(57)【要約】  いくつかの実施形態は、クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドの類似体及びその生成方法に関する。これらの類似体は、ＭＨＣ分子と直接相互作用する残基のアミノ酸置換を含むことができ、改良されているか、改変されているか、又は有用な免疫学的性質を付与することができる。さらに、種々の置換基が非標準残基であるノルロイシン及び／又はノルバリンを含む類似体クラスを開示する。
2008543314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）であり、
Ｐ１が、Ｓ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ又はＨｓｅであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ又はＡｂｕであり、
Ｐ３が、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ又はＡｂｕであり、
Ｐ４がＱであり、
Ｐ５がＨであり、
Ｐ６が、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ又はＡｂｕであり、
Ｐ７がＩであり、
Ｐ８が、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＳａｒであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ又はＬ−ＮＨ2であり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）である配列であって、
ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）ではない配列からなる、単離ペプチド。
【請求項２】
本質的に、配列：
｛Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７２）；又は
Ｓ｛Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７３）；又は
ＳＬ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＱＨＬＩＧＬ（配列番号７４）；又は
ＳＬＬＱＨ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＩＧＬ（配列番号７５）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩ｛Ａ、Ｓ、若しくはＳａｒ｝Ｌ（配列番号７６）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ若しくはＬ−ＮＨ2｝（配列番号７７）；又は
｛Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｍ若しくはＩ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７８）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＶ｝（配列番号７９）；又は
｛Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＶ（配列番号８０）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝ＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８１）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝｛Ｎｖａ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８２）
から成る、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
本質的に配列：
｛Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号８３）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号８４）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ、Ｎｖａ若しくはＬ−ＮＨ2｝（配列番号８５）；又は
ＳＬＬＱＨ｛Ｎｖａ若しくはＡｂｕ｝ＩＧＬ（配列番号８６）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８７）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝｛Ｌ若しくはＮｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８８）
から成る、請求項２に記載の単離ペプチド。
【請求項４】
本質的に配列：
Ｓ｛Ｌ若しくはＮｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８９）；又は
Ｔ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号９０）
から成る、請求項３に記載の単離ペプチド。
【請求項５】
本質的に配列：Ｓ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８７）から成る、請求項４に記載の単離ペプチド。
【請求項６】
クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項７】
前記クラスＩ  ＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２である、請求項６に記載の単離ペプチド。
【請求項８】
クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトにおいてＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）の親和性に類似するか又はこれよりも大きい該クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）において、１〜３つの置換を含む単離ペプチド。
【請求項９】
解離の半減期が、前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項８に記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される、請求項８に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
ペプチドが、請求項１に記載のペプチド配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項１２】
クラスＩ  ＭＨＣ／ＰＲＡＭＥ425-433複合体を認識するＴＣＲと交差反応する、請求項１１に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項１３】
クラスＩ  ＭＨＣ／複合体が、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＲＡＭＥ425-433複合体である、請求項１２に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項１４】
遊離配列に組み込まれた請求項１に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチドを発現する、核酸手段。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の組成物を節内投与することを含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
【請求項２１】
請求項１５に記載の組成物及び免疫賦活剤を節内投与することを含む、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を同調させる方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の組成物を節内投与することを含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は同調させる方法。
【請求項２３】
本質的に、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）であり、
Ｐ１が、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ａｂｕ又はＳａｒであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ又はＡｂｕであり、
Ｐ３がＰ又はＷであり、
Ｐ４がＳであり、
Ｐ５がＩであり、
Ｐ６がＰであり、
Ｐ７がＶであり、
Ｐ８がＨであり、
Ｐ９が、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｓ又はＴであり、
Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｖａ又はＮｌｅであり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在である）である配列であって、
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）ではない配列から成る、単離ペプチド。
【請求項２４】
本質的に、配列：
｛Ｓ、Ｓａｒ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４３）；又は
Ｇ｛Ｍ若しくはＮｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４４）；又は
Ｇ｛Ｌ、Ｉ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４５）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ若しくはＶ｝（配列番号４６）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨ｛Ａ若しくはＳ｝Ｉ（配列番号４７）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号４８）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号４９）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号５０）；又は
Ｇ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５１）；又は
｛Ｓａｒ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５２）；又は
Ａ｛Ｖ、Ｉ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５３）；又は
ＡＶＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５４）；又は
Ａ｛Ｎｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５５）；又は
ＡＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５６）；又は
ＧＶＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５７）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＷＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５８）
から成る、単離ペプチド。
【請求項２５】
本質的に、配列：
｛Ａｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５９）；又は
Ｇ｛Ｖ、Ｎｖａ、若しくはＡｂｕ｝ＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６０）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６１）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｉ若しくはＮｖａ｝（配列番号６２）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号６３）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号６４）；又は
｛Ａ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６５）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＷＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｉ若しくはＶ｝（配列番号６６）；又は
Ａ｛Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６７）；又は
Ａ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号６８）
から成る、単離ペプチド。
【請求項２６】
本質的に、配列：
｛Ａｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５９）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６１）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６９）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号６３）
から成る、請求項２５に記載の単離ペプチド。
【請求項２７】
本質的に配列：ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号７０）から成る、請求項２６に記載の単離ペプチド。
【請求項２８】
クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項２３に記載の単離ペプチド。
【請求項２９】
前記クラスＩ  ＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２である、請求項２８に記載の単離ペプチド。
【請求項３０】
ペプチドが、請求項２３に記載のペプチド配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項３１】
クラスＩ  ＭＨＣ／ＰＳＭＡ288-297複合体を認識するＴＣＲと交差反応する、請求項３０に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項３２】
クラスＩ  ＭＨＣ／複合体が、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＳＭＡ288-297複合体である、請求項３１に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項３３】
遊離配列に組み込まれる請求項２３に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項２３に記載のペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項３５】
請求項３３に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項３７】
請求項２３に記載のペプチドを発現する、核酸手段。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項３９】
請求項３４に記載の組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
【請求項４０】
請求項３３に記載の組成物及び免疫賦活剤の節内投与を含む、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を同調させる方法。
【請求項４１】
請求項３８に記載の組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は同調させる方法。
【請求項４２】
クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の親和性に類似するか又はこれよりも大きい、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）において１〜３つの置換を含む単離ペプチド。
【請求項４３】
解離の半減期が、前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項４２に記載の単離ペプチド。
【請求項４４】
前記ペプチドＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される、請求項４２に記載の単離ペプチド。
【請求項４５】
本質的に、配列：
Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ｝（配列番号９１）；又は
Ｙ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ｝（配列番号９２）；
から成る、ｐＳＥＭプラスミドによって発現される免疫原性ペプチドの単離ペプチド類似体であって、
前記配列が、Ｅ｛Ａ、Ｌ｝ＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９３）又はＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）ではない、単離ペプチド類似体。
【請求項４６】
ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＮｖａ（配列番号９５）、ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９６）、ＹＶＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９７）、ＹＶＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９８）及びＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９９）から成る群から選択される、請求項４５に記載の単離ペプチド類似体。
【請求項４７】
本質的にアミノ酸配列ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９６）から成る、請求項４６に記載の単離ペプチド類似体。
【請求項４８】
本質的に配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９９）から成る、請求項４６に記載の単離ペプチド類似体。
【請求項４９】
ペプチドが、クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有する、請求項４５に記載の単離ペプチド類似体。
【請求項５０】
前記クラスＩ  ＭＨＣがＨＬＡ−Ａ２である、請求項４９に記載の単離ペプチド類似体。
【請求項５１】
クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）の親和性に類似するか又はこれよりも大きい前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）において１〜３つの置換を含む単離ペプチド類似体。
【請求項５２】
解離の半減期が、前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項５１に記載の単離ペプチド。
【請求項５３】
ペプチドＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される、請求項５１に記載の単離ペプチド。
【請求項５４】
クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）の親和性に類似するか又はこれよりも大きい前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）において、１〜３つの置換を含む単離ペプ
チド類似体。
【請求項５５】
解離の半減期が、前記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長い、請求項５４に記載の単離ペプチド。
【請求項５６】
前記ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される、請求項５４に記載の単離ペプチド。
【請求項５７】
ペプチドが、請求項１に記載のペプチド配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項５８】
クラスＩ  ＭＨＣ／メラン−Ａ26-35複合体を認識するＴＣＲと交差反応する、請求項５７に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項５９】
前記クラスＩ  ＭＨＣ／複合体が、ＨＬＡ−Ａ２／メラン−Ａ26-35複合体である、請求項５８に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項６０】
クラスＩ  ＭＨＣ／チロシナーゼ369-377複合体を認識するＴＣＲと交差反応する、請求項５７に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項６１】
前記クラスＩ  ＭＨＣ／複合体が、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ369-377複合体である、請求項６０に記載のクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体。
【請求項６２】
遊離配列に組み込まれた請求項４５に記載のペプチド配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
請求項４５に記載のペプチドのいずれかを含む、免疫原性組成物。
【請求項６４】
請求項６２に記載のポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項６５】
請求項６２に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項６６】
請求項６５に記載の核酸を含む、免疫原性組成物。
【請求項６７】
請求項６３に記載の組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は増幅させる方法。
【請求項６８】
請求項６３に記載の組成物及び免疫賦活剤の節内投与を含む、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を同調させる方法。
【請求項６９】
請求項６６に記載の組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は同調させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一定の実施の形態では、本明細書中に開示の本発明は、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドの類似体及びその生成方法に関する。これらの類似体は、ＭＨＣ分子と直接相互作用する残基においてアミノ酸置換を含むことができ、改良されているか、改変されているか、又は有用な免疫学的性質を付与することができる。特に、腫瘍関連抗原であるＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、及びメラン−Ａ由来のエピトープ類似体を同定する。さらに、種々の置換物が非標準残基であるノルロイシン及び／又はノルバリンを含む類似体クラスを開示する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年６月１７日出願の米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（参照によりその全体が放棄されることなく本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
主要組織適合性複合体及びＴ細胞標的認識
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、特定の抗原シグナルに対する応答に機能する抗原特異的免疫細胞である。Ｂリンパ球及びそれらが産生する抗体も、抗原特異的な存在である。しかしながらＢリンパ球とは違って、Ｔ細胞は、遊離又は可溶性形態で抗原に応答しない。Ｔ細胞が抗原に応答するには、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質から成る提示複合体に結合された抗原を必要とする。
【０００４】
ＭＨＣタンパク質は、Ｔ細胞がネイティブ、又は「自己」細胞を外来細胞から区別する手段を提供する。ＭＨＣ分子は、Ｔ細胞によりその後監視される潜在的ペプチドエピトープを提示する免疫受容体の一部類である。２種類のＭＨＣ、即ちクラスＩ  ＭＨＣ及びクラスＩＩ  ＭＨＣが存在する。ＣＤ４+Ｔ細胞は、クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主にヘルパー表現型を有し、一方、ＣＤ８+Ｔ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣタンパク質と相互作用し、主に細胞溶解性表現型を有するが、それらは各々、調節機能、特に抑制機能も示し得る。両ＭＨＣクラスＩ及びＩＩは、細胞の外表面にそれらの構造の大部分を有する膜貫通型タンパク質である。さらに両クラスのＭＨＣは、それらの外側部分にペプチド結合クレフトを有する。ネイティブ又は外来のタンパク質の小断片が結合され、細胞外環境に提示されるのは、この溝においてである。
【０００５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と呼ばれる細胞は、ＭＨＣを用いてＴ細胞に抗原を提示する。Ｔ細胞は、抗原がＭＨＣ上に提示される場合、抗原を認識することができる。この要件は、ＭＨＣ拘束性と呼ばれる。抗原が認識可能ＭＨＣにより提示されない場合、Ｔ細胞は認識せず、抗原シグナルに作用しない。認識可能なＭＨＣに結合されたペプチドに特異的なＴ細胞は、これらのＭＨＣ−ペプチド複合体と結合して、免疫応答の次の段階に進行する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＳＳＸ−２41-49類似体の実施の形態
実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープＳＳＸ−２41-49、ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の類似体、ｐＡＰＣによってプロセシングされエピトープ類似体を提示するこれらの類似体を含むポリペプチド、及びこの類似体を発現する核酸を含む。類似体は、野生型エピトープと比較して類似するか又は改良された免疫学的性質を有し得
る。
【０００７】
１つの特定の実施の形態は、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）を有するエピトープに対する免疫化によって生成されるＴ細胞株からサイトカイン産生を誘起するのに十分な量の、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の１つ又は複数のアミノ酸置換基を含む配列を有する単離されたＳＳＸ−２ペプチドに関する。一態様において、十分な量は１０μＭ未満である。さらなる態様では、この量は３μＭ未満である。さらなる態様では、この量は１μＭ未満である。一態様において、１つ又は複数のアミノ酸置換基としては、少なくとも１つの標準アミノ酸置換基が挙げられ得る。本明細書中で使用される場合、「標準アミノ酸」としては、２０の一般的にコードされるアミノ酸のいずれかが挙げられる。したがって、一態様において、少なくとも１つの標準アミノ酸置換基は、例えば、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ又はＳｅｒであり得る。さらなる態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換基としては、少なくとも１つの非標準アミノ酸置換基が挙げられ得る。非標準アミノ酸としては、例えば、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ2））、α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、α-アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、β−（３−ベンゾチエニル）−アラニン（β−（３-ベンゾチエニル）Ａｌａ）、Ｏ−メチルチロシン（Ｏ−メチル−Ｔｙｒ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、β−（１−ナフチル）−アラニン（Ｎａｌ−１）、β−（２-ナフチル）−アラニン（Ｎａｌ−２）、標準アミノ酸のＤ−立体異性体、カルボキシ末端が（−ＮＨ２で示される）アミドへと修飾されているアミノ酸のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一態様において、少なくとも１つの非標準アミノ酸置換基は、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、又は標準アミノ酸のＤ−立体異性体でであり得る。さらなる態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換基としては、修飾末端アミノ酸が挙げられ得る。一態様において、修飾末端アミノ酸は、アミド化されたＣ末端アミノ酸であり得る。さらなる態様では、置換の少なくとも１つは、Ｃ末端付加であるアミノ酸の付加であり得る。さらなる態様では、ペプチドとしてはさらに、任意の部位、好ましくは、いずれのＭＨＣ相互作用も明確な影響を受けないＰ３、Ｐ５又はＰ７部位に保存されたアミノ酸の置換基が挙げられ得る。
【０００８】
さらなる実施の形態は、各部位に１つのアミノ酸を含み得る、９つのアミノ酸、例えばＰ１〜Ｐ９の単離ペプチドに関する。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであってもよく、Ｐ２は、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ３はＳであってもよく、Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ５はＫであってもよく、Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ７はＦであってもよく、Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であってもよく、Ｐ９におけるＰΩ（Ｐ−オメガ）は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、又はＡｂｕであってもよい。いくつかの例では、配列はＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）ではない。
【０００９】
さらなる実施の形態は、各部位に１つのアミノ酸を含み得る、９つのアミノ酸、例えばＰ１〜Ｐ９の単離ペプチドに関する。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであってもよく、Ｐ２は、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ３はＳであってもよく、Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ５はＫであってもよく、Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ７はＦであってもよく、Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であってもよく、Ｐ９におけるＰΩは、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ、又はＶ−ＮＨ2であって
もよい。
【００１０】
さらなる実施の形態は、各部位に１つのアミノ酸を含み得る、９つのアミノ酸、例えばＰ１〜Ｐ９の単離ペプチドに関する。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであってもよく、Ｐ２は、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ３はＳであってもよく、Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ５はＫであってもよく、Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ７はＦであってもよく、Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であってもよく、Ｐ９はＶであってもよく、Ｐ１０におけるＰΩはＩ又はＬであってもよい。
【００１１】
さらなる実施の形態は、各部位に１つのアミノ酸を含み得る、９つのアミノ酸、例えばＰ１〜Ｐ９の単離ペプチドに関する。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであってもよく、Ｐ２はＶであってもよく、Ｐ３はＳであってもよく、Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ５はＫであってもよく、Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ７はＦであってもよく、Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であってもよく、Ｐ９はＶであってもよく、Ｐ１０におけるＰΩは、Ｉ、Ｌ、Ｖ、又はＮｌｅであってもよい。
【００１２】
さらなる実施の形態は、各部位に１つのアミノ酸を含み得る、９つのアミノ酸、例えばＰ１〜Ｐ９の単離ペプチドに関する。例えば、Ｐ１は、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであってもよく、Ｐ２はＬであってもよく、Ｐ３はＳであってもよく、Ｐ４は、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ５はＫであってもよく、Ｐ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよく、Ｐ７はＦであってもよく、Ｐ８は、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であってもよく、Ｐ９はＶであってもよく、Ｐ１０におけるＰΩは、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであってもよい。
【００１３】
さらなる実施の形態は、配列：Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２、Ａｉｂ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２）；又は｛Ｆ、Ｐｈｇ、Ｙ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｏ−メチル−Ｔｙｒ若しくはβ−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号３）；又は｛Ｙ、Ｆ若しくはＷ｝｛Ｖ、Ｍ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号４）；又は｛Ｆ若しくはＷ｝ＬＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）；又はＫ｛Ａ、Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号６）；又はＫ｛Ｌ若しくはＶ｝ＳＥＫＩＦＹＶ−ＮＨ2（配列番号７）；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、Ａｂｕ若しくはＭｅＶａｌ｝（配列番号８）；又はＦＶＳ（Ｑ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ）ＫＩＦＹＶ（配列番号９）；又はＦＶＳＥＫ（Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＦＹＶ（配列番号１０）；又はＦＶＳＥＫＩＦ｛Ｆ若しくはＰｈｅ（４−Ｆ）｝Ｖ（配列番号１１）；又はＫＡＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ若しくはＬ｝（配列番号１２）；又はＫＶＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ、Ｖ若しくはＮｌｅ｝（配列番号１３）；又はＫＬＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝（配列番号１４）を有する単離ペプチドに関する。
【００１４】
さらなる実施の形態は、配列：Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１５）；又は｛Ｆ若しくはＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１６）；又はＹＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１７）；又はＦ｛Ｌ、Ｖ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１８）；又はＷ｛Ｌ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１９）；又はＫ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２０）；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ若しくはＮｖａ｝（配列番号２１）を有する単離ペプチドに関する。
【００１５】
さらなる実施の形態は、配列：Ｋ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２２）；又は｛Ｆ若しくはＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２３）；又はＦＶＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２４）を有する単離ペプチドに関する。
【００１６】
さらなる実施の形態は、ペプチドが、上記及び本明細書の他の場所に記載の実施の形態におけるペプチドのいずれかの配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。一態様において、複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／ＳＳＸ−２41-49複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と交差反応し得る。さらなる態様では、複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＳＳＸ−２41-49複合体であり得る。
【００１７】
さらなる実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドの実施の形態のいずれかが含まれ得る免疫原性組成物に関する。一態様において、ペプチドは、例えば、配列：Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１５）；又は｛Ｆ若しくはＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１６）；又はＹＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１７）；又はＦ｛Ｌ、Ｖ若しくはＩ）ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１８）；又はＷ｛Ｌ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１９）；又はＫ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２０）；又はＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ若しくはＮｖａ｝（配列番号２１）、又はＫ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２２）；又は｛Ｆ若しくはＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２３）；又はＦＶＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２４）を有し得る。
【００１８】
いくつかのさらなる実施の形態は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の類似体、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）、ｐＡＰＣによって処理されてエピトープ類似体を提示し得るこれらの類似体を含むポリペプチド、及びこれらの類似体を発現する核酸に関する。類似体は、野生型エピトープに類似するか又はこれと比べて改善された免疫学的性質を有し得る。
【００１９】
一実施の形態は、配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）を有するエピトープに対する免疫化によって生成されるＴ細胞株からサイトカイン産生を誘起するのに十分な量の、配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）の１つ又は複数のアミノ酸置換基を含む配列を有する単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１157-165ペプチドに関する。例えば、一態様において、十分な量は１０μＭ未満であり得る。さらなる態様では、この量は３μＭ未満であり得る。また、さらなる態様では、この量は１μＭ未満であり得る。さらなる態様において、この量は０．３μＭ未満であり得る。一態様において、１つ又は複数のアミノ酸置換基としては、少なくとも１つの標準アミノ酸が挙げられ得る。さらなる態様では、１つ又は複数のアミノ置換基としては、少なくとも１つの非標準アミノ酸が挙げられ得る。さらなる態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換基としては、修飾末端アミノ酸が挙げられ得る。一態様において、修飾末端アミノ酸は、アミド化されたＣ末端アミノ酸であり得る。さらなる態様では、置換の少なくとも１つは、Ｃ末端付加であるアミノ酸の付加であり得る。
【００２０】
一実施の形態は、
Ｐ１が、Ｓ、Ｆ、Ｋ又はＷであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列であって、
ＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ若しくはＡ｝（配列番号２６）、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ（配列番号２７）、又はＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ若しくはＩ｝（配列番号２８）ではない配列を有する単離ペプチドに関する。
【００２１】
別の実施の形態は、
Ｐ１がＹであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ又はＴであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2又はＬ−ＮＨ2である配列であって、
ＹＶＬＭＷＩＴＬ（配列番号２９）又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ若しくはＬ｝（配列番号３０）ではない配列を有する単離ペプチドに関する。
【００２２】
さらなる実施の形態は、配列｛Ｓ又はＹ｝ＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ又はＶ｝｛Ｌ、Ｉ又はＮｌｅ｝（配列番号３１）を有する単離された十量体ペプチドに関する。
【００２３】
さらに別の実施の形態は、配列ＳＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｌ若しくはＡ｝（配列番号３２）、ＹＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号３３）、Ｆ｛Ｌ若しくはＶ｝ＬＭＷＩＴＱ｛Ｖ、Ｌ若しくはＩ｝（配列番号３４）、Ｙ｛Ｉ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号３５）、ＹＬＬＬＷＩＴＱＶ（配列番号３６）、又はＴＶＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号３７）を有する単離ペプチドに関する。
【００２４】
さらなる実施の形態は、配列｛Ｓ若しくはＦ｝ＶＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号３８）、ＳＬＭＷＩＴＱＮｖａ（配列番号３９）、又はＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号４０）を有する単離ペプチドに関する。
【００２５】
さらに別の実施の形態は、配列ＳＮｖａＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号４０）を有する単離ペプチドに関する。
【００２６】
いくつかの実施の形態は単離ペプチドに関する。このペプチドは、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）であり、
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２が、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ、又はＶ−ＮＨ2であ
るか、又はＰ９がＶであり、Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａであり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）である配列であって、
ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）ではない配列を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００２７】
単離ペプチドは、配列：
Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２、Ａｉｂ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２）；又は
｛Ｆ、Ｐｈｇ、Ｙ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｏ−メチル−Ｔｙｒ若しくはβ−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号３）；又は
｛Ｙ、Ｆ若しくはＷ｝｛Ｖ、Ｍ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号４）；又は
｛Ｆ若しくはＷ｝ＬＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号５）；又は
Ｋ｛Ａ、Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号６）；又は
Ｋ｛Ｌ若しくはＶ｝ＳＥＫＩＦＹＶ−ＮＨ2（配列番号７）；又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、Ａｂｕ若しくはＭｅＶａｌ｝（配列番号８）；又は
ＦＶＳ｛Ｑ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＫＩＦＹＶ（配列番号９）；又は
ＦＶＳＥＫ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＦＹＶ（配列番号１０）；又は
ＦＶＳＥＫＩＦ｛Ｆ若しくはＰｈｅ（４−Ｆ）｝Ｖ（配列番号１１）；又は
ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ若しくはＬ｝（配列番号１２）；又は
ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｉ、Ｌ、Ｖ若しくはＮｌｅ｝（配列番号１３）；又は
ＫＬＳＥＫＩＦＹＶ｛Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝（配列番号１４）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００２８】
単離ペプチドは、配列：
Ｋ｛Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１５）；又は
｛Ｆ若しくはＰｈｇ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１６）；又は
ＹＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１７）；又は
Ｆ｛Ｌ、Ｖ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１８）；又は
Ｗ｛Ｌ若しくはＩ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１９）；又は
Ｋ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２０）；又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹ｛Ｉ若しくはＮｖａ｝（配列番号２１）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００２９】
また、単離ペプチドは、配列：
Ｋ｛Ｖ若しくはＬ｝ＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２２）；又は
｛Ｆ若しくはＹ｝ＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号２３）；又は
ＦＶＳＥＫＩＦＹＩ（配列番号２４）；又は
ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号４１）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００３０】
さらに、単離ペプチドは、配列ＫＶＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号４１）を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００３１】
単離ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有し得る。ＭＨＣは、例えばＨＬＡ−Ａ２であり得る。
【００３２】
いくつかの実施の形態は、ペプチドが、上記又は本明細書の他の場所に記載のペプチドのいずれかの配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／ＳＳＸ−２41-49複合体を認識するＴＣＲと交差反応し得る。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＳＳＸ−２41-49複合体であり得る。
【００３３】
他の実施の形態は、遊離配列内に埋め込まれた上記又は本明細書の他の場所に記載のペプチドを含むポリペプチドに関する。
【００３４】
またさらなる実施の形態は、上記又は本明細書の他の場所に記載のペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００３５】
他の実施の形態は、上記又は本明細書の他の場所に記載のポリペプチドをコードする核酸又は発現のための核酸手段に関する。また、いくつかの実施の形態は、このような核酸又は核酸手段を含む免疫原性組成物に関する。
【００３６】
いくつかの実施の形態は、ＣＴＬ応答を誘導、維持、又は増幅する方法に関する。この方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の結節内投与を含み得る。
【００３７】
他の実施の形態は、クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を同調させる方法に関し、この方法は、上記又は本明細書の他の場所に記載の組成物の結節内投与を含み得る。この方法は、免疫増強薬の投与をさらに含み得る。
【００３８】
さらなる実施の形態は、ＣＴＬ応答を誘導、維持、又は同調させる方法に関し、この方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の結節内投与を含み得る。
【００３９】
いくつかの実施の形態は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の親和性に類似するか又はこれよりも大きい上記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の１〜３つのアミノ酸置換基を含む単離ペプチドに関する。解離の半減期は、上記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長くなり得る。単離ペプチドは、ペプチドＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識され得る。
【００４０】
またさらなる実施の形態は、本質的に、
