(57)【要約】  本発明は、候補物質を、(i)配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に示される配列を含むタンパク質、または(ii)  (i)と60％同一性のタンパク質、または(iii)  (i)もしくは(ii)の断片(この断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する)を含むタンパク質、または(iv)  (i)、(ii)もしくは(iii)をコードする配列を含むポリヌクレオチド、または(v)  (iv)のコード配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、およびその候補物質が(i)、(ii)、(iii)、(iv)、もしくは(v)に結合または(i)、(ii)、(iii)、(iv)、もしくは(v)をモジュレートするか否か決定することを含み、ここで(i)、(ii)、(iii)、(iv)、もしくは(v)の結合もしくはモジュレーションはその候補物質が抗菌物質であることを示す、菌類の必須タンパク質または必須遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法、に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌類の必須タンパク質または必須遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、候補物質を、
(i)配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に示される配列を含むタンパク質、または
(ii)  (i)と60％の同一性を有するタンパク質、または
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、または
(iv)  (i)、(ii)もしくは(iii)をコードする配列を含むポリヌクレオチド、または
(v)  (iv)のコード配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドと接触させるステップ、および
該候補物質が(i)、(ii)、(iii)、(iv)、もしくは(v)に結合または(i)、(ii)、(iii)、(iv)、もしくは(v)をモジュレートするか否か決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)、(iii)、(iv),もしくは(v)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法。
【請求項２】
反応を候補物質の存在下および不在下で行うことにより、該候補物質が請求項１に記載のタンパク質の活性を阻害するか否かを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
菌類のILV3遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、
候補物質を、
(i)  配列番号12、21、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に記載の配列を含むタンパク質、または
(ii)  (i)と少なくとも60％同一性を有するタンパク質、または
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、および
該候補物質が(i)、(ii)もしくは(iii)に結合または(i)、(ii)もしくは(iii)をモジュレートするか否かを決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)もしくは(iii)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法。
【請求項４】
反応を候補物質の存在下および不在下で行うことにより、該候補物質が請求項３に記載のタンパク質の活性を阻害するか否かを決定することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
菌類のILV3遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、
候補物質を、
(i)  配列番号21、42、45、53もしくは56に記載の配列を含むタンパク質、または
(ii)  (i)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、または
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、ならびに、
該候補物質を、
(iv)  配列番号12、39、48、50もしくは59に記載の配列を含むタンパク質、または
(v)  (i)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、または
(vi)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、とも接触させるステップ、ならびに
該候補物質が(i)、(ii)もしくは(iii)に結合または(i)、(ii)もしくは(iii)をモジュレートするか否か、および該候補物質が(iv)、(v)もしくは(vi)に結合または(iv)、(v)もしくは(vi)をモジュレートするか否かを決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法。
【請求項６】
反応を候補物質の存在下および不在下で行うことにより、該候補物質が請求項５に記載のタンパク質の活性を阻害するか否かを決定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
菌類のILV3遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、
候補物質を、
(i)  配列番号12、39、48、50もしくは59に記載の配列を含むタンパク質、または
(ii)  (i)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、または
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、および、
該候補物質を、
(iv)  配列番号21、42、45、53もしくは56に記載の配列を含むタンパク質、または
(v)  (iv)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、または
(vi)  (iv)もしくは(v)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、ならびに
該候補物質が(i)、(ii)もしくは(iii)に結合または(i)、(ii)もしくは(iii)をモジュレートするか否か、および該候補物質が(iv)、(v)もしくは(vi)に結合または(iv)、(v)もしくは(vi)をモジュレートするか否かを決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法。
【請求項８】
反応を候補物質の存在下および不在下で行うことにより、該候補物質が請求項７に記載のタンパク質の活性を阻害するか否かを決定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質またはポリヌクレオチドが、Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; クロコウジカビ(Aspergillus niger); Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; イネ科うどんこ病菌(Blumeria graminis); Candida albicans; Candida cruzei; Candida glabrata; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; 炭疽病菌(Colletotrichium trifolii); Cryptococcus neoformans; 脳炎性胞子虫(Encephalitozoon cuniculi); Fusarium graminarium; ニンジン乾腐病菌(Fusarium solani); Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulata; ふ枯病菌(Leptosphaeria nodorum); イネいもち病菌(Magnaporthe grisea); Mycosphaerella graminicola; アカパンカビ(Neurospora crassa); 灰色疫病菌(Phytophthora capsici); ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans); うどんこ病菌(Plasmopara viticola); ニューモシスティス肺炎菌(Pneumocystis jiroveci);エンバク冠銹病菌(Puccinia coronata); コムギ黒銹病菌(Puccinia graminis); Pyricularia oryzae; 苗立枯病菌(Pythium ultimum); Rhizoctonia solani; 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae); 分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe); Trichophyton interdigitale; 紅色白癬菌(Trichophyton rubrum); またはトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
同定した抗菌物質を農業用または医薬用組成物に配合することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
菌類と同定した抗菌物質とを接触させることにより菌類を殺菌するまたはその増殖を妨げることをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗菌物質を同定するまたは得るための、請求項1、3、5または7に定義したタンパク質またはポリヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
菌類感染の予防用または治療用の医薬の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により同定された抗菌物質の使用。
【請求項１４】
請求項1、3、5または7に定義された、単離されたタンパク質またはポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項1、3、5もしくは7に定義されたポリヌクレオチドまたは請求項15に記載のベクターを含む組換え細胞。
【請求項１７】
請求項1、3、5または7に定義するポリヌクレオチドまたは請求項15に記載のベクターからタンパク質を発現させることを含む、請求項1、3、5または7に定義されたタンパク質を取得する方法。
【請求項１８】
請求項15に定義のベクターを複製させること、またはヌクレオチドを縮合させることにより請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドを合成することを含む、請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドの取得方法。
【請求項１９】
請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドで遺伝子組み換えされた生物。
【請求項２０】
請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドまたはタンパク質が機能しないようにまたは抑制されるように遺伝子操作された生物。
【請求項２１】
請求項1、3、5または7に定義されたタンパク質に対して特異的である抗体。
【請求項２２】
請求項1、3、5または7のいずれか１項に記載の方法により同定された抗菌物質を投与することを含む、菌類感染の予防方法または治療方法。
【請求項２３】
請求項1、3、5または7に定義されたタンパク質またはポリヌクレオチドを投与することを含む、菌類感染の予防方法または治療方法。
【請求項２４】
請求項1、3、5または7に定義されたポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、菌類の殺菌方法または増殖阻害方法。
【請求項２５】
菌類がヒト、動物または植物個体に感染した、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
請求項1、3、5または7に定義されたタンパク質またはポリヌクレオチドの発現または活性の阻害により、殺菌された、またはその増殖が阻害された菌類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗菌物質のスクリーニング方法およびシグナル伝達と代謝にかかわる菌類遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
侵襲的菌類感染は、免疫不全宿主の疾患として広く認識されている。ここ２０年間で、菌類感染の記録件数は著しく増加した(Groll ら, 1996, J Infect 33, 23-32)。このことは部分的には菌類感染への認識の高まりと診断の改善による。しかし、この発生率上昇の主な原因は、易感受性個体の数が著しく増加したことである。これはいくつかの要因によるが、例えば新規かつ積極的な免疫抑制療法、集中治療における生存率の上昇、移植手術の件数の増加および世界中での抗生物質の使用の拡大が挙げられる。
【０００３】
特定の患者群では、菌類感染が高頻度で発生する。肺移植レシピエントは菌類生物による肺定着と感染の頻度が最大20％であり、また、同種造血幹移植レシピエントにおける菌類感染頻度は15％にもなる(Ribaud ら, 1999, Clin Infect Dis. 28:322-30)。
【０００４】
今のところ、全身性菌類感染を治療するために利用可能な抗菌薬は４クラスしかない。その４クラスとは、ポリエン系(例えばアンホテリシンB)、アゾール系(例えばケトコナゾールまたはイトラコナゾール)、エキノカンジン系(例えばカスポファンジン(caspofungin))およびフルシトシン(flucytosine)である。
【０００５】
ポリエン系は抗菌薬のなかでも最も古いクラスであり、1950年代に最初に導入された。作用の正確な機序は未だ不明だが、ポリエン系抗菌薬は、外膜にステロールを有する生物に対してのみ効果がある。アンホテリシンBは膜ステロールと相互作用して孔を生じ、細胞質成分の漏出とそれに続く細胞死をもたらすと提唱されている。
【０００６】
アゾール系抗菌薬は、シトクロムP450依存性の機構を介して14α-デメチラーゼの阻害により作用する。このことは、膜ステロールエルゴステロールの枯渇とステロール前駆体の蓄積をもたらし、結果的に原形質膜の流動性と構造の変化をもたらす。
【０００７】
エキノカンジン系は、細胞壁合成酵素であるβ-グルカンシンターゼを阻害することにより機能し、異常細胞壁形成、浸透圧感受性、および細胞溶菌をもたらす。
【０００８】
フルシトシンはピリミジンのアナログであり、細胞性ピリミジン代謝ならびにDNA、RNAおよびタンパク質合成を妨害する。しかしながらフルシトシン耐性の拡大はその治療的使用を制限する。
【０００９】
このように、今日までに、現行の利用可能な抗菌薬は、わずか２種類の細胞性標的、すなわち膜ステロール(ポリエン系およびアゾール系)ならびにβ-グルカンシンターゼ(エキノカンジン系)に対して主に作用するのみである。
【００１０】
アゾール系およびポリエン系に対する耐性は広く報告されており、侵襲的菌類感染に対処するには、最近導入されたエキノカンジン系しか残されていない。エキノカンジン系抗菌薬の使用が増加するにつれて、菌類による耐性は否応なく生じるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
将来的にも患者への良好な治療結果を保証するには、新しい作用機序を有する新しいクラスの抗菌物質の同定が必要である。新規菌類特異的遺伝子は、効果的な新規抗菌物質の開発のために最良の機会を提供する可能性が高い。とりわけ、標的遺伝子が種々の菌類に存在するがヒトには存在しないことが非常に望ましく、代謝およびシグナル伝達にかかわる菌類特異的遺伝子は重要な候補となろう。本発明者らは、利用可能な菌類および哺乳動物ゲノムを活用してかかる遺伝子を同定し、このことから該遺伝子は、抗菌薬の開発のための標的として適当である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明者らは、菌類には存在するがヒトには存在しない12個の遺伝子のセットを見出した。この知見は、抗菌物質を、これらの遺伝子を標的とする能力に基づいて同定することを可能にする。
【００１３】
本発明は、抗菌物質のスクリーニングに使用可能な12種類のタンパク質のセットを提供する。特に、Aspergillus fumigatus由来の12種類のタンパク質のセット(表Iを参照されたい)を提供する。
【００１４】
本発明者らは、単一の出芽酵母(S. cerevisiae)ILV3遺伝子と似ている２種のAspergillus fumigatus遺伝子を見出した。出芽酵母(S. cerevisiae)においてILV3は分枝アミノ酸であるロイシン、イソロイシンおよびバリンの生合成に必須であるが、この酵素は動物には存在せず、そのためこの酵素は抗菌物質のよい標的である。この遺伝子は、これまで抗菌物質の発見のための標的として使用されたことはなく、また、これまで組換えILV3タンパク質が合成されたこともない。驚くべきことに、本発明者らは、生物を生存不能とするためには、２種のA. fumigatus ILV3-様遺伝子をノックアウトしなければならないことを見出した。
【００１５】
従って本発明は、菌類のILV3-様遺伝子(表IおよびIIを参照のこと)を提供し、これらは抗菌物質のスクリーニングに個別にまたは一緒(対として)に使用することができる。
【００１６】
したがって、本発明は次のものを提供する。すなわち：
-菌類のタンパク質または遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、候補物質を
(i)  配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33もしくは36に記載の配列を含むタンパク質、
(ii)  (i)と60％の同一性を有するタンパク質、
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、
(iv)  (i)、(ii)もしくは(iii)をコードする配列を含むポリヌクレオチド、
(v)  (iv)のコード配列と少なくとも70％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド、
と接触させるステップ、および
該候補物質が(i)、(ii)、(iii)、(iv)もしくは(v)に結合または(i)、(ii)、(iii)、(iv)もしくは(v)をモジュレートするか否か決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)、(iii)、(iv)もしくは(v)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法；
-抗菌物質を同定または取得するための上に定義した(i)、(ii)、(iii)、(iv)もしくは(v)の使用；
-菌類のILV3遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、候補物質を
(i)  配列番号12、21、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に記載の配列を含むタンパク質、
(ii)  (i)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、ならびに
該候補物質が(i)、(ii)もしくは(iii)に結合または(i)、(ii)もしくは(iii)をモジュレートするか否かを決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)もしくは(iii)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法；
-抗菌物質を同定または取得するための上に定義した(i)、(ii)もしくは(iii)の使用；
- 菌類のILV3遺伝子を標的とする抗菌物質の同定方法であって、候補物質を
