(57)【要約】  ヒルログペプチドの新規合成方法が発明された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの２−クロロ−トリチルハンドルを具備したペプチド−樹脂共役体であって、
【化１】
2008517018.tif 000009
ここで、Ａ＝Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝ＮＨ2−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−であり、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ９はアミノ側鎖保護基であり、Ｒ１は不溶性の固相であるペプチド−樹脂共役体。
【請求項２】
前記固相は高分子であり、７００より小さなメッシュサイズ（US Bureau of Standards）を有しており、好ましくは５０乃至６００メッシュのメッシュサイズを有している請求項１に記載の共役体。
【請求項３】
Ｒ２はペンタメチルジヒドロベンゾフラニル、アダマンチルオキシ−カルボニル又はイソボルニルオキシカルボニルであり、Ｒ９はｔｅｒｔ．ブチル又はその誘導体であり、Ｒ３乃至Ｒ８は酸置換活性な保護基であることを特徴とする請求項１に記載の共役体。
【請求項４】
Ｒ２はＰｂｆであり、Ｒ４乃至Ｒ９は酸置換活性な保護基であって、少なくとも５０％のトリフルオロアセティックをそのため又はその上に必要とすることを特徴とする請求項３に記載の共役体。
【請求項５】
Ｒ３はトリチルであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７及びＲ８は第３級ブチルであることを特徴とする請求項４に記載の共役体。
【請求項６】
Ｒ９は第３級ブチルであることを特徴とする請求項５に記載の共役体。
【請求項７】
Ｎ−末端のＢｏｃ基は、強酸性条件下で除去可能な別の保護基によって置換されることを特徴とする請求項１に記載の共役体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗凝血薬ペプチドであるビバリルジン（bivalirudin）、いわゆる‘ヒルログ（hirulog）’、の固相ペプチド合成の改善された方法に関する。本発明は、さらに、樹脂に結合し、保護されたままのペプチドを具備した各々のペプチド−固相共役体生成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビン阻害剤は、有望な抗トロンビン剤とみなされている：トロンビンによるタンパク質分解処理は、血液凝固の制御における中枢である。吸血ヒル Hirudo medicinalis 由来の強力な臨床トロンビンペプチド阻害剤であるヒルジンは、６５個のアミノ酸からなる。
【０００３】
ヒルジンのアミノ酸位置４５乃至６５番目のペプチドセグメントのより短いペプチドアナログ、いわゆるヒルログは、生命を脅かす状態である血栓症の治療に有効であることが証明されている。
【０００４】
Okayama et al.（非特許文献１）及び Steinmetzer et al.（非特許文献２）は、Ｗａｎｇ樹脂上における種々のヒルログの固相合成を案出しており、それは、ｐ−ベンジルオキシ−ベンジルアルコールラジカルへとエステル化された樹脂へのＣ−末端Ｆｍｏｃアミノ酸のエステル結合を用いている。Ｗａｎｇ樹脂は、濃トリフルオロ酢酸を用いたペプチドの樹脂からの切断を必要とし、そのために樹脂の切断は、それに付随した、ペプチドの包括的な（global）脱保護を意味する。
【０００５】
Ｗａｎｇ樹脂からの酸分解的切断は、強酸性条件下で適用され、酸分解中のスカベンジ試薬の使用にも拘わらず、Ｔｒｐ残基の望ましくないアルキル化を副反応として必然的に招くとして知られている（非特許文献３）。特に、Ｃ−末端のＴｒｐは、このような副反応を被りやすい（非特許文献４）。アルキル化は、Ｗａｎｇ樹脂リンカーのフェノキシ部位から生成される芳香族カルベニウムイオンによってもたらされる。−ヒルログはＴｒｐ残基を含まないが、Ｃ−隣接部位にはＴｙｒ残基を具備している。我々は、Ｗａｎｇ樹脂からの切断に際して、このＴｙｒ残基も生成物の純度に負に影響する思いもよらないアルキル化を同程度に被りやすいことを初めて見出し、またここに報告する。
【非特許文献１】1996, Chem. Pharm. Bull. 44:1344-1350
【非特許文献２】1999, Eur. J. Biochem. 265:598-605
【非特許文献３】Giraud et al., 1999,  J. Peptide Science 5:457-461
【非特許文献４】Atherton et al., 1988, Tetrahedron 44:843-857
【発明の開示】
【０００６】
従来技術の不都合を欠いた各ヒルログの別の又は改善された合成方法を案出することは、本発明の目的である。
【０００７】
この目的は、本発明で案出されたペプチド−樹脂共役体及びそれぞれの合成方法によって解決される。
【０００８】
本発明によると、ペプチド−固相共役体を脱離及び脱保護して、最終的にペプチド、好ましくは、式 Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ のペプチドを生成するための方法が案出される。前記のペプチド−固相共役体は、式Ｉの２−クロロ−トリチルハンドルを具備しており、
【化２】
2008517018.tif 000002
【０００９】
ここで、Ａ＝Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝ＮＨ2−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−であり，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ９は、アミノ側鎖保護基であり、Ｒ１は不溶性の固相である。
【００１０】
上記のペプチド配列は、ヒルログ−８のものである（欧州特許第４８９０７０号明細書に記載）。それは、天然の強力なトロンビン阻害剤であるヒルジン（６５ｍｅｒ）の２０ｍｅｒ２価誘導体である。それは、ヒルジン由来の機能的に重要な結合された構造モチーフから構成されている：活性サイト結合モチーフＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏとヒルジン由来のＣ−末端配列Ａｓｎ9 乃至Ｌｅｕ20 とがテトラグリシンスペーサで架橋されている。定義の目的で、ここでは、‘−Ｄ−Ｐｈｅ−’はＤ−フェニルアラニンを意味し、所定のアミノ酸、この場合はＰｈｅ、の天然のＬ−鏡像異性体と対比される。
