(57)【要約】遺伝子型決定を行なう多型に直接隣接するヌクレオチド位置から識別子が離れるように誘発ヘテロデュプレックスジェネレータ（ＩＨＧ）分子を修飾することによってヘテロデュプレックスバンドの分離が向上する。意外にも、そのような修飾ＩＨＧ分子を使用すると、誘発ヘテロデュプレックスの分離が著しく向上する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ配列内の既知の多型部位に対応する少なくとも１つのヌクレオチド位置を含む合成ＤＮＡ配列であるＩＨＧであって、
前記合成ＤＮＡ配列が、前記既知の多型部位に対応する前記ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れたヌクレオチド位置に、前記ゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含み、
前記多型部位に対応する前記ヌクレオチド位置と、前記ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入との間に位置するヌクレオチドが前記ゲノムＤＮＡ配列と同一であることを特徴とする、ＩＨＧ。
【請求項２】
請求項１において、
前記ゲノムＤＮＡ配列内の前記多型部位が一塩基多型（ＳＮＰ）である、ＩＨＧ。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列内に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入が１以上の塩基の挿入を含む、ＩＨＧ。
【請求項４】
請求項３において、
前記合成ＤＮＡ配列に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入が１以上の塩基の挿入からなる、ＩＨＧ。
【請求項５】
請求項３または４において、
前記挿入は一連の同一の塩基の挿入である、ＩＨＧ。
【請求項６】
請求項５において、
前記同一の塩基はＡヌクレオチドである、ＩＨＧ。
【請求項７】
請求項６において、
前記同一の塩基はＧヌクレオチドである、ＩＨＧ。
【請求項８】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入が１以上の塩基の欠失を含む、ＩＨＧ。
【請求項９】
請求項８において、
前記合成ＤＮＡ配列に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入が１以上の塩基の欠失からなる、ＩＨＧ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項において、
前記合成ＤＮＡ配列は１本鎖である、ＩＨＧ。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項において、
前記合成ＤＮＡ配列は２本鎖である、ＩＨＧ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項において、
前記ＩＨＧの挿入塩基または欠失塩基を無視した場合に、前記合成ＤＮＡ配列は前記ゲノムＤＮＡ配列の遺伝子断片と実質的に同じ長さを有する、ＩＨＧ。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項において、
前記ＩＨＧの挿入塩基または欠失塩基を無視した場合に、前記合成ＤＮＡ配列は前記ゲノムＤＮＡ配列の遺伝子断片と異なる長さを有する、ＩＨＧ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＩＨＧを複数含む、ＩＨＧ群。
【請求項１５】
請求項１４において、
前記群がＰＣＲを使用した増幅の産物である、ＩＨＧ群。
【請求項１６】
前記既知の多型部位を含むゲノムＤＮＡとハイズリダイズさせた請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＩＨＧ分子を含む、ＤＮＡヘテロデュプレックス。
【請求項１７】
請求項１６に記載のＤＮＡヘテロデュプレックスの群。
【請求項１８】
標的遺伝子配列と前記標的遺伝子配列に対応するＩＨＧ分子との間で誘発ヘテロデュプレックスを形成するための方法であって、
（ａ）請求項１４または１５に記載のＩＨＧ群を生成する工程と、
（ｂ）標的遺伝子配列群を生成する工程と、
（ｃ）ヘテロデュプレックスの形成に適した条件下で（ａ）および（ｂ）の各群を組み合わせる工程と、
を含む、方法。
【請求項１９】
標的遺伝子配列の遺伝子型を決定するための方法であって、
請求項１８に記載の方法によって誘発ヘテロデュプレックスを形成し、適当な担体上で前記誘発ヘテロデュプレックスを分離し、前記分離された誘発ヘテロデュプレックスを分析して前記標的遺伝子配列の遺伝子型を決定することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９において、
前記誘発ヘテロデュプレックスの前記分離は、電気泳動を使用して行なわれる、方法。
【請求項２１】
ヒトまたはその他の哺乳動物などの生物が特定の遺伝子型に関連する特定の遺伝的症状または疾患に罹患する可能性を予測するための方法であって、
前記遺伝的症状または疾患に関連すると考えられる前記生物の標的遺伝子配列を、請求項１９または２０に記載の遺伝子型決定によって決定し、
前記遺伝子型決定の結果を分析し、
前記生物における前記特定の遺伝的症状または疾患の存在または非存在、存在または非存在の可能性、あるいは重症度を予測することを含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
前記遺伝子型決定は、遺伝子の特定の位置に存在する特定の一塩基多型（ＳＮＰ）に対して行なわれる、方法。
【請求項２３】
請求項１４または１５に記載のＩＨＧ群と、
前記ＩＨＧのフォーワードプライマーおよびリバースプライマーと、
を含む、キット。
【請求項２４】
請求項２３において、
対照ＤＮＡ配列および／または使用上の注意をさらに含む、キット。
【請求項２５】
請求項１９〜２２のいずれか１項の方法に使用される、請求項２３または２４に記載のキット。
【請求項２６】
ＩＬ−１０遺伝子プロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定に使用するＩＨＧであって、以下の配列を有するＩＨＧ。
【化１】
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【請求項２７】
ＩＬ−１０遺伝子プロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定に使用するＩＨＧであって、以下の配列を有するＩＨＧ。
【化２】
2008517587.tif 000013
【請求項２８】
ＩＬ−１０遺伝子プロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定に使用するＩＨＧであって、以下の配列を有するＩＨＧ。
【化３】
2008517587.tif 000014
【請求項２９】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子内の「−２３８」多型の遺伝子型決定に使用するＩＨＧであって、以下の配列を有する、ＩＨＧ。
【化４】
2008517587.tif 000015
【請求項３０】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子内の「−２３８」多型の遺伝子型決定に使用するＩＨＧであって、以下の配列を有する、ＩＨＧ。
【化５】
2008517587.tif 000016
【請求項３１】
実施例および図面を参照して明細書に実質的に記載された、ＩＨＧまたはＩＨＧ群。
【請求項３２】
実施例および図面を参照して明細書に実質的に記載された、ＤＮＡヘテロデュプレックスまたはＤＮＡヘテロデュプレックス群。
【請求項３３】
実施例および図面を参照して明細書に実質的に記載された、標的遺伝子配列と前記標的遺伝子配列に対応するＩＨＧ分子との間で誘発ヘテロデュプレックスを形成するための方法。
【請求項３４】
実施例および図面を参照して明細書に実質的に記載された、標的遺伝子配列の遺伝子型を決定するための方法。
【請求項３５】
実施例および図面を参照して明細書に実質的に記載された、ヒトまたはその他の哺乳動物の患者などの生物が特定の遺伝子型に関連する特定の遺伝的症状または疾患に罹患する可能性を予測するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知のＩＨＧ分子を改良した誘発ヘテロデュプレックスジェネレータ（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）（ＩＨＧ）分子に関する。また、本発明は、本発明の改良型ＩＨＧと標的ゲノムＤＮＡ配列との間で誘発ヘテロデュプレックスを形成するための方法、ならびに、動物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または細菌ＤＮＡ（通常はヒトＤＮＡ）の突然変異の遺伝子型決定のための誘発ヘテロデュプレックスの分析に関する。本発明は、例えば遺伝性疾患（嚢胞性繊維症（ＣＦＴＲ遺伝子）、フェニルケトン尿症（ＰＡＨ遺伝子）、鎌状赤血球貧血、β−サラセミア（ＨＢＢ遺伝子）等）に関連する遺伝子内の多型や突然変異、癌遺伝子や癌抑制遺伝子内の体細胞突然変異に関して使用することができる。また、本発明は、ゲノムＤＮＡ配列の分析方法において使用するための本発明の誘発ヘテロデュプレックスジェネレータを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物のゲノム内のＤＮＡ配列の変異（以下、便宜上「多型」というが、多型は限定されない）を検出することは、病気や疾患の診断および治療に対する反応の予測において重要な手段となっている。早期変異検出法を使用し、病気や疾患を診断および治療し、病気や疾患が物理的に発現する前にその発生を防ぐことが益々可能となりつつある。また、変異検出は、これまで原因が不明であったり、あるいは、原因が遺伝子以外であると思われていたりした疾患の原因である遺伝子塩基の発見に繋がる可能性を有しているという点で、貴重な研究手段となり得る。
