(57)【要約】  本発明は、ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬ及び／又はＢＡＦＦを阻害するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸分子、及び当該ポリペプチドを含む組成物に関する。本発明はまた、当該ポリペプチド及び本発明の組成物を用いた免疫関連疾患又は癌の治療法に関する。本発明はまた、ＢＣＭＡに結合するＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦシグナル伝達のインヒビターの同定方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｙ−Ｘ7−Ｄ−Ｘ9−Ｌ  Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｃ−Ｋ−Ｘ16−Ｃ−Ｘ18−Ｘ19−Ｘ20−Ｃ−Ｘ22−Ｘ23−Ｘ24−Ｘ25−Ｘ26−Ｘ27−Ｘ28−Ｘ29−Ｃ−Ｘ31−Ｘ32−Ｘ33−Ｃ      （式１）
の配列を含むＡＰＲＩＬに結合するポリペプチドであって：
Ｘ１１がＡ以外のアミノ酸残基であり、
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３１、Ｘ３２、Ｘ３３がシステイン以外の任意のアミノ酸である
ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１１がＬ、Ｉ又はＶである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ１８が、Ｑ、Ｄ及びＡからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
Ｘ２０がＹであれば、Ｘ１８がＤである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｘ２０がＲである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
式１の配列が、
CSQNEYFDSLLHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNEYFDSLLHACKPCDLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNEYFDSLLHACKPCDLYCSSNTPPLTCQRYC、及び
CSQNEYFDSLVHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC
からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Ｃ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｄ−Ｘ9−Ｌ−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｃ−Ｘ15−Ｘ16−Ｃ−Ｘ18−Ｘ19−Ｘ20−Ｃ−Ｘ22−Ｘ23−Ｘ24−Ｘ25−Ｘ26−Ｘ27−Ｘ28−Ｘ29−Ｃ−Ｘ31−Ｘ32−Ｘ33−Ｃ      （式２）
の配列を含むＢＡＦＦに結合するポリペプチドであって、
Ｘ６が、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｓ及びＦからなる群より選択され、
Ｘ１１が、Ａ以外のアミノ酸残基であり、
Ｘ１５が、Ａ又はＫ以外の任意のアミノ酸残基であり、
Ｘ１８が、Ｑ、Ｄ及びＡからなる群より選択され、
Ｘ２０が、Ｒ、Ｙ及びＡからなる群より選択され、
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１６、Ｘ１９、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３１、Ｘ３２、及びＸ３３がシステイン以外の任意のアミノ酸であり、
但し、式２は配列CSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCを含まない
ポリペプチド。
【請求項９】
Ｘ１１がＬ、Ｉ又はＶである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ｘ１５がＩ、Ｖ又はＡである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Ｘ１８がＤであり、Ｘ２０がＹである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
式２の配列が、
CSQNEAFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNESFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNEFFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNEYFDSLLHACIPCDLRCSSNTPPLTCQRYC、
CSQNEYFDSLLHACIPCQLYCSSNTPPLTCQRYC、及び
CSQNEYFDSLLHACIPCDLYCSSNTPPLTCQRYC
からなる群より選択される、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
式１が更に、３４番目の残基に連結するカルボキシ末端の配列NSVKGTを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
式２が更に、３４番目の残基に連結するカルボキシ末端の配列NSVKGTを含む、請求項８ないし１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
天然ＢＣＭＡポリペプチドとは異種である、式１又は２の配列に連結するＮ末端、Ｃ末端又はＮ末端とＣ末端の両方の配列を含む、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
哺乳動物のＢＣＭＡポリペプチドから得られたアミノ酸配列を有するＢＣＭＡ変異体であるポリペプチドであって、図５のＱ１０、Ｅ１２、Ｙ１３、Ｆ１４、Ｉ２２、Ｑ２５及びＲ２７からなる群より選択されるアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が変更されているポリペプチド。
【請求項１８】
Ｉ２２がＫで置換されている、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
哺乳動物のＢＣＭＡポリペプチドが、Ｉ２２に対応するアミノ酸残基並びに図５の残基Ｆ１４及びＱ２５のいずれか一方に対応するアミノ酸残基において変更されている、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
哺乳動物のＢＣＭＡポリペプチドが、Ｒ２７に対応するアミノ酸残基並びに図５の残基Ｙ１３及びＱ２５のいずれか一方に対応するアミノ酸残基において変更されている、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
Ｑ２５がＤで、並びにＲ２７がＹでそれぞれ置換されている、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項８ないし２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
更にロイシンジッパーを含む、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
非タンパク質様ポリマーに付着する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
イムノアドヘシンである、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
抗体である、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
抗体が、Ｆ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体及びｓｃＦｖ抗体からなる群より選択される、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
成長阻害剤、細胞障害性剤、検出剤、ポリペプチドの生物学的利用能を向上させる薬剤及びポリペプチドの半減期を向上させる薬剤からなる群より選択される薬剤に付着する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記細胞障害性剤が、毒素、抗生物質及び放射性同位体からなる群より選択される、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３１】
請求項３０に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３２】
請求項３０に記載の核酸分子又は前記核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含み、任意選択的に製薬的に許容可能な担体を更に含む組成物。
【請求項３４】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含み、任意選択的に、免疫関連疾患を治療するための薬剤、化学療法剤及び細胞障害剤からなる群より選択される第２の治療剤を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞を、ベクターからポリペプチドが発現するのに適した条件下で培養する工程を含む、ポリペプチド製造方法。
【請求項３６】
請求項１ないし７、及び１４のいずれか１項に記載のポリペプチドとＡＰＲＩＬとの結合を部分的に又は完全に遮断するインヒビターを検出する工程を含む、ＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬの結合のインヒビターを同定する方法。
【請求項３７】
請求項８ないし１３、及び１５のいずれか１項に記載のポリペプチドとＢＡＦＦとの結合を部分的に又は完全に遮断するインヒビターを検出する工程を含む、ＢＣＭＡに対するＢＡＦＦの結合のインヒビターを同定する方法。
【請求項３８】
ＡＰＲＩＬポリペプチドを、請求項１ないし７、１４及び１８のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、天然ＢＣＭＡに対する天然ＡＰＲＩＬの結合を阻害する方法。
【請求項３９】
ＢＡＦＦポリペプチドを、請求項８ないし１３、１５及び２１のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、天然ＢＣＭＡに対する天然ＢＡＦＦの結合を阻害する方法。
【請求項４０】
ＡＰＲＩＬポリペプチド又はＢＡＦＦポリペプチドを、請求項１７ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドと接触させる工程を含む、天然ＢＣＭＡに対する天然ＡＰＲＩＬ及び／又は天然ＢＡＦＦの結合を阻害する方法。
【請求項４１】
哺乳動物においてＡＰＲＩＬとＢＣＭＡとの結合を阻害するのに有効な量の、請求項１ないし７及び１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物において天然ＢＣＭＡに対する天然ＡＰＲＩＬの結合を阻害する方法。
【請求項４２】
哺乳動物においてＢＡＦＦとＢＣＭＡとの結合を阻害するのに有効な量の、請求項８ないし１３及び１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物において天然ＢＣＭＡに対する天然ＢＡＦＦの結合を阻害する方法。
【請求項４３】
請求項１７ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において天然ＢＣＭＡに対する天然ＢＡＦＦ及び／又は天然ＡＰＲＩＬの結合を阻害する方法。
【請求項４４】
治療的有効量の、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて哺乳動物を処置する工程を含む、免疫疾患を有する哺乳動物の免疫関連疾患の治療法。
【請求項４５】
免疫関連疾患が、リウマチ様関節炎、多発性硬化症及び全身性エリトマトーデスからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
治療的有効量の、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて哺乳動物を処置する工程を含む、癌を有する哺乳動物の癌の治療法。
【請求項４７】
前記癌が、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記癌が、消化器癌又は神経膠芽腫である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
治療的有効量の、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いて哺乳動物を処置する工程を含む、Ｔ細胞媒介性疾患を有する哺乳動物のＴ細胞媒介性疾患を治療する方法。
【請求項５０】
Ｔ細胞媒介性疾患が、移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び炎症からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１月２９日出願の米国特許仮出願第６０／５４０，２７１号の優先権を主張し、当該特許文献全体を参考文献として本明細書に包含する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＡＰＲＩＬに結合するが、ＢＡＦＦには殆ど又は全く結合しない新規のポリペプチド、ＢＡＦＦには結合するが、ＡＰＲＩＬには殆ど又は全く結合しない新規のポリペプチド、又はＡＰＲＩＬとＢＡＦＦに結合する新規のポリペプチド、それらポリペプチドをコードする核酸分子、及びそれらを含む組成物に関する。本発明はまた、本発明の組成物を使用した免疫関連疾患及び癌の予防法及び治療法に関する。本発明はまた、本発明のポリペプチドを用いた、ＡＰＲＩＬ及び／又はＢＡＦＦのインヒビターを選択する方法に関する。
【０００３】
本発明の背景及び序文
腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）は、免疫系内部における細胞連絡に関与する膜貫通レセプターのスーパーファミリーである。ＴＮＦＲのファミリーメンバーの構造は、リガンド結合モチーフを形成する、細胞外のシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）」を特徴とする。一般に、Ｂ細胞又はＴ細胞に見られるＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーは、複数のＣＲＤを有する１型膜貫通タンパク質である（Bodmer, J. L.等、(2002) Trends Biochem Sci 27:19-26）。しかしながら、３型膜貫通タンパク質であり、含まれるＣＲＤの数が少ないＢ細胞によって発現されるＴＮＦＲタンパク質のサブグループ、即ち、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）、及びＢｌｙＳ（ＢＡＦＦ）レセプター３（ＢＲ３）が存在する（Gross, J. A.等、(2000) Nature 404:995-999; Marsters, S. A.等、(2000) Curr Biol 10:785-788; Thompson, J. S.等、(2001) Science 293:2108-2111; Yu, G.等、(2000) Nat Immunol 1:252-256）。ＴＡＣＩの細胞外ドメインは２つのＣＲＤを含み、ＢＣＭＡ  ＥＣＤは１つのＣＲＤを含み、ＢＲ３のＥＣＤはＣＲＤの一部のみを含む。ＴＷＥＡＫリガンドのレセプター（Ｆｎ１４）と共に、ＢＣＭＡ及びＢＲ３はＴＮＦＲスーパーファミリーの中で最小のメンバーである。ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＲ３は、細胞内デスドメインを欠く。これらのレセプターは、様々な細胞の生存、増殖、及び／又は分化に関与していると考えられている。
ＴＮＦファミリーメンバーであるＢＡＦＦは、唯一知られているＢＲ３のリガンドである。ＢＡＦＦ依存性Ｂ細胞の増殖にはＢＲ３が必要とされると思われるが、ＢＡＦＦもＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに結合することが報告されている（Shu, H. B.、及びJohnson, H. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:9156-9161; Thompson, J. S.等、(2001) Science 293:2108-2111; Yu, G.等、(2000) Nat Immunol 1:252-256）。ＡＰＲＩＬ（ＴＲＤＬ−１、ＴＡＬＬ−２及びＴＮＦＳＦ１３Ａとしても知られる）は、ＢＡＦＦに最も密接に関連するＴＮＦファミリーメンバーであり、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに結合する（Marsters, S. A.等、(2000) Curr Biol 10:753-788; Thompson, J. S.等、(2001) Science 293:2108-2111; Yu, G.等、(2000) Nat Immunol 1:252-256）。レセプターとの交差反応性にも関わらず、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬの発現パターンは別個である。ＢＡＦＦは、マクロファージ、単球、及び樹状細胞に発現するが、ＡＰＲＩＬはリンパ球に発現し、また一部の腫瘍細胞ではさらに高いレベルで発現する（Hahne, M.等、(1998) J Exp Med 188:1185-1190）。
【０００４】
ＢＡＦＦのレベルを厳密に制御することが、Ｂ細胞の恒常性に重要であると考えられる。ＢＡＦＦノックアウトマウスは、濾胞性Ｂ細胞及び周辺性Ｂ細胞の発達と生存に有意な減少を示し、一方ＢＡＦＦ導入遺伝子を発現するマウスは、ループス様自己免疫性症候群を発症する（Gross, J. A.等、(2000) Nature 404:995-999; Mackay, F.等、(2001) Science 293:2111-2114; Khare, S. D. 等、(2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:3370-3375）。ＢＡＦＦ特異性アンタゴニストであるＢＲ３−Ｆｃ（Kayagaki, N. 等、(2002) Immunity 17, 515-524）は、ＢＡＦＦノックアウトマウスについての研究（Schiemann, B.等、(2001) Science 293:2111-2114）と共に、Ｂ細胞発達におけるＢＡＦの基本的役割を示すために使用されている。
Ｂ細胞の恒常性におけるＡＰＲＩＬの役割は、特にＡＰＲＩＬノックアウトマウスが正常なＢ細胞レベルを示すために、それ程明らかになっていない（E. Varfolomeev等、(2004) Mol. Cell. Biol 24(3): 997-1006）。しかしながら、複数のグループにより、細胞増殖及びＴ細胞機能におけるその活性が報告されている。例えば、ＡＰＲＩＬには、インビトロ及びインビボにおける特定の腫瘍細胞系の増殖を誘発する能力があることが示されている（Hahne, M.等、(1998) J. Exp. Med. 188:1185-1190）。ＡＰＲＩＬの発現はまた、大腸癌及び前立腺癌を含む多くの腫瘍において上方制御されることが示されている（Hahne, M.等、(1998) J Exp Med 188:1185-1190; Rennert, P.等、(2000) J Exp Med 192:1677-1684; Kelly, K.等、(2000) Cancer Res 60:1021-1027.）。
【０００５】
ＢＣＭＡ−Ｆｃ及びＴＡＣＩ−Ｆｃの両方が、ＡＰＲＩＬによって刺激した一次的なB細胞の増殖を阻害することができる（Yu, G.等、(2000) Nat. Immunol. 1:252-256）。研究により、ＢＲ３−Ｆｃで処置したマウスにおいて自己免疫性ループス様疾患が中和されることが示されている（例えば、Kayagaki, N.等、(2002) Immunity 17:515-524）。可溶形態のＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ−Ｆｃ）は、ＨＴ２９及びＡ５４９腫瘍細胞を移植したＮｕ／Ｎｕマウスにおける腫瘍細胞の成長を阻害することが示されている（Rennert, P.等、(2000) J. Exp. Med. 192:1677-1683）。
複数の報告により、ＢＣＭＡに対するＢＡＦＦのナノモル単位の結合親和性が明らかにされた（Marsters, S. A.等、(2000) Curr Biol 10:785-788; Shu, H. B., 及びJohnson, H. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:9156-9161; Yu, G.等、(2000) Nat Immunol 1:252-256）が、これらの研究は二価のＢＣＭＡレセプター−Ｆｃ融合コンストラクトを使用しており、これにより親和性測定値が結合活性によって増強される。Pelletier等によって、Ｆｃ領域を変異させることによって作成した単価ＢＣＭＡ−Ｆｃ融合タンパク質が低い親和性でＢＡＦＦと相互作用する事例が報告されている（Pelletier, M et al. (2003) JBC 278(35):33127-33133）。これらの報告は、ＢＣＭＡの単量体又は多量体としてＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦに対するＢＣＭＡの結合の特異性を決定するＢＣＭＡ内の残基を開拓したものでもないし、同定したものでもない。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＡＰＲＩＬに結合するが、ＢＡＦＦには殆ど又は全く結合しない新規ポリペプチド分子、ＢＡＦＦに結合するが、ＡＰＲＩＬには殆ど又は全く結合しない新規ポリペプチド分子、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに結合する新規ポリペプチド分子、或いは、天然ＢＣＭＡポリペプチドよりも小さい親和性でＢＡＦＦ及び／又はＡＰＲＩＬに結合する新規ポリペプチド分子を提供する。本発明のポリペプチドは、疾病の治療及び診断、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの値の検出、及びＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦシグナル伝達経路の阻害剤の開発を含む、研究又は医療の目的に有用である。本発明のポリペプチドには、単量体及び多量体が含まれる。本発明は、本発明のポリペプチド又は核酸分子を含む組成物、本発明のポリペプチド、及び本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の製造方法並びに使用方法を提供する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインの配列等のＢＣＭＡ配列から得られる。
一実施形態において、本発明の単量体ポリペプチドは、１００ｎＭ以下のＩＣ５０値でＡＰＲＩＬに結合し、１００ｕＭ以上のＩＣ５０値でＢＡＦＦに結合する。一実施形態では、本発明の多量体ポリペプチドは、１００ｍＭ以下のＩＣ５０値でＢＡＦＦに結合し、ＡＰＲＩＬに結合する天然ＢＣＭＡの３０分の１の親和性でＡＰＲＩＬに結合する。別の実施形態では、本発明の多量体ポリペプチドは、同程度の親和性でＢＡＦＦとＡＰＲＩＬに結合する。別の実施形態では、本発明の多量体ポリペプチドは、１００ｎＭ未満又は１０ｎＭ未満の親和性でＡＰＲＩＬに結合し、ＢＡＦＦには殆ど又は全く結合しない。
【０００７】
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、図５のＱ１０、Ｅ１２、Ｙ１３、Ｆ１４、Ｉ２２、Ｑ２５及びＲ２７からなる群より選択される残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換された、哺乳動物のＢＣＭＡポリペプチド配列から得られたＢＣＭＡ変異体である。一実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、Ｉ２２Ｋ、Ｒ２７Ｙ、Ｒ２７Ａ、Ｑ２５Ｄ、Ｙ１３Ｓ、Ｙ１３Ｆ及びＹ１３Ａからなる群より選択される哺乳動物のＢＣＭＡ残基に対応する少なくとも１つの置換を有する。好ましい一実施形態では、ＢＣＭＡ変異体は、少なくとも哺乳動物のＢＣＭＡポリペプチドのシステインに富むドメイン（ＣＲＤ）から得られる。別の好ましい実施形態では、ＢＣＭＡ変異体はヒトＢＣＭＡポリペプチドのＣＲＤ配列（例えば、図５の残基８−４１）（配列番号２２）から得られる。別の実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、Ｉ２２Ｋに位置する哺乳動物のＢＣＭＡ残基に対応する少なくとも１つの置換を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ変異体はＩ２２に対応するアミノ酸残基、並びに図５のＦ１４及びＱ２５からなる群のうちのいずれか１つに対応するアミノ酸残基に変更を含む。好ましい一実施形態では、ＢＣＭＡ変異体は、Ｆ１４Ａ及びＱ２５Ａからなる群のうちの１つ又は全部と組み合わせたＩ２２Ｋで置換される。別の実施形態では、ＢＣＭＡ変異体はＲ２７に対応するアミノ酸残基及び図５のＹ１３及びＱ２５からなる群のいずれか１つに対応する残基に変更を含む。更なる一実施形態では、ＢＣＭＡ変異体は、少なくとも、Ｙ１３Ｓ、Ｙ１３Ｆ又はＹ１３Ａと組み合わせたＲ２７又はＲ２７Ａで置換される。別の実施形態では、ＢＣＭＡ変異体は、Ｒ２７Ｙ又はＲ２７Ａと組み合わせたＱ２５Ｄ（Ｑ２５Ｄ／Ｒ２７変異体）で置換される。別の実施形態では、Ｑ２５Ｄ／Ｒ２７変異体は、更に、Ｙ１３Ｓ、Ｙ１３Ｆ又はＹ１３Ａで置換される。
【０００８】
一実施形態において、ＡＰＲＩＬに結合する本発明のポリペプチドは、以下の式１の配列を含む。
C-X2-X3-X4-X5-Y-X7-D-X9-LX11-X12-X13-C-K-X16-C-X18-X19-X20-C-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-C-X31-X32-X33-C  （式１）（配列番号１）
ここで、X11はA以外の任意のアミノ酸残基であり、X2、X3、X4、X5、X7、X9、X11、X12、X13、X16、X18、X19、X20、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X31、X32、X33は、システイン以外の任意のアミノ酸である。
更なる実施形態では、式１を含むポリペプチドは更に、式１の３４番目の残基に連結するカルボキシ末端の配列NSVKGTを含む。
【０００９】
更なる実施形態では、X11は式１のＬ、Ｉ又はＶである（配列番号３）。別の実施形態では、X18は式１のＱ、Ｄ及びＡからなる群より選択される（配列番号４）。式１の別の実施形態では、X20がYであれば、X18はDである（配列番号５）。式１の別の実施形態では、X20はRである（配列番号２８）。更なる実施形態では、式１の配列は、以下の配列からなる群より選択される。更なる実施形態では、式１を含むポリペプチドは
CSQNEYFDSLLHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号６）、
CSQNEYFDSLLHACKPCDLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号７）、
CSQNEYFDSLLHACKPCDLYCSSNTPPLTCQRYC（配列番号８）、及び
CSQNEYFDSLVHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号９）
更なる実施形態では、式１を含むポリペプチドは更に、式１の３４番目の残基に連結するカルボキシ末端の配列NSVKGTを含む（配列番号２）。
【００１０】
一実施形態では、ＢＡＦＦに結合する本発明のポリペプチドは、以下の式２の配列を含む。
C-X2-X3-X4-X5-X6-X7-D-X9-L-X11-X12-X13-C-X15-X16-C-X18-X19-X20-C-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-C-X31-X32-X33-C  (式２)（配列番号１０）
ここで、X6はY, A, D, S 及びFからなる群より選択され、
X11はA以外の任意のアミノ酸残基であり、
X15はA又はK以外の任意のアミノ酸残基であり、
X18はQ、D及びAからなる群より選択され、
X20はR、Y及びAからなる群より選択され、
X2、X3、X4、X5、X7、X9、X10、X12、X13、X16、X19、X22、X23、X24、X25、X26、X27、X28、X29、X31、X32及びX33はシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
但し、式２は以下の配列を含まない。
CSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC
式２の一実施形態において、X11はL、I又はVである（配列番号１１）。式２の別の実施形態では、X15はI、V又はAである（配列番号１２）。式２の一実施形態では、X18はDであり、X20はYである（配列番号３３）。式２の別の実施形態では、式２の配列は以下の配列からなる群より選択される。
CSQNEAFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１３）、
CSQNESFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１４）、
CSQNEFFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１５）、
CSQNEYFDSLLHACIPCDLRCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１６）、
CSQNEYFDSLLHACIPCQLYCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１７）、及び
CSQNEYFDSLLHACIPCDLYCSSNTPPLTCQRYC（配列番号１８）
【００１１】
更なる実施形態では、式２を含むポリペプチドは更に、３４番目の残基に連結するカルボキシ末端の配列NSVKGTを含む（配列番号１９）。
また別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、式１又は式２の配列に、異種配列N末端、C末端又はN末端とＣ末端の両方を含み、つまり、ＢＣＭＡポリペプチドに対して異種性である。また別の実施形態では、式１及び式２のアミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、又はそれ以上の同一性を有する。
【００１２】
また別の実施形態では、本発明はイムノアドヘシンである。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは抗体である。本発明の更なる一実施形態では、抗体は、F(ab)抗体、F(ab’)2抗体、及びscFv抗体からなる群より選択される。本発明の別の実施形態では、抗体は多重特異性抗体（例えば二重特異性又は三重特異性）である。本発明の別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
また別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤、細胞障害剤、検出剤、ポリペプチドの生物学的利用能を向上させる薬剤、ポリペプチドの半減期を向上させる薬剤、薬物動態を最適化することにより薬の効能を向上させる薬剤、ポリペプチドの免疫原性を低下させる薬剤、及び投与頻度の少ない薬剤からなる群より選択される薬剤に、直接又は間接に付着させる。別の実施形態では、細胞障害剤は、毒素、抗生物質及び放射性同位元素からなる群より選択される。別の実施形態では、薬剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む分子等の非タンパク質性ポリマーである。更なる実施形態では、非タンパク質性ポリマーは、ＰＥＧのような親水性の合成ポリマーを含む。一部の実施形態では、非タンパク質性ポリマーは、２ｋ  ＰＥＧ、５ｋ  ＰＥＧ及び２０ｋ  ＰＥＧからなる群より選択される。
【００１３】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子、及び当該核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドの作製方法を提供し、本方法は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を培養し、宿主細胞が発現するタンパク質を回収する工程を含む。本発明は更に、本発明のポリペプチド又は核酸分子を備える製造品を含む。
本発明は更に、本発明のポリペプチド又は核酸分子を含み、場合によっては更に製薬的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。この組成物は、免疫関連疾患の治療薬、化学療法剤及び細胞障害剤からなる群から選択される第２の治療薬を含むことができる。
【００１４】
本発明は、ＡＰＲＩＬレセプターに結合するＡＰＲＩＬのインヒビターを同定する方法を提供し、本方法は、本発明のポリペプチドのＡＰＲＩＬに対する結合を部分的に又は完全に阻止するインヒビターを検出する工程を含む。本発明は、ＢＡＦＦレセプターに結合するＢＡＦＦのインヒビターを同定する方法を提供し、本方法は、本発明のポリペプチドがＢＡＦＦに結合することを部分的に又は完全に阻止するインヒビターを検出する工程を含む。本発明はまた、哺乳動物においてＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬの結合を阻害する方法を提供し、本方法は、哺乳動物においてＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。本発明はまた、哺乳動物においてＢＣＭＡに対するＢＡＦＦの結合を阻害する方法を提供し、本方法は、哺乳動物においてＢＡＦＦとＢＣＭＡの結合を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。本発明は、哺乳動物におけるＡＰＲＩＬのシグナル伝達を阻害する方法を提供し、本方法は、哺乳動物においてＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。本発明は、哺乳動物におけるＢＡＦＦのシグナル伝達を阻害する方法を提供し、本方法は、哺乳動物においてＢＡＦＦとＢＣＭＡの結合を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を投与する工程を含む。
本発明のポリペプチドは、罹患していない被験者と比較してＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ及び／又はＢＣＭＡの発現レベルが上昇することを特徴とする疾病を含む、疾病の治療に有用である。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、免疫関連疾患の治療に有用である。好ましい一実施形態では、免疫関連疾患は自己免疫疾患である。更なる実施形態では、自己免疫疾患は、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス、重症筋無力症及びインスリン依存性糖尿病からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、ＢＡＦＦを阻害する本発明のポリペプチドを使用して、患者の免疫関連疾患を治療又は防止する。別の実施形態では、免疫関連疾患は、免疫抑制に関連するＴ細胞媒介性疾患、例えば移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び炎症（関節痛、腫脹貧血症又は感染性ショック）である。
本発明のポリペプチドは、哺乳動物の癌の治療に有用である。好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドを使用して患者の癌を治療又は予防し、その際、治療対象の癌は正常組織より高いレベルのＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦを発現する。一実施形態では、治療対象の癌は、白血病、リンパ腫、及び黒色腫からなる群より選択される群から選択される。別の実施形態では、治療対象の癌は、胃腸の腫瘍、例えば直腸、十二指腸、大腸、胃及び食道の腫瘍である。
【００１６】
詳細な説明
ここで使用される「ＢＣＭＡ」、「ＢＣＭＡポリペプチド」及び「ＢＣＭＡタンパク質」という用語は、ＢＣＭＡの生物学的活性を有する天然ＢＣＭＡポリペプチド、ＢＣＭＡ変異体及びそれらの相同体及び断片（例えばその可溶性の細胞外タンパク質）並びにそれらの変異体を包含する。例えば、「ＢＣＭＡ」とは、図５（配列番号２０）に示すアミノ酸配列によってコードされるＢＣＭＡポリペプチドに対する命名である。好ましい一実施形態によれば、ＢＣＭＡポリペプチドは、哺乳動物のＢＣＭＡであるか、又は哺乳動物のＢＣＭＡから得られたものである。別の好ましい実施形態によれば、ＢＣＭＡポリペプチドは、ヒトのＢＣＭＡであるか、又はヒトのＢＣＭＡから得られたものである。
本明細書においてＢＣＭＡポリペプチドの生物学的活性という表現は広義に使用され、ＡＰＲＩＬポリペプチドに結合するがＢＡＦＦポリペプチドには殆ど又は全く結合しないあらゆる分子（例えば、Ｉ２２に対応する残基に置換を含むＢＣＭＡ変異体）、ＢＡＦＦポリペプチドに結合するがＡＰＲＩＬポリペプチドには殆ど又は全く結合しないあらゆる分子(例えば、Ｒ２７及びＹ１３に対応する残基に置換を含むＢＣＭＡ変異体)、又はＡＰＲＩＬとＢＡＦＦポリペプチドの両方に同程度の強さで結合するあらゆる分子（例えば、Ｒ２７及びＱ２５に対応する残基に置換を含むＢＣＭＡ変異体）を含む。一実施形態では、ＡＰＲＩＬポリペプチドに結合するがＢＡＦＦポリペプチドには殆ど又は全く結合しないＢＣＭＡポリペプチドの生物学的活性は、更に、ＡＰＲＩＬによるシグナル伝達を部分的に又は完全に阻止、抑制又は中和する能力を含む。別の実施形態では、ＢＡＦＦポリペプチドに結合するがＡＰＲＩＬポリペプチドには殆ど又は全く結合しないＢＣＭＡポリペプチドの生物学的活性は、更に、ＢＡＦＦによるシグナル伝達を部分的に又は完全に阻止、抑制又は中和する能力を含む。他の実施態様では、ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦポリペプチドの両方に結合するＢＣＭＡポリペプチドの生物学的活性は更に、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦによるシグナル伝達を部分的に又は完全に阻止、抑制又は中和する能力を含む。
【００１７】
一実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、天然ＢＣＭＡの「システインに富むドメイン」（ＣＲＤ）配列に対し、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＣＲＤはヒトＢＣＭＡから得られる。別の好ましい実施形態では、ＣＲＤは、図５に記載のヒトＢＣＭＡタンパク質の残基番号８−４１である。別の実施形態では、アミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して９０％以上の同一性を有する。また別の実施形態では、アミノ酸は、天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対して９５％以上の同一性を有する。また別の実施形態では、アミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＣＲＤ配列に対し、９９％以上の同一性を有する。
別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、ＢＣＭＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列に対し、８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ＥＣＤはヒトＢＣＭＡから得られる。別の好ましい実施形態では、ＥＣＤは概ね、図５に示すヒトＢＣＭＡの残基番号１−５２である。別の実施形態では、アミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＥＣＤ配列に対し、９０％以上の同一性を有する。また別の実施形態では、アミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＥＣＤ配列に対し、９５％以上の同一性を有する。また別の実施形態では、アミノ酸配列は、天然ＢＣＭＡのＥＣＤ配列に対し、９９％以上の同一性を有する。
【００１８】
ここで同定したＢＣＭＡポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、比較対象のポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較用のコピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
表１
2008505607.tif 000002
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【００１９】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(或いは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対し、或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つか又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であるとスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることを認識されたい。本方法を使用した％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＢＣＭＡ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＢＣＭＡ」は対象のポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は対象の「ＢＣＭＡ」ポリペプチドと比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は、それぞれ異なる仮定アミノ酸残基を表す。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて前段落に記載されるようにして得られる。
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【００２０】
本発明による「天然」又は「天然配列」ポリペプチドは、自然由来のポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような天然ポリペプチドは、自然から単離できるか、又は組換え手段又は合成手段により製造できる。
ＢＣＭＡ「変異体」又は「突然変異体」は、天然ＢＣＭＡ  ＥＣＤアミノ酸配列の全部又は一部から得られるが、天然ＢＣＭＡポリペプチドの正確なＣＲＤ配列を含んでいない。一実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、天然ＢＣＭＡのＣＲＤとシステインの同じ数及び関連部分を含む。別の実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、天然ＢＣＭＡ又は天然ＢＣＭＡのＥＣＤよりＢＡＦＦに対する親和性が小さい（例えば、場合によってはアラニンが置換された、図５のＦ１４、Ｉ２２又はＱ２５に対応する残基の１つ又は全部を突然変異させることによって）。別の実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、天然ＢＣＭＡ又は天然ＢＣＭＡのＥＣＤよりＡＰＲＩＬに対する親和性が小さい（例えば、場合によってはアラニンが置換された、図５のＲ２７及びＹ１３に対応する残基の１つ又は全部を突然変異させることによって）。別の実施形態によれば、ＢＣＭＡ変異体は、天然ＢＣＭＡ又は天然ＢＣＭＡのＥＣＤよりＡＰＲＩＬとＢＡＦＦに対する親和性が小さい（例えば、場合によってはアラニンが置換された、図５のＤ１５、Ｌ１８及びＬ１７に対応する残基の１つ又は全部を突然変異させることによって）。好ましい一実施形態では、ＢＣＭＡ変異体はヒトＢＣＭＡから得られる。本発明によるＢＣＭＡ変異体が可溶性ポリペプチド、例えばＢＣＭＡ膜貫通領域を欠くポリペプチドを含むことを理解されたい。
【００２１】
ポリペプチドへの変更は、ポリペプチドの変更前の形態に対して化学的又は物理的にアミノ酸残基を変化させることにより、例えば他のアミノ酸残基の置換、残基の削除等他の突然変異、又は残基の化学的追加又は修飾により行うことができる。組換え核酸法は、エンジニアリングされた核酸分子から発現されるポリペプチドが変更を含むようにポリペプチドを変更（例えば残基の置換及び削除）するのに有用である。残基の変更はまた、対象のポリヌクレオチドを直接変更することにより、例えばアミノ酸残基の化学反応により、達成できる。天然配列ＢＣＭＡに対する、本明細書に特に開示する変更以外に、本発明のポリペプチドに追加的な変更を行うことができることを理解されたい。
ＢＣＭＡの「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」とは、基本的にＢＣＭＡ膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを有さないＢＣＭＡポリペプチドの形態を指す。ＢＣＭＡのＥＣＤの例として、図５に示すヒトＢＣＭＡの残基１−５２（配列番号２１）又は５−５１を挙げることができる。
【００２２】
本発明による可溶性ポリペプチド（例えば可溶性ＢＣＭＡ）は、水に溶け、脂質に対する目に見える親和性を欠く。可溶性ＢＣＭＡポリペプチドは、例えば、ＢＣＭＡの膜貫通ドメインを削除すること、及び任意で細胞質ドメインを削除することによって作成できる。
本発明による多量体は、本発明のポリペプチドが複数存在することを示す数値を意味することを理解されたい。好ましい一実施形態では、多量体は、ｎ量体であり、ｎは３〜１０のポリペプチドである。別の実施形態によれば、本発明によるポリペプチドの多量体複合体は、１０を超える値のｎ量体及び／又は２００万ダルトンを超える分子量を実質的に含まない。
【００２３】
ＢＡＦＦポリペプチドシグナル伝達は、特に、Ｂ細胞の生存とＢ細胞の成熟を促進する。ＢＡＦＦシグナル伝達の阻害、遮断又は中和により、特に、インビトロ又はインビボのＢＡＦＦポリペプチドの生物的活性のうち１以上が、部分的に又は完全に阻害、遮断又は中和される。生物的に活性のＢＡＦＦは、Ｂ細胞の生存増大、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭの値の上昇、プラズマ細胞の増加、及び脾臓Ｂ細胞でのNF-κb2/100のp52 NF-κbへのプロセシングからなる現象のうちのいずれか１つ又は組み合わせを増強する（例えば、Batten, M等、(2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465; Moore等、(1999) Science 285:260-263; Kayagaki等、Immunity (2002) 10:515-524）。
ＡＰＲＩＬシグナル伝達の阻害、遮断又は中和は、当技術分野において既知の方法のいずれか１つ又は組み合わせを用いるにより同定できる。例えば、インヒビターにより、（１）インビトロでのＡＰＲＩＬによる一次Ｂ細胞及びＴ細胞の同時刺激、又は（２）ＡＰＲＩＬによる抹消血Ｂ細胞からのＩｇＭ産生の刺激を、部分的に又は完全に阻害、遮断又は中和できる（Yu, G.等、(2000) Nat. Immunol. 1:252-256; Marsters, S.A. 等、(200) Curr. Biol. 10:785-788）。別の実施例では、インヒビターは、インビボでのＡＰＲＩＬ投与後において、Ｂ細胞集団の拡大及びＴ細胞の活性を低減することができる（Yu, G.等、(2000) Nat. Immunol. 1:252-256）。また別の実施例では、インヒビターを用いた投与の後の、マウスに移植された腫瘍の成長の低減について、インヒビターを試験することができる（Rennert, P.等、(2000) J. Exp. Med. 192:1677-1683）。
【００２４】
「ＢＬｙＳ」、「ＢＬｙＳポリペプチド」、又は「ＢＡＦＦ」は、特に、哺乳動物のＢＡＦＦの、自然に生じる完全長の形態、切断形態、分泌形態及び可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、哺乳動物ＢＡＦＦの自然に生じる変異形態（例えば異なってスプライシングされた形態）、自然に生じる対立遺伝子変異体、及び自然に生じるＢＡＦＦのアミノ酸配列を有するＢＡＦＦの、組換えにより発現される完全長の形態、切断形態、分泌形態、及び可溶性形態を包含する。
「ＢＡＦＦポリペプチド」の例を以下に示す。
ヒトＢＡＦＦ配列（配列番号２３）
MDDSTEREQS RLTSCLKKRE EMKLKECVSI LPRKESPSVR SSKDGKLLAA TLLLALLSCC LTVVSFYQVA ALQGDLASLR AELQGHHAEK LPAGAGAPKA GLEEAPAVTA GLKIFEPPAP GEGNSSQNSR NKRAVQGPEE TVTQDCLQLI ADSETPTIQK GSYTFVPWLL SFKRGSALEE
KENKILVKET GYFFIYGQVL YTDKTYAMGH LIQRKKVHVF GDELSLVTLF RCIQNMPETL PNNSCYSAGI AKLEEGDELQ LAIPRENAQI SLDGDVTFFG ALKLL
マウスＢＡＦＦ配列（配列番号２４）
MDESAKTLPP PCLCFCSEKG EDMKVGYDPI TPQKEEGAWF GICRDGRLLA ATLLLALLSS
SFTAMSLYQL AALQADLMNL RMELQSYRGS ATPAAAGAPE LTAGVKLLTP AAPRPHNSSR
GHRNRRAFQG PEETEQDVDL SAPPAPCLPG CRHSQHDDNG MNLRNIIQDC LQLIADSDTP
TIRKGTYTFV PWLLSFKRGN ALEEKENKIV VRQTGYFFIY SQVLYTDPIF AMGHVIQRKK
VHVFGDELSL VTLFRCIQNM PKTLPNNSCY SAGIARLEEG DEIQLAIPRE NAQISRNGDD
TFFGALKLL
【００２５】
「ＡＰＲＩＬポリペプチド」、「ＡＰＲＩＬ」及び「ＡＰＲＩＬタンパク質」は、哺乳動物のＡＰＲＩＬの、自然に生じる完全長の形態、切断形態、分泌形態、及び可溶性形態（例えば、配列の細胞外ドメイン）、哺乳動物のＡＰＲＩＬの自然に生じる変異形態(例えば異なってスプライシングされた形態)、哺乳動物のＡＰＲＩＬの自然に生じる対立遺伝子変異形態、及び自然に生じるＡＰＲＩＬのアミノ酸配列を有するＡＰＲＩＬの、組換えにより発現される完全長の形態、切断形態、分泌形態及び可溶性形態を特に包含する。「ＡＰＲＩＬ」という用語は、Hahne等, J.Exp.Med., 188:1185-1190(1998)；GenBank 登録番号AF046888；1999年1月7日発行のＷＯ９９／００５１８；1999年3月18日発行のＷＯ９９／１２９６５；1999年7月8日発行のＷＯ９９／３３９８０；1997年9月18日発行のＷＯ９７／３３９０２；1999年3月11日発行のＷＯ９９／１１７９１；1999年3月28日発行のEP911,633；1999年10月7日発行のＷＯ９９／５０４１６に記載されるこれらのポリペプチドを含む。
ＡＰＲＩＬポリペプチドの例を以下に示す。
ヒトＡＰＲＩＬ配列（配列番号２５）
MPASSPFLLAPKGPPGNMGGPVREPALSVALWLSWGAALGAVACAMALLTQQTELQSLRREVSRLQGTGGPSQNGEGYPWQSLPEQSSDALEAWENGERSRKRRAVLTQKQKKQHSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
マウスＡＰＲＩＬ配列（配列番号２６）
MPASSPGHMGGSVREPALSVALWLSWGAVLGAVTCAVALLIQQTELQSLRREVSRLQRSGGPSQKQGERPWQSLWEQSPDVLEAWKDGAKSRRRRAVLTQKHKKKHSVLHLVPVNITSKDSDVTEVMWQPVLRRGRGLEAQGDIVRVWDTGIYLLYSQVLFHDVTFTMGQVVSREGQGRRETLFRCIRSMPSDPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDIITVKIPRANAKLSLSPHGTFLGFVKL
【００２６】
一実施形態によれば、本発明によるインヒビターは、１５００ダルトン以下の「小」分子又は「小有機」分子である。
「抗体」なる用語は最も広い意味において使用され、特に、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、一本鎖抗体及び抗体断片を包含する。一実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、抗体フレームワークの、例えば可変領域又はＣＤＲに融合され、よって本抗体はそのレセプターに結合するリガンドに結合して該リガンドを阻害できる。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体とすることができる。本発明のポリペプチドを含む抗体は、抗体断片とすることができる。それらを生成するための抗体及び方法について以下に詳述する。
【００２７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称す、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来からの(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾詞「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産する必要があると解釈されるものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法によって作ることもできる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。キメラ抗体の作成方法は従来技術に既知である。