【００１１】
任意に、本発明の更なる目的において、式Ｉ中のラジカルＡは、以下の何れであってもよい：
１．Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２−、ここで、Ｘ１は、任意に、０乃至２００、好ましくは１乃至１００、最も好ましくは２乃至５０アミノ酸の個々のアミノ酸側鎖上に保護基を具備したペプチジル部位であり、Ｘ２は、単一の、任意に側鎖又はＣ−末端を保護され、−Ｏ−又は−ＮＨ−を介して固相に結合されたアミノ酸残基であり、好ましくは、Ｘ２はＴｒｐ、Ｃｙｓ又はＡｒｇではなく、ＰはＨ（即ち−ＮＨ２を与える）又は保護基であり、好ましくはその保護基は直交性の保護基であるか下で定義されるような強酸性条件下で除去可能な保護基であり、より好ましくはその保護基はＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｄｄｅ、Ｎｐｓ、Ａｌｌｏｃ、Ｚからなる群より選択される保護基である。
【００１２】
上記に従って、残基Ｘ２は、その側鎖にアミノ官能基が含まれている（例えば、リシン、ホモリシン、ノルリシン、又は、３−リシンのような構造異性体）場合には、１つのアミノエーテル官能を介してのみ樹脂に結合されてもよいことは、理解されるべきである。対照的に、−Ｏ−結合は、側鎖又はＣαカルボキシ基又は側鎖のヒドロキシ官能を介したハンドル又はリンカーへのエステル又はエーテル結合の何れであってもよい。
【００１３】
２．Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＰ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２−
３．Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ又はＰ−Ｘ１−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２
４．Ａ＝Ｐ−Ｘ１−［Ｇｌｙ］0-3−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ又はＰ−Ｘ１− −［Ｇｌｙ］0-3−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２
５．Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＰ−Ｘ１−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２
Ｐ、Ｘ１、Ｘ２の定義は、Ａ及び生成するペプチド−固相共役体についての全てのこれらの可能な態様に対して、構成的に適用される。
【００１４】
我々は、Ｗａｎｇ樹脂からの切断に際して、前記のＴｙｒ残基は、生成物の純度に負に影響する思いもよらないアルキル化を同程度に被りやすいことを初めて見出し、またここに報告する。ヒルログの場合は、このような修飾は、Atherton et al.によりＴｒｐに対してなされた観測と類似した近接効果によって促進されると思われる；しかしながら、例えばアルギニンの脱保護の場合におけるＴｙｒのアルキル化は、一般的な問題としては決して報告されておらず、これはＴｒｐの場合と際立って対照的である（Atherson et al., 1989, Solid phase synthesis: A practical approach, IRL press, Oxford）。
【００１５】
さらに、Athersonの観測は、Ｃ−末端のＴｒｐのみに関係しており、一方、Ｃ末端からＮ末端方向に合成されたヒルログペプチド中のＴｙｒ残基は、近接した（juxtaproximal）、つまり、成長するペプチド鎖のＣ−末端の隣の、最後から２番目の残基に過ぎない。後知恵では、理論に束縛されることを望むことなしに、このことは、フェノキシ部位は平均的なアリール化合物よりも求電子置換における反応性が高いことによって説明されるかもしれない。確かにフェノールは、樹脂からの酸分解的切断においてスカベンジ剤として使用される（D. King et al., 1990, Int. J. Peptid Protein Res., 36, 255）。それでもなお、前記の副反応は、これまで当業者によって記載又は示唆されたことはなく、今日まで、末端のＴｒｐのみがこれに関して脆弱だと信じられてきた。結果として、Ｗａｎｇ樹脂は、従来技術において、最近まで、ヒルログ合成のために広く用いられてきた。
【００１６】
本発明のペプチド−固相共役体は、当技術でよく知られ、Bodanszky et al., Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989によく記載及び参照されているルーチンの固相法により合成されうる。必然的に、固相への接着の酸置換活性のため、このような合成戦略は、固相合成中におけるカップリング反応を実施するために、Ｆｍｏｃ化学を用いる。最後の末端Ｄ−Ｐｈｅ残基のみが、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃの何れかにより保護されてもよい。このようなＦｍｏｃ保護は、例えば２０％ピペリジン又は他のＦｍｏｃ脱保護塩基試薬を用いた標準的な処理により樹脂上にありながら除去されて、本発明の、但しフリーのＮ−末端アミノ基を有している、ペプチド−樹脂共役体を生成してもよい。しかしながら、Ｎ−末端を早期にむき出しにする早期のＦｍｏｃ脱保護は、酸分解か又は特には強酸性条件下における脱離に伴う包括的な脱保護かによる樹脂からの脱離に晒されたときに、前記のフリーのＮ−末端Ｄ−Ｐｈｅ残基を遥かにラセミ化させやすくするであろう。従ってより好ましくは、別途のＦｍｏｃ脱保護工程の必要性を避けるため、末端Ｄ−Ｐｈｅ残基は、Ｂｏｃ保護されるか又は強酸性条件で容易に除去されうる別の保護基を用いて保護される。はっきりさせるために、これは、例えばＺ−（ベンジルオキシ−カルボニル−）保護基を含んでおり、とりわけ本文脈で定義されるような強酸性条件によって切断されてもよい。水素化分解的又はＨＦに活性化された切断は、より効率的であることが知られているが。重ねて、末端Ｄ−Ｐｈｅ残基上での別途のＦｍｏｃ脱保護工程であって、Ｎ−末端を早期にむき出しにし（フリーのａ−アミノ基で終端させ、それは、式ＩにおいてＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−.. 又はＮＨ2−Ｄ−Ｐｈｅ.. として同等に表示されてもよい）、フリーになったＤ−Ｐｈｅを例えば酸分解による樹脂からの脱離に伴う包括的な脱保護に供されたときにラセミ化を被りやすくする工程は、本発明の別の可能な態様ではあるが、選択肢としてそれほど良くはない。前記の単一工程での脱離又は包括的な脱保護に伴った切断は、例えば水性ＴＦＡ及びＤＣＭなどの溶媒混合物中で実施されてもよい。
