(57)【要約】【課題】最近、マイクロアレー遺伝子発現プロファイリングが用いられ、肺腺癌患者の予後サインを定義できるようになったが、扁平上皮癌集団における予後の遺伝子発現プロファイルを調査した大規模な研究は行われていない。【解決手段】肺癌予後判定を提供する方法が、一群の遺伝子を分析することによって実施される。本願には、マイクロアレーなどの様々な媒体における遺伝子発現プロファイルが、マイクロアレーを含有するキットとして含まれる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌状態を評価する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌状態を示す、
方法。
【請求項２】
肺癌患者の病期を分類する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌の病期を示す、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
前記病期が、TNM方式による分類に対応する、
方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法において、
前記病期が、同様の遺伝子発現プロファイルを有する患者に対応する、
方法。
【請求項５】
肺癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、医師が再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを決定できるように、再発リスクを十分に示す、
方法。
【請求項６】
肺癌患者を治療する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階であって、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、高再発リスクを示す、段階と、
ｃ．高リスク患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療する段階と、
を含む、方法。
【請求項７】
肺癌患者が、高死亡リスク状態にあるか、または低死亡リスク状態にあるかを決定する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表４から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、医師が再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを決定できるように、死亡リスクを十分に示す、
方法。
【請求項８】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプルが、塊状組織標本およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションから成る群から選択される方法によって調製される、
方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
前記塊状組織標本が、生検または手術検体から得られる、
方法。
【請求項１０】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプル中の構成的に発現された少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定する段階、
をさらに含む、方法。
【請求項１１】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプルが、原発腫瘍から得られる、
方法。
【請求項１２】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
特異性が、少なくとも40％である、
方法。
【請求項１３】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
感受性が、少なくとも80％である、
方法。
【請求項１４】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に比較して、前記サンプル中で、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
方法。
【請求項１５】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に比較して、転移細胞を有するサンプル中で、少なくとも統計的に有意なp値の過剰発現を有する、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、
前記p値が、0.05未満である、
方法。
【請求項１７】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレーまたは遺伝子チップ上で測定される、
方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
前記マイクロアレーが、cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーである、
方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、
前記マイクロアレーまたは遺伝子チップが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
【請求項２０】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で実施される核酸増幅によって決定される、
方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）である、
方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、
前記RT-PCRが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
【請求項２３】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコード化されるタンパク質の測定または検出によって検出される、
方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、
前記タンパク質が、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出される、
方法。
【請求項２５】
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特性の測定によって検出される、
方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法において、
測定される前記特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異から成る群から選択される、
方法。
【請求項２７】
肺癌予後患者レポートを作成する方法において、
請求項１、２、５、６、または７のいずれかの結果を決定する段階と、
前記結果を表示するレポートを準備する段階と、
を含む、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、
前記レポートが、患者転帰、および／または、前記患者集団に関するリスク確率、の評価を含む、
方法。
【請求項２９】
患者レポートにおいて、
請求項２７に記載の方法によって作成される、患者レポート。
【請求項３０】
組成物において、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される、少なくとも1個のプローブセット、
を含む、組成物。
【請求項３１】
生体サンプルで肺癌予後を決定するためのアッセイを実施するキットにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、を検出するための材料、
を含む、キット。
【請求項３２】
請求項３１に記載のキットにおいて、
マイクロアレー分析を実施するための試薬、
をさらに含む、キット。
【請求項３３】
請求項３１に記載のキットにおいて、
さらに、前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部がアッセイされる媒体を含む、
キット。
【請求項３４】
肺癌状態を評価するための物品において、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、を検出するための材料、
を含む、物品。
【請求項３５】
請求項３４に記載の物品において、
マイクロアレー分析を実施するための試薬、
をさらに含む、物品。
【請求項３６】
請求項３５に記載の物品において、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部がアッセイされる媒体、
をさらに含む、物品。
【請求項３７】
マイクロアレーまたは遺伝子チップにおいて、
請求項１、２、５、６、または７に記載の方法を実施するための、マイクロアレーまたは遺伝子チップ。
【請求項３８】
請求項３７に記載のマイクロアレーにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、
を含む、マイクロアレー。
【請求項３９】
請求項３８に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定または特徴付けが、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
マイクロアレー。
【請求項４０】
請求項３８に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現を提供する、
マイクロアレー。
【請求項４１】
請求項４０に記載のマイクロアレーにおいて、
前記p値が、0.05未満である、
マイクロアレー。
【請求項４２】
