(57)【要約】【課題】有効な抗腫瘍治療のための新規方法の提供。【解決手段】一般式Ｃｕ（Ｌ）２の銅化合物又は水和物の使用に関する。リガンドＬは独立に、抗癌剤としての４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン（メルファラン）又は／及び５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリル）−ウラシル（テガフール）である。２つのリガンドＬは好ましくはメルファラン又はテガフールであり、特に好ましくは共にＬメルファランリガンドである。式（Ｉ）の化合物は任意に結晶水、特に２分子のＨ２Ｏ（ｘ＝２）を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
Ｃｕ（Ｌ）２・（Ｈ２Ｏ）ｘ  （Ｉ）
（式中、Ｌが４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン（メルファラン）又は／及び５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリル）−ウラシル（テガフール）から独立に選択され、ｘは０、１又は２である。）
の、腫瘍の治療又は／及び予防用薬剤の調製のための使用。
【請求項２】
両方ともＬメルファラン又は両方ともＬテガフールである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
両方ともＬメルファランである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ｘ＝２である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
結腸癌、脳腫瘍、眼腫瘍、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣腫瘍、子宮癌、骨腫瘍、胆嚢及び胆道癌、頭頚部腫瘍、皮膚癌、精巣癌、腎臓腫瘍、胚細胞腫瘍、肝癌、白血病、悪性リンパ腫、神経腫瘍、神経芽細胞腫、前立腺癌、軟部組織腫瘍、食道癌及び未知の原発腫瘍の場合の癌腫の治療のための、請求項１から４のいずれか一つに記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項６】
腎臓又は／及び肺腫瘍の治療のための、請求項５に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項７】
１つ以上の式（Ｉ）の化合物が局所投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与に適する形態である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
１つ以上の式（Ｉ）の化合物を薬学的に許容できるアジュバントと共に投与する、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式Ｃｕ（Ｌ）２の銅化合物又はその水和物の使用に関する（式中、リガンドＬは独立に抗癌剤としてのメルファラン及びテガフールを意味する）。
【背景技術】
【０００２】
現在行われている研究では、悪性腫瘍の治療に非常に効果的で、更に高い選択性を有し、それゆえ極めて副作用の少ない新規な化学療法の開発が重要な目標である。多数の細胞増殖抑制剤が現在公知であり、それらの作用機構の違いにより幾つかの群に分けられる。
【０００３】
例えば、ピリミジン、プリン及びプテリジン誘導剤（例えばフルオロウラシル又はブロモウラシル）が代謝拮抗剤として挙げられ、それらは天然の代謝産物に構造的に類似している特性や、生体内でこれらと置換又は競合可能な特性を有するため、生物学的プロセスの進行を阻害又は誤誘導する。
【０００４】
有糸分裂阻害剤の群としては、例えば植物成分であるコルセミド、ポドフィリン誘導剤及びビンカアルカロイドが挙げられ、それらは細胞の有糸核分裂の進行に影響を及ぼし、それにより細胞分裂が抑制され、増殖の速い腫瘍細胞が死に至る。
【０００５】
細胞増殖抑制剤の更なる群としては、アルキル化を触媒する化合物（その効果は主に核酸のアルキル化に基づく）であり、それによりＤＮＡが変化し、その結果細胞分裂が妨害され、最終的に細胞死が起こる。アルキル化を触媒する細胞増殖抑制剤の例として、Ｎ欠失誘導体（例えばクロラムブシル、シクロホスファミド及びメルファラン（４−［ビス−（２−クロロエチル）−アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン））が挙げられる。
