(57)【要約】【課題】【解決手段】  レシピエントとドナーの遺伝子型の比較−及び対立遺伝子及びハプロタイプの基礎的な組み合わせに基づく遺伝子交差適合試験方法及びアルゴリズムを開示する。本発明の方法は、表現型予測に焦点を当てるのではなく、代わりに、レシピエント及び利用できるドナーにおいて同定された遺伝的変異の比較に依存しており、ドナーの情報は、分子適合性を最大にするために、好ましくは、広く利用できるドナー登録に従う。ある不適合が、その他の適合よりも好ましいような、ドナーとレシピエント間の遺伝子型の差の重み付けした臨床的意義に基づいて、遺伝子型を適合させることができる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー候補とレシピエントの、多形マーカセット中の多形マーカの組み合わせを比較することによって、レシピエントに対する適合性を決定することによって輸血ドナーを選択する方法であって：
ドナー候補とレシピエントの遺伝子物質からの、それぞれ増幅した標的核酸試料に、ハイブリダイゼーションアッセイ又は捕捉介在伸長アッセイ、又はその両者を行った後に前記決定を実施し、プローブ対の員が全体的に或いは部分的に相補である一対のプローブによって、前記セット中の多形マーカを表す（及び／又は、多形マーカに相補である）前記増幅した生成物の配列に適用できるときに、前記個々のハイブリダイゼーション又は伸長現象によってアッセイシグナルが発生し、前記セット中の各マーカが個別のアッセイシグナル強度によって表されるようにハイブリダイゼーション又は伸長現象からアッセイシグナル強度が発生する方法において：
前記ハイブリダイゼーション又は伸長アッセイによって発生した前記アッセイシグナル強度パターンを決定し、各プローブ対について、前記対の員に関連するシグナル強度の組み合わせを形成するステップと；
前記シグナル強度の組み合わせから、一連の値（同型接合体正常型、異型接合体又は同型接合体変異型の状態をそれぞれ示す、３つの生じうる値のうちの１つから選択した一連の各値）を生成し、これによって三元反応パターンを形成するステップと；
前記三元反応パターンによって表した前記多形マーカの組み合わせを決定するステップと；
前記ドナー候補から、前記レシピエントのマーカの組み合わせと一致する前記多形マーカの組み合わせを有するドナーを選択するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記マーカが、臨床的に有効な抗原の転写又は発現に作用することが知られていることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、１の強度、ｉＮが、試料中の正常型マーカの量と相互に関連し、もう１つの強度、ｉＶが、試料中の変異型マーカの量と相互に関連するようにシグナル強度の員の組み合わせが表されており、前記強度を組み合わせて識別パラメータΔ＝（ｉＮ−ｉＶ）／（ｉＮ＋ｉＶ）を形成し、この値が、−１と１との間を変異することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、より小さい値として第１閾値を下回る識別パラメータの値を指定し、より大きい値として第２閾値を上回る識別パラメータの値を指定し、中間の値として第２閾値は下回るが、第１閾値を上回る識別パラメータの値を指定することによって前記三元反応パターンを発生することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、１つ以上の多形マーカの組み合わせを前記三元反応パターンによって表されているため、曖昧さが生じ、少なくとも前記組み合わせ中の前記マーカを表す、及び／又は、前記マーカと相補的であるｇｔｅｈ部分配列を含む少なくとも一の増幅生成物に追加のアッセイステップを実施して、前記２つのマーカの相を決定し、これによって、前記曖昧さを解消することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記追加のアッセイステップが捕捉介在プローブ伸長であり、増幅した生成物の部分配列のアニーリングに続くオリゴヌクレオチドの伸長が、増幅した生成物のマーカの１つの存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、前記追加のアッセイステップがハイブリダイゼーションであり、増幅した生成物のマーカに対するオリゴヌクレオチドのアニーリングが、増幅した生成物の１つの部分配列の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記多形マーカが以下の血液型に含まれ、リストに挙げられている相当する表現型に関連する：