【００２８】
非ヒト抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合配列）である。大部分においてヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は別のソース等の所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の特性をさらに洗練及び最大化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体の作成方法は従来技術に既知である。
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含む従来技術に既知の様々な技術を用いて作成することができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks等、J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等及びBoerner等の技術が、ヒトモノクローナル抗体の調製に使用可能である。Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner等、J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。
【００２９】
本発明の「組成物」は、随意で製薬的に許容可能な担体と組み合わせた形態で、本発明のポリペプチドを含む。組成物は更に、目標とする症状を治療するための追加の治療薬を含むことができる。一実施形態では、組成物は、免疫関連疾患の治療薬、及び癌の治療薬から選択される第二の治療薬含む。別の実施形態では、癌の治療薬は、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤及び化学療法剤からなる群より選択される。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）を含む。
【００３０】
本明細書で用いる「標識」又は「検出薬」という語は、「標識化」ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物を作製するために、ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物に直接的又は間接的に結合させる検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
様々なタグポリペプチド及びそれら各々の抗体が、従来技術に既知である。本発明のタグポリペプチド及び抗体を考慮する。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ-ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。ＦＬＡＧペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体によって認識される（Eastman Kodak Co., New Haven, CT）。アガロースと共有結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を含む親和性基質を用いた免疫親和性クロマトグラフィによって、ＦＬＡＧペプチドを含有するタンパク質の精製を行う(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。他のタグポリペプチドは、ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【００３１】
ここで用いられる「細胞障害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は防止する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体(例えば、At２１１、I１３１、I１２５、Y９０、Re１８６、Re１８８、Sm１５３、Bi２１２、P３２及びLuの放射性同位体)、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他のインターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗体、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素又は小分子毒素等の毒素を含み、これには、それらの断片及び／又は変異体、並びに以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤が含まれる。他の細胞障害剤を以下に記載する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXANＴＭ)；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン(melphalan)、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード；ニトロ尿素類、例えばカルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン(idarubicin)、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；抗-代謝生成物、例えばメトトレキサート及び５-フルオロウラシル(5-FU)；葉酸類似体、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキサート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキサート(trimetrexate)；プリン類似体、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５-FU；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)���酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル（TAXOL(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（TAXOTERE(登録商標), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(VP-16)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン(vinorelbine)；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド(teniposide)；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；CPT-11；トポイソメラーゼインヒビターRFS2000；ジフルオロメチロールニチン(DMFO)；レチノイン酸；エスペラミシン類(esperamicins)；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。この定義にさらに含まれるものは、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン、及びトレミフェン(toremifene)(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、ロイプロリド(leuprolide)、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体である。
エスペラミシン（esperamicin）（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン及びその他の関連ナイトロジェンマスタード。この定義には更に、タモキシフェン及びオナプリストン（onapristone）等のホルモン作用を制御又は抑制するホルモン剤が含まれる。
【００３２】
ここで用いられる「成長阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのタンパク質の診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたタンパク質には、タンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３３】
「異種」成分とは、自然の状態で位置する実体から異なる実体に導入されたか、又は異なる実体内に製造された成分を指す。例えば、一生体から得られ、遺伝子エンジニアリング技術によって異なる生体内に導入されたポリヌクレオチドは、発現すると異種ポリペプチドをコードできる異種ポリヌクレオチドである。同様に、その天然コード化配列から除去され、異なるコード化配列に作用可能にリンクするプロモーター又はエンハンサーは、異種プロモーター又はエンハンサーである。同様に、ＢＣＭＡポリペプチドに融合した非ＢＣＭＡポリペプチド配列は、異種タンパク質配列である。
治療又は療法のための「哺乳動物」とは、ヒト、家庭用又は農場用動物、及び動物園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３４】
「治療的有効量」という用語は、被験者又は哺乳動物の疾病又は疾患を「軽減」又は「治療」するのに効果的な、本発明の組成物の量を意味する。一般に、疾病又は疾患の軽減は、当該疾病及び疾患を使用して、被験者又は哺乳動物における疾病又は疾患の発症又は再発を予防することができる。いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチド及び組成物を用いて治療対象又は哺乳動物の疾患又は疾病の発症ないしは再発を予防することができる。例えば、自己免疫疾患を有する被験者の場合、本発明のポリペプチドを使用して再発を防止又は軽減できる。一実施形態では、治療対象の免疫疾患がＢ細胞媒介性疾病である場合、哺乳動物のＢ細胞数の減少（Ｂ細胞枯渇）を引き起こす量である。癌の場合、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数が減少し；腫瘍の大きさが小さくなり；末梢器官への癌細胞浸潤が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止)；腫瘍の転移が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止)；ある程度、腫瘍成長が阻害され；及び／又は癌に関連した一又は複数の徴候がある程度軽減される。薬剤が癌細胞の成長を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させるならば、それは細胞成長抑制性及び／又は細胞障害性であり得る。
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか説明する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞腫等の肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎(renal)癌及びウィルムス腫瘍等の腎臓(kidney)癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々なタイプの頭部及び頸部の癌が含まれる。場合によっては、癌は、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ及び／又はＢＣＭＡの発現レベルを上げるか、又はそれらのレベルの上昇が関連する。一実施形態では、ここで治療する癌には、リンパ腫、白血病及び骨髄腫、並びにそれらのサブタイプ、例えばバーキットリンパ腫、多発性硬化症、急性リンパ芽球性又はリンパ球性白血病、非ホジキン及びホジキンリンパ腫、並びに急性骨髄性白血病が含まれる。
【００３５】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、AIDS（HIV感染）、A、B、C、D及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
【００３６】
ここで用いる「Ｂ細胞枯渇」とは、処置前のレベルと比較して、薬剤または抗体処置後に動物またはヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを表す。Ｂ細胞レベルは、既知のＢ細胞マーカーのＦＡＣＳ分析染色によって、及び実験的実施例に示した方法によって、全血球計算値を得ること等の公知のアッセイを用いて測定する。Ｂ細胞枯渇は完全または部分的なものであり得る。Ｂ細胞枯渇剤を服用する患者においては、薬剤が患者の身体を循環している間、及びＢ細胞の回復期間中は、通常Ｂ細胞が枯渇する。
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物の病的状態を直接又は間接に媒介するか、或いは当該病態に寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は、細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等に関連しており、場合によっては、例えばＴ細胞によって分泌されたリンホカインによってＢ細胞が刺激された場合、Ｂ細胞に関連する効果に関連している。
【００３７】
方法及び材料
一般に、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬが、哺乳動物の細胞中のそれぞれのレセプターに結合することを阻害する本発明の方法では、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬとそれらのレセプターとの相互作用を完全に又は部分的に遮断する本発明のポリペプチドの所望の量に細胞を曝す。一実施形態では、使用するポリペプチドの量は、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬの結合及び／又は活性に作用することにより治療効果を達成するのに有効な量である。これは、例えば、以下及び実施例に記載する方法に従って、インビトロ又はインビボで実現できる。本発明のポリペプチドを用いて処置される例示的病態又は疾患は、臨床的に自己免疫疾患と呼ばれる哺乳動物の状態を含み、それらにはリウマチ様関節炎、多発性硬化症、乾癬、及びループス又は癌及びＴ細胞媒介性疾患を含むその他の病態が含まれるが、それらに限定されない。本明細書では、診断方法もまた提供される。例えば、本発明のポリペプチドを使用して哺乳動物又はインビトロアッセイにおいてＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦを検出することができ、これはＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬに関連する病態を有すると思われるか、又は異常な量のＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦを発現していることが分かっている哺乳動物（例えば、ループス患者及びＮＺＦ／ＷＦ１マウス）において検出することを含む。一実施形態によれば、本発明のポリペプチドを、例えば免疫アッセイに使用して、試料中のＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬを検出又は定量化する。別の実施形態によれば、哺乳動物から採取した細胞等の試料を、標識した本発明のポリペプチドの存在下でインキュベートし、標識したポリペプチドの検出を行うことができる。様々な臨床的アッセイ手順を含むこのようなアッセイは、従来技術、例えばVoller等によるImmunoassays, University Park（1981）に既知である。
【００３８】
Ａ．材料
一実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの共有結合的に修飾された形態（例えば、イムノアドヘシン、標識したポリペプチド、保護されたポリペプチド、抱合型ポリペプチド等）から選択される。ポリペプチドのこれらの形態を作成するために使用される様々な技術について後述する。ポリペプチドの標識方法及びポリペプチドに分子を抱合させる方法は、従来技術に既知である。
本発明の組成物は、従来技術に既知の組換え技術を用いて調製することができる。以下の記述は、コード化核酸を含むベクターを用いて形質転換又は形質移入した宿主細胞を培養すること、及び細胞培養物からポリペプチドを回収することによる、そのようなポリペプチドの製造方法に関する。（例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach等、PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)を参照のこと。）
【００３９】
所望するポリペプチドをコードする核酸（例えば、cDNA又はゲノムDNA）を、さらなるクローニング（DNAの増幅）又は発現のための複製可能なベクターへ挿入することが可能である。種々のベクターが公的に入手可能である。限定されるものではないが、そのベクター成分には一般的に、次の１つ又は複数のものを含む：シグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、そして転写終結因子、下に記載のそれぞれ。使用できる任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写ターミネーター配列は、当該分野で知られており、国際公開第97/25428号にさらに詳細に記載されている。
発現及びクローニングベクターは、通常は、宿主生物体によって認識されるプロモーターを有し、コード化核酸配列と作用可能に連結している。プロモーターとは、特定の核酸配列の転写及び翻訳をコントロールするものであって、構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００bp内）の開始コドンの上流（5'）に位置する非翻訳配列であり、作用可能に構造遺伝子と連結している。このようなプロモーターは、典型的には、誘導性及び構成性の２つのクラスに分けられる。誘導プロモーターは、幾つかの培養条件の変化、例えば、栄養素の有無又は温度変化への応答におけるコントロール下でDNAの転写レベルの上昇を開始するプロモーターである。現在では、種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によってソースのDNAからプロモーターを取り出し、その単離したプロモーター配列をベクターへ挿入することによって、コード化DNAと作用可能に連結される。
【００４０】
原核生物及び真核生物宿主に利用するのに適したプロモーターが当該分野で既知である。一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messingら, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照のこと］。
コード化ＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。
【００４１】
組換え脊椎動物細胞培養での所望のポリペプチドの合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979); EP117,060; 及びEP117,058に記載されている。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。
【００４２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。すべてのこのような宿主細胞の例は、さらにＷＯ９７／２５４２８に記載されている。
宿主細胞を形質移入し、好ましくは上述の発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００４３】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることができる。
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法を用いることができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた使用できる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００４４】
原核生物細胞は、一般にSambrook等、上掲に記述されているような適当な培地中で培養できる。市販の培地の例には、Ham's F10（Sigma）、最小必須培地（「MEM」, シグマ）、RPMI-1640（シグマ）及びダルベッコの修正イーグル培地（DMEM, シグマ）が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、バッファー（例えばHEPES）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン（商品名）剤）、微量元素（最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について従来用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
【００４５】
発現されたポリペプチドは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収できるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶解液から回収することもできる。このポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させる。
このポリペプチドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、ポリペプチドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、実質的に相同である調製物を得るには、通常、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから該ポリペプチドを回収又は精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去する。ついで、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；疎水的相互作用クロマトグラフィー；逆相HPLC；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAE；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;及びIgGのような夾雑物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【００４６】
本発明による変異体は、適当なヌクレオチド置換をＤＮＡへ導入することによって、及び／又はポリペプチドの合成（例えば、Kunkel突然変異誘発）によって調製できる。当業者等であれば、アミノ酸により、グリコシル化部位の番号又は位置を変化させる、又は膜結合性を変える等、ポリペプチドの翻訳後のプロセスが変化することが分かるであろう。
ここに記載した本発明のポリペプチドの種々の変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異に関する任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化を起こさせる、１つ又は複数のポリペプチドコード化コドンの置換、削除又は挿入とすることができる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンをセリンで置換すること、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列中のアミノ酸の挿入、削除又は置換を系統的に作成し、その結果得られた変異体を完全長又は成熟天然配列によって示される活性に関して試験することによって決定することができる。
【００４７】
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ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はら旋構造、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
（２）中性の親水性：Cys, Ser,Thr; Asn, Gln
（３）酸性：Asp, Glu;
（４）塩基性：His, Lys, Arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入され得る。
【００４８】
本発明の範囲内で用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味で使用され、天然発生Ｌ  α−アミノ酸または残基を意味する。天然発生アミノ酸に一般的に使用されている１文字及び３文字の略号がここでも使用される(Lehninger, A. L., Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92 (1975), Worth Publishers, New York）。この用語はＤ-アミノ酸並びにアミノ酸類似物などの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどの通常はタンパク質に組み込まれない天然発生アミノ酸、及びこの分野でアミノ酸の特徴であると知られた特性を持つ化学合成された化合物を含む。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同様のペプチド化合物のコンホメーション的制限を可能にするフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物は、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物は、ここで、アミノ酸の「機能的等価物」と呼ばれる。アミノ酸の他の例は、Roberts及びVellaccio (The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology), Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5 p341, Academic Press, Inc, N.Y. 1983に列挙されており、この文献を参考文献として本明細書に包含する。
アミノ酸は、その側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：
（１）無極性：Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met
（２）荷電していない電極性：Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
（３）酸性：Asp, Glu
