(57)【要約】  第VIII因子、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ因子又はいずれかのアナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のために、式（II）｛式中、１のＸがＮであり、そして他のＸがＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；  Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスであり；  ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；  ＺはＯ，Ｓ又はＮ−Ｒ3であり；  Ｒ2とＲ3は各々Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；  ＢとＷは各々、１〜１０個の炭素原子を含む場合により置換された炭化水素連結であり；  ＤはＨ，ＯＨ又は第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四アンモニウム、イミダゾール、グアニジノ又はアミジノ基であり；又は  Ｂ−Ｄは、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3-4−ＮＨ2であり；そして  Ｒ7は、中性pHにおいて正電荷をもつ基である。｝で表される化合物であるアフィニティー吸着剤を使用する。
2008543738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第VIII因子、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ因子又はいずれかのアナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のためのアフィニティー吸着剤の使用であって、当該アフィニティー吸着剤が、以下の式（II）：
【化１】
2008543738.tif 000009
｛式中、１のＸがＮであり、そして他のＸがＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスであり；
ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮ−Ｒ3であり；
Ｒ2とＲ3は各々Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；
ＢとＷは各々、１〜１０個の炭素原子を含む場合により置換された炭化水素連結であり；
ＤはＨ，ＯＨ又は第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四アンモニウム、イミダゾール、グアニジノ又はアミジノ基であり；又は
Ｂ−Ｄは、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3-4−ＮＨ2であり；そして
Ｒ7は、中性pHにおいて正電荷をもつ基である。｝で表される化合物である前記使用。
【請求項２】
Ｒ7が第二又は第三アミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アミンが環の一部を形成する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｂ又はＷが、芳香族基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記吸着剤が式（III）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記吸着剤が式（IV）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記吸着剤が式（Ｖ）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記吸着剤が血漿のサンプルと接触する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載される式（II）を有する新規化合物。
【請求項１０】
Ａが、トリアジン環に直接又は間接的に連結された官能基により置換される、請求項９に記載の化合物の前駆体である化合物であって、それにより固体支持体上での当該前駆体の固定化が可能にされている前記前駆体である化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、化合物、及びアフィニティー・リガンドとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
（抗血友病因子として先に知られていた）第VIII因子は、約２００ng／mLのレベルで循環血漿中に存在する糖タンパク質である。天然の成熟１本鎖タンパク質は、糖添加に依存して２６５〜２７０kDaの間の異質な分子量をもつ。但し、１７０〜２８０kDaの広いレンジの分子量のタンパク質が、対立遺伝子の変動、糖添加、修飾、及びインビボにおける断片化に依存して、血漿中で観察される。多数の組換え第VIII因子産物が入手可能であり、そしてまた、タンパク質構造及び分子量においてかなり変動している。
【０００３】
血漿第VIII因子は、追加の複合体化因子を有し、それは、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ因子（ｖＷＦ）、すなわち血液凝固に関連する複合体多量体タンパク質と密接に関係して存在する。ｖＷＦ自体も、単独で又は第VIII因子とともに、治療用途をもつ。
【０００４】
