(57)【要約】  本発明は、誘導性発現系、並びに真核細胞及び非ヒト動物における少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するための、組成物及び方法に関する。
2008508887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡエレメントに対して３’の転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置する第一のテトラサイクリンオペレーター、及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーターを含有し、ここで第一のテトラサイクリンオペレーターが、第二のテトラサイクリンオペレーターのポリヌクレオチド配列と同一のポリヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列。
【請求項２】
第一のテトラサイクリンオペレーター及び第二のテトラサイクリンオペレーターそれぞれが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）及びｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のプロモーター配列。
【請求項３】
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターである、請求項１に記載のプロモーター配列。
【請求項４】
ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡエレメントに対して３’の転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置しＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの一部を形成する第一のテトラサイクリンオペレーター、及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーターを含有し、ここで第一のテトラサイクリンオペレーターが、第二のテトラサイクリンオペレータのポリヌクレオチド配列と同一のポリヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ  依存性プロモーター配列。
【請求項５】
第一のテトラサイクリンオペレーター及び第二のテトラサイクリンオペレーターそれぞれが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）及びｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含有する、請求項４に記載のプロモーター配列。
【請求項６】
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターである、請求項５に記載のプロモーター配列。
【請求項７】
ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡエレメントに対して３’の転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置する第一のテトラサイクリンオペレーター、及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーターを含有し、ここで第一のテトラサイクリンオペレーターが、第二のテトラサイクリンオペレーターのポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチド配列を有し、但し、第一のテトラサイクリンオペレーターが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する場合、第二のテトラサイクリンオペレーターが、ｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）のポリヌクレオチド配列を有さない、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列。
【請求項８】
第二のテトラサイクリンオペレーターが、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）及びｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載のプロモーター配列。
【請求項９】
第一のテトラサイクリンオペレーターが、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号２）のポリヌクレオチド配列を有し、第二のテトラサイクリンオペレーターが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載のプロモーター配列。
【請求項１０】
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターである、請求項７に記載のプロモーター配列。
【請求項１１】
ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡエレメントに対して３’の転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置しＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの一部を形成する第一のテトラサイクリンオペレーター、及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーターを含有し、ここで第一のテトラサイクリンオペレーターが、第二のテトラサイクリンオペレータのポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチド配列を有し、但し、第一のテトラサイクリンオペレーターが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する場合、第二のテトラサイクリンオペレーターが、ｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）のポリヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ  依存性プロモーター配列。
【請求項１２】
第二のテトラサイクリンオペレーターが、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）及びｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載のプロモーター配列。
【請求項１３】
第一のテトラサイクリンオペレーターが、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号２）のポリヌクレオチド配列を有し、第二のテトラサイクリンオペレーターが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する、請求項１１に記載のプロモーター配列。
【請求項１４】
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターである、請求項１１に記載のプロモーター配列。
【請求項１５】
関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１個の請求項１に記載のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を含有する、ベクター。
【請求項１６】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項５に記載の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を含有する、ベクター。
【請求項１８】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項７に記載の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を含有する、ベクター。
【請求項２０】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された請求項１１に記載の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を含有する、ベクター。
【請求項２２】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１５に記載のベクターを含有する真核細胞。
【請求項２４】
請求項１７に記載のベクターを含有する真核細胞。
【請求項２５】
請求項１９に記載のベクターを含有する真核細胞。
【請求項２６】
請求項２１に記載のベクターを含有する真核細胞。
【請求項２７】
ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ  依存性プロモーター配列に作動可能に連結された関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列を含有するトランス遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物であって、ここで関心のある前記ポリヌクレオチド配列の転写により、前記トランスジェニック非ヒト動物において少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡ分子が産生され、さらに、前記プロモーター配列は、ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’の近位配列エレメント（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡエレメントに対して３’の転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置する第一のテトラサイクリンオペレーター、及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーターを含有し、第一のテトラサイクリンオペレーターは、第二のテトラサイクリンオペレーターのポリヌクレオチド配列と同一のポリヌクレオチド配列を有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２８】
第一のテトラサイクリンオペレーター及び第二のテトラサイクリンオペレーターそれぞれが、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）及びｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を有する、請求項２７に記載の動物。
【請求項２９】
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターである、請求項２７に記載の動物。
【請求項３０】
マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、霊長類及びモルモットからなる群から選択される、請求項２７に記載の動物。
【請求項３１】
少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項２７に記載の動物。
【請求項３２】
ＲＮＡ分子が小分子干渉ＲＮＡ又は小分子ヘアピン型ＲＮＡである、請求項２７に記載の動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、真核細胞及び非ヒト動物での標的遺伝子の発現調節での使用のための誘導性発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡを用いて遺伝子発現を抑制するためのプロセスである。ＲＮＡｉ機構は、植物、無脊椎動物及び脊椎動物で保存されている。その単純性及び特異性により、ＲＮＡｉは、様々なモデル生物において遺伝子機能を研究するための好ましい方法となっている（例えば、Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４−２５１（２００２）、Ｐａｄｄｉｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２：１７−２３（２００２）、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：４８５−４９０（２００１）、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．，２：２３９−２４５（２００１）及びＺａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，８：７４６−７５０（２００１））。化学的に合成した小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞にトランスフェクトされると関心のある遺伝子を効率的に抑制することができるが、ｓｉＲＮＡの使用は、時間経過によりｓｉＲＮＡが分解されるか又は細胞分裂後に希釈されるため、短期間の実験に限られている。この制限を乗り越えるために、１９から２０ｂｐのステムを含有し、４から９ヌクレオチドのループサイズである小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するベクターを利用した系が開発された。「ｄｉｃｅｒ（ダイサー）」として知られる酵素により、ｓｈＲＮＡがｓｉＲＮＡへとプロセシングされ、ヒト細胞で発現される際に特異的な遺伝子の抑制を示す（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６：５５０−５５３（２００２）、Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４９７−５００（２００２）、Ｐａｄｄｉｓｉｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６：９４８−９５８（２００２）、Ｐａｕｌ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：５０５−５０８（２００２）及びＳｕｉ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９：５５１５−５５２０（２００２））。さらに、ｓｈＲＮＡ発現系を染色体に組み込み、安定な細胞株を樹立するか、インビボ遺伝子機能研究のためにノックダウン動物を作製できることが分かった（Ｐａｄｄｉｓｉｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６：９４８−９５８（２００２）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２：２４３−２４７（２００２）、Ｈｅｍａｎｎ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：３９６−４００（２００３）、Ｔｉｓｃｏｒｎｉａ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８４４−１８４８（２００３）、Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４９４３−１４９４５（２００２）、Ｈａｓｕｗａ，Ｈ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５３２：２２７−２３０（２００２）、Ｋｕｎａｔｈ，Ｔ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１：５５９−５６１（２００３）及びＲｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：４０１−４０６（２００３））。
【０００３】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存性プロモーター配列は、ｓｈＲＮＡの発現ために選択されることが多い。ＲＮＡｐｏｌｙＩＩにより産生されるｍＲＮＡとは異なり、ｐｏｌｙＩＩＩにより産生される転写産物は５’キャップ及び３’ポリＡテールを持たず、それにより、ダイサー酵素によるｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡへの効率的プロセシングが可能となる。ｓｈＲＮＡ発現系の開発により、細胞又は動物において安定な標的ノックダウンが可能となったが、ｐｏｌｙＩＩＩ依存性プロモーター配列の構成的活性がｓｈＲＮＡ発現系の使用に様々な制限を与えている。例えば、重要な発生機能を有する遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡの構成的発現は胚段階で致死をもたらし、成体動物での機能表現型喪失の研究が妨げられる。さらに、細胞又は動物において重要な機能を有する標的の構成的ノックダウンにより代償性反応が引き起こされることが多く、これにより、遺伝子抑制の真の帰結を変化させる可能性がある。従って、当分野において、細胞及び動物での基本的な遺伝子の機能表現型の喪失を偏らずに分析するために有用なｓｈＲＮＡの発現調節が必要とされている。
