(57)【要約】  本発明は、マロニル−ＣｏＡからの、最終的にはグルコースのような単純な出発物質から得られるフロログルシノールの生合成生産のための方法、酵素、および細胞を提供し、生合成フロログルシノールの誘導体（例えば、レソルシノールを含む）を調製するための方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、またはＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、またはその細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）。
【請求項２】
酵素系または細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項１に記載の酵素系または細胞。
【請求項３】
少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素をさらに含んでなる、請求項１に記載の酵素系。
【請求項４】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素がマロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項３に記載の酵素系。
【請求項５】
同化フロログルシノールの生産のための工程であって、
（Ａ）
（１）
（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである、単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または
（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである、ＰｈｌＤ＋組換え細胞、または
（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されている、ＰｈｌＤ＋組換え細胞
（ここで、該酵素系または組換え細胞は、炭素源をフロログルシノールへと変換することができる）；および
（２）マロニル−ＣｏＡ、または該酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡへと変換することができる別の炭素源の少なくとも１つ
を提供するステップ；および
（Ｂ）
（１）該マロニル−ＣｏＡと該酵素系もしくは組換え細胞とを、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ、または
（２）該他の炭素源と該酵素系もしくは組換え細胞とを、該炭素源をマロニル−ＣｏＡへと変換することができ、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ
を含む、工程。
【請求項６】
酵素系（１)（a）または細胞（１)（b）がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項５に記載の工程。
【請求項７】
酵素系または組換え細胞がマロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなる、請求項５に記載の工程。
【請求項８】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素がマロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項５に記載の工程。
【請求項９】
請求項５に記載の工程によって製造されたフロログルシノール。
【請求項１０】
マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる単離または組換えフロログルシノールシンターゼ酵素。
【請求項１１】
配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の酵素。
【請求項１２】
配列番号：２と少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の酵素。
【請求項１３】
配列番号：２のアミノ酸配列の保存的置換変異体を含んでなる、請求項１２に記載の酵素。
【請求項１４】
ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであり、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでなる単離または組換え核酸。
【請求項１５】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをさらに含んでなる、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号：１である塩基配列、それに対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれと重複するコドン配列を含んでなる、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１７】
配列番号：１と少なくとも８０％相同である塩基配列を含んでなる、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１８】
請求項１４に記載の核酸で形質転換されており、それによりフロログルシノールシンターゼを発現することができる、ｐｈｌＤ＋組換え細胞。
【請求項１９】
ｐｈｌＤ＋組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ｐｈｌＤ＋組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２１】
レソルシノールの調製のための工程であって、
（Ａ）
（１）（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール；および
（２）水素およびロジウム触媒
を提供すること；および
（Ｂ）前記フロログルシノールと水素およびロジウム触媒とを、該フロログルシノールが水素化されてレソルシノールが生成される条件下で接触させること
を含み、それによってレソルシノールを調製する、工程。
【請求項２２】
（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞、でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールの、医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料の製造における使用。
【請求項２３】
医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料において、またはそれらとして有用である、（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールを、含むまたはその化学修飾によってもたらされる医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料組成物。
【請求項２４】
マロニル−ＣｏＡからフロログルシノールを生合成することができる組換え細胞の調製のための工程であって、
（Ａ）以下の、
（１）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであり、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むか、またはＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームとマロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームの両方を含む、単離もしくは組換え核酸を提供すること、
（２）（ａ）前記核酸で形質転換することができ、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ−細胞（そのＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の特徴もその核酸によって共有されている）、または（ｂ）前記核酸で形質転換することができるＰｈｌＤ＋細胞を提供すること；および
（３）その細胞をその核酸と、その細胞をその核酸で形質転換することができる条件下で接触させること
により細胞を、その細胞による発現が可能な、ＰｈｌＤをコードする核酸で形質転換することを含み、それによって組換え細胞を得ること；または
（Ｂ）以下によりＰｈｌＤ＋細胞における遺伝子を不活化することを含み、それによって組換え細胞を得ること
（１）ＰｈｌＡ＋、ＰｈｌＢ＋、もしくはＰｈｌＣ＋の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋細胞を提供すること；および
（２）その細胞におけるＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、もしくはＰｈｌＣ遺伝子の少なくとも１つを不活化すること
を含む、工程。
【請求項２５】
組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項２４に記載の工程。
【請求項２６】
微生物である、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項２７】
酵母、真菌、または細菌である、請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項２８】
細菌である、請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項２９】
エシェリキア属(Escherichia)またはシュードモナス属(Pseudomonas)のうちのいずれかのメンバーである、請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項３０】
大腸菌(E. coli)またはＰ．フルオレセンス(P. fluorescens)のうちのいずれかである、請求項２６に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
炭素源が単純な炭素源である、請求項５に記載の工程。
【請求項３２】
炭素源が糖類、脂肪族ポリオール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項３１に記載の工程。
【請求項３３】
炭素源がグルコース、キシロース、アラビノース、グリセロール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項３１に記載の工程。
【請求項３４】
組換え細胞が提供され、前記接触（Ｂ）ステップがその細胞を炭素源を含む増殖培地において培養することを含む、請求項５に記載の工程。
【請求項３５】
培養が抽出発酵として実施される、請求項３４に記載の工程。
【請求項３６】
培養が二重温度プロフィールを用いて実施される、請求項３４に記載の工程。
【請求項３７】
噴射剤化合物または爆発性化合物を生産するための方法であって、
（Ａ）（１）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（２）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（３）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール；を提供すること；および
（Ｂ）同化フロログルシノールを化学修飾して、またはそれから製造されるレソルシノールを化学修飾して、噴射剤化合物または爆発性化合物を生産すること
を含む、方法。
【請求項３８】
同化フロログルシノールが
（Ａ）（１）（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、炭素源をフロログルシノールへと変換することができる）；および
（２）マロニル−ＣｏＡ、または該酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡへと変換することができる別の炭素源の少なくとも１つ
を提供するステップ；および
（Ｂ）（１）該マロニル−ＣｏＡと該酵素系もしくは組換え細胞とを、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ、または
（２）該他の炭素源と該酵素系もしくは組換え細胞とを、該炭素源をマロニル−ＣｏＡへと変換することができ、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ
を含み、それによって同化フロログルシノールを得る工程によって生合成される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
酵素系または組換え細胞がマロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素がマロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ｐｈｌＤ＋酵素系（A)（１）または組換え細胞（A)（２）がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
組換え細胞が提供される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、またはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＰｈｌＤ＋組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項４３に記載の方法。 
【請求項４５】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその少なくとも１つのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、またはｐｈｌＣ遺伝子を不活化すること、を含む工程によって生産される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその総てのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、およびｐｈｌＣ遺伝子を不活化すること、を含む工程によって生産される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ−細胞を提供すること、およびｐｈｌＤ遺伝子を該細胞に挿入すること、を含む工程によって生産される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
ｐｈｌＤ遺伝子がその細胞のゲノムＤＮＡに位置される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ｐｈｌＤ遺伝子がその細胞のゲノム外ＤＮＡに位置される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
