(57)【要約】  本発明は、その増殖が成長因子に依存しないブタ肥満細胞株に関する。本発明は、前記肥満細胞株の培養を含む、生物活性なヘパリン型分子を製造する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＩａ  ＩＩｓ  ｇｌｕ四糖を含むヘパリン型分子を産生することを特徴とする、ブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項２】
少なくとも５０ＩＵ／ｍｇ超の抗Ｘａ活性を示すヘパリン型分子を産生することを特徴とする、請求項１に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項３】
少なくとも５０ＩＵ／ｍｇ超の抗ＩＩａ活性を示すヘパリン型分子を産生することを特徴とする、請求項１に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項４】
ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素を過剰発現することを特徴とする、請求項１ないし３の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項５】
ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素をコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし４の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項６】
３−ＯＳＴをコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし５の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項７】
３−ＯＳＴ１をコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし６の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項８】
ブタ３−ＯＳＴをコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし７の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項９】
変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１ないし８の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項１０】
マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９の位置と等価な位置に変異を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を発現することを特徴とする、請求項１ないし９の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項１１】
マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９、ブタｃ−ｋｉｔＧ５５６又はヒトｃ−ｋｉｔＧ５６０タンパク質を発現することを特徴とする、請求項１ないし１０の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項１２】
変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質をコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし１１の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項１３】
マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９の位置と等価な位置に変異を示すｃ−ｋｉｔタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１ないし１２の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株。
【請求項１４】
２００１年１０月１７日に、パスツール研究所の「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ  ｄｅ  ｌ’Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕ」に、番号Ｉ−２７３４、Ｉ−２７３５又はＩ−２７３６で寄託された、変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を発現するように修飾されたブタ肥満細胞株の１つであることを特徴とする、ブタ肥満細胞株。
【請求項１５】
ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素をコードする外来核酸を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のブタ肥満細胞株。
【請求項１６】
請求項１ないし１５の何れか１項に記載のブタ肥満細胞培養物又は株の培養を含む、ヘパリン型分子を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その成長が成長因子非依存的であるブタ肥満細胞株に関する。本発明は、これらの肥満細胞株の培養を含む、生物活性ヘパリン型分子を生産する方法にも関する。
【０００２】
肥満細胞は、炎症応答、特に、アレルギー及び過敏性現象に関わる造血前駆体に由来する免疫系の細胞である。肥満細胞は、結合組織（特に皮膚内）、並びに腸及び呼吸器粘膜中に存在する。
【０００３】
肥満細胞は、約５及び２５μｍの間の直径を有する丸い細胞の形態であり、単一の、中央の又は中央から外れた丸い核を有する。肥満細胞は、多数の異染色細胞質顆粒形成の存在によっても特徴付けられる。
【０００４】
これらの顆粒は、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン又はコンドロイチン硫酸などのプロテオグリカン、酵素、サイトカイン並びに好酸球及び好中球を化学的に誘引する因子などの、炎症促進活性を有する様々な分子種を含有する。これらの種は、肥満細胞の活性化の間に放出される。
【０００５】
活性化後、第２の応答が開始され、この間に、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ＰＡＦ（血小板活性化因子）、インターロイキン（ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２及びＩＬ１３）、サイトカイン（ＴＧＲ−β、γ―ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ）及びケモカイン（ＭＣＰ−１、ＩＬ８、ＲＡＮＴＥＳ）などの媒介物質の合成が起こる。これらの種は全て、炎症プロセスの惹起、及び特異的Ｔリンパ球依存性免疫応答の開始に関与する。
【０００６】
肥満細胞培養物は、ヒト、マウス及びブタにおいて既に得られている。ブタでは、ブタ肥満細胞株は、胎児肝臓から得られた幹細胞を培養することによって確立されている。これらは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ（ＩＮＲＡ）［フランス国立農学研究所］及びＥｃｏｌｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｓ  Ａｌｆｏｒｔ（ＥＮＶＡ）［メゾン・アルフォールフランス国立獣医学校］の名で寄託された特許出願ＷＯ０３／０３５８５３号の主題であった。それぞれ、番号Ｉ−２７３４、Ｉ−２７３５及びＩ−２７３６で、２００１年１０月１７日に、パスツール研究所の「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」［微生物培養フランス国立収集所］に、３つの株が寄託された。
【０００７】
自発的に不死化されるこれらの細胞は、ｒｐＳＣＦ及びｒｐＩＬ３などの成長因子の存在下で、１７０世代超にわたって、培養中で維持されてきた。これらの条件下で、細胞は、ヘパリン型の化合物を合成することが可能である。これらの肥満細胞株は、ヘパリン型分子のかなりの量を産生する。
【０００８】
特許出願ＷＯ０３／０３５８８６号（その主題は、これらの株からヘパリンを製造する方法である。）は、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓ．Ａ．の名前で寄託された。
【０００９】
ブタでは、Ｅｍｅｒｙら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４，９２７−９３５，１９９６）は、骨髄から得られた細胞培養物を７週間、維持した。しかしながら、得られた培養物は、様々な細胞種の混合物であり、肥満細胞の均一な培養物又は株ではないように見受けられる。さらに、これらの培養物は、均一な肥満細胞培養物中に非分化細胞を含有する。
【００１０】
Ａｓｈｒａｆら（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ；  ２９，  １３４−１５８，  １９８８）は、増幅可能な培養物を維持せずに、超粘膜からブタ肥満細胞を単離した。さらに、単離された肥満細胞の特徴づけは、ヘパリンの不存在を明らかにする。
【００１１】
Ｒａｚｉｎら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７，  ７２２９−７２３６，  １９８２）は、ＩＬ３を含有する培地を用いて、マウス肥満細胞を得ることを記載する。
【００１２】
Ｗａｎｇら（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８４，７４−８３，１９９９）は、ラット胸膜及び腹腔から得られた漿液肥満細胞の単離を記載する。ラット大動脈平滑筋細胞とともに肥満細胞が共培養されたときだけ、様々な分子種が産生される。出願ＷＯ９９／２６９８３号は、類似の研究を記載しているが、他の種への応用に関しては極めて不正確である。
【００１３】
マウスでは、細胞株が確立されているが（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９，  １１３２７−１１３３１  ，  １９９２  及び出願ＷＯ９０／１４４１８号）、肥満細胞腫から確立されたものである。これらの腫瘍は、ブタでは、極めて稀である。
【００１４】
ヒトでは、肥満細胞培養物を取得することは困難であることが明らかとなった。これは、最初、繊維芽細胞との共培養の系を使用することによって可能となった（Ｉｓｈｉｚａｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５，９３７−９４３，１９９３）。その後、他の著者は、腸細胞から肥満細胞を取得すること、及びＳＣＦの存在下で約６ヶ月間、これらの細胞を培養中に維持することに成功した（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９、５５６０−５５６７，１９９７）。
【００１５】
これらの様々な文献の著者は、しかしながら、測定を行った際に、ヘパリン型化合物の低い産生を報告したにすぎない。
【００１６】
