(57)【要約】本発明は、白血球におけるＣＤ６４およびＣＤ１６３発現を定量化する方法、および、特に定量的蛍光マイクロビーズ標準の懸濁液、ＣＤ６４およびＣＤ１６３を対象とする蛍光標識抗体および解析ソフトウェアを含むフローサイトメーターでの使用のためのキットに関する。前記ソフトウェアは、フローサイトメーターからのマイクロビーズ懸濁液および蛍光標識抗体に関する情報を得、データを解析し、曲線を平滑化し、新たなパラメーター計算をし、品質管理の手段を提供しおよびアッセイシステムの有効期限を示すために用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血球におけるＣＤ６４およびＣＤ１６３発現を定量化する自動性能解析およびフローサイトメーターの較正のためのキットであって、前記キットはフローサイトメーター、血液試料、プログラム可能なコンピューターおよびディスプレイスクリーンとともに用い、以下を含む前記キット：
（ａ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ６４を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（ｂ）フィコエリトリンまたは同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ１６３を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（ｃ）少なくとも１つまたは２つ以上の蛍光色素とのポリスチレンマイクロビーズの懸濁液であって、蛍光色素の１つはＣＤ６４モノクローナル抗体に結合したものと同一であり、細胞に結合する抗体の蛍光に影響する同様の要素に対して環境的に感度がよく、および外部標準、例えばNIST SRM 8640などに対して追跡可能な前記懸濁液；
（ｄ）有効期限を有し、前記有効期限はかかるキットにおいて指定されている少なくとも１つまたは２つ以上の蛍光色素；および
（ｅ）前記コンピューター上で操作をするソフトウェアであって、以下を含むソフトウェア。
１）それぞれの蛍光剤およびマイクロビーズの蛍光強度の情報であって、前記ソフトウェアは前記コンピューターとともに、較正の計算および前記マイクロビーズに合わせた蛍光情報を制御する操作をし、および前記スクリーン上に前記マイクロビーズの有効期限に関連させた期限日を、前記フローサイトメーターを前記マイクロビーズで較正する操作者に向けて表示をする操作をし、ここで前記ソフトウェアは、前記フローサイトメーターを、前記ソフトウェアおよび前記マイクロビーズを用いてもはや較正できなくなり、操作者が、他のマイクロビーズ群の懸濁液およびフローサイトメーターを較正するための前記他の懸濁液を用いる前記コンピューター上での使用に合わせたソフトウェアを使用しなければならなくなる前記期限日において、前記コンピューター上での操作を止める前記情報；２）蛍光シグナル、ＦＳおよびＳＳを用いて血液試料上のデータを獲得し、そして自動的にゲートし、およびデータを平滑化し、それぞれのマイクロビーズおよび細胞特異的な集団に対応する蛍光強度におけるピークを配置し、直線回帰プロットを作成し、フローサイトメーターの蛍光閾値強度を決定し、ヒストグラムを作成する能力；３）細胞特異的な集団を発見する能力；４）自動データ正規化を実施する能力；および５）特異的な細胞集団でのＣＤ６４およびＣＤ１６３値を計算する能力。
【請求項２】
ＣＤ６４を対象とするモノクローナル抗体がＣｌｏｎｅ２２である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ＣＤ６４を対象とするモノクローナル抗体がＣｌｏｎｅ３２．２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９４６９）である、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
ＣＤ１６３を対象とするモノクローナル抗体がＣｌｏｎｅ  Ｍａｃ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１０７１４）である、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
蛍光色素がフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
マイクロビーズがポリスチレンを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
細胞特異的な集団がリンパ球を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
細胞特異的な集団が単球を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
細胞特異的な集団が好中球を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
ソフトウェアがさらに、品質管理の機能を実施する能力を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
品質管理の機能が、単球集団が蛍光モノクローナル抗体により同定される予測したＣＤ６４発現を有することを評価するものであり、結果的にそれぞれの試料に対する内部陽性対象としての役割を果たす、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
以下を含む、ヒト白血球ＦｃγＲＩ受容体（ＣＤ６４）発現を定量化するための方法；
（ａ）フローサイトメーター、血液試料、プログラム可能なコンピューターおよびディスプレイスクリーンを備える；
（ｂ）ＦｃγＲＩ受容体を検出できるようにする試薬の組み合わせを備える；および、
（ｃ）蛍光、ＦＳおよびＳＳを用いて血液試料のデータを獲得し、そしてヒストグラムを作成し、自動的にゲートし、およびデータを平滑化し、それぞれのマイクロビーズおよび細胞特異的な集団に対応する蛍光強度におけるピークを配置し、直線回帰プロットを作成し、フローサイトメーターの蛍光閾値強度を決定する；細胞特異的な集団を発見する能力、自動データ正規化を実施する能力およびＣＤ６４値を計算する能力を含む、前記コンピューター上におけるソフトウェア操作を備える。
