(57)【要約】  本発明は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）のファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、及び抗体のＦｃ部分を含む二機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する。さらに、上記核酸分子、及び当該核酸分子によりコードされるポリペプチドを含むベクター、及び宿主細胞、並びに当該ポリペプチド製造するための方法を開示する。さらに、本出願は、上記ポリペプチド及び組成物、特に上記核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド又は抗体を含む診断用組成物を特異的に結合する抗体を提供する。さらに、特に腫瘍組織又は腫瘍細胞において、メチル化ＤＮＡを検出するための本発明のポリペプチドを使用する方法、及び使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）ファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、及び抗体のＦｃ部分を含む二機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
【請求項２】
リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）ファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメインが、ＭＢＤ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
以下の：
（ａ）配列番号１（図１）に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子；
（ｂ）配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；
（ｃ）配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、ここで、該断片は、該ポリペプチドの少なくともアミノ酸１３０〜３６１番を含み、メチル化ＤＮＡと結合し得る；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、ここで、該変異体において、１又は複数のアミノ酸残基は該ポリペプチドに比べて置換されており、該変異体はメチル化ＤＮＡと結合し得る；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの核酸分子とハイブリダイズし、かつ、（ａ）の核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも６５％同一であって、メチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、核酸分子；
（ｆ）メチル化ＤＮＡと結合し得る（ｂ）の核酸分子によりコードされるポリペプチドと少なくとも６５％同一であるポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を有する核酸配列；および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を有する核酸分子、
またはかかるポリヌクレオチドの相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７】
前記核酸分子が、原核生物または真核生物宿主細胞における発現を可能とする発現制御配列と作動可能なように連結されている、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項６若しくは７に記載のベクターで遺伝的に操作された、宿主細胞。
【請求項９】
メチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドを産生する方法であって、請求項８に記載の宿主細胞を培養すること、および該ポリペプチドを回収することを含む、前記方法。
【請求項１０】
メチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドを発現し得る細胞を製造する方法であって、請求項６または７に記載のベクターで細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて遺伝的に操作することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有する、または請求項１０の方法により得られる、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６または７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項１１に記載のポリペプチド、または請求項１２に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項１４】
場合により好適な診断手段をさらに含む診断用組成物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
場合により製薬上許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）メチル化および／または非メチル化ＤＮＡを含むサンプルを請求項１１に記載のポリペプチドと接触させること；および
（ｂ）請求項１１に記載のポリペプチドとメチル化ＤＮＡとの結合を検出すること
を含む方法。
【請求項１７】
逆サウスウエスタンブロット法、免疫沈降法、アフィニティー精製、メチル−ＣｐＧ免疫沈降法（ＭＣｉＰ）またはメチル結合（ＭＢ−）ＰＣＲ法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
メチル化ＤＮＡを制限酵素消化、重亜硫酸塩シークエンシング、ピロシークエンシング、サザンブロット法またはＰＣＲにより分析するステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
メチル化ＤＮＡを検出するための、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
メチル化ＤＮＡの検出を目的とした診断用組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６若しくは７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項１１に記載のポリペプチド、または請求項１２に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
腫瘍組織または腫瘍細胞の検出を目的とした診断用組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項６若しくは７に記載のベクター、請求項８に記載の宿主細胞、請求項１１に記載のポリペプチド、または請求項１２に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）のファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、及び抗体のＦｃ部分を含む二機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する。さらに、上記核酸分子、及び当該核酸分子によりコードされるポリペプチドを含むベクター、及び宿主細胞、並びに当該ポリペプチド製造するための方法を開示する。さらに、本出願は、上記ポリペプチド及び組成物、特に上記核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド又は抗体を含む診断用組成物を特異的に結合する抗体を提供する。さらに、特に腫瘍組織又は腫瘍細胞において、メチル化ＤＮＡを検出するための本発明のポリペプチドを使用する方法、及び使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全生体の細胞を形成するための情報は、それらのＤＮＡ中に含まれる。ＤＮＡは、Ｇ、Ａ、Ｔ、及びＣとして省略された４塩基からなり、はしごの「横木」の各々を形成するこれらの文字と対を有する非常に長い当該はしごのように形成される。当該文字Ｇは、Ｃと対になり、ＡはＴと対になる。これらの対の文字列は、遺伝子と呼ばれる領域に分類された特定の細胞を形成するための情報と共に、コードされたメッセージのような情報を保存する。２倍体動物の全細胞は、全遺伝子の２つのコピーを含む。一方は、母親由来のものであり、もう一方は父親由来のものである（このルールの唯一の例外は、生物が「雄」か「雌」のいずれかとして発達することを決定する染色体上の遺伝子である。）。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化、及び遺伝子調節
私たちのゲノムを「つづる」４つの塩基−アデニン、グアニン、シトシン、及びチミンは別として、複製後のＤＮＡの一時的変異により産生される５番目の塩基もある。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）は、メチル供与体Ｓ−アデノシルメチオニンからシトシン環へのメチル基の移転を触媒し得る、そしてその結果、５−メチルシトシン塩基を形成する。特定のシトシン残基が哺乳類において修飾され、それは、ＤＮＡ配列のグアノシン残基の前にある（ＣｐＧジヌクレオチド）（Ｓｉｎｇａｌ，Ｂｌｏｏｄ９３（１９９９），４０５９-４０７０）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１（２０００），１１−１９；Ｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ.Ｇｅｎｅｔ.Ｄｅｖ.（２０００），１５８−１６３；Ｒａｚｉｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ.１７（１９９８），４９０５−４９０８）。当該ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、一般的に、安定した転写抑制と関連し、おそらく、非コードゲノムの大部分、及びトランスポゾン、繰り返し体、ウイルス性挿入部分の如き潜在的に有害な配列は転写されないといった事実を導く。ＣｐＧジヌクレオチドが、ゲノム中において、非常に遍在していることは興味深い（Ｓｉｎｇａｌ（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｎｇ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｒａｚｉｎ（１９９８），ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【０００４】
ゲノムの大部分は、統計的に予期されるよりも非常に少ないＣｐＧを含む。このことは、おそらく、５−メチルシトシンは比較的容易にアミノ基を取り去りチミジンとなり、進化の過程で、当該ＣｐＧジヌクレオチドの数の低減を導くという事実に起因する。しかしながら、ゲノム中に区分される何度も繰り返される多くのＣｐＧ、いわゆるＣｐＧアイランドがある。これらの領域は、しばしば、転写開始点、及び遺伝子プロモーターを含み、そして一般的に、ＣｐＧアイランドに関連しないＣｐＧとは対照的にメチル化されない。正常細胞において、当該ＣｐＧアイランドのメチル化は、雌性細胞中のＸ染色体、及び親の刷り込みゲノムの第２転写の不活性化の如き例外的ケースの場合のみ観察される（Ｓｉｎｇａｌ（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｎｇ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ，Ｒａｚｉｎ（１９９８），ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【０００５】
ＤＮＡメチル化の調節
ＤＮＡメチル化パターンが胚形成の過程中でどのように確立されるのか、及びＣｐＧメチル化がどのようにゲノム中に維持され、調節されるのかは、一部しかわかっていない（Ｓｉｎｇａｌ（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔ，Ｎｇ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｒａｚｉｎ（１９９８），ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。哺乳類において、ＤＮＡメチル化過程を触媒する既知の３つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１、３ａ、及び３ｂ）がある。各ＤＮＭＴがＣｐＧメチル化の維持、及び調節に寄与する対応分担は、明らかとされなければならないが、いまだ明らかではない。しかし、全３つの酵素は、明らかに胚形に必要不可欠であり、対応するノックアウトマウスは、生まれる前に、又は生後間もなく死に至る（Ｂｅｓｔｏｒ，Ｈｕｍ．ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．９（２０００），２３９５−２４０２；Ｅｌ  Ｏｓｔａ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２５（２００３），１０７１−１０８４）。その間、ＤＮＡメチル化、クロマチン構造の一時的変異と、特定のヒストン一時的変異との関連は、数回見られる。ＤＮＡのメチル化は、ヒストン脱アセチル化、及びヒストンＨ３でのリジン９残基のメチル化と大部分関係がある（Ｓｉｍｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９（２００３），６２９−６３９，Ｆａｈｒｎｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（２００２），７２１３−７２１８）。従って、ＤＮＭＴは、ヒストンアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）又はコリプレッサー複合体と関連する。メチル基がどのようにＣｐＧ残基から除かれるのかもほとんどわかっていない。増殖細胞において、ＤＮＡメチル化は、おそらく複製の間にも受動的に生じ得るだろう。しかしながら、活性のある未知のデメチラーゼの存在により説明され得る有糸分裂細胞におけるＤＮＡ脱メチル化の例もある（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．９６（１９９９），５８９４−５８９６）。
【０００６】
ＣｐＧメチル化、及び遺伝子抑制
プロモーターのメチル化（しかし、非調節配列のものではない）は、安定、転写抑制と相互に関連する（Ｓｉｎｇａｌ（１９９９），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｎｇ（２０００），ｌｏｃ．ｃｉｔ．，Ｒａｚｉｎ（１９９８），ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。５−メチルシトシンの抑制特性は、２つの機構により影響され得る。第１に、ＤＮＡメチル化は、転写因子の結合を直接的に損なわせ得るというもの。第２に、抑制の最大部分に関与しそうな可能性は、メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質（ＭＢＰ）の増大であるというものである（Ｂａｌｌｅｓｔａｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８（２００１），１−６）。ＭＥＣＰ２又はＭＢＤ２（ＭｅＣＰ１複合体の構成要素）の如きＭＢＰは、コリプレッサー複合体、及び抑制作用を有するＨＤＡＣを伴い、そして転写因子に利用できない高密度クロマチン構造（ヘテロクロマチン）の形成に関与する（Ｂａｌｌｅｓｔａｒ（２００１），ｌｏｃ．ｃｉｔ）。
【０００７】
腫瘍形成における後成的変化
腫瘍の形成が、遺伝子病変（例えば、突然変異又は転座）だけでなく、後成的変化によっても支持されることが明らかとなっている。異常なクロマチン構造又はＤＮＡメチル化は、腫瘍遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の転写状態に影響を与え得、及び腫瘍の成長を促進し得る。当該ＤＮＡメチル化における変化は、正常なメチル化配列におけるメチル化の損失（低メチル化）、あるいは正常な非メチル化配列におけるメチル化（高メチル化）のいずれかを含む（Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎ（２０００），Ｉｏｃ．ｃｉｔ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９（２００３），２０４２−２０５４；Ｍｏｍｐａｒｌｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２（２００３），６４７９−６４８３；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７（２００２），１８０７−１８０８；Ｐｌａｓｓ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ１１（２００２），２４７９− ４８８）。
【０００８】
低メチル化
広範囲のＤＮＡ低メチル化は、ほぼ全ての種類の腫瘍について記載される。腫瘍組織において、５−メチルシトシン含有量は、反復サテライト配列又は染色体のセントロメア領域に見られる脱メチル化事象の大部分を有する正常な組織と比較して、低減される。しかしながら、個々の場合、ｂｃｌ-２又はｃ-ｍｙｃの如き原がん遺伝子の脱メチル化、及び活性化もまた記載される（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３８（２００１），２８５−３０３）。
【０００９】
ＣｐＧアイランドの高メチル化
ＣｐＧアイランドは、通常、遺伝子調節機能に影響を及ぼす。これは、メチル化状態における変化が、関連する遺伝子座の転写活性における変化と主に直接的に関与することによる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９９）；Ｈｅｒｍａｎ（２００３）；Ｅｓｔｅｌｌｅｒ（２００２）；Ｍｏｍｐａｒｌｅｒ（２００３）；Ｐｌａｓｓ（２００２），ａｌｌ  Ｉｏｃ．ｃｉｔ。）。大抵のＣｐＧアイランドは、正常細胞における非メチル化形態中に存在する。しかしながら、ある態様において、ＣｐＧアイランドは、遺伝子調節事象においてもメチル化され得る。例えば雌性細胞の非活性化Ｘ染色体のＣｐＧアイランドの大部分は、メチル化される（Ｇｏｔｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２（１９９８），３６２−３７８）。ＣｐＧアイランドは、正常な老化作用の過程においてもメチル化され得る（Ｉｓｓａ，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（２００３），１０３−１０８）。
【００１０】
特定の腫瘍において、通常メチル化されないＣｐＧアイランドが高メチル化形態に存在し得る。多くの場合において、高メチル化により影響を受ける遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子の如き腫瘍の成長に対抗するタンパク質をコードする。以下の表は、高メチル化の後成的機構を通じて腫瘍中で非活性化され得ることが明らかである遺伝子の例を挙げるものである。
【００１１】
【表１】
2008521389.tif 000002
【００１２】
腫瘍特異的高メチル化の理由は、ほとんどわかっていない。興味深いことに、ある種の腫瘍は、それら自身の高メチル化プロフィールを有しているようである。高メチル化が均一に分布されず、腫瘍に依存して生ずることが、より多くの比較研究において示され得た。白血病の場合、例えば結腸がん又は神経こう腫と比較して、ほとんど他の遺伝子が高メチル化される。それ故、高メチル化は、腫瘍を分類するために有用となり得た（Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６１（２００１），３２２５−３２２９；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４（２０００），１３２−１３８）。
【００１３】
多くの場合において、高メチル化は、ＨＤＡＣの増大活性も混合される。脱メチル化物質（例えば、５−アザシチジン）での処理の後、メチル化遺伝子は、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、トリコスタチン（ＴＳＡ））も使用した後にのみ、再活性化され得た（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３１（２００２），１４１−１４９；Ｇｈｏｓｈａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（２００２），８３０２−８３１９；Ｋａｌｅｂｉｃ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ９８３（２００３），２７８−２８５）。
【００１４】
大抵の分析は、ＤＮＡのメチル化は優位に抑制されること、及びＴＳＡの如きＨＤＡＣ阻害剤での処理により逆転され得ないことを示す（Ｓｕｚｕｋｉ（２００２）；Ｇｈｏｓｈａｌ（２００２），ｌｏｃ．ｃｉｔ）。しかしながら、既に臨床に使用されるＨＤＡＣ阻害剤、バルプロエートは、ＤＮＡの脱メチル化を導きうることもさらに最近示された（Ｄｅｔｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３），２７５８６−２７５９２）。しかしながら、この観点において実施される系統的分析は、今のところない。
【００１５】
後成的変化を逆転するための臨床的研究
がん（例えば突然変異）の遺伝的原因は不可逆的なものであるが、腫瘍形成に対する役割に寄与する後成的変化は可逆的となり得る。それ故、後成的変化の可能な処置は、新組織形成の治療のための新たな可能性を提示する（Ｈｅｒｍａｎ（２００３）；Ｍｏｍｐａｒｌｅｒ（２００３）；Ｐｌａｓｓ（２００２），ａｌｌｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｌｅｏｎｅ，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（２００３），８９−１０２；Ｃｌａｕｓ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２ （２００３）， ６４８９−６４９６）。
【００１６】
２０年以上前、５−アザシチジンは、抗腫瘍薬として既に開発されており、及び知られた基質の分子効果なしに使用されていた。現在、さらに発達した形態（デオキシ−５−アザシチジン，デシタビン）において、骨髄異形成症候群、及び二次性白血病の治療のために、すでに首尾よく使用されている（Ｌｅｏｎｅ（２００３），ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｌｙｏｎｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ４（２００３），１４４２−１４５０；Ｉｓｓａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１５（２００３），４４６−４５１）。
【００１７】
ＨＤＡＣ阻害剤がメチル化プロモーターの再活性化を支持し得、及び脱メチル化基質と相乗的に作用し得るといった生体外の観察に起因して、現在、基質双方の種類の使用を含む、試験的研究が世界中で実施される（Ｋａｌｅｂｉｃ（２００３）；Ｃｌａｕｓ（２００３），ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｇａｇｎｏｎ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １４（２００３），１９３−２０２；Ｓｈａｋｅｒ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２７（２００３），４３７−４４４）。
【００１８】
ＣｐＧメチル化の分析のための検出方法
ゲノムのＣｐＧメチル化分析のための検出方法の開発は、ＣｐＧメチル化パターンにおける変化ががんの如き疾患に関連し得ることが見出される事実に起因する重要性を主に有している。現在のところ、主に、既知の遺伝子座のＣｐＧメチル化の検出のために使用されることが知られている技術がある（Ｄａｈｌ，Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ４（２００３），２３３−２５０）。ゲノムを通じてＣｐＧメチル化の分析を可能とする方法は、ほとんど確立されていない。以下に、適用の主要分野と共にＣｐＧメチル化の分析のための最も一般的な方法を要約する。
【００１９】
ＣｐＧメチル化の検出のためのメチル化感受性制限酵素の使用
