(57)【要約】  本発明は、治療的抗ｃ-ｍｅｔ抗体と、この抗体を含んでなる組成物及びこの抗体の使用方法を提供するものである。
2008508880.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも一のＨＶＲ配列
(i)   KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号１)である配列Ａ１-Ａ１７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  WASTRES (配列番号２)である配列Ｂ１-Ｂ７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQYYAYPWT (配列番号３)である配列Ｃ１-Ｃ９を含有してなるＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GYTFTSYWLH (配列番号４)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含有してなるＨＶＲ-Ｈ１
(v)   GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号５)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含有してなるＨＶＲ-Ｈ２
(vi)  XYGSYVSPLDY (配列番号６) であり、ＸがＲでない配列Ｆ１-Ｆ１１を含有してなるＨＶＲ-Ｈ３；
(ｂ) 変異体ＨＶＲが配列番号１、２、３、４、５又は６に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体ＨＶＲ
を含んでなる抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、Ｆ７がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒト化である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
少なくとも一部のフレームワーク配列がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記修飾が置換、挿入又は欠損である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６( Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号１の配列を有するＨＶＲ-Ｌ１を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号３の配列を有するＨＶＲ-Ｌ３を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３がＲ又はＳである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体のヒトｃ-ｍｅｔに対する一価親和性が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性と実質的に同じである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項１６】
抗体のヒトｃ-ｍｅｔに対する一価親和性が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性より少なくとも３倍大きいものである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項１７】
前記マウス抗体が、ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)と称してアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されているハイブリドーマ細胞株によって産生されるものである、請求項１５又は１６に記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
前記結合親和性がＫｄ値として表される、請求項１５ないし１７の何れか一に記載の抗体。
【請求項１９】
前記結合親和性がＢｉａｃｏｒｅ又はラジオイムノアッセイによって測定される、請求項１５ないし１８の何れか一に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒトκサブグループ１コンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
重鎖ヒトサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
前記フレームワーク配列の位置７１、７３及び／又は７８が置換されている、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記置換が、Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＮ７８Ａである、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子のそのレセプターに対する結合を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２５】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値で結合を阻害する、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記ＩＣ５０がおよそ０．０１ｎＭからおよそ１０００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子(ＨＧＦ)レセプター活性を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２８】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値でレセプター活性を阻害する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記ＩＣ５０がおよそ０．１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ｃ-ｍｅｔ依存性細胞増殖を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項３１】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値で細胞増殖を阻害する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
前記ＩＣ５０がおよそ０．０１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方が一価性である、請求項１ないし３２の何れか一に記載の抗体。
【請求項３４】
前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方がＦｃ領域に結合した単一Ｆａｂ領域を含有してなる、請求項１ないし３３の何れか一に記載の抗体。
【請求項３５】
図１３(配列番号１９１−１９３)に記載のＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有する重鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
【請求項３６】
前記可変ドメインが、図１３(配列番号１８７−１９０)に記載のＦＲ１-ＨＣ、ＦＲ２-ＨＣ、ＦＲ３-ＨＣ及び／又はＦＲ４-ＨＣ配列を含有してなる、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
図１３(配列番号１９４及び／又は１９５)に記載のＦｃ配列及び／又はＣＨ１配列を含有してなる、請求項３５又は３６に記載の抗体。
【請求項３８】
図１３(配列番号１８３−１８５)に記載のＨＶＲ１-ＬＣ、ＨＶＲ２-ＬＣ及び／又はＨＶＲ３-ＬＣを含有する軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
【請求項３９】
前記可変ドメインが、図１３(配列番号１７９−１８２)に記載のＦＲ１-ＬＣ、ＦＲ２-ＬＣ、ＦＲ３-ＬＣ及び／又はＦＲ４-ＬＣ配列を含有してなる、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
図１３(配列番号１８６)に記載のＣＬ１配列を含有してなる、請求項３８又は３９に記載の抗体。
【請求項４１】
請求項３５ないし３７の何れか一に記載の重鎖可変ドメインと請求項３８ないし４０の何れか一に記載の軽鎖可変ドメインを含有してなる抗体。
【請求項４２】
前記抗体が一価性であり、Ｆｃ領域を含有してなる、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記Ｆｃ領域が第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含有してなり、該第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれが野生型ヒトＦｃに関して一又は複数の変異を含有する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
前記第一ポリペプチドが図１３(配列番号１９５)に記載のＦｃ配列を含有し、前記第二ポリペプチドが図１４(配列番号１９６)に記載の配列を含有する、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖の阻害方法であって、細胞又は組織に、有効量の請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を接触させることを含む方法。
【請求項４６】
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達系統の調節不全が関与する疾患を調節する方法であって、有効量の請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を被検体に投与することを含む方法。
【請求項４７】
癌を有する被検体の治療方法であって、有効量の請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を該被検体に投与することを含む方法。
【請求項４８】
前記癌が、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、結腸直腸癌及び／又は膵臓癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
被検体の増殖性疾の治療方法であって、有効量の請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を該被検体に投与することを含む方法。
【請求項５０】
前記増殖性疾患が癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸を含有してなる宿主細胞。
【請求項５３】
請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を含有してなる組成物。
【請求項５４】
前記組成物が担体を含んでなる、請求項５３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（出願について）
この出願は、米国特許法規則１．５３（ｂ）（１）に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、２００４年８月５日に出願の仮出願第６０／５９８９９１号の優先権を主張し、参照によりここにその内容全体が組み込まれるものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学及び成長因子調節の分野に関する。より具体的には、本発明はＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のモジュレータと該モジュレータの使用に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ＨＧＦは、多くの異なる種類の細胞の分裂促進活性、モトジェニック活性及び形態形成活性を有する間充織誘導性多指向性因子である。ＨＧＦ効果は、特定のチロシンキナーゼであるｃ-ｍｅｔに媒介され、異常なＨＧＦ及びｃ-ｍｅｔ発現は様々な腫瘍において、みられることが多い。例としてMaulik ら, Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13:41-59、 Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867参照。ＨＧＦ／ｃ-Ｍｅｔシグナル伝達経路の調節機能は、腫瘍発達及び転移に関係する。例としてTrusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002), 2:289-300を参照。
ＨＧＦは、Ｍｅｔレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の細胞外ドメインを結合して、多様な生物学的プロセス、例えば細胞分散、増殖及び生存を制御する。ＨＧＦ-Ｍｅｔシグナル伝達は、特に筋肉始原細胞の移動と肝臓及び神経系の発生における正常な胚発生に必須である(Bladt 等, 1995、 Hamanoue 等, 1996、 Maina 等, 1996、 Schmidt 等, 1995、 Uehara 等, 1995)。Ｍｅｔ及びＨＧＦノックアウトマウスの発生上の表現型は非常に類似しており、ＨＧＦがＭｅｔレセプターの同族リガンドであることが示唆される(Schmidt 等, 1995、 Uehara 等, 1995)。また、ＨＧＦ-Ｍｅｔは、肝再生、血管新生及び創傷治癒においても働く(Bussolino 等, 1992、 Matsumoto and Nakamura, 1993、 Nusrat 等, 1994)。前駆体Ｍｅｔレセプターは、ジスルフィド結合により結合されている細胞外αサブユニットと膜架橋βサブユニットにタンパク質切断する(Tempest 等, 1988)。βサブユニットは細胞質キナーゼドメインを含有しており、アダプタータンパク質が結合してシグナル伝達を開始するＣ末端の多基質ドッキング部位を有している(Bardelli 等, 1997、 Nguyen 等, 1997、 Pelicci 等, 1995、 Ponzetto 等, 1994、 Weidner 等, 1996)。ＨＧＦ結合の際に、Ｍｅｔ活性化により、チロシンリン酸化と、Ｇａｂ１及びＧｒｂ２／Ｓｏｓ媒介性ＰＩ３キナーゼ及びＲａｓ／ＭＡＰＫ活性化それぞれを介する下流のシグナル伝達が引き起こされ、これによって、細胞運動及び増殖が作動される(Furge 等, 2000、 Hartmann 等, 1994、 Ponzetto 等, 1996、 Royal and Park, 1995)。
【０００４】
Ｍｅｔは、発癌物質治療の骨肉腫細胞株におけるトランスフォーミングであることが示された(Cooper 等, 1984、 Park 等, 1986)。Ｍｅｔの過剰発現又は遺伝子増幅は、様々なヒト癌において、観察されている。例えば、Ｍｅｔタンパク質は、結腸直腸癌において、少なくとも５倍過剰発現しており、肝転移における遺伝子増幅が報告された(Di Renzo 等, 1995、 Liu 等, 1992)。また、Ｍｅｔタンパク質は、経口扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、腎臓細胞上皮癌、乳癌及び肺上皮癌において、過剰発現することが報告されている(Jin 等, 1997、 Morello 等, 2001、 Natali 等, 1996、 Olivero 等, 1996、 Suzuki 等, 1994)。加えて、ｍＲＮＡの過剰発現は、肝細胞癌、胃上皮癌及び結腸直腸上皮癌において、観察されている(Boix 等, 1994、 Kuniyasu 等, 1993、 Liu 等, 1992)。
Ｍｅｔのキナーゼドメインの多くの突然変異は、恒常的なレセプター活性化を引き起こす腎臓乳頭上皮癌において、観察されている(Olivero 等, 1999、 Schmidt 等, 1997、 Schmidt 等, 1999)。これらの活性化突然変異により、恒常的なＭｅｔチロシンリン酸化が起こり、ＭＡＰＫ活性化、フォーカス形成及び腫瘍形成が生じる(Jeffers 等, 1997)。加えて、これらの突然変異は細胞運動及び浸潤を亢進する(Giordano 等, 2000、 Lorenzato 等, 2002)。形質転換細胞のＨＧＦ依存性Ｍｅｔ活性化は、最終的に浸潤性腫瘍成長及び転移を引き起こす転移、拡散及び移動性の増加を媒介する(Jeffers 等, 1996、 Meiners 等, 1998)。
Ｍｅｔは、レセプター活性化、形質転換及び浸潤を作動する他のタンパク質と相互に作用することが示されている。新生細胞において、Ｍｅｔは、ラミニンなどの細胞外基質(ＥＣＭ)構成成分であるα６β４インテグリンと相互に作用して、ＨＧＦ依存性浸潤性成長を促進することが報告されている(Trusolino 等, 2001)。加えて、Ｍｅｔの細胞外ドメインは、セマフォリンファミリのメンバーであるプレキシンＢ１と相互に作用して、浸潤性成長を亢進することが示されている(Giordano 等, 2002)。さらに、腫瘍形成及び転移に関係したＣＤ４４ｖ６は、ＭｅｔとＨＧＦとの複合体を形成して、Ｍｅｔレセプター活性化を引き起こすことも報告された(Orian-Rousseau 等, 2002)。
【０００５】
Ｍｅｔは、Ron and Sea (Maulik 等, 2002)を含むＲＴＫのサブファミリのメンバーである。Ｍｅｔの細胞外ドメイン構造の予測から、セマフォリン及びプレキシンとの相同性の共有が示唆される。ＭｅｔのＮ末端は、すべてのセマフォリン及びプレキシンにおいて、保存されるおよそ５００のアミノ酸のセマドメインを含有する。セマフォリン及びプレキシンは、神経発達における役割について最初に記載された、分泌型及び膜結合型タンパク質の大きなファミリーに属する(Van Vactor and Lorenz, 1999)。しかしながら、近年では、セマフォリン過剰発現は、腫瘍浸潤及び転移と相関していた。プレキシン、セマフォリン及びインテグリンにおいて、みられるシステイン-豊富なＰＳＩドメイン(Ｍｅｔ関連配列ドメインとも称される)は、プレキシン及び転写因子にみられるイムノグロブリン様領域である４つのＩＰＴリピートが続くセマドメインに近接して存在する。最近の研究では、ＭｅｔセマドメインがＨＧＦ及びヘパリン結合に充足するものであることが示唆される(Gherardi 等, 2003)。さらに、Kong-Beltran 等 (Cancer Cell (2004), 6:61-73)は、Ｍｅｔのセマドメインがレセプターの二量体化及び活性化に必要であることが報告されている。
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路を標的とした分子は、数多く報告されている。これらの分子は、米国特許番号５，６８６，２９２号において、記述されるものなどの抗体を含む。また、ｃ-ｍｅｔの一部の細胞外ドメインは、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路に対して拮抗性効果がありうることが示されている。この経路が様々な病的状態の病因において、機能するという重要性を鑑みると、やはり、治療薬としての開発に最適である臨床特質を有する薬剤が必要とされ続けることは明らかである。本願明細書において、記述される本発明は、この必要性を満たして、他の利点を提供するものである。
特許出願及び刊行物を含む本願明細書中のすべての引例は、その全体が出典明記によって、組み込まれる。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、重要かつ有用な治療的標的として表される生物学的／細胞性工程であるＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ生物学的経路の多様なアンタゴニストの同定にある程度基づく。本発明は、限定するものではないがｃ-ｍｅｔ及びレセプター多量体化の細胞外部位へのＨＧＦ結合を阻害することを含む、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化を阻害することに基づく組成物及び方法を提供する。本明細書中に記載のように、本発明のアンタゴニストは、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路の異常な又は望ましくないシグナル伝達が関与する病理学的症状を治療するために用いる、重要な治療的薬剤及び診断用薬剤を提供する。したがって、本発明は、ｃ-ｍｅｔリガンド結合、ｃ-ｍｅｔ二量体化、活性化、及びＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達が関与する他の生物学的／生理学的活性の調節を含む、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ経路を調節することに関する方法、組成物、キット及び製造品を提供するものである。
【０００７】
