(57)【要約】  本発明は、有効成分としてＨＣＶ特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＣ型肝炎の治療剤に関する。本発明のｓｉＲＮＡは、哺乳類細胞においてウイルスのＲＮＡの分解を誘導し、それによってＨＣＶタンパク質の発現および複製を阻害する、ＨＣＶのヌクレオチド配列に特異的な二本鎖ＲＮＡである。合成ｓｉＲＮＡまたはこのＲＮＡをコードするＤＮＡベクターを投与する段階を含む本発明の方法は、それゆえ、ＨＣＶ遺伝子の発現および複製を阻害することによりＨＣＶキャリアの治療に有効である。
2008541754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３６のヌクレオチド配列のうちの１つ、またはその相補物、またはその一部を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号４、１０、１６、１８、１９、２３、２９、３３もしくは３４のヌクレオチド配列のうちの１つ、またはその相補物、またはその一部を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１の核酸分子のセンスおよびアンチセンス配列とハイブリダイズした、単離された核酸分子。
【請求項４】
核酸分子が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端がｄＴｄＴ分子に連結されている、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
センス鎖およびアンチセンス鎖がリンカー分子を媒介して共有結合している、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
リンカー分子がポリヌクレオチドリンカーである、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
リンカー分子が非ヌクレオチドリンカーである、請求項５に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
ＨＣＶ  ＲＮＡに結合する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項１１】
請求項２に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクター。
【請求項１２】
有効成分として請求項１〜請求項９の核酸分子のうちの１つ、または請求項１０もしくは請求項１１のＤＮＡベクターを含む、ＨＣＶ感染に関連した病気の治療のための医薬組成物。
【請求項１３】
組成物がさらに医薬上許容されるキャリアを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜請求項９の核酸分子のうちの１つ、または請求項１０もしくは請求項１１のＤＮＡベクターを標的の患者に注入する段階を含む、ＨＣＶ感染に関連した病気の治療方法。
【請求項１５】
図１で表されるｓｉＲＮＡ発現ベクター、ｐＲＮＡｉＤｕ（受託番号：ＫＣＴＣ  １０８００ＢＰ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてＨＣＶ特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＣ型肝炎の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で２億７千万人以上の人々がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に慢性的に感染していると考えられている。このウイルス病原にかかっている患者の４０から６０％は肝硬変または肝細胞がん（ＨＣＣ）を進行しうる。しかし、その感染を予防するための有効なワクチンが存在していない。主な抗ＨＣＶ治療の１つは、アルファインターフェロン（ＩＦＮ−α）単独またはリバビリンとの組み合わせによる治療である。しかし、現在の治療法では効果が限られており、一定のＨＣＶ遺伝子型に対して反応が乏しい。それゆえ、ＨＣＶ感染を治療するための新しい治療の開発が望まれている。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、全ての真核生物において進化的に保存された過程であり、（内在性および外因性）遺伝子の発現が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の誘導によって阻害される。ＲＮＡｉはダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様エンドヌクレアーゼによって開始される。このダイサーは、長いｄｓＲＮＡの２１〜２３ｎｔの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への連続的な切断を促進する（Bernsteinら, Nature, 409: 363, 2001）。ｓｉＲＮＡは、ＡＴＰの存在下でｓｉＲＮＡを巻き戻す、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる（Hammondら, Nature, 404: 293, 2000）。ＲＩＳＣに取り込まれたアンチセンスＲＮＡは細胞質領域内で相同ＲＮＡを認識し、それらの分解を指示する。
【０００４】
３０ｎｔ以上の長さのｄｓＲＮＡは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）およびＲＮａｓｅ  Ｌを活性化する非特異的なインターフェロン（ＩＦＮ）反応を誘導する（Balachandranら, Immunity, 13: 129, 2000）。ＰＫＲおよびＲＮａｓｅ  Ｌ活性の誘導は、最終的には、特に哺乳類細胞において、非特異的なｍＲＮＡの分解を導き、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。しかし、ｓｉＲＮＡはインターフェロン経路を回避するには十分に短く、配列特異性をもって遺伝子のサイレンシングを指示する（Elbashirら, Nature, 411: 494, 2001）。ｓｉＲＮＡの作成は、長いｄｓＲＮＡ要素を部分的または全体的に抱えるトランスポゾン、導入遺伝子およびウイルスにより引き起こされる遺伝子の侵入から保護することを期待されている（Plasterk, Science, 296: 1263, 2002; Zamore, Science, 296: 1265, 2002; Hannon, Nature, 418: 244, 2002）。
【０００５】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ポリウイルス、等のごとき病原ＲＮＡウイルスの複製を阻害するｓｉＲＮＡを選択するための多くの試みが行われてきた（Novinaら, Nat Med, 8: 681, 2002; Wilsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 2783, 2003; Getlinら, Nature, 418: 430, 2002）。特に、ＨＣＶのセンス鎖ＲＮＡはアンチセンス鎖ＲＮＡの合成だけではなく、翻訳およびウイルス構築に関連することからＲＮＡｉの主な候補である。
【０００６】
