(57)【要約】化合物との接触に対するゲノム応答に基づいて化合物の遺伝毒性を判定するための方法および試薬が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)試験生細胞を試験化合物に接触させる段階と;
(b)Prelp(末端にプロリンとアルギニンを多く含むロイシンリッチリピート);Sesn2(セストリン2);4833427G06 Rik(RIKEN cDNA);Dda3(ディファレンシャルディスプレイ、およびp53により活性化される);Usp30(ユビキチン特異的プロテアーゼ30);0610013D04 Rik(RIKEN cDNA);Slc19a2(溶質運搬体ファミリー19(チアミントランスポーター)、メンバー2);Trp53inp1(形質転換関連タンパク質53、誘導性核タンパク質1);D4Ertd421e(DNAセグメント、Chr4、ERATO Doi 421、発現される);Shcbp1(Shc SH2-ドメイン結合タンパク質1);Mki67(Mab Ki67によって特定される抗原);Phex(リン酸を調節する中性エンドペプチダーゼ(X染色体));Tk1(チミジンキナーゼ1);Mmhead(ハツカネズミ(Mus musculus)15日胚頭部cDNAクローン);Osbpl6(オキシステロール結合タンパク質様6);Mphosph1(M期リンタンパク質);Ephx1(エポキシド加水分解酵素1(ミクロソームの生体異物加水分解酵素));Top2a(トポイソメラーゼ(DNA)IIα);Ccng1(サイクリンG1);Plf(プロリフェリン);Np95(核タンパク質95);Rad51ap1(RAD51関連タンパク質1);Nos3(一酸化窒素合成酵素3、内皮細胞);2610005B21 Rik(RIKEN cDNA);Brca1(乳癌1);Stk18(セリン/トレオニンキナーゼ18);Calmbp1(カルモジュリン結合タンパク質1);Lek1(ロイシン、グルタミン酸、リジンファミリー1タンパク質);Smc2l1(SMC2 染色体構造維持2様1);E2f7(E2F転写因子7);Hmmr(ヒアルロナンを介した運動性の受容体(RHAMM));Nusap1(核小体および紡錘体関連タンパク質1);Fbxo5(fボックスのみのタンパク質31);Slc19a2(溶質運搬体ファミリー19(チアミントランスポーター)、メンバー2);9030617O03 Rik(RIKEN cDNA);Ly6e(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座E);6530401L14 Rik(RIKEN cDNA);Mad3(Max二量体化タンパク質3);Hmgb2(高移動度群ボックス2);Kif11(キネシン11);Mad2l1(MAD2(有糸分裂停止不完全、相同体)様1(酵母));Asf1b(ASF1抗サイレンシング機能1相同体B(サッカロミセス(Saccharomyces));Mcm3(ミニ染色体維持欠損3(サッカロミセス));MGC：32192(ハツカネズミcDNAクローン MGC：32192 IMAGE：5006129);Foxm1(フォークヘッドボックスM1);Anxa8(アネキシンA8);Slc35a5(溶質運搬体ファミリー35、メンバーA5);E030024M05 Rik(RIKEN cDNA);Cks2(CDC28タンパク質キナーゼ調節サブユニット2);Cilp(軟骨中間層タンパク質);Tacc3(コイルドコイルを含む形質転換酸性タンパク質3);Prc1(細胞質分裂のタンパク質調節因子1);2610509G12 Rik(RIKEN cDNA);2810417H13 Rik(RIKEN cDNA);Pbk(PDZ結合キナーゼ);Capn6(カルパイン6);Gmnn(ジェミニン);Mcmd4(ミニ染色体維持欠損4相同体);Ccna2(サイクリンA2);Pola1(DNAポリメラーゼα1、180kDa);Hmgb3(高移動度群ボックス3);Tagln(トランスゲリン(平滑筋22タンパク質));1600013K19 Rik(RIKEN cDNA);Serpine1(Ser(またはCys)プロテイナーゼインヒビター、クレードE、メンバー1);Wig1(野生型p53に誘導される遺伝子1);Hgf(肝細胞増殖因子(分散因子);Gnpi(グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ);Birc5(バキュロウイルスIAPリピート含有5);Prim1(DNAプライマーゼ、p49サブユニット);Rbl1(網膜芽細胞腫様1(p107));Pcna(増殖細胞核抗原);E130315B21 Rik(RIKEN cDNA);2610019I03 RIK(RIKEN cDNA)からなる群より選択される指標遺伝子の発現レベルの変化を測定する段階を含む、試験化合物の遺伝毒性を判定するための方法であって、
少なくとも1.5倍の発現の増大により、該試験化合物が遺伝毒性を示すことが示される方法。
【請求項２】
指標遺伝子が、4833427G06RikおよびDda3からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試験細胞が筋芽細胞を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
試験細胞が、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ヒト、チンパンジー、およびニワトリの芽細胞より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
発現レベルの変化を測定する段階が、RT-PCRを用いて、産生されたmRNAの量を測定する段階を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
発現レベルの変化を測定する段階が、標識の発現の増大によって生成されるシグナルの増大を測定する段階を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
上記に記載した方法、キット、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、マイクロアレイ、抗体、またはトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および毒物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、化合物の遺伝毒性を判定するための方法、ならびにそのための試験細胞、トランスジェニック動物、キット、および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝毒性損傷に対する哺乳動物細胞の応答は、染色体異常または小核形成のインビトロ試験をしばしば含む一連の試験を用いて、しばしば分析される。これらの試験の両方とも、回収した染色体の異常を分析することによって(S.M. Galloway, Environ Mol Mutagen(2000) 35：191-201（非特許文献1)）、またはDNAが損傷された細胞において形成される小核を検査することによって(W. von der Hude et al., Mutation Res(2000)468：137-63（非特許文献2)）、潜在的な遺伝毒物に曝露された後の細胞におけるDNA損傷を可視化する。しかしながら、現在使用されているインビトロの遺伝毒性試験の結果を解釈するには重大な問題がある。これらの試験における偽陽性の結果は稀ではなく、かつ、インビボの動物試験を含むその後の分析は、費用がかかり、かつ時間がかかる場合がある。化合物の遺伝毒性の可能性をより良く予測することができるアッセイ法が必要とされている(例えば、R.K. Newton et al., Environ Health Persp(2004)112：420-22（非特許文献3）を参照されたい)。細胞分化を受けている繰り返し分裂する細胞(cycling cell)は、遺伝毒性ストレスに応答して、細胞周期中の別々の段階で停止させられる(例えば、T. Weinert et al., Nature Gen(1999)21：151-52（非特許文献4）; T. Weinert, Cell(1998)94：555-58（非特許文献5）を参照されたい)。この分化停止は、細胞周期中の重要なチェックポイントでのDNA損傷に応答して重要な調節キナーゼおよび他の成分が活性化されることに起因すると考えられている( T. Weinert (1998)（非特許文献5）;B.S.Zhou-Bin et al., Nature Rev Cancer(2004)4：216-25（非特許文献6)）。
【０００３】
P.L. Puri et al., Nature Gen(2002)32：585-93（非特許文献7）では、4種の公知の遺伝毒性物質(メチル-メタンスルホナート、シスプラスチン、エトポシド、および電離放射線)が、C2C12筋芽細胞の筋管への分化を阻害する能力を調査した。これらの作用物質の効果はまた、筋肉に特異的なタンパク質(ミオゲニン、ミオシン重鎖、MyoD)の発現を分析すること、および筋肉クレアチニンキナーゼプロモーターに結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いることによっても、検査された。
【０００４】
マウス遺伝子DDA3が、p53によるその調節に関する研究のために配列決定された（P.-K. Lo et al., Oncogene(1999)18：7765-74(非特許文献8)）。P-K Loらはまた、DDA3が、アドリアマイシンおよびマイトマイシンCなどのDNA損傷物質に曝露されたNIH3T3細胞において上方調節されていることも発見した。P-K Loらは、DDA3が、脳、脾臓、および肺で強く発現されること(腎臓においては中程度の発現)：心臓、肝臓、骨格筋、または精巣においては発現が見出されないか、または最小限の発現しか見出されないことを発見した(KM/29.08.2005)。(上流の調節領域を含む)5'ゲノム配列が、S.-C. Hsieh et al., Oncogene(2002)21：3050-57（非特許文献9）によって配列決定および説明され、彼らは、p53結合エレメントを同定し、かつp73によっても発現が誘導されることを確認した。P.-K. LoおよびF. -F. Wang, Biochim Biophys Acta(2002)1579：214-18（非特許文献10）では、ヒト DDA3相同体の同定および配列決定、さらに、成人骨格筋以外のほぼすべての組織においてそれが発現されるという発見を報告した。P.-K. LoおよびF.-F. Wang, Arch Biochem Biophys(2004)425：221-32（非特許文献11）では、マウスDDA3が、いくつかの異なる形態に転写または編集されることを報告した。
【０００５】
Tugendreichらは、WO2004/037200（特許文献1）において、それぞれインビボで投与されたヒドロキシ尿素、シタラビン、ドキソルビシン、イホスファミド、チオグアニン、アザチオプリン、エトポシド、およびアルベンダゾールに対するラット肝臓細胞のゲノム応答の測定を開示した。次いで、ゲノム応答を用いて、2種の遺伝子(アミノレブリン酸シンターゼ2δ、Genbank NM 013197;およびペリフェリン1、Genbank NM 012633)の転写調節を、各化合物が網赤血球の枯渇を引き起こす傾向と関連付ける「薬剤シグネチャー(drug signature)」を得た。
【０００６】
【特許文献１】WO2004/037200
【非特許文献１】S.M. Galloway, Environ Mol Mutagen(2000) 35：191-201
【非特許文献２】W. von der Hude et al., Mutation Res(2000)468：137-63
【非特許文献３】R.K. Newton et al., Environ Health Persp(2004)112：420-22
【非特許文献４】T. Weinert et al., Nature Gen(1999)21：151-52
【非特許文献５】T. Weinert, Cell(1998)94：555-58
【非特許文献６】B.S.Zhou-Bin et al., Nature Rev Cancer(2004)4：216-25
【非特許文献７】P.L. Puri et al., Nature Gen(2002)32：585-93
【非特許文献８】P.-K. Lo et al., Oncogene(1999)18：7765-74
【非特許文献９】S.-C. Hsieh et al., Oncogene(2002)21：3050-57
【非特許文献１０】P.-K. LoおよびF. -F. Wang, Biochim Biophys Acta(2002)1579：214-18
【非特許文献１１】P.-K. LoおよびF.-F. Wang, Arch Biochem Biophys(2004)425：221-32
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、ここに、いくつかの遺伝子が、DNA損傷(遺伝毒性)物質に曝露され、続いて分化を誘導された場合にさらに分化することができる真核細胞において活性化されていることを確認した。
【０００８】
本発明の1つの局面は、分化能を有する細胞を試験化合物に接触させる段階、分化を誘導する段階、および1種または複数種の指標遺伝子の発現レベルを測定する段階によって、試験化合物の遺伝毒性を判定するための方法を含む。したがって、本発明は、(a)試験生細胞を前記試験化合物に接触させる段階と;(b)Prelp(末端にプロリンとアルギニンを多く含むロイシンリッチリピート);Sesn2(セストリン2);4833427G06 Rik(RIKEN cDNA);Dda3(ディファレンシャルディスプレイ、およびp53により活性化される);Usp30(ユビキチン特異的プロテアーゼ30);0610013D04 Rik(RIKEN cDNA);Slc19a2(溶質運搬体ファミリー19(チアミントランスポーター)、メンバー2);Trp53inp1(形質転換関連タンパク質53、誘導性核タンパク質1);D4Ertd421e(DNAセグメント、Chr4、ERATO Doi 421、発現される);Shcbp1(Shc SH2-ドメイン結合タンパク質1);Mki67(MAb Ki67によって特定される抗原);Phex(リン酸を調節する中性エンドペプチダーゼ(X染色体));Tk1(チミジンキナーゼ1);Mmhead(ハツカネズミ(Mus musculus)15日胚頭部cDNAクローン);Osbpl6(オキシステロール結合タンパク質様6);Mphosph1(M期リンタンパク質);Ephx1(エポキシド加水分解酵素1(ミクロソームの生体異物加水分解酵素));Top2a(トポイソメラーゼ(DNA)IIα);Ccng1(サイクリンG1);Plf(プロリフェリン);Np95(核タンパク質95);Rad51ap1(RAD51関連タンパク質1);Nos3(一酸化窒素合成酵素3、内皮細胞);2610005B21 Rik(RIKEN cDNA);Brca1(乳癌1);Stk18(セリン/トレオニンキナーゼ18);Calmbp1(カルモジュリン結合タンパク質1);Lek1(ロイシン、グルタミン酸、リジンファミリー1タンパク質);Smc2l1(SMC2 染色体構造維持2様1);E2f7(E2F転写因子7);Hmmr(ヒアルロナンを介した運動性の受容体(RHAMM));Nusap1(核小体および紡錘体関連タンパク質1);Fbxo5(fボックスのみのタンパク質31);Slc19a2(溶質運搬体ファミリー19(チアミントランスポーター)、メンバー2);9030617O03 Rik(RIKEN cDNA);Ly6e(リンパ球抗原6複合体、遺伝子座E);6530401L14 Rik(RIKEN cDNA);Mad3(Max二量体化タンパク質3);Hmgb2(高移動度群ボックス2);Kif11(キネシン11);Mad2l1(MAD2(有糸分裂停止不完全、相同体)様1(酵母));Asf1b(ASF1抗サイレンシング機能1相同体B(サッカロミセス(Saccharomyces));Mcm3(ミニ染色体維持欠損3(サッカロミセス));MGC：32192(ハツカネズミcDNAクローン MGC：32192 IMAGE：5006129);Foxm1(フォークヘッドボックスM1);Anxa8(アネキシンA8);Slc35a5(溶質運搬体ファミリー35、メンバーA5);E030024M05 Rik(RIKEN cDNA);Cks2(CDC28タンパク質キナーゼ調節サブユニット2);Cilp(軟骨中間層タンパク質);Tacc3(コイルドコイルを含む形質転換酸性タンパク質3);Prc1(細胞質分裂のタンパク質調節因子1);2610509G12 Rik(RIKEN cDNA);2810417H13 Rik(RIKEN cDNA);Pbk(PDZ結合キナーゼ);Capn6(カルパイン6);Gmnn(ジェミニン);Mcmd4(ミニ染色体維持欠損4相同体);Ccna2(サイクリンA2);Pola1(DNAポリメラーゼα1、180kDa);Hmgb3(高移動度群ボックス3);Tagln(トランスゲリン(平滑筋22タンパク質));1600013K19 Rik(RIKEN cDNA);Serpine1(Ser(またはCys)プロテイナーゼインヒビター、クレードE、メンバー1);Wig1(野生型p53に誘導される遺伝子1);Hgf(肝細胞増殖因子(分散因子);Gnpi(グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ);Birc5(バキュロウイルスIAPリピート含有5);Prim1(DNAプライマーゼ、p49サブユニット);Rbl1(網膜芽細胞腫様1(p107));Pcna(増殖細胞核抗原);E130315B21 Rik(RIKEN cDNA);2610019I03 RIK(RIKEN cDNA)からなる群より選択される指標遺伝子の発現レベルの変化を測定する段階を含む、試験化合物の遺伝毒性を判定するための方法であって、少な��とも1.5倍の発現の増大により、該試験化合物が遺伝毒性を示すことが示される方法を提供する。好ましくは、指標遺伝子は、4833427G06RikおよびDda3からなる群より選択される。
【０００９】
試験細胞は、好ましくは、筋芽細胞を含む。好ましくは、試験細胞は、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ヒト、チンパンジー、またはニワトリに由来する芽細胞である。試験細胞は、指標遺伝子に加えて検出可能な標識を発現するように、または指標遺伝子の代わりに標識を発現するように、改変され得る。
【００１０】
発現レベルの変化は、好ましくは、RT-PCRを用いて、産生されたmRNAの量を測定することによって測定され得る。発現レベルの変化を測定するためのさらに好ましい方法は、標識の発現の増大によって生成されるシグナルの増大を測定する段階を含む。
【００１１】
本発明の別の局面は、試験化合物の遺伝毒性を判定するためのキットを含み、分化能を有する適切な細胞、および選択された指標遺伝子の発現レベルを定量するための試薬を含むキットを含む。
【００１２】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、もしくは17の配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む。本発明の別の局面は、複数の選択された指標遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる1セットのポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
本発明の別の局面は、複数の選択された指標遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる1セットのポリヌクレオチドを含むマイクロアレイである。