(i)  配列番号21、42、45、53もしくは56に記載の配列を含むタンパク質、
(ii)  (i)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、
(iii)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、
同じ物質を
(iv)  配列番号12、39、48、50もしくは59に記載の配列を含むタンパク質、
(v)  (iv)と少なくとも60％の同一性を有するタンパク質、
(vi)  (i)もしくは(ii)の断片を含むタンパク質、ここで該断片は少なくとも50アミノ酸の長さを有する、と接触させるステップ、ならびに
該候補物質が(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)に結合または(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)をモジュレートするか否かを決定するステップを含み、ここで(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)の結合もしくはモジュレーションは該候補物質が抗菌物質であることを示す、前記方法；
-第１のスクリーニングを配列番号12、39、48、50または59を用いて行い、第２のスクリーニングを配列番号21、42、45、53または56を用いて行う上記方法；
-抗菌物質を同定または取得するための上に定義した(i)、(ii)もしくは(iii)、および(iv)、(v)もしくは(vi)の使用、
-菌類感染の予防用または治療用の医薬の製造における本発明の方法により同定された抗菌物質の使用；
-本発明の単離されたタンパク質またはポリヌクレオチド；
-本発明のポリヌクレオチドで遺伝子組換えされた生物、
-本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質を、機能しないようにまたは抑制されるように遺伝子操作された生物；
-本発明のタンパク質に対して特異的な抗体；
-本発明のスクリーニング方法により同定された抗菌物質を投与することを含む、菌類感染の予防方法または治療方法；ならびに
-本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドの発現または活性の阻害により、殺菌されたまたはその増殖が阻害された菌類。
【表１】
2008521427.tif 000002
【００１７】
【表２】
2008521427.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は抗菌物質を同定するための、特定のタンパク質およびポリヌクレオチド配列(本明細書では「本発明のタンパク質」および「本発明のポリヌクレオチド」という)(例えば菌類タンパク質およびポリヌクレオチドのホモログおよび／または断片を含む)の使用に関する。
【００１９】
本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、そのファミリーの別のメンバーとの配列類似性により定義されうる。この類似性は同一性パーセンテージ(例えば配列表に示す配列に対する同一性パーセンテージ)に基づくことができる。
【００２０】
本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、ILV3またはILVDタンパク質であってもよく、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼとして、または配列番号21に相同性を示すタンパク質として、またはILVD_EDD Pfamプロファイルとマッチするタンパク質として定義されうる。
【００２１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、他種の本発明のタンパク質またはポリヌクレオチド(配列番号1〜63に示されるもの)とアラインされうる。
【００２２】
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、例えば本発明の方法に使用するときは、単離された形態(例えば非細胞性形態)であってもよく、または、膜結合性タンパク質の場合には、膜調製物の形態であってもよい。該ポリヌクレオチドは、天然、合成または組換えポリヌクレオチドを含むことができ、該タンパク質は天然、合成または組換えタンパク質を含むことができる。該ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、それぞれ、天然、合成または組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の組み合わせを含みうる。本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、天然のポリヌクレオチドおよびタンパク質と同一または異なる配列を有しうる。
【００２３】
本明細書では、「から単離された」という用語は「の」と読まれうると理解すべきである。従って、特定の生物「から単離された」ポリヌクレオチドおよびタンパク質には、該生物から取得するのとは別の手段、例えば合成または組換えなどにより調製されたポリヌクレオチドおよびタンパク質が含まれる。
【００２４】
好ましくはポリヌクレオチドまたはタンパク質は、菌類、より好ましくは糸状菌、さらに好ましくは子嚢菌から単離される。
【００２５】
好ましくは、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、アスペルギルス属(Aspergillus); Blumeria属; カンジダ属(Candida); Colletotrichium属; Cryptococcus属; Encephalitozoon属; Fusarium属; Histoplasma属、Leptosphaeria属; Magnaporthe属; Mycosphaerella属; Neurospora属; エキビョウ菌属(Phytophthora); Plasmopara属; Pneumocystis属; Pyricularia属; Pythium属; Puccinia属; Rhizoctonia属; サッカロマイセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces)、Trichophyton属; およびUstilago属から選択される生物から単離される。
【００２６】
好ましくはポリヌクレオチドまたはタンパク質はアスペルギルス属(Aspergillus)から単離される。
【００２７】
好ましくは、ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; クロコウジカビ(Aspergillus niger); Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; イネ科うどんこ病菌(Blumeria graminis); Candida albicans; Candida cruzei; Candida glabrata; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; 炭疽病菌(Colletotrichium trifolii); Cryptococcus neoformans; 脳炎性胞子虫(Encephalitozoon cuniculi); Fusarium graminarium; ニンジン乾腐病菌(Fusarium solani); Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulata; ふ枯病菌(Leptosphaeria nodorum); イネいもち病菌(Magnaporthe grisea); Mycosphaerella graminicola; アカパンカビ(Neurospora crassa); 灰色疫病菌(Phytophthora capsici); ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans); うどんこ病菌(Plasmopara viticola); ニューモシスティス肺炎菌(Pneumocystis jiroveci); エンバク冠銹病菌(Puccinia coronata); コムギ黒銹病菌(Puccinia graminis); Pyricularia oryzae; 苗立枯病菌(Pythium ultimum); Rhizoctonia solani; 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae); 分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe); Trichophyton interdigitale; 紅色白癬菌(Trichophyton rubrum); およびトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)の種から選択される生物から単離される。
【００２８】
好ましくは、ポリヌクレオチドまたはタンパク質はAspergillus fumigatusから単離され、好ましくはタンパク質はA. fumigatus AF293から単離されうる。
【００２９】
上記ポリヌクレオチドおよびタンパク質の変異体もまた提供され、それらについては以下で言及する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明のタンパク質は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61、63のいずれかに実質的に記載され独立にこれらから選択されるアミノ酸配列またはその変異体を含み得る。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドはDNA、例えばゲノムDNAを含みうる。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、51、54、57、60、62のいずれかに実質的に記載され独立してこれらから選択される配列またはその相補体もしくは変異体を含みうる。
【００３２】
該ポリヌクレオチドはRNA、好ましくはmRNA、好ましくはスプライシングされたmRNAを含みうる。好ましくは、該ポリヌクレオチドは配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、49、52、55、58、60、62に示される配列またはその相補体もしくは変異体を実質的に含む。
【００３３】
好ましくは、該タンパク質は、表IまたはII中の「gDNA」の列に記載されるように配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、51、54、57、60もしくは62の配列の領域またはその相補体もしくは変異体によりコードされる。
【００３４】
好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは表IまたはII中の「gDNA」の列に記載される領域および配列から独立に選択されるヌクレオチド配列を実質的に含む。
【００３５】
好ましくは、該タンパク質は、表IまたはII中の「gDNA」の列に記載される領域および配列の少なくとも１つから独立に選択される配列またはその相補体もしくは変異体を実質的に含むポリヌクレオチドによりコードされる。
【００３６】
好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、39、42、45、48、50、53、56、59、61、63のアミノ酸配列またはその変異体を実質的に含むタンパク質をコードする。
【００３７】
「天然アミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質」という用語は、in vivoまたはin vitroのいずれかで生物学的供給源から天然に産生されるアミノ酸、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味する。
【００３８】
「合成アミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質」という用語は、当技術分野で公知のDNAまたはタンパク質合成装置を用いて人工的にまたはデノボ(de novo)で製造されたアミノ酸、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味する。
【００３９】
「組換えアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質」という用語は、当業者に公知の組換えDNAまたはタンパク質技術もしくは方法論を用いて製造されたアミノ酸、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を意味する。
【００４０】
「変異体」という用語、および「実質的なアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列」という用語は、関連する配列を言うために本明細書において使用する。下に記載するように、かかる関連配列は、典型的には所定配列に相同(所定配列に対する同一性パーセンテージを有する)である。例えば該配列の全長に対してまたは所定の長さの一部に対して相同である。関連配列はまた、該配列または相同配列の断片であり得る。変異体タンパク質は、変異体ポリヌクレオチドによりコードされ得る。
【００４１】
「変異体」という用語、および「実質的なアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列」という用語は、その配列が、言及された配列のいずれか１つのアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列と少なくとも30％、好ましくは40％、より好ましくは50％、およびさらに好ましくは60％配列同一性を有することを意味する。「実質的にアミノ酸/ポリヌクレオチド/ペプチド配列」である配列は、関連する配列と同一でありうる。
【００４２】
種々のアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列間の同一性パーセンテージの計算は以下のように行うことができる。最初にClustalXプログラムにより多重アライメントを作成する(対ごとのパラメーター：ギャップ開き10.0、ギャップ伸長0.1、タンパク質マトリックスGonnet 250、DNAマトリックスIUB; 多重パラメーター：ギャップ開き10.0、ギャップ伸長0.2、遅延不一致配列30％、DNA変化(transition)重み0.5、負のマトリックス-オフ, タンパク質マトリックスgonnetシリーズ、DNA重みIUB; タンパク質ギャップパラメーター、残基特異的ペナルティー-オン、親水性ペナルティー-オン、親水性残基GPSNDQERK、ギャップ分離距離4、末端ギャップ分離-オフ)。次に多重アライメントから(N/T)*100として同一性パーセンテージを計算する[式中、Nは２つの配列の残基が同一である位置の数であり、Tは比較した位置の総数である]。あるいはまた、同一性パーセンテージを(N/S)*100[式中Sは比較する配列のうちの短い方の配列の長さである]として計算することもできる。アミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列は、デノボ(de novo)合成されたものであるか、または天然アミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列であるか、またはその誘導体でありうる。
【００４３】
言及される配列のいずれかと65％より高い同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列もまた想定される。言及される配列のいずれかと70％より高い同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列もまた想定される。言及される配列のいずれかと75％より高い同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列もまた想定される。言及される配列のいずれかと80％より高い同一性を有するアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列は、言及された配列のいずれかと85％同一性、より好ましくは90％同一性、さらに好ましくは92％同一性、さらに好ましくは95％同一性、さらに好ましくは97％同一性、さらに好ましくは98％同一性および最も好ましくは言及された配列のいずれかと99％同一性を有する。
【００４４】
上記同一性パーセンテージは、元の配列の全長にわたり、または元の配列の15、20、50または100アミノ酸/塩基の領域にわたり測定することができる。好ましい実施形態において、同一性パーセンテージは、配列番号 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、 61もしくは63と比較して測定する。好ましくは変異体タンパク質は、配列番号 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63またはこれらの１つの一部と少なくとも40％同一性、例えば少なくとも60％または少なくとも80％同一性を有する。
【００４５】
あるいはまた、配列番号1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、34、35、37、38、40、41、43、44、46、47、49、51、52、54、55、57、58、60、62、に記載の配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列により、実質的に類似するヌクレオチド配列がコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが6x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で約45℃でフィルター結合型DNAまたはRNAにハイブリダイズし、その後0.2x SSC/0.1％ SDS中で約5-65℃で少なくとも１回の洗浄を行うことを意味する。あるいはまた、実質的に類似するタンパク質は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に示す配列と少なくとも１アミノ酸、しかし5、10、20、50または100未満のアミノ酸が相違することができる。かかる相違はそれぞれ、付加、欠失または置換でありうる。
【００４６】
遺伝暗号は縮重していることから、あらゆる核酸配列は、それがコードするタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく変異または変化させ、該核酸の機能性の変異体を提供することができることは明白である。適当なヌクレオチド変異体とは、配列内に同一アミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更され、そのことからサイレント変化を生じる配列を有する変異体である。
【００４７】
他の適当な変異体としては、相同ヌクレオチド配列を有し、しかし配列の全部または一部が、置換されるアミノ酸と生物物理学的性質の類似する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更され、保存的変更が生じた変異体がある。例えば小さい非極性の疎水性アミノ酸としてはグリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが挙げられる。大きい非極性の疎水性アミノ酸としてはフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としてはリシン、アルギニンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。カンジダを含む特定の生物は、真核生物の大半に使用される標準的コドンと比較して、非標準的コドンを使用することが知られている。本明細書に提供する配列とかかる生物由来のポリヌクレオチドおよびタンパク質とのどのような比較も、こうした違いを考慮に入れるべきである。
【００４８】
