(57)【要約】Ｎｏｇｏ、ＭＡＧ、およびＯＭｇｐは、ニューロンＮｏｇｏ−６６受容体（ＮｇＲ）に結合してＣＮＳ損傷後の軸索再生を制限するミエリン由来タンパク質である。Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質は、インビボで最も顕著な役割を果たしている可能性がある。おそらく、その作用がＮｇＲと他の受容体の両方によって媒介されているからである。ここで、本発明者らは、Ｎｏｇｏ−ＡおよびＮｇＲの機能的ドメインについての以前の解析を発展させている。ＮｇＲに依存するＮｏｇｏ−６６阻害ドメインおよびＮｇＲに依存しないアミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ特異的ドメインに加え、本発明者らは、ナノモルの親和性でＮｇＲに結合する第３のＮｏｇｏ−Ａ特異的ドメインを特定している。１９アミノ酸（ａａ）のこの第３のドメインは、細胞伸展または軸索伸長を変化させない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１３、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１４、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１５、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１６、
（ｅ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１７、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸９９２〜１０１８、
（ｈ）配列番号２のアミノ酸９９３〜１０１８、および
（ｉ）配列番号２のアミノ酸９９４〜１０１８
からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＮｇＲ１に結合する、ポリペプチド断片。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、前記参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド断片。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、前記参照アミノ酸配列と同一である、請求項２に記載のポリペプチド断片。
【請求項４】
２００残基以下の単離されたポリペプチド断片であって、
配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８と少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列を含み、ここで該第１のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に結合されており、かつ該ポリペプチド断片はＮｇＲ１に結合する、ポリペプチド断片。
【請求項５】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８を含む、請求項４に記載のポリペプチド断片。
【請求項６】
前記第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸９５０〜１０１８を含む、請求項５に記載のポリペプチド断片。
【請求項７】
前記ポリペプチド断片は、ＮｇＲが媒介する神経突起伸長阻害を増強する、請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド断片。
【請求項８】
配列番号５を含む、請求項５に記載のポリペプチド断片。
【請求項９】
配列番号５から本質的になる、請求項５に記載のポリペプチド断片。
【請求項１０】
前記ポリペプチド断片は修飾されている、請求項４〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド断片。
【請求項１１】
前記修飾はビオチン化である、請求項１０に記載のポリペプチド断片。
【請求項１２】
前記ポリペプチド断片は、異種のポリペプチドに結合されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド断片。
【請求項１３】
前記異種のポリペプチドは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、およびＦｃからなる群より選択される、請求項１２に記載のポリペプチド断片。
【請求項１４】
単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、少なくとも、
（ａ）アミノ酸６７、６８および７１、
（ｂ）アミノ酸１１１、１１３および１１４、
（ｃ）アミノ酸１３３および１３６、
（ｄ）アミノ酸１５８、１６０、１８２、および１８６、
（ｅ）アミノ酸１６３、ならびに
（ｆ）アミノ酸２３２および２３４
からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて、配列番号４のアミノ酸２７〜４７３を含み、
ここで該ＮｇＲ１ポリペプチドはＮｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１のいずれにも結合しない、単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、少なくとも、
（ａ）アミノ酸７８および８１、
（ｂ）アミノ酸８７および８９、
（ｃ）アミノ酸８９および９０、
（ｄ）アミノ酸９５および９７、
（ｅ）アミノ酸１０８、
（ｆ）アミノ酸１１７、１１９および１２０、
（ｇ）アミノ酸１３９、
（ｈ）アミノ酸２１０、ならびに
（ｉ）アミノ酸２５６および２５９
からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて、配列番号４のアミノ酸２７〜４７３を含み、
ここで該ＮｇＲポリペプチドはＮｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１の少なくとも１つに選択的に結合するが、それらのすべてに結合するわけではない、単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチドと、薬学的に受容可能な担体とを含む、組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、口腔内投与、経口投与、および微小注入投与からなる群より選択される経路による投与のため処方されている、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は担体をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、神経生物学、神経学、および薬理学に関する。より具体的に本発明は、軸索成長を媒介するための方法および組成物ならびにニューロンに関する。
【背景技術】
【０００２】
成熟した哺乳動物の脳および脊髄において、軸索の接続は固定されている。接続が損傷によって切れた場合、軸索の再生はほとんど起こらないか全く起こらない。ニューロンの外から、星状グリア瘢およびＣＮＳミエリンは軸索成長を阻害する（非特許文献１；非特許文献２）。成熟したＣＮＳ軸索を取り囲む環境が変化した場合、軸索の成長が起こり得る（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＣＮＳミエリンから、軸索成長を阻害できる３種のタンパク質、Ｎｏｇｏ、ＭＡＧおよびＯＭｇｐが単離されている（非特許文献２）。
【０００３】
Ｎｏｇｏは、３つのイソ体で存在しており、それらの全ては、２つの疎水性セグメントを含む１つのカルボキシル末端セグメントを共有している（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献２；非特許文献８）。３つのイソ体は、異なる親水性アミノ末端セグメントを有しており、そしてＮｏｇｏ−Ａは、ＣＮＳミエリンにおいて乏突起膠細胞により生産される主要な形態である（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献９；非特許文献１０）。Ｎｏｇｏ−Ａは２つの阻害ドメインを有することが明らかにされている。カルボキシル領域にある阻害Ｎｏｇｏ−６６ドメインは、その両側に２つの疎水性セグメントが存在し、乏突起膠細胞の表面において検出することができる（非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献１２）。Ｎｏｇｏ−Ａのアミノ末端セグメントは単独で軸索阻害を示す（非特許文献６；非特許文献１１）。中央のΔ２０領域がこの活性に最も重要であると思われる（非特許文献１２）。Ｎｏｇｏ−６６ドメインのようなアミノ−Ｎｏｇｏドメインは、乏突起膠細胞の表面で検出されており、Ｎｏｇｏ−Ａについて２つのコンフォメーションが提案されている（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１２）。その１つにおいて、アミノ末端とカルボキシル末端は細胞質ゾルにあり、Ｎｏｇｏ−６６ループは２つの膜貫通セグメントによって細胞外に位置する。もう１つの形態では、第１の疎水性セグメントが、膜貫通セグメントを形成することなく原形質膜内からその外にループ状になっており、そのためアミノ−ＮｏｇｏおよびＮｏｇｏ−６６は脂質二重層の同じ側に配置されている。
【０００４】
脊髄損傷または脊髄卒中の後、Ｎｏｇｏ経路を抗体またはペプチドによってかく乱することにより、軸索の成長が促進され、形成性、および機能回復がもたらされる（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。Ｎｏｇｏ機能の遺伝子研究は、軸索再生におけるＮｏｇｏの本質的な役割について矛盾するデータをもたらしている（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。Ｎｏｇｏ−Ａ−Ｉ−ミエリンは全ての研究で阻害活性を減少させているが、２つの研究において、これはインビボである程度の軸索再生を伴っていた一方、もう１つの研究ではインビボでの再生がなかった（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。末梢でのＮｏｇｏのトランスジェニック発現は、遅いさもなくば速い再生に十分なものである（非特許文献２２；非特許文献２３）。ＭＡＧを欠くマウスはＣＮＳ軸索再生がないことが報告されている（非特許文献２４）。ただし、末梢での再生は、特定の遺伝的背景において促進され得る（非特許文献２５）。
【０００５】
Ｎｏｇｏ−６６ドメインに対する受容体は発現クローニングによって特定された（Ｎｏｇｏ−６６受容体（ＮｇＲ））（非特許文献１１）。このタンパク質は、生後のニューロンにおいて選択的に発現され、Ｎｏｇｏ−６６への応答を媒介する。ＮｇＲは、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含むタンパク質であり、ニューロンの表面にＧＰＩで固定されている。ＬＲＲドメインは、リガンド結合部位を形成しており、その構造は明らかにされている（非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。注目すべきことに、ＭＡＧとＯＭｇｐは、同じＮｇＲタンパク質のＬＲＲドメインに結合してインビトロで軸索成長を阻害する（非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１）。インビボにおいて、ＮｇＲの遺伝子欠損は、脊髄離断の後、いくらかの軸索繊維が成長し機能回復を促進することを可能にする（非特許文献３２）。軸索の運動性を調節するため、補助受容体は、シグナルをＮｇＲから細胞の内部に伝達することを必要とされる。ｐ７５ＮＴＲおよびＬｉｎｇｏ−１膜貫通タンパク質の両方が、ＮｇＲシグナル伝達に関係している（非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献３５）。しかし、アミノ−Ｎｏｇｏドメインに対する受容体も、複数のリガンドとのＮｇＲ相互作用の分子的根拠も明らかにされていなかった。
【０００６】
Ｎｏｇｏ−Ａ活性の我々の最初の機能解析は、Ｎｏｇｏ−６６ドメインからアミノ−Ｎｏｇｏドメインを分離したことであった（非特許文献１１）。我々は、ＮｇＲがＮｏｇｏ−６６に対する受容体である一方、アミノ−Ｎｏｇｏは別のメカニズムを利用していることを明らかにしてきた。ここで我々は、形態学的アッセイでは明らかにされていなかった別の活性を明らかにしている。
【非特許文献１】Ｈｏｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９６３−９７０（２０００）
【非特許文献２】ＭｃＧｅｅ，Ａ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：１９３−１９８（２００３）
【非特許文献３】Ｂｅｎｆｅｙ，Ｍ．ａｎｄ  Ａｇｕａｙｏ，Ａ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：１５０−１５２（１９８２）
【非特許文献４】Ｄａｖｉｄ，Ｓ．ａｎｄ  Ａｇｕａｙｏ，Ａ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：９３１−９３３（１９８１）
【非特許文献５】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：２６４−２６５（１９８０）
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）
【非特許文献７】ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００）
【非特許文献８】Ｐｒｉｎｊｈａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：３８３−３８４（２０００）
【非特許文献９】Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：３５５３−３５６７（２００２）
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５５０５−５５１５（２００２ｃ）
【非特許文献１１】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）
【非特許文献１２】Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ）
【非特許文献１３】Ｂｒｅｇｍａｎ，Ｂ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４９８−５０１（１９９５）
【非特許文献１４】ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２）
【非特許文献１５】Ｌｅｅ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６２０９−６２１７（２００４）
【非特許文献１６】Ｌｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４２１９−４２２７（２００３）
【非特許文献１７】Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｌ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：２６９−２７２（１９９０）
【非特許文献１８】Ｗｉｅｓｓｎｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２３：１５４−１６５（２００３）
【非特許文献１９】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１８７−１９９（２００３ｂ）
【非特許文献２０】Ｓｉｍｏｎｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，３８：２０１−２１１（２００３）
【非特許文献２１】Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．３８：２１３−２２４（２００３）
【非特許文献２２】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：４５１−４５９（２００３ａ）
【非特許文献２３】Ｐｏｔ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５９：２９−３５（２００２）
【非特許文献２４】Ｂａｒｔｓｃｈ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １５：１３７５−１３８１（１９９５）
【非特許文献２５】Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １６：１１０７−１１１３（１９９６）
【非特許文献２６】Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３）
【非特許文献２７】Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８８７６−８８８３（２００２）
【非特許文献２８】Ｈｃ，Ｘ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１７７−１８５（２００３）
【非特許文献２９】Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２）
【非特許文献３０】Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２）
【非特許文献３１】Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２ｂ）
【非特許文献３２】Ｋｉｍ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ４４：４３９−４５１（２００４）
【非特許文献３３】Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）
【非特許文献３４】Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：７４−７８（２００２ａ）
【非特許文献３５】Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１３０２−１３０８（２００２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、Ｎｏｇｏ−Ａのアミノ−Ｎｏｇｏドメインが、ＮｇＲにおける中心結合ドメインと相互作用する領域を保有しているという発見に基づいている。Ｎｏｇｏ−６６と、このアミノ−Ｎｏｇｏドメインとの組合せは、実質的により高い親和性のＮｇＲリガンドを作り出しており、これは、インビボで軸索の再生を制限することにおいて最も重要であると考えられる。さらに、ＮｇＲは、中心結合ドメインにおいて複数のリガンドと相互作用するため特定の残基を利用しており、また、特定のリガンドと相互作用するため周りの特定の残基を利用している。これらの発見に基づき、本発明は、ＣＮＳニューロンにおける軸索成長阻害を促進するのに有用な分子および方法に関する。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本発明は、３０残基以下の単離されたポリペプチド断片を提供し、それは、（ａ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１３、（ｂ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１４、（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１５、（ｄ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１６、（ｅ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１７、（ｆ）配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８、（ｇ）配列番号２のアミノ酸９９２〜１０１８、（ｈ）配列番号２のアミノ酸９９３〜１０１８、および（ｉ）配列番号２のアミノ酸９９４〜１０１８からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、かつＮｇＲ１に結合する。ある実施態様において、本発明が提供するポリペプチド断片は該参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。他の実施態様において、ポリペプチド断片は該参照アミノ酸配列と同一である。
【０００９】
いくつかの実施態様において、本発明は、２００残基以下の単離されたポリペプチド断片を提供する。該ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８と少なくとも９０％同一である第１のアミノ酸配列を含み、そこにおいて、該第１のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に結合されており、かつ該ポリペプチド断片はＮｇＲ１に結合するものである。ある実施態様において、該第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に結合された配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８を含む。他の実施態様において、該第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に結合された配列番号２のアミノ酸９５０〜１０１８を含む。ある実施態様において、本発明のポリペプチド断片は、ＮｇＲが媒介する神経突起伸長阻害を増強する。いくつかの態様において、ポリペプチド断片は、配列番号５を含みかつ／または配列番号５から本質的になる。
【００１０】
いくつかの実施態様において、本発明が提供するポリペプチドは修飾されている。ある実施態様において、該修飾はビオチン化である。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本発明がさらに提供するポリペプチドは、異種のポリペプチドに融合されている。ある実施態様において、該異種ポリペプチドはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。ある実施態様において、該異種ポリペプチドはヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）である。ある実施態様において、該異種ポリペプチドはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）である。ある実施態様において該異種ポリペプチドはＦｃである。
【００１２】
