(57)【要約】  核酸の多形を検出するための方法および組成物を提供する。
2008520245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  プローブをポリヌクレオチドの多形を含むと思われる領域にアニーリングさせて複合体を形成すること（ここで、該プローブは非伸長性３’末端を含み、該多形に相補的でない）；
（ｂ）  該複合体を、該プローブおよび該ポリヌクレオチドを該プローブと該ポリヌクレオチド間のミスマッチの領域で切断する酵素または化学物質と接触させ、伸長性３’末端を有するプローブを生成させること；
（ｃ）  人工鋳型を添加すること（ここで、切断されたプローブは、人工鋳型を増幅させるためのプライマとしての機能を果たす）；および
（ｄ）  該人工鋳型を増幅させること（ここで、増幅産物の存在は多形の存在を示す）、
を含む、ポリヌクレオチドにおける多形の検出方法。
【請求項２】
前記プローブとポリヌクレオチド間のミスマッチの領域が、新たに生成された制限酵素部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、天然の供給源またはインビトロもしくはインビボ合成された核酸から得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、インビトロまたはインビボ合成されたＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのキメラである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブがその５’末端に、ポリヌクレオチドに相補的でないアダプタ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記プローブのアダプタ配列が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに相補的な配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ポリメラーゼからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵素が制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素がエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
酵素が、バクテリオファージＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、バクテリオファージＴ７エンドヌクレアーゼＩ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｍｕｔ  Ｙ、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  Ｓ、Ｍｕｔ  ＬおよびＣＥＬヌクレアーゼファミリーからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化学物質が、ヒドロキシルアミンおよび四酸化オスミウムからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
伸長および増幅が、鎖置換活性を有する、または有しないＤＮＡポリメラーゼによって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅が、ＰＣＲ、鎖置換型増幅、ローリングサークル増幅および定温核酸増幅方法からなる群より選択される方法を用いて行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記人工鋳型が非伸長性３’末端を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
人工鋳型が、ポリヌクレオチドに相補的な３’領域および５’末端に非特異的領域を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非特異的領域が、ＲＮＡポリメラーゼのアダプタプライマまたはプロモータ配列に相補的なアダプタを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プローブの非伸長性３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻止するように修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
人工鋳型が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
増幅された鋳型が、ＵＶ吸光度を測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
増幅された鋳型が、標識されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
増幅が、増幅反応で生成したピロリン酸塩を測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
増幅が、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣまたは質量分析を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
標識が、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、タンパク質タグ、抗体および酵素コンジュゲートからなる群より選択される、請求項２０、１３、１４に記載の方法。
【請求項２４】
プローブ、人工鋳型、および任意選択でアダプタプライマが、固相支持体上に固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
増幅が、アダプタ配列の任意の部分のために設計された標識プローブを用いて、リアルタイムＰＣＲによって行なわれる、請求項５に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）  標的核酸の一領域に相補的な、非伸長性３’末端を有する遺伝子特異的プローブを調製すること；
