(57)【要約】本発明は、誘導体化により固定化糖質を操作する方法に関する。それによって、誘導体化の性質に応じてその糖質をより容易に検出および／もしくは同定するか、または取扱うことができる。特に、本発明は、ｉ）還元糖を含む試料を用意するステップ、ｉｉ）−ＮＨ２基を有する捕捉基を有するリンカーに共有結合した固体支持体を用意するステップであって、前記リンカーが場合によりスペーサーを介して前記固体支持体に結合しているステップ、ｉｉｉ）前記還元糖を前記−ＮＨ２基と反応させることによって固定化糖を得るステップ、ｉｖ）遊離−ＮＨ２基をキャップ剤と反応させるステップであって、そのキャップ剤が−ＮＨ２基と反応することができる反応基を有するステップ、ならびにｖ）Ｃ＝Ｎ結合を還元剤で還元することによって、リンカーおよび場合によりスペーサーを介して固体支持体に結合した糖ＣＨｎ−ＮＨ−という構造（ｎは１または２である）の反応性糖を得るステップを含む、反応性糖を調製する方法に関する。
2008530538.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．還元糖を含む試料を用意するステップと、
ｉｉ．−ＮＨ2基を有する捕捉基を有するリンカーに共有結合した固体支持体（固体）を用意するステップであって、前記リンカーがスペーサーを介して前記固体支持体に場合により結合しているステップと、
ｉｉｉ．前記還元糖を前記−ＮＨ2基と反応させることによって固定化糖を得るステップと、
ｉｖ．遊離−ＮＨ2基をキャップ剤と反応させるステップであって、前記キャップ剤が−ＮＨ2基と反応することができる反応基を有するステップと、
ｖ．Ｃ＝Ｎ結合を還元剤で還元するステップと、
ｖｉ．それによってリンカーおよび場合によりスペーサーを介して固体支持体に結合した糖ＣＨn−ＮＨ−（ｎは１または２である）という構造の反応性糖を得るステップと
を含む、反応性糖を調製する方法であって、ステップｉｖおよびｖは任意の順序で行うことができる方法。
【請求項２】
ｖｉｉ．前記反応性糖の−ＮＨ−基を、窒素反応性官能基（Ｘ）を有する誘導体化剤と反応させることにより、前記作用剤に共有結合した糖を得るステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記窒素反応性官能基が、イソチオシアネート、活性エステル、カルボン酸、マイケルアクセプター、αβ不飽和スルホン、アルキル化剤、アルデヒド、ケトン、および電気陰性基を有する置換ハロ芳香族基からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導体化剤が、窒素反応性官能基で誘導体化された分光学的に検出可能な化合物である、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記誘導体化剤が、窒素反応性官能基で誘導体化された蛍光化合物である、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｖｉｉｉ．前記糖に結合した前記作用剤を分光分析により検出するステップ
をさらに含む、請求項４および５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記誘導体化剤が窒素反応性官能基で誘導体化された質量分析用タグであり、前記質量分析用タグが糖の検出および／または構造の特徴付けを改善することができる、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記質量分析用タグが臭素を有する分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記質量分析用タグが荷電分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記質量分析用タグが同位体標識分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ｖｉｉｉ．前記糖に結合した質量分析用タグを質量分析により検出するステップ
をさらに含む、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記誘導体化剤が、第２の結合パートナーと特異的相互作用することができる第１の結合パートナーであり、前記第１の結合パートナーが窒素反応性官能基で誘導体化されている、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
一方の結合パートナーがタンパク質であり、他方の結合パートナーが前記タンパク質のリガンドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
一方の結合パートナーがエピトープを含み、他方の結合パートナーが前記エピトープを特異的に認識する抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
一方の結合パートナーがビオチンであり、他方の結合パートナーがアビジンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の結合パートナーが検出可能な標識にコンジュゲートしている、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記誘導体化剤が窒素反応性官能基または保護された窒素反応性官能基で誘導体化された核酸である、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｖｉｉｉ．前記糖に結合した前記核酸を検出するステップ
をさらに含む、請求項１７および１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸が検出可能な標識にコンジュゲートした本質的に相補的な核酸により検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸の検出が前記核酸の増幅を伴う、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記作用剤がＸ−テザー−ＹまたはＸ−テザー−Ｙpという構造の二官能性試薬であり、ここで、Ｘは窒素反応性官能基であり、Ｙは第２の反応性官能基であり、Ｙpは保護された反応基Ｙである、請求項２および３のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の反応性官能基Ｙが、チオール、カルボキシル基、活性化カルボキシル基、ジスルフィド、活性化ジスルフィド、アルキル化剤、アルケン、アルキン、アルデヒド、ケトン、およびアジドからなる群から選択されるか、またはＹpが、前記基Ｙの保護された誘導体および保護されたアミンからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｖｉｉｉ．Ｙと反応することができる官能基（Ｚ）を有する第２の誘導体化剤を用意するステップと、
ｉｘ．官能基ＺおよびＹを反応させることによって、テザーおよび前記第１の誘導体化剤を介して前記第２の誘導体化剤を前記糖に共有結合させるステップと
をさらに含む、請求項２２および２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の誘導体化剤が薬物、造影剤、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、核酸、分光学的に検出可能な化合物、質量分析用タグ、および第２の結合パートナーと特異的に相互作用することができる第１の結合パートナーからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｖｉｉｉ．微生物、ミセル、ファージ、ウイルス、およびナノ粒子からなる群から選択される粒子を用意するステップであって、前記粒子がＹと反応することができる官能基（Ｚ）を有するステップと、
ｉｘ．前記官能基ＺおよびＹを反応させることによって、前記テザーおよび前記作用剤を介して前記粒子を前記糖に共有結合させるステップと
をさらに含む、請求項２２および２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ｖｉｉｉ．前記糖を、前記糖と関連することができる検出剤と接触させるステップと、
ｉｘ．前記検出剤を検出するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出剤が、アリールボロン酸またはヘテロアリールボロン酸を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出剤がポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、レクチン、セレクチン、毒素、受容体、抗体、および酵素からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉基がＭ−ＮＨ2という構造を含むか、またはそれからなり、ここで、Ｍは複素原子である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記リンカーが、アルキル、アリール、エーテル、およびアミドからなる群から選択される切断不可能なリンカーであり、前記の任意のものが場合により置換されていてもよい、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記リンカーが、酸、塩基、求核体、求電子体、酸化、還元、フリーラジカル、光、熱、または酵素との反応により切断可能である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、前記切断可能なリンカーを切断することによって前記糖を放出させるステップをさらに含み、このステップが、ステップｖ、ｖｉ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ、またはｉｘの後に行われてもよい、請求項３３および３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記リンカーがスペーサーを介して前記固体支持体に結合している、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記スペーサーが０から１０００原子長の範囲であり、場合により分岐している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記固体支持体が、ポリマー、固体、不溶性粒子、および表面からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記固体支持体がセンサーである、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記糖を１つまたは複数の前記グリコシダーゼと接触させることにより、新しい還元糖を作製するステップをさらに含み、但し、前記最初の糖がグリコシダーゼの基質である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
新たに作製された還元糖を固体支持体に固定化するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記糖を、グリコシルトランスフェラーゼ、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、グリコシンターゼ、およびトランスグリコシダーゼのクラスから選択される１つまたは複数の酵素と接触させることにより、前記糖を新しい構造に変換するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
新しく作製された糖または構造を検出するステップを含む、請求項４０から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記還元剤がＢＨ結合を有するボランもしくは水素化ホウ素、またはＳｉＨ結合を有するシランである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記還元糖、前記固体支持体、および前記還元剤を含む試料の同時インキュベーションを伴う、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において参照された全ての特許文献および非特許文献は、引用により組込まれている。
（発明の分野）
本発明は、糖質操作の分野に関する。特に、本発明は、誘導体化により固定化糖質を操作する方法に関する。この方法により、誘導体化の性質に応じて糖質をさらに容易に検出および／もしくは同定するか、または取扱うことができる。したがって、一態様では、本発明は糖質の検出および同定の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
糖質は自然界において多様な形態で存在する。ヒトを含む動物における例には、溶液中の遊離還元糖（血清中の単糖であるグルコースなど）、溶液中の遊離オリゴ糖（乳中の二糖であるラクトースなど）が挙げられ、それらの糖質は、様々なアミノ酸（アスパラギン、セリン、トレオニン、その他など）との共有結合を介してペプチドまたはタンパク質に結合しているか、（ガングリオシドにおけるように）セラミドなどの脂質に共有結合しているか、またはホスファチジルイノシトールを介して膜アンカーに結合していることがある。糖は、グルクロニダーゼなどの代謝に関与する一部の小分子を含む多数の小分子にも結合していることが見出されている。上記例において、糖鎖の長さは糖残基１個から１００個超まで異なりうる。
【０００３】
細菌および植物を含む下等生物では、さらに広い構造アレイが存在する。細菌細胞の表面は、数千残基長の糖ポリマーで被覆されていることがあり、その糖ポリマーは細菌の検出における抗原として、およびワクチンとして作用することがある。糖は、細菌細胞壁に内在する部分として存在する。その糖自体は（アミノグリコシド系抗生物質、例えばストレプトマイシンなどの）抗生物質でありうるし、また（エリスロマイシンおよびバンコマイシンなどの）抗生物質に不可欠な構成要素として、（アカルボースにおけるような）酵素阻害剤として、もしくは（例えばカリケアミシンなどの）抗癌剤として見出されることがある。
【０００４】
特に対象となる一領域は、糖タンパク質および糖脂質に結合していることが見出された糖鎖（グリカン）の構造である。糖タンパク質のグリコシル化パターンは、そのバイオアベイラビリティ、そのターゲティングを含めた生体機能に重要であることが示され、腫瘍細胞の転移能と直接相関付けられてさえもいる。例えばヒト血清トランスフェリンのグリコシル化パターンは、糖タンパク質糖鎖不全症候群（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と名付けられた一連の遺伝性疾患のための診断テストとして使用されている。特異的糖脂質配列は、糖尿病においてニューロン発生および細胞表面シグナル伝達に関与することが示され、テイ−サックス病などのある種の特異的代謝疾患において蓄積し、特異的糖脂質配列がその疾患に関して診断に役立っている。
【０００５】
上記のオリゴ糖および多糖における糖残基間の結合は、αまたはβ配置のいずれかを有することがあり、グリカンは多分岐することがある。したがって、グリカン鎖に可能な構造の多様性は莫大であり、したがって、その構造の特徴付けは本質的に複雑である。したがって、研究、診断、組換え糖タンパク質のグリコシル化のモニタリング、ならびに新しい医薬品の開発における糖質およびグリカンの構造の検出、構造の特徴付け、同定、定量、および化学／酵素的操作のための方法には強い関心が存在する。
【０００６】
糖質の構造分析のためにいくつかの方法が現在使われており、これらについては最近総説された。非誘導体化オリゴ糖および糖脂質は、ＮＭＲ分光法、質量分析、およびクロマトグラフィーにより分析することができる。はるかに大きな糖タンパク質については、質量分析はいっそう限られた情報しかもたらさないが、その糖タンパク質のタンパク質分解消化産物、すなわち糖ペプチドの分析が大規模に使用されてきた。非誘導体化オリゴ糖に関する間接的な構造情報は、そのオリゴ糖がレクチン、抗体、または酵素などの糖質結合タンパク質と相互作用する能力からも推定することができる。
【０００７】
糖質自体はＮ−アセチル基を除いて特徴的な発色団を有さないため、光学的または分光学的検出による糖質の分離のモニタリングは一般に使用されない。しかし、ポリオールのパルスアンペロメトリック検出はクロマトグラフィーでの検出に重要な技術である。
【０００８】
糖質の高感度検出に最も広く使用されている方法は、放射性または蛍光タグのいずれかを用いた還元末端（ラクトール、すなわちヒドロキシアルデヒドおよびヒドロキシケトンの互変異性体（tautomer））の標識である。糖タンパク質および糖脂質から糖質を切断する化学的方法および酵素法の両方が記載されており、糖タンパク質、糖脂質、および他の複合糖質（glycoconjugate）から必要な還元糖を作製することが可能になっている。通常、そのような還元糖は、還元アミノ化の条件で、すなわち最初に形成したイミン（Ｃ＝Ｎ）がアミン（ＣＨ−ＮＨ）に還元して安定な結合を生成する条件で、蛍光分子のアミノ含有誘導体と反応する。大部分の場合、標識反応は大過剰の標識剤を使用して溶液中で行われてきた。これは、分析前または分析中にその過剰の標識剤と、その副生成物とを分離することを必要とする。質量分析で役立つ他のタグは、アミノ化または還元アミノ化のいずれかにより同様に付加され、その場合、検出は質量分析計により行われてきた。
【０００９】
標識が付加されて、特異的検出が可能になったとき、続いて上記糖質を分離および検出／定量に供することができる。タグ付き糖質をグリコシダーゼなどの酵素に曝露することによって、さらなる構造情報を得ることができる。特異的グリコシダーゼがそのタグ付き糖質に作用する場合、そのグリコシダーゼは１つまたは複数の糖残基を切断する結果として、例えばＨＰＬＣおよびＣＥでの蛍光検出器により、もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥでの糖質の移動度の変化により検出される、クロマトグラフィーもしくは電気泳動での移動度変化、または質量分析計でのｍ／ｚ値の変化により検出される糖質の質量の変化を生じることができる。より高スループットの分析を提供するために、一連の酵素が使用されてきた。
【００１０】
従来技術の概要を以下に簡潔に示す。
【００１１】
Ｇａｏら、２００３は、溶液中の糖質の誘導体化に好適な技術を総説している。溶液中で糖質を還元アミノ化により誘導体化することができる。一般に、アミンの−ＮＨ2基は還元糖のアルデヒド基またはケトン基と反応することにより、−Ｃ＝Ｎ構造の化合物を生成することがある。そのような化合物を例えばＮａＣＮＢＨ3でさらに還元することができる。Ｇａｏら、２００３は、固定化糖質の操作については開示していない。
【００１２】
ＵＳ５１００７７８は、オリゴ糖の還元末端残基に同定用標識を配置すること、複数の別々の部分に分割すること、各部分を例えば特異的グリコシダーゼで処理すること、生成物をプールすること、および得られたプールを分析することを含むオリゴ糖配列決定の方法を記載している。この文書は固定化オリゴ糖について記載していない。
【００１３】
ＵＳ４４１９４４４は、反応性−ＮＨ2基を有する支持体に、糖質残基を有する有機化合物を化学的に結合させる方法を記載している。この方法は、糖質ジオールを過ヨウ素酸酸化してその糖質のＣ−Ｃ結合を切断することにより反応性アルデヒドを生成させること、または−ＣＨ2ＯＨ基を酵素的に−ＣＨＯ基に酸化することのいずれかを伴う。どちらの酸化も糖質の構造変化を生じるものである。この反応性アルデヒドを−ＮＨ2基との反応により固定化することができる。糖質含有化合物の固定化後に、（例えばＮａＢＨ4を使用した）還元ステップを行って、安定性を高めることができる。この文書は、還元糖の還元末端を経由したその還元糖の固定化も、還元されたアミン結合を介した固定化改変糖質含有化合物の操作も記載していない。さらに、その糖質の化学的性質は改変されており、この改変は、グリコシダーゼによる特異的酵素切断などのさらなる調節を損なうおそれがある。この文書は、固定化オリゴ糖に分子構造の付加が生じる、そのオリゴ糖へのいずれかの化学試薬の付加についてもまた記載していない。
【００１４】
ＷＯ９２／７１９９７４はオリゴ糖を配列決定する方法を記載している。この方法は、固体支持体上にオリゴ糖を固定化し、続いて多様なグリコシダーゼで処理することを伴う。固定化前にそのオリゴ糖をコンジュゲートに結合させることができる。この文書は、グリコシダーゼ処理以外の固定化オリゴ糖の調節については記載していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記は、グリカンの生物学的重要性および複雑性を説明し、単糖などの還元糖およびオリゴ糖の還元糖末端にタグを結合させるいくつかの有益性をまとめたものである。今日まで、そのような結合は、大過剰のタグ剤（および多くの場合還元剤などのさらなる化学薬剤）を使用して溶液中で行われている。したがって、検出またはさらなる操作のいずれかを行う前に、時間がかかり、困難であることが多い分離技術をその結合に適用することが必要となる。そのような分離技術は、常に物質の損失および希釈を招き、よって分析をかなり複雑化して偏らせる。したがって、簡便な方法が大いに必要とされている。その簡便な方法は、糖質構造にタグを取付け、さらにその構造を操作することができ、反応出発物質、試薬、副生成物、および求められている生成物を分離するための複雑で偏った方法を必要としない。本明細書においてそのような簡便な方法を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、いずれかのスペーサー（すなわちスペーサーの存在下または不在下）および−ＮＨ2官能基（functionality）を含有する捕捉基を含む（切断可能でありうる）リンカーからなる固定化された分子との反応により、（本明細書下記の「固体支持体」の項に記載したいずれかの固体支持体でありうる）固体支持体に（本明細書下記の「還元糖」の項に言及したいずれかの還元糖でありうる）還元糖を共有結合させる方法に関する。結果として生じた固定化糖は、Ｃ＝Ｎ結合を有する非環式形態を有し、その非環式形態は、その環式グリコシルアミン互変異性体と平衡でありうる。
【００１７】
固定化後に固体支持体上の遊離−ＮＨ2基をキャップしてもよく、Ｃ＝Ｎ結合を還元することもできる。この方法は、図１のＡ＋Ｂ→Ｅに要約されている。この図は、非誘導体化ピラノースを示しているが、いずれかの還元糖を表すことが意図される。
【００１８】
変形形態では、本発明の方法は、遊離−ＮＨ2基をキャップする前にＣ＝Ｎ結合を有する（図１の構造Ｃに例示される）固定化糖をＣＨ−ＮＨに還元し、構造Ｃredの化合物（図１）を生成させることを含みうる。次に、この段階でＣredの−ＮＨ2基をキャップし、上記および図１に示したＣ→Ｄ→Ｅという順序により生成した構造と同じ構造Ｅの化合物を生成させてもよい。
【００１９】
したがって、構造Ｅの化合物を、Ａ＋Ｂ→Ｃ→Ｄ→Ｅ、またはＡ＋Ｂ→Ｃ→Ｃred→Ｅという順序のいずれかにより生成させることができる。
【００２０】
したがって、反応性糖を調製する方法を提供することが本発明の目的であり、前記方法は、
ｉ．（図１のＡのような）還元糖を含む試料を用意するステップと、
ｉｉ．−ＮＨ2基を有する捕捉基を有するリンカーに共有結合した固体支持体（例えば図１の固体）を用意するステップ（ここで、前記リンカーは場合により（図１のＢのような）スペーサーを介して前記固体支持体に結合している）と、
ｉｉｉ．前記還元糖を前記−ＮＨ2基と反応させることによって、（図１のＣのような）固定化糖を得るステップと、
ｉｖ．遊離−ＮＨ2基をキャップ剤と反応させるステップ（ここで、そのキャップ剤は、−ＮＨ2基と反応することができる反応基を有する）と、
ｖ．還元剤でＣ＝Ｎ結合を還元するステップと、
ｖｉ．それによってリンカーと、場合によりスペーサーとを介して固体支持体に結合した糖ＣＨn−ＮＨ−という構造（ｎは１または２である）を含む（図１の化合物Ｅのような）反応性糖を得るステップと