【０００６】
例えばメルファランが様々な癌の治療用に提唱されている。アルケラン（登録商標）（有効成分としてメルファランを含む）は多発性骨髄腫、卵巣癌及び乳癌用の医薬品組成物である。進行した前立腺癌におけるメルファランの検討がこれまで実施されている（非特許文献１，２）。メルファランの使用に関する他の従来技術として、例えば非特許文献３から１２が挙げられる。
【０００７】
Ｒ．Ｔｏｂｅｙらの“Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４５（１９８５）”では、金属含有溶液とメルファラン含有溶液を異なる時点で投与する方法を記載する。この研究ではメルファランに対する細胞の耐性が解析されている。
【０００８】
実際、周知の抗腫瘍有効成分の多くが非常に有毒であり、さらにそれら自身が発癌物質又は突然変異誘発因子として作用するため、それは細胞増殖抑制剤の使用に際し深刻な問題となる。更に、有効な癌治療法は治療を受けている悪性腫瘍のタイプ、及びそれぞれの疾患の形態、進行及び段階に依存するため、該有効成分は非常に制限された使用にのみ用いられることが多い。それゆえメルファランの場合、それが抗腫瘍治療の効率及び用途の幅を制限するだけだったことが明らかとなった。
【０００９】
特許文献１には、メルファランと比較し改良された抗癌剤が開示されている。そこでは式Ｄ２−Ｍ−Ｔで表される化合物が記載され、それは金属原子（例えば銅又はマンガン）、２つのβジケトンリガンド及び例えばメルファランなどの少なくとも一つのＮ−、Ｏ−又はＳ−含有基を有する物質である一つのリガンドを含んでなる。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、これらの金属化合物は例えば、腺癌、肉腫、白血病、黒色腫及び腎細胞癌の治療に効果的であると判明し、それによりメルファランと比較した優れた効果を示すことが可能となった。
【特許文献１】国際公開第２００３／００４０１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｃａｎａｄａ，Ａ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９３，３２（１），７３−７
【非特許文献２】ｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．１９７７，６１（８），９２３−４
【非特許文献３】Ｓｔｏｌｆｉ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９８８  ８０（／１），５２−５
【非特許文献４】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｂ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９７５，２９２（１６），１１７−１２２（乳癌）
【非特許文献５】Ｃｏｒｎｗｅｌｌ  Ｇ．Ｇ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．，１９８２，６６（３），４７５−８１
【非特許文献６】Ｇｏｌａ，Ａ．ら、Ｆｏｌｉａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１９９０，１１７，１６７（骨髄腫／白血病）
【非特許文献７】Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．，１９８８，６６（５），１７１９−２５
【非特許文献８】Ｓｔｅｖｅｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９８６，２３，１６８（腺癌）
【非特許文献９】Ｖｒｏｕｅｎｒａｅｔｓ，Ｂ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９７，６５（２），８８−９４
【非特許文献１０】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ａ．Ｃ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９，１４１（Ｓｕｐｐｌ  Ｎｏｖ．）９３５−３６（肉腫）
