(57)【要約】本発明は、ホスホペプチドで安定化した非晶質リン酸カルシウムおよび／または非晶質フッ化リン酸カルシウム複合体に関し、この複合体はｐＨ７．０未満で形成される。このような複合体の生成方法も提供される。この複合体は、歯科用途、特に歯の再石灰化に有用である。好ましくは、この複合体は、約５．０〜最大７．０未満の範囲のｐＨで形成される。より好ましくは、この複合体は、約５．０〜約６．０のｐＨ範囲で形成される。好ましい実施形態では、この複合体は、ｐＨ約５．５で形成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホペプチドで安定化した非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）または非晶質フッ化カルシウム（ＡＣＦＰ）複合体であって、該複合体は、ｐＨ７．０以下で形成され、該ＡＣＰまたはＡＣＦＰが主に塩基形態である、複合体。
【請求項２】
前記ホスホペプチドが、配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを含み、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが独立に、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
歯科用途に適する、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ホスホペプチドが、配列Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを含み、Ｓｅｒ（Ｐ）がホスホセリンであり、Ｇｌｕがグルタミン酸である、請求項２に記載の複合体。
【請求項５】
前記ホスホペプチドが、カゼインホスホペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記カゼインホスホペプチドが、酵素加水分解または化学的加水分解によって全長カゼインタンパク質から単離される、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記カゼインホスホペプチドが、αＳ１（５９−７９）、β（１−２５）、αＳ２（４６−７０）およびαＳ２（１−２１）からなる群から選択される、請求項５または６に記載の複合体。
【請求項８】
ｐＨ約５．０〜最大７．０未満の範囲で形成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
ｐＨ約５．０〜約６．０の範囲で形成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
ｐＨ約５．５で形成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨを約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオンおよび水酸化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、ホスホペプチドで安定化した非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）複合体の生成方法。
【請求項１２】
前記水酸化物イオンを、前記ホスホペプチド溶液中で滴定して、本質的に一定のｐＨに維持する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルシウムイオンおよびリン酸イオンを、絶えず混合しながら、かつホスホペプチド溶液中のリン酸カルシウム沈殿物の形成を回避する速度で、ホスホペプチド溶液中で滴定する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨ約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオンおよび水酸化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、ホスホペプチドで安定化した非晶質フッ化リン酸カルシウム（ＡＣＦＰ）複合体の生成方法。
【請求項１５】
前記水酸化物イオンを、前記ホスホペプチド溶液中で滴定して、本質的に一定のｐＨに維持する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記カルシウムイオンおよびリン酸イオンを、絶えず混合しながら、かつホスホペプチド溶液中のリン酸カルシウム沈殿物の形成を回避する速度で、ホスホペプチド溶液中で滴定する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスホペプチドが、配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを含み、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥが独立に、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホスホペプチドが、配列Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕを含み、Ｓｅｒ（Ｐ）がホスホセリンであり、Ｇｌｕがグルタミン酸である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ホスホペプチドが、カゼインホスホペプチドである、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記カゼインホスホペプチドが、酵素加水分解または化学的加水分解によって、全長カゼインタンパク質から単離される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を、そのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む、齲蝕の治療または予防方法。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を、そのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む、歯のエナメル質の再石灰化方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を、そのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む、歯石の治療または予防方法。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を、そのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む、象牙質知覚過敏症の治療または予防方法。
【請求項２５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体を、そのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む、歯の侵食／腐食の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホペプチドによって安定化した非晶質リン酸カルシウムおよび／または非晶質フッ化リン酸カルシウムに関する。本発明の複合体の生成方法、ならびに齲蝕、歯石、歯の侵食／腐食、および歯の過敏症の治療方法または予防方法が提供される。これらは、齲蝕ならびに他の歯科／医療用途（歯石防止、侵食／腐食防止、および歯の過敏症防止を含めた）の早い段階で再石灰化（修復）するため、歯の構造を保護するという抗齲蝕原性の特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
齲蝕は、通常、歯垢の歯原性バクテリアによって食物の糖発酵から産生される有機酸による、歯の硬組織の脱灰によって開始される。齲蝕は、依然として公衆衛生の主要な問題である。さらに、修復された歯の表面は、修復部辺縁周辺で、さらなる齲蝕を受けやすいことがある。ほとんどの先進国では、フッ化物を使用することによって齲蝕の罹患率が低下したが、この疾患は依然として公衆衛生の主要な問題である。歯の浸食／腐食は、食物由来の酸または逆流酸による歯のミネラル損失である。歯の過敏症は、保護用石灰化層であるセメント質の損失による露出した象牙質細管に起因するものであり、歯石は、歯の表面上の、リン酸カルシウムミネラルの望ましくない付着である。したがって、これらの症状、齲蝕、歯の侵食／腐食、歯の過敏症、および歯石はすべて、リン酸カルシウム濃度の不均衡である。