【００１４】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、または18の配列を有するポリペプチドを含む。
【００１５】
本発明の別の局面は、SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、または18の配列を有するポリペプチドに特異的に結合することができる抗体を含む。
【００１６】
本発明の別の局面は、レポーター遺伝子が指標遺伝子に機能的に連結されているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を含む。
【００１７】
本開示において引用されるすべての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１８】
定義：
別段の定めが無い限り、明細書および特許請求の範囲を含む本出願において使用される以下の用語は、以下に示す定義を有する。明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに他の意味を規定するのでは無い限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００１９】
「試験細胞」という用語は、例えば、筋小管、脂肪細胞、または赤血球など最終分化を遂げた状態にさらに分化することができる芽細胞のような細胞を意味する。試験細胞は、好ましくは、例えば、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ(Danio rerio))、ニワトリ(セキショクヤケイ(Gallus gallus))、マウス(ハツカネズミ)、ラット(ドブネズミ(Rattus norvegicus))、チンパンジー(ナミチンパンジー(Pan troglodytes))、およびヒト(ホモサピエンス(Homo sapiens))などの脊椎動物に由来する。「試験細胞」には、初代細胞試料および樹立細胞株の両方が含まれ、組換え型であるか野生型であるかを問わない。例示的な試験細胞には、マウスC2C12細胞、ラットL6E9細胞、前脂肪細胞、3T3-L1細胞、および骨芽細胞などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。試験細胞は、指標遺伝子に加えて、またはその代わりに検出可能な標識を発現するように改変され得る。例えば、試験細胞は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β-ガラクトシダーゼ(βGal)、または西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)などの検出可能な標識遺伝子に機能的に連結された、指標遺伝子に由来する調節配列を含む構築物で安定にトランスフェクトされ得る。
【００２０】
「試験試料」という用語は、その遺伝毒性を評価するために、試験細胞が接触または処理され得る、物質、混合物、または試験条件を意味する。本発明の方法は、純粋な化合物および溶液以外の物質の遺伝毒性効果を評価するのに有用であり、したがって、例えば、放射線;(例えば、汚染大気、水、または土壌の)環境試料;およびウイルスまたは他の微生物;タンパク質、ポリヌクレオチド、ならびにポリマーおよび他の高分子などを試験するのに使用され得る。試験細胞は、細胞が反応するのを可能にするような方法で放射線のような条件に細胞を曝露させることによって、該条件に「接触」され得る。
【００２１】
「指標遺伝子」という用語は、発現レベルの調節が、遺伝毒性(DNA損傷)と相関している遺伝子を意味する。本発明の範囲内の指標遺伝子には、DDA3(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3)、4833427G06Rik(SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、または17)、および下記の表2に記載する遺伝子が含まれる。
【００２２】
「プロモーター」および「調節領域」という用語は、本明細書において同義的に使用され、転写因子および転写酵素に結合して、指標遺伝子の発現を調節するポリヌクレオチド配列を意味する、。プロモーターは、コード領域または構造遺伝子の(シス)に隣接し、かつ(通常)コード領域または構造遺伝子の上流に存在する。
【００２３】
本明細書において使用される「レポーター遺伝子」という用語は、検出可能な生成物をコードする遺伝子を意味する。「レポーター遺伝子」は、発現されると、そのレポーター遺伝子を発現する細胞に表現型を与え、その結果、適切な条件下でその細胞を同定できるようにする遺伝子である。本発明の場合、レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現がプロモーターまたは調節配列の活性化を指示するように、プロモーターまたは調節配列に機能的に連結されている。「異種レポーター遺伝子」は、自然界で連結されているプロモーターまたは調節領域とは異なるプロモーターまたは調節領域に機能的に連結されているレポーター遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子は、ルーチンなアッセイ法で容易に検出または測定され得るポリペプチド生成物を産生し得る。この特徴を与える、当技術分野において公知の適切なレポーター遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT活性)、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ヒト成長ホルモン、および緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光タンパク質などをコードするものが含まれる。実際は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)のようなイムノアッセイ法によって、または検出可能な生成物に基質を酵素的に変換することによって容易に測定され得るタンパク質または酵素をコードし、かつ、宿主細胞において実質的に発現されていない(バックグラウンドの無い特異的発現)、任意の遺伝子が、プロモーター活性を試験するためのレポーター遺伝子として使用され得る。本明細書において使用するための他のレポーター遺伝子には、極めて重要な細胞機能を阻害する化学物質または他の作用物質の存在下または不在下で増殖する能力に基づいて細胞を選択することを可能にする遺伝子が含まれる。したがって、適切なマーカーには、それらに薬物耐性もしくは薬物感受性を与えるか、または適切な選択培地においてそれらの細胞を増殖させた場合に、レポーター遺伝子を発現するそれらの細胞の抗原性の特徴を変更するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例えば、レポーター遺伝子には、以下のものが含まれる：1種または複数種の細胞毒または薬物を含む培地上で増殖する能力によって細胞が選択される細胞毒性マーカーおよび薬物耐性マーカー;特定の栄養素または補助成分を含むまたは含まない合成培地上で増殖する能力によって細胞が選択される栄養要求性マーカー;ならびに、例えば、唯一の炭素供給源として適切な糖を含む合成培地上で増殖する能力に基づいて細胞が選択される代謝マーカー。これらおよび他のレポーター遺伝子は、当技術分野において周知である。
【００２４】
「レポーター遺伝子産物のレベルの変化」は、候補化合物に曝露された細胞におけるレポーター遺伝子産物の発現レベルを、試験化合物に曝露されていない細胞において発現されたレポーター遺伝子産物のレベル、および/または対照化合物に曝露された細胞に対して比較することによって示される。レベルの変化は、例えば、分光光度計、分光蛍光光度計、および照度計などを用いた測定によって、定量的に測定されることができ、かつ、一般に、統計学的に有意な、バックグラウンドからのレベルの増加または減少を示す。しかしながら、このような変化はまた、定量的測定をせずに、例えば、レポーター遺伝子が、色素生成基質上で有色のコロニーを形成する能力を細胞に与えるものである場合のように、単に可視化によっても示され得る。
【００２５】
「機能的に連結されている」という用語は、プロモーターまたは調節領域の活性化が構造遺伝子の転写の増大をもたらすような、プロモーターまたは調節領域と調節されている構造遺伝子との機能的関係を示す。
【００２６】
「Dda3」または「DDA3」という用語は、SEQ ID NO：1(マウス)またはSEQ ID NO：3(ヒト)の配列を有するポリヌクレオチドを意味する。DDA3の「相同体」は、他の種に由来し、かつ、少なくとも60％の配列同一性を有する、マウスおよび/またはヒトDda3(センス鎖もしくは相補体)に類似した配列を有する、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、cDNA、もしくはゲノムDNA)である。マウスおよび/またはヒトのDDA3タンパク質の相同体は、マウスまたはヒトDDA3タンパク質(それぞれSEQ ID NO：2もしくはSEQ ID NO：4)と少なくとも60％の配列同一性を有する、他の種に由来するポリペプチドである。
【００２７】
「4833427G06Rik」という用語は、SEQ ID NO：5(マウス)、SEQ ID NO：7(ヒト)、SEQ ID NO：9(ラット)、SEQ ID NO：11(ゼブラフィッシュ)、SEQ ID NO：13(第2のゼブラフィッシュ相同体)、SEQ ID NO：15(ニワトリ)、またはSEQ ID NO：17(チンパンジー)の配列を有するポリヌクレオチドを意味する。4833427G06Rikの「相同体」は、他の種に由来し、かつ、少なくとも60％の配列同一性を有する、マウスおよび/またはヒト4833427G06Rik(センス鎖もしくは相補体)に類似した配列を有する、ポリヌクレオチド(例えば、RNA、cDNA、もしくはゲノムDNA)である。マウスおよび/またはヒトの4833427G06Rikタンパク質の相同体は、マウスまたはヒト4833427G06Rikタンパク質(それぞれSEQ ID NO：6もしくはSEQ ID NO：8)と少なくとも60％の配列同一性を有する、他の種に由来するポリペプチドである。
【００２８】
本明細書において使用される「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、水素結合を介した、核酸の相補鎖の互いへの結合を意味する。所与のプローブを標的DNAとハイブリダイズさせるのに使用されるストリンジェンシーのレベルは、当業者によって容易に変更され得る。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、本明細書において使用され、2本鎖(「ds」)ポリヌクレオチドの融解温度(Tm)に反映されるように、2本鎖ポリヌクレオチド分子が、高度に相補的であり、ほとんど塩基のミスマッチを有さない場合にのみ安定である条件を意味する。一般に、dsポリヌクレオチドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェンシーの低い条件下で実施され、続いて、ストリンジェンシーを段階的に高めて洗浄される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーへの言及は、このような洗浄条件に関する。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という語句は、標的DNAが、標的DNAに対して約60％の同一性、好ましくは約75％の同一性、より好ましくは約85％の同一性を有する相補的な核酸に結合することを可能にする条件を意味し、その際、標的DNAに対して約90％を上回る同一性を有することが特に好ましい。好ましくは、中程度にストリンジェントな条件は、42℃、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中でのハイブリダイゼーションとそれに続く65℃、0.2×SSPE、0.2％SDS中での洗浄と同等の条件である。「ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション」という語句は、65℃、0.018M NaCl中で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する(すなわち、あるハイブリッドが65℃、0.018M NaCl中で安定ではない場合、それは、本明細書において企図されるようなストリンジェンシーの高い条件下では安定ではないと考えられる)。ストリンジェンシーの高い条件は、例えば、42℃、50％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、5×SSPE、0.2％SDS中でのハイブリダイゼーションとそれに続く65℃、0.1×SSPEおよび0.1％SDS中での洗浄によって、提供され得る。「ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション」という語句は、42℃、10％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、6×SSPE、0.2％SDS中でのハイブリダイゼーションとそれに続く50℃、1×SSPE、0.2％SDS中での洗浄と同等の条件を意味する。デンハルト溶液およびSSPE(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい)は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液のように、当業者には周知である。
【００３０】
2つの実体の間の「特異的結合」という用語は、少なくとも107M-1の親和力を意味する。
【００３１】
「実質的な同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、初期設定のギャップウェイトを用いたGAPまたはBESTFITプログラムなどによって最適に整列された場合に、少なくとも65％の配列同一性、好ましくは少なくとも80％または90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性またはそれ以上(例えば、99％の配列同一性もしくはそれ以上)を共有することを意味する。ポリペプチドの場合、同一ではない残基位置は、好ましくは、保存的アミノ酸置換によって異なる。配列比較をする場合、典型的には、一方の配列が参照配列の役割を果たし、それに対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テスト配列および参照配列がコンピューターに入力され、(必要な場合には)部分配列座標が指定され、かつ配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性パーセントを算出する。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、SmithおよびWaterman, Adv.Appl. Math.(1981)2：482の局所的相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch, J. Mol. Biol.(1970)48：443の相同性アライメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman, Proc Natl Acad Sci USA(1988)85：2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または、視覚的検査によって、実施され得る。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Altschul et al., J. Mol. Biol.(1990)215：403-10によって説明されたBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に入手可能である。典型的には、初期設定のプログラムパラメータが配列比較を行うために使用されるが、特別に設定したパラメータもまた、使用され得る。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、ワード長(W)3、期待値(E)10、およびBLOSUM62 スコアリングマトリックスを初期設定として使用する(HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1989)89：10915を参照されたい)。
【００３２】
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換に分類するために、アミノ酸を、以下のようにグループ分けする：疎水性側鎖：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;中性親水性側鎖：cys、ser、thr;酸性側鎖：asp、glu;塩基性側鎖：asn、gln、his、lys、arg;鎖の向きに影響を与える残基：gly、pro;および芳香族側鎖：trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのクラスのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することに相当する。
【００３３】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、使用され、完全な抗体およびその結合断片を含む。典型的には、異なる重鎖、軽鎖Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、およびFvを含む断片は、抗原断片に対する特異的結合に際して、それらの由来元である完全な抗体と競合する。断片は、組換えDNA技術によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な分離によって作製される。「抗体」という用語はまた、他のタンパク質に化学的に結合しているか、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現されている、1種または複数種の免疫グロブリン鎖も含む。「抗体」という用語はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体または二機能性抗体は、2種の異なる重鎖/軽鎖ペアおよび2種の異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む様々な方法によって、作製され得る。例えば、SongsivilaiおよびLachmann, Clin. Exp. Immunol.(1990)79：315-21;Kostelny et al., J. Immunol.(1992)148：1547-53を参照されたい。「抗原」は、抗体が特異的に結合する実体である。
