(57)【要約】  本発明は、遺伝子治療剤のごとき様々な治療剤の哺乳類対象における標的器官の血管系への強化された送達方法を提供する。全体としての哺乳類肝臓または単一の肝葉における標的化遺伝子療法のための方法が開示される。開示された方法は、カテーテルに基づく低侵襲手段に依存しており、ここで、標的器官は分離され、遺伝子治療剤で局所的に処置される。該方法は、より効率的および局在化された組織トランスフェクションを提供し、ヒト対象における遺伝子療法にも十分に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるための、哺乳類対象の選択された器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達する方法であって、
ａ．器官を流れる静脈血管系内に１個または複数のカテーテルを留置する工程；ここで、該カテーテルの少なくとも１つは１個または複数の膨張可能で拡張可能な部材を有するものであり；
ｂ．１個または複数の膨張可能で拡張可能な部材を膨張させることによって器官または器官のセクションを流れる静脈血管系内の血液の流れを閉塞させることにより器官または器官のセクションを分離する工程；
ｃ．分離された器官または分離された器官のセクション中の通常の静脈圧の４０％増までの血圧上昇を惹起する容量でウイルス性遺伝子治療剤を送達する工程；
ｄ．治療上有効量の該遺伝子治療剤の形質導入に十分な時間、該遺伝子治療剤を分離された器官または分離された器官のセクション内に持続させておく工程
を含む、方法。
【請求項２】
哺乳類対象がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
静脈血管系が肝静脈、下葉肝静脈または下大静脈である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
分離された器官または分離された器官のセクション内に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションが少なくとも０．２である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
分離された器官または分離された器官のセクション内に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションが少なくとも０．３である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
分離された器官または分離された器官のセクション内に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションが少なくとも０．４である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
分離された器官または分離された器官のセクション内に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションが少なくとも０．５である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
分離された器官または分離された器官のセクション内に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションが少なくとも０．６である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
ウイルス投与前に器官が溶液でフラッシュされる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
血圧上昇が、分離された器官または分離された器官のセクション中の通常の静脈圧の３０％増までの、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
血圧上昇が、分離された器官または分離された器官のセクション中の通常の静脈圧の２０％増までの、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
血圧上昇が、分離された器官または分離された器官のセクション中の通常の静脈圧の１０％増までの、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
カテーテルがバルーン閉塞カテーテルである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子治療剤が血管内カテーテルにより送達される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子治療剤が経皮針により送達される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子治療剤がアデノウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子治療剤がアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子治療剤がレンチウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子治療剤がレトロウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子治療剤がヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子治療剤がアルファウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子治療剤がバキュロウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子治療剤がハイブリッドウイルスベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
器官が肝臓である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
器官が腎臓である、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス投与前に肝臓が溶液でフラッシュされる、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
溶液が生理食塩水である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ウイルス投与前に器官が溶液でフラッシュされる、請求項７記載の方法。
【請求項２９】
器官が肝臓であり、溶液が生理食塩水である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
滞留時間が延長されて、かかる延長が、分離された器官または分離された器官のセクション中に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションを少なくとも０．８にまで増大させるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
ウイルス投与前に器官が溶液でフラッシュされ、工程ｄ）が延長されて、かかる延長が、分離された器官または分離された器官のセクション中に存在し、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞のうち肝細胞のフラクションを少なくとも０．８にまで増大させるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
工程ｄ）が約１分間〜約４分間の長さである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物対象の標的器官へ遺伝物質をバルーンカテーテルにより送達するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子療法は、既存の欠陥を修正するか、または細胞に新規の有益な機能を与える外来性遺伝物質の細胞内送達である。肝臓は、代謝および血清蛋白質の産生におけるその中心的役割のために、遺伝子療法の重要な標的器官である。多数の疾患が知られており、その幾つかは、肝特異的遺伝子産物の欠損により惹起され、肝臓の分泌蛋白質産生から恩恵を享受し得る。家族性高コレステロール血症、血友病、ゴーシェ病およびファブリー病はほんの一例である。かかる疾患の多くは遺伝子療法に適している可能性がある（Ｓｉａｔｓｋａｓら．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２００１，２４（Ｓｕｐｐｌ．２）：２５−４１；Ｂａｒｒａｎｇｅｒら．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ  ２００１，１（５）：８５７−８６７；Ｂａｒｒａｎｇｅｒら．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．１９９９，２４（５）：６０１−６１５）。
【０００３】
ウイルスおよび非ウイルスベクターを用いて肝臓へ外来性遺伝物質を送達するために、様々な方法が開発されている。一般的に、各方法はある種の欠点を有する。ウイルスベクターを用いる遺伝物質の送達におけるこれまでの試みは、中和宿主免疫応答、既存の宿主免疫に起因する毒性、大量の治療剤を対象の循環系へ注入する必要性があること、治療中の標的器官内の圧力上昇、および体内の特定の細胞型を標的化する困難性により、複雑化されている。
【０００４】
ウイルスベクターの門脈内注入は、肝臓の標的化手段として試みられてきた。しかし、門脈内注入は幾つかの問題を提示している。アデノウイルス遺伝子移入ベクターがラットの門静脈に注入される場合、高レベルのトランスジーン発現が肝臓において観察されるが（Ｒｏｓｅｆｅｌｄら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５２：４３１−４３４）、かかる発現は一時的なものであるので、繰り返し注入する必要がある。さらに、血清陽性動物の循環系に注入される場合、ウイルスベクターは既存の抗体により直ちに中和され得る。組換えアデノウイルスベクターの全身注入の研究により、中和宿主免疫応答が繰り返し注入におけるかかるベクターの有効性を制限することが示された（Ｙａｎｇら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９４，９１：４４０７−４４１１；Ｋｏｚａｒｓｋｙら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９：１３６９５−１３７０２）。
【０００５】
他の場合において、ウイルスベクターの全身または門脈内注入は、用量依存的毒性に関連している。これらの毒性は、比較的大量のウイルスが注入される必要があること、および事前に共通のウイルス血清型へ環境曝露された結果としての既存の免疫の両方に起因する。故に、対象へ送達するウイルスの量、ならびに全身循環およびそれ故に免疫系にウイルスを曝露させる程度の両方を制限することが望ましい。
【０００６】
ウイルス性遺伝子療法の全身送達に関する別の試みは、標的器官内の適切な細胞に治療剤を標的化することである。例えば、肝臓において、肝細胞および非肝細胞（クッパー細胞および他の抗原提示細胞を含む）の両方がトランスフェクションされてもよい。肝細胞は、優れた蛋白質産生細胞であり、発現された蛋白質を血清中に分泌し得、多くの場合、機能喪失した欠陥部位である。故に、肝臓の非肝細胞に対して肝細胞のトランスフェクションを最大化することが望ましい。しかし、全身投与されるウイルス性遺伝子療法の場合、トランスフェクションされた肝臓の細胞の有意なフラクションは非肝細胞である。
【０００７】
抗原提示細胞（クッパー細胞、肝臓類洞内皮細胞を含む）のごとき非肝細胞におけるトランスジーン発現の否定的な結果が存在するかもしれない。かかる発現は、トランスジーン産物に対する免疫応答を生じるかもしれない。
【０００８】
これまでの試みは、バルーン閉塞カテーテルを用いる体内の分離された領域への遺伝物質の送達に対してなされてきた（米国特許第５，６９８，５３１号）。これらの方法は、血管表面を裏打ちする内皮細胞のトランスフェクションを目的としている。本発明は、器官の実質細胞へ遺伝物質を送達するための方法を提供する。
【０００９】
バルーンカテーテルを用いて標的器官へ遺伝物質を送達するための別の方法が記載されている（ＷＯ  ２００４／００１０４９）。しかし、この方法は、標的器官内に高圧を用いることが必要である。十分に圧力を高めるために、より大量の治療剤を注入する必要があり、これらのより大量の治療剤は上記した理由のために都合が悪い。さらに、高圧は標的器官を損傷する危険性があり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
従って、本発明の目的は、標的器官を流れる静脈血管系を通じて、標的器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、標的器官の静脈血管系中の圧力を有意に増大させることなく、標的器官を流れる静脈血管系を通じて、標的器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、標的器官を流れる静脈血管系を通じて、標的器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法であって、該器官が肝臓であり、該静脈血管系が肝静脈、肝静脈の支流または下大静脈である方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるために、標的器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、肝細胞および非肝細胞の両方においてウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるために、肝臓へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法であって、該ウイルス遺伝子によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞および非肝細胞の合計のうち、該ウイルス遺伝子によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞のフラクションが、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８または少なくとも０．９である方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるために、標的器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法であって、該ウイルス性遺伝子治療剤に対して既存の免疫を有する対象へ該ウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法を提供することである。
【００１６】
本発明に従って、バルーンカテーテルを用いて遺伝物質を標的化送達するための方法が提供される。一の方法において、バルーン閉塞カテーテルは単一の肝静脈中に近位で埋め込まれ、治療溶液は、カテーテルを経由する膨張された（閉塞）バルーンを越えて上記のように分離された標的葉の血管を通じて肝実質へ送達される。送達される治療剤の容量は、標的器官の静脈血管系の灌流に十分な程大きいが、静脈血管圧における有意な上昇の防止または側副循環による該剤の全身分布に十分な程小さい。異なる血管を閉塞するためにバルーンを再度留置することにより、同じ手順の間に複数の葉が順次処置され得る。処置は高度に局所的であるので、同じ手順の間に単一の器官の様々な部分が、別法では不適合となり得る異なる治療剤を用いて処置され得る。
【００１７】
別の方法において、器官全体からの静脈血流は、肝静脈血流に対して近位および遠位双方の下大静脈中にバルーンカテーテルを留置することにより一時的に閉塞され、遺伝子治療剤は、膨張された（閉塞）バルーンの間の空間内に血管内カテーテルを経由して注入される。さらに、ウイルス性治療剤の容量は、標的器官の血管系の灌流に十分な程大きいが、静脈圧における有意な上昇の防止または側副循環による該剤の全身分布に十分な程小さい。この方法を用いてウイルス性遺伝子治療剤を分離された肝臓に送達する場合、非常に効果的な遺伝子移入が成し遂げられる。
【００１８】
