(57)【要約】  ｆｕｓＢ耐性遺伝子またはその相同体を含み、かつＦｕｓＢフシジン酸耐性タンパク質またはその相同体を発現する、ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体と延長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）タンパク質との相互作用に基づいた、細菌で抗生物質フシジン酸に対する耐性を克服させることができる薬剤のスクリーニング方法。
2008517294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体と延長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）との相互作用を調節する薬剤の同定のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体を発現する細胞源を提供するステップと、
（ｉｉ）試験すべき少なくとも１つの候補薬剤を加え、該薬剤が、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体へのＥＦ−Ｇタンパク質の結合に影響を及ぼすか否かを決定するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
【請求項２】
ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体および／またはＥＦ−Ｇタンパク質は精製されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質の一方、ＦｕｓＢタンパク質もしくはその相同体またはＥＦ−Ｇタンパク質のいずれかが固定化される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質−タンパク質相互作用を破壊したり無効にしたりすることができる薬剤の存在下で、この相互作用が確認できるように、ＦｕｓＢタンパク質もしくはその相同体またはＥＦ−Ｇタンパク質が、アフィニティタギング法、化学的架橋または抗体に基づく結合を含む群から選択される技術により固定化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦｕｓＢタンパク質が組換えポリヒスチジン標識ＦｕｓＢタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
【請求項６】
ポリヒスチジン標識ＦｕｓＢタンパク質はアフィニティマトリックスに結合され、精製ＦｕｓＢ耐性タンパク質に対する薬剤の影響の有無を決定するステップは、固定化されたＦｕｓＢタンパク質を用いて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＦ−Ｇタンパク質は全細胞溶解液に由来する、請求項１〜６のいずれか一に記載の方法。
【請求項８】
結合していないＥＦ−Ｇは反復洗浄により除去され、候補／推定治療薬の存在により結合したままになっているＥＦ−Ｇの量が決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
候補／推定治療薬の存在により結合したままになっているＥＦ−Ｇの量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に続いて定性的に決定される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＥＦ−Ｇタンパク質源は、過剰発現し精製した組換えアフィニティ標識ＥＦ−Ｇに由来する、請求項１〜６のいずれか一に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＦ−ＧはＧＳＴ標識されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＬＩＳＡアッセイでＥＦ−Ｇ結合の検出を可能にするするために、酵素結合抗アフィニティ標識抗体を使用するステップをさらに含む、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＥＦ−Ｇは２５ｋＤａを超える特定の分画分子量を有する膜に保持され、その結果ＥＦ−Ｇが保持される間ＦｕｓＢは膜を透過することができ、候補／推定治療薬の存在下でのＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体とＥＦ−Ｇとの相互作用を決定することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
候補／推定治療薬の存在下でＦｕｓＢ耐性タンパク質とＥＦ−Ｇタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための技術は、アフィニティクロマトグラフィ、アフィニティブロッティング、免疫沈降、化学的架橋、タンパク質探索、ファージディスプレイおよび２ハイブリッドシステムを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＦｕｓＢタンパク質または相同体の原料は、ｆｕｓＢ耐性遺伝子または相同体が存在するか、または存在すると考えられ、ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体を発現し、その結果として、フシジン酸の作用に耐性を示すことが可能なグラム陽性またはグラム陰性の細菌種である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
