(57)【要約】  本発明は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数より、少なくとも１０％高い生産性係数（特定試験によって判定される）を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群から単離された酵素突然変異体に関する。突然変異体は、任意に特定のＣ−末端延長および／またはＮ末端延長と組み合わさった、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）野生型酵素配列中のＫ１３、Ｔ１９、Ｙ４９、Ｎ８０、Ｄ８４、Ａ９３、Ｅ１２７、Ａ１２８、Ｋ１４６、Ｋ１６０、Ｉ１６６、Ａ１７４、Ｍ１８５、Ｋ１９６、Ｆ２００、およびＳ２３９と相応する１つ以上の位置の少なくとも１つのアミノ酸置換、および／またはその中のＳ２５８およびＹ２５９に相応する位置の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する。本発明はまた、基準値よりも少なくとも１０％高い生産性係数（スクリーニングの本質的部分を形成する前記特定試験によって判定される）を有する２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素（そのもの自体または突然変異体のいずれかとして）を見いだすスクリーニングプロセスにも関する。さらに本発明は、スクリーニングプロセスによって得られる突然変異酵素、そしてこのような突然変異体をコードする核酸、そしてこのような核酸または突然変異体をそれぞれ含んでなるベクターおよび宿主細胞に関する。最後に本発明は、例えば６−クロロ−２，４，６−トリデオキシＤ−エリスロヘキサピラノシドの生成におけるこのような（好ましくは突然変異）酵素、核酸、ベクター、および宿主細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素突然変異体であって、このような各野生型酵素が、少なくともアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成におけるＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体が、それからそれが突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素双方の生産性係数が同一条件下で測定される、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素突然変異体。
【請求項２】
単離された突然変異体が、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋｌ２（ＥＣ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２酵素双方の生産性係数が同一条件下で測定される、請求項１に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項３】
［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの突然変異体である、請求項１または２に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項４】
突然変異体が、任意にＣ−末端延長と組み合わさったおよび／またはＮ−末端延長と組み合わさった、Ｋ１３、Ｔ１９、Ｙ４９、Ｎ８０、Ｄ８４、Ａ９３、Ｅ１２７、Ａ１２８、Ｋ１４６、Ｋ１６０、Ｉ１６６、Ａ１７４、Ｍ１８５、Ｋ１９６、Ｆ２００、またはＳ２３９の１つ以上の［配列番号１］中の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも１つのアミノ酸置換、および／またはＳ２５８またはＹ２５９の１つの［配列番号１］中の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項５】
突然変異体が、
任意にＣ−末端延長と組み合わさったおよび／またはＮ−末端延長と組み合わさった、
ａ．正に帯電したアミノ酸によって、好ましくはＲまたはＨによって置換されたＫ１３および／またはＫ１９６、
ｂ．別のアミノ酸によって置換されたＴ１９および／またはＭ１８５、好ましくは親水性アミノ酸、特にＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなるもの、および／または、疎水性アミノ酸、特にＶ、Ｌ、およびＩからなるもの、からなる群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＴ１９および／またはＭ１８５、
ｃ．ＦおよびＷからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたＹ４９、
ｄ．Ｔ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＮ８０および／またはＩ１６６および／またはＳ２３９、
ｅ．サイズの大きい順に、Ｅ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ａ、およびＧからなる小型アミノ酸の群から選択される別の、好ましくはより小型のアミノ酸によって置換されたＤ８４および／またはＡ９３および／またはＥ１２７、
ｆ．Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、およびＹからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＡ１２８および／またはＫ１４６および／またはＫ１６０および／またはＡ１７４および／またはＦ２００
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を［配列番号１］中に有する、またはその中の置換に相応する、
および／またはＳ２５８およびＹ２５９の位置の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を［配列番号１］中に、またはそれに相応する位置に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項６】
Ｃ−末端が、断片ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つによって延長される、請求項４または５に記載の単離された突然変異体。
【請求項７】
突然変異体が、Ｋ１３Ｒ、Ｔ１９Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ｎ８０Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ａ９３Ｇ、Ｅ１２７Ｇ、Ａ１２８Ｖ、Ｋ１４６Ｖ、Ｋ１６０Ｍ、Ｉ１６６Ｔ、Ａ１７４Ｖ、Ｍ１８５Ｔ、Ｍ１８５Ｖ、Ｋ１９６Ｒ、Ｆ２００Ｉ、Ｆ２００Ｍ、Ｆ２００Ｖ、Ｓ２３９Ｃ、ΔＳ２５８、ΔＹ２５９、ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］によるＣ−末端延長、およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長の群から選択される、１つ以上の突然変異を［配列番号１］中に有する、またはその中の突然変異に相応する、請求項５または６に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項８】
突然変異体が、Ｆ２００ＩおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＭおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＶおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＩおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、Ｆ２００ＭおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、およびＦ２００ＶおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長の群から選択される、少なくとも２つの突然変異を［配列番号１］中に有する、またはその中の２つの突然変異に相応する、請求項７に記載の、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された突然変異体。
【請求項９】
アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成において、ＤＥＲＡ生産性係数試験による判定で、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのための方法であって、
（Ａ）引き続いて（ｉ）総および／またはゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡが単離され、（ｉｉ）前記単離されたＤＮＡを含んでなる個々のクローンからなる前記単離されたＤＮＡの発現ライブラリーが調製され、（ｉｉｉ）得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、アセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの基質混合物と共にインキュベートされ、（ｉｖ）４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）へのこれらの基質の転換を示す１つ以上のクローンからの１つ以上の遺伝子が単離され、［配列番号６］と同一の遺伝的背景中に再クローンされ、
（Ｂ）ステップ（ｉｖ）で得られた再クローンされた遺伝子によってコードされるＤＥＲＡ酵素が発現され、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって試験されることで、このような野生型酵素の各生産性係数が得られ、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）からのこれらの野生型酵素の生産性係数が、［配列番号１］の配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの野生型酵素と比較され、前記比較において少なくとも１０％より高い生産性係数を有するＤＥＲＡ酵素をコードする１つ以上の遺伝子が選択され単離される、
方法。
【請求項１０】
アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成において、ＤＥＲＡ生産性係数試験による判定で、相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高いか、または［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高いかのいずれかの生産性係数を有する２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）引き続いて（ｉ）野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で［配列番号６］を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡをコードする遺伝子と同一の遺伝的背景中に、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同一の遺伝的背景中にクローンされることで、このようにして調製された突然変異体からのクローンの発現ライブラリーが得られ、
（Ｂ）クローン中のＤＥＲＡ−酵素が発現され、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって試験されることで、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
（Ｃ）突然変異酵素の生産性係数が、相応する野生型酵素のそれと、または［配列番号１］配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの野生型酵素のそれと比較され、各比較において少なくとも１０％高い生産性係数を有するＤＥＲＡ突然変異体をコードする１つ以上の遺伝子が選択され単離される、
方法。
【請求項１１】
ステップ（Ａ）（ｉ）の後、ステップＡ（ｉｉ）で、得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが基質アセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、その後ステップＡ（ｉｉｉ）で、これらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への最大の転換を示すクローンの１つ以上が選択され、選択されたクローンがステップＢで使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のスクリーニング法によって得られる単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの突然変異体、または請求項１０または１１に記載のスクリーニング法に従って得られるような突然変異酵素を含んでなる宿主細胞、および／または請求項１２または１３に記載の単離された核酸を含んでなる、および／または請求項１４に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１６】
相応する野生型酵素および／または［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの調製のための方法であって、
請求項１２または１３に記載の核酸、または請求項１４に記載のベクター、または請求項１５に記載の宿主細胞を利用する方法。
【請求項１７】
式１、
【化１】
2008541693.tif 000021
（式中、
Ｒ１およびＲｘはそれぞれ独立してＨまたは保護基を表し、Ｘはハロゲンと、トシレート基と、メシレート基と、アシルオキシ基と、フェニルアセチルオキシ基と、アセトアルデヒドおよび式、ＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｘ（式中、Ｘは上に定義したとおりである）に相応する置換されたアセトアルデヒドからのアルコキシ基またはアリールオキシ基を表す）の２，４−ジデオキシヘキソースまたは２，４，６−トリデオキシヘキソースの調製のための方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の突然変異ＤＥＲＡ酵素、または請求項１０または請求項１１に記載の方法によって得られる核酸の発現によって得られる突然変異ＤＥＲＡ酵素、または請求項１６に記載の方法によって生成される突然変異ＤＥＲＡ酵素が使用され、Ｒ１および／またはＲｘが保護基を表す場合、形成された化合物中のヒドロキシ基（群）が、保護基によってそれ自体に知られている様式で保護される）の２，４−ジデオキシヘキソースまたは２，４，６−トリデオキシヘキソースの調製のための方法。
【請求項１８】
アルデヒド、２−置換アルデヒド、およびアルデヒドと２−置換アルデヒドとの間の反応中で形成される中間生成物（すなわち４−置換−３−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド中間体）の濃度の合計であるカルボニル濃度が、反応混合物１リットルあたり０．１〜５モルの間で選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１およびＲｘがＨを表す、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法、およびそれ自体に知られているさらなる加工ステップを使用した、スタチンの調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの酵素の単離された突然変異体に関し、このような各野生型酵素は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（以下、ＣＴｅＨＰとも称する）生成においてＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される、特定の生産性係数を有する。本願明細書では、改善された生産性係数とは、このようなアルドラーゼのα−脱離基置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドに対する抵抗性、触媒活性および親和力における変化を組み合わせた（そして好ましい）結果を意味する。前記生産性係数を判定する方法については本願明細書の実験部分で述べられ、以下、「ＤＥＲＡ生産性係数試験」と称する（以下、ＤＰＦＴと称する場合もある）。野生型酵素は、天然源または環境サンプルから単離できる酵素である。このような酵素の自然発生的突然変異体（すなわち本特許出願の範囲内で天然源または環境サンプルから単離できる突然変異体もまた、野生型酵素と見なされる。したがって本特許出願では、突然変異体という用語は、（例えば国際公開第／０１０３１１号パンフレットで述べられるような遺伝子組み換え技術によるこのような突然変異の遺伝子組み換えを任意に伴う、当業者によく知られている、例えばＰＣＲの助けによるランダム変異誘発と、またはＵＶ照射手段と、または例えばＰＣＲ法、飽和変異誘発などによる部位特異的突然変異とのいずれによるものであるかどうかにかかわらず）それらが前記野生型酵素をコードするＤＮＡ（核酸）の意図的突然変異によって、野生型酵素から得られたまたは得られていることのみを示すものとする。
【０００２】
自然界では、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼなどの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼが、アセトアルデヒドとＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートの間の（可逆的）アルドール反応をエナンチオ選択的に触媒して、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートを形成することが知られている。本特許出願の目的では、この反応をエナンチオ選択的に触媒できる、またはα−脱離基置換アセトアルデヒドとアセトアルデヒドからの２，４，６−トリデオキシヘキソースの形成をエナンチオ選択的に触媒できるあらゆる酵素が、ＤＥＲＡ活性を有すると述べられる。
【０００３】
