(57)【要約】本教示は、リガンドと複合体化したシトクロームタンパク質の結晶の三次元構造に関する。４のシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造を開示する。リガンドがインヒビター分子である、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド結晶構造は、薬剤スクリーニングおよび薬剤デザイン・プロセスに組み込み得る構造情報を提供するのに有用である。したがって、本教示は、シトクロームタンパク質のインヒビターを同定し、デザインし、選択しまたは試験するためのシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の結晶構造を利用する方法にも関する。かかるインヒビターは、ｉ）疾患；ｉｉ）疾患症状；またはｉｉｉ）シトクロームによって媒介される他の生理学的事象の効果の治療またはモデュレーションのための治療剤として有用である。
2008542391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行うことによってシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のインヒビターを選択し；ついで
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む試料とインヒビターとを接触させる
ことを含む、少なくとも１の医薬上活性な化合物の不活性化速度を低下する方法。
【請求項２】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が、少なくとも１の医薬上活性な化合物を用いた治療を必要とするヒト患者に含まれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１の医薬上活性な化合物が、クマリン、ハロセイン、レトロゾール、ロシガモン、（＋）−シス−３,５−ジメチル−２−（３−ピリジル）チアゾリン−４−オン塩酸塩（ＳＭ−１２５０２）、バルプロ酸、ジスルフィラムおよび８−メトキシソラレンよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
リガンドが結晶に含まれるソラレンである請求項１記載の方法。
【請求項５】
結晶に含まれるソラレンが、結晶に含まれる８−メトキシソラレンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
リガンドが結晶に含まれるクマリンである請求項１記載の方法。
【請求項７】
結晶に含まれるクマリンが、結晶に含まれる１,２−ベンゾピロンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
選択することが、
（ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行って候補インヒビターを同定し；
（ｂ）候補インヒビターとシトクロームＰ４５０  ２Ａ６とを接触させ；
（ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出する
ことを含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６がヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行うことによってシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のインヒビターを選択し；ついで
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む試料または対象とインヒビターとを接触させる
ことを含む、少なくとも１の発癌前駆物質の活性化を阻害する方法。
【請求項１１】
対象が治療を必要とするヒト対象である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１の発癌前駆物質がＮ'−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１の発癌前駆物質が４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）である請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
リガンドがソラレンである請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
ソラレンが８−メトキシソラレンである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
リガンドがクマリンである請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
クマリンが１,２−ベンゾピロンである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
選択することが、
（ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行って候補インヒビターを同定し；
（ｂ）候補インヒビターとシトクロームＰ４５０  ２Ａ６とを接触させ；
（ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出する
ことを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６がヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６である請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
インヒビターがシトクロームＰ４５０  ２Ａ６に対して指向された抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含むシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造をデジタル・コンピュータ上に提供し；ついで
（ｂ）デジタル・コンピュータに含まれるソフトウェアを用いて、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６に結合することが予想される化学化合物をデザインする
ことを含む、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の活性を妨害する薬剤をデザインする方法。
【請求項２３】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
さらに、
（ａ）化学化合物を合成し；ついで
（ｂ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の活性を妨害する能力について化学化合物を評価する
ことを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
リガンドがソラレンである請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
ソラレンが８−メトキシソラレンである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
リガンドがクマリンである請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
クマリンが１,２−ベンゾピロンである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
化学化合物をシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の構造の三次元部位に参照した計算相互作用によってデザインし、ここに三次元部位がPhe107、Phe111、Phe118、Phe209、Phe480、Val117、Asn297、Ile300、Gly301、Thr305、Ile366、Leu370およびそれらの組合せよりなる群から選択されるシトクロームＰ４５０  ２Ａ６アミノ酸を含む請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
さらに、デジタル・コンピュータに含まれるソフトウェアを用いて、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６以外のシトクロームＰ４５０に結合しないことが予想される化学化合物をデザインすることを含む請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６以外のシトクロームＰ４５０が、シトクロームＰ４５０  ２Ｃ８、シトクロームＰ４５０  ２Ｃ９、シトクロームＰ４５０  ３Ａ４およびそれらの組合せよりなる群から選択されるシトクロームＰ４５０である請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）参照シトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチドのアミノ酸配列およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体に含まれる標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列を提供し；
（ｂ）参照シトクロームＰ４５０ファミリー２のアミノ酸配列と標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列との間に共有される構造的に保存された領域を同定し；ついで
（ｃ）保存された領域からの原子座標を標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体に割り当てる
ことを含む、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造のモデルを生成する方法。
【請求項３６】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体が、表１または表２に記載の原子座標によって記載される三次元構造を有する請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体が、表４または表５に記載の原子座標に実質的に適合する原子座標によって記載される三次元構造を有する請求項３５記載の方法。
【請求項４２】
参照シトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチドが、表３に記載する原子座標に実質的に適合する原子座標によって記載される三次元構造を有するシトクローム２Ｃ８である請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列を提供し；
（ｂ）折り畳み認識アルゴリズムを用いて三次元コンフォメーションにおけるアミノ酸配列の折り畳みのパターンを予想し；ついで
（ｃ）標的構造アミノ酸配列の折り畳みのパターンと公知のシトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチド−リガンド複合体の三次元構造とを比較する
ことを含む、標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造を決定する方法。
【請求項４４】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６が実質的に配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
公知のシトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチド−リガンド複合体が、表３に記載するシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８の原子座標に実質的に適合する原子座標によって記載される三次元構造を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
公知のシトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチドが、シトクロームＰ４５０  ２Ｃ８、シトクロームＰ４５０  ２Ａ７およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ１３よりなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項５０】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶。
【請求項５１】
リガンドがソラレンである請求項５０記載の結晶。
【請求項５２】
ソラレンが８−メトキシソラレンである請求項５１記載の結晶。
【請求項５３】
結晶が寸法ａ＝７０.６６オングストローム、ｂ＝１５９.０３オングストローム、ｃ＝１０３.８８オングストロームおよびβ＝９２.００の単位格子を形成するように空間群Ｐ２１を含む請求項５２記載の結晶。
【請求項５４】
リガンドがクマリンである請求項５０記載の結晶。
【請求項５５】
クマリンが１,２−ベンゾピロンである請求項５４記載の結晶。
【請求項５６】
結晶が寸法ａ＝７０.６２オングストローム、ｂ＝１５７.５９オングストローム、ｃ＝１０３.５４オングストロームおよびβ＝９２.２５の単位格子を形成するように空間群Ｐ２１を含む請求項５５記載の結晶。
【請求項５７】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む結晶であって、ここに結晶が約２.０５オングストロームの分解能までのＸ線回折によって複合体の原子座標を決定するのに十分に純粋である該結晶。
【請求項５８】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドが８−メトキシソラレンである請求項５７記載の結晶。
【請求項５９】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む結晶であって、ここに結晶が約１.９０オングストロームの分解能までのＸ線回折によって複合体の原子座標を決定するのに十分に純粋である該結晶。
【請求項６０】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドが１,２−ベンゾピロンである請求項５９記載の結晶。
【請求項６１】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６によるタバコ発癌性物質の活性化を阻害する治療化合物であって、ここに化合物はａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行い；ｂ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む試料を化合物と接触させ；ついで、ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出する、ことによって選択する該治療化合物。
【請求項６２】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造の三次元コンピュータ像であって、ここに構造が表１、表２、表４または表５に記載する三次元座標と実質的に適合する該三次元コンピュータ像。
【請求項６３】
表１、表２、表４または表５に記載する一連の三次元座標をコードするコンピュータ読み取り可能な媒体であって、ここに、グラフィカル・ディスプレー・ソフトウェア・プログラムを用いて、表１、表２、表４または表５の三次元座標が、三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化することができる電子ファイルを生成する該コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項６４】
表１、表２、表４または表５に表す三次元座標に実質的に適合する三次元構造の一連の三次元座標をコードするコンピュータ読み取り可能な媒体であって、ここに、グラフィカル・ディスプレー・ソフトウェア・プログラムを用いて、一連の三次元座標が、三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化することができる電子ファイルを生成する該コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項６５】
シトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリー・メンバーおよびシトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリー・メンバーのリガンドを含む結晶を形成する方法であって、
シトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリー・メンバー、リガンド、水および非イオン性洗浄剤を含む組成物を形成し；ついで
硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールを含む溶液を組成物に加える
ことを含む該方法。
【請求項６６】
非イオン性洗浄剤がポリオキシエチレン非イオン性洗浄剤である請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
シトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリー・メンバーがシトクロームＰ４５０  ２Ａ６であって、シトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリー・メンバーのリガンドがシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドである請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
リガンドがソラレンである請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
ソラレンが８−メトキシソラレンである請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
リガンドがクマリンである請求項６５記載の方法。
【請求項７１】
クマリンが１,２−ベンゾピロンである請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
タバコ喫煙の中止を促進する方法であって、
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行うことによってシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のインヒビターを選択し；ついで
有効量のインヒビターを、それを必要とするヒト個人に投与する
ことを含む該方法。
【請求項７３】
さらに、個人にニコチンを投与することを含む請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
個人にニコチンを投与することが、ニコチンを経口的に投与することを含む請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
さらに、少なくとも１のタバコ発癌前駆物質の活性化を阻害する方法を含み、有効量のインヒビターを投与することが、タバコ喫煙の中止を促進し、および、少なくとも１のタバコ発癌前駆物質の活性化を阻害する双方に有効な量を投与することを含む請求項７２記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１のタバコ発現前駆物質が、Ｎ'−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）およびそれらの組合せよりなる群から選択される請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドが、結晶に含まれるソラレンである請求項７２記載の方法。
【請求項７８】
結晶に含まれるソラレンが、結晶に含まれる８−メトキシソラレンである請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドが、結晶に含まれるクマリンである請求項７２記載の方法。
【請求項８０】
結晶に含まれるクマリンが、結晶に含まれる１,２−ベンゾピロンである請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
選択することが、
ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行って候補インヒビターを同定し；
ｂ）候補インヒビターをシトクロームＰ４５０  ２Ａ６と接触させ；ついで
ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出する
ことを含む請求項７２記載の方法。