【００３４】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、B細胞および/またはT細胞が応答する、抗原上の部位を意味する。B細胞エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の3次フォールディングによって並置された不連続なアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、変性溶媒に曝露された際に典型的には保持されるのに対し、3次フォールディングによって形成されたエピトープは、変性溶媒を用いて処理すると、典型的には破壊される。エピトープは、典型的には、特有の空間的立体構造中に、少なくとも3個、およびより一般的には、少なくとも5個または8個〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体構造を決定する方法には、例えば、X線結晶構造解析および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed.(1996)を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、一方の抗体が標的抗原への別の抗体の結合を阻止する能力を示す単純なイムノアッセイ法において同定され得る。T細胞は、CD8細胞の場合は約9個のアミノ酸の連続エピトープ、またはCD4細胞の場合は約13個〜15個のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、エピトープに応答した、初回抗原刺激されたT細胞による3H-チミジン取込みによって(Burke et al., J. Inf. Dis.(1994)170：1110-19)、抗原依存的な死滅(細胞障害性Tリンパ球アッセイ法、Tigges et al., J. Immunol.(1996)156：3901-10)によって、またはサイトカイン分泌によって測定されるように、抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイ法によって、同定され得る。
【００３５】
「免疫原性物質」または「免疫原」は、任意でアジュバントと共に哺乳動物に投与した際に、それに対する免疫学的応答を誘発することができる。「アジュバント」という用語は、抗原と共に投与された場合に、その抗原に対する免疫応答を増大するが、単独で投与された場合には抗原に対する免疫応答を発生させない化合物を意味する。アジュバントは、リンパ球動員、B細胞および/またはT細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって、免疫応答を増大することができる。
【００３６】
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが、共通の抗原に対する参照抗原の特異的結合を阻害するアッセイ法によって判定される。多数のタイプの競合結合アッセイ法が公知であり、例えば、以下のものである：直接または間接固相ラジオイムノアッセイ法(RIA)、直接または間接固相酵素免疫測定法(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ法(Stahli et al., Meth Enzymol(1983)9：242-53を参照されたい);直接ビオチン-アビジン固相EIA(Kirkland et al., J. Immunol.(1986)137：3614-19を参照されたい);固相直接標識アッセイ法、固相直接標識サンドイッチアッセイ法(HarlowおよびLane, 「Antibodies, A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Press(1988)を参照されたい);125I標識を使用する固相直接標識RIA(Morel et al., Mol. Immunol.(1988)25(1)：7-15を参照されたい);固相直接ビオチン-アビジンEIA(Cheung et al., Virology(1990)176：546-52);および直接標識RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol.(1990)32：77-82)。典型的には、このようなアッセイ法は、これら、すなわち未標識の試験免疫グロブリンおよび標識された参照免疫グロブリンのいずれかを有する固体表面または細胞に結合される精製抗原の使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合される標識の量を決定することによって測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在している。競合アッセイ法によって同定される抗体(競合している抗体)には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および参照抗体によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合して立体障害を生じさせる抗体が含まれる。通常、競合する抗体が過剰に存在している場合、それは、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を少なくとも50％または75％阻害すると考えられる。
【００３７】
疾患を「治療すること」または疾患の「治療」には、(1)疾患を予防すること、すなわち、疾患に曝露される可能性があるか、もしくは罹患しやすい可能性があるが、疾患の症状をまだ経験もせず、示してもいない哺乳動物において、その疾患の臨床症状が発現しないようにさせること;(2)疾患を抑制すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発達を止めるもしくは低減させること;または(3)疾患を緩和すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の軽減を引き起こすこと、が含まれる。
【００３８】
「治療的有効量」とは、疾患を治療するために哺乳動物に投与された場合に、その疾患に対するそのような治療を実施するのに十分な化合物の量を意味する。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される哺乳動物の年齢、体重などに応じて変動すると考えられる。
【００３９】
「調節物質」とは、標的と相互作用する分子を意味する。相互作用には、本明細書において定義される、作用物質、および拮抗物質などが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００４０】
「任意の」または「任意で」とは、続いて説明される事象または状況が発生してよいが発生しなくてもよいこと、ならびにその説明が、その事象または状況が発生する場合、およびそれが発生しない場合を含むことを意味する。
【００４１】
「疾患の状態」とは、任意の疾患、状態、症状、または徴候を意味する。
【００４２】
「被験体」とは、哺乳動物および非哺乳動物を意味する。哺乳動物とは、限定されるわけではないが、ヒト;チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなどの農場動物;ウサギ、イヌ、およびネコなどのペット;ならびにラット、マウス、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などを含む、哺乳綱の任意のメンバーを意味する。非哺乳動物の例にはトリなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。「被験体」という用語は、特定の年齢も性別も示さない。
【００４３】
「トランスジェニック動物」または「ノックアウト動物」という用語は、1種または複数種の標的遺伝子の機能障害性の発現を有するか、または異種遺伝子の発現を有する、操作された動物を意味する。
【００４４】
一般的方法
本発明は、化合物の遺伝毒性を検出するための方法を提供する。本質的に、さらに分化することができる試験細胞が提供される。試験細胞を試験化合物または試験試料に接触させ、かつ試験化合物または試験試料が試験細胞と相互に作用するのに十分な期間、インキュベートする。次いで、試験細胞を誘導して分化させ、かつ1種または複数種の指標遺伝子の発現レベルの変化を測定する。
【００４５】
適切な試験細胞を最初に選択する。通常、使用される試験細胞は、中間体または最終分化を遂げた形態にさらに分化することができると考えられ、かつ、細胞株、組織試料、および単離物または移植片などを含み得る。試験細胞は、試料または単離物中の細胞集団の一部分として存在し得る。あるいは、細胞応答は、試験化合物を動物、特にトランスジェニック動物に投与することによって、インサイチューで研究され得る。好ましくは、C2C12のような永久細胞株が使用される。
【００４６】
レポーター構築物を組み入れることによって、例えば構造遺伝子DDA3または4833427G06Rikのコード領域をレポーター遺伝子で置換することによって、例えば、相同組換えによって、またはレポーター遺伝子に機能的に連結された指標遺伝子調節領域を有する構築物を用いて細胞を形質転換することによって、、適切な細胞を改変することができる。表2に列挙した遺伝子のうちのいずれか、またはそれらの組合せを使用してよい。さらに、2種またはそれ以上の異なる試験細胞のパネルを使用してもよく、その際、各試験細胞は、1種または複数種の指標遺伝子の調節領域に応答するレポーター構築物を含む。レポーター構築物が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはβ-ガラクトシダーゼ(βGal)などのような観察可能な標識を提供する場合、各試験細胞は、好ましくは、2つ以下のレポーター構築物、より好ましくは1つ以下のレポーター構築物を含む。レポーター構築物が転写標識(例えば、独特なポリヌクレオチド配列)を提供する場合、細胞は、複数のレポーター構築物を含んでもよい。どちらの場合も、様々なタイプの試験細胞(例えば筋芽細胞および骨芽細胞)、ならびに/または様々な種に由来する試験細胞(例えばマウス細胞およびヒト細胞)を有する、試験細胞のパネルが構築され得る。
【００４７】
分析される特定の指標遺伝子は、好ましくは、それらの選択性に基づいて選択される。すなわち、当然それらは、遺伝毒性の化合物または条件への曝露に対して強い応答を示し、かつ、遺伝毒性ではない化合物または条件には、ほとんど応答しないか全く応答しない。「強い応答」は、上方調節または下方調節のいずれかであることができ、かつ、一般に、遺伝毒性の化合物または条件の不在下でのシグナルの変動の程度と比較することによって(例えば、その遺伝子の「バックグラウンドノイズ」と比較することによって)評価される。好ましくは、使用される指標遺伝子は、DDA3および4833427G06Rikを含む。
【００４８】
試験される化合物は、任意の供給源に由来してよく、かつ、純粋な化合物または溶液、混合物、製剤化された薬物、および複雑な環境試料(例えば、遺伝毒性物質を含むと推測される水もしくは土壌の試料)などとして提供され得る。例えば薬物候補物のような純粋な化合物の場合、好ましくは、一連の希釈物を調製する。この希釈物は、一般に、効果が観察され得る最低濃度(または有用である可能性がある最低濃度)、および選択された細胞が耐性を有すると考えられる最高濃度(または毒性となるのに十分な多さの用量)によって制限される。未知試料の場合、含まれている任意の遺伝毒性物質の効力を測定するために、好ましくは、例えば、1：10、1：30、1：100、および1：300などの一連の希釈物を調製する。環境試料の場合、代わりに、ベースラインの「許容される」レベルを最初に確立し、かつ、その希釈度の試料をスクリーニングして、その試料がその「許容される」レベル未満の遺伝毒性物質を含むか否かを判定してよい。検査前に任意で環境試料を滅菌して、試料中に存在し得るウイルス、細菌、および真菌からもたらされ得る影響を回避してもよい。
【００４９】
選択した細胞を、有糸分裂サイクルの休止期(G0)で維持されている間に化合物または試料と接触させ、かつ何らかの相互作用を生じさせるのに十分な期間、インキュベートする。一般に、このインキュベーション時間は、少なくとも約5分、より好ましくは少なくとも約20分、さらにより好ましくは少なくとも約1時間、さらにより好ましくは少なくとも約4時間である。このインキュベーション時間は、好ましくは、約48時間未満、より好ましくは約36時間未満、最も好ましくは約12時間〜約24時間である。
【００５０】
化合物または試料と共にインキュベーションした後、これらの細胞を任意で洗浄して、任意の残存する化合物を除去し、次いで、細胞が分化するのを誘導すると考えられる条件に曝露させる(細胞は停止してもしなくてもよく、かつ実際に分化できなくてもできてもよい)。分化を誘導するための方法は、一般に、使用される個々の細胞に依存すると考えられるが、典型的には、しばしば血清の形態の、適切な増殖因子を添加する段階を含む。指標遺伝子の発現レベルの検出可能な変化が生じるのに十分な期間にわたり、細胞を分化させる。一般に、この分化時間は、少なくとも約5分、好ましくは少なくとも約20分、さらにより好ましくは少なくとも約1時間、さらにより好ましくは少なくとも約4時間である。この分化時間は、一般に、約48時間未満、より好ましくは約36時間未満、最も好ましくは約12時間〜約24時間である。
【００５１】
分化条件に曝露させた後、1種または複数種の指標遺伝子の発現レベルを決定する。発現レベルは、(例えば、RT-PCRまたは他の定量的もしくは半定量的PCR、または標的増幅方法を用いて)転写された指標遺伝子mRNAを直接測定することによって、タンパク質産物を測定することによって、指標遺伝子プロモーターの制御下で発現される検出可能な標識を測定することによって、または当技術分野において公知の他の方法を用いることによって、検出され得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、N. Kruse et al.,J Immunol Meth(1997)210：195-203を参照されたい。タンパク質産物は、(mRNAのインビボもしくはインビトロいずれかでの翻訳後の)選択的抗体への結合によってタンパク質を直接測定すること、酵素活性、または指標遺伝子産物と検出可能な標識(例えばルシフェリン、緑色蛍光タンパク質、および西洋ワサビペルオキシダーゼなど)とを組み合わせた融合タンパク質の活性を用いて、タンパク質を測定することなどを含む、当技術分野において公知の様々な方法によって測定され得る。
【００５２】
ポリヌクレオチドが直接検出される場合、使用される配列は、一般に、添付の配列表において示した配列(および相補体)のサブセットである。配列の選択は、使用される細胞の種類、ならびに使用される任意の構築物の詳細および使用される増幅形態に依存すると考えられる。RT-PCR用の例示的な配列には、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、およびSEQ ID NO：23が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００５３】
発現レベルの変化は、典型的には、対照の発現レベルに比較することによって決定され、この対照の発現レベルは、歴史的に確立された平均値、または好ましくは、遺伝毒性化合物で処理されていない(例えば、ビヒクル（vehicle）のみで処理された)が、それ以外では他の試験細胞と全く同様に処理された試験細胞の発現レベルのいずれかであり得る。一般に、指標遺伝子の発現において、1.5倍またはそれ以上、好ましくは2.0倍またはそれ以上の発現レベルの増加または減少は、その試験化合物が遺伝毒性を示すことを意味する。
【００５４】
遺伝子4833427G06Rikおよびそのタンパク質産物は、活性を有することが以前は公知ではなかった。本発明者らの発明は、以下に、それらが細胞周期の調節および分化に関与していることを実証する。
【００５５】
本発明はまた、DNAを含む組換え型のクローニングベクターおよび発現ベクター、ならびに組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。DNAを含む発現ベクターは、そのDNAによってコードされる本発明のポリペプチドまたは断片を調製するのに使用され得る。ポリペプチドを作製するための方法は、そのポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、そのポリペプチドの発現を促進する条件下で培養する段階と、次いで、発現されたポリペプチドを培養物から回収する段階を含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、使用される宿主細胞のタイプのような因子、およびそのポリペプチドが膜結合型であるか、または宿主細胞から分泌される可溶型であるかどうかによって異なることを認識すると考えられる。任意の適切な発現系が、使用され得る。これらのベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来するものなど、適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能的に連結された、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするDNAを含む。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がDNA配列に機能的に関係している場合、機能的に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がDNA配列の転写を制御する場合には、DNA配列に機能的に連結されている。所望の宿主細胞中で複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定するのに使用される選択遺伝子が、一般に、発現ベクター中に組み入れられる。
【００５６】
さらに、適切なシグナルペプチド(天然または異種)をコードしている配列を、発現ベクター中に組み入れることができる。シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNA配列は、DNAが最初に転写され、かつmRNAが、シグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるように、本発明のポリヌクレオチド配列にインフレームで融合され得る。意図した宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、細胞からポリペプチドが分泌される際に、ポリペプチドから切断される。
【００５７】
当業者はまた、シグナルペプチドが切断される位置は、コンピュータプログラムによって予測される位置とは異なる場合があり、かつ組換えポリペプチドを発現する際に使用される宿主細胞のタイプのような因子によって変動する場合があることも認識すると考えられる。タンパク質調製物には、複数の部位におけるシグナルペプチドの切断の結果として生じる、異なるN末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物が含まれ得る。
【００５８】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、またはより高等な真核細胞が含まれる。哺乳動物細胞または昆虫細胞が、一般に、宿主細胞として使用するのに好ましい。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主と共に使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Pouwels et al., 「Cloning Vectors： A Laboratory Manual」(Elsevier, New York, 1985)に記載されている。無細胞翻訳系もまた、本明細書において開示されるDNA構築物から誘導されるRNAを用いてポリペプチドを作製するのに使用され得る。
【００５９】
原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、およびブドウ球菌属(Staphylococcus)内の他の様々な種が含まれる。大腸菌のような原核宿主細胞において、ポリペプチドは、原核宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進するためにN末端メチオニン残基を含み得る。N末端Metは、発現された組換えポリペプチドから切断され得る。
【００６０】