【０００４】
テトラサイクリン応答性ｐｏｌｙ  ＩＩＩ依存性プロモーター配列を開発する試みが行われてきた。ヒトＵ６ｓｈＲＮＡプロモーター配列の２つのタイプのテトラサイクリン−応答性誘導体が当分野で公知である（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：５７７−５８５（２０００）を参照のこと）。テトラサイクリンＯ１（ｔｅｔＯ１）タイプＵ６プロモーター配列において、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する１型テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔオペレーター）を近位配列エレメント（ＰＳＥ）とＴＡＴＡボックスとの間に組み込んだ。テトラサイクリンＯ２（ｔｅｔＯ２）タイプＵ６プロモーターにおいて、ｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）のポリヌクレオチド配列を有する２型ｔｅｔオペレーターをＴＡＴＡボックスと転写開始部位（ＴＳＳ）との間に組み込んだ。ＴＡＴＡボックス及びＰＳＥは両者とも、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写開始に重要な役割を果たす。テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）をこれらの改変Ｕ６プロモーター配列にＴＡＴＡボックス又はＰＳＥに近接する位置で結合させることにより、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）活性化タンパク質複合体（ＳＮＡＰｃ）のＰＳＥへの結合が妨害され、続いて、転写開始が妨害されるということは理に適っている。ｔｅｔＯ１及びｔｅｔＯ２の両方のタイプのプロモーター配列は、構成的にｔｅｔＲを発現する細胞株においてテトラサイクリン依存性転写活性を示すことが分かっている。しかしながら、ｔｅｔＯ１は、一時的トランスフェクション実験において、ｔｅｔＯ２タイプのプロモーターと比較して、テトラサイクリン処理に対してより良い応答性を有していると思われる（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：５７７−５８５（２０００）を参照のこと。）。ｔｅｔＯ１又はｔｅｔＯ２タイプＵ６プロモーターを用いた、又は、ｔｅｔＯ２タイプＵ６プロモーターと同様の設計を有するヒトＨ１  ｓｈＲＮＡプロモーター誘導体を用いた、ｓｈＲＮＡの調節発現もまた当分野で公知である（Ｍａｔｓｕｋｕｒａ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３１：ｅ７７（２００３）及びＣｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：ｅ１２７（２００３）を参照のこと）。これらの系を用いて、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、βカテニン及びＰ１３キナーゼの誘導性ノックダウンを安定的細胞株において行った。文献中ではこれらのｐｏｌｙ  ＩＩＩ依存性プロモーター誘導体が厳重に制御されていると思われているが、本発明者らは、関心のあるポリヌクレオチド配列（ルシフェラーゼなど）を標的とするｓｈＲＮＡを発現させるためにｔｅｔＯ１プロモーター配列を使用した場合に、これらの発現系の重度の漏出性を観察した。任意の理論に縛られることを望まないが、発明者らは、Ｕ６プロモーターの１個の部位へのｔｅｔＲの結合が、基本的なプロモーターの転写活性を完全にブロックするのに十分ではないようだと考えている。強力なｓｈＲＮＡを使用する場合、系の漏出性がわずかであれば、標的タンパク質の顕著な低下が起こり得る。厳しい制御は、全ての制御発現系に対して最も重要で困難な要求の１つである。関心のある標的によっては、標的レベルのわずかな揺らぎが、表現型の変化を引き起こすのに十分であり得る。
【０００５】
ヒトＵ６  ｓｈＲＮＡプロモーター配列の第三タイプのテトラサイクリン応答性誘導体もまた当分野で公知である。このプロモーター配列において、ｔｅｔＯ１及びｔｅｔＯ２タイププロモーターの両方がＵ６プロモーターに組み込まれた（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：５７７−５８５（２０００）を参照のこと。）。ｔｅｔＯ１オペレーターをＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間に組み込み、ｔｅｔＯ２オペレーターをＴＡＴＡボックスとＴＳＳとの間に組み込んだ。しかしながら、Ｏｈｋａｗａらは、ｔｅｔＯ１及びｔｅｔＯ２の両方を含むことにより、結果として、Ｕ６プロモーター配列に関する転写活性が完全に失われることを報告した。
【０００６】
その結果、現在知られている誘導性ｓｈＲＮＡ発現系に伴う可能性のある制限のために、当分野において、最小の基本的な転写活性を有する調節ｓｈＲＮＡ発現系が必要とされている。具体的に、誘導性ノックダウン細胞株及び非ヒト動物の作製の成功率を向上させるためにこのような発現系において使用できる、厳重に制御されるプロモーターが必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
ある実施形態では、本発明は、ＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列に関する。プロモーター配列は、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター又は７ＳＫプロモーターであり得る。本発明のプロモーター配列は、ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’にある近位配列エレメント（ＰＳＥ）、ＴＡＴＡエレメントに対して３’にある転写開始部位（ＴＳＳ）、ＰＳＥとＴＡＴＡエレメントとの間に位置する第一のテトラサイクリンオペレーター（第一のｔｅｔオペレーター）及びＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する第二のテトラサイクリンオペレーター（第二のｔｅｔオペレーター）を含有する。ある態様では、第一のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＰＳＥとの間に位置し、ＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの何れの部分も形成しない。別の態様では、第一のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＰＳＥとの間に位置し、ＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの１つ又は両方の部分を形成する。第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する。ある態様では、第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置し、ＴＳＳ又はＴＡＴＡエレメントの何れの部分も形成しない。別の態様では、第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置し、ＴＳＳ又はＴＡＴＡエレメントの１つ又は両方の部分を形成する。
【０００８】
第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、同一であるか、又は異なり得る。第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列が同一である場合、ポリヌクレオチド配列は、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から選択され得る。
【０００９】
第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は互いに異なり得、ただし、第一のｔｅｔオペレーターがａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する場合、第二のｔｅｔオペレーターは、ｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）のポリヌクレオチド配列を持たない。第一のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から選択され得る。第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、独立に、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から選択され得る。好ましくは、第一のｔｅｔオペレーターが、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号２）のポリヌクレオチド配列を有する場合、第二のテトラサイクリンオペレーターは、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のプロモーターを含有するベクターに関する。より具体的には、本発明のベクターは、関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と作動可能に連結された上述のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列の少なくとも１個を含有する。少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、上述のベクターの少なくとも１個を含有する真核細胞に関する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物に関する。トランスジェニック非ヒト動物の例は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、霊長類（ヒトを除く。）及びモルモットである。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、本明細書中に記載のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列の少なくとも１個と作動可能に連結された、関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列を含有するトランス遺伝子を含有する。関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列の転写により、前記トランスジェニック動物において少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡ分子が産生される。産生されるＲＮＡ分子は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法に関する。ある態様では、次の方法に従い、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。この方法の第一段階は、トランス遺伝子を非ヒト動物の受精卵母細胞に導入することを含む。このトランス遺伝子は、本明細書中に記載のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列の少なくとも１個と作動可能に連結された、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を含有する。少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列の転写により、前記トランスジェニック動物において少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡ分子が産生される。産生されるＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。この方法における次の段階は、受精卵母細胞を胚へと発生させることを含む。次の段階は、胚を偽妊娠雌非ヒト動物に移すことを含む。次の段階は、胚を出産まで発生させることを含む。次の段階は、関心のあるポリヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック非ヒト動物を同定することを含む。
【００１４】
別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、次の方法に従い作製することができる。この方法の第一段階は、非ヒト動物の胚性幹細胞にトランス遺伝子を導入することを含む。このトランス遺伝子は、本明細書中に記載のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列の少なくとも１個と作動可能に連結された、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を含む。少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列の転写により、前記トランスジェニック動物において少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するＲＮＡ分子が産生される。産生されるＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。この方法における次の段階は、前記非ヒト胚性幹細胞を胚盤胞へと導入することを含む。この方法における次の段階は、得られた胚盤胞を偽妊娠雌非ヒト動物へと移植することを含む。この方法における次の段階は、この非ヒト動物にキメラ非ヒト動物を出産させることを含む。次の段階は、前記トランス遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製するためにキメラ非ヒト動物を繁殖させることを含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、真核細胞において、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列の転写を誘導するための方法に関する。この方法では、転写を誘導する場合、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列により、真核細胞において、少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節する少なくとも１個のＲＮＡ分子が産生される。この方法の第一の段階は、真核細胞にｔｅｔＲタンパク質を発現させることを含む。真核細胞が提供されたら、次の段階は、少なくとも１個のベクターを用いて（本明細書中で既に述べたベクターの１つなど）、この細胞を形質転換又はトランスフェクションすることである。例えば、ベクターは、本明細書中に記載の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を含有し得る。この方法の次の段階は、細胞を誘導剤と接触させることを含む。この誘導剤は、ｔｅｔリプレッサータンパク質に結合し、関心のあるポリヌクレオチド配列をプロモーター配列により転写させる。ポリヌクレオチド配列の転写により、細胞において、少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節する少なくとも１個のＲＮＡ分子が産生される。上述の方法で使用される誘導剤は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体であり得る。さらに、上述の方法で産生されるＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。
【００１６】
場合によっては、上述の方法は、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列を含有する第二のベクターを用いて真核細胞を形質転換する段階をさらに含み得、ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、プロモーターの少なくとも１個のｔｅｔオペレーターに結合するｔｅｔリプレッサーをコードする。
【００１７】
場合によっては、上記方法で使用される少なくとも１個のベクターは、関心のある第二のポリヌクレオチド配列をさらに含有し得る。ある態様では、この第二のポリヌクレオチド配列を第二のプロモーター配列に作動可能に連結でき、この第二のポリヌクレオチド配列は、プロモーターのｔｅｔオペレーターの少なくとも１個に結合するｔｅｔリプレッサータンパク質をコードし得る。
【００１８】
第二の態様では、この第二のポリヌクレオチド配列は、関心のある第一のポリヌクレオチド配列とタンデム連結され得る。この第二の態様では、細胞を誘導剤と接触させる場合、誘導剤はｔｅｔリプレッサータンパク質に結合し、プロモーターにより、関心のある第一の及び第二のポリヌクレオチド配列それぞれの転写が引き起こされる。具体的に、第一のポリヌクレオチド配列の転写により、第一の標的遺伝子の発現を調節する第一のＲＮＡ分子が産生され、第二のポリヌクレオチド配列の転写により、第二の標的遺伝子の発現を調節する第二のＲＮＡ分子が産生される。