特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態が、５−メチルシトシンに対する異なる感受性により特徴づけられる細菌の制限エンドヌクレアーゼのイソシゾマーを使用して、検出され得る。それらの例は、双方ともＣＣＧＧ配列を切断する酵素ＨｐａＩＩ、及びＭｓｐＩであって、しかしながら、ＨｐａＩＩは、内部シトシンがメチル化されない場合に限られる。いくつかのアッセイは、メチル化感受性制限酵素の使用に基づき、上記アッセイは、個々の遺伝子の分析、及び当該ゲノムを通じたＣｐＧメチル化の分析の双方のために使用され得る。メチル化感受性制限消化の断片は、サザンブロット又は制限部位の側面に接する領域のゲノムＰＣＲにより、主に検出される（Ｄａｈｌ（２００３），ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。現在までに刊行されている、ゲノムを通じたＣｐＧメチル化の全分析法は、当該方法の構成成分として、メチル化感受性制限酵素を使用する。制限ランドマークゲノムスキャニング法（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｌａｎｄｍａｒｋ  ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ、ＲＬＧＳ）（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ２７（２００２），１４４−１４９）は、例えば、全次元が異なるメチル化感受性制限酵素で消化され２つのＤＮＡ母集団のＣｐＧメチル化における相違を特定する、一種の２次元アガロースゲル電気泳動を使用する。メチル化ＣｐＧアイランド増幅法（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＭＣＡ）は、メチル化ＳｍａＩ制限部位を有する断片を充実させ、そして当該断片を増やすためにＬＭ−ＰＣＲを使用する。かかる増幅産生物は、表示差異分析（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｉｓ、ＲＤＡ）（Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（２００３），５５８−５６９）又はＣｐＧアイランドマイクロアレイ（Ｙａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６（２００１），８３７５−８３８０）を用いて、すでに成功裏に分析されている。
【００２０】
ゲノムを介したＣｐＧメチル化の分析に関して、メチル化感受性制限酵素に基づいた全アッセイは、不都合を有する。最善の方法で実施するために、とりわけ、全ての制限消化が完了することが保証される必要がある。最も著しい不都合は、当該分析が与える情報が、単に、使用されるメチル化感受性制限酵素により認識されるシトシン残基のメチル化状態に関する情報だけであることである。当該制限酵素の選択は、検出可能な配列の数を自動的に制限する。それ故、当該ＣｐＧメチル化の中立分析は、可能性のないものである。
【００２１】
ＣｐＧメチル化の分析のための重硫酸塩処理
硫酸水素ナトリウムでの二本鎖ゲノムＤＮＡの処理は、非メチル化シトシン残基の脱アミノ化を導きウラシル残基とし、及びもはや相補的ではない２つの一本鎖の形成を導く。この処理の間、５−メチルシトシンが維持される。このようにして形成された配列間の相違は、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの相違の根拠を作り出す（Ｆｒｏｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８９（１９９２），１８２７−１８３１）。亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡは、ウラシル残基（以前は非メチル化シトシンであったもの）とチミジン残基がチミジンとして増幅され、５−メチルシトシン残基のみがシトシン残基として増幅されるＰＣＲにおいて直接的に使用され得る。増幅に依存して、ＰＤＲに使用されるプライマーは、メチル化配列と非メチル化配列とを区別し、又はメチル化状態とは無関係に、断片を増幅する。例えば、非特徴的なプライマーを使用して増幅されるＰＣＲ断片は、直接的にシークエンスされ、メチル化、及び非メチル化ＣｐＧの占有率を決定し得る。
【００２２】
さらなる方法は、メチル化の程度を決定するために、かかるＰＣＲ断片の物理的な相違（融解挙動、一本鎖構造、制限酵素のための制限部位など）を活用する（Ｄａｈｌ（２００３），Ｉｏｃ．ｃｉｔ．）。他の系統的アプローチは、特徴的なプライマー又はプローブによるメチル化、及び非メチル化配列の特異的増幅（メチル化特異的ＰＣＲ、ＭｅｔｈｙｌｉｇｈｔＰＣＲ）のための配列内の相違を活用する（Ｄａｈｌ（２００３），Ｉｏｃ．ｃｉｔ．）。ＰＣＲ産物の配列における亜硫酸水素塩−誘導の相違は、メチル化特異的オリゴヌクレオチド（ＭＳＯ）マイクロアレイを用いても見出され得る（Ｓｈｉ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８８（２００３），１３８−１４３；Ａｄｏｒｊａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３０（２００２），ｅ２１；Ｇｉｔａｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（２００２），１５８−１６４）。
【００２３】
当該メチル化感受性制限酵素と対照的に、亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡは、増幅されたゲノム断片におけるいくつかのＣｐＧ残基のメチル化状態に関する情報を提供し得る。おそらく、その低減された複雑さ、及びその高程度の変性に起因して、当該処理されたＤＮＡは、当該ゲノムを介する分析に適してはいない。
【００２４】
ＣｐＧメチル化の検出のためのさらなる方法
変性された一本鎖ＤＮＡ内のＣｐＧメチル化を認識する５-メチルシトシンに対する抗体は、主に個々の固定細胞の染色体上のＣｐＧメチル化の免疫組織化学的染色のために使用される。しかし、これらの抗体は、豊富にメチル化された配列に適してはいない。
【００２５】
１９９４年に既に、Ａ．Ｂｉｒｄ研究所は、親和性クロマトグラフィーを用いてメチル化ＤＮＡ断片を濃縮するための方法を開発した（Ｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６（１９９４），２３６−２４４）。マトリクスに結合する組み換えＭＥＣＰ２が、メチル化ＤＮＡを結合するために使用された。それ以来、この技術は、使用され、改良され、そして他の作業グループによるさらなる技術と組み合わされた（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（１９９９），２９１３−２９１８；Ｂｒｏｃｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２９（２００１），Ｅ１２３）。親和性マトリクスに対する強力な又はより劣る強力なメチル化ゲノム配列の結合は、濃密なメチル化を伴うＣｐＧアイランドをより低いメチル化密度を伴う他の配列から分離することを可能とする塩濃度に、依存する。この親和性クロマトグラフィーの不都合な点は、大量のゲノムＤＮＡ（５０〜１００μｇ）を必要とすること、及び比較的時間のかかる手順である。
【００２６】
以上の観点から、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が、細胞の転写活性を制御するための重要な後成的機構であることが明らかである。一般的に、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は、転写不活性と関連がある。しかし、正常な又は変性した分化過程の間、遺伝子座のメチル化パターンは変化し得る。従って、腫瘍形成の間、正常なメチル化パターンの逆転は、各々、腫瘍抑制遺伝子又は原がん遺伝子の如き、遺伝子の異常な抑制（又は活性化）を導き得、それ故、腫瘍形成を導く。それ故、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの検出、及びそれ故、調節されない腫瘍抑制遺伝子、及び／又は原がん遺伝子の同定は、最も外部の臨床的興味である。上記のように、先行技術は、メチル化ＤＮＡの検出のために異なるアプローチを記載するが、欠陥に悩まされている。例えば、先行技術の方法は、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの中立、ゲノムレベル解析を可能とはせず、又はハイスループット適用に適しておらず、又はＣｐＧメチル化ＤＮＡの検出において、特に検出対象として少量のＤＮＡしかないとき、信頼性がない。それ故、先行技術の欠陥、及び欠点を克服し得るメチル化ＤＮＡを検出するさらなる手段、及び方法の必要性の余地がある。従って、本発明の根底にある技術的問題は、上記必要性に応じる。
【００２７】
この技術的問題に対する解決法は、本願請求項において特徴付けられる態様を提供することにより達せられる。
【発明の開示】
【００２８】
よって、本発明の第１の態様は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）ファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと抗体のＦｃ部分とを含む二機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。該ＤＮＡ結合ドメインは本明細書で後述される。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、該断片がメチル化ＤＮＡ、好ましくはＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得る限り、その断片であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明好ましい一実施形態では、本発明の二機能性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 をさらに含む。好ましくは、該リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明の二機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、ＭＢＤをコードするヌクレオチド配列とＦｃ部分の間に、該ＭＢＤとリンカーポリペプチドとＦｃ部分の間で融合が起こるように配置される。「融合」とは、タンパク質をコードする核酸分子の遺伝子発現により個々のペプチド主鎖を介して複数のタンパク質またはその断片が共に線状結合することを指す。よって、好ましい融合タンパク質としては、ＭＢＤのＤＮＡ結合ドメインまたはその断片が含まれ、この断片は好ましくは、本明細書に記載されるような抗体のＦｃ部分とそれ自体共有結合しているリンカーポリペプチドと共有結合している、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡとの結合活性を有する。
【００３１】
該ポリペプチドリンカーは好ましくは、フレキシブルリンカーである。好ましくは、該リンカーは複数の、親水性の、ペプチド結合アミノ酸を含み、ＭＢＤのＤＮＡ結合ドメインのＣ末端とＦｃ部分のＮ末端を接続している。場合により、本発明のポリペプチドは、所望により該Ｆｃ部分の切断を可能とするプロテアーゼ切断部位をＦｃ部分の前に含む。プロテアーゼ切断部位は例えば、トロンビン切断部位である。
【００３２】
好ましくは、該ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン、アラニン、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、プロリン、イソロイシンおよび／またはアルギニン残基を含む。該ポリペプチドリンカーは複数の、アミノ酸配列の連続コピーを含むのがさらに好ましい。通常、ポリペプチドリンカーは、１〜２０、好ましくは、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６または１〜１５のアミノ酸を含むが、２０を超えるアミノ酸のポリペプチドリンカーも同様に機能し得る。本発明の好ましい一実施形態では、該ポリペプチドリンカーは、１〜１４のアミノ酸残基を含む。本発明の特に好ましい一実施形態では、本発明のポリペプチドにおける該ポリペプチドリンカーは１４のアミノ酸を含む。添付の実施例に示すように、該ポリペプチドリンカーは有利には、配列番号２（図１）の１１６〜１２９番でも示されるアミノ酸配列「ＡＡＡＤＰＩＥＧＲＧＧＧＧＧ」を含む。
【００３３】
本発明のポリペプチドは場合により、そのＮ末端および／またはＣ末端にタグを含む。「タグ」は、そのタグが融合するアミノ酸配列と同種または異種のアミノ酸配列である。該タグはとりわけ、それが融合するタンパク質の精製を容易にする、または該タンパク質の検出を容易にすることができる。好ましくは、該タグは、ＨＡタグ、ｍｙｃ６タグ、ｆｌａｇタグ、ｓｔｒｅｐタグ、ｓｔｒｅｐｌｌタグ、ＴＡＰタグ、ＨＡＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、Ｈｉｓ−６タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、インテインおよびストレプトアビジン(ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｅ)結合タンパク質（ＳＢＰ）タグからなる群から選択される。
【００３４】
ＣｐＧアイランドは多くの場合、遺伝子プロモーターと転写開始部位を含み、通常、正常細胞ではメチル化されていない。ＣｐＧアイランドのメチル化は、転写抑制と関連している。がんでは、ＣｐＧアイランドプロモーターのメチル化は腫瘍抑制遺伝子の異常なサイレンシングをもたらし、疾病の病因に関与している。これまでに、ヒトのがんにおけるＣｐＧアイランドの異常なメチル化の研究は主として候補遺伝子アプローチを採ってきたが、これにはいくつかの欠点がある。これらは例えば、高メチル化であれ低メチル化であれ、メチル化の対象となり得る腫瘍形成に関与する遺伝子座のカバーが不完全なこと、または例えば、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ（ＲＬＧＳ）を用いる場合、手段および方法の限定により遺伝子座の解析が不完全なことである。偏りのない、ＣｐＧメチル化ＤＮＡのゲノム全域検出を可能とするため、本発明は、例えば、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼまたは重亜硫酸塩処理を適用せずに、ＣｐＧメチル化の分離および検出を可能とする手段および方法を提供する。これらの手段および方法はとりわけ、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと効率的に結合する、メチル−ＣｐＧ結合性抗体様タンパク質に基づく。本明細書に記載されるように、このメチル−ＣｐＧ結合性抗体様タンパク質は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）ファミリーに属すタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと抗体の定常部分とを含む。
【００３５】
驚くことに、組み換えメチル−ＣｐＧ結合性抗体様タンパク質は、抗体のような様式でＣｐＧメチル化ＤＮＡに、好ましくは結合することができることが判明した。これは、本発明のメチル−ＣｐＧ結合性抗体様タンパク質が、ＣｐＧジヌクレオチドにおいて、好ましくは、メチル化されるＤＮＡであることが好ましいその「抗原」に対して、高い親和性と高い結合力を有することを意味する。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のポリペプチドの、その「抗原」に対する高い親和性と結合力は、該メチル−ＣｐＧ結合性抗体様タンパク質の独特の構造により生じるものである。本発明のポリペプチドのユニークな構造は、抗体の定常領域の存在により達成されるものと推測され、従って、当該ポリペプチドは好ましくは二機能性分子となる。これらの定常領域は、本発明の２つのポリペプチドの分子の各定常領域の免疫グロブリン重鎖の間でジスルフィド結合を形成すると考えられている。よって、抗体様構造は、抗体の構造を密接に類似して形成されることが好ましい。
【００３６】
ここでも特定の理論に拘束されるものではないが、この構造は例えば、本発明のポリペプチドに安定性をもたらすものと思われる。これは、当技術分野において、抗体の定常領域と融合されたタンパク質は、該タンパク質により高い安定性とより長い半減期を与え得るとされているためである。さらに、これらの定常領域の分子間相互作用によって生じた抗体様構造は、本発明のあるポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインを、本発明の別のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインの近接近に持ってくると考えられている。これにより、メチル−ＤＮＡ結合タンパク質とメチル化ＤＮＡの間で二価の相互作用が可能となる。よって、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの一部である２つのメチルＤＮＡ結合ドメインを介してその抗原に好ましく結合することができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドの高親和性結合はまた、とりわけ、好ましくは、本明細書に記載されているような独特の適用性を妨害または干渉し得る他のタンパク質との相互作用のためのドメインを含む全長メチル−ＤＮＡ結合タンパク質の代わりに、非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと特異的に結合することが知られているタンパク質のメチル−ＤＮＡ結合ドメインを使用することによっても達成される。このメチル−ＤＮＡ結合ドメインの使用はさらに、この検出は直接的なものであって間接的なものないことから、実際にメチル化ＤＮＡが結合していることが保証される。ほとんどの先行技術の方法は、ＰＣＲによりメチル化ＤＮＡを間接的に検出できるにすぎない。
【００３８】
これらの特性は本発明のポリペプチドを、たとえ該ＤＮＡが、本明細書に記載されるように、例えば、約１０ｎｇを超える量、１０ｎｇ未満、７．５ｎｇ未満、５ｎｇ未満、２．５ｎｇ未満、または約１ｎｇといった極めて少量でしか存在しない場合であっても、とりわけ、メチル化ＤＮＡを単離、精製富化および／または検出するための信頼性があり、かつ、容易に適用できる診断ツールとする。よって、本発明のポリペプチドは、その抗体様構造のために、例えば、単一試験管アッセイにおいて多段階手順を含む様々な適用にそれを適用可能とする強力な分子である。例えば、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの特異的分離および検出は、逆サウスウエスタンブロット解析およびメチル−ＣｐＧ免疫沈降法（ＭＣＩｐ）を用いて実証された。この技術は、リアルタイムＰＣＲ、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲと組み合わせると、例えば、全ゲノムＤＮＡが１ｎｇといった少量からの、候補ＣｐＧアイランドプロモーターのＣｐＧアイランドメチル化の高感度検出を可能とする。ＭＣＩｐにより生成されたゲノムＤＮＡ断片は、容易に増幅、標識およびＣｐＧアイランド・マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションに使用することができる。本明細書に記載の技術を使用すれば、ヒトがんにおけるＣｐＧアイランドの異常なメチル化のゲノム域プロフィールの作製、および例えば、腫瘍抑制遺伝子またはさらなる抑制遺伝子活性の同定が可能となる。
【００３９】
本発明を詳しく記載する前に、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、細菌、ベクターおよび試薬は変更可能であるので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。また、本明細書で用いられる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解すべきである。特に断りのない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は全て、当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
【００４０】
好ましくは、本明細書で用いられる用語は、“Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ，Ｎａｇｅｌ，Ｂ．ａｎｄ  ＫｏＩｂＩ，Ｈ．ｅｄｓ．（１９９５），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の記載と同様に定義される。本明細書および特許請求の範囲を通じ、特に断りのない限り、「含む」およびその活用形は、示されている数字若しくはステップまたは一連の数字若しくはステップを包含することを意味するが、他のいずれの数字若しくはステップまたは一連の数字若しくはステップを排除するものではないと理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に断りのない限り、複数の指示対象も含むということに留意しなければならない。よって、例えば、「ある試薬(ａ  ｒｅａｇｅｎｔ)」と記載する場合には、そのような種々の試薬の１又は複数を含み、また、「その方法(ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ)」と記載する場合には、本明細書に記載の方法に対して改変または置換可能な当業者に知られている等価なステップおよび方法に対する言及も含む。
【００４１】
本明細書において「核酸分子」とは、当該核酸分子により含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基のヌクレオチド配列を有する任意の核酸分子を包含し、これにより該塩基は核酸分子の主要構造を呈する。核酸配列は、センス鎖であれアンチ鎖であれ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、合成形態（例えば、ＰＮＡ）、および混合ポリマーを含むか、或いは当業者ならば容易に認識できるように、非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基も含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子であってもよい。さらに、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域からなってもよい。また、このポリヌクレオチドは、１又は複数の修飾塩基、または安定性若しくはその他の理由で修飾されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ主鎖を含んでもよい。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの非必須塩基が挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡには様々な修飾を行うことができ、従って、「核酸分子」には、化学的、酵素的、または代謝的修飾形態が含まれる。
【００４２】
本発明において「ポリペプチド」とは、互換的に用いられ、所与の長さのアミノ酸を包含するペプチド、タンパク質またはポリペプチドを意味し、ここでアミノ酸残基が共有ペプチド結合により連結されている。しかしながら、アミノ酸結合および／またはペプチド結合が機能的類似体により置換される、かかるタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣薬も本発明に包含され、並びにセレノシステインなどの遺伝子にコードされている２０種のアミノ酸以外のものも本発明に包含される。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドと呼ぶこともできる。記載のように、ポリペプチドおよびタンパク質という用語は本明細書では互換的に用いる場合が多い。ポリペプチドという用語はまた、ポリペプチドの修飾物も指し、それを排除しない。修飾としては、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、フォーミュレーション(ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ)、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸付加（アルギニン化など）、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３），ｐｇｓ．１−１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２（１９９０）；６２６−６４６，Ｒａｔｔａｎ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３（１９９２）；４８−６２参照）。
【００４３】