一態様では、本発明は治療的使用に適する抗ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ治療剤を提供するものであり、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の破壊の程度を変化することに影響しうる。例えば一実施態様では、本発明は、ヒトｃ-ｍｅｔに対する抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としての抗体の親和性)が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるか、これらからなるか、あるいはこれらから基本的になるマウス抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としてのマウス抗体の親和性)と実施的に同じである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体を提供する。他の実施態様では、本発明は、ヒトｃ-ｍｅｔに対する抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としての抗体の親和性)が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるか、これらからなるか、あるいはこれらから基本的になるマウス抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としてのマウス抗体の親和性)より低い、例えば少なくとも３、５、７又は１０分の１より低いものである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体を提供する。他の実施態様では、本発明は、ヒトｃ-ｍｅｔに対する抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としての抗体の親和性)が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるか、これらからなるか、あるいはこれらから基本的になるマウス抗体の一価親和性(例えば、ヒトｃ-ｍｅｔに対するＦａｂ断片としてのマウス抗体の親和性)より大きい、例えば少なくとも３、５、７、１０または１３倍大きいものである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体を提供する。一実施態様では、ヒトｃ-ｍｅｔに対するマウス抗体の一価親和性が、ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)と称してアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されているハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体の可変ドメイン配列を含有するＦａｂ断片の結合親和性と実質的に同じである。当分野で確立されているように、リガンドのそのレセプターに対する結合親和性は任意の様々なアッセイを用いて測定され、種種の量的値で表されうる。したがって、一実施態様では、結合親和性はＫｄ値として表され、(例えば最小限の結合力で)内在性の結合親和性を反映する。一般的に及び好ましくは、結合親和性は、無細胞セット又は細胞を用いたセットの何れであってもインビトロで測定される。本明細書中でさらに詳述するように、結合親和性の倍数的偏差は、ヒト化抗体(例えばＦａｂ形態)の一価結合親和性値と、結合親和性値が同じアッセイ条件で測定された参照／比較抗体(例えばＦａｂ形態)(例えばドナー高頻度可変領域配列を有するマウス抗体)の一価結合親和性値に関して数量化することができる。したがって、一実施態様では、結合親和性の倍数的偏差は、Ｆａｂ型のヒト化抗体のＫｄ値と前記参照／比較Ｆａｂ抗体との比率として測定される。例えば、一実施態様では、本発明の抗体(Ａ)が、参照抗体(Ｍ)の親和性の「３分の１より低い」親和性を有する場合、その結果、ＡのＫｄ値が３倍である場合、ＭのＫｄ値を１倍とすると、ＭのＫｄ値��対するＡのＫｄ値の比率は３：１であろう。逆に、一実施態様では、本発明の抗体(Ｃ)が参照抗体(Ｒ)の親和性より「３倍大きい」親和性を有する場合、その結果、ＣのＫｄ値が１倍である場合、ＲのＫｄ値を３倍とすると、ＲのＫｄ値に対するＣのＫｄ値の比率は１：３であろう。例えばＢｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)及びＥＬＩＳＡを含め、本明細書中に記載のものを含む当分野で公知の多くのアッセイの何れかを用いて、結合親和性測定値を得ることができる。
【０００８】
一態様では、本発明のＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔアンタゴニストは、
(ａ) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも一のＨＶＲ配列
(i)   KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号１)である配列Ａ１-Ａ１７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  WASTRES (配列番号２)である配列Ｂ１-Ｂ７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQYYAYPWT (配列番号３)である配列Ｃ１-Ｃ９を含有してなるＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GYTFTSYWLH (配列番号４)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含有してなるＨＶＲ-Ｈ１
(v)   GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号５)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含有してなるＨＶＲ-Ｈ２
(vi)  XYGSYVSPLDY (配列番号６) であり、ＸがＲでない配列Ｆ１-Ｆ１１を含有してなるＨＶＲ-Ｈ３；
(ｂ) 変異体ＨＶＲが配列番号１、２、３、４、５又は６に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体ＨＶＲ
を含んでなる抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ１は、配列番号１の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ２は、配列番号２の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｌ３は、配列番号３の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ１は、配列番号４の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ２は、配列番号５の配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＨＶＲ-Ｈ３は、配列番号６の配列を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＴＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号７)を含んでなる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、ＳＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ(配列番号８)を含んでなる。一実施態様では、これらの配列を含有する本発明の抗体は、ヒト化又はヒトである(共に本願明細書において記述される)。
【０００９】
一態様では、本発明は、１、２、３、４、５又は６つのＨＶＲを含有してなる抗体を提供するものであり、各々のＨＶＲは配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８からなる群から選択される配列を含むか、それらからなるか、それらから基本的になるものであり、配列番号１はＨＶＲ-Ｌ１に相当し、配列番号２はＨＶＲ-Ｌ２に相当し、配列番号３はＨＶＲ-Ｌ３に相当し、配列番号４はＨＶＲ-Ｈ１に相当し、配列番号５はＨＶＲ-Ｈ２に相当し、そして、配列番号６、７又は８はＨＶＲ-Ｈ３に相当するものである。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号１、２、３、４、５及び７を含有する。一実施態様では、本発明の抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含有してなるものであり、各々、順に、配列番号１、２、３、４、５及び８を含有する。
【００１０】
本発明の抗体の変異体ＨＶＲは、ＨＶＲ内に一又は複数の残基の修飾を含有しうる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６( Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。それぞれの位置の後の括弧内の文字は例示的置換(すなわち置き換え)のアミノ酸を示すものであり、当分野の技術者に明らかなように、本明細書中の置換アミノ酸としての他のアミノ酸の適合性は、当分野で公知の技術及び／又は本明細書中に記載の技術を用いて慣例的に評価することができる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号１の配列を含有する。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＴである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＲである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７はＴである。一実施態様では、本発明の抗体は変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含有してなり、Ｆ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、そしてＦ７はＴである。
【００１１】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＡである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体が、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ２をさらに含んでなり、各々は順に配列番号：１、２、３、４及び５を含有する。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｂ６がＶである変異体ＨＶＲ-Ｌ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び６に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び７に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、３、４、５及び８に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
【００１２】
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１４がＴであり、Ｅ１５がＫであり、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び６に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び７に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：１、２、３、４及び８に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
一態様では、本発明は、図２、３及び／又は４(配列番号５６−１６３)に示すＨＶＲ配列の１、２、３、４、５又はすべてを含んでなる。
【００１３】
宿主被検体に使用するための治療剤は、該被検体における該薬剤に対する免疫原性応答をほとんどないしは全く誘発しない。一実施態様では、本発明はそのような薬剤を提供する。例えば、一実施態様では、本発明は、宿主被検体において配列番号９及び１０の配列を含有する抗体と比較して実質的に低減したレベルでヒト抗マウス抗体応答(ＨＡＭＡ)を誘発する、及び／又は誘発することが期待されるヒト化抗体を提供する。他の例では、本発明は、最小限のヒト抗マウス抗体応答(ＨＡＭＡ)を誘発するか、全く誘発しないことが期待されるヒト抗体を提供する。一例では、本発明の抗体は、臨床的に受容可能なレベルであるか、それよりも低い抗マウス抗体応答を誘発する。
本発明のヒト化抗体は、その重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインに一又は複数のヒト及び／又はヒトコンセンサス非高頻度可変領域(例えばフレームワーク)配列を含有してもよい。いくつかの実施態様では、ヒト及び／又はヒトコンセンサス非高頻度可変領域配列内に一又は複数の付加的な修飾が存在する。一実施態様では、本発明の抗体の重鎖可変ドメインはヒトコンセンサスフレームワーク配列を含んでなり、一実施態様では、そのヒトコンセンサスフレームワーク配列はサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列である。一実施態様では、本発明の抗体は、少なくとも一アミノ酸位置が修飾された変異体サブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含んでなる。例えば、一実施態様では、サブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列は、位置７１、７３及び又は７８の一又は複数に置換を含んでもよい。一実施態様では、前記の置換はＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＮ７８Ａの何れかの組合せである。
【００１４】
当分野で公知であるように、また、より詳細に後述するように、抗体の高頻度可変領域を示すアミノ酸位置／境界域は、(以下に記載のように)当分野で公知の様々な定義及び状況によって異なりうる。可変ドメイン内の位置は、ある定義のもとで高頻度可変領域外と判断されても、異なる定義のもとでは高頻度可変領域内であると判断されうるハイブリッド高頻度可変位置とみなされるものが多い。また、一又は複数のこれらの位置は、拡張した高頻度可変領域にあるとみなされうる(以下に定義する)。本発明は、これらハイブリッド高頻度可変位置内に修飾を含有する抗体を提供する。一実施態様では、これらのハイブリッド高頻度可変位置には、重鎖可変ドメイン内の位置２６−３０、３３−３５Ｂ、４７−４９、５７−６５、９３、９４及び１０２の一又は複数が含まれる。一実施態様では、これらハイブリッド高頻度可変位置には、軽鎖可変ドメイン内の位置２４−２９、３５−３６、４６−４９、５６及び９７の一又は複数が含まれる。一実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数のハイブリッド高頻度可変位置が修飾された可変ヒトサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数の位置２７−２８、３０、３３−３５、４９、５７−６５、９４及び１０２が修飾された可変ヒトサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含んでなる。一実施態様では、前記抗体はＦ２７Ｙ置換を含む。一実施態様では、抗体はＴ２８Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ又はＩ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＳ３０Ｉ、Ｔ又はＹ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＡ３３Ｗ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＭ３４Ｌ又はＭ３４Ｖ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＳ３５Ｈ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＴ５７Ｉ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＹ５８Ｒ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＹ５９Ｆ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＡ６０Ｎ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＤ６１Ｐ、Ｔ又はＱ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＳ６２Ｎ、Ｄ、Ｋ、Ｔ又はＶ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＶ６３Ｆ又はＶ６３Ｌ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＫ６４Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｄ又はＱ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＧ６５Ｄ、Ｙ、Ｅ又はＨ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＲ９４Ｔ又はＲ９４Ｓ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＹ１０２Ｑ、Ｓ、Ｈ又はＦ置換を含んでなる。一実施態様では、前記Ｒ９４Ｔ又はＲ９４Ｓ修飾を含む本発明の抗体は、位置９６及び／又は１００に一又は複数の修飾を更に含む。一実施態様では、前記修飾は、Ｇ９６Ｒ及び／又はＳ１００Ｔ置換(すなわちＨＶＲ-Ｈ３内に)を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数の位置２４、２５、２９及び５６で修飾された変異体ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗体はＲ24Ｋ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＡ２５Ｓ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＩ２９Ｑ置換を含んでなる。一実施態様では、抗体はＳ５６Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ置���を含んでなる。
【００１５】
一実施態様では、本発明の抗体は、位置２７−２８、３０、３３−３５、４９、５７−６５、９４及び１０２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又はすべてが修飾された変異体ヒトサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含有する重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、修飾は、Ｆ２７Ｙ、Ｔ２８(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ又はＩ)、Ｓ３０(Ｉ、Ｔ又はＹ)、Ａ３３Ｗ、Ｍ３４(Ｌ，Ｖ)、Ｓ３５Ｈ、Ｔ５７Ｉ、Ｙ５８Ｒ、Ｙ５９Ｆ、Ａ６０Ｎ、Ｄ６１(Ｐ、Ｔ、Ｑ)、Ｓ６２(Ｎ、Ｄ、Ｋ、Ｔ，Ｖ)、Ｖ６３(Ｆ，Ｌ)、Ｋ６４(Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｄ、Ｑ)、Ｇ６５(Ｄ、Ｙ、Ｅ、Ｈ)、Ｒ９４(Ｔ、Ｓ)およびＹ１０２(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)からなる群から選択される。一実施態様では、前記Ｒ９４Ｔ又はＲ９４Ｓ修飾を含んでなる本発明の抗体は、位置９６及び／又は１００に一又は複数の修飾を更に含む。一実施態様では、前記修飾は、Ｇ９６Ｒ及び／又はＳ１００Ｔ置換(すなわちＨＶＲ-Ｈ３内に)を含んでなる。
一実施態様では、本発明の抗体は、位置２４、２５、２９及び５６の１、２、３又は全てが修飾された変異体ヒトκサブグループＩコンセンサスフレームワーク配列を含有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、修飾は、Ｒ２４Ｋ、Ａ２５Ｓ、Ｉ２９Ｑ及びＳ５６(Ｒ、Ｉ、Ｍ、Ｇ)からなる群から選択される。
本発明の抗体は、任意の好適なヒト又はヒトコンセンサス軽鎖フレームワーク配列を含んでなり、提供される抗体は所望の生物学的特徴(例えば所望の結合親和性)を示す。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトｋ軽鎖のフレームワーク配列の少なくとも一部(又は全て)を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトｋサブグループＩフレームワークコンセンサス配列の少なくとも一部(又は全て)を含んでなる。
【００１６】
一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３及び／又は１６(図１)に示すフレームワーク配列を含有する重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを含んでなり、重鎖の示された位置９４がＲでない(そして好ましくはＳ又はＴである必要もない)。
一態様では、本発明の抗体は、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子のそのレセプターに対する結合を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体である。例えば、一実施態様では、本発明の抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の約半分よりも少ないＩＣ５０値でＨＧＦ結合を阻害する。一実施態様では、本発明の抗体のＩＣ５０値がキメラ抗体のＩＣ５０値のおよそ０．１、０．２、０．３又は０．４である。レセプターに対するＨＧＦ結合を阻害する能力の比較は、以下の実施例で記載するものを含め、当分野で公知の様々な方法によって行うことができる。一実施態様では、ＩＣ５０値はおよそ０．０１ｎＭからおよそ１０００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される。
一態様では、本発明の抗体は、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子(ＨＧＦ)レセプター活性を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体である。例えば、一実施態様では、本発明の抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値でレセプター活性を阻害する。一実施態様では、本発明の抗体のＩＣ５０値がキメラ抗体のＩＣ５０値のおよそ０．１、０．２、０．３又は０．４である。ＨＧＦレセプター活性化を阻害する能力の比較は、以下の実施例で記載するものを含め、当分野で公知の様々な方法によって行うことができる。一実施態様では、ＩＣ５０値はおよそ０．１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される。
【００１７】