【００１７】
一般的に、本発明によると、式Ｉの保護されたペプチドを、アミノ酸側鎖の及び好ましくはＮ−末端保護基の脱保護又は包括的な脱保護にと同時に又はその前に最初の工程において樹脂から切断することが可能である。後者の態様では、それは、最初に樹脂からの切断のために弱酸性条件へと、次に全ての残存した保護基の切断（包括的な脱保護）のために強酸性条件へと、順に供される。
【００１８】
ともかく両条件において、特に２−クロロ−トリチル樹脂（略してＣＴＣ樹脂）、及び例えば市販の、厳密に類似した４−メトキシ−若しくは４−メチル−トリチル−樹脂又は本発明で同程度に若しくはより少ない程度にクレームされた他の樹脂は、切断及び／又は脱保護の際に近接したチロシン残基の好ましくない修飾を避けるのに良く適している。それは、チロシンが樹脂からの切断の際に同時に脱保護されるときに、近接したチロシン、即ちＣ−末端上の最後から２番目のチロシンの不所望なアルキル化を妨げる。ハロゲノ置換基のおかげで、任意に、ＣＴＣ樹脂は、ほとんどの側鎖及びＮ−末端保護基が通常では影響されず、従って別々の脱保護過程を時間的に隔離することによってアルキル化が妨げられる条件である非常に穏やかな酸性反応条件下、例えばジクロロメタン（ＤＣＭ）中の０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中で、保護されたままのペプチド及びチロシンの樹脂除去をもたらすことを可能とする。以下では、固相又は樹脂の最も好ましい態様として特にＣＴＣ樹脂に関して参照される態様は、本発明において記載及びクレームされた他の樹脂を暗黙に参照する。
【００１９】
定義により、本発明によると、強酸性条件は、弱酸性条件とは対照的に、溶媒中の少なくとも５０％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を適用することを意味する。さらに、逆に、除去に強酸性条件を必要とする保護基は、最低でも８０％のＴＦＡにより除去されうる保護基である。したがって、ＨＦなどのより強い酸を必要とする保護基は、本発明の文脈において上述した定義の範疇には入らない。
【００２０】
弱酸性条件は、０．０１％（ｖ／ｖ）乃至＜５０％のＴＦＡを有していること、好ましくは０．１％乃至３０％のＴＦＡを有していることによって定義される。
【００２１】
何れの方式でも、本発明のペプチジル部位は、近接チロシンの不所望なアルキル化の予想外な不存在を顕著に示し、それは、ジケトピペラジン副反応、樹脂からの切断の際に起こり、最後の２つのＣ末端アミノ酸の性質に特に感受性であることが知られている他の可能な副反応を完全に欠いている。理論に束縛されることを望むことなしに、ＣＴＣ樹脂ハンドルの隣の、ペプチド鎖の２番目のチロシンは、芳香性フェニル部位を安定化する疎水性スタッキング
を示すのにちょうど最適な距離及び間隔にあり、例えば、ジケトピペラジン形成への前触れであるサイクリックな配置を避けると推測される。
【００２２】
ＣＴＣ樹脂のローディングは、ジフェニル−２’−クロロフェニル−クロロメタン誘導体（従ってＣＴＣ、クロロトリチルクロライドの略）の求核置換によって通常起こり、また効果的であることが知られている。１つの選択肢として、事前にローディングされたＦｍｏｃ−アミノ酸−ＣＴＣ樹脂が市販されている。
【００２３】
保護基とそれらの化学は、当技術において、さらによく知られ、よく参照されている（先のBodanszkyを参照のこと）。個々のアミノ酸側鎖の保護にはＲ２乃至Ｒ９の別々の保護基が適しており、別個の化学部位は別個の保護基を要することは、もちろん述べるまでもない。例としては、例えば、ヒスチジンは慣例的にはトリチル又はＢｏｃを用いて保護されることができ、リシンはＢｏｃ又はアリルオキシカルボニルによって保護されることができ、アスパラギン酸塩（ａｓｐａｒｔａｔｅ）はｔｅｒｔ．ブチルエステル又はアリルエステルとして保護されることができる。スレオニン、セリン及びチロシンは、通常、ｔｅｒｔ−ブチルエーテルとして保護される。アルギニンの保護は、以下でさらに議論されるだろう。脱保護の別個の方式が適用されてもよく、例えば、アリル保護基は、Ｐｄ触媒還元的アシル転移反応によって、苦労して除去される。Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）基は、効率的な除去のために水素化分解を必要とするため、あまり都合良くは用いられていない。好ましくは、Ｒ２乃至Ｒ９の保護基は、酸置換活性であり、ここで‘置換活性’とは、弱酸性又は強酸性の何れかの条件下、５時間までの間ＤＣＭ中でインキュベートされたときにおける、前記各保護基の少なくとも２０％の切断効率を意味する。より好ましくは、本発明によると、Ｒ２乃至Ｒ９の保護基は、除去され、上で定義された強酸性条件下でのみ、つまり強酸性条件下での酸分解によってのみ除去可能である。
【００２４】
Ｒ１は、不溶性の、通常は高分子の固相であり、例えば、架橋ポリスチレン／１％ジビニルベンゾール共重合体である。典型的には、本発明の実施に厳密に必要というわけではないが、このような固相Ｒ１は、当然、式Ｉ中で明示的に示されているもの以外にペプチドラジカルＡによって機能化されたさらなる複数の２−クロロ−トリチル部位を表すであろう。より重要なことに、Merrifiledによって最初に案出された固相合成において有用であるためには、高分子固相は、コロイド状の振舞いではなく、容易に濾過可能又はペレット化可能な十分なサイズの粒子を与えるための最小の粒子サイズを有するであろう。ＣＴＣハンドル若しくはリンカー（Bayerの４−カルボキシトリチルリンカー、Bayer et al, 13th American Peptide Symposium, Hodges et al., Ed., ESCOM, Leiden, 1994, page 156 等）により直接的に誘導体化されたポリスチレン基質高分子、又は、基質高分子の個々のベンゼン部位が２−クロロ−トリチル官能の一部を形成するように誘導体化されている場合は別として、純粋な若しくは混合されたＰＥＧ樹脂（例えばＴｅｎｔａｇｅｌ）又は任意にハイブリッド若しくはグラフト樹脂、例えば２−ＣＴＣリンカー（Bayerリンカー等）などのさらなる他の基質高分子は、リンカーをポリスチレン基質高分子に直接的に反応させる代わりに、ＰＥＧスペーサを介してポリスチレン基質高分子上にグラフトされている。ＰＥＧを樹脂中に含ませることは、ローディング容量が問題となるかもしれないが、より両親媒性の樹脂を、及びしたがって単一工程での脱離及び脱保護のための例えばＤＣＭ／ＴＦＡ中でのより優れた取り扱いを提供する。−もちろん厳密に不溶性のＰＥＧ樹脂が存在することは、注意されるべきである。しかしながら、Bayer, et al., Nature 1972, vol. 237, page 512f に記載された技術は、完全に溶液中で行われながらも固相の分離原理を模倣し、ペプチド樹脂共役体が可溶性のままであり、また、均一な一相系を提供するＰＥＧ高分子媒介技術を記述した。本文脈における好ましい意味においては、このような樹脂の振舞いは、ミクロスコピックなレベルでの精密又は限外濾過技術により、
