(57)【要約】本発明は、細菌感染を処置または予防するための組成物および方法を提供する。Ｌｅｗｉｓb糖質エピトープを発現する遺伝子組換え細胞もまた、本発明によって提供される。１つの局面において、本発明は、第２のポリペプチドに作動可能に結合された第１のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドを提供し、第１のポリペプチドは、ａ）Ｏ−結合型グリカン上で、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化されるか、またはｂ）Ｎ−結合型グリカン上で、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され；そして、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。
2008517073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドに作動可能に結合された第１のポリペプチドを含有する融合ポリペプチドであって、該第１のポリペプチドは、
ａ）Ｏ−結合型グリカン上で、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼ、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってグリコシル化されるか、または
ｂ）Ｎ−結合型グリカン上で、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され；そして
該第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む；
融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドは、ムチンポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の少なくとも１つの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１の細胞外部分を含む、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記第１のポリペプチドは、糖タンパク質である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記糖タンパク質は、Ｎ−結合型グリカンを保有する、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドは、α−１糖タンパク質ポリペプチドである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第１のポリペプチドは、α−１−酸性糖タンパク質の少なくとも１つの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記第２のポリペプチドは、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドは、ダイマーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載の融合ポリペプチドを含む、微生物付着のインヒビター。
【請求項１３】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染の症状の予防または緩和を必要とする被験体において、該Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染の症状を予防または緩和するための方法であって、該方法は、該被験体に、請求項１に記載の融合ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
消化酸疾患もしくは胃腺癌の症状の予防または緩和を必要とする被験体において、該消化酸疾患もしくは胃腺癌の症状を予防または緩和するための方法であって、該方法は、該被験体に、請求項１に記載の融合ポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１５】
前記消化酸疾患は、消化性潰瘍である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞に対する微生物の付着を低下させる方法であって、該方法は、該細胞と請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細胞は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで接触される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物は、細菌、ウイルスまたは真菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、胃粘膜細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
細胞に対する細菌毒素の付着を低下させる方法であって、該方法は、該細胞と請求項１に記載の融合ポリペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記細胞は、胃粘膜細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸構築物；
ｂ）β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸構築物；
ｃ）α１，３／４フコシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸構築物；および
ｄ）α１，２フコシルトランスフェラーゼポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする核酸配列を含む核酸構築物；
を含む遺伝的に改変された細胞であって、該細胞は、Ｌｅｗｉｓ  ｂ（Ｌｅｂ）を発現する、遺伝的に改変された細胞。
【請求項２４】
前記Ｌｅｂ糖質エピトープは、Ｏ−グリカン、Ｎ−グリカンまたは糖脂質において発現される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２６】
前記ポリペプチドは、安定して発現される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２３に記載の細胞の子孫。
【請求項２８】
ａ）請求項２３に記載の細胞と、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ細菌と、試験化合物とを、該細胞と該Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ細菌とが化合物の非存在下で複合体を形成し得る条件下において接触させる工程；および
ｂ）複合体形成の量を決定する工程；
を包含する、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ付着のインヒビターを同定する方法であって、該試験化合物の非存在下と比較した場合の、該試験化合物の存在下における該複合体形成の量の低下は、該化合物がＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ付着のインヒビターであることを示す、方法。
【請求項２９】
ａ）請求項１に記載の細胞と、Ｌｅｂ糖質エピトープ結合因子と、試験化合物とを、該細胞と結合因子とが化合物の非存在下で複合体を形成し得る条件下において接触させる工程；および
ｂ）複合体形成の量を決定する工程；
を包含する、Ｌｅｂ糖質エピトープを結合する化合物を同定する方法であって、該試験化合物の非存在下と比較した場合の、該試験化合物の存在下における該複合体形成の量の低下は、該化合物がＬｅｂ糖質エピトープを結合することを示す、方法。
【請求項３０】
前記Ｌｅｂ糖質エピトープ結合因子は、レクチンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記レクチンは、ＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染を処置または予防するための組成物および方法に関し、そしてより具体的には、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着を媒介する糖質エピトープを含む、融合ポリペプチドおよび細胞株を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒトは、継続的に、異なる病原体（例えば、ウイルスおよび細菌）に曝される。これらの病原体のいくつかは、種特異的であるが、他の病原体は、多様な種にコロニー形成し得、そして感染し得る。病原体の宿主細胞に対する付着は、ほとんどの感染ならびに多くの細菌、ウイルスおよび細菌毒素について必要条件であり、結合は、異なる糖質エピトープを認識し、そしてそれに対して結合するレクチンによって媒介される。現在、細菌感染に対する最も一般的な処置は、種々の抗生物質の使用である；一般的に使用される抗生物質に耐性である病原性株の出現、およびアレルギーを含む有害作用によって複雑にされ得る処置。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ付着およびＨ．Ｐｙｌｏｒｉ感染を媒介する糖質エピトープが、高密度にて、ムチン型タンパク質骨格上の異なるコア糖鎖によって特異的に発現され得るという知見に一部基づく。上記ポリペプチドは、本明細書中で、ＨＰ融合ポリペプチドと称される。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ３）、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）およびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化され、第２のポリペプチドに作動可能に結合された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。必要に応じて、上記第１のポリペプチドは、Ｏ−結合型グリカンを付加するために、β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化される。
【０００５】
上記第１のポリペプチドは、例えば、ムチンポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１またはその部分）である。好ましくは、上記ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である。あるいは、上記第１のポリペプチドは、α糖タンパク質（例えば、α１−酸性糖タンパク質（すなわち、オロソムコイド（ｏｒｏｓｏｍｕｃｉｏｄ）またはＡＧＰ）、またはその部分である。
【０００６】
上記第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。例えば、上記第２のポリペプチドは、重鎖免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域を含む。あるいは、上記第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のＦＣ領域を含む。
【０００７】
上記ＨＰ融合ポリペプチドは、マルチマーである。好ましくは、上記ＨＰ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【０００８】
ＨＰ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびに本明細書中に記載されるＨＰ融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、本明細書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞もまた、本発明に含まれる。あるいは、上記ベクターは、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ３）をコードする核酸、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）をコードする核酸およびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む。必要に応じて、上記ベクターは、β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は、細菌または細菌毒素の細胞に対する付着を阻害する（例えば、低下させる）方法を提供する。付着は、上記細胞と上記ＨＰ融合ポリペプチドとを接触させることによって阻害される。上記細胞は、インビボ、インビトロまたはエキソビボで接触される。この細胞は、例えば、胃細胞である。本発明はまた、細菌感染に罹患しているかまたは細菌感染を発症する危険性がある被験体を同定し、そしてその被験体にＨＰ融合ポリペプチドを投与することによって、この被験体において、微生物感染の症状または微生物感染に関連する障害を予防または緩和する方法を特徴とする。上記細菌は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである。
【００１０】
上記被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）である。上記被験体は、細菌感染または細菌感染に関連する障害に罹患しているかまたは細菌感染または細菌感染に関連する障害を発症する危険性がある。細菌感染または細菌感染に関連する障害に罹患しているかまたはこれらを発症する危険性がある被験体は、当該分野で公知の方法（例えば、組織の目視試験、または組織もしくは血液に関連する微生物のコロニー形成の検出）によって同定される。微生物感染または微生物感染に関連する障害の症状としては、異常な疼痛、吐き気または嘔吐が挙げられる。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのような細菌感染または細菌感染に関連する障害に罹患している被験体は、当該分野で公知の血液、息または便の試験で同定される。
【００１１】
ＨＰ融合ポリペプチドを含む薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。
【００１２】
本発明は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着を媒介する糖質エピトープ（例えば、Ｌｅｂ）を発現する遺伝的に改変された細胞および細胞培養物を、さらに提供する。上記細胞は、本明細書中で「ＬＢＣ」細胞と称される。上記細胞は、β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子（βＧｎ−Ｔ６）をコードする核酸、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（β３Ｇａｌ−Ｔ５）遺伝子をコードする核酸、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｆｕｃ−Ｔ３）をコードする核酸およびα１，２フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦｕｃＴ−２）をコードする核酸によって遺伝的に改変される。
【００１３】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ相互作用のインヒビターまたはエンハンサーは、ＬＢＣと、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌と、試験化合物とを、ＬＢＣとＨ．ｐｙｌｏｒｉ細菌とが複合体を形成し得る条件下において接触させることによって同定され、そしてその複合体形成の量が、決定される。上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の低下は、その試験化合物がＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着のインヒビターであることを示す。対照的に、上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の増加は、その試験化合物がＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着のエンハンサーであることを示す。
【００１４】