その組換え細胞が、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかであるマロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子を該細胞に挿入すること、をさらに含む工程によって生産される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
組換え細胞が微生物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
組換え細胞が酵母、真菌、または細菌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
組換え細胞が細菌である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
組換え細胞がエシェリキア属(Escherichia)またはシュードモナス属(Pseudomonas)のうちのいずれかのメンバーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
組換え細胞が大腸菌(E. coli)またはＰ．フルオレセンス(P. fluorescens)のうちのいずれかである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
炭素源が単純な炭素源である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
炭素源が糖類、脂肪族ポリオール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
炭素源がグルコース、キシロース、アラビノース、グリセロール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
組換え細胞が提供され、前記接触（Ｂ）ステップがその細胞を炭素源を含む増殖培地において培養することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項６０】
培養が抽出発酵として実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
培養が二重温度プロフィールを用いて実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールの、爆発物または噴射剤の製造における使用。
【請求項６３】
爆発物または噴射剤として有用である、（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞、によって生合成される同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールを、含むまたはその化学修飾によってもたらされる爆発性組成物または噴射剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府所有権に関する陳述
本発明は、海軍研究事務所(Office of Naval Research)により与えられる認可番号Ｎ０００１４−０２−１−０７２５を受けた国庫補助に一部よるものである。政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、ともに２００４年１０月１２日に出願された、フロログルシノールの生合成およびそれからの１，３−ジヒドロキシベンゼンの製造についての米国仮出願番号６０／６１７，９５９および米国仮出願番号６０／６１８，０２４の一部継続である。
【０００３】
背景
フロログルシノール（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン）およびその誘導体は、商業目的のために広く使用されている。フロログルシノールおよびその誘導体、例えば、トリメチルフロログルシノールは、医薬品として、例えば、鎮痙薬として使用される。フロログルシノールは、医薬、殺菌剤、および他の有機合成における出発物質または中間体として使用される。フロログルシノールは、リグニンを含む顕微鏡検査サンプル（例えば、木材サンプル）の染色剤として使用され、染料（皮革染料、織物染料、および毛髪染料を含む）の製造においても使用される。フロログルシノールは、接着剤の製造においても、エポキシ樹脂硬化剤としても使用され、爆発物、例えば、熱および衝撃に安定な高爆発性の、１，３，４−トリアミノ−２，４，６−トリニトロベンゼン（ＴＡＴＢ）の製造においても使用される。フロログルシノールは、抗酸化薬、安定剤、および防食剤としても機能し、複写感光紙のカップリング剤としても、人工降雨におけるヨウ化銀の代替物としても、骨サンプル脱灰剤としても、切花保存剤としても利用される。フロログルシノールは、接触水素化によってレソルシノールへも変換することができる。
【０００４】
レソルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）は、特に有用なフロログルシノール誘導体であるが、現在レソルシノールはその経路では製造されていない。レソルシノールは、フロログルシノールと同様に、染料および接着剤の製造においても、エポキシ樹脂硬化剤としても使用され；医薬および他の有機合成における出発物質または中間体としても使用される。レソルシノールおよびその誘導体は、単独または硫黄などの他の有効成分とともに、化粧料においても、座瘡、ふけ症、湿疹、および乾癬などの状態の治療のための局所皮膚医薬においてもさらに一般的に使用され、一部、防腐薬および鎮痒薬として機能する。レソルシノールは、ネオプレンの架橋剤としても、ゴム組成物における増粘剤としても、有機ポリマー（例えば、メラミンおよびゴム）の結合剤においても、繊維性材料および他の複合材料の製造においても使用される。レソルシノールは、樹脂および樹脂接着剤の製造においても（例えば、モノマーおよびＵＶ吸収剤の両方として）；爆発物（例えば、スチフニン酸（２，４，６−トリニトロベンゼン−１，３−ジオール）および重金属スチフニン酸塩などのエネルギー化合物）の製造においても；ジアゾ色素、可塑剤、ヘキシルレソルシノール、およびｐ−アミノサリチル酸の合成においても使用される。
【０００５】
レソルシノール系樹脂の最も一般的なものは、レソルシノール−アルデヒド樹脂およびレソルシノール−フェノール−アルデヒド樹脂である。これらのタイプのレソルシノール系樹脂は、例えば、樹脂接着剤、複合材料マトリックスとしても、レーヨンおよびナイロン製造のための出発物質としても使用される。複合材料の例としては、例えば、金属および有機金属触媒のマトリックス材料として有用であるレソルシノール−ホルムアルデヒド炭素（または他の有機）粒子ヒドロゲル、エアロゲル、およびキセロゲルが挙げられる。レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂およびそれと合成した粒子は、歯根管充填材として歯科においても使用される。
【０００６】
レソルシノール−アルデヒド樹脂接着剤は、接着強度を必要とする用途（例えば：木トラス、梁、樽、および船、ならびに航空機を含む）においてとりわけ有用である。改質レソルシノール−アルデヒド樹脂接着剤は、局部創傷だけでなく、内部創傷または手術による切傷（例えば、血管切断）における生体創傷封止剤組成物としても使用される。これは、戦地医療において、例えば、環境暴露を最小限に抑え、出血や体液喪失を少なくし、治癒過程を加速するために行われることが多い。そのような改質樹脂接着剤としては、例えば、ゼラチン−レソルシノール−ホルムアルデヒド組成物およびゼラチン−レソルシノール−グルタルアルデヒド組成物（この場合、そのアルデヒドは、そのレソルシノール−ゼラチン組成物とは別に維持してよく、必要に応じて、後にそのレソルシノール−ゼラチン組成物と混合して、封止剤を生成してよい）が挙げられる。
【０００７】
現在、フロログルシノールおよびレソルシノールは両方とも、腐食剤および高温度を用い、石油系の出発物質から出発し、非常に環境上問題のある廃棄物を作出する化学有機合成により商業的に製造されている。
【０００８】
結果として、これらの有益な化合物の生産のためのより効率的かつよりクリーンな工程を提供することが当技術分野における改善となるであろう。１つの可能な解決策が、フロログルシノールの生産のための生合成経路（生合成フロログルシノールのレソルシノールへの任意の水素化を含む）を提供することである。フロログルシノールに関連する化合物の生合成生産については、植物、藻類、および微生物において報告されている、例えば：シュードモナス属(Pseudomonas)種由来のアセチルフロログルシノール；オトギリソウ属(Hypericum)種由来のハイパーフォリン、ハイパーフォリアチン(hyperfoliatins)、ハイパージョビノール(hyperjovinols)、およびハイパーアトマリン(hyperatomarins)；アカメガシワ属(Mallotus)種由来のパリドゥソール(pallidusol)、デヒドロパリドゥソール(dehydropallidusol)、パリドール(pallidol)、マロパリドール(mallopallidol)、およびホモマロパリドール(homomallopallidol)；フクギ属(Garcinia)種由来のガルシニエリプトン(garcinielliptones)；オシダ属(Dryopteris)種由来のフラバスピド酸(flavaspidic acids)；ユーカリノキ属(Eucalyptus)種由来のマクロカルパル(macrocarpals)およびシデロキシロナル(sideroxylonals)；バラ属(Rosa)種由来の１，３，５−トリメトキシベンゼン、ならびにフロログルシノール含有グリコシドおよびフロロタンニン。
【０００９】
しかしながら、フロログルシノール産生は、そのような植物および微生物において、より複雑であるがために、不十分でありかつ／またはより高価である出発物質の分解によるにすぎないということが報告されている。例えば、L. Schoefer et al., Appl. Environ. Microbiol. 70(10):6131-37 (2004)；D. Baas & J. Retey, Eur. J. Biochem. 265:896-901 (1999)参照。さらに、ジアセチルフロログルシノールの微生物生合成生産は、植物病原体に対する生物防除剤として農業環境に放たれる組換え細菌の抗真菌活性を向上させるための手段として提案されている。Thomashow et al.の米国特許第６，０５１，３８３号；およびM.G. Bangera & L.S. Thomashow, J Bact. 181(10):3155-63 (1999)参照。しかし、例えば、グルコースのような安価な出発物質からの，フロログルシノールの同化生合成生産経路についてはまだ示されていない。
【００１０】
最近、フロログルシノール（１ａ）への別経路（図２を参照）が明らかになり、その経路はグルコースからの微生物触媒による三酢酸ラクトン（３ａ）の合成を必要とする；しかしながら、三酢酸ラクトン（３ａ）をフロログルシノール（１ａ）へと変換するには複数の化学的ステップが必要であるということがわかっている。W. Zha et al., J. Am. Chem. Soc. 126(14):4534-35 (2004)；およびC.A. Hansen & J.W. Frost, J. Am. Chem. Soc. 124(21):5926-27 (2002)参照。よって、この経路は、せいぜい部分的に生合成により、部分的に化学合成による経路である。
【００１１】
このように、現在までフロログルシノールそれ自体（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン）の商業生産に有用な完全に生合成による経路は報告されていない。フロログルシノールそれ自体の生成を触媒する酵素またはコードする遺伝子は確認されていない。
【００１２】
概要
本発明は、マロニル−ＣｏＡからの、最終的にはグルコースのような単純な出発物質からのフロログルシノールの生合成生産のための方法、酵素、および細胞を提供する。具体的に言えば、本発明は、４種類総てのｐｈｌＡＢＣＤオペロン酵素を必要とせず、ｐｈｌＤ酵素単独または他のフロログルシノールシンターゼを用いてフロログルシノールの商業生産が可能である、最初の、フロログルシノール合成のための完全に生合成による同化経路を提供する。生合成フロログルシノールの誘導体（例えば、レソルシノールを含む）を調製するための方法もまた提供される。フロログルシノールの生産のための酵素系、組換え細胞、および方法の使用；それによって生産されるフロログルシノール。フロログルシノール誘導体、例えば、レソルシノールの製造のための酵素系、組換え細胞、および方法の使用；それによって生産されるフロログルシノールおよび誘導体、例えば、レソルシノール。化合物または組成物、例えば、爆発性または噴射剤化合物および組成物の生産のための酵素系、組換え細胞、方法、フロログルシノール、または誘導体の使用；非爆発性、非噴射剤化合物および組成物（医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料など）の生産のための酵素系、組換え細胞、方法、フロログルシノール、または誘導体の使用。それによって生産される爆発性または噴射剤化合物および組成物；それによって生産される非爆発性、非噴射剤化合物および組成物。本発明は、以下をさらに提供する：
【００１３】
マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系；ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞；およびその細胞でのＰｈｌＤの発現を増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋組換え細胞；ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である上述の酵素系および細胞；少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素をさらに含んでなる上述の酵素系および細胞；
【００１４】
同化フロログルシノールの生産のための工程であって、上述の酵素系もしくは組換え細胞、およびマロニル−ＣｏＡ、またはその酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡへと変換することができる別の炭素源を提供すること、そのマロニル−ＣｏＡとその酵素系もしくは組換え細胞とを、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させること、または他の炭素源とその酵素系もしくは組換え細胞とを、その炭素源をマロニル−ＣｏＡへと変換することができ、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させることを含む工程；炭素源が糖類、脂肪族ポリオール、またはそれらの組合せのような単純な炭素源である上述の工程；上述の細胞を炭素源を含む培地において培養する上述の工程、すなわち培養を抽出発酵として実施し、かつ／または多重温度プロフィール（二重温度プロフィールなど）を用いる上述の工程；上述の工程によって製造されたフロログルシノール；
【００１５】
マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる単離もしくは組換えフロログルシノールシンターゼ酵素；配列番号：２のアミノ酸配列または配列番号：２と少なくとも７０％相同であるアミノ酸配列（配列番号：２のアミノ酸配列の保存的置換変異体など）を含んでなる上述の酵素；
