(57)【要約】  ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）グリコデンドリマーは、セレクチン媒介白血球増強規制炎症反応の多価阻害剤として機能することができる。官能化分枝グリコポリマーに関する化合物および方法を開示する。実施形態において、該化合物は、細胞接着事象および炎症状態を改変することが可能である。特定の実施形態において、硫酸化ラクトース末端基を有する多腕ＰＥＯポリマーは、Ｌ−セレクチンを含む相互作用を特異的に阻害することができる。合成的調製および使用方法も開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマー。
【請求項２】
Ｌは、硫酸化ラクトースである請求項１に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項３】
Ａは、ポリエチレンオキシドを含む請求項１〜２のいずれか一項に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４】
Ｘは、アルキルおよびホスファゼン基からなる群から選択される核である請求項１〜３のいずれか一項に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項５】
Ｘは、アルキルである請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項６】
Ｘは、ネオペンチルである請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項７】
Ｘは、ホスファゼン基である請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項８】
ホスファゼン基は、環状線形ホスファゼンである請求項７に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項９】
環状線形ホスファゼンは、環状三量体である請求項８に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１０】
単一の分枝世代が存在する請求項１〜３のいずれか一項に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１１】
複数の分枝世代が存在する請求項１〜３のいずれか一項に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１２】
２つの分枝世代が存在する請求項１１に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１３】
６つの腕の第１の分枝世代、および第１の世代の各々からの２つの腕の第２の分枝世代が存在し、腕の総数は１２である請求項１２に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１４】
ｎ＝３または４である請求項５に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１５】
ｎ＝１２である請求項７に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１６】
ｎは、約６から約９６である請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１７】
ｎは、約１２から約４８である請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１８】
ｍは、約２から約６００である請求項４に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項１９】
ｎの値は、ｎ＝２、３、４および１２からなる群から選択される請求項１〜３のいずれか一項に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項２０】
Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌは糖類または糖類誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）で表される構造式の分枝グリコポリマー組成物を調製する方法。
【請求項２１】
イミド化ラクトース供与体基を提供するステップと、シュミットグリコシド化結合を実施するステップとを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
先核手法を用いた陰イオン重合を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
先腕手法を用いてホスファゼン核上に第１の世代のＰＥＯ腕を合成することを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
第２の世代のＰＥＯ腕を合成し、第２の世代は、第１の世代の上に直接重合されることをさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
多数のさらなるＰＥＯ腕の世代を合成し、それぞれのさらなる世代は、前の世代の上に直接重合されることをさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
世代の総数は、約３から約８である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
炎症状態を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２８】
細胞接着事象を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２９】
セレクチン媒介相互作用を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
セレクチン媒介相互作用は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
セレクチン媒介相互作用は、Ｌ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
Ｌは、硫酸化ラクトースであるラクトース誘導体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変は、インビボ、インビトロまたはエキソビボで行われる請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記改変は、インビトロで行われる請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記改変は、血流力学的流動条件下にてインビトロで行われる請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３６】
腹部大動脈瘤の治療方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【請求項３７】
式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物で処理された医療用具であって、患者に接触することが可能である表面の少なくとも一部を有する医療用具。
【請求項３８】
ステント、栓塞コイル、人工血管、または患者への露出が可能な他の生体医療用具からなる群から選択される請求項３６に記載の医療用具。
【請求項３９】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物による膜、ゲル、または他のコーティングをさらに含む医療用具、細胞、組織または器官。
【請求項４０】
式：Ｌ−［Ａ２ｍ２］ｎ２−［Ａ１ｍ１］ｎ１−Ｘ（式中、Ｌは、ラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａ１およびＡ２は、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍ１およびｍ２は、単量体単位の数であり、ｎ１およびｎ２は、分枝腕の数であり、ｎ１は、２から約１００であり、ｎ２は、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマー。
【請求項４１】
ｍ１は、約２から約４００であり、ｍ２は、約２から約１００である請求項４０に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４２】
ｍ１は、約１００から約１５０であり、ｍ２は、約１０から約２５である請求項４０に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４３】
Ａ１およびＡ２は、それぞれポリ（エチレンオキシド）であり、ｍ１は、約１００から約１５０であり、ｎ１は、６であり、ｍ２は、約１０から約３０であり、ｎ２は、２であり、Ｌは、ラクトース、硫酸化ラクトースおよび他の誘導体化ラクトースからなる群から選択される請求項４０に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４４】
式：Ｓ−［Ａｍ２］ｎ２−［Ａｍ１］ｎ１−Ｘ（式中、Ｓは、糖類または糖類誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍ１およびｍ２は、単量体単位の数であり、ｎ１およびｎ２は、分枝腕の数であり、ｎ１は、２から約１００であり、ｎ２は、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマー。