本発明はまた、ＬＢＣとＬｅｂエピトープ結合因子とを接触させ（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌と試験薬剤とを接触させる）、そしてその薬剤がそのＬＢＣを結合する（例えば、複合体を形成する）か否かを決定することによってＬｅｂ糖質エピトープを結合する薬剤を同定する方法を、提供する。上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の低下は、試験化合物が、Ｌｅｂ糖質エピトープを結合することを示す。
【００１５】
本発明はまた、これらのスクリーニング方法によって同定される調節因子化合物、およびこの調節因子を含む薬学的組成物を含む。
【００１６】
特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと同様かまたは同じ方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が、支配する。さらに、この材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず、限定することを意図しない。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏ  Ｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）付着を媒介する糖質エピトープが、糖タンパク質（例えば、ムチン型糖タンパク質およびα糖タンパク質）のタンパク質骨格上で、高密度にて特異的に発現され得るという知見に一部基づく。このより高密度の糖質エピトープは、一価のオリゴ糖と比較して、増加した原子価および増加した親和性を生じる。本発明は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着を媒介する糖質エピトープを発現し、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着を阻害する化合物を同定するのに有用である遺伝的に改変された細胞をさらに提供する。
【００１９】
糖質抗原（シアリルＬｅｗｉｓ（ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ）（例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂａ、Ｌｅｘ、Ｌｅｙ））は、細胞付着分子に対するリガンドである。ヒトの胃病原体であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉは、Ｌｅｗｉｓ抗原またはそれらの表面のリポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ−抗原を発現する。
【００２０】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、世界の半分を超える人口に存在するグラム陰性菌である。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、胃粘膜に存在するか、または胃を内張りする（ｌｉｎｅ）上皮細胞に存在する。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、消化性潰瘍疾患、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）のリンパ腫および胃腺癌の発症に関連する。全ての感染した患者が胃癌を発症しない理由は、未知である。異なる複合糖質に対するＨ．ｐｙｌｏｒｉの結合特性は、広範に研究されており、そして多くの結合特異性が、同定されている。これらのうちの２つは、糖質エピトープである、Ｌｅｗｉｓ（Ｌｅ）ｂおよびシアリル−Ｌｅｗｉｓ（Ｌｅ）ｘである。
【００２１】
その宿主にコロニー形成するために、細菌は、上皮に接着する必要がある。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに対する多くの異なるレセプターが、記載されている。それらのレセプターのほとんどが、糖質であり、そして２つ（Ｌｅｗｉｓ  Ｂ（Ｌｅｂ）およびシアリル−Ｌｅｗｉｓ  Ｘ（ＳＬｅｘ）が、特に重要であると考えられる。この接着を媒介する付着因子である、ＢａｂＡ（１）およびＳａｂＡ（２）は、それぞれ、最近クローニングされた。Ｌｅｂに結合するＨ．ｐｙｌｏｒｉの能力が、悪性疾患の発症に関する主要な危険因子であり（３〜５）、そしてＳＬｅｘに対する結合と胃癌との間の相関関係が、示唆されている（２）。数種のモデルは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの接着を研究するために使用されている。１つの成功したストラテジーは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる感染に対して通常は罹患しにくいマウスにおいて、その糖質レセプターを操作することであった。このモデルにおいて、Ｌｅｂに対する結合は、接着する細菌の数を増大させないが、炎症の重症度を増大させることが、示された（６）。
【００２２】
微生物付着の糖質ベースのインヒビターを感染症を処置および／または予防する手段として使用することが、積年の一般的な見解であった。しかし、現在、このストラテジーは、ヒトの臨床試験において、不十分であると証明されている。糖質ベースの一価インヒビターの効力の欠如に関する有力な説明は、糖質リガンドがそのレセプターを結合する通常は低い親和性である。
【００２３】
対照的に、本発明は、ムチンベースの組換えタンパク質およびα１−酸性糖タンパク質ベースの組換えタンパク質を提供し、これらの組換えタンパク質は、それぞれ、Ｏ−結合型グリカン上の血液型ＬｅｂエピトープおよびＮ−結合型グリカン上の血液型Ｌｅｂエピトープによって多く置換される。さらに、本発明は、一価の糖質インヒビターを用いる先の研究とは異なり、規定された糖質結合特異性を有するＨ．ｐｙｌｏｒｉ株が、本発明の一価Ｌｅｂ置換型タンパク質に付着することを示す。
【００２４】
さらに、現在、インビトロでの付着研究のために、規定された糖質（例えば、Ｌｅｗｉｓ  ｂ（Ｌｅｂ））に対して所望の特性を有する利用可能な細胞株は、存在しない。ＨＴ−２９、ＡＧＳ、Ｋａｔｏ  ＩＩＩ、ＨｕＴｕ−８０およびＨｅｐ−２は、全て、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを用いた付着実験に使用されている細胞である。Ｔａｋａｈａｓｈｉらによる最近の報告（７）は、ムチンを発現するように作製されたマウス胃細胞株の、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉについてのモデル系としての使用を記載した。しかし、これら全ての細胞株は、それらの糖質の表現型に関して、あまり特徴付けられていない。さらに、胃腸由来の細胞株はまた、膜結合型および分泌型の両方の内因性ムチンを発現し、この内因性ムチンは、この細胞株を、可能なレセプターの概観を得ることについて、より難しくする。したがって、インビトロＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着研究のため、ならびに細菌付着および細菌感染のインヒビターを同定するための安定な細胞株に対する必要性が、存在する。したがって、さらなる局面において、本発明は、上記糖質抗原Ｌｅｂを発現する遺伝的に改変された細胞を提供する。
【００２５】
本発明は、β３Ｇａｌ−Ｔ５、βＧｎ−Ｔ６、Ｆｕｃ−Ｔ３およびＦｕｃＴ−２を安定して発現することにより、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において、Ｌｅｂを、Ｏ−グリカン、Ｎ−グリカンおよび糖脂質上に作製することが可能であることを示す。さらに、規定されたＨ．ｐｙｌｏｒｉ株を使用して、上記細胞に対するＨ．ｐｙｌｏｒｉ接着がＢａｂＡ特異的であること、およびそのＨ．ｐｙｌｏｒｉ接着がＬｅｂを必要とすることが、示された。Ｌｅｂを発現する細胞は、異なる組換えタンパク質の一過性の発現によって示されるように、上記エピトープを保有する組換えタンパク質を産生するため、および例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを用いた付着実験のために使用され得る。興味深いことに、１つのクローンである１Ｃ５は、ＬｅｂをＯ−グリカン上に発現するが、ＬｅｂをＮ−グリカンまたは糖脂質上に発現しない。その他のクローンである２Ｃ２は、ＬｅｂをＯ−グリカンおよびＮ−グリカンならびに糖脂質上に発現する。上記２つのＬｅｂ発現クローン（１Ｃ５はＬｅＹを発現しないのに対し、２Ｃ２はＬｅＹを発現する）の間の細胞表面の染色における興味深い違いもまた、存在する。グリカンのレパートリーにおけるこれらの違いにもかかわらず、これらのクローンの間でＨ．ｐｙｌｏｒｉの付着性に関して明確な違いは、検出されなかった。これらの細胞は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ接着に対する宿主細胞の応答および細菌の応答における、分子生物学的研究ならびに細胞生物学的研究のためのインビトロモデルとして有用である。
【００２６】
本発明は、複数のシアリル−Ｌｅｗｉｓエピトープを含む糖タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書中では、「ＨＰ融合タンパク質またはＨＰ融合ペプチド」と称される）を提供し、これは、細菌または細菌毒素と、細胞との間の付着相互作用をブロック（すなわち、阻害）する際に有用である。好ましくは、上記ＨＰ融合タンパク質は、Ｌｅｂエピトープを含む。上記ＨＰ融合タンパク質は、細胞に対する細菌または毒素の付着の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％を阻害する。例えば、上記ＨＰ融合タンパク質は、胃粘膜に対するＨ．ｐｙｌｏｒｉの付着を阻害する際に有用である。
【００２７】
上記ＨＰ融合ペプチドは、野生型シアリル−Ｌｅの遊離糖類と比較した場合、微生物または毒素の付着を阻害する際に、糖質分子を基準にして、より有効である。上記ＨＰ融合ペプチドは、等量の野生型シアリル−Ｌｅ決定基の遊離糖類と比較した場合、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍またはそれ以上の数の細菌または細菌毒素を阻害する。
【００２８】
本発明のＨＰ融合タンパク質は、シアリルＬｅｗｉｓ抗原に対して特異的なエピトープを保有する。例えば、上記ＨＰ融合タンパク質は、Ｌｅａエピトープ、Ｌｅｂエピトープ、ＬｅｘエピトープまたはＬｅｙエピトープのいずれかを保有する。好ましくは、ＨＰ融合タンパク質は、Ｌｅｂエピトープを保有する。あるいは、ＨＰ融合体は、２つのシアリルＬｅｗｉｓ抗原を保有する。例えば、ＨＰ融合タンパク質は、ＬｅｘエピトープおよびＬｅｂエピトープの両方を保有する。あるいは、ＨＰ融合タンパク質は、４種全てのエピトープ（すなわち、Ａ、Ｂ、ＸおよびＹ）を保有する。これらのシアリルＬｅｗｉｓ抗原は、Ｏ−結合される。あるいは、これらのシアリルＬｅｗｉｓ抗原は、Ｎ−結合される。必要に応じて、上記融合タンパク質は、Ｏ−結合されたシアリルＬｅｗｉｓ抗原およびＮ−結合されたシアリルＬｅｗｉｓ抗原を含む。
【００２９】
（融合ポリペプチド）
種々の局面において、本発明は、糖タンパク質の少なくとも一部（例えば、ムチンポリペプチドまたはα−グロブリンポリペプチド）を含み、第２のポリペプチドに作動可能に結合された、第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、非ムチンポリペプチドに作動可能に結合された糖タンパク質ポリペプチドの少なくとも一部を含む。
【００３０】
「ムチンポリペプチド」とは、ムチンドメインを有するポリペプチドをいう。上記ムチンポリペプチドは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個またはそれ以上のムチンドメインを有する。上記ムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換されたアミノ酸配列によって特徴付けられる任意の糖タンパク質である。例えば、ムチンポリペプチドは、２個おきのアミノ酸もしくは３個おきのアミノ酸がセリンまたはスレオニンであるアミノ酸を有する。上記ムチンポリペプチドは、分泌タンパク質である。あるいは、上記ムチンポリペプチドは、細胞表面タンパク質である。
【００３１】
ムチンドメインは、スレオニン、セリンおよびプロリンのアミノ酸が豊富であり、それらのアミノ酸において、オリゴ糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸に結合する（Ｏ−グリカン）。ムチンドメインは、Ｏ−結合型グリコシル化部位を含むか、あるいはＯ−結合型グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１、２、３、５、１０、２０、５０、１００またはそれ以上のＯ−結合型グリコシル化部位を有する。あるいは、上記ムチンドメインは、Ｎ−結合型グリコシル化部位を含むか、あるいはＮ−結合型グリコシル化部位からなる。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンに起因する。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３など）によってコードされる任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ、または赤血球細胞グリコホリンである。好ましくは、上記ムチンは、ＰＳＧＬ−１である。
【００３２】
「α−グロブリンポリペプチド」とは、血清糖タンパク質をいう。α−グロブリンとしては、例えば、肺および肝臓により生成される酵素、ならびにハプトグロビン（これは、ヘモグロビンに一緒に結合する）が挙げられる。α−グロブリンは、α１グロブリンまたはα２グロブリンである。α１グロブリンは、大部分は、α１アンチトリプシン（肺および肝臓によって生成される酵素）である。α２グロブリン（これは、血清ハプトグロビンを含む）は、ヘモグロビンを結合して、腎臓によるその排泄を防止するタンパク質である。他のαグロブリンは、炎症、組織損傷、自己免疫疾患または特定の癌の結果として生成される。好ましくは、α−グロブリンは、α−１酸糖タンパク質（すなわち、オロソムコイド）である。
【００３３】
「非ムチンポリペプチド」とは、その質量の少なくとも４０％未満がグルカンに起因するポリペプチドをいう。
【００３４】
本発明のＨＰ融合タンパク質において、上記ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全てまたは一部に対応する。ＨＰ融合タンパク質は、ムチンタンパク質の少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」とは、ムチンポリペプチドが、少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ結合型グリコシル化部位）を含むことを意味する。上記ムチンタンパク質は、上記ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、上記ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００３５】
αグロブリンポリペプチドは、αグロブリンポリペプチドの全てまたは一部に対応し得る。ＨＰ融合タンパク質は、αグロブリンポリペプチドの少なくとも一部を含む。「少なくとも一部」とは、αグロブリンポリペプチドが少なくとも１つのＮ−結合型グリコシル化部位を含むことを意味する。
【００３６】
上記第１のポリペプチドは、１つ以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。上記第１のポリペプチドは、２個、３個、５個またはそれ以上の血液型トランスフェラーゼによってグリコシル化される。グリコシル化は、連続的または継続的である。あるいは、グリコシル化は、同時またはランダム（すなわち、特定の順序がない）である。例えば、第１のポリペプチドは、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ３）、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ２）およびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。必要に応じて、第１のポリペプチドは、Ｏ−結合型グリカンを付加するために、β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化される。
【００３７】