本発明のポリペプチドは好ましくは、本明細書に記載されるように、本発明の核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するか、或いは該ポリペプチドの産生方法により、または本明細書に記載の該ポリペプチドを発現し得る細胞の作出方法によって得られる。
【００４４】
好ましくは、本発明に関して、該ポリペプチドは二機能性ポリペプチドである。「二機能性ポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドが、メチル化ＤＮＡ、好ましくはＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合することに加え、本発明のポリペプチドの一部である抗体のＦｃ部分によってさらなる能力を有することを意味する。例えば、該Ｆｃ部分は好ましくは、化合物または部分を当該Ｆｃ部分と接合、連結、または共有結合的にカップリングさせる能力を与える。本明細書において、「共有結合的にカップリングされる」とは、特定の化合物または部分が、互いに直接共有結合されているか、或いはまた、ブリッジ、スペーサー、または１つの連結部分若しくは複数の連結部分などの、１つの介在部分または複数の介在部分によって互いに間接的に共有結合的に連結されていることを意味する。
【００４５】
このような化合物は検出可能な物質であり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々な陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。この検出可能な物質は、当技術分野で公知の技術を用い、抗体（またはそのフラグメント）のＦｃ部分の直接、または中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカーなど）を介して間接的にカップリングまたは接合させることができる。本発明に従い診断薬として用いるために抗体のＦｃ部分に接合し得る金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。
【００４６】
好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；好適な放射性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、または99Ｔｃが挙げられる。
【００４７】
さらに、該Ｆｃ部分は、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤）などの治療用成分、治療薬または放射性金属イオン（例えば213Ｂｉなどのα放射体と接合させてもよい。細胞毒素または細胞傷害性薬剤としては、細胞に有害ないずれの薬剤も含む。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにそれらの類似体または同族体が挙げられる。
【００４８】
治療薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ(ｔｈｉｏｅｐａ)、クロルムブシル(ｃｈｌｏｒｍｂｕｃｉｌ)、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド(ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（１１）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、並びに細胞分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【００４９】
さらに、本発明のポリペプチドのＦｃ部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドとカップリングまたは接合させることもできる。かかるタンパク質として、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス薬などのタンパク質が挙げられる。
【００５０】
該Ｆｃ部分はまた、本発明のポリペプチドと、本明細書に記載されるような、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用な固相支持体との結合を可能とする。かかる固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンなどが挙げられる。
【００５１】
化合物をＦｃ部分と接合、カップリングまたは連結する技術は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｃｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５），およびＴｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１１９−１５８参照。
【００５２】
「メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）ファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン」とは、タンパク質ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３およびＭＢＤ４を含むＭＢＤファミリーのタンパク質のメチル−ＤＮＡ結合ドメインの構造的および／または機能的特徴を好ましく有するポリペプチドを包含する。このメチル−ＤＮＡ結合活性は、当技術分野で公知の方法によって試験することができる。好ましくは、「メチル化ＤＮＡ」とは、ヘミメチル化、または両鎖でメチル化されたＤＮＡ、または一本鎖メチル化ＤＮＡを含む、メチル化ＤＮＡ、より好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡを包含する。これまでで最も重要な例は、ほとんどの場合はジヌクレオチドＣｐＧに関して、また、ＣｐＮｐＧ配列およびＣｐＮｐＮ配列に関して生じたメチル化シトシンである。基本的に、他の天然ヌクレオチドもメチル化され得る。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるように、モノマーまたはダイマーまたは多価分子のいずれかとしてメチル化ＤＮＡと結合することが好ましい。本発明のポリペプチドは、高メチル化ＤＮＡまたは低メチル化ＤＮＡと結合し得るのが好ましい。本発明のポリペプチドは、単一のメチル化ＣｐＧ対と結合することができるのが好ましい。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３およびＭＢＤ４は、メチル−ＣｐＧ結合ドメインを共有する脊椎動物タンパク質の一ファミリーを構成している。該ＭＢＤタンパク質ファミリーは既知のＭＢＤの配列に基づく２つのサブグループを含む。
【００５４】
ＭＢＤ４のメチル−ＤＮＡ結合ドメインは、一次配列においてはとほとんど同じであるが、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２およびＭＢＤ３のメチル−ＤＮＡ結合ドメインは、ＭＢＤ４またはＭｅＣＰ２のいずれかよりも互いにより類似している。しかしながら、各タンパク質内のメチル−ＤＮＡ結合ドメインは、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３およびＭＢＤ４の５つ全ての遺伝子内の保存された位置にあるイントロンの存在に基づけば、進化的に近縁であると思われる。やはり、ＭＢＤファミリーのメンバー間の配列類似性は、それらのメチル−ＤＮＡ結合ドメインに主として限定されるが、ＭＢＤ２およびＭＢＤ３は類似しており、それらの長さの大部分にわたって全体として約７０％の同一性を有する。最大の違いはＣ末端にあり、そこでＭＢＤ３は１２の連続するグルタミン酸残基を有する。
【００５５】
本発明において有用なＭＢＤまたはその断片、好ましくは、メチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、例えば、当技術分野で公知の、好ましくは本明細書に記載の手段および方法を使用し、既知のＭＢＤとＭＢＤであると思われる配列とを比較し、および／または整列することによる、配列比較および／または整列を用いることで同定することができる。
【００５６】
例えば、比較される２つの配列の双方の位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットにより占められている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアラニンにより示されているか、または２つのポリペプチドの各々のある位置がリシンにより占められている場合）、それら個々の分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性％は、その２配列間で共通の一致するまたは同一の位置の数を、比較される位置の数で割ったものに１００を掛けたものの関数である。例えば、２配列中の位置１０のうち６が一致する、または同一であれば、その２配列は６０％同一である。例を示せば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは５０％の相同性を有する（全ての位置６のうち３が一致する）。
【００５７】
一般に、比較は、２配列を、最大の相同性および／または同一性が得られるように整列させて実施される。かかる整列は、例えば、便宜には整列プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータープログラムもより実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎの方法（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８（１９７０）：４４３−４５３を用いて提供することができる。相同配列は同一または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、整列させられた対照配列における対応するアミノ酸残基との保存的置換であるか、または「許容される点突然変異」である。これに関して、参照配列の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的または機能的に類似の、例えば、類似の大きさ、形状、電荷、共有結合または水素結合の形成力などを含む化学的特性を有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，５：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：Ｓｕｐｐｌ．３，ｃｈａｐｔｅｒ  ２２：３５４−３５２，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）に「許容される突然変異」として定義されている基準を満たすものである。
【００５８】
好ましくは、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、本明細書に記載されるような構造的特徴および／または機能的特徴を有する。好ましくは、本明細書に記載のメチル−ＤＮＡ結合タンパク質の断片は、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合することができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、好ましくは、昆虫起源、線虫起源、魚類起源、両生類起源、より好ましくは、脊椎動物起源、いっそうより好ましくは、哺乳類起源、最も好ましくは、マウス、特に好ましくはヒト起源のものである。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８（２００１），１−６の図１に示され、メチル化ＤＮＡと結合することができる、特徴的なループを有する固有のα−ヘリックス／β−鎖サンドイッチを有する。
【００６１】
より好ましくは、本発明のポリペプチドのＭＢＤまたはその断片は、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆｅ（２００１）前掲の図１に示され、メチル化ＤＮＡと結合することができ、ＭＢＤの少なくとも５０、より好ましくは少なくとも６０、いっそうより好ましくは少なくとも７０または少なくとも８０のアミノ酸残基を含む。
【００６２】
いっそうより好ましくは、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆｅ（２００１）前掲の図１に示され、メチル化ＤＮＡと結合することができ、ＭＢＤと、アミノ酸レベルで、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、より好ましくは９５％または９７％、いっそうより好ましくは９８％、最も好ましくは９９％の同一性を有する。配列、例えば、アミノ酸配列の同一性を決定するための手段および方法は、本明細書の他所に記載されている。
【００６３】
最も好ましくは、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインまたはその断片は、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｆｅ（２００１）前掲の図１に示されているＭＢＤタンパク質のメチル−ＤＮＡ結合ドメイン、またはＨｅｎｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９（２００３），２６９−７７に記載されるＭＢＤタンパク質のメチル−ＤＮＡ結合ドメインを含み、かつ、メチル化ＤＮＡと結合することができる。
【００６４】
もちろん、本発明によれば、本発明のポリペプチドは好ましくは二機能性であり、好ましくは、上記のような２つのメチル−ＤＮＡ結合ドメインを担持し、好ましくは両メチル−ＤＮＡ結合ドメインとも単一のメチル化ＣｐＧ対と結合することができる。
【００６５】
本発明の特定の好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＭＢＤ２のものである。より特に好ましい実施形態では、メチル−ＤＮＡ結合ドメインは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００３９２７のアミノ酸配列の１４４〜２３０番のアミノ酸を含むヒトＭＢＤ２のものである。最も特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列の２９〜１１５番のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
本発明のポリペプチドの成分である、抗体の「Ｆｃ部分」は、好ましくは、少なくとも、免疫グロブリン重鎖分子の定常領域の部分を含む。このＦｃ領域は、好ましくは、定常ドメインヒンジ領域とＣH２およびＣH３ドメインに限定される。本発明のポリペプチドのＦｃ領域はまた、ヒンジ領域の部分、分子間ジスルフィド橋を形成し得る部分、並びにＣH２およびＣH３ドメイン、またはそれらの機能的等価物に限定され得る。
【００６７】
或いは、Ｆｃ部分は、本発明のポリペプチドが上記のポリペプチドの特性、特に、添付の実施例で用いられるポリペプチドの特性をなお有するのに必要な多くのＣH領域を少なくとも含むことも好ましい。
【００６８】
別の例では、該定常領域が、当技術分野で公知の定常領域と比較した場合に１又は複数のアミノ酸置換を含み得ることも好ましい。好ましくは、定常領域は、１〜１００、１〜９０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、１〜４０、１〜３０または１〜２０、より好ましくは、１〜１０、いっそうより好ましくは、１〜９、１〜８、１〜７または１〜６、最も好ましくは、１〜５、１〜４、１〜３または２または１の置換を含む。比較は好ましくは、当技術分野で公知のように、またはより好ましくは、本明細書の他所に記載されているように行う。
【００６９】
あるいは、該定常領域は好ましくは、少なくともＣH１領域、より好ましくは、ＣH１およびＣH２領域、最も好ましくは、ＣH１、ＣH２およびＣH３領域を含む。当技術分野で公知のように、抗体の定常領域は、約１１０のアミノ酸からなる３つの特徴的な免疫グロブリンドメインを担持する２つの免疫グロブリン重鎖を含み、ここで、この２つの免疫グロブリン重鎖は、ジスルフィド結合により共有結合的に連結されている。特定の理論に拘束されるものではないが、メチル−ＤＮＡ結合ドメインと抗体のＦｃ部分を含む本発明の未完成ポリペプチドは、好ましくは２つのポリペプチドがそれらのＦｃ部分において、抗体の定常領域と類似または好ましくは同一の様式で連結されて、本明細書に記載されるような二機能性ポリペプチドとなるように、宿主細胞内で折り畳まれる。
【００７０】
また、この定常領域は好ましくは、ニワトリまたはカモ起源のものであり得ることが企図される。いっそう好ましくは、該定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥイソ型のものであり、より好ましくは、ＩｇＧイソ型のものであり、最も好ましくは、ＩｇＧＩイソ型のものである。好ましくは、上述のイソ型は脊椎動物起源、より好ましくは、哺乳類のものであり、いっそうより好ましくは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ロバ、ラクダまたはチンパンジー起源のものであり、最も好ましくは、ヒト起源のものである。好ましくは、該ＩｇＧイソ型はクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のものであり、該ＩｇＡイソ型はクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２のものである。
【００７１】
本明細書に記載されるように、本発明は好ましくは、二機能性ポリペプチドを提供する。さらにまた、本発明の１又は複数の二機能性ポリペプチドを含む多量体二機能性ポリペプチドが企図される。かかる多量体は、ＩｇＭペンタマーおよびＩｇＡダイマーなど、通常多価であるＩｇ分子のＦｃ領域またはその一部を使用することによって製造することができる。Ｊ鎖ポリペプチドは、ＩｇＭペンタマーおよびＩｇＡダイマーを形成および安定化させるのに必要であり得ると理解される。
【００７２】
より好ましい実施形態では、上述の本発明のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、
（ａ）配列番号１（図１）に示されるヌクレオチド配列を有する核酸配列；
（ｂ）配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列；
（ｃ）配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、ここで、該断片が該ポリペプチドの少なくともアミノ酸１３０〜３６１番を含み、メチル化ＤＮＡと結合し得る、前記核酸配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を有する核酸配列であって、該変異体において１又は複数のアミノ酸残基が該ポリペプチドに比べて置換されており、該変異体がメチル化ＤＮＡと結合し得る、前記核酸配列；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの核酸配列とハイブリダイズし、かつ、（ａ）の核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも６５％同一であって、メチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、核酸配列；
（ｆ）メチル化ＤＮＡと結合し得る（ｂ）の核酸分子によりコードされるポリペプチドと少なくとも６５％同一であり、かつ、メチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を有する核酸配列；および
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と縮重しているヌクレオチド配列を有する核酸分子
またはかかるポリヌクレオチドの相補鎖からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
上記のように、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドの断片は、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列の少なくともアミノ酸１３０〜３６１番を含む。これは、該断片が、Ｆｃ部分に相当するアミノ酸１３０〜３６１の他に、該断片が非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得るように１又は複数のアミノ酸を含み得ることを意味する。よって、該断片は、より好ましくは、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列の少なくとも１１６〜３６１番のアミノ酸を含むと考えられる。いっそうより好ましくは、該断片は、配列番号２（図１）に示されるアミノ酸配列の少なくとも２９〜１１５番および１３０〜３６１番のアミノ酸を含み得る。最も好ましい実施形態では、該断片は、少なくとも２９〜３６１番のアミノ酸を含み得る。一般に、本発明のポリペプチドの断片は、非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得ることが好ましい。この能力は、当技術分野で公知の方法により、または好ましくは、添付の実施例に記載されている方法によって試験することができる。
【００７４】
本発明のポリペプチドの「変異体」は、該ポリペプチドと比較して１又は複数のアミノ酸残基が置換されている、好ましくは、保存的に置換されており、かつ、該変異体が好ましくは、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドを包含する。かかる変異体としては、本発明のポリペプチドの活性に全く作用がないように、当技術分野で公知の一般ルールに従って選択された欠失体、挿入体、逆位体、反復体および置換体が挙げられる。例えば、いかにして表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作出するかに関する指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：（１９９０）１３０６−１３１０に示されており、その中で、筆者は、アミノ酸配列の変異許容性を調べるには２つの主要な方法論があることを示している。
【００７５】
第１の方法論は、進化過程での自然選択によるアミノ酸置換の許容性を利用する。異種のアミノ酸配列を比較することにより、保存されているアミノ酸を同定することができる。これらの保存されているアミノ酸はおそらくタンパク質機能に重要である。これに対し、置換が自然選択に許容されたアミノ酸位は、これらの位置がタンパク質機能には重要でないことを示す。よって、アミノ酸置換を許容する位置は、そのタンパク質の生物活性をなお維持しつつ修飾可能である。
【００７６】
第２の方法論は、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変異を導入するような遺伝子操作を用いる。例えば、部位指定突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発（分子内の各残基ごとに単一のアラニン突然変異を導入する）が使用可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：（１９８９）１０８１−１０８５）。結果として得られた突然変異分子を次に、生物活性に関して試験することができる。
【００７７】
これらの筆者らが述べているように、これら２つの方法論により、タンパク質はアミノ酸置換に驚くべき許容性を示すことが明らかになった。これらの筆者らはさらに、そのタンパク質内の特定のアミノ酸位においてどのアミノ酸変化が許容され得るかを示している。例えば、最も埋め込まれている（タンパク質の三次構造中に）アミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴で保存されているものは一般に少ない。
【００７８】
本発明は、同一性程度は低いが、本発明のポリペプチドによって遂行される１又は複数の機能を遂行するのに十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は、保存的アミノ酸置換により決定される。かかる置換は、ポリペプチドにおけるあるアミノ酸を特徴的（例えば、化学特性）別のアミノ酸で置換するものである。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（前記）によれば、かかる保存的置換は表現型的にサイレントであり得る。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントであり得るかに関するさらなる指針は、Ｂｏｗｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：（１９９０）１３０６−１３１０に示されている。
【００７９】
本発明の許容される保存的アミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの置換、並びに小型アミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの置換を含む。