例えば米国特許第５，７９５，７４９号明細書で述べられるように、特定の２，４，６−トリデオキシヘキソースの合成は、エナンチオ選択触媒として、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼを使用して達成できる。前記プロセスでは、反応物質としてアセトアルデヒドおよび２−置換アルデヒドを利用し、反応は４−置換３−ヒドロキシブタナール中間体を経て進行する。したがって、例えばジイセン（Ｇｉｊｓｅｎ）およびウォン（Ｗｏｎｇ）がＪＡＣＳ  １１６（１９９４年）８４２２頁で述べるように、ヘミアセタール６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドの合成プロセスにおいて、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼを使用できる。このヘミアセタール化合物は、本願明細書では前述のようにＣＴｅＨＰとも称する。これは例えば本願でＣｔＢＤＡｃと称する、そのｔ−ブチルエステルなどの特定の（４Ｒ、６Ｓ）−２−（６−置換−１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸誘導体の生成における適切な中間体である。このような２，４，６−トリデオキシヘキソースおよびその６−ハロ−または６−シアノ−置換誘導体、ならびにこのような（４Ｒ、６Ｓ）−２−（６−置換−１，３−ジオキサン−４−イル）酢酸誘導体、およびさらにその同等物と見なせる化合物は、コレステロール低下特性または抗腫瘍特性がある医薬品の重要な群の生成における有用なキラル構築ブロックである。このような医薬品の重要な例は、いわゆるスタチン様、例えばバスタチン  ロスバスタチン（アストラゼネカ（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）の商品名クレスター（Ｃｒｅｓｔｏｒ）（登録商標））またはアトルバスタチン（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）の商品名リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ）（登録商標））である。スタチンのその他の例は、ロバスタチン、セリバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、およびフルバスタチンである。スタチンは概して、いわゆるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害物質として機能することが知られている。さらに例えば本願でＣｙＴｅＨＰと称され、おそらくアトルバスタチン生成のための代案の中間体であるヘミアセタール６−シアノ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシドなどの医薬品化合物の様々な誘導体（またはその中間体）もまた、興味深いことが知られている。
【０００４】
国際公開第０３／００６６５６号パンフレットで言及されるように、米国特許第５，７９５，７４９号明細書（前掲）の酵素が触媒するアルドール縮合に知られている欠点は、生成能力が低いことである。したがって国際公開第０３／００６６５６号パンフレットでは、反応物質の反応を比較的高濃度で実施することで、そしてアセトアルデヒドに次ぐ好ましい基質としてα−クロロアセトアルデヒドと組み合わせた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＤＥＲＡ、ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの好ましい使用によって、このような低生成能力問題を克服することが成功裏に試みられた。
【０００５】
それにもかかわらず、本発明者らが、本発明を導いた彼らの研究において観察したように、これまでのところＤＥＲＡ酵素は、不運にもアルデヒド基質に対して（特にアセトアルデヒドに対して、そしてより顕著にはα−Ｌ−置換アセトアルデヒドに対して）かなり良くない抵抗性を示す。特に脱離基Ｌがクロロである場合、トリデオキシヘキソースの生合成に有用な濃度でＤＥＲＡ酵素の非常に高い不活性化が観察される。さらに発明者らが発見したように、既知の２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素は、基質クロロアセトアルデヒドに対して非常に低い親和力および活性を有するように見える。これらの理由から実際、良好な合成反応収率を得るために、比較的多量の（高価な）ＤＥＲＡ酵素が必要とされる。したがって改善された生産性係数を有するＤＥＲＡ酵素を見つけることに対するかなりの必要性があった（すなわちα−Ｌ−置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドに対するこのようなアルドラーゼの抵抗性、触媒活性の変化の組み合わせた結果が好ましくあるべきである）。そして当然ながら、好ましくはトリデオキシヘキソースへの合成経路の生成能力もまた改善されるべきである。
【０００６】
Ｗ．Ａ．グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）らのＰＮＡＳ、第１０１巻、５７８８〜５７９３頁（２００４年）からの最近の論文が、ＤＥＲＡ反応において改善された容積生産性がある野生型ＤＥＲＡ酵素を見いだす試みについて述べ、未知の生物源からの野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列を開示していることが注目される。以下で考察するように、論文はまた、ＤＥＲＡ酵素を見いだすスクリーニング法のための特定の方法についても述べる。しかし著者らは基質阻害に焦点を当てており、例えば（比較的高）濃度のクロロアセトアルデヒド、すなわち酵素の強力な不活性化と組み合わさったＤＥＲＡ酵素の使用に固有の問題に実際には対処してはいない。事実、著者らは、基質が反応によって取り除かれるのと同一速度で供給することによって、基質阻害の問題を最小化する事を試みている。
【０００７】
上述のように自然界では、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼは、アセトアルデヒドとＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートの間の（可逆的）アルドール反応をエナンチオ選択的に触媒して、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートを形成する。本特許出願の目的では、この天然反応、そしてより正確にはその逆反応（すなわち２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートのアセトアルデヒドおよびＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートへの分解）は、提供された突然変異酵素のために、抵抗性、ｃ．ｑ．安定性、データを確立するための基準反応の１つとして使用される。したがってこの分解反応は、以下でＤＥＲＡ天然基質反応と称する。しかしＤＥＲＡ天然基質反応に加えて、突然変異酵素の生産性のアセスメントのために、基質としてのクロロアセトアルデヒドとアセトアルデヒドと共に、さらなる試験アッセイ反応、すなわちＤＥＲＡ生産性係数試験（ＤＰＦＴ）を使用する。上で示唆したように、生産性は活性、抵抗性（安定性）と親和力の変化の組み合わせた（すなわち正味）効果を表す。
【０００８】
本発明の文脈で、特に各出現におけるＤＥＲＡ突然変異体の抵抗性および生産性は、前記ＤＥＲＡ天然基質反応および／またはＤＰＦＴ反応において、それに突然変異体が由来する野生型酵素のそれと比較され、および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ（ａ野生型ＤＥＲＡ）のそれと比較される。
【０００９】
好ましくは２つの酵素の特定の生産性係数の比較において、同一条件が使用される。「同一条件」とは、異なる核酸配列が２つの異なる酵素をコードする場合を除いて、２つのＤＥＲＡ生産性係数試験間の設定に実質的に違いがないことを意味する。これは例えば温度、ｐＨ、無細胞抽出物（ｃｆｅ）濃度、クロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドなどのパラメーターと、発現系、すなわち発現ベクターおよび宿主細胞などの遺伝的背景とが、好ましくは全て同一に保たれることを意味する。
【００１０】
したがってここでの用法では、改善された生産性係数という用語は、本願明細書の実験的部分で述べられるような、特にＤＰＦＴ反応の結果を考慮に入れた、標準試験条件下における、抵抗性、触媒活性、および親和力の（好ましい）変化の結果である。したがって本願で用いられる生産性係数は、より正確にはＣＴｅＨＰ形成値に相当する。本発明に従って提供されるＤＥＲＡ突然変異体は、ＤＥＲＡ天然基質反応および／またはＤＰＦＴ反応において、それがそれから突然変異した野生型ＤＥＲＡ酵素よりも、および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡよりも生産性が少なくとも１０％高い。したがってそれらはα−脱離基置換アセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドの存在下で、実質的により良い抵抗性を有し（すなわちそれらは所定の時間にわたり、それらの活性レベル百分率が高いままである）、または通常、天然基質ＤＥＲＡ反応において実質的に活性がより高い。
【００１１】
本発明はさらに、特にアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成におけるＤＥＲＡ生産性係数試験による判定で、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのためのプロセスに関する。
【００１２】
本発明はさらに、特に少なくともアセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドの等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成におけるＤＥＲＡ生産性係数試験による判定で、相応する野生型酵素生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関する。より詳しくはこれはまた、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関する。この配列［配列番号１］は、以下で、配列一覧中のエントリー＜４００＞１の下に示される。
【００１３】
ここでの方法では、突然変異体（酵素）という用語は、野生型ＤＥＲＡ酵素をコードするＤＮＡ（核酸）の遺伝子操作によって得られる突然変異体を包含することが意図され、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡなどの例えば野生型ＤＥＲＡ酵素の［配列番号６］の核酸（配列エントリー＜４００＞６の下の一覧参照、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡ酵素をコードする）に、例えばアミノ酸配列の置き換えまたは置換、欠失、切断および／または挿入がもたらされる。
【００１４】
本発明はなおさらに、それがそれから突然変異した野生型ＤＥＲＡ酵素と比べて、および／または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡと比べて、より高く改善された生産性係数を有する２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェート突然変異アルドラーゼをコードする単離された核酸に関し、本発明に従った２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェート突然変異アルドラーゼをコードする単離された核酸を含んでなるベクター、およびこのような核酸および／またはベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００１５】
最後に、本発明はまた、上で言及したように、本発明に従った２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェート突然変異アルドラーゼを使用した、またはこのような突然変異体をコードする核酸を使用した、またはこのような核酸を含んでなるベクターを使用した、またはこのような核酸および／またはベクターを含んでなる宿主細胞を使用した、改善された医薬品合成、それらの誘導体および中間体にも関する。
【００１６】
本発明者らは、詳細な研究後に、６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成で使用すると、改善された生産性係数を有する莫大な量の突然変異ＤＥＲＡ酵素が利用できるようになったことを見いだした。すなわち発明者らは、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの酵素の単離された突然変異体が、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源から得られることを見いだし、前記野生型酵素は、それぞれアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からのＣＴｅＨＰの生成においてＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
【００１７】
本発明に従った２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素（ＤＥＲＡ）群から単離された酵素突然変異体は、真核生物起源のまたはより好ましくは原核生物起源のＤＥＲＡのいずれかに由来することができる。ＤＥＲＡが真核生物起源である場合、それらは膜結合核ならびに細胞小器官を含有する１つ以上の真核生物細胞からなる生物体から得られる。真核生物の細胞は、例えばヒト、動物（例えばマウス）、植物、および真菌から、および様々なその他の群の細胞であることができ、その他の群は「原生生物」と総称される。適切なＤＥＲＡは、例えば後生動物に属する真核生物源、すなわち例えば線形動物、節足動物、および例えばシノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、およびヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）などの脊椎動物などのスポンジおよび原生動物以外の動物から得ることができる。
【００１８】
しかしより好ましくは、本発明に従った単離された突然変異ＤＥＲＡは、原核生物起源から、すなわち概して古細菌（クレンアーキオータ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａ）およびユリアーキオータ（Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ）門を含んでなる）および細菌界に属する、核のない単細胞生物体からのものである。
【００１９】
その種から本発明に従った適切なＤＥＲＡ突然変異体を得ることができる、古細菌界に属する種の系統樹の調査を表１に示す。最も好ましくは、本発明に従った単離された突然変異ＤＥＲＡは細菌起源のものである。その種から本発明に従った適切なＤＥＲＡ突然変異体を得ることができる、細菌界に属する種の系統樹の調査を表２に示す。表１および２において、ＧＩはＮＣＢＩアントレ（Ｅｎｔｒｅｚ）ブラウザからのアミノ酸配列の検索のための共通識別子を表し、例えば次のサイト／検索エンジンＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じてアクセスできるデータベース中の数を使用して、ＧＩ：の後ろの数を使用して野生型ＤＥＲＡのアミノ酸配列および前記アミノ酸配列をコードする核酸配列にアクセスできる。
【００２０】
当業者は、表１および２で言及されるもの以外の野生型ＤＥＲＡアミノ酸配列およびこれらの野生型ＤＥＲＡをコードする核酸配列が、例えば上述のサイト／検索エンジンを使用して、タンパク質および核酸データベース中に、それ自体に知られている様式で容易に見いだせることを認識する。
【００２１】
細菌界内で、突然変異ＤＥＲＡは、最も好ましくは、プロテオバクテリア門、その中でより具体的にはγ−プロテオバクテリア綱、特に腸内細菌科も属するエンテロバクター目に由来する野生型ＤＥＲＡに基づく。前記の科は、とりわけエシェリキア属を含む。
【００２２】
したがって本発明の文脈で使用するための適切な突然変異ＤＥＲＡは、表３に要約するように、例えば原核生物源からの前記野生型酵素をコードするＤＮＡの意図的突然変異によって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２とのほぼ増大する同一性百分率（約２０％同一性から１００％同一性まで）で、得ることができる。
【００２３】
【表１】
2008541693.tif 000002
【００２４】
【表２】
2008541693.tif 000003
【表３】
2008541693.tif 000004
【００２５】
表３：
突然変異ＤＥＲＡに適した原核生物源：サーモプラズマ・ボルカニウム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、アエロピラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）、アクイフェックス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）、シノリゾビウム・メリロティ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、オセアノバシラス・イヘイエンシス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ）、ピロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、メタノバクテリア・サーモオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ・ピルム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｉｒｕｍ）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・プルモニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．ＰＣＣ６８０３種、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）ＰＣＣ  ７１２０種、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＲＣ−１種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、ウレアプラズマ・パルブム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）亜種アウレウスＭｕ５０、それぞれの亜種アウレウスＭＷ２、表在性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、パスツーレラ・マルチコーダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｃｏｄａ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、テルモアナエロバクター・テングコンゲネシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、��シラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）エイムス株、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム・ペルフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｗ．Ａ．グリーンズバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら著、ＰＮＡＳ、第１０１巻、５７８８〜５７９３頁（２００４年）の論文で言及されるような環境サンプル、デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８株、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、シュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＣＦＴ０７３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２。
