(57)【要約】  精選されたイソフラボノイド化合物、それを含有する組成物並びに治療おける、特に炎症性疾患及び関連症状の治療のための前記化合物及び／又は組成物の使用に関して、抗炎症性治療法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患の治療のための薬物の製造における式（I）の化合物の使用であって、
式（I）の該化合物は、
【化１】
2008533177.tif 000025
及びその塩であり、式中、R1及びR2は独立して、ヒドロキシ、アルコキシ又はアシルオキシであり、R3は、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル又はハロであり、Xは、=O又は水素及びヒドロキシのいずれかである前記使用。
【請求項２】
R1及びR2がヒドロキシである請求項1に記載の使用。
【請求項３】
R3が、メチル、ブロモ、クロロ又はヒドロキシである請求項1又は2に記載の使用。
【請求項４】
Xが=Oであり、化合物が式（Ia）のイソフラバン−4−オンであり、
【化２】
2008533177.tif 000026
式中、R3が5−アルキル、6−ハロ又は8−ハロである請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５】
R3が5−メチル、6−クロロ又は8−ブロモである請求項4に記載の使用。
【請求項６】
Xが水素及びヒドロキシであり、化合物が式（Ib）のイソフラバン−4−オールであり
【化３】
2008533177.tif 000027
R3が8−アルキル又は8−ヒドロキシである請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
【請求項７】
R3が8−メチル又は8−ヒドロキシである請求項6に記載の使用。
【請求項８】
化合物が式（Ic）の8−置換のイソフラボノイド化合物
【化４】
2008533177.tif 000028
及びその塩であり、式中、R1及びR2が独立して、ヒドロキシ、アルコキシ又はアシルオキシであり、R3が、ヒドロキシ、アルキル又はハロであり、Xが、=O又は水素及びヒドロキシのいずれかである請求項1に記載の使用。
【請求項９】
R1及びR2がヒドロキシであり、R3が、ヒドロキシ、メチル又はブロモである請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
式（I）の化合物が、化合物1〜5
【化５】
2008533177.tif 000029
及び薬学上許容可能なその塩から選択される請求項1に記載の使用。
【請求項１１】
炎症性の疾患又は障害が、変形性関節症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎、自己免疫性疾患（SLE、関節リウマチ、糸球体腎炎）、喘息及び肺の炎症に関与する疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧症及び脂質障害を含む循環器障害、並びにエストロゲン受容体の活性化に関連する障害から選択される請求項1〜10のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１２】
治療が炎症に関連する疼痛、浮腫及び／又は紅斑のためである請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
炎症性障害の治療に循環器系の副作用がなく、治療が心臓保護性及び／又は消化管保護性である請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１４】
炎症に関連する疼痛を含む炎症の治療のための薬物の製造のためのトロンボキサン合成酵素阻害剤の使用。
【請求項１５】
治療が、心臓保護性及び／又は消化管保護性である請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
炎症性の疾患及び障害の治療のための、又はトロンボキサン合成酵素阻害剤としての請求項1〜10のいずれか1項に記載の式（I）の化合物を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のイソフラボノイド化合物、それを含有する組成物並びに治療、特に炎症性の疾患及び症状の治療における前記化合物及び／又は組成物の使用に関する。炎症性の症状には、過敏性腸疾患（IBD）、たとえば、潰瘍性大腸炎（UC）、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎及び／又はクローン病（CD）、並びに原発性硬化性胆管炎（PSC）、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、自己免疫性肝炎（AIH）及び過敏性腸症候群（IBS）を含むそのほかの肝臓腸症候群が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
UCは、大腸（結腸及び直腸）の内層の炎症を引き起こす。CDは、腸壁の全層で炎症を引き起こし、口から肛門までの消化管のいずれの部分も関与する可能性がある。CDは、再発腸閉塞症、瘻孔、膿瘍形成及び敗血症、並びに関節炎のような腸外の徴候を引き起こしうる。IBDは、15〜30歳で発症することが多く、約13,000人のオーストラリア人がUCに罹っており、10,000人がCDに罹っている。全米クローン病・腸炎協会は、1,000,000人もの多くのアメリカ人がIBDに罹っており、毎年、5,520億米ドル前後の費用が直接及び間接的にかかっていると推定している。さらに、IBDの人は結腸癌を発症する可能性が高いことを示唆する研究がある。
【０００３】
IBDの原因は不明である。しかしながら、両症候群は、免疫が介在すると思われ、その炎症過程は環境及び遺伝因子の影響を受ける。薬物療法は、炎症過程を制御することを狙っており、活動期の疾患及び慢性疾患に施されると同様に寛解の維持にも施される。完全に有効である管理戦略はないが、現在の治療法は、抗炎症剤（コルチコステロイド、アミノサリチレート）、免疫抑制剤、免疫療法又は外科処置を用いて炎症及び／又は免疫応答を軽減することを対象としている。治療の目標は、治療法に伴う副作用をできるだけ抑えて、疾患の寛解を誘導し、次いでそれを維持することである。UC患者の80％まで及びCD患者の35％は、寛解の誘導後１年以内に再発する（Podolsky, D. K. 「炎症性腸疾患の現在及び将来の理解」Best Practice & Research in Clinical Gastroenterology 16(6): 933-43, 2002）。さらに、重大な副作用のない治療法は現存しない。従って、IBDの薬剤開発の「聖杯」は、疾患の寛解を維持する非毒性の作用剤である（Feagan, 「炎症性腸疾患に対する維持療法」、The American Journal of Gastroenterology, 98 (12, Supplement 1):S6-S17, 2003）。
【０００４】
原発性胆汁性肝硬変（PBC）、自己免疫性肝炎（AIH）及び原発性硬化性胆管炎（PSC）は、それらの病態形成に自己免疫の土台を有すると思われる慢性肝疾患である。PSCはUCに関連すると思われる。PSC及びPBCでは、胆管が炎症性になり、瘢痕化し、最終的には遮断されて、胆汁鬱滞、肝細胞傷害及び多くの場合、肝不全を引き起こす。
【０００５】
過敏性腸症候群（IBS）は、非心臓性の胸痛、非潰瘍性の消化不良及び慢性の便秘又は下痢のような疾患を含む機能性消化器障害として知られる疾患の領域の一部である。これらの疾患はすべて、構造的な又は生化学的な原因を見つけることができない慢性の又は再発性の消化器症状を特徴とする。米国において2,500〜5,500万人がIBSに罹っている。
【０００６】
欧米諸国の一般人口におけるIBSの罹患率は6〜22％である。女性の14〜24％及び男性の5〜19％がIBSに罹っている。白人とアフリカ系アメリカ人では罹患率は類似しているが、ヒスパニックでは低いと思われる。幾つかの研究で高齢者の方がIBSの罹患率は低いことが報告されているが、本研究は、IBSに年齢不均衡が存在するかどうかを確実に結論付けることはできない。日本、中国、インド及びアフリカのような非欧米諸国でも、IBSは極めて一般的であると思われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、炎症及び関連する疾患及び症状の治療における新規の治療法、並びにそれに有用な新規の及び改善された作用剤及び化合物に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
驚くべきことに、本発明者らは、式（I）の化合物及びその塩が、
【化１】
2008533177.tif 000002
【０００９】
（式中、R1及びR2は独立して、ヒドロキシ、アルコキシ又はアシルオキシであり、R3は、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキル又はハロであり、Xは、=O又は水素及びヒドロキシのいずれかである）炎症性疾患及び循環器疾患の治療に特に有用であることを見い出した。
【００１０】
好ましくは、式（I）の化合物におけるR1及びR2は、ヒドロキシを表す。
【００１１】
好ましくは、式（I）の化合物におけるR3は、メチル、ブロモ、クロロ又はヒドロキシを表す。
【００１２】
好ましい実施態様では、Xは=Oであり、本発明の化合物は、式（Ia）のイソフラバン−4−オンである。
【化２】
2008533177.tif 000003
【００１３】
式中、R3は、5−アルキル、6−ハロ又は8−ハロであり、さらに好ましくはR3は、5−メチル、6−クロロ又は8−ブロモである。
【００１４】
別の好ましい実施態様では、Xは水素及びヒドロキシであり、本発明の化合物は式（Ib）のイソフラバン−4−オールである。
【化３】
2008533177.tif 000004
【００１５】
式中、R3は、8−アルキル又は8−ヒドロキシであり、さらに好ましくはR3は、8−メチル又は8−ヒドロキシである。
【００１６】
さらに、別の好ましい実施態様では、化合物は、式（Ic）の8−置換のイソフラボノイド化合物及びその塩である。
【化４】
2008533177.tif 000005
【００１７】
式中、R1及びR2は独立して、ヒドロキシ、アルコキシ又はアシルオキシであり、R3は、ヒドロキシ、アルキル又はハロであり、Xは、=O又は水素及びヒドロキシのいずれかである。
【００１８】
さらに好ましくは、R1及びR2はヒドロキシであり、R3は、ヒドロキシ、メチル又はブロモである。
【００１９】
特に好ましい式（I）のイソフラボノイド化合物及び薬学上許容可能なその塩は、化合物1〜5から選択される。
【化５】
2008533177.tif 000006
【００２０】
2008533177.tif 000007
【００２１】
本発明の別の側面によれば、抗炎症剤又は循環器剤としての式（I）の1以上の化合物の使用が提供される。
【００２２】