【請求項１３】
白血球が多形核白血球である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下を含むヒト白血球、特に単球、ＣＤ１６３発現を定量化するための方法；
（ａ）フローサイトメーター、血液試料、プログラム可能なコンピューターおよびディスプレイスクリーンを備える；
（ｂ）ＣＤ１６３またはヘモグロビン−ハプトグロビン複合体受容体を検出できるようにする試薬の組み合わせを備える；および、
（ｃ）蛍光、ＦＳおよびＳＳを用いて血液試料のデータを獲得し、そしてヒストグラムを作成し、自動的にゲートし、およびデータを平滑化し、それぞれのマイクロビーズおよび細胞特異的な集団に対応する蛍光強度におけるピークを配置し、直線回帰プロットを作成し、フローサイトメーターの蛍光閾値強度を決定する；細胞特異的な集団を発見する能力、自動データ正規化を実施する能力およびＣＤ１６３値を計算する能力を含む、前記コンピューター上におけるソフトウェア操作を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、フローサイトメトリー、蛍光ラベル抗体、マイクロビース標準および統合されたソフトウェアを用いて定量化できる、細胞表面抗原の分野、発現、特にＣＤ６４およびＣＤ１６３における定量化に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
敗血症は、年間に推定で約７５０，０００の新しい症例が発生する、米国において重大な健康問題である［１］。敗血症は１１番目の主な死因であり、非冠状動脈疾患の集中治療室において死亡率３０〜５０％である主な死亡原因である［１〜３］。敗血症の頻度は１０年の間で１３５％を越えて増加し、抗生物質耐性の増加に伴い上昇し続けると予測されている［１，４］。完全に進展した敗血症の症例に加えて、米国単独で年間基準で何百万もの重度の感染または診断評価を要する敗血症に類似する臨床徴候に罹患する患者が存在する。皮肉なことに、敗血症の処置はここ数十年の間に改善された抗生物質および新規の方法、例えば炎症反応の阻害物質など、の新しい治療の選択肢とともに発展してきているが、診断および治療モニタリングを改善する変化は少ない［１〜８］。今までのところ、感染または敗血症に罹患する患者の医療上の検出および確定をするためには、実験室血液試験を要する。
【０００３】
感染または敗血症の実験室診断は、未だに１９７０年代またはそれ以前以来利用されてきているものと同様の、基本的な手段に依存している。感染または敗血症の可能性に関する臨床的決定は、典型的には、白血球計数、末梢血での未熟骨髄性細胞の存在（バンドまたは「左方移動」）、「急性期反応物質」に対する実験室試験、例えばＣ反応性タンパク質など、および臨床所見、例えば発熱など、に対してなされる。細胞性診断パラメーターは典型的には問題があり、特に乳幼児［９，１０］および高齢者［１１］で特異性を欠く。さらに、近年の証明されるところによれば、白血球計数は外科手術に際し腹部痛を有する患者における臨床的決定に対し重大な影響をもたらさないかもしれず［１２］、バンド計数はある患者において感染の可能性に対し診断情報をほとんど提供しないかまたは全く提供しないかもしれない［１３，１４］ということを示唆する。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルは、新しい診断テストではないが、特に新生児および高齢者集団において、より客観的な診断アッセイおよび治療モニターとして、ますます提唱されてきている［１５〜１９］。
【０００４】
ＣＲＰ値の長所、例えば解釈の主観性および改善された感度および特異度などは、研究により白血球の計数および未熟値の診断的有用性が乏しいと実証される患者群、例えば新生児、高齢者および免疫不全患者などで最も明白である。しかしながら、敗血症または感染検出にあたってのＣＲＰ値への依存は、合併疾患過程を伴う患者においては問題のあるものである。多数の急性期反応物質の１つであるところ、ＣＲＰは感染においてでだけでなく、組織損傷を伴ういかなる疾患過程においても上昇する［１６，１８，２０，２１］。他のＣＲＰの制限は、ウイルスを細菌感染と区別する特異性を欠如することである。感染過程の病因に関する特異性のこの欠如のため、近年、プロカルシトニン（ＰＣＴ）測定の、より特異的な細菌感染の指標としての診断的有用性を提唱する者もいる［２２〜２４］。
【０００５】
同様に、ここ１０年間、敗血症患者における、ＩＬ−６および腫瘍壊疽因子（ＴＮＦ）値など、サイトカインレベルの実現性のある診断の有用性が熱望視されている。しかし、かかる研究は該して、かかる試験に対する明白な診断的有用性を実証し損ねてきており、加えて、かかる炎症性物質の短い半減期および試料の安定性の問題があると示されてきている。分子的診断もまた、早期の検出または診断に対する新規の手法であると有望視されるが、所要時間、感度またはコストの技術的な限界のために、未だに不十分である［３２，３３］。ＰＣＴ、サイトカイン、ＴＮＦおよび他の分子診断は、現在実験的なものに留まり、今までin vitroの診断に関してＦＤＡを通過したものはない。
【０００６】
敗血症および重度の感染に対する最適な診断は、全身炎症反応に関連する早期の特定的な変化を対照とすべきである。感染または組織損傷に関する急性炎症反応を検出する現在の実験室試験における主な問題の１つは、特異性を欠如することである［１４］。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要：
本発明は、白血球でのＣＤ６４およびＣＤ１６３発現を定量化する方法、および、特に定量的蛍光マイクロビーズ標準の懸濁液、ＣＤ６４およびＣＤ１６３を対象とする蛍光標識抗体および解析ソフトウェアを含むフローサイトメーターでの使用のためのキットに関する。前記ソフトウェアは、フローサイトメーターからのマイクロビーズ懸濁液および蛍光標識抗体に関する情報を得、データを解析し、曲線を平滑化し、新たなパラメーターを計算し、品質管理の手段を提供しおよびアッセイシステムの有効期限を示すために用いられる。
【０００８】