【非特許文献１１】Ｆｒａｋｅｒ  Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９６，１４（２），４７９−４８９
【非特許文献１２】Ｆｅｒｄｙ，Ｌ．ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９３，６８０，３９１−４００（黒色腫）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗腫瘍効果を有する上記の化合物が多種存在するにもかかわらず、現在多様な腫瘍を伴う疾患を患っている多数の人々の側からは、高い効果及び最少の副作用の可能性を有する新規な細胞増殖抑制剤に対するニーズが今なお存在する。
【００１１】
以上より本発明の課題は、有効な抗腫瘍治療のための新規方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
鋭意研究の結果、以下の一般式の化合物が予想外にも高い抗腫瘍効果を有し、したがって悪性腫瘍の治療の際有効成分として使用するのに適するという発見に基づき本発明の課題を解決するに至った。
Ｃｕ（Ｌ）２・（Ｈ２Ｏ）ｘ  （Ｉ）
式中、Ｌはメルファラン及びテガフールから独立に選択され、ｘは０、１又は２である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以上より本発明は、抗腫瘍治療における式（Ｉ）に係る１つ以上の化合物の使用に関する。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物は任意に結晶水、特に２分子のＨ２Ｏ（ｘ＝２）を含む。
【００１５】
銅原子と配位するリガンドＬは、４−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−Ｌ−フェニルアラニン）（メルファラン）又は／及び５−フルオロ−１−（テトラヒドロ−２−フリル）−ウラシル（テガフール）である。２つのリガンドＬは好ましくはメルファラン又はテガフールであり、特に好ましくは共にＬメルファランリガンドである。
【００１６】
本発明において特に好ましい化合物は、Ｃｕ（メルファラン）２又はその対応する結晶水含有化合物である。この銅化合物は基本的には公知であり（Ｍ．Ｄ．Ｊｏｅｓｔｅｎら、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１５９（１９８９）１４３−１４８））、メルファラン分子が２つの歯状型のリガンドとして機能し、２つの水分子と共に銅原子周辺で正方両錐型の配置をとることが報告されている。メルファラン基は、銅周辺でエクアトリアルに位置し、水分子は該銅原子に対してアキシアルに位置する。Ｊｏｅｓｔｅｎらの文献は、本発明の化合物の合成可能性を示している。該化合物の抗腫瘍活性への可能性については記載がなく、又は検討もされていない。Ｃｕ（メルファラン）２の予想外の抗癌効果は、本発明において初めて確立されたものである。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物は、非常に有効な抗癌剤であると判明した。本発明の化合物は、特に結腸癌、脳腫瘍、眼腫瘍、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣腫瘍、子宮癌、骨腫瘍、胆嚢及び胆道癌、頭頚部腫瘍、皮膚癌、精巣癌、腎臓腫瘍、胚細胞腫瘍、肝癌、白血病、悪性リンパ腫、神経腫瘍、神経芽細胞腫、前立腺癌、軟部組織腫瘍、食道癌及び未知の原発腫瘍の場合の癌腫の治療に適する。
【００１８】
解析の結果、式（Ｉ）の化合物、特にＣｕ（メルファラン）２により主に腎臓及び肺癌の有効な治療が可能となることを見出した。その際に、本発明に従い使用する式（Ｉ）のＣｕ化合物が、リガンド自身（すなわちメルファラン及びテガフール）より顕著に高い抗腫瘍効果を有することを見出した。式（Ｉ）の銅化合物を用いた治療の際に提供される効果のこのような増大は、本発明のＣｕ化合物へのメルファラン及びテガフールリガンドの導入によって得られる相乗効果に起因するといえる。
【００１９】