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２が、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎａｌ−２、Ａｂｕ、Ａｉｂ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、又はＡｂｕである配列であって、
ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）ではない配列；
又は
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴ
ｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２が、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９におけるＰΩ  が、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｖａ、ＭｅＶａｌ、Ａｂｕ、又はＶ−ＮＨ2である配列；
又は
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２が、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ又はＬである配列；
又は
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＶであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、又はＮｌｅである配列；
又は
Ｐ１が、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｐｈｇ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、ＭｅＴｙｒ、β−（３−ベンゾチエニル）−Ａｌａ、又はＤ−Ｌｙｓであり、
Ｐ２がＬであり、
Ｐ３がＳであり、
Ｐ４が、Ｅ、Ｑ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ５がＫであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ７がＦであり、
Ｐ８が、Ｙ、Ｆ、Ｐｈｅ（４−Ｆ）であり、
Ｐ９がＶであり、
Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ又はＮｖａである配列
を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
【００４１】
いくつかの実施の形態は、本質的に、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規
定する）であり、
Ｐ１が、Ｓ、Ｆ、Ｋ、Ｗ、又はＹであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ、又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ、又はＴであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2、又はＬ−ＮＨ2であり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、ＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）である配列であって、
ＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ若しくはＡ｝（配列番号２６）、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ（配列番号２７）、ＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ若しくはＩ｝（配列番号２８）、ＹＶＬＭＷＩＴＬ（配列番号２９）、又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ若しくはＬ｝（配列番号３０）ではない配列；
又は
Ｐ１が、Ｓ、Ｆ、Ｋ、又はＷであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ、又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ、又はＴであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ−ＮＨ2、又はＬ−ＮＨ2である配列であって、
ＳＬＬＭＷＩＴＱ｛Ｃ、Ｖ、Ｉ、Ｌ若しくはＡ｝（配列番号２６）、ＦＶＬＭＷＩＴＱＡ（配列番号２７）、又はＦＩＬＭＷＩＴＱ｛Ｌ若しくはＩ｝（配列番号２８）ではない配列；
又は
Ｐ１がＹであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｎｌｅ、又はＮｖａであり、
Ｐ３がＬであり、
Ｐ４が、Ｍ、Ｌ、又はＮであり、
Ｐ５がＷであり、
Ｐ６が、Ｉ、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＮであり、
Ｐ７がＴであり、
Ｐ８が、Ｑ、Ｅ、Ｄ、又はＴであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｖ、Ｖ−ＮＨ2、又はＬ−ＮＨ2である配列であって、
ＹＶＬＭＷＩＴＬ（配列番号２９）又はＹＬＬＭＷＩＴ｛Ｉ若しくはＬ｝（配列番号３０）ではない配列
を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
【００４２】
さらなる実施の形態は、ペプチドが上記又は本明細書の他の場所に記載の実施の形態中に任意のペプチド配列を有し得るクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。一態様では、複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／ＮＹ−ＥＳＯ１157-165複合体を認識するＴＣＲと交差反応することができる。さらなる態様では、複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ１
157-165複合体であり得る。
【００４３】
上記実施の形態の一態様では、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２等のクラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに親和性を有し得る。
【００４４】
さらなる実施の形態は、遊離配列に関連して本明細書中に記載の実施の形態のいずれかのペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
【００４５】
さらなる実施の形態は、本明細書中に記載のペプチドのいずれかを含む免疫原性組成物に関する。一態様では、ペプチドは、本明細書中に記載の配列を有し得る。
【００４６】
さらなる実施の形態は、本明細書中に記載のペプチドの実施の形態のいずれかであるが、好ましくは、非標準アミノ酸置換基を有しないペプチドをコードする核酸に関する。さらなる態様では、核酸は、ベクター中でコードすることができる。
【００４７】
さらなる実施の形態は、本明細書中に開示のペプチドの実施の形態のいずれかをコードする核酸を含む免疫原性組成物に関する。
【００４８】
さらなる実施の形態は、本明細書中に開示の実施の形態の組成物又はペプチドのいずれかを結節内投与することを含むＣＴＬ応答を誘導する方法に関する。さらなる態様では、この方法により、ＣＴＬ応答を維持することが可能である。さらなる態様では、この方法により、クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を増幅することが可能である。さらなる態様では、この方法により、クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を同調させることが可能である。さらなる態様では、この方法はまた、免疫増強薬を投与することを含み得る。
【００４９】
いくつかの実施の形態は、天然のエピトープ配列中に１〜３つ又は４つのアミノ酸置換を含む配列を有する単離ペプチドであって、当該配列を有するエピトープに対する免疫化によって生成されるＴ細胞株からのサイトカイン産生の誘発に必要なペプチド濃度が特定の濃度より高くない（例えば、１０μＭ、１μＭ、及び０．３μＭ等）、単離ペプチドに関する。１〜３つ又は４つのアミノ酸置換は、少なくとも１つの標準的アミノ酸置換及び／又は少なくとも１つの非標準アミノ酸置換等を含み得る。少なくとも１つの非標準アミノ酸は、本明細書中に記載の任意のアミノ酸（例えば、標準アミノ酸のＤ立体異性体（Ｎｖａ又はＮｌｅ））であり得る。１〜３つ又は４つのアミノ酸置換は、修飾アミノ酸を含むことができ、修飾末端アミノ酸はアミド化Ｃ末端アミノ酸であり得る。置換の１つは、アミノ酸の付加であり得る（例えば、付加はＣ末端付加であり得る）。
【００５０】
他の実施の形態は、標的関連抗原のセグメント配列と少なくとも１つの相違を含むアミノ酸配列であって、当該セグメントがＭＨＣタンパク質のペプチド結合クレフトに対する既知又は予想される親和性を有し、少なくとも１つの相違が上記セグメント中のＭＨＣ結合モチーフアンカー位置の残基と置換するＮｌｅ又はＮｖａ残基であり得る、アミノ酸配列を有するペプチドに関する。アンカー位置は、主要アンカー位置（例えば、Ｐ２又はＰΩ）であり得る。アンカー位置は、補助的アンカー位置であり得る。相違には、上記セグメント中の疎水性残基と置換するＮｌｅ又はＮｖａ残基が含まれ得る。いくつかの態様では、Ｉ、Ｌ、又はＶが、ＭＨＣ結合モチーフアンカー位置中の好ましい残基であり得る。いくつかの態様では、例えば、ペプチドは、約８〜約１４アミノ酸長、又はより好ましくは９〜１０アミノ酸長を有し得る。
【００５１】
ＭＨＣタンパク質は、ヒトＭＨＣタンパク質（例えば、クラスＩ  ＨＬＡタンパク質）であり得る。ＭＨＣタンパク質は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ａ３０、Ａ６６、Ａ６８、Ａ６９、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ１５、Ｂ２７、Ｂ３５、Ｂ３７、Ｂ３８、Ｂ３９、
Ｂ４０、Ｂ４８、Ｂ５１、Ｂ５２、Ｂ５３、Ｂ６０、Ｂ６１、Ｂ６２、Ｂ６３、Ｂ６７、Ｂ７０、Ｂ７１、Ｂ７５、Ｂ７７、Ｃ４、Ｃｗ１、Ｃｗ３、Ｃｗ４、Ｃｗ６、Ｃｗ７、及びＣｗ１０等の型であり得る。いくつかの態様では、ＭＨＣタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ２又はＡ２４であり得る。ＭＨＣは、アンカー残基結合ポケットを有することができ、このポケットはＨＬＡ−Ａ*０２０１のＢ又はＦポケットに相同である。結合ポケットの形成を担い、この結合ポケットがエピトープアンカー残基に適合し、それによってＭＨＣ分子の結合特異性を定義するＭＨＣ残基は、当該技術分野で十分に理解されている。このような情報の１つの編集物は、ハイパーテキスト転送プロトコル(http://)でのFIMM (機能免疫学)ウェブサイト「sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/.」で見出される(Schoenbach C., Koh J.L.Y., Sheng X., Wong L., and V.Brusic. FIMM「機能的な分子免疫学のデータベース（a database of functional molecular immunology）」Nucleic Acids Research, 2000,
Vol. 28, No. 1 222-224; Schoenbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. FIMM「機能的な分子免疫学のデータベース（a database of functional molecular immunology）」update 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 226-229;及びZhang, C. et al., J. Mol. Biol. 281:929-947, 1998;（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）も参照のこと）。また、ペプチドは、上記ＭＨＣの上記セグメントの対応する特性と実質的に同一であるか又はより良好な少なくとも１つの結合特性を有し得る。例えば、結合特性を、上記セグメントのものと比較して高めることができる。いくつかの実施の形態では、結合特性は、例えば、結合親和性又は結合安定性であり得る。
【００５２】
ペプチドは、セグメントの免疫原性と実質的に同一であるか又はより良好な免疫原性を有し得る。免疫原性は増加させることができる。免疫原性は、上記セグメントと交差反応性を示す免疫応答を誘発するこができるか、又はＣＴＬ応答を誘発することができる。免疫原性を、例えば、ＭＨＣテトラマー解析、サイトカイン解析、細胞傷害性検定を使用するか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化系を使用した、ペプチドを認識する免疫応答の測定、上記セグメントを認識する免疫応答の測定、又は任意の他の適切な方法によって評価することができる。免疫化系には、ヒト細胞が含まれ得る。免疫原性を、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化系（例えば、トランスジェニックマウスを含むもの）を使用して評価することができる。ペプチドは、少なくとも上記ＭＨＣの上記セグメントに類似の結合特性を有し得る。例えば、いくつかの態様では、本発明の開示に基づいて、「類似する」と見なすことができる。いくつかの特定の態様では、「類似性」は、例えば、半値結合、相対親和性、安定性（解離半減期）、及び交差反応性／機能的アビディティ（avidity）のペプチド濃度に基づく。一例として、ペプチドが天然ペプチドの値の２倍、さらに、３倍、４倍、５倍、又は１０倍以内の結果又は特性を有する場合、ペプチドを類似すると見なすことができる。例えば、交差反応性／機能的アビディティについて、データが天然ペプチドの３倍及び１０倍以内であるの時、類似の結果であり得る。別の例として、天然ペプチドの２、３、４、５、６、７、１０、１５、又は２０％以内である場合、結合値の比率が類似するとみなすことができる。いくつかの態様では、ＥＤ50値は、ネイティブ配列の２倍又は３倍以内の場合、類似するとみなすことができる。類似の解離半減期は、例えば、２倍又は３倍以内であり得る。さらに別の例として、野生型と約２倍相違する交差反応性の値を類似と見なすことができる。これらの類似の値は、例示でしかなく、いくつかの実施の形態のいくつかの態様の文脈で示される。他の「類似」値を、本明細書中の実験及び教示に基づいて決定することができる。
【００５３】
ペプチドは、セグメントと免疫学的に交差反応することができる。したがって、交差反応性を、セグメントでの免疫化及びペプチド認識の検定によって評価することができる。或いは、交差反応性を、ペプチドでの免疫化及びセグメント認識の検定によって評価することができる。
【００５４】
上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドを、例えば、２つの相違を含むように修飾することができる。いくつかの例では、各相違は、独立して、Ｎｌｅ又はＮｖａ残基を含み得る。いくつかの例では、１つの相違は、Ｎｌｅ置換又はＮｖａ置換ではあり得ない。また、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドには、３つ以上の相違を含み得る。
【００５５】
標的関連抗原は、腫瘍関連抗原であり得る。標的関連抗原は、病原体関連抗原であり得る。
【００５６】
他の実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載の本発明のペプチドを含む免疫原性組成物に関する。さらなる実施の形態は、このような組成物を哺乳動物に投与すること（例えば、哺乳動物のリンパ系に直接投与すること）を含む免疫化方法に関する。
【００５７】
さらに他の実施の形態は、Ｔ細胞エピトープ類似体を作製する方法に関する。この方法は、標的関連抗原セグメントのアミノ酸配列を提供することであって、当該セグメントがＭＨＣタンパク質のペプチド結合クレフトに対して既知又は予想される親和性を有し、ＭＨＣ結合モチーフのアンカー位置に対応する配列の少なくとも１つのアミノ酸をＮｌｅ又はＮｖａに変更すること、及び変更された配列を含むペプチドを合成することを含み得る。合成は、例えば、化学合成又は任意の他の合成方法であり得る。
【００５８】
いくつかの実施の形態は、Ｔ細胞エピトープ類似体であって、当該類似体がＭＨＣ結合モチーフのアンカー位置に対応する少なくとも１つの天然残基をＮｌｅ又はＮｖａ残基に置換することによって、天然エピトープと異なる、Ｔ細胞エピトープ類似体に関する。
【００５９】
いくつかの実施の形態は、本質的に、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）であり、
Ｐ１が、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ａｂｕ、又はＳａｒであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｍ、Ｉ、Ｑ、Ｖ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、又はＡｂｕであり、
Ｐ３が、Ｐ又はＷであり、
Ｐ４がＳであり、
Ｐ５がＩであり、
Ｐ６がＰであり、
Ｐ７がＶであり、
Ｐ８がＨであり、
Ｐ９が、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｓ、又はＴであり、
Ｐ１０におけるＰΩが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｎｖａ、又はＮｌｅであり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）である配列であって、
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）ではない配列を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
【００６０】
単離ペプチドは、配列：
｛Ｓ、Ｓａｒ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４３）；又は
Ｇ｛Ｍ若しくはＮｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４４）；又は
Ｇ｛Ｌ、Ｉ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４５）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ若しくはＶ｝（配列番号４６）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨ｛Ａ若しくはＳ｝Ｉ（配列番号４７）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号４８）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号４９）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号５０）；又は
Ｇ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５１）；又は
｛Ｓａｒ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５２）；又は
Ａ｛Ｖ、Ｉ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５３）；又は
ＡＶＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５４）；又は
Ａ｛Ｎｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５５）；又は
ＡＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５６）；又は
ＧＶＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号５７）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＷＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号５８）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００６１】
また、単離ペプチドは、配列：
｛Ａｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５９）；又は
Ｇ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＡｂｕ｝ＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６０）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６１）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰ｛Ｉ若しくはＮｖａ｝（配列番号６２）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号６３）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ若しくはＮｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号６４）；又は
｛Ａ若しくはＡｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６５）；又は
Ｇ｛Ｎｖａ｝ＷＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｉ若しくはＶ｝（配列番号６６）；又は
Ａ｛Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６７）；又は
Ａ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝ＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号６８）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００６２】
特に、単離ペプチドは、配列：
｛Ａｂｕ｝ＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号５９）；又は
ＧＬＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｖ若しくはＮｖａ｝（配列番号６１）；又は
ＧＬＷＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号６９）；又は
Ｇ｛Ｎｌｅ｝ＰＳＩＰＶＨＰ｛Ｎｖａ｝（配列番号６３）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００６３】
好ましくは、単離ペプチドは、配列：ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＶ（配列番号７０）を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００６４】
ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有することができ、このクラスＩ  ＭＨＣは、例えばＨＬＡ−Ａ２であり得る。
【００６５】
さらなる実施の形態は、ペプチドが、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドの配列を有する、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／ＰＳＭＡ288-297複合体を認識するＴＣＲと交差反応し得る。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＳＭＡ288-297複合体であり得る。
【００６６】
いくつかの実施の形態は、遊離配列に組み込まれている、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
【００６７】
さらなる実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００６８】
さらに他の実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載のポリペプチドをコードする核酸、又は当該ポリペプチドを発現する核酸手段、並びに、当該核酸又は核酸手段を含む免疫原性組成物に関する。
【００６９】
いくつかの他の実施の形態は、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は増幅させる方法に関する。当該方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の節内投与を含み得る。
【００７０】
また、いくつかの方法は、クラスＩ  ＭＨＣ制限Ｔ細胞応答を同調させる方法に関し、当該方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の節内投与を含み得る。当該方法はまた、免疫賦活剤の投与を含み得る。
【００７１】
他の実施の形態は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の親和性に類似するか又はこれよりも大きいクラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の１〜３つの置換基を含む単離ペプチドに関する。解離の半減期は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長くなり得る。単離ペプチドは、ペプチドＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識され得る。
【００７２】
いくつかの実施の形態は、本質的に、
Ｐ０が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）であり、
Ｐ１が、Ｓ、Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ、又はＨｓｅであり、
Ｐ２が、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、又はＡｂｕであり、
Ｐ３が、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、又はＡｂｕであり、
Ｐ４がＱであり、
Ｐ５がＨであり、
Ｐ６が、Ｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、又はＡｂｕであり、
Ｐ７がＩであり、
Ｐ８が、Ｇ、Ａ、Ｓ、又はＳａｒであり、
Ｐ９におけるＰΩが、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ、又はＬ−ＮＨ2であり、
ＰΩ＋１が、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在を規定する）である配列であって、
ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）ではない
配列を含むか、又はこれから成る、単離ペプチドに関する。
【００７３】
単離ペプチドは、配列：
｛Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７２）；又は
Ｓ｛Ｖ、Ｍ、Ｉ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７３）；又は
ＳＬ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＱＨＬＩＧＬ（配列番号７４）；又は
ＳＬＬＱＨ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＡｂｕ｝ＩＧＬ（配列番号７５）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩ｛Ａ、Ｓ若しくはＳａｒ｝Ｌ（配列番号７６）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕ若しくはＬ−ＮＨ2｝（配列番号７７）；又は
｛Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ、Ｍ若しくはＩ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７８）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＶ｝（配列番号７９）；又は
｛Ｋ、Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＶ（配列番号８０）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝ＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８１）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝｛Ｎｖａ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８２）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００７４】
また、単離ペプチドは、配列：
｛Ｆ、Ｙ、Ｔ、Ｏｒｎ若しくはＨｓｅ｝ＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号８３）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ、Ｎｌｅ若しくはＭ｝ＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号８４）；又は
ＳＬＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ、Ｎｖａ若しくはＬ−ＮＨ2｝（配列番号８５）；又は
ＳＬＬＱＨ｛Ｎｖａ若しくはＡｂｕ｝ＩＧＬ（配列番号８６）；又は
Ｓ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８７）；又は
｛Ｆ若しくはＴ｝｛Ｌ若しくはＮｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８８）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００７５】
さらに、単離ペプチドは、配列：
Ｓ｛Ｌ若しくはＮｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８９）；又は
Ｔ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号９０）
を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００７６】
単離ペプチドは、配列Ｓ｛Ｎｖａ｝ＬＱＨＬＩＧ｛Ｎｌｅ｝（配列番号８７）を含み得るか、又はこれから主に成り得る。
【００７７】
単離ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有することができ、例えば、クラスＩ  ＭＨＣはＨＬＡ−Ａ２であり得る。
【００７８】
実施の形態は、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体であって、当該ペプチドが上記及び本明細書の他の場所に開示のペプチド配列を有し得る、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／ＰＲＡＭＥ425-433複合体を認識するＴＣＲと交差反応性を示し得る。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／ＰＲＡＭＥ425-433複合体であり得る。
【００７９】
他の実施の形態は、遊離配列に関連して上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチド配列を含むポリペプチドに関する。
【００８０】
さらなる実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載のペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００８１】
いくつかの実施の形態は、上記及び本明細書の他の場所に記載のポリペプチドをコードする核酸又は発現のための核酸手段、並びにこのような核酸又は核酸手段を含む免疫原性組成物に関する。
【００８２】
さらに他の実施の形態は、ＣＴＬ応答を誘導、維持、又は増幅する方法に関し、この方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の結節内投与を含み得る。いくつかの実施の形態は、ＣＴＬ応答を同調させる方法に関し、この方法は、上記及び本明細書の他の場所に記載の組成物の結節内投与を含み得る。いくつかの実施の形態では、この方法は、免疫増強薬の投与をさらに含み得る。
【００８３】
いくつかの実施の形態は、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）中に１〜３つの置換を含み、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）の親和性に類似するか又はそれを超える上記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和
性を有する単離ペプチドに関する。解離半減期は、上記クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフト由来のＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）の解離半減期に類似するか又はこれを超え得る。単離ペプチドを、ペプチドＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識することができる。
【００８４】
さらなる実施の形態は、免疫活性を示し、１つ又は複数のＭＨＣアンカー残基に非天然アミノ酸を保有するペプチドを表す組成物の生成方法及び得られた組成物に関する。
【００８５】
本発明のさらなる実施の形態は、ｐＳＥＭプラスミド及びこのプラスミドによって発現されたメラン−Ａ26-35及び／又はチロシナーゼ369-377エピトープに対応する免疫原性ペプチドに関する。ｐＳＥＭプラスミドは、ｐＡＰＣによるその発現及び提示を可能にする様式でメラン−Ａ及びチロシナーゼエピトープをコードする。ｐＳＥＭプラスミドの詳細は、米国特許出願公開番号２００３０２２８６３４（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【００８６】
本質的に、本発明の特定の実施の形態において、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）；又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）の配列であって、Ｅ｛Ａ若しくはＬ｝ＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９３）又はＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）ではない配列から成るｐＳＥＭプラスミドによって発現される免疫原性ペプチドの単離ペプチド類似体が提供される。本発明の単離ペプチド類似体は、ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＮｖａ（配列番号９５）、ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９６）、ＹＶＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９７）、ＹＶＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９８）及びＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９９）から成る群から選択され得る。
【００８７】
本質的に、他の実施の形態において、単離ペプチド類似体は、アミノ酸配列ＥＮｖａＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９６）から成る類似体である。さらに他の実施の形態では、単離ペプチド類似体は、本質的にアミノ酸配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＮｖａ（配列番号９７）から成る類似体である。さらなる実施の形態では、ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣペプチド結合クレフトに対する親和性を有する。クラスＩ  ＭＨＣはＨＬＡ−Ａ２である。
【００８８】
本発明の他の実施の形態は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）の親和性に類似するか又はこれよりも大きいクラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）の１〜３つの置換基を含む単離ペプチド類似体に関する。さらに他の実施の形態では、解離の半減期は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長くなる。他の実施の形態では、単離ペプチドは、ペプチドＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される。
【００８９】
さらに別の実施の形態では、本発明は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対するＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）の親和性に類似するか又はこれよりも大きいクラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトに対する親和性を有する、配列ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）の１〜３つの置換基を含む単離ペプチド類似体に関する。さらに他の実施の形態では、解離の半減期は、クラスＩ  ＭＨＣ結合クレフトからのＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）の解離の半減期に類似するか又はこれよりも長くなる。他の実施の形態では、単離ペプチドは、ペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）に対する特異性を有するＴ細胞によって認識される。
【００９０】
本発明の実施の形態はまた、ペプチドが、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩ
ＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）；又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）のペプチドの配列であって、Ｅ｛Ａ若しくはＬ｝ＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９３）又はＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）ではない配列を有するクラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体に関する。他の実施の形態では、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／メラン−Ａ26-35複合体を認識するＴＣＲと交差反応する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／メラン−Ａ26-35複合体である。
【００９１】
またさらに別の実施の形態では、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、クラスＩ  ＭＨＣ／チロシナーゼ369-377複合体を認識するＴＣＲと交差反応する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ369-377複合体である。
【００９２】
本発明のいくつかの実施の形態は、遊離配列に組み込まれる、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）；又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）のペプチド配列であって、Ｅ｛Ａ若しくはＬ｝ＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９３）又はＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）ではない配列を含むポリペプチドに関する。またさらなる実施の形態では、本発明は、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）、又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）のペプチドのいずれかであって、Ｅ｛Ａ若しくはＬ｝ＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号９３）又はＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４）ではない配列を含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）、又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）のペプチドのいずれかを含むポリペプチドを含む免疫原性組成物、及びこのようなポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明の実施の形態はさらに、当該核酸を含む免疫原性組成物に関する。
【００９３】
本発明の免疫原性組成物は、癌（例えば、グリア芽細胞腫及び黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない）に対する免疫戦略における部分的な同調として、投与され得る。また、メラン−Ａ26-35及びチロシナーゼ369-377エピトープ並びにエピトープ類似体に対応するペプチドは、同じ免疫戦略の増幅タンパク質として投与することができる。好ましい実施の形態では、ペプチド類似体Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９１）；又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）を、増幅工程において利用してもよい。本発明で使用される同調及び増幅工程プロトコルは、共に「予防目的及び治療目的で、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘起、向上及び維持させる方法（METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES）」と題する米国特許出願公開番号２００５００７９１５２、及び米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）により詳細に開示されている。
【００９４】
したがって、一実施形態において、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は増幅させる方法が提供される。当該方法は、本質的に、Ｅ｛Ａ、Ｌ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＡＧＩＧＩＬＴ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ（配列番号９１）；又はＹ｛Ｍ、Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝ＤＧＴＭＳＱ｛Ｖ、Ｎｖａ若しくはＮｌｅ｝（配列番号９２）の配列から成るｐＳＥＭプラスミドによって発現される免疫原性ペプチドのペプチド配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物の節内投与を含み得る。さらなる実施の形態では、免疫原性組成物及び免疫賦活剤の節内投与を含む、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答を同調
させる方法が提供される。さらに他の実施の形態では、本明細書中に開示される任意の免疫原性組成物の節内投与を含む、ＣＴＬ応答を誘起、維持又は同調させる方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９５】
Ｔ細胞エピトープを含むペプチドは、一般に、以下の複数の要因のうちの１つに起因する不十分な免疫原又は免疫修飾因子である：最適以下の薬物動態学プロファイル、ＭＨＣ分子結合の制限（Ｋonの減少及びＫoffの増加）、又は（例えば、種々の耐性形態による）正常な免疫レパートリー中に存在するＴ細胞による固有の認識の減少。ペプチドの免疫学的性質を改良するための種々の戦略（特に、配列が天然のエピトープと異なるペプチドのスクリーニング及び使用）が追求されている。このような類似体は、当該技術分野で種々の名称（ヘテロクリティック（heteroclytic）ペプチド及び改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）等）によって既知である。このような類似体の生成は、遺伝子コード残基の標準的なセット由来のアミノ酸を最も頻繁に使用している（例えば、Valmori, D. et al., J. Immunol. 160:1750-1758, 1998を参照のこと）。非標準アミノ酸の使用は、一般的には、ペプチドの生化学的安定性を改良するための試みに関連している（例えば、Blanchet, J.-S. et al., J. Immunol. 167:5852-5861, 2001を参照のこと）。
【００９６】
一般に、類似体を以下の２つの主なクラスに分類することができる：（１）より良好なＨＬＡ結合プロファイル及びより高い免疫応答を達成するためのペプチドアンカー残基の修飾、並びに（２）自己抗原に対するＴ細胞耐性を回避するためのペプチドアンカー残基及びＴＣＲ接触残基の修飾。
【００９７】
本明細書中に記載の発明のいくつかの実施形態は、以下の維持又は改良された性質（これらに限定されない）の少なくとも１つを有する類似体に関する。
１．ＴＣＲに対する交差反応性及び機能的アビディティ、
２．ＭＨＣクラスＩへの結合に対する親和性及び安定性、
３．細胞傷害性によって評価される免疫に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの影響、
４．ＩＦＮ−γのｅｘ  ｖｉｖｏ産生によって評価される免疫に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの影響、及び／又は
５．タンパク質分解に対する耐性の増加。
【００９８】
いくつかの実施形態は、ペプチド配列（類似体が含まれる）に関し、この配列のアミノ酸を、位置指示記号（position designator）を用いて、例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、ＰΩ等と呼ぶ。さらに、ペプチド配列を、Ｐ０及び／又はＰΩ＋１指示記号を含むものと見なすことができる。いくつかの態様では、Ｐ０は、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸであることができ、Ｘは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在である。同様に、いくつかの態様では、ＰΩ＋１は、Ｘ、ＸＸ、又はＸＸＸであることができ、Ｘは任意のアミノ酸又はアミノ酸不存在である。したがって、例えば、ＸＸＸは、任意のアミノ酸残基又はアミノ酸不存在残基の任意の組み合わせを意味し得る。したがって、これらの実施形態は、特定の配列のＮ末端又はＣ末端上に３つまでのさらなるアミノ酸を有する（アミノ酸残基の任意の組み合わせを有する）ポリペプチドを含み得る。また、いくつかの態様では、実施形態は、Ｎ末端又はＣ末端上にさらなるアミノ酸残基を含むことができない。
【００９９】
結合ポケットの形成を担い、この結合ポケットがエピトープアンカー残基に適合し、それによってＭＨＣ分子の結合特異性を定義するＭＨＣ残基は、当該技術分野で十分に理解されている。この情報の１つの編集物は、ハイパーテキスト転送プロトコル(http://)でのFIMM (機能免疫学)ウェブサイト「sdmc.lit.org.sg:8080/fimm/」（参照によりその全体が本明細書に援用される）で見出される(Schoenbach C., Koh J.L.Y., Sheng X., Wong
L., and V.Brusic. FIMM, a database of functional molecular immunology. Nucleic 
Acids Research, 2000, Vol. 28, No.1 222-224;及びSchoenbach C., Koh JL, Flower DR, Wong L., and Brusic V. FIMM, a database of functional molecular immunology; update 2002. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No.1 226-229;（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）も参照のこと）で見出される。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「遊離配列」という語句は、エピトープ又は類似体を含むか又はコードし、免疫プロテアソームプロセシングによって直接、又はＮ末端トリミング若しくは他の生理学的過程と組み合わせてエピトープ又は類似体が遊離される状況を提供する、より大きな配列中に組み込まれているペプチドをいう。いくつかの態様では、類似体又はエピトープを設計するか操作することができる。
【０１０１】
他の実施形態は、類似体を遊離するようにプロセシングすることができるエピトープ類似体配列を含むエピトープアレイ及び他のポリペプチドに関する。さらなる実施形態は、このようなポリペプチド、又は単純に類似体をコードする核酸、特にＤＮＡプラスミド及び核酸からのその発現に関する。類似体、類似体を含むポリペプチド、及びコード核酸は全て、免疫原性組成物、特に、結節内送達に適切な組成物の成分であることができ、その全てがさらなる実施形態に関する。
【０１０２】
免疫学的性質が改良されたペプチド類似体を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の結合を増加させて形成を安定化するためのＭＨＣ分子との相互作用に関与するアンカー残基の修飾によって設計することができる。このような修飾を、制限ＭＨＣ分子の結合モチーフ又は好ましいアンカー残基の知識によって導くことができる。種々の規則、指標、及びアルゴリズムがさらに存在し、これらを使用して、置換が遺伝子コード可能なアミノ酸の標準的なセットから選択されるという制限のある種々の置換を有する類似体の性質を予想することができる。
【０１０３】
しかし、アンカー残基の非標準アミノ酸への置換の結果を予想するためのデータベース又はアルゴリズムは存在せず、その実用性は以前に十分に調査されていない。非標準アミノ酸であるノルロイシン（Ｎｌｅ）及びノルバリン（Ｎｖａ）を、ＭＨＣ結合ペプチドのアンカー残基位置に有利に置換することができることが本明細書中に開示されている。これらを、疎水性又は大きなアミノ酸（特に、Ｉ、Ｌ、又はＶ）によって都合良く占められている位置に配置することができることが好ましい。
【０１０４】
ＭＨＣ結合モチーフは、一般に、８〜１０アミノ酸長内の名目上の位置の好ましい残基の側鎖に関して定義される（例えば、Rammensee et al.,「ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフ（MHC Ligands and Peptide Motifs）」（(Molecular Biology Intelligence Unit), Springer-Verlag, Germany, 1997 Landes Bioscience, Austin, Texas）;及びParker, et al.,「個々の側鎖の独立した結合に基づく潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドをランク付けするスキーム（Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based
on independent binding of individual peptide side-chains）」（J. Immunol. 152:163-175）を参照のこと）。ウェブサイトアルゴリズムも利用可能であり、これを使用してＭＨＣ結合を予想することができる。例えば、ワールドワイドウェブのHans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Emmerich, Stefan Stevanovic: ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ:ＭＨＣリガンド及びペプチドモチーフのためのインターネットデータベース（An Internet Database for MHC Ligands and Peptide Motifs）（以下を介したハイパーテキスト転送プロトコルアクセス: syfpeithi. bmi-heidelberg. com/ scripts/ MHCServer. dll/ home.