【０００３】
配列の変異には多くの異なる種類がある。例えば、遺伝子内の特定の遺伝子座において、１以上のヌクレオチドが同数の他のヌクレオチドによって置換されることにより、変異が生じることがある。別の例としては、遺伝子内の特定の遺伝子座からの１以上のヌクレオチドの欠失が挙げられる。さらに別の例として、遺伝子内の特定の遺伝子座への１以上の余分なヌクレオチドの挿入が挙げられる。また、置換、欠失、挿入の組み合わせもあり得る。一般的な配列の変異は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰは、遺伝子内の特定の遺伝子座において、１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドによって置換されるものである。各ＳＮＰは１つのヌクレオチドのみを含むが、１つの遺伝子は多数のＳＮＰを含む場合がある。
【０００４】
ある種の特定の遺伝子またはその種の個体の特定の遺伝子が配列の変異を含むか否かを決定することを遺伝子型決定と呼ぶ。したがって、全塩基配列の決定は遺伝子型決定を行なうための方法のひとつであるが、時間と費用がかかり、非常に効率が悪い。
【０００５】
公知の別の遺伝子型決定法は、いわゆる誘発ヘテロデュプレックスジェネレータ（以前はユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）と呼ばれ、以下、「ＩＨＧ」という）を使用する。ＩＨＧは、ゲノムＤＮＡ配列を模倣した合成ＤＮＡ配列であるが、ゲノムＤＮＡ内の既知の多型部位に（直接隣接するように）対向するヌクレオチド位置に設けられた人為的なヌクレオチドの置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせ（「識別子」という）を含む。ゲノムＤＮＡ内の配列の変異を検出するために、ＩＨＧおよびゲノムＤＮＡ配列が同一の遺伝子座特異性ＰＣＲプライマーによって別々に増幅され、各ＰＣＲ産物は共に、ＤＮＡヘテロデュプレックスを形成するために、加熱および徐冷によってハイブリダイズされる。その後、得られたヘテロデュプレックスは、例えば非変性ポリアクリルアミドミニゲル電気泳動によって分離される。ＩＨＧとゲノムＤＮＡとの間のミスマッチの数、種類、お
よび位置に応じて、異なるヘテロデュプレックスは異なる速度で移動し、異なる対立遺伝子に特有のバンドパターンを生じさせる。
【０００６】
誘発ヘテロデュプレックスジェネレータの使用については、以下の参考文献に記載されている。
【０００７】
１．Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．Ｃｌａｙ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｍ．Ｃ．Ｐｕｒｓａｌｌ，Ａ．Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ共著、１９９３年、「ＰＣＲフィンガープリント法および関連するＤＮＡヘテロデュプレックス技術による迅速なＨＬＡ−ＤＲ−ＤｗとＤＰとのマッチング（Ｒａｐｉｄ  ＨＬＡ−ＤＲ−Ｄｗ  ａｎｄ  ＤＰ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｂｙ  ＰＣＲ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」、「ＨＬＡタイピング技術ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＨＬＡ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ、Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、フロリダ、９９〜１１６頁
２．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９３年、「ＰＣＲ増幅性合成ＤＮＡによって形成されたヘテロデュプレックスの分析によるフェニルケトン尿症遺伝子型の迅速な分類（Ｒａｐｉｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ＰＣＲ−ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ）」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ２、１３１〜１３７頁
３．Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ａ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ｔ．Ｍ．Ｃｌａｙ，Ｄ．Ｃｕｌｐａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｃ．Ｐｕｒｓａｌｌ，Ｂ．Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ共著、１９９３年、「ユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータ：ＨＬＡおよびヒトの病気の遺伝子型決定のための試薬（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ：  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＨＬＡ  ａｎｄ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｅ．Ｅ．Ｐｏｌｌｉ編、２７〜３４頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ、アムステルダム
４．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｊ．Ｈｏｗｓ，Ｂ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９３年、「ユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータを用いた鎌状赤血球貧血の診断（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）」、Ｌａｎｃｅｔ  ３４２、１５１９〜１５２０頁
５．Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｍ．Ｃｌａｙ，Ｍ．Ｃ．Ｐｕｒｓａｌｌ，Ｄ．Ｃｕｌｐａｎ，Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｂ．Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｌ．Ａ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ｇ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ共著、１９９４年、「ＤＮＡヘテロデュプレックス技術（ＤＮＡ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ａ．Ｃｈｒａｍｂａｃｈ，Ｍ．Ｊ．Ｄｕｎｎ，Ｂ．Ｊ．Ｒａｄｏｌａ共編、「電気泳動の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」、第７巻、３１１〜３５１頁、ＶＣＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ
６．Ｔ．Ｍ．Ｃｌａｙ，Ｄ．Ｃｕｐｌａｎ，Ｗ．Ｍ．Ｈｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｓａｇｅ，Ｂ．Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９４年、「ＵＨＧクロスマッチ試験：ＨＬＡ−ＤＰＢ１適合性骨髄提供者の選別におけるＰＣＲ−ＳＳＯタイピングによる比較（ＵＨＧ  ｃｒｏｓｓｍａｔｃｈｉｎｇ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＰＣＲ−ＳＳＯ  ｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＰＢ１−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｏｎｏｒｓ）」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５８、２００〜２０７頁
７．Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ著、１９９４年、「ＤＮＡに基づくＨＬＡタイピング法の
進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ＨＬＡ−ｔｙｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １５、３０３〜３０７頁  