（ｂ）  該遺伝子特異的プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、二重らせんを形成させること（ここで、標的核酸がヌクレオチド多様性を含む場合、二重らせん内に多様性構造が形成される）；
（ｃ）  二重らせんを切断酵素または化学物質に曝露させること（ここで、該酵素または化学物質は、二重らせん内の多様性構造を切断して非伸長性３’末端を遺伝子特異的プローブから除去し、プローブおよび標的核酸上に新たな伸長性３’末端を生成させる）；および
（ｄ）  切断された遺伝子特異的プローブまたは標的核酸をプライマとして用い、人工鋳型を増幅させること
を含む、標的核酸間のヌクレオチド多様性の検出方法。
【請求項２７】
増幅が、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ系増幅によって行なわれる、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国居住者で、すべての国を指定した出願人であるＸｉａｏ  Ｂｉｎｇ  Ｗａｎｇの名義で２００５年１１月１８日にＰＣＴ国際特許出願として出願されたものであり、２００４年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６３５，５６８号に対する優先権を主張するものであり、許容される場合には、引用によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
背景
１．技術分野
本開示は、一般的に、核酸、特に、特定の位置に１つ以上の特異的ヌクレオチドを有する核酸を検出するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術
遺伝子の変異は、重篤な生物学的疾患、例えば、癌および遺伝性疾患などを引き起こし得る。変異の検出は、遺伝性疾患の早期診断を補助し、薬物療法に関する個別化された情報を提供し得る。
【０００４】
ミスマッチ修復酵素を用いて核酸多様性を検出する配列決定をしない方法が知られている（米国特許第５，６９８，４００号；同第５，９５８，６９２号；同第５，２１７，８６３号；同第６，４５５，２４９号；同第６，１１０，６８４号；および同第５，８９１，６２９号）。これらの方法は、一般的に、１）プローブを標的核酸にハイブリダイズさせること；２）プローブと標的核酸間のミスマッチを、酵素または化学物質を用いて切断すること；および３）切断された断片を検出することを含む。これらの方法の不都合な点の１つは、検出が、実際に切断された断片の検出に限定されるため、感度が低いことである。試料が、低コピー数の標的核酸（例えば、多様性対立遺伝子）を含む場合、標的核酸は、切断反応に大量の標的核酸を用いても検出されにくい。他の方法では、切断にＰＣＲ増幅産物が用いられる。しかしながら、ＰＣＲ予備増幅の問題点は、非選択的な核酸増幅である。試料が野生型対立遺伝子で占められる場合、典型的には、増幅によって、多様性コピーよりも多くの野生型コピーがもたらされる。この不均衡な増幅により、検出の感度がさらに低下する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本開示の一態様は、（１）非伸長性３’末端を有する遺伝子特異的核酸プローブ（プローブ）を調製すること；（２）プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、二重らせんを形成させること；（３）該二重らせんを、プローブと標的核酸間のミスマッチにより生じる構造を認識して切断することができる切断酵素または化学物質に曝露すること；（４）ミスマッチにより生じる構造を切断して非伸長性３’末端をプローブから除去し、該プローブおよび任意選択で標的核酸上に新たな伸長性３’末端を生成させること；（５）プライマ系またはポリメラーゼプロモータ系の増幅方法による選択的増幅のために、切断されたプローブまたは標的核酸をプライマまたは／および鋳型として用いること；および（６）増幅された核酸産物を検出すること（ここで、増幅された産物は、標的核酸における配列多様性または多形の存在を示す）を含む、核酸におけるヌクレオチド塩基多様性を検出するための方法を提供する。
【０００６】
別の態様は、（１）プローブをポリヌクレオチドに、該ポリヌクレオチドの多形を含むと思われる領域にアニーリングさせて複合体を形成すること（ここで、該プローブは非伸長性３’末端を含み、多形に相補的でない）；（２）該複合体を、該プローブおよび該ポリヌクレオチドを該プローブと該ポリヌクレオチド間のミスマッチの領域で切断する酵素または化学物質と接触させ、伸長性３’末端を有するプローブを生成させること；（３）人工鋳型を添加すること（ここで、切断されたプローブは、人工鋳型を増幅させるためのプライマとしての機能を果たす）；および（４）該人工鋳型を増幅させること（ここで、増幅産物の存在は多形の存在を示す）を含む、ポリヌクレオチドにおける多形の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
開示した主題の態様は、変異型対立遺伝子を予備切断し、次いで、切断された変異型対立遺伝子を、野生型対立遺伝子を増幅することなく選択的に増幅させる方法を提供する。この特徴により、高比率で野生型対立遺伝子を含む混合試料中での検出感度が増大し、低いコピー数の変異型対立遺伝子の検出が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
詳細な説明
定義
本明細書で用いる場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は互換的であり、デオキシリボヌクレオシドで構成されたもの、またはリボヌクレオシドで構成されたもののいずれか、また、ホスホジエステル結合で構成されたもの、または修飾された結合（例えば、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホン酸メチレン、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびかかる結合の組合せなど）で構成されたもののいずれかの任意の核酸をいう。
【０００９】
