(57)【要約】  本発明は、ライゲーション部位のところにアミド結合を有するライゲーション生成物を得るために、カルボキシチオエステルを含む第一の成分と、脱着性のチオールオグジュアリーを含む分岐鎖側鎖を有するアミノ官能性化合物を含む第二の成分とを含む方法及び組成物に向けられている。本発明の反応体は化学選択的であり、そしてチオール部分を、上記ライゲーション部分から外すことができる。チオールの脱離を利用し、上記ライゲーション部位のところで、天然の側鎖を生成させることができる。本発明の方法及び組成物は、ペプチド及びポリペプチドのライゲーション向けに特に有用である。本発明のライゲーション系は、多種多様の分子に適合することができ、そしてペプチド、ポリペプチド及び他のアミノ酸含有ポリマーを生成させるために利用することができる。
2008543803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド結合により成分を連結させる方法であって、
当該方法は、下記段階；
（ａ）次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）ＳＲ
の成分を、次の式：
ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
の成分と、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
を有するチオール置換ライゲーション生成物を生成するために十分な条件の下で接触させる段階；
を含み、
式中、
Ｊ1は、第一のターゲット分子、ポリマー又は表面の残基であり；
Ｒは、チオエステルに適合する基であり；
ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを有する分岐鎖アミノ酸側鎖であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、ここで、Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基であり；そして
Ｊ2は、第二のターゲット分子、ポリマー又は表面の残基である。
【請求項２】
次の段階；
（ｂ）前記チオールオグジュアリーを外し、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＨ）−Ｊ2
（式中、ＸＨは、−ＣＨ2（Ｒ’）及び−ＣＨ2−ＣＨ2（Ｒ’）から成る基から選択される式を有するアミノ酸側鎖である）
のライゲーション生成物を生成させる段階；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｊ1及びＪ2が同一又は異なり、そしてペプチド、ポリマー及び表面の残基から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｊ1がペプチドの残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
−Ｃ（Ｏ）ＳＲが、前記ペプチドのＣ−末端のところにある、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｊ2がペプチドの残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−が前記ペプチドのＮ−末端のところにある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｘがβ−分岐鎖アミノ酸の側鎖である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記β−分岐鎖アミノ酸が、フェニルシステインである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フェニルシステインが、ｓｙｎ−フェニルシステインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
次の式：
Ｐ1−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（式中、Ｐ1は脱着性のアミノ保護基又は水素であり、
ＸＳＨは、分岐鎖アミノ酸側鎖成分であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、ここで、Ｒ’は水素であり、そして前記チオールオグジュアリーを外した後に生成する残基ＣＨ2Ｒ’及びＣＨ2ＣＨ2Ｒ’は、アミノ酸の側鎖であり；そして
Ｊ2は、ターゲット分子、ポリマー又は表面の残基である）
を有する成分。
【請求項１２】
Ｊ2が、小分子、ポリマー及び表面の残基から成る群から選択される、請求項１１に記載の成分。
【請求項１３】
Ｊ2がペプチドの残基である、請求項１１に記載の成分。
【請求項１４】
Ｐ1−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−が前記ペプチドのＮ−末端のところにある、請求項１３に記載の成分。
【請求項１５】
Ｘがβ−分岐鎖アミノ酸の側鎖である、請求項１４に記載の成分。
【請求項１６】
前記β−分岐鎖アミノ酸が、フェニルシステインである、請求項１５に記載の成分。
【請求項１７】
前記フェニルシステインが、ｓｙｎ−フェニルシステインである、請求項１６に記載の成分。
【請求項１８】
次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（式中、Ｊ1は第一のライゲーション成分の残基であり；
ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを有する分岐鎖アミノ酸側鎖であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、ここで、Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基であり；そして
Ｊ2は、第二のライゲーション成分の残基である）
を有するライゲーション生成物。
【請求項１９】
Ｊ1及びＪ2が同一又は異なり、そして小分子、ポリマー及び表面の残基から成る群から選択される、請求項１８に記載の生成物。
【請求項２０】
Ｊ1がペプチドの残基である、請求項１８に記載の生成物。
【請求項２１】
Ｊ2がペプチドの残基である、請求項１８に記載の生成物。
【請求項２２】
ＸＳＨが、式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及びβ−分岐鎖アミノ酸の一部である、請求項１８に記載の生成物。
【請求項２３】
前記β−分岐鎖アミノ酸が、フェニルシステインである、請求項２２に記載の生成物。
【請求項２４】
前記フェニルシステインが、ｓｙｎ−フェニルシステインである、請求項２３に記載の生成物。
【請求項２５】
請求項１１に記載の成分を含むキット。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法により調製された、脱着性のチオールオグジュアリー及びライゲーション部位のところのアミド結合を有するライゲーション生成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、２００５年６月１６日に出願された米国仮出願番号第６０／６９１，３９６号の優先権を主張し、全ての目的において、その全体を参照し、本明細書に組み入れる。
発明の背景
【０００２】
ケミカルライゲーションには、第一の化学成分と、第二の化学成分との間の共有結合の形成が含まれる。上記第一及び第二の成分上に存在する、特有の相互に反応性の官能基を用いて、化学選択的なライゲーション反応を与えることができる。この目的において、いくつかの種類の化学反応を利用することができ、その例には、アミド生成ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９４，２６６，７７６−７７９；Ｋｅｎｔらの国際公開第９６／３４８７８号パンフレット；Ｋｅｎｔらの国際公開第９８／２８４３４号パンフレット；Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０２／２０５５７号パンフレット；及びＫｅｎｔらの国際公開第０２／２００３４号パンフレット）；オキシム生成ケミカルライゲーション（Ｒｏｓｅらの「Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９４，１１６，３０−３４）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９２，２５６，２２１−２２５）、チオエーテル生成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎらの「Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．」１９９５，３６，８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒらの「Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．」１９９４，５，３３３−３３８）、チアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇらの「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ」１９９８，９５，９１８４−９１８９；Ｔａｍらの国際公開第９５／００８４６号パンフレット；米国特許第，５８９，３５６号明細書）が含まれる。
【０００３】
最も広く用いられているアミド生成ライゲーションは、ネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）（Ｋｅｎｔらの国際公開第９６／３４８７８号パンフレット）と称されている。ネイティブケミカルライゲーションには、Ｃ−末端α−カルボキシチオエステル部分を有する、第一のペプチド又はポリペプチドセグメントと、Ｎ−末端システイン残基を有する第二のペプチド又はポリペプチドとの間の化学選択的反応が含まれる。チオール交換反応により、初期のチオエステル架橋中間体が生じ、当該中間体は、ライゲーション部位で天然アミド結合を与えるために自発的に転位する一方で、システイン側鎖チオールを再生させる。