素早く単純なサイズ基準の分離を実質的に可能にするため、本定義により‘不溶性’に含まれる。より好ましい意味では、‘不溶性’は、ペプチド合成のための所定の溶媒系において、一方の相は完全な固体の懸濁された相である二相系を指す。
【００２５】
好ましくは、固相は、７００メッシュより小さなメッシュサイズを有している（メッシュサイズは US Bureau of Standards により定義されており、例えば、Rompps Chemie-Lexikon, 7. Auflage, 1973, Franck’sche Verlagshandlung, W. Keller & Co. Stuttgart/Germany から入手可能）。
【００２６】
好ましくは、２−クロロ−トリチルにより機能化された本発明の固相は、５０乃至６００メッシュ（US Bureau of Standards の定義による）の、より好ましくは６０乃至４００メッシュの、最も好ましくは１００乃至３００メッシュのメッシュサイズを有している。
【００２７】
本発明のチロシンは、種々の保護基、例えば、ｔｅｒｔ．ブチルエーテル又はＺ−又は、より好ましくは、２−ブロモ−Ｚエステルによって保護されてもよい。２−クロロ−トリチル又は４−メトキシ若しくは４，４’−メトキシトリチル基などのトリチルアルコール保護基も同様に使用可能である。好ましくは、Ｒ９はトリチル又はｔｅｒｔ．ブチル保護基である。より好ましくは、Ｒ９は第３級ブチル（ｔＢｕ）保護基であり、即ち、チロシンの側鎖がｔｅｒｔ．ブチルエーテルへと修飾される。そのｔＢｕ基は、強酸性条件下でのみ効率的に除去される。
【００２８】
好ましくは、単独で、及び、特には、さらに好ましい態様と組み合わせて、アルギニン保護基Ｒ２は、上で定義されたような強酸性条件下でのみ切断されるペンタメチルジヒドロベンゾフラニル−（Ｐｂｆ）、アダマンチルオキシ−カルボニル及びイソボルニル−オキシ−カルボニル、ペンタメチレンクロマンスルホニル（Ｐｍｃ）及びその４−メトキシ−２，３，５，６−テトラメチル同族体（Ｔａｒｔ）又はＢｏｃからなる群より選択される。より好ましくは、Ｒ２は、Ｐｂｆ、Ｐｍｃ、Ｍｔｒであり、最も好ましくはＰｂｆであり；強酸性条件下における側鎖の包括的な脱保護に際して、通常は水性溶媒中、Ｐｍｃ、Ｍｔｒ、及び特にはＰｂｆについては、脱保護されたチロシンの傍らでのアルキル化（bystander alkylation）は観測されない。Ｐｂｆの切断効率は、これまでで最も高い。
【００２９】
Ｇｌｕ，Ａｓｐのためのカルボキシ−保護基は良く知られており、例えば、Ｍｐｅ、Ｏ−１−アダマンチル、Ｏ−ベンジル、及び、一般にはあまり使用されないが、単純なアルキルエステルさえも使用されてよい。容易さのため、典型的には及び好ましくはｔｅｒｔ．ブチル基が、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８の保護基のために独立して使用される。
【００３０】
保護基Ｒ３は、ヒルログ−８中の、副反応としてaspartimideを特に形成しやすいジペプチド配列である上記の配列Ｇｌｙ−Ａｓｐ中に存在するため、最も重要な保護基であるかもしれない。aspartimide形成は、保護されたペプチドにおいて、線状合成中の各々の次のカップリングサイクルに亘って小程度（０．１乃至０．５％）で生じ、最終的には累積効果を有していてもよい。重ねて、トリチル保護基又はその２−クロロ及び４−メチル若しくは４−メトキシ誘導体が好ましいが、同様にアダマンチル保護基も使用されうる。最も好ましくは、トリチル保護基が用いられる。
【００３１】
側鎖とＮａ保護されたアミノ酸との両方をカップリングさせる代わりに、Ｎａ−アルキル保護されたジペプチドモジュールが線状合成中のカップリングに使用されてもよく；このようなジペプチドは２次構造を破壊する効果を有しており、合成の収率及び純度を容易にすることもまた注意されるべきである。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−（Ｎ−Ｈｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−（Ｎ−Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨは、EMD Biosciences (Novabiochem)から市販されている。このようなＮ−アルキル基は、本発明の意味では、保護基とはみなされず、したがってそれらの使用又は存在は任意であり、式Ｉの構造から除外されないことは、理解されるべきである。
【００３２】
各請求項中で本質的に述べられているように、式Ｉのペプチド共役を脱離及び脱保護する好ましい方法では、第１に保護されたペプチドをＣＴＣ樹脂から切断するための弱酸性条件下での酸分解を行い、第２に残存した保護基を強酸性条件下で除去する２工程の連続スキームが適用される。
【００３３】
この理由は、式Ｉのペプチド−固相共役体の単一工程における包括的な脱保護が、完全に脱保護された生成物と疎水性の共役した抽出物との相反する溶媒の要求、生成物の純度及び収量に負に影響する妥協の必要性に見舞われたからである。逐次的で段階的なアプローチは、このような固有の欠点を排除し、別の反応をより良く制御することを可能とし、したがって最適な収率を可能とする。本発明によると、それは、副反応としてのジケトピペラジン形成を完全に抑制するという驚くべき効果をさらに享受する。
【００３４】
したがって、上で定義されたように、式Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕのペプチドを与える式Ｉのペプチド−固相共役体の脱離及び脱保護の方法であって、第１工程において、保護されたペプチドが弱酸性条件下、好ましくは極性非プロトン性溶媒中０．１乃至１０％ＴＦＡを用いた処理により２−クロロトリチルハンドルから除去され、第２工程において、上で定義された強酸性条件下で保護基が除去されることを特徴とする方法が発明された。
