(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）で表される高光学純度のアルコールの製造方法に関する。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素、ハロゲン元素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基またはＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、残りの５つと異なり、さらにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、ハロゲン元素を表す。一般式（II）で表されるケトンが、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元されることを特徴とする。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は上記と同様である。
2008517612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＩａまたはＩｂ
【化１】
2008517612.tif 000015
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素、ハロゲン元素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基またはＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、残りの５つと異なり、さらにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、ハロゲン元素を表す）
で表される高光学純度のアルコールを製造する方法であって、
一般式II
【化２】
2008517612.tif 000016
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は上記と同様である）
で表されるケトンが、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元されることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１＝ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１＝Ｃｌであり、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一般式IIIａまたはIIIｂ
【化３】
2008517612.tif 000017
（ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を表す）
で表される高光学純度のアルコールを製造する方法であって、
一般式IV
【化４】
2008517612.tif 000018
（ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は上記と同様である）
で表されるケトンが、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元されることを特徴とする方法。
【請求項７】
Ｒ７＝Ｒ８＝Ｒ９＝ＣＨ３であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ７＝ＣＨ３であり、Ｒ８＝Ｒ９＝Ｃ２Ｈ５であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Lactobacilliales属の乳酸菌由来、特にはLactobacillus kefir、Lactobacillus brevisもしくはLactobacillus minor由来、またはジュードモナス由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、上記Ｒ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして用いられることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
Pichia属またはCandida属由来、特にはCandida boidinii ADH、Candida parasilosisまたはPichia capsulata由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、上記Ｓ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして用いられることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記オキシドレダクターゼの重量活性は、１０〜５，０００Ｕ／ｍｌの範囲であり、好ましくは１００〜１，０００Ｕ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
上記ケトン１ｋｇを還元するための上記オキシドレダクターゼの使用量は、５，０００〜１０，０００，０００Ｕであり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００Ｕであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰは、補基質によりさらにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨそれぞれに還元されることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
例えば、エタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールのような第１級および第２級アルコールを、上記補基質として用いることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔キラルアルコールの製造方法〕
本発明は、一般式ＩａまたはＩｂそれぞれの高光学純度のアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【化１】
2008517612.tif 000003
【０００３】
一般式ＩａまたはＩｂにおけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ、水素、ハロゲン元素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基またはＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、残りの５つと異なり、さらにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、ハロゲン元素である。