【００２６】
本発明に従って得られる突然変異ＤＥＲＡの特定の生産性係数を比較するのに非常に適した野生型参照ＤＥＲＡは、Ｎ−末端からＣ−末端に［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼである。
【００２７】
【表４】
2008541693.tif 000005
【００２８】
したがって本発明は、さらに、真核生物および原核生物種からなる群に属する天然源からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの単離された酵素の突然変異体に関し、このような各野生型酵素は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からのクロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成においてＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される特定の生産性係数を有し、単離された突然変異体はそれがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および相応する野生型酵素双方の生産性係数は同一条件下で測定され、単離された突然変異体は［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２酵素双方の生産性係数は、同一条件下で測定される。
【００２９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（Ｗ３１１０）ＤＥＲＡ酵素の野生型配列（２５９アミノ酸、［配列番号１］）、ならびに前記ＤＥＲＡ酵素をコードするヌクレオチド配列（７８０ヌクレオチド、［配列番号６］、配列一覧参照）については、Ｐ．バレンティン−ハンセン（Ｖａｌｅｎｔｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ）らによって「ｄｅｏＣ遺伝子のヌクレオチド配列および酵素のアミノ酸配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｏＣ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５（３）、５６１〜５６６頁（１９８２年）で述べられることが顕著である。
【００３０】
デサンティス（ＤｅＳａｎｔｉｓ）ら、２００３年、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１、４３〜５２頁は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼのホスフェート結合ポケットにおける５個の部位特異的突然変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＲＡ：Ｋ１７２Ｅ、Ｒ２０７Ｅ、Ｇ２０５Ｅ、Ｓ２３８Ｄ、およびＳ２３９Ｅのデザインを開示する。これらの突然変異ＤＥＲＡ酵素の内、Ｓ２３８ＤおよびＳ２３９Ｅは、その非リン酸化天然基質（２−デオキシ−Ｄ−リボース）に対して、野生型酵素よりも高い活性を有することが示される。これらの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼと同じ突然変異体は、米国特許出願公開第２００３／０２３２４１６号明細書で開示される。
【００３１】
本発明者らは、デフォルト設定（マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；ＧＡＰ  ＯＰＥＮ：１０；ＥＮＤ  ＧＡＰＳ：１０；ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ：０．０５；ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ：８）でＣｌｕｓｔａｌＷバージョン１．８２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）複数配列比較を使用した配列比較研究において、本発明に従った単離された突然変異体を誘導するために使用できる真核生物および原核生物起源のＤＥＲＡが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの［配列番号１］の野生型酵素配列との広範な同一性百分率にわたって変化してもよいことを見いだした。同一性百分率が約２０％でさえも、本発明に従った突然変異体を得るための出発点として使用できる、なおも非常に適切なＤＥＲＡが見いだされる。
【００３２】
発明者らは、本発明で使用できる全てのＤＥＲＡ（およびそれに由来する突然変異体）が、共通して［配列番号１］の野生型酵素配列と比べて少なくとも８個の保存アミノ酸、すなわちＦ７６、Ｇ７９、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｋ１６７、Ｔ１７０、Ｋ２０１、およびＧ２０４を有することを見いだした。したがって下で述べられる全ての突然変異は、これらの保存位置とは異なる位置にある。Ｋ１６７がアセトアルデヒドと共にシッフ塩基中間体を形成する必須活性部位リジンであり、Ｋ２０１およびＤ１０２がヘイン（Ｈｅｉｎｅ）ら著「原子解像度での酵素機序における共有結合中間体の観察（Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｔ  ａｔｏｍｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，３６９〜３７４頁（２００１年）に従って「活性化する」Ｋ１６７触媒の陽子リレー系に関与することが顕著である。他の５個の残基については、これまでのところ保存されている、または例えば基質の認識または触媒作用のために重要であるとは述べられていない。
【００３３】
好ましくは単離された突然変異ＤＥＲＡは、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する。生産性係数は、相応する野生型酵素よりも好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより優先的には少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、さらにより好ましくは少なくとも１０００％、さらにより好ましくは少なくとも１５００％高い。
【００３４】
より好ましくは、単離された突然変異ＤＥＲＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡの生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する。生産性係数は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡよりも好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより優先的には少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、さらにより好ましくは少なくとも１０００％、さらにより好ましくは少なくとも１５００％高い。
【００３５】
意図される反応において非常に効果的であることが示された単離された突然変異体の非常に重要な群は、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）から単離された２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ突然変異体である。これらの単離された突然変異ＤＥＲＡは、［配列番号１］の酵素配列の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する。生産性係数は、［配列番号１］の酵素配列よりも好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより優先的には少なくとも５０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、さらにより好ましくは少なくとも１０００％、さらにより好ましくは少なくとも１５００％高い。
【００３６】
本発明者らは、突然変異体が、任意に、好ましくはＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つの断片によるＣ−末端延長と組み合わさった、および／またはＮ−末端延長と組み合わさった、［配列番号１］中のＫ１３、Ｔ１９、Ｙ４９、Ｎ８０、Ｄ８４、Ａ９３、Ｅｌ２７、Ａｌ２８、Ｋ１４６、Ｋ１６０、Ｉ１６６、Ａ１７４、Ｍ１８５、Ｋ１９６、Ｆ２００、またはＳ２３９の位置の１つ以上、またはそれに相応する位置、好ましくはＦ２００の位置またはそれに相応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換を有すれば、および／または［配列番号１］中のＳ２５８またはＹ２５９の位置の１つの少なくとも１つのアミノ酸欠失を有すれば、非常に適切な単離された突然変異ＤＥＲＡが得られることを見いだした。
【００３７】
［配列番号２］をコードする核酸配列の例を［配列番号７］に示す。［配列番号３］をコードする核酸配列の例を［配列番号８］に示す。
【００３８】
本発明の一実施形態では、部位特異的突然変異は、例えばＦ２００の位置（それに相応する位置）上などの［配列番号１］中の上述の位置、またはそれに相応する位置の１つで実施される飽和変異誘発によって作られてもよい。飽和変異誘発とは、アミノ酸が、例えばその中で各変異型が［配列番号１］の２００の位置において特定のアミノ酸交換を含有する、変異型酵素のライブラリーを生成することで、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンなどの全ての可能なタンパク質新生アミノ酸で置換されることを意味する。好ましくは飽和変異誘発は、例えば実施例４で述べられるように、置換するアミノ酸をコードする核酸トリプレットを全ての可能な核酸トリプレットによって交換することで実施される。したがってこれらの突然変異体は、上述の少なくとも８個の保存アミノ酸、すなわちＦ７６、Ｇ７９、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｋ１６７、Ｔ１７０、Ｋ２０１、およびＧ２０４をなおも有しながら、［配列番号１］（または上述のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムに従って見いだされる同一性百分率で、それに相応する別の天然源からのあらゆるその他の野生型酵素アミノ酸配列）とは異なる配列を示された位置の１つ以上に有する。したがってここでの用法では、「相応する突然変異」とは、特定の「相応する野生型酵素アミノ酸配列」（すなわちＤＥＲＡ活性を有する酵素配列）で生じるこれらの突然変異を示すことが意図される。
【００３９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ［配列番号１］の野生型アミノ配列中のアミノ酸残基の位置に相応する野生型または変異タンパク質配列のアミノ酸残基は、デフォルト設定（マトリックス：Ｇｏｎｎｅｔ  ２５０；ＧＡＰ  ＯＰＥＮ：１０；ＥＮＤ  ＧＡＰＳ：１０；ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ：０．０５；ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ：８）でＣｌｕｓｔａｌＷバージョン１．８２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）複数配列比較を実施することで同定できる。このような配列比較において、［配列番号１］で示される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡ配列のアミノ酸残基と同じ列に配置されたアミノ酸残基は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡ［配列番号１］のこの各アミノ酸残基に相応する位置と定義される。
【００４０】
ここでの用法では、配列中、およびその中の様々な位置のアミノ酸は、次のようにそれらの一文字コードによって（それぞれそれらの三文字コードによって）示される。
【００４１】
【表５】
2008541693.tif 000006
【００４２】
上に列挙したアミノ酸は、配列中の特定の位置のように重要かもしれない様々な特性によって区別できる。例えばアミノ酸のいくつかは、正に帯電したアミノ酸のカテゴリー、すなわち特にリジン、アルギニン、およびヒスチジンに属する。アミノ酸の別のカテゴリーは、セリン、スレオニン、システイン、グルタミン、およびアスパラギンからなる親水性アミノ酸である。疎水性アミノ酸は、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、およびチロシンである。芳香族アミノ酸のカテゴリー、すなわちフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンもある。アミノ酸を分類するさらに別の可能性は、それらのサイズに従う。アミノ酸は、大きい順に次のように列挙できる。Ｗ＞Ｙ＞Ｆ＞Ｒ＞Ｋ＞Ｌ、Ｉ＞Ｈ＞Ｑ＞Ｖ＞Ｅ＞Ｔ＞Ｎ＞Ｐ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｓ＞Ａ＞Ｇ。
【００４３】
したがって権利請求の対象とする各突然変異体は、それが由来する野生型配列と比較される。これは本発明に従った突然変異体が、次の少なくとも最初の２つの基準を満たす場合のみに、突然変異体と見なすことができることを意味する。
（ａ）突然変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２について示される突然変異の１つに相応しなくてはならない。
（ｂ）突然変異は、それに突然変異体が由来する野生型酵素中に存在しない。
（ｃ）相応する位置に、少なくとも８個の保存アミノ酸、すなわちＦ７６、Ｇ７９、Ｅ１００、Ｄ１０２、Ｋ１６７、Ｔ１７０、Ｋ２０１、およびＧ２０４がなおも存在する。
【００４４】
最も好ましくは、本発明に従った単離された突然変異ＤＥＲＡは、任意に好ましくは断片ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つによるＣ−末端延長と組み合わさった、および／またはＮ−末端延長と組み合わさった、
ａ．正に帯電したアミノ酸によって、好ましくはＲまたはＨによって置換されたＫ１３および／またはＫ１９６、
ｂ．別のアミノ酸によって、好ましくは特にＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなる親水性アミノ酸からなる群、および／または特にＶ、Ｌ、およびＩからなる疎水性アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＴ１９および／またはＭｌ８５、
ｃ．ＦおよびＷからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたＹ４９、
ｄ．Ｔ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＮ８０および／またはＩ１６６および／またはＳ２３９、
ｅ．大きい順にＥ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ａ、およびＧからなる小型アミノ酸の群から選択される別の、好ましくはより小型のアミノ酸によって置換されたＤ８４および／またはＡ９３および／またはＥ１２７、
ｆ．Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、およびＹからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＡ１２８および／またはＫ１４６および／またはＫ１６０および／またはＡ１７４および／またはＦ２００
からなる群から選択されるアミノ酸置換の少なくとも１つを［配列番号１］中に有し、またはその中の置換に相応し、および／または［配列番号１］中のＳ２５８およびＹ２５９の位置、またはそれに相応する位置における少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する。
【００４５】
本発明の一実施形態では、本発明の単離された突然変異体において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、例えばＳ２５８および／またはＹ２５９の、またはそれに相応する位置での欠失によりＣ−末端が切断され、次に好ましくはＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の断片の１つによって延長されてもよい。
【００４６】
明瞭さのために、「［配列番号１］中のアミノ酸置換、またはその中の置換に相応する」という部分は、［配列番号１］中の置換、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２以外の野生型配列中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の番号付けされた位置であっただろう、相応する位置における置換のいずれかである置換を意味する。