htm）及び"bimas. dcrt. nih. gov / molbio/ hla_bind"のページを参照のこと。クラスＩ拘束性エピトープについて、Ｃ末端の位置ＰΩは、一般的には一次アンカーである。第２の位置Ｐ２もしばしば一次アンカーであるか、或いは、Ｐ３及び／又はＰ５がこの役割を果たすことができる。位置Ｐ２〜Ｐ７は、全て、一方又は他方のＭＨＣの二次又は補助
的アンカー位置として認識されている（Rammensee et al.,及び米国特許出願公開番号２００３０２１５４２５ (２００１年１２月７日に出願された、「抗原提示細胞におけるエピトープ同調（EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS）」と題する米国特許出願第１０／０２６，０６６号（その全開示全体について、参照によりその全体が本明細書に援用される）の表６を参照のこと）。クラスＩＩ拘束性エピトープＰ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７、及びＰ９は、アンカー位置として認識されている。前述は、一般的ガイドとして意図され、例示と見なすべきであり、網羅も限定もしていない。結合モチーフ及びアンカー残基等の多数の分析及び編集物は、化学文献及び特許文献並びにインターネットで利用可能である。その慣習及び結果は、本明細書中の教示と組み合わせると、エピトープ類似体設計に関する有用なガイダンスを当業者にさらに提供する。
【０１０５】
提示されたＭＨＣ分子に実際に結合したペプチドの長さは、名目上のモチーフ配列よりも長くてもよい。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子の結合クレフトの末端は開いており、その結果、結合したペプチドをコアモチーフのいずれかの末端から伸長することができる。対照的に、クラスＩ  ＭＨＣ分子における両末端の結合クレフトは閉じており、その結果、結
ペプチドの末端は、一般に、モチーフに対応しなければならないが、結合ペプチドの中心領域の隆起及び折り畳みによって長さの有意な変動に適合することができ、その結果、少なくとも約１４アミノ酸長までのペプチドを提示することができる（例えば、Probst-Kepper, M. et al., J. Immunol. 173:5610-5616, 2004を参照のこと）。
【０１０６】
エピトープ類似体は、クラスＩ  ＭＨＣ分子との相互作用に関する改良されたＫon及びＫoff、並びに元のエピトープを認識するＴ細胞受容体との保存されたか又は増加した相互作用、特異的Ｔ細胞手段の拡大の増加に反映される修飾又は改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ活性、特異的Ｔ細胞による改良されたサイトカイン産生、又はペプチドと作用したＴ細胞によって媒介される天然のエピトープを保有する標的に対するｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を有し得る。さらに、このような類似体は、より最適な様式で複数の明確なＭＨＣクラスＩ分子と相互作用することができる。
【０１０７】
免疫特異性が改良されたこのようなペプチド類似体は、１つ又は複数の置換（１つ又は複数の非標準アミノ酸置換が含まれる）を含み得る。非標準アミノ酸置換のうち、ノルバリン又はノルロイシンから成る一次アンカー残基への置換が好ましく、何故なら、下記に例示するように、これらはＭＨＣクラスＩとの相互作用を改良することができるだけでなく、天然エピトープに特異的なＴＣＲとの交差反応性を保存し、改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ免疫プロファイルを示すこともできるからである。例えば、Ａ、Ｌ、又はＶからノルバリン又はノルロイシンへのＰ２アミノ酸残基の変異によって免疫特性が改良され、したがって、好ましい。さらに、ノルバリン、又は好ましくはノルロイシンへのＣ末端残基の修飾により、類似体の免疫特性が改良された。さらに、一次及び／又は二次アンカー残基に複数の置換を含む（Ｐ２又はＰΩにノルバリン及び／又はノルロイシンを含む）類似体は、免疫特性の改良に関連し得る。
【０１０８】
ノルバリン（Ｎｖａ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）の特定の使用は、米国特許第６，６８５，９４７号、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０７６５８５Ａ２及び同ＷＯ０１／６２７７６Ａ１、並びに米国特許出願公開番号２００４０２５３２１８Ａ１で述べられている。これらの引例は、免疫学的性質を改良するためのＭＨＣ結合ペプチドのアンカー位置で置換されたＮｖａ又はＮｌｅの一般的有用性を教示していない。‘２１８号特許は、置換残基をＭＨＣ相互作用位置ではなくＴＣＲ相互作用位置に組み込むべきであることを教示している。
【０１０９】
本発明のさらに別の実施形態では、ペプチドは、免疫原性を示すが脳炎誘発性を示さないＮＳ特異的抗原由来のペプチドの類似体である。この目的に最も適切なペプチドは、脳
炎誘発性自己ペプチドのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合部位が修飾されているが、ＭＨＣ結合部位（複数可）が修飾されていないペプチドであり、その結果、アレルギーを起こすことなく免疫応答が達成される（Karin et al., 1998; Vergelli et al, 1996）。
【０１１０】
他では、種々の非標準アミノ酸をペプチドの有用性を無効にすることなく置換することができることも示唆されていた（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０２／１０２２９９Ａを参照のこと）。非標準アミノ酸を使用して、ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチド複合体との間の相互作用も調査されている（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０７６５８５Ａ及びSasada, T. et al. Eur. J. Immunol. 30:1281-1289, 2000を参照のこと）。Baratinは、マウスＭＨＣ分子Ｈ２−Ｄｂによって提示されるｐ５３ペプチド中の非アンカー位置でのＮｌｅ及びＡｂｕの有用性及びアンカー位置でのＮｌｅの有用性をいくつか示していた（J. Peptide Sci. 8:327-334, 2002）。これらの上記各文献は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【０１１１】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１／６２７７６に開示のＮｌｅを組み込んだＨＬＡ−Ａ２．１制限ペプチドは、ＣＥＡ、ｐ５３、及びＭＡＧＥ−３に由来する。ＣＥＡペプチドＩ（Ｎｌｅ）ＧＶＬＶＧＶ及びｐ５３ペプチドＳ（Ｎｌｅ）ＰＰＰＧＴＲＶ（配列番号１０１）では、ＮｌｅはＰ２位に存在する。ノルロイシンの一般的有用性については教示されておらず、これらの置換によってネイティブ配列と比較して類似体の性質がどのように変化するのか、又は変化した場合について示した開示は存在しない。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態は、ＭＨＣへの結合を促進する位置にＮｖａ及び／又はＮｌｅを組み込むエピトープ類似体に関する。いくつかの実施形態は、特に、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性エピトープ、ＣＥＡ、ｐ５３、及び／又はＭＡＧＥ−３由来のＨＬＡ−Ａ２．１エピトープ、又はＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、及び／又はｐ５３由来の他のペプチド中のＮｌｅ及び／又はＮｖａの使用を排除する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の上記特許文献中に開示の特異的配列を特に排除する。他の実施形態では、マウス又は他の非ヒトＭＨＣ拘束性エピトープの類似体を排除する。他の例示的な実施形態には、非Ａ２−ＨＬＡ拘束性エピトープ又は非Ａ２．１−ＨＬＡ拘束性エピトープの類似体を作製するための、Ｐ３、Ｐ５、及び／又はＰΩアンカー位置、補助的アンカー位置中、癌遺伝子又は腫瘍胎児性タンパク質由来でないペプチドのアンカー位置中、並びにＣＴ抗原由来のペプチドのアンカー位置中のＮｌｅ及び／又はＮｖａの使用が含まれる。
【０１１３】
一般に、このような類似体は、単剤として又は併用療法における種々の疾患（感染症、癌、又は炎症等）の免疫療法及び／又は予防に有用であり得る。これは、免疫応答の開始及び調節に重要なＭＨＣ分子とのその最適化された相互作用及びＴ細胞応答に起因する。
【０１１４】
類似体の産生
類似体を、当業者に既知の任意の方法（ペプチド合成法又は所望のペプチド類似体をコードする核酸の発現を使用したペプチドの製造が含まれる）を使用して産生することができる。したがって、類似体が１つ又は複数の非標準アミノ酸を含む場合、類似体がペプチド産生方法によって産生される可能性がより高い。類似体が標準的アミノ酸との１つ又は複数の置換のみを含む場合、類似体を、当業者に既知の任意の方法を使用して発現ベクターから発現することができる。或いは、ペプチドを、遺伝子治療法を使用して発現することができる。
【０１１５】
類似体の試験
類似体の有用性及び／若しくは活性、並びに／又は改良された性質を評価し、多少でも類似体を野生型と比較するために、以下の検定のうちの１つ又は複数を行った：ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチド結合親和性、ペプチド−ＨＬＡ−Ａ*０２０１複合体の安定
性検定、交差反応性検定（野生型ペプチド特異的ＣＴＬによるペプチド類似体の認識又はペプチド類似体を使用して生成されたＣＴＬによる野生型ペプチドの認識）、免疫原性検定（ＩＦＮ−γ分泌検定、細胞傷害性検定、及び／又はＥｌｉｓｐｏｔ検定等）、抗原性検定（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞溶解検定、ｅｘ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞溶解、及びｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍細胞溶解等）、及びタンパク質分解耐性の増加を同定するためのタンパク質分解検定。例示的検定の詳細を、以下の実施例に示す。
【０１１６】
上記方法論を使用して、有用な且つ／又は改良された類似体を同定した。有用であるために、類似体は、必ずしも同定された検定で改良されたことが見出される必要はない。例えば、有用なペプチドは、他の性質（寛容化患者又はタンパク質分解耐性で有用であること等）を含み得る。改良されるために、ペプチドは、ＴＣＲへの結合、ＭＨＣ分子への結合が明確に改良され、免疫応答又は任意の他の生物活性が改良されていることを見出すことができる。いくつかの例では、有用なペプチドは、マウス試験系を使用した場合に改良されないようであるが、ヒト免疫系の相違のために、ヒトで試験した場合に改良されると判断される。いくつかの場合、有用性は、寛容化ヒトでの寛容を破壊する可能性に起因し得る。いくつかの例では、有用性は、改良された類似体を同定するためのさらなる置換のための基本としてペプチドを使用する能力に起因し得る。
【０１１７】
類似体の使用
クラスＩＭＨＣ拘束性Ｔ細胞応答、特に抗原に対するエフェクターメモリー（effector
and memory）ＣＴＬ応答を誘起、同調、維持、調節及び増幅する上で、開示されている類似体を使用するのに有用な方法は、共に「ＣＴＬ応答を誘起する方法（A Method of Inducing a CTＬ Response）」と題する米国特許第６，９９４，８５１号（２００６年２月７日）及び同第６，９７７，０７４号（２００５年１２月２０日）；「ＭＨＣクラスＩ制限免疫応答を制御する方法（METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE）」と題する米国特許仮出願第６０／４７９，３９３号（２００３年６月１７日出願）；並びに共に「予防目的又は治療目的で、ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘起、向上及び維持する方法（METHODS TO ELICIT， ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES， FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE）」と題する米国特許出願第１０／８７１，７０７号（公開番号２００５
００７９１５２）及び米国特許仮出願第６０／６４０，４０２号（２００４年１２月２９日出願）に記載されている。また、類似体を研究に用いて、さらなる最適な類似体を得ることができる。多くのハウスキーピングエピトープは、米国特許出願第１０／１１７，９３７号（２００２年４月４日出願）（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）及び同第１０／６５７，０２２号（公開番号２００４０１８０３５４）、並びにＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９Ａ２）（２００３年９月５日出願）；並びに米国特許仮出願第６０／２８２，２１１号（２００１年４月６日出願）；同第６０／３３７，０１７号（２００１年１１月７出願）；同第６０／３６３，２１０号（２００２年３月７日出願）；及び同第６０／４０９，１２３号（２００２年９月５日出願）で提示されており、これらの出願はそれぞれ、「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題されている。類似体はさらに、これらの出願に記載されている種々の形態のいずれでも用いることができる。本発明の類似体から成るか又はこれを含み得るエピトープクラスターは、「エピトープクラスター（EPITOPE CLUSTERS）」と題する米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）に開示及びより詳細に定義されている。本発明の類似体を使用及び送達する方法は、それぞれ「ＣＴＬ応答を誘起する方法（METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE）」と題する米国特許出願第０９／３８０，５３４号及び米国特許第６９７７０７４号（２００５年１２月２０日発行）、及びＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴＵＳ９８／１４２８９（公開番号ＷＯ９９０２１８３Ａ２）に記載されている。このような免疫療法のための有益なエピトープ選択原理は、全て「抗原提示細胞におけるエピトープの同調（EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTIN
G CELLS）」と題する米国特許出願第０９／５６０，４６５号（２０００年４月２８日出願）、同第１０／０２６，０６６号（公開番号２００３０２１５４２５Ａ１）（２００１年１２月７日出願）及び同第１０／００５，９０５号（２００１年１１月７日出願）；「エピトープの発見方法（METHOD OF EPITOPE DISCOVERY）」と題する米国特許第６，８６１，２３４号（２００５年３月１日発行、出願第０９／５６１，０７４号）；「エピトープクラスター（EPITOPE CLUSTERS）」と題する米国特許出願第０９／５６１，５７１号（２０００年４月２８日出願）；「癌に関する抗新血管系の生成（ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER」と題する同第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）（２００２年３月７日出願）；共に「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題する出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９Ａ１）及びＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴＵＳ０２／１１１０１（公開番号ＷＯ０２０８１６４６Ａ２）（共に２００２年４月４日出願）；並びに、共に「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題する出願第１０／６５７，０２２号及びＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２７７０６（公開番号ＷＯ０４０２２７０９Ａ２）（共に２００３年９月５日出願）において開示されている。ワクチンプラスミドの全体的な設計の態様は、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS）」と題する米国特許出願第０９／５６１，５７２号（２０００年４月２８日出願）、及び「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN）」と題する同第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）（２００２年１１月７日出願）；共に「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES
OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS）」と題する同第１０／２２５，５６８号（公開番号２００３−０１３８８０８）（２００２年８月２０日出願）、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２６２３１（公開番号ＷＯ２００４／０１８６６６）（２００３年８月１９日出願）；並びに「プラスミド増殖における望ましくない複製中間体の回避（AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION）」と題する米国特許第６，７０９，８４４号に開示されている。特定の癌に対する免疫応答に関して特定の利点を有する具体的な抗原の組合せは、全て「様々な種類の癌に対するワクチンにおける腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS）」と題する米国特許仮出願第６０／４７９，５５４号（２００３年６月１７日出願）及び米国特許出願第１０／８７１，７０８号（２００４年６月１７日出願）、並びにＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１９５７１（公開番号ＷＯ２００４／１１２８２５）に開示されている。腫瘍新血管系に関する抗原（例えば、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ−２）も、癌疾患に関して有用であり、それは、「癌に対する抗新血管系の生成（ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER」と題する米国特許出願第１０／０９４，６９９号（公開番号２００３００４６７１４Ａ１）（２００２年３月７日出願）に開示されている。生体応答調整物質の標的投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，７２７号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。免疫応答の誘起においてＣＤ４＋細胞をバイパスする方法は、米国特許仮出願第６０／６４０，８２１号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。例示的な疾患、組織及び抗原、並びに対象とされる組織、細胞及び疾患に関するエピトープは、「ＣＴＬ応答を誘起させる方法（METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE）」と題する米国特許出願第６９７７０７４号（２００５年１２月２０日発行）（２００１年２月２日出願）に開示されている。例示的な方法は、共に「様々な種類の癌に関する診断における腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOTISTICS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS）」と題する米国特許仮出願第６０／５８０，９６９号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第２００６−０００８４６８号（Ａ１）（２００６年１月１２日発行）に見出される。方法及び組成物はまた、「様々な種類の癌に対する組成物における腫瘍関連抗原の組合せ（CO
MBINATIONS OF TUMOR-ASSOCAITED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCER）」と題する米国特許仮出願第６０／６４０，５９８号（２００４年１２月２９日出願）に開示されている。本発明の類似体を利用することを含む免疫方法による免疫応答を評価及びモニタリングする診断技法の統合されたものは、共に「診断方法と治療方法とを統合することによる有効な免疫療法の有効性の改良（IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS）」と題する米国特許仮出願第６０／５８０，９６４号（２００４年６月１７日出願）及び米国特許出願第ＵＳ−２００５−０２８７０６８号（Ａ１）（２００５年１２月２９日公開）により詳細に記載されている。免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、「標的関連抗原のエピトープをコードする発現ベクター及びそれらの設計方法（EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN）と題する米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４Ａ１）（２００２年１１月７日出願）、並びに共に「癌細胞及び腫瘍問質において発現される優性エピトープ及びサブ優性エピトープに対する多価免疫応答を誘起させる方法及び組成物（METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA）」と題する米国特許仮出願第６０／６９１，５７９号（２００５年６月１７日出願）及び対応する米国特許出願第    号（本出願と同一日付で出願、代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５３Ａ）に開示されている。問題の方法及び組成物を含むさらなる有用な開示は、「癌腫に対する多価維持増幅免疫治療薬（MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA）」と題する米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）に見出される。さらなる方法、組成物、ペプチド、及びペプチド類似体は、それぞれ「ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS）」及び「ＮＹ−ＥＳＯペプチド類似体（NY-ESO PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許仮出願第６０／５８１，００１号及び同第６０／５８０，９６２号（ともに２００４年６月１７日出願）に開示されている。上記の段落に記述されている出願及び特許はそれぞれ、教示する全てのものに関して参照によりその全体が本明細書に援用される。さらなる類似体、ペプチド及び方法は、「ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許出願公開番号２００６００６３９１３；及び「エピトープ類似体（EPITOPE ANALOGS）」と題する米国特許出願公開番号２００６−００５７６７３Ａ１（２００６年３月１６日公開）；及び「エピトープ類似体（EPITOPE ANALOGS）」と題する及びＰＣＴ国際公開第ＷＯ／２００６／００９９２０（全て２００５年６月１７日出願）、並びに「エピトープ類似体（EPITOPE ANALOGS）」と題する米国特許仮出願第６０／６９１，８８９号（２００５年６月１７日出願）；並びに「初回刺激ペプチド類似体（PRAME PEPTIDE ANALOGUES）」と題する米国特許出願第    ／    号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ）、「ＰＳＭＡペプチド類似体（PSMA PEPTIDE ANALOGUES）」と題する米国特許出願第    ／    号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ２）、並びに「黒色腫抗原ペプチド類似体（MELANOMA ANTIGEN PEPTIDE ANALOGUES）」と題する米国特許出願第    ／    号（代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５２Ａ３)（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示される。例示的な免疫原性産物は、それぞれ「癌腫のための多価維持増幅免疫療薬（MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFY IMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA）」と題する米国特許仮出願第６０／６９１，５８１号（２００５年６月１７日出願）及び米国特許出願第    ／    号（本出願と同一日付で出願された代理人整理番号ＭＡＮＮＫ．０５４Ａ）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示される。さらなる方法論及び組成物は、「ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許仮出願第６０／５８１，００１号（２００４年６月１７日出願）、及び「ＮＹ−ＥＳＯエピトープ類似体（NY-ESO PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許仮出願第６０／５８０，９６２号（２００４年６月１７日出願）
（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。参照により本明細書に明示的に援用される他の出願は、「ＳＳＸ−２ペプチド類似体（SSX-2 PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許出願第１１／１５６，２５３号（公開番号    ）（２００５年６月１７日出願）、「ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド類似体（NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS）」と題する米国特許出願第１１／１５５，９２９号（２００５年６月１７日出願）（公開番号    ）、「生体応答調整物質のリンパ組織への標的投与によって免疫応答を引き起こし、維持し且つ操作する方法（METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS」と題する米国特許出願第１１／３２１，９６７号（２００５年１２月２９日出願）；「予防目的又は治療目的で、ＭＣＨクラスＩ拘束性エピトープに対する免疫応答を誘起、向上及び維持する方法（METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE
REPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES， FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES）」と題する米国特許出願第１１／３２３，５７２号（２００５年１２月２９日出願）；「免疫応答の誘起においてＣＤ４＋細胞をバイパスする方法（METHODS TO BYPASS CD４+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE）」と題する米国特許出願第１１／３２３，５２０号（２００５年１２月２９日出願）；「様々な種類の癌に対する組成物における腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS）」と題する米国特許出願第１１／３２３，０４９号（２００５年１２月２９日出願）；「様々な種類の癌に関する診断における腫瘍関連抗原の組合せ（COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR
VARIOUS TYPES OF CANCERS）」と題する米国特許出願第１１，３２３，９６４号（２００５年１２月２９日出願）である。一例であってそれらに限定されないが、各参考文献は、クラスＩ  ＭＨＣ拘束性エピトープ、類似体、類似体の設計、エピトープ及び類似体の使用、並びにエピトープを使用及び生成する方法、それらの発現に関する核酸ベクターの設計及び使用、及び配合について教示しているものに関して参照により援用される。
【０１１８】
抗原
そのエピトープをＭＨＣ制限様式でＴ細胞によって認識することができる抗原が多数存在し、これらの抗原に対して指示される免疫応答の操作は治療的又は予防的潜在性を有する。本明細書中に記載のＭＨＣ結合ペプチド類似体作製の原理は、一般に、これらの抗原及びそのエピトープのいずれかに適用可能である。本開示は、特に、腫瘍関連抗原（（ＴｕＡＡ）ＳＳＸ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、及びメラン−Ａ）由来のエピトープに注目している。
【０１１９】
Ｈｏｍ−Ｍｅｌ−４０としても知られているＳＳＸ−２は、高レベルで保存されている癌精巣抗原のファミリーのメンバーである（Gure, A．O． et al． Int． J． Cancer 72:965-971, 1997（参照によりその全体が本明細書に援用される））。ＴｕＡＡ抗原としてのその同定は、「黒色腫特異的抗原をコードする単離された核酸分子、及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES THAT ENCODE A MELANOMA SPECIFIC ANTIGEN AND USES THEREOF）」と題する米国特許第６，０２５，１９１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に教示されている。癌精巣抗原は、種々の腫瘍において見られるが、一般的には、精巣を除く正常な成人の組織には存在しない。ＳＳＸ−２は多くの異なる種類の腫瘍で発現され、これらの腫瘍としては、滑膜肉腫、黒色腫、頭頚部癌、胸部癌、結腸癌及び卵巣癌が挙げられる。種々の癌におけるその広範な発現に加えて、ＳＳＸ−２はまた、特に後期疾患を有する患者において免疫原性である。さらに、転移性腫瘍患者におけるこの抗原に対する自発的な体液性免疫応答及び細胞性免疫応答が立証される（Ayyoub M, et
al., Cancer Res． 63(17): 5601-6, 2003; Ayyoub M, et al. J Immunol． 168(4): 1717-22, 2002)（参照によりその全体が本明細書に援用される）。２つのＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞エピトープ、すなわち、ＳＳＸ−２41-49（Ayyoub M, et al. J Immunol． 168(4)
: 1717-22, 2002；「ＨＬＡ分子と結合する、ＳＳＸ分子又はＮＹ−ＥＳＯ−１分子に存在するアミノ酸配列から成る単離ペプチド（ISOLATED PEPTIDES CONSISTING OF AMINO ACID SEQUENCES FOUND IN SSX OR NY-ESO-1 MOLECULES, THAT BIND TO HLA MOLECULE）と題する米国特許第６，５４８，０６４号；「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題する米国特許出願第１０／１１７，９３７号（米国特許出願公開番号２００３−０２２０２３９Ａ１）、並びにＳＳＸ−２103-111（Wagner C, et al. Cancer Immunity 3:18, 2003）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）は近年、Ｔ細胞逆免疫を用いて同定されている。両方のエピトープのＣ末端は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアソーム消化によって効率的に生成される。ＳＳＸ−２陽性患者の腫瘍浸潤リンパ節から単離されたＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＳＳＸ−２41-49多量体+ＣＤ８+Ｔ細胞は、高機能性アビディティ（high functional avidity）を示し、ＳＳＸ−２陽性腫瘍を効果的に識別することができる。しかしながら、この自然発生的な免疫学的応答が疾患の進行のかなり後期まで現れず、また、活性化Ｔ細胞が十分に多くないことから、この免疫学的応答は、腫瘍の成長を停止させるのに十分ではなかったであろう。米国特許第６，５４８，０６４号（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、ＳＳＸ−２エピトープのＰ２位置及びＰΩ位置の両方において、Ｔ又はＡ残基を置換することをさらに記載している。
【０１２０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、多種多様な腫瘍に存在する癌精巣抗原であり、また、ＣＴＡＧ−１（癌精巣抗原−１）及びＣＡＧ−３（癌抗原−３）としても知られている。腫瘍関連抗原（ＴｕＡＡ）であるＮＹ−ＥＳＯ−１は、「食道癌関連抗原をコードする単離された核酸分子、抗原自体、及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING AN ESOPHAGEAL CANCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF）」と題する米国特許第５，８０４，３８１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。広範な配列の同定に伴い抗原をコードするパラロガスな遺伝子座、ＬＡＧＥ−１ａ／ｓ及びＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌは、公表されているヒトゲノムのアセンブリに開示されており、選択的スプライシングを経て生じると結論付けられた。さらに、ＣＴ−２（又はＣＴＡＧ−２、癌精巣抗原−２）は、ＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌの対立遺伝子、突然変異体又は配列不一致のいずれかであると思われる。広範な配列の同定のために、ＮＹ−ＥＳＯ−１からの多くのエピトープはまた、これらの他の抗原を発現する腫瘍に対する免疫性を誘起し得る。タンパク質は、７０のアミノ酸を通して事実上同一である。残基７１〜残基１３４では、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＬＡＧＥの間で一致する最長の連は６残基であったが、おそらく交差反応性配列が存在する。残基１３５〜残基１８０では、ＮＹ−ＥＳＯとＬＡＧＥ−１ａ／ｓは、単一の残基を除いて同一であるが、ＬＡＧＥ−１ｂ／Ｌは、選択的スプライシングのため関連がない。ＣＡＭＥＬ及びＬＡＧＥ−２抗原は、ＬＡＧＥ−１  ｍＲＮＡに由来して生じると思われるが、これにより、選択的読み枠から未反応タンパク質配列が生じる。最近になって、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２７７３１５．５、ホモサピエンス染色体ＸクローンＲＰ５−８６５Ｅ１８、ＲＰ５−１０８７Ｌ１９（完全な配列）（参照によりその全体が本明細書に援用される）により、ＬＡＧＥ１（ゲノムアセンブリのＣＴＡＧ−２に対応する）、並びに、ＬＡＧＥ２−Ａ及びＬＡＧＥ２−Ｂ（共にゲノムアセンブリのＣＴＡＧ−１に対応する）と称されるこの領域の３つの独立遺伝子座が報告されている。