一態様では、本発明の抗体は、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ｃ-ｍｅｔ依存性細胞増殖を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体である。例えば、一実施態様では、本発明の抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値で細胞増殖を阻害する。一実施態様では、本発明の抗体のＩＣ５０値がキメラ抗体のＩＣ５０値のおよそ０．１、０．２、０．３又は０．４である。細胞増殖を阻害する能力の比較は、以下の実施例で記載するものを含め、当分野で公知の様々な方法によって行うことができる。一実施態様では、ＩＣ５０値はおよそ０．０１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される。
一実施態様では、ヒト化抗体及びキメラ抗体は一価性である。一実施態様では、ヒト化抗体及びキメラ抗体は、Ｆｃ領域に結合される一本鎖Ｆａｂ領域を含んでなる。一実施態様では、参照キメラ抗体は、ヒトＦｃ領域に結合される図７(配列番号：９及び１０ )に示す可変ドメイン配列を含んでなる。一実施態様では、ヒトＦｃ領域はＩｇＧのもの(例えばＩｇＧ1、２、３又は４)である。
【００１８】
一態様では、本発明は、図１３に記載のＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有する重鎖可変ドメインを含んでなる抗体を提供する。一実施態様では、前記可変ドメインが、図１３に記載のＦＲ１-ＨＣ、ＦＲ２-ＨＣ、ＦＲ３-ＨＣ及び／又はＦＲ４-ＨＣ配列を含有してなる。一実施態様では、前記抗体は、図１３に記載のＦｃ配列及び／又はＣＨ１配列を含有してなる。一実施態様では、本発明の抗体は、図１３に記載のＦＲ１-ＨＣ、ＦＲ２-ＨＣ、ＦＲ３-ＨＣ及び／又はＦＲ４-ＨＣ配列と、ＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有してなる重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、図１３に記載のＦｃ配列及び／又はＣＨ１配列と、ＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有してなる重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、図１３に記載のＦｃ配列及び／又はＣＨ１配列と、図１３に記載のＦＲ１-ＨＣ、ＦＲ２-ＨＣ、ＦＲ３-ＨＣ及び／又はＦＲ４-ＨＣ配列と、ＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有してなる重鎖可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体のＦｃ領域は、図１３に記載のＦｃ配列を含有してなるポリペプチドと図１４に記載のＦｃ配列を含有してなるポリペプチドとの複合体を含んでなる。
一態様では、本発明は、図１３に記載のＨＶＲ１-ＬＣ、ＨＶＲ２-ＬＣ及び／又はＨＶＲ３-ＬＣ配列を含有する軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体を提供する。一実施態様では、前記可変ドメインが、図１３に記載のＦＲ１-ＬＣ、ＦＲ２-ＬＣ、ＦＲ３-ＬＣ及び／又はＦＲ４-ＬＣ配列を含有してなる。一実施態様では、前記抗体は図１３に記載のＣＬ１配列を含有してなる。
【００１９】
一実施態様では、本発明の抗体は、前の２つの段落にて説明したように、軽鎖及び重鎖の可変ドメインを含んでなる。一実施態様では、抗体は一価性で、Ｆｃ領域を含んでなる。一実施態様では、Ｆｃ領域は、少なくとも一つの隆起(小円塊)と少なくとも一つの腔(cavity)(孔)を含んでなり、該隆起と腔があるために、隆起を含有するＦｃポリペプチドと腔を含有するＦｃポリペプチドとの複合体の形成が亢進される。例えば、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載される。一実施態様では、本発明の抗体のＦｃ領域は、第一および第二のＦｃポリペプチドを含んでなり、第一および第二のポリペプチドはそれぞれ野生型ヒトＦｃに関して一又は複数の突然変異を含んでなる。一実施態様では、腔突然変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖである。一実施態様では、隆起突然変異はＴ３６６Ｗである。一実施態様では、第一ポリペプチドは図１３に示すＦｃ配列を含有し、第二ポリペプチドは図１４に示すＦｃ配列を含有する。
【００２０】
本発明のアンタゴニストを用いて、ｃ-ｍｅｔ活性化、下流の分子シグナル伝達(例えば、分裂促進因子活性化型プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)リン酸化)、細胞増殖、細胞移動、細胞生存、細胞形態形成および血管新生を含むがこれに限らず、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ関連効果の一又は複数の態様を調整できる。これらは、ｃ-ｍｅｔに対するリガンド(例えばＨＧＦ)結合の破壊、ｃ-ｍｅｔリン酸化及び／又はｃ-ｍｅｔ多量体化を含め、生物学上関連するメカニズムにより調整されうる。したがって、一実施態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を阻害するｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を提供する。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体はｃ-ｍｅｔ多量体化(例えば二量体化)を崩壊させる。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体はｃ-ｍｅｔセマドメインの二量体化機能を崩壊させる。ある例では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔ二量体化を生じるために、ｃ-ｍｅｔセマドメインの能力を阻害する。干渉は直接的または間接的でもよい。例えば、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔセマドメイン内の配列と結合してもよく、このことによりその結合パートナー(例えば他のｃ-ｍｅｔ分子)と該結合したドメインの相互作用を阻害しうる。他の例では、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔセマドメイン内のものではない配列に結合してもよく、該結合により、その結合パートナー(例えば他のｃ-ｍｅｔ分子)と相互に作用するためのｃ-ｍｅｔセマドメインの能力を破壊してもよい。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔ二量体化が崩壊されるように、ｃ-ｍｅｔ(例えば細胞外ドメイン)と結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔ二量体化をもたらすｃ-ｍｅｔセマドメインの能力が崩壊されるように、ｃ-ｍｅｔと結合する。例えば、一実施態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ分子に対する結合によって、該分子の二量体化を阻害するアンタゴニスト抗体を提供する。一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔセマドメインの配列に特異的に結合する。
【００２１】
一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ホモ二量体化を含むｃ-ｍｅｔ二量体化を破壊する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ヘテロ二量体化(すなわち非ｃ-ｍｅｔ分子とのｃ-ｍｅｔ二量体化)を含むｃ-ｍｅｔ二量体化を破壊する。
場合によって、ｃ-ｍｅｔに対するリガンド(例えばＨＧＦ)の結合を阻害しないｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を有することが有用であるかもしれない。したがって、一実施態様では、本発明はｃ-ｍｅｔ上のＨＧＦ結合部位を結合しない抗体を提供する。他の実施態様では、本発明の抗体はｃ-ｍｅｔに対するＨＧＦ結合を実質的に阻害しない。一実施態様では、本発明の抗体はｃ-ｍｅｔへの結合についてＨＧＦと実質的に競合しない。ある例では、本発明のアンタゴニスト抗体は、一又は複数の他のアンタゴニストと共に用いられてもよく、該アンタゴニストはＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ系統内で異なる方法および／または機能を標的としたものである。ゆえに、一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、他のｃ-ｍｅｔアンタゴニストが結合したエピトープと異なるｃ-ｍｅｔ上のエピトープに結合する(例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)として寄託されるハイブリドーマ細胞株により生産されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片)ことを寄託した。他の実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)として寄託されるハイブリドーマ細胞株により生産されるモノクローナル抗体のＦａｂ断片と異なる(すなわち、そのものではない)。
【００２２】
一実施態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ多量体化およびリガンド結合を破壊するｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を提供する。例えば、ｃ-ｍｅｔ多量体化(例えば二量体化)を阻害する本発明のアンタゴニスト抗体は、ｃ-ｍｅｔへの結合についてＨＧＦと競合する能力を更に含みうる。
本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体の一実施態様では、ｃ-ｍｅｔに対するアンタゴニストの結合は、ＨＧＦによるｃ-ｍｅｔ活性化を阻害する。本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体の他の実施態様では、細胞中のｃ-ｍｅｔに対するアンタゴニストの結合は、細胞の増殖、生存、拡散、形態形成および／または運動性を阻害する。
一実施態様では、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体は、少なくとも一部のｃ-ｍｅｔセマドメイン又はその変異体に特異的に結合する。ある例では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＬＤＡＱＴ(配列番号：１５)(例えばｃ-ｍｅｔの残基２６９−２７３)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(配列番号：１６)(例えばｃ-ｍｅｔの残基３００−３０８)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(配列番号：１７)(例えばｃ-ｍｅｔの残基３５０−３５７)およびＮＶＲＣＬＱＨＦ(配列番号：１８)(例えばｃ-ｍｅｔの残基３８１−３８８)からなる群から選択される配列の少なくとも１を特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＬＤＡＱＴ(例えばｃ-ｍｅｔの残基２６９−２７３)、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ(例えばｃ-ｍｅｔの残基３００−３０８)、ＫＰＤＳＡＥＰＭ(例えばｃ-ｍｅｔの残基３５０−３５７)およびＮＶＲＣＬＱＨＦ(例えばｃ-ｍｅｔの残基３８１-３８８)からなる群から選択される配列の少なくとも１の一部または全体により形成される立体配置的エピトープを特異的に結合する。一実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は配列ＬＤＡＱＴ、ＬＴＥＫＲＫＫＲＳ、ＫＰＤＳＡＥＰＭおよび／またはＮＶＲＣＬＱＨＦと類似性を有するアミノ酸配列を特異的に結合する。
【００２３】
一実施態様では、本発明の抗体は、第一動物種のＨＧＦレセプターと特異的に結合して、第二動物種のＨＧＦレセプターと特異的に結合しない。一実施態様では、第一動物種はヒトおよび／または霊長類(例えばカニクイザル)であり、第二動物種はマウス(例えばマウス)および／またはイヌである。一実施態様では、第一動物種はヒトである。一実施態様では、第一動物種は霊長類、例えばカニクイザルである。一実施態様では、第二動物種はネズミ科、例えばマウスである。一実施態様では、第二動物種はイヌである。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のアンタゴニスト抗体および担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能なものである。
一態様では、本発明は、本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含有してなるベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含有してなる宿主細胞を提供する。ベクターは、任意の種類、例えば発現ベクターなどの組換えベクターであってもよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。
【００２４】
一態様では、本発明は、本発明のアンタゴニストの作製方法を提供する。例えば、本発明は、ｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体(本明細書で定義されるように、その完全長および断片を含む)の作製方法を提供するものであり、該方法は、適切な宿主細胞において、該抗体(またはその断片)をコードする本発明の組み換えベクターを発現させて、該抗体を回収することを含むものである。
一態様では、本発明は、容器と、容器内に具備される組成物とを含む製造品を提供するものであり、該組成物は本発明の一又は複数のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を含んでなるものである。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含んでなる。一実施態様では、アンタゴニスト抗体を含有してなる組成物は担体を更に含み、いくつかの実施態様では、該担体は薬学的に受容可能なものである。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト抗体)を投与するための指示書を更に含む。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体を含有してなる組成物を具備する第一容器と、バッファを具備する第二容器を含むキットを提供する。一実施態様では、前記バッファは薬学的に受容可能なものである。一実施態様では、アンタゴニスト抗体を含有してなる組成物は担体を更に含み、いくつかの実施態様では、該担体は薬学的に受容可能なものである。一実施態様では、キットは、被検体に組成物(例えばアンタゴニスト抗体)を投与するための指示書を更に含む。
【００２５】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の核酸の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性(例えば自己免疫性)疾患及び／又は血管新生関連疾患などの疾患の治療的処置及び／又は予防的処置をするための医薬の製造における本発明のキットの使用を提供する。
【００２６】
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達系統の調節不全が関連する疾患状態を制御するために有用な方法及び組成物を提供する。このＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路は、細胞増殖及び血管形成を含み、多様な生物学的な機能及び生理学的な機能を伴う。したがって、一態様では、本発明は、被検体に本発明の抗体が投与されることを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法であって、細胞又は組織と有効量の本発明のアンタゴニストとを反応させることを含み、それによって、ｃ-ｍｅｔ活性化に関係する細胞増殖が阻害される方法を提供する。
一態様では、本発明は被検体のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全に関与する病理的症状を治療する方法であって、被検体に有効量の本発明の抗体が投与されることを含み、それによって、該症状が治療される方法を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞と本発明の抗体とを反応させ、それによって、該細胞の成長が阻害されることを含む方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、該哺乳動物に有効量の本発明の抗体が投与されることを含み、それによって、該哺乳動物が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００２７】
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の発現又はその活性の亢進が関与する細胞増殖性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような処置を必要とする被検体に有効量の本発明の抗体が投与されることを含み、それによって、該細胞増殖性疾患が有効に治療ないしは予防される方法を提供する。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の成長がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の成長促進効果に少なくともある程度依存している細胞の成長を阻害する方法であって、該細胞と有効量の本発明の抗体とを反応させることを含み、それによって、該細胞の成長が阻害される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
一態様では、本発明は、腫瘍の成長がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方の成長促進効果に少なくともある程度依存している哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法であって、該細胞と有効量の本発明の抗体とを反応させることを含み、それによって、該腫瘍が有効に治療される方法を提供する。一実施態様では、前記細胞は、異なる細胞により発現されるＨＧＦと(例えば、パラ分泌を介して)反応する。
【００２８】
本発明の方法は、任意の好適な病理学的状態、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全が関与する細胞及び／又は組織に効果を示すために用いられうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞(例えば、甲状腺の癌細胞)、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞および白血病細胞からなる群から選択されるものでありうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は過剰増殖性細胞及び／又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は転移性細胞である。
本発明の方法は、さらに後処理工程を含んでもよい。例えば、一実施態様では、方法は、標的とされる細胞及び／又は組織(例えば癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤にさらされる工程を更に含む。
本願明細書において、記述されるように、ｃ-ｍｅｔ活性化は、その調節不全によって、数多くの病的状態が引き起こされる、重要な生物学的工程である。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞(例えば癌細胞)は、同じ組織起源の正常細胞と比較してｃ-ｍｅｔの活性が亢進されているものである。一実施態様では、本発明の方法によって、標的とされる細胞の死が引き起こされる。例えば、本発明のアンタゴニストと反応すると、細胞死となるｃ-ｍｅｔ経路を介するシグナルに対して細胞が不活性となりうる。
【００２９】
例えば、ＨＧＦ(ｃ-ｍｅｔの同系リガンド)及び／又はｃ-ｍｅｔ自体の過剰発現を含め、多くの細胞性変化からｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全が生じうる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子又はその両方が同じ組織起源の正常細胞と比較して、前記細胞(例えば癌細胞)によって、より多く発現される細胞を標的とすることを含んでなる。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は、様々な起源からのＨＧＦによって、すなわち自己分泌又はパラ分泌の方法で調節されうる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞は、異なる細胞において発現される肝細胞増殖因子と(例えば、パラ分泌効果を介して)反応する／結合する。前記の異なる細胞は、同じ又は異なる組織起源のものであってもよい。一実施態様では、標的とされる細胞は、標的細胞自体により発現されるＨＧＦと(例えば、自己分泌効果／ループを介して)反応する／結合する。また、ｃ-ｍｅｔ活性化及び／又はシグナル伝達はリガンドに依存する。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞におけるｃ-ｍｅｔ活性化はリガンドに依存して生じうる。
【００３０】
（発明の実施の形態）
本発明は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路のインヒビターを同定するため及び／又はこのインヒビターを用いるための方法、組成物、キット及び製造品を提供するものである。
これら方法、組成物、キット及び製造品の詳細は本明細書中に示される。
【００３１】