【０００４】
また、本発明は、一般式IIIａまたはIIIｂそれぞれの高光学純度のアルコールの製造方法に関する。
【０００５】
【化２】
2008517612.tif 000004
【０００６】
一般式IIIａまたはIIIｂにおけるＲ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。
【０００７】
一般式ＩａまたはＩｂ、およびIIIａまたはIIIｂそれぞれの高光学純度のアルコールは、薬学的な活性基質の製造のために関心を集めている多数のキラル化合物の合成のための様々なキラリティの構成要素となる。しかし、それらの高光学純度のアルコールの多くは、化学的経路によって完全に得ることができないか、または、非常に複雑な方法においてのみ得られる。このため、多量に得ることができない。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、高収率および高光学純度な一般式ＩａまたはＩｂ、およびIIIａまたはIIIｂそれぞれの高光学純度のアルコールの経済的な製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明によれば、上記の目的は、一般式IIのケトンによって、一般式ＩａまたはＩｂそれぞれのアルコールについて達成される。
【００１０】
【化３】
2008517612.tif 000005
【００１１】
一般式IIにおけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素、ハロゲン元素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基またはＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基を表す。ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、残りの５つと異なり、さらにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、ハロゲン元素である。一般式IIのケトンは、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元される。
【００１２】
本発明の方法の好ましい実施形態は、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴としている。
【００１３】
他の好ましい実施形態は、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴としている。
【００１４】
さらに好ましい実施形態は、Ｒ１＝ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴としている。
【００１５】
さらに、好ましい実施形態は、Ｒ１＝Ｃｌであり、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴としている。
【００１６】
一般式IIIａまたはIIIｂそれぞれのアルコールについての本発明に係る課題は、一般式IVのケトンによって解決される。
【００１７】
【化４】
2008517612.tif 000006
【００１８】
一般式IVにおけるＲ７、Ｒ８およびＲ９は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を表す。一般式IVのケトンは、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元される。
【００１９】
「ＮＡＤＨ」なる単語は、還元したニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドを意味しており、「ＮＡＤ」なる単語は、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドを意味している。「ＮＡＤＰＨ」なる単語は、還元したニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩を意味しており、「ＮＡＤＰ」なる単語は、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチドリン酸塩を意味している。
【００２０】
上記の方法の好ましい実施形態は、Ｒ７＝Ｒ８＝Ｒ９＝ＣＨ３であることを特徴としている。
【００２１】
他の好ましい実施形態は、Ｒ７＝ＣＨ３であり、Ｒ８＝Ｒ９＝Ｃ２Ｈ５であることを特徴としている。
【００２２】
本発明における一般式IIまたはIVのそれぞれのケトンは出発物質であり、一般的には低価格に用意することができる。
【００２３】
好ましい実施形態において、酵素による還元に用いられるデヒドロゲナーゼは、微生物を出発原料として得られる。生成物の立体配置は、デヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの型および補酵素の型によって、優勢的または排他的に形成される。
【００２４】
一般式ＩａまたはＩｂ、およびIIIａまたはIIIｂそれぞれの高光学純度のアルコールの製造方法において、Lactobacilliales属の乳酸菌由来、特にはLactobacillus kefir、Lactobacillus brevis、Lactobacillus minor由来、またはジュードモナス由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、Ｒ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして好適に用いることができる。
【００２５】
したがって、Ｒ体に特異的なデヒドロゲナーゼの下で、対応するＲ体のアルコールであるＨ３Ｃ−Ｃ（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｃのケトン基が還元される。上記のＲ体に特異的な第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、ＵＳ ５,５００,３３５またはＤＥ １０６ １０ ９８４ Ａ１、ＤＥ １０１ １９ ２７４またはＵＳ ５,３８５,８３３に記載されている。
【００２６】
PichiaまたはCandida属由来、特にはCandida boidinii ADH、Candida parasilosisまたはPichia capsulata由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼは、Ｓ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして用いられる。上記Ｓ体に特異的なデヒドロゲナーゼは、例えば、ＵＳ ５,５２３,２２３またはＤＥ １０３ ２７ ４５４１に記載されている。
【００２７】