炎症性障害には、一般に炎症に関連する疼痛、浮腫及び紅斑が挙げられ、変形性関節症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎、自己免疫性疾患（SLE、関節リウマチ、糸球体腎炎）、喘息及び肺の炎症に関与する疾患を含む炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、高血圧症及び脂質障害を含む循環器障害、並びにエストロゲン受容体の活性化に関連する障害が挙げられる。すなわち、化合物は炎症に関連する疼痛の治療に有用である。好ましい実施態様では、炎症性障害の治療は、循環器系の副作用がなく、心臓保護性及び／又は消化管保護性である。
【００２３】
本発明の別の側面によれば、炎症に関連する疼痛を含む炎症の治療のための薬物製造のためのトロンボキサン合成酵素阻害剤の使用が提供される。好ましくは、治療は心臓保護性及び／又は消化管保護性である。
【００２４】
本発明の別の側面によれば、炎症性の疾患及び障害の治療のための、又はトロンボキサン合成酵素阻害剤としての式（I）の化合物を含む医薬が提供される。
【００２５】
本明細書及び後に続くクレームの全体にわたって、特に背景が要求しない限り、用語「含む」及びその変形、たとえば、「含む（三単現のｓ）」又は「含むこと（動名詞）」は、述べられた整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含すること意味するが、そのほかの整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外しないことを意味するように理解される。
【００２６】
詳細な説明
用語アルキルは、1〜6の炭素原子の直鎖及び分枝鎖の飽和アルキル基、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、三級ブチル、ペンチルなどを包含するとみなされる。アルキル基はさらに好ましくは、1〜4の炭素原子、特に、メチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを含有する。
【００２７】
本発明の化合物は、あらゆる塩、たとえば、酸付加塩、アニオン系塩、両性イオン系塩、及び特に、当業者に既知であるような薬学上許容可能な塩を包含する。用語「薬学上許容可能な塩」は、電荷を運び、医薬剤と関連して、たとえば、塩における対カチオン又は対アニオンとして投与することができる有機又は無機の部分を言う。薬学上許容可能なカチオンは当業者に既知であり、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛及び四級アミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学上許容可能なアニオンは当業者に既知であり、塩化物、酢酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
薬学上許容可能な塩には、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ベンズスルホン酸、クエン酸、桂皮酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルコン酸、塩酸、臭化水素酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ナフトエ酸、ヒドロキシナフトエ酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンアクリル酸、オレイン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、リン酸、ピルビン酸、パラ−トルエンスルホン酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、トリカルバリル酸、サリチル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸及びコハク酸から形成されるものが挙げられる。
【００２９】
用語「薬学上許容可能な誘導体」又は「プロドラッグ」は、受入者に投与の際、直接又は間接的に親型化合物若しくは代謝物を提供することが可能であるか、又は活性それ自体を示す活性化合物の誘導体を言い、たとえば、ホスフェート誘導体及びスルホネート誘導体が挙げられる。従って、誘導体は、溶媒和物、薬学上活性のあるエステル、プロドラッグなどを包含する。
【００３０】
本発明の好ましい化合物はまた、生体内で切断されて本発明の化合物又はその活性部分を提供することができる生理的に切断可能な脱離基を持つ誘導体すべてを包含する。脱離基には、アシル、ホスフェート、サルフェート、スルホネートが挙げられてもよく、並びに好ましくは、モノ−アシルオキシ、ジ−アシルオキシ及びパー−アシルオキシで置換された化合物が挙げられてもよく、その際、1以上のペンダントヒドロキシ基が、アシル基によって、好ましくはアセチル基によって保護される。通常、アシルオキシで置換された本発明の化合物は、相当するヒドロキシ置換された化合物に容易に切断可能である。
【００３１】
本発明はまた、たとえば、炎症性腸疾患（IBD）、たとえば、潰瘍性大腸炎（UC）、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎及び／又はクローン病、並びに原発性硬化性胆管炎（PSC）、原発性胆汁性肝硬変（PBC）、自己免疫性肝炎（AIH）及び過敏性腸症候群（IBS）を含むそのほかの腸症候群の治療、又は特にそれらの治療のための薬物の製造における使用のための、式（I）の化合物及び少なくとも１つの薬学上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３２】
本明細書の背景では、実質的に、純粋は、たとえば、HPLC分析で評価されるとき、90％以上の純度、たとえば、95％の純度、特に98％の純度、とりわけ99％の純度を意味することが意図される。
【００３３】
本発明はまた、本明細書に記載される種々の側面において式（I）の少なくとも2つの化合物を採用することにまで及ぶ。
【００３４】
医薬製剤には、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内及び関節内を含む）吸入（測定された用量の加圧エアゾール、ネブライザー又は吸入器を含む）、直腸、及び局所（皮膚、頬内、舌下及び眼内を含む）の投与に好適なものが挙げられる。最も好適な経路は、たとえば、受入者の症状及び障害に依存してもよい。製剤は通常、単位投与量形態で提供されてもよく、製薬技術で周知の任意の方法によって調製されてもよい。方法はすべて、１以上の補助成分を構成するキャリアに有効成分を会合させる工程を含む。一般に、製剤は、液体キャリア又は微細に分割された固体キャリア又はその両方と有効成分を均一に且つ密接に会合させ、次いで必要に応じて生成物を所望の製剤に成形することによって調製される。
【００３５】
経口投与に好適な本発明の製剤は、それぞれ所定の量の有効成分を含有する、たとえば、ゼラチンカプセル若しくはＨＰＭＣカプセルのようなカプセル、カシェ剤又は錠剤として；水性液又は非水性液における溶液又は懸濁液として；或いは水中油の液体エマルション又は油中水の液体エマルションとして提供されてもよい。有効成分はまた、ペーストとして提供されてもよい。
【００３６】
式（I）の化合物をカプセルとして製剤化する場合、好ましくは化合物は、１以上の薬学上許容可能なキャリア、たとえば、デンプン、ラクトース、微小結晶セルロース、二酸化ケイ素及び／又は、たとえば、シクロデキストリンのような環状オリゴ糖と共に製剤化される。追加の成分には、たとえば、ステアリン酸マグネシウム及び／又はステアリン酸カルシウムのような滑沢剤が挙げられてもよい。
【００３７】
好適なシクロデキストリンには、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、デメチル−β−シクロデキストリン、2−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、2−ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、及びトリメチル−β−シクロデキストリンが挙げられる。さらに好ましくは、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００３８】
任意で1以上の補助成分と共に、圧縮又は成形によって錠剤を調製してもよい。圧縮された錠剤は、任意で結合剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウム及び／又はステアリン酸カルシウムのような滑沢剤、不活性の希釈剤、又は表面活性剤／分散剤と混合された、たとえば、粉末又は顆粒のような自由流動性の形態での有効成分を好適な機械の中で圧縮することによって調製されてもよい。成形された錠剤は、好適な機械の中で、不活性の液体希釈剤で水分を与えられた粉末化した化合物の混合物を成形することによって作製されてもよい。錠剤は任意で、たとえば、腸溶性コーティングによって被覆されてもよく、その中の有効成分の徐放又は制御放出を提供するように製剤化されてもよい。
【００３９】
非経口投与用の製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び意図される受入者の血液と製剤を等張にする溶質を含有してもよく、懸濁剤及び濃厚剤を含んでもよい水性及び非水性の無菌注射溶液が挙げられる。好ましくは、非経口製剤は、たとえば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのような環状オリゴ糖を含む。製剤は、単位用量の容器又は複数回用量の容器、たとえば、密封したアンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に無菌の液体キャリア、たとえば、生理食塩水又は注射用水の添加のみを必要とする凍結し、乾燥した（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。以前記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から即席の注射用の溶液及び懸濁液が調製されてもよい。
【００４０】
吸入による肺への局所送達のための乾燥粉末組成物は、吸入器又は吹き入れ器での使用のための、たとえば、ゼラチンのカプセル及びカートリッジ、又は、たとえば、積層したアルミニウムホイルのブリスターで提供されてもよい。製剤は一般に、本発明の1以上の化合物及びラクトース又はスターチのような好適な粉末基剤（キャリア物質）の吸入用粉末ミックスを含有する。ラクトースの使用が好ましい。各カプセル又はカートリッジは一般に、任意で、別の治療上有効な成分との併用にて20μg〜10mgの間の化合物式（I）を含有してもよい。或いは、本発明の化合物（単数）又は化合物（複数）は、賦形剤なしで提供されてもよい。製剤の包装は、単位用量送達用であっても、複数回用量送達用であってもよい。