また、核酸、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドという用語には、具体的には、生体に存在する５種類の塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成された核酸も包含される。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾された塩基部分を含有するものであり得、該塩基部分は、限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄマンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む群から選択されるものである。
【００１０】
さらにまた、本発明のポリヌクレオチドは、限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１
個の修飾された糖成分を含有するものであり得る。本発明を、ポリヌクレオチドの供給源によって限定することを意図しない。該ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物または任意の他の生物体に由来するものであり得るか、または任意の組換え供給源から誘導されたもの、インビトロもしくは化学合成により合成されたものであり得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ハイブリッドまたはこれらの任意の混合物であり得、二本鎖、一本鎖または部分的に二本鎖の形態で存在するものであり得る。本発明の核酸には、精製された形態または未精製形態の核酸およびその断片の両方が含まれ、遺伝子、染色体、プラスミド、生体物質、例えば、微生物、例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒトのゲノムなどが挙げられる。
【００１１】
核酸は、複合体混合物、例えば、生物学的試料の微量画分に過ぎないことがあり得る。核酸は、生物学的試料から、当該技術分野でよく知られた手順によって得られ得る。
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、検出の目的のために、ビオチン化、アミン修飾、アルキル化、または同様の他の修飾によって誘導体化または修飾され得る。場合によっては、例えば、ヌクレアーゼの安定性の増大が所望される場合、本発明では、修飾されたヌクレオシド間結合を有する核酸が使用され得る。例えば、ホスホネートホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートメトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン−スルフィド、ジメチレンスルホキシド、ジメチレン−スルホン、２’−Ｏ−アルキル、および２’−デオキシ−２’−フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する核酸を合成するための方法が、当該技術分野でよく知られている（Ｕｈｌｍａｎら，１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら  １９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５、およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。
【００１３】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い単鎖のポリヌクレオチドであって、通常、合成由来のものをいう。オリゴヌクレオチドは、典型的には、８〜１００ヌクレオチド長、好ましくは２０〜８０ヌクレオチド長、より好ましくは３０〜６０ヌクレオチド長である配列で構成される。種々の手法が、本発明で用いるオリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。かかるオリゴヌクレオチドは、生合成または化学合成によって得られ得る。短い配列（約１００までのヌクレオチド）には、多くの場合、化学合成が、生物学的合成と比べてより経済的である。経済性に加え、化学合成は、合成中に低分子量化合物および／または修飾塩基を組み込む簡便な方法を提供する。さらにまた、化学合成は、標的ポリヌクレオチド結合配列の長さおよび領域の選択において非常に融通性がある。オリゴヌクレオチドは、標準的な方法、例えば、市販の自動核酸合成装置で用いられるものなどによって合成され得る。適切に改質されたガラスまたは樹脂上でのＤＮＡの化学合成により、その表面に共有結合したＤＮＡがもたらされ得る。これは、洗浄および試料取扱いにおける利点を提供し得る。より長い配列には、分子生物学において用いられる標準的な複製方法が使用され得、例えば、Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１  ：２０−７８に記載のような単鎖のＤＮＡに対するＭ１３の使用が挙げられる。オリゴヌクレオチド合成の他の方法としては、ホスホトリエステル／ホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇら，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０）および支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅら，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２）ならびにホスホルアミデート合成、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９８８，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７−３１４や、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ」  Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７およびそこに示された参考文献に記載された他の方法が挙げられる。
【００１４】