８．Ｌ．Ａ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｆ．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ，Ａ．Ｈａｒｖｉｅ，Ｉ．Ｓｍｉｔｈ共著、１９９４年、「合成ＤＮＡ構成体によるヘテロデュプレックス分析を用いたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の突然変異分析（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ＤＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）」、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ  ８３、４７〜４８頁  
９．Ｄ．Ａ．Ｓａｖａｇｅ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ共著、１９９５年、「ヘテロデュプレックス分析によるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１の亜型決定（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１  ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４５、１２０〜１２４頁  
１０．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｄ．Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ，Ｌ．Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｉ．Ｒ．Ｐｅａｋｅ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９５年、「ユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータを用いたタイプ２Ｂフォン・ヴィレブランド病における迅速な遺伝子型分析（Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２Ｂ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ
ｕｓｉｎｇ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）」、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ８９、１５２〜１５６頁  
１１．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｊ．Ｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９５年、「ヘモグロビンＳおよびＣの遺伝子型決定のためのＵＨＧの最適化と特性（Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ＵＨＧ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｃ）」、Ｈｕｍ
Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ５、１６６〜１７２頁  
１２．Ｄ．Ａ．Ｓａｖａｇｅ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ａ．Ｆｉｔｃｈｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｏｌｄ，Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ共著、１９９５年、「ＤＮＡヘテロデュプレックスジェネレータ分子を用いたβ−サラセミア突然変異の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂ−ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ
ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、Ｂｒｉｔ
Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９０、５６４〜５７１頁  
１３．Ｌ．Ａ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｚｓｃｈｏｃｋｅ，  Ａ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｆ．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ，Ａ．Ｈａｒｖｉｅ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｐ．Ｈｕｎｔ共著、１９９５年、「家族における不一致フェニルケトン尿症表現型：遺伝子型と臨床結果との相関関係は複数の作因の作用である（Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｏｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ３２、１３２〜１３６頁
１４．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９６年、「ＵＨＧ：ヘテロデュプレックスおよびユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータの分析（ＵＨＧ：ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」、「突然変異検出のための研究所プロトコル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」、Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ編、１０５〜１１２頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ
１５．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９６年、「誘発ヘテロデュプレッ
クス形成による遺伝子スクリーニングおよび遺伝子検査（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １７、２４７〜２５４頁
１６．Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｒ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｄ．Ｊ．Ｂｏｗｅｎ，Ａ．Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｃ．Ｌｕｓｈ，Ｒ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９６年、「タイプ２Ｂフォン・ヴィレブランド病におけるＵＨＧに基づく突然変異スクリーニング：侯補突然変異Ｓｅｒ５４７Ｐｈｅの検出（ＵＨＧ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２Ｂ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｅｒ５４７Ｐｈｅ）」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ＆  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７５、３６３〜３６７頁
１７．Ｄ．Ａ．Ｓａｖａｇｅ，Ｊ．Ｐ．Ｔａｎｇ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．Ｋ．Ｗｅｅ，Ａ．Ａ．Ｏｅｉ，Ｋ．Ｍ．Ｈｕｉ共著、１９９６年、「ＰＣＲおよびＤＮＡヘテロデュプレックスジェネレータを用いた迅速なＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４の亜型決定法（Ａ  ｒａｐｉｄ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４  ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ）」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７、２８４〜２９２頁
１８．Ｄ．Ｊａｃｋ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｎ．Ｗｏｏｄ共著、１９９７年、「ヒトのマンナン結合レクチン遺伝子における全３箇所の既知の構造的突然変異の同時遺伝子型決定（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ｔｈｒｅｅ  ｋｎｏｗｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｎｎａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ）」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ９、４１〜４６頁
１９．Ｄ．Ｃｕｌｐａｎ，Ｇ．Ｒ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｎ．Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｍａｚｕｒｉｅｒ，Ｃ．Ｇａｕｃｈｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９７年、「ユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータを用いたタイプ２Ａフォン・ヴィレブランド病における迅速な突然変異のスクリーニング（Ｒａｐｉｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２Ａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ）」、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９６、４６４〜４６９頁
