(57)【要約】本発明は、製造方法の一段階中で、培地が微生物の一以上の菌株で接種される型の、凍結乾燥細菌のような凍結乾燥微生物の製造方法に関する。本発明は、培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい培養基に対する所与の酸化還元電位値Ｅｈを得ることを目的として、接種段階に先立ち、培地は、不活性ガス若しくは還元ガス若しくはそのような不活性及び還元ガスの混合物を含む処理ガスによって処理されることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
製造方法の一段階中で、培地が微生物の一以上の菌株で接種される型の、凍結乾燥微生物、特に凍結乾燥細菌の製造方法であって、培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい、培養基に対する所与の酸化還元電位値Ｅｈを得ることを目的として、接種段階以前に、培地は、不活性ガス、還元ガス若しくはそれらガスの混合物を含む処理ガスによって処理されることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の製造方法であって、前記所望の酸化還元電位値が、培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より、少なくとも１００ｍＶ小さいことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の製造方法であって、前記所望の酸化還元電位値が、負の値であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項記載の製造方法であって、前培養が前以て行われ、前培養物は引き続き前記接種に使用されるという事実によって、接種が間接的に行われることを特徴とし、そして、前培地が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい、前培地に対する所与の酸化還元電位値Ｅｈを得ることを目的として、前培養物の接種以前に、前培地は、不活性ガス、還元ガス若しくはそれらガスの混合物を含む前処理ガスによって処理されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスが、水素であるか、水素を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至４の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスが、窒素であるか、窒素を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至４の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスが、水素と窒素の混合物であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至４の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスはアルゴンであるか、アルゴンを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスが、水素及び/又は窒素と、このように製造された凍結乾燥微生物の後続する使用の観点から受容可能な追加的ガスを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスは、また、不活性ガス、特にヘリウムから、並びに、酸素、二酸化炭素、亜硝酸ガス及びそれらの任意の割合の混合物から、好ましくは、酸素、二酸化炭素及びそれらの混合物から、選択される追加的ガスを含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至４の何れか１項記載の製造方法であって、前記処理ガス若しくは前処理ガスは、水素と二酸化炭素の混合物であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、凍結乾燥微生物、特に凍結乾燥細菌の製造分野に関するものであり、凍結乾燥微生物の後続する貯蔵中での生存度の向上のための、新規な操作条件を提案することに努めることにより、特に凍結乾燥乳酸菌に焦点を当てるものである。
【０００２】
あらゆる型の微生物（細菌、酵母、カビ等）は、アプリオリに凍結乾燥され得ることを想起すべきであり、凍結乾燥は、特に微生物コレクションンに菌株を保存するために使用される。凍結乾燥は、例えば、乳酸菌、共生菌株、酵母に対して実施され、非常に様々の産業用途を有する。
【０００３】
微生物は、以下の場合の出発材料の生物的変換に特に使用されることも、想起すべきである。
【０００４】
-最終製品（チーズ、ヨーグルト、ワイン、ビール、パン等）の製造
-人間若しくは動物用栄養物目的のバイオマス（酵母、共生菌の抽出物及び粉体等）の製造
-関心のある特定分子（酵素、抗生物質、アミノ酸、香味剤等）の製造