オリゴヌクレオチド「プライマ」は、ポリヌクレオチド鋳型を用いる鎖伸長反応、例えば、核酸の増幅などに使用され得る。オリゴヌクレオチドプライマは、通常、単鎖であって、その３’末端またはその付近に、標的または参照ポリヌクレオチドの規定された配列とハイブリダイズすることができるハイブリダイズ可能な配列を含有する合成オリゴヌクレオチドである。通常、オリゴヌクレオチドプライマのハイブリダイズ可能な配列は、規定された配列またはプライマ結合部位に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相補性を有する。本発明のある特定の実施形態では、プライマの配列は、理想的な相補性のものから、生じるアンプリコン（以下に記載）内に変異を導入するものまで種々であり得る。オリゴヌクレオチドプライマのハイブリダイズ可能な配列内のヌクレオチド数は、オリゴヌクレオチドプライマをハイブリダイズさせるために用いられるストリンジェンシー条件によって、過剰なランダムな非特異的ハイブリダイゼーションが抑制されるようなものであるのがよい。通常、オリゴヌクレオチドプライマのハイブリダイズ可能な配列内のヌクレオチド数は、少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは２０〜５０個のヌクレオチドである。また、プライマは、その５’末端に、標的または参照ポリヌクレオチド（１〜６０個のヌクレオチド、５〜３０個のヌクレオチド、または好ましくは８〜３０個のヌクレオチドを有するものであり得る）にハイブリダイズしない配列を有し得る。
【００１５】
用語「試料」は、目的の核酸を含有すると思われる材料をいう。かかる試料としては、生体液、例えば、血液、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、糞便、尿、髄液など；生物学的組織、例えば、毛髪および皮膚；などが挙げられる。他の試料としては、細胞培養物など、植物、食品、法医学的試料、例えば、紙、織物および擦過標本、水、汚水、医薬などが挙げられる。必要な場合は、試料を、試料を液化するため、および／または核酸を結合物質から放出させるための試薬で前処理してもよい。かかる前処理は、当該技術分野でよく知られている。
【００１６】
用語「増幅」は、核酸に適用する場合、１つ以上のコピー数の核酸の形成をもたらす任意の方法をいい、この場合、好ましくは、増幅は指数関数的である。特異的ＤＮＡ配列の酵素的増幅のためのかかる方法の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られているものであり、Ｓａｉｋｉら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４に記載されている。ＰＣＲに用いられるプライマは、長さが、約１０から５０以上のヌクレオチドまで種々であり得、典型的には、充分な特異性が確保される少なくとも約１５ヌクレオチドとなるように選択される。生成される二本鎖の断片は、「アンプリコン」と呼ばれ、長さは、わずか約３０ヌクレオチド程度から２０，０００以上まで種々であり得る。用語「鎖伸長」は、ヌクレオチドまたは塩基の付加によるポリヌクレオチドの３’末端の伸長をいう。本発明と関連する鎖伸長は、一般的に鋳型依存性、すなわち、付加されるヌクレオチドは、伸長鎖がハイブリダイズする鋳型核酸の配列によって決定される。生成される鎖伸長産物の配列は鋳型配列に相補的である。通常、鎖伸長は酵素により触媒され、好ましくは、本発明では熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ａｃｑｕａｔｉｃｕｓに由来する酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓに由来する酵素などによって触媒される。
【００１７】
２つの核酸配列は、（１）互いに同一であるか、または（２）該２つの核酸配列を互いに区別する配列における一部の違いがなければ同一であり得るかのいずれかで場合、「関連している」か、または「対応している」。該違いは、配列内の任意の単一のヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る。かかる違いを、本明細書において「２つの関連する核酸配列間の違い」という。多くの場合、関連する核酸配列は、互いに単一のヌクレオチドだけ異なる。関連する核酸配列は、典型的には、少なくと
も１５個の同一のヌクレオチドを各末端に含有するが、異なる長さを有するか、または少なくとも１個のヌクレオチドだけ異なる介在配列を有する。
【００１８】
用語「変異」は、通常は保存される核酸配列のヌクレオチド配列における変化であって、正常（非改変）または野生型配列から分化した変異型の形成をもたらすものをいう。変異は、通常、２つの一般的な類型、すなわち塩基対置換およびフレームシフト変異に大別され得る。後者は、１〜数個のヌクレオチド対の挿入または欠失を伴う。１個のヌクレオチドの違いは、例えば、鎌状赤血球貧血の場合のように、表現型の正常性または異常性に関して重要であり得る。
【００１９】
「二重らせん」は、互いにアニーリングした２つの相補的な配列で構成される二本鎖の核酸配列である。「部分的二重らせん」は、一方の鎖の一部分が他方の鎖に相補的であり、アニーリングして部分的二重らせんを形成し得るが、両鎖の全長が相補的であるわけではなく、該部分的二重らせんの少なくとも一方の末端に一本鎖のポリヌクレオチドテイルがもたらされた二本鎖の核酸配列である。
【００２０】
用語「ハイブリダイゼーション」、「結合」および「アニーリング」は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列に関して互換的に用いる。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、該２つのヌクレオチド配列の相補性の程度に基づき、相補性の程度は、マッチした相補的ヌクレオチド対の割合に基づく。所与の配列において、別の配列に相補的なヌクレオチドが多いほど、ハイブリダイゼーションのための条件は、よりストリンジェントになり得、該２つの配列の結合は、より特異的になる。ストリンジェンシーの増大は、典型的には、温度を上昇させること、補助溶媒の比率を増加させること、塩濃度を低下させること、および当該技術分野でよく知られた他のかかる方法によって達成される。
【００２１】
２つの配列は、一方の配列が他方の配列に、逆平行センスに結合（各配列の３’末端が他方の配列の５’末端に結合し、そのため、一方の配列の各Ａ、Ｔ（Ｕ）、ＧおよびＣが、他方の配列のＴ（Ｕ）、Ａ、ＣおよびＧと整列）し得る場合、「相補的」である。
【００２２】
本明細書で用いる場合、「一塩基多形」または「ＳＮＰ」は、別のポリヌクレオチドと、単一のヌクレオチド交換によって異なるポリヌクレオチドをいう。例えば、限定されないが、ポリヌクレオチドの全配列において１つのＡが１つのＣ、ＧまたはＴと交換されていると、ＳＮＰが構成される。もちろん、特定のポリヌクレオチド内に２つ以上のＳＮＰを有することが可能である。例えば、ポリヌクレオチド内の１つの遺伝子座ではＣがＴに交換されており、別の遺伝子座ではＧがＡに交換されているものなどであり得る。ＳＮＰに言及する場合、ポリヌクレオチドは、ほとんどの場合、ＤＮＡであり、ＳＮＰは、通常、ＳＮＰが存在する生物体の遺伝子型に有害な変化をもたらすものである。