【００８０】
さらに、本発明はまた、下表に示される保存的置換も包含する。
【００８１】
【表２】
2008521389.tif 000003
【００８２】
上記の使用の他、かかるアミノ酸置換はまた、タンパク質またはペプチドの安定性も高め得る。本発明は、例えば、そのタンパク質またはペプチド配列内に１又は複数の非ペプチド結合を（ペプチド結合に取って代わる）を含むアミノ酸置換を包含する。また、天然のＬ−アミノ酸以外のアミノ酸残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然若しくは合成アミノ酸、例えば、βまたはγアミノ酸を含む置換も含まれる。
【００８３】
同一性および類似性とも、次の刊行物：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｌｉｕａｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，ＤＭ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｉｎｆｏｒｍａｆｉｅｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｅ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照すれば、容易に算出することができる。
【００８４】
上記のように、本発明は好ましくはまた、配列番号１に示される核酸配列、本明細書に記載されるようなその断片または変異体（図１）とハイブリダイズし、かつ、配列番号１に示される核酸配列（図１）と少なくとも６５％同一であり、かつ、好ましくは、非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
【００８５】
また、記載されるように、本発明は、好ましくは、配列番号２に示されるポリペプチドと少なくとも６５％、より好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは、９９％同一であるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
【００８６】
本発明に従って用いる場合「ハイブリダイズする」とは、好ましくは、ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションに関する。「ハイブリダイズする配列」とは、好ましくは、非メチル化ＤＮＡよりも、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドをコードする、上記のような核酸配列と少なくとも６５％、いっそうより好ましくは、少なくとも７０％、特に好ましくは、少なくとも８０％、より特に好ましくは、少なくとも９０％、いっそうより特に好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、少なくとも９７、９８％または９９％の配列同一性を示す配列を指す。
【００８７】
該ハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、またはＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（Ｅｄｓ．）“Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）に記載されている従来のプロトコールに従って確立することができる。
【００８８】
条件の設定は十分当業者の技術の範囲内であり、当技術分野に記載のプロトコールに従って決定することができる。よって、特異的にハイブリダイズする配列だけの検出は、通常、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃などのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を必要とする。相同な、または厳密にではないが相補的な配列の検出のための非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃に設定することができる。
【００８９】
周知のように、プローブの長さ、および判定される核酸の組成も、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターとなる。上記の条件の変更は、ハイブリダイゼーション試験においてバックグラウンドを抑えるために用いられる択一的遮断試薬の包含および／または置換によって行い得ることに留意する。
【００９０】
典型的な遮断試薬としては、デンハートの試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の専売製剤が挙げられる。特定の遮断試薬を含めると、適合性の問題から上記のハイブリダイゼーション条件の変更が必要となる場合がある。ハイブリッドする核酸分子はまた、上記の分子の断片を含む。このような断片は本明細書に記載されるような核酸配列を表し得る。さらに、上述の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子はまた、これらの分子の相補的断片、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。さらにまた、ハイブリダイゼーション複合体は、相補的なＧ塩基とＣ塩基の間、また、相補的なＡ塩基とＴ塩基の間の水素結合の形成による、２つの核酸配列間の複合体を指し、これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によりさらに安定化され得る。
【００９１】
この２つの相補的核酸配列において、水素結合は逆平行の形である。ハイブリダイゼーション複合体は液相中（例えば、ＣｏｔまたはＲｏｔ分析）、または液相に存在するある核酸配列と固相支持体（例えば、細胞が固定化されている膜、フィルター、チップ、ピンまたはスライドガラス）上に固定化された別の核酸配列との間で形成され得る。相補的または相補性とは、許容される塩および温度条件下での、塩基対合によるポリヌクレオチドの自然結合を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、いくつかの核酸だけが結合する「部分的」なものであってもよいし、或いは一本鎖分子間に全体的な相補性が存在する場合には完全なものであり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーション効率および強度に有意な影響を及ぼす。これは、核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【００９２】
本発明によれば、２以上の核酸配列またはアミノ酸配列に関して「同一」または「同一性％」とは、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いて、または手動の整列と目視検査により、ある比較枠にわたって、または所定の領域にわたって最大一致が得られるように比較および整列した場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（例えば、少なくとも６５％同一、好ましくは、少なくとも７０〜９５％同一、より好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の）複数の配列または部分配列を指す。例えば、６５％〜９５％またはそれを超える配列同一性を有する配列は、実質的に同一であるとみなされる。かかる定義はまた、試験配列の相補物に対しても当てはまる。好ましくは、記載されている同一性は、少なくとも約２３２アミノ酸長または６９６ヌクレオチド長の領域にわたって存在する。当業者ならば、当技術分野で公知のように、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２（１９９４），４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６（１９９０），２３７−２４５）に基づくものなどのアルゴリズムを用い、配列間の同一性％をどのようして決定すればよいかが分かるであろう。
【００９３】
ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは一般に、配列中の内部の不一致欠失または付加、すなわち、ギャップを計算に入れないが、これは手作業で補正を行い、同一性％の過剰見積を避けることができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷでは、その同一性計算において配列ギャップを考慮に入れる。また、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１９７７），３３８９−３４０２）の当業者に利用可能である。核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムはデフォルトとして、ワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス（Ｗ）３、および期待値（Ｅ）１０を用いる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，（１９８９），１０９１５）では、整列値（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖比較を用いる。
【００９４】
例えば、基本的局所配列ツールを表すＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１９９７），３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６（１９９３），２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０），４０３−４１０）は、局所配列の整列に関して検索するために使用することができる。ＢＬＡＳＴは、配列の類似性を判定するためにヌクレオチド配列とアミノ酸配列の双方の整列を行う。整列の局所性のため、ＢＬＡＳＴは正確な一致の判定または類似配列の同定に特に有用である。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本単位は、高スコア断片対（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、その整列が局所的に最大になり、その整列スコアがユーザーにより設定された閾値スコアまたはカットオフスコアに一致するか、またはそれを超える、任意の、しかし、同じ長さの２つの配列断片からなる。ＢＬＡＳＴアプローチは、問い合わせ配列とデータベース配列の間でＨＳＰを探し、見出された一致の統計学的有意性を評価し、さらにユーザーが選択した有意な閾値を満たす一致だけを報告する。パラメーターＥは、データベース配列の一致を報告するための統計学的に有意な閾値を設定するものである。Ｅは、全データベース検索の範囲内で、ＨＳＰ（またはＨＳＰセット）の機会の期待頻度の上限として説明される。その一致がＥを満たすデータベース配列が、このプログラムの出力として報告される。
【００９５】
ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７），前掲；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３），前掲；Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０），前掲）を用いる類似のコンピューター技術が、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどのヌクレオチドデータベースにおいて同一または関連の分子を検索するために用いられる。この分析は、膜に基づくハイブリダイゼーションを何回も行うより、はるかに迅速である。さらに、このコンピューター検索の感度を改良すれば、特定の一致が正確なものとして分類されるか、類似のものとして分類されるかを判定することができる。
【００９６】
この検索の基本は、
【化１】
2008521389.tif 000004
として定義される解であり、２配列間の類似性の程度および配列一致の長さの双方も考慮に入れる。
【００９７】
例えば、解が４０であれば、その一致は１〜２％の誤差内で正確であり、７０であれば、その一致は正確である。類似分子は通常、１５〜４０の間の解を示すものを選択することにより同定され、それより低いスコアは関連分子を識別し得る。
【００９８】
さらに、本発明はまた、その配列が上記の核酸分子の配列と比較して縮重している核酸分子に関する。本発明に従って用いる場合、「遺伝コードの結果として縮重している」とは、遺伝コードの重複により、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。
【００９９】
もちろん、本発明はまた、上述および後述の核酸分子が一本鎖型であり得る場合は、それらに対する相補鎖も考慮する。
【０１００】
好ましくは、本発明の核酸分子はいずれの種類の核酸であってもよく、例えば、ＤＮＡ、ゲノムｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）である。
【０１０１】
本発明の目的では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はポリアミド型のＤＮＡ類似体であり、アデニン、グアニン、チミンおよびシトシンのモノマー単位は市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。リン、酸化リン、またはデオキシリボース誘導体などのＤＮＡの特定の成分がＰＮＡには存在しない。Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７（１９９１）；およびＥｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６６６（１９９３）により開示されているように、ＰＮＡは相補的ＤＮＡ鎖と特異的かつ強固に結合し、ヌクレアーゼにより分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡそれ自体よりもＤＮＡと強く結合する。これはおそらくは、これら２鎖間に静電気的な反発がなく、また、そのポリアミド主鎖がより柔軟であるためである。このため、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重らせんは、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重らせんよりも広範なストリンジェンシー条件下で結合し、複合体のハイブリダイゼーションの遂行をより容易にする。強い結合のため、ＤＮＡの場合よりも短いプローブが使用できる。さらに、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いれば、単一塩基の不一致が判定できる可能性が高いが、これは、ＰＮＡ／ＤＮＡ１５マーの単一の不一致が融点（Ｔm）を８℃〜２０℃引き下げるためである（これに対し、ＤＮＡ／ＤＮＡ１５マー二重らせんの場合は４℃〜１６℃）。また、ＰＮＡに荷電基が存在しないことは、低イオン強度でハイブリダイゼーションを行うことができ、分析中、塩による干渉の可能性が小さくなることを意味する。
【０１０２】
このＤＮＡは例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。ＲＮＡは例えば、ｍＲＮＡであってもよい。核酸分子は天然、合成または半合成であってもよいし、或いはペプチド核酸（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４（１９９１），１４９７−１５００）またはホスホロチオエートなどの誘導体であってもよい。さらに、この核酸分子は、上述の核酸分子のいずれかを単独または組み合わせて含む、組み換え産生されたキメラ核酸分子であってもよい。
【０１０３】
好ましくは、本発明の核酸分子はベクターの一部である。よって、本発明は、もう１つの実施形態において、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。このようなベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、または遺伝子工学において通常用いられているその他のベクターであってよく、好適な宿主細胞において、好適な条件下で該ベクターの選択および／または複製を可能とするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含んでもよい。好ましい実施形態では、該ベクターは、本発明の核酸分子が、本明細書に記載されるような原核生物または真核生物宿主細胞において発現を可能とする発現制御配列に作動可能なように連結されている、発現ベクターである。本明細書において「作動可能なように連結される」とは、１又は複数の発現制御配列と発現させるポリヌクレオチドのコード領域の間における、その発現制御配列と適合する条件下で発現が遂行されるような連結を指す。
【０１０４】
よって、本発明の核酸分子は、いくつかの市販のベクター中に挿入することができる。非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＲＴｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１  ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＢＰＶ−１、ｐｄＢＰＶＭＭＴｎｅｏ、ｐＲＳＶｇｐｔ、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＵＣＴａｇ、ｐｌＺＤ３５、ｐＬＸＩＮおよびｐＳＩＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）並びにｐｌＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、哺乳類細胞に適合するプラスミドベクターが挙げられる。好ましくは、本発明の核酸分子は、ベクターＳｉｇｎａｌ  ｐｌＧ  ｐｌｕｓ（Ｉｎｇｅｎｉｕｓ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に挿入される。ｐＢｌｕｅＢａｃ、ＢａｃＰａｃｚバキュロウイルス発現系（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、およびＭａｘＢａｃＴＭバキュロウイルス発現系，昆虫細胞およびプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのバキュロウイルスベクターが市販されており、生物学的に活性なタンパク質を高収率で産生するために用い得る（また、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９３），Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，３，９；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐ．１２７も参照）。さらに、ｐｃＤＮＡ２などの原核生物ベクター、およびｐＹｅｓ２などの酵母ベクターが、本発明と共に用いるのに好適な他のベクターの限定されない例である。
【０１０５】
本願の他の好ましい発現ベクターは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＥＳ（登録商標）シリーズなど、当技術分野で周知のショウジョウバエ細胞でタンパク質を発現させるためのものがある。好ましくは、該ショウジョウバエ細胞発現ベクターはｐＭＴＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。このｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓベクターは、次のような付加的な特徴を提供する。このベクターは、ＤＮＡ収率を向上させ、サブクローニング効率を高めるために小型（３．６ｋｂ）であり、抗Ｖ５抗体を用いた迅速検出のためのＣ末端Ｖ５エピトープタグを有し、ニッケルキレート樹脂を用いた組み換え融合タンパク質の簡単な精製のためのＣ末端６ｘＨｉｓタグを有する。
【０１０６】
ベクター修飾技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１），前掲を参照すること。ベクターはクローニングまたは発現のための１又は複数の複製および遺伝系、宿主における選択のための１又は複数のマーカー（例えば、抗生物質耐性）、および１又は複数の発現カセットを含む。
【０１０７】
該ベクターに挿入されるコード配列は、標準的な方法により合成するか、天然源から単離するか、またはハイブリッドとして調製することができる。これらのコード配列と転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび／またはインスレーター）との、および／または他のアミノ酸コード配列との連結は、確立された方法を用いて行うことができる。
【０１０８】
さらに、これらのベクターは、本発明の核酸配列の他、好適な宿主内でコード領域の適切な発現を可能とする発現制御エレメントを含む。かかる制御エレメントは当業者には既知であり、プロモーター、翻訳開始コドン、翻訳および挿入部位、挿入部をベクターに導入するための内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２００１），１４７１−１４７６）を含み得る。好ましくは、本発明の核酸分子は、真核細胞または原核細胞での発現を可能とする当該発現制御配列と作動可能なように連結されている。
【０１０９】
真核細胞および原核細胞での発現を保証する制御エレメントは当業者には周知である。上述のように、これらの制御エレメントは通常、転写の開始を保証する調節配列、並びに任意選択の、転写の終結と転写物の安定化を保証するポリ−Ａシグナルを含む。さらなる調節エレメントとしては、転写エンハンサー並びに翻訳エンハンサー、および／または自然状態で会合している、または異種のプロモーター領域を含み得る。例えば哺乳類宿主細胞での発現を可能とする、あり得る調節エレメントとしては、ＣＭＶ−ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ヒト延長因子１α−プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣａＭ−キナーゼプロモーターまたはＳＶ４０−エンハンサーを含む。
【０１１０】
原核細胞での発現に関しては、例えば、ｔａｃ−ｌａｃ−プロモーター、ｌａｃＵＶ５またはｔｒｐプロモーターをはじめとする多数のプロモーターが記載されている。このような調節エレメントは、転写の開始を担うエレメントの他、当該ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終結シグナルも含み得る。これに関しては、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，とりわけ、添付の実施例において用いられる）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）またはｐＧＥＭＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはラムダｇｔ１１などの原核生物発現ベクターといった好適な発現ベクターは当技術分野で公知である。
【０１１１】
本発明の発現ベクターは、本発明の核酸のおよびタンパク質の、少なくとも複製、および好ましくは発現を命令することができる。好適な複製起点としては、例えば、Ｃｏｌ  Ｅ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３複製起源が挙げられる。好適なプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ｌａｃＺプロモーター、ｇａｌ  １０プロモーターおよびオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）多角体プロモーターが挙げられる。好適な終結配列としては、例えば、ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多角体ポリアデニル化シグナルが挙げられる。選択マーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性などが挙げられる。特殊設計ベクターは、細菌−酵母、または細菌−動物細胞、または細菌−真菌細胞、または細菌−無脊椎動物細胞など、異なる宿主細胞間のＤＮＡのシャッフルを可能とする。
【０１１２】
該ベクターは、本発明の核酸分子の他、分泌シグナルをコードする核酸配列をさらに含み得る。本発明のポリペプチドがショウジョウバエ細胞、好ましくは、ショウジョウバエＳ２細胞で発現される場合、本発明に従って好ましい使用される本発明の分泌シグナルは、当技術分野で周知のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＢｉＰ分泌シグナルである。本発明において使用される好ましいＢｉＰ分泌シグナルは、配列番号２の１〜２８番のアミノ酸配列で示される。他の分泌シグナル配列も当業者に周知である。
【０１１３】