いくつかの実施態様において、本発明は、単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチドを提供し、該ＮｇＲ１ポリペプチドは、少なくとも、（ａ）アミノ酸６７、６８および７１、（ｂ）アミノ酸１１１、１１３および１１４、（ｃ）アミノ酸１３３および１３６、（ｄ）アミノ酸１５８、１６０、１８２、および１８６、（ｅ）アミノ酸１６３、ならびに（ｆ）アミノ酸２３２および２３４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて、配列番号４のアミノ酸２７〜４７３を含み、ここで該ＮｇＲ１ポリペプチドはＮｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１のいずれにも結合しないものである。他の実施態様において、本発明は、単離されたヒトのＮｇＲ１ポリペプチドを提供し、該ＮｇＲ１ポリペプチドは、少なくとも、（ａ）アミノ酸７８および８１、（ｂ）アミノ酸８７および８９、（ｃ）アミノ酸８９および９０、（ｄ）アミノ酸９５および９７、（ｅ）アミノ酸１０８、（ｆ）アミノ酸１１７、１１９および１２０、（ｇ）アミノ酸１３９、（ｈ）アミノ酸２１０、ならびに（ｉ）アミノ酸２５６および２５９からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて、配列番号４のアミノ酸２７〜４７３を含み、ここで該ＮｇＲポリペプチドはＮｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１の少なくとも１つに選択的に結合するが、それらのすべてに結合するものではない。
【００１３】
意図される他の実施態様には、本発明のポリペプチドまたはその断片を発現するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、および該ポリヌクレオチドを含みかつ本発明のポリペプチド発現する宿主細胞が含まれる。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様には組成物が含まれ、該組成物は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含むものであり、さらに特定の実施態様において薬学的に受容可能な担体を含むものである。該組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、口腔内投与、経口投与、および微小注入投与からなる群より選択される経路による投与のため処方することができる。該組成物は、担体をさらに含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
特に断らない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。もし争いが生じた場合、定義を含む本願に照らし合わせることとなる。文脈上必要でない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。ここで言及するすべての刊行物、特許、およびその他の文献は、それぞれの刊行物または特許出願が具体的かつ個別に組み込まれて示されるかのように、引用によりその内容がそっくり本明細書に記載されたものとする。
【００１６】
ここに記載されたものに類似するかまたは均等な方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、以下に適切な方法および材料を記載することとする。材料、方法および具体例は、単なる例示であって限定を意図するものではない。本発明の他の特徴および効果は、詳細な説明や請求の範囲から明らかになるはずである。
【００１７】
本発明をさらに規定するため、以下のとおり用語および定義を規定する。
【００１８】
留意すべきこととして、用語「１つの」ものは、１つ以上のそのものを意味し、例えば、「１つの免疫グロブリン（免疫グロブリン）」は１種以上の免疫グロブリン分子を表すものとして解釈される。従って、ここで用語「１つ（ａまたはａｎ）」、「１つ以上（１以上）」および「少なくとも１つ」は、区別なく同義なものとして用いることができる。
【００１９】
本明細書および請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形（例えば「含み」「含んでいる」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））は、任意の記載した完結事項または完結事項の群を含み、任意の他の完結事項または完結事項の群を排除しないことを意味する。
【００２０】
ここで使用する用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」またはその変形（例えば「からなり」（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆまたはｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ））は、本明細書および請求の範囲を通じて使用するとき、任意の記載した完結事項または完結事項の群を含む一方、さらなる完結事項または完結事項の群を特定の方法、構造または組成に追加できないことを意味する。
【００２１】
ここで使用する用語「から本質的になる（からなる）（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」またはその変形（例えば「から本質的になり（からなり）」（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆまたはｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ））は、本明細書および請求の範囲を通じて使用するとき、任意の記載した完結事項または完結事項の群を含み、そして特定の方法、構造または組成の基本的なまたは新規な特徴を実質的に変えることのない所定の任意の完結事項または完結事項の群を必要に応じて含むことを意味する。
【００２２】
ここで使用する用語「ポリペプチド」は、単数のポリペプチドのみならず複数のポリペプチドを包含することを意図しており、そして、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により線状に結合されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖の１つまたは複数を指し、特定の長さのものを指すものではない。従って、ペプチド（類）、ジペプチド（類）、トリペプチド（類）、オリゴペプチド（類）、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または、２つ以上のアミノ酸の鎖の１つまたは複数を指すのに使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれるものであり、そして、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかに替えて、あるいは、これらの用語のいずれとも区別なく同義なものとして、用いることができる。また用語「ポリペプチド」は、発現後にポリペプチドを修飾した産物（限定されることなく、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾の産物）を指すことも意図している。あるポリペプチドは、天然の生物源から得ることができ、あるいは、組換え技術によって生産することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含む任意の態様で生成させることができる。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１０００以上、または２０００以上のアミノ酸のサイズとすることができる。ポリペプチドは特定の三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。特定の三次元構造を有するポリペプチドを、折りたたまれていると言い、そして、特定の三次元構造を有さずむしろ多数の異なるコンフォメーションを採用できるポリペプチドを、折りたたまれていないと言う。ここで使用する用語、糖タンパク質は、アミノ酸残基（例えばセリン残基またはアスパラギン残基）の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介して少なくとも１つの炭水化物部分が結合されているタンパク質を指す。
【００２４】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、それが天然の環境にないポリペプチドであることを意図している。特定のレベルの精製は必要でない。例えば、単離されたポリペプチドは、その本来の環境または天然の環境から取り出すことができる。遺伝子組換えにより生産されたポリペプチドおよび宿主細胞で発現されたタンパク質は、任意の適切な技法により分離、分画、または部分的もしくは十分に精製された本来のポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様、本発明の目的のため単離されたものとみなされる。
【００２５】
本発明において、「ポリペプチド断片」はより大きなポリペプチドの中の短いアミノ酸配列を指す。タンパク質断片は、「自立したもの」であってもよいし、より大きなポリペプチド内の領域の一部を構成するものであってもよい。本発明のポリペプチド断片の典型例には、例えば、長さで約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約６０アミノ酸、約７０アミノ酸、約８０アミノ酸、約９０アミノ酸、および約１００アミノ酸以上を含む断片がある。
【００２６】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」は、本発明のポリペプチドを指す場合、少なくともある生物活性を保持する任意のポリペプチドを含むものである。ここに記載されるポリペプチドは、その機能を依然として発揮している限り、限定されることなく、その中の断片、変異体、または誘導体の分子を含むことができる。本発明のポリペプチドまたはその断片は、タンパク質分解断片および欠失断片を含むことができ、また特に、動物に配達されるときより容易に作用部位に到達する断片を含むことができる。さらにポリペプチド断片は、元のポリペプチドの抗原エピトープまたは免疫原性エピトープ（直鎖状エピトープおよび三次元的エピトープを含む）を含むポリペプチドの任意の部分を含む。本発明のポリペプチドまたはその断片は、変異領域（上記断片を含む）を含むことができ、また、アミノ酸の置換、欠失、または挿入により変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。変異体は、対立遺伝子変異型のように自然に生じ得る。「対立遺伝子変異型」は、生物の染色体上にある所定の遺伝子座を占める遺伝子の代替的形態を意味する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない変異体は、当該技術で知られている変異誘発法を用いて生成させることができる。本発明のポリペプチドまたはその断片は、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。また本発明のポリペプチドまたはその断片は、誘導体分子を含むこともできる。ここで変異ポリペプチドは「ポリペプチド類似体」とも呼ぶことができる。ここで使用するポリペプチドまたはポリペプチド断片の「誘導体」は、対象となるポリペプチドで、官能側基の反応により化学的に誘導された１つ以上の残基を有するものを指す。さらに「誘導体」として含まれるものには、２０の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を１つ以上含むペプチドがある。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換することができ、リシンを５−ヒドロキシリシンで置換することができ、ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換することができ、セリンをホモセリンで置換することができ、また、リシンをオルニチンで置換することができる。
【００２７】
ここで使用する用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、チオール基を含み、それは、もう１つのチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成できる。
【００２８】
ここで使用する用語「融合タンパク質」は、第１のポリペプチドと、ペプチド結合を介してそれに直線的に結合した第２のポリペプチドとを含むタンパク質を意味する。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは、同じでも異なっていてもよく、また、それらは、直接結合されていても、ペプチドリンカーを介して結合されていてもよい（以下参照）。
【００２９】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形の核酸のみならず複数形の核酸をも包含しようとするものであり、また、単離された核酸分子または核酸構造物（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ））を指す。ポリヌクレオチドは、完全長のｃＤＮＡ配列（非翻訳５’および３’配列、コード配列を含む）のヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または特殊な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなることができ、それは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいし、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡからなることができ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡからなることができ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなることができ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡからなることができ、また、一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物とすることができるＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子からなることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むかまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域からなることができる。ここで使用する「ポリヌクレオチド」は、１以上の修飾された塩基を含んでもよく、あるいは、安定性のためまたは他の理由のため修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡの骨格を含んでもよい。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような異常塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して施すことができる。従って、「ポリヌクレオチド」は化学修飾された形態、酵素により修飾された形態、または代謝により修飾された形態を包含する。
【００３０】
用語「核酸」は、１以上の任意の核酸セグメント、例えばポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その本来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする組換えポリヌクレオチドであってベクターに含まれるものは、本発明の目的のため単離されたものとみなされる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞に保持される組換えポリヌクレオチドや、溶液中の（部分的にまたは十分に）精製されたポリヌクレオチドがある。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボＲＮＡ転写物またはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成によって生成されたそのような分子をさらに含む。また、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節要素（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、または転写終結因子）であってもよいし、それを含むものであってもよい。
【００３１】
ここで使用する用語「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができる。しかし、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。本発明による２以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構造物（例えば、単一のベクター）に存在することができ、あるいは、別々のポリヌクレオチド構造物（例えば別々の（異なる）ベクター）に存在することができる。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含むことができ、あるいは、２以上のコード領域を含むことができる（例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖の可変領域と免疫グロブリン軽鎖の可変領域をそれぞれコードすることができる）。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸と融合されたまたは融合されていない異種のコード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、例えば、特化された要素またはモチーフ（例えば分泌シグナルペプチドや異種の機能的ドメイン）が含まれる。
【００３２】
特定の実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１以上のコード領域に作用可能に結合されたプロモーターおよび／または他の転写調節要素もしくは翻訳調節要素を含むことができる。作用可能な結合は、遺伝子産物の発現が１つまたは複数の調節配列の影響下または制御下に置かれるよう、遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が１以上の調節配列に結合している場合をいう。プロモーター機能の誘導が、必要な遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、そして、２つのＤＮＡ断片の結合の性質が、遺伝子産物の発現を誘導する発現調節配列の能力を妨害しないものであるか、または、転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨害しないものである場合、２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーター）は「作用可能に結合」されている。従って、プロモーターが核酸の転写を引き起こすことができるならば、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸に作用可能に結合されているはずである。プロモーターは、所定の細胞のみにおいてＤＮＡの実質的な転写を誘導する細胞特異的なプロモーターとすることができる。プロモーター以外の他の転写調節要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルも、細胞特異的転写を誘導するためポリヌクレオチドに作用可能に結合させることができる。適切なプロモーターおよび他の転写調節領域は本明細書に開示される。
【００３３】
種々の転写調節領域は当業者に知られている。それらには、例えば、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えばサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロン−Ａと共同する最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の転写調節領域には、脊椎動物の遺伝子に由来するもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビンに由来するもの、さらには、真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列が含まれる。さらに他の適切な転写調節領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロン類またはインターロイキン類によって誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【００３４】
同様に、種々の翻訳調節要素が当業者に知られている。それらには、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来する要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））があるがこれらに限定されるものではない。
【００３５】
他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチド（本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を誘導するもの）をコードするさらなるコード領域と結合されていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有しており、それは、一旦、成長するタンパク質鎖の粗面小胞体を介した移出が始まると、成熟したタンパク質から切断されるものである。当業者に知られるとおり、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、該ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有しており、それは、完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されて、該ポリペプチドの分泌形または「成熟」形をもたらす。特定の実施態様において、天然のシグナルペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のシグナルペプチド）を使用するか、あるいは、ポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持した配列の機能的誘導体を、ポリペプチドに作用可能に結合させる。一方、異種の哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型のリーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置き換えることができる。
【００３７】