【０００４】
ネイティブケミカルライゲーションは、複数の目的、例えば、ポリペプチド及びたんぱく質の固相上の合成（Ｃａｎｎｅらの国際公開第９８／５６８０７号パンフレット；Ｌｏｗらの国際公開第０４／１０５６８５号パンフレット）、膜ポリペプチド及びたんぱく質の合成、並びに困難なペプチドへの一般的なアクセス（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらの国際公開第００／１２５３６号パンフレット）、可溶性の受容体領域の合成（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．の国際公開第００／５３６２４号パンフレット）、ポリマー変性ペプチド及びたんぱく質の構造（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらの国際公開第０２／２００３３号パンフレット）、並びに水溶性保護基を用いた適用のための変性（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらの国際公開第０４／０６０９２５号パンフレット）、副反応の減少（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらの国際公開第０２／２００３３号パンフレット；Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０４／００７６６１号パンフレット）、保護基選択肢の拡張（Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒらの国際公開第０２／２００３３号パンフレット；Ｖｉｌｌａｉｎらの国際公開第０２／０９８９０２号パンフレット）、及び別のチオエステル生成戦略の促進（Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０２／１８４１７号パンフレット；Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０３／１０６６１５号パンフレット；Ｍｉｒａｎｄａらの国際公開第０４／０６１０９４号パンフレット；Ｍｉｒａｎｄａらの国際公開第０４／０１１４２４号パンフレット；Ｍｉｒａｎｄａ，Ｌ．の国際公開第０４／０６０８６３号パンフレット）のために適合されてきている。当初のＮＣＬ技法の主要な欠点は、Ｎ−末端システインの要求である、すなわち、当該要求により、ライゲーション部位においてシステインを有するペプチド及びポリペプチドセグメントの参加のみが可能となるのみである。
【０００５】
システイン以外の位置におけるアミド生成ケミカルライゲーションが報告されている。拡張型（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ネイティブケミカルライゲーション又はＥＮＣＬと称される一つのアプローチでは、Ｃ−末端カルボキシチオエステルを有する第一のペプチドを、ライゲーション後に脱着可能なＮ−末端アミノ置換化オグジュアリーチオール基を有する第二のペプチドセグメントと隣接させることを用いる（Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０２／２０５５７号パンフレット；Ｂｏｔｔｉらの国際公開第０３／０４２２３５号パンフレット）。擬（ｐｓｅｕｄｏ−）ネイティブケミカルライゲーション又はＰＮＣＬと称される第二のアプローチには、Ｃ−末端カルボキシチオエステルペプチドを、Ｎ−末端システインを有するペプチドセグメントと反応させ（ＮＣＬと同様）、「擬アミノ酸」を生成させるために、ライゲーション部位のところでシステインの側鎖チオールの化学的改質が続く（Ｋｅｎｔらの国際公開第０２／２００３４号パンフレット）。ＥＮＣＬ及びＰＮＣＬの欠点は、ライゲーション部位のところに用いられる特定のアミノ酸に関連する変わりやすい反応収率である。例えば、ＮＣＬと同様、ＥＮＣＬ及びＰＮＣＬアプローチは、β−分岐鎖アミノ酸（β−ｂｒａｎｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）が含まれるライゲーション部位においてあまりうまくいかない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、以前のアミド生成ライゲーション技法の代案を提供する、広く適用でき且つ強いケミカルライゲーション系が必要である。本発明は、これら及び他の必要性を取り扱う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、側鎖伸張型（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ケミカルライゲーションのための方法及び組成物に関する。有利には、上記ライゲーション反応は、反応速度が速く、そして高収率でライゲーション生成物を生成させる。
【０００８】
態様の一つによると、本発明は、アミド結合により成分を連結させる（ｌｉｇａｔｅ）方法を提供する。
当該方法は、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）ＳＲ
の成分を、次の式：
ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
の成分と、
次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
を有するチオール置換ライゲーション生成物を生成させるために十分な条件の下で接触させることを含み、
式中、Ｊ1は、第一のターゲット分子、ポリマー又は表面の残基であり、Ｒは、チオエステルに適合する基であり、ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを有する分岐鎖アミノ酸側鎖であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基であり、そしてＪ2は、第二のターゲット分子、ポリマー又は表面の残基である。
さらなる態様では、本発明はまた、チオールオグジュアリーを外し、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＨ）−Ｊ2
（式中、ＸＨは、−ＣＨ2（Ｒ’）及び−ＣＨ2−ＣＨ2（Ｒ’）から成る群から選択される式を有するアミノ酸側鎖である）
のライゲーション生成物を生成させる方法を提供する。
【０００９】
別の態様によると、本発明は、次の式：
Ｐ1−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（式中、Ｐ1は、脱着性のアミノ保護基又は水素であり；ＸＳＨは、分岐鎖アミノ酸側鎖成分であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、Ｒ’は水素以外であり、そしてチオールオグジュアリーを外した後に生成する残基ＣＨ2Ｒ’及びＣＨ2ＣＨ2Ｒ’は、アミノ酸の側鎖であり；そしてＪ2は、ターゲット分子、ポリマー又は表面の残基である）
を有する成分を提供する。
【００１０】
さらに別の態様によると、本発明は、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（式中、Ｊ1は、第一のライゲーション成分の残基であり、ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを有する分岐鎖アミノ酸側鎖であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基であり、そしてＪ2は、第二のライゲーション成分の残基である）
を有するライゲーション生成物を提供する。
【００１１】
図面及び特許請求の範囲を含む、本明細書の残りの部分を参照することにより、本発明の他の特徴及び優位性を理解することができるであろう。本発明のさらなる特徴及び優位性、並びに本発明の種々の実施形態の構造及び操作は、添付の図面及びスキームに関して下記に詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、広範囲のペプチド、ポリペプチド、他のポリマー及び他の分子の側鎖ケミカルライゲーションに関連する方法及び組成物に向けられている。特に、本発明は、成分を連結させ、アミド結合を生成させる方法を提供する。
【００１３】
Ｉ．定義
本明細書において、用語「ターゲット分子」は、小分子、ポリマー又は表面を指す。ターゲット分子は、一価又は多価であることができる。上記ターゲット分子は、少なくとも１００、そして最大１０，０００又は１０，０００超の分子量を有する有機分子（生物起源の分子、並びに無機成分を有する有機分子を含む）であることができる。典型的には、上記有機分子は、少なくとも１０００、さらに典型的には、約１０００〜２０００の範囲の分子量を有することができる。典型的には、上記ターゲット分子は、生物学的に重要なたんぱく質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、核酸、リポソーム又は治療薬である。小分子は、１，０００未満の分子量を有する分子を意味し、当該小分子は有機分子である。
【００１４】
用語「ポリマー」は、共有化学結合により結合した構造単位及び繰返し単位から成る長鎖の分子を意味する。当該繰返し単位は、低分子量〜中間分子量の小分子であり、そして重合の際にお互いに結合する。オリゴマーを含むポリマーは、合成ポリマー又は天然ポリマーでありうる。ポリマーの例には、たんぱく質、核酸、リポソーム及び炭水化物が含まれるが、これらに限定されるものではない。典型的には、ポリマーは、１０００超の分子量を有する。
【００１５】
本明細書において、用語「表面」は、２次元のマニホールドを指す。表面物質の例には、ガラス、プラスチック、金属、繊維、及び種々のクロマトグラフィー物質等の物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本明細書において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合により共有結合している２つ又は３つ以上のアミノ酸を指す。ペプチドは、天然形態及び組換型形態、並びにペプチド又はたんぱく質の他の非天然形態を意味することを目的とする。上記ペプチドの非天然形態は、類似の生物又は化学活性のために、天然ペプチド又はたんぱく質と十分に同一である。ペプチドは、２〜５０個のアミノ酸を有することが好ましい。たんぱく質は、典型的には、５０個超のアミノ酸を有することができる。