さらに、使用する発現系に応じ、発現したポリペプチドをある細胞コンパートメントに向けることができるリーダー配列を、本発明の核酸分子のコード配列に付加してもよく、これも当技術分野で周知である。当該リーダー配列は、翻訳開始および終結配列、並びに好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部の、とりわけ細胞外の膜への分泌を命令し得るリーダー配列と適当な位相で組み立てる。所望により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現した組み換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＣまたはＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。ひと度ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主は当該ヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件下で維持され、所望により、その後、本発明のタンパク質、抗原性断片または融合タンパク質の回収および精製を行うことができる。もちろん、当該ベクターはまた、病原生物由来の調節領域も含むことができる。
【０１１４】
さらに、当該ベクターは、発現ベクターの他、遺伝子導入および／または遺伝子標的化ベクターであってもよい。治療遺伝子（例えば、ワクチン用）をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ技術により細胞へ導入することに基づく遺伝子療法は、遺伝子導入の最も重要な適用の１つである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための好適なベクター、ベクター系および方法は文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６），５３４−５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７９（１９９６），９１１−９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（１９９２），８０８−８１３，Ｉｓｎｅｒ，Ｌａｎｃｅｔ  ３４８（１９９６），３７０−３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７（１９９５），１０７７−１０８６；Ｗａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（１９９６），７１４−７１６；ＷＯ９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７；Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７（１９９６），６３５−６４０またはＶｅｒｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９（１９９７），２３９−２４２およびその中に引用されている参照文献を参照すること。
【０１１５】
本発明の核酸分子および本明細書で上記されたベクターは、細胞へ直接導入するよう、またはリポソーム若しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して導入するように設計することができる。さらに、バキュロウイルス系、またはワクシニアウイルス若しくはセムリキ森林ウイルスに基づく系を、本発明の核酸分子のための真核生物発現系として使用することもできる。組み換え産生の他、本発明のタンパク質断片、融合タンパク質、または抗原性断片を、固相技術を用いた直接的ペプチド合成によって産生させてもよい（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９６９）Ｓｏｌｏｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１９６３），２１４９−２１５４参照）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手動法を用いて、または自動法により行うことができる。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を、製造業者が提供している説明書に従って用いて行うことができる。様々な断片を別個に化学合成し、化学法を用いて化合し、全長分子を作製することができる。
【０１１６】
本発明はさらに、本発明の核酸分子または本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞に関する。当該宿主は、該ベクターまたはヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することにより作出され、その際、その細胞におけるその存在が、本発明のヌクレオチド配列によりコードされるか、または本発明のヌクレオチド配列若しくはベクター（なお、このヌクレオチド配列および／またはコードされるポリペプチドは宿主細胞に対して外来である）を含むタンパク質の発現を媒介する。
【０１１７】
「外来」とは、そのヌクレオチド配列および／またはコードされるポリペプチドが宿主に対して異種である（これは、異なるゲノムバックグラウンドを有する細胞または生物に由来することを意味する）か、または宿主と同種であるが、該ヌクレオチド配列の天然に存在する対象物とは異なるゲノム環境にあることを意味する。これは、当該ヌクレオチド配列が宿主と同種である場合に、当該宿主のゲノムにおける本来の位置にはないこと、特に、異なる遺伝子に囲まれていることを意味する。この場合、該ヌクレオチド配列はその固有のプロモーターの制御下にあっても異種プロモーターの制御下にあってもいずれでもよい。導入された核酸分子またはベクターの位置は、当業者ならば、当業者に周知の方法、例えばサザンブロット法を用いることで決定することができる。  宿主中に存在する本発明のベクターまたはヌクレオチド配列は宿主のゲノムに組み込まれても何らかの形で染色体外で維持されてもいずれでもよい。これに関し、本発明のヌクレオチド配列は、相同組換えにより突然変異遺伝子を復帰または作出するために使用することができる。
【０１１８】
該宿主はいずれの原核細胞または真核細胞であってもよい。好適な原核細胞／細菌細胞は一般に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、レイ菌(Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ)または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなクローニングに使用されているものである。該真核生物宿主は哺乳類細胞、両生類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または細菌細胞（例えば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１）であり得る。真核組み換え宿主細胞が好ましい。真核宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類起源の細胞系統、並びに限定されるものではないが、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞をはじめとする昆虫細胞、およびゼブラフィッシュ細胞が挙げられる。
【０１１９】
しかしながら、ショウジョウバエ細胞が好ましい。より好ましくは、該ショウジョウバエ細胞は、好ましくはショウジョウバエ発現系、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＥＳ（登録商標））において異種タンパク質発現に使用されるドロソフィラＳ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６３）である。該Ｓ２細胞系統は、後期（２０〜２４時間齢）のキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）胚の一次培養物に由来するものであった。この可変細胞系統はＣＯ2を含まない室温で急速に増殖し、容易に懸濁培養に適合する。一般に、本発明のポリペプチドを発現させる際には昆虫細胞が好ましいが、これはそれらがメチル化ＤＮＡを少ししか含まない、または好ましくは全く含まないという利点を有するからである。よって、本発明のポリペプチドを発現および単離、および好ましくは精製する場合、当該ポリペプチドは好ましくは、当該ポリペプチドが優先的に結合することができるメチル化ＤＮＡを混入していない。昆虫細胞を使用することのもう１つの利点は、昆虫細胞がタンパク質フリー培地で好ましく増殖し、よって、当該ポリペプチドが該培養培地に好ましく分泌される場合、好ましくは培養培地から本発明のポリペプチドを単離、回収および／または精製する際に、本発明のポリペプチドのさらなる混入が最小となるということである。
【０１２０】
使用に好適な、かつ、市販されている哺乳類種由来細胞系統としては、限定されるものではないが、Ｌ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が挙げられる。
【０１２１】
もう１つの実施形態では、本発明は、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得るポリペプチドを産生する方法であって、本発明の宿主細胞を培養すること、および産生されたポリペプチドを回収することを含む方法に関する。当該ポリペプチドは好ましくは、本発明の核酸分子によりコードされる。本発明のポリペプチドを産生するための好ましい方法は実施例２に記載されている。
【０１２２】
本発明はまた、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得る本発明のポリペプチドを発現し得る細胞を作出する方法であって、当技術分野で公知の方法により、または本明細書に記載されている方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を遺伝的に操作することを含む方法も提供する。当該ポリペプチドは好ましくは、本発明の核酸分子によりコードされる。当技術分野では、適当な宿主内でポリペプチドを産生するための多くの好適な方法が存在する。宿主が単細胞生物または哺乳類若しくは昆虫細胞である場合、当業者ならば、様々な培養条件に目を向けることができ、これらの培養条件は、余計な検討を行わずとも、さらに至適化することができる。便宜には、産生されたタンパク質を培養培地から、または単離した（生物学的）膜から、確立された技術によって採取する。さらに、産生されたポリペプチドは直接宿主細胞から単離してもよい。
【０１２３】
本発明のポリペプチドは、微生物学的方法またはトランスジェニック哺乳類により産生させてもよい。また、本発明のポリペプチドはトランスジェニック植物から回収することも企図される。或いは、本発明のポリペプチドは合成または半合性的に産生させることもできる。
【０１２４】
例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（８２）（１９８５），５１３１−５１３５により記載されている固相法などの化学的合成を使用することができる。もう１つの方法は、ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳である。好ましい方法は、上記のような宿主細胞内でのタンパク質の組み換え産生を含む。例えば、本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つの全体または一部を含む核酸配列をＰＣＲにより合成し、発現ベクターに挿入し、宿主細胞を当該発現ベクターで形質転換させることができる。その後、当該宿主細胞を培養して所望のポリペプチドを産生させ、単離および精製する。
【０１２５】
タンパク質の単離および精製は、例えば、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、分取ディスクゲル電気泳動など、いくつかの既知の技術のいずれか１つにより達成することができる。さらに、無細胞翻訳系を用いて本発明のポリペプチドを産生させることもできる。本発明において使用するのに好適な無細胞発現系としては、ウサギ網赤血球溶解物。麦芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、大腸菌Ｓ３０抽出物、およびＴＮＴ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの転写／翻訳複合系が挙げられる。
【０１２６】
これらの系は、コード領域と適当なプロモーターエレメントを含むクローニングベクター、ＤＮＡ断片、またはＲＮＡ配列を付加した際に、組み換えポリペプチドまたはペプチドの発現を可能とする。上述のように、タンパク質の単離／精製技術は、常法を用いた本発明のタンパク質の修飾を必要とすることがある。例えば、ニッケルカラムでの精製が可能となるように、当該タンパク質にヒスチジンタグを付加することができる。他の修飾はより高い若しくはより低い活性を生じたり、より高いレベルのタンパク質産生を可能としたり、またはタンパク質の精製を簡単にしたりすることができる。本発明のポリペプチドが産生された後、ペグ化、誘導体化などにより修飾することもできる。
【０１２７】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体に関する。好ましくは、当該ポリペプチドは、メチル化ＤＮＡと結合する能力を有し、本明細書に記載されるような二機能性タンパク質である。本明細書において「特異的に」とは、当該抗体は本発明のポリペプチドと反応するが、当該ポリペプチドの一部だけ、例えば、メチル−ＤＮＡ結合ドメイン、Ｆｃ部分またはリーダー若しくは分泌配列とは反応しないことを意味する。しかしながら、当該抗体は、本発明のポリペプチドのポリペプチドリンカー（そのようなポリペプチドリンカーが存在すれば）と特異的に結合することができる。
【０１２８】
よって、当該抗体は、例えば、本発明のポリペプチドのメチル−ＤＮＡ結合ドメインおよびＦｃ部分、またはメチル−ＤＮＡ結合ドメインおよびリンカーポリペプチドの部分、またはリンカーポリペプチドの部分およびＦｃ部分と、または上述のように、リンカーポリペプチドとのみ特異的に結合する。当該抗体が本発明の上記で定義されたように特異的に反応するかどうかは、とりわけ、当該抗体の結合反応を上述のような部分と、また、本発明のポリペプチドの個々の部分のみと比較することにより、容易に調べることができる。
【０１２９】
本発明の抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。「抗体」とはまた、結合特異性をなお保持しているその誘導体または断片も含む。抗体産生のための技術は当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載されている。これらの抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫沈降法および免疫学的局在決定法に、また、例えば、組み換え生物における、または診断法におけるこのようなポリペプチドの存在のモニタリングに使用することができる。これらの抗体はまた、本発明のタンパク質と相互作用する化合物を同定するために使用することもできる（本明細書に後述する）。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ系に用いられるような表面プラズモン共鳴を使用すれば、本発明のポリペプチドのエピトープと結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【０１３０】
本発明はさらに、キメラ抗体、単鎖抗体およびヒト化抗体、並びにとりわけＦａｂ断片のような抗体断片を含む。抗体断片または誘導体はさらに、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片を含む；例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ前掲参照のこと。様々な手法が当技術分野で知られており、このような抗体および／または断片の作成に使用することができる。よって、当該（抗体）誘導体は、ペプチドミメティクスにより産生させることができる。さらに、単鎖抗体の産生に関して記載されている技術（とりわけ、米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を作出するために適合させることもできる。また、トランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させることもできる。最も好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の作製のためには、連続細胞培養系により産生される抗体を提供するいずれの技術を用いてもよい。このような技術の例としては、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５），４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【０１３１】
単鎖抗体（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号）の産生を記載している技術は、上記のような免疫原性ポリペプチドに対する単鎖抗体を産生するために適合させることができる。さらに、トランスジェニックマウスを用いて、該免疫原性ポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させてもよい。本発明に従って使用される、または細胞内で発現させることができる、抗体／抗体構築物並びに抗体断片または誘導体が特に好ましい。これは、とりわけ、対応するタンパク質分子の直接注入、または対応するタンパク質分子をコードする核酸分子の注入によって達成され得る。さらに、遺伝子療法アプローチも企図される。よって、本発明において、「抗体分子」とは、完全な免疫グロブリン分子並びにこのような免疫グロブリン分子の一部に関する用語である。
【０１３２】
さらに、この用語は、上述のように、キメラ抗体およびヒト化抗体のような修飾および／または変更された抗体分子に関する。この用語はまた、モノクローナルまたはポリクローナル抗体並びに組み換え若しくは合成によって生成／合成された抗体に関する。この用語はまた、無傷な抗体、並びに分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２のようなその抗体断片に関する。「抗体分子」という用語はまた、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）または抗体−融合タンパク質のような二機能性抗体および抗体構築物も含む。本発明では、「抗体」という用語が、細胞内で発現され得る抗体構築物、例えば、とりわけウイルスまたはベクターを介してトランスフェクトおよび／または形質導入され得る抗体構築物を含むことが企図される。もちろん、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのＦｃ部分との関連で本発明で上記したように、検出可能な物質とカップリング、連結または接合させることができる。
【０１３３】
本発明はまた、本発明の核酸分子、ベクター、宿主細胞、ポリペプチドまたは抗体を含む組成物も提供する。
【０１３４】
本発明において「組成物」とは、上述の化合物の少なくとも１つを含む組成物に関する用語である。本発明で後述される本発明の組成物は、上述の化合物をいずれかの組合せで含むと考えられる。所望により、該組成物は、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと結合し得る分子をさらに含んでもよい。該組成物は固体、液体、または気体であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒剤、丸剤、懸濁液、エマルション、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、抽出物、チンキ状若しくは液状抽出物、または経口若しくは非経口若しくは局所投与に特に好適な形態であってもよい。
【０１３５】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチドまたは抗体を含むキットに関する。有利には、本発明のキットはさらに、所望により、反応バッファー、保存溶液および／または科学的アッセイ若しくは診断アッセイなどの実施に必要な残りの試薬または材料を含む。さらにまた、本発明のキットの部分は、バイアルまたは瓶に個々にパッケージングすることもできるし、或いは容器または複数容器単位に組み合わせてパッケージングすることもできる。
【０１３６】
本発明のキットは、とりわけ、本明細書に記載されるようにメチル化ＤＮＡを単離、富化、精製および／または検出する方法を実施するために有利に使用することができ、かつ／または本明細書において、例えば、診断キット、研究ツールまたは治療ツールと呼ばれる様々な適用に使用することができる。さらに、本発明のキットは、科学目的、医学目的および／または診断目的に好適な検出のための手段を含み得る。当該キットの製造は、好ましくは、当業者に公知の標準的な手順に従う。
【０１３７】
上記のように、本発明は、メチル−ＤＮＡ結合ドメインと抗体のＦｃ部分を含む二機能性抗体様分子が、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡと、高親和性および高結合力で特異的に結合することができ、これにより、サンプル中に１０ｎｇを超える量、１０ｎｇ未満、７．５ｎｇ未満、５ｎｇ未満、２．５ｎｇ未満、または約１ｎｇからメチル化ＤＮＡを単離、富化および／または検出するための好適な診断ツールとなるという、驚くべき発見に基づくものである。
【０１３８】
よって、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、所望により検出に好適な手段をさらに含む診断用組成物である。本発明のさらなる実施形態は、メチル化ＤＮＡの検出のための本発明のポリペプチドの使用である。
【０１３９】
さらに、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞または抗体は、メチル化ＤＮＡを検出することを目的とした診断用組成物の製造のために使用される。
【０１４０】
さらに、本発明の核酸分子、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞または抗体は、腫瘍組織または腫瘍細胞の検出を目的とした診断用組成物の製造のために使用される。
【０１４１】
本明細書に記載されるように、本発明のポリペプチドは、特に、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡを単離、富化、精製および／または検出するための、予期できない優れた特性を有する。よって、本発明は、本発明のポリペプチドを使用する様々な診断的使用および方法を提供する。メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの好ましい小規模富化手順が実施例３に記載されている。要するに、本発明のポリペプチドを、例えば、Ａタンパク質セファロースに結合させ、結合していない(ｉｎｂｏｕｎｄ)タンパク質を洗浄除去する。次に、対象ＤＮＡを好ましくは消化し、結合している本発明のポリペプチドに加える。さらに、該消化ＤＮＡを結合している本発明のポリペプチドと共にインキュベートし、洗浄し、その後、本発明のポリペプチドが結合したものを溶出させる。
【０１４２】
よって、本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）メチル化および／または非メチル化ＤＮＡを含むサンプルを本発明のポリペプチドと接触させること；および
（ｂ）該ポリペプチドとメチル化ＤＮＡとの結合を検出すること
を含む方法に関する。
【０１４３】
好ましくは、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、実施例３に例示されるような逆サザン−ウエスタンブロット法、免疫沈降法、メチル化ＤＮＡのアフィニティー精製、または実施例４および５に例示されるようなメチル−ＣｐＧ免疫沈降法（ＭＣＩｐ）である。しかしながら、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法はそれに限定されないが、本発明の診断用組成物に関しても記載したように、基本的に、本発明のポリペプチドが固相マトリクス、例えば、セファロース、アガロース、キャピラリー、容器壁などのマトリクスに結合されているいずれかの手順であり得る。
【０１４４】
より好ましくは、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ステップ（ｃ）として、例えば、シークエンシング、サザンブロット法、制限酵素消化、重亜硫酸塩シークエンシング、ピロシークエンシングまたはＰＣＲ法によりメチル化ＤＮＡを分析することをさらに含む。なお、本発明のポリペプチドを用いることにより単離、富化、精製および／または検出されたメチル化ＤＮＡの分析は、上述の方法に限定されず、例えば、ＲＤＡ法、マイクロアレイ法など、メチル化ＤＮＡを分析するために当技術分野で公知の全ての方法を包含する。
