(57)【要約】  関心対象試料中の核酸の初期母集団のサイズを、特にＰＣＲにより、推定するために、以下の段階が実行される：（ａ）ＰＣＲの効率のモデルを提供すること、前記モデルは一定の局面とそれに続く一定ではない局面を含み、前記局面は切替指数を有する切替領域により一体化されている；（ｂ）前記切替指数および初期母集団のサイズを代表するパラメータの間の関係を表現するために、前記効率のモデルを用いること；および（ｃ）実験的測定値との比較により前記切替指数を決定すること、および、それから、関心対象試料中の初期母集団のサイズを演繹すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも関心対象試料の現行母集団のサイズを代表する実験的な測定値が取得される、母集団の増幅反応の一連の適用に供された、関心対象試料中の核酸の初期母集団を、絶対的および／または相対的やり方で、定量化することを、コンピュータ手段により実施する方法であって、以下の段階：
ａ）増幅反応の収率のモデルを一連の増幅の関数として提供すること、前記モデルは：
・増幅反応の適用の第一の部分に関する実質的に一定の局面；および
・増幅反応の適用の第二の部分に関する一定ではない局面；を含み
前記第一および第二の部分は、前記一定のおよび一定ではない局面の間で収率が切替わる切替領域により一体化され、前記領域は、実質的に前記切替に対応する増幅指数を有し；
ｂ）少なくとも前記切替指数および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを含む関係を表すために前記収率モデルを用いること；
ｃ）実験的な測定値との比較により、少なくとも前記切替指数を決定すること；および、後の、または直後の段階において、ｄ）それから、関心対象試料中の初期母集団のサイズを演繹すること、
を含む方法。
【請求項２】
・段階ｂ）において、前記一連の増幅の関数としてパラメータ化された、切替指数を表す少なくとも一のパラメータを含む、変化を表すために前記収率モデルを用いること；および
・段階ｃ）において、少なくとも、切替指数を表す前記パラメータを、実験的な測定値との比較により決定すること、
を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パラメータ化された変化が関心対象試料中の現行母集団のサイズを代表し、
・前記変化が関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを更に含み；および
・段階ｃ）およびｄ）において、前記増幅指数および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータが、実質的に一緒に決定される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パラメータ化された変化が収率を代表し、および、段階ｃ）において、パラメータ化された変化を実験的な変化と比較するために、収率の実験的な変化が前記実験的な測定値から決定される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階ｄ）において：
ｄ１）関心対象試料中の現行母集団のサイズを代表し、そして、少なくとも前記増幅指数を表すパラメータ、および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを含む、第二のパラメータ化された変化を決定すること；
ｄ２）段階ｃ）で決定された指数に関するパラメータ化された値を、前記第二の変化に適用すること；および
ｄ３）前記第二の変化を実験的な測定値と直接比較することにより、少なくとも初期母集団のサイズを代表するパラメータを調整すること、
を包含する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階ｄ２）において、指数に関する粗値を適用すること、他方
段階ｄ３）において、初期母集団のサイズを代表するパラメータも調整しながら、指数の値を精緻化すること、
を包含する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パラメータ化された変化または、場合によっては、前記第二のパラメータ化された変化が：
・前記実験的な測定値を代表し；および
・初期母集団のサイズを代表する測定値に対応するパラメータを包含し、
並びに、初期母集団のサイズの測定値が、前記パラメータ化された変化を実験的な測定値と比較することにより決定される、
請求項３に記載の方法。
【請求項８】
測定値から背景雑音を差引くこと、および、初期母集団のサイズを代表する非ゼロの測定値を考慮するために補償を導入することを含む段階であって、実験的な測定値を処理する前段階を適用することを包含する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
公知の初期母集団のサイズを有する標準試料中の初期母集団のサイズに関する測定値を得ること、およびその間の比例関係を導出すること；および、初期母集団のサイズとその測定値の間と同じ比例関係を適用することにより、関心対象試料中の初期母集団のサイズの値を決定すること、を包含する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
公知の初期母集団のサイズを有する標準試料中の初期母集団のサイズに関するそれぞれの測定値を得ることを包含し、および：
・標準試料の初期母集団のサイズとこれらのそれぞれの初期母集団のサイズに関する対応する測定値の間の依存関係を確立すること；および
・関心対象試料の初期母集団のサイズに関する測定値を決定したあと、前記依存関係に基づく補間により関心対象母集団の初期サイズを決定すること；による
請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
それぞれ公知の初期母集団のサイズを有する一以上の標準試料を準備すること、関心対象試料に関するのと実質的に同じ条件下で前記標準試料に前記一連の増幅を適用すること、およびパラメータ化された変化を実験的な値と比較することによりそれらの有効な初期測定値を決定することを包含する請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
それぞれ公知の初期母集団のサイズを有する多数の標準試料を準備すること、関心対象試料に関するのと実質的に同じ条件下でそれらに前記一連の増幅を適用すること、並びに段階ａ）、ｂ）、およびｃ）の適用においてそれらそれぞれの指数を決定することを包含し、並びに、段階ｄ）において：
・標準試料の初期母集団のサイズとそれらの指数との間の依存関係を確立すること；および
・関心対象試料に関する指数を決定した後、前記依存関係に基づく補間により関心対象母集団の初期サイズを決定すること；による
請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
相対的な定量化のために、関心対象母集団だけではなく、増幅反応の一連の適用に供せられる参照母集団も準備し、それぞれ：
・関心対象母集団のサイズを代表する実験的な測定値；および
・参照母集団のサイズを代表する実験的測定値；を取得することにあり、
それぞれ関心対象母集団の初期サイズと参照母集団の初期サイズの間の比を決定することにある段階ｄ）と共に、参照母集団に段階ａ）、ｂ）、およびｃ）を適用することによって続く、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
収率の実験的な変化の形式の実験的な測定値を前記一連の増幅の関数として表現すること；および
・低い増幅指数の数に関する雑音に実質的に左右される第一の領域；および
・それに続くより高い増幅指数の数に関するより低い雑音を伴う第二の領域、
を含む一連の増幅の関数として収率の実験的変化を得ること、
を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
収率が一定ではない局面が、収率が低下する局面の一つであり、
・収率が一定の局面に関する粗値を推定すること；および
・少なくとも前記切替領域中の指数を求めるとき、推定された収率が閾値の下、好ましくは一定の局面の部分の下である前記雑音がより低い第二の領域中の測定値の少なくとも幾つかを無視すること、
を包含する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
収率が一定ではない局面が収率が低下する局面であり、雑音がより低い第二の領域から出発して増幅指数の数が減少する方向に進むことにより前記切替領域を特定すること、および収率が所定の値（Ｅ０＝１）を認識できるほどに超える粗増幅指数を検出することを包含する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
