(57)【要約】  クローニングした核ホルモン受容体のためのリガンド、コリプレッサー、コアクチベーター、アゴニスト、及びアンタゴニストとして作用する物質を同定するために開発された方法及びキット並びにこの方法で使用される試験キットを本発明で提供する。より詳細には、この方法は、核ホルモン受容体、受容体ヘテロ二量体、及び／又は受容体ホモ二量体、１つ又は複数のシグナル伝達分子をコードするＤＮＡ、及びマーカーをコードするＤＮＡを発現させること、細胞を試験物質とインキュベートすること、並びにマーカーの量及び／又は細胞増殖の同定によって、試験物質が受容体と定量的又は定性的に相互作用するかどうかを同定することを含む。
2008520244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体の活性に対する候補化合物の影響を評価する方法であって、
１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現する細胞であって、核内受容体及びヘルパータンパク質の少なくとも１つが、細胞に導入されている核酸から発現する細胞を得ること、
該細胞を候補化合物に接触させること、並びに
該候補化合物が核ホルモン受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質の両方が、細胞に導入されている核酸から発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質が、細胞に導入されている同一の核酸から発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１つ又は複数の核内受容体が、細胞に導入されている第１の核酸から発現し、１つ又は複数のヘルパータンパク質が、細胞に導入されている第２の核酸から発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記判定するステップが、前記核内受容体及びヘルパータンパク質を発現し、候補化合物と接触させた第１の細胞中の核ホルモン受容体の活性と、前記核内受容体及びヘルパータンパク質を発現し、候補化合物と接触させていない第２の細胞中の核内受容体の活性とを比較することであって、第１の細胞中の核内受容体の活性が第２の細胞中の核内受容体の活性と有意に異なる場合に、候補化合物は核内受容体の活性に影響を与えると判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される核酸によってコードされ、１つ又は複数のヘルパータンパク質が、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％のヌクレオチド配列が相同である核酸を含む核酸によってコードされ、１つ又は複
数のヘルパータンパク質が、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％のヌクレオチド配列が相同である核酸を含む核酸によってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のヘルパータンパク質が、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸が相同であるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のヘルパータンパク質が、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％のアミノ酸が相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸配列の組み合わせが、
配列番号５と配列番号１６１又は２１３；
配列番号９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；
配列番号２１、２３、２５又は２７と配列番号１４５、１４７又は２１３；
配列番号４９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；
配列番号４５と配列番号１４５又は２１３；
配列番号５１と配列番号１４５又は１４７；
配列番号５３、５５又は５７と配列番号１４５又は１４７；
配列番号６９と配列番号１６１又は２１３；
配列番号９３と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；
配列番号１０７と配列番号１６１；
配列番号１０３と配列番号１４５、１４７又は１６１；
配列番号１０１と配列番号１４５又は１４７；
配列番号１４３と配列番号１４５、１４７又は１６１；
配列番号２９と配列番号２１３；
配列番号４３と配列番号１６１；
配列番号６１と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；
配列番号７５と配列番号１４５又は１４７；
配列番号７９と配列番号１６１；
配列番号８７と配列番号１４５、１４７又は１６１；
配列番号８９と配列番号１４５、１４７又は１６１；
配列番号９９と配列番号１６１；
配列番号１２３、１２５又は１２７と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；並びに
配列番号１３５と配列番号１４５、１４７又は２１３
から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質のアミノ酸配列の組み合わせが、
配列番号６と配列番号１６２又は２１４；
配列番号１０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；
配列番号２２、２４、２６又は２８と配列番号１４６、１４８又は２１４；
配列番号５０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；
配列番号４６と配列番号１４６、１４８又は２１４；
配列番号５２と配列番号１４６又は１４８；
配列番号５４、５６又は５８と配列番号１４６又は１４８；
配列番号７０と配列番号１６２又は２１４；
配列番号９４と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；
配列番号１０８と配列番号１６２；
配列番号１０４と配列番号１４６、１４８又は１６２；
配列番号１０２と配列番号１４６又は１４８；
配列番号１４４と配列番号１４６、１４８又は１６２；
配列番号３０と配列番号２１４；
配列番号４４と配列番号１６２；
配列番号６２と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；
配列番号７６と配列番号１４６又は１４８；
配列番号８０と配列番号１６２；
配列番号８９と配列番号１４６、１４８又は１６２；
配列番号９０と配列番号１４６、１４８又は１６２；
配列番号１００と配列番号１６２；
配列番号１２４、１２６又は１２８と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；並びに
配列番号１３６と配列番号１４６、１４８又は２１４
から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が発現する核内受容体と、前記細胞が発現するヘルパータンパク質との組み合わせが、
ＴＲβとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＲＡＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＰＰＡＲγとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；
ＦＸＲとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＬＸＲβとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；
ＶＤＲとＳＲＣ１；
ＰＸＲとＳＲＣ１；
ＲＸＲαとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＥＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＡＲとＤＲＩＰ２０５；
ＭＲとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；
ＧＲとＳＲＣ１；
ＳＨＰとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；
ＲｅｖＥＲｂαとＥＲＫ２；
ＲＯＲγとＤＲＩＰ２０５；
ＨＮＦ４αとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＴＲ２αとＳＲＣ１；
ＴＬＸとＥＲＫ２；
ＣＯＵＰ−ＴＦβとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；
ＥＡＲ２とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；
ＥＲＲγとＥＲＫ２；
ＮＯＲ−１とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；並びに
ＧＣＮＦとＳＲＣ１又はＥＲＫ２
から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記判定するステップが、形態、リン酸化、分化、アポトーシス、突起形成、運動性、遺伝子発現、細胞受容体の発現、及び表現型の変化から成る群から選択される細胞パラメーターを評価することによって、前記化合物が１つ又は複数の核内受容体の活性に影響を与えるかどうか判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
転写レベルが前記核内受容体の活性化に応答するプロモーターを含む核酸であって、検出可能な産物をコードする核酸に作動可能に連結されている該プロモーターを含む核酸を細胞に導入すること、及び検出可能な産物の量の測定によって、候補化合物が核内受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であって、
１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
この第２の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、及び
前記核内受容体及び前記１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、該核内受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションしたが、該１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションしていない細胞の増殖レベルと比較することによって、該１つ又は複数のヘルパータンパク質が該核内受容体と相互作用するかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項１６】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記核内受容体をコードするＤＮＡが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記核内受容体をコードするＤＮＡが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列と少なくとも７０％相同の配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記核内受容体をコードするＤＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記核内受容体をコードするＤＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列と少なくとも７０
％相同の配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列と少なくとも７０％相同の配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される配列と少なくとも７０％相同の配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び前記細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡが、同一ベクター上に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び前記細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡが、別々のベクター上に存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の細胞培養物をトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートするステップが、該第１の細胞培養物を核内受容体に結合するリガンドと接触させることを含み、前記第２の細胞培養物をトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすることが、該第２の細胞培養物を核内受容体に結合するリガンドと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記リガンドがアゴニストである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リガンドがアンタゴニストである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であって、
１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該細胞培養物を、核内受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである種々の濃度のリガンドと共に、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該細胞培養物を、核内受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである種々の濃度のリガンドと共に、前記第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
前記核内受容体及び前記１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、該核内受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションしたが、該１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションしていない細胞の増殖レベルと比較することによって、該１つ又は複数のヘルパータンパク質が該核内受容体と相互作用するかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項３２】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質がコアクチベーターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質がコリプレッサーである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質がキナーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質がシグナル伝達分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質が、コリプレッサー、キナーゼ及びシグナル伝達分子から成る群から選択される少なくとも２つのヘルパータンパク質を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記核内受容体をコードするＤＮＡが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記核内受容体をコードする前記ＤＮＡが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、
１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする前記ＤＮＡが、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び前記細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡが、同一ベクター上に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び前記細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡが、別々のベクター上に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
核内受容体のリガンドである物質を同定する方法であって、
核内受容体をコードするＤＮＡ、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞と、トランスフェクションしていない細胞との混合物を含む細胞培養物を、該核内受容体の潜在的なアゴニスト又はアンタゴニストである試験物質と共に、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、及び
前記トランスフェクション細胞中のマーカーレベルの測定によって、細胞増殖の増減を判定すること
を含む方法。
【請求項４４】
核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であって、
１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、
トランスフェクションしていない第１のタイプの細胞と比較して、トランスフェクションした第１のタイプの細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、
前記１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第２の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、並びに
トランスフェクションしていない第２のタイプの細胞と比較して、トランスフェクションした第２のタイプの細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること
を含み、第１のタイプに対する試験物質の影響が、第２のタイプに対する試験物質の影響の反対である場合、該試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する方法。
【請求項４５】
核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であって、
１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、
トランスフェクションしていない細胞と比較して、第１の細胞培養物中のトランスフェクションした細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、
１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質とは異なる１つ又は複数の第２のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、並びに
トランスフェクションしていない細胞と比較して、第２の細胞培養物中のトランスフェクションした細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること
を含み、第１の細胞培養物に対する試験物質の影響が、第２の細胞培養物に対する試験物質の影響の反対である場合、該試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する方法。
【請求項４６】
核内受容体の選択的調節因子である物質を同定する方法であって、
核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、