【００３５】
好ましくは、第１工程は極性非プロトン性溶媒、つまりジクロロメタン中で実施される。これは、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）などの他の溶媒と対照的に、このような反応を行うための最良の溶媒である。溶媒中、特には第２工程のための溶媒系中において、チロシンの芳香環の不所望なアルキル化を防ぐために、反応液に対して０．１乃至１０％（ｗ／ｗ）の量で存在しているスカベンジ試薬を含むことも必須ではないが可能である。このようなスカベンジャーは、保護基の除去に際して生成する反応性のアルキル−カルベニウムイオン中間体（第１工程の切断反応中で既に少量生じていてもよい）を妨害する。
【００３６】
スカベンジャーの例は、例えばチオアニソール（第２の酸分解促進効果をも有する−このような２次的な役割及びアニソールの代替は、Bodanszky M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 23:287中で議論されている）である。このような酸分解効果を有していないスカベンジャーの他の例はフェノールであり、及び／又は、トリアルキルシランが使用される（Stierandova et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 31-38）。
【００３７】
好ましくは、樹脂からの切断又は脱離の第１工程の後で、反応はピリジンと混合することにより直接的にクエンチされ、続いて第１工程の生成物を水と混合することにより回収する。このようにして、生成物は最もシンプル且つ効率的に回収される。
【００３８】
本発明の更なる態様では、本質的には式Ｉのペプチド−固相共役体がクレームされるが、トロンビン切断サイトである−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−が標準的なペプチド結合ではなく化学的に変換された擬似切断結合（pseudoscissile bond）、即ち‘ｐｓｉ’結合（アミド結合の置換は、大括弧中に示され頭字語‘ｐｓｉ’が前に付けられた複数の原子によって表される、Rudinger et al., Drug Desgin Vol.II, Ed. Ariens, E., Academic Press, New York, p.319 (1971) 参照）であることのみで異なっている。より好ましくは、このようなｐｓｉ置換は、Ａｒｇ［ｐｓｉＣＨ2ＮＨ］Ｐｒｏ−（Kline, T. et al., 1991, Hirulog peptides with scissile bond replacements resistant to thrombin cleavage, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 1049-1055）である。最も容易には、このようなｐｓｉ結合は、例えば、固相合成中に、成長中の共役ペプチドと既成のＦｍｏｃ保護されたｐｓｉ−ペプチドとを直ちに通常通りにカップリングさせることによって導入される。
【００３９】
上述した態様及び方法を、前記ＣＴＣ樹脂以外であって、それでもなお、上で定義されたような弱酸性又は穏やかな酸性条件下で、ペプチド部位を樹脂から除去することを同様に可能にするような樹脂部位を具備したペプチド−固相共役体に拡張することは、本発明の更なる目的である。以下で定義されるような２−ＣＴＣ及び関連するトリチル並びに４−メトキシ−及び４−メチル−トリチル樹脂は、それでもなお、上記にしたがって、本発明の最良の形態であるとみなされる。
【００４０】
更なる目的として、式Ａ−Ｗのペプチド−樹脂共役体であって、ここでＡは、Ａについて上で定義された態様の何れであってもよく、任意に個々のアミノ酸側鎖保護基を具備しており、Ｒ２乃至Ｒ９は、存在するときには上のように定義され、Ｗは、好ましくは不溶性であり、弱酸性条件下でペプチド部位を除去することを可能とし、以下の樹脂ハンドル又はリンカーを具備した固相又は固相コンポジットであるペプチド−樹脂共役体が案出される。
【００４１】
ａ．式II、
【化３】
2008517018.tif 000003
【００４２】
但し、Ａは、残基Ｘ２を含んでいる場合には常に−Ｏ−を介して前記ハンドル又はリンカーに結合されるという条件付きであり、
また、ここで、Ｒ’’’は固相であり、Ｒ’’1、Ｒ’’2、Ｒ’’3 は、独立に、水素、４−若しくは４’−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）又は４−若しくは４’−（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）であり、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみが水素であってもよいという条件付きで同じ又は異なっていてもよく、Ｒ’’2 は、任意に、Ｒ’’1 がＨであるという条件付きで２−Ｃｌであってもよく、さらに及び最も好ましくは、式IIのハンドル又はリンカーは２−クロロ−トリチル、４−メトキシ−トリチル、４，４’−ジメトキシトリチル、４−メチルトリチルからなる群より選択される、
ｂ．又は式III、
【化４】
2008517018.tif 000004
【００４３】
（アミノ−又はヒドロキシ機能化樹脂から、Bayer の４−カルボキシトリチルリンカーを用いたアシル化によって誘導されてもよい、上記 E. Bayer 参照）但し、Ａは、残基Ｘ２を含んでいる場合には−Ｏ−を介して前記ハンドル又はリンカーに結合され、Ｒ’’’は先の通り定義されるという条件付きであり、
ｃ．又は式IV、
【化５】
2008517018.tif 000005
【００４４】
ここで、Ｒ’’’は固相又は高分子樹脂であり、Ｒ’’1、Ｒ’’2、Ｒ’’3 は、独立に、水素、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ4アルコキシであり、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみが水素であってもよいという条件付きで同じ又は異なっていてもよく、また、ＬはＡ（Ｌ＝Ａ）であるか、又は、Ｌは式Ｖのものである。
【化６】
2008517018.tif 000006
【００４５】
さらに好ましい態様では、樹脂ハンドルは式VIのものであり、ラジカルＲ’’’、Ｒ’’1、Ｒ’’2 に対する上記の定義が適用される。
【化７】
2008517018.tif 000007