２０．Ｄ．Ｂｏｗｅｎら著、１９９７年、「ヘテロデュプレックス技術を用いた第Ｖ因子ライデン変異の遺伝子診断（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  Ｌｅｉｄｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７７、１１９〜１２２頁
２１．Ｈ．Ａ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｂｏｗｅｎ，Ｍ．Ｗｏｒｗｏｏｄ共著、１９９７年、「ヘテロデュプレックス技術を用いたヘモクロマトーシスの迅速な遺伝子スクリーニング（Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９８、８５６〜８５９頁
２２．Ｌ．Ａ．Ｔｙｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｆ．Ｃｏｃｋｂｕｒｎ，Ａ．Ｈａｒｖｉｅ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｄ．Ｔ．Ｐｉｌｚ，Ｐ．Ｈａｒｐｅｒ，Ｉ．Ｓｍｉｔｈ共著、１９９７年、「イギリス諸島におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の配列変異（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ａｔ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｉｓｌｅｓ）」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６０、３８８〜３９６頁
２３．Ｍ．Ｓ．Ｅｎａｙａｔ，Ｂ．Ｄ．Ｍ．Ｔｈｅｏｐｈｉｌｕｓ，Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｈｉｌｌ，Ｐ．Ｅ．Ｒｏｓｅ，Ｄ．Ｃｕｌｐａｎ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｇ．Ｒ．Ｓｔａｎｄ
ｅｎ共著、１９９８年、「ＵＨＧ分析により特定されたタイプ２Ａフォン・ヴィレブランド病を引き起こす新候補突然変異（Ｋ７５５Ｅ）（Ａ  ｎｅｗ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  （Ｋ７５５Ｅ）  ｃａｕｓｉｎｇ  Ｔｙｐｅ  ２Ａ  Ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ＵＨＧ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ７９、２４０頁
２４．Ｄ．Ｃｕｌｐａｎ，Ａ．Ｇｏｏｄｅｖｅ，Ｄ．Ｊ．Ｂｏｗｅｎ，Ｇ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９８８年、「ヘテロデュプレックス分析によるタイプ２Ａフォン・ヴィレブランド病の迅速な遺伝子型診断（Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ
ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２Ａ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｈａｅｍ  ２０、１７７〜１７８頁
２５．Ｄ．Ｊ．Ｂｏｗｅｎ，Ｇ．Ｒ．Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｍａｚｕｒｉｅｒ，Ｃ．Ｇａｕｃｈｅｒ，Ａ．Ｃｕｍｍｉｎｇ，Ｓ．Ｋｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９８年、「タイプ２Ｎフォン・ヴィレブランド病：Ｇ２８１１Ａ（Ｒ８５４Ｑ）、Ｃ２６９６Ｔ（Ｒ８１６Ｗ）、Ｔ２７０１Ａ（Ｈ８１７Ｑ）およびＧ２８２３Ｔ（Ｃ８５８Ｆ）の迅速な遺伝子診断−新侯補タイプ２Ｎ突然変異の検出：Ｃ２８０１Ｔ（Ｒ８５４Ｗ）（Ｔｙｐｅ  ２Ｎ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇ２８１１Ａ  （Ｒ８５４Ｑ），  Ｃ２６９６Ｔ  （Ｒ８１６Ｗ），  Ｔ２７０１Ａ  （Ｈ８１７Ｑ）  ａｎｄ  Ｇ２８２３Ｔ  （Ｃ８５８Ｆ）  −  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｙｐｅ  ２Ｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ：  Ｃ２８０１Ｔ  （Ｒ８５４Ｗ））」、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８０、３２〜３６頁  
２６．Ｈ．Ｒ．Ｍｏｒｓｅ，Ｏ．Ｏ．Ｏｌｏｍｏｌａｉｙｅ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｊ．Ｋｅｅｎ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、１９９９年、「転写調節に関わるＴＮＦａ、ＩＬ−Ｉｂ、ＩＬ−６およびＩＬ−１０多型の誘発ヘテロデュプレックス遺伝子型決定（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＴＮＦａ，  ＩＬ−１ｂ，  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＩＬ−１０  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １１、７８９〜７９５頁
２７．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｓ．Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著，２０００年、「ＰＣＲ−ＲＦＬＰによるヒトのＴＧＦ−ｂ１シグナル（リーダー）配列多型の識別（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ
ＴＧＦ−ｂ１  ｓｉｇｎａｌ  （ｌｅａｄｅｒ）  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３４、１１７〜１２２頁
２８．Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ，Ｏ．Ｏ．Ｏｌｏｍｏｌａｉｙｅ，Ｌ．Ｊ．Ｋｅｅｎ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｈ．Ｒ．Ｍｏｒｓｅ，Ｇ．Ｊ．Ｌａｕｎｄｙ，Ｓ．Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ共著、２０００年、「サイトカイン遺伝子多型（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」、「ヒト血液細胞：遺伝的多型の結果（Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」、Ｍ−Ｊ．Ｋｉｎｇ編、３７５〜４００頁、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン
２９．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｊ．Ｋｅｅｎ，Ｌ．Ａ．Ｔｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、２００１年、「ＤＮＡの誘発ヘテロデュプレックス分析によるサイトカイン調節ハプロタイプの決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ）」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４９、１９１〜１９８頁
３０．Ｃ．Ｆ．Ｓｐｉｎｋ，Ｌ．Ｊ．Ｋｅｅｎ，Ｐ．Ｇ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、２００４年、「誘発ヘテロデュプレックス分析を用いたＴＮＦｄ
マイクロサテライト遺伝子座に存在するサブ対立遺伝子（ｓｕｂａｌｌｅｌｅ）の識別（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂａｌｌｅｌｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ＴＮＦｄ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｌｏｃｕｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５、７６〜７９頁
３１．Ａ．Ｊ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｊ．Ｋｅｅｎ，Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｊ．Ｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．Ｂｉｄｗｅｌｌ共著、２００４年、「ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１ＲＮおよびＩＬ１Ｒ１プロモーターＳＮＰのハプロタイプ分析（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩＬ１Ａ，  ＩＬ１Ｂ，  ＩＬ１ＲＮ  ａｎｄ  ＩＬ１Ｒ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＳＮＰｓ）」、ＨＬＡ  ２００２、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、デンマーク