ＨＣＶは外被ウイルスであり、フラビウイルス科に属する。ヌクレオチド配列の構成に基づいて、少なくとも６つの遺伝子型に分けられる。ＨＣＶゲノムは、単一の翻訳領域（ＯＲＦ）からなる〜９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡであり、５’および３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）が隣接する。このＯＲＦは約３０００ａａ長の単一長ポリタンパク質をコードし、翻訳と同時または翻訳後に少なくとも１０個のウイルスタンパク質：コア、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂに加工される（Bradley, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 1, 2000; ReedとRice, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 55, 2000）。ウイルス複製周期において、マイナス鎖ＲＮＡが非構造（ＮＳ）タンパク質からなる複製酵素複合体によってウイルスゲノムＲＮＡから新規に合成される（Kimら, J. Virol., 76: 6944, 2002）。この中間体マイナス鎖ＲＮＡは、単一ＯＲＦのポリタンパク質に翻訳されるか、または成熟ウイルス粒子のウイルス構造タンパク質でキャプシド形成される、ウイルスゲノムＲＮＡの増幅のための鋳型としての役割を果たす。
【０００７】
ＨＣＶ複製の分子および免疫学的な研究は利便的な動物モデルの不足によって妨げられ、インビトロ細胞培養系が利用されてきた。高力価のＨＣＶ患者の血清を用いると培養細胞で一次感染が生じるが、ＨＣＶ複製の詳細な研究のための効率的なウイルス増幅の条件は確立されていなかった。この障壁を回避するため、ヒト肝細胞腫系統Ｈｕｈ−７に感染後、高いレベルで自立的に複製する、選別可能なサブゲノムＲＮＡが開発された（Lohmannら, Science, 285: 110, 1999）。Ｃからｐ７またはＮＳ２までの構造領域を欠くサブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡのレプリコンは、ＨＣＶ  ＩＲＥＳの下流にネオマイシントランスフェラーゼ（ネオ）をコードする選別マーカー遺伝子を挿入することにより構築され、ＨＣＶ  ＮＳタンパク質の発現は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳにより制御された。ＨＣＶ複製を理解する上での著しい進歩が、このサブゲノムレプリコン系または適応性変異を抱えるこの遺伝学的改変クローンを用いることにより可能となった。
【０００８】
ＨＣＶ感染の代替的な治療の開発が早急に必要であることから、ＨＣＶレプリコン系は抗ウイルス剤としてのＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡを開発するために広く用いられている（Randallら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 235, 2003;  Kapadiaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2014,  2003;  Wilsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2783, 2003;  Yolotaら, EMBO Reports, 4: 602, 2003; Kronkeら, J. Virol, 78: 3436, 2004; Yukiら, 2004, Microbiol. Immunol., 48, 591）。
【０００９】
国際特許公開番号ＷＯ／０３／０７０７５０およびＷＯ２００５／０１２５２５、ならびに米国特許公開番号ＵＳ２００４／０２０９８３１は、ＨＣＶに対するｓｉＲＮＡについて記載する。しかし、これらのｓｉＲＮＡはＨＣＶゲノムの全領域に対してではない。選択されたｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果を調べるため、構造領域Ｃからｐ７までを含まないサブゲノムＨＣＶレプリコンＲＮＡが有用なスクリーンの道具として用いられている。しかしながら、ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの全領域に対して有効なｓｉＲＮＡを体系的に選択することが必要とされている。
【００１０】
本発明では、発明者らは、細胞に基づいたレプリコン系に全長ＨＣＶ  ＲＮＡを導入し、ウイルス複製および発現を阻害する効果を測定した。結果として、本発明者らは、特定の配列を有するｓｉＲＮＡが効果的にＨＣＶタンパク質の発現およびＲＮＡの合成を阻害できることを立証して本発明を完成させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクター、ならびに有効成分としてｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを含むＣ型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を解決するために、本発明は、配列番号１〜３６のヌクレオチド配列のうちの１つ、またはその相補物、またはその一部を含む核酸分子を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、有効成分としてｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを含む、Ｃ型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを患者に注入する段階を含むＨＣＶ感染に関連した病気の治療方法を提供する。
【００１６】
以下、本発明の詳細を記載する。
【００１７】
本発明は、配列番号１〜３６のヌクレオチド配列のうちの１つ、またはその相補物、またはその一部を含む単離された核酸分子を提供する。
【００１８】
好ましい具体例では、ｓｉＲＮＡは、２つの相補的な合成ＲＮＡのハイブリダイゼーション、または細胞におけるＲＮＡをコードするベクターの送達により得られる。ウイルス複製の有効な阻害に関して、ＨＣＶ全長ＲＮＡにおける断片の標的配列が配列番号１〜３６として選択された。
【００１９】
ｓｉＨＣＶ−５５：５’−ＣＵＡＣＵＧＵＣＵＵＣＡＣＧＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１）；
ｓｉＨＣＶ−７４：５’−ＡＧＣＧＵＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧＣＧＵＵ−３’（配列番号２）；
ｓｉＨＣＶ−２０７：５’−ＣＣＣＧＣＵＣＡＡＵＧＣＣＵＧＧＡＧＡ−３’（配列番号３）；
ｓｉＨＣＶ−５２３：５’−ＧＧＣＧＡＣＡＡＣＣＵＡＵＣＣＣＣＡＡ−３’（配列番号４）；
ｓｉＨＣＶ−７０４：５’−ＧＧＵＣＡＵＣＧＡＵＡＣＣＣＵＣＡＣＧ−３’（配列番号５）；
ｓｉＨＣＶ−８４５：５’−ＵＣＵＧＣＣＣＧＧＵＵＧＣＵＣＣＵＵＵ−３’（配列番号６）；
ｓｉＨＣＶ−９２９：５’−ＣＧＵＡＵＣＣＧＧＡＧＵＧＵＡＣＣＡＵ−３’（配列番号７）；
ｓｉＨＣＶ−９６８：５’−ＣＧＣＡＡＧＣＡＵＵＧＵＧＵＡＵＧＡＧ−３’（配列番号８）；
ｓｉＨＣＶ−１２６４：５’−ＵＡＵＡＵＣＣＣＧＧＣＣＡＣＧＵＧＡＣ−３’（配列番号９）；
ｓｉＨＣＶ−１６３１：５’−ＵＧＡＣＵＣＣＣＵＣＡＡＣＡＣＵＧＧＧ−３’（配列番号１０）；
ｓｉＨＣＶ−１９８０：５’−ＧＧＣＡＡＣＵＧＧＵＵＵＧＧＣＵＧＵＡ−３’（配列番号１１）；
ｓｉＨＣＶ−２４８６：５’−ＡＵＧＧＧＡＧＵＡＵＧＵＣＣＵＧＵＵＧ−３’（配列番号１２）；
ｓｉＨＣＶ−３０１３：５’−ＵＣＵＵＧＣＵＣＧＣＣＡＵＡＣＵＣＧＧ−３’（配列番号１３）；
ｓｉＨＣＶ−３０６１：５’−ＣＣＡＡＡＧＵＧＣＣＧＵＡＣＵＵＣＧＵ−３’（配列番号１４）；
ｓｉＨＣＶ−３１２２：５’−ＧＧＵＵＧＣＵＧＧＧＧＧＵＣＡＵＵＡＵ−３’（配列番号１５）；
ｓｉＨＣＶ−７２８４：５’−ＧＧＣＡＣＡＵＧＧＵＡＵＣＧＡＣＣＣＵ−３’（配列番号１６）；
ｓｉＨＣＶ−７７９６：５’−ＵＧＡＣＧＧＧＣＵＵＵＡＣＣＧＧＣＧＡ−３’（配列番号１７）；
ｓｉＨＣＶ−８３７３：５’−ＣＧＡＧＧＵＵＡＣＵＡＣＣＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１８）；
ｓｉＨＣＶ−８５０４：５’−ＣＡＧＧＣＡＧＣＧＵＧＧＵＣＡＵＵＧＵ−３’（配列番号１９）；
ｓｉＨＣＶ−８５４６：５’−ＡＧＣＣＧＧＣＣＡＵＣＡＵＵＣＣＣＧＡ−３’（配列番号２０）；
ｓｉＨＣＶ−８５７２：５’−ＧＵＣＣＵＵＵＡＣＣＧＧＧＡＧＵＵＣＧ−３’（配列番号２１）；