多くの肥満細胞培養物は、最適な成長のために，ＳＣＦなどの成長因子を必要とする。ＳＣＦは、受容体であるｃｋｉｔへの結合に続いて、増殖、分化などの細胞応答を変化させた。マウス及びヒト肥満細胞腫の研究によって、ｃ−ｋｉｔ受容体の恒常的（すなわち、ＳＣＦの結合がなしに）活性化に必要とされるｃ−ｋｉｔ遺伝子中の変異又は欠失を同定することが可能となった。ＩＣ２不死肥満細胞中での、Ｖ８１４が変異を受けたｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現は、これらの細胞の形質転換（すなわち、ＳＣＦ非依存性増殖及び腫瘍形成能の獲得）を誘導する（Ｐｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，８７（８），３１１７−３１２３，１９９６）。
【００１７】
ヘパリンは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ファミリーに属し、アミノ糖（Ｄ−グルコサミン又はガラクトサミン）及びウロン酸（Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）から構成される二糖配列の反復を含有する直鎖多糖を含む。
【００１８】
ヘパリンサルファートとともに、グルコサミノグリカンサブファミリーに属するヘパリンの場合、アミノ糖はＤ−グルコサミンである。ウロン酸は、グルクロン酸（Ｇｌｃ）又はイズロン酸（Ｉｄｏ）の何れかである。グルコサミンは、Ｎ−アセチル化、Ｎ−硫酸化又はＯ−硫酸化されることが可能である。
【００１９】
慣用的には、「ヘパリン」という用語は、グルコサミン残基の８０％超がＮ硫酸化されており、Ｏ−サルファートの数がＮ−サルファートの数より多い、高度に硫酸化された多糖を表す。サルファート／カルボキシラート比は、ヘパリンの場合、一般的には、２を超えている。しかしながら、実際には、ヘパリンの構造は不均一であり、極めて様々な比率を含有することが可能な鎖が存在する。
【００２０】
全てのＧＡＧと同様、ヘパリンは、実質的に、肥満細胞により、プロテオグリカンの形態で合成される。
【００２１】
ヘパリン合成の第１段階は、セリンとグリシン残基の反復からなるセルグリシンタンパク質コアの形成である。ヘパリン鎖は、四糖の付加によって、次いで、均一に交代するグルコサミンとウロン酸の連続的な付加によって伸長される。
【００２２】
このようにして形成されたプロテオグリカンは、多くの順次の変換（Ｎ−脱アセチル化、Ｎ−硫酸化、Ｄ−グルクロン酸エピマー化及びＯ−硫酸化）を行う。しかしながら、この完全な変異は、プロテオグリカンの一部に対して生じるにすぎず、その不均一性の原因となる、ヘパリン中の大きな構造的可変性を生成する。次いで、エンドグルクロニダーゼによって、セルグリシンから、多糖鎖が切断される。次いで、これらの鎖は、５０００と３００００Ｄａの間の分子量を有する。これらは、塩基性プロテアーゼとともに複合体を形成するため、肥満細胞顆粒中に保存される。ヘパリンは、肥満細胞の脱顆粒化中にのみ排泄される。
【００２３】
ヘパリンは、特に止血において、重要な生物学的役割を果たしており、治療、特に、抗凝固剤及び血栓抑制剤として、治療で極めて広く使用されている。
【００２４】
使用されているヘパリンの多くは、ブタの腸粘膜（ヘパリンは、タンパク質分解によってブタ腸粘膜から抽出される。）から単離された後、陰イオン交換樹脂上で精製される（ヘパリンの様々な調製方法に関する総説については、「Ｄｕｃｌｏｓ，  ＜＜Ｌ’Ｈｅｐａｒｉｎｅ  ：  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｒｏｐｒｉｅｔｅｓ，  ａｎａｌｙｓｅ  ＞＞［ヘパリン；産生、構造、特性、分析］発行者Ｍａｓｓｏｎ，  Ｐａｒｉｓ，  １９８４）を参照。」。
【００２５】
ヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩによる脱ポリマー化後の、ブタヘパリンの二糖組成の分析並びにクロマトグラフィーによって、他のグリコサミノグリカンからヘパリンを識別することが可能となる。特に、８つの主要な二糖が区別される（図１）。
【００２６】
ＨＰＬＣ分析によっても、ＩＩａＩＩｓｇｌｕ及びＩＩａＩＶｓｇｌｕ四糖の存在を検出することが可能となる（下線は、二糖の３−Ｏ−硫酸化を表す記号である。）。これらの四糖の存在は、ＡＴＩＩＩ親和性部位の存在と直接相関する。実際、ＡＴＩＩＩ親和性部位の３−Ｏ−硫酸化は、この部位の不完全な消化をもたらし、従って、ＩＩａＩＩｓｇｌｕ及びＩＩａＩＶｓｇｌｕ四糖の出現をもたらす。ＡＴＩＩＩ親和性部位の３−Ｏ−硫酸化によって、生物学的に活性なヘパリンを取得することが可能となる。
【００２７】
上記研究は、産生株の単離を可能とする。しかしながら、これらの産業的な使用を可能とするために、これらを改善する必要がある。特に、これらの株の増殖を、成長因子非依存性にすること、及び産生される分子の生物活性を改善することが望ましい。
【００２８】
出願人は、驚くべきことに、変異体ｃ−ｋｉｔタンパク質で肥満細胞株を形質転換することによってこれらの２つの側面を改善できること、及び３ＯＳＴ１タンパク質の過剰発現を通じて、産業的製造に適合した、生物活性を示すヘパリン型分子の産生を取得できることを示した。
【００２９】
本発明の主題は、  ＩＩａ  ＩＩｓ  ｇｌｕ四糖を含むヘパリン型分子を産生するブタ肥満細胞培養物又は株である。有利なことに、これらの培養物又は株は、ＩＩａ  ＩＩｓ  ｇｌｕ四糖の検出可能な量を産生する。好ましくは、これらの培養物又は株は、全ての糖の少なくとも０．３％、０．５％、１％又は１．５％の量でＩＩａ  ＩＩｓ  ｇｌｕ四糖を含有するヘパリン型分子を産生する。
【００３０】
有利な実施形態によれば、これらのブタ肥満細胞培養物又は株は、少なくとも５０ＩＵ／ｍｇ超、好ましくは７５ＩＵ／ｍｇ超、１００ＩＵ／ｍｇ超又は１５０ＩＵ／ｍｇ超の抗Ｘａ活性を示すヘパリン型分子を産生する。
【００３１】
別の有利な実施形態によれば、これらのブタ肥満細胞培養物又は株は、少なくとも５０ＩＵ／ｍｇ超、好ましくは７５ＩＵ／ｍｇ超、１００ＩＵ／ｍｇ超又は１５０ＩＵ／ｍｇ超の抗ＩＩａ活性を示すヘパリン型分子を産生する。
【００３２】
さらに別の有利な実施形態によれば、このような培養物又は株は、Ｉｓ二糖の少なくとも３０％（好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％）を含むヘパリン型分子を産生する。
【００３３】
好ましい実施形態によれば、本発明の株は、ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素を過剰発現するように修飾される。
【００３４】
有利なことに、前記株は、ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素をコードする外来核酸を含む。
【００３５】
ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素の安定な過剰発現によって、ヘパリン化合物の３−Ｏ−硫酸化を増加することが可能となり、従って、生物活性を増加することが可能となる。
【００３６】
有利なことに、ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素は、３−ＯＳＴであり、特に有利には、３−ＯＳＴ１である。
【００３７】
ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素は、好ましくは、配列番号６の配列を有し、配列番号５の配列によってコードされるブタ３−ＯＳＴ１である。
【００３８】
あるいは、３−Ｏ−スルファターゼ活性の発現をコードし、配列番号５の核酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％のヌクレオチド同一性を示す他の種由来の遺伝子を使用することが可能である。高ストリンジェンシー条件下で、配列番号５の核酸配列とハイブリダイズする核酸も使用し得る。
【００３９】
有利なことに、ブタ肥満細胞株は、変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を発現するように修飾され、ＳＣＦなしで済ますことが可能となる
有利なことに、前記株は、変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質をコードする外来核酸を含む。
【００４０】
変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔは、有利なことに、マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９の位置と等価な位置に変異を示すｃ−ｋｉｔタンパク質である。このため、これは、ブタｃ−ｋｉｔＧ５５６又はヒトｃ−ｋｉｔＧ５６０タンパク質など、マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９の位置と等価な位置に変異を示すｃ−ｋｉｔタンパク質であり得る。
【００４１】
好ましくは配列番号２を有し、配列番号１によってコードされる、バリンのグリシンへの修飾の原因となる点変異を有するマウスｃ−ｋｉｔＧ５５９が好ましい。
【００４２】
配列番号４の配列を有し、配列番号３の配列によってコードされるブタｃ−ｋｉｔＧ５５９でもあり得る。
【００４３】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子の種間保存のために、配列番号３の核酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％又は９９％のヌクレオチド同一性を示す、マウス、ヒト若しくはウシ遺伝子又はあらゆるその他の遺伝子を使用することが可能である。高ストリンジェンシー条件下で、配列番号３の核酸配列とハイブリダイズする核酸も使用し得る。
【００４４】
驚くべきことに、本出願人は、マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９を発現している細胞中において、マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９を発現していない細胞と比較してヘパリンプロファイルが改善されていることを観察した（すなわち、これらの細胞によって産生されるヘパリン型分子の異なる構成）。
【００４５】
それぞれ、マウス及びヒトにおいて、アスパラギン酸のバリン８１４又は８１６への修飾の原因となる点変異を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を使用することも可能である。最後に、アミノ酸ＴＱＬＰＹＤＨ５７３ないし５７９が欠失したマウスｃ−ｋｉｔ遺伝子を使用することも可能である。ブタでは、この欠失は、アミノ酸５７０ないし５７６と同等であり、ヒトでは、５７４ないし５８０と同等である。
【００４６】
より具体的には、本発明は、２００１年１０月１７日に、パスツール研究所の「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｆｒｅｎｃｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］に、番号Ｉ−２７３４、Ｉ−２７３５又はＩ−２７３６で寄託された、変異又は欠失を示すｃ−ｋｉｔタンパク質を発現するように修飾されたブタ肥満細胞株の１つに関する。
【００４７】
好ましくは、これらの株は、ヘパリン型分子の硫酸化に対して作用する酵素をコードする外来核酸を含む。
【００４８】
本明細書において、「培養物」という用語は、一般に、インビトロで培養された細胞又は細胞の群を表す。動物から採取された細胞又は組織試料から直接発育された培養物は、「初代培養物」と称される。
【００４９】
「株」という用語は、一度、少なくとも１回の継代で使用され、一般的には、数回の連続継代が、継代培養において連続して実施され、そこから得られる全ての培養物を表す（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６，９１−１０１，１９９０）。