【０００３】
齲蝕、歯の侵食／腐食、および歯の過敏症は、安定型非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）または安定型非晶質フッ化リン酸カルシウム（ＡＣＦＰ）で、生物利用可能なカルシウムイオンおよびリン酸イオンを提供して、損失したリン酸カルシウムミネラルを置き換えることによって治療することができる。安定型ＡＣＰおよび安定型ＡＣＦＰは、歯石の表面と結合し、さらなる付着を防止または低減することもできる。したがって安定型ＡＣＰおよび安定型ＡＣＦＰは、口腔疾患および他の病状の予防および治療に主要な役割を果たすことができる。
【０００４】
カゼインは、ミセルの形態で乳中に存在し、半径約１００ｎｍのほぼ球形の粒子であり、水、塩、ラクトース、および乳漿タンパク質の連続相中に分散していると考えられている（非特許文献１）。カゼインミセルは、骨および歯の形成のための、生物利用可能なカルシウムイオンおよびリン酸イオンの供給源を提供する、リン酸カルシウムの担体として働く。カルシウムイオンおよびリン酸イオンを可溶性の状態および生物利用可能な状態に維持するカゼインミセルの能力は、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）として周知の、カゼインの多重リン酸化ペプチド画分によって保持される。メルボルン大学の特許文献１には、アルカリ性ｐＨで生成されたカゼインホスホペプチド−非晶質リン酸カルシウム複合体（ＣＰＰ−ＡＣＰ）およびＣＰＰで安定化した非晶質フッ化リン酸カルシウム複合体（ＣＰＰ−ＡＣＦＰ）が記載されている。このような複合体は、動物およびヒトのインサイチュ齲蝕モデルにおいて、エナメル質の脱灰を防止し、エナメル質表層下の病変の再石灰化を促進することが示されている（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，１９９８）。
【０００５】
複合体の形成に活性であるＣＰＰは、全長カゼインタンパク質の一部分であろうとなかろうと、複合体を形成する。全長カゼインのトリプシン消化によって単離することができる活性（ＣＰＰ）の具体例は、既に特許文献２に明記されており、以下のペプチド、Ｂｏｓ  αｓ１−カゼインＸ−５Ｐ（ｆ５９−７９）［１］、Ｂｏｓ  β−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ１−２５）［２］、Ｂｏｓ  αｓ２−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ４６−７０）［３］およびＢｏｓ  αｓ２−カゼインＸ−４Ｐ（ｆ１−２１）［４］を含む。
【０００６】
【化１】
2008521754.tif 000002
今や、ペプチドで安定化した、ＡＣＰおよびＡＣＦＰの可溶性塩基形態は、ｐＨ７．０未満の媒体中でも生成できることが見出されている。このような複合体は、歯のエナメル質表層下の病変を再石灰化する、驚くべき活性レベルを示す。
【特許文献１】国際公開第９８／４０４０６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５，０１５，６２８号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｇ．（１９８２）Ｄｅｖ．Ｄａｉｒｙ  Ｃｈｅｍ，１，６１−８６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語（またはその文法上の変形）は、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と等価であり、互換的に使用することができるが、他の要素または特徴の存在を排除するものと解釈されるべきではない。
【０００８】
発明の要旨
一態様では、本発明は、ホスホペプチド（ＰＰ）で安定化したＡＣＰまたはＡＣＦＰ複合体を提供し、この複合体は、ｐＨ７．０未満で形成される。好ましくは、この複合体は、約５．０〜最大７．０未満の範囲のｐＨで形成される。より好ましくは、この複合体は、約５．０〜約６．０のｐＨ範囲で形成される。好ましい実施形態では、この複合体は、ｐＨ約５．５で形成される。好ましい実施形態では、この複合体は歯科用途に適している。好ましい別の一実施形態では、この複合体は、再石灰化を促進するための、歯および／または歯肉への適用に適している。
【０００９】
「〜のｐＨ（ｐＨ〜）で形成される」という用語は、複合体がその中で形成される媒体が、規定値の全体的なｐＨを有することを意味する。媒体内の局在的ｐＨ値は、例えば、形成する複合体の周囲の微環境で変わり得る。換言すれば、本発明の目的のための関連ｐＨ値は、総じて媒体の測定可能なｐＨである。
【００１０】
ＡＣＰ相は、好ましくは主に塩基相であり、ＡＣＰは、主にＣａ２＋、ＰＯ４３−、およびＯＨ−種を含む。ＡＣＰの塩基相は、一般式［Ｃａ３（ＰＯ４）２］ｘ［Ｃａ２（ＰＯ４）（ＯＨ）］であり、ｘ≧１である。
【００１１】
ＡＣＦＰ相は、好ましくは主に塩基相であり、ＡＣＦＰは、主にＣａ２＋、ＰＯ４３−、およびＦ−種を含む。ＡＣＦＰの塩基相は、一般式［Ｃａ３（ＰＯ４）２］ｘ［Ｃａ２（ＰＯ４）Ｆ］ｙであり、ｙ＝１のときｘ≧１であり、ｘ＝１のときｙ≧１である。
【００１２】
本発明のＰＰで安定化したＡＣＰ複合体中のＡＣＰは、構造的に、ＡＣＦＰ中のフッ化物アニオンの代わりに水酸化物アニオンを含有すると考えられている。
【００１３】
本発明の説明の文脈における「ホスホペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸がリン酸化されるアミノ酸配列を意味する。配列内の少なくとも２つのホスホアミノ酸は、好ましくは隣接している。ホスホペプチドは、好ましくは配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを含み、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立に、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ホスホヒスチジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸であり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥのうち少なくとも２つ、好ましくは３つがホスホアミノ酸である。一実施形態では、ホスホアミノ酸残基はホスホセリンであり、例えば３つの隣接したホスホセリン残基である。好ましい実施形態では、ホスホペプチドは、３つの隣接したホスホセリン残基に続く２つのグルタミン酸残基を、Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｓｅｒ（Ｐ）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ただし、Ｓｅｒ（Ｐ）はホスホセリンであり、Ｇｌｕはグルタミン酸である）で表わされる配列として含む。
【００１４】
一実施形態では、ＰＰは、そのままのカゼインまたはカゼイン画分であるカゼインホスホペプチドである。したがって、ＰＰは、カゼインリンタンパク質またはポリホスホペプチドでもよい。形成される複合体は、式［ＣＰＰ（ＡＣＰ）８］ｎまたは［（ＣＰＰ）（ＡＣＦＰ）８］ｎを有することができ、ｎは１以上、例えば６である。形成される複合体は、コロイド状の複合体でもよく、そのコア粒子は凝集して、水に懸濁するコロイド小粒子（例えば約２〜５ｎｍ）およびコロイド大粒子（例えば約１００ｎｍ）を形成する。
【００１５】
ＰＰは、どんな供給源由来のものでもよく、全長のカゼインポリペプチドを含む、より大きいポリペプチドの状態（ｃｏｎｔｅｘｔ）で存在してもよく、あるいは、カゼインもしくはホスフィチンなどのホスホアミノ酸に富む他のタンパク質のトリプシン消化もしくは他の酵素消化によって、または化学的加水分解（例えばアルカリまたは酸による）によって、あるいは先に定義したように配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅを含むならば、化学的合成または組み換え合成によって単離してもよい。このコア配列のフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列は、どんな配列でもよい。しかし、αＳ１（５９−７９）［１］、β（１−２５）［２］、αＳ２（４６−７０）［３］およびαＳ２（１−２１）［４］のフランキング配列が好ましい。フランキング配列は、場合によっては、１つまたは複数の残基の欠失、付加、または同類置換によって修飾することができる。フランキング領域のアミノ酸組成および配列は、重要ではない。