トランスフェクションしていない第１のタイプの細胞と比較して、トランスフェクションした第１のタイプの細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、
前記核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第２の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、並びに
トランスフェクションしていない第２のタイプの細胞と比較して、トランスフェクションした第２のタイプの細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること
を含み、第１のタイプに対する試験物質の影響が、第２のタイプに対する試験物質の影響の反対である場合、該試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する方法。
【請求項４７】
２つの核内受容体間の相互作用を同定する方法であって、
第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ、及び第１の核内受容体をコードするＤＮＡ又は第２の核内受容体をコードするＤＮＡのいずれかで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
前記第２の細胞培養物を、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
両方の核内受容体を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ、及び第１の核内受容体をコードするＤＮＡ又は第２の核内受容体をコードするＤＮＡのいずれかでトランスフェクションした細胞の増殖レベルと比較することによって、核内受容体が相互作用するかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項４８】
２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であって、
第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、
核内受容体の１つをコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ、及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで、又は両方の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、並びに
第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖レベルを、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖レベルと比較することによって、２つの核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質が相互作用するかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項４９】
２つの核内受容体のリガンドである物質を検出する方法であって、
第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞の混合物を含む細胞培養物を、核内受容体の潜在的なアゴニスト又はアンタゴニストである試験物質と、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、及び
前記トランスフェクション細胞中の細胞増殖マーカーレベルの測定によって、細胞増殖の増減を判定すること
を含む方法。
【請求項５０】
２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を検出する方法であって、
第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、
第１の細胞培養物中の非トランスフェクション細胞と比較して、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、
第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第２の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、並びに
第２のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第２のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること
を含み、第１のタイプに対する試験物質の影響が、第２のタイプに対する試験物質の影響の反対である場合、該試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する方法。
【請求項５１】
２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であって、
１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第１の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、
非トランスフェクション細胞と比較して、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、
１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質と異なる１つ又は複数の第２のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、
該第２の細胞培養物を試験物質と共にインキュベートすること、並びに
非トランスフェクション細胞と比較して、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること
を含み、第１の細胞培養物に対する試験物質の影響が、第２の細胞培養物に対する試験物質の影響の反対である場合、該試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する方法。
【請求項５２】
１つ又は複数のヘルパータンパク質及び１つ又は複数の核内受容体を発現する細胞中でアッセイを行うことを含む、核内受容体機能のアッセイを可能にするか又は改良する方法。
【請求項５３】
１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸あるいは１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸が前記細胞に導入されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸が前記細胞に導入されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質が、異なる核酸によってコードされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質が、同一の核酸によってコードされる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
細胞を物質に接触させること、及び該物質が核内受容体活性を正又は負に調節する核内受容体のリガンドであるかどうかを判定することを更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
細胞パラメーターを評価することにより、機能又は機能する能力が知られていない核内受容体の機能を検出又は確認することを更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
機能又は機能する能力が知られていない１つ又は複数の核内受容体のシグナル伝達性を評価することにより、該受容体のためのアッセイを最適化することを更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ又は複数の核内受容体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４
３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同の核酸によってコードされる、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ヘルパータンパク質が、受容体が通常引き起こさない受容体活性化に対して反応することができる、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ヘルパータンパク質が、受容体が通常引き起こす応答を増幅する、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ヘルパータンパク質が、受容体が通常は引き起こさないが、他のヘルパータンパク質によって引き起こすことができる反応を増幅する、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ヘルパータンパク質が、受容体の一次機能応答の検出を妨害する受容体応答を阻害する、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるコアクチベーターである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列が相同な核酸によってコードされるコアクチベーターである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるコリプレッサーである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列が相同な核酸によってコードされるコリプレッサーである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸に
よってコードされるキナーゼである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ヘルパータンパク質が、配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列が相同な核酸によってコードされるキナーゼである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ヘルパータンパク質が、シグナル伝達経路の方向を変える２つ以上のタンパク質のキメラであって、エフェクター又はシグナル出力を提供するドメインに調節又はシグナル入力を受けるドメインが結合している、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ヘルパータンパク質が、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない、天然に存在するタンパク質である、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ヘルパータンパク質が、機能アッセイのために過剰発現させて使用される細胞中で通常は発現する、天然に存在するタンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ヘルパータンパク質が、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない、天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたものである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ヘルパータンパク質が、機能アッセイするために過剰発現させて使用される細胞中で通常は発現する、天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたものである、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ヘルパータンパク質が、共発現した場合、核ホルモン受容体に対する機能応答の検出が可能となるか、又は改良される、２つ以上のタンパク質、キメラ、変異タンパク質又は切断タンパク質の混合物である、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ヘルパータンパク質が、前記受容体がより良好にシグナル伝達することを機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ヘルパータンパク質が、受容体の発現及び形成を機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ヘルパータンパク質が、前記受容体がリガンドに対してより高い感度で応答するのを機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である、請求項５２〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、クローニングされた核ホルモン受容体のリガンド又はヘルパータンパク質として作用する物質（アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト及び選択的調節因子）を同定するために開発された方法及び当該方法で使用される試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
医薬品の発見プロセスにおける重要な焦点は、受容体タンパク質の代理リガンドの同定である。核ホルモン受容体の場合、ほとんどの受容体（特に、ヒトに存在する受容体）がクローニングされ、薬理学的に特徴付けがされている。現在、製薬産業では、化学物質（天然及び人工）の膨大なライブラリーのスクリーニングによって、核ホルモン受容体のリガンドとして作用する物質の単離が試みられている。不運なことに、利用可能な方法及び技術には相当な制約があり、このことが非常に多数の標的に対してこれらのライブラリを効率的にスクリーニングする能力を制限している。
【０００３】
核ホルモン受容体は、より一般的には核内受容体と呼ばれ、リガンド活性化転写因子のファミリーと定義されている（Tenbaum他, Int J Biochem Cell Biol, 29:1325-41 (1997)、Willson他, Mol Endocrinol, 16:1135-44 (2002)）。これらは以下の調節ドメインの存在によって構造的に特徴付けられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及びそれぞれリガンド非依存性及びリガンド依存性である２つの転写活性化ドメインＡＦ−１及びＡＦ−２。単量体又は二量体（ＲＸＲ核内受容体とのホモ二量体又はヘテロ二量体）は、核内受容体に依存して機能的エフェクターを構成する。この遺伝子ファミリーは広範な種々の生理学的機能を調節し、それにより、内分泌代謝性疾患から神経障害、癌に至るまでの広範な治療可能性を有する。
【０００４】
核内受容体はコリプレッサー及びコアクチベーターと呼ばれる一連の補助ポリペプチドをリクルートすることによって機能し、これらの補助タンパク質が、転写を抑制又は活性化させる分子事象を仲介する。ほとんどの核内受容体について、このリクルートはリガンドへの核内受容体の結合により開始される。あるリガンドは、特定のコアクチベーター群又はコリプレッサー群のリクルートのみを誘発し、それにより、非常に選択的な影響を促進することができると予想される。更に、リン酸化／脱リン酸化も核内受容体自体及び／又はその補助タンパク質の活性に影響を与えることができる。同様に、このような調節に排他的に応答するあるリガンドを同定することができると推測するのは妥当である。一般的に言えば、これらの選択的調節因子は治療の観点から非常に興味深く、治療的価値を最大にし、副作用を最小にする。
【０００５】
クローニングした受容体とリガンドの相互作用の特徴付けにおける第１のステップは、リガンド感受性形態で受容体を発現することである。いくつかの受容体が、酵母及び大腸菌等の操作が容易なモデル系で発現させることができるのに対して、多くの受容体とリガンドの相互作用は、哺乳動物細胞だけに存在する翻訳後修飾の影響を受ける。更に、これらの受容体の多くは、その生物学的影響を正確に伝達するために哺乳動物タンパク質を必要とする。従って、広範に適用するために、哺乳動物系で発現するクローニングした受容体に基づくアッセイ系が最良である。
【０００６】
これまでに、核内受容体と相互作用するリガンドの能力は、受容体の結合部位に対する放射性標識リガンドとの競合によって評価されてきた。このようなアッセイは、ステップ
数が比較的少ないのでよく利用されている。しかし、結合アッセイには以下の多数の制約がある：（ｉ）多くの技術的理由のために、結合アッセイを、受容体の薬理学的性質に影響を与えることができる非生理学的条件下で行うこと、（ｉｉ）アゴニスト及びアンタゴニストを確実に区別できないこと、（ｉｉｉ）放射性標識リガンドが利用可能な結合部位のみしか研究することができないこと、（ｉｖ）リガンドが同定されていないオーファン受容体には、結合アッセイを容易に適用できないこと、（ｖ）放射性同位体の購入、取り扱い及び廃棄に多大な費用がかかること。
【０００７】
アゴニストリガンドとアンタゴニストリガンドとを確実に区別するために、核内受容体の機能的応答を測定する。受容体のアゴニスト活性に対する応答を、一般に、種々の内因性細胞タンパク質の活性変化として測定する。例としては、核内受容体とコアクチベーターとの間の相互作用の測定、核内受容体の転写活性化の測定が挙げられる。前者により、蛍光偏光（ＦＰ）及び時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）といった、蛍光ベースのアッセイが開発されている。後者は、核内受容体の転写活性化によって調節することができる、アッセイが容易なマーカータンパク質を含む。このアプローチにより、転写因子として機能する受容体を容易にアッセイすることができる。
【０００８】
上記の全ての方法に特有の理論的制約は、数種を超える受容体に対するあるリガンドを一度にアッセイできないことである。例えば、ＦＰ及びＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは核内受容体と特異的コアクチベーターの特異的相互作用に依存する。また、これらのアッセイは薬理学的特徴が非常に乏しい。より一般的には、ダイナミックレンジの制限、不適合なアッセイ条件、及び多くの受容体がその機能的応答に基づいて互いに識別することができないという事実のために、これらは多重アッセイに基づいて分析できない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［発明の要旨］
本発明の態様は、１つ又は複数のヘルパータンパク質及び１つ又は複数の核内受容体を発現する細胞におけるアッセイによって、核内受容体機能アッセイを可能にするか、又は改良する方法に関する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸あるいは１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸を細胞に導入することができる。他の実施形態では、１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質は異なる核酸にコードされるのに対して、他の実施形態では、核内受容体及びヘルパータンパク質は同一の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞を物質と接触させ、物質が受容体の活性を正又は負に調節するかどうかを判定し、それによりこの物質が核内受容体のリガンドであるかどうかを示すことができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質及び１つ又は複数の核内受容体を発現する細胞において実施される核内受容体機能のアッセイは、機能又は機能する能力が知られていない核内受容体の機能を検出又は確認するための細胞パラメーターも含み得る。いくつかの実施形態は、機能又は機能する能力が知られていない１つ又は複数の核内受容体のシグナル伝達性を評価することにより、これらの受容体の試験を最適化するステップも含み、１つ又は複数のヘルパータンパク質及び１つ又は複数の核内受容体を発現する細胞において実施される核内受容体機能のアッセイに関する。