-産業廃棄物の浄化、有機廃物の処理等
後記のように、乳酸菌の例を考慮すると、乳酸菌の発酵及び共生培養物としての産業的利用は、安定な培養物即ち長期間に亘って生存し活性である培養物を保証することを目的として使用される保存技術に、高度に依存している。凍結及び凍結乾燥は、この目的のために共通して使用されるが、これらの技術は、タンパク変性や生存度減少といった望ましくない副作用をもたらす。乾燥及び貯蔵中のブルガリア菌（Lactobacillus bulgaricus (Lb. bulgaricus)）でなされた研究は、生存に影響し得るパラメターとして、乾燥粉体の温度及び水分活性のような要因を同定した。（特に、1995年に発行されたApplied Microbiology and Biotechnology.44:172-176でのCastroその他による研究参照。）粉体の生存度損失は、細胞損傷の結果であり、優先的な標的は、細胞壁、細胞膜、ＤＮＡそしてまた脂質膜の酸化である。（1994年に発行されたInternational Daily Journal.14:835-847でのCarvelhoその他による論文参照。）
凍結若しくは凍結乾燥乳酸菌培養物の生存に関する最適化及びその長期間に亘る貯蔵は、それゆえ明確な重要性を有し、技術的かつ経済的重要性がある。
【０００５】
凍結乾燥菌株の製造は、親株からなされ、一般的には、接種、タンク培養、濃縮、貯蔵の４段階を含むことを想起すべきである。例えば、以下の研究が参照されるだろう。”Freeze Drying and Advanced Food Technology”, Goldblith et al., Academic Press 1975年若しくは、”Traite de Lyophilisation” [凍結乾燥についての学術論文],Lois Rey 1960年ハーマンにより出版。
【０００６】
接種は、濃縮された培養物を使用して、最適な生理学的状態でなされる。
【０００７】
いくつかの技術が使用でき、そのうちには、
-タンクスターターの使用
-連続的継代培養法
-直接接種
-連続接種
がある。
【０００８】
培養段階それ自体は、タンク中で振とうするか振とうせずに、夫々の微生物の特定のニーズに適した組成の培地中でなされる。例えば上記引用した研究にみられるように、培地の組成は極度に変化しているが、多糖類、グリセロール、乳、グルコース等からの１以上の成分の存在が共通して言及されている。
【０００９】
同様に、例えば、ｐＨ、温度若しくは溶存酸素圧のようなパラメターを調節することができる。
【００１０】
様々な型の培養が存在する。
【００１１】
-不連続培養若しくはバッチ培養は、乳発酵或いはパン製造酵母製造に特に使用され、
-半連続培養若しくは「流加培養」は、例えば、発酵生産物に敏感な酵素製造や発酵基質による阻害に敏感なバイオマス製造に使用され、
-再循環連続培養若しくは再循環しない連続培養、後者は、特に、関心のある酵素或いは分子の製造及び廃水の生物学的浄化に使用される。
【００１２】
保存段階は、凍結、寒冷保存、凍結乾燥若しくは乾燥により液体状態で実施されることができる。保存処理の有害作用に対して微生物を保護するために、保護剤が使用される。
【００１３】
凍結乾燥は、公知のように、凍結後の生産物に含まれる水の大部分を昇華により除去する低温脱水操作である。
【００１４】
更に、酸化還元電位（しばしば、文献ではＥｈと参照される）は、培養基が、酸化状態から還元状態へと変化できる（逆も真である）少なくとも一つの分子を含むという前提で、本来、どの培養基も有する物理化学的パラメータである。このため、その作用は、どの細胞機能にも見られる。その作用は、種々のタイプの微生物、特に細菌菌株で示されてきた。
【００１５】
-化学的還元剤の培地への添加は、コリネバクテリウム  グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、クロストリジウム  アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、スポリジオボルス(Sporidiobolus)及び大腸菌（Escherichia coli）の成長及び代謝フラックスを有意に変化させることを既に可能にしてきた。
【００１６】
-ガスにより固定された還元性Ｅｈは、グリセロール/エタノール比増加を伴うサッカロミセス  セルビジエ(Saccharomyces cervisiae)の代謝フラックスを変化させ、液体状態で保存中の生存酵母の増加による貯蔵糖の蓄積を変化させることを可能にしてきた。（本出願人のFR-2811331文書に言及がなされる）。
【００１７】
工業用培養基では、酸素による乳酸菌の阻害効果が明らかに同定され、Ｅｈは既に間接的に考慮に入れられている。この作用は、乳酸菌がヘム核を持つシトクロムと酵素を合成する能力を持たないことに基づく。
【００１８】
Ｅｈに影響を及ぼすことにより、共生発酵物の残存、代謝フラックス、及び香味剤分子の産生及び/又は安定性を変化させることもできる。これらすべての結果は、微生物自身、酸化還元分子若しくは熱処理によるＥｈの変化に従って得られてきた。