【００４７】
最も好ましくは、単離された突然変異ＤＥＲＡは、Ｋ１３Ｒ、Ｔ１９Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ｎ８０Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ａ９３Ｇ、Ｅ１２７Ｇ、Ａ１２８Ｖ、Ｋ１４６Ｖ、Ｋ１６０Ｍ、Ｉ１６６Ｔ、Ａ１７４Ｖ、Ｍ１８５Ｔ、Ｍ１８５Ｖ、Ｋ１９６Ｒ、Ｆ２００Ｉ、Ｆ２００Ｍ、Ｆ２００Ｖ、Ｓ２３９Ｃ、ΔＳ２５８、ΔＹ２５９、ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］によるＣ−末端延長、およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長の群から選択される、［配列番号１］中の１つ以上の突然変異を有し、またはその中の突然変異に相応する。
【００４８】
本願明細書で示されるように、［配列番号１］中のアミノ酸位置番号に先立つ一文字コードは前記野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）酵素中に存在するアミノ酸を示し、［配列番号１］中のアミノ酸位置番号に続く一文字コードは突然変異体中に存在するアミノ酸を示す。アミノ酸位置番号は、［配列番号１］のＤＥＲＡ中の位置番号、およびその他の供給源からのその他のＤＥＲＡ野生型中のそれに相応するあらゆる位置を反映する。
【００４９】
より具体的には、単離された突然変異ＤＥＲＡは、Ｆ２００ＩおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＭおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＶおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＩおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、Ｆ２００ＭおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、Ｆ２００ＶおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長の群から選択される、［配列番号１］中の少なくとも２つの突然変異を有し、またはその中の２つの突然変異に相応する。
【００５０】
本発明はまた、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成において、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの野生型酵素のスクリーニングのためのプロセスにも関し、
（Ａ）引き続いて（ｉ）総および／またはゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡが単離され、（ｉｉ）前記単離されたＤＮＡを含んでなる個々のクローンからなる、前記単離されたＤＮＡの発現ライブラリーが調製され、（ｉｉｉ）得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、（ｉｖ）これらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への転換を示す１つ以上のクローンからの１つ以上の遺伝子が単離され、［配列番号６］と同じ遺伝的背景中に再クローンされ、
（Ｂ）ステップ（ｉｖ）で得られる再クローンされた遺伝子によってコードされるＤＥＲＡ酵素が発現されて、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって試験されることで、このような野生型酵素の各生産性係数が得られ、
（Ｃ）ステップ（Ｂ）からのこれらの野生型酵素の生産性係数が、［配列番号１］の配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの野生型酵素のそれと比較され、前記比較において少なくとも１０％より高い生産性係数を有するＤＥＲＡ酵素をコードする遺伝子の１つ以上が選択され単離される。
【００５１】
上のステップ（ｉ）で意図される総および／またはゲノムのＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡの単離が、例えば微生物から、または土壌または水などの環境サンプルから行われてもよい。ステップ（ｉｉ）で調製される単離されたＤＮＡの発現ライブラリーは、前記単離されたＤＮＡを含んでなる個々のクローンからなり、そのＤＮＡは１つ以上の異なる酵素をコードする。ＤＥＲＡ活性の存在のアセスメントのための、上のステップ（ｉｉｉ）におけるアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物とのインキュベーションは、例えば０．２：１から５：１などの広範な分子比率のこれらの基質の混合物で実施してもよい。既に、これらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への転換の定性的アセスメントが、ステップ（ｉｉ）発現ライブラリーからの個々のクローン中に存在する遺伝子の有効性の最初の指標を提供するかもしれないことは明らかである。
【００５２】
したがって既にこの段階で、ＤＥＲＡ酵素をコードする様々な遺伝子の活性におけるいくらかの格付けが確立できる。このアセスメントは、最も有望な遺伝子の単離を可能にする。しかしスクリーニングプロセスの究極の目的は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成においてＤＰＦＴによって判定される、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する（野生型）ＤＥＲＡを見いだすことなので、これらの選択された遺伝子、または必要に応じてそれらのより少ない数が単離され、［配列番号６］と同じ遺伝的背景中に再クローンされる。このステップにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡ酵素の発現と比較できるやり方で試験される酵素の適切な発現が確実になる。ＤＰＦＴによるスクリーニングおよび試験、そして大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡ酵素のＤＰＦＴの結果との適切な比較を行った後、例えば次に本発明に従った突然変異体を得るための出発点として使用できるＤＥＲＡなどの適切な野生型ＤＥＲＡを見いだすことは非常に容易である。
【００５３】
本発明は、さらにアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成においてＤＥＲＡ生産性係数試験によって判定される、相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高いか、または［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高いかのいずれかの生産性係数を有する、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素群からの突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスに関する。前記プロセスでは、（Ａ）引き続いて（ｉ）野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で［配列番号６］を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡをコードする遺伝子と同じ遺伝的背景中に、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ遺伝的背景中にクローンされることにより、このようにして調製された突然変異体からクローンの発現ライブラリーが得られ、
（Ｂ）クローン中のＤＥＲＡ酵素が発現されて、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって試験されることにより、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
（Ｃ）突然変異酵素の生産性係数が相応する野生型酵素のそれ、または［配列番号１］の配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較において少なくとも１０％より高い生産性係数を有するＤＥＲＡ突然変異体をコードする１つ以上の遺伝子が選択され単離される。
【００５４】
より具体的には、本発明は、
（Ａ）引き続いて（ｉ）野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異されて、それ自体に知られている様式で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡと同じ、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ、遺伝的背景中にクローンされることにより、このようにして調製された突然変異体からクローンの発現ライブラリーが得られ、（ｉｉ）得られた発現ライブラリーからの個々のクローンが、基質アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの混合物と共にインキュベートされ、（ｉｉｉ）これらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への最大転換を示すクローンの１つ以上が選択され、
（Ｂ）ステップ（ｉｉｉ）からの選択されたクローン中のＤＥＲＡ酵素が発現されて、ＤＥＲＡ生産性係数試験によって試験されることで、各突然変異酵素の生産性係数が得られ、
（Ｃ）スクリーンされた突然変異酵素の生産性係数が、相応する野生型酵素のそれ、または［配列番号１］の配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの野生型酵素のそれと比較され、それぞれの比較で少なくとも１０％より高い生産性係数を有するＤＥＲＡ突然変異体をコードする１つ以上の遺伝子が選択され単離される、プロセスに関する。
【００５５】
突然変異体のためのこの第２のタイプのスクリーニングは、例えば本発明に従った野生型ＤＥＲＡ酵素のスクリーニングのためのプロセスを使用して得られた野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードすることが知られている遺伝子に始まり、または例えば表１または２で参照されるような野生型ＤＥＲＡ酵素をコードする遺伝子に始まる。これらの遺伝子は最初に突然変異され、それ自体に知られている様式で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡと同じ、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子と同じ遺伝的背景中にクローンされる。前記遺伝子は、例えば微生物から、または土壌または水などの環境サンプルから得られてもよい。上述の突然変異およびクローニングは、このようにして調製された突然変異体からのクローンの発現ライブラリーをもたらす。事実、当業者によく知られているように、このような発現ライブラリーは、引き続いて突然変異体のＤＮＡライブラリーを調製し、個々のＤＮＡのそれぞれをベクター中にクローニングし、ベクターを適切な発現宿主中に形質転換することで調製される。ＤＥＲＡ活性の存在のアセスメントのための、上のステップ（ｉｉ）におけるアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド混合物とのインキュベーションは、ここでも例えば０．２：１から５：１などの広範な分子比率のこれらの基質の混合物で実施してもよい。次にこれらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への転換の定性的アセスメントは、これらの基質の４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）および／または６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）への転換程度の最初の格付けをもたらし、ＤＰＦＴによるさらなる評価のために、最大転換を示す１つ以上のクローンが選択されてもよい。言うまでもなく試験結果が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡ酵素の発現、それぞれそれがそれから突然変異した相応する野生型遺伝子の発現と容易に比較できるように、試験する酵素の適切な発現が確実にされなくてはならない。このようにすれば、突然変異ＤＥＲＡをコードする適切な遺伝子を見いだして単離することは非常に容易であり、次にスタチンなどの有用な医薬品の商業的生成において適切に使用できる。
【００５６】
上述のスクリーニングプロセスは、上で引用したＷ．Ａ．グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら著、ＰＮＡＳ、第１０１巻、５７８８〜５７９３頁（２００４年）で使用されるものとは異なることが顕著である。前記論文の著者らは、すなわちＲ．ペレツ・カーロン（Ｐｅｒｅｚ  Ｃａｒｌｏｎ）ら著、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、６、４１５４〜４１６２頁（２０００年）で述べられる蛍光性検出アッセイを使用した。前記検出アッセイは非常に間接的な方法であり、ＤＥＲＡ活性は２−デオキシ−Ｄ−リボース基質の蛍光性ウンベリフェロン誘導体によって判定される。しかし最初の事例では酵素のみが得られ、それらはＤＥＲＡ天然基質反応と非常に類似した逆アルドール反応を示し、それらは追加的な第２のスクリーニングにおいて標的反応について試験されるために、前記方法は、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドの少なくとも等モル混合物からの６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）の生成におけるＤＥＲＡ生産性（ならびに活性）の判定では、（置換アルデヒドとの所望の反応における所望の活性を判定するために追加的アッセイを要するので）適切さに劣る。このような問題を克服するために、本発明者らは、独自の直接スクリーニング法を開発し、いわゆるＤＥＲＡ生産性係数試験もまた開発した。
【００５７】
適切に、第１のステップ中の突然変異体のための前記スクリーニングでは、表１、２および３に示す供給源の１つに由来する、野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子が突然変異される。
【００５８】
したがって本発明はまた、このようなスクリーニングプロセスのいずれかによって得られる、特に表１、２、および３で示される供給源の１つに由来する野生型２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする突然変異遺伝子に適用されるスクリーニングプロセスによって得られる、単離された核酸にも関する。
【００５９】
本発明は、さらに突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸に関し、単離された核酸は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する突然変異体をコードし、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
【００６０】
さらに本発明は、突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸に関し、単離された核酸は、それがそれから突然変異した相応する野生型酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する突然変異体をコードし、突然変異体および相応する野生型酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定され、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有し、突然変異体および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２酵素の双方の生産性係数は同一条件下で測定される。
【００６１】
さらに本発明はまた、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＥＣ  ４．１．２．４）からの突然変異体をコードする単離された核酸にも関する。さらに本発明はまた、任意に、好ましくは断片ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つによるＣ−末端延長と組み合わさった、および／またはＮ−末端延長と組み合わさった、１つ以上の位置、または［配列番号１］中のＫ１３、Ｔ１９、Ｙ４９、Ｎ８０、Ｄ８４、Ａ９３、Ｅ１２７、Ａ１２８、Ｋ１４６、Ｋ１６０、Ｉ１６６、Ａ１７４、Ｍ１８５、Ｋ１９６、Ｆ２００、およびＳ２３９の１つ以上の位置、またはそれに相応する位置、好ましくはＦ２００の位置またはそれに相応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換、および／または［配列番号１］中の位置Ｓ２５８またはＹ２５９またはそれに相応する位置の少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する、突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする単離された核酸にも関する。
【００６２】
好ましくは前記単離された核酸は、任意に、好ましくは断片ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つによるＣ−末端延長と組み合わさった、および／またはＮ−末端延長と組み合わさった、
ａ．正に帯電したアミノ酸、好ましくはＲまたはＨによって置換されたＫ１３および／またはＫ１９６、
ｂ．別のアミノ酸によって、好ましくは親水性アミノ酸からなる、特にＳ、Ｔ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなる群から選択される別のアミノ酸、および／または特にＶ、Ｌ、およびＩからなる疎水性アミノ酸によって置換されたＴ１９および／またはＭｌ８５、
ｃ．ＦおよびＷからなる群から選択される芳香族アミノ酸によって置換されたＹ４９、
ｄ．Ｔ、Ｓ、Ｃ、Ｑ、およびＮからなる親水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＮ８０および／またはＩ１６６および／またはＳ２３９、