収率が前記所定の値（Ｅ０＝１）にほぼ等しい増幅指数を検出することにより、粗指数から出発して増幅指数の数が増大する方向に進むことにより、前記切替領域における増幅指数の推定値が精緻化され、場合により少数値を得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
減少パラメータを包含する減少する指数関数により前記収率の一定ではない局面をモデル化すること、および実験的な測定値と比較することにより切替領域中の指数を伴う段階ｃ）において前記減少パラメータを決定することを包含する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応がリアルタイムで遂行されるポリメラーゼ連鎖反応である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定値が放出された蛍光の測定された量である請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を実施するための設備であって、
・少なくとも関心対象試料を支持するための試料支持体；
・少なくとも関心対象試料中の関心対象母集団に対して、前記一連の増幅反応を適用するための第一の装置；
・関心対象母集団の現行のサイズを代表する測定値を取得するための第二の装置；および
・前記第二の装置から測定信号を受信すること、および請求項１に記載の方法を実施することに適するコンピュータ手段、
を含む設備。
【請求項２２】
プロセッサユニットのメモリに、または前記プロセッサユニットの読取機と協働するのに適する取り外しできるメモリ媒体上に貯蔵するためのコンピュータプログラム製品であって、
請求項１に記載の方法を実施するための命令を含むプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一連の増幅反応に供された試料中の、関心対象母集団の初期サイズを推定することに関する。
【０００２】
背景技術
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供された試料中の核酸の初期量の、リアルタイムでの決定において、特に有利な、しかし限定的ではない、応用を見いだしている。「ＰＣＲ定量化」として公知のこの型の技術は、典型的には検診との関連で、特に患者から採取された体液試料中の病原体（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））のコピーの数を評価するために使用される。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ増幅曲線の図の外観を概略説明するための図１を参照する。示した例では、横軸にＰＣＲサイクル指数の数がプロットされ、縦軸に各ＰＣＲサイクルに関して測定した、放射された蛍光の量（任意単位）がプロットされている。各ＰＣＲサイクルに関して、試料は、ＤＮＡポリメラーゼに核酸の増幅を可能にさせる、および対応するＰＣＲ生成物の蛍光性分子による検出を可能にさせる温度変化に供されることを理解すべきである。測定された蛍光Ｆｎを、ＰＣＲサイクル数ｎの関数としてプロットすることにより、変化は、図１に示した型が得られ、および、少なくとも：
・蛍光の測定値が、蛍光測定用装置の背景雑音に実質的に一致する第一の部分ＢＮ；
・蛍光の測定量が実質的に指数関数的に増加する第二の部分ＥＸＰ；
・蛍光の測定量の増加が顕著に減衰し、全体として、実質的に直線的に振る舞う第三の部分ＬＩＮ；および
・蛍光の測定値が水平局面に達する第四の部分ＰＬＡ、
を含む。
【０００４】
初期のＰＣＲサイクル（第一および第二の部分）では、関心対象母集団は実質的に指数関数的に増加し、一方、それに続くサイクル（第三および第四の部分）では、他の現象が関心対象母集団の成長と競合するようになり、そのため前記成長が削がれて、水平局面ＰＬＡになることが観察されるべきである。      
【０００５】
Nucleic Acids Research、2003、Vol. 31、No. 16中に公開されている、R. G. RutledgeおよびC. Coteによる文献、「Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves」は、関心対象試料中の、公知ではない核酸の初期量を、ＰＣＲにより評価する方法を開示する。この方法の本質は、関心対象試料中に存在する核酸の初期量を補間により決定するために、「標準」と呼ばれる、核酸の公知の初期量を有する多数の試料を用いる点にある。
【０００６】
一般的に、試料中の核酸の初期量が多いほど、より早く、検出可能量のＰＣＲ生成物が得られる、即ち、より早く、検出可能な量の、放射される蛍光が得られる。先行技術に関連する図２を参照して、標準Ｓｔ１に関するサイクルＣｔ１は対応する標準Ｓｔ２に関するサイクルＣｔ２より前に起こり、標準Ｓｔ２に関するサイクルＣｔ２は標準Ｓｔ３に関するサイクルＣｔ３より前に起こる等から、標準Ｓｔ１中の初期母集団は標準Ｓｔ２中のそれより大きいこと、標準Ｓｔ２中の初期母集団は標準Ｓｔ３中のそれより大きいこと、等が理解されるであろう。
【０００７】
斯くして、蛍光測定値が蛍光閾値ＴＨＲ（図２に示した）に到達するサイクルに対応するようなＣＴサイクルは、任意のレベル（典型的には背景雑音より下）の位置にあり、ＰＣＲサイクルに供された核酸の母集団の初期サイズＮ０を代表するパラメータとしての役目を果たす。上記の先行技術におけるこの観察は、公知の初期母集団を有する多数の標準に関するサイクル数Ｃｔ１、Ｃｔ２、Ｃｔ３、Ｃｔ４と、それらの初期母集団Ｎ０１、Ｎ０２、Ｎ０３、Ｎ０４の間の、図３に示した種類の関係を構築するために用いられている。斯くして、縦軸にサイクルＣｔ１、Ｃｔ２、Ｃｔ３、Ｃｔ４等をプロットし、横軸に初期母集団のサイズＮ０１、Ｎ０２、Ｎ０３、Ｎ０４の対数をプロットすることにより、回帰傾斜ＲＥＧが得られる。この回帰傾斜ＲＥＧ上に、関心対象試料に関して検出されたサイクルＣｔｉｎｔがプロットされる（破線の矢印Ｆｌ）。回帰傾斜ＲＥＧ上の補間（破線の矢印Ｆ２）により、関心対象試料に関する初期母集団のサイズＮ０ｉｎｔが、次いで、決定される。
【０００８】
この方法は、広範に用いられているが、それにも拘わらず、いくつかの難点を示す。
【０００９】
第一に、これは、それぞれ公知の初期母集団を有する多数の標準試料の使用を必要とする。
【００１０】
第二に、この方法は利用者の判断に依存する。利用者に選択される蛍光の閾値は、増幅曲線中のＣｔサイクル値に直接の影響を有し、その結果、関心対象試料中の初期母集団のサイズに関する推定値に直接の影響を有するためである。精度は、一般的に、増幅曲線の指数的な成長局面ＥＸＰ中に在るように選択されるとより良いので、閾値も、結果の精度に対する影響力を有する。そうは言っても、実技においては、利用者にとって、設定されている蛍光閾値ＴＨＲが、曲線の指数的局面に本当に対応しているのか、および、全ての試料（標準試料及び関心対象試料）に対してそうなのか、知ることは困難である。
【００１１】
最後に、この方法は、如何なる証明も伴わずに、関心対象試料および全ての標準試料において、母集団は同じ増幅収率を有すると仮定している。斯くして、もし関心対象試料がＰＣＲ抑制剤を含有していると、典型的にはそうなのだが、その結果は偽って低くされるであろう。
【００１２】
斯くして、先行技術の技法は、利用者によって定義される蛍光閾値ＴＨＲに依存することを理解すべきである。選択される値はＣｔサイクルの値に、およびその結果、関心対象試料中の初期量の決定に影響を及ぼす。これは、Ｃｔサイクル検出を自動化してそれを信頼性があるものとするため、近年数多くの研究が為されてきた理由の一つである。
【００１３】
発明の目的及び概要
本発明は、全く異なる道筋を提案することによりこの状況を改善することを目指している。
【００１４】
第一に、本発明は方法を提供し、その方法は、関心対象試料中の核酸の初期母集団を、絶対的および／または相対的な手法において定量化するコンピューター手段により実施される。試料は、関心対象母集団を増幅するための反応の、一連の適用に供される。非常に普遍的なやり方で、この増幅は、連続するＰＣＲサイクルを実施することにより着手してよいが、任意の他の増幅技術を用いることもできるであろう。とりわけ、下に説明するように、増幅は、単に反応収率によって定義される必要があることを理解すべきである。これらの連続的な増幅操作の間、実験的な測定値が取得され、これは少なくとも関心対象試料中の、現在の母集団のサイズを代表する。一般性の喪失を伴わずに、各増幅反応の後または間に、１以上の測定値を取得できることが理解されるであろう。
【００１５】
目下好ましい本発明の定義において、本発明の意味における方法は以下の段階：
ａ）増幅反応の収率のモデルを一連の増幅の関数として提供すること、前記モデルは：
・増幅反応の適用の第一の部分に関する実質的に一定の局面；および
・増幅反応の適用の第二の部分に関する一定ではない局面；
を含み、
前記第一および第二の部分は、前記一定のおよび一定ではない局面の間で収率が切替わる切替領域によって一体化され、前記領域は、前記切替に実質的に対応する増幅指数を有し；
