(57)【要約】  本発明は、植物における滑膜肉腫転座（ＳＹＴ）ポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することにより、植物の収量を増加させる方法に関する。そのような方法の１つは、植物にＳＹＴ核酸またはその変異体を導入することを含む。また本発明は、導入されたＳＹＴ核酸またはその変異体を有するトランスジェニック植物に関し、該植物は対応する野生型植物と比較して収量が増加する。また本発明は、本発明の方法に有用な構築物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型植物と比較して植物の収量を増加させる方法であって、植物において滑膜肉腫転座（ＳＹＴ）ポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節すること、および任意に、収量が増加した植物を選択することを含み、前記ＳＹＴポリペプチドまたはホモログは、（ｉ）配列番号２に示されるＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン、および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン、および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＳＮＨドメインが図２の黒で示される残基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＮＨドメインが配列番号１に示されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログが、（ｉ）配列番号９０、（ｉｉ）配列番号９１、（ｉｉｉ）ＳＮＨドメインの前にあるＮ末端のＭｅｔ−リッチドメインの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記調節された発現が、好ましくはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする遺伝子の遺伝子座に、遺伝子改変を導入することにより生じる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子改変が、Ｔ−ＤＮＡアクチベーション、ＴＩＬＬＩＮＧ、部位特異的突然変異誘発または定向進化の１つにより生じる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対応する野生型植物と比較して、収量、特に種子の収量を増加させる方法であって、ＳＹＴ核酸またはその変異体を、植物、植物の部分または植物細胞に導入し、発現させることを含む、前記方法。
【請求項８】
前記変異体が、ＳＹＴ核酸の一部またはＳＹＴ核酸とハイブリダイズ可能な配列であり、前記一部またはハイブリダイズ可能な配列が、（ｉ）配列番号２に示されるＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン；および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン；および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドをコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＮＨドメインが、図２の黒で示される残基を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＮＨドメインが、配列番号１で示されるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログが、（ｉ）配列番号９０；（ｉｉ）配列番号９１；（ｉｉｉ）ＳＮＨドメインの前にあるＮ末端のＭｅｔ−リッチドメインの１つまたはそれ以上をさらに含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＹＴ核酸またはその変異体が、植物で過剰発現される、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＹＴ核酸またはその変異体が、植物起源、好ましくは双子葉植物由来、さらに好ましくはアブラナ科由来であり、より好ましくは前記核酸がシロイヌナズナ由来である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異体が、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示されるＳＹＴタンパク質のオルソログまたはパラログをコードする、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＹＴ核酸またはその変異体が、構成的プロモーターと機能的に結合される、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記構成的プロモーターが、植物由来、好ましくは単子葉植物由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記構成的プロモーターが、ＧＯＳ２プロモーターである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記収量の増加が、種子の収量の増加である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記収量の増加が、種子の全収量の増加および／またはＴＫＷの増加である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法により得ることができる植物、植物の部分または植物細胞。
【請求項２１】
（ｉ）ＳＹＴ核酸またはその変異体、
（ｉｉ）（ａ）の核酸配列の発現を駆動できる１つまたはそれ以上の制御配列、および任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列
を含む構築物。
【請求項２２】
前記制御配列が、単子葉植物由来の構成的プロモーターである、請求項２１に記載の構築物。
【請求項２３】
前記構成的プロモーターがＧＯＳ２プロモーターである、請求項２２に記載の構築物。
【請求項２４】
前記ＧＯＳ２プロモーターが、配列番号８９に示されるものである、請求項２３に記載の構築物。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の構築物で形質転換された植物、植物の部分または植物細胞。
【請求項２６】
収量が増加、特に種子の収量が増加する、好ましくは単子葉植物の、形質転換植物の作製方法であって、
（ｉ）植物または植物細胞にＳＹＴ核酸またはその変異体を導入し、発現させること、
（ｉｉ）植物の生長および発達を促進する条件下で植物細胞を培養すること、
を含む前記方法。
【請求項２７】
前記培養工程（ｉｉ）により得られた植物を交雑することにより、種子を含む植物またはその部分の１またはそれ以上の後代を作製することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
植物または植物の部分に導入されたＳＹＴ核酸またはその変異体から生じる、収量が増加、特に種子の収量が増加したトランスジェニック植物またはその部分であって、前記収量が、対応する野生型植物と比較して増加する、前記トランスジェニック植物またはその部分。
【請求項２９】
前記植物が、サトウキビなどの単子葉植物であり、またはイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キビ・アワ、ライムギ、オートムギまたはソルガムなどの穀類である、請求項２０、２５または２８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３０】
請求項２０、２５、２８または２９のいずれか１項に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項３１】
前記収穫可能な部分が種子である、請求項３０に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項３２】
請求項２９に記載の植物、および／または請求項３０または３１に記載の植物の収穫可能な部分に由来する、好ましくは直接由来する、生産物。
【請求項３３】
対応する野生型植物と比較して、収量、特に種子の収量の向上における、ＳＹＴ核酸／遺伝子またはその変異体の使用、あるいはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログの使用、あるいは請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の構築物の使用。
【請求項３４】
前記種子の収量が、種子の全収量の増加およびＴＫＷの増加である、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
分子マーカーとしての、ＳＹＴ核酸／遺伝子またはその変異体の使用、あるいはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に分子生物学の分野に関し、対応する野生型植物と比較して、植物の収量を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、植物において滑膜肉腫転座（ＳＹＴ;synovial sarcoma translocation）ポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することを含む、植物の収量を増加させる方法に関する。また本発明は、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現が調節された植物に関し、該植物は、対応する野生型植物と比較して増加した収量を有する。また本発明は、本発明の方法に有用な構築物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は増加の一途を辿り、農業に利用できる耕作地の供給が次第に減少しているために、農業の効率を上げる方向に研究が向かっている。従来の作物の手法及び園芸改良では、望ましい性質を有する植物を特定するために選抜育種技術を利用する。しかしながら、このような選抜育種技術はいくつか欠点があり、すなわちこれらの技術は、一般的に集中的な労働力を必要とし、また、しばしば、親植物から伝えられる望ましい形質をいつももたらすとは限らない異質の遺伝的要素を含む植物が生じる。分子生物学の進歩により、人間は動物及び植物の生殖質を改変できるようになった。植物の遺伝子工学は、（一般的にはＤＮＡまたはＲＮＡの形の）遺伝物質の単離及び操作と、続いて遺伝物質の植物への導入を必要とする。このような技術は、様々に改良された、経済的、作物学的または園芸学的特徴を有する作物または植物を作製する力を持っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
具体的な経済的利益の特性は収量であり、多くの植物の場合、種子の収量である。収量は、通常、作物から得られる測定可能な生産物の経済上の値と定義される。これは量及び／又は質の点から定義されうる。植物の種子は、ヒトおよび動物の重要な栄養源である。トウモロコシ、イネ、コムギ、アブラナおよびダイズなどの作物は、種子自体の直接的な消費を通じてであろうと、あるいは加工された種子から高度に改質された肉製品の消費を通じてであろうと、いずれにしても、ヒトの全カロリー摂取量の半分以上を占める。また前記作物は、砂糖、油および工業プロセスで使用される多くの種類の代謝産物の源でもある。種子は、発芽後の新しいシュートと根のもととなる胚、発芽の間、及び実生(seedling)の初期の生長の間、胚の成長の栄養源となる胚乳を含む。種子の発達には多くの遺伝子が関与し、根、葉および茎から、生育する種子へ、代謝産物の移動が必要である。胚乳は特に、炭水化物ポリマー、油およびタンパク質の代謝前駆物質を同化し、それらを貯蔵高分子に合成して、子実をいっぱいにする。植物の種子の収量を増加させる能力は、種子の数、種子のバイオマス、種子の発達、種子の充填または他の種子に関連した特性を問わずこれらを通じて、農業において、また医薬、抗体またはワクチンなどの物質の生物工学的生産などにおけるような、多くの非農業的使用においても、多くの適用があるだろう。
【０００４】
また収量は、器官の数および大きさ、植物の構造（例えば枝の数）、種子の生産などの要因にもよるであろう。根の発達、栄養の摂取及びストレス耐性も、収量を決定する重要な要因になるであろう。従って、これらの要因の最適化は作物の収量の増加に寄与するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
今回、植物においてＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することにより、対応する野生型植物と比較して収量が増加した植物が提供されることが見出された。
【０００６】
ＳＹＴは転写共活性化因子(transcriptional co-activator)であり、植物において、タンパク質のＧＲＦ(growth-regulating factor)ファミリーの転写活性化因子と機能的複合体を形成する(Kim HJ, Kende H (2004) Proc Nat Acad Sc 101: 13374-9)。またＳＹＴは、ＧＩＦ（GRF-interacting factor）とも呼ばれる。ＧＲＦ転写活性化因子は、酵母のクロマチンリモデリング複合体のＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質と（Ｎ末端領域の）構造ドメインが共通する(van der Knaap E et al., (2000) Plant Phys 122: 695-704)。これらの複合体の転写共活性化因子は、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体をエンハンサー及びプロモーター領域に救済して局所的なクロマチンリモデリングを生じさせることに関係すると提案されている(Naar AM et al., (2001) Annu Rev Biochem 70: 475-501参照)。局所的なクロマチン構造の改変は転写活性化を調節する。さらに正確には、ＳＹＴは、植物のＳＷＩ／ＳＮＦ複合体と相互作用してＧＲＦ標的遺伝子の転写活性化に影響を及ぼすと提案されている(Kim HJ, Kende H (2004) Proc Nat Acad Sc 101: 13374-9)。
【０００７】
ＳＹＴはシロイヌナズナ（Arabidopsis）の３つのメンバーのうちの１つの遺伝子ファミリーに属する。ＳＹＴポリペプチドは、ヒトＳＹＴとホモロジーを有する。ヒトＳＹＴポリペプチドは、転写共活性化因子であることが示された(Thaete et al. (1999) Hum Molec Genet 8: 585-591)。３つのドメインが、哺乳動物のＳＹＴポリペプチドを特徴付ける：
（ｉ）哺乳動物、植物、線虫および魚に保存された、Ｎ末端のＳＮＨ(SYT N-terminal homology)ドメイン、
（ｉｉ）可変間隔で存在する、グリシン、プロリン、グルタミンおよびチロシンから主に成る、Ｃ末端のＱＰＧＹ−リッチドメイン、
（ｉｉｉ）上記２つのドメイン間に位置する、メチオニンリッチ(Met-rich)ドメイン。
【０００８】