α１，３／４フコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびα，３／４フコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００１４０およびＮＭ＿０００１４９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ１３９４１およびＤ８９３２４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ１３９４２およびＤ８９３２５が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３８】
α１，２フコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびα１，２フコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５０２およびＮＭ＿０００５１１が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００３９】
β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５８５８４およびＮＭ＿０１６８８８が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４０】
β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼポリペプチドおよびβ１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５３２７８およびＮＭ＿１４４６７７、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９４５１９３およびＮＭ＿１９８９５５が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４１】
上記第１のポリペプチドは、ネイティブ（すなわち、野生型）のポリペプチドより多くグリコシル化される。上記第１のポリペプチドは、その質量の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％より多くが糖質に起因する。
【００４２】
上記融合タンパク質において、用語「作動可能に結合された」とは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、第１のポリペプチドのＯ−結合型グリコシル化および／またはＮ−結合型グリコシル化を可能にする様式で、（最も代表的には、ペプチド結合のような共有結合を介して）化学的に結合されていること示すことを意図する。融合ポリペプチドをコードする核酸を言及するために使用される場合、用語「作動可能に結合された」とは、ムチンまたはαグロブリンポリペプチドをコードする核酸および非ムチンポリペプチドをコードする核酸が、互いにインフレームで融合されていることを意味する。上記非ムチンポリペプチドは、ムチンもしくはαグロブリンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００４３】
上記ＨＰ融合タンパク質は、１つ以上のさらなる部分に結合される。例えば、上記ＨＰ融合タンパク質は、ＧＳＴ融合タンパク質にさらに結合され得、ここで、上記ＨＰ融合タンパク質の配列は、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、上記ＨＰ融合タンパク質の精製を容易にし得る。あるいは、上記ＨＰ融合タンパク質は、固体支持体にさらに結合され得る。種々の固体支持体が、当業者に公知である。このような組成物は、抗血液型抗体の除去を容易にする。例えば、上記ＨＰ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料から作製される粒子；マイクロタイタープレート；ニトロセルロースもしくはナイロン、またはそれらの組み合わせに結合される。固体支持体に結合された上記ＨＰ融合タンパク質は、生物学的サンプル（例えば、胃組織、血液または血漿）から微生物または細菌毒素を除去するための吸収体として使用される。
【００４４】
上記融合タンパク質は、異種シグナル配列（すなわち、ムチン核酸またはグロブリン核酸によってコードされるポリペプチドに存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。例えば、ムチンまたはα−糖タンパク質のネイティブのシグナル配列は、除去され、そして別のタンパク質由来のシグナル配列と置換される。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ポリペプチドの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用によって増加され得る。
【００４５】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端またはスタガー末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ  ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合、付着末端の充填、所望しない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを用いることによって、一緒にインフレームで結合される。上記融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成される。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が、２つの連続した遺伝子フラグメント（これは後に、キメラ遺伝子配列を生成するように、アニーリングされそして再増幅され得る）の間の相補オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを使用して実施される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ムチンをコードする核酸またはα−グロブリンをコードする核酸は、このような発現ベクターにクローニングされ得、その結果、この融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで結合される。
【００４６】
ＨＰ融合ポリペプチドは、オリゴマー（例えば、ダイマー、トリマーまたはペンタマー）として存在し得る。好ましくは、ＨＰ融合ポリペプチドは、ダイマーである。
【００４７】
上記第１のポリペプチド、および／または第１のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知のムチンコード配列またはα−グロブリンコード配列を用いて構築される。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。α−グロブリンポリペプチドおよびα−グロブリンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、ぞれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ２６２３８およびＢＣ０２６２３８；ＮＰ０００５９８；ならびにＢＣ０１２７２５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ１２７２５およびＢＣ０１２７２５、ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ４４５７０およびＮＭ０５３２８８が挙げられ、そしてこれらは、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
上記ムチンポリペプチド部分は、増大した糖質含量（非変異配列と比較して）をもたらす、天然に存在するムチン配列（野生型）における変異を有する改変体ムチンポリペプチドとして提供される。例えば、上記改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して、さらなるＯ−結合型グリコシル化部位を含む。あるいは、上記改変体ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較して、増大した数のセリン残基、スレオニン残基、またはプロリン残基を生じるアミノ酸配列変異を含む。この増大した糖質含量は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質：糖質の比を決定することによって評価され得る。
【００４９】
同様に、上記α−グロブリンポリペプチド部分は、増大した糖質含量（非変異配列と比較して）をもたらす、天然に存在するα−グロブリン配列（野生型）における変異を有する、改変体α−グロブリンポリペプチドとして提供される。例えば、上記改変体α−グロブリンポリペプチドは、野生型α−グロブリンと比較して、さらなるＮ−結合型グリコシル化部位を含んだ。
【００５０】
あるいは、上記ムチンポリペプチド部分またはα−グロブリンポリペプチド部分は、タンパク質分解に対する、より耐性（非変異配列と比較して）のムチン配列またはα−グロブリン配列をもたらす、天然に存在するムチン配列（野生型）または天然に存在するα−グロブリン配列（野生型）における変異を有する改変体ムチンポリペプチドまたは改変体α−グロブリンポリペプチドとして提供される。
【００５１】
上記第１のポリペプチドは、全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、上記第１のポリペプチドは、全長未満のＰＳＧＬ−１ポリペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分）を含む。例えば、上記第１のポリペプチドは、４００未満のアミノ酸長（例えば、３００アミノ酸長、２５０アミノ酸長、１５０アミノ酸長、１００アミノ酸長、５０アミノ酸長、または２５アミノ酸長以下）である。
【００５２】
上記第１のポリペプチドは、全長α酸性−グロブリンを含む。あるいは、上記第１のポリペプチドは、全長未満のα酸性グロブリンポリペプチドを含む。例えば、上記第１のポリペプチドは、２００未満のアミノ酸長（例えば、１５０アミノ酸長、１００アミノ酸長、５０アミノ酸長または２５アミノ酸長以下）である。
【００５３】
上記第２のポリペプチドは、好ましくは可溶性である。いくつかの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、上記ＨＰ融合ポリペプチドと、第２のムチンポリペプチドまたは第２のαグロブリンポリペプチドとの結合を容易にする配列を含む。上記第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも１つの領域を含む。「少なくとも１つの領域」とは、免疫グロブリン分子の任意の部分（例えば、軽鎖、重鎖、ＦＣ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意のフラグメント）を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第５，５１６，９６４号；同第５，２２５，５３８号；同第５，４２８，１３０号；同第５，５１４，５８２号；同第５，７１４，１４７号；および同第５，４５５，１６５号に記載される。
【００５４】
上記第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、上記第２のポリペプチドは、全長未満の免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ＦｖまたはＦｃ）を含む。好ましくは、上記第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含む。より好ましくは、上記第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含む。
【００５５】
上記第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能より低いエフェクター機能を有する。あるいは、上記第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と同様か、またはより大きいエフェクター機能を有する。Ｆｃエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃレセプター結合、補体結合およびＴ細胞枯渇活性が挙げられる（例えば、米国特許第６，１３６，３１０号を参照のこと）。Ｔ細胞枯渇活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態において、上記第２のポリペプチドは、Ｆｃレセプターに対して低い親和性を有するか、または全く親和性を有さない。あるいは、上記第２のポリペプチドは、補体タンパク質Ｃ１ｑに対して低い親和性を有するか、または全く親和性を有さない。
【００５６】
本発明の別の局面は、ムチンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。そのベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸に作動可能に結合された、ムチンポリペプチドまたはαグロブリンポリペプチドをコードする核酸を含む。さらに、そのベクターは、α１，３フコシルトランスフェラーゼのような血液型トランスフェラーゼをコードする核酸を含む。この血液型トランスフェラーゼは、ＨＰ融合タンパク質のムチン部分またはα−グロブリン部分のペプチド骨格上のシアリルＬｅｗｉｓ決定基の付加を促進する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、別の核酸（これに対してそのベクターが結合される）を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、プラスミドとは、さらなるＤＮＡセグメントが結合され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントは、そのウイルスゲノムに結合される。特定のベクターは、これが導入される宿主細胞において自己複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞に導入される際に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に結合される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるので、交換可能に使用される。しかし、本発明は、等価な機能を提供する、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００５７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これは、発現される核酸配列に作動可能に結合されることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に結合される」とは、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞内に導入される場合には宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、その目的のヌクレオチド配列が、調節配列に結合されることを意味することが意図される。
【００５８】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＺＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載される。調節配列は、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるものおよび特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を方向付けるもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより本明細書中に記載されるような核酸によりコードされる融合タンパク質もしくは融合ペプチド（例えば、ＨＰ融合ポリペプチド、ＨＰ融合ポリペプチドの変異形態など）を含むタンパク質またはペプチドを産生し得る。
【００５９】
本発明の組換え発現ベクターが、原核細胞または真核細胞におけるＨＰ融合ポリペプチドの発現のために設計され得る。例えば、ＨＰ融合ポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）でさらに考察される。あるいは、上記組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写かつ翻訳され得る。