ここで使用する用語「操作」は、核酸分子またはポリペプチド分子の人為的手段（例えば組換え法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素による結合または化学的結合、またはそれらの方法のある組合せ）による操作を包含する。
【００３８】
ここで使用する用語「結合」は、化学的結合または組換え手段を含む任意の手段により、２以上の要素または成分をつなぎ合わせることを指す。用語「結合」は、ペプチド結合による直接的な融合、スペーサーを用いる間接的な融合、さらには、ペプチド結合以外の手段による（例えばジスルフィド結合または非ペプチド部分を介する）繋ぎ止めを意味することができる。
【００３９】
「リンカー」配列は、１つの融合タンパク質において２つのポリペプチドコード領域を分離している１以上のアミノ酸の配列である。典型的なリンカーは少なくとも５つのアミノ酸を含む。さらなるリンカーは、少なくとも１０または少なくとも１５のアミノ酸を含む。特定の実施態様において、ペプチドリンカーのアミノ酸は、リンカーが親水性になるよう選択される。リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号  ）は好ましいリンカーであり、それは、十分な可撓性をもたらすため、多くの抗体に広く適用することができる。他のリンカーには、Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒを含むもの（配列番号  ）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒを含むもの（配列番号  ）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｎを含むもの（配列番号  ）、Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐを含むもの（配列番号  ）、Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙを含むもの（配列番号  ）、Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含むもの（配列番号  ）、およびＧｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｓｐを含むもの（配列番号  ）がある。より短いリンカーの例には上記リンカーの断片があり、より長いリンカーの例には、上記リンカーの組合せ、上記リンカーの断片の組合せ、および上記リンカーと上記リンカーの断片との組合せがある。
【００４０】
ここで使用する用語「融合された」または「融合」は、ポリペプチドまたはポリペプチド断片に関し、区別なく同義なものとして使用される。これらの用語は、２つの要素をペプチド結合により直接的にまたは間接的に（例えばペプチドスペーサー）繋ぐことを指す。「インフレーム融合」は、２以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（読み取り枠）（ＯＲＦ）を繋いで、元のＯＲＦの正しい翻訳読み取り枠を維持する態様でより長い連続するＯＲＦを形成することを指す。従って、組換え融合タンパク質は、複数の元のＯＲＦによってコードされる複数のポリペプチドに相当する２以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（それらのセグメントは通常天然においてそのように結合されていない）。従ってリーディングフレーム（読み取り枠）は、融合されたセグメントを通じて連続的になっているが、その複数のセグメントは、物理的にまたは空間的に（例えばインフレームリンカー配列により）分離されていてもよい。
【００４１】
ポリペプチドに関し、「直鎖状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ末端からカルボキシル末端への方向のアミノ酸の序列であり、そこにおいて、配列の隣り合う残基は、ポリペプチドの一次構造において隣接している。
【００４２】
ここで使用する用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを生成させるプロセスを指す。このプロセスは、細胞内での遺伝子の機能的存在のあらゆる発現（限定されることなく、例えば、遺伝子ノックダウン、さらには一過性発現および安定的発現の両方を含む）を含む。このプロセスは、例えば、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）への転写、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）への転写、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）への転写、または任意の他のＲＮＡ産物への転写を含み、さらに、そのようなｍＲＮＡのポリペプチド（類）への翻訳、さらには転写または翻訳のいずれかを調節する任意のプロセスを含む。必要な最終産物が生化学物質である場合、発現は、そのような生化学物質の生成および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現により「遺伝子産物」が生産される。ここで使用する用語「遺伝子産物」は、核酸（例えば遺伝子の転写により生産されるメッセンジャーＲＮＡ）または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。ここに記載される遺伝子産物はさらに、転写後の修飾（例えば、ポリアデニル化）を伴う核酸、または翻訳後の修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットの結合、タンパク質分解切断など）を伴うポリペプチドを含む。
【００４３】
ここで使用する用語「治療する」または「治療」は、治療上の処置と予防手段の両方を指し、ここでその対象は望ましくない生理的変化または障害を予防または遅く（軽減）するべきものである。有益なまたは望ましい臨床結果には、例えば、症状の緩和、病気の程度の減少、病気の安定した（すなわち悪くならない）状態、病気の進行の遅延または減速、症状の改善または一時的緩和、および寛解（部分的または全体的を問わず）があり、検出できるか否かを問わない。また「治療」は、治療を受けない場合に予想される延命と比べてより長くなる延命効果をも意味する。治療が必要なものには、すでに症状または障害を伴うもののほか、症状または障害を伴いやすいもの、または症状または障害を予防すべきものが含まれる。
【００４４】
「対象者」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予防、または治療が必要な対象者、特に哺乳動物の対象者を意味する。哺乳動物の対象者には、例えば、ヒト、家畜、牧畜、動物園の動物、運動競技用動物、愛玩動物（例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛）、霊長動物（例えば類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー）、イヌ類（例えばイヌおよびオオカミ）、ネコ科動物（例えばネコ、ライオン、およびトラ）、ウマ科動物（例えばウマ、ロバ、およびシマウマ）、食用動物（例えばウシ、ブタ、およびヒツジ）、有蹄動物（例えばシカおよびキリン）、げっ歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）などがあるがこれらに限定されるものではない。特定の態様において、哺乳動物の対象者はヒトである。
【００４５】
ここで使用する次のような表現「本発明のＮｏｇｏポリペプチドまたはポリペプチド断片の投与により恩恵を受け得る対象者」および「治療が必要な動物」には、使用されるＮｏｇｏポリペプチドまたはポリペプチド断片の投与から恩恵を受けうる対象者（例えば哺乳動物の対象者）が含まれる、そのような投与は、病気（例えば精神分裂病）の検出（例えば診断の処置）および／または病気（例えば精神分裂病）の治療（すなわち軽減または予防）のため本発明のＮｏｇｏポリペプチドまたはポリペプチド断片を用いて行われる。ここでより詳細に記載されるとおり、該ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、非結合の形態で用いることができ、あるいは、薬剤、プロドラッグまたはアイソトープ（同位体）と結合させることができる。
【００４６】
ここで使用する表現「治療上有効な量」は、所望の治療効果を得るため必要な用量および時間において有効な量を指す。治療効果は、例えば、症状の軽減、延命、モビリティの向上などであり得る。治療効果は「治癒」である必要はない。
【００４７】
ここで使用する表現「予防上有効な量」は、所望の予防効果を得るため必要な用量および時間において有効な量を指す。典型的に、予防上の投与量は、病気の前またはより早い段階において対象者に使用するため、予防上の有効量は治療上の有効量より少なくなる。
【００４８】
本発明は、神経突起伸長阻害を増強するかまたは異常なニューロンの発生（例えばＣＮＳニューロン）を阻害する特定のＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。例えば、本発明は、軸索成長が過度であるかまたは低活性である条件下において異常なニューロンの発生を阻害するＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片を提供する。従って、本発明のＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片は、異常なニューロンの発生を阻害するかまたは神経突起伸長を阻害することにより軽減することができる傷害、疾患、または障害の治療に有用である。
【００４９】
例示的な疾患、障害または傷害には、精神分裂病、双極性障害、強迫性障害（ＯＣＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、ダウン症、およびアルツハイマー病があるがこれらに限定されるものではない。
【００５０】
ＮｏｇｏならびにＮｏｇｏ受容体のポリペプチドおよびポリペプチド断片
本発明は、例えば神経突起伸長の阻害または異常なニューロン発生の阻害に有用な特定のＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。典型的に、本発明のＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片は、ニューロンの生存、神経突起伸長、または中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索再生のＮｇＲ１媒介阻害を増強するよう作用する。さらに本発明は、ＮｇＲを特異的に発現する細胞またはニューロンを標的とするドラッグデリバリー機構として有用な特定のＮｏｇｏポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。また本発明は、可能性のある薬剤候補のスクリーニング法に使用するための特定のＮｇＲポリペプチドおよびポリペプチド断片に関する。
【００５１】
ヒトのＮｏｇｏ−Ａポリペプチドを配列番号２として以下に示す。
【００５２】
完全長ヒトＮｏｇｏ−Ａ（配列番号２）
【００５３】
【化１】
2008515804.tif 000002
完全長ヒトＮｇＲ−１を配列番号４として以下に示す。
【００５４】
完全長ヒトＮｇＲ−１（配列番号４）
【００５５】
【化２】
2008515804.tif 000003
完全長ラットＮｇＲ−１を配列番号６として以下に示す。
【００５６】
完全長ラットＮｇＲ−１（配列番号６）
【００５７】
【化３】
2008515804.tif 000004
特定の実施態様において、本発明は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００残基以下の単離されたポリペプチド断片を提供し、ここで、該ポリペプチド断片は、Ｎｏｇｏ参照アミノ酸配列と９０％以上同一であるアミノ酸配列を含み、該ポリペプチド断片はＮｇＲ１に結合する。特定の実施態様において、該ポリペプチド断片は３０残基以下である。この実施態様に従い、Ｎｏｇｏ参照アミノ酸配列には、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１３、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１４、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１５、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１６、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１７、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１９、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０２０、アミノ酸９９２〜１０１８、配列番号２のアミノ酸９９３〜１０１８、および配列番号２のアミノ酸９９４〜１０１８があるが、これらに限定されるものではない。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、さらには、該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も本発明に含まれる。プロモーターのような発現調節要素との作用可能な結合を通じて該ポリペプチドを発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞も含まれる。
【００５８】
「Ｎｏｇｏ参照アミノ酸配列」または「参照アミノ酸配列」は、アミノ酸の置換が導入されていない特定の配列を意味する。当業者に明らかなとおり、置換がなければ、本発明の「単離されたポリペプチド」は、参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
この実施態様による例示的な参照アミノ酸配列には、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１３および配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８がある。
【００６０】
ここに記載する配列番号２またはその断片と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である、Ｎｏｇｏポリペプチドまたはポリペプチド断片の対応する断片も意図するところである。当該技術において知られるとおり、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列をもう１つのポリペプチドの配列と比較することにより求められる。ここで言及する場合、任意の特定のポリペプチドがもう１つのポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、当該技術において知られる方法およびコンピュータープログラム／ソフトウェア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）を用いて判定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列間で相同な最適セグメントを見出すため、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジー（局所類似性）アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））を用いている。例えば、ある特定の配列が本発明による参照配列と９５％同一であるかどうかをＢＥＳＴＦＩＴまたは他の任意の配列整合プログラムを用いて判定する場合、当然のことながら、参照ポリペプチド配列の全長にわたって同一性の百分率を計算して、参照配列におけるアミノ酸の総数の５％まで相同性の食い違いを許容するよう、パラメーターが設定される。
【００６１】
一局面において、本発明に含まれるものには、２以上の上述したポリペプチド断片を融合タンパク質において含むポリペプチド、ならびに、上述したポリペプチド断片に異種アミノ酸配列が融合したものを含む融合タンパク質がある。本発明はさらに、上記ポリペプチド断片の変異体、類似体、または誘導体を含む。
【００６２】
一実施態様において、本発明は、２００残基以下、または１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、若しくは１２５残基以下の単離されたポリペプチド断片を提供し、該ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８と少なくとも８０％、９０％または９５％同一である第１のアミノ酸配列を含み、ここで該第１のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に直接的または間接的に結合されている。もう１つの実施態様において、該ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に融合された配列番号２のアミノ酸９９５〜１０１８を含む。他の実施態様において、該ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸９５０〜１０１８、９６０〜１０１８、９７０〜１０１８、９８０〜１０１８、９９０〜１０１８、９９５〜１０２８、９９５〜１０３８、９９５〜１０４８、および９９５〜１０５４に少なくとも８０％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで該ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸１０５５〜１０８６に結合または融合されている。もう１つの実施態様において、該ポリペプチド断片はＮｇＲ１に結合する。特定の実施態様において、該ポリペプチド断片は、ＮｇＲが媒介する神経突起伸長阻害を増強する。ラットＮｇＲ１もこの実施態様において意図するところである。もう１つの実施態様において、該ポリペプチド断片は配列番号５を含む。さらなる実施態様において、該ポリペプチド断片は、配列番号５から本質的になる。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、さらには該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も本発明に含まれる。プロモーターのような発現調節要素との作用可能な結合を通じて該ポリペプチドを発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞も含まれる。
【００６３】
２４〜３２融合ペプチドを配列番号５として以下に示す。
【００６４】
ＮＥＰ３２に融合されたアミノ−Ｎｏｇｏ２４（配列番号５）
【００６５】
【化４】
2008515804.tif 000005
もう１つの実施態様において、本発明は、リガンド結合特性が変化したＮｇＲ１ポリペプチド変異体を提供する。例えば、本発明が提供する単離されたポリペプチドは、（ａ）配列番号４のアミノ酸６７、６８および７１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸１１１、１１３および１１４、（ｃ）配列番号４のアミノ酸１３３および１３６、（ｄ）配列番号４のアミノ酸１５８、１６０、１８２、および１８６、（ｅ）配列番号４のアミノ酸１６３、ならびに（ｆ）配列番号４のアミノ酸２３２および２３４からなる群より選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて、配列番号４（すなわち成熟したＮｇＲ１ポリペプチド）のアミノ酸２７〜４７３を含む。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、Ｎｏｇｏ６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１のいずれにも結合しない。
【００６６】
もう１つの実施態様において、本発明が提供する単離されたポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２７〜４７３を含み、かつ（ａ）配列番号４のアミノ酸７８および８１、（ｂ）配列番号４のアミノ酸８７および８９、（ｃ）配列番号４のアミノ酸８９および９０、（ｄ）配列番号４のアミノ酸９５および９７、（ｅ）配列番号４のアミノ酸１０８、（ｆ）配列番号４のアミノ酸１１７、１１９および１２０、（ｇ）配列番号４のアミノ酸１３、（ｈ）配列番号４のアミノ酸２１０、ならびに（ｉ）配列番号４のアミノ酸２５６および２５９からなる群より選択されるアミノ酸位置で少なくともアミノ酸置換を有する。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、Ｎｏｇｏ−６６、ＯＭｇｐ、Ｍａｇ、またはＬｉｎｇｏ−１の少なくとも１つに結合するが、それらのすべてに結合するものではない。ラットまたはマウスのＮｇＲ１の類似するＮｇＲ１ポリペプチド変異体も意図するところである。該ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、さらには該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も本発明に含まれる。プロモーターのような発現調節要素との作用可能な結合を通じて該ポリペプチドを発現するポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞もまた含まれる。
【００６７】
意図する他の実施態様には、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド、ならびに、本発明のポリペプチドまたはその断片を発現する宿主細胞またはベクターがある。
【００６８】
本発明のポリペプチドまたはその断片におけるアミノ酸残基は、任意の異種アミノ酸で置換することができる。特定の実施態様において、アミノ酸は、該ポリペプチドの三次元的コンフォメーションを変化させる可能性がもっとも低い小さな非荷電アミノ酸（例えばアラニン、セリン、トレオニン、好ましくはアラニン）で置換される。他の実施態様において、アミノ酸はアラニンで置換される。
【００６９】
本発明において、ポリペプチドまたはその断片は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわちペプチド同配体）により互いにつながれたアミノ酸からなることができ、および、２０の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸（例えば天然に存在しないアミノ酸）を含んでもよい。本発明のポリペプチドは、自然のプロセス（例えば翻訳後プロセッシング）または当該技術において周知の化学修飾法のいずれかにより修飾することができる。そのような修飾は、基本的な教科書によく記載されており、また研究論文に詳細に記載されており、さらに、大部の研究文献に記載されている。修飾は、ペプチドの骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドの任意の場所で起こり得る。明らかなとおり、同じ種類の修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位において同じまたは異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、枝分れしてもよく（例えば、ユビキチン化の結果）、またポリペプチドは、枝分れしたまたは枝分れのない、環状であってもよい。環状、枝分れ、または枝分れした環状のポリペプチドは、翻訳後の自然過程から生じるものであってもよいし、あるいは、合成法により作られるものであってもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸エステルの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ付加、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、トランスファーＲＮＡが媒介するタンパク質へのアミノ酸の付加（例えばアルギニル化）、およびユビキチン化がある（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【００７０】