を含み、ここで、ステップｉｖおよびｖはいずれかの順序で行うことができる。
【００２１】
ステップｉｖがステップｖの前に行われる本発明の実施形態では、ステップｉｖでの−ＮＨ2基のキャッピングは例えば図１の化合物Ｄを生じるであろうが、一方、ステップｖで行われる還元は例えば図１の化合物Ｅを生じるであろう。
【００２２】
次に、ステップｖがステップｉｖの前に行われる本発明の実施形態では、（例えば図１の化合物Ｃの）Ｃ＝Ｎ結合の還元は例えば図１の化合物Ｃredを生じるであろう。ステップｉｖの−ＮＨ2基のキャッピングは例えば図１の構造Ｅの化合物を生成するであろう。還元糖を含む試料を固体支持体および還元剤と同時にインキュベートできることは本発明に包含される。したがって、Ｃ＝Ｎ結合の還元（ステップｖ）は、還元糖と固体支持体の−ＮＨ2基との反応（ステップｉｉｉ）の直後に行われるであろう。
【００２３】
ステップｉｉｉでは、好ましくは前記還元糖の還元末端を前記−ＮＨ2基と反応させる。したがって、好ましくは還元糖のヘミアセタールまたはアルデヒド基を−ＮＨ2基と反応させる。
【００２４】
この方法は、
ｖｉｉ．反応性糖（例えば図１の化合物Ｅ）の−ＮＨ−基を、窒素反応性官能基（Ｘ）を有する誘導体化剤と反応させることにより、この作用剤に共有結合した糖を得るステップ
をさらに含むことが好ましい。前記作用剤に共有結合した前記糖は、例えば図１の化合物Ｆ（その誘導体化剤がタグである場合）または図１の化合物Ｈでありうる。化合物Ｈは、その誘導体化剤が官能基に結合したテザー（tether）である場合である。
【００２５】
この状況および図１（下記参照）における用語「タグ」は、別の分子に共有結合することができ、それにより、共有結合を受けた前記別の分子を標識することができるいずれかの原子、分子、または物質（entity）を示すことが意図される。
【００２６】
（図の説明）
図１は、本発明による方法の一例を示す。図１：Ａ〜Ｅは、反応性糖Ｅを得るために固体支持体上に還元糖を捕捉および操作することを示す。図１：Ｅ〜ＧおよびＪは、固体支持体上での反応性糖Ｅの操作およびタグ付き糖の切断を示す。本発明の方法は、図１に示された１つまたは複数のステップを含むことがある。図１では、還元糖はピラノースで例示されるが、この方法にいずれかの還元糖を使用することができる。この図は、リンカーがスペーサーを介して固体支持体に結合している例を示すが、そのリンカーは固体支持体に直接結合していてもよい。その固体支持体は、この図で「固体」と称されるが、本明細書下記に言及したいずれかの固体支持体でありうる。
【００２７】
図２は、本発明の実施例で使用された還元糖およびその混合物の構造１〜１０を示す。
【００２８】
図３は、リンカー（１４）の合成およびスペーサー（１５）の構造を示す。
【００２９】
図４は、単糖標準として使用されたＴＭＲタグ付きＤ−ガラクトース誘導体であるＧａｌＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲ（２１）の溶液相合成および命名の説明を示す。
【００３０】
図５は、糖ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲという一般式である８つの通常の哺乳動物単糖の合成タグ付き誘導体の構造２１〜２８を示す。
【００３１】
図６は、４つの固体支持体ＢP、Ｂ0、Ｂ1、およびＢ2の構造を示す。
【００３２】
図７は、一部のキャップ剤の構造を示す。
【００３３】
図８は、タグ−Ｘという一般構造である、使用したいくつかの窒素反応性タグ剤の構造を示す。
【００３４】
図９は、Ｘ−テザー−ＹPという一般構造である保護された窒素反応剤２９を用いたＥ→Ｊ（３０）の例を示す。
【００３５】
図１０は、図５に示された８つのＴＭＲ標識単糖標準のＣＥによる経時的（時間の単位はmin（分）である）な分離を示す。溶出順序はＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｘｙｌ（２４）、Ｍａｎ（２３）、Ｇｌｃ（２２）、ＧｌｃＮＡｃ（２６）、Ｆｕｃ（２５）、Ｇａｌ（２１）、およびＧｌｃＡ（２８）である。上図は拡大図である。
【００３６】
図１１は、（４．２．１項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＬａｃＮＡｃを有する）ＧP３のＣＥを示す。
【００３７】
図１２は、ネガティブイオンモードでの（４．２．２節の４−ブロモフェニルイソチオシアネートを用いてタグ付けされた還元糖としてラクト−Ｎ−テトラオースを有する）ＧP５のエレクトロスプレー質量スペクトルを示す。挿入図はＢｒの主同位体に対応する２つのピークを示す拡大図である。
【００３８】
図１３は、（４．２．３項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした単糖混合物６を有する）ＧP６aのＣＥを示す。Ｘは未同定のピークを表す。溶出順序は、ＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｍａｎ（２３）、およびＦｕｃ（２５）である。下図は拡大図である。
【００３９】
図１４は、（４．２．４項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした単糖混合物７を有する）ＧP７aのＣＥを示す。Ｘは未同定のピークを表す。溶出順序は、ＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｍａｎ（２３）、およびＦｕｃ（２５）である。下図は拡大図である。
【００４０】
図１５は、（４．２．５項のＦＩＴＣを使用してタグ付けしたオリゴ糖混合物９を有する）ＧP９のＣＥを示す。溶出順序はＧ７からＧ２である（図２）。
【００４１】
図１６は、ＧP１０（４．２．６項でＦＩＴＣを使用してタグ付けしたリボヌクレアーゼＢオリゴ糖１０）のＣＥを示す。
【００４２】
図１７は、（４．３．１項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＧａｌ２を有する）Ｇ1２のＣＥを示す。
【００４３】
図１８は、（４．３．２項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＬＮＴ５を有する）Ｇ1５のＣＥを示す。
【００４４】
図１９は、（４．３．３項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖混合物として８を有する）Ｇ1８のＣＥを示す。溶出順序はＬＮＴに続いてＧａｌである。
【００４５】
図２０は、５．１．１項の固定化ＬＮＴ（５）のβ−ガラクトシダーゼ消化後の切断生成物Ｇ0５（Ａ）、Ｇ1５（Ｂ）、およびＧ2５（Ｃ）のＣＥを示す。ＴＲＩＴＣ標識ＬＮＴ四糖は最初３６分付近で溶出する。ガラクトースの消失により３８分後に溶出する三糖生成物が得られる。
【００４６】
図２１は、Ｆ2４（ＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてのマルトトリオース（Ｇ３））と５．１．２項のグルコアミラーゼとのインキュベーション前（図Ａ）およびインキュベーション後（図Ｂ）の切断生成物のＣＥを示す。図Ａを記録する前にタグ付きＧｌｃ（２２、図５）の参照試料を試料に添加した。
【００４７】
図２２は、（ＬＮＴ基および遊離ＮＨ2基を有する）Ｃ2５のβ−ガラクトシダーゼ処理に続いて放出されたガラクトースの捕捉、還元、および５．２項のＴＲＩＴＣを用いたタグ付け後に得られた切断生成物のＣＥを示す。溶出順序はＬＮＴ、ガラクトースの消失に起因する三糖、およびガラクトースである（２１）。
【００４８】
図２３は、多様な作用剤を用いたキャッピング、還元、および６．１項のＴＲＩＴＣを用いた標識後のＣ2２（固定化ガラクトース）由来切断生成物のＣＥ分析を示す。キャップ剤は、Ａ（無水酢酸：酢酸無水物）、Ｂ（安息香酸無水物）、Ｃ（トリクロロ酢酸無水物）、およびＤ（ジブロモキシレン）であった。タグ付きガラクトース（２１）は全ての図において１７分付近に溶出している。
【００４９】
図２４は、６．２項でＣ→Ｃred→→Ｇという順序を経由してガラクトースを加工することから得られた切断生成物のＣＥを示す。ガラクトース２１は１７分に溶出している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
（還元糖の操作方法）
本発明は還元糖を操作する方法に関する。本発明の方法の例を図１に要約する。本発明の方法は、図１に示されたステップの全てを必ずしも伴わないことに留意すべきである。したがって、この方法は、図１に要約されたステップの一部しか含まないことがある。好ましくは、この方法は、少なくともＡ＋Ｂ→Ｃ、Ｃ→Ｄ、およびＤ→Ｅのステップ、またはＡ＋Ｂ→Ｃ、Ｃ→Ｃred、およびＣred→Ｅのステップを含むであろう。図１において、還元糖はピラノースによって例示されているが、本発明にいずれかの還元糖、特に本明細書下記の「還元糖」の項に記載したいずれかの還元糖を使用することができる。図１のピラノース環を横切る−ＯＨ基は、その還元糖がピラノース環に結合した１つまたは複数のヒドロキシル基を有しうることを示すことが意図される。
【００５１】
本発明の方法の各ステップを本明細書下記にさらに詳細に説明する。下記において大文字Ａ〜ＪおよびＣredは図１を参照している。
【００５２】
本発明の各化合物または中間体の同一性、例えば化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪの同一性は、ＮＭＲなどの当業者に公知の標準的な技術により評価することができる。
【００５３】
Ａ．還元糖
本明細書に使用される用語「還元糖」は、Ｃｕ2+をＣｕ+に還元することができるという糖の古典的定義を包含している。糖が還元性であるかどうかは、例えばフェーリング試薬を使用して検査することができる。さらに現代の用語では、還元糖はアルデヒド基またはＲ2Ｃ（ＯＨ）ＯＲ’（式中Ｒ’はＨではない）という式のヘミアセタールを有する糖である。好ましくは、還元糖は、ヘミアセタールと呼ばれる環化形態と平衡にあるアルデヒドを有する糖質構造である。Ｄ−グルコースはそのような還元糖の非限定的な例である。最も多い環形態は、フラノースと呼ばれる５員環およびピラノースと呼ばれる６員環を含む。（命名規則参照）。
【００５４】
本明細書に使用される用語「糖」は、単糖、オリゴ糖、多糖、および単糖、オリゴ糖、または多糖を有する化合物を包含する。用語「糖質（炭水化物）」および「糖」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００５５】
オリゴ糖および多糖は、グリコシド結合した単糖からなる化合物である。一般に多糖は、少なくとも１０個の単糖残基を有し、オリゴ糖は一般に２から１０個の範囲の単糖を含む。オリゴ糖および多糖は直鎖または分岐でありうる。単糖はポリヒドロキシアルデヒドＨ−（ＣＨＯＨ）n−ＣＨＯまたはポリヒドロキシケトンＨ−（ＣＨＯＨ）n−ＣＯ−（ＣＨＯＨ）m−Ｈ（式中ｍおよびｎは整数である）として定義される。好ましい単糖は４から９個の範囲の炭素を有する。したがって、好ましくは、ポリヒドロキシアルデヒドについては、ｎは３から８の範囲の整数であり、ポリヒドロキシケトンについては、ｎ＋ｍは３から８の範囲の整数である。単糖はアルドースおよびケトースなどの化合物、ならびに広範囲のその誘導体である。誘導には、酸化、脱酸素化、１つまたは複数のヒドロキシル基の好ましくは水素原子、アミノ基、またはチオール基による置換、およびヒドロキシ基またはアミノ基のアルキル化、アシル化、硫酸化、またはリン酸化により得られるものが挙げられる。ＩＵＰＡＣの命名によると、糖質は、アルドースおよびケトースなどの化学量論式Ｃn（Ｈ2Ｏ）nの化合物、ならびにカルボニル基（アルジトール）の還元により、１つまたは複数の末端基からカルボン酸への酸化により、あるいは、１つまたは複数のヒドロキシル基から水素原子、アミノ基、チオール基、もしくは類似の基への置換により、単糖から得られる物質、あるいはこれらの化合物の誘導体である。
【００５６】
好ましい実施形態では、還元糖は天然還元糖であるか、または糖質を有する天然もしくは組換え生成した化合物から遊離して、好ましくは遊離後にさらなる修飾に供されなかった還元糖である。特に、その還元糖が天然還元糖であるか、または天然もしくは組換え生成した化合物から遊離した還元糖であって、前記天然糖または前記遊離した糖のアルコール基のいずれもオリゴ糖レベルで酸化によりアルデヒドまたはケトンに酵素的に変換されていないことが好ましい。その還元糖は、天然還元糖または天然もしくは組換え生成した化合物から遊離した還元糖であって、前記天然糖または前記遊離した糖は過ヨウ素酸処理（periodate treatment）に供されていないことも好ましい。したがって、前記天然糖または前記遊離した糖のアルコール基はいずれもアルデヒドまたはケトンに変換されていないことが一般に好ましい。これに関連して、組換え生成した化合物は、組換え技術の助けを借りて生きた生物により生成される化合物、例えば異種（heterologous）糖タンパク質である。
【００５７】
還元糖は、多様な起源から得ることができる。例えば還元糖は、生物または生物の一部から、例えば動物もしくは植物から、または１つもしくは複数の特異的動物もしくは植物組織から、原核細胞もしくは真核細胞などの生物から、ウイルスから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、細菌細胞、酵母、もしくはファージから得ることができる。例えば還元糖は、いずれかの前記細胞、微生物、もしくは生物の抽出物から単離することができる。そのような抽出物は遊離糖質などの還元糖を含むことがある。抽出物は、単糖、オリゴ糖、多糖、または糖質部分、特に糖質が結合した糖タンパク質または糖脂質または有機小分子を含む一般にグリコシドと呼ばれる化合物を含むこともある。糖タンパク質は、糖質構成要素がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質構成要素に結合している化合物である。したがって、本明細書に使用される用語である糖タンパク質は、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンも包含する。糖脂質は、グリコシド結合によりアシルグリセロール、スフィンゴイド、セラミド（Ｎ−アシルスフィンゴイド）、またはプレニルホスフェートなどの疎水性部分に結合した１つまたは複数の単糖、オリゴ糖、多糖、または糖質部分を有する化合物である。グリコシドは、Ｏ、Ｎ、またはＳのいずれかを介して１つまたは複数の糖にグリコシド結合した有機小分子（ＭＷｔ１００〜５０００）を示すことが意図される。
【００５８】
還元糖は、溶液中または固相上での化学合成によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製されたオリゴ糖などの化学合成または化学／酵素合成の生成物でもある。例えば硫酸化、リン酸化、またはグリコシル化などの酵素反応により、まさにこれらの合成オリゴ糖をさらに修飾することができる。したがって、合成もしくは半合成オリゴ糖またはオリゴ糖ライブラリーの操作のためにもまた、本明細書に記載した方法を使用することができる。
【００５９】
好ましくは単糖、オリゴ糖、多糖、または糖質部分は、本発明の方法を行う前に糖タンパク質から遊離させる。当業者に公知の標準法によりこれを行うことができる。化学的方法または酵素法により、Ｎ−結合した単糖、オリゴ糖、多糖、または糖質を糖タンパク質から切断することができる。酵素法は、例えばエンドグリコシダーゼＨおよびＦなどのグリコシダーゼ、またはＰＮＧアーゼ−ＦなどのＮ−グリカナーゼの使用を伴うことがある。ヒドラジノリシスもしくはアルカリβ−脱離を含めた化学的方法により、またはＯ−グリコシダーゼなどの酵素を使用して酵素的に、Ｏ−結合した単糖、オリゴ糖、多糖、または糖質を糖タンパク質から切断することができる。Ｎ−結合およびＯ−結合の両方の放出に有用な化学的方法には、ヒドラジンなどの強い求核体および／または強塩基との反応が挙げられる。酸性反応もしくは塩基性反応のいずれかを使用して、またはグリコシダーゼの作用により有機小分子から糖質を切断することができる。
【００６０】
本発明の一実施形態では、所定量の参照標準を、還元糖を含む試料に添加する。これによって、リンカーが切断可能である本発明の実施形態において、固定化後の、または固定化および放出後の前記還元糖の定量が容易になりうる。
【００６１】
参照標準は、−ＮＨ2と反応することができるいずれかの化合物、例えば本明細書下記「Ｅ→Ｆ．タグの付加」の項に記載した窒素反応性官能基の１つを有するいずれかの化合物でありうる。好ましくは、参照標準はアルデヒドまたはケトンであり、さらに好ましくは糖である。本発明の別の実施形態では、同一または異なる参照標準を固体支持体に添加してから、還元糖を含有する溶液に添加した参照標準を含む条件または含まない条件で、その還元糖を含有する溶液と接触させる。（本明細書下記の「Ｂ．固体支持体」の項参照）。したがって、２つ以上の参照標準を使用することができ、１つ（または複数）の参照標準を固体支持体に添加してから、その固体支持体と還元糖を含む溶液とを接触させ、１つまたは複数の参照標準を、その還元糖を含有する溶液に添加する。
【００６２】
固体支持体が還元糖と接触した後に、１つまたは複数の参照標準をその固体支持体に添加することもできるが、好ましくはキャッピング前に添加する。したがって、好ましくは洗浄ステップ後に図１の化合物ＣまたはＣredに参照標準を添加することができる。
【００６３】
固体支持体を参照標準に結合させる本発明の実施形態では（本明細書下記「Ｂ．固体支持体」の項参照）、異なる参照標準を使用することが好ましい。
【００６４】
本発明の一実施形態では、この方法は、この方法に使用する試料を前処理するステップを含む。特に、糖タンパク質、糖脂質、またはグリコシドなどのグリコシド結合した糖を含む試料を、固体支持体と反応させる前にスカベンジャー樹脂で前処理することができる。このスカベンジャー樹脂は、好ましくは還元糖を含めたアルデヒドおよびケトンと反応することができる求核基を有する樹脂であり、好ましくはこのスカベンジャー樹脂はアミノ基またはヒドラジンを有する。したがって、試料をこのスカベンジャー樹脂と共にインキュベーションすると、さらなるアルデヒド、ケトン、および還元糖が除去されるであろう。前処理後に、そのような方法は一般に前記グリコシド結合した糖から還元糖を遊離させることにより、還元糖を含む試料を得るステップをさらに含むであろう。したがって、前記試料内の大量のアルデヒドおよびケトンはグリコシド結合した糖から放出された還元糖であろう。本明細書上記のこの項に記載したいずれかの方法などの化学的方法または酵素法を含めた多数の方法により、前記還元糖を遊離させることができる。例えばＰＮＧアーゼ−Ｆで前処理された試料の処理は、本発明の方法による捕捉および操作のための、溶液中への還元オリゴ糖の放出を引き起こすことができる。このように放出されたオリゴ糖は、混入カルボニル化合物を本質的に有さないであろう。還元糖質の放出は、上記のように混入カルボニル化合物を除去した後で、グリコシダーゼなどの他の酵素により、または化学反応を使用して実施することもできる。
【００６５】
Ｂ．固体支持体
本発明による方法は、固体支持体への還元糖の固定化を伴う。固相化学的方法は、固定化化合物の取扱い、精製、濃縮が容易なことなどの数多くの利点をもたらす。しかし、溶液中で行うことのできる全ての反応を固相上で行うことができるわけではない。固体支持体への結合は、各分子実体（molecular entity）に実際的に無限のサイズを付与する。これは、その分子が２分子反応において、その分子が溶液中で反応するであろうよりもずっとゆっくりと反応する効果を有する。溶液中で許容できる収率で実施することができる一部の反応は、固体支持体上では全く作動しないであろう。
【００６６】
本明細書に使用される用語「固体支持体」は物理的固体、不溶性ポリマー、不溶性粒子、表面、膜、および樹脂を包含し、好ましくは、固体支持体は不溶性ポリマー、不溶性粒子、表面、または樹脂である。
【００６７】
したがって、「固体支持体」は、不溶性無機マトリックス（ガラスなど）、不溶性ポリマー（プラスチック、例えばポリスチレンなど）、有機構成要素の部分および無機構成要素の部分の両方からなる不溶性マトリックス（例えば、Ｒ−Ｓｉ−Ｏ−という構造の化合物などの一部のハイブリッドケイ酸塩）、固相合成に一般に使用される有機ポリマー（ポリスチレン、ＰＥＧＡ樹脂、ＰＥＧ樹脂、ＳＰＯＣＣ樹脂、およびそのハイブリッド）、（ある種の有機溶媒に可溶性で、他の溶媒の添加により不溶性にすることができる）ポリエチレングリコール鎖のことがある。この固体は、（金などの）金属、合金、または例えばインジウム−スズ酸化物もしくは雲母などの複合体のこともある。
【００６８】
上に挙げた固体支持体のうちいずれかのものを、そのうえ糖質に対して親和性を有する、非限定的にアリールボロン酸またはそのポリマーなどの作用剤で被覆することができる。そのような被覆は、その固体支持体表面での糖質濃度を増加させ、捕捉の速度および収率を高めることができる。
【００６９】
固相合成に使用される有機ポリマーには、例えばＴｅｎｔａＧｅｌ（Ｒａｐｐ  ｐｏｌｙｍｅｒｅ、チュービンゲン、ドイツから市販されている）、ＡｒｇｏＧｅｌ（Ａｒｇｏｎａｕｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、サンカルロス、カリフォルニア州から市販されている）、ＰＥＧＡ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アマースト、マサチューセッツ州から市販されている）、ＰＯＥＰＯＰ（Ｒｅｎｉｌら、１９９６、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３７：６１８５−８８；Ｖｅｒｓａｍａｔｒｉｘ、コペンハーゲン、デンマークから市販されている）、およびＳＰＯＣＣ（Ｒａｄｅｍａｎｎら１９９９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１２１：５４５９〜６６；Ｖｅｒｓａｍａｔｒｉｘ、コペンハーゲン、デンマークから市販されている）が挙げられる。
【００７０】
本発明の一実施形態では、その固体支持体は、（Ｓａｍｏｙｏｌｏｖら、２００２、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１５：１９７〜２０３に記載されたいずれかのセンサーなどの）弾性表面波センサー（surface acoustic wave senser）または（Ｈｏｍｏｌａら、１９９９、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、５４：３〜１５に総説されたいずれかのセンサーなどの）表面プラズモン共鳴センサーなどのセンサーである。そのような固体支持体は、ガラスなどの無機物質、金などの金属、有機ポリマー物質、またはそのハイブリッドのことがあり、タンパク質もしくは多糖、デンドリマーなどのオリゴマー、またはポリアクリルアミドもしくはポリエチレングリコールなどのポリマーなどの多様な被覆で被覆されていてもよい。好ましい実施形態では、その固体支持体はガラスまたはＰＥＧＡ樹脂である。
【００７１】
本発明の一実施形態では、その固体支持体は固定化還元糖の定量を容易にすることができる参照標準と結合している。特に、前記参照標準が切断可能なリンカーによって固体支持体に（直接または間接的のいずれかで）結合していることが望ましい。そのリンカーは固定化されて放出された還元糖の定量を容易にすることができるであろう。切断可能なリンカーを介してその還元糖が固体支持体に固定化される本発明の実施形態では、参照標準が同一または類似の切断可能なリンカーを介して固体支持体に固定化されることが好ましい。
【００７２】
参照標準はいずれかの検出可能な化合物でよく、例えば参照標準は糖であることも、糖ではないこともあるが、好ましくは参照標準は糖質である。
【００７３】
