(57)【要約】改変ＨＣＶ多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）が記述される。このタンパク質は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼによるＭＥＦＡのタンパク分解性切断が阻害されるようにするための改変配列を含む。改変ＭＥＦＡを含むＨＣＶイムノアッセイも記述される。このＭＥＦＡは、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＨＣＶヘリカーゼドメインからの少なくとも１つのエピトープ及びＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＮＳ４領域からの少なくとも１つのエピトープを含み、これらのＨＣＶ  ＮＳ３のタンパク分解性切断部位は、変異のない対応するＭＥＦＡのタンパク分解性切断と比較してＮＳ３による改変ＭＥＦＡのタンパク分解性切断が阻害されるように変異されている。さらに、この改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する。
2008515391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）であって、該ＭＥＦＡは、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＨＣＶヘリカーゼドメインからの少なくとも１つのエピトープ及びＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＮＳ４領域からの少なくとも１つのエピトープを含み、該ヘリカーゼドメインエピトープ及び該ＮＳ４エピトープ中に存在する該ＨＣＶ  ＮＳ３のタンパク分解性切断部位は、ＮＳ３による改変ＭＥＦＡのタンパク分解性切断が該変異を欠く対応するＭＥＦＡのタンパク分解性切断と比較して阻害されるように変異されており、さらに、該改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、改変ＭＥＦＡ。
【請求項２】
前記切断部位への前記変異が、該部位のそれぞれにおける少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項３】
前記ＨＣＶヘリカーゼドメインからの前記エピトープが、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１４２８位、１４２９位、１４５５位及び１４５６位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項２に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項４】
ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１６５７位及び１６５８位に見出される、天然のアミノ酸のＮＳ３／４ａ接合部における置換をさらに含む、請求項３に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項５】
前記ＮＳ４領域からの前記エピトープが、５−１−１であり、且つ、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１７１１位及び１７１２位に見出される、天然のアミノ酸の置換を含む、請求項４に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項６】
前記ＭＥＦＡが、ＨＣＶ株１、２及び３それぞれからの３つの５−１−１エピトープを含み、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた、該５−１−１エピトープのそれぞれにおける１７１１位及び１７１２位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれが置換されている、請求項５に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項７】
前記ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１の配列に対して番号付けされた１４２８位、１４２９位、１４５５位、１４５６位、１６５７位及び１６５８位に見出される天然のアミノ酸の置換を有する、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１１９３位〜１６５８位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、該ＭＥＦＡは、ＨＣＶ株１、２及び３それぞれからの３つの５−１−１エピトープをさらに含み、該５−１−１エピトープのそれぞれが、ＨＣＶ−１の配列に対して番号付けされた１７１１位及び１７１２位に見出される天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１６８９位〜１７３５位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項８】
前記ＭＥＦＡが、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但し、配列番号４の４６６位、４６７位、４９３位、４９４位、６９５位、６９６位、７２１位、７２２位、７７０位、７７１位、８１９位及び８２０位にある前記アミノ酸が、該ＭＥＦＡのＮＳ３によるタンパク分解性切断を阻害する前記変異を維持する、請求項７に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項９】
前記ＭＥＦＡが、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項１０】
前記ＭＥＦＡが、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項１１】
前記ＭＥＦＡが、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項１２】
前記ＭＥＦＡが、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の改変ＭＥＦＡ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の改変ＭＥＦＡを含むイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１４】
少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープをさらに含み、該ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１５】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１６】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１７】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１８】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１９】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項２０】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、
（ａ）請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）ＨＣＶ抗体が該生物学的サンプル中に存在する場合、該抗体を前記ＭＥＦＡと、前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが存在する場合には該ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープとに結合させて、第１の免疫複合体を形成させる条件下で、該生物学的サンプルを該固体支持体と結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下で、工程（ｂ）からの該固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、該標識化抗体が該免疫複合体と反応性である、工程；
（ｄ）該検出可能に標識された抗体と該第１の免疫複合体との間で形成される第２の免疫複合体が存在する場合、該第２の免疫複合体を、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染の指標として検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体、及び免疫診断検査を実施するための説明書、を含む免疫診断検査キット。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の改変ＭＥＦＡに対するコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２３】
（ａ）請求項２２に記載のポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記コード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るように、該ポリヌクレオチドと作動可能に連結されている制御エレメント；
を含む組換えベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞の集団を提供する工程；及び
（ｂ）前記組換えベクター中に存在する前記コード配列によってコードされている前記多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、前記細胞の集団を培養する工程；
を包含する組換えＭＥＦＡの製造方法。
【請求項２６】
（ａ）固体支持体を提供する工程；及び
（ｂ）前記固体支持体に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの改変ＭＥＦＡを結合させる工程；
を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法。
【請求項２７】
ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープを前記固体支持体の別々の位置へと結合させる工程をさらに包含し、該高次構造エピトープが、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列からなる、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）（１）に基づき、米国仮特許出願第６０／６２１，７９０号（２００４年１０月２５日出願）；同第６０／６２１，５０２号（２００４年１０月２２日出願）；同第６０／６１８，３９０号（２００４年１０月１２日出願）；および同第６０／６０４，８５８号（２００４年８月２７日出願）の優先権を主張する。上記出願の全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構築物及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ＮＳ３によるＭＥＦＡのタンパク分解性切断を阻害するための改変アミノ酸配列を有する、複数のＨＣＶエピトープを含む免疫原性ＨＣＶ多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）に関する。このタンパク質は、ＨＣＶ感染を診断するためのイムノアッセイにおいて有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＨＣＶは、約３０１０個のアミノ酸をコードする約９．５ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである（非特許文献１；非特許文献２）。ＨＣＶポリタンパク質は宿主及びウイルスのプロテアーゼによりプロセシングされて、いくつかの成熟タンパク質：コア（ｃｏｒｅ）タンパク質（Ｃ）、エンベロープ糖タンパク質（Ｅ１及びＥ２）、及び６つの非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ）（非特許文献３；非特許文献４）となる。ＮＳ３は３つの酵素活性を有する６３０アミノ酸のタンパク質である：Ｎ−末端の約１８０アミノ酸はセリンプロテアーゼ機能を提供し、残るＣ末端ドメインはヘリカーゼ及びＮＴＰａｓｅ活性の両方を有する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。ＮＳ３プロテアーゼはＮＳ３／４ａ、ＮＳ４ａ／４ｂ、ＮＳ４ｂ／５ａ及びＮＳ５ａ／５ｂ接合部位における切断に関与する（非特許文献８）。ＮＳ４ａは約５４アミノ酸を含み、ＮＳ３プロテアーゼの補因子として作用し、ポリタンパク質のプロセシングに不可欠である（非特許文献９）。
【０００４】
ＨＣＶは輸血及び地域感染型の非Ａ非Ｂ型ウイルス性肝炎に関連する主要な病原因子である（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。ＨＣＶは現在、世界人口の約３％に発症している。これらの者の７０％がＨＣＶ慢性感染症を患い、それはしばしば肝硬変及び肝細胞癌へと進行する（非特許文献１３；非特許文献１４）。輸血後のＨＣＶの出現率は、血液ドナーの中でのＨＣＶ抗体に関する慣用的なスクリーニングの実施以来、徐々に減少してきている（非特許文献１５）。血液スクリーニングのための、及び、症状のある患者におけるＨＣＶ感染の診断のための、これらのアッセイの実績ある実用性にもかかわらず、アッセイ性能の向上へむけた重要な挑戦が残っている。そのような挑戦には、血清反応陰性の時期の短縮、免疫抑制患者からのＨＣＶサンプルの検出の改善、及び、異なるＨＣＶ遺伝子型特異的なエピトープに対する抗体を検出するアッセイ感度の向上を含む。
【０００５】
ＨＣＶ感染の血清診断のためのいくつかのアッセイが開発されている。例えば、非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，特許文献１；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，特許文献２；及びＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら，特許文献３参照。
【０００６】
現在認可されているＨＣＶ  ＥＬＩＳＡ抗体試験は、主に線状エピトープを含有する組換えタンパク質を用いる。例えば、コア（Ｃ２２−３）、ＮＳ３及びＮＳ４領域（Ｃ２００）及びＮＳ５からの３つの組換えＨＣＶタンパク質が、市販のＨＣＶアッセイのひとつにおいて使用されている（非特許文献２０）。本明細書中でその全体が参考として援用される特許文献４は、多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）と組み合わせたＮＳ３／４ａ高次構造エピトープを用いたイムノアッセイを記載している。ＨＣＶ  ＭＥＦＡの記載については、例えば、非特許文献２１；特許文献２；特許文献４；特許文献５；特許文献６；及び特許文献７参照。これらの試薬を用いたアッセイは、初期のＨＣＶセロコンバージョンを検出するための感度及び信頼できる方法を提供する。酵母において発現され、特許文献４に記載される非変性条件下で精製されるＮＳ３／４ａは、プロテアーゼ機能及びヘリカーゼ機能の両方を含む。この方法で精製されたＮＳ３／４ａは天然の高次構造を保存しているため、初期セロコンバージョン抗体検出においてｃ２００又はｃ３３ｃ抗原よりも感度が高いことが見出されている。抗原としてＮＳ３／４ａ及びＭＥＦＡ７．１を用いる抗体アッセイにおいて、セロコンバージョン抗体は現在認可されているＨＣＶアッセイよりも２〜１４日間早く検出される。しかしながら、ＮＳ３／４タンパク質はＮＳ３プロテアーゼ活性によって自己加水分解を受け、また、ＭＥＦＡ７．１を切断する。
【０００７】
特許文献８及び特許文献９、及び同所有者の仮特許出願第６０／６０４，８５８号は、タンパク質分解活性の低減を伴う変異されたＮＳ３プロテアーゼドメインを含むＨＣＶタンパク質を記載する。しかしながら、十分な患者のケアを提供するため、並びに血液及び血液製剤又は親密な個人的接触によるＨＣＶの感染を予防するための、高感度で正確な診断的及び予測的なツールへの需要が未だに残っている。
【特許文献１】国際公開第９４／０１７７８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／４４４６９号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，８７１，９０４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６３２，６０１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，５１４，７３１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，４２８，７９２号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００４０１４２３２１号明細書
【特許文献８】国際公開第０４／００５４７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／３８３６０号パンフレット
【非特許文献１】Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９１年，第８８巻，ｐ．２４５１−２４５５
【非特許文献２】Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１年，第６５巻，ｐ．１１０５−１１１３
【非特許文献３】ＨｉｊｉｋａｔａらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３年，第９０巻，ｐ．１０７７３−１０７７７
【非特許文献４】Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，１９９３年，第６７巻，ｐ．１３８５−１３９５
【非特許文献５】Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，１９９３年，第６７巻，ｐ．３８３５−３８４４
【非特許文献６】Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９５年，第２１５巻，ｐ．１６０−１６６
【非特許文献７】Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６年，第２７１巻，ｐ．２４４４９−２４４５７
【非特許文献８】Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９３年，第６７巻，ｐ．２８３２−２８４３
【非特許文献９】Ｆａｉｌｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４年，第６８巻，ｐ．３７５３−３７６０
【非特許文献１０】Ａｌｔｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８９年，第３２１巻，ｐ．１４９４−１５００
【非特許文献１１】Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４４巻，ｐ．３５９−３６２
【非特許文献１２】Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４４巻，ｐ．３６２−３６４
【非特許文献１３】Ｂｒｕｉｘら，Ｌａｎｃｅｔ，１９８９年，第２巻，ｐ．１００４−１００６
【非特許文献１４】Ｓａｉｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．６５４７−６５４９
【非特許文献１５】Ｐｉｌｌｏｎｅｌら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００２年，第４２巻，ｐ．９８０−９８８
【非特許文献１６】Ｃｈｏｏら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１９９０年，第４６巻，ｐ．４２３−４４１
【非特許文献１７】Ｅｂｅｌｉｎｇら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年，第３３５巻，ｐ．９８２−９８３
【非特許文献１８】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９０年，第３３５巻，ｐ．５５８−５６０
【非特許文献１９】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９１年，第３３７巻，ｐ．３１７−３１９
【非特許文献２０】Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅら，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．，１９９４年，第６６巻，ｐ．１２２−１２９
【非特許文献２１】Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第３７巻，ｐ．１３９３−１３９７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼに対する変異された切断部位を有するＭＥＦＡがＨＣＶ感染を検出可能であることを見出したことに部分的に基づく。この改変ＨＣＶ  ＭＥＦＡは免疫反応性であり、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼによるタンパク分解性切断をより受けにくい。すなわち、このＭＥＦＡは、ＮＳ３タンパク質分解活性を有するＨＣＶポリペプチド等の付加的なＨＣＶポリペプチドと組み合わせて、イムノアッセイに使用することができる。本発明の１つの代表的な実施形態において、改変ＭＥＦＡは、イムノアッセイ固体支持体上でＮＳ３／４ａ高次構造エピトープと組み合わせて使用される。本発明のＭＥＦＡはイムノアッセイ成分の製造中に分解せず、従ってＨＣＶアッセイ中で使用するための、よりすぐれた試薬を提供する。
【０００９】
ＭＥＦＡの使用は、基質の単位面積あたりのより多くのエピトープを可能にすることによって、マスキングの問題の減少、選択性向上、及び抗体検出感度の向上という利点を提供する。本明細書中で記載するアッセイを、ＨＣＶにおいて公知の６つの遺伝子型のいずれかにより引き起こされるＨＣＶ感染を検出するために使用することができる。
【００１０】
したがって、１実施形態において、本発明は、改変ＨＣＶ多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）であって、そのＭＥＦＡは、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＨＣＶヘリカーゼドメインからの少なくとも１つのエピトープ及びＨＣＶ  ＮＳ３タンパク分解性切断部位を含むＮＳ４領域からの少なくとも１つのエピトープを含み、そのヘリカーゼドメインエピトープ及びＮＳ４エピトープ中に存在するＨＣＶ  ＮＳ３のタンパク分解性切断部位は、変異のない対応するＭＥＦＡのタンパク分解性切断と比較してＮＳ３によるＭＥＦＡのタンパク分解性切断が阻害されるように変異されており、さらに、その改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するものである、改変ＭＥＦＡに関する。
【００１１】
特定の実施形態において、切断部位への変異は、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１４２８位、１４２９位、１４５５位及び１４５６位に見られる天然のアミノ酸の置換等の、それぞれの部位における少なくとも１個のアミノ酸の置換を含む。他の実施形態において、改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１６５７位及び１６５８位に見られる、天然のアミノ酸のＮＳ３／４ａ接合部における置換を含む。
【００１２】