【０１２１】
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165は、「癌関連抗原をコードする単離された核酸分子、当該抗原自体、及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING CANCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF）」と題する米国特許第６，２７４，１４５号におけるＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープであると同定され、「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題する米国特許出願第１０／１１７，９３７号（公開番号２００３０２２０２３９）は、このＣ末端が、ハウスキーピングプロテアソームによってｉｎ
ｖｉｔｒｏ検定で生成されることを報告している。単独又は別の部位のＡと組み合わされる、ＰΩにおける類似体置換基Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ又はＧは、共に「ＮＹ
−ＥＳＯ−１ペプチド誘導体及びその使用（NY-ESO-1-PEPTIDE DERIVATIVES AND USES THEREOF）」と題する米国特許第６，４１７，１６５号及び同第６，６０５，７１１号に開示されている。この段落に記載されている参考文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１２２】
ＭＡＰＥ、ＤＡＧＥ及びＯＩＰ４としても知られているＰＲＡＭＥは本来、黒色腫抗原として観察されている。したがって、ＰＲＡＭＥは、多くのＣＴ抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＢＡＧＥ）と同様ではないがＣＴ抗原として認識されている。ＰＲＡＭＥは、急性骨髄性白血病において発現される。ＰＲＡＭＥは、大部分が仮想上のタンパク質から成るＭＡＰＥファミリーのメンバーであり、限定的な配列類似性を共有している。ＴｕＡＡとしてのＰＲＡＭＥの有用性は、「腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離された核酸分子及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR DAGE AND USES THEREOF）」と題する米国特許第５，８３０，７５３号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に教示されている。「Ｔ細胞ペプチドエピトープを選択及び製造する方法、並びに当該選択されたエピトープを包含するワクチン（METHODS FOR SELECTING AND PRODUCING T CELL PEPTIDE EPITOPES AND VACCINES INCORPORATING SAID SELECTED EPITOPES）」と題する米国特許出願第１０／１８１，４９９号（米国特許出願公開番号２００３−０１８６３５５Ａ１）（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化を用いて免疫プロテアソームによりＰＲＡＭＥ425-433を含む種々の可能性のあるエピトープを同定する。
【０１２３】
「前立腺特異的膜抗原（PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN）」と題する米国特許第５，５３８，８６６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、例えばＴｕＡＡは、前立腺癌において正常な前立腺上皮により高レベルで発現される。ＰＳＭＡはまた、非前立腺腫瘍の新血管系で発見された。したがって、ＰＳＭＡは、前立腺癌及び他の腫瘍の新血管系両方に向けてのワクチンの主成分となる。この後者の構想は、米国特許出願公開番号２００３００４６７１４；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０２／０６９９０７号；及び「癌のための抗新血管系ワクチン（ANTI-NEOVASCULAR VACCINES FOR CANCER）」と題する米国特許仮出願第６０／２７４，０６３号（２００１年３月７日出願）、及び「癌のための抗新血管系製剤（ANTI-NEOVASCULAR
PREPARATIONS FOR CANCER）」と題する米国特許出願第１０／０９４，６９９号（米国特許出願公開番号２００３−００４６７１４Ａ１）（２００２年３月７日出願）（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）により詳細に記載されている。上記公開特許及び出願に記載されている教示及び実施形態は、本発明に関し、且つ本発明に関連して有用な支持する原理及び実施形態を提供する。簡潔に言うと、腫瘍が成長するにつれて、新たな血管の内部成長を高める。これは、非血管新生腫瘍の中心が一般的に懐死性であるため、成長を維持するのに必要であると理解され、また、血管形成阻害剤が腫瘍退縮を起こすことが報告されている。このような新たな血管、又は新血管系は、確立した脈管に見られない抗原を発現し、したがって、特異的に標的とされ得る。新血管系抗原に対するＣＴＬを誘起することによって、脈管を破壊させ、腫瘍への栄養分の流れ（及び腫瘍からの水の除去）を妨げて、退縮をもらす可能性がある。
【０１２４】
また、ＰＳＭＡ  ｍＲＮＡの選択スプライシングは、Ｍｅｔ58における明らかな出発点を有するタンパク質をもたらし、これによって、「選択スプライシングされた前立腺特異的抗原をコードする単離された核酸分子、及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING ALTERNATIVELY SPLICED PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN AND USES THEREOF）」と題する米国特許第５，９３５，８１８号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるようなＰＳＭＡの推定上の膜アンカー領域を欠失する。タンパク質末端ＰＳＭＡ様のタンパク質、例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２６１７１５（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、ＰＳＭＡのアミノ酸３０９〜７５０とほ
ぼ同一であり、異なる発現プロファイルを有する。したがって、より好ましいエピトープは、アミノ酸５８〜３０８から見つかるＮ末端のものである。ＰＳＭＡ288-297は、「ＨＬＡ結合ペプチド及びその使用（HLA BINDING PEPTIDES AND THEIR USES）」と題するＰＣＴ国際公開第ＷＯ０１／６２７７６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）におけるＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有すると確認された。ハウスキーピングプロテアソームを用いた消化及びＨＬＡ−Ａ２への実際の結合によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるその産生は、「エピトープ配列（EPITOPE SEQUENCES）」と題する米国特許出願公開番号２００３０２２０２３９に開示されている。
【０１２５】
チロシナーゼは、メラノサイトの識別の最も特異的なマーカーの１つであると考えられるメラニン生合成酵素である。チロシナーゼは、いくつかの細胞タイプ、主にメラノサイトにおいて発現され、高レベルのものが、黒色腫において頻繁に発見されている。ＴｕＡＡとしてのチロシナーゼの有用性は、「異常細胞のいくつかが複合体ＨＬＡ−Ａ２／チロシナーゼ誘導ペプチドを提示する癌性異常を患った個体を識別する方法、及び当該個体を処置する方法（METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUALS SUFFERING FROM A CELLULAR ABNORMALITY SOME OF WHOSE ABNORMAL CELLS PRESENT CONPLEXES OF HLA-A2／TYROSINASE DERIVED PEPTIDES, AND METHODS FOR TREATING SAID INDIVIDUALS）」と題する米国特許第５，７４７，２７１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に教示されている。
【０１２６】
ＭＡＲＴ−Ｉとも呼ばれるメラン−Ａ（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原）は、黒色腫において高レベルで発現される別のメラニン生合成タンパク質である。ＴｕＡＡとしてのメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１の有用性は、共に「黒色腫抗原、及び診断法及び治療法におけるその使用（MELANOMA ANTIGENS AND THEIR USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC METHODS）」と題する米国特許第５，８７４，５６０号及び同第５，９９４，５２３号、並びに「ＨＬＡ−Ａ２で提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原へと処理される腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離された核酸配列（ISOLATED NUCLEIC ACID SEQUENCE CODING FOR A TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR PROCESSED TO AT LEAST ONE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRESENTED BY HLA-A2）」と題する米国特許第５，６２０，８８６号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）に教示されている。このＴｕＡＡからの免疫優性ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープはメラン−Ａ26-35である。ハウスキーピングプロテアソームによって生成されることが示されている（Morel, S． et al., Immunity 12:107-117, 2000（参照によりその全体が本明細書に援用される））。Ｐ２でＬを置換する改質された類似体を含む、標準アミノ酸を包含する種々の類似体は、「ＨＬＡ分子と結合する単離されたノナペプチド及びデカペプチド、及びその使用（ISOLATED NONA- AND DECAPEPTIDES WHICH BIND TO HLA MOLECULES, AND THE USE THEREOF）」と題する米国特許第６，０２５，４７０号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示されている。生化学安定性を改良することを主な目的とする、非標準アミノ酸を包含する類似体は、Blanchet, J．-S． et al., J． Immunol． 167:5852-5861, 2001（参照によりその全体が本明細書に援用される）により報告されている。
【０１２７】
ＳＳＸ−２  ４１−４９類似体
上記のように、癌患者におけるＳＳＸ−２に対する天然の免疫応答（ＳＳＸ−２41-49に対する応答が含まれる）は、癌の制御で有効でない場合がある。さらに、野生型ＳＳＸ−２41-49は、中程度にしか免疫原性を示さないペプチドであり、その臨床的潜在性がさらに制限され得る。スーパーアゴニスト類似体の使用によって誘導されたより強いＳＳＸ−２特異的免疫応答により、ＳＳＸ−２陽性腫瘍を有する患者で臨床的利点が得られた。
【０１２８】
したがって、１つの実施形態では、組成物中で類似体を使用して被験体の免疫応答を刺激し、標的抗原を示す標的細胞に対する免疫応答を増加させることができる。この実施形態は、新生物疾患及びウイルス疾患の治療及び予防で有用であり得る。
【０１２９】
野生型ＳＳＸ−２41-49は、中程度にしか免疫原性を示さないペプチドであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの有用な腫瘍の排除を防止し得るので、より強力であるか又は種々の性質が改良されたＳＳＸ−２41-49変異型をｄｅ  ｎｏｖｏで設計する方法を使用した。より免疫原性の高いＳＳＸ−２類似体ペプチドの使用により、より強い免疫応答を刺激し、且つ／又は天然に存在する免疫応答を増幅してより良好な臨床応答機会を達成することが可能であった。したがって、改良された性質を同定するために、各類似体についての野生型エピトープに対する結合特性（親和性及びＨＬＡ−Ａ*０２０１／ペプチド複合体の安定性）、免疫原性、抗原性、及び交差反応性を分析した。いくつかの実施形態では、改良された性質は、一般に、類似体を野生型よりもいくつかの目的のためにより良好に使用することができることを意味する。したがって、類似体は、結合、安定性、又は活性の改良を示す必要はなく、過程の一定部分を媒介する能力の減少さえ示してもよいが、依然として別の方法で使用するために改良されている。例えば、いくつかの活性を保持するが全ての活性を保持するわけではない類似体は、野生型抗原を寛容するヒト系でより良好であり得る。
【０１３０】
以前に、好ましいアンカー残基の組み込みによる天然の腫瘍関連ペプチドエピトープの修飾により、ＨＬＡ分子との結合プロファイルが改良され、免疫原性が増強された類似体が生成されている。最も首尾のよい例の１つは、メラン−Ａ２６−３５エピトープのＡ２７Ｌペプチド類似体である。Valmori et al.,「選択されたメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１免疫優性ペプチド類似体によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特異的な腫瘍反応性ＣＴＬの発生の増大（Enhanced generation of specific tumor-reactive CTL in vitro by selected Melan-A/MART-1 immunodominant peptide analogs）」（J Immunol. 1998, 160(4): 1750-8）（その全体が本明細書中で参考として援用される）。元のエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２分子と安定な複合体を形成することができず、これは、元のエピトープが２位に最適なアンカーアミノ酸残基を欠いていたからであった。修飾Ａ２７Ｌメラン−Ａ２６−３５ペプチド類似体は、その野生型対応物よりもＨＬＡ−Ａ２分子との結合プロファイルの明確な増加及び高い免疫原性が証明された。この類似体での患者の免疫化により、細胞表面に提示された野生型エピトープを認識することができる強いＴ細胞免疫応答が得られた。多数の他の腫瘍関連エピトープ（ＧＰ１００  ２０９〜２１７(Parkhurst et al.,「ＨＬＡ−Ａ*０２０１結合残基で修飾された黒色腫抗原（ｇｐ１００）由来のペプチドを有する黒色腫反応性ＣＴＬの改善された誘導（Improved induction of melanoma-reactive CTL with
peptides from the melanoma antigen gplOO modified at HLA-A*0201-binding residues）」（J Immunol. 1996, 157(6): 2539-48）（その全体が本明細書中で参考として援用される）及びＨｅｒ−２  ３６９−３７７(Vertuani et al.,「ＭＨＣ接触残基の修飾によるＨＥＲ−２／ｎｅｕの免疫優勢エピトープの改善された免疫原性（Improved immunogenicity of an immunodominant epitope of the HER-2/neu protooncogene by alterations of MHC contact residues）」（J Immunol. 2004, 172(6): 3501-8）（その全体が本明細書中で参考として援用される）等）を有する類似の修飾物が首尾よく得られている。
【０１３１】
滑膜肉腫Ｘ切断点（breakpoint）２（ＳＳＸ−２）野生型配列の類似体の同定及び産生のために使用することができる方法が本明細書において開示される。本明細書中に開示の方法を使用して、アミノ酸２４１〜２４９由来の野生型配列に基づいた９５の新規のＳＳＸ−２41-49類似体のパネルを種々の改良された性質によって同定した。改良された性質には、クラスＩ  ＭＨＣ分子及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子への結合並びに生物学的応答（ＩＦＮ−γ分泌、細胞傷害性、及び腫瘍細胞溶解等）が含まれるが、これらに限定されない。野生型エピトープとの交差反応性が保持された潜在性が改良されたペプチドも同定した。これらの類似体のうちのいくつかは野生型ＳＳＸ−２41-49ペプチドのスーパーアゴニスト変異型であることが証明された。そのうちのいくつかははるかに高いＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性を有することが示され、ペプチド−ＨＬＡ複合体は広範な安定性を有した。これらの類似体は、これらの類似体で免疫化されたＨＨＤトランスジェニ
ックマウスにおいて増強されたＣＴＬ免疫応答を誘導した。得られたＣＴＬは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方でＡ２＋及びＳＳＸ−２＋腫瘍細胞株を有効に溶解することができ、このことは、類似体を使用して生成されたＣＴＬが天然に細胞表面に提示される野生型ＳＳＸ−２41-49エピトープを認識することができることを示している。野生型ＳＳＸ−２41-49エピトープと比較して、類似体は、癌ワクチン開発のより良好な候補である。
【０１３２】
したがって、本明細書中に開示の本発明の実施形態は、ヒト精巣癌（ＣＴ）抗原ＳＳＸ−２のアミノ酸４１−４９（ＳＳＸ−２41-49）に対する配列に関連する９〜１０アミノ酸長の１つ又は複数のペプチドのファミリーを含む。個々のペプチドの実施形態は、野生型配列中に１〜数個の定義されたアミノ酸置換を有する。置換アミノ酸は、様々に、一般的に遺伝子コードされるアミノ酸の標準的なセットの他のメンバー、その誘導体、そのＤ立体異性体、又は他の非標準Ｌ−アミノ酸である。これらの類似体は、クラスＩ  ＭＨＣ分子及びＴＣＲ分子並びに免疫応答の他の成分との野生型エピトープの相互作用の調査並びにさらに最適化された免疫学的性質を有するさらなる類似体の設計に有用である。類似体のいくつかの実施形態は、試験されたＨＬＡトランスジェニックマウスモデル中に野生型エピトープに少なくとも類似する免疫学的性質を有する。ＳＳＸ−２が寛容度を予想することができる自己抗原であり、且つ類似体のアミノ酸の相違が、負の選択が回避されているが、野生型エピトープとの交差反応性を示すＴ細胞集団の刺激を補助することができるので、このようなペプチドはヒトで有用であり得る。種々のペプチドの実施形態は、これらがＭＨＣに対するより高い親和性又はＭＨＣに対するより高い結合安定性を有し、野生型エピトープを認識するＴ細胞からの類似のサイトカイン産生を誘発するためにより高いサイトカイン産生を誘発するか又はより低いペプチド濃度しか必要とせず、免疫原性がより高く、野生型エピトープに対する交差反応性細胞溶解性応答を誘導又は増幅することができ、且つ／又は寛容を破壊することができると言う点で、１つ又は複数の改良された免疫学的性質を有し得る。
【０１３３】
１つの実施形態では、類似体は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９、及びＰ１０から成る群から選択される残基に少なくとも１つの置換を有し得る。さらなる実施形態では、類似体は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９、及びＰ１０から成る群から選択される残基に少なくとも２つの置換を有し得る。さらなる実施形態では、類似体は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ９、及びＰ１０から成る群から選択される残基に少なくとも３つの置換を有し得る。さらなる実施形態では、類似体は、Ｐ２及びＰ９位に置換を有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９残基に置換を有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ４残基に置換を有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ６残基に置換を有し得る。さらなる実施形態では、ペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ８残基に置換を有し得る。１つの実施形態では、２つの置換により性質を改良することができる。さらなる実施形態では、１つの置換により性質を改良することができる。さらなる実施形態では、３つの置換により性質を改良することができる。さらなる実施形態では、１つ又は複数の置換により性質を改良することができるが、野生型配列を認識するＴＣＲによって依然として認識される（依然として野生型配列と交差反応性を示す）。
【０１３４】
１つの実施形態は、類似体を遊離するようにプロセシングすることができるエピトープ類似体配列を含むエピトープアレイ及び他のポリペプチドに関する。さらなる実施形態は、このようなポリペプチド又は単純に類似体をコードする核酸（特にＤＮＡプラスミド）及びこれらからの発現に関する。類似体、類似体を含むポリペプチド、及びコードする核酸は全て、免疫原性組成物、特に、リンパ内送達に適切な組成物の成分であることができ、これは、さらなる実施形態を構成する。
【０１３５】
類似体設計
実施形態は、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１）の置換を含むＳＳＸ−２41-49ペプチドに関する（図１を参照のこと）。さらなる実施形態では、類似体は、一般に、配列ＫＡＳＥＫＩＦＹＶＹ（配列番号１）を有するＳＳＸ−２41-50十量体ペプチドの類似体であり得る。本明細書中で、ペプチド内の位置を指定するために、ペプチドを構成する残基又はアミノ酸を、Ｐ１〜Ｐ９又はＰ１〜Ｐ１０という。Ｎ末端からＣ末端に番号をつける場合、九量体中のＰ１はＮ末端リジンに対応し、Ｐ９はＣ末端バリンに対応する。或いは、残基を、残基が含まれる分子の一次活性によって言及することができる。例えば、残基Ｐ２をＮ末端一次アンカー分子として記載し、Ｐ９（又は十量体ではＰ１０）を一次Ｃ末端アンカーとして記載する。残基Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８は、主にＴＣＲ相互作用に関与する。置換は任意のアミノ酸（当業者に既知の標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）を使用することができる。多数の例示的アミノ酸を本明細書中に開示しているが、本明細書中に記載の置換は、全ての推測される置換が含まれるリストであることを意味せず、可能な置換の例である。当業者は、カタログ及び参考文献中に多数の他の非標準アミノ酸を見出すことができ、これらを本明細書中に記載の類似体と共に使用するために購入するか化学的に生成することができる。
【０１３６】
多数の可能な類似体が、より良好なＨＬＡ結合プロファイル及びより高い免疫応答を達成するためのペプチドアンカー残基の修飾（Ｎ末端一次アンカー（Ｐ２位）、Ｎ末端二次アンカー（Ｐ１位）、Ｎ末端一次及び二次アンカー（Ｐ１位及びＰ２位）、並びにＮ末端一次／二次アンカー（Ｐ１位及びＰ２位）及びＣ末端一次アンカー（Ｐ９位）での修飾が含まれる）によって生成された。さらに、アンカー残基及びＴＣＲ接触残基で修飾したペプチドを生成して、自己抗原のためのＴ細胞寛容を回避した。これらの修飾には、Ｎ末端一次／二次アンカー（Ｐ１位及びＰ２位）及び二次ＴＣＲ認識部位（Ｐ４位、Ｐ６位、及び／又はＰ８位）での修飾、Ｎ末端一次／二次アンカー（Ｐ１位及びＰ２位）での修飾、並びにＣ末端一次アンカー（Ｐ９）及び二次ＴＣＲ認識部位（Ｐ４位、Ｐ６位、及び／又はＰ８位）での修飾が含まれていた。さらに、十量体類似体を生成した。
【０１３７】
改良された性質を有する類似体を最良に生成する残基の選択には、当該技術分野で既知のＭＨＣペプチド相互作用の研究、ＴＣＲペプチド相互作用の研究、及び以前の類似体の分析が必要であった。いくつかの残基は、主に特異的相互作用に関与し、そのうちのいくつかは二次的又はさらに三次的に関与する。したがって、どのようにして残基がこれらの分子への結合に関与するかということについての知識は、分析に含まれていた。さらに、いくつかの野生型残基が好ましく、これは野生型残基が目的の相互作用のために十分に作用することを意味する一方で、他の残基は好ましくないことを意味し、他の残基が相互作用のために十分に作用しないことを意味する。したがって、１つの実施形態では、好ましくない残基を置換することができる。例えば、バリンはＨＬＡ分子と強く相互作用するので、Ｃ末端ではバリンが一般に好ましいアンカー残基である。したがって、この残基を置換することはあまり好ましくなかった。しかし、好ましいアンカー残基の組み込みによる野生型腫瘍関連ペプチドエピトープの修飾により、ＨＬＡ分子との結合プロファイルが改良され、且つ免疫原性が増強された類似体が生成された。最も首尾のよい例の１つは、メラン−Ａ  ２６−３５エピトープのＡ２７Ｌペプチド類似体である（Valmori D, et al. J Immunol. 160(4): 1750-8, 1998（その全体が本明細書中で参考として援用される））。元のエピトープは、２位に最適なアンカー残基を欠いていたので、ＨＬＡ−Ａ２分子との安定な複合体を形成することができなかった。対照的に、修飾メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌペプチド類似体は、ＨＬＡ−Ａ２分子との結合プロファイルの明白な増加及びその野生型対応物よりも高い免疫原性が証明された。この類似体での患者の免疫化により、細胞表面に提示された野生型エピトープを認識することができる強いＴ細胞免疫応答が生成された。ＧＰ１００  ２０９〜２１７(Parkhurst MR, et al. J Immunol. 157(6): 2539-48, 1996（その全体が本明細書中で参考として援用される）、Ｈｅｒ−２  ３６９−３７７(V
ertuani S, et al. J Immunol. 172(6): 3501-8, 2004）（その全体が本明細書中で参考として援用される）等の多数の他の腫瘍関連エピトープを使用して、類似の修飾を行った。
【０１３８】
残基の置換数の選択は、野生型エピトープを認識するＴ細胞によって依然として認識されるエピトープの十分な質を依然として保持しながらより良好な残基と置換することを要求することを含む。したがって、１つの実施形態では、野生型ペプチドに対して１つ又は２つの置換を行うことができる。さらなる実施形態では、野生型ペプチドとの交差反応性を保持しながら３つ以上の置換を行うことができる。
【０１３９】
一般に、ＴＣＲ認識に関与するペプチドの一部は、野生型エピトープとの交差可能性を依然として保持しながら免疫原性が改良されるように置換されることが望ましい。１つの例では、免疫原性の増加を示すペプチドが好ましい。Ｐ２位又はＮ末端の第２のアミノ酸は、主に結合特性の改良によって主に免疫原性を改良する過程に関与すると考えられるので、例示的類似体中に望ましい置換を同定するための好ましい置換部位及び多数の修飾を行うことが好ましい。カルボキシ末端の位置（ＰΩ）も同様に考慮され、この位置は、ＭＨＣ結合にも重要であり得る。
【０１４０】
したがって、１つの実施形態では、類似体は、野生型アラニンをより疎水性の高い残基に置換するＰ２残基での置換を含み得る。さらなる実施形態では、疎水性残基はまた、より嵩高い側鎖を保有し得る。さらなる実施形態では、Ｐ１の残基をより疎水性の高い残基と置換することができる。さらなる実施形態では、残基Ｐ１及びＰ２の両方をより疎水性の高い残基と置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９の少なくとも１つの残基を置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９の少なくとも２つの残基を置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ９、Ｐ４、及びＰ６の少なくとも２つの残基（ＴＣＲ結合に関与する１つ又は複数の残基が含まれる）を置換することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ分子又はＭＨＣ分子への結合に二次的にのみ関与する残基の置換が有利であり得る。例えば、二次的ＴＣＲ結合アミノ酸の置換により、依然として結合し、応答が得られ、ＭＨＣ分子への結合を妨害しないが、好ましくは、自己抗原の寛容問題を克服する類似体を生成することができる。癌患者が抗原に部分的に寛容し得るので、これは有用である。したがって、この寛容を克服するために、いくらかの活性を保持する類似体は、免疫系によって「自己」として認識される可能性が低いので、免疫原性がより改良された類似体より好ましいものであり得る。
【０１４２】
定義された名目上のエピトープの種々の位置でのアミノ酸置換に加えて、長さの変動を類似体として使用することもできる。最も一般的には、さらなるアミノ酸残基を、ペプチド末端の一方、他方、又は両方に付加するか又はこれらから除去する。いくつかの場合、被験体への投与後のタンパク質分解によってさらなる末端残基を除去し、ＭＨＣとの結合前に名目上のエピトープ又は同一の長さの類似体を再生する。他の場合、実施例２０に記載されているか又はメラン−Ａ27〜35とメラン−Ａ26-35との間の関係によって例示されるように、長さの変化したペプチドは、真に抗原的に交差反応性を示す。これらのさらなる末端位置（場所によって本明細書中でＰ０及びＰΩ＋１と呼ばれる）のいずれかの任意の特定のアミノ酸を特異的に含むか排除する個々の実施形態は、本明細書に記載の本発明の範囲内であると理解すべきである。類似体が本質的に１つの配列から成ると言われている場合、短縮されているか又は交差反応性が保持されているこのような短い長さの変異型が意図されると理解すべきである。いくつかの実施形態では、特にアンカー位置の間のより小さなアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、又はセリン）の挿入により、ＴＣＲ相互作用残基の変化に対して同様に挙動することができる。
【０１４３】
１．Ｎ末端近位一次アンカーの修飾（Ｐ２）
Ｎ末端一次アンカーは、ペプチドの第２のＮ末端アミノ酸であり、且つＮ末端近位一次アンカーである。これは、主に、ＭＨＣ分子との相互作用に関与し、置換によって結合及び安定性を改良することができる。しかし、ＴＣＲ相互作用にも二次的に関与し得る。したがって、この部位での置換により、ＭＨＣ分子との相互作用が改良され、ＴＣＲとの相互作用も改良されたペプチドを得ることができる。
【０１４４】
野生型配列中のこの位置で見出されるアラニンは、一般に、ＭＨＣ分子との相互作用に好ましくないと考えられている。したがって、類似体の好ましい実施形態は、この位置で置換される。１つの実施形態では、野生型配列中で見出される元のＡｌａ４２を、より疎水性の高いアミノ酸と置換することができる。任意のより疎水性の高いアミノ酸（利用可能な任意のアミノ酸が含まれる）又は当業者に既知のアミノ酸（標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）を使用することができる。さらなる実施形態では、元のＡｌａ４２を、嵩高い側鎖も保有するより疎水性の高いアミノ酸と置換する。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、α−アミノ酪酸、ノルロイシン、及びノルバリン。表１は、Ｎ末端近位一次アンカーの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
【０１４５】
【表１】
2008543314.tif 000003
【０１４６】
２．Ｎ末端二次アンカーの修飾（Ｐ１）
Ｎ末端二次アンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸である。この残基は、Ｌｙｓ４１であり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との相互作用における二次アンカー残基と定義される。しかし、一定の程度までのＴ細胞受容体との相互作用にも関与している。したがって、この位置の修飾により、より免疫原性が高く、且つ腫瘍ワクチンの開発により適切ないくらかヘテロクリティックな類似体を生成することができる。この位置でのリジンは一般に好ましいと見なされているが、置換によってより改良された性質を得ることができる。
【０１４７】
したがって、１つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のＬｙｓ４３を、より疎水性の高いアミノ酸に置換することができる。任意のより疎水性の高いアミノ酸（利用
可能な任意のアミノ酸が含まれる）又は当業者に既知のアミノ酸（標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）を使用することができる。さらなる実施形態では、Ｌｙｓ４３を、芳香族アミノ酸に置換することができる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＤ−Ｌｙｓ。表２は、Ｎ末端二次アンカーの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
【０１４８】
【表２】
2008543314.tif 000004
【０１４９】
３．Ｎ末端一次及び二次修飾（Ｐ２及びＰ１）
１つの実施形態では、一次及び二次アンカー残基の両方を置換して、ＨＬＡ分子に対する結合親和性を改良した。さらなる実施形態では、二重置換により、ＨＬＡ分子に対する結合安定性を改良した。さらなる実施形態では、結合及び／又は安定性が改良されずにさらに減少することさえあったが、分子の他の性質（寛容化個体による活性又は認識等）を改良した。表３は、Ｎ末端一次及び二次アンカーの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
【０１５０】
【表３】
2008543314.tif 000005
【０１５１】
４．Ｎ末端一次／二次アンカー及びＣ末端一次修飾（Ｐ２、Ｐ１、及びＰ９）
野生型ペプチドのＣ末端Ｖａｌは、一般に好ましいアンカー残基であり、主にＭＨＣ分子との相互作用に関与する。しかし、置換を行い、どのアミノ酸が一次及び二次Ｎ末端修飾をされた類似体を改良するかを同定した。これらのＣ末端置換は、１つ又は複数のＮ末端修飾の非存在下でも使用しえる。
【０１５２】
これらの修飾は、結合親和性及び安定性の改良を示し、いくつかの場合、交差反応性が減少した類似体が得られた。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃ末端への置換により、交差反応性を減少させることなく結合及び／又は安定性が改良されたペプチドが得られた。しかし、他の実施形態では、Ｃ末端への置換により、交差反応性が同等であるか減少した、結合及び／又は安定性が改良されたペプチドが得られた。各分子は、一定の症例又は一定の患者で役立ち得る。１つの実施形態では、Ｃ末端のバリンを、大きな脂肪族ア
ミノ酸に置換する。表４は、Ｎ末端一次／二次アンカーの修飾及びＣ末端一次修飾並びにそれぞれの結果のまとめである。
【０１５３】
【表４】
2008543314.tif 000006
【０１５４】
５．Ｎ末端一次／二次アンカー及びＴＣＲ残基の修飾
ＴＣＲ部位は、一般に、残基Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８として認識されており、ＴＣＲへの