【００４６】
重ねて、更により好ましいのは、樹脂又は樹脂ハンドルが式VIIのものであり、ラジカルＲ’’’、Ｒ’’1、Ｒ’’2 に対する上記の定義が適用されることである。
【化８】
2008517018.tif 000008
【００４７】
更により好ましい態様では、任意に残基Ｘ２を含んだＡが−Ｏ−を介して式VIIの前記ハンドル又はリンカーに結合される場合、Ｒ’’1、Ｒ’’2 は、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみが水素であってもよいという条件付きで、独立に、水素、メチル又はメトキシであり、また、Ｘ２を含んだＡが、−Ｎ−を介して式VIIの前記ハンドル又はリンカーに結合されル場合には、独立にメチル又はメトキシであり、好ましくはメトキシである。更により好ましくは、Ａは、Ｘ２を具備している場合には、−Ｏ−官能を介してハンドルに結合されており、Ｒ’’1 は水素であり、Ｒ’’2 はメチル又はメトキシであり、好ましくは、Ａは樹脂又は樹脂ハンドルである。最も好ましくは、Ｒ’’2 はメチルである。
【００４８】
樹脂又は樹脂ハンドルコンポジット体は、原則として、例えば、Merrifield によってヒドロキシベンジル−フェニルインテグラル（integral）リンカー部位とともに、又は Wang によってヒドロキシベンジル−ｐ−ベンジルオキシ部位とともに使用されるポリスチレン−ジビニルベンゼンベンゼン樹脂や、例えばより酸置換活性なリンカーがさらにグラフトされてもよい部位などの、合成用に用いられるあらゆる樹脂であってもよく、又は、代わりに、後者のリンカーは、樹脂にインテグラルに（integrally）若しくは直接的に結合されてもよい。原則として、合成における用途のための固相樹脂は、固相コア材料の一部である少なくとも１つのインテグラルリンカー又はハンドルを必然的に具備しており；このようなリンカー又はハンドルは、固定された保護基とみなされてもよい（Guiller et al., Chem. Rev.100,2091-2157, 2000）。例としては、例えば、Ｓｉｅｂｅｒ樹脂、関連したキサンテニル型ＰＡＬハンドル樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂、２’−クロロトリチルなどの種々のグラフトハンドルとともに利用可能なｔｅｎｔａｇｅｌ系 Ｎｏｖａｓｙｎ ＴＧ（Novabiochem, Merck Biosciences, Germany）などのより複雑なＰＥＧ−グラフトポリスチレン樹脂、又はシリカゲルなどのマトリクス材料上に機能性ハンドルをグラフトすることにより構成された樹脂である。好ましくは、樹脂がトリチル樹脂又は樹脂ハンドルであるときには、このような樹脂は４−メトキシ又は４，４’−ジメトキシトリチル樹脂である。本発明で使用される樹脂は、標準的なメッシュサイズ、つまり約５０乃至５００メッシュ、より好ましくは１００乃至４００メッシュである。式IVに示されている樹脂又は固相Ｒ’’’は、Ｒ’’’の構成部分とみなされるべきあらゆる種類の化学的に不活性なアルキル、アルキルオキシ、アリールオキシ又はアルキルエステルスペーサー又はリンカーによって、式IV乃至VIIにおいて特定されているハンドル部位へと結合されてもよい架橋された高分子マトリクス材料を具備していると解釈されるべきである。しかしながら、樹脂材料の化学的性質、及び、特にはハンドル基の化学的性質は、樹脂からの切断の条件に影響を与えるだけでなく、未だ不十分にしか理解されていない仕方で、カップリング、及び、特にはラクタム化反応の合成効率に影響するかもしれないことは注意されるべきである。樹脂上段階での成熟ペプチドの収率は、用いられる樹脂又は樹脂ハンドルのタイプに依存して異なるかもしれない。この理由のため、本発明に係る好ましい態様では、樹脂又は樹脂ハンドルは、クレーム中に記載された式IVの、より好ましくは式VIの、最も好ましくは、クレーム中に詳細に記載された式VIIのものである。このような樹脂又は樹脂ハンドルの例は、（４−メトキシフェニル）−メチル−及び（４−メチルフェニル）−メチル−ポリスチレン（Atkinson et al., 2000, J. Org. Chem. 65, 5048）であり、ペプチド部位へとＯ−又はＮ−結合した樹脂及びそれらの各々のＰＥＧ−樹脂誘導体である。更なる例は、例えば、酸置換活性なＨＭＰＢ−ＭＢＨＡ又はＨＭＰＢ−ＢＨＡ樹脂（Sieber et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28, 6147）、酸置換活性Ｒｉｎｋアミド樹脂又はＲｉｎｋ酸樹脂（Rink et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28,3787）である。用語‘酸置換活性’は��周囲温度のジクロロメタン中２乃至１０％ＴＦＡにおける、少なくとも１時間での本質的に定量的な切断に適用される。驚くべきことに、ジフェニル−メチル構造コアモチーフを有しているこのような好ましい樹脂を使用することは、線状合成及びラクタム化の間のより効率的なカップリング反応を可能とし；著しくは、このような樹脂は、例えばトリチル樹脂上での効率的なカップリングのために必要とされる標準的な４０℃と比較してより低い１５乃至２５℃の反応温度をも可能とする。
【００４９】
実験
１．Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｏ−２−ＣＴＣ（欧州特許第４８９０７０号明細書に記載の保護されたヒルログ−８、カルボキシ末端において２−ＣＴＣ樹脂へとエステル結合で共役）の合成
全ての試薬は、EMD Biosciences（Madison, WI/U.S.A.; Novabiochem-brand）から入手された。Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨによってあらかじめローディングされたポリスチレン系２−ＣｌＴｒｔ（ＣＴＣ）樹脂（Cbl Patras, ギリシア）は、基質高分子に関しては１００乃至２００メッシュであり、あらかじめローディングされた最終的なＣＴＣ樹脂生成物に関しては６０乃至２００メッシュであった。ローディング密度は、約０．６０ｍｍｏｌ／ｇであった。個々のアミノ酸は、Ｆｍｏｃアミノ酸か、又は、Ｄ−Ｐｈｅの場合には容易にＢｏｃ保護されたＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅかの、何れかとして入手された。カップリングは、ジクロロメタン／Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中、Ｈｕｎｉｇ塩基（ジイソプロピル−エチルアミン、ＤＩＥＡ）の存在下で、ＴＣＴＵを用いて実施された。２．５当量が用いられたＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）のカップリングを除いて、通常は、１．５当量のＦｍｏｃ又はＢｏｃ保護されたアミノ酸が使用された。同様に、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）の場合は、６０分（３０℃において）の標準的なカップリング反応時間が、９０分に延長された。カップリング効率の工程管理は、Ｋａｉｓｅｒ試験又はクロラニル試験によって達成された。