なおさらなる実施形態において、ＮＳ４領域からのエピトープは５−１−１であり、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた１７１１位及び１７１２位に見られる、天然のアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態において、ＭＥＦＡはＨＣＶ株１、２及び３それぞれからの３つの５−１−１エピトープを含み、ここで、ＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた、５−１−１エピトープのそれぞれにおける１７１１位及び１７１２位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれは置換されている。
【００１３】
さらなる実施形態において、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１の配列に対して番号付けされた１４２８位、１４２９位、１４５５位、１４５６位、１６５７位及び１６５８位に見られる天然のアミノ酸の置換を有する、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１１９３位〜１６５８位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含み、このＭＥＦＡは、ＨＣＶ株１、２及び３それぞれからの３つの５−１−１エピトープをさらに含み、ここで、５−１−１エピトープのそれぞれは、ＨＣＶ−１の配列に対して番号付けされた１７１１位及び１７１２位に見られる天然のアミノ酸のそれぞれに置換を有する、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた１６８９位〜１７３５位のアミノ酸に対応する連続するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、ＭＥＦＡは、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の（例えば少なくとも９０％、又は少なくとも９８％）配列同一性を有するアミノ酸配列、あるいはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、但しここで、配列番号４の４６６位、４６７位、４９３位、４９４位、６９５位、６９６位、７２１位、７２２位、７７０位、７７１位、８１９位及び８２０位にあるアミノ酸は、ＭＥＦＡのＮＳ３タンパク分解性切断を阻害する変異を維持する。特定の実施形態において、ＭＥＦＡは、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、このＭＥＦＡは、配列番号４に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【００１５】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変ＭＥＦＡを含むイムノアッセイ固体支持体に関する。さらなる実施形態において、このイムノアッセイ固体支持体は、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープをさらに含み、ここで、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する。
【００１６】
特定の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法に関する。この方法は以下を包含する：
（ａ）上述のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）ＨＣＶ抗体が生物学的サンプル中に存在する場合、その抗体をＭＥＦＡと、ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープが存在する場合にはこのＮＳ３／４ａ高次構造エピトープとに結合させて第１の免疫複合体を形成させる条件下で、その生物学的サンプルを固体支持体と結合させる工程；
（ｃ）複合体形成条件下で、工程（ｂ）からの固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここで、その標識化抗体が免疫複合体と反応性である工程；及び
（ｄ）検出可能に標識された抗体と第１の免疫複合体との間で形成される第２の免疫複合体が存在する場合、この第２の免疫複合体を、生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染の指標として検出する工程。
【００１８】
なおさらなる実施形態において、本発明は、上述のイムノアッセイ固体支持体を含む免疫診断検査キット及びその免疫診断検査を実施するための説明書に関する。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、上述の改変ＭＥＦＡにのコード配列を含むポリヌクレオチドと、このポリヌクレオチド及び制御エレメントを含む組換えベクターであって、この制御エレメントがそのコード配列が宿主細胞中で転写され翻訳され得るようにこのポリヌクレオチドに作動可能に連結されている組換えベクターとに関する。さらなる実施形態において、本発明は、この組換えベクターを用いて形質転換された宿主細胞に関する。なおさらなる実施形態において、本発明は以下を含む組換えＭＥＦＡの製造方法に関する：
（ａ）上述の宿主細胞の集団を準備する工程；及び
（ｂ）組換えベクター中に存在するコード配列によってコードされている多エピトープ融合抗原が発現される条件下で、この細胞の集団を培養する工程。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、本発明は以下を包含するイムノアッセイ固体支持体の製造方法に関する：
（ａ）固体支持体を提供する工程；及び
（ｂ）固体支持体に、上述の少なくとも１つの改変ＭＥＦＡを結合させる工程。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明はさらに、ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープを上記固体支持体の別々の位置へと結合させることを含み、ここでこの高次構造エピトープは、ＨＣＶ感染個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する。特定の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、又は少なくとも９８％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープは、配列番号６に示される連続するアミノ酸配列からなる。
【００２２】
これらの及びその他の本発明の態様は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照して明らかになるであろう。さらに、特定の手順又は組成をより詳細に記載する種々の参照文献が本明細書中に示され、それらの全体は本明細書中で参考として援用される。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、特に明記されない限り、当該分野の当業者の技術の範囲内の従来の化学的方法、生物化学的方法、組換えＤＮＡ技術による方法および免疫学的方法を使用する。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００２４】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、前出および後出を問わず、本明細書によってその全体が参考として援用される。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈中で明らかに別のものを示さない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」という言及には、２種以上のこのような抗原の混合物が含まれる、などである。
【００２６】
以下のアミノ酸の略語は、本明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）        アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）    アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）      グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）    グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）      イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）        リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）      フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）        セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）      トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）        バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００２７】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下で示すように定義されることが意図される。
【００２８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみから構成されてもよく、または何かをさらに含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００２９】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から割愛され得る。
【００３０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、産物の長さの下限に制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、および多量体などは、この定義の範囲内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保持する限り、天然の配列の改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般に、本質的に保存的である））を含むタンパク質をいう。これらの改変は部位特異的変異誘発による意図的なものであっても、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【００３１】
ＨＣＶポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質に由来する、上に定義されるようなポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来することを必要とせず、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株および単離物（例えば、ＨＣＶの株１、株２、株３、株４、株５もしくは株６に由来する単離物のいずれかであるが、これらに限定されない）のいずれかに由来し得る。これらの株の間の多くの保存領域および可変領域が公知であり、そして一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が並列された場合に、高度の配列相同性（例えば、３０％を超える（好ましくは、４０％を超える）アミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ３／４ａ」ポリペプチドとは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来する天然のＮＳ３／４ａ、ならびに以下でさらに定義されるようなＮＳ３／４ａアナログ、ＮＳ３／４ａムテインおよびＮＳ３／４ａ免疫原性フラグメントをいう。これらの株の多くの完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００および同ＡＪ２３８７９９を参照されたい。
【００３２】
ＨＣＶポリタンパク質に「由来する」ポリペプチドは、参照ＨＣＶポリタンパク質の１つ以上の領域もしくは領域の部分の配列を含むポリペプチドを意図する。代表的には、ポリペプチドは、エピトープを含む領域もしくは領域の部分からなり、一般に、以下で規定する参照ポリペプチドに実質的に相同なアミノ酸配列を有する。従って、用語「由来する」は、分子の元来の供給源を同定するために使用されるが、この分子が作製される方法（例えば、化学合成による方法もしくは組換え手段による方法であり得る）を限定することを意味しない。
【００３３】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、所望の活性（例えば、本明細書中で記載されるアッセイにおける免疫反応性）を保持する、参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、天然の分子に対する１個以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に本質的に保存的であるか、または改変ＭＥＦＡの場合においては、ＮＳ３タンパク分解性切断部位において一般的に本質的に非保存的である）および／または欠失を（これらの改変が免疫原性活性を破壊しない限り）含む、天然のポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、１種以上のアミノ酸様分子（アミノ分子および／またはイミノ分子のみを含む化合物、１種以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに当該分野で公知の他の改変（環状分子および分枝状分子などの、天然に存在する分子および天然に存在しない（例えば合成の）分子の両方）が挙げられるが、これらに限定されない）を有するポリペプチドをいう。この用語はまた、１種以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）および他の合成アミノ酸もしくは合成ペプチドを含む分子をも含む。（例えば、ペプトイドの記載について、米国特許第５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２０００）７：４６３−４７３；ならびにＳｉｍｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：９３６７−９３７１を参照されたい。）好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくとも天然の分子と同一の免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３４】
上記で説明される通り、アナログは、一般的に、天然において保存的な置換（すなわち、その側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的には、アミノ酸は、一般的に、以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、ときとして、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独置換、トレオニンのセリンとの単独置換、または同様の、構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換は、生物学的活性に大きな影響を与えないことが合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、またはさらに約１５〜２５個までの保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換もしくは非保存的アミノ酸置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓプロットおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、目的の分子の変化を許容し得る領域を容易に決定し得る。
【００３５】
用語「多エピトープ融合抗原」もしくは「ＭＥＦＡ」は、本明細書中で使用される場合、多数のウイルス抗原が、天然に存在しない、１つの連続したアミノ酸の鎖として編成されているポリペプチドを意図する。本明細書中で使用される場合、ＭＥＦＡは、ＨＣＶ抗原に限定される。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接接続してもよく、または介在するアミノ酸配列によって分離されてもよい。融合抗原はまた、ＨＣＶポリタンパク質に対して外因性である配列をも含み得る。さらに、存在するＨＣＶ配列は、多数のＨＣＶの遺伝子型および／または多数のＨＣＶの単離物に由来し得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための改変され得る特定のＭＥＦＡの例は、例えば、国際出願公開第９７／４４４６９号、米国特許第６，５１４，７３１号、同第６，４２８，７９２号および同第６，６３２，６０１号（これらの全ては本明細書中で参考として援用される）において詳述されており、さらに以下で説明される。
【００３６】
「改変ＭＥＦＡ」は、１つ以上のＮＳ３タンパク分解性切断部位において、天然に存在するＨＣＶ抗原配列に対する（ＭＥＦＡ上のＮＳ３のプロテアーゼ活性が阻害されるような）変異を有する、上で定義したようなＭＥＦＡを意味する。改変ＭＥＦＡは、したがって、親の非改変ＭＥＦＡと比較して、ＮＳ３プロテアーゼによるタンパク分解性切断に対して感受性がより低い。改変ＭＥＦＡは、ヘリカーゼドメインに由来する少なくとも１種の改変エピトープ（好ましくはＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂおよび／またはＮＳ５ａに由来するエピトープ）を含む。「改変エピトープ」により、天然に存在するアミノ酸配列と比較して、エピトープ内の１つ以上のＮＳ３タンパク分解性切断部位が変異され、それによってＮＳ３プロテアーゼによるＭＥＦＡのタンパク分解性切断が阻害されることを意味する。改変ＭＥＦＡに存在するこの変異は、天然の分子と比較して１つ以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に天然において非保存的である）および／または欠失を含み得、ここで、ＮＳ３タンパク分解性切断に対する感受性は、低下させられるかまたは削除される。目的のＭＥＦＡのタンパク分解性切断を測定する方法は、当該分野で公知であり、これは、目的のＭＥＦＡをＮＳ３タンパク分解性活性を有することが既知であるタンパク質（例えば以下でさらに議論されそして図１３Ａ〜図１３Ｄに示されるＮＳ３／４ａ高次構造抗原）と共にインキュベートする工程、およびこのＭＥＦＡを切断についてモニタリングする工程を包含する。このアッセイは、実施例において詳細に記載される。
【００３７】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドを意図する。フラグメントは、天然のポリペプチドのＣ末端の欠失、および／またはＮ末端の欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般的に、エピトープを規定する全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個またはそれより多くの連続したアミノ酸残基、あるいは５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続したアミノ酸残基を含むが、但しここで、目的のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持することが条件である。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ポリタンパク質の１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８および１２０〜１３０のアミノ酸を含むＨＣＶコアのフラグメント、エピトープ５−１−１（ウイルスゲノムのＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ領域内）、ならびに図１で示されるポリタンパク質の任意の領域（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のＥ１領域、Ｅ２領域、ＮＳ３領域（例えばＮＳ３領域由来のｃ３３ｃポリペプチド）、ＮＳ４領域（例えばＮＳ３／ＮＳ４領域由来のｃ１００ポリペプチド）、ＮＳ３／４ａ領域およびＮＳ５領域であるが、これらに限定されない）に由来する規定のエピトープ、ならびにＨＣＶポリタンパク質から同定された任意の種々の他のエピトープ。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際出願公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際出願公開第９４／０１７７８号；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号（これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照されたい。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約３〜５個、好ましくは約５〜１０個または１５個、および約１，０００個以下（またはその間の任意の整数）のアミノ酸のポリペプチド配列であって、それ自体の配列またはより長い配列の一部を規定し、このような配列に対する応答において産生される抗体に結合する配列をいう。フラグメントの長さの決定的な上限は存在せず、このフラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長を含んでもよく、ＨＣＶポリタンパク質由来の２種以上のエピトープを含む融合タンパク質ですら含んでもよい。本発明で使用するためのエピトープは、由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、常に不安定な状態であり、単離物の間で比較的高い可変性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。したがって、用語「エピトープ」は、天然の配列と同一の配列、ならびに欠失、付加、および置換（一般的に、本質的に保存的である）のような天然の配列に対する改変を包含する。
【００３９】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の多くのエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，編、１９９６）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（タンパク質分子の一部に対応するペプチド）を同時に合成し、そしてこれらのペプチドが依然として支持体に結合している間に、これらのペプチドと抗体とを反応させることによって決定され得る。このような技術は当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら、（１９８６）、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（これら全ては、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。このような技術を使用して、多くのＨＣＶのエピトープが、同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０−３２４、および以下をさらに参照されたい。同様に、高次構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴によるようなアミノ酸の空間的高次構造の決定によって容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、前出を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性プロットおよびハイドロパシープロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから利用可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算したもの）を使用して同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）、７８：３８２４−３８２８）を使用し、そしてハイドロパシープロットを決定するためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）、１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「高次構造エピトープ」とは、全長天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対して天然のままである構造的特徴を有する、全長タンパク質の一部分、またはこれらのアナログもしくはムテインをいう。天然の構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、これらエピトープが抗原の三次元形状（例えば、折りたたみ）によって形成されると考えられるので、広範な変動に供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って（またはダイマーの場合などは、異なる分子上にすら）広範に散在し、折りたたみを介して正確なエピトープ高次構造となる。エピトープを規定する残基の間の抗原の部分は、エピトープの高次構造の構成に重要ではない場合がある。例えば、これらの介在性配列の欠失もしくは置換は、エピトープの高次構造に重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）が維持されている場合、高次構造エピトープに影響を及ぼさない場合がある。