【請求項４５】
ｍは、約２０から約５０である請求項１に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４６】
ｍは、約３０から約４５である請求項１に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４７】
ｍは、約２０から約５０であり、ｎは、３または４である請求項１に記載の分枝グリコポリマー。
【請求項４８】
実質的に本明細書に記載され、例示されている発明。
【請求項４９】
実質的に本明細書に記載されている新たな化合物。
【請求項５０】
実質的に本明細書に記載されている化合物の新たな使用。
【請求項５１】
実質的に本明細書に記載されている治療法における新たな使用のための物質または組成物。
【請求項５２】
実質的に本明細書に記載されている化合物を調製するための新たな方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
【０００２】
[0001]本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれている２００５年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／６５１，８９１号の優先権を主張するものである。
［米国連邦政府が後援する研究または開発に関する記載］
【０００３】
[0002]本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＮＩＨ  ＨＬ６０４６４およびＮＩＨ  ＨＬ５７３４５に基づく政府支援によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
［発明の背景］
【０００４】
[0003]細胞接着は、細胞表面接着分子族であるセレクチンを含むことができる炎症過程の重要な局面である。内皮表面上のセレクチン誘発白血球ローリングは、炎症および細胞媒介免疫反応に至る媒介事象における基本的なステップである。特徴として、接着カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）は、セレクチンと、四糖シアリルルイスｘ（Ｎｅｕ５Ａｃα３Ｇａｌβ４（Ｆｕｃα３）ＧｌｃＮＡｃ−、ｓＬｅｘ）の硫酸化誘導体を示すＯ−グリコシル化タンパク質リガンドとの相互作用によって促進される。セレクチン媒介結合事象の競合的阻害剤として小分子、ポリマー、リポソームおよびタンパク質の形態のｓＬｅｘ模倣体を生成することに多大な労力が向けられてきた。しかし、便利な合成経路が存在しないことに加えて、親和性が比較的弱いこと、加水分解しやすいこと、潜在的抗原性、および循環半減期が短いことが、ｓＬｅｘ誘導生体複合体の制限事項であることが確認されている。したがって、細胞接着事象および炎症反応を改変することが可能な代替的な治療的オリゴ糖類似体を開発する目的が存在する。
［発明の概要］
【０００５】
[0004]概して、本明細書に用いられている用語および語句は、当業者に知られている標準的な文書、雑誌参考文献および文脈を参照することによって見いだすことができるそれらの技術分野で認識された意味を有する。
【０００６】
[0005]本明細書に用いられるときは、「分枝グリコポリマー」という用語は、複数の腕、反復単量体単位を含む少なくとも１つの多量体成分、および糖類成分を有する分子を意味する。該分子は、例えば、星形、樹枝状、櫛状または他の構成における接続点として機能する核または骨格成分を有することができる。いくつかの例において、分枝グリコポリマーを過剰分枝と記述することができる。
【０００７】
[0006]本明細書に用いられるときは、「糖類」という用語は、糖分子を意味し、単糖類および多糖類を含むことができる。特定の実施形態において、該用語は、ラクトース等の二糖類を意味することができる。
【０００８】
[0007]本明細書に用いられるときは、「誘導体化」という用語は、１つまたは複数の改変が、最初の分子の化学成分の添加、除去または改変を含むことができる改変分子を意味する。例えば、誘導体化糖類は、硫酸化ラクトースでありうる。
【０００９】
[0008]本明細書に用いられているように、「炎症」、「炎症性疾病」および／または「炎症性疾患」は、炎症によって引き起こされ、炎症に起因し、または炎症に影響される疾病または疾患を意味することができる。炎症性疾病または疾患の例としては、リウマチ関節炎、骨関節炎、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、それらに限定されない）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、乾癬、多発性硬化症、喘息、糖尿病併発症に関連する疾病および疾患、肺、肝臓、腎臓等の器官における線維性器官不全、血管状態、ならびに急性冠動脈症候群等の心臓血管系の他の急性及び慢性の炎症性併発症が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１０】
[0009]本明細書に用いられるときは、「アルキル」という用語は、誘導体化アルキルを含むことができる。アルキル基は、直鎖、分枝および環状アルキル基を含む。アルキル基は、１個から２０個の炭素原子を有するアルキル基を含む。アルキル基は、１個から３個の炭素原子を有する小さいアルキル基を含む。アルキル基は、４〜１０個の炭素原子を有する中程度の長さのアルキル基を含む。アルキル基は、１０個を上回る数、特に１０〜２０個の炭素原子を有する長いアルキル基を含む。環状アルキル基は、１つまたは複数の環を有するアルキル基を含む。環状アルキル基は、３、４、５、６、７、８、９または１０員炭素環を有するアルキル基、特に３、４、５、６または７員環を有するアルキル基を含む。環状アルキル基における炭素環は、アルキル基を担持することもできる。環状アルキル基は、二環式および三環状アルキル基を含むことができる。アルキル基は、置換アルキル基を場合によって含む。置換アルキル基は、場合によって置換されうるアリール基で置換されているアルキル基等を含む。具体的なアルキル基としては、いずれも場合によって置換されているメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロブチル、ｎ−ペンチル、分枝ペンチル、シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、分枝ヘキシルおよびシクロヘキシル基が挙げられる。
【００１１】
[00010]ＰＥＯ：ポリ（エチレンオキシド）；ｓＬｅｘ：シアリルレキシスｘ；ＡＡＡ：腹部大動脈瘤の略語が適用可能である。
［発明の詳細な説明］
【００１２】
[00011]本発明の一定の実施形態の概要として、新たな種類の高分子量のポリ硫酸化ＰＥＯ樹枝状グリコポリマーを先腕および先核手法（ａｒｍ−ｆｉｒｓｔ  ａｎｄ  ｃｏｒｅ−ｆｉｒｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ）の併用によって合成した後に、容易な生体複合手法としてトリクロロアセトイミデートグリコシド化した。これは、インビボの抗炎症活性を有する炭水化物系化合物に対して容易にアクセスできる経路を提供する複雑な分枝ＰＥＯヘパリノイド模倣体の合成および生物学的評価を示す最初の報告である。
【００１３】
[00012]実施形態において、本発明は、炎症性疾病または他の炎症状態に対する療法に関する化合物および方法を提供する。
【００１４】
[00013]一実施形態において、本発明は、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマーを提供する。一実施形態において、Ｌは、硫酸化ラクトースである。一実施形態において、Ａは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含む。
【００１５】
[00014]一実施形態において、Ｘは、アルキルおよびホスファゼン基からなる群から選択されるポリマー核である。他の実施形態において、核Ｘは、当該技術分野で理解されるような他の成分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）でありうる。特定の実施形態において、リンカー基は、核ＸをＡ等のポリマー腕成分と接続するように機能することができる。特定の実施形態において、リンカー基は、腕Ａを末端基Ｌ、または本明細書に記載されている他の末端基と接続するように機能することができる。このリンカーは、リンカーが両方の箇所で使用される場合にＸをＡに接続するリンカーと同じ、または異なりうる。特定の実施形態において、ｎの値は、ｎ＝２、３、４および１２からなる群から選択される。
【００１６】
[00015]一実施形態において、ｍは、約２０から約５０である。一実施形態において、ｍは、約３０から約４５である。一実施形態において、ｍは、約２０から約５０であり、ｎは、３または４である。特定の実施形態において、ｎ＝３およびｍ＝４０である。他の特定の実施形態において、ｎ＝４およびｍ＝３０である。
【００１７】
[00016]一実施形態において、Ｘは、アルキルである。一実施形態において、Ｘは、ネオペンチルである。一実施形態において、ｎ＝３または４である。
【００１８】