タンパク質またはDNA配列の厳密なアライメントにおいて、配列の最適マッチングを得ることと、かかるマッチングを得るためのギャップ導入とのトレードオフは重要である。タンパク質の場合には、マッチをスコアリングする手段もまた重要である。PAMマトリックス(例えばDayhoff, M. ら, 1978, Atlas of protein sequence and structure, Natl. Biomed. Res. Found.)およびBLOSUMマトリックスのファミリーは保存的置換の性質と尤度を定量し、多重アライメントアルゴリズムに使用されるが、他の同じように応用可能なマトリックスも当業者に明らかとなろう。普及している多重アライメントプログラムClustalWおよびそのウィンドウズバージョンであるClustalX (Thompson ら, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson ら, 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882)は、タンパク質およびDNAの多重アライメントを作成するための有効な手段である。
【００４９】
Alignプログラム (Hepperle, D., 2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, 16775 Stechlin, Germany)の使用も好ましく、また、他のJalViewまたはCinemaなども適当である。
【００５０】
タンパク質同士の同一性パーセンテージの計算はClustalを用いて多重アライメントを作成する際に行われる。しかしながら、こうした値はアライメントが手動で改良された場合、または２つの配列の熟考的比較のためには、再計算する必要がある。アライメント内のタンパク質配列の対についてこの値を計算するプログラムとしては、PHYLIP系統発生パッケージ内のPROTDIST (Felsenstein; http://evolution.gs.washington.edu/phylip.html)が挙げられ、これは「類似性表」オプションをアミノ酸置換(P)のためのモデルとして使用する。DNA/RNAについては、PHYLIPのDNADISTプログラム内に同質のオプションが存在する。
【００５１】
タンパク質配列中の他の改変、すなわち翻訳中または翻訳後に生じる改変、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化、GPI-連結、ミリストイル化、リン酸化、タンパク質分解性切断またはリガンドへの連結による改変も想定され本発明の特許請求の範囲に包含される。
【００５２】
「変異体」という用語、および「実質的なアミノ酸/ポリヌクレオチド/タンパク質配列」という用語はまた関連ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の断片を含み、これには上記相同配列(特定された配列に対する同一性パーセンテージを有する)の断片も含まれる。ポリヌクレオチド断片は典型的には少なくとも10塩基、例えば少なくとも20、30、50、100、200、500または1000塩基を含む。タンパク質断片は典型的には少なくとも10アミノ酸、例えば少なくとも20、30、50、80、100、150、200、300、400または500アミノ酸を含む。該断片は、タンパク質のいずれかの末端のアミノ酸から、少なくとも3アミノ酸、例えば少なくとも10、20または30アミノ酸を欠くことができる。
【００５３】
本発明は、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドのモジュレーター(例えば本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドの発現または活性の阻害剤)を同定するために使用可能なスクリーニング方法を提供する。該方法のある実施形態においては、候補物質を本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドと接触させて、該候補物質が該タンパク質またはポリヌクレオチドに結合もしくはこれらをモジュレートするか否かを決定する。
【００５４】
モジュレーターはタンパク質の活性を促進(アゴナイズする)または阻害(アンタゴナイズする)しうる。(菌類感染に対する)治療的モジュレーターは、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドの発現または活性を阻害する。
【００５５】
該方法はin vitro(細胞の中または外で)またはin vivoで行うことができる。該方法は、細胞、または細胞培養抽出物、または細胞抽出物または細胞膜画分を用いて行うことができる。細胞は、天然で該ポリヌクレオチドまたはタンパク質が存在する細胞であってもよく存在しない細胞であってもよい。細胞は菌類細胞であってもそうでなくてもよく、または本明細書に記載の菌類のいずれかの細胞であってもそうでなくてもよい。該タンパク質またはポリヌクレオチドは該方法において非細胞性形態として存在することができ、このことから該タンパク質は細胞から精製された組換えタンパク質の形態でありうる。
【００５６】
あらゆる適当な結合アッセイまたは活性アッセイを使用することができる。候補物質がタンパク質またはポリヌクレオチドに結合することができるか否かを決定する方法は、該タンパク質またはポリヌクレオチドを候補物質に供して結合が生じるか否かを決定する(例えば該タンパク質またはポリヌクレオチドに結合する該候補物質の量を測定することにより決定する)ことを含みうる。結合は、結合により変化する該タンパク質またはポリヌクレオチドの特性(例えば分光学的変化)を測定することにより決定することができる。結合は、候補物質の存在下および不在下での反応基質または産物レベルを測定すること、およびそのレベルを比較することにより決定することができる。
【００５７】
アッセイフォーマットは「バンドシフト」系でありうる。これは試験候補が、その化合物の不在下の場合と比較して、ゲル電気泳動上でタンパク質またはポリヌクレオチドを前進または遅延させるか否かを測定することに関する。
【００５８】
方法は競合結合法でありうる。この方法は、候補物質が、タンパク質またはポリヌクレオチドと、該タンパク質またはポリヌクレオチドに結合することが知られている物質(例えば該タンパク質に特異的な抗体または該タンパク質の基質)との結合を阻害することができるか否かを決定する。
【００５９】
候補物質がタンパク質の活性をモジュレートするか否かは、タンパク質の活性を許容する条件下で候補物質をタンパク質に供し、その後候補物質が産物の活性をモジュレートすることができるか否かを測定することにより決定することができる。
【００６０】
測定する活性は、本明細書に記載する本発明のタンパク質のどのような活性であってもよく、これにはエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼ、Gタンパク質共役受容体、ILV3/ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC、ホスホジエステラーゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ、イオン輸送または小分子輸送/パーミアーゼ活性が含まれる。ある実施形態において、スクリーニング方法は、候補物質の存在下および不在下で反応を行い、候補物質が本発明のタンパク質の活性を阻害するか否かを決定することを含む。
【００６１】
ILV3活性は次のように測定することができる。すなわち、ILV3タンパク質を基質分子、例えばジヒドロキシ吉草酸、ジヒドロキシメチル吉草酸、別種類のジヒドロキシ酸、またはポリヒドロキシ酸(例えばトレオン酸または2,3,4,5-テトラヒドロキシペンタン酸)とインキュベートし、その後ケト酸産物の出現を直接または間接的に測定する。直接測定は分光光度法の手段により例えば240 nmで行うことができ、これに対して間接測定は、ケト酸をセミカルバジドと反応させて産物の出現を分光光度法により例えば250 nmで測定することにより、あるいは、ケト酸を2,4-ジニトロフェニルヒドラジンと反応させて反応産物を分光光度法により540〜550 nmで測定することにより行うことができる。このアッセイは、(a) アッセイに推定上の阻害化合物を加え産物の減少を調べること、および、(b) 最初にアッセイをグループI ILV3 (表II)を用いて行い、その後アッセイをグループII ILV3を用いて行い(またはその逆順で)、両方のアッセイにおいて阻害を示す化合物を同定することにより糸状菌ILV3の阻害剤のスクリーニングとして使用することができる。アッセイは組換えA. fumigatus ILV34およびILV1352 (表II)を用いて行うことができる。
【００６２】
ILV3阻害剤はまた、単一ILV3 タンパク質、例えば下記の種のいずれか由来の単一ILV3 タンパク質を用いて上記アッセイにより同定することができる：Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; クロコウジカビ(Aspergillus niger); Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; イネ科うどんこ病菌(Blumeria graminis); Candida albicans; Candida cruzei; Candida glabrata; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; 炭疽病菌(Colletotrichium trifolii); Cryptococcus neoformans; 脳炎性胞子虫(Encephalitozoon cuniculi); Fusarium graminarium; ニンジン乾腐病菌(Fusarium solani); Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulata; ふ枯病菌(Leptosphaeria nodorum); イネいもち病菌(Magnaporthe grisea); Mycosphaerella graminicola; アカパンカビ(Neurospora crassa); 灰色疫病菌(Phytophthora capsici); ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans); うどんこ病菌(Plasmopara viticola); ニューモシスティス肺炎菌(Pneumocystis jiroveci);エンバク冠銹病菌(Puccinia coronata); コムギ黒銹病菌(Puccinia graminis); Pyricularia oryzae; 苗立枯病菌(Pythium ultimum); Rhizoctonia solani; 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae); 分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe); Trichophyton interdigitale; 紅色白癬菌(Trichophyton rubrum);およびトウモロコシ黒穂病菌 (Ustilago maydis)の種から選択される生物。
【００６３】
該方法のさらなる実施形態においては、候補物質を、過小発現する、突然変異した、破壊されたまたは欠失された遺伝子または複数種の遺伝子のコピーまたは複数のコピーについてヘテロ接合性の細胞と接触させ、その後任意の適当な手段により候補物質が該細胞の増殖を阻害する程度を測定し、次いで候補物質が該遺伝子の変更されていないコピーについてホモ接合性である細胞に及ぼす影響と比較する。ヘテロ接合細胞は、遺伝子またはその遺伝子産物を阻害する物質に対してより強い感受性を示す。
【００６４】
上記方法で試験することのできる適当な候補物質としては、抗体産物(例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体およびCDR-グラフト化抗体)が挙げられる。さらに、コンビナトリアルライブラリー、明確な化学的存在(defined chemical identities)、ペプチドおよびペプチド擬似体、オリゴヌクレオチドならびに天然物ライブラリー、例えばディスプレイライブラリー(例えばファージディスプレイライブラリー)もまた試験することができる。候補物質は化学物質でありうる。一次スクリーニングにおいて候補物質のバッチを、例えば反応あたり10種の物質を、使用することも可能であり、その後阻害を示すバッチの物質を個別に試験することができる。
【００６５】
本発明のさらなる態様において、医薬用または診断用の本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質を提供する。
【００６６】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質は使用前に改変することができ、好ましくはその誘導体または変異体を作製するために改変する。ポリヌクレオチドまたはタンパク質は誘導体化されうる。タンパク質は、エピトープタグ付け、融合パートナーまたは精製タグ(例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼ、複数のヒスチジンまたはマルトース結合タンパク質タンパク質の付加、緑色蛍光タンパク質タンパク質の付加、ビオチンまたは蛍光タグなどの分子の共有結合付加、セレノメチオニンの組込み、放射性同位体または蛍光/非蛍光ランタニドキレートの組込みまたは結合により改変することができる。ポリヌクレオチドは、メチル化またはジゴキシゲニン(DIG)の付加または上記タグ、タンパク質もしくはエピトープをコードする配列の付加により改変することができる。
【００６７】
好ましくは、医薬は菌類感染を妨害または予防するために応用する。菌類感染は、ヒト、動物または植物中のものでありうる。ポリヌクレオチドまたはタンパク質は薬剤の開発に使用することができる。ポリヌクレオチドまたはタンパク質は、前記ポリヌクレオチドまたはタンパク質の分子モデルにおいて、または分子モデルの構築において使用することができる。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、菌類感染の治療用の医薬の製造における本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質の使用を提供する。
【００６９】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質は使用前に改変することができ、好ましくはその誘導体または変異体を作製するために改変することができる。ポリヌクレオチドまたはタンパク質は誘導体化することができる。ポリヌクレオチドまたはタンパク質は改変または誘導体化されていなくてもよい。
【００７０】
好ましくは、医薬は菌類感染を妨害または予防するために応用する。治療は菌類感染を妨害または予防することを含みうる。好ましくは、薬剤および／または医薬は阻害剤を含む。好ましくは、薬剤または医薬は、ポリヌクレオチドもしくはその断片の発現および／または活性、および／またはタンパク質もしくはその断片の機能を阻害するように適合される。
【００７１】
好ましくは、菌類感染は菌類、より好ましくは子嚢菌、さらに好ましくはAspergillus属; Blumeria属; Candida属; Colletotrichium属; Cryptococcus; 属 Encephalitozoon属; Fusarium属; Histoplasma属, Leptosphaeria属; Magnaporthe属; Mycosphaerella属; Neurospora属; Phytophthora属; Plasmopara属; Pneumocystis属; Pyricularia属; Pythium属; Puccinia属; Rhizoctonia属, Trichophyton属;およびUstilagoの属から選択される生物による感染を含む。
【００７２】
好ましくは、菌類感染はAspergillus属から選択される生物による感染を含む。
【００７３】
好ましくは、菌類感染は、Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; クロコウジカビ(Aspergillus niger); Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; イネ科うどんこ病菌(Blumeria graminis); Candida albicans; Candida cruzei; Candida glabrata; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; 炭疽病菌(Colletotrichium trifolii); Cryptococcus neoformans; 脳炎性胞子虫(Encephalitozoon cuniculi); Fusarium graminarium; ニンジン乾腐病菌(Fusarium solani); Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulata; ふ枯病菌(Leptosphaeria nodorum); イネいもち病菌(Magnaporthe grisea); Mycosphaerella graminicola; アカパンカビ(Neurospora crassa); 灰色疫病菌(Phytophthora capsici); ジャガイモ疫病菌(Phytophthora infestans); うどんこ病菌(Plasmopara viticola); ニューモシスティス肺炎菌(Pneumocystis jiroveci);エンバク冠銹病菌(Puccinia coronata); コムギ黒銹病菌(Puccinia graminis); Pyricularia oryzae; 苗立枯病菌(Pythium ultimum); Rhizoctonia solani; Trichophyton interdigitale; 紅色白癬菌(Trichophyton rubrum);およびトウモロコシ黒穂病菌(Ustilago maydis)の種から選択される生物による感染を含む。
【００７４】
好ましくは、菌類感染はAspergillus fumigatusによる感染を含む。
【００７５】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えDNA分子またはベクターを提供する。
【００７６】
組換えDNA分子またはベクターは発現カセットを含みうる。好ましくは組換えDNA分子またはベクターは発現ベクターを含みうる。好ましくはポリヌクレオチド配列は発現制御配列に機能的に連結されている。適当な制御配列としては、プロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。
【００７７】
本発明の別の態様において、本発明のポリヌクレオチド、組換えDNA分子またはベクターを含む細胞を提供する。
【００７８】
細胞は適当な手段を用いてポリヌクレオチド、組換えDNA分子またはベクターにより形質転換またはトランスフェクトされうる。好ましくは細胞は本発明の組換えタンパク質を産生する。
【００７９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドで遺伝子組み換えされた生物を提供する(該生物の細胞は本明細書に記載する本発明の細胞と同一でありうる)。かかる生物は典型的には菌類、例えば本明細書に記載する菌類の任意の属または種の菌類でありうる。生物は、微生物、例えば細菌、ウイルスまたは酵母でありうる。生物は植物または動物(鳥類および哺乳動物を含む)、例えば本明細書に記載するどのような動物であってもよい。
【００８０】
生物は、本発明のポリヌクレオチドを該生物の細胞に導入することにより作製することができ、多細胞生物の場合には該細胞を完全生物へと成長させることが可能である。
【００８１】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリヌクレオチドまたはタンパク質が機能しないおよび／または抑制されている細胞を提供する。細胞は多細胞生物のものであるか、多細胞生物中に存在しうる。
【００８２】
細胞は突然変異細胞でありうる。細胞は典型的には菌類細胞、例えば本明細書に記載する菌類のどのような属または種のものであってもよい。細胞を作製する好ましい手段は、本発明のポリヌクレオチドが機能しないように該ポリヌクレオチドを改変することである。この改変は、遺伝子産物の発現または機能を破壊する突然変異を生じる改変でありうる。かかる突然変異はポリヌクレオチドに対して5’または3’調節配列として作用する核酸配列に対する突然変異、またはポリヌクレオチドのコード配列に導入された突然変異でありうる。ポリヌクレオチドの機能的欠失は、例えば、ヌクレオチド置換、付加または好ましくはヌクレオチド欠失の形態でのポリヌクレオチドの突然変異でありうる。
【００８３】
ポリヌクレオチドは、
(i)  ポリヌクレオチドのコード配列のリーディングフレーム(読み枠)をシフトさせること、
(ii)  ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質中のアミノ酸を付加、置換または欠失させること、