【００１９】
本発明のある実施形態では、関心のあるポリヌクレオチド配列の少なくとも１個は、チロシナーゼをコードする。
【００２０】
第三の態様では、少なくとも１個のベクターは、関心のある第一のポリヌクレオチド配列とタンデム連結された関心のある第二のポリヌクレオチド配列を含有するだけでなく、第二のプロモーター配列に作動可能に連結された第三のポリヌクレオチド配列も含有する。この第三のポリヌクレオチド配列は、プロモーターのｔｅｔオペレーターの少なくとも１個と結合するｔｅｔリプレッサータンパク質をコードする。この第三の態様では、細胞を誘導剤と接触させる場合、誘導剤はｔｅｔリプレッサータンパク質と結合し、プロモーター配列により、関心のある第一の及び第二のポリヌクレオチド配列それぞれの転写が引き起こされる。具体的に、第一のポリヌクレオチド配列の転写により、第一の標的遺伝子の発現を調節する第一のＲＮＡ分子が産生され、第二のポリヌクレオチド配列の転写により、第二の標的遺伝子の発現を調節する第二のＲＮＡ分子が産生される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
定義及び他の用語
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」という用語は、プロモーター活性の結果、転写が行われるポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、特定のポリペプチドをコードするか、又はＲＮＡ分子をコードし得る。遺伝子は、１以上のイントロン及び／又はエクソン及び／又は１以上の制御及び／又は調節配列を含み得る。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「誘導剤」という用語は、以下に限定されないが、テトラサイクリン、ドキシサイクリン又はテトラサイクリン類似体を含むｔｅｔリプレッサータンパク質に特異的に結合する任意の化合物を指す。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「調節」又は「調節する」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される場合、上方制御（つまり、活性化又は刺激（例えば作動化する又は増強することによる））及び下方制御（つまり、阻害又は抑制（例えば、拮抗、低下又は阻害することによる））の両方を指す。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除く全ての脊椎動物を含む。胚及び胎仔段階など、発生段階全ての個々の動物も含む。「トランスジェニック動物」は、標的化組換え又はマイクロインジェクション又は組換えウイルスを用いた感染によるものなど、細胞より小さいレベルでの慎重な遺伝子操作により、直接的又は間接的に、遺伝情報が変更されているか、遺伝情報を受容する１以上の細胞を含有する任意の動物である。
【００２５】
マウスは、飼育しやすく、比較的安価であり繁殖させやすいことから、トランスジェニック動物モデルのために使用されることが多い。しかしながら、他の非ヒトトランスジェニック哺乳動物（以下に限定されないが、霊長類、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ウシ、ネコ、モルモット及びラットなど）もまた本発明に従い作製することができる。トランスジェニック動物はトランス遺伝子を有する動物であり、このトランス遺伝子は、次の世代に引き継がれる、導入され安定に組み込まれた、クローニングされた遺伝子である。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、並列を指し、このように述べられる成分は、それらの意図する様式でそれらが機能させることができる関係にある。例えば、関心のあるポリヌクレオチド配列は、関心のある導入ポリヌクレオチド配列の転写を指示する、又は転写及び翻訳を指示する、別のポリヌクレオチド配列に近接して位置し得る（つまり、例えば、関心のある導入配列によりコードされるポリペプチド又はポリヌクレオチドの産生を促進する）。プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されているとみなされる。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド何れかの重合形態を意味する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ、ならびに２本鎖及び１本鎖ＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドの、メチル化又はキャッピングなどの修飾及び非修飾形態も含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」及び「オリゴ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「関心のあるポリヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ分子、例えば、以下に限定されないが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）又は標的細胞中のタンパク質もしくはその他の分子を発現させることができる（つまり、標的細胞においてタンパク質又はその他の生物分子の産生が可能である）、任意の、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体及び合成ＤＮＡを指す。ＤＮＡは２本鎖又は１本鎖であり得、１本鎖である場合、コード（センス）鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。関心のあるポリヌクレオチド配列は通常、少なくとも１個のプロモーター配列など、発現に必要な他のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。関心のあるあらゆるポリヌクレオチド配列を本発明で用いることができる。本発明で使用できるポリヌクレオチド配列の例としては、以下に限定されないが、マウスＩＲＡＫ４遺伝子をノックアウトするためのポリヌクレオチド配列、例えば、ｓｈＲＮＡ法で用い得るｇｇａａｇａａａｕｕａｇｃａｇｕａｇｃｕｃｕｃｕｕｇａａｇｃｕａｃｕｇｃｕａａｕｕｕｃｕｕｃｃｕｕ（配列番号１６）など、ヒトＳＴＫ３３遺伝子をノックアウトするためのポリヌクレオチド配列、例えば、それぞれｓｉＲＮＡ法で用い得る、ｇｇｇｃａｕｕｕｃｕｃａｇａｇａａｕｇｔｔ（配列番号１７）及びｔｔｃｃｃｇｕａａａｇａｇｕｃｕｃｕｕａｃ（配列番号１８）、ＮＦＫＢ阻害剤Ｒａｓ様１（「ＮＫ１ＲＡＳ１」としても知られる）タンパク質をコードする、又はＮＫＩＲＡＳ１遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（ヒトＮＫ１ＲＡＳ１タンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ−０２０３４５で見出すことができる）、低酸素誘導性因子１、αサブユニット（基本的なヘリックス−ループ−へリックス転写因子であり、「ＨＩＦ１Ａ」としても知られている。）タンパク質をコードする、又はＨＩＦ１Ａ遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（ヒトＨＩＦ１Ａタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５３０として見出すことができる）、以下に限定されないが、第８染色体ゲノムコンティーグ（ヒト第８染色体ゲノムコンティーグをコードするゲノムＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ０２３７３６．１６で見出すことができる）などの、ゲノム染色体をコードする、又はゲノム染色体をノックダウンする、ポリヌクレオチド配列、キナーゼファミリーのメンバーをコードする、又はキナーゼファミリーのメンバーをコードする遺伝子をノックダウンする、ポリヌクレオチド配列（キナーゼファミリーのメンバーの例としては、アクチビンＡ受容体タイプＩＩ様タンパク質（「ＡＣＶＲＬ１」としても知られる。）（ヒトＡＣＢＲＬ１タンパク質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００２０で見出すことができる）又はＡＴＭタンパク質（ヒトＡＴＭをコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００５１で見出すことができる）が挙げられる）、腫瘍抑制タンパク質をコードする、又は腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（���瘍抑制タンパク質の例としては、ｐ５３タンパク質（ヒトｐ５３タンパク質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５４６で見出すことができる）又はヒト網膜芽腫タンパク質（ヒト網膜芽腫タンパク質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１５４００で見出すことができる。）が挙げられる。）、転写因子をコードする、又は転写因子をコードする遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（転写因子の例としては、ｍｙｃタンパク質（ヒトｍｙｃタンパク質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１３２２８で見出すことができる）が挙げられる）、Ｓｍａ１１ＧＴＰａｓｅをコードする、又はＳｍａ１１ＧＴＰａｓｅ遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（Ｓｍａ１１ＧＴＰａｓｅの例としては、Ｒａｓタンパク質（Ｒａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３３６０で見出すことができる）が挙げられる）、Ｅ３リガーゼをコードする、又はＥ３リガーゼをコードする遺伝子をノックアウトする、ポリヌクレオチド配列（Ｅ３リガーゼの例としては、ＳＫＰ２タンパク質（ヒトＳＫＰ２タンパク質をコードするＤＮＡはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２６３７で見出すことができる）が挙げられる）などが挙げられる。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、共有及び／又は非共有結合を介して連結されたアミノ酸の少なくとも１個の分子鎖を指す。この用語は特定の長さの産物を指すものではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、タンパク質断片、類似体、突然変異又は変異型タンパク質、融合タンパク質などがポリペプチドの意義内に含まれる。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「標的遺伝子」という用語は、以下に限定されないが、関心のあるポリペプチドあるいは関心のあるＲＮＡ分子（例えば以下に限定されないがｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなど）をコードする関心のあるポリヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、その機能が本発明の方法により遮断される細胞の連続的生存に必要とされる「不可欠な」遺伝子であり得る。「標的遺伝子」という用語はまた、本明細書中に記載の方法によりノックアウトされるべき遺伝子も指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「テトラサイクリン類似体」という用語は、テトラサイクリン又はドキシサイクリンに関連し、ｔｅｔリプレッサータンパク質に特異的に結合する任意の化合物を指す。このような類似体の解離定数は、少なくとも１ｘ１０−６Ｍ、好ましくは１ｘ１０−９Ｍより大きいものであるべきである。テトラサイクリン類似体の例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７８，Ｂｌａｃｋｗｏｏｄら（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５）における、Ｈｌａｖｋａら、「Ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ，」及びＭｉｔｓｃｈｅｆ（「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，」Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓ．９，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）で考察されている（これは本明細書中に参考として援用されている）。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「テトラサイクリンリプレッサータンパク質」、「ｔｅｔリプレッサータンパク質」及び「ｔｅｔＲ」という用語は、本明細書中で全て交換可能に使用され、１）誘導剤との特異的結合性を示し、２）テトラサイクリンリプレッサータンパク質が誘導剤と結合しない場合、少なくとも１個のｔｅｔオペレーター配列に対する特異的な結合を示し、及び／又は３）誘導剤により、テトラサイクリンオペレーターから駆逐され得る、又は競合して除かれ得る、ポリペプチドを指す。「テトラサイクリンリプレッサータンパク質」という用語は、天然の（つまり、ネイティブ）テトラサイクリンリプレッサータンパク質ポリペプチド配列及びその機能的誘導体を含む。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「制御配列」という用語は、通常、ポリヌクレオチドの発現（遺伝子の転写及び翻訳、メッセンジャーＲＮＡの、スプライシング、安定性などを含む。）に影響を与える遺伝子座の（例えば、５０ｋｂ内の）コード領域と会合する配列を指す。制御配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位及びポリアデニル化部位が含まれる。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「調節配列」という用語は、それらがライゲーションされているコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。このような調節配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物では、このような調節配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、真核生物では、一般に、このような調節配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「調節配列」という用語は、最小限として、発現のために存在することが必要な全ての成分を含むものとし、また、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列など、存在すれば有利なさらなる成分も含み得る。
【００３５】
本明細書中で使用する場合、「トランス遺伝子」という用語は、細胞に導入されたポリヌクレオチド配列を指す（例えば、ポリペプチドの１つ又はそのアンチセンス転写産物をコードする。）。トランス遺伝子は、一部又は全体的に異種由来であり得、つまり、導入が行われるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して外来のものであるか、又は導入が行われるトランスジェニック動物もしくは細胞の内在遺伝子に対して同種ものであり得るが、挿入される細胞のゲノムを変化させるように動物のゲノムに挿入されるように設計されているか、又は挿入される（例えば、これは、天然の遺伝子とは異なる位置又はその挿入の結果ノックアウトが起こる位置に挿入される。）。トランス遺伝子はまた、エピソームの形態で細胞に存在し得る。トランス遺伝子は、１以上の転写制御配列及び任意の他の核酸、例えば、選択されたポリヌクレオチド配列の最適な発現に必要であり得るイントロンなどを含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド又はＤＮＡ配列を細胞に導入するビヒクルを指す。これは、任意の特定の配列に限定されるものではない。ベクターは、それ自身、内在遺伝子を調節する、ポリヌクレオチド又はＤＮＡ配列であり得るか、又は内在遺伝子を調節するポリヌクレオチド配列を含有し得る。従って、ベクターは、単純に、調節に必要な配列のみを含有する線状又は環状ポリヌクレオチドであるか、又は大きなポリヌクレオチド又はＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスゲノムなどの他の構築物、バイロン全体又は、重要なヌクレオチド配列を細胞に導入するために使用される他の生物学的コンストラクにおけるこれらの配列であり得る。「ベクター構築物」、「組換えベクター」又は「構築物」という語が本明細書中で「ベクター」という用語と交換可能に使用され得ることも理解されたい。
【００３７】