【請求項８２】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６がヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６である請求項７２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体で出典明示して本明細書の一部とみなす２００５年６月１日に出願された米国仮特許出願番号６０／６８６，９４８からの優先権を主張する。
連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
【０００２】
本発明は、一部、国立衛生研究所  助成金ＧＭ３１００１および米国臨床試験センター  助成金Ｍ01 RR00833下、政府の支援によってなされた。政府は、本発明におけるある種の権利を有する。
コンパクトディスクで提出する材料の参照による取り込み
【０００３】
本願明細書開示の一部分である配列表には、本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含むコンピュータ読み取り可能な形式および手書きの配列表が含まれる。コンピュータ読み取り可能な形式で記録した配列表情報は、手書きの配列表と同一のものである。配列表の主題事項は、その全体で出典明示して本明細書の一部とみなす。
【背景技術】
【０００４】
本発明は、種々のリガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６の三次元構造およびモデル、ならびにその使用に関する。
【０００５】
ヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６、生体異物代謝Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ニコチン解毒に寄与する主要な酵素である。ニコチン（図１）は、タバコ依存の確立および維持に寄与するタバコ生成物中の主要な嗜癖因子である。対立遺伝子の差異から生じるシトクロームＰ４５０  ２Ａ６媒介ニコチン代謝における個人的な変動は、ニコチンのバイオアベイラビリティーを変化し、喫煙行動に影響を与えることができる。さらに、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６インヒビターであるメソキサレン（８−メトキシソラレン、図１）を用いた志願者の処理は、ニコチンの経口アベイラビリティーを増大させ、喫煙を減少する。
【０００６】
シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は、７−ヒドロキシル化生成物、ウンベリフェロンに選択的に酸化されるクマリン（１,２−ベンゾピロン、図１）；(+)-シス-3,5-ジメチル-2-(3-ピリジル)チアゾリジン-4-オン塩酸塩(SM-12502)；ファドロゾール；およびロシガモンのような医薬化合物を含む数多くの比較的小さい基質分子を酸化する。さらに、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は、プロドラッグ、テガフールから抗新生物剤、５−フルオロウラシルへの変換を触媒する。
【０００７】
また、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は、（ＮＮＮ）Ｎ'−ニトロソノルニコチン４および４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）のようなタバコ特異的な発癌性物質も活性化して、それらを突然変異誘発性の生成物に変換する。日本人集団における最近の研究は、減じられた活性を有するシトクロームＰ４５０  ２Ａ６ をコードするいくつかの対立遺伝子の少なくとも１つを有する個人がタバコ関連肺ガンの顕著に低い発生を示すことを実証した。この効果は、２Ａ６＊４欠損対立遺伝子についてホモ接合体である個人において最も顕著であった。さらに、イン・ビボ(in vivo)の研究は、インヒビターであるメソキサレンを用いたシトクロームＰ４５０  ２Ａ６活性の阻害が、顕著に多くのＮＮＫを不活性ＮＮＡＬグルクロニド・コンジュゲートに代謝しつつニコチンのレベルを高いまま許容することを示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
減じられた シトクロームＰ４５０  ２Ａ６活性は、薬剤代謝に対する明らかに有害な効果を引き起こすことなく、タバコ関連肺ガンにおける減少と相関しているようである。しかしながら、関連するコンフォメーション変化の詳細な観察は未解決のままである。したがって、疾患の治療または診断の有用な試薬の開発は、シトクロームＰ４５９、および特にシトクローム−リガンド複合体の構造情報の欠落によって妨げられている。したがって、三次元構造およびシトクローム−リガンド複合体のモデルを明らかにし、ドラッグ・デザインのような治療戦略における構造およびモデルのような使用に対する当該分野における要望が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明者らは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のようなシトクロームＰ４５０によって不活性化された医薬上活性な化合物の不活性化速度を減少する薬剤をデザインする方法を開発した。同様にして、本発明者らは、少なくとも１つの発癌前駆物質の活性化を阻害する方法を開発した。これらの方法は、種々の配置で、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行うことによってシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のインヒビターを選択し；ついで、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む試料または対象とインヒビターとを接触させることを含む。対象は、いくつかの配置において、医薬上活性な化合物の不活性化速度を減少し、少なくとも１つの発癌前駆物質またはその組合せの活性化を阻害することを含む治療を必要とするヒト患者とし得る。さらに、種々の態様において、対象とインヒビターとを接触させることは、インヒビターをヒト対象に投与することを含み得る。不活性化を阻害し得る医薬上活性な化合物のいくつかの例は、限定するものではないが、１,２−ベンゾピロン、ハロセイン、レトロゾール、ロシガモン、（＋）−シス−３，５−ジメチル−２−（３−ピリジル）チアゾリジン−４−オン塩酸塩(SM-12502)、バルプロ酸、ジスルフィラムおよび８−メトキシソラレンを含む。その活性化を阻害し得る発癌前駆物質の例は、限定するものではないが、Ｎ'−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）および４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−ブタノン（ＮＮＫ）のようなある種のタバコ発癌前駆物質を含み得る。
【００１０】
本明細書の教示の種々の配置において、結晶によって構成されるシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドは、８−メトキシソラレン（メソキサレン）のようなソラレンとし得る。ある種の別の配置において、リガンドは、１,２−ベンゾピロンのようなクマリンとし得る。また、選択することは、ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行って候補インヒビターを同定すること；ｂ）候補インヒビターとシトクロームＰ４５０  ２Ａ６とを接触させること；およびｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出すること、を含み得る。本発明の教示の種々の態様において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６はヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６とし得る。また、いくつかの配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６インヒビターは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６に対して向けられたモノクローナル抗体のようなシトクロームＰ４５０  ２Ａ６に対して指向された抗体とし得る。
【００１１】
本発明の教示の種々の態様において、本発明者らは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の活性を妨害する薬剤をデザインする方法を開発した。これらの方法は、（ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のリガンドを含むシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造をデジタル・コンピュータ上に提供し；ついでｂ）デジタル・コンピュータによって構成されるソフトウェアを用いてシトクロームＰ４５０  ２Ａ６に結合することが予想される化学化合物をデザインすることを含む。これらの方法は、さらに、（ｃ）化学化合物を合成または得ること；および（ｄ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の活性を妨害する能力についてその化学化合物を評価することを含む。いくつかの配置において、方法は、さらに、デジタル・コンピュータによって構成されるソフトウェアを用いてシトクロームＰ４５０  ２Ａ６に結合するのみならず、例えば、シトクロームＰ４５０  ２Ｃ８、シトクロームＰ４５０  ２Ｃ９および／またはシトクロームＰ４５０  ３Ａ４のような他のシトクロームＰ４５０タンパク質にも結合すると予想される化学化合物をデザインすることを含み得る。
【００１２】
これらの態様の種々の配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなることができ、配列番号：２に記載したアミノ酸配列から実質的になることができ、あるいは、配列番号：２に記載したアミノ酸配列を含むことができる。これらの態様の種々の別の配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなることができ、配列番号：３に記載のアミノ酸配列から実質的になることができ、あるいは、配列番号：３に記載したアミノ酸配列を含むことができる。
【００１３】
これらの態様において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドは、８−メトキシソラレンのようなソラレン、または１,２−ベンゾピロンのようなクマリンとすることができる。また、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドは、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標））とすることができる。さらに、これらの態様において、化学化合物は、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の構造の三次元サイトに参照した計算相互作用によってデザインすることができ、ここに三次元サイトはPhe107、Phe111、Phe118、Phe209、Phe480、Val117、Asn297、Ile300、Gly301、Thr305、Ile366、Leu370およびそれらの組合せよりなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【００１４】
本教示のある種の態様において、本発明者らは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造のモデルを生成する方法を開発した。これらの態様において、方法は、（ａ）参照シトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチドのアミノ酸配列およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体によって構成される標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列を提供し；（ｂ）参照シトクロームＰ４５０ファミリー２アミノ酸配列および標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６アミノ酸配列の間で共有される構造的に保存された領域を同定し；および（ｃ）標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体に対して保存された領域からの原子座標を割り当てることを含み得る。これらの態様においてシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列は、前記のようにすることができる。これらの態様において、標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体は、表１（８−メトキシソラレンと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６の座標を記載している）または表２（１,２−ベンゾピロンと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６の座標を記載している）に記載する原子座標と実質的に適合する原子座標によって記載する三次元構造を有することができる。さらに、参照シトクロームＰ４５０は、いくつかの配置において、表３に記載する原子座標と実質的に適合する原子座標によって記載される三次元構造を有するシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８とすることができる。また、標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体は、表４（（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６の座標を記載している）または表５（４,４’−ジピリジルジスルフィドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６の座標を記載している）に記載する原子座標と実質的に適合する原子座標によって記載する三次元構造を有することができる。
【００１５】
本教示のある種の態様において、本発明者らは、標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造を決定する方法を開発した。いくつかの態様の種々の配置において、方法は、（ａ）標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列を提供し；（ｂ）折り畳み認識アルゴリズムを用いて三次元コンフォメーションにおけるアミノ酸配列の折り畳みのパターンを予測し；ついで（ｃ）標的構造アミノ酸配列と公知のシトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチド−リガンド複合体の三次元構造のフォールディングのパターンを比較することを含み得る。これらの態様における標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ６のアミノ酸配列は前記することができ、公知のシトクロームＰ４５０ファミリー２ポリペプチド−リガンド複合体は表３に記載するシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８の原子座標に実質的に適合する原子座標によって記載される三次元構造を含み得、あるいはシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８、シトクロームＰ４５０  ２Ａ７およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ１３よりなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列とすることができる。
【００１６】
本教示の種々の態様において、本発明者らは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶を開示する。これらの態様のある種の配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドは８−メトキシソラレンのようなソラレンとすることができ、結晶は寸法ａ＝７０.６６オングストローム、ｂ＝１５９.０３オングストローム、ｃ＝１０３.８８オングストロームおよびβ＝９２.００の単位格子を形成するような空間群Ｐ２１を含み得る。別の配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６は、１,２−ベンゾピロンのようなクマリンとすることができ、結晶は寸法ａ＝７０.６２オングストローム、ｂ＝１５７.５９オングストローム、ｃ＝１０３.５４オングストロームおよびβ＝９２.２５の単位格子を形成するような空間群Ｐ２１を含み得る。
【００１７】
本教示の他の態様において、本発明者らは、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む結晶を開発し、ここに結晶は、約２.０５オングストロームの分解までのＸ線回折によって複合体の原子座標を決定するのに十分に純粋である。これらの態様のいくつかの配置において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドは８−メトキシソラレン、１,２−ベンゾピロン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン）または４,４'−ジピリジルジスルフィドとすることができる。別の配置において、結晶は、約１.９０オングストロームの分解までのＸ線回折によって複合体の原子座標を決定するのに十分に純粋とすることができる。
【００１８】
本教示のいくつかの態様において、本発明は、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６によるタバコ発癌性物質の活性化を阻害する治療化合物を含む。これらの態様において、化合物は、ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行い、ｂ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６を含む試料を化合物と接触させ、ついで、ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１の活性の阻害を検出する、ことによって選択し得る。いくつかの態様において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の活性は、タバコ発癌性物質の活性化とすることができる。
【００１９】
本教示のある種の態様は、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造の三次元コンピュータ像を含む。これらの態様において、構造は、表１、表２、表４または表５に掲載した三次元座標と実質的に一致し得る。
【００２０】
本教示のある種の態様は、表１、表２、表４または表５に掲載した一連の三次元座標をコードしたコンピュータ読み取り可能な媒体を含む。これらの態様において、表１、表２、表４または表５に掲載した三次元座標は、グラフィカル・ディスプレー・ソフトウェアプログラムと結合して用いて、三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化し得る電子ファイルを生成することができる。
【００２１】
本教示のある種の態様は、表１、表２、表４または表５に表示する三次元座標に実質的に適合する三次元構造の一連の三次元座標をコードするコンピュータ読み取り可能な媒体を含む。これらの態様において、グラフィカル・ディスプレー・ソフトウェアプログラムを用いれば、一連の三次元座標を用いて、三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化し得る電子ファイルを生成することができる。
【００２２】
本教示のいくつかの態様は、シトクロームＰ４５０  ２ＡサブファミリーメンバーおよびシトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリーメンバーのリガンドを含む結晶を形成する方法を開示する。種々の配置において、これらの方法は、シトクロームＰ４５０  ２Ａサブファミリーメンバー、リガンド、水および非イオン性洗浄剤を含む組成物を形成し；ついで、硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールを含む溶液を組成物に添加することを含むことができる。種々の配置において、非イオン性洗浄剤は、限定するものではないが、ＡＮＡＰＯＥ（登録商標）−Ｘ−４０５非イオン性洗浄剤のようなポリオキシエチレン非イオン性洗浄剤とすることができる。種々の態様において、シトクロームＰ４５０  ２ＡサブファミリーメンバーはシトクロームＰ４５０  ２Ａ６とすることができ、シトクロームＰ４５０  ２ＡサブファミリーメンバーリガンドはシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドとすることができる。前記したように、これらの配置におけるリガンドは、８−メトキシソラレンのようなソラレン、または１,２−ベンゾピロンのようなクマリンとすることができる。