統合されたソフトウェア−蛍光マイクロビーズ標準システムは、モニターし、蛍光強度測定を最適化し、感度を増強させる強力なツールである。ソフトウェア、定量化標準および蛍光ラベル抗体の統合により、アッセイシステムの異なる製造ロット間の白血球でのＣＤ６４およびＣＤ１６３の測定における改善された再現性を実現する。全体の較正および解析を５分未満で完了し、概要の報告がプリンター上に作成される。全ての結果は自動的に蓄積的なファイル履歴に記録され、装置の性能により包括的な文書化をもたらす。
【０００９】
全ての蛍光分子は分解および製造ロット間の結合効率の変動にさらされるため、前記ソフトウェアは特定の多数のマイクロビーズ標準およびモノクローナル抗体の蛍光ラベル混合物に適合する。そのため、マイクロビーズおよび蛍光試薬のそれぞれの分量に対して、関連ソフトウェアプログラムは、分量内のマイクロビーズのそれぞれの群の蛍光強度に関する情報を含む。前記キットが期限日に近づくと、前記ソフトウェアは操作者に警告を発し、さらに使用者に使用中のアッセイロットおよび試料解析の一部分として用いるフローサイトメトリー装置の型を確認するよう問いただす。本発明の新規の特性の１つは、生物学的試料、特定的にはＣＤ６４およびＣＤ１６４発現レベルの異なる白血球を含むヒト血液サンプルの使用を通じて、製品ロット間の標準化をモニターし較正することである。
【００１０】
異なる製造ロット間の白血球ＣＤ６４およびＣＤ１６３発現におけるバイアスまたは相違は、ロット間の回帰分析およびソフトウェア内でマイクロビーズに割り当てられる蛍光価での変化により決定される要素により正規化される。異なる生物学的サンプルにおいてなされるアッセイキットの異なる製造ロットのこれらのモニターするところの比較は、蛍光強度が必要とする範囲内であり、アッセイロットの５％未満の間の不正確レベルを確保する。本発明のマイクロビーズおよびソフトウェアを用いるフローサイトメーターの日々の較正により、試薬、細胞調製技術、操作条件または染色細胞サンプルによる複雑さにかかわらず、蛍光強度を客観的、包括的にモニタリングできるようになる。
【００１１】
いったん較正がなされると、試料細胞に結合する蛍光抗体の実際の量を、外部標準、例えばNational Institute of Standards and Technology（ＮＩＳＴ）製のＳＲＭ８６４０などを使用して、決定してもよい。この測定を、蛍光標識抗体を用いたＣＤ６４分子（受容体）数の計算のために、または絶対的な分子発現に相当する抗原発現価の決定のために使用してもよく、そのため、感染の早期の診断において有用である。
【００１２】
特に、本発明は白血球におけるＣＤ６４およびＣＤ１６３発現を定量化のための自動性能解析およびフローサイトメーターの較正のためのキットを含み、前記キットは蛍光検出機能を有するフローサイトメーターまたは血球計測器、血液試料、プログラム可能なコンピューターおよびディスプレイスクリーンとともに用いられ、前記キットは以下を含む：
【００１３】
（ａ）フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ６４を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（ｂ）フィコエリトリンまたは同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ１６３を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（ｃ）限られた期間の時間にわたり信頼できる蛍光安定性を有する、マイクロビーズの懸濁液；
（ｄ）少なくとも１つまたは２つ以上の蛍光色素であって、前記蛍光色素は有効期限を有し、前記有効期限は前記キットに指定されている；
および、（ｅ）前記コンピューター上で操作をするソフトウェアであって、以下を含む、
【００１４】
１）各々の蛍光剤およびマイクロビーズの蛍光強度に関する情報であって、前記ソフトウェアは前記コンピューターとともに較正の計算および前記マイクロビーズに合わせた蛍光情報を制御する操作をし、および前記マイクロビーズで前記フローサイトメーターを較正する操作者に、前記マイクロビーズの耐用年数に相関する有効期限を前記スクリーン上に表示をする操作をし、ここで前記ソフトウェアは、前記フローサイトメーターを、前記ソフトウェアおよび前記マイクロビーズを用いてもはや較正できなくなり、操作者が、他のマイクロビーズ群の懸濁液およびフローサイトメーターを較正するための前記他の懸濁液を用いる前記コンピューター上での使用に合わせたソフトウェアを使用しなければならなくなる有効期限において、操作者が正確に装置モデルを理解せずアッセイキットで正さない場合、前記コンピューター上での操作を止める、前記情報；
【００１５】
２）蛍光物質を使用した血液試料に関するデータを得る能力であって、前角光散乱（“ＦＳ”）および側角または広角光散乱（“ＳＳ”）を用い、そのようにして自動的に特定の細胞部分群をゲートするかまたは同定し、データを平滑化し、それぞれのマイクロビーズおよび細胞特異群に対応する蛍光強度のピークを配置し、直線回帰プロットを作成しフローサイトメーターの蛍光閾値強度を決定し、およびヒストグラムまたは図形表示を作成する前記能力；３）反復集団発見アルゴリズムを用いて、特定の細胞集団を発見する能力；４）自動データ標準化を実施する能力；および５）ＣＤ６４およびＣＤ１６３値を計算する能力。
【００１６】
そのため、本発明のＣＤ６４アッセイは、重篤な感染での全ての年齢の個々人の診断、治療的モニタリングおよび管理において顕著な進歩を示す。他の同等に顕著なＣＤ６４アッセイの社会的な利益は、ヒト敗血症および感染のより感度がよく特異的なアッセイを提供することにより、大きくなりつつある世界規模の健康面の関心事である、細菌の抗生物質耐性の拡大の減少という第２の効果もまたあるということである。
【００１７】
本発明の他のおよびさらなる特性および長所は、開示の目的のための本教示のさまざまな実施の以下の記載から明らかとなるであろう。
【００１８】
図表の簡単な説明
図１は、培養下での患者ＰＭＮ  ＣＤ６４発現の図表の表示であり、健常な対照群（丸印）の正常な低値と比較して、感染（ダイヤモンド印）では集団の９７．５％よりも多くで上昇すると証明される；ＰＭＮ  ＣＤ６４値は好中球白血球計数で較正しておらず、値は感染する患者では増加するが、正常好中球計数である。
【００１９】