【００２３】
「多形を含むと思われる」によって、本発明の方法に供されるポリヌクレオチド（通常、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、既知配列であって、該配列内の既知の遺伝子座に特定の多形を含むことができることがわかっていることが意図される。
【００２４】
本明細書で用いる場合、「鋳型」は、標的ポリヌクレオチド鎖、例えば、限定されないが、ポリメラーゼが、天然に存在する鎖の相補鎖を重合するために、次に伸長鎖内に組み込むべきヌクレオチドを認識する手段として使用する非修飾の天然に存在するＤＮＡ鎖をいう。かかるＤＮＡ鎖は、一本鎖であり得るか、または二本鎖ＤＮＡ鋳型の一部分であり得る。重合の反復サイクルが必要とされる本発明の適用、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、鋳型鎖自体が、修飾ヌクレオチドの組込みによって修飾状態となり得るが、依然としてさらなるポリヌクレオチドを合成するためのポリメラーゼの鋳型としての機
能を果たす。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「標識」または「タグ」は、例えば、限定されないが、共有結合またはハイブリダイゼーションによって、別の分子（例えば、これも限定されないが、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド断片）に付加されたとき、他方の分子を検出するための手段を提供または増強する分子をいう。蛍光または蛍光標識またはタグは、異なる波長で励起されると、検出可能な特定波長の光を放射する。放射能標識または放射性タグは、限定されないがシンチレーションカウンタなどの機器で検出可能な放射能粒子を放射する。
【００２６】
ある波長の光を吸収し、次いで第２波長の検出可能な光を放射する分子は、上記に規定のような蛍光標識を含み、本明細書において「フルオロフォア」という。
【００２７】
「質量変更された（ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ヌクレオチドは、原子または化学置換基が付加、欠失または置換されたヌクレオチドであるが、かかる付加、欠失または置換によって、該ヌクレオチドに本明細書に規定のようなヌクレオチド特性の変更はもたらされない；すなわち、付加、欠失または置換の効果は、ヌクレオチドの質量を変更することだけである。
【００２８】
実施形態
一実施形態は、ポリヌクレオチドにおける多形の検出方法を提供する。該方法は、プローブをポリヌクレオチドに、該ポリヌクレオチドの多形を含むと思われる領域にアニーリングさせて複合体を形成することを含み、ここで、該プローブは非伸長性３’末端を含み、多形に相補的でない。一般的に、プローブはポリヌクレオチドに、多形がプローブの３’と５’末端間に存在するようにアニーリングする。多形は、１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の連続または非連続ヌクレオチドであり得る。プローブが多形を有するポリヌクレオチドにアニーリングすると、多様性構造またはミスマッチ構造が生じる。該構造は、隆起（ｂｕｌｇｅ）、ループ、またはプローブと多形間のヌクレオチドのミスマッチにより生じる他の立体構造であり得る。
【００２９】
該方法は、該複合体を、該プローブおよび該ポリヌクレオチドを該プローブと該ポリヌクレオチド間のミスマッチの領域で切断する酵素または化学物質と接触させ、伸長性３’末端を有するプローブを生成させることをさらに含む。人工鋳型を添加し、この場合、切断されたプローブは、人工鋳型を増幅させるためのプライマとしての機能を果たす。該方法は、人工鋳型を増幅させることをさらに含み、ここで、増幅産物の存在は多形の存在を示す。
【００３０】
別の実施形態は、（１）非伸長性３’末端を有する遺伝子特異的核酸プローブ（プローブ）を調製すること；（２）プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、二重らせんを形成させること；（３）二重らせんを、プローブと標的核酸間のミスマッチにより生じる構造を認識して切断することができる切断酵素または化学物質に曝露すること；（４）ミスマッチにより生じる構造を切断して非伸長性３’末端をプローブから除去し、該プローブおよび任意選択で標的核酸上に新たな伸長性３’末端を生成させること；（５）プライマ系またはポリメラーゼプロモータ系の増幅方法による選択的増幅のために、切断されたプローブまたは標的核酸をプライマまたは／および鋳型として用いること；および（６）増幅された核酸産物を検出すること（ここで、増幅された産物は、標的核酸における配列多様性または多形の存在を示す）を含む、核酸におけるヌクレオチド塩基多様性を検出するための方法を提供する。
【００３１】
標的核酸
標的核酸またはポリヌクレオチドは、天然もしくは合成のＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド（インビトロもしくはインビボ）であり得る。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であり得る。典型的には、ポリヌクレオチドは、所定の位置に多形（例えば、一塩基多形）を有すると思われる遺伝子に対応する。多形は、欠失、挿入または置換の結果であり得る。多形は、既知配列と比べて、例えば、第１の対立遺伝子を特徴とする。したがって、第１の対立遺伝子のヌクレオチド配列がわかっている場合、該配列由来の多様性または多形が検出され得る。一般的に、単一の多形が、病変、例えば鎌状赤血球貧血をもたらし得ることが認められている。したがって、開示した方法および組成物は、既知の多形と関連する疾病の存在または患者の素因を発見または診断するために使用され得る。
【００３２】
遺伝子特異的プローブ