腫瘍治療の際のそのような高い効果に加え、式（Ｉ）の化合物が免疫調節能及び抗増殖能、並びに抗血管新生効果をも有することを見出した。従来の抗癌剤と比較し、本発明の化合物はまた加水分解安定性が顕著に増大しており、それにより腫瘍治療の幅広い領域における使用が可能となる。更に、式（Ｉ）の化合物が選択的に腫瘍組織にダメージを与えるものの、健康な組織には実質的に影響を及ぼさないことを見出した。以上より、ほとんどの周知の化学療法とは対照的に、式（Ｉ）の化合物を用いることで副作用がないか、又はわずかな副作用のみを伴う抗癌治療が可能となる。
【００２０】
本発明にて使用する銅化合物の更なる効果としては、これらの化合物が医薬品組成物への耐性を誘発せず、特定の状況下では癌細胞のアポトーシスを誘導できるということである。
【００２１】
本発明において特に好ましい銅化合物であるＣｕ（メルファラン）２は青い固体状の物質で、化学的に安定で、持続性の効果を有する。この化合物は更に血液脳関門を通過することができ、それにより脳腫瘍の治療が可能となる。この化合物はメルファランよりも顕著に効果的であることが見いだされ、それは例えば腎細胞癌及び肺転位形成の解析によって示すことができる。匹敵する効果は、本発明における別の好ましい化合物、すなわちＣｕ（テガフール）２により示すことができる。効果が短期間に限られ、下痢及び口内炎などの副作用を引き起こし、ゆえに利用可能性が限られているテガフールそのものとは対照的に、本発明の銅−テガフール化合物は、これらの欠点を有さず、更に効果的な抗癌剤であることさえ見出すに至った。
【００２２】
本発明において、式（Ｉ）の化合物は個々に、又はこれらの抗腫瘍治療用の化合物の２つ以上の混合物として使用してもよい。式（Ｉ）の化合物は適宜、従来使用されている当業者に公知の医薬品添加物及び補助剤と共に製剤化又は投与できる。この種の添加物又は補助剤の例としては、生理的に許容できる担体、希釈剤、着色剤又は／及び香料が挙げられる。
【００２３】
本発明において、式（Ｉ）の銅化合物は局所投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与に適する形態としてもよい。式（Ｉ）の銅化合物は、好ましくは錠剤の形であるか、又は静脈内注射若しくは注入の形で提供される。特定の場合において、式（Ｉ）の化合物は体腔に標的特異的に注入してもよく、又は腫瘍領域の血管若しくは腫瘍が存在する器官にカテーテル注入できる。
【００２４】
式（Ｉ）の化合物又はこの種の化合物の混合物は、他の有効成分と共に投与してもよく、これらの他の有効成分は例えば、他の効果を有する抗癌剤、抗生物質又は薬剤であってもよい。
【００２５】
本発明において、治療される腫瘍疾患の様々な段階において式（Ｉ）の化合物を使用できる。すなわち本発明において使用する銅化合物は、腫瘍疾患を伴う症状を軽減することができ、腫瘍疾患の範囲を減少でき（例えば腫瘍成長の減速）、腫瘍疾患の状態を安定化でき（例えば腫瘍成長の抑制）、腫瘍疾患の更なる拡散（例えば転移）を防止でき、腫瘍疾患の発生又は再発生を防止でき、並びに腫瘍疾患の進行を遅延又は減速（例えば腫瘍サイズの減少）できる。いずれの場合においても所望の目的を提供するのに十分な量の式（Ｉ）の化合物を投与する。有効量は個別的に、様々な要因（例えば複合体の選択、投与方法、腫瘍疾患のタイプ及び範囲、年齢、体重及び患者の健康状態）に依存する。式（Ｉ）の化合物は、好ましくは１μｇ／ｋｇ患者体重〜８ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは〜７．５ｍｇ／ｋｇ患者体重、更に好ましくは〜５ｍｇ／ｋｇ患者体重の投与量で投与する。特に、本発明による化合物を１μｇ／ｋｇ患者体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重、特に好ましくは１０μｇ／ｋｇ患者体重〜０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重で投与する。
【００２６】
式（Ｉ）の銅化合物は従来技術に記載されている合成手順に従って容易に調製されうる（例えばＭ．Ｄ．Ｊｏｅｓｔｅｎ、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１４３−１４８  １５９（１９８９）を参照）。本発明の更に重要な効果は、本発明において使用する銅化合物の高純度での容易な合成、取得が可能であり、これは医薬品組成物として供給する際の重要な必要条件を意味するものである。
【００２７】
本発明はまた、腫瘍治療用の薬剤の調製のための、一つ以上の式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【００２８】