ｅ．別の、好ましくは大きい順にＥ、Ｔ、Ｎ、Ｐ、Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ａ、およびＧからなる小型アミノ酸群から選択されるより小型のアミノ酸によって置換されたＤ８４および／またはＡ９３および／またはＥ１２７、
ｆ．Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、およびＹからなる疎水性アミノ酸の群から選択される別のアミノ酸によって置換されたＡ１２８および／またはＫ１４６および／またはＫ１６０および／またはＡ１７４および／またはＦ２００
からなる群から選択される、［配列番号１］中の少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、またはその中の置換に相当し、
および／または［配列番号１］中の位置Ｓ２５８およびＹ２５９、またはそれに相応する位置に少なくとも１つのアミノ酸の欠失を有する、突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
【００６３】
最も好ましくは、本発明に従った単離された核酸は、任意に断片ＴＴＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号２］およびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］の１つによるＣ−末端延長と組み合わさった、Ｋ１３Ｒ、Ｔ１９Ｓ、Ｙ４９Ｆ、Ｎ８０Ｓ、Ｄ８４Ｇ、Ａ９３Ｇ、Ｅ１２７Ｇ、Ａ１２８Ｖ、Ｋ１４６Ｖ、Ｋ１６０Ｍ、Ｉ１６６Ｔ、Ａ１７４Ｖ、Ｍ１８５Ｔ、Ｍ１８５Ｖ、Ｋ１９６Ｒ、Ｆ２００Ｉ、Ｆ２００Ｖ、Ｆ２００Ｍ、およびＳ２３９Ｃ、および／または［配列番号１］中の位置ΔＳ２５８およびΔＹ２５９における、またはそれに相応する位置における少なくとも１つのアミノ酸の欠失の群から選択される、［配列番号１］中の少なくとも１つ以上の突然変異を有する、またはその中の突然変異に相応する、突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
【００６４】
より具体的には、本発明に従った核酸は、Ｆ２００ＩおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＭおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＶおよびΔＹ２５９、Ｆ２００ＩおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、Ｆ２００ＭおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長、およびＦ２００ＶおよびＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］によるＣ−末端延長の群から選択される［配列番号１］中の少なくとも２つの突然変異を有する、またはその中の２つの突然変異に相応する、突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素をコードする。
【００６５】
さらに本発明は、上で述べられる核酸のいずれかを含んでなるベクター、ならびに上で述べられる２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ野生型酵素群からの突然変異体を含んでなる宿主細胞、または上で述べられるスクリーニングプロセスに従って得られる突然変異酵素、および／または上で述べられる単離された核酸を含んでなる、および／または既述のベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００６６】
本発明は、同様に、相応する野生型酵素、および／または、［配列番号１］の野生型酵素配列を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥＣ  ４．１．２．４）からの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ酵素の生産性係数よりも少なくとも１０％高い生産性係数を有する突然変異２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼの調製のためのプロセスに関し、上で述べられるような核酸、または上で述べられるようなベクター、または上で述べられるような宿主細胞が利用される。
【００６７】
本発明はまた、式１、
【化１】
2008541693.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲｘはそれぞれ独立してＨまたは保護基を表し、Ｘはハロゲンと、トシレート基と、メシレート基と、アシルオキシ基と、フェニルアセチルオキシ基と、アセトアルデヒドおよび式、ＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｘ（式中、Ｘは上で定義したとおりである）の相応する置換アセトアルデヒドからのアルコキシ基またはアリールオキシ基とを表す）の２，４−ジデオキシヘキソースまたは２，４，６−トリデオキシヘキソースの調製のための改善されたプロセスにも関し、本発明に従った、または本発明に従ったプロセスによって生成される、または本発明に従った突然変異酵素のスクリーニングのためのプロセスによって得られる、突然変異ＤＥＲＡ酵素が使用され、Ｒ１および／またはＲｘが保護基を表す場合、形成された化合物中のヒドロキシ基は、保護基によってそれ自体に知られている様式で保護される。
【００６８】
好ましくはＸは、ハロゲン、より好ましくはＣｌ、ＢｒまたはＩを、またはアシルオキシ基、より好ましくはアセトキシ基を表す。
【００６９】
例えば米国特許第５，７９５，７４９号明細書の例えば４欄１〜１８行で述べられる反応条件を使用して、または例えばＷ．Ａ．グリーンズバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）ら著、ＰＮＡＳ、第１０１巻、５７８８〜５７９３頁、（２００４年）で述べられる流加反応条件を使用して、野生型ＤＥＲＡ酵素を使用した反応について当該技術分野で述べられる反応条件を使用して、上述の反応で突然変異ＤＥＲＡ酵素を用いてもよい。
【００７０】
好ましくは本発明の突然変異ＤＥＲＡ酵素は、国際公開第０３／００６６５６号パンフレットで述べられる反応条件を使用して、上述の反応で用いられる。アルデヒドと、２−置換アルデヒドと、アルデヒドおよび２−置換アルデヒドの間の反応で形成される中間生成物（すなわち４−置換−３−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド中間体）との濃度の合計であるカルボニル濃度は、合成プロセス中に好ましくは６モル／Ｌ未満の値に保たれる。（非常に）短時間のわずかにより高い濃度がほとんど効果がないことは、当業者には明らかである。より好ましくは、カルボニル濃度は、反応混合物１リットルあたり０．１〜５モルの間、最も好ましくは反応混合物１リットルあたり０．６〜４モルの間で選択される。
【００７１】
反応温度およびｐＨは重要でなく、双方は基質に応じて選択される。好ましくは反応は液相中で実施される。反応は例えば−５〜＋４５℃の反応温度、および５．５〜９の間、好ましくは６〜８の間のｐＨで実施できる。
【００７２】
反応は、例えば、緩衝液または自動滴定を利用して、好ましくはほぼ一定のｐＨで実施される。緩衝液としては例えば炭酸水素ナトリウムおよび炭酸水素カリウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、トリエタノールアミン／ＨＣｌ、ビス−トリス−プロパン／ＨＣｌおよびＨＥＰＥＳ／ＫＯＨが適用できる。好ましくは例えば反応混合物１Ｌあたり２０〜４００ｍモル間の濃度で、炭酸水素カリウムまたは炭酸水素ナトリウム緩衝液が適用できる。
【００７３】
アルデヒド総量と２−置換アルデヒド総量間のモル比は非常に重要ではなく、好ましくは１．５：１〜４：１、特に１．８：１〜２．２：１の間にある。
【００７４】
本発明のプロセスで使用される突然変異ＤＥＲＡ酵素量は、原則的に重要ではない。酵素反応のための酵素の最適濃度を判定することは日常的実験法であるので、当業者は使用する突然変異ＤＥＲＡ酵素の量を容易に判定できる。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲｘのどちらもＨを表す。本発明のさらにより好ましい実施形態では、式（１）の化合物は鏡像体富化される。
【００７６】
Ｒ１およびＲｘで表されてもよい保護基としてはアルコール保護基が挙げられ、その例は部分的によく知られている。特定の例としては、テトラヒドロピラニル基が挙げられる。好ましい保護基は例えばトリアリールなどのシリル基、好ましくはトリアルキルシリル基およびヒドロカルビル基である。さらにより好ましい保護基は、ベンジル、メチル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルメチルシリル、およびｔ−ブチルジフェニルシリル基である。
【００７７】
Ｒ１およびＲｘで表されてもよい保護基は、同一または異なってもよい。保護基Ｒ１およびＲｘが異なる場合、有利なことにこれはＲ１およびＲｘのみの選択的除去を可能にするかもしれない。好ましくは保護基Ｒ１がＲｘが異なる場合、Ｒ１はベンジルまたはシリル基であり、Ｒｘはメチル基である。
【００７８】
国際公開第０４／０９６７８８号パンフレット、国際公開第０５／０１２２４６号パンフレットまたは国際公開第０４／０２７０７５号パンフレットで述べられるプロセス（プロセスと類似の）において、ＲｘがＨを表す式（１）の化合物を使用してもよい。したがって本発明はまた、ＸおよびＲ１が上で定義したとおりであり、ＲｘがＨを表す式（１）の化合物が本発明に従って生成され、引き続いて酸化剤と反応され、式（２）、
【化２】
2008541693.tif 000008
（式中、ＸおよびＲ１は上で定義されたとおりである）の相応する化合物を形成し、式２の化合物は引き続いてシアン化物イオンと反応され、式（３）、
【化３】
2008541693.tif 000009
（式中、Ｒ１は上に定義したとおりである）の化合物を形成する、プロセスにも関する。
【００７９】
この反応では、このプロセスステップについて国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットの２頁１０行から３頁１３行で述べられるプロセス条件を利用してもよい。代案としては、国際公開第０５／０１２２４６号パンフレット（例えば５頁１９から２６行参照）で述べられる、または国際公開第  ０４／０２７０７５号パンフレットで述べられる（例えば実施例２で述べられる）プロセス条件を使用してもよい。
【００８０】
本発明の異なる実施形態では、例えば国際公開第０５／０１２２４６号パンフレットで述べられるプロセス条件下で、または国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットまたは国際公開第０４／０２７０７５号パンフレットのプロセス条件を使用して、式（１）の化合物を最初にシアン化物イオンと反応させて、式（４）、
【化４】
2008541693.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲＸはそれぞれ独立してＨまたは保護基を表す）の化合物を形成してもよく、その後、Ｒｘが保護基を表す場合は保護基Ｒｘ−の除去後、式（４）の化合物を酸化剤と反応させて、Ｒ１が上に定義したとおりである相応する式（３）の化合物を形成してもよい。
【００８１】
上のシアノ化反応では、例えばテトラヒドロフラン、ＣＨ３ＣＮ、アルコール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、トルエン、ジエチルエーテルおよび／またはメチル−ｔ−ブチルエーテルなどのその他の溶剤と組み合わせて、水を溶剤として使用してもよい。好ましくは少なくとも５％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも１０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも２０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも３０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも４０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも５０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも６０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも７０％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは少なくとも８０％ｗ／ｗの水、最も好ましくは少なくとも９０％ｗ／ｗの水が、その他の溶剤中で使用される。実用的な理由から、水を唯一の溶剤として使用することが特に好ましい。
【００８２】
国際公開第０４／０９６７８８号パンフレット（例えば５頁１４行〜７頁３行）で述べられるプロセスおよび反応条件を使用して、式（４）の化合物を引き続いて式（５）、
【化５】
2008541693.tif 000011
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立して、例えば炭素原子１〜１２個、好ましくは炭素原子１〜６個のアルキル、例えば炭素原子１〜１２個、好ましくは炭素原子１〜６個のアルケニル、例えば炭素原子３〜７個のシクロアルキル、例えば炭素原子３〜７個のシクロアルケニル、例えば炭素原子６〜１０個のアリール、または例えば炭素原子７〜１２個のアラルキルを表し、各Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、置換されていてもよく、例えば国際公開第０２／０６２６６号パンフレットで述べられる酸触媒の存在下で、適切なアセタール形成剤を利用して、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する炭素原子と共に環を形成してもよい）の化合物に転換してもよい。
【００８３】
国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットに従って、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が上で定義されたとおりであってもよい式５の化合物は、引き続いて加水分解されて、相応する式６、
【化６】
2008541693.tif 000012
（式中、Ｙは例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、好ましくはナトリウムなどのアルカリ金属、例えばマグネシウムまたはカルシウム、好ましくはカルシウムなどのアルカリ土類金属、または例えば国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットの７頁４行〜８頁１６行で述べられるような、好ましくはテトラアルキルアンモニウム基などの置換されたまたは置換されていないアンモニウム基を表す）の塩を形成する。任意に、例えば国際公開第０２／０６２６６号パンフレットで述べられるように、ＹがＨである場合、相応する式（６）の化合物への転換が加水分解に続く。
【００８４】
国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットに従って、式（６）の塩を相応する式７、
【化７】
2008541693.tif 000013
（式中、Ｒ２およびＲ３は上で定義されたとおりであり、Ｒ５は（例えば国際公開第０２／０６２６６号パンフレットで述べられるように）それ自体に知られている様式で、上でＲ２およびＲ３について述べられたの同じ基を表してもよい）のエステルにさらに転換してもよい。
【００８５】
例えばＲ５は、メチル、エチル、プロピル、イソブチルまたはｔｅｒｔブチル基を表してもよい。本発明に従ったプロセスで調製できる式８のエステルの重要な基は、ｔｅｒｔブチルエステルである（Ｒ５がｔｅｒｔブチルを表す）。
【００８６】
本発明の特別な態様では、国際公開第０３／１０６４４７号パンフレットおよび国際公開第０４／０９６７８８号パンフレットの９頁２行〜１０頁２行で述べられるプロセスに従って、式（６）の塩を例えばトルエンなどの不活性溶剤中で酸塩化物形成剤と接触させることで相応する酸塩化物を形成し、形成された酸塩化物をＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で式Ｒ５ＯＨ（式中、Ｒ５は上に定義したとおりである）のアルコールに接触させることで、式（６）の塩が相応する式（７）のエステルに転換される。
【００８７】
本発明のプロセスを使用して調製された化合物は、医薬品の活性成分の調製において、例えばＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害物質の調製において、より具体的には、例えばロバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、シムバスタチン、プラバスタチン、およびフルバスタチンなどのスタチン、特にＭ．ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら著、「将来の薬剤（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ）」（１９９９年）、２４（５）、Ｂｉｏｏｒｇ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９７年）、５（２）、４３７〜４４４頁で述べられるＺＤ−４５２２の調製において特に有用である。したがって本発明は、スタチン合成のために使用できる化合物、特に式（１）の化合物の調製のための新しい経済的に魅力的な経路を提供する。このような調製の特に興味深い例は、Ａ．クリーマン（Ｋｌｅｅｍａｎｎ）、Ｊ．エンゲル（Ｅｎｇｅｌ）著「医薬物質、合成、特許、応用（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐａｔｅｎｔｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」第４版、２００１年、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、１４６〜１５０頁で述べられるようなアトロバスタチンカルシウムの調製である。
【００８８】
したがって本発明はまた、本発明のプロセスおよびそれ自体に知られているさらなるプロセス段階を使用して、本発明に従ったプロセスで得られた化合物が、スタチン、好ましくはアトルバスタチン、または例えばそのカルシウム塩などのその塩にさらに転換するプロセスにも関する。このようなプロセスは、当該技術分野でよく知られている。