請求項４０に記載のマイクロアレーにおいて、
cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレー、
を含む、マイクロアレー。
【請求項４３】
請求項４０に記載のマイクロアレーにおいて、
1種類以上の内部対照試薬、
をさらに含む、マイクロアレー。
【請求項４４】
診断／予後判定ポートフォリオにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、
を含む、ポートフォリオ。
【請求項４５】
請求項４４に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または特徴付けが、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
ポートフォリオ。
【請求項４６】
請求項４５に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現を提供する、
ポートフォリオ。
【請求項４７】
請求項４５に記載のポートフォリオにおいて、
前記p値が、0.05未満である、
ポートフォリオ。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の技術分野〕
本発明は、生体サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づく肺癌予後判定手段に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
肺癌は、先進国における癌死の主要原因で、毎年、世界中で約100万人を殺傷する。米国では、2003年には、推定171,900例の新規症例が、予想されており、これは、全癌診断の約13％に達する。非小細胞肺癌（NSCLC）は、気管支癌の大半（〜75％）であるが、残りは、小細胞肺癌（SCLC）である。NSCLCは、3つの主要サブタイプから成る。腺癌40％、扁平上皮癌40％、および大細胞癌20％である。腺癌は、ここ25年に亘って最も多く見られる組織型サブタイプとして扁平上皮癌に取って代わっており、1990年代前半をピークとした。これは、煙草の煙をより深く吸入する「低タール」煙草の使用と関連すると思われる。ウィンゴ（Wingo）ら（1999）。NSCLC患者の総10年生存率は、最悪の8〜10％である。
【０００３】
NSCLC患者のおよそ25〜30％は、第I病期であり、これらのうちの35〜50％は、術後5年以内に再発する。腺癌は、病期に応じて、扁平上皮癌よりも高い再発率を示し、SCCおよび腺癌患者の5年生存率は、それぞれ、およそ65％および55％である。マウンテン（Mountain）ら（1987）。現在、高い再発リスクを有する患者の識別は不可能でない。第I病期のグループの中の高リスク患者の識別が可能であることにより、さらなる治療行為の検討が可能となり、生存率の改善の可能性をもたらす。事実、最近の臨床試験は、肺腫瘍切除後のアジュバント療法（adjuvant therapy）が生存率の改善を招き得ることを立証している。加藤（Kato）ら（2004）。具体的には、加藤らは、テガフールウラシル（uracil-tegafur）によるアジュバント化学療法が、病期I期腺癌、特にT2腫瘍、を完全切除された患者の生存率を改善すること実証した。
【０００４】
最近、マイクロアレー（microarray）遺伝子発現プロファイリングが用いられ、肺腺癌患者の予後サイン（signature）を定義できるようになった（ビア（Beer）ら（2002））が、扁平上皮癌集団における予後の遺伝子発現プロファイルを調査した大規模な研究は行われていない。今回、我々は、SCCサンプル134個と正常対応肺サンプル10個をアフィメトリクス（Affymetrix） U133Aチップでプロファイルした。階層的クラスタリングおよびコックス（Cox）モデリングが、患者予後と相関する遺伝子を識別した。これらのサインは、初回手術後のアジュバント療法が有益である患者を識別するのに使用することができる。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明は、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子（Marker genes）と関連するバイオマーカー（Biomarkers）を測定することによって、肺癌状態を評価する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベル（cut-off levels）を上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌状態を示す。
【０００６】
本発明は、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者の病期を分類する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌状態を示す。
【０００７】
本発明は、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを医師が決定できるだけの、十分な再発リスクを表す。
【０００８】
本発明は、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定し、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、高再発リスクを示し、患者が高リスク患者であれば、アジュバント療法で当該患者を治療することによる、肺癌患者を治療する方法を提供するものである。
【０００９】
本発明は、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表４から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者が高死亡リスク状態か、あるいは、低リスク状態かを決定する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、推奨される治療の程度およびタイプを医師が決定できるだけの、十分な再発リスクを表す。
【００１０】
本発明は、本明細書に説明されているいずれかの方法の結果を決定し、その結果およびその結果によって作成された患者レポートを表示するレポートを準備することによって、肺癌予後患者レポートを作成する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される、少なくとも1個のプローブセットを含む組成物を提供する。
【００１２】
本発明は、生体サンプルにおいて肺癌予後を決定するアッセイ(assay)を実施するためのキットであって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を検出する材料を含むキットを提供する。
【００１３】
本発明は、肺癌状態を評価する物品であって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を検出する材料を含む物品を提供する。
【００１４】
本発明は、本明細書に記載されている方法を実施するためのマイクロアレーまたは遺伝子チップを提供する。
【００１５】
本発明は、診断／予後判定ポートフォリオであって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を含むポートフォリオを提供する。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
非小細胞肺癌（NSCLC）は、肺癌の大半（〜75％）を占め、扁平上皮癌40％、腺癌40％、および大細胞癌20％の、3種類の主要サブタイプを含む。NSCLC患者のおよそ25〜30％は、第I病期であり、このうちの35〜50％は、術後5年以内に再発する。現行の組織病理検査および遺伝子バイオマーカーは、高再発リスク患者の識別には不十分である。本発明において説明されるように、原発性扁平上皮肺癌129個と対応する正常肺組織10個が、アフィメトリクスU133Aチップを使ってプロファイルされた。教師無し（unsupervised）階層的クラスタリングは、病期との相関はないが、総生存率中央値（p=0.036）が大きく異なる、肺癌患者の2つのクラスターを識別した。次に、コックスの比例ハザードモデル（proportional hazard model）が用いられ、65個の患者トレーニングセット（training set）での遺伝子50個の最適セット（表１）を識別し、64個の患者テストセット（test set）で生存率を有意に予測した。このサインは、52％の特異性（specificity）と82％の感受性（sensitivity）を達成し、総予測値71％を提供した。カプランマイヤー（Kaplan-Meier）分析は、高リスクおよび低リスク患者の明確で有意な層化を示した（p=0.0075）。予後サインの識別は、初回手術後のアジュバント療法が有益となり得る、高リスク扁平上皮肺癌患者の識別を可能にする。
【表１】
2008521412.tif 000003
【００１７】
バイオマーカーは、指示マーカー遺伝子（indicated Marker gene）の発現レベルのいずれかの指標である。この指標は、直接的もしくは間接的であることができ、生理的パラメーターを考慮し、かつ、内部対照（internal control）、正常組織、または別の癌と比較して、過剰または過少発現（over- or under-expression）を測定できる。バイオマーカーは、核酸（過剰および過少発現、ならびに直接および間接の、双方の指標）を含むが、それに限定されない。バイオマーカーとしての核酸の使用は、DNA増幅、RNA、マイクロRNA、ヘテロ接合性の消失（LOH）、一塩基多型（SNPs、ブルックス（Brookes）（1999））、マイクロサテライトDNA、DNA低または高メチル化（DNA hypo- or hyper-methylation）の測定を含むが、それらに限定されない当業者に周知のあらゆる方法を含むことができる。バイオマーカーとしてのタンパク質の使用は、量、活性、修飾（グリコシル化、加リン酸化、ADPリボシル化、ユビキチン化など）、免疫組織化学検査（IHC）の測定を含むが、それらに限定されない当業者に周知のあらゆる方法を含むことができる。他のバイオマーカーは、画像描出、細胞数、およびアポトーシス（apoptosis）マーカーを含む。