【００１７】
ペプチド分子内で用いられうるアミノ酸には、たんぱく質、例えば、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンの中に見出される天然アミノ酸が含まれる。用語「アミノ酸」には、天然アミノ酸の類似体、誘導体及び同属種がさらに含まれ、それらの１種又は２種以上が、ペプチド誘導体中に存在しうる。例えば、アミノ酸類似体は、適切な官能基を有する長い又は短い側鎖、すなわち種々の側鎖を有することができる。
【００１８】
また、アミノ酸の構造が立体異性体の形態を取りうる場合には、当該アミノ酸のＤ及びＬ立体異性体が含まれる。用語「ペプチド誘導体」は、ペプチド主鎖によく似るが、アミノ酸ではない分子（いわゆる、ペプチド模倣薬）、例えば、ベンゾジアゼピン分子を含む化合物をさらに含む（例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｇ．Ｌ．らの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９３，２６０，１９３７−１９４２を参照せよ）。
【００１９】
本明細書において、用語「チオエステル」は、次の一般式：
Ｒ20−Ｃ（Ｏ）Ｓ−Ｒ30
（式中、Ｒ20及びＲ30は、それぞれ独立して、小分子、ポリマー又は表面の残基である）
を有する、硫黄をアシル基と結合させて得られる化合物を指す。
本明細書において、用語「ＨＢＴＵ」は、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート、ペプチドカップリング剤を指す。
【００２０】
本明細書において用語「ＴＢＴＵ」は、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、ペプチドカップリング剤を指す。
本明細書において用語「ＴＣＥＰ」は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、水溶性還元剤を指す。
【００２１】
ＩＩ．一般
本発明は、側鎖伸張型ライゲーションに関連する方法及び組成物に向けられている。
態様のひとつでは、本発明の側鎖伸張型ライゲーション方法には、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）ＳＲ
の第一の成分を、次の式：
ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
の第二の成分と、当該第一及び第二の成分の間にアミド結合を生成させるため且つ次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
のチオール置換ライゲーション生成物を生成させるために十分な条件の下で接触させることが含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｊ1−は、第一のターゲット分子、ポリマー又は表面の残基であり、−Ｒは、チオエステルに適合する官能基を有する小分子、ポリマー又は表面の残基であることができ；Ｒ基には、アリール、ベンジル、アルキル及び硫黄保護基（「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に記載）が含まれるが、これらに限定されるものではなく；ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを含む所望による分岐鎖アミノ酸側であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択されるが、当該ＸＳＨは、式（ＣＨ3）2ＣＳＨ、
【化１】
2008543803.tif 000003
を有する基ではなく；Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基であり、そしてＪ2は、第二のターゲット分子の残基である。Ｊ1及び／又はＪ2に関する最小の長さは、少なくとも１０、１５、２０、３０又は４０の残基長を有することが好ましい場合がある。Ｒ’基の例には、アルキル、例えば、イソプロピル、メチル、エチル及びエチレン；アリール、例えば、フェニル及びヒドロキシルフェニル；アリルチオアルキル；カルバモイル（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）；カルバモイルアルキル；インドリル；ヒドロキシカルボニル；アミノアルキル；グアニジンアルキル；及びイミダゾリルが含まれるが、これらに限定されるものではない。当業者は、ライゲーション反応と干渉しうる官能基を、好適に保護できることを理解するであろう。
【００２２】
本発明はまた、上記チオールオグジュアリーを外して、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ’）−Ｊ2
のライゲーション生成物を生成させる段階をさらに含むことができる。
Ｊ1−、Ｒ’及び−Ｊ2は、上記規定の通りであることが好ましい。
【００２３】
本発明の組成物は、前駆体化合物、例えば、次の式：
Ｐ1−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
を含む成分、並びに次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
を有するチオール置換ライゲーション生成物を含む組成物に向けられている。
いくつかの好ましい実施形態では、Ｐ1は、脱着性のアミノ保護基又は水素であり；−ＣＨ（ＸＳＨ）、Ｊ1−及び−Ｊ2は、上記規定の通りである。好適なアミノ保護基は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に記載されている。別の態様では、本発明はまた、本発明の１種又は２種以上の成分、１種又は２種以上の組成物を含むキットに向けられている。
【００２４】
本発明の方法及び組成物は、アミド生成ケミカルライゲーションの範囲を拡張し、そして本発明の当初、中間及び最終生成物は、広範囲の使用を見出した。優位性の一つは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、核酸又は他の化学系部分、例えば、染料、ハプテン、炭水化物、脂質、固体支持体、生体適合性ポリマー又は他のポリマー等を含む広範囲の化学系部分と結合するために、上記式中のＪ1、Ｊ2又はＪ1及びＪ2の両方を構成するか、又は参加させることができることである。
【００２５】
別の優位性は、本発明のアミド生成ライゲーション化学系が強く、そして水性条件の範囲の下、中性ｐＨ付近の系内で実施することができることである。さらに別の優位性は、「ワンポット」ライゲーション及びチオールオグジュアリーの取り外しを実施する本発明の能力、並びに適合する条件下でそれらが存在する場合の他のチオール保護基を保持又は外す本発明の能力である。さらに別の優位性は、ライゲーション反応速度の速さと、ライゲーション生成物の収率の高さである。
【００２６】
ＩＩＩ．ライゲーションの方法
態様のひとつでは、本発明の方法は、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）ＳＲ
の第一の成分を、次の式：
ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
の第二の成分と、当該第一の及び第二の成分の間のアミド結合を生成させ且つ次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
のチオール置換ライゲーション生成物を生成させるために十分な条件の下で接触させることが含まれる。
実施形態の一つでは、上記方法は、上記チオールオグジュアリーを外し、次の式：
Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＨ）−Ｊ2
（式中、ＸＨは、−ＣＨ2（Ｒ’）及び−ＣＨ2−ＣＨ2（Ｒ’）から成る群から選択される式を有するアミノ酸側鎖である）
のライゲーション生成物を生成させる段階をさらに含むことができる。
上記方法を、次の通りに具体的に説明することができる。
（ａ）Ｊ1−Ｃ（Ｏ）ＳＲ＋ＮＨ2−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（ｂ）Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＳＨ）−Ｊ2
（ｃ）Ｊ1−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＸＨ）−Ｊ2
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｊ1−は、第一のターゲット分子の残基である。Ｊ1は、化学選択的なライゲーション反応に適合する任意の化学系部分、例えば、保護された又は保護されていないアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、他のポリマー、染料、架橋剤等であることができる。−Ｃ（Ｏ）−はカルボニル基であり、−Ｓ−は硫黄基であり、−Ｒはチオエステルに適合する官能基を有する小分子、ポリマー又は表面の残基である。Ｒ基の例には、アリール、ベンジル、アルキル、および硫黄保護基（「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９に記載）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
ある実施形態では、Ｒ基は、Ｃ1~15の官能化されたアルキル、直鎖又は分岐鎖；Ｃ1~15芳香族構造体；２０個のアミノ酸又はその誘導体；及び１０００超の分子量を有するペプチドであることができる。