酵素は、混ざりもののない状態の酵素を用いる必要はない。多少なりとも精製されている、または酵素を含む微生物または溶解物自体を用いることが適当である。反応が継続的に進行すれば、固定化した酵素も用いることができる。例えば、固定化は、特に、重合体網または半透膜に酵素が組み込まれること、もしくは、例えば吸着、イオン結合または共有結合によって担体に保持されることにより達成されている。しかし、デヒドロゲナーゼは、自由な状態において好適に用いられる。
【００２８】
酵素による還元自体は、穏和な条件下において進行するため、アルコール生成物はさらに反応することはない。本発明に係る方法は、一般式IIまたはIVそれぞれのケトン化合物の使用量を基として、高い滞留時間、一般式ＩａまたはＩｂおよびIIIａまたはIIIｂそれぞれの生成したキラルアルコールの９５％以上の光学純度、ならびに高収率を示す。
【００２９】
本発明に係る方法において、オキシドレダクターゼは、完全に精製した状態か、または部分的に精製した状態のいずれかの状態、細胞溶解物の形状か、または完全な細胞の形状のいずれかで用いることができる。したがって、細胞は、自然な状態または透過した状態において用いることができる。クローン化し、かつ過剰に発現したオキシドレダクターゼは、好適に用いることができる（例えば、ＵＳ ５,５２３,２２３、ＤＥ １０３ ２７ ４５４１、またはＤＥ １０１ １９ ２７４参照）。
【００３０】
上記の方法に好適な実施形態によれば、オキシドレダクターゼの重量活性は、１０〜５,０００Ｕ／ｍｌの範囲であり、好ましくは１００〜１,０００Ｕ／ｍｌの範囲で用いる。
【００３１】
上記の方法において、ケトン１ｋｇを還元するためには、５,０００〜１,０００Ｕ、好ましくは１０,０００〜１,０００,０００Ｕのオキシドレダクターゼが用いられる。したがって、酵素ユニット１Ｕは、１分あたりに一般式IIまたはIVそれぞれのケトン化合物を１μｍｏｌ変換するために必要な酵素の量に対応する。
【００３２】
さらに、本発明の好適な実施形態では、還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰそれぞれは、補基質によりさらにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに還元されることを特徴としている。
【００３３】
その際に、例えばエタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールのような第１級および第２級アルコールは、補基質として好適に用いられる。
【００３４】
上記補基質は、オキシドレダクターゼおよびＮＡＤまたはＮＡＤＰそれぞれによって、アルデヒドまたはケトンおよびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨそれぞれに対応するように反応される。これによって、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨそれぞれの再生が起きる。この結果から、再生のための補基質の比率は、全重量に基づいて、５〜９５重量％の範囲である。
【００３５】
補酵素の再生のために、さらなるアルコールデヒドロゲナーゼが加えられる。好適なＮＡＤＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、パン酵母、Candida boidinii、Candida parasilosis、Pichia capsulataから得られる。さらに、好適なＮＡＤＰＨ依存アルコールデヒドロゲナーゼは、Lactobacillus brevis（DE 196 10 984 A1）、Lactobacillus minor（DE 101 19 274）、ジュードモナス（US 5,385,833）または
Thermoanaerobrium brockiiから得られる。これらのアルコールデヒドロゲナーゼの好適な補基質は、例えばエタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールのような上述した第２級アルコールである。
【００３６】
さらに、補酵素の再生は、例えばＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存ギ酸塩デヒドロゲナーゼを用いても達成できる（Tiskkovら、J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase）。ギ酸塩デヒドロゲナーゼの好適な補基質は、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウムまたはギ酸カルシウムなどのギ酸の塩である。しかし、本発明に係る方法では、例えば、基板結合補酵素再生を生じる上記のさらなるデヒドロゲナーゼなしに好適に行われる。
【００３７】
反応混合溶液の水溶液部分、すなわち酵素的に還元生成物は、例えば、リン酸カリウム、トリス塩酸またはトリエタノールアミンバッファーなどのバッファーを含むことが好ましい。バッファーのｐＨは、５〜１０であり、６〜９であることが好ましい。さらに、バッファーは、例えば、亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンのような酵素を安定化または活性化させるためのイオンを含むことができる。
【００３８】
本発明に係る方法を行うときには、温度を１０〜７０℃程度の範囲とすることが好ましく、２０〜４０℃程度の範囲とすることがより好ましい。
【００３９】
本発明に係る方法のさらに好適な実施形態では、酵素変換は、全く水と混和しないか、または部分的に混和する有機溶媒の存在下において達成される。上記の溶媒は、例えば、対照的、または非対称的なジ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルエーテル、直鎖または分岐鎖アルカン、シクロアルカン、または同時に補基質ともなる不水溶性第２級アルコールである。好適な有機溶媒は、例えば、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、２−オクタノール、２−ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノールまたはシクロヘキサンである。
【００４０】
不水溶性溶媒および補基質それぞれを用いるときには、反応釜は、水相と有機相とから構成される。基質は、その溶解度に応じて、有機相と水相との間に分布する。一般的に、有機相は、全反応容量に基づいて、５〜９５％の割合を有しており、好ましくは２０〜９０％である。２つの液相は、機械的に混合されることが好ましい。したがって、それらの間に巨大な境界面が形成される。本実施形態においても、酵素的に還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰそれぞれは、上述したような補基質を用いて、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨにそれぞれ還元し直される。