【００８９】
ここで決して限定されることなく、次の実験的結果によって本発明について述べる。
【００９０】
実験
一般的部分
改善された抵抗性または生産性があるＤＥＲＡ突然変異体を同定する方法。
改善された抵抗性または生産性があるＤＥＲＡ突然変異体を同定する２つの方法を使用できる。一方法はクロロアセトアルデヒドに対するＤＥＲＡ突然変異体の抵抗性を調べ、もう一つは基質としてクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを使用した、６−クロロ−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−エリスロヘキサピラノシド（ＣＴｅＨＰ）生成におけるＤＥＲＡ突然変異体の生産性を評価する。第１の方法は、天然ＤＥＲＡ基質２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートを基質として使用して、標準ＤＥＲＡ天然基質活性アッセイのマイクロタイターベースの形態を使用して、クロロアセトアルデヒドに対するＤＥＲＡ突然変異体の抵抗性を調べる。第２の方法は、質量分光分析（ＧＣ／ＭＳ）法に連結した高速大量処理ガスクロマトグラフィーを使用して、アセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド各１個の分子のＤＥＲＡ触媒アルドール反応の生成物であり、したがってＣＴｅＨＰへの反応の中間体である、４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）の生成において、基質としてのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドに対するＤＥＲＡ突然変異体の生産性を分析する。
【００９１】
溶液中のタンパク質濃度判定
無細胞抽出物（ｃｆｅ）などの溶液中のタンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４頁（１９７６年）で述べられるように、変性タンパク質−染料結合法を使用して判定された。適切な希釈液中の各５０μｌのサンプルを９５０μｌの試薬（４６ｍｌのエタノールおよび１００ｍｌの８５％オルト−リン酸に溶解し、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１，０００ｍｌにした１００ｍｇのブリリアントブルーＧ２５０）と共に、室温で少なくとも５分間インキュベートした。波長５９５ｎｍにおける各サンプルの吸収をパーキン・エルマー・ラムダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ）２０  ＵＶ／ＶＩＳ分光計内で測定した。既知濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ〜０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲）を含有する溶液で判定された検量線を使用して、サンプル中のタンパク質濃度を計算した。
【００９２】
ＤＥＲＡ生産性係数試験
クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性、または増大するＣＨＢＡ形成を示す、双方の方法から選択されたクローンは、ＤＥＲＡ生産性係数試験を使用して、ＣＴｅＨＰの形成におけるそれらの生産性に関して特徴付けられる。この特性決定では、１．０と１．４ｍｇの間のｃｆｅを含有する容積のｃｆｅを総容積０．２ｍｌ中の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（最終ｐＨ＝７．２）中の０．０４ｍｍｏｌのクロロアセトアルデヒドおよび０．０９３ｍｍｏｌのアセトアルデヒドと共に、撹拌しながらインキュベートする。１６時間後、９容積のアセトンまたはアセトニトリルの添加によって反応を停止させ、１６，０００×ｇで１０分遠心分離する。それらのＣＴｅＨＰおよびＣＨＢＡ含量のためのＦＩＤ検出器を使用して、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）からのクロモパック（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）ＣＰ−ＳＩＬ８ＣＢカラム上でのガスクロマトグラフィーによって上清を分析する。野生型または変異ＤＥＲＡを含有する１ｍｇの無細胞抽出物タンパク質によって、室温（２５℃）でｐＨ７．２において１６時間内に、基質濃度０．２Ｍクロロアセトアルデヒドおよび０．４Ｍアセトアルデヒドで形成されたｍｍｏｌでのＣＴｅＨＰ量が、「ＤＥＲＡ生産性係数」と定義される。
【００９３】
ＤＥＲＡ天然基質活性アッセイ
ＤＥＲＡ活性の推定のために、ＤＥＲＡ天然基質反応中の初期活性である、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートのアセトアルデヒドおよびＤ−グリセルアルデヒド３−ホスフェートへのアルドール開裂を室温（ＲＴ）で判定できる。１０μｌの無細胞抽出物を１４０μｌの５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）中に移す。５０μｌの補助酵素および基質混合溶液（０．８ｍＭ  ＮＡＤＨ、２ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェート、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からのトリオースホスフェートイソメラーゼ（３０Ｕ／ｍｌ）、およびロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）からのグリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）を添加して活性アッセイを開始する。３０秒後に５０μｌの停止液（６Ｍ塩酸グアニジン塩、１００ｍＭリン酸水素ナトリウム、１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５）を添加して反応を停止する。存在する初期ＤＥＲＡ活性は、３４０ｎｍの波長でサンプルのＵＶ−吸光度を測定して判定される。１個のＮＡＤＨ分子の消費は、１個の２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェート分子の開裂に相当する。実施例１−クロロアセトアルデヒドに対する改善された抵抗性があるＤＥＲＡ突然変異体
【００９４】
ランダム変異誘発による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）変異型ｄｅｏＣライブラリーの構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ酵素［配列番号１］をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ遺伝子［配列番号６］のランダム変異誘発ライブラリーの構築のために、クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）多様化ＰＣＲランダム変異誘発キットを使用した。供給業者のマニュアルに従って、様々なＭｎＳＯ４濃度で（それによって濃度が高いほどより多くの突然変異が導入される）いくつかの反応を実施し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ遺伝子中の１〜３個の点突然変異を得て、ＤＥＲＡ酵素アミノ酸配列中の１〜２個のアミノ酸交換を得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）２−デオキシ−Ｄ−リボース５−リン酸アルドラーゼ［配列番号１］をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｅｏＣ遺伝子［配列番号６］の増幅のために、プライマーＤＡＩ  １３６００およびＤＡＩ  １３４６５（それぞれ［配列番号４］および［配列番号５］に相応する）をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。双方のプライマーは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）技術を使用した部位特異的遺伝子組み換えによって、得られたＰＣＲ増幅ｄｅｏＣ遺伝子断片をクローニングするのに適合性の部位を含有した。
【００９５】
順方向プライマー（ＤＡＩ１３６００）の配列：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＣＡＧ  ＣＣ  ３’  ［配列番号４］
逆方向プライマー（ＤＡＩ  １３４６５）の配列：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  Ｃ  ３’  ［配列番号５］
【００９６】
エラープローンＰＣＲ増幅は、次の温度プログラムを使用した。９４℃で２分間、９４℃で３０秒間および６８℃で１分間を２５サイクル、続いて６８℃で１０分間。エラープローンＰＣＲ断片を最初にインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＯＮＲベクター中にクローンし、２０，０００個を超えるコロニーから開始して、大規模ｐＥＮＴＲクローンプラスミド調製品を作成した。次にインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４ベクターを使用して、これらのｐＥＮＴＲ調製品を発現コンストラクト構築のために使用した。次にＤＥＲＡ酵素突然変異体をコードする突然変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ遺伝子の発現のために、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に、発現コンストラクトを形質転換する。
【００９７】
ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異ｄｅｏＣ遺伝子の発現
ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｘ）Ｑ−ピックを使用して、コロニーをＱ−トレーから拾い、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）内の２００μｌの２＊ＴＹ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）培養物に接種して、次に、これらの前培養を旋回振盪機上で、２５℃で２日間、または３７℃で一晩のいずれかで生育させた。前培養から１００μｌを使用して、ディープウェルプレート内の５００μｌの発現培養（２＊ＴＹ、１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ）に接種した。次にこれらの発現培養を旋回振盪機上で３７℃で２４時間生育させた。
【００９８】
マイクロタイタープレートＤＥＲＡ安定性アッセイ
クロロアセトアルデヒドに対する突然変異ＤＥＲＡ酵素の抵抗性の検査のために、ＤＥＲＡ天然基質反応に基づくアッセイを用いることができる。ディープウェル発現培養を４，０００回転／分（ｒｐｍ）で１５分間遠心分離し、得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペレットを４００μｌのＢ−ＰＥＲ溶解緩衝液（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）からの２５％ｖ／ｖ  Ｂ−ＰＥＲＩＩ、７５％（ｖ／ｖ）５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５、１００ｍｇ／ｌのＲＮＡ分解酵素Ａ）中で溶解する。１２０ｍＭクロロアセトアルデヒドを超えるクロロアセトアルデヒド濃度では、２００ｍＭトリエタノールアミンを使用する。遠心分離（４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）によって細胞残骸を除去し、各ウェルからの２１０μｌの無細胞抽出物を新しいマイクロタイタープレートに移す。ＤＥＲＡ活性の推定のためには、上述のようにＤＥＲＡ天然基質活性アッセイを使用して、ＤＥＲＡ天然基質反応中の初期活性を判定する。残る２００μｌの容積の無細胞抽出物を取って、５０μｌのクロロアセトアルデヒド溶液を添加し、ＤＥＲＡ突然変異体のクロロアセトアルデヒドに対する抵抗性を調べる。
【００９９】
スクリーニングの第１ラウンドでは、６００ｍＭクロロアセトアルデヒド原液、第１の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリーのスクリーニングのためには１．０Ｍ原液、そして第２の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリーのためには１．５Ｍ原液を使用して、それぞれ１２０、２００、および３００ｍＭクロロアセトアルデヒドの最終濃度をもたらした。全ての場合で、曝露時間は２分間であった。その後、５０μｌのサンプル（エラープローンＰＣＲライブラリー）、３０μｌのサンプル（第１の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリー）または２５μｌのサンプル（第２の遺伝子組み換え突然変異体ライブラリー）をそれぞれ採取して、５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５、最終容積２００μｌ）を含有するマイクロタイタープレートに移した。初期ＤＥＲＡ活性と同様に、５０μｌの補助−酵素／基質混合物を添加してＤＥＲＡ天然基質反応に対する残るＤＥＲＡ活性を判定した。５０μｌの停止溶液を添加する前に、ＤＥＲＡ天然反応アッセイを３０秒間進行させた。消費ＮＡＤＨ量を判定するために、サンプルのＵＶ−吸光度を３４０ｎｍで測定した。
【０１００】
平滑末端制限酵素（ＢＥＲＥ）遺伝子組み換えを使用した（国際公開第０３／０１０３１１号パンフレットに従った）好ましい突然変異の遺伝子組み換え
それらの突然変異の遺伝子組み換えによるＤＥＲＡのさらなる改善の基礎として、エラープローンＰＣＲライブラリーから選択された突然変異体クローンを使用した。保存培養から、選択された突然変異体クローンのプラスミドＤＮＡを単離してテンプレートとして使用し、突然変異遺伝子を増幅した。得られた突然変異体遺伝子ＰＣＲ断片を平滑末端切断制限エンドヌクレアーゼで消化して、アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）およびハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）からのＤＮＡポリメラーゼを使用して、得られた遺伝子断片を全長遺伝子に再構築した。遺伝子組み換えのためには、制限エンドヌクレアーゼＨａｅｌｌｌ、ＨｉｎＣＩＩ、およびＦｓｐｌ（プールＡ）およびＣａｃｌ８またはＢｓｔＵｌ（プールＢ）を使用して、２個の遺伝子断片プールを作成した。各プールからの０．５μｇの遺伝子断片ＤＮＡとのアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）反応（５０μｌ総容積）では、次の温度プログラムを使用した：９４℃で２分間、９４℃で３０秒および６０℃で１分間を３０サイクル、および最終６０℃サイクルを１０分間。２０μｌのアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）反応をエタノール沈殿させてＤＮＡペレット（約０．４μｇのＤＮＡ）を４０μｌ滅菌水に溶解し、遺伝子組み換え突然変異体遺伝子のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）からのＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ）を使用したＰＣＲ反応（５０μｌ容積）では、プライマーＤＡＩ１３６００（［配列番号４］）およびＤＡＩ１３４６５（［配列番号５］）をそれぞれ順方向および逆方向プライマーとして使用した。次のＰＣＲプログラムを使用した：７２℃で５分間、９４℃で３０秒間と５０℃で３０秒間と７２℃で４５秒間とを１５サイクル、最終７２℃サイクルを１０分間。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して得られた全長突然変異体遺伝子断片を精製し、上述のように部位特異的遺伝子組み換えを使用してｐＤＥＳＴ１４ベクター中にクローンした。
【０１０１】
改善されたクロロアセトアルデヒド抵抗性があるＤＥＲＡ突然変異体の再検査
ＤＥＲＡ酵素突然変異体前培養を冷凍グリセロールマスタープレートから接種し、２５℃において１８０ｒｐｍで振盪しながら一晩インキュベートした。前培養アリコートを使用して、２５ｍｌの発現培養（２＊ＴＹ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ）を接種し、２５℃で３６時間（１８０ｒｐｍで振盪しながら）インキュベートした。遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１５分）によって細胞を収集し、２．５ｍｌのＢ−ＰＥＲ  ＩＩを使用して細胞ペレットを溶解した。最初に５，０００ｒｐｍで１５分間、次にエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）卓上遠心分離器を１４，０００ｒｐｍ（４℃）で１５分間使用して、細胞の残骸を遠心分離によって除去した。得られた無細胞抽出物を使用して、経時変化実験において濃度範囲にわたり、クロロアセトアルデヒドに対する発現したＤＥＲＡ突然変異酵素の抵抗性を検査した。
【０１０２】
経時変化実験では、サンプル中に存在する初期ＤＥＲＡ天然基質反応活性を四連で判定した。適量のＤＥＲＡ活性がある規定容積の抽出物を２００ｍＭクロロアセトアルデヒドに曝露し、クロロアセトアルデヒド添加後ｔ＝１、ｔ＝５、ｔ＝１０、ｔ＝１５、およびｔ＝２０分の時点でアリコートを採取して、ＤＥＲＡ天然基質活性アッセイを使用して四連でＤＥＲＡ活性の残量を測定した。判定された初期ＤＥＲＡ天然基質活性を１００％に設定し、示した時点で判定された活性を前記初期開始ＤＥＲＡ天然基質活性に対する百分率で表した。
【０１０３】
クロロアセトアルデヒド抵抗法の結果
上述の抵抗法を使用して、約１０，０００個のクローンを調べた。初期安定性キャンペーンでは、エラープローンＰＣＲ由来突然変異ＤＥＲＡ酵素を１５０ｍＭクロロアセトアルデヒドに２分間曝露した。遺伝子組み換え変異体のスクリーニングのために、クロロアセトアルデヒド濃度を第１の遺伝子組み換えでは２００ｍＭ、第２の遺伝子組み換えラウンドでは３００ｍＭにそれぞれ増大させた。選択された突然変異体クローンを同一設定を使用して三連で再調査した。初期結果と同様似に機能するクローンを選択し単離した。