【００５０】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを表すために使用される。核酸は、有利に、相補的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである。
【００５１】
本発明において、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の「パーセント同一性」は、比較のウィンドウを通じて、最適に並置された２つの配列を比較することによって決定することが可能である。
【００５２】
比較のウィンドウ中のヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、このため、２つの配列の最適なアラインメントを得るために、（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較して、付加又は欠失（例えば、ギャップ）を含み得る。
【００５３】
パーセントは、比較される２つの（核酸又はペプチド）配列に対して、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が観察されている位置の数を決定し、次いで、比較のウィンドウ中の位置の総数によって、２つの塩基又はアミノ酸残基間に同一性が存在する位置の数を割り、次いで、パーセント配列同一性を取得するために、結果に１００を乗ずることによって計算される。
【００５４】
比較用配列の最適なアラインメントは、「Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ」から得られるパッケージ中に含まれる公知のアルゴリズムを用いて、コンピュータ上で実施することが可能である。
【００５５】
例として、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴソフトウェア（ＢＬＡＳＴ  ｖｅｒｓｉｏｎｓ１．４．９  １９９６年から、ＢＬＡＳＴ  ２．０．４  １９９８年２月から及びＢＬＡＳＴ  ２．０．６  １９９８年９月）を使用し、専ら初期設定パラメータ（Ｓ．  Ｆ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０  ２１５  ：  ４０３−４１０，  Ｓ．  Ｆ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９７  ２５  ：  ３３８９−３４０２）を用いて計算され得る。Ｂｌａｓｔは、Ａｌｔｓｃｈｕｌらのアルゴリズムを用いて、基準「リクエスト」配列に対して類似／相同な配列を検索する。使用されるリクエスト配列及びデータベースは、ペプチドをベースとしたもの、又は核酸をベースとしたものであり得、あらゆる組み合わせが可能である。
【００５６】
本発明において「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」という表現は、以下の条件を意味するものとする。
【００５７】
１−膜のプレハイブリダーゼション及び
−  混合：サケの精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬ＋ヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬ
−  ９６℃で５分間変性した後、混合物を氷中へ入れる。
【００５８】
−  ２×ＳＳＣを除去し、膜を含有するハイブリダイゼーション管中へホルムアミド混合物４ｍＬを注ぐ。
【００５９】
−  ２つの変性されたＤＮＡの混合物を添加する。
【００６０】
−  回転しながら、４２℃で、５ないし６時間インキュベートする。
【００６１】
２−標識されたプローブの競合：
−  標識及び精製されたプローブに、反復の量に従って、Ｃｏｔ  Ｉ  ＤＮＡの１０ないし５０μＬを添加する。
【００６２】
−  ９５℃で、７ないし１０分間変性させる。
【００６３】
−  ６５℃で、２ないし５時間インキュベートする。
【００６４】
３−ハイブリダイゼーション：
−  プレハイブリダイゼーション混合物を除去する。
【００６５】
−  サケの精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬ＋ヒト胎盤ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬを混合する；９６℃で５分間変性した後、氷中へ入れる。
【００６６】
−  ハイブリダイゼーション管へ、ホルムアミド混合物（２つのＤＮＡと変性され、標識されたプローブ／ＣｏｔＩ  ＤＮＡの混合物）４ｍＬを添加する。
【００６７】
−  回転しながら、４２℃で、１５ないし２０時間インキュベートする。
【００６８】
４−洗浄：
−  濯ぐために、２×ＳＳＣ中、周囲温度で１回洗浄
−  周囲温度で、６５℃の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、２回５分
−  ６５℃で、６５℃の１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、２回１５分。
膜をサランラップに包み、露出する。
【００６９】
上記ハイブリダイゼーション条件は、２０ヌクレオチドないし数百ヌクレオチドの変動し得る長さの核酸分子を、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションするのに適している。
【００７０】
上記ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知の技術に従って、ハイブリダイゼーションが望まれる拡散の長さに又は選択された標識の種類に応じて調節可能であることはいうまでもない。
【００７１】
適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓによる書籍（１９８５，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ）」あるいは、Ｆ．Ａｕｓａｕｂｅｌらによる書籍（１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）に含まれる教示に従って調節することが可能である。
【００７２】
本出願は、上述されているブタ肥満細胞培養物又は株の培養を含む、ヘパリン型分子を生産する方法にも関する。
【００７３】
本発明の株は、好ましくは、規定の培地（ＭＥＭα／ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭなど）中で培養される。
【００７４】
培地には、０．５％と２０％の濃度（ｖ／ｖ）で、ウシ血清を補充してもよい。
【００７５】
培地のタンパク質濃度及び動物起源の化合物の使用に伴うリスクを減らすために、培地へのウシ血清の添加は、ＡＩＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの無血清培地の使用と置き換えることが可能である（Ｋａｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４０，  １０１−１０，  ２０００）。
【００７６】
肥満細胞は、例えば、「Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｎｉｍａｌ  ＣｅＩＩ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｓｐｉｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｖｏｌ．３，  １７９−２２０，  １９８６）」に記載されているような、真核細胞の大量培養のために開発された技術を用いて培養することが可能である。「Ｐｈｉｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｅｄｓ．  Ｆｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｔｏｌｂｅｒｔ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １９８５）」又は「Ｍｉｚｒａｈｉ  （Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  Ａｕｇｕｓｔ，  ９−１２，  １９８３）によって記載されているような、数ｍ３を超える容量を有するバイオリアクターを使用し得る。
【００７７】
培養は、Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ（Ｎａｔｕｒｅ，２１６，６４−６５，１９６７）によって記載されている技術に従って、懸濁液中で又は微小支持体上で実施することも可能である。
【００７８】
産業的規模での使用がより簡易であるため、真核細胞培養のために一般的に使用されているバッチ培養システムを使用することもできる（Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ｔｏｄａｒｏ，  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎｏｙｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  Ｕ．  Ｓ．Ａ．，  １９９７）。これらのシステムを用いて得られる細胞密度は、一般に、１０６と５×１０６細胞／ｍＬの間である。
【００７９】
バッチ培養の生産性は、ＧＡＧ抽出及びヘパリン単離操作に対して、細胞の幾つかをバイオリアクター（７０％ないし９０％）から除去し、新しい培養を開始するために、同時に、同じバイオリアクター中に残りの細胞を保持することによって有利に増加し得る。この反復バッチ培養モードでは、細胞増殖相の最適パラメータをそれらから識別することも可能であり、ＧＡＧ及びヘパリンの細胞内への蓄積をより多くすることが可能となる。
【００８０】
細胞の保持あり又はなしの連続的融合供給培養システムも使用することが可能である（Ｖｅｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０２（２），  ２７５−２７８，  １９８７  ；  Ｃｈａｕｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎ．  Ｅｎｇ．  Ｎｅｗｓ，  ２０，  １８−４８，  ２０００）。
【００８１】
本発明に関連して、特に、細胞をリアクター内で保持できるようにし、バッチ培養中で取得可能な細胞を上回る増殖と産生をもたらす融合−供給培養系（ｆｕｓｉｏｎ−ｆｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用し得る。保持は、スピンフィルター、中空フィルター又は固体マトリックスタイプの保持システムを用いて実施することが可能である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ９，  ４１−４９，  １９９２  ；  Ｖｅｌｅｚ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０２（２），  ２７５−２７８，  １９８７）。
【００８２】
得られる細胞密度は、一般に、１０７と５×１０７細胞／ｍＬの間である。バイオリアクター中での培養により、オンライン測定センサーの使用を通じて、細胞増殖の物理化学的パラメータ：ｐＨ、ｐＯ２、Ｒｅｄ／Ｏｘ、ビタミン、アミノ酸、炭素を基礎とする基質（例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース）、ラクタート又はアンモニア水などの代謝物などの成長物質の、より優れた調節が可能となる。  
【００８３】