植物ＳＹＴポリペプチドでは、ＳＮＨドメインが良く保存されている。Ｃ末端のドメインでは、グリシンおよびグルタミンはリッチであるが、プロリンまたはチロシンはリッチではない。従って、哺乳動物のＱＰＧＹドメインとは対照的に、ＱＧ−リッチドメインと命名されている。哺乳動物のＳＹＴと同様に、Ｍｅｔ−リッチドメインはＱＧドメインのＮ末端に同定されうる。ＱＧ−リッチドメインは、実質的にタンパク質のＣ末端の残部（ＳＮＨドメインをマイナスする）であると取られるであろう；Ｍｅｔ−リッチドメインは、典型的には、ＱＧ−リッチ（Ｎ末端からＣ末端まで）の最初の半分の範囲に含まれる。第２のＭｅｔ−リッチドメインは植物ＳＹＴポリペプチドのＳＮＨドメインの前にあるであろう（図１参照）。
【０００９】
ＳＹＴの発現が低減されたＳＹＴ機能欠失突然変異体およびトランスジェニック植物は、細胞が少ない、小さく幅の狭い葉と花弁に発達することが報告された(Kim HJ, Kende H (2004) Proc Nat Acad Sc 101: 13374-9)。
【００１０】
本発明により、植物においてＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することを含む、植物の収量を増加するための方法が提供される。
【００１１】
本明細書において「対応する野生型植物」という場合は、適切な対照植物または植物を意味するととられ、その選択は十分に当業者の能力の範囲内であり、例えば、目的の遺伝子を持っていない対応する野生型植物または対応する植物を含んでもよい。本明細書で使用される「対照植物」は、植物全体だけでなく、種子及び種子の一部を含む、植物の部分もいう。
【００１２】
有利なことに、本発明による方法を行うことにより、植物において対応する野生型植物と比較して、収量、特に種子が増加する。
【００１３】
本明細書で定義される用語「収量の増加」は、対応する野生型植物と各々比較して、以下のいずれか１つまたはそれ以上についての増加を意味するととられる：（ｉ）植物の１つまたはそれ以上の部分、特に地上の（収穫可能な）部分のバイオマス（重量）の増加、根のバイオマスの増加、あるいは他の収穫可能な部分（果実、ナッツ、豆類など）のバイオマスの増加、（ｉｉ）種子のバイオマス（種子の重量）の増加を含む、植物当たりまたは個々の種子を基準とした種子の重量の増加でもよい、種子の全収量の増加、（ｉｉｉ）（充実した（filled））種子の数の増加、（ｉｖ）種子の大きさ（size）の増加（種子の組成に影響があってもよい）、（ｖ）種子の体積（volume）の増加（種子の組成（油、タンパク質及び炭水化物の全含量および全組成を含む）に影響があってもよい）、（ｖｉ）個々の種子の面積（area）の増加、（ｖｉｉ）個々の種子の長さ（length）及び幅（width）の増加、（ｖｉｉｉ）収穫指数の増加（全バイオマスに対する、種子などの収穫可能な部分の収量の比率として表される）、および（ｉｘ）千粒重（thousand kernel weight, ＴＫＷ）の増加（数えた充実した種子数及びその全重量から外挿される）。ＴＫＷの増加は、種子の大きさおよび／または種子の重量の増加で生じうる。ＴＫＷの増加は、胚の大きさおよび／または胚乳の大きさの増加で生じうる。種子の大きさ、種子の体積、種子の面積、種子の周囲長（perimeter）、種子の幅および種子の長さの増加は、種子の特定の部分の増加により、例えば胚および／または胚乳および／またはアリューロンおよび／または胚盤、あるいは種子の他の部分の増加によるものであってもよい。
【００１４】
トウモロコシを例にとると、収量の増加は、以下の１つまたはそれ以上により表すことができる：ヘクタール又はエーカーあたりの植物数の増加、植物あたりの穂（ear）の数の増加、列の数、列あたりの穀粒数、穀粒重量、千粒重、穂の長さ／直径などの増加、種子の充填率（filling rate）（充実した種子の数を全種子数で割り、１００を掛ける）など。イネを例にとると、収量の増加は、以下の１つまたはそれ以上の増加により表すことができる：ヘクタール又はエーカーあたりの植物の数、植物当たりの花序（panicle）の数、花序あたりの小穂（spikelet）の数、花序あたりの花（floret）の数（一次花序の数に対して充実した種子の数の割合として表される）、種子の充填率の増加（充実した種子の数を全種子数で割り、１００を掛ける）、千粒重の増加など。
【００１５】
また、収量の増加は構造の改変により生じうるし、または構造の改変の結果として生じうる。
【００１６】
本発明の好ましい特徴によれば、本発明の方法を行うことにより、種子の収量が増加した植物が得られる。従って本発明によれば、植物において種子の収量を増加させる方法が提供され、該方法は、植物においてＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することを含む。
【００１７】
本発明のトランスジェニック植物は増加した収量を有しているので、該植物は（そのライフサイクルの少なくとも一部の間に）対応する野生型植物のライフサイクルの対応するステージでの生長速度と比較して、生長速度の増加を示すと思われる。生長速度の増加は、植物の１つまたはそれ以上の部位（種子を含む）に特異的であってもよいし、全体的に実質的に植物全体であってもよい。生長速度の増加した植物は早い開花期を示すこともある。生長速度の増加は、植物のライフサイクルの１またはそれ以上のステージ、または実質的に植物体全体のライフサイクルにおいて生じることがある。植物のライフサイクルにおける初期のステージでの生長速度の増加は、活力の増強を反映し得る。生長速度の増加により、植物が、別の可能なものよりももっと遅く播種され、および／またはもっと早く収穫されるように、植物の収穫サイクルを変えることができる。もし生長速度が十分に増加されれば、幾つかの植物種の種子を更に播種することが可能になるだろう（例えば従来の生長期間内に、播種しイネ植物を収穫し、その後、更に播種し、イネ植物全てを収穫する）。同様に、もし生長速度が十分に増加されれば、違う植物種の種子をさらに播種することができるだろう（例えば播種しイネ植物を収穫し、続いて例えばダイズ、ジャガイモまたは他の適切な植物を播種し任意に収穫する）。幾つかの作物の場合、同じ根茎から収穫する回数を追加することも可能であろう。植物の収穫サイクルを変えることにより、エーカーあたりの１年間のバイオマス生産を（特定の植物を生育して収穫する（いわば１年の）回数の増加により）上げることができる。また、作物が生育する地域的限定は、植え付けの時（時期の初め）または収穫の時（時期の終わり）の有害な環境条件によってしばしば決定されることから、生長速度の増加により、野生型の対応する植物よりももっと広い地理的なエリアでトランスジェニック植物を栽培することもできる。そのような有害な条件は、収穫サイクルを短くすれば避けることができる。生長速度は生長曲線から様々なパラメーターを導き出すことにより決定することができ、そのようなパラメーターは、例えばＴ−Ｍｉｄ（植物が最大の大きさの５０％に到達するのにかかる時間）及びＴ−９０（植物が最大の大きさの９０％に到達するのにかかる時間）などである。
【００１８】
本発明の方法を行うことにより、対応する野生型植物と比較して生長速度が増加した植物が提供される。従って、本発明によれば、植物において生長速度を増加させる方法が提供され、該方法は、植物においてＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現を調節することを含む。
【００１９】
植物が非ストレス条件下にあっても、あるいは植物が適切な対照植物と比べて様々なストレスにさらされていても、（種子の）収量および／または生長速度の増加が生じる。一般的に植物は、ストレスの曝露に対して、よりゆっくりとした生長により応答する。強いストレス条件では、植物は完全に生長を停止することもある。一方、軽度のストレスは、本明細書において、植物がストレスにさらされても、生長を再開する能力が無く完全に成長を止めた植物にならないストレスであると定義される。農作業（灌漑、施肥、農薬処理）の進歩により、栽培される作物は強いストレスにあまり遭遇しない。その結果、軽度のストレスにより誘発された障害が起きた生長は、しばしば農業にとって望ましくない特性となる。軽度のストレスは、植物がさらされる可能性のある一般的なストレスである。これらのストレスは、植物がさらされる毎日の生物的および／または非生物的（環境）ストレスでありうる。一般的な非生物的または環境ストレスとして、非一般的な高温または低温／凍結温度により起こる温度ストレス、塩分ストレス、水分ストレス（渇水又は過剰水）が挙げられる。また、化学物質は非生物的ストレスを起こす。生物的ストレスは、一般的に、細菌、ウイルス、真菌および昆虫などの感染因子によって生じるストレスである。
【００２０】
有利なことに、どんな植物でも収量を変更できる。
【００２１】
本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体、植物の原種及びその後代、及び植物の部分を包含し、植物の部分には種子、シュート、茎、葉、根（塊茎を含む）、花、組織及び器官を含み、上記のそれぞれは目的の導入遺伝子を含む。また、用語「植物」は、植物細胞、懸濁培養物、カルス組織、胚、分裂組織領域、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含し、さらに上記のそれぞれは導入遺伝子を含む。
【００２２】
本発明の方法で特に有用な植物には、緑色植物（Viridiplantae）スーパーファミリーに属する全ての植物、特に、以下の植物を含むリストから選択される、飼料または飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木または低木を含む、単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる：アカシア（Acacia spp.）、カエデ（Acer spp.）アクティニディア（Actinidia spp.）、トチノキ（Aesculus spp.）、アガチス・アウストラリス（Agathis australis）、アルビジア・アマラ（Albizia amara）、アルソフィラ・トリカラー（Alsophila tricolor）、メリケンカルカヤ（Andropogon spp.）、ラッカセイ（Arachis spp.）、アレカ・カテチュ（Areca catechu）、アステリア・フラグランス（Astelia fragrans）、アストラガルス・シサー（Astragalus cicer）、バイキアエア・プルリジュガ（Baikiaea plurijuga）、カバノキ（Betula spp.）、アブラナ（Brassica spp.）、ブルグイエラ・ジムノルヒザ（Bruguiera gymnorrhiza）、ブルケア・アフリカーナ（Burkea africana）、ブテア・フロンドーサ（Butea frondosa）、カダバ・ファリノーサ（Cadaba farinosa）、ネムノキ（Calliandra spp.）、カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）、カンナ・インディカ（Canna indica）、トウガラシ（Capsicum spp.）、桂皮（Cassia spp.）、セントロエマ・プベスケンス（Centroema pubescens）、ボケ（Chaenomeles spp.）、キンナモムム・カシア（Cinnamomum cassia）、コフィア・アラビカ（Coffea arabica）、コロフォスペルムム・モパネ（Colophospermum mopane）、コロニリア・バリア（Coronillia varia）、コトネアスター・セロティナ（Cotoneaster serotina）、クルタエグス（Crtaegus spp.）、キュウリ（Cucumis spp.）、クプレッサス（Cupressus spp.）、サイアセア・デアルバータ（Cyathea dealbata）、サイドニア・オブロンガ（Cydonia oblonga）、クリプトメリア・ジャポニカ（Cryptomeria japonica）、キンボポゴン（Cymbopogon spp.）、シンシア・ディアルバータ（Cynthea dealbata）、キドニア・オブロンガ（Cydonia oblonga）、ダルベルジア・モネタリア（Dalbergia monetaria）、ダバリア・ディバリカータ（Davallia divaricata）、デスモディウム（Desmodium spp.）、ディクソニア・スクアローサ（Dicksonia squarosa）、ディヘテロポゴン・アンプレクテンス（Diheteropogon amplectens）、ディオクレア（Dioclea spp.）、ドリコス（Dolichos spp.）、ドリクニウム・レクタム（Dorycnium rectum）、エチノクロア・ピラミダリス（Echinochloa pyramidalis）、エラルティア（Ehrartia spp.）、エレウシン・コラカナ（Eleusine coracana）、エラグレスティス（Eragrestis spp.）、エリスリナ（Erythrina spp.）、ユーカリ（Eucalyptus spp.）、ユークレア・シンペリー（Euclea schimperi）、ユーラリア・ビローサ（Eulalia villosa）、ファゴピルム（fagopyrum spp.）、フェイジョア・セロウィアナ（Feijoa sellowiana）、イチゴ（Fragaria spp.）、フレミンジア（Flemingia spp.）、フレイシネチア・バンクシイ（Freycinetia banksii）、ゲラニウム・ツンベルギイ（Geranium thunbergii）、ギンゴ・ビロバ（Ginkgo biloba）、グリシン・ジャバニカ（Glycine javanica）、グリリシディア（Gliricidia spp.）、ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）、グレビレア（Grevillea spp.)、グイボウルティア・コレオスペルマ（Guibourtia coleosperma）、ヘディサルム（Hedysarum spp.）、ヘマルチア・アルティッシマ（Hemarthia altissima）、ヘテロポゴン・コントルツス（Heteropogon contortus）、ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare）、ヒパーレニア・ルファ（Hyparrhenia rufa）、ヒペリクム・エレクツム（Hypericum erectum）、ヒペルセリア・ディソルタ（Hyperthelia dissoluta）、インディゴ・インカルナータ（Indigo incarnata）、アイリス（Iris spp.）、レプタルレナ・ピロリフォリア（Leptarrhena pyrolifolia）、レスペディザ（Lespediza spp.）、レチュカ（Lettuca spp.）、レウカエナ・レウコセファラ（Leucaena leucocephala）、ロウデチア・シンプレクス（Loudetia simplex）、ロトヌス・バイネシイ（Lotonus bainesii）、ハス（Lotus spp.）、マクロチローマ・アキシラレ（Macrotyloma axillare)、リンゴ（Malus spp.）、マニホット・エスクレンタ（Manihot esculenta）、メディカゴ・サティバ（Medicago sativa）、メタセコイア・グリプトストロボイデス（Metasequoia glyptostroboides）、ムサ・サピエンツム（Musa sapientum）、ニコチアヌム（Nicotianum spp.）、オノブリョチス（Onobrychis spp.）、オルニトプス（Ornithopus spp.）、イネ（Oryza spp.）