(57)【要約】  本発明は、低悪性度の子宮頸部形成異常の状態を特定し、個々の病変が高悪性度の子宮頸部形成異常及び子宮頸部扁平上皮細胞癌更に子宮頸部腺癌に発達する進行する可能性を評価するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅を検出し、それにより患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌への変化を評価することを含んでなる、
低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌の症状への変化を評価するための方法。
【請求項２】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出することが、患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常への進行を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノム増幅が、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記低悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード１の子宮頸部上皮内新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード２の子宮頸部上皮内新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード３の子宮頸部上皮内新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、生体内原位置での（in situ）癌腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ゲノム増幅が、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブの核酸配列が、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出可能なマーカーが、蛍光シグナルを発する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出可能なマーカーが、発色性である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能なマーカー、及び第３染色体又は第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブ（centromere enumeration probe）に対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記ゲノム増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノム増幅が、テロメラーゼポリペプチドの量を測定することによって検出される、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、子宮頸部からの調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記調製物が、パップスメア又は細胞の薄層懸濁物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法に従って、当該プローブを用いての低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常の症状への変化を評価するための説明書を含んでなる、低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常の症状への変化を評価するためのキット。
【請求項１８】
ｉ）低悪性度の子宮頸部形成異常；又は
ｉｉ）形成異常なし
の何れかの症状を有することが既知の患者から得たサンプルで、染色体３ｑのゲノム増幅の第１の同定を行い、それにより侵襲性の子宮頸部癌を発症するリスクのある患者を同定することを含んでなる、侵襲性の子宮頸部癌を発症するリスクのある患者を同定するための方法。
【請求項１９】
前記ゲノム増幅が、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記低悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード１の子宮頸部上皮内新生物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
細胞学的に正常なパップスメアが、形成異常を全く有さない患者から得られる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ゲノム増幅が、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブの核酸配列が、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能なマーカーが、蛍光シグナルを発する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能なマーカーが、発色性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
検出可能なマーカー及び第３染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲノム増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ゲノム増幅が、テロメラーゼポリペプチドの量を測定することによって検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルが、子宮頸部からの調製物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記調製物が、パップスメア又は細胞の薄層懸濁物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び請求項１８〜３０の何れか一項に記載の方法に従って、当該プローブを用いての侵襲性の子宮頸癌を発症するリスクのある患者を同定するための説明書を含んでなる、侵襲性の子宮頸癌を発症するリスクのある患者を同定するためのキット。
【請求項３２】
低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅についてアッセイし、それにより低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターすることを含んでなる、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするための方法。
【請求項３３】
染色体３ｑのゲノム増幅が、前記サンプルに存在することを確定する工程を更に含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
染色体３ｑのゲノム増幅が、前記サンプルに存在しないことを確定する工程を更に含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ゲノム増幅が、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記低悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード１の子宮頸部上皮内新生物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード２の子宮頸部上皮内新生物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード３の子宮頸部上皮内新生物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記高悪性度の子宮頸部形成異常が、生体内原位置での癌腫である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記ゲノム増幅が、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブの核酸配列が、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能なマーカーが、蛍光シグナルを発する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出可能なマーカーが、発色性である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
検出可能なマーカー及び第３染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲノム増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記ゲノム増幅が、テロメラーゼポリペプチドの量を測定することによって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルが、子宮頸部からの調製物である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４８】
前記調製物が、パップスメア又は細胞の薄層懸濁物である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び請求項３２〜４８の何れか一項に記載の方法に従って、当該プローブを用いての低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするための説明書を含んでなる、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするためのキット。
【請求項５０】
ａ）低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅についてアッセイすること、及び
ｂ）工程ａ）のゲノム増幅が存在しないことを確定すること、
ここにおいて、工程ａ）のゲノム増幅の存在しないことが、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を示すこと、
を含んでなる、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するための方法。
【請求項５１】
前記ゲノム増幅が、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記低悪性度の子宮頸部形成異常が、グレード１の子宮頸部上皮内新生物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
退行が、患者からの細胞学的に正常なパップスメアを得ることにより検出される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記ゲノム増幅が、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記プローブの核酸配列が、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記検出可能なマーカーが、蛍光シグナルを発する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記検出可能なマーカーが、発色性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
検出可能なマーカー、及び第３染色体又は第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記ゲノム増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって検出される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記ゲノム増幅が、テロメラーゼポリペプチドの量を測定することによって検出される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記サンプルが、子宮頸部からの調製物である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記調製物が、パップスメア又は細胞の薄層懸濁物である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び請求項５０〜６２の何れか一項に記載の方法に従って、当該プローブを用いての患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するための説明書を含んでなる、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するためのキット。
【請求項６４】
前記プローブの核酸配列が、異所性ウイルス組み込み部位１、骨髄異形成症候群１、ミオネウリン(myoneurin)、Ｇタンパク質共役型受容体１６０、プロテインキナーゼＣ、ＳＫＩ様、クローディン１１、真核細胞翻訳開始因子５Ａ２、ＴＲＡＦ２及びＮＣＫ相互作用キナーゼ、ホスホリパーゼＤ１、成長ホルモン分泌促進因子受容体、腫瘍壊死因子１０、上皮細胞形質転換配列２発癌遺伝子、ｐ５３標的ジンクフィンガータンパク質、ホスホイノシチド３−キナーゼ（phosphoinositide-3-kinase）、マイトフュージン１（mitofusin1）及びユビキチン特異的プロテアーゼ１３からなる群より、選択される相補的な核酸配列である、請求項８、２２、４０又は５０に記載の方法。