−ＸＳＨは、脱着性のチオールオグジュアリーを含む分岐鎖アミノ酸側鎖であり、そして式−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのβ−メルカプトオグジュアリー及び式−ＣＨ2−ＣＨ（Ｒ’）−ＳＨのγ−メルカプトオグジュアリーから成る群から選択され、
式中、Ｒ’は、水素以外のアミノ酸側鎖の残基である。
Ｊ2は、第二のターゲット分子の残基である。ターゲット分子Ｊ1及びＪ2は、同一又は異なる、例えば、小分子、ポリマー又は表面の残基であることができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、Ｊ1及びＪ2は、それぞれ独立して、小分子、ポリマー又は表面の残基である。Ｊ1及び／又はＪ2に関する最小の長さは、少なくとも１０、１５、２０、３０、４０の残基長であることが好ましい。Ｊ1及び／又はＪ2に関する長さは、４５，５０，６０，７０，８０，９０又は１００の残基長であることができる。好ましいＪ1及びＪ2基の例には、所望により１種又は２種以上の保護されたアミノ酸側鎖を有することができるペプチド又はポリペプチドの残基が含まれる。上記ペプチド又はポリペプチドの残基は、天然アミノ酸、類似体、誘導体、同属種、非天然アミノ酸及びそれらの組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸から構成されうる。ペプチドの好ましい残基には、約１０〜２０、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜５０、４０〜６０、５０〜８０又は５０〜１００の範囲にわたるアミノ酸が含まれうる。
【００３０】
小分子の例には、恒久的な又は脱着性の保護基、染料、蛍光体、架橋剤、洗浄剤、トレーサ、小分子薬物及び種々の小さい有機物、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、脂質等が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリマーには、ペプチド、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、繊維等が含まれるが、これらに限定されるものではない。表面の例には、ガラス、プラスチック、金属、繊維、及び種々のクロマトグラフィー物質等の物質が含まれるが、これらに限定されるものではなく、そして官能化されたアミンを付着させるために好適なものが好ましい。
【００３１】
Ｒは、アリール、ベンジル、アルキル基及び硫黄保護基を含む（これらに限定されるものではない）、チオエステル基に適合する任意の基でありうる。Ｒの例には、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルチオエステル、及びメルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステルが含まれる（例えば、Ｄａｗｓｏｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９４，２６６，７７６−７７９；Ｃａｎｎｅらの「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．」１９９５，３６，１２１７−１２２０；Ｋｅｎｔらの国際公開第９６／３４８７８号パンフレット；Ｋｅｎｔらの国際公開第９８／２８４３４号パンフレット；Ｉｎｇｅｎｉｔｏらの「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」１９９９，１２１，１１３６９−１１３７４；及びＨａｃｋｅｎｇらの「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１９９９，９６，１００６８−１００７３を参照せよ）。他の例には、周知でもある、インテイン媒介生物系技法により生成できるジチオトレイトール又はアルキル若しくはアリールチオエステルが含まれる（例えば、Ｃｈｏｎｇらの「Ｇｅｎｅ」１９９７，１９２，２７７−２８１；Ｃｈｏｎｇらの「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９９８，２６，５１０９−５１１５；Ｅｖａｎｓらの「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９９８，７，２２５６−２２６４；及びＣｏｔｔｏｎらの「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９９，６，２４７−２５６を参照せよ）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、上記カルボキシチオエステルを、当業者に公知の技法（例えば、例に含まれる、本明細書に記載されるもの）に従う化学又は生物系方法により生成させることができる。化学合成において、カルボキシチオエステルペプチドを、溶液中で、又はチオエステル生成樹脂から合成することができる（当該技法は、周知である）（例えば、Ｄａｗｓｏｎらの上記；Ｃａｎｎｅらの上記；Ｈａｃｋｅｎｇらの上記、Ｈｏｊｏ  Ｈ，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．の「Ｂｕｌｌ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｊｐｎ」（１９９１）６４：１１１−１１７を参照せよ）。例えば、化学的に合成されたチオエステルペプチドを、同様に、チオエステル樹脂上で又は溶液中で合成することができる、対応するペプチド−α−チオ酸から製造することができるが、樹脂アプローチが好ましい。上記ペプチド−α−チオ酸を、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、又は任意種のアルキルチオエステルに転化させることができる。
【００３３】
これらのチオエステルの全ては、ライゲーション反応用の満足な離脱基を提供し、そして３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルは、対応するベンジルチオエステルよりも幾分速い反応速度を実証し、同様に、アルキルチオエステルよりもさらなる反応性を有する場合がある。別の例として、Ｃ−末端チオエステル（Ｈａｃｋｅｎｇらの上記を参照）を構成させるために、トリチルが結合したメルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステル生成樹脂を利用することができる。Ｃ−末端チオエステル合成はまた、ジアゾメタン又はヨードアセトニトリルとの活性化により、続いて好適なチオールと置換することにより、３−カルボキシプロパンスルホンアミドセイフティーキャッチ架橋剤を用いて達成することができる（Ｉｎｇｅｎｉｔｏらの上記；Ｓｈｉｎらの「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」（１９９９）１２１，１１６８４−１１６８９を参照せよ）。
【００３４】
求核条件、例えば、Ｆｍｏｃ系ペプチド合成を含む１又は２以上の段階を要求する合成のため（国際公開第０２／１８４１７号パンフレット；同第０３／１０６６１５号パンフレット）、又は上記チオエステル部分に近接して反応性を有する酸性基を有するチオエステル化合物のため（国際公開第０４／００７６６１号パンフレット）に、チオエステル化合物をまた構成させることができる。
【００３５】
ペプチド又はポリペプチドＣ−末端カルボキシチオエステルをまた、生物系工程を用いて製造することができる。アフィニティータグ等のラベルを有する又は有しないインテイン発現系等を利用して、Ｃ−末端チオエステルペプチド又はポリペプチドセグメントを生成させるために好適なチオールの存在下で、「インテイン」たんぱく質スプライシング要素の誘導性自己切断活性を開発することができる。特に、上記インテインは、Ｃ−末端チオエステルを有するペプチドセグメントを生成させる、チオール、例えば、ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエタンスルホン酸又はシステインの存在下で、特有の自己切断を受ける。例えば、Ｃｈｏｎｇらの上記（１９９７）；Ｃｈｏｎｇらの上記（１９９８）；Ｅｖａｎｓらの上記；そしてＣｏｔｔｏｎらの上記；国際公開第０３／１０６６１５号パンフレット；同第０２／０９８９０２号パンフレットを参照せよ。
【００３６】
本発明のチオール含有成分の、カルボキシチオエステル含有成分とのライゲーションにより、脱着性のチオールオグジュアリー及びライゲーション部位のところのアミド結合を有するライゲーション生成物が生成する。上記反応のライゲーション条件は、チオエステルの、チオール部分との選択的反応性を保持するように選択される。好ましい実施態様では、上記ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８を有する緩衝液中で実施され、そして好ましいｐＨ範囲は、６．５〜７．５である。上記緩衝液は、水性、有機又はそれらの混合物であることができる。上記ライゲーション反応はまた、１種若しくは２種以上の触媒及び／又は１種若しくは２種以上の還元剤、脂質、洗浄剤、他の変性剤又は可溶化試薬等を含むことができる。
【００３７】
好ましい触媒の例は、チオール、イミダゾール及びホスフィン含有部分、例えば、チオフェノール、ヒスチジン、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰ及びアルキルホスフィンである。変性剤及び／又は可溶化剤の例には、グアニジニウム、水又は有機溶媒、例えば、ＴＦＥ、ＨＦＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、水と混合したアセトニトリルのウレア、又は水中のグアニジニウム及びウレアが含まれる。当該温度をまた、上記ライゲーション反応の速度を調節するために利用することができ、その温度は、通常５℃〜５５℃であり、そして好ましい温度は、１５℃〜４０℃である。一例として、上記ライゲーション反応は、６．８〜７．８のｐＨにおいて、６Ｍのグアニジニウム中で、２％チオフェノールを有する反応系内で良好に進行する。
【００３８】