【００１８】
本明細書で提示される指示遺伝子は、特定の腫瘍または組織型と関連する遺伝子である。マーカー遺伝子は、多数の癌タイプと関連することができるが、遺伝子の発現が、本明細書で述べられるアルゴリズムを使って識別できるほど十分に１つの腫瘍または組織型に関連し、肺癌細胞に特異的である場合は、マーカー遺伝子を特許請求の範囲に記載されている発明において使用し、癌状態と予後を決定することができる。1種類以上の癌と関連する多数の遺伝子が、当業者に周知である。本発明は、好ましいマーカー遺伝子、および、さらに好ましいマーカー遺伝子の組み合わせを提供する。これらは、本明細書で詳細に説明される。
【００１９】
マーカー遺伝子は、そのマーカー遺伝子がSEQ ID NOによって指定される配列を含有する場合に、そのSEQ ID NOによって指定される配列に対応する。遺伝子のセグメントまたは断片は、遺伝子の配列として識別されるのに十分な参照配列（referenced sequence）またはその補体の一部を含有する場合、その遺伝子配列に対応する。遺伝子発現産物（expression product）は、そのRNA、mRNA、または、cDNAが参照配列（例、プローブ）を有する組成物にハイブリダイズする場合、あるいは、ペプチドまたはタンパク質の事例では、このようなmRNAによってコード化される場合、その参照配列に対応する。遺伝子発現産物のセグメントまたは断片は、遺伝子または遺伝子発現産物の配列であると識別されるのに十分な、参照遺伝子発現産物の一部またはその補体を含有する場合、その遺伝子または遺伝子発現産物の配列に対応する。
【００２０】
本明細書で説明および特許請求の範囲に記載されている本発明の方法、組成物、物品、およびキットは、1個以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」または「マーカー遺伝子」は、本明細書の全体を通じ、任意の遺伝子と対応する遺伝子および遺伝子発現産物であって、その任意の遺伝子の過剰または過少発現が、腫瘍または組織型と関連する、遺伝子および遺伝子発現産物を指す。好ましいマーカー遺伝子は、表８にさらに詳細に記述される。
【００２１】
本発明は、肺癌状態を評価する方法であって、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌状態を評価する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが肺癌状態を示す。
【００２２】
本発明は、肺癌患者の病期を分類する方法であって、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者の病期を分類する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが肺癌状態を示す。病期は、TNM方式を含むが、それに限定されないいずれかの分類方式、あるいは、同様の遺伝子発現プロファイルを有する患者に対応することができる。
【００２３】
本発明は、肺癌患者の治療プロトコルを決定する方法であって、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者の治療プロトコルを決定する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、医師が再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを決定できるのに十分な再発リスクを示す。
【００２４】
本発明は、肺癌患者を治療する方法であって、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定し、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルが、高再発リスクを示し、患者が高リスク患者であれば、アジュバント療法でその患者を治療することによって、肺癌患者を治療する方法を提供するものである。
【００２５】
本発明は、肺癌患者が高死亡リスク状態か、あるいは、低リスク状態かを決定する方法であって、肺癌患者から生体サンプルを入手し、表４から選択された配列に対応するマーカー遺伝子と関連するバイオマーカーを測定することによって、肺癌患者が高死亡リスク状態か、あるいは、低リスク状態かを決定する方法を提供するものであり、この場合、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回るマーカー遺伝子の発現レベルは、医師が推奨される治療の程度およびタイプを決定できるのに十分な再発リスクを示す。
【００２６】
前述した方法において、サンプルは、塊状組織標本（bulk tissue preparation）およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（laser capture microdissection）を含むが、それらに限定されない当業者に周知のいずれかの方法によって、調製されることができる。塊状組織標本は、例えば生検または手術検体から得ることができる。
【００２７】
前述した方法において、遺伝子発現の測定は、サンプル中に構成的に発現される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルの測定も含むことができる。
【００２８】
前述した方法において、特異性は、少なくとも約40％であることが好ましく、感受性は、少なくとも約80％である。
【００２９】
前述した方法において、所定カットオフレベルは、良性細胞または正常組織に比較して、少なくとも約1.5倍の過剰または過少発現である。
【００３０】
前述した方法において、所定カットオフレベルは、良性細胞または正常組織に比較して、転移細胞を有するサンプルが少なくとも統計的に有意なp値の過剰発現を有し、好ましくはp値は、0.05未満である。
【００３１】
前述した方法において、遺伝子発現は、マイクロアレーまたは遺伝子チップ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）などのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸増幅、そのタンパク質に特異的な抗体等の遺伝子によってコード化されたタンパク質の測定または検出、もしくは、DNA増幅、メチル化、突然変異、または対立遺伝子のばらつきなどの遺伝子特性の測定を含むが、それらに限定されない当業者に周知のいずれかの方法によって測定されることができる。マイクロアレーは、例えば、cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーであることができる。これらの方法は、すべて、さらに、1個以上の内部対照試薬を含有することができる。
【００３２】
本発明は、肺癌予後患者レポートを作成する方法であって、本明細書に説明されているいずれかの方法の結果を決定し、その結果およびその結果によって作成された患者レポートを表示するレポートを準備することによって、肺癌予後患者レポートを作成する方法を提供する。このレポートは、さらに、患者転帰（patient outcome）および／または患者集団に関するリスク確率の評価を含有することができる。
【００３３】
本発明は、組成物であって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択された、少なくとも1個のプローブセットを含む組成物を提供する。
【００３４】
本発明は、生体サンプル中で肺癌予後を決定するアッセイを実施するためのキットであって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択された遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を検出する材料を含むキットを提供する。キットは、さらに、マイクロアレー分析を実施するための試薬、および／または、前述の核酸配列、その補体またはその一部をアッセイする際の媒体を含むことができる。本発明は、肺癌状態を評価する物品であって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択された遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を検出する材料を含む物品を提供する。この物品は、さらに、マイクロアレー分析を実施するための試薬、および／または、前述の核酸配列、その補体、またはその一部がアッセイされる媒体を含むことができる。
【００３５】
本発明は、請求項１、２、５、６、または７に記載の方法を実施するためのマイクロアレーまたは遺伝子チップを提供する。マイクロアレーは、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択された遺伝子の組合せのうち、単離核酸配列、その補体、または、その一部を含有することができる。好ましくは、マイクロアレーは、少なくとも1.5倍の過剰または過少発現の測定または特徴付けが可能である。好ましくは、マイクロアレーは、統計的に有意なp値の過剰または過少発現を提供する。好ましくは、p値は、0.05未満である。マイクロアレーは、cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーおよび／または1個以上の内部対照試薬を含有することができる。
【００３６】
本発明は、診断／予後判定ポートフォリオであって、表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択された遺伝子の組合せの、単離核酸配列、その補体、または、その一部を含む、診断／予後判定ポートフォリオを提供する。好ましくは、ポートフォリオは、少なくとも1.5倍の過剰または過少発現の測定または特徴付けが可能である。好ましくは、ポートフォリオは、統計的に有意なp値の過剰または過少発現を提供する。好ましくは、p値は、0.05未満である。