【００６０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそのベクター中にコードされるタンパク質に（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に）加える。このような融合ベクターは、代表的に、３つの目的に寄与する：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大するため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を上昇させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部において導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にし、その後、融合タンパク質の精製が続く。このような酵素およびその同族認識配列（ｃｏｇｎａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、標的の組換えタンパク質に対し、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【００６１】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【００６２】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大にする１つのストラテジーは、タンパク質分解的に組換えタンパク質を切断する能力が損なわれた宿主細菌においてタンパク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変え、それによって各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンとなるようにすることである（例えば、Ｗａｄａら，１９９２．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。このような本発明の核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【００６３】
ＨＰ融合ポリペプチド発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，１９８７．Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００６４】
あるいは、ＨＰ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞において発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現のための利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が挙げられる。
【００６５】
本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，１９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方についての他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【００６６】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、相互交換可能に使用される。このような用語は、特定の目的細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解される。続く産生において、変異または環境的影響のいずれかに起因して特定の改変が起こり得るので、実際には、このような子孫は、親細胞と同一でない場合があるが、なおも、本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００６７】
宿主細胞は、任意の原核細胞または任意の真核細胞であり得る。例えば、ＨＰ融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００６８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術または従来のトランスフェクション技術を介して、原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）の宿主細胞への導入のための、分野で認められた（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）種々の技術をいうことを意図する。これらの技術としては、リン酸カルシウム共沈殿または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトするための適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の研究室マニュアルにおいて見出され得る。
【００６９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクト技術に依存して、細胞の小さい画分のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組込み得ることが公知である。これらの組込み物を同定し、選択するために、一般的に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）に対する耐性を与える選択マーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸が、上記融合ポリペプチドをコードする同一のベクターにより宿主細胞に導入され得るかまたは別個のベクターにより導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞が、生存するのに対して、他の細胞は死滅する）により同定され得る。
【００７０】
本発明の宿主細胞（例えば、培養された原核宿主細胞または真核宿主細胞）は、ＨＰ融合ポリペプチドを産生する（すなわち、発現する）ために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＨＰ融合ポリペプチドを産生する方法を提供する。１つの実施形態において、その方法は、ＨＰ融合ポリペプチドが産生されるような、適した培地中での本発明の宿主細胞（ＨＰ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）の培養を包含する。別の実施形態において、その方法はさらに、培地または宿主細胞からのＨＰ融合ポリペプチドの単離を包含する。
【００７１】
上記ＨＰ融合ポリペプチドは、従来の条件（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など）に従って単離され得、そして精製され得る。例えば、上記免疫グロブリン融合タンパク質は、溶液を、固定化したプロテインＡまたはプロテインＧ（これらは、この融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結合する）を含むカラムに通すことによって精製され得る。例えば、Ｒｅｉｓ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３０９８〜３１０２（１９８４）；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照のこと。上記融合ポリペプチドは、カオトロピック塩を用いた処理、または酢酸水溶液（１Ｍ）を用いた溶出により溶出され得る。
【００７２】
あるいは、本発明に従うＨＰ融合ポリペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して化学的に合成され得る。種々のタンパク質合成方法が、当該分野で一般的であり、その方法としては、ペプチド合成機を使用する合成が挙げられる。ポリペプチドの化学的合成は、例えば、以下に記載される。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９８；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：２４１〜２４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：７０５〜７３９（１９８７）；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７〜９８９（１９８８）およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１８７〜１９８（１９８９）を参照のこと。上記ポリペプチドは、標準的なペプチド精製技術を使用して、それらのポリペプチドが化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように精製される。用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からそのペプチドが分けられるペプチドの調製を含む。１つの実施形態において、用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、約３０％未満（乾燥重量による）の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、よりさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチドの調製を含む。
【００７３】
ポリペプチドの化学合成は、改変されたアミノ酸またはＤ―アミノ酸を含む非天然のアミノ酸および他の小さな有機分子の取り込みを促進する。ペプチド中の１つ以上のＬ−アミノ酸の対応するＤ−アミノ酸アイソフォームによる置換は、酵素的加水分解に対するペプチドの抵抗性を増加させるため、および生物学的に活性なペプチドの１つ以上の特性（すなわち、レセプターの結合、機能的な潜在性または作用の持続性）を増強するために使用され得る。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら，１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２５８５−２５９４；Ｋｉｒｂｙら，１９９３．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８０２−３８０８；Ｍｏｒｉｔａら，１９９４．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：８４−８８；Ｗａｎｇら，１９９３．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４２：３９２−３９９；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ，１９９２．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２３：１２７−１５９を参照のこと。
【００７４】
ペプチド配列の中への共有結合性架橋の導入は、立体配置的かつトポグラフィックにそのポリペプチド骨格を束縛し得る。このストラテジーは、増加した潜在性、増加した選択性および増加した安定性を備える上記融合ポリペプチドのペプチドアナログを開発するために使用され得る。環状ペプチドの立体配置的エントロピーがその線形の対応物より低いので、特異的な立体配置の受け入れは、非環状アナログより環状アナログに対するエントロピーにおいて、より小さな減少が生じ得、それにより、より好まれる結合のための自由エネルギーを生じる。大環状化は、ペプチドのＮ末端とペプチドのＣ末端との間のアミド結合の形成、および側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間のアミド結合の形成（例えば、ｐＨ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６による）（Ｓａｍｓｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７：５１８２−５１８５（１９９６））、あるいは２つのアミノ酸側鎖間のアミド結合の形成によりしばしば遂行される。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３９：５１−１２４（１９８８）を参照のこと。ジスルフィド架橋もまた、それらの柔軟性を減少させるために線形配列へ導入される。例えば、Ｒｏｓｅら，Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ，３７：１−１０９（１９８５）；Ｍｏｓｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１０６：５０５−５１２（１９８２）を参照のこと。さらに、システイン残基のペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）による置換は、いくつかのオピオイド−受容体相互作用の選択性を増加させるために使用された。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｇｕｔｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．２８７−３２０（１９９５）。
【００７５】
（細菌付着を低下させる方法）
細菌または細菌毒素の細胞への付着は、組織または細胞と本発明のＨＰ融合ペプチドとを接触させることによって阻害される（例えば、低下する）。あるいは、付着は、ＨＰ融合ペプチドをコードする核酸を細胞に導入することによって阻害される。微生物は、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌である。細菌は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉである。処置される組織としては、腸組織、心臓組織、肺組織、真皮組織、または肝臓組織が挙げられる。例えば、上記組織は、胃粘膜組織である。細胞としては、例えば、胃細胞、心臓細胞または肺細胞が挙げられる。
【００７６】
付着の阻害は、罹患組織の細菌のコロニー形成の低下によって特徴付けられる。組織または細胞は、ＨＰペプチドと直接接触される。あるいは、インヒビターが、被験体に全身投与される。ＨＰペプチドは、細菌付着を低下させる（例えば、阻害する）のに十分な量で投与される。あるいは、付着は、当該分野で公知の標準的な付着アッセイを使用して測定される。
【００７７】
上記方法は、種々の微生物感染または微生物感染に関連する疾患の症状を緩和するのに有用である。この微生物感染は、例えば、細菌感染、ウイルス感染または真菌感染である。細菌感染は、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染である。微生物感染（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染）に関連する疾患としては、例えば、消化酸疾患（例えば、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、胃萎縮、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺癌）が挙げられる。
【００７８】
本明細書中に記載される方法は、本明細書中に記載されるような微生物感染または障害の１つ以上の症状の重篤度の減少またはこの症状の緩和をもたらす。微生物感染または微生物感染に関連する障害は、代表的には、標準的な方法を使用して医師によって、診断され、そして／またはモニタリングされる。
【００７９】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染に関連する障害の症状としては、例えば、異常な不快さ、体重減少、食欲不振、鼓脹、げっぷ、吐き気または嘔吐が挙げられる。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染は、血液、息、便および組織の試験を使用して診断される。潰瘍は、例えば、上部ＧＩシリーズまたは内視鏡で診断される。胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺癌は、例えば、生検によって組織病理学的に診断される。
【００８０】
上記被験体は、例えば、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）である。上記処置は、微生物感染または障害の診断の前に施される。あるいは、処置は、被験体が感染を有した後に施される。