酪酸ナトリウムでの処理に引き続き、肥満細胞のヘパリン型分子含量を定量的及び定性的に増加させることを想定し得る（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．６２７，６０−７０，１９８０））。
【００８４】
培養の３から１４日後、好ましくは、３ないし５日後、細胞を採集し、一般的に遠心又はろ過によって、培地から分離する。
【００８５】
様々な遠心系を使用することが可能であり、例えば、Ｖｏｇｅｌ及びＴｏｄａｒｏ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｎｏｙｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって記載されているものを挙げることができる。
【００８６】
あるいは、又は遠心と組み合わせて、同時に、溶液／懸濁液中の他の化合物を通過させながら、空隙率が細胞の平均直径（５ないし２０μｍ）より少ない膜を用いて、接線精密ろ過によって分離を実施し得る。膜を通じて与えられる接線流の速度と圧力は、膜の目詰まりを軽減し、分離操作中に細胞の完全性を保持するために、ほとんどせん断力（５０００／秒未満のレイノルズ数）を生成するように選択される。
【００８７】
様々な膜、例えば、らせん状の膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、平坦な膜又は中空の繊維（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｐａｌｌ、ＧＦ）を使用することが可能である。
【００８８】
タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス又はその他の微生物など、培地中に存在する可能性があるきょう雑物に関して分離及び第１の精製の実施を可能とする空隙率、電荷又はグラフトの膜を選択することも可能である。
【００８９】
肥満細胞の全部又は一部の脱顆粒化又は溶解によって、細胞内内容物からヘパリンが放出され、分離工程の時点で培地中にヘパリンが存在する場合には、より小さな空隙率の膜の使用も想定され得る。この場合には、細胞分離は、１つ以上の膜を通じた限外ろ過からなる工程と組み合わされ、その組織と空隙率は、ヘパリンの濃縮を可能とし、サイズ及び分子量に従って、並びに場合によっては、電荷又は生物学的特性に従って、培地中に存在する他の種から分離することを可能とする。
【００９０】
本実施形態の文脈において、膜のカットオフ閾値は、好ましくは、１０００と５ｋＤａの間である。精密ろ過に対して使用されるものと同様の膜システム、例えば、らせん状膜、平坦な膜又は中空の繊維を使用し得る。ヘパリンに対して親和性を示すリガンドの電荷特性及びグラフティングの特性のために、ヘパリンを分離及び精製することを可能とする膜を有利に使用し得る（例えば、抗体、ＡＴＩＩＩ、レクチン）。
【００９１】
しかしながら、一般的に、ヘパリンを細胞内内容物中に保つことができる細胞採集及び産生法を好ましく使用し得る。
【００９２】
ヘパリンは、細胞の脱顆粒又は溶解後に、肥満細胞から回収することも可能である。
【００９３】
脱顆粒化は、肥満細胞表面に存在する受容体への特異的リガンドの結合（例えば、アレルゲンタイプの因子の、肥満細胞ＩｇＥ受容体への結合（この断片のＩｇＥ  Ｆｃ断片又は類縁体など））によって引き起こすことが可能である。
【００９４】
その他の因子も、肥満細胞の脱顆粒化を誘導することが可能である。これらの因子は、細胞毒性因子、酵素、多糖、レクチン、アナフィラトキシン、塩基性化合物（化合物４８／８０、サブスタンスＰなど）、カルシウム（Ａ２３１８７イオノフォア、イオノマイシンなど）、幾つかのカテゴリーに分離することが可能である［Ｄ．  Ｌａｇｕｎｏｆｆ  ａｎｄ  Ｔ  ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ．  １９８３．  Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ２３：３３１−５１］。脱顆粒因子は、培養中に維持されている同一細胞に対して、繰り返し使用することが可能である。この産生方法においては、生産性は、上清から採集する方法の簡易化によって、培養中の細胞の維持によって著しく増加される。
【００９５】
Ａ２３１８７イオノフォアの事例では、肥満細胞の脱顆粒化は、例えば、２．１０６個の肥満細胞／ｍＬを、１と１００μｇ／ｍＬの間の濃度のＡ２３１８７イオノフォアと１分から４時間までの作用時間で処理することによって誘導することが可能である。
【００９６】
肥満細胞溶解は、例えば、低張又は高張溶液を用いた浸透圧衝撃によって、熱的ショック（凍結／融解）によって、機械的ショック（例えば、音波処理又は圧力変動）によって、化学因子（ＮａＯＨ、ＴＨＥＳＩＴＴＭ、ＮＰ４０ＴＭ、ＴＷＥＥＮ  ２０ＴＭ、ＢＲＩＪ−５８ＴＭ、ＴＲＩＴＯＮ  ＸＴＭ−１００など）によって、又は酵素溶解（パパイン、トリプシンなど）によって、又はこれらの方法の２つ以上の組み合わせによって誘導することが可能である。
【００９７】
細胞可溶化液からヘパリンを抽出及び精製するために、多糖鎖をセルグリシンのコアから分離するために、及び抽出媒体中に存在する他のＧＡＧからヘパリン鎖を分離するために、動物組織から得られるヘパリンの抽出及び精製の関連において使用される方法と類似の、それ自体公知であり、Ｄｕｃｌｏｓによるマニュアル（上記）などの一般的な著作に記載されている方法を使用し得る。
【００９８】
非限定的な例として、核酸から及び細胞タンパク質からヘパリンを分離し、ヘパリンを可溶化するために、すなわち、セルグリシンのコアとの結合を切断するために、
−細胞可溶化液を、１つ以上の酵素消化（プロナーゼ、トリプシン、パパインなど）に供することが可能である；
−ヘパリン−タンパク質結合は、サルファート又は塩化物の存在下で、アルカリ培地中で加水分解することが可能である；
−細胞に由来する核酸及びタンパク質を破壊するために、酸培地中で、（例えば、冷たい条件下で、トリクロロ酢酸を用いた）処理を実行することも可能であり、これには、ＧＡＧ−タンパク質相互作用を解離させることを可能とするイオン性溶液の使用が添加される。
【００９９】
酵素加水分解後に、グアニジンによる抽出を実行すること、可溶化されたヘパリンを精製することも可能である。例えば、酢酸カリウム、四級アンモニウム、アセトンなどでそれを沈殿することが可能である。
【０１００】
これらの精製工程は、有利に、それらに追加することが可能であり、又は１つ以上のクロマトグラフィー工程、特に陰イオン交換クロマトグラフィー工程と置き換えることが可能である。
【０１０１】
本発明の主題は、本発明の方法を用いて、肥満細胞培養物から取得可能なヘパリン調製物でもある。
【０１０２】
動物組織から、従来技術で得られるヘパリン調製物の生物学的特性と同等の生物学的特性を有する、本発明に係るヘパリン調製物は、ヘパリンに対する通常の用途の何れにおいても使用することが可能である。
【０１０３】
本発明は、以下の実施例によって例示される。これらの実施例は、純粋に、例示の目的で与えられ、限定的であると考えるべきではない。
【０１０４】
実施例
【０１０５】
（実施例１）
肥満細胞の遺伝的修飾
肥満細胞は、例えば、形質移入、電気穿孔、核穿孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｌａｔｉｏｎ）又は導入される核酸の一過性又は安定的発現をもたらす感染技術を用いて外来核酸を導入することによって、遺伝的に修飾することが可能である。安定な発現の場合、ＤＮＡは、細胞ゲノム中に組み込まれることができ、又はエピソームと維持されることができる。
【０１０６】
１  核穿孔及び電気穿孔による形質移入
安定に形質移入された細胞は、核穿孔から２４ないし７２時間後に、選択圧（ハイグロマイシン、ジェネチシン、ブラスチシジン、ピューロマイシン又はゼオシン）を適用することによって、以下に記載されている核穿孔法を用いて取得することが可能である。選択因子に対する耐性は、目的の遺伝子及び耐性遺伝子を有するプラスミドの組み込みによって付与される。
【０１０７】
核穿孔
核内へＤＮＡを直接誘導することを可能とするので、本方法は好ましく使用される。
【０１０８】
指数増殖期、好ましくは培養の３又は４日後、１ないし２×１０６個の肥満細胞を、１０００ｒｐｍで、５分間遠心し、核穿孔溶液（Ａｍａｘａ、ｋｉｔ  ８３５１）１００μＬ中に採取する。ｐｃＤＮＡ３．１−ｅＧＦＰ（ＧＦＰをコードするプラスミド）２ないし４μｇを、次いで、細胞懸濁液へ添加する。次いで、細胞を電気穿孔キュベット中に移し、特定のプログラム（Ｕ１４、Ｕ２３及びＵ２８  ＡＭＡＸＡなど）を用いた電気ショックに供する。
【０１０９】
次いで、予め３７℃まで加熱された完全な培地２ｍＬ中に細胞を移し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０１１０】
形質移入から２４ないし４８時間後、１％のパラホルムアルデヒド（Ｐｒｏｌａｂｏ）で固定するために細胞を採集する。このために、培養物全体を、１０００ｒｐｍで５分間遠心する。上清の除去後、１×ＰＢＳ  ４ｍＬ中で細胞を洗浄し、次いで、再び遠心する。次いで、細胞ペレットを、１％のパラホルムアルデヒド１ｍＬ中に採取する。次いで、血球計算器（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）中で、このようにして固定された細胞を分析する。
【０１１１】
上記核穿孔条件によって、同時に、５０％を上回る優れた細胞生存性を得ながら、３０と５０％の間の形質移入効率でブタ肥満細胞を形質移入することが可能となる。
【０１１２】
電気穿孔
指数増殖期にある１ないし５×１０６細胞を、ＤＮＡの１ないし３０μｇと接触させる。５００又は９６０μＦの静電容量を用い、１５０Ｖと４００Ｖの間の電圧で電気穿孔（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ、Ｂｉｏｒａｄ）する前に、４ｍｍの電気穿孔キュベット中に移された細胞を、氷中で５分間インキュベートする。電気穿孔後、細胞を、氷中で再度５分間インキュベートし、最後に完全な培地５ｍＬ中に移し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０１１３】
導入遺伝子を安定に組み込んだ細胞を選択する方法は、プラスミドの組み込みによって付与された、選択因子に対する耐性を用いて、上記と同じ技術を使用する。
【０１１４】
２  ウイルスベクターによる形質移入、汎親和性レトロウイルスベクターの使用
電気穿孔及び核穿孔による形質移入の方法の代替法として、複製欠損組み換えレトロウイルスベクターを使用し得る。例えば、ブタ細胞を感染させることができる汎親和性レトロウイルスベクターの産生を可能とする水泡性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）で偽型化されたベクターを使用し得る。
【０１１５】
この形質移入法では、偽型化されたエンベロープタンパク質（ｅｎｖ−ＶＳＶ−Ｇ）の産生用遺伝子を除き、ベクターを産生するための遺伝要素（ｇａｇ及びｐｏｌ）を含有するＧＰ−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコールｒｅｆ  ＰＴ  ３１３２−１）などのパッケージング細胞を用いて、ブタ肥満細胞中で発現されるべき、又はブタ肥満細胞中に組み込まれるべき目的の遺伝子を保有するレトロウイルスベクターを、まず作製する。
【０１１６】
レトロウイルスベクターの産生の時点で、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ遺伝子をコードするプラスミドと、選択遺伝子あり又は選択遺伝子なしで、プロモーターの制御下にある目的の遺伝子をコードするレトロウイルスプラスミドとを、パッケージング細胞に同時形質移入する。
【０１１７】
