(57)【要約】  本発明は、眼の内境界膜、硝子体、及び／又は水晶体カプセルを染色する方法、並びにこの方法に好適な色素及び薬物に関するものである。そのような色素、薬物、及び方法は、眼科手術、特に黄斑手術及び／又は白内障手術及び／又は硝子体切除術において必要とされる。本発明の方法によれば、蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つが眼に投与される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼の内境界膜（ＩＬＭ）、硝子体、及び／又は水晶体カプセルの染色方法であって、蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つを眼に投与することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つを眼内注射によって投与することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つを内境界膜及び／又は水晶体カプセルへ投与することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つを哺乳動物へ投与することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法又は使用。
【請求項６】
蛍光色素がローダミンであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つを含む薬物。
【請求項８】
蛍光色素がローダミンであることを特徴とする、請求項７に記載の薬物。
【請求項９】
医薬に使用するための、蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、銅フタロシアニン−テトラスルホン酸四ナトリウム塩、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及び／又はシカゴブルー。
【請求項１０】
蛍光色素がローダミンであることを特徴とする、請求項９に記載の蛍光色素。
【請求項１１】
蛍光色素、ライトグリーンＳＦ、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーのうちの少なくとも１つの、眼科手術における薬物を製造するための使用。
【請求項１２】
眼科手術が、黄斑手術、硝子体切除術、及び／又は白内障手術であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
眼科手術において眼の内境界膜、硝子体、及び／又は水晶体カプセルを染色するための薬物を製造するための、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
蛍光色素がローダミンであることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
哺乳動物の眼科手術における薬物を製造するための、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、眼の内境界膜、硝子体、及び／又は水晶体カプセルを染色するための方法、並びにこの方法に好適な色素及び薬物に関するものである。そのような色素、薬物、及び方法は、眼科手術、特に黄斑手術及び／又は白内障手術及び／又は硝子体切除術において必要とされている。
【背景技術】
【０００２】
現在のところ、前部及び後部における眼科手術を補助するために生体染色色素が使用されている。特に黄斑手術において、色素によって補助された硝子体切除術は、硝子体網膜界面の術中の良好な可視化を可能にした。眼科手術では２種類の色素が一般に使用されている：トリパンブルーは、カプセル破裂（capsulorrhexis）を補助するため、及び全層角膜移植術実施前のドナー組織の角膜内皮を評価するために水晶体カプセルを染色することが最初に示唆された。現在では、黄斑ひだ術における網膜上膜組織及び内境界膜（ＩＬＭ）の染色にも利用可能である。動物モデルでは毒性効果が記載されているが、ヒトでは色素に関連した合併症は全く記載されていない。それにもかかわらず、トリパンブルーの発癌性及び催奇性が動物モデルにおいて記載されている。
【０００３】