【００４１】
例えばＮＳ３／４ａ領域内に存在する、高次構造エピトープは、上で議論している方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおける高次構造エピトープが存在するかもしくは存在しないかは、抗体（この高次構造エピトープに対するポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体）による目的の抗原のスクリーニング、ならびにその反応性をこの抗原の変性型（存在する場合でも、線状エピトープしか有さない）に対する反応性と比較する工程を介して、容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を最初に変性抗原で吸収させ、そして目的の抗原に対する抗体を有するか否かを調べることは、有利であり得る。さらに、ＮＳ３／４ａの場合、天然の高次構造を保存する分子は、また、プロテアーゼ酵素活性をも有し、必要に応じてヘリカーゼ酵素活性をも有する。このような活性は、以下にさらに記載されるような酵素アッセイを使用して検出され得る。
【００４２】
好ましくは、高次構造エピトープは、組換えによって産生され、そしてエピトープの所望の構造特徴を保存する条件下で（例えば、エピトープの変性を伴わずに）エピトープを抽出可能である細胞において発現される。そのような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質に由来する組換え高次構造エピトープの発現および単離は、例えば、国際出願公開第９６／０４３０１号、同第９４／０１７７８号、同第９５／３３０５３号、同第９２／０８７３４号（これらの出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてこのタンパク質を回収後さらに復元することが可能である。また、化学的合成が、「天然の」抗原の高次構造エピトープと交差反応する高次構造抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）を提供し得ることもまた、理解される。
【００４３】
「抗体」は、抗原に存在する目的のエピトープに特異的に結合する分子を意図する。「特異的に結合する」は、抗体が、エピトープを認識し、そして「鍵と鍵穴（ｌｏｃｋ  ａｎｄ  ｋｅｙ）」型の相互作用においてエピトープと相互作用し、抗原と抗体との間に複合体を形成することを意味する。これは、抗体と例えば試験基質との間に生じ得る非特異的結合とは対照的である。従って、例えば、ＨＣＶコア抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合する分子であり、ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ抗体は、ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａタンパク質のエピトープに特異的に結合する分子である、などである。同様に、目的の抗原は、抗体がこの抗原に存在するエピトープに「特異的に結合する」場合、この抗体と「特異的に反応する」。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに以下を包含する：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）；二量体抗体フラグメント構築物および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；および英国特許出願公開第２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照）；ならびに、このような分子から得られた、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持している任意の機能的フラグメント。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種もしくは供給源に関して限定されず、作製された様式によっても限定されないことが意図される。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、ならびにマウスハイブリドーマではなくヒトハイブリドーマを用いて得られたヒトモノクローナル抗体を、包含する。例えば、Ｃｏｔｅら，Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照されたい。
【００４５】
ポリペプチドに関する場合、「単離された」により、指定の分子が、この分子が天然において見出される生物全体から分離されて独立しているか、または他の同種の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在していることが、意味される。ポリヌクレオチドに関する用語「単離された」は、通常天然で伴っている配列全体または一部を有さない核酸分子であるか、または天然に存在する通りの配列であるがそれと結合する異種配列を有する配列であるか、あるいは染色体から分離された分子である。
【００４６】
「等価な抗原決定基」は、ＨＣＶの株１、株２、株３のような異なるＨＣＶの亜種または株に由来する抗原決定基を意味する。より具体的には、エピトープは、公知であり（例えば、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けられたおよそ１６９４〜１７３５位に存在する「５−１−１」、図１を参照のこと）、そしてこのようなエピトープは、株１と、株２と、株３との間で変動する。従って、３つの異なる株に由来するエピトープ５−１−１は、等価な抗原決定基であり、従って、その配列が同一でなくとも、「コピー」である。一般に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が並列される場合、高度な（例えば、３０％より大きく、好ましくは４０％より大きい）配列相同性を有する。
【００４７】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の％をいう。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、定義した分子の長さにわたって、これらの配列が少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対する完全な同一性を示す配列をもいう。
【００４８】
一般的に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。％同一性は、配列を並列することによって２つの分子（参照配列と参照配列に対する％同一性が未知である配列と）の間の配列情報を直接比較する工程、並列された２つの配列間の正確な適合の数を計数する工程、参照配列の長さで除算する工程、およびこの結果に１００を掛ける工程によって決定され得る。
【００４９】
容易に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、ペプチド分析用のＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１）に適合させたＡＬＩＧＮ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、第５補遺，３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ））が、相同性および同一性の分析を補助するために使用され得る。ヌクレオチド配列の相同性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから利用可能）で利用可能である（例えば、やはりＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＦＡＳＴＡプログラム、およびＧＡＰプログラム）。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、かつ上記で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載される初期設定のパラメータを使用して容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の％相同性は、初期設定のスコアリング表およびヌクレオチド上の６つの位置でのギャップペナルティを使用したＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５０】
本発明に関連して％相同性を確立する別の方法は、エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から販売されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表のために初期設定のパラメータ（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ、および６のギャップ）を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが、使用され得る。作成されたデータからの「適合」値は、「配列相同性」を反映する。配列間の同一性または類似性の％を計算するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、初期設定のパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定のパラメータを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；分類＝ハイスコア；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳物＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、容易に利用できる。
【００５１】
あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化フラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定したストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００５２】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下においた場合に、インビトロまたはインビボで転写（ＤＮＡの場合）され、そしてポリペプチドに翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。
【００５３】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素がその所望の機能を発揮するように構成されるエレメントの配置をいう。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合に、コード配列の発現を達成し得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、転写されたイントロンがそうであるように、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得るので、プロモーター配列は、なおコード配列に「作動可能に連結された」と見なされ得る。
【００５４】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、このポリヌクレオチドは、その起源または操作ゆえに、天然において結合するポリヌクレオチドの全体または一部と結合しない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下でさらに記載されるように、形質転換された生物中で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【００５５】
「制御エレメント」とは、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ、ならびに、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーが含まれる）を包含し、これらは、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を共同して提供する。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてそこに作動可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（共通配列）が存在する。真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常にこれらを含むわけではない。
【００５７】
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、制御配列は、細胞中のコード配列の「転写を指示し」、その後、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされたポリペプチドに翻訳される。
【００５８】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得る集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）をいう。発現カセットは、上に記載されるような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指示するように）作動可能に連結されたプロモーター）を含み、多くの場合、またポリアデニル化配列をも含む。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つのマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「形質転換」とは、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいい、挿入のために使用した方法（例えば、直接取り込み、トランスフェクション、および感染などによる形質転換）を問わない。特定のトランスフェクション法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノム内に組み込まれ得る。
【００６０】
「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換されている細胞であるか、または形質転換可能な細胞である。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織もしくは液体のサンプルをいい、通常、被験体によって産生された抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、脊髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸および生殖器官の分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検ならびにまたインビトロ細胞培養構成物（培養培地中の細胞および組織の増殖から得られた馴化培地（例えば組換え細胞および細胞構成要素）が挙げられるが、これらに限定されない）のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
「固体支持体」は、本発明のイムノアッセイにおいて使用されるＨＣＶポリペプチドが、共有結合的に結合するか、または非共有結合的手段（例えば、疎水性吸着）によって結合する、固体マトリックスを意図する。
【００６３】
「免疫学的に反応性である」または「免疫反応性である」は、目的の抗原が、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応することを意味する。
【００６４】
「免疫原性」とは、目的の抗原が、個体に投与された場合に免疫応答を誘発することを意図する。
【００６５】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上のエピトープに結合する場合に形成される結合物（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を意図する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出の可能な分子をいい、放射性同位体、蛍光剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、蛍光ナノ粒子、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことの可能な基質もしくはその部分をいう。本発明の下で使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
（ＩＩ．発明を実施する形態）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の処方物または処理パラメータに制限されず、当然に変更可能であることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことがまた、理解されるべきである。
【００６８】
本明細書中に記載のものに類似するか、またはそれらと等価な多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００６９】
上述のように、本発明は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼによる改変ＭＥＦＡのタンパク分解性切断が阻害されるような改変ＮＳ３プロテアーゼ切断部位を有する新規なＨＣＶ  ＭＥＦＡの発見に基づく。かかる改変ＭＥＦＡは、初期ＨＣＶ感染を正確に検出するための診断方法において特に有用である。この改変ＭＥＦＡは、例えば、ＨＣＶの主要線状エピトープであるコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、５−１−１、ｃ１００−３及びＮＳ５配列のような多数の免疫優勢なエピトープのような、同一又は異なるＨＣＶ遺伝子型及び単離物のいずれかに由来する種々のＨＣＶポリペプチドを含む。
【００７０】
改変ＭＥＦＡはイムノアッセイにおいて単独で、又はその他のＨＣＶ抗原、好ましくは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域に由来する高度に免疫原性の高次構造エピトープと組み合わせて用いられ得る。このイムノアッセイはＨＣＶセロコンバージョンの初期段階の間におけるＨＣＶ感染を検出するために用いられ得、それにより検出の正確性を向上させ、誤った結果の発生率を低減させる。この方法は、限定されるものではないが、例えば、ＨＣＶ抗原を結合させる固体支持体を用いるアッセイ様式のような、以下に記載するいくつかのアッセイ様式のいずれかを用いて、単回のアッセイで簡便に実践することができる。
【００７１】
本発明のさらなる理解のために、改変ＭＥＦＡ、ＨＣＶ高次構造ＮＳ３／４ａエピトープ、並びに、これらのタンパク質の製造及びこれらのタンパク質の使用方法に関して、より詳細な考察が以下に提供される。
【００７２】
（ＨＣＶ  ＭＥＦＡ）
ＨＣＶ株のゲノムは、ポリタンパク質へと転写される約９，０００〜１２，０００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含む。図１及び表１に示すように、ＨＣＶポリタンパク質は切断の際に少なくとも１０の異なる産物を以下の順で生じる：ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。このコアポリペプチドはＨＣＶ−１に対して番号付けされた１位〜１９１位に生じる（ＨＣＶ−１ゲノムに関して、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５参照）。このポリペプチドはさらに処理されておよそ１〜１７３のアミノ酸を伴うＨＣＶポリペプチドを生産する。エンベロープポリペプチドであるＥ１及びＥ２は、およそ１９２位〜３８３位及びおよそ３８４位〜７４６位にそれぞれ生じる。Ｐ７ドメインはおよそ７４７位〜８０９位に見出される。ＮＳ２はタンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質のおよそ８１０位〜１０２６位に見出される。ＮＳ２は、ＮＳ３（およそ１０２７位〜１６５７位に見出される）と組み合わさって、ＮＳ２−ＮＳ３のｓｉｓｓｌｅ結合を切断し、これは次に、ＮＳ３のＮ末端を作り出し、またセリンプロテアーゼ活性及びＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。およそ１０２７位〜１２０７位に見出されるＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質を処理するために役割を果たす。ヘリカーゼ活性はおよそ１１９３位〜１６５７位（「ヘリカーゼドメイン」）に見出される。ＮＳ３はＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ、およそ１６５８位〜１７１１位に見出される）、２つのタンパク質（およそ１７１２位〜１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、及びおよそ１９７３位〜２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（およそ２４２１位〜３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離させる。ポリタンパク質の成熟の終結は、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒されるＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部における自己触媒切断によって開始される。
【００７３】
【表１】
2008515391.tif 000003
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けされたもの。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５参照。
【００７４】
コア、ＮＳ２、ｐ７、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂの遺伝子及びポリペプチドを含む、ＨＣＶポリタンパク質の種々の領域の核酸配列及びアミノ酸配列を含む、多数のＨＣＶ株及び単離物の核酸配列及びアミノ酸配列が決定されている。
【００７５】