【請求項６５】
正常との診断を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅を検出し、それにより患者の症状の低悪性度の子宮頸部形成異常、高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌への変化を評価することを含んでなる、患者の正常な状態から低悪性度の子宮頸部形成異常、高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌への変化を評価するための方法。
【請求項６６】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出することが、患者の症状の低悪性度又は高悪性度の子宮頸部形成異常への進行を示す、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ゲノム増幅が、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
対象におけるテロメラーゼ遺伝子又はその一部のゲノム増幅を検出することを含んでなる、対象における腺癌を診断する方法。
【請求項６９】
前記ゲノム増幅が、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記プローブが、５つの重複するＢＡＣクローンのコンティグを含んでなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記プローブの核酸配列が、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記サンプルが、子宮頸部からの調製物である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
検出可能なマーカー及び第３染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
検出可能なマーカー及び第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対して前記サンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
検出可能なマーカー並びに第３染色体及び第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び請求項６８〜７４の何れか一項に記載の方法に従って、当該プローブを用いての腺癌をモニターするための説明書を含んでなる、患者において腺癌をモニターするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連の出願／特許及び参照による取り込み）
本明細書に引用される各々の出願及び特許、更にこれらの出願及び特許の各々に引用される各々の文書又は参考文献（各々の発行された特許の審査の間を含む；「出願引用文書（application cited documents）」）、並びにこれらの出願及び特許の何れかからの優先権に対応するか及び／又は優先権を主張する各々のＰＣＴ及び外国出願又は特許、更に各々の出願引用文書に引用又は言及された各々の文書は、参照して本明細書に明確に取り込まれる。更に一般的には、文書又は参考文献は、本明細書において、添付の参考文献リストに又は本明細書自体のいずれかにおいて引用され；そしてこれらの文書又は参考文献の各々（「本明細書において引用される参考文献（herein-cited references）」）、更に本明細書において引用される各々の参考文献に引用される各々の文書又は参考文献（製造業者の仕様書、説明書等の何れかを含む）は、明らかに参照して本明細書に取り込まれる。
【０００２】
（連邦政府の支援研究の下で成された本発明に対する権利声明）
本検討は、アメリカ国立衛生研究所（National Institute of Health）によって支援され、政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
染色体異数性及び特定の癌関連の遺伝子のコピー数変化の可視化は、細胞学的なサンプルの通常の形態学的評価に対する重要な補完物となっている１。このアプローチは、生物学的に有効でありかつ成功したものである。なぜなら、染色体異数性及び生じたゲノム不均衡は、癌細胞に特異的であり、異なる癌腫について区分でき、そして疾患の進行時の初期に生じるからである２、３。幾つかのゲノム不均衡は、予後不良及び治療ミスと関連しており４〜６、そして、例えば、乳癌におけるＨｅｒ２／ｎｅｕ発癌遺伝子の増幅のような他の不均衡では、治療上の判断を導くことができる７。
【０００４】
その他の殆どのヒト癌腫と同様に、子宮頸部癌は、ゲノム不均衡の分布が保存されていることによって定義される。高リスクのヒトパピローマウイルスでの感染に加えて９，１０、子宮頸部扁平上皮の遂次的な形質転換には、その他の細胞遺伝学的な異常１２の中でも染色体腕３ｑの更なるコピーの獲得１１が必要となる。子宮頸癌のＣＧＨ分析によって、侵襲性の子宮頸癌の８５％以上が特定のゲノム不均衡を保持して、染色体腕３ｑのコピー数が増大していることが示されている５、１１、２０〜２６。最小重複の領域は、ヒトテロメラーゼのＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）の遺伝子を含む染色体バンド３ｑ２６を指す２７。
【０００５】
子宮頸癌のスクリーニングプログラムの実施によって、先進工業国における疾患頻度及び死亡率は大きく減少している１６、１７。しかし、単一の細胞学的評価は、相対的に感度が高くないままであり、それ故に、頻繁に追跡検討する必要がある。これは、サンプリング又は解釈ミスに、そして幾つかの初期の病変が、認識可能な表現型変化を捕捉できないという事実に起因している１７。侵襲性の子宮頸癌は、子宮頸部形成異常の段階の増大を通じて発症し、そしてＣＩＮ３に進行し、これは、外科的処置を要する真正の（bonafide）前癌病変とみなされる。しかし、全ての低悪性度の形成異常病変のうち、直線的に進行するような経路に従うのはわずか約１０〜１５％である。従って、疾患の進行のマーカーを同定することは、重要な臨床的目的となるであろう。
【０００６】
以前の検討によって、ＴＥＲＣの更なるコピーの可視化は、低悪性度の子宮頸部形成異常のサンプルを含む、通常に収集された細胞学的サンプルにおける３ｑ２６増幅のための特異的かつ感度の良い試験として役立つことが実証された８。この知見は、３ｑに課せられた増殖の利点として、子宮頸部上皮細胞が順次悪性の形質転換する間、もとに戻ることのないポイントを示すという仮説と一致するが、確証的ではない。例えば、２００４年６月４日出願で、米国出願公開第２００５００２６１９０号として公開された米国出願第１０／８５７８５９号にて、３ｑ２６増幅は、子宮頸部生検及びパップスメア標本において、低悪性度の子宮頸部上皮内新生物を検出することなく、高悪性度の子宮頸部の上皮内新生物（ＣＩＮ  ＩＩ及びＣＩＮ  ＩＩＩ）及び悪性の癌腫を選択的に検出するために用いることができると示される。従って、３ｑ２６増幅は、低悪性度の子宮頸部形成異常と高悪性度の子宮頸部形成異常及び腺癌との間の識別要因であると考えられた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
低悪性度の子宮頸部形成異常における３ｑ増幅の同定が、高悪性度の子宮頸部形成異常及び癌への個々の病変の進行の可能性に関する情報を提供できることが現在実証されている。
【０００８】
一態様では、本発明は、低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌の症状への変化を評価するための方法を提供し、この方法は、低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅を検出し、それにより患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌への変化を評価することを包含する。染色体３ｑのゲノム増幅の検出が、患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常への進行を示す。
【０００９】
別の態様では、本発明は、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするための方法を提供し、この方法は、低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅についてアッセイし、それにより低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターすることを包含する。この方法は、染色体３ｑのゲノム増幅がサンプルに存在すること、又は染色体３ｑのゲノム増幅がサンプルに存在しないことを、確定する工程を更に含んでもよい。
【００１０】
本発明の低悪性度の子宮頸部形成異常は、グレード１の子宮頸部上皮内新生物であってもよいが、それに限定されるものではない。本発明の高悪性度の子宮頸部形成異常は、グレード２の子宮頸部上皮内新生物、グレード３の子宮頸部上皮内新生物及び生体内原位置での（in situ）癌腫を包含するが、それらに限定されるものではない。
【００１１】
一態様では、患者から得られるサンプルは、子宮頸部からの調製物であり、これらに限定されないが、パップスメア又は細胞の薄層（例えば、単層）懸濁物が挙げられる。
【００１２】
本発明の特定の態様によれば、ゲノム増幅は、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内であってもよい。この遺伝子座としては、テロメラーゼ（ＴＥＲＣ）遺伝子のコード配列が挙げられる。従って、一態様では、このゲノム増幅は、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される。本発明の方法は、検出可能なマーカー及び第３染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを更に含んでもよい。
【００１３】
一態様では、このプローブの核酸配列は、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である。
【００１４】
その他の態様では、プローブの核酸配列は、染色体３ｑ又はその一部の核酸配列に対して相補的であり、これらに限定されないが、ＥＶＩ１（異所性ウイルス組み込み部位１、３ｑ２４−３ｑ２８）、ＭＤＳ１（骨髄異形成症候群１、３ｑ２６）、ＭＹＮＮ（ミオネウリン(myoneurin)、３ｑ２６．２）、ＧＰＲ１６０（Ｇタンパク質共役型受容体１６０、３ｑ２６．２−３ｑ２７）、ＰＲＫＣＩ（プロテインキナーゼＣ、３ｑ２６．３）、ＳＫＩＬ（ＳＫＩ様３ｑ２６）、ＣＬＤＮ１１（クローディン１１、３ｑ２６．２−３ｑ２６．３）、ＥＩＦ５Ａ２（真核細胞翻訳開始因子５Ａ２、３ｑ２６．２）、ＴＮＩＫ（ＴＲＡＦ２及びＮＣＫ相互作用キナーゼ、３ｑ２６．２）、ＰＬＤ１（ホスホリパーゼＤ１、３ｑ２６）、ＧＨＳＲ（成長ホルモン分泌促進因子受容体、３ｑ２６．３１）、ＴＮＳＦ１０（腫瘍壊死因子１０、３ｑ２６）、ＥＣＴ２（上皮細胞形質転換配列２発癌遺伝子、３ｑ２６．１−３ｑ２６．２）、ＷＩＧ１（ｐ５３標的ジンクフィンガータンパク質、３ｑ２６．３−３ｑ２７）、ＰＩＫ３Ａ（ホスホイノシチド３−キナーゼ、３ｑ２６．３）、ＭＦＮ１（マイトフュージン１、３ｑ２６．３２）及びＵＳＰ１３（ユビキチン特異的プロテアーゼ１３、３ｑ２６．２−３ｑ２６．３）が挙げられる。
【００１５】
別の態様では、プローブの検出可能なマーカーは、蛍光シグナルを発する。
【００１６】
更に別の態様では、プローブの検出可能なマーカーは、発色性である。
【００１７】
更に別の態様では、上記ゲノム増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって検出される。
【００１８】
更に別の態様では、このゲノム増幅は、このゲノム増幅内の遺伝子座を有する遺伝子から転写されるポリペプチドの量を測定することによって検出される。
【００１９】
特定の態様では、ゲノム増幅は、テロメラーゼポリペプチドの量を測定することによって検出される。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は、侵襲性の子宮頸部癌を発症するリスクのある患者を同定するための方法を提供し、この方法は、ｉ）低悪性度の子宮頸部形成異常；又はｉｉ）形成異常なし、の何れかの症状を有することが既知の患者から得たサンプルで、染色体３ｑのゲノム増幅の第１の同定を行い、それにより侵襲性の子宮頸部癌を発症するリスクのある患者を同定することを含む。
【００２１】
特定の態様では、細胞学的に正常なパップスメアは、形成異常を全く有さないで染色体３ｑのゲノム増幅を有する患者から得ることができる。
【００２２】
更に別の態様では、本発明は、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するための方法を提供し、この方法は、ａ）低悪性度の子宮頸部形成異常を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅についてアッセイすること、及びｂ）工程ａ）のゲノム増幅が存在しないことを確定する工程を含み、ここにおいて、工程ａ）のゲノム増幅の存在しないことが、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を示している。