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ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法において、前記多形マーカが、前記血液型ＲｈＣＥ及びＲｈＤに含まれ、前記マーカが：
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に記載されている通りであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法において、前記アッセイがハイブリダイゼーションアッセイであり、前記シグナル強度パターンが、プローブ対に関連したシグナル強度比を形成するステップと、第１閾値を上回る比率についての前記マーカの同型接合体としての試料を指定するステップと、第２閾値を下回る比率についての変異型対立遺伝子のマーカの同型接合体としての試料を指定するステップと、前記第１閾値を下回り第２閾値を上回るマーカ比率について異型接合体として前記試料を指定するステップと、によって、三元反応パターンに変換されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記標的核酸配列が、アンプリコン又は転写物であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡそれぞれの試料上でポリメラーゼ鎖反応又は逆転写を実施することによって、前記標的核酸配列を発生することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の方法において、伸長生成物が、標識化したｄｄＮＴＰ又は標識ｄＮＴＰを組み込むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰが、前記伸長生成物に組み込まれたときに、検出できるアッセイシグナルを選択的に発生するように、標識されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、比較に用いられる前記アッセイシグナル強度が、正規化した強度比であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、前記プローブが、コード化した担体上にプローブを示すことによってコード化されて、前記関連するプローブの同定を可能にすることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法が、一本鎖増幅生成物を発生するステップを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記標的鎖の１つをリン酸化し、次いで酵素で消化することによって、前記一本鎖標的を発生することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、前記コード化した担体が、微粒子であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法において、前記コード化が色を伴うことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１３又は１４に記載の方法において、前記標識が蛍光であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法において、前記多形サイトが少数の血液型に関連していることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法において、ドナーの構成対立遺伝子の組み合わせが、電子的に照会することができるレジストリで照合することを特徴とする方法。
【請求項２４】
次の配列：
Ｅｘｏｎ１：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：Ｒｈ  ＣＥ  ５’ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１）
Ｅｘｏｎ２：ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ＲｈＤ：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）
Ｅｘｏｎ３：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ（ＳＥＱ  ＴＤ  ＮＯ．：３）
Ｅｘｏｎ５：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ｔ  （ＳＥＱ  ＴＤ  Ｎ０．：４）
Ｅｘｏｎ７：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：５）