参照標準は種々の量で用いられ、一般にその固体支持体は１つの参照標準あたり２０から５００個の範囲、好ましくは５０から２００個の範囲、例えば９０から１１０個の範囲の−ＮＨ2基を含んでもよい。
【００７４】
Ｂ．スペーサー
本発明によると、その固体支持体は場合によりスペーサーを介してリンカーに結合している。しかし、その固体支持体がそのリンカーに直接結合していることも本発明に含まれる。
【００７５】
スペーサーは、１から１０００原子長の範囲の化学実体である。好ましくは、前記スペーサーは直鎖もしくは分岐鎖および／または環構造である。スペーサーの性質は疎水性もしくは親水性であるか、またはこれら２つの特性が混じり合ったものを有することがある。スペーサーの群は、固相合成、およびスペーサーを介して固体支持体に結合した分子の検出を伴うビーズ上、ウェル中、またはスライド上のアッセイに一般に使用される分子を含む。当業者は、与えられた固体支持体に有用なスペーサーを容易に同定することができるであろう。
【００７６】
スペーサーは、好ましくは場合により分岐していることがあるアルキル鎖（より好ましくはＣ1からＣ1000アルキル鎖）であり、ここで、前記アルキル鎖は、場合により１つまたは複数の位置で、１つまたは複数のＢ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを含む基に置換されている。スペーサーは、場合により同様に分岐、または置換されていてもよい１つまたは複数のアリール残基も含むことがある。好ましい一実施形態では、そのスペーサーはアミドおよびエーテルからなる群から選択される。したがって、そのスペーサーは１つまたは複数のアミド結合（−ＣＯＮＨ−）、もう１つのまたは複数のエチレングリコールユニット（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−）、またはこれらのユニットとアルキルもしくはアリール鎖との組合せを含む鎖から本質的になることがある。
【００７７】
本発明の一実施形態において、スペーサーは、好ましくは第１アミンおよび第２アミンのどちらも含まない。本発明の別の実施形態では、スペーサー内に含まれる全てのアミンはキャップされている。
【００７８】
Ｂ．リンカー
本発明は、捕捉基を有するリンカーと共有結合している固体支持体上に、還元糖を捕捉することに関する。リンカーは、末端が−ＮＨ2の捕捉基を、場合によりスペーサーを経由してその固体支持体に結合させることに役立つ。リンカーは、固相有機合成に一般に使用されるリンカーなどの、多種多様のリンカーのうちいずれかのものでありうる。
【００７９】
そのリンカーは、切断可能ではないリンカーまたは切断可能なリンカーのいずれかでありうる。
【００８０】
切断可能ではないリンカーは、例えばアルキル、アリール、エーテル、またはアミドのことがあり、ここで、前記リンカーのいずれかのものは場合により置換されていてもよい。例えば、前記リンカーのいずれかのものは複素原子で置換されていてもよく、分岐としてＯ−アルキル、アルキル、アリール、または複素原子を含むことがある。一例では、そのリンカーはＰＥＧおよび／もしくはポリアミドを含むか、または本質的にそれからなる。
【００８１】
そのリンカーは、スペーサーおよび固体支持体由来の（捕捉された分子を含み、場合によりさらに修飾された）捕捉基を含む部分を切断するための反応を生じさせることができる部位を含むことがある。そのようなリンカーは切断可能なリンカーと呼ばれ、固相有機合成に広く利用されている。切断を求電子体、求核体、酸化剤、還元剤、フリーラジカル、酸、塩基、光、熱、または酵素により実施することができる切断可能なリンカーの例が公知である。
【００８２】
切断可能なリンカーは、例えば酸に不安定（例えばＲｉｎｋ、１９８７、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ  Ｌｅｔｔ．、２８：３８７に記載されたＲｉｎｋアミドおよびＰｌｕｎｋｅｔｔら、１９９５、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：６００６〜７に記載されたトレースレスシリルリンカー）、塩基に不安定（例えばＡｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ、１：５３８に記載されたＨＭＢＡ）、または光に不安定（例えばＨｏｍｌｅｓら、１９９５、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：２３１８〜２３１９に記載された２−ニトロベンジル型）でありうる。そのリンカーは、シリルリンカー（例えばＢｏｅｈｍら、１９９６、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６２：６４９８〜９９に記載されたフッ化物で切断されるもの）、アリルリンカー（例えばＫｕｎｚら、１９８８、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２７：７１１〜７１３）、およびセーフティキャッチスルホンアミドリンカー（例えば、Ｋｅｎｎｅｒら、１９７１、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１２：６３６〜７に記載されたもの）などのように、行われる化学反応の種類にさらに特異的で限定的でありうる。酵素切断可能なリンカーは、例えばＲｅｅｎｔｓら、２００２、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ、７：７１〜７６に記載された酵素切断可能なリンカーのうちいずれかのもの、またはＷａｌｄｍａｎｎら、２００１、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：３３６７〜３３９６による総説に記載された酵素不安定な保護基のいずれかの官能化誘導体でありうる。熱不安定なリンカーは、例えばＭｅｎｇら、２００４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、４３：１２５５〜１２６０に記載された種類でありうる。
【００８３】
Ｂ．捕捉基
本発明によると、リンカーは捕捉基を含み、ここで、その捕捉基は少なくとも１つの−ＮＨ2基を有する。好都合な形式では、その捕捉基の末端は基であり、その基はいずれかの基Ｒを経由してリンカーに結合した−ＮＨ2基で終結する。したがって、その捕捉基は好ましくは構造Ｒ−ＮＨ2である。Ｒは単純アルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリール基でありうる。好ましくは、Ｒは−ＮＨ2基に直接結合した複素原子を有し、リンカー−Ｍ−ＮＨ2タイプの構造を生成する。ここで、Ｍは複素原子であり（すなわち炭素ではなく）、好ましくは、ＭはＮ、Ｏ、およびＳからなる群から選択される。特に好ましいのは、Ｍがリンカー−Ｏ−ＮＨ2、リンカー−ＮＨ−ＮＨ2、リンカー−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、リンカー−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2、リンカー−Ｓ（Ｏ）2ＮＨ−ＮＨ2、およびリンカー−Ｓ−ＮＨ2という構造などにおける複素原子である化合物である。
【００８４】
Ａ＋Ｂ→Ｃ．捕捉方法
還元糖の捕捉は、捕捉基の−ＮＨ2基を、前記還元糖の還元末端と、すなわちアルデヒド基またはヘミアセタール基と反応させることにより行われる。この反応はいずれかのｐＨ値で起こりうるが、ｐＨ２〜９の範囲が最も好都合である。この方法は、鎖式アルデヒド形態の還元糖とヘミアセタール形態の還元糖（例えば図１の化合物Ａ）との間の平衡を促進するか、または好都合に改変するかのいずれかを行うことができる添加物などの１つまたは複数の添加物の添加を伴うことがあり、ここで、鎖式（open chain）アルデヒド形態が好ましい。この添加物は、例えば金属イオン、ボロン酸エステル（塩）、またはケイ酸塩でありうる。その捕捉は、（Ｃ＝Ｎとして示される）共有二重結合を経由して固体支持体に結合した種を生成し、ここで、Ｃは糖部分に、Ｎは捕捉基に由来する。この固定化糖はその環形態と平衡でありうるし、特にその還元糖がピラノースならば、固定化糖はその環状６員環形態と平衡でありうる（例えば図１の化合物ＣおよびＣ’参照）が、その糖上の適切なＯＨ基が置換されていないのであれば、その５員環形態も平衡でありうる。
【００８５】
捕捉反応はいずれかの有用な溶媒中で行うことができる。当業者は、与えられたいずれかの化合物ＡおよびＢに有用な溶媒を容易に同定することができるものである。その溶媒は、例えば水、水性緩衝液、有機溶媒、ならびに混合された水性溶媒および有機溶媒からなる群から選択することができる。その溶媒は、酸、塩基、塩、二価金属陽イオン、洗剤（界面活性剤）、シクロデキストリンもしくはカリキサレンなどの包接複合体形成分子、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、ホウ酸塩、ボロン酸エステル（塩）、またはケイ酸塩を含めた錯化剤などの１つまたは複数の添加物を含む、前述のいずれかのものでもありうる。
【００８６】
好ましい実施形態では、反応物に添加される固体支持体（図１の化合物Ｂ）の量は、還元糖に関してモル過剰の捕捉基が存在するように調整され、好ましくは前記過剰は、例えば少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも５０倍、例えば少なくとも１００倍以上大きいものである。この過剰は、還元糖のより効率的な捕捉を確実にするであろう。
【００８７】
捕捉反応をいずれかの温度で行うことができるが、好ましくは０から１００℃の範囲の温度で行う。
【００８８】
Ｃ．洗浄
捕捉基との反応により、いったん還元糖が固体支持体に固定化されたならば（図１のステップＡ＋Ｂ→Ｃ）、その固体支持体を洗浄して非共有結合した物質を除去することができる。したがって、他の化合物、特に−ＮＨ2反応基を有さない他の化合物を含む溶液中にその還元糖が用意されたならば、その還元糖を前記溶液から精製することができる。したがって、還元糖が、例えば粗細胞抽出物などの形態の非精製形態で用意されることは、本発明に含まれる。グリコシダーゼもしくはアミダーゼなどの酵素の作用により、または化学試薬によるグリコシド結合の切断を経由して、精製または部分精製した糖タンパク質、糖脂質、またはグリコシドからその還元糖を生成させることができることも含まれる。
【００８９】
当業者は、与えられた固定化糖（図１、化合物Ｃ）について適切な洗浄条件を容易に同定することができる。その洗浄は、例えば洗剤および変性剤に加えて上に言及したいずれかの添加物を場合により含む、上に言及したいずれかの溶媒を用いて行うことができる。洗浄をいずれかの温度で実施することができるが、好ましくは０〜１００℃の範囲の温度で行う。
【００９０】
Ｃ→Ｄ．キャッピング
固定化糖に結合した固体支持体（図１の化合物Ｃなど）は、未反応の遊離−ＮＨ2基をまだ含むので、この固体支持体を、その有用性の範囲を増加させる独特の操作に供することができる。
【００９１】
本発明の好ましい一実施形態では、還元糖の固定化に続いて、ＣのＣ＝Ｎ結合が反応しない条件で、当技術分野で十分に公知のアシル化剤（例えば無水酢酸）または他の窒素反応剤などのキャップ剤で未反応の−ＮＨ2基をキャップする。キャップ後に、その固体支持体は遊離アミン基をもはや全く有さず、求電子体に対して非常に低反応性のキャップされた窒素原子（Ｎ（Ｈ）キャップ）だけを有する。化合物Ｃのキャップ生成物は、例えば−Ｒ−Ｎ（Ｈ）キャップ基を有する一般構造Ｄ（図１参照）を有し、ここで、（Ｈ）はキャップ基の構造に応じて存在することもあるし、存在しないこともある。
【００９２】
したがって、糖を固体支持体と結合させているＣ＝Ｎ結合が−ＮＨ−に還元されるならば、それは、Ｒ−ＮＨ−ＣＨ2−という配列におけるｓｐ3形式で混成した窒素原子であろう。したがって、特異的反応をこの基に向けて、その還元糖で特異的な化学量論的反応を起こすことができる。
【００９３】
好ましくは、キャップ剤は、Ｃ＝Ｎ官能基と実質的に反応せずに残りの−ＮＨ2基と特異的に反応する。そのような試薬は当技術分野で十分に公知であり、その試薬には、アミド結合形成に使用される一般のアシル化剤、例えば無水酢酸、他のアルカン酸無水物、芳香族無水物（例えば安息香酸無水物）、環状無水物（例えばコハク酸無水物、フタル酸無水物）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、およびペプチド結合の固相合成を含めたアミド結合形成に一般に使用される多様な活性エステルなどの他の活性エステルが挙げられる。あるいは、対応する遊離酸と、ペプチド結合形成に一般に使用されるＤＣＣなどのｉｎ  ｓｉｔｕ活性化剤とを添加することにより−ＮＨ2基をキャップすることによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで活性エステルを生み出すことができる。アルキルイソチオシアネート（Ｒ−ＮＣＳ）、アリールイソチオシアネート（Ａｒ−ＮＣＳ）、アルキル化剤Ｒ−Ｌ（Ｌは、典型的には系列Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＳ（Ｏ）2Ｒ’からの脱離基であり、Ｒ’はアルキルまたはアリールでありうる）、αβ不飽和カルボニル化合物（ＣＨＲ＝ＣＨ−ＣＯ−（ＲはＨ、アルキルもしくはアリール、または置換されたアルキルもしくはアリールでありうる））またはαβ不飽和スルホン（ＣＨＲ＝ＣＨＳ（Ｏ）2Ｒ’またはＡｒ（Ｒは、Ｈ、アルキルもしくはアリール、または置換されたアルキルもしくはアリールでありうる））などのマイケルアクセプター、スルホン化剤（ＲＳＯ2Ｃｌなど）およびその誘導体などの、−ＮＨ2基に反応性であることが公知の他の試薬を使用することができる。同様に、一般式ＲＯ−Ｃ（Ｏ）Ｌ（Ｌは上述）のカルボネートの活性エステルとの反応により−ＮＨ2基をキャップすることができる。
【００９４】
Ｄ→Ｅ．還元
本発明の好ましい態様では、還元剤を使用して、糖をリンカーに結合しているＣ＝Ｎ結合（例えば図１の化合物Ｄ）を還元する。十分に公知の多様な還元剤によりＣ＝Ｎ結合を還元することができ、好ましくはその還元剤は二重結合を飽和させる一方で、Ｎ上に水素原子を配置することができる。
【００９５】
特に価値があるのはＢＨ結合を有するボランまたは水素化ホウ素であり、その例には、ＮａＢＨ4、ＮａＣＮＢＨ3、およびＢＨ3−ピリジン、ＢＨ3−ジメチルスルフィドなどのＢＨ3複合体が挙げられる。ＳｉＨ結合を有するシランなどの、構造Ｒ3ＳｉＨを有するシランを使用することもでき、同様にジイミドなどの水素移動剤または均一系の水素化触媒もしくは金属−Ｈ結合を有する水素化触媒を使用することができる。
【００９６】
還元の結果として、リンカーと、場合によりスペーサーとを介して固体支持体に好ましくは結合した糖ＣＨ−ＮＨ−という構造を含む反応性糖が生じる。一般に、その還元糖がアルデヒドであったならば、還元の結果として糖ＣＨ2−ＮＨ−という構造の化合物が生じるであろう。その還元糖がケトンであったならば、還元の結果として糖ＣＨ−ＮＨ−という構造の化合物が生じるであろう。
【００９７】
還元生成物は、例えばｓｐ3形式で混成したＮ原子を有する一般式Ｅ（図１）の生成物である。
【００９８】
Ｃ→Ｃred→Ｅ
この方法の別の好ましい実施では、キャッピングのステップおよび還元ステップの順序が逆になる。上記Ｄ→Ｅに記載したいずれかの試薬により、化合物ＣにおけるＣ＝Ｎ結合の還元（図１）を実施して、構造Ｃredの化合物（図１）を生成させることができる。この還元はｉｎ  ｓｉｔｕでも行うことができ、これは（ＮａＣＮＢＨ3などの）還元剤を還元糖と同時に固体支持体（例えば化合物Ｂ）に添加することにより、それが形成するときにＣ＝Ｎ結合が還元され、同じくＣredが生成することを意味する。したがって、還元糖を含む試料を固体支持体および還元剤と共に同時にインキュベートすることができることが本発明に含まれる。したがって、Ｃ＝Ｎ結合の還元（ステップｖ）は、還元糖と固体支持体のＮＨ2基との反応（ステップｉｉｉ）の直後に行われるであろう。次に、糖ＣＨ−ＮＨ−部分との反応を引き起こさない条件で、上記Ｃ→Ｄに記載したいずれかの試薬を使用して、Ｃredにおける遊離−ＮＨ2基をキャップすることができる。特に、本発明のこの実施形態では、キャップ剤が第２アミノ基よりも第１アミノ基と選好的に反応することが好ましい。第２アミノ基よりも第１アミノ基との選好的（優先的）な反応が生じるように反応温度および時間を調整することも好ましい。アミノ基と反応する事実上全ての化合物は、より多く置換されたアミノ基よりも第１アミノ基と迅速に反応するが、例えば活性ベンゾイルエステル、イソプロパン酸活性エステル、ピバロイル活性エステル、Ｂｏｃ無水物またはＢｏｃ−アジドなどのように当該化合物が立体的に大きい場合にこれは特にあてはまる。第２アミノ基よりも第１アミノ基と選好的（優先的）に反応させるのに有用な化合物および条件は、Ｇｒｅｅｎｅら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、第７章、５０３〜６５３頁に記載されている。他の非常に好ましいキャップ剤は、ＮＨＳ−エステルまたは立体障害されたペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルである。
【００９９】
Ｅ→Ｆ．タグの付加
上記経路のいずれかにより得られた図１の化合物Ｅは、求電子体に対して非常に低い反応性のキャップされた窒素原子（Ｎ（Ｈ）キャップ）と、糖ＣＨ2−ＮＨ−Ｒという配列におけるｓｐ3形式で混成した窒素原子とに結合した固体を含む。したがって、Ｅと、適切な窒素反応性官能基（好ましくはその窒素反応性官能基は弱求電子体（mild electrophile）である）との反応の結果として、ｓｐ3窒素原子への求電子体の付加が限定的に、またはほぼ限定的に生じ、その糖が結合した窒素に、本明細書において「タグ」と記載した分子構造または別の誘導化剤が効果的に付加される。タグの付加生成物を図１にＦとして示す。
【０１００】
この説明全体にわたり、用語「窒素反応基」は、ｓｐ3形式で混成した窒素に対する反応性を記載するために使用され、例えばその窒素は、構造Ｒ−ＮＨ−Ｒ’の化合物、例えば、ＲおよびＲ’が独立して（場合により置換された）アルキルもしくはアリールである、アミン、またはヒドロキシルアミン誘導体（Ｒ−ＮＨ−ＯＲ’）もしくはヒドラジン誘導体（Ｒ−ＮＨ−ＮＨ−Ｒ’）などにおける、Ｒ’が−ＮＨ−に結合したＯまたはＮなどの複素原子を有する化合物の中のものである。
【０１０１】
誘導体化剤（例えばタグ）の同一性、すなわち誘導体化剤の特定の化学構造は、利用者によって選択されることができる。Ｅにおけるｓｐ3窒素に付加するために、誘導体化剤（例えばタグ）は、それ自体図１で「Ｘ」と称される窒素反応性官能基を有するべきである。好ましくは、そのタグは求電子体を含むか、または窒素反応性官能基Ｘに結合しているべきである。好ましくは、その誘導体化剤はタグ−Ｘ（TAG-X：図１参照）という一般構造であり、ここで、Ｘは窒素反応性官能基である。好ましくは、Ｘはｓｐ3窒素原子と反応性のいずれかの弱求電子体であるが、好ましくはその糖に存在する−ＯＨ基とあまり反応しない（反応性の低い）弱求電子体である。そのような弱求電子体には、イソチオシアネート（タグ−ＮＣＳ）、活性エステル（タグ−Ｃ（Ｏ）−Ｌ）（ここで、Ｌはペプチド結合の合成時などでアミド結合形成に一般に使用される脱離基である）、ペプチド結合の合成時などでアミド結合形成に一般に使用される方法によりｉｎ  ｓｉｔｕで活性エステルに活性化することのできるカルボン酸（タグ−ＣＯＯＨ）、アルキル化剤（タグ−Ｌ）（ここでＬは、限定的ではなく好ましくは系列Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＳ（Ｏ）2Ｒからの脱離基であり、ここでＲはアルキルまたはアリールでありうる）、（典型的には配列−ＣＲ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−を含む）マイケルアクセプターまたはαβ不飽和スルホン（−ＣＲ＝ＣＨ−Ｓ（Ｏ）２−）を有するタグ、および前述のうちいずれかのものの誘導体、還元アミノ化により糖ＣＨ2−ＮＨ−アミノ基と反応できるアルデヒドもしくはケトン、または例えばサンガー試薬である１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンもしくは４−ハロ−７−ニトロ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）試薬（ここで、ハロゲンは好ましくはＦまたはＣｌである）におけるように芳香環がニトロ基などの電気陰性基を有する置換ハロ芳香族基が挙げられる。
【０１０２】
タグは、例えば蛍光部分、質量分析用タグ、第２の結合パートナーに結合することができる第１の結合パートナー、核酸のことがあり、ここで、前述のいずれかのタグは好ましくは窒素反応性官能基を含むか、またはそれに結合している。特に、タグは本明細書下記にさらに詳細に記載したいずれかのタグのことがあり、ここで、これらいずれかのタグはいずれかの前記窒素反応性官能基に結合していてもよい。
【０１０３】
化合物Ｅにタグを付加することにより得ることのできる化合物の例を、図１のＦに示す。
【０１０４】
Ｆ．洗浄
一実施形態では、タグ付き糖（例えば図１の化合物Ｆ）を洗浄してからいずれかのさらなる操作を行う。したがって、いずれかの量の未結合タグを除去する。タグ付き糖が固体支持体上に固定化されていることから、洗浄を容易に遂行することができる。
【０１０５】
洗浄後に、共有結合しているタグだけが存在するであろう。したがって、タグの量は固定化糖の量に相関するであろう。したがって、タグの存在を決定することによって固定化糖の量を決定することができる。したがって、与えられた試料中の本質的に全ての還元糖が固定化されたならば、この方法は、一態様では試料中に存在する還元糖の量を決定させるものである。
【０１０６】
当業者は、与えられたタグ付き固定化糖（例えば図１の化合物Ｆ）に適した洗浄条件を容易に同定することができるものである。洗浄は、例えば水、水性緩衝液、有機溶媒、ならびに混合された水性溶媒および有機溶媒からなる群から選択される溶媒を用いて行うことができる。溶媒は、塩、二価金属陽イオン、洗剤（界面活性剤）、シクロデキストリンまたはカリキサレンなどの包接複合体形成分子を含めた錯化剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、ホウ酸塩、ボロン酸エステル（塩）、またはケイ酸塩などの１つまたは複数の添加物を含む前述のいずれかのものでもありうる。さらに、溶媒は場合により洗剤および変性剤を含むことがある。洗浄をいずれかの温度で行うことができるが、好ましくは０〜１００℃の範囲の温度で行う。
【０１０７】
Ｈ．切断可能なリンカーの切断
使用されるリンカーが切断可能なリンカーである場合、本発明の方法は、前記切断可能なリンカーを切断することにより捕捉された糖を放出させるステップを含むことがある。好ましくは、その切断は固定化糖の−ＮＨ−基への（タグ−Ｘを用いて付加された）タグまたは（Ｘ−テザー−Ｙを用いて付加された）テザー−Ｙなどの誘導体化剤の付加に続いて行われる。したがって、タグ付き糖（図１の化合物Ｇまたは化合物Ｊ）をそれぞれＦまたはＩから溶液に放出させることができる。Ｇは、窒素原子上にタグを有する糖部分からなり、その窒素原子は切断後に残るリンカーの残基（がある場合）に結合しており、分かり易くするために糖−タグと表示される。Ｊは、窒素原子上にテザーを有する糖部分からなり、その窒素原子は切断後に残った残基（がある場合）に結合している。テザーは場合によりタグと結合していてもよい。
【０１０８】
しかし、切断可能なリンカーをこの方法のいずれかの所望の時間で切断することができる。
【０１０９】