原核宿主細胞において使用するための発現ベクターは、一般に、1種または複数種の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるタンパク質または独立栄養要求物を供給するタンパク質をコードしている遺伝子である。原核宿主細胞のための有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターpBR322(ATCC37017)のような市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。適切なプロモーターおよびDNA配列が、pBR322ベクター中に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)およびpGEM1(Promega Biotec, Madison, Wis., USA)が含まれる。
【００６１】
組換え原核宿主細胞発現ベクターのために通常使用されるプロモーター配列には、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトースプロモーター系(Chang et al., Nature(1978)275：615;およびGoeddel et al., Nature(1979)281：544)、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddel et al., Nuc Acids Res.(1980)8：4057;およびEP036776)、ならびにtacプロモーター(Maniatis, 「Molecular Cloning： A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982)が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλPLプロモーターおよびcI857ts熱不安定性リプレッサー配列を使用する。λPLプロモーターの誘導体を組み入れている、米国微生物株保存機関(American Type Culture Collection)から入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2(大腸菌株JMB9、ATCC 37092中に内在)およびpPLc28(大腸菌株RR1、ATCC 53082中に内在)が含まれる。
【００６２】
あるいは、ポリペプチドは、酵母宿主細胞において、好ましくは、サッカロミセス属(例えば、S.セレビシエ(S. cerevisiae))から発現され得る。ピキア(Pichia)またはクルイベロマイセス(Kluyveromyces)など酵母の他の属もまた、使用され得る。酵母ベクターは、2μ酵母プラスミドに由来する複製起点配列、自律複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択マーカー遺伝子をしばしば含む。酵母ベクターのために適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J.Biol. Chem.(1980)255：2073)、または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど他の解糖系酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg.(1968)7：149;およびHolland et al., Biochem.(1978)17：4900)が含まれる。酵母発現において使用するのに適した他のベクターおよびプロモーターは、Hitzeman, EP073,657においてさらに説明されている。別の代替手段は、Russell et al., J. Biol. Chem.(1982)258：2674およびBeier et al., Nature(1982)300：724によって説明された、グルコースに抑制されるADH2プロモーターである。酵母および大腸菌の両方において複製可能なシャトルベクターは、大腸菌における選択および複製のためにpBR322に由来するDNA配列(Ampr遺伝子および複製起点)を上記の酵母ベクター中に挿入することによって、構築され得る。
【００６３】
酵母α因子リーダー配列が、ポリペプチドの分泌を指示するために使用され得る。α因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間にしばしば挿入される。例えば、Kurjan et al., Cell(1982)30：933、およびBitter et al., Proc Natl Acad Sci USA(1984)81：5330を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、1つまたは複数の制限部位を含むように3'末端近くを改変され得る。これにより、リーダー配列の構造遺伝子への融合を容易にすると考えられる。
【００６４】
酵母の形質転換プロトコールは、当業者に公知である。1つのこのようなプロトコールは、Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci USA(1978)75：1929, 1978によって説明されている。Hinnenらのプロトコールでは、0.67％酵母窒素ベース、0.5％カザミノ酸、2％グルコース、10mg/mlアデニン、および20mg/mlウラシルからなる選択培地においてTrp+形質転換体を選択する。
【００６５】
ADH2プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母宿主細胞を、発現を誘導するために「富栄養(rich)」培地において増殖させてよい。富栄養培地の例は、80mg/mlアデニンおよび80mg/mlウラシルを添加された、1％酵母抽出物、2％ペプトン、および1％グルコースからなるものである。ADH2プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から使い尽くされた場合に起こる。
【００６６】
哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現するのに使用され得る。昆虫細胞において異種タンパク質を生成させるためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers, Bio/Technology(1988)6：47に概説される。哺乳動物起源の樹立細胞系もまた、使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のCOS-7株(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., Cell(1981)23：175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、およびBHK(ATCC CRL10)細胞株、ならびにMcMahan et al. EMBO J.(1991)10：2821によって説明されているような、アフリカミドリザル腎臓細胞株CV1(ATCC CCL 70)に由来するCV1/EBNA細胞株が含まれる。
【００６７】
DNAを哺乳動物細胞中に導入するための確立された方法は、説明されている(Kaufman, R.J., 「Large Scale Mammalian Cell Culture」, 1990, pp. 15-69)。リポフェクタミン脂質試薬(Gibco/BRL)またはリポフェクタミン-プラス脂質試薬など市販の試薬を使用する別のプロトコールも、細胞をトランスフェクトするのに使用され得る(Felgner et al., Proc Natl Acad Sci USA(1987)84：7413-17)。さらに、エレクトロポレーションが、Sambrookら(「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」, 2d ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)におけるもののような従来の手順を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに使用され得る。安定な形質転換体の選択は、例えば、細胞毒性薬物に対する耐性のような当技術分野において公知の方法を用いて実施され得る。Kaufman et al., Meth Enzymol(1990)185：487-511では、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)耐性のようないくつかの選択スキームを説明している。DHFR選択に適した宿主株は、DHFRを欠損しているCHO株DX-B11であり得る(UrlaubおよびChasin, Proc Natl Acad Sci USA(1980)77：4216-20)。DHFR cDNAを発現しているプラスミドをDX-B11株中に導入することができ、かつそのプラスミドを含む細胞のみが、適切な選択培地において増殖することができる。発現ベクター中に組み入れることができる選択マーカーの他の例には、G418およびハイグロマイシンBなどの抗生物質に対する耐性を与えるcDNAが含まれる。ベクターを有する細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択され得る。
【００６８】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出すことができる。通常使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス2、サルウイルス40(SV40)、およびヒトサイトメガロウイルスに由来する。SV40ウイルスゲノムに由来するDNA配列、例えば、SV40複製起点部位、初期および後期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライス部位、およびポリアデニル化部位は、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝因子を提供するのに使用され得る。ウイルスの初期および後期プロモーターは、両方ともウイルスゲノムから断片として容易に得られ、ウイルスの複製起点も含み得るため、特に有用である(Fiers et al., Nature(1978)273：113;Kaufman, Meth. Enzymol(1990))。Hind III部位からSV40ウイルスの複製起点部位中に位置するBglI部位に向かって伸びる約250bpの配列が含まれているという条件で、より小型またはより大型のSV40断片もまた使用され得る。
【００６９】
哺乳動物の発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが示されているその他の制御配列には、CHO細胞に由来する発現増強配列エレメント(EASE)(Morris et al., WO 97/25420)ならびにアデノウイルス2に由来する3要素(tripartite)リーダー(TPL)RNAおよびVA遺伝子RNA(Gingeras et al., J. Biol. Chem.(1982)257：13475-91)のようなエレメントが含まれる。ウイルス由来の内部リボソーム進入部位(IRES)配列により、2シストロン性mRNAが効率的に翻訳されることが可能になる(OhおよびSarnow, Cur Op Gen Dev(1993)3：295-300;Ramesh et al., Polynuc Res(1996)24：2697-700)。2シストロン性mRNAの一部分としての異種cDNAとそれに続く選択マーカー用遺伝子(例えばDHFR)の発現により、宿主のトランスフェクション能および異種cDNAの発現が向上することが示されている(Kaufman, Meth Enzymol, 1990)。2シストロン性mRNAを使用する例示的な発現ベクターは、Mosser et al., Biotechniques(1997)22：150-61によって説明されているpTR-DC/GFP、およびMorris et al., 「Animal Cell Technology」, 1997, pp.529-34によって説明されているp2A5Iである。
【００７０】
有用な高発現ベクターであるpCAVNOTが、Mosley et al., Cell(1989)59：335-48によって説明された。哺乳動物宿主細胞において使用するための他の発現ベクターは、OkayamaおよびBerg, Mol. Cell. Biol.(1983)3：280によって開示されているように構築することができる。C127マウス乳腺上皮細胞における哺乳動物cDNAの安定で高レベルな発現のために有用な系は、Cosman et al., Mol. Immunol.(1986)23：935によって説明されているようにして実質的に構築することができる。Cosman et al., Nature(1984)312：768によって説明された有用な高発現ベクターであるPMLSV N1/N4は、ATCC 39890として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、参照により本明細書に組み入れられる、EP0367566およびWO91/18982において説明されている。さらに別の代替方法において、これらのベクターは、レトロウイルスに由来し得る。
【００７１】
別の有用な発現ベクターであるpFLAG.RTMが使用され得る。FLAG.RTM技術は、低分子量(1kD)、親水性のFLAG.RTMマーカーペプチドをpFLAG.RTM発現ベクターによって発現される組換えタンパク質のN末端に融合することを中心としている。
【００７２】
使用され得るシグナルペプチドに関して、天然のシグナルペプチドは、所望の場合は、異種のシグナルペプチドまたはリーダー配列によって置き換えられ得る。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、組換えポリペプチドが生成される場所となる宿主細胞のタイプのような因子に依存し得る。例示として、哺乳動物宿主細胞において機能的である異種シグナルペプチドの例には、US4,965,195において説明されているインターロイキン-7(IL-7)に対するシグナル配列;Cosman et al., Nature(1984)312：768において説明されているインターロイキン-2受容体に対するシグナル配列;EP367,566において説明されているインターロイキン-4受容体シグナルペプチド;US4,968,607において説明されているインターロイキン-1のI型受容体シグナルペプチド;およびEP460,846において説明されているインターロイキン-1のII型受容体シグナルペプチドが含まれる。
【００７３】
本発明によって包含される「単離された」ポリペプチドまたはその断片は、それまたはそれらが自然界で見られ得る環境と同一の環境中に無いポリペプチドまたは断片である。本発明によって包含される「精製された」ポリペプチドまたはその断片は、例えば、前記のもののような組換え発現系の精製産物として、または天然の細胞および/もしくは組織などの非組換え供給源からの精製産物として、他のタンパク質またはポリペプチドから本質的に離れている。
【００７４】
当業者には公知であるように、任意のタイプの宿主細胞に関して、組換えポリペプチドまたは断片を精製するための手順は、使用される宿主細胞のタイプのような因子、およびその組換えポリペプチドまたは断片が、培地中に分泌されるか否かによって異なると考えられる。
【００７５】
一般に、組換えポリペプチドまたは断片は、分泌されない場合には宿主細胞から、または、可溶性のかつ分泌される場合には培地もしくは上清から単離することができ、続いて1回もしくは複数回の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー精製、またはサイズ排除のクロマトグラフィーの段階を実施する。これらの段階を遂行するための具体的な方法に関しては、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて、培地を最初に濃縮することができる。濃縮段階に続いて、ゲルろ過媒体のような精製マトリックス上にその濃縮物を添加することができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル(DEAE)ペンダント基を有するマトリックスまたは基材（substrate）も、使用され得る。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において通常使用される他のタイプであり得る。あるいは、陽イオン交換段階も使用され得る。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。さらに、等電点電気泳動段階も使用され得る。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー段階も、使用され得る。適切なマトリックスは、樹脂に結合されたフェニル部分またはオクチル部分であり得る。さらに、組換えタンパク質と選択的に結合するマトリックスを用いたアフィニティクロマトグラフィーも、使用され得る。使用されるこのような樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、および金属キレートカラムである。最後に、疎水性RP-HPLC媒体(例えば、シリカゲル、またはペンダント型のメチル、オクチル、オクチルデシル、もしくは他の脂肪族基を有するポリマー樹脂)を使用する1回または複数回の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)段階が、ポリペプチドをさらに精製するために使用され得る。様々に組み合わせられた、前記の精製段階のうちのいくつかまたはすべては周知であり、かつ単離および精製された組換えタンパク質を提供するのに使用され得る。
【００７６】
本発明のポリペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体のような、本発明のポリペプチドを結合するタンパク質を含むアフイニティーカラムを、発現されたポリペプチドをアフィニティー精製するために使用することもまた可能である。これらのポリペプチドは、従来の技術を用いて、例えば、高塩濃度溶出緩衝液中に入れ、次いで、使用するためにより低塩濃度の緩衝液中に透析して、または、使用したアフイニティーマトリックスに応じてpHもしくは他の成分を変更することによって、アフイニティーカラムから除去することができ、または、本発明から得られるポリペプチドのような、アフィニティー部分の天然基質を用いて競合的に除去することができる。
【００７７】
本発明のこの局面において、本発明の抗ポリペプチド抗体のようなポリペプチド結合タンパク質、または本発明のポリペプチドと相互に作用し得る他のタンパク質は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、またはそれらの表面で本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定、分離、もしくは精製するのに適した同様の基材など固相の支持体に結合され得る。本発明のポリペプチド結合タンパク質の固相接触表面への接着は、任意の手段によって達成され得る。例えば、磁性微粒子をこれらのポリペプチド結合タンパク質でコーティングし、かつ磁場を通過するインキュベーション容器中で保持することができる。細胞混合物の懸濁液を、そのようなポリペプチド結合タンパク質を表面に有する固相と接触させる。表面に本発明のポリペプチドを有する細胞は、固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、次いで未結合の細胞は洗い流される。このアフィニティー結合法は、このようなポリペプチドを発現している細胞を溶液から精製、スクリーニング、または分離するのに有用である。固相から陽性として選択された細胞を遊離させる方法は当技術分野において公知であり、例えば、酵素の使用を包含する。このような酵素は、好ましくは、それらの細胞に対して非毒性かつ非傷害性であり、かつ、好ましくは細胞表面の結合相手を切断することを対象としている。