【００４１】
補酵素ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨそれぞれの濃度は、一般的に、水相において０．００１〜１ｍＭの範囲であり、０．０１〜０．１ｍＭの範囲であることが好ましい。
【００４２】
本発明に係る方法において、さらに、オキシドレダクターゼ／デヒドロゲナーゼの安定剤を用いることができる。好適な安定剤は、例えば、グリセロール、ソルビトール、１,４−ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００４３】
本発明に係る方法は、例えば、ガラスまたは金属製の密封反応容器において行われる。このため、成分は反応容器内において個々に移動され、例えば、窒素または大気雰囲気下において撹拌される。反応時間は、１〜４８時間の範囲であり、特には２〜２４時間である。
【００４４】
続いて、反応混合液が処理される。これによって、水相は分離され、有機相がろ過される。状況に応じて、例えば、有機相をさらに処理するなど水相が再度抽出される。そして、状況に応じて、溶媒はろ過した有機相から蒸留される。
【００４５】
以下に、より詳細な実施例によって本発明を説明する。
【００４６】
〔実施例〕
（分析）
ａ）アミド
ｅｅ（鏡像体過剰率）の測定は、キラルガスクロマトグラフィーを用いて測定した。このために、島津製のガスクロマトグラフＧＣ−１７Ａを、キラル分離カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ（Varian Chrompack, Darmstadt, Germany）、水素炎イオン化検出器およびキャリアーガスのヘリウムと共に用いた。
【００４７】
Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−ヒドロキシブタンアミドの分離は、０．８６気圧、１２０℃、２℃／分→１２５℃を１０分で達成した。保持時間は、３Ｒが１０．４２分であり、３Ｓが１０．０９分であった。
【００４８】
Ｎ,Ｎ−エチル−３−ヒドロキシブタンアミドの分離は、０．７５気圧、１３０℃、２℃／分→１３５℃を１０分で達成した。保持時間は、３Ｒが１１．６分であり、３Ｓが１１．３分であった。
【００４９】
ｂ）塩素化合物
ｅｅ（鏡像体過剰率）の測定は、キラルガスクロマトグラフィーを用いて測定した。このために、島津製のガスクロマトグラフＧＣ−１７Ａを、キラル分離カラムＦＳ−Ｈｙｄｒｏｄｅｘ  β−６−ＴＢＤＭ（Machery-Nagel, Duren, Germany）、水素炎イオン化検出器およびキャリアーガスのヘリウムと共に用いた。
【００５０】
１−クロロプロパン−２−オールの分離は、０．９４気圧、４０℃、１℃／分→５０℃を１５分で達成した。保持時間は、２Ｒが２０．３分であり、２Ｓが２０．９分であった。
【００５１】
１,１−ジクロロプロパン−２−オールの分離は、０．６９気圧、８０℃、２℃／分→９５℃を１５分で達成した。保持時間は、２Ｒが２０．８分であり、２Ｓが２１．４分であった。
【００５２】
１,１,２−トリクロロプロパン−２−オールの分離は、０．６９気圧、１２０℃の等温において１５分で達成した。保持時間は、２Ｒが２５．０分であり、２Ｓが２４．５分であった。
【００５３】
３−クロロブタン−２−オールの分離は、０．９８気圧、５０℃の等温において２５分で達成した。保持時間は、（３Ｒ）−３−クロロブタン−２−オンが６．０分であり、（３Ｓ）−３−クロロブタン−２−オールが６．２分であり、（３Ｒ，２Ｒ）−３−クロロブタン−２−オールが１７．５分であり、（３Ｒ，２Ｓ）−３−クロロブタン−２−オールが１８．１分であり、（３Ｓ，２Ｒ）−３−クロロブタン−２−オールが２０．７分であり、（３Ｓ，２Ｓ）−３−クロロブタン−２−オールが２２．１分であった。
【００５４】
（１．Ｎ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドから（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドの合成）
（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドの合成のために、１７２ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、０．５ｍＭ ＤＴＴ、２０％ グリセロール）、１８ｍｌの２−プロパノール（０．２３ｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミド（６３ｍｍｏｌ）、２００ｍｇのＮＡＤ、そして３０００ユニットのCandida parapsilosis由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、９７％のＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドが、（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドは２．５ｇ得られ、純度９８％以上であり、鏡像体過剰率は９９％以上であった。
【００５５】
（分析結果）
元素分析％（計算値）：Ｃ８Ｈ１７ＮＯ２
Ｃ：５９．８（６０．４）
Ｈ：１０．７（１０．８）
Ｎ：８．９（８．８）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００５６】
【表１】
2008517612.tif 000007
【００５７】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００５８】
【表２】
2008517612.tif 000008
【００５９】
比旋光度の量
エナンチオマーの比旋光度[α]Ｄ２０量は、１ｄｒｎの層厚の高精度旋光計ＰＯＬ−Ｓ２を用いて測定した。分析のために、０．５ｇの資料を２５ｍｌのエタノールに溶解させた。
（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミド（１００％）  [α]Ｄ２０＝＋１９．９２±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００６０】
（２．Ｎ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドから（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドの合成）