【００１１】
上記方法のいくつかの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体が核酸によってコードされ、少なくとも１つのヌクレオチド配列が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４
１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される。上記方法のいくつかの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同の核酸によってコードされる。
【００１２】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は、通常は受容体が引き起こさない受容体活性化に応答することができる。上記方法の他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、通常は受容体が引き起こす応答を増幅することができる。更に他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、通常は受容体が引き起こさないが、他のヘルパータンパク質によって引き起こすことができる応答を増幅することができる。更に他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、受容体の一次機能応答の検出を妨害する受容体応答を阻止することができる。
【００１３】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又は配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同の核酸によってコードされるコアクチベーターである。
【００１４】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又は配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同の核酸によってコードされるコリプレッサーである。
【００１５】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又は配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％相同の核酸によってコードされるキナーゼである。
【００１６】
上記方法の他の実施形態では、ヘルパータンパク質はシグナル伝達経路の方向を変える
２つ以上のタンパク質のキメラであり、エフェクター又はシグナル出力を提供するドメインに調節又はシグナル入力を受けるドメインが結合する。
【００１７】
上記方法の実施形態では、ヘルパータンパク質は、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない、天然に存在するタンパク質である。他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、機能アッセイのために過剰発現させて使用される細胞中で通常は発現する、天然に存在するタンパク質である。
【００１８】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない、天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたものである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は、機能アッセイのために過剰発現させて使用される細胞中で通常は発現する、天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたものである。
【００１９】
上記方法のいくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は、２つ以上のタンパク質、キメラ、変異タンパク質又は切断タンパク質の混合物であり、共発現した場合に、核ホルモン受容体に対する機能的応答の検出を可能にするか、又は改良する。例えば、いくつかの実施形態では、ヘルパータンパク質は、受容体がより良好にシグナル伝達することを機能的にアッセイできるようにする、他の天然又は非天然の受容体である。他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、受容体の発現及び形成を機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である。他の実施形態では、ヘルパータンパク質は、受容体がリガンドに対してより高い感度で応答するのを機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である。
【００２０】
他の実施形態は、核内受容体の活性に対する候補化合物の影響を評価する方法に関し、核内受容体及びヘルパータンパク質を発現する細胞であって、核内受容体及びヘルパータンパク質の少なくとも１つが、細胞に導入されている核酸から発現される細胞を得ること、細胞を候補化合物に接触させること、候補化合物が核ホルモン受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定することを含む。いくつかの実施形態では、クローニングした核内受容体のリガンドを同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、複数のクローニングした受容体の活性に関して、化合物を同時スクリーニングすることによってリガンドを同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、核内受容体の活性によってリガンド濃度を測定する方法を提供する。他の実施形態では、核内受容体のリガンドを容易にアッセイするために組換えシグナル伝達分子を使用する方法を提供する。他の実施形態では、リガンドの核内受容体をコードするＤＮＡを同定する方法を提供する。他の実施形態は、リガンド依存性が変化した核内受容体の変異型を同定する方法を提供する。
【００２１】
１つの実施形態は、核ホルモン受容体のリガンドである物質を検出する方法であり、この方法は細胞内で１つ又は複数の核ホルモン受容体あるいは１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現すること、その細胞と候補物質を接触させること、及びその候補物質が核内受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定することを含む。実施形態の一つの態様において、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列を含む。一つの態様では、ヘルパータンパク質はコアクチベーターであり、そのコアクチベーターをコードするＤＮＡは、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９
、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１及び１９３から成る群から選択される配列を含む。更なる態様では、リガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子である。更なる実施形態では、ヘルパータンパク質はコリプレッサーであり、そのコリプレッサーをコードするＤＮＡは、配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択される配列を含む。更なる実施形態では、リガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子である。更なる実施形態において、ヘルパータンパク質はキナーゼであり、そのキナーゼをコードするＤＮＡは配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列を含む。更なる実施形態では、ヘルパータンパク質はリガンドであり、そのリガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子である。更なる実施形態では、ヘルパータンパク質はシグナル伝達分子であり、そのシグナル伝達分子は核ホルモン受容体の活性を直接的又は非直接的に調節する任意のポリペプチドとして定義される。更なる態様では、リガンドはアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子である。
【００２２】
更なる実施形態は、核ホルモン受容体のリガンドとして作用することができる物質を検出するための試験キットであり、（ａ）核内受容体及び１つ又は複数のコアクチベーターを発現すること、（ｂ）核内受容体及び１つ又は複数のコリプレッサーを発現すること、（ｃ）核内受容体及び１つ又は複数のキナーゼを発現すること、又は（ｄ）核内受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現することを含む。実施形態の１つの態様では、リガンドは、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子である。
【００２３】
本発明の更なる実施形態は、受容体の変異型又は受容体に会合するヘルパータンパク質の変異型を検出する方法であり、変異型が、１つ又は複数の以下の組み合わせ：（ａ）核内受容体及び１つ又は複数のコアクチベーターを発現すること、（ｂ）核内受容体及び１つ又は複数のコリプレッサーを発現すること、（ｃ）核内受容体及び１つ又は複数のキナーゼを発現すること、又は（ｄ）核内受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現することとして存在する、上記のクローニングした核内受容体の、リガンドに対する応答に影響を与える。本発明の１つの実施形態は、受容体の変異型又は受容体に会合するシグナル伝達タンパク質の変異型を検出する方法であり、変異型が、１つ又は複数の以下の組み合わせ：（ａ）核内受容体及び１つ又は複数のコアクチベーターを発現すること、（ｂ）核内受容体及び１つ又は複数のコリプレッサーを発現すること、（ｃ）核内受容体及び１つ又は複数のキナーゼを発現すること、又は（ｄ）核内受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現することとして存在する、上記のクローニングした核内受容体の、リガンドに対する応答に影響を与える。
【００２４】
本発明の更なる実施形態は、核ホルモン受容体のリガンドである物質を検出する方法であり、この方法は、以下の１つ：核ホルモン受容体及び１つ又は複数のコアクチベーターを発現すること、核ホルモン受容体及び１つ又は複数のコリプレッサーを発現すること、核ホルモン受容体及び１つ又は複数のキナーゼを発現すること、核ホルモン受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現することを含む。
【００２５】
１つの実施形態は、１つ又は複数のヘルパータンパク質及び１つ又は複数の核内受容体を発現する細胞中でアッセイを行うことによって、核内受容体の機能のアッセイを可能にするか、又は改良する方法である。１つの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸又は１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸は、細胞に導入されている。
【００２６】
更なる実施形態では、１つ又は複数の核内受容体をコードする核酸及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸は、細胞に導入されている。１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質は、異なる核酸によってコードされるか、又は同一の核酸によってコードされる。更なる実施形態では、この方法はまた、細胞を物質に接触させること、及び物質が核内受容体のリガンドであるかどうかを判定することを含む。リガンドは、核内受容体の活性を正又は負に調節することができる。この方法はまた、機能又は機能する能力が知られていない核内受容体の機能を検出又は確認するために細胞パラメーターを評価することを含む。あるいは、この方法は更に、機能又は機能する能力が知られていない１つ又は複数の核内受容体のシグナル伝達性を評価することにより、これらの受容体のためのアッセイを最適化することを含む。１つ又は複数の核内受容体が配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸、又はそれと少なくとも７０％相同のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。ヘルパータンパク質は、通常では受容体が引き起こさない受容体活性への応答を可能にし、且つ／又は通常では受容体が引き起こす応答を増幅する。１つの実施形態では、ヘルパータンパク質は、通常では受容体が引き起こさないが、他のヘルパータンパク質により引き起こされる応答を増幅さするか、又は代替的には、受容体の主な機能的応答の検出を妨害する受容体応答を阻害する。ヘルパータンパク質は、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又はそれと７０％相同のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるコアクチベーターである。ヘルパータンパク質は、配列番号１９５、１９７、１９９、２０１及び２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又はそれと少なくとも７０％相同のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるコリプレッサーである。ヘルパータンパク質は、配列番号２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、又はそれと７０％相同のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるキナーゼである。更なる実施形態では、ヘルパータンパク質は、シグナル伝達経路の方向を変える２つ以上のタンパク質のキメラであって、このキメラにはエフェクター又はシグナル出力を提供するドメインに調節又はシグナル入力を受けるドメインが結合している。ヘルパータンパク質は、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない天然に存在するタンパク質、機能アッセイのために過剰発現させて使用される細胞中で通常発現する、天然に存在するタンパク質、機能アッセイのために使用される細胞中で通常は発現しない天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたもの、機能アッセイのために過剰発現させて使用される細胞中で通常発現する、天然に存在するタンパク質を切断したもの又は変異させたもの、あるいはその混合物である。１つの実施形態では、ヘルパータンパク質は、受容体がより良好にシグナル伝達することを機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体、受容体の発現及び形成を機能的にアッセイできるようにする他の天然及び非天然の受容体、又は受容体がリガンドに対してより高い感度で応答することを機能的にアッセイできるようにする、他の天然及び非天然の受容体である。
【００２７】
１つの実施形態は、核内受容体の活性に対する候補化合物の影響を評価する方法であり、この方法は、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現し、核内受容体及びヘルパータンパク質の少なくとも１つが細胞に導入されている核酸から発現される細胞を得ること、細胞を候補化合物に接触させること、並びに候補化合物が核ホルモン受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定することによって評価する。
【００２８】
１つの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質の両方は、細胞に導入されている核酸から発現される。あるいは、１つ又は複数の核内受容体又は１つ又は複数のヘルパータンパク質は、細胞に導入されている同一の核酸から発現される。あるいは、１つ又は複数の核内受容体は、細胞に導入されている第１の核酸から発現され、１つ又は複数のヘルパータンパク質は、細胞に導入されている第２の核酸から発現される。
【００２９】
１つの実施形態では、判定ステップは、核内受容体及びヘルパータンパク質を発現し、候補化合物と接触させた第１の細胞中の核ホルモン受容体の活性と、核内受容体及びヘルパータンパク質を発現し、候補化合物と接触させていない第２の細胞中の核内受容体の活性を比較することを含み、第１の細胞中の核内受容体の活性が第２の細胞中の核内受容体の活性と有意に異なる場合に、候補化合物が核内受容体の活性に影響を与えると判定される。
【００３０】
１つの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される核酸によってコードされ、１つ又は複数のヘルパータンパク質は、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される核酸又は上記配列と７０％相同の配列によってコードされる。
【００３１】
更なる実施形態では、１つ又は複数の核内受容体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のヘルパータンパク質は、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択されるアミノ酸配列又は任意の上記配列と少なくとも７０％相同のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
１つの実施形態では、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸配列の組み合わせは、配列番号５と配列番号１６１又は２１３；配列番号９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号２１、２３、２５又は２７と配列番号１４５、１４７又は２１３；配列番号４９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号４５と配列番号１４５又は２１３；配列番号５１と配列番号１４５又は１４７；配列番号５３、５５又は５７と配列番号１４５又は１４７；配列番号６９と配列番号１６１又は２１３；配列番号９３と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号１０７と配列番号１６１；配列番号１０３と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号１０１と配列番号１４５又は１４７；配列番号１４３と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号２９と配列番号２１３；配列番号４３と配列番号１６１；配列番号６１と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号７５と配列番号１４５又は１４７；配列番号７９と配列番号１６１；配列番号８７と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号８９と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号９９と配列番号１６１；配列番号１２３、１２５又は１２７と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；並びに配列番号１３５と配列番号１４５、１４７又は２１３から成る群から選択される。
【００３３】