本明細書中で使用する場合、「ａ、」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈において明確に他に示されない限り、複数形の意味を含む。別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の熟練者により一般に理解されるものと同様の意味を有する。
【００３８】
値の範囲が示される場合、文脈において明確に他に示されない限り、個々の介在値が、下限の単位の十分の一まで、同範囲の上限と下限の間にあり、その指定された範囲における任意のその他の指定された値又は介在値が本発明に含まれると理解すべきである。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立に、より小さい範囲に含まれ得、本発明内にも包含され、指定された範囲における任意の具体的な排除限界に従う。指定された範囲が上限又は下限の１又は両方を含む場合、上限又は下限が含まれるものの何れか又は両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３９】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書中に記載のものと同様又は同等のあらゆる方法、装置及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、代表的方法、装置及び材料をここで記載する。
【００４０】
テトラサイクリン耐性オペロン
重要ではないが、本発明の理解の促進を促すために、細菌におけるテトラサイクリン耐性（ｔｅｔ）オペロンに関する情報を本明細書中で簡潔に示す。
【００４１】
ｔｅｔオペロンにおいて、関心のあるポリヌクレオチド配列及びｔｅｔリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）をコードする遺伝子は、両方とも同じオペレーターエレメントの制御下にある。誘導剤がない場合、ｔｅｔリプレッサータンパク質はオペレーター配列に結合し、それにより、近接するプロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼなどの転写活性化因子と相互作用することが立体的に妨げられる。従って、関心のあるポリヌクレオチド配列の転写がブロックされる。細菌中の誘導剤のレベルが上昇する場合、誘導剤はｔｅｔリプレッサータンパク質に結合し、ｔｅｔリプレッサータンパク質のオペレーター配列への結合が妨げられる。結果として、ポリメラーゼはプロモーター配列に結合することができ、ポリヌクレオチド配列は転写される。
【００４２】
本発明のプロモーター
ある実施形態では、本発明はＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列に関する。好ましくは、本発明のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列は誘導性であり、つまり、このようなプロモーターは誘導性プロモーターである。本明細書中で使用する場合、「誘導性」又は「誘導性プロモーター」という用語は、両方とも本明細書中で交換可能に使用され、本発明のプロモーター配列がある特定の化学条件の設定下で活性化されることを指す。これらの特定の条件とは、ｔｅｔリプレッサータンパク質に結合する誘導剤の存在である。例えば、本発明において、誘導剤が存在する場合、本発明のプロモーター配列が活性化され、前記プロモーター配列に作動可能に連結された関心のあるポリヌクレオチド配列の転写が起こる。本発明は、以下に限定されないが、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列又は７ＳＫプロモーター配列など、任意のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列を本明細書中で使用できることを意図する。
【００４３】
本発明のプロモーター配列は、ＴＡＴＡエレメント、ＴＡＴＡエレメントに対して５’に位置する近位配列エレメント（ＰＳＥ）、ＴＡＴＡエレメントに対して３’に位置する転写状態部位（ＴＳＳ）、少なくとも１個の第一のテトラサイクリンオペレーター（第一のｔｅｔオペレーター）及び少なくとも１個の第二のテトラサイクリンオペレーター（第二のｔｅｔオペレーター）を含有する。本発明のプロモーター配列は、少なくとも２個のテトラサイクリンオペレーターを含有するが、２を超えるテトラサイクリンオペレーターを含有するプロモーター配列もまた、本発明の範囲内にあるものとする。
【００４４】
本発明のプロモーター配列において、第一のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＰＳＥとの間に位置する（図１参照）。ある態様では、第一のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＰＳＥとの間に位置し、ＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの何れの部分も形成しない。別の態様では、第一のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＰＳＥとの間に位置し、ＰＳＥ又はＴＡＴＡエレメントの一方又は両方の部分を形成する。第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置する（図１参照）。ある態様において、第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置し、ＴＳＳ又はＴＡＴＡエレメントの何れの部分も形成しない。別の態様では、第二のｔｅｔオペレーターは、ＴＡＴＡエレメントとＴＳＳとの間に位置し、ＴＳＳ又はＴＡＴＡエレメントの一方又は両方の部分を形成する。これらのエレメントの配置は、所望ならば、プロモーター配列が関心のある下流ポリヌクレオチド配列の転写又は遺伝子産物の翻訳を指揮する能力を実質的に妨げてはいけない。さらに、プロモーター配列、オペレーター及びその他のポリヌクレオチド配列を合成又は精製する手段は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載のような、適切に配置されたエレメントを用いてベクターを構築するのに利用することができる（本明細書中でより詳細に説明する）。
【００４５】
本明細書中に記載のプロモーター配列の特定の位置内で少なくとも２個のテトラサイクリンオペレーターを工作することにより、本発明者らは、本発明のプロモーター配列が関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列と作動可能に連結され、このプロモーター配列が当分野で公知のその他の誘導性ｐｏｌｙ  ＩＩＩ依存性プロモーターと比較して、基礎転写活性が低くなることを見出した。従って、本発明のプロモーターがより厳重な制御を示す結果、これらのプロモーター配列は、誘導性ノックダウン細胞株を作製する際の成功率を大きく向上させる。
【００４６】
第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、同じ（つまり同一）であるか、又は異なり得る。第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターは、任意のポリヌクレオチド配列を有し得るが、ただし、前記ポリヌクレオチド配列は、誘導剤の非存在下で、前記オペレーターの一方及び／又は両方に対してｔｅｔリプレッサータンパク質が結合できるようにするようなものである。例えば、第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列が同一である場合、前記オペレーターのポリヌクレオチド配列は、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から選択される。
【００４７】
既に述べたように、第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、互いに同一ではなく、互いに異なり得る。同様に、既に述べたように、第一のｔｅｔオペレーター及び第二のｔｅｔオペレーターは任意のポリヌクレオチド配列を有し得るが、ただし、前記ポリヌクレオチド配列は、誘導剤の非存在下で、前記オペレーターの一方及び／又は両方に対してｔｅｔリプレッサータンパク質が結合できるようにするようなものである。例えば、第一のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から選択され得る。第二のｔｅｔオペレーターのポリヌクレオチド配列は、ａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）、ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号３）ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｇｇ（配列番号４）及びｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）からなる群から独立に選択され得る。しかしながら、第一のｔｅｔオペレーターがａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有する場合、第二のｔｅｔオペレーターは、ｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａａ（配列番号５）のポリヌクレオチド配列を有してはいけない。それでもなお、第一のｔｅｔオペレーターがｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａｃｃ（配列番号２）のポリヌクレオチド配列を有し、第二のテトラサイクリンオペレーターがａｃｔｃｔａｔｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｔａｔ（配列番号１）のポリヌクレオチド配列を有することが好ましい。
【００４８】
本発明のベクター
本発明のプロモーター配列は、通常、少なくとも１個の発現ベクター（例えば、以下に限定されないが、プラスミド、ウイルス又はファージなど）に組み込まれる。多数の好適なベクターが当業者に公知であり、市販されており、本発明において使用できる。例として次のベクターを示す。細菌性：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ．Ｃａｌｉｆ）、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）;ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、複製可能で宿主中で生存可能である限り、任意の他のベクターを使用し得る。所望ならば、大量のベクターＤＮＡを生成させることができる（例えば、リプレッサータンパク質を産生する細菌へとベクターを転移させることにより）。
【００４９】
発現ベクターはまた、関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列も含有する。関心のあるこのポリヌクレオチド配列はあらゆるソース由来であり得、当業者に公知の様々な手段によりベクターに挿入し得る。通常、関心のあるポリヌクレオチド配列を好適な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入することができる。このような手段及び他の手段は、当業者の範囲内にあるものとする。発現ベクターはまた、複製起点、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための好適な配列も含み得る。さらに、ベクターは、抗生物質（例えば、アンピシリン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８）耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ又は、ベクターを含有する細胞の選択に使用できるその他の遺伝子産物などの１以上の選択可能なマーカー配列を含有し得る。
【００５０】
上記で簡潔に述べたように、ベクターは、関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列を含有し得る。ベクターは、関心のある２以上のポリヌクレオチド配列を含有し得る（ここで、各ポリヌクレオチド配列は、それ自身のプロモーター配列に作動可能に連結されている）。各ポリヌクレオチド配列に対するプロモーター配列は、同じ又は異なり得るが、ただし、少なくとも１個のポリヌクレオチド配列が、本発明の少なくとも１個のプロモーター配列に作動可能に連結されている。例えば、ベクターは、関心のある第一のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第一のプロモーター配列及び第二のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第二のプロモーター配列を含有し得る。第一の及び第二のプロモーター配列は、それぞれ、本発明のプロモーター配列であるか、又は異なるプロモーター配列であり得るが、ただし、第一の又は第二のプロモーター配列の少なくとも１個は、本発明のプロモーター配列である。本発明のプロモーター配列ではなく、関心のある第一の又は第二のポリヌクレオチド配列の何れかに作動可能に連結することができる好適なプロモーター配列の例としては、以下に限定されないが、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．コリｌａｃ又はｔｒｐ、ファージλＰｓｕｂＬプロモーター、及び当業者に公知の他のプロモーターが挙げられる。その他の制御及び／又は調節配列が前記プロモーターとともに同様に含まれ得る。あるいは、関心のある第一の及び第二のポリヌクレオチド配列を本発明のプロモーター配列に、好適な様式で、タンデムに、及び作動可能に連結することができる。
【００５１】
以下に限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション及び受容体を介したエンドサイトーシス、ポリブレン、粒子衝突法及びマイクロインジェクションなどの当業者に公知の任意の方法を用いて、本明細書中に記載のベクターを哺乳動物（以下に限定されないが、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、げっ歯類、マウスなど）又は非哺乳動物（以下に限定されないが、昆虫、爬虫類、魚類、鳥類など）細胞などの宿主細胞に導入（つまり、形質転換又はトランスフェクション）することができる。あるいは、ベクターをウイルス粒子として細胞にデリバリーすることができる（複製可能又は複製欠損性のいずれか）。核酸のデリバリーに有用なウイルスの例としては、以下に限定されないが、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスが挙げられる。当分野で公知の細胞へのポリヌクレオチド配列のデリバリーに好適なその他のウイルスを本発明において同等に使用できる。
【００５２】
プロモーター配列を活性化し、トランスフェクトされた細胞を選択することなどに好適なように改変した従来の栄養培地中で操作した宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した細胞とともに既に使用されるものであり、当業者にとって明らかである。
【００５３】
好ましくは、ｔｅｔリプレッサータンパク質を発現するように操作した宿主細胞に組換えベクターを転移させるか、形質転換又はトランスフェクトする。ｔｅｔリプレッサータンパク質を発現するように宿主細胞を操作する方法は数多くある。例えば、ある方法は、ｔｅｔリプレッサー遺伝子配列をプロモーター配列に作動可能に連結すること及び次いで、関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能にタンデム連結された本発明のプロモーター配列を含有するベクターにこれを組み込み、次にこのベクターを宿主細胞に転移させるか、形質転換又はトランスフェクトすることである。このような発現ベクターにおいて、ｔｅｔリプレッサー配列を第二のプロモーター配列（第一のプロモーター配列は、少なくとも２個のｔｅｔオペレーターを含有し、関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列である）に作動可能に連結させる。組換えベクターは、関心のある少なくとも２個のポリヌクレオチド配列を含有し、ｔｅｔリプレッサー配列は、関心のあるポリヌクレオチド配列がそれぞれ１個のプロモーターに作動可能に連結されているか、又は別々のプロモーターに作動可能に連結されているかに依存して、「第二」又は「第三」のプロモーター配列に作動可能に連結される。あるいは、プロモーター配列に作動可能に連結されたｔｅｔリプレッサー配列を含有する個別の組換えベクターを用いて、関心のあるポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された本発明のプロモーター配列を含有するベクターの転移前に、細胞に対して形質転換又はトランスフェクションを行い得る。ｔｅｔリプレッサー配列に作動可能に連結させ得る好適な「プロモーター配列」又は「第二」もしくは「第三」のプロモーター配列の例としては、以下に限定されないが、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、Ｅ．コリｌａｃ又はｔｒｐ、ファージλＰｓｕｂＬプロモーター、及びｔｅｔリプレッサー配列の発現を調節することが知られているその他のプロモーターが挙げられる。その他の制御及び／又は調節配列も同様に前記プロモーターとともに含まれ得る。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて特異的なポリヌクレオチド配列を増幅することにより、当業者にとって周知のハイブリダイゼーション技術を用いて、組み込まれたベクターを含有する操作した宿主細胞を同定することができる。例えば免疫学的又は酵素的アッセイにより検出可能なタンパク質を産生する細胞にポリヌクレオチド配列が転移される場合、細胞にテトラサイクリンを導入し、次いで細胞周囲の培地又は細胞ライゼートの何れかにおいてアッセイを行うことにより、組換えタンパク質の有無を確認できる。