【００１６】
ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであり、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでなる単離もしくは組換え核酸；マロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをさらに含んでなる上述の核酸；ＰｈｌＤをコードするＯＲＦが配列番号１の塩基配列、もしくは配列番号１と少なくとも８０％相同である塩基配列、それに対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれと重複するコドン配列を含んでなる上述の核酸；
【００１７】
上述の核酸で形質転換されており、それによりフロログルシノールシンターゼを発現することができるｐｈｌＤ＋組換え細胞；ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである上述の細胞；ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である上述の細胞；さらにＰｈｌＥ−もしくはＰｈｌＦの少なくとも１つである上述の細胞；
【００１８】
レソルシノールの調製のための工程であって、上述の単離もしくは組換え酵素系または組換え細胞によって生合成される上述の同化フロログルシノールを、水素およびロジウム触媒とともに提供すること、およびそのフロログルシノールとその水素およびそのロジウム触媒とを、そのフロログルシノールが水素化されてレソルシノールを生成する条件下で接触させることを含む工程；上述の同化フロログルシノールから調製されたレソルシノール；
【００１９】
上述の同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールの、医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料の製造における使用；上述の同化フロログルシノール、またはそれから製造されるレソルシノールを、含むまたはその化学修飾によってもたらされる医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料組成物；
【００２０】
マロニル−ＣｏＡからフロログルシノールを生合成することができる組換え細胞の調製のための工程であって、細胞を、その細胞による発現が可能な上述のＰｈｌＤをコードする核酸で形質転換することを含む工程、またはｐｈｌＡ＋、ｐｈｌＢ＋、ｐｈｌＣ＋の少なくとも１つであるｐｈｌＤ＋細胞を提供すること、およびその細胞におけるＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、もしくはＰｈｌＣ遺伝子の少なくとも１つを不活化することによりｐｈｌＤ＋細胞における遺伝子を不活化することを含む工程；細菌のような微生物である（その例としては、大腸菌(Escherichia coli)およびシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)が挙げられる）上述の組換え細胞；酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなる上述の工程；ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその少なくとも１つのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、もしくはｐｈｌＣ遺伝子を不活化すること、または少なくとも１つのｐｈｌＤ＋核酸を、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるその細胞に挿入することのいずれかまたはその両方を含む上述の工程；ｐｈｌＤ＋組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である上述の工程；ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその総てのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、およびｐｈｌＣ遺伝子を不活化することを含む上述の工程；ｐｈｌＡＢＣＤ−細胞を提供すること、およびｐｈｌＤ遺伝子をその細胞に挿入することを含む上述の工程；ｐｈｌＤ＋核酸がその細胞のゲノムＤＮＡに位置する上述の工程；それがその細胞のゲノム外ＤＮＡに位置する上述の工程。
【００２１】
噴射剤化合物または爆発性化合物を生産するための方法であって、上述の単離もしくは組換え酵素系または組換え細胞によって生合成される同化フロログルシノールを提供すること、およびその同化フロログルシノールを化学修飾すること、またはそれから調製されるレソルシノールを化学修飾すること含む方法；
【００２２】
上述の同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールの、爆発物または噴射剤の製造における使用；ならびに上述の同化フロログルシノール、またはそれから調製されるレソルシノールを、含むまたはその化学修飾によってもたらされる爆発性組成物または噴射剤組成物。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、フロログルシノールおよびその誘導体を生産するための方法、材料および生物を提供する。本発明は、微生物のアセチルフロログルシノール経路に関連する複数の遺伝子、例えば、ｐｈｌＡＢＣＤＥＦを発現させる代わりに、単一遺伝子を発現させることによりフロログルシノール自体を十分な濃度で生産させることができるという驚くべき発見をした研究に基づく。刊行物（米国特許第６，０５１，３８３号など）では、上述の遺伝子を使用することによりフロログルシノールが生産されるならば、そのようにする最良または唯一の経路が、その経路に少なくとももう１つの酵素を加えて、アセチルフロログルシノールを脱アセチル化することであるという可能性が極めて高いという結論に達している。
【００２４】
それどころか、現今では、本明細書において「フロログルシノールシンターゼ」と称し、ｐｈｌＤ遺伝子から発現される単一酵素の発現によって、直接、すなわち、アセチル化またはジアセチル化中間体を経ないフロログルシノールの形成が起こるということが思いがけなく見つかっている。結果として、この１つの酵素は、他のいずれのｐｈｌオペロン遺伝子とも別にして単独で発現されて、高水準のフロログルシノール合成を得ることができる。さらに、フロログルシノール合成のこの経路は、３，５，７−トリケトオクタノアートチオエステルを経ずに、３，５−ジケトヘキサノアートチオエステル中間体を経て進行する。現今では、他のいずれのｐｈｌオペロン遺伝子とも別にした、フロログルシノールシンターゼそれ自体の発現によって、今までに提示された他のいずれの生合成経路または半生合成経路よりも著しく多いフロログルシノールを生産することができることが証明されていること；およびそれによってフロログルシノールがこれまでに提示されている他のいずれの生合成経路または半生合成経路よりも簡単に、効率的かつ経済的に生産されることがさらに発見されている。
【００２５】
本明細書において用いる見出し（「序論」および「概要」など）および小見出しは、本発明の開示内容内でテーマを一般的に構成することのみを目的としており、本発明の開示内容またはそのいずれの態様も限定するものではない。特に、「序論」において開示される対象には、本発明の範囲内で技術の側面が含まれるが、先行技術の引用ではない。「概要」において開示される対象は、本発明の全範囲またはその総ての実施形態の網羅的または完全開示ではない。
【００２６】
本明細書における参考文献の引用は、それらの参考文献が先行技術であること、または本明細書に開示される本発明の特許性と何らかの関連性があることを承認するものではない。序論において引用される参考文献の内容のいずれの考察も、単にその参考文献の著者らによって主張された全体概要を提供することを目的としているに過ぎず、そのような参考文献の内容の正確さについて承認するものではない。本明細書の説明節において引用される総ての参考文献は、それら総て、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２７】
説明および具体的な実施例により本発明の実施形態を示すが、それらは例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。さらに、記載した特徴を有する複数の実施形態の引用は、さらなる特徴を有する他の実施形態、または記載した特徴の様々な組合せを組み込んだ他の実施形態を排除することを目的とするものではない。
【００２８】
本明細書において、「好ましい」および「好ましくは」とは、特定の状況下で一定の利益を与える本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も同じまたは他の状況下で好ましい可能性もある。さらに、１以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用でないということを意味するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から排除することを目的とするものではない。
【００２９】
本明細書において、「含む」およびその変形は、リストでの項目の引用により、本発明の材料、組成物、装置、および方法において同様に有用であり得る他の同様の項目が排除されないように非限定的である。
【００３０】
「組換え」とは、核酸操作を使用したということを示すために本明細書において用いられる。結果として、少なくとも部分的に、核酸操作により生産された存在物に対しては、「組換え」核酸、「組換え」ポリペプチド、および「組換え」細胞のように表現する。「in vivo」とは、その細胞が生細胞である場合には「in cyto」を含むということを示すために本明細書において用いられる。
配列相同性
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明による変異ポリペプチドは、その変異体と同じ機能を果たす天然ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％相同であるアミノ酸配列を有する。一例として、本発明によるフロログルシノールシンターゼは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％相同であるアミノ酸配列を有し；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも６０％相同であり；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも７０％相同であり；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも８０％相同であり；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも９０％相同である。
【００３２】
一実施形態において、所望のポリペプチドをコードする本発明による組換えポリヌクレオチドは、上記のように、同じ機能の天然ポリペプチドと相同性を有するポリペプチドをコードするいずれかのものある。一実施形態において、所望のポリペプチドをコードする本発明による組換えポリヌクレオチドは、その変異体と同じ機能を果たすポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチドのアミノ酸配列と８０％を超える相同性を有するアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態において、、そのポリヌクレオチドはそれと少なくとも８５％相同であり；好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチドはそれと少なくとも９０％相同であり；好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチドはそれと少なくとも９５％相同である。
【００３３】
配列相同性とは、アミノ酸残基の２配列間、または核酸塩基の２配列間の同一性(identicality)の程度を意味する。この配列相同性は、２配列の目視比較によるか、または比較のために配列をアラインメントさせる生物情報アルゴリズムもしくは比較する配列間の相同率を決定する生物情報アルゴリズムを用いて決定することができる。有用な自動アルゴリズムは、Wisconsin Genetics ソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, Madison, WI, USAから入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡコンピューターソフトウェアモジュールとして入手可能である。それらのモジュールで自動化されるアラインメントアルゴリズムとしては、Needleman & Wunsch配列アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman配列アラインメントアルゴリズム、およびSmith & Waterman 配列アラインメントアルゴリズムが挙げられる。配列アラインメントおよび相同性の決定に有用な他のアルゴリズムは、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ、およびＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖなどのソフトウェアで自動化される；例えば、N.P. Brown et al., Bioinformatics: Applications Note, 1998, 74:380-81；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tools/index.htmlのthe U.S. National Center for Biotechnology Information；および本明細書における相同性の決定に有用なソフトウェアパラメーター設定を規定する米国特許第６，７９０，６３９号参照。
【００３４】
核酸塩基ポリマー（核酸および核酸類似体など）によって示される配列相同性は、第１の配列と第２の配列の相補体との間でのハイブリダイゼーションアッセイによって決定することができる。この目的に、いずれの周知のハイブリダイゼーションアッセイを用いてもよく、これらの例としては、米国特許第６，７６７，７４４号および同第６，７８３，７５８号に記載されているものが挙げられ、「高ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、そこに定義されたとおりである。
保存的置換
【００３５】