【０１０４】
ＢＥＲＥ−方法を（上述のように）使用して、これらの選択クローンのプールされた突然変異ｄｅｏＣ遺伝子を無作為に遺伝子組み換えした。第１の遺伝子組み換えラウンドでは１，０００個のクローンを２００ｍＭクロロアセトアルデヒドで調査した。クロロアセトアルデヒドに対する少なくとも５０％の抵抗性増大を示す２２個のクローンを単離した。これらの突然変異体クローンをマスタープレートから再度単離し、発現ベクターを精製して、ＰＣＲによって変異遺伝子を増幅しプールした。第２の遺伝子組み換えラウンドでは、３００ｍＭクロロアセトアルデヒドで２分間のインキュベーション時間後に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡと比べて少なくとも２倍の抵抗性増大を示す、４１個のＤＥＲＡ酵素突然変異体を同定した。
【０１０５】
ＤＥＲＡ天然基質反応活性アッセイを適用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡに並行して、第２ラウンドの１０個の最良の突然変異体を２００ｍＭクロロアセトアルデヒドに対するそれらの抵抗性について２５ｍｌの発現培養から再試験した。結果は３個の独立した実験の平均であり、ＤＥＲＡ酵素突然変異体の名称およびアミノ酸交換を含む表４中で、０ｍＭクロロアセトアルデヒドにおける各値と比べた％残留ＤＥＲＡ活性として示される。
【０１０６】
【表６】
2008541693.tif 000014
【０１０７】
実施例２−改善されたＣＨＢＡ生産性があるＤＥＲＡ突然変異酵素
それぞれ１分子のアセトアルデヒドとクロロアセトアルデヒドのアルドール化によって形成される、４−クロロ−３−（Ｓ）−ヒドロキシ−ブチルアルデヒド（ＣＨＢＡ）の生産性増大があるＤＥＲＡ突然変異体のスクリーニングのために、約３，０００個の突然変異体クローンのライブラリーを構築した。エラープローンＰＣＲ断片をｐＥＮＴＲベクターの単離なしにｐＤＥＳＴ１４ベクター中に直接クローンして、発現ライブラリーの遺伝的多様性を最大化したこと以外は、実施例１で述べられるようにしてエラープローンＰＣＲ、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニング、およびＤＥＲＡ突然変異体発現を実施した。
【０１０８】
ＧＣ／ＭＳを用いた生産性方法によるサンプル調製
２００ｍＭクロロアセトアルデヒドおよびアセトアルデヒドを基質として使用して、ＣＨＢＡ生成物形成を調べるＧＣ／ＭＳベースの生産性方法のために、クロロアセトアルデヒド抵抗性スクリーニングと同様に、６００μｌの発現培養から無細胞抽出物を調製できる。旋回振盪機上のディープウェルプレート中で２４時間インキュベートされた発現培養を遠心分離する（４０００ｒｐｍで１５分間）。得られた細胞ペレットを３５０μｌの５０％（ｖ／ｖ）Ｂ−ＰＥＲＩＩ、５０％（ｖ／ｖ）２５０ｍＭＮａＣＯ３、ｐＨ７．５に溶解する。上述のようにして、細胞の残骸を遠心分離によって除去する。突然変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ酵素を含有する１００μｌのｃｆｅを１００μｌのアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒド双方の４００ｍＭ溶液と混合する。室温で１時間のインキュベーション後、生成物定量のための内部標準（ＩＳ）の役目をする０．０５％（ｗ／ｗ）シクロヘキシルベンゼンを含有する９００μｌのアセトニトリルに、１００μｌの各反応物を添加する。タンパク質沈殿物を遠心分離によって除去し、５００μｌの各サンプルを新しいディープウェルマイクロタイタープレートに移す。
【０１０９】
ハイスループットＧＣ／ＭＳによる４−クロロ−３−ヒドロキシ−ブチルアルデヒドの分析
アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）からのＨＰ５９７３質量検出器に連結したヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０型ガス・クロマトグラフ上で、サンプルをそれらのＣＨＢＡ含量について分析した。自動化された注入器を通じて、マイクロタイタープレートから直接、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）からのクロムパック（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）ＣＰ−ＳＩＬ１３ＣＢカラム上にサンプルを注入した。キャリアガスとして１．１ｍｌ／分の一定流量のヘリウムと共に、１００℃から２５０℃への温度プログラムを２分以内で実施した。単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）によって、内部標準（Ｍ＝４５、ｔ＝０〜２．８０分）およびＣＨＢＡ（Ｍ＝１６０、ｔ＝２．８０分から方法終了まで）の特徴的なイオンが検出された。１個のサンプルの総サイクル時間（注入から注入まで）は５分未満であった。
【０１１０】
生産性方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡと比べて少なくとも３倍のＣＨＢＡ濃度増大がある、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡの７個の酵素突然変異体をもたらした。上述のようにＤＥＲＡ生産性係数試験を使用して、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡと比較して、それらのＤＥＲＡ生産性係数（１６時間内にｃｆｅ中のタンパク質１ｍｇあたり生成されたＣＴｅＨＰのｍｍｏｌ）を判定し、選択された突然変異体クローンを再試験した。
【０１１１】
２．５ｍｌルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ＬＢ）前培養（１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する）に全ての再形質転換突然変異体クローンの単一コロニーを接種して、２８℃で１８０ｒｐｍで振盪しながら一晩インキュベートした。これらの前培養から１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する５０ｍｌのＬＢ発現培養を０．０５のＯＤ６２０ｎｍの細胞密度に接種して、旋回振盪機（１８０ｒｐｍ）上において２８℃で培養した。３時間のインキュベーション後に、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって突然変異ＤＥＲＡの発現を誘発し、２１時間後、遠心分離（５，０００×ｇで５分間）によって光学濃度約０．４の細胞を収集し、１ｍｌの５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．２）に再懸濁した。細胞懸濁液の５分間の超音波処理（１０秒間のパルス続いて１０秒間の中断）および４℃において１６，０００×ｇでの１時間遠心分離によって無細胞抽出物（ｃｆｅ）を得た。後でＤＥＲＡ生産性係数試験において使用するまで、ｃｆｅを４℃で保存した。生産性方法によって見いだされたＤＥＲＡ酵素突然変異体の名称およびアミノ酸交換を表５に列挙する。
【０１１２】
【表７】
2008541693.tif 000015
【０１１３】
実施例３−ＤＥＲＡ突然変異体９−１１ＨによるＣＴｅＨＰ合成のスケールアップ
実施例２で述べられるようにして、それぞれプラスミドｐＤＥＳＴ１４−Ｅｃｏｌ−ｄｅｏＣおよびｐＤＥＳＴ１４＿９−１１Ｈ（Ｆ２００Ｉ突然変異体）と共に、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を新たに形質転換した。２つの５０ｍｌ  ＬＢ前培養（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する）に各形質転換寒天プレートから単一コロニーを接種して、２８℃において旋回振盪機（１８０ｒｐｍ）上で一晩インキュベートした。
【０１１４】
翌日、それぞれ１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを添加した１ＩのＬＢ培地を含有する滅菌エルレンマイアーフラスコに、５０ｍｌ前培養を開始細胞密度ＯＤ６２０＝０．０５に接種して、振盪（１８０ｒｐｍ）しながら２８℃でインキュベートした。細胞密度ＯＤ６２０≒０．６で１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の野生型ＤＥＲＡの発現、およびアミノ酸交換Ｆ２００Ｉを含有するそれに由来する突然変異ＤＥＲＡ９−１１Ｈが誘導された。総培養時間２１時間まで、同一条件下で培養をさらにインキュベートした。この時点で、遠心分離（５０００×ｇで５分間）によって双方の培養を収集し、２５ｍｌの５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．２）に細胞ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液の２回５分間（１０秒間パルス、続いて１０秒間休止、大型プローブ）の超音波処理および４℃において３９，０００×ｇで１時間の遠心分離によって無細胞抽出物を得た。後程使用するまでｃｆｅを４℃に保った。上述のように、しかし５ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートを用いてＤＥＲＡ天然基質活性アッセイによって判定された双方のｃｆｅの比活性は、同一範囲内であった。
【０１１５】
スケールアップした反応のために、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ７．２）を含有する５０ｍｌの総容積中で、１０ｍｍｏｌクロロアセトアルデヒドおよび２３ｍｍｏｌアセトアルデヒドをそれぞれ１．５ｋＵの野生型および突然変異ＤＥＲＡ  Ｆ２００Ｉと共に、室温で撹拌しながらインキュベートした。反応を５時間かけて行い、１００μｌのサンプルを反応経路の異なる時点で採取した。これらの５時間経過後、９００μｌのアセトニトリルの添加、および１０分間の１６，０００×ｇの遠心分離によってサンプル中の酵素反応を停止した。それらのＣＴｅＨＰおよびＣＨＢＡ含量のためにＦＩＤ検出器を使用して、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）からのクロムパック（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）ＣＰ−ＳＩＬ８ＣＢカラム上でガスクロマトグラフィーによって上清を分析した。これらのサンプル中で判定された各濃度を表６に示す。
【０１１６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ突然変異体Ｆ２００Ｉは、クロロアセトアルデヒド１ｍｍｏｌあたり１５０Ｕを用いると、２および４時間後に、それぞれ存在するクロロアセトアルデヒドからＣＴｅＨＰへの８１および８６％の転換を示す。Ｕとは１単位の酵素を意味し、それはＤＥＲＡ天然基質活性アッセイ条件下で、１分以内に１μｍｏｌの２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートを転換するのに必要な酵素量である。反応の始めにおいてのみ、少量の中間体ＣＨＢＡが検出可能である。クロロアセトアルデヒド１ｍｍｏｌあたり１５０Ｕの野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡとの反応においては、ＣＨＢＡは検出されず少量のＣＴｅＨＰのみが検出可能である。野生型ＤＥＲＡでは、インキュベーション時間２および４時間後に、それぞれクロロアセトアルデヒドからＣＴｅＨＰへの７％および８％の転換が見いだされた。したがって同一時間枠内で、発見された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２突然変異ＤＥＲＡ  Ｆ２００Ｉは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡよりも約１１〜１２％高い転換を示した。
【０１１７】
【表８】
2008541693.tif 000016
【０１１８】
実施例４−野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡのＦ２００の飽和変異誘発
Ｆ２００Ｘ点突然変異の導入
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キットを使用して、供給業者のマニュアルに従って以下の変異誘発プライマーにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ｄｅｏＣ遺伝子［配列番号６］中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡアミノ酸配列［配列番号１］の位置２００のアミノ酸残基フェニルアラニンをコードするＤＮＡ配列の全ての可能な６４コード配列（Ｘは上に列挙するような２０個のタンパク質新生アミノ酸および３個の終止コドンを画定する）への交換を実施した。
【０１１９】
Ｆ２００Ｘ＿順方向４３
５’  ＧＣ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＮＮＮ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＧ  ＣＧ  ３’
［配列番号９］
Ｆ２００Ｘ＿逆方向４３
５’  ＣＧ  ＣＡＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＮＮＮ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＴＡＣ  ＧＣ  ３’
［配列番号１０］
【０１２０】
（Ｎは、４個のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴのいずれかを表す）。テンプレートとしては、国際公開第０３／００６６５６号パンフレットで述べられる手順に従って、プラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の複数クローニング部位のＮｃｏｌおよびＥｃｏＲｌ制限部位中にクローンされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ｄｅｏＣ遺伝子を使用した。
【０１２１】
供給業者のプロトコルで述べられるようにして得られるＰＣＲ生成物をＤｐｎｌ消化し、引き続いてインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのワンショット（ＯｎｅＳｈｏｔ）ＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を形質転換するのに使用した。１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有する選択ＬＢ培地上に播種後、無作為に選択された独立コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足した１ｍｌの２＊ＴＹ培地を含有する４つのディープウェルマイクロタイタープレートに、ウェルあたり１個の独立コロニーを使用して接種した。各プレートで、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０コロニーを３つのウェルに接種し、クローンされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）野生型ｄｅｏＣ遺伝子［配列番号６］、および［配列番号６］のＴ７０６Ａ突然変異を示し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＲＡアミノ酸配列［配列番号１］の位置２００において、フェニルアラニンからイソロイシンへのアミノ酸交換をもたらす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｅｏＣ遺伝子が、それぞれ対照の役目をした。
【０１２２】
Ｆ２００Ｘライブラリーの培養、発現、およびスクリーニング
２５℃において３００ｒｐｍでキューナー（Ｋｕｅｈｎｅｒ）ＩＳＦ−１−Ｗ旋回振盪機（５０ｍｍ振幅）上で、接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを２日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異ｄｅｏＣ変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの６５μｌを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−アラビノースを補足した９３５μｌの滅菌２＊ＴＹ培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
【０１２３】
引き続いて発現培養をキューナー（Ｋｕｅｈｎｅｒ）ＩＳＦ−１−Ｗ旋回振盪機上で２４時間インキュベートした（５０ｍｍ振幅、３７℃、３００ｒｐｍ）。ウェルあたり総容積５００μｌの溶解緩衝液を使用したこと以外は、実施例２で述べられるようにして細胞収集および溶解を実施した。実施例２で述べられるようにして、しかし２０時間、基質インキュベーションを実施した。ＧＣ／ＭＳ分析における生成物定量化の内部標準の役目をする１０００ｐｐｍシクロヘキシルベンゼンを含有する１ｍｌアセトニトリルの各ウェルへの添加によって、反応を停止した。実施例２で述べられるようにして実施されるＧＣ／ＭＳ分析による生成物定量化に先だって、タンパク質を遠心分離（４℃において５，０００ｒｐｍで３０分間）によって沈殿させた。
【０１２４】
ＣＴｅＨＰ形成に少なくとも２．５倍の上昇がある、全部で１４個のクローンが同定された（表７参照）。これらの１４個のクローンの内、７個はバリンに、６個はイソロイシンに、１個はメチオニンに、それぞれ３個の各アミノ酸のための可能な全てのコドンによるＦ２００の突然変異を含有した。これらの全１４個のクローンのＤＮＡシーケンシング結果によれば、ｄｅｏＣ遺伝子の追加的突然変異は起きなかった。
【０１２５】
ＤＥＲＡ生産性係数試験によるＦ２００Ｘ「ｈｉｔｓ」の再試験
上述のようにＤＥＲＡ生産性係数試験に従った大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡとの比較で、これらの１４個のクローンを再試験した。この目的で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＣベースのシステムが使用されて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ遺伝子変異体の発現が１ｍＭＩＰＴＧによる代わりに、対数増殖期中期の０．０２％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースの添加によって誘発されたこと以外は、実施例２で述べられるようにして１４個のクローンを５０ｍｌ規模で培養し、無細胞抽出物を調製した。