別の実施態様において、本発明の方法は、ウイルス投与前の「フラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）」工程を含んでもよい。フラッシングは、生理食塩水のごとき生理的に適切な溶液を利用して、ウイルスの投与前に分離された器官または器官のセクションを灌流または部分的に灌流させ、そうでなければ標的細胞に形質導入または感染する遺伝子移入ベクターの能力を軽減し得るウイルスベクターに対する既存の抗体を軽減または排除する。
【００１９】
別の実施態様において、肝臓が標的器官である場合、ウイルス投与前のフラッシング工程は、トランスフェクションされる肝細胞の数および割合を増大してもよい。別の好ましい実施態様において、ウイルス投与前のフラッシング工程は、投与されるウイルスベクターに対して既存の免疫を有する動物においてトランスフェクションされる肝細胞の数および割合を増大する。
【００２０】
さらなる別の実施態様において、本発明の方法は、標的器官におけるウイルス性遺伝子治療剤について、延長された持続または滞留時間を含んでもよい。延長された滞留時間は、本方法に付随する急性毒性を増大させることなく、動物にトランスフェクションされる肝細胞の数および割合を増大してもよい。
【００２１】
本発明のさらなる目的および利点は、一部には、以下の記載にて示されており、一部には、該記載から明かであり、または本発明を実施することにより認識できよう。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲にて特に指摘されているエレメントおよび組み合わせにより、理解および達成され得る。
【００２２】
前記した一般的な説明および下記する詳細な説明の両方は本発明の単なる例示および説明であり、特許請求された本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００２３】
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図は、本発明の幾つかの実施態様を説明しており、本明細書の記載と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１は、肝静脈（３）を閉塞するバルーンカテーテル（４）を示す。該カテーテルは、頸静脈（５）から挿入され、上大静脈（１）、心臓（２）を経て、肝静脈（３）まで通される。
【００２５】
図２は、ウサギモデルにおける肝静脈を通じてのウイルスのバルーンカテーテル投与の蛍光透視法によるスポットイメージを示す。点線は大静脈および４つの主要な肝静脈を示す。カテーテルは、上大静脈を通じて右尾状葉に下降していることが分かり、そこで、造影剤で膨張された閉塞バルーンが静脈からの血流を遮断する。造影剤を含有する注入溶液により、この葉の静脈分岐（点線サークル）が強調して示され得る。該イメージはウイルス注入の直前に獲得されており、選択された肝静脈のバルーン介在閉塞の開存性を示す。
【００２６】
図３は、肝静脈内のバルーンカテーテル（４）の蛍光透視法によるイメージを示す（ＨＶブロック）。第２のバルーン（６）は下大静脈内で膨張される（ＩＶＣブロック）。
【００２７】
図４は、肝臓の静脈排出路を分離するための二重バルーン技法を示す。第１のバルーン（７）は、頸静脈（５）から挿入された後、上大静脈（１）を介して、肝臓まで通される。第２の閉塞バルーン（８）は、下大静脈（１８）から挿入される。第１のバルーン（７）は、肝静脈（３，１０，１１）の上側にある下大静脈の一部を閉塞し、第２のバルーン（８）は、肝静脈（３，１０，１１）の下側にある下大静脈（１８）の一部を閉塞する。第３のカテーテル（９）を用いて治療剤を注入する。
【００２８】
図５は、別の二重バルーン技法を示す。バルーン（１２，１３）を閉塞に用いる。また、カテーテルチップ（１４，１５）の一方または両方にある穴を通じて治療剤が注入できるように、バルーン（１２，１３）の一方または両方を通じて内腔を拡張させてもよい。
【００２９】
図６は、バルーンカテーテルおよびＡｄ２ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ウサギを用いて１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを投与した後の、３ｍｌ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、８ｍｌ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）または２０ｍｌ（Ｇ，Ｈ，Ｉ）の注入量の関数としての、β−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。免疫組織化学により評価される発現は、注入（葉１）および非注入（葉４）の葉（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ）の両方について、２匹の注入された動物に典型的な顕微鏡写真により１０×で示される。１葉あたり３コアにおける細菌性β−ガラクトシダーゼの発現を図式的に示す（Ｃ，ＦおよびＩ）；注入された葉に陰影を付ける。数値は、β−ガラクトシダーゼ／ｍｇ蛋白質の相対発光量での発現を示す。簡単にするため、葉に番号を付ける。注入された葉（葉１）は図２で示したマルで囲った葉であることに注意すること。
【００３０】
図７は、Ａｄ２ナイーブウサギ（Ａ，Ｃ，Ｅ）および抗−Ａｄ２抗体含有のヒト血清で受動免疫されたウサギ（Ｂ，Ｄ，Ｆ）に対して８ｍｌの容量で１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを全身投与した後のβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。葉１におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の免疫組織化学的局在性は、２〜３匹の注入された動物に典型的な顕微鏡写真において１０×および４０×で示される。ＥＬＩＳＡにより測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の分布図を、ナイーブ（Ｅ）および受動免疫された（Ｆ）ウサギについて示す（これは全身投与なので葉間の区別はない）。
【００３１】
図８は、バルーンカテーテルおよび８ｍｌの注入量を用いてＡｄ２ナイーブウサギ（Ａ−Ｅ）およびＡｄ２に対して受動免疫されたウサギ（Ｆ−Ｊ）へ１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを投与した後のβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。免疫組織化学により評価される発現は、注入（葉１；Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｈ）および非注入（葉４；Ｂ，Ｄ，Ｇ，Ｉ）の両方の葉について、３匹の注入されたウサギに典型的な顕微鏡写真において１０×および４０×で示される。ＥＬＩＳＡにより測定された発現を図式的に示す；注入葉に陰影を付ける。数値は、１葉あたり３つの組織コアからのβ−ガラクトシダーゼ（ｐｇ）／蛋白質（μｇ）の単位での平均発現を示す。
【００３２】
図９は、本発明の方法に従ってウイルス性遺伝子治療剤を送達した後の、トランスジーンを発現する肝細胞および非肝細胞の数の定量化を示す。ナイーブウサギ（ＡおよびＤ）または抗−Ａｄ２抗体含有ヒト血清で受動免疫されたウサギ（Ｂ，ＣおよびＥ）へ同容量（８ｍｌ）で同量のウイルス（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌ）を局所（Ａ，ＢおよびＣ）または全身（ＤおよびＥ）送達した後の、各肝葉の１ｍｍ２フィールドあたりのβ−ガラクトシダーゼ陽性肝細胞（黒の棒）および非肝細胞（白の棒）の数のＭｅｔａｍｏｒｐｈ定量。（Ｃ）における動物の注入された葉は、８ｍｌのウイルス投与の直前に２０ｍｌの生理食塩水でフラッシュされた。括弧書きの数値は、各特定の葉内の全β−ｇａｌ陽性細胞のうちのβ−ｇａｌ陽性肝細胞のフラクションを示す。番号１および４の葉は図６〜８に図式的に示したものに対応する（Ａ，Ｂ，ＣおよびＥ，Ｎ＝３０フィールド，Ｄ；Ｎ＝４５フィールド）。
【００３３】
図１０は、バルーンカテーテル介在送達を用いて３匹のナイーブウサギへ肝臓への局所送達により全量８ｍｌで５×１０１２ｄｒｐのＡＡＶ２ＤＣ１９０ＨＡＧＡＬウイルスを投与した後の、８４日間にわたるヒトα−ガラクトシダーゼＡ発現を示す。３匹のウサギのうち２匹では全８４日間にわたって発現を検出し、３匹目のウサギでは、７日目および１４日目の間に発現の検出を開始し、８４日間の残りの期間、発現を検出した。
【００３４】
図１１Ａは、本発明の方法に従って４分間の滞留時間を用いてナイーブウサギに８ｍｌ容量でＡｄ２βｇａｌウイルス（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）をカテーテルに基づいて局所送達した後の、トランスジーンを発現する全細胞と比較したトランスジーンを発現する肝細胞の比率である、トランスフェクションされた肝細胞フラクションを示す。β−ガラクトシダーゼ陽性肝細胞および非肝細胞の数のＭｅｔａｍｏｒｐｈ定量化を、注入肝葉および非注入肝葉の両方の３セクションにて行った。各棒は、１つの肝臓セクションの肝細胞フラクション［トランスフェクションされた肝細胞／（トランスフェクションされた肝細胞＋トランスフェクションされた非肝細胞）］分析を示す。８−２０および８−２２についての棒は４分間の滞留時間で処置したウサギを示し、一方、４、５および１についての棒は１分間の滞留時間で処置したウサギを示す。これらは、滞留時間を除き同一のプロトコルを用いた先の実験に由来するものである。
【００３５】
図１１Ｂは、１）４分間の滞留時間（８−２０および８−２２）によるバルーンカテーテルおよび８ｍｌの容量を用いて１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌをウサギへ投与した後の、ならびに２）１分間の滞留時間（４、５および１）以外は先の実験と同一の条件での、ＥＬＩＳＡにより測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。発現を４つの肝葉、肺、腎臓および脾臓にて測定した。３つの組織コアを各肝葉から採集し、これを用いて発現を測定した；それらは、大静脈への葉肝静脈の入口部に対して葉の近位、中位および遠位であった。ＲＣＰ、ＲＣＭ、ＲＣＤは、各々、近位、中位および遠位の外側右葉（注入葉）を言う。ＲＬＰ、ＲＬＭ、ＲＬＤは、各々、近位、中位および遠位の内側右葉を言う。ＭＰ、ＭＭ、ＭＤは、各々、近位、中位および遠位の内側左葉を言う。ＬＰ、ＬＭ、ＬＤは、各々、近位、中位および遠位の外側左葉を言う。
【００３６】
実施態様の説明
ここで、本発明の実施態様に対して詳細な言及がされるが、その例は添付の図に示されている。可能な場合には、同じまたは同様の部分を言及するために、同じ参照番号が図において用いられ得る。
【００３７】
別記しない限り、本発明の実施は、分子生物学（組換えＤＮＡ技法を含む）、細菌学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技法を用い、これらは当業者の範囲内である。かかる技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら．，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ＆ＣＣ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．（１９８８））；およびＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭＪ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５））のごとき文献において十分に説明されている。
【００３８】
用語「トランスジーン」は、組織または器官の細胞中に導入されて、適切な条件下で発現し得るか、またはそうでなければ細胞に有用な特性を付与し得るポリヌクレオチドを言う。所望の治療結果に基づいてトランスジーンを選択する。それは、例えば、ホルモン、酵素、受容体または目的とする他の蛋白質をコードしていてもよい。それは、内因性または体外から投与された遺伝子の発現を減少または排除するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡをコードしていてもよい。例えば、家族性高コレステロール血症の処置において、ＬＤＬ受容体をコードするトランスジーンを用いてもよい（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６８５２−６８６０）。
【００３９】
用語「トランスフェクション」は、用語「遺伝子移入」および「形質導入」と同義的に用いられ、トランスジーンの細胞内導入を意味する。「トランスフェクション効率」は、トランスフェクションに付された細胞により取り込まれたトランスジーンの相対量を言う。実際、トランスフェクション効率は、トランスフェクション手順の後に発現されるレポーター遺伝子産物の量により評価される。
【００４０】
本明細書中、遺伝子送達、遺伝子移入等なる用語は、外来性ポリヌクレオチド（場合により「トランスジーン」と言う）の宿主細胞への導入を言う。導入されたポリヌクレオチドは、安定にまたは一時的に宿主細胞中に維持されてもよい。典型的に、安定な維持には、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製起点を含むか、或いは染色体外レプリコンのごとき宿主細胞のレプリコンまたは核もしくはミトコンドリア染色体に組み込む必要がある。当該技術分野において知られており、本明細書中に記載されているように、多数のウイルスベクターが哺乳類細胞への遺伝子移入を介在し得ることが知られている。
【００４１】
外来性ポリヌクレオチドは、本発明の方法を介して宿主へ送達するために、ウイルスベクターに導入される。各々多数の種を含む多数のウイルスベクターが知られており、多数が遺伝子療法目的のために研究されている。最も一般的に用いられているウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス［ＡＡＶ］、およびレンチウイルスを含むレトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス［ＨＩＶ］を包含する。
【００４２】
用語「ウイルス」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に移入し得る物質であり、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび蛋白質コートから構成される、非細胞性生物である偏性細胞内生物である物質を言う。ウイルスは、裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、裸のＲＮＡ、蛋白質コートのないプラスミドＤＮＡ、または蛋白質コートのないＲＮＡを含まない。本発明の方法に適用されてもよいウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ヘパデナウイルス（ｈｅｐａｄｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、バキュロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルスおよびパルボウイルスを含む。加えて、これらの任意のウイルスの組み合わせから産生されるハイブリッドウイルスが用いられてもよい。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む。例示的なウイルスの型は、ＨＳＶ（ヘルペスシンプレックスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）およびＭＬＶ（ネズミ白血病ウイルス）を含む。
【００４３】
本発明の方法を用いて特定の哺乳類へ送達するためのウイルスを選択する際、念頭にある処置すべき哺乳類について、特定のウイルスの特定の血清型を選択してもよい。血清型は、上記哺乳類において単離されたもの、および／または処置すべき特定の標的哺乳類の特定の標的器官について高められた指向性を有し得るものから選択されてもよい。
【００４４】
或いは、本発明の方法を用いて特定の哺乳類へ送達するためのウイルスを選択する際、特定の哺乳類種において単離されていない血清型を選択してもよい。
【００４５】