ここに記載するポリペプチドまたはその断片は環状でもよい。ポリペプチドの環化は、直鎖状ペプチドの配座の自由度を減らし、より構造上制約された分子をもたらす。ペプチド環化の多くの方法が当該技術において知られる。例えば、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基とのアミド結合形成による「骨格−骨格」の環化がある。この「骨格−骨格」環化の方法には、２つのω−チオアミノ酸残基（例えばシステイン、ホモシステイン）間のジスルフィド架橋形成が含まれる。本発明の特定のペプチドは、環状ポリペプチドを形成するため、ペプチドのＮ末端とＣ末端上に修飾を有する。そのような修飾には、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基、およびビオチンがあるが、これらに限定されるものではない。ペプチド環化の他の方法はＬｉ  ＆  Ｒｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（この引用によりその内容はそっくり本明細書に記載されたものとする）に記載されている。
【００７１】
本発明の特定の方法において、本発明のポリペプチドまたはその断片は、予め形成したポリペプチドとして直接投与することができ、あるいは、核酸ベクターを介して間接的に投与することができる。本発明のある実施態様において、本発明のポリペプチドまたはその断片は、（１）移植可能な宿主細胞を、本発明のポリペプチドまたはその断片を発現する核酸（例えばベクター）で形質転換または形質移入（トランスフェクト）すること、および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物の疾患部位、障害部位または傷害部位に移植することを含む治療方法において投与される。本発明のある実施態様において、移植可能な宿主細胞は、哺乳動物から取り出され、一時的に培養され、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする単離された核酸で形質転換または形質移入され、そして、細胞が取り出された元の同じ哺乳動物に移植される。この細胞は、移植と同じ部位から取り出すことができるが、必ずしもそうである必要はない。そのような実施態様（ときに生体外遺伝子治療として知られる）は、本発明のポリペプチドまたはその断片を、作用部位に局在化させて、ある限られた時間、連続的に供給することができる。
【００７２】
本発明のポリペプチドまたはその断片、ならびに、本発明を実施するためのそれらの分子を得る方法および材料についてさらなる例示を以下に述べる。
【００７３】
（融合タンパク質および結合されたポリペプチド）
本発明のいくつかの態様は、完全長タンパク質でない本発明のポリペプチド（例えばポリペプチド断片）を使用して異種ポリペプチド成分に融合させ融合タンパク質を形成することを含む。そのような融合タンパク質は、種々の目的（例えば、血清半減期の向上、生物学的利用能の向上、特定の器官または組織種へのインビボ・ターゲッティング、組換え発現効率の向上、宿主細胞分泌の向上、精製し易さ、およびより高いアビディティー（結合活性））を達成するため用いることができる。達成すべき１つまたは複数の目的に応じて、異種の成分は、不活性なものまたは生物活性なものとすることができる。また、異種の成分は、本発明のポリペプチド成分に安定に融合されるよう選択することができ、あるいは、インビトロまたはインビボで切断可能になるよう選択することができる。これらの他の目的を達成するための異種成分は当該技術において知られている。
【００７４】
融合タンパク質を発現させる代わりに、選ばれた異種成分を予め形成し、そして本発明のポリペプチド成分に化学的に結合させることができる。多くの場合、選ばれた異種成分は、ポリペプチド成分に融合されていようが結合されていようが、同様に機能する。従って、異種アミノ酸配列の以下の論述では、特に断らない限り、異種配列は、融合タンパク質の形態でまたは化学結合体としてポリペプチド成分に繋ぐことができると解釈すべきである。
【００７５】
本発明のポリペプチドまたはその断片のような薬理学的に活性なポリペプチドは、インビボで速やかに除去される可能性があり、体内で治療上有効な濃度を達成するため大きな用量を必要とする可能性がある。さらに、約６０ｋＤａより小さなポリペプチドは、糸球体ろ過を受けるおそれがあり、それは時に腎毒性をもたらす。比較的小さなポリペプチドの融合または結合を、そのような腎毒性のリスクを低減または回避するため用いることができる。治療ポリペプチドのインビボでの安定性（すなわち血清半減期）を高める種々の異種アミノ酸配列（すなわちポリペプチド成分または「担体」）が知られている。具体例には、血清アルブミン類（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））がある。
【００７６】
その長い半減期、広いインビボでの分布、そして酵素的機能または免疫機能の欠如のため、実質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ断片が、一般的に異種成分として用いられる。Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２（１９９７）に示されるような方法および材料を適用することにより、ＨＳＡを融合タンパク質またはポリペプチド結合体の形成に用いることができ、そのような融合タンパク質またはポリペプチド結合体は、ポリペプチド成分の効力によって薬理活性を示す一方、顕著に向上したインビボ安定性（例えば１０倍〜１００倍高い）を示す。ＨＳＡのＣ末端は、ポリペプチド成分のＮ末端に融合させることができる。ＨＳＡは天然の分泌タンパク質であるため、細胞培養培地への融合タンパク質の分泌をもたらすためＨＳＡシグナル配列を利用することができ、その場合、融合タンパク質は、真核生物（例えば哺乳動物の発現系）において生産される。
【００７７】
本発明のいくつかの実施態様は、ヒンジおよびＦｃ領域（すなわちＩｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合されたポリペプチド成分を利用する。ポリペプチド−Ｆｃ融合体の可能な利点には、溶解性、インビボ安定性、および多価性（例えば二量化）がある。使用するＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）とすることができる。一方、それはＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）とすることができる。ＩｇＧのＦｃ領域、例えばＩｇＧ１のＦｃ領域またはＩｇＧ４のＦｃ領域を一般的に用いることができる。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡの構築および発現のための材料および方法は、当該技術において知られており、必要以上の実験を行うことなく融合体を得るため適用することができる。本発明のある実施態様は、Ｃａｐｏｎ他の米国特許第５４２８１３０号および第５５６５３３５号に記載されるような融合タンパク質を利用する。
【００７８】
シグナル配列は、小胞体の膜を横切るタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体の構築に有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列（例えば抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体重鎖シグナル配列（例えばＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４（１９８０））がある。一方、他のシグナル配列を用いることもできる（例えばＷａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）参照）。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼにより小胞体の内腔において切断される。この結果、Ｆｃ領域とポリペプチド成分を含む免疫融合タンパク質の分泌がもたらされる。
【００７９】
いくつかの実施態様において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとポリペプチド成分との間のタンパク質分解切断部位をコードしてもよい。そのような切断部位は、例えば、コードされた融合タンパク質のタンパク質分解切断をもたらし、その結果、Ｆｃドメインは目的のタンパク質から分離される。有用なタンパク質分解切断部位には、タンパク質分解酵素（例えばトリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫ）により認識されるアミノ酸配列がある。
【００８０】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み込むことができる。有用なベクターには、直鎖状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどがある。具体的な発現ベクターとしてｐｄＣがあり、そこにおいて、免疫融合ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの調節下に置かれる（例えばＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００（１９９８）参照）。適切な宿主細胞を、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡで形質転換または形質移入させることができ、そして該ポリペプチドの発現および分泌に用いることができる。一般的に利用される宿主細胞には、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、およびＣＯＳ細胞がある。
【００８１】
十分に無傷である野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法に使用されるＦｃ融合タンパク質において通常不要であるか望ましくないエフェクター機能を示す。従って、通常、所定の結合部位を、分泌カセットの構築過程においてＦｃ領域から除去する。例えば、軽鎖との共発現は不要であるため、重鎖結合タンパク質Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ８：１１１−１４（１９８７））に対する結合部位を、ＩｇＥにおけるＦｃ領域のＣＨ２ドメインから除去し、この部位が免疫融合体の効率的な分泌を妨害しないようにすることができる。膜貫通ドメイン配列（例えばＩｇＭに存在するもの）もまた一般的に除去される。
【００８２】
ＩｇＧ１のＦｃ領域が最もよく用いられる。その代わりに、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス（ガンマ−２、ガンマ−３およびガンマ−４）のＦｃ領域を分泌カセットに用いてもよい。免疫グロブリンガンマ−１のＩｇＧ１Ｆｃ領域が一般的に分泌カセットに使用され、それは、ＣＨ３領域、ＣＨ２領域、およびヒンジ領域の少なくとも一部を含むものである。ある実施態様において、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２が除去されたＦｃであり、これはＣＨ３領域とヒンジ領域の一部を含む一方、ＣＨ２領域を含まないものである。ＣＨ２が除去されたＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７（１９９０）に記載されている。ある実施態様においては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの１つのＦｃ領域が使用される。
【００８３】
ポリペプチド成分−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる構成で組み立てることができる。１つの構成では、ポリペプチド成分のＣ末端がＦｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。少し異なる構成では、短いポリペプチド（例えば２〜１０アミノ酸）が、融合体におけるポリペプチド成分のＮ末端とＦｃ成分のＣ末端の間に組み込まれる。そのようなリンカーは、構造の柔軟性をもたらし、それはある環境において生物活性を向上させることができる。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ成分に保持されている場合、ポリペプチド成分−Ｆｃ融合体は二量化することができ、従って、二価の分子を形成することができる。単量体Ｆｃ融合体の同種集合体は、単特異性で二価の二量体をもたらす。それぞれ異なる特異性を有する二種の単量体Ｆｃ融合体の混合物は、二重特異性で二価の二量体をもたらす。
【００８４】
対応するアミノ反応性基とチオール反応性基を含む多くの架橋剤の任意のものを用いて、本発明のポリペプチドまたはその断片を血清アルブミンに結合させることができる。適切な架橋剤の例には、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳがある。他の適切な架橋剤には、チオール反応性ハロアセテート基を挿入するものがあり、例えばＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢがある。スルフヒドリル基との反応のため保護されたまたは保護されていないチオールを付与し、還元可能な結合を生成させる架橋剤には、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰがある。これらの試薬は市販されている（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。
【００８５】
結合は、本発明のポリペプチドまたはその断片のＮ末端、または血清アルブミンのチオール部分を伴わなくともよい。例えば、ポリペプチド−アルブミン融合体は、遺伝子操作法を用いて得ることができ、そこにおいて、ポリペプチド成分は、そのＮ末端、Ｃ末端または両方において血清アルブミン成分と融合される。
【００８６】
本発明のポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドタグと融合させることができる。ここで使用する用語「ポリペプチドタグ」は、本発明のポリペプチドまたはその断片に付加、接続、または結合することができ、そして、該ポリペプチドまたはその断片を識別、精製、濃縮、または分離することができる任意の配列のアミノ酸を意味することを意図している。ポリペプチドまたはその断片へのポリペプチドタグの付加は、例えば、（ａ）該ポリペプチドタグをコードする核酸配列および（ｂ）本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を含む核酸分子を構築することにより、起こり得る。具体的なポリペプチドタグには、例えば、翻訳後に修飾することができるアミノ酸配列（例えばビオチン化されるアミノ酸配列）がある。他の具体的なポリペプチドタグには、例えば、抗体（またはその断片）または他の特異的結合試薬が認識および／または結合できるアミノ酸配列がある。抗体（またはその断片）または他の特異的結合試薬が認識できるポリペプチドタグには、例えば、当該技術において「エピトープタグ」として知られるものがある。エピトープタグは、天然のエピトープタグでもよいし、人工のエピトープタグでもよい。天然および人工のエピトープタグは、当該技術において知られており、例えば、ＦＬＡＧ、Ｓｔｒｅｐ、またはポリヒスチジンペプチドのような人工エピトープがある。ＦＬＡＧペプチドには、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号  ）またはＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号  ）がある（Ｅｉｎｈａｕｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：１−３：４５５−４６５（２００１））。Ｓｔｒｅｐエピトープは、配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号  ）を有する。またＶＳＶ−Ｇエピトープも使用することができ、それは、配列Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（配列番号  ）を有する。もう１つの人工エピトープは、６つのヒスチジン残基を有するポリ−Ｈｉｓ配列である（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号  ））。天然に存在するエピトープには、モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認識されるインンフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号  ）（Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９：１７０−１７９（１９９５））およびモノクローナル抗体９Ｅ１０により認識されるヒトｃ−ｍｙｃ（Ｍｙｃ）由来の１１アミノ酸の配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号  ））（Ｍａｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６２：１２９−１３４（１９９５））がある。他の有用なエピトープは、モノクローナル抗体ＹＬ１／２によって認識されるトリペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅである（Ｓｔａｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  ��ｅｔｔ．２８３：２９８−３０２（１９９１））。
【００８７】
特定の実施態様において、本発明のポリペプチドまたはその断片とポリペプチドタグとは、連結アミノ酸配列を介して接続されてもよい。ここで使用する「連結アミノ酸配列」は、１種以上のプロテアーゼが認識かつ／または切断できるアミノ酸配列とすることができる。１種以上のプロテアーゼが認識かつ／または切断できるアミノ酸配列は、当該技術において知られている。具体的なアミノ酸配列には、以下のプロテアーゼによって認識されるものがある：第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、カテプシンＧ、レニン、アンギオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメリシン、ゼラチナーゼ）、マクロファージエラスターゼ、Ｃｉｒ、およびＣｉｓ。上記プロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列は当該技術において知られている。特定のプロテアーゼにより認識される具体的な配列は、例えば、米国特許第５８１１２５２号に見出すことができる。
【００８８】
ポリペプチドタグは、市販のクロマトグラフィー媒質を用いる精製を容易にすることができる。
【００８９】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチド融合構造物は、細菌における本発明のポリペプチド成分の生産を高めるため使用される。そのような構造物において、通常高いレベルで発現かつ／または分泌される細菌タンパク質が、本発明のポリペプチドまたはその断片のＮ−末端融合パートナーとして用いられる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７（１９９３）参照）。
【００９０】
本発明のポリペプチド成分を適切な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端において融合することにより、本発明のポリペプチドまたはその断片の二価形または四価形を得ることができる。例えば、本発明のポリペプチド成分を、Ｉｇ成分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合して、本発明の２つのポリペプチド成分を含む二価の単量体ポリペプチドを生成させることができる。これらの単量体２つを二量化することにより、Ｉｇ成分のおかげで、本発明のポリペプチドの四価形が得られる。そのような多価形は、標的への結合親和性を高めるため用いることができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片の多価形は、本発明のポリペプチド成分を縦一列に配置してコンカテマーを形成することにより得ることができる。コンカテマーは、単独で使用することができ、あるいは、ＩｇまたはＨＳＡのような融合パートナーに融合させることができる。
【００９１】
（結合されるポリマー（ポリペプチド以外））
本発明のいくつかの実施態様は、本発明のポリペプチドまたはその断片を用い、そこにおいて、１種以上のポリマーが本発明のポリペプチドまたはその断片と結合（共有結合）される。そのような結合に適するポリマーの例には、ポリペプチド類（上述）、糖ポリマー類、およびポリアルキレングリコール鎖がある。典型的に、しかし必ずしもそうする必要はないが、溶解性、安定性、または生物学的利用能の１つ以上を向上させるため、本発明のポリペプチドまたはその断片にポリマーを結合させる。
【００９２】
本発明のポリペプチドまたはその断片への結合に一般的に使用されるポリマーの種類としてポリアルキレングリコールがある。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も多く使用される。ＰＥＧ成分（例えば１、２、３、４、または５のＰＥＧポリマー）を、本発明のポリペプチドまたはその断片のそれぞれに結合させることにより、本発明のポリペプチドまたはその断片だけの場合に対し、血清半減期を伸ばすことができる。ＰＥＧ成分は、非抗原性であり、実質的に生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ成分は枝分れしたものでも枝分れしていないものでもよい。
【００９３】