【００１６】
好ましい実施形態では、ＰＰは、αＳ１（５９−７９）［１］、β（１−２５）［２］、αＳ２（４６−７０）［３］およびαＳ２（１−２１）［４］からなる群から選択される、１つまたは複数のカゼインホスホペプチドである。
【００１７】
いかなる理論または作用の態様にも拘泥するものではないが、ＰＰは、ＡＣＰまたはＡＣＦＰクラスターに結合して、溶液中に存在する準安定な複合体を生成すると考えられている。この結合は、リン酸カルシウムの核生成および沈降を開始する寸法へとＡＣＰまたはＡＣＦＰが成長するのを阻害すると考えられている。このように、カルシウムイオンおよびフッ化物イオンなどの他のイオンは、例えば歯の表面で脱灰を防止し、齲蝕の形成を防止するために局在化することができる。したがって、これによって、歯を再石灰化することができる生物利用可能な形態で、非晶質リン酸カルシウムを送達する機構が提供されると考えられている。
【００１８】
さらなる実施形態では、本発明は、上記のように、安定なＡＣＦＰ複合体または安定なＡＣＰ複合体を提供し、この複合体は、これらに限定されるものではないが、カルシウムイオン、フッ化物イオン、およびリン酸イオンを含めたイオンを共局在化する送達ビヒクルとして、標的部位で作用する。好ましい実施形態では、複合体は、齲蝕防止（ａｎｔｉ−ｃａｒｉｅｓ）、侵食／腐食防止、歯石防止、および歯の過敏症防止の優れた効果をもたらす非晶質形態のリン酸カルシウムを含む。標的部位は、好ましくは歯または骨である。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ホスホペプチドで安定化した非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）または非晶質フッ化カルシウム（ＡＣＦＰ）複合体を提供し、この複合体はｐＨ７．０以下で形成され、ＡＣＰまたはＡＣＦＰは主に塩基形態である。
【００２０】
錯誤回避のために、本発明のホスホペプチドで安定化したＡＣＰまたはＡＣＦＰ複合体は、ＷＯ９８／４０４０６に記載のように、ｐＨ７．０超で形成される複合体を排除する。
【００２１】
複合体は、水分子を含有するものの、カルシウムイオン、フッ化物イオンおよび水酸化物イオン以外のイオンを好ましくは実質的に含まない。複合体はまた、好ましくはＰＰで配合され、それによって水に可溶性となる。本発明のコンテキストでは、「可溶性」という用語はまた、複合体もコロイド分散液中に存在していると説明される状況を含む。
【００２２】
一実施形態では、ＡＣＰ複合体は、本質的にＰＰ、リン酸カルシウムイオンおよび水酸化物イオン、ならびに水から構成される。
【００２３】
一実施形態では、ＡＣＦＰ複合体は、本質的にＰＰ、リン酸カルシウムイオン、フッ化物イオンおよび水酸化物イオン、ならびに水から構成される。
【００２４】
さらなる態様では、本発明はまた、
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨを約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオンおよび水酸化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、上記の安定なＡＣＰ複合体の生成方法を提供する。
【００２５】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、水酸化物イオンを溶液中で滴定して、ホスホペプチド溶液を実質的には一定のｐＨに維持する。別の好ましい実施形態では、カルシウムイオンおよびリン酸イオンを、絶えず混合しながら、かつホスホペプチド溶液中のリン酸カルシウム沈殿物の形成を回避する速度で、ホスホペプチド溶液中で滴定する。
【００２６】
さらなる態様では、本発明はまた、
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨを約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオン、水酸化物イオンおよびフッ化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、前述の安定なＡＣＦＰ複合体の生成方法を提供する。
【００２７】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、水酸化物イオンを溶液中で滴定して、ホスホペプチド溶液を実質的には一定のｐＨに維持する。別の好ましい実施形態では、リン酸カルシウムイオンおよびフッ化物イオンを、絶えず混合しながら、かつホスホペプチド溶液中のリン酸カルシウム沈殿物の形成を回避する速度で、ホスホペプチド溶液中で滴定する。
【００２８】
ｐＨは、所望により、水素イオン（酸）または水酸化物イオン（塩基）を添加することによって調節することができる。
【００２９】
複合体自体を攻撃しない水素イオンの供給源ならば、生理学的に相溶性のあるまたは許容されるどんな酸を使用してもよい。一般には、塩酸が使用される。ｐＨを調節し、そうでなければ複合体を形成するために必要とされる水酸化物イオンを供給するために、生理学的に許容される任意の塩基、例えばＮａＯＨを、水酸化物イオンの供給源として使用することができる。使用される厳密な酸および塩基は、上記に対して重要な問題であるとは考えられていない。
【００３０】
好ましい実施形態では、高濃度のカルシウムイオンおよびリン酸イオン（例えば、３Ｍカルシウムイオンおよび１Ｍリン酸イオン）を、本発明の安定なＡＣＰ複合体の生成方法または安定なＡＣＦＰ複合体の生成方法で使用されるホスホペプチド溶液中で滴定する。好ましくは、カルシウムイオンおよびリン酸イオンの溶液は、アリコート（例えば、１分当たり約１体積％）で、混合しながら非常にゆっくり添加される。好ましい実施形態では、カルシウムイオン溶液のアリコートの前に、リン酸イオン溶液のアリコートを添加する。水酸化物イオンは、好ましくは連続的に添加される。好ましい実施形態では、カルシウムイオンの各添加後に、水酸化物イオンが添加される。
【００３１】
本発明のさらなる態様では、
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨを約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオンおよび水酸化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、ホスホペプチドで安定化した非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）複合体の生成方法が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる態様では、
（ｉ）少なくとも１種のホスホペプチドを含む溶液を得るステップと、
（ｉｉ）ｐＨを約７．０以下に維持しながら、カルシウムイオン、リン酸イオンおよび水酸化物イオンを含む溶液を混合するステップと
を含む、ホスホペプチドで安定化した非晶質フッ化リン酸カルシウム（ＡＣＦＰ）複合体の生成方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様では、ホスホペプチドで安定化したＡＣＰまたはＡＣＦＰ複合体を含む配合物が提供され、その配合物のｐＨは、７．０未満である。一実施形態では、配合物のｐＨは、約ｐＨ５．０〜最大ｐＨ７．０未満である。好ましくは、配合物のｐＨは、約ｐＨ５．０〜約６．０である。好ましい実施形態では、配合物のｐＨは、約５．５である。
【００３４】
したがって、ホスホペプチドで安定化したＡＣＰまたはＡＣＦＰ複合体は、ｐＨ約７．０未満で形成し、その後異なるｐＨ、好ましくはｐＨ４〜１０の環境に置くことができる。一実施形態では、そのｐＨは、４．５〜６．５、より好ましくは、５〜６、最も好ましくは約５．５である。
【００３５】