【００２３】
一態様では、退行は、患者から細胞学的に正常なパップスメアを得ることによって検出される。
【００２４】
本発明の他の態様では、本発明の方法を行うためのキットが提供される。
【００２５】
一態様では、本発明は、低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常の症状への変化を評価するためのキットを提供し、このキットは、染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び本発明の方法に従って、このプローブを用いての低悪性度の子宮頸部形成異常の患者の症状の高悪性度の子宮頸部形成異常の症状への変化を評価するための説明書を包含する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、侵襲性の子宮頸癌を発症するリスクのある患者を同定するためのキットを提供し、このキットは、染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び本発明の方法に従って、このプローブを用いての侵襲性の子宮頸癌を発症するリスクのある患者を同定するための説明書を包含する。
【００２７】
更に別の態様では、本発明は、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするためのキットを提供し、このキットは、染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び本発明の方法に従って、このプローブを用いての低悪性度の子宮頸部形成異常の症状から高悪性度の子宮頸部形成異常の症状へのシフトをモニターするための説明書を包含する。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するためのキットを提供し、このキットは、染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び本発明の方法に従って、このプローブを用いての患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の維持又は退行を評価するための説明書を包含する。
【００２９】
一態様では、患者の正常な状態から低悪性度の子宮頸部形成異常、高悪性度の子宮頸部形成異常、又は癌の症状への変化を評価するための方法が提供され、そしてこの方法は、正常との診断を有しているか又は以前に有していた患者からのサンプルの染色体３ｑのゲノム増幅を検出し、それにより患者の症状の低悪性度の子宮頸部形成異常、高悪性度の子宮頸部形成異常又は癌への変化を評価することを包含する。
【００３０】
一態様では、染色体３ｑのゲノム増幅を検出することは、患者の症状の低悪性度又は高悪性度の子宮頸部形成異常への進行を示す。
【００３１】
別の態様では、上記ゲノム増幅は、染色体３ｑの３ｑ２６遺伝子座内である。
【００３２】
一態様では、対象における腺癌を診断する方法が提供され、そしてこの方法は、対象におけるテロメラーゼ遺伝子又はその一部のゲノム増幅を検出することを包含する。
【００３３】
一態様では、上記ゲノム増幅は、検出可能なマーカー及び３ｑ２６遺伝子座の核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、プローブに対してサンプルをハイブリダイズすることによって検出される。
【００３４】
別の態様では、このプローブは、４つの重複するＢＡＣクローンのコンティグを包含する。関連の態様では、このプローブは、５又は６つの重複するＢＡＣクローンを包含する。
【００３５】
更に別の態様では、このプローブの核酸配列は、テロメラーゼ遺伝子又はその一部に対して相補的である。
【００３６】
特定の態様では、このサンプルは、子宮頸部からの調製物である。
【００３７】
一態様では、この方法は、検出可能なマーカー及び第３染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブ（centromere enumeration probe）に対してサンプルをハイブリダイズさせることを、更に含んでいてもよい。
【００３８】
一態様では、この方法は、検出可能なマーカー及び第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを、更に含んでいてもよい。
【００３９】
一態様では、この方法は、検出可能なマーカー並びに第３染色体及び第７染色体のセントロメアに近接する核酸配列に対して相補的である核酸配列を包含する、セントロメア計数プローブに対してサンプルをハイブリダイズさせることを、更に含んでいてもよい。
【００４０】
一態様では、患者の腺癌をモニターするためのキットが提供され、このキットは、染色体３ｑのゲノム増幅を検出するためのプローブ、及び本明細書に記載の方法に従って、このプローブを用いての腺癌をモニターするための説明書を包含する。
【００４１】
本発明の他の態様は、以下の開示に記載されるか又は以下の開示から明白であり、そして本発明の範囲内である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（Ｉ．定義）
「腺癌（adenocarcinoma）」とは、少なくとも当業者に公知の腺癌を意味する。子宮頸部腺癌は、少なくとも部分的には、子宮頸部の粘液産生性の腺細胞から発症する。
【００４３】
「低悪性度の子宮頸部形成異常(low grade cervical dysplasia)」とは、グレード１の子宮頸部上皮内新生物を含むわずかな形成異常の子宮頸部病変を意味する。
【００４４】
「高悪性度の子宮頸部形成異常(high grade cervical dysplasia)」とは、グレード２又は３の子宮頸部上皮内新生物を含む、生体内原位置での癌腫又は高悪性度の扁平上皮内病変を意味する。
【００４５】
「子宮頸部上皮内新生物(cervical intraepithelial neoplasm)」又は「ＣＩＮｓ」は、細胞の層形成における異常の程度に依存してグレード１、２又は３と分類される。ＣＩＮ１は、上皮の下部１／３における未成熟基底型細胞の存在によって特徴付けられる。ＣＩＮ２は、上皮の下部２／３における未成熟基底型細胞の存在によって特徴付けられる。ＣＩＮ３では、上皮の全層が未分化でかつ非層状化の細胞を含む。
【００４６】
患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の「進行(progression)」とは、グレード１又はグレード２の子宮頸部上皮内新生物のような、小さい子宮頸部形成異常病変から高悪性度の子宮頸部形成異常への悪性転換を意味する。
【００４７】
患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の「維持(maintenance)」とは、わずかな形成異常の子宮頸部病変の、長期間の継続的な存在を意味する。
【００４８】
患者の低悪性度の子宮頸部形成異常の症状の「退行(regression)」とは、わずかな形成異常の病変の、経時的な減少又は根絶を意味する。根絶は、低悪性度の子宮頸部形成異常と以前に診断された患者における細胞学的に正常なパップスメアによって検出することができる。
【００４９】
「ゲノム増幅(genomic amplification)」とは、ゲノム配列、例えば、１つ又はそれ以上の遺伝子をコードする配列におけるコピー数の増大を意味する。
【００５０】
「遺伝子座(locus)」とは、生物体の遺伝子マップに従って規定された染色体領域を意味する。一般的には、遺伝子マップは、染色体上にそして特定の遺伝子座に所与の遺伝子によって占有される特異的位置（すなわち、「遺伝子座」）を指定しており、そして変異体遺伝子の何れか一つが存在してもよい。
【００５１】
「核酸配列(nucleic acid sequence)」とは、一本鎖型又は二本鎖型の何れかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして特に定められていない限り、自然発生するヌクレオチドと同様の様態で機能できる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含する。
【００５２】
「相補的な核酸配列(complimetrary nucleic acid sequences)」とは、配列の間で塩基対を形成するように、対応する位置に適合性のヌクレオチド（例えば、Ａ／Ｔ、Ｇ／Ｃ）を有する、隣接するＤＮＡ又はＲＮＡの配列を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡらせんのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、相補的であることが当該分野で公知である。
【００５３】
本明細書で用いられる「プローブ(probe)」又は「核酸プローブ(nucleic acid probe)」は、染色体核酸配列に対するハイブリダイゼーションが検出できる、１つ又はそれ以上の核酸フラグメントのコレクションであると規定される。
【００５４】
「ハイブリダイズする(hybridizing)」とは、相補的な塩基対を介する２つの一本鎖核酸の結合を、並びに２つ又はそれ以上の核酸の結合を意味する。
【００５５】
「セントロメア計数プローブ(centromere enumeration probe)」とは、セントロメアに近接する染色体領域、通常は反復配列領域に対してハイブリダイズするプローブであって、染色体全体の有無を示すことができる。
【００５６】
「患者(patient)」とは、癌又は子宮頸部形成異常、例えば、低悪性度の子宮頸部形成異常又は細胞学的に正常なパップスメアを有しているか、又は以前に有していた雌性の対象、好ましくはヒトである。
【００５７】
その他の定義は、本開示全体を通じて本文中に記述される。
【００５８】
（ＩＩ．本発明の方法）
（サンプルの調製）
患者から得られた生物学的サンプルは、一般的には子宮頸部調製物であって、これには、パップスメア又は細胞の薄層懸濁物が挙げられる。生物学的サンプルとは、細胞又は細胞物質、例えば、子宮の子宮頸部からの細胞又は物質を含むサンプルである。子宮頸部標本の例としては、子宮頸部の生検、スメア、剥落物等が挙げられる。一般的には細胞は、当該分野で公知の技術を用いて、生物学的サンプルから収集して、調製する。サンプルは、臨床診断に十分である数の細胞を含んでもよく、そして一般的には少なくとも約１００個の細胞を含む。一般的なアッセイでは、ハイブリダイゼーションパターンは、約２５〜５，０００個の細胞で評価される。評価のための子宮頸部細胞を収集するには、多数の方法が利用可能である。例えば、子宮頸膣部及び子宮頸膣部／移行部からの細胞は、子宮膣部ブラシ（endocervical brushes）（又は「ほうき（brooms）」）又は木製及びプラスチックのスパチュラ（へら）のような公知の器具を用いて収集される。従来のスメアは、ガラススライドに細胞を均一かつ薄く延展することによって調製される。次いで、このスライドは、製品取扱説明書に従って、９５％エタノール中への浸漬又は市販の固定液を用いる噴霧によって迅速に固定される。
【００５９】
ＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）収集法（Cytyc Corp.,Boxborough,Mass）のために、細胞を、子宮頸部から固定液ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）中に移す。これによって、細胞は、更なる工程に備えて保存される。次いで、細胞は徐々に分散し、ランダム化し、そして減圧状態でのフィルターの全面にサンプルを引き寄せて、ＴｒａｎｓＣｙｔ（登録商標）メンブレンフィルター上に、このフィルターに最適数の細胞が沈着するまで収集される。この細胞は、要望通り更に処理され得る。別の方法では、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）又は他の固定溶液中に収集された細胞は、遠心分離によって更に洗浄されてもよく、これにより、上清が除去されてＣａｒｎｏｙｓ溶液（３：１のメタノール：酢酸）中に再懸濁され、これが必要に応じて（例えば、３回）繰り返される。次いで、スライド上に直接細胞懸濁液の小アリコートを滴下することによって、細胞をガラススライドに移す。スライドは、一般的には一晩乾燥させる。
【００６０】
ハイブリダイゼーション法が望ましい場合、このような生物学的サンプルは、本発明のプローブの１つに対するハイブリダイゼーションに好適な形態のＤＮＡを含む。核酸は、全ゲノムＤＮＡ、全ｍＲＮＡ、特定の染色体からのゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又は選択された配列（例えば、３ｑ配列）であってもよい。
【００６１】
生物学的サンプルは、生物学的サンプル中の核が実質的に無傷なままであって、標準的な技術に従って調製された間期核を含むように、調製されてもよい。この生物学的サンプルはまた、実質的に無傷な凝縮した染色体（例えば、分裂中期の染色体）を含んでもよい。このような凝縮した染色体又は間期核は、インサイツハイブリダイゼーション技術（例えば、ＦＩＳＨ）のハイブリダイゼーション標的としての使用に好適である。
【００６２】
（染色体異常の検出）