上記チオールオグジュアリー基の取り外しは、上記ライゲーション反応の完了後に実施されることが好ましい。好ましい方法では、スキームＩ（β−分岐鎖オグジュアリーチオール誘導体に関して具体的に説明する）に記載されるように、上記チオールがアルキル化され、続いて、チオールオグジュアリーが外されるライゲーション生成物を生成させるための加水分解が続き、そこでは、アルキル化は、ハライドで官能化されたアルキル基、例えば、ブロモアセトアミド又はヨードアセトアミドを用いて実施することが好ましい。アルキル化に続き（又はそれと並列）、スキームＩＩに具体的に説明するように、変性したチオールオグジュアリーを、例えば、亜鉛−酢酸を用いて加水分解により外し、チオール結合の開裂を促進し、上記ライゲーション部位のところに、安定化された、残基が置換されていない側鎖を生じさせる。
【００３９】
【化２】
2008543803.tif 000004
【００４０】
適切な場合には、１種若しくは２種以上の触媒及び／又は賦形剤をまた、開裂系、例えば、１種又は２種以上の捕捉剤、洗浄剤、溶媒、金属等の中で利用することができる。一般に、特定の捕捉剤の選択は、存在するアミノ酸によって決まる。例えば、開裂の際に生成するカルボニウムイオンが一定のアミノ酸（例えば、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）を保有する捕捉剤の存在を用いて、損傷効果を抑制することができる。溶解性を調節して開裂を改良するために、洗浄剤、ポリマー、塩、有機溶媒等の他の添加剤をまた用いることができる。レドックス系を調節する触媒又は他の化学物質がまた、有利でありうる。
【００４１】
【化３】
2008543803.tif 000005
【００４２】
他の種々の物理化学的条件（例えば、緩衝系、ｐＨ及び温度）を慣例により調整して、所与の開裂系（例えば、ペプチドに適合する開裂条件）を最適化することができることがまた明白である。「ペプチドに適合する開裂条件」は、ペプチドに適合する物理化学的条件を意図し、そして上記ライゲーション生成物からチオール部分を開裂させるために好適である。ペプチドに適合する開裂条件は、慣例及び周知のアプローチにより容易に導き出すことができる、用いられるチオール部分によって選択されるのが一般的である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，」Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；及び「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，」Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４を参照せよ）。
【００４３】
本発明のライゲーション方法を、下記（これらに限定されるものではない）を含む種々の治療に重要なたんぱく質を調整するために用いることができる；単一クローン系及びポリクローン系抗体；抗ウイルス系たんぱく質；ホルモン、例えば、インスリン；サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、コロニー刺激因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；幹細胞成長因子；リンフォカイン；ＩＬ−２及びＩＬ−３；成長因子、例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ；ペプチドホルモン、例えば、ｈＧＨ及びエリスロポエチン；血液凝固因子、例えば、因子ＶＩＩＩ；イムノゲン；酵素及び酵素阻害物質；配位子；ワクチン抗原；血しょうたんぱく質、例えば、フィブリノゲン、免疫クロブリン又はその断片；酵素、例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター等。
【００４４】
ＩＶ．組成物
実施形態の一つでは、本発明の組成物は、脱着性のチオールオグジュアリーで置換された側鎖を有するβ−分岐鎖又はγ−分岐鎖アミノ酸残基、並びに前駆体、中間体、及び上記残基を含むライゲーション生成物を含む。
好ましいアミノ酸組成物には、次の式Ｉ：
【化４】
2008543803.tif 000006
のβ−分岐鎖チオールオグジュアリー（すなわち、２−メルカプトアミノ）が含まれる。
【００４５】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｊ1及びＪ2は、それぞれ独立して、小分子、ポリマー又は表面の残基であり；Ｒは、水素又はチオール保護基であり；Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素又は有機基であるが、Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つは有機基を含む。Ｒ1及びＲ2基の例には、アルキル、例えば、イソプロピル、メチル、エチル及びエチレン；アリール、例えば、フェニル及びヒドロキシルフェニル；アリルチオアルキル；カルバモイル（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2）；カルバモイルアルキル；インドリル；ヒドロキシカルボニル；アミノアルキル；グアニジンアルキル；及びイミダゾリル（但し、Ｒ1及びＲ2は同時にＣＨ3基でないか、又はＲ1及びＲ2が一緒になって５員又は６員の炭素環を形成しない）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
当業者は、ライゲーション反応と干渉しうる官能基を、好適に保護することができることを理解するであろう。小分子の例は、恒久的な又は脱着性の保護基、染料、蛍光体、架橋剤、洗浄剤、トレーサ、小分子薬物及び種々の小さい有機物、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、脂質等である。ポリマーには、ペプチド、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、繊維等が含まれる。表面の例は、ガラス、プラスチック、金属、繊維、及び種々のクロマトグラフィー物質等の物質を含み、そして好ましいのは、官能化されたアミノ酸を付着されるために好適なものである。
【００４７】
好ましいＪ1及びＪ2基の例には、所望により、１種又は２種以上の保護されたアミノ酸側鎖を含むペプチド又はポリペプチドの残基が含まれる。有機基の例には、グリシン以外のアミノ酸側鎖、特に、保護された又は保護されていない形態の標準的な２０個の遺伝的に符号化されたアミノ酸側鎖の成分が含まれる。式Ｉの化合物はまた、環状誘導体、例えば、Ｒ1及びＲ2で置換されたチアゾリジン誘導体を含むことができる。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、γ−分岐鎖チオールオグジュアリー（すなわち、３−メルカプトアミノ）を含むアミノ酸組成物に向けられており、そして次の式ＩＩ：
【化５】
2008543803.tif 000007
（式中、Ｊ1、Ｊ2、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、上記規定の通りである）
を含む。
【００４９】
本発明の式Ｉ及び式ＩＩに従う化合物の合成を、本明細書に記載されるように、そして当業界に公知である標準有機化学系技法に従って実施することができる。例えば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍａｒｃｈ（Ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ（Ｅｄ．），ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８９を参照せよ。それらを、溶液中で、ポリマーにより支持された合成により、又はそれらの組み合わせにより合成することができる。合成向けに利用する試薬を、複数の商業的な供給源から得ることができる。キット内等で提供される、当初成分及び種々の中間体、例えば、個々のアミノ酸誘導体を後の使用のために貯蔵することができる。
【００５０】
次の所望の化合物の精製又は分離の前に、所望の結合した化合物の純度は、上記ライゲーション組成物中で、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５及び１００％の純度であることが好ましい。
【００５１】
合成に、保護基の戦略を用いることができる。種々の合成戦略に利用される好ましい保護基（ＰＧ）は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）に適合するのが一般的である。また、場合によっては、種々の条件の下で脱着性であるオルトゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基を利用する必要がある。上記保護基の多くが、この目的において公知であり、そして好適である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗ．Ｄ．．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；及び「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ」ＰＪ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４）を参照せよ。例には、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｎｐｓ、ＦｍｏｃＣｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ；ＮＳＣ；ＭＳＣ、Ｄｄｅ等が含まれる。硫黄部分において、好適な保護基の例には、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル、Ａｃｍ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリル及びフェナシルが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