[00017]一実施形態において、Ｘは、ホスファゼン基である。一実施形態において、ホスファゼン基は、環状線形（ｃｙｃｌｏｌｉｎｅａｒ）ホスファゼンである。一実施形態において、環状線形ホスファゼンは、環状三量体である。一実施形態において、ｎは、約６から約９６である。一実施形態において、ｎは、約１２から約４８である。好ましい実施形態において、ｎ＝１２である。一実施形態において、ｍは、約２から約６００である。一実施形態において、ｎ＝１２であり、ｍは、約１６０から約１７０である。
【００１９】
[00018]一実施形態において、本発明は、単一分枝世代（ｓｉｎｇｌｅ  ｂｒａｎｃｈ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）が存在する分枝グリコポリマーを提供する。一実施形態において、複数の分枝世代が存在する。一実施形態において、２つの分枝世代が存在する。一実施形態において、６つの腕の第１の分枝世代、および第１の世代の各々からの２つの腕の第２の分枝世代が存在し、腕の総数は、１２である。
【００２０】
[00019]一実施形態において、本発明は、Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌは糖類または糖類誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）で表される構造式の分枝グリコポリマー組成物を調製する方法を提供する。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。一実施形態において、該方法は、イミド化ラクトース供与体基を提供するステップと、シュミットグリコシド化結合を実施するステップとを含む。一実施形態において、該方法は、先核手法を用いた陰イオン重合を含む。一実施形態において、該方法は、先腕手法を用いてホスファゼン核上に第１の世代のＰＥＯ腕を合成することを含む。
【００２１】
[00020]一実施形態において、該方法は、第２の世代のＰＥＯ腕を合成し、第２の世代は、第１の世代の上に直接重合されることを含む。一実施形態において、該方法は、多数のさらなるＰＥＯ腕の世代を合成し、それぞれのさらなる世代は、前の世代の上に直接重合されることを含む。一実施形態において、世代の総数は、約３から約８である。一実施形態において、世代の総数は、２である。
【００２２】
[00021]一実施形態において、本発明は、炎症状態を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。
【００２３】
[00022]一実施形態において、本発明は、細胞接着事象を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。
【００２４】
[00023]一実施形態において、本発明は、セレクチン媒介相互作用を改変する方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。一実施形態において、セレクチン媒介相互作用は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンからなる群から選択されるセレクチンを含む。特定の実施形態において、セレクチン媒介相互作用は、Ｌ−セレクチンを含む。好ましい実施形態において、Ｌは、硫酸化ラクトースであるラクトース誘導体である。
【００２５】
[00024]一実施形態において、炎症状態、細胞接着事象および／またはセレクチン媒介相互作用を改変する方法は、インビボ、インビトロまたはエキソビボで行われうる。特定の実施形態において、前記改変は、インビボで行われる。特定の実施形態において、前記改変は、インビトロで行われる。より特異的な実施形態において、前記インビトロ改変は、血流力学的流動条件下で行われる。
【００２６】
[00025]一実施形態において、本発明は、腹部大動脈瘤の治療方法であって、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
[00026]一実施形態において、本発明は、式Ｌ−［Ａｍ］ｎ−Ｘ（式中、Ｌはラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍは、単量体単位の数であり、ｎは、分枝腕の数であり、ｎは、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）の化合物で処理された医療用具であって、患者に接触することが可能である表面の一部を少なくとも有する医療用具を提供する。一実施形態において、医療用具は、ステント、栓塞コイル、人工血管、または患者への露出が可能な他の生体医療用具からなる群から選択される。
【００２８】
[00027]一実施形態において、本発明は、本発明の化合物による膜、ゲル、または他のコーティングをさらに含む医療用具、細胞、組織または器官を提供する。
【００２９】
[00028]一実施形態において、本発明は、式：Ｌ−［Ａ２ｍ２］ｎ２−［Ａ１ｍ１］ｎ１−Ｘ（式中、Ｌは、ラクトースまたはラクトース誘導体であり、Ａ１およびＡ２は、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍ１およびｍ２は、単量体単位の数であり、ｎ１およびｎ２は、分枝腕の数であり、ｎ１は、２から約１００であり、ｎ２は、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマーを提供する。一実施形態において、ｍ１は、約２から約４００であり、ｍ２は、約２から約１００である。一実施形態において、ｍ１は、約１００から約１５０であり、ｍ２は、約１０から約２５である。ＳＲ−１２（３ｃとも称する）にほぼ相当すると考えられる特定の実施形態において、Ａ１およびＡ２は、ＰＥＯであり、ｍ１は、計算により約１４４であり、ｎ１＝６であり、ｍ２は、計算により約２２であり、ｎ２＝２である。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。
【００３０】
[00029]一実施形態において、本発明は、Ａ１およびＡ２は、それぞれポリ（エチレンオキシド）であり、ｍ１は、約１００から約１５０であり、ｎ１は、６であり、ｍ２は、約１０から約３０であり、ｎ２は、２であり、Ｌは、ラクトース、硫酸化ラクトースおよび他の誘導体化ラクトースからなる群から選択される分枝グリコポリマーを提供する。
【００３１】
[00030]一実施形態において、本発明は、式：Ｓ−［Ａｍ２］ｎ２−［Ａｍ１］ｎ１−Ｘ（式中、Ｓは、糖類または糖類誘導体であり、Ａは、ポリ（アルキレンオキシド）を含むポリマー腕であり、ｍ１およびｍ２は、単量体単位の数であり、ｎ１およびｎ２は、分枝腕の数であり、ｎ１は、２から約１００であり、ｎ２は、２から約１００であり、Ｘは、ポリマー核である）を含む分枝グリコポリマーを提供する。特定の実施形態において、一定の変更は、本明細書に記載されている通りである。
【００３２】
[00031]一実施形態において、本発明は、ＰＥＯ系ポリマーを官能化する方法を提供する。
【００３３】
[00032]特定の実施形態において、１ａ、１ｂ、１ｃ（ＳＲ−３とも称する）、２ａ、２ｂ、２ｃ（ＳＲ−１２とも称する）および３ａ、３ｂ、３ｃ（ＳＲ−１２とも称する）と呼ばれる化合物を提供する。化学構造式については、例えば図１Ｂ、図１Ｃ、図２等を参照されたい。
【００３４】
[00033]実施形態において、本発明は、人体を含む哺乳類の体への物質および器具の露出に関する方法および化合物を提供する。本発明の方法に従って表面被覆される血液接触材料、人工器官および他の移植材料および器具としては、人工血管、塞栓コイル、シャント、ステント、小径（内径が約４から約６ｍｍ）透析チューブ、膜および中空繊維系、膜型人工肺、人工心臓弁、左心室補助具、移植可能な他の生体医療用具、および医療診断用具、ならびに患者への露出／移植のための生体材料、例えば、ブタ心臓弁およびウシ頸動脈人工血管を含む（ただし、それらに限定されない）異種移植組織を挙げることができるが、それらに限定されない。人工心臓、肺、腎臓または肝臓等の血液接触器官の表面被覆は、本発明の範囲内である。
【００３５】
[00034]実施形態において、本発明の化合物は、例えば相溶性を有する溶液および／または賦形剤を使用して、当該技術分野で理解されている製剤処方（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）で調製される。医薬用塩は、当該技術分野で理解されているように調製される。一実施形態において、本発明は、本発明の化合物の医薬として許容可能な塩を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明の化合物の製剤処方を提供する。
【００３６】
[00035]実施形態において、本発明は、化合物を供給する方法であって、化合物を被検体に導入、適用または露出するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、化合物は、静脈内、皮下、骨内、硝子体内、鼻内、経口、眼内、または当該技術分野で知られている他の適切な経路を介して添加される。
【００３７】
[00036]いくつかの実施形態において、本発明は、セレクチンおよびヒト炎症性疾患における治療介入のためのグリコサミノグリカン模倣分子としての硫酸化ポリアニオン性グリコ樹枝状ＰＥＯ生体複合体を構成するための化合物および方法を提供する。
【００３８】
[00037]実施形態において、本発明は、多重および協同的受容体結合特性を示すセレクチン結合拮抗剤である治療用オリゴ糖類似体を提供する。
【００３９】