、ペルトフォルム・アフリカヌム（Peltophorum africanum）、ペニセツム（Pennisetum spp.）、ペルセア・グラテッシマ（Persea gratissima）、ペチュニア（Petunia spp.）、ファセオルス（Phaseolus spp.）、フェニックス・カナリエンシス（Phoenix canariensis）、フォルミウム・クッキアヌム（Phormium cookianum）、フォチニア（Photinia spp.）、ピセア・グラウカ（Picea glauca）、ピヌス（Pinus spp.）、ピスム・サティブム（Pisum sativum）、ポドカルプス・トタラ（Podocarpus totara）、ポゴナルスリア・フレッキイ（Pogonarthria fleckii）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Pogonarthria squarrosa）、ハコヤナギ（Populus spp.）、プロソピス・シネラリア（Prosopis cineraria）、シュードツガ・メンジエシイ（Pseudotsuga menziesii）、プテロロビウム・ステラツム（Pterolobium stellatum）、パイラス・コミュニス（Pyrus communis）、クエルクス（Quercus spp.）、ラフィオレプシス・アンベルラタ（Rhaphiolepsis umbellata）、ロパロスチリス・サピダ（Rhopalostylis sapida）、ルス・ナタレンシス（Rhus natalensis）、リベス・グロッスラリア（Ribes grossularia）、スグリ（Ribes spp.）、ロビニア・シュードアカシア（Robinia pseudoacacia）、バラ（Rosa spp.）、キイチゴ（Rubus spp.）、ヤナギ（Salix spp.）、スキザクリウム・サングイネウム（Schyzachyrium sanguineum）、スシアドピティス・ヴァティシラタ（Sciadopitys verticillata）、セコイア・セムペルビレンス（Sequoia sempervirens）、セコイアデンドロン・ギガンテウム（Sequoiadendron giganteum）、ソルガム・バイカラー（Sorghum bicolor）、ホウレンソウ（Spinacia spp.）、スポロボルス・フィムブリアツス（Sporobolus fimbriatus）、スチブルス・アロペクロイデス（Stiburus alopecuroides）、スチロサントス・フミリス（Stylosanthos humilis）、タデハギ（Tadehagi spp.）、タキソディウム・ディスチクム（Taxodium distichum）、テメダ・トリアンドラ（Themeda triandra）、トリフォリウム（Trifolium spp.）、コムギ（Triticum spp.）、ツガ・ヘテロフィラ（Tsuga heterophylla）、スノキ（Vaccinium spp.）、ビシア（Vicia spp.）、ビティス・ビニフェラ（Vitis vinifera）、ワトソニア・ピラミダタ（Watsonia pyramidata）、ザンテデスキア・アエチオピカ（Zantedeschia aethiopica）、トウモロコシ（Zea mays）、アマランス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（collard greens）、亜麻、ケール、レンティル、アブラナ(oilseed rape)、オクラ、タマ��ギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スカッシュ、茶及び藻類など。本発明の好ましい態様によれば、植物は作物である。作物の例として他に、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、アブラナ(rapeseed)、綿、トマト、ジャガイモまたはタバコなどが挙げられる。シロイヌナズナは一般的に作物として考えられていない。更に好ましくは、植物は、サトウキビなどの単子葉植物である。より好ましくは、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、アワ・キビ（millet）、ライムギ、ソルガムまたはカラスムギなどの穀類である。
【００２３】
本明細書で定義される用語「ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログ」は、（ｉ）配列番号２に示されるＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン、および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン、および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドをいう。
【００２４】
好ましくは、配列番号２に示されるＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の同一性を有するＳＮＨドメインは、図２の黒で示された残基を含む。さらに好ましくは、ＳＮＨドメインは、配列番号１に示される。
【００２５】
従って、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、以下の１つまたはそれ以上を含み得る：（ａ）配列番号９０、（ｂ）配列番号９１、および（ｃ）ＳＮＨドメインの前にあるＮ末端のＭｅｔ−リッチドメイン。
【００２６】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、一般的に、酵母ツーハイブリッドシステムにおいてＧＲＦ（growth-regulating factor、生長調節因子)ポリペプチドと相互作用する。酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイは当該技術分野で周知である(Field et al. (1989) Nature 340(6230): 245-246参照)。例えば、配列番号４に示されるＳＹＴポリペプチドはAtGRF5およびAtGRF9と相互作用可能である。ＳＹＴポリペプチドとそのホモログは、植物において収量、特に種子の収量を増加させることが、本発明者らによって示された。
【００２７】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、ＳＹＴ核酸／遺伝子によりコードされる。従って、本明細書で定義される用語「ＳＹＴ核酸／遺伝子」は、上記で定義されたＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸／遺伝子である。
【００２８】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、当該技術分野において周知の日常的な技術、例えば配列アラインメントを用いて容易に同定することができる。比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術分野で周知であり、そのような方法として、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰは、NeedlemanおよびWunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453)のアルゴリズムを用いて、マッチの数を最大にし、ギャップの数を最小限にする２つの完全な配列のアラインメントを見つける。ＢＬＡＳＴアルゴリズム(Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)は、パーセント配列同一性を計算し、２つの配列間の類似について統計学的分析を行う。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウエアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Centre for Biotechnology Information）から公的に入手可能である。配列番号２のＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の配列同一性を有するＳＮＨドメインを含むＳＹＴのホモログ、および／または配列番号９０および／または配列番号９１を含むＳＹＴホモログは、例えばhttp://clustalw.genome.jp/sit-bin/nph-clustalwで入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷマルチプルシークエンスアラインメントアルゴリズム(version 1.83)を用いて、デフォルトペアワイズアラインメントパラメーターで、パーセンテージでのスコアリング方法を用いて、容易に特定することができる。配列番号２のＳＮＨドメインに対して４０％の同一性を有する配列は、ＳＹＴとして配列を特定するのに十分である。
【００２９】
さらに、Ｍｅｔ−リッチドメインまたはＱＧ−リッチドメインの存在も容易に特定することができる。図３に示したように、Ｍｅｔ−リッチドメインとＱＧ−リッチドメインはＳＮＨドメインに続く。ＱＧ−リッチドメインは実質的にタンパク質のＣ末端の残部（ＳＮＨドメインをマイナスする）であるととることができる；Ｍｅｔ−リッチドメインは、一般的に、ＱＧ−リッチ（Ｎ末端からＣ末端）の最初の半分の範囲に含まれる。ポリペプチドドメインが、特定のアミノ酸がリッチであるかどうかを決める一次アミノ酸組成（％）は、ＥｘＰＡＳｙサーバー のソフトウエアプログラム(Gasteiger E et al. (2003) ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788)、特にＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いて計算できる。次に、目的のタンパク質の組成をＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔタンパク質配列データバンクの平均アミノ酸組成（％）と比較することができる。このデータバンクでは、平均Ｍｅｔ（Ｍ）含量が２．３７％であり、平均Ｇｌｎ（Ｑ）含量が３．９３％であり、平均Ｇｌｙ（Ｇ）含量が６．９３％である。本明細書で定義したように、Ｍｅｔ−リッチドメインまたはＱＧ−リッチドメインは、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質配列データバンクの平均アミノ酸組成（％）を上回るＭｅｔ含量（％）、またはＧｌｎおよびＧｌｙ含量（％）を有する。
【００３０】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログの例として以下が挙げられる（カッコ内のアクセッションナンバーのポリヌクレオチド配列によりコードされる。表１も参照のこと）：Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）Arath_SYT1 (AY102639.1) 配列番号４、 Arabidopsis thaliana Arath_SYT2 (AY102640.1) 配列番号６、Arabidopsis thaliana Arath_SYT3 (AY102641.1) 配列番号８、Aspergillus officinalis（アスペルギルス・オフィシナリス）Aspof_SYT (CV287542) 配列番号１０、Brassica napus（アブラナ）Brana_SYT (CD823592) 配列番号１２、Citrus sinensis(オレンジ)Citsi_SYT (CB290588) 配列番号１４、Gossypium arboreum(綿) Gosar_SYT (BM359324) 配列番号１６、Medicago trunculata（マメ科植物）Medtr_SYT (CA858507.1) 配列番号１８、Oryza sativa（イネ）Orysa_SYT1 (AK058575) 配列番号２０、Oryza sativa Orysa_SYT2 (AK105366) 配列番号２２、Oryza sativa Orysa_SYT3 (BP185008) 配列番号２４、Solanum tuberosum（ジャガイモ）Soltu_SYT (BG590990) 配列番号２６、Zea mays(トウモロコシ) Zeama_SYT1 (BG874129.1, CA409022.1) 配列番号２８、Zea mays Zeama_SYT2 (AY106697) 配列番号３０、Homo sapiens（ヒト）Homsa_SYT (CAG46900) 配列番号３２、Allium cepa（タマネギ）Allce_SYT2 (CF437485) 配列番号３４、Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens（オダマキの交雑種）Aqufo_SYT1 (DT758802) 配列番号３６、Brachypodium distachyon（ミナトカモジグサ）Bradi_SYT3 (DV480064) 配列番号３８、Brassica napus Brana_SYT2 (CN732814) 配列番号４０、Citrus sinensis Citsi_SYT2 (CV717501) 配列番号４２、Euphorbia esula（ハギクソウ）Eupes_SYT2 (DV144834) 配列番号４４、Glycine max（ダイズ）Glyma_SYT2 (BQ612648) 配列番号４６、Glycine soya Glyso_SYT2 (CA799921) 配列番号４８、Gossypium hirsutum(綿) Goshi_SYT1 (DT558852) 配列番号５０、Gossypium hirsutum Goshi_SYT2 (DT563805) 配列番号５２、Hordeum vulgare(オオムギ) Horvu_SYT2 (CA032350) 配列番号５４、Lactuca serriola(野生レタス) Lacse_SYT2 (DW110765) 配列番号５６、Lycopersicon esculentum（トマト）Lyces_SYT1 (AW934450, BP893155) 配列番号５８、Malus domestica（リンゴ）Maldo_SYT2 (CV084230, DR997566) 配列番号６０、Medicago trunculata Medtr_SYT2 (CA858743, BI310799, AL382135) 配列番号６２、Panicum virgatum（スイッチグラス）Panvi_SYT3 (DN152517) 配列番号６４、Picea sitchensis（シトカトウヒ）Picsi_SYT1 (DR484100, DR478464) 配列番号６６、Pinus taeda(タエダマツ) Pinta_SYT1 (DT625916) 配列番号６８、Populus tremula（ヨーロッパヤマナラシ）Poptr_SYT1 (DT476906) 配列番号７０、Saccharum officinarum（サトウキビ）Sacof_SYT1 (CA078249, CA078630, CA082679, CA234526, CA239244, CA083312) 配列番号７２、Saccharum officinarum Sac