【００７８】
あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含むと推測される細胞混合物を、ビオチン標識した本発明のポリペプチド結合タンパク質と共に最初にインキュベートする。インキュベーション期間は、典型的には、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確実にするために、少なくとも1時間の期間である。次いで、結果として生じる混合物を、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに通し、それによって、ビオチンのアビジンに対する高い親和性により、ポリペプチド結合細胞がビーズに結合する。アビジンでコーティングしたビーズの使用は、当技術分野において公知である。Berenson, et al. J. Cell. Biochem(1986)10D：239を参照されたい。未結合の材料の洗浄および結合された細胞の遊離は、従来の方法を用いて実施する。
【００７９】
所望の純度は、タンパク質の意図される用途に依存する。例えば、ポリペプチドがインビボで投与されることになっている場合は、比較的高い純度が望ましい。このような場合、これらのポリペプチドは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した際に、他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出されなくなるように、精製される。差次的なグリコシル化、および差次的な翻訳後プロセッシングなどのために、このポリペプチドに対応する複数のバンドがSDS-PAGEによって可視化され得ることは、当業者によって認識されると考えられる。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、SDS-PAGEによって分析した際に単一のタンパク質バンドによって示されるように、実質的に均質になるまで精製される。タンパク質バンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、または(タンパク質が放射標識されている場合には)オートラジオグラフィーによって、可視化され得る。
【００８０】
本発明の精製されたポリペプチド(タンパク質、ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマー、および他の形態を含む)は、従来の結合アッセイ法のような任意の適切なアッセイ法において、結合相手と結合する能力について試験され得る。ポリペプチドは、検出可能な試薬(例えば、放射性核種、発色団、および比色反応もしくは蛍光反応を触媒する酵素など)で標識され得る。標識されたポリペプチドを、結合相手を発現している細胞と接触させる。次いで、細胞を洗浄して未結合の標識されたポリペプチドを除去し、かつ、標識の性質に従って選択した適切な技術によって、細胞に結合された標識の存在を判定する。
【００８１】
別のタイプの競合結合アッセイ法は、可溶性4833427G06Rik/Fc融合タンパク質のような放射標識された可溶性の結合相手、および特異的抗体を発現している完全な細胞を使用する。オートラジオグラフィーを用いた競合的プレート結合アッセイ法によって質的な結果を得ることができ、スキャッチャードプロット(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci.(1949)51：660)を使用して、定量的結果を得ることができる。このような結合アッセイ法は、結合相手への結合に関して天然のタンパク質と競合する変異体の能力を分析することによって、変異ポリペプチドの生物活性を評価するのに有用であり得る。
【００８２】
本発明の4833427G06Rikポリペプチドは、本発明の4833427G06Rikポリペプチドに(拮抗すること)によって活性化を阻害する化合物および低分子のスクリーニングアッセイ法においても使用され得る。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然産物混合物から拮抗物質を同定するのに使用され得る。拮抗物質は、天然もしくは改変された基質、リガンド、酵素、もしくは4833427G06Rikポリペプチドの受容体であり得るか、または4833427G06Rikポリペプチドの構造的もしくは機能的模倣体であり得る。拮抗物質はさらに、低分子、ペプチド、抗体、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。
【００８３】
4833427G06Rikポリペプチドに拮抗する化合物を同定するための方法の1つの態様は、4833427G06Rikポリペプチドに応答する細胞に候補化合物を接触させ、かつそれらの細胞に対する4833427G06Rikの結合、または機能的応答の刺激もしくは抑制を観察することである。次いで、候補化合物に接触させた細胞の活性を、接触させなかった同一の細胞と4833427G06Rikポリペプチド活性に関して比較して、4833427G06Rikポリペプチドの作用物質および拮抗物質を同定することができる。本発明のさらに別の態様は、4833427G06Rikポリペプチドを発現する細胞に候補化合物を接触させ、かつ4833427G06Rik産生を測定することにより、4833427G06Rikの合成または分泌を阻害する化合物を同定する方法を提供する。4833427G06Rik産生の測定は、(例えばELISAによる)存在するタンパク質の量の測定、またはタンパク質の活性の測定などいくつかの周知の方法によって実施され得る。
【００８４】
本発明による精製されたポリペプチドは、そのようなポリペプチドの阻害物質(もしくは拮抗物質)および/または作用物質の発見を容易にすると考えられる。その潜在的な阻害物質および/または作用物質をスクリーニングする際に本発明の精製されたポリペプチドを使用することは重要であり、かつ汚染物質が反応を妨害する可能性を排除または減少させ得る。
【００８５】
さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの阻害物質および/または作用物質の構造に基づいた設計のために使用され得る。このような構造に基づく設計はまた、「合理的薬物設計」としても公知である。ポリペプチドは、例えば、X線結晶構造解析、核磁気共鳴、またはホモロジーモデリングによって3次元的に解析することができ、これらはすべて周知の方法である。阻害物質設計および阻害物質とポリペプチドの相互作用を支援する分子モデリングソフトウェアシステムにおけるポリペプチド構造情報の使用もまた、本発明に包含される。このようなコンピューター支援モデリングおよび薬物設計は、化学的配座解析、分子の静電ポテンシャル、タンパク質フォールディングなどの情報を用いることができる。例えば、メタロプロテアーゼのクラス特異的阻害物質の設計の大半は、触媒の亜鉛原子とキレート化するか、またはそれに結合する試みに焦点を当てている。合成阻害物質は、通常、個々のプロテアーゼの特異的ポケットに適合するように設計された一連の他の基が結合する、負電荷を持った部分を含むように設計される。本発明の特定の方法は、有望な基質結合部位に関して本発明のポリペプチドの3次元構造を解析する段階、予測的な反応部位を組み込む新しい分子を合成する段階、および上記のように新分子をアッセイする段階を含む。
【００８６】
具体的なスクリーニング方法は当技術分野において公知であり、かつそれに加えて、多数の試験化合物の拮抗物質または作用物質活性を短期間内に試験できるように、ハイスループットなスクリーニングにおいては、統合されたロボットシステムおよび化学化合物/天然産物の収集物が大規模に組み入れられる。これらの方法には、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移、シンチレーション近接アッセイ法、レポーター遺伝子アッセイ法、蛍光消光酵素基質、色素産生酵素基質、および電気化学発光のような同種のアッセイ形式、ならびに酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ法のようなより伝統的な異種のアッセイ形式が含まれる。同種のアッセイ法が好ましい。細胞ベースのアッセイ法、例えばレポーター遺伝子を使用するもの、ならびに、拮抗物質または作用物質が4833427G06Rikの生物学的機能または活性に与える影響を分析する機能的アッセイ法もまた、本明細書において含まれる。
【００８７】
したがって、本発明の1つの局面において、その試験化合物が、4833427G06Rikポリペプチドの生物活性に影響を及ぼすか(または調節するか)どうかを判定するために試験化合物をスクリーニングするための方法が提供され、この方法は、試験化合物および4833427G06Rikポリペプチドを、4833427G06Rikと接触した場合に生物活性を示すことができる細胞に接触させる段階、ならびに生物活性の存在に関して細胞を分析する段階を含み、その際、試験化合物の存在下で観察される生物活性が、試験化合物が存在しない場合に観察される生物活性と異なる場合には、その試験化合物が4833427G06Rikの生物活性に影響を及ぼしている。これらの細胞は、インビトロまたはインビボで接触させられ得る。
【００８８】
4833427G06Rikを介した、シグナル伝達経路の調節は、例えば以前に考察されているような、分子変化のカスケードをしばしば伴い、その際、受容体は、標的基質(それら自体が、リン酸化後に活性化されるキナーゼ、またはリン酸化後のタンパク質-タンパク質相互作用を通じて下流のシグナル伝達を促進するアダプター分子であり得る)をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することによって、リガンド-受容体を介したシグナルを伝播して、他の因子(例えばNFκB)の活性化をもたらす。本発明のスクリーニング方法が、4833427G06Rikによって誘導される、シグナル伝達経路の調節を分析する段階を含む場合、分析され得るシグナル伝達経路には、NFκBの活性化を含むものが含まれる。シグナル伝達カスケードの活性化をアッセイする段階は、IκB(IκB分解アッセイ法、および遊離IκBのアッセイ法を含む)、p38MAPキナーゼ、ならびにストレス活性化タンパク質キナーゼ(SAPK/JNK)のリン酸化のような、シグナル伝達カスケードの間に発生する分子のリン酸化を検出する段階をさらに含む。
【００８９】
さらに、当業者は、生物活性が、ほとんどの場合、細胞上に存在する受容体(対応構造体（counter-structure）または結合部分)へのリガンド(すなわち、4833427G06Rik)の結合によって誘導されることを理解する。したがって、以前に説明されているように、4833427G06Rikポリペプチド(4833427G06Rikポリペプチド断片を含む)は、受容体発現細胞を同定するための結合調査において使用され得る。このような結合調査はまた、本発明の方法において有用なアッセイ法も提供する。4833427G06Rikポリペプチドはまた、受容体(または4833427G06Rikに結合する他の分子)をクローニングするため、および受容体/リガンド相互作用を妨害する分子をスクリーニングするためにも使用され得る。当業者は、生物活性には、細胞増殖、細胞死、ならびに細胞の形態および/または機能の変化(例えば、活性化、成熟)が含まれることをさらに理解する。4833427G06Rikのこのような影響を評価するアッセイ法は当技術分野において公知であり、かつ、本発明の方法においても有用であると考えられる。さらに、本明細書において開示するもののような症候群および/または状態の動物モデルは、4833427G06Rikの拮抗作用(または受容体活性化作用のスクリーニングを含む、生物活性に関する化合物のスクリーニングに有用である。
【００９０】
本発明の方法は、4833427G06Rik活性の作用物質または拮抗物質を発見および/または分析するために複数のアッセイ法(すなわち、組合せ方法)を実施することをさらに包含する。一般に、このような方法は、4833427G06Rikの性質(すなわち、4833427G06Rikが4833427G06Rikの対応する構造体に結合する能力)に影響を及ぼす試験化合物を選択する段階、次いで、4833427G06Rikの別の性質に対する影響に関して選択された化合物を試験する段階(すなわち、選択された試験化合物および4833427G06Rikポリペプチドを、4833427G06Rikと接触した場合に生物活性を示すことができる細胞に接触させる段階、およびそれらの化合物が生物活性に影響を及ぼすかどうか判定する段階)を含む。例えば、本発明の方法は、候補分子が4833427G06Rikと相互作用するか(結合するか)どうかを判定するための第1のアッセイ法を含み得る。1つの態様において、第1のアッセイ法は、ハイスループットな形式であり、それらの多数の形態が当技術分野において公知であり、かつ本明細書において開示される。このようなアッセイ法は、一般に、試験化合物および4833427G06Rikポリペプチドを4833427G06Rikの対応構造体に接触させる段階;それらの試験化合物が、対応構造体に4833427G06Rikが結合する能力に影響を及ぼすかどうかを判定する段階;ならびに対応構造体に4833427G06Rikが結合する能力に影響を及ぼす1種または複数種の試験化合物を選択する段階を含む。本発明の組合せ方法は、前記のアッセイ法のうちの1種または複数種を用いて、生物活性に対する作用的効果または拮抗的効果について、選択された化合物を第2のアッセイ法において評価する段階をさらに含む。
【００９１】
あるいは、本発明の組合せ方法は、本明細書において説明するように、インビトロアッセイ法またはインビボアッセイ法(例えば動物モデル)を用いて、候補分子が4833427G06Rikの生物活性を調節するかどうかを判定するための第1のアッセイ法を含み得る。このような組合せ方法に従って、この様式で4833427G06Rikの生物活性を調節する分子が、生物活性に関する前記のアッセイ法のうちの1種または複数種を用いて選択され、かつ、候補分子が4833427G06Rikに結合するかどうかを判定するためにアッセイされる。選択された分子は、試験分子が結合する、4833427G06Rikの正確な1つまたは複数の領域をさらに明確にするために試験され得る(例えば、抗体のエピトープマッピング)。
【００９２】
以前に開示されているように、本発明の組合せ方法において使用され得るタイプの、4833427G06Rikの生物活性に関するアッセイ法には、本明細書において説明するように、サイトカイン発現に関するアッセイ法、細胞表面分子の発現に関するアッセイ法、シグナル伝達分子の活性化を検出するアッセイ法、mRNAの誘導を検出するアッセイ法、および細胞増殖または細胞死を評価するアッセイ法(ならびにそれらの組合せ)が含まれる。結合し、かつ生物活性に対して作用的効果または拮抗的効果を有する分子は、これらのポリペプチドが関係があるとされている疾患または状態を治療または予防する際に有用であると考えられる。
【００９３】
当業者は、試験化合物の存在下で観察される生物活性が、試験化合物が無い場合に観察されるものより大きい場合、その試験化合物が4833427G06Rikの作用物質であるのに対し、試験化合物の存在下で観察される生物活性が、試験化合物が無い場合に観察されるものより小さい場合、その試験化合物は4833427G06Rikの拮抗(または阻害物質)であることを理解する。一般に、拮抗は、活性を少なくとも30％低減または抑制すると考えられ;より好ましくは、拮抗物質は、少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも90％、活性を抑制すると考えられる。同様に、作用物質は、活性を少なくとも20％増大または増強させると考えられ;より好ましくは、作用物質は、少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも50％、活性を増強させると考えられる。当業者はまた、それぞれ様々なレベルの受容体活性化作用もしくは拮抗作用を有する作用物質および/または拮抗物質が、様々な用途のために(すなわち、様々な疾患状態の治療のために)有用であり得ることも認識すると考えられる。
【００９４】
同種のアッセイ法は、ロボット適用に非常に適する、混合および読取(mix and read)スタイルのアッセイ法であるのに対し、異種のアッセイ法は、ろ過、遠心分離、または洗浄などより複雑な単位操作による、結合された分析物からの分離を必要とする。これらのアッセイ法は、多種多様な特異的生体分子相互作用(タンパク質-タンパク質、受容体-リガンド、および酵素-基質などを含む)、および有機低分子によるそれらの阻害を検出するために使用される。これらのアッセイ方法および技術は当技術分野において周知である(例えば、「High Throughput Screening： The Discovery of Bioactive Substances」, John P. Devlin(ed.), Marcel Dekker, New York, 1997 ISBN： 0-8247-0067-8を参照されたい)。本発明のスクリーニングアッセイ法は、化学ライブラリーのハイスループットなスクリーニングに適用でき、かつ、天然または合成の、低分子の薬物候補物、抗体、ペプチド、ならびに他の拮抗物質および/または作用物質の同定に適している。いくつかの有用なアッセイ法が、US2003-0165985において開示されている(関連する開示は、参照により本明細書に組み入れられる)。
【００９５】
本発明の方法は、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、cDNAライブラリー、組換え抗体ライブラリー(または抗体のサブユニットを含むライブラリー)および天然産物混合物から、4833427G06Rik活性の拮抗物質(阻害物質とも呼ばれる)および作用物質を同定するのに使用され得る。拮抗物質および作用物質は、本発明のポリペプチドの天然または改変された基質、リガンド、酵素、受容体などであり得るか、または、4833427G06Rikもしくはその結合相手/対応構造体の構造的もしくは機能的模倣体であり得る。本発明の潜在的な拮抗物質には、本発明のポリペプチドまたはその結合相手の結合部位に結合し、かつ結合部位を占有して、それらを天然の結合相手への結合に使用できなくさせ、これにより、正常な生物活性を妨げる、低分子、ペプチド、および抗体が含まれる。拮抗物質には、(例えば、受容体サブユニットの相互作用を阻害することにより、またはシグナル伝達カスケードの細胞内構成要素の相互作用を阻害することにより)、4833427G06Rikによって使用されるシグナル伝達経路に干渉する化学物質(低分子およびペプチドを含む)も含まれる。潜在的な作用物質には、本発明のポリペプチドまたはその結合相手に結合し、かつ、本発明のポリペプチドの結合によって引き起こされるものと同じまたは増強された生物学的効果を引き出す、低分子、ペプチド、および抗体が含まれる。さらに、4833427G06Rikによって使用されるシグナル伝達経路を活性化(または増強)する物質もまた、4833427G06Rikの作用物質の範囲内に含まれる。
【００９６】
低分子の作用物質および拮抗物質は、通常、分子量が10K未満であり、細胞浸透を向上させ、分解に耐え、かつそれらの生理学的半減期を延長させるいくつかの物理化学的特性および薬理学的特性を備え得る。完全な分子、ならびにFabおよびF(ab')2断片などの断片が含まれる抗体、ならびにそれらから誘導される組換え分子(ファージ上で発現される抗体、細胞内抗体、scFvのような単鎖抗体、および当技術分野において公知である免疫グロブリンから誘導される他の分子)は、本発明のポリペプチドに結合し、かつ、シグナル伝達カスケードの伝播を阻止することによって本発明のポリペプチドを阻害するのに使用され得る。これらの抗体はヒト化されていることが好ましく、かつ、それらの抗体がヒト抗体であることがより好ましい。本発明の抗体は、本明細書において開示するように、様々な周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。