更なる実施形態では、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質のアミノ酸配列の組み合わせは、配列番号６と配列番号１６２又は２１４；配列番号１０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号２２、２４、２６又は２８と配列番号１４６、１４８又は２１４；配列番号５０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号４６と配列番号１４６、１４８又は２１４；配列番号５２と配列番号１４６又は１４８；配列番号５４、５６又は５８と配列番号１４６又は１４８；配列番号７０と配列番号１６２又は２１４；配列番号９４と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号１０８と配列番号１６２；配列番号１０４と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号１０２と配列番号１４６又は１４８；配列番号１４４と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号３０と配列番号２１４；配列番号４４と配列番号１６２；配列番号６２と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号７６と配列番号１４６又は１４８；配列番号８０と配列番号１６２；配列番号８９と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号９０と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号１００と配列番号１６２；配列番号１２４、１２６又は１２８と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；並びに配列番号１３６と配列番号１４６、１４８又は２１４から成る群から選択される。
【００３４】
更なる実施形態では、細胞によって発現される核内受容体と細胞によって発現されるヘルパータンパク質との組み合わせは、ＴＲβとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＲＡＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＰＰＡＲγ／ＲＸＲとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＦＸＲ／ＲＸＲとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＬＸＲβ／ＲＸＲとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＶＤＲ／ＲＸＲとＳＲＣ１；ＰＸＲとＳＲＣ１；ＲＸＲαとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＥＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＡＲとＤＲＩＰ２０５；ＭＲとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；ＧＲとＳＲＣ１；ＳＨＰとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＲｅｖＥＲｂαとＥＲＫ２；ＲＯＲγとＤＲＩＰ２０５；ＨＮＦ４αとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＴＲ２αとＳＲＣ１；ＴＬＸとＥＲＫ２；ＣＯＵＰ−ＴＦβとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；ＥＡＲ２とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＥＲＲγとＥＲＫ２；ＮＯＲ−１とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；並びにＧＣＮＦとＳＲＣ１又はＥＲＫ２から成る群から選択される。
【００３５】
１つの実施形態では、判定するステップが、形態、リン酸化、分化、アポトーシス、プロセス形成、運動性、遺伝子発現、細胞受容体の発現、及び表現型の変化から成る群から選択される細胞パラメーターの評価によって、化合物が１つ又は複数の核内受容体の活性
に影響を与えるかどうか判定することを含む。更なる実施形態では、この方法は、転写レベルが核内受容体の活性化に応答する、検出可能な産物をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含む核酸を細胞に導入すること、及び検出可能な産物の量を測定することによって、候補化合物が核内受容体の活性に影響を与えるかどうかを判定することを含む。
【００３６】
更なる実施形態は、核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であって、この方法は、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、並びに核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、核内受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションしたが、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションしていない細胞の増殖レベルと比較することによって、１つ又は複数のヘルパータンパク質が核内受容体と相互作用するかどうかを判定することによって同定される。
【００３７】
１つの実施形態では、ヘルパータンパク質は、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択されるか、又はこれらと７０％相同である。
【００３８】
更なる実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列又はこれらと７０％相同の配列を含む。
【００３９】
更なる実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列又はこれらと７０％相同の配列を含むポリペプチドをコードする。
【００４０】
更なる実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０
３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列又はこれらと７０％相同の配列を含む。
【００４１】
更なる実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される配列又はこれらと７０％相同の配列を含むポリペプチドをコードする。
【００４２】
更なる実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡは、同一ベクター上又は異なるベクター上に存在する。
【００４３】
更なる実施形態では、第１の細胞培養物をトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすることは、第１の細胞培養物を核内受容体に結合するリガンドと接触させることを含み、第２の細胞培養物をトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすることは、第２の細胞培養物を核内受容体に結合するリガンドと接触させることを含む。リガンドは、アゴニスト又はアンタゴニストである。
【００４４】
１つの実施形態は、核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であり、この方法は、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、核内受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである種々の濃度のリガンドと共に細胞培養物を、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、核内受容体のアゴニスト又はアンタゴニストである種々の濃度のリガンドと共に細胞培養物を、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、核内受容体をコードするＤＮＡでトランスフェクションしたが、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションしていない細胞の増殖レベルと比較することによって、１つ又は複数のヘルパータンパク質が核内受容体と相互作用するかどうかを判定することによって同定する。１つ又は複数のヘルパータンパク質は、コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ、シグナル伝達分子又は上記の少なくとも２つである。
【００４５】
１つの実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される配列を含む。更なる実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、
９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする。
【００４６】
１つの実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される配列を含む。更なる実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２から成る群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする。核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡは、同一ベクター上又は別々のベクター上に存在する。
【００４７】
更なる実施形態は、核内受容体のリガンドである物質を同定する方法であり、この方法は、核内受容体をコードするＤＮＡ、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ、及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞と非トランスフェクション細胞との混合物を含む細胞培養物を、核内受容体の潜在的なアゴニスト又はアンタゴニストである試験物質と、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、及びトランスフェクション細胞中のマーカーレベルの測定によって細胞増殖の増減を判定することによって同定する。
【００４８】
更なる実施形態は、核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であり、この方法は、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、第１のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第１のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定すること、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、第２のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第２のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定することによって同定し、試験物質の第１のタイプに対する影響が試験物質の第２のタイプに対する影響の反対である場合、試験物質は核内受容体の選択的調節因子であると判定する。
【００４９】
更なる実施形態は、核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であり、この方法は、１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、非トランスフェクション細胞と比較して、第１の細胞培養物培中のトランスフェクション細胞の増殖が、試
験物質により増減するかどうかを判定すること、１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質と異なる１つ又は複数の第２のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、非トランスフェクション細胞と比較して、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定することによって同定し、試験物質の第１の細胞培養物に対する影響が試験物質の第２の細胞培養物に対する影響の反対である場合、試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する。
【００５０】
更なる実施形態は、核内受容体の選択的調節因子である物質を同定する方法であり、この方法は、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、第１のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第１のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が試験物質により増減するかどうかを判定すること、核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、第２のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第２のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定することによって同定し、試験物質の第１のタイプに対する影響が試験物質の第２のタイプに対する影響の反対である場合、試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する。
【００５１】
更なる実施形態は、２つの核内受容体間の相互作用を同定する方法であり、この方法は、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ及び第１の核内受容体をコードするＤＮＡ又は第２の核内受容体をコードするＤＮＡのいずれかで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、両方の核内受容体を発現するトランスフェクション細胞の増殖レベルを、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡ及び第１の核内受容体をコードするＤＮＡ又は第２の核内受容体をコードするＤＮＡのいずれかでトランスフェクションした細胞の増殖レベルと比較することによって、核内受容体が相互作用するかどうかを判定することによって同定する。
【００５２】
更なる実施形態は、２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との間の相互作用を同定する方法であり、この方法は、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、核内受容体の１つをコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡでトランスフェクションするか、又は両方の核受容をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖レベルを、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖レベルと比較することによって、２つの核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質が相互作用するかどうかを判定することによって同定する。
【００５３】
１つの実施形態は、２つの核内受容体のリガンドである物質を検出する方法であり、この方法は、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ
、細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡでトランスフェクションした細胞の混合物を含む細胞培養物を、核内受容体のアゴニスト又はアンタゴニストとなる可能性がある試験物質と、トランスフェクション細胞の細胞増殖に十分な時間インキュベートすること、及びトランスフェクション細胞中の細胞増殖マーカーのレベルを測定することによって細胞増殖の増減を判定することによって検出する。
【００５４】
更なる実施形態は、２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質の特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を検出する方法であり、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１のタイプの細胞を含む第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、第１の細胞培養物中の非トランスフェクション細胞と比較して、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定すること、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２のタイプの細胞を含む第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、及び第２のタイプの非トランスフェクション細胞と比較して、第２のタイプのトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定することによって検出し、試験物質の第１のタイプに対する影響が試験物質の第２のタイプに対する影響の逆である場合、試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する。
【００５５】
１つの実施形態は、２つの核内受容体と１つ又は複数のヘルパータンパク質との特定の組み合わせに対する選択的調節因子である物質を同定する方法であり、１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第１の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第１の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、非トランスフェクション細胞と比較して、第１の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定すること、１つ又は複数の第１のヘルパータンパク質と異なる１つ又は複数の第２のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡと共に、第１の核内受容体をコードするＤＮＡ、第２の核内受容体をコードするＤＮＡ及び細胞増殖マーカーをコードするＤＮＡで第２の細胞培養物をコトランスフェクションすること、第２の細胞培養物を試験物質とインキュベートすること、非トランスフェクション細胞と比較して、第２の細胞培養物中のトランスフェクション細胞の増殖が、試験物質により増減するかどうかを判定することによって同定し、試験物質の第１の細胞培養物に対する影響が試験物質の第２の細胞培養物に対する影響の反対である場合、試験物質が核内受容体の選択的調節因子であると判定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本明細書は、核内受容体のリガンドを検出及び同定し、核内受容体とヘルパータンパク質との間の相互作用を判定し、２つの核内受容体の間の相互作用を判定し、２つの核内受容体とヘルパータンパク質との間の相互作用を判定する方法を開示する。
【００５７】
少なくとも１つの核内受容体及び少なくとも１つのヘルパータンパク質を細胞中で発現させる方法を開示する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核内受容体及び少なくとも１つのヘルパータンパク質を発現する細胞を使用して、核内受容体活性に対する候補化合物の影響を評価することができる。他の実施形態では、少なくとも１つの核内受容体及び少なくとも１つのヘルパータンパク質を発現する細胞を使用して、特定の核ホルモン受容体と相互作用するヘルパータンパク質を同定することができる。本発明の他の実施形態は、２つの核内受容体の間の相互作用を同定する方法に関し、２つの核内受容体が細