of_SYT2 (CA110367) 配列番号７４、Saccharum officinarum Sacof_SYT3 (CA161933, CA265085) 配列番号７６、Solanum tuberosum Soltu_SYT1 (CK265597) 配列番号７８、Sorghum bicolor（ソルガム）Sorbi_SYT3 (CX611128) 配列番号８０、Triticum aestivum(コムギ) Triae_SYT2 (CD901951)配列番号８２、Triticum aestivum Triae_SYT3 (BJ246754, BJ252709) 配列番号８４、Vitis vinifera（ブドウ）Vitvi_SYT1 (DV219834) 配列番号８６、Zea mays Zeama_SYT3 (CO468901) 配列番号８８。
【表１】
2008528014.tif 000002
2008528014.tif 000003
【００３１】
「ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログ」の定義に該当する配列は、以下に示される配列に限定されないことは理解されるべきである：配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８。また、（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン、および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン、および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドは、本発明の方法を行うのに、適切であろうことは理解されるべきである。
【００３２】
ＳＹＴ核酸の例として、以下のいずれかに示される核酸が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７。ＳＹＴ核酸／遺伝子およびその変異体は本発明の方法を行うのに適切であり得る。変異ＳＹＴ核酸／遺伝子は、一般的に、天然に生じるＳＹＴ核酸／遺伝子と同一の機能を有する核酸／遺伝子であり、その機能は、同一の生物学的機能、または植物において核酸／遺伝子の発現が調節された場合に収量を増加する機能でありうる。そのような変異体は、ＳＹＴ核酸／遺伝子の一部、および／または以下に定義するＳＹＴ核酸／遺伝子とハイブリダイズ可能な核酸を含む。
【００３３】
本明細書で定義される用語「一部」は、（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン、および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン、および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの断片をいう。例えばＳＹＴ核酸に１つまたはそれ以上の欠失を作ることにより、一部を調製することができる。単離された形態で該一部を用い、あるいは例えばいくつかの活性を組合せたタンパク質を作製するために、該一部を他のコード（または非コード）配列と融合させてもよい。他のコード配列と融合させた場合、翻訳で作られたポリペプチドは、ＳＹＴフラグメントに対して予測されるものよりも大きいものであり得る。好ましくは、前記一部は、以下のいずれかにより示される核酸の一部である：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７。最も好ましくは、核酸の一部は、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示されるものである。
【００３４】
別のＳＹＴ核酸／遺伝子の変異体は、低くされたストリンジェンシー条件、好ましくはストリンジェントな条件下で、上記に定義されたＳＹＴ核酸／遺伝子とハイブリダイズできる核酸であり、ハイブリダイズする配列は、（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン、および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン、および (iii)ＱＧ−リッチドメインのＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドをコードする。好ましくは、ハイブリダイズする配列は、以下のいずれか１つに示される核酸とハイブリダイズ可能な配列である：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、あるいは上に定義されたように、上記配列のいずれかの一部。最も好ましくは、核酸のハイブリダイズする配列は、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示されるものである。
【００３５】
本明細書で定義される用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションのプロセスは、完全に溶液中で起こり、すなわち両方の相補的核酸は溶液中に存在する。またハイブリダイゼーションのプロセスは、磁性ビーズ、セファロースビーズまたはその他の樹脂などのマトリックスに固定化された相補的核酸の１つとも起こりうる。さらにハイブリダイゼーションのプロセスは、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体に固定化された、あるいは、例えば石英質ガラス（siliceous glass）支持体に例えばフォトリソグラフィーによって固定化された（後者は核酸アレイ、またはマイクロアレイ、または核酸チップとして知られる）、相補的核酸の１つと起こりうる。ハイブリダイゼーションを起こすようにするため、一般的に、核酸分子を熱的にまたは化学的に変性して、２本鎖を２つの１本鎖に融解し、および／または１本鎖の核酸からヘアピンまたは他の二次構造を除く。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成などの条件により影響される。
【００３６】
サザンおよびノザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験との関連における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、異なる環境パラメーター下で違う。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄中に変化しうる、またストリンジェンシーな条件を維持するか変える、様々なパラメーターについて知っている。
【００３７】
Ｔｍは、標的の配列の５０％が完全にマッチするプローブにハイブリダイズする、規定のイオン強度およびｐＨ下での温度である。Ｔｍは、溶液の条件と塩基組成とプローブの長さに依存する。例えば、長い配列は高い温度で特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの最高率は、Ｔｍより下の約１６℃から３２℃までに得られる。ハイブリダイゼーション溶液の一価カチオンの存在は、２つの核酸の鎖間の静電反発を低減し、それによりハイブリッド形成が促進する；この効果は０．４Ｍまでのナトリウム濃度に見られる。ホルムアミドは、パーセントホルムアミドごとにＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡ２本鎖の融解温度を０．６℃から０．７℃低くし、５０％ホルムアミドの添加により、ハイブリダイゼーションの割合は低くなるだろうが、３０〜４５℃でハイブリダイゼーションが行われるようになる。塩基対のミスマッチは、ハイブリダイゼーション率と２本鎖の熱安定性を低くする。平均して、大きいプローブでは、Ｔｍは％塩基ミスマッチあたり約１℃減少する。Ｔｍは、ハイブリッドのタイプにより、以下の式を用いて計算できる：
１．ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド(Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): 
Tm=81.5℃+16.6xlog[Na+]a+0.41x%[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x%ホルムアミド
２．ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド：  
Tm=79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
３．オリゴ−ＤＮＡまたはオリゴ−ＲＮＡｄハイブリッド：  
＜２０ヌクレオチドの場合：      Tm=2(ln)
２０−３５ヌクレオチドの場合：  Tm=22+1.46(ln)
ａまたは他の一価カチオンの場合、ただし０．０１〜０．４Ｍの範囲での計算のみ。
【００３８】
ｂＧＣ％が３０％〜７５％の範囲での計算のみ。
【００３９】
ｃＬ＝塩基対の２本鎖の長さ
ｄオリゴは、オリゴヌクレオチド；lnは、プライマーの有効な長さ＝２×（Ｇ／Ｃの数）＋（Ａ／Ｔの数）
（注）：１％ホルムアミドごとに、Ｔｍは約０．６〜０．７℃下がり、６Ｍ尿素の存在はＴｍを約３０℃下げる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションの特異性は、一般的に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の作用である。非特異的なハイブリダイゼーションの結果生じるバックグラウンドを除去するために、サンプルを希釈塩溶液で洗浄する。そのような洗浄の重要な要素として、イオン強度、最終洗浄液の温度が挙げられる：塩濃度が低く、洗浄温度が高いと、洗浄のストリンジェンシーが高くなる。洗浄条件は、一般的に、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーで、あるいはそれよりも低くして行われる。一般的に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出方法の適切なストリンジェントな条件は上述したとおりである。ストリンジェンシーのより高いまたはより低い条件を選択することもできる。一般的に、低ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列について熱融解点（Ｔｍ）よりも約５０℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件はＴｍより１０℃低い場合である。例えば、ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば条件Ａ〜Ｌと同じくらいのストリンジェントな条件である；低くしたストリンジェンシー条件は、少なくとも、例えば条件Ｍ〜Ｒと同じくらいである。非特異的結合は、例えばタンパク質含有溶液で膜をブロッキングすること、異種ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＳＤＳをハイブリダイゼーション緩衝液に添加すること、ＲＮａｓｅで処理することなどの多くの公知技術のいずれかを用いて制御することができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例を以下の表２に挙げる。
【表２】
2008528014.tif 000004
2008528014.tif 000005
【００４１】
ストリンジェンシーのレベルを決めるには、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)を参照することができる。
【００４２】
ＳＹＴ核酸またはその変異体は、人工源または天然原由来、例えば植物、藻類あるいは動物由来でもよい。該核酸は、意図的な人間の操作を介して、組成および／またはゲノム環境におけるその天然の形から改変されてもよい。該核酸は、（例えば核酸が導入される植物種と）同一の植物種由来であろうが、または異なる植物種由来であろうが、植物起源が好ましい。好ましくは、植物起源の核酸はＳＹＴ１をコードする。あるいは該核酸は、ポリペプチドレベルで互いに近縁関係にあるＳＹＴ２またはＳＹＴ３をコードしてもよい。該核酸は、双子葉植物種から、好ましくはアブラナ科（Brassicaceae）から、さらに好ましくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から単離されてもよい。さらに好ましくは、シロイヌナズナから単離された上記３つのＳＹＴ核酸は、配列番号３、配列番号５および配列番号７に示され、上記３つのＳＹＴアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号６および配列番号８に示される。
【００４３】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の発現は、遺伝子改変を（好ましくはＳＹＴ遺伝子の遺伝子座に）導入することにより調節することができる。本明細書で定義される遺伝子座は、目的の遺伝子およびコード領域の１０ｋｂ上流または下流を含む、ゲノム領域を意味するととられる。
【００４４】
遺伝子改変は、例えば以下のいずれか１つ（またはそれ以上）の方法により、導入することができる：Ｔ−ＤＮＡ活性化、ＴＩＬＬＩＮＧ、部位特異的突然変異誘発、定向進化(directed evolution)および相同遺伝子組換え、またはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸を植物に導入し発現させる。遺伝子改変を導入した後、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の調節された発現（発現の調節により収量が増加し、好ましくは種子の収量が増加した植物が提供される）について選択するステップが続く。
【００４５】
Ｔ−ＤＮＡ活性化タグ化 (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353)は、通常プロモーター（翻訳エンハンサーまたはイントロンでもよい）を含むＴ−ＤＮＡを、プロモーターが標的の遺伝子の発現を導くように目的の遺伝子のゲノム領域または立体構造の遺伝子のコード領域の１０ｋｂ上流または下流に挿入することを含む。一般的に、天然のプロモーターによる標的遺伝子の発現の調節が乱されて、該遺伝子は新しく導入されたプロモーターの制御下に置かれる。プロモーターは一般的にＴ−ＤＮＡに組み込まれる。該Ｔ−ＤＮＡは、例えばアグロバクテリウム感染を介して、植物ゲノムにランダムに挿入され、挿入されたＴ−ＤＮＡに近い遺伝子の過剰発現を誘導する。得られた形質転換植物は、導入されたプロモーターに近い遺伝子の過剰発現により優性表現型を示す。導入されるプロモーターは、所望の生物（本発明の場合は植物）において、遺伝子の発現を導くことができるプロモーターであればよい。例えば、構成的、組織に好適な、細胞型に好適な、および誘導可能なプロモーターは、Ｔ−ＤＮＡ活性化での使用にすべて適切である。
【００４６】