第VIII因子は、最終的に、ｖＷＦ／ＦVIIIからフィブリンへの変換、及びフィブリン血塊の形成に至る複雑な血液凝固カスケードに参加する。第VIII因子の生成における遺伝的異常は、血友病Ａをもたらし、これは、低下した血塊形成又はその不在に因る、主に繰り返される出血エピソードに現れる。血友病Ａ及びその兆候（例えば、制御できない出血）は、血漿由来又は組換え第VIII因子により処置されうる。適当な投薬により、第VIII因子の予防的使用は、外科手術の間に観察されるものを含む、出血エピソードの数及び重度を顕著に低減しうる。
【０００５】
血漿からの第VIII因子／ｖＷＦの精製又は組換え源からの第VIII因子の精製は、一般に、多数のクロマトグラフィー、及び／又は沈殿、及び／又は不活性化ステップを含む複雑なプロセスである。血漿からの精製は、さらに、しばしば、初期の寒冷沈降及び再構成ステップを含む。これらの複雑な精製手順は、タンパク質に固有な不安定性とともに、精製された産物の低収率をもたらす。免疫アフィニティー・クロマトグラフィーが記載されているが、その固有の高価を除き、使用されるクロマトグラフィー材料は安定性とクリーニング可能性を欠くという問題があり、再使用は極めて困難である。ペプチド・リガンド−ベースの媒質も、免疫アフィニティー媒質として同様の問題があり、そして広く受け入れられていない。これまで不可能であった収率、純度、及び費用効果をもって多数の源から第VIII因子又は第VIII因子／ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ因子を単離することができるクロマトグラフィー材料を取得することが望まれる。
【０００６】
ＷＯ９７／１０８８７は、アフィニティー吸着剤として有用な、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2008543738.tif 000003
｛式中、Ｒ1は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、ＮＨ2、フェニル、ナフチル、１−フェニルピラゾール、インダゾール、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール又はベンズイミダゾールであり、その芳香族基の内のいずれかは、アルキル、アルコキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノ、ＮＨ2，ＯＨ，ＣＯ2Ｈ、スルホニル、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル、及びハロゲンの内の１以上で置換されていてもよく；
１のＸはＮであり、そして他のＸはＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮＲ3であり；
Ｒ2とＲ3は各々Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；
Ｑは、ベンゼン、ナフタレン、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール、１−フェニルピラゾール、インダゾール又はベンズイミダゾールであり；
Ｒ4，Ｒ5とＲ6は各々、Ｈ，ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アミノ、ＮＨ2、アシルオキシ、アシルアミノ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル又はハロゲンであり；
ｎは０〜６であり；
ｐは０〜２０であり；そして
Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスである。｝で表されるトリアジン−ベースの化合物を開示する。
【０００７】
式（Ｉ）の化合物は、免疫グロブリン、インスリン、第VII因子又はヒト成長ホルモンの如きタンパク質に対してアフィニティーをもつものとして開示されている。
【０００８】
関連構造をもつ化合物は、ＷＯ００／６７９００及びＷＯ０３／０９７１１２中に開示される。それらは内毒素に対するアフィニティーをもつ。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の概要
驚ろくべきことに、その内の多くが新規である特定の化合物がｖＷＦ／ＦVIIIのアフィニティー−ベースの単離のために有用であることが発見された。これらの化合物は以下の式（II）：
【化２】
2008543738.tif 000004
｛式中、Ｘ，Ｙ，Ｚ，ｎ、及びＡは先に式（Ｉ）のために定義したものと同じであり；
Ｒ7は、中性pHにおいて正電荷をもつ基であり；
Ｗは、任意的リンカーであり；
Ｖは、Ｑのために先に記載したものと同じであるが、節構造であってもよく；そして
Ｒ8とＲ9は、Ｒ4，Ｒ5とＲ6のために定義したものと同じであるが、環構造をさらに含むか、又はＲ8とＲ9は連結して、当該環構造を形成する。｝を有する。
【００１０】
さらに、本発明の化合物は、式中Ａがトリアジン環に直接又は間接的に連結された官能基により置換され、支持マトリックス上に固定化されうる、対応のリガンドを含む。用語「リガンド」と「吸着剤」は、以下、互換使用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の説明
ＷＯ９７／１０８８７，ＷＯ００／６７９００、及びＷＯ０３／０９７１１２は、リガンドのコンビナトリアル・ライブラリーが固体支持体上でどのようにして構築されうるかということを開示する。本発明に共通する態様及び手順の例を含むそれらの開示を、本明細書中に援用する。供給原料としてプールされたヒト血漿を用いてこれらのコンビナトリアル・ライブラリーのセットをスクリーニングする間、ヒトｖＷＦ／ＦVIIIに選択的に結合し、かつ、これを溶出することができるものとして多数のリガンドが同定された。
【００１２】
本発明において使用される式（II）の化合物は、当業者に知られた手順により調製されうる。これらの手順は、前記した３つのＰＣＴ公開公報中に記載され；それらは、新規化合物の調製のために容易に改作されうる。