３２．１９９５年１１月、Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｗｏｏｄによる博士論文：タイトル「ＤＮＡ内の点突然変異の識別におけるユニバーサルヘテロデュプレックスジェネレータの有用性の検討（Ａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ＤＮＡ）」、ブリストル大学図書館蔵
また、国際公開第ＷＯ−Ａ−９３／１９２０１号および英国特許第２３３８０６２号は、ＩＨＧ技術を用いた遺伝子型決定に関するものである。
【０００８】
上記特許文献およびその他の参考文献の内容は、この参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０００９】
ただし、従来技術の状況は国内法によって判断されるものであるため、上記特許文献およびその他の参考文献の内容が、本国際特許出願の各指定国において必ずしも従来技術であるとは限らないことに留意されたい。したがって、ここで参照する特定の文献が、本出願に現在含まれる請求項、将来の補正によって組み込まれる可能性のある請求項、継続または分割出願または本国際特許出願を基礎として今後提出される可能性のあるその他の対応する出願または別の出願に含まられるか組み込まれる可能性のある請求項の従来技術であると認めるものではない。
【００１０】
ＩＨＧを使用する遺伝子型決定は使用が容易であり、迅速に実施することができ、信頼性があるが、対立遺伝子特異パターンをさらに容易に識別することができるように、ヘテロデュプレックスバンドの分離を向上させることが望ましい。これによって、例えばゲル電気泳動時間を短縮させることができる。
【発明の開示】
【００１１】
本発明によれば、遺伝子型決定を行なう多型に直接隣接した位置から識別子を離すようにＩＨＧ分子を修飾することによって、ヘテロデュプレックスバンドの分離を向上させることができることが分かった。予期しなかったことだが、そのように修飾したＩＨＧ分子を使用した場合に、誘発ヘテロデュプレックスの分離が著しく向上することが分かった。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、ゲノムＤＮＡ配列内の既知の多型部位に対応する少なくとも１つのヌクレオチド位置を含む合成ＤＮＡ配列であるＩＨＧであって、合成ＤＮＡ配列は、既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れたヌクレオチド位置に、ゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入（以下「識別子」という）を含み、多型部位に対応するヌクレオチド位置とヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入との間に位置するヌクレオチドがゲノムＤＮＡ配列と同一であり、ゲノムＤＮＡ配列が複数の既知の多型部位を含む場合には、識別子は、既知の多型部位のそれぞれに対応するヌクレオチド位置から少なくとも１
塩基分だけ離れていることを特徴とするＩＨＧが提供される。
【００１３】
本発明に係るＩＨＧ分子は、ゲノムＤＮＡの既知の多型部位における１以上の既知の多型（例えば遺伝子突然変異）の検出に使用できることが好ましく、ＩＨＧ識別子が既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から離れていない類似の方法と比べて、ヘテロデュプレックスを分離する工程に続く工程（例えば電気泳動）によるバンドの分離に関して、誘発ヘテロデュプレックスの分離を著しく向上させるＩＨＧ検出方法に使用できることが最も好ましい。
【００１４】
本明細書で使用する「既知の多型部位」という表現は、ＩＨＧ分子を用いて特定の検査を行なう際の多型部位を特に意味する。ゲノム（野生型）ＤＮＡ配列内の多型部位とは、遺伝子の既知の対立遺伝子変異型における遺伝子変異部位に対応するＤＮＡ配列内の位置である。そのような遺伝子の変異部位は、１つの塩基の置換、挿入、欠失または連続する２以上の塩基の置換、付加、挿入またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１５】
本明細書で使用する「ヌクレオチド位置」という表現は、例えば、ヌクレオチド配列の領域、ヌクレオチド配列の領域が欠失する遺伝子座、ヌクレオチド配列の領域間の点、およびヌクレオチド配列の個々の塩基等のヌクレオチド配列に関連するあらゆる遺伝子座をその範囲に含む。
【００１６】
例えば、対立遺伝子変異型において多型部位が１つの塩基変異を含む場合には、ＩＨＧは当該多型部位に対応する１つのヌクレオチド位置を含み、ＩＨＧ分子内の識別子は、当該ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。多型部位が連続する３つの塩基の変異を含む場合には、ＩＨＧは当該多型部位に対応する連続する３つのヌクレオチド位置を含み、ＩＨＧ分子内の識別子は、３つのヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。
【００１７】
対立遺伝子変異型において多型部位が１つの塩基欠失を含む別の例では、ＩＨＧは当該多型部位に対応する１つのヌクレオチド位置を含み、ＩＨＧ分子内の識別子は、当該ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。多型部位が連続する３塩基の欠失を含む場合には、ＩＨＧは当該多型部位に対応する３つの連続するヌクレオチド位置を含み、ＩＨＧ分子内の識別子は、当該１連の３つのヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。
【００１８】
対立遺伝子変異型において多型部位が１つの塩基挿入を含むさらに別の例では、ＩＨＧは多型部位をまたぐ１対のヌクレオチド位置を含み、ＩＨＧ分子内の識別子は、当該ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。多型部位が連続する３つの塩基の挿入を含む場合には、ＩＨＧは当該多型部位をまたぐ５つのヌクレオチド位置を含むことができ、ＩＨＧ分子内の識別子は、当該１連の３つのヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。
【００１９】
多型部位は、連続する置換、挿入または欠失の組み合わせを含むことができる。全ての場合において、識別子は、多型部位の連続部分に対応する一連のヌクレオチド位置から少なくとも１塩基だけ離れている。本発明の第２の態様によれば、遺伝子配列と前記標的遺伝子配列に対応するＩＨＧ分子との間で誘発ヘテロデュプレックスを形成するための方法であって、（ａ）ＩＨＧ分子群を生成する工程と、（ｂ）標的遺伝子配列群を生成する工程と、（ｃ）ヘテロデュプレックスの形成に適した条件下で（ａ）および（ｂ）の各群を組み合わせる工程と、を含み、ＩＨＧ分子が本発明の第１の態様に係るＩＨＧ分子である方法が提供される。
【００２０】
ＩＨＧ分子群および標的遺伝子配列群は、ＩＨＧおよび標的遺伝子配列を増幅することによって得ることができる。好適な公知の増幅方法はＰＣＲ法である。
【００２１】
本発明の上記方法の態様では、誘発ヘテロデュプレックスは、電気泳動等によって適当な担体上で分離され、標的遺伝子配列の遺伝子型を決定するために分析されることができる。本発明によって形成される誘発ヘテロデュプレックスの分離（特に、ヘテロデュプレックスを分離する工程に続く、例えば電気泳動等によるバンドの分離）は、ＩＨＧ識別子が既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から離れていない類似の方法と比較して、向上（好ましくは著しく向上）していることが分かる。
【００２２】
本発明の第３の態様によれば、ＩＨＧ識別子が既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から離れていない類似の方法と比較して、例えば電気泳動等によって適当な担体上で誘発ヘテロデュプレックスの分離を向上させるための本発明の第１の態様に係るＩＨＧ分子の使用が提供される。分離の向上は、担体上でのヘテロデュプレックスに対応するバンドの分離の向上であってもよい。
【００２３】
本発明の方法は、人間の患者が、ＩＨＧの設計対象である多型に関連する特定の遺伝的症状または疾患に罹患する可能性を予測するために使用することができる。したがって、別の態様では、本発明は、特定の遺伝子型に関連する特定の症状または疾患の存在または非存在、存在または非存在の可能性、あるいは重症度を予測するための方法に関する。この方法では、核酸サンプルを個体から得て、必要であれば多型部位の性質を理解するのに必要なレベルまで調べる。この場合、通常、１つの特定の塩基または塩基配列の有無が特定の遺伝性疾患または症状と相互に関連付けできることが必要である。ゲノムＤＮＡ配列内の多型部位に関する知見に基づいて、本発明の第１の態様に係るＩＨＧを形成することができる。形成されたＩＨＧを使用して、本発明の第２の態様に係る方法を実施し、および／または本発明の第３の態様にしたがってＩＨＧを使用し、分離された誘発ヘテロデュプレックスを分析することで、個体の特定の症状または疾患の存在または非存在、存在または非存在の可能性、あるいは重症度を予測する。
【００２４】
本発明の第４の態様によれば、本発明の第１の態様に係るＩＨＧ、ＩＨＧ用のフォーワードプライマーおよびリバースプライマー、必要に応じて対照ＤＮＡ配列、ならびに、使用上の注意を含むキットが提供される。