また、遺伝子改変は、ＴＩＬＬＩＮＧ(Targeted Induced Local Lesions In Genomes)の技術を用いてＳＹＴ遺伝子の遺伝子座に導入することもできる。これは、増強されたＳＹＴ活性を有するタンパク質をコードするＳＹＴ核酸の突然変異誘発された変異体を作製しおよび／または同定するため、また該変異体を最終的に単離するために有用な技術である。またＴＩＬＬＩＧは、そのような突然変異の変異体を保有する植物を選択することも可能にする。これらの突然変異の変異体は、その天然の形の遺伝子により示されるＳＹＴ活性よりも高い活性を示すこともありうる。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度突然変異誘発とハイスループットスクリーニング方法を組合せる。ＴＩＬＬＩＮＧでの一般的な後のステップは以下のとおりである：（ａ）ＥＭＳによる突然変異誘発(Redei GP and Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104)；（ｂ）ＤＮＡ調製および個体のプール；（ｃ）目的の領域のＰＣＲ増幅；（ｄ）ヘテロ２本鎖を形成させる変性とアニーリング；（ｅ）ＤＨＰＬＣ、この手法では、プールのヘテロ２本鎖の存在はクロマトグラムの余分なピークとして検出される；（ｆ）突然変異個体の同定；および（ｇ）突然変異ＰＣＲ産物の配列の決定。ＴＩＬＬＩＮＧの方法は当該技術分野で周知である(McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; reviewed by Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50)。
【００４７】
部位特異的突然変異誘発もＳＹＴ核酸の変異体を作製するために用いることができる。幾つかの方法が部位特異的突然変異誘発を行うために利用可能であり、最も一般的なものはＰＣＲをベースとした方法である(current protocols in molecular biology. Wiley Eds.  http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
【００４８】
また、定向進化もＳＹＴ核酸の変異体を作製するのに用いることができる。これは、改変された生物活性を有するＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログもしくは一部をコードするＳＹＴ核酸またはその一部の突然変異体を作製するため、ＤＮＡシャッフリングに続く適切なスクリーニングおよび／または選択の反復からなる(Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4;米国特許第5,811,238号および第6,395,547号)。
【００４９】
Ｔ−ＤＮＡ活性、ＴＩＬＬＩＮＧ、部位特異的突然変異誘発および定向進化は、新規ＳＹＴアレルおよび変異体を作製することができる技術の例である。
【００５０】
相同遺伝子組換えは、選択された核酸のゲノムに、規定され選択された位置に導入を可能にする。相同遺伝子組換えは、酵母または蘚類のニセツリガネゴケ（Physcomitrella）などの下等生物に対し、生物科学において日常的に用いられる標準的な技術である。植物で相同遺伝子組換えを行う方法は、モデル植物(Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84)についてだけでなく、作物、例えばイネ(Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; Iida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8)についても述べられている。標的化される核酸（前述のように定義されたＳＹＴ核酸またはその変異体であり得る）は、ＳＹＴ遺伝子の遺伝子座に標的化される。標的化される核酸は内生の遺伝子を置換するために用いられる改良されたアレルであってもよいし、内生の遺伝子の他に導入されてもよい。
【００５１】
遺伝子改変を導入するための好ましい方法（この場合、ＳＹＴ遺伝子の遺伝子座である必要はない）は、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸を植物に導入して発現させることである。ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、以下のＮ末端からＣ末端までを含むポリペプチドとして定義される；（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン；および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン；および（ｉｉｉ）ＱＧ−リッチドメイン。
【００５２】
好ましくは、配列番号２のＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の同一性を有するＳＮＨドメインは、図２で黒く示された残基を含む。さらに好ましくは、ＳＮＨドメインは配列番号１に示される。
【００５３】
植物に導入される核酸は、完全長の核酸でもよいし、前述で定義されたように、一部あるいはハイブリダイズする配列でもよい。
【００５４】
タンパク質の「ホモログ」は、当の未改変のタンパク質と比べて、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を有し、かつ由来する未改変のタンパク質と同等の生物活性および機能活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を含む。そのようなホモログを作製するため、タンパク質のアミノ酸を類似の性質（例えば類似の疎水性、親水性、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成あるいは壊す性質）を有する他のアミノ酸で置換してもよい。保存的置換の表は、当該技術分野で周知である(例えばCreighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Companyおよび以下の表３を参照)。
【００５５】
ホモログは、遺伝子の先祖の関係を説明するのに使用される進化の概念を含有する、オルソログおよびパラログを含む。パラログは、先祖遺伝子の重複を通じて生じた同種内の遺伝子であり、オルソログは、種分化を通じて生じた異なる生物からの遺伝子である。
【００５６】
例えば単子葉植物種におけるオルソログは、いわゆる相互のブラスト(blast)サーチを行うことにより容易に見つけることができる。これは、http://www.ncbi.nlm.nih.govで見つけることができる、公的に入手可能なＮＣＢＩデータベースなどの配列データベースに対して、照会配列（例えば配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６．配列番号７または配列番号８）をブラストすることを含むファーストブラストにより行うことができる。ヌクレオチド配列から開始する場合は、ＢＬＡＳＴＮまたはＴＢＬＡＳＴＸ（標準のデフォルト値を用いる）を使用することができ、タンパク質の配列から開始する場合は、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮ（標準のデフォルト値を用いる）を使用することができる。ＢＬＡＳＴの結果は任意にフィルタリングしてもよい。つぎに、フィルタリングした結果またはフィルタリングしなかった結果のいずれの完全長配列も、照会配列が由来する生物の配列に対して再度ブラスト（セカンドブラスト）する（従って、クエリ配列が配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８の場合、セカンドブラストはシロイヌナズナの配列に対して行う）。次に、ファーストおよびセカンドブラストの結果を比較する。セカンドブラストからのハイランキングのヒットが、照会配列が由来する種と同一の種からのものであれば、パラログが同定される；ハイランキングのヒットが、照会配列が由来する種と同一の種からのものでなければ、オルソログが同定される。ハイランキングのヒットは、低いＥ−値を有するヒットである。Ｅ−値が低いと、スコアはより有意である（言い換えれば、ヒットが偶然に見出された可能性が低い）。コンピュータによるＥ−値の計算は、当該技術分野で周知である。大きなファミリーの場合、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、続いて近接結合法による系統樹により、関連遺伝子のクラスタリングの視覚化を援助し、オルソログおよびパラログを同定することができる。
【００５７】
ホモログは、タンパク質の「置換変異体」の形であってもよく、すなわち、アミノ酸配列の少なくとも１つの残基が除去されて、違う残基がその位置に挿入される。アミノ酸置換は、一般的に単一の残基の置換であるが、そのポリペプチド上に配置された機能的な束縛に応じてクラスターに分けられてもよい；また、挿入は、通常約１〜１０アミノ酸残基程度の挿入である。好ましくは、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を含む。保存的置換の表は、当該技術分野で容易に入手できる。以下の表は、保存アミノ酸の置換の例である。
【表３】
2008528014.tif 000006
【００５８】
またホモログは、タンパク質の「挿入変異体」の形でもよく、すなわち、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質の予定された部位に挿入される。挿入は、１つのまたは複数のアミノ酸の配列内挿入だけでなく、Ｎ末端および／またはＣ末端の融合を含んでもよい。一般的に、アミノ酸配列内での挿入はＮまたはＣ末端の融合よりも小さく、約１〜１０残基程度の挿入であろう。ＮまたはＣ末端の融合タンパク質またはペプチドの例として、酵母ツーハイブリッドシステムで使用される転写活性化因子の活性化ドメインまたは結合ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）−６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、タグ・１００エピトープ、ｃ-ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン−結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープおよびＶＳＶエピトープが挙げられる。
【００５９】
タンパク質の「欠失変異体」の形のホモログは、タンパク質から１つまたはそれ以上のアミノ酸の除去によって特徴づけられる。
【００６０】
タンパク質のアミノ酸変異体は、固相ペプチド合成などの当該技術分野で周知のペプチド合成技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ操作によって、容易に作製することができる。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体を作製するＤＮＡ配列の操作のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＤＮＡの予定された部位に置換の変異を作る技術は当業者に周知であり、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎ in vitro突然変異誘発(USB, Cleveland, OH)、QuickChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene, San Diego, CA)、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発または他の部位特異的突然変異誘発のプロトコールなどが挙げられる。
【００６１】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、誘導体であってもよい。「誘導体」とは、タンパク質の天然形のアミノ酸配列、例えば配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、  配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６および配列番号８８と比較して、非天然のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を含みうる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素が挙げられる。
【００６２】
タンパク質の「誘導体」は、ポリペプチドの天然形のアミノ酸配列と比較して、自然に生じる変更された、グルコシル化された、アシル化された、プレニル化された、あるいは非天然アミノ酸残基を含みうる、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を含有する。また誘導体は、それが由来するアミノ酸配列と比較して、１つまたはそれ以上の非アミノ酸置換基、例えば、その検出を容易にするために結合されるレポーター分子などの、アミノ酸配列に共有または非共有結合されたレポーター分子または他のリガンド、および天然のタンパク質のアミノ酸配列に対して非天然のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００６３】
ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、ＳＹＴ核酸／遺伝子の代替的なスプライス変異体によりコードされてもよい。本明細書で使用される用語「代替的なスプライス変異体」は、選択されたイントロンおよび／またはエクソンが切除、置換または付加された、あるいはイントロンが短くまたは長くなった核酸配列の変異体を含む。そのような変異体は、タンパク質の生物活性を保持する変異体であり、タンパク質の機能的セグメントを選択的に保持することにより達成しうる。そのようなスプライス変異体は天然に見られるものでもよいし、人為的なものでもよい。そのようなスプライス変異を作製する方法は、当該技術分野で周知である。好ましいスプライス変異体は、以下のＮ末端からＣ末端を含むポリペプチドをコードする核酸のスプライス変異体である：（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン；および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン；および（ｉｉｉ）ＧＱ−リッチドメイン。好ましくは、配列番号２のＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の同一性を有するＳＮＨドメインは、図２に黒で示される残基を含む。さらに好ましくは、ＳＮＨドメインは配列番号１によって示される。
【００６４】
さらに、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、以下の１つまたはそれ以上を含んでもよい：（ｉ）配列番号９０；および／または（ｉｉ）配列番号９１；および／または（ｉｉｉ）ＳＮＨドメインの前にあるＮ末端のＭｅｔ−リッチドメイン。
【００６５】
さらに好ましくは、核酸のスプライス変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５および配列番号８７によって示される。最も好ましくは配列番号３、配列番号５および配列番号７によって示されるＳＹＴ核酸／遺伝子のスプライス変異体である。
【００６６】
またホモログは、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸のアレル変異体、好ましくは以下のＮ末端からＣ末端までを含むポリペプチドをコードする核酸のアレル変異体によりコードされてもよい：（ｉ）配列番号２のＳＮＨドメインに対して、好適さの増加する順に、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するＳＮＨドメイン；および（ｉｉ）Ｍｅｔ−リッチドメイン；および（ｉｉｉ）ＧＱ−リッチドメイン。好ましくは、配列番号２のＳＮＨドメインに対して少なくとも４０％の同一性を有するＳＮＨドメインは、図２の黒で示された残基を含む。さらに好ましくは、ＳＮＨドメインは配列番号１によって示される。さらに、ＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、以下の１つまたはそれ以上を含んでもよい：（ｉ）配列番号９０；および／または（ｉｉ）配列番号９１；および／または（ｉｉｉ）ＳＮＨドメインの前にあるＮ末端のＭｅｔ−リッチドメイン。