【００２３】
本教示の種々の態様において、本発明者らは、タバコ喫煙の中止を促進する方法を開発した。これらの態様の方法は、前記したもののようなシトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ６リガンドを含む結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行うことによってシトクロームＰ４５０  ２Ａ６のインヒビターを選択し、ついで、それを必要とするヒト個人に有効量のインヒビターを投与することを含むことができる。種々の態様において、方法は、さらに、個人にニコチンを投与することを含むことができる。ニコチンを投与することには、ニコチンを個人に経口的に投与することを含むことができる。種々の態様において、方法は、さらに、少なくとも１のタバコ発癌前駆物質の活性化を阻害する方法をさらに含むことができる。これらの態様において、有効量のインヒビターを投与することは、タバコ喫煙の中止を促進し、および、少なくとも１つのタバコ発癌前駆物質の活性化を阻害する両方に有効な量を投与することを含むことができる。また、いくつかの配置において、タバコ発癌前駆物質は、Ｎ'−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４−（メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）またはそれらの組合せのようなシトクロームＰ４５０  ２Ａ６によって活性化することができる発癌性物質とすることができる。ある種の態様において、選択することは、ａ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の結晶について決定した三次元構造を用いて構造に基づく薬剤デザインを行って候補インヒビターを同定し、ｂ）候補インヒビターをシトクロームＰ４５０  ２Ａ６と接触させ、ついで、ｃ）シトクロームＰ４５０  ２Ａ６の少なくとも１つの活性の阻害を検出することを含むことができる。さらに、これらおよび本明細書に記載する他の態様において、シトクロームＰ４５０  ２Ａ６はヒト・シトクロームＰ４５０  ２Ａ６とすることができる。
【００２４】
本教示のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明、実施例および添付する特許請求の範囲に参照してより良好に理解されるであろう。
【００２５】
図面
図１．ＣＹＰ２Ａ６リガンド、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、ニコチン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４’−ジピリジルジスルフィドの化学構造。
【００２６】
図２．ＣＹＰ２Ａ６（左）およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８（右）の全体折り畳みの２の図。
【００２７】
図３．ＣＹＰ２Ａ６（左）およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８（右）のＣα軌跡重複の２の図。
【００２８】
図４．ヘリックスＧ領域に対するＣＹＰ２Ａ６ヘリックスＢ'およびヘリックスＦ'の間の安定化相互作用の２の斜視立体図。
【００２９】
図５．ＣＹＰ２Ａ６活性部位の孔の２の図。
【００３０】
図６．ヘムおよびクマリンのσＡ加重（weighted）２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図。
【００３１】
図７．ヘムおよびメソキサレンのσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図。
【００３２】
図８．ＣＹＰ２Ａ６のクマリン（ａ）およびメソキサレン（ｂ）の重ね合わせ構造を示す２の図。
【００３３】
図９．クマリン、ポリペプチド鎖およびヘリックスＢ'後のターン中に結合した保存された水分子とAsn297の潜在的な水素結合の斜視立体図。
【００３４】
図１０．シトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびヘム配合団基の間の相互作用の２の斜視立体図。
【００３５】
図１１．活性部位に結合した（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン（左）および４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標））（右）とＣＹＰ２Ａ６の複合体に対するリガンドの１σで輪郭を付け１.５オングストローム以内にしたσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜omit電子密度マップ。
【００３６】
図１２．ＣＹＰ２Ａ６と４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標）（ＡＬＤ））の相互作用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本教示は、種々のリガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０  ２Ａ６（「ＣＹＰ２Ａ６」）（各々の複合体は「シトクロームＰ４５０  ２Ａ６−リガンド複合体」または「シトクローム−リガンド複合体」と個別にいう）の三次元構造の発見、かかる三次元構造のモデル、かかる構造を用いた構造に基づく薬剤デザインの方法、かかる方法によって同定した化合物ならびに治療組成物におけるかかる化合物の使用に関する。特に、本教示は、リガンドであるクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４’−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６の新規な結晶；かかる結晶の生成の方法；かかるＣＹＰ２Ａ６−リガンド複合体の三次元座標；ＣＹＰ２Ａ６−リガンド複合体の三次元構造；ならびに他のシトクローム−リガンド複合体構造を導くためおよび薬剤デザイン戦略におけるかかる構造およびモデルの使用に関する。
【００３８】
本教示の１の態様は、モデルがシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を表すシトクローム−リガンド複合体のモデルを含む。本教示のもう１の態様は、各々、ＣＹＰ２Ａ６−メソキサレン複合体、ＣＹＰ２Ａ６−クマリン複合体、ＣＹＰ２Ａ６−（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン）複合体およびＣＹＰ２Ａ６−（４,４'−ジピリジルジスルフィド）複合体に対応する表１、表２、表４または表５に表す原子座標と実質的に適合するシトクローム−リガンド複合体の三次元構造のようなシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を含む。本教示において、「実質的に適合する」なる用語は、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造を、シトクローム−リガンド複合体の三次元構成を規定する原子座標を決定するための基礎として特定の一連の原子座標を用いてシトクローム−リガンド複合体の三次元構造のモデル化または計算することを許容するための、特定の一連の原子座標（例えば、表１、表２、表４または表５によって表されるもの）の特定した三次元構成の少なくとも一部分に十分に空間的に類似するシトクローム−リガンド複合体の三次元構造の少なくとも一部分をいう。
【００３９】
より詳細には、所定の一連の原子座標に実質的に適合する構造は、かかる構造の少なくとも約５０％が各ドメインにおいて二次構造要素中の骨格原子について約１.８オングストローム未満の、および種々の態様において、各ドメインにおいて二次構造要素中の骨格原子について約１.２５オングストローム未満の、および種々の態様において、各ドメインにおいて二次構造要素中の骨格原子について約１.０オングストローム未満の、他の態様において、各ドメインにおいて二次構造要素中の骨格原子について約０.７５オングストローム未満の、約０.５オングストローム未満の、および約０.２５オングストローム未難の平均標準偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造である。本教示の１の態様において、所定の一連の原子座標に実質的に適合する構造は、かかる構造の少なくとも約７５％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する、いくつかの態様において、かかる構造の少なくとも９０％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する、ならびにいくつかの態様において、かかる構造の約１００％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する構造である。特に、「実質的に適合する」の前記定義は、アミノ酸側鎖の原子を含むように拡大し得る。本明細書中で用いるように、「共通アミノ酸側鎖」なる句は、所定の一連の原子座標に実質的に適合する構造およびかかる原子座標によって実際に表される構造の両方に共通するアミノ酸側鎖をいう。
【００４０】
本教示のもう１の態様において、所定の一連の原子座標に実質的に適合する三次元構造は、共通アミノ酸側鎖の少なくとも５０％が約１.８オングストローム未満の平均ＲＭＳＤを有する構造であり、種々の態様においては約１.２５オングストローム未満、他の態様においては約１.０オングストローム未満、約０.７５オングストローム未満、約０.５オングストローム未満、および約０.２５オングストローム未満の平均ＲＭＳＤを有する構造である。本教示の１の態様において、所定の一連の原子座標に実質的に適合する構造は、共通アミノ酸側鎖の少なくとも約７５％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する、およびいくつかの態様において、共通アミノ酸側鎖の少なくとも約９０％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する、およびいくつかの態様において、共通アミノ酸側鎖の約１００％が引用した平均ＲＭＳＤ値を有する構造である。
【００４１】
特定した一連の原子座標に実質的に適合するシトクローム−リガンド複合体の三次元構造は、例えば、以下のデータ：（１）シトクローム−リガンド複合体のアミノ酸配列；（２）三次元構成を有する特定した一連の原子座標によって表されるタンパク質の関連部分（または複数の関連部分）のアミノ酸配列；および（３）特定した三次元構成の原子座標、から導かれた情報を用いて、MODELER  (Accelerys (San Diego, Calif.)から入手可能なInsight II software package Insight IIに備えられた、A. SaliおよびT.L. Blundell, J. Mol. Biol., vol. 234:779-815, 1993）および実施例に掲載したたソフトウェア・パッケージのような好適なモデリング・コンピュータ・プログラムによってモデル化することができる。特定した一連の原子座標に実質的に適合するシトクローム−リガンド複合体の三次元構造は、以下に詳細に記載する、分子置換のような方法によって計算することもできる。
【００４２】
もう１のシトクローム−リガンド複合体の三次元構造をモデル化または計算するのに使用するシトクローム−リガンド複合体の好適な三次元構造は、表１、表２、表４または表５に表す一連の原子座標を含む。表１、表２、表４および表５に記載する一連の三次元座標は、標準的なProtein Data Bank様式で表す。本教示によれば、シトクローム−リガンド複合体は、表１、表２、表４および／または表５によって表される一連の原子座標に実質的に適合する三次元構造を有する。本明細書中で用いるように、三次元構造は一連の原子座標と最もありそうな、または重要な合致とすることもできる。本教示によれば、最もありそうなまたは重要な合致とは、特定のシトクローム−リガンド複合体が特定のシトクローム−リガンド複合体から導き出した一連の原子座標を有する合致をいう。かかる原子座標は、例えば、本明細書に提供するシトクローム−リガンド複合体構造について決定した座標のようなタンパク質の結晶構造から、またはタンパク質の構造のモデルから導き出し得る。例えば、天然発生または組換え作製したシトクロームＰ４５０タンパク質を含む、単量体または多量体タンパク質の三次元構造は、表１、表２、表４および／または表５の原子座標に実質的に合致し、最もありそうに合致し、または顕著に合致する。シトクローム−リガンド複合体の三次元結晶構造は、表１、表２、表４または表５の原子座標を含むことができる。また、例として、もう１のシトクローム−リガンド複合体の三次元構造が表１、表２、表４および／または表５の原子座標と実質的に適合することは、当業者により理解されるであろう。この定義は、同様にして他のシトクロームＰ４５０タンパク質にもあてはめることができる。
【００４３】
本教示の種々の態様において、シトクローム−リガンド複合体の構造は、表１、表２、表４および／または表５に表した原子座標に実質的に適合する。表１、表２、表４および／または表５に掲載したかかる値は、当業者によって解釈し得る。他の態様において、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造は、表１、表２、表４および／または表５に表す三次元座標に実質的に適合する。他の態様において、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造は、表１、表２、表４および／または表５に表す三次元座標と最もありそうに合致する。実質的に適合するおよびありそうに合致することを決定する方法は、当業者の範囲内であり、実施例セクションにおいて本明細書に記載している。
【００４４】
表１、表２、表４および／または表５によって表される原子座標に実質的に適合する三次元構造を有するシトクローム−リガンド複合体は、真核生物ＣＹＰ２Ａ６タンパク質のアミノ酸配列、特にＣＹＰ２Ａ６タンパク質配列の完全長を横切る、配列番号：２または配列番号：３を有するアミノ酸配列に対して少なくとも約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を有するシトクロームＰ４５０タンパク質を含む。BLAST（National Institutes of Health Internet web site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTから入手可能である）のような配列アライメント・プログラムは、ＣＹＰ２Ａ６タンパク質の配列を他のシトクロームＰ４５０タンパク質の配列と比較するために当業者によって使用され得る。
【００４５】
いずれのシトクローム−リガンド複合体の三次元構造も、シトクローム−リガンド複合体結晶の分析から、およびシトクローム−リガンド複合体結晶から導き出される他のシトクローム−リガンド複合体構造から得られる情報に基づいて当該技術分野で一般的に知られている方法を用いてモデル化することができる。以下の実施例セクションは、シトクローム−リガンド複合体結晶、特にクマリンと複合体化したＣＹＰ２Ａ６、メソキサレンと複合体化したＣＹＰ２Ａ６、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンと複合体化したＣＹＰ２Ａ６、４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６の作製、ならびにシトクロームＰ４５０  ２Ａ−リガンド複合体のモデル、特にシトクロームＰ４５０  ２Ａ６  ２Ａ−リガンド複合体結晶の分析から得た情報を用いたクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６の三次元構造を開示する。本教示の態様は、結晶シトクロームＰ４５０  ２−リガンド複合体の三次元構造を用いて、もう１のシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を導き出すことを含む。したがって、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化した結晶ＣＹＰ２Ａ６、および、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６の三次元構造は、ここで当業者がいずれかのシトクロームＰ４５０−リガンド複合体の三次元構造およびそのモデルを導き出すことを許容する。いずれのシトクローム−リガンド複合体の構造の導き出しは、ここで、かかる他のシトクローム−リガンド複合体について結晶構造データを有していなくても達成することができ、もう１のシトクローム−リガンド複合体の結晶構造が入手可能な場合は、シトクローム−リガンド複合体構造からすでに得られている知識を用いて新しいシトクローム−リガンド複合体の三次元構造のモデリングを正確にすることができる。
【００４６】
本教示のいくつかの構成において、他のシトクローム−リガンド複合体の結晶構造データの不存在、他のシトクローム−リガンド複合体のアミノ酸配列における差異を考慮しつつ、他のシトクローム−リガンド複合体の三次元構造をモデル化することができる。さらに、本教示は、実質的にいずれのシトクロームＰ４５０、特にＣＹＰ２ファミリーメンバー、より特にはＣＹＰ２Ａサブファミリーメンバー、および最も特にはヒトＣＹＰ２Ａ６のようなＣＹＰ２Ａ６の活性に影響する化合物の構造に基づく薬剤デザインを許容する。
【００４７】
本教示の１の態様は、シトクローム−リガンド複合体の原子座標を（ａ）結晶形状のリガンドと複合体化したシトクロームＰ４５０を準備し；（ｂ）リガンドと複合体化した結晶シトクロームＰ４５０の電子密度マップを作製し；ついで（ｃ）電子密度マップを分析して原子座標を作成する、ことを含む方法によって作成するシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を含む。例えば、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したヒトＣＹＰ２Ａ６の構造を本明細書に提供する。
【００４８】
いくつかの態様において、クマリンとの複合体のＣＹＰ２Ａ６の結晶は、ＣＹＰ２Ａ６、クマリンおよび非イオン性洗浄剤を含むタンパク質溶液と、ポリエチレングリコール・ポリマー、緩衝液および硫酸アンモニウムを含む結晶化溶液とを混合することによって調製することができる。高分解のデータセットをこれらの結晶から収集することができる。同様にして、ＣＹＰ２Ａ６−メソキサレン複合体の結晶は、ＣＹＰ２Ａ６、メソキサレンおよび非イオン性洗浄剤を含むタンパク質溶液と、ポリエチレングリコール・ポリマー、緩衝液および硫酸アンモニウムを含む結晶化溶液とを混合することによって調製することができる。（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィド結晶は、同様にして調製することができる。これらの方法によって調製した結晶を用いて初期データセットを生成することができる。
【００４９】