【００５５】
本明細書中で既に述べたように、誘導剤の非存在下で、本明細書中に記載のプロモーター配列を含有する組換えベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトを行った宿主細胞は、当分野で公知の他の誘導性ｐｏｌ  ＩＩＩ依存性プロモーター配列と比較して、基礎転写活性が低い。それでもなお、誘導剤を用いて、宿主細胞に組み込まれた関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列の転写を達成することができる。関心のある少なくとも１個のポリヌクレオチド配列の転写を達成するために宿主細胞に添加すべき誘導剤の量は、当業者によって容易に決定され得る。いったん誘導されると、少なくとも１個のポリヌクレオチド配列の転写により、ＲＮＡ分子が生じる。好ましくは、このＲＮＡ分子は、宿主細胞において標的遺伝子の発現を調節する。宿主細胞に対して、１を超える関心のあるポリヌクレオチド配列を含有する組換えベクターを用いて形質転換又はトランスフェクトを行う場合、各ポリヌクレオチド配列からＲＮＡ分子が産生される。好ましくは、これらのＲＮＡ分子は、宿主細胞において１を超える標的遺伝子の発現を調節する。例えば、前記宿主細胞に対して、関心のある２個のポリヌクレオチド配列を用いて形質転換又はトランスフェクトを行う場合、関心のある第一のポリヌクレオチド配列は、転写の結果として、前記細胞中で第一の標的遺伝子の発現を調節する第一のＲＮＡ分子を産生し得る。関心のある第二のポリヌクレオチド配列もまた、転写の結果として、前記細胞中で第二の標的遺伝子の発現を調節する第二のＲＮＡ分子を産生し得る。好ましくは、前記第二の標的遺伝子は第一の標的遺伝子とは異なる。また、好ましくは、第一の及び／又は第二のＲＮＡ分子によって遂行される調節は、第一の及び／又は第二の標的遺伝子の阻害又は抑制である。しかしながら、本発明が意図するのは、１個のＲＮＡ分子が第一の標的遺伝子を阻害又は抑制し得、一方で第二のＲＮＡ分子が第二の標的遺伝子を活性化又は刺激し得ることである。
【００５６】
小分子干渉ＲＮＡ及び小分子ヘアピン型ＲＮＡ
本発明の理解を促進するために、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの簡潔な説明を与える。いくつかの米国特許及びＰＣＴ特許出願公開は、ｓｉＲＮＡs及びｓｈＲＮＡの、設計、合成、精製及び細胞へのデリバリーの好ましい方法を教示する。特に米国特許出願Ｕ．Ｓ．２００３／０１４８５１９（その全体が本明細書中に参考として援用されている）は、哺乳動物細胞でのｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの細胞内発現及びデリバリーに対する組成及び方法を提供し、米国特許出願Ｕ．Ｓ．２００２／０１３２７８８（その全体が本明細書中に参考として援用されている）は、細胞での遺伝子発現を阻害する目的のために、インビボでｓｉＲＮＡを細胞にデリバリーするためのプロセスを提供する。
【００５７】
小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、小分子の分子間デュプレックスであり、一般に、ＲＮＡの２本の相異なる（センス及びアンチセンス）鎖から成り、それぞれ、およそ２１ヌクレオチドであり、１〜３個、好ましくは２個のヌクレオチドの１本鎖の３’オーバーハンドを伴い、およそ１９塩基対を形成する。ｓｉＲＮＡの塩基対領域は通常、分解又は翻訳阻害に標的化されるＲＮＡ転写産物において、実質的に「標的遺伝子」及びその相補体に対応するか、好ましくは全く同じである。
【００５８】
対応するＲＮＡ転写産物の効率的な分解又は抑制を誘導するのに必要とされるｓｉＲＮＡの特異的及び必要な特性は、標的とされる転写産物内の標的遺伝子の特性とともに調べられてきた。効果的なｓｉＲＮＡ設計のための方法は、Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：３１９１−３１９７（１９９９）及びＥｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８（２００１）（それぞれが本明細書中に参考として援用されている）に記載されている。
【００５９】
本発明の目的のために、ｓｉＲＮＡを含む個々の１本鎖ＲＮＡを内生的に（細胞内で）合成する。次に、２本の相補的１本鎖をアニーリングさせてＲＮＡデュプレックス−ｓｉＲＮＡを形成させねばならない。アニーリング段階もまた内生的に起こる。本発明のプロモーターを含有する本明細書中に記載のベクターを用い、細胞性ＲＭＡポリメラーゼによって、内生的合成１本鎖ＲＮＡを合成する。
【００６０】
小分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、互いにペアになり得る自己相補性の領域を有する１本鎖ＲＮＡであり、この自己相補性の領域により、１本鎖が、ステム−ループ型構造を有する分子内デュプレックスに折りたまれることが可能となる。ペアにならないループ領域は理論的にあらゆるサイズであり得るが、同じ１本鎖ＲＮＡ内の自己相補性配列が互いに容易に見出され、塩基対を形成できるよう十分にループが小さいことが有利である。好ましいループサイズは、４〜９ヌクレオチド以上であり、最も好ましくは、５〜８ヌクレオチドのループである。一般に、ループの配列は重要ではないが、パリンドローム配列を含有すべきでない。細胞内でｓｈＲＮＡのループが切断され、ｓｉＲＮＡとは異なる分子間デュプレックスが形成される。ｓｈＲＮＡのステム領域は、一般に、およそ１９〜２９塩基対を含有し、通常、対になった領域を越えて伸びるｓｈＲＮＡの３’末端は、複数のチミジル残基から構成される。分解の標的とされるＲＮＡ転写物において、ｓｉＲＮＡの塩基対領域がそうであるように、ｓｈＲＮＡの塩基対領域は、通常、実質的に、好ましくは正確に、標的遺伝子及びその相補体と一致する。
【００６１】
ｓｉＲＮＡの１本鎖と同様に、内部的または外部的の何れかでｓｈＲＮＡを合成することができる。内部合成されたｓｈＲＮＡは通常、本発明のプロモーターを含有する本明細書中に記載のベクターを用い、細胞性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。
【００６２】
非ヒト哺乳動物における遺伝子発現調節のための方法
別の実施形態では、本発明は、非ヒト動物の少なくとも１個の真核細胞において少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節する方法に関する。これらの方法は、本明細書中に記載のプロモーター配列及び組換えベクターを用いて、関心のあるポリヌクレオチド配列の転写を誘導することを含む。本明細書中で既に述べたように、前記関心のあるポリヌクレオチド配列の転写により、少なくとも１個のＲＮＡ分子が産生される。産生され得るＲＮＡ分子の例としては、以下に限定されないが、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが挙げられる。これらのＲＮＡ分子は、このような細胞中で少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するために使用される。
【００６３】
真核細胞中で少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節するための様々な方法において、本明細書中に記載の本発明のプロモーター配列及びベクターを使用することができる。より具体的には、この方法は、少なくとも１個の真核細胞を提供することと、次いで、本明細書中に記載の組換えベクターの少なくとも１個を用い、前記真核細胞に対して形質転換又はトランスフェクションを行うことを含む。本明細書中に記載の組換えベクター内に含有される少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列により、転写後に、前記細胞中で好ましくは少なくとも１個の標的遺伝子の発現を調節する少なくとも１個のＲＮＡ分子が産生される。意図する目的に依存して、少なくとも１個のＲＮＡ分子は、１）標的遺伝子を活性化又は刺激、あるいは２）標的遺伝子を阻害又は抑制することができる。例えば、真核細胞内の標的遺伝子が「ノックアウト」されるべき場合、産生されるＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり得る。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを使用して標的遺伝子を「ノックアウト」できることは、当業者に公知である。従ってこの調節の結果、標的遺伝子を阻害又は抑制することとなる。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードする関心のあるポリヌクレオチド配列を作製する方法を本明細書中に記載する。
【００６４】
トランスジェニック非ヒト動物
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のプロモーター配列及びベクターを含有するトランスジェニック非ヒト動物ならびに前記動物を作製する方法に関する。様々な方法を使用して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。例えば、標的遺伝子のポリヌクレオチド配列の特定の変更を行うことは、使用できる１つのアプローチである。インビトロで使用される様々な酵素的及び化学的方法により、変更を行うことができる。最も一般的な方法の１つは、突然変異原として特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、標的遺伝子において、精密に設計された欠失、挿入及び点突然変異を生じさせることである。第二に、野生型ヒト遺伝子及び／又はヒト化非ヒト動物遺伝子を相同組換えにより挿入し得る。本発明のプロモーターを用い、ゲノム又はミニジーン構築物として、変更された又は突然変異（１又は複数）ヒト遺伝子を挿入することも可能である。
【００６５】
さらに、少なくとも１個の内在標的遺伝子が「ノックアウト」されている、トランスジェニック非ヒト動物も作製することができる。ノックダウン動物の作製により、当業者は、ノックアウトされた遺伝子のインビボでの機能を評価できるようになる。様々な方法において、少なくとも１個の標的遺伝子のノックアウトを行うことができる。標的遺伝子を「ノックアウト」するのに使用できる或るストラテジーは、相同組換えにより内在遺伝子の人工的修飾断片を挿入することによるものである。この技術において、相同組換えにより、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞に変異対立遺伝子を導入する。研究されている遺伝子の１つの対立遺伝子にノックアウト突然変異を含有する胚性幹細胞を胚盤胞に導入する。得られた動物は、移植したＥＳ細胞及び宿主細胞の両方由来の組織を含有するキメラである。キメラ動物を交尾させ、突然変異が生殖細胞系に組み込まれているか否かを評価する。ノックアウト突然変異に対してそれぞれヘテロ接合であるこれらのキメラ動物を交尾させ、ホモ接合型のノックアウトマウスを作製する。少なくとも１個の遺伝子を「ノックアウト」するのに使用できる第二のストラテジーは、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ及び卵母細胞マイクロインジェクション又は胚性幹細胞へのトランスフェクション又はマイクロインジェクション（本明細書中でさらに述べる）を使用することを含む。本明細書中で既に述べたように、本発明のプロモーター配列がより厳重な制御を示すので、当分野で公知の他のプロモーター配列と比較した場合、これらのプロモーター配列により、誘導性ノックダウン細胞株及び動物作製の成功率が大きく向上する。
【００６６】
変更されたヒト標的遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を作製するために、卵母細胞マイクロインジェクション又は胚性幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロインジェクションの標準的な技術を用い、関心のあるポリヌクレオチド配列を非ヒト動物生殖系列に挿入することができる。あるいは、内在遺伝子のノックアウト又は置換が必要である場合、卵母細胞マイクロインジェクション又は胚性幹細胞へのトランスフェクションもしくはマイクロインジェクションを用い、胚性幹細胞を用いた相同組換え又はｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡを本明細書中に記載のように使用できる。
【００６７】
卵母細胞インジェクションの場合、本発明のプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を、受精させたばかりの非ヒト動物卵母細胞の前核に挿入することができる。次に、この卵母細胞を偽妊娠養母に再移植する。次に、関心のあるポリヌクレオチド配列の存在に関して尾部由来などの動物のＤＮＡを分析することにより（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて）、生きて生まれた非ヒト動物を組み込みについてスクリーニングすることができる。次いで、キメラ非ヒト動物を同定する。トランス遺伝子は、ＹＡＣ又は染色体断片として注入された完全なゲノム配列、ｃＤＮＡ又はコード領域全体を含有するミニジーン及び、最適な発現のために必要であることが分かっている他のエレメントであり得る。
【００６８】
初期胚のレトロウイルス又はレンチウイルス感染（Ｌｏｉｓ  Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５：８６８−８７２（２００２）を参照のこと（レンチウイル遺伝子組換えを用いたトランスジェニックのための方法を教示する））もまた、変更された遺伝子を挿入するために行われ得る。この方法では、キメラを作製するために発生の初期段階でマウス胚に直接感染させるのに使用するレトロウイルスベクターへと変更遺伝子を挿入し、これらの幾つかにより、生殖細胞系列伝達が導かれる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３：１２６０−１２６４（１９７６））。
【００６９】
胚性幹細胞を用いた相同組換えにより、遺伝子転移細胞のスクリーニングによって稀な相同組換えを同定することができるようになる。いったん同定されると、これらを使用して、少なくとも１個の非ヒト動物胚盤胞の注入によりキメラを作製することができ、得られる動物の割合から、組換え系列からの生殖細胞系列伝達が示される。この遺伝子標的法は、特に、遺伝子の不活性化が望ましい場合に有用である。例えば、選択可能マーカーに隣接するエクソンからの配列を含有するポリヌクレオチド断片を設計することにより、遺伝子の不活性化を行うことができる。相同組換えにより、エクソンの途中でのマーカー配列の挿入が導かれ、遺伝子が不活性化される。次に、個々のクローンのＤＮＡ分析を用いて、相同組換えを見分けることができる。
【００７０】
あるいは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを用いて標的遺伝子の「ノックアウト」を行うことができる。あるストラテジーでは、卵母細胞マイクロインジェクションを本明細書中に記載のように使用することができる。特に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである少なくとも１個のＲＮＡ分子を発現し、本発明の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を含有するトランス遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて調製される。このトランス遺伝子を好ましくは注入により、非ヒト動物受精卵母細胞に導入する。次に、受精卵母細胞を胚へと発生させる。次に、得られる胚を偽妊娠雌非ヒト動物及に移し、次いで出産させる。次に、試料を得て、動物のＤＮＡを解析することにより（ＰＣＲなどの技術を用いる。）、トランス遺伝子を含有するキメラ動物に関して、生きて生まれた非ヒト動物のスクリーニングを行い、このようなキメラ非ヒト動物を同定する。これらの非ヒト動物を誘導剤で処理すると、転写が誘導され、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが発現され、標的遺伝子が抑制もしくは「ノックアウト」される。誘導剤がない場合、遺伝子は抑制又は「ノックアウト」されない。