【００４１】
吸入による肺への局所送達のためのスプレー組成物は、好適な液体高圧ガスの使用と共に、たとえば、計測された用量の吸入器のような加圧包装から送達される水性の溶液若しくは懸濁液又はエアゾールの懸濁液若しくは溶液として製剤化されてもよい。好適な高圧ガスには、フルオロカーボン又は水素含有のクロロフルオロカーボン又はこれらの混合物、特に、ハイドロフルオロアルカン類、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、とりわけ、1,1,1,2−テトラフルオロエタン、1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン又はこれらの混合物が挙げられる。二酸化炭素又はそのほかの好適な気体も高圧ガスとして使用してもよい。エアゾール組成物は、賦形剤を含まなくてもよく、又は任意で、当該技術で周知の追加の製剤賦形剤、たとえば、界面活性剤、たとえば、オレイン酸若しくはレシチン及び共溶媒、たとえば、エタノールを含有してもよい。加圧製剤は一般に、弁（たとえば、絞り弁）で閉じられ、口金が設けられた作動装置に固定された密閉容器（たとえば、アルミニウム密閉容器）に保持される。
【００４２】
吸入による投与用の薬物は望ましくは制御された粒度を有する。気管支系への吸入のための最適な粒度は普通、1〜10μm、好ましくは2〜5μmである。吸入されて小さな気道に達する場合、20μmを超える大きさを有する粒子は一般に大き過ぎる。賦形剤がラクトースである場合、それは通常、製粉されたラクトースとして存在し、その際、85％以下のラクトース粒子が60〜90μmのMMDを有し、15％未満が15μm未満のMMDを有する。
【００４３】
直腸投与のための製剤は、カカオバター若しくはポリエチレングリコールのようなキャリアを伴った座薬として、又はキャリアが生理食塩水のような等張液である浣腸剤として提供されてもよい。製剤の追加の成分には、環状オリゴ糖、たとえば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのような上述のようなシクロデキストリン、１以上の界面活性剤、ｐＨを調整するための緩衝液の塩又は酸又はアルカリ、等張調整剤及び／又は抗酸化剤が挙げられてもよい。
【００４４】
特に上述の成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類に対する考慮を有する当該技術で慣習的なそのほかの作用剤を含んでもよく、たとえば、経口投与に好適なものは風味剤を含んでもよいことが理解されるべきである。
【００４５】
本発明に係る化合物及び医薬製剤は、1以上のそのほかの治療剤、たとえば、抗炎症剤、抗コリン作用性剤（特に、M1、M2、M1/M2又はM3受容体拮抗剤）、β2−アドレノ受容体作動薬、抗感染剤（たとえば、抗生剤、抗ウイルス）又は抗ヒスタミンとの併用で使用されてもよく、或いは、これらを含んでもよい。好ましいのは、コルチコステロイド及び／又は抗コリン作用剤及び／又はPDE−4阻害剤と一緒に、式（I）の化合物（単数）又は化合物（複数）又は薬学上許容可能なその塩、溶媒和物、又は生理的に機能的な誘導体を含む組み合わせである。
【００４６】
好適な抗炎症剤には、コルチコステロイド及びNSAIDが挙げられる。本発明の化合物との併用で使用されてもよい好適なコルチコステロイドは、経口の及び吸入されるコルチコステロイド及び抗炎症活性を有するそれらのプロドラッグである。例には、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、6α，9α−ジフルオロ−17α−［（2−フラニルカルボニル）オキシ］−11β−ヒドロキシ−16α−メチル−3−オキソ−アンドロスタ−1,4−ジエン−17β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、6α，9α−ジフルオロ−11β−ヒドロキシ−16α−メチル−3−オキソ−17α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−1,4−ジエン−17β−カルボチオ酸Ｓ−（2−オキソ−テトラヒドロ−フラン−3S−イル）エステル、ベクロメタゾンエステル（たとえば、17−プロピオネートエステル又は17,21−ジプロピオネートエステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（たとえば、フロエートエステル）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド及びプロピオン酸ブチクソコルトが挙げられる。好ましいコルチコステロイドには、プロピオン酸フルチカゾン、及び6α，9α−ジフルオロ−17α−［（2−フラニルカルボニル）オキシ］−11β−ヒドロキシ−16α−メチル−3−オキソ−アンドロスタ−1,4−ジエン−17β−カルボチオ酸S−フルオロメチルエステルが挙げられ、さらに好ましくは、6α，9α−ジフルオロ−17α−［（2−フラニルカルボニル）オキシ］−11β−ヒドロキシ−16α−メチル−3−オキソ−アンドロスタ−1,4−ジエン−17β−カルボチオ酸S−フルオロメチルエステルが挙げられる。
【００４７】
好適なNSAIDには、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ホスホジエステラーゼ（PDE）阻害剤（たとえば、テオフィリン、PDE4阻害剤又は混合PDE3/PDE4阻害剤）、ロイコトリエン拮抗剤、ロイコトリエン合成の阻害剤、iNOS阻害剤、トリプターゼ及びエラスターゼの阻害剤、β−2インテグリン拮抗剤及びアデノシン受容体作動剤又は拮抗剤（たとえば、アデノシン2a作動剤）、サイトカイン拮抗剤（たとえば、ケモカイン拮抗剤）又はサイトカイン合成阻害剤が挙げられる。
【００４８】
有効成分の同時投与は、同時であっても、順次であってもよい。同時の投与は、同一単位用量にある化合物によって、又は同時若しくは類似時間に投与される個々の及び別個の単位用量によって達成されてもよい。順次の投与は、必要に応じて任意の順でもよく、通常、第２の又は後の活性剤を投与する際、特に累積的な又は相乗的な効果が所望される場合、進行中である第１の又は最初の活性剤の継続中の生理的効果を必要とする。
【００４９】
好ましくは、製剤は経口製剤であり、さらに好ましくはカプセル製剤である。
【００５０】
好ましくは、カプセル製剤は、式（I）の化合物及び二酸化ケイ素を含む、本質的にそれらから成る又はそれらから成る。
【００５１】
好ましくは、カプセルはHPMCカプセルである。
【００５２】
代替的実施態様では、製剤は、座薬又は浣腸剤であり、それは、身体の疾患に冒された領域にさらに近くに有効成分を方向付けるのに使用することができる。
【００５３】
好ましくは、本発明に係る組成物は、経口か又はそうでないものであって、患者の体重当たり5mg/kg以下、たとえば、0.01〜4mg/kg、たとえば、0.5〜3mg/kgの式（I）の化合物を含む。
【００５４】
たとえば、製剤は、単位用量当たり、50〜500mg、さらに好ましくは200〜400mg、たとえば、250mgの式（I）の化合物を含む。
【００５５】
従って、本発明は、治療又は薬物の製造における使用のために1以上の式（I）の化合物及び／又はそれを含む組成物を提供する。
【００５６】
本発明はまた、治療を必要とする患者に治療上有効量の1以上の式（I）の化合物又はそれを含む組成物を投与することを含む治療の方法も提供する。これらの方法は、上記で列記された疾患に特に有効である。
【００５７】
好ましくは、本発明に係る化合物及び組成物は、IBD、たとえば、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎のような大腸炎；クローン病の治療及び／又は結腸癌の予防に採用されるであろう。
【００５８】
別の好ましい側面では、本発明の化合物及び組成物は、前記疾患、特に、IBDの寛解の維持に有用である。
【００５９】
最終的には、処方される用量及び処方された用量が服用される間隔は、患者に責任を持つ内科医の裁量である。
【００６０】
たとえば、50〜500mgの範囲の用量にて、たとえば、1日4回、たとえば、1日1回又は2回、式（I）の化合物を投与してもよい。
【００６１】
化合物及びそれを含む組成物は、驚くべきことに毒性が低い。さらに、それらは、類似の構造の化合物よりも、さらに選択的であり、毒性がさらに低く及び／又は、たとえば、体重減少、消化管の潰瘍形成などの臨床症状を軽減することにおいてさらに有効性が高いという点で、それらは有利である。
【００６２】
理論によって束縛されることを望まないが、本発明の化合物は選択的なトロンボキサン合成酵素阻害剤であると考えられる。トロンボキサン（TX）は、IBDにおいて主な病態形成の役割を担っている可能性がある。TXは、炎症を起こした消化管粘膜でのみならず、単離された腸及び末梢血単核細胞及びクローン病における炎症を起こしていない腸管によっても過剰に産生される。
【００６３】
これらイソフラバン−4−オン及びイソフラバン−4−オール及びそれらの誘導体は、当該技術で既知の標準的な手順によって容易に入手可能である。その開示を参照によって本明細書に組み入れる公開された国際特許出願、WO98/08503、WO00/49009及びWO01/17986（すべてNovogen Research Pty Ltdへのもの）も、出発モノマーとしてのイソフラボン、イソフラバノン、イソフラバン−４−オール及び関連するイソフラボノイド化合物の製造のための有用な合成方法も提供している。代表的な一般的合成を以下のスキーム1に述べる。
【化６】
2008533177.tif 000008
【００６４】
置換されたR5〜R8フェノール及びR2〜R4フェニル酢酸出発物質を相応して選択することによってイソフラバン−4−オールのベンゾピラン環及びペンダントのフェノール環の双方の周りでの様々な置換パターンへのアクセスを可能にする。当業者に知られているように、R1置換された塩化メタンスルホニル反応物によって環の環化反応を好都合に行ってもよい。水素の存在下、アルコール性溶媒中にてPd−C又はPd−アルミナによって還元反応を上手く行う。条件が還元の最終生成物を決定することができる。当業者は、アルキル化、環化、水素添加及び／又は還元のそのほかの常法を適宜採用できることに気付くであろう。
【００６５】
本発明の化合物及び誘導体における官能基の保護は、当該技術において十分に確立された方法、たとえば、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1981.に記載された方法によって行うことができる。
【００６６】
ヒドロキシル保護基には、カルボン酸エステル、たとえば、酢酸エステル、アリールエステル、たとえば、ベンゾエート、アセタール／ケタール、たとえば、アセトニトリル及びベンジリデン、エステル、たとえば、オルト−ベンジル及びパラ−メトキシベンジルエステル、テトラヒドロピラニルエーテル及びシリルエーテル、たとえば、tert−ブチルジメチルシリルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