[00038]実施形態において、本発明の化合物は、プロドラッグ形態を有することができる。本発明の化合物のプロドラッグは、本発明の方法に有用である。インビボで変換されて、本発明の化合物の生物的、医薬的または治療的に活性な形態を与える任意の化合物が、プロドラッグである。プロドラッグの様々な例および形態が当該技術分野で知られている。プロドラッグの例は、特に、Design of Prodrugs、編集：H. Bundgaard、(Elsevier、1985)、Methods in Enzymology、第42巻、 309〜396頁、編集：K. Widderら（Academic Press、 1985）；A Textbook of Drug Design and Development、編集：Krosgaard-Larsen and H.Bundgaard、Chapter5、「Design andApplication of Prodrugs」 H. Bundgaard著、113〜191頁（1991）；H. Bundgaard、Advanced Drug Delivery Reviews、第8巻、1〜38頁 （1992）； H. Bundgaardら、 Journal of Pharmaceutical Sciences、第77巻、285頁 （1988）；およびNogrady（1985）Medicinal Chemistry ABiochemical Approach、Oxford University Press、New York、388〜392頁に見いだされる。
【００４０】
[00039]実施形態において、本発明は、Ｌ−セレクチンの選択的阻害によって白血球浸透を規制する方法を提供する。
【００４１】
[00040]実質的に本明細書に記載され、例示されている発明が提供される。本発明は、特に、実質的に本明細書に記載されている新たな化合物；実質的に本明細書に記載されている化合物の新たな使用；実質的に本明細書に記載されている治療方法における新たな使用に向けた物質または組成物；および／または実質的に本明細書に記載されている、化合物を調製するための新たな方法を提供する。
【００４２】
[00041]いかなる特定の理論に縛られることを望むことなく、本発明に関する基本的原理の考えまたは理解についての議論を本明細書に示すことができる。任意の機構的説明または仮説の究極的な正当性にかかわらず、本発明の実施形態は、有効および有益でありうる。
【実施例】
【００４３】
[00072]以下の非限定的な例によって本発明をさらに深く理解することができる。
【００４４】
［実施例１．過剰分枝ＰＥＯグリコポリマーは、インビボで抗炎症特性を示す。］
[00073]序。適切な巨大分子骨格上に糖類エピトープを同時に呈示させると、グリコシド媒介受容体標的の親和性を増幅する多価表示が生成される。この点において、分枝ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）ポリマーは、それらの確定分子構造、親水性、および多数の表面反応部位の可用性により、インビボのセレクチン結合の阻止のための有用な骨格を提供することができる。さらに、分枝ポリマー構造は、確定循環半減期を有する最適なセレクチン結合拮抗剤の設計を容易にすることができるさらなる要素として、ペンダント糖（ｐｅｎｄａｎｔ  ｓｕｇａｒ）エピトープの接近性、移動性、密度および超分子構造を制御するための機構をも提供する。本明細書において、潜在的なＬ−セレクチン阻害剤として第１および第２世代の樹枝状ＰＥＯグリコポリマー担持硫酸化β−ラクトースを合成するための簡単な手法を報告する。
【００４５】
[00074]ほとんどの現行のグリコ結合手法としては、反応生成分としてアミン、チオール、チオ尿素、酸または活性エステルを担持する脂肪族または芳香族アグリコンリンカーの使用が記載されている。重要なことに、イミド化ラクトース供与体およびシュミットグリコシド化結合プロトコルを用いることによって、グリコポリマー合成の過程において保護基操作を最小限にした。
【００４６】
[00075]「先核」手法を用いた陰イオン重合によって、ヒドロキシ末端基を担持する３腕（Ｍｎ〜５２００ｍｕ）および４腕（Ｍｎ〜５１００ｍｕ）ＰＥＯ星状ポリマー（第１世代）を合成した（Houら、2003、Macromolecules 36:3874-3881；Angotら、2000、Macromolecules 33:5418-5424）。加えて、ホスファゼン核に基づいて樹枝状第２世代ＰＥＯ星状ポリマー（１２腕）を合成した。このポリマーは、ホスファゼン核に対する「先腕」手法によって生成された第１世代の６つのＰＥＯ腕と、本来の６つの腕核（Ｍｎ〜５２ｋＤ）の上に直接重合された第２世代の１２のヒドロキシ末端ＰＥＯ分枝とから構成されていた（Houら、2003、Polymer 44:5067-5074）。オクタ酢酸β−ラクトースをアノマー中心において選択的に臭素化し、続いて活性化させて、図１Ｂに示されているイミダート供与体（Ａ）とした。
【００４７】
[00076]ＢＦ３・ＯＥｔ２をルイス酸活性剤として使用して、トリクロロアセトイミダートグリコシド化手法によりヒドロキシ末端ＰＥＯ星状および樹枝状ポリマーをグリコシル化すると、アセチル保護ラクトース残基が高収率で共有結合した。脱アセチル化（ＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）を行い、その後に過剰量のＳＯ３・トリメチルアミン錯体を使用してラクトース硫酸化を行うためのセンプレン（ｚｅｍｐｌｅｎ）条件は、末端硫酸化オリゴ糖類１ｃ、２ｃおよび３ｃを担持する標的ＰＥＯグリコクラスターを与えた（図２参照）。ＰＥＯポリマーに対するリガンド（ラクトース）充填の効率性、均一性および程度を１Ｈ  ＮＭＲ分光法、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびレーザ光散乱によって得られた質量推定値によって推定した。さらに、ＦＴＩＲおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析は、硫酸化ラクトース単位についてのさらなる証拠を与えた。
【００４８】
[00077]具体的には、３腕（１ａ）誘導体に対する６：２０．９：３のアノマーＨ：Ａｃ：ＣＨ３信号比および４腕グリコクラスター２ａに対する７．９５：２７．９７：８の積分比の相対的強度は、親ＰＥＯ前駆体におけるヒドロキシル基のグリコシル化が完全であることを示すものであった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（１ａ：６８９９ｍｕ、２ａ：７５２４ｍｕ）およびＬＬＳ測定を用いて、分子量の増加をさらに確認し、定量的官能化を確認した。同様に、３．９：１３．７：３のＮＭＲ積分比、ならびにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、１２腕の第２世代の分枝化合物の樹枝状ＰＥＯ骨格に対する高度なラクトース結合（＞９５％）を実証した。続いて脱保護を行い、その後に硫酸化を行うと、高度に荷電した硫酸化グリコデンドロン３ｃ（観察されたＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ：６１．８ｋＤ；予測値：６２ｋＤ以下）が生成された。
【００４９】
[00078]ヘパリンは、硫酸塩依存性相互作用を介するＬ−およびＰ−セレクチンの阻止を媒介することによって抗炎症特性を発揮することができる。硫酸化エステルは、ラクトース核上で適切に配向されるとセレクチン結合を促進できることがインビトロ観察で報告された。例えば、フコースおよびシアル酸残基を欠いた硫酸化ラクトース誘導体（６，６’−ジスルホラクトース）は、ＧｌｙＣＡＭ−１に結合するＬ−セレクチンのインビトロ阻害剤としてｓＬｅｘより優れていた。参考文献８（ａ、ｂ、ｃ）を参照されたい。
【００５０】
[00079]オリゴ糖決定基の多価呈示を通じてセレクチングリコリガンド結合を大いに増幅できるという理論に基づいて、推定セレクチン依存性阻止を介して、インビボで炎症性反応を制限する硫酸化分枝星状および樹枝状グリコポリマーの能力を探求した。炎症状態、腹膜炎の状況で我々の化合物を使用してこの手法を試験した。
【００５１】
[00080]腹膜腔へのチオグリコレート注入により、マウスモデルに急性炎症を誘発した。効力は、価数に依存し、１ｃ／２ｃは活性をほとんど示さなかったが、３ｃ（０．５ｍｇ／マウスＩＶ）は、好中球およびマクロファージの増強をそれぞれ８６％および６０％も劇的に減少させた（図４、ρ＜０．０５）。ヘパリンは、炎症性細胞の増強を同様の程度まで抑制したが、同時発生的な抗凝血効果が、ヘパリンの臨床的利用可能性を実質的に制限しているものと考える。対照的に、３ｃは、実質的な抗トロンビン活性を示さない（データは示されていない）。
【００５２】