【００６７】
さらに好ましくは、アレル変異体は、以下のいずれか１つによって示される核酸のアレル変異体である：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５および配列番号８７。最も好ましくは、アレル変異体は、配列番号３、配列番号５および配列番号７のいずれか１つによって示される核酸のアレル変異体である。
【００６８】
アレル変異体は天然に存在し、これらの天然のアレルの使用は、本発明の方法の範囲内に含まれる。アレル変異体は、小さい挿入／欠失多型（ＩＮＤＥＬ）だけでなく、一塩基多型（ＳＮＰ）も含有する。ＩＮＤＥＬの大きさは、通常、１００ｂｐ以下である。ＳＮＰおよびＩＮＤＥＬは、ほとんどの生物の天然多型系統において、配列の変異体の最も大きいセットを形成する。
【００６９】
本発明の好ましい態様によれば、ＳＹＴ核酸またはその変異体の調節された発現は、増加された発現である。発現の増加により、ＳＹＴ ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルの上昇を誘導することができ、ＳＹＴポリペプチドの上昇された活性と同一視できる；あるいはポリペプチドレベルに変化がない場合、またはポリペプチドのレベルが下がった場合であっても、活性が上がることもある。これは、ポリペプチドの固有の性質が変わった場合、例えば野生型ポリペプチドよりももっと活性がある突然変異体型を作製することによりに起こり得る。遺伝子の発現または遺伝子産物を増加させる方法は、当該技術分野で十分に実証されており、例えば、適切なプロモーターの作動による過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸を、ＳＹＴ核酸またはその変異体の発現をアップレギュレーションするように、ポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（一般的に上流）に導入することができる。例えば、内生のプロモーターをin vivoで、突然変異、欠失、および／または置換により変化させてもよいし(Kmiec, US 5,565,350; Zarling et al., PCT/US93/03868参照)、または単離されたプロモーターを、遺伝子の発現を制御するように、本発明の遺伝子の適切な配向および距離で、植物細胞に導入してもよい。遺伝子の発現または遺伝子産物を減少させる方法は、当該技術分野で十分に開示されている。
【００７０】
ポリペプチドの発現が望まれる場合、一般的に、ポリヌクレオチドコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことが望ましい。ポリアデニレーション領域は、天然の遺伝子、他の植物遺伝子の種類、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。付加される３’末端配列は、例えばノパリン合成酵素またはオクトピン合成酵素遺伝子、あるいは別の植物遺伝子、または好ましさは少し低いが他の真核生物遺伝子に由来してもよい。
【００７１】
また、イントロン配列を５’非翻訳領域または部分コード配列のコード配列に付加して、サイトゾルに蓄積する成熟したメッセージの量を増加させてもよい。植物および動物の両方の発現構築物の転写ユニットにスプライス可能なイントロンを包含することにより、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルが１０００倍まで遺伝子発現を増加させたことが示されている（Buchman and Berg, Mol. Cell biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987)）。そのような遺伝子発現のイントロンの増強は、一般的に、転写ユニットの５’末端の近くに配置されると最も大きくなる。トウモロコシのイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用は当該技術分野で公知である。一般的には、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)を参照されたい。
【００７２】
また本発明は、本発明による方法に有用な前記ヌクレオチド配列の導入及び／又は発現を容易にする遺伝子構築物及びベクターを提供する。
【００７３】
従って、
（ｉ）上記に定義された、ＳＹＴ核酸またはその変異体、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたはそれ以上の制御配列；および任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列
を含む遺伝子構築物が提供される。
【００７４】
好ましい構築物は、制御配列が植物由来、好ましくは単子葉植物由来のプロモーターの構築物である。
【００７５】
本発明による方法に有用な構築物は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。遺伝子構築物は、市販されており、植物に形質転換するのに適切で、形質転換された細胞で目的の遺伝子を発現させるのに適切なベクターに挿入することができる。
【００７６】
植物は、目的の配列（すなわちＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸）を含むベクターで形質転換される。目的の配列は、１つまたはそれ以上の制御配列に（少なくともプロモーターに）機能的に結合される。用語「調節エレメント」、「制御配列」および「プロモーター」は、本明細書において全て交換可能に用いられ、結合された配列の発現を生じさせることができる調節核酸配列を指す広い意味でとられるべきである。古典的な真核生物のゲノム遺伝子に由来する転写調節配列（ＣＣＡＡＴボックス配列の有無にかかわらず、正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスを含む）、および発生的および／または外的刺激に応答して、または組織特異的な方法で、遺伝子発現を変化させる追加の調節エレメント（すなわち上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）は、前述した用語に包含される。また古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列も上記用語の範囲に含まれ、この場合、−３５ボックス配列および／または−１０ボックス転写調節配列を含んでもよい。また、用語「調節エレメント」は、細胞、組織または器官で核酸分子を発現させ、発現を活性化または増強する合成融合分子または誘導体も包含する。本明細書で使用される用語「機能的に（operably）結合された」は、プロモーター配列及び目的の遺伝子間の機能的な結合をいい、それによりプロモーター配列は目的の遺伝子の転写を開始することができる。
【００７７】
有利なことに、プロモーターのどんなタイプも核酸配列の発現を駆動するのに用いられ得る。プロモーターは誘導性プロモーター、すなわち発生的、化学的、環境または物理的刺激に応答して転写の開始が誘導されまたは増大されるプロモーターであればよい。誘導性プロモーターの例は、ストレス誘導性プロモーター、すなわち植物が様々なストレス条件にさらされた場合に活性化されるプロモーターである。さらにまたはそれとは別に、プロモーターは組織選択プロモーター、すなわち葉、根、種子組織などの特定の組織で転写を選択的に開始できるプロモーターでもよい。特定の組織で転写を開始できるプロモーターのみを本明細書で「組織特異的」と言う。
【００７８】
好ましくは、ＳＹＴ核酸またはその変異体は構成的プロモーターと機能的に結合される。構成的プロモーターは殆どの間、しかし必ずしも全てではないが、生長および発達の段階で転写活性があり、実質的に普遍的に発現される。好ましくはプロモーターは植物由来、さらに好ましくは単子葉植物由来である。最も好ましくはＧＯＳ２プロモーター（イネ由来）（配列番号８９）の使用である。本発明の適用は、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示されるＳＹＴ核酸に限定されず、また本発明の適用は、ＧＯＳ２プロモーターにより駆動される場合、ＳＹＴ核酸の発現に限定されない。またＳＹＴ核酸の発現を駆動するために使用され得る他の構成的プロモーターの例を、以下の表４に示す。
【表４】
2008528014.tif 000007
【００７９】
また任意に、１つ以上のターミネーター配列を、植物に導入された構築物に使用してもよい。用語「ターミネーター」は、一次転写産物の３’プロセシング及びポリアデニル化並びに転写の終結を知らせる、転写単位の末端のＤＮＡ配列である制御配列を包含する。追加の調節エレメントは、翻訳エンハンサーだけでなく転写エンハンサーも含んでもよい。当業者であれば、本発明の実施で使用するのに適切でありうるターミネーター及びエンハンサー配列を認識しているであろう。このような配列は当業者に知られており、または容易に得ることができる。
【００８０】
更に、本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞型において維持及び／又は複製に必要とされる複製配列の開始点を含んでもよい。１つの例は、遺伝子構築物がエピソームの遺伝子エレメント（例えばプラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞に維持されることが必要とされる場合である。複製の好ましい開始点としてｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１が挙げられるが、これに限定されない。
【００８１】
遺伝子構築物は、任意に、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本明細書で使用されるように、用語「選択マーカー遺伝子」は、本発明の核酸構築物でトランスフェクトまたは形質転換された細胞の同定及び／又は選択を容易にするように発現される細胞に表現型を付与する遺伝子を含む。適切なマーカーは、抗生物質抵抗性または除草剤抵抗性を付与するマーカー、新しい代謝特性を導入するマーカー、或いは可視選択できるようにするマーカーから選択することができる。選択マーカー遺伝子の例として、抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子（例えばネオマイシン及びカナマイシンをリン酸化するｎｐｔII、またはハイグロマイシンをリン酸化するｈｐｔ）、除草剤に対して耐性を与える遺伝子（たとえばＢａｓｔａに対する耐性を与えるｂａｒ、グリホセートに対する耐性を与えるａｒｏＡまたはｇｏｘ）、または代謝特性を与える遺伝子（例えば植物が単一炭素源としてマンノースを使用できるようにするｍａｎＡ）が挙げられる。可視マーカー遺伝子は、色（例えばβ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）、発光（例えばルシフェラーゼ）または蛍光（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ及びその誘導体）の形成をもたらす。
【００８２】
また本発明は、本発明による方法で得ることができる植物を包含する。従って本発明は、本発明による方法で得ることができる植物、植物の部分および植物細胞を提供し、植物は、ＳＹＴ核酸またはその変異体をその中に導入され、また植物、植物の部分および植物細胞は、好ましくは作物由来、さらに好ましくは単子葉植物由来である。
【００８３】
また本発明は、植物におけるＳＹＴ核酸またはその変異体の導入および発現を含む、収量の増加したトランスジェニック植物の作製方法を提供する。
【００８４】
さらに具体的には、本発明は、好ましくは単子葉植物であって、収量が増加したトランスジェニック植物の作製方法を提供し、該方法は、
（ｉ）植物または植物細胞にＳＹＴ核酸またはその変異体を導入し、発現させること、および
（ｉｉ）植物の生長(growth)および発達(development)を促進する条件下で植物細胞を培養すること
を含む。
【００８５】
培養のステップ（ｉｉ）で得られた植物の次の世代（後代）は、例えばクローン増殖または古典的繁殖技術などの様々な方法によって繁殖させることができる。例えば、第１世代（またはＴ１）の形質転換された植物は、自家受粉してホモ接合性の第２世代（またはＴ２）の形質転換体を生じさせることができ、Ｔ２植物は古典的繁殖技術を介してさらに増殖される。
【００８６】
核酸は、植物細胞または植物自体に直接導入されてもよい（組織、器官または植物の他の部分への導入を含む）。本発明の好ましい特徴によれば、核酸は形質転換により植物に導入される。
【００８７】
本明細書で言及される用語「形質転換」は、宿主細胞への外来性のポリヌクレオチドの移入を包含し、移入に用いられる方法によらない。次のクローン増殖が可能な植物組織は、器官形成または胚形成のいずれによってもよいが、本発明の遺伝子構築物で形質転換されて、そこから完全な植物体に再生され得る。選択される具体的な組織は、形質転換される特定の種に用いることができ、かつその種に最も適しているクローン増殖システムに応じて変わるであろう。例えば標的となる組織として、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、現存の分裂組織（たとえば頂端分裂組織、腋芽分裂組織及び根分裂組織）及び誘発された分裂組織（たとえば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に過渡的に又は安定して導入することができ、ゲノムに組み込まれずに、例えばプラスミドとして、維持され得る。あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。得られた形質転換植物細胞は、次に、当業者に公知の方法で形質転換植物に再生するのに使用することができる。
【００８８】
植物種の形質転換は、今や完全に日常的な技術である。有利なことに、幾つかの形質転換の方法のいずれも、適切な始祖細胞に目的の遺伝子を導入するのに有利に使用できる。形質転換の方法として、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学物質、植物への直接的なＤＮＡ注入、パーティクルガンボンバードメント、ウイルスまたは花粉を使った形質転換及びマイクロプロジェクションの使用が挙げられる。方法は、プロトプラストのカルシウム／ポリエチレングリコール法（(Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373）；プロトプラストのエレクトロポレーション（Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102）；植物材料へのマイクロインジェクション（Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185）；ＤＮＡまたはＲＮＡ被覆パーティクルボンバードメント（Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70）；（非組み込みの）ウイルスの感染などから選択することができる。ＳＹＴ核酸／遺伝子を発現する形質転換イネ植物は、好ましくは、例えば以下のいずれかに説明される、イネの形質転換の周知の方法のいずれかを用いたアグロバクテリウムを介した形質転換を経由して作製される：公開欧州特許出願 EP 1198985 A1、AldemitaおよびHodges （Planta, 199, 612-617, 1996）；  Chanら、（Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993）、Hieiら（Plant J. 6 (2) 271-282, 1994）（これらの開示は、完全に記載されているように本明細書に参照により組み込まれる）。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、Ishidaら（Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996）、またはFrameら（Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002）のいずれかに記載されており、これらの開示は、完全に記載されているように本明細書に参照により組み込まれる。