【００９７】
本明細書において「試験分子」または「試験化合物」とも呼ばれる、4833427G06Rik活性を調節する能力に関して試験される候補分子のさらなる例には、炭水化物、低分子(通常、有機分子またはペプチド)、タンパク質、および核酸分子(典型的には8〜30個の核酸残基からなるオリゴヌクレオチド断片を含む)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。試験されるペプチドは、典型的には、5〜25個のアミノ酸残基からなる。また、候補核酸分子は、アンチセンス核酸配列であり得る、かつ/またはリボザイム活性を備え得る。
【００９８】
本発明の方法は、4833427G06Rikに依存性の細胞応答を媒介する1種または複数種のタンパク質をコードする1種または複数種のmRNA分子の機能的発現を阻害するアンチセンス分子をスクリーニングするために使用され得る。アンチセンス核酸分子は、ワトソン-クリックの塩基対を介して標的mRNA分子にハイブリダイズし、かつその翻訳を阻害することができるDNA配列である。あるいは、DNAは、転写の正常な方向に対して逆転されることができ、したがって、標的mRNA分子に相補的であるRNA転写物を発現することができる(すなわち、アンチセンス核酸分子のRNA転写物が、ワトソン-クリックの塩基対を介して標的mRNA分子にハイブリダイズすることができる)。アンチセンス核酸分子は、標的タンパク質の発現に干渉することができることを条件として、いくつかの異なる方法で構築され得る。スクリーニングされる典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは30〜40ヌクレオチドである。アンチセンス核酸分子は、一般に、標的遺伝子に実質的に同一である(ただし、アンチセンスの向きである)と考えられる。最小限の同一性は、典型的には、約80％より大きいと考えられるが、同一性がより高い方が、内在性配列の発現のより効果的な抑制を作用させ得る。約90％を超える実質的により高い同一性が好ましいが、約95％〜完全な同一性が最も好ましいと考えられる。
【００９９】
候補核酸分子は、リボザイム活性を備え得る。したがって、本発明の方法は、IL-1 ηに依存性の細胞応答を媒介する1種または複数種のタンパク質をコードする1種または複数種のmRNA分子の機能的発現を阻害するリボザイム分子をスクリーニングするために使用され得る。リボザイムは、リボザイムの配列に完全または部分的に相同である配列を有する核酸分子を切断することができる触媒RNA分子である。標的RNAと特異的に対をなし、かつ特定の位置でリン酸ジエステル主鎖を切断し、それによって標的RNAを機能的に不活性化するRNAリボザイムをコードするリボザイム導入遺伝子を設計することが可能である。この切断を実施する際、リボザイムそれ自体は改変されず、したがって、再利用され、かつ他の分子を切断することができる。アンチセンスRNA内部にリボザイム配列を含めると、それらにRNA切断活性が与えられ、それによって、アンチセンス構築物の活性が増大する。
【０１００】
標的RNAに特異的なリボザイムの設計および使用は、Haseloff et al.,  Nature(1988)334：585およびUS5,646,023において説明されており、これら刊行物の両方とも、参照により本明細書に組み入れられる。Tabler et al., Gene(1991)108：175では、単一の構築物においてアンチセンスRNAおよびリボザイム技術の利点を組み合わせることによって、触媒RNAの構築を大幅に簡略化した。リボザイム触媒に必要とされる相同性の領域はより小さく、したがって、これにより、切断部位が保存されている場合には、大きな遺伝子ファリミーの様々なメンバーの抑制が促進され得る。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドの使用のうちの1つは、プローブまたはプライマーとしての断片の使用である。このような断片は、一般に、あるDNA配列の少なくとも約17個の連続したヌクレオチドを含む。別の態様において、DNA断片は、あるDNA配列の少なくとも30個、または少なくとも60個の連続したヌクレオチドを含む。
【０１０２】
他の哺乳動物種に由来する4833427G06Rikの相同体は本明細書において企図されるため、4833427G06RikのマウスDNA配列に基づくプローブは、従来の異種間のハイブリダイゼーション技術を用いて、他の哺乳動物種に由来するcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。上記のアミノ酸配列と組み合わせて遺伝コードの知識を用いることにより、縮重オリゴヌクレオチドのセットを調製することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、DNA断片が単離および増幅されるポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)において、プライマーとして有用である。
【０１０３】
本発明のDNAは、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の欠陥、または不十分な量によって(直接的にまたは間接的に)媒介された任意の疾患に対する治療を開発する際に使用され得る。天然のヌクレオチド配列の本明細書における開示により、欠陥遺伝子を検出し、かつ正常遺伝子でそれらを置き換えることが可能になる。欠陥遺伝子は、インビトロの診断アッセイ法において、かつ、本明細書において開示される天然のヌクレオチド配列を、この遺伝子に欠陥を含むと疑われるヒトに由来する遺伝子の配列と比較することによって、検出され得る。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドの他の有用な断片には、標的mRNA(センス)またはDNA(アンチセンス)配列に結合することができる一本鎖ポリヌクレオチド配列(RNAもしくはDNAのいずれか)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、DNA(SEQ ID NO：5)の断片を含む。このような断片は、一般に、少なくとも約14個のヌクレオチド、好ましくは約14個〜約30個のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするcDNA配列に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、SteinおよびCohen, Cancer Res.(1988)48：2659およびvan der Krol et al., BioTechniques(1988)6：958において説明されている。
【０１０５】
標的ポリヌクレオチド配列にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを結合すると、RNAseHによるmRNAの分解の促進、スプライシングの阻害、転写もしくは翻訳の未熟終結を含むいくつかの手段のうちの1つによって、または他の手段によってタンパク質発現を阻止または抑制する二重鎖が形成される。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の発現を阻止するのに使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖-リン酸ジエステル主鎖(または、WO91/06629において説明されているもののような他の糖結合)を有するオリゴヌクレオチドであって、このような糖結合が内因性ヌクレアーゼに対して耐性であるオリゴヌクレオチドをさらに含む。耐性の糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である(すなわち、酵素分解に耐えることができる)が、標的ヌクレオチド配列に結合することができる配列特異性は保持している。
【０１０６】
センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、WO 90/10448に記載されているもののような有機部分、および、ポリ-(L-リジン)のような、標的ポリヌクレオチド配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大させる他の部分に共有結合されているオリゴヌクレオチドが含まれる。さらになお、エリプチシンのような挿入剤、およびアルキル化剤または金属複合体が、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変するために、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得る。
【０１０７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、CaPO4によるDNAトランスフェクション、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子導入方法によって、または、エプスタイン・バー(Epstein-Barr)ウイルスのような遺伝子導入ベクターを用いることによって、標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞中に導入され得る。
【０１０８】
センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、WO91/04753において説明されているように、リガンド結合分子との結合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含む細胞中に導入され得る。適切なリガンド結合分子には、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、対応する分子もしくは受容体にそのリガンド結合分子が結合する能力に実質的に干渉もせず、センスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型の細胞中への移行を妨害もしない。
【０１０９】
あるいは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO90/10448において説明されているように、オリゴヌクレオチド-脂質複合体の形成によって、標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞中に導入され得る。センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド-脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼによって、細胞内部で切り離される。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、タンパク質精製試薬としての使用を提供する。これらのポリペプチドは、固体支持材料に結合され、かつ結合相手のタンパク質をアフィニティクロマトグラフィーによって精製するのに使用され得る。特定の態様において、(結合相手に結合することができる、本明細書において説明する任意の形態の)ポリペプチドは、従来の手順によって、固体支持体に結合される。一つの例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基と反応すると考えられる官能基を含むクロマトグラフィーカラムが、入手可能である(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.)。代替の方法において、(上記のような)ポリペプチド/Fcタンパク質は、Fc部分との相互作用を通じて、プロテインAまたはプロテインGを含むクロマトグラフィーカラムに結合される。
【０１１１】
これらのポリペプチドはまた、細胞表面上で結合相手を発現する細胞を精製または同定する際の使用も提供する。ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィーマトリックスまたは同様の適切な基材などの固相に結合される。例えば、磁性微粒子をこれらのポリペプチドでコーティングし、かつ磁場を通過するインキュベーション容器中で保持することができる。結合相手を発現する細胞を含む細胞混合物の懸濁液を、表面にこれらのポリペプチドを有する固相に接触させる。細胞表面で結合相手を発現する細胞は、固定されたポリペプチドに結合し、次いで未結合の細胞は洗い流される。あるいは、これらのポリペプチドを検出可能な部分に結合させ、次いで、結合相手の発現に関して試験しようとする細胞と共にインキュベートすることができる。インキュベーション後、未標識の物質を除去し、かつ細胞上の検出可能な部分の有無を判定する。
【０１１２】
さらなる代替方法において、結合相手を発現している細胞を含むと推測される細胞の混合物を、ビオチン標識したポリペプチドと共にインキュベートする。インキュベーション期間は、典型的には、十分な結合を確実にするために、少なくとも1時間の期間である。次いで、結果として生じる混合物を、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに通し、それによって、ビオチンのアビジンに対する高い親和性により、所望の細胞がビーズに結合する。アビジンでコーティングしたビーズを使用するための手順は公知である(Berenson, et al. J Cell Biochem.(1986)10D：239を参照されたい)。未結合の材料を除去するための洗浄および結合された細胞の遊離は、従来の方法を用いて実施される。
【０１１３】
ポリペプチドはまた、結合親和性の面から、結合相手タンパク質の生物活性を測定する際の使用も提供する。したがって、これらのポリペプチドは、例えば、様々な条件下でのタンパク質の貯蔵寿命および安定性をモニターするために、「品質保証」調査を実施する人々によって使用され得る。例えば、これらのポリペプチドは、様々な温度で保存されていたか、または様々な細胞型において産生された結合相手のタンパク質の生物活性を測定するための結合親和性調査において使用され得る。これらのタンパク質はまた、結合相手タンパク質の改変(例えば、化学的改変、切断、変異など)後に生物活性が保持されているかどうかを判定するのにも使用され得る。これらの改変が結合相手の生物活性に与える任意の有害な影響を検出するために、改変された結合相手タンパク質の結合親和性を、未改変の結合相手タンパク質の結合親和性と比較する。このようにして、例えば、研究調査において使用する前に、結合相手タンパク質の生物活性を確認することができる。
【０１１４】
ポリペプチドに結合され得る検出可能な(診断用の)物質および治療用物質には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞毒性物質、薬物、放射性核種、発色団、および熱量測定的反応または蛍光定量的反応を触媒する酵素などが含まれ、これら個々の作用物質は、意図される用途に従って選択される。毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)エキソトキシンA、リボソーム不活性化タンパク質、トリコテセンのようなマイコトキシン、ならびにそれらの誘導体および断片(例えば単鎖)がある。診断用途に適する放射性核種には、123I、131I、99mTc、111In、および76Brが含まれるがこれらに限定されるわけではない。治療用途に適する放射性核種の例は、131I、211At、77Br、186Re、188Re、212Pb、212Bi、109Pd、64Cu、および67Cuである。
【０１１５】
このような作用物質は、任意の適切な従来の手順によって、ポリペプチドに結合され得る。ポリペプチドは、例えば、所望の作用物質上の官能基と反応して共有結合を形成することができる、アミノ酸側鎖上の官能基を含む。あるいは、タンパク質または作用物質は、所望の反応性官能基を生成するか、またはそれに結合するように誘導体化され得る。この誘導体化は、タンパク質に様々な分子を結合させるために利用可能な2官能性カップリング試薬(Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.)のうちの1つの結合を含み得る。タンパク質を放射標識するためのいくつかの技術が公知である。例えば、適切な2官能性キレート剤を用いることによって、放射性核種金属がポリペプチドに結合され得る。
【０１１６】
このようにして、ポリペプチドおよび適切な診断用物質または治療用物質を含む結合体(好ましくは共有結合されている)が調製される。これらの結合体は、個々の用途に適した量で投与されるか、または別の方法で使用される。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、ポリヌクレオチドの欠陥、または不十分な量によって(直接的にまたは間接的に)媒介された任意の疾患に対する治療を開発する際に使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、過剰なポリペプチドに(直接的にまたは間接的に)起因する任意の疾患に対する治療を開発する際に使用され得る。本発明のポリペプチドは、このような障害に苦しむ哺乳動物に投与され得る。
【０１１８】
これらのポリペプチドはまた、インビトロまたはインビボの手順において、結合相手の生物活性を抑制するのにも使用され得る。例えば、精製された4833427G06Rikポリペプチドは、その細胞受容体への内因性4833427G06Rikの結合を阻害するのに使用され得る。
【０１１９】
本発明のポリペプチドは、結合相手に媒介された疾患を治療するために、哺乳動物に投与され得る。このような結合相手に媒介された疾患には、結合相手によって(直接的にもしくは間接的に)引き起こされるか、または悪化させられる状態が含まれる。
【０１２０】
本発明の組成物は、天然のタンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、および生物学的に活性な断片など、本明細書において説明する任意の形態のポリペプチドを含み得る。特定の態様において、組成物は、本発明の可溶性のポリペプチドまたは可溶性のポリペプチドを含むオリゴマーを含む。
【０１２１】
有効量の本発明のポリペプチドを生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤など他の成分と組み合わせて含む組成物が、本明細書において提供される。これらのポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに使用される公知の方法に従って製剤化され得る。これらは、単独の活性材料として、または所与の徴候に適する他の公知の活性材料と共に、薬学的に許容される希釈剤(例えば、生理食塩水、Tris-HCl、酢酸緩衝溶液、およびリン酸緩衝溶液)、保存剤(例えば、チメロサール、ベンジンアルコール、パラベン)、乳化剤、可溶化剤、補助剤、および/または担体と混合して組み合わせられ得る。薬学的組成物に適する製剤には、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 16th ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PAにおいて記載されているものが含まれる。
【０１２２】
さらに、このような組成物は、ポリエチレングリコール(PEG)、金属イオンと複合体を形成させるか、もしくはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、およびデキストランなどのようなポリマー化合物中に組み入れるか、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層膜もしくは多重膜の小胞、赤血球ゴースト、もしくはスフェロプラスト中に組み入れることもできる。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響すると考えられ、したがって、意図される用途に従って選択される。