化合物Ｅに付加されたタグが蛍光特性などの有益な分光特性を有するならば、糖−タグ（図１の化合物Ｇ）の量を溶液中で定量することができる。さらに、糖−タグ（図１の化合物Ｇ）をＨＰＬＣまたはＣＥなどの分析分離技術に供することができ、そのうえ１つを超える糖が存在するならば個別の構成要素を分離することができ、その相対比を決定し、基準となる標準物質が入手可能ならばその構成要素を同定することができ、それを定量することができる。糖質認識タンパク質に結合することができるリガンドとして糖−タグを使用して、糖質またはタンパク質のいずれかの構造に関する情報を提供することもできる。
【０１１０】
感度増加、スペクトル解釈の簡略化、または同位体エンコーディングを用いた差次的分析（differential analysis）の実行を可能にすることのいずれかにより、タグが質量分析の実施に有用な糖−タグの特性を与える構造であるならば、溶液に放出された糖−タグを質量分析により好都合に分析することができる。
【０１１１】
Ｆ．分光特性を有するタグ
本発明の好ましい一実施形態では、例えば化合物Ｅまたは化合物Ｈに付加されたタグは有益な分光特性を有する。好ましくは、有益な分光特性を有するタグが、構造Ｘ−タグの誘導体を使用して例えば化合物Ｅに付加され、ここで、Ｘは、本明細書上記「Ｅ→Ｆ  タグの付加」の項に記載したいずれかの窒素反応性官能基などの窒素反応性官能基である。有益な分光特性により、タグを例えば分光分析により容易に可視化できることを意味する。したがって、タグは例えば分光的に検出可能でありうる。好ましい実施形態では、タグは蛍光タグである。そのようなタグ付けの例には、イソチオシアネート（例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ）との反応、活性エステル、マイケルアクセプター、αβ不飽和スルホニル（具体的にはビニルスルホン）、およびハロゲン化アルキルおよびアルキルトシレートなどのアルキル化剤、例えばサンガー試薬などのハロアリール化合物が挙げられる。
【０１１２】
そのようなタグの付加生成物（例えば図１の化合物Ｆ）は光を吸収して、検出可能な光を再発光することができる。Ｆに存在するそのようなタグの数は、Ｂに付加され捕捉されてＣを生成する糖分子Ａの数を反映するであろう。したがって、用意された固体支持体（化合物Ｂ）が過剰の捕捉基を有するという条件で、試料に本来存在する還元糖分子（Ａ）の数を化合物Ｆの蛍光により推定することができる。蛍光分子以外のタグを使用することもできる。これらには放射性タグ、リン光タグ、化学発光タグ、ＵＶ吸収タグ、ナノ粒子、量子ドット、着色化合物、電気化学活性タグ、赤外活性タグ、ラマン分光分析またはラマン散乱で活性なタグ、原子間力顕微鏡により検出できるタグ、または金属原子もしくはそのクラスターを含むタグが含まれうる。
【０１１３】
化合物Ｆの固体支持体が弾性表面波センサーまたは表面プラズモン共鳴センサーなどのセンサーであるならば、そのタグに特異的に結合する種の付加は、タグに、したがって糖分子の数に比例するシグナルの生成を生じることができる。例は、タグがビオチンの活性エステルとの反応により一般に導入されるビオチン残基の場合である。タグがビオチン残基である場合の化合物Ｅへのアビジン−タンパク質の付加は、センサーにより容易に検出され報告されるシグナルを生じることができる。固定化タグへの第２の結合パートナーの結合を検出するために使用することができるセンサーの他の例には、圧電センサー、アンペロメトリックセンサー、表面プラズモン共鳴蛍光分光分析センサー、二重偏光干渉測定（ＤＰＩ）センサー、波長インテロゲート光学センサー（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ）（ＷＩＯＳ）、インピーダンスセンサー、光導波路グレーティングカップラーセンサー、音波センサー、および熱量測定センサーが挙げられるが、それに限定されるわけではない。
【０１１４】
その糖が分光特性を有するタグに結合すると、前記分光特性を決定することができる。（図１の化合物ＦまたはＩなどのように）固体支持体にまだ固定化されている糖について、または（例えば図１の化合物ＧまたはＪの）溶液に放出された糖について分光特性を決定することができる。後者はリンカーが切断可能なリンカーであることを必要とする。分光特性を有するタグの性質に応じて、分光分析などの従来法を使用して前記特性を決定することができる。したがって、本発明の方法は、糖に結合したタグを分光分析により検出するステップを含むことがある。
【０１１５】
Ｆ．質量分析用タグ
本発明の一実施形態において、タグは質量分析用タグである。前記質量分析用タグは、好ましくはＸ−タグという構造の試薬により付加される（ここでＸは、本明細書上記の「タグの付加」の項に言及されたいずれかの窒素反応性官能基などの窒素反応性官能基である）。本明細書に使用される用語「質量分析用タグ」は、好ましくは（本明細書上記の「切断可能なリンカーの切断」の項に記載した）固体支持体からの切断後の、質量分析による生成物の検出および構造の特徴付けを改善する分子を表す。例には、マススペクトルにおいて特徴的な同位体パターンを与える臭素標識の導入がある。そのような臭素標識を付加することができ、例えば化合物Ｅにｐ−ブロモフェニルイソチオシアネートを付加することにより、タグが臭素原子を有する構造Ｆの化合物を生成させることができる。糖質の質量分析における臭素含有標識の有用性は、例えばＬｉら、２００３、Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．、１７：１４６２〜１４６６に記載されている。別の例には、ポジティブイオンモードまたはネガティブイオンモードのいずれかの質量／電荷分離での検出を高めるための、正の電荷または負の電荷のいずれかを与える分子の導入が挙げられる。別の例には、質量分析の実施に一般的なエレクトロスプレー、ＭＡＬＤＩ、または他のイオン化技術における性能または感度を高める分子の導入が挙げられる。なお別の例には、質量分析により標識された種を定量させる安定な同位体標識分子の導入が挙げられる。同位体標識に有用な方法は、例えばＴａｏら、２００３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１１０〜１１８に総説されている。
【０１１６】
糖が質量分析用タグに結合すると、タグ付き糖（図１のＦ、Ｇ、Ｉ、またはＪ）を質量分析により検出することができる。固体支持体にまだ固定化されている糖について（例えば図１の化合物ＦおよびＩについて）質量分析を行うことができるが、好ましくは例えば切断可能なリンカーの切断により（例えば図１の化合物ＧまたはＪについて）溶液に放出された糖について質量分析を行う。したがって、リンカーが切断可能なリンカーであることが好ましい。当業者は、質量分析用タグの性質に応じて適切な質量分析を行うことができるものである。したがって、本発明の方法は、質量分析用タグに結合した糖を質量分析により検出するステップを含むことがある。
【０１１７】
Ｆ．結合パートナー性タグ
本発明の別の好ましい実施形態では、タグは第２の結合パートナーと特異的相互作用することができる第１の結合パートナーであり、前記第１の結合パートナーは例えばＸ−タグという構造の試薬との反応を経由して化合物Ｅ（または化合物Ｈ）に付加される。ここで、Ｘは窒素反応性官能基（例えば「誘導体化剤」）である。第２の結合パートナーは、好ましくは色素、蛍光標識、放射性同位体、重金属、または酵素などの検出可能な標識で標識される。第１の結合パートナーは、例えばタンパク質に対するリガンドである分子のことがあり、そのタンパク質は、化学量論的または増幅後のいずれかで、結果として生じる固定化リガンドの検出に有用である。第１の結合パートナーもまたタンパク質で、第２の結合パートナーが前記タンパク質に対するリガンドであることもある。
【０１１８】
結合パートナーの例には、ＥＬＩＳＡアッセイで一般に使用されるリガンド−タンパク質対が挙げられる。例えば、化合物Ｅをビオチン化試薬と反応させ、洗浄後に、こうして固定化されたビオチンを、蛍光タグ、放射性同位体、もしくは重金属などの検出可能な標識で直接標識されたストレプトアビジン（またはその他のアビジン）で、または分光分析により検出することのできるシグナルの生成を招く化学反応を触媒することができるホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートしたストレプトアビジン（またはその他のアビジン）で検出することができる。
【０１１９】
結合パートナーのその他の例は抗体−エピトープ対である。したがって、一方の結合パートナーはエピトープを含むことがあり、他方の結合パートナーは、高い親和性で前記エピトープと結合することができる抗体、好ましくは前記エピトープと特異的に結合する抗体でありうるであろう。
【０１２０】
Ｆ．核酸タグ
本発明の別の実施形態では、タグは核酸である。本発明による核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどのいずれかの核酸、またはＬＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡなどのそのアナログでありうる。好ましくは、その核酸はＤＮＡであり、好ましくはＤＮＡオリゴマーである。好ましくは、前記ＤＮＡは本明細書上記の「タグの付加」の項で言及したいずれかの窒素反応性官能基などの窒素反応性官能基で誘導体化されている。前記核酸タグの配列は公知であるか、または少なくとも部分的に公知であることが好ましく、このことから、当業者は標準法を用いて前記タグを容易に検出できるようになるであろう。
【０１２１】
核酸タグは、いずれかの所望の長さ、好ましくは少なくとも特異的検出を可能にするであろう長さでありうる。したがって、好ましくはその核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば１０から５０００ヌクレオチド長の範囲である。
【０１２２】
窒素反応性核酸タグを糖に付加した後に、ＤＮＡオリゴマーなどの核酸を、次にその相補的核酸または本質的に相補的な核酸にハイブリダイズさせることにより、固体支持体上で直接検出することができる。本質的に相補的な核酸により、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されたようなストリンジェントな条件で与えられた核酸にハイブリダイズすることができる核酸を意味する。好ましくは、前記相補的核酸は検出可能な標識に結合していてもよい。前記検出可能な標識は、例えば蛍光標識、放射性同位体、または酵素のことがあり、好ましくは蛍光標識である。したがって、例えばその相補的蛍光標識ＤＮＡにハイブリダイズさせることにより、核酸タグを検出することができる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応などの当技術分野で公知の従来法を使用して、核酸タグを増幅することができる。したがって、固定化された核酸タグをＰＣＲ反応に供して、固定化されたＤＮＡオリゴマーを増幅させることができ、それをＰＣＲにおける定量についての十分に公知の多様な技術により溶液中で測定することができる。この工程は、固体支持体上に存在する非常に少量の糖ＣＨ−ＮＨ−リンカー−スペーサー−固体の間接的検出および定量に特に有用性を有する。あるいは、ＤＮＡに結合した糖をリンカーの切断により溶液に放出させ、続いて例えばＰＣＲにより溶液中で増幅させるか、または本質的に相補的な核酸との特異的ハイブリダイゼーションに基づいて溶液中で検出することができる。
【０１２３】
Ｅ→Ｈ  テザー
本発明による誘導体化剤は、少なくとも２つの官能基に結合したテザーのこともある。そのような二官能性試薬は、一般にＸ−テザー−ＹまたはＸ−テザー−Ｙpという構造であろう（ここで、Ｘは窒素反応性官能基であり、Ｙは第２の反応性官能基であり、Ｙpは潜在的反応性官能基または保護された反応基Ｙである）。化合物ＥとＸ−テザー−Ｙ（またはＸ−テザー−Ｙｐ）との反応生成物は、例えば図１の化合物Ｈの一般構造を有しうる。第２の反応性官能基Ｙは、固相合成に使用するいずれかの種類の試薬と反応しうる。例えば、糖ＣＨ−ＮＨ−リンカー−スペーサー−固体におけるＮは二官能性試薬（Ｘ−テザー−Ｙ）と反応することができ、ここで、一方の官能基（窒素反応性官能基Ｘ）は固定化された窒素と結合を作ることにより反応し、他方の官能基は第２の反応性官能基Ｙでありうるか、または（例えばアンマスキング、脱保護、またはさらなる反応により）第２の反応性官能基Ｙに変換することができる。
【０１２４】
テザーはいずれかの有用なテザー、例えば（直鎖、分岐、もしくは環状でありうる）アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル、またはアリールであるか、あるいはアミド結合（ＮＣ（Ｏ）Ｒ）もしくはエチレングリコール基（−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−）を有するか、あるいは複素原子で置換された前述のいずれかのものおよびその誘導体でありうる。
【０１２５】
第２の官能性反応基Ｙは、例えばチオール、カルボキシル基、活性化カルボキシル基、ジスルフィド、活性化ジスルフィド、アルキル化剤、アルケン、アルキン、アルデヒド、ケトン、およびアジドからなる群から選択されうる。アルキル化剤は、例えばハロゲン化アルキルまたはα−ハロカルボニル基でありうる。Ｙpは、例えば保護されたアミンまたは前述のいずれかの基Ｙの保護された誘導体でありうる。したがって、Ｙpは、例えば保護されたアミン、保護されたチオール、保護されたカルボキシル基、保護されたアルデヒド、および保護されたケトンからなる群から選択することができる。保護された反応基は、本明細書においてＹpと表示され、ここで、Ｙpは脱保護されて官能性反応基Ｙを生じることができる。有用な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅら、１９９９、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨークに、具体的にはカルボニル基（第４章、２９３〜３６８頁）、カルボキシル基（第５章、３６９〜４５３頁）、チオール（第６章、４５４〜４９３頁）、およびアミノ基（第７章、４９４〜６５３頁）について見出すことができる。保護されたアミンの例には、固相ペプチド合成に一般に使用されるものが挙げられるが、それに限定されるわけではなく、例えばＦｍｏｃ、Ｂｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、トリチルおよび置換トリチル、ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｎ−スルフェニル、またはアジドである。しかし、第２の反応性官能基は、固相合成の技術分野ならびに固体支持体および表面への小分子の結合における十分に公知の例などの、固相上で反応するようにされたいずれかの官能基Ｙまたは保護された官能基（Ｙp）でありうる。次に、これらの官能基は直接に、または反応性種に脱保護した後に、第２の官能基Ｙと反応することができる官能基（Ｚ）を有する第２の誘導体化剤を捕捉することができる。
【０１２６】
化合物ＨにおけるＹがＮＨ2基を有するか、脱保護時にＮＨ2基を有するようにできるならば、Ｅ→Ｆに記載したいずれかのアミン反応性試薬（例えばイソチオシアネート）を使用してタグを付加して一般構造Ｉの化合物を生成させることができる（図１）。
【０１２７】
化合物Ｈにおけるいずれかの官能基Ｙ（図１）と反応するようにされた第２の誘導体化剤は、例えば分光分析用タグまたは上記Ｅ→Ｆの項で言及したいずれかのタグのことがあり、前記タグは窒素反応基の代わりにＹと反応することができる官能基（Ｚ）を有するか、またはそれで誘導体化されている。これらのタグは、薬物などの小分子、造影剤、ペプチド、タンパク質、酵素、および生体活性を示す他の分子、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸のこともある。
【０１２８】
前記小分子、造影剤、ペプチド、または核酸は、好ましくは与えられた第２の官能性反応基Ｙと反応することができる官能基Ｚを有するか、またはそれと結合している。当業者は、有用な官能基ＹおよびＺを容易に同定することができるものである。第２の誘導体化剤は、上記「分光特性を有するタグ」、「質量分析用タグ」、「結合パートナー性タグ」、および「核酸タグ」の項に記載した上に言及したいずれかのタグのこともある。ここで、前記タグは窒素反応性官能基の代わりに、官能基Ｙと反応することができる官能基Ｚを有する。Ｈにおけるテザーに結合した官能基（図１）は、化学反応または酵素反応によりＹに変換することができる潜在的基または保護された基（Ｙp）のこともある。そのＹを次にさらに上記のように反応させることができる。この潜在的基が第１または第２アミンに変換することができるならば（すなわちＹは−ＮＨ2または−ＮＨ−という構造を含むであろう）、上記Ｅ→Ｆに記載したいずれかのアミン反応性種を付加して構造Ｉのタグ付き化合物を生成させることができる。
【０１２９】
したがって、本発明の方法は以下のステップを含むことができる。
ｖｉｉ．反応性糖の−ＮＨ−基を、構造Ｘ−テザー−ＹまたはＸ−テザー−Ｙpの二官能性試薬と反応させることにより、前記テザー−Ｙまたは前記テザー−Ｙpに共有結合した糖を得るステップ（ここで、Ｘは窒素反応性官能基であり、Ｙは第２の反応性官能基であり、Ｙpは反応性官能基Ｙに変換または脱保護することができる潜在的官能基である）。
【０１３０】
このステップは、好ましくは出発物質として図１の化合物Ｅを使用して行われる。したがって、このステップにより例えば図１の一般構造Ｈの化合物を作製することができる。
【０１３１】
二官能性試薬がＸ−テザー−Ｙpという構造である本発明の実施形態では、好ましくはこの方法はさらにＹpを変換または脱保護して反応性官能基Ｙを得るステップを含む。このステップはＸを−ＮＨ−と反応させる前または後に行うことができ、好ましくはＸを−ＮＨ−と反応させた後に行う。
【０１３２】
なお、本発明の方法は、以下のステップをさらに含みうる。
ｖｉｉｉ．Ｙと反応することができる官能基（Ｚ）を有する第２の誘導体化剤を用意するステップ。
ｉｘ．官能基ＺおよびＹを反応させることによって、テザーおよび第１の誘導体化剤を介してその糖に第２の誘導体化剤を共有結合させるステップ。
【０１３３】
あるいは、本発明の方法は以下のステップをさらに含みうる。
ｖｉｉｉ．真核細胞、原核細胞、微生物、ミセル、ファージ、ウイルス、およびナノ粒子からなる群から選択される粒子を用意するステップ（その粒子はＹと反応することができる官能基（Ｚ）を含む）。
ｉｘ．その官能基ＺおよびＹを反応させることにより、そのテザーおよびその作用剤を介して糖に粒子を共有結合させるステップ。
【０１３４】
したがって、ステップｉｘ．により図１に概説した一般構造Ｉの化合物が作製され、ここでタグは粒子である。リンカーが切断可能なリンカーであるという条件で、この方法はリンカーを切断することにより、例えば図１の一般構造Ｊの化合物を作製するステップをさらに含むことがある。
【０１３５】
例えば、糖ＣＨ−ＮＨ−リンカー−スペーサー−固体（例えば図１の化合物Ｅ）と二官能性試薬Ｘ−テザー−Ｙとの反応の生成物は一般構造Ｈを有するが、分子よりも大きいアセンブリー、例えば細菌、ファージ、酵母、ミセル、ウイルス、ナノ粒子、または真核もしくは原核細胞と共有結合を形成することができるさらなる反応基を有するか、または有するようにすることができる。次に、リンカーの切断の結果としてアセンブリーに糖を効果的に付加した糖ＣＨ−Ｎ（アセンブリー）−リンカーという一般式の種が生じる。したがって、原則として糖を固体支持体からアセンブリーに移動させることができる。
【０１３６】
酵素処理
固体支持体が生体適合性であるならば、すなわち酵素のような生体高分子との接触を許容し、その活性を有意に改変しないならば、固定化糖分子の構造を改変するであろう酵素によりその固定化糖分子は作用されうる。その固定化糖分子は、例えば図１の一般構造Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、またはＩのうちいずれかの化合物でありうる。
【０１３７】
生体適合性固体支持体の非限定的な例には、ガラス、ＰＥＧＡ、ＳＰＯＣＣ、または多糖ゲルが挙げられる。本実施形態の中で、リンカーは相対的に長いことが好ましく、よって、リンカーは少なくとも２原子、好ましくは少なくとも６原子を有することが好ましく、さらに好ましくは、リンカーは少なくとも６原子の鎖を含み、例えばそのリンカー内の原子の最長鎖は少なくとも６原子長であり、例えば６から１０００原子長である。リンカーが親水性であることも好ましい。
【０１３８】
図１の化合物ＧまたはＪなどの切断可能なリンカーの切断により溶液中に遊離された糖を、酵素などの生体高分子と接触させることも可能である。
【０１３９】
酵素は、糖質に作用することができるいずれかのクラスに属しうるものであり、例えばグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、およびアシル化、リン酸化、硫酸化、または酸化によりアルコール基を修飾する酵素でありうる。あるいは、糖が−ＯＨ基ですでに置換されているならば、例えばアシル化、リン酸化、または硫酸化されているならば、デアシラーゼ、ホスファターゼ、およびスルファターゼがその構造を改変することができる。したがって、本発明の方法は、糖（例えば図１の化合物Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪのうちいずれかのもの）を、グリコシルトランスフェラーゼ、スルファターゼ、ホスホリラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、グリコシンターゼ、およびトランスグリコシダーゼのクラスから選択される１つまたは複数の酵素と接触させることにより、前記糖を新しい構造に変換するステップをさらに含みうる。好ましい実施形態では、その方法は、その最初の糖がグリコシダーゼの基質であるという条件で、その糖（例えば図１の化合物Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪのうちいずれかのもの）を１つまたは複数のグリコシダーゼと接触させることにより、新しい還元糖を作製するステップをさらに含む。
【０１４０】
一例には、まだ遊離−ＮＨ2基を有するキャップされていない糖−Ｃ＝Ｎ−リンカー−スペーサー−固体（例えば図１の化合物Ｃ）と、１つの単糖残基だけ糖の長さの減少を引き起こすエキソグリコシダーゼとのインキュベーションが挙げられるであろう。この単糖残基の切断は１糖ユニット短い、固体支持体に結合したオリゴ糖を残し、同一の固体支持体または図１の一般構造Ｂの固体支持体などの異なる固体支持体により捕捉されうる還元糖を生成し、その還元糖に、続いて上記ＢからＪに記載したいずれかの操作を受けさせることができる。
【０１４１】
したがって、本発明の方法は以下のステップをさらに含むことができる。
ａ）糖質に作用することができる１つまたは複数の酵素を用意するステップ
ｂ）その糖を前記の１つまたは複数の酵素と接触させるステップ
これらのステップをこの方法の間のいずれかの与えられた時間で行うことができる。その酵素はこの項に記載したいずれかの酵素でありうる。
【０１４２】
特定の実施形態では、その酵素はグリコシダーゼであり、本明細書上記の概要の項に記載した方法は、以下のさらなるステップを含む。
ｉｉｉ．ａ）糖質に作用することのできる１つまたは複数のグリコシダーゼを用意するステップ
ｉｉｉ．ｂ）その糖が前記グリコシダーゼの基質であるという条件で、その糖を１つまたは複数の前記グリコシダーゼと接触させることにより、新しい還元糖を作製するステップ
ｉｉｉ．ｃ）固体支持体上に新たに作製された還元糖を固定化するステップ
ステップｉｉｉ．ａ〜ｉｉｉ．ｃは、本明細書上記の「発明の概要」の項に概略を述べられた方法のステップｉｉｉに従って実施することができる。しかし、ステップｉｉｉ．ａからｉｉｉ．ｃは、前記方法のステップｉｖ、ｖ、ｖｉ、またはｖｉｉのうちいずれかのものに従って実施することもできる。したがって、ステップｉｉｉ．ａ〜ｉｉｉ．ｃは、図１の構造Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、またはＩにより例示されるいずれかの固定化糖に関して実施することができる。