（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドの合成のために、２９０ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ グリセロール）、１００ｍｌの２−プロパノール（１．３ｍｏｌ）、１０ｍｌのＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミド（６３ｍｍｏｌ）、２０ｍｇのＮＡＤＰ、そして６０００ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、６０％のＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドが、（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドは２．５ｇ得られ、純度９８％以上であり、鏡像体過剰率は９９％以上であった。
【００６１】
（分析結果）
元素分析％（計算値）：Ｃ８Ｈ１７ＮＯ２
Ｃ：５９．８（６０．４）
Ｈ：１０．７（１０．８）
Ｎ：８．９（８．８）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
実施例１の結果と同様
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
実施例１の結果と同様
比旋光度の量
（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミド（１００％）  [α]Ｄ２０＝−１９．７±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲおよび元素分析を通して、アルコール（Ｓ）または（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジエチルブタンアミドの構造を確認した。鏡像体過剰率の正確な測定は、キラルＧＣを通して、また比旋光度[α]Ｄ２０の量を決定することによって行った。
【００６３】
（３．Ｎ，Ｎ−ジメチル酢酸アセトアミドから（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドの合成）
（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドの合成のために、５２５ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ グリセロール）、９０ｍｌの２−プロパノール（１．１８ｍｏｌ）、１５ｍｌのＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミド（１２０ｍｍｏｌ）、３０ｍｇのＮＡＤＰ、そして５００００ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、９５％のＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドが、（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドは２．３ｇ得られ、純度９８％以上であり、鏡像体過剰率は９９％以上であった。
【００６４】
（分析結果）
元素分析％（計算値）：Ｃ６Ｈ１３ＮＯ２
Ｃ：５４．２（５４．９）
Ｈ：９．７（１０．０）
Ｎ：１０．４（１０．７）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００６５】
【表３】
2008517612.tif 000009
【００６６】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００６７】
【表４】
2008517612.tif 000010
【００６８】
比旋光度の量
（Ｒ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミド（１００％）  [α]Ｄ２０＝−２９．１±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００６９】
（４．Ｎ，Ｎ−ジメチル酢酸アセトアミドから（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドの合成）
（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドの合成のために、８９ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１０％ グリセロール）、９ｍｌの２−プロパノール（０．１２ｍｏｌ）、２．５ｍｌのＮ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミド（１９ｍｍｏｌ）、１０ｍｇのＮＡＤ、そして１６０００ユニットのCandida parapsolosis由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、Ｎ，Ｎ−ジエチル酢酸アセトアミドの９５％が、（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミドは、純度９８％以上であり、鏡像体過剰率は９９％以上であり、０％の収率で得られた。
比旋光度の量
（Ｓ）−３−ヒロドキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタンアミド（１００％）  [α]Ｄ２０＝＋２９．１±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００７０】
（５．１，１−ジクロロアセトンから（Ｓ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールの合成）
（Ｓ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールの合成のために、６４０ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２０％ グリセロール）、８０ｍｌの２−プロパノール（１．０５ｍｏｌ）、２０ｍｌの１，１−ジクロロアセトン（０．２ｍｏｌ）、４０ｍｇのＮＡＤ、そして１３０００ユニットのPichia capsulata（ＤＥ−Ａ 103 27 454）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％の１，１−ジクロロアセトンが、（Ｓ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｓ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールは６．５ｇ得られ、純度９９％以上であり、鏡像体過剰率は９９．９％以上であった。
【００７１】
（分析結果）
元素分析および塩素測定％（計算値）：Ｃ３Ｈ６Ｃｌ２Ｏ
Ｃ：２６．７（２７．９）
Ｈ：４．７（４．７）
Ｏ：１４．８（１２．４）
Ｃｌ：５３．４（５５）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００７２】
【表５】
2008517612.tif 000011