本発明は、以下の図、実施例及び試験結果によって更に詳細に記載される。
【実施例】
【００２９】
実施例１．Ｃｕ（メルファラン）２の合成
Ｊｏｅｓｔｅｎ、Ｍ．Ｄ．，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、１５９（１９８９）１４３−１４８に従って合成した。
【００３０】
Ｃｕ（ＯＨ）２溶液（３．５ｍｌの水に０．０５０ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）に、０．３０ｇメルファラン（０．９８ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加した。１時間後に青紫色の沈殿物が生じ、それを真空濾過し、大過剰の熱湯で洗浄した。
【００３１】
実施例２．Ｃｕ（テガフール）２の合成
０．２００２７ｇのテガフールを０．１Ｎ  ＮａＯＨのエタノール溶液１０ｍｌに添加し、６２〜６５℃で還流しながら加熱し、全て溶解させた。塩化銅（ＩＩ）（無水）０．０６９０１ｇをこの溶液に添加し、黄色がかった濃緑色の透明な溶液を形成した。混合物を還流しながら６２〜６５℃で２時間加熱し、約５分後に青い沈殿物を生成させた。溶液は黄色がかった濃緑色のままであった。反応混合物を冷却し、マグネチックスターラによって室温で更に４８時間撹拌した。沈殿物を含む黄色がかった濃緑色の溶液を得た。その全溶液をガラス製の遠心管に充填し、４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。青色の物質を沈殿物として残留させた。上澄の溶液は黄色がかった緑色を示していた。上澄の溶液を廃棄した。５ｍｌのエタノール（純粋）を沈殿物に添加し、振とうし、固体成分を４，０００ｒｐｍで４分間再び遠心分離した。黄色がかった緑色を示す上澄の溶液を廃棄した。５ｍｌのエタノール（純粋）を沈殿物に再び添加し、振とうし、固体成分を４，０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。黄緑色の溶液を廃棄した。上澄の溶液が無色になるまで精製を繰り返した。通常この目的に必要なエタノール（純粋）は合計約２５ｍｌである。固体を空気乾燥し、乾燥後、淡青色で肉眼で見ても均一な生成物を得、それは効率良くかつ微細な粉砕を容易に行える。
【００３２】
得られた銅−テガフール化合物の溶解性パターンは、実質的に銅（ＩＩ）塩のそれと一致した。淡青色の水溶液となり、また撹拌により泡が形成された。その物質のそのような特性は、化合物Ｃｕ（Ｔｆ）２が塩としての性質を有するという事実を示すものである。
【００３３】
図４ではＣｕ（Ｔｆ）２の合成を反応式を用いて示す。
【００３４】
実施例３．Ｃｕ（メル）２の抗腫瘍効果
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腎細胞癌モデル（ＲＥＮＣＡ）を使用し、メル−Ｃｕ−メルの効果の試験を、原発腫瘍、転移及び血管密度に関して実施した。腫瘍細胞をシンジェニックマウスの左側腎周囲被膜に局所的に投与した：（治療日当たりの投与量：５ｍｇ／ｋｇマウス及び７．５ｍｇ／ｋｇマウス。５匹の動物に薬剤を投与し、コントロールとして５匹の動物に溶媒を投与した）。本発明の抗癌剤Ｃｕ（メル）２を腹腔内投与した。処置モデルを以下に示す。
第０日目：腫瘍細胞の投与
第１〜９日目：腫瘍の成長
第１０〜１８日目：薬剤の投与
第１９日目：動物のと殺及び所見
【００３５】
コントロールとして活性成分を投与しない５匹の動物を使用し、またコントロールとしてメルファランのみを投与した、５匹の動物の一群を設けた。
【００３６】
図５から７に解析の結果を示す。それらを考察すると、コントロールと比較して本発明の化合物Ｃｕ（メル）２では腎臓重量及び腎臓体積が著しく低く（図５を参照）、これは悪性腫瘍の治療における本発明の化合物の効果を示すものである。図６においても、Ｃｕ（メル）２で処理した場合に、コントロールと比較し、またメルファランのみを投与したマウスと比較してもマウスの肺重量が減少していることが観察された。本発明の化合物の肺の転移形成における有益な効果は図６（本発明によって処置したマウス、コントロールマウス及びメルファランのみで処置したマウスで肺転位形成を比較した）の右の部分においても特に明確であった。
【００３７】
本発明によって処置されたマウスは、コントロールマウス、及びメルファランのみで処置されたマウスよりも顕著に低い肺転位形成を示した。