【００７１】
第二のストラテジーでは、本明細書中に記載のように、胚性幹細胞のマイクロインジェクションを用いることができる。特に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであり、本発明の少なくとも１個のＲＮＡ  ｐｏｌＩＩＩ依存性プロモーター配列に作動可能に連結された、少なくとも１個のＲＮＡ分子を発現する少なくとも１個の関心のあるポリヌクレオチド配列を含有するトランス遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて調製される。好ましくは注入によって、これらの胚性幹細胞を少なくとも１個の非ヒト動物胚盤胞に導入することにより、キメラを作製するのに使用できる非ヒト動物胚性幹細胞にこのトランス遺伝子を導入する。次に、得られる胚盤胞を偽妊娠雌非ヒト動物に移植し、次にキメラ非ヒト動物を出産させる。ＰＣＲを使用して、関心のある動物を同定することができる。次に、試料を得て、前記動物のＤＮＡ試料を得て解析することにより（ＰＣＲなどの技術を用いて）、トランス遺伝子を含有するキメラ動物に関して、生きて生まれた非ヒト動物のスクリーニングを行い、このようなキメラ非ヒト動物を同定する。次に、このキメラ非ヒト動物を繁殖に用いて、それらのゲノム内にこのトランス遺伝子を安定的に含有するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。前出の方法と同様に、これらの非ヒト動物を誘導剤で処理すると転写が誘導され、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが発現され、標的遺伝子が抑制もしくは「ノックアウト」される。誘導剤がない場合、遺伝子は抑制又は「ノックアウト」されない。
【００７２】
例えば、Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｊｕｎｅ：４９（２）、１１３−２０（１９９２）；Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ」、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；ＷＯ９１／０８２１６又は米国特許第４，７３６，８６６号（これらの開示全体が本明細書中に参考として援用されている）において、トランスジェニック動物を作製する方法が記載されている。
【００７３】
ここで、一例として、限定的なものでなしに、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００７４】
ｓｈＲＮＡ発現用の厳重に制御されたＵ６プロモーターの開発
ａ．ルシフェラーゼアッセイ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、ルシフェラーゼレポーター構築物、ｐＧＬ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、細胞にトランスフェクトした。Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いてルシフェラーゼ活性を調べた。
【００７５】
ｂ．ウェスタン分析
６ウェルプレートにおいて１ＸＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で細胞を直接溶解させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、Ｃｈｋ１（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｔｚ，ＣＡ９５０６０）、ＨＩＦ−１α（１：５００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ９４３０３）、又はｔｅｔＲ（１：２０００、Ｍｏ  Ｂｉ  Ｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｙ）に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
【００７６】
ｃ．細胞培養
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＤ５４−ＭＧ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが所有する特許品の細胞株）細胞を増殖させた。１０％ＦＢＳを添加した最小必須培地（ＭＥＭ）中でＨｅＬａ−ＴＲＥｘ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を増殖させた。１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中でＨ１２９９（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが所有する特許品の細胞株）細胞を増殖させた。細胞は全て、５％ＣＯ２の環境中、３７℃にて維持した。ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８）を用いてＤ５４−ＭＧ親細胞株をトランスフェクトし、ブラスチシジン１０μｇ／ｍＬを用いて選択することにより、Ｄ５４−ＭＧ−ｔｅｔＲ細胞株を樹立した。
【００７７】
ｄ．分子クローニング
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ヒトＵ６プロモーターを合成した。ＰＣＲ反応は全て、次のプライマーを用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により行った：
【００７８】
【化１】
2008508887.tif 000003
【００７９】
プライマーＵ６＿１、Ｕ６＿２、Ｕ６＿３、Ｕ６＿４、Ｕ６＿５及びＵ６＿６を用いてアセンブリした後、Ｕ６＿５’ＰＣＲ（ｇａｔｃｇａａｔｔｃｃａｇｇｃａａａａｃｇｃａｃｃａｃｇｔｇ）（配列番号２５）及びＵ６＿３’ＰＣＲ（ｔｃｔａｇａａｇｃｔｔｇｇｔｇｔｔｔｃｇｔｃｃｔｔｔｃｃａｃ）（配列番号２６）のプライマーペアを用いて、全長Ｕ６プロモーターを増幅した。増幅されたＰＣＲ断片を、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ＋）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしして、ｐＵ６を作製した。
【００８０】
テトラサイクリン制御Ｕ６プロモーター変異体ｐＵ６＿Ｏ１、ｐＵ６＿Ｏ２、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿１、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿２、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿３、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿４、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿５、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿６及びｐＵ６＿２Ｏ２は全て、Ｕ６プロモーターのＰＣＲ修飾により作製した。Ｕ６＿５’ＰＣＲを５’プライマーとして用いて、次のプライマーをそれぞれ３’プライマーとして用いた：
【００８１】
【化２】
2008508887.tif 000004
2008508887.tif 000005
【００８２】
簡潔に述べると、鋳型としてｐＵ６を、プライマーとしてそれぞれＵ６＿５’ＰＣＲ及びＯ１ｒｅｖ又はｐＵ６＿Ｏ２を用いて、ＰＣＲによりｐＵ６＿Ｏ１及びＵ６＿Ｏ２を作製した。テトラサイクリン制御Ｕ６プロモーター変異体ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿１、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿２、ｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿３及びｐＵ６＿Ｏ１Ｏ２＿４は全て、鋳型としてｐＵ６＿０１を、５’プライマーとしてＵ６＿５’ＰＣＲを、３’プライマーとしてそれぞれＯ１Ｏ２＿l、Ｏ１Ｏ２＿２、Ｏ１Ｏ２＿３、又はＯ１Ｏ２＿４を用いて、ＰＣＲにより作製した。２つのＰＣＲ段階によりｐＵ６＿０１０２＿５及びｐＵ６＿０１０２＿６を作製した。第一の段階において、ｐＵ６＿０１を鋳型として使用し、プライマーペアＵ６＿５’ＰＣＲ及びＯ１Ｏ２＿５又はＵ６＿５’ＰＣＲ及びＯ１Ｏ２＿６をそれぞれプライマーとして用いた。第二の段階において、第一の段階からのＰＣＲ産物をそれぞれ鋳型として使用し、Ｕ６＿５’ＰＣＲ及びＯ１Ｏ２＿ｒｅｖをプライマーとして用いた。ｐＵ６を鋳型として、Ｕ６＿５’ＰＣＲ及び２Ｏ２をプライマーとして用いて、ＰＣＲにより２個のＯ２タイプｔｅｔオペレーターを有するＵ６プロモーター変異体、ｐＵ６＿２Ｏ２を作製した。
【００８３】
ｓｈＲＮＡ標的ルシフェラーゼ又はＨＩＦ−１αを発現するＵ６プロモーター変異体を、Ｕ６＿ｌｕｃ、Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ２＿ｌｕｃ、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ１、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ２、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ４、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ６、２Ｏ２＿ｌｕｃ及び２Ｏ２＿Ｈｉｆ１と名付けた。プライマー、Ｕ６＿５’ＰＣＲ及び、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ６の両方を作製するためにプライマーＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ＿ｒｅｖを使用することを除き、次の３’プライマーそれぞれを用いて、各プロモーター変異体からＰＣＲによってこれらの構築物を作製した。次に、ＰＣＲ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳＫ＋）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。
【００８４】
【化３】
2008508887.tif 000006
2008508887.tif 000007
【００８５】
ｅ．転写活性及びＵ６プロモーター変異体のテトラサイクリン応答
ｓｈＲＮＡを発現するためにＵ６プロモーター変異体それぞれを使用するプラスミドをＵ６＿ｌｕｃ、Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ１、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ２、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ４、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ６と名付けた。これらのプラスミドのそれぞれ（０．００８μｇ）又は対照ベクター（対照ベクターはｐＵ６ベクターと同一であるが、ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを含有しない）を、１μｇ  ｐＧＬ３−対照及び０．５μｇ  ｐＲＬ−ＴＫとともに共トランスフェクトした（ｐＧＬ３−対照及びｐＲＬ−ＴＫプラスミドそれぞれが、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼを発現する。ホタルルシフェラーゼを阻害するようにこれらの構築物それぞれにおけるｓｈＲＮＡを設計した。正規化を行うためにウミシイタケルシフェラーゼを使用した。）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造者推奨のプロトコールに従い、トランスフェクトを行った。
【００８６】
トランスフェクト７２時間後に、トランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。Ｕ６＿ｌｕｃ、Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ１Ｏ２＿３、Ｏ１Ｏ２＿４、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ６（それぞれ０．２μｇ）及び対照プラスミドも、１μｇ  ｐＧＬ３−対照、０．５μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ及び１μｇ  ｐｃＤＮＡ６／ＴＲとともに、個々に共トランスフェクトした。さらに、１μｇ  ｐＧＬ３−対照、０．５μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ及び１μｇ  ｐｃＤＮＡ６／ＴＲとともに、対照プラスミド、Ｕ６＿ｌｕｃ、Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ２＿ｌｕｃ及び２Ｏ２＿ｌｕｃ（それぞれ０．２μｇ）を個々に共トランスフェクトした。ドキシサイクリン処理のために、トランスフェクト２４時間後、ドキシサイクリン１μｇ／ｍＬを含有する培地へと細胞の培地を交換した。ドキシサイクリンによる誘導から４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８７】
ｆ．ルシフェラーゼ  ｓｈＲＮＡを発現する安定的細胞株作製における、ｔｅｔＯ１及び２Ｏ２発現系の比較
安定的に組み込まれたＯ１＿ｌｕｃ（Ｏ１＿ｌｕｃ１からＯ１＿ｌｕｃ４）、２Ｏ２＿ｌｕｃ（２Ｏ２＿ｌｕｃ１から２Ｏ２＿ｌｕｃ７）又は２Ｏ２ベクター（対照）を有するＤ５４−ＭＧ−ｔｅｔＲ細胞に対して、１μｇ  ｐＧＬ３−対照及び０．５μｇ  ｐＲＬ−ＴＫを用いてトランスフェクトを行った。ドキシサイクリン処理のために、トランスフェクト２４時間後、ドキシサイクリン１μｇ／ｍＬを含有する培地へと細胞の培地を交換した。ドキシサイクリンによる誘導から４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。１μｇ／ｍＬ  ドキシサイクリンを用いて４８時間処理した後、細胞を溶解させ、抗ｔｅｔＲ抗体を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。同じブロットから結合物を剥がし、抗アクチン抗体を用いて免疫ブロットを行い、各レーンに試料が同じようにローディングされていることを示した。
【００８８】
ｇ．Ｈｉｆ−１  ｓｈＲＮＡを発現する安定的細胞株作製における、ｔｅｔＯ１及び２Ｏ２発現系の比較
組み込まれたＯ１＿Ｈｉｆ１カセット又は２Ｏ２＿Ｈｉｆ１カセットを有するＤ５４−ＭＧ−ＴｅｔＲ細胞株を１μｇ／ｍＬドキシサイクリンで４８時間処理し、次いで、１００μＭデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）で６時間処理した。１ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で細胞を溶解させ、Ｈｉｆ−１αに対する抗体（１：５００）を用いてウェスタンブロッティングにより分析した。
【００８９】
ｈ．結果
本発明者らは、最初に、転写活性を無効にすることなくＵ６プロモーターへと２個のｔｅｔオペレーターを遺伝子操作し得るか否かをを調べた。ＰＳＥとＴＡＴＡボックスとの間でＯ１タイプｔｅｔオペレーターを最初に操作し、Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：５７７−５８５（２０００）で報告されたものと同一であるＯ１タイプＵ６プロモーターを作製した（図１、Ｏ１参照）。次に、Ｏ１タイププロモーターの一部をＯ２タイプｔｅｔオペレーターで置換することにより、一群の、２個のｔｅｔオペレーターを有する改変ヒトＵ６プロモーターを作製した（図１参照）。各プロモーターがルシフェラーゼを標的とするｓｈＲＮＡを発現し、レポーター活性を阻害する能力により、改変ヒトＵ６プロモーターの転写活性を評価した。野生型Ｕ６プロモーターを利用してルシフェラーゼｓｈＲＮＡの発現を駆動するＵ６＿ｌｕｃを用いた用量反応実験に基づき、レポーター活性の８０％阻害を示すｓｈＲＮＡプラスミド（０．００８μｇ）の量を、改変Ｕ６プロモーターにより示される転写活性の評価のために選択した。阻害の程度は、Ｏ１及びＯ２タイプｔｅｔオペレーターの両方を含有するＵ６誘導体を用いてトランスフェクトした細胞において様々であった。Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ４、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ６を用いてトランスフェクトした細胞において、ルシフェラーゼ活性に対する同様のレベルの阻害が観察され、このことから、これらの位置におけるＯ１タイププロモーターへのさらなるＯ２タイプｔｅｔオペレーターの導入が、転写活性において限界効果しか持たないことが示唆される（図２Ａ、Ｏ１Ｏ２＿３、Ｏ１Ｏ２＿４、Ｏ１Ｏ２＿５及びＯ１Ｏ２＿６を参照）。
