(57)【要約】  以下の工程を含む標的ポリマー分子のシーケンシング法：（ｉ）標的ポリマーの少なくとも１つの末端を逐次的に分解する試薬で標的ポリマーを処理し；（ii）異なる分解されたポリマーの分解された末端の少なくとも一部を読み取り可能なシグナル配列に変換し、該分解されたポリマーのそれぞれを、分解の相対的順序を表すタグで標識し；（iii）読み取り可能シグナル配列の配列を決定し；そして（iv）工程（iii）で得た配列データおよびそれぞれの付随するタグの識別表示を用いて標的ポリマーの配列を決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリマー分子をシーケンシングする方法であって、
（ｉ）標的ポリマーの少なくとも１つの末端を逐次的に分解する試薬で標的ポリマーを処理し；
（ii）異なる分解されたポリマーの分解された末端の少なくとも一部を読み取り可能なシグナル配列に変換し、該分解されたポリマーのそれぞれを、分解の相対的順序を表すタグで標識し；
（iii）読み取り可能なシグナル配列の配列を決定し；そして
（iv）工程（iii）で得た配列データおよびそれぞれの付随するタグの種類を用いて標的ポリマーの配列を決定する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
分解されたポリマーのサンプルを分解反応中の既定の時点で取り出し、分析のために別々のコンパートメントに配する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
各読み取り可能シグナル配列が、少なくとも１つの他の分解されたポリマーの読み取り可能シグナル配列に相補的な領域を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
全ての分解されたポリマーの読み取り可能シグナル配列を合わせたものが標的ポリマーの配列を表す、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標的ポリマーがポリヌクレオチドである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ポリヌクレオチドがDNAである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
標的ポリマーがポリペプチドである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試薬がエキソヌクレアーゼである、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試薬がプロテアーゼである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
読み取り可能シグナル配列が拡大タグであるか、または拡大タグを含む、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タグが既定の配列の拡大タグであるか、または既定の配列の拡大タグを含む、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
タグが蛍光体である、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体ポリマー分子のシーケンシングのための方法に関する。この方法は特にポリヌクレオチドのシーケンシングに好適である。
【背景技術】
【０００２】
分子の研究が進歩してきているが、これは一部には分子またはその生体反応の特性決定に用いられる技術の進歩による。特に核酸DNAおよびRNAの研究は、配列分析およびハイブリダイゼーション事象の研究に用いられる技術の開発の恩恵を受けてきた。
【０００３】
一般に大規模DNAシーケンシングに使用される主な方法はチェーン・ターミネーション法である。この方法はSangerおよびCoulsonによって最初に開発され（Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467）、４つのヌクレオチドのジデオキシ誘導体を使用し、それらがポリメラーゼ反応において新生ポリヌクレオチド鎖に導入されることに基づくものである。導入の際、ジデオキシ誘導体によってポリメラーゼ反応が停止され、その後ゲル電気泳動法によって生成物を分離し、分析を行って、特定のジデオキシ誘導体がどの位置で鎖に導入されたかを明らかにする。
【０００４】
この方法は広く使用され、信頼度のある結果が得られるが、時間と手間と費用がかかることが認識されている。
【０００５】
米国特許第5302509号は、固相支持体に固定化したポリヌクレオチドのシーケンシングを行う方法を開示している。この方法は、DNAポリメラーゼの存在下で、固定化されたポリヌクレオチドに異なる蛍光標識を有する3’-ブロッキングした塩基A、G、C、およびTを導入することに基づくものである。ポリメラーゼによって標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基が導入されるが、3’-ブロッキング基によって更なる添加は阻止される。その後、導入された塩基の標識を判定し、化学的切断によってブロッキング基を除去し、それによって更なる重合を行うことができるようになる。しかしながら、このようにブロッキング基を除去しなければならないことは時間がかかり、また、高効率で行わなければならない。