保護基は、たとえば、酸若しくは塩基が触媒する加水分解、又は還元、たとえば、水素添加によって外すことができる。シリルエーテルは切断されるには、フッ化水素又はフッ化テトラブチルアンモニウムを必要としてもよい。
【００６８】
具体的には、式（I）の化合物は、たとえば、以下の方法によって調製することができる。本明細書では、置換パターンは、好ましい実施態様のものであり、8−置換の化合物であるが、出発物質を変えることによって、異なった置換パターンが容易に得られてもよいことが理解されるであろう。
【００６９】
イソフラボンの選択的還元によってイソフラバノン及びイソフラバン−4−オールは容易に入手可能である（ノボゲンWO00/49009を参照のこと）。還元剤は、当業者に周知であり、ホウ化水素及びアルカリ金属ホウ化水素のような水素化物源を挙げることができるが、パラジウム炭素又は酸化白金のような好適な触媒を用いる場合、触媒的水素添加では、水素が挙げられる。そのほかの好適な水素化物源には、トリアセトキシホウ化水素ナトリウム及びシアノホウ化水素ナトリウムが挙げられる。
【００７０】
好ましくは、水素添加によって二重結合が還元される。好ましくは、採用される触媒はパラジウム炭素又は酸化白金である。
【００７１】
レゾルシノールは、上記スキーム1における鍵となる出発物質である。置換されたレゾルシノールは容易に入手可能であり、必要に応じて合成することができる。たとえば、好適な溶媒の存在下、水素添加剤でレゾルシノールを処理することによってレゾルシノールをメチル化してもよく、又は水素添加してもよい。好適な水素添加剤には、ヨウ素、臭素、塩素又はフッ素が挙げられる。低い温度、たとえば、0℃にて水素添加工程を行うことが必要であってもよい。
【００７２】
式（I）の化合物及びすべての中間体化合物もまた、本明細書に記載されるすべての化合物の調製のための工程を行うので、本発明の側面を形成する。
【００７３】
化合物、3,4−エポキシ−4’,7−ジヒドロキシイソフラバンもまた抗炎症活性を示す。それは、4’,7−ジヒドロキシイソフラバン−4−オールの4’,7−ジヒドロキシイソフラブ−３−エンへの脱水（P2O5）によって得られる。二重結合のエポキシ化（m−CPBA）は、エポキシドを生じる。
【００７４】
本発明者らは、選択的に又は非選択的にのいずれかでトロンボキサン合成酵素（TXS）を阻害することによるエイコサノイドトロンボキサン（TX）の阻害が以下の多面的機能を有することを見い出した。
【００７５】
1．疼痛、浮腫及び腫脹のような古典的臨床徴候の軽減によって現れる抗炎症活性、並びに
2．高血圧症を軽減すること、血清脂質を加減すること、及び／又は抗アテローム性動脈硬化活性を有すること、又は循環器疾患のリスクを高めるのに貢献するCOX−2阻害の血栓形成促進性効果を除くこと又は低減することのいずれかによる心臓保護活性；
3．プロスタグランジンの産生を高める又はその阻害を減らすので、NSAIDSの副作用を回避することを介した消化管保護効果。
【００７６】
抗炎症活性
プロスタグランジン、たとえば、PGE2及びPGI2並びにトロンボキサン（TX）、たとえば、TXA2は、エイコサノイドとして知られる脂肪酸のファミリーのメンバーである（Penglis et al., 2000）。それらは、正常な生理及び炎症反応に関与するが、たとえば、サイトカインの放出及び血小板凝集に対して相反する効果を有する。膜のリン脂質からのアラキドン酸（AA）の放出は、エイコサノイド合成の一次基質を提供する。シクロオキシゲナーゼ（COX）酵素の作用は、アイソタイプにかかわりなく、PGE2、PGI2及びTXA2の共通する前駆体である、中間体プロスタグランジンPGH2の合成を生じる。
【００７７】
本発明者らは、トロンボキサンそれ自体の阻害が抗炎症戦略であることを見い出した。
【００７８】
1．プロスタノイドは、炎症を起こした臓器における白血球と実質細胞による複雑な相互作用を介した免疫応答において重要な調節性の役割を担う。それらは、炎症性刺激、産生された優勢なプロスタノイド及びプロスタノイド受容体発現の特性に依存して、炎症誘発性及び抗炎症性の双方の作用を生じることができる（Tilley et al. 2001）。
【００７９】
2．トロンボキサンTXA2は、主として炎症誘発性であると思われる作用を持つプロスタノイドである（Thomas et al. 2003）。TXの高い産生は、種々の免疫介在性疾患、たとえば、ループス腎炎の病態形成に関係するとみなされている。
【００８０】
3．本発明者らは、TX阻害剤である、本発明のイソフラボノイド化合物が、種々の動物モデルにおいて新規の及び選択的な作用様式に従って顕著な抗炎症活性を有することを実証した。
【００８１】
4．トロンボキサンは、炎症性腸疾患（IBD）で主な病態形成の役割を担う。TXは、炎症を起こした粘膜のみならず、クローン病において炎症を起こしていない腸によって並びに単離された腸及び末梢血単核細胞によって過剰に産生される。それらの細胞性の供給源には、血小板、好中球、内皮細胞及び上皮細胞、並びに単核細胞が含まれる可能性が高い（Hawkey et al. 1985; Rampton and Collins 1993; McCartney et al. 1999; Carty et al. 2000; Carty et al. 2002）。TXの炎症誘発性の効果は、直接的（白血球の血管外漏出、好中球の活性化、粘膜の潰瘍化、抑制性T細胞活性の低下）及び間接的（血管収縮、血小板の活性化）の両方である。PGは、消化管粘膜に対して保護的であると考えられている（Carty et al. 2000）。慢性IBDの治療に頻繁に投与される化合物であるスルファサラジン、並びにその主な代謝物、スルファピリジンは、それぞれ、TXB2の合成を阻害するが、PGF2α及びPGE2の合成を高めることが明らかにされている（Hawkey et al. 1985）。言い換えれば、それらは、あるレベルのTX合成酵素の阻害を有すると思われる。
【００８２】
５．TX合成酵素の阻害はTX形成の低下を招くが、PG合成酵素のための基質PGH2の高い利用性があり、PGの合成が高まるためである（Carty et al. 2000; Penglis et al. 2000）。PGE2の増加は抗炎症効果を発揮することができる。たとえば、
a）PGE2は、一部の急性炎症反応、特に、肥満細胞の脱顆粒によって開始されるものを減弱することが報告されている（Raud et al. 1988）。
【００８３】
b）TNFα及びIL-1βをPGE2は抑制するが、TXA2は高める（Caughey et al. 1997）。TXA2の阻害は、炎症性サイトカインの産生、特にTNFの産生を阻害する可能性のある方法である。現在、TNFのレベル（抗体による)又は可溶性TNF受容体を抑制する生物学的療法は、ほかの治療法に対して難治性であるか、又はもはや反応しない関節リウマチを治療することに成功している。TNF産生を抑制し、経口で服用できる化学薬品は、大きな前進であった。TXA2形成の阻害は、関節の炎症の徴候及び症状に関与し、軟骨の分解、関節空間の減少及び最終的には関節不全で明らかな関節の炎症の長期間の分解段階に関与するサイトカインであるTNFの産生を抑制する手段であってもよい。
【００８４】
c）PGE2は、Tリンパ球の活性化及び増殖及びIg産生の阻害を含む広い範囲のT及びBの細胞機能を阻害する（Tilley et al. 2001）。逆に、TXA2は、T細胞の活性化及び増殖を促進し、細胞傷害性T細胞（CTL）のエフェクターの発生を促進する。PGの産生を優先してこの均衡を変えることによって自己免疫疾患で生じるような不適当な免疫応答の「火消し」を促進してもよい。
【００８５】
d）喘息では、PGE2は、血管拡張を促進し、血管の透過性を高める（Tilley et al. 2001）。炎症が進むにつれて、COX−2及びPGE合成酵素の発現が増加するので、マクロファージによりPGE2の合成が高められる。PGE2は、白血球の活性化を阻害し、気管支拡張を促進する。TXA2合成酵素阻害剤及びトロンボキサンプロスタノイド（TP）受容体の拮抗剤が抗喘息薬として開発されている（Shi et al. 1998）。
【００８６】
e）糸球体腎炎では、PG及びTXの合成に向かうAA COX経路及びロイコトリエンの合成に向かうリポキシゲナーゼ経路の同時活性化がある。TXA2は、腎炎の糸球体で合成される最も豊富なエイコサノイドであり、今や、TXA2合成酵素阻害剤（たとえば、ダズメグレル）が、糸球体腎炎の治療に利用可能である。腎炎のラットのモデルでは、ダズメグレルは、糸球体腎炎でPGE2が腎臓機能を保護するので有用であるPGE2の合成を高めた（Lianos and Bresnahan 1999）。
【００８７】
f）COX−2に由来するプロスタグランジンは、炎症の回復に関連する。炎症病変にて産生されるPGの特性は、炎症の進行の間の炎症誘発性のPGE2が優位を占めるときから炎症の回復の間の抗炎症性のシクロペンテノン（cyPG）が優位を占めるときまで変化する（Gilroy et al. 1999）。
【００８８】
心臓保護活性
COX阻害を利用するそのほかの抗炎症剤とは対照的に、トロンボキサン自体の阻害は、心臓保護的戦略である。
【００８９】
1．PG対TXの比は、COXのどのアイソフォーム（COX−１又はCOX−2）が存在するかに依存する（Caughey et al. 2001）。TXA2は、COX−1に由来する主な生成物であるが、COX−2の誘導はPGE2及びPGI2の合成の優先的な増加を招く。逆に、COX−2が抑制されると、TX合成の増加がある。
【００９０】
2．TXA2は、血小板凝集の強力な誘発因子である。レフェコキシブ（ビオックス）の
場合における循環器疾患へのリスクの増加は、選択的COX−2の阻害によって生じるTX合成の増加の血栓形成促進性の結末によるものだった。非選択性のCOX阻害はまた、TX及びPG双方の基質、PGH2が、COX−1又はCOX−2のいずれか、又は双方によって阻害されるので、ある種の循環器のリスクの原因ともなる。
【００９１】
3．従って、COXの阻害が抗炎症「課題」から全体的に外されるのであれば、特定のTXSの阻害で起きるように、循環器疾患のリスクの増加はないけれども炎症性メディエータ、すなわち、TXA2は阻害される。
【００９２】
4．TXA2はまた血管収縮性なので、その阻害は、血圧降下剤に寄与すると思われる。循環器機能において、アンギオテンシンIIとTXA2との間に連関がある（Dogne et al. 2004）。たとえば、血管の平滑筋の収縮を刺激することによってTXA2及びPGH2はアンギオテンシンII依存性の高血圧症に関与する。さらに、一般的に使用される一部のアンギオテンシンII阻害剤はまた、血小板凝集を阻害するトロンボキサン受容体（TP）拮抗剤である。
【００９３】
消化管保護活性
TXの阻害剤がPGの基質の利用性を高めるので、PGE2の合成が増加する可能性があり、もし高められなくても、COXの阻害で生じるほどには少なくとも阻害されることはない。COXを阻害するNSAIDの使用は、PGE2の阻害による消化管の潰瘍形成、穿孔及び出血に関連する。