【００３７】
組織サンプル中の特定核酸配列の単なる有無が、診断または予後判定価値を有することは、まれにしか認められなかった。他方、各種タンパク質、ペプチド、またはmRNAの発現に関する情報は、次第に重要と見なされている。ゲノム内でのタンパク、ペプチド、またはmRNA発現能を有する核酸配列（「「遺伝子」と称されるような配列）の単なる存在自体は、所定の細胞中にタンパク、ペプチド、またはmRNAが発現されるか否かを決定しない。タンパク、ペプチド、またはmRNAを発現できる所定の遺伝子が発現するか否か、また、その発現がどの程度起こるかは、仮にあったとしても、多様で複合的な要因によって決定される。これらの要因を理解し、評価するのが困難であることとは無関係に、遺伝子発現アッセイは、腫瘍形成、転移、アポトーシス、および他の臨床関連の現象などの重要な事象の発生について、有用な情報を提供することができる。遺伝子がどの程度活性または不活性であるかの相対的指標は、遺伝子発現プロファイル中に認められることができる。本発明の遺伝子発現プロファイルは、肺癌患者の診断、状態、予後、および治療プロトコルの提供に使用される。
【００３８】
サンプル標本は、患者サンプルの収集を必要とする。本発明の方法で使用される患者サンプルは、組織の穿針吸引細胞診（fine needle aspirate）（FNA）中の小結節から得られる細胞などの罹病細胞の含有が疑われるサンプルである。生検または手術検体から得られる塊状組織標本、およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）も、使用に適する。LCM技術は、検討対象細胞を選択する一方法であり、細胞型の異質性によって引き起こされるばらつきを最小化する。その結果、正常または良性細胞と癌細胞の間のマーカー遺伝子発現の中程度または小規模な変化が、容易に検出されることができる。サンプルは、末梢血から抽出される循環上皮細胞も含むことができる。これらは、多数の方法によって入手されることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第6,136,182号に記述されている磁気分離技術（magnetic separation technique）である。いったん、対象細胞を含有するサンプルが得られると、バイオマーカーを使って、適正なポートフォリオ中の遺伝子について遺伝子発現プロファイルが入手される。
【００３９】
遺伝子発現プロファイルを定める好ましい方法は、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子によって産生されるRNA量の決定を含む。これは、逆転写酵素PCR（RT-PCR）、競合（competitive）RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、ディファレンシャルディスプレー（differential display）RT-PCR、ノーザンブロット分析（Northern Blot analysis）、および他の関連検査法によって達成される。個々のPCR反応を使ってこれらの技術を実施することは可能であるが、mRNAから産生される相補的DNA（cDNA）または相補的RNA（cRNA）を増幅し、それをマイクロアレーで分析するのが最も良い。多数の異なるアレー構造およびその産生法が当業者に周知であり、米国特許第5,445,934号、同第5,532,128号、同第5,556,752号、同第5,242,974号、同第5,384,261号、同第5,405,783号、同第5,412,087号、同第5,424,186号、同第5,429,807号、同第5,436,327号、同第5,472,672号、同第5,527,681号、同第5,529,756号、同第5,545,531号、同第5,554,501号、同第5,561,071号、同第5,571,639号、同第5,593,839号、同第5,599,695号、同第5,624,711号、同第5,658,734号、および同第5,700,637号に記述されている。
【００４０】
マイクロアレー技術は、数千個の遺伝子の定常状態mRNAレベルの同時測定を可能にし、それによって、無制御な細胞増殖の開始、停止、または調節などの識別作用の強力なツールを提示する。2種類のマイクロアレー技術が、現在汎用されている。その第一はcDNAアレー、その第二はオリゴヌクレオチドアレーである。これらのチップの構造には差があるが、基本的に、すべての下流データ（downstream data）分析およびアウトプットは同じである。これらの分析成果は、典型的には、標識プローブ（labeled probe）から出されるシグナル強度測定であり、標識プローブは、マイクロアレー上の既知の位置で核酸配列にハイブリダイズするサンプルからcDNA配列を検出するために使用される。典型的には、シグナルの強度は、サンプル細胞中に発現されるcDNA、よってmRNAの量に比例する。多数のこのような技術が利用可能で、有用である。遺伝子発現を定量（determine）する好ましい方法は、米国特許第6,271,002号、同第6,218,122号、同第6,218,114号、および同第6,004,755号に認められることができる。
【００４１】
発現レベルの分析は、このようなシグナル強度を比較することによって実施される。これは、被験サンプルの遺伝子発現強度対対照サンプルの遺伝子発現強度の比の行列を作成することによって実施されるのが最良である。例えば、罹病組織からの遺伝子発現強度は、同一タイプの良性または正常組織から発生する遺伝子強度と比較されることができる。これらの発現強度の比は、被験サンプルと対照サンプルの間の遺伝子発現差（fold-change）を示す。
【００４２】
遺伝子発現プロファイルも、多数の方法によって表示されることができる。最も一般的方法は、生の蛍光強度または比の行列をデンドグラム（dendogram）で図解することであり、デンドグラムでは、縦の列が被験サンプルを示し、横の行が遺伝子を示す。データは、同様の発現プロファイルを有する遺伝子が、互いに近位であるように配列される。各遺伝子の発現比は、色で視覚化される。例えば、1未満の比（下方調節を示す）は、スペクトルの青色部分で見ることができ、一方、1以上の比（上方調節を示す）は、スペクトルの赤色部分での色で見ることができる。このようなデータを示すには、シリコンジェネティクス社（Silicon Genetics, Inc.）の「ジェネスプリング（GENESPRING）」、ならびにパーテック社（Partek, Inc）の「ディスカバリー（DISCOVERY）」および「インファー（INFER）」ソフトウェアを含めた、市販のコンピューターソフトウェアプログラムが利用できる。
【００４３】
遺伝子発現を定量するためにタンパク質レベルを測定する場合、適切な特異性および感受性を生じるような、あらゆる当業者に周知の方法が適している。例えば、タンパク質レベルは、そのタンパク質に特異的な抗体または抗体断片に結合させ、抗体結合タンパク質を測定することによって測定されることができる。検出を容易にするために、抗体は、放射能試薬、蛍光試薬、または他の検出可能な試薬によって標識されることができる。検出方法は、酵素免疫定量法（ELISA）およびイムノブロット（immunoblot）技術を含むが、それらに限定されない。
【００４４】
本発明の方法で使用される調節マーカー（Modulated Markers）は、実施例に記述されている。各種肺癌予後判定患者において、差次的（differentially）発現される遺伝子は、上方調節または下方調節のいずれかをされる。上方調節および下方調節は、相対的用語で、あるベースラインに対して、遺伝子の発現量の検出可能な差（発現量の測定に使用されるシステムのノイズの寄与を上回る）が認められることを意味する。この場合、ベースラインは、アルゴリズムに基づいて決定される。罹病細胞中の対象遺伝子は、同じ測定方法を使って、ベースラインレベルに対して上方または下方調節のいずれかをされる。
【００４５】
罹病とは、この文脈上、細胞の無制御な増殖が起こるにつれ、身体機能の適正な性能を中断または妨害する、あるいは、妨害する可能性を有する、身体状態の変化を指す。ある患者は、その患者の遺伝子型または表現型のある態様が疾病の存在と一致する場合、病気と診断される。しかし、診断または予後判定を実施する行為は、再発率、治療法および治療モニタリングのタイプの決定など、疾病／状態の問題点の決定を含む場合がある。治療モニタリングでは、一定の治療経過の効果に関して、遺伝子発現を経時的に比較して、遺伝子発現プロファイルが正常組織により近いパターンに変化したか、あるいは、変化しつつあるかを決定することによって、臨床判定が下される。
【００４６】
遺伝子は、群内の遺伝子セットについて得られる情報が、診断、予後、または治療の選択などの臨床に関連する判定を下すための確かな基礎を提供するように、群分けされることができる。これらの遺伝子セットは、本発明のポートフォリオを構成する。大半の診断マーカーのように、多くの場合は、正しい医学的判定を下すのに十分な最少マーカー数を使用するのが望ましい。これが、追加分析を待つ間の治療の遅れと、さらに時間と資源の無益な使用を防ぐ。
【００４７】
遺伝子発現ポートフォリオを確立する１つの方法は、株式ポートフォリオの確立に汎用される平均分散アルゴリズム（mean variance algorithm）などの最適化アルゴリズムの使用による。この方法は、米国特許公報第20030194734号に詳細に記述されている。基本的に、この方法は、一連のインプット（金融の場合における株式、本明細書では強度によって測定される発現レベル）の確立を要し、これが、インプットの使用から得られるリターン（例、生じるシグナル）の変動性を最少化しながら、リターンを最適化する。このような操作の実施には、多くの市販ソフトウェアプログラムが利用できる。本明細書全体で「ワグナー（Wagner）ソフトウェア」と呼ばれる、「ワグナー・アソシエイツ平均分散最適化アプリケーション（Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application）」が好ましい。このソフトウェアは、「ワグナー・アソシエイツ平均分散最適化ライブラリ（Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library）」からの関数を使用して、有効フロンティア（efficient frontier）を決定するもので、マルコビッツ（Markowitz）の理論における最適ポートフォリオは、一つのオプションとなる。この種のソフトウェアの使用には、マイクロアレーデータを変換することにより、本来の目的である金融分析のためにソフトウェアが使用される場合に株式収益およびリスク測定が使用される方法で、マイクロアレーデータがインプットとして処理されることができるようにすることを要する。