細菌種は、ブドウ球菌属、エンテロコッカス種、リステリア種、バチルス種およびラクトコッカス種を含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ブドウ球菌の種または亜種は、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ亜種ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ亜種ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ亜種ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ亜種ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｓｔｉｍｕｌａｎｓ，Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ亜種ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ亜種ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｐｕｌｖｅｒｅｒｉ、Ｓ．ｆｅｌｉｓ、Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．ｍｕｓｃａｅおよびＳ．ｓｃｕｉｒ、または哺乳動物の細菌感染症に関与するあらゆる他のブドウ球菌を含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体とＥＦ−Ｇタンパク質との相互作用を防止し、細菌細胞におけるｆｕｓＢ介在耐性の表現型発現を阻止する薬剤をスクリーニングおよび同定する方法。
【請求項１９】
請求項２〜１７に記載の特徴のいずれか一以上をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌、特に、ＦｕｓＢフシジン酸耐性タンパク質またはその相同体を発現する、ｆｕｓＢ耐性遺伝子またはその相同体を含む細菌における、抗生物質フシジン酸に対する耐性を克服させることができる薬剤（薬物）のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フシジン酸は、特に、ブドウ球菌感染に起因する幾つかの疾病の治療に有効なことが証明されている、全身用および局所用の抗生物質である。フシジン酸は、骨髄炎、心内膜炎、皮膚組織および軟組織感染症、カテーテル関連感染症、尿路感染症、中枢神経系シャント感染症、手術部位感染症、細菌性結膜炎および眼の他の細菌感染、たとえば眼内炎等の病気に対して、しばしば処方される。しかし、最も一般的には、フシジン酸は、アトピー性湿疹、膿痂疹および感染性下腿潰瘍を含む、表在ブドウ球菌性皮膚感染の治療のための局所用抗生物質として、外来診療の場で使用される。フシジン酸はまた、抗菌薬として動物用にも処方される。
【０００３】
フシジン酸は、トランスロカーゼ、伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）のリボソームからの解離を阻害することにより、原核細胞のタンパク質合成を選択的に阻害することによって作用する。通常の状態で、ＥＦ−Ｇ・ＧＤＰ・リボソーム三元複合体は、アミノアシルｔＲＮＡ複合体がリボソームのＡ部位に入る前に解離する。しかし、フシジン酸が存在すると、該三元複合体は安定化して、タンパク質合成の阻害を招く。
【０００４】
フシジン酸は、４０年にわたり抗菌薬としてうまく使用されてきたが、その効力は今や、細菌の耐性出現により低下している。
【０００５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）の臨床分離菌におけるフシジン酸耐性に関する限られたデータから、該耐性は、ＥＦ−Ｇ（ｆｕｓＡ）をコードしている遺伝子の点突然変異に起因する（Ｂｅｓｉｅｒら２００３年、Ｏ’Ｎｅｉｌｌら２００４年およびＮａｇａｅｖら２００１年）か、またはあまり明らかにされていない耐性機構（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら２００２年およびＰｒｏｊａｎ  ２０００年）をコードする外因性耐性決定因子（ｆｕｓＢ）の獲得により生じることが分かる。後者の機構は、臨床状況におけるフシジン酸耐性への最も重要な経路のようである。欧州の、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）のフシジン酸耐性臨床分離菌の最近の分析で、欧州に蔓延している流行性膿痂疹の原因菌株にはｆｕｓＢが存在し（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら２００４年）、この決定因子はまた、重篤な市中感染を引き起こすＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株でも検出されている（Ｗｉｔｔｅら、Ｅｕｒｏ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，１：１−２，２００４年）。
【０００６】
フシジン酸に対するｆｕｓＢ型耐性に関する初期の研究では、タンパク質合成装置の修飾またはフシジン酸の分解を同定することができず（Ｃｈｏｐｓ  １９７６年、ＳｉｎｄｅｎおよびＣｈｏｐｒａ，１９８１年）、耐性は、細菌細胞内へのフシジン酸の侵入減少により獲得される可能性があることが示唆された。このため、細菌細胞からの抗生物質の排除は、ｆｕｓＢ遺伝子にコードされた透過性障壁の形成に起因する可能性があると、著者は提唱するに至った。
【０００７】
本発明において、特にフシジン酸に対するｆｕｓＢ型耐性に重要であると我々が考えているＦｕｓＢとＥＦ−Ｇとの間のタンパク質−タンパク質相互作用の同定により、我々は、ＦｕｓＢタンパク質の作用機序の解明に向けて、飛躍的な進歩を遂げた。我々は、細菌における抗生物質フシジン酸に対する耐性を克服させることができる薬剤をスクリーニングするためのアッセイを開発するために、またこのタンパク質−タンパク質相互作用を防止するための治療方法のデザインを可能にするために、このタンパク質−タンパク質相互作用を使用してきた。したがって、本発明は、フシジン酸耐性細菌菌株と闘う上で飛躍的な進歩を提供し、その結果、臨床環境で極めて重要になるであろう。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第一の態様によれば、