本教示の種々の態様において、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６のＸ−線回折データは、当業者によく知られている方法を用いて個々の結晶上で収集することができる。いくつかの構成において、クマリン複合体の初期データは、非均等側鎖をアラニン残基で置換するＣＹＰ２Ｃ８（ＰＤＢ受理番号１ＰＱ２）のモデルを用いたＡＭｏＲｅの分子置換によってＰ２１空間群に組み込むことができる。いくつかの構成において、他の複合体の初期データは、ＣＹＰ２Ａ６のモデル（表２、Protein DataBank受理番号１Ｚ１０）を用いた同形物置換によってＰ２１空間群に組み込むことができる。データを精密にするために、４倍ＮＣＳ制限（restrain）を非対称ユニットの単量体の各々に当てはめることができる。精密化の後期ステージの間に、ＮＣＳ制限を開放して、単量体の各々における差を許容する。例えば、初期クマリン複合体のモデルは、ねじれをシミュレートしたアニーリングの複数のラウンドを用いて約２.６５オングストロームのデータに対してさらに精密化することができる。最終ステージにおいては、等方性の個々のＢ−要素正確化を用いることができる。発明のいくつかの態様において、このようにして生成したモデルを用いて、高分解クマリン複合体についてのデータセットを組み込み、それをさらに構築および用いてメソキサレン・データセットを組み込むことができる。種々の態様において、クマリンおよびメソキサレン複合体のモデルは、CNS（Brunger, A. T.ら, Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1998, 54 (Pt 5), 905-921）のようなコンピュータ・プログラムを用いた接合傾斜最小二乗最小化（conjugant gradient least-squares minimization）、ねじれ角をまねたアニーリングおよび等方性の個々のＢ−要素精密化の複数のラウンドを用いて２.０５オングストロームおよび１.９０オンぐるとロームのようなデータに対して精密化することができる。クマリンおよびメソキサレン複合体の精密化の最終ステージの間に、リガンド、基質および水分子を加えることができる。σＡ−加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜、１｜Ｆｏ｜−｜ｆｃ｜および２｜Ｆｏ｜−｜ｆｃ｜組成omitマップへのモデルの編集および調節の複数のサイクルはグラフィック・プログラムＯ (Jones, T. A.およびKjeldgaard, M. Electron-Density Map Interpretation. Methods Enzymol. 1997, 277, 173-208)を用いて行うことができる。いくつかの構成において、分子グラフィックは、PyMOL（DeLano Scientific, LLC (South San Francisco, Calif.; pymol.sourceforge.net)から入手可能）のようなコンピュータ・プログラムを用いて作成することができる。プローブがアクセスし得る穴の体積は、VOIDOO  (Tan,Y.Z.ら, Competitive interactions between CYP2A6 and cytochrome P450 2E1 for NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the microsomal membranes produced by a baculovirus expression system. Arch. Biochem. Biophys. 342, 82-91 (1997))のようなコンピュータ・プログラムの支援でもって計算することができる。これらの計算においては、１.４オングストロームのようなプローブの半径および０.３３オングストロームのような格子間隔を用いることができる。
【００５０】
本教示によれば、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６タンパク質の三次元構造を用いて、もう１つのシトクローム−リガンド複合体の三次元構造（すなわち、モデル化するべき構造）のモデルを導き出すことができる。本明細書中で用いるタンパク質の「構造」とは、タンパク質を構成するための要素および要素のアライメントの様式をいう。本明細書中で用いる「モデル」なる用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの三次元構造の実体的媒体での表示をいう。例えば、モデルは電子ファイルの、コンピュータ・スクリーン上、一片の紙（すなわち、２次元の媒体）および／またはボール−スティック図としての三次元構造の表示とすることができる。物理的三次元モデルは有形であり、限定するものではないが、スティック・モデルおよび空間充填モデルを含む。「コンピュータ・スクリーン上にモデルをイメージする」なる句は、当業者に知られている適当なコンピュータ・ハードウェアおよびソフトウェア技術を用いてコンピュータ・スクリーン上にモデルを発現（または表示）するおよび操作する能力をいう。かかる技術は、例えばAccelerys, Inc. (San Diego, Calif.)を含む種々の源から入手可能である。「モデルの写真を提供する」なる句は、モデルの「ハードコピー」を生成する能力をいう。ハードコピーには、動画および静止画の両方が含まれる。モデルのコンピュータ・スクリーン像および写真は、空間充填表示、α−炭素軌跡（trace）、リボン図および電子密度マップを含む多くの様式で視覚化し得る。
【００５１】
本教示の方法を用いてモデル化する好適な標的シトクローム−リガンド複合体の構造は、クマリンまたはメソキサレン、例えば、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６タンパク質に対して実質的に構造的に関係するシトクロームＰ４５０タンパク質の単量体および多量体を含む、いずれのシトクロームＰ４５０タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。種々の態様において、異なるシトクローム−リガンド複合体に実質的に構造的に関係する標的シトクローム−リガンド複合体構造は、ヒトＣＹＰ２Ａ６タンパク質のような真核生物ＣＹＰ２Ａ６タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を有する、特に配列番号：２または配列番号：３のような本明細書に記載する配列を含む、実質的にからなる、またはからなるアミノ酸配列を有する標的シトクローム−リガンド複合体構造を含むことができる。これらの構成において、BLAST（前掲）のような配列アライメント・プログラムを用いて分析において支援し得る。本教示の種々の態様において、モデル化するための標的シトクローム−リガンド複合体構造は、BLAST（前掲）のようなアライメント・プログラムを用いてアミノ酸配列を整列した場合に、アミノ酸配列のいずれか１のリガンドまたは基質結合サイトのアミノ酸配列のような配列の好適な領域を比較した場合に、アミノ酸配列配列番号：２または配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含む。
【００５２】
本教示の種々の構成において、構造は、例えば、Sali, Current Opinions in Biotechnology, vol. 6, pp. 437-451, 1995によって一般的に記載される技術を用いてモデル化することができ、Accelerys (San Diego, Calif.)から入手可能なInsight IIのようなプログラム・パッケージでアルゴリズムを実行することができる。Insight II  HOMOLOGYの使用には、モデル化すべき標的構造のアミノ酸配列のアライメントを必要とする。アライメントは、（例えば、Rost, Meth. Enzymol., vol.266, pp.525-539, 1996によって一般的に記載されている方法を用いて）他の関連配列を含む一対のアライメントまたは複数の配列アライメントとして、精度を改善することができる。構造的に保存された領域は、関係する構造特徴を比較することによって、または公知の構造および標的構造の間の配列同一性の程度を調べることによって同定することができる。標的構造のある種の座標は、公知の構造からの公知の構造を用いて割り当てることができる。標的構造の他の領域の座標は、Protein Data Bankのような供給源に見出されるもののような公知の構造から得られるフラグメントから生成することができる。標的構造の側鎖のコンフォメーションは、（PonderおよびRichards, J. Mol. Biol., vol. 193, pp. 775-791, 1987に一般的に記載されているように）何が立体的に許容し得るかを参照して、および、ロタマーのライブラリーおよびその出現の頻度を用いて割り当てることができる。標的構造の得られたモデルは、分子メカニクスによって精密化して、モデルが化学的およびコンフォメーション的に合理的であることを確かめることができる。
【００５３】
したがって、本教示の１の態様は、（ａ）シトクローム−リガンド複合体のアミノ酸配列および標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０のアミノ酸配列を提供し；（ｂ）シトクローム−リガンド複合体のアミノ酸配列と標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０のアミノ酸配列との間に共有されている構造的に保存された領域を同定し；（ｃ）標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０の該構造的に保存された領域を、表１または表２に表した原子座標に実質的に適合する原子座標に基づくシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を用いて三次元構造に割り当てて標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０アミノ酸配列の三次元構造のモデルを導き出す
工程を含む、標的シトクロームＰ４５０  ２Ａ−リガンド複合体構造の三次元構造のモデルを導き出す方法である。１の態様において、本教示のモデルは、コンピュータ・モデルを含む。コンピュータ・モデルの作成は、いくつかの構成において、電子的にシミュレートした構造割り当てを含んで、標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０  ２Ａアミノ酸配列の三次元構造のコンピュータ・モデルを導き出すことができる。
【００５４】
本教示のもう１の態様は、結晶が生成されている（本願明細書中においては「結晶化標的構造」という）標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０  ２Ａ構造の三次元構造のコンピュータ・モデルを導き出す方法である。かかるモデルを生成する好適な方法は、分子置換を含む方法を含む。分子置換の方法は一般的に当業者に知られており、例えば、Accelerys (San Diego, Calif.)から入手可能なX-PLORを含むソフトウェア・プログラムで行う。種々の態様において、本教示にかかる分子置換の方法において有用な結晶化標的リガンド複合体化シトクロームＰ４５０構造は、２のアミノ酸配列をBLAST（前掲）のようなアライメント・プログラムを用いて比較した場合に、サーチ構造（例えば、ＣＹＰ２Ａ６）のアミノ酸配列に対して少なくとも約25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を有する。本教示の好適なサーチ構造は、表１、表２、表４または表５に掲載した原子座標と実質的に合致する三次元構造を有するシトクローム−リガンド複合体を含む。
【００５５】
本教示のもう１の態様は、標的シトクローム−リガンド複合体の三次元構造を決定する方法である。かかる方法は、標的構造の三次元構造のみに基づくシトクローム−リガンド複合体の三次元構造に関係する構造を同定するのに有用である。例えば、本方法は、ＣＹＰ２Ａ６タンパク質と高いアミノ酸配列同一性を有しないが、リガンド−複合体化ＣＹＰ２Ａ６の三次元構造類似性を共有する構造の同定を可能にする。本教示の種々の態様において、標的シトクローム−リガンド複合体構造の三次元構造を決定する方法は：
（ａ）標的構造のアミノ酸配列を提供し、ここに標的構造の三次元構造は知られておらず；（ｂ）折り畳み認識によって三次元コンフォメーションでアミノ酸配列の折り畳みのパターンを分析し；および
（ｃ）標的構造アミノ酸配列とシトクローム−リガンド複合体の三次元構造の折り畳みのパターンを比較して標的構造の三次元構造を決定し、ここにシトクローム−リガンド複合体の三次元構造は表１、表２、表４および／または表５に表す原子座標に実質的に適合すること
を含むことができる。例えば、折り畳み認識の方法は、Jones, Curr. Opinion Struc. Biol., vol. 7, pp. 377-387, 1997に一般的に記載されている方法を含むことができる。かかる折り畳みは、標的構造の疎水性および／または親水性特性に基づいて分析することができる。
【００５６】
本教示の１の態様は、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造の三次元コンピュータ像を含む。１の態様において、コンピュータ像は、表１、表２、表４および／または表５に掲載する三次元座標と実質的に適合する構造に作成する。本教示のコンピュータ像は、限定するものではないが、PyMOL（前掲）を含むいずれか好適なソフトウェア・プログラムを用いて作成することができる。本教示の像を作成するのに有用な好適なコンピュータ・ハードウェアは当業者に知られている。
【００５７】
本教示のもう１の態様は、表１、表２、表４および／または表５に表わす一連の三次元座標をコードしたコンピュータ読み取り可能な媒体に関し、ここにグラフィカル・ディスプレイ・ソフトウェア・プログラムを用いれば、三次元座標は三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化し得る電子ファイルを作成する。本教示のいまだもう１の態様は、表１、表２、表４および／または表５に表す三次元座標に実質的に適合する三次元構造の一連の三次元座標をコードするコンピュータ読み取り可能な媒体に関し、ここに、グラフィカル・ディスプレイ・ソフトウェア・プログラムを用いれば、一連の三次元座標は、三次元像として電子ファイルを表示することができるコンピュータ上に視覚化し得る電子ファイルを作成する。
【００５８】
また、本教示は、標的構造の三次元構造の三次元モデルも含み、かかる三次元モデルは、
（ａ）シトクローム−リガンド複合体により構成されるシトクロームＰ４５０のアミノ酸配列および標的シトクローム−リガンド複合体構造のアミノ酸配列を提供し；（ｂ）シトクロームＰ４５０アミノ酸配列および標的シトクローム−リガンド複合体構造によって構成されるアミノ酸配列との間で共有される構造的に保存された領域を同定し；（ｃ）標的シトクローム−リガンド複合体の構造的に保存された領域を、表１、表２、表４および／または表５に表す原子座標に実質的に適合する原子座標に基づいてシトクローム−リガンド複合体によって構成されるシトクロームＰ４５０の三次元構造を用いて、三次元構造に割り当てることによって標的シトクローム−リガンド複合体の原子座標を決定して、標的シトクローム−リガンド複合体の三次元構造のモデルを導き出すことを含む方法によって作成する。１の態様において、モデルはコンピュータ・モデルを含む。
【００５９】
いずれの単離したシトクロームＰ４５０タンパク質も、本教示の方法で用いることができる。単離したシトクロームＰ４５０タンパク質は、その自然環境から単離することができ、あるいは組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて生成することができる。組換えシトクロームＰ４５０タンパク質を作製するためには、シトクロームＰ４５０をコードする核酸分子を、核酸分子を宿主細胞にデリバリーすることができるいずれかのベクターに挿入することができる。本教示の核酸分子は、シトクロームＰ４５０タンパク質のいずれかの部分、種々の態様において完全長シトクロームＰ４５０タンパク質、および種々の態様においてシトクロームＰ４５０タンパク質の可溶性形態（すなわち、かかるタンパク質を産生する細胞によって分泌されることができるシトクロームＰ４５０タンパク質の形態）をコードすることができる。組換えベクター、および特に組換え分子に含める好適な核酸分子は、配列番号：２または配列番号：３によって表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００６０】
組換えベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれか、および典型的にはウイルスまたはプラスミドとすることができる。種々の態様において、シトクロームＰ４５０タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクターを含むベクターに挿入して組換え分子を形成する。本明細書中で用いる発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ、特定の核酸分子の発現に影響することができるＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。本教示の発現ベクターには、細菌、糸状菌、内部寄生者、昆虫、他の動物、および植物細胞を含む本教示の組換え細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を指示する）いずれのベクターも含む。
【００６１】
発現ベクターはいずれか好適な宿主細胞に形質転換して、組換え細胞を形成することができる。好適な宿主細胞は、発現ベクターに挿入した核酸分子を発現することができるいずれの細胞も含む。例えば、原核細胞発現ベクターは、細菌宿主細胞に形質転換することができる。リガンド複合体化シトクロームＰ４５０結晶を生成するのに有用なシトクロームＰ４５０タンパク質を単離する１の方法は、かかるシトクロームＰ４５０を発現している組換え細胞の細胞培養物から組換えタンパク質を回収することを含む。
【００６２】
本教示のシトクロームＰ４５０タンパク質は、限定するものではないが、アフィニティー・クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび異なる溶解性のような種々の標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができる。本教示の種々の態様において、シトクロームＰ４５０タンパク質は、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造に関係する情報を得るのに有用な結晶の形成にタンパク質が十分に精製されるように精製する。いくつかの態様において、シトクロームＰ４５０タンパク質の組成物は、約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%純粋である。
【００６３】
本教示のもう１の態様は、結晶形でシトクローム−リガンド複合体（すなわち、シトクローム−リガンド複合体結晶）を含む組成物を含む。本明細書中で用いる「結晶シトクローム−リガンド複合体」および「シトクローム−リガンド複合体結晶」は両方とも、結晶化されたシトクローム−リガンド複合体をいい、相互変換可能に用いることを意図する。本教示の種々の態様において、結晶シトクローム−リガンド複合体は、実施例に記載する結晶形成方法を用いて作成する。
【００６４】
特に、本教示は、結晶形でクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化したＣＹＰ２Ａ６（すなわち、リガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６結晶）を含む組成物を含む。本明細書において用いる「結晶リガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６」および「リガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６結晶」なる用語は、両方とも、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体化した結晶化ＣＹＰ２Ａ６をいう。これらの用語は、相互変換可能に用いることを意図する。本教示の種々の態様において、結晶リガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６は、実施例に記載した結晶形成方法を用いて生成する。いくつかの態様において、本教示の組成物は、寸法ａ＝７０．６２オングストローム、ｂ＝１５７．５９オングストローム、ｃ＝１０３．５４オングストローム、およびβ＝９２．２５°（ＣＹＰ２Ａ６−クマリン）またはａ＝７０．６６オングストローム、ｂ＝１５９．０３オングストローム、ｃ＝１０３．８８オングストロームおよびβ＝９２．００°（ＣＹＰ２Ａ６−メソキサレン)の単位格子寸法を形成するような空間群Ｐ２１の結晶様式で並んだリガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６分子を含む。
【００６５】
本教示の好適な結晶は、約４.２オングストローム、およびいくつかの態様において約３.０オングストローム、および他の態様において約１.５オングストロームの分解能までリガンド複合体化ＣＹＰ２Ａ６の原子座標を決定するためのＸ線回折データを提供する。
【００６６】
本教示の態様によれば、結晶シトクローム−リガンド複合体を用いて、結晶シトクローム−リガンド複合体を用いて、本教示の構造に基づく薬剤デザイン法によって予想されるようなシトクロームＰ４５０に結合する本教示の化合物の能力を決定することができる。本教示の種々の態様において、シトクローム−リガンド複合体結晶は、本教示の化学化合物を含有する溶液に浸漬する。ついで、結晶に対する化学化合物の結合は、本明細書の実施例セクションに提供するもののような当該技術分野で標準的な方法によって決定する。
【００６７】
本教示の１の態様は治療組成物である。本教示の治療組成物は、１またはそれを超える治療化合物を含む。１の態様において、シトクロームＰ４５０を含む治療組成物を提供し、それは喫煙中止を促進する。例えば、本教示の治療組成物は、シトクロームＰ４５０の結合サイトを妨害することによって例えばシトクロームＰ４５０リガンドまたは基質に対するシトクロームＰ４５０を有する細胞（例えば、真核生物細胞）上のシトクロームＰ４５０の結合を阻害する（すなわち、妨げる、ブロックする）ことができる。本明細書で用いる「結合サイト」なる用語は、もう１の分子が特異的に結合する分子の領域をいう。本教示の１の態様において、治療有効量の本教示の治療組成物を喫煙中止を必要とする対象に投与することを含む対象における喫煙中止を誘導する方法を提供する。