実際には、ＧＰ−２９３細胞は、指数増殖期にあるようにするために、形質移入の前に、４８ないし７２時間、培養に配置される。形質移入の日に、培地を、新鮮な培地と置き換え（１５−２０ｍＬ／１０６細胞）、次いで、リン酸カルシウム緩衝液ｐＨ中にＶＳＶ−Ｇプラスミド（５ないし２０μｇ／１０６細胞）と目的の遺伝子を保有するプラスミド（１０ないし３０μｇ／１０６細胞）の混合物を含有する溶液１ないし２ｍＬを、培地へ滴加する（１ないし２ｍＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。
【０１１８】
次いで、細胞を、３７℃で、又は好ましくは、３２と３５℃の間の温度で、１６ないし２４時間、再びインキュベートする。再び、培地を新鮮な培地と置き換える。３２〜３５℃で、細胞をさらに４８時間インキュベートする。インキュベーションが終了したら、新たに形成されたレトロウイルスベクターを含有する培養上清を採集する。パッケージング細胞の感染から得られる上清の一部を分取試料として採取し、−８０℃で凍結し、他の部分は、指数増殖期にある肥満細胞の培地と混合する。実際には、培養中の肥満細胞を遠心し、新鮮な培地５０％と感染上清５０％を含有する培地中に再懸濁する。肥満細胞を、３２〜３５℃で、２４時間インキュベートし、次いで、再度、培地を新鮮な培地と置き換える。
【０１１９】
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）蛍光レポーターとの感染を伴う対照の場合には細胞蛍光分析によって、又は目的の遺伝子による感染のためのＰＣＲを用いて分析するために、肥満細胞の感染から４８ないし７２時間後に試料を採取する。細胞蛍光分析によって、形質移入の効率の測定は、総細胞の２０％より大きい。
【０１２０】
次いで、目的の遺伝子と耐性遺伝子を保有するレトロウイルスベクターを形質移入された肥満細胞のみが増殖し続ける細胞毒性因子（ハイグロマイシン、ピューロマイシン、Ｇ４１８、ゼオシン）を培地に添加することによって、形質移入された細胞集団を選択する。本方法を用いることにより、目的遺伝子が、安定に組み込まれ、発現される。
【０１２１】
集団の選択及びクローニング後に、選択因子は、同時に目的の遺伝子の発現を保持しながら、培地から除去することが可能である。このようにして産生されたレトロウイルスベクターは、宿主肥満細胞中で複製せず、従って、複製ベクターの産生は存在しない。
【０１２２】
あるいは、所望の時点で培地に添加される化合物を用いて、発現が、目的の遺伝子の発現を制御するプロモーターの誘導に供せられるベクターも使用し得る。
【０１２３】
（実施例２）
マウスｃ−ｋｉｔＧ５５９遺伝子の安定な発現を通じて、ＳＣＦの不存在下で増殖することが可能な株の生成
成長が長期間、ＳＣＦ非依存的であるブタ肥満細胞を取得するために、変異を受けたｃ−ｋｉｔ遺伝子で肥満細胞を形質転換した。このために、バリン５５９のグリシンへの修飾の原因となる点変異を保有するマウスｃ−ｋｉｔ遺伝子（ｃ−ｋｉｔＧ５５９と称される遺伝子）を使用した。
【０１２４】
形質移入に使用される肥満細胞は、特許出願ＷＯ０３／０３５８５３号に記載されているように、胎児肝臓から得られたブタ肥満細胞の培養物に由来する。この肥満細胞株Ｉ−２７３５を、サイトカインの存在下で、９２９日間、培養中に維持した。
【０１２５】
肥満細胞は、１５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎＭ  ｐＧＥ２（Ｓｉｇｍａ）、２ｎｇ／ｍＬ  ｒｐＩＬ−３（Ｂｉｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）及び８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｐＳＣＦ（Ｂｉｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を補充したＭＥＭα培地中で培養する。この培地は、完全培地１と称される。５％ＣＯ２下、３７℃で、この細胞をインキュベートし、３〜４日ごとに、２×１０５Ｃ／ｍＬで播種する。
【０１２６】
マウスプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｃｋｉｔＧ５５９は、変異されたマウスｃｋｉｔ遺伝子のＸｂａＩ断片を、ＸｂａＩで開環されたプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １８（１７）：５３２２，  １９９０によって記載）中にクローニングすることによって得た。
【０１２７】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子は、バリン５５９のグリシンへの修飾の原因となる点変異を保有する（ｃ−ｋｉｔＧ５５９と称される遺伝子）。この変異は、ブタにおけるｃ−ｋｉｔＧ５５６変異体及びヒトにおけるｃ−ｋｉｔＧ５６０変異体と類似している。
【０１２８】
変異したマウスｃｋｉｔＧ５５９ｃＤＮＡを得るために、ＸｂａＩで、マウスプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ｃｋｉｔＧ５５９を消化した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ部位に、ｃＤＮＡ断片をクローニングした。ｃＤＮＡの完全な配列決定の後、得られたプラスミドは、ｐＢＸＬ２００８と称された。
【０１２９】
変異したマウスｃｋｉｔＧ５５９ｃＤＮＡを得るために、ＸｂａＩで、プラスミドｐＢＸＬ２００８を消化した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｂａＩ部位に、ｃＤＮＡ断片をクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＢＸＬ２０１５と称される。
【０１３０】
ｃＤＮＡ断片は、配列番号１の配列を含む。
【０１３１】
形質移入のためのＤＮＡ調製物は、「Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｘｉ」キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて作製した。
【０１３２】
ハイグロマイシン耐性集団の形質移入選択
培養の３日後に、指数増殖期にある５×１０６個の肥満細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、形質移入培地１００μＬ（２ｍＭ  グルタミン、１０ｎＭ  ＰＧＥ２、８０ｎｇ／ｍＬ  ｒｐＳＣＦ及び２ｎｇ／ｍＬ  ｒｐＩＬ３を補充したＭＥＭα）中に採取した。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ又はｐＢＸＬ２０１５の３０μｇを細胞懸濁液に添加する。次いで、細胞を電気穿孔キュベット中に移し、９６０μＦ、３４０Ｖの電気ショック（ｇｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ，Ｂｉｏｒａｄ）に供する。電気穿孔後、、予め３７℃まで加熱された完全培地１の５ｍＬ中に細胞を移し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。形質移入から４８時間後、細胞を計数し、遠心し、選択培地（０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で、ハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した完全培地１）中に、２×１０５Ｃ／ｍＬで播種する。
【０１３３】
ハイグロマイシン選択の適用から１６日後に、ハイグロマイシン耐性細胞集団が得られる。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロを安定に形質移入された細胞は、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロと称され、プラスミドｐＢＸＬ２０１５を安定に形質移入された細胞は、ＭＣｐＢＸＬ２０１５と称される。
【０１３４】
細胞培養物は、選択培地中で培養して維持される。
【０１３５】
分子特性
ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞中のマウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の検出
内在性ブタ遺伝子を増幅せずに、マウス遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを用いて、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物から抽出されたゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって、マウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の検出を実施した。
【０１３６】
ＱｕｉａｇｅｎのＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅキットのプロトコールに従って、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物由来の５×１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１３７】
次いで、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＧＣ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って、配列番号７の配列５’−ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＣＧＣ−３’のセンスプライマーＣ１９８１０及び配列番号８の配列５’−ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＣＧＣ  ＴＧ−３’のアンチセンスプライマーＣ１９８１４の存在下で、ＰＣＲによって、これらのゲノムＤＮＡ１００ｎｇを増幅した。２５のサーマルサイクル（９４℃での変性３０秒、５８℃でのハイブリダイゼーション４５秒及び６８℃で伸長４５秒）の後、３２５ｂｐの増幅された断片を検出するために、１×ＴＢＥ  ２％アガロースゲル上で、ＰＣＲ反応を分析した。
【０１３８】
これらの条件下で、ＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物から得られたゲノムＤＮＡから、約３５０ｂｐのＰＣＲ産物が観察されたが、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ培養物から得られたゲノムＤＮＡでは観察されなかった。これは、マウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の存在を示している（図２Ａ）。
【０１３９】
ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞中のマウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の発現の検出
ｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。
【０１４０】
ＱｕｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙミニキットのプロトコールに従って、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物由来の１０７個の細胞からＲＮＡを抽出した。次いで、３７℃で、１時間、ＤＮアーゼＩの２０Ｕで、ＲＮＡ３０μｇを消化し、次いで、ＱｕｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙミニキットの「クリーンアップ」プロトコールに従って精製した。