アデノウイルスは、約３６ｋｂのゲノムを有する非エンベロープ、核ＤＮＡウイルスであり、古典的な遺伝学および分子生物学における研究により十分に特徴付けられている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓら．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｈｉｔｔ，Ｍ．Ｍ．ら．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９）。ウイルス遺伝子は、初期（Ｅ１−Ｅ４と称する）および後期（Ｌ１−Ｌ５と称する）転写ユニットに分類され、これらは、ウイルス蛋白質の２つの一時的なクラスの産生に言及する。これらの事象を区別するものは、ウイルスＤＮＡ複製である。ヒトアデノウイルスは、赤血球細胞の血球凝集、発癌性、ＤＮＡおよび蛋白質アミノ酸の組成および相同性、ならびに抗原的関連性を含む特性に基づいて、様々な血清型に分類される（約４７、適宜ナンバリングされ、６群：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに分類される）。
【００４６】
組換えアデノウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞の両方に対する指向性、潜在的病原性がわずかであること、ベクターストックの調製のために高力価で複製する能力、および大きなインサートを保有する潜在力を含む、遺伝子送達ビヒクルとしての使用のために幾つかの利点を有する（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３９−６６，１９９２；Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５１−６４  １９９４）。様々なアデノウイルス遺伝子配列の欠失を伴うアデノウイルスベクター、例えば、偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶｓ）および部分的に欠失したアデノウイルス（「ＤｅＡｄ」と言う）は、アデノウイルスの望ましい特徴を利用するように設計されており、レシピエント細胞への核酸の送達に適するビヒクルとなる。
【００４７】
特に、「弱い（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルス」またはミニ−アデノウイルスベクターとしても知られている偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）は、ベクターゲノムの複製およびパッケージに必要とされる最小のシス作用性ヌクレオチド配列を含み、１個または複数のトランスジーンを含み得るアデノウイルスのゲノムに由来するアデノウイルスベクターである（偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）およびＰＡＶの産生方法を含む米国特許第５，８８２，８７７号を参照のこと。該文献は出典明示により本明細書の一部となる）。ＰＡＶは、アデノウイルスの望ましい特徴を利用するように設計されており、遺伝子送達に適するビヒクルとなる。一般的に、アデノウイルスベクターは、ウイルス成長に重要でない領域の欠失により最高８ｋｂの大きさのインサートを保有可能であるが、最大保有能は、ＰＡＶを含む、大部分のウイルスコーディング配列の欠失を含有するアデノウイルスベクターの使用により達成され得る。Ｇｒｅｇｏｒｙらの米国特許第５，８８２，８７７号；Ｋｏｃｈａｎｅｋら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５７３１−５７３６，１９９６；Ｐａｒｋｓら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３５６５−１３５７０，１９９６；Ｌｉｅｂｅｒら．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８９４４−８９６０，１９９６；Ｆｉｓｈｅｒら．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７：１１−２２，１９９６；米国特許第５，６７０，４８８号；１９９６年１０月２４日公開のＰＣＴ公開番号  ＷＯ９６／３３２８０；１９９６年１２月１９日公開のＰＣＴ公開番号  ＷＯ９６／４０９５５；１９９７年６月１９日公開のＰＣＴ公開番号  ＷＯ９７／２５４４６；１９９５年１１月９日公開のＰＣＴ公開番号  ＷＯ９５／２９９９３；１９９７年１月３日公開のＰＣＴ公開番号  ＷＯ９７／００３２６；Ｍｏｒｒａｌら．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２７０９−２７１６，１９９８を参照のこと。最高約３６ｋｂの外来核酸を収容し得るかかるＰＡＶは有利である。というのも、ベクターに対する宿主免疫応答の可能性または複製能のあるウイルスの産生を軽減する一方で、ベクターの保有能が最適化されるからである。ＰＡＶベクターは、複製起点およびＰＡＶゲノムのパッケージに必要とされるシス作用性ヌクレオチド配列を含む、５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲヌクレオチド配列を含有し、プロモーター、エンハンサー等のごとき適切な調節エレメントと共に１個または複数のトランスジーンを収容し得る。
【００４８】
他の部分的に欠失したアデノウイルスベクターは、一の部分的に欠失したアデノウイルス（「ＤｅＡｄ」と言う）ベクターを提供し、該ベクターにおいて、ウイルス複製に必要とされるアデノウイルス初期遺伝子の大部分は、ベクターから欠失しており、条件付き（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）プロモーターの制御下で産生細胞の染色体内に存在する。産生細胞中に存在する欠失可能なアデノウイルス遺伝子は、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ４（ＯＲＦ６およびＯＲＦ６／７のみが細胞中に存在する必要がある）、ｐｌＸおよびｐｌＶａ２を含んでもよい。Ｅ３もベクターから欠失されてよいが、それはベクター産生に必要ではないので、産生細胞から削除することもできる。通常、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にあるアデノウイルス後期遺伝子はベクター中に存在するが、ＭＬＰは条件付きプロモーターにより置換されてもよい。
【００４９】
ＰＡＶまたはＤｅＡｄウイルスベクターおよび産生細胞株における使用に適する条件付きプロモーターは、以下の特徴：細胞傷害性または細胞増殖抑制性アデノウイルス遺伝子が細胞に有害なレベルで発現されないような、非誘導状態における低い基礎的発現；ならびに十分な量のウイルス性蛋白質がベクター複製およびアセンブリを支持するために産生されるような、誘導状態における高レベル発現：を有するものを含む。ＤｅＡｄベクターおよび産生細胞株における使用に適する好ましい条件付きプロモーターは、免疫抑制剤ＦＫ５０６およびラパマイシンに基づく二量体化（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）遺伝子制御系、エクジソン遺伝子制御系およびテトラサイクリン遺伝子制御系を含む。Ａｂｒｕｚｚｅｓｅら．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１９９９  １０：１４９９−５０７に記載されているＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技法［Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ］も本発明に有用であってもよい。該文献の開示内容は出典明示により本明細書の一部となる。部分的に欠失したアデノウイルス発現系はＷＯ９９／５７２９６にさらに記載されている。該開示内容は出典明示により本明細書の一部となる。
【００５０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．６ｋｂのゲノムサイズを有する一本鎖ヒトＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶゲノムは、２つの主要な遺伝子：ｒｅｐ蛋白質（Ｒｅｐ７６，Ｒｅｐ６８，Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子、ならびにＡＡＶ複製、レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）、転写および組込みをコードするｃａｐ遺伝子、ここで、ｃａｐ蛋白質はＡＡＶウイルス粒子を形成する：を含有する。ＡＡＶの名前の由来は、ＡＡＶの増殖感染を可能にするのに、すなわち、宿主細胞におけるそれ自身の複製を可能とするのに必須の遺伝子産物を供給するために、該ウイルスがアデノウイルスまたは他のヘルパーウイルス（例えば、ヘルペスウイルス）に依存することによる。ヘルパーウイルスの不在下で、ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、通常、アデノウイルスでの宿主細胞の重複感染によりそれがレスキューされるまで、プロウイルスとして宿主細胞の染色体に組み込む（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２７，１９９２）。
【００５１】
遺伝子移入ベクターとしてのＡＡＶにおける興味深さは、その生態における幾つかの特有の特徴からもたらされる。ＡＡＶゲノムの両端には、ウイルス複製、レスキュー、パッケージおよび組込みに必要とされるシス作用性ヌクレオチド配列を含む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）として知られているヌクレオチド配列がある。ｒｅｐ蛋白質によりｉｎ  ｔｒａｎｓで介在されるＩＴＲの組込み機能により、ヘルパーウイルスの不在下、感染後に、ＡＡＶゲノムは細胞の染色体に組み込むことが可能となる。該ウイルスのこの特有の特性は、目的の遺伝子を含有する組換えＡＡＶの細胞ゲノムへの組込みを可能とするので、遺伝子移入におけるＡＡＶの使用に関連性がある。故に、遺伝子移入の多数の目的に理想的な安定な遺伝子形質転換は、ｒＡＡＶベクターを用いることにより成し遂げられてもよい。さらに、ＡＡＶについての組込み部位は十分に確立されており、ヒトの１９番染色体に局所している（Ｋｏｔｉｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：２２１１−２２１５，１９９０）。組込み部位のこの予測可能性により、宿主遺伝子を活性化もしくは不活性化するか、またはコーディング配列を遮断して、結果としてＡＡＶ組込みベクターの使用を制限し得る、細胞ゲノムへのランダム挿入事象の危険性が軽減される。ｒＡＡＶベクターの設計におけるこの遺伝子の除去は、ｒＡＡＶベクターについて観察された改変された組込みパターンをもたらしてもよい（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：２７５−２８４，１９９７）。
【００５２】
遺伝子移入用ＡＡＶの使用には他の利点がある。ＡＡＶの宿主域は広い。さらに、レトロウイルスと異なり、ＡＡＶは静止細胞および分裂細胞の両方に感染し得る。加えて、ＡＡＶはヒト疾患に関連しておらず、レトロウイルスに由来する遺伝子移入ベクターにより引き起こされる多数の問題を未然に防ぐ。
【００５３】
組換えｒＡＡＶベクターの産生に対する標準的アプローチでは、一連の細胞内事象：ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に隣接する目的のトランスジーンを含有するｒＡＡＶベクターゲノムで宿主細胞をトランスフェクションすること；ｉｎ  ｔｒａｎｓで必要とされるＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ蛋白質に関する遺伝子をコードするプラスミドにより宿主細胞をトランスフェクションすること；ならびにトランスフェクションされた細胞をヘルパーウイルスに感染させて、ｉｎ  ｔｒａｎｓで必要とされる非ＡＡＶヘルパー機能を供給すること：を協調させる必要があった（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９，１９９２）。アデノウイルス（または他のヘルパーウイルス）蛋白質はＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子の転写を活性化し、次いで、ｒｅｐ蛋白質はＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子の転写を活性化する。次いで、ｃａｐ蛋白質はＩＴＲ配列を利用して、ｒＡＡＶゲノムをｒＡＡＶウイルス粒子中にパッケージ化する。故に、パッケージ化の効率は、一部には、十分量の構造蛋白質のアベイラビリティにより、ならびにｒＡＡＶベクターゲノムにおいて必要とされる任意のシス作用性パッケージ配列の利便性により決定される。
【００５４】
レトロウイルスベクターは遺伝子送達のための一般的ツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：４５５−４６０）。広範な齧歯類、霊長類およびヒト体細胞中へ再配列していない単一コピーの遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの能力により、細胞への遺伝子の移入に十分に適したレトロウイルスベクターが作製される。
【００５５】
レトロウイルスは、ウイルスゲノムがＲＮＡであるＲＮＡウイルスである。宿主細胞がレトロウイルスに感染する場合、ゲノムＲＮＡはＤＮＡ中間体に逆転写され、該中間体は感染された細胞の染色体ＤＮＡ中に非常に効果的に組み込まれる。この組み込まれたＤＮＡ中間体をプロウイルスと言う。プロウイルスの転写および感染性ウイルスへのアセンブリは、適切なヘルパーウイルスの存在下にて、または汚染ヘルパーウイルスの同時産生を伴わずにカプシド形成を可能とする適切な配列を含有する細胞株にて生じる。カプシド形成に関する配列が適切なベクターとの共トランスフェクションによりもたらされるならば、ヘルパーウイルスは組換えレトロウイルスの産生に必要ではない。
【００５６】
レトロウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接する３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを有する。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）蛋白質をコードし；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ特異的ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルス性エンベロープ糖蛋白質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化の促進に関与する。ＬＴＲは、ウイルス複製に必要な他の全てのシス作用性配列を含有する。レンチウイルスは、（ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２および／またはＳＩＶ中に）ｖｉｔ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘを含むさらなる遺伝子を有する。５’ＬＴＲに隣接して、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）および粒子中へのウイルス性ＲＮＡの効果的なカプシド形成に必要な配列（Ｐｓｉ部位）がある。カプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージ化）に必要な配列がウイルスゲノムから欠損しているならば、ゲノムＲＮＡのカプシド形成を阻害するシス欠損がもたらされる。しかし、得られた突然変異体は依然として全てのビリオン蛋白質の合成を導き得る。
【００５７】
レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて調節または構造的機能を有する他の遺伝子を含む複雑なレトロウイルスである。より高い複雑性により、潜在的な感染の経過において見られるように、レンチウイルスはその生活環を調節できる。典型的なレンチウイルスは、ＡＩＤＳの原因菌であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。インビボでは、ＨＩＶは、リンパ球およびマクロファージのごとき、めったに分裂しない最終分化細胞に感染し得る。インビトロでは、ＨＩＶは、アフィジコリンまたはガンマ照射での処理により細胞周期を停止させた単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）ならびにＨｅＬａ−Ｃｄ４またはＴリンパ球様細胞の初代培養物に感染し得る。細胞の感染は、標的細胞の核膜孔を介するＨＩＶプレインテグレーション複合体の活発な核内輸送に依存する。これは、複合体中の複数の部分的に重複している分子決定因子と、標的細胞の核内輸送機構との相互作用により生じる。同定された決定因子は、ｇａｇマトリックス（ＭＡ）蛋白質中の機能的核局所化シグナル（ＮＬＳ）、核親和性ビリオン関連蛋白質、ｖｐｒ、およびｇａｇＭＡ蛋白質中のＣ−末端ホスホチロシン残基を含む。遺伝子療法のためのレトロウイルスの使用は、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号；および米国特許第５，９９４，１３６号に記載されており、その開示内容は出典明示により本明細書の一部となる。
【００５８】
本発明の方法に適用され得るウイルスについてのさらなる情報は、ウイルス学の多数のテキストにて見出され得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔｈｅｏｄｏｒｅ；Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）。
【００５９】
本発明の方法により投与されるウイルスベクターは、選択したトランスジーンに作動可能に連結したプロモーターおよびエンハンサーのごとき調節エレメントを含有する発現カセットを含む。適当なプロモーターおよびエンハンサーは、選択したウイルスベクターにおいて用いるために当該分野において広く利用可能である。好ましい実施態様において、調節エレメントは、ＰＣＴ  ＵＳ  ００／３１４４４に開示されているもののように、肝臓において優先的にトランスジーン発現を導き得るプロモーターおよびエンハンサーエレメントの組み合わせを含む。該文献の開示内容は出典明示により本明細書の一部となる。それらは、構成的または高発現プロモーターおよび１個または複数の肝特異的エンハンサーエレメントの組み合わせを含んでもよい。
【００６０】
強力な構成的プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、切断型ＣＭＶプロモーター、ヒト血清アルブミンプロモーターおよびα−１−アンチトリプシンプロモーターを含む群から選択されてもよい。他の実施態様において、プロモーターは、既知の転写リプレッサーに関する結合部位が欠失している切断型ＣＭＶプロモーターである。肝特異的エンハンサーエレメントは、ヒト血清アルブミン［ＨＳＡ］エンハンサー、ヒトプロトロンビン［ＨＰｒＴ］エンハンサー、α−１−ミクログロブリンエンハンサーおよびイントロンアルドラーゼエンハンサーからなる群より選択されてもよい。これらの肝特異的エンハンサーエレメントの１個または複数をプロモーターと組み合わせて用いてもよい。発現カセットの一の好ましい実施態様において、１個または複数のＨＳＡエンハンサーを、ＣＭＶプロモーターまたはＨＳＡプロモーターからなる群より選択される一のプロモーターと組み合わせて用いてもよい。別の好ましい実施態様において、ヒトプロトロンビン（ＨＰｒＴ）エンハンサーおよびα−１−ミクログロブリン（Ａ１ＭＢ）エンハンサーからなる群より選択される１個または複数のエンハンサーエレメントをＣＭＶプロモーターと組み合わせて用いてもよい。さらなる別の好ましい実施態様において、エンハンサーエレメントは、ＨＰｒＴエンハンサーおよびＡ１ＭＢエンハンサーからなる群より選択され、α−１−アンチトリプシンプロモーターと組み合わせて用いてもよい。
【００６１】
本発明は、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるために、哺乳類対象の選択された器官へウイルス性遺伝子治療剤を送達するための方法を提供する。該方法は、器官または器官のセクションを流れる静脈血管系内に１個または複数のカテーテルを留置する工程、ここで、少なくとも１つのカテーテルは１個または複数の膨張可能で拡張可能な部材を有する；１個または複数の膨張可能で拡張可能な部材を膨張させることによって器官または器官のセクションを流れる静脈血管系内の血液を閉塞させることにより器官または器官のセクションを分離する工程；分離された器官または分離された器官のセクション中の通常の静脈圧の４０％増までの血圧上昇を惹起する容量でウイルス性遺伝子治療剤を送達する工程；ならびに治療上有効量の該遺伝子治療剤のトランスフェクションに十分な時間、該遺伝子治療剤を分離された血管系のセクション内に持続させておく工程を含む。それは、所望により、ウイルス性遺伝子治療剤の送達前に抗ウイルス抗体を除去するために静脈血管系をフラッシュするさらなる工程を含んでもよい。
【００６２】
本発明の方法において、ウイルス性遺伝子治療剤は、分離された器官または分離された器官のセクションの通常の静脈圧より上側に該静脈血管系内の圧を有意に高めることなく、分離された器官または分離された器官のセクションを流れる静脈血管系を灌流させるのに十分な容量で送達される。肝臓の場合において、分離された器官または分離された器官のセクション内の通常の静脈圧は、閉塞肝静脈圧（ＷＨＶＰ）により測定される。ＷＨＶＰは、肝静脈中にバルーンカテーテルを挿入し、次いで、バルーンカテーテルを膨張させて、肝静脈を閉塞させることにより測定される。閉塞された静脈における圧はバルーンカテーテルの遠位末端のチップ上にて圧変換器により測定され、この測定された圧はＷＨＶＰに等しい。ヒト対象におけるＷＨＶＰについての典型的な値は４０〜１４０ｍｍの生理食塩水である。肝臓、血管または心臓疾患を有する患者においてはより高い値が示されてもよい。
【００６３】
本発明の方法において、ウイルス性遺伝子治療剤は、分離された器官または分離された器官のセクションを流れる静脈血管系に送達される。器官全体への送達の場合には、当業者には、器官を流れる静脈血管系は器官全体を流れる静脈血管系を言うことが明かであろう。肝臓の場合には、肝臓を流れる静脈血管系は肝静脈、右または左肝静脈、下葉静脈、中心静脈および類洞を言う。門静脈は、肝臓を流れる静脈血管系の部分と見なされない。さらに、肝臓の場合において、器官を流れる静脈血管系のセクションを本発明の方法により閉塞させて、器官のセクションを分離してもよい。当業者は、本発明の方法により分離された器官および器官のセクションを流れる静脈血管系のセクションが、ウイルス性治療剤の送達に用いるカテーテルの１つを用いてＸ線造影剤を注入することにより同定されてもよいことを認識できよう。同一の分離された器官または分離された器官のセクションに用いられ得るウイルス性治療剤と同量の造影剤を注入することにより、分離されたセクションは蛍光透視により同定され得る。肝臓の場合において、閉塞された肝静脈または肝静脈の閉塞された区分へ注入された造影剤により、蛍光透視下で、分離されるべき肝臓のセクションが明示され得る。
【００６４】
本発明の目的のために、分離された器官または分離された器官のセクションへ注入された場合に、分離された器官または分離された器官のセクションにおける通常の静脈圧の１０％、２０％、３０％または４０％増まで、分離された器官または分離された器官のセクションにおける静脈圧の上昇を惹起する注入量が選択されてもよい。さらに、肝臓の場合において、肝臓を流れる静脈血管系の通常の静脈圧はＷＨＶＰにより測定され得る。１００ｍｍの生理食塩水のＷＨＶＰの場合には、１０ｍｍの生理食塩水（０．７５ｍｍＨｇ）まで、２０ｍｍの生理食塩水（１．５ｍｍＨｇ）まで、３０ｍｍの生理食塩水（２．２５ｍｍＨｇ）まで、または４０ｍｍの生理食塩水（３．０ｍｍＨｇ）までＷＨＶＰの上昇を惹起するように、注入量が選択されてもよい。注入量は、処置されるべき標的器官または標的器官の部分の容積の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％または３０〜４０％と等しくなるように選択されてもよい。
【００６５】
本発明の方法において、ウイルス性遺伝子治療剤を、ウイルスに対して既存の免疫を有するヒトのごとき哺乳類対象へ送達してもよい。既存の免疫は、対象の血清中のウイルス性治療剤の一部に対する抗体の存在によってか、またはウイルス性遺伝子治療剤に対する細胞免疫応答を同定することにより認識されてもよい。抗体は、ウイルス上もしくはウイルス内に含まれる蛋白質、またはウイルス内に含まれるＤＮＡもしくはＲＮＡに指向していてもよい。酵素結合型イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または凝集アッセイを含む様々な方法が、対象の血清中の抗体を同定するために存在する。細胞免疫応答を同定するための方法は、混合型リンパ球反応および細胞介在リンパ溶解（ｌｙｍｐｈｏｌｙｓｉｓ）アッセイを含む。抗体を同定するための、または細胞免疫応答を測定するためのこれらの方法は一般的な免疫学のテキストに記載されている（Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９７；Ｒｏｉｔｔら．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，２００１，Ｍｏｓｂｙ）。
【００６６】
本発明の方法において、ウイルス性遺伝子治療剤は、器官の標的細胞においてウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現させるために、器官または器官のセクションを流れる分離された静脈血管系へ送達される。器官が様々な細胞型から構成されるので、本発明は、非標的細胞における発現に対する標的実質細胞における発現の比を最大化するための方法を提供する。ウイルスによりコードされた蛋白質を発現する細胞は、本発明の方法によりウイルス性治療剤でトランスフェクションされ、その後、ウイルス性治療剤によりコードされた蛋白質を産生する細胞として定義される。
【００６７】
肝臓の場合において、標的実質細胞は肝細胞であり、非標的細胞は非肝細胞である。非肝細胞は、血管内皮細胞、クッパー細胞および支持ストロマ細胞を含む。故に、本発明の方法において、ウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する非肝細胞の比に対するウイルス性遺伝子治療剤によりコードされる蛋白質を発現する肝細胞の比が最大化され得る。該比は、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８または少なくとも０．９であってもよい。
【００６８】
本発明の一の実施態様において、少量のウイルス性遺伝子治療剤を用いて、肝臓の一葉がトランスフェクションされる。図１に示すように、バルーン閉塞カテーテル（４）は、頸静脈（５）から挿入され、上大静脈（１）を経て、所望の肝静脈（３）まで通される。トランスフェクション物質の血管内、経カテーテル注入の直前に、カテーテル上のバルーン（１７）を膨張させ、静脈血流を遮断し、それにより、分離された標的葉の実質へ注入溶液を限局させる。当業者には、頸静脈以外の多数の解剖学的位置を介して静脈血管系に進入することにより同一の手順が実施されてもよいことが理解されよう。例えば、大腿静脈が用いられてもよい。
【００６９】
本発明の別の実施態様において、単一の肝葉がトランスフェクションされる。バルーン閉塞（４）カテーテルを選択した肝静脈の内腔内に留置する。図３に示すように、第２の閉塞バルーン（６）を下大静脈の肝部分に留置し、肝静脈血流を遮断する。トランスフェクション物質の経カテーテル注入の前に、バルーン（４，６）を下大静脈および肝静脈内で膨張させ、静脈血流を遮断し、それにより、分離された標的葉の実質に注入溶液を限局させる。
【００７０】
本発明のさらなる別の実施態様において、トランスフェクション物質が単一注入により肝臓全体に送達される。図４に示すように、肝臓は、２つの別個の二重ルーメンバルーンカテーテル（７，８）を用いることにより分離され、該カテーテルを、肝静脈血流に対して上位および下位双方の下大静脈（１８）において膨張させる。次いで、バルーンおよび血流の間に位置付けた血管内カテーテル（９）を介して、肝静脈から全肝実質への逆行性様式にて、トランスフェクション物質を注入する。図４に示すように、血管内カテーテル（９）はバルーン閉塞カテーテル（１５）の１つに組み込まれてもよく、これにより配置すべきカテーテルの数を少なくできる。本発明の全ての実施態様において、バルーンの大きさは、手順の間に標的器官の血管流出の非外傷性閉塞を確保するように、各患者の血管の大きさに合わせたものとする。本発明の方法は、遺伝子療法の間のウイルス性遺伝子治療剤の使用を含むが、制御された圧力下での診断または治療溶液の分離された器官に対する標的化送達が所望される場合、該方法は、同様に、化学療法剤もしくは他の薬剤、幹細胞またはイメージング造影剤の治療的注入に十分に適用される。
【００７１】
本発明の方法は、ウイルス投与前の「フラッシング」工程を含んでもよい。フラッシングは、生理食塩水のごとき生理的に適切な溶液を利用して、ウイルスの投与前に分離された器官または器官のセクションを灌流または部分的に灌流させる。理論に限定されないが、フラッシング溶液は、器官の血液および生理液を希釈し、流体成分およびウイルスの間の潜在的相互作用を最小限にする。これらの相互作用を最小限にすることにより、全体的な器官トランスフェクションが増大される。好ましい一の実施態様において、肝臓が標的器官である場合、ウイルス投与前のフラッシング工程は、トランスフェクションされる肝細胞の数および割合を増大してもよい。別の好ましい実施態様において、ウイルス投与前のフラッシング工程は、投与されるウイルスベクターに対して既存の免疫を有する動物においてトランスフェクションされる肝細胞の数および割合を増大する。
【００７２】
本発明の方法は、ウイルス性遺伝子治療剤の滞留時間のバリエーションを含んでもよい。滞留時間は、ウイルス性遺伝子治療剤が標的器官に注入された後から、閉塞バルーンが収縮し、それにより標的器官内の通常の血流が回復する前までの時間である。ウイルス性遺伝子治療剤が注入された直後に回収される場合に、滞留時間は最小であってもよい。手順に付随する急性毒性をグレード２の毒性を超えて増大し得ない一定時間、ウイルス性遺伝子治療剤が標的器官内に滞留可能である場合に、滞留時間は延長されてもよい。この期間は、問題とする特定の標的器官に依存し得、当業者により容易に測定され得る。延長された滞留時間は、少なくとも２分、少なくとも３分、少なくとも４分、少なくとも５分またはそれ以上であってもよい。滞留時間を有する能力は、送達手順の逆行性に起因して生じ得る本発明の特徴である。該方法は、逆行性の流れを介してベクターを送達するので、ウイルスを器官組織に接触させておくために、標的器官は閉塞されてもよい。かかる滞留時間は、先行技術で用いられている順行性送達方法では、一般的に成し遂げることができない。これらの順行性方法では、通常の血流は安全に閉塞されない可能性がある。
【００７３】
ウイルス性遺伝子療法ベクターの投与の前および後に、免疫抑制剤を動物に投与して、例えば、ウイルスベクターまたはトランスジーン産物のいずれかに対する免疫応答の可能性を最小限にまたは軽減してもよい。例えば、細胞傷害性リンパ球を抑制する物質を投与してもよい。該物質は、任意の発現されたウイルス性カプシド蛋白質を認識してもよく、それ故に、形質導入された細胞を排除してもよい。器官移植の分野において一般的に利用されている免疫抑制剤は、恐らく、本方法との併用に適する免疫抑制剤である。かかる物質は、単独で使用されてもよく、または他の同様の物質と組み合わせて使用されてもよい。これらの免疫抑制剤は、導入用に用いられるものおよび／または維持用に用いられるものを含んでもよい。例示的な物質は、シクロスポリン（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標），Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、プレドニゾン（Ｎｏｖｏ  Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（登録商標），Ａｐｏ  Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、タクロリムスまたはＦＫ５０６（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））、ミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））、ＯＫＴ３（Ｍｕｒｏｍｏｒａｂ  ＣＯ３（登録商標），Ｏｒｔｈｏｃｌ１（登録商標））、ＡＴＧＡＭおよびサイモグロブリンを含む。しかし、免疫抑制をもたらす任意の臨床的に認可される物質が用いられてもよい。有効な免疫抑制レジメンは当該分野において慣用的に実施されている。故に、適切なレジメンおよび投与は、問題とする特定の標的器官に依存し得、当業者により容易に決定され得る。