を有する、遺伝子ＲｈＣＥ及びＲｈＤの変異体のエクソン１、２、３、５、又は７についてのプライマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１０月２２日に出願された米国暫定特許出願番号第６０／６２１，１９６号の優先権を主張する。
【０００２】
背景
抗体の同定及び抗原陰性の血液の供給は、患者の血流内に循環する抗体が、ドナーの赤血球に示される抗原に遭遇するときに引き起こされる、輸血拒絶反応の危険性を最小にすることによって安全な輸血の根拠を形成する。輸血医療の現在の実務は、ＡＢＯ及びＲＨＤ抗原について、全てのドナー血液の血清型分類及び標識を提供し、レシピエントの血液型に対する赤血球成分の一致を容易にする。同種異系免疫性の更なる減少は、重要な臨床的関心事であり、従って、追加の血液型抗原を一致させることが非常に望ましい。しかしながら、この実務は、適切な抗血清の欠如、及び、特に多様な同種異系抗体に遭遇する場合に、労働集約的血清型分類プロトコルの複雑さによって不可能となる。結果として、ほとんどのドナーセンタは、選択したドナーの同齢集団のみを選別し、抗原陰性のユニットの限定した一覧表を維持する。この実務は、治療の遅れを招き、従って、患者の治療に著しい追加の費用が生じ、また、危機的状況を悪化させてしまう。
【０００３】
最近記載されたように（Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍａｙ  ２００５参照）、ドナーの包括的なドナーＤＮＡ分類によって、ドナーセンタは、ドナー候補の登録、及び簡単な輸送に使用可能である完全に特徴付けられた血液製剤の大きく多様性のある一覧表を維持することができる。加えて、ＤＮＡレベルでの血液型遺伝子の分析は、表現型可変性を基礎とする対立遺伝子の多様性の詳細な実態や、利用可能な抗体が弱い反応をする抗原型の決定等の血清学的技術によって取り組むことができない臨床学的問題を解決するのに役立つアプローチや、最近の輸血患者の分析や、新生児の溶血性疾患の危険のある胎児の特定等を提供する。遺伝子型は、表現型を反映することができないが、ＤＮＡ分析は、所望ならば古典的な血球凝集によって確認することができる潜在的な抗原陰性を同定する。また、包括的なＤＮＡ分類を、レシピエントに拡張することができ、実際、ＢｅａｄＣｈｉｐＴＭプラットフォーム上で実施される実用的方法論、好ましくはｅＭＡＰＴＭを起動することによって、広く集団に渡って適用することができる（米国特許出願第１０／２７１，６０２号参照、参照することによって本明細書に組み込む）。
【０００４】
遺伝子交差適合
輸血のレシピエントとドナー候補との間に同定されている選択したマーカ−血液型抗原をコードする遺伝子にある多形サイトに相当し、特にマイナーな血液型抗原を含むマーカ−間の適合、又は近適合は、一般的にレシピエントの免疫感作の危険性、及び免疫感作したレシピエントの、輸血に続く同種異系抗体媒介免疫拒絶反応の危険性を最小にする。即ち、マーカの組を選択して、臨床的に著しい溶血性輸血反応と関連した関連対立遺伝子を調べる場合（アロ反応）、レシピエントとドナーのマーカの比較は、所定のレシピエントと遺伝的に適合性があるドナーの選択を可能にする。例えば、遺伝的に同一の一卵性双生児組の各々は、他方に対する理想的なドナーである。輸血の場合、レシピエントとドナー候補の遺伝的同一性−又は近同一性−の要求は、関連遺伝子の組に限定される。これは、−発現した場合−レシピエントが、（早期の曝露に基づいて）抗体（「同種異系抗体」）を既に作っているか、抗体を作ることができる血液由来の細胞上に表示されるある種のヒト赤血球抗原（ＨＥＡ）をコードする。従って、米国特許出願第１１／１６８２２４号で議論されているように、若干の臨床的に関連する「少数の」抗原（例えば、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ＭＮＳ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ等）と同様に、「多数の」抗原（Ａ、Ｂ、及びＲｈ）を含むヒト赤血球抗原（ＨＥＡ）と相互に関連するマーカが対象である。
【０００５】
このような遺伝子交差適合手順の利益は、第１に免疫拒絶反応の危険性だけでなく、免疫レシピエントの危険性も最小にする、又は低減することができ、登録し、完全に特徴付けられたドナー群から、輸血用の血液製剤の迅速な選択の必要性を排除する。このドナー群は、ここではドナー登録ともいう。一度完全に実施されると、遺伝的に実施した遺伝子交差適合は、血清学的試薬のコスト及び複雑で労働集約的プロトコルのコストの増加、又試験を繰り返す必要性によって生じる狭いボトルネックを排除する。
【０００６】