非伸長性遺伝子特異的プローブ（プローブ）は、非伸長性３’末端および任意選択でアダプタ部分を５’末端に有する配列特異的部分を含む（図１）。配列特異的部分は、標的核酸の特定領域、例えば、多形を含む領域に相補的な配列を有する。プローブの配列特異的部分は、野生型または変異型標的核酸の目的の該特定領域に相補的であり得る。遺伝子特異的プローブは、任意選択で、標的核酸に相補的でないアダプタ配列を含有する。このアダプタ配列は、さらなる増幅のために、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモータなど）に相補的な配列を含み得る。遺伝子特異的プローブは、インビトロもしくはインビボで合成された核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組合せであり得る。遺伝子特異的プローブの３’末端は、ポリメラーゼによる伸長反応が抑制回避されるように非伸長性となるように修飾される。修飾は、プライマ伸長反応を阻止する部分を付加することによりなされ得る。阻止部分としては、限定されないが、ターミネータヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、付加的な非マッチヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはタンパク質部分などの化学物質基が挙げられる（図１）。
【００３３】
人工鋳型
また、人工鋳型も、開示した方法とともに使用され得る。人工鋳型は、遺伝子特異的部分を３’末端に、および非特異的部分を５’末端に含むポリヌクレオチドである。鋳型の３’末端は、ポリメラーゼによる伸長を阻止するように修飾される。修飾は、プライマ伸長反応を阻止する部分（限定されないが、ターミネータヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、付加的な非マッチヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびタンパク質部分などの化学基が挙げられる）を付加することによりなされ得る。遺伝子特異的部分は、切断された遺伝子特異的プローブまたは標的核酸の３’末端部分に相補的な配列を有する。非特異的部分は、遺伝子特異的プローブまたは標的核酸に相補的でない。非特異的部分は、任意選択で、アダプタプライマに相補的なアダプタ配列、またはＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列に相補的な配列を含有する（図１Ｂ）。
【００３４】
アダプタプライマ
アダプタプライマ（アダプタ）は、遺伝子特異的プローブのアダプタ部分に相補的なヌクレオチド配列を有する（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００３５】
切断−増幅反応
多形を有すると思われる標的核酸またはポリヌクレオチドを、遺伝子特異的プローブと混合する。遺伝子特異的プローブは、多形を有しない該ポリヌクレオチドに相補的となるように設計する。混合物を加熱して核酸を変性させ、次いで、冷却してプローブを標的核酸とアニーリングさせ、二重らせんを形成させる（図２）。標的核酸が配列多様性または多形を有する場合、プローブおよび標的核酸は、多様性構造またはミスマッチ構造を二重らせん内に形成する。多様性構造は、配列多様性またはミスマッチ塩基対によってもたらされた新たに生成された制限酵素部位であり得る。二重らせんを、二重らせん内の多様性
構造を化学的に切断する切断酵素または化学物質を含有する反応溶液に曝露する。該酵素が多様性構造を切断し、それによりプローブの非伸長性３’末端が除去され、該プローブに新たな伸長性３’末端を生成させる。プローブは活性化され、伸長性となる。また、切断により、新たな伸長性３’末端が標的核酸上にも生成される。切断されたプローブおよび標的核酸は、プライマ系増幅またはＲＮＡポリメラーゼプロモータ系増幅のプライマとしての機能を果たす。任意の増幅核酸の検出は、標的核酸における多様性または多形の存在を示す（図２および図３）。
【００３６】
プライマ系増幅方法としては、限定されないが、ＰＣＲ、鎖置換型増幅、ローリングサークル増幅、および定温核酸増幅（ＷＯ２００４０６７７２６Ａ２、ＷＯ２００４０５９００５）が挙げられる。
【００３７】
ＰＣＲ増幅では、切断された遺伝子特異的プローブまたは標的核酸はプライマとしての機能を果たし、ＰＣＲ増幅は、切断された遺伝子特異的プローブと人工鋳型間で行なわれる（図２）。
【００３８】
別の実施形態では、標的核酸またはプローブの新たに生成された３’末端を、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに相補的な配列を含有する人工鋳型を用いて伸長させ、プロモータ構造を形成させ得る。切断シグナルは、ＲＮＡポリメラーゼ増幅によって検出され得る（図３）。
【００３９】
別の実施形態では、標的核酸の新たに生成された３’末端を、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータに相補的な配列を含有する非切断のプローブまたは人工鋳型を用いて伸長させ、プロモータ構造を形成させ得る。切断シグナルは、ＲＮＡポリメラーゼ増幅によって検出され得る（図３）。
【００４０】
増幅産物を検出するため、遺伝子特異的プローブおよびアダプタプライマをタグ化し、検出可能な部分または標識とハイブリダイズさせ得るか、あるいは該部分または標識を組み込み得る。該部分は、任意の型の検出可能な分子であり得、限定されないが、フルオロフォア、ビオチン、ジゴキシゲニン、タンパク質タグなどのタンパク質、または抗体が挙げられる。
【００４１】
遺伝子特異的プローブ、遺伝子特異的リバースプライマおよびアダプタプライマを、分離および検出の目的のために、固相または支持体に固定化してもよい。
【００４２】
多様性構造を切断するために使用される切断酵素は、あらゆる型のミスマッチを認識して切断する任意の型の制限エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼであり得る。かかる酵素としては、限定されないが、バクテリオファージＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ（Ｋｏｓａｋら，（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：７７９）またはバクテリオファージＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ｄｅＭａｓｓｙ，Ｂ．，ら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：３５９）、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｍｕｔ  Ｙ、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  ＳおよびＭｕｔ  Ｌ修復タンパク質ファミリー（Ｗｅｌｓｈ，Ｋ．Ｍ．ら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５６２４−１５６２９）、セロリ由来のミスマッチヌクレアーゼのＣＥＬヌクレアーゼファミリー（Ｏｌｅｙｋｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ａ．ら（１９９８）．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４５９７−４６０２）が挙げられる。