【００７４】
本発明の方法は、様々な特定の実施態様の組み合わせを含んでもよい。例えば、ウイルス送達前の器官のフラッシングは、延長された滞留時間と組み合わせて用いられてもよい。或いは、ウイルス送達前の器官のフラッシングは、免疫抑制レジメンと組み合わせて用いられてもよい。或いは、ウイルス送達前の器官のフラッシングは、処置すべき哺乳類に対して高い指向性を有するとして選択された血清型の使用と組み合わされてもよい。或いは、ウイルス送達前の器官のフラッシングは、延長された滞留時間および免疫抑制レジメンと組み合わせて用いられてもよい。記載した実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００７５】
標的器官に存在する場合または血流に分泌される場合に有用な分子をコードするトランスジーンは本方法における使用に適する。かかる分子は蛋白質およびホルモンを含んでもよい。例示的な蛋白質は、以下に示すリソソーム貯蔵障害において欠損しているものを含む。
【００７６】
表１
【表１】
2008521575.tif 000002
【表２】
2008521575.tif 000003
＊  ＣＮＳ関与
【００７７】
他の例示的な蛋白質は、ヒトを含む哺乳類におけるアルツハイマー病のごとき他の疾患を処置するためのものである。かかる方法において、トランスジーンはメタロエンドペプチダーゼをコードする。メタロエンドペプチダーゼは、例えば、アミロイド−ベータ分解酵素ネプリライシン（ＥＣ３．４．２４．１１；配列アクセッション番号、例えば、Ｐ０８４７３（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））、インスリン分解酵素インスリジン（ＥＣ３．４．２４．５６；配列アクセッション番号、例えば、Ｐ１４７３５（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））またはｔｈｉｍｅｔオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１５；配列アクセッション番号、例えば、Ｐ５２８８８（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ））であり得る。
【００７８】
さらに、トランスジーンは、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）、カルビンジンＤ２８、パルブアルブミン、ＨＩＦ１−アルファ、ＳＩＲＴ−２、ＶＥＧＦ、ＳＭＮ−１、ＳＭＮ−２、ＧＤＮＦおよびＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）からなる群より選択される蛋白質をコードしてもよい。かかる蛋白質は、血流への分泌後の作用を媒介することによる、本発明の方法を用いた筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置に適当であってもよい。ＡＬＳは、脊髄および脳幹運動ニューロンの変性に関連する、進行性の致死的な神経筋疾患である。該疾患の進行は、四肢、体軸および呼吸器官の筋肉の萎縮に至り得る。マウスおよびラットにおけるスーパオキシド・ジスムターゼ−１（ＳＯＤ１）遺伝子突然変異の過剰発現は、ヒトにおけるＡＬＳの臨床的および病理学的特徴で反復される。このモデルにおける徴候を遅延するのに有効な化合物は、ＡＬＳを有する患者における臨床的有効性の予測となることが示されており、それ故に、この疾患の治療的に関連するモデルである。かかるマウスモデルは、Ｔｕら（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９３：３１５５−３１６０；Ｋａｓｐａｒら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：８３９−８４２；Ｒｏａｕｌら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２３−４２８およびＲａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（４）：４２９−４３３において既に記載されている。
【００７９】
別の例では、トランスジーンは、ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子のごとき血友病において欠損している蛋白質をコードしていてもよい。記載した実施例は本発明を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００８０】
以下の代表的な実施例は本発明を説明することを目的としており、本発明を限定するものではない。代表的な手順はウサギにて実施されているが、それらは、非ヒト霊長類およびヒト対象のごとき他の哺乳類において、臨床的に実行可能なパラメーターの範囲内で、首尾よく実施される。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ウサギ肝臓へのアデノウイルス遺伝子療法ベクターのカテーテルに基づく送達
各実験について、各々約４ｋｇの体重のニュージーランド白ウサギを用いた（Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ  Ｆａｒｍｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）。用いたアデノウイルスベクターＡｄ２βｇａｌは、血清型２のバックボーンを有し、Ｅ１領域を欠失しているが、Ｅ３およびＥ４領域を保有する。発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターおよびエンハンサー、核局在性β−ガラクトシダーゼに関するｃＤＮＡ、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルから構成される（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．，ら．（１９９７）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２４０８−２４１６）。各ウサギへ１．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇ（粒子：感染単位の比＝１０：１）のＡｄ２βｇａｌウイルスを注入した。
【００８２】
以下のように本発明の方法の実施態様を利用して、アデノウイルス遺伝子療法ベクターをウサギの肝臓へ送達した。ウサギの血管系に進入するために、下顎から尾側に向かう正中切開により、頸静脈を露出させ、次いで、筋組織の鈍的切開により、右外頸静脈を露出させた。露出させた頸静脈に血管カテーテル針を挿入し、ガイドワイヤをその針に挿入した。蛍光透視的誘導の下、ガイドワイヤを上大静脈および心臓を経て、肝静脈循環まで通した。血管カテーテル針を取り出し、次いで、バルーン閉塞カテーテルをガイドワイヤ上にセットし、次いで、頸静脈に挿入した。蛍光透視的誘導の下、カテーテルをガイドワイヤに沿って肝静脈まで通した。ガイドワイヤを取り出し、次いで、生理食塩水中の非イオン性造影剤を少量注入し、適切なカテーテル位置を確認した。次いで、閉塞バルーンを造影剤で膨張させ、次いで、少量の造影剤を注入することにより、その位置を再度確認した。図１に示すように、肝静脈内の閉塞バルーンの膨張は、肝臓の右葉を流れる肝静脈を遮断した。次いで、ウイルス性溶液を、約１ｍｌ／秒の速度で肝臓の選択された葉へ逆行的に注入し、次いで、少量（１ｍｌ）のＰＢＳを注入して、カテーテル系に残存する任意のウイルスを葉へ洗い流した。ウイルスを組織中に約１分間滞留させておき、その間、注入シリンジへの逆流は阻止された。該滞留時間の後、注入速度とほぼ同じ速度でシリンジを引き戻すことにより、注入量に相当する容量を回収した。次いで、閉塞バルーンを収縮させ、次いで、カテーテルを取り出した。止血を行い、次いで、適切な材料を用いて切開部を閉鎖した。
【００８３】
上記送達方法を用いて、同じ総数のウイルス粒子（１．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇのＡｄ２βｇａｌベクター）を含有する幾つかのボーラス容量（３，８および２０ｍｌ）をウサギにて評価し、各容量にてアデノウイルスベクターにより介在される相対的な肝細胞形質導入を測定した。ウサギ肝臓の平均的な一葉は約２０ｇであると推定した。これを用いて、ウイルス性ボーラスの送達容量について２０ｍｌの上限を設定した。この上限は、注入された葉全体にわたってウイルス性ボーラスを分布させると考えられた。この想定に基づいて、注入された葉全体にわたるウイルス性ボーラスの完全な分布を成し遂げないように、より少量の３ｍｌおよび８ｍｌを選択した。処置後３日目に、ウサギを屠殺した。ベータ−ガラクトシダーゼ発現を肝臓、腎臓、肺および脾臓にて測定した。
【００８４】
ルミネセンスに基づくアッセイを用いるＡＭＰＧＤ（β−ガラクトシダーゼのための化学発光基質、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２９−トリシクロ（３．３．１．１３，７）デカン］−イル｝フェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）により発現を特徴付け、相対的発現レベルを得た。ルミネセンスアッセイにおいて、Ｊａｎｋｅ＆Ｋｕｎｋｅｌ  Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５ホモゲナイザーを用いて、１００〜２００ｍｇの組織を２×容量の１×溶解バッファー（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓキット，Ｔｒｏｐｉｘ）中でホモジナイズした。そのホモジネートを、２ラウンドの凍結および解凍に付し、次いで、４８℃の水浴中で１時間、内因性β−ガラクトシダーゼを熱不活性化した。試料を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、次いで、上清を清浄な１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ蛋白質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、各試料の蛋白質濃度をアッセイし、次いで、ＢｉｏＲａｄ  ＥＩＡプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍにおける吸光度を読み取った。製造元の指示に従ってＴｒｏｐｉｘ  Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓキットを用いて、各試料のベータ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイし、次いで、Ｔｒｏｐｉｘ  ＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーターおよびＷｉｎＧｌｏｗソフトウェアを用いて読み取った。
【００８５】
一般的に、組織試料について免疫組織化学を以下の通り実施した。４ミリメートルの組織片をホルマリン−亜鉛中で一晩固定し、ＰＢＳでリンスし、パラフィン包埋し、次いで、細かく分割した。Ｈｅｍｏ−Ｄ、１００％、９５％、７０％および５０％エタノール、再蒸留水およびＰＢＳで連続的に洗浄することにより、セクションを脱パラフィン化した。過酸化水素のメタノール中３％溶液を用いて、内因性ペルオキシド活性を排除し、次いで、水で再水和した。ＰＢＳ中の５％ヤギ血清中でセクションをブロックした。セクションをマウス抗βガラクトシダーゼと共に一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、アフィニティ精製したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗−マウスＩｇＧと共に１時間３７℃でインキュベートし、次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、０．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５で１回洗浄した。製造元の指示に従ってＬｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を用いてペルオキシダーゼ標識を検出し、次いで、セクションのメチルグリーン対比染色を検出した。
【００８６】
一般的に、ベータ−ガラクトシダーゼを発現する細胞の定量を以下の通り実施した。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて、Ａｄ２β−ｇａｌに感染した肝細胞および非肝細胞の核を識別および定量化した。感染細胞の一貫性のあるＭｅｔａＭｏｒｐｈ検出を確実にするために、ベータ−ガラクトシダーゼシグナルの免疫組織化学的検出のための着色時間を一定に保持した。各肝臓セクションをＭｅｔａｍｏｒｐｈにスキャンし、次いで、５領域（各１ｍｍ２）をＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析用の各肝臓セクションから選択した。色の閾値を用いて、非感染細胞の青緑色の核から、ベータ−ガラクトシダーゼ陽性核を示す茶色のＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）シグナルを識別した。試料の肝臓セクションに由来する核の予備的な実証的分析により、色の閾値およびその後の全てのＭｅｔａＭｏｒｐｈ分類を最適化し、次いで、各分類のヒト検証を実施した。
【００８７】
核を肝細胞、非肝細胞または未知対象に分類するために、全てのベータ−ガラクトシダーゼ陽性核の「全領域」および「楕円形因子」をＭｅｔａＭｏｒｐｈにより測定した。全領域（ＴＡ）は、色の閾値を満たす特定のベータ−ガラクトシダーゼ陽性核に隣接した全てのピクセルの合計として定義される。楕円形因子（ＥＦＦ）は、特定のベータ−ガラクトシダーゼ陽性核の全長をその全幅で割ったものとして定義される。例えば、完全な円のＥＦＦは１．０であり、一方、楕円のＥＦＦは一般的に１．２５より大きい。
【００８８】
単一の肝細胞の核はほぼ球状であり、ＥＦＦ≦１．２５およびＴＡ＝１６−１８のピクセルを生じる。二重の肝細胞の核は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈにより組織学的に分析できない密接して配置する２つの球体のようであり、一般的に１．５より大きいＥＦＦおよびＴＡ＞１８のピクセルを生じる。非肝細胞のベータ−ガラクトシダーゼ陽性核は、主に、肝臓マクロファージ（クッパー細胞）および内皮細胞に由来し、ＥＦＦ＞１．２５およびＴＡ＞６かつ≦１８を生じる。
【００８９】
セクション面内の特定の核の位置および配向に起因して、幾つかのベータ−ガラクトシダーゼ陽性核は、正確に肝細胞または非肝細胞へ分類できなかったので、未知対象として分類された。未知対象は、それらの各集団に応じて、肝細胞および非肝細胞であるとみなされ、いずれの定量分析にも付されなかった。未知対象は、ＴＡは１に等しいか、６以下、ＥＦＦについては任意の値、或いはＴＡは６よりも大であるが１６未満、そしてＥＦＦ≦１．２５を有した。ウサギ肝臓の４つの主な葉の各々に由来する近位、中位および遠位セクション各々から５フィールド（各１ｍｍ２）をＭｅｔａＭｏｒｐｈ分析のために収集した。
【００９０】
３ｍｌのボーラス注入で処置したウサギにおいて、注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現は、２０〜３００×１０６ＲＬＵ／ｍｇ組織の範囲であり、注入部位に対して遠位で相対的により大きな発現を伴った。非注入肝葉における発現は、１〜１２×１０６ＲＬＵ／ｍｇ組織の範囲であり、一貫性のある近位−遠位発現パターンを伴わなかった。腎臓、肺および脾臓における発現は大部分が検出不能だった。注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現細胞の免疫組織化学的な局在性により、細胞の解剖学的発現分布は、主に、ウイルス性ボーラスの送達経路である中心静脈周囲の領域に限定されることが実証された。これらの発現細胞の大部分は肝細胞であった。非注入肝葉において、ベータ−ガラクトシダーゼ発現細胞は、主に、門脈三管周囲の領域に免疫学的に局在化した。
【００９１】