図２は、ＰＭＮ  ＣＤ６４値単位から導き出されるビーズ較正を用いて定量化された、正常（上のパネル）および上昇（下のパネル）好中球ＣＤ６４でのヒト血液のフローサイトメーター解析を示す；リンパ球、単球ならびに好中球の他の血液白血球集団（図中ゲートする領域で示す）を、アルゴリズムおよびサンプルの抗ＣＤ６４ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１６３ＰＥ染色を発見する反復集団を用いたソフトウェアデータ解析を通じて同定する。
【００２０】
図３は、定義された内部細胞コントロールが「通過」しないサンプルのソフトウェア解析を実証するか、または、典型的には不適切な装置の設定または間違った剤の添加によるＣＤ６４発現欠損リンパ球（上のパネル）および、通常は血液サンプルに加える不十分な抗ＣＤ６４剤の結果である明白なＣＤ６４発現を欠損する単球（下のパネル）による予測された結果を実証する。自動化フラグまたはポップアップボックスにより、使用者にアッセイの技術的性能に関する問題を警告する。
【００２１】
図４は、Trillium  ＰＭＮ  ＣＤ６４値の、ＭＥＳＦを用いたＰＭＮ  ＣＤ６４発現の測定のビーズ測定方法に対する優れた関連性が、２つの別の臨床的研究で所見されることを示す。
【００２２】
図５は、ＰＭＮ  ＣＤ６４のレベルが、病院の救急治療室において所見される患者の臨床インプレッションと関連することを示し（左下）、全身炎症反応に対するスクリーニングにおけるＣＤ６４アッセイの役割を示唆し、患者を適切な医療管理の設定および治療へとトリアージする；好中球スコア（左下で定義する）および好中球計数またはＣＲＰレベル間の同程度の関連性は、同じ研究では観察されなかった（左上および右）。
【００２３】
図６は、ロット間関連が高いが、マクロビーズ蛍光および抗体蛍光色素結合効率における相違のために、ＰＭＮ  ＣＤ６４値において相違が存在することを示す（左上のパネル）。しかしながら、複数の生物学的血液サンプルにおけるロット間比較に基づきマイクロビーズ蛍光価を割り当てるＬｅｕｋｏ６４ソフトウェアを用いる本発明は、良好なロット間関連ならびに低度のロット間不正確を実現する（右上のパネル）。本発明はまた、前記ソフトウェアでの単球ＣＤ１６３価に対するロット間不正確の同様の改善も実現する（下のパネル群）。
【００２４】
発明の詳細な説明：
本発明の発明者たちおよび他の者たちは、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現が活動性急性炎症反応の特異的な診断的指標を示すということを報告した［３４~４３］。好中球類（ＰＭＮ）および他の白血球類、たとえばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤｌ６、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌなどでの抗原性の変化に関連する多くの他の活性化とは異なり、好中球ＣＤ６４は健康個人におけるごくわずかな発現を有し、血液サンプル操作に対する感度に根拠を示さない［３５，３７］。多くの他の骨髄性抗原、例えばＣＤ１６またはＣＤ１１ｂなどと対照的に、健康な個人および上方調節されたＣＤ６４発現の個人両方におけるＰＭＮ  ＣＤ６４発現は、走化性の要素、ＰＭＡまたはin vitroでの細菌への暴露により変化しない［３５，３７，３８，４４，４５］。
【００２５】
加えて、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現は抗凝固血液サンプルにおいて、４８時間以内は安定である［３５，４５］。加えて、Trilliumでの先の研究により、他のＰＭＮおよび単球抗原、例えばＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３２およびＣＤ６２Ｌなどと対照的に、健康妊婦でない期間のＣＤ６４が正常レベルであることを示しており、妊娠期間中の女性において顕著な変化を示すということを報告している［４６，４７］。このようにＰＭＮ  ＣＤ６４が診断試験として実践的であることを示し、外来患者および入院患者両方に対するいかなる実験室設定においても実施が可能となる。炎症関連サイトカイン、例えばＧ−ＣＳＦおよびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）などによるＰＭＮ  ＣＤ６４の上方調節は、細胞表面発現に対しては４〜６時間およびノーザンブロット解析による検出可能なｍＲＮＡ増加に対しては１〜３時間の短いタイムスケールで発生する［３５，４０，４８〜５０］。
【００２６】
ＰＭＮ  ＣＤ６４のこの上方調節は、直接増強した殺菌性［４０］および抗真菌性［４１］活性と関連があるように見える。ＣＤ６４の正常好中球発現が細胞あたり１０００部位より少なく、検知可能な上方調節を急性組織損傷、感染の播種、組換えインターフェロンγまたはＧ−ＣＳＦの投与後４〜６時間以内に発見できるならば、早期の診断が可能である。つまり、ＰＭＮ  ＣＤ６４の定量化により、白血球計数、ミエロイド未熟度評価、および急性期反応物質と比較した改善された診断としての理想的な対象であると、表１に羅列した理由および図１におけるデータにより示される。要するに、定量化ＰＭＮ  ＣＤ６４測定方法により、全身急性炎症反応の臨床的に有用である診断的な細胞を基とするパラメーターの実現性を、まず提供する。
【００２７】
表１．ＰＭＮ  ＣＤ６４アッセイの臨床的有用性に対する論理的根拠
・ＰＭＮ  ＣＤ６４発現は健全な状態でごくわずかであり、炎症関連サイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ）の影響下で増加する。
・ＰＭＮ  ＣＤ６４発現が増加する結果、増強した抗体媒介の機能的反応（ファゴサイトーシス、酸化的破壊、細菌性活性）がＰＭＮで起こり−病態生理学的な明白な変化が起こる。
・定常的に収集し操作した抗凝固血液サンプルに関し、室温で３０時間および冷蔵で４８時間の間、測定的に安全である。
・１時間以内に実施されるアッセイであり、少ない分量しか必要とせず、一括処理解析が可能である。
・敗血症、感染または全身急性炎症と高度に関連する、ＰＭＮ  ＣＤ６４の増加。
・全身性炎症反応のＰＭＮ  ＣＤ６４バロメーターのレベル−抗細菌用途での治療的モニターの役割に対する可能性。
・絶対的な好中球計数、バンド計数、ＣＢＣ装置減少、沈殿率、Ｃ反応性タンパク質に対する代替をなさない、ＣＤ６４上方調節。
・ＣＤ６４上方調節が可能な、全ての年齢および免疫抑制状態の患者