胞中で発現し、相互作用する能力を細胞パラメーターによって評価する。前記の各方法で評価された相互作用を、このような相互作用を検出することができる任意のアッセイを使用して評価することができる。好ましい実施形態では、前記の各方法で評価された相互作用を、全体が本明細書中で参照として援用される米国特許第５，７０７，７９８号、同第５，９１２，１３２号及び同第５，９５５，２８１号に記載のＲＳＡＴアッセイによって、細胞増殖の程度を評価することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、受容体活性に対する候補化合物の影響を、候補化合物と接触させた細胞中の受容体活性と候補化合物と接触させていない細胞中の受容体活性を比較することによって判定することができる。いくつかの実施形態では、細胞を受容体の既知のアクチベーター又は既知のインヒビター及び候補化合物と接触させて、アクチベーター又はインヒビターの作用に対する候補化合物の影響を判定する。
【００５８】
１つの実施形態では、細胞中で１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質を発現し、細胞を候補化合物と接触させ、候補化合物が受容体活性に影響を与えるかどうかを判定することによる、核内受容体活性に対する候補化合物の影響を評価する方法を開示する。本発明の各方法に当てはまることだが、本発明のいくつかの態様では、核内受容体及びヘルパータンパク質の少なくとも１つ又は両方を、細胞に導入されている核酸から発現することができる。既知の化合物を試験する場合でも、受容体と相互作用する新規の化合物を同定する場合においても任意の候補化合物を使用することができる。例えば、候補化合物を使用することができ、この中には小分子、薬物、核酸、ペプチド、リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、他の受容体（他の核内受容体を含む）、コリプレッサー、コアクチベーター、キナーゼ及び／又はシグナル伝達分子をコードする核酸が細胞に導入される。
【００５９】
１つの実施形態では、上記方法は、核ホルモン受容体と相互作用するヘルパータンパク質をコードする他の「ヘルパー遺伝子」を同定するため及び／又は「ヘルパー遺伝子」の存在下でクローニングした核ホルモン受容体と相互作用するリガンドを同定するために用いられる。本発明の方法を使用して同定することができる分子には、クローニングした核ホルモン受容体のリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト及び選択的調節因子が含まれるが、これらに限定されない。上記方法は、単一クローニング受容体、多クローニング受容体、及びヘテロ二量体として作用する混合受容体に対する活性についての化合物の同時スクリーニングによってこれらの化合物を同定するために用いられる。上記方法は、リガンド依存性が変化した核内受容体の変異型及び核内受容体活性を直接又は間接的に調節するコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子の群由来の任意のヘルパータンパク質の変異型を同定するためにも用いられる。この方法により、アッセイに機能的に関連する測定可能な出力が得られる。測定可能な出力は、当業者に既知の任意の出力であり、リガンド及び／又は「ヘルパー遺伝子」の活性を同定し、試験化合物を使用した細胞と使用しない細胞とを比較することができる。１つの実施形態では、測定可能な出力は、細胞増殖である。更なる実施形態では、測定可能な出力には、遺伝子発現、リン酸化、形態、分化、細胞受容体の発現、アポトーシス、任意の他の表現型の変化、又は細胞運動性といった活性が含まれるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、レポーター遺伝子を対象のプロモーターから発現させ、測定可能な出力をレポーター遺伝子発現による測定によって分析する。
【００６０】
１つの実施形態では、この方法は、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子として作用することができる物質を検出することを含み、
（ａ）１つ又は複数の、核内受容体及び１つ又は複数のコアクチベーター、核内受容体及び１つ又は複数のコリプレッサー、核内受容体及び１つ又は複数のキナーゼ、核内受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現させるために細胞を培養すること、
（ｂ）細胞を少なくとも１つの試験化合物とインキュベートすること、
（ｃ）核内受容体活性の任意の変化を判定し、当該核内受容体のリガンドである試験化合物を同定すること、
によって検出する。
【００６１】
別の態様では、リガンド、アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト及び／又は選択的調節因子として作用することができる物質を検出するための試験キットを提供し、このキットは、
（ａ）少なくとも１つの核内受容体及び１つ又は複数のコアクチベーターの少なくとも１つを発現する細胞、又は核内受容体及び１つ又は複数のコリプレッサーを発現する細胞、又は核内受容体及び１つ又は複数のキナーゼを発現する細胞、又は核内受容体及び１つ又は複数のシグナル伝達分子を発現する細胞、
（ｂ）細胞とインキュベートするための少なくとも１つの試験化合物、
（ｃ）測定可能な出力を使用して、核内受容体活性の任意の変化を判定する方法であって、当該核内受容体のリガンドである試験化合物を同定する方法
を含む。
【００６２】
この試験キットは、１つ又は複数の核内受容体と試験物質を同時にインキュベートすることによって、試験物質（又は、場合によっては多数の試験物質）が特定の受容体のリガンド、アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト及び／又は選択的調節因子として作用する能力を判定するという、本発明の方法の実施形態に有用である。
【００６３】
本発明の各方法における核内受容体は、当業者に既知の任意の核内受容体である。核内受容体を細胞中で単一で発現することができ、あるいは複数の核内受容体を同一の細胞内又は細胞群内で発現することができる。例えば、ヘテロ二量体のような相互作用することが知られている核内受容体を同一細胞中で発現することができる。あるいは、共通のリガンド又はヘルパータンパク質を共有する核内受容体を、同一細胞中で発現することができる。あるいは、いかなる既知の相互作用又は共通点も有さない受容体を、同一細胞中で発現することができる。表１は、本明細書中に記載のアッセイで使用することができる核内受容体の非制限的なリストを示す。
【００６４】
ヘルパータンパク質を発現する１つ又は複数のヘルパー遺伝子は、任意のヘルパータンパク質である。特異的な受容体と相互作用することが知られているヘルパータンパク質を使用することができる。あるいは、ヘルパータンパク質が特定の受容体と相互作用し、調節するかどうかを同定することにより、ヘルパータンパク質を試験することができる。表２は、本明細書中に記載のアッセイで使用することができるヘルパータンパク質の非制限的なリストを示す。
【００６５】
１つ又は複数の核内受容体に加えて、ヘルパータンパク質を使用することの１つの利点は、受容体活性を増強して、より容易に測定できる影響を得ることができることである。別の利点は、核内受容体とヘルパータンパク質との組み合わせと特異的に相互作用する化合物を同定することができることである。核内受容体とヘルパータンパク質の組み合わせの非制限的な例を表４に示すが、これらはアッセイの任意の実施形態で使用することができる。
【００６６】
核内受容体及び／又はヘルパータンパク質の少なくとも１つの発現は、細胞に導入された核酸に由来する。いくつかの実施形態では、核内受容体及びヘルパータンパク質を同一の核酸から発現させる。他の実施形態では、これらを異なる核酸から発現させる。いくつかの実施形態では、２つ以上の核内受容体を同一細胞中で発現させる。いくつかの実施形態では、２つ以上のヘルパータンパク質を同一細胞中で発現させる。更なる実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパクを細胞によって自然に発現させるか、又は過剰発現さ
せる。
【００６７】
更なる実施形態では、細胞増殖マーカー又は代替的にはレポーター遺伝子も細胞中で発現させる。細胞増殖マーカー又はレポーター遺伝子を、受容体又はヘルパー由来の別々の核酸から発現させるか、もしくは核内受容体及び／又はヘルパー遺伝子と同一の核酸から発現させることができる。
【００６８】
１つの実施形態では、測定可能な出力を使用して、試験される化合物による受容体活性の変化を同定する。１つの実施形態では、測定可能な出力は形態学的変化である。従って、例えば、細胞を試験物質でトランスフェクションし、試験物質を含まない対照細胞を試験物質を発現する細胞と比較することができる。この細胞を顕微鏡によって分析し、任意の形態学的変化を同定することができる。１つの実施形態では、形態学的変化は細胞の分化によって起こる。
【００６９】
更なる実施形態では、リン酸化の変化に関して細胞を分析する。リン酸化の変化は、当業者に既知の任意の方法を使用して同定することができ、例えば、Ｐ32標識化ＡＴＰをリン酸化アッセイで使用し、細胞に取り込まれた放射性標識の量を分析することができる。リン酸化の変化は、リン酸化の増減を含む定量的変化であるか、又は代替的には、リン酸化したタンパク質の分子量の変化又はリン酸化したタンパク質の位置の変化といった定性的変化である。１つの実施形態では、リン酸化タンパク質を認識する抗体を使用することができる。これらの抗体を、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析及びｉｎ  ｓｉｔｕ技術が含まれるが、これらに限定されない当業者に既知の種々の方法で定量及び／又は分析することができる。抗体の位置、量及び／又はパターンといった変化を分析することができる。あるいは、細胞抽出物中で結合する抗体の量及び／又は抗体に結合するタンパク質の大きさを分析することができる。他の実施形態では、核内受容体レベルに応じた細胞内のタンパク質のリン酸化を、二次元ゲル電気泳動を使用して評価することができる。
【００７０】
更なる実施形態では、測定可能な出力として遺伝子発現を使用することができる。１つの実施形態では、レポーター遺伝子を使用する。レポーター遺伝子を、このアッセイ中の少なくとも１つの核ホルモン受容体に特異的なホルモン応答エレメントを含むプロモーターから発現させることができる。いくつかの実施形態では、レポーターコンストラクトを少なくとも１つの受容体をコードする核酸及び少なくとも１つのヘルパータンパク質をコードする核酸（「ヘルパー遺伝子」）と共に細胞にトランスフェクトし、この細胞を１つ又は複数の試験物質と接触させることができる。トランスフェクトされた任意の又は全ての遺伝子は、同一の核酸又は別々の核酸上に存在する。レポーターの転写レベルと相関する測定可能な出力は、試験物質の存在下及び非存在下で定量することができる。
【００７１】
［定義］
本明細書及び特許請求の範囲では、以下の用語を、以下に示すように定義するものとする。
【００７２】
「試験物質」及び／又は「候補化合物」は、生物活性を有する可能性のある任意の薬物、化合物又は分子が含まれると意図される。試験物質は、ヘルパー遺伝子と組み合わされて、核ホルモン受容体と機能的に相互作用することができる任意の物質である。
【００７３】
「リガンド」は、受容体活性を阻害するか又は刺激する任意の物質が含まれると意図される。「アゴニスト」は、受容体の機能活性（すなわち、受容体を介したシグナル伝達）を増加させるリガンドと定義される。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用の阻害するか又はそれ自体の活性の阻害（逆アゴニスト）することによって受容体の機能活性を低減させるリガンドと定義される。「選択的調節因子」は、核内受容体とコアクチベーター
、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子の群由来の１つ又は複数のポリペプチドとの特定の組み合わせに対する活性を調節するリガンドと定義される。
【００７４】
核ホルモン受容体の「調節因子」及び／又は「ヘルパー遺伝子」には、核内受容体の活性を直接又は間接的に調節する任意のポリペプチドであって、コリプレッサー、キナーゼ、シグナル伝達分子、コアクチベーター、ペプチド及び受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
「核内受容体」には、細胞の内側の細胞質中及び／又は細胞の生理機能に影響を与える核内に存在し、リガンドによって阻害又は刺激される任意の分子が含まれると意図される。一般的には、核内受容体は、リガンド結合に応答せず（ＡＦ−１）、又は応答して（ＡＦ−２）細胞シグナルを引き起こす１つ又は２つの転写活性化ドメイン（ＡＦ−１及びＡＦ−２）、リガンド結合性を有するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ＤＮＡ上の特異的配列（シス作用エレメント）と相互作用するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。更に、「核内受容体」には、切断受容体、修飾受容体、変異受容体、又は核内受容体の配列の一部もしくは全体を含む任意の分子が含まれる。
【００７６】
[実施形態]
本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核内受容体をコードするＤＮＡは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される核酸、あるいはそれと相同な核酸を含む。いくつかの実施形態では、相同な核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％あるいは少なくとも７０％相同である。いくつかの実施形態では、相同な核酸は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３の１つの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続的なヌクレオチドを含む核酸と少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％あるいは少なくとも７０％の核酸配列と相同である。相同性はデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０あるいはデフォルトパラメータを用いたｔＢＬＡＳＴＸを使用して測定できる(Altschul, S.F.他, ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新たなタンパク質データベース探索プログラム, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は参照により全体が本明細書に援用される)。あるいは、いくつかの実施形態では、相同な核酸は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、
２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３から成る群から選択される核酸を含む機能的オーソログクラスター中に存在する核酸である。そのオーソログクラスターの全ての他の要素はホモログであると考えられる。機能的オーソログクラスターの例示的なライブラリは、米国国立衛生研究所の米国国立医学図書館における米国国立バイオテクノロジーセンターのウェブ・サイトで見られ、ＩＮＴＥＲＮＥＴ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）又はＮＥＴＳＣＡＰＥ（商標）といったウェブ・ブラウザのアドレスバーに以下の引用文「www.ncbi.nim.nih」を入力し、その続きに「.gov/COG」を入力することでインターネット上でアクセスできる。遺伝子は上記の米国国立バイオテクノロジーセンターのウェブ・サイトで利用可能なＣＯＧＮＩＴＯＲプログラムを用いて、あるいは対象となる遺伝子とＣＯＧ要素を直接的にＢＬＡＳＴＰ比較し、その結果をTatusov, R. L., Galperin, M. Y., Natale, D. A.及びKoonin, E. V. 「ＣＯＧデータベース : タンパク質機能と進化のゲノム規模の分析ツール」(Nucleic Acids Research, vol.28 no.1, pp.33-36, 2000)に記載されるように分析することでオーソログのクラスター群又はＣＯＧに分類することができる。
【００７７】
本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４の１つのアミノ酸配列、あるいは少なくともそれの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続的なアミノ酸を含む断片と少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも２５％の相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、相同性又は類似性はデフォルトパラメータを用いたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムより確定される。あるいは、タンパク質の相同性や類似性はデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＸ、デフォルトパラメータを用いたＴＢＬＡＳＴＮ又はデフォルトパラメータを用いたｔＢＬＡＳＴＸで同定することができる(Altschul, S.F.他, ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新たなタンパク質データベース探索プログラム, Nucleic Acid Res., 25:3389-3402, 1997)、この開示は参照により全体が本明細書に援用される)。
【００７８】
本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの核内受容体をコードするＤＮＡはストリンジェントな条件あるいは緩やかな条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３の１つに相補的な核酸配列から成る群から選択される核酸にハイブリダイズするＤＮＡを含む。本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡはストリンジェントな条件あるいは緩やかな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１
７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１及び１４３の１つを含むが、これらに限定されない、核ホルモン受容体をコードする核酸と相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続的なヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするＤＮＡを含む。本明細書中で用いる場合、「ストリンジェントな条件」は、約４５℃で６×ＳＳＣにおいてフィルタに結合した核酸にハイブリダイズし、続いて約６８℃で０．１×ＳＳＣ/０．２％ＳＤＳを用いて１回又は複数回洗浄することを意味する。他の例示的なストリンジェントな条件としては例えば使用される特定のプローブに適切な３７℃、４８℃、５５℃及び６０℃で６×ＳＳＣ/０．０５％ピロリン酸ナトリウムを用いて洗浄することを示す。本明細書中で用いる場合、「緩やかな条件」とは、４５℃で６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）においてフィルタに結合したＤＮＡにハイブリダイズし、続いて約４２〜６５℃で０．２×ＳＳＣ/０．１％ＳＤＳにおいて１回、好ましくは３〜５回洗浄することを意味する。
【００７９】