式Ｉに従う好ましい化合物は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びｐ−メチルベンジル（Ｐ−ＣＨ3−Ｃ6Ｈ4ＣＨ2−）により保護された誘導体に関して具体的に説明するように、ペプチド又は他の重要な合成物のための準備をした保護された誘導体として好都合に調製することができるスキームＩＩＩに従って合成された保護されたアミノ酸誘導体を含み、ここで、Ｒ’は、重要な、保護されている又は保護されていないアミノ酸である。例えば、Ｂｏｃ系ペプチド合成との適合性が望ましい場合、重要なアミノ酸側鎖、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）側鎖を、合成の間、保護しなくともよい一方で、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）側鎖は、Ｏ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２ＢｒＺ）基を有することができる。
【００５３】
スキームＩＩＩを参照すると、合成に、位置異性体（示されている）又は単一異性体を用いることができる。スキームＩＩＩによれば、一般に、トリフェニルホスフィンを、適切な溶媒（例えば、ＣＨ3ＣＮ）中の、１種又は２種以上の所望のアジドアルコールに添加し、続いて還流し、溶媒を除去し、そしてアジリジンを精製する。上記アジリジンを、適切な溶媒の中で、そして穏やかなルイス酸触媒（例えば、三フッ化ホウ素エーテラート）の存在下で、４−メチルベンジルチオールを付加させることにより、オグジュアリーチオールと共に変性する。次いで、上記所望のｐ−メチルベンゼンスルホニルにより保護された中間体を、有機層から一般的な方法により精製し、続いてＮ−末端保護基（例えば、Ｂｏｃ）を付加させ、そして標準的な方法によりカルボキシル基を脱保護することができる。
【００５４】
【化６】
2008543803.tif 000008
【００５５】
式ＩＩに従う好ましい化合物は、ペプチド又は他の重要な合成物のために準備をした保護された誘導体として好都合に調製することができるスキームＩに従って合成された、保護されたアミノ酸誘導体を含む。スキームＩを参照すると、（Ｅ）−フェニル４−（ｐ−トリルチオ）−４−Ｒ’−２−エノエートを、所望のアミノ酸側鎖Ｒ’（例えば、ベンジル／Ｐｈｅ側鎖）を用いて調製し、そしてＡＤ−ミックス−α及びメタンスルホンアミドの水性溶液に添加し、そして環状スルフェートを生成する。次いで、上記環状スルフェートを、アジドに転化させ、そしてスキームＩＩＩのようにさらに調製する。
【００５６】
本発明はまた、本発明の側鎖オグジュアリーチオール組成物の保護された形態を提供する。これらの化合物は、自動ペプチド合成並びにオルトゴナル及びコンバージェント（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）ライゲーション戦略に特に有用である。これらの組成物は、完全に保護された化合物、並びに部分的に保護された化合物を含む。上記保護基の多くは、この目的において公知であり、そして好適である（例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ  ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；「Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；及び「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ」ＰＪ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４）を参照せよ。
【００５７】
本発明の側鎖オグジュアリーチオール組成物を、種々のライゲーション方法、例えば、ネイティブケミカルライゲーション（Ｄａｗｓｏｎらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９４）２６６：７７６−７７９；Ｋｅｎｔらの国際公開第９６／３４８７８号パンフレット）、拡張型一般ケミカルライゲーション（Ｋｅｎｔらの国際公開第９８／２８４３４号パンフレット）、オキシム生成ケミカルライゲーション（Ｒｏｓｅらの「Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」（１９９４）１１６：３０−３３）、チオエステル生成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒらの「Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１９９２）２５６：２２１−２２５）、チオエーテル生成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎらの「Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．」（１９９５）３６（４８）：８８７１−８８７４）、ヒドラゾン生成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒらの「Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．」（１９９４）５（４）：３３３−３３８）、及びチアゾリジン生成ライゲーション及びオキサゾリジン生成ライゲーション（Ｚｈａｎｇらの「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」（１９９８）９５（１６）：９１８４−９１８９；Ｔａｍらの国際公開第９５／００８４６号パンフレット）又は他の方法（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．及びＤａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１，１２３，５２６−５３３（参照することにより本明細書に組み入れる）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎらの「Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．」２００１  ３（９）：１３３１−１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．らの「Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ」Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｍｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）と組み合わせて用いることができる。
【００５８】
本発明または、上記ライゲーション生成物上のグラフト化ポリマーの組成物を企図する。ペプチド又はたんぱく質の特性を、それらの上に有機鎖様分子をグラフトすることにより強化することができることが良好に評価されている。これらの分子は、ポリエチレングリコール系（「ＰＥＧ」系、すなわち、繰返し単位−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−に基づく）であることが多い。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉらの「Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」１９９４，８５，９−１２を参照せよ。ＰＥＧ系鎖は両親媒性であり、非免疫原性であり、そしてたんぱく質分解酵素による開裂の余地がない。ＰＥＧ又はＰＥＧ系鎖により変性されている物質を調製することにより、免疫原性及び抗原性が減る。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉらの「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９７７，２５２，３５７８−３５８１を参照せよ。ＰＥＧはまた、当該ＰＥＧが結合する物質の分子サイズを大きくし、それによりその生物学的半減期を長くするように作用する。
【００５９】
ＰＥＧにより変性された物質のこれらの有益な特性により、それらは、様々な治療用途で非常に有用となる。次の特許出願（参照することにより、本明細書に組み入れる）は、種々の生物学的に重要なたんぱく質のＰＥＧ系変性を報告している：米国特許第４，１７９，３３７号明細書；同４，６０９，５４６号明細書；同４，２６１，９７３号明細書；同４，０５５，６３５号明細書；同３，９６０，８３０号明細書；同４，４１５，６６５号明細書；同４，４１２，９８９号明細書；同４，００２，５３１号明細書；同４，４１４，１４７号明細書；同３，７８８，９４８号明細書；同４，７３２，８６３号明細書；及び同４，７４５，１８０号明細書；欧州特許第１５２，８４７号明細書；１９８４年１月１１日に発行された欧州特許第９８１１０号明細書；及びＪＰ５７９２４３５。ポリアミド鎖はまた、特性を強化するために有機鎖様分として有用である。さらに、げっ歯類の急性毒性スクリーニングにより、ポリアミドは、毒性も免疫原性も有しないことが示唆された（Ｈａｉらの「Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．」１９９８，９，６４５−６５４）。
【００６０】
たんぱく質上のＰＥＧ鎖又はＰＥＧ系鎖のグラフト化が知られている。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙの米国特許出願第５，１２２，６１４号明細書（Ｎ−スクシンイミドカーボネート誘導体に転化するＰＥＧが記載されている）を参照せよ。たんぱく質へのグラフト化を促進するため、反応性基を用いて変性したＰＥＧ鎖がまた公知である。例えば、Ｈａｒｒｉｓの米国特許出願第５，７３９，２０８号明細書（分子及び表面のチオール部分に選択的に付着するため、スルホン部分を用いて活性化したＰＥＧ誘導体を記載する）と、Ｈａｒｒｉｓらの米国特許出願第５，６７２，６６２号明細書（単一のプロピオン酸又はブタン酸部分を有するＰＥＧ酸の活性なエステルを開示する）を参照せよ。この分野は、ＺａｌｉｐｓｋｙのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，６，１５０−１６５（１９９５）に広くレビューされている。ＰＥＧの使用に加えて、Ｗｒｉｇｈｔの欧州特許出願第０  ６０５  ９６３号明細書には、たんぱく質上にアルデヒド基とのヒドラジン結合を生成する水溶性ポリマーを含む架橋試薬が記載されている。