本発明の複合体は、骨の成長刺激を必要とする対象、例えば、骨折修復、関節置換術、骨移植術、または頭蓋顔面外科手術を受ける対象におけるカルシウム補給として有用である。これらの複合体は、食物不耐、アレルギー、あるいは宗教的または文化的要因などの何らかの理由により、食物カルシウム必要量を供給するのに十分な量の乳製品を消費することができない、またはそれを不本意とする対象における食物補給としても有用である。
【００３６】
本発明の実施形態を以下に記載するが、その複合体用の環境は以下に例示されるように、ある特定の目的の配合物であってよい。この環境のｐＨは、当初複合体が形成されたｐＨに関わらず、形成された複合体の安定性をもたらす最適な効果のために、先に設定したように調節することができる。
【００３７】
一実施形態では、上記のように、望ましくは薬剤として許容される担体として複合体を歯に適用することを含む、歯を再石灰化する方法が提供される。複合体は、ＡＣＰ、ＡＣＦＰ、またはその両方を含有することができる。この方法は、好ましくは治療を必要とする対象に適用される。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態では、安定なＡＣＦＰまたはＡＣＰ複合体は、齲蝕もしくは虫歯の予防および／または治療を助けるための、練り歯磨き、洗口剤、あるいは口腔用配合物などの経口組成物中に組み込まれる。ＡＣＦＰまたはＡＣＰ複合体は、組成物の０．０１〜５０重量％、好ましくは１．０〜５０％を構成することができる。経口組成物では、投与されるＰＰ−ＡＣＰおよび／またはＰＰ−ＡＣＦＰの量は、組成物の０．０１〜５０重量％、好ましくは１．０％〜５０重量％であることが好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明の経口組成物は、約２％のＰＰ−ＡＣＰ、ＰＰ−ＡＣＦＰ、またはその両方の混合物を含有する。上記の薬剤を含有する本発明の経口組成物は、練り歯磨き、歯磨き粉、および液体歯磨剤を含めた歯磨剤、洗口剤、トローチ、チューインガム、歯科用軟膏剤、歯肉マッサージクリーム、うがい用錠剤、乳製品ならびに他の食料品など、口腔に適用できる様々な形態で調製し、使用することができる。本発明の経口組成物は、さらに、特定の経口組成物のタイプおよび形態に応じて、周知の追加成分を含むことができる。
【００３９】
本発明の特定の好ましい形態では、経口組成物は、うがい剤または洗浄剤など、実質的に液体の特徴のものでよい。このような調製物では、ビヒクルは一般に、望ましくは下記の湿潤剤を含む水−アルコール混合物である。一般に、水とアルコールの重量比は、約１：１〜約２０：１の範囲である。このタイプの調製物における水−アルコール混合物の総量は、一般に、調製物の約７０〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは、一般に、エタノールまたはイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【００４０】
本発明のこのような液体調製物および他の調製物のｐＨは、一般に約５〜約９、典型的には約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨは、酸（例えばクエン酸または安息香酸）または塩基（例えば水酸化ナトリウム）で、あるいは緩衝化して（クエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等と同様）制御することができる。
【００４１】
一実施形態では、本発明の経口組成物は、ｐＨ約５．５であり、安定なＡＣＰまたはＡＣＦＰを含有する。
【００４２】
本発明の他の望ましい形態では、経口組成物は、歯磨き粉、歯科用錠剤、または練り歯磨き（歯科用クリーム）、あるいはゲル状歯磨剤など、実質的に固体またはペースト状の特徴のものでよい。このような固体またはペースト状の経口調製物の担体は、一般に歯科用として許容される研磨剤を含有する。研磨剤の具体例は、非水溶性のメタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム二水和物、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム、アルミナ水和物、焼成アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、シリカ、ベントナイト、およびそれらの混合物である。他の適切な研磨剤には、メラミン−、フェノール−、および尿素−ホルムアルデヒド、ならびに架橋ポリエポキシドおよびポリエステルなどの微粒子の熱硬化性樹脂が含まれる。好ましい研磨剤には、粒径が最大約５ミクロン、平均粒径が最大約１．１ミクロン、および表面積が最大約５０，０００ｃｍ２／ｇである結晶シリカ、シリカゲルまたはコロイド状シリカ、ならびに非晶質アルミノケイ酸アルカリ金属複合体が含まれる。
【００４３】
視覚的に透明なゲルを使用する場合には、商標ＳＹＬＯＤでＳｙｌｏｉｄ  ７１およびＳｙｌｏｉｄ  ７４として、または商標ＳＡＮＴＯＣＥＬでＳａｎｔｏｃｅｌ  １００として販売されているもの、アルミノケイ酸アルカリ金属複合体などのコロイド状シリカの研磨剤が特に有用である。それらは一般に、歯磨剤内に使用するゲル化剤−液体（水および／または湿潤剤を含む）系の屈折率に近い屈折率を有するからである。
【００４４】
いわゆる「非水溶性」の研磨剤の多くは、アニオン性の特徴を有し、また少量の可溶性材料を含む。したがって不溶性メタリン酸ナトリウムは、例えばＴｈｏｒｐｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ９，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．５１０−５１１に示されるような、任意の適切な方法で形成することができる。マドレル（Ｍａｄｒｅｌｌ’ｓ）塩およびクロール（Ｋｕｒｒｏｌ’ｓ）塩として周知の不溶性メタリン酸ナトリウムの形態は、適切な材料のさらなる具体例である。これらのメタリン酸塩は、水にわずかに溶解するに過ぎず、したがって一般に、不溶性メタリン酸（ＩＭＰ）と呼ばれる。この中には、少量の可溶性リン酸塩材料が、通常は最大４重量％といった数パーセントの不純物として存在している。可溶性リン酸塩材料の量は、不溶性メタリン酸塩の場合には、可溶性トリメタン酸ナトリウムを含むと考えられているが、所望により水洗によって減少または排除することができる。不溶性メタリン酸アルカリ金属は、一般に、材料の１％以下が３７ミクロンを超える粒径の粉末形態で使用される。
【００４５】
研磨材料は一般に、固体またはペースト状の組成物中に約１０％〜約９０％の重量濃度で存在する。好ましくは、練り歯磨き中に約１０％〜約７５％、歯磨き粉中に約７０％〜約９９％の量で存在する。練り歯磨きは、研磨剤がシリカの性質である場合には、一般に、約１０〜３０重量％の量で存在する。他の研磨剤は、一般に、約３０〜７５重量％の量で存在する。
【００４６】
練り歯磨きでは、液体賦形剤は、調製物中に約１０〜約８０重量％の範囲の量の水および湿潤剤を含むことができる。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトールおよびポリプロピレングリコールは、適切な湿潤剤／担体の具体例である。水、グリセリンおよびソルビトールの液体混合物も有利である。屈折率が重要視される透明ゲルでは、好ましくは水２．５〜３０％ｗ／ｗ、グリセリン０〜約７０％ｗ／ｗ、およびソルビトール約２０〜８０％ｗ／ｗが使用される。
【００４７】
練り歯磨き、クリーム、およびゲルは、一般に、約０．１〜約１０、好ましくは約０．５〜約５％ｗ／ｗの割合で、天然または合成増粘剤またはゲル化剤を含有する。適切な増粘剤は、例えばＬａｐｏｒｔｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ．製のＬａｐｏｎｉｔｅ（例えば、ＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として利用可能な合成ヘクトライト、合成コロイド状のアルカリ金属ケイ酸マグネシウム複合体クレイである。Ｌａｐｏｎｉｔｅ  Ｄは、およそ、ＳｉＯ２  ５８．００重量％、ＭｇＯ  ２５．４０重量％、Ｎａ２Ｏ  ３．０５重量％、Ｌｉ２Ｏ  ０．９８重量％ならびに少量の水および微量金属となっている。その真比重は２．５３であり、湿度８％での見かけのバルク密度は１．０ｇ／ｍｌである。
【００４８】