さらに、本発明によるポリペプチドには、保存的アミノ酸置換が存在することがある。「保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸残基についての任意のアミノ酸置換を示し、その置換では、置換残基がその特定の残基と化学的に極めて類似しているため、ポリペプチド機能（例えば、酵素活性）の大幅な低下は起こらない。保存的アミノ酸置換は当技術分野では周知であり、その例は、例えば、米国特許第６，７９０，６３９号、同第６，７７４，１０７号、同第６，１９４，１６７号、または同第５，３５０，５７６号に記載されている。好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は以下の６つの群のうちの１群内で起こるいずれか１つのものとなる
１．小型の実質的に非極性の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ；
２．大型の非極性脂肪族残基：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌ；Ｍｅｔ；
３．極性負電荷残基およびそれらのアミド：ＡｓｐおよびＧｌｕ；
４．極性負電荷残基のアミド：ＡｓｎおよびＧｌｎ；Ｈｉｓ；
５．極性正電荷残基：ＡｒｇおよびＬｙｓ；Ｈｉｓ；ならびに
６．大型の芳香族残基：ＴｒｐおよびＴｙｒ；Ｐｈｅ。
好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は、天然残基（保存的置換）対として記載した以下のうちのいずれか１つのものとなる：Ａｌａ（Ｓｅｒ）；Ａｒｇ（Ｌｙｓ）；Ａｓｎ（Ｇｌｎ；Ｈｉｓ）；Ａｓｐ（Ｇｌｕ）；Ｇｌｎ（Ａｓｎ）；Ｇｌｕ（Ａｓｐ）；Ｇｌｙ（Ｐｒｏ）；Ｈｉｓ（Ａｓｎ；Ｇｌｎ）；Ｉｌｅ（Ｌｅｕ；Ｖａｌ）；Ｌｅｕ（Ｉｌｅ；Ｖａｌ）；Ｌｙｓ（Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ）；Ｍｅｔ（Ｌｅｕ；Ｉｌｅ）；Ｐｈｅ（Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ）；Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）；Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）；Ｔｒｐ（Ｔｙｒ）；Ｔｙｒ（Ｔｒｐ；Ｐｈｅ）；およびＶａｌ（Ｉｌｅ；Ｌｅｕ）。
【００３６】
ポリペプチドが保存的アミノ酸置換を含み得るように、本明細書におけるポリヌクレオチドは保存的コドン置換を含み得る。発現時に、コドン置換によって上記のように保存的アミノ酸置換がもたらされるならば、そのコドン置換は保存的であると考えられる。アミノ酸置換が起こらない縮重コドン置換もまた、本発明によるポリヌクレオチドにおいて有用である。よって、例えば、本発明の実施形態において有用な選択ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、それで形質転換される発現宿主細胞によって示されるコドン使用頻度を近づけるため、そうでなければその発現を向上させるために、縮重コドン置換によって突然変異させてもよい。
【００３７】
さらに、核酸塩基配列含有ポリマー（核酸など）は、本発明による一酵素または酵素群をコードするものを含むことが好ましい。加えて、これらには、例えば、酵素をコードする特定の核酸と少なくとも８０％配列相同性を共有する核酸が含まれる。一例として、本発明によるフロログルシノールシンターゼコード配列は、配列番号：１の塩基配列と少なくとも８０％相同である塩基配列を有し；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも８５％相同であり；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも９０％相同であり；好ましい実施形態において、その配列はそれと少なくとも９５％相同である。
フロログルシノールおよびその誘導体の生産
【００３８】
図３で説明するように、フロログルシノールシンターゼは、現今では同定され、特徴付けられており、この酵素がフロログルシノール合成を触媒する機構は、以下の一連のステップに従って、または図で示したチオエステル（−ＳＲ）結合を形成するために転移される基を提供する第１のマロニル−ＣｏＡが、そのためにアセチル基ではなくマロニル基を提供するという別の機構によって、進行することが思いがけなく見つかっている。
・アセチル活性化−第１のステップはアセチル基の活性化を必要とする。これはアセチル基をマロニル−ＣｏＡから酵素へと転移するマロニル−ＣｏＡの脱炭酸により起こり、それによって酵素活性化アセチルチオエステルが生成される（図３の「Ｒ」は酵素またはそれと結合している部分を表す）；別の実施形態では、その第１のステップは、酵素活性化マロニルチオエステルを生成するために、全マロニル基の活性化を必要とする；
・鎖伸長−次の段階は、酵素活性化３−ケトブタノアートチオエステルを生成し、その後、酵素活性化３，５−ジケトヘキサノアートチオエステルを生成するために、アセチル基を追加的に転移させる２回の連続したマロニル−ＣｏＡの脱炭酸を必要とする；別の実施形態では、連続転移により酵素活性化３−ケトグルタラートチオエステルおよび３，５−ジケトピメラートチオエステルを生成する；
・環化−最終ステップは、フロログルシノールを生成するために、３，５−ジケトヘキサノアートチオエステル中間体の環化を必要とする；別の実施形態では、３，５−ジケトピメラートエステルの脱炭酸を行って、フロログルシノールへと環化する。
３つのステップ総てがフロログルシノールシンターゼによって触媒される。
【００３９】
本発明による酵素系は、少なくとも１つのフロログルシノールシンターゼを含むことができる。好ましい実施形態において、フロログルシノールシンターゼはシュードモナス(Pseudomonad)から得られ；好ましい実施形態において、フロログルシノールシンターゼはシュードモナス属のメンバーから得られ；好ましい実施形態において、フロログルシノールシンターゼはＰ．フルオレセンス(P. fluorescens)種のメンバーから得られるであろう。好ましい実施形態において、フロログルシノールシンターゼはＰ．フルオレセンス  Ｐｆ−５から得られる。本研究において同定したＰ．フルオレセンス  Ｐｆ−５フロログルシノールシンターゼのアミノ酸配列を配列番号：２で示され、その天然コード配列を配列番号：１に示す。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明による酵素系は、単独でまたは他の酵素と共同で、マロニル−ＣｏＡの生成を触媒することができる少なくとも１つの酵素をさらに含むことができる。マロニル−ＣｏＡは、例えば、マロニル−ＣｏＡ合成酵素（例えば、マロナートをマロニル−ＣｏＡへと変換する、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)由来のマロニル−ＣｏＡシンセターゼ（ＭａｔＢ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託  ＡＡＣ８３４５５［ｇｉ：３９８２５７３］参照）；マロン酸セミアルデヒドをマロニル−ＣｏＡへと変換する、リゾビウム・レグミノサルム由来のマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（ＭａｔＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託  ＡＡＣ８３４５６［ｇｉ：３９８２５７４］参照）；またはアセチル−ＣｏＡをカルボキシル化して、マロニル−ＣｏＡを生成する、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ  ６．４．１．２）のトランスカルボキシラーゼ活性）により、アセチル−ＣｏＡから生合成により生成され得る。そのマロン酸、マロン酸セミアルデヒド、またはアセチル−ＣｏＡ出発物質は、生合成されたものでよく、好ましくは、生合成されたものである；例えば、アセチル−ＣｏＡは、種々の供給源（例えば、グルコース、光合成３−ホスホグリセラートなど）のうちのいずれか１つから生合成により得たものであってよい。
【００４１】
本発明による酵素系はin vitroであってもin vivoであってもよい。マロニル−ＣｏＡ合成酵素が不足している場合、マロニル−ＣｏＡは、それらの細胞および／または酵素と接触するようにその培地に供給される。一実施形態において、フロログルシノールシンターゼをコードする核酸を、マロニルＣｏＡを合成することができる生物の細胞に形質転換することができ、そのようにした場合にはフロログルシノールがその細胞で生成される。マロニルＣｏＡを合成する生物の例としては、植物、藻類、動物、およびヒトが挙げられる。in vitro系としては、例えば、バッチ酵素懸濁液または（吸着もしくは共有結合）固定化酵素バイオリアクターが挙げられる。in vivo系としては、例えば、固定化細胞バイオリアクター、連続発酵、およびバッチ発酵が挙げられる。本明細書において「発酵」とは、例えば、好気条件または嫌気代謝の必要条件ではなく、単に本明細書における別の実施形態として認められる任意の有効な条件下での培養細胞増殖を示す。任意の実施形態において、マロニル−ＣｏＡの供給源は、その供給源が添加された(例えば、外因性)マロニル−ＣｏＡであるか、またはin situで生合成された(例えば、内因性)マロニル−ＣｏＡであるかには関わらず、フロログルシノールシンターゼに提供されるであろう。
【００４２】
本発明による組換え細胞は、少なくとも１つのフロログルシノールシンターゼと、所望により、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素を発現することができるが、全ｐｈｌＡＢＣＤオペロンも３つのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、およびｐｈｌＣ遺伝子総ても発現することができない。好ましい実施形態において、組換え細胞は、その細胞で組換えフロログルシノールシンターゼを発現することができるものである。好ましい実施形態において、フロログルシノールシンターゼを発現することができ、所望により、マロニル−ＣｏＡ合成酵素も発現することができる組換え細胞は、有壁細胞（walled cell）である。有壁細胞の例としては、植物細胞、酵母／真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、および一部の原生生物が挙げられる。一実施形態において、その組換え細胞は、無維管束植物（例えば、苔）細胞、原生生物（例えば、藻類）細胞、酵母細胞、真菌細胞、細菌細胞、または古細菌細胞である。一実施形態において、その組換え細胞は組換え微生物である。一実施形態において、その組換え細胞は酵母細胞、真菌細胞、細菌細胞、または古細菌細胞であり、より好ましくは、酵母細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。好ましい実施形態において、組換え細胞は細菌細胞である。好ましい実施形態において、組換え細胞はプロテオバクテリア細胞である。好ましくは、組換え細胞は、ｐｈｌＡＢＣ、ｐｈｌＥ、およびｐｈｌＦ遺伝子の機能酵素を発現する能力を欠いている。好ましい実施形態において、その細胞はｐｈｌＡＢＣ−、ｐｈｌＥ−、およびｐｈｌＦ−細胞である。組換え宿主細胞は本発明のフロログルシノールシンターゼをコードする少なくとも１つの核酸を含むである。好ましい実施形態において、その核酸はベクター形態（例えば、プラスミドまたはトランスポゾン）であろう。
【００４３】
本明細書において有用なｐｈｌＤ＋組換え細胞を生成するための一実施形態において、ｐｈｌＤ＋と、ｐｈｌＡ＋、ｐｈｌＢ＋、および／またはｐｈｌＣ＋の両方である細胞を、任意の遺伝子ノックアウト技術（すなわち、プレノックアウト遺伝子によってコードされる機能性発現産物を作る細胞の能力をなくしてしまう任意の遺伝子切り出しまたは突然変異技術）などによりｐｈｌＡ−、ｐｈｌＢ−、および／またはｐｈｌＣ−にする。好ましくは、その細胞に存在するｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、およびｐｈｌＣ遺伝子の総てをノックアウトする。得られた細胞はそのｐｈｌＤ＋表現型を保有する。所望により、その細胞に存在するｐｈｌＥおよび／またはｐｈｌＦ遺伝子をノックアウトしてもよい。１つの好ましい実施形態において、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞はｐｈｌＡＢＣ−となるであろう。一実施形態において、ｐｈｌＤ−と、ｐｈｌＡ−，ｐｈｌＢ−、および／またはｐｈｌＣ−の両方である細胞を、発現可能な、ＰｈｌＤをコードする核酸をその細胞に挿入すること（そのゲノムＤＮＡ内に挿入するか、またはプラスミドなどの染色体外ユニットの一部として挿入するか、あるいはその両方において挿入するかは問わない）によりｐｈｌＤ＋にする。１つの好ましい実施形態において、ｐｈｌＡＢＣＤ−細胞はｐｈｌＤ＋となる。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ＰｈｌＤ＋である天然または組換え細胞（ｐｈｌＤ＋細胞など）に、フロログルシノールシンターゼをコードする１以上の発現可能なオープンリーディングフレームを含んでなる核酸での形質転換などによりさらなるｐｈｌＤ遺伝子を、さらに追加することができる。そのＰｈｌＤ＋細胞はＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、および／またはＰｈｌＣ−細胞（ｐｈｌＡ−、ｐｈｌＢ−、および／またはｐｈｌＣ−など）であってもよいし、そのＰｈｌＤ＋細胞はＰｈｌＡ＋、ＰｈｌＢ＋、および／またはＰｈｌＣ＋細胞（ｐｈｌＡ＋、ｐｈｌＢ＋、および／またはｐｈｌＣ＋細胞（例えば、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞）など）であってもよい。得られた、追加のｐｈｌＤ遺伝子を発現することができる組換え細胞は増強されたフロログルシノール合成能力を示すことができる。
【００４５】
組換え細胞と同様に、本発明による単離もしくは組換え酵素系は、少なくとも１つのフロログルシノールシンターゼと、所望により、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素もしくは酵素セットを含むが、３つのＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、およびＰｈｌＣ酵素の総てを含むわけではなく、好ましくは、ＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、およびＰｈｌＣ酵素のいずれも含まない。よって、少なくとも１つのフロログルシノールシンターゼと、所望により、少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなるが、３つのＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、およびＰｈｌＣ酵素の総てを含むことがない、本発明による組換え細胞および酵素系は、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋存在物とも、好ましくは、ＰｈｌＡＢＣ−であるＰｈｌＤ＋存在物ともいえる。
【００４６】