ＨＣＶ−１単離物について記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５及びＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離物ＨＣ−Ｊ１及びＨＣ−Ｊ４はＯｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離物ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１及びＥＣ１０はＷｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載されている。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１及びＨＣＶ−Ｋ２はＥｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載されている。ＨＣＶ単離物Ａ、Ｃ、Ｄ及びＥはＴｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４に記載されている。単離物ＨＣＶ  Ｊ１．１はＫｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；及びＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載されている。２種類の別個の単離物ＨＣＶ−Ｊ及びＢＫの完全コード配列が、それぞれ、Ｋａｔｏら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８及びＴａｋａｍｉｚａｗａら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３に記載されている。
【００７６】
上記に説明されるように、本発明は、ＨＣＶ検出のためのイムノアッセイに用いるための改変多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）に関する。この改変ＭＥＦＡは、図１及び表１に示され、さらに以下に記載されるような種々のＨＣＶウイルス領域のいずれかに由来する多数のＨＣＶエピトープを含む。通常、改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶポリタンパク質における少なくとも３つの異なる領域、より代表的には、ＨＣＶポリタンパク質の４〜１０の領域からの、例えばＨＣＶポリタンパク質の５〜８（例えば５、６、７、８）の領域に由来する、少なくとも３つのエピトープ、好ましくは３〜２５又はそれ以上のエピトープ（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０あるいはそれ以上のエピトープ（例えば１０〜２０のエピトープ）を含む。改変ＭＥＦＡは、ヘリカーゼドメインからの少なくとも１つの改変エピトープ及び好ましくはＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ及び／又はＮＳ５ａからのエピトープを含む。改変ＭＥＦＡはまた、ＭＥＦＡの組換え発現を助ける配列のような非ＨＣＶ配列（以下にさらに記述するスーパーオキシドジスムターゼ配列が挙げられる）を含み得る。
【００７７】
改変ＭＥＦＡにおいては、多数のＨＣＶ抗原が一本の連続したアミノ酸鎖として配列されており、この鎖はその状態で天然に存在しない。したがって、エピトープの直線的順序は、それらが存在するゲノム中でのこれらエピトープの直線的順序とは異なる。本明細書中で使用するための改変ＭＥＦＡの配列はの直線的順序は、好ましくは、最適な抗原性のために並べられる。好ましくは、エピトープは、２以上のＨＣＶ株、例えば、２、３、４、５、６以上の株に由来し、それにより、単一アッセイにおいて多数のＨＣＶ株を検出する能力が付与される。さらに、ＭＥＦＡ中に存在するポリペプチドは、免疫診断が使用される特定の地理的領域における特定のウイルス固有種に基づいて選択することができる。このようなＭＥＦＡが様々な状況においてＨＣＶ感染を診断するための有効な手段を提供することは容易に理解される。さらに、改変ＭＥＦＡの使用は、ＮＳ３プロテアーゼによるＭＥＦＡのタンパク分解性切断を生じないことを確認し、したがって、ＨＣＶイムノアッセイにおいて使用するためのより良い試薬が提供される。
【００７８】
本発明の改変ＭＥＦＡは、ＮＳ３による改変ＭＥＦＡの切断が阻害されるように、ＮＳ３タンパク分解性切断部位において変異されている。ＮＳ３タンパク分解性切断部位は、ＮＳ３／４ａ、ＮＳ４ａ／４ｂ、ＮＳ４ｂ／５ａ及びＮｓ５ａ／５ｂ接合部位において見られる（Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：２８３２−２８４３）。したがって、表１を参照すると、これらの部位は、それぞれ、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされたアミノ酸の１６５７位／１６５８位、１７１１位／１７１２位、１９７２位／１９７３位及び２４２０位／２４２１位に存在する。さらに、切断部位は、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた１４２８位／１４２９位及び１４５５位／１４５６位にあるＮＳ３のヘリカーゼドメイン内にも存在する。改変のためのさらなる部位は、例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；並びにＳｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２に記載されているようなＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって決定され得る。
【００７９】
ＮＳ３タンパク分解性切断部位の全て又はそのいくつかを欠失することにより、ＭＥＦＡは改変され得る。あるいは、ＮＳ３プロテアーゼによるタンパク分解性切断は、タンパク分解性切断部位内のアミノ酸の置換により、その部位がＮＳ３プロテアーゼのための基質として機能しないように、阻害され得る。最終的に、ＮＳ３プロテアーゼが作用しないようにタンパク分解性切断部位が改変されるアミノ酸付加もまた、タンパク質分解活性を阻害するために機能し得る。タンパク分解性切断に影響を及ぼさないさらなる改変は、必ずしも必要ではないが、本発明のＭＥＦＡ中に見られるエピトープ中に存在していてもよい。改変ＭＥＦＡの用途に沿う場合、プロテアーゼ切断部位を除去する任意の改変が、そのように改変されたＭＥＦＡの免疫反応性に影響を及ぼするべきではないことは明らかであろう。
【００８０】
したがって、例えば、上記の１以上の部位における１以上のアミノ酸（例えば、これらのアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は全て）を、ＮＳ３プロテアーゼによるタンパク分解性切断を抑制するために置換又は欠失させることができる。あるいは、ＮＳ３プロテアーゼによるＭＥＦＡの切断を阻害するためにこれらの切断部位に付加することができる。
【００８１】
好ましい実施形態においては、ＭＥＦＡ中に存在する全てのタンパク分解性切断部位における各アミノ酸が、ＮＳ３プロテアーゼによる切断を防ぐために改変されている。したがって、ＭＥＦＡがヘリカーゼドメイン中の切断部位に広がる１以上のエピトープ、（ＮＳ３／４ａ接合部、ＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ接合部等）を含む場合、その部位を規定するアミノ酸は置換されているか又は改変されている。ヘリカーゼドメイン中の部位の具体的な置換としては、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１４２８位に存在する、アミノ酸ＬｅｕのＴｈｒとの置換；通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１４２９位に存在する、ＰｒｏのＳｅｒとの置換；通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１４５５位に存在する、ＬｅｕのＡｓｎとの置換；及び、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１４５６位に存在する、ＰｒｏのＴｈｒとの置換が挙げられる。ＮＳ３／４ａ接合部における具体的な置換としては、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１６５７位に存在するＬｅｕのＴｈｒとの置換；及び、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１６５８位に存在するＰｒｏのＳｅｒとの置換が挙げられる。これらの位置の上記アミノ酸はＨＣＶ−１配列を参照しており、対応するアミノ酸がＮＳ３によるＭＥＦＡのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のＨＣＶ遺伝子型のいずれかのヘリカーゼドメイン及びＮＳ３／４ａドメインからのエピトープをも、ＭＥＦＡは含んでいてもよいことを理解すべきである。
【００８２】
さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３（第３補遺）：９９−１０９；並びにＳｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２に記載されているようなＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの公知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。特に、ＮＳ３プロテアーゼがセリンプロテアーゼであり、そのタンパク質分解メカニズムは標的とされるペプチド結合のセリンによる求核攻撃に基づくものであることが公知である。セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の整列された側鎖は、多くのセリンプロテアーゼに共通の触媒性三連構造を構築する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する裂け目として形作られる。Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒ（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２）は、ポリペプチド基質（Ｐｉ、・・・、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、・・・、Ｐｊ）のＮ末端からＣ末端の標識アミノ酸残基及びそれらの各結合サブサイト（Ｓｉ、・・・、Ｓ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ１’、Ｓ２’、Ｓ３’、・・・、Ｓｊ）を標識化し、そして切断が、Ｐ１とＰ１’との間で触媒されることを見出した。ＮＳ３プロテアーゼはキモトリプシン様の折り畳み構造を取り、非常に長いペプチド基質（Ｐ６〜Ｐ４’）に対する要件と一致する、非常に長い、溶媒に曝露される基質結合部位を含む。ＮＳ３プロテアーゼは基質Ｐ１の位置のシステイン残基に対して選択性を有する。したがって、上述の及び当技術分野において既知の構造及び機能に基づいて、ＮＳ３プロテアーゼに対するタンパク分解性切断を妨害し、それによって、切断されにくいＭＥＦＡを産生するように機能するその他のアミノ酸の置換、付加及び欠失を、当業者は容易に決定することができる。
【００８３】
ＭＥＦＡ中に存在する場合、５−１−１エピトープ中に見られる、ＮＳ４ａ／４ｂ接合部における具体的な置換としては、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１７１１位に存在するＰｒｏのＣｙｓとの置換、並びに、通常、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の１７１２位に存在するＩｌｅのＳｅｒとの置換が挙げられる。５−１−１エピトープは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた、およそ１６９４位〜１７３５位に見られる。これらの位置の上記アミノ酸はＨＣＶ−１配列を参照しており、対応するアミノ酸がＮＳ３によるＭＥＦＡのタンパク分解性切断を阻害するように機能するアミノ酸と置換されている場合、これらの位置に同じアミノ酸を含んでいても又は含んでいなくてもよい、その他のＨＣＶ遺伝子型のいずれかの５−１−１ドメインからのエピトープをＭＥＦＡは含んでいてもよく、好ましくは含むことを理解すべきである。例えば、ＨＣＶ−３の１７１１位及び１７１２位における天然のアミノ酸は、ＨＣＶ−１において見られるものと同じである。ＨＣＶ−２の１７１１位にあるアミノ酸は、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−３のそれと同じである。しかしながら、ＨＣＶ−２の１７１２位に存在するアミノ酸はＡｌａである。このＡｌａは、ＮＳ３によるＭＥＦＡのタンパク分解性切断を阻害するために、例えば、Ｉｌｅと置換され得る。さらに、これらの部位におけるその他の適当なアミノ酸改変は、例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；並びにＳｃｈｅｃｈｔｅｒ及びＢｅｒｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７）２７：１５７−１６２に記載されているようなＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼの既知の構造及び機能に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。
【００８４】
上述のとおり、本発明のＭＥＦＡは、ＮＳ３及びＮＳ４ａ領域由来の少なくとも１以上のエピトープ（直線的又は高次構造的のいずれか）、例えば、ＮＳ３のヘリカーゼ及び／又はプロテアーゼ領域由来のものを含んでもよい。したがって、ＭＥＦＡは、１以上のＨＣＶ単離物からのＮＳ３／４ａ領域由来の多数の免疫ドミナントエピトープを含んでもよい。多数のＮＳ３／４ａエピトープが多エピトープ融合体に用いられる場合、それらは、同一又は異なるエピトープであってもよい。あるいは、融合抗原は、ＮＳ３／４ａ領域由来の１以上のエピトープ、並びに、限定するものではないが、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、Ｐ７、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂ配列のようなその他のＨＣＶ領域からの主要な直線的エピトープを含み得る。
【００８５】
ＮＳ３／４ａ領域由来のエピトープを含むポリペプチドは、限定するものでないが、ＮＳ３、ＮＳ４ａ及びＮＳ３／４ａ領域の全て又は一部を含むポリペプチドを含み、ＮＳ３のヘリカーゼ及び／又はプロテアーゼドメインからのエピトープを含んでもよい。これらの領域からの多数のエピトープが公知であり、例えば、限定するものではないが、ｃ３３ｃ領域、ｃ２００領域及びｃ１００領域由来の抗原、並びに、ｃ２５のようなＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質が挙げられる。これら及びその他のＮＳ３エピトープは、本発明のＭＥＦＡにおいて有用であり、当技術分野において公知であり、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；及び米国特許第６，３４６，３７５号及び米国特許第６，１５０，０８７号に記載されており、これらの開示は本明細書中で参考としてその全体が援用される。
【００８６】
さらに、５−１−１として知られる抗原決定基は部分的にＮＳ４ａ領域（図１参照）内に存在しており、本発明のアッセイにおいて使用するためのＭＥＦＡにおいて特に有用である。５−１−１エピトープは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされたおよそ１６９４位〜１７３５位に見られる。この抗原決定基はＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２及びＨＣＶ−３上に異なる形態として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態においては、これらの形態をとる５−１−１の全てが本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原において現れる。
【００８７】
改変ＭＥＦＡは種々のＨＣＶ単離物のいずれかのコア領域からのエピトープを含むこともできる。この領域は、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１位〜１９１位に存在する。全長タンパク質、そのフラグメント（例えば、アミノ酸１〜１５０、例えば、アミノ酸１〜１３０、１〜１２０、例えば、アミノ酸１〜１２１、１〜１２２、１〜１２３等）又は全長タンパク質のエピトープを含むより小さなフラグメントのいずれかが、本発明のＭＥＦＡ中に存在し得、例えば、それらのエピトープは、アミノ酸９〜３２、１０〜５３、１０〜４５、３９〜４２、６４〜８８、６７〜８４、６７〜８８、１２０〜１３０の間に見られるか、或いは、コアエピトープのいずれかは、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；並びに米国特許第６，２８０，９２７号及び米国特許第６，１５０，０８７号に示されている。これらの開示は参考として本明細書中でその全体が援用される。さらに、国際公開第９９／６３９４１号に記載されるようなポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから得られるタンパク質を使用しても良い。
【００８８】
同様に、ＨＣＶ  Ｅ１及び／又はＥ２領域からのポリペプチドは改変ＭＥＦＡに使用することができる。Ｅ２は複数種存在し（Ｓｐａｅｔｅら，Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）、クリッピング及びタンパク分解はＥ２ポリペプチドのＮ−末端及びＣ−末端で生じ得る。したがって、本明細書中で使用するためのＥ２ポリペプチドは、全長又はＮ−末端及び／若しくはＣ−末端を切断された免疫原性タンパク質、例えば、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた、アミノ酸４０５〜６６１を有するタンパク質（例えば、４００、４０１、４０２・・・〜６６１、例えば、４０５〜４４４、３８３又は３８４〜６６１、３８３又は３８４〜７１５、３８３又は３８４〜７４６、３８３又は３８４〜７４９或いは３８３又は３８４〜８０９、或いは３８３又は３８４から６６１〜８０９の間の任意のＣ末端まで）を含んでもよい。ＭＥＦＡにおいて使用するためのさらなるＨＣＶエピトープは、Ｅ２の超可変領域に由来するエピトープ、例えば、アミノ酸３８４〜４１４若しくは３９０〜４１０に広がる領域、又はこの領域からの共通配列であるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号７）を含み、これは、１型ＨＣＶゲノムのアミノ酸３９０〜４１０に対する共通配列を表す。本発明のＭＥＦＡ中に存在する代表的Ｅ２エピトープは、アミノ酸３８４〜４１４に広がるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、第２の株からの共通配列と融合される、共通配列を表すアミノ酸３９０〜４１０を含み得る。あるいは、このＥ２エピトープはアミノ酸３９０〜４４４に広がるハイブリッドエピトープを含んでもよい。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、例えば、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１〜４４４に対する天然のアミノ酸配列へと融合される、上述したような共通配列を表すアミノ酸３９０〜４１０を含み得る。
【００８９】
さらに、改変ＭＥＦＡは、アミノ酸３０３〜３２０を含むＥ１エピトープ等のＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、１９２〜３３０、１９２〜３３３、１９２〜３６０、１９２〜３６３、１９２〜３８３、又は１９２から３２６〜３８３の間の任意のＣ末端までを含むエピトープ等のＥ１ポリペプチドを含んでもよい。
【００９０】
上述のとおり、抗原は種々のＨＣＶ株に由来し得る。複数のＨＣＶウイルス株が公知であり、これらの株いずれかに由来するエピトープは融合タンパク質として使用することができる。任意の所定の有機体の種は、個々の有機体の間で互いに異なり、さらに、ウイルス等の特定の有機体は多数の異なる株を有し得ることが周知である。例えば、上述のとおり、ＨＣＶは少なくとも６つの遺伝子型を含む。これらの各遺伝子型は同等の抗原決定基を含む。より具体的には、それぞれの株は、ウイルスの全ての株に存在するが、ウイルス株同士でわずかに異なる多くの抗原決定基を含む。例えば、ＨＣＶは、５−１−１として知られる抗原決定基を含む（図１参照）。上述のとおり、この特定の抗原決定基は異なる形態ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２及びＨＣＶ−３として現れる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、これらの５−１−１形態の全てが、本発明のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるＨＣＶ株のコア領域からの同等の抗原決定基も存在し得る。通常、同等の抗原決定基はアミノ酸配列に関して高度の相同性を有し、相同性の程度は、整列させた際に、通常３０％以上、好ましくは４０％以上である。本発明の複数コピーのエピトープは、正に同一エピトープのコピーである複数コピーを含むことができる。
【００９１】
図８は本明細書中で「ＭＥＦＡ７．２」と呼ばれる代表的な改変ＭＥＦＡを示す。しかしながら、ＨＣＶゲノム由来のその他のエピトープも本発明の改変ＭＥＦＡにおける用途を見いだすであろうことを理解すべきである。ＭＥＦＡ７．２をテンプレートとして形成された親ＭＥＦＡは「ＭＥＦＡ７．１」であった。ＭＥＦＡ７．１のマップ並びに対応するＭＥＦＡ７．１のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列をそれぞれ図４及び５Ａ〜５Ｆに示す。ＭＥＦＡ７．１は米国特許第６，６３２，６０１号に詳細に記載されており、当該文献は参考として本明細書中でその全体が援用される。ＭＥＦＡ７．１及びＭＥＦＡ７．２のアミノ酸配列の比較を、２つの構築物の間の違いを太字で注記して、図１０Ａ〜１０Ｂに示す。全ての相違は上述のタンパク分解性切断部位において生じている。したがって、ＭＥＦＡ配列に対して番号付けされた変異は、図１０Ａ〜１０Ｂの４６６位、４６７位、４９３位、４９４位、６９５位、６９６位、７２１位、７２２位、７７０位、７７１位、８１９位及び８２０位において生じている。これらのアミノ酸位置は、それぞれ、ＨＣＶ−１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた１４２８位、１４２９位、１４５５位、１４５６位、１６５７位、１６５８位、１７１１位、１７１２位、１７１１位、１７１２位、１７１１位及び１７１２位に相当する（３回の５−１−１の反復による）。
【００９２】
ＭＥＦＡ７．２のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図９Ａ〜９Ｆに示す。ＭＥＦＡ７．２の一般構造式を図８に示し、これは以下の通りである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（タイプ１）−Ｅ２  ＨＶＲ共通（タイプ１ａ）−Ｅ２  ＨＶＲ共通（タイプ１及び２）−変異ヘリカーゼ（タイプ１）−変異５−１−１（タイプ１）−変異５−１−１（タイプ３）−変異５−１−１（タイプ２）−ｃ１００（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−コアエピトープ（タイプ１＋２）−コアエピトープ（タイプ１＋２）。このＭＥＦＡは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた以下のアミノ酸配列を含む（アミノ酸の番号付けは、アミノ酸＃１がコア領域のコード配列によってコードされる第１のメチオニンである、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５に示されている番号表示に従い、以下に示す）：スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、タンパク質の組換え発現を促進するために使用される）のアミノ酸１〜１５６；Ｅ１領域由来のポリタンパク質のアミノ酸３０３〜３２０；ＨＣＶ−１ａＥ２の超可変領域に対する共通配列を表す、ポリタンパク質のアミノ酸３９０〜４１０；ＨＣＶ−１及びＨＣＶ−２のＥ２超可変領域に対する共通配列を表す、領域Ｅ２由来のポリタンパク質のアミノ酸３８４〜４１４；ポリタンパク質の対応するアミノ酸１４２８、１４２９、１４５５、１４５６、１６５７及び１６５８（図９Ａ〜９Ｆに示されたＭＥＦＡ配列に対して番号付けされたアミノ酸４６６、４６７、４９３、４９４、６９５及び６９６）に変異を有する、ヘリカーゼを規定するＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１１９３〜１６５８；５−１−１からのエピトープの３つのコピー、アミノ酸１６８９〜１７３５（ＨＣＶ−１からの１つ、ＨＣＶ−３からの１つ及びＨＣＶ−２からの１つ）、これらのコピーは、３つの異なるＨＣＶウイルス株からの同等の抗原決定基であり、これらのコピーそれぞれが、ポリタンパク質の対応する１７１１及び１７１２のアミノ酸（図９Ａ〜９Ｆに示されるＭＥＦＡ配列に対して番号付けされたアミノ酸７２１、７２２、７７０、７７１、８１９及び８２０）に変異を有する；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドｃ１００、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１〜１９３６；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域からのエピトープの２つの正確なコピー、それぞれがＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８〜２３１３を有する；並びに、コア領域からのいくつかの２コピーのエピトープ（ＨＣＶ−１からの１つ及びＨＣＶ−２からの１つ）、これらのコピーはＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、３９〜４２及び６４〜８８並びにＨＣＶ−２の６７〜８４によって表される同等の抗原決定基である。