【００８１】
処置の有効性は、特定の細菌感染または微生物感染に関連する障害を診断または処置するための任意の公知の方法と関連して決定される。微生物感染または障害の１つ以上の症状の緩和は、上記化合物が臨床的利益を与えることを示す。
【００８２】
（ＨＰ融合ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む薬学的組成物）
本発明のＨＰ融合タンパク質またはこれらの融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書中で、「治療剤」または「活性化合物」と称される）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適切な薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、上記核酸分子、タンパク質、または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、医薬投与に適合性の、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適切なキャリアは、当該分野で標準的な参考テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。このようなキャリアおよび希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた使用され得る。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化  合物と適合性である限り、上記組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物もまた、上記組成物に組み込まれ得る。
【００８３】
本明細書中に開示される活性剤はまた、リポソームとして処方され得る。リポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される方法）によって調製される。増大した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【００８４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成を用いて、逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するために、規定された孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【００８５】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈、皮内、皮下）、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（例えば、局所）、経粘膜投与および経腸投与が挙げられる。非経口適用、経皮適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）；および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアル中に入れられ得る。
【００８６】
注射用用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、滅菌キャリアとしては、生理食塩水、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、上記組成物は、無菌であり、かつ容易にシリンジ中に（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）存在する程度まで、流動性でなければならない。その組成物は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒または分散媒体であり、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤を使用すること、必要な粒径を維持すること（分散液の場合）、および界面活性剤を使用することによって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、上記組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。上記注射用組成物の延長した吸収は、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによってもたらされ得る。
【００８７】
滅菌注射用溶液は、上記活性化合物（例えば、ＨＰ融合タンパク質）を必要な量で、必要に応じて上記の成分の１つまたは組み合わせと共に、組込み、次いで滅菌濾過することによって、調製され得る。一般に、分散液は、上記活性化合物を滅菌ビヒクル（これは基本的な分散媒体および必要な上記の他の成分を含む）に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは上記活性成分と、その予め滅菌濾過した溶液由来の任意のさらなる所望の成分とを生じ得る。
【００８８】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。その組成物は、ゼラチンカプセルに封入されても、錠剤に圧縮されてもよい。治療的経口投与の目的のために、上記活性化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、そして錠剤、トローチまたはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体キャリアを使用して調製され得、ここでこの流体キャリア中の化合物は、経口適用され、そしてうがいされ、そして吐き出されるかまたは嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料は、上記組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の任意の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたは乳糖）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバー）。
【００８９】
吸入による投与について、上記化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）またはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００９０】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。例えば、経粘膜投与または経皮投与について、透過されるべきバリアに適切な透過剤が、処方物に使用される。このような透過剤は一般に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与については、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフジシン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与について、上記活性化合物は、当該分野で周知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔまたはｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームに処方される。
【００９１】
これらの化合物はまた、坐剤（例えば、従来の坐剤基剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリド）を用いて）、または腸送達のための保持浣腸剤の形態で調製され得る。
【００９２】
上記活性化合物は、化合物が身体から迅速に排泄されるのを防ぐキャリアを用いて調製される（例えば、移植物および微小カプセル化送達システムを含む制御放出処方物、）。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酪酸）が使用され得る。このような処方物を調製するための方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法）に従って調製され得る。
【００９３】
経口組成物または非経口組成物は、容易な投与および投薬量の一貫性のための投薬単位形態で処方される。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置される被験体の単位投薬量として適した物理的に別個の単位をいう；各々の単位は、必要な薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための仕様書は、上記活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体を処置するための活性化合物のような化合物の当該分野における固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【００９４】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。上記遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリクスを含み得る。あるいは、完全遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、上記薬学的調製物は、遺伝子送達系を生じる１つ以上の細胞を含み得る。
【００９５】
持続放出性調製物が、所望の場合、調製され得る。持続放出性調製物の適切な例としては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア））およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間にわたる分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。
【００９６】
上記薬学的組成物は、容器、パックまたはディスペンサー中に、投与のための指示書と共に含まれ得る。
【００９７】
（Ｌｅｂ発現細胞）
本発明は、遺伝的に改変されたＬｅｂ発現細胞（本明細書中でＬＢＣと称される）を提供する。
【００９８】
用語「遺伝的な改変」とは、外因性ＤＮＡの意図的な導入によるＬＢＣの遺伝子型の、安定した変化または一過性の変化をいう。ＤＮＡは、合成であっても、天然に由来してもよく、そしてそのＤＮＡは、遺伝子、遺伝子の部分、または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝的な改変」とは、天然のウイルス活性、天然の遺伝的組換えなどによって生じるような、天然に存在する変化を含むことを意味しない。
【００９９】
上記細胞は、β１，３，Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子（βＧｎ−Ｔ６）をコードする核酸、β１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（β３Ｇａｌ−Ｔ５）遺伝子をコードする核酸、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｆｕｃ−Ｔ３）をコードする核酸およびα１，２フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦｕｃＴ−２）をコードする核酸を用いて遺伝的に改変される。適切な供給源またはこれらの遺伝子をコードする核酸配列は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、本明細書中に記載されるものが挙げられる。
【０１００】
上記遺伝的な改変は、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、改変型ヘルペスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）による感染、または当該分野で公知の方法（リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションなど）を使用するトランスフェクションのいずれかによって行なわれる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。例えば、上記キメラ遺伝子構築物は、ウイルス（例えば、レトロウイルス）の長い末端反復配列（ＬＴＲ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；または、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子の発現を指向する哺乳動物細胞特異的プロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、ドパミン細胞についてのマーカー）、ＤＢＨ、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）、ＣｈＡＴ、ＧＦＡＰ、ＮＳＥ、ＮＦタンパク質（ＮＥ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈなど））を含み得る。さらに、上記ベクターは、薬物選択マーカー（例えば、試験遺伝子と一緒に同時感染したとき、ジェネティシン（Ｇ４１８）（タンパク質合成インヒビター）に対する耐性を与えるＥ．ｃｏｌｉアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含み得る。
【０１０１】
ＬＢＣは、発現ベクターによるトランスフェクションを使用して遺伝的に改変され得る。１つのプロトコルにおいて、上記遺伝子を含むベクターＤＮＡは、０．１×ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、４０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈される。２２μｌのそのＤＮＡは、使い捨ての５ｍｌ滅菌プラスチックチューブ中の２５０μｌの２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭデキストロース、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に添加される。３１μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２が、ゆっくりと添加され、そしてその混合物は、室温にて３０分間（ｍｉｎｕｔｅまたはｍｉｎ）インキュベートされる。この３０分間のインキュベーションの間、細胞は、８００ｇで５分間、４℃にて遠心分離される。その細胞は、２０容量の氷冷したＰＢＳ中に再懸濁され、そして１×１０７個の細胞からなるアリコートに分けられ、これらのアリコートは、再び遠心分離される。各アリコートの細胞は、１ｍｌのＤＮＡ−ＣａＣｌ２懸濁液中に再懸濁され、そして室温で２０分間インキュベートされる。次いでその細胞は、増殖培地中に希釈され、そして５％〜７％のＣＯ２において３７℃で６時間〜２４時間インキュベートされる。その細胞は、再び遠心分離され、ＰＢＳで洗浄され、そして１０ｍｌの増殖培地中に４８時間戻される。
【０１０２】
ＬＢＣはまた、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を使用して遺伝的に改変される。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションのために、上記細胞は、単一細胞懸濁液へと機械的に分けられ、そして５０％コンフルエンス（ｃｍ２あたり５０，０００個〜７５，０００個の細胞）にて培養処理したディッシュ上にプレートされ、そして一晩接着させられる。１つのプロトコルにおいて、改変型リン酸カルシウムトランスフェクション手順は、以下の通りに行われる：滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のＤＮＡ（１５〜２５μｇ）は、ＴＥによって４４０μＬまで希釈され、そして６０μＬの２Ｍ  ＣａＣｌ２（１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液により５．８のｐＨ）が、そのＤＮＡ／ＴＥ緩衝液に添加される。合計で５００μＬの２×ＨｅＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；２７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭデキストロース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤粉末、ｐＨ６．９２）が、この混合物に滴下される。その混合物は、室温にて２０分間静置される。その細胞は、１×ＨｅＢＳによって簡単に洗浄され、そして１ｍｌのリン酸カルシウム沈殿したＤＮＡ溶液が、各プレートに添加され、そしてその細胞は、３７℃で２０分間インキュベートされる。このインキュベーションの後、１０ｍｌの培地が、その細胞に添加され、そしてそのプレートは、インキュベーター（３７℃、９．５％のＣＯ２）内に、さらに３〜６時間おかれる。そのＤＮＡおよびその培地は、インキュベーション期間の終わりにおいて吸引によって取り出され、そしてその細胞は、３回洗浄され、次いでそのインキュベーターに戻される。