典型的技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第２版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら, 編., 1987, and periodic updates)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)；「Phage Display: A Laboratory Manual」(Barbas 等, 2001)。
【００３２】
定義
本明細書で用いるアミノ酸残基／位置の「修飾」とは、開始アミノ酸配列と比較した場合の初性のアミノ酸配列の変化であって、該アミノ酸残基／位置を伴う配列変異から生じる変化を意味する。例えば、典型的な修飾には、ある残基の(又は該位置での)他のアミノ酸への弛緩(例えば保存的置換又は非保存的置換)、該残基／位置に近接する一又は複数(一般的には５ないし３より少ない)のアミノ酸の挿入、及び該残基／位置の欠損などがある。「アミノ酸置換」又はその変異とは、予定される(開始)アミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置換を意味する。一般的に及び好ましくは、前記修飾によって、開始(又は「野生型」)アミノ酸配列を含有してなるポリペプチドと比較して、変異体ポリペプチドの少なくとも一の物理生化学的な活性に変異が生じる。例えばある抗体の場合、変更された物理生化学的活性は結合親和性、結合能及び／又は標的分子に対する結合効果でありうる。
【００３３】
「単離された」抗体とは、自然環境の成分から同定され及び分離及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるまで、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「Kabatに記載の可変ドメイン残基番号付け」又は「Kabatに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語およびその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばKabatによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」Kabat番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい決定した。
【００３４】
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる句は、当業者が２つの数値(一般的には、本発明の抗体に関連するものと参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％以下、好ましくは約４０％以下、好ましくは約３０％以下、好ましくは約２０％以下、好ましくは約１０％以下である。
一般的に「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【００３５】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、所望の抗体のＦａｂ型（バージョン）とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート（Dynex）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％の（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Prestaら., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する）。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔγ計測器（Packard）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備え���分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００３６】
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、抗体のＦａｂ型（バージョン）と抗原分子を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート（Dynex）を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％の（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(Prestaら., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する）。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達��るまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で１時間インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔγ計測器（Packard）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００３７】
一実施態様では、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。
【００３８】
ここで用いる「実質的に減弱した」、「実質的に異なる」なる句は、当業者が２つの数値(一般的には、本発明の抗体に関連するものと参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値、ＨＡＭＡ応答)によって測定される生物学的性質の上で統計学的に有意であると差異を認める程度に、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約１０％以上、好ましくは約２０％以上、好ましくは約３０％以上、好ましくは約４０％以上、好ましくは約５０％以上である。
【００３９】
ペプチド又はポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のペプチド又はポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表Ａに示される配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表Ａに示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の図８に示されるソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００４０】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られたものである。
【００４１】
表Ａ
2008508880.tif 000003
2008508880.tif 000004
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【００４２】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００４３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００４４】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
本願明細書において用いられるように、「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を起こす条件下においてこの経路を活性化しうる任意の（天然／天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ）天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体（例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体）及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００４５】
「抗体断片」は、無傷の抗体の部分のみを含有するものであり、該部分は完全な抗体中に存在する場合、その部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体の抗原結合部位を含有するため、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片、例えばＦｃ領域を含有するものは、完全抗体に存在するＦｃ領域が通常関連する少なくとも一の生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全抗体と実質的に同じインビボ半減期を有する一価抗体である。例えばそのような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を供与しうるＦｃ配列に結合した抗原結合アーム上に含みうる。一実施態様では、本発明の抗体は、国際公開公報２００５／０６３８１６に記載の一アーム形抗体である。例えば、孔(hole)突然変異は、Ｆｃポリペプチド内のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数であり、腔(cavity)突然変異はＴ３６６Ｗでありうる。
【００４６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
【００４７】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００４８】
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物又は合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。本願明細書において、目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５つのみ、好ましくは４つ以下、又は３つ以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈおよび７８Ｈの３つ、２つ又は１つのみである、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔおよび／または７８Ａであってもよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
【００４９】
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部又は配列の全てを含んでなる：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ(配列番号：４２)-Ｈ１-ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ(配列番号：４３)-Ｈ２-ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ(配列番号：４４)Ｈ３-ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：４５)。
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列の各々の少なくとも一部又は配列の全てを含んでなる：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：４６)-Ｌ１-ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ(配列番号：４７)-Ｌ２-ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：４８)Ｌ３-ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：４９)。
「非修飾ヒトフレームワーク」は、アクセプターヒトフレームワーク、例えばアクセプターヒトフレームワーク中の非ヒトアミノ酸置換(一又は複数)に対して欠如しているヒトフレームワークと同じアミノ酸配列を有するヒトフレームワークである。
本明細書中の「変更された高頻度可変領域」は、その中に一又は複数(例えば１から約１６)のアミノ酸置換(一又は複数)を含有する高頻度可変領域である。
本願明細書中の「非修飾高頻度可変領域」は、それが得られた非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する高頻度可変領域、すなわち一又は複数のアミノ酸置換がないものである。
【００５０】
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変しているおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。各々のこれらの高頻度可変領域の残基を以下に示す。
ループ    Kabat         ＡｂＭ        Chothia         接触
L1        L24-L34      L24-L34      L26-L32        L30-L36
L2        L50-L56      L50-L56      L50-L52        L46-L55
L3        L89-L97      L89-L97      L91-L96        L89-L96
H1        H31-H35B     H26-H35B     H26-H32        H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1        H31-H35      H26-H35      H26-H32        H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2        H50-H65      H50-H58      H53-H55        H47-H58
H3        H95-H102     H95-H102     H96-H101       H93-H101 
【００５１】
高頻度可変領域は、以下の「伸展した高頻度可変領域」を含有してもよい：ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)および８９−９７(Ｌ３)およびＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)および９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２(Ｈ３)。可変ドメイン残基は、各々のこれらの定義にあるように上掲のKabat 等に従って番号を付けた。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００５２】
「ブロッキング(ブロック)抗体」又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか、減弱するものである。好適なブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にないしは完全に阻害する。
本明細書中で用いられる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を擬態する抗体である。
「疾病」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ球性悪性腫瘍；神経系、神経膠系、星状性、視床下部系及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胚盤胞性疾患；及び炎症性、免疫性及び他の血管形成性関連疾患が含まれる。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００５３】
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌、並びに様々な頭頸部の癌が含まれる。
【００５４】
血管形成調節不全により、本発明の組成物及び方法によって治療される多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性又は腫瘍性症状の両方が含まれる。腫瘍性のものは上記に記載のものに限らない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬の斑、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性斑、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、虹彩(angle)（ルベオーシス）の血管新生、眼性新生血管疾患、脈管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブズ病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関連している）、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化、高親和性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣の疾患、子宮内膜症、液体性疾患の第３の間隔(3rd spacing)（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長（癌以外）、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の抑制、Ｏｓｌｅｒ-Ｗｅｂｅｒ症候群、化膿性肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、脈管粘着力、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（例えば心外膜炎と関連しているもの）および胸水が含まれる。
【００５５】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の抗体の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び個体の体重、並びに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力のような因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は抗体の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００５６】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００５７】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（HYCAMTIN（登録商標）、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィ��マイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine) （ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録��標））；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)（XELODA（登録商標）；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン（ELOXATINTM）を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００５８】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、EVISTA（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ERD）；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えばLUPRON（登録商標）及びELIGARD（登録商標）酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばBONEFOS（登録商標）又はOSTAC（登録商標））、DIDROCAL（登録商標）エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX（登録商標）アレンドロネート、AREDIA（登録商標）パミドロン酸、SKELID（登録商標）チルドロン酸、又はACTONEL（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（EGF-R）；THERATOPE（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００５９】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性化に依存する成長を有する細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ依存性細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００６０】
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損を示す変異体抗体の生成
ＨＡＭＡ応答の減弱又は欠損は、適切な治療薬の臨床開発の重要な態様である。例として、Khaxzaeli 等, J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937、Jaffers 等, Transplantation (1986), 41:572、Shawler 等, J. Immunol. (1985), 135:1530、Sears 等, J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138、Miller 等, Blood (1983), 62:988、Hakimi 等, J. Immunol. (1991), 147:1352、Reichmann 等, Nature (1988), 332:323、Junghans 等, Cancer Res. (1990), 50:1495を参照。本願明細書において、記述されるように、本発明はＨＡＭＡ応答が減弱されるかまたは欠損されるように、ヒト化された抗体を提供する。これらの抗体の変異体は、当分野で公知の慣例的な方法を使用して、さらに得られてもよい。その方法のいくつかを後述する。