過剰のｍＲＮＡ及びタンパク質は、染色体３ｑの増幅領域内の重複遺伝子の転写物から生じ得る。従って、ゲノム増幅を検出するための方法としては、ｍＲＮＡレベル（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）及びタンパク質のレベル（例えば、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫沈降及び免疫蛍光）を測定するための当該分野で公知の方法を挙げることができる。タンパク質発現は、イムノアッセイを用いて評価することができる。イムノアッセイは、分析物（例えば、テロメラーゼタンパク質）に特異的に結合するような抗体を利用するアッセイである。このイムノアッセイは、タンパク質が抗体に特異的に結合するのを検出することによって特徴付けられる。ウエスタンブロット（イムノブロット）分析も、サンプル中のタンパク質の存在を定量化するために用いることができる。この技術は一般に、ゲル電気泳動によってサンプルのタンパク質を、分子量に基づいて分離すること、分離されたタンパク質を好適な固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化されたナイロンフィルターのような）に移すこと、そしてこのサンプルを所望のタンパク質と特異的に結合する抗体と共にインキュベートすることを含む。
【００６３】
ゲノム増幅はまた、ハイブリダイゼーション法を通じて同定することができ、この方法では、プローブは、サンプル内の又はサンプルから得られるヌクレオチド配列に結合する。本質的に、ゲノム増幅は、染色体３ｑの核酸配列（例えば、３ｑ２６）に対して相補的であるプローブをハイブリダイズすることによって検出される。
【００６４】
好適なハイブリダイゼーション形式は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、サザンブロットの変法、ノーザンブロット、ＣＧＨ、インサイツハイブリダイゼーション、及び定量的ＰＣＲのような定量的な増幅方法、が挙げられる（例えば、「Sambrook et al., Kallioniemi et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325(1992)」、及び「PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y.,(1990)」を参照されたい）。このサンプルはまた、サザン又はドットブロットハイブリダイゼーション等での使用のために固体表面（例えば、ニトロセルロース）に固定された、単離された核酸を含んでもよい。種々のブロット形式（例えば、ドットブロット、サザンブロット及びノーザンブロット）では、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）は、標的領域に特異的なプローブにハイブリダイズされる。プローブ又は標的のいずれが、固体表面に固定されてもよい。サザンハイブリダイゼーションを実施するための手順は、当業者に公知であって、例えば、「Sambrook et al.,」を参照されたい。
【００６５】
染色体又は染色体領域の増加（gain）又は欠失（loss）は、インサイツハイブリダイゼーションの方法によって評価することができ、この方法では染色体プローブ又は染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターン（例えば、各々のプローブのシグナルの数）が検査されて、シグナルの数が記録される。インサイツハイブリダイゼーションは、以下の主な工程を含む：（１）分析される組織又は生物学的構造体の固定すること；（２）標的ＤＮＡの接近性を増大するため、そして非特異的な結合を減少させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理すること；（３）生物学的構造体又は組織における核酸に対する核酸の混合物のハイブリダイゼーションすること；（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを除去するためのポストハイブリダイゼーション洗浄すること；及び（５）ハイブリダイズした核酸フラグメントの検出すること。これらの工程の各々で用いられる試薬及び使用のためのそれらの条件は、特定の適用に依存して変化する。
【００６６】
ある適用では、反復配列のハイブリダイゼーション能力をブロックすることが必要である。この場合、ヒトゲノムＤＮＡ又はＣｏｔ１のＤＮＡが、このようなハイブリダイゼーションをブロックするための因子として用いられる。好ましいサイズ範囲は、二本鎖のニックトランスレーションの核酸として、約２００ｂｐ〜約１０００塩基、より好ましくは約４００〜約８００ｂｐである。
【００６７】
本明細書で開示される特定の適用のためのハイブリダイゼーション手順は、「Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9138-9142(1988)」及びＥＰＯ公開第４３０，４０２号に記載される。好適なハイブリダイゼーション手順はまた、「Methods in Molecular Biology Vol.33: In Situ Hybridization Protocols, K.H.A. Choo ed., Humana Press, Totowa, N.J.(1994)」及び「Kalliniemi et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 89: 5321-5325(1992)」に見出すことができる。
【００６８】
一般的には、二色ＦＩＳＨを用いることが望ましく、そこでは、２つのプローブが異なる蛍光色素で各々が標識されて利用される。目的の領域にハイブリダイズするテストプローブが一方の色素で標識され、そして異なる領域にハイブリダイズする対照のプローブが、第２の色素で標識される（例えば、セントロメア計数プローブ）。セントロメア領域のような目的の染色体の安定した部分にハイブリダイズする核酸は、しばしば対照プローブとして最も有用である。この方法では、サンプルとサンプルとの間のハイブリダイゼーション効率の差異を算出することができる。
【００６９】
染色体異常を検出するためのＦＩＳＨ方法は、サンプルからの単細胞で行なうことができる。パラフィン包埋腫瘍切片が用いられてもよく、また新しくても凍結材料であってもよい。ＦＩＳＨは、限られた物質にしか適用できないので、培養されていない原発性腫瘍から調製されたタッチ調製物（touch preparation）を用いることもできる（例えば、「Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60: 190-193(1992)」を参照されたい）。例えば、腫瘍からの小さい生検組織サンプルをタッチ調製物に用いてもよい（例えば、「Kallioniemi, A. et al., Cytogenet. Cell Genet. 60: 190-193(1992)」を参照されたい）。吸引生検又は体液（例えば、血液、尿、痰など）中の細胞から得た少数の細胞も分析することができる。標的領域に対するプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、セントロメアのＤＮＡのような対照（増幅も欠失もされていない）に対するプローブからのシグナルとの比較によって、標的核酸の相対的なコピー数の評価が得られる。
【００７０】
（染色体プローブ）
本明細書に提供される結果を用いて、当業者は、遺伝子変化を有することが公知の３ｑの配列に対して相補的である核酸プローブを調製することができる。特に、このような核酸配列としては、これらに限定されないが、ＴＥＲＣ（テロメラーゼ、３ｑ２６）、ＥＶＩ１（異所性ウイルス組み込み部位１、３ｑ２４−３ｑ２８）、ＭＤＳ１（骨髄異形成症候群１、３ｑ２６）、ＭＹＮＮ（ミオネウリン(myoneurin)、３ｑ２６．２）、ＧＰＲ１６０（Ｇタンパク質共役型受容体１６０、３ｑ２６．２−３ｑ２７）、ＰＲＫＣＩ（プロテインキナーゼＣ、３ｑ２６．２）、ＳＫＩＬ（ＳＫＩ様３ｑ２６）、ＣＬＤＮ１１（クローディン１１、３ｑ２６．２−３ｑ２６．３）、ＥＩＦ５Ａ２（真核細胞翻訳開始因子５Ａ２、３ｑ２６．２）、ＴＮＩＫ（ＴＲＡＦ２及びＮＣＫ相互作用キナーゼ、３ｑ２６．２）、ＰＬＤ１（ホスホリパーゼＤ１、３ｑ２６）、ＧＨＳＲ（成長ホルモン分泌促進因子受容体、３ｑ２６．３１）、ＴＮＳＦ１０（腫瘍壊死因子１０、３ｑ２６）、ＥＣＴ２（上皮細胞形質転換配列２発癌遺伝子、３ｑ２６．１−３ｑ２６．２）、ＷＩＧ１（ｐ５３標的ジンクフィンガータンパク質、３ｑ２６．３−３ｑ２７）、ＰＩＫ３Ａ（ホスホイノシチド−３−キナーゼ、３ｑ２６．３）、ＭＦＮ１（マイトフュージン１、３ｑ２６．３２）及びＵＳＰ１３（ユビキチン特異的プロテアーゼ１３、３ｑ２６．２−３ｑ２６．３）が挙げられる。
【００７１】
好ましい態様では、染色体バンド３ｑ２６上のテロメラーゼ（ＴＥＲＣ）遺伝子のゲノムプローブは、２つの対照プローブ（ＣＥＰ３及びＣＥＰ７）と組み合わせて適用される。
【００７２】
このプローブはしばしば、検出可能なマーカーで標識されて、その結果、その標的核酸配列に対する結合を同定することができる。幾つかの態様では、プローブは、核酸分子のアレイとして固体表面に結合される。このプローブは、ゲノムの１つ又はそれ以上の特定の（事前に選択された）部分の核酸の供給源、例えば、１つ又はそれ以上のクローン、単離された染色体全体若しくは染色体フラグメント、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅生成物のコレクションから生成される。本発明のプローブは、本明細書に記載のような遺伝子変化の領域で見い出される核酸から生成される。このプローブは、いくつかの方法で、例えば、反復性の核酸のブロック若しくは除去、又は固有の核酸での富化によって、処理することができる。
【００７３】
本発明で用いられるサンプル又はプローブは、サザン又はドットブロットハイブリダイゼーション等での使用のために固体表面（例えば、ニトロセルロース）上に固定された、単離された核酸であってもよい。幾つかの態様では、サンプル又はプローブは、例えば、国際公開第９６／１７９５８号公報に記載されるような核酸のアレイを含んでもよい。種々の適用のための高密度アレイを生成し得る技術も当該分野で公知である（例えば、「Fodor et al. Science 767-773(1991)」及び米国特許第５，１４３，８５４号を参照されたい）。幾つかの場合には、核酸は、ハイブリダイゼーションの前に、ＰＣＲのような標準的な技術を用いて増幅することができる。
【００７４】
多数の方法を、本明細書で例示される以外の３ｑ２６領域に対して特異的にハイブリダイズするプローブを同定するために用いることができる。例えば、プローブは、染色体特異的ライブラリーからのクローンのランダムな選択によって、生成されて、次いで、デジタル画像化顕微鏡によってマッピングされる。この手順は、米国特許第５，４７２，８４２号に記載されている。要するに、ゲノム又は染色体特異的なＤＮＡは、少なくとも約２０ｋｂ、更に好ましくは約４０ｋｂ〜３００ｋｂのＤＮＡ配列を得るために、制限酵素で消化されるか、又は機械的に剪断される。部分的な配列の消化の技術は、当該分野で公知である。例えば、「Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning 2nd Ed., Wiley N.Y.(1988)」を参照されたい。得られた配列を、ベクターと連結して、適切な宿主に導入する。この目的のために好適なベクターの例としては、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）及びＰ１ファージが挙げられる。染色体全体にわたる種々のライブラリーがまた、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。あるいは、ライブラリーは、ＢＡＣ／ＰＡＣクローン登録（registry）、又はＣａｌｔｅｃｈクローンから得ることができる。
【００７５】
プローブライブラリーが一旦構築されると、プローブのサブセットが染色体３ｑ上に物理的にマッピングされる。ＦＩＳＨ及びデジタル画像分析が、所望の染色体に沿ってクローンを局在化するために用いることができる。要するに、クローンは、例えば、蛍光プローブ（フルオロフォア）としてＦＩＴＣを用いて、正常な細胞から分裂中期スプレッド（spreads）までＦＩＳＨによってマッピングされる。染色体は、塩基組成にかかわらずＤＮＡを染色する染色液（例えば、ヨウ化プロピジウム）によって対比染色されて、染色体の概要を規定することができる。染色された分裂中期は、色に依存した画像シフトを避けるために多染性のビームスプリッターを備える蛍光顕微鏡で画像化される。異なる色の画像は、ＣＣＤカメラで得られ、デジタル化画像は、コンピューターに保存される。次いで、コンピュータープログラムを用いて、染色体の軸を計算して、２つの（単一のコピー配列についての）ＦＩＴＣシグナルをこの軸に対して垂直に投射させて、規定の位置、一般的にはｐ−テロメアからの平均の部分的な長さを計算する。このアプローチは、例えば、米国特許第５，４７２，８４２号に記載される。
【００７６】