【０１４３】
特に、前記の新しく作製された還元糖を、同じ固体支持体または別の固体支持体の遊離−ＮＨ2基に固定化することができる。前記の他の固体支持体は、例えば未置換であるか、固定化参照標準を有するかのいずれかでありうる。前記の他の固体支持体は、本明細書上記の固体支持体であり、かつその固体支持体は（場合によりスペーサーを介して）リンカーに結合していることが好ましい。ここで、前記リンカーは捕捉基を有する（本明細書上記のリンカー、捕捉基、およびスペーサーの詳細な説明を参照のこと）。
【０１４４】
特に価値があるのは、構造の情報を得るための同一または異なる固体支持体上でのグリコシダーゼ生成物および放出された単糖の還元および蛍光標識である。特定の例には、構造Ｂ（図１）のＮＨ2−リンカー−スペーサー−固体上にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ（ラクト−Ｎ−テトラオース、ＬＮＴ）を捕捉し、捕捉され固定化されたＬＮＴ（図１構造Ｃの化合物の一例）とβ−ガラクトシダーゼとのインキュベーションに続いて、同じ固体支持体（Ｃ）上に放出されたガラクトースを捕捉して、未反応のＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＣ＝Ｎ−リンカー−スペーサー−固体と、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＣ＝Ｎ−リンカー−スペーサー−固体およびＧａｌ−Ｃ＝Ｎ−リンカー−スペーサー−固体である反応生成物との混合物を得ることが挙げられる。次に、上記ステップＦ→Ｇに記載したキャッピング、還元、ＴＲＩＴＣを用いた蛍光タグ付け、および固体からの切断は、三糖生成物および単糖生成物と公知の標準との同時泳動によって、その固定化ＬＮＴが末端β−ガラクトース残基を有していたという確認を可能とする。
【０１４５】
多くの有用なグリコシダーゼが当技術分野で記載されており、例えばＵＳ５１００７７８またはＷＯ９２／１９９７４に記載されたいずれかのグリコシダーゼを本発明に採用することができる。
【０１４６】
固体支持体が生体適合性である場合、糖−Ｃ＝Ｎ−リンカー−スペーサー−固体（例えば図１の化合物Ｃ）の未反応−ＮＨ2基を（例えば上記Ｃ→Ｄに記載したように無水酢酸で）キャップし、次に糖質−活性酵素に曝露するか、またはさらに（上記Ｄ→Ｅの項に記載したように）糖ＣＨ−ＮＨ−リンカー−スペーサー−固体に還元し、次に糖質−活性酵素に曝露することができる。あるいは、図１の化合物ＣをＣredに還元し、次に糖質−活性酵素に曝露することもできる。糖ＣＨ−ＮＨ−リンカー−スペーサー−固体（例えば図１の化合物Ｅ）を（本明細書上記のＥ→Ｆの項に記載したように）さらにタグ付けして、糖ＣＨ−Ｎ（タグ）−リンカー−スペーサー−固体（例えば図１の化合物Ｆ）を得、次に糖質−活性酵素に曝露することができる。これらのいずれかの工程では、固体支持体に結合したままである酵素反応生成物をさらに本発明の方法により操作するか、またはさらなる分析のためにリンカーでの反応により切断することができる。固定化糖の断片の切断を生じさせる酵素反応による生成物が溶液中に出現するであろう。ここで、分析化学の確立された技術を用いてその生成物をさらに研究してもよいし、またその生成物自体が還元糖である場合は、図１の一般糖Ａについて記載した操作にその生成物を供することができる。
【０１４７】
個別の糖を、キャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、マイクロカラム超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、マイクロカラム液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高性能キャピラリー電気泳動（ＨＰＣＥ）、イオン交換クロマトグラフィー、または質量分析により検出することができる。誘導体化剤を用いた標識の前または後に、溶液中または固相上のいずれかで個別の糖の検出を行うことができる。
【０１４８】
検出剤
本発明の一実施形態において、この方法は、以下のステップを含む。
ｖｉｉｉ．その糖を前記糖と関連（結合）することができる検出剤と接触させるステップ
ｉｘ．その検出剤を検出するステップ
好ましくは、前記糖は本明細書上記の固体支持体に固定化されており、したがって、例えば図１の一般構造Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、またはＩの化合物を前記検出剤と接触させることができる。切断可能なリンカーの切断により前記糖を固体支持体から放出させることも可能であり、したがって、一般構造ＧまたはＪの化合物を前記検出剤と接触させることもできる。
【０１４９】
その検出剤は前記糖と関連することができるいずれかの作用剤でありうる。好ましい検出剤は他のいずれかの化合物よりもずっと高い親和性で糖と関連することができる化合物であり、糖に対して例えば他のいずれかの化合物よりも少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍高い親和性を有する化合物である。
【０１５０】
さらに、前記検出剤が当業者に公知の方法により直接または間接的に検出することができることが好ましい。例えば、検出剤はそれ自体例えば蛍光化合物または着色化合物（色素）でありうる。検出剤は容易な検出方法を利用することができる化合物でもありうる。
【０１５１】
本発明の一実施形態において、検出剤はアリールボロン酸またはヘテロアリールボロン酸であり、ここでそのアリール部分は、本明細書上記の「Ｆ．分光特性を有するタグ」の項に記載した蛍光タグまたは他のいずれかの検出可能なタグなどの分光学的に活性な基で置換されている。
【０１５２】
別の実施形態では、検出剤はポリペプチド、好ましくはレクチン、セレクチンおよび他の糖質結合タンパク質からなる群から選択されるポリペプチド、毒素、受容体、抗体、ならびに酵素である。検出剤がポリペプチドの場合、前記ポリペプチドは酵素または蛍光化合物などの検出可能な標識に結合していてもよい。抗体または類似の高親和性化合物の助けを借りてそのポリペプチドを検出することもできる。
【実施例】
【０１５３】
（実施例）
以下は本発明の方法の例示的な実施例であり、本発明を限定するものとしてみなしてはならない。特に状況から明らかでなければ、大文字Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪは図１に概略された一般構造を表す。
実験の部
１．Ａの実施例：この研究に使用された還元糖
固体支持体Ｂにより捕捉された還元糖の構造を図２に示す。これらには、単糖であるＤ−Ｇｌｃ（１）およびＤ−Ｇａｌ（２）、二糖であるＮ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ、３）、三糖であるマルトトリオース（マルトトリオースＧ３、４）、ならびに四糖であるラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ、５）が含まれる。試料６および７は、単糖Ｆｕｃ：Ｍａｎ：ＧａｌＮＡｃの混合物をそれぞれ２：３：１および１：３：２の比で含有する。試料８はＧａｌ（２）およびＬＮＴ（５）の１：１混合物を含有する。試料９はマルトビオース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）、およびマルトヘプタオース（Ｇ７）のほぼ等モル混合物を含有する。試料１０は、ＰＮＧアーゼＦ（製品番号１３６５１７７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、ドイツ）の作用によりリボヌクレアーゼＢ（Ｓｉｇｍａ）から放出されたＮ−結合オリゴ糖鎖からなる。
【０１５４】
２．リンカー、スペーサー、およびタグ付き糖の参照標準
２．１  リンカーおよびスペーサー
切断可能なリンカーの合成およびスペーサーの構造を図３に示し、下に説明する。
１２：Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル−安息香酸
４−アミノオキシメチル安息香酸塩酸塩１１1（２．０ｇ、０．０１０ｍｏｌ）のジオキサン溶液（２０ｍＬ）および半飽和Ｎａ2ＣＯ3溶液（２０ｍＬ）をＦｍｏｃ−Ｃｌ（２．８ｇ、０．０１１ｍｏｌ）に加え、得られた混合物を２時間撹拌した。
（注；１：この物質は、以前にＤｅｌｅｓ，Ｊ．ら；ＰＪＣＨＤＱ；Ｐｏｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．；ＥＮ；  ５３；１９７９；１０２５〜１０３２に記載されたように調製された。）
酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加し、（濃）ＨＣｌを慎重に加えることにより水相のｐＨを１〜３に調整した。この混合物を分液漏斗に注ぎ、有機相を分離し、水（１００ｍＬ）で１回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去して油を得た。その油は放置すると固化した。この粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル、酢酸エチル、ＡｃＯＨ６０：４０：１）により精製した。収量：３．５ｇ（９２％）1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４．０５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、４．２７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、４．５１（２Ｈ，ｓ）、７．０８〜７．２２（６Ｈ，ｍ）、７．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、１０．２９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）、１２．７８（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４７．０４、６６．０３、７６．９１、１２０．５１、１２５．４１、１２７．４５、１２８．０３、１２８．８９、１２９．３３、１２９．６３、１３０．８２、１４１．１９、１４４．０１、１５７．１２、１６７．４８。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３８９（ＭＨ+）。
【０１５５】
１３：Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル−安息香酸（１２）とブロモ酢酸ｔ−ブチルとの反応
Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル−安息香酸（１２）（１．０ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶かし、Ｃｓ2ＣＯ3（０．４２ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、続いて室温で５分間撹拌した。ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．５５ｇ、２．２８ｍｍｏｌ、Ｆｌｕｋａ）を加え、得られた混合物を５０℃に３０分間加熱し、次にもう一度室温に冷却した。ＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍＬ）を加え、その混合物を分液漏斗に注ぎ、半飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３×５０ｍＬ）の次に水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させた。減圧下で溶媒を除去して油として粗生成物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の２０〜４０％酢酸エチル）後に、収量１．１５ｇ（８９％）で白色固体を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ＝１．３７（９Ｈ，ｓ）、４．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、４．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、４．６１（２Ｈ，ｓ）、４．６７（２Ｈ，Ｓ）、７．１１〜７．１８（２Ｈ，ｍ）、７．２２〜７．２７（４Ｈ，ｍ）、７．４３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．７５（１Ｈ，ｓ）、７．９３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６．６Ｈｚ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ＝２６．３１、４５．２８、５９．９５、６５．５２、７５．９９、８０．８４、１１８．３０、１２３．２７、１２５．４１、１２６．１０、１２６．９３、１２７．２３、１２８．３０、１３９．２９、１３９．５８、１４１．７３、１５５．７０、１６３．９４、１６５．１５。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝５４２（ＭＫ+）。
【０１５６】
１４：リンカーの調製
前の実験で得られた白色固体１３（１．１５ｇ）を、５０％のＣＦ3ＣＯ2Ｈ濃度のＣＨ2Ｃｌ2溶液（３０ｍＬ）中で３時間撹拌し、蒸発乾固させた。油性残渣を少量の酢酸エチルに溶かし、得られた溶液にヘキサンをゆっくりと加えることにより微細白色粉末として生成物を沈殿させた。生成物を濾過し、ヘキサンで２回洗浄し、真空下で乾燥させ、ほぼ定量的な収量（１．０ｇ、９８％）で所望の生成物を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４．０７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６，３Ｈｚ）、４．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６，３Ｈｚ）、４．５３（２Ｈ，ｓ）、４．６２（２Ｈ，Ｓ）、７．０７〜７．１４（２Ｈ，ｍ）、７．１７〜７．２６（４Ｈ，ｍ）、７．４６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．６６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、１０．３０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４７．０４、６１．６２、６６．０４、７６．７９、１２０．５０、１２５．４１、１２７．４６、１２８．０３、１２９．０５、１２９．６９、１４１．１９、１４２．２０、１４４．００、１５７．１２、１６５．５０、１６９．４７。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝４４６（Ｍ−Ｈ+）。ＨＲＭＳ（ＥＳ）計算値（Ｃ25Ｈ21ＮＯ7Ｎａ+）：４７０．１２１０  実測値：４７０．１２２４。
【０１５７】
２．２  一般構造Ｇのテトラメチルロダミン（ＴＭＲ）−タグ付け単糖標準の合成
８つの単糖Ｄ−Ｇｌｃ、Ｄ−Ｇａｌ、Ｄ−Ｍａｎ、Ｄ−Ｘｙｌ、Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ、Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、Ｌ−Ｆｕｃ、およびＤ−ＧｌｃＡを使用した。Ｄ−Ｇａｌ（２）についての一般合成スキームを図４に示し、生成物２１の構造を図４に示し、示したようにＧａｌＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲと省略する。調製された８つ全ての糖ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲ単糖誘導体の構造を図５に示す。
【０１５８】
１６：Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル−安息香酸（１２）と臭化ベンジルとの反応
Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル−安息香酸（１２、２．０ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶かし、Ｃｓ2ＣＯ3（０．８４ｇ、２．５７ｍｍｏｌ）を添加し、続いて室温で５分間撹拌した。臭化ベンジル（１．０５ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温でもう３０分間撹拌させた。水（２００ｍＬ）を加え、得られた混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を水（３×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、蒸発乾固して油を得て、その油をそれ以上特徴付けずに次の実験に使用した。
【０１５９】
１７：ベンジル−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノオキシメチル）−ベンゾエートからＦｍｏｃ基の除去
前の実験で得られた粗生成物（１６）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の２０％ピペリジンと共に１分間撹拌し、それにシリカゲルのベッドを通過させ、吸引により大部分のＤＭＦおよびピペリジンを除去した。酢酸エチルおよび石油エーテル（１：１）の混合物を用いて生成物をシリカゲルのベッドから溶出させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、石油エーテル１：１）によりさらなる精製を果たし、１．１６ｇ（８８％、２ステップ）の収量で透明な油を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ＝４．６６（２Ｈ，ｓ）、５．２９（２Ｈ，ｓ）、７．２５〜７．３９（７Ｈ，ｍ）、７．９９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，６．５Ｈｚ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ＝６７．１１、７７．５９、１２８．３２、１２８．５７、１２８．６６、１２９．０２、１２９．１９、１３０．３２、１３６．４８、１４３．４７、１６６．６４。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝２５８（ＭＨ+）。
【０１６０】
ガラクトース標準の調製により例示されるＴＭＲ標識単糖標準の調製のための一般手順。
１８：ガラクトースとベンジル−（４−アミノオキシメチル）−ベンゾエートとの間のオキシム形成
ガラクトース（９０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの混合物（７：３、３ｍＬ）に溶かし、１７（１２８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を５５℃で３時間加熱し、水（３０ｍＬ）に注ぎ、氷浴上で冷却することによって、生成物を純白色結晶として結晶化させた。その生成物を濾過により分離し、水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させ、単一のアノマーとして生成物１７０ｍｇ（８３％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝３．３８〜３．５５（４Ｈ，ｍ）、３．６７〜３．７５（１Ｈ，ｍ）、４．２７〜４．３３（１Ｈ，ｍ）、５．１２（２Ｈ，ｓ）、５．３７（２Ｈ，ｓ）、７．３６〜７．５２（７Ｈ，ｍ）、７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、８．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝６３．４０、６６．５２、６８．３７、６９．２１、７０．０４、７２．６３、７４．２７、１２８．２５、１２８．３３、１２８．４９、１２８．９１、１２９．１３、１２９．６７、１３６．５２、１４４．２２、１５４．００、１６５．７８。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝４４２（ＭＮａ+）。
【０１６１】
１９：ＢＨ3−ピリジンを用いた「ガラクトース−オキシム」（１８）の還元
前の実験で得られたオキシム（１８、１５０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解させた。ＢＨ3−ピリジン（２２５μＬ、８Ｍピリジン溶液、１．８０ｍｍｏｌ、Ｆｌｕｋａ）およびＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ（０．５０ｍＬ、５０％水溶液）を加え、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＮａ2ＣＯ3の半飽和溶液（２０ｍＬ）に慎重に注ぎ、エーテルおよびヘキサンの１：１混合物（２×１０ｍｌ）で抽出し、過剰のボラン試薬を除去した。それから（濃）ＨＣｌを慎重に加えることによりｐＨを２〜３に調整し、ロータリーエバポレーターで体積を本来の半分に減らした。蒸発中に生成物を綺麗な白色結晶状固体として分離し、それを濾過し、水（２×１０ｍＬ）およびエーテル（２×１０ｍＬ）で洗浄し、最終的に生成物を真空下で乾燥させ、純粋な生成物１１２ｍｇ（７５％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝３．３１〜３．３３（２Ｈ，ｍ）、３．４０〜３．５５（５Ｈ，ｍ）、３．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）、５．２４（２Ｈ，ｓ）、５．３７（２Ｈ，ｓ）、７．３６〜７．５０（５Ｈ，ｍ）、７．６０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、８．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝５３．３４、６３．４０、６４．７３、６６．６８、６９．３７、７０．１９、７０．８９、７４．２０、１２８．３６、１２８．５３、１２８．９２、１２９．４７、１２９．８７、１３０．２７、１３６．４１、１３９．７３、１６５．６２。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝４２２（ＭＨ+）。
【０１６２】
２０：ＴＲＩＴＣを用いた還元生成物（１９）の標識
前の実験で調製した少量の生成物（１９、４．２ｍｇ、１０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かし、ＴＲＩＴＣ（４．４ｍｇ、１０μｍｏｌ）を添加した。１時間撹拌後に、水（１０ｍＬ）を添加し、（濃）ＨＣｌの添加により沈殿生成物を再溶解させ、得られた透明赤色溶液を小さいＣ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムに適用して生成物を結合させた。そのカラムに水を数回フラッシュし（合計体積３０ｍＬ）、続いてメタノール（５ｍＬ）で生成物を放出させた。体積を約０．５ｍＬに減らし、ＣＨ2Ｃｌ2、メタノール、水、ＡｃＯＨ（７０：２０：９：１）の混合物を用いて、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによりその物質を精製した。その化合物の同一性をＭＳにより確認し、次の実験に直接使用した。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ＝８６５（ＭＨ+）。