他の適切な増粘剤には、アイリッシュモス、イオタカラゲナン、ガムトラガカント、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、Ｎａｔｒｏｓｏｌとして利用可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および微砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）などのコロイド状シリカが含まれる。プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、およびへキシレングリコールなどの湿潤性ポリオール、メチルセロソルブおよびエチルセロソルブなどのセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油、および石油など、直鎖中に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油およびワックス、ならびに酢酸アミル、酢酸エチル、および安息香酸ベンジルなどのエステルといった可溶化剤を含めることもできる。
【００４９】
経口調製物は、従来と同じく販売されているものであり、またはその他の方法でラベルを付した適切なパッケージとして流通しているものであることを理解されたい。したがって、口内洗浄剤の瓶は、実質的に口内洗浄剤またはうがい剤と記載され、その使用指示を記したラベルを有するものであり、練り歯磨き、クリーム、またはゲルは、通常、実質的に練り歯磨き、ゲル、または歯科用クリームと記載されたラベルを有する、一般にはアルミニウム、裏打ち鉛、またはプラスチックの押し出しチューブ、あるいは内容量を測量するための他のスクイーズ、ポンプ、または加圧ディスペンサに入れられることになる。
【００５０】
有機界面活性剤は、予防作用を高めるために本発明の組成物に使用することができ、有効な薬剤を口腔全体に完全に分散させるのを助け、本発明の組成物を、より化粧品として許容されるものにする。有機界面活性剤は、好ましくはアニオン性、非イオン性または両性の性質であり、好ましくは有効な薬剤と相互作用しない。界面活性剤として、組成物に洗浄特性および発泡特性を付与する洗浄材料を使用することが好ましい。アニオン性界面活性剤の適切な具体例は、硬化ヤシ油脂肪酸のモノ硫酸化モノグリセリドのナトリウム塩などの高級脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸、ラウリル硫酸ナトリウムなどの高級アルキル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルアリールスルホン酸塩、高級アルキルスルホ酢酸、１，２−ジヒドロキシプロパンスルホン酸エステルなどの高級脂肪酸エステル、ならびに脂肪酸、アルキル基、またはアシル基中に１２〜１６個の炭素を有するものなどの、低級脂肪酸アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和の高級脂肪酸アシルアミド等である。前記アミドの具体例は、石鹸または類似の高度脂肪酸材料を実質的に含まない、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ならびにＮ−ラウロイル、Ｎ−ミリストイル、またはＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウム、およびエタノールアミン塩である。これらのサルコナイト化合物を本発明の経口組成物に使用することは、特に有利である。というのは、これらの材料は、酸性溶液における歯のエナメル質の可溶性をいくらか低減させることに加えて、口腔内の炭水化物分解による酸形成の阻害において、顕著な効果を延長するからである。使用に適した水溶性の非イオン性界面活性剤の具体例は、エチレンオキシドと、疎水性長鎖（例えば、約１２〜２０個の炭素原子の脂肪族鎖）を有する様々な反応性水素含有化合物との濃縮生成物であり、それらの濃縮生成物（「エトキサマー（ｅｔｈｏｘａｍｅｒｓ）」）は、ポリ（エチレンオキシド）と、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸アミド、多価アルコール（例えば、ソルビタンモノステアラート）、およびポリプロピレンオキシド（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ材料）との濃縮生成物など、親水性ポリオキシエチレン部分を含有するものである。
【００５１】
界面活性剤は、一般に、約０．１〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が本発明の有効な薬剤を溶解する助けとなり、それによって可溶化湿潤剤の必要量を低減できるということは、注目に値するものである。
【００５２】
増白剤、保存剤、シリコーン、クロロフィル化合物、ならびに／あるいは尿素、リン酸二アンモニウム、およびそれらの混合物などのアンモニア処理した材料などの様々な他の材料を、本発明の経口調製物に組み込むことができる。これらの助剤が存在する場合には、所望の特性および特徴に実質的に悪影響を及ぼさない量で、調製物に組み込まれる。
【００５３】
任意の適切な矯味材料または甘味材料を使用することもできる。
【００５４】
適切な矯味用成分の具体例は、芳香油、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサフラス、クローブ、セージ、ユーカリ、マジョラム、シナモン、レモン、およびオレンジの油、ならびにサリチル酸メチルである。適切な甘味剤には、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル）、サッカリン等が含まれる。適切には、矯味剤および甘味剤は、それぞれまたは一緒に、調製物の約０．１％〜５％超を構成することができる。
【００５５】
本発明はまた、上記の組成物の使用を提供する。本発明の好ましい実施においては、本発明の組成物を含有するうがい剤または歯磨剤などの本発明の経口組成物は、好ましくは、歯肉および歯に、毎日もしくは２日置きまたは３日置き、あるいは好ましくは１日に１〜３回というように規則的に、好ましくは約４．５〜７．０の酸性のｐＨで、少なくとも２週間〜８週間まで、またはさらに最長では生涯施用される。一実施形態では、経口組成物のｐＨは、約５．０、５．５、６．０、６．５または７．０である。
【００５６】
本発明の組成物は、望ましくは通常の可塑剤または軟化剤、グルコース、ソルビトール等の糖類または他の甘味剤と共に、ロゼンジ、あるいはチューインガムまたは他の製品に、例えば温めたガムベースに攪拌することによって、あるいはガムベース、具体例としてはジェルトン、ゴムラテックス、ビニライト樹脂等の外面をコーティングすることによって、組み込むこともできる。
【００５７】
別の実施形態では、本発明の複合体は、好ましくは、食用品０．１〜１００％ｗ／ｗ、より好ましくは１〜５０％ｗ／ｗ、最も好ましくは１〜１０％、特に２％ｗ／ｗを含む栄養補助食品を形成するために配合される。この複合体は、食品に組み込むこともできる。
【００５８】
さらなる態様では、本発明は、上記のＡＣＦＰおよび／またはＡＣＰ複合体のいずれかを、薬剤として許容される担体と一緒に含む薬剤組成物を含む組成物を提供する。このような組成物は、歯科用の抗齲蝕原性組成物、治療組成物および栄養補助食品からなる群から選択することができる。歯科用組成物または治療組成物は、ゲル、液体、固体、粉末、クリームまたはロゼンジの形態でよい。治療組成物は、錠剤またはカプセル剤の形態でもよい。一実施形態では、ＡＣＰおよび／またはＡＣＦＰ複合体は、実質的には、このような組成物の唯一の再石灰化用の有効成分である。
【００５９】
本発明はさらに、齲蝕もしくは虫歯、歯の侵食／腐食、象牙質知覚過敏症、および歯石の任意の１種または複数を治療する、あるいは予防するための、使用指示と一緒に提供される前述の配合物を含む。
【００６０】
本発明のさらなる態様によれば、本発明のＡＣＦＰおよび／またはＡＣＰ複合体が添加された歯の修復材料を含む、歯の修復用組成物が提供される。歯の修復材料のベースは、グラスアイオノマーセメント、複合材料または相溶性のある任意の他の修復材料でよい。歯の修復材料に含まれるＣＰＰ−ＡＣＰ複合体またはＣＰＰ−ＡＣＦＰ複合体の量は、０．０１〜８０重量％、好ましくは０．５〜１０％、より好ましくは１〜５重量％であることが好ましい。前述の薬剤を含有する本発明の歯の修復材料は、歯科実務に適用できる様々な形態で調製し、使用することができる。本例の歯の修復材料はさらに、他のイオン、例えば抗菌イオンであるＺｎ２＋、Ａｇ＋等、あるいは特定の歯の修復材料のタイプおよび形態に応じて、他の追加成分を含むことができる。本実施形態による歯の修復材料のｐＨは、２〜１０、より好ましくは５〜９、さらにより好ましくは５〜７であることが好ましい。ＣＰＰ−ＡＣＰ複合体またはＡＣＦＰ複合体を含有する歯の修復材料のｐＨは、約２〜１０の範囲、より好ましくは約５〜９の範囲、さらに好ましくは約５〜７の範囲であることが好ましい。