本発明のポリペプチドまたはその断片に結合されるＰＥＧ成分の数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は、変わり得る。一般に、該ポリマーの分子量が高ければ高いほど、ポリペプチドに結合されるポリマー鎖は少なくなる。通常、本発明のポリペプチドまたはその断片に結合されるポリマーの総質量は、２０ｋＤａ以上４０ｋＤａ以下である。従って、１つのポリマー鎖を結合させる場合、その鎖の分子量は通常２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖を結合させる場合、各鎖の分子量は通常１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖を結合させる場合、その分子量は通常７〜１４ｋＤａである。
【００９４】
ポリマー（例えばＰＥＧ）は、ポリペプチド上で露出した任意の適切な反応性基を介して本発明のポリペプチドまたはその断片に結合させることができる。１つまたは複数の露出した反応性基は、例えば、Ｎ末端のアミノ基もしくは内部リシン残基のε−アミノ基、またはその両方とすることができる。活性化されたポリマーを、本発明のポリペプチドまたはその断片上にある任意の遊離アミノ基に対して反応させ共有結合させることができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片の遊離のカルボキシル基、適切には活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、イミダゾール基、酸化された炭水化物部分、およびメルカプト基を（利用可能であれば）ポリマー結合用の反応性基として用いることができる。
【００９５】
結合反応では、ポリペプチドの濃度に応じて、ポリペプチド１モルあたり、約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーを典型的に使用する。通常、反応を最大にすることと、本発明のポリペプチド成分の望ましい薬理活性を損なう可能性のある副反応（しばしば非特異的）を最小にすることのバランスを反映して上記比率が選ばれる。本発明によるポリペプチドまたはその断片の生物活性（例えば、ここに記載されるかまたは当該技術で知られるアッセイのいずれかで明らかにされるような生物活性）の少なくとも５０％が維持されることが好ましく、そのほぼ１００％が維持されることが最も好ましい。
【００９６】
ポリマーは、一般的な化学作用を用いて本発明のポリペプチドまたはその断片に結合させることができる。例えば、ポリアルキレングリコール成分は、本発明のポリペプチドまたはその断片のリシンεアミノ基に結合させることができる。リシン側鎖への結合は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えばＰＥＧコハク酸スクシンイミジル（ＳＳ−ＰＥＧ）およびプロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行うことができる。適切なポリアルキレングリコール成分には、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣがある。これらの試薬は市販されている。他のアミン反応性ＰＥＧリンカーを、スクシンイミジル成分の代わりに用いることができる。それらには、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾールカルボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰカルボネートがある。一般的に条件を最適化して反応の選択性および程度を最大にする。反応条件のそのような最適化は、当該技術における通常の技術の範囲内である。
【００９７】
ＰＥＧ付加は、当該技術において知られるＰＥＧ付加反応のいずれかにより行うことができる（例えばＦｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０，１９９２および欧州特許出願ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４参照）。ＰＥＧ付加は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行うことができる。
【００９８】
アシル化によるＰＥＧ付加では、一般的に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させる。任意の反応性ＰＥＧ分子をＰＥＧ付加に用いることができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化したＰＥＧは、よく使用される活性化ＰＥＧエステルである。ここで使用する「アシル化」には、例えば、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）との間で以下のような種類の結合が含まれる：アミド、カーバメート、ウレタンなど（例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４参照）。反応パラメーターは、一般的に、本発明のポリペプチドまたはその断片を損傷または不活性化するような温度、溶媒、およびｐＨ条件を回避するように、選択される。
【００９９】
一般的に、接続結合はアミドであり、そして典型的に、得られる生成物の９５％以上がモノＰＥＧ付加物、ジＰＥＧ付加物、またはトリＰＥＧ付加物である。しかし、より高度のＰＥＧ付加を伴ういくつかの種が、使用する特定の反応条件に応じた量で形成され得る。必要に応じて、通常の精製方法（例えば、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、および電気泳動を含む）により、精製されたＰＥＧ付加物種を混合物（特に未反応種）から分離する。
【０１００】
アルキル化によるＰＥＧ付加では、一般的に、還元剤の存在下、本発明のポリペプチドまたはその断片をＰＥＧの末端アルデヒド誘導体と反応させる。さらに、ＰＥＧ付加が実質的に本発明のポリペプチドまたはその断片のＮ末端アミノ基のみにおいて優先的に起こるように（すなわちモノＰＥＧ付加タンパク質）、反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ付加またはポリＰＥＧ付加のいずれの場合でも、ＰＥＧ基は、典型的に−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合される。特に−ＣＨ２−基に関し、この種の結合は「アルキル」結合として知られている。
【０１０１】
Ｎ末端に的を絞ったモノＰＥＧ付加物を生成させるための還元性アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化に利用できる異なる種類の第１アミノ基の反応性の違い（リシン対Ｎ末端）を利用する。この反応は、リシン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基との間のｐＫａ差が利用できるようなｐＨで行われる。そのような選択的誘導体化により、反応性基（例えばアルデヒド）を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合は、制御される。すなわち、ポリマーによる結合は、タンパク質のＮ末端において優先的に起こり、他の反応性基（例えばリシン側鎖アミノ基）の顕著な修飾は起こらない。
【０１０２】
アシル化法およびアルキル化法の両方で使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選ばれる。選ばれたポリマーは、一般的に、単一の反応性基（例えばアシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を持つように修飾され、それにより、重合度を本方法において示されたように制御することができる。具体的な反応性ＰＥＧアルデヒドには、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体がある（例えばＨａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５２５２７１４号参照）。ポリマーは、枝分れしたものでもよいし枝分れしていないものでもよい。アシル化反応のため、選ばれた１つまたは複数のポリマーは、典型的に単一の反応性エステル基を有する。還元性アルキル化のため、選ばれた１つまたは複数のポリマーは、典型的に単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基から選ばれることはない。というのも、それらは一般的に、哺乳動物の組換え発現系によってより都合よく作られるからである。
【０１０３】
本発明のＰＥＧ付加されたポリペプチドまたはポリペプチド断片を調製する方法は、一般的に（ａ）本発明のポリペプチドまたはその断片を、該分子が１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基に結合されるような条件下において、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステル誘導体またはＰＥＧの反応性アルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）１つまたは複数の反応生成物を得る工程を含む。一般的に、アシル化反応のための最適な反応条件は、既知のパラメーターおよび所望する結果に基づいてケースバイケースで求められる。例えば、タンパク質に対するＰＥＧの比が大きくなればなるほど、一般的に、ポリＰＥＧ付加物の百分率が大きくなる。
【０１０４】
モノ−ポリマー／本発明のポリペプチドまたはその断片の実質的に均質な群を生成させるための還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）還元的アルキル化条件下で、本発明のポリペプチドまたはその断片のＮ末端アミノ基の選択的修飾を可能にするのに適切なｐＨにおいて、本発明のポリペプチドまたはその断片を反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程、および（ｂ）１つまたは複数の反応生成物を得る工程を含む。
【０１０５】
モノ−ポリマー／本発明のポリペプチドまたはその断片の実質的に均質な群を得るため、還元的アルキル化反応の条件は、本発明のポリペプチドまたはその断片のＮ末端に水溶性ポリマー成分を選択的に結合させるような条件である。そのような反応条件は、リシン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間にｐＫａ差をもたらすものである。本発明の目的のため、このｐＨは一般的に３〜９の範囲内にあり、典型的に３〜６の範囲内にある。
【０１０６】
本発明のポリペプチドまたはその断片は、タグ（標識）（例えばタンパク質分解によって後に放出させることができる成分）を含むことができる。従って、リシンおよびＮ末端の両方と反応する低分子量のリンカー（例えばトラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））で修飾されたＨｉｓタグを最初に反応させ、次いでＨｉｓタグを放出させることにより、リシン部分を選択的に修飾することができる。その結果、ポリペプチドは遊離のＳＨ基を含むこととなり、該ＳＨ基は、チオール反応性の頭基（例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離のもしくは保護されたＳＨ）を有するＰＥＧで選択的に修飾することができる。
【０１０７】
トラウト試薬は、ＰＥＧ付加のため特異的な部位をもたらす任意のリンカーに置き換えることができる。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に置き換えることができる。同様に、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーとタンパク質を反応させることができ、そして遊離ＳＨを有するＰＥＧと得られた生成物を反応させることができる。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、ポリアルキレングリコール成分を、本発明のポリペプチドまたはその断片のシステイン基に結合させる。結合は、例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を用いて行うことができる。
【０１０９】
必要に応じて、本発明のポリペプチドまたはその断片を、不安定結合を介してポリエチレングリコール成分に結合させることができる。この不安定結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断において、切断することができる。例えば、この結合は、インビボ（生理的）条件下で切断することができる。
【０１１０】
反応性基がＮ末端のα−アミノ基上に存在する場合、反応は、生物活性物質を不活性なポリマーと反応させるのに使用される任意の適切な方法により、一般的に約５〜８のｐＨ、例えばｐＨ５、６、７、または８において、起こり得る。一般的に、このプロセスは、活性化されたポリマーを調製することと、その後タンパク質を活性化されたポリマーと反応させて処方に適する可溶性タンパク質を生成させることを含む。
【０１１１】
本発明のポリペプチドまたはその断片は、特定の実施態様において、可溶性ポリペプチドである。ポリペプチドを可溶性にする方法、またはポリペプチドの溶解性を高める方法は、当該技術においてよく知られている。
【０１１２】
（ポリヌクレオチド）
また本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片の任意の１つをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。さらに本発明は、本発明のポリペプチドの任意の１つをコードするポリヌクレオチドの非コード鎖すなわち相補鎖と、中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。ストリンジェントな条件は当業者に知られており、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出すことができる。
【０１１３】
ヒトＮｏｇｏ−Ａポリヌクレオチドを配列番号１として以下に示す。
【０１１４】
ヌクレオチド１３５〜ヌクレオチド３７１０によりコードされる完全長ヒトＮｏｇｏ−Ａ（配列番号１）
【０１１５】
【化５−１】
2008515804.tif 000006
【０１１６】
【化５−２】
2008515804.tif 000007
ヒトＮｏｇｏ受容体−１ポリヌクレオチドを配列番号３として以下に示す。
【０１１７】
ヌクレオチド１３〜ヌクレオチド１４２２によってコードされる完全長ヒトＮｏｇｏ受容体−１（配列番号３）
【０１１８】
【化６】
2008515804.tif 000008
（ベクター）
また、本発明の方法に使用するポリペプチドを生成させるため、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を含むベクターを用いることができる。ベクターおよびそのような核酸に作用可能に結合される発現調節配列の選択は、必要な機能的特性（例えばタンパク質発現）および形質転換すべき宿主細胞に応じて変わってくる。
【０１１９】
作用可能に結合されたコード配列の発現を制御するため有用な発現調節要素は、当該技術において知られている。具体例には、例えば、誘導プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節要素があるが、これらに限定されない。誘導プロモーターを使用する場合、それは、例えば、宿主細胞培地において、栄養状態の変化または温度変化により制御することができる。
【０１２０】
ベクターは、原核生物のレプリコン（すなわち細菌宿主細胞において染色体外で組換えＤＮＡ分子の自律的複製および保存を誘導できる能力を有するＤＮＡ配列）を含むことができる。そのようなレプリコンは当該技術においてよく知られている。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターは、薬剤耐性のような検出可能なマーカーを発現によってもたらす遺伝子を含むことができる。細菌の薬剤耐性遺伝子の具体例には、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性をもたらすものがある。
【０１２１】
また原核生物のレプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞においてコード遺伝子配列の発現を誘導するため、原核生物またはバクテリオファージのプロモーターを含むことができる。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的に、発現すべきＤＮＡセグメントの挿入用に都合がよい制限部位を含むプラスミドベクターに設けられる。そのようなプラスミドベクターの例には、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ｐＰＬならびにｐＫＫ２２３がある。本発明の方法に使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させるため、任意の適切な原核生物宿主を用いることができる。
【０１２２】
本発明の目的のため、多数の発現ベクター系が使用可能である。例えば、ベクターの１種は、動物ウイルス（例えばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶおよびＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡ構成要素を用いるものである。他のものには、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系を用いるものがある。さらに、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーを導入することにより、ＤＮＡをその染色体に組み込んだ細胞を選択することができる。マーカーは、ある栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生剤耐性（例えば抗生物質）、または重金属（例えば銅）に対する耐性をもたらすことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ配列に直接結合させることができ、あるいは、共形質転換により同じ細胞に導入することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は選択可能なマーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。さらなる要素が、ｍＲＮＡの最適合成にさらに必要となる場合がある。それらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。
【０１２３】
一実施態様において、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．が自社開発した発現ベクター（ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれる（米国特許第６１５９７３０号））を用いることができる。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ならびにリーダー配列を含んでいる。このベクターは、ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地における選別およびメトトレキセート増幅により、非常に高いレベルの発現をもたらすことがわかっている。勿論、真核細胞で発現を誘導できる任意の発現ベクターを本発明に用いてもよい。適切なベクターの具体例には、例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｃｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）があるが、これらに限定されるものではない。さらに別の真核細胞発現ベクターも当該技術において知られており、市販されている。一般にそのようなベクターは、必要なＤＮＡセグメントの挿入のため都合のよい制限部位を含んでいる。具体的なベクターには、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、およびＡＡＶベクターが含まれる。他の具体的なベクター系は例えば米国特許第６４１３７７７号に開示されている。
【０１２４】
一般に、適切に高いレベルのアンタゴニスト（拮抗物質）を発現するものについて多数の形質転換された細胞をスクリーニングすることは、慣用実験法であり、例えばロボットシステムにより行うことができるものである。
【０１２５】
哺乳動物宿主細胞の発現によく使用される調節配列には、哺乳動物において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス構成要素、例えば、レトロウイルスのＬＴＲに由来するプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターおよびエンハンサー、ならびに強い哺乳動物のプロモーター（例えば天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーター）がある。ウイルスの調節要素およびその配列のさらなる説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５１６８０６２号、Ｂｅｌｌ，米国特許第４５１０２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４９６８６１５号を参照されたい。
【０１２６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えばＡｘｅｌ，米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号参照）。例えば、典型的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤（例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）耐性を付与する。よく使用される選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞で使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）がある。
【０１２７】
ポリペプチドまたはポリペプチド断片をコードするベクターは、適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は任意の適切な方法によることができる。外来ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術において周知であり、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより、哺乳動物細胞に導入することができる。
【０１２８】
宿主細胞の形質転換は、使用するベクターおよび宿主細胞に適した通常の方法により達成することができる。原核宿主細胞の形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理法が利用できる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、カチオン脂質処理法、または塩処理法が利用できる（例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）参照）。