ｓｉＨＣＶ−８６７２：５’−ＵＣＧＧＧＵＵＧＣＵＧＣＡＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２２）；
ｓｉＨＣＶ−８７４９：５’−ＧＣＣＵＵＣＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＵＡ−３’（配列番号２３）；
ｓｉＨＣＶ−９１１７：５’−ＣＣＵＡＣＵＣＣＣＵＧＣＵＡＵＣＣＵＣ−３’（配列番号２４）；
ｓｉＨＣＶ−９６５０：５’−ＣＡＵＵＣＣＣＣＡＵＵＡＡＣＧＣＧＵＡ−３’（配列番号２５）；
ｓｉＨＣＶ−１０４６４：５’−ＧＡＧＧＡＣＧＧＵＵＧＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号２６）；
ｓｉＨＣＶ−１０４８６：５’−ＵＣＵＡＣＣＧＵＧＵＣＵＵＣＵＧＣＣＵ−３’（配列番号２７）；
ｓｉＨＣＶ−１０８８１：５’−ＧＡＡＧＧＵＣＡＣＣＵＵＵＧＡＣＡＧＡ−３’（配列番号２８）；
ｓｉＨＣＶ−１１０４８：５’−ＡＧＧＡＣＧＵＣＣＧＧＡＡＣＣＵＡＵＣ−３’（配列番号２９）；
ｓｉＨＣＶ−１１１９６：５’−ＧＣＣＡＧＣＵＣＧＣＣＵＵＡＵＣＧＵＡ−３’（配列番号３０）；
ｓｉＨＣＶ−１１４７６：５’−ＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＵＡＡＧＧＵ−３’（配列番号３１）；
ｓｉＨＣＶ−１１７９６：５’−ＡＣＣＡＧＡＡＵＡＣＧＡＣＵＵＧＧＡＧ−３’（配列番号３２）；
ｓｉＨＣＶ−１１９９６：５’−ＧＧＡＵＧＡＵＣＣＵＧＡＵＧＡＣＵＣＡ−３’（配列番号３３）；
ｓｉＨＣＶ−１２５０９：５’−ＣＧＧＧＧＡＧＣＵＡＡＡＣＡＣＵＣＣＡ−３’（配列番号３４）；
ｓｉＨＣＶ−１２５２０：５’−ＡＣＡＣＵＣＣＡＧＧＣＣＡＡＵＡＧＧＣ−３’（配列番号３５）；および
ｓｉＨＣＶ−１２６８０：５’−ＡＧＧＵＣＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＵＵＧＡ−３’（配列番号３６）。
【００２０】
合成ｓｉＲＮＡの安定性、またはウイルス標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡ断片間の特異的な相互作用を増加させるため、ｓｉＲＮＡの両鎖の３’末端は化学合成によってｄＴｄＴに伸長された。好ましい具体例では、合成ｓｉＲＮＡは、その生理的安定性を獲得し、かつ細胞内におけるその分布を追跡するために化学誘導体または標識分子で内部修飾されうる。
【００２１】
本発明はまた、各鎖ＲＮＡの３’末端がそれらの安定性のためにｄＴｄＴに伸長された合成ｓｉＲＮＡで誘導されるＲＮＡｉ活性を示す。合成ＲＮＡはレプリコン細胞系統で〜８０％まで遺伝子発現を効果的に阻害する。合成ｓｉＲＮＡまたはベクターのそれを必要とする患者への投与による、ＨＣＶに感染した肝炎ウイルスキャリアを治療するための新しい治療の試みであろう。
【００２２】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡ発現のための発現ベクターを提供する。
【００２３】
好ましい具体例では、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）が独立して単一のプロモーターから転写され、細胞のダイサーにより二本鎖ｓｉＲＮＡに加工されうる。代替的には、二本鎖ｓｉＲＮＡの各鎖は、２つの別々のプロモーターから反対または平行方向に発現され、ハイブリダイズし、次いで標的ＲＮＡの分解を誘導する。ｓｉＲＮＡを発現するベクターは転写開始のプロモーターだけではなくエンハンサー、転写終結シグナル、または他の発現調節配列を含む。ベクターは、裸のプラスミドＤＮＡ、移入剤もしくは標的送達物質との複合体、または組み換えウイルスベクターの形態として細胞核に送達されうる。ベクターの構成は、移入する細胞の状態もしくは型、ｓｉＲＮＡ発現の時期およびレベル、ならびにその他のごとき特定の状況により決定される。
【００２４】
本発明は、収束性逆方向プロモーターから転写されるｓｉＲＮＡを直接発現するベクターｐＲＮＡｉＤｕを提供する（図１を参照）。ベクターは、２つの収束性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１とＵ６）およびＥＧＦＰ−ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡの転写を誘導するＳＶ４０プロモーターを含む。特に、ｐＲＮＡｉＤｕベクターにおいて、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の融合遺伝子、ＥＧＦＰ−ＦｌｕｃがＳＶ４０プロモーターの下流に含まれる。実験的に、これは、移入効率を可視化し、定量的にモニターし、蛍光または発光の検出によってＲＮＡｉ活性を標準化するのに有用である（KaykasとMoon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zhengら, Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004）。
【００２５】
本発明者らは、発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを２００５年５月１６日付けで韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）の生命工学研究院生物支援センター（ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ  １０８００ＢＰ）。
【００２６】
合成ｓｉＲＮＡの安定性または標的ＲＮＡとｓｉＲＮＡ断片間の特異的な相互作用を高めるため、ｓｉＲＮＡ両鎖の３’末端は化学合成によってｄＴｄＴに伸長された。ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおいて、３’末端の２つのヌクレオチドＵＵは、ＲＮＡ転写の最終段階でポリメラーゼＩＩＩ終結配列から作成される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の効果は検出時間および移入したＤＮＡ濃度に依存し、タンパク質発現およびウイルスＲＮＡ転写のレベル各々の５０％および６０％未満の阻害を引き起こす。ｓｉＲＮＡベクターから発現される高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の量が、ＦＡＣＳ解析によると移入効率５０％を示すことから、選択したｓｉＲＮＡが劇的かつ特異的な抗ウイルス効果を誘導することが考えられうる。特に、５’リン酸化プライマーを用いたＰＣＲ増幅法によりベクターから分離したｓｉＲＮＡ発現カセットは、ＲＮＡｉ効果を誘導する必須要素である。
【００２７】
本発明はさらに、有効成分としてｓｉＲＮＡまたは発現ベクターを含むＣ型肝炎の治療または予防のための医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明は、Ｈｕｈ−７細胞系統で安定に維持される全長レプリコンＲＮＡ、ＦＫ／Ｒ２ＡＮを基にした、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子の知見に基づく。ウイルス特異的なｓｉＲＮＡはこの外因性ＲＮＡの分解を誘導し、最終的に、哺乳類細胞におけるウイルスタンパク質の発現およびウイルスの複製を阻害する。これは、ｓｉＲＮＡまたは発現ベクターが有効成分としてＣ型肝炎の治療組成物に含まれうることを示唆する。
【００２９】
本発明のｓｉＲＮＡは化学的または酵素的に合成されうる（Caruthersら, Methods in Enzymology, 211: 3, 1992;  Wicottら, Nucleic Acids Res, 23: 2677, 1995; Brennanら, Biotechnol Bioeng, 61: 33, 1998）。
【００３０】
本発明のｓｉＲＮＡまたはベクターは、リポソーム、ハイドロゲル、生体接着性微粒子およびこれらの類似物のごとき移入物質を用いることにより標的細胞に送達されうる（Akhtarら, Trends Cell Bio, 2: 139, 1992）。