【０１４１】
配列番号９の配列５’−ｇａｃ  ｃａｃ  ｇｃｇ  ｔａｔ  ｃｇａ  ｔｇｔ  ｃｇａ  ｃｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｖ−３’のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ＡＭＶ  ＲＴ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ）により、これらのＲＮＡ２μＬをｃＤＮＡへと逆転写した。
【０１４２】
上記パラグラフに記載されている条件下で、ｃＤＮＡの１μＬに対してＰＣＲを実施した。
【０１４３】
これらの条件下で、ＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物由来のＲＮＡからは、約３５０ｂｐの、ＲＴ−ＰＣＲ由来の産物が観察されたが、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ培養物由来のＲＮＡでは観察されなかった。これは、マウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子が細胞中で有効に発現されることを示している（図２Ｂ）。
【０１４４】
ＳＣＦの不存在下での増殖の特徴決定
ＳＣＦを欠く培地中で細胞が増殖する能力を分析することによって、ｃｋｉｔＧ５５９の官能性を評価した。
【０１４５】
このために、形質移入から５ないし６週後、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の幾つかを、ＳＣＦを欠如する培地中に、２×１０５Ｃ／ｍＬで播種した。週に２回、及び３週間、培地を新鮮な培地と交換した。ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞は、このような培地中で増殖することができない。増殖停止後、かなりの細胞死が観察される（図３Ａ）。
【０１４６】
ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の場合、約３週間、初期期間が観察され、この間、増殖は僅かである（図３Ａ）。ハイグロマイシンに対する耐性に関わらず、全ての細胞が機能的マウスｃｋｉｔＧ５５９受容体を発現するとは限らず、これが、ＳＣＦの不存在下で増殖できないようにするという事実によって、この潜伏期間は、説明することが可能である。この潜伏期間の後、ＳＣＦの不存在下で増殖できるＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の集団が出現する。少なくとも１１週間、３〜４日ごとに、計数及び２×１０５Ｃ／ｍＬでの播種後、これらの亜集団を増幅した。これらの条件下では、２×１０５Ｃ／ｍＬでの播種後、到達した最大細胞密度は、２４と４８時間の指数増殖期倍加時間で、４×１０５と１０×１０５細胞／ｍＬの間である。
【０１４７】
ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖は、ＳＣＦの不存在下において、ＳＣＦを補充した培地中でのＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞の増殖と同一である（図３Ｂ）。従って、マウスｃｋｉｔＧ５５９遺伝子の発現は、同時に、増殖の同じレベルを保持しながら、ＳＣＦなしで済ますことを可能とする。
【０１４８】
培養物中に含有されるプロテオグリカンのＨＰＬＣによる特徴決定
ＳＣＦ欠損培地中でのＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖の研究は、ｃｋｉｔＧ５５９受容体の発現が、ＳＣＦ無しで済ますことを可能にすることを示している。本発明者らは、肥満細胞によるプロテオグリカンの産生に対する、ＳＣＦ除去の影響も研究した。
【０１４９】
ＳＣＦの不存在下での培養の５週後、「Ｌｉｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｅｓ，９，１８３−１９７，１９９７）」によって記載されたプロトコールに従って、肥満細胞のプロテグリカン組成を分析するために、ＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物の試料を採取した。
【０１５０】
以下のように、試料を処理する。
【０１５１】
タンパク分解：細胞試料（２×１０６個の細胞）を遠心し、ＰＢＳ緩衝液中で２回濯ぐ。アルカラーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）１０μＬが添加された蒸留水１００μＬ中に、各ペレットを採取した後、撹拌しながら、６０℃で５時間加熱する。次いで、１００００ｒｐｍで１０分間遠心する前に、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（Ｐｒｏｌａｂｏ）を含有する１０ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．０（Ｐｒｏｌａｂｏ）２００μＬで試料を希釈する。タンパク分解工程は、細胞内の内容物の放出を可能とし、タンパク質−多糖結合を解離させる。
【０１５２】
抽出：９６ウェルプレートフォーマット、１００ｍｇ／２ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏｈｙｐｅｒｓｉｌ）中のＳＡＸ４級アンモニウム樹脂上でのイオン交換により、各試料の上清を精製する。発見及び０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有するｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７中での洗浄後、３Ｍ  ＮａＣｌを含有するｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．０の５００μＬでグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を溶出する。
【０１５３】
脱塩／濃縮：
次いで、ゲル浸透カラム（ＮＡＰ−５，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で試料を脱塩する。１ｍＬの容量での溶出後、凍結乾燥によって試料を濃縮し、次いで、蒸留水１３０μＬ中に採取する。
【０１５４】
脱重合化。
【０１５５】
ＨＰＬＣ分析のために、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｇｒａｍｐｉａｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ）の混合物で、ＧＡＧを脱重合化した。リン酸緩衝液中で、０．５ＩＵ／ｍＬになるように各ヘパリナーゼ溶液を調整する。各ヘパリナーゼ溶液の容量に対して１／３容量を混合することによって、ヘパリナーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの溶液を調製する。試料１００μＬを分析する場合、蒸留水３０ｍＬ当り、ヘパリナーゼ混合物１５μＬ及び１００％酢酸（Ｐｒｏｌａｂｏ）０．７３ｍＬを含有する酢酸緩衝液１０μＬ、ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）１２．５ｍｇ及び酢酸カルシウム（Ｐｒｏｌａｂｏ）３９．５ｍｇを添加する。
【０１５６】
ＨＰＬＣ分析
次いで、Ｗａｔｅｒｓ  ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＳＡＸ  ５μｍ、２５０×３ｍｍ、ｔｈｅｒｍｏｈｙｐｅｒｓｉｌカラム上でのＨＰＬＣによって、試料を分析する。分析当り試料５０μＬを注入する。移動相用の緩衝液は、２．５Ｍリン酸二水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｐｒｏｌａｂｏ）から構成され、そのｐＨは、オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４、Ｐｒｏｌａｂｏ）で２．９となるように調整される。細胞試料から抽出されたＧＡＧを構成する二糖の溶出は、５０分にわたる、１Ｍ過塩素酸（ＮａＣｌＯ４、Ｐｒｏｌａｂｏ）を含有する２．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液の０から１００％へのグラジエントで実施される。二糖は、それらの保持時間を用いて、及び２３４ｎｍでのＵＶ下での標準ヘパリン試料（Ａｖｅｎｔｉｓ）に関して検出される。
【０１５７】
ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞をＳＣＦの不存在下で培養すると、ＳＣＦの存在下で培養される対照細胞と比較して、ヘパリン特性は改善される。
【０１５８】
出願人は特定の理論に拘泥することはないが、ＳＣＦの不存在下で増殖する細胞を取得する際に実施された細胞選択を通じて、又はＳＣＦの存在下若しくは不存在下での肥満細胞の成熟化の差を通じて、この現象を説明することが可能である。実際に、ＳＣＦは、細胞の増殖を可能とするが、細胞分化にも関与している。
【０１５９】
（実施例３）
限界希釈によるクローニングを用いたＭＣｐＢＸＬ２０１５クローンの取得
ＳＣＦを欠如する培地中での限界希釈技術により、ＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞をクローニングした。このために、１０個の９６ウェルプレートに、０．３細胞／１００μＬ／ウェルを播種した。９６ウェルプレート中で満足な増殖を示すクローンのみを選択し、増幅した。一旦、集密状態に達したら、クローンを回収した後、４８ウェルプレート中に培地５００μＬを播種し、次いで、培地２ｍＬを６ウェルプレート中に播種し、最後に培地５ｍＬをＦ２５中に播種する。
【０１６０】
この増幅の終了時に、３〜４日ごとの計数及び２×１０５Ｃ／ｍＬでの播種後、９つのクローンを取得し、増幅した。
【０１６１】
増殖の分析及び肥満細胞のプロテオグリカン組成の分析後、クローンの最終選択を行った。
【０１６２】
原ＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物及び得られた９つのクローンを用いて、増殖の比較研究を実施した。全てのクローンは、クローニングされていないＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物と同等の増殖を示す（図３）。
【０１６３】
培養の４日後、様々なクローンのプロテオグリカン組成を分析するために、試料を採取した。
【０１６４】
表２に要約されたＨＰＬＣの結果に従い、各クローンによって合成された多糖は、ヘパリン鎖を構成する各二糖の相対量の変動（例えば、Ｉｓ二糖の割合が、クローンに従って、５から３０％まで変動する。）を有する、ヘパリン型特性を示す。しかしながら、クローニングされていないＭＸｐＢＸＬ２０１５集団同様、全てのクローンは、検出の閾値を下回る３−Ｏ−硫酸化の程度を示す（ＩＩａＩＩｓｇｌｕ四糖は検出できない。）。
【０１６５】
ヘパリン類似物質の生産性及び生産に対する質の基準に基づいて、ＭＣ  ｐＢＸＬ２０１５クローン６−Ｇ４を選択した。このクローンは、ＰＭＣ１２５の名称で凍結した。
【０１６６】
（実施例４）
増加した３−Ｏ−硫酸化活性を有するＳＣＦ非依存性株の生成
肥満細胞培養物から得られたヘパリン型化合物の生物活性を増加させるために、３−ＯＳＴ−１（３  Ｏ−スルファターゼ−１）をコードする遺伝子を安定に過剰発現することが可能である。本実施例では、ブタの遺伝子を使用した。
【０１６７】
使用した肥満細胞は、実施例３に記載したＰＭＣ１２５培養物から得た。