【００９３】
表２は本明細書中の図９Ａ〜９Ｆに関連する種々のエピトープのアミノ酸の位置を示す。
【００９４】
【表２】
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従って、ひとつの特定の改変ＭＥＦＡが、ＭＥＦＡ７．２によって表される。ＭＥＦＡ７．２に対する実質的な相同性を示すＭＥＦＡも、上述のように意図される。このようなＭＥＦＡは、タンパク分解性切断部位に対する少なくとも１つの改変を有し、好ましくはタンパク分解性切断部位に対する全ての改変が維持され、且つそのＭＥＦＡが免疫反応性を有し、従って本明細書中に記載するようなＨＣＶ免疫診断において有用である限り、分子の全長に渡って少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す配列を有し得る。
【００９５】
上記に説明したように、ＭＥＦＡ７．１をテンプレートとして用いてＭＥＦＡ７．２を作製した。しかしながら、多数のその他の公知のＭＥＦＡが、ＮＳ３によるタンパク分解性切断の感受性を低減したさらなる改変ＭＥＦＡを提供するために上述のように改変され得る。本明細書中に記載の改変され得るＭＥＦＡとしては、ＭＥＦＡ−３、ＭＥＦＡ−５及びＭＥＦＡ−６が挙げられ、これらは、図１２Ａ、１２Ｂ及び１２Ｃにそれぞれ示され、国際公開第０１／９６８７５号、同第０１／０９６０９号、同第９７／４４４６９号及び米国特許第６，５１４，７３１号及び同第６，４２８，７９２号（本明細書中にその全体が参考として援用される）中に記載される。例えば、ＭＥＦＡ６のエピトープ配列の配置はＭＥＦＡ７．２に類似する。しかしながら、ＭＥＦＡ７．２は、Ｅ２超可変（ＨＶＲ）領域及びＥ２  ＨＶＲ  １＋２共通配列を組み込む。さらに、ＮＳ３のヘリカーゼ領域全体が、ＭＥＦＡ７．２中に含まれる。すなわち、ＭＥＦＡ７．２は分子量約１２０ｋＤａを有し、ＭＥＦＡ６よりも大きいと考えられる。しかしながら、酵母における発現レベルはＭＥＦＡ６のものに類似し、９５％を超える純度で精製することができ、測定可能である。
【００９６】
改変ＭＥＦＡは単独で使用されるか、又は好ましくは、ＭＥＦＡに関して上述される任意のＨＣＶ免疫原性タンパク質のような別のＨＣＶ抗原と組み合わせて使用される。好ましい実施形態において、改変ＭＥＦＡは、ＨＣＶウイルスを検出するためのイムノアッセイにおいて、ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａエピトープ、好ましくは高次構造エピトープと組み合わせて用いられる。したがって、図２に示される本発明の１実施形態において、ＭＥＦＡ７．２及びＮＳ３／４ａエピトープを用いて迅速捕捉リガンドイムノアッセイ（ｒａｐｉｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が実行される。サンプルは、固体支持体上に存在し得る抗原と、以下に記載するように組み合わされる。サンプルがＨＣＶに感染している場合、固体支持体上に存在するそれらのエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体成分へと結合する。検出は、抗原／抗体複合体のメンバーへの検出可能なマーカー（図２中に示す西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等）の結合による。結合は、共有的な手段により、又は、（例えば標準的なサンドイッチアッセイにおいて）検出可能に標識された抗体もしくは既知の抗原のその後の結合により、あるいは反応産物が検出可能な酵素反応によるものであり得る。検出可能なマーカーは、限定されるものではないが、発色団、抗体、抗原、酵素、その切断産物が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、又はローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ，Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）のような化学発光化合物、それらのマーカーの誘導体及び／又は組み合わせを含む。存在するヒトＩｇＧ分子を検出可能な、検出可能に標識された抗ヒト抗体を簡便に使用できる。あるいは、検出可能に標識されたＨＣＶ抗原、例えば、ＮＳ３／４ａ又はＭＥＦＡを使用することができる。
【００９７】
（ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープ）
上記に説明したように、本発明の改変ＭＥＦＡをＮＳ３／４ａ領域からのエピトープと組み合わせてイムノアッセイに使用することが特に好ましい。ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域は記述されており、そのタンパク質のアミノ酸配列及び全体構造は、例えば、Ｙａｏら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９９）７：１３５３−１３６３；Ｓａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７：３３９２−３４０１；及びＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．（１９９９）６：１６５−１８１中に開示されている。また、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号も参照（本明細書中にその全体が参考として援用される）。本発明のイムノアッセイは、ＮＳ３／４ａ遺伝子産物により通常呈されるプロテアーゼ酵素活性の保存、及び必要に応じてヘリカーゼ酵素活性の保存により、ならびに／又は、ＨＣＶ−１感染被験体からの生物学的サンプル中の抗体と抗原との免疫反応性の維持、及び抗原変性の際のエピトープにおける免疫反応性喪失により証明されるように、天然のＨＣＶ粒子又は、その感染産物中に見いだされるような高次構造で存在するＮＳ３／４ａ領域由来の少なくとも１つの高次構造エピトープを利用し得る。例えば、高次構造エピトープは、加熱、強酸又は強塩基へのｐＨの変化、又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）もしくは適切な界面活性剤等のような公知の有機変性剤の添加により破壊することができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ａｎｇａｌ編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）及び上記のように処理されなかった産物と比較した変性産物を参照されたい。
【００９８】
プロテアーゼ活性及びヘリカーゼ活性は、当技術分野において周知の標準的酵素アッセイを用いて測定しても良い。例えば、プロテアーゼ活性は、当技術分野において周知であるアッセイを用いて測定しても良い。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５３−１５８；及びＫｉｍら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照されたい。プロテアーゼ活性を試験するための特に便利なアッセイを以下の実施例において示す。
【００９９】
同様に、ヘリカーゼ活性アッセイは当技術分野において周知であり、ＮＳ３／４ａエピトープのヘリカーゼ活性は、例えばＨｓｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２５３：５９４−５９９中に記載のＥＬＩＳＡアッセイ；Ｋｙｏｎｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７：１２０−１２６中に記載のシンチレーション近傍アッセイシステム；例えば、Ｈｉｃｈａｍら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（２０００）４６：１８１−１９３及びＫｗｏｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０００）２４：９７−１１６中に記載の高スループットスクリーニングアッセイ；ならびにその他の本技術分野で公知のアッセイにより決定できる。例えば、Ｋｈｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５：２０５−２１４；Ｕｔａｍａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２７３：３１６−３２４；Ｐａｏｌｉｎｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）８１：１３３５−１３４５；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：５１７４−５１８３；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９８）１９：３５３−３６４；及びＨｅｓｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：２６１９−２６２５参照。
【０１００】
高次構造ＮＳ３／４ａエピトープが用いられる場合、抗原の長さは、免疫反応性の高次構造エピトープを維持するのに十分である。しばしば、使用される抗原を含むポリペプチドはほとんど完全長であるが、ポリペプチドを例えば、溶解性を向上させるため、又は分泌を改善するために、短縮することもできる。通常、ＮＳ３／４ａ中に見いだされる高次構造エピトープは組換えポリペプチドとして細胞中で発現され、このポリペプチドは所望の形態において、以下に記載のエピトープを提供する。
【０１０１】
ＮＳ３／４ａポリペプチドに対する代表的なアミノ酸配列を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。図１３Ａ〜１３Ｄの２位〜６８６位に示されるアミノ酸配列はＨＣＶ−１における１０２７位〜１７１１位のアミノ酸に相当する。Ｍｅｔをコードする開始コドン（ＡＴＧ）を１位に示す。さらに、ＨＣＶ−１の１４２８位に通常存在するＴｈｒ（図１３における４０３位のアミノ酸）がＰｒｏへと変異し、ＨＣＶ−１の１４２９位に通常存在するＳｅｒ（図１３における４０４位のアミノ酸）がＩｌｅへと変異している。このＮＳ３／４ａ高次構造エピトープを本明細書中で「ＮＳ３／４ａ  ＰＩ」及び「ＮＳ３ＮＳ４ａ  ＰＩ」と称する。しかしながら、その天然の高次構造を保持し又は回復させる方法を用いてエピトープが生成される限り、Ｎ−末端のＭｅｔを有するかもしくは有しない天然の配列、Ｎ−末端のＭｅｔを有するかもしくは有しない示されるアナログ（すなわち、「ＰＩ」アナログ）、又はその他のアナログ及びフラグメントのいずれかを本発明のアッセイにおいて使用することができる。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号及びＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号参照、両者はＮＳ３／４ａのアナログを記載する。
【０１０２】
ＮＳ３／４ａのＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされたおよそ１０２７位〜１２０７位（図１３の２位〜１８２位）に見出される。ＮＳ３プロテアーゼの構造及び活性部位は公知である。例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０参照。通常耐容性のある天然の配列に対する変化は、この分子の活性部位の外側に存在する。特に、図１３の１〜又は２〜１５５のアミノ酸をほとんど置換しないか、又は保存的な置換のみを有するように維持することが望ましい。１５５位より後ろに存在するアミノ酸は、より大きな変化に耐える。さらに、ＮＳ３／４ａ配列のフラグメントを使用する場合、これらのフラグメントは通常、Ｎ−末端のＭｅｔを有する又は有しない少なくとも１〜又は２〜１５５のアミノ酸、好ましくは１〜又は２〜１７５のアミノ酸及び、最も好ましくは１〜又は２〜１８２のアミノ酸を含む。ヘリカーゼドメインは、ＨＣＶ−１のおよそ１１９３位〜１６５７位（図１３における２０７位〜６３２位）において見出される。したがって、ヘリカーゼ活性が所望される場合には、分子のこの部分はほとんど変化しない又は保存的な変化のみを有して保持されるであろう。当業者は、ＮＳ３／４ａの公知の構造に基づいて、変化に耐えるその他の領域を容易に決定することができる。
【０１０３】
上記に説明したように、限定されるものではないが、ｃ３３ｃ領域、ｃ２００領域、ｃ１００領域及び５−１−１領域、並びにｃ２５のようなＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質由来の抗原を含む、ＮＳ３／４ａ由来のエピトープを含む多数の抗原が公知である。
【０１０４】
その他のＨＣＶ領域からの、これら及び種々のその他のＨＣＶエピトープの記述に関しては、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開第９３／００３６５号；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；及び米国特許第６，２８０，９２７号及び同第６，１５０，０８７号を参照（本明細書中にそれらの全体が参考として援用される）。
【０１０５】
（ＨＣＶ抗原の生産）
上記に説明したように、本発明の分子は通常組換え的に生産される。したがって、本発明と共に使用するためのＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは標準的な分子生物学の技法を用いて製造可能である。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列を、組換え手法を用いて（例えばその遺伝子を発現している細胞からのｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーのスクリーニングによって、又はその遺伝子を含むことが知られているベクターからの遺伝子を抽出することによって）得ることができる。さらに、所望の遺伝子を、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号のような当該技術分野において記載される技法を用いてウイルスの核酸分子から直接的に単離することができる。目的の遺伝子をクローニングするのではなく、合成的に生産することもできる。分子は特定の配列のために、適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全な配列が、標準的な方法により調製されるオーバーラップしたオリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコード配列へと組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；及びＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１参照。
【０１０６】
従って、好適な場合に、部位特異的突然変異誘発技術及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のような当該技術分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、特定のヌクレオチド配列を、所望の配列を保持するベクターから得てもよく、又は、完全にもしくは部分的に合成してもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得るための１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成装置で製造されるオーバーラップした合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットを、アニーリングし、次いで適切なＤＮＡリガーゼにより連結して、連結されたヌクレオチド配列をＰＣＲを介して増幅することによる。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４−４０８８参照。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５−８２）、予め存在するヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）、及び、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３）を用いたギャップオリゴヌクレオチドの酵素的埋め合わせ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）が、タンパク分解性切断部位の変化及び／又はプロテアーゼに対する感受性の低減を分子にもたらす本発明の下で使用され得る。
【０１０７】
ＭＥＦＡの製造方法は当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，４２８，７９２号；同第６，５１４，７３１号；同第６，６３２，６０１号；同第６，７９７，８０９号中に記載されており、その開示は本明細書中にその全体が参考として援用される。手短に言えば、ＭＥＦＡ中で使用するための所望のエピトープをコードするＤＮＡを合成的に製造するか、又は同じものを含むベクターから上述のように入手する。所定の順序でエピトープをコードする配列を連結し、ＭＥＦＡの設計における改変を助けることによって本発明の有用性を増加させることができるようにするために、固有の制限酵素部位を導入することができる。制限酵素部位及びクローニング方法の選択は、組換えＤＮＡ技術における通常の技術を有する者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部（クローニングによってエピトープ間に作られたアミノ酸配列）は非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはＨＣＶエピトープに隣接して存在しない非ＨＣＶ配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体に結合し得、偽陽性のアッセイ結果をもたらし得る。接合部配列によるＭＥＦＡとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするＤＮＡ配列は、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用が低減され、エピトープフラグメントのクローニングが可能となるように変異され得る。ヌクレオチド配列は次いで発現カセット内に配置され、好適な宿主がこのカセットを用いて形質転換される。宿主は、この配列を発現して、ＭＥＦＡを提供し得る。次いで、産生されたＭＥＦＡを、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。このプロセスは、所定のエピトープの複数のコピーが存在することによってある程度効率化される。
【０１０８】
ＨＣＶ変異体のような所望のヌクレオチド配列の変異体又は類似体を製造する方法は周知である。例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号及びＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号参照。イムノアッセイにおける使用のためのＨＣＶ抗原の変異体又はアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠損させることにより、配列を挿入することにより、及び／又はその配列内の１以上のヌクレオチドを置換することにより調製され得る。部位特異的突然変異誘発などのようなヌクレオチド配列を改変するための技法は当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−  ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６４０９参照。
【０１０９】
ひとたびコード配列が調製されるか又は単離されると、このような配列は任意の好適なベクター又はレプリコンへとクローニング可能である。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選定はその選択の問題である。好適なベクターは、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、クロモソーム又は適切な制御エレメントと組み合わせたときに複製可能なウイルスを含む。
【０１１０】
次いで、コード配列を、発現のために用いられる系に依存して、好適な制御エレメントの制御下に置く。すなわち、このコード配列を、プロモーター、（細菌性発現のための）リボソーム結合部位及び、必要に応じて目的のＤＮＡ配列が好適な形質転換体によりＲＮＡへと転写されるためのオペレーターの制御下に置くことができる。コード配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって後に除去され得るシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号参照。
【０１１１】
制御配列に加えて、宿主細胞の成育に関する配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが望ましい場合がある。調節配列は当業者に公知であり、その例には、化学的又は物理的刺激（調節化合物を含む）に対して応答して遺伝子の発現が作動する又は作動が切れることをもたらすものを含む。その他のタイプの調節エレメントには、ベクター中に存在するものもある。例えば、エンハンサーエレメントは、本明細書中で、構築物の発現レベルを増加させることができる。例としてはＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）、及びＣＭＶイントロンＡ配列（米国特許第５，６８８，６８８号）中に含まれるエレメントのようなヒトＣＭＶ由来のエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）を含む。発現カセットはさらに、好適な宿主細胞における自己複製のための複製起点、１以上の選択マーカー、１以上の制限酵素部位、高コピー数に関する潜在力及び強力なプロモーターを含み得る。
【０１１２】
好適な調節配列を伴うベクター中に特定のコード配列が配置され、その制御配列に対してコード配列の位置及び向きが、そのコード配列が制御配列の「制御」下で転写される（すなわち、制御配列の位置でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）ような位置および向きであるように、発現ベクターを構築する。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成することが所望され得る。例えば、いくつかの場合においては、それが適切な向きで制御配列へと連結される（すなわちリーディングフレームを維持する）ように、その配列を改変することが必要であり得る。制御配列及びその他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコード配列へと連結され得る。あるいは、コード配列を、すでに制御配列及び適切な制限部位を有する発現ベクターへと直接的にクローニングしてもよい。