【００２５】
添付図面は例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明によれば、合成ＤＮＡ配列は、既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れたヌクレオチド位置に、ゲノムＤＮＡ配列に対して、少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含み、多型部位に対応するヌクレオチド位置とヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入との間に位置するヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ配列と同一である。ゲノムＤＮＡ配列が複数の既知の多型部位を含む場合には、識別子は、既知の多型部位にそれぞれ対応するヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れている。
【００２７】
ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入と、既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置との間隔は、好ましくは約１０塩基以下、さらに好ましくは約８塩基以下（例えば１〜約６塩基）、最も好ましくは１，２，３，４，５または６塩基から選択される任意の塩基数である。２以上の既知の多型部位が存在する場合には、１０塩基以下の好ましい間隔とは、識別子に最も近接する多型部位との間隔である。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、被検者（通常は人間の被検者）の遺伝物質を分析し、遺伝子の特定の位置に存在する特定の一塩基多型（ＳＮＰ）に関連する遺伝子型を決定する。ＳＮＰを含む遺伝子は、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、ここでは、一方を参照対立遺伝子、他方を変異対立遺伝子と呼ぶ。参照対立遺伝子（原型対立遺伝子または野生型対立遺伝子）は任意に指定されたものであり、通常、所定の登録番号でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）またはゲノム研究所（ＴＩＧＲ）に寄託されている遺伝子のヌクレオチド配列に対応する。変異対立遺伝子は、遺伝子内のＳＮＰ部位または複数のＳＮＰ部位の各部位に存在する変異ヌクレオチド（参照対立遺伝子のヌクレオチドとは異なるヌクレオチド）を含む。
【００２９】
ＩＨＧ技術を使用する遺伝子型決定では、核酸のサンプルを被検者から得、多型部位を含む遺伝子断片を増幅して、遺伝子断片の配列を有する単位複製配列群を生成する。通常は、遺伝子断片の側部に配置される一対のプライマーを使用するＰＣＲによって、遺伝子断片を増幅する。対象の遺伝子断片に特異的な適当なプライマーを選択する。長さが９０〜４００塩基（好ましくは１００〜１５０塩基対）である遺伝子断片を増幅するためのプライマーを選択する。通常は、多型部位が遺伝子断片の中央領域（すなわち、遺伝子断片のほぼ中央３分の１の領域）に位置することが好ましい。遺伝子断片のＰＣＲ増幅によって、周知のように、二本鎖の単位複製配列群が得られる。ＰＣＲ増幅に使用することができる手順のさらなる詳細は、国際公開第ＷＯ９３／１９２０１号に記載されている。
【００３０】
検査対象の核酸が哺乳動物のゲノムＤＮＡである場合には、ＤＮＡのサンプルは、研究を行なう特定の遺伝子型を有する個体またはその他の対象動物から得る（「個体」という用語は胎児を含む）。ＤＮＡは全ての有核細胞から抽出することができる。通常は、便宜上、末梢血液細胞からＤＮＡを得る。胎児のＤＮＡは胎盤細胞または羊水から得ることができる。その他に、ＤＮＡは毛嚢やミイラ体等からも得ることができる。ＤＮＡは、例えばミラーらの文献に記載されている迅速な塩析法等の任意の適切な方法によって単離することができる（Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄｙｋｅｓ，Ｈ．Ｐｏｌｅｓｋｙ共著、１９８８年、「ヒトの有核細胞からＤＮＡを抽出するための簡単な塩析手順（Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ
ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、第１６巻、１２１５頁）。あるいは、ＤＮＡは、逆転写によってｍＲＮＡからｃＤＮＡとして単離することもできる。
【００３１】
また、遺伝子断片に対応する配列を有するが、本明細書に記載されているように、人為的なヌクレオチドの置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせを含むように修飾されたＩＨＧ分子群を準備する。通常、例えばＰＣＲを用いた増幅によって、ＩＨＧ群を調製する。ＰＣＲ増幅に使用することができる手順のさらなる詳細は、国際公開第ＷＯ９３／１９２０１号に記載されている。ＰＣＲ用として選択されたプライマーは、ＩＨＧ分子を増幅するために選択される。ＰＣＲ増幅によって二本鎖のＩＨＧ単位複製配列群が得られる。ＩＨＧは、好ましくは対象の遺伝子断片と実質的に同じ長さであってもよく（ＩＨＧの必須の挿入塩基または欠失塩基は考慮しない）、あるいは、異なる長さ（例えば、ＩＨＧが遺伝子断片よりも短いか、または長い場合等）であってもよい。ただし、遺伝子断片とＩＨＧとが異なる長さである場合（ＩＨＧの必須の挿入塩基または欠失塩基は考慮しない）、増幅された遺伝子断片群と、増幅されたＩＨＧ群との間でテロデュプレックスを形成することができる程度の十分な重なりが必要である。ＩＨＧおよび遺伝子断片をそれぞれ増幅するために使用するプライマーは同一であってもよく、あるいは異なっていてもよい。ただし、通常は、同一のプライマーを使用することによって、実質的に同じ長さを有する増幅されたＩＨＧおよび遺伝子断片を得る（ＩＨＧの必須の挿入塩基または欠失塩基は考慮しない）。国際公開第ＷＯ９３／１９２０１号に教示されているように、プライマーを標識してもよい。
【００３２】
ＰＣＲ増幅は、同一または別々の容器（それぞれ、「混合」ＰＣＲまたは「個別」ＰＣＲ）で行なうことができる。別々に増幅を行なった後に、ヘテロデュプレックスの形成が進行するように、増幅された遺伝子断片群および増幅されたＩＨＧ群を結合またはプールする（ｐｏｏｌ）ことが好ましい。
【００３３】
ＩＨＧおよび多型部位を含む遺伝子断片の結合群からのヘテロデュプレックスの形成は、例えば国際公開第ＷＯ−Ａ−９３／１９２０１号に記載されているように、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離するためにＩＨＧおよび遺伝子断片の結合群を加熱し、次に、冷却してヘテロデュプレックスを形成することによって行なう。
【００３４】
ヘテロデュプレックスの見かけの分子量に影響を与えるが、実際の分子量には影響を与えない分子立体配座に応じて、形成されたヘテロデュプレックスを分離する。分離は、例えば電気泳動によって行なうことができる。通常は、非変性ポリアクリルアミドゲル等の核酸を完全に変性させることのないゲル上で分離を行なう。電気泳動は、所望の程度にデュプレックスを分離することができる条件下で行なう。通常は、（異なる分子立体配座によって生じる）「見かけのサイズ」が、約１０ｂｐ異なるデュプレックスを分離することができる程度の分離で十分である。また、デュプレックスの移動度および見かけのサイズを推定するために、サイズマーカーをゲル上で泳動させることができる。また、対象の遺伝子の既知の対立遺伝子に対応する配列を有する対照ＤＮＡ分子をＰＣＲによって個別に増幅し、使用するＩＨＧと共にヘテロデュプレックスを形成することができ、得られたサンプルをゲル上で泳動させて、異なるヘテロデュプレックスのためにゲル上にマーカーを設けることができる。
【００３５】
ヘテロデュプレックスの分布（分離パターン）は、対立遺伝子特異性を有する。次に、分離パターンまたはＰＣＲフィンガープリントを視覚化することができる。ＰＣＲプライマーが標識されている場合には、標識を表示させることができる。分離された標識デュプレックスを担持する基板を、標識の存在を検出する試薬と接触させる。ＰＣＲプライマーが標識されていない場合には、ＰＣＲフィンガープリントを担持する基板を、例えば臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ（商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）と接触させて、核酸断片を紫外線で視覚化することができる。あるいは、ヘテロデュプレックスを銀染色で視覚化することもできる。
【００３６】
上記説明は、当該分野において公知の方法によってＩＨＧ技術を使用する遺伝子型決定法の進め方に関する全般的な概要である。本発明は、いわゆる「識別子」が対象の多型部位に対応する位置から離れている修飾ＩＨＧ分子を提供することによって、従来の方法を改良するものである。上述したように、既知の多型部位に対応するヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れたヌクレオチド位置に、少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含み、多型部位に対応するヌクレオチド位置とヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入との間に位置するヌクレオチドがゲノムＤＮＡ配列と同一であるように、ＩＨＧのＤＮＡ配列を修飾する。
【００３７】