例えば、本願明細書において、記述されるように、抗体のアミノ酸配列はフレームワークおよび／または高頻度可変配列(一又は複数)を多様化させるために開始(親)配列として働きうる。開始高頻度可変配列が連結される選択されたフレームワーク配列は、本明細書において、アクセプターヒトフレームワークと称する。アクセプタヒトフレームワークがヒト免疫グロブリン(そのＶＬおよび／またはＶＨ領域)のものかあるいはそれに由来するものである一方で、そのようなフレームワークがヒト患者において、ごく小さい免疫原性、あるいは全く免疫原性を示さないことが証明されているので、アクセプターヒトフレームワークはヒトコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものである。
【００６１】
アクセプターがヒト免疫グロブリンから得られる場合、場合によっては、ドナーフレームワーク配列を一まとまりのヒトフレームワーク配列の様々なヒトフレームワーク配列に合わせることによって、ドナーフレームワーク配列に対するその相同性に基づいて選択されるヒトフレームワーク配列を選択してもよく、アクセプターとして最も相同性のあるフレームワーク配列を選択してもよい。
一実施態様では、本願明細書中のヒトコンセンサスフレームワークは、ＶＨサブグループIIIおよび／またはＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク配列のものかあるいはそれに由来するものである。
ゆえに、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ(配列番号：４２)を含有してなるＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ(配列番号：４３)を含有してなるＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＸ1ＤＸ２ＳＫＮＴＸ３ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ(配列番号：５０)を含有してなるＦＲ３を含んでなるＦＲ３、この場合、Ｘ１はＡ又はＲであり、Ｘ２はＴ又はＮであり、Ｘ３はＡ又はＬである、
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：４５)を含有してなるＦＲ４。
【００６２】
ＶＨコンセンサスフレームワークの例として：
ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：１９)
ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２０−２２)
ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２３)
ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２４−２６)
ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２７)
ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２８−３０)
ヒトＶＨアクセプターフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３１)
ヒトＶＨアクセプターフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３２−３３)
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３４)又は
ヒトＶＨアクセプター２フレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３５−３７)
などが含まれる。
【００６３】
一実施態様では、ＶＨアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ(配列番号：４２)を含有してなるＦＲ１、
ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ(配列番号：４３)を含有してなるＦＲ２、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ(配列番号：５１)、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ(配列番号：５２)、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ(配列番号：５３)、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳ(配列番号：５４)、または、
ＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲ(配列番号：５５)、を含有してなるＦＲ３
ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：４５)を含有してなるＦＲ４。
【００６４】
ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、１、２、３又は以下のすべてのフレームワーク配列を含有してなってもよい：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：４６)を含有してなるＦＲ１、
ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ(配列番号：４７)を含有してなるＦＲ２、
ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：４８)を含有してなるＦＲ３、
ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：４９)を含有してなるＦＲ４。
ＶＬコンセンサスフレームワークの例として：
ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３８)、
ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク(配列番号：３９)、
ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク(配列番号：４０)、または、ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク(配列番号：４１)がある。
【００６５】
アクセプターが選択されたヒトフレームワーク配列と配列において同一でもよい一方で、ヒト免疫グロブリン又はヒトコンセンサスフレームワークからのものか否かにかかわらず、本発明は、アクセプター配列がヒト免疫グロブリン配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に関して既存のアミノ酸置換を含有してもよいことを意図する。これらの既存の置換は最小限、通常、ヒト免疫グロブリン配列又はコンセンサスのみに関して４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸の相違であることが好ましい。
非ヒト抗体の高頻度可変領域残基は、ＶＬおよび／またはＶＨアクセプターヒトフレームワークに組み込まれる。例えば、カバットＣＤＲ残基、Ｃｈｏｔｈｉａ高頻度可変性ループ残基、Ａｂｍ残基および／または接触残基に対応する残基を取り込んでもよい。場合によって、以下のような伸展した高頻度可変領域残基が組み込まれる：２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)および８９−９７(Ｌ３)、２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)および９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２(Ｈ３)。
【００６６】
高頻度可変領域残基の「取込み」が本願明細書において述べられる場合、周知のように、所望のアミノ酸配列をコードする核酸は、例えば、そのフレームワーク残基がアクセプターヒトフレームワーク残基に変化するようにマウス可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、高頻度可変ドメイン残基が非ヒト残基に変化するようにヒト可変ドメイン配列をコードする核酸を変異させることによって、又は所望の配列をコードする核酸を合成することによってなどして生成できる。
本願明細書中の実施例では、高頻度可変領域融合変異体は、各々の高頻度可変領域の異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトアクセプター配列をコードする核酸のキュンケル突然変異誘発により生成された。Kunkel 等, Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)。慣例的な技術を用いてフレームワークおよび／または高頻度可変領域の中に適当な変異を導入して、厳密な高頻度可変領域-抗原相互作用を修正して、再確立できる。
ファージ(ファジミド)ディスプレイ(また本明細書中ではファージディスプレイとも称する)は、配列のランダム化により生成されたライブラリ中の多くの異なる潜在的な変異体抗体を生成してスクリーニングをするための簡便で迅速な方法として用いることができる。しかしながら、変更された抗体の他の作製方法およびスクリーニング方法は、当業者に有用である。
【００６７】
ファージ(ファジミド)ディスプレイ技術は、抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成して選別するための強力なツールを提供している。ファージ(ファジミド)ディスプレイ技術を用いると、高い親和性で標的分子と結合する配列について迅速に選別できるタンパク質変異体の大きなライブラリを生成できる。変異体ポリペプチドをコードする核酸は、通常、遺伝子IIIタンパク質又は遺伝子VIIIタンパク質などのウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列に融合する。タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列が遺伝子IIIタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合されている一価性ファジミドディスプレイシステムが開発されている。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)、 Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価性ファジミドディスプレイシステムにおいて、遺伝子融合は低レベルで発現され、粒子の感染力が保持されるように野生型遺伝子IIIタンパク質も発現される。ペプチドライブラリを生成する方法およびそれらのライブラリのスクリーニング方法は、多くの特許に開示されている(例えば米国特許第５,７２３,２８６号、同第５,４３２号、０１８、同第５,５８０,７１７号、同第５,４２７,９０８号および同第５,４９８,５３０号)。
抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入することによって、単一遺伝子を変更すること、または、関連した遺伝子のファミリをクローニングすることなどを含む、多くの方法により調製されている。ファージ(ファジミド)ディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片のディスプレイ方法は、米国特許第５，７５０，３７３号、同第５，７３３，７４３号、同第５，８３７，２４２号、同第５，９６９，１０８号、同第６，１７２，１９７号、同第５，５８０，７１７号および同第５，６５８，７２７号に記述されている。次いでライブラリは、抗体の又は所望の特徴を有する抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングされる。
【００６８】
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用して高頻度可変領域残基を置換することができる。例えば、Kunkel他, Methods Enzymol.(1987), 154:367-382頁を参照。
オリゴヌクレオチド配列は、変更する高頻度可変領域残基の一又は複数の設定したコドンを含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、ＩＵＢコードによって下で示すように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を示すために符号を使って表される。
【００６９】
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）
【００７０】
例えば、コドンセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡまたはＧまたはＴであり、ＶはＡまたはＧまたはＣであり；ＫはＧまたはＴである。このコドンセットは１８の異なるコドンがあり、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ及びＣｙｓをコードする。
オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、制限コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを代表し、所望の制限されたアミノ酸群をコードする配列を含む固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメインの核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００７１】
１つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、４Ｄ５の抗体可変ドメインなどのソースまたは鋳型ポリペプチドをコードしている核酸配列のオリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はZoller他, Nucleic Acids Res.10:6487-6504頁(1987)が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は所望の制限コドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変部核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の二次相補鎖すべてを合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供される制限コドンセットを含むようになる。他のソースまたは鋳型分子をコードしている核酸は公知であるか、または容易に決定することができる。
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチドの両側が鋳型と完全に相補性である少なくとも１２から１５個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばCrea他, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA, 75:5765頁(1978)に記載の手法を使って容易に合成される。
【００７２】
ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当）に由来するベクター、またはViera他, Meth.Enzymol.153:3頁(1987)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
未変性のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡ重合酵素、通常、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの１つの鎖は遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元の鋳型）は遺伝子１の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２リン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
【００７３】
この上で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは適当な他のヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使って形成される。このホモ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
【００７４】
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、またはViera他((1987), Meth.Enzymol.153:3頁)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
他の方法によると、ライブラリーは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持つ。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ＰＣＲ産物の「ライブラリー」を作製するためにＰＣＲ法で使うことができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質構成成分および二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
【００７５】
ＰＣＲプライマー配列は、ＣＤＲ領域の溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計されたコドンセットの１つまたは複数を含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
好適なスクリーニング／選別工程を介して選択されるので、所望の基準を満たす抗体選択物を単離して、標準的な組み換え技術を用いてクローニングすることができる。
【００７６】
（ベクター、宿主細胞及び組換え方法）
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物）由来の細胞である。
【００７７】
（原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成）
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能（異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方）及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【００７８】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン（翻訳単位）対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５'）に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【００７９】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター）も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる（Siebenlist等 (1980) Cell 20:269）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる（つまりシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【００８０】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する（例として大腸菌ｔｒｘＢ−系）。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明は、発現されるポリペプチド成分の量的割合を本発明の抗体の分泌及び好適な集積効率が最大となるように調節することができる発現系を提供する。ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくともある程度その調節が達成される。
【００８１】
翻訳強度を調節する一つの方法は、Simmons等の米国特許第５８４０５２３号に開示されている。このアプローチはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。与えられたＴＩＲに対して、ある範囲の翻訳強さを持つ一群のアミノ酸又は核酸配列変異体をつくり出すことができ、それによって、所望の発現レベルの特異的鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供する。ＴＩＲ変異体はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な突然変異誘発法によって産生することができるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（つまり変化がサイレントである）コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる；加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この突然変異誘発の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
好ましくは、そこの各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強さを有する一群のベクターが産生される。この制限された群は各鎖の発現レベルと様々なＴＩＲ強さの組合せ下で所望の抗体産物の収量の比較をもたらす。ＴＩＲ強さはSimmons等の米国特許第５８４０５２３号に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定することができる。翻訳強度を比較することによって、所望の個々のＴＩＲｓが選択されて、本発明の発現ベクターコンストラクト中で組み合わされる。
【００８２】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【００８３】