概要
レシピエントとドナーの遺伝子型の比較−及び、対立遺伝子とハプロタイプの基本的な組み合わせに基づく遺伝子交差適合のための方法及びアルゴリズムを開示する。好ましくは、２００２年１０月１５日出願された、出願番号１０／２７１，６０２号の“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｌｏｃｉ  ｂｙ  Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”と題する同時係属中の出願に記載されているように（参照することによって組み込まれている）、遺伝子型は、単一（「複合」）試験で決定され、迅速で大規模な分類を可能にする。本発明の方法は、従来の手順で推奨されているような表現型予測に焦点を当てるよりもむしろ、レシピエントと利用できるドナーにおいて同定された遺伝的変異の比較に依存しており、ドナーの情報は、広く利用できるドナー登録に集めて、分子適合性を最大にすることが好ましい。例えば、臨床的に関係がある輸血抗原の大規模で包括的な遺伝子分類を、手頃な値段で可能にする、本明細書で開示されているようなＢｅａｄＣｈｉｐＴＭフォーマットであって、好ましくは、新生児スクリーニングコンテキストで実施されるＢｅａｄＣｈｉｐＴＭフォーマットを用いることで、輸血抗原遺伝子型（「ＴＡＧ」）−及び、関連する遺伝子情報−が、インプラント可能なチップ、又は、例えばブレスレットに担持されたその他の電子タグ等の容易にアクセスできるフォーマットに保存することができる個人の医療記録の一部になることが可能になるであろう。
【０００７】
詳細な説明
本目的のために、我々は、選択した多形サイトで、一連のマーカとして遺伝子型を規定する（また、ここでは対立遺伝子ともいう）；即ち、値は、対象の１つ又はそれ以上の遺伝子内に位置する標的核酸マーカの構造を与える。好ましくは、各指定した部位は、１対の伸長プローブで尋問されるこのプローブは、３’−末端で対立遺伝子に適合する適合プローブについては、ポリメラーゼ触媒プローブ伸長が発生するが、不適合プローブを発生しない条件下で、１つは通常型（Ｎ）対立遺伝子を見つけるように、もう１つは特異的変異型（Ｖ）遺伝子を見つけるように設計されている。このｅＭＡＰＴＭフォーマット（上記の出願番号１０／２７１，６０２号参照）によって、個別のプローブ伸長反応の収率を表すアッセイシグナル強度のパターンは、各マーカに対して指定される１対のプローブ内のプローブに関連したアッセイシグナル強度の率（又はその他の組み合わせ）に対する−前もってセットした閾値を用いることによって−、個別の反応パターンに変換される。
【０００８】
次いで、遺伝子型は、文字列Ｇ＝｛（ＮＶ）ｉｋ｝によって表される。ここで、ｉは対象となる選択した遺伝子セットの遺伝子を示し、ｋはｉ番目の遺伝子内の指定した多形サイトを示し、対（ＮＶ）は、ＡＡ、ＡＢ（又はＢＡ）、及びＢＢの値を取ることができる。好ましい実施例では、同じマーカを対象とするプローブ対に関連する、好ましくは非特異的（「バックグラウンド」）寄与によって補正したシグナル強度、及び試料中の正常型対立遺伝子の量を表すこのような強度の一つであるｉＮと、試料中の変異型対立遺伝子の量を表すもう１つのこのような強度を組み合わせて、識別パラメータΔ＝（ｉＮ−ｉＶ）／（ｉＮ＋ｉＶ）を形成する。このパラメータの数量は、−１から１の間で変化する。与えられた試料について、予め設定した低い閾値より小さいΔの値は同型のノーマルの導入を示し、予め設定した高い閾値より大きいΔの値は同型の変異の導入を示し、低い閾値よりも大きく、高い閾値よりも小さいΔの値は異型の導入を示す。輸血抗原遺伝子型は、文字列Ｇ＝｛Δｉｋ｝、によって表され、上記のように、ｉは対象の選択した遺伝子の組の遺伝子を示し、ｋは、ｉ番目の遺伝子内で指定した多形マーカを示す。従って、輸血抗原遺伝子型は、ここでは表示ＡＡ、ＡＢ（又はＢＡ）、及びＢＢか、同等の、表示１、０、−１のどちらかで示されている。
【０００９】
対立遺伝子の割当：ハプロタイプへの遺伝子型の分解
発現抗原決定遺伝子は、コードする遺伝子の特異的対立遺伝子の組み合わせを反映する。一般的に、遺伝子型は、２つの構成ハプロタイプ文字列の組み合わせ、ここでは、Ｈ１及びＨ２を表し、各々が、Ｈ１ＯＲＨ２が遺伝子型を発生するような３つの文字列の形で表される。全ての適合可能な２文字列の組み合わせは、２００４年８月２日に出願された、出願番号１０／９０９，６３８号の：“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ：Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”と題した同時継続中の出願（参照によって組み込まれている）で詳しく述べられている、自動化対立遺伝子分析用のＡＡＡプログラム等を用いて、ここで対立遺伝子割当、又は自動対立遺伝子分析（ＡＡＡ）と呼ばれている、好ましくは自動的に実行される手順において決定される。