【００５０】
Ｆｍｏｃの脱保護は、間にＮＭＰを用いた適切なすすぎを伴いながら、３０℃でのＮＭＰ中２０％ピペリジンの３乃至４サイクルによって実施された。
【００５１】
２．Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
実験１で生成された４８．３ｇの樹脂（約１００ｍｌの膨潤した樹脂）からの切断は、それぞれ、１５℃におけるジクロロメタン中の２％（ｗ／ｗ）ＴＦＡ、１％（ｗ／ｗ）トリエチルシラン（ＴＥＳ）の３サイクルによって成し遂げられた。反応は、窒素バブリングによって攪拌され；反応の色はサイクル毎に黄色／橙色から茶色系に変化した。各サイクルの後、切断反応は、全反応液を希ピリジン（ピリジン／エタノール １：９（ｖ／ｖ））中へと注ぐことによって直接的にクエンチされた。樹脂は、その後、フリットを用いた濾過によって除去され、次のサイクルに供された。全ての濾液は、溜められ、真空下（ＲｏｔａＶａｐ）で橙色の半液体へと濃縮され、ＤＣＭで洗浄され、４００ｍｌの再蒸留水中で再び懸濁され、室温で攪拌され、濾過され、水を用いて洗浄され、乾燥された。収量は、分析品質（〜９０％純度）のわずかに黄色の粉末の２８．８ｇであった。生成物は、ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００５２】
３．包括的な脱保護、ＮＨ２−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨの合成
包括的な脱保護は、切断カクテル（‘ＣＣ’）によって希釈されたＤＣＭ、ＤＣＭ：‘ＣＣ’＝１：１０（ｖ／ｖ）、中で実施された。‘ＣＣ’は、混合比（％ｗ／ｗ）８９：２．５：２．５：５．０：１．０のＴＦＡ／チオアニソール／フェノール／水／ＴＥＳから調合された。実験２からの１ｇの乾燥生成物は、先に述べたように‘ＣＣ’を用いて希釈されたＤＣＭ１０ｍｌに溶解され、室温で５時間攪拌された。生成物は、その後、５０ｍｌのメチル−ｔｅｒｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ、Fluka Chemie, Buchs/スイス）を添加し攪拌しながら水浴中で３０分間０℃へと反応を冷却し、その間に形成された塩析沈殿物を濾過することによって回収された。濾過ケークは、ＭＴＢＥを用いて数回すすがれ、その後室温で乾燥され、ＨＰＬＣによって決定された約５５％の純度の粗生成物０．８ｇを生成する。第２及び第３工程を併せた総収率は、約５５％である。
【００５３】
４．Ｗａｎｇ樹脂上又はＣＴＣ樹脂上の何れかにおけるヒルログ−８又はそのＣ−末端テトラペプチド断片の合成のための比較切断実験及びＬＣ−ＭＳ分析論。
【００５４】
ＨＰＬＣ ＬＣ−ＭＳ分析論を使用して、強酸性条件での樹脂からの切断及び包括的な脱保護に際して、Ｗａｎｇ樹脂の場合は１乃至１０％のペプチド生成物がアルキル化されることが証明され、一方ＣＴＣ樹脂からの切断に際してはこのような修飾は観察されえないことが示されることができた。ＭＳ分析は、チロシル残基へのその修飾をマッピングすることを可能とした。合成手順は上記記載の通り。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月15日(2007.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの２−クロロ−トリチルハンドルを具備したペプチド−樹脂共役体であって、
【化１】
2008517018.tif 000010
ここで、Ｒ１は不溶性の固相であり、また、
Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２−
であり、ここで、Ｒ９はアミノ側鎖保護基であり、Ｘ１はペプチジル部位であり、Ｘ１は任意に０乃至２００アミノ酸の個々のアミノ酸側鎖上に保護基を具備しており、また、Ｘ２は単一の、任意に側鎖又はＣ−末端を保護され−Ｏ−を介して前記固相へと結合したアミノ酸残基であり、ＰはＨであるか又はＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｄｄｅ、Ｎｐｓ、Ａｌｌｏｃ、Ｚからなる群より選択される保護基であるペプチド−樹脂共役体。
【請求項２】
ペプチド−樹脂共役体Ａ−Ｗであって、ここでＡ＝Ｐ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２−又はＡ＝Ｐ−Ｘ１−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−であり、Ｘ１は０乃至２００アミノ酸のペプチジル部位であり、Ｘ１は任意に個々のアミノ酸側鎖上の保護基を具備しており、Ｒ９はアミノ側鎖保護基であり、Ｘ２は、−Ｏ−又は−ＮＨ−を介して固相へと結合し、そして任意に側鎖又はＣ−末端を保護された単一のアミノ酸残基であり、ＰはＨであるか又はＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｄｄｅ、Ｎｐｓ、Ａｌｌｏｃ、Ｚからなる群より選択される保護基であり、また、
Ｗは、樹脂ハンドル又はリンカーを具備した固相コンポジットであり、前記樹脂ハンドルリンカーは、
ａ．式II、
【化２】
2008517018.tif 000011
但し、残基Ｘ２を含んだＡは、常に−Ｏ−を介して前記ハンドル又はリンカーへと結合されるという条件付きであり、
また、ここで、Ｒ’’’は固相、好ましくは高分子樹脂であり、Ｒ’’1、Ｒ’’2、Ｒ’’3 は、独立に、Ｈ、４−（Ｃ1−Ｃ4アルキル）又は４’−（Ｃ1−Ｃ4アルキル）又は４−（Ｃ1−Ｃ4アルコキシ）又は４’−（Ｃ1−Ｃ4アルコキシ）であり、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみがＨであってもよいという条件付きで同じ又は異なっていてもよく、Ｒ’’2 は、任意に、Ｒ’’1 はＨであるという条件付きで、２−Ｃｌであってもよい、