ｂ）少なくとも前記切替指数および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを含む関係を表すために前記収率モデルを用いること；
ｃ）実験的な測定値との比較により、少なくとも前記切替指数を決定すること；および、後の、または直後の段階において、ｄ）それから、関心対象試料中の初期母集団のサイズを演繹すること、
を含む。
【００１６】
さらなる詳細な説明
上記の方法の特徴を実証する、本発明の幾つかの原理を概略説明している図４Ａおよび４Ｂを参照する。
【００１７】
初めに、図４Ａは、各反応が指数ｎのインデックスを付されている、一連の増幅反応に漸次供されている関心対象母集団の現時点におけるサイズを代表する、一連の実験的測定値Ｆｎをプロットしていることを理解すべきである。ここで説明する非限定的な例において、この一連の反応は、一連のＰＣＲサイクルに対応する。この非限定的な例において、実験的測定値Ｆｎは、各ＰＣＲサイクルに対する蛍光の測定量に対応する。斯くして、ＰＣＲ反応および関心対象試料により放出される蛍光を組み合わせる定量化方法において、ＰＣＲサイクルの間に放出される蛍光が試料中の核酸母集団のサイズに比例するように、試料中に蛍光試薬が導入される。実際には、あるＰＣＲサイクルに対して、多数の測定を行うか、または全く測定を行わないことが好ましい場合があり得る。更に、もっと一般的に、蛍光がＰＣＲによる定量化に対して頻繁に用いられる方法であるにしても、測定方法は、蛍光以外の技術を用いてよい。最後に、他の増幅技術を、その増幅に対応する反応収率における変化を追跡可能な場合には、本発明の状況の中で実施できるであろうことを理解すべきである。以下に説明する例は優先的にＰＣＲサイクルに関連するので、増幅反応の収率に言及するために、指数ｎの各ＰＣＲサイクルについての「ＰＣＲの効率」をＥｎと記載する。
【００１８】
図１を参照して上に述べたように、図４Ａは、２つの領域を主に含み、その場合：
・初期のＰＣＲサイクル（部分ＥＸＰ）の間、母集団は実質的に指数関数的に増加する；他方
・引き続くサイクル（ＬＩＮおよびＰＬＡ部分）の間、関心対象母集団の成長に伴って他の現象が競合し始め、それで、成長が鈍化する。
【００１９】
以下の２つの仮定をする：
・反応の収率Ｅｎは、部分ＥＸＰにわたる初期サイクルの間、比較的一定である；および
・ある回数のサイクルが実行された後、反応の収率Ｅｎは、部分ＬＩＮおよびＰＬＡにわたって減少を始める。
【００２０】
収率におけるこの減少には種々の説明、特に、ＰＣＲ試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマー、等）の劣化および／または欠乏および／または自身から造られた生成物による阻害があり得る。
【００２１】
ここでは、収率は、初期は一定で、その後減少すると仮定する。そうは言っても、
・初期に一定である、これは増幅による成長に関する通常の状態に対応する；および
・その後一定ではない（減少する、または増加する）、これは実質的に正常ではない状況に対応する、
という収率の状況に対して、本発明がより一般的に適用されることを理解すべきである。
【００２２】
核酸の量を増幅するための反応の状況において、収率は、一定の局面から一定ではない局面にわたって、しばしば変わることが見いだされている。以下に詳細に説明するように、本発明の意味において、この観察は、それから核酸の初期量を演繹するために有利である。当初、収率も、早期のサイクルの間の一定ではない局面から後の一定の局面へと変わり得るとだけ、述べられている。本発明は、等しく、そのような環境に適用可能である。一般的に、それ故、本発明の意味において、一定の局面と一定ではない局面との間の収率の切替が検出されることが理解されるべきである。
【００２３】
目的は、増幅に供された母集団の初期サイズ見いだすことである。図４を参照して、この初期母集団のサイズを代表する測定値Ｆ０は、これは実際には背景雑音ＢＮの測定値に一致するが、初期母集団のサイズを直接決定するためにそのまま用いることはできないことが理解されるであろう。先行技術において、指数関数の局面、即ち、背景雑音から抜け出る際に典型的に起こる局面を用いることにより、この初期母集団のサイズを定量化する試みが為されてきた。次いで、図４Ａにおいて、閾サイクルＣｔが決定される（「先行技術」に対する点ＰＡに対応する）。上述のとおり、この領域において、測定値は、しばしば、雑音に影響され、背景雑音からの抜けだしを代表する閾サイクルＣｔを正確に決定することは困難である。
【００２４】
全く異なる取組により、本発明は、その代わりに、収率が一定の局面から一定ではない局面の間で、本環境においては、典型的には指数関数の局面ＥＸＰから線形関数の局面ＬＩＮの間で切替わる領域ＣＨＯを正確に決定するために、増幅曲線の殆ど全ての点を利用する。領域ＣＨＯはより遅いサイクルの間に起こるため、測定は、この領域ＣＨＯにおける方が背景雑音出口領域におけるより、論理的に雑音による影響が少ないことが理解されるであろう。更に、特に、収率が伴う数学的な特性故に、最も有利なことに、関心対象母集団の初期サイズの定量化に用いる必要がある標準の数は、先行技術の定量化において用いる標準の数より少ないことが、以下に示される。
【００２５】
切替領域ＣＨＯを関心対象母集団の初期サイズと結び付ける関係を、概略以下に示す。増幅反応の収率は：
Ｎｎ＋１＝Ｎｎ＋Ｅｎ×Ｎｎ
で与えられ、ここで：
・Ｎｎは、一連の増幅における、指数ｎの増幅後の関心対象母集団のサイズであり；
・Ｎｎ＋１は、上述の一連の増幅における、それに続く、指数ｎ＋１の増幅後の関心対象母集団のサイズであり；および
・Ｅｎは、上述の一連の増幅における、指数ｎの増幅反応の収率である。
【００２６】
この関係を回帰関係に再定式化すると、我々は：
Ｎｎ＋１＝（１＋Ｅｎ）（１＋Ｅｎ−１）（１＋Ｅｎ−２）・・・（１＋Ｅ０）Ｎ０
を得、ここで、Ｎ０は関心対象母集団の初期サイズである。収率Ｅｎが一定である限り、上の関係は更に単純に、以下のように書けることが理解されるであろう：
Ｎｎ＋１＝Ｎ０×（１＋Ｅ０）ｎ＋１
ここで、指数ｎ＋１は未だ切替領域ＣＨＯに達していない。初期サイクルの間、収率は一定なので、以下が適用される：
Ｅｎ＝Ｅｎ−１＝Ｅｎ−２＝・・・＝Ｅ０
ここで、Ｅ０は一定の局面の間の収率の値である。とは言っても、指数ｎ＋１が切替領域ＣＨＯ中に移動するとき、関係は：
Ｎｎ＋１＝Ｎ０×（１＋Ｅ０）ＣＥＥＰ×関数（ＣＥＥＰ、ｎ＋１）
となり、ここで、
・（ＣＥＥＰ−１）は、収率がなおも一定である間の増幅反応の最後の指数であり（それ故、指数ＣＥＥＰそれ自身が、指数関数の局面と線形関数の局面の間に固有の切替指数を表していることが理解されるであろう）；および
・関数（ＣＥＥＰ、ｎ＋１）の項は、収率の一定ではない局面を特徴付け、並びに、少なくとも切替指数ＣＥＥＰおよび現行の増幅指数ｎ＋１に依存する、特有の関数である。
【００２７】
斯くして、如何にして切替指数ＣＥＥＰと関心対象母集団の初期サイズＮ０を結びつけることが可能かを見ることができる。この局面において、上で定義した方法の段階ａ）およびｂ）は、既に実施されていることが理解できる。
【００２８】
最初の実施は、実験的に切替指数ＣＥＥＰを決定すること、および、関心対象試料と同じ増幅処理に供される多数の標準試料を用いる回帰により、それを初期サイズに関連づけることにある。このような環境下、初期には、切替指数ＣＥＥＰ（段階ｃ））は実験的に決定され、および、後において、指数ＣＥＥＰと初期サイズＮ０（段階ｂ））の関係は、初期サイズＮ０（段階ｄ））で終わるために決定されるので、上で定義した方法の段階ｂ）およびｃ）は単に入れ替えられることが理解されるであろう。
【００２９】
第一の実施の意味においてこれらの段階を全て詳細に説明する前に、実験的測定値に基づいて指数ＣＥＥＰを決定するための方法を説明する。特に、実験的に指数ＣＥＥＰを決定するこの方法は、上述の第一の実施とは異なる別の実施に適用できることが理解されるであろう。
【００３０】
あるサイクルｎの効率Ｅｎと、同じサイクルＮｎ及び引き続くサイクルＮｎ＋１における関心対象母集団の現在のサイズの関係に戻って、増幅の効率は以下のように表される：
Ｅｎ＝（Ｎｎ＋１／Ｎｎ）−１
【００３１】
ある環境においては、特に測定において背景雑音ＢＮを考慮する必要がないときは、第一近似に対して、測定値が関心対象母集団の現行のサイズに実質的に比例すると仮定することができる。そうは言っても、実際には、図４Ａに示されるように、直接の測定値Ｆｎに基づいて決定される、補正された実験的な測定値Ｆ’ｎを伴って、もっとしばしば測定値のドリフトが考慮されるであろう。
【００３２】