結合に関与する一次残基である。しかし、他の残基もより小さな範囲の相互作用に関与し得る。１つの実施形態では、主にＴＣＲ相互作用に関与する１つ又は複数の部位を置換して相互作用を増加させることができる。好ましくは、これらの置換により、ＭＨＣ分子への結合を妨害しないが、野生型ペプチドの寛容問題を克服するヘテロクリティック類似体を生成することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及び／又はＰ９位での少なくとも１つの置換と共に少なくとも１つのＴＣＲ置換を含むことができる。さらなる実施形態では、任意の１つ又は複数のＰ４、Ｐ６、及びＰ８位での置換は、極性アミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、Ｐ８位の芳香族アミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、Ｐ６位に大きな脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、置換は、相互作用を保存するためのより大きな側鎖を有するアミノ酸であり得る。表５は、Ｎ末端一次／二次アンカー及びＴＣＲ残基の修飾並びにそれぞれの結果のまとめである。
【０１５５】
【表５−１】
2008543314.tif 000007
【表５−２】
2008543314.tif 000008
【０１５６】
６．Ｃ末端アミド
いくつかの実施形態では、遊離カルボン酸の代わりにアミドを含むようにＣ末端残基を修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが９量体（九量体）である場合、Ｐ９残基を修飾することができる。ペプチドが１０量体（十量体）である場合、Ｐ１０残基を修飾することができる。好ましくは、これにより、生体媒質（血液、リンパ、及びＣＮＳが含まれるが、これらに限定されない）中での安定性が増加したペプチド又は類似体が得られる。好ましくは、ペプチドは、ワクチン接種又は免疫原として有用な類似体を得るための他の必要な活性を保持することができる。表６は、Ｃ末端アミドの修飾及びそれぞれの結果のまとめである。
【０１５７】
【表６】
2008543314.tif 000009
【０１５８】
７．十量体
一般的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、約８アミノ酸長から約１１アミノ酸長まで変化し得る。しかし、前に使用したほとんどのＨＬＡ−Ａ*０２０１は、９量体（九量体）又は１０量体（十量体）である。したがって、１つの実施形態では、類似体は、野生型配列ＳＳＸ−２41-50の類似体であり得る。しかし、野生型１０量体が正確な結合モチーフを有せず、且つ免疫学的活性を示さないので、Ｐ１０位のアミノ酸の置換及び種々の野生型及び類似体の影響の同定によって１０量体を作製した（図１Ｂを参照のこと）。
【０１５９】
８．残存残基
図１Ａ及び図１Ｂに関して、任意の残基を保存的アミノ酸に置換することもできる。保存的置換を、影響を与えることができる上記置換のいずれかと組み合わせることができる。或いは、保存的置換は、一次、二次レベル、又は三次レベルでさえもいかなる活性にも関与しないと考えられる残基で特異的に行うことができる。このような残基には、Ｐ３、Ｐ５、及びＰ７が含まれる。例えば、Ｐ３位のセリンをアラニン又はトレオニンに置換して、類似体を生成することができる。一般的には、このような保存的置換は、類似体の活性に有意に影響を与えないが、いくつかの実施形態では、保存的置換は、一定の活性を増加させるか、一定の活性を減少させることができる。
【０１６０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165類似体
一般的な又はＳＳＸ−２エピトープに適用されるような類似体設計の種々の実施形態及び態様に関する多数の特徴を上記に開示している。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
【０１６１】
実施形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５））の類似体、エピトープ類似体を提示するためにｐＡＰＣによってプロセシングすることができるこれらの類似体を含むポリペプチド、及び類似体を発現する核酸に関する。類似体は、野生型エピトープと比較して類似又は改善された
免疫学的性質を有し得る。
【０１６２】
１つの実施形態は、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の類似体を誘導及び改良する方法及び置換を含む特異的配列に関する。類似体は、少なくとも１つの置換を含み得るが、標準的又は非標準アミノ酸を単独又は種々の組み合わせで含む複数の置換を有し得る。類似体により、性質が保持又は改良されたペプチドを得ることができる。
【０１６３】
エピトープＮＹ−ＥＳＯ−１157-165は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細胞に対するエピトープ特異的Ｔ細胞活性の測定により、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細胞株によって提示されることが示されている（Jaeger, E. et al., J. Exp. Med. 187:265-270, 1998; 「癌関連抗原をコードする単離核酸分子、その抗原自体、及びその使用（ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING CANCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF）」と題される米国特許第６，２７４，１４５号（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される））。ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の物理化学的性質を改良する方法論は、「ＮＹ−ＥＳＯ−１−ペプチド誘導体及びその使用（NY-ESO-1-PEPTIDE DERIVATIVES, AND USES THEREOF）」と題される米国特許第６，４１７，１６５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されており、末端システインの、ＭＨＣとの相互作用を保存又は増強し、活性を妨害するジスルフィドＣ−Ｃ結合形成の有害な性質を欠く他のアミノ酸への置換から成り得る。しかし、Ｃ末端システイン残基のみの操作は、主要組織適合性（ＭＨＣ）及び／又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合のためのペプチド全体の複数の残基の最適化による利点を無視する。したがって、Ｃｙｓ残基の変異の実用性を超えて、ペプチド全体でさらなるアミノ酸が変異する機会が顕著にある。例えば、置換を使用して、クリニックでより有効に適用することができる様式でＭＨＣ及び／又はＴＣＲへの結合をさらに最適化することができる。
【０１６４】
実施形態は、ヒト精巣癌（ＣＴ）抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１のアミノ酸１５７−１６５（ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165）と配列が関連する９又は１０アミノ酸長の１つ又は複数のペプチドのファミリーに関する。
【０１６５】
類似体設計
類似体は、一般に、配列ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）を有するＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の類似体である。野生型アミノ酸が好ましいか否かの分析には、他のペプチド−ＭＨＣ又はＴＣＲ相互作用の以前の分析を使用した。例えば、Ｃ末端のシステインは、ＨＬＡ分子と強く相互作用しないので、一般に、好ましくないアンカー残基である。したがって、この残基を置換することが非常に好ましかった。しかし、Ｐ１位のセリンが一般に好ましいにもかかわらず、芳香族の置換により性質が改良されたペプチドを生成することができることが見出された。さらに、Ｐ２位のロイシンは一般に許容可能であるが、疎水性且つ／又は嵩高いアミノ酸の置換により、性質が改良されたペプチドが得られた。残基は、主に、ＴＣＲとの相互作用に関与し（Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８）、これはいくらかの極性を優先する傾向があり、Ｐ８の場合、芳香族は、一般に、好ましい性質を有するペプチドを生成した。
【０１６６】
１つの好ましい実施形態は、Ｐ２位で置換された類似体に関する。１つのこのような実施形態では、置換は、疎水性残基であり得る。さらなる実施形態では、置換は、嵩高い疎水性残基であり得る。別の実施形態では、Ｐ１の残基を、より疎水性の高い残基に置換することができる。さらなる実施形態では、残基Ｐ１及びＰ２の両方をより疎水性の高い残基と置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９の少なくとも１つの残基を置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ９の少なくとも２つの残基を置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ９、Ｐ４、及びＰ６の少なくとも２つの残基（ＴＣＲ結合に関与する１つ又は複数の残基が
含まれる）を置換することができる。さらなる実施形態では、Ｐ８の残基を芳香族残基に置換することができる。以下の置換の例を、図１３Ａ〜図１３Ｃに示す。
【０１６７】
１．Ｎ末端近位一次アンカーの修飾（Ｐ２）
Ｎ末端一次アンカーは、ペプチドの第２のＮ末端アミノ酸であり、したがって、Ｎ末端近位一次アンカーである。元のロイシン１５８はＭＨＣ分子への結合に「好ましくない」と見なされないが、置換によって結合が改良されたペプチドを生成することができる。したがって、１つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のＬｅｕ１５８を、類似又はより疎水性の高いアミノ酸と置換することができる。任意の疎水性アミノ酸（利用可能であるか当業者に既知のアミノ酸（標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）が含まれる）を使用することができる。さらなる実施形態では、元のＬｅｕ１５８を、これもまた嵩高い側鎖を保有するより疎水性の高いアミノ酸と置換することができる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、α−アミノ酪酸、ノルロイシン、及びノルバリン。さらに、ナフタル側鎖も置換することができる。好ましくは、置換により、ＨＬＡ分子との結合及び安定性が改良される。しかし、この残基は、ＴＣＲ相互作用に二次的又は三次的に関与し得、置換により、ＴＣＲによる認識も改良することができる。
【０１６８】
２．Ｎ末端二次アンカーの修飾
Ｎ末端二次アンカーは、Ｎ末端又はＰ１の第１のアミノ酸である。この残基は、多数の相互作用に関与する。Ｓｅｒ１５７残基を、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との相互作用における二次アンカー残基と定義した。これは、一定の程度までのＴ細胞受容体との相互作用にも関与している。したがって、この位置の修飾により、より免疫原性が高く、且つ腫瘍ワクチンの開発により適切ないくらかヘテロクリティックな類似体が生成される。したがって、置換により、種々の質を改良することができる。
【０１６９】
セリンは「好ましくない」と見なされているが、多数の置換により、ペプチドの質を改良することができる。したがって、１つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のＳｅｒ１５７を、より疎水性の高いアミノ酸に置換することができる。任意のより疎水性の高いアミノ酸（利用可能であるか又は当業者に既知のアミノ酸（標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）が含まれる）を使用することができる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＤ−Ｌｙｓ。
【０１７０】
３．Ｎ末端一次及び二次修飾（Ｐ２及びＰ１）
１つの実施形態では、一次及び二次アンカー残基の両方を置換して、ＨＬＡ分子に対する結合親和性を改良した。さらなる実施形態では、二重置換により、ＨＬＡ分子に対する結合安定性を改良した。さらなる実施形態では、結合及び／又は安定性が改良されずにさらに減少することさえあったが、分子の他の性質（寛容化個体による活性又は認識等）を改良した。
【０１７１】
４．Ｎ末端一次／二次アンカー及びＣ末端一次アンカーの修飾（Ｐ２、Ｐ１、及びＰ９）
野生型ペプチドのＣ末端システインは、一般に好ましくないアンカー残基である。この残基は、一般に、主にＭＨＣ分子との相互作用に関与するので、ＭＨＣ分子とのより強く相互作用する残基を置換することが好ましいと思われる。したがって、置換により、結合親和性及び安定性の改良が示され、いくつかの場合、交差反応性が減少した類似体が得られた。いくつかの実施形態では、Ｃ末端への置換により、交差反応性を減少させることなく結合及び／又は安定性が改良されたペプチドを得ることができる。しかし、他の実施形態では、Ｃ末端への置換により、交差反応性が同等又は減少した、結合及び／又は安定性が改良されたペプチドを得ることができる。この残基の置換によって改良されたペプチド
が得られることが以前に示されていたので、ＭＨＣ分子との相互作用及び他の相互作用（ＴＣＲによる認識等）がより改良されたペプチドを生成することが好ましいと思われる。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃ末端置換を、少なくとも１つの他の置換と組み合わせることができる。Ｃ末端へのアミノ酸置換の例には、バリン、リジン、アラニン、及びイソロイシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
５．Ｎ末端一次／二次アンカー及びＴＣＲ残基の修飾
ＴＣＲとの相互作用に関与する一次残基を、一般に、残基Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８として認識する。しかし、他の残基もより小さな範囲の相互作用に関与し得る。１つの実施形態では、主にＴＣＲ相互作用に関与する部位のうちの１つ又は複数を置換して相互作用を増加させることができる。好ましくは、これらの置換により、ＭＨＣ分子への結合を妨害しないが、野生型ペプチドの寛容問題を克服するヘテロクリティック類似体が生成される。１つの実施形態では、Ｐ１、Ｐ２、及び／又はＰ９位での少なくとも１つの置換と共に少なくとも１つのＴＣＲ置換を含むことができる。１つの実施形態では、いくらかの極性を有するアミノ酸を、Ｐ４、Ｐ６、及びＰ８で置換することができる。さらなる実施形態では、芳香族アミノ酸を、Ｐ８位で置換することができる。
【０１７３】
６．Ｃ末端アミド
いくつかの実施形態では、遊離カルボン酸の代わりにアミンを含むようにＣ末端残基を修飾することができる。したがって、例えば、ペプチドが９量体（九量体）である場合、Ｐ９残基を修飾することができる。ペプチドが１０量体（十量体）である場合、Ｐ１０残基を修飾することができる。好ましくは、これにより、生体媒質（血液、リンパ、及びＣＮＳが含まれるが、これらに限定されない）中での安定性が増加したペプチド又は類似体が得られる。好ましくは、ペプチドは、ワクチン接種又は免疫原として有用な類似体を得るための他の活性を保持する。
【０１７４】
７．十量体
一般的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、約８アミノ酸長から約１１アミノ酸長まで変化する。しかし、前に使用したＨＬＡ−Ａ*０２０１のほとんどは、９量体（九量体）又は１０量体（十量体）である。したがって、１つの実施形態では、類似体は、野生型配列ＮＹ−ＥＳＯ−１157-166の１０量体であり得る。しかし、野生型１０量体が正確な結合モチーフを有せず、且つ免疫学的活性を示さないので、Ｐ１０位のアミノ酸の置換及び種々の修飾の影響の同定によって１０量体を作製した（図１３Ａ〜図１３Ｃを参照のこと）。１つの実施形態では、Ｃ末端で野生型に付加又は置換した残基を、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、バリン、及びアラニンから成る群から選択することができる。
【０１７５】
８．残存残基
図１３Ａ及び図１３Ｃに関して、任意の残基を保存的アミノ酸に置換することもできる。保存的置換を、影響を与えることができる上記置換のいずれかと組み合わせることができる。或いは、保存的置換は、一次、二次レベル、又は三次レベルでさえもいかなる活性にも関与しないと考えられる残基で特異的に行うことができる。このような残基には、Ｐ３、Ｐ５、及び／又はＰ７が含まれ得る。保存的置換は当業者に既知であるが、例えば、Ｐ３位のロイシンをアラニン又はトレオニンに置換して、類似体を生成することができる。一般的には、このような保存的置換は、類似体の活性に有意に影響を与えない。しかし、いくつかの実施形態では、保存的置換は、一定の活性を増加させるか、又は一定の活性を減少させることができる。既知の相互作用により、このような保存的置換が任意の活性に有意に影響を及ぼす可能性はない。
【０１７６】
ＰＳＭＡ288-297類似体
一般的な又は特定のエピトープに適用されるような類似体設計の種々の実施形態及び態
様に関する多数の特徴を上記に開示している。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
【０１７７】
いくつかの実施形態は、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞エピトープＰＳＭＡ288-297（ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２））の類似体、エピトープ類似体を提示するためにｐＡＰＣによってプロセシングすることができるこれらの類似体を含むポリペプチド、及び類似体を発現する核酸に関する。類似体は、野生型エピトープと比較して類似又は改善された免疫学的性質を有し得る。ヒト癌細胞によるこのエピトープの提示を立証する証拠を、以下の実施例３２に提示する。
【０１７８】
１つの実施形態は、ＰＳＭＡ288-297の類似体を誘導及び改良する方法及び置換を含む特異的配列に関する。類似体は、少なくとも１つの置換を含み得るが、標準的又は非標準アミノ酸を単独又は種々の組み合わせで含む複数の置換を有し得る。類似体により、性質が保持又は改良されたペプチドを得ることができる。
【０１７９】
実施形態は、ヒトＰＳＭＡのアミノ酸２８８−２９７と配列が関連する９又は１０アミノ酸長の１つ又は複数のペプチドのファミリーに関する。
【０１８０】
類似体設計
いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ288-297類似体は、配列ＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩ（配列番号４２）の置換を含み得る。以下の実施例２中の表７中等に示す結合モチーフデータを参照すると、Ｐ２アンカー残基がＡ２．１拘束性エピトープ中の任意の位置の親和性に個別に最も寄与することができることを示す。この場合、Ｐ２位のアミノ酸は、最適に好ましいロイシンである。ＰΩアンカー残基であるイソロイシンが好ましい。Ｔ２細胞検定系を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合研究（図示せず）は、天然ペプチドが特にＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと比較して一般により優れた結合特性を有することを示した。エピトープは、比較的低濃度で有意な結合を示したが、これは、飽和に対して比較的浅い上昇を伴った。野生型エピトープを改良することができる。表７及び表８に示される分析等の分析は平均であり、特定の配列中の所与の残基の挙動は平均から逸脱し得る。上記で考察されたＳＳＸ−２及びＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープについてＮｌｅ及びＮｖａを用いて得た好ましい結果と一致して、Ｎｌｅ及びＮｖａを、本発明のＰＳＭＡエピトープに首尾よく使用することもできる。最後に、存在し得るエピトープに対するどのような寛容の回避も補助する変化と組み合わせた場合、類似の結合特性でさえ、ペプチドの有効な免疫原性を増加させることができる。トランスジェニックマウスモデルでは、天然ペプチドは免疫原性が不十分であり（例えば、実施例３５を参照のこと）、エピトープに対する寛容を反映し得る。このエピトープが由来するＰＳＭＡ領域は、マウスＰＳＭＡとヒトＰＳＭＡとの間で同一である。
【０１８１】
１．Ｎ末端近位一次アンカーの修飾（Ｐ２）
上記のように、このエピトープのＰ２位の天然残基が遺伝子コードされるアミノ酸の間で最適な残基である。他の好ましい残基又は嵩高い疎水性残基の置換の影響を、結合の潜在的改良、寛容の破壊、及び交差反応性免疫について試験した。例示的置換には、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、及びアミノ酪酸（Ａｂｕ）が含まれ得る。
【０１８２】
２．Ｎ末端二次アンカーの修飾（Ｐ１）
Ｎ末端二次アンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸である。天然Ｇｌｙは、この位置でわずかに好ましいだけである。種々の所見（例えば、表７及び表８を参照のこと）は、エピトープを改良する可能性を有するアミノ酸には、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｂｕ、及びサルコシン（Ｓａｒ、すなわち、Ｎ−メチルグリシン）が含まれることを示す。
【０１８３】
３．Ｃ末端一次アンカーの修飾（ＰΩ）］
この位置での天然Ｉｌｅは、一般に好ましいが最適ではない残基である。この位置での置換により、結合を改良することができる。例示的置換には、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｖａ、及びＮｌｅが含まれ得る。
【０１８４】
４．二次アンカー及びＴＣＲの調査
最後から２番目の位置（ＰΩ−１）は、二次アンカー位置及びＴＣＲ相互作用位置として共に役立ち得る。Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒの置換は、ＴＣＲ相互作用に主な影響を与え得るが、この置換は、結合の改良にも寄与し得る。Ｐ３は、結合及び免疫原性の両方に影響を及ぼし得る別の位置である。この位置でのＴｒｐの置換により、両方を改良することができる。
【０１８５】
さらなる実施形態は、１つの置換を用いて得られた種々の影響を組み合わせ、それらに協力し、且つそれらに反作用するための複数の位置での置換の組み合わせに関する。
【０１８６】
ＰＲＡＭＥ425-433類似体
類似体設計の種々の実施形態及び態様に関する多数の特徴を、一般に、又は特定のエピトープに適用するものとして上記に開示する。このような開示をこのエピトープ及びその後のエピトープにも適用可能であると理解すべきである。簡潔にするために、このような開示の明らかな再度の記述を最小限にする。
【０１８７】
実施形態は、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープＰＲＡＭＥ425-433（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１））、エピトープ類似体を提示するためにｐＡＰＣによってプロセシングすることができるこれらの類似体を含むポリペプチド、及び類似体を発現する核酸を含む。類似体は、野生型エピトープと比較して類似の又は改善された免疫学的性質を有し得る。ヒト癌細胞によるこのエピトープの提示を立証する証拠を、以下の実施例３９に示す。
【０１８８】
１つの実施形態は、ＰＲＡＭＥ425-433の類似体を誘導及び改良する方法及び置換を含む特異的配列に関する。類似体は、少なくとも１つの置換を含み得るが、標準的又は非標準アミノ酸を単独又は種々の組み合わせで含む複数の置換を有し得る。類似体により、性質が保持又は改良されたペプチドを得ることができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態は、ヒトＰＲＡＭＥ配列のアミノ酸４２５−４３３と配列が関連する９又は１０アミノ酸長の１つ又は複数のペプチドファミリーに関する。
【０１９０】
類似体設計
いくつかの実施形態は、配列ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１）の置換を含み得るＰＲＡＭＥ425-433の類似体に関する。以下の実施例２中の表７中等に示す結合モチーフデータを参照すると、Ｐ２アンカー残基がＡ２．１拘束性エピトープ中の任意の位置の親和性に個別に最も寄与し得ることを示す。この場合、Ｐ２位のアミノ酸は、最適に好ましいロイシンである。ＰΩアンカー残基であるイソロイシンが好ましいが非常に好ましいわけでもなく、野生型ＰΩ残基が必ずしもこの位置に最も好ましいわけでもない。表７及び表８等に報告される分析は平均であり、特定の配列中の所与の残基の挙動は平均から逸脱し得る。他のエピトープについてＮｌｅ及びＮｖａを用いて得た好ましい結果と一致して、Ｎｌｅ及びＮｖａをこの配列と置換して同様に改良することができる。最後に、類似の結合特性すら、存在し得るエピトープに対するどのような寛容の回避をも補助する変化と組み合わせた場合、ペプチドの有効な免疫原性を増加させることができる。
【０１９１】
種々の置換についての理論的根拠を上に記載した。ＰＲＡＭＥ425-433エピトープについての調査した特定の置換は同一の論理に従い、実施例４０〜実施例４８及び図２５〜図２７に開示されている。一次アンカー位置Ｐ２及びＰΩ（Ｐ９）、二次アンカー位置Ｐ１及びＰΩ−１（Ｐ８）を置換した。ＴＣＲ相互作用位置（二次アンカー位置に加えて）Ｐ３及びＰ６も置換した。選択された置換は、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の結合及び／又は安定性に影響を及ぼした（ペプチドの免疫学的特長を決定する重要な特徴）。さらに、Ｔ細胞レパートリーの考慮の結果及び天然エピトープに対する免疫の制限を担う機構を回避するために、天然ペプチドを認識するＴ細胞受容体と相互作用する類似体の能力を保持する置換は、実用的価値があり得る。
【０１９２】
［実施例］
以下の実施例は、類似体及び類似体の同定方法を提供する。類似体を、例えば、免疫原、ワクチンとして、及び／又は種々の癌治療のために使用することができる。類似体を、実施例１に記載のように生成した。ＳＳＸ−２41-49類似体を、実施例２に示すように同定し、実施例３に列挙する。類似体を、実施例４〜実施例２１に示すように、改良された性質について試験した。改良された性質についてのＮＹ−ＥＳＯ−１157-165類似体の試験を、実施例２２〜実施例３０に示す。改良された性質についてのＰＳＭＡ類似体の試験を、実施例３３〜実施例３８に示す。改良された性質についてのＰＲＡＭＥ425-433類似体の試験を、実施例４０〜実施例４８に示す。
【実施例１】
【０１９３】
ペプチドの合成、精製、及び特徴付け
ペプチドを、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ多ペプチド合成機（PTI technologies, MA）又はＡＢＩ
４３３Ａペプチド合成機（Applied Biosystems, Foster City, CA）のいずれかによって、０．０５〜０．１ｍｍｏｌｅスケールで標準的なＦｍｏｃ固相化学を使用して合成した。Ｃ末端遊離酸ペプチドを、プレロードＰＥＧ−ＰＳ樹脂（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）又はＷａｎｇ樹脂（ＡＢＩ）を使用して合成した。Ｃ末端アミド化ペプチドを、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂にて合成した。全ての樹脂を、Applied Biosystems (Foster Ciy, CA)から購入した。ペプチド合成で使用したＦｍｏｃ−アミノ酸を、Novabiochem（San Diego, CA）及びAnaSpec（San Jose, CA）から購入した。標準的プロトコルによって合成後切断を行った。
【０１９４】
半調製HPLCカラム又はSPEカートリッジ（Phenomenex, Torrance, CA）にてペプチド精製を行った。全ペプチドの純度は、９０％以上であった。各ペプチドの同一性を、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ  ＭＳ（Voyager DE, Applied Biosystems）及びＳｙｎｅｒｇｉ  Ｃ１２カラム（Phenomenex, Torrance, CA）を使用した分析HPLC（Varian又はShimazu）によって立証した。
【実施例２】
【０１９５】
ｄｅ  ｎｏｖｏで設計したＳＳＸ−２41-49類似体
中程度の免疫原性を示すペプチドの構造修飾により、ペプチド−ＭＨＣ結合、ＣＴＬ認識、及び／又は免疫原性を顕著に改良することができる。どのようにして効力が増強されたペプチド類似体を達成するために野生型エピトープを修飾するのかに関する一般的なガイドラインは、当該技術分野で既知である。認識されている戦略は、問題の特定のＭＨＣ分子への結合のためのいわゆるアンカー位置の残基を最適化することである。ＨＬＡ−Ａ２の場合、Ｐ２位及びＰΩ位の疎水性残基の顕著な優先（特に、Ｐ２のＬ及びＭ、ＰΩのＶ）が認められた（ＰΩはエピトープのＣ末端残基を示す。ＨＬＡ−Ａ２については、ＰΩは、ペプチドの長さに応じてＰ９又はＰ１０である）。Ｐ１位の芳香族残基（Ｆ、Ｙ、及びＷ等）との置換も有利であり得る。
【０１９６】
【表７】
2008543314.tif 000010
【０１９７】
【表８】
2008543314.tif 000011
【実施例３】
【０１９８】
実施例１の予想を使用して、以下の類似体を生成した。
【０１９９】
【表９−１】
2008543314.tif 000012
【表９−２】
2008543314.tif 000013
【表９−３】
2008543314.tif 000014
【０２００】
非標準アミノ酸の略語を以下に示す：Ｎｌｅ、ノルロイシン；Ｎｖａ、ノルバリン；Ｐｈｇ、フェニルグリシン；Ｐｈｅ（４−Ｆ）、４−フルオロフェニルアラニン；Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、４−ニトロフェニルアラニン；Ａｂｕ、α−アミノ酪酸；Ａｉｂ、α−アミノイソ酪酸；ＭｅＬｅｕ、メチル−ロイシン；ＭｅＶａｌ、メチルバリン；β−（３−ベンゾチエニル）Ａｌａ、β−（３−ベンゾチエニル）−アラニン；Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｙｒ、Ｏ−メチルチロシン；Ｃｈａ、シクロヘキシルアラニン；Ｎａｌ−１、β−（１−ナフチル）−アラニン；Ｎａｌ−２、β−（２−ナフチル）−アラニン；−ＮＨ２はカルボキシル末端がアミドに修飾されていることを示す。
【０２０１】
［実施例４〜実施例２１］
ＳＳＸ−２41-49類似体の試験
実施例３で生成された類似体を、活性（以下の実施例４〜実施例２１中の結合及び生物学的影響等）について試験した。
【実施例４】
【０２０２】
Ｔ２細胞を使用したペプチド結合
ＨＬＡ−Ａ*０２０１へのペプチド類似体及び野生型エピトープの結合親和性を、Ｔ２細胞ベースの検定を使用して評価した（Regner M, et al., Exp Clin Immunogenet. 1996;13(l):30-5）（その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【０２０３】
結合検定について、簡潔に述べれば、ＴＡＰ発現を欠き、それにより、細胞表面上に安定なＭＨＣクラスＩをアセンブリしないＴ２細胞を、異なる濃度のペプチド（対照又は類似体）にて３７度で一晩パルスし、十分に洗浄し、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する蛍光タグ化抗体で染色し、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器に通した。所与の濃度の類似体及びネガティブ対照（非ＭＨＣ結合物（binder））に対応するＭＦＩ（平均蛍光強度）の相違は、ＭＨＣとペプチドとの間でいくつの安定化複合体がＴ２細胞表面上に提示されたかについての関数である。したがって、限界濃度のペプチドで主にＫonを測定し、飽和レベルのペプチドでＫon及びＫoffの両方を測定する。数学的に関連する以下の２つの要因によって結合を定量した：半値結合（Halfmaximal binding）（飽和に対応するシグナルの５０％が得られるペプチド濃度）及び相対親和性（１／ＲＡ）。相対親和性（ＲＡ）は、基準（野生型ペプチド）に正規化した結合である（例えば、ペプチド類似体に対する対照の半値結合間の比）。１／ＲＡ指標が高く、且つ半値結合が低いほど、類似体とＭＨＣとの間の相互作用のＫonが高くなる。
【０２０４】
結合パラメーターを使用して同定した５３の類似体は、野生型ペプチドと比較して改良されていると判断された。これらの改良された結合物は、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知の位置を含む１つ、２つ、３つ、又は複数の置換（標準的アミノ酸及び／又は非標準アミノ酸が含まれる）を有する。しかし、ＭＨＣ結合に及ぼす全影響は、修飾に依存した。このようなペプチド類似体は、治療組成物において有用であるか又は治療組成物をさらに誘導するためのプラットフォームとして有用であり得る。
【実施例５】
【０２０５】
Ｔ２細胞を使用したペプチド安定性
ＭＨＣ上のペプチド安定性（Ｋoff）を、一般に、結合（Ｋon）から単独で推測することができない。結合に加えて、Ｔ細胞の活性化が「シグナル１」（ＭＨＣペプチド複合体のＴ細胞受容体との相互作用）の持続時間に依存するので、ＭＨＣクラスＩ上のペプチドの安定性は、このようなペプチドの免疫学的性質に関して重要であることが既知である。安定性検定について、簡潔に述べれば、ＴＡＰ発現を欠き、それにより、細胞表面上に安定なＭＨＣクラスＩをアセンブリしないＴ２細胞を、ＭＨＣクラスＩの最大負荷（「飽和」）を達成することが既知の異なる濃度のペプチド（対照又は類似体）にて３７度で一晩パルスし、十分に洗浄し、内因性タンパク質合成を遮断するエメチンの存在下で異なる間隔で追跡した。十分な洗浄後、細胞を、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する蛍光タグ化抗体で染色し、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器に通した。所与の濃度の類似体及びネガティブ対照（非ＭＨＣ結合物）に対応するＭＦＩ（平均蛍光強度）の相違は、ＭＨＣとペプチドとの間でいくつの安定化複合体がＴ２細胞表面上に提示されたかについての関数である。長期間のシグナルの減衰を、０時間（追跡間隔の開始時）での結合と比較した安定性指標の５０％として数学的に示す。
【０２０６】
このような改良された類似体は、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知の位置を含む１つ、２つ、３つ、又は複数の置換（標準的アミノ酸及び／又は非標準アミノ酸が含まれる）を有する可能性があり、ＭＨＣ安定性に及ぼす全影響は、修飾に依存する。このようなペプチド類似体は、治療組成物において有用であり得るか又は治療組成物をさらに誘導するためのプラットフォームとして有用であり得る。４３個の類似体は、天然ペプチドと比較して安定性が増加した。
【０２０７】
結合及び安定性の両方が改良された類似体は、改良された組成物において有用であるか
又は治療上有利な改良された組成物を生成するためのプラットフォームとして有用である。
【実施例６】
【０２０８】
類似体の免疫学的性質の評価：交差反応性及び機能的アビディティ
ペプチドの免疫学的性質を、ＭＨＣ分子（Ｋon及びＫoff）及びＴＣＲへの結合の関数（ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチド複合体との間の相互作用の親和性）として記載することができる。一次ＭＨＣアンカー残基の修飾は、一般に、ＭＨＣ分子への結合に及ぼす全影響を有意に予測可能である。
【０２０９】
二次ＭＨＣアンカー残基の修飾により、ペプチド−ＭＨＣ相互作用と比較したＫon及びＫoffと共にＭＨＣ−ペプチド複合体のＴＣＲに対する相互作用の親和性に影響を及ぼし得る。
【０２１０】