（方法）[00081]腹膜炎症のチオグリコレート誘発マウスモデル。マウス（Ｃ５７ＢＬ、雄、生後６〜８週間）に２ｍＬの３％チオグリコレートブロスを腹腔内注入した。５分後に、動物は、ヘパリン（Ｈ）または類似体（３ｃ）（０．５ｍｇ／マウス（０．２ｍｌの食塩水による））を含む、および含まない０．２ｍＬの無菌のピロゲン（ｐｙｒｏｇｅｎ）フリー食塩水（Ｓ）の静脈内注射を受けた。３時間後にマウスは死亡し、３ｍＭのＥＤＴＡを含む８ｍＬの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した潅注により腹膜細胞を採取した。腹膜細胞を計数し、２．５％ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈したＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＧｒ−１ｍＡｂにより細胞を４℃で３０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後に、Wangら（2002）が記載しているようにＦＡＣＳｃａｎ分析を行い、それを用いて、好中球およびマクロファージを分類し、計数し、その百分率を分析し、それを、それぞれ式：Ｎ／Ｍ＝Ｎ／Ｍの全細胞数Ｘ％（Ｎ：好中球；Ｍ：マクロファージ）を用いて細胞数に変換した。高レベルのＧｒ−１抗原（Ｎ）およびＭａｃ−１（Ｍ）を示す細胞をゲーティング（ｇａｔｅｄ）した（ＦＡＣＳ）（さらなる参考文献：Lagasse；E., Weissman；l. J. Immunological Meth. 1996、197、139〜150参照）。群間の統計的な差を、ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェアを用いたＡＮＯＶＡ法によって解析した。
【００５３】
［実施例２．細胞接着の阻害における機能的活性の実証］
[00082]Ｕ９３７細胞の固定化セレクチンへの接着を阻害する３ｃの能力を調べて、観察されたインビボ効果が、推定されたセレクチン阻止によって媒介されるかどうかを判断した。３ｃは、Ｕ９３７細胞のＬ−セレクチンへの接着を用量依存的に選択的に阻止したが（ＩＣ５０＝２．４ｎＭ）、抗Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン活性を示さなかった。図５を参照されたい。したがって、３ｃは、これまで報告された最も強力なＬ−セレクチン阻害剤の１つである（参考文献２ａ、８−１０参照）。
【００５４】
[00083]この実質的な生物活性に対する部分的な説明として、生物活性の向上は、線状骨格と比較した場合における樹枝状骨格によるリガンド呈示の成果であるといえる。有意な抗Ｌ−セレクチン活性にかかわらず、ヘパリンのインビボの抗炎症活性は、Ｌ−およびＰ−セレクチン双方が媒介する炎症性細胞接着を阻害する能力に大きく依存すること（Wangら、2002）が最近報告されているため、観察されたインビボ活性は驚くべきものであった。実際、Ｌ−セレクチンの選択的阻害剤として専ら作用する化合物は、インビボの白血球浸透をそれほど完全に阻止するとは考えられない。したがって、３ｃは、ヘパリンのように、内皮へのケモカイン結合を阻止し、それが、白血球溢出をさらに制限することになる。
【００５５】
（方法）[00084]固定化Ｅ−、Ｌ−またはＰ−セレクチンへのＵ９３７細胞結合。９６ウェルプレートの各ウェルに、５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）に含めた８μｇ／ｍＬのタンパク質Ａを４℃で一晩被覆することによって、Ｕ９３７細胞の固定化Ｐ−、Ｌ−またはＥ−セレクチンへの接着を競合的に阻害する試験化合物の能力を調べた。ＰＢＳに含めた１％ＢＳＡでプレートを遮断した後、Ｐ−セレクチン（０．０５μｇ／ウェル）、Ｌ−セレクチン（４μｇ／ウェル）またはＥ−セレクチン（１μｇ／ウェル）キメラを添加した。１時間後、ウェルを遮断溶液で洗浄した。空気中に５％のＣＯ２を含み、相対湿度が１００％の雰囲気中にて、（１０％の胎児性ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する）ＲＰＭＩ−１６４０培地でＵ９３７細胞を増殖させた。２．５％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、細胞を１０μＭのカルセインＡＭにより３７℃で３０分間蛍光標識した。細胞を低速遠心分離で回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、ＦＢＳを含まない培地に２×１０６個／ｍＬの濃度で再懸濁させた。ヘパリンおよび試験化合物または１０ｍＭのナトリウムＥＤＴＡ（負の対照）を５０μＬ／ウェルで添加し、次いで蛍光標識されたＵ９３７細胞懸濁物（５０μＬ／ウェル）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄することによって非接着細胞を除去し、ｐＨ９．５の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌに含めた２％トリトンＸ−１００による後の細胞の４８５ｎｍにおける蛍光強度を測定することによって、接着細胞の数を定量した。比較を目的として、生データを相対蛍光強度（ＲＦＩ）に変換した。
【００５６】
［実施例３．合成手順および分析］
（実験）[00085]一般的方法：すべての薬品は、試薬グレードであり、特に指定のない限り調達されたものをそのまま使用した。溶媒を使用前に乾燥し、蒸留した。モレキュラシーブを真空中にて３５０℃で３時間にわたって活性化させた。ジクロロメタンをＣａＨ２から蒸留し、４Åモレキュラシーブ上で保存した。いずれの反応もアルゴン雰囲気下でオーブン乾燥ガラス器具を用いて実施し、２５０μｍのＡｌで予め被覆されたシリカゲルプレート上の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって観察した。ＵＶ光（２５４ｎｍ）下での検査、および１０％の硫酸水溶液による炭化によって検出を行った。適切な溶媒を用いてシリカゲル（２００〜４２５メッシュ）フラッシュクロマトグラフィーを実施した。溶離剤として水を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。４５℃未満の減圧下で抽出物を濃縮した（水浴）。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを３００ＭＨｚ、４００ＭＨｚまたは６００ＭＨｚのＮＭＲ分光計で記録した。ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、Ｄ２ＯおよびＤＭＳＯに記録された、１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについては、化学シフト（δ，デルタ）を溶媒ピークに対して相対的にｐｐｍで示す。結合定数（Ｊ）をヘルツ（Ｈｚ）で報告する。２，５−ジヒドロキシ安息香酸を基質として使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析データを取った。シナピン酸、および疾病管理センター（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）から入手した「ＣＤＣオリゴ」基質を使用して、表面増強レーザ脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を硫酸化１２星状腕樹枝状３ｃに対して実施した。ＢＳＡをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ実験のための外部標準として使用した。２５μＬの試料溶液をラムリ緩衝液（９５μＬのラムリ緩衝液＋９５μＬのメルカプトエタノール）の２５μＬ原液で希釈することによって、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析用の試料調整を実施した。全量の５０μＬをゲルに充填し、電気泳動試料を１０×トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液に仕込んだ。
【００５７】
[00086]ポリ（エチレンオキシド）グリコポリマー（１ａ、２ａ、３ａ）の合成のための一般手順
【００５８】
[00087]無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した３、４、１２末端腕を含むＯＨ末端ポリ（エチレンオキシド）樹枝状ポリマーの氷冷溶液にアセチル化ラクトースイミダート（各ＯＨ当たり１．５当量）を添加した。ルイス酸ＢＦ３Ｅｔ２Ｏ（５当量）を反応混合物に添加し、０℃で１．０時間攪拌した後、室温で１６持間攪拌した。反応物を、ジイソプロピルアミンで反応停止させ、濃縮し、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨを溶離剤（０％→１０％）として使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。白色固体としての生成物を得た。すべてのアセチル保護グリコポリマー１ａ、２ａ、３ａは、水に可溶であった。
【００５９】
[00088]１ｂ、２ｂ、３ｂを与える脱アセチル化のための一般手順。アセチル化グリコポリマーを乾燥ＭｅＯＨに溶解させた溶液に対してシリンジを介してＮａＯＭｅ（１．５当量／Ａｃ基）を添加し、反応混合物を室温で５時間攪拌した。ＴＬＣ上の開始化合物の消失によって判断されるように完了すると、反応混合物をＨ＋イオン交換カラムに通し、濾過し、ＭｅＯＨで５回洗浄した。回収したＭｅＯＨ部を蓄積し、濃縮して、オフホワイト色の残渣を与え、それを、水を溶離剤としたゲル濾過カラムを使用して精製し、凍結乾燥した。
【００６０】