（ｉ）ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体を発現する細胞源を提供するステップと、
（ｉｉ）試験すべき少なくとも１つの候補薬剤を加え、該薬剤が、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体へのＥＦ−Ｇタンパク質の結合に影響を及ぼすか否かを決定するステップと
を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体と延長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）との相互作用を調節する薬剤を同定するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング方法が提供される。
【０００９】
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、明言された物または物の集合の包含を意味すると理解されるが、他の物または物の集合の除外を意味するものではない。
【００１０】
本明細書で、「ＦｕｓＢタンパク質相同体」への言及は、黄色ブドウ球菌で同定されたＦｕｓＢタンパク質と同様の機能を有するタンパク質を包含することを意図するが、他の生物に由来し、かつＦｕｓＢタンパク質と特定の程度の配列同一性を有するものであってもよい（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら２００２年）。特定の程度の相同性は、３０％以上の相同性であることもあり、好ましくは４０％または６０％またはそれ以上の相同であることもあり、より好ましくは８０％またはそれ以上の相同性であることもある。２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「配列同一性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３年）のように修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０年）を使用して決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０年）。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施される。２配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７年）に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが使用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【００１１】
好ましくは、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体および／またはＥＦ−Ｇタンパク質は精製されている。ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体および／またはＥＦ−Ｇタンパク質は、当該技術分野で周知の任意の方法で精製されてもよく、ポリヒスチジン（ｈｉｓ）タギング法により簡便に精製することが可能である。
【００１２】
好ましくは、該タンパク質の一方、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体あるいはＥＦ−Ｇタンパク質のいずれかを、固定化する。
【００１３】
好ましくは、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体あるいはＥＦ−Ｇタンパク質は、たとえば下記により固定化されるがその限りではない。
・２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第４章に、Ｅｉｎａｒｓｏｎ，ＭＢ．およびＯｒｌｉｎｉｃｋ，ＪＲ．により記述されているアフィニティ・タギング法。
・２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第６章に、Ｎａｄｅａｕ，ＯＷ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，ＧＭ．により記述されている化学的架橋。
・２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第５章、免疫共沈降に、Ａｄａｍｓ，Ｐ．、Ｓｅｅｈｏｌｚｅｒ，Ｓ．、およびＯｈｈ，Ｍ．により記述されている抗体に基づく結合。
【００１４】
タンパク質−タンパク質相互作用を破壊したり無効にしたりすることができる薬剤の存在下で、この相互作用が確認できるように、上記の任意の技術を使用してもよい。本発明の方法には、ＦｕｓＢ耐性タンパク質とＥＦ−Ｇタンパク質の相互作用が必須であると理解され、したがって、ある薬剤が該相互作用を破壊させることができるかどうかという結果は、固定化されるものがＦｕｓＢ耐性タンパク質であってもＥＦ−Ｇタンパク質であっても同じである。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ＦｕｓＢタンパク質は、アフィニティマトリックスに結合された組換えｈｉｓ標識ＦｕｓＢタンパク質であり、精製ＦｕｓＢ耐性タンパク質に対するある薬剤による影響の有無を決定するステップは、全細胞溶解液中のＥＦ−Ｇタンパク質とともに固定化されたＦｕｓＢタンパク質を用いて達成される。精製ＦｕｓＢ耐性タンパク質を金属アフィニティ樹脂に結合させ、ＥＦ−Ｇを結合させるために、ブドウ球菌細胞溶解液（簡便なＥＦ−Ｇ源である）で洗浄する。推定治療薬は、このプロセスの前またはプロセス中のいずれに加えてもよい。推定治療薬の存在により結合しなかったＥＦ−Ｇを除去するために繰り返し洗浄した後、結合したまま残ったＥＦ−Ｇの量を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に続く定性的方法で決定する。