提案された使用方法と一貫した様式でペプチド類似体をスクリーニングし、全免疫学的性質を設計する（ＭＨＣ相互作用と比較したＫon及びＫoff並びに統合された様式でのＴＣＲ結合特性）迅速且つ合理的に可能な方法論を考案した。いくつかの例では、この方法は、天然（非変性）エピトープ（ＳＳＸ−２41-49）に対するＴ細胞株の生成及びヒトＭＨＣ（Ａ２対立遺伝子等）を保有するトランスジェニックマウスにおいて有用な応答を生成するのに十分に強力な免疫化戦略の使用を含んでいた。ペプチド類似体を、コンピテントＡＰＣの存在下にてｅｘ  ｖｉｖｏで検索し、天然（非変性）エピトープに特異的なＴ細胞の機能的影響を測定した。交差反応性ペプチドの場合、予想される影響が二相性であったので（抗原誘導性細胞死（ＡＩＣＤ）による限界濃度での活性化及びより高い濃度での阻害）、種々の濃度の類似体で評価を行った。以下の３つのパラメーターの測定を使用して、ペプチド類似体の基本的且つ有用な特徴を定義した。
１．Ｔ細胞活性化（例えば、サイトカイン産生）を示す効果を誘発するために必要なペプチド類似体の最小濃度、
２．任意の類似体濃度での最大（ピーク値）効果（例えば、サイトカイン産生）、
３．効果（例えば、サイトカイン産生）を活性化するピーク値での類似体濃度。
【０２１１】
例えば、パラメーター番号１及び３に関連する値が減少するが、番号２に関連する値が増加する類似体が有用であり得る。天然エピトープ及び基準としての無関係の非交差反応性ペプチドの使用は、潜在的価値のある類似体クラスの同定に有益である。定量的に天然エピトープに匹敵するかやや減少した性質を示す類似体は、類似体が交差反応性を保持しながら、天然ペプチドと異なる免疫学的性質（例えば、ＡＩＣＤを誘導するためのより低い傾向又はｉｎ  ｖｉｖｏでの寛容を破壊するか応答性を修復する能力）を示し得るという事実に照らして、依然として有用であると見なされる。
【０２１２】
このスクリーニング戦略のいくつかの利点には、実用性及び素早さ、読み取りとしての潜在的に偏ったＴ細胞クローンの代わりのより関連するポリクローナルＴ細胞株の使用、複合値（composite value）、積算パラメーター（ＴＣＲと比較したペプチド−ＭＨＣ複合体の交差反応性及び機能的アビディティに変えることができるＫon、Ｋoff、及びＴＣＲ親和性等）が含まれる。これらのパラメーターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫学的性質を予想することができ、したがって、さらなる評価、最適化、及び実際の適用を受けるためのペプチド類似体の有用なパネルを描写することができる。ＭＨＣに結合し、名目上の野生型ペプチドに特異的なＴＣＲに対して交差反応性を保持する類似体を、この検定では測定可能な効果を誘発すると予想する。全方法論を、図２に示す。
【０２１３】
Ｔ細胞株の生成に有用な方法は以下であった：０、４、１４、及び１８日目に、Ａ２ヒト対立遺伝子を保有するＨＨＤトランスジェニックマウス（Pascolo et al., J. Exp Med
. 185(12):2043-51, 1997（その全体が本明細書中で参考として援用される））を、鼠径リンパ節への両側投与によって、２５μｇのｐＩｐＣと混合した５０μｇのＳＳＸ−２天然エピトープ（４１−４９）で免疫化した。最後の追加免疫から７日後、マウスを屠殺し、脾細胞の懸濁液を、完全ＨＬ−１培地中に５×１０6細胞／ｍｌで調製した。平底９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）中で細胞を異なる濃度のペプチドと４８時間インキュベートし、ウェルに添加した１０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２とさらに２４時間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ等の標準的方法によってＩＦＮ−γ濃度を評価した。
【実施例７】
【０２１４】
１つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
上記の戦略（実施例６、図２）を適用して、その野生型バージョン中の天然ＳＳＸ−２41-49エピトープ（ＫＡＳＥＫＩＦＹＶ（配列番号１））と比較して１つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした（図３）。ｅｘ  ｖｉｖｏでＩＦＮ−γ産生を誘発するために必要な類似体の最少量と任意の濃度の類似体での最大サイトカイン産生量との間に強い逆相関が認められた。
【０２１５】
Ａ42のＬ、Ｖ、又はＭとの置換により、この検定で評価されたペプチドの免疫学的性質が改良された。Ｌ変異体及びＶ変異体が活性を示した。Ｍは、天然エピトープよりも活性が高かった。Ｉ変異体は、野生型エピトープを認識するＴＣＲに対する交差反応性を保持した。
【０２１６】
４２位でのＡの非標準アミノ酸Ａｂｕ、Ｎｌｅ、又はＮｖａとの置換により、サイトカイン産生の誘発に必要な最少量の類似体及びサイトカインのピーク産生量の両方に関して、野生型エピトープと比較してペプチドの免疫学的性質が改良された。Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｎａｌ−２、又はＡｉｂを含む変異体は、天然ペプチドと比較して、本検定において交差反応性が保持され、免疫活性が減少したが、依然としてその性質を調整又は増強するためのさらなる誘導体化に有用であり得る。４２位のＮａｌ−１は、活性を無効にした。
【０２１７】
第１の残基Ｋ41の変化は、本検定においてＦ又はＰｈｇとの置換によって活性が改良される一方で、Ｗ、Ｄ−Ｌｙｓ、及びＣｈａは免疫原性を除去することを示した。ＫのＹ、Ｐｈｅ−４Ｆ、Ｐｈｅ（４−ＮＯ2）、Ｏ−メチル−Ｔｙｒ、又はβ−（３−ベンゾチエニル−Ａｌａ）との置換により、活性が保持された。
【０２１８】
Ｉとの置換によるＶ49位（Ｃ末端残基）の修飾により、元のエピトープと比較してより低いレベルで活性が保持された。ＮＨ２部分の付加による最後の残基の修飾により、ペプチドの活性が除去され、その後、４２位のＡのＬ又はＶでの修飾によって活性が救済された。これは、野生型ペプチドよりも低い活性を有する類似体が依然としてさらなる誘導体化に有用であることを直接示す。
【実施例８】
【０２１９】
２つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
実施例６（図２）由来の戦略を適用して、その野生型バージョン中の野生型ＳＳＸ−２41-49エピトープと比較して２つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした（図４）。
【０２２０】
１位及び２位での調和的修飾により、類似体活性に対して様々な影響が及ぼされた。例えば、Ｋ４１のＹ、Ｆ、又はＷの置換により、Ａ４２のＶ、Ｍ、又はＩの置換が確認され、野生型ペプチドと比較して類似体の活性が保存又は増強された。Ｐ１残基が一定の範囲
でＴＣＲへの結合に関与するので、このような二重変異ペプチドにより、寛容が破壊する（したがって、実際の適用に有用である）様式でＴＣＲとの相互作用に影響を及ぼす機会が増加する。以下：Ｙ（４１位）のＶ（４２位）との置換、Ｗ（４１位）のＩ又はＬ（４２位）の置換、及びＦ（４１位）のＬ、Ｖ、Ｉ（４２位）との置換の組み合わせにより、野生型ペプチドと比較してより活性が高い類似体が得られた。４１位のＹと４２位のＩとの間の組み合わせ又は４１位のＷと４２位のＶ又はＭとの間の組み合わせにより、野生型ペプチドに類似の活性が付与された。４１位のＫのＤ−リジンとの置換により、この検定で保持された活性が減少した類似体がもたらされた。非標準アミノ酸を含むこのようなペプチドの代謝性分解がｉｎ  ｖｉｖｏで減少するので、このようなペプチドは非常に有用であり得る。
【０２２１】
４２位のＶ又はＬと４９位のＩとの間の組み合わせにより、天然ペプチドを超えて活性が増加した。
【実施例９】
【０２２２】
複数の位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
実施例６（図２）由来の戦略を適用して、その野生型バージョン中の天然ＳＳＸ−２41-49エピトープと比較して３つ以上の置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした（図５）。
【０２２３】
４９位のＩ又はＡと組み合わせた４１位のＦ及び４２位のＶにより、野生型エピトープと比較して改良されたか又は類似の活性が得られた。対照的に、４９位のＬ又はＭにより、活性が非常に減少した。
【０２２４】
最後の位置に非標準アミノ酸Ｎｖａ、Ａｂｕ、又はＭｅＶａｌを含む三重変異体は、免疫活性が保持又は改良された。このようなペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性及び酵素分解耐性の増加により、極めて有用である。
【０２２５】
推定ＴＣＲ結合領域内のアミノ酸残基の修飾により、交差反応性と共にＭＨＣへの結合が保持された非常に価値のあるペプチドを得ることができる。このようなペプチドは、そのＭＨＣ溝中の高次構造が天然ペプチドとわずかに異なるので、免疫応答性又は寛容破壊の修復に有用である。４４位（Ｑ、Ｎｖａ、又はＮｌｅ）、４６位（Ｌ、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａ）、又は４８位（Ｆ又はＰｈｅ−４Ｆ）でのさらなる置換により活性類似体が得られたのに対して、４４位のＤ、Ｎ、Ｓ、又はＴ、４６位のＭ、４８位のＴ、Ｓ、Ｐｈｇ、又は４６位のＬの４８位のＴとの置換により、活性を欠く類似体が得られた。最後に、５つの置換を有する２つの類似体は、活性を示さなかった（図５）。
【実施例１０】
【０２２６】
天然ペプチド及び種々の位置での変異を含む十量体の交差反応性及び機能的アビディティ
実施例６（図２）由来の戦略を適用して、名目上のＳＳＸ−２41-49ペプチドを含む十量体の類似体のライブラリーをスキャンした（図６）。
【０２２７】
十量体ＳＳＸ−２41-50は、４１−４９九量体と比較して、４１−４９九量体に特異的なＴ細胞株の刺激で有意に活性が低かった。５０位でのＹ残基のＩ又はＬへの修飾により、Ｖ、Ｎｌｅ、又はＮｖａよりも狭いか又は広くない範囲で、この検定において活性が修復された。２位のＡのＬ又はＶでの修飾によって十量体類似体の活性をさらに最適化した。Ａ４２Ｌ置換により、Ｙ５０Ｎｖａ十量体の活性が救済された。天然ペプチドと比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が類似又は減少した（しかし、交差反応性が保持されている）ペプチド類似体は、依然として免疫応答の誘導又は追加免疫に有用であり、これは、以下に起因する：ｉ）より制限されたＡＩＣＤ、ｉｉ）寛容破壊に重要であり得るクラスＩ  Ｍ
ＨＣに対する安定性の増加及び／又はＴＣＲとのとの相互作用のわずかな修飾に起因する潜在的に高いｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【実施例１１】
【０２２８】
ｅｘ  ｖｉｖｏで評価した天然エピトープに対して増加した免疫を誘発するための類似体の使用
３つのマウス群（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、２８日目及び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（類似の量）を行った。免疫化計画を、図７に示す。追加免疫から１週間後、脾細胞を、ＳＳＸ−２41-49天然ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識標的細胞（Ｔ２細胞）に対して試験した（図８）。結果は、類似体Ａ４２Ｖが追加免疫剤として類似体Ａ４２Ｌ又は野生型ペプチド自体と比較して天然ペプチドを発現する標的細胞に対してより高い応答を誘発することを示した。これは、ｅｘ
ｖｉｖｏ実験によって決定された結合及び安定性のパラメーターと相関した。
【実施例１２】
【０２２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで評価した天然エピトープに対して増加した免疫を誘発するための類似体の使用
８つのマウス群（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図９に示すように、ネガティブ対照ペプチド（メラン−Ａ  ２６−３５「ＥＡＡ」）、天然ペプチド、又は類似体を使用して、２８日目及び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（類似の量）を行った。
【０２３０】
天然ペプチドに対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するために、同腹子対照ＨＨＤマウスから脾細胞を単離し、２０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの天然ペプチドと２時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＣＦＳＥhi蛍光（４．０μＭ又は1μＭで１５分間）で染色し、同数のＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した対照脾細胞を免疫化マウスに同時に静脈内注射した。１８時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照（非負荷）集団と比較して計算し、比溶解率（% specific lysis）として示した。図１０（脾臓）及び図１１（血液）は、図７に記載の処方計画によって誘発されたｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性を示す。試験ペプチドのうちの３つ（Ａ４２Ｖ、Ｋ４１Ｆ、及びＫ４１Ｙ）は、脾臓及び血液の両方において、２０μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌの天然ペプチドでコーティングした標的細胞に対する活性が天然ペプチドと比較して増加した（図１１）。
【実施例１３】
【０２３１】
腫瘍細胞に対して増加した応答を誘発するための類似体の使用
８つのマウス群（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってＳＳＸ−２41-49天然エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図９に示すように、ネガティブ対照ペプチド（メラン−Ａ  ２６−３５「ＥＡＡ」）、天然ペプチド、又は類似体を使用して、２８日目及び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（類似の量）を行った。
【０２３２】
追加免疫から１週間後、脾細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにてＳＳＸ−２41-49野生型ペプチドで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（６２４．３８黒色腫細胞）に対して試験した（図１２）。類似体Ａ４２Ｖ、Ｋ４１Ｆ、Ａ４２Ｖ、Ｖ４９Ｉは免疫応答を誘発し、この免疫応答は、天然ＳＳＸ−２41-49エピトープを発現するヒト腫瘍細胞に対
して増加した細胞傷害性を媒介した。
【実施例１４】
【０２３３】
Ｎ末端近位一次アンカーの修飾（２NDＡＡ）
表３中に示す置換類似体を試験した場合、類似体は、野生型ペプチドエピトープと比較して、結合及び安定性プロファイルが改良された。しかし、各類似体の改良の程度は異なり、Ａ４２Ｖの置換はＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との結合親和性に関して最も高い改良を示した。さらに、Ａ４２Ｖ−ＨＬＡ−Ａ*０２０１複合体の安定性は、野生型ペプチドとＨＬＡ−Ａ*０２０１との間で形成された複合体よりも良好であり、Ｔ１／２は、１１．５時間〜２０時間に延長された。４２ＡからＬ、Ｖ、及びＭに置換されたペプチドは、顕著により低い濃度で、野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ分泌を誘導することができた。４２ＡのＩへの置換により、結合及び安定性プロファイルが改良された類似体が生成された。Ｐ２位の残基は、一定の程度でＴＣＲとの相互作用にも関与し得る。この所見はまた、野生型エピトープと比較してＨＬＡ−Ａ*０２０１との結合親和性が類似した４２ＡをＡｉｂに置換した類似体を用いた結果によって支持される。
【実施例１５】
【０２３４】
Ｎ末端二次アンカーの修飾（１STＡＡ）
Ｎ末端二次アンカーは、Ｎ末端の第１のアミノ酸である。したがって、１つの実施形態では、野生型配列中に見出される元のＬｙｓ４３を、より疎水性が高く嵩高いアミノ酸で置換する。任意のより疎水性が高く嵩高いアミノ酸（任意の利用可能であるか当業者に既知のアミノ酸（標準的アミノ酸及び非標準アミノ酸が含まれる）が含まれる）を使用することもできる。より疎水性の高いアミノ酸の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、及びＤ−Ｌｙｓ。
【０２３５】
Ｌｙｓ４１の残基は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との相互作用における二次アンカー残基と定義され、一定の程度までのＴ細胞受容体との相互作用にも関与している。したがって、この位置の修飾により、より免疫原性が高く、且つ腫瘍ワクチンの開発により適切ないくつかヘテロクリティックな類似体を生成することができる。
【０２３６】
表３に示すように、Ｌｙｓ４１のＴｙｒ、Ｐｈｅ、又はＰｈｅ誘導体（フェニルグリシン、パラ−フルオロフェニルアラニン、パラ−ニトロフェニルアラニン）との置換により、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子とより高い親和性を有する類似体が得られ、より安定な複合体を形成する。他方では、ＬｙｓのＴｒｐ又はＴｒｐ誘導体類似体との置換により、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性が有意に減少し、推定アルゴリズムに基づくにもかかわらず、Ｔｒｐ類似体はＴｙｒ及びＰｈｅ類似体と類似の親和性を有するはずである。実験データは、推定アルゴリズムの限定を証明している。例えば、Ｌｙｓ４１のＰｈｇ置換により、親和性が改良され、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との安定性が拡大した類似体が得られた。ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性は野生型ペプチドとほぼ同一であったにもかかわらず、パラ−ニトロフェニルアラニン類似体は、はるかに低い濃度で野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ分泌を誘導することが示された。
【実施例１６】
【０２３７】
Ｎ末端一次／二次アンカーの修飾
一次及び二次アンカー残基の両方のＮ末端を修飾した場合、一般的傾向として、得られた類似体はＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との親和性の改良及び安定性の拡大（表３）が証明され、わずかであるが以下が例外である：（Ｋ４１Ｙ、Ａ４２Ｖ）、（Ｋ４１Ｙ、Ａ４２Ｍ）、及び（Ｋ４１（Ｄ−Ｌｙｓ）、Ａ４２Ｖ）。さらに、類似体は、野生型ペプチド特異的ＣＴＬと非常に良好な交差反応性を有していた。Ｋ４１Ｗ置換のＡ４２Ｖ又はＡ４２Ｌとの組み合わせにより、結合／安定性プロファイルが改良された。これらの類似体はま
た、野生型ペプチドと望ましい交差反応活性を有していた。Ｎ末端一次アンカー及び二次アンカーの組み合わせ修飾により、より高い程度にペプチドの構造及び高次構造が変化した。
【実施例１７】
【０２３８】
Ｎ末端一次／二次アンカー及びＣ末端一次アンカーの修飾
野生型ペプチドのＣ末端Ｖａｌは、好ましいアンカー残基であった。しかし、１つのさらなる−ＣＨ２基を有するＩｌｅに変異した場合、効力が改良された。ＶａｌからＡｂｕへの置換によって類似の改良も認められた。他の類似体は、ＭＨＣ分子との結合親和性及び安定性が改良された。これらの類似体の結果は、ペプチドのＣ末端アンカー残基がＴ細胞認識で極めて重要な役割も果たすことを示した（表４）。
【実施例１８】
【０２３９】
Ｎ末端一次／二次アンカー及びＴＣＲ部位の修飾
二次ＴＣＲ結合アミノ酸残基の置換により、ＭＨＣ分子への結合を妨害しないが、自己抗原の寛容問題を克服するヘテロクリティックな類似体が生成された。Ｎ末端一次／二次アンカー残基（Ｋ４１Ｆ及びＡ４２Ｖ）の置換及びＴＣＲ部位の置換の組み合わせにより、結合親和性及び安定性が改良された類似体が生成された（表６）。いくつかのこれらの類似体は、低濃度で野生型ペプチド特異的ＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を誘導した（Ｋ４１Ｆ、Ａ４２Ｖ、Ｅ４４（Ｎｖａ）／（Ｎｌｅ）変異体及びＫ４１Ｆ、Ａ４２Ｖ、Ｉ４６Ｌ／（Ｎｖａ）／（Ｎｌｅ）変異体等）。
【実施例１９】
【０２４０】
Ｎ末端アミド
ペプチドの遊離カルボン酸Ｃ末端のアミドとの置換により、タンパク質分解に対する安定性の付与及びペプチドに対するジペプチジルカルボキシペプチダーゼ耐性の付与によって生体媒質中でのペプチドの安定性が改良された。しかし、得られた類似体のいくつかは、かなりの量のＭＨＣ分子とのその親和性並びに免疫原性及び抗原性が喪失した。予想外に、本明細書中の表７に開示の３つの類似体がＭＨＣ分子とのその結合能力を喪失したにもかかわらず、ＳＳＸ−２41-49−ＮＨ２（Ａ４２Ｖ）は、野生型ペプチドに類似の濃度でのＩＦＮ−γの分泌を誘導する能力によって示すように、野生型ペプチド特異的ＣＴＬとのその反応性が保持された。しかし、ＳＳＸ−２41-49−ＮＨ２（Ａ４２Ｌ）は、より低い濃度でＩＦＮ−γ産生を刺激することができた。
【実施例２０】
【０２４１】
十量体
一般的なＭＨＣ結合ペプチドの長さは、８量体から１１量体まで様々であり、ほとんどのＨＬＡ−Ａ*０２０１結合ペプチドは９量体又は１０量体である。以前の所見では、ネイティブ配列由来の９量体及び１０量体は共に同一ＭＨＣの結合モチーフを保有することが見出され、同一のＮ末端を有していた。プロテオソームプロセシングの観点から、これらは異なるエピトープであるが、それにもかかわらず、抗原的に交差反応性を示した。野生型エピトープＳＳＸ−２41-49の場合、エピトープは９量体ペプチドであり、１０量体ペプチド（ＳＳＸ−２41-50）は、適切なＭＨＣ結合モチーフを欠き、免疫学的活性を示さなかった。したがって、野生型エピトープを、適切な結合モチーフを作製することができるアミノ酸を使用して１０量体に伸長した。表８に示すように、多数の１０量体類似体がＨＬＡ−Ａ*０２０１分子とより低い結合親和性を有する一方で、類似体ＳＳＸ−２41-50（Ａ４２Ｌ、Ｙ５０Ｌ／Ｖ／Ｎｌｅ／Ｎｖａ）は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子との結合親和性が改良された。２つの１０量体類似体（特に、Ａ４２Ｌ及びＹ５０Ｎｌｅ／Ｎｖａ）は、野生型ペプチドよりも低い濃度で、野生型ペプチドに対して免疫化したＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導することができた。
【実施例２１】
【０２４２】
寛容を克服するための類似体の使用
類似体が野生型エピトープを超えて改良され得る１つの態様は、ヒト系での免疫原性及び寛容破壊の増加である。ＴＣＲレパートリーの相違は、生殖系列の相違又は負の選択の相違に起因するのかを問わず、特異な結果が得られる可能性がある。この問題に取り組むために、類似体をＨＬＡ−Ａ２+血液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化で使用して、ＣＴＬを生成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化技法は、ナイーブドナーを使用する場合でさえ、当該技術分野で既知である（例えば、Stauss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7871-7875, 1992; Salgaller et al., Cancer Res. 55:4972-4979, 1995; Tsai et al., J. Immunol. 158:1796-1802, 1997;及びChung et al., J. Immunother. 22:279-287, 1999（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される））。
【０２４３】
具体的には、正常ドナー由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅでの遠心分離によって軟膜から精製した。全ての培養を、潜在的な異種病原体への曝露及びＦＢＳペプチドの認識を回避するために自家血漿（ＡＰ）を使用して行った。ペプチド特異的ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成を支持するために、ＡＰＣとして自家樹状細胞（ＤＣ）を使用した。Keogh et al., 2001（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ＤＣを生成し、ＣＴＬをＤＣ及びＰＢＭＣ由来のペプチドを用いて誘導した。簡潔に述べれば、単球富化細胞画分を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と５日間培養し、２μｇ／ｍｌ  ＣＤ４０リガンドを含む培養培地中でさらに２日間培養して成熟を誘導した。２×１０6個のＣＤ８＋富化Ｔリンパ球／ウェル及び２×１０5個のペプチドパルスＤＣ／ウェルを、１０％ＡＰ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７、及び２０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を捕捉した２ｍｌ  ＲＰＭＩを含む２４ウェルプレート中で同時培養した。７日目及び１４日目に、培養物を自家照射ペプチドパルスＤＣで再刺激した。本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性及びサイトカイン産生検定を使用して、免疫原性を検定した。
【０２４４】
［実施例２２〜実施例３０］
ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165類似体の試験
図１３に列挙した類似体を、以下の実施例２２〜実施例３０に示すように、活性（結合及び生物学的影響等）について試験した。
【実施例２２】
【０２４５】
１つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ（図１３Ａ〜図１３Ｃ）
上記の戦略（実施例６）を適用して、その天然（又は野生型）バージョン中の野性型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープと比較して１つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした（図１３）。ｅｘ  ｖｉｖｏでＩＦＮ−γ産生を誘発するために必要な類似体の最少量と任意の濃度の類似体での最大サイトカイン産生量との間に強い逆相関が認められた。
【０２４６】
Ｓ１５７のＦ又はＫの置換により、名目上のエピトープに特異的なＭＨＣ結合及びＴ細胞との交差反応性を部分的に保持した類似体が得られた。Ｌ１５８のＩとの置換により、この方法論で評価したところ、ペプチドの免疫学的特長が改良されたのに対して、Ｌ１５８Ｖにより、活性が部分的に保持された。Ｃ１６５の任意のアミノ酸Ｖ、Ｌ、Ａ、又はＩとの修飾により、免疫性が改良された。
【０２４７】
Ｎ末端位置又は他の場所を置換し、野生型ペプチドと比較してこの検定において活性が保持されているか増加していないペプチドは、ヒトで有用であり得る。さらに、下記のように、ペプチドは、その性質を改良するためのさらなる誘導体化のための材料である。
【実施例２３】
【０２４８】
２つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ（図１３Ａ〜図１３）
実施例６由来の戦略を適用して、野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープと比較して２つの置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした。２位及び９位での同時半保存的修飾により、類似体の正確な同一性に応じて、類似体の免疫特性に対して顕著に影響を及ぼすことが見出された。Ｌ１５８ＩとＣ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｌとの組み合わせにより、野生型ペプチドと比較して活性がさらに増加した。同様に、Ｌ１５８Ｖにより、Ｃ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｌ類似体の活性が改良され、このような活性は、野生型ペプチドと比較してさらに増加した。Ｌ１５８Ｖにより、Ｃ１６５Ａ又はＣ１６５Ｉ類似体の活性が保持され、一次アンカー残基の二重変異の興味深い影響を示す。同様に、Ｌ１５８Ｉにより、Ｃ１６５Ａ類似体の活性が部分的に保持された。
【０２４９】
１位及び９位の同時修飾により、類似体の正確な同一性に応じて、類似体の免疫特性に対して顕著に影響を及ぼすことが見出された。９位でのＣ１６５Ｎｖａ（ノルバリン）又はＮｌｅ（ノルロイシン）と組み合わせたＳ１５７Ｙにより、Ｓ１５７Ｙのみ又は野生型ペプチドよりも活性が実質的に改良された。Ｃ１６５Ｖ変異体はまた、Ｓ１５７Ｙ変異体の活性を救済した。９位でのＶ−ＮＨ２又はＬ−ＮＨ２により、Ｓ１５７Ｙ類似体の活性が部分的に救済されたが、Ａ−ＮＨ２ではできなかった。９位でのＳ１５７ＦとＶ、Ｌ、Ｉとの組み合わせ、より狭い範囲でのＡとの組み合わせにより、類似体の強い活性が保持され、ＴＣＲとの相互作用における第１の残基の関与により、９位で修飾が１つの変異体よりも有用であり得る。９位でのＳ１５７ＫとＶ、Ｌ、Ｉとの組み合わせ、より狭い範囲でのＡとの組み合わせにより、類似体の強い活性が保持され、ＴＣＲとの相互作用における第１の残基の関与により、９位で修飾が１つの変異体よりも有用であり、１位でのＫのペプチドの可溶性に対して全体的に有利に影響を及ぼす。
【実施例２４】
【０２５０】
複数の位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ（図１３Ａ〜図１３Ｃ）
実施例６由来の戦略を適用して、野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと比較して複数の置換を保有する類似体のライブラリーをスキャンした。
【０２５１】
Ｌ１５８Ｎｖａ又はＬ１５８Ｎｌｅにより、Ｓ１５７Ｙ  Ｃ１６５Ｖ変異体の活性が非常に改良された。１５８位でのＶ又はＩと１６５位でのＶ、Ｌ、Ａ、又はＩとの組み合わせにより、野生型ペプチドと比較して類似体の効力が部分的に修復された。Ｓ１５７Ｙ  Ｌ１５８Ｉ  Ｃ１６５Ｖは、野生型ペプチド及びＳ１５７ＶのＣ１６５Ｖ又はＣ１６５Ｉとの組み合わせと比較して高い活性を示し、Ｓ１５７ＩとＣ１６５Ｌ又はＩとの組み合わせにより、野生型ペプチドに特異的なＭＨＣ結合及びＴ細胞との交差反応性が保持された。
【０２５２】
１６０位でのＬ若しくはＮ、１６２位でのＡ、Ｌ、Ｖ、若しくはＮ、又は１６４位でのＥ、Ｄ、若しくはＴに加えたそれぞれ１５７位及び１６５位でのＹ及びＶを含む三重置換により、この交差反応性検定においてペプチドの活性が保持された。１６０位、１６２位、及び１６４位がＴＣＲとの相互作用に関与するので、これらの類似体からｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞寛容の破壊に有用な化合物が作製される。
【０２５３】
１５７Ｆ及び１５８Ｖ＋１６５位でのＶ、Ｌ、又はＩを含む三重置換は、実施例２に記載の検定において活性を示した。さらに、Ｓ１５７Ｆ及びＬ１５８Ｉ＋１６５位でのＶ又はＡを含む三重変異体により、活性が保持された。まとめると、これらのデータは、複数の置換の複雑な相互作用及び非線形性を明確に示す。
【０２５４】
最後に、１５８Ｖ及び１６５Ｖと共にＳ１５７Ｗ及びより広い範囲でのＳ１５７Ｔを含む三重変異体により、野生型ペプチドと比較して、それぞれ、活性が保持されるか又は増加した。
【実施例２５】
【０２５５】
野生型ペプチド及び種々の位置で変異したペプチドをコードする十量体の交差反応性及び機能的アビディティ（図１３Ａ〜図１３Ｃ）
実施例６由来の戦略を適用して、名目上のＮＹ−ＥＳＯ−１157-165ペプチドを含む十量体の類似体のライブラリーをスキャンした。十量体自体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有意に欠く一方で、この位置での種々の置換（１５７位でのＹ及び１６５位でのＶと組み合わせた１６６位でのＬ又は１６６位でのＬ、Ｉ、Ｎｌｅ等）によって活性が部分的に救済された。
【０２５６】
野生型ペプチドと比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性が類似するか又は減少した（しかし、交差反応性は保持された）ペプチド類似体は、以下に起因して、免疫応答の誘導又は追加免疫に依然として有用である：ｉ）より制限されたＡＩＣＤ（抗原誘導性細胞死）、ｉｉ）クラスＩ  ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとのわずかに修飾された相互作用に対する安定性の増加に起因するより高いｉｎ  ｖｉｖｏ活性。したがって、これらの類似体は、寛容の破壊に有用である。
【実施例２６】
【０２５７】
類似体の免疫学的性質の評価：ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの結合（図１３Ａ〜図１３Ｃ）
ＨＬＡ−Ａ*０２０１に対するペプチド類似体及び野生型エピトープの親和性を、Ｔ２細胞ベースの検定によって評価した（Regner M, et al., Exp Clin Immunogenet. 1996; 13 (l):30-5）（その全体が本明細書中で参考として援用される）。結合検定について、簡潔に述べれば、ＴＡＰ発現を欠き、それにより、細胞表面上に安定なＭＨＣクラスＩをアセンブリしないＴ２細胞を、異なる濃度のペプチド（対照又は類似体）にて３７℃で一晩パルスし、十分に洗浄し、ＭＨＣクラスＩ（Ａ２対立遺伝子）を認識する蛍光タグ化抗体で染色し、ＦａｃｓＳｃａｎ分析器に通した。Ａ２に結合するペプチドは、細胞表面でのその存在を安定させる。所与の濃度の類似体及びネガティブ対照（非ＭＨＣ結合物）に対応するＭＦＩ（平均蛍光強度）の相違は、ＭＨＣとペプチドとの間でいくつの安定化複合体がＴ２細胞表面上に提示されたかについての関数である。したがって、限界濃度のペプチドで主にＫonを測定し、飽和レベルのペプチドでＫon及びＫoffの両方を測定する。
【０２５８】
図１３では、数学的に関連する以下の２つの要因によって結合を定量した：半値結合（Half-maximal binding）（飽和に対応するシグナルの５０％が得られるペプチド濃度）及び相対親和性（１／ＲＡ）（すなわち、基準（野生型ペプチド）に正規化した結合）（すなわち、ペプチド類似体と比較した対照の半値結合間の比）。１／ＲＡ指標が高く、且つ半値結合が低いほど、類似体とＭＨＣとの間の相互作用のＫonが高くなる。図１３では、野生型ペプチドと比較して改良されたこのような結合パラメーターを有する３９の類似体を記載している。このような改良された結合物は、ＭＨＣ及び／又はＴＣＲとの相互作用に関与することが既知の位置に標準的及び／又は非標準アミノ酸の１つ、２つ、３つ、又はそれを超える置換を有する。ＭＨＣ結合に対する全ての影響は、正確な／複合的修飾に依存する。このような類似体は、治療組成物又は治療組成物をさらに誘導するためのプラットフォームとして有用である。
【実施例２７】
【０２５９】
免疫化法（図１４）
８つのマウス群（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対して２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって野生型ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、図１４に示すように、ネガティブ対照ペプチド（ＨＢＶｃ）、野生型ペプチド、又は類似体を使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（類似の量）を行った。
【実施例２８】
【０２６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏで評価した野生型エピトープに対して増加した免疫を誘発するための類似体の使用（図１５Ａ〜図１５Ｃ）