【０１６８】
肥満細胞は、１５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎｇ／ｍＬ  ｒｐＩＬ−３（Ｂｉｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を補充したＭＥＭα培地中で培養する。この培地は、培地２と称される。５％ＣＯ２下、３７℃で、細胞をインキュベートし、３〜４日ごとに継代した。
【０１６９】
ブタ３−ＯＳＴ１をコードするＨＳ３ＳＴ１−ｐＥ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ２−は、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓ．Ａ．の名前で出願された出願ＰＣＴ／ＦＲ０４／００９０２に記載した。残留物として、プラスミドＨＳ３ＳＴ１−ｐＥ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ２が、以下のように得られた。
【０１７０】
ブタ３−ＯＳＴ遺伝子の３’コード配列の単離及び配列決定
３−ＯＳＴをコードするブタ遺伝子の部分配列は、ＥＳＴライブラリー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＦ０７５４８３）で入手可能である。この配列の、ヒト配列とのアラインメントによって、３’コード領域の約６５０ｂｐを欠如していることが示される。
【０１７１】
ブタ３−ＯＳＴ遺伝子中の欠落部分は、ＲＮＡ源として、トリゾールキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従って単離されたブタ肝臓ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ及び３’−ＲＡＣＥを組み合わせることによって同定された。
【０１７２】
全ＲＮＡ２μｇのｃＤＮＡへの逆転写は、それぞれ、配列番号１０の配列５’−ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＧＧ−３’及び配列番号１１の配列５’−ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＹＣＡ  ＧＴＣ  ＲＡＡ  ＴＧＴ  ＴＣ−３’の、オリゴヌクレオチドＢＳ０２とＢＳ０３の混合物をプライマーとして使用して、第１鎖合成システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従うことによって実施した。
【０１７３】
次いで、ＫＯＤホットスタートポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いる、配列番号１２の配列５’−ＣＧＧ  ＮＧＡ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＮＡＴ  ＣＡＧ−３’のセンスプライマーＢＳ０５及び配列番号１３の配列５’−ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＹＣＡ  ＧＴＣ  ＲＡＡ  ＴＧＴ  ＴＣ−３’の配列のアンチセンスプライマーＢＳ０６の存在下でのＰＣＲによって、これらのｃＤＮＡの２μＬを増幅した。３０のサーマルサイクル（９８℃での変性１５秒、６０℃でのハイブリダイゼーション３０秒、及び６８℃での伸長３０秒、２７７ｂｐの増幅された断片を、ベクターｐＣＲ−ブラントＩＩ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ゼロブラントＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット）中にクローニングした後、配列決定した。
【０１７４】
３’−ＲＡＣＥによって、３’領域全体を単離するために、２つのプライマーＢＳ２１及びＢＳ２２を生成するために、この断片の配列を使用した。
【０１７５】
３’−ＲＡＣＥでは、配列番号１４の配列（５’−ＡＴＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＴＶＮ−３’）のオリゴｄＴ  ＣＤＳＩＩＩをプライマーとして使用し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの第１鎖合成システムキットのプロトコールに従って、ブタ肝臓ＲＮＡ１μＬをｃＤＮＡへ逆転写した。
【０１７６】
次いで、２つの連続するＰＣＲによって、３−ＯＳＴをコードする遺伝子の３’領域を増幅した。第１のＰＣＲは、配列番号１５の配列５’−ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＧＡ  ＣＣＣ  Ｃ−３’のセンスプライマーＢＳ２１及びアンチセンスプライマーＣＤＳＩＩＩを用いて、上で得られたｃＤＮＡの２μＬに対して行った。３０のサーマルサイクル（９４℃での変性１０秒、６０℃でのハイブリダイゼーション３０秒、及び６８℃での伸長１２０秒）を適用した。次いで、第２のＰＣＲは、配列番号１６の配列５’−ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＣＧ−３’のセンスプライマーＢＳ２２及びアンチセンスプライマーＣＤＳＩＩＩを使用し、第１のＰＣＲから得られた産物１μＬを用いて、第１のＰＣＲと同じ条件下で実施した。
【０１７７】
３’−ＲＡＣＥの終了時にこのようにして得られたＰＣＲ産物の配列決定によって、ブタ３−ＯＳＴの３’配列及び非コード領域の約２５０ｂｐを同定することが可能となった。
【０１７８】
ブタ３−ＯＳＴ遺伝子の完全なコーディング相の単離
ブタ３−ＯＳＴの完全なコーディング相をクローニングするために、第１の工程で得られた情報を用いて、さらなるＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。ＲＮＡ源は、前工程と同じである。
【０１７９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの第１鎖合成システムキットのプロトコールに従い、オリゴヌクレオチドｄＴ２４をプライマーとして使用して、ＲＮＡの２μｇをｃＤＮＡへと逆転写した。
【０１８０】
次いで、２段階のＰＣＲによって、３−ＯＳＴをコードする遺伝子を増幅した。第１のＰＣＲによって、遺伝子の３’非コード配列の一部を含む遺伝子を増幅することが可能となり、次いで、第２のＰＣＲによって、Ｇａｔｅｗａｙシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と適合性のあるプライマーを用いて、コード配列を増幅することが可能となった。
【０１８１】
第１のＰＣＲは、ブタ３−ＯＳＴ遺伝子の５’非コード領域中に特異的にハイブリダイズする配列５’−ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＡＧＴ−３’のセンスプライマーＢＳ１０、及びＵＴＲ中の３’位に特異的にハイブリダイズする配列５’−ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＡＴＴ  ＴＡＣ−３’のアンチセンスプライマーＢＳ３０を用いて、ｃＤＮＡの２μＬに対して実施した。３５のサーマルサイクル（９８℃での変性１０秒、６４℃でのハイブリダイゼーション３０秒、及び６８℃での伸長１５０秒）を適用した。
【０１８２】
次いで、コーディング相を特異的に増幅するために、ＰＣＲ産物の１μＬに対して第２のＰＣＲを実施した。このために、配列番号１７の配列５’−ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ−３’のセンスプライマーＢＳ３１及び配列番号１８の配列５’−ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  Ｃ−３’のアンチセンスプライマーＢＳ３２を使用する。使用したＰＣＲプログラムは、第１のＰＣＲに対して使用したものと同一である。
【０１８３】
次いで、ＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎのＧａｔｅｗａｙクローニング技術キットの手順に従って、エピソームベクターｐＥ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ２中に、１ｋｂのＰＣＲ産物をクローニングした。配列決定によって、ブタ遺伝子の配列を確認した。得られたヌクレオチド配列は、配列番号５の配列である。推測されるタンパク質配列は、配列番号６である。
【０１８４】
プラスミドｐＢＸＬ２０３３の取得
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ＧＣ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコールに従って、配列番号１９の配列５’−ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＣＣ−３’のセンスプライマーＣ２１７５５及び配列番号２０の配列５’−ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＴＣ−３’のアンチセンスプライマーＣ２１７５６の存在下で、プラスミドＨＳ３ＳＴ１−ｐＥ−ＩＲＥＳ−ｎｅｏ２から、ＰＣＲによって、ブタ３−ＯＳＴ１遺伝子を増幅した。２５のサーマルサイクル（９４℃での変性３０秒、５８℃でのハイブリダイゼーション４５秒及び６８℃で伸長４５秒）の後、ＱｕｉａｇｅｎのＱｕｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットのプロトコールに従って、ＰＣＲ反応物を精製する。次いで、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、３７℃で４時間、全てのＰＣＲ産物を消化する。次いで、ＱｕｉａｇｅｎのＱｕｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットのプロトコールに従って、１×ＴＢＥ  １％アガロースゲル上での移動後、消化産物を精製する。このようにして消化されたＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩで開環されたベクターｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ中にクローニングする。
【０１８５】
ｃＤＮＡの完全な配列決定の後、得られたプラスミドは、ｐＢＸＬ２０３２と称された。
【０１８６】
ブタ３−ＯＳＴ１  ｃＤＮＡを得るために、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩで、プラスミドｐＢＸＬ２０３２を消化した。
【０１８７】
ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩで開環されたプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、ｃＤＮＡ断片をクローニングした。このようにして得られたプラスミドは、ｐＢＸＬ２０３３と称した。
【０１８８】
形質移入用のＤＮＡ調製物は、「無内毒素プラスミド（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｅｅ  ｐｌａｓｍｉｄ）」キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて実施した。
【０１８９】
ゲネチシン耐性集団の形質移入−選択