【００１６】
代替実施形態では、ＥＦ−Ｇタンパク質とともに固定化された精製ＦｕｓＢ耐性タンパク質に対するある薬剤による影響の有無を決定するステップは、細胞溶解液からの天然のＥＦ−Ｇに代えて、過剰発現し精製したアフィニティ標識（理想的にはＧＳＴ標識）組換えＥＦ−Ｇを添加することにより達成される。この実施形態はまた、ＥＬＩＳＡアッセイでＥＦ−Ｇの結合を検出できるように、市販の酵素結合抗アフィニティ標識抗体を使用することも可能であろう。
【００１７】
また、固定化を必要とせずに、例えばタンパク質の大きさの違いなどの異なるパラメーターに基づいた技法によっても、このようなタンパク質−タンパク質相互作用を評価することが可能であることが理解されるであろう。８０ｋＤａであるＥＦ−Ｇに比して、ＦｕｓＢ耐性タンパク質は２５ｋＤａの分子量を有する。したがって、異なる大きさに基づいて、分子量２５ｋＤａを超える、例えば、限定されないが５０ｋＤａの分画分子量を有する膜上にＥＦ−Ｇを保持することが可能であり、その結果、ＦｕｓＢは膜を透過することができ、一方でＥＦ−Ｇは保持される。
【００１８】
ＦｕｓＢ耐性タンパク質とＥＦ−Ｇタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための他の方法も、本発明の方法に使用できることは、当業者に理解されるであろう。このような方法の例としては、限定されないが、アフィニティクロマトグラフィ、アフィニティブロッティング、免疫沈降および上文に記載したような架橋に基づく方法など、別のタンパク質に結合するタンパク質を検出する物理的方法などを含む。加えて、２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第９章に、Ｓｔｒｉｃｈ  Ｒにより記述されているタンパク質探索、または２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第８章に、Ｇｏｏｄｙｅａｒ  Ｃ．Ｓ．およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ  Ｇ．Ｊ．により記述されているファージディスプレイ、または２００２年、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから出版された、Ｅｒｉｃａ  Ｇｏｌｅｍｉｓ編、「タンパク質−タンパク質相互作用」の第７章に、Ｓｅｒｅｂｒｉｌｉｓｋｉｉ  ＩおよびＪｏｕｎｇ  Ｊ．Ｋ．より記述されている２ハイブリッドシステム等の、ライブラリーに基づく方法を使用することができる。
【００１９】
さらに、ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体およびＥＦ−Ｇタンパク質と、それらの相互作用を阻害する薬剤との相互作用が検出可能である限りは、当該技術分野で周知の、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の方法を、本発明に応用できることも理解されるであろう。
【００２０】
好ましくは、ＦｕｓＢタンパク質または相同体の原料は、ｆｕｓＢ耐性遺伝子または相同体が存在するか、または存在すると考えられ、ＦｕｓＢ耐性タンパク質またはその相同体を発現し、かつ、その結果として、フシジン酸の作用に耐性を示すことが可能なグラム陽性またはグラム陰性の細菌種である。ｆｕｓＢまたは相同体は、今までに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびブドウ球菌属の他のメンバー、ならびにエンテロコッカス種、リステリア種、バチルス種およびラクトコッカス種で同定されてきた。したがって、これらの細菌はいずれも、適当なＦｕｓＢタンパク質源を提供することが可能であろう。
【００２１】
好ましくは、細菌がブドウ球菌である場合、該細菌は、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ亜種ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ亜種ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ亜種ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ亜種ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｓｔｉｍｕｌａｎｓ，Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ亜種ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ亜種ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｐｕｌｖｅｒｅｒｉ、Ｓ．ｆｅｌｉｓ、Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．ｍｕｓｃａｅおよびＳ．ｓｃｕｉｒ、または哺乳動物の細菌感染症に関与するあらゆる他のブドウ球菌を含む群から選択されるブドウ球菌の種である。
【００２２】
ｆｕｓＢのクローニング、ならびに組換えＦｕｓＢの過剰発現および精製により、このタンパク質がどのような方法でフシジン酸に対する耐性を与えるのか、分子レベルでの理解が可能になった。我々は、無細胞転写翻訳共役反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）を用いて、可溶性タンパク質である精製ＦｕｓＢは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの転写装置をフシジン酸による阻害から保護することを証明した。対照的に、ＦｕｓＢタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）無細胞系を保護することはできないようであり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてはｆｕｓＢ遺伝子の発現はフシジン酸に対する耐性を与えることができないという我々の観察結果と一致する。我々は最近、この耐性タンパク質が相互に作用する細胞タンパク質を同定するために、固定化したＦｕｓＢタンパク質をアフィニティマトリックスとして使用して、ＦｕｓＢタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＥＦ−Ｇに結合するが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＦ−Ｇには結合しないことを、証明した（図１）。