インドシアニングリーンＩＣＧには、血管造影の際、脈絡膜灌流を画像化するための診断ツールとしての長い歴史がある。眼球内では、成熟白内障において水晶体カプセルを染色するために使用された。最近では、ＩＣＧは、黄斑手術の際にＩＬＭ染色のために導入された最初の色素であった。しかしながら、ＩＣＧの公知の光吸収性及び光酸化性により、この色素を、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける腫瘍細胞の破壊、並びに脈絡毛細管レベルでの光線力学療法にも利用可能にした。ＩＣＧの静脈内投与は依然として非常に安全であると考えられているが、眼球内に投与したときの色素関連毒性に関する懸念が、実験的に及び臨床的に観察された悪影響に関するいくつかの報告後に浮上した。
【発明の開示】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、眼の内境界膜、硝子体、及び／又は水晶体カプセルを異なって染色し、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に対する毒性効果がほんのわずかであるか又は全くない色素を提供することである。更に、これらの色素を含有する薬物、それらの使用、並びに内境界膜、硝子体、及び／又は水晶体カプセルの染色方法が提供されるはずである。
【０００５】
この問題は、請求項１に記載の膜、請求項７に記載の薬物、請求項９に記載の色素、及び請求項１１に記載の使用によって解決される。更に、それぞれの従属請求項に、方法、色素、薬物、及び使用の改良が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の色素は全て、水晶体カプセル、硝子体、及び網膜上膜を異なる様式で染色するため、例えば黄斑ひだ術中に、水晶体カプセル、硝子体、及び／又は網膜上膜を周囲組織から区別することができる。これらの色素は全て、可視領域である５８６〜６３４ｎｍの範囲内で長波長の最大吸収を示す。最も重要で、先行技術において使用された色素及び請求していない他の色素と異なることは、これらの色素は、関連する毒性を示さないか毒性を全く示さないことであり、眼の組織の染色に好適である。
【０００７】
したがって、本発明は、満足のいく染色性を有し、関連する毒性又は検出可能な毒性を全く示さない色素を特定する。
本発明の色素のライトグリーンＳＦ、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、及びシカゴブルーを以下に定義する。
【０００８】
ライトグリーンＳＦ：  Ｃ３７Ｈ３４Ｎ２Ｎａ２Ｏ９Ｓ３
【０００９】
【化１】
2008543395.tif 000002
【００１０】
Ｅ６８：  銅フタロシアニン−３，４’，４”，４”’−テトラスルホン酸四ナトリウム塩
【００１１】
【化２】
2008543395.tif 000003
【００１２】
ブロモフェノールブルー：  Ｃ１９Ｈ１０Ｂｒ４Ｏ５Ｓ
【００１３】
【化３】
2008543395.tif 000004
【００１４】
シカゴブルー：  Ｃ３４Ｈ２４Ｎ６Ｎａ４Ｏ１６Ｓ４
【００１５】
【化４】
2008543395.tif 000005
【００１６】
以下に、色素のライトグリーンＳＦ（ＬＧＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、及びシカゴブルー（ＣＢ）の使用に関する結果を示す。
【実施例】
【００１７】
以下の実施例では、以下の欄に記載の方法を用いた。
色素の選択及び染色性の評価
本研究では、本発明の色素の例として、以下の４種の色素：ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、及びシカゴブルー（ＣＢ）について試験した。ＩＣＧ（Ｐｕｌｓｉｏｎ、ミュンヘン、ドイツ）を基準として用いた。全ての色素は、平衡塩類溶液（ＢＳＳプラス；アルコン・ラボラトリーズ社、フォートワース、テキサス州）に溶解及び希釈し、１．０、０．５、０．２、及び０．０５％の濃度を得た。乾燥ＩＣＧ粉末は初めに製造者によって提供された滅菌水に溶解して０．５％溶液とし、次にＢＳＳプラスを用いて０．０５％濃度まで更に希釈した。次に色素を用いて、眼球内手術のあいだに除去した水晶体カプセル及び網膜上膜を染色した。除去直後、材料をスライドグラス上に置き、２、３滴の色素で覆った。１分後、ＢＳＳプラスによる洗浄によって色素を注意深く除去した。次に水晶体カプセル及び網膜上膜組織を肉眼的に及び光学顕微鏡検査によって評価した。染色効果を、特定の個人（Ｓ．Ｐ）によって主観的に「優、良、中、又は無」として等級付けし、写真撮影を行った。