背景雑音ＢＮを差引くこと、およびその後、初期母集団のサイズを代表する非ゼロの測定値εを考慮するために補償を導入することにある、実験的な測定値Ｆｎを処理する前段階は、好ましく適用される。図４Ａに示された例において、テスト結果が、ＰＣＲにおける蛍光測定に対して線形モデルが満足のいくことを示しているので、指数ｎの関数としての背景雑音ＢＮの変化は線形関数により表すことができる。そうは言っても、環境によっては、指数関数的に変化するモデルを用いることが好ましい可能性がある。いずれにせよ、典型的には初期測定点により与えられる背景雑音ＢＮの変化に最も適合するモデルが適用される。以降、背景雑音ＢＮの変化に関する選択されたモデルを、全ての実験的な測定値Ｆｎから差し引く。この段階を適用することにより、理論的な蛍光測定値Ｆ０は、初期母集団のサイズＮ０がゼロに対応する、ゼロの測定値に減らされ、これは物理的実態を代表していない、ということが理解されるであろう。その結果、以下のように、この補正に対する補償を適用することが有利である：
Ｆ’ｎ＝Ｆｎ−ＢＮ＋ε
ここで：
・項Ｆ’ｎは、現行の指数ｎに対する補正された測定値に対応する；
・項Ｆｎは、前記現行の指数ｎにおける生の実験的測定値に対応する；
・項ＢＮは、現行の指数ｎに関してモデル化された背景雑音に対する値に対応する；および
・εは、説明されている例において一定であると仮定され、および、初期母集団のサイズＮ０を直接表す、対応する補償項である。
【００３３】
背景雑音を補正するこれらの段階は切替指数ＣＥＥＰの決定において非常に有利であるが、これらは、背景雑音が初期母集団のサイズＮ０の測定値を歪曲しがちな場合はいつでも、前記母集団のサイズＮ０のいかなる決定及び定量化にも、適用できるであろう。この点において、これらの段階は、適切な場合は、別個の保護の主題を構成する可能性がある。
【００３４】
この様にして得られる補正された測定値Ｆ’ｎは、関心対象試料における現行母集団のサイズＮｎに対して有利に比例するので、収率Ｅｎは、今や、測定値（上述のように補正された）の関数として、以下の関係により直接表される：
Ｅｎ＝（Ｆ’ｎ＋１／Ｆ’ｎ）−１
【００３５】
斯くして、図４Ａの実験的測定値Ｆｎから、補正された測定値Ｆ’ｎが得られ、それから、図４Ｂに示すように、その後、一連の指数ｎの関数として効率における変化が決定される。
【００３６】
要するに、実験的測定値は、一連の増幅ｎの関数として図４Ｂに示された種類の、効率Ｅｎにおける実験的変化の形式で表される。これは：
・低い増幅指数ｎに対する認知できる程度に雑音がある第一の領域（具体的には、図４Ｂの例におけるサイクルＣＧに先立つ）；および
・それに続くより高い増幅指数に対するより少ない雑音を示す第二の領域（少なくとも切替領域ＣＨＯの後）、
を含む、収率に関する実験的に決定された変化を提供する。
【００３７】
少なくとも、ＰＣＲによる増幅及び蛍光による測定の最も普通の環境において、収率の一定ではない局面は減少しており、殆ど雑音を示さない前記第二の領域に一致する（図４Ｂに示すように）。具体的には、収率の変化に適用するためにモデルを選択するときに結果を改ざんする危険を冒す測定点を取り除く目的で：
・一定の収率の局面に対して、生の値Ｅ０を推定する；および
・特に切替指数ＣＥＥＰを求めるとき、例えば一定の局面Ｅ０の幾つかの部分（fraction）に対応する、推定された収率が閾値より低い、雑音がより低い第二の領域における少なくとも幾つかの測定値を無視する。
【００３８】
取り除かれるこれらの点ＮＥＧ（図４）は、典型的には非常に高い増幅指数ｎに対応する点であり、および実質的に切替領域ＣＨＯの周囲で選択される効率に関するモデルを最早満足しないかもしれない点である。一例として、これらを取り除くために、収率Ｅ０が一定の局面、典型的には初期指数ｎに関して、平均を評価する。その後、一定の局面Ｅ０に関して見いだされる平均の一部分、例えば１０％に対応する閾値を選択する。その後、最高の指数ｎから出発して、測定された収率が前記閾値以下の全ての測定点ＮＥＧを取り除く。指数ＣＥＥＰの検出に対して最も有利であるこの段階は、それでもなお収率Ｅｎに基づく任意の決定に対して適用でき、および、適切な場合には、別個の保護の主題を構成するであろう。
【００３９】
図４Ｂに示すように、収率が、収率が減少していて一定ではない局面を示し、および、その局面が、一定である局面に続くとき、切替領域ＣＨＯは、雑音がより少ない第二の領域から出発して、指数の数ｎが減少する方向に進むことにより、および収率が所定の値を通り過ぎる粗指数ＣＧを検出することにより、特定される。斯くして、図４Ｂを参照して、減少する指数の数ｎの方向に進み、切替領域ＣＨＯに向かって昇って行き、各指数の数と関連する収率が評価される。上述の所定の値より顕著に大きい収率の第一の測定点に関して、上述の粗指数ＣＧが検出されており、その測定点の指数に対応すると考えられる。
【００４０】
引き続く実施において以下に説明するとおり、各測定点に関して、あたかも、前記設定された点自身が切替指数ＣＥＥＰに対応するかのように、その収率の変化をモデル化することができる。その実施において、もし一定の収率の局面Ｅ０が推定され、および、もし推定された値が上述の所定の値を超えるなら、その点は粗指数ＣＧに対応すると考えられる。
【００４１】
一般的に、最大収率は１の値を持ち、それ故、上述の所定の値は１に等しいと選択することができる。そうは言っても、これは変化させることができ、および、例えば、初期反応サイクルにわたって評価された平均収率Ｅ０に対応するように所定の値を設定するために条件を設けることができる。
【００４２】
その後、粗指数ＣＧから出発して、増幅指数の数が増加する方向に進めることにより、および、収率が上述の所定の値とほぼ等しい増幅指数を検出することにより、切替領域における増幅指数ＣＥＥＰの値の推定を精緻化する。その値は有利に少数であってよい。斯くして、再度図４Ｂを参照して、粗指数ＣＧが決定された後、切替指数ＣＥＥＰに対する検索を精緻化するために、粗指数ＣＧから出発して、および指数の数ｎが増加する方向に向けて、一の全指数よりサイズが小さい段階で検索が下方へ為され、および、例えば補間により、横軸値が決定され、そこで所定の値が交差する。典型的には、一定の局面の値が１より大きいままである限りは、検索は、数ｎが増大する方向に続けられ、および、切替に先行する指数（ＣＥＥＰ−１）は、定常値Ｅ０が１に等しいか、または非常に近いときは直ちに決定される。それが、指数の一部、例えば１サイクルｎの１０％に対応する検索段階サイズを選択することが適切な理由である。
【００４３】
上述の第一の実施において、それぞれ公知の初期母集団のサイズを有する多数の標準試料が提供され、および、関心対象試料に対するのと実質的に同じ条件下で、それらに一連の増幅が適用される。これらそれぞれの切替指数は、上記の段階ａ）、ｂ）、およびｃ）に対応して決定される。段階ｄ）において：
・標準試料の初期母集団のサイズＮ０ｓｔとそれらの指数ＣＥＥＰｓｔの間に、依存関係を構築する；および
・関心対象試料に関する指数ＣＥＥＰを決定した後、その依存関係に対する補間により、関心対象母集団の初期サイズＮ０を決定する。
【００４４】
斯くして、図５を参照して、例えば回帰により、標準の切替サイクルＣＥＥＰ１、ＣＥＥＰ２とそれらの初期濃度Ｎ０１、Ｎ０２（実際にはそれらの対数）との間に依存関係を構築できる。関心対象試料に関する切替指数ＣＥＥＰｉｎｔを測定することにより、および、図５の回帰勾配上にその値をプロットすることにより、補間によって関心対象試料における初期濃度Ｎ０ｉｎｔが得られる。
【００４５】
この第一の実施は、このように、図３を参照して説明した先行技術のそれに非常に似ている。そうは言っても、この第一の実施が依存している切替指数ＣＥＥＰは、先行技術の閾サイクルＣｔと決して対応しないことを忘れるべきではない。
【００４６】
この第一の実施と顕著に異なる取組において：
段階ｂ）において、一連の増幅の関数としてパラメータ化された変化を表すために収率モデルの使用が為される、前記変化は、切替指数ＣＥＥＰを表す少なくとも一のパラメータを用いている；および
段階ｃ）において、少なくとも切替指数ＣＥＥＰを表す前記パラメータを、実験的な測定値と比較することにより決定する。
【００４７】
第二の実施において、このパラメータ化された変化は、関心対象試料中の現行母集団のサイズＮｎを代表する。
【００４８】
典型的には、このパラメータ化された変化は、上に挙げた型の式：
Ｎｎ＋１＝Ｎ０×（１＋Ｅ０）ＣＥＥＰ×関数（ＣＥＥＰ、ｎ＋１）
から導くことができる。
【００４９】
斯くして、切替指数ＣＥＥＰを表すパラメータに加えて、この変化は、関心対象試料中の初期母集団のサイズＮ０を代表するパラメータを利用する。
【００５０】
その後、この第二の実施の段階ｃ）およびｄ）において、これら２個のパラメータ−ＣＥＥＰおよびＮ０は、実質的に一緒に決定される。
【００５１】
あらかじめ、段階ａ）において、上述した関数、関数（ＣＥＥＰ、ｎ＋１）に関するモデルを決定することが必要である。
【００５２】
通常、ＰＣＲの定量化に対して、下で遙かに詳細に説明する減少パラメータβを有する、減少する指数関数に対応する、収率の一定ではない局面に関するモデルが選択される。この減少パラメータβは、次いで、実験的な測定値との比較により、少なくとも切替指数ＣＥＥＰと共に、段階ｃ）で決定される。