(iii)  ポリヌクレオチドおよび／または該ポリヌクレオチドに結合した上流または下流調節配列をコードするDNAを部分的にまたは完全に欠失させること、あるいは
(iv)  コードまたは非コード領域にDNAを挿入すること、
により機能しないおよび／または抑制されるようにすることができる。
【００８４】
ポリヌクレオチドに突然変異を導入するための好ましい手段は、突然変異させるポリヌクレオチドを特異的に標的とする分子生物学的技術を利用するものである。突然変異はDNA分子を用いて誘発することができる。突然変異を導入するための最も好ましい手段は、標的ポリヌクレオチドとDNA分子とで相同組換えが生じるように特別に調製したDNA分子を使用することである。この場合、DNA分子(二本鎖でありうる)は、標的ポリヌクレオチドに類似または同一な塩基配列を含有してもよく、DNA分子の標的とのハイブリダイゼーション(およびその後の組換え)を可能にする。
【００８５】
ILV3タンパク質の場合には、突然変異細胞は２つの異なるILV3遺伝子の突然変異を有することができ、このときいずれかまたは両方の遺伝子産物の機能は抑制または停止されうる。
【００８６】
また、遺伝子またはその調節領域に突然変異を導入することなく、ポリヌクレオチドが機能しないおよび／または抑制されている細胞を用意することも可能である。このことは、特異的阻害剤を使用することにより行うことができる。かかる阻害剤の例としてはポリヌクレオチドの転写を妨げる、翻訳、発現を妨げる、または翻訳後修飾を破壊する物質が挙げられる。あるいはまた、阻害剤は遺伝子産物の分解を増加させる因子(例えば特定のタンパク質分解酵素)でありうる。同様に、阻害剤はポリヌクレオチド産物が機能するのを妨げる物質、例えば中和抗体でありうる。阻害剤はまた、遺伝子の発現またはタンパク質の安定性および／もしくは機能を阻害することのできるあらゆる合成化学物質あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。阻害剤はまた本発明のタンパク質と相互作用してその機能を妨げるタンパク質でありうる。阻害剤はまた、RNA干渉により阻害を引き起こすRNA分子でありうる。ある実施形態において、RNA干渉を引き起こすアンチセンスポリヌクレオチドまたはRNA分子は、本発明のポリヌクレオチドの一例である。
【００８７】
さらなる態様において、本発明のタンパク質について免疫特異性を示す抗体を提供する。抗体は診断試薬として使用することができる。
【００８８】
抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウマ、ヤギまたはロバにて誘発されたものでありうる。抗体を、本発明のタンパク質のいずれかに対して誘発してもよく、またはタンパク質分解断片または組換え断片に対して誘発してもよい。
【００８９】
本発明において、「抗体」という用語は、特に断らない限り、本発明のタンパク質に結合するフラグメントを包含する。かかるフラグメントとしてはFv、F(ab’)およびF(ab’)2 フラグメント、ならびに一本鎖抗体が挙げられる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、キメラ抗体、CDR-グラフト化抗体またはヒト化抗体でありうる。
【００９０】
投与
本明細書に記載するあらゆる治療用物質(例えばタンパク質、ポリヌクレオチドまたはモジュレーター)の配合は、その物質の性質や治療する症状などといった要因に依存する。任意のかかる物質は種々の剤形により投与することができる。前記物質は、経口(例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤、分散性粉剤または顆粒剤として)、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内(intrasternally)、経皮または注入技術により投与することができる。該物質はまた坐剤として投与することもできる。臨床医はそれぞれの特定の患者に必要な投与経路を決定することができる。
【００９１】
典型的には物質を製薬上許容される担体または賦形剤と共に使用のために製剤化する。製薬上の担体または賦形剤は、例えば等張液でありうる。例えば、固体の経口用形態は、活性成分と共に、賦形剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチもしくはジャガイモ澱粉; 滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、および／もしくはポリエチレングリコール; 結合剤; 例えば澱粉、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドン; 脱凝集剤、例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩またはデンプングリコール酸ナトリウム; 発泡混合物; 色素; 甘味剤; 湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩; ならびに、製薬配合物に一般に使用される無毒性かつ薬理学上不活性な物質を含有することができる。かかる医薬調製物は既知の方法により、例えば、混合、顆粒化、打錠、糖衣をコーティングすること、またはフィルムコーティング工程により製造することができる。
【００９２】
経口投与用の液体分散剤は、シロップ、エマルジョンおよび懸濁液でありうる。シロップは担体として、例えばサッカロースまたはグリセリンを伴ったサッカロースおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールを含有しうる。懸濁液およびエマルジョンは、担体として、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含有しうる。筋内注射用の懸濁液または溶液は、活性化合物と一緒に、製薬上許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブオイル、オレイン酸エチル、グリコール類、例えばプロピレングリコール、および所望であれば適当な量のリドカイン塩酸塩を含みうる。
【００９３】
静脈内用または注入用の溶液は、担体として、例えば滅菌水を含有することもでき、または好ましくは静脈内用または注入用の溶液は滅菌性、水性、等張性の、生理食塩水溶液の形態であり得る。
【００９４】
治療的に有効であり無毒性の量の物質が投与される。用量は種々のパラメーターに応じて決定されうる。パラメーターは、特に使用される物質、治療される患者の年齢、体重および状態、投与経路ならびに所要の投薬計画などである。この場合も、臨床医は任意の特定患者のための必要な投与経路および用量を決定することができる。典型的な１日用量は、その特定の阻害剤の活性、治療される被験者の年齢、体重および症状、疾患の種類と重症度ならびに投与の頻度と経路に従い、kg(体重)当たり約0.1〜50 mg、好ましくは約0.1mg/kg〜10mg/kg(体重)である。好ましくは１日用量レベルは5 mg〜2 gである。
【００９５】
農業用途
本発明の方法により同定されたモジュレーターを、菌類感染の予防または処置のために、植物に投与することができる。モジュレーターは通常、１種以上の農業的に許容可能な担体または賦形剤と一緒の組成物の形態で適用され、他の化合物と同時にまたは相次いで、処置すべき作物地帯または植物に適用することができる。
【００９６】
本発明のモジュレーターは、配合の技術分野に慣用的に用いられる担体、界面活性剤または適用促進補助剤と共に適用することができる。適当な担体および賦形剤は、配合技術に通常使用される物質、例えば天然もしくは再生性のミネラル物質、溶媒、分散化剤、湿潤剤、粘着性付与剤、結合剤または肥料に対応する。
【００９７】
本発明のモジュレーターまたはそれを含む農芸化学組成物を適用する好ましい方法は葉への散布である。散布回数と散布の頻度は、菌類による感染の強度に依存する。しかしながら、活性成分はまた、土壌を介して根から植物に浸透することも可能であり(全身作用)、これは植物のある場所(locus)に液体組成物を含浸させることにより、または化合物を土壌に固形物として、例えば顆粒形態として散布する(土壌適用)ことにより行う。活性成分はまた、種子に適用することができ(コーティング)、これは種子を活性成分を含有する液体配合物で含浸することにより、または種子を固形配合物でコーティングすることにより行う。特殊なケースでは、さらなる種類の適用、例えば植物の茎または芽の選択的処置も可能である。
【００９８】
活性成分は、未改変の形態で使用され、または好ましくは配合の技術分野で慣用的に利用される賦形剤と共に使用され、そのため乳化濃縮物、コーティング可能なペースト、直接噴霧可能または希釈可能な溶液、希釈エマルジョン、可湿性粉体、可溶性粉体、粉末、顆粒、ならびにカプセル化物(例えばポリマー物質中カプセル化物)に既知の方法で配合される。組成物の性質と同様に、適用の方法、例えば噴霧すること、霧化すること、振りかけること、まき散らすことまたは流し込むことなどは意図する目的および主要な状況に応じて選択する。適用の有利な割合は通常、ヘクタール(「ha」、約2.471エーカー)当たり50g〜5kgの活性成分(略してa.i.)、好ましくは100g〜2kg a.i./ha、最も好ましくは200g〜500g a.i./haである。
【００９９】
活性成分、および適当であれば固体または液体賦形剤を含有する配合物、組成物または調製物は、既知の方法で調製するが、一例として活性成分と増量剤(例えば溶媒、固体担体および適当であれば界面活性化合物(界面活性剤))とを均一に混合および／または顆粒化することにより調製する。
【０１００】
適当な溶媒としては、芳香族炭化水素、好ましくは8〜12個の炭素原子を有する画分、例えばキシレン混合物または置換されたナフタレン、フタレート類、例えばジブチルフタレートまたはジオクチルフタレート、脂肪族炭化水素、例えばシクロヘキサンまたはパラフィン、アルコールとグリコールおよびそのエーテルとエステル、例えばエタノール、エチレングリコール、モノメチルエーテルまたはモノエチルエーテル、ケトン類、例えばシクロヘキサノン、極性の強い溶媒、例えばN-メチル-2-ピロリドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムアミド、ならびにエポキシド化植物油、例えばエポキシド化ココナッツ脂またはダイズ油、あるいは水が挙げられる。
【０１０１】
粉末剤や可分散化散剤などに使用される固体担体は、通常は天然のミネラル増量剤、例えばカルサイト、タルカム、カオリン、モンモリロナイトまたはアタパルジャイトなどである。物理的性質を改善するためには、高度に分散したケイ酸または高度に分散した吸着性ポリマーを添加することも可能である。適当な顆粒化された吸着性担体は多孔性タイプのもの、例えば軽石、破壊された煉瓦、海泡石またはベントナイトであり、適当な非吸着性担体は例えばカルサイトまたは砂のような材料である。さらに、多数種の無機または有機的性質の予備顆粒化材料(例えば特にドロマイトまたは粉砕された植物残留物)を使用することができる。
【０１０２】
配合物に使用する活性成分の性質に応じて、適当な界面活性化合物は、良好な乳濁化、分散化、および湿潤化性質を有する非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面活性剤である。「界面活性剤」という用語は、界面活性剤の混合物をも包含すると理解される。
【０１０３】
適当なアニオン性界面活性剤は、水溶性石けんおよび水溶性合成界面活性化合物のどちらでもありうる。適当な石けんは、高級脂肪酸(10〜22個の炭素原子の鎖)の、あるいはココナッツ脂または獣脂などから得られうる天然脂肪酸混合物の、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換アンモニウム塩(例えばオレイン酸またはステアリン酸のナトリウム塩もしくはカリウム塩)である。脂肪酸メチルタウリン塩も使用可能である。
【０１０４】
しかしより多くの場合、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪スルホン酸塩、脂肪硫酸塩、スルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体またはアルキルアリールスルホン酸塩が使用される。脂肪スルホン酸塩または脂肪硫酸塩は通常、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または未置換または置換アンモニウム塩の形態であり、アルキル基のアルキル部分も含めて8〜22個の炭素のアルキル基を有し、例えばリグノスルホン酸の、ドデシル硫酸の、または天然脂肪酸から得られた脂肪アルコール硫酸塩の混合物のナトリウム塩もしくはカルシウム塩である。こうした化合物はまた、脂肪アルコール／エチレンオキシド付加化合物のスルホン酸および硫酸エステルの塩を含む。スルホン酸化ベンゾイミダゾール誘導体は、好ましくは2つのスルホン酸基および8〜22個の炭素原子を含有する１つの脂肪酸基を含む。アルキルアリールスルホン酸塩の例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸/ホルムアルデヒド縮合物のナトリウム塩、カルシウム塩もしくはトリエタノールアミン塩である。対応するリン酸塩、例えば4〜14モルのエチレンオキシドを有するp-ノニルフェノールの付加化合物のリン酸エステルの塩もまた好ましい。
【０１０５】
非イオン性界面活性剤は、好ましくは脂肪族または脂環式アルコール、または飽和もしくは不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体であり、前記誘導体は、(脂肪族)炭化水素部分中に3〜30個のグリコールエーテル基と8〜20個の炭素原子を、およびアルキルフェノールのアルキル部分に6〜18個の炭素原子を含有する。
【０１０６】
さらなる適当な非イオン性界面活性剤は、アルキル鎖に1〜10個の炭素原子を有し、ポリプロピレングリコール、エチレンジアミンプロピレングリコールまたはアルキルポリプロピレングリコールを有するポリエチレンオキシドの水溶性付加化合物であり、該付加化合物は20〜250個のエチレングリコールエーテル基および10〜100個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。こうした化合物は通常、１プロピレングリコール単位当たり、1〜5個のエチレングリコール単位を有する。
【０１０７】
非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン/ポリエチレンオキサイド付加化合物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレートもまた適当な非イオン性界面活性剤である。
【０１０８】
カチオン性界面活性剤は好ましくは、N-置換基として、少なくとも１個のC8〜C22アルキル基および、さらなる置換基として、低級の未置換またはハロゲン化アルキル、ベンジルまたは低級ヒドロキシアルキル基を有する四級アンモニウム塩である。該塩は、好ましくはハロゲン化物塩、メチル硫酸塩またはエチル硫酸塩の形態、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロリドまたはベンジルジ(2-クロロエチル)エチルアンモニウムブロミドである。
【０１０９】
配合の技術分野で慣習的に利用される界面活性剤は、例えば“McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual”, MC Publishing Corp. Ringwood, New Jersey, 1979, およびSisely and Wood, “Encyclopaedia of Surface Active Agents,” Chemical Publishing Co., Inc. New York, 1980に記載されている。
【０１１０】
農芸化学組成物は通常、約0.1〜約99％ 好ましくは約0.1〜約95％、最も好ましくは約3〜約90％の活性成分、約1〜約99.9％、好ましくは約1〜99％、および最も好ましくは約5〜約95％の固体または液体賦形剤、ならびに約0〜約25％、好ましくは約0.1〜約25％、および最も好ましくは約0.1〜約20％の界面活性剤を含有する。これに対して市販製品は、好ましくは濃縮物として配合され、エンドユーザーは通常希釈配合物を使用する。
【０１１１】
本明細書に記載のすべての構成は、あらゆる組み合わせで上記態様のいずれとも組み合わせることができる。
【０１１２】
本発明の実施形態をここに例示を目的として説明する。
【実施例】
【０１１３】
実施例１  Aspergillus fumigatusにおける菌類特異的遺伝子の同定
理想としては、菌類標的遺伝子は可能な限り広範な菌類に存在するものであるべきであり、しかしヒトに存在してはならない。かかる潜在的標的を同定するために、菌類およびヒトゲノムの利用可能性を活用するバイオインフォマティックスストラテジーを考案した。プログラムはPERLで記述し、公に入手可能なダウンロードされたデータベースおよびBLASTアルゴリズム(Altschul ら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)を使用した。
【０１１４】
A. nidulans ゲノム由来の推定タンパク質(http://www.broad.mit.edu/ftp/pub/annotation/aspergillus/assembly1/release3.1/aspergillus_nidulans_1_r3.1_proteins.fasta.gz)を、ヒトrefseq タンパク質 (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/H_sapiens/protein/)に対してブラスト検索(blaste)し、タンパク質マッチするヒト配列を有しないもの(すなわち E-値> 1e-4)のみを残した。次にこのセットをN. crassa 推定タンパク質 (http://www.broad.mit.edu/ftp/pub/annotation/neurospora/assembly3/neurospora_3_protein.gz )に対してブラスト検索し、良好なマッチを示す(すなわち、E-値 < 1e-10)タンパク質のみを残した。したがって、得られた2993種のタンパク質のセットは、糸状菌同士で保存されしかしヒトには存在しない遺伝子を有した。次にこのセットをC. albicans orfs(http://www-sequence.stanford.edu/group/candida/download.html)に対してブラスト検索し、そのことにより「汎菌類的(pan-fungal)」タンパク質と考えてもよい良好なホモログを有する819種のタンパク質のセット、および「糸状菌のみ」タンパク質と考えてもよい他の2184種のタンパク質に分けた。
【０１１５】
汎菌類的セットを、酵素または酵素ファミリーについて調べた。驚くべきことに、４つのILV3-様遺伝子、AN4058、AN6346、(表IおよびII)、AN5138およびAN7358が同定され、その各々がA. fumigatus オーソログを有した。これは出芽酵母(S. cerevisiae)に単一のILV3遺伝子が存在することと対照的である。この４種のILV3遺伝子と他の生物由来のILV3遺伝子のアライメントおよびそれに続く系統解析から、出芽酵母(S. cerevisiae) ILV3遺伝子に最も近い遺伝子として表Iに示す２種のILV3遺伝子が同定された。これは表IIIに示す同一性パーセンテージ値により支持された。ホスホイノシトールホスホリパーゼCも同定された(表Iを参照されたい)。
【表３】
2008521427.tif 000004
【０１１６】
「汎菌類的(pan-fungal)」および「糸状菌のみ」の配列セットはまた、シグナル伝達分子および代謝分子を同定するために解析したが、これはPERLスクリプトおよびダウンロードしたHMMを使用して、PFAM HMM (Bateman ら, 2004, Nucl. Acids Res.  32, D138-D141; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)でデータセットを検索することにより行った。この方法に使用したHMMおよび同定したタンパク質を表IVに示す。
【表４】
2008521427.tif 000005
【０１１７】