特定の染色体遺伝子座にハイブリダイズするプローブは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Downers Grove, Illinois.）及びＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（River Vale, New Jersey）から市販されている。あるいは、プローブは、公知の技術を用いて、商業的でなく作成されてもよい。ＤＮＡプローブの構築に使用するためのＤＮＡの供給源としては、ゲノムＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）のようなクローンＤＮＡ配列、宿主の正常な染色体補体と共にヒト染色体の１つ又は一部を含む体細胞ハイブリッド、及びフローサイトメトリー又は顕微解剖によって精製される染色体が挙げられる。目的の領域は、クローニングを通じて単離されても、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する部位特異的な増幅によって単離されてもよい。例えば、「Nath, et al., Biotechnic Histochem, 1998, 73(1): 6-22」；「Wheeless et al., Cytometry, 1994, 17:319-327」；及び米国特許第５，４９１，２２４号を参照されたい。合成されたオリゴマーのＤＮＡ又はＰＮＡのプローブも用いられてもよい。
【００７７】
本明細書において同定された遺伝子の配列情報によって、これらの遺伝子からの標的配列の検出のために好適な、高度に特異的なハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーの設計が可能になる。上記の通り、これらの遺伝子の完全な配列は公知である。遺伝子内の特異的なＤＮＡ配列を検出するための手段は、当業者に公知である。例えば、遺伝子内の選択された配列に対して、相補的である選択されたオリゴヌクレオチドプローブが用いられてもよい。あるいは、配列又はサブ配列は、プローブを用いる検出の前に、種々のＤＮＡ増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅等を介して）によって増幅することができる。ＤＮＡの増幅は、可能な標的サブ配列の更に多くのコピーを提供することによって、アッセイの感度を増大させる。更に、増幅プロセスにおいて標識されたプライマーを用いることによって、ＤＮＡ配列は、プライマーが増幅することで標識することができる。
【００７８】
本発明に用いられるプローブによって検出される染色体領域のサイズは、例えば、数百塩基対のプローブ配列から１５０，０００塩基という大きいセグメントまで様々に可能である。直接標識される遺伝子座特異的プローブについて、少なくとも１００，０００塩基の複雑なプローブを用いることが好ましく、そして、プローブの非特異的な結合を回避するために、米国特許第５，７５６，６９６号（参照して本明細書に取り込まれる）に開示されるように、未標識のブロッキング核酸を用いることが好ましい。未標識の、合成されたオリゴマー核酸又はタンパク質核酸を、ブロッキング核酸として用いることも可能である。特定の遺伝子座を標的とするために、プローブは遺伝子のゲノムコード遺伝子座の全体に広がることが好ましい。
【００７９】
本発明のプローブは、検出可能なマーカーで標識することができる。核酸を標識する方法は、当業者に公知である。好ましい標識は、インサイツハイブリダイゼーションの使用に好適な標識である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーション反応の前に、検出可能な標識をすることができる。あるいは、ハイブリダイゼーション生成物に結合する、検出可能な標識が用いられてもよい。このような検出可能な標識としては、検出可能な物理的又は化学的特性を有する物質の何れかが挙げられ、そしてこれらは、イムノアッセイの分野では十分開発されている。
【００８０】
標識は、当業者に公知の種々の方法で、プローブに結合させることができる。ある態様では、核酸プローブは、ニックトランスレーション（nick translation）又はランダムプライマー伸長（random primer extension）を用いて標識される（「Rigby et al.,Ｊ．Mol.Biol., 113: 237(1977)」又は「Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)」）。プローブを標識するための特に好ましい方法は、米国特許第５，４９１，２２４号に記載される。これらの方法には、シトシン残基の化学的修飾によってプローブを直接標識することを含む。
【００８１】
本明細書において用いる場合、検出可能なマーカーは、分光学的、光化学的、生化学的、酵素的、免疫化学的又は化学的な手段によって検出可能な組成物の何れかである。本発明において有用な標識としては、放射性標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ及び３５Ｓ）、蛍光プローブ（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド（Texas Red））、高電子密度の試薬（例えば、金）、酵素（例えば、基質を代謝して発色性シグナルを生成する酵素）、比色標識（例えば、コロイド金）、磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））等が挙げられる。直接検出されないが、直接検出可能な標識の使用を通じて検出される標識の例としては、ビオチン及びジオキシゲニン、更に標識された抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なハプテン及びタンパク質が挙げられる。
【００８２】
染色体プローブは、染色体にハイブリダイズする場合にプローブの検出を容易にする検出可能なマーカーの何れかを含んでもよい。有効なマーカーとしては、下記のような直接的及び間接的な標識の両方が挙げられる。
【００８３】
染色体プローブは、検出可能なマーカーで直接標識されていてもよい。検出可能なマーカーの例としては、蛍光プローブ、すなわち、光を吸収した後に蛍光を発する有機分子、及び放射性同位体、例えば、（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ及び３５Ｓ）が挙げられる。蛍光プローブは、ニックトランスレーション、ランダムプライミング及びＰＣＲ標識のような標準的な技術を用いて、標識されたヌクレオチドをプローブに組み込むことによって、ヌクレオチドに共有結合して、直接標識することができる。あるいは、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドは、リンカーとアミノ基転移されてもよい。次いで、蛍光プローブは、アミノ基転移されたデオキシシチジンヌクレオチドと共有結合することができる。例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒらの米国特許第５，４９１，２２４号（参照して本明細書に取り込まれる）を参照されたい。有用なプローブ標識技術は、「Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, Y.-S. Fan, Ed., Chap.2, "Labeling Fluorescence In Situ Hybrydization Probes for Genomic Targets", L. Morrison et al., p.21-40, Humana Press,(2002)」（参照して本明細書に取り込まれる）に記載される。
【００８４】
本明細書に記載される方法で用いられる蛍光プローブの例は：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）（Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.）；５−（及び６−）カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミン・ローダミン（lissamine rhodamine）Ｂ、５−（及び６−）カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチル−ローダミン−５−（及び６−）イソチオシアナート；５−（及び６−）カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（及び６−）カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアナート；エリトロシン−５−イソチオシアナート；５−（及び６−）カルボキシローダミン６Ｇ；Ｃａｓｃａｄｅ（登録商標）ブルーアセチルアジド（Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄ（登録商標）、及びＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ（登録商標）（Vysis, Inc., Downers Grove, I11.）である。
【００８５】
複数のプローブを用いる場合、セット中の各々の染色体プローブを区別して可視化できるように、異なる色の蛍光プローブを選択してもよい。好ましくは、本発明のプローブパネルは、各々が別の蛍光プローブで標識された、４つの別のプローブを含む。同じサンプルに対して複数のパネルを連続的に用いることも、本発明の範囲内である。この態様では、最初のパネルがハイブリダイズされた後に、結果をデジタル的に画像化して、サンプルを脱染し、次いで、第２のパネルでハイブリダイズする。プローブは、蛍光顕微鏡及び各々の蛍光プローブについて適切なフィルターを用いて、又は複数の蛍光プローブを観察するために二重若しくは三重の帯域通過フィルターを用いることによって、可視化することができる。例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒらの米国特許第５，７７６，６８８号（参照して本明細書に取り込まれる）を参照されたい。好適な顕微鏡的画像化方法の何れかを、ハイブリダイズされたプローブを可視化するために用いることができ、これには、自動化デジタル画像化システム、例えば、ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇから入手できるシステムが挙げられる。あるいは、フローサイトメトリーのような技術を用いて、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを検査してもよい。
【００８６】
プローブはまた、当該分野で公知の方法によって、例えば、ビオチン又はジゴキシゲニンで間接的に標識されてもよい。しかしながら、二次的に検出可能なマーカー又は更なる処理が、標識されたプローブを可視化するために必要である。例えば、ビオチンで標識されたプローブは、検出可能なマーカー、例えば蛍光プローブに結合体化されたアビジンによって検出可能である。更に、アビジンは、アルカリホスファターゼ又はホースラディシュ・ペルオキシダーゼのような酵素マーカーに結合することができる。このような酵素マーカーは、酵素の基質を用いて標準的な比色定量反応で検出できる。アルカリホスファターゼの基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート及びニトロ・ブルー・テトラゾリウムが挙げられる。ジアミノベンゾエートは、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼの基質として用いることができる。ハイブリダイズされたビオチン又は他の間接的に標識されたプローブの蛍光検出は、市販のチラミド増幅システムの使用によって得ることができる。
【００８７】
本発明は、本発明及びその多くの利点のより良好な理解を提供するように、例示的な以下の実施例によって更に記載されるが、これらにより限定されるものではない。
（実施例）
【実施例１】
【００８８】
患者サンプルのコレクション及び細胞学的スクリーニング
３４名の患者からの、前に染色され、規定通りに診断された５９例のパップスメアのサンプルを、インフォームドコンセントによって、ドイツのゾースト（Soest）のＫｌｉｎｉｋ  Ｋｌｏｓｔｅｒ  ＰａｒａｄｉｅｓｅのＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙのアーカイブから収集して、３つの群に割り当てた。パップスメアは、確立された通常の診断手順、すなわち、細胞検査技師による最初のスクリーニングによって、そして異常な細胞が見出された場合、２名の細胞病理学者による合意診断に従って評価した。
【００８９】
要するに、全てのサンプルを、標準的な手順に従って染色して、カバーガラスの下で永続的に装填した培地中に包埋した。細胞学的画像を、サンプルから得た。細胞学的に正常な病変から、１５〜３０の明視野画像を、合理的な細胞密度を有する上皮細胞を含むスライド上の領域から撮った。もし、正常なパップスメアのスクリーニングプロセスの間、疑いが生じた細胞が見つかれば、それらの細胞も同様に画像を撮った。ＣＩＮ病変及び癌腫から、２０×のＬｅｉｃａの位相差ｄｒｙ型対物レンズ（ＮＡ０．５）を用いて表現型として疑わしい細胞を含んだ領域から、１５〜３０の画像を得た。これらの領域のｘｙ座標を記録した。
【００９０】
細胞学的な類別は、ドイツのカスタム分類体系（custom clasification system）に従って行った。表１は、ドイツの分類体系（ミュンヘン（Munich）命名法に基づく）１３のベテスダ（Bethesda）命名法１４への変換及び子宮頸部上皮内新生物を用いる命名法を示す。
【００９１】
【表１】
2008530998.tif 000002
【００９２】