【００５３】
斯くして、この第二の実施において、一旦収率モデルＥｎが選択されてしまうと、これは、上記の関係により与えられる現行母集団のサイズＮｎに対する一般式に適用される。これは、現行母集団のサイズＮｎにおける変化に対するモデルを提供する。
【００５４】
そうは言っても、実験的な測定値が現行母集団のサイズＮｎに関する値を直接与えるのでなければ（これは、目下、実際問題としてめったに事実ではない）、上記のように、差し引かれた背景雑音、および引き続く補償εを考慮して、続いて、実験的測定値Ｆｎそれ自身をモデル化することが適切である。
【００５５】
斯くして、目下好ましい実施において、上述のパラメータ化された変化は：
・実験的な測定値を代表する；および
・初期母集団のサイズを代表する測定値Ｆ０に対応するパラメータを包含する。
【００５６】
その後、初期母集団のサイズの測定値Ｆ０は、前記パラメータ化された変化Ｆｎを実験的な測定値と比較することにより決定される。
【００５７】
この比較を遂行するために、例えば、生の実験的測定値に適用される統計的な相関関係（典型的には最小二乗法）を用いることにより、測定値Ｆｎのモデル中のパラメータＦ０、Ｅ０、ＣＥＥＰおよび減少パラメータβを調整することができる。
【００５８】
例えば図６Ａに示すように、初期には、変化は、適用されたＰＣＲサイクルの数の関数として、測定されおよび調整された蛍光量に関して得られる。この図は、核酸、この場合は供給者BI-RAD（登録商標）由来のI-Cycler IQ（登録商標）装置上で遂行されるＰＣＲ反応の間SYBRGREENインターカラントによって印を付けた、１００，０００コピーの初期量を有するＤＮＡのフラグメントを含有する関心対象試料に関する増幅曲線を示す。
【００５９】
説明した例において、増幅反応がリアルタイムのＰＣＲ反応であることが理解されるであろう。実験的測定値は、放射された蛍光の量を示す。
【００６０】
上述したように、背景雑音に対する調整後のサイクルｎの蛍光を、以下、Ｆｎと記す。第一のサイクルより前の理論的な初期蛍光をＦ０と記す。サイクルｎにおけるＰＣＲの効率をＥｎと記す。ＰＣＲ反応の間に遂行されるサイクルの合計数をＮと記す。
【００６１】
仮定により、ＰＣＲ反応サイクルの各サイクルｎにおいて測定される蛍光は：
【００６２】
【化１】
2008521104.tif 000002
【００６３】
により定義される。ここで０≦Ｅｎ≦１である。
【００６４】
各サイクルｎにおける反応の効率は、以下のように計算される：
【００６５】
【化２】
2008521104.tif 000003
【００６６】
等式（１）はｎ＝０に対して成り立つと仮定されていることに気付くべきである。そうは言っても、定義により、初期蛍光Ｆ０は公知ではない。それ故、第一のサイクルＥ０に対する効率を、等式（２）に関して直接計算することはできない。
【００６７】
図６Ｂは、等式（２）で近似され、および図６Ａの蛍光における調整された変化に基づくＰＣＲ反応の効率を、サイクル数ｎの関数として示す。
【００６８】
以下の仮定が好ましく為される:
・反応の効率は、初期サイクルの間、比較的一定である；および
・ある数のサイクルが遂行された後、反応の効率は減少する。
【００６９】
図６Ｂは第二の仮定を裏付けている。効率はサイクルｎ＝１７から減少していることが見られるからである。しかしながら、サイクル１から１６における測定された効率は非常に雑音が多く、これは、グラフ的に第一の仮定を証明することを困難にしている。
【００７０】
そうは言っても、効率の変化は：
・第一のＰＣＲサイクルと、ＣＥＥＰと書かれる切替サイクルに先立つサイクル（ＣＥＥＰ−１）との間で一定である第一の局面；および
・サイクル（ＣＥＥＰ−１）以上の数のサイクルに対してそれが減少する第二の局面、
を包含する型のモデルに従うと仮定することが好ましい。
【００７１】
斯くして、サイクル（ＣＥＥＰ−１）は効率が一定であり続ける最後のサイクル（これは部分（fraction）であってよい）を表す。
【００７２】
次いで、反応の効率を以下のようにモデル化することを提案する：
【００７３】
【化３】
2008521104.tif 000004
【００７４】
ここでＥ０およびβは、下に示すように、図６Ａの増幅曲線を用いて、または図６Ｂの効率曲線を用いて推定される実数のパラメータである。
【００７５】
変形においては、例えば下に与えられたモデルＦ１からＦ３から、特に、定量化すべき核酸の型に依存して、何らかの他の選択が好ましい可能性がある。
Ｆｌ：Ｅｎ＝ｅｘｐ（−β（ｎ−ＣＥＥＰ＋ｌ））−１
Ｆ２：Ｅｎ＝ｅｘｐ（−μ（ｎ−ＣＥＥＰ＋ｌ）α）−ｌ
Ｆ３：Ｅｎ＝α−ｅｘｐ（−μ（ｎ−ＣＥＥＰ＋ｌ）α）−１
【００７６】
好ましくは、幾つかの候補切替サイクルＣＥＥＰに関して、段階ｃ）において幾つかの組のパラメータが推定され、および各切替サイクルＣＥＥＰに関して、関連したパラメータが、段階ｃ）において保証できる統計的な相関関係を最大にする、最小の候補サイクルが選択される。
【００７７】
上記したように、式（１）は、
【００７８】
【化４】
2008521104.tif 000005
【００７９】
の形に書くことも可能である。
【００８０】
このように、効率に関する式（３）を式（４）に導入することにより、調整された放出された蛍光Ｆｎに関して、４個のパラメータ（Ｆ０、Ｅ０、β、ＣＥＥＰ）を有する新しいモデルが得られる：
【００８１】
【化５】
2008521104.tif 000006
【００８２】
関心対象母集団の初期サイズＮ０、ｎ＝０の反応の効率Ｅ０、パラメータβ、および切替サイクルＣＥＥＰは、切替サイクルＣＥＥＰと等しい最小サイクル値に対して得られる統計的な相関最大を見いだすために、切替領域ＣＨＯ付近におけるいくつかのサイクル値に対して繰り返し評価される。
【００８３】
この第二の実施において、測定されおよび調整された蛍光の量における変化を、効率のモデルまたは変化に基づくサイクル数の関数としてモデル化し、その後、直接、測定されおよび調整された蛍光の量に対して相関を行うことが好ましい。
【００８４】
背景雑音に対して、測定された放出された蛍光を調整することにより、初期の蛍光Ｆ０に対しても人為的な調整が為されることに気付くべきである。斯くして、調整された蛍光測定値から演繹される効率測定値に基づいて効率モデルのパラメータを推定することは、追加の誤差源を構成し、第三の実施に関して下に記載したような２つの局面に進むことが好ましいかもしれない。
【００８５】
そうは言っても、説明した第二の実施は、より単純であり、および蛍光測定値を用いるＰＣＲ定量化に良く適合する。それは、測定に対する補償εと共に背景雑音におけるドリフトに対して調整された蛍光測定値に対応する、蛍光Ｆ’ｎの実際の測定値に基づく。一旦背景雑音が差し引かれると、我々は以下の型の関係を有する：
Ｆ’ｎ＝Ｆｎ＋ε
ここで、εはサイクル数ｎに依存してもしなくてもよい量である。一定と選択されるのが好ましい。
【００８６】
このような環境下、サイクルｎに対してＥ’ｎとも書かれる、測定されおよび「調整された」効率は：
【００８７】
【化６】
2008521104.tif 000007
【００８８】
で定義される。
【００８９】
上の関係（５）のモデルは、斯くして：
【００９０】
【化７】
2008521104.tif 000008
【００９１】
となる。
【００９２】
このような環境の下、効率値Ｅ’ｎは、効率が減少している局面の間に最小の許容できる効率閾を設定できるように、測定値から実験的に近似される。閾サイクルはこのように決定され、それを超えては、調整された蛍光測定値はこのモデルの目的には用いられない（図４Ｂ中の点ＮＥＧ）。典型的には、閾サイクルは、効率が減少している局面において、効率がある最小の受容できる効率閾（例えば、０．１Ｅ０）より下に落ちる、最初のサイクルに対応する。
【００９３】
さらに一般的には、効率閾の値は、好ましくは０から０．５の範囲にあり、およびこの閾より下の効率値を有するＰＣＲは、制御されていない抑制現象により、潜在的にバイアスをかけられている。
【００９４】
図７に示した例において、効率に対する閾値は０．０２に設定された（即ち、Ｅ０の２％）。閾サイクルＣＳは、サイクルｎ＝３６に対応した。図７は、放出された蛍光の調整された測定値を示す。サイクルｎ＝３６まで、これらの実験的な測定値（「○」で印をつけた）に対してモデル（連続線）と満足できる相関があることが判る。図８も、測定されおよび調整された蛍光に基づくモデルを用いて図７から得られた予言的な効率に対して実験的な測定値と良好な相関を示す。
【００９５】
この実施の主な段階は、図９を参照して、以下のように要約できる。
【００９６】
図６Ａに示すように、開始段階７０において、蛍光の量に関する測定値は、サイクル数ｎの関数として得られ、および背景雑音に対して調整されている。
【００９７】
段階７１において、サイクルｎにおける反応の効率に関する近似は、サイクルｎ＝１、２、・・・、（Ｎ−１）の各々に関して上記の式（２）を用いて計算される。
【００９８】