【００１３】
ＷＯ９７／１０８８７は、それを介してトリアジン環が固体支持体Ｍに連結されうるところのスペーサー又はリンカーＬを含むＡの実施例を与える。ＷＯ９７／１０８８７中に記載されるように、このような支持体は、アガロース、セファロース、シリカ、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナン、合成ポリマー、ガラス、及び金属酸化物を含む。このような材料は、反応前に活性化されて、本発明の吸着剤が形成される。
【００１４】
Ｌは、例えば、−Ｔ−（−Ｖ1−Ｖ2）m−であることができ、ここで
ＴはＯ，Ｓ又は−ＮＲ7−であり；
ｍは０又は１であり；
Ｖ1は２〜２０個のＣ原子の場合により置換された炭化水素基であり；そして
Ｖ2はＯ，Ｓ，−ＣＯＯ−，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−，−ＰＯ3Ｈ−，−ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−又は−ＮＲ8−であり；そして
Ｒ7とＲ8は各々独立にＨ又はＣ1-6アルキルである。
【００１５】
本発明の化合物においては、Ｒ7は、好ましくは、第二、又はより好ましくは、第三アミンであり、例えば、式ＮＲ10Ｒ11｛式中、Ｒ10とＲ11は各々独立にＣ1-6アルキル（例えば、メチル）である。｝を有し、又はＮＲ8Ｒ9は、環を形成し、又はＲ10とＲ11の内の１つは、リンカーＷ内の原子と一緒になって環を形成する。リンカーＷは、アルキル、芳香族又はアラルキル・リンカーであることができ、例えば、２〜７、好ましくは３〜４個の鎖原子をもち、それら自身、例えば、ＯＨ基で置換されうる。
【００１６】
他の「腕」、すなわち、Ｚ−Ｂ−Ｄの性質は、決定的ではない。
【００１７】
本発明の好ましい態様においては、ｖＷＦ／ＦVIII結合性吸着剤は、以下の構造III：
【化３】
2008543738.tif 000005
により表される。
【００１８】
本発明のさらに好ましい態様においては、ｖＷＦ／ＦVIII結合性吸着剤は、（生理学的pHにおいてプロトン化される）以下の構造IV：
【化４】
2008543738.tif 000006
により表される。
【００１９】
本発明の最も好ましい態様においては、ｖＷＦ／ＦVIII結合性吸着剤は、以下の構造Ｖ：
【化５】
2008543738.tif 000007
により表される。
【００２０】
本明細書中に記載するｖＷＦ／ＦVIII結合性リガンド及び吸着剤は、非制限的に、ヒト血漿及び組換え発酵上清を含む複雑な混合物からのｖＷＦ／ＦVIIIの精製に有用である。この有用性は、ヒトのプールされた血漿を用いたクロマトグラフィー実験により、実施例４において以下に証明される。
【００２１】
用語「ｖＷＦ／ＦVIII」は、ｖＷＦ／ＦVIII自体、及び例えば、本明細書中に記載される所定の化合物に対するアフィニティーの点で、ｖＷＦ／ＦVIIIの機能特性をもつアナログを記載するために使用される。したがって、アナライトは、ｖＷＦ／ＦVIIIの機能的断片であるタンパク質、又は同一結合部位の全ての内の１以上をもつ構造アナログ、又は融合タンパク質でありうる。
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００２２】
ジクロロトリアジニル−（Ｒ）−１−（３−メトキシフェニル）−エチルアミンの合成
アセトン（３５mL）中に溶解した塩化シアヌール酸（５．０ｇ）を０℃に冷却し、その後、アセトン（５０ml）中に溶解した（Ｒ）−１−（３−メトキシフェニル）エチルアミン（４．１ｇ）を冷却しながら３０分間にわたり滴下して添加して、その温度が５℃を上廻らないようにした。次いで、１０Ｍ水酸化ナトリウム（２．７１mL）をゆっくりと添加した。４５分後、反応混合物を撹拌しながら氷水（２０ｇ）に添加した。油状生成物をジクロロメタン（１５０mL）中に抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして蒸発させて黄色油（７．９６ｇ）として生成物を得た。
【００２３】
実施例１−吸着剤Ｖの合成
アミノ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（水中沈殿４７５ｇ−１６μmol／ｇ置換）に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４７５mL）を添加した。ジイソプロピルエチルアミン（４．３７mL）を添加し、混合物を１５分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（２５０mL）中に溶解したジクロロトリアジニル−（Ｒ）−１−（３−メトキシフェニル）−エチルアミン（７．５７ｇ）を反応混合物に添加した。この混合物を３時間にわたり撹拌し、その後、ゲルを、７０％水性ＤＭＦ（４×５００mL）、５０％水性ＤＭＦ（２×５００mL）、及び水（１１×５００mL）で洗浄した。水（７５mL）中にスラリー化した上記材料１５０ｇを、６０℃で水（７５mL）中Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（３．８mL）の溶液に分割して添加した。添加後、混合物を６０℃に温め、そして１９時間にわたりこの温度で撹拌した。次いで、ゲルを濾過し、そして水（１２×１５０mL）で洗浄し、その後、２０％水性エタノール保存液中で保存した。
【００２４】
実施例２−吸着剤IIIの合成
実施例２（１５０ｇ沈殿）からの中間体ゲル生成物を、水（７５mL）中にスラリー化し、そして６０℃における水（７５mL）中の２−（２−アミノエチル）−１−メチルピロリジン（３．５mL）の溶液に分割して添加した。添加後、混合物を再び６０℃に温め、そして１９時間にわたりこの温度で撹拌した。次いで、このゲルを濾過し、そして水（１２×１５０mL）で洗浄し、その後、２０％水性エタノール保存液中で保存した。