【０１１３】
分子は、広範な系において発現させられ得、これらの系としては、昆虫発現系、哺乳類発現系、細菌発現系、ウイルス発現系及び酵母発現系が挙げられ、これらは全て、当技術分野において周知である。例えば、バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系は当業者に公知であり、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）中に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料及び方法は、キットの形態で、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニアから市販されている（「ＭａｘＢａｃ」キット）。同様に、細菌及び哺乳類の細胞発現系は当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）において記載されている。酵母の発現系も当技術分野において公知であり、例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら，編，１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ中に記載されている。
【０１１４】
上記の系と共に使用するための多数の好適な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳類の細胞株が当該分野で公知であり、限定されるものではないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎臓細胞、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞などの、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．のような細菌宿主も、本発明の発現構築物による用途を見出すであろう。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉを含む。
【０１１５】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当技術分野において周知の種々の遺伝子送達技術を用いて宿主細胞ゲノムへと安定的に組み込まれ得るか、又は好適な宿主細胞中の安定なエピソーム成分上に保持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい。
【０１１６】
上記で説明したように、組換え発現を助けるために、ＭＥＦＡのコード配列を別の配列に融合し得る（例えば、５０ｋＤａのＥ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質をコードする配列との融合物、酵母スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードする配列又はそれらのフラグメントとの融合物、あるいはユビキチンをコードする配列との融合物）。ヒトＳＯＤのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は公知であり、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、米国特許第５，７１０，０３３号中で報告されている。
【０１１７】
発現系及び選択される宿主に依存して、上述の発現ベクターにより形質転換された成育中の宿主細胞によって、タンパク質が発現する条件下で分子が生産される。発現されたタンパク質は次いで宿主細胞から単離され、精製される。発現系がタンパク質を生育培地へと分泌する場合、その産物を培地から直接精製することができる。それが分泌されない場合には、細胞溶解液から単離できる。好適な生育条件及び回収方法は当該分野の技術範囲内である。
【０１１８】
上述の種々の融合において使用される抗原を含む種々のＨＣＶ抗原の組換え生産が記述されている。例えば、国際公開第９４／０１７７８号、同第９３／００３６５号、同０４／００５４７号及び同０１／３８３６０号；米国特許第５，３５０，６７１号、同第５，６８３，８６４号、同第６，３４６，３７５号、同第６，１５０，０８７号、同第６，５１４，７３１号、同第６，４２８，７９２号及び同第６，６３２，６０１号；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開第９４／０１７７８号；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５を参照（全ての開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。
【０１１９】
（免疫診断アッセイ）
一旦産生されると、ＨＣＶ抗原は、抗体を検出するために既知の抗原を使用する実質的に任意のアッセイ形式において使用され得る。これらの全てのアッセイに共通する特徴は、抗原が、ＨＣＶ抗体を含むことが疑われる身体の成分と、この抗原がこの成分中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で、接触させられることである。このような条件は、代表的に、生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度であり、過剰な抗原を用いる。この抗原と標本とのインキュベーションの次に、抗原からなる免疫複合体の検出が行われる。
【０１２０】
イムノアッセイの設計は、大きな変動に供され得、そして多くの形式が、当該分野で公知である。例えば、プロトコールは、固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降を使用してもよい。ほとんどのアッセイは、標識化抗体もしくは標識化ポリペプチドの使用を包含する；例えば、この標識は、上で詳しく考察した通り、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子もしくは色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた、公知である。このアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに酵素標識化イムノアッセイおよび酵素媒介型イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【０１２１】
このイムノアッセイは、限定されないが、異種形式でも同種形式でもよく、そして標準型でも競合型でもよい。異種形式において、抗原が、代表的に、固体マトリックスもしくは固体支持体に結合し、インキュベーション後に、サンプルからの抗原抗体結合体の分離を容易にする。本発明の目的のために、固体支持体は、可溶性マトリックスである任意の材料であり得、そして剛性もしくは半剛性の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ニトロセルロースのような基質（例えば、膜もしくはマイクロタイターウェル形態）；塩化ポリビニル（例えば、シートもしくはマイクロタイタープレート）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズもしくはマイクロタイターウェル）；フッ化ポリビニリジン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性型ビーズ、磁気応答ビーズなど。具体的な支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空ファイバー、針、ピン、固体ファイバー、セルロースビーズ、穴あきガラス（ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）ビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンに架橋したポリスチレンビーズ、グラフト共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンに架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられる。
【０１２２】
所望される場合、上記固体支持体に添加されるべき分子は、スチレン部分もしくはアクリレート部分を作製するように容易に官能性付与され得、それによって、この分子のポリスチレン、ポリアクリレートもしくは他のポリマー（例えば、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、石英ガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸塩、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどへの組み込みを可能にする。
【０１２３】
上記抗原は、固体支持体に直接固定される必要はなく、間接的に（例えば、別の結合分子を介して）結合されてもよい。例えば、この抗原に結合する既知の抗体は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。目的の抗原（例えば、ＭＥＦＡもしくはＮＳ３／４ａ高次構造エピトープ）が、ビオチン化抗体への結合によって固体支持体に結合される。あるいは、目的の抗原は、ビオチン化され得、そしてストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングされた固体支持体と合わせられ得る。
【０１２４】
１種より多くのＨＣＶ抗原（例えば、改変ＭＥＦＡおよび高次構造ＮＳ３／４ａエピトープ）がアッセイにおいて使用される場合、これらの抗原は、同じ固体支持体上もしくはこのアッセイにおいて合わせられ得る異なる固体支持体上で提供され得る。したがって、例えば、これらの抗原は、別個の実態として、例えば、１枚のプレート上に存在してもよく、または、例えば、目的のアッセイにおける使用のために一緒に加えられる個々の微小ビーズ上に存在してもよい。
【０１２５】
１つの状況において、図２で示すように、固体支持体は、最初に、例えばＨＣＶ  ＭＥＦＡ７．２およびＮＳ３／４ａのようなＨＣＶ抗原（本明細書中で、集合的に「固相成分」と呼ぶ）と、この分子が十分に固体支持体に固定化されるような適切な結合条件下で反応させられる。時々、支持体への固定化は、最初により良い固相結合特性を有するタンパク質へ抗原とカップリングすることによって増強され得る。適切なカップリングタンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、および当業者に公知の他のアルブミン。分子を支持体に結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子およびこれらの分子の抗原へのカップリングの方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照されたい。
【０１２６】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定化固相成分は、洗浄によって支持体から除去され、次いで、この支持体に結合した成分は、ＨＣＶ抗体（本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ぶ）を含むことが疑われる生物学的サンプルと、適切な結合条件下で接触させられる。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、その固体支持体上でＨＣＶ抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、検出可能に標識化された抗体（例えば、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する抗外因性抗体（例えば、抗ヒト抗体））が、添加される。これらの抗体は、複合体形成に起因して結合する。
【０１２７】
別のアッセイ形式が、図３に示される。このアッセイ形式は、当該分野で周知であり、ビオチン標識化抗体（改変ＭＥＦＡおよび、必要な場合ＮＳ３／４ａ（例えば、ＮＳ３／４ａ高次構造エピトープ）と結合する）と反応させられるストレプトアビジンコーティングされた固体支持体を用いる。このサンプルは、適切な結合条件下で加えられる。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と複合体を形成する。任意の非結合リガンド分子を除去するための洗浄の後、上述のように、検出可能に標識化された抗体が添加される。
【０１２８】
同種形式において、試験サンプルは、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートされる。例えば、これは、形成された任意の抗原−抗体複合体を沈殿する条件下であり得る。同種アッセイのための標準形式および競合形式の両方が、当該分野で公知である。
【０１２９】
標準形式において、抗体−抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体の量が、直接モニタリングされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識化抗外因性抗体（例えば、抗ヒト抗体）が、複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって、達成され得る。競合形式において、サンプル中のＨＣＶ抗体の量は、複合体中の既知の量の標識化抗体（または他の競合性リガンド）の結合における競合作用をモニタリングすることによって推定される。
【０１３０】
より詳細には、抗ＨＣＶ抗体（または、競合アッセイにおいては、競合性抗体の量）を含んで形成される複合体が、その形式に依存して、多くの公知の技術のいずれかによって検出される。例えば、その複合体中の未標識化ＨＣＶ抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗外因性Ｉｇの結合体を用いて検出され得る。免疫沈降アッセイ形式もしくは凝集アッセイ形式において、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応は、ネットワークを形成し、このネットワークは、溶液もしくは懸濁液から沈殿し、そして沈殿物の可視の層もしくは薄膜を形成する。抗ＨＣＶ抗体が試験標本中に存在しない場合、可視の沈殿物は形成されない。
【０１３１】
代替の実施形態において、ＮＳ３／４ａもしくは改変ＭＥＦＡが、サンドイッチ型アッセイ形式において検出薬剤として使用され得る。サンドイッチアッセイは、当該分野で周知である。
【０１３２】
上述のアッセイ試薬（結合した抗体および抗原を有するイムノアッセイ固体支持体、ならびに捕獲したサンプルと反応させられる抗体および抗原を含む）は、上述のイムノアッセイを実施するために、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキット中で提供され得る。このキットは、抗原の組み合わせ（既に固体マトリックスに結合しているか、またはそれら抗原をマトリックスに結合するための試薬と別個であるかのいずれか）、コントロール抗体処方物（ポジティブおよび／またはネガティブ）、標識がシグナルを直接産生しない場合にアッセイ形式が同一のシグナル発生試薬（例えば酵素基質）を必要とする場合は標識化抗体を、通常、別個の容器において含む。アッセイを実施するための指示書（例えば、書類、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）が、通常、キット中に含まれる。このキットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、他の梱包された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。上述のもののような種々のイムノアッセイが、これらのキットを用いて実施され得る。
【実施例】
【０１３３】
（ＩＩＩ．実施例）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの例は、例示のみの目的で提供され、そして本発明の範囲を限定することをいかなるようにも意図しない。
【０１３４】
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを期するために努力がなされているが、無論、ある程度の実験誤差および偏差は許容される。
【０１３５】
（実施例１）
（ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２の構築）
以下の実施例は、複数のＨＣＶエピトープのポリタンパク質カセットの調製を説明する。複数のエピトープカセットから発現するこのポリタンパク質を、本明細書中では多エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）と称する。好ましくは、エピトープが繰り返される場所においては、余分なコピーは同じ向きに直列して配列される。エピトープとして使用されるウイルスのコード配列のこの領域は、わずかに変化し得かつ抗原活性をなお保持することが理解され、そのアミノ酸の指定番号付けは株ごとに相違し得ることが理解される。従って、繰り返しエピトープは株の配列バリエーション及び／又は番号付けの指定により、アミノ酸配列中で互いに異なり得る。好ましくは、ＭＥＦＡ内の繰り返しエピトープのアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも３０％相同であり、より好ましくは、アミノ酸レベルで少なくとも４０％相同である。
【０１３６】
固有の制限酵素部位を、キメラ抗原の設計における改変を手助けすることにより、予め決められた順序でエピトープを連結するように、本発明の有用性を高めるように、導入した。制限酵素切断部位及びクローニング手法の選択は、組換えＤＮＡ技法の分野の当業者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部（クローニングによりエピトープの間に作り出されるアミノ酸配列）は、非特異的エピトープを生じない。非特異的エピトープは、例えば、天然にはＨＣＶエピトープに隣接して存在しない非ＨＣＶ配列である。非特異的エピトープは、試験サンプル中の抗体と結合して偽陽性のアッセイ結果をもたらす場合がある。好ましくは、多エピトープ融合タンパク質を、エピトープ接合部において生じるこのような配列による偽陽性の結果について試験する。接合部配列による、ＭＥＦＡとの非特異的な相互作用を回避するため、接合部をコードするＤＮＡ配列を、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的な相互作用を減少させ、エピトープフラグメントのクローニングが可能になるように変異させることができる。
【０１３７】
例えば、ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２の図解をそれぞれ示す図４及び図８において示すように、主要エピトープを直列配置で含有するコードヌクレオチド配列のクローニングによってＨＣＶ  ＭＥＦＡ  ７．１及びＨＣＶ  ＭＥＦＡ  ７．２の発現カセットを構築した。主要エピトープは抗体反応の頻度及びエピトープに対する反応強度（力価）に基づいて選択された（Ｃｈｅｉｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９４）Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ｐｐ．３２０−３２４）。ＰＣＲ増幅により、又は合成オリゴヌクレオチドによって、ＨＣＶエピトープをコードする種々のＤＮＡセグメントが構築された。ＭＥＦＡ７．２の各セグメント中のアミノ酸は上記の表２及び図９Ａ−９Ｆ中で示される。完全なＨＣＶ−１アミノ酸配列（３０１１個のアミノ酸）がＣｈｏｏら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５（本明細書中でその全体が参考として援用される）により決定される。ＨＣＶと結合し得るオリゴヌクレオチドは米国特許第５，３５０，６７１号中に記載される（本明細書中でその全体が参考として援用される）。本発明のエピトープにおけるアミノ酸の番号付けは、別に特定されない限り、Ｃｈｏｏら（前出）により提供される番号付け指定に従う。この番号付けにおいて、アミノ酸番号１は、コア領域のコード配列によりコードされる第１番目のメチオニンである。例えば、ＮＳ５からの１つのエピトープセグメントがＨＣＶポリタンパク質の２２７８〜２３１３のアミノ酸により表される。Ｅ１領域からのエピトープはＨＣＶ−１ポリタンパク質と比較して番号付けされた３０３〜３２０のアミノ酸により表される。
【０１３８】
ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２は各々ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２及びＨＣＶ−３からのエピトープを含み、単回のアッセイでウイルスの複数タイプの検出を可能にする。ＨＣＶ血清型の決定方法は国際公開第９６／２７１５３号中に見出され、本明細書中でその全体が参考として援用される。例えば、５−１−１領域からのエピトープはＨＣＶの血清型間で異なることが見出されている。本明細書中で記載されるＭＥＦＡ中に存在する、ＨＣＶ型特異的な５−１−１エピトープのそれぞれのコピーは、試験生物学的サンプル中に存在し得る任意のＨＣＶ型の結合を可能にする。
【０１３９】
ＭＥＦＡ構築物を、酵母における自己複製のための２μ配列ならびに選択可能なマーカーとしての酵母遺伝子ｌｅｕ２−ｄ及びＵＲＡ３を含む酵母の発現ベクターｐＢＳ２４．１を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のために遺伝子操作した。細菌におけるプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子及びＣｏｌＥ１複製起点もまた、この発現ベクター中に存在していた。ＭＥＦＡ  ７についての酵母発現ベクターであるｐｓ．ＭＥＦＡ７を最初に構築した。次いで、ＭＥＦＡ７．１抗原をコードするプラスミドであるｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を作り出すために、ＨＣＶコアエピトープに関するコード領域においてプラスミドを改変した。最終的に、アミノ酸の１４２８位／１４２９位、１４５５位／１４５６位、１６５７位／１６５８位及び１７１１位／１７１２位に存在するＮＳ３タンパク分解性切断部位（５−１−１エピトープ中で３つの繰り返しとして存在する）を変異させることにより、ＭＥＦＡ７．２抗原を作出した。
【０１４０】
特に、図６Ａ〜６Ｄに示すように、ＭＥＦＡ  ７についての酵母発現プラスミドを以下のように構築した。まず、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーター、ｈＳＯＤ（ヒトＳＯＤ、アミノ酸１〜１５６）、その後に続くＥ１エピトープ（アミノ酸３０３〜３２０、ＨＣＶ１株）をコードする１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、国際公開第９７／４４４６９号中に記載されたＭＥＦＡ  ６（図１２Ｃ）をコードする発現プラスミドであるｐｓ．ＭＥＦＡ６から単離した。次に、Ｅ２  ＨＶＲ１ａ共通エピトープ（アミノ酸３９０〜４１０、ＨＣＶ−１）、Ｅ２  ＨＶＲ１＋２共通エピトープ（アミノ酸３８４〜４１４、ＨＣＶ１＋２）及びヘリカーゼドメインの５’末端（アミノ酸１１９３〜１２２９、ＨＣＶ−１）のコード配列を含む２６９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ合成ＤＮＡフラグメントを作製した。ヘリカーゼドメイン（アミノ酸１２３０〜１６５１、ＨＣＶ−１）の残りの部分をコードする１２６４ｂｐのＳｐｈＩ／ＥｃｌＸＩフラグメントを、ｐＴａｃ５／ＨｅｌＩプラスミドプラスミドＤＮＡからゲル精製した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ合成ＤＮＡフラグメント及びＳｐｈＩ／ＥｃｌＸＩの１２６４ｂｐのフラグメントを、ベクターｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩベクターへと連結し、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩ／ｅ２．ヘリカーゼを生産した。このベクターはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ウイスコンシン州）から市販されているｐＳＰ７２由来のＥ．ｃｏｌｉベクターであった（ＧｅｎＢａｎｋ／ΕＭＢＬ登録番号Ｘ６５３３２）。特に、いくつかのＭΕＦＡ  ７エピトープをサブクローニングすることを容易にするために、ｐＳＰ７２のＳｐｈＩ部位とＢｇｌＩＩ部位との間に、合成オリゴを介して新たなマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）ポリリンカーを導入した。ｐＳＰ７２ｎｅｗと称するこの新たなプラスミドを、ＭＣＳ中に唯一の部位を有するＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｌＸＩ（ＥａｇＩとしても知られる）で消化した。次いで、それを脱リン酸化してゲル精製した。