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地（ＬＢ）プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【００８４】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照）。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【００８５】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【００８６】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【００８７】
発現された異種タンパク質（特にタンパク分解を受けやすいもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【００８８】
抗体精製
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【００８９】
（真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成）
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【００９０】
（ｉｉ）複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【００９１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６）。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【００９２】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００９３】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００９４】
（ｖｉ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【００９５】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【００９６】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００９７】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【００９８】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 1567 1575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【００９９】
活性のアッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
【０１００】
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes ら. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro ら., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法、例えば実施例の項目で示す方法を用いて行うことができる。
【０１０１】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１０２】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１０３】
抗体変異体
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び／又は促進される。この修飾は、第一Ｆｃポリペプチド内への隆起と第二Ｆｃポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
【０１０４】
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体ないし細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表２に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
【０１０５】
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【０１０６】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの（非保存的）部位内に置換された残基を導入してもよい。
【０１０７】
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１０８】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、国際公開公報９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を変更する（すなわち改良又は減少する）結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及びWO94/29351を参照。
【０１０９】
免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１１０】
ゼバリン(ZEVALIN)（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１１１】
このような免疫複合体（免疫コンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１１２】
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１１３】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１１４】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１１５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１１６】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１１７】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１１８】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１１９】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【０１２０】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(１)共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(２)共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            Ｉ
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
【０１２１】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(ｉ)活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物）；(ｉｉ)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(ｉｉｉ)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
【０１２２】
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１２３】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１２４】
医薬製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２５】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１２６】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１２７】
使用
例えば、本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック（遮断）するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物（例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス）の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。抗原はヒトタンパク質分子であることが好ましい。
一実施態様において、本発明の抗体を抗原活性が有害である疾患に罹患している対象体の抗原を阻害する方法に用いることができ、その方法は対象体の抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を対象体に投与することを含む。好ましくは、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象体は患者である。あるいは、対象体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物でありうる。また更に、対象体は、抗原が導入された哺乳動物でありえる（例えば、抗原の投与や、抗原導入遺伝子の発現による）。本発明の抗体は、治療的目的のために患者に投与することができる。さらに、本発明の抗体は、免疫グロブリンが獣医学の分野で、又はヒト疾患の動物モデルとして交差反応する抗原を発現する人間以外の哺乳動物（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性（例えば用量のテストおよび投与の時間経過）を評価するために有効であるかもしれない。治療的に有効である本発明の遮断抗体には、例えば、限定するものではなく、抗ＨＥＲ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロン、抗インターフェロンレセプタ、抗肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、抗ｃ-ｍｅｔおよび抗組織因子抗体が含まれる。本発明の抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び／又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防／遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患；及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
【０１２８】
一態様では、本発明の遮断抗体はリガンド抗原に特異的で、リガンド抗原を伴うリガンド-レセプタ相互作用をブロックするかまたは妨げることによって、対応するシグナル経路および他の分子又は細胞性の現象を阻害することによって抗原活性を阻害する。また、本発明は必ずしもリガンド結合を阻害するというわけではなくて、レセプター活性化を妨ぐレセプター特異的な抗体を特徴とし、それによって通常リガンド結合によって開始する任意の応答を阻害する。また、本発明は、好ましくは又は排他的にリガンド-レセプター複合体と結合する抗体を包含する。また、本発明の抗体は、特定の抗原レセプターのアゴニストとして作用し、それによって、リガンド媒介性のレセプター活性の活性化を完全に又は部分的に潜在化、亢進又は活性化する。
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。ある実施態様では、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤（例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０１２９】
本発明の抗体は、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤（一又は複数）（化学療法剤の混合を含む）、他の細胞障害性剤（一又は複数）、抗血管形成剤（一又は複数）、サイトカインおよび／または増殖阻害性剤（一又は複数）と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一つ以上の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。例えば、本発明の抗体は、処置、例えば結腸直腸癌、転移性乳癌および腎臓癌を含む本明細書中に記載の何れかの疾患の治療に、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばアバスチン）及び／又は抗ＥｒｂＢ抗体（例えばハーセプチン（登録商標）抗ＨＥＲ2抗体）を組み合わせてもよい。あるいは又は加えて、放射線療法（例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療）を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与（２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される）及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療（一又は複数）の前及び／又はその後に投与することができる。
本発明の抗体（及び補助治療薬）は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
【０１３０】
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は（単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合）、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を（又はそれらを組み合わせて）患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい（例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される）。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０１３１】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１３２】
一般的に本発明を記載したものであって、同様に、限定を意図するのではなく例としてあげる以下の実施例を参照することによって容易に理解しうるであろう。
【実施例】
【０１３３】
材料および方法
残基番号はカバットに従う(Kabat 等, Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。一文字アミノ酸表記を用いる。ＤＮＡ縮重はＩＵＢコードを用いて表す(Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ)。
【０１３４】
アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク上への直接高頻度可変領域の融合
基本的にはLee 等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93にて説明されるように、この実施例に使用するファジミドは、ｐｈｏＡプロモータの制御下に２つのオープンリーディングフレームを有する一価性Ｆａｂ-ｇ３ディスプレイベクター(ｐＶ０３５０-２Ｂ)である。第一オープンリーディングフレームはＶＬに融合するｓｔＩＩシグナル配列およびＣＨ１ドメインアクセプター軽鎖から成り、第二オープンリーディングフレームはＶＨに融合するｓｔＩＩシグナル配列およびアクセプター重鎖のＣＨ１ドメインとその後に続く切断型微量ファージコートタンパク質Ｐ３から成る。上記のLee 等を参照。
マウスの５Ｄ５(１９９５年５月２３日寄託のハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-１１８９５を参照)のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ヒトコンセンサスκI(ｈｕＫＩ)およびヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨ(ｈｕIII)ドメインと整列配置した。ＨＶＲ移植片を作るために、３つの位置：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ａ (Carter 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992))がヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨドメインと異なるアクセプターＶＨフレームワークを用いた。マウスの５Ｄ５(ｍｕ５Ｄ５)抗体の高頻度可変領域は、５Ｄ５の直接のＨＶＲ-移植片(５Ｄ５移植片)を生成するために、アクセプターヒトコンセンサスフレームワーク内に操作した。ＶＬドメインでは、以下の領域をヒトコンセンサスアクセプターに融合した：位置２４-３４(Ｌ１)、５０-５６(Ｌ２)および８９-９７(Ｌ３)。ＶＨドメインでは、位置２６-３５(Ｈ１)、４９-６５(Ｈ２)および９５-１０２(Ｈ３)を融合した(図１)。
直接の移植片変異体は、各々の高頻度可変領域の異なるオリゴヌクレオチドを用いたキュンケル突然変異誘発法によって生成した。適切なクローンをＤＮＡ塩基配列決定によって、評価した。
【０１３５】
高頻度可変領域の穏やかなランダム化(Soft randomization)−
配列多様性は、マウスの高頻度可変領域配列に対するバイアスを維持する穏やかなランダム化法を用いて、各々の高頻度可変領域に導入した。これは、Gallop 等, J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994)に記述されるように、毒性オリゴヌクレオチド合成法を用いて行った。変異させる高頻度可変領域内の位置を特定するために、野生型アミノ酸をコードするコドンの各々の位置に、平均５０パーセントの突然変異率となるようにヌクレオチドの７０-１０-１０-１０混合物にて毒性を与えた。
穏やかにランダム化されたオリゴヌクレオチドを、マウスの高頻度可変領域配列に従って作製し、直接的な高頻度可変領域移植片によって、定められる同じ領域を包含させた。ＶＨドメインのＨ２の初めのアミノ酸位(位置４９)は、コドンＲＧＣを用いてＡ、Ｇ、Ｓ又はＴに配列多様性を限定した。
【０１３６】
ファージライブラリの生成−
各々の高頻度可変領域について設定したランダム化オリゴヌクレオチドプールを、６６０ｎｇのオリゴヌクレオチド、５０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび、５Ｕポリヌクレオチドキナーゼを含む２０μｌの６つの反応溶液中で、３７℃で１時間によって別々にリン酸化した。次いで、６つのリン酸化オリゴヌクレオチドプールを、オリゴヌクレオチド対鋳型比が３となるように、２０μｇのキュンケル鋳型と、終容量５００μｌの５０ｍＭ トリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２中で混合させた。混合物を９０℃で４分間、５０℃で５分間アニールさせ、氷上で冷ました。過剰な、アニールされていないオリゴヌクレオチドは、アニールされたＤＮＡの過剰な変性を避けるために変更したプロトコールを用いてＱＩＡＱＵＩＣＫ  ＰＣＲ精製キット(Qiagenキット２８１０６)により除去した。５００μｌのアニールされた混合物に、１５０μｌのＰＢを添加し、混合物を２つの二酸化ケイ素カラムに分割した。それぞれのカラムを７５０μｌのＰＥで洗浄し、カラムを乾燥させるために余計に回転させた後、各々のカラムを、１１０μｌの１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８にて溶出した。次いで、アニールして精製した鋳型(２２０μｌ)を、１μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、１０μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰｓ(各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ)、１５μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ、２５μｌの１０×ＴＭバッファ(０．５Ｍ トリスｐＨ７.５、０.１Ｍ ＭｇＣｌ２)、２４００ＵのＴ４リガーゼ、および３０ＵのＴ７ポリメラーゼを充填して、室温で３時間置いた。
【０１３７】
充填した生成物を、トリス-酢酸塩-ＥＤＴＡ／アガロースゲルにて分析した(Sidhu 等, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000))。３つのバンドが正常に観察された：下部バンドは正常に充填されてライゲーションされた生成物であり、真ん中のバンドは充填されたがライゲーションされなかった生成物であり、上部バンドは鎖置換された生成物である。上部バンドは、Ｔ７ポリメラーゼの内因性の副活性により生産されるものであり、避けるのは難しい(Lechner 等, J. Biol. Chem. 258:11174-11184 (1983))、しかしながら、このバンドは、下部バンドの３０分の一より低い効率で形質転換するもので、通常ライブラリにほとんど関与しない。真ん中のバンドは、最終ライゲーション反応のためのリン酸塩がないことによる、このバンドは効率よく形質転換するものであり、主に野生型配列を示す。
Sidhu 等, Methods in Enzymology 328:333-363 (2000)に記述されるように、充填された生成物を精製し、ＳＳ３２０細胞に電気穿孔して、Ｍ１３／ＫＯ７ヘルパーファージ存在下にて広げた。ライブラリサイズは、１− ２×１０９の独立クローン の範囲とした。最初のライブラリからのランダムなクローンを配列決定して、ライブラリの質を評価した。
【０１３８】
ファージ選別−