【００９４】
PGは、炎症の顕著な特徴−疼痛、腫脹及び浮腫に介在するエイコサノイドのリストに含まれるが、それらはまた、それが産生する塩酸から胃粘膜を保護する有益な役割を有する（Vane and Botting 2003）。これは種々の方法で生じる：
1．外因性に投与されたPGは、胃粘膜障壁の崩壊を防ぎ、胃粘膜血流を高め、粘液及び重炭酸の分泌を刺激することができる（Miller 1983）。
【００９５】
2．PGE2の阻害は、生体内で胃粘膜細胞の増殖を低下させる（Levi et al., 1990）。その結果、PGE2は粘膜の整合性の維持に重要であるということになる。
【００９６】
3．内因性のPGは、穏やかな刺激により胃で誘導される適応的細胞保護において中心的な役割を担う（Robert at al., 1979）。培養された胃粘膜細胞のPGE2による前処理は、エタノールで誘発した細胞の傷害を軽減した（Sakamoto et al., 1993）。さらに、非選択性のCOX阻害剤であるインドメタシンによる胃粘膜細胞の前処理がエタノール誘発の傷害を増やすということは、内因性のPGE2が細胞の保護に関与することを示唆する。PGE2によって活性化される受容体は、薬学的には少なくとも4つの亜型（EP1、EP2、EP3及びEP4）にさらに分類され、生体内では、適応的な胃の細胞保護にはEP1−受容体が介在する（Takeuchi et al., 2001）。
【００９７】
4．PGE2の保護的役割は、胃粘膜の微小循環の調節にも関与する。血管拡張剤、たとえば、PGE2と血管収縮メディエータ、たとえば内皮由来ペプチド、エンドセリン−１（ET−1）の局所放出のバランスの崩壊は、粘膜傷害の病態形成に関与すると考えられている（Whittle and Lopez-Belmonte, 1993）。
【００９８】
PGE2は、マウスの小腸における放射線誘発のアポトーシスを低下させ、腸における内因性のPGE2は放射線照射後の上皮陰窩の生存率を高める（Cohn et al., 1997）。この効果には、EP2を介したシグナル伝達、AKTのリン酸化、及びbax転移の阻害が関与する（Tessner et al., 2004）。
【００９９】
本発明の化合物が化学増感剤であると考えられることも驚くべきであり、すなわち、それらは、それらと同時投与される1以上の抗癌剤、及び／又は放射線増感剤の細胞傷害性を高め、そのことは、これらの化合物が、癌様細胞を殺傷するのに必要とされるガンマ照射の量を減らすか、又は放射線耐性から放射線感受性に癌細胞を変換することを意味している。
【０１００】
さらに、本発明の化合物は、癌、炎症性障害、自己免疫性障害、循環器障害、及びエストロゲン受容体の活性化に関連する障害を含むヒトの様々な重大疾患の治療及び予防に有用である。
【０１０１】
以下の非限定の実施例及び添付の図面によって本発明をさらに説明する。
【０１０２】
実施例
置換されたイソフラバノン及びイソフラバン−４−オールの合成方法
4−ヒドロキシフェニル酢酸による2−ブロモレゾルシノールの縮合：1−（3−ブロモ−2,4−ジヒドロキシフェニル）−2−（4−ヒドロキシフェニル）−エタノンの合成
【化７】
2008533177.tif 000009
【０１０３】
コンデンサ及び磁気撹拌器を装着した丸底フラスコにて2−ブロモレゾルシノール（5.0g、26mM）と4−ヒドロキシフェニル酢酸（3.0g、26mM）の混合物に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（30mL）を加えた。混合物を撹拌しながら、100〜110℃にて1時間半加熱した。次いで、混合物を室温に冷却し、冷凍庫で一晩保持した。沈殿した固形物をろ過し、エタノールから再結晶させて白っぽい結晶としてデオキシベンゾインを得た。次いで、結晶を回収し、デシケータ中にて乾燥した。
【０１０４】
1HNMR(CDCl3):δ4.16(s,2H,CH2), 6.61(d,1H,J9.0Hz,ArH), 6.80(d,2H,J8.6Hz,ArH), 7.12(d,1H,J8.6Hz,ArH), 7.75(d,1H,J9.0Hz,ArH)。
収量：5.2g、69％
1−（3−ブロモ−2,4−ジヒドロキシフェニル）−2−（4−ヒドロキシフェニル）−エタノンの環化：3−（4−ヒドロキシフェニル）−7−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オンの合成
【化８】
2008533177.tif 000010
【０１０５】
50℃に維持された1−（3−ブロモ−2,4-ジヒドロフェニル）−2−（4−ヒドロキシフェニル）−エタノン（2.5g）の無水ジメチルホルムアミド（20mL）溶液に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（6mL）を一滴ずつ加えた。次いで、塩化メタンスルホニル（3.3mL）を溶液に加え、混合物を110℃にて１時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物に塩酸（2M、120mL）をゆっくり加えた。得られた黄色の沈殿物をろ過し、水で十分洗浄し、乾燥させた。
【０１０６】
1H NMR (d6-DMSO): d 6.79 (d, 2H, J 8.7 Hz, ArH),7.08 (d, 1H, J 8.7 Hz, H6), 7.36 (d, 2H, J 8.7 Hz, ArH), 7.94 (d, 1H, J 8.7 Hz, H5), 8.39 (s, 1H, H2).
収量：2.35g
さらに精製することなく粗生成物を次の工程で使用した。
【０１０７】
3−（4−ヒドロキシフェニル）−7−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オンのアセチル化：3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オンの合成
【化９】
2008533177.tif 000011
【０１０８】
コンデンサ及び磁気撹拌器を装着した丸底フラスコにて3−（4−ヒドロキシフェニル）−7−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オン（2.35g）に無水酢酸（15mL）及びピリジン（2.5mL）を加えた。混合物を110℃にて１時間加熱した。それを冷却し、冷蔵庫に放置して結晶化させた。白色の結晶性固形物をろ過し、水で数回洗浄した。エタノールから粗生成物を再結晶させることによって白色の結晶針状物として3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オンを得た。
【０１０９】
1H NMR (CDCl3): d 2.32, 2.42 (各 s, 3H, OCOCH3), 7.17-7.22 (m, 3H, ArH),7.58 (d, 2H, J 8.7 Hz, ArH), 8.1 (s, 1H, H2), 8.29 (d, 1H, J 9.0 Hz, H5).
収量：1.5g
3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オンの水素添加：3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−4−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロマン−4−オン及び3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−4−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロマン−4−オールの合成
【化１０】
2008533177.tif 000012
【０１１０】
酢酸エチル（80mL）中の3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロメン−4−オン（0.3g）懸濁液を含有する250mLの丸底フラスコから気体を抜き出し、アルゴンを満たして不活性の雰囲気を提供した。混合物に酸化白金（67mg）を迅速に加え、混合物を穏やかに回転させて触媒が酢酸エチルで完全に覆われることを確かなものにした。室温にて３日間、標準的な条件下、混合物に水素添加した。セライトのパッドを介して溶液をろ過して触媒を除き、溶液を真空下で蒸発させて無色の油状物を得た。油状物のTLC分析は、それがクロマン−4−オンとクロマン−4−オールの混合物であることを示した。溶出液としてジクロロメタン／酢酸エチル（98:2）を用い、シリカカラムにて粗生成物のクロマト分画を行った。
【０１１１】
3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロマン−4−オール
収量：100mg
1H NMR (CDCl3): d 2.30, 2.35 (各 s, 3H, OCOCH3), 3.32 (dt, 1H, J 3.4 Hz, J 11.7 Hz, H3), 4.48 (m, 1H, H2); 4.65 (dd, 1H, J 10.5 Hz, 11.7 Hz, H2), 4.78 (bs, 1H, H4), 6.75 (d, 1H, J 8.3 Hz, H6), 7.10 (d, 2H, J 8.3 Hz, ArH), 7.25 (d, 1H, J 8.3 Hz, H5), 7.30 (d, 2H, J 8.3 Hz, ArH).
3-(4-アセトキシフェニル)-7-アセトキシ-8-ブロモ-クロマン-4-オン
収量：170 mg
1H NMR (CDCl3): 2.29, 2.38 (各 s, 3H, OCOCH3), 4.02 (dd, 1H, J 5.7 および8.7 Hz, H3), 4.60 (m, 2H, H2), 6.88 (d, 1H, J 8.6 Hz, H6),7.09 (d, 2H, J 8.7 Hz, ArH), 7.29 (d, 2H, J 8.7 Hz, H2), 7.96 (d, 1H, J 8.6 Hz, H5).
3−（4−ヒドロキシフェニル）−7−ヒドロキシ−8−ブロモ−クロマン−4−オン
【化１１】
2008533177.tif 000013
【０１１２】
無水エタノール（7.0mL）中の3−（4−アセトキシフェニル）−7−アセトキシ−8−ブロモ−クロマン−4−オン（0.17）の懸濁液にイミダゾール（0.50g）を加え、アルゴンのもとで混合物を１時間還流した。減圧下、溶液を濃縮し、蒸留水（5mL）及び塩酸（1M、5mL）を残留物に加えた。混合物を一晩冷蔵庫に放置し、得られたクリーム状の白色固形物をろ過し、水で十分に洗浄して、真空デシケータ中にて乾燥させた
収量：130mg
1H NMR (d6-アセトン): 3.93 (t, 1H, J 6.8 Hz, H3), 4.60 (d, 2H, J 7.2 Hz, H2), 6.75-6.81 (m, 3H, ArH), 7.13 (d, 2H, J 8.7 Hz, ArH), 7.72 (d, 1H, J 8.6 Hz, H5), 8.44 (bs, 1H, OH), 10.2 (bs, 1H, OH).