[00089]グリコポリマー１ｃ、２ｃ、３ｃの硫酸化のための一般手順。三酸化硫黄−トリメチルアミン錯体を水で広範囲にわたって洗浄して、大量の捕捉Ｈ２ＳＯ４を除去した後に、それぞれエタノールおよびＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄し、濾過し、真空乾燥した。脱保護グリコポリマー（１ｂ、２ｂ、３ｂ）を乾燥ＤＭＦに溶解させた溶液にＳＯ３・ＮＭｅ３錯体をモル過剰（７当量／ヒドロキシル基）で添加し、反応混合物を６０℃で３日間攪拌した。次いで、５当量のＳＯ３・ＮＭｅ３錯体を添加し、６０℃でさらに３日間攪拌を続けた。次いで、反応混合物を濾過し、残渣をＭｅＯＨ／水（５０：５０）で完全に洗浄した。反応溶液を濃縮し、ＭｅＯＨ／水を溶離剤として使用するゲル濾過カラムに通した。生成物３ｂから３ｃを３日間透析し、凍結乾燥し、次いでカラム精製した。適切な分量を蓄積し、凍結乾燥して、非晶質の白色固体としての硫酸化グリコポリマーを与えた。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、レーザ光散乱およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を用いてすべての化合物の特徴を調べた。
【００６１】
[00090]１ａのスペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：５．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ）、５．１４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．０８〜５．０３（ｍ，３Ｈ）、４．９２（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）、４．８５（ｍ，３Ｈ）、４．５２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、４．４４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、４．２〜４．０（ｍ，１２Ｈ）、３．９２〜３．７１（ｍ，６Ｈ）、３．６８〜３．３４（ｍ，ＰＥＯ主鎖）、３．２２（ｓ，６Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ−）、２．０８〜１．９１（７×３ＣＯＣＨ３）、０．８９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【００６２】
[00091]１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：１６４．１（ＣＯＣＨ３）、１６４．０（ＣＯＣＨ３）、１６３．８（ＣＯＣＨ３）、１６３．７（ＣＯＣＨ３）、１６３．４（ＣＯＣＨ３）、１６３．３（ＣＯＣＨ３）、１６２．７（ＣＯＣＨ３）、９４．７（Ｃ−１’）、９４．２（Ｃ−１）、６９．９、６７．５、６６．４、６６．２、６５．３、６４．７、６４．６、６４．２、６４．０、６３．９、６３．８、６２．７、６０．２、５９．５、５５．６、５５．３、５４．４、３４．６、２３．３、１４．５、１４．４、１４．３、１４．２、１４．１、１０．９。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ６８９９．８２９９（期待値  ７０５０）。
【００６３】
[00092]１ｂ（脱保護）のスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：４．３５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．２８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、３．９０〜３．３４（ｍ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ  骨格）、３．２５（ｓ，６Ｈ，−ＣＨ２−Ｏ）、３．１６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、０．８７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：１０３．１、１０２．２、７８．５、７５．５、７４．９、７４．４、７３．６、７２．９、７２．６、７１．９、７１．１、７０．７、６９．７、６９．３、６８．８、６８．７、６１．２、６０．５、６０．２、４０．６、１７．０。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ５９０９．２６４９（期待値  ６１００）。
【００６４】
[00093]１ｃ（硫酸化）のスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：４．９４〜４．９２（ｍ，糖環プロトン）、４．４〜４．０（ｍ，糖環プロトン）、３．９３〜３．４２（ｍ，ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）、３．２６（ｓ，６Ｈ）、３．１〜３．０４（ｍ，糖環プロトン）、０．７８（ｓ，ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：９４．８（Ｃ−１’）、９３．２（Ｃ−１）、７１．１、７０．８、６９．４、６９．０、６８．７、６８．４、６７．６、６７．１、６５．５、６４．１、６３．２、６２．９、６２．４、６２．２、６１．２、６０．８、５９．９、３４．１、１０．５。
【００６５】
[00094]２ａのスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，６００ＭＨｚ）：５．０５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ）、４．９６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．８２（ｍ，４Ｈ）、４．７４（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．３５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．３４（ｄ，４Ｈ，Ｈ−１と部分的に併合）、４．１〜３．９２（ｍ，１６Ｈ）、３．８〜３．７２（ｍ，８Ｈ）、３．７〜３．３８（ｍ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−  骨格）、３．２８（ｓ，８Ｈ，ＣＨ２−Ｏ）、２．０１〜１．８２（７×４  ＣＯＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，６００ＭＨｚ）：１６３．９（ＣＯＣＨ３）、１６３．８（ＣＯＣＨ３）、１６３．６（ＣＯＣＨ３）、１６３．５（ＣＯＣＨ３）、１６３．２（ＣＯＣＨ３）、１６３．１（ＣＯＣＨ３）、１６２．６（ＣＯＣＨ３）、９４．６（Ｃ−１’）、９４．２（Ｃ−１）、６９．８、６６．４、６６．２、６５．２、６４．６、６４．１、６３．９、６３．８、６３．５、６２．６、６０．１、５５．６、５４．４、４７．２、３９．４、２５．１、１６．２、１４．４、１４．３、１４．２、１４．１、１４．０。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ７５２４．１８（期待値  ７５００）。
【００６６】
[00095]２ｂ（脱保護）のスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：４．３４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．２６（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．８９〜３．８７（ｍ，環プロトン）、３．８１〜３．７８（ｄｄ，環プロトン，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、３．７５（ｄ，環プロトン，Ｊ＝３．０Ｈｚ）、３．７〜３．３７（ｍ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−骨格）、３．３２（ｓ，８Ｈ，−ＯＣＨ２）、３．１８〜３．１５（ｍ，環プロトン）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：１０３．１、１０２．３、７８．５、７５．５、７４．９、７４．４、７２．９、７２．６、７１．１、７０．７、６９．７、６８．８、６８．７、６１．２、６０．２、４５．２。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ６３５６．７３３３（期待値  ６３００）
【００６７】
[00096]２ｃ（硫酸化）のスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：４．９６（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、４．９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、４．６４〜４．６２（ｍ，環プロトン）、４．５９〜４．５７（ｍ，環プロトン）、４．３８（ｄｄ，環プロトン，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｊ＝３．０Ｈｚ）、４．３４（ｔ，環プロトン，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｊ＝４．２Ｈｚ）、４．３１（ｄｄ，環プロトン，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｊ＝４．８Ｈｚ）、４．２４（ｄ，環プロトン，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．２１（ｄ，環プロトン，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．１２〜４．０５（ｍ，環プロトン）、３．９７〜３．８５（ｍ，環プロトン）、３．７２〜３．４６（ｍ，−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−  骨格）、３．３６（ｓ，８Ｈ，ＣＨ２Ｏ−）、３．０８（ｍ，糖環プロトン）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）：９４．７、９３．３、７１．２、７０．８、６９．４、６９．１、６８．７、６８．５、６７．２、６５．４、６４．２、６３．８、６３．２、６２．６、６２．３、６０．５、５９．９、４５．８。