【０１４５】
本発明のポリペプチドの好ましい診断適用は、図７に示される、いわゆるＭＢ−ＰＣＲである。要するに、第１のステップにおいて、本発明のポリペプチドをコアテーブルＰＣＲ容器、例えば、Ｎｕｎｃ製のＴｏｐＹｉｅｌｄ  Ｓｔｒｉｐｓに加える。このようにすれば、当該ポリペプチドは当技術分野で公知の技術により、該容器の内面に好ましくコーティングされる。次のステップで、このコーティングＰＣＲ容器に遮断試薬、例えば、４．５％粉乳を加える。さらなるステップで、好ましくは対象ＤＮＡ断片（例えば、メチル化および／または非メチル化ＤＮＡ断片）を、このコーティングおよび遮断済みのＰＣＲ容器に加える。本発明のポリペプチドは、存在すれば、メチル化ＤＮＡと特異的に結合すると考えられる。その後のステップで、好ましくはＤＮＡ断片を含むコーティングおよび遮断済みＰＣＲ容器をインキュベートし、その後、結合していないＤＮＡ断片を洗浄除去する。
【０１４６】
その後、例えば、メチル化または非メチル化であると思われる対象の遺伝子または遺伝子座または複数の遺伝子座に関する多重ＰＣＲのための、好ましくは遺伝子特異的プライマー、または、これもまた好ましいが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つなどのプライマー対を含むＰＣＲ混合物を加え、好ましくは、リアルタイムＰＣＲまたは通常のＰＣＲを実施した後、ゲル電気泳動により増幅産物を分離する。
【０１４７】
ＭＢ−ＰＣＲは好ましくは次のように行う。好ましくは、ＰＣＲ試験管は熱安定性ＴｏｐＹｉｅｌｄ（商標）ストリップ（Ｎｕｎｃカタログ番号２４８９０９）を用いて調製する。好ましくは、好ましくは組み換え型の本発明のポリペプチド５０μｌ（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＬ  ｐＨ７．５中、１５μｇ／ｍｌに希釈）を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートする。好ましくは、ウェルを２００μｌのＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣＬを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、４℃にて一晩、１００μｌ遮断溶液（１５０ｍＭのＮａＣＬ、４．５％スキムミルク粉末、５ｍＭのＥＤＴＡおよび各０．８μｇ／ｍｌのポリｄ（Ｉ／Ｃ）、ポリｄ（Ａ／Ｔ）およびポリｄ（ＣＧ）を含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５）で遮断する。好ましくは、その後、これらの管を２００μｌのＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ）で３回洗浄する。
【０１４８】
好ましくは、５０μｌの結合バッファー（４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５）を各ウェルに加え、好ましくは、１μｌの消化ＤＮＡ、好ましくは、Ｍｓｅｌで消化したゲノムＤＮＡを、好ましくは１０ｎｇ／μｌの量で各第２のウェルに加える（Ｍ−反応）。
【０１４９】
ゲノムＤＮＡを、好ましくは、例えば、Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるなど、当技術分野で公知のキットを用いることにより調製する。このゲノムＤＮＡ調製物の質は、好ましくは、アガロースゲル電気泳動により制御し、ＤＮＡ濃度は好ましくは、ＵＶ分光光度法により測定した。ＤＮＡの定量は好ましくは、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いることにより行う。
【０１５０】
本発明のポリペプチドとＤＮＡ、好ましくは、ＤＮＡ（酵素消化または機械的断片化により生成）を含有するウェルを、好ましくは４℃にて、好ましくは３時間、シェーカー上でインキュベートする。好ましくは、これらの管を２００μｌの結合バッファーで３回、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で１回洗浄した。
【０１５１】
次に、ＰＣＲを好ましくは、直接ＴｏｐＹｉｅｌｄ（商標）ストリップで行った。好ましくは、ＰＣＲ混合物（５０μｌ／ウェル）は、標準的なＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ）、好ましくは、２．５Ｕ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、好ましくは、各１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマー（Ｑｉａｇｅｎにより合成）、ｄＮＴＰ（好ましくは、各２００ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、好ましくは、１Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ）、プライマー配列を含み、特定の対象遺伝子のサイクリングパラメーターは実施例６の表２および３に示されている。当然のことながら、当業者ならば、他の好適な遺伝子特異的または遺伝子座特異的または複数の遺伝子座特異的プライマーを設計することができる。
【０１５２】
さらに、当業者ならば、対象とするプライマーおよび遺伝子、遺伝子座医／複数の遺伝子座に最も好適なＰＣＲパラメーターを容易に決定および／または試験することができる。ＰＣＲ混合物を加えた後、好ましくは、１μｌのＭｓｅＩ消化ＤＮＡ（好ましくは、１０ｎｇ／μｌ量）を、事前にＤＮＡ断片と共にインキュベートしなかった各第２のウェルに加える（Ｐ−反応）。好ましくは、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、臭化エチジウムで染色したゲルを、例えば、Ｔｙｐｈｏｏｎ９２００Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて走査した。
【０１５３】
よって、本発明のポリペプチドは、単一細胞を含み得る、本明細書に後述されるようなサンプル中におけるメチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの検出に有用であると考えられる。また、本発明のポリペプチドは完全細胞にも有用であると考えられる。「完全細胞」とは、ゲノムという点から完全な単一の細胞を意味する。よって、完全細胞は、メチル化ＤＮＡのゲノム分析に有用である。
【０１５４】
かかる方法は、好ましくは、本発明のポリペプチドを用いたメチル化ＤＮＡの富化／精製ステップと、例えば、ゲノムＤＮＡマイクロアレイ、ティリングアレイ、低密度アレイのハイブリダイゼーション、またはｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ−アプローチなどの検出ステップを含む。当業者ならば、当技術分野で公知の検出方法を容易に行うことができる。それらのいくつかが添付の実施例に示されているが、ここでは、メチル化ＤＮＡを富化、精製および／または単離するために本発明のポリペプチドが使用される。１つの実施例は、ハイスループット・ロバスト・ワンチューブ・アッセイに好適であり得る、いわゆるＭＢ−ＰＣＲを示す。さらに、本発明のポリペプチドは、単一遺伝子レベルでＣｐＧメチル化の検出に特に有用であり得る。このような方法は好ましくは、単一遺伝子のメチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡを富化および／または精製するステップと、該メチル化ＤＮＡを、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲなどを用いて検出するステップを含む。
【０１５５】
本発明のポリペプチドのもう１つの可能性のある診断適用として、免疫組織化学がある。よって、本発明のポリペプチドは、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡを「染色する」ために使用することができる。本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるような好適な検出可能物質に、そのＦｃ部分を介してカップリング、連結または接合されるか、または例えば、メチル化ＤＮＡに結合されている場合の本発明のポリペプチドを検出するには、第２の抗Ｆｃ部分抗体が用いられる。
【０１５６】
数種の悪性疾患は、本発明の方法により、それらのメチル化パターン／プロフィールによって検出することができ、従って、予後的および／または属性的に有用であり得ると思われる。これは、このメチル化パターンが患者の薬理学的プロフィールを設定するために使用可能であることを意味する。例えば、抗がん薬に対する感受性および／または感度は、あるがん遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子が高メチル化であるか、低メチル化であるかが検出されれば、判定することができる。よって、当業者は、例えば、がん遺伝子がすでに高メチル化され、従って、不活性であると思われるが、ある薬剤ががん遺伝子を阻害し得る場合に、負の作用および／または有害作用を回避するのに最も適当な薬剤を選択する。
【０１５７】
本明細書に記載の方法は、第１に、がんまたは腫瘍性疾患などの悪性疾患において高メチル化または低メチル化(ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ)されている遺伝子座および／または遺伝子を同定するため、また、第２に、単一遺伝子レベルでこのような遺伝子座および／または遺伝子のメチル化状態をアッセイするための基礎を提供するのに有用であり得る。該悪性疾患は好ましくは腫瘍である。腫瘍はあり得るいずれの腫瘍種であってもよい。例としては、皮膚がん、乳がん、脳がん、子宮頸がん、精巣がん、頭頸部がん、肺がん、縦隔がん、消化管がん、尿生殖器系がん、婦人科系がん、乳がん、内分泌系がん、皮膚がん、小児がん、原発部位不明のがんまたは転移がん、軟組織および骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、腫瘍随伴症候群、腹膜がん腫症(ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓｔｏｓｉｓ)、免疫抑制関連の悪性および／または転移がんなどがある。
【０１５８】
これらの腫瘍細胞は、例えば、鼻腔、副鼻洞、鼻咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺のがんおよび傍神経節腫を含む頭頸部；非小細胞肺がん、小細胞肺がんを含む肺のがん；縦隔のがん；食道、胃、膵臓、肝臓、胆管、小腸、結腸、直腸および肛門領域のがんを含む消化管のがん；腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎および精巣のがんを含む尿生殖器系のがん；子宮頸がん、膣がん、外陰がん、子宮胎がん、妊娠性栄養膜疾患、卵巣がん、卵管がん、腹膜がん、乳がんを含む婦人科がん；甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍、膵内分泌腫瘍を含む内分泌系のがん；カルチノイド腫およびカルチノイド症候群；多発性内分泌腺腫症；軟組織および骨の肉腫；中皮腫；皮膚がん；皮膚黒色腫および眼内黒色腫を含む黒色腫；中枢神経系の新生物；網膜芽腫、ビルムス腫瘍、神経繊維腫瘍、神経芽腫、ユーイング肉腫系の腫瘍、横紋筋肉腫を含む小児がん；非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、およびホジキン病を含むリンパ腫；急性白血病、慢性骨髄性白血病およびリンパ性白血病、血漿細胞新生物、および骨髄異形成症候群を含む白血病；腫瘍随伴症候群；原発部位不明のがん；腹膜がん腫症；カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連原発性中枢神経系リンパ腫、エイズ関連ホジキン病およびエイズ関連肛門性器などのエイズ関連悪性疾患を含む免疫抑制関連悪性疾患、および移植関連悪性疾患、肝臓への転移がん、骨への転移がん、悪性胸腔および心膜滲出および悪性腹水に由来し得る。
【０１５９】
多くの場合、該がんまたは腫瘍性疾患は、頭頸部がん、肺がん、縦隔がん、消化管がん、尿生殖器系がん、婦人科系がん、乳がん、内分泌系がん、皮膚がん、小児がん、原発部位不明のがんまたは転移がん、軟組織および骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、腫瘍随伴症候群、腹膜がん腫症、免疫抑制関連の悪性および／または転移がんであることが好ましい。好ましい腫瘍はＡＭＬ、形質細胞腫またはＣＬＬである。
【０１６０】
本発明の診断用組成物は、本明細書に記載の本発明の少なくとも１つを含む。当該診断用組成物は、とりわけ、例えば、上記のような個体からのサンプルにおいて、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡの存在を単離、富化および／または測定するための方法に使用することができる。
【０１６１】
本発明において「サンプル」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその一部を含有する個体、細胞系統、組織培養またはその他の供給源から得られるいずれの生体サンプルも企図する。示されているように、生体サンプルとしては、本発明のポリヌクレオチドを発現することが見出された体液（血液、血清、血漿、尿、滑液および脊髄液など）および組織源が挙げられる。哺乳類から組織生検および体液を得る方法は本技術分野で周知である。ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはタンパク質を含む生体サンプルが供給源として好ましい。
【０１６２】
診断用組成物のさらなる適用は本明細書に記載されており、添付の実施例に示されている。
【０１６３】
当該診断用組成物は、所望により、検出に好適な手段を含む。上記の核酸分子、ベクター、宿主、抗体、およびポリペプチドはイムノアッセイにおける使用に好適であり、それらは例えば、液相において、または固相担体に結合させて使用することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリビニルイオン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が挙げられる。本発明において、当該担体の性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。
【０１６４】
固相担体は当業者に公知であり、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、金属コロイド粒子、ガラスおよび／またはシリコーンチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、デュラサイト(ｄｕｒａｃｙｔｅｓ)、および反応トレーのウェル、プラスチックチューブまたは他の試験管の壁面を含み得る。固相支持体に核酸分子、ベクター、宿主、抗体、アプタマー、ポリペプチドなどを固定化する好適な方法は、限定されるものではないが、イオン的、疎水性、共有結合的相互作用または（化学的）架橋などがある。
【０１６５】
本発明の当該化合物を使用することができるイムノアッセイの例としては、直接的または間接的な形式の、競合的および非競合的イムノアッセイがある。一般に使用される検出アッセイは、放射性同位元素的または非放射性同位元素的方法を含み得る。かかるイムノアッセイの例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫測定アッセイ）およびノーザンまたはサザンブロットアッセイがある。さらに、これらの検出法は、とりわけ、ＩＲＭＡ（免疫放射定量測定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、ＦＩＡ（蛍光免疫測定法）、およびＣＬＩＡ（化学発光免疫測定法）がある。さらに、本発明の診断用化合物は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイのような技術に使用することもできる。
【０１６６】
標識のための適当な標識および方法は当業者に公知である。本発明において使用可能な標識種の例としては、とりわけ、蛍光色素（フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなど）、酵素（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）、放射性同位元素（32Ｐ、33Ｐ、35Ｓまたは125Ｉなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属コロイド、化学発光化合物および生物発光化合物（ジオキセタン、ルミノールまたはアクリジニウムなど）が挙げられる。
【０１６７】
様々な技術が生体分子を標識するために利用でき、当業者に周知であり、本発明の範囲内であり、とりわけ、酵素またはビオチニル基の共有結合的カップリング、リン酸化、ビオチン化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（ターミナルトランスフェラーゼを用いる）を含む。このような技術は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｂｕｒｄｅｎ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ（Ｅｄｓ），Ｖｏｌｕｍｅ  １５（１９８５）；“Ｂａｓｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｄａｖｉｓ  ＬＧ，Ｄｉｂｍｅｒ  ＭＤ，Ｂａｔｔｅｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９０）；Ｍａｙｅｒ，（Ｅｄｓ）“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；またはシリーズ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。検出方法は、限定されるものではないが、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法、直接的および間接的酵素反応などを含む。
【０１６８】
本発明のもう１つの好ましい組成物は、所望により、製薬上許容される担体をさらに含む医薬組成物である。当該医薬組成物は、とりわけ、例えばヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ＤＮＡ−メチラーゼおよび／またはＤＮＡ−デメチラーゼなどのさらなるタンパク質とカップリングさせ得る本発明のポリペプチドを含む。当該医薬組成物はまた、制限酵素またはリボザイムとカップリングさせることもできる。上記のように１又は複数のさらなるタンパク質(ｐｒｏｔｅｉａｎ)とカップリングさせた本発明のポリペプチドがメチル化ＤＮＡと結合すれば、上記そのさらなるタンパク質をＤＮＡへターゲッティングし得ると考えられる。よって、ＤＮＡ−メチラーゼは低メチル化ＤＮＡ、例えば、低メチル化発癌遺伝子座またはがん遺伝子またはＤＮＡを高メチル化することができる。このようにして、遺伝子の不活化が達成できる。
【０１６９】
或いは、ＤＮＡ−デメチラーゼは、高メチル化遺伝子または遺伝子座、例えば、腫瘍抑制遺伝子または遺伝子座を脱メチル化し得る。このようにして、遺伝子の活性化が達成できる。
【０１７０】
ヒストンデアセチラーゼは、ヒストンのアセチル化リシン残基を脱アセチル化し、それにより、ＤＮＡのヒストンへのより強固なパッケージングと遺伝子抑制をもたらすことによって活性遺伝子の転写抑制に関与する。当技術分野で公知のように、ヒストンアセチラーゼは反対の作用を示し得る。
【０１７１】
制限酵素またはリボザイムは、切断されるべきＤＮＡにターゲッティングされる場合にその作用を発揮し得る。適当な制限酵素は当技術分野で公知である。標的ＤＮＡ配列に特異的なリボザイムは、当技術分野で公知のように調製することができる。
【０１７２】
よって、当該医薬組成物は、がんおよび／または腫瘍性疾患を治療するのに有用であり得る。その双方が非制御の遺伝子発現、活性化および／または抑制により引き起こされることが知られており、これはとりわけ、ヒストンアセチル化／脱アセチル化および／またはＤＮＡメチル化／脱メチル化により調節される。
【０１７３】
当該医薬組成物は、本明細書に記載されるように、生理学上許容される担体と共に患者に投与することができる。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、動物、より詳しくは、ヒトでの使用が、規制機関または他の一般に認知されている薬局方により認可されていることを意味する。「担体」とは、それと共に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を指す。かかる医薬担体は、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油といった無菌の液体であり得る。
【０１７４】
当該医薬組成物が静脈投与される場合、水が好ましい担体である。特に注射可能な溶液に関しては、液体担体として、生理食塩水並びにデキストロースおよびグリセロール水溶液を使用することもできる。好適な医薬賦形剤としては、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【０１７５】
当該組成物はまた、所望により、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、徐放性処方物などの形態を採ることができる。当該組成物は、通常の結合剤およびトリグリセリドなどの担体と共に坐剤として処方することもできる。経口処方物は、医薬級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。
【０１７６】
好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、治療有効量の上述の化合物を、好ましくは精製形態で、患者への適切な投与のための形態を提供するよう、好適な量の担体と共に含む。当該処方物は投与様式に適したものとすべきである。
【０１７７】
もう１つの好ましい実施形態では、当該組成物は、ヒトへの静脈投与に適合した医薬組成物としてありふれた手段に従って処方される。典型的には、静脈投与用組成物は、無菌等張水性バッファー中の溶液である。必要であれば、当該組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、これらの成分は個別に、または例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として単位投与形中に共に混合して、有効剤の量を示す、アンプルまたサシェなどの湿気遮断容器にて提供される。当該組成物が注入により投与される場合、無菌医薬級の水または生理食塩水を含む注入瓶を用いて調剤することができる。当該組成物が注射により投与される場合、投与前に成分を混合し得るように無菌注射水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１７８】
本発明の医薬組成物は、中性または塩の形態で処方することができる。医薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られるものなど、陰イオンを伴って形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られるものなど、陽イオンを伴って形成されるものが挙げられる。
【０１７９】
所望により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、至適用量範囲を特定する補助としてもよい。処方物に用いる厳密な用量はまた、投与経路、および疾病または疾患の重篤度によっても異なり、医師の判断および各患者の状況に従って決定されなければならない。有効量はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定することができる。好ましくは、当該医薬組成物はそのまま投与するか、またはアジュバントと組み合わせて投与する。
【０１８０】
当該医薬組成物は好ましくは、遺伝子療法に適用するために設計される。遺伝子療法の技術は、本発明の核酸分子に関して既に上記されており、そこで述べたことは全て、当該医薬組成物についても当てはまる。例えば、当該医薬組成物中の核酸分子は、好ましくは、治療される個体の細胞へのその導入、発現および／または安定な組み込みを可能とする形態である。
【０１８１】
遺伝子療法のために使用可能なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーヴェーネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。その他のレトロウイルスベクターの多くは、複数の遺伝子を組み込むこともできる。
【０１８２】