A. nidulans遺伝子に対応するA. fumigatus遺伝子は次のように同定した： A. nidulans タンパク質をA. fumigatusゲノム (ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/A_fumigatus/AF.contigs.031704)に対してブラスト検索し、マッチング領域を同定した。Genscan (genes.mit.edu/GENSCAN.html; 設定; 生物= 脊椎動物; 準最適エクソンカットオフ= 1.00) および／またはWISE2 (http://www.ebi.ac.uk/Wise2/)を用いて、この配列からマッチング遺伝子を予測した。blast、多重アライメントプログラムであるClustalX (Thompson ら, 1997, Nucleic Acids Research, 24:4876-4882)およびQAlign (Sameth ら, 2003, Bioinformatics 19, 1592-1593; http://www.ridom.de/qalign)、ならびにアライメントエディター/ビューアーAlign (Hepperle, D., 2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, 16775 Stechlin, Germany)を用いて予測遺伝子を類似配列と比較した。Artemis (http://www.sanger.ac.uk/Software/Artemis/; Rutherford ら, 2000, Bioinformatics 16, 944-945)を用いて遺伝子構造を可視化し編集した。情報に基づいた予測を得るには、注意深く予測を調べ、予測遺伝子を相同性タンパク質と比較する必要があった。得られた遺伝子を表IおよびIIに示す。
【０１１８】
実施例２  A. fumigatusにおける遺伝子ノックアウト体の作製
対象の遺伝子が抗菌薬標的として適当であるには、該遺伝子を無効化したノックアウト株を作製することによりそれが必須遺伝子であることを示す必要がある。最初に対象遺伝子およびその両側2〜3 kbに対応するゲノムDNAの一部をPCRにより合成し、ついでPCR産物をpGEMT-easy (Promega)中にクローニングする。次に、Epicentre Tn5細菌トランスポゾン(菌類および細菌選択マーカーを挿入してある)を使用する転移反応の基質としてゲノムDNAを使用する。適当な菌類選択遺伝子はPyrG、ハイグロマイシンまたはゼオマイシン(zeomycin)であり、適当な細菌マーカーはカナマイシンまたはゼオマイシンである。次に転移構築物をPCRによりスクリーニングして、トランスポゾンが遺伝子内に挿入されたものを同定する。PCRプライマーは、遺伝子全体を含むように(このことによりトランスポゾンの挿入は分子量の大きい産物の出現をもたらす)、または遺伝子の最初または最後からトランスポゾン内へと伸長するように(このことによりトランスポゾンが挿入されたときにのみ産物が得られる)設計する。
【０１１９】
トランスポゾンコピーを同定したならば、ベクターのみを切断する制限酵素(例えばNotIまたはDraI)を用いてpGEMT-easyからゲノムDNA/トランスポゾン構築物を切り出し、その後該構築物を用いてPEG-媒介形質転換によりハプロイド菌類プロトプラストを形質転換するために使用する。菌類は、使用するマーカーにより決定される選択条件下で増殖させ、形質転換体をピッキングする。次にこれらを対象遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRによりスクリーニングする。内因性遺伝子がトランスポゾン改変遺伝子で置換されると、PCRにより分子量のより大きい単一バンドが得られる。したがって、改変遺伝子が観察されるならば、その遺伝子は必須ではない。しかし、形質転換体のいずれもが遺伝子置換を示さなければ、対象の遺伝子は必須遺伝子の可能性がある。この場合、次に同じ方法を用いて二倍体に対して形質転換を行い、再ハプロイド化およびそれに続くハプロイドにおける分離パターンの検査により、該遺伝子が必須であるかを試験する。
【０１２０】
2.1  Aspergillus fumigatus ILV3遺伝子の遺伝子破壊
２種のAspergillus fumigatus ILV3-様遺伝子 ILV34AおよびILV1352 (表1およびII)を次のようにノックアウトした。最初にそれぞれの遺伝子について、以下のようにゲノム配列の約6 kbp断片を作製した。
【０１２１】
2.1.1.  ILV34A 突然変異体構築物
Extensorマスターミックス、A. fumigatus ゲノムDNA、ならびにプライマーILV34A_F1およびILV34A_R1(配列番号72および73)を用いてPCRを調製した。得られた5889 bp PCR産物をゲル精製(Qiaquick ゲル精製キット、Qiagen)し、その後一晩4℃でpGEMTeasy(Promega)に連結した。1μlの連結混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)Genehogs (Invitrogen)内に形質転換した。形質転換細胞をLB-アンピシリン-IPTG-Xgal寒天プレート上に塗布しその後37℃で一晩インキュベートした。白いコロニーをピッキングしてLB-アンピシリン培養液に移し、その後220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。Qiaprep miniprep DNA単離 (Qiagen)によりプラスミドDNAを単離した。プラスミドDNAのNotI消化から、5.9 kb挿入物が存在するか否かが示され、その後、次のPCRプライマーセットを用いてPCR反応によりILV34 DNAの存在を確認した。すなわち、a) 配列番号72および73; b) 配列番号74および75。次の大きさのPCR産物を生じるプラスミドはpGEMTEasy_ILV34Aであると見なされた: a) 5889 bp、b) 1930 bp。
【０１２２】
TN5トランスポザーゼにより認識されるモザイク末端、Aspergillus fumigatus pyr G配列および細菌性ゼオシン(zeocin)耐性遺伝子を含有するプラスミド、pMB4zeoを構築した。pyrGカセットはゲノムpyrG配列を両側から挟む(flanking)EcoRI部位を有するように作製した。このカセットをpMOD2 (Epicentre)のEcoRI部位に導入した。pEMzeo (Invitrogen)のXbaI-NheI断片から、XbaI部位にゼオシン耐性カセットをサブクローニングした。pMB4zeoをPshAIおよびXmnIで消化し、得られた2551 bp断片をゲル精製した。この断片(PshAI-MB4zeo)は、転移用のモザイク末端、Aspergillus pyrGカセットおよび細菌性ゼオシン耐性マーカーを含有した。EZ::TN トランスポザーゼキット(Epicentre)を使用して、pGEMTEasy_ILV34AをPshAI-MB4zeoによる転移により突然変異させた。次のものをマイクロ遠心分離チューブ内に会合させた: 1 μl EZ::TN 10X 反応バッファー、1 μl pGEMTEasy_ILV34A、1 μl PshAI-MB4zeo、6 μl 滅菌水、1 μl EZ::TNトランスポザーゼ。反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。1 μl EZ::TN 10X停止溶液を添加し、混合して70℃で10分加熱した。1 μlの停止反応物をエレクトロポレーションによりエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli) Genehogs (Invitrogen)内に形質転換した。形質転換細胞をLB-アンピシリン-ゼオシン寒天プレート上に塗布し、その後37℃で一晩インキュベートした。コロニーをLB-アンピシリン培養液にピッキングして移し、その後220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。Qiaprep miniprep DNA単離(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを単離した。プラスミドは、プライマー配列番号74および80を用いてPCRによりスクリーニングした。トランスポゾンPshAI-MB4zeoがコード配列のATG開始部位から約600 bpに挿入された(そのことによりが遺伝子は破壊される)ことを示す、約600bpのPCR産物を生じるプラスミドを選択した。このプラスミドをILV34A_KO33と命名した。このプラスミドをNotIで消化し8.4kb断片をゲル精製した。この断片を菌類形質転換に使用した。
【０１２３】
2.1.2  ILV1352突然変異体構築物
ILV1352のゲノムコピーを含有するBACを単離し、Extensorマスターミックスならびに配列番号76および77のプライマーを使用するPCRの鋳型として用いた。得られた5958 bp PCR産物を精製(Qiaquick ゲル精製キット、Qiagen)し、4℃で一晩かけてpGEMTeasy(Promega)内に連結させた。1μlの連結混合物を、エレクトロポレーションによりエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli)Genehogs (Invitrogen)内に形質転換した。形質転換細胞をLB-アンピシリン-IPTG-Xgal寒天プレート上に塗布しその後37℃で一晩インキュベートした。白いコロニーをピッキングしてLB-アンピシリン培養液に移し、その後220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。Qiaprep miniprep DNA単離 (Qiagen)によりプラスミドDNAを単離した。プラスミドDNAのNotI消化から、6 kb挿入物が存在するか否かが示され、その後、次のPCRプライマーセットを用いてPCR反応によりILV1352 DNAの存在を確認した。すなわち、a) 配列番号 76 および77; b) 配列番号 78および79。次の大きさのPCR産物を生じるプラスミドはpGEMTEasy_ILV1352であると見なされた:  a) 5958 bp, b) 1923 bp。
【０１２４】
ハイグロマイシン耐性カセットの転移のためのプラスミドを構築した。最初に、pEMzeo由来の細菌性ゼオシン耐性カセットを、pMOD2のモザイク末端の間のEcoRI部位に導入した。次にゼオシン耐性カセットをモザイク末端と一緒に、プライマー上のSpeI部位を付加しつつPCRにより増幅した。次に産物をSpeIで消化し、pGEMTeasyのSpeI部位に連結した。その後ハイグロマイシン耐性カセットをXba I部位内にクローニングした。得られたプラスミド(pPH8と命名)をSpe IとXmn Iで消化して、3649 bp断片を得てこれをゲル精製した。この断片 (SpeI_PH8)は、転移用のモザイク末端、Aspergillus ハイグロマイシン耐性カセットおよび細菌性ゼオシン耐性マーカーを含有した。
【０１２５】
pGEMTEasy_ILV1352を EZ::TN トランスポザーゼキット(Epicentre)を使用して(SpeI_PH8)による転移により突然変異させた。次のものをマイクロ遠心分離チューブ内に会合させた: 1 μl EZ::TN 10X反応バッファー、1 μl pGEMTEasy_ILV1352、2 μl (SpeI_PH8)、5 μl 滅菌水、1 μl EZ::TN トランスポザーゼ。反応混合物を37℃で2時間インキュベートした。1 μl EZ::TN 10X停止溶液を添加し、混合して70℃で10分加熱した。1 μlの停止反応物をエレクトロポレーションによりエレクトロコンピテント大腸菌(E. coli) Genehogs (Invitrogen)内に形質転換した。形質転換細胞をLB-アンピシリン-ゼオシン寒天プレート上に塗布し、その後37℃で一晩インキュベートした。コロニーをLB-アンピシリン培養液にピッキングして移し、その後220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。Qiaprep miniprep DNA単離(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを単離した。プラスミドは、プライマー配列番号78および80を用いてPCRによりスクリーニングした。約900bpのPCR産物は、トランスポゾンPshAI-MB4zeoがコード配列のATG開始部位から約900 bpに挿入され、そのことによりその遺伝子が破壊されたことを示した。この突然変異プラスミドをILV1352_KO21と命名した。このプラスミドをDraIで消化し、約12kb断片をゲル精製した。この断片を菌類形質転換に使用した。
【０１２６】
2.1.3  菌類形質転換
初期の研究から、ILV34Aの単一ノックアウトは致死ではないものの増殖力の低下した株を生じることが実証された。そこでILV34AとILV1352の両方をノックアウトすることの影響を調べた。Aspergillus fumigatus (CDP3.1)の茶／白色の二倍体pyrG- 株を、ILV1352_ノックアウト構築物で形質転換した。形質転換体をハイグロマイシンで選択し、配列番号80および83のプライマーを使用するPCRによりスクリーニングした。陽性クローンをサザンブロッティングでチェックして、単一ノックアウトが存在するか確認した。ILV1352単一ノックアウトについては増殖表現型は観察されなかった。次に二倍体ILV1352ノックアウトをILV34A突然変異体構築物で形質転換し、得られたコロニーを配列番号80および81のプライマーを用いてPCRによりスクリーニングした。陽性クローンをPCRとサザンブロッティングで大規模にチェックした。ベノミル(benomyl) SABにウリジンとウラシルを添加した培地の上で二倍体をハプロイド化(haploidise)させた。ハプロイド胞子を、ハイグロマイシンおよびpyrG 選択マーカーの存在について評価した。ウリジンとウラシルを含まずハイグロマイシンを含む培地上にハプロイド胞子を播種した時には増殖は見られず、二重ノックアウトが致死であることが示された。
【０１２７】
実施例３  遺伝子のゲノム配列決定
上の実施例１で同定した遺伝子のゲノム配列は次のように実験的に決定することができる。
【０１２８】
3.1  細菌株および菌類株
細菌クローニングのために、大腸菌(E. coli) Select96細胞(Promega)を製造業者の説明書に従い使用する。
【０１２９】
A. fumigatus臨床単離株AF293 (ref. No. NCPF7367; NCPF repository; Bristol, U.K.; the CBS repository (Belgium)またはDr. David Denningの臨床単離株カルチャーコレクション, Hope Hospital, Salford. U.K. から公に入手可能)が本発明における好ましい株である。AF293は、侵襲性アスペルギルス症および再生不良性貧血を有する患者の肺生検材料から1993年に単離された。同株はShrewsbury PHLSにより寄贈された。
【０１３０】
3.2  A. fumigatusゲノムDNAの精製
ゲノムDNAを単離するための菌糸体材料を取得するために、約107個のA. fumigatus分生子を50 mlのVogel最小培地に接種して、後期対数増殖期(18〜24時間)まで200 rpmで振とうしながら37℃でインキュベートする。真空ポンプに接続されたブフナー漏斗および枝付きフラスコを用いて、菌糸体をWhatmann 54紙上に乾燥してのせ、PBS/Tweenで洗浄する。この時点で菌糸体を後日の抽出のために凍結乾燥することができる。
【０１３１】
菌糸体(新鮮または凍結乾燥されたもの)を、−20℃に冷却された乳鉢中で液体窒素を用いて粉末へと砕く。粉砕されたバイオマスを氷上の50 mlチューブに移し、10 mlの目印まで入れる。次に各チューブに等容量の抽出バッファー(0.7 M NaCl; 0.1 M Na2SO3; 0.1 M Tris-HCl pH 7.5; 0.05 M EDTA; 1％(w/v) SDS; 65℃に予備加熱)を加え、ピペットチップを用いて十分に混合し、水浴中で65℃で20分インキュベートする。元のバイオマスの容量と等しい容量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を各チューブに添加し、チューブを十分に混合し、氷上で30分インキュベートする。次にチューブを3,500 x gで30分遠心分離し、ついで界面を乱さずに水相を慎重に新鮮な50 mlチューブに移す。
【０１３２】
等容量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を添加し、チューブを激しく撹拌(vortex)し氷上で15分インキュベートする。次にチューブを3,500 x gで15分回転させる。この回転後、尚も沈殿物が大量に存在するようであれば上清をうつしてクロロホルム:イソアミルアルコール工程を繰り返す。上清を移して、汚れていない滅菌Oak Ridge チューブに入れる。等容量のイソプロパノールを添加し穏やかに混合する。チューブを室温で少なくとも15分インキュベートする。その後チューブを3,030 x gで4℃で10分遠心分離しDNAをペレット化させる。上清を除き、ペレットを10〜25分ほど空気乾燥させる。ペレットを2 ml滅菌水中に懸濁させる。1 mlの7.5 M酢酸アンモニウムを添加し、混合して氷上で1時間インキュベートする。チューブを12,000 x gで30分遠心分離し、上清を新鮮なチューブに移し、次いで0.54容量のイソプロパノールを添加し、混合して、少なくとも15分室温でインキュベートする。その後チューブを5,930 x gで10分遠心分離し、上清を除いてペレットを1 mlの70％エタノールで洗浄する。チューブを5,930 x gで10分遠心分離し、ついですべてのエタノールを除去する。ペレットを室温で20〜30分空気乾燥させ、その後0.5〜1.0 mlのTE (10 mM Tris-HCl pH 7.5; 1 mM EDTA)に懸濁する。最後にDNAをRNase A(5 μlの1mg/mlストック)で処理する。
【０１３３】
3.3  PCR反応
A. fumigatus AF293遺伝子の上流領域および下流領域に対してプライマーの対を設計する。対象の遺伝子の両側の200塩基領域をPrimer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) のインプット配列として使用し、遺伝子にかかるプライマーの対を用意する。遺伝子が特別に長い場合は内部配列に対するプライマー対を設計し、そして遺伝子を部分ごとに配列決定しなければならない可能性がある。次の試薬と条件を使用する：
10x 高フィデルティー(fidelity)PCRバッファー    5 μl
dNTP (Clontech: 10 mM)                         １μl
nH2O                                            39μl
Pfu Ultra ポリメラーゼ(2.5 U/μl)              １μl
プライマー対 (10 pmol/μl ストック)            それぞれ１μl
gDNA 
PCRサイクルは次のとおりである: (1) 95℃、2分; (2) 95℃、30秒; (3) 54℃、30秒; (4) 72℃、2分; (5) 72℃、10分; (6) 8℃、ホールド。ステップ2〜4を40サイクル行い、その後PCR産物をゲルに流す。産物バンドをゲルから切り出し、QIAquick ゲル抽出キット(Qiagen Ltd, Boundary Court, Gatwick Road, Crawley, West Sussex, RH10 9AX, UK)を製造業者の説明書に従って使用して精製し、30 μlの滅菌水(BDH分子生物学グレード/フィルター滅菌)で溶出させる。 
(ストックの1:30希釈)                      2 μl
【０１３４】
3.4  ゲノムDNAクローニングおよび配列決定
平滑末端を生じるPfu ultra ポリメラーゼを用いてgDNAを増幅することから、pGEM Teasyへの連結の前に、「A」オーバーハングを付加しなければならない。12.5 μlの精製PCR産物を12.5 μl 2x PCR Reddy Mix (ABGene)と70℃で30分インキュベートする。次にサンプルをQigen Qiaquickゲル抽出キットを使用して精製し、30 μlの分子生物学グレード水で溶出させる。
【０１３５】
その後PCR産物を次の連結混合液を用いてpGEM-Teasy (Promega)内に連結させる: 2x バッファー、 5 μl; pGEM Teasy、1 μl; PCR産物、3 μl; T4 DNA リガーゼ、1 μl。反応液を4℃で一晩インキュベートする。
【０１３６】
次に2 μlの連結混合液をSelect 96細胞(Promega)に添加し、氷上で20分インキュベートする。その後細胞に42℃で45秒のヒートショックを加え、氷上に戻す。次に250 μlの室温SOC培地を加え、細胞を220 rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。アンピシリン(100 μg/ml)、50 μl X-gal (4％)および10 μl IPTG(100 mM)を含むLB寒天プレート上に50および200 μl量を播種し、その後37℃で一晩インキュベートする。