【００１９】
凍結乾燥後及び保存後の微生物の生存は、微生物の初期濃度、成長状態、成長培養基、乾燥媒体及び再水和状態を含む、多くの要因に依存している。
【００２０】
凍結若しくは凍結乾燥型の保存方法においては、成長培養基はそれゆえ制御すべき重要なパラメターであり、培養基の夫々の構成成分は、特に、溶質の集積、エキソポリサッカライドの産生及び膜脂質特性の変性を許容することにより、特に不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比を増加することにより、保護を与えることができる。
【００２１】
従前の研究は、細胞損傷は凍結乾燥法の際に出現すること、また、凍結乾燥媒体に添加された抗酸化剤はこの損傷に対して膜脂質を保護することができることを示し、凍結乾燥中若しくは貯蔵中に起こる酸化に対して、膜脂質を保護するために、乳酸菌濃縮物に（培養後に、即ち凍結乾燥若しくは凍結媒体に）、化学的抗酸化剤分子を添加する利点を示してきた。（WO 03/018778文書或いは2003年に刊行されたInternational Dairy Journal.13:917-926 Fonseca et al.の研究が参照されるであろう。）
したがって、凍結乾燥に対して菌株生存度を改善することができる、凍結乾燥微生物、特に凍結乾燥細菌の新規な製造法を提供することを可能とすることに現実的なニーズが存在することが見て取れる、
加えて、栄養薬剤若しくは獣医学的適用を念頭に置くと、Ｅｈ変化は、生産物の特性を変えず、生産物の無害性を保存する化合物を包含すべきである。
【００２２】
以下、より詳細に見られるように、本発明によれば、接種以前に、不活性ガス及び/又は還元ガスを含む処理ガスを使用して、菌株培地の酸化還元電位を変更することが提案されている。
【００２３】
本発明によれば、それゆえ、培養基の接種段階以前に、混合物が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい酸化還元電位値Ｅｈを得るために、培地は窒素、アルゴン、ヘリウム或いは二酸化炭素の如き不活性ガス若しくは不活性ガスの混合物若しくは水素の如き還元ガス若しくは不活性ガスと還元ガスの混合物を含む処理ガスで処理される。
【００２４】
処理、即ち気液接触は、焼結ガラス漏斗、膜若しくは多孔質物質を使用する培養基への通気、中空軸タービンによる撹拌、注水器の使用等のような当業者によく知られた方法の一つにより行われ得る。
【００２５】
本発明は、それゆえ、製造方法の一段階中で培地が微生物の一以上の菌株で接種される型の、凍結乾燥微生物、特に凍結乾燥細菌、特に凍結乾燥乳酸菌の製造方法に関するものであって、培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい培養基に対する所与の酸化還元電位値Ｅｈを得ることを目的として、接種段階以前に、培地が、不活性ガス若しくは還元ガス若しくはそれらガスの混合物を含む処理ガスによって処理されることを特徴とする。
【００２６】
本発明の好適な実施例では、随意に、付加的に、以下の一及び/又は他の手段が使用される。
【００２７】
-前記所望の酸化還元電位値は、培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より少なくとも１００ｍＶ小さい；
-前記所望の酸化還元電位値は、負の値である；
-前培養が前以て行われ、その前培養物は引き続き前記接種に使用されるという事実によって、接種が間接的に行われ、そして、前培養基が空気と平衡状態にある時に得られる値より小さい前培養基に対する所与の酸化還元電位値Ｅｈを得ることを目的として、前培養物の接種前に、前培地は、不活性ガス若しくは還元ガス若しくはそれらガスの混合物を含有する前処理ガスによって処理される；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、水素であるか、水素を含む；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、窒素であるか、窒素を含む；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、水素と窒素の混合物である；
-前記処理ガス或若しくは前処理ガスは、アルゴンであるか、アルゴンを含む；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、水素及び/又は窒素及びこのように製造された凍結乾燥微生物の後続する使用の観点から受容可能な追加的ガスを含む；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、不活性ガス、特にヘリウムから、並びに酸素、二酸化炭素及び亜硝酸ガス及びそれらの任意の割合の混合物から、好ましくは、酸素、二酸化炭素及びそれらの混合物から選択される追加的ガスをも含む；
-前記処理ガス若しくは前処理ガスは、水素と二酸化炭素の混合物である。
【００２８】