【００２３】
ＦｕｓＢの生物情報学的分析では、機能が確認されている他のタンパク質との有意な配列相同性が明らかにされず、その結果、ＦｕｓＢはどのような機構でＳ．ａｕｒｅｕｓ転写装置を保護するのかについては様々な推測が可能である。しかし、ＥＦ−Ｇとの相互作用は、防御機構の中心であると考えられる。
【００２４】
本発明の第二の態様によれば、ＦｕｓＢタンパク質またはその相同体とＥＦ−Ｇタンパク質との相互作用を防止し、細菌細胞におけるｆｕｓＢ介在耐性の表現型発現を阻止する薬剤をスクリーニングおよび同定する方法が提供される。
【００２５】
好ましくは、本発明の第二の態様の方法は、本発明の第一の態様の方法の特徴のいずれか１つまたは複数を含む。
【００２６】
次に、ほんの一例として、以下の図を参照しながら、本発明を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
材料と方法
＜ｆｕｓＢのクローニング＞
ｆｕｓＢのＰＣＲ増幅は、プライマー５’−ＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴ（配列番号１）および５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＣＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡ（配列番号２）を使用して行った。ＰＣＲ増幅産物は、遺伝子工学的に導入したＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を介してｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する寒天上で選択し、次いで、プラスミド調製物の制限分解により挿入断片を含有する形質転換体をスクリーニングした。忠実なＰＣＲ増幅を検証するために挿入断片をＤＮＡ配列決定に付し、次いでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（λＤＥ３）を形質転換した。
【００２８】
＜ポリヒスチジン標識ＦｕｓＢの発現および精製＞
ｐＥＴ２８：ｆｕｓＢを担持するＢＬ２１（λＤＥ３）を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む２ＹＴ＋０．５％グルコース中、３７℃で１５時間培養した。菌体を、カナマイシン３０μｇ／ｍｌを含む２５０ｍｌの用時調製した２ＹＴ中に１／２５希釈し、ＯＤ600が０．６に達するまで、３０℃（２２０ｒｐｍ）で培養した。ＩＰＴＧを３００μＭになるように加え、５時間インキュベーションを続けた。菌体を、５０００×ｇで１５分間遠心して収菌し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、−８０℃で凍結した。必要に応じて、菌体ペレットを２０分間氷上で解凍し、次いで、氷上で、冷やした溶解バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ；１０×濃縮物から）、０．５ｍＭ  ＴＨＰ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、５ｍＭイミダゾール、コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル錠（Ｒｏｃｈｅ）１／４錠）１２ｍｌ中に、完全に再懸濁させた。次に、９０ＫＵのｒＬｙｓｏｚｙｍｅおよび１ＫＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（両者ともＮｏｖａｇｅｎ）を加え、その混合物を、穏やかに振盪している台上で、氷中に２０〜３０分間インキュベートしてから、４℃、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を冷却した新品の試験管中に回収した。完全に平衡化したＴａｌｏｎ金属アフィニティ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のアリコート（１ｍｌ）を、澄んだサンプルに加え、氷中で６０分間穏やかに撹拌し、ポリヒスチジン標識タンパク質を樹脂に結合させた。次に、これを４℃、７００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。洗浄用バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．５ｍＭ  ＴＨＰ）４０ｍｌを加え、氷上で１０分間穏やかに撹拌することにより樹脂を洗浄した。これを繰り返した後、２ｍｌの洗浄用バッファーを樹脂に加え、穏やかにボルテックスすることにより再懸濁させた。樹脂は２ｍｌの重力溶出カラムに移し、懸濁液から沈殿させ、バッファーを流出させた。このカラムを１０ｍｌの洗浄用バッファーで１回洗浄し、５ｍｌの溶出用バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＴＨＰ、１５０ｍＭイミダゾール）を加えることによりポリヒスチジン標識タンパク質を溶出した。最初の５００μｌを棄て、続く溶出液１．５ｍｌを回収した。３．５Ｋ  ＭＷＣＯ透析カセットを使用して、５００ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴに対して、４℃で、これを透析した。３時間後、バッファーを５０％グリセロールを含有する用時調製したバッファーと取り替え、４℃で一晩放置した。１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で１〜１０μｌアリコートを分析することにより、ポリヒスチジン標識タンパク質の存在および純度を確認し、ブラッドフォード法で定量した。