【０１２３】
本発明の組成物は、任意の適切な様式で、例えば、局所的に、非経口的に、または吸入によって投与され得る。「非経口の」という用語は、例えば、皮下、静脈内、または筋肉内の経路による注射を含み、また、例えば疾患または損傷の部位での局部的な投与も含む。当業者は、他のタイプの局部的投与(例えば、関節内、関節包内、手根内、腔内、脳室内、滑液嚢内、脊髄内、靭帯内、髄膜内、眼内、硬膜外、経上皮的、かつ/または疾患もしくは損傷の部位の近くもしくは隣接した部位での、これらの経路のうちの1種もしくは複数種による投与)が、本発明の組成物を投与する際に使用するのに適していることを認識する。埋め込まれたものからの持続放出もまた、企図される。
【０１２４】
当業者は、適切な投薬量は、治療される疾患の性質、患者の体重、年齢、および全身状態、ならびに投与経路などの因子に応じて変動することを認識すると考えられる。予備的な用量は、動物試験によって決定することができ、かつヒト投与のための投薬量の調整（scaling）は、技術分野で容認されている通例に従って実施される。
【０１２５】
生理学的に許容される製剤中にポリヌクレオチドを含む組成物もまた、企図される。DNAは、例えば、注射用に製剤化され得る。さらに、当業者は、核酸組成物(DNAを含む)は細胞によって取り込まれ、かつその核酸組成物が投与された領域中またはその近くでのタンパク質の発現をもたらすことを知っているため、本発明の核酸組成物は、それらによってコードされたポリペプチドの局部的投与に有用であると考えられる。
【０１２６】
本発明のポリペプチドの別の用途は、4833427G06Rikとその結合相手との相互作用、またはこれらの相互作用の抑制に起因する、様々な細胞型に対する生物学的影響を研究するための調査道具としての用途である。ポリペプチドはまた、4833427G06Rik、その結合相手、またはそれらの相互作用を検出するためのインビトロのアッセイ法においても使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、p53ファミリーメンバーのシグナル伝達経路を解明する際、およびそのようなシグナル伝達経路の様々な局面を調節する分子を同定する際にも有用であると考えられる。本発明のポリペプチドを使用する研究によって同定される調節物質は、細胞周期の調節またはアポトーシスがある役割を果たしている多種多様な疾患および症候群を治療または寛解させる際に有益である。
【０１２７】
本発明のポリペプチドに免疫反応性である抗体が、本明細書において提供される。このような抗体は、(非特異的結合とは対照的に)抗体の抗原結合部位を介して、ポリペプチドに特異的に結合する。したがって、前記のようなポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などが、それらに免疫反応性な抗体を作製する際に「免疫原」として使用され得る。より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。
【０１２８】
これらの抗原決定基またはエピトープは、直線状または立体構造的(非連続的)のいずれかであり得る。直線状エピトープは、ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分から構成されるのに対し、立体構造的または非連続的エピトープは、タンパク質フォールディングの際に近接するようになる、ポリペプチド鎖の異なる領域に由来するアミノ酸部分から構成される(C.A. Janeway et al., 「Immuno Biology」(1996)3：9(Garland Publishing Inc., 2nd ed.)。フォールディングされたタンパク質は複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は、極めて多数である。しかしながら、タンパク質の立体構造および立体障害が原因で、エピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない(C.A. Janeway et al., 「Immuno Biology」 2：14(Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996))。エピトープは、当技術分野において公知の方法のいずれかによって同定され得る。
【０１２９】
したがって、本発明の1つの局面は、本発明のポリペプチドの抗原エピトープに関する。このようなエピトープは、以下により詳細に説明するように、抗体、特にモノクローナル抗体を産生させるのに有用である。さらに、本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、アッセイ法において研究試薬として使用することができ、かつ、ポリクローナル血清またはハイブリドーマ培養上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために使用することができる。このようなエピトープまたはそれらの変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的もしくは酵素的切断など当技術分野において周知の技術を用いて、または組換えDNA技術を用いて、作製することができる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドのエピトープによって誘導され得る抗体に関して、エピトープが切り離されていようとポリペプチドの一部分のままであろうと、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、従来の技術によって調製され得る。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas： A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al.(eds.), Plenum Press, New York(1980);およびAntibodies： A Laboratory Manual, HarlowおよびLand(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1988)を参照されたい。
【０１３１】
本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書において企図される。このようなハイブリドーマは、従来の技術によって作製および同定され得る。このようなハイブリドーマ細胞株を作製するための1つの方法は、動物をポリペプチドで免疫化する段階;免疫化された動物から脾臓細胞を採取する段階;該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成させる段階;および前記ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定する段階を含む。これらのモノクローナル抗体は、従来の技術によって回収され得る。
【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。このようなヒト化抗体は、公知の技術によって調製されることができ、かつ、これらの抗体がヒトに投与された場合に免疫原性が低下するという利点を与える。1つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域(または単にその抗原結合部位だけ)およびヒト抗体に由来する定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位、およびヒト抗体に由来する、(抗原結合部位を欠いた)可変領域断片を含んでもよい。キメラ抗体、およびさらに操作されたモノクローナル抗体を作製するための手順には、Riechmann et al., Nature(1988)332：323, Liu et al.(Proc Natl Acad Sci USA(1987)84：3439, Larrick et al., Bio/Technology(1989)7：934、およびWinterおよびHarris(TIPS 14：139, May, 1993)において説明されているものが含まれる。トランスジェニックにより抗体を生成させるための手順は、GB2,272,440、US5,569,825、およびUS5,545,806、ならびにそれらからの優先権を主張している関連特許において確認することができ、これらはすべて、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３３】
従来の技術によって作製され得る、抗体の抗原結合断片もまた、本発明によって包含される。このような断片の例には、Fab断片およびF(ab')2断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。遺伝子工学技術によって作製される、抗体の断片および誘導体もまた、提供される。
【０１３４】
1つの態様において、これらの抗体は、本発明のポリペプチドに対して特異的であり、かつ他のタンパク質と交差反応しない。このような抗体を同定し得るスクリーニング手順は周知であり、かつ、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。
【０１３５】
本発明の抗体は、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するためのアッセイ法において使用することができる。これらの抗体はまた、本発明のポリペプチドまたは断片をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製する際にも使用され得る。
【０１３６】
本発明のポリペプチドの結合相手への結合をさらに阻止することができる抗体は、そのような結合に起因する生物活性を抑制するのに使用され得る。このような阻止抗体は、4833427G06Rik受容体を発現するある種の細胞への4833427G06Rikの結合を阻害する能力に関して抗体を試験することによってなど、任意の適切なアッセイ手順を用いて同定され得る。あるいは、阻止抗体は、標的細胞に対する、結合相手に結合する本発明のポリペプチドに起因する生物学的影響を抑制する能力に関するアッセイ法において同定され得る。抗体は、例えば、4833427G06Rik、または結合相手に媒介される細胞溶解を阻害する能力に関して分析され得る。
【０１３７】
このような抗体は、インビトロの手順で使用され得るか、または抗体を生成させた実体によって媒介される生物活性を抑制するためにインビボで投与され得る。したがって、本発明のポリペプチドと結合相手との相互作用によって(間接的または直接的に)引き起こされるか、または悪化させられる障害が、治療され得る。治療方法は、結合相手によって媒介される生物活性を抑制するのに効果的な量で、阻止抗体を哺乳動物にインビボで投与することを含む。モノクローナル抗体が、このような治療方法において使用するのに一般に好ましい。1つの態様において、抗原に結合する抗体断片が使用される。
【０１３８】
抗体は、作用的(すなわち、リガンドを模倣する)特性に関してスクリーニングされ得る。このような抗体は、細胞表面受容体に結合すると、細胞表面IL-1受容体にIL-1が結合した場合に誘導される生物学的効果に類似した生物学的効果(例えば生物学的シグナルの伝達)を誘導する。作用物質抗体は、血管内皮細胞およびリンパ球を活性化し、局所的な組織破壊および発熱を誘導し(Janeway et al., 1996、前記)、マクロファージおよび血管内皮細胞を刺激してIL-6を産生させ、かつ血管内皮細胞の表面上の分子を上方調節するのに使用され得る。
【０１３９】
本発明のポリペプチドに対する抗体、および生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む組成物が、本明細書において提供される。このような組成物の適切な成分は、本発明のポリペプチドを含む組成物に関しては上記のとおりである。
【０１４０】
抗体に結合された、検出可能な(診断用の)物質または治療用物質を含む結合体もまた、本明細書において提供される。このような作用物質の例は、先に提示している。これらの結合体は、インビトロまたはインビボの手順において使用される。
【０１４１】
本発明はまた、改変された指標遺伝子活性を有するトランスジェニック動物も包含する。例えばイントロンを含む、ゲノム配列に由来する組換えクローンは、トランスジェニック細胞、生物、およびノックアウト動物を含むトランスジェニック研究およびノックアウト研究ならびに遺伝子治療のために有用であると考えられる。(例えば、Goodnow(1992) 「Transgenic Animals」 Roitt(ed.), Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, Calif., pp. 1502-1504;Travis, Science(1992)254：707-10;Capecchi, Science(1989)244：1288-92;Robertson(ed.)(1987)「Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells： A Practical Approach」, IRL Press, Oxford;Rosenberg, J. Clinical Oncology(1992)10：180-99;Hogan, et al.(eds.)(1994) 「Manipulating the Mouse Embryo： A Laboratory Manual」, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, NY;Wei, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.(1997)37：119-41;およびRajewsky, et al., J. Clin. Inves.(1996)98：S51-S53を参照されたい)。
【０１４２】
これらの技術の例には以下のものが含まれる： 1)トランスジェニック動物を作製するための、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染、または当業者に公知の他の手段による、指標遺伝子に由来するプロモーター領域に機能的に連結されたレポーター遺伝子の適切な受精胚中への挿入(例えば、Hogan、前記を参照されたい);ならびに2)変異したまたは正常な、ヒト型または動物型遺伝子を動物の生殖細胞系に導入することを可能にする、胚性幹細胞中への相同組換え(例えば、Capecchi、前記;およびZimmerおよびGruss, Nature(1989)338：150-53を参照されたい)。結果として生じるノックアウト動物は、別の方法で指標遺伝子の転写を誘導すると考えられる刺激、例えば遺伝毒性化合物の投与に応答して、レポーター遺伝子を発現することができる。
【０１４３】
相同組換えの技術は、当技術分野において既知である。これは、動物ゲノム中の天然の遺伝子を挿入された遺伝子で置き換えたので、元の天然の遺伝子を発現することができないが、例えば、受容体を発現しないか、挿入された変異受容体を発現するか、または代替の形態の受容体を発現する、動物を作製するのに有用である。本発明において、この技術は、天然の指標遺伝子産物の代わりに、遺伝毒性化合物による刺激に応答してレポーター遺伝子産物を産生する動物をもたらす。
【０１４４】
トランスジェニック動物の作製に関して、マイクロインジェクションは、ゲノムに遺伝子を追加するが、それらを除去はしないため、それ独自のタンパク質および追加されたタンパク質を発現する動物を作製するのに有用である。トランスジェニック動物、例えばマウスを作製するために利用可能な1つの手段は、以下のとおりである。雌マウスを交尾させ、かつ結果として生じる受精卵を輸卵管から切離する。これらの卵をM2培地(例えば、Hogan、前記を参照されたい)のような適切な培地中で保存する。レポーター遺伝子に機能的に連結された指標遺伝子の調節領域またはプロモーターをコードするDNAまたはcDNAは、当技術分野において公知の方法によって適切なベクターから精製する。付加的な誘導性プロモーターが、導入遺伝子の発現を調節する実験的手段を提供するためにDNAのコード領域に融合され得る。あるいは、またはさらに、付加的な組織特異的調節エレメントが、導入遺伝子の組織特異的発現を可能にするために、コード領域に融合され得る。適切に緩衝化した溶液中のDNAをマイクロインジェクションの針に入れ、かつ、注射しようとする卵をくぼみ付きスライドグラスに置く。卵の前核中に針を挿入し、かつDNA溶液を注射する。次いで、偽妊娠マウス(妊娠を維持するのに適したホルモンによって刺激されているが、実際には妊娠していないマウス)の輸卵管中に注射された卵を移し、そこで、それは、子宮まで進み、着床し、かつ出産まで発達する。上記のように、マイクロインジェクションは、卵にDNAを挿入するための唯一の方法ではなく、例示的な目的のためにのみ本明細書において使用される。
【０１４５】
本発明のトランスジェニック動物は、化合物の遺伝毒性をスクリーニングまたは試験するのに使用することができ、生じる化合物の任意の代謝生成物の影響を同時に検査し得るという付加的な利点がある。
【０１４６】
本発明の方法および試薬は、化合物が動物に投与された際に遺伝毒性を引き起こす可能性を判定するのに有用である。本発明の方法は、例えば、利用可能なマイクロアレイ技術を用いて、または、指標遺伝子に対応するか、もしくは由来する異種性もしくは内因性のプロモーター配列に機能的に連結されたレポーター遺伝子を挿入することによって、実施することができる。試験化合物を試験細胞にインビトロで投与することによって、高価かつ時間のかかるインビボの試験を要さずに、許容されない遺伝毒性を提示する薬物候補を排除することができる。
【０１４７】
これまで本発明を一般的に説明したが、同じ内容が、具体的な実施例を以下の図面と共に参照することにより、より良く理解されると考えられる。これらの実施例は、例証のためにのみ本明細書に含まれ、かつ、別段の指定が無い限り、限定することは意図されていない。
【０１４８】
実施例
以下の調製法および実施例は、当業者がより明確に本発明を理解し、かつ実施することを可能にするために与えられる。これらは、本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではなく、単に本発明を例示し、代表するものとしてみなされるべきである。
【０１４９】
実施例1：表現型アッセイ法
薬物製剤
すべての化合物は、Sigma-Aldrich Fine Chemicalsから購入した。MeOHに溶解したピレンを除いて、これらの薬物をDMSOに溶解した。遺伝毒性試験のために使用する各薬物の濃度は、インビトロで小核形成を誘導することが公知である濃度に基づいた。この濃度が公知ではなかった場合は、1nM〜5mMの範囲の広範な薬物濃度を試験した。遺伝毒性物質および非遺伝毒性物質の両方に関して、試験する最高濃度は、細胞毒性または化合物溶解度(表1)のいずれかによって決定した。
【０１５０】
遺伝毒性アッセイ法