【００１０】
また、本出願は、エラー修正の方法を開示し、ここで、アッセイから発生した（プローブ−標的の）反応パターンを、数字毎に可能な反応パターンと比較する。即ち、文字列は、公知の対立遺伝子の２つの対立遺伝子の組み合わせを表し；また、このような参照文字列のリストは、ここではヒットテーブルと呼ばれる。適合しない数については、エラー修正は、（既知の対立遺伝子の組み合わせから発生した）有効な参照文字列との一致を作るために必要な判断としての文字列の個々の数を変更することによる。
【００１１】
対立遺伝子又はハプロタイプのいくつかの組み合わせは、以下の例で示すように、一般的に単一遺伝子型と適合することができる。この問題は、上記の出願番号１０／２７１，６０２号に開示されている「フェージング」方法論を適用することによって、ここで取り組まれている。
【００１２】
ドナー登録
一般性を失わずに、複合遺伝子型決定の好ましい実施例の適用を仮定すると、見込まれているドナーの遺伝子型は、ｅＭＡＰフォーマットによって決定される。好ましい実施例では、この遺伝子型、及び構成対立遺伝子又はハプロタイプの組み合わせセットを、ＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ又はＳＱＬのような適切なデータベースフォーマットに、記録のリストの形で以下のように保存する：
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ここで、Γは、これらのコード化血液型抗原のような選択した遺伝子の数を表し、Ｍ（ｉ）は、ｉ番目の遺伝子のマーカの数を表し、ｐは、例えば、与えられた遺伝子型のドナーのリストを含む一覧表のようなデータベース中の記憶域に関連するアドレス（「ポインタ」）を表す。この一覧表で、適合するドナーを、試料収集の日付、特徴化の完成（例、ＨＬＡ又はＨＰＡ等の更なる抗原型の同定）、年齢、性別等の追加の基準によって区別する。
【００１３】
指定した多形サイトの選択及び関連する重量の表
患者とドナーの対立遺伝子又はハロタイプ間の不適合は、免疫感作、又は、重症度の異なる逆の免疫反応を引き起こすことがある。これは、ドナーマーカ対立遺伝子（又は抗原性決定因子）によってコード化した発現エピトープを同定する、患者の血清内を循環する抗体によって媒介される。この有意性の度合を表すために、本発明は、対象となるｉ番目の遺伝子上に、ｋ番目の指定マーカに関連する数的重量セット、ｗｉｋを導入する。比較的大きいこれらの重量は、相当するサイトでの不適合と関連する既知の、又は予測される輸血反応、及び相当する表現型の不適合に関連する異なる反応の重症度を反映する。表１及び２に示すように、重量を選択して、ＮＯＮＥ（０）、ＭＩＬＤ（１）、ＭＩＬＤ−ＴＯ−ＳＥＶＥＲＥ（３）、ＳＥＶＥＲＥ（５）等の臨床的重要度の経験による測定を反映させることができる。一般的に、ドナーのヌル表現型を作る突然変異を抑制することは、相当する抗原の不存在下で与えられる適合性を強化する。同種異系抗体を同定する場合、相当する同種抗原と関連するマーカは、高い重量を与えられる。これは、表４に示す抗体の臨床的重要性を反映している。
【００１４】
遺伝子型同一レシピエント及びドナーの対立遺伝子の適合：Ｄｏｍｂｒｏｃｋ
この例は、Ｄｏａ／Ｄｏｂ、即ち：遺伝子型同一レシピエント及び予想されるドナーの適合性を示すＭ１（３７８Ｃ＞Ｔ）；Ｍ２（６２４Ｔ＞Ｃ）；Ｍ３（７９３Ａ＞Ｇ）に関連するＤｏｍｂｒｏｃｋ系の３つのマーカを用いる。
【００１５】
プローブ対と標的のセットの相互作用を表す反応パターン（対のうちの１つのプローブは、「正常型」対立遺伝子の存在を示し、この対のもう１つのプローブは、「変異型」対立遺伝子の存在を示す）は、例えば、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ遺伝子に対してアニーリング可能なプローブ対セットを有するｅＭＡＰアッセイフォーマット（又は、ＰＣＲ増幅によるＤｏｍｂｒｏｃｋ遺伝子、他から誘導したアンプリコン又は標的）を用いて発生させることができる。３つの選択したマーカについて、生じうる反応パターンは：反応パターン：０，０，０であるＡＢ  ＡＢ  ＡＢである。２倍体ゲノムでは、特定の反応パターンは、少なくとも２つの対立遺伝子の組み合わせに相当する。従って、この反応パターンは、まず対立遺伝子の組み合わせによって表されるパターンに分解され、この場合は、次のどちらかである（表４参照）：
ＡＢ  ＡＢ  ＡＢ＝ＡＡＡ又はＢＢＢ；即ち、ＤｏＡ  ＯＲ  ＤｏＢ
代替的に：