（４）塩基性：Lys, Arg, His
【００４９】
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Cys残基は、還元された（チオール）形態よりも極性の低い酸化された（ジスルフィド）形態に存在する。Arg側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ（Trp、Tyr、及びPhe）を含む側鎖は、イオン性-芳香族又は「カチオン-π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Pro、Gly、及びCys（ジスルフィド形態）のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
本明細書に記載する標準固相合成技術により合成されたペプチドは、例えば、アミノ酸に関する置換を行う遺伝子によってコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝コードによってコードされていない一般的なアミノ酸には、例えば、国際公開WO 90/01940に記載のもの、並びに、例えばGlu及びAspの２−アミノアビジン酸（Aad）；Glu及びAspの２−アミノピメリン酸（Apm）；Met、Leu及びその他脂肪族アミノ酸の２−アミノブチル（Abu）酸；Met、Leu及びその他脂肪族アミノ酸の２−アミノヘプタン酸（Ahe）；Glyの２−アミノイソ酪酸（Aib）；Val、及びLeu及びIleのシクロヘクシルアラニン（Cha）；Arg及びLysのホモアルギニン（Har）；Lys、Arg及びHisの２，３−二アミノプロピオン酸（Dpr）；Gly、Pro、及びAlaのＮ−エチルグリシン（EtGly）；Gly、Pro、及びAlaのＮ−エチルグリシン（EtGly）；Asn、及びGlnのＮ−エチルアスパラギン（EtAsn）；Lysのヒドロキシリジン（Hyl）；Lysのアロヒドロキシリジン（AHyl）；Pro、Ser、及びThrの３−（及び４）ヒドロキシプロリン（3Hyp、４Hyp）；Ile、Leu、及びValのアロ−イソロイシン（AIle）；Alaのアミジノフェニルアラニン；Gly、Pro、及びAlaのＮ−メチルグリシン（MeGly、サルコシン）；IleのＮ−メチルイソロイシン（MeIle）；Met及びその他脂肪族のアミノ酸のノルバリン（Nva）；Met及びその他脂肪族のアミノ酸のノルロイシン（Nle）；Lys、Arg及びHisのオルニチン（Orn又はOr）；Thr、Asn及びGlnのシトルリン（Cit）及びメチオニンスルホキシド（MSO）；Pheの−メチルフェニルアラニン（MePhe）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（F、Cl、Br、及びI）フェニルアラニン、トリflourylフェニルアラニンが含まれる。
【００５０】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。更に、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５１】
本発明のポリペプチドを含むイムノアドヘシン分子の、ここに開示する方法におけるさらなる使用を考慮する。一実施態様では、この分子は、免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域と本発明のポリペプチドの融合を含む。イムノアドヘシンの二価の形体については、そのような融合は、IgG分子のFc領域を効果的に含むことができる。更なる実施形態では、Fc領域はヒトIgG1分子に由来する。一実施態様では、免疫グロブリンの融合は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。イムノグロブリン融合体の産生については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
最も単純で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、アドヘシンの結合ドメイン（例えば本発明のポリペプチド）と免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせたものであることが多い。通常、本発明のイムノアドヘシンを調製するとき、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸は、免疫グロブリンの定常ドメインの配列のＮ末端をコードする核酸に融合されたＣ末端であるが、Ｎ末端の融合も可能である。
【００５２】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択できる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(ｂ)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
【００５３】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される：
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ；
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【００５４】
簡潔性のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3' 末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【００５５】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリン部分を、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入することができる。
【００５６】
本発明によって、これら分子のロイシンジッパー型も考慮される。「ロイシンジッパー」は、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合し、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために当該技術分野において使用される語句である。当該分野において、様々なロイシンジッパーポリペプチドが記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号；国際公開第94/10308号；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパーを本発明のポリペプチドの5'又は3'末端の何れかに融合できることを理解するであろう。
また、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列とポリペプチドを融合することによってキメラ分子を形成する方法で、本発明のポリペプチドを修飾することができる。一実施形態によれば、そのような異種ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとポリペプチドとの融合物を含む。エピトープタグは、一般的にはポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。ポリペプチドのそのようなエピトープタグ型の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの提供によって、エピトープタグに結合する抗タグ抗体又は他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製による、このポリペプチドの容易な精製が可能となる。種々のタグポリペプチドとその各抗体が、当該分野で良く知られている。その例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチドとその抗体12CA5［Fieldほか, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグとそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体［Evanほか, Mol. Cell. Biol., 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウィルス糖タンパクD(gD)タグとその抗体が含まれる［Paborskyほか, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］。他のタグポリペプチドには、Flag-ペプチド［Hoppほか, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martinほか, Science, 255:192-194 (1992)］；αチューブリンエピトープペプチド［Skinnerほか, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びT7遺伝子10タンパクペプチドタグ［Lutz-Freyermuthほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］が含まれる。
【００５７】
本発明のポリペプチドを使用してポリペプチドを含む抗体を作製することが考えられる。
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して修正することにより、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の有効性を亢進させることが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、この領域において鎖間ジスルフィド結合を形成できる。このようにして生成されたホモ二量体の抗体では、内部移行能力を向上させ、及び／又は相補体性細胞死滅及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を増大させることができる。Caron等によるJ. Exp Med 176:1191-1195 (1992)、及びShopes, B.によるJ. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性を増強したホモ二量体抗体はまた、Wolff等によるCancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製することができる。別法として、二重Ｆｃ領域を有し、よって相補体の溶解及びＡＤＣＣ能を増強した抗体を、エンジニアリングすることができる。Stevenson等によるAnti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照のこと。
【００５８】
モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)によって測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等、Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
本発明のポリペプチドを含む抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等、J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。
【００５９】
ＤＮＡも、例えば、免疫グロブリンのコード化配列に、非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部又は一部を共有結合的に加えることにより修飾することができる。
通常、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインに置換されるか、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインに置換され、１の抗原に対する特異性を有する抗原結合部位及び異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二量体抗体を生成する。
【００６０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には、非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称されることが多い。ヒト化は基本的にWinter及び共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、高頻度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には一部の高頻度可変領域残基及び場合によっては一部のＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(FR)として受け入れる(Sims等, J.Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901 (1987))。
【００６１】
もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J.Immunol., 151:2623 (1993))。
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータプログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのFR残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【００６２】
抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81[1985]を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、ＡＰＲＩＬ上のエピトープとＢＡＦＦ上のエピトープ）に対して結合特異性を有する抗体である。一実施形態では、抗−ＢＡＦＦ又は抗−ＡＰＲＩＬ結合アームは、ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦを発現する細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、ＦｃＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃＲ)に対するＦｃレセプター、又はＮＫレセプター(例えばＮＫＧ２Ｄ)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合し得る。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体は、Ｂ細胞マーカー結合アーム及び細胞傷害剤(例えば、サポリン(saporin)、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００６３】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。１のアプローチによれば、本発明のポリペプチドを含む抗体の可変ドメインを、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。好ましくは、融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の部分を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインと行う。好ましくは、融合のうちの少なくとも１つに、軽鎖の結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有する。免疫グロブリン重鎖融合、及び必要であれば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、個別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に使用する３つのポリペプチド鎖の比率を同等にしないことにより最適な収率が得られる実施形態において、３つのポリペプチド断片の比率を互いに調節する際に大きな柔軟性が得られる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現比率を等しくすることで収率が高くなるか、比率に特に有意性が無い場合、２又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード化配列を１の発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００６４】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（国際公開第９１／００３６０号、同９２／２００３７３号、及び欧州特許第０３０８９号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【００６５】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の１つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロ定方向化学カップリングを供されて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００６６】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの作製のために使用することも可能である。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、とても短くて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成ができないリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。従って、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００６７】
ここに開示する抗体を含む本発明のポリペプチドの追加的なアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、本発明のポリペプチドの結合親和性および／または生物学的特性を向上することができれば望ましい。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、コード化核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製できる。そのような修飾は、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴であるＢＣＭＡの生物学的活性を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、また、グリコシル化部位の数または位置を変えることなどの、アンタゴニストの翻訳後プロセスを改変することが可能である。
突然変異誘発に好ましい位置である本発明のポリペプチドの他の残基または領域の同定に有益な方法は、CunninghamおよびWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基または残基の組が同定され（例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電した残基）、中性の、または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、または置換の部位のために、さらなる、または他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドンまたは領域においてａｌａスキャンニングまたはランダム突然変異誘発を実行し、発現したアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００６８】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合および／またはカルボキシ−末端融合、ならびに、単一または多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ本発明のポリペプチド、または細胞障害性ポリペプチドに融合した本発明のポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの他の挿入変異体には、ポリペプチドの血清半減期を増加させる薬剤（例えば血清アルブミン結合ペプチド）に対するポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端の融合が含まれる。
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これら変異体では、抗体分子の少なくとも１つのアミノ酸残基が別の残基で置換されている。抗体アンタゴニストの置換突然変異誘発に関して最も興味深い部位には高頻度可変領域が含まれるが、ＦＲ変換も考慮される。常套的な置換を上掲の表４の「好ましい置換」の欄に示す。このような置換により生物学的活性に変化が生じたならば、表４の「例示的置換」の欄に示す更に重要な変化を導入することができ、産物をスクリーニングできる。
【００６９】
本発明のイムノアドヘシン、抗体又はその他ポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、本発明の抗体(特に抗体断片)、イムノアドヘシン又はポリペプチドへサルベージレセプター結合エピトープを接着させることができる。（例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸は、核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のエピトープとポリペプチド配列とを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体及び血清半減期が増大した抗体については、WO00/42072 (Presta, L.)にも記載されている。別の実施態様では、例えば血清アルブミン又は血清アルブミンの一部をＦｃＲｎレセプターに、或いはWO01/45746に記載の血清アルブミン結合ペプチドを本発明のイムノアドヘシン、抗体又はポリペプチドに接着させることによっても、血清半減期を増大させることができる。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S.等、(2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
本発明のポリペプチドに直接的又は間接的に付着することにより、治療用又は診断用の使用能を高める薬剤には、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む非タンパク質様ポリマーが含まれる。ポリペプチドを他の分子（例えば、ポリマー、小分子、検出試薬）に接合する複数の方法が従来技術に既知である。例えば、各々が、互いに対して反応性の特殊な機能を有するポリエチレングリコールを含むポリペプチド及びポリマーを、連鎖により溶液中で結合することができる。ポリペプチドは、適切な官能基により特異的な部位において「プレ活性化」することができる。ＰＥＧによるポリペプチドの連結は、水相で起こり、逆相分析用ＨＰＬＣにより容易にモニターできる。ＰＥＧ化したポリペプチドは、調製用ＨＰＬＣにより容易に精製することができ、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法により特徴付けることができる。
【００７０】
ａ．ポリペプチド反応部位
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、主に反応条件、ポリマーの分子量等に応じて、当該ポリペプチドの一以上のアミノ酸残基を介してポリマーの末端反応基に共有結合的に結合される。一部の実施形態では、複数のポリペプチドが、２以上の末端反応基を有するポリマーに抱合される。反応基を有するポリマーを、本明細書では活性化ポリマーと呼ぶ。反応基は、遊離アミノ又はポリペプチド上の他の反応基に反応できる。潜在的反応部位は、Ｎ末端アミノ基、リジン残基上のεアミノ基、並びに他のアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、及び他の親水基を含む。しかしながら、結果を最適化するために、選択する反応基の種類と量、並びに使用するポリマーの種類は、使用する特定のポリペプチドによって変わり得る。一部の実施形態では、反応性残基（例えば、リジン（Ｋ）、修飾された非天然アミノ酸、又は他の小分子）は、抱合に適した位置において置換できる。
一部の実施形態では、本ポリペプチドは、
式１（配列番号１）、
CSQNEYFDSLLHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号６）
CSQNEYFDSLLHACKPCDLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号７)、
CSQNEYFDSLLHACKPCDLYCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号８）、
CSQNEYFDSLVHACKPCQLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号９）、
式２  （配列番号１０）、
CSQNEAFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１３）、
CSQNESFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１４）、
CSQNEFFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１５）、
CSQNEYFDSLLHACIPCDLRCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１６）、
CSQNEYFDSLLHACIPCQLYCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１７）、及び
CSQNEYFDSLLHACIPCDLYCSSNTPPLTCQRYC  （配列番号１８）
からなる群より選択された配列を含み、更に末端反応基を有する。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、抱合された複数の本発明のポリペプチドを含む。例えば、リンクされるポリペプチドは、同じ又は異なる配列、及び末端反応基を有することができる。別の実施形態では、これらポリペプチドは、リンカーを用いて互いに結合することができる。
【００７１】
ポリペプチドの任意の反応性アミノ酸における抱合を考慮する際、一部の実施形態において反応性アミノ酸は、その遊離εアミノ基により活性化ポリマーの反応基にリンクするリジンであるか、又はアミド結合によりポリマーにリンクするグルタミン酸又はアスパラギン酸である。