【００６８】
本教示の好適な阻害化合物は、シトクロームＰ４５０と、および種々の態様においてＣＹＰ２Ａ６タンパク質と直接的に相互作用し、それによって、シトクロームＰ４５０の結合サイトをブロッキングすることによってシトクロームＰ４５０に対するシトクロームＰ４５０リガンドまたは基質、例えばクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドの結合を阻害する（本明細書中において基質アナログという）。シトクロームＰ４５０基質アナログは、シトクロームＰ４５０の結合サイトと相互作用する（例えば、それに結合する、それと会合する、それを修飾する）化合物をいう。シトクロームＰ４５０基質アナログは、例えば、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン、４,４’−ジピリジルジスルフィドまたはシトクロームＰ４５０の結合サイトのもう１のリガンドまたは基質を模倣する化学化合物を含み得る。
【００６９】
本教示によれば、本教示の好適な治療化合物は、ペプチドまたは他の有機分子および無機分子を含む。好適な有機分子は、小さい有機分子を含む。種々の態様において、本教示の治療化合物は、かかる化合物を動物に投与した場合に動物に対して有害（例えば、毒性）でない。ペプチドとは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50kDa未満であって加水分解時に２またはそれを超えるアミノ酸を与える化合物のクラスをいう。ポリペプチドは２またはそれを超えるペプチドからなる。本明細書中で用いるタンパク質は、１またはそれを超えるポリペプチドからなる。デザインする好適な治療化合物は、直鎖状または分岐鎖構成の、正常またはレトロインバーソ（retroinverso）ペプチドとして形つくられる「Ｌ」および／または「Ｄ」アミノ酸からなるペプチド、ペプチドミメティック化合物、小さい有機分子、またはそれらのホモもしくはヘテロポリマーを含む。
【００７０】
本教示の治療化合物は、構造ベース薬剤デザインを用いてデザインすることができる。構造に基づく薬剤デザインとは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドもしくはポリペプチド間のコンフォメーション相互作用、および治療化合物のコンフォメーションを予想するコンピュータ・シミュレーションの使用をいう。本教示において、シトクロームＰ４５０のクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィド結合サイトの三次元構造の知見は、１）シトクロームＰ４５０、またはシトクロームＰ４５０の選択したサブセットに特異的に結合する、２）安定である、および３）シトクロームＰ４５０を有する細胞における発癌前駆物質活性化のような生物学的応答の阻害を生じる、治療化合物をデザインする能力を当業者に提供する。例えば、シトクロームＰ４５０のクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィド結合サイトの三次元構造の知見は、シトクロームＰ４５０の基質またはリガンドとして機能し得るまたは高い特異性でもってシトクロームＰ４５０の選択したサブセット、例えばＣＹＰ２Ａ６、および特にヒトＣＹＰ２Ａ６に結合することができるクマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４'−ジピリジルジスルフィドのアナログをデザインする能力を当業者に提供する。
【００７１】
構造に基づく薬剤デザインに有用な好適な構造およびモデルを本明細書に記載する。構造に基づく薬剤デザインの方法において使用する標的構造のモデルは、例えば分子置換および折り畳み認識に関連する方法のような本明細書において開示するいずれのモデリング方法によって生成するモデルを含む。本教示のいくつかの態様において、構造に基づく薬剤デザインは、クマリン、メソキサレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４'−ジピリジルジスルフィドと複合体形成したＣＹＰ２Ａ６の構造に、および標的シトクロームＰ４５０構造のモデルに当てはめることができる。
【００７２】
本教示の１の態様は、シトクロームＰ４５０の活性を妨害する薬剤をデザインする方法である。種々の構成において、方法は、シトクロームＰ４５０およびシトクロームの少なくとも１のリガンドを含むシトクローム−リガンド複合体の三次元構造を提供し；ついで、シトクロームＰ４５０に結合することが予想される化学化合物をデザインすることを含む。デザインは、例えば原子および結合のボール−スティック表示、または分子モデリング・ソフトウェアを備えたデジタル・コンピュータ上のような物理モデルを用いることを含むことができる。いくつかの構成において、これらの方法は、さらに、化学化合物を合成し、ついでシトクロームＰ４５０の活性を妨害する能力について化学化合物を評価することを含むことができる。
【００７３】
本発明の方法と一緒に使用するシトクローム−リガンド複合体の好適な三次元構造およびモデルを本明細書に開示する。本教示によれば、化合物をデザインすることは、新しい化学化合物を創製すること、または公知化合物のライブラリーのデータベース（例えば、公知化合物の三次元構造を含むコンピュータ・サーチ・データベースに掲載された化合物）をサーチすることを含み得る。デザインすることには、ある種の構造特徴に置換基を有する化学化合物をシミュレートすることも含むことができる。いくつかの構成において、デザインすることには、化合物の公知の機能に基づいて化学化合物を選択することを含むことができる。いくつかの構成において、デザインすることは、化合物の三次元構造が知られている１またはそれを超える化合物のデータベースのコンピュータ・スクリーニングを含むことができる。これらの構成において、候補化合物は、例えばAutoDockソフトウェア・パッケージ(The Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.)またはHumbletおよびDunbar, Animal Reports in Medicinal Chemistry, vol. 28, pp. 275-283, 1993, M Venuti編, Academic Pressによって記載されたようなソフトウェアを備えたコンピュータによって、シトクローム−リガンド複合体の三次元構造と実質的に相互作用する（例えば、ドッキングする、整列する、マッチする、界面で連結する）ことができる。候補化学化合物を合成する方法は、当業者に知られている。
【００７４】
構造に基づく薬剤デザインの種々の他の方法は、その全体を出典明示して本明細書の一部とみなすMaulikら, 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc.のような参考文献に開示されている。Maulikらは、例えば、使用者が適当に選択したフラグメント・ライブラリーから新規な分子を生成する方法を支持する指定デザインの方法；使用者が同時に選択基準をあてはめて候補リガンドの適合性を評価しつつ、フラグメントおよびその組合せを無作為に突然変異誘発する遺伝的または他のアルゴリズムを使用するランダム・デザイン；および、使用者が三次元構造および小さいフラグメント・プローブの間の相互作用エネルギーを計算し、つづいて有利なプローブサイトと一緒に連鎖する格子ベースのアプローチを開示している。
【００７５】
１の態様において、シトクローム−リガンド複合体に結合する本教示の化学化合物は、ＣＹＰ２Ａ６と化学的および／または立体化学的相補性を有する化学化合物、例えば、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンまたは４,４’−ジピリジルジスルフィドのようなＣＹＰ２Ａ６リガンドとすることができる。いくつかの構成において、シトクロームＰ４５０に結合する化学化合物は、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、または少なくとも約１０−８Ｍのアフィニティーで会合することができる。
【００７６】
シトクロームＰ４５０のいくつかのサイトは、構造に基づく薬剤デザインの標的とすることができる。これらのサイトは、非限定的な例において８−メソキサレンまたは１,２−ベンゾピロンのようなリガンドまたは基質に接触する残基（例えば、Phe107、Phe111、Phe118、Phe209、Phe480、Val117、Asn297、Ile 300、Gly301、Thr305、Ile366、Leu370）を含む。かかるサイトは、特異的に掲載したアミノ酸に加えて、Ｎ−またはＣ−末端のいずれかに向かういくつかのアミノ酸を含むことができる。
【００７７】
リガンド複合体化したＣＹＰ２Ａ６結晶の残基および領域に先に詳記した薬剤デザイン戦略は、本明細書に開示する他のシトクロームＰ４５０  ２およびシトクロームＰ４５０  ２Ａ構造を含む他のシトクロームＰ４５０構造に同様に適用し得る。当業者であれば、その多くを本明細書に記載する、当該技術分野において認識されたモデリング・プログラムおよび薬剤デザイン方法を用いて、アミノ酸配列中の差異に従うシトクロームＰ４５０デザイン戦略を修飾することができる。例えば、この戦略を用いて、喫煙中止または他のシトクロームＰ４５０における発癌前駆物質活性化を調節する化合物をデザインすることができる。また、当業者であれば、ＣＹＰ２Ａ６のような１のシトクロームＰ４５０に由来するリード化合物構造を用いることができ、例えばＣＹＰ２Ａ８のような他のシトクロームＰ４５０中のアミノ酸残基における差異を考慮することができる。
【００７８】
構造に基づく薬剤デザインの本発明の方法においては、標的サイト中の各残基に候補化学化合物を並べる（すなわち、化学化合物を、例えば本教示のコンピュータ・スクリーニング方法において分析する）ことは必ずしも必要でない。好適な化学化合物は、標的サイトについて記載した残基のサブセットに並べることができる。本教示のいくつかの構成において、候補化学化合物は、標的サイトと候補化学化合物との間の共有または非共有架橋の形成を促進するコンフォメーションを含むことができる。ある種の態様において、候補化学化合物は、標的サイトに近接した表面に結合して、複合体における相互作用のさらなるサイトを提供することができる。例えば、アンタゴニスト（すなわち、結合サイトまたは界面をブロッキングすることによってシトクロームＰ４５０に対するリガンドの結合を阻害する化学化合物）をデザインする場合、そのアンタゴニストは結合サイトに十分なアフィニティーで結合するように、または、リガンドが標的空間に結合することを実質的に妨げるようにデザインすることができる。候補化学化合物と標的サイトとの間の相補性が本明細書において詳記したすべての残基にわたって伸長していることが必ずしも必要でないことは当業者であれば理解されるであろう。
【００７９】
種々の態様において、立体化学相補性を有する化学化合物のデザインは、化学化合物と標的サイトとの間の「対合」を化学的または構造的に最適化する技術によって行うことができる。かかる技術は、例えば、その全体を出典明示して本明細書の一部とみなす、SheridanおよびVenkataraghavan, Acc. Chem Res., vol. 20, p. 322, 1987; Goodford, J. Med. Chem., vol. 27, p. 557, 1984; Beddell, Chem. Soc. Reviews, vol. 279, 1985; Hol, Angew. Chem., vol. 25, p. 767, 1986;ならびにVerlindeおよびHol, Structure, vol. 2, p. 577, 1994によって開示されている。
【００８０】
構造に基づく薬剤デザインの本教示のいくつかの態様は、シトクロームＰ４５０の形状またはシトクロームＰ４５０に関係する構造に相補的な化学化合物を同定する方法を含む。かかる方法は、本明細書中において「外形アプローチ」という。本教示の外形アプローチにおいて、２の剛直な物体（そのうちの１の物体（活性部位）が第２の物体（リガンドのような相補的分子）に対する結合サイトを形成する「ポケット」または「グルーブ」を含む）の外形（硬質球面）相互作用のみ考慮することによって内部自由度の数（および分子コンフォメーション空間中の対応する局所最小単位（local minima））を減少することができる。
【００８１】
外形アプローチは、その全体を出典明示して本明細書の一部とみなすKuntzら, J. Mol. Biol., vol. 161, p. 269, 1982によって記載されている。化学化合物デザインのアルゴリズムは、The Scripps Research Institute (La Jolla, Calif.)から入手可能なAutoDockのようなソフトウェア・プログラムを用いて実行することができる。１またはそれを超える結晶学データの実在するデータベース（例えば、University Chemical Laboratory, Cambridge University, Lensfield Road, Cambridge CB2 lEW, U.K.によって維持されるCambridge Structural Database SystemまたはRutgers Universityによって維持されるProtein Data Bank）を、かくして明確にした形状に近い化学化合物についてサーチする。外形アプローチによって同定した化学化合物を修飾して、水素結合、イオン相互作用またはファンデルワールス相互作用のような化学的相補性と関連する基準を満たすことができる。
【００８２】
いくつかの態様において、本教示の治療組成物は、１またはそれを超える治療化合物を含むことができる。治療組成物は、さらに、喫煙中止を誘導するまたは発癌前駆物質活性化を阻害することができる他の化合物を含むことができる。本教示の治療組成物を用いて、例えばかかる組成物を動物に投与することによって治療を必要としているヒトのような動物における疾患を治療することができる。治療する動物の非限定的な例は、哺乳類、有袋類、爬虫類および鳥類、ヒト、伴侶動物、食用動物、動物園飼育動物および他の経済上関連する動物（例えば、競争馬、ならびにチンチラおよびミンクのようなコート用に価値のある動物）を含む。治療するさらなる動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウを含む。したがって、いくつかの態様において、治療する動物は、ヒト、イヌおよびネコを含む。
【００８３】
本教示の治療組成物は、賦形剤、補助剤および／または担体をも含むことができる。好適な賦形剤は、治療する動物が許容することができる化合物を含む。かかる賦形剤の例は、水、塩類溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の水性の生理学的にバランスのとれた塩溶液を含む。固定油、ゴマオイル、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水性ビヒクルも使用することができる。他の有用な処方は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような増粘剤を含有する懸濁液を含む。賦形剤は、等張性および化学安定性を向上する物質のような微量の添加剤も含むことができる。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、炭酸水素緩衝液およびトリス緩衝液を含み、一方、保存剤の例はチメロサール、ｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールを含む。標準的処方は、液体注射液または注射用の懸濁液または溶液として好適な液体中に取り上げることができる固体のいずれかとし得る。したがって、非液体処方においては、賦形剤は、投与の前に滅菌水または塩類溶液を添加することができるデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤ほかを含むことができる。
【００８４】
本教示の１の態様において、治療組成物は担体を含むことができる。担体は、治療した動物における治療組成物の半減期を増大する化合物を含む。好適な担体は、限定されるものではないが、ポリマー性徐放ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油類、エステル類およびグリコール類を含む。
【００８５】
有効な様式で本教示の治療組成物を投与する許容し得るプロトコールは、個々の用量サイズ、用量の数、用量投与の頻度、および投与の様式を含む。かかるプロトコールの決定は、当業者によって行うことができる。投与の様式は、限定するものではないが、吸入、皮下、皮内、静脈内、鼻腔内、経口、経皮、眼内および筋肉内の経路を含む。
【００８６】
【表１−１】
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【００８７】
【表１−２】
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【００８８】
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【表１−１１３】
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【表５−２２６】
2008542391.tif 001150
【１２３４】
【表５−２２７】
2008542391.tif 001151
【１２３５】
【表５−２２８】
2008542391.tif 001152
【１２３６】
【表５−２２９】
2008542391.tif 001153
【１２３７】
【表５−２３０】
2008542391.tif 001154
【１２３８】
【表５−２３１】
2008542391.tif 001155
【１２３９】
【表５−２３２】
2008542391.tif 001156
【１２４０】
【表５−２３３】
2008542391.tif 001157
【１２４１】
【表５−２３４】
2008542391.tif 001158
【１２４２】
【表５−２３５】
2008542391.tif 001159
【１２４３】
【表５−２３６】
2008542391.tif 001160
【１２４４】
【表５−２３７】
2008542391.tif 001161
【１２４５】
【表５−２３８】
2008542391.tif 001162
【１２４６】
【表５−２３９】
2008542391.tif 001163
【１２４７】
【表５−２４０】
2008542391.tif 001164
【１２４８】
【表５−２４１】
2008542391.tif 001165
【１２４９】
【表５−２４２】
2008542391.tif 001166
【１２５０】
【表５−２４３】
2008542391.tif 001167
【１２５１】
【表５−２４４】
2008542391.tif 001168
【１２５２】
【表５−２４５】
2008542391.tif 001169
【１２５３】
【表５−２４６】
2008542391.tif 001170
【１２５４】
【表５−２４７】
2008542391.tif 001171
【１２５５】
【表５−２４８】
2008542391.tif 001172
【１２５６】
【表５−２４９】
2008542391.tif 001173
【１２５７】
【表５−２５０】
2008542391.tif 001174
【１２５８】
【表５−２５１】
2008542391.tif 001175
【１２５９】
【表５−２５２】
2008542391.tif 001176
【１２６０】
【表５−２５３】
2008542391.tif 001177
【１２６１】
【表５−２５４】
2008542391.tif 001178
【１２６２】
【表５−２５５】
2008542391.tif 001179
【１２６３】
【表５−２５６】
2008542391.tif 001180
【１２６４】
【表５−２５７】
2008542391.tif 001181
【表６】
2008542391.tif 001182
[1] 括弧内の最高分解シェルの値。Rsymについての値は２の分解通過の間で平均した。リダンダンシーの値を平均した。
[2]メソキサレン複合体のラマチャンドランプロット：最も有利な領域における残基の89.2 %、許容された領域の 10.2 %、寛大に許容された領域の0.3 %、不利な領域の0.2 %。クマリン複合体のラマチャンドランプロット：最も有利な領域における残基の90.5 %、許容された領域の9.1 %、不利な領域中の寛大に許容された領域の0.2 %。
[3]残基30ないし496、32ないし495、31ないし494、31ないし494は、各々、メソキサレン複合体の分子A-D。残基30ないし494、32ないし496、31ないし494、31ないし494は、各々、クマリン複合体の分子A-D。クマリン複合体の別のコンフォメーションに見出された残基L370。
【１２６５】
【表７】
2008542391.tif 001183
【１２６６】
実施例
本明細書に記載する方法および組成物は、当業者によく知られている研究室技術を利用しており、Sambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYのような研究室マニュアルに見出すことができる。.