フロログルシノールの生産のための工程は、フロログルシノールシンターゼをマロニル−ＣｏＡと接触させることを必要とする。レソルシノールの生産のための工程は、生合成フロログルシノールにおいて、例えば、水素およびロジウム触媒を用いて水素化反応を行うことを必要とする。本発明による工程によって生産されるフロログルシノールおよびレソルシノールは、医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、噴射剤、爆発物、複合材料、および積層もしくは結合材料などの組成物において、またはそれらとして、あるいはそれらを調製するために使用することができる。
全細胞発酵様式
【００４７】
本明細書における組換え細胞の全細胞発酵は、任意の培養様式で、好ましくは、バッチ、フェドバッチ、または連続（もしくは半連続、すなわち、再播種）様式で行うことができる。本明細書におけるいくつかの実施形態においては、本発明による組換え細胞の培養によって生産されるフロログルシノールを含有する使用済み培地を処理して、フロログルシノールを抽出する。しかしながら、場合によっては、フロログルシノールが増殖培地において閾値濃度に達すると、それ自体が最終生成物阻害と呼ばれる工程によりその培養細胞に対して毒性を与え得る。これが起こった場合、この阻害によりフロログルシノールの細胞産生が減少し、細胞生存力の低下が起こり得る。よって、いくつかの実施形態においては、その他の点ではなお有用である増殖培地からのフロログルシノールと、所望により、フロログルシノール誘導体（存在する場合）の抽出を、好ましくは、細胞がフロログルシノールを活発に産生している期間中に行う。そのような実施形態を「抽出発酵」と呼んでいる。
【００４８】
抽出発酵は、本明細書において、当技術分野において有用な公知の様式のいずれのものでも行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では分散抽出発酵様式を採用し、この分散抽出発酵様式では、フロログルシノールを取り込むことができる抽出吸収剤または吸着剤液体もしくは粒子相を、組換え細胞を増殖させる培地に導入し、そこでその抽出粒子もしくは液体領域がフロログルシノールと接触し、フロログルシノールを取り込む。いずれの抽出工程でも同様であるが、吸収または吸着材料によるこの生成物の取込みは、フロログルシノールに対して非特異的、選好的、または特異的であり得るが、好ましくは、選好的、または特異的である。
【００４９】
フロログルシノールでいっぱいになったら、その「いっぱいになった」抽出相を培養培地から、例えば、遠心分離、濾過、磁性もしくは磁化粒子の磁気回収により、および／または相分離（例えば、その場合、抽出相は培養培地の大部分より上に上昇するか、またはそれより下に沈む）により取り出す。いくつかの実施形態においては、培養培地からフロログルシノールを抽出するために、向流または逆流抽出技術を利用してもよい（例えば、その場合、培養培地の流れに対して向流または逆流である流れはそのような抽出液体もしくは粒子相を含んでなる）。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、培養培地を抽出膜（イオン交換膜など）に通すことにより膜抽出発酵を行う。いくつかの実施形態においては、培養培地を抽出カラム（中空繊維膜抽出器または繊維性もしくはビーズ樹脂カラムなど）に通すことによりカラム抽出発酵を行う。培地で培養中の細胞をカラムに通してもよいし、培地をカラムに通す前に、例えば、濾過により細胞の一部または総てを除去してよい。いずれの抽出発酵工程においても、抽出発酵は、１回、複数回、または発酵工程中連続して行うことができる。向流、逆流、膜、およびカラム抽出発酵様式では、フロログルシノールの一部または総て（好ましくは、大部分または総て）を取り出した培地は、その後、発酵容器に戻す。
【００５１】
好ましい実施形態において、生合成中の培養培地からフロログルシノールを取り出すために、カラム抽出発酵技術を採用する。この目的に有用な媒体としては、陰イオン交換媒体（陰イオン交換ビーズ、繊維、および中空繊維など）が挙げられる。陰イオン交換膜および陰イオン交換媒体粒子は、膜抽出発酵様式および分散抽出発酵様式それぞれにおいてもまた有用である。粒子陰イオン交換媒体を使用する場合には、流動床抽出発酵様式で用いることが好ましいが、代わりに固定床様式を用いてもよい。
【００５２】
有用な陰イオン交換媒体は、有機、無機に関係なく、陰イオン交換基を有するかまたは陰イオン交換基と共有結合により結合している任意の担体を含んでいてよい。いくつかの実施形態においては、陰イオン交換基を有するかまたは陰イオン交換基と結合している、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリスチレン、ポリビニル、アクリル、フェノール−ホルムアルデヒド、有機ケイ素、またはセルロースポリマー主鎖などの有機担体を用いることができる。
【００５３】
有用な陰イオン交換基は、いずれもの陽性基、好ましくは、非金属陽性基（有機アンモニウム基、スルホニウム基、およびホスホニウム基など）であってもよい。好ましい陽性基としては、有機：第三級アンモニウム（例えば、ジエチルアミノエチルセルロース）基、第四級アンモニウム基、ピリジニウム基、第三級スルホニウム基、および第四級ホスホニウム基が挙げられる。一実施形態において、陰イオン交換媒体の陰イオン交換基は、第四級アンモニウム基またはピリジニウム基である。第四級アンモニウム型樹脂の例としては、ＡＧ−１  Ｘ８樹脂（Bio-Rad Laboratories Inc.製, Hercules, CA, USA）およびＤＯＷＥＸ  １樹脂（The Dow Chemical Co.製, Midland, MI, USA）が挙げられ；ピリジニウム型樹脂の例としては、ＲＥＩＬＬＥＸ  ＨＰ（Reilly Industries, Inc.製, Indianapolis, IN, USA）などのポリビニル−ピリジン樹脂のハロゲン化アルキル処理によって得られるポリビニル−アルキル−ピリジニウム樹脂、または商業的供給源から直接得られるポリ（４−ビニル  Ｎ−メチルピリジニウムヨージド）（Polymer Source Inc.製, Montreal, QC, CA）などのポリビニル−アルキル−ピリジニウム樹脂が挙げられる。
【００５４】
１つの好ましい実施形態においては、使用前に陰イオン交換媒体を処理して、その媒体の陽性基とのリン酸複合体を調製する。陰イオン交換媒体を（それからのフロログルシノールの取り出しを行わずに）再利用するかまたは特定の発酵と連続して接触させる場合には、陰イオン交換媒体を十分に頻繁に新品または再生済みの陰イオン交換媒体と取り替えて、培養培地のフロログルシノール濃度がかなりの程度の最終生成物阻害が起こるレベルまで上昇しないようにすることが好ましいであろう；フロログルシノールが約２ｇ／Ｌを超えない、または約１．５ｇ／Ｌを超えないことが好ましい。
【００５５】
抽出発酵または発酵後抽出工程のいずれかによってフロログルシノールで既にいっぱいになっている陰イオン交換媒体には、それを水、酸性水、酸性アルコール（例えば、酸性エタノール）またはそれらの組合せで洗浄することにより処理して、フロログルシノールを取り出すことが好ましい。水洗後に、酸性アルコールでも洗浄することは１つの好ましい技術である。陰イオン交換媒体からフロログルシノールの（好ましくは）大部分または総てを取り出した後、その媒体は、フロログルシノール抽出に再利用するために、例えば、再利用の前にそれをリン酸溶液で平衡化して、陽性基−リン酸複合体を形成することにより調製することができる。洗浄液中に存在するフロログルシノールは、当技術分野で公知の任意の技術、例えば、相分離、溶媒蒸発などによりさらに単離および／または精製してよい。
全細胞発酵条件
【００５６】
本発明によるフロログルシノールを生産するための方法に使用する全細胞の培養では、細胞増殖させる条件および培養細胞に同化フロログルシノールを産生させる条件を用いる。場合によっては、フロログルシノールシンターゼを細胞培養期間を通じて、例えば、構成的に、発現させるが、多くの場合では、指数増殖期（ＥＧＰ）の終わり近くになって初めてフロログルシノールシンターゼの発現を開始することが望ましい。後者の発現が望まれる場合、調節プロモーターの制御下にあるフロログルシノールシンターゼコード配列は、ＥＧＰの約７０〜１００％、好ましくは、約７０〜約９０％、より好ましくは、約７０〜約８０％が経過したときに、一般に活性化または抑制解除される。この目的に有用なプロモーターの例としては、ｔａｃ、Ｔ５、およびＴ７プロモーターが挙げられ；これらのうちではＰＴ７が好ましく；ラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）のような無償性誘導物質を用いて誘導することができる。
【００５７】
本明細書におけるいくつかの好ましい実施形態においては、組換え微生物細胞（組換え細菌宿主細胞など）を、本明細書における全細胞生体触媒として使用する。この目的に好ましい細菌としては、プロテオバクテリアが挙げられ；プロテオバクテリアの好ましい例としては、腸内細菌およびシュードモナスのようなγプロテオバクテリアが挙げられ；これらのうちではエシェリキア属(Escherichia)種（大腸菌(E. coli)など）およびシュードモナス属種（Ｐ．フルオレセンスなど）が好ましい。好ましい微生物は、本発明によるフロログルシノールシンターゼおよび／またはマロニル−ＣｏＡ合成酵素を分解し得るプロテアーゼ活性がないか、またはそのプロテアーゼ活性を低下もしくは消失させるように処理されているものである。細菌では、好ましくは、存在しない、そうでなければ、例えば、突然変異によって、低下もしくは消失させた２つのプロテアーゼはＬｏｎおよびＯｍｐＴである。ｐｈｌＤ遺伝子の挿入に好ましいｐｈｌＡＢＣＤ−細胞の例が大腸菌株ＢＬ２１およびＷ３１１０であり；さらなるｐｈｌＤ遺伝子の挿入を行うまたは行わないｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、および／またはｐｈｌＣの不活性化、あるいはさらなるｐｈｌＤ遺伝子の挿入を行う、ｐｈｌＡＢＣＤの不活性化、あるいはさらなるｐｈｌＤ遺伝子の追加に好ましい、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞の例がＰ．フルオレセンス株Ｐｆ−５である。大腸菌株ＢＬ２１は：ＢＬ２１  ＳＴＡＲ（ＤΕ３）  ＯＮＥ  ＳＨＯＴ(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)；またはＵＬＴＲＡ  ＢＬ２１（ＤＥ３）(Edge BioSystems, Gaithersburg, MD, USA)として入手してよい。大腸菌株Ｗ３１１０はＡＴＣＣ番号２７３２５（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）として入手してよく；Ｐ．フルオレセンス株Ｐｆ−５はＡＴＣＣ番号ＢＡＡ−４７７として入手してよい。
【００５８】
大腸菌の場合、好ましい発酵温度は、約２０〜約３７℃、好ましくは、約２５〜約３７℃、より好ましくは、約３０〜約３７℃である。同化フロログルシノール合成の場合、ＥＧＰの期間中、または少なくともＥＧＰの前誘導部分の期間での高温と、残存培養期間の少なくとも一部の期間での（例えば、誘導後の総てもしくは一部または維持期の総てもしくは一部の期間にわたる）低温の組合せは、優れたフロログルシノール生産プロトコールの重要な特徴であるということが判明した。よって、１つの好ましい実施形態においては、組換え大腸菌細胞を、ＥＧＰの期間中、またはＥＧＰ前誘導期間中、約３５〜３７℃にて、好ましくは、約３６〜３７℃にて、より好ましくは、約３６℃にて増殖させ；維持期の期間中、または誘導後の期間中、約３０〜３４℃にて、好ましくは、約３０〜約３３℃にて、より好ましくは、約３３℃または約３０℃にて増殖させる。いくつかの実施形態においては、維持期に入ってから、例えば、ＥＧＰが終了した後約１５時間までに低温への切替を行ってよい。よって、ＥＧＲが培養開始から約１５時間の時点で終了する細胞（例えば、大腸菌）培養の場合、二温度発酵プロフィールでの高温から低温への切替は、例えば、培養開始から約１１時間もしくは約１２時間の時点（例えば、７０％もしくは８０％ＥＧＲ誘導時とほぼ同時点）で、または約１５時間、場合によっては約３０時間までの時点で行ってよい。あるいは、例えば、そのような二重温度の実施形態でのＥＧＲに有用な高温は、培養期間全体においても有用な温度である。Ｐ．フルオレセンスの場合、好ましい温度は、約２０〜約３０℃であり、好ましい高温は約２７〜約３０℃であり、好ましい低温は約２４〜約２７℃である。
炭素源
【００５９】
本発明の実施形態によるフロログルシノールを生産するための細胞、酵素系、および方法は炭素源を利用する。マロニル−ＣｏＡ以外の炭素源を細胞もしくは酵素系と接触させる場合、実施する実施形態の酵素系もしくは組換え細胞がその炭素源を、本明細書に記載するようにフロログルシノールを同化合成するのに使用することができる物質へと代謝させることができるならば、本発明による酵素系もしくは組換え細胞は他のいずれの炭素源も利用することができる。反応混合物に存在する、フロログルシノールシンターゼを除く他の酵素の性質と、任意でマロニル−ＣｏＡ合成活性により、使用し得る炭素源の種類が決定される。図４では、炭素源からのフロログルシノールの同化合成のための代表的な多くの経路を例示している。
【００６０】
このように、大部分の炭素源の場合では、細胞がアセチル−ＣｏＡを生成するための単純な有機分子を提供するために、細胞もしくは酵素系が、まず、炭素源を異化するかまたはそれを固定する。あるいは、その炭素源は直接アセチル−ＣｏＡへと変換される。例えば、アセテート炭素源の場合には、アセテートが直接アセチル−ＣｏＡへと変換され得るか、または、そのアセテートがまず、アセチルリン酸へと変換される可能性がある。アセチル−ＣｏＡはそれ自体が炭素源として使用されてもよい。一度得られたかまたは提供されたら、アセチル−ＣｏＡはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの作用などによりマロニル−ＣｏＡの合成に使用され得る。炭素源の分解により異化マロナートもしくは異化マロン酸セミアルデヒドが生じる場合、またはマロナートもしくはマロン酸セミアルデヒドが炭素源に存在する場合には、これらは細胞もしくは酵素系の酵素プールに存在するマロニル−ＣｏＡシンセターゼもしくはマロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼそれぞれにより、マロニル−ＣｏＡへと変換されるか、またはそれらはアセチル−ＣｏＡ合成用に異化され、続いてマロニル−ＣｏＡへと変換される。一度得られたかまたは提供されたら、マロニル−ＣｏＡはフロログルシノールシンターゼにより基質として使用され、フロログルシノールを生成する。
【００６１】