【０１２６】
Ｆ２００Ｖ変異体は、スクリーニングおよびＤＥＲＡ生産性係数において、このスクリーニングから得られたＦ２００Ｉ変異体と比較できるＣＴｅＨＰ形成を示した。Ｆ２００Ｍ変異型は、Ｆ２００ＶおよびＦ２００Ｉ変異体よりもわずかに低いＤＥＲＡ生産性係数を示したが、それでもなお大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡ生産性係数と比べて１０倍を超えて増大する（１０００％を超える）。
【０１２７】
【表９】
2008541693.tif 000017
【０１２８】
Ｆ２００Ｘ反応のスケールアップ
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡのＦ２００位置の飽和変異誘発によって見いだされた３個のアミノ酸置換Ｆ２００Ｉ、Ｆ２００Ｖ、およびＦ２００Ｍをより詳しく調査するために、クロロアセトアルデヒド濃度０．６Ｍおよびアセトアルデヒド濃度１．２ＭでのＣＴｅＨＰ形成におけるそれらの性能について、選択されたクローンの規定量の無細胞抽出物を調査した。
【０１２９】
それらの各ｃｆｅ中の１５μｇのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、クローン１−Ｄ１０（Ｆ２００Ｍ）、２−Ｈ８（Ｆ２００Ｖ）、および３−Ｃ１０（Ｆ２００Ｉ）をそれらの発現レベルについて調査した。突然変異酵素の発現レベルは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡと同一であることが検証された。２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートとのＤＥＲＡ天然基質反応中の酵素活性は、それぞれＦ２００Ｍで２９Ｕ／ｍｇ、Ｆ２００Ｖで３８Ｕ／ｍｇ、Ｆ２００Ｉで３６Ｕ／ｍｇ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２の野生型ＤＥＲＡで５４Ｕ／ｍｇであった。
【０１３０】
ＣＩＡＡ反応では、各無細胞抽出物からの３ｍｇの総タンパク質を総容積１ｍｌ中で使用した。全ての反応を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ７．２）中で、室温において穏やかに撹拌しながら実施した。ＣＴｅＨＰ形成の定量化のためには、１００μｌのサンプルを反応経過中の異なる時点で採取した。サンプル中の酵素反応を９００μｌのアセトニトリル（内部標準として１，０００ｐｐｍシクロヘキシルベンゼンを含有する）の添加によって停止し、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。それらのＣＴｅＨＰ含量のためにＦＩＤ検出器を使用して、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）からのクロムパック（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ）ＣＰ−ＳＩＬ８ＣＢカラム上でガスクロマトグラフィーによって上清を分析した。この分析結果を表８に示す。
【０１３１】
【表１０】
2008541693.tif 000018
【０１３２】
これらの結果は、ＣＩＡＡおよびアセトアルデヒドからＣＴｅＨＰへの転換のために、アミノ酸位置Ｆ２００におけるＦ２００Ｉ、Ｆ２００Ｖ、およびＦ２００Ｍ置換が有益な突然変異であることを検証する。
【０１３３】
実施例５−ΔＹ２５９と組み合わさったＦ２００Ｉ突然変異、Ａ２５９および［配列番号３］によるＣ−末端延長と組み合わさったＦ２００Ｉ突然変異
ＰＣＲベースの部位特異的変異誘発アプローチを使用して、Ｆ２００Ｉ交換をそれぞれ、（ｉ）Ｃ−末端Ｙ２５９残基の欠失、および（ｉｉ）その置換に加えたアミノ酸配列ＫＴＱＬＳＣＴＫＷ［配列番号３］による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡのＣ−末端延長で遺伝子組み換えした。各突然変異体を含んでなるおよそ３０〜５０個のヌクレオチドのＰＣＲプライマーをそれぞれ順方向および逆方向で合成した。２つの別個のＰＣＲ反応で、これらの変異誘発プライマーをそれぞれインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのゲータウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）システム特異的順方向および逆方向プライマーまたは追加的変異誘発順方向および逆方向プライマーと組み合わせて、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＤＥＳＴ１４中でクローンされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２［配列番号６］からの野生型ｄｅｏＣ遺伝子に使用した。
【０１３４】
ゲータウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）システム特異的順方向プライマー配列：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ３’
［配列番号１１］
ゲータウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）システム特異的逆方向プライマー配列：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ３’
［配列番号１２］
Ｆ２００Ｉ順方向
５’  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  Ｇ  ３’
［配列番号  １３］
Ｆ２００Ｉ逆方向：
５’  ＣＣＧ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＡＣＧ  Ｇ  ３’
［配列番号  １４］
ΔＹ２５９逆方向：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＣＣ  ３’
［配列番号  １５］
Ｃ−延長３逆方向：
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＧＴＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＧＣ  ＴＣ  ３’
［配列番号１６］
【０１３５】
生じた部分的ｄｅｏＣ遺伝子断片をゲル精製して、テンプレートｄｅｏＣ断片ＤＮＡによる引き続くＰＣＲ反応の汚染を防止した。得られた断片をＰＣＲ反応で使用して、所望の突然変異を含有する変異型全長ｄｅｏＣ遺伝子断片を再構築した。次に供給業者のワンチューブプロトコルに従って、全長変異型ｄｅｏＣ断片をｐＤＥＳＴ１４ベクター中にサブクローンした。挿入断片を完全に配列決定して、所望の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ突然変異体発現コンストラクト中に好ましくない変更が起きていなかったことを確認した。
【０１３６】
得られた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ変異体Ｆ２００Ｉ／ΔＹ２５９およびＦ２００Ｉ／ΔＹ２５９＋配列番号３は、クロロアセトアルデヒドの不在下でＤＥＲＡ天然基質活性アッセイによって、２−デオキシ−Ｄ−リボース５−ホスフェートに対して非常にわずかな触媒活性を示した。したがって過剰発現したＤＥＲＡ変異体は、ウォン（Ｗｏｎｇ）および共同研究者ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１２）、３３３３〜３３３９（１９９５年）で述べられるような手順に従って、イオン交換クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム分画によって精製された。実施例３および４で述べられるような無細胞抽出物の代わりに、反応容積１ｍｌあたり２．５ｍｇの各精製ＤＥＲＡ（野生型または変異体）の規定量が使用されたこと以外は、実施例３で述べられるようにして、ＣＴｅＨＰ合成について、遺伝子組み換え変異体Ｆ２００Ｉ＋ΔＹ２５９およびＦ２００Ｉ＋ΔＹ２５９＋配列番号３と、ＤＥＲＡ変異型Ｆ２００Ｉおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡとを比較した。８時間後に、精製されたＦ２００Ｉ／ΔＹ２５９およびＦ２００Ｉ／ΔＹ２５９＋配列番号３によって、０．５Ｍ  ＣＩＡＡおよび１．０Ｍアセトアルデヒドの基質濃度で、それぞれ供給アルデヒドのＣＴｅＨＰへの６１％および７０％の転換が得られた（表９）。精製されたＦ２００Ｉでは、０．１１ＭのＣＴｅＨＰ濃度が８時間後に得られ、所望生成物への２３％の転換に相応した。精製大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡでは、非常にわずかなＣＴｅＨＰが形成された。ここでは７％未満の供給アルデヒドが転換された。
【０１３７】
【表１１】
2008541693.tif 000019
【０１３８】
実施例６−ＣＴｅＨＰ生成に関する野生型ＤＥＲＡのスクリーニング
野生型ｄｅｏＣ遺伝子のクローニング
ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニングのためのａｔｔＢ認識配列を含有する遺伝子特異的プライマーを使用して、アエロピラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）Ｋ１（ＧＩ：２４６３８４５７）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（ＧＩ：１７０６３６３）、デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）Ｒ１（ＧＩ：２４６３６８１６）、およびサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８（ＧＩ：７６７４０００）の野生型ＤＥＲＡをコードするｄｅｏＣ遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【０１３９】
Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）５’順方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＣＧＧ  ３’
［配列番号１７］
Ａ．ペルニクス（Ａ．ｐｅｒｎｉｘ）３’逆方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  Ｃ  ３’
［配列番号  １８］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）５’順方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  Ａ  ＡＴ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＴＡＣ  ＡＧ  ３’
［配列番号１９］
枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３’逆方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＴＡ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ３’
［配列番号２０］
Ｄ．ラジオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）５’順方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＣＣ  ３’  
［配列番号２１］
Ｄ．ラジオデュランス（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）３’逆方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＧＣ  ３’
［配列番号２２］
Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）５’順方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＧ  ＡＡＣ  Ｃ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＧＡＧ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  Ｇ  ３’  
［配列番号２３］
Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）３’逆方向
５’  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ３’  
［配列番号２４］
【０１４０】
供給業者のプロトコルに従って４つの野生型ｄｅｏＣ遺伝子をｐＤＥＳＴ１４中にクローンし、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）からの化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）（ＤＥ３）を各ｐＤＥＳＴ１４−ｄｅｏＣコンストラクトで形質転換した。それぞれｐＤＥＳＴ１４−Ｅｃｏｌ−ｄｅｏＣおよびｐＤＥＳＴ１４＿９−１１Ｈを有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ｄｅｏＣ遺伝子および突然変異大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ｄｅｏＣ遺伝子を含有し、［配列番号６］のＴ７０６Ａ突然変異を示して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＥＲＡアミノ酸配列［配列番号１］の位置２００においてフェニルアラニンからイソロイシンへのアミノ酸交換をもたらす大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）（ＤＥ３）株は、対照の役目をした。ＬＢ寒天プレート（１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する）からのこれらの各６株の８個の無作為に選択した独立コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補足した１ｍｌの２＊ＹＴ培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートに接種した。
【０１４１】
野生型ＤＥＲＡの培養、発現、およびスクリーニング
２０℃において３００ｒｐｍでキューナー（Ｋｕｅｈｎｅｒ）ＩＳＦ−１−Ｗ旋回振盪機（５０ｍｍ振幅）上で接種されたディープウェルマイクロタイタープレートを２日間インキュベートし、ディープウェルマイクロタイタープレート内の突然変異ｄｅｏＣ変異体の発現培養のための前培養として使用した。この目的のために、各ウェルの６５μｌを１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、および１ｍＭのＩＰＴＧを補足した９３５μｌの滅菌２＊ＴＹ培地を含有するディープウェルマイクロタイタープレートの相応するウェルに移して、遺伝子発現を誘発した。
【０１４２】
引き続いて発現培養をキューナー（Ｋｕｅｈｎｅｒ）ＩＳＦ−１−Ｗ旋回振盪機上で２４時間インキュベートした（５０ｍｍ振幅、２５℃、３００ｒｐｍ）。総容積５００μｌを使用し、溶解緩衝液がロシュ（Ｒｏｃｈｅ）からの０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅＩ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの２ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．５から構成されたこと以外は、実施例２で述べられるようにして細胞収集および溶解を実施した。実施例２で述べられるようにして、しかし２．５時間で、０．２Ｍクロロアセトアルデヒドおよび０．４Ｍアセトアルデヒドの基質濃度を用いて基質インキュベーションを実施した。ＧＣ／ＭＳ分析における生成物定量化の内部標準の役目をする１０００ｐｐｍシクロヘキシルベンゼンを含有する１ｍｌアセトニトリルの各ウェルへの添加によって、反応を停止した。実施例２で述べられるようにして実施されるＧＣ／ＭＳ分析による生成物定量化に先だって、タンパク質を遠心分離（４℃において５，０００ｒｐｍで３０分間）によって沈殿させた。
【０１４３】
用いたスクリーニング条件下では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ変異型Ｆ２００Ｉ、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株ＤＥＲＡを入れたウェルで、顕著なＤＥＲＡ活性およびＣＨＢＡ形成が検出できた。このスクリーニング条件下では、その他の野生型ＤＥＲＡは、ＤＥＲＡ天然基質アッセイでも生産性スクリーニング法におけるＣＨＢＡまたはＣＴｅＨＰ生成でも活性を示さなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡ変異型Ｆ２００ＩのＣＨＢＡ形成の平均値は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２野生型ＤＥＲＡによるＣＨＢＡ形成よりも約４倍高く、したがって実施例２において同一株背景で得られた値と比較できた。さらに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株野生型ＤＥＲＡは、わずかにより低いＤＥＲＡ天然基質活性と共に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２からの野生型ＤＥＲＡよりも５０％高いＣＨＢＡ生成を示した（表１０）。これは、配列番号１を有してＣＨＢＡおよびＣＴｅＨＰを合成できる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２  ＤＥＲＡより高い生産性がある野生型ＤＥＲＡもまた、実施例２で使用されて述べられるようなＧＣ／ＭＳベースの生産性方法によって見いだせることを意味する。
【０１４４】
【表１２】
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【配列表】
2008541693000001.app
【国際調査報告】
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