【０００６】
国際特許公開WO-4-00/39333は、標的ポリヌクレオチドの配列を所定の配列およびそれに含まれる位置に関する情報を含有する第２のポリヌクレオチドに変換することによってポリヌクレオチドをシーケンシングする方法について報告している。標的の配列情報は第２のポリヌクレオチド中で“拡大（magnified）”されるといわれており、それによって標的分子上の個々の塩基間の識別が非常に簡便になる。これは既定の核酸配列である“拡大タグ（magnifying tag）”を用いて行われる。標的分子上の塩基アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンはそれぞれ個々の拡大タグによって表され、元の標的配列が拡大された配列に変換される。次いで従来の技術を用いて拡大タグの順序を決定し、それによって標的ポリヌクレオチド上の特定の配列を決定する。
【０００７】
長いポリマーのシーケンシングは有用ではあるが、なお問題があり、多数のポリマーフラグメントのシーケンシングおよびそれに続くかなりの配列再構築が必要とされる。読み取りの長さを長くし、必要とされる再構築を単純化することが、特にデノボでポリマーのシーケンシングを行う際に必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、標的ポリマーの逐次的分解によって生成したフラグメントに位置および配列に関する情報をコード化させることによって標的ポリマーのシーケンシングを行うことができるという認識に基づく。これらのフラグメントを使用して標的ポリマーの配列を再構築することができる。
【０００９】
本発明の第１の観点によれば、標的ポリマー分子のシーケンシングの方法は以下の工程：
（ｉ）標的ポリマーの少なくとも１つの末端を逐次的に分解する試薬で標的ポリマーを処理し；
（ii）異なる分解されたポリマーの分解された末端の少なくとも一部を読み取り可能なシグナル配列に変換し、該分解されたポリマーのそれぞれを、分解の相対的順序を表すタグで標識し；
（iii）読み取り可能なシグナル配列の配列を決定し；そして
（iv）工程（iii）で得た配列データおよびそれぞれの付随するタグの識別表示(identification)を用いて標的ポリマーの配列を決定すること、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は標的ポリマー分子の配列の決定に用いられる。この方法はデノボシーケンシングに特に有用である。
【００１１】
本発明の方法は以下の一般的な工程を含む：まず、標的ポリマーを逐次的に分解する。次いで各フラグメントを２つの標識で標識する。第１の標識は“読み取り可能シグナル配列”と呼ばれ、フラグメントの配列に関する情報を含む。第２の標識は“位置情報タグ（positional tag）”と呼ばれ、フラグメントが分解反応から取り出された点を示すために加えられる。全てのフラグメントを“読み取り可能シグナル配列”および“位置情報タグ”で標識した後、これらの標識を検出し、各フラグメントの配列および標的ポリヌクレオチドにおけるその位置に関する情報を得る。次いでこの情報を用いて、シーケンシングした各フラグメントの型および順序を照合して標的ポリマーの配列を決定できる。
【００１２】
好ましくは分解反応後にサンプルを取り出し、分析のために別々のコンパートメントに配する。従って各サンプルは異なる長さの標的ポリマーのフラグメントを含有し、そのため分解された末端に他のフラグメントとは異なる配列を有する。
【００１３】
この方法により、標的ポリマーに関する配列情報が得られる。本明細書で使用する“ポリマー”という用語は、連結されたモノマーユニットからなる任意の分子をいう。好ましくはポリマーは生体ポリマー、特にポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。“ポリヌクレオチド”という用語は当該分野で周知であり、一連の連結された核酸塩基、例えばDNAまたはRNAを表すために用いられる。核酸模倣体、例えばPNA（ペプチド核酸）、LNA（ロックされた核酸）、および2-O-methRNAも本発明の範囲に含まれる。標的ポリヌクレオチドは１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
【００１４】
本明細書で使用する“塩基”という用語は、各核酸モノマー、Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、またはＣをいう。これらの略語はヌクレオチド塩基、アデニン、チミン（ウラシル）、グアニン、およびシトシンを表す。ポリヌクレオチドがRNAの場合はウラシルがチミンに置き換わるか、あるいはdUTPを用いてDNAに導入することもでき、これも当該分野で周知である。
【００１５】
“ポリペプチド”という用語も当該分野で周知であり、一連の連結されたアミノ酸分子を表すのに用いられる。この用語は短いペプチド配列およびより長いタンパク質配列の両方を含むことを意図する。
【００１６】
本発明の方法は、標的ポリマーを逐次的に分解して種々の長さのフラグメントを生成することを含む。分解は標的ポリマーの一端または両端のいずれから起こってもよい。標的ポリマーを逐次的に分解する方法は当該分野で周知であり、例えば酵素消化がある。当業者に明白なように、ヌクレアーゼはポリヌクレオチドの分解に好適であり、プロテアーゼおよびペプチダーゼはポリペプチドの分解に好適である。好ましい態様では、酵素活性に好適な条件下でエキソヌクレアーゼまたはエキソプロテアーゼを使用する；これらの酵素は、それぞれポリヌクレオチドおよびポリペプチドから、末端モノマーユニットを逐次的に除去する。酵素活性に好適な条件は当業者に明白である。