段階７２において、最小サイクルＣｓが決定され、これに関して以下の２つの条件が満たされる：
・サイクルＣｓは効率が減少している局面中にある；および
・閾サイクルの効率は、閾効率値Ｅｓ（例えば、Ｅｓ＝０．１Ｅ０）より小さい：
ＥＣＳ≦ＥＳ
【００９９】
効率がＥＳ未満の点ＮＥＧを取り除くことは既に可能である。
【０１００】
段階７３において、補償εがε＝Ｆ’０により与えられると仮定している式（８）を用い、サイクル範囲ＣＥＥＰ＝（ＣＳ−５）からＣＳにわたって効率が減少している調整された、放出された蛍光の曲線に関して、モデルが形成される：
【０１０１】
【化８】
2008521104.tif 000009
【０１０２】
その後、値E'0に関して見積もられた値
【化９】
2008521104.tif 000010
、および切替サイクルＣＥＥＰに関する値の段階７５における減少に対する試験７４は、段階のサイズＰ（これは１に等しくてよい）を用いて、および
【化１０】
2008521104.tif 000011
の値が１未満でありさえすれば繰り返し段階７３において、ＣＥＥＰの予期された値を見つけ出そうと努める。
【０１０３】
その後、推定される効率値が値１を超えるとき（試験７４から立ち去る際の矢印ｎ）、指数ＣＥＥＰの値は、段階７６において、サイズｈの段階（一単位より小さい部分であってよい）だけ増やされ、および段階７７において、蛍光Ｆｎは、段階７３におけるのと同じやり方でモデル化される。段階７８において、見積もられた効率
【化１１】
2008521104.tif 000012
が１以上である限りは、段階７６から７８が繰り返される。見積もられた効率が１未満の値を取るときは、推定されたパラメータ
【化１２】
2008521104.tif 000013
は、最終段階７９において保存される。
【０１０４】
この段階において、値
【化１３】
2008521104.tif 000014
が最終的に得られ、これだけが関心対象試料中の初期母集団のサイズＮ０を代表する。関心対象試料中の初期母集団のサイズＮ０を段階８０において決定するように、次いで、公知の母集団サイズＮ０ｓｔを有する少なくとも一の標準試料を用いることができる。
【０１０５】
この目的のために、公知の標準試料中の初期母集団Ｎ０ｓｔにおける初期母集団サイズＦ０ｓｔの測定値が得られる。その後、標準試料に関する測定値とその公知の初期母集団のサイズの間の比例関係を導出すること、およびその関係を、実際の初期母集団のサイズＮ０を得るための測定Ｆ’０に適用することにより、関心対象試料中の初期母集団のサイズＮ０の値を得る。
【０１０６】
言い換えると、図９の段階８０において、標準Ｎ０ｓｔ中の初期母集団のサイズ、並びに蛍光モデルを調整することにより補償されおよび推定された補正された蛍光の比は、関心対象試料および標準試料の両方に適用されることを暗示する、型：
【０１０７】
【化１４】
2008521104.tif 000015
【０１０８】
の単純な比例関係を適用して、関心対象試料中の初期母集団のサイズの値Ｎ０を決定することができる。
【０１０９】
斯くして、関心対象試料における関心対象母集団の初期サイズを決定するために、たった一つの標準で十分であるに違いないことが理解されると思われ、これは、本発明により提供される利点である。
【０１１０】
そうは言っても、変形においては、および必要な場合は、公知の初期母集団のサイズＮ０ｓｔを有する多数の標準試料中の初期母集団のサイズ
【化１５】
2008521104.tif 000016
に関するそれぞれの測定値を得るために、対策がなされるであろう。その後、標準試料の初期母集団のサイズＮ０ｓｔとそれらの初期母集団のサイズに関するそれぞれの測定値
【化１６】
2008521104.tif 000017
の間に、依存関係が確立される。その後、関心対象試料の初期母集団のサイズ
【化１７】
2008521104.tif 000018
に関する測定値を見いだした後、関心対象の実際の初期母集団のサイズＮ０を、依存関係を用いて補間により決定する。この依存関係も典型的には図５に示す型の回帰であり得るが、しかし、切替指数ＣＥＥＰに関する値をプロットする代わりに、縦軸にプロットされた、標準および関心対象試料の初期蛍光値
【化１８】
2008521104.tif 000019
および
【化１９】
2008521104.tif 000020
（またはそれぞれの対数値）を有することが理解されるであろう。
【０１１１】
一旦一以上の標準を利用すると、それぞれ公知の初期母集団のサイズＮ０ｓｔを有する一以上の標準試料に対する対策がなされ、関心対象試料に関するのと実質的に同じ条件下で、一連の増幅反応が適用される。その後、関心対象試料について、パラメータ化された変化を実験的な測定値と比較することにより、これら初期母集団のサイズに関する測定値
【化２０】
2008521104.tif 000021
を決定する。
【０１１２】
言い換えると、標準に対するおよび関心対象試料の両方に対する、測定されおよび調整された蛍光に関して、当然ながら、同じ計算が適用される。上で説明したとおり、第一のサイクルの前の蛍光の量
【化２１】
2008521104.tif 000022
は、関心対象試料に関する
【化２２】
2008521104.tif 000023
を決定するために用いられるのと同じ方法を用いて、標準に関して推定される。
【０１１３】
上記の第二の実施の変形に対応する第三の実施は、全体として、効率Ｅｎに関するモデルを実験的測定値に対して調整すること、および、引き続き、前記調整された効率モデルを現行母集団のサイズＮｎに関するモデル、または測定値Ｆｎに関するモデルに投入する点にある。この第三の実施は、以下のように要約できる。
【０１１４】
段階ｂ）で構築されたパラメータ化された変化は、収率を代表し、および段階ｃ）において、パラメータ化された変化を実験的な変化と比較するため、実験的測定値に基づいて、収率の実験的な変化が決定される。その後、初期母集団のサイズＮ０を代表するパラメータを得るために、段階ｄ）において以下の段階が実行される：
ｄ１）少なくとも切替指数ＣＥＥＰを表すパラメータを利用して、関心対象試料中の現行母集団のサイズＮｎを代表する第二のパラメータ化された変化を、および初期母集団のサイズＮ０を代表するパラメータを決定すること；
ｄ２）段階ｃ）で決定された切替指数ＣＥＥＰに関するパラメータ化された値を、前記第二の変化に適用すること；および
ｄ３）前記第二の変化を実験的な測定値と直接比較することにより、少なくとも初期母集団のサイズＮ０を代表するパラメータを調整すること。
【０１１５】
有利に、以下が実行される：
・段階ｄ２）において、切替指数ＣＥＥＰに関する粗値を、上記図４Ｂを参照してそれを検出するために説明したのと同じやり方で、適用すること；および
・段階ｄ３）において、その後、初期母集団のサイズＮ０を代表するパラメータを調整することと共に、指数値を精緻化すること。
【０１１６】
最後に、目下好ましい図７および８の第二の実施は、効率に対する相関を実行するための試みを為しているのではなく、正確なおよび補償された蛍光の推定をモデル化しおよび精緻化するために、単に効率変化に関する数学的モデルを利用しているという事実により、この第三の実施とは異なることを理解すべきである。
【０１１７】
当然ながら、本発明は、例として上で説明した態様に限定はされず、他の変形にまで及ぶ。
【０１１８】
斯くして、本発明は、相対的な定量化、特にＰＣＲによる、にも適用できることが理解されるであろう。この適用において、関心対象母集団を増幅することと共に、参照母集団も同じ媒体中で同時に、または別個に増幅される。測定値は、以下のように選び取られる：
・関心対象母集団のサイズを代表する実験的測定値；および
・参照母集団サイズを代表する実験的測定値。
【０１１９】
この方法は、段階ａ）、ｂ）、およびｃ）を参照母集団に適用することにより継続することができ、他方、段階ｄ）は、単に、関心対象母集団および参照母集団のそれぞれの初期サイズの間の比を決定することにある。
【０１２０】
相対的定量化は、生命体の発展の間における関心対象遺伝子の発現を分析するために用いることができる。異なる時間に生命体から採取した試料の間の、特に量的および質的変化を矯正するために、関心対象標的遺伝子を分析することに加えて、発展の間に安定なままである、ある水準の発現を有していることが公知の参照遺伝子も分析される。
【０１２１】
最終段階は、次に、採取されている種々の試料の間の比
【０１２２】
【化２３】
2008521104.tif 000024
【０１２３】
を比較することにある。
【０１２４】
所望の結果を達成するために、２つの方策が可能である。
【０１２５】
先行技術の方策は閾サイクルＣｔを検出することに基づき、それは、通常以下のように行われる。異なる瞬間ｔ０、ｔ１、ｔ２、・・・ｔｎにおいて採取された各試料に関して、少なくとも一の標準（即ち、Ｎ０標的およびＮ０参照が公知の標準）を利用して、比
【０１２６】
【化２４】
2008521104.tif 000025
【０１２７】