【０１２９】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものが最も好ましい。当業者は、そこで発現すべき必要な遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を有しているはずである。具体的な宿主細胞株には、例えば、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸がん）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原によるＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、および２９３（ヒト腎臓）があるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞株は、民間のサービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または刊行された文献から利用可能である。
【０１３０】
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、既知の技法を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）系が、特定の条件下、発現の増強によく用いられる（例えば、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号および第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号参照）。
【０１３１】
真核細胞発現系は、当該技術において知られており、市販されている。典型的に、そのようなベクターは、必要なＤＮＡセグメントの挿入のため、都合のよい制限部位を含んでいる。具体的なベクターには、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧ、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターがある。
【０１３２】
真核細胞発現ベクターは、選択可能なマーカー（例えば薬剤耐性遺伝子）を含むことができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子はそのような遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。
【０１３３】
哺乳動物宿主細胞の発現によく使用される調節配列には、哺乳動物において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス構成要素、例えば、レトロウイルスのＬＴＲに由来するプロモーターおよびエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターおよびエンハンサー（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターおよびエンハンサー、ならびに強い哺乳動物のプロモーター（例えば天然の免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーター）がある。ウイルスの調節要素およびその配列のさらなる説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉ，米国特許第５１６８０６２号、Ｂｅｌｌ，米国特許第４５１０２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ，米国特許第４９６８６１５号を参照されたい。
【０１３４】
組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えばＡｘｅｌ，米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号参照）。例えば、典型的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤（例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）耐性を付与する。よく使用される選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞で使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）がある。
【０１３５】
本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子、およびそれらの核酸分子を含むベクターは、適切な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は任意の適切な方法によることができる。外来ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入する方法は、当該技術において周知であり、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターにより、哺乳動物細胞に導入することができる。
【０１３６】
宿主細胞の形質転換は、使用するベクターおよび宿主細胞に適した通常の方法により達成することができる。原核宿主細胞の形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理法が利用できる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、カチオン脂質処理法、または塩処理法が利用できる（例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６（１９７９）参照）。
【０１３７】
（宿主細胞）
本発明の方法に用いる本発明のポリペプチドまたはその断片を発現させるための宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。具体的な真核宿主細胞には、例えば、酵母および哺乳動物の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）があるが、これらに限定されるものではない。他の有用な真核宿主細胞には、昆虫細胞および植物細胞がある。具体的な原核宿主細胞には、大腸菌およびストレプトミセス属がある。
【０１３８】
発現のため宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術において知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および他の相当数の細胞株がある。
【０１３９】
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、既知の技法を用いて増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）系が、特定の条件下、発現の増強によく用いられる（例えば、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号および第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号参照）。
【０１４０】
（医薬組成物）
本発明のポリペプチド、ポリペプチド断片、ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞は、哺乳動物（ヒトを含む）への投与のための医薬組成物に処方することができる。本発明の方法に使用される医薬組成物は、薬学的に受容可能な担体（例えば、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、シリカコロイド、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの材料、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス類、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー類、ポリエチレングリコール、および木脂がある）を含む。
【０１４１】
本発明の方法に使用される組成物は、任意の適切な方法により（例えば、非経口で、脳室内に、経口で、吸入スプレーにより、局所的に、直腸より、鼻より、口腔より、膣より、または移植されたレザバー（貯留部）より）投与することができる。ここで使用する用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内局および頭蓋内の注射法または点滴法が含まれる。本発明の方法において、本発明のポリペプチドまたはその断片は、それが血液脳関門を通過するように投与される。この通過は、ポリペプチド分子自身に固有の物理化学的特性、医薬製剤中の他の成分、または血液脳関門を突破させる物理的手段（例えば針、カニューレ、または外科用器具）の使用によってもたらすことができる。本発明のポリペプチドまたはその断片が、血液脳関門を本来通過しない分子である場合、例えば、通過を容易にする成分への融合が行われ、適切な投与経路は、例えば髄腔内または頭蓋内である。本発明のポリペプチドまたはその断片が本来的に血液脳関門を通過する分子である場合、投与経路は、下記の種々の経路の１以上によるものとすることができる。
【０１４２】
本発明の方法に使用される組成物の無菌で注射可能な形態は、水性または油性の懸濁剤とすることができる。これらの懸濁剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用い、当該技術において知られる手法により調製することができる。また無菌で注射可能な製剤は、非毒性で非経口投与可能な希釈剤または溶媒の無菌で注射可能な溶液または懸濁液とすることができ、例えば、１，３−ブタンジオールの懸濁液とすることができる。許容される賦形剤および溶媒の中で、水、リンゲル液、および生理食塩水を用いることができる。また、無菌の不揮発性油を、溶媒または懸濁媒質として都合よく用いることができる。この目的のため、任意の刺激のない不揮発性油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む）を用いることができる。脂肪酸（例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、天然の薬学的に受容可能な油類（例えばオリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化物の形態で）と同様に、注射剤の調製に有用である。また、これらの油溶液または懸濁物は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えばカルボキシメチルセルロース、または乳剤および懸濁剤を含む薬学的に受容可能な剤形の調製に通常使用される同様の分散剤）をさらに含んでもよい。他の通常使用される界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ類、Ｓｐａｎ類および他の乳化剤）または薬学的に受容可能な固体、液体または他の剤形の製造に通常使用される生物学的利用能増強剤も、製剤のために使用することができる。
【０１４３】
非経口製剤は、単一の大用量、点滴、または後に維持用量が伴う充填大用量とすることができる。組成物は、特定の決められた間隔または可変の間隔（例えば１日１回または「必要に応じて」の基準）で投与することができる。
【０１４４】
本発明の方法に使用される特定の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または溶液を含む可能な剤形で経口投与することができる。また特定の医薬組成物は、鼻用エアゾールまたは吸入により投与することができる。それらの組成物は、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存料、生物学的利用能を高める吸収促進剤、および／または他の一般的な可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理的食塩水中の溶液として調製することができる。
【０１４５】
単一の剤形を調製するため担体と合わせることができる本発明のポリペプチドまたはその断片の量は、治療される主体および投与の特定の態様に応じて変わってくる。組成物は、単一用量として、複数回用量として、または所定期間の点滴として投与することができる。また用法・用量は、所望の最適応答（例えば治療または予防の応答）が得られるよう調節することができる。
【０１４６】
本発明の方法は、本発明のポリペプチドまたはその断片の「治療上有効な量」または「予防上有効な量」を用いる。そのような治療上または予防上有効な量は、個体の症状、年齢、性別、および体重のような因子によって変わり得る。また治療上または予防上有効な量は、毒性または有害な効果があったとしても治療上の有利な効果がそれを上回っているものである。
【０１４７】
任意の特定の患者に対する特定の用量および治療法は、種々の因子によって変わってくる。そのような因子には、使用される特定の本発明のポリペプチドまたはその断片、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食生活、ならびに投与時間、排出率、薬剤の組み合わせ、および治療する特定の疾患の重症度がある。医療介護者によるそのような因子の判定は、当該技術において通常の技術の範囲内である。また、その量は、治療すべき個々の患者、投与経路、製剤の種類、使用される化合物の性質、病気の重症度、および所望する効果によって変わってくる。使用量は、当該技術においてよく知られている薬理学的原則および薬動力学的原則によって決定することができる。
【０１４８】
本発明の方法において、本発明のポリペプチドまたはその断片は、一般的に、脳室内または髄腔内において神経系に直接投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、本発明のポリペプチドまたはその断片が１日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されるように処方することができる。本発明のある実施態様において、その用量は１日あたり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。ある実施態様において、その用量は１日あたり０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１４９】
また補助的な活性化合物を、本発明の方法に使用される組成物に組み込んでもよい。例えば、本発明のポリペプチドもしくはその断片、またはその融合タンパク質は、ドラッグデリバリー標的化剤として作用する１種以上のさらなる治療剤とともに、処方かつ／または投与することができる。
【０１５０】
本発明のポリペプチドまたはその断片による治療のため、その用量は、例えば、対象者の体重１ｋｇあたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、より一般的には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲とすることができる。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ、あるいは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以上とすることができる。上記範囲内にある中間の用量が本発明の範囲内であることも意図するところである。対象者は、そのような用量を、毎日、隔日で、毎週、または実験的分析により求められたその他のスケジュールで投与される。ある治療の例では、長期間（例えば６ヶ月以上の間）にわたって多用量による投与が必要となる。他の治療法の例では、２週間ごとに１回、１ヶ月に１回、または３〜６ヶ月ごとに１回投与が必要となる。具体的な用量スケジュールとして、例えば、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日で３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは、毎週６０ｍｇ／ｋｇとなる。
【０１５１】
いくつかの方法において、２種以上の本発明のポリペプチドまたはその断片が同時に投与され、そこにおいて、投与される各ポリペプチドの用量は、上記範囲内にある。また補助的活性化合物を、本発明の方法に用いる組成物に組み込むこともできる。例えば、抗体を、１種以上の追加の治療剤とともに、同時に処方することができかつ／または同時に投与することができる。
【０１５２】
本発明は、選択した目標の組織に本発明のポリペプチドまたはその断片を送達させるための任意の適切な方法を含み、それは、徐放系による水溶液または水性注入物のボーラス注入を含む。徐放性移植物を用いることにより、注入の繰り返しの必要性が減る。
【０１５３】
本発明の方法に用いる本発明のポリペプチドまたはその断片は、脳に直接注入してもよい。化合物を直接脳に注入するための種々の移植物が知られており、神経障害を有するヒトの患者に治療化合物を送達するのに有効である。それらには、ポンプ、定位移植された、一時的な間質内のカテーテル、永続的な頭蓋内のカテーテル移植物、および外科移植された生物分解性の移植物を用いる脳への長期にわたる注入が含まれる（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５Ｉ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ  ６６，ｐａｇｅｓ  ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ  Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｘｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３（１９９５）参照）。
【０１５４】
また組成物は、化合物のための適切なデリバリーシステムまたはサポートシステムとして機能する生物適合性の担体材料に分散された本発明のポリペプチドまたはその断片を含むことができる。徐放性担体の適切な具体例には、坐剤またはカプセル剤のような成形物の形態を有する半透過性のポリマーマトリックスがある。移植用またはマイクロカプセル用の徐放性マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第３７７３３１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６（１９８５））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、エチレンビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、本発明のポリペプチドまたはその断片は、脳の適切な領域への直接的な注入によって患者に投与され（例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）参照）。その他の手法も利用可能であり、本発明によるポリペプチドまたはその断片を投与するため適用することができる。例えば、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的ローカライジング・ユニットを用いて、カテーテルまたは移植物の定位配置を行うことができる。コントラスト促進コンピューター断層撮影（ＣＴ）走査法（１２０ｍｌのオムニパーク（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ）、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注入し、２ｍｍ厚みの薄片を用いる）により、三次元マルチプラナー治療計画が可能になる（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この装置は、明確な標的の確認のためＣＴとＭＲＩによる標的情報を統合する磁気共鳴画像法の研究に基づいて計画を可能にする。
【０１５６】
ＧＥ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）さらにはＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）と用いるため改良したＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）をこの目的に用いることができる。かくして、移植の開始時に、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に取り付けることができる。ベースプレートに固定したグラファイトロッドローカライザーを用いて、（標的組織の）領域を通じ、連続的なＣＴ断面を３ｍｍの間隔で得ることができる。コンピューターによる治療計画プログラムは、ＶＡＸ１１／７８０コンピューター（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）上で、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間のマッピングのためグラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いて、実行させることができる。
【０１５７】
（治療方法）
本発明の一実施態様は、ニューロンの過剰なまたは低下した活性、異常なニューロン発生、および／または異常な神経突起伸長に伴う病気、障害、または傷害（例えば精神分裂病）を、そのような病気を有する動物において治療する方法を提供し、該方法は、本発明のＮｏｇｏ断片の有効な量を該動物に投与すること、を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１５８】
さらに、本発明は、哺乳動物において神経突起伸長阻害を増強する方法に関し、該方法は、本発明のＮｏｇｏポリペプチド断片の治療上有効な量を投与すること、を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１５９】
さらに本発明は、神経突起伸長阻害を増強する方法を含み、該方法は、本発明のポリペプチドまたはその断片の有効な量をニューロンに接触させること、を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１６０】
本発明のＮｏｇｏポリペプチド断片は、ニューロンの成長または再生を負の方向に調節する能力を高める治療剤として調製し使用することができる。
【０１６１】
本発明の方法により治療または改善できる病気または障害には、ニューロンの過剰なまたは低下した活性、異常なニューロン発生、および／または異常な神経突起伸長に関係する病気、障害、または傷害が含まれる。そのような病気の具体例には、例えば、精神分裂病、双極性障害、強迫性障害（ＯＣＤ）、注意欠陥過活動性障害（ＡＤＨＤ）、ダウン症、およびアルツハイマー病があるがこれらに限定されるものではない。
【０１６２】
（インビトロ法）