ＩＨＧ分子は、二重鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子のいずれかの形で形成することができる。分子の長さが約１５０ｂｐ未満の場合には、一本鎖のＤＮＡを使用することが好ましい。以下の説明では、「塩基」および「塩基対」という表現を使用する。ただし、それらの表現は、ＩＨＧの一本鎖または二本鎖の一方のみを厳密に意味する訳ではなく、理解可能な適切な修飾を用いて、いずれかに適用することができる。本発明に係る方法では、例えばＰＣＲを用いて最初の分子を増幅する。通常は、本発明で使用するように、ＩＨＧの「コード」鎖の配列である。ＩＨＧでは、「コード」鎖は、ＩＨＧが模倣するように設計されたゲノムＤＮＡのコード鎖に対応する。「対応する」とは、人為的なミスマ
ッチを創出し、誘発ヘテロデュプレックスを形成することができる人為的な欠失、置換、および／または挿入以外を効果的に模倣するようにＩＨＧが設計されたゲノムＤＮＡ配列をＩＨＧが有することを意味する。本発明の操作の対象領域以外におけるＩＨＧの配列とゲノムＤＮＡの配列との正確なハイブリダイズ適合性は必要不可欠なものではなく、本発明はそれらに限定されるものではないことに特に留意されたい。ＩＨＧとゲノムＤＮＡとの相対配列に差異が存在する場合であっても、実施可能なシステムを得ることができる。実際に、状況によっては、ＩＨＧとゲノムＤＮＡとの間に人為的なミスマッチを創出し、例えば得られたヘテロデュプレックスの分離に所望の効果を生じさせることが望ましい場合もある。もちろん、そのような人為的なミスマッチは、ヘテロデュプレックスを形成するために有効なハイブリダイゼーションを妨げる程大きなものではない。
【００３８】
ＩＨＧにおいて、多型部位に対応する位置に存在するヌクレオチドは、野生型ゲノムＤＮＡまたは対立遺伝子変異型のヌクレオチドと同一であることができる。
【００３９】
本発明は、所与の遺伝子断片内の２以上の多型部位をプローブするように適応させることができる。したがって、例えば、遺伝子断片が、互いに比較的近接した２以上の多型部位を含む場合（例えば、多型部位間の距離が約３００塩基対以内である場合）には、異なる対立遺伝子の組み合わせを識別するようなＩＨＧを設計し、かつ、ＩＨＧは、各多型部位に対する「識別子」配列を含むことができる。ＩＨＧが、人為的なミスマッチが創出された２以上の部位を含む場合には、ヘテロデュプレックスバンドの生じ得るパターンの数は増加するが、原則として、適当な対照データを使用して、対立遺伝子のあらゆる組み合わせのバンドパターンを分析・解釈することができる。
【００４０】
識別子が塩基対の欠失であって、ＩＨＧが一つのミスマッチ部位を含むように設計されている場合には、欠失は、ゲノムＤＮＡ配列に対して一つの塩基の欠失または１連の塩基対の欠失であってもよい。通常は、欠失したＤＮＡの長さは１〜約１０塩基対（例えば約２〜約６塩基対）である。
【００４１】
識別子が塩基対の置換であって、ＩＨＧが一つのミスマッチ部位を含むように設計されている場合には、置換は、ゲノムＤＮＡ配列に対して一つの塩基の置換または１連の塩基対の置換であってもよい。通常は、置換されたＤＮＡの長さは１〜約１０塩基対（例えば約２〜約６塩基対）である。
【００４２】
識別子が塩基対の挿入であって、ＩＨＧが一つのミスマッチ部位を含むように設計されている場合には、挿入は、ゲノムＤＮＡ配列に対して一つの塩基の挿入または１連の塩基対の挿入であってもよい。通常は、挿入されたＤＮＡの長さは１〜約１０塩基対（例えば約２〜約６塩基対）である。
【００４３】
ＩＨＧが２以上のミスマッチ部位を含む場合には、各識別子は少なくとも１塩基対の長さを有し、通常は１〜約５塩基対（例えば約２または３塩基対）の長さを有する。２以上の識別子の欠失、置換または挿入長さの合計は、ゲノム標的の全長の１０％以下であってもよく、通常はゲノム標的の全長の約３％である。
【００４４】
識別子は、ゲノムＤＮＡ配列に対して欠失、置換または挿入の組み合わせからなることもできる。
【００４５】
現在のところ、修飾は塩基対の挿入であることが好ましい。好ましい挿入は、同一の塩基の配列、例えば一連のＡ（アデニン）ヌクレオチドまたはＧ（グアニン）ヌクレオチドであり、最も好ましくは、一連のＡヌクレオチドの挿入である。ただし、挿入は異なる塩基の組み合わせであってもよい。
【００４６】
本発明のＩＨＧ分子は、例えば国際公開第ＷＯ９３／１９２０１号に記載されているような公知の方法によって合成することができる。
【実施例】
【００４７】
［実施例１］
本実施例は、本発明のＩＬ−１０遺伝子における−１０８２多型を検出するための使用について説明する。
【００４８】
−１０８２多型のＰＣＲに用いたプライマー配列は以下の通りである。
【００４９】
【化６】
2008517587.tif 000003
以下の配列を有する従来技術に係る第１のＩＨＧ（ＩＨＧ０）を合成した。
【００５０】
【化７】
2008517587.tif 000004
太字で示し、アスタリスク（＊）を付した「Ａ」残基は多型の位置である。下線を付した一連の４つのＡ残基は、「識別子」として機能する挿入された残基の配列を示す。
【００５１】
また、本発明に係るＩＨＧ分子を以下のようにして合成した。
【００５２】
【化８】
2008517587.tif 000005
【００５３】
【化９】
2008517587.tif 000006
【００５４】
【化１０】
2008517587.tif 000007
ＩＨＧ１、ＩＨＧ２、およびＩＨＧ３は、４つの識別用「Ａ」残基が多型部位からそれぞれ１、２または３塩基（右に）移動していること以外は、ＩＨＧ０と同一の配列を有する。
【００５５】
ゲノムＤＮＡまたはＩＨＧを１００ｎｇ、タックポリメラーゼ（先進バイオテクノロジー社）を０．５Ｕ、各プライマー（フォーワードおよびリバース）を５μＭ、ＭｇＣｌ２
を１．５ｍＭ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．８）を６７ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を１６ｍＭ、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）を０．０１％含む２０μｌの総反応体積でＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲは、ＭＪ−ＰＴＣ−１００サーマルサイクラー（ＧＲＩ社、ブレイントリー、イギリス）上で最適化した。ゲノムＤＮＡおよびＩＨＧのＰＣＲパラメータは以下の通りとした：９５℃で５分間の変性を行なった後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で３０秒間、７２℃で５分間を１サイクルとして３２サイクル行なった。
【００５６】
ＰＣＲ産物を結合・クロスマッチ（ｃｒｏｓｓ−ｍａｔｃｈｅｄ）させた。
パラメータのクロスマッチは、９５℃で２分間加熱した後、第一の制御冷却工程で６５℃に冷却し（冷却速度＝１．０℃／秒）、１分間保持して行なった。第二の制御冷却工程で４５℃に冷却し（冷却速度＝０．１℃／秒）、１分間保持した（最終保持工程は６℃で行なった）。
【００５７】
ヘテロデュプレックスを、「トリプルワイド」ミニゲルシステム（３０ｃｍ×８ｃｍ；ＣＢＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、デル・マー、米国）を使用して、非変性１５％プロトゲル（Ｐｒｏｔｏｇｅｌ）（登録商標）ポリアクリルアミドゲル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ハル、イギリス）上で分離した：ゲル構成３７．５：１（ｗ／ｖ  アクリルアミド：ビスアクリルアミド）。電気泳動は３００Ｖで９０分間行なった。０．５μｇ．ｍｌの臭化エチジウムを含む１×ＴＢＥ（トリスホウ酸−ＥＤＴＡ）緩衝液内でゲルを後染色し、３０２ｎｍの紫外線ライトボックスを使用して、ゲルを調べた。ＥＤＡＳ１２０システム（コダック社）を使用して、分析のための画像を撮影した。
【００５８】
得られた結果を図１に示す。識別子が多型部位と直接隣接して配置された場合よりも、多型から離れている場合（すなわち、ＩＨＧ１、ＩＨＧ２、ＩＨＧ３）に、ヘテロデュプレックスバンドの分離が向上していることが理解できる。ポリアクリルアミドゲル内でのヘテロデュプレックスバンドの分離が向上した結果、対立遺伝子特異パターンをより容易に識別することができ、対立遺伝子の識別を短い電気泳動時間で行なうことができる。この実験では、ＩＨＧ２によって、バンドの最適な分離と、対立遺伝子特異パターンの識別とを行なうことができた。
【００５９】
［実施例２］
本実施例は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子プロモーターにおける−２３８多型を検出するための本発明に係る使用を説明する。以下のプライマーおよびＩＨＧ分子を使用して、実施例１と同じ実験手順を行なった。
【００６０】
【化１１】
2008517587.tif 000008
【００６１】
【化１２】
2008517587.tif 000009
太字で示し、アスタリスク（＊）を付した「Ｇ」残基は、ＴＮＦ内の−２３８ＳＮＰの位置である。下線を付した一連の４つの「Ａ」残基は、「識別子」として機能する挿入さ
れた残基の配列を示す。
【００６２】
また、本発明に係るＩＨＧ分子を以下のようにして合成した。
【００６３】
【化１３】
2008517587.tif 000010
【００６４】
【化１４】
2008517587.tif 000011
ＩＨＧ１およびＩＨＧ２は、４つの識別用「Ａ」残基が多型部位からそれぞれ２または３塩基（右に）移動していること以外は、ＩＨＧ０と同一の配列を有する。
【００６５】
パラメータのクロスマッチは、９５℃で２分間加熱した後、第一の制御冷却工程で６５℃に冷却し（冷却速度＝１．０℃／秒）、１分間保持して行なった。第二の制御冷却工程で４５℃に冷却し（冷却速度＝０．１℃／秒）、１分間保持した（最終保持工程は６℃で行なった）。