【００３１】
医薬組成物は、ＨＣＶ感染を治療するための器官標的物質および医薬上許容されるキャリアとともに本発明のｓｉＲＮＡもしくはベクターを含む。医薬組成物の濃度は、投与経路、製剤の性質、肝臓不全の段階、患者の大きさ、重量、または分布範囲、ならびに患者の年齢と性別のごとき特定の状況により治療上決定されうる。
【００３２】
本発明の治療組成物は、組成物の総重量の０．０００１〜５０重量％の有効成分を含む。
【００３３】
本発明の組成物はさらに、活性成分と同一または類似の機能を有する１つまたはそれ以上の有効成分を含みうる。
【００３４】
本発明の組成物はまた、上記の有効成分に加えて、１つまたはそれ以上の投与用の医薬上許容されるキャリアを含みうる。医薬上許容されるキャリアは、生理食塩水、蒸留水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、ブドウ糖溶液、マルトブドウ糖溶液、グリセロール、エタノールおよびリポソームから成る群から選択される１つ以上の成分を混合することにより選択または製造されうる。抗酸化剤、緩衝水溶液、静菌剤などのごとき他の一般的な添加物が添加されうる。注射用溶液、ピル、カプセル、顆粒もしくはタブレット錠剤を製造するために、希釈剤、噴霧剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤がさらに添加されうる。本発明の組成物はさらに、各病気に適する形態に、あるいはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最新刊）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに表記される方法による成分によって調製されうる。
【００３５】
本発明の組成物は経口または非経口（例えば、静脈内、皮下内、局所または腹膜の注射）で投与されうる。組成物の有効な濃度は、重量、年齢、性別、健康状態、食事、投与の頻度、投与方法、排泄量および病気の重症度によって決定されうる。本発明の組成物の濃度は１日あたり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは１日あたり０．５〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与の頻度は１日１回または好ましくは１日数回である。
【００３６】
本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターがマウスに静脈内注射されることにより、毒性が調べられた。結果として、その推定されるＬＤ５０値がマウスにおいて１０００ｍｇ／ｋｇ以上であることから、安全な物質であると評価された。
【００３７】
本発明はまた、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを患者に注入する段階を含む、ＨＣＶ感染に関連する病気の治療方法を提供する。
【００３８】
本発明は、合成ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡをコードするベクターの治療上の適用ならびにウイルスキャリア中でＨＣＶ複製を阻害するｓｉＲＮＡを含む組み合わせ治療を示す。
【００３９】
（図面の説明）
本発明の好ましい具体例の適用は添付した図面を参照にすると最も良く理解される。
【００４０】
図１は、ｐＲＮＡｉＤｕプラスミドの模式図である。
【００４１】
図２は、ＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡ発現用に構築されたｓｉＲＮＡ発現カセットの模式図である。
【００４２】
図３は、全長ＨＣＶレプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮの模式図である。
【００４３】
図４および図５は、ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞におけるＨＣＶ複製に対するＲＮＡｉの効果を示す図である。図４は、ＨＣＶ全長レプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮの細胞が、陽性コントロール、ＨＣＶ特異的、またはＲｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡベクターを移入され、二重ルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。図５は、ＨＣＶ全長レプリコン細胞が、ＰＣＲ増幅法により作成されたｓｉＲＮＡ発現カセットを移入され、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。
【００４４】
図６は、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを移入された細胞におけるＨＣＶレプリコンＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。
【００４５】
図７および図８は、合成ｓｉＲＮＡによるＨＣＶレプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮのＲＮＡｉ効果を表す。図７は、ＨＣＶコアおよびβ−アクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を表す写真である。図８は、選択したｓｉＲＮＡ候補のＲＮＡｉ活性を確認するために、合成ｓｉＲＮＡで処理したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞において、レポータータンパク質の発現レベルを表すＲｌｕｃアッセイの結果を表す図である。
【００４６】
図９は、化学的に合成したｓｉＨＣＶ７２８４を送達したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞のウイルスＲＮＡレベルを表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明の実施および現在の好ましい具体例を以下の実施例で示されるように例示する。
【００４８】
しかし、この開示を考慮に入れた上で、当業者は本発明の精神と範囲内で修飾と改良をなし得ると考えられるだろう。
【００４９】
実施例１：ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ発現ベクター
哺乳類細胞において、これまでのｓｉＲＮＡベクターは、ポリ（Ａ）シグナル配列と一緒にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｕ６、Ｈ１、およびｔＲＮＡプロモーターなど）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写するように設計されていた（Brummelkampら, Cancer Cell, 2: 243, 2002; Tushcl, Nat. Biotechnol., 20: 446, 2002; Xiaら, Nat. Biotechnol., 20: 1006, 2002）。しかし、ｓｈＲＮＡベクターは複数の欠点を示す。それらの非天然型二次構造が細菌内でそれらを合成し、配列決定することを困難にしており、それらを作成するためのＤＮＡオリゴマーはハイスループットスクリーンの場合では費用がかかりうる。さらに、多様なｓｉＲＮＡライブラリーを構築するための付加配列を含まずに、プロモーターから終結シグナルまでを含むｓｉＲＮＡ発現カセットを作成することは容易ではない。ｓｈＲＮＡ発現ベクターのこれらの限定を回避するために、本発明者らはｓｉＲＮＡを直接発現するベクターを構築した。ｓｉＲＮＡは収束性逆方向プロモーターから転写され、それをｐＲＮＡｉＤｕと名付けた（図１）。
【００５０】