ヒトＨＧＦレセプターを生成して、Ｆｃ融合(ＨＧＦＲ-Ｆｃ)として用いた (Mark 等, J. Biol. Chem. (1992), 267:26166-26171)。５μｇ／ｍｌのＨＧＦＲ-Ｆｃを含むＰＢＳにてＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート(Nunc)上をコートした。最初の選別ラウンドでは、標的として８ウェルを用いた、標的の単一ウェルを選別の連続ラウンドに用いた。ウェルを、カゼインブロッカー(Pierce)を用いて１時間、反応を停止した。ファージを培養液上清から回収し、１％ＢＳＡおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＢＴ)に懸濁した。２時間、ウェルに結合させた後、結合していないファージは、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)にて余計に洗浄することによって、除去した。結合したファージは、５０ｍＭ ＨＣｌ、０．５Ｍ ＫＣｌにて３０分間インキュベートすることによって、溶出させた。ファージは、Ｔｏｐ10細胞およびＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを用いて増幅させ、２ＹＴ、５０μｇ／ｍｌカルバネシリン(carbanecillin)中で終夜、３７℃生育させた。標的のコートしたウェルから溶出されるファージの力価は、非標的のコートウェルから回収したファージの力価と比較して、濃縮を評価した。
【０１３９】
親和性成熟について、ファージライブラリを溶液分類法を用いて分類した。ＨＦＧＲ-Ｆｃは、５００μｌの３．６ｍｇ／ｍｌ ＨＧＦＲ-Ｆｃを含むＰＢＳと１０μｌの１Ｍ リン酸カリウム, ｐＨ８を２０μlの４ｍＭ スルホ-ＮＨＳ-ＬＣ-ビオチン(Pierce)と混合することによって、ビオチン化した。ビオチン化されたＨＧＦＲ-Ｆｃ(ｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃ)を、ＰＢＳのＮＡＰ５カラム(Amersham Biosciences)を用いて精製した。マイクロタイタウェルを、１０μｇ／ｍｌニュートラビジンにて終夜、４℃でコートして、カゼインブロッカー(Pierce)を用いて１時間反応を止めた。最初のパニングでは、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ(ＰＢＳＴ)に懸濁した２００μｌのファージを、１０ｎＭ ｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃと１時間混合した。ｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃに結合したファージは１０分間でニュートラアビジンコートウェルに捕獲され、結合していないファージはＰＢＳＴによって、洗い流した。ファージは、２０ｍＭ ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌを用いて４５分間溶出し、中和して、ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs)の存在下にてＸＬ1ブルー細胞(Stratagene)中で増殖させた。その後の分類ラウンドは、以下を除き、同様に行った：ラウンド２での最終的なｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃ濃度は５．６ｎＭ、ラウンド３での最終的なｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃ濃度は０．１ｎＭ、ラウンド４での最終的なｂ-ＨＧＦＲ-Ｆｃ濃度は０．５ｎＭであり、７８０ｎＭの非ビオチン化ＨＧＦＲ-Ｆｃをニュートラビジン上の捕獲の１時間前に混合物に添加した。
【０１４０】
ファージＥＬＩＳＡ−
ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのヒトＨＧＦＲ-Ｆｃを含有するＰＢＳにて終夜コートして、カゼインブロッカーにて反応を停止させた。８０μｌの混合物を標的コートウェルに１５分間移して結合しなかったファージを捕獲した後、培養物上清からのファージを組織培養マイクロタイタープレート中で、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて段階的に希釈したＨＧＦＲ-Ｆｃとともにインキュベートした。プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３(Amersham Pharmacia Biotech)を添加して４０分間置いた(１％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにて１:５０００)。プレートをＰＢＳＴにて洗浄して、テトラメチルベンジジン基質(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加して反応させた。４０５ｎｍの吸光度を溶液の標的濃度の関数としてプロットして、ＩＣ５０を測定した。これは、ファージの表面上に表出されるＦａｂクローンの親和性評価として用いた。
【０１４１】
Ｆａｂ産生および親和性決定−
親和性測定のためにＦａｂタンパク質を発現させるため、停止コドンを、ファージディスプレイベクターの重鎖とｇ３の間に導入した。クローンを大腸菌３４Ｂ８細胞内に形質移入して、ＡＰ５培地にて３０℃で生育させた (Presta 等 Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997))。細胞を遠心分離によって、回収して、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ  ｐＨ８に懸濁して、マイクロフルイダイザーを用いて破壊した。ＦａｂはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィにて精製した。
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００を用いた表面プラスモン共鳴によって、親和性分析を行った。ＨＧＦＲ-Ｆｃは、ＣＭ５チップに固定し(〜１０００応答単位(ＲＵ))、ＰＢＳＴ中の様々な濃度のＦａｂ(４〜５００ｎＭ)を注入した。各々の注入の後、チップを１００ｍＭ ＨＣｌを用いて再生成した。結合応答は、ＲＵを空のフローセルから減算することによって、補正した。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１Ｌａｎｇｕｉｒモデルを動態分析のために用いた。
【０１４２】
ＨＧＦ／ｃＭｅｔ結合のＯＡ５Ｄ５ブロックについての電子化学発光アッセイ
Genentech (South San Francisco, CA)で産生される精製されたｃＭｅｔ-Ｉｇタンパク質を、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を用いて、２０倍過剰モルのＮＨＳ-Ｘ-ビオチンとともに０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５中でインキュベートすることによって、ビオチン化した。ジェネンテクで産生される精製されたヒト２-鎖ＨＧＦは、製造業者の指示(BioVeris International, Gaithersburg, MD)に従ってＮＨＳ-エステル化学を介してＢＶ-ＴＡＧ(ｃａｔ＃１１００３４)にて標識した。ｃＭｅｔ-Ｉｇ-ビオチン(５００ｎｇ／ｍＬ)、ＨＧＦ-ルテニウムＴａｇ(２５０ｎｇ／ｍＬ)および、３３３３−０．２１ｎＭの範囲の抗体力価のＯＡ５Ｄ5抗体を、１００ｕｌ容量のアッセイ希釈液：ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．０３３％プロクリン(Supelco Inc. Bellefonte PA)中で共にインキュベートした。混合物を密閉したポリプロピレン丸底９６ウェルプレート(Corning)にて、室温で２−４時間、振とうしながらインキュベートした。ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads, BioVeris)を添加した。激しく振盪しながら最終的に４５分間インキュベートした後、プレートは、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍシリーズ計測器(BioVeris International, Gaithersburg, MD)を用いて読み取った。
【０１４３】
ＫＩＲＡ(ＨＧＦ依存性Ｍｅｔリン酸化)
Ａ５４９細胞(ATCC, Manassas, VA)を成長培地(１０％ウシ胎児血清(FBS, Sigma, St. Louis, MO)を含有するHamのＦ１２／ＤＭＥＭ ５０:５０[Gibco, Grand Island, NY])中で維持した。アッセイのための細胞を調製するために、集密的な培養物から回収した細胞を、アキュターゼ(ICN, Aurora, OH)を用いて剥離し、１ウェル当たり５００００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。３７℃で終夜インキュベートした後、成長培地を取り除き、細胞を０．１％ＦＢＳを含有する培養液中で３０−６０分間血清飢餓状態とした。ｃＭｅｔリン酸化を阻害するためのＯＡ-５Ｄ５の能力を決定するために、前記分子を、培地＋０．１％ＦＢＳ中で２００から０．１９ｎＭまで段階的に希釈して、アッセイプレートに加えた。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ＨＧＦ(５０ｎｇ／ｍｌ)を添加した。次いで、プレートを更に１０分間、３７℃でインキュベートして、培地を除去し、細胞溶解バッファを添加した(Cell Signaling Technologies, Cat # 9803, Beverly, MA、Calbiochem, Cat #539131, San Diego, CAから市販のプロテアーゼインヒビター反応混液を添加したもの)。溶解物は、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍシリーズ計測器(BioVeris International, Gaithersburg, MD)を用いた電気化学ルミネセンスアッセイにて、リン酸化ｃ-Ｍｅｔについて分析した。抗ホスホチロシンｍＡｂ(クローン４Ｇ１０、Upstate, Lake Placid, MY)を、製造業者の指示(BioVeris)に従ってＮＨＳ-エステル化学を介するＢＶ-ＴＡＧにて標識した。ｃ-Ｍｅｔ細胞外ドメインに対する抗体を、ビオチン-Ｘ-ＮＨＳ (Research Organics, Cleveland, OH)を用いてビオチン化した。ＢＶ-ＴＡＧ-標識４Ｇ１０およびビオチン化抗ｃ-Ｍｅｔ ｍＡｂをアッセイバッファ(ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ)にて希釈して、細胞溶解物に混合液として添加した。室温で１．５−２時間、激しく振とうしながらインキュベートした後、ストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads, BioVeris)を添加した。最終的に４５分間インキュベートした後、プレートをＢｉｏＶｅｒｉｓ計測器にて読み込んだ。
【０１４４】
細胞培養および増殖アッセイ
ＢａＦ３は、通常ｃＭｅｔを発現せずＨＧＦに反応しないマウスのＩＬ-３依存性リンパ系細胞である。しかしながら、ヒトｃ-Ｍｅｔ(Schwall et al., J.Cell Biol. (1996), 133:709-718)の正常な、完全長ｃＤＮＡの形質移入によって、得られるＢａＦ３-ｈＭｅｔにおいて、ＨＧＦは、ＩＬ-３の非存在下で増殖および生存を促進する。ＢａＦ３-ｈＭｅｔおよびＢａＦ３ネオ細胞は、通常通り、ＲＰＭＩ１６４０、５％ウシ胎児血清、４μｌ／Ｌのβ-メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ-グルタミンおよび、ＩＬ-３の供与源として５％のＷＥＨＩ調整培養液中で継代した。ＨＧＦ依存性増殖を測定するために、処理後３日の細胞の数を、２５μｌのアラマブルー (Trek Diagnostic Systems、 Cleveland, OH)を加えて６時間後の蛍光強度を測定することによって、数量化した。対照実験は、ＨＧＦの非存在下での細胞の増殖とした。Ｈ３５８-ＰＳＦ２およびＨＧＦ-ＰＳＦ８細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ-グルタミン中で継代した。アッセイ培養液は、ＲＰＭＩ１６４０にそれぞれ０．１％、０．５％のＢＳＡ又は１０％のＦＢＳを加えたものとした。アッセイは、上記の通りに行った。
【０１４５】
免疫沈降およびウエスタンブロット
Ｈ３５８細胞は、ヒト非小細胞肺上皮癌(ＮＳＣＬＣ)から得られる細胞株である。Ｈ３５８-ＰＳＦ２、Ｈ３５８-ＰＳＦ８細胞は、ヒトのＨＧＦを安定して形質移入したＨ３５８細胞であり(Tsao 等, Neoplasia, Vol.2, No.3, 2000)、ＲＰＭＩ１６４０、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ-グルタミン中で培養した。ｃＭｅｔチロシンリン酸化検出は基本的に既に記述されているように(Zioncheck, J Bio Chem, 270(28): 16871-8, 1995)行った。簡単に言えば、細胞を６０ｍｍのプレートに終夜播いて、培養液を０．５％ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ１６４０に交換した後に、１ｎＭのＨＧＦ又は競合物質ＯＡ５Ｄ５.ｖ２抗体の有無にかかわらず混合した。３７℃で１０分間の後、培養液を除去し、細胞を、溶解用バッファ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のトリトンＸ-１００、１ｘプロテアーゼインヒビター反応混液、１Ｘホスファターゼインヒビター反応混液(Sigma, St. Louis, MO))を用いて溶解した。回転にかけた後、溶解物の上清を、プロテインＧセファロースに結合した抗ｃＭｅｔ ＩｇＧポリクローナル抗体(ｃ-２８、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) とともに、４℃で１時間インキュベートした。免疫複合体を洗浄し、１×試料緩衝液中で煮沸した後に、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる分離およびニトロセルロースに対するエレクトロブロッティングを行った。ホスホチロシン含有タンパク質を、抗ホスホチロシン抗体(４Ｇ１０、Upstate Biotechnology, Waltham, MA)の後に、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＦａｂ(１:１０,０００、Jackson Labs, West Grove, PA)を用いて、そして、総ｃＭｅｔの場合には、ｃ-２８抗体(１:４００、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)の後に化学発光検出を伴うヤギ抗ウサギＦｃ-ＨＲＰ(１:１０,０００、Jackson Labs, West Grove, PA)を用いて視覚化した。
【０１４６】
腫瘍異種移植片研究
胸腺欠損雌マウスの皮下に５，０００，０００個のＫＰ４膵癌細胞を接種した。腫瘍が１５０−２００ｍｍ３に到達したときに、マウスを１０匹ずつ２群に分けた。グループ１は、週２回、溶媒をＩＰ注入した。グループ２は、週２回、ＯＡ５Ｄ５.ｖ２、３０ｍｇ／ｋｇをＩｐ注入した。腫瘍サイズは週に２回測定した。腫瘍容量が開始腫瘍容量の２倍を上回るか又は腫瘍が潰瘍化したときに、マウスを屠殺した。
【０１４７】
結果および考察
５Ｄ５のヒト化−
５Ｄ５のヒト化のために使用するヒトアクセプターフレームワークは、コンセンサスヒトκIＶＬドメインおよびヒトサブグループIIIコンセンサスＶＨドメインの変異体を含んでなる。変異体ＶＨドメインには、ヒトコンセンサスからの３つの変異：Ｒ７１Ａ、Ｎ７３ＴおよびＬ７８Ａがある。マウス５Ｄ５のＶＬドメインおよびＶＨドメインを、ヒトκIおよびサブグループIIIドメインと整列配置した、各々のＨＶＲを特定し、次いで、ファージ上でＦａｂとして表出される５Ｄ５移植片を生成するためにヒトアクセプターフレームワークに融合した。５Ｄ５移植片を表出しているファージの固定されたＨＧＦＲ-Ｆｃへの結合について試験したところ、結合は観察されなかった。
ライブラリは、５Ｄ５移植片のＨＶＲ領域の各々が穏やかにランダム化されて生成された。このライブラリは、４回(ラウンド)の選別のために固定されたＨＧＦＲ-Ｆｃに対してパンした。クローンをＤＮＡ配列分析のためにピックアップし、示された単一のクローンを選択した。このクローンには、突然変異誘発のために目標とされるＨＶＲ-Ｈ３の目的の領域のちょうど外側の位置９４(Ｒ９４Ｓ)で、ＶＨドメイン内の変異があった。ファージＥＬＩＳＡによるこのクローンの分析により、マウスの５Ｄ５の一価性親和性と同じ親和性を有することが示された。Ｆａｂとして発現させ、Ｂｉａｃｏｒｅによって、試験すると、Ｋｄはマウス５Ｄ５の一価性親和性の８．３ｎＭと比較して９．８ｎＭであった。したがって、この予想外の置換により５Ｄ５移植片に対する結合親和性が完全に回復され、Ｒ９４Ｓ(ｈｕ５Ｄ５.ｖ１)を有する５Ｄ５移植片は完全なヒト化抗体を表す。面白いことに、相同なアミノ酸であるスレオニンは、マウス抗体のこの位置にみられる。MacCallum 等 (MacCallum 等 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))は、抗体と抗原との複合体結晶構造を分析して、重鎖の位置９３および９４が接触領域の一部であることを示した。したがって、抗体をヒト化する場合、Ｈ３(ＨＶＲ-Ｈ３)の高頻度可変領域といえるこれらの位置を含むことは当然であろう。
【０１４８】
ｈｕ５Ｄ５.ｖ１の親和性成熟−
ｈｕ５Ｄ５.ｖ１の親和性を向上させるために、６つのファージディスプレイライブラリをｈｕ５Ｄ５.ｖ１をバックグラウンドとして生成し、穏やかなランダム化のために各々について単一のＨＶＲを標的とした。バックグラウンドの高い野生型鋳型からのｈｕ５Ｄ５.ｖ１の再選択を避けるために、停止コドンをＨＶＲ内に挿入して、各々のライブラリを生成した。溶液分類法を用いて、親和性ベースのファージ選択方法の有効性を上げた。ビオチン化された標的の濃度を操作することによって、バックグラウンドを低くするためにファージ捕獲時間を短くし、早い解離速度の高親和性クローンにてクローンを溶出するために非ビオチン化標的の添加を減少することによって、うまく選択できた。上記のLee 等を参照。選別の初めのラウンドで、濃縮(標的依存性ファージ捕獲)がみられたことにより、ＨＧＦＲ-Ｆｃに対して有意に高い親和性を有する各々のライブラリに多くのクローンが存在したことが示唆された。選別ストリンジェンシー(上記の方法を参照)はその後のラウンドで増加し、ラウンド３で、６つすべてのライブラリを混合して第７のライブラリプールが生成された。４回の選別の後、７つのライブラリの各々のクローンを分析した。ＨＶＲ-Ｌ１およびＨＶＲ-Ｌ３を標的とするライブラリ中のすべてのクローンは、ｈｕ５Ｄ５.ｖ１と同一であった、しかしながら、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３を標的とするライブラリに新規の配列が観察された(図２)。６つすべてのライブラリの組合せからなるライブラリプールはＨＶＲ-Ｈ３ライブラリの配列で占められる。このことは、これらの配列がＨＧＦＲ-Ｆｃに対する親和性を最も大きく改善したことを示唆する(図３)。選択されたクローンをファージＥＬＩＳＡによって、スクリーニングして、次いでＦａｂタンパク質として発現させて、その親和性をＢｉａｃｏｒｅを用いて決定した。ＨＶＲ-Ｈ３内の変異を有する混合ライブラリからの様々なクローンは、ｈｕ５Ｄ５.ｖ１又はマウス５Ｄ５一価性親和性と比較して親和性が向上した(図４)。これらのクローンは、位置９４のＳ／Ｔの何れか、位置９６のＲ／Ｓの何れか、および位置１００のＴ／Ｓの何れかおよび位置１００ａのＰ／Ｓ／Ａのいずれを有した。最もよいクローンであるクローン７８(ｈｕ５Ｄ５.ｖ２)は、ｈｕ５Ｄ５.ｖ１からの３つの変異(９４Ｔ、９６Ｒおよび１００Ｔ)を有しており、１３-倍の親和性改善があった。
したがって、６つのマウス５Ｄ５のＨＶＲをヒトアクセプタースキャフォールド内に移植することから初め、ＨＶＲ-Ｈ３を伸展させて位置９４(スレオニン)とＨＶＲ-Ｈ３内に２つの変異を付加することによって、ＨＧＦＲに対して１３倍亢進した結合親和性を有する完全なヒト５Ｄ５抗体となる。さらに、本願明細書において、記述される選択されたヒト化抗体は、例えばレセプターリン酸化アッセイなどにおいて、親5Ｄ5抗体に少なくとも匹敵する生物活性を有することが明らかとなった(データは示さない)。
【０１４９】
本発明の抗体の特徴づけ−
「一アーム形」(「１-アーム」および「ＯＡ」とも称する) 抗Ｍｅｔ抗体の特徴付けを行った。本発明の２の抗体を試験した。具体的には、「ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２」抗体は図１３に示す可変ドメイン配列を含有する単一のＦａｂアームを含んでなり、該ＦａｂはＦｃ領域と融合し、該Ｆｃ領域は、図１３に示すＦｃ配列を含有する一Ｆｃポリペプチドと、図１４に示すＦｃ配列を含有する一Ｆｃポリペプチドとの複合体であった。抗体は以下のような特徴を有する：
(１) ＨＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするＯＡ-５Ｄ５.ｖ２の能力を試験するためのアッセイにおいて、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、少なくとも２つの比較抗体と同様にそのレセプターに対するＨＧＦ結合をブロックすることができた。その比較抗体は、キメラ一アーム形抗体(マウス親５Ｄ５抗体のＦａｂアーム(図７に示す可変ドメイン)を含有するもの)と本発明の他の抗体(ＯＡ-５Ｄ５.ｖ１)である。「材料および方法」の項目で述べた条件で、およそ３３３３〜０．２１ｎＭの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、キメラ一アーム形抗体やＯＡ-５Ｄ５.ｖ１などの比較抗体のもののおよそ半分より低いＩＣ５０値であったことが明らかとなった。ＯＡ-５Ｄ５.ｖ１も、参照キメラ抗体より良好なＩＣ５０で有意にブロックした。図８を参照のこと。
(２) ＨＧＦレセプター活性化を阻害するためのＯＡ-５Ｄ５.ｖ２の能力を試験するためのアッセイにおいて、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、上記の(１)にて説明したように、少なくとも２つの比較抗体と同様にキナーゼレセプター活性化を阻害することができた。「材料および方法」の項目で述べた条件で、およそ２００〜０．１９ｎＭの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、キメラ一アーム形抗体やＯＡ-５Ｄ５.ｖ１などの比較抗体のもののおよそ半分より低い値のＩＣ５０を有することが明らかとなった。図９を参照のこと。