【００４８】
ポートフォリオ選択プロセスは、発見的規則の応用も含むことができる。好ましくは、このような規則は、生物学と、臨床結果を得るために使用される技術の理解に基づいて、公式化される。さらに好ましくは、このような規則は、最適化方法からのアウトプットに応用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法が、癌被験者における多数の差次的発現遺伝子のマイクロアレーデータに応用されることができる。この方法からのアウトプットは、末梢血や罹病組織に発現される遺伝子を含むことができる、最適化された遺伝子のセットであろう。この検証方法で使用されるサンプルが末梢血から入手され、癌の場合の特定の差次的発現遺伝子が末梢血でも差次的発現される場合、発見的規則が応用されることができ、その場合、ポートフォリオは、末梢血で差次的発現される遺伝子を除く有効フロンティアから選択される。当然、この規則は、例えば、データの事前選択中にこの規則を応用することによって、有効フロンティアの形成前に応用されることができる。
【００４９】
必ずしも問題の生物学と関連しない他の発見的規則が、応用されることができる。例えば、所定割合のポートフォリオのみが、特定の遺伝子または遺伝子群によって代表されることができる規則を、応用することができる。ワグナーソフトウェアのような市販のソフトウェアは、これらのタイプの経験則に容易に対応する。これは、例えば、真度および精度以外の要因（例、予想ライセンス料）が、1個以上の遺伝子を含むことの望ましさに影響を与える場合に有用である。
【００５０】
癌診断、予後、または、治療モニタリングに有用な他の非遺伝子診断方法と合わせて、本発明の遺伝子発現プロファイルが使用されることもできる。例えば、ある状況では、前述した方法に基づいた遺伝子発現診断能に、血清タンパク質マーカー（例、癌抗原27.29（CA 27.29））などの慣用的なマーカーからのデータを組み合わせるのが有益である。CA 27.29などの分析物を含めた、このようなマーカーが多様に存在する。ある方法では、血液が、治療対象患者から定期的に採取され、次に、前述した血清マーカーの１つについて酵素イムノアッセイに供される。マーカーの濃度が腫瘍再発または治療不全を示唆する場合、遺伝子発現分析に適したサンプル源が採取される。疑わしい腫塊が存在する場合、穿刺吸引細胞診（FNA）が行われ、次に、腫塊から得られた細胞の遺伝子発現プロファイルが前述のとおりに分析される。別法として、腫瘍がすでに除去された組織に隣接する区域から、組織サンプルが採取されることができる。この手法は、他の検査法があいまいな結果を生じる場合に、特に有用である。
【００５１】
本発明に従って調製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するためにフォーマットされたアッセイを含む。これらは、試薬および説明書など、アッセイの実施に必要な材料の全部または一部、ならびにバイオマーカーがアッセイされる媒体を、含むことができる。
【００５２】
本発明の物品は、治療、診断、予後判定、およびその他の疾病評価に有用な、遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらのプロファイル表示は、コンピューター読み取り可能媒体（磁気、光学的など）などの、機械によって自動読み取りされることができる媒体に縮小される。本物品は、このような媒体中に、遺伝子発現プロファイルを評価するための説明書も含むことができる。例えば、本物品は、前述した遺伝子ポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するための、コンピューター解説書を有するCD ROMを含むことができる。本物品は、物品中にデジタル記録された遺伝子発現プロファイルを含むこともでき、それによって、プロファイルが患者サンプルからの遺伝子発現データと比較されることができる。別法として、プロファイルは、異なる表示フォーマットで記録されることができる。グラフでの記録は、このようなフォーマットの一つである。前述したパーテック社の「ディスカバリー」および「インファー」に組み入れられたものなどのクラスタリングアルゴリズムが、データの視覚化を、最も良く補助することができる。
【００５３】
本発明によって製造された別のタイプの物品は、遺伝子発現プロファイルの解明に使用される媒体またはフォーマットされたアッセイである。これらは、例えば、配列補体またはプローブがマトリックスに貼付されるマイクロアレーを含むことができ、マトリックスに対象遺伝子を示す配列が結合し、その遺伝子の存在を示す読み取り可能な決定因子となる。別法として、本発明による物品は、癌検出のための対象遺伝子のハイブリダイゼーション、増幅、および、発現レベルを示すシグナル発生の実施用試薬キットに組み込まれることができる。
【００５４】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、さらに詳細に説明される。本明細書に示される全参照文献は、参照により本明細書に組み入れられている。
【００５５】
〔実施例〕
本発明に従って分析される遺伝子は、概して、タンパク質またはペプチドの産生をコードする完全長核酸配列（full-length nucleic acid sequences）に関連する。分析の観点から、完全長配列の識別は必要ないことを、当業者は認識することになる。即ち、配列またはESTの一部が、対応する遺伝子の遺伝子発現を評価するためにプローブをデザインする周知の原理に従って、選択されることができる。
【００５６】
〔実施例１〕
方法
患者集団
全病期の個々の扁平上皮癌患者133名（LS-71およびLS-136は、同一腫瘍の異なる区域からの重複サンプルであった）からの、新鮮凍結の手術切除肺SCCサンプル134個と対応する正常肺サンプル10個が、本研究で評価された。これらのサンプルは、1991年10月から2002年7月までに、ミシガン大学病院の患者から、患者の同意と施設内検討委員会（Instituional Review Board）（IRB）の承認を得て収集された。切除肺癌の一部は、切断され、通常のヘマトキシリンエオジン（H&#38;E）染色後、検査病理医によって評価された。分析用に選択されたサンプルは、70％を超える腫瘍細胞を含有した。患者のおよそ1／3（各病期ごとに等しい割合で）は、術後、放射線療法または化学療法を受けた。77名の患者は、リンパ節陰性であった。全患者について経過観察データが入手できた。患者の平均年令は、68±10才（範囲42〜91才）で、およそ45％が70才以上であった。1名の患者（LS-3）は、手術に関連する原因によって死亡した可能性があり、そのため、予後サインの識別に用いられなかった。また、3個の検体は、組織混合型（mixed histology）であり、これらも、予後プロファイリングの対象とされなかった（LS-76、LS-84、LS-112）。
【００５７】
〔マイクロアレー分析〕
RNAの単離のため、30μmのクライオスタット（cryostat）切片20〜40個が、各サンプルから切断され、合計、およそ100mgの組織に相当した。腫瘍細胞の有無の確認のために、RNA単離用切片の切断前、切断中、および切断後、ヘマトキシリンエオジン染色用に5 μm切片が切断された。トータルRNA（total RNA）が、RNAゾルB（RNAzol B）（オランダ、ベーネンダールのカンプロ・サイエンティフィック社（Campro Scientific））で単離され、DEPC（0.1％）処理H2O中に溶解された。約2 ngのトータルＲＮＡが、10 μLに再浮遊され、T7 RNAポリメラーゼによる増幅が2ラウンド実施され、約50μgの増幅RNAを生じた。RNAの品質は、アジレント・バイオアナライザ（Agilent Bioanalyzer）を使って検査された。全サンプルの平均リボソーム比（28s／18s）は、1.5（範囲1.0〜2.1）であった。製造会社の説明書に従って、4μgのトータルＲＮＡが増幅、標識され、aRNAが、破断され、アフィメトリクスUl 33 Aチップにハイブリダイズされた。マイクロアレーデータは、アフィメトリクスMAS 5ソフトウェアを使って抽出された。全体的遺伝子発現は、平均強度600単位まで調整された。次に、データは、スプライン区分正規化法（spline quantile normalization method）を使って正規化された。
【００５８】
〔統計分析〕
最適予後遺伝子サインの識別に、コックス比例ハザード回帰モデル、ブートストラッピング、および20％抜きクロスバリデーション（leave 20 percent out cross validation、L20OCV）の、3種類の補足統計法が実施された。
【００５９】
総生存率と有意に関連する遺伝子の識別には、単変量コックス比例ハザード回帰モデルが実施された。コックススコアは、選択遺伝子のチップシグナルの対数（log2）値にコックス回帰のzスコアを乗じた値の和として定義された。同様に、トレーニングセットからの同一選択遺伝子で、テストセットの患者について、コックススコアが算出された。一連のカットオフ値（トレーニングセットの患者についてのリスク指数パーセンタイル）が適用され、テストセットの患者のコックススコアをリスク指数のカットオフ値と比較することによって、テストセットの患者の臨床結果が予測された。患者のコックススコアがカットオフ値よりも高い場合、患者は、「高リスク」に分類され、さもなければ、「低リスク」群に分類された。