【００１８】
更に、死後９時間の摘出したブタの眼の水晶体カプセルの染色性を評価した。空気で満たした前房へ色素を注射し、１分後、洗浄によって除去した。次に角膜を除去し、曲がった針を用いてカプセルを破裂させた。全ての手順をビデオテープに録画した。
【００１９】
光吸収性
溶剤としてＢＳＳプラスを用い、０．０５％溶液中で光吸収を測定した。色素の原液の調製直後にＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ分光計（Ｌａｍｂｄａ  ９００、パーキンエルマー）を用いて２００〜１０００ｎｍの光吸収を測定した。ＩＣＧとは異なり、他の色素のＢＳＳプラス溶液への溶解性は非常に高い（＞０．０５％色素）。
【００２０】
色素の毒性評価
ヒトＲＰＥ細胞培養物
ルートヴィッヒ−マキシミリアン大学（ミュンヘン、ドイツ）のアイバンクから、５人のヒトドナー由来のＲＰＥ細胞を入手し、Ａｌｇｅ  ＣＳ、Ｐｒｉｇｌｉｎｇｅｒ  ＳＧ、Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ＡＳ、Ｋａｍｐｉｋ  Ａ、Ｚｉｌｌｉｇ  Ｍ、Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌ  Ｈ、Ｗｅｌｇｅ−Ｌｕｓｓｅｎ  Ｕ．、「網膜色素上皮はαＢ−クリスタリンによってアポトーシスから保護される」、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００２；４３：３５７５−８２に記載のようにして調製した。簡潔に言えば、眼球全体を０．９％ＮａＣｌ溶液中で徹底的に洗浄し、５％ポリビニルピロリドンヨード中に浸漬し、塩化ナトリウム溶液で再度リンスした。各ドナー眼球の前部を除去し、両眼用実体顕微鏡を用いて後極を試験し、全体的に網膜疾患がないことを確認した。次に、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜から小鉗子を用いて神経網膜を注意深く剥がした。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋が不含のハンクス平衡塩類溶液で眼杯をリンスし、３７℃にて０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ、カールスルーエ、ドイツ）で３０分間満たした。トリプシンを注意深く吸引し、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、バイオクロム、ベルリン、ドイツ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、バイオクロム）で置換した。ピペットを用いて培地を穏やかに撹拌し、ブルッフ膜の損傷を避けることによってＲＰＥを培地へ放出させた。ＲＰＥ細胞溶液を、２０％ＦＣＳ（バイオクロム）を添加した２０ｍｌのＤＭＥＭ（バイオクロム）を含有する５０ｍｌフラスコ（ファルコン、ウィースバーデン、ドイツ）へ移し、３７℃、５％二酸化炭素に維持した。汎サイトケラチン抗体（シグマ）を用いたサイトケラチンの免疫組織化学染色によって上皮由来であることを確認した。細胞を試験して、マクロファージ（抗ＣＤ１１；シグマ）及び内皮細胞（抗フォンビルブラント因子、シグマ）の混入がないことを発見した（データは示していない）。コンフルエント（１００％）まで増殖させた後、初代ＲＰＥ細胞を２次培養し、１０％ＦＣＳ（バイオクロム）を添加したＤＭＥＭ（バイオクロム）中で３７℃、５％二酸化炭素にて維持した。３〜６継代の初代ＲＰＥ、及びＡＲＰＥ−１９細胞を実験に用いた。
【００２１】
ＡＲＰＥ−１９細胞、ヒト網膜色素上皮細胞株（４２）はＡＴＣＣ（マナサス、ヴァージニア州、米国）から購入し、１０％ＦＣＳ（バイオクロム）を添加したダルベッコ変法イーグル培地とハムＦ１２培地との１：１混合物（ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、バイオクロム）中で増殖させた。
【００２２】
ＭＴＴアッセイ