【０１４１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞をこのプラスミドを用いて形質転換し、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬｕｒｉａ寒天プレート上にプレート培養した。所望のクローンを、ミニプレップＤＮＡ分析を用いて同定した。配列確認後、このプラスミドｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩ／ｅ２．ヘリカーゼサブクローン＃４をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｌＸＩ（ＥａｇＩ）で消化し、１５３４ｂｐのフラグメントを生成させた。このＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩフラグメントをゲル精製し、ヘリカーゼドメインの最後のアミノ酸（アミノ酸１６５１〜１６５８、ＨＣＶ−１）をコードするＥｃｌＸＩ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドと共に、ｐＧＥＭ７  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩベクターへと連結した。ＨＢ１０１コンピテント細胞を形質転換し、Ｌｕｒｉａアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）上にプレート培養した。所望のクローンの同定及び配列確認後、ｐＧＥＭ７ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩサブクローン＃９をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｐｈＩで消化し、ゲル精製された１５６０ｂｐのフラグメントを生成させた（図６Ａ参照）。
【０１４２】
ＭＥＦＡ  ７の３’末端部分を組み立てるために、以下の工程を実行した。ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−３及びＨＣＶ−２（この順番で）からの５−１−１エピトープ（アミノ酸１６８９〜１７３５）を、国際公開第９７／４４４６９号中に４４１ｂｐのＳｐｈＩ／ＡｖａＩフラグメントとして記載されたＭＥＦＡ  ６をコードする発現プラスミドであるｐｓ．ＭＥＦＡ６からゲル単離した。このフラグメントを、ｃ１００エピトープ（アミノ酸１９０１〜１９３６）をコードする合成ＡｖａＩ／ＸｂａＩオリゴヌクレオチドと共に、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＳｐｈＩ／ＸｂａＩベクターへと連結した。ＨＢ１０１形質転換、クローン同定及び配列確認後に、ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸｉサブクローン＃６をＸｂａＩ及びＮｏｔＩを用いて消化し、ｐＳＰ７２ｎｅｗＸｂａＩ／ＮｏｔＩベクターを調製した。さらに、ＮＳ５エピトープ（アミノ酸２２７８〜２３１３、ＨＣＶ−１）の２回繰り返しをコードする２２１ｂｐのＸｂａＩ／ＮｃｏＩフラグメントをｐｓ．ＭＥＦＡ６から単離した。このＸｂａ／ＮｃｏＩフラグメントを、ＨＣＶ−１のコアエピトープの第１番目のアミノ酸をコードするＮｃｏＩ／ＮｏｔＩオリゴヌクレオチド、９位のＬｙｓがＡｒｇへと変化し、１１位のＡｓｎがＴｈｒへと変化したアミノ酸９〜１７と共に、上記で調製されたｐＳＰ７２ｎｅｗＸｂａＩ／ＮｏｔＩベクターへと連結した。ＨＢ１０１形質転換体を分析し、それらのプラスミドＤＮＡを配列解析した。ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮｉ＃３と名付けたサブクローンをＮｏｔＩ／ＳａｌＩを用いて消化し、続くサブクローニングのためのベクターを調製した（図６Ｂ参照）。
【０１４３】
ＭＥＦＡ  ７の３’末端の組み立てを完成するために、コアエピトープをコードする配列の２回繰り返しを、ＨＣＶ−１からのアミノ酸９〜５３、加えてこのコア領域の２つの遺伝子型に特異的なエピトープ（アミノ酸６４〜８８、ＨＣＶ−１及びアミノ酸６７〜８４、ＨＣＶ−２）と共に、ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ消化したｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮｉサブクローン＃３へと以下のようにサブクローニングした。まず、コアエピトープのアミノ酸１８〜５１をコードする９２ｂｐのＮｏｔＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、ｐｄ．Ｃｏｒｅ１９１ＲＴクローン＃２０から単離した。プラスミドｐｄ．Ｃｏｒｅ１９１ＲＴは、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ酵母発現ベクターへと、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターのための１３６５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメント及び、アミノ酸９がＬｙｓからＡｒｇへと変異し、アミノ酸１１がＡｓｎからＴｈｒへと変化したＨＣＶ−１コアの最初の１９１アミノ酸をコードする６１５ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントを連結することによって構築した。この６１５ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントは、上記と同じ２つの変異を伴うアミノ酸１〜１９１についてのコア配列がクローニングされたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターに由来する。
【０１４４】
９２ｂｐのＮｏｔＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮｏｔ／Ｋｐｎベクター、及び、完全コアエピトープの３’末端をコードするＸｍｎＩ／ＫｐｎＩオリゴヌクレオチドと連結した。陽性クローンの配列確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮＫｉサブクローン＃４をＮｏｔＩ及びＫｐｎＩを用いて消化し、２２４ｂｐのフラグメントをゲル単離した。このＮｏｔＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、上述のコアエピトープの完全繰り返しをコードする２８４ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ末端）と共に、上述のｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮｉ  ＮｏｔＩ／ＳａｌＩベクターへと連結した。ＨＢ１０１形質転換、クローン同定及び配列確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮ／ＮＳｉサブクローン＃１８をＳｐｈＩ及びＳａｌＩを用いて消化し、１３１７ｂｐのフラグメントをゲル単離した（図６Ｃ参照）。
【０１４５】
最後に、上述した以下のフラグメントを、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクターへと連結し、ｐｓ．ＭＥＦＡ７（図６Ｄ参照）を作製した：
１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図６Ａ）
１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩフラグメント（図６Ａ）
１３１７ｂｐのＳｐｈＩ／ＳａｌＩフラグメント（図６Ｃ）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３をｐｓ．ＭＥＦＡ７を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した（クーマシーブルー染色により検出した）。特に酵母細胞は、酢酸リチウムプロトコールを用いて、ＭＥＦＡ発現プラスミドで形質転換した。Ｕｒａ−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにＬｅｕ−／８％グルコースプレート上へと移植した。Ｌｅｕ−の出発培養物を２４時間、３０℃で生育させ、次いでＹＥＰＤ（酵母エキスバクトトリプトン２％グルコース）培地中で１：２０に希釈した。細胞を４８時間、３０℃で生育させ、回収した。ＭＥＦＡ  ７組換え抗原の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速で遠心分離した。上清及び不溶性のペレットをＳＤＳタンパク質ゲル上で分析した。ＭＥＦＡ  ７は不溶性沈殿画分中に高度に濃縮された。
【０１４６】
ＭＥＦＡ  ７抗原は以下のように精製した。ＭＥＦＡ  ７を発現しているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ  ８．０）中に懸濁し、ダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ、Ｂａｓｅｌ、スイス）又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液を低速条件（３，０００〜５，０００ｒｐｍ、１５分間）で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ）洗浄した。０．１ＮのＮａＣｌ、４Ｍの尿素を含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣を３，０００〜５，０００ｒｐｍ、１５分間の低速遠心分離によって除去した。６ＮのＨＣｌを用いて上清をｐＨ８．０に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【０１４７】
沈殿を遠心分離によって除去し、上清を２．３％のＳＤＳ、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０に調整し、３分間煮沸した。混合物中のタンパク質を、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７．４に調整したリン酸緩衝化生理食塩水中で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００上でのゲル濾過により分画した。ＭＥＦＡ  ７を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ−３０膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件を用いてゲル濾過を繰り返した。
【０１４８】
試験アッセイにおけるＭＥＦＡ  ７の分析の間に、検出結合体として使用されたモノクローナル抗体がコアエピトープ（アミノ酸３３〜３８）の特異的な配列と反応することが見いだされた。従って、ｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を、コアエピトープ領域からのアミノ酸３３〜３８を除去するように設計した。
【０１４９】
ＭＥＦＡ７．１のための酵母発現ベクターは以下のように作製した。まず、ｐｓ．ＭＥＦＡ７の３’末端におけるコアエピトープの２回繰り返しを改変した。それを行うために、第１のコアエピトープ繰り返し（ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、３９〜４２及び６４〜８８、及びＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８２）をコードする２０６ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ合成フラグメント、ならびにＨＣＶ−２のアミノ酸８３および８４、その後に第２のコアエピトープ繰り返し（ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、３９〜４２及び６４〜８８、及びＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８４）をコードする２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩ合成フラグメントを、それぞれｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩベクター及びｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＫｐｎＩ／ＳａｌＩベクターへとサブクローニングした。ＨＢ１０１形質転換、クローン同定及び配列確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮＫｉクローン＃２１をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩを用いて消化して２０６ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩフラグメントを単離し、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮＳｉクローン＃３２をＫｐｎＩ及びＳａｌＩを用いて消化して、２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメントを単離した。
【０１５０】
プラスミドｐｓ．ＭＥＦＡ７．１は、以下のフラグメントを、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクターへと連結することにより組み立てた（図７参照）：
ｐｓ．ＭＥＦＡ７について上述された１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；
ｐｓ．ＭＥＦＡ７について上述された１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩフラグメント；
ｐｓ．ＭＥＦＡ７から単離された、５−１−１エピトープ、ｃ１００エピトープ及びＮＳ５エピトープをコードする７７６ｂｐのＳｐｈＩ／ＮｃｏＩフラグメント；
２０６ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩフラグメント；
２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメント。
【０１５１】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３をｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、上述のように、培地中のグルコース枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、酵母中で高レベルで発現した（クーマシーブルー染色により検出した）。
【０１５２】
ＭＥＦＡ７．１抗原は以下のように精製した。ＭＥＦＡ７．１を発現しているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を上述のように回収した。この細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）中に懸濁し、ダイノミル（Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ）（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ、Ｂａｓｅｌ、スイス）又はグラスビーズを用いた相当する装置中で溶解させた。溶解液をＪＡ−１０ローター中、１０，０００ｒｐｍ、３０分間で遠心分離し、不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度を増加させながら（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ）洗浄した。０．１ＮのＮａＣｌ、４Ｍの尿素、５０ｍＭのＤＴＴを含む溶解緩衝液を用いて、遠心分離のペレットからタンパク質を可溶化した。細胞残渣をＪＡ−１４ローター中、１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって除去した。６ＮのＨＣｌを用いて上清をｐＨ８．０に合わせ、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【０１５３】
沈殿をＪＡ−１４ローター中、１４，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離によって除去し、上清を２．３％のＳＤＳに調整し、沸騰水中で７０〜７５℃に加熱し、次いで室温にさました。混合物中のタンパク質を、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７．４に調整したＰＢＳ中で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００ＨＲ上でのゲル濾過により分画した。ＭＥＦＡ７．１を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ−３０膜上で濃縮した。プールされた画分を、同一のカラム及び条件の下でゲル濾過を繰り返した。プールされたゲル濾過画分を２．３％のＳＤＳ、５０ｍＭのＤＴＴに調整し、上述のように加温／冷却した。このプールを、第１のゲル濾過工程と同様の条件下で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲカラム上の第２のゲル濾過工程に供した。
【０１５４】
ＭＥＦＡ７．２についての酵母発現ベクターを以下のように作製した。この大きな多エピトープ融合抗原のクローニングを容易にするために、この分子を３つの制限フラグメントへと分割した。第１番目に、１８９６ｂｐのＢａｍΗＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐｓ＿ｍｅｆａ７．１（上述）からゲル精製した。このフラグメントはＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、ヒトＳＯＤ及びＨＣＶ−１のＥ１エピトープをコードしていた。
【０１５５】
次のフラグメントである、Ｅ２  ＨＶＲ−１ａ共通、Ｅ２  ＨＣＶ１＋２共通、及びヘリカーゼドメイン（プロテアーゼ切断部位をなくすためのアミノ酸１４２８、１４２９、１４５５、１４５６、１６５７及び１６５８における変異を伴う、ＨＣＶ−１、アミノ酸１１９３〜１６５８）をコードする１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、ｐＧＥＭ７ベクターへとサブクローニングした。特に、そのコード配列は、１４２８位、１４５５位及び１６５７位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がロイシンに置換され、また、１４２９位、１４５６位及び１６５８位におけるそれぞれの天然のアミノ酸がプロリンに置換されるように変異された。従って、上記の組のそれぞれにおける変異は本明細書中で「ＬＰ」と称される。このサブクローンは、ｐＧＥＭ７  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩサブクローン＃９（「ｐＧＥＭ７／ＨＳｉ＃９」と称し上述される）から以下のように得られた：（１）１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ挿入物を含むｐＧΕＭ７ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩサブクローン＃９をＳａｃＩＩ＋ＳｐｈＩを用いて消化し、脱リン酸化して、ゲル精製し、それにより３つのプロテアーゼ切断部位が配置された７２１ｂｐのヘリカーゼを除去した。（２）最初の２箇所のＬＰ変異を含むヘリカーゼの２６６ｂｐのＳａｃＩＩ−ＢｇｌＩ部分をクローニングするために、合成オリゴを使用した。このクローニングを助けるために、オリゴは５’−末端及び３’−末端においてそれぞれＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位を含んだ。このオリゴを、ｐＵＣ１９  ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩベクターへとクローニングした。ＨＢ１０１形質転換及び陽性コロニーの配列確認後に、ｐＵＣ１９  ｍｅｆａＳＢ＃５を増幅して２６６ｂｐのＳａｃＩＩ−ＢｇｌＩフラグメントをゲル精製した。（３）４２９ｂｐのＢｇｌＩ−ＥａｇＩフラグメントを、ｐＧＥＭ７ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩサブクローン＃９からゲル精製した。ヘリカーゼのこの領域には変異が存在しない。（４）３番目の変異を含むヘリカーゼの２６ｂｐのＥａｇＩ−ＳｐｈＩ部分を完成させるために２つの付加的なオリゴを使用した。（５）２６６ｂｐのＳａｃＩＩ−ＢｇｌＩフラグメント、４２９ｂｐのＢｇｌＩ−ＥａｇＩフラグメント及び、これらの２つのオリゴをｐＧＥＭ７ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩサブクローン＃９ベクターへと連結した。得られたｐＧＥＭ７／ＳａｃＩＩ−ＥａｇＩ−ＳｐｈＩ＃６（図１１Ａ）と名付けられたΗＢ１０１クローンのひとつから、１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩフラグメントをＭＥＦＡ７．２のためにゲル精製した。
【０１５６】
ＭＥＦＡ７．２にとって必要とされる３番目の制限フラグメントである、それぞれがプロテアーゼ切断部位におけるＰＩ変異、Ｃ１００エピトープ、２つののＮＳ５エピトープ、及び２つのコアエピトープを有する、ΗＣＶ１、２、３についての５−１−１ドメインをコードする１２１５ｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメントを以下のようにサブクローニングした：（１）ΗＣＶ−１についての５−１−１  ＰＩエピトープを、合成オリゴと共にｐＵＣ１９  ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩベクターへとクローニングした。このオリゴは、ＥｃｏＲＩクローニング部位及びＳａｌＩクローニング部位にそれぞれ隣接したＳｐｈＩ部位及びＮｒｕＩ部位を含んでいた。ＨＢ１０１形質転換及び陽性クローンの配列確認後、ｐＵＣ１９  ｍｅｆａＳＮ＃１６を増幅し、１４７ｂｐのＳｐｈＩ−ＮｒｕＩ挿入物をゲル精製した。（２）ＨＣＶ−３及びＨＣＶ−２についての５−１−１  ＰＩ、Ｃ１００、及びＮＳ５繰り返しをコードする６２９ｂｐのＮｒｕＩ−ＮｃｏＩフラグメントを、ｐｓ．ｍｅｆａ１３＃１２（米国特許第６，６３０，２９８号（本明細書中にその全体が援用される）に記載される）からゲル精製した。（３）コアエピトープの２回の繰り返しをコードする４３９ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐｓ．ｍｅｆａ７．１＃１５からゲル精製した。（４）１４７ｂｐのＳｐｈＩ−ＮｒｕＩフラグメント、６２９ｂｐのＮｒｕＩ−ＮｃｏＩフラグメント、及び４３９ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐＧＥＭ５  ＳｐｈＩ−ＳａｌＩベクターへと連結した。得られたクローンのひとつであるｐＧＥＭ５  ＳｐｈＩ−ＳａｌＩ．ｍｅｆａ．７．２＃６２（図１１Ｂ）から、１２１５ｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ挿入物をゲル単離した。