を決定する。これは、後に比を計算することが続く、２つの連続的な絶対的定量化を行うということに等しい。
【０１２８】
本発明の状況の中で特に有利な別の方策は、異なる瞬間ｔ０、ｔ１、ｔ２、・・・ｔｎにおいて採取された各試料に関して、比：
【０１２９】
【化２５】
2008521104.tif 000026
【０１３０】
を、以下の式：
【０１３１】
【化２６】
2008521104.tif 000027
【０１３２】
を用いることにより、直接決定することにある。
【０１３３】
本発明の技術と組合せて、結局パラメータＦ０だけを利用するこの第二の実施において、標準試料は必要とされず、これは特に有利である。
【０１３４】
ここで、本発明の方法を実施するための設備を示す図１０を参照する。それは、この場合、関心対象試料ＥＣＨを含有する窪み、および、例えば、Ｓｔと参照される標準試料を含有する窪みを含む、支持体ＳＵＰＰを含む。支持体ＳＵＰＰは、例えば、標準および関心対象試料にＰＣＲ反応を適用するための加熱手段（図示せず）が取り付けられた、囲いＥＮＣの中に囲われている。
【０１３５】
説明した例において、標準Ｓｔおよび関心対象試料ＥＣＨの両者により、各サイクルにおいて放出される蛍光の量を測定するための対策がなされることが好ましい。この目的のため、窪みの中に選択された試薬を挿入し、並びに、適用される各ＰＣＲサイクルにおいて、関心対象試料および標準試料由来のそれぞれの蛍光の量を測定するために、試料をランプ（例えば、ハロゲン−タングステンランプ）により照射する。更に、蛍光検出装置は、例えば、蛍光由来の光を収集するための対物レンズ１１、並びに、関心対象試料からのおよび標準からの、各ＰＣＲサイクルにおける放出された蛍光を測定するため、フォトン計数手段１０、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび／または光電子増倍管を含む。斯くして、各窪みにより放出された蛍光は、レンズ１１により有利に集められ、次いで、好ましくは、コンピュータの中央ユニット２０に設置された、例えばPersonal Computer Memory Card International Association (PCMCIA)型の収集カード２１に接続されたＣＣＤカメラ１０により検出される。
【０１３６】
コンピュータを、次いで、上述の測定手段１０に接続し、それから各ＰＣＲサイクルに関して検出された蛍光の測定量を代表する信号を受け取り、および、第一のサイクルに先立つ関心対象母集団に関する初期サイズを決定するために、本発明の方法を実施することにより、これらの信号を処理する。
【０１３７】
典型的には、プロセッサユニットは以下を含む：
・測定手段１０に接続された収集カード２１；
・上述の信号の一時的貯蔵及び処理用のワーキングメモリ２５（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）型の）；
・本発明の意味におけるコンピュータプログラム製品を貯蔵するための、および、処理されて、例えばその後の診断に、使用する用意ができているデータを貯蔵するための永久メモリ２４；
・適切な場合には、当初コンピュータプログラム製品を携行してよい、例えばＣＤ−ＲＯＭのような記憶媒体の読取機２２；
・場合により、近くのまたは遠方の場所と通信するための、例えば、患者から遠く離れて診断を可能にするために、処理データを通信するための通信用インターフェイス２６（連結部２８）；
・典型的にはディスプレースクリーン３０に接続されたグラフィクインターフェイス２７；および
・機材のこれら種々の品目間の相互作用を管理するためのプロセッサ２３。
【０１３８】
コンピュータは、中央ユニット２０に接続されたキーボード４１および／またはマウス４２等の入力部材を有してもよい。
【０１３９】
そうは言っても、本発明の意味において、設備は：
・少なくとも関心対象試料用の、試料支持体ＳＵＰＰ；
・少なくとも関心対象試料中の関心対象母集団に前記一連の増幅反応を適用するための第一の装置ＥＮＣ；
・関心対象母集団の現行のサイズを代表する測定値を得るための第二の装置１０；および
・第二の装置１０から測定信号を受け取るために、および本発明の方法の、全部のまたはいずれかの段階を実施するために適するコンピュータ手段２０、
を全体として含むことを理解すべきである。
【０１４０】
この目的のため、コンピュータ手段を制御するためにコンピュータプログラム製品を用いることができる。プログラムは、プロセッサユニット２０のメモリ中に、またはプロセッサユニットの読取機と協働するのに適する取り外しできるメモリ媒体（ＣＤ−ＲＯＭ等）上に貯蔵されてよい。本発明の意味におけるコンピュータプログラムは、ひいては、本発明の方法の、全てのまたはいずれかの段階を実施するための指示を含有する。例えば、プログラムのアルゴリズムは、図９の線図と同等のフローチャートで表されてよい。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
発明の他の利点及び特徴は、以下の、図を伴う実施例による実施の詳細な記載から見てとれる。
【図１】図１は先行技術に関連し、および、上述したように、蛍光の測定量における変化を、ＰＣＲサイクル数の関数として示す。
【図２】先行技術に関連し、および、上述したように、ＰＣＲサイクル数の関数としての、放出される蛍光の増加している量の代表例である。
【図３】先行技術で公知であり、また上述した方法を用いた、関心対象試料中の、関心対象母集団の初期の量を決定するための補間方法を示す。
【図４Ａ】上述の実験的測定値における変化を、関心対象試料に適用された一連の増幅の関数として示す線図である。
【図４Ｂ】実験的測定値から得られた、増幅反応の収率における変化を、関心対象試料に適用された一連の増幅の関数として示す線図である。
【図５】第一の実施で用いられる、一定の局面と一定でない局面の間の切替で起こる収率切替指数と、標準試料および関心対象試料に関する初期母集団の対数の間の、回帰関係をプロットする。
【図６Ａ】その測定値に特有の背景雑音を考慮して調整され、およびＰＣＲ反応サイクルの数ｎの関数としてプロットされた後の、蛍光の測定量における典型的な変化を示す。
【図６Ｂ】図６Ａに示したＰＣＲの効率における変化を、サイクルの数ｎの関数として示す。
【図７】図６Ａに示した放出される蛍光における実験的な変化と、第二の実施において効率モデルを包含することにより得られる放出される蛍光モデルを適用して得られる結果を比較する。
【図８】図６Ｂの効率における変化と、図７の放出される蛍光モデルから演繹される効率モデルの適用の比較である。
【図９】本発明の提案された実施における方法中の主な段階を概説する流れ図である。
【図１０】関心対象試料の初期母集団を定量化するための設備の図解である。
【図１】
2008521104.tif 000028
【図２】
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【図３】
2008521104.tif 000030
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2008521104.tif 000033
【図６Ａ】
2008521104.tif 000034
【図６Ｂ】
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【図７】
2008521104.tif 000036
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月12日(2007.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも関心対象試料の現行母集団のサイズを代表する実験的な測定値が取得される、母集団の増幅反応の一連の適用に供された、関心対象試料中の核酸の初期母集団を、絶対的および／または相対的やり方で、定量化することを、コンピュータ手段により実施する方法であって、以下の段階：
ａ）増幅反応の収率のモデルを一連の増幅の関数として提供すること、前記モデルは：
・増幅反応の適用の第一の部分に関する実質的に一定の局面；および
・増幅反応の適用の第二の部分に関する一定ではない局面；を含み
前記第一および第二の部分は、前記一定のおよび一定ではない局面の間で収率が切替わる切替領域により一体化され、前記領域は、実質的に前記切替に対応する増幅指数を有し；
ｂ）少なくとも前記切替指数および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを含む関係を表すために前記収率モデルを用いること；
ｃ）実験的な測定値との比較により、少なくとも前記切替指数を決定すること；および、後の、または直後の段階において、ｄ）それから、関心対象試料中の初期母集団のサイズを演繹すること、
を含む方法。
【請求項２】
・段階ｂ）において、前記一連の増幅の関数としてパラメータ化された、切替指数を表す少なくとも一のパラメータを含む、変化を表すために前記収率モデルを用いること；および