【００６１】
本発明の方法及び組成物は、多くの用途を有する。本発明の方法及び組成物は、ペプチド、ポリペプチド及び他のポリマーを連結させるために特に有用である。
【実施例】
【００６２】
次の調製及び例は、当業者が、本発明をより明確に理解し、そして実施することができるように提供されている。次の調製及び例は、本発明の範囲を制限するものとしてみなされるべきではなく、それらの実例及び典型例としてみなされるべきである。
【００６３】
例１：一般的な物質及び方法
規格のプロトコルに従って、ＰＡＭ樹脂又はチオエステル生成樹脂上のＢＯＣ−ケミストリーのための、その場での中和／ＨＢＴＵアクチベーションプロトコルを用いるＳＰＰＳにより、変性したＡＢＩ  ４３３Ａ  ペプチド合成器上で、段階的な様式においてペプチドを合成した（Ｈａｃｋｅｎｇらの上記；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒらの「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．」１９９２，４０，１８０−１９３；及びＫｅｎｔの「Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１９８８，５７，９５７−９８４を参照せよ）。鎖アセンブリの後、上記ペプチドを脱保護化し、そして同時に、５％のｐ−クレゾールと共に無水のフッ化水素（ＨＦ）を用いて処理することにより開裂させ、そして凍結乾燥させ、そして分取ＨＰＬＣにより精製した。
【００６４】
例２：ａｎｔｉ−及びｓｙｎ−フェニルシステインの設計
本発明の側鎖伸張型ケミカルライゲーション方法に関する残基を初期に試験するので、ペプチド断片に導入されるべく用意される一又は複数のフェニルアラニン残基を構成させた。ベンジル位置上のメルカプタンの存在と共に、ライゲーション向けに用いることができる２種の、可能性のある幾何異性体が存在した。
【化７】
2008543803.tif 000009
【００６５】
同一側（ｓｙｎ−フェニルシステイン）又は反対側（ａｎｔｉ−フェニルシステイン）に２つの反応性部分（メルカプタン及びアミン）を有することにより、２種の異性体は、ライゲーション若しくは脱硫／開裂段階のどちらか、又はその両方において、異なる特性を有することができる。従って、上記２種の異性体の合成は、我々の戦略上用いるべき最良の異性体（ライゲーション及び開裂段階の両方）を見出すために必要である。
【００６６】
例３：（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸ベンジルエステルの調製
図２を参照すると、ベンジルシンナメート（１．６７ｇ、７ミリモル）を、室温において、ｔ−ＢｕＯＨ（ｍＬ）及び水（ｍＬ）中の、ＡＤ−ミックス−α（９．８ｇ）及びメタンスルホンアミド（６６６ｍｇ、７ミリモル）の撹拌された溶液に添加した。得られた混合物を、２４時間、室温で撹拌した。亜硫酸ナトリウム（１０．５ｇ）を添加し、そして当該混合物を、３０分間（ｍｎ）撹拌し、エチルアセテートで希釈し、そして水で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン、１／２）により、白い固体として、化合物１（１．５５ｇ、８１％）を得た。
【００６７】
例４：環状スルフェートの調製
図２及び３を参照すると、チオニルクロリド（２７５μＬ、３．７５ミリモル）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のジオール１（６８０ｍｇ、２．５ミリモル）及びトリエチルアミン（６９５μＬ、５ミリモル）の氷で冷却された撹拌溶液に、１０分の間、液滴として添加した。混合物を、１０〜１５分間撹拌し、冷却したエーテルで希釈し、そして冷水で洗浄した。水性層を、エーテルを用いて抽出した。混合した有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。未精製の環状スルファイトを、水（１４ｍＬ）、ＣＨ3ＣＮ（７ｍＬ）及びＣＣｌ4（７ｍＬ）の混合物中に溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム（８０２ｍｇ、３．７５ミリモル）及びＲｕＣｌ3水和物（触媒量）を添加し、そして得られた混合物を、室温で１時間力強く撹拌し、エーテルで希釈し、そして当該有機層をセライトのパッドを用いてろ過した。上記有機層を、水、飽和のＮａＨＣＯ3溶液及び塩性溶液を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／４）により、無色のオイルとして、化合物２（５６８ｍｇ、６３％）を得た。
【００６８】
例５：位置異性体（２Ｓ，３Ｓ）−２−アジド−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸ベンジルエステル及び（２Ｒ，３Ｒ）−３−アジド−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸ベンジルエステルの混合物の調製
図２を参照すると、固体としてＮａＮ3（１３８ｍｇ、２．１３ミリモル）を、アセトン（１０ｍＬ）及び水（１ｍＬ）中の環状スルフェート２（５６８ｍｇ、１．７ミリモル）の撹拌された溶液に添加した。当該反応混合物を、０℃で、５分間、次いで、室温で２時間撹拌し、そして減圧下で濃縮した。エーテル（７ｍＬ）及び水（２ｍＬ）を添加し、そして当該溶液を、０℃まで冷却し、続いて２０％Ｈ2ＳＯ4水性溶液（７ｍＬ）を添加した。得られた混合物を０℃で１時間撹拌し、次いで、室温までゆっくりと温め、そして室温で３時間撹拌した。当該有機層を収集し、飽和のＮａＨＣＯ3溶液及び水を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／４）により、白い固体として、位置異性体３ａ，ｂ（３８４ｍｇ、７６％）の混合物を得た。
【００６９】
例６：（２Ｓ，３Ｒ）−３−フェニルアジリジン−２−カルボン酸ベンジルエステルの調製
図２を参照すると、固体としてトリフェニルホスフィン（３５１ｍｇ、１．３４ミリモル）を、ＣＨ3ＣＮ（６ｍＬ）中のアジドアルコール３ａ，ｂ（３８４ｍｇ、１．２９ミリモル）の撹拌された溶液に、室温で添加した。当該混合物を、室温で１時間撹拌し、次いで６時間還流させた。溶媒を除去した後、純粋なアジリジン４（２５０ｍｇ、７７％）を、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／４）により、白い固体として単離した。
【００７０】
例７：（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−３−（４−メチルベンジルスルファニル）−３−フェニルプロピオン酸の調製
図２を参照すると、三フッ化ホウ素エーテラート（９５μＬ、０．７５ミリモル）を、０℃のジクロロメタン（５ｍＬ）中の、アジリジン４（１２５ｍｇ、０．５ミリモル）及び４−メチルベンジルチオール（１３５μＬ、１ミリモル）の撹拌された溶液に、液滴として添加した。混合物を、０℃で６〜８時間撹拌し、次いで、一晩中、室温までゆっくりと温めた。次いで、当該反応を、飽和のＮａＨＣＯ3を添加してクエンチさせ、そして有機層を塩性溶液、水を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／２）により、無色のオイルとして化合物５ａ（１５０ｍｇ、７７％）を得た。この生成物を、ＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解させた。当該溶液を、ＮＥｔ3（５４μＬ、０．３９ミリモル）を用いて処理し、そしてＢｏｃ2Ｏ（８４ｍｇ、０．３８ミリモル）を添加した。次いで、反応混合物を、室温で一晩中撹拌し、濃縮した。
【００７１】
未精製の残差を、ジオキサン（２．２ｍＬ）に溶解させ、そして４ＭのＮａＯＨ溶液（４７５μＬ、１．９０ミリモル）を添加した。得られた混合物を、室温で１７時間撹拌した。水を添加し、そして当該水性層を、エチルアセテートで抽出し、次いで、１ＭのＨＣｌ溶液を用いて酸性化し、そしてエチルアセテートを用いて抽出した。混合された有機層を、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／１）により、白い固体として、化合物（２Ｒ，３Ｓ）−６ａ（８５ｍｇ、６２％）を得た。
【００７２】
例８：（２Ｓ，３Ｒ）−３−ブロモ−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸ベンジルエステルの調製
図２及び図３を参照すると、固体のＬｉＢｒ（２．０７ｇ、２３．８９ミリモル）を、ＴＨＦ（８８ｍＬ）中の環状スルフェート２（２．１ｇ、６．２９ミリモル）の撹拌された溶液に、室温で添加した。得られた混合物を、室温で一晩中撹拌し、次いで濃縮した。エーテル（３０ｍＬ）及び水（５ｍＬ）を添加し、そして当該溶液を０℃まで冷却し、次いで２０％Ｈ2ＳＯ4水性溶液（４０ｍＬ）を液滴として添加した。当該混合物を、０℃で２〜３時間、次いで室温で６時間撹拌した。当該有機層を収集し、飽和のＮａＨＣＯ3溶液及び水を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／４）により、白い固体として、化合物７（１．８３ｇ、８７％）を得た。
【００７３】
例９：（２Ｒ，３Ｓ）−３−アジド−２−ヒドロキシ−３−フェニルプロピオン酸ベンジルエステルの調製
図２及び図３を参照すると、固体のＮａＮ3（６７１ｍｇ、１０．３３ミリモル）を、ＤＭＳＯ（２０ｍＬ）中の臭素化物７（１．７３ｇ、５．１６ミリモル）の撹拌された溶液に添加した。当該混合物を室温で２４時間撹拌し、次いでペンタン／ジクロロメタンの１／１混合物で希釈し、そして水で希釈した。当該有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン１／４）により、白い固体として化合物３ｂ（１．１３ｇ、７４％）を得た。