【００７３】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００７４】
【表６】
2008517612.tif 000012
【００７５】
比旋光度の量
（Ｓ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノール（１００％）  [α]Ｄ２０＝−１９．１±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００７６】
（６．１，１−ジクロロアセトンから（Ｒ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールの合成）
（Ｒ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールの合成のために、３２０ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ グリセロール）、６０ｍｌの２−プロパノール（０．７８ｍｏｌ）、４０ｍｌの酢酸エチルに溶解した２０ｍｌの１，１−ジクロロアセトン（０．２ｍｏｌ）、４０ｍｇのＮＡＤＰ、そして８０００ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％の１，１−ジクロロアセトンが、（Ｒ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｒ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノールは４．８ｇ得られ、純度９８％以上であり、鏡像体過剰率は９５％以上であった。
【００７７】
（分析結果）
元素分析および塩素測定％（計算値）：Ｃ３Ｈ６Ｃｌ２Ｏ
Ｃ：２６．７（２７．９）
Ｈ：４．７（４．７）
Ｏ：１４．８（１２．４）
Ｃｌ：５３．４（５５）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：実施例５と同様である
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：実施例５と同様である
比旋光度の量
（Ｒ）−１，１−ジクロロ−２−プロパノール（１００％）  [α]Ｄ２０＝＋１９．５６±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００７８】
（７．１，１，３−トリクロロアセトンから（Ｒ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールの合成）
（Ｒ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールの合成のために、１１０ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ グリセロール）、４０ｍｌの２−プロパノール（０．５２ｍｏｌ）、４０ｍｌの酢酸エチルに溶解した１０ｍｌの１，１，３−トリクロロアセトン（９３ｍｍｏｌ）、２０ｍｇのＮＡＤＰ、そして１２０００ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％の１，１，３−トリクロロアセトンが、（Ｒ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールに還元されていた。続けて、反応混合液を酢酸エチルで抽出し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。このようにして得られた未精製の生成物は、真空蒸留によって精製した。（Ｒ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールは８．３ｇ得られ、純度９９％以上であり、鏡像体過剰率は９７％以上であった。
【００７９】
（分析結果）
元素分析および塩素測定％（計算値）：Ｃ３Ｈ６Ｃｌ２Ｏ
Ｃ：２２．１（２２．１）
Ｈ：２．８（３．１）
Ｏ：１１．１（９．８）
Ｃｌ：６３．９（６５．１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００８０】
【表７】
2008517612.tif 000013
【００８１】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
【００８２】
【表８】
2008517612.tif 000014
【００８３】
比旋光度の量
（Ｒ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノール（１００％）  [α]Ｄ２０＝＋１０．１±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００８４】
（８．１，１，３−トリクロロアセトンから（Ｓ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールの合成）
（Ｓ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールの合成のために、１１０ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、２０％ グリセロール）、０．８ｍｌの２−プロパノール（１０ｍｍｏｌ）、０．２５ｍｌの１，１，３−トリクロロアセトン（０．２ｍｍｏｌ）、１０ｍｇのＮＡＤ、そして２０００ユニットのPichia capsulata（ＤＥ−Ａ 103 27 454）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、９７％の１，１，３−トリクロロアセトンが、（Ｓ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノールに還元されており、鏡像体過剰率は６０％以上であった。
比旋光度の量
（Ｓ）−１，１，３−トリクロロ−２−プロパノール（１００％）  [α]Ｄ２０＝−１０．１±１°ｘｌ／ｇ・ｄｍ。
【００８５】
（９．クロロアセテートからＳ−クロロ−２−プロパノールの合成）
Ｓ−クロロ−２−プロパノールの合成のために、０．６ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）、４００μｌの４−メチル−２−プロパノール、１００μｌのクロロアセテート、１ｍｇのＮＡＤ、そして６０ユニットのPichia capsulata（ＤＥ−Ａ 103 27 454）またはCandida parapsilosis由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％のクロロアセテートが、Ｓ−クロロ−２−プロパノールに還元されており、鏡像体過剰率は９７％以上であった。
【００８６】
（１０．クロロアセテートからＲ−クロロ−２−プロパノールの合成）