【００６０】
高リスク患者および低リスク患者の生存特性の探究に、カプランマイヤー分析が実施された。この集団で再発をきたす患者の大半が3年以内の再発であるため、3年生存率のカットオフ値が用いられた。キールナン（Kiernan）ら（1993）ら。また、これらの患者の多くは、3年後に非癌関連疾病で死亡する。キールナンら（1993）ら。この論理は、コックスモデル実施時にも用いられた。
【００６１】
さらに厳密な、予後判定遺伝子の規定手段の提供には、ブートストラップ法も用いられた。前述したものと同一のトレーニングおよびテストセットを使って、トレーニングセットからの置換によって65個のサンプルが選択され、その後、これらのサンプルに対してコックス回帰が実施された。各遺伝子のP値およびzスコアが記録された。この段階が400回繰り返され、その結果、遺伝子毎に400個のP値およびzスコアが得られた。遺伝子毎に、P値の上位および下位5％が除外され、次に、各遺伝子の平均P値とランク（平均P値に基づく）が規定された。同様に、トレーニングセットの各遺伝子のzスコアの上位および下位5％が除外され、残りのzスコアの和が算出された。平均P値に基づく最高位遺伝子数が規定され、そのチップシグナルの対数（log2）値にｚスコアの和を乗じた。これが、これらの遺伝子のコックススコア、即ち、リスク指数と見なされた。テストセットの患者のコックススコアも、この方法で算出された。トレーニングセットとテストセットの患者について、受信者操作特性（ROC）曲線が描かれ、各遺伝子分類子の曲線下面積（AUC）値が記録された。次に、AUC値が各種遺伝子分類子数に対してプロットされ、トレーニングセットにおける定常AUC値を提供する最適遺伝子数が決定された。
【００６２】
L20OCVも実施され、分類子の最適遺伝子数が確認された。第一のサンプルは、サンプル数が同じ、または、非常に近い5群に分けられた。5対のトレーニングおよびテストセットが作成され、トレーニングセットがサンプルの80％から成り、テストセットが残りの20％から成った。そのため、テストセットでは、各サンプルは、正確に1回選択された。コックス回帰モデルが実施され、トレーニングセットの最上位予後判定遺伝子が選択され（2〜200）、選択された遺伝子が、対応するテストセットで検討された。ROCが実施され、AUCが算出された。2〜200の遺伝子数に関する5個のテストセットの平均AUCが算出された。これは、100回繰り返され、次に、2〜200の遺伝子数の100とおりのAUCの平均値が算出された。平均AUC対遺伝子数（2〜200）がプロットされ、サインの最適遺伝子数が選択された。
【００６３】
主な患者クラスターを識別し、患者共変量とのそれらの関連を検討するために、
ジーンスプリング７．０（GeneSpring7.0）（シリコンジェネティクス社）によって、階層的クラスタリングが実施された。データセット全体で最少の発現変化を示した遺伝子の影響を減少させるために、クラスタリングの前に、0.3未満（任意に選択）の変動係数（CV）を有する遺伝子が除外された。よって、クラスタリング分析には、11,101個の遺伝子によるデータセットが作成された。各遺伝子のシグナル強度は、全患者からのその遺伝子の発現レベル中央値で除された。類似性の測定として、ピアソン（Pearson）相関を使って、サンプルがクラスター化された。同じ方法で遺伝子がクラスター化された。
【００６４】
〔結果〕
マイクロアレープロファイリング
マイクロアレー144個中141個は、優れたデータを生じた（存在％＞40、倍率＜10）が、残りの3個のサンプル（LS76、LS78、LS82）は、許容可能な結果を生じた（存在％＞30、倍率＜15）。表2は、マイクロアレーによって分析されたSCCサンプル134個の臨床および病理学的病期分類を示す。初期クラスタリング分析には、全サンプルが対象となった。全サンプル（正常サンプルを含む）の少なくとも10％に遺伝子が存在すると考えられない場合、遺伝子は、データセットからフィルタリングされた。これは、分析用に14,597個の遺伝子を残した。
【表２】
2008521412.tif 000004
【００６５】
〔教師無し階層的クラスタリング〕
教師無しクラスタリング用として、データセット全体で低発現変動を有した遺伝子（CV＜30％）を除外することによって、データセットは、さらにフィルタリングされた。残りの11,101個の遺伝子の教師無しk平均クラスタリング法（k-means clustering）に基づいて、SCCサンプル134個および正常肺サンプル10個が、初めに、クラスター化された。正常肺サンプルは、癌とは異なるプロファイルを有しており、合わせてクラスター化された。2個の重複SCCサンプル（LS-71およびLS-136）は、合わせてクラスター化され、マイクロアレー分析の再現性を実証した。特異な患者癌133個中、4個は、以後の分析から除外された。理由は、当該患者が、手術が原因で死亡し（LS3）、あるいは、サンプルが組織混合型であった（LS-76、LS-84、LS-112）ためである。11,101個の遺伝子を使って129 個のサンプルがクラスター化され、2個の主要クラスターが形成されたところ、一方は、55名の患者によるもので、他方は、74名の患者によるものであった（図１Ａ）。腫瘍の病期、分化、または、患者の性別と2個のクラスターの間には、有意な関連が確認されなかった。両クラスターにおいて、各病期がほぼ等しい割合で存在した（クラスター1は、Ｉ期31名、II期15名、およびIII期9名の患者から成る。クラスター2は、Ｉ期42名、II期18名、およびIII期14名の患者から成る）。しかし、クラスター1および2の患者は、有意に分離した生存率曲線を示しており（図１Ｂ、p=0.036）、総生存率と関連した（図１Ｂ）発現プロファイルが、病期に関係なく、存在したことを示している。
【００６６】
〔予後判定遺伝子サインの識別〕
病期早期患者を予後良好群と予後不良群にさらに層別化することができる遺伝子を識別するために、数種類の補足的統計分析が実施された。これは、１）トレーニングセットに対するコックスモデル化とテストセットサンプルに対する予後判定サインバリデーション（validation）、２）ブートストラッピング、および３）L20OCVを含んだ。
【００６７】
第一に、SCCサンプル129個を、トレーニングセットとテストセットに分割し、両群とも、等数の病期とした。両群は、同様の総生存時間中央値を示した。65名の患者のトレーニングセットが、ブートストラッピング法（方法の節参照）を使って分析され、予後判定サインに使用される最適遺伝子数が決定された。遺伝子数を増加させて受信者操作特性分析からのAUCに対してプロットすると、サイン性能（signature performance）が遺伝子50個付近でプラトーに達し始めることが確認されることができた（図２Ａ）。L20OCV手法が使用され、65名の患者のトレーニングセットにおける最適な予後判定遺伝子数が確認された。結果は、遺伝子数が50に達した際に、サインが安定な性能を有することを示した。そのため、最上位にランクされた50個の遺伝子が、サインとして使用されるのがよい。50個の遺伝子分類子は、64名の患者のテストセットで使用されると、70％の総予測値を示した（図２Ｂ）。
【００６８】
次に、LOOCV手法が65名の患者のトレーニングセットで使用され、リスク指数の最適カットオフ値が決定された。各種カットオフ値で誤り率が算出された。これは、58パーセンタイルでのカットオフ値が最低誤り率を生じることを示した（図３）。そのため、58パーセンタイルの患者が、生存率の決定に、カットオフ値として使用された。その後、このカットオフ値を使って、テストセットで予後サインの性能が検討された。サインは、テストセットにおいて52.4％の特異性および81.8％の感受性を達成した（図３）。カプランマイヤープロットも、予測高リスク患者群と低リスク患者群の間の良好な分離を示した（p=0.0075）。性別、分化、病期、腫瘍サイズ、年令、およびリンパ節状態を含む、多変量分析が実施された。50個の遺伝子サイン以外のパラメーターは、いずれも、有意なp値を示さなかった（表３）。カプランマイヤー分析も、50個の遺伝子サインおよび58％のリスクカットオフ値を使って実施された。高リスク群は、全患者において（p=0.0075、図４Ａ）、さらに、Ｉ期患者だけが検証された場合に（p=0.029、図４Ｂ）、低リスク群から良好に分離された。
【表３】
2008521412.tif 000005
【００６９】
〔実施例２〕
頑健な予後判定サインの識別
我々は、トレーニング・テスト法（training-testing method）におけるランダムサンプリングの問題を回避するために、ブートストラップ法を使用したが、トレーニングセットで129個のサンプル全部を使用すると、さらに頑健な予後判定サインが識別されるはずである。そのため、遺伝子サインは、129名の患者データセット全体にブートストラッピングを適用することによっても選択された。遺伝子は、その平均P値に基づいてランク付けされ、最上位100個の遺伝子が識別された（表４）。これらの遺伝子のうちの23個は、トレーニング・テスト法から識別された最上位50個の遺伝子と共通していた。
【００７０】
我々は、16名の患者について、再発時間（TTR）に関するデータを得た。平均TTRは、21.7ヶ月であり、患者の88％が3年以内に再発した。3年後に死亡した患者の過半数は、非癌関連の原因で死亡したので、我々は、肺癌関連死を遂げる患者の分類に、36ヶ月のカットオフ値を選択した。我々の規定分類子は、36ヶ月カットオフ値を用いた場合と、用いない場合で検証された。3年カットオフ値が用いられた場合、テストセットで、サインは、より良好な性能を有した。そのため、期限によって選択された遺伝子サインは、期限によらない場合よりも良好である。
【表４】
2008521412.tif 000006
【００７１】
〔実施例３〕
SCC患者の高リスクサブグループの識別