【０１５０】
(３) また、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、ヒト、霊長類(カニクイザル)、イヌおよびネズミ(マウス)の中の種交差結合(cross-species binding)についても試験した。ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、ヒトおよび霊長類(カニクイザル)のＨＧＦレセプターには特異的に結合するが、イヌ又はネズミ(マウス)には結合しないことが明らかとなった(データは示さない)。
(４) ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、ＨＧＦの存在下における細胞増殖の阻害能力について試験した。図１０に示すように、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、少なくともそのキメラ抗体相対物およびＯＡ-５Ｄ５.ｖ１(上記の(１)に記載)と同様に細胞増殖を阻害した。「材料および方法」の項目で述べた条件で、およそ０．０１〜１００ｎＭの抗体濃度範囲全体にわたって試験した場合、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、キメラ一アーム形抗体やＯＡ-５Ｄ５.ｖ１などの比較抗体のもののおよそ半分より低いＩＣ５０値を有することが明らかとなった。図１０を参照のこと。Ｍｅｔを形質移入した細胞に対するＯＡ-５Ｄ５.ｖ２の特異的結合をＦＡＣ分析によって、確認した(データは示さない)。
(５) ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、ＨＧＦ存在下におけるレセプターチロシンリン酸化の阻害能力について試験した。図１１ＡおよびＢに示すように、およそ１０〜１０００ｎＭの抗体濃度で試験した場合、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２はレセプターチロシンリン酸化を阻害した。図１１ＡおよびＢを参照のこと。
(６) ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２は、膵臓腫瘍細胞株(ＫＰ４)に基づく腫瘍異種移植片モデルを用いてインビボ有効性について試験した。この有効性研究からの結果により、ＯＡ-５Ｄ５.ｖ２抗体がインビボでの腫瘍の再発を引き起こしうることと阻害しうることが示唆された。図１２に示すように、抗体により処置される多くの動物の腫瘍が十分に減少した。
【０１５１】
引用文献の一部
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１Ａ】以下の可変軽鎖の配列のアラインメントを表す：軽鎖ヒトサブグループIコンセンサス配列、重鎖ヒトサブグループIIIコンセンサス配列、マウス５Ｄ５抗ｃ-ｍｅｔ抗体、及び５Ｄ５融合「ヒト化」抗体。
【図１Ｂ】以下の可変重鎖の配列のアラインメントを表す：軽鎖ヒトサブグループIコンセンサス配列、重鎖ヒトサブグループIIIコンセンサス配列、マウス５Ｄ５抗ｃ-ｍｅｔ抗体、及び５Ｄ５融合「ヒト化」抗体。
【図２Ａ】別々にランダム化されたＨＶＲを有するライブラリから選択された親和性成熟抗体の様々なＨＶＲ配列を表す。
【図２Ｂ】別々にランダム化されたＨＶＲを有するライブラリから選択された親和性成熟抗体の様々なＨＶＲ配列を表す。
【図３】各々のライブラリが一本鎖のＨＶＲにおいて、ランダム化されている、６つすべてのＨＶＲを包含している６つのライブラリの組合せを含んでなるライブラリプールから選択された親和性成熟抗体のＨＶＲ-Ｈ３配列を表す。
【図４】選択された抗ｃ-ｍｅｔ抗体のＢｉａｃｏｒｅ分析の結果を表す。
【図５Ａ】以下の配列識別子を用いて本発明を実施する際に用いる、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す：可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワークヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：１９)ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２０−２２)ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２３)ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２４−２６)ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２７)ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２８−３０)ヒトＶＨアクセプターフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３１)ヒトＶＨアクセプターフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３２−３３)ヒトＶＨアクセプター２フレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３４)ヒトＶＨアクセプター２フレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３５−３７)
【図５Ｂ】以下の配列識別子を用いて本発明を実施する際に用いる、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す：可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワークヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：１９)ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２０−２２)ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２３)ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２４−２６)ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：２７)ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２８−３０)ヒトＶＨアクセプターフレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３１)ヒトＶＨアクセプターフレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３２−３３)ヒトＶＨアクセプター２フレームワークからKabatＣＤＲを除いたもの(配列番号：３４)ヒトＶＨアクセプター２フレームワークから伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３５−３７)
【図６】以下の配列識別子を用いて本発明を実施する際に用いる、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す：可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワークヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３８)ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３９)ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：４０)ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(配列番号：４１)
【図７】ドナー(マウス抗体５Ｄ５)軽鎖(ＬＣ)および重鎖(ＨＣ)可変ドメイン配列を表す。
【図８】本発明の抗体によるレセプターへのＨＧＦ結合のブロックについての図解データを表す。
【図９】本発明の抗体によるＨＧＦレセプター活性化の阻害についての図解データを表す。
【図１０】本発明の抗体による細胞増殖の阻害についての図解データを表す。「ｒｃｈＯＡ５Ｄ５ ＨＧＦ」は、キメラ一アーム形5Ｄ5抗体にＨＧＦが付加したものを意味する、「ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ２ ＨＧＦ」は、ＯＡ５Ｄ５.ｖ２にＨＧＦが付加したものを意味する、「ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ１ ＨＧＦ」は、ＯＡ５Ｄ５.ｖ1にＨＧＦが付加したものを意味する。「ｒｃｈＯＡ５Ｄ５ コントロール」は、ＨＧＦのないキメラ一アーム形５Ｄ５抗体を意味する、「ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ２ コントロール」は、ＨＧＦのないＯＡ５Ｄ５.ｖ２を意味する、「ｒｈｕＯＡ５Ｄ５ｖ１ コントロール」は、ＨＧＦのないＯＡ５Ｄ５.ｖ１を意味する。
【図１１】本発明の抗体存在下におけるレセプターリン酸化の阻害についてのデータを表す。図１１Ａは、Ｈ３５８細胞のレセプターリン酸化を表す。図１１Ｂは、ＨＧＦを形質移入したＨ３５８細胞のレセプターリン酸化を表す。
【図１２】本発明の抗体のインビボ有効性を示す図解データを表す。「ＴＩ」は、腫瘍発生率を意味する。ＴＩ＝８／１０は、１０匹のマウス群のうちの８匹のマウスが腫瘍を有することを意味する。ＴＩ＝２／８は、８匹のマウスの群のうちの２匹のマウスが腫瘍を有することを意味する。
【図１３】本発明の抗体の一実施態様(５Ｄ５.ｖ２)のフレームワーク(ＦＲ)、高頻度可変領域(ＨＶＲ)、第一定常ドメイン(ＣＬ又はＣＨ1)およびＦｃ領域(Ｆｃ)のアミノ酸配列を表す。示されたＦｃ配列は、国際公開公報２００５／０６３８１６にて記載される、「孔」(腔)突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。
【図１４】国際公開公報２００５／０６３８１６にて記載される、「ノブ」(隆起)突然変異Ｔ３６６Ｗを含むＦｃポリペプチドの配列を表す。一実施態様では、この配列を含有してなるＦｃポリペプチドは、図１３のＦｃ配列を含有してなるＦｃポリペプチドとの複合体を形成して、本発明の抗体のＦｃ領域を生成する。
【図１Ａ】
2008508880.tif 000030
【図１Ｂ】
2008508880.tif 000031
【図２Ａ】
2008508880.tif 000032
【図２Ｂ】
2008508880.tif 000033
【図３】
2008508880.tif 000034
【図４】
2008508880.tif 000035
【図５Ａ】
2008508880.tif 000036
【図５Ｂ】
2008508880.tif 000037
【図６】
2008508880.tif 000038
【図７】
2008508880.tif 000039
【図８】
2008508880.tif 000040
【図９】
2008508880.tif 000041
【図１０】
2008508880.tif 000042
【図１１】
2008508880.tif 000043
【図１２】
2008508880.tif 000044
【図１３】
2008508880.tif 000045
【図１４】
2008508880.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月2日(2007.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ) 以下の配列からなる群から選択される少なくとも一のＨＶＲ配列
(i)   KSSQSLLYTSSQKNYLA (配列番号１)である配列Ａ１-Ａ１７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  WASTRES (配列番号２)である配列Ｂ１-Ｂ７を含有してなるＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQYYAYPWT (配列番号３)である配列Ｃ１-Ｃ９を含有してなるＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GYTFTSYWLH (配列番号４)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含有してなるＨＶＲ-Ｈ１
(v)   GMIDPSNSDTRFNPNFKD (配列番号５)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含有してなるＨＶＲ-Ｈ２
(vi)  XYGSYVSPLDY (配列番号６) であり、ＸがＲでない配列Ｆ１-Ｆ１１を含有してなるＨＶＲ-Ｈ３；
(ｂ) 変異体ＨＶＲが配列番号１、２、３、４、５又は６に示す配列の少なくとも一の残基の修飾を含有する、少なくとも一の変異体ＨＶＲ
を含んでなる抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、Ｆ７がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒト化である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
少なくとも一部のフレームワーク配列がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記修飾が置換、挿入又は欠損である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６( Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号１の配列を有するＨＶＲ-Ｌ１を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号３の配列を有するＨＶＲ-Ｌ３を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３がＲ又はＳである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７がＴである、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体のヒトｃ-ｍｅｔに対する一価親和性が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性と実質的に同じである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項１６】
抗体のヒトｃ-ｍｅｔに対する一価親和性が、図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖可変配列及び重鎖可変配列を含有してなるマウス抗体の一価親和性より少なくとも３倍大きいものである、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項１７】
前記マウス抗体が、ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)と称してアメリカ培養細胞系統保存機関に寄託されているハイブリドーマ細胞株によって産生されるものである、請求項１５又は１６に記載のヒト化抗体。
【請求項１８】
前記結合親和性がＫｄ値として表される、請求項１５ないし１７の何れか一に記載の抗体。
【請求項１９】
前記結合親和性がＢｉａｃｏｒｅ又はラジオイムノアッセイによって測定される、請求項１５ないし１８の何れか一に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒトκサブグループ１コンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
重鎖ヒトサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含有してなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
前記フレームワーク配列の位置７１、７３及び／又は７８が置換されている、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記置換が、Ｒ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ及び／又はＮ７８Ａである、請求項２２に記載の抗体。
【請求項２４】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子のそのレセプターに対する結合を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２５】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値で結合を阻害する、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
前記ＩＣ５０がおよそ０．０１ｎＭからおよそ１０００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ヒト肝細胞成長因子(ＨＧＦ)レセプター活性を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項２８】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値でレセプター活性を阻害する、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記ＩＣ５０がおよそ０．１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
図７(配列番号９及び１０)に記載の軽鎖及び重鎖の可変配列を含有してなるキメラ抗ｃ-ｍｅｔ抗体を含んでなる参照抗体より、ｃ-ｍｅｔ依存性細胞増殖を良好に阻害する、ヒト化抗ｃ-ｍｅｔ抗体。
【請求項３１】
前記ヒト化抗体が、前記キメラ抗体のＩＣ５０値の半分よりも少ないＩＣ５０値で細胞増殖を阻害する、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
前記ＩＣ５０がおよそ０．０１ｎＭからおよそ１００ｎＭの範囲の抗体濃度を超えて測定される、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方が一価性である、請求項１ないし３２の何れか一に記載の抗体。
【請求項３４】
前記ヒト化抗体及びキメラ抗体の両方がＦｃ領域に結合した単一Ｆａｂ領域を含有してなる、請求項１ないし３３の何れか一に記載の抗体。
【請求項３５】
図１３(配列番号１９１−１９３)に記載のＨＶＲ１-ＨＣ、ＨＶＲ２-ＨＣ及び／又はＨＶＲ３-ＨＣ配列を含有する重鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
【請求項３６】
前記可変ドメインが、図１３(配列番号１８７−１９０)に記載のＦＲ１-ＨＣ、ＦＲ２-ＨＣ、ＦＲ３-ＨＣ及び／又はＦＲ４-ＨＣ配列を含有してなる、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
図１３(配列番号１９４及び／又は１９５)に記載のＦｃ配列及び／又はＣＨ１配列を含有してなる、請求項３５又は３６に記載の抗体。
【請求項３８】
図１３(配列番号１８３−１８５)に記載のＨＶＲ１-ＬＣ、ＨＶＲ２-ＬＣ及び／又はＨＶＲ３-ＬＣを含有する軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
【請求項３９】
前記可変ドメインが、図１３(配列番号１７９−１８２)に記載のＦＲ１-ＬＣ、ＦＲ２-ＬＣ、ＦＲ３-ＬＣ及び／又はＦＲ４-ＬＣ配列を含有してなる、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
図１３(配列番号１８６)に記載のＣＬ１配列を含有してなる、請求項３８又は３９に記載の抗体。
【請求項４１】
請求項３５ないし３７の何れか一に記載の重鎖可変ドメインと請求項３８ないし４０の何れか一に記載の軽鎖可変ドメインを含有してなる抗体。
【請求項４２】
前記抗体が一価性であり、Ｆｃ領域を含有してなる、請求項４１に記載の抗体。
【請求項４３】
前記Ｆｃ領域が第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含有してなり、該第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドのそれぞれが野生型ヒトＦｃに関して一又は複数の変異を含有する、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
前記第一ポリペプチドが図１３(配列番号１９５)に記載のＦｃ配列を含有し、前記第二ポリペプチドが図１４(配列番号１９６)に記載の配列を含有する、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖の阻害方法であって、細胞又は組織に、有効量の請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を接触させることを含む方法。
【請求項４６】
ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達系統の調節不全が関与する疾患を調節するための薬剤であって、有効量の請求項１ないし４５の何れか一に記載の抗体を含んでなる薬剤。
【請求項４７】
癌を有する被検体の治療のための医薬であって、有効量の請求項１ないし４６の何れか一に記載の抗体を含んでなる医薬。
【請求項４８】
前記癌が、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、結腸直腸癌及び／又は膵臓癌である、請求項４７に記載の医薬。
【請求項４９】
被検体の増殖性疾患の治療のための医薬であって、有効量の請求項１ないし４８の何れか一に記載の抗体を含んでなる医薬。
【請求項５０】
前記増殖性疾患が癌である、請求項４９に記載の医薬。
【請求項５１】
請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸を含有してなる宿主細胞。
【請求項５３】
請求項１ないし４４の何れか一に記載の抗体を含有してなる組成物。
【請求項５４】
前記組成物が担体を含んでなる、請求項５３に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008508880.tif 000047
2008508880.tif 000048
2008508880.tif 000049
2008508880.tif 000050