本発明者らは、発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを２００５年５月１６日付けで韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）の生命工学研究院生物支援センター（ＫＣＴＣ）に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ  １０８００ＢＰ）。
【００５１】
このベクターは２つの収束性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１とＵ６）およびＥＧＦＰ−ＦｌｕｃをコードするｍＲＮＡの転写を誘導するＳＶ４０プロモーターを含む。特に、ｐＲＮＡｉＤｕベクターにおいて、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）およびホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の融合遺伝子ＥＧＦＰ−ＦｌｕｃがＳＶ４０プロモーターの下流に含まれる。実験的には、これは、移入効率を可視化し、かつ定量的にモニターし、蛍光または発光の検出によってＲＮＡｉ活性を標準化することに有用である（KaykasとMoon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zhengら, Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004）。
【００５２】
ヒトＵ６とＨ１プロモーターの両方を改変することにより、−５から−１までの位置の５つのチミジンヌクレオチドのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列、ならびに−１２から−６までの位置のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれの各部位が含まれた。Ｕ６プロモーターが効率的に転写開始するためにはプリンヌクレオチドが好ましいことから、ｓｉＲＮＡの最初のヌクレオチド配列がピリミジンである場合には、グアニジンがＵ６プロモーターの＋１位置下流に挿入される。この付加ヌクレオチドで誘導される人為的な効果を最小限にし、ＲＮＡｉ工程におけるアンチセンスｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡ間の逐次的なハイブリダイゼーションを確保するために、Ｕ６プロモーターがアンチセンスＲＮＡの転写を担い、該アンチセンスＲＮＡがＲＩＳＣに指図して相同なｍＲＮＡが切断されることを考え出した。ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを作出するために、３６塩基対のオリゴヌクレオチドがアニールされ、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＲＮＡｉＤｕに結合された（図２）。図２において、ｓｉＲＮＡ転写の開始部位を矢印で示す。
【００５３】
Ｕ６とＨ１プロモーターからのｓｉＲＮＡ発現カセットの単離をＰＣＲ増幅法により行った。Ｕ６順方向プライマー（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣ−３’：配列番号３７）およびＨ１順方向プライマー（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣ−３’：配列番号３８）の両方を、リン酸で各オリゴヌクレオチド５’末端を修飾することにより調製した。各々のｓｉＲＮＡ発現カセットをＨＣＶ特異的、陰性コントロール、または陽性コントロールｓｉＲＮＡ配列を含む対応ｐＲＮＡｉＤｕプラスミドから増幅した。全てのＰＣＲ反応を以下の通りに行った：９４℃で４５秒、５０℃で１分および７２℃で１分を３０サイクル。ＰＣＲ産物をキアクイック（Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、米国）を用いて精製し、それらの濃度をＵＶ−分光光度計で定量的に測定した。
【００５４】
実施例２：ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡによるＦＫ／Ｒ２ＡＮレプリコンのタンパク質発現の阻害
Ｈｕｈ−７細胞系統および遺伝子型１ｂのＨＣＶ全長レプリコンＲＮＡを安定的に支持するそのレプリコン細胞系統（Ｈｕｈ−７ＦＫ／Ｒ２ＡＮ）をＳ．Ｋ．Ｊａｎｇ博士（ＰａｎＢｉｏＮｅｔ、韓国）からいただいた。ＦＫ／Ｒ２ＡＮレプリコンは、Ｒｌｕｃとネオコード領域間に口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのシグナル配列挿入を有する、ＨＣＶ全長レプリコンＲＮＡ、ＦＫ／ＲＮからの改変型（韓国特許公開番号２００４−３２３４１）である。ＨＣＶレプリコンを有する細胞系統を１０％ＦＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、米国）および６００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）を含むＤＭＥＭ中で培養し、全実験に使用した。
【００５５】
ｓｉＲＮＡ発現プラスミドもしくはＰＣＲ産物のＤＮＡまたは合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの移入を、製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）を用いて１２−ウェルプレートで行った。簡単に説明すると、１．５×１０５のＨｕｎ−７  ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞をプレートに播き、翌日、０．６ｍｇのｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡまたは８０ｎＭのｓｉＲＮＡ二本鎖を送達した。レポータータンパク質としてレプリコンＲＮＡから発現されるウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）活性を、移入したＤＮＡベクターから発現されるホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）活性を用いて調整し、あるいはＰＣＲ産物または合成ｓｉＲＮＡを移入する場合には総タンパク質量によって補正して移入効率を標準化した。
【００５６】
レプリコン細胞中の全細胞タンパク質を移入後３日間培養し、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国）またはウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ、米国）を用いて定量してＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果を間接的にモニターした。
【００５７】
細胞質中のＨＣＶ複製におけるｓｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉ効果を測定するために、本発明者らはＨＣＶ全長ＨＣＶレプリコン系を利用した。このＨＣＶレプリコンＲＮＡ、ＦＫ／Ｒ２ＡＮにおいて、ＲｌｕｃとネオのｍＲＮＡ配列をＨＣＶのＮＳ２とＮＳ３翻訳領域の間に導入し、ポリオウイルスＩＲＥＳの制御下でタンパク質を発現させた。この融合タンパク質は、Ｒｌｕｃとネオ翻訳領域間の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼのシグナル配列の切断によって分離したタンパク質として加工されることになる。これは、安定的にレプリコンＲＮＡおよびその発現を維持する細胞の選択を可能にし、また細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をモニターすることによる複製レベルの正確な定量を可能にする（図３）。Ｈ−Ｉ、ＨＣＶの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；コア−ＮＳ２、コアからＮＳ２までのＨＣＶ翻訳領域；Ｐ−Ｉ、ポリオウイルスのＩＲＥＳ；Ｒｌｕｃ、ウミシイタルシフェラーゼ遺伝子；２Ａ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａプロテアーゼ切断部位；ネオ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；Ｅ−Ｉ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳ；ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ、ＮＳ３からＮＳ５ＢまでのＨＣＶ翻訳領域；３’ＵＴＲ、ＨＣＶの３’非翻訳領域。