Ｒ−クロロ−２−プロパノールの合成のために、０．４ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１０％ グリセロール）、３００μｌの２−プロパノール、２００μｌの酢酸エチルに溶解した１００μｌのクロロアセテート、１ｍｇのＮＡＤＰ、そして３０ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％のクロロアセテートが、Ｒ−クロロ−２−プロパノールに還元されており、鏡像体過剰率は９５％以上であった。
【００８７】
（１１．３−クロロ−２−ブタノンから（２Ｓ）−３−クロロ−２−ブタノールの合成）
（２Ｓ）−３−クロロ−２−ブタノールの合成のために、０．４５ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）、４５０μｌの４−メチル−２−プロパノール、１００μｌの３−クロロ−２−ブタノン（１ｍｍｏｌ）、０．１ｍｇのＮＡＤ（０．１５μｍｏｌ）、そして６０ユニットのPichia capsulata（ＤＥ−Ａ 103 27 454）またはCandida parapsilosis由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％の３−クロロ−２−ブタノンが、（２Ｓ）−３−クロロ−２−ブタノールに還元されており、鏡像体過剰率は９８％以上であった。
【００８８】
（１２．３−クロロ−２−ブタノンから（２Ｒ）−３−クロロ−２−ブタノールの合成）
（２Ｒ）−３−クロロ−２−ブタノールの合成のために、０．４５ｍｌのバッファー（１００ｍＭ トリエタノールアミン、ｐＨ＝７、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）、４５０μｌの４−メチル−２−プロパノール、１００μｌの３−クロロ−２−ブタノン（１ｍｍｏｌ）、０．１ｍｇのＮＡＤＰ（０．１３μｍｏｌ）、そして６０ユニットのLactobacillus minor（ＤＥ−Ａ 101 19 274）由来の組み換えアルコールデヒドロゲナーゼの混合液を、一定の混合条件下、２４時間室温で培養した。２４時間後、１００％の３−クロロ−２−ブタノンが、（２Ｒ）−３−クロロ−２−ブタノールに還元されており、鏡像体過剰率は９８％以上であった。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月22日(2006.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＩａまたはＩｂ
【化１】
2008517612.tif 000019
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ、水素、ハロゲン元素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基またはＣ１〜Ｃ６のアルコキシ基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、残りの５つと異なり、さらにＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の少なくとも１つは、ハロゲン元素を表す）
で表されるエナンチオピュアなアルコールを製造する方法であって、
一般式II
【化２】
2008517612.tif 000020
（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は上記と同様である）
で表されるケトンが、補酵素としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを利用するＳ体またはＲ体に特異的なデヒドロゲナーゼ／オキシドレダクターゼの存在下において、酵素的に還元され、
還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰは、第２級アルコールによりさらにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨそれぞれに還元されることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１＝ＣＨ３であり、Ｒ２＝Ｃｌであり、Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１＝Ｃｌであり、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Lactobacilliales属の乳酸菌由来、特にはLactobacillus kefir、Lactobacillus brevisもしくはLactobacillus minor由来、またはジュードモナス由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、上記Ｒ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして用いられることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Pichia属またはCandida属由来、特にはCandida boidinii ADH、Candida parasilosisまたはPichia capsulata由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼが、上記Ｓ体に特異的なデヒドロゲナーゼとして用いられることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記オキシドレダクターゼの重量活性は、１０〜５，０００Ｕ／ｍｌの範囲であり、好ましくは１００〜１，０００Ｕ／ｍｌの範囲であることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記ケトン１ｋｇを還元するための上記オキシドレダクターゼの使用量は、５，０００〜１０，０００，０００Ｕであり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００Ｕであることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記第２級アルコールとして、エタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールおよびシクロヘキサノールからなる群のアルコールを用いることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2008517612.tif 000021
2008517612.tif 000022
2008517612.tif 000023
2008517612.tif 000024
2008517612.tif 000025
2008517612.tif 000026
2008517612.tif 000027
2008517612.tif 000028