【０１０３】
上記ＬＢＣは、それぞれの細胞分裂によって、少なくとも１つの娘細胞がまた、ＬＢＣ細胞であるような、自発維持（ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）が可能である。ＬＢＣは、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍またはそれ以上に拡大培養され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）得る
例示的なＬＢＣとしては、１Ｃ５および２Ｃ２が挙げられる。上記ＬＢＣの表現型解析（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）は、１Ｃ５がＯ−グリカン上にＬｅｂを発現するが、Ｎ−グリカンまたは糖脂質上にＬｅｂを発現しないことを示す。対照的に、２Ｃ２は、ＬｅｂをＯ−グリカンおよびＮ−グリカンならびに糖脂質上に発現する。さらに、１Ｃ５はＬｅＹを発現しないにの対して、２Ｃ２はＬｅＹを発現する。グリカンのレパートリーにおけるこれらの違いにもかかわらず、これらのクローンの間でＨ．ｐｙｌｏｒｉの付着性に関して違いが、検出された。
【０１０４】
ＬＢＣは、長期培養物においてインビトロで維持され得る。ＬＢＣは、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回またはそれ以上の培養を経過（ｐａｓｓ）し得る。
【０１０５】
ＬＢＣは、当該分野で周知の方法を使用して増殖される。培養するための条件は、生理学的条件に近くあるべきである。培養培地のｐＨは、生理学的ｐＨに近くあるべきである（例えば、ｐＨ６〜ｐＨ８の間、ｐＨ約７〜ｐＨ約７．８の間、またはｐＨ７．４）。生理学的温度は、約３０℃〜４０℃の間の範囲である。ＬＢＣは、約３２℃〜約３８℃の間（例えば、約３５℃〜約３７℃の間）の温度で培養される。
【０１０６】
一般的に、インビトロで約３〜１０日後、増殖するＬＢＣから上記培地を吸引し、そしてその培養フラスコに新鮮な培地を添加する。必要に応じて、その吸引した培地は、回収され、濾過され、そしてその後のＬＢＣの継代にコンディション培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）として使用される。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ以上のコンディション培地が、使用される。
【０１０７】
上記ＬＢＣ細胞培養は、増殖を再開する（ｒｅｉｎｉｔｉａｔｅ）ために容易に継代され得る。例えば、インビトロで３〜７日後、上記培養フラスコは、十分に振盪され、次いでＬＢＣは、５０ｍｌ遠心チューブに移され、そして低速で遠心分離され、その培地は、吸引され、そのＬＢＣは、少量の培養培地中に再懸濁される。次いでその細胞は、数えられ、そして増殖を再開するために、所望の密度にて再度プレートされる。この手順は週に１回繰り返されて、各継代における生存可能な細胞の数の対数的増加をもたらす。この手順は、所望の数のＬＢＣが得られるまで継続される。
【０１０８】
ＬＢＣおよびＬＢＣの子孫は、それらが必要とされるまで、当該分野において公知である任意の方法によって低温保存され得る（例えば、米国特許第５，０７１，７４１号、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ９３／１４１９１、同ＷＯ９５／０７６１１、同ＷＯ９６／２７２８７、同ＷＯ９６／２９８６２および同ＷＯ９８／１４０５８、Ｋａｒｌｓｓｏｎら，６５  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．２５２４−２５３６（１９９３）を参照のこと）。上記ＬＢＣは、特定の低温保存剤（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｎｔ）を含む等張溶液（好ましくは、細胞培養培地）中に再懸濁され得る。このような低温保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが挙げられる。これらの低温保存剤は、５〜１５％（例えば、８〜１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃〜−１５０℃（例えば、−２０℃〜−１００℃、または−７０℃〜−８０℃）の温度まで徐々に冷凍される。
【０１０９】
（Ｌｅｂ発現細胞に対する薬物の効果をスクリーニングするための方法）
ＬＢＣ培養物は、有力な治療用組成物のスクリーニングのために使用され得る。例えば、ＬＢＣは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着を媒介（例えば、増強または阻害）するか、またはＬｅｂ糖質エピトープを結合する化合物を同定するために使用される。これらの試験組成物は、培養中の細胞に、異なる投薬量にて適用され得、そしてその細胞の応答は、種々の時期についてモニタリングされる。その細胞の物理的特性は、顕微鏡法を用いて細胞増殖および形態を観察することによって分析され得る。
【０１１０】
種々の方法において、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ相互作用のインヒビターまたはエンハンサーは、ＬＢＣと、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌と、試験化合物とを、ＬＢＣとＨ．ｐｙｌｏｒｉ細菌とが複合体を形成し得る条件下において接触させることによって同定され、そしてその複合体形成の量が、決定される。上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の低下は、その試験化合物がＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着のインヒビターであることを示す。対照的に、上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の増加は、その試験化合物がＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着のエンハンサーであることを示す。
【０１１１】
本発明はまた、ＬＢＣとＬｅｂエピトープ結合因子とを接触させ（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ細菌と試験薬剤とを接触させる）、そしてその薬剤がそのＬＢＣを結合する（例えば、複合体を形成する）か否かを決定することによって、Ｌｅｂ糖質エピトープを結合する薬剤を同定する方法を提供する。上記試験化合物の非存在下と比較した場合の、その試験化合物の存在下における複合体形成の量の低下は、試験化合物が、Ｌｅｂ糖質エピトープを結合することを示す。
【０１１２】
本発明はまた、これらのスクリーニング方法によって同定された調節因子化合物、およびこの調節因子を含む薬学的組成物を含む。
【０１１３】
本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに例示される。
【実施例】
【０１１４】
（実施例１：一般的方法）
（抗体）
マウス抗Ｌｅｂ（ＩｇＭ、クローンＴ２１８）抗体を、Ｓｉｇｎｅｔ（Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入し、マウス抗シアリル−Ｌｅｘ抗体（ＩｇＭ、クローンＫＭ９３）を、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入し、そしてＣＳＬＥＸ（ＩｇＭ）抗体を、ＣＳＬＥＸマウスハイブリドーマ細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって産生した。ＨＲＰに結合体化したヤギ抗マウスＩｇＭ抗体を、Ｃａｐｐｅｌ（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）から購入した。
【０１１５】
ＦＡＣＳに関する全ての免疫組織化学染色実験を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）において行なった。Ａｌｅｘａ  ４８８に結合体化（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）したヤギ抗マウスＩｇＭおよびＩｇＧを、１：２，０００希釈〜１：４，０００希釈にて、二次抗体として使用した。抗Ｌｅａ（Ｔ１７４、ＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１：５０希釈〜１：１００希釈において使用した。抗Ｌｅａ（７８ＦＲ２．３；ＩｇＭ；Ｂｉｏｍｅｄ）を、１：２００希釈において使用した。
【０１１６】
抗Ｌｅｂ（ＢＧ−６、ＩｇＭ；Ｓｉｇｎｅｔ）を、１：２００希釈において使用した。抗Ｌｅｙ（Ｆ３、ＩｇＭ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１：２００希釈において使用した。
【０１１７】
（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株および培養）
ＬｅｂとＳＬｅｘとに結合するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ株Ｃａｇ７．８を、１０％ウシ血液および１％アイソバイタルエックス（ＩｓｏＶｉｔａｌｅｘ）を補充したブルセラ寒天培地（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｇａｒ）上で、微好気性雰囲気において３７℃にて２日間増殖させた（ＢＢＬ  ＧａｓＰａｋ  Ｐｌｕｓ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ  ２１５２）。
【０１１８】
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株１７８７５／Ｌｅｂを、使用した（１８）。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉを、２％  ＦＣＳおよびアイソバイタルエックスを補充した血液寒天プレート上で４８〜７２時間培養した。細菌を、滅菌した白金耳（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐ）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）およびＰＢＳを使用して１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。その細胞を、５，０００ｒｐｍにて遠沈し、上清を除去し、そしてその細菌を、１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。ＯＤ６００を、０．１に調整した。
【０１１９】
上記細菌を、ＦＩＴＣ標識し、そして細胞を、先に記載されるように細菌によって重層した（１９）。
【０１２０】
（細胞培養）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびその安定なトランスフェクト体を、先に記載（１５）されるように、１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）およびグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
【０１２１】
（ＣＨＯ−Ｋ１細胞のトランスフェクション）
付着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、７５ｃｍ２  Ｔフラスコに播種し、そして約２４時間後に７０〜８０％の細胞密集度にてトランスフェクトした。一過性トランスフェクションを、改変型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法にとってか、または製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって記載される通りにリポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）によって達成した。
【０１２２】
全てのトランスフェクション混合物において、１９．５μｇの融合タンパク質プラスミドを使用した。低いトランスフェクション効率に起因して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、リポフェクトアミン２０００を用いて、製造業者によって推奨される通りにトランスフェクトした。安定なトランスフェクト体について、プラスミドを、ＡｖｒＩＩまたはＳｐｅ１を用いて直線化し、次いでそのプラスミドを、リポフェクトアミン２０００を使用し、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、各Ｔフラスコ中の細胞を、５個の１００ｍｍペトリ皿へと分け、そして選択培地中でインキュベートした。異なる選択薬物の濃度は、ゼオシン、ハイグロマイシンＢ、およびＧ４１８について、それぞれ、４００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、および０．５ｍｇ／ｍｌであった。Ｇｐｔ発現細胞を、ミコフェノール酸（２５μｇ／ｍｌ）、キサンチン（１３．６μｇ／ｍｌ）およびヒポキサンチン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む培地における増殖によって選択した。その選択培地を、３日おきに取り換えた。薬物耐性クローンは、約２週間後に形成された。クローンを、顕微鏡下において同定し、そしてそのクローンを、ピペットマンを使用して慎重に選抜した。選択したクローンを、９６ウェルプレートで、選択薬物の存在下においてさらに２週間培養した。
【０１２３】
（１次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ＭＥＳ緩衝液および非還元条件を用いて、４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓの不連続型のポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）で行なった。分離したタンパク質を、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ電気泳動転写セル（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、電気泳動的にブロットした。膜を、０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）および３％  ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水中で一晩ブロックし、次いでブロッキング緩衝液に希釈した上記抗Ｌｅｂ抗体と一緒に、室温で１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ−Ｔを用いて５回洗浄し、そして上記ＨＲＰに結合体化した二次抗体と一緒にインキュベートした。結合した抗体を、ＥＣＬウェスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、次いでＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にその膜を曝すことによって検出した。
【０１２４】