【００７４】
例１０：（２Ｓ，３Ｓ）−３−フェニルアジリジン−２−カルボン酸ベンジルエステル４ｂの調製
図２及び図３を参照すると、ＮＥｔ3（３７５μＬ、２．７０ミリモル）を、ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のアジドアルコール３ｂ（４００ｍｇ、１．３５ミリモル）の撹拌された溶液に室温で添加し、メタンスルホニルクロリド（１６０μＬ、２．０３ミリモル）が続いた。得られた混合物を、室温で２時間撹拌し、エチルアセテートで希釈し、そして水で洗浄した。当該水性層を、エチルアセテートで抽出し、そして混合された有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮した。未精製の残差を、ＴＨＦ／水の１０／１混合物（２７ｍＬ）に溶解させた。
【００７５】
ＤＩＥＡ（４６０μＬ、２．７０ミリモル）を、この溶液に室温で添加し、トリフェニルホスフィン（７０８ｍｇ、２．７０ミリモル）が続いた。得られた混合物を、３５℃で３．５時間撹拌し、室温まで冷却した。水を添加し、そして当該水性層をエチルアセテートで抽出した。混合した有機層を、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、ろ過し、そして濃縮した。シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（エチルアセテート／ペンタン  １／４）により、白い固体として化合物４（１７０ｍｇ、５０％）を得た。
【００７６】
例１１：（２Ｒ，３Ｒ）−２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）−３−（４−メチルベンジルスルファニル）−３−フェニルプロピオン酸の調製
図２及び図３を参照すると、（２Ｒ，３Ｓ）−６ａの調製において記載される手順と同一であるが、アジリジン（２Ｒ，３Ｒ）−４ｂ（１７０ｍｇ、０．６７ミリモル）を用いて開始することにより、白い固体として、化合物（２Ｒ，３Ｒ）−６ｂ（１８ｍｇ、３段階において７％）を得た。
【００７７】
例１２：ａｎｔｉ−６ａ及びｓｙｎ−６ｂ誘導体の、カルボキシエステル樹脂への結合及び次のＨＦ開裂に関する一般手順
図４を参照すると、（２Ｒ，３Ｓ）−６ａ又は（２Ｒ，３Ｒ）−６ｂ（０．１１ミリモル）を、ＴＢＴＵ（０．１１ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．２０ミリモル）の存在下で、ペプチド樹脂（０．１０ミリモル）に１．５時間、結合させた。結合の完了を、ニンヒドリン試験によりモニターした。次いで、上記ペプチドを脱保護化し、そして捕捉剤として５００μＬのｐ−クレゾールを用いて、０℃で、１時間、無水ＨＦを用いて処理することにより樹脂から開裂させた。開裂後、エーテルを用いてペプチドを沈殿させ、アセトニトリル／水の５０／５０混合物中に溶解させ、そして凍結乾燥した。（２Ｒ，３Ｓ）−６ａ及び（２Ｒ，３Ｒ）−６ｂとの結合から、それぞれ得られたペプチドジアステレオマー７ａ又は７ｂを、逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＥＳＩ質量分析により特徴付けられた白い粉末を得た。ペプチド７ａのＥＳＩ−ＭＳにおいて、Ｃ51Ｈ75Ｎ10Ｏ11Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の計算値は１０３５．５３であり、実験値は１０３５．５５であった。ペプチド７ｂのＥＳＩ−ＭＳにおいて、Ｃ51Ｈ75Ｎ10Ｏ11Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の計算値は１０３５．５３であり、実験値は１０３５．５４であった。
【００７８】
例１３：ワンポットライゲーション／アルキル化／脱硫反応に関する一般手順
図４を参照すると、ペプチド７ａ（又は７ｂ）（３ｍＭ、最終濃度）を、ペプチドチオエステルＬＹＲＡＧ−ＣＯＳＲ（１．２５ｅｑ．）を有するリン酸緩衝液*中に溶解させ、そして得られた溶液を、チオフェノール（０．３％  Ｖ／Ｖ）の存在下で３７℃で撹拌した。ライゲーションの完了を、ＨＰＬＣ分析によりモニターし：この溶液のアリコートを、２０分間、ＢＭＥ（２０％  Ｖ／Ｖ）を用いて処理し、次いで、注入前に５分間、ＴＣＥＰを用いて処理した（*緩衝液は、０．２ＭのＮａＨ2ＰＯ4、６Ｍのグアニジニウム、２０ｍＭのＭｅｔを含み、ｐＨ７．６）。
【００７９】
上記ライゲーション反応の完了の後、ｐＨ＝３〜４を有するように、一部のＴＣＥＰを反応混合物に添加した。５分後、当該溶液を、ｐＨ８まで塩基性化させ、そしてヨードアセトアミド又はブロモアセトアミドを添加した。得られた混合物を室温で撹拌し（アルキル化反応を、ＨＰＬＣ分析によりモニターした）、次いで、ジエチルエーテルで抽出し、チオフェノール誘導体を除去した。アルキル化により、ライゲーション未精製物に対して概ね定量的な収率が得られた。次いで、酢酸（２０％  Ｖ／Ｖ）を添加し、脱硫反応のために、亜鉛粉末（マイクロスパチュラ）が続き（ＨＰＬＣ分析によりモニターした）、「ワンポット」反応から１時間後、約９８％の天然生成物を得た。
【００８０】
エレクトロスプレー質量分析の解析は次の通りであった：ペプチド８（分離されていない中間体）のＥＳＩ−ＭＳにおいて、Ｃ77Ｈ115Ｎ18Ｏ17Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の計算値は１５９５．８４であり、実験値は１５９５．９０であった；ペプチド−（分離されていない中間体）のＥＳＩ−ＭＳにおいて、Ｃ79Ｈ118Ｎ19Ｏ18Ｓ（Ｍ＋Ｈ）の計算値は１６５２．８６であり、実験値は１６５２．８５であった；そしてペプチド１０のＥＳＩ−ＭＳにおいて、Ｃ77Ｈ115Ｎ18Ｏ17（Ｍ＋Ｈ）の計算値は１５６３．８７であり、実験値は１５６３．８２であった。
【００８１】
上述のように、上記反応は、全て、ライゲーション条件；６Ｍグアニジニウム、ｐＨ７．６、３７℃に適合する条件の下で実施され、ひいては、「ワンポット」は、最終の天然生成物を得るために、中間体の精製が必要ないことを意味する。重要なことは、「ワンポット」反応内の最終生成物が、シーケンスＬＹＲＡＧＦＹＡＫＹＡＫＬの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により製造された２種の標準ペプチドと比較して、天然ペプチド（Ｐｈｅライゲーション部位のところのＬ−残基、ラセミ化なし）であることが確認され、ある対照のペプチド内のＦ残基は、天然のＬ−Ｐｈｅであり、そして他方の対照ペプチドは、非天然のＤ−Ｐｈｅであった。ＨＰＣＬにより解析されたように上記ライゲーション生成物は、天然の標準と同一であることが見出され、そして微量の非天然誘導体を含まない（データは示されていない）。
【００８２】
例１４：モデルペプチドチオエステルＬＹＲＡＡ−ＣＯＳＲ又はＬＹＲＡＩ−ＣＯＳＲとのライゲーション反応
図４を参照すると、ペプチド７ａ（若しくは７ｂ又はモデルペプチドＣＹＡＫＹＡＫＬ）を、それぞれ、ペプチドチオエステルＬＹＲＡＡ−ＣＯＳＲ又はＬＹＲＡＩ−ＣＯＳＲ（１．２５ｅｑ．）を有するリン酸緩衝液*（３ｍＭ、最終濃度）に溶解させ、そして得られた溶液を、チオフェノール（０．３％  Ｖ／Ｖ）の存在下で、３７℃で撹拌した。ライゲーションの完了を、ＨＰＬＣ分析によりモニターし：この溶液のアリコートを、２０分間、ＢＭＥ（２０％  Ｖ／Ｖ）を用いて処理し、次いで注入前に、５分間、ＴＣＥＰを用いて処理した（*緩衝液は、０．２ＭのＮａＨ2ＰＯ4、６Ｍのグアニジニウム、２０ｍＭのＭｅｔを含み、ｐＨ７．６）。
【００８３】
ａｎｔｉ又はｓｙｎ−フェニルシステインを用いたライゲーション試験を、ネイティブケミカルライゲーション（システインを使用）と比較し、下記表Ｉ及び表ＩＩに報告する。
【００８４】
【表１】
2008543803.tif 000010
【００８５】
【表２】
2008543803.tif 000011
【００８６】
本明細書に記載される例及び実施形態は、実例の目的のみであり、そしてそれらの知識における種々の改良又は変化が当業者に示唆され、そして本出願の範囲及び精神並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきことが理解されるべきである。本明細書内で引用される全ての出版物、特許及び特許出願を、全ての目的において、それら全体を参照し、本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、β−分岐鎖チオールオグジュアリーを用いたペプチドの側鎖伸張型ケミカルライゲーションを具体的に説明する；同一のスキームを、γ−分岐鎖チオールオグジュアリーとのライゲーションを含む、任意の好適な分子のライゲーションを実施するために用いることができる。
【図２】図２は、ａｎｔｉ−（２Ｒ，３Ｓ）−フェニルシステイン誘導体のための合成スキームを描写する。
【図３】図３は、ｓｙｎ−（２Ｒ，３Ｒ）−フェニルシステイン誘導体のための合成スキームを描写する。
【図４】図４は、ａｎｔｉ−及びｓｙｎ−フェニルシステイン誘導体及びワンポットライゲーション／アルキル化／脱硫のためのカップリングを描写する。
【００８８】
【図５】図５は、Ｃ−末端ペプチドＬＹＲＡＧ−チオエステルと、ａｎｔｉ−フェニルシステイン（２Ｒ，３Ｓ）を用いたＮ−末端ペプチドHSＦ−ＹＡＫＹＡＫＬとの、ワンポットライゲーション／アルキル化／脱硫反応のＨＰＬＣクロマトグラムを具体的に説明する。
【図６】図６は、Ｃ−末端ペプチドＬＹＲＡＧ−チオエステルと、ｓｙｎ−フェニルシステイン（２Ｒ，３Ｓ）を用いたＮ−末端ペプチドHSＦ−ＹＡＫＹＡＫＬとの、ワンポットライゲーション／アルキル化／脱硫反応のＨＰＬＣクロマトグラムを具体的に説明する。
【図１】
2008543803.tif 000012
【図２】
2008543803.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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