・段階ｃ）において、少なくとも、切替指数を表す前記パラメータを、実験的な測定値との比較により決定すること、
を包含する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パラメータ化された変化が関心対象試料中の現行母集団のサイズを代表し、
・前記変化が関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを更に含み；および
・段階ｃ）およびｄ）において、前記増幅指数および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータが、実質的に一緒に決定される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パラメータ化された変化が収率を代表し、および、段階ｃ）において、パラメータ化された変化を実験的な変化と比較するために、収率の実験的な変化が前記実験的な測定値から決定される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階ｄ）において：
ｄ１）関心対象試料中の現行母集団のサイズを代表し、そして、少なくとも前記増幅指数を表すパラメータ、および関心対象試料中の初期母集団のサイズを代表するパラメータを含む、第二のパラメータ化された変化を決定すること；
ｄ２）段階ｃ）で決定された指数に関するパラメータ化された値を、前記第二の変化に適用すること；および
ｄ３）前記第二の変化を実験的な測定値と直接比較することにより、少なくとも初期母集団のサイズを代表するパラメータを調整すること、
を包含する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階ｄ２）において、指数に関する粗値を適用すること、他方
段階ｄ３）において、初期母集団のサイズを代表するパラメータも調整しながら、指数の値を精緻化すること、
を包含する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パラメータ化された変化または、場合によっては、前記第二のパラメータ化された変化が：
・前記実験的な測定値を代表し；および
・初期母集団のサイズを代表する測定値に対応するパラメータを包含し、
並びに、初期母集団のサイズの測定値が、前記パラメータ化された変化を実験的な測定値と比較することにより決定される、
請求項３又は６に記載の方法。
【請求項８】
測定値から背景雑音を差引くこと、および、初期母集団のサイズを代表する非ゼロの測定値を考慮するために補償を導入することを含む段階であって、実験的な測定値を処理する前段階を適用することを包含する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
公知の初期母集団のサイズを有する標準試料中の初期母集団のサイズに関する測定値を得ること、およびその間の比例関係を導出すること；および、初期母集団のサイズとその測定値の間と同じ比例関係を適用することにより、関心対象試料中の初期母集団のサイズの値を決定すること、を包含する請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
公知の初期母集団のサイズを有する標準試料中の初期母集団のサイズに関するそれぞれの測定値を得ることを包含し、および：
・標準試料の初期母集団のサイズとこれらのそれぞれの初期母集団のサイズに関する対応する測定値の間の依存関係を確立すること；および
・関心対象試料の初期母集団のサイズに関する測定値を決定したあと、前記依存関係に基づく補間により関心対象母集団の初期サイズを決定すること；による
請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１１】
それぞれ公知の初期母集団のサイズを有する一以上の標準試料を準備すること、関心対象試料に関するのと実質的に同じ条件下で前記標準試料に前記一連の増幅を適用すること、およびパラメータ化された変化を実験的な値と比較することによりそれらの有効な初期測定値を決定することを包含する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
それぞれ公知の初期母集団のサイズを有する多数の標準試料を準備すること、関心対象試料に関するのと実質的に同じ条件下でそれらに前記一連の増幅を適用すること、並びに段階ａ）、ｂ）、およびｃ）の適用においてそれらそれぞれの指数を決定することを包含し、並びに、段階ｄ）において：
・標準試料の初期母集団のサイズとそれらの指数との間の依存関係を確立すること；および
・関心対象試料に関する指数を決定した後、前記依存関係に基づく補間により関心対象母集団の初期サイズを決定すること；による
請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
相対的な定量化のために、関心対象母集団だけではなく、増幅反応の一連の適用に供せられる参照母集団も準備し、それぞれ：
・関心対象母集団のサイズを代表する実験的な測定値；および
・参照母集団のサイズを代表する実験的測定値；を取得することにあり、
それぞれ関心対象母集団の初期サイズと参照母集団の初期サイズの間の比を決定することにある段階ｄ）と共に、参照母集団に段階ａ）、ｂ）、およびｃ）を適用することによって続く、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
収率の実験的な変化の形式の実験的な測定値を前記一連の増幅の関数として表現すること；および
・低い増幅指数の数に関する雑音に実質的に左右される第一の領域；および
・それに続くより高い増幅指数の数に関するより低い雑音を伴う第二の領域、
を含む一連の増幅の関数として収率の実験的変化を得ること、
を包含する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
収率が一定ではない局面が、収率が低下する局面の一つであり、
・収率が一定の局面に関する粗値を推定すること；および
・少なくとも前記切替領域中の指数を求めるとき、推定された収率が閾値の下、好ましくは一定の局面の部分の下である前記雑音がより低い第二の領域中の測定値の少なくとも幾つかを無視すること、
を包含する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
収率が一定ではない局面が収率が低下する局面であり、雑音がより低い第二の領域から出発して増幅指数の数が減少する方向に進むことにより前記切替領域を特定すること、および収率が所定の値（Ｅ０＝１）を認識できるほどに超える粗増幅指数を検出することを包含する請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
収率が前記所定の値（Ｅ０＝１）にほぼ等しい増幅指数を検出することにより、粗指数から出発して増幅指数の数が増大する方向に進むことにより、前記切替領域における増幅指数の推定値が精緻化され、場合により少数値を得る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
減少パラメータを包含する減少する指数関数により前記収率の一定ではない局面をモデル化すること、および実験的な測定値と比較することにより切替領域中の指数を伴う段階ｃ）において前記減少パラメータを決定することを包含する請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
増幅反応がリアルタイムで遂行されるポリメラーゼ連鎖反応である請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定値が放出された蛍光の測定された量である請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法を実施するための設備であって、
・少なくとも関心対象試料を支持するための試料支持体；
・少なくとも関心対象試料中の関心対象母集団に対して、前記一連の増幅反応を適用するための第一の装置；
・関心対象母集団の現行のサイズを代表する測定値を取得するための第二の装置；および
・前記第二の装置から測定信号を受信すること、および請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法を実施することに適するコンピュータ手段、
を含む設備。
【請求項２２】
プロセッサユニットのメモリに、または前記プロセッサユニットの読取機と協働するのに適する取り外しできるメモリ媒体上に貯蔵するためのコンピュータプログラム製品であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法を実施するための命令を含むプログラム製品。
【国際調査報告】
2008521104.tif 000040
2008521104.tif 000041