この患者群は、以下の通りであった：第１の患者群（ｎ＝２２サンプル）は、最初の診断がＣＩＮ１及びＣＩＮ２（ＰａｐＩＩＩｄ）であった１２症例から構成された。初回の診断の２ヶ月〜２年後にスクリーニングした、対応したパップスメアは、ＣＩＮ３（ＰａｐＩＶ）への進行が明らかになった。この群は、ＣＩＮ３に進行するＣＩＮ１及びＣＩＮ２病変が、染色体腕３ｑの余分なコピーを既に保持しているか否かを評価するために選択された。
【００９３】
第２群（ｎ＝１９のサンプル）は、パップスメアがＣＩＮ１又はＣＩＮ２と評価され、その数ヶ月〜２年後のパップスメアでは細胞学的に正常であった、１０症例から構成されている。この群でのＣＩＮ１及びＣＩＮ２病変は、３ｑの増加を獲得していないであろうという仮説を立てた。
【００９４】
第３群（ｎ＝２３サンプル）は、パップスメアが最初に正常と診断された１２症例から構成された。しかし、全ての場合に、これらの女性は、わずか１〜３年の追跡期間後に、ＣＩＮ３（ＰａｐＩＶａ／ｂ）（ｎ＝１１）又は子宮頸癌（ＰａｐＶ）（ｎ＝１）を発症した。この群では、正常なパップスメアの幾つかが、３ｑ増加について既に最初に陽性であったか否かを知ること、そして細胞学的スクリーニングで異常な細胞が同定されなかった理由を評価することが、目的である。
【実施例２】
【００９５】
ＦＩＳＨ及びシグナルの計数（enumeration）
インサイツハイブリダイゼーションの前に、キシレン中でスライドを２〜４日間インキュベートすることによってカバーガラスを除去した。カバーガラスの除去後、そのスライドをキシレン中で２回洗浄して、再水和し、０．５％ＨＣｌ／７０％ＥｔＯＨ中で１〜２時間脱染した。スライドを０．０５％のペプシンを用いて１０〜３０分間事前処理して、１００％のＥｔＯＨ中で固定した。
【００９６】
３色の蛍光プローブパネルは、以前に詳細に記載されている８。これは、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）で標識した、ＴＥＲＣ）、第３染色体のセントロメア計数プローブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）で標識した、ＣＥＰ３）及び第７染色体のセントロメアの対照プローブ（ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ（登録商標）で標識した、ＣＥＰ７）を含む、ＢＡＣコンティグからなる。このプローブセットは、図１に模式的に示される。
【００９７】
ハイブリダイゼーション条件及びポストハイブリダイゼーション洗浄の詳細は、以前に記載した８。このプローブは、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．／Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Downers Grove, IL）によって提供された。サンプルのうち約１／３を、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Milford, MA）によって提供されたプローブのカクテル（cocktail）を用いてハイブリダイズした。このプローブのセットでは、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅで標識したＴＥＲＣプローブを、Ｋｒｅａｔｅｃｈ（http://www.kreatech.com）によって開発された手順を用いて、ローダミンで直接標識されたＴＥＲＣに特異的なＢＡＣコンティグと置き換えた。要するに、この手順は、白金錯体、検出可能な分子、及び標的との反応の際に置換される脱離基からなる、分子の使用に依存する。この分子は、配位結合を形成し、これにより標的に対して強固に結合される。このプローブセットの能力は、同程度のものであった（データ示さず）。
【００９８】
ハイブリダイゼーション後に、細胞の核をＤＡＰＩで対比染色して、退色防止（antifade）溶液に包埋した。ＦＩＳＨ手順の詳細は、「http://www.riedlab.nci.nih.gov」で検索でき、以下の通りである：ハイブリダイズされたスライドを、５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７〜７．５）中で５分間で３回、４５℃で振盪しながら洗浄した。そのスライドを、０．１×ＳＳＣ中で４５℃で５分間で３回、振盪しながら洗浄した。そのスライドを、４×ＳＳＣ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０中に浸漬した。１２０μＬのブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／４×ＳＳＣ／０．１％のＴｗｅｅｎ２０）をこのスライドに添加し、次いでこれを湿式ハイブリダイゼーションチャンバ中で３７℃で３０分間、２４ｍｍ×６０ｍｍのカバーガラスを用いてカバーした。
【００９９】
ブロッキング溶液を洗い流すためにスライドを４×ＳＳＣ／０／１５のＴｗｅｅｎ２０に浸漬した。そのスライドを、光保護された小型染色ビン（coplin jar）中のＤＡＰＩ染色溶液中で５分間染色した。そのスライドを、２×ＳＳＣ中で５分間、振盪しながら洗浄した。次いでそのスライドを、７０％、９０％及び１００％の一連のエタノール溶液に浸漬することによって脱水して、風乾した。最終的に、３５μＬの退色防止溶液（１，４−フェニレン−ジアミン系）を加えて、そのスライドを２４ｍｍ×６０ｍｍのカバーガラスでカバーして、スライドの画像化まで、光保護容器中において４℃で保管した。
【０１００】
再配置後、４０×のＬｅｉｃａの油浸対物レンズ（ＮＡ１．２５）を用いてＦＩＳＨ画像を得た。細胞学及びＦＩＳＨの両方の結果の一般的な画像を、図２に示す。スライド上の同一領域の画像を得るために、いくつかの蛍光画像を得た。１症例当たりに種々の数の細胞を評価した。この数は、細胞密度に、そして形態学的に異常な細胞の数に依存した（先のパップ（Pap）染色によって同定された通り）。シグナルの計数は、通常の細胞学的スクリーニングによって疑いの生じた細胞に、主に集中させた（図２の例を参照されたい）。従って、シグナル計数手順は、前記のものとは異なった８。２０％より多くの細胞が、２より大きいＴＥＲＣシグナル数を示した場合、症例を３ｑアッセイに陽性とみなした。
【０１０１】
一連のサンプルの成功した分析は、第１群では２２症例のうち１２例で、第２群では１９症例のうち１０例で、そして第３群では２３症例のうち１２例で可能であった。ＦＩＳＨの前に得られた形態学的画像は、２名の細胞病理学者によって個々に再検討し、評価されて、細胞学的診断と遺伝子の直接の相関が確認された。２名の病理学者の間でのわずかな不一致の見られた少数の例においては、総合的合意の診断を得た。
【０１０２】
結果を表２〜４にまとめる。
【０１０３】
【表２】
2008530998.tif 000003
【０１０４】
第１群の１２のＣＩＮ３病変のうち９症例（表２：進行型（progressor））は、染色体腕３ｑの余分なコピーを有する細胞の種々なレベルを示しており、そして２症例は、四倍体であった（３つのプローブ全てについて４つのシグナルのハイブリダイゼーションパターン、４−４−４）；１症例は特定されなかった。対応する先行したＣＩＮ１及びＣＩＮ２病変のうち７つが、同様に、３ｑ増加について陽性であって、このことは、進行の確率が高いこれらのＣＩＮ１／ＣＩＮ２病変がしばしば、この遺伝子マーカーの余分のコピーを保持することを示す。残りの５つの病変は、四倍体であって、これには２つの四倍体ＣＩＮ３病変の前駆体を含む。
【０１０５】
【表３】
2008530998.tif 000004
【０１０６】
第２群（表３：退行型（regressor））では、非進行性ＣＩＮ／ＣＩＮ２病変のうち７例が二倍体であった（全てのプローブについて各々２つのシグナルのハイブリダイゼーションパターン、２−２−２）；３つの例は、四倍体であって（４−４−４）、そして３ｑの増加を示した例はなかった。これらの知見によって、自発的に退行するＣＩＮ１／ＣＩＮ２病変は、ＴＥＲＣの増加を保持しないことが実証される。
【０１０７】
【表４】
2008530998.tif 000005
【０１０８】
第３群における１２のＣＩＮ３病変及び癌腫のうち１１症例（表４：正常なパップスメアに続いてＣＩＮ３又は癌腫）が、３ｑ増加を示した。１つの病変（表４の＃８）は四倍体であった。１２の細胞学的に正常なパップスメアのうち４症例は、既に３ｑの増加を示したことに注目されたい。これにより、ＴＥＲＣ遺伝子の更なるコピーの可視化は、ＣＩＮ３病変又は侵襲性の疾患を発症しやすい女性から得た細胞学的に正常なパップスメアの、早期かつ特異的なマーカーとして役立つことが示される。
【０１０９】
進行型及び退行型の群における特定数の症例は、ゲノムの四倍体化と適合するシグナルパターン（すなわち、ＣＥＰ７、ＣＥＰ３及び３ｑの４つのコピーは、表２〜４において４−４−４と表される）を示したことに注目されたい。３ｑ−陽性ＣＩＮ３病変で観察されたハイブリダイゼーションパターン及びそれらに対応するＣＩＮ１／２前駆体によって、特定の染色体異数性は、一旦確立されれば、腫瘍進行時（クローンの増殖を示唆する）維持されることが示唆される（表２〜４）。ＴＥＲＣの増加が、二倍体のバックグラウンドで生じた（ＣＥＰ３及びＣＥＰ７についてのコピー数で評価した場合）３ｑ陽性の病変はいずれも、低悪性度の病変で四倍体のハイブリダイゼーションパターンを示しさなかったことは、特筆すべきである。
【０１１０】
対応する前癌病変が四倍体である全てのＣＩＮ３病変は、四倍性を維持したか、又は四倍体バックグラウンドでの３ｑ増加を生じた。この観察によって、３ｑの増加は、二倍体又は四倍体のゲノムのいずれかに基づいて生じ得ることが示される。従って、定量的なＤＮＡ含量測定単独では、子宮頸部の細胞学における診断方法として十分ではないかもしれない３０。
【０１１１】
第２群（退行型）のサンプルで、３ｑ増加について陽性であったものはないが、３つの病変は四倍体であった。このことは、四倍体化自体は、進行が不可避であるようにゲノムを改変するものでないことを意味する。これは、ゲノムの複製が、ある特定の環境負荷に対する生理学的な応答として生じ得ることを示している、以前の観察と一致している３０、３１。
【０１１２】
２名の経験ある細胞病理学者による形態学的画像の再検討診断において、４つの３ｑ陽性病変のうち１つが、正常からＣＩＮ２にグレードアップされ（ＰａｐＩＩＩＤ）、そして他の１つは、ＣＩＮ３（ＰａｐＩＶａ）にグレードアップされたが、それらの残りの２つについての診断は、以前に決定されたまま、すなわち正常のままであった。
【０１１３】
細胞の細胞学的表現型と遺伝子構造との比較によって、２つの症例で、形成異常細胞は、スライド上に存在したが、実際には見落とされたことが示される（子宮頸部の細胞学では公知の問題）；しかし、他の２つの症例では、細胞表現型は、染色体の異数性の存在及び３ｑの増加にかかわらず、再検討においては正常に現れた。これによって、特異的なゲノム増加の捕捉は、形態学的検査によって感知できる表現型の変化に先行できることが実証される。これらの症例の画像の例は、図２に示される。
【０１１４】
図２Ａは、ＰａｐＩＩＩＤ（ＣＩＮ１）として評価されたパップスメアに相当する。形態学的に疑わしい細胞は、ＴＥＲＣ遺伝子の余分なコピーを保持しないことに注目されたい（１細胞当たり２コピーのみ）。図２Ｂは、ＰａｐＩＩＩＤとして評価されたパップスメアに相当する（ＣＩＮ２）。図２Ｃは、ＰａｐＩＩＩＤと最初に診断され（２０００年１０月）、引き続くパップスメアが正常（２００１）であったため退行型とみなされた患者のパップスメアに相当する。しかし、２００２年のパップスメアを介してＣＩＮ２と、そして２００３年のパップスメアを介してＣＩＮ３と評価された（従って、第１群に割り当てられる）。図２Ｄは、形態学的に正常と繰り返し判定されたパップスメアに相当するが、この患者は、２８ヵ月後にＣＩＮ３病変を示した。
【０１１５】
多くの場合、３ｑの追加のコピーで陽性であった細胞（複数）は、診断スライド上でお互いに隣り合って位置していたことに注目されたい。これは、クローン進化事象であって、３ｑの余分なコピーが子宮頸部上皮細胞に対して増殖の利点を与え、それが、大部分の細胞が３ｑについて陽性である子宮頸部癌の細胞集団を最終的に生じさせる。従って、前癌状態の形成異常病変におけるＴＥＲＣ遺伝子の追加のコピーの可視化は、形成異常の診断にとって有益であるだけでなく、個々の病変の進行性の可能性に関しての情報も提供することができる。
【０１１６】
３ｑマーカーで評価が可能な領域の形態学的画像の再検討診断は、５９の標本のうち５３（９０％）について最初の診断と一致した。６つの標本は、もとの診断からグレードアップ又はグレードダウンされ、これには、上記の考察された例（表４の第３群、症例１０はＰａｐＩからＰａｐＩＩＩＤに、そして症例１１はＰａｐＩＩからＰａｐＩＶａに）を含む。症例１０の最初のＰａｐＶなる診断（表４）は、ＰａｐＩＶａにグレードダウンされた。表４の第３群では、症例６は、ＰａｐＩＩからＰａｐＩＩＩＤにグレードアップされ、そして表２の第１群では、症例１は、ＰａｐＩＩＩＤからＰａｐＩＶａにグレードアップされ、そして症例９は、ＰａｐＩＩＩＤからＰａｐＩＩｗ、ＡＳＣＵＳにグレードダウンされた。
【０１１７】
仮説のように、以前に正常と評価されたパップスメアの幾つかは、３ｑの存在を示し、その検出でより早期の診断が得られた。実際、ＣＩＮ３に進行した１２のＣＩＮ１／ＣＩＮ２病変のうち７例は、３ｑについて陽性と見い出された（対応するＣＩＮ３病変の全てが、増幅したＴＥＲＣを保持した）。それとは全く対照的に、自発的に退行する病変のどれも、３ｑ増加を示さなかった。
【実施例３】
【０１１８】
データの統計学的評価
（Ａ．フィッシャーの正確確率検定）