・高い特異性の、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現が以下において上昇しない：
・骨髄性細胞（ＣＭＬ、ＭＰＤ、ＭＤＳ）の悪性度
・任意の薬物両方（サイトカイン以外）
・局所組織損傷を伴う臨床状態（心筋虚血、単純な外科手術および運動での損傷）
・妊娠
【００２８】
フローサイトメーター定量化技術は、骨髄性細胞におけるＣＤ６４発現を実現する研究の大多数で採用される手順であった。この装置は、臨床試験の高度に複雑な形態と考えられるが、米国および多くの先進工業国において大学医療センター、大規模な三次医療地域病院および参照診断試験所で現在利用可能である。臨床的適用に間して最も優れた手順は、本発明の発明者たちにより開発されてきており、抗ＣＤ６４に直接結合して用いる全血溶解技術および標準化蛍光ビーズを立証する［３５，３７，４０，５２，５３］。現行の手順は５０μｌ以下の全血が必要であり、このため全ての年齢の患者の試験に利用可能である。前記アッセイの正確さは、５％未満の変化率しか有さずして再現可能であると立証され［３５］、そのため正確さにおいて他の臨床的実験室アッセイと非常に競合する（図２，３）。
【００２９】
臨床的診断試験に対するのと等しく実践的に重要であるところ、定量化ＰＭＮ  ＣＤ６４の結果は、室温で少なくとも３０時間および冷蔵温度で保った抗凝固血液では７２時間まで安定である。その結果を、ＣＤ６４モノクローナル抗体およびアイソタイプ対照抗体の間の相違に由来する、平均等価溶解蛍光単位(mean equivalent soluble fluorescence units(MESF))により定量化できる。日々の結果およびアッセイ間の結果を、Quantum 26 FITCビーズ(かつてのFlow Cytometry standards, San Juan, PR, now Bang Labs, Fishers, IN)の使用およびLeuk64ソフトウェア(Verity Software House, Topsham, Maine)でのコンピューターデータ解析により較正する。代替的に、正確な蛍光色素体タンパク質（F／P）率の決定により、ＭＥＳＦ単位を、細胞あたりの実際の平均抗体結合または抗原（モノクローナル試薬が単量体の場合）部位に変換できる。前記方法で問題なのは、定量化のためのビーズを用いるＣＤ６４に対するフローメーターアッセイは感度が良好で相対的に正確であるのだが、ＰＭＮ  ＣＤ６４臨床アッセイに必要な費用は相対的に高く（試験あたり＞５０＄）、技術的な時間および複雑さはビーズおよび抗体のロット間の測定の不正確に左右される。
【００３０】
本発明はＰＭＮ  ＣＤ６４発現の定量化の新規の方法であり、一見、以前のフローサイトメータービーズアッセイと同等ではあるが、アッセイに対して低コストであり、ロット間の不正確さは著しく低下する。ＣＤ６４の定量化の新規の方法、つまりＰＭＮ６４値は、リンパ球、つまりＣＤ６４発現を欠く白血球細胞集団、またはマイクロビーズ懸濁液に対する、好中球への抗ＣＤ６４抗体結合の率に基づく。今までの進展により、ＰＭＮ  ＣＤ６４値がビーズ較正を用いるより複雑なＣＤ６４定量化と実質的に同等であることが示唆される（図４）。
【００３１】
今までのＰＭＮ  ＣＤ６４測定の研究により、全身性感染の検出に対し９８％より大きい、高度の特異性が示唆される［３５，３８，４１，４２，５４］。感染に関連する急性炎症反応を同定する感度に関し、興味深いことに、好中球、沈殿率および／またはバンドの存在には弱い関連しかなく［３５，３７］、付加的な診断情報が標準的実験室試験手段と比較してＣＤ６４測定により活用されるということを示唆する。上昇した好中球計数に対する複数の臨床的上昇が存在するならば、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現に対する可能性により感染の増加した診断的感度および特異度を提供し、時間に関して臨床的設定で実施できる能力を伴うものでもあり、臨床的有用性を見い出すであろう。
【００３２】
臨床的血液サンプルは、増加した好中球計数またはバンド計数と平行して、増加したＰＭＮ  ＣＤ６４発現に対する中等度の傾向に対して抑制を弱く示すが［３５］、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現および白血球の一覧が調和する場合に、臨床的サンプルを一貫して同定する。上昇した絶対的好中球計数を伴う臨床的サンプルは、通常のＣＤ６４発現を呈するが、３つの臨床的状況で共通して見られる。かかる状況は糖質コルチコイドまたはステロイド療法、初期の術後期間、および慢性骨髄増殖性障害であるが、そこにおいて治療するところの内科医は上昇するＰＭＮ計数を予期するようになってきており、さらなる治療行為または感染への危惧に対する必要性がなくなる。１００症例を越える、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患および骨髄異形成症候群の今までの観察により、成熟骨髄性細胞においてＣＤ６４発現が増加しないことが示されてきている。ただし、感染または他の確認できるまたは急性炎症過程の確定を報告された患者を除く［４５，５５，５６］。
【００３３】
そのため、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現のもう１つの付加的な可能性のある臨床的適用は、また、好中球増加をもたらす血液学的悪性腫瘍から急性炎症反応を区別するために用いることができるであろう。結果とする状況は、増加したＰＭＮ  ＣＤ６４が正常または低下した好中球計数と平行して観察されるところであるが、患者が骨髄抑制性薬物、例えば癌の化学療法など、を受ける臨床的状において最も共通して観察され、未だに感染の臨床的徴候または実験室的確証を有する。特異的な臨床条件における定量化ＰＭＮ  ＣＤ６４測定の診断的有用性を立証し、in vitro診断試験としてＦＤＡの認可を得るためには、さらなる研究を必要とする。
【００３４】