20％FBS、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを含むDMEM中でC2C12細胞(ATCC)を増殖させ、コンフルエントに近い状態を維持した。P.L.Puri et al., Nature Gen(2002)32：585-93によって説明された方法に従って、1％ DMSOまたは最終濃度1％ DMSO中化合物(化合物および濃度については表Iを参照されたい)をさらに含む増殖培地中で、分化アッセイ法を実施した。これらの細胞を24時間インキュベートし、PBSで洗浄し、かつ、薬物もビヒクルも含まない、分化培地(DMEM、2％ウマ血清、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン-ストレプトマイシ-グルタミン)中に入れた。48時間目および72時間目に、細胞の分化を視覚的に検査した。分化した細胞は筋管を形成するのに対し、阻止または遅延された細胞は、単層を維持し、筋管はほとんどない。阻止が極端である場合には、これらの細胞は3日後に分化培地中で死滅し始める(例えば、エトポシドまたはシスプラスチンによる処置)。化合物に24時間曝露した後の細胞数をビヒクルの場合と比べて評価することによって、薬物の細胞毒性を判定した。
【０１５１】
（表１）  
2008520216.tif 000002
2008520216.tif 000003
(s)化合物溶解度によって制限される範囲
(t)化合物毒性によって制限される範囲
【０１５２】
遺伝毒性化合物および非遺伝毒性化合物は、公開されている結果に従って、インビトロの小核形成試験(W. von der Hude et al., Mut Res(2000)468：137-63)または染色体異常試験(S.Kalweit et al., Mut Res(1999)439：183-90;B. Miller et al., Mut Res(1998)410：81-116;B. Miller et al., Mut Res(1997)392：45-59)を用いて、分類した。試験された非遺伝毒性化合物は、抗精神病剤(クロザピン)、抗高リポタンパク血症剤(クロフィブラート)、および麻酔剤(ウレタン)(表1)を含む、広範囲の化学構造物および治療的用途を包含した。19種の非遺伝毒性作用物質はすべて、広範囲の濃度にわたって分析された場合にさえ、筋原性分化を阻止することができなかった。一方、18種の遺伝毒性薬物はすべて、試験した複数の濃度において筋管へのC2C12細胞の分化を阻止した。これらの化合物は、検出可能な細胞の細胞毒性作用を引き起こさない濃度で分化を阻止した。遺伝毒性化合物は、2本鎖DNAにおける切断の誘導(硫酸ブレオマイシンおよびエトポシド)、DNAアルキル化(MMSおよびEMS)、付加体形成(シスプラスチンおよびDES)、DNA挿入(5-FU)、および有糸分裂紡錘体形成の阻害剤(ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル)を含む、様々な異なるメカニズムを通して作用した。このパネルの化合物から得られた結果は、遺伝毒性化合物を同定するために筋細胞分化のシステムを使用できることを実証する。
【０１５３】
実施例2：ゲノムアッセイ法
遺伝子発現解析
溶媒(DMSO)または化合物(MMS-0.008μg/ml;MNNG-4μg/ml;シスプラスチン-0.6μg/ml;エトポシド-0.5μg/ml;ベロマイシン-0.5μg/ml;硫酸ビンクリスチン-0.6μg/ml)で24時間処理した後、C2C12細胞を洗浄して薬物を除去し、分化培地に変更して分化を誘導し、かつ誘導後6時間目、18時間目または24時間目に採取した。各薬物および時点に対して、3つの独立なレプリケートを作製した。試料の処理は、Affymetrix Expression Analysis Technical Manualにおいて説明されているプロトコールに従って実施した。手短に言えば、酸グアニジウムチオシアナート-フェノール-クロロホルム抽出法(Trizol(登録商標)、Invitrogen, Carlsbad, CA)によって細胞から全RNAを単離した。2回精製したpoly(A+)RNAを単離し、かつT7-プロモーターを結合したオリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写し、続いてインビトロ転写を実施した。標識した試料をAffymetrix Murine Genome MOE430セットに添加し、かつ45℃/60 rpmで一晩ハイブリダイズさせ、FS450 Fluidics stationを用いて洗浄し、かつGS3000スキャナー上でスキャンした。Affymetrixソフトウェア(Microarray Analysis Suite 5.0バージョン)を用いて、得られた画像ファイルを解析した。
【０１５４】
薬物処理が細胞の遺伝子発現に与える影響を測定するために、各薬物および時点から得られたレプリケート（replicate）データを、スチューデントのt-検定を用いて、同じ溶媒の対照のレプリケートと比較した。スチューデントのt-検定を適用する前に、遺伝子発現レベルを対数変換した。対照細胞と薬物処理細胞の間の平均発現レベルの変化倍率も算出した。以下の条件のすべてが少なくとも1つの遺伝子および時点に関して満たされた場合には、薬物処理後の遺伝子発現の変化は有意であるとみなした。第1に、薬物処理細胞または溶媒処理細胞のいずれかにおいて遺伝子を発現させなければならなかった。Affymetrixソフトウェアが、3つのレプリケートのうちの2つにおいて、遺伝子が「存在」していると判定した場合、遺伝子は発現されているとみなした。これにより、真の発現変化が同定され、かつバックグラウンドの変動と区別できることが確実になった。第2に、5種の試験された薬物のそれぞれについて算出された発現変化が、少なくとも2倍であり、かつスチューデントのt-検定を用いて算出された発現変化のp値が0.01未満であった。
【０１５５】
この実験系をさらに確認するために、かつこれらの遺伝毒性物質が筋原性分化を阻害したメカニズムを検査するために、本発明者らは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して、遺伝毒性薬物による処理に応答して発現が改変された遺伝子を同定した。プロファイリングした薬物のうちの5つは、細胞DNAへの損傷を直接引き起こすことが公知であった。硫酸ビンクリスチンは、間接的なメカニズムによって遺伝毒性を引き起こす。これは、チューブリン重合を妨害することによって、有糸分裂紡錘体形成を阻害する。異なる作用メカニズムを有することと一致して、ビンクリスチンは、試験した他の5種の薬物と比べて独特なパターンの遺伝子発現変化を誘導した。ビンカアルカロイドの方が、試験された他の薬物が誘導したものよりも、極めて異なる遺伝子発現の変化を誘導した(U.Scherf et al., Nature Gen(2000)24：236-44も参照されたい)。このため、5種の直接作用性遺伝毒性薬物に曝露された後に一般に誘導される遺伝子発現変化を解析した。遺伝子発現データの解析により、86種の遺伝子が、これら5種の直接作用性遺伝毒性薬物による処理後、mRNA発現レベルの有意な変化を示すことが明らかにされた(ビンクリスチンの結果は遺伝子を選択するのに使用されなかった)(表2を参照されたい)。選択された各遺伝子は、これら5種の各薬物による処理後、発現レベルの少なくとも1.5倍の変化を示し、かつ、各薬物に誘導された発現変化に関して算出されたp値は0.01未満であった。28種の遺伝子の発現は、薬物処理後、上方調節されたのに対し、他の58種の遺伝子の発現は、下方調節された。
【０１５６】
（表２）遺伝毒性化合物に応答した、発現の変化倍率
2008520216.tif 000004
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【０１５７】
86種の差次的に発現された遺伝子のうち60種は、Gene Ontology(www.geneontology.org/)索引中に公知の注釈付き機能を有していた。これらの遺伝子の注釈付き機能は、遺伝毒性薬物が、細胞形質転換およびDNA損傷応答に関連する経路に影響を及ぼすことを指摘した。興味深いことに、p53またはc-Mycは、これらの遺伝子の26種(58％)の転写を調節することが公知である。p53によって調節される遺伝子(2610509G12Rik、Birc5、Brca1、Calmbp1、Ccna2、Ccng1、Dda3、Hmgb2、Hmmr、Mcm3、Mcm4、Mki67、Nos3、Np95、Nusap1、Pcna、Pola1、Prc1、Rad51ap1、Slc19a2、Smc2l1、Tk1、Top2a、Trp53inp1、Wig1、Cks2、Lmnb1、Pbk)は、公表された文献において特定されていた。c-Mycによって調節される遺伝子(Brca1、Ccna2、Ccng1、Cks2、Ephx1、Fabp5、Foxm1、Hmmr、Lmnb1、Mad2l1、Mcm3、Mcm4、Mcm5、Mki67、Pcna、Rad51ap1、Serpinel、Tk1、Ugt1a1)は、Myc標的遺伝子データーベース(http：//www.myccancergene.org/index.asp)を用いて確認した。さらに、特定の生物学的プロセスに対する機能的注釈を有する53種の影響を受けた遺伝子のうち32種は、DNA損傷に対する応答に関与している事が公知であった。特に、これらの遺伝子のうち14種(26％)は、DNA代謝に関与しているとして注釈され、21種(40％)は細胞周期の制御に関与しているとして注釈されていた。比較すると、すべての注釈付きマウス遺伝子の3％および5％しか、DNA代謝または細胞周期の制御に関与していない。
【０１５８】
このデータは、最終分化を遂げていない細胞が、DNAを直接的に損傷する作用物質に曝露された場合に、特有のパターンの遺伝子発現改変が生じることを実証する。したがって、この発現パターン(およびパターンのサブセット)は、他の化合物を分類し、かつ直接的なDNA損傷を引き起こす可能性がある化合物を同定するのに有用である。
【０１５９】
実施例3：RT-PCRアッセイ法
このインビトロの分化系における遺伝子のサブセットの発現変化は、DNA損傷の全般的な指標を提供し得る。したがって、直接作用性遺伝毒性物質のすべてに曝露された後にその発現が著しく増大する2種の遺伝子に対するRT-PCRアッセイ法を開発した。1つは機能が未知である新規の遺伝子、4833427G06Rikであった。もう一方は、Dda3、すなわち、その発現がp53およびp73の両方に応答性であることが示されており(P.K. Lo et al., Oncogene(1999)18：7765-74)、かつ過剰発現された場合は細胞増殖を抑制する遺伝子(S. C. Hsieh et al., Oncogene(2002)21：3050-57)であった。RT-PCRアッセイ法を用いて、12種の遺伝毒性物質(アクチノマイシンD(ACTD)、ジエチルスチルベストロール(DES)、ドキソルビシンHCl(DOX)、メタンスルホン酸エチルエステル(EMS)、硫酸ブレオマイシン(BLEO)、シスプラスチン(CIS)、エトポシド(ETOP)、メタンスルホン酸メチルエステル(MMS)、1-メチル-3-ニトロ-ニトロソグアニジン(MNG)、硫酸ビンクリスチン(VINC)、硫酸ビンブラスチン(VINB)、およびパクリタキセル(PACL))、ならびに9種の非遺伝毒性化合物(ジメチルスルホキシド(DMSO)、セフォペラゾンナトリウム(CER)、ファモチジン(FAM)、ピロカルピン HCl(PILO)、マレイン酸チモロール(TIM)、酢酸ベンジル(BA)、クロフィブラート(CLOF)、メサラミン(MES)、メチル尿素(MU)、およびフタル酸酸ジエステル(PTD))に曝露後のC2C12細胞から調製されたmRNAを解析した。細胞を各薬物に24時間曝露させた後、それらを誘導して18時間分化させてから、RNAを調製した。
【０１６０】
全RNAをDnase1で処理し、かつMultiscribe逆転写酵素(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)を用いてcDNAに変換した。このcDNAを鋳型として用いて、cDNA SYBRグリーンリアルタイム定量PCRアッセイ法を実施し、かつABI PRISM 7900 Sequence Detectorを用いて解析した。Primer Express V2.0ソフトウェア(Applied Biosystems Inc.Foster City, CA)を用いて、Dda3および新規のRikenクローンに対する以下のプライマーおよびプローブを設計した。
2008520216.tif 000009
【０１６１】
これら2種の遺伝子の発現は、12種の各遺伝毒性物質に曝露された後、有意に増大したが、9種の非遺伝毒性物質のいずれかに曝露された後は、有意に増大しなかった。4833427G06Rik mRNAの相対的発現は、これらの遺伝毒性物質に曝露された後、2.3〜13.9倍増大し、Dda3は1.6〜12.7倍増大した。溶媒対照に比べた、各薬物に曝露された後の4833427G06Rik mRNA発現の変化に関して算出したp値は、0.001未満であり;かつ、Dda3 mRNAの発現変化に関するp値は、0.04(パクリタキセル)〜0.0001(ビンブラスチン)の範囲であった。これら2種の遺伝子の発現の変化が、遺伝毒性化合物に曝露された後の期間、比較的一定であるかどうかを測定することも重要であった。このために、遺伝毒性化合物に曝露された後に分化中のC2C12細胞においてこれら2種の遺伝子の発現が増大している期間の経時変化を評価した。化合物曝露後の細胞分化の誘導後6時間目、18時間目、および24時間目に得られたRNA試料に対してRT-PCRアッセイ法を実施した。両方の遺伝子の発現は、遺伝毒性物質曝露後の6時間〜24時間の分化誘導期間中、一貫して高かった。ビンブラスチンの方が、ビンクリスチンよりも、これらの指標遺伝子の発現のより大きな増大を引き起こしたことは意外であった。ビンクリスチンおよびビンブラスチンは構造的に類似したビンカアルカロイドであり、かつ両方とも、微小管形成の阻害を通じて作用するが、これらの臨床的活性範囲は異なる(B.A. Chabner et al., 「Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics」(J. G. HardmanおよびL.E. Limbard, Eds., McGraw-Hill, NH, 2001)chapter 52)。ビンクリスチンは、小児白血病および固形腫瘍を治療する際に使用され、かつ成人のリンパ腫治療において頻繁に使用される。ビンブラスチンは、睾丸癌およびリンパ腫の治療に第1に使用され、かつ様々な固形腫瘍の第2選択療法として使用される。
【０１６２】
遺伝毒性薬物によってその発現に影響を及ぼされた遺伝子のセットの間で顕著に多い遺伝子オントロジー(GO)用語を特定するために、本発明者らは、各遺伝子に対する注釈付きGO用語のすべてを集めた。GO注釈において使用されている各用語に関して、その用語、または任意の補足的用語で注釈されている差次的に発現された遺伝子の数を計数した。各GO注釈を伴う差次的に発現された遺伝子の比率を、そのGO用語で注釈されているマウス遺伝子の総数の比率と比較した。このプロセスにより、差次的に発現された遺伝子のうちで多いGO用語を特定することが可能になった。生物学的プロセスに関するゲノムオントロジー注釈を伴う53種の遺伝子のうちで、32種はDNA損傷に対する細胞応答、または細胞周期の調節に関与していた。
【０１６３】
実施例4：RNAi実験
Dog1(4833427G06Rik)に対する以下のsiRNAを、SMARTPOOL(Dharmacon)を用いて設計し;
Dog1-2は、以下の配列のプールである。
2008520216.tif 000010
またはSTEALTH(Invitrogen)アルゴリズムを用いて設計した。
2008520216.tif 000011
対照のsiRNAは、Dharmaconから入手した。
対照-1;CCCUAUUCUCCUUCUUCGCTT(ホタルルシフェラーゼ対照)(SEQ ID NO：31)
対照-2：RISCの無い登録配列（proprietary sequence）
【０１６４】
4種のSMARTPOOLオリゴをプールとして使用した(Dog1-2)。登録配列を有するsiCONTROL RISCの無いRNAを含む対照siRNA、およびホタルルシフェラーゼ対照は、Dharmaconから入手した。10nM〜80nMの範囲の濃度のsiRNAおよび2ul脂質/ウェル(12ウェルプレート)のリポフェクタミン2000(Invitrogen)を含むOptimem培地(Invitrogen)を用いて、5時間、C2C12細胞を溶液中でトランスフェクトした(M. Amarzguioui, Biotechniques(2004)36： 766-768)。次いで、培地を、抗生物質を含まない増殖培地に変更した。トランスフェクション後28時間目に、培地を、抗生物質およびビヒクルまたは75μM MMSを加えた増殖培地に変更した。さらに24時間インキュベーションした後、これらの細胞を洗浄し、かつ培地を分化培地に変更した。筋管の形成をその後の72時間に渡って観察した。トランスフェクション後28時間目に、RT-PCR解析によって遺伝子ノックダウンのレベルを定量した。
【０１６５】
RNAiの媒介によるDog1 mRNAのノックダウンが、変異誘発物質によって誘導されたDNA損傷後のC2C12分化に与える影響を分析した。確実に生物学的効果が、標的遺伝子の減少によって特異的に引き起こされるようするために、3種の異なるDog1特異的siRNAをこれらの実験において使用した。さらに、これらのsiRNAは、2種の異なるアルゴリズムを用いて設計し、かつ2種の異なる会社から入手した。トランスフェクション後28時間目のこれらの細胞中のDog1 mRNAの解析により、Dog1特異的siRNAがそれぞれ、対照に比べてDog1 mRNAの量を80〜96％減少させることが明らかになった(図1A)。一方、対照のsiRNAは、Dog1 mRNAを有意に減少させなかった。筋管へのC2C12細胞の分化は、遺伝毒性物質への曝露後、完全に阻害された(図1B)。偽のトランスフェクションも、濃度80nMの2種の異なる対照siRNAを用いたトランスフェクションも、変異誘発物質によって誘導された、筋管へのC2C12の分化の妨害に打ち勝つことができなかった(図1B)。一方、20nMの3種のDog1特異的siRNAをそれぞれ用いたトランスフェクションにより、変異誘発物質曝露後に筋細胞分化が進行することが可能になった(図1B)。したがって、Dog1 mRNAの特異的減少により、C2C12細胞は、損傷されたDNAの存在下で筋原性分化を経ることが可能になった。
【０１６６】
本発明を、その特定の態様に関連して説明したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされることができ、かつ均等物は代用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。さらに、個々の状況、材料、組成物、プロセス、またはプロセスの段階を本発明の目的の精神および範囲に適合させるために、多くの修正がなされ得る。このような修正はすべて、本発明に添付される特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】siRNAの媒介によるDog mRNAのノックダウンの図を示す。損傷を受けた後でさえ、筋原細胞が分化することが可能になる。示された、Dog1特異的siRNA 20nM(D1-1;D1-2)、対照のsiRNA(C)、または脂質のみ(M)を、28時間、C2C12細胞にトランスフェクトした。次いで、75μM  MMSまたはビヒクルで24時間これらを処理した後、洗浄し、かつ分化培地中で72時間培養した。図1Aは、トランスフェクション後28時間目に、Dog1特異的siRNAは、C2C12細胞中のDog1 mRNAを80〜96％減少させた。対照のsiRNAは、Dog1 mRNAレベルを有意に低下させなかった。図1Bは、偽トランスフェクションC2C12細胞または対照のsiRNAをトランスフェクトしたC2C12細胞は変異誘発物質に曝露した後、筋管に分化しなかった。しかしながら、変異誘発物質で処理した、Dog1特異的siRNAをトランスフェクトしたC2C12細胞は、筋管に分化した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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