【０１６３】
２１：最終標準を得るためのエステル保護基の加水分解
前の実験で得られた全ての物質（２０）を１Ｍ  ＬｉＯＨ（１ｍＬ）に溶解させ、３０分間撹拌し、続いて水（１０ｍＬ）を添加し、（濃）ＨＣｌで酸性化して透明な赤色溶液を得た。水（合計体積３０ｍＬ）で繰り返し洗浄することによって小型Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカラムで生成物を脱塩し、続いてメタノール（５ｍＬ）を用いて生成物を放出させた。体積を約０．５ｍＬに減らし、クロロホルム、メタノール、水の混合物（１２０：８５：２０）を用いたシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによりその生成物を精製した。高分解能ＭＳにより化合物の同一性を確認し、その純度をＣＥを使用して分析した。ＨＲＭＳ（ＥＳ）計算値（Ｃ39Ｈ43Ｎ4Ｏ11Ｓ）：７７５．２６４９、実測値：７７５．２７００。
【０１６４】
ガラクトースについて記載したものと同じプロトコールを使用して、残りの単糖（グルコース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、キシロース、フコース、およびグルクロン酸）の標準を同様の収量および純度で調製した。高分解能質量分析により化合物の同一性を同様に確認した（下の表参照）。各化合物はＣＥで単一ピークを与え、８つの化合物全て（２１〜２８）をＣＥで分割することができた（図１０）。
【０１６５】
【表１】
2008530538.tif 000003
【０１６６】
３．Ｂの実施例：固体支持体の調製および命名
ＰＥＧＡ樹脂（ＰＥＧＡ１９００、Ｖｅｒｓａｍａｔｒｉｘ  Ａ／Ｓ）および調整多孔性ガラス（ＣＰＧ）の両方を使用して一般構造Ｂ（図１）の固体支持体を調製した。ＢPはリンカーがスペーサーなしに市販の樹脂上のアミノ基に直接結合しているＰＥＧＡ樹脂を示す。Ｂ0、Ｂ1、およびＢ2はリンカーがアミノプロピル化ガラス（ＡＭＰ−ＣＰＧ、ＣＰＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）にそれぞれ０、１、および２個のスペーサーを経由して結合したＣＰＧを示す。４つの固体支持体の構造を図６に示す。
【０１６７】
３．１  ＢP（一般構造ＢのＰＥＧＡ樹脂）
メタノール中で膨潤した市販のＰＥＧＡ１９００樹脂（アミノ基の負荷：０．２３ｍｍｏｌ／ｇ）１ｇをＤＭＦで繰り返し洗浄し、メタノールが完全の除去されたことを確認した。リンカー（１４）（３０８ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（２０７ｍｇ、６４４ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１１９ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中で混合し、放置して５分間予備活性化させてからその混合物を樹脂に加えた。３時間後に試薬を吸引により除去し、樹脂をＣＨ2Ｃｌ2（５×２０ｍＬ）で洗浄した。
【０１６８】
樹脂のごく一部のを、Ｋａｉｓｅｒ試験のために採取し、その試験により樹脂にリンカーがうまく結合したことを確認した。同様に、樹脂へのリンカーの負荷を実施例３．３に記載したように決定し、標準曲線と比較することにより約０．２０ｍｍｏｌ／ｇであることを見出した。それからＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて（１５ｍＬで２分間および１５ｍＬで１８分間）処理することにより残りの樹脂からヒドロキシルアミン保護基（Ｆｍｏｃ）を除去し、続いてＤＭＦ（５×２０ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（７×２０ｍＬ）を用いて徹底的に洗浄した。その樹脂を高真空下で２４時間乾燥させ、最終ＰＥＧＡ樹脂（ＢP）を得て、それをその後の実験全てに使用した。
【０１６９】
３．２  Ｂ0、Ｂ1、およびＢ2（調整多孔性ガラス、ＣＰＧ）
Ｂ0：リンカー１４とＣＰＧ−ＮＨ2との結合
ＡＭＰ  ＣＰＧ（２５０ｍｇ、負荷＝５０．１μｍｏｌ／ｇ、０．０１２５ｍｍｏｌ。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、製品番号ＡＭＰ１４００Ｂ）をＤＭＦ（３×２ｍＬ）、５０％ＤＩＰＥＡ（３×２ｍＬ）、およびＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中の１４（１７ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（１２ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（８．６μＬ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合物でビーズを室温で一晩処理した。ビーズをＤＭＦ（３×２ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）で洗浄し、ピリジン中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。Ｂ1について記載したように負荷を１４．２μｍｏｌ／ｇと決定した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用して２×１０分間室温でＦｍｏｃ基を除去し、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）、エタノール（３×２ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）で洗浄した。その樹脂を真空中で乾燥させた。
【０１７０】
Ｂ1：１つのスペーサー１５およびリンカー１４とＣＰＧ−ＮＨ2との結合
ＡＭＰ  ＣＰＧ（２．２６ｇ、負荷＝５０．１μｍｏｌ／ｇ、０．１１ｍｍｏｌ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、製品番号ＡＭＰ１４００Ｂ）をＤＭＦ（３×２ｍＬ）、５０％ＤＩＰＥＡ（３×２ｍＬ）、およびＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中の１５（１６８ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（１０５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（７８μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）の混合物でビーズを室温で３時間処理した。樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ピリジン中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理した。ビーズをＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＣＨ2Ｃｌ2中の５０％ＴＦＡと共に室温で２時間処理した。ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄した。ビーズの１／３（２．５ｍＬ、約０．７０ｇ、約３５μｍｏｌ）をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。１４（４７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（３４μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）で室温で一晩処理した。ビーズをＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ピリジン中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥した。負荷を決定し（２９μｍｏｌ／ｇ）、ビーズをＤＭＦ中の２０％ピペリジンで室温で２×１０分間処理した。ビーズをＤＭＦ（３×２ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）、エタノール（３×２ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×２ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。
【０１７１】
Ｂ2：２つのスペーサー１５およびリンカー１４とＣＰＧ−ＮＨ2との結合
Ｂ1からのスペーサー１つを有する樹脂（５．５ｍＬ、約１．５４ｇ、約７７μｍｏｌ）の２／３をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。ＤＭＦ中の１５（１１４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（７２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５３μＬ、０．３１ｍｍｏｌ）の混合物でビーズを室温で一晩処理した。ビーズをＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ピリジン中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ＣＨ2Ｃｌ2中の５０％ＣＦ3ＣＯ2Ｈで室温で２時間処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄した。半量のビーズ（約４２μｍｏｌ）をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄し、１４（５６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、ＴＢＴＵ（３９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（２９μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）で室温で一晩処理した。ビーズをＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、ピリジン中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた。Ｂ1について記載したように負荷を３６μｍｏｌ／ｇと決定した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて樹脂を室温で２×１０分間被覆し、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）、エタノール（３×５ｍＬ）、および３×ＣＨ2Ｃｌ2（３×５ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させた。
【０１７２】
３．３  一般構造Ｂ（図１）の固体支持体上の捕捉基の負荷を推定する実施例
ＤＭＦ中の２０％ピペリジンに入れた７つの濃度のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０．０ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ）を調製した。ナノドロップ技術（Ｓａｖｅｅｎ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｎａｎｏｄｒｏｐ、モデル：ＮＤ−１０００、製造番号０９１１）を使用して放出されたフルベンのＵＶ吸光度を２９０ｎｍで測定した。吸光度を濃度に対してプロットして、傾き０．５８１ｍＭ-1の直線を得た。
【０１７３】
Ｆｍｏｃで保護されたＢ1ビーズ（４．８ｍｇ）をＤＭＦ（２００μＬ）中の２０％ピペリジンで１０分間処理した。２９０ｎｍのＵＶ吸光度を０．４１０と測定し、遊離したフルベン濃度を計算した。
［フルベン］＝ａｂｓobs（吸光度（観察値））／ｓｌｏｐｅstd curve（傾き（標準曲線）
［フルベン］＝０．４１０／０．５８１ｍＭ-1＝０．７０６ｍＭ
次に、次式を使用して負荷を計算した。
負荷＝［フルベン］×Ｖ（溶媒）／ｍ（ビーズ）
Ｂ1の負荷：
負荷＝０．７０６ｍｍｏｌ／Ｌ×２００μＬ／４．８ｍｇ＝２９．４μｍｏｌ／ｇ。
【０１７４】
４．Ａ＋Ｂ→ＣおよびＣの処理の実施例
４．１  還元糖としてグルコースおよび固体支持体としてＢ2を使用した捕捉条件の変動
一般構造Ｂの固体支持体に還元糖を捕捉してＣを生成させるための好ましい条件を見出すために、様々な溶媒、温度、および添加物を検討した。溶液中の未捕捉のＧｌｃの量は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイを使用して高感度で容易に推定できると思われることから、Ｄ−Ｇｌｃをモデル化合物として使用した。捕捉されたＧｌｃの量は、このように添加された量からインキュベーション後に溶液中に残存している量を引いたものであると計算された。
【０１７５】
ビーズ（Ｂ2）１５〜２０ｍｇを異なる条件でグルコース溶液と共に処理した。反応完了時の後に上清を除去し、未反応のグルコースの量をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイキット（Ａ−２２１８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して推定した。
異なる溶媒、濃度、温度、および反応時間を使用したグルコースの捕捉
【０１７６】
【表２】
2008530538.tif 000004
【０１７７】
４．２  ＢP上の代表的な還元糖の捕捉、処理、および分析
一般構造Ｃ、Ｃred、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪ（図１）の化合物を記載するために以下の名称を下に使用した。論じている特定の構造を説明している特定の文字、例えばＣまたはＥを最初に示す。次の上付きの数字は、図６に示した４つの固体支持体のどれが使用されたかを表す。したがって、一例としてＢP（図６）が糖を捕捉するために使用されるならば、その生成物は一般構造Ｃを有し、ＣはさらにＣPと呼ばれるであろう。次の数字は図２に示した還元糖の１０試料のうちのどれが捕捉されたかを表す。したがって、ＣP２はガラクトース（図２の化合物２）を捕捉したＰＥＧＡ樹脂ＢPの生成物を表す。同様に、Ｄ2５は固体支持体Ｂ2が四糖ＬＮＴ（５、図２）を捕捉してＣ2５が得られ、次にさらにキャップされＤ2５になったときに得られた生成物を表すであろう。
【０１７８】
４．２．１  還元糖３の捕捉および処理
ＣP３：ＢP上でのＬａｃＮＡｃ（３）の捕捉
最初にＬａｃＮＡｃ（３）（３８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を水（１．０ｍＬ）に溶かし、次にＤＭＳＯおよびＡｃＯＨ（７：３、９ｍＬ）の混合物で試料を１０倍に希釈し、ＬａｃＮＡｃ（３）の１０ｍＭ原液を得ることによって、原液（ストック用溶液）を作製した。次に、この原液から４０μＬ（０．４０μｍｏｌ）を採取し、ＤＭＳＯおよびＡｃＯＨ（７：３、１５０μＬ）の混合物でさらに希釈し、その全体をＢP（１０ｍｇ、２μｍｏｌ）に加え、放置して６０℃で一晩インキュベートした。この樹脂を、数回ＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１７９】
ＤP３：無水酢酸を用いたＣP３のキャッピング
実験ＣP３で得られた全ての樹脂を、Ａｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（０．４ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、水（２×０．５ｍＬ）、およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１８０】
ＥP３：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP３の還元
実験ＤP３で得られた樹脂をメタノール（０．１ｍＬ）で被覆し、ＢＨ3−ピリジン（２０μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（４０μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ酸を加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１８１】
ＦP３：ＴＲＩＴＣを用いたＥP３のタグ付け
ＴＲＩＴＣ（０．８９ｍｇ、２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶かし、得られた溶液を樹脂（ＥP３）に加え、室温で２時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除去した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１８２】
ＧP３：支持体からのＴＭＲタグ付けＬａｃＮＡｃの切断
前の実験で得られた樹脂ＦP３を、ＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．２ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によって液体をビーズから収集し、続いて水（３×０．５ｍＬ）でビーズを洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、１０％ＡｃＯＨでｐＨを中性に調整した。暗赤色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝９７８（ＭＨ+）により確認し、そのプロファイルをＣＥにより記録した（図１１）。
【０１８３】
４．２．２  還元糖５の捕捉および処理
ＣP５：ＢP上へのラクト−Ｎ−テトラオース（５）の捕捉
ＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの７：３の混合物（３ｍＬ）中に５（５．０ｍｇ、７．１μｍｏｌ）を溶かすことにより溶液を作製した。この混合物をＰＥＧＡ樹脂ＢP（１７５ｍｇ、３５μｍｏｌ）に加え、６０℃で一晩インキュベートした。この樹脂をＤＭＦ（５×５ｍＬ）およびメタノール（５×５ｍＬ）で数回洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１８４】
ＤP５：無水酢酸を用いたＣP５のキャッピング
実験ＣP５で得られた全ての樹脂をＡｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（５ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×５ｍＬ）、水（２×５ｍＬ）、およびメタノール（５×５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１８５】
ＥP５：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP５の還元
実験ＤP５で得られた樹脂をメタノール（２ｍＬ）中で膨潤させ、ＢＨ3−ピリジン（２００μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（４００μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ酸を加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×５ｍＬ）、メタノール（５×５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×５ｍＬ）で洗浄した。最後に樹脂を真空下で一晩乾燥させ、さらに使用するために室温で保存した。
【０１８６】
ＦP５：ＭＳ−タグを有する臭素を用いたＥP５のタグ付け
樹脂を膨潤させるために少量の乾燥樹脂ＥP５（１０ｍｇ、０．４μｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。４−ブロモフェニルイソチオシアネート（０．８５ｍｇ、４μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶解させることによって溶液を作製し、得られた混合物をその樹脂に加え、室温で２時間反応させ、続いてその樹脂をＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１８７】
ＧP５：支持体からの臭素タグ付きラクト−Ｎ−テトラオースの切断
前の実験で得られた樹脂ＦP５をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．２ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引により液体をビーズから収集し、続いてそのビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、１０％ＡｃＯＨでｐＨを弱酸性（ｐＨ３〜４）に調整した。この所望の生成物を含有する溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１０７２（９８％、ＭＨ+）、１０７４（１００％、ＭＨ+）、ｍ／ｚ＝１０７０（９８％、Ｍ−Ｈ+）、１０７２（１００％、Ｍ−Ｈ+）により確認した。図１２は、臭素の２つの同位体をはっきりと識別することができる挿入拡大図有する質量スペクトルを示すものである。
【０１８８】
４．２．３  還元糖混合物６の捕捉および処理
ＣP６：ＢP上での単糖混合物６（Ｆｕｃ：Ｍａｎ：ＧａｌＮＡｃ、２：３：１）の捕捉
３つの個別の単糖（Ｆｕｃ：１６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、Ｍａｎ：１８ｍｇ、０．１０ｍｏｌ、ＧａｌＮＡｃ：２２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を水（３×１．０ｍＬ）に溶かし、次にその試料をＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの混合物（７：３、３×９ｍＬ）で１０倍に希釈し、３つの単糖の１０ｍＭ原液を得ることにより、一連の３つの原液を作製した。それから、この３つの原液から以下の量を採取することにより混合物を調製したＦｕｃ（２０μＬ、０．２μｍｏｌ）、Ｍａｎ（３０μＬ、０．３μｍｏｌ）、およびＧａｌＮＡｃ（１０μＬ、０．１μｍｏｌ）。ＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの混合物（７：３、１５０μＬ）を加えることにより、この単糖溶液をさらに希釈し、その全体をＰＥＧＡ樹脂ＢP（１０ｍｇ、２μｍｏｌ）に加え、６０℃で一晩インキュベートさせた。この樹脂を数回ＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１８９】
ＤP６：無水酢酸を用いたＣP６のキャッピング
実験ＣP６で得られた全ての樹脂を、Ａｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（０．４ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、水（２×０．５ｍＬ）、およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１９０】
ＥP６：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP６の還元