アセトキシイソフラバン−4−オンの同様の脱保護は、相当するヒドロキシ化合物をもたらす。出発レゾルシノールの置換パターンを変えることによって、本発明のそのほかの化合物が合成された。合成された化合物はすべて、割り当てられた構造に一致するスペクトルデータを示した。
【０１１３】
化合物2の合成は、4−ヒドロキシフェニル酢酸によるピロガロールの縮合で始まった。上記のようなさらなる反応によって化合物2が得られる。化合物3、4及び5はそれぞれ、2−メチルレゾルシノール、4−クロロレゾルシノール及び5−メチルレゾルシノールから開始する。
【０１１４】
抗炎症活性
ヒト単球で誘発されたエイコサノイドの阻害
単核細胞のリンホプレップ勾配分離、次いで向流遠心エルトリエーション（Demasi et al., 2000）によるバフィコートからヒトの末梢血単球（３人の異なった個人から）を単離した。試験化合物をDMSOに溶解し、新鮮な単球に加えて0、10及び100μMの濃度を達成した。30分後、リポポリ多糖（PLS）を加えて200ng/mLの最終濃度を達成した。5%CO2にて37℃で18時間インキュベートした後、上清を取り出して、放射性免疫アッセイ（RIA）によってPGE2及びTXB2（TXA2の安定な加水分解生成物）の産生を測定した。１回だけ調べたに過ぎない化合物4を除いて、各化合物は3回の異なったアッセイで調べ、ANOVA、その後ニューマン−クールズの多重比較検定を用いて、用量と対照の値との間の差異を調べた。0.05の統計学的に有意なレベルを用い、及び対照の値との差異。
【０１１５】
10μMの濃度で得られた結果を図1（PGE2）及び図2（TXB2）に提示する。試験化合物によってPGE2は、用量反応性に誘導され、又はPGE2の効果は最少限であり、TXB2は一般に阻害されたので、これらの結果は、化合物がトロンボキサン（TX）合成酵素の阻害剤であることを示唆した。
【０１１６】
TX合成酵素（TXS）に対する試験化合物の効果を直接調べるために、異なったアッセイ系を使用した。アラキドン酸（AA）はCOXの基質であるが、PGE2はTX合成酵素の基質である。これらの化合物の効果を直接調べるために、外因性のPGH2をアッセイ系に加えた。エイコサノイドの合成を以下に示す。
【化１２】
2008533177.tif 000014
【０１１７】
0μM、1μM、10μM及び100μM（DMSO中）での試験化合物を未分化のU937細胞（6x106/mL）と共に、37℃にて30分間インキュベートし、その後、PGH2（5μM）を加えた。10分間インキュベートした後、遠心によって反応を終了させ、上清を回収し、TXB2の産生をRIAにて三連一組で調べた。ANOVA、その後ニューマン−クールズの多重比較検定を用いて、用量と対照の値との間の差異を調べた。0.05の統計学的に有意なレベルを用い、対照の値との差異は星印（＊）によって示す。結果を図3に示す。
【０１１８】
最初のアッセイでこれらの化合物はいずれもPGE2を阻害しなかったので、これらのアッセイで実証された阻害は、TXSに特異的であることが推測されうる。これらの結果は、化合物1、2、4及び5は選択的トロンボキサン合成酵素阻害剤であり、化合物3によって示されるトロンボキサン合成酵素活性はあまり特異的ではないことを示している。
【０１１９】
NFκBの阻害
核内因子κB（NFκB）は、アポトーシス、ウイルス複製及び腫瘍形成と同様に炎症及び種々の自己免疫疾患の調節に決定的である多数の遺伝子（COX-2を含む）の発現を調節する核内転写因子である。NFκBは、増殖因子、サイトカイン、リンホカイン、UV照射、薬理学的作用剤及びストレスを含む様々な刺激によって活性化される。試験化合物によるNFκBの阻害は、化合物が生体内で抗炎症活性を有することを示唆している。
【０１２０】
RPMI1640培地（70μL）の存在下、β−ラクタマーゼレポーター遺伝子を含むように改変されたヒトのマクロファージTHP-1細胞を96穴プレート（5x103個／ウエル）に播いた。TNFα（7.5ng/mL）及びヒト血清（20％の最終濃度）を各ウエルに加えた。37℃にて5時間プレートをインキュベートしてNFκB刺激のβ−ラクタマーゼ産生を可能にした。次いで、LiveBLAzerTM FRET B/G基質（CCF4-AM）をβ−ラクタマーゼ活性用のアッセイに加えた。CCFA-AMがいったん細胞に入ると、内因性のエステラーゼによってそれは、負に荷電したCCF4に変換される。409nmでのこの基質の励起は、クマリン部分とフルオレセイン部分の間に十分なFRETをもたらし、結果的に530nmで検出可能な緑色の蛍光を生じる。β−ラクタマーゼの存在は、CCF4の切断を招き、結果的にFRETの喪失を生じ、その結果、460nmで検出可能な堅調な青色の蛍光シグナルを生じる。従って、β−ラクタマーゼの活性（NFκBのプロモータ活性のマーカー）は、基質の比率（青／緑の蛍光比率：460nm／530nm）として測定される。
【０１２１】
図4で示されるように、ビヒクル対照と比較したとき、化合物2、3及び5は、NFκBを有意に阻害した（p<0.001）。
【０１２２】
一酸化窒素の阻害
一酸化窒素（NO）は、種々の炎症症状で重要な調節性／変調性の役割を担う（Blantz and Munger, 2002）。炎症の部位にて浸潤する白血球及び常在性の組織細胞の双方に存在する誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の作用を介して大量のNOが産生される（Evans, 1995）。それは、血管拡張性であることができ、好中球の接着を妨げる接着分子を妨害する。NOの放出は、ペルオキシ亜硝酸塩や安定なニトロソチオール類のような反応性の高い種の形成をもたらしてもよく、ミトコンドリアの損傷及びタンパク質チロシン残基のニトロ化を起こしてもよい。全身性エリテマトーデス（SLE）、シューグレン症候群（SS）、血管炎、関節リウマチ及び変形性関節症を含む種々の炎症及び自己免疫疾患の経過中に過剰のNOが産生される（Clancy et al., 1998）。その結果、その阻害は抗炎症性戦略であるとみなされる。
【０１２３】
種々の細胞（たとえば、マクロファージ及び平滑筋細胞）の細菌性LPS及び炎症誘発性のサイトカインへの暴露は、NOを生成するiNOSを誘導する。NOの産生は、NOの安定な崩壊産物である亜硝酸塩（NO2-）の測定によって間接的に定量することができる。FCS、
2mMのグルタミン、及び50U/mLのペニシリン／ストレプトマイシンを補完したDMEM中にて、マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7を培養した。10ng/mLのLPSと共に10μMの試験化合物（0.125％DMSO中にて）又はビヒクル単独で細胞を処理した。24時間のインキュベーションの後、培養培地を回収し、グリース反応（Eigler et al., 1995）を用いてNO濃度について直ちに分析した。
【０１２４】
化合物1、3a及び3bは、10μMにてNOの合成は阻害しなかったが、化合物2及び4は、それを誘導した。化合物5は調べなかった。
【表１】
2008533177.tif 000015
【０１２５】
これらのデータは、化合物が抗炎症性であるさらに別のメカニズムを示している。
【０１２６】
マウスの耳の炎症における抗炎症性活性
アラキドン酸（AA）の局所塗布によって誘発されるマウスにおける耳の腫脹を阻害するその能力について化合物を調べた。エイコサノイドの直接前駆体であるAAによる炎症反応は、シクロオキシゲナーゼ（COX）経路及びリポキシゲナーゼ（LOX）経路の双方を介したAAの代謝産物の形成による（Young at al., 1984）。AAは、耳の肥厚に先行するPGE2及びLTC4の合成の双方を高める（Opas et al., 1985; Chang et al., 1986）。
【０１２７】
体重15〜21gのメスBALB/ｃマウス（ARC、WA、オーストラリア）に、AAの耳への塗布の30分前又は直前に25mg/kgの用量でポリエチレングリコール（PEG）400：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1:1で送達される化合物2を腹腔内（ip）注射した。イソフルランを用いてマウスを麻酔し、バネ式マイクロメータを用いて両耳のベースラインの厚さを測定した。各マウスは、各耳介（すなわち、耳当たり0.5g）の内側及び外側の表面に塗布された、エタノール（50mg/mL）中の合計20μLのAAを受け入れた。マウスを再び麻酔し、AA塗布の１時間後、耳を測定した。
【０１２８】
各耳についてAAの塗布前及び塗布後の耳の腫脹の差異を算出し、各マウスにおける2つの耳についての平均を算出した。対応のない両側ｔ検定（プリズム4、グラフパッドソフトウエア）を用いて、ビヒクルのみを与えた群と比べた各試験群の平均腫脹の差異を算出した。
【０１２９】
化合物はすべてAAが誘発した耳の炎症を軽減した。化合物2、3a及び3bによる処理は、ビヒクルのみによる処理に比べて耳の厚さに有意な減少を生じた。
【表２】
2008533177.tif 000016
【０１３０】
これらのデータは、試験化合物の生体内での抗炎症活性を実証している。
【０１３１】
UV照射で誘発した皮膚浮腫のマウスモデルにおける抗炎症活性
哺乳類の皮膚のUVへの急性の暴露は、紅斑及び浮腫によって明らかにされる炎症反応を引き起こす。この反応は、部分的には炎症誘発性のプロスタグランジン（PGD2、PGE2、PGF2α、及び多分PGI2）及びロイコトリエンが介在し、同様に、反応性の遊離ラジカル及び反応性の酸素種の生成が介在する（Sondergaard et al. 1985; Gonzalez and Pathak 1996; Widyarini et al. 2001)。
【０１３２】
4〜5匹のメスSkh:hr-1系アルビノマウスの群に1x3MEdD（浮腫発生の最低用量）の、太陽を模倣したUV線（SSUV）を照射した。太陽を模倣したUV線（SSUV）は、6つのUVA管（Hitachi 40W F40T 10/BL、黒い光）及び１つのUVB管（Philips TL 40W/12RS）の平面的なバンクによって提供され、輻射は、0.125mmのセルロースアセテートのシートを介したフィルターにかけられて（Eastman Chemical Products, Kingport, Tenn, USA）、2.96x10-4W/cm2のUVA及び1.59x10-5W/cm2のUVBを生じた。照射の間、ケージを光の下で回転させて、異なった位置での輻射強度の変動を低減した。
【０１３３】
試験化合物（20μMの溶液の0.2mL）又はビヒクル（プロピレングリコール／エタノール／水、1:2:1）のいずれかを照射後30分、2時間及び4時間に、照射された背部の皮膚に塗布した。UV暴露の前、UV暴露の24時間及び48時間後、バネ式マイクロメータによって背部皮膚折り曲げ測定を行った。各マウスについて、UVRの暴露前及び暴露後の皮膚の厚さの差異を算出し、対応のない両側ｔ検定を用いて試験化合物とビヒクル対照との間で調べれらた差異を解析した。