【００４３】
また、ミスマッチ構造は、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムなどの化学物質での処理によって切断され得る。
【００４４】
増幅された核酸は、ＵＶ吸光度を測定することにより、または蛍光色素サイバーグリーンなどの検出可能な色素で染色することにより検出され得る。また、検出は、標識プローブ、プライマを用いて増幅産物を標識すること、または標識されたヌクレオチドを増幅産物内に組み込むことによりなされ得る。増幅産物は、増幅反応で生じるピロリン酸塩（ＰＰｉ）を測定することにより検出され得る。該方法では、サイズ分画アプローチが利用され得、例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬＣおよび質量分析計が、検出のための標識方法とともに、またはこれらと組み合わせて使用され得る。
【００４５】
増幅はまた、リアルタイムＰＣＲにより行なわれ得る。遺伝子特異的プローブ内のアダプタ配列およびアダプタプライマ、またはプローブとプライマ間の配列のいずれかの部分に対するリアルタイムＰＣＲハイブリダイゼーションのために、標識プローブが設計される（図４）。標識プローブとしては、限定されないが、Ｔａｑｍａｎプローブ、分子ビーコンプローブまたはＳｃｏｐｉｎｅプローブが挙げられる。
【００４６】
別の実施形態は、特異的核酸多形を検出するために設計されたプローブ、アダプタプライマ、人工鋳型、およびミスマッチ構造を切断するための酵素または化学物質を含むキットを提供する。キットは、任意選択で、人工鋳型を増幅させるための試薬、およびキットを用いて特定の多形を検出するための使用説明書を含む。
【００４７】
検出可能な標識
開示したプローブまたは標的は、検出可能な標識、例えば第１の検出可能な標識を含み得る。試料ポリヌクレオチドは、検出可能な標識、例えば第２の検出可能な標識を含み得る。適切な標識としては、放射能標識および非放射能標識、直接検出可能な標識および間接的に検出可能な標識などが挙げられる。直接検出可能な標識は、１種類以上のさらなる化学薬剤との相互作用なしで直接検出可能なシグナルを提供する。適切な直接検出可能な標識としては、比色標識、蛍光標識などが挙げられる。間接的に検出可能な標識は、１種類以上のさらなる成分と相互作用して検出可能なシグナルを提供する。適切な間接的標識としては、標識された抗体に対するリガンドなどが挙げられる。
【００４８】
適切な蛍光標識としては、当該技術分野で知られた任意の種々の蛍光標識が挙げられる。具体的に好適な蛍光標識としては、キサンテン系色素、例えば、フルオレセインおよびローダミン色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオレセイン（一般に、ＦＡＭおよびＦの略号で知られている）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、ならびにローダミン１１０；シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンジミド色素、例えば、ヘキスト３３２５８；フェナントリジン色素、例えば、テキサスレッド；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５など；ＢＯＤＩＰＹ色素およびキノリン色素が挙げられる。
【実施例１】
【００４９】
コドン１２におけるＫ−ｒａｓ点変異（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）の同定
コドン１２におけるＫ−ｒａｓ変異（ＧＧＴ＞ＧＡＴ）により、ＢｃｃＩの新たな制限酵素部位が生じる。この変異を検出するため、変異の両側のフランキング配列に相補的なプローブを、切断および増幅用に設計する。
【００５０】
非伸長性遺伝子特異的プローブ
5'-TGTTCTTGTTTATTCGACACAGTTCTTCATAAACTTGTGGTAGTTGGAG CTGATGGTTT*（配列番号１）
＊は、逆位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ｄＴＴＰである。
【００５１】
人工鋳型
5'-CTTGTTCTTGTTTATTCGACACAGTTCTTC GCTTTGGCCG
CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCTCCAACTACCACAAGTTTATCCGAAA*（配列番号２）
＊は、ｄｄＡＴＰである。
【００５２】
アダプタプライマ
CTTGTTTATTCGACACAGTTCTTC（配列番号３）
ＤＮＡ試料
野生型ゲノムＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａから購入したものであり、変異型ＤＮＡは、ＡＴＣＣ（＃ＣＲＬ−２５４７）のヒト膵臓腺癌細胞から、市販のＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによって抽出した。ゲノムＤＮＡの最終濃度を１００ｎｇ／μｌに調整した。
【００５３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、０．１〜１μｇのゲノムＤＮＡ、０．０５μＭのプローブ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する全量１０μｌのハイブリダイゼーション溶液中で行なった。混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで、５０℃まで２５分間で冷却した。
【００５４】
酵素切断