【００２５】
実施例３−吸着剤IVの合成
アミノ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（水中沈殿１００ｇ−１６μmol／ｇ置換）を、１Ｍリン酸カリウムpH７．０（１００mL）中に懸濁し、次いで排水した。その後このゲルに、１Ｍリン酸カリウムpH７．０（２５mL）、及びＲＯ水（２５０mL）を添加した。このスラリーを激しく撹拌し、同時にアセトン（５０mL）を添加した。３０分間にわたり氷／塩浴内で冷却した後、冷アセトン（２５mL）中塩化シアヌール酸（２．５ｇ）を一部で添加した。この混合物を１時間にわたり０℃で撹拌し、その後、５０％水性アセトン（５×１００mL）、ＲＯ水（５×１００mL）、５０％水性アセトン（５×１００mL）、及びＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄した。この沈殿ゲルをその後、４時間にわたり室温で、２−アミノブタノール（１ｇ）を含む５０％水性ＤＭＦ（１００mL）でスラリー化した。このスラリーを濾過し、次いで５０％水性ＤＭＦ（５×１００mL）及びＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄した。次いでこの沈殿ゲルを、４−アミノ−ａ−ジエチルアミノ−ｏ−クレゾールジヒドロクロリド（４．２ｇ）を含む５０％水性ＤＭＦ（１００mL）でスラリー化し、そして６０℃で一夜撹拌した。このスラリーを濾過し、その後、５０％水性ＤＭＦ（５×１００mL）とＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄した。このゲルを４０℃で３日間にわたり０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノールの最終濃度でインキュベートし、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２５％エタノール（５×１００mL）で洗浄し、その後ＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄した。最終洗浄液を重力下で放置して排水した後、１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１００mL）を添加し、そして混合物を３日間４０℃でインキュベートした。その後、ゲルを０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１００mL）で、次いでＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  pH７．０（３×１００mL）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×１００mL）で洗浄し、その後、２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００２６】
実施例４−吸着剤Ｖを用いたヒト血漿に対するクロマトグラフィーの例
低圧クロマトグラフィー・システム（Ｋｉｐｐ  ＆  Ｚｏｎｅｎ平床チャート−レコーダー、Ｇｉｌｓｏｎミニプラス３蠕動ポンプ、及びＧｉｌｓｏｎ  ＵＶ検出器）を用いた２０mLカラム容量をもつ１．６cm直径ＸＫ１６／２０カラムを用いて、クロマトグラフィー実験を実施した。カラムを、８０cm／時間において、２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０mMクエン酸ナトリウム、１４０mM塩化ナトリウムpH７．５の５カラム容量で平衡化した。ヒト起源血漿を、２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１００mM塩化ナトリウム（最終濃度）で処理した。処理した血漿２００mLを１０μｍで濾過し、次いで、８０cm／時間でロードした。ロード後洗浄を２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０mMクエン酸ナトリウム、及び１４０mM塩化ナトリウムpH７．５で行い、ベースライン吸光度までもっていった。次いでこのカラムを２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０mMクエン酸ナトリウム、３mM  ＣａＣｌ2、３０％エチレングリコール、及び５００mM塩化ナトリウム、及び０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０  pH７．５で溶出した。溶出後、カラムを８Ｍ尿素pH７．０で殺菌洗浄した。その後、カラムを０．５Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄した。ロード、非結合、及び溶出フラクションを、比濁計、ｖＷＦ  ＥＬＩＳＡ、及び第VIII因子発色活性アッセイにより分析して回収率を測定した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥも実施して純度を調べた。
回収率を以下の表１に報告する。
【００２７】
【表１】
2008543738.tif 000008
【００２８】
第VIII因子の結果は、発色活性アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘにより供給されたＣＯＡＴＥＳＴ  VIII：Ｃ／４）により測定された。結果は、国際単位（IU）で表され、ここで、正常ヒト血漿は、１mL当り１国際単位の第VIII因子活性を含有する。
ｖＷＦ結果はＥＬＩＳＡにより測定された。
【国際調査報告】
2008543738.tif 000010
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2008543738.tif 000012