【００５８】
有効な抗ウイルス効果を有するＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡの選択のため、本発明者らは、３６個のＨＣＶのｓｉＲＮＡ候補、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクター（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国）から単離された１個の陰性コントロールＲＮＡ、あるいは本発明者らの研究室で３個の候補から実験的に活性のある配列としてスクリーンしたＲｌｕｃ特異的なｓｉＲＮＡを設計した。
【００５９】
これら３８個のｓｉＲＮＡ、すなわち、陰性コントロールに対して１個で、その他はＨＣＶレプリコンＲＮＡに相当するもののサイレンシング効果をモニターするため、本発明者らは、ｓｉＲＮＡが収束性の逆方向のヒトＵ６とＨ１プロモーターから転写されるｓｉＲＮＡ発現プラスミドを調製し、ＰＣＲ増幅法によってｓｉＲＮＡ発現カセットも作出した。各ＤＮＡとも、別個独立にＦＫ／Ｒ２ＡＮレプリコン細胞に移入し、レプリコンＲＮＡに対する２つの異なるｓｉＲＮＡ発現系によって影響される複製レベルを、Ｒｌｕｃ活性を測定することにより比較した（図４および図５）。
【００６０】
図４および図５は、ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞におけるＨＣＶ複製に対するＲＮＡｉの効果を示す図である。ＨＣＶ全長レプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮの細胞に、陽性コントロール、ＨＣＶ特異的、またはＲｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡベクターを移入した。移入３日後に内部ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定し、二重ルシフェラーゼアッセイによって移入したＤＮＡベクターから指示されるホタルルシフェラーゼ活性で標準化した。ＨＣＶ全長レプリコン細胞に、ＰＣＲ増幅法で作成したｓｉＲＮＡ発現カセットを移入した。ｓｉＲＮＡ陰性コントロールの割合として、すなわち平均±標準偏差として値を示す。レプリコンＲＮＡにおけるｓｉＲＮＡ標的の遺伝子位置を模式的に表した。少なくとも３つの別個独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００６１】
図４および図５に示すように、ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞へのプラスミドの移入から生じたこのレポーター遺伝子発現の阻害解析結果は、ＲＮＡｉ効果を指示する遺伝学的に必須な要素を含む同等量のＰＣＲ産物の移入から生じたものと厳密に適合する。テストした３８個の誘因因子のうち、ｓｉＨＣＶ−５２３、１６３１、７２８４、８３７３、８５０４、８７９４、１１０４８、１１９９６、および１２５０９のｓｉＲＮＡが共通して最も高い効果を示した。特に、ベクターに基づいた系において、最も高い能力のＨＣＶｓｉＲＮＡはタンパク質発現を〜３５−５０％減少させた（図４）。これらのプラスミドＤＮＡのリポフェクタミン  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロゲン、米国）を用いたＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞への移入効率がＦＡＣＳ解析によると約５０％に達することを考慮に入れると、これらの抑制レベルは、細胞質に分布するウイルスＲＮＡがｓｉＲＮＡにより誘導されるサイレンシング経路によってすべて根絶されうることを示す。
【００６２】
ベクターに基づいたｓｉＲＮＡは、ＰＣＲ産物に基づいたｓｉＲＮＡが阻害するより高い能力でＨＣＶレプリコンの発現を阻害した（図５）。これは、ＰＣＲ産物の直鎖状ＤＮＡと比較して環状ＤＮＡの高い移入効率および細胞生存率の上昇によって引き起こされるのかもしれない。ＰＣＲ産物と比較したＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡ発現ベクターによるレプリコンの阻害レベルは：ｓｉＨＣＶ−５２３では３５％であるのに対して３３％；ｓｉＨＣＶ−１６３１では１８％であるのに対して４２％；ｓｉＨＣＶ−７２８４では４４％であるのに対して５１％；ｓｉＨＣＶ−８３７３では２６％であるのに対して４８％；ｓｉＨＣＶ−８５０４では３４％であるのに対して４９％；ｓｉＨＣＶ−８７４９では３６％であるのに対して３９％；ｓｉＨＣＶ−１１０４８では１７％であるのに対して４４％；ｓｉＨＣＶ−１１９９６では２３％であるのに対して３６％；ｓｉＨＣＶ−１２５０９では１８％であるのに対して３６％；およびｓｉＲｌｕｃでは６７％であるのに対して６６％であった。ｓｉＲＮＡ発現ベクターのクローンを、代替的なアプローチによる遺伝子サイレンシング効果のさらなる研究に用いた。
【００６３】
本発明において、本発明者らは、ＨＣＶの５’ＵＴＲ特異的なｓｉＲＮＡを含む３つの異なるプラスミドを調製した。この領域がｓｉＲＮＡ治療の発展に最も望ましい領域であると考えられていたためである。しかし、本発明者らは、これらのｓｉＲＮＡによるＨＣＶゲノムレプリコンの有意な抑制を観察できなかった。それは、この二次構造があまりに安定であるため、ＲＩＳＣに取り込まれたｓｉＲＮＡが、ワトソン−クリック塩基対の巻き戻しと置換によって標的領域に近づけないか、あるいは細胞またはウイルスのタンパク質がこの領域を一緒に阻害してウイルス遺伝子の発現およびキャプシド形成を調節し、ｓｉＲＮＡの標的に望ましくないことを起こすからだと予想されうる。
【００６４】
実施例３：ベクター媒介ＨＣＶ  ｓｉＲＮＡによるウイルス転写の減少
合計ＲＮＡを、陰性コントロールまたはＨＣＶレプリコン特異的ｓｉＲＭＡ発現ベクターを移入したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞から、移入後２日目に、製造業者の説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロゲン、米国）を用いて抽出した。単離した合計ＲＮＡをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ、米国）で消化した。最終的に、ＲＮＡの絶対量を、ＵＶ−分光光度計を用いて２６０ｎｍ／２８０ｎｍのＵＶ吸光度を測定することにより定量した。
【００６５】