炭素源が生体分子型炭素化合物を含んでなる場合、その炭素化合物が一次代謝産物型化合物であることが好ましい。一次代謝産物型化合物の例としては、好ましくは、Ｃ１−Ｃ１８であるものはいずれも：脂肪酸、ワックス、モノ−、ジ−、およびトリ−グリセリド；ポリオール；脂肪族ヒドロキシ酸；リン脂質；ホスホアシッド(phosphoacid)；単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースなど）；アミノ酸；およびヌクレオチド；ならびに上述の化合物から生成される加水分解性ホモ−およびヘテロ−オリゴマー（すなわち、−ダイマーを含む）および−ポリマー；ならびに生物学的に活性化された型の上述の化合物（例えば、アセチル−ＣｏＡ）が挙げられる。生体分子型化合物は、生体起源であるか合成起源であるかには関わらず、いずれの起源のものでもよい。他の好ましい化合物としては、小型または非複雑有機化合物はいずれも、すなわち、一般に、あらゆる起源の、１８個の炭素原子当たりの炭素−炭素分岐点が４つ以下の好ましいモノマー複雑性を有する、Ｃ１−Ｃ１８化合物、脂肪族脂環式化合物、および芳香族化合物など、例えば：Ｃ１−Ｃ１８脂肪族炭化水素およびそれらのモノ−およびポリ−酸、−アルコール、−アミン、−カルボニル；ならびにそれから生成される加水分解性ホモ−およびヘテロ−オリゴマーおよび−ポリマーが挙げられる。
【００６２】
上述の小型／非複雑有機化合物および／または一次代謝産物型化合物を含んでなり、二次代謝産物または大型モノマー型もしくは複雑有機化合物を実質的に含まない（好ましくは、炭素について１０重量％未満の）炭素源も本明細書においては「単純な」炭素源と呼ぶ。本明細書において、二次代謝産物としては、例えば：アルカロイド；クマリン；ポリケチド；テルペノイド、イソプレノイド、ステロール、ステロイド、およびプロスタグランジン；カテコールアミン；ポルフィリン；キサントン；フラボノイド；フェニルプロパノイドおよびフェノール類（例えば、ベンゼン化合物およびポリフェノール類を含む）；などが挙げられる。大型または複雑有機化合物には、Ｃ１８を上回るモノマー化合物サイズおよび／または１８個の炭素原子当たりの炭素−炭素分岐点が４つを上回るモノマー化合物複雑性を有する、脂肪族化合物、脂環式化合物、および芳香族化合物などがある。
【００６３】
好ましい実施形態において、炭素源は単純な炭素源である。好ましい単純な炭素源は、二次代謝産物および大型もしくは複雑有機物を０重量％〜約５重量％、より好ましくは、０重量％〜約２重量％、または０重量％〜約１重量％、または０重量％〜約０．５重量％、または好ましくは、約０重量％含む；すなわち、好ましくは、二次代謝産物および大型／複雑有機物を含まないまたは少なくとも実質的に含まない。いくつかの実施形態において、単純な炭素源は一次代謝産物型化合物を含んでなる。本明細書における使用に好ましい一次代謝産物型化合物の例としては：糖類、好ましくは、単糖類および／または二糖類；ならびにポリオールが挙げられる。本明細書における炭素源用に好ましい単糖類の例がグルコース、キシロース、およびアラビノースであり；ゆえにポリオールの１つの好ましい例がグリセロールである。本明細書における一実施形態においては、グルコース、キシロース、および／またはアラビノースを、炭素源として、好ましくは、細胞培養の指数増殖期および維持期の両方の期間を通じての炭素源として使用する。一実施形態においては、単糖類（好ましくは、グルコース、キシロース、および／またはアラビノース）とグリセロールの組合せ（例えば、１：１または２：１重量比）を使用する；好ましくは、そのような組合せを維持期の期間中のみ使用し、指数増殖期の期間中には単糖類（グリセロールなし）を使用する。
【実施例】
【００６４】
フロログルシノール（１ａ、スキーム１、すなわち、図１）は様々な天然物の代用品として見出されている。しかしながら、独立した分子としてのフロログルシノール１ａの生合成は明確に示されていない。そのような生合成活性の研究の一環として、シュードモナス・フルオレセンス  Ｐｆ−５におけるアセチル化フロログルシノールの生成（６および７、スキーム１）について調べる。B. Novak-Thompson et al., Can. J. Microbiol. 40:1064 (1994)。フロログルシノール生合成を検出する。Ｐ．フルオレセンス  ｐｈｌＤの事後異種発現により大腸菌培養物においてフロログルシノール１ａの蓄積が起こる。これらの発見は、アセチルフロログルシノールの生合成と関連した意味合いのほか、新しく、環境に優しい、フロログルシノールおよびレソルシノールの合成の基礎を完成させるものである。
【００６５】
活性化３，５−ジケトヘキサノアート２（すなわち、活性化３，５−ジケトカプロアート）は、構造的に最も単純な２つのポリケチド天然物であるフロログルシノール１ａと三酢酸ラクトン３ａの有望な前駆体である（スキーム１）。例えば、ガーベラ(Gerbera hybrida)由来の２−ピロンシンターゼは、マロニル−ＣｏＡの三酢酸ラクトンへの変換を触媒する。S. Eckermann et al., Nature 396:387 (1998)；J. Jez et al., Chem. Bio. 7:919 (2000)。活性部位チロシンのフェニルアラニンへの変化により、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)脂肪酸シンターゼによる排他的生合成産物として三酢酸ラクトンが生成される。B. W. Zha et al., J. Am. Chem. Soc. 126:4534 (2004)。これらの天然または変異酵素のいずれによってもフロログルシノールの生成は認められない。フロログルシノール１ａのもう１つの別の可能性ある前駆体は活性化３，５−ジケト−ｎ−ヘプタンジオアート１２（すなわち、活性化３，５−ジケトピメラート）である。
【００６６】
フロログルシノール１ａの生合成調査の結果として、Ｐ．フルオレセンス  Ｐｆ−５と２，４−ジアセチルフロログルシノール７の生合成（スキーム１）が導かれる。B. Novak-Thompson et al., Can. J. Microbiol. 40:1064 (1994)。アセチルフロログルシノール生合成は、ｐｈｌＡＣＢＤからなる遺伝子群、ｐｈｌＥによってコードされる産物輸送用のタンパク質、および分岐転写されたｐｈｌＦによってコードされるレギュレーター、によってコードされる。ＰｈｌＤは、活性化３，５，７−トリケトオクタノアート５の生成および環化と関連していることが示唆されている（スキーム２）。生じた中間体２−アセチルフロログルシノール６は、その後、推定上アセチル化されて、２，４−ジアセチルフロログルシノール７が生成される（スキーム２）。M.G. Bangera & L.S. Thomashow, J. Bacteriol. 181:3155 (1999)参照。フロログルシノール１ａの生合成はＰｈｌＤが担当している作用ではない。
【００６７】
Ｐ．フルオレセンス  Ｐｆ−５／ｐＭＥ６０３１を、その培養上清に蓄積する産物について調べる。２，４−ジアセチルフロログルシノール７および２−アセチルフロログルシノール６の蓄積に加えて、フロログルシノールの生成も認められる（エントリー１、表１）。生合成されるフロログルシノールの濃度を高めるために、Ｐ．フルオレセンス  Ｐｆ−５をｐＪＡ２．２３２（ｐｈｌＡＢＣＤＥ遺伝子群をｐＭＥ６０３１に挿入することにより得たプラスミド）で形質転換する。目的は、生合成遺伝子群の複数のコピーを提示することによりゲノム的にコードされるＰｈｌＦによる調節を回避することである。このアプローチの結果、Ｐ．フルオレセンス  Ｐｆ−５／ｐＭＥ６０３１（エントリー１、表１）と比べて、Ｐ．フルオレセンス  Ｐｆ−５／ｐＪＡ２．２３２（エントリー２、表１）によって合成されるフロログルシノール１ａ、６、７の濃度に大幅な上昇が生じる。
【００６８】
【表１】
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大腸菌におけるｐｈｌＡＣＢＤＥ遺伝子のＴ７プロモーターからの異種発現からさらなる解析が得られる（エントリー３〜８、表１）。総ての大腸菌構築物は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする染色体性遺伝子ｌ挿入物も有している。ＰｈｌＡＣＢＤＥプラスミド挿入物を有する大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．０８５は、フロログルシノールおよび２−アセチルフロログルシノールを合成するが、２，４−ジアセチルフロログルシノールは合成しない（エントリー３、表１）。大腸菌  ＢＬ２１（ＤΕ３）／ｐＪＡ３．１５６にはｐｈｌＥによってコードされる産物のエクスポーターが存在しないため、生合成されるフロログルシノール１ａおよび２−アセチルフロログルシノール２の濃度に悪い影響は及ぼさない（エントリー４、表１）。さらに、ｐｈｌＤ単独の異種発現に伴う産物生成を大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ２．０４２を用いて評価する（エントリー５、表１）。フロログルシノール１ａの生成だけが観察される。大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１５６と比べての、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ２．０４２によって生合成されるフロログルシノール１ａの濃度における違い（エントリー４対エントリー５、表１）は、恐らくｐｈｌＤとＴ７プロモーターとの近接性を反映している。発酵装置制御条件下、最少塩培地におけるグルコースからのフロログルシノールの合成を大腸菌  ＪＷＦｌ（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１３１Ａを用いて調べる（エントリー６、表１）。
【００６９】
フロログルシノール生合成におけるその役割をさらに調査するために、ＰｈｌＤを均一に精製し、そのin vitro酵素学を調べる。アセチル−ＣｏＡ単独を基質として使用する場合には活性は認められない（表１）。マロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡをＰｈｌＤとともにインキュベートした場合、ＰｈｌＤとマロニル−ＣｏＡ単独とのインキュベーションと比べると、ほぼ等しい特異活性が認められる。ＰｈｌＤについては、マロニル−ＣｏＡに対してＫｍ＝３７μＭ、ｋｃａｔ＝４．７分−１と決定される。比較のため、ＰｈｌＤと同様に活性化３，５−ジケトヘキサノアート２（スキーム１）を使用する２−ピロンシンターゼを均一に精製する。２−ピロンシンターゼは、アセチル−ＣｏＡを基質として使用できない。しかしながら、２−ピロンシンターゼをマロニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡとともにインキュベートすると、アセチル−ＣｏＡの不在下でマロニル−ＣｏＡとともにインキュベートするよりも２倍高い特異活性を得る。２−ピロンシンターゼについての速度パラメーターは、マロニル−ＣｏＡに対してＸＸμＭ、アセチル−ＣｏＡに対してＫｍ＝２．２μＭ、ｋｃａｔ＝３．３分−１である。
【００７０】
ＰｈｌＡＣＢＤＥおよびＰｈｌＤの異種発現において生成する産物により、活性化３，５−ジケトヘキサノアート２の環化（スキーム１）、続いて起こる、フロログルシノール１ａの段階的アセチル化が、２−アセチルフロログルシノール６および２，４−ジアセチルフロログルシノール７の生合成の基礎であるという可能性が高まる。この可能性をさらに調査するために、プラスミド局在ｐｈｌＡＣＢを用いて大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１６９を構築する。M.G. Bangera & L.S. Thomashow, J. Bacterial. 181:3155 (1999)。この構築物はプラスミド局在ｐｈｌＤを欠いているため、この構築物の培養ではフロログルシノールは合成されない（エントリー７、表８）。しかしながら、大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１６９の培養培地にフロログルシノール１ａを添加することで、２−アセチルフロログルシノール６と少量の２，４−ジアセチルフロログルシノール７の生成が起こる（エントリー８、表１）。
【００７１】
ＰｈｌＤは、現在、Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７を利用した酸化を必要とする経路によって２，４，６−トリニトロトルエン８から合成されている（スキーム２、すなわち、図２）フロログルシノールの新規合成の概要の確立においてもとりわけ重要である。G. Leston, In Kirk-Othmer Encyclopedia of chemical Technology, Vol. 19, p 778 (J.I. Kroschwitz & M. Howe-Grant, eds.) (4th ed., 1996) (Wiley: New York)。２，４，６−トリニトロトルエン８からのフロログルシノール１ａの合成中は、爆発の危険はないが、環境上問題のあるクロマートが廃棄物の流れとして生成される。最近になって、三酢酸ラクトン３ａの微生物触媒による合成を含むフロログルシノール１ａへの別の経路（スキーム２）が明らかになった。W. Zha et al., J. Am. Chem. Soc. 126:4534 (2004)。三酢酸ラクトン３ａをフロログルシノール１ａへと変換するには複数の化学的ステップが必要である。C.A. Hansen & J.W. Frost, J. Am. Chem. Soc. 124:5926 (2002)。フロログルシノールへのこれらの化学的経路および化学酵素的経路に対し、大腸菌におけるＰｈｌＤの異種発現では、フロログルシノール１ａをグルコースから微生物触媒による単一ステップで作製することができる（スキーム２）。
【００７２】
現今では、レソルシノール９の代替合成も可能である。レソルシノールは、現在、１，３−ベンゼンジスルホン酸１０のアルカリ融解または１，３−ジイソプロピルベンゼン１１のヒドロペルオキシデーションにより製造される（スキーム２）。アルカリ融解では高温を必要とし、多量の廃塩流が生じる。ヒドロペルオキシデーション中に生成するアセトンヒドロペルオキシドは爆発の危険がある。L. Krumenacker et al., In Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 13, p 996 (J.I. Kroschwitz & M. Howe-Grant, eds.) (4th ed., 1995) (Wiley: New York)参照。さらに、１，３−ベンゼンジスルホン酸１０および１，３−ジイソプロピルベンゼン１１は両方とも石油系発癌性ベンゼンから製造される（スキーム２）。レソルシノール９への新規経路は、フロログルシノール１ａの微生物による合成と、続いて行うこの中間体のＲｈ触媒による水素化に基づいている（スキーム２）。C.A. Hansen & J.W. Frost, J. Am. Chem. Soc. 124:5926 (2002)。フロログルシノール１ａは、現今ではグルコースから合成することができるため、レソルシノールは非毒性の植物由来グルコースから合成することができるジヒドロキシ芳香族化合物としてカテコールおよびヒドロキノンと仲間である（スキーム２）。それぞれ：K.D. Draths & J.W. Frost, J. Am. Chem. Soc. 117:2395 (1995)；およびN. Ran et al., J. Am. Chem. Soc. 123:10927 (2001)参照。
【００７３】
実施例２  大腸菌株におけるＰｈｌＤの発現およびその結果起こるフロログルシノール合成