しかしながら先行文献は、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現のレベルが、臨床的な感染可能性［３５，３７〜３９，４１〜４３］ならびに感染の型（グラム陽性菌と比較して高いＰＭＮ  ＣＤ６４発現を含む、グラム陰性菌）［４２］と関連することを示唆する。加えて、図５で示すように、ＰＭＮ  ＣＤ６４発現の規模は、全身性感染と比較して一見低く局在化する［３７，４２］。要するに、本発明はＰＭＮ  ＣＤ６４診断試験に関する；１）感染を示唆する臨床徴候を有する患者に対するトリアージの役割としての機能；２）全身性炎症反応の定量化評価を提供する；３）上昇した白血球計数に対する炎症関連および白血病関連の要因の間の区別をする；４）敗血症または感染患者における治療的モニターとしての役割をする。
【００３５】
本発明のアッセイで用いる構成要素：
以下は、多形核白血球でのＣＤ６４発現の定量化による、炎症に対するアッセイおよび組織損傷の検出で用いられる要素および試薬のリストである。
（Ａ）フルオレセインイソチアシアネート（ＦＩＴＣ）または同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ６４を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（Ｂ）フィコエリトリンまたは同様の蛍光色素に結合した、ＣＤ１６３を対象とする、少なくとも１つまたは２つ以上のモノクローナル抗体；
（Ｃ）ポリスチレンマイクロビーズの、少なくとも１つまたは２つ以上の蛍光色素との懸濁液であって、蛍光色素の１つはＣＤ６４モノクローナル抗体に結合したものと同一であって、抗体の蛍光に影響を及ぼす同じ要素に対して環境的に感度がよく、および例えばNIST SRM 8640などの外部標準に対して追跡可能である。
（Ｄ）マイクロビーズに対する蛍光価を割り当てられるようにし、ならびにＣＤ６４およびＣＤ１６３の発現、およびユーザーの相互影響に対し独立してゲートする細胞集団の測定の定量化を較正できるようにする、Ｌｅｕｋｏ６４ソフトウェア。
【００３６】
Ｌｅｕｋｏ６４ソフトウェアの説明：
ＰＭＮ  ＣＤ６４に対する現在のアッセイは、フローサイトメーターのデータを解析できるサードパーティーのソフトウェアを用いて実施できるが、かかる方法はデータ解析において、典型的には技量の幅を有するところの、末端ユーザーに依存するある程度の主観性が残存する。そのため、かかるアッセイ結果において、間違いや主観性に対する可能性が存在する。それゆえ、データ解析におけるユーザーの主観性を最小化し、アッセイを能率化する好ましい方法は、ＣＤ６４アッセイでのフローサイトメーターデータに対するソフトウェアを含有する。Ｌｅｕｋo６４  ＣＤ６４アッセイキットは、アッセイ試薬の期限外と平行して、キットの期限外を示すであろうソフトウェアを含む。かかるソフトウェアは、細胞集団（リンパ球、単球および好中球）を発見し、自動データ標準化およびＰＭＮ  ＣＤ６４価の計算を実施する能力を有する。
【００３７】
加えて、かかるプログラムは、品質管理の機能として、いくつかの特定の解析を実施でき、例えば、単球集団が予測したＣＤ６４発現を有するものであると蛍光抗体試薬を同定することにより評価し、そうすることによりそれぞれの試料に対する内部陽性対照としての役割を果たし、およびリンパ球集団が有意なＣＤ６４発現を有さないと評価し、それによりそれぞれの試料に対する内部陰性対照としての役割を果たす。最も重要なことには、かかるプログラムは多様な市販の臨床的フローサイトメーター装置からの急速なデータ解析を可能にし、品質管理に関する「フラグ」を操作者に提供し、およびデータ解析の標準化を改善しアッセイの不正確さをさらに最小化する。
【００３８】
本発明の好ましい態様は、ソフトウェアの統合およびＣＤ６４およびＣＤ１６３値に対するビーズ蛍光値割り当てであり、特異的な蛍光色素に対する蛍光の参照標準へと追跡可能である。生物学的細胞サンプル、例えば血液白血球など、アッセイロット間の回帰相関を用いたビーズのこの値の割り当てにより、低い程度のアッセイロット間の不正確が提供され、そのようにして臨床実務において診断の有用性を改善する。
【００３９】
例示：
ここでの例は本発明のさまざまな態様を記す目的のために提供し、本発明をいかなる方法においても限定を意味するものではない。ここで述べる全ての文書を、その全体で引用文献として組み込む。
対象を実施し、記載するところの結果および長所ならびにそこに具備されるものを得るように本発明が構成されていることを、当業者は容易に理解するであろう。本発明の精神または範囲から出発せず、さまざまな派生および変化を本発明の実践において為せるということは、当業者にとっては明らかであろう。請求の範囲で定義する発明の精神内に含まれる当業者は、そこでの変化および用途に到達するであろう。
【００４０】
例１：白血球ＣＤ６４アッセイ：
ＰＭＮ  ＣＤ６４の血液サンプルのフローサイトメーター解析に対する方法を簡単に概要を述べるが、詳細はDavis et al［３４〜３７，４０，５２，５３，５８，５９］により提供される。フローサイトメーターＣＤ６４染色および解析の現行の手順は、以下の通りである：
【００４１】
Trillium診断白血球ＣＤ６４アッセイ染色の手順：
１  １０Ｘ  Trillium Lyse（試薬Ｂ）を、１部分の濃縮試薬Ｂを９部分の濾過蒸留水で混合し、１：１０で希釈する。試験の予想回数に対する十分量を調製する（各々のサンプルに対して１．０ｍＬ必要である）。希釈試薬Ｂの最終ｐＨは、７．４０±０．０２とする；必要ならばＮａＯＨまたはＨＣｌで調整する。希釈または１Ｘ  Trillium Lyseは、室温（２０〜２６℃）で１週間または２〜８℃で３０日間、安定である。
２  希釈溶液は、使用時は２０〜３７℃とする。溶液を冷却すると、結果として溶解が不十分となるかもしれない。
３  ５０μＬのLeuko64試薬Ａを１２×７５ｍｍのポリスチレンチューブに分割する。
４  ＜２５×１０９細胞／Ｌ白血球計数（必要ならば希釈する）の混合抗凝固血液サンプルを試薬Ａ含有チューブへと分割し、静かに混合するかボルテックスし、暗所・室温で１０分間培養する。
５  １．０ｍＬのTrillium Lyse(希釈した試薬Ｂ)を加え、完全にボルテックスする。暗所・室温に１５分間置く。間欠的にボルテックスするか混合すると、溶解が増強する。
６  ５μＬのLeuko64ビーズ（試薬Ｃ）を各々のチューブに加え、装置の設定および以下の解析プロトコールを用いたフローサイトメーターで解析する。調製サンプルは２〜８℃で維持すべきであり、解析まで光から遮断するべきである。解析は染色から２４時間以内に実施すべきである。