【００９０】
次に、活性のあるＵ６プロモーター誘導体の誘導剤ドキシサイクリンに対する応答について調べた。ドキシサイクリンの有無にかかわらず、Ｏ１＿ｌｕｃ、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ６を用いてトランスフェクトを行った細胞において、ルシフェラーゼ活性の強い阻害が観察され、このことから、これらの実験条件下でこれらのプロモーターが非常に漏出性が高いことが示唆される（図２Ｂ、Ｏ１、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ５及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ６参照）。対照的に、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ４を用いてトランスフェクトを行った細胞では、ドキシサイクリン非存在下よりもドキシサイクリン存在下でルシフェラーゼ活性が非常に低くなった。しかしながら、ドキシサイクリンの非存在下でさえも、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３及びＯ１Ｏ２＿ｌｕｃ４をトランスフェクトした細胞では、対照ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性は＞５０％低く（図２Ｂ、Ｏ１Ｏ２＿３及びＯ１Ｏ２＿４を参照）、このことから、これらのプロモーターがＯ１タイププロモーターと比較して、制御が向上したにもかかわらず、まだ非常に漏出性が高いことが示唆される。
【００９１】
誘導系をさらに向上させるために、Ｏ２タイプｔｅｔオペレーターを導入して、Ｏ１Ｏ２＿３においてＯ１タイプｔｅｔオペレーターを置換し、２Ｏ２タイププロモーターを作製した（図１、２Ｏ２参照）。Ｏ２タイプｔｅｔオペレーターは、Ｏ１タイプｔｅｔオペレーターよりも、ｔｅｔＲに対して強い結合親和性を有するので（Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４８：３４５−６９（１９９４））、発明者らは、Ｏ１Ｏ２＿３タイププロモーターよりも、２Ｏ２タイププロモーターに固く結合し、その結果、プロモーターの基礎転写活性が低下すると考えた。ドキシサイクリン非存在下では、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３は、対照プラスミドと比較して、ルシフェラーゼ活性の＞７０％の低下を引き起こした。同じ条件下では、２Ｏ２＿ｌｕｃの場合、ルシフェラーゼ活性の阻害はわずか３０％にすぎず（図２Ｃ参照）、このことから、２Ｏ２プロモーターは実際に、Ｏ１Ｏ２＿３プロモーターと比較して基礎活性が低いことが示された。その一方、Ｏ２＿ｌｕｃはルシフェラーゼ活性を約８５％低下させ、このことから、ドキシサイクリン非存在下でｓｈＲＮＡ発現を厳重に調節するためには、２個のＯ２タイプｔｅｔオペレーターが同時に必要とされることが示唆される（図２Ｃ参照）。ドキシサイクリンの存在下では、Ｏ１Ｏ２＿ｌｕｃ３及び２Ｏ２＿ｌｕｃの両方がルシフェラーゼ活性を８０％超阻害し、このことから、２Ｏ２及びＯ１Ｏ２＿３タイププロモーターが誘導において同様の活性を有することが示唆される（図２Ｃ参照）。これらの結果から、転写活性を顕著に犠牲にすることなく、Ｕ６プロモーターに２個のｔｅｔオペレーターを導入できることが分かった。その一方、ＴＡＴＡボックスにフランキングする２個のＯ２タイプｔｅｔオペレーターによれば、得られたＵ６プロモーター変異体、２Ｏ２は、単一のｔｅｔオペレーター（Ｏ１又はＯ２）又はＯ１及びＯ２タイプｔｅｔオペレーターの組み合わせを有するＵ６プロモーター変異体と比較して、最も優れたドキシサイクリン応答を示した。
【００９２】
染色体への組み込み後、２Ｏ２プロモーターがドキシサイクリンに対する応答能を維持しているか否かを調べるために、発明者らは、市販のｔｅｔＲ発現細胞株、ＨｅＬａＴＲＥｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８）を用いて、ヒトＨｉｆ１α（２Ｏ２＿Ｈｉｆ１）を標的とするｓｈＲＮＡに連結された２Ｏ２プロモーターを有する安定的クローンを樹立した。２Ｏ２＿Ｈｉｆ１カセットを有する５種類のクローンの中で、２種類のクローンにおいて誘導時のＨｉｆ１αタンパク質が９０％超低下した（図３Ａ、Ｈｉｆ１−６及びＨｉｆ１−７参照）。これらの結果から、染色体への組み込み後、２Ｏ２プロモーターがそのドキシサイクリン応答性を維持することが分かった。
【００９３】
最もよく制御された２Ｏ２＿Ｈｉｆ１クローン（Ｈｉｆ１−７）を用いて、発明者らは、さらに、２Ｏ２発現系のドキシサイクリン誘導の時間及び用量依存性の特徴を調べた。誘導から１２時間という早い段階でＨｉｆ１αタンパク質の顕著な低下が観察され、ドキシサイクリン処理から２４時間後、Ｈｉｆ−１タンパク質の９０％超の阻害が観察された。さらに長く誘導しても、Ｈｉｆ１αタンパク質のより完全な阻害が導かれなかった（図３Ｂ参照）。用量反応実験において、２Ｏ２系の最大誘導に必要なドキシサイクリン濃度を調べた。ドキシサイクリン０．１ｎｇ／ｍＬの存在下でＨｉｆ−１タンパク質の９０％超の阻害が観察され、ドキシサイクリン１０ｎｇ／ｍＬの存在下でＨｉｆ１αタンパク質の阻害が最大となった（図３Ｃ参照）。これらの結果から、ドキシサイクリン誘導に対する２Ｏ２系の迅速な応答及び極めて強い感受性が明らかとなる。
【００９４】
制御された標的ノックダウンのためのｐｏｌｙ  ＩＩＩ依存性誘導性発現系の使用は当分野で公知である（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．ら、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，４：６０９−６１５（２００３）、Ｍａｔｓｋｕｒａ，Ｓ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３１：ｅ７７（２００３）及びＣｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：ｅ１２７（２００３）を参照のこと）。これらの報告された観察とは対照的に、本発明者らは、最初の研究において、Ｏ１及びＯ２プロモーターの深刻な漏出性を観察した（図２Ｃ、Ｏ１及びＯ２を参照）。文献における系において観察された漏出性が、これらの系を用いた安定的な細胞株の作製能に負の影響を有するか否かを調べるために、発明者らは、Ｏ１及び２Ｏ２系の両方を用いて誘導性細胞株作製の成功率を直接比較した。ｔｅｔＲ発現レベルが高いＤ５４−ＭＧ細胞株を最初に樹立し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を用いて、ルシフェラーゼ（Ｏ１＿ｌｕｃ及び２Ｏ２＿ｌｕｃ）又はヒトＨｉｆ１α（Ｏ１＿Ｈｉｆ１及び２Ｏ２＿Ｈｉｆ１）を標的とするｓｈＲＮＡ発現を駆動するために、Ｏ１又は２Ｏ２プロモーターを利用するプラスミドをこの細胞株にトランスフェクトした。薬物耐性クローンを選択し、ＰＣＲで分析して誘導性ｓｈＲＮＡ発現カセットを担うクローンを同定した。発明者らは、ＰＣＲにより分析した際に、安定に組み込まれたＯ１＿ｌｕｃを有する４種類のクローン及び安定に組み込まれた２Ｏ２＿ｌｕｃカセットを有する７種類のクローンを得た。全クローンが同様のレベルのｔｅｔＲ発現を示した（図４Ｂ参照）。これらのクローンのドキシサイクリン誘導に対する応答性を調べた。４種類のＯ１＿ｌｕｃクローンの中で、顕著なドキシサイクリン依存性のルシフェラーゼ活性低下を示すものはなかった（図４Ａ、Ｏ１＿ｌｕｃ１からＯ１＿ｌｕｃ４を参照）。興味深いことに、４種類のＯ１＿ｌｕｃクローンのうち３種類が、ドキシサイクリンの有無に関わらず、ルシフェラーゼ活性の構成的な阻害を示し、このことから、Ｏ１系の激しい漏出性が示される（図４Ａ、Ｏ１＿ｌｕｃ１、Ｏ１＿ｌｕｃ２及びＯ１＿ｌｕｃ４を参照）。対照的に、７種類の２Ｏ２＿ｌｕｃクローンの中で、２種類のクローンが、ルシフェラーゼ活性の明らかなドキシサイクリン依存性阻害を示し（図４Ａ、２Ｏ２＿ｌｕｃ２、２Ｏ２＿ｌｕｃ４を参照）、３種類のクローンが、中程度の、ルシフェラーゼ活性のドキシサイクリン依存性阻害を示した（図４Ａ、２Ｏ２＿ｌｕｃ１、２Ｏ２＿ｌｕｃ５及び２Ｏ２＿ｌｕｃ７を参照）。クローンＯ１＿３、２Ｏ２＿３及び２Ｏ２＿６に対するｓｈＲＮＡ発現カセットを染色体の転写不活性部位に挿入することができ、その結果、ドキシサイクリンの有無に関わらず、ルシフェラーゼ活性は阻害されなかった。
【００９５】
Ｏ１  Ｈｉｆ１クローン及び２Ｏ２＿Ｈｉｆ１クローンからも同様の結果が得られた。分析した１０種類のＯ１＿Ｈｉｆ１クローンの中で、ドキシサイクリン処理時にＨｉｆ１αタンパク質の明らかな低下を示したものはなかった（図４Ｃ、上参照）。一方、１１種類の２Ｏ２＿Ｈｉｆ１クローンのうち２種類が、ドキシサイクリン処理時にＨｉｆ１αタンパク質の顕著な低下を示した（図４Ｃ、下、クローン５及び１１参照）。
【実施例２】
【００９６】
ドキシサイクリン調節下でＨｉｆ１αをノックダウンする癌細胞株の調製
Ｈｉｆ１阻害の治療効果の可能性を評価するために、発明者らは、ドキシサイクリン調節下でＨｉｆ１αに対するｓｈＲＮＡを発現するＤ５４−ＭＧ親細胞から安定的な細胞株を樹立した。Ｈｉｆ１αに対する一群の８種類のｓｈＲＮＡにおいて、標的をノックダウンする能力について最初にスクリーニングし（データは示さない）、Ｈｉｆ１αノックダウン細胞株の作製のために最良のｓｈＲＮＡを選択した。Ｈｉｆ１α  ｓｉＲＮＡの発現を駆動するために、２Ｏ２プロモーター、ｓｈＲＮＡの発現を厳重に制御する改変Ｕ６プロモーター（Ｘｉａｏｙｕ  Ｌｉｎ、印刷中）を選択した。作製された安定的なクローンは、ドキシサイクリン誘導時にＨｉｆ１αをノックダウンする能力には多様性があり、おそらくこれは、ｓｈＲＮＡ発現における様々な組み込み部位の影響によるものであろう（図５Ａ、及びデータは示さない）。Ｄ５４＿Ｌｕｃ、ドキシサイクリン誘導時にルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを発現する対照細胞株と比較して、Ｄ５４＿Ｈｉｆクローンは全て、ドキシサイクリン非存在下で同様のレベルのＨｉｆ１αタンパク質を産生し、このことから、２Ｏ２発現系が非常に厳重に制御されることが示される（図５Ａ）。エノラーゼプロモーターからのＨＲＥを含有するＨｉｆ１レポーターを用いて、誘導後に様々な程度のＨｉｆ１αノックダウンを示す複数のクローンのＨｉｆ１依存性転写活性についてさらに分析した。驚くべきことに、Ｈｉｆ１αタンパク質の８０％の低下は、レポーター活性において限界効果しかない（図５Ｂ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ１８）。レポーター活性における阻害の欠失はＨｉｆ２αのリダンダント機能によるものではなく、それは、これらの細胞が辛うじて検出可能なＨｉｆ２αを有し、Ｈｉｆ２αに対する強力なｓｉＲＮＡを用いてこれらの細胞をトランスフェクトすることにより、レポーター活性のさらなる阻害が行われなくなるからである（データは示さない）。これらの結果から、非常に低レベルのＨｉｆ１αタンパク質でさえＨｉｆ１−依存性下流因子の転写を活性化するのに十分であり、Ｈｉｆ１αの場合、Ｈｉｆ１経路を阻害するために非常に高レベルのノックダウンが必要であることが分かった。
【００９７】
Ｈｉｆ１αタンパク質の完全なノックダウンを示した細胞において、ドキシサイクリン処理により、レポーター活性の８０％低下が観察された（図５Ｂ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５）。Ｈｉｆ２αに対する強力なｓｉＲＮＡを用いてこれらの細胞をトランスフェクトした結果、レポーター活性がさらに阻害されず（データは示さない）、このことから、Ｈｉｆ１αがこれらの細胞において主要な形態であることが示される。ＱＰＣＲ分析から、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５細胞におけるドキシサイクリン処理の結果、ＰＧＫ１及びＬＤＨなどのＨｉｆ１下流因子の転写が低下したことが示された（図５Ｃ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５）。対照として、Ｄ５４＿Ｌｕｃ細胞も平行して分析した。Ｄ５４＿Ｌｕｃ細胞におけるドキシサイクリンにより、ルシフェラーゼレポーターの低下が起こった（図５Ｂ、Ｄ５４＿Ｌｕｃ）が、Ｈｉｆ１αタンパク質のノックダウン（図５Ａ、Ｄ５４＿Ｌｕｃ）又はＨｉｆ１標的遺伝子の阻害（図５Ｃ、Ｄ５４＿Ｌｕｃ）は起こらなかった。これらの結果から、Ｈｉｆ１αに対するｓｈＲＮＡの発現の結果、Ｈｉｆ１依存性転写の障害が起こり、この阻害効果は、ｓｈＲＮＡ発現又はドキシサイクリン処理による非特異的効果ではなく、むしろ、ｓｈＲＮＡによるＨｉｆ１αの特異的阻害によるものであることが分かった。
【実施例３】
【００９８】
異種移植腫瘍におけるＨｉｆ１αのドキシサイクリン依存性阻害
標的ノックダウンにより異種移植腫瘍を誘導することができるか否かを調べるために、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５細胞をＳＣＩＤマウスに対して皮下注入した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均サイズに到達した後、１ｍｇ／ｍＬドキシサイクリンを含有する飲用水をマウスに与えてＨｉｆ１α  ｓｈＲＮＡの発現を誘導した。ドキシサイクリンで３、６、９又は１２日間マウスを処理した後、腫瘍を回収し、ＱＰＣＲにより分析して、Ｈｉｆ１αメッセンジャーレベルを求めた。ドキシサイクリンを３日間与えたマウス由来の腫瘍において、Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡの８０％低下が観察され、全１２日間の処理期間にわたり、ノックダウンが維持された（図６Ａ）。免疫組織化学による腫瘍試料の試験から、第３日以降からのＨｉｆ１αタンパク質が明らかに減少していることが示された（データは示さない）。
【００９９】
標的ノックダウンを誘導する能力が、長期ドキシサイクリン処理にわたり又は腫瘍が非常に大きいサイズに到達した際に障害されるか否かを調べるために、ドキシサイクリンで４５日間処理したマウス由来の腫瘍におけるＨｉｆ１αのノックダウンをさらに分析した。処理終了時の平均腫瘍サイズは２０００ｍｍ３であった。３日間のドキシサイクリン処理を行ったマウス由来の腫瘍と比較して、これらの腫瘍において比肩し得る程度のＨｉｆ１αノックダウンが観察された（図６Ｂ）。免疫組織化学分析からもまた、Ｈｉｆ１αタンパク質がこれらの腫瘍において辛うじて検出可能なレベルに低下することが分かった（図６Ｃ）。これらの結果から、腫瘍が大きくなった場合でも、標的発現の強い抑制が長期にわたり維持され得ることが分かった。対照として、Ｄ５４＿Ｌｕｃ細胞の皮下注入も行い、異種移植腫瘍を生成させ、これらの腫瘍においてもＨｉｆ１αノックダウンを調べた。ドキシサイクリン誘導後、Ｄ５４＿Ｌｕｃ腫瘍においてＨｉｆ１α  ｍＲＮＡ又はタンパク質の低下は観察されず（図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃ）、このことから、Ｄ５４−Ｈｉｆ２５腫瘍におけるＨｉｆ１αの低下は、Ｈｉｆ１α  ｓｈＲＮＡ発現に特異的によるものであることが示唆される。
【実施例４】
【０１００】
Ｄ５４−ＭＧ腫瘍増殖に対するｓｉＲＮＡを介したＨｉｆ１αの阻害の効果
樹立された腫瘍において、Ｈｉｆ１αを阻害する治療効果の可能性を評価するために、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５又はＤ５４＿Ｌｕｃ（Ｌｕｃ）細胞を用いて、異種移植腫瘍を作製し、腫瘍が１９０ｍｍ３の平均サイズに達したときに、Ｈｉｆ１αノックダウンを開始した。Ｈｉｆ１αノックダウンの結果、腫瘍増殖が２相になった。最初の相において（図３Ａ、第１日から第１１日）、腫瘍は増殖を続けたが、機能的Ｈｉｆ１αを有する腫瘍と比較して、僅かに増殖速度は遅かった。第二の相において、腫瘍は、小さいが再生可能な一時的退化を示し、Ｈｉｆ１αなしで増殖を再開した（図５Ａ、第１１日及びそれ以降）。対照群と比較して、ドキシサイクリン処理群において全体的な腫瘍増殖がより遅かったにもかかわらず、処理群の腫瘍は全て最終的に大きくなり、その結果、動物は死亡した（図７Ａ）。Ｄ５４＿Ｌｕｃ細胞から作製した異種移植腫瘍は、飲用水中のドキシサイクリンの有無に関わらず同じ速度で増殖し、このことから、Ｈｉｆ１α  ｓｈＲＮＡを発現する腫瘍の増殖が遅いという表現型は、Ｈｉｆ１αノックダウンの結果であることが示される（図７Ａ）。ドキシサイクリン処理時にＨｉｆ１α  ｓｈＲＮＡを発現する２種類の独立のクローンを用いて腫瘍増殖におけるＨｉｆ１αノックダウンの同様の阻害効果が観察され、これにより、観察された効果は一定であり、異常なクローンによるものでないことが分かった（データは示さない）。これらの結果から、樹立された腫瘍におけるＨｉｆ１αの欠失により、腫瘍退化を導く一時的な危機が起こることが示唆される。しかしながら、腫瘍はＨｉｆ１αの欠失に適応することができ、より遅い速度で増殖を続けることができる。
【０１０１】