【００６１】
本発明はまた、修復組成物の製造方法を対象とする。この方法は、好ましくは前述のＡＣＰおよび／またはＡＣＦＰ複合体を、ベースとなる歯の修復材料に添加することを含む。本発明はまた、齲蝕の治療および／または予防のための、前記修復組成物の使用に関する。
【００６２】
本発明はまた、（ａ）歯の修復材料および（ｂ）ＣＰＰ−ＡＣＰ複合体またはＣＰＰ−ＡＣＦＰ複合体を、歯の修復用の、前述の複合体を含有する組成物の調製に関する使用指示と一緒に含むパーツ一式に関する。
【００６３】
本発明はまた、（ａ）歯の修復材料、（ｂ）カゼインホスホペプチド、（ｃ）カルシウムイオンおよび（ｄ）リン酸イオン、および（ｅ）水酸化物イオン、ならびに場合によってはフッ化物イオンを、歯の修復用組成物の調製に関する使用指示と一緒に含むパーツ一式に関する。
【００６４】
さらなる態様では、齲蝕または虫歯、歯の侵食／腐食、象牙質知覚過敏症、および歯石のそれぞれの１種または複数の治療方法または予防方法が提供され、この方法は、本発明の複合体または組成物を、好ましくはこのような治療を必要とする対象の歯または歯肉に投与するステップを含む。複合体の局所投与が好ましい。この方法は、好ましくは、複合体を前述の配合物として投与することを含む。
【００６５】
本発明はまた、本発明の修復組成物または本発明に従って製造された歯の修復組成物を提供すること、ならびに治療および／または予防を必要とする動物の歯に適用することを含む、動物の齲蝕、歯の侵食／腐食、歯の過敏症および歯石の治療方法ならびに／あるいは予防方法を提供する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、身体、特に骨からのカルシウム損失、カルシウム欠乏、カルシウム吸収不良等に関係する１種または複数の症状の治療方法に関する。このような症状の具体例には、これらに限定されるものではないが、骨粗鬆症および骨軟化症が含まれる。一般に、カルシウム生体利用性を高めることによって改善することができる任意の症状が企図される。
【００６７】
本明細書は、特にヒトへの適用に言及しているが、本発明は、獣医用の目的にも有用であることが明確に理解されよう。したがって、すべての態様において、本発明は、牛、羊、馬および家禽などの家畜、猫および犬などのペット、ならびに動物園の動物に有用である。
【００６８】
ここで本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
ＣＰＰ−ＡＣＦＰおよびＣＰＰ−ＡＣＰ溶液の調製
３．２５ＭのＣａＣｌ２、１．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ＭのＮａＯＨおよび１ＭのＮａＦの保存溶液を、約３０アリコートで、カゼインのトリプシン消化物１０〜１５％ｗ／ｖに、最終濃度約７８ｍＭのＣａ２＋、４８ｍＭのリン酸塩および１２ｍＭのフッ化物の濃縮物が得られるまで添加した。溶液をゆっくり添加した（すなわち、１分当たり約１体積％未満を添加）。まず、リン酸溶液の１アリコートを添加し、次いでカルシウム溶液の１アリコートを添加した。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて十分に混合して、７．０、６．５、６．０、５．５および５．０に維持した。水酸化ナトリウム溶液を、通常はカルシウムイオンの各添加後に水酸化物イオンを添加し、ｐＨスタットによって自動的に添加した。カルシウムイオン、リン酸イオン、水酸化物イオンおよびフッ化物イオンの添加後、溶液を０．１ミクロンのフィルタで濾過して１〜２倍の濃度にした。濃縮水を、所望により水洗して、塩および不活性（かつ苦味）ペプチドを除去することができる。フッ化物の添加なしに、ＣＰＰ−ＡＣＰ溶液を、上記のように調製した。
【００７０】
各滴定および濾過が完了したら、各濃縮水のサンプルを取り、３０００分子量のカットオフＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３限外濾過膜を使用して、濾液として１０％未満を収集した。サンプルを含有するＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１遠心分離機中、ＪＡ１０．５ロータを使用して、１，０００ｇで１５分間、遠心分離にかけた。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離の前の元のサンプルおよびＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離後の濾液のサンプルを、カルシウム、リン酸およびフッ化物の濃度分析用に取っておいた。元のサンプルの分析によって、カルシウムイオン、リン酸イオンおよびフッ化物イオンの全濃度が得られ、濾液の分析によって、遊離（未結合）のカルシウム、リン酸およびフッ化物の濃度が得られた。全体の濃度および未結合の濃度の間の差は、ＣＰＰによるＣａ、Ｐｉ、およびＦの結合濃度であり、表１および表２に示されている。
【００７１】
本発明の一実施形態の第１の実例では、表１に示すように、２％ＣＰＰ−ＡＣＦＰの結合したカルシウム、リン酸およびフッ化物を、酸性ｐＨ値で調製した複合体として測定した。
【００７２】
【表１】
2008521754.tif 000003
本発明の一実施形態の第２の実例では、表２に示すように、２％ＣＰＰ−ＡＣＰの結合したカルシウムおよびリン酸塩を、酸性ｐＨ値で調製した複合体として測定した。
【００７３】
【表２】
2008521754.tif 000004
この実験の結果は、カゼインホスホペプチド（ＣＰＰ）によって安定化した非晶質リン酸カルシウムおよび非晶質フッ化リン酸カルシウムのナノ複合体またはナノクラスターが、酸性ｐＨで形成され、濾過ステップ後、高濃度での凝集により保持されることを示している。表１および２のカルシウムおよびリン酸塩およびフッ化物塩の結合比は、形成された複合体が、塩基性非晶質リン酸カルシウムおよび塩基性非晶質フッ化リン酸カルシウム（ＡＣＦＰ）を含有することを示している。塩基性ＡＣＰ相は、［Ｃａ３（ＰＯ４）２］Ｘ［Ｃａ２（ＰＯ４）（ＯＨ）］であり、すべてのｐＨ値に対してｘ＝１〜２である。塩基性ＡＣＦＰ相は、［Ｃａ３（ＰＯ４）２］Ｘ［Ｃａ２（ＰＯ４）Ｆ］ｙであり、ｘ＝１かつｙ＝１〜２（ｐＨ５．０）であり、ｙ＝１かつｘ＝１〜２（ｐＨ５．５〜７．０）である。また、酸性ｐＨで結合したカルシウムイオンおよびリン酸イオンの量は、形成ｐＨが約５．０の領域に低下するまで、比較的多いままであることがわかる。
【００７４】
いかなる理論または作用の態様にも拘泥するものではないが、複合体の形成は、好ましくは攪拌を伴ってＮａＯＨを添加するなど、規則的にＯＨアニオンを添加することによって、酸性ｐＨで実現することができ、その結果ＯＨアニオンとカルシウムイオンおよびリン酸（ＰＯ４３−）イオンとが、ＣＰＰによって安定化される塩基性ＡＣＰを十分に形成し、次いでさらなるＯＨ添加の際に、ＡＣＰをより多く形成するための反応を促進すると考えられる。さらに、ＡＣＦＰの場合には、Ｆによって複合体形成のためのより低いｐＨ環境が可能となり、表１から、多量のカルシウムが、所与の酸性ｐＨで、それと同じｐＨでのＡＣＰよりもＡＣＦＰ複合体中で結合することがわかる。
【００７５】
（実施例２）
酸性ｐＨ値でのＣＰＰ−ＡＣＰおよびＣＰＰ−ＡＣＦＰによるエナメル質表層下病変のインビトロ再石灰化の比較
摘出したヒトの第三大臼歯の研磨したエナメル質表面を、スラブ（８×４ｍｍ２）として切り取り、耐酸性マニキュア液で被覆して、１ｍｍだけ分離した咬合半分および歯肉半分の近遠心ウィンドウ（１×７ｍｍ２）を形成した。比較に使用したプロトコルは、当業者には周知であり、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（１９９７），Ｒｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎａｍｅｌ  ｓｕｂｓｕｒｆａｃｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ７６：１５８７−１５９５に記載されているものとした。表層下エナメル質の病変を、ＷｈｉｔｅのＣａｒｂｏｐｏｌ法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、１９９７に記載）を使用してこれらのウィンドウ上に発症させた。エナメルスラブを、４×４ｍｍ２ブロックに半分に切断した。あるブロック上の歯肉半分の病変および別のブロック上の咬合半分の病変を、マニキュア液で封止して、脱灰した対照を作成した。