実験ＤP６で得られた樹脂をメタノール（０．１ｍＬ）で被覆し、ＢＨ3−ピリジン（２０μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（４０μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈを加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を２つの別々の容器（ＥP６aおよびＥP６b、それぞれ約５ｍｇ）に分け、次のステップに直接使用した。
【０１９１】
ＦP６a：ＴＲＩＴＣを用いたＥP６aのタグ付け
ＴＲＩＴＣ（０．５ｍｇ、１．２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶解させ、得られた溶液を樹脂（ＥP６a）に加え、室温で２時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除去した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１９２】
ＧP６a：支持体からのＴＭＲタグ付き単糖単糖混合物の切断
前の実験（ＦP６a）で得られた樹脂をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．１ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によりビーズから液体を収集し、続いてビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、１０％ＡｃＯＨでｐＨを中性に調整した。暗赤色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。３つのタグ付き生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝７５９（Ｆｕｃ、ＭＨ+）、７７５（Ｍａｎ、ＭＨ+）、８１６（ＧａｌＮＡｃ、ＭＨ+）により確認し、それらのプロファイルをＣＥにより記録した（図１３）。
【０１９３】
ＦP６b：無水酢酸を用いたＥP６bのタグ付け
Ａｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（０．２ｍＬ）を樹脂（ＥP６b）に加え、室温で１６時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１９４】
ＧP６b：支持体からの酢酸タグ付き単糖混合物の切断
前の実験（ＦP６b）で得られた樹脂をＮＨ4ＯＨの１０％溶液（０．１ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によりビーズから液体を収集し、続いてそのビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固させ、水（１ｍＬ）に再溶解させ、凍結乾燥した。３つのタグ付き生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３５６（Ｆｕｃ、Ｍ−Ｈ+）、３７２（Ｍａｎ、Ｍ−Ｈ+）、４１３（ＧａｌＮＡｃ、Ｍ−Ｈ+）により確認した。３つのシグナルの強度比は約１．３：２：１であった。
【０１９５】
４．２．４  還元糖混合物７の捕捉および処理
ＣP７：ＢP上への単糖混合物７（Ｆｕｃ：Ｍａｎ：ＧａｌＮＡｃ、１：３：２）の捕捉
実験ＣP６で使用したものと同じ３つの単糖原液（各１０ｍＭ）を以下の実験に使用した。３つの原液から以下の量を採取することによって混合物を調製した：Ｆｕｃ（１０μＬ、０．１μｍｏｌ）、Ｍａｎ（３０μＬ、０．３μｍｏｌ）、およびＧａｌＮＡｃ（２０μＬ、０．２μｍｏｌ）。ＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの混合物（７：３、１５０μＬ）の添加によってこの単糖溶液をさらに希釈し、その全体をＰＥＧＡ樹脂であるＢP（１０ｍｇ、２μｍｏｌ）に加え、６０℃で一晩インキュベートさせた。この樹脂を数回ＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
ＤP７：無水酢酸を用いたＣP７のキャッピング
実験ＣP７で得られた全ての樹脂をＡｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（０．４ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、水（２×０．５ｍＬ）、およびメタノール（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０１９６】
ＥP７：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP７の還元
実験ＤP７で得られた樹脂をメタノール（０．１ｍＬ）で被覆し、ＢＨ3−ピリジン（２０μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（４０μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈを加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）で洗浄した。樹脂を２つの別々の容器に分け（ＥP７aおよびＥP７b、それぞれ約５ｍｇ）、次のステップに直接使用した。
【０１９７】
ＦP７a：ＴＲＩＴＣを用いたＥP７aのタグ付け
ＴＲＩＴＣ（０．５ｍｇ、１．２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶かし、得られた溶液を樹脂（ＥP７a）に加え、室温で２時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除いた。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０１９８】
ＧP７a：支持体からのＴＭＲタグ付け単糖混合物の切断
前の実験で得られた樹脂（ＦP７a）をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．１ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によりビーズから液体を収集し、続いてビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、１０％ＡｃＯＨでｐＨを中性に調整した。暗赤色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。３つのタグ付き生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝７５９（Ｆｕｃ、ＭＨ+）、７７５（Ｍａｎ、ＭＨ+）、８１６（ＧａＩＮＡｃ、ＭＨ+）により確認し、それらのプロファイルをＣＥにより記録した（図１４）。
【０１９９】
ＦP７b：重水素化無水酢酸を用いたＥP７bのタグ付け
重水素化無水酢酸およびメタノール（０．２ｍＬ）の１：１混合物を樹脂（ＥP７b）に加え、室温で１６時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０２００】
ＧP７b：支持体からの重水素タグ付け単糖混合物の切断
前の実験（ＦP７b）で得られた樹脂をＮＨ4ＯＨの１０％溶液（０．１ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によりビーズから液体を収集し、続いてそのビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固し、水（１ｍＬ）に再溶解させ、凍結乾燥した。３つの重水素タグ付き生成物の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３５９（Ｆｕｃ、Ｍ−Ｈ+）、３７５（Ｍａｎ、Ｍ−Ｈ+）、４１６（ＧａｌＮＡｃ、Ｍ−Ｈ+）により確認した。３つのシグナルの強度比は約１：４：４であった。
【０２０１】
４．２．５  還元オリゴ糖混合物９の捕捉および処理
ＣP９：ＢP上へのオリゴ糖混合物９（Ｇ２〜Ｇ７）の捕捉
水（１ｍＬ）に等モル量（各１０μｍｏｌ）の純粋なオリゴ糖Ｇ２〜Ｇ７を溶解することによって溶液を作製した。オリゴ糖含有溶液１００μＬをＤＭＳＯおよびＡｃＯＨの混合物（７：３、０．９ｍＬ）に加え、その全体をＰＥＧＡ樹脂であるＢP（６０ｍｇ、１２μｍｏｌ）に加え、放置して５０℃で一晩インキュベートした。この樹脂を数回ＤＭＦ（５×２ｍＬ）およびメタノール（５×２ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０２０２】
ＤP９：無水酢酸を用いたＣP９のキャッピング
実験ＣP９で得られた全ての樹脂をＡｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（２ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×２ｍＬ）、水（２×２ｍＬ）、およびメタノール（５×２ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０２０３】
ＥP９：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP９の還元
実験ＤP９で得られた樹脂をメタノール（１ｍＬ）で被覆し、ＢＨ3−ピリジン（１５０μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（３００μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈを加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×２ｍＬ）、メタノール（５×２ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×２ｍＬ）で洗浄した。樹脂を次のステップに直接使用した。
【０２０４】
ＦP９：ＦＩＴＣを用いたＥP９のタグ付け
ＦＩＴＣ（１２ｍｇ、３０μｍｏｌ）をＤＭＦおよびメタノールの１：１混合物（１ｍＬ）に溶かし、この溶液を樹脂（ＥP９）に加え、室温で２時間放置し、続いてＤＭＦ（５×２ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×２ｍＬ）、メタノール（５×２ｍＬ）、および最後に水（５×２ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除去した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０２０５】
ＧP９：ＦＩＴＣを使用してタグ付けしたオリゴ糖混合物の支持体からの切断
前の実験（ＦP９）で得られた樹脂をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（１ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引により液体をビーズから収集し、続いてこのビーズを水（３×３ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、ｐＨを１０％ＡｃＯＨで中性に調整した。得られた強烈な黄色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（３５０ｍｇ）に吸着させ、水（１０ｍＬ）で洗浄し、メタノール（３ｍＬ）で溶出した。６つのタグ付きオリゴ糖の存在をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝８８１（Ｇ２、ＭＨ+）、１０４３（Ｇ３、ＭＨ+）、１２０５（Ｇ４、ＭＨ+）、１３６７（Ｇ５、ＭＨ+）、１５２９（Ｇ６、ＭＨ+）、１６９１（Ｇ７、ＭＨ+）により確認し、この混合物のプロファイルをＣＥにより記録した（図１５）。
【０２０６】
４．２．６  リボヌクレアーゼＢから放出されたオリゴ糖の捕捉および処理
ＣP１０：ＲＮアーゼＢ（１０）からのオリゴ糖のＢP上への捕捉および処理
ＲＮアーゼＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｒ−７８８４）のＰＮＧアーゼＦ消化からの粗オリゴ糖を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でタンパク質を除去し、続いてＣａｒｂｏｇｒａｐｈ  ＳＰＥカラム（１５０ｍｇベッド重量；Ｓｃａｎｔｅｃ  Ｌａｂ）で糖質を精製した後で、使用した。０．９Ｍクエン酸含有ＤＭＳＯおよびＴＨＦの２：１混合物（１００μＬ）にＲＮアーゼＢ（１０）2由来の粗オリゴ糖（３００μｇ、約０．２μｍｏｌ）を溶かすことにより溶液を作製した。この混合物をＰＥＧＡ樹脂であるＢP（５ｍｇ、１．０μｍｏｌ）に加え、６０℃で一晩インキュベートした。この樹脂を数回ＤＭＦ（５×０．３ｍＬ）およびメタノール（５×０．３ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０２０７】
ＤP１０：無水酢酸を用いたＣP１０のキャッピング
実験ＣP１０で得られた全ての樹脂をＡｃ2Ｏおよびメタノールの１：１混合物（０．２ｍＬ）で１時間処理し、続いてＤＭＦ（５×０．３ｍＬ）、水（２×０．３ｍＬ）、およびメタノール（５×０．３ｍＬ）で洗浄し、次の実験に直接使用した。
【０２０８】
ＥP１０：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤP１０の還元
実験ＤP１０で得られた樹脂をメタノール（０．２ｍＬ）で被覆し、ＢＨ3−ピリジン（１０μＬ、８Ｍピリジン溶液）を加え、続いて水（２０μＬ）中の５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈを加えた。反応を室温で２時間進行させ、続いてＤＭＦ（５×０．３ｍＬ）、メタノール（５×０．３ｍＬ）、およびＣＨ2Ｃｌ2（５×０．３ｍＬ）で洗浄した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０２０９】
ＦP１０：ＦＩＴＣを使用したＥP１０のタグ付け
ＦＩＴＣ（１．９ｍｇ、５μｍｏｌ）をＤＭＦおよびメタノールの混合物（１：１、０．２ｍＬ）に溶かし、この溶液を樹脂（ＥP１０）に加え、６０゜で２時間放置し、続いてＤＭＦ（５×０．３ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．３ｍＬ）、メタノール（５×０．３ｍＬ）、および最後に水（５×０．３ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除去した。この樹脂を次のステップに直接使用した。
ＧP１０：ＦＩＴＣを使用してタグ付けしたＲＮアーゼ由来オリゴ糖の支持体からの切断
前の実験（ＦP１０）で得られた樹脂をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．２ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引によりビーズから液体を収集し、続いてビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集した液体および洗浄液をプールし、ｐＨを１０％ＡｃＯＨで中性に調整した。この所望の生成物を含有する、黄色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。標識オリゴ糖のプロファイルをＣＥにより分析した。ＣＥ（図１６）は、数個のオリゴ糖およびいくつかの未同定混入物の存在を示している。少なくとも１つの公知の構成要素の同一性をＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１７７５（Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃＧｌｃＮＡｃＣＨ2−Ｎ−（Ｒ）−タグ、ＭＨ+）により確認した。
【０２１０】
４．３  代表的還元糖のＣＰＧ支持体上への捕捉および処理
４．３．１  Ｂ1上への２の捕捉および処理
Ｃ1２：Ｂ1上へのガラクトース（２）の捕捉
クエン酸−リン酸緩衝液（１１３μＬ）中でＢ1（２０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）を２（６．６μＬ、１ｍｇ／ｍＬ水、０．０３μｍｏｌ）で処理し、５５℃で一晩放置した。ビーズをシリンジに移し、水（３×０．５ｍＬ）およびエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｃ1２を得た。
Ｄ1２：無水酢酸を用いたＣ1２のキャッピング
Ｃ1２（０．６μｍｏｌ）をエタノール中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間キャップし、エタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｄ1２を得た。
【０２１１】
Ｅ1２：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤ1２の還元
ＢＨ3−ピリジン（２５μＬ）および５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ（５０μＬ）のエタノール溶液（５００μＬ）の１００μＬでＤ1２（０．６μｍｏｌ）を処理した。この混合物を室温で２時間放置した。このビーズをエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｅ1２を得た。
Ｆ1２：ＴＲＩＴＣを用いたＥ1２の標識
Ｅ1２（０．６μｍｏｌ）をＴＲＩＴＣ（ＮＭＰ  ３００μＬおよびＣＨ2Ｃｌ2  ３００μＬに１．０ｍｇを加えたもの１００μＬ）で処理し、室温で２時間放置した。ビーズをＣＨ2Ｃｌ2（３×０．５ｍＬ）、エタノール（３×０．５ｍＬ）、および水（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｆ1２（赤色ビーズ）を得た。
Ｇ1２：Ｆ1２の塩基処理
Ｆ1２’（０．６μｍｏｌ）をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（１００μＬ）で室温で１時間処理し、得られた赤色溶液を単離し、水中の５０％ＡｃＯＨで中和し、Ｇ1２（赤色溶液）を得て、この溶液にＳｅｐ−Ｐａｋカラム（水中の３０％ＣＨ3ＣＮ）を通過させ、ＭＳ（７７５．３、ＭＨ+）およびＣＥにより分析した（図１７）。
【０２１２】
４．３．２  Ｂ1上への５の捕捉および処理
Ｃ1５：Ｂ1上へのＬＮＴ（５）の捕捉
Ｂ1（２０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）をクエン酸−リン酸緩衝液（１１３μＬ）中の５（２５Ｌ、２ｍｇ／ｍＬ水、０．０３μｍｏｌ）で処理し、５５℃で一晩放置した。ビーズをシリンジに移し、水（３×０．５ｍＬ）およびエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｃ1５を得た。
Ｄ1５：無水酢酸を用いたＣ1５のキャッピング
Ｃ1５（０．６μｍｏｌ）をエタノール中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間処理し、（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｄ1５を得た。
Ｅ1５：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤ1５の還元
Ｄ1５（０．６μｍｏｌ）を、ＢＨ3−ピリジン（２５μＬ）および５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ（５０μＬ）のエタノール溶液（５００μＬ）の１００μＬで処理した。得られた混合物を室温で２時間放置した。このビーズをエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｅ1５を得た。
Ｆ1５：ＴＲＩＴＣを用いたＥ1５の標識
Ｅ1５（０．６μｍｏｌ）をＴＲＩＴＣ（ＮＭＰ  ３００μＬおよびＣＨ2Ｃｌ2  ３００μＬに１．０ｍｇを加えたもの１００μＬ）で処理し、室温で２時間放置した。このビーズをＣＨ2Ｃｌ2（３×０．５ｍＬ）、エタノール（３×０．５ｍＬ）、および水（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｆ1５（赤色ビーズ）を得た。
【０２１３】
Ｇ1５：Ｆ1５の塩基処理
この樹脂をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（１００μＬ）で室温で１時間処理し、得られた赤色溶液を濾過により分離し、ビーズを水（３×７５μＬ）で洗浄し、水中の５０％ＡｃＯＨで中和し、Ｇ1５（赤色溶液）を得て、これにＳｅｐ−Ｐａｋカラム（水中の３０％ＣＨ3ＣＮ）を通過させ、ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１３００．６（Ｍ−Ｈ+）、１３０２．４（ＭＨ+）およびＣＥにより分析した（図１８）。
【０２１４】
あるいは、Ｅ1５を１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（サンガー試薬、図８）で以下のように標識することができた。樹脂をエタノール（７０μＬ）中のサンガー試薬（２０当量、０．４μＬ、Ｓｉｇｍａ）およびＴＥＡ（１０当量、０．２μＬ）で５５℃で２時間処理した。このビーズをエタノール（３×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（３×０．５ｍＬ）、エタノール（３×０．５ｍＬ）、および水（３×０．５ｍＬ）（黄色ビーズ）で洗浄し、次にＬｉＯＨの１Ｍ溶液（７０μＬ）で、室温で１時間処理した（褐色溶液）。得られた溶液を濾過により収集し、このビーズを水（３×５０μＬ）で洗浄した。この混合物を５０％ＡｃＯＨで中和した（黄色溶液）。水中の３０％ＣＨ3ＣＮを用いてこの混合物にＳｅｐ−Ｐａｋカラムを通過させた。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１０２３．１（Ｍ−Ｈ+）。
【０２１５】
４．３．３  Ｂ1上への混合物８の捕捉および処理
Ｃ1８：Ｂ1上へのガラクトース（２）およびＬＮＴ（５）の捕捉
Ｂ1（２０ｍｇ、０．６μｍｏｌ）を２（６．６μＬ、１ｍｇ／ｍＬ水、０．０３μｍｏｌ）、５（２５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ水、０．０３μｍｏｌ）、およびクエン酸−リン酸緩衝液（１００μＬ）で処理し、５５℃で一晩放置した。ビーズを水（３×０．５ｍＬ）およびエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｃ1８を得た。
Ｄ1８：無水酢酸を用いたＣ1８のキャッピング
Ｃ1８（０．６μｍｏｌ）中に残ったヒドロキシルアミンをエタノール中の５０％Ａｃ2Ｏで室温で１５分間キャップし、エタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｄ1８を得た。
【０２１６】
Ｅ1８：ＢＨ3−ピリジンを用いたＤ1８の還元
Ｄ1８（０．６μｍｏｌ）を、ＢＨ3−ピリジン（Ｆｌｕｋａ、２５μＬ）および５０％ＣＣｌ3ＣＯ2Ｈ（５０μＬ）のエタノール溶液（５００μＬ）の１００μＬで処理した。得られた混合物を室温で２時間放置した。このビーズをエタノール（３×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｅ1８を得た。
Ｆ1８：ＴＲＩＴＣを使用したＥ1８の標識
Ｅ1８（０．６μｍｏｌ）をＴＲＩＴＣ（ＮＭＰ  ３００μＬおよびＣＨ2Ｃｌ2  ３００μＬに１．０ｍｇを加えたもの１００μＬ）で処理し、室温で２時間放置し、Ｆ1８を得た。ビーズをＣＨ2Ｃｌ2（３×０．５ｍＬ）、エタノール（３×０．５ｍＬ）、および水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した（赤色ビーズ）。