色素に曝露させるため、ＲＰＥ細胞及びＡＲＰＥ−１９細胞を血清不含条件下で２４時間維持した。細胞をＰＢＳで３回洗浄後、細胞をそれぞれ０．２％又は０．０２％の色素を含有する３００μｌのＢＳＳプラスとともに１０分間インキュベーションした。この幾分長い曝露時間は毒性の検出機会を増加させるには適当であるが、それにもかかわらず、ＩＣＧ若しくはトリパンブルーの最新臨床用途、又は新規色素の同様の用途を再現してはいない。次に細胞をＢＳＳプラスで注意深く３回リンスすることによって色素を除去した。血清含有培地とともに２４時間インキュベーション後、細胞増殖アッセイを行った。ＲＰＥ細胞（３〜６継代）を２４ウェルプレートに蒔き、２つの濃度（０．２％及び０．０２％）の色素に曝露させた。ＢＳＳプラス単独及びＨ２Ｏ２（２００μＬ／ｍＬ）を対照とした。
【００２３】
テトラゾリウム色素還元アッセイ（ＭＴＴ；臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル  テトラゾリウム）を用いて細胞生存率を測定した。Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ．による文献、「細胞の増殖及び生存に関する迅速比色アッセイ：増殖アッセイ及び細胞毒性アッセイへの応用」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８３；６５：５５−６３に記載のようにしてＭＴＴ試験を行った。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０００μＬ／ウェルのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ原液１．５ｍＬと、ＤＭＥＭ２８．５ｍＬ）を加えた。ＲＰＥ細胞を３７℃にて１時間インキュベーションした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；１０００μＬ／ウェル）の添加によって、形成したホルマザン結晶を溶解させた。マルチウェル分光光度計（モレキュラープローブス、ガルヒング、ドイツ）を５５０ｎｍにてスキャンすることにより吸収を測定した。ウェルの結果は、対照増殖に対する平均％で表した。実験は３重に行い、３回繰り返した。ＢＳＳとともにインキュベーションし、色素を添加していない、同一継代のＲＰＥ細胞及びＡＲＰＥ−１９細胞を対照とした。ＳＰＳＳ（マンホイットニーＵ検定）により、色素濃度間で統計的比較を行った。
【００２４】
本研究で実施したようなＭＴＴ試験は、細胞生存率の評価として十分に確立された試験であるが、ブルー（５５０ｎｍ）ホルマザン反応産物の比色測定に依拠している。この色は、試験したいくつかの色素の吸収スペクトルと重複する。したがって、残留色素によるアッセイへの潜在的干渉を確認するために対照実験を行った。上記実験のようにして単層の細胞を色素で処理したが、吸収の読み取りはＭＴＴを前もって適用せずに行った。ＢＳＳ対照と比較して色素処置後に差は認められなかった。実験は３重に行い、３回繰り返した。
【００２５】
生死判定
コンフルエントなＲＰＥ細胞及びＡＲＰＥ−１９細胞を調製し、上記のようにして処置した。非生存細胞の核は膜不透過性色素ヨウ化プロピジウム（シグマ）による染色によって赤く見えるが、全ての細胞の核は膜透過性色素ヘキスト３３３４２（インタージェン、パーチェイス、ニューヨーク州）で染色される２色蛍光アッセイに基づいて細胞生存率を定量した。２４ウェル組織培養プレートのカバースリップ上で増殖したＲＰＥ細胞のコンフルエント培養物を、ＭＴＴアッセイについて記載したように、０．２％及び０．０２％のライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ）に曝露させた。細胞生存率を評価するため、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム及び１．０μｇ／ｍＬヘキスト３３３４２とともに３７℃にて２０分間インキュベーションした。その後、細胞を落射蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ；ツァイス、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）で解析した。次に標識した核を蛍光顕微鏡写真中で計数し、視野中の全核の割合として死細胞を表した。データは、２重のウェルで行った３回の実験の総数に基づいており、１ウェルあたり３〜５枚の代表的視野を記録した。色素を添加していない、ＢＳＳとともにインキュベーションした同一継代のＲＰＥ細胞及びＡＲＰＥ−１９細胞、並びにＨ２Ｏ２（２００μＬ／ｍＬ）を対照とした。