プラスミド  ｐＪＡ３．１３１Ａ（ＫａｎＲ、ｌａｃＩＱ、ＰＴ７−ｐｈｌＤ、ｓｅｒＡ）をｓｅｒＡ−大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｗ３１１０（ＤＥ３）、およびＪＷＦ１（ＤＥ３）［すなわち、ＲＢ７９１ｓｅｒＡ−（ＤＥ３）］、ならびに株ＫＬ３（ＤＥ３）［すなわち、ＡＢ２８３４（ｓｅｒＡ：：ａｒｏＢ）］（大腸菌株ＲＢ７９１およびＡＢ２８３４はthe E. coli Genetic Stock Center, New Haven, CT, USAから入手可能である）に染色体的にトランスフェクトする。総てのＤＥ３株は、λＤＥ３プロファージの細胞染色体への組込みによって得られる。細胞はフェドバッチ条件により無機塩および制限グルコース下で培養する。総ての形質転換株はフロログルシノールをかなりのレベルで発現するが、ＢＬ２１株およびＷ３１１０株は、それぞれ、３．０ｇ／Ｌおよび３．１ｇ／Ｌ  フロログルシノールという優れた力価を示し；培養物に補給されたグルコースの量に対して、これらの株は、グルコース１００モル当たりフロログルシノール４．４および３．１モル（％ｍｏｌ／ｍｏｌ）という優れたフロログルシノール収率を与える。
【００７４】
これらの試験ではｐｈｌＤがＰｔａｃまたはＰＴ５の制御下にあるプラスミドで同様に形質転換したＢＬ２１株におけるフロログルシノールの発現レベルも比較する；ＰＴ７については優れた結果を与えることが分かっている（データでは示していない）。これらの試験において、総ての株についてのフロログルシノールの蓄積は、定常（または維持）期の期間中増加は止まる。ＢＬ２１およびＷ３１１０では、それぞれ、誘導開始、すなわち、最初のＩＰＴＧ添加の約６時間後および約１２時間後に最も高いフロログルシノール濃度に達する。最終生成物阻害も認められる。さらなる試験では、フロログルシノールが約２ｇ／Ｌ以上の濃度の場合にその阻害に関与するということが立証されている（データでは示していない）。
【００７５】
実施例３  抽出フロログルシノール発酵
発酵中のフロログルシノールの細胞毒性およびフロログルシノール合成抑制を減少させるまたは排除するために、陰イオン交換樹脂カラムに基づく抽出発酵を用いて、フロログルシノールを取り出す。攪拌槽型反応器には陰イオン交換カラムを貫通し、その槽へと戻る管系があり；その管系は培地をカラム中で循環させるために蠕動ポンプを装備している。ＡＧ１−Ｘ８樹脂８０ｍＬ（ベット容量）を充填したＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｅｃｏｎｏ  カラム（２５×２００ｍｍ）は、in situ抽出の前に１５ベッド容量のＫＨ２ＰＯ４（０．８Ｍ）で洗い流して、第三級アンモニウム塩をリン酸塩形態に変える。培養培地のフロログルシノール濃度を約１．５ｇ／Ｌ未満に維持するために、各発酵につき合計３〜５本のカラムを使用し；各カラムを約６〜１２時間使用した後、別のカラムと取り替える。総てのカラムを流動床様式で操作し、循環流速は約８〜１２ｍＬ／分とする。
【００７６】
ＡＧ１−Ｘ８樹脂に吸着したフロログルシノールを回収するために、カラムを流動床様式で１０ベッド容量の蒸留脱イオン水で洗浄して、残留細胞を除去する；これにより樹脂からフロログルシノールの約１５％も水溶液中に回収される。次いで、そのカラムを固定床様式で１５ベッド容量の酸性エタノール（酢酸、１０％（ｖ／ｖ）；エタノール、７５％（ｖ／ｖ）；Ｈ２Ｏ、１５％（ｖ／ｖ））で洗い流して、樹脂から残りのフロログルシノールを酸性エタノール溶液中に回収する。フロログルシノールを回収した後、そのカラムは、１５ベッド容量のＫＨ２ＰＯ４（０．８Ｍ）、２ベッド容量のエタノール（７０％）、および５ベッド容量の滅菌蒸留脱イオン水それぞれでさらに洗い流すことにより再生させることができる。
【００７７】
回収したフロログルシノールを精製するために、得た水溶液中の細胞を遠心分離により除去し；その溶液をさらに、最初の容量の約１／１０まで濃縮する。別に、酸性エタノール溶液を濃縮乾固する。この残渣を濃縮した水溶液で再溶解する。得られた水相をさらに、同量の酢酸エチルで３回抽出する。その有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、シリコーンゲルと混合し、濃縮乾固し、フラッシュカラムにかける。ヘキサン：アセテート（１：１）で洗い流すことによりフロログルシノールを他の褐色の不純物から分離し、ＴＣＬにより同定する。次いで、フロログルシノールを含む画分を濃縮乾固し、高真空条件下で乾燥させ、青白色の結晶としてフロログルシノールを得る。
【００７８】
実施例４  フロログルシノール発酵の最適化
上述の形質転換Ｗ３１１０株の抽出発酵および非抽出発酵において様々な二重温度発酵プロフィールを用いる。グルコースはｐＯ２カスケード制御によりを着実に供給し、排出ＣＯ２レベルは発酵が終了するまで定常レベルで維持する。両タイプの発酵において、開始時３６℃の温度を発酵中に低下させるとフロログルシノールの力価および収率が大幅に高まり、抽出発酵での結果でより顕著であることが分かる。独立した発酵において１２時間の時点（ＩＰＴＧによる最初の誘導時）、１５時間の時点（維持期開始時）、または３０時間の時点で３０℃へと温度を変化させる。１５時間の時点で温度変化を起こした場合に優れた結果が得られ、抽出発酵は合計６０時間行うことができる。これらの条件下で、Ｗ３１１０ｓｅｒＡ−（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１３１Ａは収率１１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）において１５ｇ／Ｌフロログルシノールを合成する。非抽出発酵と比べると、抽出発酵では発酵中ずっとフロログルシノール産生が衰えず、ＰｈｌＤ特異活性が安定し、細胞生存力が維持され、最大発酵時間がより長いことが分かる。
【００７９】
同一抽出発酵条件で同一発酵プロフィールを用いて、上述のＢＬ２１ｓｅｒＡ−（ＤＥ３）／ｐＪＡ３．１３１Ａ株によるフロログルシノール産生も試験する。Ｗ３１１０発酵の結果と同等の結果が得られる。開始時３６℃の温度を１５時間の時点で３３℃へと変化させる１つのさらなる二重温度プロフィールは、ＢＬ２１からのフロログルシノールの回収をいっそうさらに増加させ、力価１７．３ｇ／Ｌおよび収率１２．３％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を与えることが分かる。
【００８０】
さらに、酵母、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)においても組換えｐｈｌＤの発現には成功するが、試験条件下での収率は０．５〜約１．５ｍｇ／Ｌである（データでは示していない）。
【００８１】
本明細書において記載する実施例および他の実施形態は例示であり、本発明の組成物および方法の全範囲を記載することにより限定するものではない。本発明の範囲内で、実質的に同様の結果をもたらす、具体的な実施形態、材料、組成物および方法の等価な変更、修飾および変形は行ってよい。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】（ａ）中間体としてのフロログルシノールが存在しないアセチルフロログルシノール生合成について（M.G. Bangera & L.S. Thomashow, J Bact. 181(10):3155-63 (1999)参照）；および（ｃ）三酢酸ラクトン生合成について（S. Eckermann et al., Nature 396:387 (1998)、J.M. Jez et al., Chem. Bio. 7:919 (2000)；W. Zha et al., J. Am. Chem. Soc. 126:4534 (2004)参照）の文献で報告された経路を説明するスキーム１を示す。フロログルシノールが中間体として存在するアセチルフロログルシノール生合成についての本研究において仮定され、確認された経路（ｂ）および（ｂ’）も示している。
【図２】フロログルシノール合成についての共通する商業的化学合成経路（ａ、ｂ、ｃ）；グルコースからのフロログルシノールの合成についてこれまでに提示された多段階経路（ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）；レソルシノール合成についての第１の共通の商業的化学合成経路（ｉ、ｊ）；およびレソルシノール合成についての第２の共通の商業的化学合成経路（ｋ、ｌ）を説明するスキーム２である。丸で囲んだ矢印で、（１）フロログルシノールの生産についての本研究において報告された完全に生合成による経路（丸で囲んだアスタリスクで示してある）；および（２）フロログルシノールのレソルシノールへの化学水素化（ｈ）も示している。示した具体的な反応または反応段階は：（ａ）Ｎａ２Ｃｒ２Ｏ７，Ｈ２ＳＯ４；（Ｂ）Ｆｅ，ＨＣｌ；（ｃ）Ｈ２ＳＯ４、１０８℃；（ｄ）W. Zha et al., J. Am. Chem. Soc. 126:4534 (2004)参照；（ｅ）Ｄｏｗｅｘ  ５０  Ｈ＋，ＭｅＯＨ；（ｆ）Ｎａ，ＭｅＯＨ、１８５℃；（ｇ）１２Ｎ  ＨＣｌ；（ｈ）ｉ）Ｈ２，Ａｌ２Ｏ３上のＲｈ、ii）０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４，還流；（ｉ）ＳＯ３，Ｈ２ＳＯ４；（ｊ）ＮａＯＨ，３５０℃；（ｋ）ＨＺＳＭ−１２  ゼオライト，プロペン；および（１）ｉ）Ｏ２，ii）Ｈ２Ｏ２，iii）Ｈ＋である。
【図３】本発明による推定反応経路を示す図である。この経路では、フロログルシノールシンターゼによって、酵素活性化３，５−ジケトピメラート（３，５−ジケトヘプタンジオアート）を経るか、または酵素活性化３，５−ジケトヘキサノアート（３，５−ジケトカプロアート）を経て、マロニル−ＣｏＡが生合成によりフロログルシノールへと変換される。
【図４】同化フロログルシノール合成のための工程での異なる炭素源の利用についての様々な例示的経路を示す図である。破線の矢印で、考えられる代替的炭素源利用経路を示し；一部の経路には存在しない可能性のある中間体を角括弧で囲っている。  本明細書に示した図が、本明細書における上述の実施形態を説明するために、本発明のものの中で装置、材料および方法の一般的な特徴を例示することを目的としていることには留意すべきである。これらの図は任意の実施形態の特徴を正確に示していないかもしれず、必ずしも本発明の範囲内で具体的な実施形態を定義または限定することを目的としているものではない。
【図１】
2008517588.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2008517588000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月22日(2006.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、またはＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−であるＰｈｌＤ＋組換え細胞、またはその細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−組換え細胞。
【請求項２】
少なくとも１つのマロニル−ＣｏＡ合成酵素をさらに含んでなる、請求項１に記載の酵素系。
【請求項３】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素が、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項３に記載の酵素系。
【請求項４】
同化フロログルシノールを生産する工程であって、
（Ａ）
（１）
（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである、単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または
（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである、ＰｈｌＤ＋組換え細胞、または
（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞である、ＰｈｌＤ＋組換え細胞
（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）；および
（２）マロニル−ＣｏＡ、または該酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡへと変換することができる別の炭素源の少なくとも１つ
を提供するステップ；および
（Ｂ）
（１）該マロニル−ＣｏＡと該酵素系もしくは組換え細胞とを、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ、または
（２）該他の炭素源と該酵素系もしくは組換え細胞とを、該炭素源をマロニル−ＣｏＡへと変換することができ、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ
を含んでなり、それにより同化フロログルシノールを得る、工程。
【請求項５】
酵素系（１)（a）または細胞（１)（b）が、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項４に記載の工程。
【請求項６】
酵素系または組換え細胞が、マロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなる、請求項４に記載の工程。
【請求項７】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素が、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項４に記載の工程。
【請求項８】
単離同化フロログルシノール。
【請求項９】
配列番号：２と少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を含んでなり、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる、単離もしくは組換えフロログルシノールシンターゼ酵素。
【請求項１０】
配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる、請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
配列番号：２のアミノ酸配列の保存的置換変異体を含んでなる、請求項９に記載の酵素。
【請求項１２】
ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであり、マロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームをさらに含んでなる、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでなる、単離もしくは組換え核酸ベクター。
【請求項１３】
配列番号：１である塩基配列、それに対応するＲＮＡ塩基配列、またはそれと重複するコドン配列を含んでなる、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