各ポリペプチドとのポリマーの抱合の度合いは、例えば、ポリペプチドの反応部位の数、分子量、ポリマーの親水性及び他の特徴、並びに選択された特定のポリペプチドの誘導体化部位に応じて変わる。一部の実施形態では、抱合の最終モル比は、ポリペプチド分子１つ当たり１〜１０ポリマー分子であるが、本発明のポリペプチドにさらに多くのポリマー分子を付着させることも考えられる。別の実施形態では、抱合の最終モル比は、１ポリマー分子当たり１〜１０ポリペプチド分子である。誘導体化の所望の量は、時間、温度、及び他の反応条件を変化させることにより置換の程度を変える実験マトリクスを用いることにより達成することができ、その後抱合体のポリマー置換のレベルを、サイズ排除クロマトグラフィー又は従来技術に既知の他の手段によって決定することができる。
【００７２】
ｂ．活性化ポリマー
一部の実施形態では、ポリマーは、反応性を有する単一基のみを含む。好ましい一実施形態では、ポリマー−ポリペプチド反応条件を最大化することにより、架橋を低減するか、或いは、ゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を精製してほぼ均一な誘導体を回収することができる。一部の実施形態では、ポリマーは、多機能性架橋剤を用いずに、共有結合的に直接ポリペプチドに結合する。
他の実施形態では、ポリマーは、多数のポリペプチドをポリマーのバックボーンにリンクさせることができる、２以上の反応基を含む。例えば、ホモ二機能性のＰＥＧ分子は、直鎖状ＰＥＧの各端部にそれぞれ１の反応基を有するので、ポリペプチドを各端部に共有結合的に付着させることができる。一部の実施形態では、分岐したＰＥＧ分子を使用して、ポリペプチド抱合のための複数の反応部位を提供する。ゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して、ほぼ均一な形態で所望の誘導体を回収することができる。
【００７３】
共有結合性修飾反応は、通常生物学的に活性の材料を不活性なポリマーと反応させるのに使用される方法のうちいずれかの適切な方法により引き起こすことができる。一部の実施形態では、ポリペプチドの反応基がリジン基である場合、反応は約ｐＨ５〜９で起こる。例示的方法では、活性化したポリマー（このポリマーの少なくとも１つの末端ヒドロキシル基を活性化する）調製し、このポリマーから活性の基板を調製し、その後ポリペプチドを活性基板と反応させることにより修飾されたポリペプチドを製造する。上述の修飾反応は、複数の方法で行うことができ、それらは１以上の工程を有する。１段階の反応で活性ポリマーを製造するために使用できる修飾剤には、塩化シアヌル酸（２，４，６−トリクロロ−Ｓ−トリアジン）及びフッ化シアヌル酸が含まれる。
一部の実施形態では、修飾反応は２段階で引き起こされる。その場合、まずポリマーを、無水コハク酸又は無水グルタル酸等の無水酸物と反応させてカルボン酸を形成し、次いでカルボン酸を、カルボン酸と反応する化合物に反応させ、ポリペプチドとの反応能を有する反応性エステル基を有する活性化ポリマーを形成する。そのような化合物の例として、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸等を挙げることができる。好ましい一実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド又は４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸を使用する。例えば、モノメチルで置換したＰＥＧを高温で、好ましくは約１００〜１１０℃で１時間に亘り、無水グルタル酸と反応させることができる。このようにして製造されたモノメチルＰＥＧ−グルタル酸を、次に、ジシクロヘキシル又はイソプロピルカルボジイミド等のカルボジイミド試薬の存在下でＮ−ヒドロキシスクシニミドと反応させることにより、活性化されたポリマーであるメトキシポリエチレングリコリル−Ｎ−スクシニミジルグルタレート（methoxypolyethylene glycolyl-N-succinimidyl glutarate）を製造することができ、次いでこれをＧＨに反応させることができる。この方法は、Abuchowski等、Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984)に詳細に説明されている。別の実施例では、モノメチル置換したＰＥＧを無水グルタル酸と反応させた後、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させることにより、活性化されたポリマーを製造することができる。ＨＮＳＡは、Bhatnagar等、Peptides: Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich等(編集) (Pierce Chemical Co., Rockford Ill., 1981), p. 97-100, 及びNitecki等、High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) 表題 "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications"に記載されている。
【００７４】
一部の実施形態では、アミノ基への共有結合的結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール（carbonyl diimidazole）、アルデヒド反応基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯ及び無水酢酸、或いは、塩化ＰＥＧ＋４−ヒドロキシルベンズアルデヒド、活性化スクシニミジルエステル、活性化ジチオ炭酸塩ＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロギ酸塩又はＰ−ニトロフェニルクロロギ酸塩活性化ＰＥＧのフェノール塩）に基づく既知の化学により行われる。カルボキシル基は、例えば、カルボジイミドを用いてＰＥＧ−アミンを結合することにより誘導体化することができる。スルフヒドリル基は、例えば、1997年3月27日公開のWO97/10847に記載のように、マレイミドで置換したＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミン＋スフホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩に結合するか、又はNektar Technologies, San Carlos, CA (旧Shearwater Polymers, Inc.)より市販されているＰＥＧ−マレイミドに結合することにより誘導体化することができる。別法として、ポリペプチド上の遊離アミノ基（例えば、リジン残基上のεアミノ基）を、Ｎ−ヒドロキシルスクシミニジル置換ＰＥＧ（Nektar TechnologiesのＰＥＧ−ＮＨＳ）に結合することができるか、又は２−イミノ−チオラン（thiolane）（Trautの試薬）を用いてチオラン化し、次いでPedley等、Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994)に記載のように、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体に結合することができる。
多くの不活性ポリマーが、医薬品に使用するのに適している。例えば、Davis等、Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp.441-451 (1980)参照のこと。非タンパク様ポリマーは、通常、親水性合成ポリマー（すなわちそれ以外には自然に見られないポリマー）であるが、自然に存在し、組換え又はインビトロ法によって生産されるか、或いは自然から単離されるポリマーを含む。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンは、本発明の範囲に含まれる。他の有用なポリマーは、ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）;ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、及びポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（PLURONIC（登録商標））;ポリメタクリル酸塩;カルボマー;糖類モノマーＤ-マンノース、Ｄ-及びＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ‐グルコース、及び酸性のムコ多糖（例えばヒアルロン酸）のラクトース、アミロペクチン、澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、又は多糖類サブユニットのようなホモ多糖類及びヘテロ多糖類を含むノイラミン酸から成る分岐又は非分岐多糖類;砂糖アルコール類のポリマー、例えばポリソルビトール及びポリ・マンニトール;ヘパリン又はヘパロン（heparon）である。
【００７５】
抱合前のポリマーは、好ましくは水溶性であるが、これは必須ではない。しかし、最終的な抱合体は水溶性であることが好ましい。好ましくは、抱合体は少なくともおよそ０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくともおよそ０．１ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは少なくともおよそ１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。加えて、抱合体が静脈内注入、注射又は吸入によって投与される場合、投与経路に適合しないので、投与ポリマーは抱合形態で免疫原性及び粘性があまり高くないことが望ましい。
ポリマーの分子量は、約１００，０００ダルトン（Ｄ）までとすることができ、好ましくは少なくとも約５００Ｄ、又は少なくとも約１，０００Ｄ、又は少なくとも約５，０００Ｄである。一部の実施形態では、ＰＥＧ又は他のポリマーの分子量の範囲は５０００（５Ｋ）〜２０，０００（２０Ｋ）Ｄである。選択される分子量は、最終的な抱合体の有効サイズ、ポリマーの性質（例えば直鎖又は分岐等の構造）、及び誘導体化の程度、つまり１ポリペプチド当たりのポリマー分子の数、及びポリペプチド上のポリマー付着部位によって決まる。一部の実施形態では、分岐ＰＥＧを使用してポリペプチドの有効サイズの大規模な増大を誘発することができる。ＰＥＧ又は他のポリマー抱合体は、特に、半減期の増大、可溶性の増大、タンパク分解性攻撃に対する安定化、及びポリペプチドの免疫原性の低下に有効であり得る。一部の実施形態では、分子量５Ｋ〜４０Ｋの単一のＰＥＧ分子を１以上の本発明のポリペプチドに抱合させることができ、これは例えば吸入による投与に適している。
【００７６】
上記のような官能性ＰＥＧポリマーは、合成することができるか、Nektar Technologies／San Carlos, CA (旧Shearwater Polymers, Inc.)等の会社から購入することができる。このような市販のＰＥＧ誘導体は、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステルを含むがこれらに限定されない。ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシナミド化学（ＮＨＳ）、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−琥珀酸塩、カルボキシメチレート化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシニミジル琥珀酸塩、ＰＥＧスクシニミジルプロピオン酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシニミジルエステル、ＰＥＧのスクシニミジル炭酸塩、アミノ酸ＰＥＧのスクシニミジルエステル類、ＰＥＧ−キシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニル炭酸塩、ＰＥＧ  tresylate、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−二硫化物、ヘテロ機能的なＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシラン及びＰＥＧホスホリド（phospholides）。これらＰＥＧ誘導体を一般にタンパク質に結合させる反応条件は既知であり、それはポリペプチド、所望のＰＥＧ化の度合い、及び使用するＰＥＧ誘導体を含む因子の数に応じて決まる。ＰＥＧ誘導体の選択に関わる一部の因子は、所望の付着地点（例えばリジン又はシステインのＲ基）、加水分解の安定性及び誘導体の反応性、連鎖の安定性、毒性及び抗原性、分析のための適合性を含む。
【００７７】
ｃ．抱合体の特徴
ポリマー−タンパク質抱合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシンマッピング、液体クロマトグラフィー−質量分光光度法、及びインビトロ生物学的アッセイを含む多数のアッセイのいずれか１つによって特徴付けることができる。例えば、ＰＥＧ抱合体の範囲をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過により示し、次いで、ＰＥＧのメチレン水素に特異的な共鳴のピークを有するＮＭＲによって分析することができる。各分子上のＰＥＧ基の数は、ＮＭＲスペクトル又は質量分析から計算できる。１０％のＳＤＳ中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を、溶出緩衝液として１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌを用いて適切に行う。いずれの残基がＰＥＧ化されたかを示すため、トリプシンマッピングを行うことができる。このように、タンパク質／酵素の比をｍｇベースで１００対１とし、３７℃で４時間に亘り、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ８．３中においてＰＥＧ化ポリペプチドをトリプシンで消化し、ｐＨ＜４に酸性化し、HPLC NUCLEOSIL（登録商標）Ｃ−１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５ｍｕ．，１００Ａ）上で分離する前に消化を止めることができる。そのクロマトグラムは、ＰＥＧ化していない出発物質のクロマトグラムと比較することができる。その際、各ピークを質量分析により分析してピークにおける断片の大きさを検証する。ＰＥＧ基を有する断片は、注入後通常ＨＰＬＣカラムに保持されず、クロマトグラフから消失する。このように、クロマトグラフからの消失は、その特定の断片上にＰＥＧ化が起こったことを示す。ＰＥＧ化ペプチドは、従来の方法により、Ａｐｒｉｌ又はＢＡＦＦへの結合能についてアッセイすることができる。
一部の実施形態では、抱合体はイオン交換クロマトグラフィーによって精製される（例えばイオン交換ＨＰＬＣ）。求電子的に活性化されるＰＥＧの多くの化学的性質により、ＰＥＧ化産物のアミノ基の電荷が減少する。これにより、高分解能イオン交換クロマトグラフィーを使用して、遊離タンパク質と抱合タンパク質を分離し、ＰＥＧ化のレベル異なる複数の種に分解することができる。実際、異なる種の分解（例えば１又は２のＰＥＧ残基を含む）はまた、反応しないアミノ酸のイオン特性の差異により行うことができる。一実施形態では、ＰＥＧ化のレベルが異なる複数の種を、ＷＯ96/34015（1996年10月31日公開、国際出願番号PCT/US96/05550）に記載の方法に従って分解する。一実施形態によれば、抱合体の異なる種を、同じ方法で互いに精製する。
【００７８】
Ｂ．アッセイ方法
一実施形態によれば、ＢＡＦＦ／ＢＡＦＦレセプターの結合の研究又はＡＰＲＩＬ／ＡＰＲＩＬレセプターの結合の研究は、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等の任意の既知のアッセイ方法により実行することができる。別の実施形態によれば、ここに記載のように、天然配列ＢＣＭＡの位置に本発明のポリペプチドを用いて結合アッセイを実行する。細胞に基づくアッセイ及び動物モデルを使用して、ＢＣＭＡとそのリガンドとの間の相互作用、並びに本明細書で言及する病態と疾病の進行及び病因に対する理解を更に深めることができる。アッセイに応じて、本発明のポリペプチドは、例えば、可溶性ポリペプチド、非ＢＣＭＡポリペプチド又は天然ＢＣＭＡポリペプチドの膜貫通領域及び細胞質領域を有する膜結合性ポリペプチド、或いは固定基板に固定したポリペプチドとすることができる。
一の方法では、哺乳動物の細胞を、ＢＣＭＡをコード化する核酸分子で形質移入し、試験ポリペプチドがＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦの、そのレセプターへの結合を阻害する能力、或いはＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ活性を阻害する能力を分析する。
また、遺伝子導入動物から採取した一次培養物を細胞に基づくアッセイに使用できる。遺伝子導入動物から連続的な細胞系を採取する技術は従来技術に周知である[例えば、Small等、Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)参照]。
【００７９】
１の細胞に基づくアッセイでは、本発明のポリペプチドを有するか、又は本発明のポリペプチドを発現する細胞に、エピトープタグを付したＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬ（例えばＡＰ又はＦｌａｇ）を添加し、ＦＡＣＳ染色により抗タグ抗体を用いて細胞への結合について分析する。別のアッセイでは、本発明のポリペプチドが、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬによって誘発されたＢ細胞、Ｔ細胞又は腫瘍細胞の増殖を阻害する能力をアッセイする。ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬを用いて、試験ポリペプチドの存在下又は不在下で一次細胞又は細胞系を培養し、例えば３Ｈ−チミジン取り込み又はＦＡＣＳ分析により当該細胞の増殖を測定することができる。
Ｔ細胞活性化の阻害におけるポリペプチドの直接的役割を試験するため、Ｔ細胞の抗原特性の活性のインビトロアッセイを行うことができきる。試験ポリペプチドの存在下でのインビトロにおける抗ＣＤ３抗体Ｔ細胞の活性化は、これらＴ細胞によるＩＬ−２産生及び増殖を測定することにより検査することができる。
【００８０】
上述のように、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Pharmingen）を様々な濃度で用いて、倍地中における様々な濃度の試験ポリペプチドの存在下又は不在下で、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞（Jackson Laboratory）を培養することができる（１×１０６／ウェル）。増殖は、３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定できる。また、２４時間培養システムにおいて、抗ＣＤ３抗体誘発性のＩＬ−２産物生成に対する試験ポリペプチドの影響を測定するために、平行アッセイを設定することができる。Pharmingen社の抗体を使用し、それらの組換えプロトコルを用いることにより、ＥＬＩＳＡを使用して上清中のＩＬ−２のレベルを決定することができる。
ＴＣＲ遺伝子導入細胞のインビトロでの刺激に対する試験ポリペプチドの影響を研究するために、成体のＭＢＰ−ＴＣＲ遺伝子導入マウス（例えばDr. Richard Flavell, Howard Hughes Medical Institute, Yale Universityから入手）由来の細胞１×１０６個を、１０μｇ／ｍｌのＭＢＰ−Ａｃ１−１１（アミノ酸配列ASQKRPSQRSK（配列番号２７）を有し、最初のアミノ酸がアセチル化されているミエリン塩基性タンパク質の合成ＮＨ２−末端ペプチド）の存在下で、５％のＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地の９６ウェルプレートで、試験ポリペプチドの濃度を様々に変化させて、或いは試験ポリペプチドの不在下で、培養することができる。増殖は、５日間に亘る培養の最後の１８時間の間、１μＣｉの[３Ｈ]チミジン（International Chemical and Nuclear, Irvine, CA）を添加することにより測定することができ、放射能の取り込みを液体シンチレーション計数によりアッセイすることができる。抗ＣＤ３抗体によって誘発された天然Ｔ細胞の増殖、又は抗ＣＤ３抗体によって誘発されたＩＬ２の産生が、容量に依存して阻害されることは、試験ポリペプチドを用いてＴ細胞活性を遮断できることを示すものである。
【００８１】
更に、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルにより証明することができる。免疫関連疾患又は癌において本発明のポリペプチドを更に研究するため、及び候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、及び腎被膜下移植により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。
遅発型過敏症の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイをまた提供する。遅発型過敏反応は、抗原投与後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。これらの反応はまた組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(ＭＳ)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル)で生じる。適切な手順はCurrent Protocols in Immunology, unit4.5.に詳細に記載されている。
【００８２】
関節炎の動物モデルは、コラーゲン-誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及び軟骨下(subchondral)骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology, unit15.5.に記載されているプロトコルを使用し、自己免疫関節炎に対する活性を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology (1996) 88:569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。例えば、１のＣＩＡモデルでは、２つのグループのマウス（生後７〜８週の雄ＤＢＡ／１マウス（Jackson Laboratory）を、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（Difco）で乳化した１００μｇのウシコラーゲンタイプ２（ＢＣＩＩ）（Sigma Chemical Co.）を用いて皮内免疫できる。次いで、２１日後に、フロイント不完全アジュバント中でＢＣＩＩを用いてマウスに再度負荷をかけた。動物に関節炎の臨床的兆候を持つ著しい疾病が発症し、時間と共に重症度が増した。２４日目からは、１グループのマウスに本発明のポリペプチド１００μｇの注射を開始し、注射は１週間に３回、腹腔内に、６週間に亘って行った（Ｎ＝９）。同じく２４日目から、コントロール群として２番目のグループにはマウスＩｇＧ１００μｇを投与した（Ｎ＝１０）。次いで動物を、関節炎の臨床的兆候についてモニターし、試験終了時には、以下に記載のように、放射線による試験及び組織病理学的試験を行った。
関節の炎症の兆候についてマウスを毎日試験し、正常の場合は０、紅斑及び軽度の腫れが足首の関節に限定的に見られる場合は１、紅斑及び軽度の腫れが足首から中足骨／中手骨に広がっている場合は２、紅斑及び中程度の腫れが足首から中足指節／中手指節関節に広がっている場合は３、紅斑及び重度の腫れが足首から指に広がっている場合は４というようにスコアリングした。足１本当たりの最大の関節炎スコアは４であり、マウス１匹当たりの最大の疾病スコアは１６であり、平均の関節炎スコアはグループ内の全動物から計算する。
【００８３】
試験終了時の放射線学的分析のために、Ｘ線Ｆａｘｉｔｒｏｎ製の画像化システム（Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL）を用いて前足と後足の両方をＸ線撮影することができる。データをデジタル化し、Ｘ線写真を準備することができる。次いでＸ線写真を骨糜爛及び軟組織膨張について試験することができる。組織病理学的分析のため、マウスの前足を切除し、１０％のフォルマリン中に固定し、脱灰し、パラフィンに埋設する。関節の切片（６〜８μｍ）を準備し、標準的な組織化学的方法を用いてヘマトキシリン及びエオシンで染色する。関節炎の前足の顕微鏡による評価を盲目法で実施することができる。足首の関節炎の変化、中手指節関節／中足指節関節、近位指関節、及び関節を、関節軟骨及び肋軟骨下骨糜爛について試験することができる。
更に、本発明の組成物は乾癬用疾患の動物モデルにおいて試験することができる。本発明の化合物は、Schon. M.P.等, Nat. Med. (1997) 3:183により記載されているscid／scidマウスモデルにおいて試験することができ、そのモデルではマウスは乾癬に類似した組織病理学的皮膚病巣を示す。他の適切なモデルはNickoloff, B.J.等, Am. J. Path. (1995) 146:580に記載されているようにして調製されたヒトskin／scidマウスキメラである。
【００８４】
候補治療用組成物の抗癌活性を試験するために、様々な動物モデルが周知である。これらには、ヒト腫瘍の胸腺欠損ヌードマウス又は重症複合免疫不全／重症複合免疫不全マウスへの異種移植、或いはｐ５３ノックアウトマウス等の遺伝的マウス腫瘍モデルが含まれる。
多発性骨髄腫の１モデルは、ヒトプラズマ細胞腫の異種移植マウスモデル（LeBlanc, R.等、(2002) Cancer Res. 2002 62(17): 4996-5000）である。このアッセイでは、免疫不全の（ベージュ−ヌード−ｘｉｄ）マウスを２つの独立した実験に使用できる。マウスには、例えば３×１０７個のＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫細胞を皮下注射する。腫瘍が測定可能になったら（９．２日、腫瘍注入後６〜１３日の範囲）、試験ポリペプチドを様々な濃度で投与する治療群又は媒体のみを投与するコントロール群にマウスを分割する。腫瘍の成長が有意に阻害された場合、場合によっては腫瘍が完全に退行した場合、治療的インヒビターであることが示される。コントロールと比較して全体の生存のメジアン値が有意に伸びた場合、治療的インヒビターであることが示される。
【００８５】
本明細書に記載のポリペプチドと組成物は、好ましくは担体中で用いられる。適切な担体とそれらの製剤は、Osloらにより編集された、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co.,に記載されている。典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。溶液のｐＨは、好ましくは約５から８、さらに好ましくは約７．４から７．８である。例えば投与される抗体の投与経路及び濃度によっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。担体は凍結乾燥又は水溶液の形態であってもよい。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商品名）、PLURONICS（商品名）又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な２つ以上の活性化合物を含むことができ、これらは好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つ。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌であるべきである。これは、無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγエチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-（-）-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。