指数増殖期にある、培養の３日後の、５×１０６個の肥満細胞を、１０００ｒｐｍで遠心し、核穿孔溶液８３５１（Ａｍａｘａ）１００μＬ中に採取する。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１又はｐＢＸＬ２０３３の４μｇを、細胞懸濁液に添加する。次いで、細胞を電気穿孔キュベット中に移し、電気ショック：プログラムＵ−２８（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ，Ａｍａｘａ）に供する。
【０１９０】
電気穿孔後、予め３７℃まで加熱された培地２の２ｍＬ中に細胞を移し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で、６ウェルプレート中においてインキュベートする。形質移入から４８時間後、細胞を計数し、遠心し、選択培地（０．８ｍｇ／ｍＬの濃度で、ゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した培地２）中に、２×１０５Ｃ／ｍＬで播種する。
【０１９１】
選択の適用から２０日後に、ゲネチシン耐性細胞集団を得た。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１を安定に形質移入されたＰＭＣ１２５細胞は、ＰＭＣ１２５ｐｃＤＮＡ３．１と称され、プラスミドｐＢＸＬ２０３３を安定に形質移入された細胞は、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３と称される。
【０１９２】
細胞培養物は、選択培地中で培養して維持される。
【０１９３】
培養物中に含有されるプロテオグリカンのＨＰＬＣによる特徴決定
ＰＭＣ１２５ｐｃＤＮＡ３．１対照肥満細胞及びＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３肥満細胞によって産生されたプロテオグリカンの３−Ｏ−硫酸化の程度の分析によって、３−ＯＳＴ１の機能性を評価した。３−Ｏ−硫酸化の程度は、３−Ｏ−硫酸化を明らかにするＩＩａＩＩｓｇｌｕ四糖の量を定量することによってモニターすることが可能である。
【０１９４】
このために、選択の適用から３週後に、２×１０５Ｃ／ｍＬでの培養物の播種から４日後に、試料を採取した。
【０１９５】
ＰＭＣ１２５ｐｃＤＮＡ３．１対照細胞によって産生されたプロテオグリカンは、ＩＩａＩＩｓｇｌｕ四糖の検出可能な量を含有していない（表３）。他方、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３細胞によって合成されたプロテオグリカンは、ＩＩａＩＩｓｇｌｕの０．９％を含有し、これらの培養物中での３−Ｏ−硫酸化の程度の著しい増加を明らかにする。
【０１９６】
これらの結果は、肥満細胞中に過剰発現されたブタ３−ＯＳＴ１が機能的である、すなわち、３−Ｏ−硫酸化を誘導することを示している。
【０１９７】
次いで、これらの試料の生物活性を調べた。このために、抗Ｘａ及び抗ＩＩａ活性を測定した。
【０１９８】
培養物中に含有されるプロテオグリカンの生物活性の特徴決定
第Ｘａ因子及び第ＩＩａの不活性化は、ヘパリンに特徴的であり、ヘパリンを、ヘパラン硫酸及びデルマタンを区別することを可能とする。使用される方法は、「Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）の論文に記載されている方法である。
【０１９９】
反応は、３段階で起こる。
【０２００】
１：ＡＴＩＩＩ＋ヘパリン  ［ＡＴＩＩＩ−ヘパリン］
２：［ＡＴＩＩＩ−ヘパリン］＋残存する過剰の因子  ［ＡＴＩＩＩ−ヘパリン−因子］＋因子
３：残りの因子＋発色団基質  着色したｐ−ニトロアニリン
放出されたｐ−ニトロアニリンの量は、ヘパリンの量に反比例する。
【０２０１】
抗−Ｘａ及び抗−ＩＩａの量は、ＳＰＩＭ標準（標準国際的ヘパリン）を用いて確定された検量線に関して測定する。本方法の感度は、０．００６ＩＵ／ｍＬである。
【０２０２】
生物活性は、ＩＵ／ｍｇで表され、ＨＰＬＣによって得られた二糖の定量を考慮に入れる。
【０２０３】
ＨＰＬＣによって分析されたものと同じ試料の生物活性が求められた。
【０２０４】
ＰＭＣ１２５ｐｃＤＮＡ３．１対照細胞によって合成されたプロテオグリカンは、検出可能な生物活性を示さない。他方、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３細胞によって産生されたプロテオグリカンの活性の分析は、６０と８０ＩＵ／ｍｇの間の抗Ｘａ及び抗ＩＩａ生物活性の存在を明らかにする（表３）。
【０２０５】
培養のこの段階で（すなわち、播種から４日後）、２つの活性の比は１に近く、これは、ブタの腸粘膜からの抽出から得られるヘパリンに特徴的であることが注目される。
【０２０６】
これらの結果は、ＩＩａＩＩｓｇｌｕ及び抗Ｘａ生物活性の出現をもたらす３−ＯＳＴ１の発現の有効性をさらに示している。
【０２０７】
（実施例４）
限界希釈によるクローニングを用いたＭＣｐＢＸＬ２０３３クローンの取得
限界希釈技術により、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３細胞をクローニングした。このために、２０個の９６ウェルプレートに、０．３細胞／１００μＬ／ウェルを播種した。９６ウェルプレート中で満足な増殖を示すクローンのみを選択し、増幅した。一旦、集密状態に達したら、クローンを回収した後、２４ウェルプレート中に培地０．５又は１ｍＬを播種し、１２ウェルプレート中に培地２ｍＬを播種し、次いで、培地４ｍＬを６ウェルプレート中に播種し、最後に培地１０ｍＬをＦ２５に播種する。
【０２０８】
この増幅の終了時に、３〜４日ごとの計数及び２×１０５Ｃ／ｍＬでの播種後、１５６のクローンを取得し、増幅した。
【０２０９】
合成されたプロテオグリカンの第１の分析は、３−Ｏ−硫酸化活性を示すクローンを同定するために、ＨＰＬＣによって実施した。この第１の研究が終了した時点で、調べた１５６のうち２５のクローンのみが、ＨＰＬＣによって陽性であった。次いで、合成されたプロテオグリカンの生物活性を測定するために、これらの２５個のクローンを分析した。この第２の分析の終了の時点で、僅か１９個のクローンが保存されていた。
【０２１０】
２つの分析の終了時に選択された１９個のクローンは、３−Ｏ−硫酸化の増加した程度を示すプロテオグリカンを産生する。
【０２１１】
原ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３培養物及び得られた１２個のクローンに対して、増殖の比較研究を実施した。
【０２１２】
研究したクローンの全てに対して、細胞の増殖が観察された（図５）。
【０２１３】
増殖曲線の最後に、様々なクローンのプロテオグリカンを分析するために、試料を採取した。
【０２１４】
ＨＰＬＣによるクローンによって合成されたプロテオグリカンの分析は、全てのクローンが３−Ｏ−硫酸化を共通に有するプロテオグリカンを産生するが、それらの組成が変動することを示している（表４）。同様に、プロテオグリカンの抗−Ｘａ生物活性は、１７と１００ＩＵ／ｍｇの間で、分析されるクローンに従って変動する（表５）。
【０２１５】
産生されたプロテオグリカンの増殖の基準及び品質を考慮に入れて、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３クローン１９−Ｄ４を選択した。
【０２１６】
ほぼ５ヶ月間、ＰＭＣ１２５ｐＢＸＬ２０３３クローン１９−Ｄ４の安定性をモニターした。このモニタリングによって、（ＨＰＬＣ分析によって測定される）生産性、（ＩＩａＩＩｓｇｌｕ四糖をモニタリングすることによって測定される）３−Ｏ−硫酸化の程度及び産物の生物活性などのパラメータが、細胞増殖と同様に、この期間中安定であることが示された（図６）。
【０２１７】
【表１】
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【０２１８】
【表２】
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【０２１９】
【表３】
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【０２２０】
【表４】
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【０２２１】
【表５】
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【０２２２】
本願の図面は、以下のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】ヘパリンのＮ硫酸化された二糖に対応するＩｓ、ＩＩｓ、ＩＩＩｓ及びＩＶｓ二糖の化学構造、アセチル化された相同な二糖Ｉａ、ＩＩａ、ＩＩＩａ及びＩＶａの化学構造、及びＩＩａ  ＩＩｓ  ｇｌｕ及びＩＩａ  ＩＶｓ  ｇｌｕ四糖の化学構造。
【図２Ａ】ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物の分子分析。図２Ａ−ゲノムＰＣＲ。図２Ｂ−ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照培養物から（１）又はＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物から（２）抽出されたＲＮＡに対して、逆転者酵素の不存在下（−）又は存在下（＋）で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｃ：対照ｐＢＸＬ２０１５プラスミドＤＮＡ）。
【図２Ｂ】ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ及びＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物の分子分析。図２Ａ−ゲノムＰＣＲ。図２Ｂ−ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照培養物から（１）又はＭＣｐＢＸＬ２０１５培養物から（２）抽出されたＲＮＡに対して、逆転者酵素の不存在下（−）又は存在下（＋）で、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（Ｃ：対照ｐＢＸＬ２０１５プラスミドＤＮＡ）。
【図３Ａ】図３Ａ：無ＳＣＦ培地中での、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞及びＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖。図３Ｂ：ＳＣＦの存在下にあるＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞の増殖の、無ＳＣＦ培地中のＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖との比較。
【図３Ｂ】図３Ａ：無ＳＣＦ培地中での、ＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞及びＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖。図３Ｂ：ＳＣＦの存在下にあるＭＣｐｃＤＮＡ３．１／ハイグロ対照細胞の増殖の、無ＳＣＦ培地中のＭＣｐＢＸＬ２０１５細胞の増殖との比較。
【図４】原ＭＣｐＢＸＬ２０１５培養及びＭＣｐＢＸＬ２０１５クローンに対する成長曲線。
【図５】原ＰＭ１２５培養及びＰＭＣ１２５  ｐＢＸＬ２０３３クローンに対する成長曲線。
【図６】ＰＭＣ１２５  ｐＢＸＬ２０３３クローン１９−Ｄ４による、経時的なプロテオグリカン産生の安定性の研究。細胞と同じ条件下で抽出及び分離された粘膜を、対照として導入する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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