【００７６】
エナメル質の半病変を、３７℃で１０日間、混合なしで異なる再石灰化溶液に曝した。再石灰化溶液は、２％ＣＰＰ−ＡＣＰまたは２％ＣＰＰ−ＡＣＦＰであり、ｐＨ７．０、６．５、６．０、５．５および５．０で調製され、それぞれの形成ｐＨの溶液として維持された。
【００７７】
再石灰化後、ブロックの各組をエタノールで脱水し、メタクリル酸メチル樹脂（Ｐａｌａｄｕｒ、Ｋｕｌｚｅｒ、ドイツ）に埋め込んだ。３つの２００〜３００μｍ断面を、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８０：２０６６−２０７０）に既に記載のように、病変の表面に対して垂直に切り、８０±５μｍにまで重ね、１０×１４μｍの厚さの増分のアルミニウムステップウェッジに沿ってＸ線写真を撮った。
【００７８】
病変のＸ線写真画像は、Ｄｉｌｕｘ  ２２顕微鏡（Ｅｒｎｓｔ  Ｌｅｉｔｚ  Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）によって透過光線を介して視覚化された。その画像は、ビデオカメラ（Ｓｏｎｙ  ＤＸＣ  ９３０Ｐ）によって得られ、画像ソフト（Ｏｐｔｉｍａｓ  ６．２）の制御下でデジタル化された（Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ｃｏｌｏｕｒ  ｇｒａｂｂｅｒ  ７）。病変、対照およびアルミニウムステップウェッジの画像を、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって既に記載のように走査した。エナメル質断面厚を測定し、体積パーセントのミネラルデータを、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって以前記載されているように、Ａｎｇｍａｒ（１９６３）の式を使用して決定した。再石灰化パーセント（％Ｒ）も、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって既に記載のように計算した。
【００７９】
これらの溶液による、エナメル質表層下の病変の再石灰化が、表３に示される。
【００８０】
【表３】
2008521754.tif 000005
表３の結果は、２％ＣＰＰ−ＡＣＰおよびＣＰＰ−ＡＣＦＰ溶液が、酸性ｐＨ値にも関わらず、かなりのレベルでエナメル質表層下病変を再石灰化することを示している。ＣＰＰ−ＡＣＰおよびＣＰＰ−ＡＣＦＰは両方、ｐＨ５．５で最適に再石灰化した。通常、エナメル質の脱灰が普通なら生ずるはずのｐＨ５．０でさえ、２％ＣＰＰ−ＡＣＰは１８％を再石灰化し、２％ＣＰＰ−ＡＣＦＰは４０％を再石灰化し、これによって酸性溶液中のＣＰＰ−ＡＣＦＰの優れた特性が示された。
【００８１】
（実施例３）
ｐＨ７．０および５．５でのＣＰＰ−ＡＣＰによるエナメル質のインサイチュ再石灰化の比較
この研究は、ｐＨ５．５で調製され、それに維持されたＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％ｗ／ｖを含有する口内洗浄剤を、ｐＨ７．０で調製され、それに維持されたＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％ｗ／ｖを含有する口内洗浄剤と比較し、口腔内モデルにおけるエナメル質再石灰化を高める能力を評価するための、二重盲目試験およびクロスオーバー設計である。研究の承認は、メルボルン大学Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＲｏｙａｌ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｅｔｈｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから得た。スタッフおよび歯学科の大学院生（年齢２１〜４７歳）から４人の健康な成人被験者（男性２人および女性２人）を採用した。すべての被験者は、進行中の齲蝕活動、歯周病、または他の口腔病のない、少なくとも２２本の本来の歯を有していた。被験者には、唾液分泌量に影響を与える抗生物質または薬剤を使用している者はいなかった。各被験者の未刺激性の唾液分泌量は、０．２ｍｌ／分を超えていた。未刺激性唾液分泌量は、被験者に頭を前下方に傾け、正確に２分間、予め秤量した遠心分離管中に唾液を流すように指示することによって測定した。刺激性唾液分泌量は、被験者に無糖のチューインガムを正確に２分間噛み、生成されるすべての唾液を、予め秤量した遠心分離管中に流すよう指示することによって測定した。
【００８２】
既に記載のように（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、歯列弓内で第１小臼歯から最も奥にある歯までを被覆する取り外し可能な口蓋用アクリル製器具を、各被験者に合わせて製造した。
【００８３】
摘出したヒト第３大臼歯は、Ｒｏｙａｌ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅから得た。摘出されたいかなる軟組織も除去し、歯を１８％ｖ／ｖ酢酸ホルマリン溶液中で保存した。健康な、比較的平面な口腔および亀裂、染み、およびフッ素沈着のない（解剖顕微鏡で観察した）舌側面を選択し、ミリＱ水で三回すすいだ。エナメル質表面を除去し、低速コントラアングル歯科用ハンドピースでＳｏｆｌｅｘ（商標）（３Ｍ）ディスクを使用して、鏡面になるよう湿潤研磨した。次いで、研磨した各表面を、水冷ダイアモンドブレードソーを使用して、約８×４ｍｍのスラブとして歯から切り取り、互いに１ｍｍだけ分離した２種類（咬合および歯肉）の近遠心ウィンドウ（１×７ｍｍ）を除き、総スラブを耐酸性マニキュア液で被覆した。各スラブを、黄色歯科用粘着性ワックスの３〜４ｃｍスティックの端部上に載せ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９０７（商標）（カルボキシポリメチレン、ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）２０ｇ／ｌ、ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（登録商標）ＨＴＰ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＬ）５００ｍｇ／ｌ、および乳酸（Ａｊａｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＮＳＷ）０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ４．８からなる未攪拌の脱灰緩衝液４０ｍｌ中に、３７℃で４日間浸すことによって、エナメル質ウィンドウ中で病変を発症させた。２日後に溶液の交換を行い、その時スラブを溶液から除去し、ミリＱ水で３回すすぎ、ふき取って乾燥させ、新しい脱灰緩衝液中に入れた。スラブは、脱灰の４日後に同様にすすぎ乾燥させた。人工病変断面のＸ線顕微鏡写真によって評価されるように、この脱灰手順によって、表面層はそのままで、約８０〜１００μｍの深さの一貫した表層下病変（ＬＤｄ）が発症した。各エナメルスラブの脱灰後、各ウィンドウの正中線に沿ってスラブを４×４ｍｍの半スラブに切断し、各半スラブの切断面をマニキュア液で被覆した。各組の一方の半スラブを脱灰対照として保持し、ラベルを付した１．５ｍｌ微小遠心管中でミリＱ水１滴と一緒に保存し、それによって加湿環境を作り出した。その組の他方のエナメル質半スラブを、口腔内器具内に挿入し、再石灰化プロトコル用の歯科用ワックスを使用して保持した。ワックスのないウィンドウを維持するために注意が払われた。４つの半スラブを各器具に挿入し、２つを両側のトラフ内のそれぞれの側に挿入した（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００８４】