【００２６】
染色性の評価
除去した水晶体カプセル材料及びＥＲＭの染色効果は、さまざまな色素及び色素適用濃度で異なっていた。ライトグリーン帯黄色（ＬＧＳＦ）は０．５％以下の濃度で水晶体カプセルを十分に染色せず、１％濃度のみがＥＲＭを弱く染色した。したがって、ＬＧＳＦは低濃度で試験しなかった。他の色素は、０．２％の低濃度でさえ水晶体カプセル及びＥＲＭにおいて優〜良の染色効果を表した。各色素の染色効果の等級付け及び色素濃度を図６に示す。ブタの眼では、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ）、及びＥ６８で水晶体カプセルをよく染色できたが、ＬＧＳＦは染色効果が弱かった。一般に、透明なブタの水晶体のバックグラウンドに対して染色効果を評価したため、ブタの眼で見られる対比はあまり明白ではなかった。成熟白内障ではカプセル破裂を顕著に補助するために術中に色素を用いるため、より良い対比が期待されるはずである。
【００２７】
光吸収性
色素濃度０．０５％の光吸収性及び最大吸収ピークは変化した。長波長最大吸収ピークは５２７〜６５５ｎｍの範囲であった（図１参照）。ライトグリーンＳＦ帯黄色（ＬＧＳＦ）を除いて、４００〜５００ｎｍで関連する光吸収を示す色素はなかった。調査した色素で７００ｎｍを越える最大吸収は見られなかった。
【００２８】
色素の毒性評価
ＭＴＴアッセイ
対照として働く色素を添加していないＢＳＳプラスと比較して、本発明の４種の新規色素（ライトグリーンＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）；Ｅ６８；ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）；シカゴブルー（ＣＢ））は、濃度０．２％でも０．０２％でもＡＲＰＥ−１９細胞の細胞生存率に顕著な影響を及ぼさなかった（図２参照）。更に、濃度０．２％及び０．０２％でＬＧＳＦ、Ｅ６８、ＢＰＢ、及びＣＢへの曝露後、初代ＲＰＥ細胞の細胞生存率に対する影響は観察されなかった（図３）。初代ＲＰＥ細胞では、２つの濃度間の差はライトグリーンＳＦ（ＬＧ  ＳＦ、ｐ＜０．０５）及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ、ｐ＜０．０５）に対してのみ統計的に有意であった。
【００２９】
生死判定
細胞を処理後、非生細胞の核をヨウ化プロピジウムで２４時間標識することによってＲＰＥ細胞の生存率を試験したところ、２種の色素（ライトグリーン帯黄色（ＬＧＳＦ）及びシカゴブルー（ＣＢ））は、ＢＳＳプラス単独で処理した対照と比較して、細胞生存率に著しく影響を及ぼしたことが同定された。この効果は、濃度０．２％及び０．０２％でＣＢ処理後、ＡＲＰＥ−１９細胞及び初代ＲＰＥ細胞の培養物において見られた。しかしながら、０．２％色素溶液と比較して、０．０２％ＬＧ  ＳＦは非常に毒性が低いと思われた。Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、及びＢＳＳプラス（対照）は細胞生存率に影響を及ぼさなかった。
【００３０】
硝子体の染色性
この調査には５種の色素（ライトグリーンＳＦ帯黄色（ＬＧ  ＳＦ）；Ｅ６８；ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）；シカゴブルー（ＣＢ）；ローダミン６Ｇ）が含まれた。全ての色素を平衡塩類溶液（ＢＳＳプラス；アルコン・ラボラトリーズ社、フォートワース、テキサス州）を用いて溶解し、希釈した。
【００３１】
現地の倫理委員会の承認を得た後、動物（ブタの眼）及びヒトで実験を行った。全ての実験は、ヘルシンキ宣言にしたがって行われた。
ブタの眼の外科的処置（ＬＧ  ＳＦ；Ｅ６８；ＢＰＢ；ＣＢ；ローダミン６Ｇ）
眼科手術は標準的な扁平部硝子体切除から成った。最初に、透明な硝子体をできるだけ完全に除去した。次に、硝子体腔における無制御な色素の分布を避けるために流動空気交換を行った。次に空気を充填した眼球に色素を注射した。１分後、ＢＳＳで洗浄することによって色素を除去した。この後、０．２％〜２％の濃度で色素を注射した。外科的処置を行った２人の試験官によって硝子体の染色を等級付けした。