【００４２】
ＣＤ６４装置構成ビーズ試料：
フローサイトメーターの設定
１  ５μＬのLeuko64ビーズ（試薬Ｃ）を０．５ｍＬの１×Trillium Lyse（試薬B   濾過蒸留水での１：１０希釈、ｐＨ７．４０±０．０２）を含有するチューブに加える。これを装置のＰＭＴ電圧および分散設定を確立するために用いる。
２  ４つの２パラメーターヒストグラム：
FS(lin)対SS (log)
CD64 FITC対SS (log)
CD163対SS (log)
CD163 PE対CD64 FITC
および、３つの１パラメーターヒストグラム：
FLl-CD64 FITC
FL2-CD163 PE
FL3（６８５ｎＭを検出できる、フィルター設定でのＰＭＴ）
３  全ての補正設定をＯＦＦにする。
４  ビーズ懸濁液を流し、１０２４チャンネル解像度における、１パラメーターヒストグラムで以下の調整をする（ダイアグラムを参照）：
・  ＦＬＩ（ＦＩＴＣ）軸上のピークの中心を、蛍光強度の第２decadeの末端にする（ＭＦＩ＝〜９０）。
・  ＦＬ２（ＰＥ）軸上のピークの中心を、ＭＦＩ＝〜２０にする（蛍光強度の第２decadeの第１チック）。
・  ＦＬ３軸上のピークの中心を、第２decadeのスケールの中心にする（ＭＦＩ＝−３０）。
【００４３】
５  ＦＳ対ＳＳのヒストグラムにおいて、ビーズ群をｌｏｇ側の散乱シグナルの第３deacade、および前方角および低角散乱シグナルのチャンネル８５から１２５に位置させる。
６  血小板および赤血球の破片を除外する閾値を、リンパ球を用いてＳＳ（ｌｏｇ）に設定する。破片および小粒子を除く識別は、リンパ球のちょうど左側に設定すべきである。
７  獲得および蓄積の設定を調節し、５０，０００の非ゲートイベントをできるようにする。１０２４で設定の解像度が一般的に推奨されるが、Beckman Coulter FC-500（登録商標）またはBecton Dickinson FACSCanto（登録商標）サイトメーターを使用する場合は必須である。
８  設定および取得テンプレートを保存する。
【表１】
2008520247.tif 000002
【００４４】
フローサイトメトリーの獲得：
１．フローサイトメーターの日常の装置ＱＣプログラムを実施し、サイトメーターが試料取得のための準備が整っていることを決定する。
２．ＣＤ６４プロトコールを呼び出し、ビーズを含む染色した試料を流す。
３．少なくとも５０，０００イベント取得し、Ｌｅｕｋｏ６４ソフトウェアでの解析のためのリストモードファイルを保存する。
【００４５】
リストモードファイルの解析：
１．結果の計算のために用いるソフトウェアプログラムである、Ｌｅｕｋｏ６４ソフトウェア
２．ビーズミックスリストモードファイルを呼び出し、Ｌｅｕｋｏ６４のマニュアルの指示に従い、Ｌｅｕｋｏ６４プログラムを開始する。
３．第１のリストモードを呼び出し、解析する。リンパ球、単球および顆粒球の白血球集団近辺の粗いゲートが正しく配置されていることを確認する。必要ならば、ゲート領域を適切な細胞集団を囲むように調節できる。
４．試料のリストモードファイルの解析を、ステップバイステップの方法で、または自動化バッチ解析の方法で解析できる。解析結果をデータベースに蓄積でき、結果印刷を提供し結果の文書化および白血球部分群の適切なゲートの再検討を可能にする。
５．リンパ球または単球のフラグまたは警告ダイアログボックスの出現のために解析が終止される場合、使用者はこれらの不都合な所見の可能性のある原因を調査し、再解析および／またはサンプルの再染色を考慮する（必要ならば）。
【００４６】
手順の限定：
１．適切な数のビーズイベント（５００以上）を取得することが必要不可欠である。不適切なビーズ数は、無効なＣＤ９６およびＣＤ１６３値の結果の原因となるかもしれなく、その結果として間違った陽性または陰性結果を引き起こすかもしれない。
２．ある試料は完全に溶解しない。しかしながら、注目は好中球およびビーズの集団であり、それでもなお試料を流すことができる。識別の設定が最適化されない場合、リストモードファイルは統計的に正常であるビーズまたは細胞イベントを不十分にしか有していないかもしれない。
３．アッセイはチューブに加える十分な抗ＣＤ６４試薬を必要とし、これは単球集団の試験により検証され、この集団は常に”陽性”の染色をされるため、内部陽性対象としての役割を果たすことができる。そうでない場合、ソフトウェア解析単球フラグが起動される。
【００４７】
発明の要素
【表２】
2008520247.tif 000003
試薬Ａを試験あたり０．００５ｍＬの容量で用いる。そのため、２５０試験キットには総容量で１．２５ｍＬ、加えて０．２５ｍＬの損失分が必要である。記録容量２．０ｍｌの１つの容器にボトル詰めする。ボトルは平底の褐色ガラス組成とすべきであり、漏れ防止スクリューキャップを有するものとすべきである。
【００４８】
ＩＩ．Ｌｅｕｋｏ６４試薬Ｂ：１０×Ｔｒｉｌｌｉｕｍ  Ｌｙｓｅ溶液
【表３】
2008520247.tif 000004
希釈後、試験あたり１．０ｍＬの容量で、試薬Ｂを用いる（希釈形態は１週間の期限を有する）。そのため、２５０試験キットには総容量で２５ｍＬ、加えて１５ｍＬの損失分が必要である。充満容量５０ｍＬの容器にボトル詰する。ボトルは平底でスクリューキャップを有するプラスチック組成(nalgene)にすることができる。
【００４９】
ＩＩＩ．Ｌｅｕｋｏ６４試薬Ｃ：較正ビーズ（ＮＩＳＴ追跡可能参照材料）独自の組み込みの赤色染料(starfire red)でタグをし、ＦＩＴＣで表面被覆したポリスチレン５．２μｍビーズ (NTRM to NIST SRM 1932)
ＢＳＡ、アゾ化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０を含有する等張緩衝溶液に懸濁する、ｐＨ７．４。最終ビーズ濃度は、ｍＬあたり４〜６×１０６。
【表４】
2008520247.tif 000005
試薬Ｃを試験あたり０．００５ｍＬの容量で用いる。そのため、２５０試験キットには総容量で１．２５ｍＬ、加えて０．２５ｍＬの損失分および装置較正分が必要である。記録容量２．０ｍＬの１つの容器に詰める。ボトルは平底の褐色ガラス組成とすべきであり、漏れ防止スクリューキャップを有するものとすべきである。Trillium Diagnostics, LLCおよびBangs, Inc製OEMによるＱＣのあとに、それぞれのロットに対して試薬Ｃを提供する。