【００１７】
逐次的分解の際、好ましくは分解された標的ポリマーのサンプルを特定の時間間隔で反応混液から取り出し、別々のコンパートメントに配する。従って、それぞれの別個のコンパートメントは異なる長さのフラグメントを含む。分解反応の初期に取り出されたフラグメントは分解反応の後期に取り出されたものより長いフラグメントである。分解反応の開始前にサンプルを取り出してもよく、この最初のサンプルは完全長の標的ポリマーを含有する。分解反応中、任意の数のサンプルを取り出すことができ、好ましくは生成されるフラグメントの数が最適になるように設計された既定の時間間隔で取り出す。本明細書で使用する“サンプルフラグメント”という用語は、分解の間に取り出されるフラグメントをいう。
【００１８】
反応混液から取り出す際には、分解反応を停止させる必要がある。酵素反応の停止に好適な方法は当業者に明らかである。温度およびpHの変化は、阻害剤の添加と同様、酵素を不活性化することが知られている。好ましくは、分解を停止するのに用いられる手法はサンプルフラグメントに損傷または有害な影響を与えない。サンプルの断片化にエキソヌクレアーゼを用いる場合、エキソヌクレアーゼは当該分野で知られる方法によって不活性化することができる。例えばTris塩基およびEDTAを含むバッファーを添加した後70℃に加熱すると、エキソヌクレアーゼIIIは不活性化される。この方法はErase-a-Base法（Promega社）に用いられる。この方法では、1μlのS1ヌクレアーゼ停止バッファー（0.3M Tris塩基、0.05M EDTA）を2.5μlの反応容量に添加し、70℃で10分間加熱する（Promega Erase-a-Baseシステム技術マニュアル#006（www.promega.comから入手可能）およびHenikoff, Nucleic. Acids Res. 1990 May 25; 18 (10):2961-2966参照）。
【００１９】
分解反応の停止に使用できる別の方法はサンプルからの分解酵素の除去である。混合液から酵素を特異的に除去するのに好適な方法は当該分野で周知であり、例えばアフィニティークロマトグラフィーの使用があるが、これは酵素の結合パートナーを固定化し、酵素を固定化されたアフィニティーパートナーに接触させて酵素をサンプルから除去するものである。あるいはまた、各標的ポリマーを固相支持体に固定化した後、分解反応を行ってもよい；好ましくは標的ポリマーをビーズ上に固定化し、分解反応の際にアリコートを取り出せるようにする。分解反応中に取り出した各ビーズサンプルは、その上に固定化されたサンプルフラグメントを有する。その後、当業者に認識されるように、サンプリングしたこれらのビーズを洗浄して酵素を除去する。この態様では、分解が均一となるよう、ポリマーが結合したビーズが分解反応中に確実に均質な混合物をなしていることを確実にすることが望ましい。これはサンプルの撹拌またはビーズの撹拌によって行うことができる。
【００２０】
支持体（例えばビーズ）上に生体ポリマーを固定化させる方法は当該分野で周知である。例えばポリヌクレオチドは、ビオチン-アビジン相互作用、フォトリソグラフィー法、および個々のポリマーを支持体上の所定の位置に“スポッティング（spotting）”することを利用する方法を用いて固定化することができる。
【００２１】
固定化は特異的共有結合または非共有相互作用によって行ってもよい。相互作用は、不要な反応成分を除去するための洗浄段階の際に支持体上にポリマーが保持されるのに十分なものであるべきである。好ましくは固定化は一つの末端のみ、例えばポリヌクレオチドの5’または3’末端でのみで行い、それによってポリマーはその一端のみで支持体に結合する。しかしながら、ポリマーはその全長に沿った任意の位置で支持体に結合してもよく、結合はポリヌクレオチドを支持体に係留する役割を果たす。
【００２２】
ポリマーを支持体に固定化するための好適な方法は当業者に認識される。当業者に認識されるように、好適なコーティングを支持体に施与し、固定化を容易にしてもよい。ポリヌクレオチドの結合に好適なコーティングには、エポキシコーティング（例えば3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン）、スーパーアルデヒドコーティング、メルカプトシラン、およびイソチオシアネートがある。あるいはまた、いくつかのリンカー基を用いてもよく、それらにはPAMAM樹状構造（Bentersら, Chem. Biochem., 2001; 2:686-694）およびZhaoら（Nucleic Acids Research, 2001;29(4):955-959）に記載される固定化リンカーがある。
【００２３】
別の態様では、分解反応をすぐに停止しない。代わりに、分解反応から取り出した直後に、読み取り可能シグナル配列をサンプルフラグメントに結合させてもよい。
【００２４】