統計学的評価は、少ないサンプル数に適切である、フィッシャーの正確確率検定及び正確二項パラメーター評価に基づいた。フィッシャーの正確確率検定は、カテゴリーデータの２×２の分割表分析に用いた。用いた２つのカテゴリー変数は、病理学的な評価（進行及び退行）及びゲノム異常の検出であって、これは陽性又は陰性のいずれかである。表５の各々の細胞は、患者サンプルからの観察された結果を反映する。
【０１１９】
ヌル仮説（Ｈ０）は、ゲノム異常の存在（３ｑの増加又は四倍性の何れか）及び進行状況が、互いに独立している、と推論する。進行率は、テストされた症例の総数に対する進行する症例の数として規定される。この二項パラメーターの評価のための正確な信頼区間の上限値及び下限値は、ＰαＬ（ｎ，Ｂ）によるＰＬ（α）及びＰαｕ（ｎ，Ｂ）によるＰＵ（α）と示されて、下記の式に基づいて決定された１５。
【０１２０】
【数１】
2008530998.tif 000006
【０１２１】
Ｂは、ｎベルヌーイ試行における進行（成功）の数を指しており、そしてｆγ，ｎ１，ｎ２は、分子におけるｎ１自由度及び分母におけるｎ２自由度を有するＦ分布についての上部のγ番目の百分率である。
その結果は表５に纏める。
【０１２２】
【表５】
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【０１２３】
パップスメアが四倍体細胞を含んだ患者については、進行の可能性は、（５対３の）率であるが、それにも関わらずｐ値は０．６７４９である。従って、Ｈ０は、拒絶され得ない（すなわち、四倍性が進行に関連するという強力な統計学的な証拠はない）。
【０１２４】
３ｑ増加を有する症例対二倍体及び四倍体の症例については、ｐ値は、０．００５３である。従って、Ｈ０を拒絶する強力な証拠があり、このことは、３ｑの更なるコピーと進行が関連することを示している。９５％信頼区間は、０．５９０４〜１．００００に及ぶ。従って、９５％の信頼度をもって、進行の確率は５９％〜１００％と予想される。
【０１２５】
３ｑの増加又は四倍体の何れかを有する患者については、試験のｐ値は、０．０００７である。従って、Ｈ０を確実に拒絶することができる。３ｑの更なるコピーと癌腫発達との間には、有意な相関があり、３ｑ陽性又は四倍体サンプルの何れかを有する患者で、５２％〜９６％の進行率が予想される。
【０１２６】
ゲノムの四倍体化に匹敵するシグナルパターンを示す進行型及び退行型の群の上記の症例（上記の実施例２を参照されたい）が、２０％の控えめの閾値を使用して含まれる場合、このテストは、７０％の特異性を有して感度（すなわち、四倍性又はＴＥＲＣ増加の何れかと進行との関連性）１００％を得る。この特異性は、３ｑ陽性のパターン（すなわち、四倍性を含む３ｑ増加）が存在しないことと退行との関連性として定義される（表５のように、１０例のうち７例）。
【０１２７】
（Ｂ．ＲＯＣ分析）
受診者動作特性（Receiver Operator Characteristic）（ＲＯＣ）分析を用いて、最適閾値を更に確立して、進行を最適予測するＦＩＳＨパラメーターを特定した。ＲＯＣ曲線は、０％〜１００％（１％増分）の範囲で細胞の閾値パーセントで算出して、１から退行を予測する特異性を引いた値に対して、進行を予測する感度をプロットすることにより作成した。曲線は、四倍体細胞の割合（４−４−４ハイブリダイゼーションパターン）、３ｑ増加を有する細胞の割合（四倍性を除いた、１細胞当たり２を超えるＴＥＲＣシグナル）及び四倍性又は３ｑ増加の何れかを有する細胞の割合（すなわち、四倍性を含む、１細胞当たり２を超えるＴＥＲＣシグナル）に基づいて作成した。
【０１２８】
図３Ａでは、ＲＯＣ曲線の比較によって、四倍性単独（青色の四角）では、進行の良好な指標ではないが、３ｑ増加（白色の三角、四倍性を除いた、１細胞当たり２を超えるＴＥＲＣシグナルとしてこの目的のために規定される）は、より良好な指標であり、そして四倍性を含む３ｑ増加（赤色の丸、３ｑの全ての増加）は、極めて良好なＲＯＣ特徴を示している。
【０１２９】
ＲＯＣプロットでは、１００％の感度及び１００％の特異性という理想的な値に最も近くなる曲線（ＲＯＣグラフの上の左側の角、図３Ａを参照されたい）によって、感度及び特異性の最良の組み合わせが得られ（各々の等しい重要性を想定する）、そして最適の閾値は一般的に、曲線中の「ブレーク（breaks）」（上部左側の角に最も近い領域；曲線の勾配は４５°に近い）に近いポイントから選択される。
【０１３０】
グラフの上部左側の角の最も近くにある後者のＲＯＣ曲線上のポイントは、それぞれ、９１．７％（１１／１２）及び１００％（１０／１０）の感度及び特異性の値を示しており、これは、４５％〜４９％の細胞の閾値百分率について得られる。しかし、進行する可能性の高い女性を同定するためには、より高い感度が好ましく、そして９０％の特異性（９／１０）を有する１００％の感度（１２／１２）が、２５〜３９％の閾値範囲で得られる。進行型の可能性が高い同定を更に確実にするために、２０％の更に控えめな閾値を本検討において用いた。
【０１３１】
（Ｃ．ＤＦＩ分析）
閾値に対する感度及び特異性の依存性のより良好な見識は、閾値に対して理想からの距離（Distance From Ideal）（ＤＦＩ）をプロットすることによって得ることができる（図３Ｂ、これは、図３Ａを構築するために使用した同じデータを用いる）。ＤＦＩは、ＲＯＣプロット上の理想的なポイント（０，１）（１００％感度、１００％特異性）からの距離として定義され、そして［（１−感度）２＋（１−特異性）２］１／２として算出される。ＤＦＩは、（お互いに等しい重みを与える）感度及び特異性の最適な組み合せが最小となり、そして１００％感度及び１００％特異性を与える閾値の０の値、すなわち理想的なポイントから２１／２の最大値まで変化する。
【０１３２】
この曲線によって、感度及び特異性の組み合わせの最低値を提供する閾値範囲を同定し、そして四倍性を含む３ｑ増加（赤色の丸）は、四倍性単独（青色の四角）又は３ｑ増加単独（白色の三角）よりも進行を予測するのにより好適である（３つの曲線のうち最低の最小値かつ最小値の幅が最も広い）ということが、強調される。ＤＦＩ曲線上の最小値によって、閾値について最適値が示され、そして最小値の幅が広いことは、閾値の配置の重要性が低いので、より強力なアッセイであることを示す。
【０１３３】
前述の発明は、明確化及び理解の目的のために図示及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、特定の変化及び改変が実施され得ることは当業者に理解されるであろう。従って、詳細な説明及び実施例は、添付の番号付けされた特許請求の範囲によって表されている、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例４】
【０１３４】
子宮頸部腺癌におけるＴＥＲＣの頻繁な増加
（腫瘍物質）
本検討は、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｈｕｄｄｉｎｇｅで１９９２年〜２０００年に診断されて、外科的に処理された１２の原発性の子宮頸部腺癌からのホルマリン固定されたパラフィン包埋腫瘍組織標本を含む（表６）。全ての腫瘍の症例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅによって組織されたＳｗｅｄｉｓｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙから同定された。この登録は、１９５９年以降に組織病理学的に診断された悪性腫瘍の全症例を含み、これによって各々の腫瘍は、組織分布的及び組織病理学的なコードによって同定される。全ての腫瘍サンプルは、インフォームドコンセント及び地域の倫理委員会の承認を受けて収集された。
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
各々の症例の臨床的情報は、表６に詳細に示すが、以前に公開されている（Andersson et al.,2003a）。組織病理学的診断は、ＷＨＯの基準に基づいた。１２の腫瘍を子宮頸部腺癌として分類して、全てに扁平上皮細胞成分は全くなかった。７つの腫瘍は、十分に分化しており（５８％）、１つは中程度に分化し（８％）、そして４つの腫瘍は、分化が不十分であった（３３％）。臨床的な段階（ステージ）は、子宮頸部癌のＦＩＧＯ分類（Benedet et al.,2000）に従った。初回の診断では、１０の腫瘍がステージＩに（８３％）、そして２つの腫瘍がステージＩＩとして分類された（１７％）。２症例の患者は、最初にリンパ節関与（１７％）を示した。全ての患者は、パップスメア分析について以前にサンプリングされた。１つ（細胞性炎症の徴候を示すと評価された）を除く全てのパップスメアが、最終の細胞学的な評価の時点で、正常と評価された（表６）。全ての患者は、診断の時点から２００５年６月まで、遡及的に追跡されて、疾患の再発及び生存のデータが記録された。
【０１３７】
（ＨＰＶ状況）
ＨＰＶスクリーニング分析からの結果は、全ての症例について以前に公開されている（Andersson et al.,2003a）。要するに、分析は、前述の切片を形態学的診断について用いたパラフィンブロックの切片から得られた、抽出されたＤＮＡ上で行った。１３９〜１４８ｂｐのフラグメントは、ＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーを用いてＬ１領域から増幅され、直接ＤＮＡ配列決定法及びＢＬＡＳＴアルゴリズム（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）を用いる公知のＨＰＶ配列データベースに対する比較によって、ＨＰＶの型を特定された。従って１２の腫瘍のうち８例は、ＨＰＶ陽性であることが見出され；５つの腫瘍は、ＨＰＶ１８で、２つはＨＰＶ１６で、そして１つはＨＰＶ４５で感染された（表６）。残りの４つの腫瘍標本は、ＨＰＶ陰性であった。癌診断時の平均年齢は、ＨＰＶ陰性の女性に比較した場合、ＨＰＶ陽性の症例については有意に低かった（４４．２歳、ＳＤ＝１０．４対５４歳、ＳＤ＝１０．８；ｐ＝０．００１）。
【０１３８】
（ＦＩＳＨ分析のための核懸濁物の調製）
間期ＦＩＳＨハイブリダイゼーションのための単層核調製物は、改変を伴うＨｅｄｌｅｙ法を用いて調製した（Castro et al., 1993）。５０μｍの切片を、１２のホルマリン固定のパラフィン包埋腫瘍組織サンプルの各々から切り出した。キシレン中での脱パラフィン処理後、この切片をエタノール系において、そして蒸留水中で再水和して、その切片を５００μｌの０．１％プロテアーゼ／１×ＰＢＳ（プロテアーゼ：ＸＸＩＶ型、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、Ｓｉｇｍａコード：P8038（St. Luis, MO）及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ １×ＰＢＳ（Life Technologies, Rockville, MD））中で４５℃にて４５〜６０分間、分解した。その反応を、室温で５００μｌの１×ＰＢＳを添加することによって停止させた。次いで、そのサンプルをナイロンメンブレン（ＣＮ０５１；DAKO, Glostrup, Denmark）を通じて濾過し、遠心分離して、１×ＰＢＳ中に再懸濁した。サイトスピン（cytospin）・スライドは、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（登録商標）で調製して、エタノール系で固定した。
【０１３９】
（蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））
三色ＦＩＳＨ分析を、各々の場合に、以下のプローブセットを用いて実施した：第７染色体のセントロメア特異的プローブ（ＣＥＰ（登録商標）７）；第３染色体のセントロメア特異的プローブ（ＣＥＰ３）；及び染色体位置３ｑ２６でＴＥＲＣ遺伝子を含む４つの重複するＢＡＣクローンからなるコンティグ。全てのプローブは、Ｖｙｓｉｓ／Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａ，Ｉｎｃ．（Des Plaines, IL）から入手した。このプローブセットの感度及び特異性、更に実験条件の詳細は、以前に公開された（Heselmeyer-Haddad et al., 2003）。つまり、ＣＥＰ７をＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｑｕａ（登録商標）（ＳＡ）で、ＣＥＰ３をＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）（ＳＧ）で、そしてＴＥＲＣコンティグをＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（ＳＯ）で、「Bittner et al.,1996」に記載のように、化学的標識を用いて標識した。ハイブリダイゼーションの前に、サイトスピン・スライドを、ペプシン消化で事前処理して、エタノール系で固定した。スライドを７０％のホルムアミド及び２×ＳＳＣ中で、３．５分間８０℃で変性した。そのプローブを、製造業者の推奨に従って変性した。３７℃にて一晩のハイブリダイゼーション後、スライドを最初に５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中において４５℃で４回（１回は３分間、そして３回は７分間）洗浄し、続いて、２×ＳＳＣ中において４５℃で５分間、そして２×ＳＳＣ／０．１％のＮＰ４０中において４５℃で５分間洗浄した。そのスライドを、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色して、引き続き退色防止（antifade）溶液に包埋した。