【００５０】
ＩＶ．Ｌｅｕｋｏ６４ソフトウェア
ロット特異的なＬｅｕｋｏ６４ソフトウェアは、標準ＣＤディスクにおけるキット中に提供される。ＣＤは、Trillium Diagnostics, LLCおよびVerity software HouseによるＱＣ評価ののちにパッケージ化され提供される。かかるソフトウェアは較正ビーズに割り当てられるロット特異的な値および引き続き最終ＰＭＮおよび単球ＣＤ６４値を提供する；このようにして、ビーズ製造またはモノクローナル抗体蛍光色素ラベル化における、任意のロット間の変化を正す。ソフトウェア検証手順は、ソフトウェアフォルダー中にある。
【００５１】
ここに開示する全ての出版物および特許出願は、米国特許番号第4,918,004 号および第5,380,663号を含めて、本出願中に引例として全体を組み込み、本発明で用いることができる。
【００５２】
本発明が目的を実行し、そこに備わるものだけでなく、記載した最終物および長所を得るためにうまく適合していることを、当業者は容易に理解するであろう。さまざまな修飾および変化を、本発明の精神および範疇から開始せず、本発明を実践するに際し為すことができるということは、当業者には明らかであろう。そこでの変化および他の用途を当業者は思い付くであろうが、請求の範囲により定義する発明の精神内に含まれるものであり、同等のものである。
【００５３】
引用文献
【表５】
2008520247.tif 000006
【００５４】
【表６】
2008520247.tif 000007
【００５５】
【表７】
2008520247.tif 000008
【００５６】
【表８】
2008520247.tif 000009
【００５７】
【表９】
2008520247.tif 000010
【００５８】
【表１０】
2008520247.tif 000011
【００５９】
【表１１】
2008520247.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】絶対的好中球計数と好中球ＣＤ６４の関連を示すグラフである。
【図２】図２の全体図である。
【図２Ａ】正常好中球ＣＤ６４でのヒト血液のフローサイトメーター解析を示す図である。
【図２Ｂ】上昇好中球ＣＤ６４でのヒト血液のフローサイトメーター解析を示す図である。
【図３】図３の全体図である。
【図３Ａ】ＣＤ６４発現欠損リンパ球の予測された結果を実証する、フローサイトメーター解析を示す図である。
【図３Ｂ】ＣＤ６４発現を欠損する単球の予測された結果を実証する、フローサイトメーター解析を示す図である。
【図４】TrilliumおよびＭＥＳＦを用いた測定の、ＰＭＮ  ＣＤ６４値の関連を示す２つのグラフである。
【００６１】
【図５】図５の全体図である。
【図５Ａ】臨床炎症スコアと絶対ＰＭＮ計数の関連を示すグラフおよび臨床炎症スコアの一覧である。
【図５Ｂ】臨床炎症スコアとＣ反応性タンパク質の関連を示すグラフである。
【図５Ｃ】臨床炎症スコアとＰＭＮ  ＣＤ６４の関連を示すグラフである。
【図６】図６の全体図である。
【図６Ａ】ＰＭＮ  ＣＤ６４値の、ソフトウェアを用いないロット比較のグラフである。
【図６Ｂ】ＰＭＮ  ＣＤ６４値の、ソフトウェアを用いたロット比較のグラフである。
【図６Ｃ】単球ＣＤ１６３値、のソフトウェアを用いないロット比較のグラフである。
【図６Ｄ】単球ＣＤ１６３値、のソフトウェアを用いたロット比較のグラフである。
【図１】
2008520247.tif 000013
【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008520247.tif 000019
【図４】
2008520247.tif 000020
【図５】
2008520247.tif 000021
【図５Ａ】
2008520247.tif 000022
【図５Ｂ】
2008520247.tif 000023
【図５Ｃ】
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【図６】
2008520247.tif 000025
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2008520247.tif 000027
【図６Ｃ】
2008520247.tif 000028
【図６Ｄ】
2008520247.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月5日(2007.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
手順の限定：
１．適切な数のビーズイベント（５００以上）を取得することが必要不可欠である。不適切なビーズ数は、無効なＣＤ６４およびＣＤ１６３値の結果の原因となるかもしれなく、その結果として間違った陽性または陰性結果を引き起こすかもしれない。
２．ある試料は完全に溶解しない。しかしながら、注目は好中球およびビーズの集団であり、それでもなお試料を流すことができる。識別の設定が最適化されない場合、リストモードファイルは統計的に正常であるビーズまたは細胞イベントを不十分にしか有していないかもしれない。
３．アッセイはチューブに加える十分な抗ＣＤ６４試薬を必要とし、これは単球集団の試験により検証され、この集団は常に”陽性”の染色をされるため、内部陽性対象としての役割を果たすことができる。そうでない場合、ソフトウェア解析単球フラグが起動される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ＩＩ．Ｌｅｕｋｏ６４試薬Ｂ：１０×Ｔｒｉｌｌｉｕｍ  Ｌｙｓｅ溶液
【表３】
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希釈後、試験あたり１．０ｍＬの容量で、試薬Ｂを用いる（希釈形態は１週間の期限を有する）。そのため、２５０試験キットには総容量で２５ｍＬ、加えて１５ｍＬの損失分が必要である。充満容量５０ｍＬの容器にボトル詰する。ボトルは平底でスクリューキャップを有するプラスチック組成(nalgene)にすることができる。
【国際調査報告】
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