【００６８】
[00097]３ａのスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，６００ＭＨｚ）：５．６１〜５．３８（ｍ，環プロトン）、５．２６〜５．２３（ｍ，環プロトン）、５．１１〜４．９９（ｍ，環プロトン）、４．８７〜４．６６（ｍ，環プロトン）、４．４７〜４．３６（ｍ，２４  アノマーＨ）、４．２〜３．９２（ｍ，環プロトン）、３．６６〜３．４４（ｍ，ＰＥＯ  骨格）、３．４２（ｓ，ＰＥＯ  骨格）、２．０７〜１．８７（７×１２  ＣＯＣＨ３）、０．９（ｓ，１８Ｈ，ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，６００ＭＨｚ）：１６３．９、１６３．７、１６３．６、１６３．３、１６３．２、１６３．１、１６２．６、９４．７、９４．４、９４．２、８３．５、７０．１、６９．９、６８．７、６７．４、６６．４、６６．２、６５．２、６０．１、６４．７、６４．６、６４．１、６３．９、６３．８、６３．６、６３．４、６２．７、６２．５、６１．４、６０．２、５５．６、５４．４、３４．２、３２．１、１４．５、１４．４、１４．２、１４．１、１０．８。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ６０２５４（期待値  ５９５００）。
【００６９】
[00098]３ｂ（脱保護）のスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：４．５４〜４．４８（ｍ，環プロトン）、４．３７〜４．２６（ｄ，環プロトン）、４．１６〜３．８８（ｍ，環プロトン）、３．８２〜３．３２（ｍ，ＰＥＯ  骨格）、３．１２（ｓ，ＰＥＯ  骨格）、３．０８〜３．０６（ｍ，環プロトン）、０．８１（ｓ，ＣＨ３）。１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：９６．５、９５．７、７２．１、７１．９、７１．８、７０．６、６８．９、６８．３、６７．９、６７．８、６７．４、６７．１、６６．４、６６．１、６５．１、６４．７、６４．５、６４．１、６３．８、６３．２、６２．５、６２．３、６２．１、６１．３、５４．６、５３．６、３４．１、１０．４。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ５６１３２．２６６（期待近似値  ５６  ｋＤ）。
【００７０】
[00099]３ｃのスペクトルデータ  １Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：４．９６（ｓ，環プロトン）、４．８４（ｄ，環プロトン，Ｊ＝６．０Ｈｚ）、４．５４〜４．５３（ｍ，環プロトン）、４．３６〜４．２８（ｍ，環プロトン）、４．２４〜４．２１（ｍ，環プロトン）、４．１９（ｄ，環プロトン）、４．０６〜３．８３（ｍ，環プロトン）、３．７１〜３．３８（ｍ，ＰＥＯ主鎖）、３．５２（ｓ，ＰＥＯ主鎖）、１．２３〜１．０２（ｍ）、０．８２（ｓ，ＣＨ３）。
【００７１】
[000100]１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ）：９４．６、９３．１、７１．３、７０．７、６９．３、６９．０、６８．７、６８．５、６７．１、６６．９、６５．３、６４．２、６３．７、６２．１、６１．４、６０．３、５９．８、３４．１、１０．４。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ：実測値  ６１８５２．９３８６（期待近似値  ６２．６  ｋＤ）。
【００７２】
［実施例４．インビボ状況の腹部大動脈瘤における機能的活性の実証］
[000101]腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）は、人口の２〜９％に影響を及ぼし、６５歳以上の白人男性において１０番目の死因となっている。エラスチンの破壊、平滑筋細胞の損失、および炎症性細胞の経壁浸透を伴う大動脈媒体における細胞外基質の希薄化によって該疾病を特徴づけることができる。ＭＭＰ、ケモカイン、炎症誘発性媒介物等の一定の分子を上方制御することができる。Ｌ−セレクチン依存性白血球内皮細胞相互作用は、大動脈瘤形成に至る炎症反応の発生において重要な役割を果たしうる。
【００７３】
[000102]その抗炎症活性が、抗Ｌ−セレクチン効果（ＩＣ５０  ２．４ｎＭ）によって少なくとも一部に媒介されるＳＲ−１２と呼ばれる多価グリコデンドリマーを合成した。多価グリコデンドリマーを介するＬ−セレクチンの阻止は、血管壁への白血球導入を抑制することによって腹部大動脈瘤の形成および／または成長を抑制するであろうと仮定している。
【００７４】
[000103]Ｌ−セレクチンのポリエチレンオキシドグリコポリマー拮抗剤で治療することによるマウスにおける実験的腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）の抑制を評価した。１２腕多価ヘパリノイド化合物ＳＲ−１２（図１Ｃ参照）は、マウスにおける実験的ＡＡＡを抑制する。統計的に有意な大動脈直径の減少が、化合物ＳＲ−１２で処理した群に認められた。図６および以下の表を参照されたい。
【００７５】
【表１】
2008530307.tif 000002
【００７６】
（方法）[000104]本実施例では、エラスターゼ注入モデルをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、ｎ＝２０）に使用した。マウスに大動脈エラスターゼ潅流を施して、実験的な大動脈瘤を誘発した（ThompsonおよびBaxter、1999）。マウスは、エラスターゼ注入後の最初の５日間にわたって毎日０．５ｍｇの化合物ＳＲ−１２（３ｃとも称する）または０．２ｍｌの食塩水ＩＶを与えられた。１４日目にマウスは死亡した。エラスターゼ注入前および直後、ならびに１４日目の大動脈直径（ＡＤ）が報告されている。
【００７７】
［さらなる研究］
[000105]ＡＡＡ形成および成長を制限する上でのグリコデンドリマーＳＲ−１２の効果を測定する。大動脈瘤の頻度、大きさおよび成長率をＡＡＡ形成のエラスターゼ注入およびアンギオテンシンＩＩ（ＡｇＩＩ）マウスモデルで測定する。細胞および構造変化の特徴を調べるために免疫組織化学試験を実施し、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９発現をＲＴ−ＰＣＲおよびゲル酵素電気泳動法によって調べる。
【００７８】
[000106]表面結合ヘパラン硫酸に対するケモカイン結合を制限し、ケモカイン特異的細胞活性を抑止するＳＲ−１２の能力を定義づける。ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＣＰ−１およびＳＤＦ−１を結合させ、それらの表面結合ヘパラン硫酸との相互作用を制限するＳＲ−１２の能力を表面プラスモン共鳴結合検定によって測定する。運動速度定数および平衡定数の両方の特徴を調べることができる。また、ケモカイン媒介細胞活性を阻止するＳＲ−１２の能力を調べる。
【００７９】
[000107]ともに経口投与された場合にＳＲ−１２の効果的な生態再分布を促進する担持体化合物であるＮ−［８−（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）の能力を評価する。単独または担体化合物とともに経口投与した後にＳＲ−１２の有効血漿濃度および循環半減期をマウスで測定する。測定した血漿濃度および半減期をグリコポリマーの静脈内投与によって達成された値と比較する。
【００８０】
[参照による組込みおよび変更に関する記載]
[000108]本出願全体を通じてのすべての参考文献、例えば、発行または認可された特許または同等物を含む特許文献、特許出願公報、未公開特許出願、および非特許文献または他の資料は、各参考文献が本願における開示内容と少なくとも部分的に矛盾しない（例えば、部分的に矛盾する参考文献が、該参考文献の部分的に矛盾する部分を除いて参照により組み込まれている）範囲で、個々に参照により組み込まれているように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８１】
[000109]本明細書に対するあらゆる付録は、明細書および／または図面の一部として参照により組み込まれている。
【００８２】