ｂ．又は、式III、
【化３】
2008517018.tif 000012
但し、Ｘ２を含んだＡは、−Ｏ−を介して前記ハンドル又はリンカーへと結合しており、Ｒ’’’は先の通り定義されるという条件付きであり、
ｃ．又は、式IV、
【化４】
2008517018.tif 000013
ここで、Ｒ’’’は先の通りに定義され、Ｒ’’1、Ｒ’’2、Ｒ’’3 は、独立に、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル又はＣ1−Ｃ4アルコキシであり、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみがＨであってもよいという条件付きで同じ又は異なっていてもよく、ＬはＡ（Ｌ＝Ａ）であるか、Ｌは式Ｖのもの、
【化５】
2008517018.tif 000014
ここで、Ｗは０．１％乃至３０％トリフルオロ酢酸の弱酸性条件下でペプチド部位を切断することを可能にする、
の樹脂ハンドル又はリンカーであるペプチド−樹脂共役体。
【請求項３】
Ｗは、定義された式IIのものであるか、又は式VI
【化６】
2008517018.tif 000015
のものであって、ラジカルＲ’’’、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の上記の定義が適用されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項４】
Ｗは、式VII
【化７】
2008517018.tif 000016
のものであって、ラジカルＲ’’’、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の上記の定義が適用され、また、Ｒ’’1、Ｒ’’2 は、独立に、Ｒ’’1、Ｒ’’2 の一方のみがＨであってもよいという条件付きで、Ｈ、メチル又はメトキシであり、Ｘ２を含んだＡが−Ｎ−を介して式VIIの前記ハンドル又はリンカーに結合されている場合には、独立に、メチル又はメトキシ、好ましくはメトキシであることを特徴とする請求項３に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項５】
式IIの前記ハンドル又はリンカーは、２−クロロトリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル及び４−メチルトリチルからなる群より選択される請求項２又は３に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項６】
Ｘ２はＴｒｐ、Ｃｙｓ又はＡｒｇではないことを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項７】
Ｘ１は０乃至５０個のアミノ酸残基を具備していることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項８】
Ａ＝Ｐ−Ｘ１−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ又はＡ＝Ｐ−Ｘ１−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｘ２であり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８はアミノ酸側鎖保護基であり、Ｘ１，Ｘ２は先に定義された通りであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載のペプチド−固相共役。
【請求項９】
Ｒ９は第３級ブチルであることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１０】
Ａ＝Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−又はＡ＝ＮＨ2−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｒ３）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ４）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（Ｒ５）−Ｇｌｕ（Ｒ６）−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（Ｒ７）−Ｇｌｕ（Ｒ８）−Ｔｙｒ（Ｒ９）−Ｌｅｕ−Ｏ−であり、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ８，Ｒ９はアミノ側鎖保護基であり、Ｒ１は不溶性固相である請求項１乃至９の何れか１項に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１１】
前記固相は高分子であり、７００より小さなメッシュサイズ（US Bureau of Standards）を有していることを特徴とする請求項１乃至１０の何れか１項に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１２】
Ｒ２はペンタメチルジヒドロベンゾフラニル、アダマンチルオキシ−カルボニル又はイソボルニルオキシカルボニルであり、Ｒ９はｔｅｒｔ．ブチル又はその誘導体であり、Ｒ３乃至Ｒ８は酸置換活性な保護基であることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１３】
Ｒ２はＰｂｆであり、Ｒ４乃至Ｒ９は除去のために少なくとも５０％のトリフルオロ酢酸を必要とする酸置換活性な保護基であることを特徴とする請求項１０又は１２に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１４】
Ｒ３はトリチルであり、Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７及びＲ８は３級ブチルであることを特徴とする請求項１３に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１５】
Ｒ９は３級ブチルであることを特徴とする請求項１４に記載のペプチド−樹脂共役体。
【請求項１６】
トロンビン切断部位である−Ａｒｇ（Ｒ２）−Ｐｒｏ−は−Ａｒｇ［ｐｓｉＣＨ２ＮＨ］Ｐｒｏ−であることを特徴とする請求項１乃至１５の何れか１項に記載のペプチド−樹脂共役体。
【国際調査報告】
2008517018.tif 000017
2008517018.tif 000018