【０１３７】
各形質転換から個別の白色コロニーをピッキングし、これをアンピシリン(100 μg/ml)を含むLBに接種し、ついで220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートする。Qiagen miniprepキットを製造業者の説明書に従って使用しプラスミドDNAを抽出する。1 μlのプラスミドDNAを、制限酵素で37℃で1時間消化する。その結果を構築物の予測サイズと比較し、正しい制限消化パターンを示すクローンをMWG Biotech UK Ltd, Waterside House, Peartree Bridge, Milton Keynes, MK6 3BYで配列決定する。
【０１３８】
実施例４  cDNA配列決定およびRACE
cDNAをクローニングし配列決定することにより対象の遺伝子の内部配列を実験的に決定し、該遺伝子の5’および3’末端をRACE(cDNA末端の迅速な増幅)により決定する。
【０１３９】
4.1  cDNAクローニングおよび配列決定
4.1.1   A. fumigatus RNAおよびcDNAの調製
実施例３に記載のように菌類培養物を調製した。培養物を濾過により回収し、ついでDEPC処理水で２回洗浄し50 mlファルコンチューブに移した。サンプルを液体窒素中で凍結させ、必要になるまで−80℃で保存した。
【０１４０】
RNAを調製するために、菌類サンプルを液体窒素下で微粉末へと粉砕した。その後、Qiagen RNeasy Plant ミニキットを用いて、RNeasy Miniハンドブック (06/2001, 75-78頁, http://www.qiagen.com/literature/ handbooks/rna/rnamini/1016272HBRNY_062001WW.pdf)中の糸状菌からの全RNAの単離のためのプロトコルに従いRNAを抽出した。次の改良を使用した。すなわち、ステップ3において、選択する溶解バッファーとしてRLCを使用した;ステップ7において、RW1の添加後にRneasyカラムを室温で5分インキュベートした;任意のステップ9aを実行した;ステップ10において、30μl RNaseフリー水を添加し、サンプルを室温で10分インキュベートし、その後遠心分離した;ステップ11において、溶出ステップを反復して合計容量60 μlのRNAを得た。
【０１４１】
10X DNaseバッファーの存在下でDnaseを添加し(μg RNA当たり2 μl DNaseを使用)、37℃で2時間インキュベートすることにより、DNA混入物をRNAから除去した。RNeasy Plant ミニキットを使用し、RNA清浄化のためのRNeasyミニプロトコル(RNeasy Mini Handbook 06/2001、79-81頁)に従い、DNase-処理RNAを清浄化した。
【０１４２】
上記RNAからcDNAを合成するために、次の反応混合物を調製した: 100 ng〜1 μgのDNAフリーRNA、3 μlオリゴ(dT) (100 ng/μl)、および合計容量を42 μlとするDEPC処理された水。サンプルをヒートブロックで65℃で5分インキュベートし、その後徐々に室温まで冷ました。その後2 μl Ultrapure dNTP、1 μl逆転写酵素(Stratascript)および5 μl 10X 逆転写酵素反応バッファー (Stratascript)を添加した。サンプルを42℃で1時間インキュベートし、90℃で5分変性させ、その後氷上で冷却した。
【０１４３】
4.1.2  cDNA構築物の作製
上記cDNAを用いてPCRを行いcDNA断片を生成させる。プライマーを予測遺伝子の5’および3’末端に基づき設計する。次の試薬および条件を用いてPCR反応を行う:
10x 高フィデルティー(fidelity)PCRバッファー    5μl
dNTP (clontech: 10 mM)                         1μl
MgSO4 (50 mM)                                   2μl
nH2O                                            37.8 μl
Platinum TAQポリメラーゼ (5 U/μl)             0.2μl
プライマー対(10 pmol/μlストック)              それぞれ１μl
cDNA                                            2μl
PCRサイクルは次のように行う; (1) 94℃、5分; (2) 94℃、30秒; (3) 53℃、30秒; (4) 68℃、90秒; (5) 68℃、10分; (6) 8℃、一次停止。サイクル2〜4を40回行う。QIAquick PCR精製キット(Qiagen Ltd、Boundary Court、Gatwick Road、Crawley、West Sussex、RH10 9AX、UK)を用いて製造業者の説明書に従いPCR産物を精製し、アガロースゲルに流す。PCR産物をpGEM-Teasy内に連結し、Select 96細胞の形質転換に使用し、実施例３に記載のように配列決定する。
【０１４４】
4.2  RACE
遺伝子の5’および／または3’末端を決定するために、原則的に製造業者の説明書に従ってGeneRacer(商標)キット(Invitrogen; カタログ番号L1502-01)を使用し、RACE(cDNA末端の迅速な増幅)を行った。
【０１４５】
4.2.1  RNAの調製
実施例３に記載のようにA. fumigatusバイオマスを調製した。FastRNAキット(QBIOgene)を製造者の説明書(Revision 6030-999-1J05)に従い使用してRNAを調製したがその際、次の変更を加えた: ステップ1において、１回の抽出当たり40 mgのバイオマスを使用した; ステップ2において、サンプルをスピード5で20秒処理し、3分氷上でインキュベートし、その後再度スピード5で20秒処理した;ステップ3においてサンプルを5分遠心分離した; ステップ5において、500 μl DIPSを添加し、混合し、次いで室温で2分インキュベートした。サンプルを再度混合し、さらに2分インキュベートした;ステップ6において、250 μl SEWSで２回洗浄を行った; ステップ7において、ペレットを50 μl SAFEバッファーに溶解させた。
【０１４６】
4.2.2  RACE
上記のように調製した1 μg全RNAを、10 μl反応液中で、10単位の仔牛腸由来ホスファターゼ(CIP)、1 μl 10X CIPバッファーおよび40U RNaseOut(商標) (DEPC水中で10 μlに調製)を使用して50℃で1時間、脱リン酸化した。次にサンプルをDEPC水を用いて100 μlに調製し、その後100 μl(25:24:1)フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを用いてRNAを抽出した。ついで、2 μlイガイグリコーゲン(10 mg/ml)、10 μlの3M酢酸ナトリウム、pH 5.2、および220 μlの95％ エタノールの添加によりRNAを沈殿させ、サンプルをドライアイス上で10分凍結させた。14,500 rpm、4℃で20分の遠心分離によりRNAをペレット化させ、70％ エタノールで洗浄し、空気乾燥させ、その後8 μl DEPC水に再懸濁させた。
【０１４７】
脱リン酸化RNA (7 μl)を、10 μl反応において、0.5 Uタバコ酸性ピロホスファターゼ (TAP)、1 μl 10x TAPバッファーおよび40 U RnaseOut(商標)を用いて、37℃で1時間脱キャップ化(de-capped)させた。フェノール:クロロホルムを用いてRNAを抽出し、上記のように沈殿させ、その後DEPC処理水7 μlに再懸濁させた。
【０１４８】
脱リン酸化、脱キャップ化RNA (7 μl)をあらかじめ分注しておいた GeneRacer(商標) RNA オリゴ(0.25 μg)に添加し、65℃で5分インキュベートした。次に、1 μlの10xリガーゼバッファー、1 μlの10 mM ATP、40 UのRnaseOut(商標)および5 UのT4 RNAリガーゼを添加した10 μlの連結反応液を調製し、37℃で1時間インキュベートした。上記のようにRNAを抽出し沈殿させ11 μl DEPC処理水に再懸濁させた。
【０１４９】
1 μl GeneRacer(商標)オリゴdTプライマーおよび1 μl dNTP混合液(各10mM)を10 μl連結済みRNAに添加し、65℃で5分インキュベートすることにより第１鎖(First-strand)cDNAを調製した。次の試薬を12 μl連結RNAおよびプライマー混合液に添加した; 4 μl 5x第１鎖(First-strand)用バッファー、2 μl 0.1 M DTT、1 μl RNaseOut(商標)および1 μl SuperScript(商標) II RT (200 U/μl)。最初に42℃で50分インキュベートし、その後、反応を停止させるために、70℃で15分インキュベートした。2 U RNase Hを反応混合液に加え、37℃で20分インキュベートした。
【０１５０】
5’cDNA末端を増幅するために、上で調製した1 μlのRACEレディーcDNA、1 μl GeneRacer(商標) 5’プライマー、1 μlリバース遺伝子特異的プライマー(コード配列の相補鎖に対して設計されている: 5 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(各10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、0.5 μl Platinum(登録商標) Taq DNAポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および38.5 μl滅菌水を用いて50 μl PCR反応を調製する。サイクリングパラメーターは下の表Vに示す。
【０１５１】
二次的な、ネステッドPCR段階を実施することもできる。これは上記第１段階からの1 μlのRACE cDNA、1 μlネステッド5’プライマー(キットに付属)、1 μlの第２のリバース遺伝子特異的プライマー(コード配列の相補鎖に対して設計され、上記プライマーに関してネステッド状態(入れ子)である: 5 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(それぞれ10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、0.5 μl Platinum(登録商標) Taq DNAポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および38.5 μl滅菌水を使用して調製する。サイクリングパラメーターは下の表Vに示す。
【０１５２】
3’末端を増幅するために、上で調製した1 μlのRACEレディーcDNA、1 μl GeneRacer(商標)3’プライマー(10 μM)、1 μlフォワード遺伝子特異的プライマー(コード配列のコード鎖に対して設計 : 5 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(それぞれ10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、0.5 μl Platinum(登録商標) Taq DNA ポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および38.5 μl滅菌水を使用して、50 μl PCR反応を調製する。サイクリングパラメーターは下の表Vに示す。
【０１５３】
二次的な、ネステッドPCR段階を実施することもできる。これは上記第１段階からの1 μlの3’ RACE cDNA、1 μlネステッド3’プライマー(キットに付属)、1 μlリバース遺伝子特異的プライマー(コード配列のコード鎖に対して設計され、上記プライマーに対してネステッド状態(入れ子)になっている: 5 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(それぞれ10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、0.5 μl Platinum(登録商標) Taq DNA ポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および38.5 μl 滅菌水を使用して調製する。サイクリングパラメーターは下の表Vに示す。
【０１５４】
5’および3’RACEは、5’ATGコドンおよび3’終止コドンを同定すると同時に、遺伝子の5’および3’非翻訳領域を明らかにする。
【表５】
2008521427.tif 000006
【０１５５】
ILV34の5’末端を決定するために、上記のように調製した1.5 μlのRACEレディーcDNA、3 μl GeneRacer(商標) 5’プライマー、1 μlリバース遺伝子特異的プライマー(コード配列の相補鎖に対して設計; 配列番号67: 10 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(それぞれ10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、1 μl Platinum(登録商標) Taq DNA ポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および36 μl滅菌水を用いて50 μl PCR反応を調製した。サイクリングパラメーターは下の表VIに示す。5’ RACEから、予測5’開始部位およびILV34の第１イントロンが確認された。
【０１５６】
ILV1352の5’cDNA末端を増幅するために、上記に調製したRACEレディーcDNAを1 μl、1 μlのGeneRacer(商標) 5’プライマー、1 μlリバース遺伝子特異的プライマー(コード配列の相補鎖に対して設計: 配列番号68; 5 pmol/μlストック)、1 μl dNTP溶液(それぞれ10 mM)、2 μlの50 mM MgSO4、5 μl高フィデルティーPCRバッファー、0.5 μl Platinum(登録商標) Taq DNA ポリメラーゼ高フィデルティー(5 U/μl)および38.5 μl滅菌水を使用して50 μl PCR反応を調製した。サイクリングパラメーターは下の表VIに示す。550 b.p.産物を製造者の説明書に従ってpCR4-Topoにクローニングし、その後T7およびT3配列決定用プライマーを用いて配列決定した。5’ RACEから、ILV1352の予測された5’開始部位が確認された。
【表６】
2008521427.tif 000007
【０１５７】
実施例５  対象遺伝子の菌類ホモログの同定
バイオインフォマティックス解析を用いて、本発明のタンパク質またはポリペプチドのホモログを他の菌類から同定することができる。バイオインフォマティックスにより同定された配列を使用してプライマーを設計し、次いでそのプライマーをPCRに使用してそのホモログをコードするDNAを生成させることができる。あるいはまた、縮重PCRを使用して配列を取得し、次いでその取得配列を使用してプローブを作製し、対象の生物のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、ホモログを有するクローンを同定することができる。さらに別の方法として、ある生物種由来の遺伝子の断片をプローブとして使用するサザンブロットを、第２の生物種のゲノム内のホモログの存在を同定するために使用することができる。次に同じプローブを使用してcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。新規遺伝子に対応するクローンが得られたならば、それらをそのタンパク質の機能的特徴付けのために発現させることができる。
【０１５８】
5.1  バイオインフォマティックスによるホモログの同定
本発明のタンパク質およびポリヌクレオチドのホモログは、ローカルに開かれたデータベース(表VIIに詳述)を検索することにより同定することができ、このときBLASTを用いて配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63をクェリー配列として使用する。必要であれば、マッチングするコンティグをダウンロードし、実施例１に記載のようにゲノムDNAから遺伝子を予測する。あるいは、ウェブ越しにBLAST検索を行うことができる。
【表７】
2008521427.tif 000008
【０１５９】
配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63と上記blast検索から同定されたヒットとの関係は、系統解析から解明することができ、これには例えばPHYLIPパッケージソフト(Felsenstein, Felsenstein, J., 2002. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) バージョン3.6a3。作成者により配布されている。 Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle)を使用する。PROTDISTを用いてJones-Taylor-Thorntonモデルにより距離マトリックスを生成し、グローバルな再配置と10ジャンブルの入力順によるFITCHを使用してツリーを推論する。SEQBOOTを使用して100ブートストラップ複製物を生成し、上記のようにPROTDISTを使用して距離マトリックスを生成し、NEIGHBOURを使用して樹を推論し、その後CONSENSEを用いてブートストラップ値およびコンセンサス・ツリーを計算する。ツリーはTREEVIEW (Page, 1996頁, R. D. M., 1996. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12, 357-358.)を用いて閲覧する。多重アライメントパッケージQAlign (Sameth ら, 2003, Bioinformatics 19, 1592-1593; http://www.ridom.de/qalign)により、予備的系統樹を「オンザフライ(on the fly)」で生成することができる。
【０１６０】
あるいはまた、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63とホモログとの関係は、例えばWall ら (Bioinformatics 19, 1710-1711)に記載されているように相互blastヒットを用いて解明することができる。
【０１６１】
A. nidulansおよびA. fumigatus以外の糸状菌におけるILV3 配列を、上記方法により、およびNCBI nrデータベースに対するBLAST検索により同定した。タンパク質配列をAspergillus ILV3 タンパク質とアライメントし、必要であれば遺伝子予測を改良した。得られた配列(配列番号37〜63)を表IIにまとめた。アライメントからは、ILV3配列を２つのグループのオーソログへとクラスター化することができた。すなわち表中に示すようにA. fumigatus配列の配列番号21とクラスター形成するグループIおよびA. fumigatus配列番号12とクラスター形成するグループIIである。
【０１６２】
5.2  縮重PCRによるホモログの同定
5.2.1.  対象の生物からのゲノムDNAの調製
菌類培養物は、特定の種に適した方法を用いて調製する。例えばAspergillusおよびCandida種、Cryptococcus neoformans、Fusarium solani(ニンジン乾腐病菌)および Trichophyton種は、サブロー(Sabouraud)デキストロースアガー上で30〜35℃で維持する; Leptosphaeria nodorum(ふ枯病菌)は麦芽アガー培地(30 g/L麦芽抽出物; 15 g/L Bacto-アガー、pH 5.5)、24.0℃で; Magnaporthe grisea(イネいもち病菌)はオートミール寒天(6.7 g/L寒天、53.3 g/Lインスタントオートミール)25.0℃で、またはコーンミール寒天(Difco 0386)、26.0℃で;  Phytophthora capsici培養物はV-8寒天上に24℃で維持し; Pyricularia oryzae培養物は精米アガー上に24℃で白色蛍光下で(12時間人工日)維持し、菌糸プラグ(plug)を新鮮なプレートに移すことにより7〜14日ごとに継代培養する; Pythium ultimum(苗立枯病菌)培養物はPDA上で24℃で維持し、気中菌糸体を接種針を用いて新鮮なプレートに移すことにより7日ごとに継代培養する; Rhizoctonia solani培養物はPDA上で24℃で蛍光下で(12時間人工日)維持し、菌糸プラグ(plug)を新鮮なプレートに移すことにより7日ごとに継代培養する; Ustilago maydis(トウモロコシ黒穂病菌)培養物はPDYアガー上で30℃で暗中で維持し、再-画線植菌により継代培養する。ゲノムDNAは標準的方法論を用いて培養物から調製する。例えばQiagen DNeasy Plantキットを使用し、または実施例３に記載の方法を使用することにより調製する。