本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列と少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも２５％のアミノ酸の相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、核内受容体をコードするＤＮＡが配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２及び１４４から成る群から選択される配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続的なアミノ酸を含む断片と少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも２５％のアミノ酸の相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。相同性又は類似性はデフォルトパラメータを用いたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムにより確定される。あるいは、タンパク質の相同性又は類似性はデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＸ、又はデフォルトパラメータを用いたＴＢＬＡＳＴＮで同定することができる(Altschul, S.F.他, ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新たなタンパク質データベース探索プログラム, Nucleic Acid Res., 25:3389-3402, 1997、この開示は参照により全体が本明細書に援用される)。
【００８０】
あるいは、上記の核内受容体は変異型核内受容体であり、変異体の活性と野生型の受容体の活性とを比較するためのアッセイに用いられる。
【００８１】
核内受容体をコードするＤＮＡに加えて、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが発現する、本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される「補助遺伝子」のＤＮＡ配列、あるいは配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％又は少なくとも４０％相同のＤＮＡを含む。別の実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１の１つの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続的なヌクレオチドを含む核酸と少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％又は少なくとも４０％のヌクレオチド配列と相同のＤＮＡ配列を含む。相同性はデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮバージョン２．０又はデフォルトパラメータを用いたｔＢＬＡＳＴＸで測定することができる(Altschul, S.F.他, ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新たなタンパク質データベース探索プログラム, Nucleic Acid Res., 25:3389-3402, 1997、この開示は参照により全体が本明細書に援用される)。あるいは、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡは配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１から成る群から選択される核酸を含む機能的オーソログクラスター中に含まれる核酸を含む。このオーソログクラスターの全ての他のメンバーは本明細書中に記載の各方法で用いることができる。機能的オーソログクラスターのこのようなライブラリは、米国国立衛生研究所の米国国立医学図書館における米国国立バイオテクノロジーセンターのウェブ・サイトで見られ、ＩＮＴＥＲＮＥＴ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ（商標）又はＮＥＴＳＣＡＰＥ（商標）といったウェブ・ブラウザのアドレスバーに以下の引用文「www.ncbi.nim.nih」を入力し、その続きに「.gov/COG」を入力することで、インターネット上でアクセスできる。遺伝子は上記の同様のウェブ・サイトで利用可能なＣＯＧＮＩＴＯＲプログラムを用いて、あるいは対象となる遺伝子とＣＯＧ要素を直接的にＢＬＡＳＴＰ比較し、その結果をTatusov, R. L., Galperin, M. Y., Natale, D. A.及びKoonin, E. V. 「ＣＯＧデータベース : タンパク質機能と進化のゲノム規模の分析ツール」(Nucleic Acids Research, vol.28 no.1, pp.33-36, 2000)に記述されるように分析することでオーソログのクラスター群又はＣＯＧに分類することができる。
【００８２】
核内受容体をコードするＤＮＡに加えて、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが発現される、本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが配列番号１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０及び２４２の１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、あるいはそのアミノ酸配列の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０個の連続的なアミノ酸を含む断片と少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも２５％のアミノ酸の相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。相同性又は類似性はデフォルトパラメータを用いたＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムより確定される。あるいは、タンパク質の相同性又は類似性はデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＸ、デフォルトパラメータを用いたＴＢＬＡＳＴＮ、又はデフォルトパラメータを用いたｔＢＬＡＳＴＸで同定される(Altschul, S.F.他, ギャップＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新たなタンパク質データベース探索プログラム, Nucleic Acid Res., 25:3389-3402, 1997、この開示は参照により全体が本明細書に援用される)。
【００８３】
１つ又は複数の核内受容体をコードするＤＮＡに加えて、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが発現される、本明細書中に記載の各方法のいくつかの実施形態では、１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、ストリンジェントな条件あるいは緩やかな条件下で、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１の１つと相補的なヌクレオチド配列から成る群から選択される核酸にハイブリダイズするＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、この１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードするＤＮＡが、ストリンジェントな条件あるいは緩やかな条件下で、配列番号１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９及び２４１の１つと相補的な配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００個の連続的なヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするＤＮＡを含む。本明細書中で用いる場合、「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃で６×ＳＳＣにおいてフィルタに結合した核酸にハイブリダイズし、続いて約６８℃で０．１×ＳＳＣ/０．２％ＳＤＳにおいて１回又は複数回洗浄することを意味する。他の例示的なストリンジェントな条件としては、例えば用いられる特定のプローブに適切な３７℃、４８℃、５５℃及び６０℃で６×ＳＳＣ/０．０５％ピロリン酸ナトリウムを用いて洗浄することを示す。本明細書中で用いる場合、「緩やかな条件」とは、約４５℃で６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いてフィルタに結合したＤＮＡにハイブリダイズし、続いて約４２〜６５℃で０．２×ＳＳＣ/０．１％ＳＤＳを用いて１回、好ましくは３〜５回洗浄することを意味する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは核内受容体活性又はヘルパータンパク質活性を維持する任意の上記核内受容体又はヘルパータンパク質の一部をコードする。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡは核内受容体又はヘルパータンパク質が１つ又は複数のその正常な生理学的機能を発揮する能力を維持する、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０又は３５０を超える、核内受容体又はヘルパータンパク質の連続アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。このような生理学的機能には、転写活性化、シグナル伝達影響、リン酸化、他のタンパク質との相互作用が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、受容体とヘルパータンパク質との特定の組み合わせが本発明の各方法に用いられる。１つの実施形態では、その組み合わせとして、ＴＲβとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＲＡＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＰＰＡＲγとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＦＸＲとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＬＸＲβとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＶＤＲとＳＲＣ１；ＰＸＲとＳＲＣ１；ＲＸＲαとＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＥＲβとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＡＲとＤＲＩＰ２０５；ＭＲとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；ＧＲとＳＲＣ１；ＳＨＰとＳＲＣ１又はＥＲＫ２；ＲｅｖＥＲｂαとＥＲＫ２；ＲＯＲγとＤＲＩＰ２０５；ＨＮＦ４αとＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＴＲ２αとＳＲＣ１；ＴＬＸとＥＲＫ２；ＣＯＵＰ−ＴＦβとＳＲＣ１又はＤＲＩＰ２０５；ＥＡＲ２とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；ＥＲＲγとＥＲＫ２；ＮＯＲ−１とＳＲＣ１、ＤＲＩＰ２０５又はＥＲＫ２；並びにＧＣＮＦとＳＲＣ１又はＥＲＫ２から成る群から選択される組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
更なる実施形態では、１つ又は複数の核内受容体及び１つ又は複数のヘルパータンパク質をコードする核酸配列は配列番号５と配列番号１６１又は２１３；配列番号９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号２１、２３、２５又は２７と配列番号１４５、１４７又は２１３；配列番号４９と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号４５と配列番号１４５又は２１３；配列番号５１と配列番号１４５又は１４７；配列番号５３、５５又は５７と配列番号１４５又は１４７；配列番号６９と配列番号１６１又は２１３；配列番号９３と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号１０７と配列番号１６１；配列番号１０３と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号１０１と配列番号１４５又は１４７；配列番号１４３と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号２９と配列番号２１３；配列番号４３と配列番号１６１；配列番号６１と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；配列番号７５と配列番号１４５又は１４７；配列番号７９と配列番号１６１；配列番号８７と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号８９と配列番号１４５、１４７又は１６１；配列番号９９と配列番号１６１；配列番号１２３、１２５又は１２７と配列番号１４５、１４７、１６１又は２１３；並びに配列番号１３５と配列番号１４５、１４７又は２１３から成る群から選択される。
【００８７】
更なる実施形態では、上記の１つ又は複数の核内受容体及び上記の１つ又は複数のヘルパータンパク質のアミノ酸配列が、配列番号６と配列番号１６２又は２１４；配列番号１０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号２２、２４、２６又は２８と配列番号１４６、１４８又は２１４；配列番号５０と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号４６と配列番号１４６、１４８又は２１４；配列番号５２と配列番号１４６又は１４８；配列番号５４、５６又は５８と配列番号１４６又は１４８；配列番号７０と配列番号１６２又は２１４；配列番号９４と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号１０８と配列番号１６２；配列番号１０４と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号１０２と配列番号１４６又は１４８；配列番号１４４と配列番号１４
６、１４８又は１６２；配列番号３０と配列番号２１４；配列番号４４と配列番号１６２；配列番号６２と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；配列番号７６と配列番号１４６又は１４８；配列番号８０と配列番号１６２；配列番号８９と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号９０と配列番号１４６、１４８又は１６２；配列番号１００と配列番号１６２；配列番号１２４、１２６又は１２８と配列番号１４６、１４８、１６２又は２１４；並びに配列番号１３６と配列番号１４６、１４８又は２１４から成る群から選択される。
【００８８】
本発明の更なる実施形態を、本出願と共に提出した別表Ａに記載している。
【００８９】
核内受容体
核内受容体ファミリーには、エストロゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド、Ｔ３／Ｔ４甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤ3といった古典的な内分泌ホルモンの受容体が含まれる。グループとして、核内受容体には、大量の疎水性小リガンドに応答し、対応する一群の標的遺伝子を調節する広範な種々の核内受容体が含まれる。核内受容体ファミリーはまた、その元となる前駆体に類似して、例えば、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）及びファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）などの内分泌ホルモン自体よりも脂質代謝の中間体に応答するメンバーを含む。最後に、ニワトリオブアルブミン上流調節配列転写因子（ＣＯＵＰ−ＴＦ）といった、リガンドが同定されていないオーファン受容体が挙げられる。
【００９０】
オーファン受容体を除く一般的な核内受容体は、１段落シグナル伝達物質として機能し、入力（化学小リガンドの結合）を出力（特異的な標的遺伝子の転写速度の変化等）に伝達する。特異的な経路に制限されないが、多くの経路では、そうするために、核内受容体は、（ａ）標的遺伝子中又は標的遺伝子付近のホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）と呼ばれる特異的なＤＮＡ配列を認識し、（ｂ）ホルモン又は脂質リガンドに結合し、最終的に、（ｃ）標的プロモーターの転写速度を変化させる分子事象を仲介する。
【００９１】
簡潔に述べれば、ほとんどの核内受容体は、ホモ二量体、又は核内受容体ファミリーの他のメンバー（特に、ＲＸＲメンバー）とのヘテロ二量体のいずれかとしてＤＮＡに結合し、いくつかの核内受容体は、受容体モノマー又はオリゴマーとしてＤＮＡを認識することもできる。各受容体モノマー中のジンクフィンガーモチーフは、ハーフサイトと呼ばれるＤＮＡ上の６〜８ヌクレオチドの配列を認識する。受容体二量体をリクルートするために、機能的ＨＲＥは、特異的な配向及び位置で配置された２つのハーフサイトを含む。例えば、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）は、４塩基スペーサーを有する反復配列（ＤＲ−４）として配向した２つのＡＧＧＴＣＡハーフサイトに優先的に結合し、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）は、同一のＡＧＧＴＣＡハーフサイトに結合するが、ＤＲ−５として配向し、エストロゲン受容体は、３塩基スペーサーを有する逆方向反復（ＩＮＶ−３）として配向したＡＧＧＴＣＡハーフサイトに結合し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、ＡＧＡＡＣＡハーフサイトを含むＩＮＶ−３配向を認識する。つまり、必然的に次のように簡略化される：ＨＲＥは事実上、しばしばこれらのプロトタイプエレメントと配列及びトポロジーが異なるハーフサイトを含む。核内受容体はまた、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓといった非受容体転写因子と相互作用して、受容体をＤＮＡに間接的に結合させるか、受容体及び非受容体の両方が特異的にＤＮＡ接触に寄与する複合体を形成する。これらの相互作用により、転写調節の複雑な組み合わせ様式を得ることができる。
【００９２】
どのように核内受容体がホルモンリガンドを認識するのかということを理解するために、非常に的確な研究が行われた。これに関する操作物質は、三層のサンドイッチ構造にねじれた１２個のαヘリックスドメインから構成されるＣ末端ホルモン結合ドメイン（ＨＤＢ）である。ホルモンリガンドは、実質的にこのポリペプチドサンドイッチに取り囲まれ
、このホルモンは、受容体自体のフォールディングを完全にする疎水性コアとしての機能を果たす。リガンドと受容体との間のこの接近により、異なるホルモンは、受容体中で異なる立体構造を誘導することができる。これらのリガンド駆動受容体立体構造により、異なる生物学的結果が得られる。例えば、リガンドアゴニストによって、転写活性化を促進する受容体立体構造が得られるのに対して、リガンドアンタゴニストにより、転写抑制する受容体立体構造が得られる。
【００９３】
核内受容体は、コリプレッサー及びコアクチベーターと呼ばれる一連の補助ポリペプチドをリクルートすることによって機能し、これらの補助タンパク質は、転写を抑制又は活性化する分子事象を仲介する。この転写の分子的機序を、以下により詳細に記載する。
【００９４】
核内受容体は、転写調節のために使用されるサブドメインを有し、ＤＮＡ結合又はホルモン認識のために使用される配列と区別することができる。これらの転写調節ドメインは、いくつかの別名（活性化ドメイン、活性化機能ドメイン、τドメイン、抑制ドメイン、サイレンシングドメイン）を有するが、機能様式は共通であり、これらは、コリプレッサー及びコアクチベーターがリクルートされる受容体上の結合表面を示す。ほとんど全ての核内受容体は、受容体ＨＢＤ中にホルモン依存性活性化ドメインを有し、この活性化機能（ＡＦ）−２受容体ドメインは、コアクチベーターのための結合表面を形成して、ＨＤＢヘリックス３／５／６及び１２の一部由来の三次元空間中で集合する。興味深いことに、この同一表面は重要なコリプレッサー結合部位と重複し、ｙｉｎ  ｙａｎｇメカニズムが作動し、それにより、ＨＢＤヘリックス１２におけるホルモン誘導性の変化が代替的にどちらか一方の種類のコレギュレーターのリクルートを促進する。全てではないが、多くの核内受容体は、コアクチベーターに結合するＮ末端ドメイン（ＡＦ−１配列と呼ばれる）内に更なる活性化ドメインを有し、そのＤＮＡ結合ドメイン内にあまり特徴付けがされていないコリプレッサー及びコアクチベーター相互作用表面を有する。