【００３２】
染色効果を以下の表に示すように等級付けした。
【００３３】
【表１】
2008543395.tif 000006
【００３４】
ＢＰＢによるヒトの外科的処置
全ての患者（ｎ＝９）は手術前に書面による同意書を提出した。硝子体と網膜表面との癒着の増加が疾患の病因に著しく寄与することが記載されている、黄斑ひだ及び黄斑円孔などの牽引性黄斑症を治療するための手術を行った。標準的な３ポート扁平部硝子体切除を行った。最初に、硝子体切除プローブを用いて透明な硝子体をできるだけ完全に除去した。次に流動空気交換を行い、２、３滴の色素（ＢＰＢ、０．２％）を注射した。１分後、洗浄によって色素を除去した。網膜表面に癒着した硝子体残余物の青色染色が観察された。硝子体の可視化により、合併症もなく硝子体の完全除去を行うことができた。
【００３５】
結論
調査した色素は、通常透明な硝子体ゲルを染色することを示すことができた。これは、網膜レベルでの牽引力を緩和するために、硝子体の徹底的且つ完全な除去が重要な外科的処置に関連するであろう。これは、網膜剥離及び牽引性黄斑症、並びに増殖性硝子体網膜症又は糖尿病性網膜症の治療のための外科的処置の場合である。
【００３６】
概要
水晶体カプセル、硝子体又は網膜上膜又はＩＬＭなどの眼組織を術中に染色するための生体染色色素の使用は眼科手術を潜在的に容易にする。黄斑手術を補助するために特にＩＣＧを導入することは、当初、黄斑ひだ又は黄斑円孔などの牽引性黄斑症の手術においてＩＬＭの除去を可視化して容易にすることによって眼球内手術を安全に、より制御可能にすると思われたため、眼科団体に大きな熱意を生んだ。更に、硝子体網膜界面の染色は、経験の浅い外科医にも、黄斑手術においてＩＬＭ除去の原理に従う道を開くであろう。しかしながら、完全に理解されていない状況下で潜在的な色素関連毒性を示す観察結果があるため、ＩＣＧの使用は外科医の間で議論の多い問題となっている。ＩＣＧを「毒性付加物」とみなすべきかどうかの問題は現在調査中である。ＩＣＧの臨床眼球内投与に先行した、ＩＣＧの眼球内使用に関するｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ安全性試験はない。
【００３７】
ＩＣＧの公知の化学特性及び眼球内投与後のＩＣＧの潜在的毒性効果に関する最近の議論を鑑みると、新規色素を選択して評価する際に以下の考察が興味深いであろう：
ａ）  色素は大きな吸収係数を示すべきである。大きな吸光係数は、極めて少量の色素注射を可能にする。結果として、凝集物の形成は低色素濃度で抑制される。
ｂ）  色素は水及びＢＳＳ（術中の洗浄溶液として用いられる）中で高溶解性を示すべきであるが、濃度依存性を示すべきではない。多くの場合、この効果は、最大吸収の劇的なシフト及び/又は新規吸収バンドの出現を伴う。
ｃ）  材料は高光化学安定性を有するべきである。これは、最初の励起一重項状態における不可逆的光反応を意味する。Ｓ１又は三重項状態Ｔ１は、光増感剤ＩＣＧに関して記載されるように、回避すべきである。
ｄ）  三重量子収率はできるだけ低くあるべきであり、ＩＬＭ／組織の不可逆的酸化又は色素自体の光分解をもたらし得る一重項酸素形成を回避する。一方、水中でも固体の状態でも一重項酸素の寿命は非常に短い。
ｅ）  染色材料は暗所毒性が最小であるべきである。
ｆ）  色素は標的組織に対して非常に良好な吸着性を示すべきである。
【００３８】
全ての要件を満たすことはほとんどできないため、妥協を認めるべきであることは上記の簡単な説明から明らかである。
本実施例によって、さまざまな色素クラスに由来する陽イオン性及び陰イオン性のさまざまな色素は、上記基準により眼科手術に非常に好適であることが示された。これらの色素は吸収係数が大きい（５×１０４〜２０×１０５Ｌ・ｍｏｌ−１・ｃｍ−１）。全ての化合物は水及びＢＳＳ溶液に高い溶解性を示す。水又はＢＳＳ溶液中の光安定性及び暗所安定性は、いくつかの場合においてＩＣＧの場合よりも非常に良好である（データは示していない）。ライトグリーンＳＦ帯黄色、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー、シカゴブルーの最大長波長の位置は色素濃度によって影響されなかった（０．０５％色素含量まで測定した）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、及びシカゴブルー（ＣＢ）の光吸収性を示す。最大吸収ピークは５８６〜６３４ｎｍでさまざまであった。ほとんどの色素は４００〜５００ｎｍ及び７００ｎｍ以上で関連する光吸収を全く示さなかった。