各サンプルフラグメントの少なくとも一部を読み取り可能シグナル配列に変換する。１個の塩基から全サンプルフラグメントまで、どの部分が変換されてもよい。好ましくは各サンプルフラグメントからの少なくとも３個のモノマーユニットが、より好ましくは３から１００個のモノマー、例えば２０個のモノマーユニットが変換される。標的ポリマーが一方の末端のみから分解される場合、少なくとも各サンプルフラグメントの相当する末端は読み取り可能シグナル配列に変換される。例えば標的ポリヌクレオチドの3’末端から分解が起こる場合、サンプルフラグメントの少なくとも３個の3’塩基が読み取り可能シグナル配列に変換される。標的の両端が分解される場合、各フラグメントの一端または両端を変換することができる。好ましい態様では、各サンプルフラグメントの全配列が読み取り可能シグナル配列に変換される。最も好ましくは全てのサンプルフラグメントの読み取り可能シグナル配列を組み合わせたものが標的ポリヌクレオチドの全配列を表す。
【００２５】
本明細書で使用する“読み取り可能シグナル配列”という用語は、その後の読み取り段階で配列の少なくとも一部を同定できるようにするための標識または標識の結合手段を含む配列をいう。任意の標識を使用することができる。標識を用いる生体ポリマーのシーケンシング法は当該分野で周知である。例えば、N-末端アミノ酸残基と反応する試薬を添加し、その後の読み取り段階で末端残基の同定ができるようにすることによって、ポリペプチドを読み取り可能シグナル配列に変換できる。一般的に用いられる試薬には、塩化ダンシルおよびフェニルイソチオシアネート（PITC）がある。PITCはポリペプチドシーケンシングの“エドマン分解”に用いられ、これは当該分野で周知である。任意の好適な技術を用いてポリヌクレオチドを読み取り可能シグナル配列に変換できる。ポリヌクレオチドシーケンシングのチェーン・ターミネーション（“サンガー”）法を用いることができるが、その方法ではサンプルフラグメントをジデオキシヌクレオシド３リン酸を含む読み取り可能シグナル配列に変換する。
【００２６】
当業者に認識されるように、サンプルフラグメント中の一連のモノマーユニットの配列を得るために、多くのシーケンシングサイクルが必要とされうる。これは本発明の範囲内である。
【００２７】
好ましい態様では、読み取り可能シグナル配列は、サンプルフラグメント中の１つのモノマーユニットを表す少なくとも２つの塩基を含むポリヌクレオチドである。サンプルフラグメントの配列情報は読み取り可能シグナル配列中で“拡大”されると言われ、それによって標的分子上の個々の塩基間の識別が大幅に簡易になる。上記で“拡大された（または拡大する）タグ”配列として記載したこれらの好ましい読み取り可能シグナル配列を、本明細書では“拡大型読み取り可能シグナル配列”と記載する。これらの配列の例は国際特許公開WO-A-00/39333およびWO04/94663（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。従来技術で知られているように、任意の生体ポリマーを拡大型読み取り可能シグナル配列に変換することができる。WO-A-00/39333はポリヌクレオチドの拡大型読み取り可能シグナル配列への変換について記載している。タンパク質およびペプチドのポリヌクレオチド拡大型読み取り可能シグナル配列への変換はWO 04/94663（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００２８】
好ましくは、それぞれの拡大型読み取り可能シグナル配列は２個以上のヌクレオチド塩基、好ましくは２から５０塩基、より好ましくは２から２０塩基、そして最も好ましくは４から１０塩基、例えば６塩基を含む。好ましい態様では、それぞれの拡大型読み取り可能シグナル配列中に３つの異なる塩基が存在する。例えば１つの塩基は読み取り段階で取り込まれる標識されたヌクレオチドに相補的であり、１つの塩基は“スペーサー”として作用して取り込まれた標識間を分離し、そして１つの塩基は停止シグナルとして作用する。
【００２９】
同時係属出願中のPCT/GB04/04665に開示されるように、は拡大型読み取り可能シグナル配列中に２進コードが含まれていてもよい。この“２進”の態様では、拡大型読み取り可能シグナル配列はそれぞれ、識別可能な(distinct)配列の２つのユニットを含み、これでサンプルフラグメント上の４つの塩基全てが表される。２つのユニットを２進法として用い、一方のユニットが“０”、他方のユニットが“１”を示す。サンプルフラグメント上の各塩基は拡大型読み取り可能シグナル配列中の２つのユニットの組合せで特徴付けられる。例えばアデニンは“０”＋“０”、シトシンは“０”＋“１”、グアニンは“１”＋“０”、そしてチミンは“１”＋“１”で表される。ユニット間を識別する必要があるため、“停止”シグナルを各ユニットに取り込むことができる。サンプルフラグメント上の塩基が奇数番号の位置にあるか偶数番号の位置にあるかによって異なるユニットを用いて、“１”および“０”を表すことも好ましい。
【００３０】
これは以下のように表される：
奇数番号のテンプレート配列：
“０”：ＴＴＴＴＴＴＡ（ＣＣＣ）
“１”：ＴＴＴＴＴＴＧ（ＣＣＣ）
偶数番号のテンプレート配列：
“０”：ＣＣＣＣＣＣＡ（ＴＴＴ）
“１”：ＣＣＣＣＣＣＧ（ＴＴＴ）
【００３１】
この例では、下線を付した塩基はポリメラーゼ反応における標識されたヌクレオチドの標的であり、括弧内の塩基は停止シグナルとして使用され、それ以外の塩基は標識間を分離するためのものである。
【００３２】
好ましくはサンプルフラグメント中の複数のモノマーユニットが拡大型読み取り可能シグナル配列に変換される。それぞれの拡大型読み取り可能シグナル配列は標的ポリマーに順番に結合したままであり、このことにより一連の拡大型読み取り可能シグナル配列ユニットを含む単一のポリヌクレオチド分子を形成し、これは標的ポリマーの配列をコード化する。