前述した教師無し階層的クラスタリングは、総生存率に有意差のある2つの主要患者群を識別した。2つの患者群について実施されたブートストラップ分析は、高リスク群と低リスク群の間で発現レベルに有意差のある遺伝子121個（一意でない）を認めた（p＜0.001、平均差＞3倍；表５）。興味深いことに、これらの遺伝子の過半数（118）は、高リスク群において下方調節された（図５Ａ、クラスター1）。経路分析は、ケラチンおよびスモールプロリンリッチタンパク質（small-proline rich proteins）を含む表皮発生機能に関与する遺伝子が、このデータセットにおいて有意に富化されることを実証した。表６に示されるこれらのデータは、2 種類の主要なSCCサブタイプが存在し、その一方が、低分化と一致する遺伝子発現プロファイルを有し、それ自体、より侵襲的な傾向を示すことを指摘している。表皮分化のみに関与する遺伝子（図５Ｂ）が、患者サンプルのクラスター化に使用された場合、2つの予後分化群が維持された（図５Ｃ）。これらのデータは、2 種類の主要なSCCサブタイプが存在し、その一方が、低分化と一致する遺伝子発現プロファイルを有し、それ自体、より侵襲的な傾向を示すことを指摘している。表皮分化遺伝子の発現が起こらない点は、脱分化され、そのために、侵襲性が高まった腫瘍サブタイプと関連すると思われる。
【表５】
2008521412.tif 000007
【表６】
2008521412.tif 000008
【００７２】
〔実施例４〕
肺癌の予後に対する遺伝子発現サイン
方法
リアルタイム定量RT-PCR
トータルＲＮＡサンプルは、OD260で標準化された。品質検査は、バイオアナライザ（アジレント社）を使ったキャピラリー電気泳動による分析を含んだ。aRNAには、リボビースト（Ribobeast）（商標）の１ラウンド・アミノアリル・ａＲＮＡ（1 -Round Aminoallyl-aRNA）増幅キット（エピセンター社（Epicentre））が使用された。第一鎖cDNA合成、第二鎖cDNA合成、aRNAのインビトロ（in vitro）転写、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）処理、精製、および他の段階は、すべて、製造会社のプロトコルに従って実施された。サンプル毎に、aRNAが第一鎖cDNAに逆転写され、リアルタイム定量RT-PCRに使用された。第一鎖cDNA合成反応は、100 ngのaRNA、1μLの50 ng／μL Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライマー（T7-Oligo(dT) primer）、0.25μL の10 mM dNTPs、1μLの5Xスーパースクリプト（Superscript）（商標）III逆転写酵素緩衝液（III Reverse Transcriptase Buffer）、0.25μL の200 U／μLスーパースクリプト （商標） III逆転写酵素（III Reverse Transcriptase）（インビトロジェン社（Invitrogen Corp））、0.25μLの100 mM DTT、および0.25μLの0.3 U／μLリボヌクレアーゼ阻害剤（RNase Inhibitor）（エピセンター社）を合計反応量5μLに含有した。
【００７３】
リアルタイム定量RT-PCR分析は、ＡＢＩプリズム（ABI Prism）7900HT配列検出装置（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems））で実施された。各反応物は、10μLの2Xタックマン（TaqMan）（登録商標）ユニバーサルＰＣＴマスターミックス（Universal PCR Master Mix ）（アプライドバイオシステムズ社）、5μLのcDNAテンプレート、およびlμLの20Xアッセイズ・オン・デマンド・ジーン・エクスプレッション・アッセイ・ミックス（Assays-on-Demand Gene Expression Assay Mix）（アプライドバイオシステムズ社）を合計反応量20μL中に含有した。PCRは、50℃で2分間のUNG活性化段階および95℃で10分間の初期酵素活性化、それに続く、95℃で15秒間、60℃で1分間の40サイクルから成った。
【００７４】
〔免疫組織化学検査〕
60個の肺扁平上皮癌を含有する組織マイクロアレーについて、免疫組織化学検査（IHC）が実施された。コノネン（Kononen）ら（1998）によって先に述べられたとおりに、組織マイクロアレー（TMA）ブロックの作成用に形態全体を最も良く代表する腫瘍部分が選択された。全対照は、染色すると、背景陰性（negative for ground）であった。
【００７５】
〔経路分析〕
初めに遺伝子オントロジー（Gene Ontology）（GO）の生物学的プロセス（Biological Process）カテゴリーにアフィメトリクスU133Aチップ上でマッピングすることによって、経路分析が実施された。その後の経路分析用に、U133Aチップ上に少なくとも10個の遺伝子を有するカテゴリーが使用された。データ分析から選択された遺伝子が、GO生物学的プロセスカテゴリーにマッピングされた。次に、カテゴリー毎に、遺伝子の超幾何分布確率が算出された。0.05未満のp値を有し、少なくとも2個の遺伝子を有するカテゴリーは、選択遺伝子リストにおいて代表過多（over-represented）と見なされた。
【００７６】
〔予後判定遺伝子コアセットの識別〕
手短に言うと、肺SCC患者129名から、65名の患者の400個のランダムトレーニングセットが選択された。トレーニングセット毎に、コックス回帰が実施され、5％有意水準で（即ち、P＜0.05）有意な遺伝子が識別された。トレーニングセットの40％以上において有意である遺伝子331個が、コア遺伝子セットとして使用される。これらの331個の遺伝子は、表７に示される。
【００７７】
〔マイクロアレー結果の検証〕
我々は、マイクロアレー結果を確認するため、初めに、4個の遺伝子（FGFR2、KRT13、NTRK2、およびVEGF）に対してタックマン（登録商標）定量RT-PCRを実施した。プラットフォーム間の相関は、0.71〜0.96の範囲であり、発現データが再現性のあることを示していた。
【００７８】
次に、腫瘍細胞内でのこれらのタンパク質のうちのいくつかの発現を確認するため、組織マイクロアレー上で免疫組織化学検査が実施された。SCC細胞中のチロシンキナーゼタンパク質（tyrosine kinase proteins）FGFR2およびNTKR2に加えて、複数のケラチンの各種発現レベルが実証された。
【００７９】
〔予後判定遺伝子コアセットの識別〕
先の分析では、50個の遺伝子のセットが、患者65名の単一トレーニングセットから識別された。この手法の一つの問題は、分子サインがトレーニングセットの患者の選択に強く左右されるために、予後の予測因子として識別された遺伝子が不安定になり得る点である。繰り返しランダムサンプリングによるバリデーションの使用が、この不安定性を回避できる。そのため、我々は、肺SCC患者129名のランダムトレーニングセット400個を作成し、コックス回帰を実施し、5％有意水準（即ち、p＜0.05） で有意な遺伝子を識別した。トレーニングセットの40％以上で有意であった遺伝子331個が、扁平上皮癌の予後判定遺伝子のコアセットとして識別された。これらの遺伝子が、表７のSEQ ID NOsである。
【表７】
2008521412.tif 000009
【００８０】
前述した発明は、明確な理解のために、例証としてある程度詳細に説明されたが、本説明および実施例は、本発明の範囲を限定すると見なしてはならない。
【表８−１】
2008521412.tif 000010
【表８−２】
2008521412.tif 000011
【表８−３】
2008521412.tif 000012
【表８−４】
2008521412.tif 000013
【表８−５】
2008521412.tif 000014
【表８−６】
2008521412.tif 000015
【表８−７】
2008521412.tif 000016
【表８−８】
2008521412.tif 000017
【表８−９】
2008521412.tif 000018
【表８−１０】
2008521412.tif 000019
【表８−１１】
2008521412.tif 000020
【表８−１２】
2008521412.tif 000021
【００８１】
〔参照文献〕
2008521412.tif 000022
【００８２】
〔実施の態様〕
（１）  肺癌状態を評価する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌状態を示す、
方法。
（２）  肺癌患者の病期を分類する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、肺癌の病期を示す、
方法。
（３）  実施態様２に記載の方法において、
前記病期が、TNM方式による分類に対応する、
方法。
（４）  実施態様２に記載の方法において、
前記病期が、同様の遺伝子発現プロファイルを有する患者に対応する、
方法。
（５）  肺癌患者の治療プロトコルを決定する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、医師が再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを決定できるように、再発リスクを十分に示す、
方法。
（６）  肺癌患者を治療する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表１、表４、表５、または表７から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階であって、所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、高再発リスクを示す、段階と、
ｃ．高リスク患者である場合、前記患者をアジュバント療法で治療する段階と、
を含む、方法。
（７）  肺癌患者が、高死亡リスク状態にあるか、または低死亡リスク状態にあるかを決定する方法において、
ａ．肺癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