８ｍｌのボーラス注入で処置したウサギの肝臓におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現は、３ｍｌのボーラス注入について得られたものよりも有意に高かった。注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現は３００〜６００×１０６ＲＬＵ／ｍｇ組織の範囲であり、一方、非注入肝葉における発現は１００〜３００×１０６ＲＬＵ／ｍｇ組織の範囲であった。３ｍｌの注入ボーラスについて記載したように、注入肝葉における発現は、注入部位に対して近位ないし遠位方向で増大した。非注入葉において、一貫性のある近位−遠位発現パターンは存在しなかった。腎臓、肺および脾臓における発現は大部分が検出不能だった。注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現細胞の免疫組織化学的な局在性により、葉全体にわたる本質的に均一な発現パターンが実証された；これらの発現細胞の大部分は肝細胞であった。ベータ−ガラクトシダーゼ発現も、免疫組織化学な局在性により測定されるように、肝臓構造に関して、非注入葉において均一であった。
【００９２】
２０ｍｌのボーラス注入で処置したウサギにおいて、注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現は、８ｍｌの容量で成し遂げられたもののほぼ半分であり、発現において類似する近位ないし遠位の勾配を伴った。非注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現は均一に分布しており、注入葉にて測定された発現より約１０倍低かった。注入肝葉におけるベータ−ガラクトシダーゼ発現細胞の免疫組織化学的な局在性により、葉全体にわたる本質的に均一な発現パターンが実証された；これらの発現細胞の大部分は肝細胞であった。腎臓、肺および脾臓における発現は大部分が検出不能であった。
【００９３】
図６は、３、８および２０ｍｌの注入量を用いて見出された発現分布を示す。免疫組織化学的に、８ｍｌ容量は、注入葉（葉１）（図６Ｄ）および非注入葉（葉４）（図６Ｅ）の両方において最大数の発現細胞を生じると考えられた。これらの定量的結果は、各葉から取り出された３つの組織コアにおけるβ−ガラクトシダーゼ蛋白質レベルの定量測定により確認された。図６Ｃ、６Ｆおよび６Ｉは、図式的に、４つの主要な葉の各々における３つの位置（肝静脈の大静脈からの入口に対して近位、中位および遠位）から測定された平均発現レベルを示す。４つの葉各々に由来するβ−ガラクトシダーゼ発現についての値の総和は、８ｍｌの注入量は３ｍｌの注入量よりも約４０％高く、２０ｍｌの注入量よりも約６０％高いことを実証した。これらの分析から、８ｍｌ容量を選択し、その後の全ての実験、局所（カテーテル）および全身注入の両方に８ｍｌの注入量を用いた。
【００９４】
全発現に加えて、図６は、異なる注入量から得られた異なる発現分布を示す。故に、例えば、３ｍｌの注入量については、注入葉の発現細胞（図６Ａ）は、主に、肝静脈周囲の領域に限定され、門脈三管周囲または非注入葉に局在している発現細胞は相対的にずっと少ない（図６Ｂ）。非注入葉におけるより少ない発現を示す定量結果（図６Ｃ）と合わせて、ウイルスの初期分布は注入された肝静脈の周辺領域に限定されることが実証された。
【００９５】
３ｍｌの注入量を用いて得られた結果と対照的に、図６は、８ｍｌの注入量が有意により大きなウイルス性ボーラスの分布を成し遂げたことも実証する。故に、図６Ｄは、肝臓腺房全体にわたり、かつ肝静脈周辺領域に限定されない発現細胞を示し、図６Ｅは、ある種の注入ウイルスが非注入葉に感染したことを示す。図６Ｆにおいて、これらの結果を確認および定量化し、これは注入葉（葉１）および非注入葉（葉２、３および４）の両方における有意な発現を実証する。これらのデータは、注入葉全体にわたり、かつ非注入葉の門脈および静脈循環に入り、その後、再分布して、非注入葉に感染し得る、ウイルス性ボーラスの初期分布と一致している。
【００９６】
注入葉を越えて十分に初期のウイルス性ボーラスを分布させると考えられる２０ｍｌの注入量は、注入（図６Ｇ）および非注入（図６Ｈ）葉の両方において、広範囲に及ぶがより少ない（８ｍｌの容量と比較して）発現細胞をもたらした。これらの定量結果をβ−ガラクトシダーゼ定量化（図６Ｉ）により確認した。該結果は、注入されたウイルス性ボーラスが門脈循環中に十分に分布されたというシナリオと一致している。
【００９７】
実施例２：ナイーブウサギにおける全身投与に対する局所投与の比較
ウイルスベクターの局所送達が全身送達に勝る利点を付与するか否かを調べるため、１）実施例１に記載したバルーンカテーテル介在送達を用いる肝臓への局所送達；または２）静脈内注入を用いる全身送達；のいずれかを介して、Ａｄ２βｇａｌウイルスをウサギに送達した。送達経路に関係なく、１．５×１０１２のウイルス粒子／ｋｇのＡｄ２βｇａｌウイルスを各ウサギに注入した。
【００９８】
ウイルスベクターの全身送達を以下のプロトコルに従って実施した。ロールガーゼおよびメディカルテープを用いて耳に固定した２０ゲージの血管カテーテル針を用いて、鎮静をかけたウサギの辺縁耳静脈に進入した。ルアーロックフラッシュをカテーテルに取り付け、ベネドリル（Ｂｅｎａｄｒｙｌ）；１ｍｇ／ｋｇをＩＶ投与し、起こりうるアナフィラキシー応答を制御した。Ａｄ２βｇａｌウイルスを含有する８ｍｌ容量の生理食塩水を約１ｍｌ／秒の速度で耳静脈に注入した。Ａｄ２βｇａｌウイルスの肝臓への局所送達を、実施例１に記載したバルーンカテーテル介在送達を用いて実施した。
【００９９】
様々な手順の毒性を以下の通り評価した。ウイルス投与の直前ならびにウイルス投与の１、２および３日後に、各ウサギから血液を採取した。示差的細胞計数（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）（白血球および赤血球細胞、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均血球体積、平均血球ヘモグロビン濃度、有核赤血球細胞、セグメント化ヘテロフィル（ウサギ好中球）、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板）、ならびに血清化学特性（アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、クレアチンキナーゼ、アルブミン、全蛋白質、グロブリン、総ビリルビンおよび直接ビリルビン、ＢＵＮ、クレアチン、コレステロール、グルコース、カルシウム、リン、ビカルボナート、塩化物、カリウムおよびナトリウム）を実施した。
【０１００】
処置したウサギの肝臓をベータ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。ウサギ肝臓ホモジネートにおける細菌性ベータ−ガラクトシダーゼ発現は、実施例１に記載のように定量化されたか、或いは市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を製造元の指示に従って用いて定量化した。組織試料についての免疫組織化学は、実施例１に記載の通りに実施した。形態学的分析を実施して、肝臓における発現パターンを決定し、肝臓の非肝細胞に対する肝臓の肝細胞のトランスフェクション比率を決定した。
【０１０１】
図７Ａおよび７Ｃは、これらの動物におけるＡｄ２βｇａｌの全身投与が、肝臓構造に関して相対的に均一な発現分布をもたらすことを示し、円形の核を目立たせる核のβ−ガラクトシダーゼ染色により示されるように、形質導入された細胞の大部分が肝細胞であると考えられることを示す。形質導入された細胞のこの均一性は、本質的に、全ての肝葉にわたって同じであり（データ示さず）、図７Ｅで示された定量データはこの評価を裏付けた。すなわち、全ての葉は、ＥＬＩＳＡにより測定されるように、ほぼ同じβ−ガラクトシダーゼ発現を示す。
【０１０２】
同一のウイルス用量および注入量（８ｍｌ）の局所送達方法を用いて、図８Ａは、注入葉（葉１）中に生じた発現細胞が腺房全体にわたって分布したことを示し、実施例１（図６）におけるより初期の容量の評価研究と一致した。より高い倍率では（図８Ｃ）、注入葉中で核−局在化β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の大部分は肝細胞であるようだった。注入葉と比較して、図６Ｂは、非注入葉（葉４）中の発現細胞の相対数は有意に少なかったことを示す。注入葉においてのように、非注入葉中の発現細胞は、大部分が肝細胞であるようで、腺房内に均一に分布していた。
【０１０３】
ナイーブ動物におけるこれらの定性的知見は、非注入葉と比較して注入葉において有意により大きな全体的発現を示す図６Ｅにおいて図式的に示されるβ−ガラクトシダーゼの定量測定により支持された。容量評価実験において見られるように（図６）、全ての非注入葉はほぼ同じ程度で形質導入された。
【０１０４】
図９Ａは、ナイーブウサギにおける肝静脈経路を介するバルーンカテーテルを用いたカテーテル介在局所送達が、非注入葉においてよりも注入葉において約２〜３倍多い感染細胞をもたらすことを示す；注入葉および非注入葉の両方において肝細胞として同定され得る発現細胞の割合は、注入葉および非注入葉の両方において本質的に同じだった（約０．７）。
【０１０５】
図９Ｄは、ナイーブ動物における全身送達が、局所送達（図９Ａ）と比較した場合に、全発現細胞において概して２〜３倍の減少をもたらすことを示す。葉１および４の両方の評価により（全身送達に関しては「注入」または「非注入」葉の区分はないことに注意）、本質的に同数の発現細胞を得た。発現細胞の肝細胞フラクションの評価は、注入（０．６３）および非注入（０．６９）葉において本質的に同一であり、局所送達後に得られたもの（約０．７１；図９Ａ）とほぼ同等だった。
【０１０６】
統合すれば、これらのデータにより、アデノウイルスベクターのカテーテル介在局所送達は、全身送達と比較して、利点を有することが実証される。肝静脈アプローチを用いる局所送達は、全身アプローチを用いる送達（図７Ｅおよび９Ｄ）と比較して、２〜３倍多い発現（図８Ｅおよび９Ａ）をもたらした。
【０１０７】
Ａｄ２−βｇａｌの送達に起因する毒性は、局所（バルーン−カテーテル）および全身アプローチの両方で、軽微であった。手術前（ベースライン）ならびにアデノウイルスの注入または生理食塩水の偽注入の１、２および３日後にウサギから得た血液試料について、血球カウントおよび血清の化学的分析を実施した。
【０１０８】
軽度であるが統計的に有意なリンパ球減少症（ベースラインに対して５０〜６０％減少）が、ウイルスで処置した動物において２４時間以内に明かとなった。軽度であるが統計的に有意な（ベースラインに対して５０％減少）血小板減少症が、ウイルスで処置した動物において２４時間以内に明かとなった。軽度であるが統計的に有意な好中球増加症（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉａ）（ベースラインに対して１００〜２００％増加）は、ウイルスで処置した動物または偽手術（生理食塩水の局所注入）に付された動物において２４時間以内に明かとなった。血清クレアチンキナーゼにおける統計的に有意な増大（ベースラインに対して１００〜１０００％増加）は、ウイルスで処置した動物または偽手術（生理食塩水の局所注入）に付された動物において２４時間以内に明かとなった。全血球カウントおよび血清の化学特性は、ウイルス投与または偽手術から３日以内に正常に戻った。
【０１０９】
ウイルスの局所もしくは全身送達により感染させた動物または非感染動物に由来するヘマトキシリンおよびエオシン染色した肝臓セクションの組織病理学的評価により、いずれの具体的な処置に相関し得る一貫性のある肝細胞変化がないことが示された。
【０１１０】
実施例３：受動免疫されたウサギにおける全身投与に対する局所投与の比較
このような文脈において局所送達が全身送達に勝る利点を付与するか否かを調べるために、抗ウイルス免疫を有する動物において、アデノウイルスベクターのカテーテル介在局所送達を全身送達と比較した。これを成し遂げるために、実施例２の実験を、既知の抗−アデノウイルス２型力価（抗−Ａｄ２）のプールされたヒト血清で受動免疫したウサギにおいて繰り返した。
ウイルス投与の一日前に、ロールガーゼおよびメディカルテープを用いて耳に固定した２０ゲージの血管カテーテル針を用いて鎮静をかけたウサギの辺縁耳静脈に進入した。ルアーロックフラッシュをカテーテルに取り付け、ベネドリル（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に投与し、起こり得るアナフィラキシー応答を制御した。次いで、４０ミリリットルの抗−Ａｄ２抗体含有プールされたヒト血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）を０．１ｍｌ／秒の速度で注入した。プールされたヒト血清は平均ヒト抗−Ａｄ２力価（データ公開せず）の約１０倍の抗−Ａｄ２力価を有した（総力価＝１２，８００，中和力価＝３，２００）。故に、全ウサギ循環中へこの送達用量が希釈されると（３５０〜４００ｍｌと推定）、平均ヒト力価に近似する最終的な抗−Ａｄ２力価をもたらすと予測された。Ａｄ２βｇａｌ投与時における抗−Ａｄ２力価の実際の測定は、全動物において、１，６００の全抗−Ａｄ２力価および４００の中和力価をもたらした。
【０１１１】
プールされたヒト血清およびウサギ血清における抗−Ａｄ２抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。血清の段階希釈を熱不活性化アデノウイルス２型でコーティングした９６ウェルプレートのウェルに加えた。西洋わさびペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗−ウサギ免疫グロブリンＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡを用いて、結合したウイルス特異的抗体を検出した。次いで、発色基質と共に３０分間インキュベートすることにより、ウサギ抗−Ａｄ２抗体を検出した。抗ウイルス力価を、ＯＤ４９０≧０．１を生じる最大の血清希釈の逆数として定義した。
【０１１２】
プールされたヒト血清におけるアデノウイルス中和抗体力価を、Ａｄ２−βｇａｌによる感受性細胞株の形質導入を阻害するその能力により評価した。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＴＣ）をフラット−ボトム９６−ウェル組織培養プレート上に播種し、次いで、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で一晩インキュベートした。血清試料をＤＭＥＭ中で１：２５〜１：６４００に段階希釈し、次いで、Ａｄ２−βｇａｌ（５０ＭＯＩ）を血清希釈液に加え、次いで、３７℃で１時間インキュベートし、その後、播種した細胞へ加え、次いで、培養を３日間続けた。３日目に、細胞を回収し、次いで、溶解した。市販のＡＭＰＧＤ／β−ガラクトシダーゼアッセイキットを用いて基質転換について溶解物をアッセイした。血清試料の中和抗体力価を、測定したＲＬＵにおいて負対照（ヒト免疫グロブリン−枯渇血清）に対して５０％以上の減少をもたらす希釈の逆数として定義した。ウイルス投与時における全抗−Ａｄ２力価は全ウサギにおいて１：１６００であり；中和力価は１：４００だった。これらの力価は、平均抗−Ａｄ２力価を有するヒトにおいてのものと本質的に同じである。
【０１１３】
受動免疫の一日後、実施例１および２に記載したように、１）静脈内注入を用いる全身送達か、または２）バルーンカテーテル介在送達を用いる肝臓への局所送達のいずれかにより、Ａｄ２βｇａｌウイルスを送達した。別記しない限り、用いた材料および方法は実施例１および２において利用したものと同様であった。送達経路に関わらず、各ウサギに１．５×１０１２ウイルス粒子／ｋｇのＡｄ２βｇａｌウイルスを注入した。
【０１１４】
受動免疫されたウサギにおけるＡｄ２βｇａｌの全身投与は、中心静脈または門脈三管周囲への発現細胞の明かな集中を伴うことなく、肝臓構造に関して一様のβ−ガラクトシダーゼ発現をもたらした（図７Ｂおよび７Ｄ）。しかし、ナイーブ動物における同一用量のウイルスの全身投与と比較して（図７Ａおよび７Ｃ）、ウサギにおける既存の抗−Ａｄ２抗体を用いた全身投与は、全β−ガラクトシダーゼ発現が約２倍軽減したように、発現の弱小化をもたらした（図７Ｆ）。
【０１１５】