加えて、以下に詳細に見られるように、このようにして得られた凍結乾燥微生物は、特に、凍結乾燥に対する菌株抵抗性及び後続する保存中の菌株の抵抗性の点で、改善された性質を有する。
【００２９】
本発明の他の特徴及び利点は、乳酸菌に関する以下の詳細な実例から明らかになるであろう。
【００３０】
無菌脱脂乳（４．５リットル）が、変形５リットルショットフラスコ中で、１５０ｍｌ/分の流速で２種の異なるガスにより通気することにより１時間処理された。通気しない対照条件も実施された：
-対照（比較例）；
-窒素（本発明による）
-窒素/水素混合物、体積比９６／４（本発明による）
三つの試験が夫々の条件でなされた。
【００３１】
このように獲得された酸化還元電位は、ｐＨ７での値に戻して（当業者に周知のライスナー  ミルナ方程式のような公式により、ｐＨ＝ｘの培養基のＥｈを、ｐＨ７でのＥｈ値に戻して関連付けることができる）、メットラー  トレド  プローブで測定すると、使用ガスに応じて以下のようになる。
【表１】
2008530995.tif 000002
【００３２】
培養基（無菌脱脂乳）は、それから、カゼイ菌（Lactobacillus casei）共生菌株で接種され、その後、７２時間３７℃でインキュベーター中に置かれた。
【００３３】
７２時間成長後、培養物は回収され、凍結乾燥用フィラー（前記発明の詳細な説明で言及された通常型のもの）が添加される。混合物は、水酸化カルシウム溶液を使って、中和される。このようにして得られた調製物は、凍結乾燥に付すために、トレーに置かれる。
【００３４】
そこで、培地中の細菌の数が、７２時間成長後、計数され、凍結乾燥用フィラーが添加される。得られた結果は、以下の表１に示される。
【００３５】
三つの処理により得られた計数に統計処理がなされた。「ｎｓ」は観察された差が有意でないことを示す。（ニューマン-クールズ検定で５％）
そこからは、研究された二種のガス混合物処理の間には、バイオマス生産に有意の差がないという結論が得られる。
【００３６】
表１：培地の三種の処理下、液体培養基中で７２時間成長後フィラー添加で得られた、CFU/mlで表現されたカゼイ菌（Ｌｂ．Casei）のバイオマス（夫々の場合３回の試験の平均値）
【表２】
2008530995.tif 000003
【００３７】
D+1での凍結乾燥粉体について得られた計数（つまり得られた後1日間保存されたもの、即ち計数は、粉体獲得の翌日に実施される）は、以下に調べられるだろう。
【００３８】
これらの結果は、以下の表２に示される。
【００３９】
三つの処理により得られた計数に統計処理がなされた。第１に窒素/水素処理と、第２に窒素と対照処理、との間に観察された相違が示されている。（ニューマン-クールズ検定で５％）
したがって、窒素-水素で処理された培養基でなされた培養物から得られた粉体の計数は、対照或いは窒素処理培養基でなされた計数より大であることが見て取れる。窒素で得られた結果は、対照と比較して、かなりの増加を既に示していることが注目される。
【００４０】
したがって、窒素/水素処理で培養された細胞に対して、凍結乾燥に関する菌株の抵抗性の増加が観察され、これは、凍結乾燥に関する菌株の抵抗性に関する培地処理の積極的な効果を立証している。
【００４１】
表２：一日後の、成長培養基の当初処理の関数としての、粉体のCFU/gで表現されたカゼイ菌（Ｌｂ．Casei）のバイオマス（夫々の場合３回の試験の平均値）
【表３】
2008530995.tif 000004
【００４２】
D+60での粉体の得られた計数結果（得られた後６０日間保存）が、引き続き検討されるだろう。それらは、以下の表３に示される。
【００４３】
表３：環境温度で６０日間保存後の、成長培養基の当初処理の関数としての、粉体のCFU/gで表現されたカゼイ菌（Ｌｂ．Casei）のバイオマス（夫々の場合３回の試験の平均値）
【表４】
2008530995.tif 000005
【００４４】
ここでも再度、三つの処理により得られた計数に統計処理がなされた。三つの処理の間に有意な相違が示されている。（ニューマン-クールズ検定で５％）
これらの結果は、窒素/水素で処理された培養基で培養された細胞の計数は、窒素処理培養された細胞の計数と比較してより高いこと、また窒素処理培養された細胞の計数もまた、対照で得られた計数よりも、有意に高いことを示している。
【００４５】
凍結乾燥に関する抵抗性に関して、窒素及び窒素/水素による菌株成長培養基の当初処理の積極的効果が確認され、そして、保存中に増幅されることさえ明確に結論付けられるといってよい。このことは、凍結乾燥に関する菌株の抵抗性及び保存中のそれの抵抗性に関して、接種段階自体以前の成長培養基自体のＥｈを変化させるガスの使用の利点を示している。
【国際調査報告】
2008530995.tif 000006
2008530995.tif 000007
2008530995.tif 000008
2008530995.tif 000009
2008530995.tif 000010
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