【１２６７】
実施例１
この例は、ＣＹＰ２Ａ６ｄＨ構築物の作製を説明する。
CYP2A6dH構築物をデザインして、野生型の活性を保持する条件付きで可溶性の酵素を生成した。この目的を達成するために、最初の２８残基からなるＮ−末端貫膜シグナルアンカー領域をコードするＤＮＡを、ウサギＰ４５０  ２Ｃ５の発現および結晶化について最適化された配列ＭＡＫＫＴＳをコードするＤＮＡで置き換えた(Johnson, E.F、The 2002 Bernard B. Brodie Award lecture: deciphering substrate recognition by drug-metabolizing cytochromes P450. Drug Metab Dispos. 31, 1532-1540 (2003)）。Ｎ−末端突然変異に加えて、４残基のヒスチジンタグをコードするＤＮＡを精製における支援のために加えた。この構築物をＣＹＰ２Ａ６ｄＨ構築物という。このストラテジーは、Ｐ２１空間群で結晶化され、０．２３±０．０３μＭのＫｍおよびＰ４５０レダクターゼで復元した場合にクマリン７−ヒドロキシル化について１０．８３±１．３８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｎｍｏｌ  Ｐ４５０のＶｍａｘを示した切頭タンパク質を生成した。精製したＣＹＰ２Ａ６ｄＨの結合についての解離定数は、高スピン鉄ヘムタンパク質の基質依存変換をモニターすることによって、クマリンおよび８−メトキシソラレンについて決定し、各々０．２７μＭおよび１．８５μＭである。クマリン・ヒドロキシル化の同様の値（Ｋｍの平均値は０．４０μＭ、Ｖｍａｘは６．３４ｎｍｏｌｓ／ｍｉｎ／ｎｍｏｌ  Ｐ４５０）およびメトキシソラレン阻害（Ｋｉ＝１．９μＭ）は、一連の１２のヒト肝臓ミクロソームからのミクロソーム調製物中の完全長野生型ＣＹＰ２Ａ６についてKoenigsらによって報告された (Mechanism-based inactivation of human liver cytochrome CYP2A6 by 8-methoxypsoralen. Drug Metab. Dispos. 25, 1407-1415 (1997))。これらの結果は、Ｎ−およびＣ−末端に対する修飾が酵素の基質結合または触媒活性を顕著に変化させなかったことを示唆している。この実施例において、切頭Ｎ−末端貫膜シグナル・アンカー・ドメインを含みつつ触媒活性を変化させ得る内部修飾を含まない触媒ドメインの残基29-494を発現するシトクロームCYP2A6の発現のためにベクターをデザインした（配列番号：２）。この実施例においては、残基1-28をコードするＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてアミノ酸配列ＭＡＫＫＴＳをコードするＤＮＡで置換した。さらに、４残基のヒスチジンタグをコードするＤＮＡをＣ−末端に加えた。このＤＮＡ構築物をエスシェリキア・コリ（Escherichia coli）中で発現させ、CYP2A6dHという。CYP2A6dHは、僅かな修飾を有するＰ４５０ ２Ｃ５について以前に記載されているのと同様にして発現および精製した(Johnson, E.F. The 2002 Bernard B. Brodie Award lecture: deciphering substrate recognition by drug-metabolizing cytochromes P450. Drug Metab Dispos. 31, 1532-1540 (2003)）。この構築物によってコードされるポリペプチドの配列は、本明細書中において配列番号：３として開示する。
【１２６８】
実施例２
この実施例は、ＣＹＰ２Ａ６ｄＨポリペプチドの酵素活性を説明する。
この実施例において、精製タンパク質の触媒特性を決定するために、Ｌ−α−ジラウロイル−Ｌ−α−レシチン不存在下、Tanら（Competitive interactions between CYP2A6 and cytochrome P450 2E1 for NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the microsomal membranes produced by a baculovirus expression system. Arch. Biochem. Biophys. 342, 82-91 (1997)）によって記載されたプロトコールに対するわずかな修飾を用いて、ＣＹＰ２Ａ６ｄＨをＥ．ｃｏｌｉ−発現した精製ヒト・レダクターゼを用いて復元した。１０ピコモルのＣＹＰ２Ａ６ｄＨを、最終容量１０μｌ、１：６の比、レダクターゼに対するＣＹＰ２Ａ６ｄＨで０．０６Ｕのヒト・レダクターゼと一緒に氷上で１０分間インキュベートした。ついで、２５μＭないし２．５ｍＭの範囲の濃度の１，２−ベンゾピロンを、４３０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４と一緒に１０μｌアリコートで添加した。その反応混合物を３７℃で３分間平衡した。反応を開始するために、５０μｌのＮＡＤＰＨ再生系（５０ｍＭイソクエン酸、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５Ｕ／ｍｌイソクエン酸デヒドロゲナーゼおよび１０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ）を添加した。反応は５分間進行させ、１００μｌの２０％冷トリクロロ酢酸を添加することによって終結させた。成分を１３，０００ｒｐｍで遠心した。１０μｌの上清を除去し、１９０μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９．０に添加した。クマリン含量は、蛍光測定で定量化した（３６８ｎｍ励起および４５３ｎｍ発光）。
【１２６９】
実施例３
この実施例は結晶化を説明する。
この実施例においては、ＸＢ中の３８０μＭのＣＹＰ２Ａ６ｄＨ、１ｍＭのクマリン、および０．１７％のＡＮＡＰＯＥ（登録商標）−Ｘ−４０５を含有する等用量のタンパク質溶液を３０％のポリエチレングリコール４０００、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、２００ｍＭの硫酸アンモニウムを含有する結晶化ウェル溶液と混合することによって調製した結晶を用いて、初期データセットを収集した。高分解データセットは、ＸＢ中の５４０μＭのＣＹＰ２Ａ６ｄＨ、８．８９ｍＭのクマリン、および０．２％のＡＮＡＰＯＥ（登録商標）−Ｘ−４０５を含有する等用量のタンパク質溶液を３０％のポリエチレングリコール３３５０、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５および２００ｍＭの硫酸アンモニウムを含有する結晶化ウェル溶液と混合することによって調製した結晶から収集した。ＸＢ中に〜５４０μＭのＣＹＰ２Ａ６ｄＨ−メソキサレン複合体および０．２％のＡＮＡＰＯＥ（登録商標）−Ｘ−４０５を含有する等容積のタンパク質溶液を、３０％のポリエチレングリコール３３５０、１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、および２００ｍＭの硫酸アンモニウム、１００μＭのメソキサレンを含有する結晶化ウェル溶液と合した。すべての基質および洗浄剤はSigma (St. Louis, MO)およびAnatrace (Maumee, OH)から各々購入した。すべての結晶は、２.５μｌの液滴で液滴蒸気拡散（drop vapor diffusion）を受けることによって成長した。Ｘ線によって誘導される放射線損傷を減少するために、結晶を液体Ｎ２中で凍結した。結晶は、ＸＢおよび結晶ウェル溶液の１：１混合物７００μｌと３００μｌの１００％エチレングリコールを含有する凍結防止溶液を用いて液体Ｎ２の蒸気中で１００Ｋまで急速に冷却した。
【１２７０】
実施例４
この実施例は回折データの収集を説明する。
この実験においては、クマリンおよびメソキサレン複合体のデータを、クマリン複合体についてはビームライン１１−１で、メソキサレン複合体についてはビームライン９−２でStanford Synchrotron Radiation Laboratory (SSRL, Palo Alto, California)で１００Ｋまで冷却した単一結晶上で収集した。すべてのデータをHKL2000で処理し、Scalepackを用いてデータを剥がし落とし、減少した（Fukami,T.ら、A novel polymorphism of human CYP2A6 gene CYP2A6*17 has an amino acid substitution (V365M) that decreases enzymatic activity in vitro and in vivo. Clin. Pharmacol. Ther. 76, 519-527 (2004)）。クマリン複合体についての初期データは、非等価の側鎖をアラニン残基で置換したCYP2C8のモデル（PDB受理番号1PQ2）を用いてＡＭｏＲｅ中の分子置換によってＰ２１空間群に入った（Kitagawa, K., Kunugita, N., Kitagawa, M.およびKawamoto, T. CYP2A6*6, a novel polymorphism in cytochrome P450 2A6, has a single amino acid substitution (R128Q) that inactivates enzymatic activity. J. Biol. Chem. 276, 17830-17835 (2001))。マシュー係数は、非対称単位に４つの分子が存在し、４が見出されたことを示唆した。精密化の初期段階の間は、非対称単位中の各々の単量体にして４の折り畳みＮＣＳ制限を適用した。精密化の後期段階の間は、ＮＣＳ制限を解放して各単量体における差を許容した。初期クマリン複合体のモデルを、ねじれ角をシミュレートしたアニーリングの複数のラウンドを用いて２.６５オングストロームのデータに対して精密化した。最終段階においては、１ラウンドの等方性の個々のＢ−ファクター精密化を行った。このモデルを用いて、高分解クマリン複合体について一連のデータを層化し、これをさらに構築し、用いてメトキサレンの一連のデータを層化した。クマリンおよびメトキサレン複合体のモデルは、複数ラウンドのコンジュガント・グラジエント最小二乗最小限化、ねじれ角シミュレートしたアニーリングおよびプログラムＣＮＳを用いた等方性の個々のＢ−ファクター精密化を用いて２.０５オングストロームおよび１.９０オングストロームに対して精密化した。クマリンおよびメトキサレン複合体の精密化の最終段階の間は、基質および水分子を加えた。クマリンおよびメトキサレン複合体のデータ収集および構造精密化統計学は、表１および２に見出すことができる。σＡ−加重２｜Ｆｏ｜−｜ｆｃ｜、１｜Ｆｏ｜−｜ｆｃ｜および２｜Ｆｏ｜−｜ｆｃ｜組成omitマップへのモデルの編集および調節の複数のサイクルは、グラフィック・プログラムＯ（Denton,T.T., Zhang,X.およびCashman,J.R. 5-Substituted, 6-Substituted, and Unsubstituted 3-Heteroaromatic Pyridine Analogues of Nicotine as Selective inhibitors of cytochrome P-450 2A6. J. Med. Chem. 48, 224-239 (2005))を用いて行った。別段指摘しない限り、分子グラフィックはPyMOL（前掲）で作成した。すべてのプローブが近づき易い孔の体積は、１.４オングストロームのプローブ半径および０.３３オングストロームの格子間隔を用いてプログラムＶＯＩＤＯＯを用いて計算した。
【１２７１】
実施例５
この実施例は三次元構造の決定を説明する。
２.６５オングストロームの限定分解に回折したＣＹＰ２Ａ６ｄＨクマリン複合体の単一結晶からのデータを、非等価側鎖をアラニン残基で置き換えたシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８（Protein Data Bank受入コード１ＰＱ２）のモデルを用いる分子置換によって層化した。一連のより高分解データは入手可能となったため、最新のモデルを用いて一連の新たなデータを層化した。ペプチド骨格および側鎖の電子密度マップへの手動の構築を続けた。最終的なモデルは、１.９オングストロームの限定分解に回折したクマリン複合体の単一結晶から収集したデータを用いたつづくフィッティングおよび精密化によって作成した。得られた構造は、非対称単位中の４の分子で、０.１９４のＲ値および０.２３０のＲｆｒｅｅ値を示した（表６）。鎖Ａ−Ｄの残基３０−４９６、３２−４９５、３１−４９４および３１−４９４、各々、８１６の水分子、４分子のクマリンおよび１のグリセリン分子は、２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜σＡ加重電子密度マップによって決定した。メソキサレン複合体のフィッティングおよび精密化は、２.０５オングストロームの限定分解に回折した複合体の単一結晶について収集したデータを利用した。構造は０.２１９のＲ値および０.２６１のＲｆｒｅｅ値を示した（表６）。鎖Ａ−Ｄの残基３０−４９６、３２−４９５、３１−４９４および３１−４９４、各々、４分子のメソキサレン、１分子のグリセリンおよび５２１の水分子は、２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜σＡ加重電子密度マップにモデル化した。
【１２７２】
実施例６
この実施例は可視示差分光学による結合定数の決定を説明する。
この実施例においては、クマリンまたはメソキサレン存在下の低スピンから高スピン状態へのＣＹＰ２Ａ６ｄＨの転換を、ＣＡＲＹ  １Ｅ  ＵＶ−可視光分光光度計上、常温の２６０ｎｍから７００ｎｍのスペクトル変化を観察することによってモニターした。精製したＣＹＰ２Ａ６ｄＨを、１ｃｍ光路長のマイクロキュベット中の５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ７.４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセリン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＸＢという）中でから３μＭまで希釈した。５０％メタノールに溶解したクマリンまたはメソキサレンの新たに調製したアリコートを希釈したタンパク質に添加し、測定をとった。メタノールの総濃度は１％より低いままであった。結合は、異なるスペクトルのピーク（〜３８５ｎｍ）および谷（〜４１７ｎｍ）の間の吸収差、ΔＡとしてモニターした。見かけの結合定数Ｋｓおよび外挿最大スペクトル変化、ΔＡｍａｘは、以下の式を用いた非線形最小二乗回帰フィッティングから概算した