ｂ．表４から選択された配列に対応するマーカー遺伝子に関連するバイオマーカーを測定する段階と、
を含み、
所定のカットオフレベルを上回るまたは下回る前記マーカー遺伝子の発現レベルが、医師が再発防止に推奨される治療の程度およびタイプを決定できるように、死亡リスクを十分に示す、
方法。
（８）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプルが、塊状組織標本およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションから成る群から選択される方法によって調製される、
方法。
（９）  実施態様８に記載の方法において、
前記塊状組織標本が、生検または手術検体から得られる、
方法。
（１０）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプル中の構成的に発現された少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定する段階、
をさらに含む、方法。
【００８３】
（１１）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記サンプルが、原発腫瘍から得られる、
方法。
（１２）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
特異性が、少なくとも40％である、
方法。
（１３）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
感受性が、少なくとも80％である、
方法。
（１４）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に比較して、前記サンプル中で、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
方法。
（１５）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、良性細胞または正常組織に比較して、転移細胞を有するサンプル中で、少なくとも統計的に有意なp値の過剰発現を有する、
方法。
（１６）  実施態様１５に記載の方法において、
前記p値が、0.05未満である、
方法。
（１７）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレーまたは遺伝子チップ上で測定される、
方法。
（１８）  実施態様１７に記載の方法において、
前記マイクロアレーが、cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーである、
方法。
（１９）  実施態様１７に記載の方法において、
前記マイクロアレーまたは遺伝子チップが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
（２０）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で実施される核酸増幅によって決定される、
方法。
【００８４】
（２１）  実施態様２０に記載の方法において、
前記PCRが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）である、
方法。
（２２）  実施態様２１に記載の方法において、
前記RT-PCRが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
（２３）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコード化されるタンパク質の測定または検出によって検出される、
方法。
（２４）  実施態様２３に記載の方法において、
前記タンパク質が、前記タンパク質に特異的な抗体によって検出される、
方法。
（２５）  実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特性の測定によって検出される、
方法。
（２６）  実施態様２５に記載の方法において、
測定される前記特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異、および対立遺伝子変異から成る群から選択される、
方法。
（２７）  肺癌予後患者レポートを作成する方法において、
実施態様１、２、５、６、または７のいずれかの結果を決定する段階と、
前記結果を表示するレポートを準備する段階と、
を含む、方法。
（２８）  実施態様２７に記載の方法において、
前記レポートが、患者転帰、および／または、前記患者集団に関するリスク確率、の評価を含む、
方法。
（２９）
患者レポートにおいて、
実施態様２７に記載の方法によって作成される、患者レポート。
（３０）  組成物において、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される、少なくとも1個のプローブセット、
を含む、組成物。
【００８５】
（３１）  生体サンプルで肺癌予後を決定するためのアッセイを実施するキットにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、を検出するための材料、
を含む、キット。
（３２）  実施態様３１に記載のキットにおいて、
マイクロアレー分析を実施するための試薬、
をさらに含む、キット。
（３３）  実施態様３１に記載のキットにおいて、
さらに、前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部がアッセイされる媒体を含む、
キット。
（３４）  肺癌状態を評価するための物品において、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、を検出するための材料、
を含む、物品。
（３５）  請求項３４に記載の物品において、
マイクロアレー分析を実施するための試薬、
をさらに含む、物品。
（３６）  実施態様３５に記載の物品において、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部がアッセイされる媒体、
をさらに含む、物品。
（３７）  マイクロアレーまたは遺伝子チップにおいて、
実施態様１、２、５、６、または７に記載の方法を実施するための、マイクロアレーまたは遺伝子チップ。
（３８）  実施態様３７に記載のマイクロアレーにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、
を含む、マイクロアレー。
（３９）  実施態様３８に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定または特徴付けが、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
マイクロアレー。
（４０）  実施態様３８に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現を提供する、
マイクロアレー。
【００８６】
（４１）  実施態様４０に記載のマイクロアレーにおいて、
前記p値が、0.05未満である、
マイクロアレー。
（４２）  実施態様４０に記載のマイクロアレーにおいて、
cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレー、
を含む、マイクロアレー。
（４３）  実施態様４０に記載のマイクロアレーにおいて、
1種類以上の内部対照試薬、
をさらに含む、マイクロアレー。
（４４）  診断／予後判定ポートフォリオにおいて、
表１、表４、表５、または表７から選択される配列に対応するマーカー遺伝子から成る群から選択される遺伝子の組合せの、単離核酸配列、前記核酸配列の補体、または前記核酸配列の一部、
を含む、ポートフォリオ。
（４５）  実施態様４４に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または特徴付けが、少なくとも1.5倍の過剰発現または過少発現である、
ポートフォリオ。
（４６）  実施態様４５に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp値の過剰発現または過少発現を提供する、
ポートフォリオ。
（４７）  実施態様４５に記載のポートフォリオにおいて、
前記p値が0.05未満である、
ポートフォリオ。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】肺SCC患者129名の階層的クラスタリングを示す。
【図２】AUC対遺伝子数のプロットを示す。
【図３】65名のサンプルトレーニングセットにおけるLOOCVの誤り率対各種カットオフ値を示す。
【図４】テストセットにおける50個の遺伝子サインのカプランマイヤープロットを示す。
【図５】教師無しクラスタリングが、高リスク患者において表皮分化経路を下方調節であると識別していることを示す。Ａ．最上位121に基づいた患者クラスタリングは、2種類の患者クラスターを示した。クラスター1の遺伝子の過半数は、下方調節された（緑）。Ｂ．表皮分化経路に関連する20個の遺伝子のリスト。Ｃ．表皮関連遺伝子20個によって規定されたクラスター化患者群のカプランマイヤー曲線。
【図６】リアルタイムRT-PCRを使った遺伝子発現データの検証を示す。RT-PCR用に4個の遺伝子（NTRK2、FGFR2、VEGF、KRT 13）が選択された。発現は、アフィメトリクスチップデータと非常に良好に相関する（R=0.71〜0.96）。
【図１】
2008521412.tif 000023
【図２】
2008521412.tif 000024
【図３】
2008521412.tif 000025
【図４】
2008521412.tif 000026
【図５】
2008521412.tif 000027
【図６】
2008521412.tif 000028
【配列表】
2008521412000001.app
【国際調査報告】
2008521412.tif 000029
2008521412.tif 000030
2008521412.tif 000031