【００９５】
ツーハイブリッド又は共沈実験において、これらの種々の結合表面のベイトとして活用することにより、研究者はコアクチベーター及びコリプレッサーに関する調査書類を一層増加させている。このようにして同定されたコアクチベーターを、以下の４つの群に大きく分類することができる：（ａ）クロマチンテンプレートを調節することができる、アセチラーゼ及びメチラーゼを含む酵素活性を有する（又はリクルートする）Ｐ１６０ファミリー、ＣＡＲＭ、及びＣＢＰ／ｐ３００といったヒストン共有結合性調節因子、（ｂ）ヌクレオソームの高次構造及び位置を変化させる、Ｓｗｉ／ＳｎｆファミリーといったＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合体、（ｃ）前開始複合体の集合を助けるために一般的な転写機構と相互作用する、ＴＲＡＰ／ＤＲＩＰといったメディエーター複合体成分、及び（ｄ）未知の機能を有するコアクチベーター。
【００９６】
核内受容体のために同定された第１のコリプレッサーは、ＳＭＲＴ（Ｔ３Ｒ関連コファクター、ＴＲＡＣとしても既知）及びそれに近いパラログであるＮ−ＣｏＲ（受容体相互作用タンパク質１３、すなわちＲＩＰ１３としても既知である）であった。ＳＭＲＴ及びＮ−ＣｏＲは、２つの異なる遺伝子座によってコードされるが、共通の分子構造を有し、約４５％のアミノ酸が相同であり、更なるＳＭＲＴ及びＮ−ＣｏＲ形態が、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって生成され、これにはＳＭＲＴτが含まれる。
【００９７】
ＳＭＲＴ及びＮ−ＣｏＲの両方を、３〜４つの異なる転写抑制（又はサイレンシング）ドメイン（ＲＤ）を有するＮ末端部分、及び２つ又は３つの核内受容体相互作用ドメイン（ＮＤ）から構成されるＣ末端部分に概念的に分類することができる。ＲＤは、コリプレッサーの更なる成分である、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、トランスデューシン様タンパク質１（ＴＢＬ−１）、Ｇタンパク質経路サプレッサー２（ＧＰＳ２）及び（おそらく）ｍＳｉｎ３並びにそのコホートなどをリクルートする結合表面である。
【００９８】
受容体ホモ二量体及びヘテロ二量体は、異なるＮ−ＣｏＲ結合性及びＳＭＲＴ結合性を示す。例えば、Ｔ３Ｒホモ二量体はＤＮＡ応答エレメントに結合した場合にＳＭＲＴ及びＮ−ＣｏＲを有効にリクルートするが、Ｔ３Ｒ／ＲＸＲヘテロ二量体ではリクルートされず、Ｔ３Ｒホモ二量体はＴ３Ｒ抑制の重要なメディエーターである。
【００９９】
核内受容体の第３のサブグループは、ホルモンの非存在下でコリプレッサーとあまり結合しないか又は全く結合しないが、ホルモンアンタゴニストの存在下ではコリプレッサーに結合する能力が増加する。これらのホルモンアンタゴニストにはエストロゲン受容体（ＥＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）が含まれる。
【０１００】
多数の核内受容体は、複数の遺伝子座から発現するか、又は選択的ｍＲＮＡスプライシングによって、発生及び生理機能において異なる役割を果たす複数の受容体アイソタイプ（又はアイソフォーム）が生成される。これらの受容体アイソタイプは、異なるコリプレッサーのリクルート能を示す。例えば、ＲＡＲは３つの異なる遺伝子α、β及びγによってコードされる。ＲＡＲαがホルモンの非存在下で標的遺伝子の発現を抑制するにもかかわらず、ＲＡＲβ及びγは抑制せず、むしろ、これらはホルモンアゴニストの非存在下及び存在下の両方で転写を活性化する。転写調節におけるこれらの相違は、これらのイソ型のコリプレッサー結合性を反映する。すなわちＲＡＲαはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでコリプレッサーに強く結合するのに対して、ＲＡＲβ及びγは結合しない。
【０１０１】
本発明における細胞のトランスフェクションは、当該分野で既知の多数の方法のいずれか１つに従って行うことができる。一般に、１つ又は複数の核内受容体をコードするＤＮＡ配列、並びにコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ及び他のシグナル伝達分子をコードするＤＮＡ配列を、組換えＤＮＡ操作に都合良く用いることができる適切なクローニングベクターに挿入することができる。発現ベクターは、核内受容体、コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又は他のシグナル伝達分子を発現させるプロモーター配列を有する。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、宿主細胞と相同又は非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来する。ベクターはまた、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、複製起点及び組み込み配列といったエレメントを含む。適切なベクターにＤＮＡ配列を挿入するために使用される手順は、当業者に既知である。
【０１０２】
更なる実施形態では、第１の核内受容体とヘテロ二量体化することが既知であるか、疑われるか又はそれを判定するために試験されるであろう、少なくとも１つの他の核内受容体でトランスフェクトすることができる。このような方法で、ヘテロ二量体と特異的に相互作用するリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト又は選択的調節因子を同定することができる。
【０１０３】
哺乳動物細胞中における核内受容体をコードするＤＮＡ及び／又はコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ、又は他のシグナル伝達分子をコードする遺伝子といった「ヘルパー遺伝子」の転写の方向付けに適切なプロモーターの例には、ＳＶ４０プロモーター(Subramani他, Mol. Cell Biol., 1 (1981), 854-864)、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter他, Science, 222, (1983), 809-814）又はアデノウイルス２主要後期プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
核内受容体、及びコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子といったヘルパータンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ヒト成長ホルモンターミネーター（前記のPalmiter他）といった適切なターミネーターに機能可能に連結することもでき
る。ベクターは、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルス５Ｅｌｂ領域由来）、転写エンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のようなエレメントを更に含んでもよい。
【０１０５】
ベクターは、対象の宿主細胞中でベクターが複製することができるＤＮＡ配列を更に含む。このような配列の例（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）は、ＳＶ４０複製起点である。
【０１０６】
受容体、プロモーター及びターミネーターをそれぞれコードするＤＮＡ配列をライゲーションするため及び複製に必要な情報を含む適切なベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、当業者に既知である（例えば、Sambrook他, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)を参照のこと）。
【０１０７】
本発明の方法で使用することができる細胞には、コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ、又はシグナル伝達分子といったヘルパータンパク質をコードする１つ又は複数の「ヘルパー遺伝子」の存在下で核内受容体を介してシグナル伝達を媒介することができる任意の細胞が含まれる。このような細胞は、典型的には哺乳動物細胞であるが、真核細胞（昆虫細胞等）又は原核細胞も適切である。使用することができる有用な哺乳動物細胞としては、好ましくはマウス線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＲＡＴ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞及びＣＯＳ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
哺乳動物細胞をトランスフェクションし、細胞中に導入したＤＮＡ配列を発現する方法は、例えば、Kaufman及びsharp, J. MoI. Biol., 159, (1982), 601-621、Southern及びBerg, J. Mol. Appl. Genet., 1, (1982), 327-341、Loyter他, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 79, (1982), 422-426、Wigler他, Cell, 14, (1978), 725、Corsaro及びPearson, Somatic Cell Genetics, 7, (1981), 603、 Graham 及び ver der Eb, Virology, 52, (1973), 456、Neumann他, EMBO J., 1, (1982), 841-845、並びにWigler他, Cell, 11, 1977,
pp.223-232に記載されている。
【０１０９】
当業者に既知の任意の核ホルモン受容体を本発明で使用することができ、これらには、表１及び３に記載のもの、「核ホルモン受容体」と見出しを付した上記のもの、核ホルモン受容体として新規に同定されたものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で具体的に言及したほとんどの核ホルモン受容体はヒトのものであるにもかかわらず、既に同定されているものもあるこれらの受容体の哺乳動物、昆虫及び他のホモログを使用してアッセイすることができると理解される。ホモログには、任意のヒト核ホルモン受容体とアミノ酸が約３０％〜１００％（３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％が含まれるが、これらに限定されない）相同な全てのホモログが含まれる。アミノ酸相同性をＢＬＡＳＴを含む任意の従来のソフトウェアを使用して判定することができる。あるいは、相同性は本明細書中に開示の配列番号（配列番号１〜４８が含まれるが、これらに限定されない）に対するものである。ホモログを当業者に既知の任意の方法を使用して同定することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、リガンド依存的に活性が調節される核ホルモン受容体は、核ホルモン受容体を発現する細胞中での１つ又は複数のシグナル伝達分子を同時発現させることによって本発明でアッセイすることができる。シグナル伝達分子は、コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子などの、核内受容体の活性を直接又
は間接的に調節する任意の分子である。
【０１１１】
【表１】
2008520244.tif 000003
【０１１２】
表１中の全てのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列は、参照により本明細書中に援用される。この配列はアクセッション番号、それに続くヌクレオチド配列の配列番号及び更にそれに続くタンパク質の配列番号により示される。例えば、ＮＭ１９９３３４−１，２は、ＮＲ１Ａ１（ＴＲα）のヌクレオチド配列が配列番号１であり、タンパク質配列が配列番号２であることを意味する。
【０１１３】
既知のリガンドを使用する実施形態では、リガンドは核ホルモン受容体に結合し、当業者に既知の任意のリガンドである。既知のリガンドの例には表３中のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。リガンドはこれらが会合する核ホルモン受容体も同定する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、非限定的にコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ及び／又はシグナル伝達分子を含むヘルパータンパク質をコードする１つ又は複数の「ヘルパー遺伝子」を、核内受容体を発現する細胞中で発現させる。あるいは、いくつかの実施形態では、コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子としての活性について試験すべきポリペプチドを、受容体を発現する細胞中で発現させる。既知の「ヘルパー遺伝子」（コアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子といったヘルパータンパク質をコードする）を使用する実施形態では、表２で同定した分子が含まれるが、これらに限定されない当業者に既知の任意のこのような分子も使用することができる。ヘルパータンパク質として作用するこれらのコアクチベーター、コリプレッサー又はキナーゼを、アッセイすべき細胞中に供給することができる。これらの分子を供給することにより、核内受容体と１つ又は複数のコアクチベーター、コリプレッサー、キナーゼ又はシグナル伝達分子といったヘルパー遺伝子タンパク質の特定の組み合わせに対して選択的なリガンドを同定することができる。従って、１つ又は複数の受容体に加えて、シグナル伝達分子を細胞中で発現させることができ、細胞をリガンドと接触させることができる。あるいは、受容体が構成的に活性な実施形態では、細胞をリガンドと接触させることなくアッセイを行うことができる。
【０１１５】
【表２】
2008520244.tif 000004
【０１１６】
表２中の全てのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号の配列は、参照により本明細書中に援用される。
【０１１７】
スクリーニングアッセイ
本発明の方法で使用したスクリーニングアッセイには、例えば、適切な核内受容体を含む哺乳動物細胞又は非哺乳動物細胞、タンパク質、細胞質抽出物及び／又は核抽出物、膜抽出物中において、１つ又は複数の核内受容体活性を反映し、化合物の受容体活性化又は不活性化能を感知することができる任意の機能的なアッセイが含まれる。
【０１１８】
好ましい実施形態では、受容体選択及び増幅技術Ｒ−ＳＡＴ（米国特許第５，７０７，７９８号、同第５，９１２，１３２号及び同第５，９５５，２８１号  これらの開示の全体が参照により本明細書中に援用される）をスクリーニングアッセイとして使用する。
【０１１９】
他のアッセイは、発現可能な核ホルモン受容体遺伝子をトランスフェクションすること、少なくとも１つの「ヘルパー遺伝子」をトランスフェクションすること、及び少なくとも１つの試験物質の存在下で測定可能な出力を同定する初期ステップを含む。１つの実施形態では、受容体を表１から選択し、少なくとも１つのヘルパー遺伝子を表２から選択する。次いで、少なくとも１つの試験物質を添加し、測定可能な出力を分析することができる。
【０１２０】
ハイブリッド形成のために、ＤＮＡを細胞から単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼで消化することができる。消化後、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上の電気泳動に供することができる。次いで、ゲルからのＤＮＡをニトロセルロースフィルター上にブロットし、放射性標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成することができる。プローブは受容体遺伝子のＤＮＡフラグメントを含む（E. M. Southern, J. Mol. Biol., 98, 1975, pp.503の方法に実質的に従う）。
【０１２１】
増幅のために、細胞から単離された総ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡライブラリを調製することができる。次いで、受容体をコードするｃＤＮＡを目的の受容体をコードする遺伝子のセグメントに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、アガロースゲル上でサイズによって検出することができる。受容体をコードする遺伝子の少なくとも一部に対応するＤＮＡ配列を含む放射性標識化オリゴヌクレオチドプローブへのハイブリッド形成によって、増幅した受容体ｃＤＮＡを検出することもできる。この方法は、例えば、上記のSambrook他により記載されている。
【０１２２】
変異受容体は本明細書中に記載の任意の方法で使用することができる。このような変異受容体を、種々の理由のために使用することができ、ホモ二量体形態、ヘテロ二量体形態、ホルモン結合形態、選択的スプラインシグ形態、活性化形態又は抑制形態といった１つの受容体形態と特異的に相互作用するコリプレッサー、コアクチベーター、キナーゼ、シグナル伝達分子、アゴニスト、及び／又はアンタゴニストを同定することを含むが、これらに限定されない。従って、任意の既知の部位を、他の受容体、ホルモン、コアクチベーター及び／又はコリプレッサーがもはや結合できないような方法で変異させることができる。多数のこのような受容体が同定及び産生されており、従って、当該分野で既知である。あるいは、受容体のクローニング、クローニングした受容体に対する変異誘発、及び構成的に活性化された受容体又はリガンド非依存性受容体のスクリーニングによるこのような変異受容体を産生する方法は、一般に、Maniatis著「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」及びAusubel他著「Short Protocols in Molecular Biology」(1989)(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)（例えば、２３３〜２５０頁の変異誘発
方法を参照のこと）等の参考文献で見出すことができる。あるいは、本明細書中に記載の方法を使用して、リガンドの存在下及び非存在下でトランスフェクションした受容体の活性を比較することによってリガンド非依存性受容体をスクリーニング及び同定することができる。受容体がリガンド非依存性である場合、リガンドの存在は、アッセイにおける受容体の活性に影響を与えないであろう。更に、リガンド非依存性受容体を本発明の方法で使用して、その活性を阻害するアンタゴニスト又は逆アゴニストといった化合物を同定することができる。
【実施例】
【０１２３】
本明細書中に記載及び主張されている発明は、本明細書中に開示の特定の実施形態によってその範囲が制限されるべきではなく、それは、これらの実施形態が、本発明のいくつかの態様の例示を意図するからである。任意の同等な実施形態は、本発明の範囲内であると意図される。実際、本明細書中に示し、記載したこれらの実施形態に加えて、本発明の種々の変更形態が、上記記載から当業者に明らかとなる。このような変更形態も、添付の特許請求の範囲の内に含まれると意図される。
【０１２４】
本発明は、以下の実施例に更に開示され、本実施例は主張された本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【０１２５】
実施例１：単一の核内受容体をアッセイするための一般的プロトコル
細胞ベースの機能的なアッセイである受容体及び選択増幅技術（Ｒ−ＳＡＴ（商標））（米国特許第５，７０７，７９８号）を改良して、１つの核内受容体の薬理学的表現型を調べることができるアッセイを開発した。