組換え融合タンパク質を、先に行われた通り（１５）、免疫沈降によって精製した。手短には、トランスフェクトした細胞由来の１０ｍｌの上清を、スラリーの１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）と一緒に、４℃にて一晩インキュベートした。そのビーズを約２００ｇにて１５分間遠沈し、上清を廃棄し、そのビーズを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、そしてＰＢＳ中で２回洗浄した。ビーズを、１００μｌの２×ＬＤＳ−サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、そして７０℃にて１０分間加熱した。サンプル（代表的には、１０μｌ）を、４〜１２％  ＮＵＰＡＧＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。電気泳動を、２００Ｖにて約６０分間行った。ウェスタンブロッティングのために、そのサンプルを、０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、４０Ｖにて２時間ブロットした。膜を、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含む３％  ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて、４℃にて一晩ブロックするか、または室温にて１時間ブロックした。一次抗体と一緒に１時間インキュベートし、次いで３回洗浄し、そして二次抗体と一緒に１時間インキュベートし、３回の洗浄を繰り返した。その後、製造業者の指示書に従ってＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用し、膜を現像した。
【０１２５】
ヤギ抗マウスＩｇＭ  ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、１：８０，０００希釈〜１：１６０，０００希釈にて使用した。ウェスタンブロットを、３％  ＢＳＡ／ＰＢＳＴにおいて行った。
【０１２６】
（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ付着アッセイ）
細菌等級（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｒａｄｅ）のペトリ皿を、ＰＢＳ中で２０μｇ／ｍｌの濃度のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体（５０μｌ）を用いて、４℃にて一晩コーティングした。インキュベーション後、そのディッシュを、ＰＢＳ中で３回洗浄し、そのＰＢＳを、最後の洗浄後に完全に吸引した。その後、安定にトランスフェクトした細胞株（ＳＬｅｘ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、２９３Ｔ細胞由来であった）由来の１００μｌの粗製上清または一過性にトランスフェクトした細胞株（Ｌｅｂ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびＬｅａ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、ＣＨＯ−Ｋ１由来であった）由来の１００μｌの粗製上清を、各ドットに添加した。コントロールＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを、昆虫細胞株（Ｈｉ−５）において産生した。ディッシュを、室温にて３時間インキュベートし、次いでＰＢＳを用いて３回洗浄した。１００μｌのＨ．ｐｙｌｏｒｉ懸濁液（１ｍｌあたり約１×１０８個の細菌）を、各ドットに添加した。ディッシュを、氷上で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳを用いて２回洗浄した。付着した細菌を、ＰＢＳ中のホルムアルデヒドによって固定し、そしてその細菌を、倒立位相差顕微鏡法によって分析した。
【０１２７】
（ＦＡＣＳ分析）
ＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用し、そして１００００のイベントを収集した。細胞を、分析のために以下の様式で調製した：細胞を、最初に、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。次いでその細胞を、それらが解離されるまで、１％  ＥＤＴＡと一緒にインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中に懸濁し、そして２００ｇにて５分間遠沈した。上清を取り除き、そしてその細胞を、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてさらに１回遠沈した。一次抗体を添加し、そして染色を４℃にて３０分間行った。ＰＢＳにおける２回の洗浄工程を行い、そして二次抗体による染色を、一次抗体に関する染色の通りに行った。次いで、その細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてＦＡＣＳ分析まで４℃に保持した。ネガティブコントロールの染色を、二次抗体のみを用いて行った。
【０１２８】
（ベクターの構築）
融合タンパク質。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１マウスＩｇＧ２ｂ融合タンパク質をコードする発現プラスミドを、先に記載（参照）される通りに構築した。α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）コード配列を、その停止コドンおよびそのリーダーペプチド（表Ｉ）を除いて、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。そのＡＧＰ  ｃＤＮＡを、発現カセット中のＮｈｅＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を使用して、ＣＤ５リーダー配列（上流）およびマウスＩｇＧ２ｂのＦｃ部分（下流）をコードするｃＤＮＡとインフレームで融合した。同じベクター骨格を、両方の融合タンパク質構築物について使用した。
【０１２９】
β３ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ６。Ｃ３  β３ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ６（２０）を、順方向プライマーとしてｃｇｃ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｔｔｔ  ｃｃｃ  ｔｇｃ  ｃｇｃを使用し、かつ逆方向プライマーとしてｃｇｃ  ｇｇｇ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｔｃａ  ｇｇａ  ｇａｃ  ｃｃｇ  ｇｔｇ  ｔｃｃを使用してヒト胃ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを使用してＣＤＭ８にサブクローニングした。
【０１３０】
β３Ｇａｌ−Ｔ５。β３Ｇａｌ−Ｔ５（２１）を、鋳型としてヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡを使用して、順方向プライマーとしてｃｇｃ  ｇｇｇ  ａａｇ  ｃｔｔ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ｔｔｃ  ｃｃｇ  ａａｇ  ａｔｇ  を用い、かつ逆方向プライマーとしてｃｇｃ  ｇｇｇ  ｃｇｇ  ｃｃｇ  ｃｔｔ  ｔａｇ  ａｃａ  ｇｇｃ  ｇｇａ  ｃａａ  ｔｃｔ  ｔｃを用いたＰＣＲによって増幅し、次いでＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを使用してＣＤＭ８発現プラスミドにサブクローニングした。
【０１３１】
α１，２Ｆｕｃ−Ｔ２。ＦＵＴ−ＩＩ（分泌型遺伝子（ｓｅｃｒｅｔｏｒ  ｇｅｎｅ））（２２）ｃＤＮＡを、増幅し、そして記載（２３）される通りにサブクローニングした。
【０１３２】
α１，３／４Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ。Ｌｅｗｉｓ遺伝子にコードされるα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ−ＩＩＩ）（２４）の発現プラスミドは、Ｐｒｏｆ．Ｂｒｉａｎ  Ｓｅｅｄ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＭＧＨ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡの親切な贈呈品であった。
【０１３３】
安定なトランスフェクト体を作製するために使用したベクターは、両方向性であり、そのベクターは、ＣＤＭ８のものと同一のポリリンカーのＣＭＶプロモーター（上流）、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、ならびにＳＶ４０の両方向性ポリ（Ａ）付加シグナル（この転写ユニットに対して方向性が反対）を有し、そして反対方向からのそのポリ（Ａ）シグナルの利用は、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター、ならびにそれに続くグアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＣＭＶ／Ｇｐｔ）、ハイグロマイシンｂ耐性遺伝子（ＣＭＶ／Ｈｙｇ）、ゼオシン耐性遺伝子（ＣＭＶ／Ｚｅｏ）およびネオマイシン耐性遺伝子（ＣＭＶ／Ｎｅｏ）についてのコード配列からなる第２の転写ユニットである（Ｊ．ＨｏｌｇｅｒｓｓｏｎおよびＢ．Ｓｅｅｄ、未発表）。上に記載したｃＤＮＡを、上に記載した制限酵素を使用して、安定な発現のためにそのベクター中に置き換えた。Ｃ３  ＧｎＴ−ＶＩは、ゼオシン耐性遺伝子を保有し；ＧａＩＴ−Ｖプラスミドは、ＧＰＴを保有し；ＦＵＴ−ＩＩは、ネオマイシン耐性遺伝子を保有し；ＦＵＴ−ＩＩＩは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を保有した。
【０１３４】
（Ｌｅｂ糖質エピトープを保有するＰＳＧＬ−ｌ／ｍＩｇＧ２ｂおよびＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂを安定して発現するＣＨＯ細胞の構築）
付着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂまたはＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂ、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６、β３ＧａｌＴ５、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３（これらの各々はまた、薬物選択エレメント（それぞれ、ピューロマイシン、ゼオシン、グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ネオマイシンおよびハイグロマイシンｂ）を含んだ）をコードする直線化した発現プラスミドを使用して、上に記載する通りにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、各Ｔフラスコ中の細胞を、５個の１００ｍｍペトリ皿へと分け、そして選択培地中でインキュベートした。その選択培地を、３日おきに取り換えた。薬物耐性クローンは、約２週間後に形成された。クローンを、顕微鏡下で同定し、そしてピペットマンを使用して慎重に選抜した。選択したクローンを、９６ウェルプレートで、選択薬物の存在下においてさらに２週間培養した。細胞培養上清を、細胞が８０〜９０％の密集度に到達したときに、回収し、そしてＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度およびＬｅｂ決定基の濃度を、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体または抗Ｌｅｂ抗体を使用し、次いでＨＲＰまたは、ＡＬＰに結合体化した、抗マウスＩｇＭ二次抗体を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１３５】
（実施例２：ムチン型融合タンパク質、Ｌｅｂ糖質決定基を保有するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における発現）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ、ならびにグリコシルトランスフェラーゼのβ３ＧｌｃＮＡｃＴ６、β３ＧａｌＴ５、ＦＵＴ２（Ｓｅ遺伝子にコードされるα１，２フコシルトランスフェラーゼ）およびＦＵＴ３（Ｌｅｗｉｓ遺伝子にコードされるα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ）をコードする発現プラスミドによって、一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の細胞培養上清を、抗マウスＩｇＧ抗体に結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートした；次いでそのビーズを、洗浄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で煮沸した。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清からアフィニティー精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして抗Ｌｅｂモノクローナル抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した（図１）。レーン１、レーン２およびレーン５、レーン６において、上述したｃＤＮＡの全てによってトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の上清から単離し、イムノアフィニティー精製したＩｇ含有タンパク質の強いＬｅｂ反応性を、見出したが、β３ＧａｌＴ５（レーン３およびレーン４）、ＦＵＴ２（レーン７およびレーン８）、またはＦＵＴ２およびＦＵＴ３の両方（レーン９）をコードするプラスミドを、トランスフェクション混合物から除外した場合、モノマーのＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの予想サイズからなるイムノアフィニティー精製したＩｇ含有タンパク質の非常に弱い抗Ｌｅｂ反応性が、見られた（図１Ａおよび図１Ｂ）。全てのｃＤＮＡを含まないレーンにおいて見られる弱い染色は、おそらく、二次抗体の結合によって引き起こされるバックグラウンド染色の結果であろう。
【０１３６】
（実施例３：Ｌｅｂ糖質エピトープを保有するＰＳＧＬ−１融合タンパク質またはＬｅｂ糖質エピトープを保有するＡＧＰ  ｍＩｇＧ２ｂ融合タンパク質を産生する安定なＣＨＯ細胞の構築）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、グリコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡであるβ３ＧｌｃＮＡｃＴ６、β３ＧａｌＴ５、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３を、それぞれ、ゼオシン、ミコフェノール酸、ネオマイシンおよびハイグロマイシンｂの混合物によって選択され得る薬物耐性エレメントと組み合わせて含むプラスミドによって、同時にトランスフェクトした。数種のクローンを、ピペットマンを使用して慎重に選抜し、そしてそれらのクローンのうちの３種（図２、クローン１Ｃ５、クローン２Ｃ２およびクローン５Ｃ５）は、抗Ｌｅｂ抗体による強い表面の染色を示した。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）のマウスＩｇＧ２ｂ融合体またはα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）のマウスＩｇＧ２ｂ融合体をコードする発現プラスミドによる、これらのクローンの一過性トランスフェクションの後、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂタンパク質およびＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂタンパク質を、抗ｍＩｇＧアガロースビーズを使用して上清から単離した。ウェスタンブロッティングは、３種全てのクローンで発現したＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂにおいてＬｅｂ反応性を示した（図２）が、一方で、強いＬｅｂ反応性は、クローン２Ｃ２で産生されたＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂにおいてのみ見出された。１Ｃ５で産生されたＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂは、任意のＬｅｂ決定基を保有しないようであり、そして５Ｃ５で産生されたＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂは、弱い抗Ｌｅｂ反応性を示した（図２）。この観察は、ＣＨＯ細胞がＮ−グリカン生合成における変化に対して感受性であり、その結果、上述したグリコシルトランスフェラーゼについての前駆体の鎖を欠く改変体が、ＣＨＯ培養および選択の間に生じ得ることを示す。対照的に、Ｏ−グリカン生合成は、Ｏ−結合型グリカン構造における培養誘導性の変化に対して、より安定であり、そしてそれに対して、より低い感受性であるようである。Ｌｅｂ保有ＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂを分泌するＣＨＯ安定体（ｓｔａｂｌｅｓ）を、ＡＧＰ／Ｉｇおよびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするプラスミドを用いて、上に記載されるクローン２Ｃ２を安定にトランスフェクトすることによって構築した。Ｌｅｂ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを産生するＣＨＯ−Ｋ１安定体を、上述したグリコシルトランスフェラーゼプラスミドの全てと共にＰＳＧＬ−１／Ｉｇ発現プラスミドを用いて、同時トランスフェクトすることによって作製した。