ＡＢ  ＢＡ  ＡＢ＝ＡＢ  ＢＡ  ＢＡ＝ＡＢＢ  ＯＲ  ＢＡＡ；即ち、Ｈｙ又はＪｏ
ここで、「Ａ」は、正常型対立遺伝子を指定し、「Ｂ」は、その変異型を指定する。次に、重量の適用、即ち、不適合からもたらされる逆臨床転帰の重症度によって示す「不適合マトリックス」が構成される。本ケースでは：
【００１６】
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【００１７】
上記表において、重み付けを対立遺伝子の不適合（対象の遺伝子の、ここではＤｏｍｂｒｏｃｋ）に適用する。これらの重みは、好ましくは別々の参照テーブルで、ｗ１＝１、ｗ２＝５、ｗ３＝５（又は、臨床的な重要性に関する経験的知識によって提供される、その他の予め指定した値）である。
【００１８】
「フェージング」による対立遺伝子の曖昧性の解消
多重二対立遺伝子の組み合わせは、選択したマーカセットを超えて決定した特定の遺伝子型と適合できる。同じ遺伝子型の適合ドナーに対する既知の遺伝子型、ＧＲとレシピエントの適合には、実際に基礎となる対立遺伝子（又はハプロタイプ）セットの適合が必要である。２点相互関係を確立する以下のフェージング戦略によって、これらを確立することができる（米国公開公報第２００４０００２０７３Ａ１も参照。参照することによって組み込まれている）。この戦略は、（アニーリング又は脱アニーリングの多重ラウンドで）一度に、或いは、好ましくは多色の検出を含む平行プロセスのどちらかで、タグを付したハイブリダイゼーションプローブを用いたビード表示伸長生成物のプロービングを必要とし、好ましくは、このような場合は、伸長生成物自体は標識されない。
【００１９】
これは、図１Ａ及び１Ｂに示されており、ここで、（（ＤｏＡに相当する）第１対立遺伝子では、それぞれＣ、Ｔ、又はＡであり、又は（Ｈｙに相当する）第２対立遺伝子では、それぞれＣ、Ｃ、Ｇである多形サイト、或いは別のヌクレオチドを有する）マーカＭ１、Ｍ２、Ｍ３を、タグを付したプローブを用いて尋問する。異なる標識を付した拡張可能なプローブを第１対立遺伝子の検出に用いる。ここで、（マーカＭ１を対象とする）プローブ「１Ｎ」は３’末端に“Ｇ”ヌクレオチドを有し、（同じくマーカＭ１を対象とする）プローブ“１Ｖ”は３’末端に“Ａ”ヌクレオチドを有し、（マーカＭ２を対象とする）プローブ“２Ｎ”は３’末端に“Ａ”ヌクレオチドを有し、（同じくマーカＭ２を対象とする）プローブ“２Ｖ”は３’末端に“Ｇ”ヌクレオチドを有する。マーカＭ１、Ｍ２、及びＭ３の組み合わせによっては、プローブの様々な組み合わせが伸長され、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、相互作用生成物が、タグを付したプローブと相互作用する時に様々なシグナル強度パターンが発生する。従って、ＤｏＡと遭遇すると（図１Ａ）、プローブ１Ｎが伸長され、マーカＭ２の位置で伸長生成物にアニーリングする蛍光プローブによって修飾される；逆に、Ｈｙと遭遇した場合（図１Ｂ）、プローブ２Ｖが伸長され、マーカＭ３の位置で伸長生成物にアニーリングする蛍光プローブによって修飾される。蛍光発光したプローブの添加（図に示すように、マーカＭ２及び／又はＭ３を対象とする）によって生成されたシグナル強度パターンは、反応パターン０，０，０によって表される組み合わせとして、ＤｏＡとＤｏＡ  ＯＲ  ＤｏＢのいずれかを同定する、又は、反応パターン０，０，０によって表される組み合わせとしてＨｙとＨｙ  ＯＲ  Ｊｏを同定する。即ち、フェージングが、曖昧性を解消する。
【００２０】
遺伝子公差適合試験：ハプロタイプ間の距離
好ましくは、入手できるドナー遺伝子型（レシピエントに対して遺伝子型が同一の１人又はそれ以上のドナーの）の少なくとも部分列を表す表現で、レシピエント遺伝子型を与えられると、この遺伝子型はハプロタイプ（文字列）適合によって同定される。ここで、好ましくは、レシピエントのハプロタイプは、少なくとも、入手できるドナーの相当するハプロタイプに表されるマーカ対立遺伝子セットを具える。一の実施例では、各文字列Ｈ２、ＨＲは、ドナーデータベース中の文字列セット｛Ｈ｝と比較され、重み付けが増加したハミング距離程度に適合性をランク付けする。ここで、不一致マトリックスの議論に関連して議論されるように、重みは、臨床的重症度を反映するように設定されている。例えば、Ｍ不一致対立遺伝子があると仮定すると、生じうる距離関数は：Π２＝（１／Ｍ）３ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ａｌｌｅｌｅｓｗ２である。
【００２１】
実装
好ましくは、文字列一致アルゴリズムを実行するコンピュータプログラムを用いて、遺伝子交差適合試験を自動的に実行し、患者とドナーの文字列間の最大距離まで、Π２（又は等しい距離関数）を増やす程度に入手できるドナーを一覧にする。