また本発明は、インビトロでニューロン細胞成長の阻害を増強する方法を含む。例えば、本発明は、異常なニューロン細胞成長を阻害するインビトロの方法、神経突起伸長を阻害するインビトロの方法、または異常なニューロン発生を阻害するインビトロの方法を含む。
【０１６３】
（ターゲッティング（標的化）およびスクリーニングアッセイ）
また本発明は、本発明のポリペプチドまたはその断片を用いて医薬候補のスクリーニングを行う方法を含む。例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片は、ＮｇＲに結合する小分子についてスクリーニングを行うため、用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドまたはその断片は、ＮｇＲを特異的に発現するニューロンまたは細胞に狙いを定めるためのドラッグデリバリー標的化剤として用いることができる。
【０１６４】
関連する技術の当業者に容易にわかるとおり、本明細書に記載した方法および用途に対する他の適切な修飾変更および改変は、自明のことであり、本発明の技術的範囲またはその任意の実施態様から逸脱することなく行うことができるものである。これまで本発明を詳細に説明してきたが、以下の具体例を参照することによりさらに明瞭に理解されるはずである。なお、以下の具体例は、単なる例示のため本明細書に含められたものであり、本発明を限定しようとするものではない。
【実施例】
【０１６５】
（実施例１）
アミノＮｏｇｏ断片はＮｇＲに結合する
この例は、アミノ−Ｎｏｇｏドメインのカルボキシル末端が高い親和性でＮｇＲと相互作用することを明らかにする。アミノ末端と最初の疎水性セグメントとの間にある領域から得られる種々のＮｏｇｏ−Ａセグメントを含むいくつかのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質を調べてアミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ作用のメカニズムを特定した。さらなるＡＰ融合タンパク質を生成させるため、ヒトのアミノＮｏｇｏ断片を増幅し、そして上述したように制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌで消化したｐｃＡＰ６ベクターに結合させた（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１））。次いでプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして馴化培地を７日後に採集した。これらの断片のいずれもが、トランスフェクトされていないＣＯＳ−７細胞に高い親和性で結合しなかった。想定した対照条件を調べている間に、意外にも、本発明らは、アミノ−Ｎｏｇｏ（断片Ｂ）のカルボキシル側半分が、ＮｇＲを発現するＣＯＳ−７細胞に対して高い親和性の結合を示すことを認めた（図１Ｂ）。この結合は、ＮｇＲとのＡｐ−Ｎｏｇｏ−６６結合と変わらないＫｄで飽和できる（表Ｉ）。ＮｇＲとのアミノ−Ｎｏｇｏ相互作用に係わっている領域をさらに特定するため、ある範囲のアミノ−Ｎｏｇｏトランケーション変異体をＡＰ融合タンパク質として調べた。Ｂ断片を重複する１５０ａａセグメントに細分することにより、ＮｇＲ相互作用の部位が最もカルボキシル末端側にあるセグメントに局在することが明らかになっている。実際のところ、アミノ−ＮｏｇｏのＮｇＲ相互作用セグメントは、極端にカルボキシル側の２４アミノ酸（ａａ９９５〜１０１８、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−２４）において十分に成立する（表Ｉおよび図１Ｄ）。ａａ９９５に位置するＩｌｅ残基は、高い親和性の結合にとって重要であり、同様に、隣の残基９９６〜残基１０１３のカルボキシル１８ａａも重要である（表Ｉ）。本発明らはこのドメイン（ａａ９９５〜１０１３）をアミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−１９と名付けた。
【０１６６】
アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａの１９ａａＮｇＲ−結合性残基を、ｎｏｇｏ遺伝子のＮｏｇｏ−Ａ特異的エキソンと該遺伝子の５’共通エキソンとの間のスプライス部位（ａａ１００４／１００５）にまたがるヌクレオチドによってコードする（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）；ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００）；Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：２９９−３２３（２００３ａ））。Ｎｏｇｏ−Ａ−特異的領域のみに由来するａａからなるＡＰ融合タンパク質はＮｇＲに結合しない（ａａ９５０〜１００４）。Ｎｏｇｏ−ＢまたはＮｏｇｏ−ＣのアミノＮｏｇｏ残基も、ＮｇＲ−発現細胞と結合しない（表Ｉ）。従って、この第２の高親和性ＮｇＲ相互作用ドメインは、Ｎｏｇｏ−Ａ特異的であり、そして、それをＮｏｇｏ−６６から分離する疎水性セグメントに対してアミノ末端側に隣接している。
【０１６７】
もしこれらのアミノ−Ｎｏｇｏ断片が神経突起伸長の制御において役割を果たしているならば、それらは、ニューロンのプロセスに結合すると考えられる。以前、本発明らは、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６がＤＲＧプロセス上でＮｇＲに結合することを明らかにしている（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１））。ＣＯＳ−７ＮｇＲ結合実験から予測されるとおり、アミノ−Ｎｏｇｏのカルボキシル末端２４ａａも、ＤＲＧ軸索に結合するＡＰ融合タンパク質を媒介することができる。一方、Ｎｏｇｏ−Ａのより短い断片（ａａ９９９〜１０１８）は、ＤＲＧニューロンと相互作用しない（図１Ｅ）。アミノ−Ｎｏｇｏのアミノ末端Ａ断片もＤＲＧ軸索に結合する（おそらくＮｇＲ−非依存のメカニズムによる）。
【０１６８】
乏突起膠細胞においてＮｏｇｏ−Ａのある部分が、アミノ末端とＮｏｇｏ−６６ドメインの両方を細胞表面に露出させるコンフォメーションで配置されていることが報告されている（Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ））。Ｎｏｇｏ−Ａのより多くのアミノ末端疎水性セグメントがループとして原形質膜に入り込んでいることが提案されている。理論に縛られるものではないが、このコンフォメーションによれば、細胞表面にあるアミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−１９セグメントとＮｏｇｏ−６６ドメインは細胞表面において近接すると予測される（図７）。これらの両方のドメインがＮｇＲと相互作用する能力は、このコンフォメーションに対する生理学的役割と整合する。
【０１６９】
【表１】
2008515804.tif 000009
ＡＰ融合アミノ−Ｎｏｇｏ断片に対する結合Ｋｄは、ＡＰ融合タンパク質を含む馴化培地をＮｇＲ発現ＣＯＳ−７細胞に付与することにより測定した。結合されたＡＰを染色し測定した。
【０１７０】
（実施例２）
細胞伸展および軸索伸長のアミノＮｏｇｏによる阻害はＮｇＲ結合から切り離すことができる
アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質は、基質に結合される場合、非ニューロン細胞の伸展および軸索伸長を阻害することが認められている（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１））。Ｏｅｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．による研究は、この活性が、アミノ末端近くの特定のａａ範囲とアミノ−Ｎｏｇｏ−Ａの中央部に起因していること示唆している（Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ））。後者のドメインはΔ２０と名付けられている。例１に示したアミノ−Ｎｏｇｏ−ＡのＮｇＲ相互作用性ａａが細胞伸展および軸索伸長を制御するかどうか判定するため、種々の断片をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、そして大腸菌から精製した。ＧＳＴ融合タンパク質を生成させるため、アミノＮｏｇｏ断片をｐＧＥＸ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。記載のとおり元々のＧＳＴタンパク質と可溶性ＧＳＴタンパク質を発現させ、精製した（ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００））。記載のとおりＣＯＳ−７結合アッセイを行った（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１））。ＣＯＳ−７細胞に対して結合されたＡＰは、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いて測定した。記載されたものにいくつかの修飾を行って、線維芽細胞伸展およびｃＤＲＧ伸長アッセイを行った（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１））。簡単に説明すると、ＰＢＳ中で希釈したペプチドまたは精製ＧＳＴ融合タンパク質５０μｌを、ポリリジンでプリコートした９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏａｔプレート）にピペットで取り、室温で一夜乾燥させた。線維芽細胞伸展アッセイのため、次にサブコンフルエントなＣＯＳ−７細胞を、固定およびローダミン−ファロイジンによる染色の前に、培地を含む血清中で１時間培養した。
【０１７１】
Δ２０領域の部分を含む断片は、ＣＯＳ−７細胞の付着と伸展を顕著に低減する（図２Ａ〜Ｃ）。ＣＯＳ−７細胞の抑制にΔ２０領域全体が不可欠なわけではないようである。というのも、アミノ−ＮｏｇｏのＢ断片は、活性である一方、Δ２０領域の一部しか含んでいないからである。カルボキシル末端７５ａａ（Ｂ４Ｃ）または１５０ａａ（Ｂ４）からなる断片は、Δ２０領域を欠いているが、１９ａａＮｇＲ結合領域全体を保有している（図１Ｃ）。Ｂ４タンパク質およびＢ４Ｃタンパク質は、基質として与えられたとき、ＣＯＳ−７の形態を変化させない（図２Ａ〜Ｃ）。従って、線維芽細胞伸展の阻害は、アミノ−Ｎｏｇｏ−ＡによるＮｇＲ結合から切り離すことができる。
【０１７２】
同じＧＳＴ−アミノ−Ｎｏｇｏタンパク質を、ニワトリＥ１３ＤＲＧニューロンからの神経突起伸長を抑制する能力について試験した。ｃＤＲＧ伸長アッセイのため、固定の前に、解離Ｅ１３ｃＤＲＧニューロンを６時間平板培養した。ニューロンを、抗ニューロフィラメント抗体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ４１４２）および抗ＨｕＣ／Ｄ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ−２１２７１）で染色した。細胞面積、付着細胞の数、および神経突起の長さを、Ｉｍａｇｅｅｘｐｒｅｓｓ装置およびソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて測定した。
【０１７３】
アミノ−Ｎｏｇｏドメイン全体についてこれまで示したとおり、Δ２０領域の部分を含むそのサブフラグメントは、神経突起伸長に対して阻害的である（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ））（図２Ｄおよび２Ｅ）。これらの培養物がＮｇＲを発現しかつＮｏｇｏ−６６による結合に反応することが知られているため、本発明らは、アミノ−ＮｏｇｏのＮｇＲ結合性Ｂ４断片およびＢ４Ｃ断片が神経突起伸長を変化させるかどうか調べた。予想外に、アミノ−Ｎｏｇｏ−ＡのＮｇＲ結合性Ｂ４断片およびＢ４Ｃ断片でコーティングした基質は、軸索成長に対して阻害的ではなかった（図２Ｄおよび２Ｅ）。従って、アミノ−ＮｏｇｏのＮｇＲ結合性ドメインは、ＮｇＲ陰性のＣＯＳ−７細胞には結合せず、また、ＮｇＲ陽性ニューロンに結合されるとき、それは軸索成長を変化させない。１９ａａのＮｇＲ結合性ドメイン（アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−１９）が細胞伸展または軸索伸長を変化させないと考えると、それが最初のアッセイで検出されなかった理由の説明がつく。このドメインはＮｏｇｏ−Ａのみに存在しており、Ｎｏｇｏ−ＡがＮｏｇｏ−Ｃに比べてより強い軸索成長阻害因子である１つの根拠を与えている（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）；ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３９−４４４（２０００））。
【０１７４】
さらに、本発明らおよび他の研究者は、基質により結合されたまたは集められたアミノ−Ｎｏｇｏが線維芽細胞伸展および神経突起伸長を阻害することを報告している（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：４３４−４３９（２０００）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ））。これらの性質から示唆されるように、本発明らは、これらの活性に係わっているアミノ−ＮｏｇｏドメインはＮｇＲに結合するものではないと確信する。これらの作用の分子的根拠は不明のままである。少なくともこの活性の重要な部分は、アミノ−Ｎｏｇｏの中央部分に近いΔ２０セグメントに特定することができる。最近、Ｎｏｇｏのアミノ末端は、Ｎｏｇｏ−ＡとＮｏｇｏ−Ｂの間で共用される極端にアミノ末端側のドメインを介して、もう１つのＮｇＲに依存しない作用を有することが認められている。このドメインは、負傷の後、脈管構造の再建に選択的な役割を有している（Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１０：３８２−３８８（２００４））。従って、Ｎｏｇｏは、多様な機能的ドメインおよび受容体を有しているようである。Ｎｏｇｏ−ＡのΔ２０領域は、ＮｇＲに結合しないが、多種の細胞に対する基質として非許容性である。Ｎｏｇｏ−ＡおよびＮｏｇｏ−Ｂのアミノ末端セグメントは、ＮｇＲに対する親和性がないが、未確認の受容体を通じて、血管内皮および平滑筋細胞の移動を確かに規制している。
【０１７５】
（実施例３）
アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａのカルボキシル領域はＮｇＲのＬＲＲドメインに結合する
ニューロンＮｇＲに結合するアミノ−Ｎｏｇｏが軸索伸長を阻害しないため、本発明者らは、ＮｇＲに対するアミノ−Ｎｏｇｏの特異性がＮｏｇｏ−６６ドメインのものと類似するかどうか確認することに努めた。Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧおよびＯＭｇｐ（Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２ｂ））に関し、任意の２つのＬＲＲが欠失することにより、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ｂ４Ｃ断片についてＮｇＲへの結合がなくなった（図３Ａ）。同様に、システインに富むＬＲＲ−ＮＴドメインおよびＬＲＲ−ＣＴキャッピングドメインは、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ｂ４Ｃ結合に不可欠である。一方、ＬＲＲ領域からＧＰＩ足場部位にわたるＮｇＲのユニークなシグナル伝達ドメイン（ＣＴドメイン）が欠失しても、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ｂ４Ｃ結合は変わらない。ＮｇＲは、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３を含む遺伝子ファミリーの一部である。ＣＯＳ−７細胞の表面上に発現されるとき、これらの関連するタンパク質は、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６またはＡＰ−ＭＡＧまたはＡＰ−ＯＭｇｐに結合しない（Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３））。同様に、ＮｇＲ２およびＮｇＲ３は、アミノ−Ｎｏｇｏに対する結合パートナーではない（図３Ｂ）。これらの指標から、Ｎｏｇｏ−６６結合に対するＮｇＲの要件とアミノ−Ｎｏｇｏ−Ｂ４Ｃ結合に対するＮｇＲの要件は、区別がつかないものである。
【０１７６】
（実施例４）
異なるリガンドの結合に必要なＮｇＲ残基
ＮｇＲは、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧ、ＯＭｇｐ、およびＬｉｎｇｏ−１とアミノ−Ｎｏｇｏに結合する能力がある。以前の研究は、Ｎｏｇｏ−６６に対する結合部位とＭＡＧに対する結合部位が離れているのか重なっているのかについてつじつまが合っていなかった。Ｎｏｇｏ−６６のＮＥＰ１−４０アンタゴニストを用いると、本発明者らは、ＮｇＲとのＭＡＧ相互作用の阻害を認めなかった（Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２））。立体障害性のＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６リガンドを用いると、ＮｇＲへのＭＡＧ−Ｆｃ結合に対するいくらかの競合が検出された（Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２））。ＮｇＲの構造は現在明らかにされているため（Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３）；Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３−２９０（２００２）；Ｈｅ，Ｘ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１７７−１８５（２００３））、本発明らは、Ａｌａ置換により、リガンド結合部位についてその表面を綿密に調べた。
【０１７７】
多様なリガンドがどのようにしてＮｇＲタンパク質に結合するかについてさらに明確にするため、本発明者らは、リガンド結合活性について、一連のＡｌａ置換ＮｇＲを調べた。ＮｇＲの変異誘発を、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クイックチェンジ多部位指定変異誘発キット）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１４）を用いて行った。ヒトＮｇＲ１を鋳型（テンプレート）として用いた。ＮｇＲのリガンド結合ドメインの表面において溶媒が接近できると予測される荷電残基のそれぞれに対して、Ａｌａ置換を生成させた（Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３）；Ｈｅ，Ｘ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１７７−１８５（２００３））。本発明らは、変異体を生成させ、そこにおいて、互いの５Ａ内にとどまる１〜８の表面残基をＡｌａで置換した。ＬＲＲ構造のコイル形成性のため、タンパク質表面に並置される残基は、通常その一次構造において約２５残基離される。特定の荷電表面断片における変異に加えて、グリコシル化部位と、ＮｇＲ構造に基づきリガンド結合に関与すると予測される領域とを、他の変異の対象にした（Ｂａｒｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ．２２：３２９１−３３０２（２００３）；Ｈｅ，Ｘ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３８：１７７−１８５（２００３））。さらに、ヒト多形性に相当する変異体を調べた（Ｄ２５９Ｎ）。変異体のいずれも、ＬＲＲ構造自体を決定づけるＬｅｕ残基を変えておらず、また、アミノ末端およびカルボキシル末端のキャッピングドメインにおいて重要なＣｙｓ残基を変えていなかった。そのようなＡｌａ表面置換変異体の大多数は、野生型ＮｇＲと区別がつかない分子量および発現レベルで、免疫反応性ポリペプチドとして発現させた（図４Ｃ、データは示さず）。そうでなかったものは、さらなる分析から除外した。さらに、リガンド結合について分析された変異体ＮｇＲのすべては、トランスフェクトされたＣＯＳ−７において、野生型タンパク質と同じ細胞分布を示した。特に、ａａ２７〜３１０領域においてグリコシル化部位を除去したそれらの変異は、イムノブロット分析により分子量が減っていたにも係らず、表面発現の発現レベルを変化させなかった（データは示さず）。
【０１７８】
７４の個々のＮｇＲ変異体のコレクションを、ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６、ＡＰ−アミノ−Ｎｏｇｏ−Ｂ４Ｃ、ＡＰ−ＭＡＧ、ＡＰ−ＯＭｇｐ、およびＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１の結合について調べた。ＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６、ＡＰ−ＭＡＧ、ＡＰ−ＯＭＧＰ、およびＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１の構造は、別の文献に記載されている（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３４１−３４６（２００１）；Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２）；Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：９４１−９４４（２００２ｂ））。ＮｇＲ変異体の性質は、３つの大きな範疇の１つに入った（表ＩＩおよび図５）。Ａｌａ置換ＮｇＲポリペプチドの相当数が、リガンドのすべてに野生型のレベルで結合した。本発明者らは、該当するａａがリガンド相互作用において本質的な役割を果たしていないと結論づけている。これらの残基の多くは、ＮｇＲ構造の「外」にある凸面上に位置しており、この表面が分子間の相互作用にとって主要な部位ではないことを示している。さらに、凹面のかなりの範囲もリガンド結合にとって重要ではない。
【０１７９】
変異体の第２の群は、リガンドのそれぞれに対し、弱い結合を示すか結合を示さなかった。理論に縛られるものではないが、１つの解釈としては、これらの残基はＮｇＲの折りたたみに必要であり、そのＡｌａによる置換は、リガンド結合のない誤った折りたたみのタンパク質をもたらしているということである。しかし、これらの残基の多くが、共通の結合性ポケットにおいて多様なＮｇＲリガンドの結合に寄与するという別の仮説を支持するいくつかの理由がある。
【０１８０】