【０１４０】
（ＦＩＳＨの結果のスコア付け）
ＦＩＳＨ及び画像分析は、ＤＡＰＩ、ＳＡ、ＳＧ及びＳＯのための特注の光学フィルター（Chroma Technologies, Brattleboro, VT）及び４０×Ｐｌａｎ  Ａｐｏ（ＮＡ１．２５）対物レンズを装備したＬｅｉｃａのＤＭ−ＲＸＡ蛍光顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）を用いて行った。画像は、ＯＲＣＡ  ＥＲ（IEEE1394I/F）デジタルカメラ（Hamamatsu, Bridgewater, NJ）を用いて、最小細胞塊で最適細胞密度の領域で撮った。Ｌｅｉｃａ  Ｑ−Ｆｌｕｏｒｏを用いて、ＤＡＰＩ、ＳＡ、ＳＧ及びＳＯの各々の光学フィルターについて多焦点画像を得た。１０〜１６の画像を得て、これらのデジタル画像で、各々の場合に２０８〜６４１の核について、シグナルの計数（enumeration）を実施した。カウントしたシグナルを列挙して、エクセルに基づいた特注のソフトウェアで評価した。
【０１４１】
評価できなかった核を（例えば、不十分なハイブリダイゼーション又は重複する核のために）、更なる分析から除いた。全ての「カウント可能な（countable）」核についての結果を、プローブパネル全体についてのパターンの形態で、再配置チャートに登録した。例えば、パターン（２−３−３）は、所与の核におけるＣＥＰ７の２つのシグナル、ＣＥＰ３の３つのシグナル、そしてＴＥＲＣの３つのシグナルを指す。３つのプローブについて正常なシグナル数（すなわち、２−２−２）を有する核を、「二倍体（diploid）」として記録し、そして各々のプローブについて４つのシグナル（パターン４−４−４）を有する核を、「四倍体（tetraploid）」とみなした。ＣＥＰ７−ＣＥＰ３−ＴＥＲＣプローブのパネルのバックグラウンドのレベルは、正常な子宮頸部細胞からの核を含んだ細胞学的スライドで以前に評価された（Heselmeyer-Haddad et al., 2003）。これによって、予想（２−２−２）パターンからの逸脱は、正常細胞の２％未満であることが確認された。
【０１４２】
１２症例の子宮頸部腺癌（表６）を、間期ＦＩＳＨを用いて、染色体バンド３ｑ２６でのＴＥＲＣ遺伝子座のコピー数変化について評価した。ＣＥＰ７−ＣＥＰ３−ＴＥＲＣからなる三色プローブパネルを、ホルマリン固定された組織切片から調製された間期核を有するサイトスピン・スライドに対して、同時にハイブリダイズした。全ての症例が、うまくハイブリダイズされて、分析され、それによって１症例当たり２０８〜６４１の核をスコア付けした。図１は、代表的なハイブリダイゼーションを示す。正常な「二倍体」パターン（２−２−２）及び非二倍体パターンを有する核の両方が、観察された。その結果を表７にまとめる。１２の全ての腫瘍において、有意の比率で「非二倍体（non-diploid）」核が検出され、そして腫瘍のうち９例が、５０％を超える「非二倍体」核を示した。個々の腫瘍において、２より大きいＴＥＲＣシグナルを有する核は、「非二倍体」パターンを有する細胞と同様の頻度で見出され、そして「非二倍体」パターンを有するほぼ全ての核が、２より大きいＴＥＲＣシグナルを示した。この「非二倍体」核では、「四倍体」パターン（４−４−４）は、一般には観察されなかった。腫瘍のうち１０例で、核の１％未満が（４−４−４）を示し、そして２例では（４−４−４）が、それぞれ４％及び１２％で確認された（表７）。従って、ＴＥＲＣの増加が、検討された全ての腫瘍で存在し、「四倍体」であることの効果はなかった。
【０１４３】
【表７】
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【０１４４】
（ＴＥＲＣ遺伝子座の増加及び増幅についての腫瘍間の異質性）
個々の症例において、異なるＦＩＳＨパターンが観察された。腫瘍の幾つかでは、１又は数個の優勢なパターンが見られた。更に、全ての場合に、割合が変化する、異なった反復性の「非二倍体」パターンが見られた。ＣＥＰ７及びＣＥＰ３に対するＴＥＲＣの記録されたシグナル数の比較によって、検討された１２例における相対的なＴＥＲＣコピー数の増大が示された（範囲１．０４〜２．０；表７）。１つの核当たりのＴＥＲＣシグナルの絶対的平均数は、２．３（症例１１）〜５．２（症例１０）であり、そして腫瘍のうち５つでは、１０より多いシグナルを有する核が、繰り返し見い出された（表７）。図４は、ＣＥＰ３及びＣＥＰ７の６つのシグナルと一緒に、２０より多いＴＥＲＣシグナルの増幅を有する症例１０の核を図示する（図１Ｇ及びＨ）。個々の核のレベルでのＴＥＲＣのＦＩＳＨシグナルの分布は、それらのシグナルがクラスターを明確に形成しないで、ランダムに分布していることで、同じようなタイプであった。これらの知見によって、ＴＥＲＣの増加は、常に第３染色体のコピー数の増大の結果だけではなく、むしろＴＥＲＣ遺伝子の遺伝子座のサブ染色体の増加／増幅でもあることが実証される。
【０１４５】
（ＴＥＲＣの増加は、ＨＰＶ感染状況と独立している）
臨床的及び追跡調査の情報更に１２の子宮頸部腺癌のＨＰＶ状況を表６に示す。８例がＨＰＶ陽性であって、４例がＨＰＶ陰性であった。２より大きいＴＥＲＣシグナルを有する「非二倍体」核が、極めて高い割合でＨＰＶ陽性の腫瘍で（８３〜９９％）更にＨＰＶ陰性の腫瘍で（８６〜９９％）確認された。１核当たりのＴＥＲＣシグナルの絶対数は、ＨＰＶ陽性（平均３．４；範囲２〜２２）及びＨＰＶ陰性（平均３．３；範囲２〜１２）の腫瘍で同様に増大した。ＴＥＲＣコピー数と、診断時の年齢、段階、分化、リンパ節関与又は追跡時の転帰のような臨床的な特徴との間の明確な関連は、全く見られなかった。従って、ＴＥＲＣの増加は、子宮頸部腺癌自体の特徴であって、ＨＰＶ感染状況と独立している。
【０１４６】
一連の１２の原発性子宮頸部腺癌を、ヒトテロメラーゼ遺伝子ＴＥＲＣの増加又は増幅について分析し、染色体バンド３ｑ２６にマッピングする。１２の腺癌のうち８症例（６７％）は、ＨＰＶ陽性であった（５つの腫瘍がＨＰＶ１８に対して、２つがＨＰＶ１６に対して、そして１つがＨＰＶ４５に対して陽性であった）（Ａndersson et al.,2003a;Skyldberg et al.,1999）。残りの４つの腫瘍標本は、ＨＰＶ陰性であった。次いでＦＩＳＨを、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲＣ）を含む特注設計のプローブパネルを用いて、この遺伝子マーカーが子宮頸部腺癌の形態学的診断を改善させる能力を評価する。
【０１４７】
ＣＧＨによるトリソミー（三染色体性）の検出には、この数的な異常が細胞のうちの少なくとも４０％に存在することが必要である。ＦＩＳＨは当然ながら、単一の細胞ベースでの変化を検出するので、希釈には非感受性である。更に、小さい領域の低コピー数の単位複製配列（amplicons）は、ＣＧＨの検出を回避することができる。
【０１４８】
ＨＰＶ−ＤＮＡは、扁平上皮子宮頸部癌において腺癌と同じ割合では同定されていない（Andersson et al., 2003b; Skyldberg et al., 1999; Tenti et al., 1996）。おそらく、ＨＰＶ以外の発癌性因子が、子宮頸部腺癌の悪性形質転換においてある役割を果たす可能性が高い（Skyldberg et al., 1999; Pirog et al., 2000）。
【０１４９】
このデータによって、１２症例の女性のうち１０症例が、侵襲性疾患の診断の前の３年以内には正常なパップスメアを有していることが示され、そして特定の科学的理論の何れかによって束縛されることは望まないが、急速に出現する癌腫であるという仮説を支持することができる。他方では、子宮頸部腺癌の検出のためのパップスメアの感度は、極めて低いので（Krane et al., 2001）、急速発現の仮説（rapid-onset hypothesis）は、これらの場合には適用できないかもしれない。
【０１５０】
子宮頸部扁平上皮癌は、非ランダム的かつ反復性のゲノム不均衡の分布によって規定される。ＨＰＶに加えて、子宮頸部扁平上皮の遂次的な形質転換には、染色体腕３ｑの更なるコピーの獲得を必要する。２つのセントロメア特異的なプローブ（ＣＥＰ３及びＣＥＰ７）と組み合わせて、染色体バンド３ｑ２６でのＴＥＲＣ遺伝子のゲノムプローブを用いて、この遺伝子座の高コピー数が、子宮頸部腺癌において示された。３ｑの増加又は増幅は、検討された全ての子宮頸部腺癌で見い出された。このプローブセットの適用によって、子宮頸部腺癌の診断のための客観的な遺伝子テストが提供され、そして高レベルの腺細胞を有するスメア（なすりつけ標本）の解釈を補助することができる。
【０１５１】
これらの病変をサンプリングする上での技術的問題による、これらの細胞の細胞形態学的に困難な同定及び限定された代表の細胞数のために、この患者群における客観的な分子マーカーが、当該技術分野で必要である。本明細書において示されるように、子宮頸部腺癌を有する多くの女性が、しばしば診断のわずか１〜２年前には、形態学的に正常なパップスメアを示していた。
【０１５２】
以下の特定の参考文献はまた、これらを参照して本明細書中に取り込むが、参照番号に対応して上記に示されている。
【０１５３】
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【０１５４】
以下の詳細な説明は、例として与えられるものであり、記載される特定の態様に本発明を限定する意図はなく、参照して本明細書に取り込まれる添付の図面と組み合わせて理解することができる。本発明の種々の好ましい特徴及び態様は、限定するものではない例によって、そして添付の図面を参照して記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、三色のＦＩＳＨプローブセット（Heselmeyer-Haddad et al.,2003）を、模式的に示す。
【図２】図２Ａは、患者９（表３の第２群、退行型）からの前もって染色した通常のパップスメア（Pap smear）に対するＴＥＲＣ遺伝子（赤）のハイブリダイゼーションの結果を示す。スライドの２つの異なる領域が可視化される。簡便のために、ＴＥＲＣプローブのシグナルのみを示す。全ての核が２つのＴＥＲＣシグナルを示し、このことはこれらの細胞について正常な二倍体状態を示している。  図２Ｂは、患者２（表２の第１群、進行型）からの前もって染色された通常のパップスメアに対するＴＥＲＣ遺伝子（赤色）のハイブリダイゼーションの結果を示す。スライド全体にわたる細胞学的スクリーニング時に異常を現した複数の核によって、ＴＥＲＣの余分なコピーが明らかになる（赤のシグナルとして示される）。より大きい核も小さい核の細胞も両方が、この遺伝子についてコピー数の増大を示すことに注目されたい（下方の右側の領域）。  図２Ｃは、患者７（表２の第１群）からの前もって染色された通常のパップスメアに対するＴＥＲＣ遺伝子（赤色）のハイブリダイゼーションの結果を示す。パップスメアにおける複数の３ｑ陽性細胞に注目されたい（主なパターン２−３−３）。  図２Ｄは、患者９（表４の第３群）からの前もって染色された通常のパップスメアに対するＴＥＲＣ遺伝子（赤色）のハイブリダイゼーションの結果を示す。この場合、二倍体バックグラウンドに４つの、時折５つの３ｑのコピーが明らかになった（すなわち、ＣＥＰ７についての２つのシグナル）。興味深いことに、引き続くＣＩＮ３病変によって、同じ主要なパターン（２−３−４）が示され、これによりクローン増殖の仮説が支持される。
【図３】図３Ａは、３ｑ増加についての０〜１００％の範囲の閾値の異常な細胞での、（１−特異性）に対する感度のＲＯＣプロットを示しており、そして図３ｂは、３ｑ増加についての、閾値に対するＤＦＩのプロットを示す。図３Ａ及び３Ｂの両方での白色の三角は、陽性として、４倍性を除いた１細胞当たり２を超えるＴＥＲＣシグナルを有する細胞を対象とする場合の結果を示す。青色の四角は、４倍体細胞のみを対象とする場合の結果、すなわち、各々のプローブについて４つのシグナルのハイブリダイゼーションパターン（４−４−４）を反映する。赤色の丸は、３ｑ増加の何れかを有する細胞（四倍体ハイブリダイゼーションパターンを有する細胞を含む、１細胞あたり２を超えるＴＥＲＣシグナル）を対象とする場合の結果を示す。
【図４】図４は、ＨＰＶ感染及びＨＰＶ陰性の子宮頸部腺癌における、３ｑ２６におけるＴＥＲＣの増加を示す、間期（interphase）ＦＩＳＨ分析を示す。（Ａ）三色プローブセットの染色体位置：ＣＥＰ７（パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＧにおいて淡青色で擬似着色されたスペクトル・アクア（Spectrum Aqua）で標識）、ＣＥＰ３（パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＧにおいて緑色で擬似着色したスペクトル・グリーン（Spectrum Green））、及びＴＥＲＣ（赤色で擬似着色したスペクトル・オレンジ）。（Ｂ）１核当たり１プローブ当たり２つのシグナルの予想パターン（２−２−２）を有する正常な核。（Ｃ及びＤ）ＨＰＶ陰性の症例４。（Ｅ及びＦ）ＨＰＶ感染した症例６、そして（Ｇ及びＨ）ＨＰＶ陽性の症例１０。全ての症例が、異なる程度のＴＥＲＣの増加を示す。Ｃ、Ｅ及びＧ並びにＤ、Ｆ及びＨにおける細胞のクラスターは、それぞれ、示された三色のプローブセットか又はＴＥＲＣプローブのみかの何れかにより、同一の異常なシグナル数を有する細胞を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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