【０１３７】
（実施例４：β３ＧａｌＴ１，β３ＧａｌＴ２およびβ３ＧａｌＴ５は、全て、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３の存在下においてＮ−グリカン上のＬｅｂ生合成を補助し得る）
ＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂ（Ｎ−結合型グリカンのみを保有するレポータータンパク質）を使用して、β３ＧａｌＴ１、β３ＧａｌＴ２およびβ３ＧａｌＴ５がＮ−結合型グリカン上のＬｅｂ生合成を補助する能力（図３）を、調査した。ＦＵＴ２およびＦＵＴ３を同時トランスフェクトした場合（図３）、β３ＧａｌＴ１、β３ＧａｌＴ２およびβ３ＧａｌＴ５は、全て、ＡＧＰ／Ｉｇ上のＬｅｂ生合成を補助し得る。β３ＧｌｃＮＡｃＴ６トランスフェラーゼ（これは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂのＯ−結合型グリカン上のＬｅｂ生合成に必要である）がＮ−グリカン上のＬｅｂ生合成に必要とされなかったことに、留意すべきである。
【０１３８】
（実施例５：Ｌｅｂ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびシアリル−Ｌｅｘ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ付着を補助する）
Ｌｅｂ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂおよびシアリル−Ｌｅｘ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂがＨ．ｐｙｌｏｒｉ付着を補助する能力を、付着アッセイにおいて調査した。短いコア１構造を保有するＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（図４Ａ）と比較して、Ｌｅｂ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（図４Ｄ）およびそのほかにシアリル−Ｌｅｘ置換型ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（図４Ｂ）は、Ｌｅｂ保有複合糖質およびシアリル−Ｌｅｘ保有複合糖質に結合することが公知であるＨ．ｐｙｌｏｒｉ株の結合を補助した（図４）。
【０１３９】
（実施例６：Ｌｅｗｉｓ  Ｂを発現する安定なＣＥＯ−Ｋ１細胞株の作製）
β３ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ６、β３Ｇａｌ−Ｔ５、α２Ｆｕｃ−Ｔ２およびα３／４Ｆｕｃ−Ｔ３をコードする発現ベクターの同時トランスフェクションの後、多くのクローンを、ピペットマンを使用して選び、そして９６ウェルプレートに移した。拡大培養（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の後、増殖する細胞を含むウェルを、二つ組のウェルに分け、そして抗Ｌｅｂ抗体を用いて染色した。２つのポジティブクローン（１Ｃ５および２Ｃ２）を、さらに拡大培養し、そしてウェル１つあたり０．３個の細胞の推定細胞密度を用いて単一細胞にクローニング（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅ）した。フローサイトメトリーによって、両方のクローンがＬｅａエピトープおよびＬｅｂエピトープを発現することを、見出したが、２Ｃ２のみが、Ｌｅｙと称されるＬｅｂの２型異性体を発現した（図５）。いずれのクローンも、あらゆる検出可能なＬｅｘを発現しなかった。
【０１４０】
（実施例７：１Ｃ５および２Ｃ２は、Ｌｅｗｉｓ  Ｂを異なるグリカン上で発現する）
１Ｃ５および２Ｃ２を、ａ１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）の免疫グロブリン融合タンパク質をコードするプラスミドおよびＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）の免疫グロブリン融合タンパク質をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした（これらの融合タンパク質は、それぞれ、Ｎ−結合型グリカンおよびＯ−結合型グリカンを保有するタンパク質である）。培養培地への分泌後、ＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂおよびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを、抗マウスＩｇＧアガロースビーズにおいてアフィニティー精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに抗Ｌｅｂ抗体および抗マウスＩｇＧ抗体を使用したウェスタンブロッティングによって分析した（図６）。興味深いことに、２Ｃ２細胞で発現された融合タンパク質が、Ｎ−グリカンおよびＯ−グリカンの両方においてＬｅｂを発現したのに対して、１Ｃ５細胞で発現された融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（ほぼＯ−グリカンのみを保有する融合タンパク質）においてのみ、Ｌｅｂを発現した（図６）。さらに、２Ｃ２細胞のみが、グリコスフィンゴリピドにおいてＬｅｂを発現し、そして１Ｃ５細胞は、グリコスフィンゴリピドにおいてＬｅｂを発現しなかった（これらのグリコスフィンゴリピドは、それぞれの細胞株から単離した）（図７）。
【０１４１】
（実施例８：ＢａｂＡを介するＨ．ｐｙｌｏｒｉの接着は、Ｌｅｂ発現に依存するが、Ｌｅｂを保有するグリカン型に依存しない）
Ｌｅｂ結合性Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株（１７８７５／Ｌｅｂ）は、両方のＬｅｂ発現クローンに対して接着したが、この１７８７５／Ｌｅｂは、２Ｃ２クローンに対して、より大きい数で接着した（図８および図９）。親のＣＨＯ−Ｋ１細胞（図８および図９）、またはＬｅａ発現細胞およびＨ１型発現細胞に対するこのＨ．ｐｙｌｏｒｉ株の結合は、見られなかった。
【０１４２】
（参考文献）
【０１４３】
【化１】
2008517073.tif 000003
【０１４４】
【化２】
2008517073.tif 000004
【０１４５】
【化３】
2008517073.tif 000005
（他の実施形態）
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、上述の説明は、例示を意図し、そして添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、抗Ｌｅｂモノクローナル抗体の結合に由来する発光を示すウェスタンブロットの写真である。レーン１、レーン２、レーン５およびレーン６は、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６、βＧａｌＴ５、ＦＵＴ２、およびＦＵＴ３を発現するＣＨＯ細胞由来の溶解物から得られた溶出物を含む。レーン３およびレーン４は、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６、βＧａｌＴ５、およびＦＵＴ３を発現するＣＨＯ細胞の溶解物から得られた溶出物を含む。レーン７およびレーン８は、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６、ＦＵＴ２、およびＦＵＴ３を発現するＣＨＯ細胞由来の溶解物から得られた溶出物を含む。レーン９は、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合した結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６およびβＧａｌＴ５を発現するＣＨＯ細胞の溶解物から得られた溶出物を含む。
【図２】図２は、抗マウスＩｇＧ抗体の結合または抗Ｌｅｂモノクローナル抗体の結合に由来する発光を示すウェスタンブロットの写真である。それらのレーンは、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、β３ＧｌｃＮＡｃＴ６、βＧａｌＴ５、ＦＵＴ２、およびＦＵＴ３についての発現プラスミドによってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の１Ｃ５株、２Ｃ２株または５Ｃ５株のいずれかに由来する溶解物から得られた溶出物を含み、これらのＣＨＯ細胞は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）またはα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）のいずれかを発現するように、一過性にトランスフェクトされている。
【図３】図３は、抗マウスＩｇＧ抗体の結合または抗Ｌｅｂモノクローナル抗体の結合に由来する発光を示すウェスタンブロットの写真である。それらのレーンは、抗マウスＩｇＧ２ｂに結合したアガロースビーズと一緒にインキュベートされた、α１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、ＦＵＴ２およびＦＵＴ３、ならびにβＧａｌＴ１、βＧａｌＴ２、βＧａｌＴ５またはその３種全てのいずれかについての発現プラスミドによってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に由来する溶解物から得られた溶出物を含む。
【図４Ａ】図４Ａは、付着アッセイの写真であり、ここでマウスＩｇＧは、ディッシュ上でインキュベートされる。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含み、いずれのＬｅｗｉｓエピトープも含まない昆虫細胞株Ｈｉ−５由来の溶解物は、その溶解物がマウスＩｇＧと結合するようにそのディッシュ上にスポットされる。次いでＨ．ｐｙｌｏｒｉが、そのディッシュに添加され、そしてホルムアルデヒドによって固定され、ここでそれらの存在は、倒立位相差顕微鏡法によって識別された。
【図４Ｂ】図４Ｂは、付着アッセイの写真であり、ここでマウスＩｇＧは、ディッシュ上でインキュベートされる。ＳＬｅｘ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含む２９３Ｔ細胞由来の溶解物は、その溶解物がマウスＩｇＧと結合するようにそのディッシュ上にスポットされる。次いでＨ．ｐｙｌｏｒｉが、そのディッシュに添加され、そしてホルムアルデヒドによって固定され、ここでそれらの存在は、倒立位相差顕微鏡法によって識別された。
【図４Ｃ】図４Ｃは、付着アッセイの写真であり、ここでマウスＩｇＧは、ディッシュ上でインキュベートされる。溶解物は、その溶解物がマウスＩｇＧと結合するようにそのディッシュ上にスポットされる。次いでＨ．ｐｙｌｏｒｉが、そのディッシュに添加され、そしてホルムアルデヒドによって固定され、ここでそれらの存在は、倒立位相差顕微鏡法によって識別された。
【図４Ｄ】図４Ｄは、付着アッセイの写真であり、ここでマウスＩｇＧは、ディッシュ上でインキュベートされる。ＳＬｅｂ保有ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含むＣＨＯ細胞由来の溶解物は、その溶解物がマウスＩｇＧと結合するようにそのディッシュ上にスポットされる。次いでＨ．ｐｙｌｏｒｉが、そのディッシュに添加され、そしてホルムアルデヒドによって固定され、ここでそれらの存在は、倒立位相差顕微鏡法によって識別された。
【図５】図５は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、１Ｃ５細胞および２Ｃ２細胞におけるＬｅｗｉｓ抗原の発現のフローサイトメトリー分析を示す、一連のチャートである。Ｔ１７４および７８ＦＲ２．３は、両方とも抗Ｌｅａ  Ａｂであり；Ｔ２１８は、抗Ｌｅｂ  Ａｂであり；Ｐ１２は、抗Ｌｅｘ  Ａｂであり；そしてＦ３は、Ｈ２型構造と交差反応（ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔ）する抗Ｌｅｙ  Ａｂである。
【図６】図６は、Ｌｅｂ発現１Ｃ５細胞株およびＬｅｂ発現２Ｃ２細胞株において発現されるＡＧＰ／ｍＩｇＧ２ｂ（Ａ）融合タンパク質およびＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（Ｐ）融合タンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析ならびにウェスタンブロット分析を示す写真である。左のパネルにおいて、抗Ｌｅｂ  Ａｂ（Ｔ２１８）が、使用され、そして右のパネルにおいて、その融合タンパク質が、抗マウスＩｇＧ  ｍＡｂによって検出された。
【図７】図７は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、１Ｃ５細胞および２Ｃ２細胞から単離された全ての非酸性グリコスフィンゴリピドの薄層クロマトグラフィー分析を示す一連の写真である。これらのクロマトグラムは、グリコスフィンゴリピドを緑色に染色する化学試薬（アニスアルデヒド）（パネルＡ）によって現像されたか、または抗Ｌｅａ抗体（パネルＢ）もしく抗Ｌｅｂ抗体（パネルＣおよびパネルＤ）によってプローブされたかのいずれかであった。
【図８】図８は、ＣＨＯ−Ｋ１、１Ｃ５および２Ｃ２の固定された単層を示す一連の写真であり、これらの単層は、ＦＩＴＣ標識されたＬｅｂ結合性Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株（１７８７５／Ｌｅｂ）と一緒にインキュベートされ、洗浄され、そして蛍光顕微鏡法によって検査された。
【図９】図９は、ＣＨＯ−Ｋ１、１Ｃ５および２Ｃ２の固定された単層を示す一連の写真であり、ＦＩＴＣ標識されたＬｅｂ結合性Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ株（１７８７５／Ｌｅｂ）と一緒にインキュベートされ、洗浄され、そして蛍光顕微鏡によって検査された。
【図１】
2008517073.tif 000006
【図２】
2008517073.tif 000007
【図３】
2008517073.tif 000008
【図４Ａ】
2008517073.tif 000009
【図４Ｂ】
2008517073.tif 000010
【図４Ｃ】
2008517073.tif 000011
【図４Ｄ】
2008517073.tif 000012
【図５】
2008517073.tif 000013
【図６】
2008517073.tif 000014
【図７】
2008517073.tif 000015
【図８】
2008517073.tif 000016
【図９】
2008517073.tif 000017
【国際調査報告】
2008517073.tif 000018
2008517073.tif 000019
2008517073.tif 000020
2008517073.tif 000021