これらのベクターは全て、形質導入された細胞を識別および生成可能なように、選択マーカーの遺伝子を導入または組み込むことができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、標的特異的とすることができる。当業者ならば、挿入ポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能とするためにレトロウイルスゲノムに挿入可能な特定のポリヌクレオチド配列を知っているか、または余計な実験を行わずに容易に確認することができる。
【０１８３】
組み換えレトロウイルスは欠陥型のものが好ましいので、感染性のベクター粒子を産生するためには補助を必要とする。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下に、レトロウイルスの全構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系統を用いることにより、提供することができる。
【０１８４】
これらのプラスミドは、パッケージング機構にキャプシド形成に関するＲＮＡ転写物を認識させ得るヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルの欠失したヘルパー細胞系統としては、限定されるものではないが、例えば、ｗ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が挙げられる。これらの細胞系統は、ゲノムがパッケージングされていないので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルが無傷な細胞にレトロウイルスベクターが導入されるが、それらの構造遺伝子が対象とする他の遺伝子で置換されている場合、このベクターはパッケージング可能で、ベクタービリオンも産生可能である。或いは、ＮＩＨ３Ｔ３または他の組織培養細胞を、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションにより、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることができる。
【０１８５】
次に、これらの細胞を、対象遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られた細胞は培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。本発明の核酸分子のための別の標的送達系として、コロイド分散系がある。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、並びに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送達媒体として有用な人工膜小胞である。０．２〜４．０ｐｍの範囲の大きさの大型単層小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む、実質的パーセンテージの水性バッファーを封入し得ることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷なビリオンは水性の内部に封入することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１）。
【０１８６】
哺乳類細胞の他、リポソームは植物、酵母および細菌細胞においてポリヌクレオチドの送達に使用されている。リポソームを効率的な遺伝子導入媒体とするためには、次の特徴が存在しなければならない：（１）それらの生物活性を損なわずに高効率で対象遺伝子を封入すること；（２）非標的細胞に比べて標的細胞と優先的かつ実質的に結合すること；（３）その小胞の水性内容物を高効率で標的細胞細胞質に送達すること；および（４）遺伝情報の正確および有効な発現（Ｍａｎｎｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８）。当該リポソーム組成物は通常、リン脂質、特に、高相転移温度リン脂質の組合せ、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせたものである。他のリン脂質または他の脂質も使用可能である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在によって異なる。
【０１８７】
リポソームの産生に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールが特に好ましい。例示的リン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化は、解剖学的因子および機会的因子に基づいて分類することができる。解剖学的分類は選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性およびオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械的標的化は、受動的であるか能動的であるかに基づいて識別することができる。受動的標的化は、洞様毛細管を含む器官における細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然の傾向を利用する。
【０１８８】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、メチル化ＤＮＡ、好ましくは、ＣｐＧメチル化ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで画像化するのに有用であり得る。よって、当該組成物は、それを必要とする被験体に投与することができる。本発明において「被験体」とは、情動障害の治療を必要とする個体を意味する。好ましくは、該被験体は脊椎動物、いっそうより好ましくは哺乳類であり、特に好ましくはヒトである。
【０１８９】
「投与される」とは、本発明のポリペプチドをコードする上述の核酸分子の、治療上または診断上有効量を投与することを意味する。「治療上または診断上有効量」とは、それが投与される目的の作用をもたらす用量を意味する。厳密な用量は治療または診断の目的によって異なり、当業者ならば既知の技術を用いて確認することができる。
【０１９０】
当業者で公知のように、また、上記のように、全身投与か局所投与、齢、体重、健康状態、性、食餌、投与時間、薬剤の相互作用、および症状の重篤度に関する判断が必要である場合があり、当業者ならば通常の検討で確認することができる。
【０１９１】
これらの方法は、ヒト療法および獣医学的適用の双方に適用可能である。所望の治療活性を有する本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載されるように、生理学上許容される担体中にて患者に投与することができる。導入の方法に応じ、当該化合物は後述するような様々な方法で処方することができる。処方物中の治療上有効な化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％で様々であってよい。これらの薬剤は単独または他の治療と組み合わせて投与することができる。
【０１９２】
当該医薬組成物の投与は、限定されるものではないが、経口、皮下、静脈内、動脈内、節内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、気管支内、経皮、節内、直腸内、腹膜内、筋肉内、肺内、膣、直腸、または眼内を含む上述のような様々な方法で行うことができる。場合によっては、例えば、創傷および炎症の治療において、これらの候補薬剤は溶液ドライスプレーとして直接適用することもできる。
【０１９３】
主治医および臨床因子が投与計画を決定する。医療分野で周知のように、ある患者の用量は、患者の大きさ、体表面積、齢、投与される特定の化合物、性、投与時間および投与経路、健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含む多くの因子によって異なる。典型的な用量は例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲であり得るが、上述の因子を考慮して、この例示的範囲よりも低いまたは高い用量も考えられる。
【０１９４】
これらの用量は好ましくは、１週間に１回与えられるが、これらの用量は治療の進行過程で、ずっと長い時間間隔で与えることもでき、必要があれば、例えば毎日など、ずっと短い時間間隔で与えることもできる。好ましい場合では、免疫応答は本明細書に記載の方法、および当業者に公知のさらなる方法を用いてモニタリングされ、用量は、例えば、時間、量および／または組成において至適化することができる。
【０１９５】
用量は様々であるが、ＤＮＡの静脈投与に好ましい用量は、ＤＮＡ分子およそ１０6〜１０12コピーである。投与計画が持続的注入である場合、用量はまた、それぞれ、１μｇ〜１０ｍｇ単位／体重キログラム／分の範囲でなければならない。進行は定期的評価によりモニタリングすることができる。本発明の医薬組成物は局所投与または全身投与可能である。
【０１９６】
好ましくは、投与は非経口、例えば、静脈投与である。非経口投与用の剤形としては、無菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などんの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、ナトリウムイオン溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよびナトリウムイオン、乳酸リンゲル液、または硬化油が挙げられる。静脈用媒体としては、流体および栄養補液、電解質補液（リンゲルのデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。
【０１９７】
また、当該医薬組成物は、例えば、メチル化ＤＮＡの検出に有用な、従って例えば、典型的なメチル化パターンを示し得る悪性疾患の診断に有用な他の薬剤との同時治療アプローチに用いられると考えられる。
【０１９８】
本発明およびその多くの利点のより良い理解は以下の実施例から得られるが、これらの実施例は単に例示のために示されるものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１９９】
実施例１：ｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃのクローニング
ヒトＭＢＤ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００３９２７；ＡＡ１４４〜２３０）のメチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）に相当するｃＤＮＡを、プライマーＭＢＤ２−Ｎｈｅ  Ｓ（５’−ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＴＡＧ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  Ｇ−３’）（配列番号４）およびＭＢＤ２−Ｎｏｔ  ＡＳ（５’−ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＴＴＣ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣ−３’）（配列番号５）並びにＨｅｒｃｕｌａｓｅＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、逆転写ヒト一次マクロファージ全ＲＮＡからＰＣＲ増幅させた。サイクリングパラメーターは、９５℃３分変性；９５℃２０秒、６５℃２０秒、７２℃８０秒の増幅３４サイクル；７２℃５分の最終伸張であった。このＰＣＲ産物を沈殿させ、ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩで消化し、Ｓｉｇｎａｌ  ｐｌｇ  ｐｌｕｓベクター（Ｉｎｇｅｎｉｕｓ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ部位にクローニングし、配列を確認し、ｐｌｇ／ＭＢＤ２−Ｆｃ（真核細胞発現ベクター）を得た。ショウジョウバエＳ２細胞における組み換え発現のためのｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃをクローニングするため、ヒトＩｇＧ１のＦｃテールと融合されたヒトＭＢＤ２のＭＢＤを含むｐｌｇ／ＭＢＤ２−ＦｃのＡｐａＩ／ＮｈｅＩ断片を、ｐＭＴＢｉＰ／Ｖ５−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｐａＩ／ＳｐｅＩ部位にサブクローニングした。
【０２００】
実施例２：抗体様メチル−ＣｐＧ−ＤＮＡ結合タンパク質の組み換え発現
一本鎖のメチル化シトシンは、５−ｍＣ抗体を用いて効率的に検出され得るが、二本鎖ＤＮＡ分子は検出されない。二本鎖ＣｐＧメチル化ＤＮＡの抗体様検出を可能にするため、上記実施例１に記載のベクターを、ヒトメチル−ＣｐＧ結合ドメイン２（ＭＢＤ２）のメチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）、フレキシブルリンカーポリペプチドおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む融合タンパク質をコードするように構築した。このタンパク質をショウジョウバエＳ２  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞において金属誘導プロモーターの制御下で発現させ、Ａタンパク質アフィニティークロマトグラフィーにより上清から回収した。この精製タンパク質は多量に発現され（４〜５ｍｇ／Ｌ細胞培養上清）、推定分子量は約４０ｋＤａであった（図２参照）。
【０２０１】
よって、詳しくは、ＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質の組み換え発現用として、いくつかの理由で昆虫細胞系が選択された。主な理由は、ＣｐＧメチル化が存在しないか、低量であることである。哺乳類（特にヒト）細胞でのこのタンパク質の産生ではＤＮＡ混入（細胞培養上清におけるＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質への結合）が起こるおそれがあり、これがその後のＣｐＧメチル化ＤＮＡの分析を煩雑にすることがある。他の理由としては、培養条件が簡単なこと、およびタンパク質収量が潜在的に高いことである。
【０２０２】
ショウジョウバエＳ２細胞はＡＴＴＣから入手し、２５℃のインキュベーター内で、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ）を含有するＩｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養した。４×１０6個のショウジョウバエＳ２細胞／６０ｍｍ細胞培養ディッシュを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って用い、１．５μｇ  ｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃと０．３μｇ  ｐＣｏＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物でトランスフェクトした。
【０２０３】
３日目にトランスフェクト細胞を採取し、洗浄し、１０％ＦＣＳおよび３００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する選択培地（Ｉｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ）に再プレーティングした。５週間、４〜５日おきに選択培地を交換した。安定トランスフェクトされたショウジョウバエＳ２細胞のプールを拡張し、いくつかのアリコートにして液体窒素中で保存した。
【０２０４】
大規模生産では、１〜５×１０8細胞を、２０００ｍｌ容の回転瓶にて、ＦＣＳを含まない１００〜２００ｍｌのＩｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ中で（任意選択で３００μｇ／ｍｌハイグロマイシン）２日間培養した後、０．５ｍＭ  ＣｕＳＯ4を加えた。培地を４〜７日おきに採取し、さらなるタンパク質産生のため、細胞を培地＋ＣｕＳＯ4に再プレーティングした。細胞培養上清を合わせ、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、Ａタンパク質カラムを用いて精製した。ＭＢＤ−Ｆｃを含有する画分を合わせ、ＴＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。安定トランスフェクトされたショウジョウバエＳ２細胞は、細胞培養上清１リットル当たり３〜５ｍｇの組み換えＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質を産生した。
【０２０５】
実施例３：メンブラン上でのＣｐＧメチル化ＤＮＡの検出（逆サウス−ウエスタンブロット法）
ウエスタンブロット様の手順にて、ＭＢＤ２−Ｆｃが膜上でＣｐＧメチル化ＤＮＡを検出できるかどうかを調べるため、本発明者らは、従来のサザンブロット法と同等であるが、ブロット前にＤＮＡを変性させないキャピラリートランスファー系を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにてナイロン膜上に、種々のＣｐＧ濃度のメチル化または非メチル化ＰＣＲ断片をブロットした。図３に示すように、標準的な免疫ブロット条件と一次抗体と等価なものとしてＭＢＤ−Ｆｃを用い、メチル化ＤＮＡをナイロン膜上、一列に（図３Ａ）、また、ＣｐＧ含量に依存して（図３Ｂ）検出することができる。これらの結果は、ＭＢＤ−Ｆｃ融合タンパク質が固相支持体に結合したＣｐＧメチル化ＤＮＡを検出することができることを示す。
【０２０６】
実施例４：メチル−ＣｐＧ免疫沈降法（ＭＣＩｐ）を用いたＣｐＧメチル化ＤＮＡの小規模富化
次のプロトコールは、スピンカラムを用いたＣｐＧメチル化ＤＮＡ断片の迅速富化を可能とする。このＤＮＡは、Ａタンパク質を介してセファロースビーズにカップリングされたＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質と結合している。メチル化ＤＮＡに対する親和性はメチル化ＣｐＧ−ジヌクレオチドの密度と共に高くなり、洗浄するバッファーのイオン強度と共に低くなる。
【０２０７】
４．１  Ａタンパク質セファロースに対するＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質の結合
１ｍｌのＴＢＳ中、５０μｌのＡタンパク質セファロース４ファーストフロービーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に、８〜１０μｇの精製ＭＢＤ２−Ｆｃタンパク質を加え、４℃で一晩、回転装置上で回転させた。翌日、ＭＢＤ２−Ｆｃ−ビーズをバッファーＡ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０）で２回洗浄した。
【０２０８】
４．２  ＤＮＡの制限消化および定量
少なくとも１μｇのゲノムＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎカラムを用いて調製）をＭｓｅＩで消化した。アガロースゲル電気泳動を用いて完全消化物を制御し、消化したＤＮＡを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて正確に定量した。
【０２０９】
４．３  高メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡの精製
消化したＤＮＡ（３００ｎｇ）を１ｍｌのバッファーＡ中の洗浄ＭＢＤ２−Ｆｃ−ビーズに加え、４℃、回転装置上で３時間回転させた。ビーズをＳｐｉｎＸカラムに移し、およそ１ｍｌのバッファーＡで回転洗浄した。ビーズを４００μｌのバッファーＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、４５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０）で２回、バッファーＣ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、６５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０）で２回洗浄した。各洗浄ステップの流出液は廃棄するか、またはさらなる分析のために回収した。ＣｐＧメチル化ＤＮＡを、２５０μｌバッファーＤ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０）で、新しい試験管中へ溶出した。溶出したＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（溶出）で脱塩した。並行して、３００ｎｇの消化ＤＮＡ（投入）を２５０μｌのバッファーＤに再懸濁させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて脱塩した。溶出ＤＮＡおよび投入ＤＮＡの双方を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて正確に定量した。
【０２１０】
４．４．  別法
ＤＮＡは種々の制限エンドヌクレアーゼを用いて、または音波処理によって制限処理してもよい。
【０２１１】
実施例５：ＭＣＩｐにより作出されたメチル化ＣｐＧ−ＤＮＡ断片の検出および定量
ＭＢＤ−Ｆｃ融合タンパク質が免疫沈降様のアプローチでＣｐＧメチル化ＤＮＡ断片と結合し得るかどうかを調べるため、本発明者らは、まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、種々のメチル化を受けたＤＮＡ断片の結合特性を調べた。種々のＣｐＧ密度を有するヒトプロモーターのＰＣＲ断片を、ＰＣＲを用いて作製し（図４参照）、ＳｓｓＩ（ＣＣＬ１３、ＴＬＲ２、ＣＨＩ３Ｌ１）を用いてＣｐＧのメチル化を行うか、またはメチル化せずにおいた（ＣＰＭ）。ＤＮＡを、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、ＭＢＤ−Ｆｃ−Ａタンパク質セファロースビーズに結合させ（実施例４参照）、ＮａＣｌ濃度を引き上げて溶出させた。画分を回収し、スピン精製し、アガロースゲル電気泳動を行った。
【０２１２】
図４Ｂに示されるように、メチル化断片の親和性はメチル化ＣｐＧ−ジヌクレオチドの密度と共に上昇し、非メチル化ＤＮＡ（ＣＰＭプロモーター断片）は比較的低い塩濃度で溶出し、高メチル化ＤＮＡ（ＴＬＲ２プロモーター断片）は高い塩濃度で溶出する。投入ＤＮＡの量を変えても溶出プロフィールは有意には変化しなかった。しかしながら、このＤＮＡの塩依存的な親和性は、Ａタンパク質セファロースビーズ上のＭＢＤ−Ｆｃ融合タンパク質の密度に依存的であった。これらの結果は、このＭＢＤ−Ｆｃ融合タンパク質が、塩濃度およびＣｐＧメチル化濃度依存的に、溶液中のＣｐＧメチル化ＤＮＡを補足し、それと結合し得ることを示唆した。
【０２１３】
５．１  遺伝子特異的リアルタイムＰＣＲを用いた単一遺伝子レベルの定量
５．１．１
組み換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質が、複合ゲノムＤＮＡ混合物中のＣｐＧアイランドプロモーターのメチル化密度を検出できるかどうかを調べるため、３つの白血病細胞系統、正常ドナー単球、並びにＡＭＬ患者の芽細胞由来のゲノムＤＮＡをＭｓｅＩで制限処理し、ＭＣＩｐを行った。１０００ｍＭのＮａＣｌ  ＭＣＩｐ画分中、３つのＣｐＧアイランドプロモーター（ＴＬＲ２、ｐ１５およびＥＳＲ１）の富化を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＰＣＲを用いて検出した。ｐ１５とＥＳＲ１は白血病においてメチル化の既知の標的であり、また、ＴＬＲ２はこれまでにＵ９３７細胞でメチル化され、ＴＨＰ−１細胞ではメチル化されないことが示されていることから、この３つの遺伝子座を選択した。
【０２１４】
図５に示されるように、この３つの遺伝子座の中に、正常ドナーＤＮＡ（ＭＯ）からのＤＮＡ調製物において有意に検出可能なものはなく、これは正常細胞のＣｐＧアイランドプロモーターの通常の非メチル化状態と一致している。Ｕ９３７ではＴＬＲ２は富化されるが、ＴＨＰ−１では富化されないことは、両細胞においてこれまでに観察されているメチル化パターンと一致している。Ｈａｈｎｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（２００２），５６２９−３７に記載されているようなＴＬＲ２プロモーターの重亜硫酸塩シークエンシングは、ＫＧ１細胞におけるＴＬＲ２プロモーターのほぼ完全なメチル化を示し（データは示されていない）、これは図５に示されている強力なＭＣＩｐ富化と一致している。ＫＧ１およびＵ９３７におけるｐ１５に関する結果は公開されているデータと一致している。これらのデータは、ＭＣＩｐを用い、ゲノムＤＮＡにおける単一遺伝子断片のメチル化ＤＮＡ断片を検出することができることを示す。
【０２１５】
よって、ＭＣＩｐ溶出物における特定のＭｓｅＩ断片の富化は、リアルタイムＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ−ＰＣＲにより、ゲノム投入に対して検出および定量された（図５参照）。この富化はまた、溶出ＤＮＡおよび投入ＤＮＡの双方の非特異的ＤＮＡ増幅後に定量してもよい（下記実施例５．２．１のアンプリコン精製参照、データは示されていない）。
