、（５）１３Ｃ−ピルビン酸塩で補正した１３Ｃ−乳酸塩の画像及び（６）１３Ｃ−アラニンで補正した１３Ｃ−乳酸塩の画像よりなる典型的な画像の組を示す。画像（２）〜（６）は、プロトンの参照画像と融合している。
【００９０】
図２は、同じ画像の組を示すが、解剖学的プロトン画像と融合していない画像（２）〜（６）よりなる。
【００９１】
結果として、腫瘍の位置は、高い代謝活性に起因するピルビン酸塩の高信号（２）により示される。しかし、乳酸塩の信号（３）により、最終的に腫瘍の正確な位置が特定される。アラニンは、骨格筋内では観測されるが、腫瘍組織には存在しない（４）。ピルビン酸塩及びアラニンで補正した乳酸塩の信号（５）及び（６）は、いずれも腫瘍に対して優れたコントラストを有する。
【００９２】
このように、代謝画像で腫瘍の位置は乳酸塩の高信号、ピルビン酸塩で補正した乳酸塩の高信号及びアラニンで補正した乳酸塩の高信号によって示されることが実証された。
【００９３】
代謝１３Ｃ−ＭＲ画像の解析より、以下の症例数で腫瘍領域で代謝のコントラストを示した。
【００９４】
乳酸塩の信号については２６の腫瘍中２４例。
【００９５】
ピルビン酸塩で補正（５．５，，ａ）した乳酸塩の信号については２６の腫瘍中２６例。
【００９６】
アラニンで補正（５．５，ｂ）した乳酸塩の信号については２６の腫瘍中２６例。
【００９７】
本研究における全成功率は、２６例中２６例、１００％であった。
【００９８】
本研究により、腫瘍は、過分極１３Ｃ１−ピルビン酸塩を用いて同定され、対象となる領域（腫瘍）に、化合物の撮像が可能な時間内に到達し、化合物及びその代謝産物の撮像が可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】１頭のラットについて撮像した、（１）プロトンの参照画像で、図中の矢印は腫瘍の位置を示す、（２）１３Ｃ−ピルビン酸塩の画像、（３）１３Ｃ−乳酸塩の画像、（４）１３Ｃ−アラニンの画像、（５）１３Ｃ−ピルビン酸塩で補正した１３Ｃ−乳酸塩の画像及び（６）１３Ｃ−アラニンで補正した１３Ｃ−乳酸塩の画像からなる典型的な画像の組を示す図。画像（２）〜（６）は、プロトンの参照画像と融合している。
【図２】同じ画像の組であるが、解剖学的プロトン画像と融合していない画像（２）〜（６）からなる画像の組を示す図。
【図１】
2008508023.tif 000003
【図２】
2008508023.tif 000004
【国際調査報告】
2008508023.tif 000005
2008508023.tif 000006
2008508023.tif 000007