インビトロ抗ウイルス活性を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ５７００；アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を用いて測定した。移入した細胞から単離した５００ｎｇの合計ＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）を用いて５０μｌの反応体積中でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。標準ＲＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる５’ＵＴＲ  ＲＮＡのインビトロ転写により調製した。ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ領域に特異的なプライマーおよびプローブ配列は、５’−ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＡ−３’（順方向プライマー；配列番号３９）、５’−ＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＧＡＡＡ−３’（逆方向プライマー；配列番号４０）および５’−（蛍光）ＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣＣＧ（ＴＡＭＲＡ）−３’（プローブ；配列番号４１）を含む。合計ＲＮＡ量を、同時に内部コントロールとしてヒトアクチン遺伝子を標的とするリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことにより精密に調節した。アクチン遺伝子に対するプライマーおよびプローブ配列は、５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’（順方向プライマー；配列番号４２）、５’−ＴＣＴＣＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＡＴ−３’（逆方向プライマー；配列番号４３）および５−（蛍光）ＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＡ（ＴＡＭＲＡ）−３’（プローブ；配列番号４４）を含む。全ての実験を３回ずつ行った。
【００６６】
選択したｓｉＲＮＡ発現ベクターを移入したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞中のＨＣＶのＲＮＡレベルを正確に定量するために、本発明者らは、ＨＣＶ  ５’ＵＴＲおよびアクチン遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った（図６）。
【００６７】
図６は、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを移入した細胞におけるＨＣＶレプリコンＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を表す図である。ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞に、１２ウェルプレートにおいて、陰性コントロール、ＨＣＶ特異的、またはＲｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを発現する６００ｎｇのｐＲＮＡｉＤｕプラスミドを送達した。定量解析のために、ＨＣＶ  ＲＮＡ値をアクチンＲＮＡの値で標準化した。合計ＲＮＡのマイクログラムあたりのＨＣＶ  ＲＮＡコピー数を測定した。少なくとも３つの独立した実験から得た代表的なデータ（平均±標準偏差）を示す。
【００６８】
図６に示されるように、定量解析は、ＨＣＶ転写レベルが、移入後２日にｓｉＨＣＶ−８７４９または１１９９６を移入した細胞で６２％に、およびｓｉＨＣＶ−５２３を移入した細胞で４７％にそれぞれ減少したことを明らかにした。同様の阻害解析結果を、ＰＣＲ産物に基づいたｓｉＲＮＡカセットを用いた移入実験においてＲＮＡレベルを測定することにより得た。これらの結果は、タンパク質レベルで最も高い阻害効果を示す選択ＨＣＶ  ｓｉＲＮＡが、ウイルスＲＮＡの分解を誘導することによりレプリコンＲＮＡレベルをも著しく減少させることを示す。予想外なことに、ｓｉＨＣＶ−７２８４クローンはウイルスＲＮＡレベルの有意な減少を示さなかった。本発明者らは、ｓｉＲＮＡ発現ベクターから生成される各ｓｉＲＮＡ量が種々の時間で一定ではなく、細胞における転写効率と生理的な安定性によって影響されうると推測する。
【００６９】
実施例４：合成ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果の検出
本発明者らは、合成センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡを調製し、それらをアニールさせてコントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＨＣＶ−７２８４およびｓｉＨＣＶ−８７４９各々に相当する二本鎖ＲＮＡにした。それらのヌクレオチド配列は以下の通りである：コントロールｓｉＲＮＡのセンス鎖、５’−ＡＣＵＡＣＣＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＧＵＧＴＴ−３’（配列番号４５）；コントロールｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、５’−ＣＡＣＣＵＡＵＡＡＣＡＡＣＧＧＵＡＧＵＴＴ−３’（配列番号４６）；ｓｉＨＣＶ−７２８４のセンス鎖、５’−ＧＧＣＡＣＡＵＧＧＵＡＵＣＧＡＣＣＣＵＴＴ−３’（配列番号４７）；ｓｉＨＣＶ−７２８４のアンチセンス鎖、５’−ＡＧＧＧＵＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵＧＣＣＴＴ−３’（配列番号４８）；ｓｉＨＣＶ−８７４９のセンス鎖、５’−ＧＣＣＵＵＣＵＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＵＡＴＴ−３’（配列番号４９）；ｓｉＨＣＶ−８７４９のアンチセンス鎖、５’−ＵＡＵＵＣＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＣＴＴ−３’（配列番号５０）。ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞を同等濃度の８０ｎＭ  ｓｉＲＮＡで処理し、２日目にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ転写レベルの定量および移入後３日目にルシフェラーゼ活性アッセイまたはウェスタンブロットアッセイによるレプリコンタンパク質レベルの測定のために回収した。全ての移入濃度をコントロールｓｉＲＮＡで８０ｎＭの最終濃度にした。全ての実験を少なくとも３回ずつ実施した（図７および図８）。
【００７０】
図７および図８は、合成ｓｉＲＮＡによるＨＣＶレプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮのＲＮＡｉの効果を示す。図８は、ＨＣＶコアおよびアクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示す写真の１組である。合成ｓｉＲＮＡで処理したＦＫ／Ｒ２ＡＮからの細胞溶解物の合計タンパク質３０ｍｇにウェスタンブロット解析を行った。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国）に移行させた。ブロット物をＨＣＶコアおよびアクチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国）に特異的なモノクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）、米国）で検出し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス抗体（ＫＰＬ、米国）と反応させた。ブロット物をＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ基質（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）で発色させた。合成ｓｉＲＮＡを各々、ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞に移入し、ＨＣＶコアタンパク質レベルを移入後３日目のウェスタンブロット解析により視覚化した（上）。アクチンの発現レベルもまた調べた（下）。タンパク質溶解物をＳＤＳ／１５％ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。親のＨｕｈ−７細胞（列１）およびレプリコン細胞であるＦＫ／Ｒ２ＡＮ（列２）からのサンプルを示す。８０ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡ（列３）あるいは１０ｎＭ（列４）、２０ｎＭ（列５）、４０ｎＭ（列６）または８０ｎＭ（列７）のｓｉＨＣＶ−７２８４を移入したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞を解析した。最終的な濃度をコントロールｓｉＲＮＡ（列４−６）で８０ｎＭにした。