野生型ペプチドに対して得られたｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するために、同腹子対照ＨＨＤマウスから脾細胞を単離し、２０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの野生型ペプチドと２時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＣＦＳＥhi蛍光及びＣＦＳＥmed蛍光（それぞれ、４．０μＭ又は１μＭで１５分間）で染色し、同数のＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した対照脾細胞を免疫化マウスに同時に静脈内注射した。１８時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照（非負荷）集団と比較して計算し、比溶解率として示した。図１５Ａは、ネガティブ対照ペプチドを投与したマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性の欠如を示す。図１５Ｂは、プラスミドで免疫化し、野生型ペプチドで増幅したマウスにおける種々の細胞傷害性を示す。図１５Ｃは、プラスミドで免疫化し、類似体Ｌ１５８Ｎｖａ
Ｃ１６５Ｖで増幅したマウスにおける実質的に一定の細胞傷害性を示す。
【実施例２９】
【０２６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで評価した野生型エピトープに対して増加した免疫の誘発における種々の類似体の比較（図１６Ａ〜図１６Ｂ）
実施例８に記載の免疫化プロトコル及び実施例９に記載の方法論の使用の文脈では、限定量（１μＭ；図１６Ａ）又は最適以上の量（２０μＭ、図１６Ｂ）の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性を、それぞれ２段階についてのプラスミド及びペプチド類似体を使用した同調（entrain）及び増幅プロトコル後に評価した。平均比溶解率＋／−ＳＥとして示した結果は、類似体Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｎｖａが最も高い活性を誘導し、類似体Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｖ、Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｎｖａ及びＳ１５７Ｋ  Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｖが野生型ペプチド又はＣ１６５Ｖ変異体と同一範囲の効果を示した。複数の置換によってＴＣＲ結合部位を変化させることができるので、このような類似体は、自己エピトープに対する寛容の破壊において野生型ペプチドよりも有用であり得る。さらに、Ｓ１５７Ｋ三重変異体は、野生型ペプチド又は直接的使用を意図する他の類似体の不十分な可溶性を改善することができる。
【実施例３０】
【０２６２】
サイトカイン産生によるｅｘ  ｖｉｖｏで評価した野生型エピトープに対して増加した免疫を誘発するための類似体の使用（図１７Ａ〜図１７Ｂ）
実施例２７に記載の免疫化プロトコル及び以下の実施例２８に記載の攻撃誘発の文脈では、脾細胞を単離し、プールし、１０μＭの野生型ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１157-165でそれぞれ３日間及び６日間刺激した。上清を回収し、ＩＦＮ−γ濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２６３】
類似体Ｌ１５８Ｎｖａ  Ｃ１６５Ｖは、ｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の際により迅速に高レベルのＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を誘導した（図１７Ａ）。Ｓ１５７Ｆ  Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｖ、Ｌ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｎｖａ、及びＬ１５８Ｖ  Ｃ１６５Ｖ等の他の類似体は、野生型ペプチドでのｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激の際に増量したＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を誘導した（図１７Ｂ）。対照的に、実施例２７及び実施例２８に記載のプロトコルに従っ
て、Ｃ１６５Ｖは、野生型ペプチドと比較して、Ｔ細胞のＩＦＮ−γを産生する能力の増加を誘導できなかった。
【実施例３１】
【０２６４】
ＥＬＩＳＡによる結合及び安定性の特徴付け（ＩＴＯＰＩＡ試験）
いわゆる代替ペプチド（placeholder peptide）を負荷したクラスＩ単量体を含むアビジンコーティングしたマイクロタイタープレートを使用して、ペプチドの結合、親和性、及び解離（off-rate）を評価した。単量体コーティングしたプレートは、iTopiaエピトープ発見システムキット(Beckman Coulter, Inc., San Diego, CA, USA)の一部として供給された。検定緩衝液、抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂ、β２−マイクログロブリン、及び対照ペプチドもこのキットと共に供給された。
【０２６５】
結合検定
天然のペプチド及び類似体を、結合検定によってその各ＭＨＣ分子への結合能力について最初に評価した。この検定は、各ペプチドが標準化された最適結合条件下でＨＬＡ分子に結合する能力を測定する。単量体コーティングしたプレートを最初に剥離し、代替ペプチドを放出させ、プレートに結合したＭＨＣ重鎖のみを遊離した。次いで、試験ペプチドを、抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂと共に最適折り畳み条件下に導入した。プレートを、２１℃で１８時間インキュベートした。抗ＭＨＣ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂは、再折り畳みＭＨＣ複合体に優先的に結合する。したがって、各ペプチドに起因する蛍光強度を、ペプチドのＭＨＣ分子と複合体を形成する能力と比較した。各ペプチドの結合を、キットから提供されているポジティブ対照ペプチドと比較して評価し、結果を、「結合率」で示した。天然ペプチドと比較して「より良好な結合物」と同定された類似体を、その後に親和性及び解離検定で分析した。
【０２６６】
親和性検定：
親和性検定のために、代替ペプチドの最初の剥離後、漸増濃度（１０-4〜１０-8Ｍの範囲）の所与の対立遺伝子についての各試験ペプチドを、一連のウェルに添加し、前記条件下でインキュベートした。プレートを、フローサイトメーターで読み取った。Prismのソフトウェアを使用して、Ｓ字用量応答曲線を作成した。最大の５０％を達成するのに必要なペプチドの量を、ＥＤ50値として記録した。
【０２６７】
解離検定：
解離検定のために、２１℃で１８時間のインキュベーション後にプレートを洗浄して、過剰なペプチドを除去した。次いで、プレートを、対立遺伝子特異的単量体プレート上にて３７℃でインキュベートした。プレートを、複数の時点で（０、０．５、１、１．５、２、４、６、及び８時間）、相対蛍光強度について測定した。ＭＨＣ単量体から５０％のペプチドを解離するのに必要な時間を、Ｔ１／２値（時間）と定義する。
【０２６８】
ｉスコアの計算：
ｉスコアは、iTopiaのソフトウェア内に提供された多重パラメーター計算である。その値を、結合、親和性、及び安定性データに基づいて計算した。
【実施例３２】
【０２６９】
ＰＳＭＡ288-297の抗原性の検証
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目にＰＳＭＡ288-297ペプチド（２５μｌＰＢＳ中の２５μｇ＋各リンパ節への１２．５μｇのｐＩ：Ｃ）で免疫化した。追加免疫から１週間後、天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで脾細胞を刺激し、種々のＥ：Ｔ比で、51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（ＰＳＭＡ+Ａ２+ＬｎＣａｐ細胞、又はネガティブ対照としてのＭＨＣクラスＩ遮断抗体でコーティン
グしたＬｎＣａｐ細胞）に対して試験した。比溶解率（平均±ＳＥＭ）として示した結果は、ＰＳＭＡ特異的Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ利用可能性に応じた様式でヒト腫瘍細胞を溶解することができ、免疫媒介性攻撃が可能な様式での腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ上のＰＳＭＡエピトープの提示が確認されることを示した。
【０２７０】
［実施例３３〜実施例３８］
ＰＳＭＡ288-297類似体の試験
以下の実施例３３〜実施例３８の通りに、図１９及び２０に列挙した類似体を、改良された、結合の親和性及び安定性、天然エピトープとの交差反応性、並びに免疫原性等の種々の性質について試験した。
【実施例３３】
【０２７１】
１つの位置で置換された類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
実施例３１に記載の手順を使用して、ＰＳＭＡ288-297及び類似体の結合特性を、互いに比較して評価した（図１９を参照のこと）。結合についてのポジティブ対照は、メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌであった。天然エピトープとの交差反応性を、本質的に実施例６に記載のように、天然エピトープに特異的なＴ細胞株からのＩＦＮ−γ分泌を刺激するための類似体ペプチドの使用によって評価した。図１９に示したデータを、１０μｇ／ｍｌの類似体（約１０μＭ）での刺激によって作成した。この濃度により、一般に、類似体について最大又はほぼ最大のＩＦＮ−γが産生された。したがって、この濃度を交差反応性を示すために選択した。
【０２７２】
認められた類似体の親和性を、ＥＤ50として図１９に報告している。Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、及びＡｂｕを、Ｐ２位で置換し、それにより、一般に、類似の親和性が得られた。Ｎｌｅ及びＭｅｔ置換もまた、類似の結合安定性が維持され、この安定性を、数時間後の解離半減期として測定した。Ｖａｌ、Ｎｖａ、及びＡｂｕ類似体は、ＩＦＮ−γ産生レベルを同様に誘導した。
【０２７３】
ＰΩ一次アンカー位置のＩｌｅを、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｖａ、及びＮｌｅに置換した。上記４つは、類似の結合親和性を有していた。Ｖａｌ及びＮｖａ置換により、結合安定性が改良され、ＩＦＮ−γの産生量（交差反応性を示す）が増加し、類似体が改良された免疫原性を有し得ることを示した。
【０２７４】
Ｐ１でのＳｅｒ、Ａｌａ、Ｓａｒ、及びＡｂｕ置換により、類似の結合特性が維持されたが、交差反応性は少ししか類似していなかった。ＰΩ−１位でのＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒ置換により、類似の結合特徴も維持された。最後に、Ｐ３でのＴｒｐ置換により、天然ペプチドの約２倍に増加した安定性及び結合並びに２倍以内のＩＦＮ−γ産生が示され、これらの値は全て一般に類似していた。
【実施例３４】
【０２７５】
２つの位置で置換された類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
上記で認められたパターンは、このエピトープにおける置換によって結合親和性が大きく損なわれず、試験した二重置換（図２０）でも継続された。この二重置換は、天然ペプチドと比較して類似又は改良された結合親和性が一様に示された。両方の一次アンカー位置が置換された類似体のうち、Ｐ２でのＮｌｅのＮｖａ及びＰΩでのＶａｌ並びにＰ２でのＶａｌ及びＰΩでのＮｖａ置換を含む類似体は、結合安定性が改良され、前者の２つはＩＦＮ−γ産生が増加した（第３の類似体についてのデータは示さず）。ＰΩでのＶａｌ及びＮｖａ置換を、Ｐ１でのＡｌａ及びＡｂｕ置換とも組み合わせた。これらの類似体は全て、１つのＰΩ置換と比較して強い結合安定性及び改良されたＩＦＮ−γ産生を示し、したがって、Ｐ１置換をさらに改良した。ＰΩＮｖａ置換はまた、Ｐ３  Ｔｒｐ置換と組
み合わせた場合、種々の結合パラメーターは一般に類似していたにもかかわらず、ＰΩ  Ｖよりも良好な交差反応性を維持することができた。
【実施例３５】
【０２７６】
３つの位置で置換された類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３；Ｐ１、Ｐ２、及びＰΩ；Ｐ２、Ｐ３、及びＰΩ；並びにＰ１、Ｐ３、及びＰΩでの三重置換を行った（図２１）。全ての場合、Ｐ１置換はＡｌａであり、Ｐ３置換はＴｒｐであり、ＰΩ置換はＶａｌ又はＮｖａであった。上記のように、天然ペプチドと少なくとも類似する親和性が維持された。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３クラスについて、Ｐ２でのＮｖａ及びＮｌｅ置換により、結合安定性が改良された。このＰ２  Ｎｖａ類似体は、類似の量のＩＦＮ−γを誘発する一方で、Ｎｌｅ類似体は実質的増加を示した。
【０２７７】
Ｐ１、Ｐ２、ＰΩクラスについて、いずれかの組み合わせにおけるＰ２及びＰΩでのＮｖａ及びＶａｌ置換により、結合安定性が改良された。このＰ２  Ｎｖａ  ＰΩ  Ｖａｌ類似体はまた、ＩＦＮ−γ産生の実質的増加を示した（データ示さず）。この三重置換におけるＰ２及びＰΩの両方でのＶａｌ置換により、天然ペプチドのほぼ半分の結合安定性及びＩＦＮ−γ産生を示した。
【０２７８】
Ｐ２、Ｐ３、ＰΩ群について、Ｎｖａ／Ｗ／Ｖ類似体のみで結合又はＩＦＮ−γ産生が改良された。試験した２つのＰ１、Ｐ３、ＰΩ類似体について、Ｖａｌ又はＮｖａのＰΩにより、結合安定性が改良された。
【実施例３６】
【０２７９】
種々の類似体の交差反応性免疫原性
ＨＨＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝８）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌの各リンパ節へのＰＢＳ＋１２．５μｇのｐＩ：Ｃでの鼠径リンパ節への直接接種によって、ペプチド（天然エピトープＰＳＭＡ288-297又は一次又は二次アンカー残基が置換された類似体）で免疫化した。
【０２８０】
最後の追加免疫から１０日後にマウスを屠殺し、脾細胞を調製し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によってＩＦＮ−γ産生について評価した。抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、種々の脾臓数／ウェルを１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドで刺激した。４８時間のインキュベーション後、検定を構築し、天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドを認識したサイトカイン産生Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データを、スポット形成コロニー数／ウェル（三連の平均±ＳＤ）として図２２に示す。データは、天然ペプチドよりもわずかに高い（しかし、有意な）活性を示す他の類似体（Ｉ２９７Ｎｖａ、Ｇ２８８Ａｂｕ、又はＬ２８９Ｎｌｅ  Ｉ２９７Ｎｖａ）と共に、Ｉ２９７Ｖ及びＰ２９０Ｗ類似体によって達成された天然エピトープに対する免疫応答の初回刺激の増加を示す。天然エピトープの不十分な免疫原性が寛容を反映する範囲で、これらの類似体の改良された活性は寛容破壊を示す。
【実施例３７】
【０２８１】
プラスミドによって誘導されたＰＳＭＡ288-297に対する応答のＩ２９７Ｖ類似体による増幅
２つのＨＨＤマウス群（ｎ＝８）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対する２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用した鼠径リンパ節への直接接種によって、ＰＳＭＡ288-297を発現するプラスミドで免疫化した。その後、天然ペプチド又はＩ２９７Ｖ類似体のいずれかを使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（２５μｇ）を行った。
【０２８２】
最後の追加免疫から１０日後にマウスを屠殺し、脾細胞を調製し、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によってＩＦＮ−γ産生について評価した。抗ＩＦＮ−γ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、種々の脾臓数／ウェルを１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドで刺激した。４８時間のインキュベーション後、検定を構築し、ＰＳＭＡ288-297ペプチドを認識したサイトカイン産生Ｔ細胞の頻度を自動的に計数した。データを、５０万個の応答細胞（responder cell）に正規化した特異的Ｔ細胞の頻度（三連の平均±ＳＤ）として図２３に示す。データは、脾細胞数／ウェルと無関係に、天然エピトープ特異的Ｔ細胞の頻度がＩ２９７Ｖ類似体で免疫化したマウス群よりも顕著に高かったことを示す。
【実施例３８】
【０２８３】
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対する２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用した鼠径リンパ節への直接接種によって、ＰＳＭＡ288-297エピトープを発現するプラスミドで免疫化した。その後、類似体Ｉ２９７Ｖを使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫から１週間後に、脾細胞を天然ＰＳＭＡ288-297ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（Ｌｎｃａｐ、Ａ２+ＰＳＭＡ+、又は６２４．３８Ａ２+ＰＳＭＡ-、又は対照６２４．２８細胞Ａ２-ＰＳＭＡ-）に対して一晩試験した。得られた免疫は、ＬＮＣＡＰに対する細胞傷害性の媒介で有効であった（図２４）。
【実施例３９】
【０２８４】
ＰＲＡＭＥ425-433の抗原性の検証
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目に、ＰＲＡＭＥ425-433ペプチド（各リンパ節に対する２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ＋１２．５μｇのｐＩ：Ｃ）で免疫化した。追加免疫から１週間後に、脾細胞を天然ＰＲＡＭＥ425-433ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（ＰＲＡＭＥ+Ａ２+６２４．３８黒色腫細胞又はＡ２発現が欠損されたネガティブ対照６２４．３８細胞）に対して試験した。比溶解率（平均±ＳＥＭ）として示した結果は、ＰＲＡＭＥ特異的Ｔ細胞がヒト腫瘍細胞を溶解することができ、免疫媒介性攻撃が可能な様式での腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ上のＰＲＡＭＥ425-433エピトープの提示が確認されることを示した（図２５）。
【０２８５】
［実施例４０〜実施例４８］
ＰＲＡＭＥ425-433類似体の試験
図２６〜図２８に列挙した類似体を、以下の実施例４０〜実施例４８に従って、結合の親和性及び安定性の改良、天然エピトープとの交差反応性、並びに免疫原性等の種々の性質について試験した。実施例３１に記載の手順を使用して、ＰＲＡＭＥ425-433及び６９個の類似体のＨＬＡ−Ａ*０２０１結合特性を、互いに比較して評価した。結合についてのポジティブ対照は、メラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌであった。認められた類似体の親和性を、結合率（ポジティブ対照との比較）及びＥＤ50として報告し、結合安定性を解離半減期として報告する。天然エピトープとの交差反応性を、本質的に実施例６に記載のように、天然エピトープに特異的なＴ細胞株由来のＩＦＮ−γ分泌を刺激するための類似体ペプチドの使用によって評価した。図２６〜図２８に示したデータを、約０．３μＭでの類似体ペプチドでの刺激によって作成した。３つの個別の試験から結果を収集し、それぞれ天然ペプチドによって誘発されたＩＦＮ−γ量に対して正規化した。いくつかの場合、報告した値は、２つの決定値の平均である。アスタリスク「*」は、ＩＦＮ−γ産生がバックグラウンドと区別できなかったことを示す。
【実施例４０】
【０２８６】
１つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ（図２６）
Ｐ２一次アンカー位置のＬｅｕに対してＶａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、及びＡｂｕの１つの置換を行った。これらの全類似体は、天然ペプチドの２０％以内の結合率を示した。Ｍｅｔ類似体についてのＥＤ５０が天然ペプチドに匹敵する親和性を示した一方で、Ｎｖａ及びＩｌｅ類似体の親和性は約１／３以内に減少したが、依然としてＰＳＭＡ288-287エピトープに匹敵した。全Ｐ２置換により、天然ペプチドに少なくとも類似する結合安定性が保持された。Ｍｅｔ、Ｎｌｅ、及びＮｖａ類似体は、天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ産生を誘発し、Ｖａｌ類似体はいくらか低かった。
【０２８７】
Ｐ１位のＳｅｒに対してＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｏｒｎ（オルニチン）、及びＨｓｅ（ホモセリン）の１つの置換を行った。これらの全類似体は、天然ペプチドの２０％以内の結合率を示したが、この範囲を超えるＰｈｅ類似体は例外である。Ｌｙｓ類似体についてのＥＤ５０はほぼ１／６に減少したが、他の５つの類似体は、天然ペプチドの３倍以内の親和性を有していた。結合安定性は、一般に、天然ペプチドに類似していた。Ｐｈｅ  Ｐ１類似体は、この群で最も高い結合安定性を示し、天然ペプチドの１２．２時間と比較して、解離半減期が１７．７時間であった。天然ペプチドのＩＦＮ−γの４０％を誘発するＬｙｓ  Ｐ１類似体を除き、これらの全類似体は、天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ産生を誘発するので、交差反応性を示すと見なした。
【０２８８】
Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ａｂｕの１つの置換をＰΩアンカー位置で行い、アミド基の付加によってカルボキシ末端を修飾した。これらの全類似体は、天然ペプチドの２０％以内の結合率を示した。ＥＤ５０測定値は、Ａｌａ置換についての１０倍未満からＮｌｅ置換についての類似の値までの範囲であった。Ｎｖａ置換及びＣ末端アミドも、天然ペプチドのＥＤ５０の３倍以内であった。結合安定性も、一般に、類似しており、Ｎｖａ類似体の外れ値が最高であり（ｔ１／２は１７．２時間）、Ｃ末端アミドが最低であり、ｔ１／２時間がたった３時間に有意に減少した。Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、及びＡｂｕ  ＰΩ類似体は、より低い好ましい交差反応性を示すが、他は天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γ産生を誘発した。
【０２８９】
以下の主にＴＣＲ相互作用に影響を及ぼす位置での１つの置換も行った：Ｐ３及びＰ６でのＮｌｅ、Ｎｖａ、及びＡｂｕ、Ｐ８でのＡｌａ、Ｓｅｒ、及びＳａｒ。Ｐ６  Ｎｖａ類似体は、天然ペプチドの２倍以内のＩＦＮ−γを産生するが、Ｐ６  Ａｂｕ類似体はほぼ４４％であった。
【実施例４１】
【０２９０】
２つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
上記の１つの置換の種々の組み合わせを使用して、Ｐ１及びＰ２、Ｐ２及びＰΩ、並びにＰ１及びＰΩで二重置換類似体を作製した（図２７Ａ及び２７Ｂ）。試験したＰ１−Ｐ２二重置換によって結合親和性又は安定性に大きな変化はなかったが、ＩＦＮ−γ検定において有意な交差反応性を示さなかった。Ｐ２−ＰΩ二重置換類似体で類似のパターンが認められたが、Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体は、ＩＦＮ−γ検定において天然ペプチドと有意なレベルの交差反応性を示し、また同様に結合特性がいくらか改良された。最後に、Ｐ１−ＰΩ二重置換について、試験した類似体はまた、少なくとも類似の結合特性を有する一般的パターンに従うが、交差反応性検定において無視できるＩＦＮ−γを誘発した。この群の例外は、いくらか改良された結合安定性及び有意な交差反応性を示すＳ４２５Ｆ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体及び天然ペプチドよりもＥＤ50が１／４未満に減少し、解離半減期がほぼ２倍であり、より多くのＩＦＮ−γを誘発したＳ４２５Ｆ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体であった。
【実施例４２】
【０２９１】
３つの位置で置換した類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
Ｐ１にＰｈｅ又はＴｈｒ、Ｐ２にＮｖａ又はＭｅｔ、及びＰΩにＮｌｅを有する４つの三重置換類似体を調査した。Ｓ４２５Ｔ  Ｌ４２６Ｍ  Ｌ４３３Ｎａｌｅ類似体が類似の親和性を有するのに対して、他の３つの類似体は親和性が改良された。Ｐ２  Ｎｖａ置換された類似体は、結合安定性の増加及び有意なレベルの交差反応性を示した。図２８を参照のこと。
【実施例４３】
【０２９２】
Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体の交差反応性及び機能的アビディティ
２つのＨＤＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝８）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対して２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、以下の実施例４９に記載のＰＲＡＭＥ425-433を発現するｐＣＴＬＲ２プラスミドで免疫化した。その後、ネガティブペプチド又はＰＲＡＭＥエピトープ類似体Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅを使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行った。
【０２９３】
最後の追加免疫から１０日後にマウスを屠殺し、脾細胞を調製し、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドと共に０．５×１０6細胞／ウェルでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後にＩＦＮ−γ産生について評価した。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ等によってＰＲＡＭＥ425-433ペプチドに応答して産生されたＩＦＮ−γの濃度を測定した。データを図２９に示し、これは、ＰＲＡＭＥ425-433Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体で追加免疫したマウスにおけるＩＦＮ−γ産生の有意な増加を示す。
【実施例４４】
【０２９４】
Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体によって誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性
２つのＨＤＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝８）を、上記の実施例４３に記載のように免疫化した。
【０２９５】
天然エピトープに対して得られたｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するために、同腹子対照ＨＨＤマウスから脾細胞を単離し、２０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの天然ペプチドと２時間インキュベートした。次いで、細胞を、ＣＦＳＥhi蛍光及びＣＦＳＥmed蛍光（それぞれ、４．０μＭ又は1μＭで１５分間）で染色し、同数のＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した対照脾細胞を免疫化マウスに同時に静脈内注射した。１８時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去及びフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照（非負荷）集団と比較して計算し、比溶解率として示した。図３０中の結果は、類似体を追加免疫剤（booster agent）としての天然ペプチドに置換した場合の細胞傷害性誘導の保存を示した。この傾向は、類似体が細胞傷害性免疫の誘導を改善することができることを示す。
【実施例４５】
【０２９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性及び四量体染色
ＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミド（ｐＣＴＬＲ２）を用いて、０、３、１４及び１７日目に各リンパ節へ２５μｌのＰＢＳ中の２５μｇを、鼠径部のリンパ節に直接接種することによって、いくつかのＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）群に免疫を与えた。この後、天然ペプチド、すなわちネガティブ対照（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶペプチド（配列番号１００））、又は一次及び／又は二次アンカー残基（Ｓ４２５Ｆ、Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｓ４２５Ｔ  Ｌ４３３Ｎｌｅ、及びＳ４２５Ｔ  Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ）に変異を有するＰＲＡＭＥ425-433エピトープ類似体の２８日目及び３１日目の２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を行なった。
【０２９７】
天然エピトープに対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するために、同腹子対照ＨＨＤマウスから脾細胞を単離し、０．２μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの天然ペプチドと２時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＣＦＳＥ蛍光（それぞれ、１μＭ及び２．５μＭで１５分間）で染色し、同数のＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した対照脾細胞を免疫化マウスに同時に静脈内注射した。１８時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓の除去及びフローサイトメトリーによる得られた細胞懸濁液中のＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照（非負荷）集団と比較して計算し、比溶解率として示した。さらに、ＰＲＡＭＥ425-433特異的Ｔ細胞の頻度を、四量体／ＣＤ８同時染色によって評価した。
【０２９８】
一次又は二次アンカー残基に変異を含む類似体での追加免疫により、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性及び四量体染色に基づいて、天然ペプチドと比較して類似の免疫活性が示された。類似体は、無関係のペプチドで追加免疫された「ＥＡＡ」群と比較した場合、免疫応答を増幅することができた。これに関して、Ｓ４２５Ｆ、Ｌ３３Ｎｌｅ、Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｓ４２５Ｔ  Ｌ４３３Ｎｌｅ、又はＳ４２５Ｔ  Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅを含む類似体は全て、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性によって評価したところ、天然エピトープに対する免疫を拡大することができた。しかし、Ｌ４３３Ｎｌｅ、Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ、及びＳ４２５Ｔ  Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体のみが、天然エピトープに特異的なＴ細胞の小集団をプラスミドで初回刺激し、ネガティブ対照ペプチドで追加免疫したマウスよりも有意に高いレベルに拡大した（図３１）。
【実施例４６】
【０２９９】
ｅｘ  ｖｉｖｏでのサイトカイン産生
３つのＨＨＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対して２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、ＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミド（ｐＣＴＬＲ２）で免疫化した。その後、ＰＲＡＭＥエピトープ類似体Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ及びＳ４２５Ｔ
Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ又はネガティブ対照ペプチドメラン−Ａ（ＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００））の２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を、２８日目及び３１日目に行った。
【０３００】
最後の追加免疫から１０日後にマウスを屠殺し、脾細胞を調製し、１０μｇ／ｍｌの天然ペプチドとのインキュベーションから４８時間後にＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ産生について評価した。データを、サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）（三連の平均±ＳＤ）として図３２に示す。データは、両類似体で追加免疫したマウス由来の脾細胞によるｅｘ  ｖｉｖｏサイトカイン産生及びＳ４２５Ｔ  Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅよりも高いＬ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅに対する応答を示した。
【実施例４７】
【０３０１】