受動免疫後にトランスフェクションされる細胞型に関して（肝細胞対非肝細胞）、図９Ｅは、受動免疫されたウサギにおける全身送達が、ナイーブ動物における全身送達（２５３±１６６肝細胞／フィールド）（図９Ｄ）と比較して、感染した肝細胞の数において１０倍の減少（１８．０±１４肝細胞／フィールド）をもたらしたことを示す。しかし、抗−Ａｄ２抗体（受動免疫された）の存在下では、全身送達は、ナイーブ動物における全身送達（１４７±８２非肝細胞／フィールド）（図９Ｄ）と比較して、感染した非肝細胞の数においてごくわずかな減少（１２４±４７非肝細胞／フィールド）（図９Ｅ）しかもたらさなかった。故に、これらのデータは、受動免疫に起因する発現における２〜３倍の減少も示す、得られた定性的および定量的発現データ（図７）と一致している。故に、ウイルスの全身投与後の最も劇的な抗−Ａｄ２抗体の効果は、ナイーブ動物における全感染細胞の６６％から受動免疫された動物における全感染細胞の１４％までの、感染肝細胞のフラクションにおける減少だった。故に、抗−ベクター抗体存在下での全身送達は発現の軽減をもたらし、ここで、発現細胞の大部分は肝臓類洞内皮細胞およびクッパー細胞のごとき非肝細胞だった（図９Ｅ）。受動免疫された動物において発現細胞の約１５％のみが肝細胞として同定された。
【０１１６】
受動免疫された動物におけるＡｄ２βｇａｌの局所送達は、Ａｄ２βｇａｌを投与されたナイーブ動物において見られたもの（図８Ａ）と同様の、注入葉におけるβ−ガラクトシダーゼ発現細胞の分布（図８Ｆ）をもたらした。ナイーブウサギ（図８Ｅ）および受動免疫されたウサギ（図８Ｊ）の間のカテーテル介在局所投与の比較は、抗−Ａｄ２抗体の存在が肝臓全体のβ−ガラクトシダーゼ発現において約５〜１０倍の軽減をもたらしたことを示す。
【０１１７】
受動免疫された動物における全β−ガラクトシダーゼ発現における減少に加えて、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞型の割合も、アデノウイルスベクターのカテーテル介在局所送達で処置したナイーブ動物における割合と比較して、変化した。注入葉において肝細胞として同定され得る発現細胞の割合は、ナイーブ動物における０．７２から受動免疫された動物における０．４５まで減少した（図９Ａおよび９Ｂ）。より著しいのは非注入葉における差異であり、そこではこの割合が受動免疫に起因して０．７０から０．０９まで減少した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１１８】
要約すると、受動免疫された動物における肝臓の全領域の合計である全β−ガラクトシダーゼ発現は、ＥＬＩＳＡ（図７および図８）およびＭｅｔａｍｏｒｐｈ（図９）分析の両方により定量されるように、局所および全身送達後に本質的に同一だった。しかし、重要なことには、局所送達後に肝細胞として同定されたβ−ガラクトシダーゼ発現細胞のフラクションは約７倍大きかった。これは、受動免疫された動物における全身送達後の全β−ガラクトシダーゼ発現の主な部分が非肝細胞に由来することを示唆し、この主張は定性的免疫組織化学（図８Ｇおよび８Ｉ）および定量的Ｍｅｔａｍｏｒｐｈデータ（図９Ｅ）の両方により支持される。さらに、抗−Ａｄ２抗体が有する全感染および全発現についての負の効果にも関わらず、局所送達は、治療的遺伝子療法のための望ましい標的細胞である肝細胞を優先的に標的とすることができる。故に、免疫されたウサギへの全身送達が肝細胞として同定される約１４％の発現細胞を生じさせた一方で、局所送達は、注入葉において肝細胞である約４５％の発現細胞、非注入葉において約１０％の発現細胞を生じさせた。非注入葉における発現肝細胞のより低いパーセンテージは、非注入肝葉内に分布する抗ウイルス抗体とウイルスの相互作用の程度がより大きいことと一致する。
【０１１９】
受動免疫された動物について、これらの結果から、局所送達が全身送達に勝る有意な利点を提供することが明かである。受動免疫された動物における局所送達の後、非肝細胞に対する肝細胞におけるトランスジーンの発現の比は、受動免疫された動物における全身送達後の比よりも有意に高い。故に、この方法は、既存の免疫を有する動物へウイルス性遺伝子治療剤を投与する場合に利点を提供することが明かである。
【０１２０】
実施例４：受動免疫されたウサギにおける、生理食塩水でプレフラッシュしたウサギ肝臓へのアデノウイルス遺伝子療法ベクターのカテーテルに基づく送達
カテーテルを介して２０ｍｌの生理食塩水を注入する「フラッシング」工程をウイルス投与の直前に加えることにより、アデノウイルスベクターのカテーテル介在局所送達を評価した。これは、抗−Ａｄ２ウイルス性免疫を有する動物において実施し、この文脈において、生理食塩水を用いた肝臓のプレフラッシングが、プレフラッシング工程のない送達に勝る利点を付与し得るか否かを調べた。
【０１２１】
これを成し遂げるために、実施例３に記載したように、既知の抗−アデノウイルス２型力価（抗−Ａｄ２）のプールされたヒト血清を用いてウサギを受動免疫した。受動免疫の一日後、以下の工程を加えて、実施例１および２に記載したバルーンカテーテル介在送達手順を続けた。Ａｄ２βｇａｌ送達の直前、カテーテルを通じて２０ｍｌ容量の生理食塩水を送達した。
【０１２２】
受動免疫された動物におけるＡｄ２βｇａｌのカテーテル介在局所送達へ生理食塩水フラッシュを加えることにより、生理食塩水フラッシュを受けていないカテーテル介在局所送達で処置した受動免疫された動物と比較して、トランスジーン発現細胞の数およびβ−ガラクトシダーゼ発現肝細胞の割合の両方が増大した。生理食塩水プレフラッシュを受けた受動免疫された動物において、発現肝細胞の数は、プレフラッシュを受けなかった動物と比較した場合に、約５倍増大した（図９Ｂおよび９Ｃ）。注入葉において肝細胞として同定され得る発現細胞の割合も増大し、生理食塩水プレフラッシュなしの受動免疫された動物における０．４５（図９Ｂ）および非免疫動物における０．７１（図９Ａ）と比較して、その割合は０．６８（図９Ｃ）だった。より著しいのは非注入葉における差異であり、そこで、肝細胞として同定され得る発現細胞は、受動免疫された動物における生理食塩水プレフラッシュに起因して、０．０９から０．４０に増大した（図９Ｂおよび９Ｃ）。受動免疫された動物の場合、ウイルスベクターのカテーテル介在局所送達に加えて生理食塩水プレフラッシングが、ウイルスベクターに対する既存の免疫を有する動物において有意な利点を提供することが明かである。生理食塩水プレフラッシュを用いて、発現細胞の総数およびトランスジーン発現肝細胞のフラクションの両方が、受動免疫された動物において生理食塩水フラッシングなしのものよりも有意により大きかった。故に、既存の免疫を有する動物へウイルス性遺伝子治療剤を投与する場合に、本方法のこの実施態様が利点を提供することが明かである。
【０１２３】
実施例５：ウサギ肝臓へのアデノ随伴ウイルス遺伝子療法ベクターのカテーテルに基づく送達
各実験について、各々約４ｋｇの体重のニュージーランド白ウサギを用いた（Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ  Ｆａｒｍｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）。利用したアデノ随伴ウイルスベクター、ＡＡＶ２／８ＤＣ１９０ＨＡＧＡＬ（ＡＡＶ２／８）は、ＡＡＶ８血清型のカプシド領域およびＡＡＶ２血清型の逆方向末端反復配列を含む。発現カセットは、２つのα−１ミクログロブリンエンハンサー、１つのα−１−アンチトリプシンプロモーター、およびヒトα−ガラクトシダーゼＡトランスジーンを含む。実施例１〜３に記載したように、バルーンカテーテル介在送達を用いる肝臓への局所送達により、ウサギへ１ｋｇあたり１．２５×１０１１または１．２５×１０１２のＤＮＡ−ａｓｅ耐性粒子（ｄｒｐ）のＡＡＶ２／８ウイルス（８ｍｌの全容量中）を注入した。別記しない限り、用いる材料および方法は実施例１〜３で利用したものと同様であった。
【０１２４】
既に記載されているように［Ｚｉｅｇｌｅｒら．，（１９９９）．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｊｕｌ  １；１０（１０）：１６６７−８２．］、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ特異的酵素結合イムノソルベントアッセイを用いて、動物の血清中のヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡＬ）発現を測定した。
【０１２５】
１ｋｇあたり１．２５×１０１１ｄｒｐのＡＡＶ２／８ウイルスで処置したウサギにおいて、血清中のＡＧＡＬ発現は、３〜３１ｎｇＡＧＡＬ／ｍｌ血清の範囲であった。１ｋｇあたり１．２５×１０１２のＤＮＡ−ａｓｅ耐性粒子（ｄｒｐ）のＡＡＶ２／８で処置したウサギにおいて、血清中のＡＧＡＬ発現は、１５〜１３２ｎｇＡＧＡＬ／ｍｌ血清の範囲であった。
【０１２６】
実施例６：ウサギ肝臓へのアデノ随伴ウイルス遺伝子療法ベクターのカテーテルに基づく送達後のＡＧＡＬ発現の経時変化
各々約４ｋｇの体重のニュージーランド白ウサギを用いた（Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ  Ｆａｒｍｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）。利用したアデノ随伴ウイルスベクター、ＡＡＶ２ＤＣ１９０ＨＡＧＡＬ（ＡＡＶ２／２）は、ＡＡＶ２血清型のカプシド領域および逆方向末端反復配列を含む。発現カセットは、２つのα−１ミクログロブリンエンハンサー、１つのα−１−アンチトリプシンプロモーター、およびヒトα−ガラクトシダーゼＡトランスジーンを含む。実施例１〜３にて記載したように、バルーンカテーテル介在送達を用いた肝臓への局所送達により、８ｍｌの全容量中、５×１０１２のＤＮＡ−ａｓｅ耐性粒子（ｄｒｐ）のＡＡＶウイルスをウサギへ注入した。別記しない限り、用いた材料および方法は実施例１〜３で利用したものと同様であった。
【０１２７】
既に記載されているように［Ｚｉｅｇｌｅｒら．，（１９９９）．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｊｕｌ  １；１０（１０）：１６６７−８２．］、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ特異的酵素結合イムノソルベントアッセイを用いて、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＡＧＡＬ）発現を動物の血清中で測定した。ＡＧＡＬ発現を８４日間にわたって測定した。
【０１２８】
処置ウサギの血清中の抗−ＡＧＡＬ抗体力価も、ＥＬＩＳＡを用いて経時で測定した。血清の段階希釈液を、精製組換えヒトα−ガラクトシダーゼＡでコーティングした９６ウェルプレートのウェルへ加えた。結合したヒトα−ガラクトシダーゼＡ特異的抗体を、西洋わさびペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗−ウサギ免疫グロブリンＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡで検出した。次いで、発色基質との３０分間のインキュベーションを用いて、ウサギ抗−Ａｄ２抗体を検出した。抗−ウイルス力価を、ＯＤ４９０≧０．１をもたらす最大の血清希釈の逆数として定義した。
【０１２９】
図１０に示すように、ＡＧＡＬ発現は、８４日間の時間経過にわたって、ウサギの血清中に存在した。検出可能な抗−ＡＧＡＬ抗体は、８４日間の時間経過にわたって、ウサギの血清中で検出されなかった。ＡＡＶ２送達からもたらされた毒性はわずかなものであり、一般的に、Ａｄ２−βｇａｌ送達に付随するものと本質的に同様であった。
【０１３０】
実施例７：延長された滞留時間を伴う、ウサギ肝臓へのアデノウイルス遺伝子療法ベクターのカテーテルに基づく送達
各々約４ｋｇの体重のニュージーランド白ウサギを用いた（Ｍｉｌｌｂｒｏｏｋ  Ｆａｒｍｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）。利用したアデノウイルスベクター、Ａｄ２βｇａｌは実施例１に記載した。各ウサギに１ｋｇあたり１．５×１０１２ウイルス粒子のＡｄ２βｇａｌウイルスを注入した。
【０１３１】
ウイルスを組織中へ１分間ではなく約４分間滞留させておくこと除き、実施例１〜３に記載した方法を利用して、８ｍｌの全注入量を用いて、アデノウイルス遺伝子療法ベクターをウサギの肝臓へ送達した。
【０１３２】
注入から３日後、処置ウサギの肝臓をベータ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。製造元の使用説明書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ウサギ肝臓ホモジネート中の細菌性ベータ−ガラクトシダーゼ発現を定量した。組織試料についての免疫組織化学を実施例１に記載したように実施した。実施例１に記載したような形態学的分析を実施して、肝臓中の発現パターンおよび肝臓非肝細胞に対する肝臓肝細胞のトランスフェクション比率を測定した。各ウサギについて、注入葉の３セクションおよび非注入葉の３セクションを評価し、肝細胞フラクション［トランスフェクションされた肝細胞／（トランスフェクションされた肝細胞＋トランスフェクションされた非肝細胞）］を測定した。
【０１３３】
図１１Ａに示されるように、延長された滞留時間は、１分間の滞留時間を利用する前研究と比較した場合、注入および非注入葉の両方において、肝細胞として同定されるトランスフェクションされた細胞の割合を有意に増大した。４分間の滞留時間を用いるアデノウイルスベクターで処置したウサギは、注入葉において約０．７５〜０．９０の肝細胞フラクションを有し、非注入葉において約０．７０〜０．９０の肝細胞フラクションを有した（図１１Ａにおける８−２０および８−２２を示す棒を参照のこと）。対照的に、１分間の滞留時間を伴う同一の送達方法を用いてアデノウイルスベクターで処置したウサギは、注入葉において約０．６〜０．７５の、および非注入葉において約０．３０〜０．７０の、トランスフェクションされた肝細胞フラクションを有した（図１１Ａ中の４，５および１を示す棒を参照のこと）。興味深いことに、図１１Ｂに示すように、増大した滞留時間は全ベータ−ガラクトシダーゼ発現レベルを増大するようには思われなかった。
【０１３４】
実施例８：流出遮断を用いる葉送達
実施例１に記載したように、葉送達方法は、閉塞バルーンに対して遠位の貯蔵器官の一部に対する送達を制限する。全身循環から貯蔵器官をさらに分離するために、肝大静脈中に留置したバルーンカテーテル（６）で肝静脈口を被覆することにより、全肝静脈の流出遮断が成し遂げられ得る。
【０１３５】
この手順を実施するために、大腿溝から下方に向かう縦方向の皮膚切開を介して、大腿中位から大腿静脈に進入した。筋膜を鈍的に解離させて、神経血管束を露出させた。大腿静脈を、付随する動脈および神経から慎重に解離させた。大腿静脈の１〜２ｃｍのセグメントを分離し、次いで、遠位に結紮した。７フレンチのシースイントロデューサーを、該結紮に対して近位の大腿静脈に挿入した。蛍光透視法によるガイダンスを用いて、ガイドワイヤを下大静脈に進めた。５フレンチの１４ｍｍ×４ｃｍのノンコンプライアンスバルーンカテーテルを、ガイドワイヤ上のシースを介して、大静脈の肝部分へ通した。シースの外側直径はウサギ大腿静脈に比べて大きいため、ウサギモデルでは血管損傷を伴うことなくこの手順を繰り返すことは困難である。この厄介な問題はヒト対象においては予期されない。
【０１３６】
カテーテルの内腔をヘパリン化した。肝静脈に留置したバルーン閉塞バルーンカテーテルを介してトランスフェクション物質を注入する直前にバルーンを膨張させた。バルーンを膨張させた後、シースイントロデューサーを介して少量のＸ線造影剤を注入し、下大静脈において、バルーンで閉塞された血流を確認した。次いで、血管内カテーテルを介して８ｍｌのトランスフェクション物質を単一の分離された葉中に注入した。その直後に、カテーテルおよびシースを引き抜き、その後、止血を行った。図３に示すように、高密度のＸ線造影剤は分離された葉を染色し、一方で、より低濃度の造影剤は逆行性の様式で門静脈を介して肝臓の残りの部分へ再循環した。
【０１３７】
実施例９：標的化した器官全体への送達
単一の注入で遺伝子治療剤を肝臓全体へ送達するために、肝静脈血流に対して上位および下位双方の下大静脈において膨張させたバルーンを用いることにより、肝臓を分離した。次いで、トランスフェクション物質の溶液を、肝静脈から全肝実質までの逆行性の様式で、バルーンおよび血流の間に注入する。この方法の１つのヴァージョンを図４に示す。このヴァージョンにおいて、バルーン閉塞バルーン（７，８）を、上位にある頸静脈（５）から、右心房と最も上位の肝静脈（１１）の間にある下大静脈（１６）中の位置へ、そして下位にある大腿静脈から、最も上位の腎静脈（１９）と最も下位の肝静脈（３）の間にある下大静脈（１６）中の位置へ、進める。チップ付近に複数の側孔を有する４フレンチのピグテールカテーテル（ｐｉｇｔａｉｌ  ｃａｔｈｅｔｅｒ）を、逆側の大腿静脈を通じて、２つのバルーン閉塞バルーンの間の下大静脈中の位置へ、進める。ピグテールカテーテルを介する遺伝子療法用溶液の注入直前に、バルーンを膨張させて、肝臓を分離させる。