【００８７】
Ｄ．治療方法
ここに記載のポリペプチドは、免疫関連疾患又は癌等の様々な病態を治療するのに有用である。これらの症状は、本発明の１以上のポリペプチドを投与して、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬの活性を阻害することか、或いはＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬを発現する細胞を標的として哺乳動物体内で死滅させることにより治療することができる。
ここに記載の種々の病理学的状態の哺乳動物の診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。診断技術は、例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検知を考慮する技術分野において入手可能である。例えば癌は、触診、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等を含むがこれらに限定されない技術により同定することができる。免疫関連疾患もすぐに同定することができる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受けた。
【００８８】
慢性関節リュウマチ(RA)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はTリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己IgGに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、RA疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。RAで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はRAといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【００８９】
脊椎関節症は、一般的にHLA-B27遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；HLA-B27(血清学的には、クラスＩ MHCのHLA-B座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ MHC分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、MHCクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ MHC対立遺伝子HLA-B27と反応する。HLA-B27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応が誘発されると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ICAM-1は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【００９０】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びRNAに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ-タンパク質複合体であるRo及びLa抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
【００９１】
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群(ＭＬＮＳ又は川崎病)、単離したCNS血管炎、ベヘット(Behet's)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
【００９２】
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はADCC/Fc-レセプター-媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc-レセプター-媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
【００９３】
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット(BUF及びBBラット)及びチキン(肥満チキン種)；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン-非-反応性の表現型を産出することができる。
【００９４】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症を含む中枢及び末梢神経系の脱髄疾患；特発性脱髄性多発神経障害又はギラン-バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫に基礎をなし、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因する損傷の結果である神経脱髄を起こすと考えられている。MSでは、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。病巣はTリンパ球媒介が主である小グリア細胞及び浸潤マクロファージの湿潤を有し；病巣では、CD4+Ｔリンパ球が主な細胞型である。オリゴデンドロサイトの細胞死とその後の脱髄のメカニズムはよく知られていないが、T細胞で促進されるようである。
【００９５】
好球性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、脱制御された免疫免疫炎症反応が関わっている。そのような応答の阻害は、治療的に有益であろう。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、その発生はＴリンパ球に依存する。
【００９６】
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。病巣はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤を有する。
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びIgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
【００９７】
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、MLRを刺激する(分子／誘導体／アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばHIV感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
【００９８】
本発明のポリペプチドは、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、病巣内又は吸入の経路により投与することができる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することができる。また、本発明のポリペプチドは、当該技術分野において説明されている遺伝子治療技術を使用して用いてもよい。
本発明のポリペプチドの投与にとって有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。一回又は複数回服用を用いることができる。単独に使用される本発明のポリペプチドの効果的な用量又は量は、１日当り体重の約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれより多い範囲であると現在考えられている。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような、当該分野において既知の方法を用いて実施することができる。
【００９９】
本発明のポリペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。特定の用量及び送達方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号を参照のこと。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で送達することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないポリペプチドの用量が、例えば、アゴニスと又はアンタゴニストを投与される哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療物によって変わりうることを理解するであろう。
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)のポリペプチドが患者への最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬計画も有効であり得る。
【０１００】
随意で、何らかのポリペプチドを投与する前に、哺乳動物又は患者を試験してＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦのレベル又は活性を決定することができる。そのような試験は、血清試料又は抹消血白血球のＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより行うことができる。
また本発明に別の療法を加えることも考慮できる。本発明のポリペプチド（及び１以上のほかの療法）を、同時に又は連続して投与することができる。１以上の療法は、限定されないが、放射線治療、サイトカイン、成長阻害剤、化学療法剤、細胞障害性剤、チロシンキナーゼ阻害薬、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、血管形成阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬を含み得る。加えて、腫瘍抗原を標的とする治療的抗体、例えばＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）又はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、並びに抗血管形成抗体、例えば抗ＶＥＧＦに基づくものが含まれる。
【０１０１】
化学療法剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用できるか、有能な実務家により経験的に決定されて使用できる。このような化学療法剤の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams &amp; Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、例えば本発明のポリペプチドの投与の前又は後、或いはそれと同時に投与できる。本発明のポリペプチドは、抗エストロゲン化合物、例えばそのような分子に知られている投与におけるonapristone（EP616812参照）等の抗プロゲステロン又はタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物と組み合わせてもよい。
他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子（ＶＥＧＦ）、又はその他ＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）も投与することが望ましい。或いは、ここに開示される同じ抗原又は２以上の異なる抗原に結合する加えて２以上の抗体を患者に同時投与できる。場合によっては、加えて１以上のサイトカインを患者に投与することが効果的となり得る。一実施形態では、ここに開示するアンタゴニストと成長阻害剤を同時投与した。例えば、成長阻害剤をはじめに投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与することができる。
【０１０２】
Ｅ．スクリーニング方法
本発明はまた、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬの、それらのレセプターに対する結合のインヒビターを同定する方法を含む。そのような分子は、抗体を含めた小分子又はポリペプチドを含むことができる。小分子の例には、限定されるものではないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性のペプチド、及び合成非ペプチジル有機化合物又は無機化合物が含まれる。候補薬剤のスクリーニングアッセイは、ここで同定されるポリペプチドに結合するか、又はそれと複合する化合物又は分子、或いはこれらのポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物又は分子の同定を目的としている。このようなスクリーニングアッセイは、化学ライブラリのハイスループットスクリーニングに使用可能なアッセイを含むことにより、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとなっている。
本アッセイは、従来技術で良好に特徴付けられている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞に基づくアッセイを含め、様々な形式で実施することができる。
【０１０３】
例えば、インヒビターを同定するアッセイは、候補薬剤と本発明のポリペプチドが相互作用するのに十分な条件下及び時間で候補薬剤を本発明のポリペプチドに接触させる点で共通している。
結合アッセイでは、そのような相互作用は結合であり、形成された複合体を反応混合物の中で単離又は検出することができる。特定の実施形態では、ここに同定されるポリペプチド又は候補薬剤を、共有結合的又は非共有結合的付着により、マイクロタイタープレート等の固相に固定する。非共有結合的付着は通常、固体表面をポリペプチドの溶液でコーディングし、乾燥させることにより達成される。別法では、固定したポリペプチドに特異的に固定した抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して固体表面に係留することができる。本アッセイは、固定化した成分、例えば係留成分を含むコーティングした表面に対し、検出可能な標識により標識化できる非固定化成分（例えば候補薬剤）を添加することにより実行される。反応が完了したら、例えば洗浄により非反応成分を除去し、固体表面に係留された複合体を検出する。元々固定化されていない成分が検出可能な標識を有するとき、表面に固定化された標識が検出されるということは、複合体が形成されていることを示す。元々固定化されていない成分が標識を有さない場合、複合体の形成は、例えば、非固定化成分に特異的に結合する標識した抗体を用いることにより検出することができる。
【０１０４】
ＢＡＦＦとそのレセプター、及びＡＰＲＩＬとそのレセプターの相互作用を妨害する化合物又は分子、並びに他の細胞内又は細胞外成分を以下のように試験することができる。通常、二つの産物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間で本発明のポリペプチドを含む反応混合物を調製する。候補化合物の結合阻害能を試験するため、試験化合物の存在下及び不在下で反応を実施する。加えて、プラセボを３番目の反応混合物に加え、ポジティブコントロールとすることができる。試験化合物と本発明のポリペプチドとの結合（複合体の形成）をモニターする。コントロール反応物に複合体が形成され、反対に試験化合物を含む反応混合物に形成されないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
また、本発明のポリペプチドを従来技術に既知のアッセイを用いて評価し、その活性の強さを決定することができる。一実施形態によれば、ＢＡＦＦインヒビターの同定方法は、脾臓Ｂ細胞におけるＮＦ−κｂ２／１００プロセシングアッセイである。更なる実施形態によれば、ＮＦ−κｂ２／１００プロセシングアッセイは、以下のように実施される。ＭＡＣＳビーズ（Miltenyi）を用いてマウス由来の脾臓Ｂ細胞を単離する。試験するポリペプチドを用いて室温で３０分間に亘り前持ってインキュベートしておいた組換えＢＡＦＦ（２ｎＭ）又はコントロール（例えば、ポジティブ抑制性コントロールとして天然ＢＣＭＡポリペプチドを用いて）の存在下又は不在下において、Ｂ細胞を２４時間に亘り培養する。その後、Ｂ細胞を溶解する。抗−ＮＦ−κＢ２又は抗βアクチン抗体を用いて可溶化液（１０μｇ）に対するウエスタンブロット分析を行う。Kayagaki, N等、(2002) Immunity 10:515-524を参照のこと。本アッセイにおけるインヒビターは、ＮＦκＢ２／１００のｐ５２タンパク質へのプロセシングを低減する。
【０１０５】
別のアッセイでは、ＢＣＭＡ−ＤＲ４キメラレセプター（ヒトＤＲ４の細胞外ドメインをＢＣＭＡポリペプチドの細胞外ドメインで置換した）をアポトーシスアッセイに用いる。ＨｅＬａ細胞を使用してＢＣＭＡ−ＤＲ４を安定して発現させることができる。ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ−ＤＲ４キメラレセプターの活性化によるアポトーシスを開始させる。細胞に基づくスクリーニングは、ＢＡＦＦアンタゴニスト又はＡＰＲＩＬアンタゴニストがＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬによって誘発される細胞死を防ぐという事実に基づいている。アッセイの１６時間前に、ＢＣＭＡ−ＤＲ４を発現するＨｅＬａ細胞を１２ウェルプレートに播種する。まず、試験対象の試薬（例えば本発明のポリペプチド）を用いて、室温で３０分間に亘り精製された組換えＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬ（１０ｎｇ／ｍｌ）を前もってインキュベートし、ＢＣＭＡ−ＤＲ４を発現する細胞に添加する。ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬ添加の８〜１６時間後、細胞死をトリパンブルーアッセイによって定量化する。
【０１０６】
Ｆ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は、容器、ラベル、及び本発明のポリペプチド又は核酸を具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成することができる。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルとすることができる）。組成物中の活性剤は、本発明のポリペプチドを、単体で、又は追加の治療剤との組み合わせで含む。追加の治療剤の例としては、化学療法剤、細胞障害剤等を挙げることができる。容器上の又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備することができる。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含むことができる。
【０１０７】
実施例において言及する市販の試薬は、特に断らない限り製造者の指示に従って使用した。以下の実施例、並びに本明細書において、ＡＴＣＣ受入番号によって特定されるこれらの細胞の供給源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ヴァージニア州マナッサス）である。特に断らない限り、本発明では、組換えＤＮＡ技術の標準的な手順、例えば上掲及び後述の教科書に記載の手順を使用する：Sambrook等、上掲、Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis等、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow等、Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等、Current Protocols in Immunology, 1991。
本明細書及び請求の範囲を通して、「含む」、「備える」又はそのような動詞の変化形は、言及された整数又は整数組を含むが、他の整数又は整数の組を除外するものではないことを理解されたい。
上述の記載は、本技術分野の当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。以下の実施例は、説明のみを目的として提供するものであり、如何なる意味でも本発明の範囲を制限するものではない。実際、本明細書に示し、説明するものに加えて、本発明には様々な修正を行うことができることは、上述の記載から当業者には自明であり、それらの修正は請求の範囲に示される本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【０１０８】
実施例１  材料及び方法
以下に挙げる試薬は、以下の供与源から得られた：ｏ-フェニレンジアミド二塩化水素化物(OPD) (Sigma)、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ(POD) (Roche/Boehringer Mannheim)、ＩｇＧ-ワサビペルオキシダーゼ(HRP) (Jackson Immuno Research Laboratories) プロテアーゼ完全型(Boehringer Mannheim)、抗Ｍ13-ＨＲＰ (Boehringer Mannheim)、スルホＮＨＳ-ビオチン(Pierce）。ヒトＢＲ３-Ｆｃ (Pelletier, M.,等, (2003) J Biol Chem 278, 33127-33133)は、Ｙ.-Ｍ. Ｈｓｕ (Biogen)から快く贈与してもらった。ＢＲ３-Ｆｃは、Ｖａｌ２０―> Ａｓｎ及びＬｅｕ２７―>Ｐｒｏ突然変異を有するヒトＢＲ３細胞外ドメインの最初の７０アミノ酸を含有し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインと融合している。
ＢＡＦＦ８２-２８５生成。前述したように(Gordon, N. C.,等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)、ヒトＢＡＦＦを発現させ、精製した。簡潔には、ヒトＢＡＦＦ（残基８２-２８５）をコードするＤＮＡ断片はｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓ-タグにて融合させた後トロンビン切断部位によって生成した。大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)(Novagen)培養物を、５０ｍｇ／Ｌ カルベニシリンを有するＬＢ培地にて３７℃で中間対数期にまで生育し、１．０ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の前に、１６℃まで冷却した。１２時間の更なる生育の後、細胞を遠心によって回収し、−８０℃で貯蔵した。細胞ペレットを、５０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０及び５００ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁し、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen)に流し込んだ。カラムは、５０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ イミダゾールにて洗浄し、次いで２５０ｍＭ イミダゾールを含む同じ緩衝液の段階勾配によって溶出した。ＢＡＦＦ含有分画をプールし、トロンビンを添加し、試料を２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、及び５ｍＭ ＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。さらに、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ（Pharmacia）カラム、最終的にＳ-２００サイズ排斥カラムに２０ｍＭ トリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて精製した。結果として生じるＢＡＦＦタンパク質を後述するように用いた。
【０１０９】
ＡＰＲＩＬの発現及び生成。マウスのＡＰＲＩＬのアミノ酸Ｋ１０４-Ｌ２４１をコードするＰＣＲ産物を、欠損したＳ-Ｔａｇ及びエレテロキナーゼ部位（塩基対５６０２-５６８３）を有する改変ｐＥＴ-３２ａベクター(Novagen)であるｐＥＴ-３２ａΔＥＫのＸｂａＩ／ＮｏｔＩ部位にサブクローニングして、Ｎ末端チオレドキシン(ＴＲＸ)融合タンパクを生成した。ｐＥＴ-３２ａ-ＡＰＲＩＬ(Ｋ１０４-Ｌ２４１)をＯｒｉｇａｍｉ(ＤＥ３)コンピテント細胞(Novagen)に形質転換した。オーバーナイト培養物を１:１００に希釈し、しっかり振盪しながら０．８のＡ６００まで、５０μｇ／ｍｌ カルベニシリンを有するＬＢ培地にて室温（ＲＴ）で生育させた。最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して誘導を行い、培養物は２５℃で終夜生育した。１リットルの凍結した細胞ペレットを、５ｍＭ イミダゾールを有する１００ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．６、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭ ベンズアミジン）に再懸濁し、３０分間の氷上に置いた。細胞をマイクロ流動器を通すことによって均質化し、４５分間、１５，０００回転数／分で遠心分離した。上清を、３ｍｌのＮｉ-ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen)に流し、１０のカラム体積の１０ｍＭ イミダゾールを含有する緩衝液Ａにて洗浄し、１０のカラム体積の３００ｍＭ イミダゾールを含有する緩衝液Ａにて溶出した。ＴＲＸ-ＡＰＲＩＬ融合タンパクを含有する分画をプールして、濃縮させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排斥クロマトグラフィにて精製した。