試験用口内洗浄剤は、実施例１に記載のようにｐＨ５．５またはｐＨ７．０で調製されたＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％ｗ／ｖを含有するものとした。その生成物を、コードを付した生成物として提供した。コードは、データすべてが得られるまで解除しなかった。この研究は、２つの処理（ｉ）ｐＨ７．０でＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％（ｗ／ｖ）を含有する口内洗浄剤、および（ｉｉ）ｐＨ５．５でＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％（ｗ／ｖ）を含有する口内洗浄剤を伴う、二重盲目試験のクロスオーバー設計を利用する。被験者は、口内洗浄剤のそれぞれを、無作為に割り当てられる。
【００８５】
試験の開始時、すべての被験者は、試験期間中、使用するように指示された標準的なフッ化物歯磨剤を適切に供給された。被験者は、早朝および就寝時に、フッ化物歯磨剤で歯を磨くように指示された。また、口腔内器具の挿入前に、水で口をすすぐように指示された。被験者は、表層下に脱灰した病変を含有する、４種類のヒトエナメル質半スラブが挿入された、取り外し可能な口蓋用器具を装着した。各被験者は、器具を口内に挿入するとすぐに、口内洗浄剤５ｍｌで６０秒間すすぐように指示された。被験者は、その器具をさらに４０分間装着し続けた。これを１０日間、１日に４回、以下の時刻、１０：００ａｍ、１１：３０ａｍ、２：００ｐｍ、および３：３０ｐｍに行った。器具が装着されている間、被験者は、いかなる飲食もしないよう指示された。１０日の試験期間後、１週間の洗浄期間を取った。次いで被験者は、他の処理にクロスオーバーされた。器具を口内から取り外すとき、ミリＱ水で簡単にすすぎ、湿った封止ビニール袋内に保持し、室温で保存した。被験者は、エナメル質ブロックを含有する領域を磨かないよう伝えられた。被験者は製品の使用および器具の装着回数を日誌につけた。試験期間中、被験者の食事または口腔衛生手順に変更はなかった。各処理期間後、エナメル質半スラブを除去し、そのそれぞれの脱灰した対照エナメル質半スラブと組にし、埋め込み、切片し、Ｘ線顕微鏡およびコンピュータを使用した濃度測定画像分析にかけて、再石灰化のレベルを決定した。
【００８６】
各処理後、エナメル質半スラブを、そのそれぞれの対照半スラブと組にし、次いで、無水アルコールで脱水した。半スラブの各組を、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）によって記載されているように、埋め込み、切片し、Ｘ線顕微鏡およびコンピュータを使用した濃度測定画像分析にかけた。病変および健康なエナメル質の隣接領域のＸ線画像を、０〜２５６の濃淡値で読み取りを行う、プログラムの線形輝度関数を使用して走査した。各病変を、人為結果または亀裂のない領域を介して、６回走査した。各走査は、歯の表面から病変を介して健康なエナメル質まで、２００の読み取りから構成された。各スライド上のアルミニウムステップウェッジ画像を走査し、平均ステップ濃淡値の読み取り値を、アルミニウムの厚さに対してプロットした。ステップウェッジ曲線の直線部分および直線回帰内にある、歯の断面画像の読み取り値を使用して、濃淡値データを、アルミニウムの等価厚値に変換した。断面厚を測定し、Ａｎｇｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９６３）の式を使用して、体積％のミネラルデータを算出し、アルミニウム、有機物質と水およびアパタイト系ミネラルの線吸収係数を算出した（それぞれ１３１．５、１１．３および２６０．５）。２つの病変間のメジアンストリップ（ｍｅｄｉａｎ  ｓｔｒｉｐ）の画像を、６回走査し、平均して、健康なエナメル質の対照濃度測定プロファイルを得た。同様に、メジアンストリップの歯肉および咬合部位に対する病変画像（処理したウィンドウおよび脱灰対照ウィンドウ）を、可能な限りそのメジアンストリップに近いものの、病変の縁部で一般に見られるいかなる異常も回避するように走査し、ミネラルプロファイル％を算出した。
【００８７】
脱灰し、処理した病変の各エナメル質半スラブの体積％でのミネラルプロファイルを、メジアンである健康なエナメル質の同じ断面の体積％でのミネラルプロファイルと比較した。脱灰した対照病変およびメジアンである健康なエナメル質の濃度測定プロファイル未満の領域間の差を、台形積分によって計算し、それをΔＺｄで表す。処置した病変およびメジアンである健康なエナメル質の濃度測定プロファイル未満の領域間の差を、台形積分によって計算し、それをΔＺｒで表す。次いでこれらのパラメータを、処理後の変化％値に変換し、したがって、ミネラル変化％（％ＭＣ）は、ΔＺ値における変化％を表す。
【００８８】
【化２】
2008521754.tif 000006
３つの処理データを、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、無作為完全ブロック設計（Ｎｏｒｕｓｉｓ  Ｍ．１９９３）に関して統計的に試験した。Ｌｅｖｅｎｅ’ｓ試験を使用して、分散の均一性を確認し、正規確率プロットおよびコルモゴロフ−スミルノフ試験を使用して、データの正規性を確認した。すべての統計的分析は、ＳＰＳＳバージョン１１．０ソフトウェア（Ｎｏｒｕｓｉｓ  Ｍ．１９９３）を使用して実施した。
【００８９】
エナメル質再石灰化値の完全なデータ一式が得られたら、コードを解除し、デコードされたデータを分析した。表４の結果は、４人の被験者についての平均ＭＣ％値、ならびに各器具における４つのエナメル質半スラブからの各断面上で実施された１２つの走査（６つはそれぞれ歯肉および咬合の病変からものである）から得られた、各被験者についてのデータを表している。ｐＨ５．５のＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％（ｗ／ｖ）を含有する口内洗浄剤の使用によって、１４．１６±１．９０％のエナメル質表層下病変の再石灰化が生じ、ｐＨ７．０のＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％（ｗ／ｖ）を含有する口内洗浄剤の使用では、わずかに１０．３±２．２８％のエナメル質表層下の再石灰化が生じた。この差は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０１）。これらのデータは、ｐＨ５．５で形成されたＣＰＰ−ＡＣＰが、ｐＨ７．０で形成されたＣＰＰ−ＡＣＰよりも３７％高いエナメル質インサイチュ再石灰化効果を有することを示しており、したがって、実施例３で得られたインビトロでの結果を裏付けるものである。
【００９０】
表４
ｐＨ７．０またはｐＨ５．５でのＣＰＰ−ＡＣＰ０．５％（ｗ／ｖ）を含有する口内洗浄剤によるエナメル質表層下病変のインサイチュ再石灰化
【００９１】
【表４】
2008521754.tif 000007
ａ．ｐＨ７．０での口内洗浄剤と比べた再石灰化の増加パーセント
（実施例４）
この実施例では、先により一般的に記載したように、本発明の複合体を異なる目的の組成物に配合することができる方法を例示するために、いくつかの配合物が提供される。これらは単に、本発明の様々な実施形態を使用して提供することができる配合物のタイプの具体例である。
【００９２】
ＣＰＰ−ＡＣＰまたはＣＰＰ−ＡＣＦＰを含有する練り歯磨き配合物
【００９３】
【表５】
2008521754.tif 000008
【００９４】
【表６】
2008521754.tif 000009
【００９５】
【表７】
2008521754.tif 000010
【００９６】
【表８】
2008521754.tif 000011
うがい剤配合物
【００９７】
【表９】
2008521754.tif 000012
【００９８】
【表１０】
2008521754.tif 000013
ロゼンジ配合物
【００９９】
【表１１】
2008521754.tif 000014
チューインガム配合物
【０１００】
【表１２】
2008521754.tif 000015
本明細書に開示され定義される本発明は、本文もしくは図より言及されまたは明らかである２つ以上の個々の特徴の、他の組合せすべてに及ぶことを理解されたい。これらの異なる組合せのすべては、本発明の様々な代替の態様を構成している。
【国際調査報告】
2008521754.tif 000016
2008521754.tif 000017
2008521754.tif 000018