【００７１】
ゲノム全域のｓｉＲＮＡ候補から選択したＨＣＶ  ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を確認するために、本発明者らは、合成ｓｉＲＮＡを送達したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞におけるレポータータンパク質発現のレベルをＲｌｕｃアッセイによって調べた。コントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＨＣＶ−７２８４およびｓｉＨＣＶ−８７４９に相当する化学的に合成されたｓｉＲＮＡの３’突出をＵＵの代わりにｄＴｄＴにすることでそれらの安定性を確保した。
【００７２】
図８に示されるように、合成ｓｉＲＮＡもまた、濃度依存的な形でＨＣＶレプリコンを阻害した。コントロールｓｉＲＮＡの移入によるウミシイタケルシフェラーゼレベルを１００％とすると、ｓｉＨＣＶ−７２８４による遺伝子発現の阻害効果は７５％であった。それは、ｓｉＲＮＡのサイレンシング活性が、ベクターまたはＰＣＲ産物に基づくｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡよりも合成ｓｉＲＮＡを用いることによって、より急激に飽和したことを示す。
【００７３】
以前、ｓｉＨＣＶ−７２８４  ｓｉＲＮＡを発現するｐＲＮＡｉＤｕが、ウイルスＲＮＡ転写レベルではなくウイルスタンパク質レベルを減少させることにより、有意なＲＮＡｉ効果を示すことが観察された。本発明者らは、このｓｉＲＮＡ量が検出限界点における飽和した遺伝子サイレンシング効果を誘導するのに十分に発現されていないと推測した。この推測を試すために、本発明者らは、同一の移入条件下で細胞質への同様のｓｉＲＮＡ送達効率を発揮する合成ｓｉＲＮＡの移入によりレプリコンＲＮＡレベルを測定し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてそれらのＲＮＡｉ効果を比較した（図９）。
【００７４】
８０ｎＭの化学的に合成された陰性コントロールｓｉＲＮＡあるいは１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭまたは８０ｎＭのｓｉＨＣＶ−７２８４を送達したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞のウイルスＲＮＡレベルを定量的に解析した。最終濃度をコントロールｓｉＲＮＡで８０ｎＭにした。ＨＣＶ  ＲＮＡの値をアクチンＲＮＡの値で標準化した。合計ＲＮＡのマイクログラムあたりのＨＣＶ  ＲＮＡコピー数を測定した。誤差のバーは３つの独立した実験の平均の標準偏差を示す。
【００７５】
図９に示されるように、ｓｉＨＣＶ−７２８４もまた、ｓｉＨＣＶ−８７４９と同様に濃度依存的な形でレプリコンＲＮＡレベルを大幅に減少させた。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
これまで説明したように、本発明は、ＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクター、ならびに有効成分としてｓｉＲＮＡまたは発現ベクターを含むＣ型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供する。合成ｓｉＲＮＡまたは本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡ分子の投与は、ＨＣＶ遺伝子発現および複製の阻害を起こした。それゆえ、本発明のｓｉＲＮＡおよびＤＮＡベクターは、Ｃ型肝炎ウイルス慢性キャリアの治療に効果的に使用され得る。
【００７７】
（配列表の説明）
配列番号１−３６に示される配列は、ＨＣＶ全長ＲＮＡの標的ヌクレオチド配列であり、
配列番号３７および３８に示される配列は各々、Ｕ６順方向プライマーおよびＨ１順方向プライマーであり、
配列番号３９−４１に示される配列は、ＨＣＶ５’ＵＴＲ特異的なプライマーおよびプローブ配列であり、
配列番号４２−４４に示される配列は、β−アクチン遺伝子のプライマーおよびプローブ配列であり、
配列番号４５−５０に示される配列は、コントロールｓｉＲＮＡのｓｉＨＣＶ−７２８４およびｓｉＨＣＶ−８７４９各々に相当する合成センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列である。
【００７８】
当業者は、前記に開示される概念および特定の具体例が、本発明と同一の目的を達成するための他の具体例を改良または設計する基礎として容易に利用されうることを理解するであろう。当業者はまた、かかる同等の具体例が添付の請求項を説明すると同時に本発明の精神および範囲から切り離せないことを理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ｐＲＮＡｉＤｕプラスミドの模式図である。
【図２】図２は、ＨＣＶ特異的なｓｉＲＮＡ発現用に構築されたｓｉＲＮＡ発現カセットの模式図である。
【図３】図３は、全長ＨＣＶレプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮの模式図である。
【図４】図４および図５は、ＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞におけるＨＣＶ複製のＲＮＡｉ効果を示す図である。図４は、ＨＣＶ全長レプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮの細胞が、陽性コントロール、ＨＣＶ特異的、またはＲｌｕｃ  ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡベクターを移入され、二重ルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。
【図５】図５は、ＨＣＶ全長レプリコン細胞が、ＰＣＲ増幅法により作成されたｓｉＲＮＡ発現カセットを移入され、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを移入された細胞におけるＨＣＶレプリコンＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。
【図７】図７および図８は、合成ｓｉＲＮＡによるＨＣＶレプリコン、ＦＫ／Ｒ２ＡＮのＲＮＡｉ効果を表す。図７は、ＨＣＶコアおよびβ−アクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を表す写真である。
【図８】図８は、選択したｓｉＲＮＡ候補のＲＮＡｉ活性を確認するために、合成ｓｉＲＮＡで処理したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞において、レポータータンパク質の発現レベルを表すＲｌｕｃアッセイの結果を表す図である。
【図９】図９は、化学的に合成したｓｉＨＣＶ７２８４を送達したＦＫ／Ｒ２ＡＮ細胞のウイルスＲＮＡレベルを表す図である。
【図１】
2008541754.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月18日(2008.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008541754000001.app
【国際調査報告】
2008541754.tif 000031
2008541754.tif 000032
2008541754.tif 000033
2008541754.tif 000034