【１２７３】
【数１】
2008542391.tif 001184
式中、Ｓはリガンドの総濃度であり、ＰはＰ４５０の総濃度である
【１２７４】
実施例７
この実施例は基質およびインヒビター結合を説明する。
この実施例において、ＣＹＰ２Ａ６の活性部位中のクマリンおよびメソキサレン分子の位置は、σＡ−加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜omit電子密度によって決定した（図４および５）。クマリンおよびメソキサレン複合体の三次元構造は、すべての等価Ｃαポジションについて０.２７オングストロームのＲＭＳＤで非常に類似した。また、活性部位（101-120、196-256、288-318、364-371および476-484)と関連する領域のＲＭＳＤは０.１５オングストロームであり、これはより大きなメソキサレン分子の結合の際に骨格に実質的に全く構造変化が存在しないことを実証している。さらに、基質分子と接触する側鎖のポジションの差異も最小限であった（図８）。図８において、ＣＹＰ２Ａ６のクマリン（矢印１２０）およびメソキサレン（矢印１２１）複合体の重なった構造を示す２の図（ａ）および（ｂ）を提供する。酸素原子は矢印１１３によって示し、窒素原子は矢印１１４によって示し、および、炭素原子は矢印１２０（クマリン複合体）または矢印１２１（メソキサレン複合体）によって示す。リガンドの５オングストローム以内の側鎖は、棒表示として表示する。ヘム基は棒図として表示する。各基質のピラン環は、水素がPhe107のπ電子系と相互作用するように向いている。また、基質および側鎖のポジションは、非対称単位を構成する各分子において非常に類似している。しかしながら、Leu370は、クマリン複合体のＡ分子中の２の交互の位置に見出され、それが複合体中の基質結合によって閉じ込められていないことを示している。
【１２７５】
電子密度は、各分子のケタール酸素が、クマリンおよびメソキサレンについてAsn297の側鎖窒素と各々３.３±０.１３および２.９±０.０２オングストロームの水素結合を形成する電位で向いていることを示唆している（図４および５）。図４において、ヘム基の情報に位置する活性部位の孔はメッシュにしており、矢印１０８によって示し、ヘムは矢印１０９によって示し、安定化した相互作用を形成する側鎖は矢印１１０によって示し、ペプチド骨格はリボンとして表示し、矢印１１１によって示す。Glu222はペプチド骨格と水素結合相互作用を形成し、ヘリックス双極子と静電相互作用を形成し、ヘリックスＢ'およびヘリックスＦ'を安定化し、Trp109はPhe238とπ−π相互作用を形成し、ヘリックスＧとヘリックスＢ'のパッキングを安定化する。図５において、薄いメッシュ（矢印１１２によって示す）とした活性部位の孔の２の図を示す。活性部位の孔に接触する側鎖は棒として表示する。原子は、矢印１１６によって示すヘム基を除いて元素にしたがって表示し；Ｏは矢印１１３によって示し；Ｎは矢印１１４によって示し、Ｃは矢印１１５によって示す。
【１２７６】
電子密度単独でもAsn側鎖ヘテロ原子の向きを区別するのに使用できるが、さらなる水素結合相互作用はそれが図６に示すように向いていることを示唆しており、それは、クマリンに対するヘムおよび基質の１σで輪郭を描き、１オングストローム以内にしたσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図を描いている。基質は、マップの作成に使用したモデルから省略した。クマリンおよびメソキサレンは、Asn297との水素結合によって安定化され、それは酸化した炭素をヘムイオンから３.２±０.１３オングストローム（クマリン）または３.８±０.０９オングストローム（メソキサレン）に位置する。距離は点線として示し、距離について引用した値は、非対称単位中の４の分子の平均および標準偏差である。ペプチド骨格は矢印１１７によって示される薄いコイルとして表し、側鎖は原子について以下の表示を含む棒図とした；炭素はタンパク質については矢印１１８によって、基質については矢印１１９によって示し、酸素は矢印１１３によって示し、および、窒素は矢印１１４によって示す。ヘム基は、矢印１０７によって表す。このコンフォメーションにおいて、Asn297側鎖からの窒素はクマリン分子のケタール酸素に対する水素結合を示すことができるが、Asn297の酸素原子は残基117の骨格窒素原子およびヘリックスＢ'の後のターンを安定化することが通常見出される保存された水分子からの２の水素結合を潜在的に受容するように位置する。水分子は、F118のペプチド窒素からの水素結合を受容し得、Y114のカルボニルへの水素結合を示す（図６）。Asn297側鎖を１８０°回転させると、Asn297からの窒素原子は残基１１６および１１７の骨格水素原子と衝突するであろう。
【１２７７】
クマリンは、鉄−オキソ中間体によって酸化された７'炭素がヘムイオンから３.２４±０.１３オングストロームに存在するように位置する。精製したＣＹＰ２Ａ６酵素を用いたスペクトル滴定実験は、クマリンが１型スペクトル変化を引き起こすことを示し、それはヘムの第６の軸リガンドとしてその位置からの水の置換と一致する。ＣＹＰ２Ａ６の活性部位中のクマリンの位置はＵＶ−可視光分光学と一致するが、クマリン分子とヘムイオンとの間の接近した距離はクマリンが酸素に移動して結合し、触媒を生じさせなければならないであろうことを示している。典型的に、酸化される原子までのヘムイオン原子の距離は、Ｐ４５０−基質複合体の調査に基づいて４−５オングストロームである。
【１２７８】
水素結合に加えて、図７に示すPhe107の環系に直接向いているクマリン分子の芳香族水素からの有利な相互作用が存在する。図７は、メソキサレンについてのヘムおよび基質の１σで輪郭を付け１オングストローム以内にしたσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図の描写である。マップの作成に使用したモデルから基質を省略した。クマリンおよびメソキサレンは、酸化された炭素を３.２±０.１３オングストローム（クマリン）または３.８±０.０９オングストローム（メソキサレン）に位置させるAsn297との水素結合によって安定化される。距離は点線として示し、距離について引用した値は非対称単位中の４の分子についての平均および標準偏差である。ペプチド骨格は矢印１１７によって示す薄いコイルとして表し、側鎖は原子について以下の表示を有する棒図としている；炭素はタンパク質については矢印１１８または基質については１１９によって示し、酸素は矢印１１３によって示し、窒素は矢印１１４によって示す。ヘム基は矢印１０７によって表す。非結合ポテンシャルエネルギー計算は、芳香族相互作用から得られた自由エネルギーがモル当たり−１ないし−２キロカロリーのオーダーであり、クマリンは約−０.５ないし−１.８Ｋｃａｌモルに寄与しているようであると見積もった。したがって、２の相互作用は選択的７’−ヒドロキシル化に基質を向かせることに寄与しているようである。
【１２７９】
メソキサレンはＣＹＰ２Ａ６のメカニズムに基づくインヒビターである。特定の理論に拘束されることなく、不活性化の提唱されたメカニズムはメソキサレンの５'炭素が酸化してフラノエポキシドを形成し、つづいてＣＹＰ２Ａ６を不活性化することであることが示されている。メソキサレンの位置は、図５に示すように活性部位中の電子密度によって決まる。クマリンよりもサイズにおいて大きいが、メソキサレンのケタール酸素もAsn297側鎖の窒素原子と水素結合を形成し、芳香族水素はPhe107のｐ−電子系と相互作用する。５'炭素はヘムイオンから３.８３±０.０９オングストロームに位置するが、ヘムイオンに最も近接する原子は１'酸素であり、それはヘムイオンからわずか３.３３±０.０８オングストロームに存在する。酸素分子のわずかに近いポジションは、メソキサレンの５'ポジションの酸化を制限し得、反応性酸素種の非カップリングおよび生成に通じる。したがって、このことは、Koenigsら（前掲）によって提唱されているように反応性酸素種によるＣＹＰ２Ａ６の重要な非カップリングおよびつづく不活性化にメソキサレン結合が通じるというモデルを支持するであろう。活性部位中に水分子は明白でなく、クマリンについて示されるように、酵素に対するメソキサレンの結合は１型スペクトル変化を与える。
【１２８０】
図９において、ヘリックスＢ'の後のターンにおいて結合したポリペプチド鎖および保存された水分子を示した、クマリン（矢印１１２）とAsn297の潜在的な水素結合の斜視立体図を示す。水分子（矢印１２３）は、F118のペプチド窒素から水素結合を受容し、Y114のカルボニルおよびN297の側鎖酸素原子に水素結合を供与することによって安定化する。N297はV117のペプチド窒素からの水素との相互作用によっても安定化する。水素原子は矢印１２４によって示され、炭素は矢印１２０（クマリン）または矢印１１８（タンパク質）によって示され、酸素は矢印１１３によって示され、窒素は矢印１１４によって示される。水分子は球として表示し（矢印１２３）、側鎖およびヘム基は棒図としている。
【１２８１】
図９において、Asn297とクマリン（矢印１２２）の潜在的な水素結合、ペプチド鎖およびヘリックスＢ'の後のターン中に結合した保存された水分子の斜視立体図を示す。水分子（矢印１２３）は、F118のペプチド窒素からの水素結合を受容し、水素結合をY114のカルボニルおよびN297の側鎖酸素原子に与えることによって安定化される。N297は、V117のペプチド窒素からの水素との相互作用によっても安定化される。水素原子は矢印１２４によって示し、炭素は矢印１２０（クマリン）または矢印１１８（タンパク質）によって示し、酸素は矢印１１３によって示し、窒素は矢印１１４によって示す。水分子は球（矢印１２３）として表示し、側鎖およびヘム基は棒図としている。
【１２８２】
図１０において、ＣＹＰ２Ａ６およびヘム置換基の間の相互作用の斜視立体図を示す。ＣＹＰ２Ａ６は、ＷおよびＲ側鎖がヘム・プロピオネートに水素結合している非常に保存性が高いＷＸＸＸＲモチーフを欠いていることによって他のシトクロームＰ４５０とは異なる。ＣＹＰ２Ａ６はトリプトファンの代わりにアラニン（示さず）を有する。等しいポジションのＰ４５０  ２Ｂ４のトリプトファン側鎖は、参考のためＡ１２４Ｗと示す。ヘム・プロピオネートへ水素結合を与える側鎖は、棒図として表示する。ヘムイオンの軸ポジションに一致する保存されたシステイン残基(C439）も示す。炭素は矢印１２５（ＣＹＰ２Ａ６）または矢印１２６（シトクロームＰ４５０  ２Ｂ４）によって示し、窒素は矢印１１４によって示し、酸素は矢印１１３によって示し、硫黄は矢印１２７によって示し、鉄は矢印１２８によって示す。
【１２８３】
実施例８
この実施例は、ＣＹＰ２Ａ６とシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８の全体的折り畳みおよび折り畳みを説明する。
この実施例において、本明細書に記載したように収集したデータに基づくＣＹＰ２Ａ６の構造の分析は、Ａ−Ｌおよび４β−シートと標識した、１６α−ヘリックスを含むＰ４５０と結合した他の哺乳動物の膜の特徴である全体的折り畳みにＣＹＰ２Ａ６を適合すると結論付けることに我々を導いた。それは、疎水性であって膜相互作用ドメインの一部分を形成すると考えられるヘリックスＦおよびＧ間に位置する２のヘリックスＦ'およびＧ'の付加によって、可溶性原核生物シトクロームＰ４５０と異なる。図２において、ヘリックスは矢印１００によって表し、β−ストランドは矢印１０１によって表す。孔の表面はメッシュにしており、矢印１０２によって示す。ヘム基は棒図として表し、矢印１０３によって示す。
【１２８４】
ＣＹＰ２Ａ６構造とヒト薬剤代謝シトクロームＰ４５０の他の実験的に決定した構造との間の最も大きな差異は、図２ａに示すメッシュ表面によってくくった活性部位の孔のコンパクトな疎水的性質である。基質または溶媒に近づくチャネルは明らかでない。活性部位の体積は〜２５０オングストロームであり、これは、４〜６倍より大きな体積を示す他の人薬剤代謝Ｐ４５０の２Ｃ８、２Ｃ９または３Ａ４よりも顕著に小さい。このことは、ＣＹＰ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８のＣα軌跡を比較する、図２ａに示す活性部位の孔の外側表面を形成するペプチド骨格のコンフォメーションにおける差異を一部分反映している。これらの領域は、典型的にファミリー２薬剤代謝Ｐ４５０の間で典型的に異なり、活性部位の孔のサイズおよび形状における差異に寄与している。それに対して、酵素の構造コアは、ＣＹＰ２Ａ６およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８について示されるように非常に類似している（図２ｂ）。図２における比較は、ヘム上の活性部位の孔の上面に延びるＦおよびＧヘリックスのピッチがシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８よりもＣＹＰ２Ａ６において低いことを示している。したがって、コンパクトな構造は、シトクロームＰ４５０構造のフレキシブルな部分、ヘリックスＣに対するＢおよびヘリックスＧに対するＦの互いのおよび構造の残りの間のタイトなパッキング相互作用を示している。
【１２８５】
ヘリックスＦ'上Glu221およびヘリックスＢ'の第１のターン中の残基１０５および１０６の骨格窒素の間およびヘリックスＢ'のヘリックス双極子との水素結合および静電気的相互作用はこのパッキングを安定化する（図３ａ）。図３において、ポジションにおいて異なる領域は、ＣＹＰ２Ａ６については矢印１０４およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８については矢印１０５によって示す。Ｃαポジションがよく重複する領域は矢印１０６によって示す。ヘム基は棒図として表し、鉄を球として示しつつ矢印１０７によって示す。ヘリックスＢ'からのThr106およびGly217の骨格カルボニルも架橋している水分子を介して相互作用する。ヘリックスＢ'からのTrp109およびヘリックスＧからのPhe238の間のπ−π積み重なり相互作用（図３ａ）も、「閉じた」コンフォメーション中の「活性部位」を安定化する。また、ヘム上の活性部位の孔の表面に並ぶ５のフェニルアラニン残基（Phe107、Phe111、Phe118、Phe209およびPhe480)のバルキーな側鎖間の顕著な芳香族相互作用が存在する（図３ｂ）。これらの残基はＣＹＰ２Ａ６活性部位のおおいに疎水的な性質および小さいサイズに寄与し、酵素のコンパクトなフォールドを安定化しているようである。フェニルアラニン・クラスターは、活性部位の頂部に並び、活性部位内の芳香族基質の結合を安定化するのに重要な役割を果たし得る。２の極性残基Asn297およびThr305しか存在しない（図３ｂ）。Thr305は、還元型酸素中間体と還元型酸素分子の陽子獲得を促進して化合物Ｉ様のオキソ−ヘム中間体を生成する水分子の鎖との相互作用を安定化すると考えられるＰ４５０活性部位中に高度に保存されている。