【０１３４】
皮膚の折り曲げ肥厚は、UV照射の24時間後で明らかであり、測定の最終時点である48時間でピークだった。試験化合物は、UV照射後3回しか塗布せず、投薬は、最初の皮膚折り曲げ測定の20時間前に終了したにもかかわらず、ほとんどの化合物は、以下の表及びグラフで強調されるように、UVが誘発した炎症を軽減することに活性があった。
【０１３５】
化合物すべての局所投与がUV誘発の炎症を軽減する傾向を示した。化合物3aは、両方の時点で皮膚の浮腫を有意に抑制した。化合物1及び2は、48時間で有意に抑制した。
【表３】
2008533177.tif 000017
【表４】
2008533177.tif 000018
【０１３６】
これらの結果は、化合物1、2及び3aの抗炎症活性を明らかに実証している。たとえ、局所的に、炎症の誘導後、短い時間間隔の間でそれらを投与したとしても、それらの効果は48時間後まで依然として明らかであった。
【０１３７】
ラットの空気嚢アッセイにおける抗炎症活性
抗炎症性の有効性を測定するのに使用される代替アッセイは、空気嚢モデルであり、ラットの背面に空気を繰り返し皮下注射し、24時間後に炎症性の刺激を嚢内に注射することが関与する（Gilroy et al., 1998）。
【０１３８】
およそ７週令のメスのダークアグーチ系ラットの背面に空気嚢を作った。各嚢の内側に並ぶ細胞膜の形成を促進するために、最初の空気の注射後、2日目及び5日目に再び膨らませることによって嚢を維持した。再膨張の際、2mLの無菌の空気で再膨張させる前に、針が正しく位置取りされていることを確実にするために嚢を先ず、しぼませた。このプロトコールを用いて、0.5mLの100μM試験化合物又はビヒクル対照のいずれかを注射した場合、7日目の使用まで嚢を膨らませたままにした。15分後、血清処理したチモサン（STZ-500μg）を空気嚢に注射した。4時間で空気嚢の洗浄（4x2mL、洗浄）を行い、白血球を計数し、その後、ラットを屠殺して空気嚢を摘出し、組織検査のためにホルマリンで処理した。計数する人にとって切片は盲検とした。100枡の目盛り付きレンズ及び40倍の対物レンズを用いて、10箇所の異なった、隣接しない領域での嚢の層にて多形体の数を数えた。一群は、5〜6匹のラットとした。各実験の範囲内で、対ではないｔ検定を用いて統計的有意性についてデータを解析した。
【０１３９】
一般に、炎症性浸潤（洗浄液における白血球の数及び組織切片における多形体の数）の程度の2つの別々の測定の間には一致があった。試験化合物の効果に関する2つの測定の間にも一致があったが、それは各データセットの妥当性を強化する。
【０１４０】
調べた化合物はほとんど抗炎症活性を示した。1mMの適用では、化合物1及び3aを除く化合物はすべて洗浄液における白血球の数を有意に抑制した。化合物2、3a及び4は、組織切片における多形体の数を抑制した。
【表５】
2008533177.tif 000019
【０１４１】
これらの結果は化合物2、3a、3b及び4の生体内での抗炎症活性を明瞭に示している。
【０１４２】
DSS誘発の大腸炎のマウスモデルにおける抗炎症活性
方法
6〜7週令のメスBALB/cマウスを実験開始前、最低1週間飼育した。大腸炎を誘発するには、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS、分子量40kD、TdB Consultancy AB, Uppsala, Sweden (Dieleman et al. 1994)）を、4.5〜5%の濃度で5日間、飲料水中にて新鮮に毎日投与し（Okayasu et al. 1990）その後、水のみを与えた。この投与レジメンは、下痢及び直腸出血によって証明される軽い大腸炎を誘発し、その重症度をスコア化し、同様に結腸の長さの減少も誘発した。組織学的には、結腸の炎症は、潰瘍形成及び好中球の粘膜への浸潤によって証拠付けられ、スコア化された。大腸炎の全身性の影響は、体重減少を起こすが、それもモニターした。
【０１４３】
結果
一連の実験において、化合物1、化合物2、化合物3a、化合物3b又は化合物4の経口投与は、結腸の炎症を軽減させた。重要なことに、これらの化合物が活性がある用量比は、相対的に低く、1.0〜1.25mg/kgであり、１日当たりの単一経口用量として与えられる。
【０１４４】
実験1
マウスが17日目に屠殺されるまで実験を通してずっと、ビヒクル（PEG 400:PBS 1:1）、用量比1mg/kgでの化合物1又は4のいずれかを投与した。双方の化合物は大腸炎を減らした。このアッセイでは、化合物1は、化合物2よりも良好な抗炎症活性を提供した（結腸の潰瘍形成における軽減、臨床徴候の発症の遅延、臨床スコアの低下、臨床徴候の発生及び重症度の軽減、体重減少の緩和、及び回復までの時間の軽減に基づいて）。
【０１４５】
組織検査の平均スコアを図5に示すが、化合物1及び4で処理したマウスでは大腸炎が少ないことを示唆している。ビヒクルのみを与えられたものに比べて、化合物1を与えられたマウスの結腸上皮では、潰瘍形成は統計的に有意に少なかった（p=0.0135）。
【０１４６】
DSSの摂取により誘発される結腸の炎症は、結腸の短縮を引き起こすので、試験剤により付与される保護は、この短縮の軽減によって証拠付けられる可能性がある。ビヒクルのみを与えられたマウスのものよりも化合物1（p=0.1922）及び4（p=0.0542）を与えられたマウスの結腸は長くなる傾向があった。図6を参照のこと。
【０１４７】
臨床徴候は、ビヒクルのみを与えた群で5日目に数匹のマウスに現れたが、化合物1及び4のいずれかを与えた群では6日目まで明らかではなかったということは、これらの化合物が大腸炎の発症を遅らせることを示唆している。11日目までに、平均の臨床スコアは、ビヒクルのみを与えたマウスよりも、化合物1及び4のいずれかを与えたマウスで有意に低かった（それぞれ、p=0.017及びp=0.043）。これらの結果は、化合物1及び4の双方が抗炎症性であることを示唆している。図7を参照のこと。
【０１４８】
最大の平均体重減少は、化合物4についてはたった1％及び化合物1については2％であったが、ビヒクルのみを与えた群では5％だった。特定の群における平均体重の減少から平均体重の増加への転換は、その群についての大腸炎の回復が生じていることを部分的には示唆している。このことは、化合物1を与えた群では10日目に、化合物4をについては12日目に生じたが、ビヒクルについては15日までに生じなかった。図8を参照のこと。
【０１４９】
実験2
DSSを飲料水に添加して大腸炎を誘発する前に1mg/kg用量での化合物1及び2又はビヒクルのいずれかを10日間投与し、その後、試験化合物を停止した。DSSを5日間投与し、8日後、マウスを屠殺した（23日目）。誘発前に投与し、誘発中は投与しなかったにもかかわらず、炎症は双方の化合物によって軽減された。図9を参照のこと。
【０１５０】
粘膜の潰瘍形成の量及び重症度は、ビヒクル処理群の方が顕著であったが、さほど有意ではなかった。
【０１５１】
傾向があった一方で、試験群とビヒクル群の結腸の長さの間には有意差はなかった。DSSを与えなかったマウスとビヒクル群の結腸の長さの間には有意差があった（p=0.0414）。しかしながら、化合物1処理群の結腸が対照群の結腸と長さについて有意差がなかったということは、化合物1がDSS摂取の炎症性効果に対してある程度しか保護しなかったことを示唆している。図10を参照のこと。
【０１５２】
ビヒクルで処理した群で18日目に1匹死亡したが、いずれの治療群でもマウスは死亡しなかった。ビヒクル処理群と比較した場合、統計的に有意ではないが、双方の治療群では大腸炎の臨床徴候における軽減の揺るぎない証拠があった。図11を参照のこと。
【０１５３】
化合物2の投与、及びさらに少ない程度に、化合物1の投与は、DSSが誘発する結腸の炎症に関連する体重減少を軽減した。22日目までに、化合物2の投与を受けたマウスは、ビヒクルの投与を受けたものよりも有意に体重を増やした（p=0.0291）。図12を参照のこと。
【０１５４】
実験3
化合物3のシス又はトランスの異性体（それぞれ化合物3a及び3b）を1.25mg/kgで、又はビヒクルを、17日目でマウスを屠殺するまで実験の始めから終わりまで投与した。臨床的指標、結腸の長さ及び組織学的な変化に基づいて、化合物3a及びさらに少ない程度に化合物3bのよる投薬は、結腸の炎症を軽減し、その回復を早めた。
【０１５５】
後部結腸の潰瘍形成は、化合物3aを与えた群では認められず、化合物3bを与えた群でたった1/8に認められた。しかしながら、ビヒクルのみを与えた群では潰瘍形成は3/8のマウスに認められた。化合物3aを与えたマウスの粘膜損傷の程度は、ビヒクル処理群で経験したものより有意に低かった（p=0.018）。図13を参照のこと。
【０１５６】
化合物3aを与えた群の結腸は、ビヒクルのみを与えた群の結腸よりも有意に長かった（p=0.039）。図14を参照のこと。
【０１５７】
化合物3aの投与を受けた群の平均スコアは、ビヒクル群よりも、8日目（p=0.0078）、９日目（p=0.0326）、10日目（p=0.0386）及び11日目（p=0.0252）を通して有意に低かった。しかしながら、ビヒクル処理群で大腸炎が回復し始めるにつれて、その差異は明らかでなくなり、統計的有意性を喪失した。しかしながら、実験の最終日までに、15日目（p=0.0033）及び16日目（p=0.0016）の双方で、平均の臨床スコアは、化合物3aの投与を受けた群で再び有意に低かった。このことは、化合物3aが抗炎症効果を発揮し、炎症の回復を早めることを示唆した。
【０１５８】
同様に、化合物3bの投与を受けた群の平均スコアは、ビヒクル群よりも、8日目（p=0.0055）、９日目（p=0.0057）、及び11日目（p=0.0252）を通して有意に低かった。平均スコアは、17日目（p=0.0177）に化合物3bの投与を受けた群で再び有意に低かった。このことは、化合物3ｂによる経口の投薬もまた抗炎症効果を発揮し、炎症の回復を早めることを示唆した。図15を参照のこと。
【０１５９】
傾向は明らかではあるが、化合物3の各異性体を与えた群とビヒクルを与えた群の間で体重変化に統計的有意差はなかった。最大の平均体重減少は、化合物3aを与えた群での2%未満であったが、ビヒクルのみを与えた群ではそれは、ほぼ5％であった。平均体重の減少から平均体重の増加への転換は、化合物3aについては相対的に早く、4日目で生じたが、ビヒクル群については全く確実ではなかった。図16を参照のこと。
【０１６０】
実験4
1mg/kgの化合物1又はビヒクルを1日1回マウス（n=5）の群に実験の始めから終わりまで投与し、6、9又は13日目のいずれかで屠殺した。結腸を取り出し、長手方向に切開し、ペニシリン／ストレプトマイシン（100U/mL、100μg/mL、インビトロゲン）を伴い、フンギゾン（2.5μg/mL、インビトロゲン）を加えたPBSで洗浄した。次いで、それらを細かく切り刻み、およそ100mgの結腸を、ConA（10μg/mL、シグマ）を含有する1mLのRPMIc（上記のようなペニシリン／ストレプトマイシン及びフンギゾン）の存在下又は非存在下にて24穴プレートの１つのウエルに18〜24時間入れた。上清を回収し、遠心し、-80℃にて保存した。培養上清中のPGE2及びTXB2を三連一組にてELISA（カイマンケミカル）によって測定した。