インビトロでのドキシサイクリン処理時にＨｉｆ１αタンパク質の８０％ノックダウンを示したいくつかのクローンが利用できるため、Ｈｉｆ１αの部分的阻害がインビボでの治療的有用性を生み出すのに十分であるか否かを調べることができた。Ｄ５４＿Ｈｉｆ１８細胞を用いて異種移植腫瘍を生成させ、平均腫瘍サイズが１５０ｍｍ３になった時点でＨｉｆ１αノックダウンを開始した。インビトロにおいてＨｉｆ１−依存性転写の顕著な阻害がないことと一致して（図５Ｂ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ１８）、ドキシサイクリン処理により、これらの腫瘍では腫瘍増殖に対して十分な効果を生み出すことができなかった（図７Ｂ）。これらの結果から、インビボで腫瘍増殖に負の影響を与えるためには、Ｈｉｆ１αタンパク質レベルでの高度の阻害が必要であることが示唆される。
【実施例５】
【０１０２】
チロシナーゼノックダウンマウスの作製
ａ．前核注入を用いたノックダウンマウスの作製
前核注入は、トランスジェニック動物を作製するためのよく樹立された方法である。このアプローチにおいて、ＤＮＡ断片（トランス遺伝子）を受精卵の前核段階に注入し、注入した卵を偽妊娠動物に移植する。通常の実験においては、５０から８０個の卵に注入し、注入した卵の半分が生存して新生仔を生成し、新生仔の５％から２０％がトランス遺伝子を含有する。
【０１０３】
ノックダウンする標的として、チロシナーゼを選択した。チロシナーゼはメラニン産生に重要な酵素であり、マウスでのチロシナーゼノックダウンにより、明確な体毛の色の変化が生じる。
【０１０４】
ｂ．チロシナーゼノックダウンマウス作製のための、２Ｏ２プロモーターにより駆動されるトランス遺伝子及び前核注入の使用
改変ｐｏｌｙ  ＩＩＩ依存性プロモーター（例えば２Ｏ２プロモーターなど）がノックダウン動物の作製に適切であるか否かを調べるために、チロシナーゼに対する２つの最良のｓｈＲＮＡを発現させるよう２Ｏ２プロモーターを使用するトランス遺伝子を調製した（２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１（配列番号４６）及び２Ｏ２−Ｔｙｒ３３８（配列番号４７））。これらのトランス遺伝子を以下に示す。太字はｓｈＲＮＡ配列を表し、下線のある文字はプロモーター配列を表す。ｔｅｔリプレッサー（ｔｅｔＲ）を発現しないマウスからの胚を用いて、第一セットの注入を行った。ｔｅｔＲ発現のないマウスにおいて、２Ｏ２プロモーターは構成的に活性であると予想される。
【０１０５】
２Ｏ２プロモーターにより駆動されるトランス遺伝子：
【０１０６】
【化４】
2008508887.tif 000008
【０１０７】
２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１トランス遺伝子（配列番号４６）を注入した胚から生まれた２０匹の仔の中で、３匹の仔が安定的に組み込まれたトランス遺伝子を有しており、図８ＡからＢで示すように、様々な程度の体毛の色の変化を示した。図８Ａは、野生型マウスの濃い体毛の色と比較して、初代マウスの１匹のＦＯの体毛の色が薄いことを示す。トランス遺伝子特異的プライマーを用いて、ＰＣＲによりマウスの遺伝子型を調べた。図８Ｂは、３匹の仔が他のＦ１仔の濃い色と比較して白く、２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１トランス遺伝子（配列番号４６）に対して陽性であることを示す。体毛の色が薄い初代マウスからのこれらのＦ１トランスジェニック子孫は、ｓｉＲＮＡ介在抑制効果が世代を通じて受け継がれ得ることを示す。
【０１０８】
２Ｏ２−Ｔｙｒ３３８トランス遺伝子（配列番号４７）を注入した胚から、４０匹の仔が生まれ、２個の胚が死んだ。４０匹の新生仔のうち、トランス遺伝子を有するものはなかったが、死んだ両胚は２Ｏ２−Ｔｙｒ３３８トランス遺伝子（配列番号４７）を有しており、このことから、２Ｏ２−Ｔｙｒ３３８トランス遺伝子（配列番号４７）により、Ｔｙｒ３３８ｓｈＲＮＡの標的外れの効果による、胚の致死が起こることが示唆される。
【０１０９】
これらの結果から、２Ｏ２プロモーターがノックダウン動物の作製によく適していることが示唆される。
【０１１０】
２Ｏ２系を用いて条件付きのノックダウン動物を作製するための２つの平行するアプローチを利用することができる。第一のアプローチは、１個のトランス遺伝子において、２Ｏ２−ｓｈＲＮＡカセットをＣＡＧＧＳ−ｔｅｔＲカセットとともに共デリバリーすることを含む。ニワトリβアクチンプロモーターは、遍在性の遺伝子発現のための、特徴がよく分かっているプロモーターである。ＣＡＧＧＳ−ｔｅｔＲカセットは、ニワトリβアクチンプロモーターを利用してｔｅｔＲの発現を駆動し、その結果、マウス組織の大部分でｔｅｔＲの発現が起こる。このアプローチを使用して、短時間で条件つきノックダウン動物を作製することができる。
【０１１１】
第二のアプローチは、遍在性なｔｅｔＲ発現のあるマウス系列の作製を含む。次に、全ての条件付きノックダウンプロジェクトに対してこのマウス系列を親系列として使用して、標的をより均一に制御することができる。ＲＯＳＡ２６遺伝子座の遺伝子が遍在性に発現されることが分かっている。従って、ＲＯＳＡ２６遺伝子座においてｔｅｔＲ発現カセットを破壊して、遍在性ｔｅｔＲ発現のあるマウス系列を得る。
【０１１２】
本発明が目的を実行し、述べた結果及び長所ならびにそこに固有であるものを得るように構成されることを当業者は容易に認めるであろう。本明細書中に記載の、分子複合体及び方法、手段、処理、分子、具体的化合物は、目下、好ましい実施形態の代表であり、典型であって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書中で開示する本発明に対して、様々な置換及び変形がなされ得ることは、当業者にとって容易に認められよう。
【０１１３】
明細書中で述べた全ての特許及び刊行物は、本発明が関連する分野の当業者のレベルの指標である。全ての特許及び刊行物は、それぞれの個々の刊行物が具体的に及び個別に参考として援用されていることが示されるように、同程度に本明細書中に参考として援用されている。
【０１１４】
本明細書中で具体的に開示しない任意の要素（単数又は複数）、制限（単数又は複数）がない状態で、説明として本明細書中で適切に記載される本発明を実施することができる。従って、例えば、本明細書中で各例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「原則的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の何れも、他の２つの用語の何れかで置き換え得る。使用されている用語及び表現は、説明であって制限ではない用語として使用され、かかる用語及び表現の使用において、示され、述べられるものの任意の同等物又はそれらの一部を除外する意図はないが、主張される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。従って、好ましい実施形態により本発明を具体的に開示するが、本明細書中で開示される概念の、任意の特性、変更及び変化が当業者により用いられ得ること、及び、かかる変更及び変化が添付の請求項の範囲により定義されるように本発明の範囲内にあるとみなされることを理解されたい。
【０１１５】
さらに、本発明の特性又は態様をマーカッシュグループの観点で述べる場合、本発明が、マーカッシュグループのあらゆる個々のメンバー又はメンバーのサブグループの観点で、それによっても述べられることを当業者は理解するであろう。例えば、Ｘが臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択される場合、臭素であるＸに対する主張及び臭素及び塩素であるＸに対する主張が十分に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、Ｕ６プロモーター変異型の配列アラインメントを示す。Ｕ６は野生型ヒトＵ６プロモーター（配列番号６）である。Ｏ１（配列番号７）又はＯ２（配列番号８）は、Ｏ１及びＯ２タイプのヒトＵ６プロモーターである。Ｏ１Ｏ２＿１（配列番号９）、Ｏ１Ｏ２＿２（配列番号１０）、Ｏ１Ｏ２＿３（配列番号１１）、Ｏ１Ｏ２＿４（配列番号１２）、Ｏ１Ｏ２＿５（配列番号１３）及びＯ１Ｏ２＿６（配列番号１４）は、Ｏ１及びＯ２両方のタイプのｔｅｔオペレーターを伴うＵ６プロモーター変異型である。２Ｏ２（配列番号１５）は、２個のＯ２タイプｔｅｔオペレーターを伴うＵ６プロモーター変異型である。下線を引いた斜字体配列は、Ｏ２タイプｔｅｔオペレーターを表す。下線を引いた斜字体でない配列は、Ｏ１タイプｔｅｔオペレーターを表す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｕ６プロモーター変異型の転写活性及びテトラサイクリン応答を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｕ６プロモーター変異型の転写活性及びテトラサイクリン応答を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｕ６プロモーター変異型の転写活性及びテトラサイクリン応答を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、２Ｏ２発現系を用いた、安定的細胞株における内在遺伝子のテトラサイクリン依存性ノックダウンを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２Ｏ２発現系を用いた、安定的細胞株における内在遺伝子のテトラサイクリン依存性ノックダウンを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、２Ｏ２発現系を用いた、安定的細胞株における内在遺伝子のテトラサイクリン依存性ノックダウンを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、安定的細胞株作製における、Ｏ１及び２Ｏ２発現系の比較を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、安定的細胞株作製における、Ｏ１及び２Ｏ２発現系の比較を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、安定的細胞株作製における、Ｏ１及び２Ｏ２発現系の比較を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｄ５４＿Ｌｕｃ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５及びＤ５４＿Ｈｉｆ１８細胞における、Ｈｉｆ１αタンパク質レベルを示す。１μｇ／ｍＬドキシサイクリン存在下又は非存在下で細胞をインキュベートした。３６時間後、細胞を非処理とするか（Ｎ）又は、さらに１６時間低酸素処理（Ｈ）した。細胞を溶解し、Ｈｉｆ１α（上のパネル）又はＨｉｆ１β（下のパネル）に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｄ５４＿Ｌｕｃ、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５及びＤ５４＿Ｈｉｆ１８細胞における、Ｈｉｆ１レポーター（１ｘＨＲＥ）又は構成的レポーター（ｐＧＬ３）の活性を示す。１μｇ／ｍＬドキシサイクリン存在下又は非存在下でｐＧＬ３−対照／ｐＲＬ−ＴＫ（左パネル）又は１ｘＨＲＥ／ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（右パネル）の何れかを用いて細胞に対してトランスフェクションを行った。トランスフェクションから３６時間後、細胞を低酸素処理した。低酸素処理から１６時間後、ルシフェラーゼ活性を調べた。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｄ５４＿Ｌｕｃ及びＤ５４＿Ｈｉｆ２５細胞における、Ｈｉｆ１標的遺伝子、ＰＧＫ１及びＬＤＨのｍＲＮＡレベルを示す。１μｇ／ｍＬドキシサイクリン存在下又は非存在下で細胞をインキュベートした。３６時間後、細胞を非処理とするか（Ｎ）又は、さらに１６時間低酸素処理（Ｈ）した。トータルＲＮＡを調製し、指定の遺伝子のレベルを分析するために定量的ＰＣＲにおいて使用した。
【図６Ａ】図６Ａは、ドキシサイクリン処理した、３種類のＤ５４＿Ｈｉｆ２５（Ｈｉｆ）又はＤ５４＿Ｌｕｃ（Ｌｕｃ）由来の皮下腫瘍における、平均Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡレベル及び標準偏差（ＳＤ）を示す。２００から３００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスに、３、６、９又は１２日間、ドキシサイクリン（１ｍｇ／ｍＬ）を与えた。処置終了時に腫瘍を回収し、Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡレベルをＱＰＣＲにより測定した。Ｄｏｘ処置なしのマウスからの腫瘍を対照として使用した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、４５日間水（対照）又はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）処理したマウスから切り出した４種類のＤ５４＿Ｈｉｆ２５又はＤ５４＿Ｌｕｃ由来の腫瘍における、平均Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡレベルを示す。Ｈｉｆ１α  ｍＲＮＡレベルをＱＰＣＲにより測定した。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｂ）からの同じ腫瘍試料の平均Ｈｉｆ１α発現レベル及び標準偏差を示す。ＩＨＣにより、及びＡｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ４（Ｚｅｉｓｓ）を用いて定量して、Ｈｉｆ１α発現レベルを調べた。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５（Ｈｉｆ２５）又はＤ５４＿Ｌｕｃ（Ｌｕｃ）細胞を用いて１５匹のマウスで生成した、及びドキシサイクリン処理及び非処理の、皮下腫瘍における平均腫瘍サイズ及び標準誤差（ＳＥ）を示す。腫瘍が１９０ｍｍ３の平均サイズに到達した後、腫瘍を有するマウスをランダム化し、２群に分けた。各群に対して、ドキシサイクリンを含有する（Ｄｏｘ）又は含有しない（対照）飲用水を与えた。マイクロキャリパーを用いて週に２回腫瘍サイズを測定した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｄ５４＿Ｈｉｆ２５（Ｈｉｆ２５）又はＤ５４＿Ｌｕｃ（Ｌｕｃ）細胞を用いてマウスで生成した、及びドキシサイクリン処理及び非処理の、８匹のマウスの皮下腫瘍の平均腫瘍サイズ及び標準誤差（ＳＥ）を示す。腫瘍が１５０ｍｍ３の平均サイズに到達した後、腫瘍を有するマウスをランダム化し、２群に分けた。各群に対して、ドキシサイクリンを含有する（Ｄｏｘ）又は含有しない（対照）飲用水を与えた。マイクロキャリパーを用いて週に２回腫瘍サイズを測定した。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは、２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１トランス遺伝子を注入した胚から生まれたマウスを示し、これらは、野生型マウスと比較して、様々な程度の体毛の色の変化を示す。図８Ａは、体毛の色が濃い野生型マウスと比較して、初代マウスのＦ０の体毛の色がより淡いことを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１トランス遺伝子を注入した胚から生まれたマウスを示し、これらは、野生型マウスと比較して、様々な程度の体毛の色の変化を示す。図８Ｂは、濃い色のＦ１仔と比較して白色である３匹の仔を示す。白色の仔は、２Ｏ２−Ｔｙｒ７３１トランス遺伝子（配列番号４８）に関して陽性である。
【図１】
2008508887.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2008508887.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2008508887.tif 000015
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2008508887.tif 000017
【図４Ｃ】
2008508887.tif 000018
【図５Ａ】
2008508887.tif 000019
【図５Ｂ】
2008508887.tif 000020
【図５Ｃ】
2008508887.tif 000021
【図６Ａ】
2008508887.tif 000022
【図６Ｂ】
2008508887.tif 000023
【図６Ｃ】
2008508887.tif 000024
【図７Ａ】
2008508887.tif 000025
【図７Ｂ】
2008508887.tif 000026
【図８Ａ】
2008508887.tif 000027
【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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