類似体でのペプチド追加免疫後のヒト腫瘍細胞株に対するｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４）を、０、３、１４、及び１７日目の各リンパ節に対して２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳを使用する鼠径リンパ節への直接接種によって、ＰＲＡＭＥ425-433を発現するプラスミド（ｐＣＴＬＲ２）で免疫化した。その後、類似体Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅを使用した２回のペプチド追加免疫（２．５μｇ）を、２８日目及び３１日目に行った。追加免疫から１週間後、脾細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏにて天然ペプチドで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（ＩＦＮ−γで前処置しているか又はしていないＰＲＡＭＥ+６２４．３８黒色腫細胞又はＨＬＡ−Ａ２発現が欠損したネガティブ対照６２４．３８細胞）に対して試験した。類似体Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅは、Ａ２を発現するヒト腫瘍細胞（６２４．３８）に対して有意
な細胞傷害性を媒介する免疫応答を誘発し、この応答は、ＩＦＮγでのその前処置の際にわずかに上昇した。対照的に、Ａ２−６２４．２８対照細胞に対する有意な活性は測定されなかった。図３３を参照のこと。
【実施例４８】
【０３０２】
ＰＲＡＭＥ425-433に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫化
図３４に示す一般的スキームに従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化を行った。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ分離によって健康なドナー（ＨＬＡ−Ａ*０２０１+）から得た。新鮮なＰＢＭＣ（２．５×１０6）を、５ｎｇ／ｍｌ  ＰＲＡＭＥ425-433又はペプチド類似体と共に、Ｔ細胞培養培地中にプレートした。その後、７２時間後及び９６時間後に２０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２を各ウェルに添加し、７日目にさらなるペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）を添加した。培養物をさらに１０日間維持し、その後、エフェクター細胞を回収し、四量体染色で使用した。ＩＶＳ  ＰＢＭＣを、ＰＲＡＭＥ425-433四量体で標識し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（BD, San Jose, CA）にて分析した。ネガティブ対照に基づいて四分円（quadrant）を設定し、無関係のＨＢＶ四量体及びＳＳＸ２四量体で染色し、最小の１０，０００個のゲーティング事象を捕捉した。四量体陽性細胞を、リンパ球集団の比率として示した。ＰＲＡＭＥ425-433特異的四量体は、天然ペプチドと比較して、ペプチド類似体でのＩＶＳ後に有意に増強された。図３５を参照のこと。これは、類似体が好ましい免疫原であり得ることを証明している。
【実施例４９】
【０３０３】
ｐＣＴＬＲ２（ＰＲＡＭＥ425-433エピトープを発現するプラスミド）
ｐＣＴＬＲ２は、ＰＲＡＭＥ由来のＨＬＡ  Ａ２特異的ＣＴＬエピトープ（アミノ酸残基４２５−４３３（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号７１））及びＰＲＡＭＥのエピトープクラスター領域（アミノ酸４２２〜５０９）を有する１つのポリペプチドをコードする組換えＤＮＡプラスミドワクチンである。プラスミド中のポリペプチドのｃＤＮＡ配列は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター／エンハンサー配列（ＣＭＶｐ）の調節下にあり、抗原提示細胞により取り込みの際にポリペプチドのメッセンジャーを有効に転写することが可能である。コード配列の３’末端のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨポリＡ）により、その安定性を増加させるためのメッセンジャーのポリアデニル化シグナルが得られ、このシグナルが核から細胞質に移動する。プラスミドの核への輸送を容易にするために、サルウイルス４０由来の核輸送配列（ＮＩＳ）を、プラスミド骨格に挿入した。ＣｐＧ免疫刺激モチーフの１つのコピーをプラスミド中で操作して、免疫応答をさらに促進した。最後に、プラスミド中の２つの原核生物遺伝因子（カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）及びｐＭＢ細菌複製起点）は、大腸菌中での増幅を担う（図３６を参照のこと）。
【０３０４】
免疫原翻訳産物の配列
コードされたポリペプチドのアミノ酸配列（１５０アミノ酸残基長）を以下に示す。
【０３０５】
ｍａｌｑｓｌｌｑｈｌｉｇｌｓｎｌｔｈｖｌｙｐｖｐｌｅｓｙｅｄｉｈｇｔｌｈｌｅｒｌａｙｌｈａｒｌｒｅｌｌｃｅｌｇｒｐｓｍｖｗｌｓａｎｐｃｐｈｃｇｄｒｔｆｙｄｐｅｐｉｌｃｐｃｆｍｐｎｋｒｓｌｌｑｈｌｉｇｌｇｄａａｙｓｌｌｑｈｌｉｇｌｉｓｐｅｋｅｅｑｙｉａｓｌｌｑｈｌｉｇｌｋｒｐｓｉｋｒｓｌｌｑｈｌｉｇｌ（配列番号１９６）。
【０３０６】
最初の８９アミノ酸残基は、ＰＲＡＭＥ422-509を示すエピトープクラスター領域である。種々のエピトープ推定アルゴリズムを使用して、このエピトープクラスター領域内に多数の潜在的ＨＬＡ  Ａ２特異的ＣＴＬエピトープが見出された。アミノ酸残基９０〜１５０は、組み込まれたＰＲＡＭＥ425-433ＣＴＬエピトープ（太字）の４つのコピーを有
するエピトープ遊離（Ｓｙｎｃｈｒｏｔｏｐｅ（商標））配列である。隣接する定義されたＰＲＡＭＥ  ＣＴＬエピトープは、短いアミノ酸配列であり、ＰＲＡＭＥ  ＣＴＬエピトープのプロセシングで重要な役割を果たすことが示されている。さらに、アミノ酸配列ｉｓｐｅｋｅｅｑｙｉａ（配列番号１９７）（ＰＲＡＭＥアミノ酸２７６〜２８６に対応、斜体）を、数珠状（sting-of-beads）領域に操作して、コードされたポリペプチドの発現の検出を容易にした。
【０３０７】
種々の免疫学的検定（四量体、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、及び細胞傷害性が含まれる）の使用により、ｐＣＴＬＲ２プラスミドで免疫化したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスからエピトープＰＲＡＭＥ425-433に特異的な強いＣＴＬ応答が検出され、これにより、ｐＣＴＬＲ２の免疫原性効力が示唆された。これらのデータは、プラスミドが抗原提示細胞によって利用され、コードされたポリペプチドを合成し、タンパク質分解的にプロセシングして九量体エピトープペプチド（提示のために結合した九量体エピトープペプチドＨＬＡ−Ａ２）を産生することを示した。
【０３０８】
プラスミドの構築
長い相補性オリゴヌクレオチド組の段階的ライゲーションにより、「数珠状」エピトープ遊離配列（アミノ酸９０〜１５０）中にアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡが生成された。これらのｃＤＮＡは、ＰＲＡＭＥエピトープクラスター領域（アミノ酸１〜８９）をコードするｃＤＮＡでのさらなるライゲーションに使用することができる制限酵素の適切な付着末端を保有し、これらのｃＤＮＡを、鋳型としてＰＲＡＭＥをコードするｃＤＮＡに対するＰＣＲの実施によって増幅した。次いで、全挿入を、Ａｆｌ  ＩＩとＥｃｏＲ  Ｉ部位との間のベクター骨格にライゲーションした。全コード配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。
【実施例５０】
【０３０９】
抗原特異的Ｔ細胞応答の生成
Ｈ−２クラスＩ陰性ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックＨＨＤマウスを、無病原体条件下に収容し、ＨＬＡ−Ａ２．１制限ヒト腫瘍関連細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープの免疫原性の評価のために使用した。８〜１２週齢の雌マウスを、リンパ管内免疫化及びｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性研究のための脾細胞の単離のために使用した。マウスを、両側性鼠径リンパ節注射によって免疫化した。マウスを、イソフルレン吸入によって麻酔し、無菌条件下で外科処置を行った。外科処置のための準備の後、鼠径襞及び鼠径リンパ節を０．５ｃｍの長さの切開によって露呈させた。最大体積２５μｌ（２５μｇ）のプラスミドＤＮＡワクチン又はペプチドを、０．５ｍｌインスリンシリンジを使用してリンパ節に直接注射した。滅菌６−０ナイロン皮膚縫合を使用して創傷を閉じた。
【実施例５１】
【０３１０】
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４／群）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってメラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌエピトープ類似体を発現するプラスミドｐＳＥＭ（米国特許出願第１０／２９２，４１３号（公開番号２００３０２２８６３４号Ａ１）（その全体が本明細書中で参照により援用される）により完全に記載されている）で免疫化した。その後、類似体Ａ２７Ｌ、Ａ２７Ｎｖａ又はＡ２７Ｌ  Ｖ３５Ｎｖａを使用して、２８日目及び３１日目に２回のさらなるペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫から１週間後、脾細胞を、メラン−Ａ26-35ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（６２４．３８細胞）に対して試験した。Ａ２７Ｌ又はＡ２７Ｎｖａ類似体での追加免疫後に得られた免疫は類似し、天然ペプチドＥＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００）よりも有効であった（図３７）。初回刺激プラスミドがＡ２７Ｌ類似体を発
現するので、試験は、このペプチドを支持して潜在的に偏っていた。したがって、Ａ２７Ｎｖａ類似体を用いて得た実質的細胞傷害性は、初回刺激がこの配列を使用する場合に得られる効力よりも過小評価され得る。
【実施例５２】
【０３１１】
テトラマー解析
ＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞の計数には、クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の同族認識が必要である。特定のペプチドにそれぞれ結合し、蛍光タンパク質と抱合した４つのＨＬＡ  ＭＨＣクラスＩ分子の複合体から構成されるクラスＩ
ＭＨＣ四量体を使用して、これを行うことができる。したがって、四量体検定により、特定のＭＨＣ分子中に複合体形成した所与のペプチドに特異的な総Ｔ細胞集団の定量が可能である。さらに、結合が機能的経路に依存しないので、この集団は、機能状態に関わらず全ての特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。免疫化動物におけるＣＴＬ応答を、ＨＬＡ−Ａ*０２０１  ＭＡＲＴ１（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１００））−ＰＥ  ＭＨＣ四量体（Beckman Coulter、Ｔ０１００８）又はチロシナーゼ369-377（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号９４））特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ*０２０１チロシナーゼ−ＰＥ、Beckman
Coulter）及びＦＩＴＣ抱合ラット抗マウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）モノクローナル抗体（BD Biosciences）を使用した密度遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍａｍｍａｌ、Cedarlane Labs）後の末梢血から単離した単核細胞の同時染色によって測定した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用してデータを収集し、cellquestのソフトウェアを使用して、リンパ球集団上のゲーティング及びＣＤ８+ＣＴＬ集団内の四量体+細胞の比率の計算によって分析した。
【実施例５３】
【０３１２】
四量体染色（プラスミド初回刺激、ペプチド追加免疫−天然対類似体）
２つのＨＨＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝８）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ３６９−３７７を発現するプラスミドで免疫化した。その後、２８日目及び３１日目に天然ペプチド又は３７７Ｎｖａ類似体の２回のさらなるペプチド追加免疫（類似の量）を行った。１０日後、チロシナーゼ369-377特異的四量体試薬（ＨＬＡ−Ａ*０２０１チロシナーゼ−ＰＥ、Beckman Coulter）を使用して、免疫応答をモニタリングした。眼窩後洞静脈を介して各マウスから採血し、２０００ｒｐｍで２５分間の密度遠心分離（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍａｍｍａｌ、Cedarlane Labs）を使用してＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、ＣＤ８に対するマウス特異的抗体（BD Biosciences）及びチロシナーゼ四量体試薬で同時染色し、特定の比率を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用したフローサイトメトリーによって決定した。チロシナーゼ特異的ＣＤ８+細胞の比率は、天然ペプチドの類似体との置換によってチロシナーゼ特異的小集団の拡大が保存されることを示す。この傾向は、類似体がチロシナーゼ特異的Ｔ細胞の拡大を改良することができることを示す（図３８）。
【実施例５４】
【０３１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性及び四量体染色（天然ペプチドと類似体候補パネルとの間の直接比較）
４つのＨＨＤトランスジェニックマウス群（ｎ＝６）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇのプラスミドを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ369-377及びメラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌエピトープを発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）で免疫化した。その後、左鼠径リンパ節へのメラン−Ａ26-35Ａ２７Ｌ及び右リンパ節への一次及び／又は二次アンカー残基の置換を有するチロシナーゼ369-377類似体の２回のペプチド追加免疫（類似の量）を２８日目及び３１日目に行った。対照として、プラスミドのみで免疫化したマウス又はナイーブマウスを使用した。
【０３１４】
天然チロシナーゼ及びメラン−Ａエピトープに対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を評価するために、同腹子対照ＨＨＤマウスから脾細胞を単離し、ＨＬ−１無血清培地（Cambrex）中で２０μｇ／ｍｌの天然ペプチド（メラン−Ａ26-35又はチロシナーゼ369-377）と２０×１０6細胞／ｍｌの濃度で２時間インキュベートした。次いで、これらの細胞を、ＣＦＳＥ（Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＦＤＡ  ＳＥ細胞追跡キット, Molecular Probes）（それぞれ、１μＭ又は２．５μＭで１５分間）で染色し、同数のＣＦＳＥlo蛍光（０．４μＭ）で染色した対照非ペプチドコーティング脾細胞を免疫化マウス又はナイーブ対照ＨＨＤマウスに同時に静脈内注射した。１８時間後、標的細胞の特異的消失を、攻撃誘発動物からの脾臓の除去及びフローサイトメトリーによる得られた細胞懸濁液中のＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した。ペプチド負荷脾細胞に対応する集団の相対枯渇を、対照（非負荷）集団と比較して計算し、比溶解率として示した。さらに、チロシナーゼ369-377及びメラン−Ａ26-35特異的Ｔ細胞の頻度を、四量体／ＣＤ８同時染色（ＨＬＡ−Ａ*０２０１−四量体、Beckman Coulter）によって評価した。
【０３１５】
チロシナーゼ類似体Ｖ３７７Ｎｖａは、チロシナーゼ特異的Ｔ細胞集団を拡大し、天然ペプチドに類似し、チロシナーゼ類似体Ｍ３７０Ｖ  Ｖ３７７Ｎｖａよりも高い細胞傷害性免疫を増幅することができる（図３９）。
【実施例５５】
【０３１６】
ヒト腫瘍細胞に対するｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性
ＨＨＤトランスジェニックマウス（ｎ＝４／群）を、０、３、１４、及び１７日目の２５μｇのプラスミドを含む２５μｌのＰＢＳ／各リンパ節での鼠径リンパ節への直接接種によってチロシナーゼ369-377エピトープを発現するプラスミド（ｐＳＥＭ）で免疫化した（図４０中の一般的プロトコルに従う）。その後、天然ペプチド又はＰ２及びＰΩ（３７０及び３７７）の一次アンカー残基が置換された類似体を使用して、２８日目及び３１日目に２回のペプチド追加免疫（同量）を行った。追加免疫から１週間後、脾細胞を、天然チロシナーゼ369-377ペプチドにてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、種々のＥ：Ｔ比で51Ｃｒ標識ヒト腫瘍細胞（６２４．３８細胞）に対して試験した。天然ペプチド及びＭ３７０Ｖ
Ｖ３７７Ｎｖａ類似体の両方により、６２４．３８細胞に対する強い細胞傷害性が得られた（図４１）。天然ペプチドを使用して細胞溶解活性がいくらか弱まったのに対して、類似体では弱まらなかったので、実施例５２中の四量体の結果から得られたより高い免疫原性の兆候を強化した。上記実施例とあわせると、この所見は、潜在的に有用な類似体を概説するためのより感度の高い検定（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性）でのよりストリンジェント検定（ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性及び四量体染色）の補助が有用であることを示す。
【実施例５６】
【０３１７】
ＩＴＯＰＩＡシステムによる天然ペプチド及び類似体の結合及び安定性（半減期）の特徴付け
ＭＨＣ１複合体に結合したペプチドの結合及び安定性が良好な免疫応答を得るのに不可欠であるので、天然エピトープ及びその類似体を、ｉＴｏｐｉａエピトープ発見システムを使用してＡ０２０１制限ＭＨＣクラス１分子への結合及び安定性（Ｔ1/2）について試験した（実施例３１でも考察されている）。６つの天然エピトープ及び免疫応答を増強するように設計したその類似体の結合及び解離（Ｔ1/2）を決定した。天然ペプチド及び類似体は以下であった：ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ））、メラン−Ａ26-35、メラン−Ａ26-35（Ａ２７Ｎｖａ）、ＳＳＸ−２41-49、ＳＳＸ−２41-49（Ａ４２Ｖ）、Ｐｒａｍｅ425-433、Ｐｒａｍｅ425-433（Ｌ４２６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）、チロシナーゼ369-377、チロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）、ＰＳＭＡ288-297、及びＰＳＭＡ288-297（Ｉ２９７Ｖ）。
【０３１８】
表１０（以下）は、６つの類似体及びその天然ペプチドのペプチド結合及び安定性又は半減期の平均値を示す。ＳＳＸ−２41-49及びＮＹ−ＥＳＯ−１157-165の類似体は、天然ペプチドと比較して結合率が実質的に増加した。メラン−Ａ26-35、Ｐｓｍａ288-297、Ｐｒａｍｅ425-433、及びチロシナーゼ369-377の類似体は、天然ペプチドと比較してペプチドの結合率がわずかに増加した。
【０３１９】
メラン−Ａ26-35（Ａ２７Ｎｖａ）は、天然ペプチドと比較して安定性（半減期）が実質的に増加した。他の類似体Ｐｓｍａ288-297（Ｉ２９７Ｖ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１157-165（Ｌ１５８Ｎｖａ、Ｃ１６５Ｖ）、Ｐｒａｍｅ425-433（Ｌ２３６Ｎｖａ、Ｌ４３３Ｎｌｅ）、及びＳＳＸ−２41-47（Ａ４２Ｖ）に安定性の有意な増加が認められた。天然ペプチドと比較して類似体チロシナーゼ369-377（Ｖ３７７Ｎｖａ）の半減期に有意な相違は認められなかった。類似体の半減期で認められた相違は、ＭＨＣ１分子への各類似体の結合機構の相違に起因し得る。
【０３２０】
【表１０】
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【０３２１】
上記の種々の方法及び技法により、本発明を実施するための多数の方法が得られる。勿論、本明細書中に記載の任意の特定の実施形態に従って記載の全ての目的又は利点を必ずしも達成することができるわけではないと理解すべきである。したがって、例えば、当業者は、本明細書中で教示又は示唆することができる他の目的又は利点を必ずしも達成することなく、１つの利点又は複数の利点を達成するか又は最適にする様式で本方法を実施することができると認識するであろう。種々の有利な代替物及び不利な代替物を本明細書中に述べている。いくつかの好ましい実施形態は、特に、一方、他方、又はいくつかの有利な特徴を含み、他の実施形態は、特に、一方、他方、又はいくつかの有利な特徴を排除し、さらに他の実施形態は、特に、一方、他方、又はいくつかの有利な特徴を含めることによってこの不利な特徴を軽減すると理解すべきである。
【０３２２】
さらに、当業者は、異なる実施形態由来の種々の特徴の適用可能性と認識するであろう。同様に、上記で考察した種々の要素、特徴、及び過程並びにそれぞれのこのような要素、特徴、又は過程についての他の既知の等価物を、当業者によって本明細書中に記載の原理にしたがって方法を実施するために混合及び適合させることができる。種々の要素、特徴、及び過程のうちのいくつかが特に含まれ、多様な実施形態において他は特に排除される。
【０３２３】
本発明を一定の実施形態及び実施例の文脈で開示しているが、本発明が具体的に開示した実施形態を超えて別の実施形態及び／又は用途並びにその修正形態及び等価物に拡大されると当業者に理解されるであろう。
【０３２４】
本発明の多くの変形形態及び変更形態を開示している。なおさらなる変形形態及び代わりの要素が当業者に明らかである。これらのうち、変形形態は、スクリーニングパネル中又は治療薬によって標的化された特定の数の抗原、抗原型、癌型、及び指定された特定の抗原であるが、これらに限定されない。本発明の種々の実施形態は、任意のこれらの変形形態又は要素を明確に含むか排除することができる。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、本発明の或る特定のいくつかの実施形態を説明及び主張するために使用される成分の量、分子量及び反応条件等の性質を示す数は、いくつかの場合、用語「約」で修飾されると理解すべきである。したがって、いくつかの実施形態では、説明文及び添付の特許請求の範囲に記載の数のパラメーターは近似値であり、これらは、特定の実施形態によって得られると考えられる所望の性質に応じて変化し得る。いくつかの実施形態では、数のパラメーターは、報告した有効数字に照らし、通常の丸め処理技法の適用によって解釈すべきである。広域の本発明のいくつかの実施形態を示す数値域及びパラメーターは近似値であるが、特定の例に記載の数値は実用可能に正確に報告している。本発明のいくつかの実施形態に示す数値は、一定の誤差を含む可能性があり、この誤差は必然的にその各試験での測定で見出された標準偏差に起因する。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の特定の実施形態を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の一定の文脈）で使用される類似の指示対象は、単数又は複数の両方を対象とすると解釈することができる。本明細書中の値の範囲の列挙は、範囲内に含まれる１つ１つの別個の値について言及する簡便な方法としての機能を果たすことを意図するに過ぎない。本明細書中の他で示さない限り、各個々の値は、本明細書中で個別に引用されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載の全ての方法を、本明細書中の他で示さない限り、又は文脈上明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書中の一定の実施形態に関して提供される任意及び全ての実施形態又は例示の用語（例えば、「〜等」）の使用は、本発明をより明確に説明することを意図するに過ぎず、別で特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。明細書中に記載されていない事項は、本発明の実施に不可欠な、特許請求の範囲に記載していない任意の要素を示すと解釈すべきである。
【０３２７】
本明細書中に開示されている本発明の別の要素又は実施形態のグループ（grouping）は、本発明を制限すると解釈すべきではない。各グループのメンバーを、個別に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書中で見出される他の要素との任意の組合せを言及し、主張することができる。利便性及び／又は特許性の理由で、グループの１つ又は複数のメンバーを、グループに含めるかグループから削除することができると予想される。任意のこのような含有又は削除が起こる場合、明細書は、修正されたグループを含み、それにより、添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの記載を満たすと見なされる。
【０３２８】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載しており、これらには、本発明者らに既知の、発明実施の最良の形態が含まれる。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記説明を読んだ際に当業者に明らかとなるであろう。当業者は必要に応じてこのような変形形態を使用することができ、本明細書中に具体的に記載されていない別の方法で本発明を実施することができることが意図される。したがって、本発明の多数の実施形態には、適用法によって許容される場合、添付の特許請求の範囲に引用した主題の全ての修正形態及び等価物が含まれる。さらに、他に示されないか、又は文脈上明確に矛盾しない限り、全ての可能な変形形態における上記要素の任意の組合せは、本発明に含まれる。
【０３２９】
さらに、本明細書の至るところに、特許及び刊行物への多数の言及がなされている。上記の各参考文献及び刊行物は、その全体が本明細書に参照により個別に援用される。
【０３３０】
最後に、本明細書中に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理を例示すると理解すべきである。使用することができる他の修正形態は、本発明の範囲内に含まれ得る。したがって、制限されないが、例として、本明細書中の教示にしたがって本発明の別の形態を使用することができる。したがって、本発明は、正確に表示及び説明した発明に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０３３１】
【図１Ａ】九量体についての各アミノ酸位置でのＳＳＸ−２41-49類似体の置換をまとめている。
【図１Ｂ】十量体についての各アミノ酸位置でのＳＳＸ−２41-49類似体の置換をまとめている。
【図２】類似体同定のための好ましい実施形態の方法の略図である。
【図３】１つの位置で置換されたＳＳＸ−２41-49類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図４】２つの位置で置換されたＳＳＸ−２41-49類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図５】３つ以上の位置で置換されたＳＳＸ−２41-49類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図６】名目上の４１−４９ペプチドを含むＳＳＸ−２41-49十量体類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図７】ＳＳＸ−２41-49類似体の注射スケジュールを示す時間軸の図である。
【図８】腫瘍細胞の溶解における、ＳＳＸ−２41-49Ａ４２Ｖ類似体、Ａ４２Ｌ類似体、及び野生型の活性を示す棒グラフである。
【図９】ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性研究及びｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害性研究のための注射スケジュールを示す時間軸並びに追加免疫のために使用したＳＳＸ−２41-49類似体ペプチドの図である。
【図１０】対照（野生型ペプチド）及びＥＡＡ（メラン−Ａ２６−３５）と比較した多数の類似体のｉｎ  ｖｉｖｏ特異的溶解の結果を示す表である。
【図１１】対照（野生型ペプチド）及びＥＡＡと比較した多数のＳＳＸ−２41-49類似体のｉｎ  ｖｉｖｏ特異的溶解の結果並びにＭＨＣ結合及びＭＨＣ安定性を示す表である。
【図１２】野生型対照と比較した多数の類似体での免疫化後に達成された腫瘍細胞（６２４．３８ヒト腫瘍細胞）の特異的溶解率を示す棒グラフである。
【図１３Ａ】九量体及び十量体それぞれについての各アミノ酸位置での置換並びにそれぞれについて得た結果をまとめた表である。
【図１３Ｂ】九量体及び十量体それぞれについての各アミノ酸位置での置換並びにそれぞれについて得た結果をまとめた表である。
【図１３Ｃ】九量体及び十量体それぞれについての各アミノ酸位置での置換並びにそれぞれについて得た結果をまとめた表である。
【図１４】ＮＹ−ＥＳＯ−１類似体の分析及び試験のために使用した注射スケジュールを示す時間軸の図である。
【図１５Ａ】攻撃誘発した動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去並びにフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す。
【図１５Ｂ】攻撃誘発した動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去並びにフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す。
【図１５Ｃ】攻撃誘発した動物からの脾臓及びＰＢＭＣの除去並びにフローサイトメトリーによるＣＦＳＥ蛍光の測定によって測定した標的細胞の特異的消失を示す。
【図１６Ａ】ＮＹ−ＥＳＯ−１類似体での追加免疫後の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性を示す棒グラフである。
【図１６Ｂ】ＮＹ−ＥＳＯ−１類似体での追加免疫後の野生型ペプチドでコーティングした標的細胞に対するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性を示す棒グラフである。
【図１７Ａ】サイトカイン産生によって評価した野生型エピトープに対して増強された免疫を誘発する類似体の能力のｅｘ  ｖｉｖｏ分析を示す棒グラフである。
【図１７Ｂ】サイトカイン産生によって評価した野生型エピトープに対して増強された免疫を誘発する類似体の能力のｅｘ  ｖｉｖｏ分析を示す棒グラフである。
【図１８】ＰＳＭＡ288-297エピトープの抗原性を立証するためのプロトコル及び試験結果を示す図である。
【図１９】１つの位置を置換したＰＳＭＡ288-297類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２０】２つの位置を置換したＰＳＭＡ288-297類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２１】３つ以上の位置を置換したＰＳＭＡ288-297類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２２】Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定した種々のＰＳＭＡ288-297類似体の免疫原性を示す棒グラフである。
【図２３】Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定したＩ２９７Ｖ類似体による抗ＰＳＭＡ288-297応答の増幅を示す線グラフである。
【図２４】Ｉ２９７Ｖ類似体での追加免疫の結果を示す棒グラフである。検定は、追加免疫によってＰＳＭＡ+ヒト腫瘍株に対する細胞傷害性免疫が得られることを示した。
【図２５】ＰＲＡＭＥ425-433エピトープの抗原性を立証するためのプロトコル及び試験結果を示す図である。
【図２６】１つの位置を置換したＰＲＡＭＥ425-433類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２７Ａ】２つの位置を置換したＰＲＡＭＥ425-433類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２７Ｂ】２つの位置を置換したＰＲＡＭＥ425-433類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２８】３つ以上の位置を置換したＰＲＡＭＥ425-433類似体の交差反応性及び機能的アビディティを示す表である。
【図２９】Ｅｌｉｓｐｏｔによって測定したＰＲＡＭＥ425-433類似体の免疫原性を示す棒グラフである。
【図３０】Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体での追加免疫の結果を示す図である。検定は、追加免疫によって天然エピトープをコーティングした細胞に対する細胞傷害性免疫が得られたことを示した。
【図３１】ＰＲＡＭＥ類似体のｉｎ  ｖｉｖｏ評価のためのプロトコル及びこの評価の結果を示す棒グラフを示す図である。
【図３２】類似体誘導された天然エピトープ再刺激Ｔ細胞のサイトカイン産生のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激のためのプロトコル及びこの評価の結果を示す棒グラフを示す図である。
【図３３】Ｌ４２６Ｎｖａ  Ｌ４３３Ｎｌｅ類似体での追加免疫の結果を示す棒グラフである。検定は、追加免疫によってヒト腫瘍細胞株に対する細胞傷害性免疫が得られたことを示した。
【図３４】ＰＲＡＭＥ425-433に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化のためのプロトコルを示す図である。
【図３５】ＰＲＡＭＥ425-433類似体でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫化後のテトラマー解析の結果を示す図である。
【図３６】プラスミドｐＣＴＬＲ２（ＰＲＡＭＥ425-433エピトープを発現するプラスミド）の構造を示す図である。
【図３７】体液性（humor）腫瘍細胞（６２４．３８）をプラスミドＤＮＡで初回刺激したＴ細胞によって溶解し、ペプチドで追加免疫した実験についての検定結果を示す棒グラフである。
【図３８】Ｔｙｒ369-377でのプラスミド初回刺激及びＶ３７７Ｎｖａ類似体でのペプチド追加免疫後のテトラマー解析結果を示す棒グラフである。
【図３９】類似体であるチロシナーゼ及びメラン−Ａエピトープに対するｉｎ  ｖｉｖｏ応答を示す棒グラフである。
【図４０】チロシナーゼ類似体免疫原性評価プロトコルを示す時間軸の図である。
【図４１】プラスミドで初回刺激し、Ｔｙｒ369-377類似体で追加免疫したＨＨＤ由来のエフェクター細胞と接触させた６２４．３８細胞に対する免疫応答の結果を示す棒グラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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2008543314.tif 000066
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