【０１６１】
分裂刺激の非存在下で結腸を培養することによって、現在産生されている炎症性メディエータの評価を行うことができる。DSSに暴露したマウスに由来する炎症を起こした結腸は、健常な、炎症を起こしていない結腸よりもさらに炎症性のメディエータを産生する傾向がある（Dieleman et al. 1998; Tomoyose et al. 1998; Morteau et al. 2000; Micallef et al. 2002)。この実験では、大腸炎なしの健常なマウスの結腸と比べて、DSSが摂取された場合、結腸は、9日目で有意に多いPGE2を（p<0.05）、6日目で有意に多いTXB2を（p<0.05）産生した。しかしながら、実験全体を通して、特に初期に、DSSを与えたマウスの結腸はさらに多いPGE2及びTXB2を産生する傾向があった。DSSを与え、化合物1で処理したマウスの結果をDSSを与え、ビヒクルのみで処理したマウスの結果と比べることによって炎症性反応を改善する化合物1の効果を評価した。化合物1で処理したマウスの結腸は、9日目と13日目でさらに少ないPGE2を、6日目と9日目でさらに少ないTXB2を産生する傾向があった（p<0.05）。図17を参照のこと。
【０１６２】
マイトジェンの存在下で結腸を培養すると、炎症性／分裂性の刺激に反応するそれらの能力が評価されつつあった。大腸炎なしの健常なマウスの結腸と比べて、DSSを摂取された場合、結腸は、ConAに反応して9日目（p<0.05）にて6日目にて有意に多いPGE2を産生した。再び、実験全体を通して、特に初期に、DSSを与えたマウスの結腸はさらに多いPGE2及びTXB2を産生する傾向があった。13日目までに、健常な結腸と炎症を起こした結腸との間で差異がなかったということは、DSSによる急性の炎症が回復し始めたことを示唆した。さほど有意ではないけれども、化合物1による処理にはこれらの反応を低減する傾向があった。図18を参照のこと。
【０１６３】
これらの結果は、大腸炎モデルにおける化合物1による経口投薬の抗炎症性効果がおそらく、炎症を起こした結腸によるエイコサノイド合成を減弱するその効果によることを明らかにしている。
【０１６４】
心臓保護活性
ラットの大動脈リングアッセイにおける血管拡張活性
ラットの大動脈リングアッセイを用いて、試験化合物の血管拡張能を生体外で調べた。試験槽へのノルアドレナリンの添加は、リングを収縮させ、試験剤によってその血管収縮が抑制されるのであれば、すなわち、それが、ノルアドレナリンの効果に拮抗するのであれば、それは、その剤が血管拡張性の血圧降下活性を有してもよいことを示唆する。
【０１６５】
方法
80％のCO2及び20％のO2によってオスのスプラーグ・ドーリー系ラット（250±50g）を安楽死させた。胸部大動脈を摘出し、記載されたような臓器−槽に素早く載せた ADDIN ENRfu （Chin-Dusting et al. 2001)。1μg/mLで送達された試験化合物の有無にてノルアドレナリン（0.1nM〜10mM）に対して完全な濃度−収縮曲線を得た。実験は、5匹の異なった動物からのn=5の異なったリングにて反復した。任意の１つの濃度にてたった１つの化合物を任意の１匹の動物からの任意の１つのリングにて調べた。S字状の用量反応曲線をデータにあてはめて、logEC50を算出した（プリズム4、グラフパッドソフトウエア）。対応のある両側t検定を用いて、試験化合物の存在下と非存在下の間のこれらの値の差異を計算した。β−エストラジオール及ビヒクル単独の効果をそれぞれ、陽性対照及び陰性対照として調べた。
【０１６６】
結果
このアッセイで化合物1、2、4、5及び化合物3の異性体混合物を調べた。ビヒクル単独に比べて、化合物1及び3は、ノルアドレナリンに対する大動脈リングの収縮反応（logEC50）を有意に抑制した。これらのデータは、これらの化合物が、抗炎症活性を持つことに加えて、同様に循環器活性を有してもよいことを示す。図19を参照のこと。
【０１６７】
消化管毒性の欠如
化合物1
11日間毎日投与した場合の化合物1の経口毒性を検討した。300mg/kgの非常に高い用量及び1000mg/kgの上限用量で4匹のスプラーグ・ドーリー系ラット（各性別2匹）に投与されたときのCMC0.1％中の化合物1。ビヒクルは第3の群に投与した。図20を参照のこと。
【０１６８】
CMC0.1％における化合物1は、4℃、25℃及び40℃のいずれでも7日間にわたって安定だった。7日目後、化合物1の新鮮バッチを供給した。投与直前、次いで8日目、及び再び12日目の屠殺時に体重を測定した。実験の始めから終わりまで、毒性の徴候について毎日、ラットすべてを観察した。身体、あらゆる穴、胸腔、腹腔、及びそれらの内容物の剖検及び外面の肉眼検査を行った。肝臓、腎臓、副腎、脾臓及び生殖腺の重量を測定した。終末の血液検査、血清の臨床検査並びに肝臓、脾臓及び骨髄の組織学的検査を行った。
【０１６９】
いかなる種類の毒性、特に消化管妨害、体重減少、凝固障害、消化管出血を示唆する貧血又は血液疾患の証拠はなかった。
【０１７０】
化合物2
5mg/kg（n=3）での化合物2又はビヒクル（PEG400:PBS=1:1、n=2）をメスBALB/cマウスに10日間、強制飼養を介して投与した。どちらの群にも有害な臨床徴候はなく、体重の変化は類似していた。剖検で肉眼的な病理変化の証拠はなかった。盲腸及び結腸の組織検査は正常だった。図21を参照のこと。
【０１７１】
化合物3
PEG400:PBS=1:1中の化合物3aと3bのジアステレオマー混合物を20mg/kgで10日間、強制飼養によって7週令のメスBALB/cマウス（n=8）に投与した。比較のためのビヒクル対照群はなかった。しかしながら、マウスはすべて体重を維持し、10日間にわたって群において出発体重の5％の平均増加があり、それはその週令のマウスの典型であった。図22を参照のこと。
【０１７２】
化合物4
5mg/kg（n=3）での化合物4又はビヒクル（n=2、PEG:PBS=1:1）をメスBALB/cマウスに10日間、強制飼養を介して投与した。どちらの群にも有害な臨床徴候はなく、体重の変化は類似していた。剖検で肉眼的な病理変化の証拠はなかった。盲腸及び結腸の組織検査は正常だった。
【０１７３】
これらの結果は、長期間にわたり、多くは非常に高い用量にてそれらを与えられた動物における正常な体重増加、臨床徴候の欠如及び組織病理学的変化の欠如によって証拠付けられるように、化合物が消化管毒性を生じないことを裏付けている。
【０１７４】
別の方法では本発明は、前記要素又は整数から成る又は本質的に成る組み合わせにも広がることが、用語、含まれることが本明細書で使用される程度まで理解されるべきである。
【０１７５】
本明細書における従来技術への言及は、その従来技術が努力の分野において共通する一般的知識の一部を形成するという認識又は示唆の任意の形態として解釈されず、又解釈されるべきではない。
【０１７６】
当業者は、本明細書で記載された本発明が、具体的に記載されたもの以外の変異及び改変に対して余地があることを十分に理解するであろう。本発明はそのような変異及び改変を包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書で個々に又はまとめて言う又は示される工程、特徴、組成物及び化合物のすべてを包含し、前記工程又は特徴の2以上の組み合わせのいずれか及びすべてを包含する。
【０１７７】
参考文献
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】LPSで刺激されたヒト単球によるPGE2の合成に対する10μMの試験化合物の効果を示す図である。
【図２】LPSで刺激されたヒト単球によるTXB2の合成に対する10μMの試験化合物の効果を示す図である。
【図３】U937細胞への外因性PGH2の添加に続くTXB2の合成に対する試験化合物の効果を示す図である。
【図４】TNFαで刺激したTHP-1単球／マクロファージにおけるNFκBプロモータ活性のパーセント阻害を示す図である。
【図５】1mg/kgで経口投与された化合物1及び4の結腸の炎症に対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図６】１mg/kgで経口投与された化合物1及び4の結腸の長さに対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図７】1mg/kgで経口投与された化合物1及び4の臨床スコアに対する効果を示す図である。
【図８】1mg/kgで経口投与された化合物1及び4の体重に対する効果を示す図である。
【図９】1mg/kgで事前に経口投与された化合物1及び2の結腸の炎症に対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図１０】１mg/kgで事前に経口投与された化合物1及び2の結腸の長さに対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図１１】1mg/kgで事前に経口投与された化合物1及び2の臨床スコアに対する効果を示す図である。
【図１２】1mg/kgで10日間経口で化合物1及び2を事前に経口投与することの、大腸炎誘発からの体重に対する効果を示す図である。
【図１３】1.25mg/kgで経口投与された化合物3a及び3bの結腸の炎症に対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図１４】1.25mg/kgで経口投与された化合物3a及び3bの結腸の長さに対する効果を示す図である（平均±標準誤差）。
【図１５】1.25mg/kgで経口投与された化合物3a及び3bの臨床スコアに対する効果を示す図である。
【図１６】1.25mg/kgで経口投与された化合物3a及び3bの体重に対する効果を示す図である。
【図１７】分裂促進刺激の非存在下で培養された結腸によるPGE2及びTXB2の産生を示す図である。
【図１８】ConAの存在下で培養された結腸によるPGE2及びTXB2の産生を示す図である。
【図１９】ノルアドレナリンの収縮反応の阻害比率を示す図である。
【図２０】高用量の化合物1を経口で11日間与えられたラットにおける体重変化を示す図である。
【図２１】5mg/kg/日での化合物2又はビヒクルの経口投与に続く体重変化を示す図である。
【図２２】20mg/kg/日での化合物3aと3bの混合物の経口投与に続く体重変化を示す図である（データは個々のマウスから確定し、群の平均は太字体で概略した）。
【図２３】5mg/kg/日での化合物4又はビヒクルの経口投与に続く体重変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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