【００３３】
“読み取り”段階で（例えば重合化反応における検出可能な標識がなされたヌクレオチドの取り込み、または相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際を含む）、または慣例的なシーケンシング反応で、種々の拡大型読み取り可能シグナル配列を識別できる。上記の例では、検出可能な標識がなされたヌクレオチドの取り込みを用いてもよい。奇数番号位置（１、３、５など）では、ポリメラーゼ反応の際に導入されるヌクレオチド混合物は蛍光X-dUTP、蛍光Y-dCTP、およびdATPからなる（cGTPは混合物に含まれない）。“０”には蛍光Yの相補的塩基が含まれず、“１”には蛍光Xの相補的塩基が含まれない。従ってポリメラーゼ反応の際、ユニット“０”が存在すれば蛍光Xをモニタリングすることによって、“１”が存在すれば蛍光Yをモニタリングすることによってこれを検出できる。
【００３４】
全ての偶数番号位置（２、４、６など）では、ヌクレオチド混合物は同じ２つの蛍光標識したヌクレオチドを含有するが、dATPではなくdGTPを使用し、１つ以上のT塩基が停止シグナルを規定する。
【００３５】
それぞれの拡大型読み取り可能シグナル配列を“読み取”った後、欠けていた相補的ヌクレオチド（例えばdGTPまたはdATP）を導入して停止配列における取り込みを可能とすることによって工程を再開することができる。取り込まれなかったヌクレオチドを洗浄除去した後、次の読み取り段階を行う。
【００３６】
当該分野で知られる方法を用いて、各サンプルフラグメントを拡大型読み取り可能シグナル配列（またはこれらの一連のもの）に変換することができる。国際特許公開WO-A-00/39333に開示される制限酵素を用いる変換法を採用してもよい。例えばサンプルフラグメントがポリヌクレオチドであれば、挿入位置の近傍にクラスIIS制限部位を有するベクターにサンプルフラグメントをライゲートするか、またはサンプルフラグメントを遺伝子操作してそれらの部位を含有するようにしてもよい。その後、好適なクラスIIS制限酵素を用いて制限部位を切断し、サンプルフラグメント中にオーバーハングを生成させる。
【００３７】
次に、１つ以上の拡大型読み取り可能シグナル配列ユニットを含む好適なアダプターを用いて、オーバーハングの１個以上の塩基に結合させることができる。アダプターのオーバーハングと切断したベクターがハイブリダイズすれば、これらの分子はライゲートすることができる。これはオーバーハングの全長にわたって完全に相補的である場合にのみ起こる。その後、平滑末端ライゲーションによってアダプターの他の末端をベクターに結合させる。更なるクラスII制限酵素部位、または他の好適な制限酵素部位（前に使用した酵素と同じでも異なってもよい）を好適に配することにより、標的配列中の、第１のアダプターが標的とする配列の下流にオーバーハングを生成させるように切断を行うことができる。このようにして、隣接またはオーバーラップしている配列を規定の配列のユニットを有する配列に連続的に変換することができる。
【００３８】
読み取り可能シグナル配列への変換後で読み取り段階の前に、それぞれの別々のコンパートメント中のサンプルフラグメントを必要により固相支持体上に固定化し、例えばアレイを形成してもよい。生体ポリマーを支持体に固定化する方法は上記のように当該分野で周知である。固定化はマイクロビーズ、ナノ粒子、および平面上へのポリヌクレオチドのランダム分布によって行ってもよい。好適な支持体物質は当該分野で知られており、ガラススライド、セラミックおよびシリコン表面、そしてプラスチック物質がある。支持体は通常平らな表面（平面）である。
【００３９】
サンプルフラグメントを支持体物質上に固定化してアレイを形成してもよく、これは固相支持体上にランダムまたは規則的なパターンをなしてもよい。好ましくは、使用するアレイは別々の光学的に解析可能な領域にサンプルフラグメントを含む単一分子アレイであり、例えばポリヌクレオチドアレイは国際特許公開WO-A-00/06770に開示されている（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４０】
好ましくは、各サンプルフラグメントは、少なくとも１つの他のサンプルフラグメントの読み取り可能シグナル配列に相補的な読み取り可能シグナル配列を含有する。更に好ましくは、サンプルフラグメント上の複数のモノマーユニット、例えばポリヌクレオチド中の２から２０塩基、例えば３、４、または５塩基を表す複数の読み取り可能シグナル配列の間に相補性がある。当業者に認識されるように、これによって、別個のサンプルフラグメントの読み取り可能シグナル配列情報の間にオーバーラップがあり、それらの重複するオーバーラップ領域に基づいて標的配列を再構築できることが確実となる。異なるサンプルフラグメント上の読み取り可能シグナル配列間の相補性が高いほど配列の再構築が容易になる。
【００４１】
各サンプルフラグメントの少なくとも一部を読み取り可能シグナル配列で標識することに加え、フラグメントを分解反応から取り出した時点を表す“位置情報タグ”でも各フラグメントを標識する。好ましい態様では、各サンプルフラグメントを異なる位置情報タグで標識し、このことによりそれが分解反応から取り出された時点を識別する。生体ポリマーの標識に好適ないずれのタグを用いてもよい。好ましい態様では、位置情報タグは蛍光体である。好適な蛍光体は当業界で周知であり、例えば以下がある：