【０１５７】
最終的に、１８６９ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩフラグメント及び１２１５ｂｐのＳｐｈＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ＢａｍΗＩ−ＳａｌＩ  ｐＢＳ２４．１酵母発現ベクターへと連結した。ＨＢ１０１形質転換及びミニスクリーン分析後、２つの陽性クローンが正確な大きさのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物を有することが見いだされた。プラスミドＤＮＡを、ｐｓ．ｍｅｆａ７．２＃３及びｐｓ．ｍｅｆａ７．２＃４２について増幅した（図１１Ｃ）。
【０１５８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｅａｓｙ  Ｃｏｍｐ  Ｓｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア）を使用して、ｐｓ．ＭＥＦＡ７．２で形質転換した。Ｕｒａ−の形質転換体を画線培養して単コロニーを得、プラスミドのコピー数を増加させるためにＬｅｕ‐／８％グルコースプレート上へと移植した。Ｌｅｕ−の出発培養物を２４時間、３０℃で生育させ、次いでＹＥＰＤ（酵母エキスバクトトリプトン２％グルコース）培地中で１：２０に希釈した。細胞を４８時間、３０℃で生育させ、回収した。組換えタンパク質の発現を試験するために、細胞のアリコートを溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ  ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ）中でグラスビーズを用いて溶解した。溶解液を高速遠心分離により清澄にした。不溶性のペレット画分をＳＤＳタンパク質ゲルのクーマシー染色により分析した。１２０ｋＤａのＭＥＦＡ７．２タンパク質が高度に発現された。
【０１５９】
ＭＥＦＡの存在は、上記ＭＥＦＡのそれぞれがヒトＳＯＤのアミノ酸１〜１５６を含むので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル）及びｈ−ＳＯＤに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットを用いて確認した。
【０１６０】
ＭＥＦＡ７．２に関するＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図９Ａ〜９Ｆに示す。
【０１６１】
（実施例２）
（ＮＳ３／４ａＰＩの生産）
ＮＳ３／４ａＰＩは、通常１４２８位及び１４２９位に存在し、プロテアーゼの推定自己加水分解部位を除去するアミノ酸の変異を伴う、完全長ＮＳ３ＮＳ４ａタンパク質（アミノ酸１０２７〜１７１１）である。米国特許第６，６３０，２９８号及び第６，６３２，６０１号を参照されたい。このエピトープは図１３Ａ〜１３Ｄに特定される配列を有し、４０３位（ＨＣＶ−１完全長配列のアミノ酸１４２８）及び４０４位（ＨＣＶ−１完全長配列のアミノ酸１４２９）において天然の配列と異なっている。具体的には、天然の配列の１４２８位において通常ＴｈｒであるものがＰｒｏへと変異し、天然の配列の１４２９位において通常ＳｅｒであるものがＩｌｅへと変異している。この分子は「ＮＳ３／４ａＰＩ」と称された。この分子はまた、本明細書中で「ＮＳ３ＮＳ４ａ  ＰＩ」とも呼ばれる。
【０１６２】
本明細書中でその全体が参考として援用される米国特許第６，６３２，６０１号に記載されたように、ＮＳ３／４ａＰＩを生産し、酵母中で発現させた。ＮＳ３／４ａＰＩタンパク質の存在は、ＮＳ３プロテアーゼドメインに対するポリクローナル抗体及び、ＮＳ４  ５−１−１エピトープに対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにより確認した。ＮＳ３／４ａエピトープのプロテアーゼ活性は、ＭＥＦＡ７．１を基質として用い、以下にさらに記載するように実証した。
【０１６３】
（実施例３）
（ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２におけるＮＳ３／４ａＰＩのタンパク分解性切断活性）
改変ＭＥＦＡであるＭＥＦＡ  ７．２がタンパク分解性切断を受けないことを確認するために、以下の実験を行った。ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２をそれぞれ、上述のように製造したＮＳ３／４ａＰＩと共に、室温にて３０分間インキュベートした。タンパク質ゲルサンプルを調製し、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動して、クーマシーブルーを用いてゲルを染色した。さらに、ｈＳＯＤに対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。上述の通り、ＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２の両方がｈＳＯＤと融合した。結果を図１４Ａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び１４Ｂ（ウェスタンブロット）中に示す。これで見られるように、ＮＳ３／４ａはＭＥＦＡ  ７．１（レーン５、図１４Ａ及び図１４Ｂ）を分解した。一方、ＭＥＦＡ７．２は、全く分解を示さなかった（レーン６、図１４Ａ及び図１４Ｂ）。したがって、ＮＳ３タンパク分解性切断部位はＭＥＦＡ  ７．２中で首尾よく変異されていた。
【０１６４】
（実施例４）
（モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体結合アッセイ）
ＨＣＶ特異的組換えコア抗原、Ｅ１抗原、Ｅ２抗原、ＮＳ３抗原、ＮＳ４抗原、及びＮＳ５抗原に対し惹起したモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を、抗原性の評価及びＭＥＦＡ  ７．１、ＭＥＦＡ  ７．２及びＮＳ３／４ａ  ＰＩにエピトープを曝すために使用した。精製ＭＥＦＡ又はＮＳ３／４ａ  ＰＩをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で最適なコーティング濃度に希釈し、Ｃｏｓｔａｒ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）上にコーティングした。線状エピトープ又は高次構造エピトープのいずれかに対する抗体を適宜希釈して、プレートへと添加した。３７℃、１時間のインキュベーション後、そのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化させたヤギ抗マウスＩｇＧ又はヤギ抗ウサギＩｇＧと共に、１時間、３７℃でインキュベートした。最後に、Ｈ２Ｏ２及び基質であるｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を含有する発色緩衝液をウェルに添加し、４９２ｎｍ及び６２０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）をプレートリーダーを用いて測定した。
【０１６５】
表３に示すように、試験されたエピトープに特異的な各々の抗体はＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２の両方と反応し、（ｉ）ＭＥＦＡ上の全ての主要エピトープが露出し、従って検出のために接近可能であること、及び（ｉｉ）ＭＥＦＡ７．２中のアミノ酸変異が線状エピトープの露出を変化させないことを示した。
【０１６６】
（実施例５）
（ＭＥＦＡ及びＮＳ３／４ａＰＩを用いたイムノアッセイ）
ＮＳ３のＣ３３ｃ抗原及びＣ２２コア抗原は非常に免疫原性であり、Ｃ３３ｃ及びＣ２２に対する抗体は初期セロコンバージョンパネルにおいて見出されている（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５）。従って、セロコンバージョン感度を調べるために、ＨＣＶ−１に感染したヒト血液サンプルの十分に特性が明らかにされた市販のＣ３３ｃ及びＣ２２のパネルを用いて、イムノアッセイにおけるこの抗原の性能を試験した。以下の表に示すＰＨＶパネルを、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＭＡ（ＢＢＩ）；Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ（ＢＣＰ）；及びＮｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＢｏｃｏＲａｔａｎ、ＦＬ（ＮＡＢＩ）から購入した。アッセイは、以下のように行った。
【０１６７】
ＨＣＶ抗原をイムノアッセイのために以下のようにプレート上にコーティングした。ＨＣＶコーティング緩衝液（５０ｍＭのＮａ３ＰＯ４、ｐＨ７．０、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％のクロロアセタミド）を０．２２μのフィルターユニットを通過させて濾過した。次いで以下の試薬を順にこのＨＣＶコーティング緩衝液に加え、添加を行うごとに攪拌した：２μｇ／ｍｌのスルフヒドリル改変ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｐｅｎｔｅｘ、Ｋａｎｋａｋｅｅ、イリノイ）から）；５ｍＭのＤＴＴ（１Ｍ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ）から）；０．４５μｇ／ｍｌのＮＳ３／４ａ（タンパク質濃度０．３ｍｇ／ｍｌ）；０．３７５μｇ／ｍｌのＮＳ３．４ａＰＩ、ＭＥＦＡ  ７．１又はＭＥＦＡ  ７．２（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）。最後の溶液を室温で１５分間攪拌した。
【０１６８】
２００μｌの上記溶液を、Ｃｏｓｔａｒ  ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）の各ウェルへと添加し、このプレートを室温にて１６時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％のＴＷＥＥＮ−２０）で洗浄し、軽く叩いて乾燥させ、２８５μｌのＯｒｔｈｏ  Ｐｏｓｔ−Ｃｏａｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡ、３％のスクロース）を添加した。プレートを少なくとも１時間インキュベートし、軽く叩いて、２〜８℃で一晩乾燥させた。このプレートを乾燥剤と共に袋に入れ、後の使用のために４℃にて保管した。
【０１６９】
ＨＣＶアッセイは以下のように行った。２００μｌの試料希釈緩衝液（１ｇ／ｌのカゼイン、１００ｍｇ／ｌの組換えヒトＳＯＤ、１ｇ／ｌのクロロアセタミド、１０ｇ／ｌのＢＳＡ、５００ｍｇ／ｌの酵母エキス、０．３６６ｇ／ｌのＥＤＴＡ、１．１６２ｇ／ｌのＫＰＯ４、５ｍｌ／ｌのＴｗｅｅｎ−２０、２９．２２ｇ／ｌのＮａＣｌ、１．６２７ｇ／ｌのＮａＰＯ４、１％のＳＤＳ）を、コーティングしたプレートに添加した。次いで２０μｌのサンプルを添加した。これを３７℃で、１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄した。２００μｌの結合体溶液（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡＶｅバルク結合体希釈液（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ、ニュージャージー）を用いたＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ中で１：２２，０００に希釈されたマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰなどのマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ）を添加し、６０分間、３７℃でインキュベートした。これを上記のように洗浄し、２００μｌの基質溶液（１錠のＯＰＤ／１０ｍｌ）を添加した。このＯＰＤの錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応の発色進行のためのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド及び過酸化水素を含有する。これを３０分間、室温にて暗所でインキュベートした。５０μｌの４ＮのＨ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止し、コントロールとしての６９０ｎｍにおける吸光度に対し、４９２ｎｍでプレートを読み取った。カットオフ値を０．６０００＋３つの陰性コントロール血清の平均シグナル（Ｏ．Ｄ．）に設定した。１．０以上のＳ／ＣＯ値（カットオフ比を超えるシグナルのＯ．Ｄ．）のサンプルを陽性と考え、１．０を下回るものを陰性と考えた。
【０１７０】
このイムノアッセイを用いた結果を、市販の抗−ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡキットを用いて得られるものと比較した。特に、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、イリノイ）は、市販の、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＣＶ  ３．０）（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ、ニュージャージー）は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してアッセイを実行した。Ｐａｓｔｅｕｒ  ＭＯＮＯＬＩＳＡ抗−ＨＣＶ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２アッセイ（Ｓａｎｏｆｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）は、抗体をベースとした検出アッセイである。製造者の説明書を使用してこのアッセイを実行した。
【０１７１】
結果を表４に示す。試験したパネルについて、ＭＥＦＡ  ７．１単独及びＭＥＦＡ  ７．２単独は非常に類似の免疫反応性を有し、いずれもセロコンバージョンパネルＰＨＶ９１３中のＣ２２タイプ抗体及びＰＨＶ９０４及びＰＨＶ９１４パネルにおける後期採血中のＣ３３ｃタイプ抗体を検出した（表４）。ＮＳ３／４ａ  ＰＩは、一方で、ＰＨＶ９０４及びＰＨＶ９１４パネルの初期採血中のＣ３３ｃタイプ抗体を検出した（表４）。従って、ＭＥＦＡ  ７．１又はＭＥＦＡ  ７．２及びＮＳ３／４ａ  ＰＩの組み合わせは、初期セロコンバージョンサンプル中のＣ２２及びＣ３３ｃに対する抗体を検出した。その検出は、Ｃ３３ｃ及びＣ２２タイプ抗体における現在認可されたＯｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０及びＡｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍアッセイよりも、それぞれ２日間及び１２日間先行した。
【０１７２】
全部で１７の市販のＨＣＶセロコンバージョンパネルを試験した。抗Ｃ３３ｃタイプパネルに関して、新たな抗原は、９パネルのうち９つにおいて、Ｏｒｔｈｏ  ３．０およびＡｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍよりも２日間〜１４日間先行した。抗Ｃ２２（コア）タイプパネルに関して、新たな抗原は、８パネルのうち３つにおいてＯｒｔｈｏ  ＨＣＶ  ３．０よりも、また８パネルのうち２つにおいてＡｂｂｏｔｔ  Ｐｒｉｓｍよりも、２日間〜５日間先行した。残りのパネルは同等であった。新たなアッセイと認可されたアッセイとの間で同等の性能を示す５つの抗コアパネルの中で、３パネルは抗体陰性から抗体陽性へと変化する間に長い採血間隔を有したことが重要視されるべきである：ＰＨＶ  ９０９（２８日間）、ＰＨＶ  ９１１（１１日間）、及びＳＣ−００１０（７日間）。表６を参照されたい。採血間隔の長さによって、これらの３パネルを用いて新アッセイと認可されたアッセイとの間のセロコンバージョン感度を比較することは困難であった。
【０１７３】
遺伝子型希釈感度もまた、この抗原を用いて、これら市販のアッセイに対して比較した。３つの全てのイムノアッセイを同時に行った。表５に示すように、連続的に希釈したＨＣＶ遺伝子型１〜６の全てが、ＨＣＶ  ３．０又はＭｏｎｏｌｉｓａ  Ｖｅｒ．２  Ｐａｓｔｅｕｒと比較して、ＭＥＦＡ  ７．１およびＮＳ３／４ａ  ＰＩを用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて強く検出された。別個の実験においては、ＭＥＦＡ  ７．１又はＮＳ３／４ａ  ＰＩを単独で用いて遺伝子型希釈感度を比較した。
【０１７４】
まとめると、ＮＳ３／４ａ  ＰＩ及びＭＥＦＡ  ７．１又はＭＥＦＡ  ７．２を利用するＨＣＶ抗体アッセイは、初期のセロコンバージョン検出及び種々の遺伝子型サンプルの検出の両方において、より優れた感度を達成した。アッセイの特異性は現在認可されたアッセイに匹敵した。両方の抗原は高度に精製され、製品の開発にとって好適な量で生産された。ひとたびＮＳ３／４ａ  ＰＩ及びＭＥＦＡ  ７．１又はＭＥＦＡ  ７．２が固相上にコーティングされると、それらは顕著に安定であった。融合タンパク質の免疫反応性はこれらの試験においては影響を受けないように見えた（表４及び表５）が、ＭＥＦＡ  ７．１は複数のＮＳ３／４ａ  ＰＩプロテアーゼ切断部位を有し、抗原をコーティングする間にいくつかのフラグメントへと分解された（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。改良されたＭＥＦＡ  ７．２は、ＮＳ３／４ａ  ＰＩの存在下では損なわれず（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、露出したエピトープ及び免疫反応性は、ＭＥＦＡ  ７．１と非常に類似している（表３、表４及び表５）。これらのデータは、初期のセロコンバージョンサンプルにおける検出感度の増大がＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２中の複数のエピトープに由来することを証明する；ＭＥＦＡ融合タンパク質それ自体の全体的な構造は、ＭＥＦＡ  ７．２中で損なわれていない状態、又はＭＥＦＡ  ７．１中で分解したもののいずれかにおいて、初期のセロコンバージョン検出においてはほとんど影響がない。しかし、ＭＥＦＡの完全性を維持することがイムノアッセイ成分の製造をより効果的なものとする。
【０１７５】
このように、新規な改変ＭＥＦＡ及び検出アッセイにおけるその使用が開示された。上述から、本発明の具体的態様が説明を目的として本明細書中に記載されているが、その精神及び範囲を逸脱しない多様な改変が行われ得ることが理解されるであろう。
【０１７６】
（表３．  露出したＨＣＶエピトープについてのＭＥＦＡ  ７．１及びＭＥＦＡ  ７．２のＥＬＩＳＡ分析）
【０１７７】
【表３】
2008515391.tif 000005
（表４．  ＨＣＶセロコンバージョン検出の比較）
【０１７８】
【表４】
2008515391.tif 000006
ＡＱ：Ｋ
ａ  Ｓ／ＣＯが１以上を陽性とし、太字で示す。カットオフ値は、材料及び方法に示すように計算する。
ｂ  ＭＥＦＡ  ７．１又はＭＥＦＡ  ７．２と組み合わせたＮＳ３ＮＳ４ａＰＩを用いた検出が、現在認可されたアッセイによる検出よりも先行する日数。
【０１７９】
（表５．  ＨＣＶ遺伝子型希釈感度の比較）
【０１８０】
【表５】
2008515391.tif 000007
ＡＱ：Ｌ  ａＮＤ、測定なし
（表６．  １７のセロコンバージョンパネルの試験のまとめ）
【０１８１】
【表６】
2008515391.tif 000008
ａ  ＨＣＶパネル供給元により提供されたデータ。
ｂ  現在認可されているアッセイである、Ｏｒｔｈｏ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ又はＡｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭに対する、ＮＳ３ＮＳ４ａ  ＰＩと組み合わせたＭＥＦＡ  ７．１を用いたアッセイ感度の比較。
ｃ  抗体陰性から抗体陽性へと変化する間の採血間隔：ＰＨＶ  ９０９については２８日間、ＰＨＶ  ９１１については１１日間、そしてＳＣ−００１０パネルについては７日間。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノムを図示したものであり、本発明のアッセイ試薬（タンパク質及び抗体）が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図２】図２は、ＨＣＶ抗原が固体支持体上に固定化されている、本発明に従う改変ＭＥＦＡを用いた代表的イムノアッセイの概略図である。
【図３】図３は、ストレプトアビジンによってコーティングされた固体支持体と共に改変ＭＥＦＡを用いる代表的イムノアッセイ様式の概略図である。
【図４】図４は、ＭＥＦＡ７．１を図示したものである。
【図５】図５Ａ〜５Ｆ（配列番号１及び配列番号２）は、ＭＥＦＡ７．１のＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｄは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｄは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｄは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図７】図７は、ｐｓＭＥＦＡ７．１の構築の図である。
【図８】図８は、ＭＥＦＡ７．２を図示したものである。
【図９】図９Ａ〜９Ｆ（配列番号３及び配列番号４）は、ＭＥＦＡ７．２のＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＭＥＦＡ７．１（配列番号２）とＭＥＦＡ７．２（配列番号４）との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、ＭＥＦＡ７．１（配列番号２）とＭＥＦＡ７．２（配列番号４）との間のアミノ酸配列の比較を示す。異なる点を太字で示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｐｓ．ｍｅｆａ７．２の構築の図である。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｐｓ．ｍｅｆａ７．２の構築の図である。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｐｓ．ｍｅｆａ７．２の構築の図である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、本発明のイムノアッセイに用いるために改変し得る代表的なＭＥＦＡを示す。図１２ＡはＭＥＦＡ３を図示したものである。図１２ＢはＭＥＦＡ５を図示したものである。図１２ＣはＭＥＦＡ６を図示したものである。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄ（配列番号５及び配列番号６）は、本明細書中で「ＮＳ３／４ａ  ＰＩ」と名付けた、本発明のアッセイに使用するための代表的なＮＳ３／４ａ高次構造抗原のＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を示す。図１３Ａ〜１３Ｄにおける４０３位及び４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１の天然のアミノ酸配列におけるＴｈｒに対するＰｒｏ及びＳｅｒに対するＩｌｅの置換を表す。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＮＳ３／４ａ  ＰＩのプロテアーゼ活性並びにＭＥＦＡ７．１及びＭＥＦＡ７．２に及ぼすその影響を示す。図１４ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、図１４Ｂはウェスタンブロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月8日(2007.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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