【１２８６】
実施例９
ＣＹＰ２Ａ６／（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４'−ジピリジルジスルフィド複合体の結晶化
ＣＹＰ２Ａ６の結晶化は前記したように行った。ビームライン９−１上でStanford Synchrotron Radiation Laboratoryにおいて単一の結晶からデータを収集した。すべてのデータは、HKL2000／Scalepack（Otwinowski, ZおよびMinor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.  Methods Enzymol. 1997, 276, 307-326）またはMosflm／Scala（CCP The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Cryst. 1994, D50, 760-763）のいずれかで減少および剥がし落とした。データは、ＣＹＰ２Ａ６ｄＨ, ＰＤＢ：１Ｚ１０の以前に決定した構造を用いた同形物置換によって最初に層化した。タンパク質およびインヒビター構造は、コンピュータ・プログラムＯ（前掲）を用いて電子密度マップに適合し、ＣＮＳ（前掲）を用いて精密化した。データ減少および構造精密化統計学を表７に示す。
【１２８７】
実施例１０
（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４'−ジピリジルジスルフィドＣＹＰ２Ａ６阻害の特徴付け
ＣＹＰ２Ａ６の公知のインヒビターである（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよびＣＹＰ２Ａ６の潜在的なインヒビターであるAldrithiol−４（商標）（４,４'−ジピリジルジスルフィド）を比較した。（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンの活性はDentonらに記載されている（出典明示して本明細書の一部とみなす5-Substituted, 6-Substituted, and Unsubstituted 3-Heteroaromatic Pyridine Analogues of Nicotine as Selective Inhibitors of Cytochrome P-450 2A6. J. Med. Chem., 2005, 48, 224-239）。
【１２８８】
酵素インヒビター複合体は、活性部位に結合した基質クマリンと複合体化したＣＹＰ２Ａ６ｄＨについて以前に用いたものに類似する条件を用いて結晶化した（前掲）。構造決定に用いたデータは、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４'−ジピリジルジスルフィド複合体の各々についてＰ２１格子群中の２.０５オングストロームおよび１.６５オングストロームの限定分解に回折する単一結晶から収集した（図７）。ＣＹＰ２Ａ６ｄＨの構造を用いた同形体置換（表２、Protein Data Bank受理番号１Ｚ１０）をデータの初期層化およびつづく数ラウンドの適合および精密化に使用した。活性部位中の各インヒビターのポジションおよび向きは、シグマＡ加重電子密度マップ中に定義した。この結果は、第１級アミノ基の窒素原子を介してヘム鉄に、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４'−ジピリジルジスルフィド複合体が各々配位したことを示した（図１１）。図１１において、１σで等高を示し、活性部位に結合した（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン（左側）および４,４’−ジピリジルジスルフィド（右側）とＣＹＰ２Ａ６との複合体について、リガンドの１.５オングストローム以内としているσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜omit電子密度マップを各々示す。各々の場合において、マップの作成に用いたモデルから基質を省略している。赤色点線は、Asp297との水素結合相互作用についての電位またはヘム鉄への配位窒素からの距離を示す。
【１２８９】
アミノ基の窒素は、第一級アミンについては２.２７±０.０２オングストロームの距離で、軸連結ポジションでヘム鉄の上方に直接的に位置する。第一級アミンと複合体化したＣＹＰ２Ａ６タンパク質の構造はクマリン複合体のものに非常に類似し、このことは（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンの結合に酵素の再組織化はほとんど必要でないことを示している。クマリンおよびメソキサレンのＣＹＰ２Ａ６複合体との比較は、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン、基質に接触するＣＹＰ２Ａ６残基の同一物が同一であることを示している。さらに、接触残基部分における変化の大部分はフェニルアラニン残基のわずかな再配列に制限されて、インヒビターとの直交芳香族相互作用を最大限化する。複合体の活性部位の体積も、〜２４０−２７５オングストロームでクマリン複合体のものに類似したままであった。
【１２９０】
これは、４,４'−ジピリジルジスルフィドの複合体と対照的であった（図１２）。図１２において、４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標）（ＡＬＤ））はＣＹＰ２Ａ６と相互作用する。示した各アミノ酸のオフセット（アミノ酸の後ろに示す影付き領域）は、クマリン複合体と比較した空間的差異を示す（クマリンは図に示さず）。４,４'−ジピリジンジスルフィドを適合させるために、F209の側鎖をクマリン複合体に対して〜３オングストロームで活性部位から遠ざけて移動して、４,４'−ジピリジルジスルフィドの硫黄原子のための空間を作成した。これにより、活性部位の体積は〜３２５オングストロームに増加した。活性部位における変化は、どのようにしてタンパク質がほかのより大きな分子に活性部位において適合するかの手掛かりを提供する。１の環のピリジル窒素は、ヘム鉄から２.３０±０.０１オングストロームに位置し、バルキーなピリジル環もThr301の再位置決定および２の水分子による裂け目の同時の占有を伴うヘリックスＩの開口も生じる。４,４'−ジピリジルジスルフィドの他のピリジル窒素は、Asn297の側鎖窒素から２.９３±０.１３オングストロームに位置し、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンの３−ピリジル環について見られたように、水素結合を受容する位置に存在する。したがって、活性部位における変化はヘム鉄に対する強力な窒素配位、Asn297との水素結合相互作用、およびインヒビターとすべてのこれら潜在的なインヒビターのタンパク質側鎖との間の直交芳香族−芳香族相互作用を維持している。特定の理論に拘束させることなく、これらの比較的小さい分子に対する高い結合アフィニティーは、タンパク質およびインヒビターの間に広範囲のファンデルワールス相互作用を示す閉じた、疎水性の活性部位から水の置換から生じる疎水性効果の顕著な寄与からも生じるようである。
【１２９１】
結果は、それが、ヘム鉄に配位する（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンの側鎖アミノ基であることを示している。このことは、ヘム鉄に配位するためのアミノ−対−ピリジン窒素のアフィニティーにおけるいずれかの固有の差に対するピリジン環の芳香族窒素との水素結合および芳香族−芳香族相互作用の重要性を反映し得る。
【１２９２】
実施例１１
グラフィックス
別段指摘しない限り、分子グラフィックスはＰｙＭＯＬ（前掲）で作成した。すべてのプローブが近づき易い孔の体積は、１.４オングストロームのプローブ半径および０.３３オングストロームの格子間隔を用いてプログラムＶＯＩＤＯＯで計算した。
【１２９３】
他の態様
前記した詳細な説明は、当業者が本願の教示を実施するのを援助するために提供するものである。しかしながら、本明細書に記載した教示および特許請求の範囲は、本明細書に開示する特定の態様による範囲に限定されるものではない。こおれらの態様は教示のいくつかの態様を説明することを意図するからである。いずれの等価な態様も、この教示の範囲内に存在することが意図される。実際、本明細書に示しおよび記載したものに加えて、教示の種々の変形は、本発明の発見の意図または範囲から逸脱しない前記記載から、当業者に明らかになるであろう。かかる修飾も、添付した特許請求の範囲の範囲内に入ることも意図する。
【１２９４】
引用文献
本願において引用したすべての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、各々個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献が特異的かつ個別的にすべての目的について出典明示して本明細書の一部とみなすと示されている場合と同じ程度でもって、すべての目的について出典明示して本明細書の一部とみなす。本明細書における文献の引用は、それが本教示に対して先行技術となることを許すことを意図するものでは断じてない。特に、その全体を出典明示して本明細書の一部とみなすのは、Ｙａｎｏ  ＪＫ，  Ｈｓｕ  ＭＨ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＫＪ，  Ｓｔｏｕｔ  ＣＤ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＦ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ａ６  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｕｍａｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｘｓａｌｅｎ．  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００５  Ｓｅｐ；１２（９）：８２２−３である。
【図面の簡単な説明】
【１２９５】
【図１】図１はＣＹＰ２Ａ６リガンド、１,２−ベンゾピロン、８−メトキシソラレン、ニコチン、（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミンおよび４,４’−ジピリジルジスルフィドの化学構造である。
【図２】図２はＣＹＰ２Ａ６（左）およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８（右）の全体折り畳みの２の図である。
【図３】図３はＣＹＰ２Ａ６（左）およびシトクロームＰ４５０  ２Ｃ８（右）のＣα軌跡重複の２の図である。
【図４】図４はヘリックスＧ領域に対するＣＹＰ２Ａ６ヘリックスＢ'およびヘリックスＦ'の間の安定化相互作用の２の斜視立体図である。
【図５】図５はＣＹＰ２Ａ６活性部位の孔の２の図である。
【図６】図６はヘムおよびクマリンのσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図である。
【図７】図７はヘムおよびメソキサレンのσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜組成omit電子密度マップの斜視立体図である。
【図８】図８はＣＹＰ２Ａ６のクマリン（ａ）およびメソキサレン（ｂ）の重ね合わせ構造を示す２の図である。
【図９】図９はクマリン、ポリペプチド鎖およびヘリックスＢ'後のターン中に結合した保存された水分子とAsn297の潜在的な水素結合の斜視立体図である。
【図１０】図１０はシトクロームＰ４５０  ２Ａ６およびヘム配合団基の間の相互作用の２の斜視立体図である。
【図１１】図１１は活性部位に結合した（５−（ピリジン−３−イル）フラン−２−イル）メタンアミン（左）および４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標））（右）とＣＹＰ２Ａ６の複合体に対するリガンドの１σで輪郭を付け１.５オングストローム以内にしたσＡ加重２｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜omit電子密度マップである。
【図１２】図１２はＣＹＰ２Ａ６と４,４'−ジピリジルジスルフィド（Aldrithiol（商標）（ＡＬＤ））の相互作用である。
【図１】
2008542391.tif 001185
【図２】
2008542391.tif 001186
【図３】
2008542391.tif 001187
【図４】
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【図５】
2008542391.tif 001189
【図６】
2008542391.tif 001190
【図７】
2008542391.tif 001191
【図８】
2008542391.tif 001192
【図９】
2008542391.tif 001193
【図１０】
2008542391.tif 001194
【図１１】
2008542391.tif 001195
【図１２】
2008542391.tif 001196
【配列表】
2008542391000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月22日(2008.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008542391000001.app
【国際調査報告】
2008542391.tif 001204