【図２】図２は、調査した色素で処置後に比色試験（ＭＴＴ）によって測定したＡＲＰＥ−１９細胞の生存率を示す。試験は３重に行い、３回繰り返した。色素を添加していない等量のＢＳＳとともにインキュベーションした同一継代のＡＲＰＥ−１９細胞を対照とした。結果は、対照生存率に対する平均％として表した。データは、各々３重に行った３回の実験の結果の平均である。エラーバーはＳＥＭである（ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ））。市販の色素としてインドシアニングリーン（ＩＣＧ）も試験した。２つの濃度（０．２％及び０．０２％）間で統計的に関連のある差は観察されなかった。ＢＳＳプラス単独及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、２００μｌ／ｍｌ）を対照とした。
【図３】図３は、調査した色素で細胞を処置後に比色試験（ＭＴＴ）によって測定した網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の生存率を表す。色素を添加していない等量のＢＳＳとともにインキュベーションした同一継代のＲＰＥ細胞を対照とした。結果は、対照生存率に対する平均％として表す。データは、各々３重に行った３回の実験の結果の平均である。エラーバーはＳＥＭである（ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ））。市販の色素としてインドシアニングリーン（ＩＣＧ）も試験した。２つの濃度間の差は、ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ、ｐ＜０．０５）及びインドシアニングリーン（ＩＣＧ、ｐ＜０．０５）に関してのみ統計的に有意であった。ＢＳＳプラス単独及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、２００μｌ／ｍｌ）を対照とした。
【図４】図４は、試験した色素（０．２％及び０．０２％）の、ＡＲＰＥ１９細胞培養物中の非生存細胞数に対する効果の定量を示す。死細胞の割合は、代表的視野の蛍光顕微鏡写真で少なくとも１４００細胞を計数することによって得た。データ（平均±ＳＥＭ）は、２重に行った３回の独立した実験において１条件あたり６〜１０枚の顕微鏡写真のサンプリングに基づいている（ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ））。市販色素としてインドシアニングリーン（ＩＣＧ、０．５％及び０．０５％）も試験した。
【図５】図５は、試験した色素（０．２％及び０．０２％）の、初代ＲＰＥ細胞培養物中の非生存細胞数に対する効果の定量を示す。死細胞の割合は、代表的視野の蛍光顕微鏡写真で少なくとも１４００細胞を計数することによって得た。データ（平均±ＳＥＭ）は、２重に行った３回の独立した実験において１条件あたり６〜１０枚の顕微鏡写真のサンプリングに基づいている（ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、シカゴブルー（ＣＢ））。市販色素としてインドシアニングリーン（ＩＣＧ、０．５％及び０．０５％）も試験した。
【図６】図６は、水晶体カプセル及び網膜上膜（ＥＲＭ）におけるさまざまな色素及び色素濃度を用いた染色効果の等級付けの結果を示す。染色効果は、優（＋＋＋）、良（＋＋）、中（＋）、無（−）として等級付けした。ライトグリーン帯黄色ＳＦ（ＬＧ  ＳＦ）、Ｅ６８、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、及びシカゴブルー（ＣＢ）。第１列は水晶体カプセルの染色結果を表し、第２列は網膜上膜組織の染色結果を表す。染色効果を白いバックグラウンドに対して評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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