Ｇ1８：Ｆ1８の塩基処理
Ｆ1８をＬｉＯＨの１Ｍ溶液（１００μＬ）で室温で１時間処理し、この赤色溶液を分離し、水中の５０％ＡｃＯＨで中和し、Ｇ1８（赤色溶液）を得て、これにＳｅｐ−Ｐａｋカラム（水中の３０％ＣＨ3ＣＮ）を通過させ、ＣＥにより分析した（図１９）。
【０２１７】
５．固定化オリゴ糖と酵素との反応
５．１  固定化タグ付きオリゴ糖とグリコシダーゼとの反応
５．１．１  スペーサー０個（Ｆ0５）、１個（Ｆ1５）、および２個（Ｆ2５）を有するＣＰＧ支持体上での構造Ｆ（キャップ＝アセチル、タグ＝ＴＭＲ）の固定化ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ、５）とβ−ガラクトシダーゼ（ウシ精巣、ＳＩＧＭＡ製品番号Ｇ−４１４２、１Ｕ／ｍＬ）との反応。３つの固定化オリゴ糖全てを本質的にＦ1５について記載した（４．３．２項）ように調製した。
【０２１８】
固体支持体（５ｍｇ）をβ−ガラクトシダーゼ（０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の濃度０．２Ｕ／ｍＬの溶液１００μＬ）と共に３７℃で２３時間インキュベートし、次にその樹脂を３×水、３×エタノール、３×ＣＨ2Ｃｌ2、３×ＥｔエタノールＯＨ、および３×水で洗浄した。このビーズをＬｉＯＨの１Ｍ溶液（６０μＬ）で室温で１時間処理し、溶液中に一般構造Ｇ0５、Ｇ1５、およびＧ2５の生成物を得た。各赤色溶液を濾過により収集した。濾液を５０％ＡｃＯＨで中和し、ＣＥを使用して分析した。
【０２１９】
図２０は、Ｆ0５についてＬＮＴから検出できるガラクトースの切断がなく、Ｆ1５について３９％の変換（すなわち四糖の３９％が末端Ｇａｌ残基を失い、三糖に変換された）およびＦ2５について８３％の変換があったことを示す。したがって、スペーサーの性質は酵素反応の過程に重要であることが見出された。
【０２２０】
５．１．２：２つのスペーサーを有するＣＰＧ支持体上での固定化マルトトリオースＦ2４（キャップ＝アセチル、タグ＝ＴＭＲ）と黒色麹菌由（アスペルヂルス  ニガー）来グルコアミラーゼ２（親切にもＢｉｒｔｅ  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ博士、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから供与を受けた）との反応。本質的にＦ1５について記載した通り（４．３．２項）であるが、還元糖としてマルトトリオース（Ｇ３、図２）および固体支持体としてＢ2を使用してＦ2４を調製した。Ｆ2４（約５ｍｇ）を、０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中の濃度０．１ｍｇ／ｍＬの酵素５０μＬと共に３７℃で２３時間インキュベートした。上記のように洗浄および切断後に、生成物をＣＥにより分析した（図２１）。その生成物は、固定化標識マルトトリオースから標識マルトトリオースおよびグルコースの間に溶出する新しいピークへの完全な変換を示し、したがってマルトビオース（Ｇ２）ＴＭＲ付加物と特定された。
【０２２１】
５．２  固定化タグなしオリゴ糖とグリコシダーゼとの反応および同支持体上に放出された還元単糖の捕捉
構造Ｃ2５の固定化ＬＮＴ（非還元、キャップなし、タグなし）とβ−ガラクトシダーゼ（ウシ精巣）との反応を、２つのスペーサーを有するＣＰＧ固体支持体上で実施した。本質的にＣ1５について記載した通り（４．３．２項）にＣ2５を調製した。使用前に、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して繰り返し遠心分離することにより酵素溶液から小分子混入物を除いた。Ｃ2５（５ｍｇ）を、０．２％ＢＳＡを含有する０．１Ｍクエン酸／リン酸（ｐＨ５．０）中の濃度０．９Ｕｇ／ｍＬの酵素５５μＬと共に３７℃で２３時間、次に５５℃でさらに２０時間インキュベートして、放出したガラクトースの捕捉を可能にした。この固体を洗浄し、還元し、無水酢酸でキャップし、ＴＲＩＴＣを使用してタグ付けし、Ｃ1５からＧ1５への変換について上記のようにＬｉＯＨで切断した。切断生成物のＣＥを図２２に示す。図２２は未反応ＬＮＴ（３２％）ならびに同様の量のＴＭＲ−標識生成物である三糖および切断されたガラクトースの両方の存在を示している。この実験は、切断された糖の、それが切断された同じキャップなし支持体上への捕捉を確認するものである。
【０２２２】
６．キャップ剤の変更
６．１．Ｄを生成するためのＣのキャッピング
キャップ剤の選択を使用してＣからＤへの変換を実施した（図１）。Ｃ2２を基質として使用した（ここでその固体は２つのスペーサーを有するＣＰＧであり、捕捉された糖はガラクトースであった）。次に、Ｃ上のアミノ基をとりわけ無水酢酸、安息香酸無水物、トリクロル酢酸無水物、およびジブロモキシレンでキャップした（図６）。５０％のキャップ剤濃度のエタノール溶液を用いてキャッピングを室温で１５〜１２０分間行った。次に、Ｃ1２からＧ1２への変換について記載したように（４．３．１項）試料を処理、すなわち還元、ＴＲＩＴＣを使用した標識、塩基切断、およびＣＥによる分析を行った。結果を図２３に示す。図２３は、全ての条件が、電気泳動図で化合物２１の前に出現する様々な量の他の不純物を有する標的ＴＭＲ−標識ガラクトース（図５の化合物２１）をもたらしたことを示すものである。
【０２２３】
６．２  Ｅを生成するためのＣredキャッピングの実施例
上記６．１項からのＣ2２を、上記Ｄ1２からＥ1２への変換について記載した通りに（４．３．１項）、ＢＨ3−ピリジンで還元した。生成物Ｃred2２は、それがキャップなしＮＨ2基を有する点でＥ1２と異なる。Ｃred2２（５ｍｇ）を、ＤＭＦ（５０μＬ）中の安息香酸ＮＨＳ−エステル（０．４ｍｇ、１．７５μｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．０μＬ）と６０℃で一晩反応させた。次に、一般構造Ｅ2２（ベンゾエートであるキャップを有する）を有する反応生成物を洗浄し、ＴＲＩＴＣを使用してタグ付けすることにより通常通り処理し、切断し、ＣＥにより分析した。図２４はその生成物がＣ→Ｄ→Ｅ→Ｇの順序により形成されたものと実質的に同一であることを示すものである。生成物の同一性をそのＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝７７５．０（ＭＨ+）により確認した。
【０２２４】
７．テザー使用の実施例：Ｅ→Ｈ→Ｉ→Ｊ（図１）
Ｘ−テザー−ＹPの実施例としての２９の合成
２９：４−イソチオシアナト−ベンジル）−カルバミド酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル
４−アミノベンジルアミン（０．９３ｍＬ、８．２０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2溶液（２０ｍＬ）に、ＴＥＡ（１．１５ｍＬ、８．２７ｍｍｏｌ）に続いてＦｍｏｃ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２．４８ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）溶液を加えた。３０分間撹拌後にＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）を加え、得られた混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ3（２×５０ｍＬ）および食塩水（５０ｍＬ）で連続的に洗浄し、乾燥した（Ｎａ2ＳＯ4）。溶媒を減圧下で除去し、残渣を乾燥カラム真空クロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン中の０〜６０％ＥｔＯＡｃ）により精製し、Ｆｍｏｃ保護された物質である（４−アミノ−ベンジル）−カルバミド酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（２．３０ｇ、９１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）＝４．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５，３Ｈｚ）、４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６，８Ｈｚ）、４．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６，８Ｈｚ）、４．９５（２Ｈ，ｓ）、６．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、６．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．２９〜７．４４（４Ｈ，ｍ）、７．６４〜７．７２（３Ｈ，ｍ）、７．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４３．９７、４７．１９、６５．６５、１１４．０９、１２０．４６、１２１．７５、１２５．５８、１２７．１１、１２７．４２、１２７．９６、１２８．４７、１２９．３０、１４１．１３、１４４．３２、１４７．８９、１５６．６３。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３４５（ＭＨ+）。
【０２２５】
（４−アミノ−ベンジル）−カルバミド酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチルエステル（７１８ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2溶液（３０ｍＬ）を、チオホスゲン（１９９μＬ、２．６１ｍｍｏｌ）のＣＨ2Ｃｌ2−水混合物溶液（４０ｍＬ、１：１、ｖ／ｖ）に滴下した。この混合物を一晩撹拌した後に、有機層を分離し、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）。減圧下で溶媒を除去し、残渣を乾燥カラム吸引クロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン中の０〜１００％ＣＨ2Ｃｌ2）により精製し、２９（６４３ｍｇ、８０％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４．１８〜４．２５（３Ｈ，ｍ）、４．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、７．２５〜７．４５（８Ｈ，ｍ）、７．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、７．８７〜７．９０（３Ｈ，ｍ）。13Ｃ−ＮＭＲ（６３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝４３．６４、４７．１９、６５．７０、１１５．５５、１２０．４８、１２５．１５、１２５．４９、１２６．２０、１２７．４２、１２７．９８、１２８．７２、１２８．８３、１３３．５５、１３６．２９、１４０．２６、１４１．１６、１４４．２３、１５６．７４。ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝３８７（ＭＨ+）。
【０２２６】
ＨP５：２９を使用したＥP５へのＦｍｏｃ保護されたアミノテザーの結合（図９）
乾燥樹脂（ＥP５）（０．２μｍｏｌ）５ｍｇをＣＨ2Ｃｌ2で２回洗浄し、樹脂がほどよく膨潤していることを確認した。Ｆｍｏｃ保護されたテザー（２９）（０．８ｍｇ、２μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶かし、樹脂に加え、２時間反応させた。樹脂をＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）およびＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）で洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を標準条件（ＤＭＦ中の２０％ピペリジン、０．５ｍｌ、２×１０分間）で除去した。ＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）で洗浄後に、その樹脂を次の実験に直接使用した。
【０２２７】
ＩP５：ＴＲＩＴＣを使用したＨP５のタグ付け
遊離第１アミノ基を有する実験ＨP５で得られた樹脂を、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中のＴＲＩＴＣ（０．９ｍｇ、２μｍｏｌ）と共に室温で２時間インキュベートし、続いてＤＭＦ（５×０．５ｍＬ）、ＣＨ2Ｃｌ2（５×０．５ｍＬ）、メタノール（５×０．５ｍＬ）、および最後に水（５×０．５ｍＬ）で徹底的に洗浄し、過剰の色素を除いた。この樹脂を次のステップに直接使用した。
【０２２８】
ＪP５：ＴＲＩＴＣを使用してアミノテザーを介してタグ付けされたラクト−Ｎ−テトラオースの切断
前の実験（ＩP５）で得られた樹脂を、ＬｉＯＨの１Ｍ溶液（０．２ｍＬ）で被覆し、２時間放置した。吸引により液体をビーズから収集し、続いてそのビーズを水（３×０．５ｍＬ）で洗浄した。収集された液体および洗浄液をプールし、１０％  ＡｃＯＨでｐＨを弱酸性（ｐＨ３〜４）に調整した。この所望の生成物を含有する暗赤色溶液をＳｅｐ−Ｐａｋカラム（５０ｍｇ）に吸着させ、水（２ｍＬ）で洗浄し、メタノール（０．５ｍＬ）で溶出させた。生成物の同一性は  ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｚ＝１４６５（ＭＨ+）により確認した。
【０２２９】
標識糖質のキャピラリー電気泳動分析
自動ＰｒｉｎＣＥ  ２−ｌｉｆｔ、モデル５６０ＣＥシステム（Ｐｒｉｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、オランダ）を使用してキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を行った。５０〜７５ｃｍの範囲の有効長（および検出ウインドウから出口までの余剰長３０ｃｍ）を有するＩＤ７５μｍの未被覆溶融シリカキャピラリーで、サーモスタットで２５℃に制御して分離を実施した。ＣＥの泳動液（ＢＧＥ）は、（Ａ）１５０ｍＭ  ＳＤＳを含有する５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）または（Ｂ）０．８％（ｗ／ｖ）γ−ＣＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−４８９２）を含有する０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）のいずれかであった。条件Ａは図１１および１５〜２２に示した分析に使用した。条件Ｂは図１０、１３、１４、２３、および２４に示した分析に使用した。
【０２３０】
使用前に室温で、２０００ｍｂａｒで１Ｍ  ＮａＯＨを用いて３０分間、水を用いて１０分間、およびＢＧＥを用いて１０分間すすぐことによって、キャピラリーをコンディショニングした。運転の間に２０００ｍｂａｒで１Ｍ  ＮａＯＨを用いて３分間、水を用いて３分間、およびＢＧＥを用いて３分間キャピラリーを洗浄した。試料を５０ｍｂａｒで６秒間流体力学的に注入し、２５ｋＶの電位差を横切るように電気泳動した。全ての実験を通常の極性、すなわち入口が陽極となるように実施した。検出を、適切なフィルターを備える蛍光検出器（Ａｒｇｏｓ  ２５０Ｂ、Ｆｌｕｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、スイス）を使用して実施した。ＴＲＩＴＣを使用して標識された試料については、励起および発光フィルターはそれぞれ５４６．１／１０および５７０ｎｍであった。ＦＩＴＣを使用して標識した試料については、励起および発光フィルターはそれぞれＵＧ１１（２００〜４００ｎｍ）および４９５ｎｍであった。
略号
本出願にわたり以下の略号を使用した。
ＡＭＰ  ＣＰＧ      アミノプロピル調整多孔性ガラス
ＢＧＥ      泳動液（バックグランド液）
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
ＣＥ      キャピラリー電気泳動
ＣＰＧ      調整多孔性ガラス
ＤＩＰＥＡ      Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ      Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＳ      エレクトロスプレー
ＦＩＴＣ      フルオレセインイソチオシアネート
Ｆｍｏｃ      ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＲＭＳ      高分解能質量分析
ＬＮＴ      ラクト−Ｎ−テトラオース
ＭＳ      質量分析
ＮＨＳ      Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＰ      １−メチル−２−ピロリドン
ＰＥＧＡ      ポリエチレングリコールアクリルアミドポリマー
ＲＮアーゼＢ      リボヌクレアーゼＢ
ｒｔ      室温
ＴＢＴＵ      Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオルボレート
ＴＥＡ      トリエチルアミン
ＴＭＲ      テトラメチルロダミン
ＴＲＩＴＣ      テトラメチルロダミンイソチオシアネート
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１．Ａ−Ｅ】本発明による方法の一例を示す。Ａ〜Ｅは、反応性糖Ｅを得るために固体支持体上に還元糖を捕捉および操作することを示す。
【図１．Ｅ−Ｇ．Ｊ】Ｅ〜ＧおよびＪは、固体支持体上での反応性糖Ｅの操作およびタグ付き糖の切断を示す。本発明の方法は、図１に示された１つまたは複数のステップを含むことがある。図１では、還元糖はピラノースで例示されるが、この方法にいずれかの還元糖を使用することができる。この図は、リンカーがスペーサーを介して固体支持体に結合している例を示すが、そのリンカーは固体支持体に直接結合していてもよい。その固体支持体は、この図で「固体」と称されるが、本明細書下記に言及したいずれかの固体支持体でありうる。
【図２】本発明の実施例で使用された還元糖およびその混合物の構造１〜１０を示す。
【図３】リンカー（１４）の合成およびスペーサー（１５）の構造を示す。
【図４】単糖標準として使用されたＴＭＲタグ付きＤ−ガラクトース誘導体であるＧａｌＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲ（２１）の溶液相合成および命名の説明を示す。
【図５】糖ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−ＴＭＲという一般式である８つの通常の哺乳動物単糖の合成タグ付き誘導体の構造２１〜２８を示す。
【図６】４つの固体支持体ＢP、Ｂ0、Ｂ1、およびＢ2の構造を示す。
【図７】一部のキャップ剤の構造を示す。
【図８】タグ−Ｘという一般構造である、使用したいくつかの窒素反応性タグ剤の構造を示す。
【図９】Ｘ−テザー−ＹPという一般構造である保護された窒素反応剤２９を用いたＥ→Ｊ（３０）の例を示す。
【図１０】図５に示された８つのＴＭＲ標識単糖標準のＣＥによる分離を示す。溶出順序はＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｘｙｌ（２４）、Ｍａｎ（２３）、Ｇｌｃ（２２）、ＧｌｃＮＡｃ（２６）、Ｆｕｃ（２５）、Ｇａｌ（２１）、およびＧｌｃＡ（２８）である。上図は拡大図である。
【図１１】（４．２．１項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＬａｃＮＡｃを有する）ＧP３のＣＥを示す。
【図１２】ネガティブイオンモードでの（４．２．２節の４−ブロモフェニルイソチオシアネートを用いてタグ付けされた還元糖としてラクト−Ｎ−テトラオースを有する）ＧP５のエレクトロスプレー質量スペクトルを示す。挿入図はＢｒの主同位体に対応する２つのピークを示す拡大図である。
【図１３】（４．２．３項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした単糖混合物６を有する）ＧP６aのＣＥを示す。Ｘは未同定のピークを表す。溶出順序は、ＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｍａｎ（２３）、およびＦｕｃ（２５）である。下図は拡大図である。
【図１４】（４．２．４項のＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした単糖混合物７を有する）ＧP７aのＣＥを示す。Ｘは未同定のピークを表す。溶出順序は、ＧａｌＮＡｃ（２７）、Ｍａｎ（２３）、およびＦｕｃ（２５）である。下図は拡大図である。
【図１５】（４．２．５項のＦＩＴＣを使用してタグ付けしたオリゴ糖混合物９を有する）ＧP９のＣＥを示す。溶出順序はＧ７からＧ２である（図２）。
【図１６】ＧP１０（４．２．６項でＦＩＴＣを使用してタグ付けしたリボヌクレアーゼＢオリゴ糖１０）のＣＥを示す。
【図１７】（４．３．１項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＧａｌ２を有する）Ｇ1２のＣＥを示す。
【図１８】（４．３．２項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてＬＮＴ５を有する）Ｇ1５のＣＥを示す。
【図１９】（４．３．３項でＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖混合物として８を有する）Ｇ1８のＣＥを示す。溶出順序はＬＮＴに続いてＧａｌである。
【図２０】５．１．１項の固定化ＬＮＴ（５）のβ−ガラクトシダーゼ消化後の切断生成物Ｇ0５（Ａ）、Ｇ1５（Ｂ）、およびＧ2５（Ｃ）のＣＥを示す。ＴＲＩＴＣ標識ＬＮＴ四糖は最初３６分付近で溶出する。ガラクトースの消失により３８分後に溶出する三糖生成物が得られる。
【図２１】Ｆ2４（ＴＲＩＴＣを使用してタグ付けした還元糖としてのマルトトリオース（Ｇ３））と５．１．２項のグルコアミラーゼとのインキュベーション前（図Ａ）およびインキュベーション後（図Ｂ）の切断生成物のＣＥを示す。図Ａを記録する前にタグ付きＧｌｃ（２２、図５）の参照試料を試料に添加した。
【図２２】（ＬＮＴ基および遊離ＮＨ2基を有する）Ｃ2５のβ−ガラクトシダーゼ処理に続いて放出されたガラクトースの捕捉、還元、および５．２項のＴＲＩＴＣを用いたタグ付け後に得られた切断生成物のＣＥを示す。溶出順序はＬＮＴ、ガラクトースの消失に起因する三糖、およびガラクトースである（２１）。
【図２３】多様な作用剤を用いたキャッピング、還元、および６．１項のＴＲＩＴＣを用いた標識後のＣ2２（固定化ガラクトース）由来切断生成物のＣＥ分析を示す。キャップ剤は、Ａ（無水酢酸：酢酸無水物）、Ｂ（安息香酸無水物）、Ｃ（トリクロロ酢酸無水物）、およびＤ（ジブロモキシレン）であった。タグ付きガラクトース（２１）は全ての図において１７分付近に溶出している。
【図２４】６．２項でＣ→Ｃred→→Ｇという順序を経由してガラクトースを加工することから得られた切断生成物のＣＥを示す。ガラクトース２１は１７分に溶出している。
【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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