Alexa色素（Molecular Probes）
BODIPY色素（Molecular Probes）
シアニン色素（Amersham Biosciences社）
テトラメチルローダミン（Perkin Elmer、Molecular Probes 、Roche Diagnostics）
クマリン（Perkin Elmer）
テキサスレッド（Molecular Probes）
フルオレセイン（Perkin Elmer、Molecular Probes 、Roche Diagnostics）
【００４２】
当業者に明白なように、いずれの蛍光検出法を用いて読み取り段階で蛍光体を検出してもよい。蛍光検出法の例を以下に概説する。
【００４３】
別の好ましい態様では、位置情報タグは既定の配列の“拡大タグ”である。上記およびWO-A-00/39333に記載されるように、不確かさを無くすため、拡大タグは２つ以上の塩基を含む。好ましくは、位置情報タグは既定の一連の拡大タグを含むポリヌクレオチドである。拡大タグを位置情報タグとして用いる場合、これはサンプルフラグメントの配列を表すのではなく、読み取り段階で認識できる既定の配列である。読み取り可能シグナル配列および位置情報タグを２つ以上の塩基からなる識別可能なユニット（すなわち“拡大タグ”）を含むポリヌクレオチドの形態で有することによって、読み取り可能シグナル配列および位置情報タグの両方を同じ方法で読み取ることができるため、読み取り段階は簡易化される。任意の方法で拡大タグをサンプルフラグメントに結合させることができる。好ましくは、国際特許公開WO-A-00/39333に開示される（そして本明細書に概要を記載する）制限酵素／ライゲーションに基づく方法を用いる。
【００４４】
位置情報タグはサンプルフラグメントに直接結合させるか、または読み取り可能シグナル配列に結合させてもよい。好ましい態様では、読み取り可能シグナル配列および位置情報タグの両方が２つ以上の塩基からなる識別可能なユニットを含む拡大タグである場合、位置情報タグおよび読み取り可能シグナル配列は連続し、両方の標識を含む単一のポリヌクレオチド鎖を形成する。あるいはまた、位置情報タグおよび読み取り可能シグナル配列はサンプルフラグメントの反対の末端に結合させる。
【００４５】
各サンプルフラグメントの少なくとも一部を、サンプルフラグメントの配列をコード化する読み取り可能シグナル配列および分解反応における位置を示す位置情報タグで標識した後に、読み取り段階で各フラグメント内に含まれるデータを検出し、それによって各フラグメントの配列および標的分子におけるその位置を同定する。次いでこれらのシーケンシングしたフラグメントを再構築して標的ポリマーの配列を得る。タグおよび読み取り可能シグナル配列がどちらも拡大タグ配列である場合、読み取り段階は任意の好適な方法で、例えば国際特許公開WO-A-00/39333およびPCT/GB04/01665に記載され、本明細書に概説されるように行ってもよい。好ましい検出方法は上記のように、選択した検出可能なように標識したヌクレオチド、または続く間接的標識のための基を取り込んだヌクレオチドのいずれかを用いて、ポリメラーゼ反応を用いて読み取り可能シグナル配列上の塩基に相補的な塩基を導入し、取り込み事象をモニタリングする。
【００４６】
ポリメラーゼ反応に基づく読み取り段階を行うためには、通常、まず拡大型読み取り可能シグナル配列ポリヌクレオチドにプライマー配列をアニールさせる必要がある。プライマー配列はポリメラーゼ酵素によって認識され、次の相補鎖の伸長のための開始部位として作用する。プライマー配列をポリヌクレオチドとは別の成分として添加してもよく、プライマーはアニールできる相補的配列を含む。好ましくは相補的ヌクレオチドが一度に１ユニットずつ導入されるように制御できる条件下でポリメラーゼ反応を行う。このことにより、導入された標識の検出によってそれぞれの拡大型シグナル配列ユニットを分類することが可能となる。上記のように、好ましくは各ユニットは“停止”配列を含むため、第１のユニットへの導入に必要なヌクレオチドのみを供給することによって導入を制御することが可能である。各ユニットは特定の標識によって認識されるので、各サイクルで２つの異なるユニット（０および１）を識別できる。これによって任意の導入された標識を検出でき、ユニットの種類および位置を判定することが可能となる。
【００４７】
読み取り可能シグナル配列および位置情報タグの両方が拡大タグ配列である場合、読み取り法は以下のように実施することができる：
（ｉ）重合化反応が進行しうる条件下で所定のユニットを含む読み取り可能シグナル配列をヌクレオチドdATP、dTTP、dGTP、およびdCTPの少なくとも１つと接触させ、ここで、少なくとも１つのヌクレオチドはそのヌクレオチドに特有の検出可能な標識を含み；
（ii）取り込まれていないヌクレオチドを除去して取り込み事象を検出し；
（iii）任意の取り込まれたヌクレオチドから標識を除去し；そして
（iv）工程（ii）から（iv）を反復して異なるユニットを同定し、それによって標的ポリヌクレオチドの配列を同定する。
【００４８】