ＢＣＭＡ  ＥＣＤのバキュロウイルス発現及び精製。ヒトのＢＣＭＡ細胞外ドメイン(ＥＣＤ)の残基４-５３(Ｍ４からＮ５３)をコードするＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を用いてベクターｐＥＴ１５ｂ(Novagen)にサブクローニングして、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、ＢＣＭＡコード領域に先行するトロンビン切断配列を導入した。このＨｉｓタグ付加ＢＣＭＡコンストラクトを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を用いてバキュロウイルス導入ベクターｐＡｃＧＰ６７Ｂ(Pharmingen)にサブクローニングした。導入ベクターはＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡと共にＳｆ９細胞に形質移入し、その後組換えウイルスを単離、増幅してタンパク質生成を容易にした。ウイルス感染したＨｉ５細胞を２７℃で３日間成長させた後、既に記載のあるように(Hymowitz, S. G.,等, (2001) Embo J 20, 5332-5341)、Ｎｉ-ＮＴＡ樹脂上のクロマトグラフィの後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムのゲル濾過によって培養液からＨｉｓタグ付加タンパク質を精製した。ＢＣＭＡはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムから単量体として溶出された。Ｎ末端配列決定及び質量分析を用いて、精製されたタンパク質の厳密な同一性と、精製されたタンパク質プールのグリコシル化及び非グリコシル化種の存在を確認した。
【０１１０】
ＢＣＭＡ-Ｚ融合タンパクの発現及び精製。ＢＣＭＡ ＥＣＤ（残基５-５０）とブドウ球菌のタンパク質ＡのＺドメインとのタンパク質融合を発現するために設定したプラスミドＢＣＭＡ-Ｚ(Nilsson, B.,等, (1987) Protein Eng 1, 107-113)を、ＰＣＲを用いて構築して、ＢＣＭＡ１-ｇ３の遺伝子３部位とアンバー停止コドンをプラスミドｐＺＣＴ由来のＺドメイン断片に置き換えた (Starovasnik, M. A.,等, (1999) Protein Sci 8, 1423-1431)。これらの実験のために、Ｚドメインは以下の配列を含有した：
AQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (配列番号２９)
既に記載のあるように(Kunkel, T. A.,等, (1987) Methods Enzymol 154, 367-382)、オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発を行い、ＢＣＭＡ配列に点突然変異を生成し、全てのコンストラクトをＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。既に記載のあるように(Starovasnik, M. A.,等, (1996) Biochemistry 35, 15558-15569)、ＢＣＭＡ-Ｚ及び突然変異体ＢＣＭＡ-Ｚ融合タンパク質を大腸菌で発現させて分泌させ、ＩｇＧ-セファロースのクロマトグラフィによって精製した。さらに、ＢＣＭＡ-Ｚ及び突然変異体ＢＣＭＡ-Ｚ融合タンパク質は、ＨｉＰｒｅｐ１６／６０セファクリルＳ-１００ＨＲカラムのサイズ排斥クロマトグラフィによって精製した。Ｓ-１００カラムからのＢＣＭＡ-Ｚは、可溶性ヒト組織因子（ＭＷ＝２４８００）及び大腸菌チオレドキシン（ＭＷ＝１１６７５）の間溶出量であった。アミノ酸配列から算出される１３０１７の単量体ＭＷに相当する１２，０００のモル質量は、ｍｉｎｉＤＡＷＮ検出器(Wyatt Technologies)に集められる光散乱データから算出された。アミノ酸分析は、ＢＣＭＡ-Ｚを精製して、吸光係数（ε２８０ = ９８３２Ｍ−１ｃｍ−１）を測定した。
【０１１１】
競合置換ＥＬＩＳＡ。ＢＣＭＡ、ＢＣＭＡ突然変異体及びＢＲ３ポリペプチドを、競合ＥＬＩＳＡアッセイによってＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ何れかに対する結合性について試験した。２μｇ／ｍｌの標的リガンド（ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦの何れか）を含有している炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｌ溶液にてヌンクＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを４℃で終夜コートする。プレートをＰＢＳにて洗浄し、０．２％ＢＳＡのＰＢＳ  ２００μｌにて１時間反応を止めた。一連の実験において、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含有する９６ウェルプレートに調製したリガンドの３倍段階希釈液に最終濃度０．２μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ-Ｚを添加し、室温で、１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０にてコートしたプレートを洗浄した後に、各々の１００μｌ／ウェルの希釈物を洗浄したプレートへ移し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０にて洗浄し、ＩｇＧ-ＨＲＰの１:３０００希釈物１００μｌ／ウェルと共に室温で１時間インキュベートし、Ｚドメイン-ＩｇＧ相互作用により結合したＢＣＭＡ-Ｚを検出した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０の後に最終的にＰＢＳでプレートを洗浄した後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ(Sigma)及び０．０１％ Ｈ２Ｏ２を含有する１００μｌ／ウェルのＰＢＳ基質溶液と共に室温で５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４によって反応を止め、４９２ｎｍでプレートを読み取った。図１Aを参照。バックグラウンドシグナルを考慮して、１００μｌ／ウェルの各々の希釈物も、０．２％ＢＳＡのＰＢＳでブロックした非コートウェルに移し、上記の通りに処理した。
上記のＥＬＩＳＡの変法では、レセプターの３倍階段希釈液を７ｐＭビオチン化ＢＣＭＡ-Ｚ（ＡＰＲＩＬが標的である場合）又は０．３ｐＭビオチン化「ｍｉｎｉＢＲ３」（ＢＲ３残基１７-４２）（ＢＡＦＦが標的である場合）を含有するＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０に調整した。既に記載のあるように(Gordon, N. C.,等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)、ＭｉｎｉＢＲ３を調製して、ビオチン化した。ＢＣＭＡ-Ｚビオチン化のために、２０μｇの精製したＢＣＭＡ-Ｚを、３倍モル過剰量のビオチン-スルホＮＨＳ(Pierce)と共にＰＢＳ中で３時間、２５℃でインキュベートし、次いで１０倍モル過剰量のトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によって反応を止めた。洗浄後にＮＵＮＣプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ-２０を用いてＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ何れかにてコートし、１００μｌ／ウェルの各々のレセプター希釈物を移して、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ-２０で洗浄して、０．１Ｕ／ｍｌ ストレプトアビジン-ＰＯＤ (Boehringer Mannheim)１００μｌ／ウェルと共に１５分間インキュベートした。ペルオキシダーゼシグナルを反応させ、上記の通りに検出した。バックグラウンドシグナルを考慮して、１００μｌ／ウェルの各々の希釈物も、０．２％ＢＳＡのＰＢＳによってブロックした非コートウェルに移して、上記の通りに処理した。
【０１１２】
リガンドに対するレセプターの結合定数の測定。ＢＩＡｃｏｒｅ３０００の計測器(Pharmacia Biosensor)による表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)測定を用いて、固定されたＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに対するレセプターの結合能を測定した。ＢＩＡｃｏｒｅからのＣＭ５チップは、製造業者の指示に従って差し引いた。次いで、ＢＩＡｃｏｒｅシステムのために、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する０．２μｍフィルタ処理緩衝液にて予備処理した。緩衝液処理後、７０％ グリセロールにてフローセルを正常化した。各々のフローセル表面を、チップに対するリガンドの結合に備えて、ＥＤＣ（Ｎ-エチル-Ｎ´-（３-ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）及びＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）の１：１混合物を用いて個々に活性化した。この場合、リガンドは固定された成分（例えばＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ）であり、被検体（例えばＢＣＭＡ又はＢＲ３）は結合が測定されている成分である。通常、固定されるリガンド（１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５緩衝液３０μｇ／ｍｌ）は、４０μｌ／分でシステムに注入した。およそ４００のＲＵが生成されたら、フローセルはエタノールアミンによって反応を止めた。対照として、何も結合していない１の活性化フローセルも、エタノールアミンによって反応を止めた。次いで、再びシステムを予備処理した。
６．２５ｎＭから２００ｎＭまで２倍増加の濃度範囲にある被検体５０μｌの試料を、３０μｌ／分の流速で、フローセルに注入した。リガンド-レセプター複合体は、３０μｌ／分で６００秒間フローセルを洗浄することによって分離し得られた。あるいは、同じフローセルに対して結合測定値を何度か行う場合には、リガンド-レセプター複合体は３０μｌ／分で９００秒間フローセルを洗浄することによって分離し得られた。各々の結合アッセイについてセンサーグラムを記録した。１：１ラングミュア結合方程式を同時に用いて、リガンド-被検体相互作用の対合速度及び解離速度をフィッティングした。ｋａ、ｋｄ、ＫＤは、ＢｉａＣｏｒｅ計測器で提供される曲線フィット分析ソフトウェアを用いて算出した。
【０１１３】
実施例２  ＢＣＭＡの単量体及び二量体を用いた結合アッセイ
二量体ＢＣＭＡコンストラクト（ＢＣＭＡ-Ｆｃ）を利用したＢＡＦＦとＢＣＭＡとの相互作用についての以前の報告によると、約１ｎＭのＫＤ値の高親和性相互作用が示唆されている (Marsters, S. A.,等, (2000) Curr Biol 10, 785-788；Yu, G.,等, (2000) Nat Immunol 1, 252-256)。近年、一価性ＢＣＭＡ-Ｆｃを用いた研究により、ＢＡＦＦに対して非常により弱い親和性が示された (Pelletier, M.,等, (2003) J Biol Chem 278, 33127-33133)。この研究では、単量体ＢＣＭＡｓを生成し、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬに対するそれらの親和性を測定した。実施例１のように、大腸菌の分泌物から精製したタンパク質Ａ（ＢＣＭＡ-Ｚ）のＺドメインに融合したＢＣＭＡ  ＥＣＤを含有するタンパク質又は、バキュロウイルス発現から精製したＢＣＭＡ  ＥＣＤの形態で用いた。ヒトＢＣＭＡ及びヒトＢＡＦＦをこれらの実験に用いたが、マウスタンパク質がインビトロではヒトタンパク質より非常に好適なので、マウスのＡＰＲＩＬを用いた。マウス及びヒトのＡＰＲＩＬは、８０％より大きい配列同一性を有し、推定のレセプター-結合残基が完全に保存されている。実施例１にて説明したように、ＡＰＲＩＬはチオレドキシン融合タンパク質として発現、精製された。限定加水分解によるチオレドキシンの除去により溶解性が減低するので、全ての結合実験は完全な融合タンパク質を用いて行った。マウスＡＰＲＩＬ及びヒトＢＡＦＦに対する単量体のヒトＢＣＭＡ-Ｚの結合能は、実施例１にて説明したように、競合ＥＬＩＳＡで測定した。
溶液中のＡＰＲＩＬは２０ｎＭのＩＣ５０で固定されたＡＰＲＩＬとＢＣＭＡ-Ｚの結合について競合することができた一方で、溶液中のＢＡＦＦが６５μＭより大きいＩＣ５０で固定されたＢＡＦＦとのＢＣＭＡ-Ｚ結合について競合した（図１Ａ）。競合ＥＬＩＳＡにおいてＢＣＭＡ-Ｚに対するＡＰＲＩＬ結合能とバキュロウイルス発現由来のＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬ結合能との比較により、Ｚドメインが測定された親和性に影響しないことが示された（図１Ｂ）。この等価性結合によって、残りのＢＣＭＡ結合測定をＢＣＭＡ-Ｚを用いて行うことができた。ビオチン化ＢＣＭＡ-Ｚ（ＡＰＲＩＬ結合の場合）又はビオチン化されたｍｉｎｉＢＲ３ (Gordon, N. C.,等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)（ＢＡＦＦ結合の場合）を用いてＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに対するＢＣＭＡ-Ｚ結合を測定する競合ＥＬＩＳＡによって、レセプター（図１Ｃ）に対するＢＣＭＡ-Ｚ結合の親和性測定値がリガンド競合データと一致していることが確認された：ＡＰＲＩＬに対するＢＣＭＡ-Ｚ結合のＩＣ５０値（ＩＣ５０＝１１ｎＭ）は、ＢＡＦＦに対するＢＣＭＡ-Ｚ結合より約１０００倍親和性が高い（ＩＣ５０＝ＢＡＦＦに対して８μＭ）。
【０１１４】
既にＢＣＭＡ-ＢＡＦＦ相互作用の結合能は低ｎＭ範囲であることが報告されているので(Marsters, S. A.,等, (2000) Curr Biol 10, 785-788；Yu, G.,等, (2000) Nat Immunol 1, 252-256；Pelletier, M.,等, (2003) J Biol Chem 278, 33127-33133)、様々なレセプターコンストラクトとリガンドとの比較により、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに対するレセプター結合上の結合活性の効果を試験した。図２は、ＡＰＲＩＬ（図２Ａ）又はＢＡＦＦ（図２Ｂ）何れかに対するＢＣＭＡ-Ｚ、ＢＣＭＡ-Ｆｃ及びＢＲ３-Ｆｃの結合能の比較を示す。これらのデータにより、一価性ＢＣＭＡ-ＺがＡＰＲＩＬ（ＩＣ５０＝７ｎＭ）と比較してＢＡＦＦ（ＩＣ５０＝９μＭ）に対して１０００分の１の親和性で結合するのに対して、二価性コンストラクトであるＢＣＭＡ-ＦｃはＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの両方に低ｎＭ親和性（それぞれＩＣ５０ = ５ｎＭ及び１３ｎＭ）で結合する。ＢＲ３-Ｆｃは生理的リガンドと予測されるＢＡＦＦをＩＣ５０＝７ｎＭで結合するが、ＡＰＲＩＬには測定可能な親和性はなかった。
また、ＢＣＭＡのリガンド結合能を表面プラスモン共鳴で測定した。移動相において用いられる場合に、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦはセンサチップ表面とＡＰＲＩＬとの非特異的相互作用によって固定されるかどうかによって選択した。表５に、ＢＣＭＡ-Ｚ及びＢＣＭＡ-Ｆｃについての動態データを要約する。
【０１１５】
2008505607.tif 000029
表５  リガンドに対するレセプター結合の結合定数
対合率定数（ｋａ）及び解離（ｋｄ）率定数、並びに、解離定数（ＫＤ）は１：１結合モデルを用いた非線形回帰分析法によって算出した。ＮＭＢは測定可能な結合がないことを意味する。
【０１１６】
ＢＣＭＡ-Ｚは５．５ｎＭのＫＤで固定されたＡＰＲＩＬに結合するのに対して、ＢＡＦＦに対する結合は検出不可能な程度であった。また、バキュロウイルス発現を経て生成されるＢＣＭＡ  ＥＣＤによるＢＡＦＦ-結合も、検出不可能であった。対照的に、ＢＣＭＡ-ＦｃはＢＡＦＦ（ＫＤ＝４．９ｎＭ）及びＡＰＲＩＬ（ＫＤ＝０．２ｎＭ）の両方に高い親和性で結合し、これは競合ＥＬＩＳＡの結果と一致した。固定されたＡＰＲＩＬに対するＢＣＭＡ-Ｆｃ結合は、ＢＣＭＡ-Ｚ-ＡＰＲＩＬ相互作用について測定されたものより解離率が遅く、結合率が早く、これは結合活性が結合に寄与する二価性分子で予測されるものである。
一価性ＢＣＭＡは、ＡＰＲＩＬと高親和性で結合する。対照的に、ＢＡＦＦに対する親和性はＡＰＲＩＬに対するものの１０００分の１である。大腸菌で生成されるＢＣＭＡがＡＰＲＩＬと高親和性で結合し、昆虫細胞での発現によって生成される物質と等価性であるので、ＢＡＦＦに対する弱い親和性はＢＣＭＡ-Ｚのミス折畳み(misfolding)によっては説明されない。この研究は、一価性ＢＣＭＡ及びＡＰＲＩＬ間の高親和性相互作用の初の報告であると考えられている。以前の研究(Marsters, S. A.,等, (2000) Curr Biol 10, 785-788；Yu, G.,等, (2000) Nat Immunol 1, 252-256；Pelletier, M.,等, (2003) J Biol Chem 278, 33127-33133)と一致して、二価のタンパク質（ＢＣＭＡ-Ｆｃ）はＢＡＦＦと見かけ上高親和性で結合する。３つの結合部位を有するリガンドと相互作用する二価のレセプターに由来する結合活性成分は、見かけの親和性を改良することができる。ゆえに、レセプターが細胞表面に予め編制される場合だけ、ＢＡＦＦがＢＣＭＡを発現する細胞に高親和性で結合するようである。ＦＡＳ及びＴＮＦＲ１はリガンドの非存在下で細胞表面上にホモオリゴマー形成すると考えられるが(Chan, F. K.,等, (2000) Science 288, 2351-2354)、ＢＣＭＡはこの対合のために必要な前リガンド集合ドメイン（「ＰＬＡＤ」）を欠いているように思われる。正常な生理学的条件の下で、内在性ＢＣＭＡは、ＢＡＦＦに対するものでなくＡＰＲＩＬに対するレセプターとしてのみ天然に作用する。
【０１１７】
実施例３  ＢＣＭＡ突然変異分析
ＢＣＭＡの単一細胞外システイン豊富なドメイン（ＣＲＤ）のショットガンアラニンスキャン(Weiss, G. A.,等, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8950-8954)を用いて、ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦの何れかの結合に対する個々のアミノ酸側鎖の貢献を決定した。これは、ショットガンアラニンスキャンによって作製されたＢＣＭＡ突然変異体を発現するファージディスプレイライブラリを作製し、ＡＰＲＩＬ及び／又はＢＡＦＦに結合するものについてファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることによって行った。
【０１１８】
ライブラリ構築。ＢＣＭＡ細胞外ドメインのファージディスプレイのための初期のベクターは、ファジミドｓＴＦ-ｇ３に残基５-５０（Ａ５からＫ５１）をコードする断片をＰＣＲサブクローニングすることによって調製した(Lee, G. F.,及びKelley, R. F. (1998) J Biol Chem 273, 4149-4154)。結果として生じたコンストラクト（ＢＣＭＡ１-ｇ３）は、トリペプチド（Ｇ-Ｓ-Ａ）リンカーにＣ末端で融合した残基５-５０とアンバー停止コドンに続くＭ１３ ｐ３コートタンパク質の半分のＣ末端を含有した。細菌シグナル配列ｓｔＩＩは、シグナルペプチダーゼのためのＰ１'切断部位を含有してなる挿入されたセリン残基を有するＢＣＭＡのＮ末端に結合した。発現はアルカリホスファターゼプロモータによって作用させた。ファジミドＢＣＭＡ２-ｇ３を部位特異的突然変異(Kunkel, T. A.,等, (1987) Methods Enzymol 154, 367-382)を用いて調製し、抗体(３Ｃ８：２Ｆ４, Genentech, Inc.)に対するペプチドエピトープ（MADPNRFRGKDLGG）（配列番号３２）をシグナル配列切断部位のＰ１とＰ1'残基間に挿入した。ファージプールによって十分に表されたファージライブラリを生成するために、ＥＣＤを、後述するように２つの異なったライブラリに分けた。
基本的には既に記載のあるように(Weiss, G. A.,等, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8950-8954)、ＢＣＭＡ２-ｇ３ファジミドを用いて２つの「ショットガンアラニン」スキャンライブラリを調製した。これらのライブラリにおいて、特定の野生型コドンをＢＣＭＡ  ＥＣＤ（システイン及びアラニン以外）のアミノ酸位７-３６内の縮重コドンに置き換えて、選択された部位での野生型アミノ酸又はアラニン又は２、３の代替アミノ酸を発現させた。より詳しくは、別々に調製したそれぞれのライブラリは、以下の位置でショットガンコドンを含有する：ライブラリ１は位置７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９にショットガンコドンを有し、ライブラリ２は位置２２、２３、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６でショットガンコドンを有する。これらの部位は、ＢＣＭＡ-ＢＡＦＦ結晶構造のＢＡＦＦに近いこと(Liu, Y.,等, (2003) Nature 423, 49-56)、そして、ＢＲ３のショットガンスキャンにおいてＢＡＦＦ-結合に重要であることが明らかな残基に構造的に等しいこと(Gordon, N. C.,等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)を基準として突然変異誘発に選択した。各々の野生型位置で置換されるショットガンコドンは以下の通りである：
【０１１９】
2008505607.tif 000030
【０１２０】
それぞれのアミノ酸について、好適なショットガンコドンにより典型的にｗｔアミノ酸又はアラニンだけをコードしたが、遺伝コードの性質上いくつかのショットガン置換については２以外のアミノ酸が発生した。一文字アミノ酸表記とヌクレオチド略記号を用いる。＊ＤＮＡ縮重は、ＩＵＢコード（Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ）によって表される。したがって、野生型残基がＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＴｙｒである位置には、ショットガンコードは、２の付加的なアミノ酸置換を生じうる。それぞれのライブラリは少なくとも１×１０１１ファージ／ｍｌを含有し、理論上完全な多様性を表す（１０５倍より大きい）[ライブラリ１は１．１×１０６ユニーク配列をコードする、ライブラリ２は５．２×１０５ユニーク配列列をコードする］。
【０１２１】
ライブラリ分類及び分析。ＢＣＭＡファージライブラリは別々に２つのタイプに選別した：標的リガンド選別（ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬ）、及び、全てのＢＣＭＡライブラリメンバー上に表出されるエピトープタグＮ末端を認識する抗体（例えば、３Ｃ８：２Ｆ４(Genentech, Inc.)）に対する結合によるディスプレイ選別(Skelton, N. J.,等, (2003) J Biol Chem 278, 7645-7654)。ディスプレイ選別は、ライブラリ間の発現の違いに関してＢＡＦＦ-及びＡＰＲＩＬ-結合選別を正常化するために重要である。ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ又は抗タグ抗体、３Ｃ８：２Ｆ４は、９６ウェルヌンクＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート(Sidhu, S. S. (2001) Biomol Eng 18, 57-63)に固定した。ＢＳＡコートウェルを用いて、非特異的バックグラウンド結合を決定した。ファージは、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．２％ＢＳＡにて１×１０９ファージ／ｍｌに希釈し、穏やかに振盪しながら室温で２時間結合させた。インキュベーションの後、ファージ溶液を廃棄し、結合したファージをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて１０回洗浄した。結合したファージは、１００μｌの１００ｍＭ ＨＣｌと共に室温で５分間、各々のウェルをインキュベートすることによって溶出した。各々の標的から溶出されたファージを、２Ｍ トリス塩基にて中和し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ存在下にて大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅにおいて繁殖させた；増幅されたファージを用いて、前段階で同じ標的に対して選別した。一般に２又は３の段階で、１００倍濃縮された場合に、ファージ分類をやめた。濃縮は、ＢＳＡコートウェルから溶出されるファージ力価に対する標的コートウェルから溶出されるファージ力価の比率により算出した。次いで、各々のライブラリと選別標的からの個々クローンを、カルベニシリン及びＫＯ７ヘルパーファージを添加した４００μｌの２ＹＴ培地を含む９６ウェルフォーマットにおいて生育した。
【０１２２】
ファージＥＬＩＳＡアッセイ(Sidhu, S. S., Weiss, G. A., 及びWells, J. A. (2000) J Mol Biol 296, 487-495)を行って、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ又は抗タグ抗体を結合可能なＢＣＭＡ  ＥＣＤのファージディスプレイ変異形を検出した。通常、ファージＥＬＩＳＡアッセイは後述するように行った。
ファジミドを有する大腸菌ＸＬ１-Ｂｌｕｅの培養物を、１ｍｌの２ＹＴ、５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン、１０ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンにて３７℃で８時間生育した。培養物を、適当な濃度のＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ（１０＾１０ファージ／ｍｌ）を添加した同じ培地３０ｍｌに移し、３７℃で終夜生育した。ファージは、２０％ ＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて２度沈殿させて培養物上清から回収し、１．０ｍｌのＢＳＡブロック緩衝液（リン酸塩緩衝食塩水、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）に再懸濁した。ファージ濃度を分光測光法で測定した（２６８＝１．２×１０  ８Ｍ−１ｃｍ−１）。
Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（９６ウェル）を捕獲標的タンパク質にて室温で２時間コートした（５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中５ｇ／ｍｌで１００ｌ）。次いで、プレートを、０．２％ＢＳＡを含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）にて室温で１時間ブロックし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて８回洗浄した。ファージ粒子をＢＳＡブロック緩衝液にて段階的に希釈し、１００μｌをコートしたウェルへ移した。室温で１時間後に、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて８回洗浄し、１：３０００西洋わさびペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体複合体を含むＢＳＡブロック緩衝液１００μｌと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて８回、そしてＰＢＳにて２回洗浄した。プレートはｏ-フェニレンジアミン二塩化水素化物／Ｈ２Ｏ２溶液（１００μｌ）を用いて反応させ、２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４（５０μｌ）にて反応を止め、４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２３】
次いで、それぞれのＥＬＩＳＡにおいて陽性であることが明らかとなった試験された全てのクローンは、既に記載のあるように(Sidhu, S. S. (2001) Biomol Eng 18, 57-63)配列決定した。ＢＣＭＡ  ＥＣＤ配列の曖昧さのない配列データを、翻訳し、比較した。ＢＡＦＦに対する結合の選別のために、４０及び４７の配列を、それぞれライブラリ１及びライブラリ２から分析した。ＡＰＲＩＬに対する結合の選別のために、４４及び４６の配列を、それぞれライブラリ１及びライブラリ２から分析した。ディスプレイ選別（抗タグ抗体に対する結合）のために、最低４０の配列を、各々のライブラリについて分析した。リガンド結合に対する各々の突然変異の効果を定量化するために、それぞれのアミノ酸位置について標準化した頻度比率(Ｆ)を、既に記載のあるように(Skelton, N. J.,等, (2003) J Biol Chem 278, 7645-7654)、ディスプレイ効率選別に対するリガンド選別の比率から算出した。
ディスプレイ効率の差を考慮して、Ｆ値は標的結合に対する突然変異の効果を記載する。これは通常、同じ位置（アラニン又はホモログ）でそれぞれ設計された突然変異を有するクローンの数と各々の位置で野生型残基を有するクローンの数とを比較して、ペプチドに対する結合を減弱し（比率>１）、該結合に影響しない（比率＝約１）、又は、該結合を改善する（比率<１）ものとして置換を分類することによって行った。異なるライブラリメンバーについて発現又はディスプレイレベルにおける変化の対照として、ライブラリは、全てのライブラリメンバーのＮ末端でディスプレイされるエピトープタグを認識することが可能な固定された抗体（例えば、３Ｃ８：２Ｆ４）に対する結合についても選別した。標準化された発生頻度(Ｆ)は、ディスプレイ選別ｗｔ／突然変異体比によってｗｔ／突然変異体比の機能的選別を割ることによって得られた。ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ選別について各々の位置で得られた標準化された野生型／アラニン比（Ｆ）を、図３に示す。
【０１２４】
分析された豊かな配列のプールが比較的少ないために、１０倍より大きい効果を表すＦ値だけを有意とした。ＢＣＭＡのＴｙｒ１３位置は、いくつかのアラニン、並びにアスパラギン酸及びセリン（ＢＡＦＦ-結合のための置換であるがＡＰＲＩＬ-結合のために完全に保存される））を許容した。Ｐｈｅ１４のＦ値は、ＢＡＦＦ-結合に有意に貢献するが、ＡＰＲＩＬのための親和性に対する効果はより穏やかなものである。ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ結合のために、野生型残基だけが選択されたという点で、アミノ酸Ａｓｐ１５及びＬｅｕ１７は絶対に重要である。Ａｓｐ１５及びＬｅｕ１７は、ＢＣＭＡのＩ型ｂ-ターンの先端に存在するＤｘＬモチーフの１部を形成する(Kayagaki, N.,等, (2002) Immunity 17, 515-524; Liu, Y., et al., (2003) Nature 423, 49-56)。
Ｌｅｕ１８のＶａｌへの保存的置換はＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦ選別の両方に観察された、しかしながら、この位置ではアラニンは観察されなかった。Ｉｌｅ２２のＡｌａ置換は、ＢＡＦＦへの結合のために許容されないが、ＡＰＲＩＬ結合と互換性がある。Ｇｌｎ２５のＡｌａへの置換はＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦ結合に対して逆の影響を及ぼすように見えたが、Ｆ値の違いはわずかに有意だった。対照的に、Ａｒｇ２７のＡｌａ置換は、ＢＡＦＦへの結合には非常に好適であるが、ＡＰＲＩＬ結合には好ましくない。ＢＣＭＡのＣ末端部分における他の置換は、リガンド結合に対して効果がなかった。
これらの結果から、ＢＣＭＡのこの部分がＢＣＭＡ及びＢＲ３を結合するためにＢＡＦＦ上のポケット（窪み）と類似しているＡＰＲＩＬ上のキャビティ内に結合することが示唆される (Liu, Y.,等 (2002) Cell 108, 383-394；Kim, H. M.,等 (2003) Nat Struct Biol 10, 342-348; Oren, D. A., et al. (2002) Nat Struct Biol 9, 288-29232-34)。図４Ａに、ＢＣＭＡの残基８〜４６の構造を示す。
ＢＲ３-ＢＡＦＦ又はＢＣＭＡ-ＢＡＦＦ（図４Ｂ）複合体について決定された構造において、ＤｘＬモチーフのロイシン残基（ＢＲ３ではＬｅｕ２８、ＢＣＭＡではＬｅｕ１７）は、ＢＡＦＦ残基Ａｌａ２０７、Ｌｅｕ２１１、Ｉｌｅ２３３及びＰｒｏ２６４、ポケットの底にあたるＧｌｙ２０９と相互作用する。ＤｘＬモチーフのＡｓｐ残基（ＢＲ３のＡｓｐ２６、ＢＣＭＡのＡｓｐ１５）はＢＡＦＦ残基Ａｒｇ２６５と塩橋を形成し、Ａｓｐの高次構造はＢＡＦＦ残基Ｔｙｒ２０６と水素結合により安定化しうる。ＡＰＲＩＬ自体又はＢＣＭＡとの複合体についての高解像度の構造は有用でない；しかしながら、図４Ｂに示すように、鍵となる残基が保存される（Ｇｌｙ２０９、Ｉｌｅ２３３、Ｐｒｏ２６４）か又は保守的に置換される（Ａ２０７Ｔ、Ｌ２１１Ｖ）ので、ＡＰＲＩＬはロイシン側鎖に対する同様な結合ポケットを有すると思われる。Ａｒｇ２６５はＡＰＲＩＬにおいて保存されているため、Ａｓｐ１５と塩橋の形成が可能である。
【０１２５】
実施例４  ＢＣＭＡ-リガンド結合特異性における更なる研究
ＮＮＳライブラリ構造及び分類。実施例３の残基Ｉｌｅ２２、Ｇｌｎ２５及びＡｒｇ２７についての突然変異結果により、Ａｌａ置換がＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ結合に対して逆効果を示すので、これらの位置がリガンド特異性を提供する候補かもしれないことが示唆される。位置Ｌｅｕ１８、Ｉｌｅ２２、Ｇｌｎ２５及びＡｒｇ２７を選択して、ＢＣＭＡ２-ｇ３ファジミドのこれらの位置にＮＮＳ縮重コドンを取り込ませた後に、リガンド結合について選別することによって、更なるファージ最適化研究を行った（ＩＵＢコードにより定義されるＮＮＳ縮重コドン）(Sidhu, S. S.,等 (2000) Methods Enzymol 328, 333-363)。ライブラリは、理論的には１×１０６の別々のメンバーとなるようライブラリを完全に表す１×１０１０ファージ／ｍｌを含有した。
ＮＮＳコドンの導入に選択した各々のアミノ酸位置は３１の３コドンから２０すべてのアミノ酸をコードする可能性があるので、既に提唱されているように(LaBean, T. H.及びKauffman, S. A. (1993) Protein Sci 2, 1249-1254)、指定する位置にあるアミノ酸のパーセント縮重に対するパーセント発生頻度の比を算出することによってデータをコドン縮重に従って計測した。標準化したＦ'値はディスプレイ編重を補正し、ディスプレイ効率のパーセント縮重比に対するパーセント発生頻度によって割ったリガンド選別のパーセント縮重比に対するパーセント発生頻度として算出した。パーセント発生頻度は特定の位置で見られる特定のアミノ酸の頻度の数をその位置で配列決定される全アミノ算数で割った後に１００を乗じることによって算出した。パーセント縮重は、特定のアミノ酸（以下の表を参照）の暗号の縮重をその位置で考えられ得る全縮重によって割った後に１００を乗じることによって算出した（例えば、Ａ、Ｇ及びＩのみが選択された場合、全縮重の可能性は５となる）。
【０１２６】
2008505607.tif 000031
【０１２７】
この新しいファージライブラリはＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬの何れかに対して３段階の分類を行い、ディスプレイ標的抗体と比較した。
特定の位置のアミノ酸のＦ'値が大きければ、アミノ酸が標的リガンドへの結合に好適な置換であることを示す。表６に示すように、ＡＰＲＩＬ結合及びＢＡＦＦ結合間のＦ'に最大の差が生じる置換(Sidhu, S. S.,等, (2000) Methods Enzymol 328, 333-363, LaBean, T. H.及びKauffman, S. A. (1993) Protein Sci 2, 1249-1254)は、Ｉ２２Ｋ、Ｑ２５Ｄ及びＲ２７Ｙである。Ｉ２２Ｋ置換は、ＢＡＦＦ結合よりもＡＰＲＩＬ結合に対して１２倍より大きい選択性を示した；Ｑ２５Ｄ及びＲ２７Ｙは、ＡＰＲＩＬ結合と比較してＢＡＦＦ結合に対してそれぞれ１３倍及び９．５倍より大きい選択性を示した。Ｌ１８Ｉ置換は相対的に保守的な置換であった。
【０１２８】
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表６  ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬへの結合に関するＢＣＭＡ位置１８、２２、２５、２７の残基選択性。これらの４つの部位が完全にランダム化されている（ＮＮＳコドン）ライブラリを調製し、ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬへの結合について分類した。ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬへの結合について３回選別した後に、陽性クローンの配列からＢＣＭＡのスキャンした各々の位置の標準化したＦ'値を求めた。標準化された頻度値（Ｆ'）は、実験手順にて説明したように、コドン縮重を考慮に入れて標的／ディスプレイ比から算出される。頻度に１０倍より大きい変化があるＦ'値を太字で示す。ゼロ値は、スクリーニングされたクローンに観察されなかったアミノ酸位置であることを示す。
【０１２９】
実施例５  変異形ＢＣＭＡ-Ｚ融合体を用いた競合結合アッセイ
ファージディスプレイの結果によって示されたリガンド結合に対する効果を確認するために、点突然変異体をＢＣＭＡ-Ｚ融合タンパク質として生成し、精製し、競合的置換ＥＬＩＳＡによってＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ結合について分析した（表７）。
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表７  ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦへのＢＣＭＡ-Ｚ突然変異体結合の競合置換アッセイ。示されるＩＣ５０値は、ＢＣＭＡ-Ｚ  ｗｔ（４組のデータの平均値±ｓ.ｄ）又は、固定されたＡＰＲＩＬないしはＢＡＦＦへの結合についてビオチン化したＢＣＭＡ-Ｚと競合するＢＣＭＡ-Ｚ点突然変異体、ＢＡＦＦへの結合についてビオチン化したＢＲ３との競合物質（データは示さない）のものである。
【０１３０】
これらのデータにより、Ｔｙｒ１３残基のＡｌａ、Ｓｅｒ又はＰｈｅへの置換すべてによりＩＣ５０が少なくとも４００倍増加することから、Ｔｙｒ１３がＡＰＲＩＬへのＢＣＭＡ結合のために重要であることが示唆される（表７）。Ｔｙｒ１３のＡｌａ、Ｓｅｒ又はＰｈｅへの置換は、ＢＡＦＦに対する親和性においてはわずかな変化しか生じなかった。ＢＣＭＡ-ＺのＩ２２Ｋの単一アミノ酸置換によりＢＡＦＦに対する親和性は１０分の１以下となったが、ＡＰＲＩＬ結合についてはおよそ３分の１程度であった。これはファージディスプレイの結果と一致している。また表７は、ＢＣＭＡ-ＺのＱ２５Ｄの単一置換によりＡＰＲＩＬと比較してＢＡＦＦへの結合が有意に改善されなかったのに対して、Ｒ２７Ｙの単一アミノ酸置換により野生型と比較してＡＰＲＩＬ結合が４０分の１となったことを示す。二重突然変異体Ｑ２５Ｄ／Ｒ２７Ｙは、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの両方をほとんど同じ親和性で結合しうるレセプターを産生した。二重突然変異体の測定された効果が単一突然変異体の測定された効果の合計より大きいので、これらの置換は結合に関与しなかった。例えば、Ｑ２５Ｄ置換によりＢＡＦＦに対する親和性は減少するが、Ｒ２７Ｙと組み合わせた場合、親和性が増加した。
表面プラスモン共鳴を用いて、ＡＰＲＩＬに対する突然変異体ＢＣＭＡ-Ｚタンパク質の結合定数を個々に測定した（表８）。
【０１３１】
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表８  表面プラスモン共鳴による固定されたＡＰＲＩＬに対するＢＣＭＡ-Ｚ結合。速度定数及び解離定数（ＫＤ）は、１：１結合モデルを用いた非線形回帰分析法によって算出した。
【０１３２】
ＢＣＭＡ-Ｚ野生型、Ｉ２２Ｋ及びＱ２５ＤのすべてはＡＰＲＩＬに低ｎＭ範囲で結合した。これはＥＬＩＳＡ  ＩＣ５０測定値と一致していた。ＡＰＲＩＬへのＲ２７Ｙ  ＢＣＭＡ-Ｚ結合は、１０００分の１の親和性を示した。この突然変異体の親和性の減少は主に結合率の低下によるものであり、これは１:１結合モデルにあまりフィットせず、実際のＫＤを過小評価しているようである。ＡＰＲＩＬへのＢＣＭＡ-Ｚ  Ｑ２５Ｄ／Ｒ２７Ｙ結合についてのＳＰＲデータは１:１結合モデルによって表されないので、率及び平衡定数を算出することはできなかった。
ＤｘＬモチーフ以外の残基は、ＡＰＲＩＬに対するＢＣＭＡの特異性とＢＡＦＦに対するＢＲ３の特異性を与える。ＢＡＦＦ-ＢＣＭＡ結晶構造(Liu, Y.,等, (2003) Nature 423, 49-56)により、Ｔｙｒ１３の水酸基はＢＣＭＡ上のＡｓｐ１５及びＡｒｇ２７と及び／又はＢＡＦＦ上のＴｙｒ２０６と水素結合する可能性があることが示される（図４）。これらの結果は、これらの潜在的水素結合のいずれもがＢＡＦＦ-結合にとって重要でないことを示唆する。対照的に、水酸基は、高親和性ＡＰＲＩＬ結合のために明らかに必須である。面白いことに、ＡＰＲＩＬのＴｙｒ２０６に対応する残基はフェニルアラニンである。このことは、ＢＣＭＡ内の分子内水素結合のためにＴｙｒ１３が重要であるらしいことを示唆する。作用領域内でのＡｓｐ１５の役割が重要なため、ＡＰＲＩＬ結合に対するＴｙｒ１３は、Ａｓｐ１５の位置に間接的に影響するので重要であるかもしれない；ＢＡＦＦでは、このような役割はリガンド上のＴｙｒ２０６によるものである。
【０１３３】
また、ＢＣＭＡのＡｒｇ２７は、ＡＰＲＩＬ結合とＢＡＦＦ結合を特定するために重要である。また、この位置の突然変異は、ＢＡＦＦ-結合にほとんど影響を及ぼさないが、ＡＰＲＩＬ-結合を有意に崩壊する（表３及び４）。ＢＡＦＦ-ＢＣＭＡ結晶構造において、Ａｒｇ２７はＧｌｕ２６６と塩橋を形成するが、Ｒ２７Ｙ突然変異体はこの塩橋がＢＡＦＦ対合に必要でないことを示唆する。この結論は、ＢＲ３はＡｒｇ２７に類似した位置にロイシン（Ｌｅｕ３８）を有するので、高親和性ＢＡＦＦ-ＢＲ３相互作用の所見と一致している。ＡＰＲＩＬがＡｌａに置換されるＧｌｕ２６６を有するので、ＢＣＭＡのＡｒｇ２７がＡＰＲＩＬに高親和性結合するためになぜ必要かは不明である。この効果を更に理解するために、ＢＣＭＡ-ＡＰＲＩＬ複合体構造の分析が必要であろう。Ｌｅｕ３８相互作用の関与に加えて、Ｔｙｒ１３相当の残基をシステイン残基（Ｃｙｓ３５とジスルフィド結合を形成するＣｙｓ２４）に置換することにより、ＡＰＲＩＬ上のＢＡＦＦに対するＢＲ３の特異性を説明することができる。実際、ＢＲ３のＣ２４Ｙ突然変異はＡＰＲＩＬに対する親和性を増やし(Liu, Y., 等 (2003) Nature 423, 49-56)、ＢＲ３の位置３８の疎水性残基はＢＡＦＦ-結合にとって重要である(Gordon, N. C.,等, (2003) Biochemistry 42, 5977-5983)。
ＢＣＭＡ残基Ｔｙｒ１３及びＡｒｇ２７に加えて、ファージディスプレイ実験からの結果により、Ｉｌｅ２２及びＧｌｎ２５がリガンド特異性を確定するために重要であることが示唆された。Ｉｌｅ２２はＢＡＦＦと疎水的に接触するため、Ｉ２２Ｋ置換はＢＡＦＦに対する親和性を弱くする。ＢＡＦＦ上のＩｌｅ２２に対する接触残基であるＴｙｒ２０６及びＬｅｕ２４０を、ＡＰＲＩＬのＰｈｅ及びＡｒｇに置換される。ＡＰＲＩＬ残基Ａｒｇ２４０に正の電荷がある一方で、Ｉ２２Ｋ置換がＡＰＲＩＬに対する親和性に影響しないことは、驚くべきことである。Ｇｌｎ２５の側鎖はＢＡＦＦと接触していないので、Ｑ２５Ｄ単一突然変異はＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ結合に有意な効果を及ぼさない。しかしながら、二重特異性ＢＣＭＡ変異形が得られるようにＲ２７Ｙと組み合わせた場合、Ｑ２５ＤはＢＡＦＦに対する親和性を増やした。Ａｒｇ２７とＧｌｎ２５が逆方向に位置するのに、この非相加効果の原因は不明である。
【０１３４】
実施例６  ＢＣＭＡ（Ｉ２２Ｋ）-Ｆｃ融合体
図６に記載の配列を有するＢＣＭＡ（Ｉ２２Ｋ）-Ｆｃイムノアドヘシン及びＢＣＭＡ（ｗｔ）-Ｆｃは、ＩｇＧ１のＦｃドメインをコードする核酸配列の上流のＢＣＭＡのＧ５１（ｗｔ又はＩ２２Ｋ突然変異体）に残基Ａ５をコードする核酸配列を連結させることによって設計した。融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞において発現させ、親和性クロマトグラフィによって精製した。ＨＥＫ２９３成長培地から分泌されたＦｃ融合タンパク質をプロテインＡセファロースカラムに結合させ、１０カラム容量のＰＢＳにて洗浄した。結合したＦｃ融合体を、グリシンｐＨ３．０を用いて樹脂から溶出させ、その後２Ｍ トリス塩基によって中和した。
ＢＣＭＡ-Ｆｃ ｗｔ及びＩ２２Ｋ突然変異体コンストラクトを、競合ＥＬＩＳＡアッセイによってＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦへの結合について試験した。２μｇ／ｍｌの標的リガンド（ＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ）を含有する炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）１００μｌ溶液にてヌンクＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを４℃で終夜コートした。プレートをＰＢＳにて洗浄し、０．２％ＢＳＡのＰＢＳ２００μｌと共に室温で１時間ブロックした。ＢＣＭＡ-Ｆｃコンストラクトの３倍階段希釈液を７ｐＭビオチン化ＢＣＭＡ-Ｚ（ＡＰＲＩＬが標的である場合）又は０．３ｐＭビオチン化「ｍｉｎｉＢＲ３」（ＢＲ３残基１７-４２）（ＢＡＦＦが標的である場合）を含有するＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０に調整した。既に記載のあるように(Gordon, 2003)、ＭｉｎｉＢＲ３を調製して、ビオチン化した。ＢＣＭＡ-Ｚビオチン化のために、２０μｇの精製したＢＣＭＡ-Ｚを、３倍モル過剰量のビオチン-スルホＮＨＳ(Pierce)と共にＰＢＳ中で３時間、２５℃でインキュベートし、次いで１０倍モル過剰量のトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）によって反応を止めた。洗浄後にＮＵＮＣプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を用いてＡＰＲＩＬ又はＢＡＦＦ何れかにてコートし、１００μｌ／ウェルの各々のレセプター希釈物を洗浄したプレートに移して、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ-２０で洗浄して、０．１Ｕ／ｍｌ ストレプトアビジン-ＰＯＤ (Boehringer Mannheim)１００μｌ／ウェルと共に１５分間室温でインキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０の後に最終的にＰＢＳでプレートを洗浄した後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌ ＯＰＤ(Sigma)及び０．０１％ Ｈ２Ｏ２を含有する１００μｌ／ウェルのＰＢＳ基質溶液と共に室温で５分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４によって反応を止め、４９２ｎｍでプレートを読み取った。
図７は、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦへのｗｔ  ＢＣＭＡ-Ｆｃ結合、並びにＡＰＲＩＬへのＢＣＭＡ-Ｉ２２Ｋ-Ｆｃ結合のＩＣ５０が７〜１０ｎＭの範囲であることを示す。ＢＡＦＦへのＢＣＭＡ-Ｉ２２Ｋ-Ｆｃの見かけの結合はなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】ＢＣＭＡリガンド相互作用の競合的置換ＥＬＩＳＡを示す。Ａは、同じ可溶性リガンドの量を次第に増加した場合の、固定化したＡＰＲＩＬ（丸）又はＢＡＦＦ（四角）に対するＢＣＭＡ−Ｚの結合の阻害を示す。データは、ＡＰＲＩＬのＩＣ５０値を２０ｎＭ、及びＢＡＦＦのＩＣ５０値を＞６５μＭとした場合の３つのデータの組の平均値±標準偏差を表す。
【図１Ｂ】ＢＣＭＡリガンド相互作用の競合的置換ＥＬＩＳＡを示す。Ｂは、ビオチン標識していないＢＣＭＡによる固定化ＡＰＲＩＬに対するビオチン標識ＢＣＭＡの置換を示す。（丸−ビオチン標識したバキュロウイルスＢＣＭＡ及び標識していないバキュロウイルスＢＣＭＡ、四角−ビオチン標識したバキュロウイルスＢＣＭＡ及び標識していないＢＣＭＡ−Ｚ、ひし形−ビオチン標識したＢＣＭＡ−Ｚ及び標識していないバキュロウイルスＢＣＭＡ、ｘ−ビオチン標識したＢＣＭＡ−Ｚ及び標識していないＢＣＭＡ−Ｚ）
【図１Ｃ】ＢＣＭＡリガンド相互作用の競合的置換ＥＬＩＳＡを示す。Ｃは、固定化したＡＰＲＩＬに対する結合（丸；ＩＣ５０＝１１ｎＭ）又は固定化したＢＡＦＦに対する結合（四角；ＩＣ５０＝８μＭ）に冠するＢＣＭＡ−Ｚのビオチン標識化ＢＣＭＡ−Ｚとの競合を示す。データは、データは３つのデータの組の平均±標準偏差を表し、曲線は４パラメータ方程式との一致を示す。
【図２】Ａ及びＢは、固定化リガンドへの結合について一価及び二価レセプターを比較したものである。Ａは、ＢＣＭＡ−Ｚ（丸）、ＢＣＭＡ−Ｆｃ（四角）、又はＢＲ３−Ｆｃ（ひし形）による、固定化ＢＡＦＦに対する結合のビオチン標識したｍｉｎｉ−ＢＲ３の置換を示す。Ｂは、ＢＣＭＡ−Ｚ（丸）、ＢＣＭＡ−Ｆｃ（四角）、又はＢＲ３−Ｆｃ（ひし形）による、固定化ＡＰＲＩＬに対する結合のビオチン標識したＢＣＭＡ−Ｚの阻害を示す。
【図３】ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬに対する結合に関するＢＣＭＡの突然変異のショットガンアラニンスキャンを示す。ＢＡＦＦ（黒）又はＡＰＲＩＬ（斜線）に対する結合の選択を２回行った後、ポジティブクローンの配列から採取したＢＣＭＡにおいてスキャンしたタンパクの各々に観察された、質標準化した度数比（Ｆ）を示す。Ｆ値はアラニン置換の実験手順に説明されているように計算した。上部のアスタリスク（＊）を付した棒グラフは、これらの位置にＡｌａが観察されなかったことにより、最小限度を示す値を意味する。
【図４】Ａ及びＢは、ＢＣＭＡによるリガンド結合の機能的及び構造的エピトープを示す。Ａは、ＢＣＭＡの構造上にマッピングしたＢＡＦｆ結合とＡＰＲＩＬ結合の決定要因をまとめたものである（ＰＤＢコード  １０ＱＤ、(Liu, Y等、(2003) Nature 423:49-56)。ショットガンアラニンスキャンで評価した全ての側鎖を示す。Ｆ１４、Ｉ２２及びＱ２５と記された側鎖は、アラニンで置換したとき、ＢＡＦＦに対する結合が１０分の１よりも小さくなり、Ｒ２７及びＹ１３と記された側鎖は、アラニンで置換したとき、ＡＰＲＩＬに対する結合が１０分の１よりも小さくなり、Ｄ１５、Ｌ１７及びＬ１８と記された側鎖は、アラニンで置換したとき、ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの両方に対する結合が１０分の１よりも小さくなった。Ｂは、リガンド−レセプター共結晶構造のＢＡＦＦ−ＢＣＭＡ接触領域のクローズアップである（ＰＤＢコード  １ＯＱＤ、（Liu, Y等、上掲））。ＢＡＦＦ接触残基は黒字で、ＢＣＭＡの接触残基は白字で示す。ＢＣＭＡはリボンで示し、ＢＡＦＦに接触する側鎖のみをＧｌｎ２５を加えて示した。ＢＡＦＦは、太字で記されたＢＣＭＡに接触する表面の部分で表面的に表した。ＢＡＦＦのＩ２２３、Ｌ２００’、Ｇ２０９、Ｒ２３１、Ｐ２６４及びＲ２６５と記された残基は、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬで同一である。Ｙ１６３（Ｖ）、Ｙ２０６（Ｆ）、Ａ２０７（Ｔ）、Ｌ２１１（Ｉ），Ｌ２４０’（Ｒ），Ｅ２６６（Ａ）、Ｄ２７３’（Ｓ）及びＤ２７５’（Ｈ）と記された残基は、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬとで異なっており、ＡＰＲＩＬの残基のタイプは括弧内の単一のアミノ酸コードを用いて示す。アポストロフィーは、残基が三量体の隣接する単量体によって寄与されていることを示す。
【図５】ヒトＢＣＭＡタンパク質の配列（配列番号２０）及びｍｉｎｉ−ＢＲ３（配列番号３０）をしめす。
【図６】ＢＣＭＡ（Ｉ２２Ｋ）−Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号３１）を示す。下線で示すタンパク質は、ヒトＢＣＭＡの残基５−５１を示す。「（Ｋ）」は、ヒトＢＣＭＡのＩ２２に対応する残基における置換を示す。
【図７】競合的置換アッセイを示す。それぞれ、ビオチン標識していないＢＣＭＡ−Ｆｃ又はＢＣＭＡ−Ｉ２２Ｋ−Ｆｃレセプターの量を次第に増加した場合の、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに対するＢＣＭＡ−Ｆｃの結合、並びにＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦに対するＢＣＭＡ−Ｉ２２Ｋ−Ｆｃの結合を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
2008505607.tif 000039
【図４】
2008505607.tif 000040
【図５】
2008505607.tif 000041
【図６】
2008505607.tif 000042
【図７】
2008505607.tif 000043
【配列表】
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【国際調査報告】
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