【０１６３】
5.2.2  PCR
プライマーは、対象の遺伝子とそのホモログの間の保存領域(上記のように同定する)に対応するように設計する。当業者ならば、何種かのプライマー対を試さなければならないことがあると理解するであろう。プライマー対を使用するPCR反応は次のように調製する: 
2x レディーミックスPCRマスターミックス(ABgene)  12.5 μl
プライマー(5 pmol)                               それぞれ1 μl
鋳型gDNA                                         1.5〜4 μg/ml
ヌクレアーゼフリー水                              最終容量25μlまで
【０１６４】
反応は、Biometra personal PCRサイクラー(Thistle Scientific Ltd, DFDS House, Goldie Road, Uddington, Glasgow, G71 6NZ)を使用して次の条件を用いて行う: (1) 95℃、5分; (2) 95℃、1分; (3) 53℃、1分 30秒; (4) 68℃、2分 30秒; (5) 72℃、10分; (6) 4℃、ホールド。ステップ2〜4を30サイクル行う。Qiagen社のQIAquick PCR精製キット(Qiagen Ltd, Boundary Court, Gatwick Road, Crawley, West Sussex, RH10 9AX, UK)を製造者の説明書に従って使用してPCR産物を(残留酵素およびヌクレオチドを除去するために)精製し、40 μlの滅菌水(BDH分子生物学グレード/フィルター滅菌)へと溶出させる。精製PCR産物を1％アガロースゲルで調べる。
【０１６５】
当業者ならば、縮重PCRで産物を生成する試みにおいては、多数のパラメーターを変化させなければならない、と理解するであろう。こうしたパラメーターとしては、プライマー濃度、鋳型濃度、Mg2+イオンの濃度、伸長およびアニーリング時間、およびアニーリング温度が挙げられる。温度の変化は、グラジエントPCR装置を使用することにより提供することができる。
【０１６６】
精製PCR産物をpPEM-Teasy (Promega)内にクローニングし、その後製造者の説明書に従いXL10-Gold(登録商標) Kan ultracompetent大腸菌(E. coli)細胞に形質転換する。次いで形質転換反応物を、アンピシリン(100 μg/ml)、50 μl X-gal (4％)および10 μl IPTG (100 mM)を含有するLB寒天プレートに播種する。37℃での一晩のインキュベーション後、各形質転換からの個々の白色コロニーを、アンピシリン(100 μg/ml)を含有するLB培養液へと継代培養する。振とうしながら37℃で一晩インキュベートした後、Qiagen spin ミニプラスミド抽出キットを製造者の説明書に従って使用してプラスミドを抽出し、その後、全長配列決定のために送付する。
【０１６７】
5.3  サザンブロッティングによるホモログの同定
5.3.1  ゲノムDNAの切断およびナイロンメンブレンへの転写
対象の菌類由来のゲノムDNAを適当な制限酵素で消化して、その後0.8 ％アガロースゲルに流す。次にゲルを室温で振とうしながら250 mM HCl中に10 分程度浸し、その後ゲルを滅菌RO水でリンスする。
【０１６８】
DNAのナイロンメンブレンへの転写は0.4 M NaOHを用いて行う。転写プロトコルおよび器具は周知であり例えばSambrook ら, (1989), Molecular Cloning, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。転写後、120℃で30分焼く(bake)ことによりDNAをメンブレンに固定する。その後メンブレンは直ちに使用するか、将来的使用のために乾燥させて貯蔵することができる。
【０１６９】
5.3.2.  プローブの調製
プローブは、DNAの制限消化によりまたは適当な領域のPCRにより作製する。Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)を用いて設計したプライマー対およびA. fumigatusゲノムDNAを使用するPCRにより、適当なプローブを作製することができる。
【０１７０】
1 μg DNA鋳型を分子生物学水に合計容量16 μlまで希釈し、沸騰している水浴中で10 分変性させ、素早く氷上で冷やす。その後4 μl DIG-High Prime (1 mM dATP、1 mM dCTP、1 mM dGTP、0.65 mM dTTP、0.35 mM アルカリ-不安定-ジゴキシゲニン-11-dUTP、1 U/μl 標識グレードクレノウ酵素、5 x反応バッファー、50％(v/v)グリセロール中)を添加し、反応を37℃で20時間インキュベートし、その後2 μlの200 mM EDTA pH 8.0を添加して標識反応を終了させる。標識効率はDIG-標識対照DNAとの比較から推算する。
【０１７１】
5.3.3.  プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション
メンブレンを、100cm2のメンブレン表面積当たり20 mlのプレハイブリダイゼーション溶液(DIG Easy Hyb、Roche)を含有するハイブリダイゼーションチューブに入れ、その後ハイブリダイゼーション・オーブン中で42℃で2時間プレハイブリダイズさせる。DIG標識プローブを、沸騰している水浴で10分加熱し、その後氷上で直接冷やすことにより変性させる。次いでプローブをハイブリダイゼーション溶液(Easy Hyb、Roche; 各ハイブリダイゼーション当たり、少なくとも5 mLのハイブリダイゼーション溶液が必要である)で〜200 ng/mLに希釈する。ハイブリダイゼーションチューブからプレハイブリダイゼーション溶液を廃棄し、その後DIG標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液を素早く加える。次にハイブリダイゼーションを42℃のハイブリダイゼーション・オーブン内で一晩進行させる。最適温度はプローブサイズおよび標的配列との相同性に依存し、実験的に決定される。
【０１７２】
ハイブリダイゼーション後、50 mLのストリンジェンシー洗浄溶液(3 x SSC、0.1％ SDS; ここで20 x SSCバッファーは3 M NaCl、300 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0)を用いてメンブレンを42℃で２回洗浄し(１回の洗浄あたり5分)、その後室温で50 mLのストリンジェンシー洗浄溶液を用いて２回洗浄(１回の洗浄あたり15分)する。こうした洗浄のストリンジェンシーは、SSC濃度を6 x SSC、0.1％ SDSへと増加させることおよび／または洗浄温度を低下させることにより、緩和することができる。
【０１７３】
5.3.4.  検出
メンブレンを20 mL洗浄バッファー(100 mM マレイン酸、150 mM NaCl; pH 7.5; 0.3％ v/v Tween 20)で洗浄し、その後逐次的に次のものとインキュベートする; 20 mLブロッキング溶液(1％ w/v核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬、Roche、100 mM マレイン酸、150 mM NaCl、pH 7中に溶解)を用いて室温で30分; ブロッキングバッファー中に1:5,000へと希釈した抗DIG-アルカリホスファターゼ(Roche)を用いて室温で30分;洗浄バッファー、２回洗浄、それぞれ室温で15分; 検出バッファー(100mM Tris-HCl、100 mM NaCl; pH 9.5)、室温で2分。その後メンブレンを移し、アセテートシートの上に置き、次いでメンブレンの上に〜 0.5 ml (100cm2当たり)のCSPDまたはCDP-starを加える。その後、メンブレンの表面に第２のアセテートのシートを被せ、このアセンブリーを室温で5分インキュベートし、その後プラスチックバッグ中に密封する。次いで該アセンブリーを15分〜1時間、X線フィルムに露光する。最適露光時間は露光時間を24時間まで増加させることにより実験的に決定する。
【０１７４】
ゲル上のバンドの存在は、対象のゲノムDNA内に遺伝子がある証拠である。バンドの分子量は、その遺伝子を含む制限断片の大きさに依存する。
【０１７５】
実施例６  組換えタンパク質および／または断片の発現
機能の詳細な研究を可能にするため、および阻害化合物のin vitroハイスループットスクリーニングの開発のために、組換えタンパク質または断片を発現させる。上記のように調製したcDNAを用いてPCRを行い、配列番号 3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、50、53、56、59、61もしくは63に本質的に対応するタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを生成させる。
【０１７６】
プライマーは、コード配列の5’および3’末端がコードされ、pET-30 Xa/LICベクターとアニーリングするために必要な塩基(5'付加配列、GGTATTGAGGGTCGC; 3’付加配列、AGAGGAGAGTTAGAGCC)が付加されるように設計する。もしタンパク質がN末端リーダーペプチドを有するならば、これは除外すべきである。もしタンパク質が複数のドメインからなるときは、限られた数のドメイン、さらには単一ドメインのみを発現させることが望ましいまたは必要でありうる。こうした場合には、プライマーをドメイン境界に対応するように設計する。PCR反応は次の反応混合液および条件を用いて行う。すべての試薬はKOD キット(Novagen)に含まれている。
【０１７７】
2.5 μl   10x PCRバッファー
5 μl     dNTP (2mM)
2 μl     MgSO4 (25mM)
1 μl     各プライマー (それぞれ5 pmol)
1 μl     鋳型cDNA
11.5 μl   ヌクレアーゼフリー水
1 μl KOD ポリメラーゼ
【０１７８】
PCR反応は次の条件を用いて行う: (1) 94℃、5分; (2) 94℃、1分; (3) 59.3℃、1分; (4) 68℃、1分30秒; (5) 68℃、10分; (6) 10℃、ホールド。ステップ2〜4を40サイクル行い、その後QIAquick PCR精製キット(Qiagen Ltd, Boundary Court, Gatwick Road, Crawley, West Sussex, RH10 9AX, UK)を製造者の説明書に従って使用しPCR産物を精製する。精製PCR産物はアガロースゲルで調べる。
【０１７９】
その後、cDNA断片をpET30 Xa/LICベクター(Novagen)にクローニングし、Nova Blue化学的コンピテント大腸菌(E. coli)細胞に形質転換し、予備加温したカナマイシン(+)選択プレート上に播種する。37℃で一晩のインキュベーション後、カナマイシン耐性コロニーを選択して、カナマイシン含有LB培地で増殖させる。プラスミドミニキット(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを単離する。インサートの存在と正しい配置の確認は、制限分析および構築物の配列決定により行う。
【０１８０】
精製プラスミドDNAの配列と配置が正しいことを確認し、これを化学的コンピテントBL21 Star (DE3) One Shot大腸菌(E. coli)細胞内に形質転換し、37℃で一晩増殖させる。2 mlの一晩培養した培養物を使用して100 mlのLB, 30 μg/mlカナマイシンに接種し、細胞密度が0.6の光学密度となる(約3時間)まで37℃、220 rpmで培養物をインキュベートする。次に組換えタンパク質の発現をIPTG (1mM)で5時間誘導する。
【０１８１】
4500 rpmで10分の遠心分離により細菌を回収し、その後ペレットを溶解バッファー(10 ml Bugbuster (Novagen)、10 μl Benzonase (Novagen)、0.4 μl リゾチーム (Novagen)および100 μl 1M イミダゾール)中で室温で20分溶解させる。次に細胞を4℃で20分、16000gで沈降させ、可溶性組換えタンパク質を含む上清を、汚れていないチューブに移す。
【０１８２】
予備洗浄済みNi-Nta樹脂に樹脂1 ml当たり5〜10 mg タンパク質の濃度の上清を加え、4℃で1時間結合させる。その後タンパク質-樹脂混合物をカラムに流し込み、4 mlの洗浄バッファー(2.5 mlの1M リン酸バッファーpH8、6.25 mlの4M NaCl、1 mlの1MイミダゾールpH8、0.5 ml 10％ Tween 20; n.H2O 中で50 mlとする)で２回洗浄し、その後溶出バッファー(250 μlの1Mリン酸バッファーpH8、625 μlの4M NaCl、1.25 mlの1MイミダゾールpH8、50 μlの10％ Tween 20、n.H2O 中で5 mlとする)を用いて4x 0.5 ml画分として溶出させる。精製タンパク質を含む画分を、S-tag HRPコンジュゲート(Novagen)を使用してSDS-Pageおよびウェスタンブロッティングにより同定し、プールし、次いで25 mlの0.1 M KPO4 pH7で平衡化したPD10カラム(Amersham)を用いて脱塩する。精製組換えタンパク質を含む画分は、YM10カラム(Millipore)を用いて濃縮し、−80℃で貯蔵することができる。
【０１８３】
細菌における発現のために他の発現系、例えばグルタチオンS-トランスフェラーゼまたはマンノース結合融合タンパク質系を使用することができる。
【０１８４】
6.1  組換えILV34の発現
ILV34(表II)の完全長のバージョンおよびトランケートされたバージョンを発現させた。トランケートされたバージョンは29アミノ酸のN末端ミトコンドリア標的配列を欠くものであった。プライマーは、コード配列の5’および3’末端をコードし、pET-30 Ek/LICベクターとアニーリングするのに必要な塩基が付加されるように設計した(完全長構築物5’プライマー配列番号64; トランケート構築物5’プライマー配列番号65; 共通3’プライマー、配列番号66)。PCRは次の反応混合液および条件を用いて行った(すべての試薬はKOD Hot Start DNA ポリメラーキット、Novagenに付随する): 5μl 10x PCRバッファー; 5μl dNTP (2mM); 3μl MgSO4 (25mM); 1.5μl 各プライマー(それぞれ15 pmol); 1μl 鋳型cDNA; 29.5μl ヌクレアーゼフリー水; 2.5μl DMSO; 1μl KOD Hot Startポリメラーゼ。
【０１８５】
PCRは次の条件を用いて行った: (1) 94℃、5分; (2) 94℃、1分; (3) 59℃、1分30秒; (4) 68℃、1分30秒; (5) 68℃、10分; (6) 8℃、ホールド。ステップ2〜4を40サイクル行い、その後PCR産物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen Ltd, Boundary Court, Gatwick Road, Crawley, West Sussex, RH10 9AX, UK)を製造者の説明書に従って使用し精製した。精製PCR産物をアガロースゲルで調べた。
【０１８６】
次いでcDNA断片をpET30 Ek/LICベクター(Novagen)にクローニングし、Nova Blue 化学的コンピテント大腸菌(E. coli)細胞に形質転換し、予備加温カナマイシン(+)選択プレートに播種した。37℃で一晩インキュベート後、カナマイシン耐性コロニーを選択しカナマイシン含有LB培地(30μg/ml)で増殖させた。プラスミドミニキット(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを単離した。インサートの存在および正しい配列と配置の確認は、制限分析、PCRおよび構築物の配列決定により明らかにした。
【０１８７】
正しい配列と配置の精製プラスミドDNAを、化学的コンピテント BL21 Star (DE3) One Shot大腸菌(E. coli)細胞内に形質転換し37℃で一晩増殖させた。6 mlの一晩培養した培養物を使用して200 mlのLB、30 μg/mlカナマイシンに接種し、その後細胞密度が0.5〜0.7の光学密度となる(約2時間)まで220 rpm、37℃で培養物をインキュベートした。次に組換えタンパク質の発現をIPTG (0.5 mM)を用いて20℃で20時間誘導した。細菌を3500gで10分遠心分離することにより回収し、次いでペレットを溶解バッファー(24 ml Bugbuster, Novagen; 24 μl Benzonase, Novagen; 0.4 μl rLysozyme, Novagen;および1200 μlの1M イミダゾール)を用いて室温で20分混合しながら溶解させた。次にサンプルを16000gで20分、4℃で遠心分離することにより細胞残渣を除去し、可溶性タンパク質を含有する上清を汚れていないチューブに移した。
【０１８８】
予備洗浄済みNi-NTA樹脂に樹脂1 ml当たり約25 mgタンパク質の濃度の上清を加え、混合しながら4℃で1時間結合させた。タンパク質/樹脂混合物を大きな使い捨てプラスチック製カラムに流し込み、7.5 ml 洗浄/結合バッファー(2.5 ml 1M Na2HPO4 pH8.0、6.25 ml 4 M NaCl、1 ml 1 MイミダゾールpH8.0、0.5 ml 10％ Tween 20、dH2Oで50 mlに調整する)で２回洗浄し、その後6.5 mlの溶出バッファー(1 ml 1 M Na2HPO4、pH8.0、2.5 ml 4 M NaCl、5 ml 1 MイミダゾールpH8.0、200μl 10％ Tween 20、200 μl プロテアーゼインヒビターカクテルIII、dH2O で20 mlに調製する)で溶出させた。溶出液中の精製ILV34 タンパク質の存在はSDS-PAGEにより確認し、次いで溶出液を50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、pH 8.0を含むバッファーで平衡化したPD10カラムを用いて脱塩した。アリコートを−80℃で貯蔵した。
【０１８９】
6.2  組換えILV1352の発現
ILV1352 (表II)の完全長のバージョンおよびトランケートされたバージョンをコードする構築物を作製した。トランケートされたバージョンは、ILV1352 DNA配列の最初の84塩基対を欠く。プライマーは、コード配列の5’および3’末端をコードし、pET-30 Ek/LICベクターとアニーリングするために必要な塩基が付加されるように設計した; (5’プライマー、完全長用、配列番号68;  5’プライマー、トランケート化用、配列番号69; 共通3’プライマー、配列番号70)。PCRは次の反応混合液および条件を用いて行った。すべての試薬はKOD Hot Start DNA ポリメラーゼキット(Novagen)に付随した; 2.5 μl 10x PCRバッファー、2.5 μl dNTP (2 mM)、1 μl MgSO4 (25 mM)、1.5 μl各プライマー(5 pmol/μl)、1 μl鋳型cDNA、15 μlヌクレアーゼフリー水、0.5 μl KOD Hot Startポリメラーゼ。
【０１９０】
PCRは次の条件を用いて行った。すなわち、(1) 95℃、5分; (2) 95℃、1分; (3) 56℃、1分30秒; (4) 68℃、2分30秒; (5) 68℃、10分; (6) 8℃、ホールド。ステップ2〜4を45サイクル行い、その後、QIAquick PCR精製キット(Qiagen Ltd, Boundary Court, Gatwick Road, Crawley, West Sussex, RH10 9AX, UK)を製造者の説明書に従って使用し、PCR産物を精製した。精製PCR産物をアガロースゲルを用いて調べた。
【０１９１】
その後、cDNA断片をpET30 Ek/LICベクター(Novagen)にクローニングし、Nova Blue 化学的コンピテント大腸菌(E. coli)細胞内に形質転換し、予備加温したカナマイシン(+)選択プレート上に播種した。37℃で一晩インキュベートした後、カナマイシン耐性コロニーを選択し、次いでカナマイシン含有LB培地 (30 μg/ml)で増殖させた。培養物からグリセロールストックを作製し、その残りを使用してQiagen社のプラスミドミニキットを用いてプラスミドDNAを精製した。インサートの存在および正しい配列と配置の確認は、構築物のPCRおよび配列決定により決定した。精製プラスミドDNAを化学的コンピテント BL21 Star (DE3) One Shot大腸菌(E. coli)細胞内に形質転換した。