配列番号：１と少なくとも８０％相同である塩基配列を含んでなる、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１５】
ｐｈｌＡ−、ｐｈｌＢ−、およびｐｈｌＣ-であり、その細胞で発現されるフロログルシノールシンターゼの作用によりマロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができるｐｈｌＤ＋組換え細胞であって、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含んでなる核酸ベクターで形質転換されており、それによりフロログルシノールシンターゼを発現することができる、ｐｈｌＤ＋組換え細胞。
【請求項１６】
レソルシノールの調製のための工程であって、
（Ａ）（１）（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）、の作用によりフロログルシノールを同化作用により生合成すること；および
（２）水素およびロジウム触媒を提供すること；および
（Ｂ）それによって生合成されたフロログルシノールと該水素およびそのロジウム触媒とを、該フロログルシノールが水素化されてレソルシノールが生成される条件下で接触させること
を含み、それによってレソルシノールを調製する、工程。
【請求項１７】
医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料を製造する方法であって、
（１）マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる、（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋組換え細胞、の作用によりフロログルシノールを同化作用により生合成すること；および
（２）それによって生合成された同化フロログルシノールから、または該同化フロログルシノールを化学修飾することによって得られるレソルシノールから医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料を調製すること
を含む、方法。
【請求項１８】
（１）（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系；または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞；または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）、の作用によりフロログルシノールを同化作用により生合成すること；および
（２）それによって生合成された同化フロログルシノールから、または該同化フロログルシノールを化学修飾することによって得られるレソルシノールから医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料を調製すること
を含む工程により調製される、医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料。
【請求項１９】
マロニル−ＣｏＡからフロログルシノールを生合成することができる組換え細胞の調製のための工程であって、
（Ａ）以下の、
（１）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−であり、ＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むか、またはＰｈｌＤ酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームとマロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームの両方を含む、単離もしくは組換え核酸を提供すること、
（２）（ａ）前記核酸で形質転換することができるＰｈｌＤ−、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−細胞、または（ｂ）前記核酸で形質転換することができるＰｈｌＤ＋、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−細胞、を提供すること；および
（３）該細胞と該核酸とを、該細胞を該核酸で形質転換することができる条件下で接触させること
により細胞を、該細胞による発現が可能な、ＰｈｌＤをコードする核酸で形質転換することを含み、それによって組換え細胞を得ること；または
（Ｂ）以下によりｐｈｌＤ＋細胞における遺伝子を不活化することを含み、それによってＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である組換え細胞を得ること
（１）ＰｈｌＡ＋、ＰｈｌＢ＋、もしくはＰｈｌＣ＋の少なくとも１つであるｐｈｌＤ＋細胞を提供すること；および
（２）その細胞における前記ＰｈｌＡ、ＰｈｌＢ、およびＰｈｌＣ遺伝子の総てを不活化すること
を含んでなる、工程。
【請求項２０】
微生物である、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項２１】
酵母、真菌、または細菌である、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２２】
細菌である、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
エシェリキア属(Escherichia)またはシュードモナス属(Pseudomonas)のうちのいずれかのメンバーである、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
大腸菌(E. coli)またはＰ．フルオレセンス(P. fluorescens)のうちのいずれかである、請求項２０に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
炭素源が単純な炭素源である、請求項４に記載の工程。
【請求項２６】
炭素源が糖類、脂肪族ポリオール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項２５に記載の工程。
【請求項２７】
炭素源がグルコース、キシロース、アラビノース、グリセロール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項２５に記載の工程。
【請求項２８】
組換え細胞が提供され、前記接触（Ｂ）ステップが、その細胞を炭素源を含む増殖培地において培養することを含む、請求項４に記載の工程。
【請求項２９】
培養が抽出発酵として実施される、請求項２８に記載の工程。
【請求項３０】
培養が二重温度プロフィールを用いて実施される、請求項２８に記載の工程。
【請求項３１】
噴射剤化合物または爆発性化合物を生産するための方法であって、
（Ａ）（１）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系、または（２）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞、または（３）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）、の作用によりフロログルシノールを同化作用により生合成すること；および
（Ｂ）それによって生合成された同化フロログルシノールを化学修飾して、またはそれから製造されるレソルシノールを化学修飾して、噴射剤化合物または爆発性化合物を生産すること
を含んでなる、方法。
【請求項３２】
同化フロログルシノールが
（Ａ）（１）（ａ）前記単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系（Ａ)(１)、または（ｂ）前記ＰｈｌＤ＋組換え細胞（Ａ)(２)、または（ｃ）前記ＰｈｌＤ＋組換え細胞（Ａ)(３)（ここで、該酵素系または組換え細胞は、炭素源をフロログルシノールへと変換することができる）；および
（２）マロニル−ＣｏＡ、または該酵素系もしくは組換え細胞がマロニル−ＣｏＡへと変換することができる別の炭素源の少なくとも１つ
を提供するステップ；および
（Ｂ）（１）該マロニル−ＣｏＡと該酵素系もしくは組換え細胞とを、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ、または
（２）該他の炭素源と該酵素系もしくは組換え細胞とを、その炭素源をマロニル−ＣｏＡへと変換することができ、そこからフロログルシノールを合成することができる条件下で接触させるステップ
を含み、それによって同化フロログルシノールを得る工程によって生合成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酵素系または組換え細胞が、マロニル−ＣｏＡ合成酵素を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
マロニル−ＣｏＡ合成酵素がマロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｐｈｌＤ＋酵素系（A)（１）または組換え細胞（A)（２）が、ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、およびＰｈｌＣ−である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
組換え細胞が提供される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３７】
組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＰｈｌＤ＋組換え細胞がＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその少なくとも１つのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、もしくはｐｈｌＣ遺伝子を不活化すること、を含む工程によって生産される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ＋細胞を提供すること、およびその総てのｐｈｌＡ、ｐｈｌＢ、もしくはｐｈｌＣ遺伝子を不活化すること、を含む工程によって生産される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
その組換え細胞が、ｐｈｌＡＢＣＤ−細胞を提供すること、およびｐｈｌＤ遺伝子をその細胞に挿入すること、を含む工程によって生産される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ｐｈｌＤ遺伝子がその細胞のゲノムＤＮＡに位置される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｐｈｌＤ遺伝子がその細胞のゲノム外ＤＮＡに位置される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
その組換え細胞に、マロニル−ＣｏＡシンセターゼ、マロニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、またはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼのうちのいずれかであるマロニル−ＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子が該細胞に挿入されることをさらに含む工程によって生産される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
組換え細胞が微生物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
組換え細胞が酵母、真菌、または細菌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
組換え細胞が細菌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
組換え細胞がエシェリキア属(Escherichia)またはシュードモナス属(Pseudomonas)のうちのいずれかのメンバーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４９】
組換え細胞が大腸菌(E. coli)またはＰ．フルオレセンス(P. fluorescens)のうちのいずれかである、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
炭素源が単純な炭素源である、請求項３２に記載の方法。
【請求項５１】
炭素源が糖類、脂肪族ポリオール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
炭素源がグルコース、キシロース、アラビノース、グリセロール、またはそれらの組合せを含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
組換え細胞が提供され、前記接触（Ｂ）ステップがその細胞を炭素源を含む増殖培地において培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項５４】
培養が抽出発酵として実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
培養が二重温度プロフィールを用いて実施される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
（１）（ａ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つである単離もしくは組換えＰｈｌＤ＋酵素系；または（ｂ）ＰｈｌＡ−、ＰｈｌＢ−、もしくはＰｈｌＣ−の少なくとも１つであるＰｈｌＤ＋組換え細胞；または（ｃ）その細胞でのＰｈｌＤの発現をさらに増強させるように遺伝子操作されているＰｈｌＤ＋細胞であるＰｈｌＤ＋組換え細胞（ここで、該酵素系または組換え細胞は、マロニル−ＣｏＡをフロログルシノールへと変換することができる）、の作用によりフロログルシノールを同化作用により生合成すること；および
（２）それによって生合成された同化フロログルシノールから、またはその同化フロログルシノールを化学修飾することによって得られるレソルシノールから爆発性組成物または噴射剤組成物を調製すること
を含む工程によって調製される爆発性組成物または噴射剤組成物。
【請求項５７】
単離同化フロログルシノールまたはその誘導体を含んでなる組成物。
【請求項５８】
医薬、化粧料、染料、ポリマー樹脂、ゴム、接着剤、封止剤、被覆剤、複合材料、または積層もしくは結合材料である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
爆発物または噴射剤である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項６０】
誘導体が、レソルシノールまたはその誘導体である、請求項５７に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008517588.tif 000011
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