【０２１６】
【表３】
2008521389.tif 000005
【０２１７】
ＭＣＩｐを用い、ゲノムＤＮＡからメチル化および非メチル化ＤＮＡ断片を識別し得るかどうかを調べるため、健康なドナーの単球由来の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳｓｓＩメチル化された、および非処理の正常ＤＮＡのＭｓｅＩ制限ゲノムＤＮＡを富化するためにＭＣＩｐを用いた。ＭｓｅＩは低ＣｐＧ含量の領域で優先的に切断し、多くのＣｐＧアイランドは切断せずに残すことが知られていることから、ＤＮＡの断片化のために選択した（Ｃｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６（１９９４），２３６−２４４）。
【０２１８】
４つの異なるＣｐＧアイランドプロモーターと、低ＣｐＧ密度の１つのプロモーターの塩濃度依存性の富化は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲを用い、投入ＤＮＡに対するＳｓｓＩメチル化および非処理ＤＮＡで判定した。ＤＮＡメチル化の陽性対照として、正常細胞においてもメチル化されるその２コピーのうち１つで母性刷り込みを受けるＳＮＲＰＮ遺伝子プロモーター（Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６（１９９７），３８７−３９５）を使用した。正常なＤＮＡにおいて、ＳＮＲＰＮの２つの異なるメチル化を受けた対立遺伝子断片が、２つの別の画分で富化された（図９Ａ参照）。ＳｓｓＩメチル化ＤＮＡでは、富化された画分は１つだけ見られた。白血病細胞において頻繁にメチル化されていることが知られている（Ｃｈｉｍ，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８２（２００３），７３８−７４２；Ｄｏｄｇｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８（１９９８），５６１−５６７；Ｄｏｄｇｅ，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２５（２００１），９１７−９２５）ＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子（ｐ１５INK4bとしても知られる）の場合（図９Ｂ）、断片は主として、正常ＤＮＡ由来の低塩画分と、ＳｓｓＩメチル化ＤＮＡ由来の高塩画分で検出された。
【０２１９】
同様の結果がヒトエストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）遺伝子（Ｉｓｓａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６（１９９６），９７３−９７７）およびヒトＴｏｌｌ様受容体２遺伝子（ＴＬＲ２）（データは示されていない）でも得られた。図９Ｃに示されるように、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子座におけるメチル化および非メチル化ＤＮＡのプロフィールは上記供試のＣｐＧアイランドプロモーターのプロフィールとは有意に異なっていた。ほとんどの非処理ＣＨＩ３Ｌ１断片は低ＮａＣｌ濃度において回収され、そのＤＮＡがＳｓｓＩメチル化された場合に、より高いＮａＣｌ濃度への若干のシフトが見られた。
【０２２０】
上記の溶出プロフィールの解析から次のことが示唆される。
ａ．）低または高塩画分のいずれかで、低メチル化ゲノム断片より２００〜３００倍強い富化が見られる。
ｂ．）低ＣｐＧ密度の断片は高塩画分から主として排除される。
ｃ．）分画ＭＣＩｐアプローチはＣｐＧメチル化密度における小さな違いを分解することができる｛ＳｓｓＩ処理単球ＤＮＡと非処理単球ＤＮＡの間の平均的な違いはメチル化ＣｐＧ残基１２のうちおよそ６個である（データは示されていない）｝。
【０２２１】
ＭＣＩｐが腫瘍サンプルにおける異常な高メチル化を検出できるかどうかを調べるため、３つの白血病細胞系統（ＫＧ１、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１）並びに健康なドナーの単球からのＤＮＡを、高塩画分におけるＳＮＲＮＰ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＥＳＲ１およびＴＬＲ２プロモーター富化に関して分析した（図９Ｄ〜Ｇ参照）。ＴＬＲ２遺伝子プロモーターは、ＫＧ−１およびＵ９３７細胞においては富化されたが、ＴＨＰ−１または正常細胞においては富化されなかった。ＴＬＲ２のメチル化パターンを重亜硫酸塩シークエンシングにより確認した（Ｈａｅｈｎｅｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（２００２），５６２９−５６３７）（データは示されていない）。ＣＤＫＮ２Ｂ（ＫＧ−１とＵ９３７）およびＥＳＲ１（ＫＧ−１）の結果もこれまでに公開されている研究に一致していた（Ｃｈｉｍ（２００３）；Ｄｏｄｇｅ（２００１）；Ｉｓｓａ（１９９６），全て前掲）。上記３つのＭｓｅＩ断片で、正常細胞由来のＤＮＡにおいて富化されたものはなかった。その刷り込み関連のメチル化状態に従い、ＳＮＲＰＮ遺伝子プロモーターは全ての白血病細胞系統並びに正常細胞で有意に富化された。これらの実験により、高塩ＭＣＩｐ画分は高い程度のＣｐＧメチル化を有するゲノムＤＮＡ断片を特異的に富化することが確認された。
【０２２２】
【表４】
2008521389.tif 000006
【０２２３】
５．１．２
ゲノムＤＮＡの複雑な混合物における単一遺伝子断片の検出に必要はＤＮＡの量を決定するため、ＤＮＡ断片の量を引き下げてＭＣＩｐおよびその後のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲを行った。図６に示されるように、メチル化ＴＬＲ２プロモーターはＵ９３７細胞由来のゲノムＤＮＡ  １ｎｇといった少量から、富化および検出が可能である。非メチル化ｐ１５−プロモーターは、Ｕ９３７細胞においては有意には富化されなかった（２０ｎｇ、ＭＣＩｐ溶出物）、または検出できなかった（４ｎｇまたは１ｎｇ、ＭＣＩｐ溶出物）（図６）。これらの結果は、ＭＣＩｐが、複雑なゲノム混合物においてメチル化ＤＮＡ断片を検出するための高感度の方法であることを示す。
【０２２４】
このアプローチの感度を調べるため、ＭＣＩｐアプローチを用い、Ｕ９３７ＤＮＡの量を引き下げて分析した。ＴＬＲ２（強いメチル化）およびＣＤＫＮ２Ｂ遺伝子断片（メチル化無し）の富化を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲにより測定した。図１０Ａに示されるように、ＭＣＩｐ手順に対してゲノムＤＮＡ断片１ｎｇといった少量（およそ１５０腫瘍細胞に相当）を用いて、ＴＬＲ２断片の有意な富化が達成された。腫瘍由来のサンプルは有意な数の正常細胞を含む場合があり、それはほとんどのＣｐＧアイランドにおいてメチル化されていないと予想される。
【０２２５】
ＣｐＧメチル化の検出が細胞純度に関してどのような直線性があるかを調べるため、正常血液細胞および白血病細胞系統ＫＧ−１由来のＤＮＡの混合物を用いてＭＣＩｐを行ったところ、いくつかのプロモーターでＣｐＧアイランドの高レベルのメチル化が示された。図１０Ｂに示されるように、ＫＧ−１  ＤＮＡを含有するサンプルでのみＴＬＲ２プロモーター断片が検出され、そのシグナルは、サンプル中のメチル化ＤＮＡの割合と共に緩やかに増強された。ＥＳＲ１遺伝子座についても同様の結果が得られた（データは示されていない）。一般に、標的遺伝子断片がＣｐＧアイランド内に近位プロモーターのみを含んでいた場合に、最も有益（転写に対する効果に関して）かつ最も明瞭な結果（ノイズおよびバックグラウンドの点で）が得られた。また、酵素の制限作用の他、機械的手段、例えば、音波処理によってもＤＮＡの断片化が達成され得る（データは示されていない）。
【０２２６】
５．２  マイクロアレイ技術を用いたゲノムレベルでの定量
５．２．１
ライゲーション媒介（ＬＭ）−ＰＣＲを用いたゲノムＭｓｅＩ−断片由来のＤＮＡアンプリコンの生成
ＭｓｅＩ適合性ＬＭＰＣＲ−リンカーを生成するため、オリゴヌクレオチドＬＭＰＣＲ  Ｓ−Ｌ（５’−ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＡＡ  Ｇ−３’）（配列番号２２）およびＬＭＰＣＲ  ＡＳ−Ｌ（５’−ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  Ｃ−３’）（配列番号２３）を次のようにアニーリングした。両オリゴをヌクレアーゼフリーＨ2Ｏ（ＵＳＢ）中２０μＭの濃度で混合し、８０℃で１０分間インキュベートし、室温までゆっくり冷却した。アニーリングしたリンカーを５０μｌのアリコートとして−２０℃で保存した。
【０２２７】
ＬＭＰＣＲ−リンカー（０．５μｌ／ｎｇ溶出ＤＮＡまたは投入ＤＮＡ）を、６０μｌの反応液中、１μｌのＴ４−リガーゼ（１２００ｕ／μｌ，ＮＥＢ）を１６℃  ｏ／ｎで用い、溶出ＤＮＡと連結し、さらに別の反応で同量の投入ＤＮＡと連結した。リンカー連結ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて脱塩し、５５μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（５ｍＭ）で溶出させた。
【０２２８】
リンカー連結ＤＮＡ（溶出および投入それぞれ）を、ＬＭＰＣＲ−プライマー（５’−ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＴＡＡ  Ｇ−３’）（配列番号２４）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲ混合物は、総量２５０μｌ中、２５μｌの１０×ＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ）、１５μｌのＭｇＣｌ2（２５ｍＭ，Ｒｏｃｈｅ）、１０μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）、６５μｌベタイン（５Ｍ，Ｓｉｇｍａ）、２．５μｌのＬＭＰＣＲ−プライマー、４５μｌのリンカー連結ＤＮＡ、２．５μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を含み、これを５本のＰＣＲチューブに分注した。サイクリングパラメーターを５８℃２分（ＬＭＰＣＲ  ＡＳ−Ｌ融解）、７２℃５分（オーバーハングの充填）；９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３分の増幅１５サイクル；７２℃１０分の最終伸張とした。
【０２２９】
ＰＣＲ反応液を混合し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。溶出アンプリコンおよび投入アンプリコンの双方を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて正確に定量した。
【０２３０】
５．２．２  ＣｐＧアイランドマイクロアレイを用いたＭＣＩｐアンプリコンの分析
単一遺伝子断片の富化を検出するため、ＭＣＩｐアンプリコンを、ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ，標準的ＰＣＲ）を用いて分析した。多重遺伝子断片を検出するため、アレイ技術を用い得る。例えばＣｐＧアイランドマイクロアレイを用いたＭＣＩｐアンプリコンの分析は、ＭＣＩｐ−ＤＮＡ断片の蛍光標識と、その後の標準的プロトコールを用いたマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを含む。
【０２３１】
実施例６：メチル結合ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＢ−ＰＣＲ）を用いたＣｐＧメチル化ＤＮＡ断片の検出のための一試験管アッセイ
この方法はＥＬＩＳＡと類似のアプローチを用いる。ＣｐＧメチル化ＤＮＡに対して高親和性を有するタンパク質を、ＰＣＲサイクラー適合性反応容器の壁面にコーティングし、ゲノムＤＮＡ混合物から高メチル化ＤＮＡ断片を選択的に捕捉するために使用する。特定のＤＮＡ断片（例えば、特定の遺伝子のＣｐＧアイランドプロモーター）の保持は、同じ試験管でＰＣＲ（標準的ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ、単一または多重）を用いて検出することができる。メチル化の程度は、ゲノム投入ＤＮＡのＰＣＲ反応に対して評価することができる。図７は、ＭＢ−ＰＣＲの模式図を示す。
【０２３２】
６．１  ＤＮＡの調製および断片化
３つの細胞系統（ＫＧ１、Ｕ９３７、およびＴＨＰ−１）、正常ヒト単球（健康なドナー）およびＡＭＬ患者の冷凍芽細胞からのゲノムＤＮＡを、Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。このゲノムＤＮＡ調製物の質はアガロースゲル電気泳動により制御し、ＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度法により測定した。ゲノムＤＮＡをＭｓｅ  Ｉ（ＮＥＢ）で消化し、最後に、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量した。
【０２３３】
６．２  ＰＣＲ試験管の調製
ＭＢＤ−ＦｃコーティングＰＣＲ試験管を、熱安定性ＴｏｐＹｉｅｌｄ（商標）ストリップ（Ｎｕｎｃカタログ番号２４８９０９）を用いて調製した。５０μｌの組み換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質（１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、１５μｇ／ｍｌに希釈）を各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２００μｌのＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．４）で３回洗浄し、４℃で一晩、１００μｌ遮断溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、４．５％スキムミルク粉末、５ｍＭのＥＤＴＡおよび各０．８μｇ／ｍｌのポリｄ（ｌ／Ｃ）、ポリｄ（Ａ／Ｔおよびポリｄ（ＣＧ）を含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５）で遮断した。試験管を２００μｌのＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ）で３回洗浄した。
【０２３４】
６．３  メチル化ＤＮＡの結合
５０μｌの結合バッファー（４００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣＩ2、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５）を各ウェルに加え、１μｌのＭｓｅＩ消化ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を各第２のウェルに加えた（Ｍ−反応）。ウェルを４℃で３時間、シェーカー上でインキュベートした。試験管を２００μｌの結合バッファーで３回、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５で１回洗浄した。
【０２３５】
６．４  メチル化ＤＮＡ断片の検出
ＴｏｐＹｉｅｌｄ（商標）ストリップで直接ＰＣＲを行った。ＰＣＲ混合物（５０μｌ／ウェルｌ）は、標準的なＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ）、２．５Ｕ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、各１０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマー（Ｑｉａｇｅｎにより合成）、ｄＮＴＰ（各２００ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ）を含み、プライマー配列およびサイクリングパラメーターはそれぞれ表２および３に示される。このＰＣＲ混合物を加えた後、１μｌのＭｓｅＩ消化ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を、事前にＤＮＡ断片と共にインキュベートしなかった各第２のウェルに加えた（Ｐ−反応）。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、臭化エチジウムで染色したゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９２００Ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて走査した。
【０２３６】
【表５】
2008521389.tif 000007
【０２３７】
【表６】
2008521389.tif 000008
【０２３８】
図８は、５つの細胞種における、３つの異なるＣｐＧアイランドプロモーターのメチル化プロフィールを分析するＭＢ−ＰＣＲ実験の結果を示す。Ｐと表示したレーンは、ゲノム投入ＤＮＡの増幅を示す。ＴＨＰ−１細胞のｐ１５遺伝子を除き（おそらく欠失または突然変異）、全てのプロモーターが増幅された。注目すべきは、正常ＤＮＡ対照からのＭＢ−ＰＣＲ反応において検出されたプロモーターは無かったことであり、これは、正常個体においてこれらのプロモーターがメチル化されていないという事実と一致する。これらの細胞系統並びに患者サンプルにおいては、プロモーターは大部分メチル化されていた。これらの結果は、独立した実験のＭＣＩｐで得られたデータと一致する。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１−１】図１は、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃのヌクレオチド配列と、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−ＦによりコードされるＭＢＤ２−Ｆｃ二機能性タンパク質のタンパク質配列（太字）を示す。ＭＢＤ２−Ｆｃ二機能性タンパク質のアミノ酸配列は次のような特徴を有する。
【表７】
2008521389.tif 000009
【図１−２】図１は、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃのヌクレオチド配列と、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−ＦによりコードされるＭＢＤ２−Ｆｃ二機能性タンパク質のタンパク質配列（太字）を示す。
【図１−３】図１は、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−Ｆｃのヌクレオチド配列と、プラスミドｐＭＴＢｉｐ／ＭＢＤ２−ＦによりコードされるＭＢＤ２−Ｆｃ二機能性タンパク質のタンパク質配列（太字）を示す。
【図２】Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞におけるＭＢＤ２−ＦCの発現。安定トランスフェクトされたＳ２細胞を、ｗ／ｏ  ５００μＭ  ＣｕＳＯ4を含む培地ｗ／ｏ  ＦＣＳに播種した。４日後、上清を回収し、セファロースビーズを用い、４℃でｏ／ｎ、予備洗浄した。予備洗浄された上清１ｍｌを、Ａタンパク質セファロースを用いて沈降させ、洗浄し、ＳＤＳローディング色素に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このゲルをクマシー染色して沈降したタンパク質を検出した。
【図３】逆サウス−ウエスタンブロット。ヒトＩＣＳＢＰ−プロモーター（Ａ）の６５０ｂｐのＰＣＲ断片、または種々のＣｐＧ密度のメチル化プロモーター断片（５０ｎｇ）（ＣｐＧ−ジヌクレオチドの数／１００ｂｐ：ＩＣＳＢＰ：１０，６；ＣＨＩ３Ｌ１：２，９；ＴＬＲ２：６，２；ＴＬＲ３：２，１）を、ＳｓｓＩを用いてメチル化し、アガロースゲル電気泳動（対照として臭化エチジウム染色が示されている）を行い、ナイロン膜に直接ブロットした。膜を、実施例３に記載するように、ＭＢＤ２−Ｆｃ、ＨＲＰコンジュゲート(ｋｏｎｊｕｇａｔｅｄ)抗ヒトＦｃおよびＥＣＬを用いて染色した。
【図４】ＭＢＤ−Ｆｃビーズに対するＣｐＧメチル化物の塩濃度依存性結合。（Ａ）ヒトプロモーター断片の模式図。丸はＣｐＧ−ジヌクレオチドの位置を示す（白丸：非メチル化ＣＰＭ；黒丸：ＳｓｓＩメチル化ＣＣＬ１３、ＴＬＲ２、ＣＨＩ３Ｌ１）。（Ｂ，Ｃ）メチル化および非メチル化断片の混合物をＭＢＤ２−Ｆｃ−セファロース（Ａタンパク質−セファロース５０μｌ当たりのＭＢＤ２−Ｆｃの量が示されている）に結合させ、塩濃度を引き上げて溶出させ、アガロースゲル電気泳動を用いて精製および分離した（投入混合物の１／５と共に）。バンドを臭化エチジウムで可視化し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて走査した。
【図５】ＭＣＩｐによるＣｐＧアイランドの富化。示された細胞種のゲノムＤＮＡ（３００ｎｇ）に対してＭＣＩｐを行った。３つのＣｐＧアイランドプロモーター（ＴＬＲ２、ｐ１５およびＥＳＲ１）の富化を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲを用いて定量した。ＭＣＩｐ溶出物から増幅させた特定のプロモーター断片の量が、非処理のゲノムＤＮＡ対照と比較して示されている。ＴＨＰ−１細胞にはｐ１５プロモーターが検出できなかったが、このことはこの遺伝子の突然変異または欠失を示す。
【図６】ＭＣＩｐによるメチル化ＣｐＧアイランド検出の感度。制限ゲノムＵ９３７ＤＮＡの量を引き下げてＭＣＩｐを行った。２つのＣｐＧアイランドプロモーター（ＴＬＲ２、ｐ１５）の富化を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲを用いて定量した。ＭＣＩｐ溶出物から増幅させた特定のプロモーター断片の量が、非処理のゲノムＤＮＡ対照と比較して示されている。
【図７】ＭＢ−ＰＣＲの原理。この図はＭＢ−ＰＣＲの模式図を示す。
【図８】正常ＤＮＡサンプルおよび４つの白血病ＤＮＡサンプルにおけるＴＬＲ２、ＥＳＲ１およびｐ１５プロモーターのＭＢ−ＰＣＲ。示された細胞種のゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）に対してＭＢ−ＰＣＲを行った。３つのＣｐＧアイランドプロモーター（ＴＬＲ２、ｐ１５およびＥＳＲ１）の富化を標準的なゲノムＰＣＲにより検出した。ＴＨＰ−１細胞にはｐ１５プロモーターが検出できなかったが、このことはこの遺伝子の突然変異または欠失を示す。
【図９】リアルタイムＰＣＲを用いた特定のＣｐＧアイランドプロモーターにおけるＣｐＧメチル化のＭＣＩｐ検出。（Ａ〜Ｃ）分画メチル−ＣｐＧ免疫沈降（ＭＣＩｐ）をリアルタイムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲと併用し、非処理（グレーのバー）並びにＳｓｓＩメチル化およびＭｓｅＩ制限ゲノムＤＮＡ断片（黒いバー）由来の示された遺伝子のメチル化状態を検出した。ＭＣＩｐ溶出物から回収された遺伝子断片（上の四角にはＮａＣｌ濃度（ｍＭ）を示す）および同量の投入ＤＮＡをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＰＣＲにより増幅させた。個々の画分の値（平均値±ＳＤ，ｎ＝４）は回収率％を表し、個々の投入ＤＮＡから生成したＰＣＲ産物の量（１００％）に対して算出する。各図の上に相当するＣｐＧアイランドの３ｋＢ領域を模式的に示している。各ＣｐＧジヌクレオチドは垂直線により示されている。エキソンの位置はグレーの四角として示され、転写開始部位は矢印で示されている。白四角は１００ｂｐ断片を表す。黒四角は検出されるＭｓｅＩ断片の位置を示す。（Ｄ〜Ｇ）３つのヒト骨髄性白血病細胞系統（ＫＧ−１、Ｕ９３７およびＴＨＰ−１）並びに正常ヒト血液単球（Ｎ）の高塩（１０００ｍＭ）ＭＣＩｐ画分におけるＳＮＲＰＮ、ＴＬＲ２、ＥＳＲ１およびＣＤＫＮ２Ｂを、上記のようにリアルタイムＰＣＲにより分析した。
【図１０】ＭＣＩｐアプローチの感度および直線性。（Ａ）ＭｓｅＩ処理されたＵ９３７ＤＮＡの量を引き下げて、ＭＣＩｐを行った。ＣＤＫＮ２ＢおよびＴＬＲ２遺伝子断片を上記のように定量した。（Ｂ）正常ヒト血液単球（Ｎ）とＫＧ−１細胞のＭｓｅＩ処理ＤＮＡを示された比率で混合し、その混合物に対してＭＣＩｐを行い、ＴＬＲ２遺伝子断片を上記のようにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＰＣＲを用いて定量した。
【図１（Ｉ）】
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【図１（ＩＩ）】
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【図１（ＩＩＩ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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