各サイクルの工程（i）で必要とされる異なるヌクレオチドの数は、拡大型シグナル配列ユニットの設計によって異なる。各ユニットが１つの塩基型だけを含む場合は、（検出可能な標識がなされた）１つのヌクレオチドのみが必要である。しかしながら２つの塩基が使用される場合は（１つは検出可能な標識がなされたヌクレオチドの標的として、１つは異なる標的塩基間を隔てるため）、２つのヌクレオチドが必要である（１つは標的塩基に結合させるため、１つは標的塩基間の塩基を充填するため）。
【００４９】
塩基を停止シグナルとして使用することにより、ポリメラーゼ反応中の制御不能な取り込みを防止するためのブロックされたヌクレオチドを必要とすることなく、検出段階を実施することができる。ポリメラーゼ混合物に“停止”塩基の相補体が含まれないため、停止シグナルは有効である。従って、各ユニットを特性決定した後、欠失したヌクレオチドを用いて“充填”段階を行って、停止塩基に相補体を取り込ませ、それによって次のユニットの特性決定が可能となる。これは検出段階後に実施する。あるユニットの“停止”塩基は、それに続くユニットの第１塩基と同じ型のものではない。これによって“充填”操作が次のユニットにまで進行しないことが確実となる。その後“充填”操作で使用された取り込まれなかったヌクレオチドを除去し、次のユニットを特性決定できる。
【００５０】
ポリメラーゼおよび検出可能な標識の選択は当業者に明白である。以下は単に手引きとして用いるものである：
ａ）クレノウおよびクレノウ（エキソ−）はテトラメチルローダミン-4-dUTPおよびローダミン-110-dCTP（Amersham Pharmacia Biotech）を効率的に取り込むことができる（BrakmannおよびNieckchen, 2001、BrakmannおよびLobermann, 2000）
ｂ）Vent、Taq、およびTgo DNAポリメラーゼは間隔をあけずに少なくともいくつかの位置にジオキシゲニン（dioxigenin）および蛍光体、例えばAMCA、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、およびCy5を効率的に取り込むことができる（Augustinら,2001）
ｃ）T4 DNAポリメラーゼは蛍光体で標識されたヌクレオチドを効率的に充填する
【００５１】
好ましいポリメラーゼはクレノウラージフラグメント（エキソ−）およびT4 DNAポリメラーゼである。
【００５２】
ポリメラーゼ反応の実施に必要な他の条件、例えば、温度、pH、バッファー成分などは当業者に明白である。重合化段階は塩基を第１のユニットに取り込むのに十分な時間行うのが適切である。その後取り込まれなかったヌクレオチドを、例えばアレイを洗浄することによって除去し、次いで取り込まれた標識の検出を行うことができる。
【００５３】
別の読み取り法では、短い検出可能な標識がなされたオリゴヌクレオチドを用いて、拡大型読み取り可能シグナル配列および／または位置タグ上のユニットにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション事象を検出する。短いオリゴヌクレオチドは読み取り可能シグナル配列の特定のユニットに相補的な配列を有する。例えば２進法を用いて、サンプルフラグメント中のそれぞれのモノマーを異なる拡大型読み取り可能シグナル配列ユニットの組み合わせ（一方は“０”、一方は“１”を表す）で定義する場合、本発明は“１”ユニットに特異的なオリゴヌクレオチドを必要とする。この態様では、他のユニットとは異なるポリヌクレオチド配列となるように各ユニットを設計することによって、オリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーションを行うことができる。これによって、特定のユニットが存在する場合にのみハイブリダイゼーション事象が起きることが確実となり、ハイブリダイゼーション事象の検出によってサンプルフラグメントの特性が同定される。
【００５４】
好ましい態様では、標識は蛍光成分である。上記のように、使用できる蛍光体の多くの例が従来技術で知られている。適切な蛍光体のヌクレオチドへの結合は慣用の手段により行うことができる。また、好適に標識されたヌクレオチドは市販されている。標識の結合は、検出段階後に除去することが可能なように行う。これは任意の慣例的な方法で行うことができ、それらには以下がある：
Ｉ．シグナル自体の攻撃
ｄ）退色
ｉ）光退色
ii）化学退色
ａ）蛍光のクエンチング
ｉ）蛍光に対する抗体による（例えば抗フルオレセイン、抗オレゴングリーン）
ii）ＦＲＥＴによる（シグナルの隣に消光体を導入することによってシグナルのクエンチングができる。例えばタックマン法）
ｂ）シグナルの切断
ｉ）化学切断（例えば塩基およびシグナル間のジスルフィド架橋の還元）
ii）光切断（例えばニトロベンジルまたはtert-ブチルケトン基の導入）
iii）酵素（例えばペプチドリンカーのα-キモトリプシン消化）
II．シグナルを有するヌクレオチド：
ｂ）エキソヌクレアーゼ分解除去
ｉ）充填されたヌクレオチドの3’-5’エキソヌクレアーゼ消化（例えばエキソヌクレアーゼIII、または一定のヌクレオチドが存在しない場合はDNAポリメラーゼの3’-5’エキソヌクレアーゼ分解活性の活性化による）
ｃ）制限酵素消化
ｉ）２本鎖DNAを有するシグナルの消化（例えば停止シグナルに導入できるApal、Dral、Smal部位）
【００５５】
除去が可能な標識を使用する代わりに、生化学過程の際に再活性化される、不活性な標識を使用してもよい。
【００５６】
好ましい方法は光または化学切断である。
【００５７】