【００２２】
以下の擬似コードは、文字列一致アルゴリズム（用語「対立遺伝子」と「ハプロタイプ」は、ほとんど同じ意味で用いられる）を要約したものである。対象となる大きなデータベースを扱う実行速度を最適化するために、ｗＡＡＡＴＭ（上記の米国特許出願番号第１０／９０９，６３８号）内での実行、といった実行は、好適なデータ構造を用いて、整数演算を呼び出す。
【００２３】
2008517603.tif 000005
2008517603.tif 000006
2008517603.tif 000007
【００２４】
表１．血液型及び関連するＳＮＰを示すＨＥＡパネル組成物
2008517603.tif 000008
【００２５】
表２．ＡＡ交換と関連するＳＮＰｓを示すＲｈパネル組成物
2008517603.tif 000009
＊「ｐｓｅｕｄｏＤ」として知られる。
【００２６】
添付した配列表で、様々なエクソン１、２、３、５、又は７について、フォワード及び／又はリバースプライマ（表に示すように）のプライマ配列は、配列表上に「チェック」マーク付で表示されており、もう１つのプライマセット（フォワード又はリバース、適用可能）の配列を以下の表３に示す。
【００２７】
表３
Ｅｘｏｎ１：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：Ｒｈ  ＣＥ  ５’ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１）
Ｅｘｏｎ２：ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ＲｈＤ：ＴＣＴ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）
Ｅｘｏｎ３：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ（ＳＥＱ  ＴＤ  ＮＯ．：３）
Ｅｘｏｎ５：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＣ  Ｔ  （ＳＥＱ  ＴＤ  Ｎ０．：４）
Ｅｘｏｎ７：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｈ  ＣＥ：ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：５）
【００２８】
多数のその他のマーカ及び対立遺伝子も、ＨｐＡを含む本明細書で記載されている方法を用いて分析することができる。
【００２９】
Ｄｏｍｂｒｏｃｋ：２つの新しい対立遺伝子
Ｄｏ−７９３、Ｄｏ−６２４、Ｄｏ−３７８、Ｄｏ−３５０、及びＤｏ−３２３の位置で、５つの一般的な突然変異をプローブすることによって、例えばＲＦＬＰ分析を用いて、４つの対立遺伝子が同定される（表４）：
【００３０】
表４
2008517603.tif 000010
【００３１】
ＢｅａｄＣｈｉｐ  ｅＭＡＰ設計
多形の伸長媒介多重分析（ｅＭＡＰ）の形式により、コードした伸長プローブ対を、５つの指定した位置で標的を尋問するように構成した。各対で、期待された正常型（「野生型」）と一致する１つのプローブと、第１プローブとは異なり、３’末端で、又は３’末端の近傍で、予想された突然変異と一致する第２プローブとを選択する。プライマを用いて、部分配列の伸長分析用の標的配列として機能するアンプリコンを発生し、このアンプリコンが、指定された多形サイトで、又は指定された多形サイトに近接した部分配列に相当する、又は部分配列を補完する、又は、このような部分配列に全体的に相当する、又はこのような部分配列を全体的に補完する部分配列を含む。代替として、相補的プローブ及び適切な伸長条件を用いて、ターゲティング、ハイブリダイゼーション及び伸長を可能にする、試料の遺伝的ＤＮＡの十分な濃度を増幅なしで発生することが可能である。対象となる５つの突然変異全てについて、単一ＢｅａｄＣｈｉｐプローブ対に組み込んだｅＭＡＰ配置を用いて、〜４３０の対照及び臨床試料のコホートから選択した６３の試料のサブセットを分析した。結果を以下の表５に示す。
【００３２】
表５
2008517603.tif 000011
【００３３】
表５において太字フォントで強調されている４つの新しい対立遺伝子の組み合わせ（ＤｏＢ／Ｓｈ；Ｈｙ／Ｓｈ；ＤｏＢ／Ｈａ；ＤｏＡ／Ｈａ）は、明らかである。−ここで、１、０、及び−１は、それぞれ対立遺伝子の組み合わせＡＡ、ＡＢ又はＢＡ、及びＢＢを示す。
【００３４】
表６
2008517603.tif 000012
【００３５】