[000110]「含む（comprise、comprises）」、「構成された（comprised）」または「含んでいる（comprising）」という用語が本明細書に用いられている場合は、それらは、言及される指定の特徴、整数、ステップまたは成分の存在を明示するものとして解釈されるべきであり、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または追加を排除するものと解釈されるべきではない。「含んでいる（comprising）」または「含む（comprise(s)）」あるいは「構成された（comprised）」という用語を、文法的に類似した用語、例えば「構成されている／構成される（consisting／consist(s)）」または「〜から実質的に構成されている／〜から実質的に構成される（consisting essentially of／consist(s) essentially of）」に置き換えることによって、必ずしも同一の広がりをもたないさらなる実施形態を記載する本発明の独立した実施形態も包括されているものとする。
【００８３】
[000111]様々な具体的および好ましい実施形態および技術を参照しながら本発明を説明した。しかし、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正を加えることができることを理解すべきである。本明細書に具体的に開示されているもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイス要素、材料、手順および技術を、不必要な実験に頼ることなく、本明細書に広く開示されている本発明の実行に適用できることを当業者なら理解するであろう。本明細書に記載されている組成物、方法、デバイス、デバイス要素、材料、手順および技術の当該技術分野で知られているすべての同等物が、本明細書に包括されているものとする。ある範囲が開示されている場合は、常にすべての小範囲および個々の値が、個別に規定されているように包括されているものとする。本発明は、例または例示を目的として示され、制限することを目的としない、図面に示される、または明細書に例示されるあらゆる実施形態を含む開示の実施形態によって制限されるものではない。本発明の範囲は、請求項によってのみ制限される。
【００８４】
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【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】細胞表面受容体とセレクチン族の分子との潜在的相互作用、および多価分枝グリコ複合体による相互作用の阻止を示す図である。
【図１Ｂ】ラクトースイミダート（Ａ）を使用した末端ヒドロキシルのグリコシド化を示す図である。１２腕の基質は、示されていないが、同様に反応して、類似の１２腕の生成物を生成することが可能である。
【図１Ｃ】１２腕多価ヘパリノイド化合物ＳＲ−１２
【図２】セレクチンリガンドとしての糖類官能化ＰＥＯ星状および「樹枝状」ポリマーを示す図である。
【図３】３ａの１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ）スペクトルの結果を示す図である。挿入図は、本来のヒドロキシル末端ポリマーおよび３ａのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図４】チオグリコレート誘発腹膜炎症における好中球（Ａ）およびマクロファージ（Ｂ）内容（ｎ＝６）の結果を示す図である。１ｃ／２ｃは、実質的なインビボ活性を示さなかった。各棒は、平均値±ＳＤを表す。
【図５】固定化（Ａ）Ｌ−セレクチン、（Ｂ）Ｐ−セレクチンに対するＵ９３７細胞接着の結果を示す図である。ヘパリンも３ｃもＥ−セレクチン（Ｃ）に対する実質的な阻害活性を示さなかった。試験化合物またはヘパリンの不在下で阻害は認められなかった。データは、少なくともｎ＝３（ＳＤ＜１０％）の平均を表す。
【図６】腹部大動脈瘤に関するインビボの結果を示す図である。
【図７】ヒドロキシ末端基を有する３および４星状腕ＰＥＯポリマーの生成のための合成スキームにおける初期のステップを示す図である。
【図８】硫酸化ラクトース単位を有する、官能化末端基を有する３および４星状腕ＰＥＯポリマーの生成のための合成スキームを示す図である。
【図９】１ａの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図１０】１ａの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１１】１ｂの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図１２】１ｂの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１３】１ｃの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図１４】１ｃの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１５】２ａの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図１６】２ａの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１７】２ｂの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図１８】２ｂの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図１９】２ｃの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図２０】２ｃの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図２１】３ａの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図２２】３ａの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図２３】３ｂの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図２４】３ｃの１Ｈ  ＮＭＲである。
【図２５】３ｃの１３Ｃ  ＮＭＲである。
【図２６】非硫酸化ＰＥＯ−グリコデンドロン２ｂおよび硫酸化グリコデンドロン２ｃの代表的なＦＴＩＲスペクトルを示す図である。硫酸化の後に、スルホキシド（Ｓ＝Ｏ）およびＣ−Ｏ−Ｓ伸縮結合に特有の新たなピークがｖ１２４８ｃｍ−１および８１０ｃｍ−１に現れた。３腕グリコ誘導体１ｂ／１ｃの場合も同様のパターンが認められた。
【図２７】硫酸化３腕（１ｂ、１ｃ）および４腕（２ｂ、２ｃ）グリコポリマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（トリス−トリシン１６．５％）を示す図である。Ａ：硫酸化グリコポリマーの染色。トルイジンブルー（トルイジンブルーＯ０．２ｇ＋ＥｔＯＨ５０ｍＬ＋Ｈ２Ｏ４９ｍＬ＋ＡｃＯＨ１ｍＬ）を使用して、ゲルをシェーカ（ｓｈａｋｅｒ）中で３０分間染色した。次いで、脱染（ＥｔＯＨ５０ｍＬ＋Ｈ２Ｏ４９ｍＬ＋ＡｃＯＨ１ｍＬ）を行った。また、分子量マーカを識別するために、ゲルをクーマシーブルーで染色した。Ｂ：ポリエチレンオキシド成分の染色。ゲルを５％ＢａＣｌ２溶液中に５分間温置し、次いで水で洗浄した。次いで、ゲルをＩ２溶液で染色し、水で脱染した。
【図２８】３腕グリコポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＧＰＣプロフィルを示す図である。
【図２９】４腕グリコポリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＧＰＣプロフィルを示す図である。
【図３０】３ａ、３ｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ、および３ｃのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロフィルを示す図である。
【図１Ａ】
2008530307.tif 000003
【図１Ｂ】
2008530307.tif 000004
【図１Ｃ】
2008530307.tif 000005
【図２】
2008530307.tif 000006
【図３】
2008530307.tif 000007
【図４】
2008530307.tif 000008
【図５】
2008530307.tif 000009
【図６】
2008530307.tif 000010
【図７】
2008530307.tif 000011
【図８】
2008530307.tif 000012
【図９】
2008530307.tif 000013
【図１０】
2008530307.tif 000014
【図１１】
2008530307.tif 000015
【図１２】
2008530307.tif 000016
【図１３】
2008530307.tif 000017
【図１４】
2008530307.tif 000018
【図１５】
2008530307.tif 000019
【図１６】
2008530307.tif 000020
【図１７】
2008530307.tif 000021
【図１８】
2008530307.tif 000022
【図１９】
2008530307.tif 000023
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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