【０１３８】
この方法の別の実施態様において、図５に示すように、２つの別個の二重内腔バルーンカテーテル（１２，１３）を介して、バルーン閉塞バルーンを送達してもよい。
【０１３９】
実施例１０：ＡＡＶ８に対して多様な自然免疫を有するアカゲザルにおける、ＡＡＶ８．ＤＣ１９ＯｈＡＧＡのカテーテルに基づく局所送達を用いた予測的（Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ）研究
プロトロンビンエンハンサー／ヒトアルブミンプロモーター（ＤＣ１９０）駆動ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ（ｈＡＧＡ）遺伝子を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８に基づくベクターの肝静脈を介するカテーテルに基づく局所送達後の、遺伝子移入の有効性およびヒトアルファ−ガラクトシダーゼの発現は、ＡＡＶ８血清型に対して多様な自然免疫を有するアカゲザルにおいて評価され得る。
【０１４０】
局所送達に起因するｈＡＧＡの発現は、末梢静脈を介する全身送達から得られたものと比較され得る。循環アルファ−ガラクトシダーゼのレベルおよび持続時間、サイトカインの産生、ならびに抗−ＡＡＶ８および抗−アルファ−ガラクトシダーゼ抗体の存在が調べられ得る。トランスジーンの組織分布も測定され得る。
【０１４１】
免疫抑制剤も同様にＡＡＶ８．ＤＣ１９ＯｈＡＧＡの投与の前および後に動物へ投与され、ウイルス性カプシド蛋白質を認識する細胞傷害性リンパ球が形質導入された細胞を排除し得る可能性を最小限にまたは排除し得る。器官移植の分野において一般的に利用されている免疫抑制剤は、単独または他の物質と組み合わせて用いられてもよい。かかる免疫抑制剤は、導入用のものおよび／または維持用のものを含んでもよい。これらの物質は、シクロスポリン（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））、プレドニゾン（Ｎｏｖｏ  Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（登録商標）、Ａｐｏ  Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、タクロリムスまたはＦＫ５０６（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））、ミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌＩＣｅｐｔ（登録商標））、シロリムス（Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））、ＯＫＴ３（Ｍｕｒｏｍｏｒａｂ  ＣＯ３（登録商標）、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標））、ＡＴＧＡＭおよびサイログロブリンを含んでもよい。同様に、免疫抑制レジメンは、少なくともＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）経口懸濁液およびＲａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液を含み得る。ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）経口懸濁液（ＭＭＦ）は、１日２回、約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で強制経鼻により投与され得る。Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標）経口溶液は、約２ｍｇ／ｋｇの用量で強制経鼻により投与され得る。これらは、アカゲザルに適する最も妥当な推定値であると考えられる。
【０１４２】
カテーテルに基づく局所アプローチおよび全身アプローチによるＡＡＶ８．ＤＣ１９ＯｈＡＧＡの単一静脈内注入が用いられ得る。約２×１０１３粒子／ｋｇの用量レベルのＡＡＶ８．ＤＣ１９ＯｈＡＧＡは、ＡＡＶ８．ＤＣ１９ＯｈＡＧＡの薬物動態学的および薬力学的特性を評価するのに十分であると仮定される。用量レベルの選択は、ウサギにおいて実施された先の研究から得られた情報およびアカゲザルにおける関連材料を用いた他の研究者らによる情報に基づく。
【０１４３】
サルを抗−ＡＡＶ８抗体についてスクリーニングして、ＡＡＶ８ベクターに対する自然免疫の存在または不在が測定され得る。元々、ＡＡＶ８はサルから単離されており、それ故に、研究において用いるために該血清型が選択される。処置が模索されている哺乳類から単離された血清型の使用により、標的器官の形質導入の増大において利点が提供されてもよい。理論的には、かかる増大は、かかる血清型からもたらされてもよく、というのも、ウイルスが哺乳類から単離されたという事実に基づき、該血清型は哺乳類の標的器官に対して増大された指向性を有してもよいからである。様々な自然免疫を有するサルを用いることによっても、選択したウイルスベクターに対して既存の免疫を有する哺乳類において本方法を評価することもできよう。
【０１４４】
カテーテルに基づく局所送達によりウイルスを投与されたサルは、実施例１および４に記載した本発明の方法を用いて処置され得る。簡潔に言うと、サルは、実施例４に記載したさらなるフラッシング工程を付加したカテーテルに基づく手順によりウイルスを投与され得る。該フラッシング工程は、標的葉に存在する任意の抗ウイルス抗体を希釈するように理論付けられており、理論的には、ウイルス性遺伝子移入および特に肝細胞形質導入の効率を増大し得る。加えて、ウイルスの滞留時間は、実施例１および４に記載した１分から、４分を超えない滞留時間にまで増大され得る。この滞留時間における増大は、理論的には、ウイルス性遺伝子移入および特に肝細胞形質導入の効率を増大し得る。
【０１４５】
研究期間を３６５日間と見積もる。トランスジーン発現、抗体レベル、血清化学および血液学的パラメーターの評価用血液試料は、全研究期間にわたって、様々な所定の時間ポイントにて全動物から収集され得る。
【０１４６】
上記研究は、元々サルから単離された血清型により送達された治療用トランスジーンの遺伝子移入および発現の有効性を評価し得る。それは、該血清型に対して自然な範囲の既存免疫を有する哺乳類において有効性および発現を評価し得る。該研究の送達方法は、ウイルス投与前の器官のフラッシング工程および延長されたウイルス滞留時間を利用し得る。免疫抑制も、該研究プロトコルの一部であり得る。この方法論を用いるトランスジーンの有効性および発現は、ウサギに基づくモデルにおいて観察されたものより大きいとはいかないまでも、それと同等の標的器官形質導入をもたらし得ることが理論付けられる。さらに、ウイルスベクターの順行性送達を利用する哺乳類における他のカテーテルに基づく系において観察されたものより大きいとはいかないまでも、それと同等の標的器官形質導入をもたらし得ることが理論付けられる。
【０１４７】
疾患は様々な器官または組織に影響し得るので、体中の様々な位置において本発明の方法の使用が所望され得ることが明かであるはずである。本発明を用いて、肝臓、腎臓、心臓、肺、骨格筋、胃または腸を含む様々な器官または組織を処置してもよい。
【０１４８】
本明細書中に引用した参考文献の教示内容を考慮すると、本明細書は非常に十分に理解される。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。本明細書中の実施態様は、本発明の実施態様の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者には、他の多数の実施態様が本発明内に包含され、かつ、本明細書および本実施例は単なる例示であり、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されるものであることが、理解されよう。
【０１４９】
本発明の実施態様は、本明細書および本明細書中に開示した本発明の実施例から、当業者に明かであろう。本明細書および本実施例は単なる例示であり、本発明の真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲により示されるものであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】肝静脈（３）を閉塞するバルーンカテーテル（４）を示す。該カテーテルは、頸静脈（５）から挿入され、上大静脈（１）、心臓（２）を経て、肝静脈（３）まで通される。
【図２】ウサギモデルにおける肝静脈を通じてのウイルスのバルーンカテーテル投与の蛍光透視法によるスポットイメージを示す。点線は大静脈および４つの主要な肝静脈を示す。カテーテルは、上大静脈を通じて右尾状葉に下降していることが分かり、そこで、造影剤で膨張された閉塞バルーンが静脈からの血流を遮断する。造影剤を含有する注入溶液により、この葉の静脈分岐（点線サークル）が強調して示され得る。該イメージはウイルス注入の直前に獲得されており、選択された肝静脈のバルーン介在閉塞の開存性を示す。
【図３】肝静脈内のバルーンカテーテル（４）の蛍光透視法によるイメージを示す（ＨＶブロック）。第２のバルーン（６）は下大静脈内で膨張される（ＩＶＣブロック）。
【図４】肝臓の静脈排出路を分離するための二重バルーン技法を示す。第１のバルーン（７）は、頸静脈（５）から挿入された後、上大静脈（１）を介して、肝臓まで通される。第２の閉塞バルーン（８）は、下大静脈（１８）から挿入される。第１のバルーン（７）は、肝静脈（３，１０，１１）の上側にある下大静脈の一部を閉塞し、第２のバルーン（８）は、肝静脈（３，１０，１１）の下側にある下大静脈（１８）の一部を閉塞する。第３のカテーテル（９）を用いて治療剤を注入する。
【図５】別の二重バルーン技法を示す。バルーン（１２，１３）を閉塞に用いる。およびカテーテルチップ（１４，１５）の一方または両方にある穴を通じて治療剤が注入できるように、バルーン（１２，１３）の一方または両方を通じて内腔を拡張させてもよい。
【図６】バルーンカテーテルおよびＡｄ２ナイーブウサギを用いて１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを投与した後の、３ｍｌ（Ａ，Ｂ，Ｃ）、８ｍｌ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）または２０ｍｌ（Ｇ，Ｈ，Ｉ）の注入量の関数としての、β−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。免疫組織化学により評価される発現は、注入（葉１）および非注入（葉４）の葉（Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ）の両方について、２匹の注入された動物に典型的な顕微鏡写真により１０×で示される。１葉あたり３コアにおける細菌性β−ガラクトシダーゼの発現を図式的に示す（Ｃ，ＦおよびＩ）；注入された葉に陰影を付ける。数値は、β−ガラクトシダーゼ／ｍｇ蛋白質の相対発光量での発現を示す。簡単にするため、葉に番号を付ける。注入された葉（葉１）は図２で示したマルで囲った葉であることに注意すること。
【図７】Ａｄ２ナイーブウサギ（Ａ，Ｃ，Ｅ）および抗−Ａｄ２抗体含有のヒト血清で受動免疫されたウサギ（Ｂ，Ｄ，Ｆ）に対して８ｍｌの容量で１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを全身投与した後のβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。葉１におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の免疫組織化学的局在性は、２〜３匹の注入された動物に典型的な顕微鏡写真において１０×および４０×で示される。ＥＬＩＳＡにより測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の分布図を、ナイーブ（Ｅ）および受動免疫された（Ｆ）ウサギについて示す（これは全身投与なので葉間の区別はない）。
【図８】バルーンカテーテルおよび８ｍｌの注入量を用いてＡｄ２ナイーブウサギ（Ａ−Ｅ）およびＡｄ２に対して受動免疫されたウサギ（Ｆ−Ｊ）へ１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌを投与した後のβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。免疫組織化学により評価される発現は、注入（葉１；Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｈ）および非注入（葉４；Ｂ，Ｄ，Ｇ，Ｉ）の両方の葉について、３匹の注入されたウサギに典型的な顕微鏡写真において１０×および４０×で示される。ＥＬＩＳＡにより測定された発現を図式的に示す；注入葉に陰影を付ける。数値は、１葉あたり３つの組織コアからのβ−ガラクトシダーゼ（ｐｇ）／蛋白質（μｇ）の単位での平均発現を示す。
【図９】本発明の方法に従ってウイルス性遺伝子治療剤を送達した後の、トランスジーンを発現する肝細胞および非肝細胞の数の定量化を示す。ナイーブウサギ（ＡおよびＤ）または抗−Ａｄ２抗体含有ヒト血清で受動免疫されたウサギ（Ｂ，ＣおよびＥ）へ同容量（８ｍｌ）で同量のウイルス（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌ）を局所（Ａ，ＢおよびＣ）または全身（ＤおよびＥ）送達した後の、各肝葉の１ｍｍ２フィールドあたりのβ−ガラクトシダーゼ陽性肝細胞（黒の棒）および非肝細胞（白の棒）の数のＭｅｔａｍｏｒｐｈ定量。（Ｃ）における動物の注入された葉は、８ｍｌのウイルス投与の直前に２０ｍｌの生理食塩水でフラッシュされた。括弧書きの数値は、各特定の葉内の全β−ｇａｌ陽性細胞のうちのβ−ｇａｌ陽性肝細胞のフラクションを示す。番号１および４の葉は図６〜８に図式的に示したものに対応する（Ａ，Ｂ，ＣおよびＥ，Ｎ＝３０フィールド，Ｄ；Ｎ＝４５フィールド）。
【図１０】バルーンカテーテル介在送達を用いて３匹のナイーブウサギへ肝臓への局所送達により全量８ｍｌで５×１０１２ｄｒｐのＡＡＶ２ＤＣ１９０ＨＡＧＡＬウイルスを投与した後の、８４日間にわたるヒトα−ガラクトシダーゼＡ発現を示す。３匹のウサギのうち２匹では全８４日間にわたって発現を検出し、３匹目のウサギでは、７日目および１４日目の間に発現の検出を開始し、８４日間の残りの時間、発現を検出した。
【図１１Ａ】本発明の方法に従って４分間の滞留時間を用いてナイーブウサギに８ｍｌ容量でＡｄ２βｇａｌウイルス（１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇ）をカテーテルに基づいて局所送達した後の、トランスジーンを発現する全細胞と比較したトランスジーンを発現する肝細胞の比率である、トランスフェクションされた肝細胞フラクションを示す。β−ガラクトシダーゼ陽性肝細胞および非肝細胞の数のＭｅｔａｍｏｒｐｈ定量化を、注入肝葉および非注入肝葉の両方の３セクションにて行った。各棒は、１つの肝臓セクションの肝細胞フラクション［トランスフェクションされた肝細胞／（トランスフェクションされた肝細胞＋トランスフェクションされた非肝細胞）］分析を示す。８−２０および８−２２についての棒は４分間の滞留時間で処置したウサギを示し、一方、４、５および１についての棒は１分間の滞留時間で処置したウサギを示す。これらは、滞留時間を除き同一のプロトコルを用いた先の実験に由来するものである。
【図１１Ｂ】１）４分間の滞留時間（８−２０および８−２２）でのバルーンカテーテルおよび８ｍｌの容量を用いて１．５×１０１２ｖｐ／ｋｇのＡｄ２−βｇａｌをウサギへ投与した後の、ならびに２）１分間の滞留時間（４、５および１）以外は先の実験と同一の条件での、ＥＬＩＳＡにより測定されたβ−ガラクトシダーゼ発現の分布を示す。発現を４つの肝葉、肺、腎臓および脾臓にて測定した。３つの組織コアを各肝葉から採集し、これを用いて発現を測定した；それらは、大静脈への葉肝静脈の入口部に対して葉の近位、中位および遠位であった。ＲＣＰ、ＲＣＭ、ＲＣＤは、各々、近位、中位および遠位の外側右葉（注入葉）を言う。ＲＬＰ、ＲＬＭ、ＲＬＤは、各々、近位、中位および遠位の内側右葉を言う。ＭＰ、ＭＭ、ＭＤは、各々、近位、中位および遠位の内側左葉を言う。ＬＰ、ＬＭ、ＬＤは、各々、近位、中位および遠位の外側左葉を言う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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