相当するアンプリコンの配列によって確認されたこれらの４つの組み合わせは既に示されており、２つの新しい対立遺伝子と既知の対立遺伝子の組み合わせを表す。即ち（表６）である。即ち、位置Ｄｏ−３７８においてＡをＢに、ＢをＡにそれぞれ置き換えることによって、Ｈａは、ＤｏＡとは異なり、ＳｈはＤｏＢとは異なる。結果として、ＨａとＳｈの組み合わせは、ＤｏＡ／ＤｏＢの組み合わせを発生するのと同じ文字列（「単語」）、即ち０００１１を発生し；同様に、Ｈｙ／Ｈａも同じ文字列を発生する。この縮重は、比較的高い頻度での文字列の発生によるものと考えられ、分析の第１パスの０００の観察が、ＤｏＡ／ＤｏＢの発生を見誤らない旨を示唆している。しかしながら、２つの５文字の文字列は、縮重したままであり、この曖昧さは、追加のマーカの分析をしなければ解消しない。
【００３６】
ここで同定された２つの新しい対立遺伝子を含む６つのＤｏｍｂｒｏｃｋ対立遺伝子は、次の２１つの組み合わせを生じる。
【００３７】
表７
2008517603.tif 000013
【００３８】
表７に示すように、第１の３つのＤｏｍｂｒｏｃｋ多形、即ち、ＤＯ−７９３、−６２４、及び−３７８によって提供される解決において、３文字の対立遺伝子の組み合わせのいくつかが縮重する。対立遺伝子の組み合わせの縮重の完全な解決には、現在の５を上回る多形の決定が必要である。
【００３９】
突然変異抑制：Ｄｕｆｆｙ及びＧＡＴＡ
抗原の発現は、例えばＤｕｆｆｙ（Ｆｙ）をコードする遺伝子のＧＡＴＡボックスで、突然変異を抑制することによって影響を受ける。従って、特に、異型接合のＧＡマーカの場合、マーカＦｙ  １２５  Ｔ＞Ｃ及びＧＡ−３３  Ｔ＞Ｃの対立遺伝子の組み合わせを確立することは、以下に述べるようにフェージングを必要とする。
【００４０】
自動対立遺伝子割当：ヒットテーブル
好ましくは、ｅＭＡＰによって生成した特定の実験パターンに一致、又は部分的に一致する対立遺伝子の組み合わせを選択するプロセスは、上記の５つのＤｏｍｂｒｏｃｋ多形について、ヒットテーブル（以下の表８等）を用いる。既知の対立遺伝子のリストと共にヒットテーブルを用いて、パターン一致のアルゴリズムを適用して、自動化した態様で、米国特許出願第１０／９０９，６３８号に記載されている自動対立遺伝子指定（ＡＡＡ）プログラムによって提供されるような一体化ソフトウエア環境で再検討し、編集することができる対立遺伝子の組み合わせの一致、又は部分的な一致を選択することができる。この特許は参照によって組み込まれている。表８では、「８」は、例えば、プローブ伸長を示す正のアッセイシグナルを示し、「１」は、例えば、プローブ伸長の欠如を示す負のアッセイシグナルを示す。
【００４１】
表８
2008517603.tif 000014
【００４２】
フェージングによるハプロタイプ決定
ハプロタイプ（同じホモログ上の対立遺伝子の組み合わせ）を区別する１つの方法は、米国特許出願第１０／２７１，６０２号；国際出願番号第ＷＯ０３０３４０２９号（参照により組み込まれている）に記載されているような、フェージングを用いることである。フェージングは、第１多形標的サイトを検出することができるプローブから伸長生成物を発生するステップと、次いで、別の指定した多形サイトの対応部分が伸長生成物内に存在するかどうかを決定するステップと、を含む。対応する部分が存在するのであれば、これは、第１の多形サイトと、もう１つの指定した多形サイトの双方を含む２つのマーカが、同じ対立遺伝子に属することを示している。
【００４３】
より具体的には、伸長プローブを示すコード化されたビードを用いてフェージングを実施し、これによって、プローブと伸長生成物の双方を同定し、次いで、伸長生成物を標識したオリゴヌクレオチドプローブにアニーリングして、追加の多形サイトの対応部分が伸長生成物内に存在するかどうかを決定する。連続して指定されている一連の多形サイトに対して導入されるプローブから発生した伸長生成物を尋問することによって、反応パターンを発生する対立遺伝子の組み合わせの相を決定することができる。
【００４４】
本明細書の用語、表現、及び例は、例示のみであって限定せず、本発明を次の特許請求の範囲でのみ規定し、これらの特許請求の範囲の対象の全ての均等物を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａは、フェージングによって曖昧性を解消するための多重コードされたプローブの使用を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、フェージングによって曖昧性を解消するための多重コードされたプローブの使用を示す。
【図１Ａ】
2008517603.tif 000017
【図１Ｂ】
2008517603.tif 000018
【配列表】
2008517603000001.xml
【国際調査報告】
2008517603.tif 000021
2008517603.tif 000022