【０１２６】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（American Type Culture CollectionからＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８として入手可能）の培養物を、５０〜６０％のコンフルエンシーに調製した。１日目に細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、１０％ウシ血清を含む１００μｌ／ウェルのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含む９６ウェルプレート中に８，０００細胞／ウェルでまいた。２日目に、製造業者が推奨するようにトランスフェクション試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）(Qiagen, Inc.)を使用して細胞をトランスフェクションした。種々の用量の核内受容体プラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。ＤＮＡ混合物は、０．１〜１０ｎｇ／ウェルの受容体ＤＮＡ、２０〜３０ｎｇ／ウェルのβ−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＳＶ  β−ガラクトシダーゼ、Promega）、及び１５μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）を含んでいた。３日目に、培地を、種々の量の試験化合物を含む２％のＣｙｔｏ−ＳＦ３（Kemp Biotechnologies, Inc.）を含むＤＭＥＭと置換した。細胞を、５％のＣＯ2を補充した加湿環境下で３７℃で５日間培養し、その後、米国特許第５，７０７，７９８号に記載のように、培地をβ−ガラクトシダーゼ基質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシドとの置換によって、β−ガラクトシダーゼ活性を評価した。自動プレートリーダーを使用して４２０ｎｍの吸光度の変化を測定することによって全データを得た。式ｒ＝Ａ＋Ｂ（ｘ／（ｃ＋ｃ））（式中、Ａ＝最小応答であり、Ｂ＝最大応答−最大応答であり、ｃ＝ＥＣ５０であり、ｒ＝応答であり、ｘ＝リガンドの濃度である）を使用してＥＣ５０値を計算した。ＸＬＦｉｔソフトウェア（Microsoft）を使用して曲線を作成した。
【０１２７】
表３に示す実験では、上記の単一受容体形態法を使用し、既知のリガンドと結合したいくつかの核内受容体を試験した。表３のデータは、本方法が全ての核ホルモン受容体に対する薬理学的に関連する応答を得るのに有用であることを示す。
【０１２８】
実施例２：複数の受容体形態
実施例１に記載の方法を複数の受容体形態に適用できるかを試験するために、実施例１
に記載のように、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、エストロゲン受容体β（ＥＲＢ）及びβ−ガラクトシダーゼのｃＤＮＡをコードするプラスミドでコトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を各受容体の既知のリガンドと接触させ、実施例１に記載のように活性を測定した。正のβ−ガラクトシダーゼ応答は有効なリガンド／受容体相互作用を示した。示すように、２つのリガンドに対する選択的薬理学的応答が認められ、本明細書中に開示の方法を複数の受容体形態で使用することができることが確認された。
【０１２９】
実施例３：核応答におけるコアクチベーターの重要性
以下の実施例は、リファンピシン（ＰＸＲ）受容体（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ６１０５６）の薬理学的応答におけるコアクチベーターの重要性を実証する。ＰＸＲ受容体は、レチノイン酸核内受容体ＲＸＲサブタイプ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３８４８０）とヘテロ二量体を形成する。コアクチベーターＧＲＩＰ１（糖質コルチコイド受容体相互作用タンパク質１）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３９０６０）及びＳＲＣ−１（ステロイド受容体コアクチベーター１）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ９０６６１）をこのアッセイで使用した。まとめると、コアクチベーターをコードするプラスミドＤＮＡを、上記トランスフェクション混合物（ＰＸＲ、ＲＸＲ及びβ−ＧａｌプラスミドＤＮＡを含む）とコトランスフェクションした。コトランスフェクションした細胞を、リファンピシンと接触させ、実施例１に記載のようにβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【０１３０】
結果を図２に示す。図２は、Ｒ−ＳＡＴによって判定されたＰＸＲ受容体のアゴニスト応答の一般的な薬理学的プロファイルを示す。この研究から導くことができる結論は以下の通りである：
（ａ）１つのコアクチベーター（ＳＲＣ−１又はＧＲＩＰ１のいずれか）のコトランスフェクションにより、薬理学的なＰＸＲ応答が部分的に活性化され、ＰＸＲ及びＲＸＲのみを使用して認められた不十分な応答よりも有意に高い。
（ｂ）両方のコアクチベーター（ＳＲＣ−１及びＧＲＩＰ１）のコトランスフェクションにより相乗影響が得られ、完全なＰＸＲの薬理学的応答が得られる。
（ｃ）複数のコアクチベーターのコトランスフェクションにより、いかなる不利益な影響を示すことなくＰＸＲアゴニスト応答が改良される。
【０１３１】
上記実験は、コアクチベーターが特に容易にアッセイするのに十分な範囲で核内受容体ＰＸＲ及びＲＸＲでトランスフェクションした細胞の増殖の誘発に非常に有用であることを示す。実際、単独で発現したＰＸＲ及びＲＸＲにより、弱く（有効性５〜１０％）影響のない薬理学的応答が明示された。コアクチベーターの存在下ではＰＸＲ／ＲＸＲの薬理学的な応答は強く（有効性１００％）、薬理学的に関連していた。更に、これらの研究は、増幅アッセイが核内受容体のシグナル伝達必要条件（例えば、コアクチベーター等）の同定に非常に有用であるという事実を反映する。
【０１３２】
実施例４：多数の核内受容体の刺激
表３は、そのリガンド結合特性に基づいたいくつかの機能カテゴリーに属するいくつかの核内受容体を列挙している。これらの核レポーターでトランスフェクションした細胞を、示したリガンドを使用した実施例１に記載の単一核内受容体法のアッセイに一般的なプロトコルを使用してアッセイした。結果を表３に示す。これらのデータは、本明細書中に記載の方法又は当業者に明らかであろうアッセイの任意の変形形態を使用して、全ての核内受容体をアッセイすることができることを示す。
【０１３３】
【表３】
2008520244.tif 000005
【０１３４】
実施例５：核内受容体の構成的活性の検出
構成的活性を、アゴニストへの結合がない状態で受容体が示す活性によって定義する。以下の実施例は、本明細書中に記載の増幅アッセイ及び増幅方法が種々の核内受容体の構成的活性の判定に有用であることを示す。実施例６で示されるように、このような情報は、例えば、受容体に対する既知又は未知の化合物の逆アゴニスト活性を評価するための実験パラメーターを判定するのに特に有用である。
【０１３５】
実施例１に記載のように、ＲＸＲレチノイン酸受容体及びβ−Ｇａｌ受容体をコードするプラスミドＤＮＡ並びにＰＰＡＲγ又はＣＡＲα核内受容体をコードする一定範囲の濃度のプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクションした。ＰＰＡＲγは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体である。ＣＡＲαは、構成的アンドロスタン受容体（ＣＡＲ）αである。両方の受容体はＲＸＲ受容体とヘテロ二量体を形成する。３００ｐｇ、１．５ｎｇ、６．０ｎｇ又は３０ｎｇのＰＰＡＲγ又はＣＡＲαＤＮＡでトランスフェクションを行った。実施例１に記載のように、トランスフェクション細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、組換え核内受容体を発現しなかった細胞と比較した。図３は、Ｍｉｌｌｅｒ単位で示した実験結果を示す。
【０１３６】
この研究から導くことができる結論は以下の通りである：
１．Ｒ−ＳＡＴ（商標）技術は、核内受容体によって示された構成的活性レベルの測定
に適用することができる。
２．各核内受容体は異なる程度の構成的活性を発現し、この活性は細胞にトランスフェクションされた受容体量に一部依存する。
３．核内受容体によって示された構成的活性の範囲は、逆アゴニストに対して応答可能なダイナミックレンジを構成する。
【０１３７】
実施例６：核内受容体の逆アゴニズムの検出
以下の実施例は、本明細書中に記載の方法が、核内受容体の逆アゴニストの同定及び検出に有用であることを示す。
【０１３８】
実施例５で示したように、ＰＰＡＲγ及びＣＡＲαは構成的活性を示す。実施例１に記載のように、ＰＰＡＲγ及びＲＸＲ受容体（ヘテロ二量体を形成することが知られている）をコードするプラスミドＤＮＡ又はＣＡＲα及びＲＸＲ核内受容体（ヘテロ二量体を形成することが知られている）をコードするプラスミドＤＮＡ及びβ−ＧａｌレポーターＤＮＡで細胞をトランスフェクションした。実施例１に記載のように、細胞を指定の量の既知の逆アゴニストＢＲＬ４９６５３又はアンドロステノールとそれぞれ接触させ、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。データを図４Ａ及び４Ｂに示すが、これらは両方の化合物が逆アゴニスト活性を有することを示す。これらのデータは、Ｒ−ＳＡＴ（商標）技術が核内受容体において逆アゴニスト活性を有する化合物を検出するのに適用することができることを示す。
【０１３９】
実施例７：異なる補助計画による受容体活性の使用可能性
以下の実施例は、核ホルモン受容体活性を有効にするか、又は改良するために異なる補助計画が必要であることを示す。
【０１４０】
既知のリガンドを有する核内受容体（表４Ａ）又はオーファン受容体（表４Ｂ）及び示したヘルパー遺伝子（ＳＲＣ１、ＧＲＩＰ又はＥｒｋ２）で細胞をトランスフェクションした。ＳＲＣ１及びＧＲＩＰは２つの異なるタイプのコアクチベーターであり、Ｅｒｋ２はキナーゼである。実施例１に記載のように、トランスフェクション細胞をＲ−ＳＡＴ（商標）を使用してアッセイした。５００未満の吸収単位（ＡＵ）の活性を示す細胞サンプルを「−」と示した。１００〜５００の単位の活性を示すサンプルを「＋」で示し、５００〜１，０００の単位の活性を示すサンプルを「＋＋」で示し、１，０００を超える単位の活性を示すサンプルを「＋＋＋」で示した。データを表４Ａ及び４Ｂに示す。
【０１４１】
【表４Ａ】
2008520244.tif 000006
【０１４２】
【表４Ｂ】
2008520244.tif 000007
【０１４３】
これらのデータは、核ホルモン受容体のアッセイを可能にするか、又は改良するのにヘルパー遺伝子がしばしば必要であることを示す。
【０１４４】
実施例８：選択的な核内受容体調節因子
本実施例は、特定の受容体に対する活性を有する候補分子をスクリーニングするために、開示した方法をどのように使用することができるのかを示す。選択的な核内受容体調節因子は、混合したアゴニスト／アンタゴニストの特徴を有する種類の化合物をいう。この特異性は細胞タイプ依存性であり、エストロゲン調節因子の場合、コレギュレーターのリクルートに関連している（Shang及びBrown, 2002, Nature, 295:2465）。より一般的には
、選択的な核内受容体調節因子の設計により、現在利用可能な治療プロファイルよりも良好な治療プロファイルを有する新規の薬物を同定できる可能性があると考えられる。本明細書中に記載の増幅技術及び、例えばＲ−ＳＡＴ（商標）により、多数の核内受容体−コレギュレーター相互作用を区別することが可能である（表４を参照）。従って、Ｒ−ＳＡＴ（商標）は核内受容体の活性の選択的調節因子の同定に適用することができる。
【０１４５】
実施例９：核応答におけるキナーゼの重要性
以下の実施例は、核内受容体の薬理学的な応答におけるキナーゼなどのヘルパー遺伝子の重要性を示す。
【０１４６】
細胞を、核内受容体ＲＡＲβ２及びβ−ＧａｌプラスミドＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡ並びにＭＡＰキナーゼＥＲＫ２でトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、示した量のＡＭ５９０（ｐａｎ−レチノイドアゴニストリガンド）と接触させた。実施例１に記載のように、Ｒ−ＳＡＴ（商標）を使用して細胞をアッセイした。結果を図５に示すが、これは、Ｒ−ＳＡＴによって判定したレチノイド受容体のアゴニスト応答の一般的な薬理学的プロファイルを示す。これらのデータは、ＥＲＫ２のコトランスフェクションによってＲＡＲβ２で認められたアゴニスト応答が改良されることを示す。
【０１４７】
実施例１０：新規の相互作用の同定
この実施例は、特定の受容体とシグナル伝達分子との間の新規の相互作用を同定及び分析するために、どのように開示した方法をすることができるのかを示す。
【０１４８】
ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードに関連する多数のシグナル伝達分子と相互作用することが知られているβ−アレスチン１及びβ−アレスチン２のどちらであるかを判定するために、β−アレスチン１又はβ−アレスチン２が異なるレチノイド核内受容体の活性に影響を与える能力をアッセイした。実施例１に記載のように、示したＲＡＲ受容体、及びアレスチン１又はβ−アレスチン２のいずれか、並びにβ−ＧａｌプラスミドＤＮＡでコトランスフェクションした。実施例１に記載のように、細胞をＡＭ５９０と接触させ、Ｒ−ＳＡＴ（商標）を使用してアッセイした。データを図６に示す。示すように、シグナル伝達中間体β−アレスチン２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００４３１３、ＮＭ１９９００４  参照により全体が本明細書中に援用される）は、ＲＡＲβ２といったＲＡＲ受容体の活性を正に調節できるが、β−アレスチン１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ００４０４１、ＮＭ０２０２５１  参照により全体が本明細書中に援用される）は調節できない。
【０１４９】
免疫共沈降実験を使用して、β−アレスチン２とＲＡＲβ２及びＥｒｋの相互作用を確認した。実施例７に記載のようにＲＡＲβ２及びＥｒｋをコードするプラスミドでコトランスフェクションした細胞をプレートから掻き取り、スピンして沈殿させ、溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１2、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した。５０μｇの細胞抽出物を免疫前血清で予め浄化し、タンパク質Ａ／Ｇセファロース及び抗Ｅｒｋ、Ｊｎｋ又はＰ３８抗体（表示のもの）と２時間インキュベートし、その後に丁寧に洗浄した。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Millipore， ビルリカ， マサチューセッツ）にブロットした。Piu他(2002)に記載のように、抗ＲＡＲβ２抗体を使用してウェスタンブロットを行った。図７Ａ中のデータは、ＲＡＲβ２とＥｒｋの間の相互作用を示す。対照的に、ＲＡＲβ２とＪｎｋ又はｐ３８の間には相互作用は認められなかった。
【０１５０】
図７Ｂに示した一連の実験では、Ｅｒｋ２、ＲＡＲβ２及びβ−アレスチン２で細胞を
コトランスフェクションした。上記のように、示された抗Ｅｒｋ２抗体又は抗ＲＡＲβ２抗体を使用して免疫共沈降を行った。抗β−アレスチン２抗体をウェスタンブロット法で使用した。図７Ｂに示すように、β−アレスチン２はＭＡＰキナーゼＥＲＫ２と物理的に相互作用し、図７Ａに示すように、それはＲＡＲβ２に結合して活性化させる。
【０１５１】
この実施例のデータは、核内受容体と他のシグナル伝達タンパク質との間の新規の相互作用を同定及び特徴付けるために本明細書中に記載の方法が有効であることを示す。
【０１５２】
上記の種々の方法及び技術は本発明を実施するための多数の方法を提供する。もちろん、記載された目的又は利点の必ずしも全てが本明細書中に記載の任意の特定の実施形態に従って達成できるわけではないことは理解すべきである。従って、例えば、当業者は、本明細書中で教示された１つの利点又は複数の利点を達成又は至適化する様式であって、他の目的又は利点が必ずしも達成されない様式によって本方法は達成されることを認識する。
【０１５３】
更に、当業者は異なる実施形態由来の種々の特徴が交換可能であることを認識する。同様に、当業者は上記で考察した種々の特徴及びステップ並びにこのような特徴又はステップと同等の他の既知のものを組み込み、適合させて、本明細書中に記載の原理に従って本方法を実施することができる。
【０１５４】
本発明は特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、当業者は本発明が詳細に開示している実施形態を超えて、他の別の実施形態及び／又は使用並びにその明らかな変更形態及び同等なものまで拡大されると理解するだろう。従って、本発明は本明細書中の好ましい実施形態の特定の開示に制限されることを意図しないが、本明細書に添付の特許請求の範囲が参照される。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】受容体のアゴニスト誘導をβ−ガラクトシダーゼ活性として検出した、複数の受容体形態の実施形態を示した図である。糖質コルチコイド受容体ＧＲα及びエストロゲン受容体ＥＲβをコードする受容体ＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼマーカーＤＮＡとコトランスフェクションした。次いで、各細胞アリコートを種々の濃度のＧＲ選択性リガンドであるデキサメタゾン及びＥＲ選択性リガンドであるエストロンとインキュベートした。
【図２】核ホルモン受容体の活性調節において、本明細書中に記載の実施形態を使用してどのようにシグナル伝達分子及び特定のコアクチベーターの重要性を評価することができるのかを示す図である。ＰＸＲ受容体（リファンピシン受容体）及びＲＸＲ受容体（レチノイン酸受容体）をコードするＤＮＡを、コアクチベーターＧＲＩＰ１及びＳＲＣ１（糖質コルチコイド受容体相互作用タンパク質１及びステロイド受容体コアクチベーター１）単独又はその組み合わせの存在下又は非存在下で、β−ガラクトシダーゼマーカーＤＮＡとコトランスフェクションした。リファンピシンはＰＸＲ／ＲＸＲヘテロ二量体の基準となるアゴニストリガンドである。
【図３】核ホルモン受容体によって示された構成活性レベルを定量するために、どのようにして本発明を使用することができるのかを示すヒストグラムである。単一受容体、形態法を使用して、β−ガラクトシダーゼマーカーと共に濃度を上げながら核内受容体をトランスフェクションした。データは、ペルオキシソームＰＰＡＲγ／ＲＸＲ受容体及びアンドロスタンＣＡＲα／ＲＸＲヘテロ二量体受容体の相対構成的活性を示す。
【図４】図４Ａはアンドロステノールの量を増加させながらの、ＣＡＲα／ＲＸＲの逆アゴニズムを示す図である。図４ＢはＢＲＬ４９６３５の量を増加させながらの、核内受容体ＰＰＡＲγ／ＲＸＲの逆アゴニズムを示す図である。
【図５】Ｒ−ＳＡＴ（商標）によって判定したレチノイド受容体のアゴニスト応答の一般的な薬理学的プロファイルを示す図である。
【図６】受容体とシグナル伝達分子の間の相互作用同定するために、本明細書中に記載の実施形態をどのように使用することができるのかを示す図である。示したＲＡＲ受容体をコードするＤＮＡを、βアレスチン１又はβアレスチン２をコードするプラスミドＤＮＡを伴って、又は伴わずβ−ガラクトシダーゼマーカーＤＮＡでコトランスフェクションした。細胞をＡＭ−５８０と接触させ、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【図７】図７Ａは核内受容体（ＲＡＲβ２）と他のシグナル伝達タンパク質（Ｅｒｋ、Ｊｎｋ及びＰ３８）の間の相互作用を示す免疫共沈降実験のブロットを示す図である。図７Ｂは核内受容体（ＲＡＲβ２）と他のシグナル伝達タンパク質（ｂＡｒｒ２）の間の相互作用を示す免疫共沈降実験のブロットを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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