【００８９】
一般的に形質転換後は、植物細胞または細胞集団は、目的の遺伝子と同時に移入された植物で発現可能な遺伝子によりコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択され、続いて形質転換された材料は完全な植物体に再生される。
【００９０】
ＤＮＡの移入及び再生後、形質転換されたと推定される植物を例えばサザン法を使って、目的の遺伝子の存在、コピー数および／またはゲノム組織について評価することができる。それとは別に又は追加して、新たに導入されたＤＮＡの発現レベルをノザンおよび／またはウエスタン法、定量的ＰＣＲを使ってモニターすることができ、そのような技術は当業者に周知である。
【００９１】
作製された形質転換植物は、様々な方法、例えばクローン増殖または古典的繁殖方法で増殖することができる。例えば、第１世代（またはＴ１）の形質転換された植物を自家受粉させて、ホモ接合性の第２世代（またはＴ２）形質転換体を得ることができ、更にＴ２植物を古典的繁殖技術によって増やすことができる。
【００９２】
作製された形質転換生物は多様な形をとることができる。例えば形質転換生物は、形質転換細胞と非形質転換細胞のキメラ、クローン形質転換体（例えば発現カセットを含むように形質転換された全ての細胞）、形質転換組織と非形質転換組織の移植片（例えば植物において、非形質転換の枝と接ぎ木された形質転換された台木）でもよい。
【００９３】
本発明は、明確に、本明細書で説明されたいずれかの方法で作製されたあらゆる植物細胞または植物、全ての植物部分及びその栄養繁殖体にまで拡張する。本発明は更に、上述のいずれかの方法で作製された、最初に形質転換又はトランスフェクトされた細胞、組織、器官または全植物体の後代を包含するよう拡張するが、ただ必要なのは、後代が、本発明の方法において親により作られたものと同じ遺伝子型及び／又は表現型の特徴を示すことである。また本発明は、単離されたＳＹＴ核酸またはその変異体を含む宿主細胞を含む。本発明の好ましい宿主細胞は植物細胞である。また本発明は、植物の収穫可能な部分、例えば種子、葉、果実、花、茎栽培物（stem culture）、根茎、塊茎、及び鱗茎に拡張するが、これらに限定されない。さらに、本発明はそのような植物の収穫可能な部分に由来する、好ましくは直接的に由来する生産物、例えば乾燥ペレットまたは粉末、穀粉、油、脂質および脂肪酸、デンプンまたはタンパク質などに関する。
【００９４】
また本発明は、ＳＹＴ核酸またはその変異体の使用、およびＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログの使用、および植物の収量の増加、特に種子の収量の増加について上記に定義された構築物の使用を含有する。種子の収量は、上記に定義されたとおりであり、好ましくは全体的な種子の収量の増加またはＴＫＷの増加を含む。
【００９５】
ＳＹＴ核酸またはその変異体、あるいはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、育種計画での使用を見出すことができ、ＳＹＴ遺伝子またはその変異体に遺伝的に関係し得るＤＮＡマーカーが同定される。ＳＹＴ核酸／遺伝子またはその変異体、あるいはＳＹＴポリペプチドまたはそのホモログは、分子マーカーを決定するために使用することができる。そして該ＤＮＡまたはタンパク質マーカーは、収量が増加した植物を選択する育種計画に使用することができる。ＳＹＴ遺伝子またはその変異体は、例えば以下のいずれかに示される核酸であり得る：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５および配列番号８７。
【００９６】
ＳＹＴ核酸／遺伝子のアレル変異体も、マーカーを使った育種計画での使用を見出すことができる。そのような育種計画は、場合によっては、例えばＥＭＳによる突然変異誘発を用いる植物の変異原性処理によるアレル変異の導入が必要である；あるいは上記計画は、意図せずに起こるいわゆる「天然」起源のアレル変異体を集めることから始めてもよい。次にアレル変異体の同定を例えばＰＣＲで行う。この後、問題となっている収量が増加した、配列の優れたアレル変異体を選択するステップが続く。選択は、一般的に、問題となる配列の異なるアレル変異体、例えば以下のいずれか１つの異なるアレル変異体を含む植物の生長パフォーマンスをモニタリングすることにより行われる：配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５および配列番号８７。生長パフォーマンスは温室または野外でモニタリングできる。さらに任意のステップとして、優れたアレル変異体が同定された植物を他の植物と交雑することを含む。これは、例えば興味ある表現型の特徴の組み合わせを作るために用いることができるであろう。
【００９７】
また、ＳＹＴ核酸またはその変異体は、遺伝子を遺伝的および物理的マッピングするためのプローブとして（プローブは前記遺伝子の一部である）、また前記遺伝子に関連した形質のためのマーカーとしても使用し得る。そのような情報は、所望の表現型を有する系統を開発するため、植物の育種に有用であり得る。そのようなＳＹＴ核酸またはその変異体の使用は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さの核酸配列のみを必要とする。ＳＹＴ核酸またはその変異体は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーとして使用できる。制限酵素で消化された植物ゲノムＤＮＡのサザンブロット(Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual)は、ＳＹＴ核酸またはその変異体を用いて精査することができる。そして得られたバンドパターンは、遺伝子マップを構築するため、ＭａｐＭａｋｅｒ(Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181)などのコンピュータープログラムを使った遺伝学的分析に掛けられる。さらに、前記核酸は、確定された遺伝的交雑の親および後代を代表する個体のセットの、制限酵素エンドヌクレアーゼで処理されたゲノムＤＮＡを含むサザンブロットを精査するために使用できる。ＤＮＡ多型の分離が注目され、該集団を用いて先に得られた遺伝子マップでのＳＹＴ核酸またはその変異体の位置を計算するために使用される(Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331)。
【００９８】
遺伝子マッピングに用いるための植物遺伝子由来のプローブの作製と使用は、Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41に説明されている。多数の刊行物が、上記に概略が説明された方法またはその変形を用いた具体的なｃＤＮＡクローンの遺伝子マッピングを説明している。例えば、Ｆ２交雑雑種の集団、戻し交雑の集団、ランダムに交雑した集団、ほぼ同質な遺伝子の系統、および他の個体のセットをマッピングに使用することができる。そのような方法は、当業者に周知である。
【００９９】
上記核酸は、物理マッピングに使用することもできる（すなわち物理的マップでの配列の配置；Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, およびそれに引用される文献を参照）。
【０１００】
別の実施形態において、核酸プローブは直接蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マッピング(Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154)に使用することができる。ＦＩＳＨマッピングの従来法では大きいクローンの使用が好ましいが（数ｋｂから数百ｋｂ；Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20を参照)、感度の向上により、短いプローブを使ったＦＩＳＨマッピングの実施が可能になるだろう。
【０１０１】
遺伝子および物理マッピングのための核酸増幅をベースにした様々な方法を、上記核酸を用いて行うことができる。例えば、アレル特異的増幅(Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96)、ＰＣＲ−増幅フラグメントの多型(CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332)、アレル特異的ライゲーション(Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080)、ヌクレオチド伸長反応(Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671)、放射線ハイブリッドマッピング(Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28)、Ｈａｐｐｙマッピング(Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807)が挙げられる。これらの方法において、核酸の配列は、増幅反応またはプライマー伸長反応に用いるためのプライマーペアを設計及び作製するために使用することができる。そのようなプライマーの設計は当業者に周知である。ＰＣＲをベースにした遺伝子マッピングを行う方法では、本願の核酸配列に対応する領域における、マッピング交差(mapping cross)の親間のＤＮＡ配列の違いを同定する必要があろう。しかしながら、これはマッピング法において一般的に必要ではない。
【０１０２】
本発明の方法によれば、上述したように、収量が増加した植物が得られる。これらの収量増加の特性は、他の経済的に有利な特性、例えば更なる収量増加の特性や、様々なストレスに対する耐性、様々な構造上の特徴および／または生化学的および／または生理的特徴を改変する特性などと組合せてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０３】
本発明は、添付の図面を参照して説明される。
【実施例】
【０１０４】
本発明を以下の実施例を参照して説明するが、説明のみを目的とする。
【０１０５】
ＤＮＡ操作：特に明記しない限り、組換えＤＮＡ技術はSambrook(2001) Molecular Cloning:a laboratory manual,3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York、またはAusubelら(1994),Volumes 1及び2,Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocolsに記載される標準的なプロトコルに従って行う。標準的な材料と植物分子研究の方法は、R.D.D. CroyのPlant Molecular Biology Labfase(1993)、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)及びBlackwell Scientific Publications(UK)出版に説明されている。
【０１０６】
実施例１：AtSYT1, AtSYT2およびAtSYT3の遺伝子クローニング
Arabidopsis thaliana AtSYT1遺伝子をシロイヌナズナシードリングｃＤＮＡライブラリー（Invitrogen, Paisley，英国）をテンプレートとして用いてＰＣＲで増幅した。実生から抽出したＲＮＡを逆転写後、ｃＤＮＡをｐＣＭＶ  Ｓｐｏｒｔ  ６．０にクローニングした。バンクの平均挿入体サイズは１．５ｋｂであり、クローンの最初の数は１．５９×１０７ｃｆｕ程度であった。最初の力価は９．６×１０５ｃｆｕ／ｍｌと測定され、最初の増幅後は６×１０１１ｃｆｕ／ｍｌと測定された。プラスミド抽出後、テンプレート２００ｎｇを５０μｌのＰＣＲミックスに使用した。プライマーｐｒｍ０６６８１  (配列番号９２; センス、開始コドンは太字、ＡｔｔＢ１部位はイタリックで示す):
【化１】
2008528014.tif 000008
【０１０７】
およびｐｒｍ０６６８２  （配列番号９３; リバース、相補的、ＡｔｔＢ２部位はイタリックで示す)
【化２】
2008528014.tif 000009
【０１０８】
（Ｇａｔｅｗａｙ組換えの上記ＡｔｔＢ部位を含む）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲはＨｉｆｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使って標準的な条件下で行った。７２７ｂｐ（ａｔｔＢ部位を含む）のＰＣＲフラグメントを増幅し、標準的な方法を用いて精製した。次に、Ｇａｔｅｗａｙ用語による「エントリークローン」ｐ０７４６６を作製するため、ＰＣＲフラグメントをin vivoでｐＤＯＮＲ２０１プラスミドを用いて組換える間、Ｇａｔｅｗａｙの手順の最初のステップのＢＰ反応を行なった。プラスミドｐＤＯＮＲ２０１はＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の一部として、Invitrogenから購入した。
【０１０９】
Arabidopsis thaliana AtSYT2遺伝子は、Arabidopsis thaliana AtSYT1遺伝子と同じ方法を用いてＰＣＲで増幅した。プライマーｐｒｍ０６６８５（配列番号９４；センス、開始コドンは太字、ＡｔｔＢ１部位はイタリックで示す）
【化３】
2008528014.tif 000010
【０１１０】
およびｐｒｍ０６６８６（配列番号９５）；リバース、終止コドンは太字、相補的、ＡｔｔＢ２部位はイタリックで示す）
【化４】
2008528014.tif 000011
【０１１１】
（Ｇａｔｅｗａｙ組換えの上記ＡｔｔＢ部位を含む）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲはＨｉｆｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使って標準的な条件下で行った。６６６ｂｐのＰＣＲフラグメント（ａｔｔＢ部位を含む）を上述のように増幅し、精製した。エントリークローンはｐ０７４６７とした。
【０１１２】
Arabidopsis thaliana AtSYT3遺伝子は、Arabidopsis thaliana AtSYT1およびAtSYT2遺伝子と同じ方法を用いてＰＣＲで増幅した。プライマーｐｒｍ０６６８３（配列番号９６；センス、開始コドンは太字、ＡｔｔＢ１部位はイタリックで示す)