標識が蛍光体の場合、取り込み時に生成する蛍光シグナルを光学的方法、例えば共焦点顕微鏡によって測定することができる。あるいはまた、高感度2-D検出器、例えば電荷結合素子検出器（ＣＣＤ）を用いて、生じた個々のシグナルを可視化することができる。
【００５８】
光検出の一般的な設定は以下の通りである：
顕微鏡：エピ・フルオレセンス
対物レンズ：油浸（100x、1.3NA）
光源：レーザーまたはランプ
フィルター：バンドパス
ミラー：ダイクロイック（Dichroic）ミラーおよびダイクロイックウェッジ
検出器：フォトマルチプライヤー（ＰＭＴ）またはＣＣＤカメラ
【００５９】
以下のような改良型を使用することもできる：
Ａ．全反射型蛍光顕微鏡（TIRFM）
光源：１つ以上のレーザー
バックグラウンド制御：ピンホール不要
検出：ＣＣＤカメラ（ビデオおよびデジタルイメージングシステム）
Ｂ．共焦点走査型レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）
光源：１つ以上のレーザー
バックグラウンド低減：１つまたは数個のピンホール開口
検出：ａ）１個のピンホール：種々の蛍光波長のためのフォトマルチプライヤー管（ＰＭＴ）検出器［最終画像はコンピューターによって一定時間にわたる一点一点から構築される］
ｂ）数千個のピンホール（ニポウ回転盤）：画像のＣＣＤカメラ検出［最終画像をカメラで直接記録できる］
Ｃ．二光子（ＴＰＬＳＭ）および多光子走査型レーザー顕微鏡
光源：１つ以上のレーザー
バックグランド制御：ピンホール不要
検出：ＣＣＤカメラ（ビデオおよびデジタルイメージングシステム）
好ましい方法はＴＩＲＦＭおよび共焦点顕微鏡である。
【００６０】
認識されるように、拡大型読み取り可能シグナル配列に好適な方法の特定の例を本明細書に記載したが、拡大型読み取り可能シグナル配列および“拡大タグ”位置情報タグの読み取りは任意の好適な読み取りのプラットフォームを用いて行ってもよい。
【００６１】
読み取り可能シグナル配列が拡大型読み取り可能シグナル配列ではない場合、例えばPITC標識したポリペプチドまたはddNTP標識したポリヌクレオチドである場合、任意の好適な読み取り段階を使用することができる。当該分野で周知のように、クロマトグラフィーおよび電気泳動による読み取り段階が一般的に使用される。
【００６２】
各フラグメントの配列がわかれば、当業者に明白なように、標的分子内の各フラグメントの順序を示す位置情報タグに基づいて、標的ポリマー分子の配列を再構築することができる。それぞれの読み取り可能シグナル配列中のオーバーラップした領域は配列再構築の助けとなる。これは慣例的なソフトウェアプログラムを用いて行ってもよい。本明細書に引用した文献のそれぞれの内容は本明細書に組み込まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月27日(2007.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリマー分子をシーケンシングする方法であって，
（ｉ）  標的ポリマーを，標的ポリマーの少なくとも１つの末端からポリマーを分解する試薬で処理し；
（ｉｉ）  異なるポリマーの分解された末端の少なくとも一部を分析し，ポリマーに前記分析された部分を規定する１つ以上の第１の標識を導入し，さらに，前記分解されたポリマーのそれぞれを分解の相対的順序を表す検出可能なタグ分子で標識し；
（ｉｉｉ）  前記第１の標識の種類を判定し；そして
（ｉｖ）  工程（ｉｉｉ）で得られた前記第１の標識の種類をおよびそれぞれの付随する検出可能なタグの種類を用いて標的ポリマーの配列を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
分解されたポリマーのサンプルを分解反応中の規定の時点で取り出し，分析のために別々のコンパートメントに配する，請求項１記載の方法。
【請求項３】
すべての分解されたポリマーの第１の標識を合わせたものが標的ポリマーの配列を表す，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的ポリマーがポリヌクレオチドである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである，請求項４記載の方法。
【請求項６】
標的ポリマーがポリペプチドである，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試薬がエキソヌクレアーゼである，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試薬がプロテアーゼである，請求項６記載の方法。
【請求項９】
第１の標識が，標的ポリマー中の単一のモノマーユニットを表す少なくとも２つの塩基を含むポリヌクレオチドである，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
検出可能なタグが規定の配列のポリヌクレオチドであるかまたはこれを含む，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
検出可能なタグが蛍光体である，請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2008515453.tif 000002
2008515453.tif 000003
2008515453.tif 000004
2008515453.tif 000005