切断は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ
ジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、および２単位のＢｃｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ）を含有する全量１０μｌの溶液中で、３７℃にて１時間行なった。
【００５５】
増幅
切断後、１０μｌの切断混合物を、最終濃度０．１μＭの人工鋳型（配列番号：２）、０．５μＭのアダプタプライマ（配列番号：３）、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２単位のプラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する４０μｌの増幅溶液に移した。ＰＣＲ増幅は、サーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ）にて行ない、サイクル条件は以下の通りとした：９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間を３５サイクル、７２℃で１０分間を１サイクル。ＰＣＲ反応後、１０ｕｌのＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルにて解析し、ＤＮＡバンドを臭化エチジウムで染色することにより可視化した。
【００５６】
結果を図５に示し、以下の表にまとめる。
【００５７】
【表１】
2008520245.tif 000003
【００５８】
１９８塩基対のＰＣＲ増幅産物が、変異型ＤＮＡを入れたチューブ内で検出された。野生型ＤＮＡを用いた場合では増幅産物は検出されなかった（図５）。ＤＮＡ鋳型なし、または酵素処理なしのＤＮＡ鋳型を有するコントロールチューブでは、増幅は見られなかった（図５）。増幅されたＰＣＲ産物は、試料中の変異対立遺伝子の存在を示した。
【実施例２】
【００５９】
コドン５９９におけるＢ−ｒａｆ変異（ＧＴＧ＞ＧＡＧ）の同定
コドン５９９におけるＢ−ｒａｆ変異（ＧＴＧ＞ＧＡＧ）は、新たな制限酵素部位をもたらさなかった。この変異を検出するため、野生型配列を用いて相補的プローブを設計し、ハイブリダイズさせ、変異型対立遺伝子を有するミスマッチ構造を形成させる。プローブをミスマッチの位置で、ミスマッチ切断酵素によって切断する。切断されたプローブは、ＰＣＲ増幅用のプライマとしての機能を果たす。
【００６０】
非伸長性遺伝子特異的プローブ
5'-GTTCTTGTTTATTCGACACAGTTCTTCGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT GAAATCTC*A*G*T*T*T**（配列番号４）
＊は、チオール修飾遺伝子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を有するヌクレオチド塩基であり、＊＊は逆位ｄＴＴＰである。
【００６１】
人工鋳型
5'-CTTGTTCTTGTTTATTCGACACAGTTCTTC GCTTTGGCCG
CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG
CATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTTTT*（配列番号５）
＊はｄｄＴＴＰである。
【００６２】
ＤＮＡ鋳型
ゲノムＤＮＡは、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８９（６）：２８６７−２８７２に記載の甲状腺癌細胞株から調製する。ゲノムＤＮＡの最終濃度を１００ｎｇ／μｌに調整する。
【００６３】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションは、１μｇのゲノムＤＮＡ、０．０５ｕＭプローブ（配列番号：４）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する全量２０μｌの溶液中で行なう。混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで、５０℃で２５分
間インキュベートした。
【００６４】
酵素切断
ハイブリダイゼーション後、２単位のＣｅｌ  Ｉヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ）をハイブリダイゼーション混合物に添加した。切断を３７℃で１時間行なった。切断後、酵素をチューブ内で熱不活化した（９５℃で１０分間）。
【００６５】
増幅
ＰＣＲ増幅および結果の解析を、実施例１に記載の条件下で行なった。最終濃度は、人工鋳型（配列番号  ５）では０．１μＭであり、アダプタプライマ（配列番号３）では０．５μＭである。
【００６６】
結果を図６に示し、以下の表にまとめる。
【００６７】
【表２】
2008520245.tif 000004
【００６８】
特異的な２００塩基対の増幅産物が、プローブおよび変異を有するＤＮＡを入れたチューブ番号４から検出されたが、プローブおよび野生型ＤＮＡ試料を入れたチューブ番号２からは検出されなかった。結果は、試料中の変異の存在を示した。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、例示的な切断−増幅系のための遺伝子特異的プローブ、人工鋳型およびアダプタプライマの模式図を示す。
【図２】図２は、切断−増幅検出のための例示的な方法を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ系増幅による増幅の例示的な方法を示す。
【図４】図４は、リアルタイムＰＣＲ法を用いることによる切断産物の増幅のためのプローブ設計の模式図を示す。
【図５】図５は、例示的な方法での増幅産物を有するゲルを示す。
【図６】図６は、別の例示的な方法での増幅産物を有するゲルを示す。
【図１】
2008520245.tif 000005
【図２】
2008520245.tif 000006
【図３】
2008520245.tif 000007
【図４】
2008520245.tif 000008
【図５】
2008520245.tif 000009
【図６】
2008520245.tif 000010
【配列表】
2008520245000001.app
【国際調査報告】
2008520245.tif 000011