決定的に、ＮｇＲ発現レベルおよび細胞内分布は、これらの変異体に対し変化していない。対照的に、折りたたまれなかったまたは誤って折りたたまれたタンパク質は、不安定で誤った位置に配置されると考えることができる。また、リガンド結合の損失なくＡｌａに変異できないそれらの残基の大部分が互いの近くにかたまっているということも注目すべきである。従って、本発明者らは、限定されることなく例えば、６７／６８、１１１／１１３、１３３／１３６、１５８／１６０、１６３、１８２／１８６、および２３２／２３４を含む残基によって作られるＮｇＲ表面が、これらのリガンドに対して重要な結合部位を構成していると結論づけている。ラットおよびヒトのＮｇＲは、これら１３の位置すべてにおいて一致している。ＮｇＲ関連タンパク質ＮｇＲ２およびＮｇＲ３は、それぞれ、１０の同じ残基、２の類似／非同一の残基、および１の非類似残基をこれらの位置において有している。
【０１８１】
Ａｌａ置換ＮｇＲ変異体の第３のグループは、あるリガンドに対して選択的に結合が失われる一方、他のリガンドに対してはそうではない（表ＩＩＩおよび図４）。このクラスのメンバーそれぞれが少なくとも１つのリガンドに対する結合親和性を保存しているということは、Ａｌａ置換がＮｇＲの折りたたみや表面発現を妨げているのではないことを示している。異なるリガンド結合に係わるＮｇＲ残基の大部分が、上述した主要結合部位の周辺部に位置している。これらの置換の大部分が、Ｎｏｇｏ−６６またはアミノ−Ｎｏｇｏ−ＡのＢ４Ｃ断片による結合を減少させることなく、ＭＡＧ、ＯＭｇｐおよびＬｉｎｇｏ−１の結合を減少させるか消滅させている。理論に縛られるものではないが、このトポグラフィックな関係の最もシンプルな解釈は、ＭＡＧ、ＯＭｇｐ、およびＬｉｎｇｏ−１は、Ｎｏｇｏ−６６と部分的に共通する中央リガンド結合ドメインを必要とするだけでなく、高い親和性の結合のため、ａａの隣接した群も必要としているということである。この隣接する領域は、例えば、ａａ７８／８１、８７／８９、８９／９０、９５／９７、１０８、１１９／１２０、１３９、２１０、および２５６／２５９を含む。マウスとヒトのＮｇＲは、これら１４の残基のうち１１において一致しており、また、１４のうち１３において類似している。ＮｇＲ２は、これら１４の位置においてあまり保存を示しておらず、８つが同一ａａであり、１つが類似／非同一ａａであり、そして５つが非類似ａａである。ＮｇＲ３については、６つが同一ａａであり、４つが類似／非同一ａａであり、４つが非類似ａａである。
【０１８２】
特に興味深いのは、ａａ９５／９７および１３９でのＡｌａ置換であり、これらの置換は、アミノ−ＮｏｇｏのＢ４Ｃ断片による結合よりも大きくＮｏｇｏ−６６結合を減少させる。これらの残基は、ＮｇＲの凹面上で中心結合部位の非グリコシル化側に存在する。これらのＡｌａ置換ＮｇＲタンパク質の異なる結合は、Ｎｏｇｏ−６６とアミノ−ＮｏｇｏがＮｇＲ上で部分的に分離可能な複数の部位と相互作用することを示している。この知見は、１つのＮｏｇｏ−Ａの両方のドメインが１つのＮｇＲタンパク質と相互作用することができる可能性を示している。
【０１８３】
この分析は、異なるリガンドの結合に必要な残基間の類似点と相違点の両方を明らかにしている。アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−１９、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧ、およびＯＭｇｐリガンドにより必要とされる中心的な結合ドメインがあると考えられる。さらに、種々のリガンドは、この中心部位を取り囲む特定の残基を必要とする。これらの知見は、リガンド間の部分的であるが不完全な競合と整合するものである。すべてのリガンドが、ＮｇＲ凹面の中央部分に集中する表面残基を必要とするので、ＮｇＲシグナル伝達を活性化するそれらのメカニズムは類似し得る。アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−２４への融合によるＮｏｇｏ−６６アンタゴニストＮＥＰ１−３２のアゴニスト（作動体）への変換は、この活性化のメカニズムが、この中心ドメインの結合を介して受容体集合体の結合価が変わることを必要とする可能性を示している。
【０１８４】
ＮｇＲは、軸索再生療法開発のためのターゲットと考えることができるため（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：８７２−８７８（２００３））、多様なリガンドに共通するこの中央結合ドメインを明らかにすれば、すべてのＮｇＲリガンドを遮断する小分子療法の設計および／または開発を促進させることができる。従って、本発明の変異体ＮｇＲ１ポリペプチドを、スクリーニングアッセイに用いることができる。一方、それぞれのリガンドが、高い親和性の結合のため、完全に離れた残基を必要とするならば、低分子量の化合物でＮｇＲにおけるすべてのミエリンタンパク質の作用を遮断する薬剤（遮断薬）を開発できる可能性は、顕著に低くなるはずである。
【０１８５】
Ｌｉｎｇｏ−１は、シグナル伝達ＮｇＲ複合体の成分として報告されている（Ｍｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４））。ここで注目すべきことは、ＮｇＲへのその結合に必要な残基は、リガンドＭＡＧおよびＯＭｇｐにとって必要なものと非常に類似するということである。理論に縛られるものではないが、Ｌｉｎｇｏ−１も乏突起膠細胞により発現されるので、結合分析は、それがリガンドとして作用する可能性を示唆している。一方、補助受容体の機能が、アゴニスト結合のように、同じ部位でＮｇＲの結合価を制御している可能性がある。ＮｇＲ上のＬｉｎｇｏ−１結合部位がリガンド結合部位と類似することの意味を十分に明らかにするには、さらなる構造的および生物化学的研究が必要である。
【０１８６】
【表２】
2008515804.tif 000010
アラニン置換ＮｇＲ変異体のＮｇＲリガンドへの結合は、野生型ＮｇＲと比較された。そして、結合のレベルは、＋＋（ＷＴ（野生型）レベル）、＋（野生型より弱いレベル）、ｔｒ（ごくわずかな結合）、−（結合せず）、Ｎ／Ａ（検出されず）として分類した。またＮｇＲ変異タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＮｇＲ抗体により調べた。野生型ＮｇＲと同様の発現レベルを有する変異体を「ｙ」と表示した。
【０１８７】
【表３】
2008515804.tif 000011
アラニン置換ＮｇＲ変異体を、ＡＰ−Ｎｏｇｏ６６、ＡＰ−Ｂ４Ｃ、ＡＰ−Ｂ４Ｃ６６、ＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１、ＡＰ−ＯＭｇｐ、およびＡＰ−ＭＡＧに対するそれらの結合について試験し、そして、それらを、３つの範疇：（１）すべてのＮｇＲリガンドに対して結合が消滅した変異体、（２）すべてのＮｇＲリガンドに対して依然として結合を維持する変異体、および（３）あるリガンドには依然として結合する一方、他のリガンドに対する結合が消滅した結合が異なる変異体に分類した。Ｄ２５９Ｎ変異体は、ヒト多形性を模倣するためのアスパラギン置換体である。
【０１８８】
（実施例５）
Ｎｏｇｏ−Ａに由来する２つのＮｇＲ結合性ドメインの並置は、高い親和性のアゴニスト活性をもたらす
本発明者らは、Ｎｏｇｏ−６６とアミノ−Ｎｏｇｏドメインが同時にＮｇＲに結合できるかどうか検討した。もしこの２つのドメインが同時に受容体に結合するならば、２つのドメインの融合体は、２つの部位の結合に基づいてより高い受容体親和性を有する可能性がある。無傷のＮｏｇｏ−Ａについて、これら２つのドメインは、原形質膜表面において互いに隣接する可能性がある。というのも、これらは、一次構造において、脂質二重層の中に伸びる疎水性ループによって分離されているからである（Ｏｅｒｔｌｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：５３９３−５４０６（２００３ｂ））。このコンフォメーションに類似する可溶性の標識されたリガンドを作るため、本発明者らは、上述したようにアミノ−Ｎｏｇｏ−ＡのＢ４Ｃ断片がＮｏｇｏ−６６に直接融合されたＡＰ融合タンパク質を生成させた。ＮｇＲに対するこのＡＰ−Ｂ４Ｃ−６６リガンドの親和性は、ＡＰ−Ｂ４ＣまたはＡＰ−Ｎｏｇｏ−６６の親和性よりもかなり大きいものである。この結合についてのＫｄはサブナノモルである（図６Ａおよび６Ｂ）。従って、２つの連結されたＮｏｇｏ−Ａドメインの二価結合は、顕著により強いＮｇＲリガンドをもたらしている。
【０１８９】
アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−１９結合は、軸索伸長を阻害するよう、ＮｇＲを活性化しない。しかし、このドメインがＮｏｇｏ−６６と融合すると、ＮｇＲに対して二価のリガンドがもたらされ、実質的に受容体親和性が高まる。理論に縛られるものではないが、この親和性の増強によれば、ミエリン調製物においてＭＡＧタンパク質の方がより豊富にあるにもかかわらず、軸索成長を制限する際には、ＭＡＧよりもＮｏｇｏ−Ａの方がより大きな役割を果たすことがインビトロアッセイおよびインビボアッセイにより示されることを説明することができる。
【０１９０】
次に、本発明者らは、これら２つのペプチドドメインの神経突起伸長に対する作用について検討した。合成Ｎｏｇｏ−６６ペプチド断片はＮｇＲへの結合により神経突起伸長を阻害する一方、より短いＮｏｇｏ−６６ペプチドは、アンタゴニストとしてＮｇＲに結合し、伸長を変化させない。以前、本発明者らは、Ｎｏｇｏ−６６のアミノ末端４０ａａからなるポリペプチド（ＮＥＰ１−４０）の拮抗活性を明らかにした（ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２））。同様のＮｇＲ拮抗効果が、３２ａａという短いペプチドに対して得られ（データは示さず）、これは、３３−６６領域が受容体の活性化に必要であるが、高い親和性の結合ではないことを示唆する（ＧｒａｎｄＰｒｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：５４７−５５１（２００２）、データは示さず）。アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａのカルボキシル２４ａａセグメントは、ＮｇＲに結合するＡＰタンパク質を媒介するものであるが（図１Ｃおよび１Ｄ）、このペプチドは、神経突起伸長についてＮｏｇｏ−６６の作用を遮断または増強しない（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【０１９１】
本発明者らは、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａの２４ａａセグメントをＮＥＰ３２アンタゴニストペプチドに融合することにより、ＡＰ−Ｂ４Ｃ−６６のＮｇＲへの結合に類似する効力を有する高親和性のアンタゴニストが作れるのではないかと考えた。この仮説を検証するため、そのカルボキシル末端でＮＥＰ３２に融合されたアミノ−Ｎｏｇｏ−２４配列を含むビオチン化ペプチドを合成した。ビオチンで標識したＮｇ２４（ビオチン−ＩＦＳＡＥＬＳＫＴＳＶＶＤＬＬＹＷＲＤＩＫＫＴＧ）および２４／３２（Ｂ２４／３２：ビオチン−ＩＦＳＡＥＬＳＫＴＳＶＶＤＬＬＹＷＲＤＩＫＫＴＧＧＲＩＹＫＧＶＩＱＡＩＱＫＳＤＥＧＨＰＦＲＡＹＬＥＳＥＶＡＩＳＥＥ）を合成し、イェール大学においてＷ．Ｍ．Ｋｅｃｋ研究室で精製した。ｃＤＲＧ伸長アッセイのため、固定の前に、解離Ｅ１３ｃＤＲＧニューロンを６時間平板培養した。ニューロンを、抗ニューロフィラメント抗体（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ４１４２）および抗ＨｕＣ／Ｄ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ−２１２７１）で染色した。細胞面積、付着細胞の数、および神経突起の長さを、Ｉｍａｇｅｅｘｐｒｅｓｓ装置およびソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて測定した。
【０１９２】
思いがけず、２４−３２融合ペプチドは、ＤＲＧニューロンからの軸索伸長を強く阻害した（図６Ｃおよび６Ｄ）。アミノ−Ｎｏｇｏ−２４ドメインは、独立してＮｇＲに結合できるが、ＮＥＰ３２と融合されるとき、高親和性のＮｏｇｏ−Ａ選択的ＮｇＲアゴニストを生成させることがわかる。従って、Ｎｏｇｏ−６６（３３−６６）領域は、受容体の活性化に不可欠なものではない。ＮｇＲは、それ自身に結合でき、脂質の浮遊物中に集まるため（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：８８７６−８８８３（２００２）；Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０−１１９３（２００２））、二価のリガンドは、二重層の面におけるその集合状態の調節を通じて受容体を活性化することができる。
【０１９３】
明らかなとおり、詳細な説明の欄（要旨および要約の欄ではない）は、請求の範囲の解釈に利用することを意図するものである。要旨および要約の欄は、本発明者らが意図する本発明の具体的実施態様の１つ以上（しかしすべてではない）を示すが、本発明および添付の請求の範囲を決して限定しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１Ａ】図１Ａは、アミノ−Ｎｏｇｏ断片のＮｇＲへの結合について、アミノ−Ｎｏｇｏ断片Ａ、ＢおよびΔ２０の模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合アミノ−Ｎｏｇｏ断片Ｂ（ＡｍＮｇ  Ｂ）がＮｇＲを発現するＣＯＲ−７細胞に結合する一方、断片Ａ（ＡｍＮｇ  Ａ）またはΔ２０はＮｇＲを発現するＣＯＲ−７細胞に結合しないことを示している。表示した濃度のＡＰ融合タンパク質を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地を、ＮｇＲを発現するＣＯＳ−７細胞またはトランスフェクトされていないものに付与し、結合されたＡＰを染色した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−２４がアミノ−ＮｏｇｏにおいてＮｇＲに対する結合ドメインであることを示す図である。表示されるとおりアミノＮｏｇｏの異なる断片がＡＰに融合され、ＮｇＲへのそれらの結合が、（Ｂ）におけるように、細胞結合アッセイで測定された。
【図１Ｄ】図１Ｄの上は、ＡＰ−アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−２４の濃度の関数として測定された、ＮｇＲ発現ＣＯＳ−７細胞に結合するＡＰ−アミノ−Ｎｏｇｏ−Ａ−２４を示す図であり、図１Ｄの下は、上のパネルからの再プロットデータを示す図である。結合Ｋｄは、４つの独立した測定値から求めた。
【図１Ｅ】図１Ｅは、解離Ｅ１３ニワトリＤＲＧニューロンへのＡＰ融合アミノ−Ｎｏｇｏ断片の結合を示す図である。表示のとおりＡＰ融合タンパク質を含むＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地を、解離Ｅ１３ニワトリＤＲＧニューロンに付与し、結合されたＡＰを染色した。
【図２Ａ】図２Ａは、アミノ−Ｎｏｇｏ断片の線維芽細胞伸展および神経突起伸長に対する作用を示す図である。線維芽細胞伸展に対する複数のアミノ−Ｎｏｇｏ断片の作用は異なっている。ＣＯＳ−７細胞を、表示の乾燥ＧＳＴ融合タンパク質５０ｎｇでコーティングされたスポットを有するスライドに付着させ、広げ、そしてＦ−アクチンに対して染色した。ＧＳＴ−Ａは、ＧＳＴとアミノ−ＮｏｇｏのＡ断片（図１）との融合タンパク質である。ＧＳＴ−Ａ、ＧＳＴ−Ｂ、ＧＳＴ−２０Δ、ＧＳＴ−Ｂ４、およびＧＳＴ−Ｂ４Ｃは、それぞれ、ＧＳＴと、アミノ−ＮｏｇｏのＡ、Ｂ、Δ２０、Ｂ４、またはＢ４Ｃ断片（図１）との融合タンパク質である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、（Ａ）におけるような実験についてＣＯＳ−７細胞の面積を測定しプロットした図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＯＳ−７細胞を、表示の乾燥ＧＳＴ融合タンパク質でコーティングした９６ウェル皿に付着させて広げた。付着した細胞の数を数え、９６ウェル皿におけるウェルあたりの乾燥された種々のタンパク質の量の関数としてプロットした。
【図２Ｄ】図２Ｄは、複数のアミノ−Ｎｏｇｏ断片の神経突起伸長に対する異なった作用を示す図である。Ｅ１３ニワトリＤＲＧからの解離ニューロンを、ウェルあたり１ｐｍｏｌのタンパク質でコーティングされた９６ウェル皿にのせ、ニューロフィラメントの位置特定のため染色した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、（Ｅ）で示した実験について、乾燥タンパク質の濃度を増加させていき、ニューロンあたりの神経突起の長さを測定し、ＰＢＳ対照に対する百分率としてプロットした図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＮｇＲへのアミノ−Ｎｏｇｏの結合がＬＲＲリピートを必要とすることを示す図である。ＮｇＲ変異体を発現するＣＯＳ−７細胞へのＡＰまたはＡＰ融合Ｎｏｇｏ断片の結合が示される。ＡＰ−ＢおよびＡＰ−Ｂ４はアミノ−Ｎｏｇｏ断片ＢまたはＢ４断片のＡＰ融合タンパク質である。ＮｇＲ変異体の表面発現は、抗Ｍｙｃ抗体を用いて検出した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、アミノ−ＮｏｇｏがＮｇＲ２またはＮｇＲ３に結合しないことを示す図である。表示のＡＰ融合タンパク質２０ｎＭを含むトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの馴化培地を、マウスＮｇＲ１、ヒトＮｇＲ２またはマウスＮｇＲ３を発現するＣＯＳ−７細胞に付与し、結合されたＡＰを染色した。ＮｇＲ類の表面発現は、抗Ｍｙｃ抗体または抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した。ＡＰ−ＡｍＮｇＡはアミノ−Ｎｏｇｏ断片ＡのＡＰ融合タンパク質である。ＡＰ−ＡｍＮｇＢはアミノ−Ｎｏｇｏ断片ＢのＡＰ融合タンパク質である。
【図４Ａ】図４Ａは、複数のＭｇＲリガンドに対して異なる結合を示すＮｇＲ変異体の例を示す図である。種々のＮｇＲ変異体を発現するＣＯＳ−７細胞へのＡＰまたはＡＰ融合ＮｇＲリガンドの結合が示される。付与されたリガンドの濃度は以下のとおりである。ＡＰ  ３０ｎＭ、ＡＰ−Ｎｇ６６  ５ｎＭ、ＡＰ−Ｎｇ３３  １０ｎＭ、ＡＰ−Ｂ４Ｃ  １０ｎＭ、ＡＰ−Ｂ４Ｃ６６  ０．５ｎＭ、ＡＰ−Ｌｉｎｇｏ−１  １０ｎＭ、ＡＰ−ＯＭＧＰ  １０ｎＭ、ＡＰ−ＭＡＧ  ３０ｎＭ。これらの濃度は、それらのタンパク質のＮｇＲに対する結合Ｋｄに近いものであり、従って、染色において、Ｋｄの減少は直線的に反映される。
【図４Ｂ】図４Ｂは、発現されるＮｇＲ変異体に対するＮｇＲリガンドのＡＰ結合を野生型ＮｇＲに対する百分率として示す図である。ＡＰ融合リガンドとのインキュベーションの後のＡＰ、ＮｇＲまたはＮｇＲ変異体を発現するＣＯＳ−７細胞に結合されるＡＰを、染色し測定した。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＮｇＲ変異体を発現するＣＯＳ−７細胞の全細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＮｇＲ抗体でブロットした結果を示す図である。
【図５】ＮｇＲにおけるリガンド結合部位を示す図である。ＮｇＲの分子表面を示しており、すべてのリガンドの結合に必須である残基を赤で表示し、リガンド結合に必要のない残基を青で表示し、あるリガンドに必要である一方他のリガンドには必要のない残基を黄色で表示している。Ｎｇ６６の結合に必要である一方、Ｂ４Ｃには必要でない残基を矢印で示している。この図は、ＳｗｉｓｓＰｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いて作成した。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｂ４ＣのＮｏｇｏ６６との融合がＮｇＲに対して高い親和性のリガンドをもたらすことを示す図である。ＮｇＲを発現するＣＯＳ−７細胞に結合するＡＰ−Ｂ４Ｃ６６を、ＡＰ−Ｂ４Ｃ６６の濃度の関数として測定した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、（Ａ）からの再プロットデータを示す図である。結合Ｋｄを、４つの独立した測定値から求めた。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｂ２４／３２ペプチドが神経突起伸長を阻害することを示す図である。Ｅ１３ニワトリＤＲＧからの解離ニューロンを、表示の乾燥ペプチド５００ｐｍｏｌでコーティングした９６ウェル皿に配置し、ニューロフィラメントの位置特定のため染色した。
【図６Ｄ】図６Ｄは、（Ｃ）の実験について、ニューロンあたりの神経突起の長さを測定し、ＰＢＳ対照に対する百分率としてプロットした図である。
【図７】ＮｇＲのシグナル伝達についてモデルを示す図である。ＮｇＲは、乏突起膠細胞タンパク質であるＮｏｇｏ、ＭＡＧ、およびＯＭｇｐに対して共通する受容体である。アミノ−ＮｏｇｏにおけるＮｇ１９領域とＮｏｇｏ６６は、ＮｇＲのＬＲＲドメインに結合する。アミノ−Ｎｏｇｏ−１９のＮｇＲへの結合は、伸長を阻害するようにシグナルを送らないが、Ｎｏｇｏにおいてアミノ−Ｎｏｇｏ−１９とＮｇ６６の両方が存在すると、Ｎｏｇｏは、ＮｇＲに対して高い親和性のアゴニストとなる。ＭＡＧおよびＯＭｇｐも、ＮｇＲのＬＲＲドメインに結合する。アミノ−ＮｏｇｏのΔ２０領域は、ＮｇＲに結合しないが、線維芽細胞伸展および神経突起伸長を阻害する（おそらく、多くの細胞種に存在する未確認の受容体を介して）。Ｎｏｇｏ−ＡとＮｏｇｏ−Ｂに共有されるＮｏｇｏのアミノ末端ドメインは、他の未確認の受容体を介して、血管の再建を制御するよう作用する可能性がある。
【図１Ａ】
2008515804.tif 000012
【図１Ｂ】
2008515804.tif 000013
【図１Ｃ】
2008515804.tif 000014
【図１Ｄ】
2008515804.tif 000015
【図１Ｅ】
2008515804.tif 000016
【図２Ａ】
2008515804.tif 000017
【図２Ｂ】
2008515804.tif 000018
【図２Ｃ】
2008515804.tif 000019
【図２Ｄ】
2008515804.tif 000020
【図２Ｅ】
2008515804.tif 000021
【図３Ａ】
2008515804.tif 000022
【図３Ｂ】
2008515804.tif 000023
【図４Ａ】
2008515804.tif 000024
【図４Ｂ】
2008515804.tif 000025
【図４Ｃ】
2008515804.tif 000026
【図５】
2008515804.tif 000027
【図６Ａ】
2008515804.tif 000028
【図６Ｂ】
2008515804.tif 000029
【図６Ｃ】
2008515804.tif 000030
【図６Ｄ】
2008515804.tif 000031
【図７】
2008515804.tif 000032
【配列表】
2008515804000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月17日(2007.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008515804000001.app
【国際調査報告】
2008515804.tif 000033