【００２９】
＜ポリＨｉｓプルダウン＞
このアッセイのプロトコールは、「ｂａｉｔ」タンパク質を使用して、相互に作用する「ｐｒｅｙ」タンパク質を「プルダウン」するため、簡便に「プルダウンアッセイ」と呼ばれる。
Ｉ．ｂａｉｔタンパク質を調製する
１）固定化コバルトキレートを平衡化する
１．サンプル、非処理ゲルコントロールおよび固定化ｂａｉｔコントロールを含むために十分なミニスピンカラム（Ｍｉｎｉ−Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を標識する。
２．各ミニスピンカラムごとに、８ｍｌの洗浄用バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣ１［ｐＨ７．２］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＴＨＰ、１００μｌプロテアーゼインヒビター混合物／１．２５ｍｌ）を調製し、８０μｌの４Ｍイミダゾールを加える。
３．コバルトキレートをボルテックスによって再懸濁させ、このスラリー５０μｌを、各標識ミニスピンカラムに入れる。
４．４００μｌの洗浄溶液を各スピンカラムに加える。両カラム端に蓋をし、数回逆さにして平衡化する。
５．両方の蓋を外し、スピンカラムをコレクションチューブに入れる。
６．１，２５０×ｇで３０秒間、遠心分離する。底蓋を元に戻す。洗浄液を棄てる。
７．洗浄ステップを５回、繰り返す。
【００３０】
２）前もって精製したタンパク質からｂａｉｔを固定する。
１．洗浄用バッファーで総量５００μｌにしたポリヒスチジン標識ｂａｉｔタンパク質（ＦｕｓＢ）１００〜１５０μｇを加える。
２．各ミニスピンカラムの底蓋および上端の蓋を元に戻す。
３．回転台上で穏やかに揺らしながら、４℃で少なくとも３０分間、インキュベートする。
４．各スピンカラムから両方の蓋を外し、カラムをコレクションチューブに入れる。
５．１，２５０×ｇで３０秒間、遠心分離する。
６．底蓋をスピンカラムに戻す。
７．４００μｌの洗浄液を加え、前述同様、５回洗浄する。
【００３１】
ＩＩ．ｐｒｅｙタンパク質
１）ｐｒｅｙタンパク質を調製して捕獲する（ステップ１および２は、実験日の前に行わなければならない）
１．５ｍｌのＲＮ４２２０飽和培養ＴＳＢを用時調製した１００ｍｌの培地に加え、通気しながら３７℃で３時間培養する。
２．４℃で遠心分離することにより収菌し、５ｍｌの冷やしたバッファーＡ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ［ｐＨ７．２］  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄する。
３．ペレットを−８０℃で保存する。
４．０．５ｇ／ｍｌになるように冷やしたバッファーＡ中に再懸濁させる。
５．リゾスタフィンを２０μｇ／ｍｌになるまで加え、穏やかに混合しながら３７℃で３０分間、インキュベートする。
６．４℃、３０，０００×ｇで３０分間、遠心分離する。
７．上清をデカントし、イミダゾールを４０ｍＭまで加える。
８．最高８００μｌまで、固定化した融合タンパク質およびコントロールチューブ（＋樹脂／−ｂａｉｔタンパク質）に加える。
９．穏やかに撹拌しながら４℃で１時間、インキュベートする。
１０．前述同様、５回洗浄する。
【００３２】
ＩＩＩ．ｂａｉｔ−ｐｒｅｙ溶出および分析
１．樹脂を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えたＳＤＳサンプル用緩衝溶液２μｌ中、９９℃で３分間煮沸し、直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０〜１２％）で泳動する。
【実施例１】
【００３３】
図１を参照すると、ＦｕｓＢとＥＦ−Ｇの相互作用が示されている。２つ目のレーンに見られる上方のバンドは、このタンパク質バンドのトリプシン消化物に対する質量分析で確認された通り、ＥＦ−Ｇである。無細胞転写翻訳共役反応系を使用して、我々は、可溶性タンパク質である精製ＦｕｓＢは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの転写装置を、フシジン酸による阻害から保護することを証明した。一方で、ＦｕｓＢタンパク質はＥ．ｃｏｌｉの無細胞系を保護することはできないようであり、これはＥ．ｃｏｌｉにおけるｆｕｓＢ遺伝子の発現がフシジン酸に対する耐性を付与しないという以前の観察結果と一致する。我々は最近、固定化したＦｕｓＢタンパク質をアフィニティマトリックスとして用いて、ＦｕｓＢタンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＥＦ−Ｇに結合するが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＦ−Ｇには結合しないことを証明した（図１のレーン４および５を参照）。レーン３および５は、ＦｕｓＢが存在しなければ、金属アフィニティ樹脂へのＥＦ−Ｇの非特異的結合が起こらないことを示す、コントロールレーンである。
【００３４】
［参考文献］
【表１】
2008517294.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】精製ＦｕｓＢ（下のバンド）と黄色ブドウ球菌溶解液由来の天然ＥＦ−Ｇ（上のバンド）との間の相互作用を示す。ＦｕｓＢとＥ．ｃｏｌｉ由来のＥＦ−Ｇタンパク質との間には相互作用は生じない。
【図１】
2008517294.tif 000004
【国際調査報告】
2008517294.tif 000005
2008517294.tif 000006