【化５】
2008528014.tif 000012
【０１１３】
およびｐｒｍ０６６８４（配列番号９７；リバース、終止コドンは太字、相補的、ＡｔｔＢ２部位はイタリックで示す）
【化６】
2008528014.tif 000013
【０１１４】
（Ｇａｔｅｗａｙ組換えのＡｔｔＢ部位を含む）をＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲはＨｉｆｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使って標準的な条件下で行った。７４５ｂｐのＰＣＲフラグメント（ａｔｔＢ部位を含む）を上述のように増幅し、精製した。エントリークローンはｐ０７６０４とした。
【０１１５】
実施例２：ベクターの構築
続いて、エントリークローンｐ０７４６６、ｐ０７４６７およびｐ０７６０４を、ｐ００６４０（Oryza sativa（イネ）の形質転換に使用されるディスティネーションベクター）とのＬＲ反応に使用した。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡボーダー内に機能的エレメントとして、植物選択マーカー、植物スクリーナブルマーカー発現カセット及びエントリークローンにすでにクローニングされた目的の配列を有するＬＲ in vivo組換え用のＧａｔｅｗａｙカセットを含む。構成的発現（ＰＲＯ０１２９）のためのイネＧＯＳ２プロモーター（配列番号８９）を該Ｇａｔｅｗａｙカセットの上流に配置した。
【０１１６】
ＬＲ組換えステップ後、得られた発現ベクターを、それぞれAtSYT1についてはｐ０５２３、AtSYT2についてはｐ０５２４、AtSYT3についてはｐ０７６７とし(図５〜７参照)、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４０４４に形質転換し、続いてOriza sativa（イネ）植物に形質転換した。形質転換されたイネ植物は生長することができ、次に実施例３で説明するパラメーターについて試験した。
【０１１７】
実施例３：ＧＯＳ２プロモーターの制御下でのAtSYT1、AtSYT2およびAtSYT3の評価及び結果
約１５〜２０の独立したＴ０イネ形質転換体を作製した。初代の形質転換体を、生長させてＴ１種子を収穫するため、組織培養チャンバーから温室に移した。Ｔ１後代が３：１で導入遺伝子の存在／不存在に分離した、６つの事象が保持された。これらの各事象について、導入遺伝子（ヘテロ−及びホモ−接合体）を含む約１０本のＴ１実生、及び導入遺伝子を欠く（無接合体（nullizygote））約１０本のＴ１実生を、可視マーカーの発現をモニタリングすることにより選択した。
【０１１８】
統計学的分析：Ｆ−テスト
２つのファクターＡＮＯＶＡ（変異体の分析）を、植物の表現型の特性を全体的に評価するための統計学的モデルとして使用した。Ｆ−テストを、本発明の遺伝子で形質転換した全ての事象の全ての植物を測定する全てのパラメーターについて行った。Ｆ−テストは、全ての形質転換事象にわたって遺伝子の効果をチェックするため、及びグローバルな遺伝子効果としても知られる遺伝子の全体的な効果を証明するために行った。真のグローバルな遺伝子効果についての有意性の閾値は、Ｆ−テストについて５％確率レベルに設定した。有意なＦ−テスト値は遺伝子の効果を示し、表現型の違いを起こしている遺伝子の存在または位置のみだけではないことを意味する。
【０１１９】
種子に関連するパラメーターの測定
熟した初代の花序を収穫し、袋に入れ、バーコードを貼り、３７℃のオーブンで３日間乾燥させた。次に花序を脱穀し、全ての種子を集めて数えた。空気を吹き付ける装置を使って、充実した外皮(husk)を空の外皮と分離した。空の外皮は廃棄し、残りの画分を再び数えた。充実した外皮を化学天秤で秤量した。充実した種子の数を、分離ステップ後に残った充実した外皮の数を数えることにより決定した。全体的な種子の収量を、植物から収穫された全ての充実した外皮を秤量することにより測定した。植物当たりの全種子の数を、植物から収穫された外皮の数を数えることにより測定した。千粒重（ＴＫＷ）を、数えた充実した種子の数とそれらの全重量から推定する。
【０１２０】
個々の種子のパラメーター（幅、長さ、面積、重量を含む）を２つの主要な構成要素、すなわち画像分析用のソフトウエアを連結した撮像装置および秤量装置からなるオーダーメイドの装置を使って測定した。
【０１２１】
３．１  温室で生長した形質転換植物の全体的な種子の収量およびＴＫＷ測定の結果
Ｔ１世代のAtSYT1、AtSYT2およびAtSYT3のトランスジェニック植物における全種子収量およびＴＫＷ測定の結果を表５〜７にそれぞれ示す。いずれかのパラメーターで増加した系統の数を示す。トランスジェック体と、対応する無接合体（nullizygote）との間のパーセンテージの差と、ＦテストからのＰ値を示す。
【０１２２】
全体的な種子の収量およびＴＫＷの両方が、AtSYT1、AtSYT2およびATSYT3のトランスジェニック植物のＴ１世代で有意に増加する（それぞれ表５〜７を参照）。
【表５】
2008528014.tif 000014
【表６】
2008528014.tif 000015
【表７】
2008528014.tif 000016
【０１２３】
３．２ Ｔ２世代のAtSYT1トランスジェニック植物の種子の大きさの測定結果
個々の種子パラメーター（幅、長さおよび面積）を、Ｔ２植物の種子について、２つの主要な構成要素、すなわち画像分析用のソフトウエアを連結した撮像装置および秤量装置からなるオーダーメイドの装置を使って、測定した。測定は、外皮を除去および除去しない種子の両方について行った。
【０１２４】
Oryza sativa AtSYT1トランスジェニック植物のＴ３種子（Ｔ２植物から収穫）の個々の種子面積、長さおよび幅の測定（平均）の結果を、表８に示す。トランスジェニック体と、対応する無接合体との間のパーセンテージの差と、特定のパラメーターで増加した事象の数とＦテストからのｐ値を示す。
【０１２５】
Ｔ３の外皮を除去および除去しない種子（Ｔ２の形質転換Oryza sativa AtSYT1植物から収穫）の個々の種子の面積、長さおよび幅の平均は、そのヌル対応物と比較して、全て有意に増加した。
【表８】
2008528014.tif 000017
【０１２６】
３．３  Ｔ２世代のAtSYT1トランスジェニック植物の種子の胚および胚乳の大きさの測定結果
胚および胚乳の大きさも、外被を除去しない種子を縦方向に半分に切り、着色料の塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムで３５℃、２〜３時間染色することにより、測定した。染色後、２個の半分に切った種子を画像用に準備したペトリ皿のアガロースゲル上に置いた。３つの独立した事象を選び、各事象から導入遺伝子のホモ接合の１２０個の種子と導入遺伝子の無い１２０個の種子を分析した。種子のデジタル写真を撮り、画像をImageProソフトウエアで分析した。３つの事象の結果を以下に示す。
【０１２７】
３つの全ての事象について、導入遺伝子のホモ接合性の種子の胚は、導入遺伝子無しの種子の胚よりも大きかった。３つの事象のそれぞれの種子の胚の平均面積に有意な増加があり、ｔ−テストのｐ値は０．０３２５、＜０．０００１および＜０．０００１であった。同様に、３つの事象のそれぞれの種子の胚の平均周囲長に有意な増加があり、ｔ−テストのｐ値は０．０１７６、＜０．０００１および＜０．０００１であった。さらに、３つの事象のそれぞれの種子における胚乳の平均面積および周囲長に有意な増加があり、すべてにおいてｐ値は＜０．０００１であった。
【０１２８】
３．４  野外で生長したAtSYT1トランスジェニック植物のＴＫＷの測定結果
AtSYT1ホモ接合性トランスジェニック植物とそれに対応する対照植物を９月に野外に移植し、１２月に収穫した。各項目（４つの事象）について１回あたり１０４本の植物を、４回反復して植えた。植物の間隔は２０ｃｍ×２０ｃｍにした。地面を冠水させ灌注させた。種子の収穫後、上述のようにＴＫＷについて種子を測定した。これらの測定結果を表９に示す。
【表９】
2008528014.tif 000018
【０１２９】
ＴＫＷは野外で評価されたすべての遺伝子導入事象で増加する。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】植物および哺乳動物のＳＹＴポリペプチドの一般的なドメイン構造を示す。保存されたＳＮＨドメインは、前記タンパク質のＮ末端に位置する。前記タンパク質ドメインのＣ末端の残部は、植物ＳＹＴポリペプチドのＱＧ−リッチドメインから、および哺乳動物ＳＹＴポリペプチドのＱＰＧＹ−リッチドメインからなる。Ｍｅｔ−リッチドメインは一般的に、植物のＱＧ−リッチ（Ｎ末端からＣ末端まで）または哺乳動物のＱＰＧＹ−リッチの最初の半分に含まれる。第２のＭｅｔ−リッチドメインは、植物ＳＹＴポリペプチドのＳＮＨドメインの前にあり得る。
【図２】数種のＳＹＴポリペプチドのＮ末端のマルチプルアラインメントを示し、gap opening penaltyが１０、gap extensionが０．０５のデフォルト設定で、改変されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づく、ＶＮＴＩ  ＡｌｉｇｎＸマルチプルアラインメントプログラムを用いた。ＳＮＨドメインは、植物及びヒトＳＹＴポリペプチドを横断するようにボックスで囲まれている。アラインメントの最後の行は、整列された配列に由来するコンセンサス配列からなる。
【図３−１】数種の植物ＳＹＴポリペプチドのマルチプルアラインメントを示し、gap opening penaltyが１０、gap extensionが０．０５のデフォルト設定で、改変されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム(InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com)に基づく、ＶＮＴＩ  ＡｌｉｇｎＸマルチプルアラインメントプログラムを用いた。Ｎ末端からＣ末端までの２つの主要ドメインはボックスで囲まれ、ＳＮＨドメインとＭｅｔ−リッチ／ＱＧ−リッチドメインと同定される。さらに、Ｎ末端のＭｅｔ−リッチドメインもボックスで囲まれ、配列番号９０および配列番号９１の位置が太線でアンダーラインされている。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図３−３】図３−２の続きである。
【図３−４】図３−３の続きである。
【図３−５】図３−４の続きである。
【図３−６】図３−５の続きである。
【図３−７】図３−６の続きである。
【図４】ＣＬＵＳＴＡＬＷ  １．８３(http://align.genome.jp/sit-bin/clustalw)を用いて複数のＳＹＴポリペプチドのアラインメントから得られた近隣結合系統樹を示す。ＳＹＴ１及びＳＹＴ２／ＳＹＴ３クレードはブラケットで示される。
【図５】ＧＯＳ２プロモーター（内部参照ＰＲＯ０１２９）の制御下にあるArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ） AtSYT1のOryza sativa（イネ）での発現のための、バイナリーベクターｐ０５２３を示す。
【図６】ＧＯＳ２プロモーター（内部参照ＰＲＯ０１２９）の制御下にあるArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ） AtSYT2のOryza sativa（イネ）での発現のための、バイナリーベクターｐ０５２４を示す。
【図７】ＧＯＳ２プロモーター（内部参照ＰＲＯ０１２９）の制御下にあるArabidopsis thaliana（シロイヌナズナ） AtSYT3のOryza sativa（イネ）での発現のための、バイナリーベクターｐ０７６７を示す。
【図８−１】本発明の方法を行うのに有用な配列の例を詳述する。ＳＹＴ核酸配列は、開始から終止まで示される。これらの配列の大部分は、ＥＳＴ配列決定からのものであり、質が低い。従って核酸の置換がありうる。
【図８−２】図８−１の続きである。
【図８−３】図８−２の続きである。
【図８−４】図８−３の続きである。
【図８−５】図８−４の続きである。
【図８−６】図８−５の続きである。
【図８−７】図８−６の続きである。
【図８−８】図８−７の続きである。
【図８−９】図８−８の続きである。
【図８−１０】図８−９の続きである。
【図８−１１】図８−１０の続きである。
【図８−１２】図８−１１の続きである。
【図８−１３】図８−１２の続きである。
【図８−１４】図８−１３の続きである。
【図８−１５】図８−１４の続きである。
【図８−１６】図８−１５の続きである。
【図８−１７】図８−１６の続きである。
【図８−１８】図８−１７の続きである。
【図８−１９】図８−１８の続きである。
【図８−２０】図８−１９の続きである。
【図８−２１】図８−２０の続きである。
【図８−２２】図８−２１の続きである。
【図８−２３】図８−２２の続きである。
【図１】
2008528014.tif 000019
【図２】
2008528014.tif 000020
【図３−１】
2008528014.tif 000021
【図３−２】
2008528014.tif 000022
【図３−３】
2008528014.tif 000023
【図３−４】
2008528014.tif 000024
【図３−５】
2008528014.tif 000025
【図３−６】
2008528014.tif 000026
【図３−７】
2008528014.tif 000027
【図４】
2008528014.tif 000028
【図５】
2008528014.tif 000029
【図６】
2008528014.tif 000030
【図７】
2008528014.tif 000031
【図８−１】
2008528014.tif 000032
【図８−２】
2008528014.tif 000033
【図８−３】
2008528014.tif 000034
【図８−４】
2008528014.tif 000035
【図８−５】
2008528014.tif 000036
【図８−６】
2008528014.tif 000037
【図８−７】
2008528014.tif 000038
【図８−８】
2008528014.tif 000039
【図８−９】
2008528014.tif 000040
【図８−１０】
2008528014.tif 000041
【図８−１１】
2008528014.tif 000042
【図８−１２】
2008528014.tif 000043
【図８−１３】
2008528014.tif 000044
【図８−１４】
2008528014.tif 000045
【図８−１５】
2008528014.tif 000046
【図８−１６】
2008528014.tif 000047
【図８−１７】
2008528014.tif 000048
【図８−１８】
2008528014.tif 000049
【図８−１９】
2008528014.tif 000050
【図８−２０】
2008528014.tif 000051
【図８−２１】
2008528014.tif 000052
【図８−２２】
2008528014.tif 000053
【図８−２３】
2008528014.tif 000054
【配列表】
2008528014000001.app
【国際調査報告】
2008528014.tif 000055
2008528014.tif 000056
2008528014.tif 000057