【０１９２】
予備研究から、組換えトランケート化ILV1352は封入体(inclusion bodies)として蓄積されることが示された。次のように封入体を精製し、トランケート化ILV1352を可溶化およびリフォールディング(re-fold)させた: pET30 Ek/LIC中のトランケート化ILV1352を含むBL21細胞から作製したグリセロールストックを使用して、10 ml LB、30 μg/mlカナマイシン培養液に接種した。この培養液を220 rpmで振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。培養物を90 ml LBカナマイシン培養液に添加し、OD600が0.4〜1.0となるまで37℃でインキュベートした(約1.5 hr)。この時点で、IPTG (0.1 mM)を培地に添加し、これを30℃で5時間、インキュベートした。細胞を8,500 rpmで10分の遠心分離により回収した。ペレットをBugbusterマスターミックス(100 ml培養物当たり5 ml)に再懸濁し、その後、室温で20分振とうしながらインキュベートした。
【０１９３】
細胞懸濁物を11,000 rpmで20分、4℃で遠心分離した。上清を除いた後、ペレットを5 ml Bugbuster Master Mixに再懸濁した。６倍容量(30 ml) 1:10 Bugbuster タンパク質抽出試薬を細胞懸濁物に添加し、封入体を6,000 rpmで15分、4℃で遠心分離することにより回収した。
【０１９４】
上清を除去し、その後封入体を50 ml 1:10 Bugbuster試薬に再懸濁させた。細胞懸濁物を6,000 rpmで15分、4℃で遠心分離した。この洗浄ステップをさらに２回繰り返したが、最後のステップにおいては遠心分離速度を11,000rpmまで上げた。精製封入体の最終ペレットを0.1培養液容量(10 ml)の1x IB洗浄バッファー (Novagen)に再懸濁した。封入体を8,500 rpmで10分の遠心分離により回収した。ペレットを0.1培養液容量の1x IB 洗浄バッファーに再懸濁し、その後封入体を8,500 rpmで10分の遠心分離により回収した。上清を除き、1x IB可溶化バッファーに0.3％N-ラウロイルサルコシンおよび10 mg/mlの濃度の1mM DTT(Novagen)を加えたもので封入体を再懸濁した。サンプルを穏やかに混合し、室温で15分インキュベートし、その後8,500 rpmで10分遠心分離した。Slide-A-Lyzer 7K MWCO 透析カセット (Pierce)を用いて、ILV1352の可溶化画分を、３回交換する中性pHバッファー(20mM Tris-HCl、pH 8.5)＋0.1mM DTTに対して透析し、このとき最終透析ステップからはDTTを省略した。
【０１９５】
実施例７  阻害剤の同定のためのアッセイ
7.1  阻害剤の同定のための生化学的アッセイ
組換えタンパク質は、その特定のタンパク質について特異的な種類のアッセイを用いてアッセイすることができる。例えば次ぎのとおりである。
【０１９６】
エンドヌクレアーゼは、タンパク質をDNA、例えばLamdbaまたはpBR322とインキュベートし、アガロースゲルに流すことによりDNAが切断されるか否か観察することによりアッセイすることができる。
【０１９７】
エキソヌクレアーゼは、タンパク質を蛍光または放射標識DNA、例えばLamdbaまたはpBR322とインキュベートし、その後蛍光または標識ヌクレオチドが放出されるか否かを観察することによりアッセイすることができる。
【０１９８】
エキソリボヌクレアーゼは、タンパク質を蛍光または放射標識RNAとインキュベートし、その後蛍光または標識リボヌクレオチドが放出されるか否かを観察することによりアッセイすることができる。
【０１９９】
GPCR(Gタンパク質共役受容体)は、FlashBlueTM ビーズ(Perkin Elmer)で誘導体化されたGPCR膜画分を放射標識リガンドとインキュベートし、その後放出される光を測定することによりアッセイすることができる。GPCR膜画分は、対象のGPCRを発現または過剰発現する細胞から調製する。
【０２００】
ILV3/ILV3/ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ケト酸反応産物の形成を、313 nmで直接測定することにより、またはケトンを2,4-ジニトロフェニルヒドラジンで誘導体化して530 nmを測定することにより、アッセイすることができる。
【０２０１】
キナーゼは、キナーゼを[32P]-ATPおよび基質とインキュベートし、基質への32P-標識の組込みを測定することによりアッセイすることができる。適当な基質としては、ミエリン塩基性タンパク質、グリコーゲンシンターゼ、およびエノラーゼが挙げられる。あるいはまた、蛍光消光(quenching)技術、例えばQTL Lightspeed TMキナーゼアッセイ(QTL biosystems, Reigate, Surrey)を使用することができる。
【０２０２】
ホスファターゼは、タンパク質を[32P]-ATP-標識基質とインキュベートし、その後32P-標識の放出を測定することによりアッセイすることができる。適当な基質としては、ミエリン塩基性タンパク質、グリコーゲンシンターゼ、およびエノラーゼが挙げられる。あるいはまた、蛍光消光(quenching)技術、例えばIQホスファターゼアッセイ(Pierce, Cramlington, Northumberland)を利用するホスファターゼアッセイを使用することができる。
【０２０３】
ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼCは、発色基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-ミオイノシトール-1-リン酸または蛍光基質4-メチルウンベリフェリル-ミオ-イノシトール-1-リン酸(Restaino ら, 1999, J. Food Prot. 62, 244-251; Reissbrodt, 2004, Int. J. Food Microbiol. 15, 1-9)を使用することによりアッセイすることができる。
【０２０４】
ホスホジエステラーゼ、例えば3’5’サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼは、Wera ら (FEBS Lett. 1997, 420, 147-150)に記載のようにcAMPの時間依存的分解を追跡することによりアッセイすることができる。サンプルおよび対照を、50 mM Tris-HCl (pH 8)、0.1 mMEDTA、および500 mM cAMPと共に30℃でインキュベートする。反応を加熱により停止し、その後cAMP [3H]アッセイシステム(Amersham, Arlington Heights, IL)を用いてcAMPを測定する。
【０２０５】
タンパク質チロシンホスファターゼは、チロシンを[32P]で標識してある基質タンパク質(例えばミエリン塩基性タンパク質)を用いて、酵素とのインキュベーション後に放出される標識を測定することによりアッセイすることができる。あるいはまた、非放射性ProFluorTM アッセイキット(Promega)を使用することができる。
【０２０６】
インキュベーションに候補物質を追加し、その後酵素活性がどの程度阻害されるか測定することにより、こうしたアッセイを阻害剤の同定用に改変する。
【０２０７】
7.2  阻害剤の同定のための遺伝学的スクリーニング
機能が不明または自明ではないときのタンパク質については、ジェネリックな遺伝学的スクリーニングを用いて阻害剤を同定することができる。ヘテロ接合性ノックアウト変異体を、例えば実施例２に記載のように作製する。ほとんどの場合、これは野生型二倍体と比べて、ヘテロ接合体において産生される遺伝子産物の減少をもたらすはずである。遺伝子が増殖に必須であるならば、ヘテロ接合体は、その遺伝子の産物を標的とする化合物により感受性となるはずである。この現象はハプロ不全(haploinsufficiency)と呼ばれ、酵母において実証されている(Genomic profiling of drug sensitivities via induced haploinsufficiency. Giaever G, Shoemaker DD, Jones TW, Liang H, Winzeler EA, Astromoff A, Davis RW. Nat Genet. 1999 21:278-83.)。
【０２０８】
機能不明の遺伝子の一次スクリーニングは、Aspergillus fumigatusの野生型二倍体株の増殖に対するヘテロ接合性突然変異体の増殖を、化合物のパネルの存在下および不在下でモニタリングすることに関する。こうした株の胞子懸濁物を96ウェルプレートのRPMI 1640培地に調製する。1x104 cfu/mlの接種物を使用する。可能性のある阻害物質を添加して最終濃度を32 μg/mlとする。次にプレートを37℃で48時間インキュベートする。プレート測定型分光光度計を用いて培養物のOD485を測定する。
【０２０９】
ヘテロ接合体と野生型の両方が影響を受けなければ、その化合物についてはそれ以上の研究は行わない。もし(a)野生型は増殖するがヘテロ接合体は増殖しない、または(b)いずれの株も増殖しないならば、各株における化合物の最小抑制濃度(MIC)を次のように決定する。
【０２１０】
ヘテロ接合性突然変異体および野生型二倍体を、ある濃度範囲の化学物質の存在下でインキュベートする。生物の増殖を抑制する化学物質の最小濃度(最小抑制濃度、MIC)を両方の株について計算する。対象の化合物の２倍希釈を、96ウェルプレート上のRPMI 1640培地に50 μg/mlから開始して0.1 μg/mlまで、二重反復しながら調製する。各ウェルに野生型または突然変異体Aspergillus fumigatusのいずれかを接種し、次いでプレートを37℃で24/48時間インキュベートし、その後OD485を測定する。
【０２１１】
機能不明の遺伝子の産物の阻害剤は、野生型株におけるMICよりも突然変異体株において低いMICを有する、すなわち該２種の株の間に2倍以上のMICの相違を有するであろう。次いでこの抗菌化合物を、該化合物の特異性、有効性、および他の性質を改善するための化学的アプローチの基礎として使用することができる。
【０２１２】
7.3 ILV3アッセイ
ILV34のためのアッセイは、この酵素がジヒドロキシ酸基質をケト酸へと脱水する能力に基づく。天然の基質は2,3-ジヒドロキシ-3-メチルブチレートおよび2,3-ジヒドロキシ-3-エチルブチレートであり、市販されている代替基質はL-トレオン酸である。ケト酸産物の出現は240 nmで直接モニタリングすることができ、あるいはまた、ケト酸産物をセミカルバジドおよび酢酸ナトリウムと反応させて250 nmでモニタリングすることができる。セミカルバジド/酢酸ナトリウムは酵素反応を効果的に停止させ、増大した吸収を付与しつつ反応産物を発色させ、これは少なくとも24時間安定である(Kanamori and Wixom, 1963, J. Biol. Chem. 238:998-1005; Kiritani and Wagner, 1970, Meth. Enzymol. 17:755-764;  Limberg ら, 1995, Bioorg. Med. Chem. 3:487-494)。
【０２１３】
アッセイは96-または384-ウェルプレートを用いて行った。384-ウェルプレートの各ウェルに、0〜8000 ngの組換えトランケート化ILV34および25 μlの0〜50mM トレオネート(50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、pH8.0中に溶解)を添加し、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2 (pH8.0)を用いて容量を50 μlへと調製した。サンプルを室温でインキュベートし、適当な間隔で反応を停止させ、25 μlセミカルバジド溶液(1.89％ w/v酢酸ナトリウム溶液中の1.26％ w/vセミカルバジド)の添加により発色させた。最終セミカルバジド／酢酸ナトリウム添加の後にサンプルを15分インキュベートし、その後250nmを測定した。
【０２１４】
反応の速度(１分当たりの吸光変化)は種々のILV34濃度について線形であったが、高い基質濃度では飽和するようになった。ILV34はトレオネートについてのKmが約10 mMであり、pH 8.0で最も活性が強かった。マグネシウムイオン濃度は、50 μM〜10 mMの範囲ではILV34活性にまったく影響を及ぼさなかった。ILV34の阻害剤である2-ヒドロキシ-3-メチル酪酸(Sigma 219835)を試験したところ、IC50は約10 mMであった。
【０２１５】
7.4  ILV34阻害剤の同定のための高スループットスクリーニング
ILV34の阻害剤のスクリーニングは上記アッセイに基づくものであった。記載したスクリーニングは384フォーマットであるが、このプロトコルは1536フォーマットまたは他のフォーマットを必要に応じて行うように応用することができる。
【０２１６】
試験する化合物を100％ DMSOに溶解させ、水に希釈し、384四角ウェル型ポリスチレンプレート(例えば‘Greiner bio-one’ UV-Star 384 マイクロプレート; 10μl/ウェル)に加えた。すべてのアッセイウェルの最終DMSO濃度は5％v/vであった。
【０２１７】
基質であるL-トレオン酸(ヘミカルシウム塩 [Aldrich 380644-5G]; 62.5 mM Tris-HCl中20mM、12 mM MgCl2 pH8.0)をスクリーニングの当日に使用前に調製した。清明になるまで溶液を室温で超音波にかけ、ガラス棒を用いて溶解の遅い材料を押し潰した。アッセイウェルにおけるL-トレオン酸の最終濃度は8mMであった。
【０２１８】
停止/シグナル増幅試薬(セミカルバジドHCl [Aldrich S220-1]; 酢酸ナトリウム、無水性[BDH 301045M]); 1.26％ w/v セミカルバジド、1.89％ w/v 酢酸ナトリウム、脱イオン水中)もスクリーニングの当日に使用前に調製した。
【０２１９】
上記のように調製した組換えILV34酵素は、62.5 mM Tris-HCl、12 mM MgCl2バッファー (pH8.0)を用いて調製した。アッセイにおける最終バッファー濃度は50 mM Tris-HCl、9.6 mM MgCl2バッファー (pH8.0)であった。
【０２２０】
アッセイはTecan Freedom、Tecan TeMoおよび PerkinElmer  Minitrakロボットを、ThermoLabsystems multidrop 384およびTecan Safire自動プレートリーダーと共に使用して行った。
【０２２１】
20 μlの酵素(典型的には約2 μg/ウェル、バッチの比活性による)を、およびその後20 μl L-トレオン酸溶液を、試験化合物を含むマイクロタイタープレートのウェルに添加した。複製したセットのプレート (すなわちバックグラウンド、酵素不含対照のため)のためには20 μlの62.5 mM Tris-HCl、12 mM MgCl2バッファー(pH8.0)を使用した。化合物不含対照のためには、DMSO (可溶化化合物ストックと同じ方法で希釈)を使用した。プレートを室温で40分インキュベートし、その後25 μlの停止/増幅試薬を添加した。室温で15分後、プレートを250 nmで読み取り、Excelスプレッドシートを用いてデータ処理し、生データを阻害パーセントデータへと変換した。
【０２２２】
インキュベーション時間に対するスクリーニングの反応速度は、反応進行曲線が時間およびタンパク質濃度の両方に対して線形となるものであった。スクリーニングのZ値は0.83であり、すなわち十分に許容できるものであった(Zhang ら, 1999, J. Biomolecular Screening, 4, 67-73)。プレート上のウェル同士、プレートとプレート同士、行ったスクリーニングと行ったスクリーニング同士のシグナルの一貫性も、HTS型(regime)について許容可能であった。
【０２２３】
選択化合物の用量応答データを測定するために、一次スクリーニングと本質的に同じプロトコルを使用して、二次スクリーニングを行うことができる。二次スクリーニングは、シグモイド型モデル606を使用するExcelfit バージョン3ソフトウェア(IDBS)を使用して、適当な阻害値をプロットし、化合物のIC50データを決定する。
【０２２４】
ILV1352は、ILV34について行ったアッセイと類似のものを用いてアッセイすることができ、ILV34阻害剤に対するのと同様にILV1352阻害剤を同定することができる。ILV34アッセイから阻害剤として同定された化合物は組換えILV1352を使用する類似アッセイにおいて試験する(またはその逆も同様)ことができ、そして両方のアッセイにおいて阻害を示す化合物は抗菌物質の候補である。あるいはまた、１種のILV3タンパク質の阻害を示す化合物はILV3阻害剤でありうる。
【０２２５】
実施例８  抗体の製造
組換えタンパク質は、(実施例６に記載のように)免疫原として使用することができる。あるいはまた、個々のタンパク質にユニークな領域、またはホモログのセットにおいて交差反応性を提供する可能性が高い領域のいずれかをコードする合成タンパク質またはポリペプチドを使用する。免疫する前にペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲートする必要があるかもしれない。
【０２２６】
免疫する動物由来の免疫前血清を免疫原に対してスクリーニングし、内因性交差反応性が存在しないことを確認する。その後、動物(典型的にはヒツジ、ウサギまたはマウス)を免疫する。ポリクローナル抗体の製造のためには、クロマトグラフィーマトリックスに架橋された免疫原を用いて、得られた血清をアフィニティー精製する。あるいはまた、血清からの抗体画分の精製(例えばマトリックスに架橋されたプロテインGまたはプロテインAを使用)が適切でありうる。モノクローナル抗体製造は、当業者に周知の方法により行われる。
【０２２７】
得られるポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体の特異性は、ELISAおよび／またはウェスタンブロッティングにおいて、免疫原、関連構築物または全細胞溶解物および抽出物を標的として使用して確認する。また、陰性対照、例えばパラロガスタンパク質、異なる構築物または異なる種を利用して、特異性を試験するならびに／または種および／もしくは属交差反応性の範囲を決定する。
【０２２８】
本出願に関連し本明細書と共に公の閲覧に公開された、本明細書と同時に、またはそれ以前に提出されたすべての論文および文献に読者の注意を向けると共に、かかるすべての論文および文献の内容を、参照により本明細書に組み入れる。
【０２２９】
本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示するすべての構成、および／またはそのように開示されたあらゆる方法または手法のすべてのステップは、少なくともかかる構成および／またはステップの一部が相互に排他的である組み合わせを除き、どのような組み合わせとしても併用することができる。
【０２３０】
本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示する各構成は、特に明確に断らない限り、同じ、均等、または類似の目的を果たす代替的構成により置換されうる。したがって、特に明確に断らない限り、開示した各構成は、ジェネリックな系列の均等なまたは類似の構成のうちの１つの例に過ぎない。
【０２３１】
本発明は先の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、あらゆる新規な１つの、またはあらゆる新規な組み合わせの本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む)に開示する構成、または、あらゆる新規な１つの、またはあらゆる新規な組み合わせの、かかる開示のあらゆる方法または手法のステップに及ぶ。
【０２３２】
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【０２３３】
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【０２３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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