【００６６】
図２は、２つのゲノムＤＮＡサンプルをクロスマッチさせた結果を示し、３つの異なるＩＨＧ試薬を使用し、一方がＧＧ変異型であり、他方がＧＡ変異型である。この遺伝子座で生じ得る３つの遺伝子型の内の２つを示している。レーン１および２は、２つのゲノムＤＮＡサンプルをＩＨＧ０とクロスマッチさせた結果を示している（ＩＨＧ０試薬は、多型部位に直接隣接して配置された４つの「Ａ」残基からなる識別子を有する。）。レーン２〜３および４〜５は、同じ２つのゲノムＤＮＡサンプルを、（それぞれ多型部位から２塩基および３塩基離れて配置された識別子を有する）ＩＨＧ１およびＩＨＧ２とクロスマッチさせて得られたヘテロデュプレックスバンドパターンを示している。図２の結果は、ＩＨＧ０とクロスマッチさせた場合よりも、ＩＨＧ１とクロスマッチさせて得られた対立遺伝子特異バンドパターンの方が容易に識別することができるため、識別用の「Ａ」残基を多型部位から２塩基離すことにより、有益な効果が得られることを示している。識別子を多型部位から３塩基離した場合には、バンドの分離のさらなる増加は見られない。この場合には、ＩＨＧｌによって最適な分離を行なうことができた。
【００６７】
以上、本発明を限定することなく概括的に説明した。当業者に容易に明らかになるであろう変更および変形は、本願および本願の特許付与後の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＩＬ−１０遺伝子プロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定における、従来技術のＩＨＧ（ＩＨＧ０）および本発明のＩＨＧ（ＩＨＧ１、ＩＨＧ２、ＩＨＧ３）を使用して得られたヘテロデュプレックスパターンを示す。
【図２】腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子プロモーター内の「−２３８」多型の遺伝子型決定における、従来技術のＩＨＧ（ＩＨＧ０）および本発明のＩＨＧ（ＩＨＧ１、ＩＨＧ２）を使用して得られたヘテロデュプレックスパターンを示す。
【図１】
2008517587.tif 000017
【図２】
2008517587.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月20日(2006.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝性疾患に関連する標的遺伝子配列の遺伝子型を決定するための方法であって、
（ａ）前記標的遺伝子配列に対応する誘発ヘテロデュプレックスジェネレータ（ＩＨＧ）分子の群を生成する工程であって、
前記ＩＨＧ分子は、前記標的遺伝子配列のゲノムＤＮＡ配列内の既知の多型部位に対応する少なくとも１つのヌクレオチド位置と、前記既知の多型部位に対応する前記ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れたヌクレオチド位置に前記ゲノムＤＮＡ配列に対して少なくとも１つのヌクレオチド置換、欠失および／または挿入（「識別子」）とを含む合成ＤＮＡ配列であり、
前記多型部位に対応する前記ヌクレオチド位置と前記識別子との間に位置するヌクレオチドは、前記ゲノムＤＮＡ配列と同一であり、
前記少なくとも１つの識別子は、１以上の挿入された塩基を含み、
前記ＩＨＧ分子によって得られる分離と、前記識別子が間隔を空けて配置されていない対応するＩＨＧを使用して得られる分離とを比較することを含む方法によって、分離されたバンドの分離の向上が得られるように、前記ＩＨＧ分子を選択する工程と、
（ｂ）前記標的遺伝子配列の群を生成する工程と、
（ｃ）ヘテロデュプレックスの形成に適した条件下で（ａ）および（ｂ）の各群を組み合わせて、前記標的遺伝子配列と前記標的遺伝子配列に対応するＩＨＧ分子との間で誘発ヘテロデュプレックスを形成する工程と、
（ｄ）前記誘発ヘテロデュプレックスを適当な担体上でバンドに分離する工程と、
（ｅ）前記分離された誘発ヘテロデュプレックスを分析して、前記標的遺伝子配列の遺伝子型を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記ゲノムＤＮＡ配列内の前記多型部位が一塩基多型（ＳＮＰ）である、方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列内に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つの識別子は、１つの塩基の挿入からなる、方法。
【請求項４】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列内に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つの識別子は、２以上の塩基の挿入を含む、方法。
【請求項５】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列内に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つの識別子は、１つの塩基の挿入からなる、方法。
【請求項６】
請求項１または２において、
前記合成ＤＮＡ配列内に含まれる前記ゲノムＤＮＡ配列に対する前記少なくとも１つの識別子は、２以上の塩基の挿入からなる、方法。
【請求項７】
請求項１において、
前記ゲノムＤＮＡ配列は、複数の既知の多型部位を含み、
前記識別子は、前記既知の多型部位のそれぞれに対応する前記ヌクレオチド位置から少なくとも１塩基分だけ離れている、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、
前記挿入は、一連の同一の塩基の挿入である、方法。
【請求項９】
請求項８において、
前記同一の塩基はＡヌクレオチドである、方法。
【請求項１０】
請求項８において、
前記同一の塩基はＧヌクレオチドである、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において、
前記合成ＤＮＡ配列は１本鎖である、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項において、
前記合成ＤＮＡ配列は２本鎖である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項において、
前記ＩＨＧの挿入塩基または欠失塩基を無視した場合に、前記合成ＤＮＡ配列は、前記ゲノムＤＮＡ配列の遺伝子断片と実質的に同じ長さを有する、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項において、
前記ＩＨＧの挿入塩基または欠失塩基を無視した場合に、前記合成ＤＮＡ配列は、前記ゲノムＤＮＡ配列の遺伝子断片と異なる長さを有する、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項において、
前記誘発ヘテロデュプレックスの分離は、電気泳動を使用して行われる、方法。
【請求項１６】
ヒトまたはその他の哺乳動物の患者などの生物が特定の遺伝子型に関連する特定の遺伝的症状または疾患に罹患する可能性を予測するための方法であって、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法にしたがって、前記遺伝的症状または疾病に関連すると考えられる前記生物の標的遺伝子の遺伝子型を決定し、
前記遺伝子型決定の結果を分析して、前記生物における前記特定の遺伝的症状または遺伝性疾患の存在または非存在、存在または非存在の可能性、あるいは重症度を予測することを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６において、
前記遺伝子型決定は、遺伝子の特定の位置に存在する特定の一塩基多型（ＳＮＰ）に対して行なわれる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項において、
前記遺伝性疾患は、嚢胞性繊維症、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血、β−サラセミア、ＩＬ−１０遺伝子プロモーター内の−１０８２多型、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）遺伝子プロモーター内の−２３８多型から選択される、方法。
【請求項１９】
ＩＬ−１０遺伝子のプロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定における、以下の配列を有するＩＨＧの使用。
【化１】
2008517587.tif 000019
【請求項２０】
ＩＬ−１０遺伝子のプロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定における、以下の配列を有するＩＨＧの使用。
【化２】
2008517587.tif 000020
【請求項２１】
ＩＬ−１０遺伝子のプロモーター内の「−１０８２」多型の遺伝子型決定における、以下の配列を有するＩＨＧの使用。
【化３】
2008517587.tif 000021
【請求項２２】
腫瘍壊死因子遺伝子内の「−２３８」多型の遺伝子型決定における、以下の配列を有するＩＨＧの使用。
【化４】
2008517587.tif 000022
【請求項２３】
腫瘍壊死因子遺伝子内の「−２３８」多型の遺伝子型決定における、以下の配列を有するＩＨＧの使用。
【化５】
2008517587.tif 000023
【国際調査報告】
2008517587.tif 000024
2008517587.tif 000025
2008517587.tif 000026
2008517587.tif 000027
2008517587.tif 000028
2008517587.tif 000029
2008517587.tif 000030