【００３８】
図７に示すように、マウスの血管密度に関する試験も行った。それによると、本発明の化合物が血管新生阻害効果を有することが明確に示された。
【００３９】
実施例４．マウスの局所性腎細胞癌モデル（ＲＥＮＣＡ）を用いた、銅メルファランの抗腫瘍性及び血管新生阻害効果に関するｉｎ  ｖｉｖｏ試験
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腎細胞癌モデル（ＲＥＮＣＡ）を用いて試験を実施した。腫瘍細胞をシンジェニックマウスの左側腎被膜に局所的に投与した。原発腫瘍（インプラントされた腎臓）、転移（主に肺、脾臓及び腸のリンパ節）及び血管密度に対する治療効果を試験した。
【００４０】
方法：
イソフルラン麻酔法（約２．０ＬのＯ２流入、０．５〜１．５％のイソフルラン注入）による麻酔の後、マウスの左の横腹に小さい切傷を与えた。腎臓に処置を加え、腹膜がない状態にした。２７Ｇの針を、目視検査しながら下部の腎臓の下端から腎被膜の下部を通して刺入し、４×１０５個の腫瘍細胞／７０μＬをそれぞれ注入した。腎実質と腎被膜間の液体充填水疱の発生及び腎臓の変色の肉眼による観察により、好適な投与か否かが基準として示されると考えられる。次いで腎臓を整形し、腹壁の切開部を、吸収性の糸による筋膜縫合及び皮膚縫合によって閉じた。１０匹の動物を有する５つの試験群をそれぞれ構成した。
群１：陰性コントロール、
群２：陽性コントロールのメルファラン（Ｇｌａｘｏ）、
群３及び４：ＭＯＣメルファラン、２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ。
群５では、抗血管新生にとり有効な物質を陽性コントロールとして塗布した。
術後１日目を、Ｃｕ（メルファラン）２による治療開始日とした。治療は、第７日（治療モデルを参照）まで毎日継続した。試験を１９日後に終了させた（コントロールにおける腫瘍サイズが、倫理的な理由から終了を余儀なくされる程になったため）。
【００４１】
治療モデル：
【表１】
2008520617.tif 000002
注入する日を第０日として計算した。試験期間は１９日。試験の開始時は動物は５０匹で、動物は手術の間生存していた。第１４又は１５日目に対照群において３匹の動物が死亡していた。試験物質の投与量の選択は、投与効果を決定するための事前の予備試験から導出した。
【００４２】
原発腫瘍
データシート：腎臓体積（ｃｍ３）
【表２】
2008520617.tif 000003
データシート：腎臓重量（ｇｒ）
【表３】
2008520617.tif 000004
【００４３】
肺転位
データシート：肺転位の数
【表４】
2008520617.tif 000005
データシート：肺重量（ｇｒ）
【表５】
2008520617.tif 000006
【００４４】
リンパ節転移
データシート：腸のリンパ節転移の数
【表６】
2008520617.tif 000007
血管密度（抗ＣＤ３１抗体）
【００４５】
方法：
動物を選択した後、試験対象の組織をすぐに液体窒素中に移し、−８０℃で凍結させた。５〜１０μｍ厚い切片を組織の一部から作製した。切片を抗ＣＤ３１抗体（Ｐｅｃａｍ−１）で免疫組織化学染色し、コントロール及び治療群の血管数を計数した。各腫瘍の２つの切片につき、それぞれ３つの領域ずつ、血管の数を計数した。
データシート：血管密度（各切片の３つの領域の計数値の平均）
【表７】
2008520617.tif 000008
試験の間に毒性は観察されず、副作用の徴候のような顕著な体重減少もなかった。解剖によっても特定の病理学的所見が観察されなかった。
【００４６】
Ｃｕ（メルファラン）２は２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で顕著な抗癌効果を発揮し、メルファランのみの場合のほぼ２分の１モルの投与量によってより高い効果が得られた。メルファランとほぼ４分の１モルの投与量によって同等の効果が提供された。
【００４７】
肺転位形成の評価においては、Ｃｕ（メルファラン）２の５ｍｇ／ｋｇの投与により顕著な転移抑制効果が得られることが試験により証明できた。
【００４８】
腸のリンパ節転移形成の評価においては、Ｃｕ（メルファラン）２の２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与により顕著な転移抑制効果が得られることが試験により証明できた。
【００４９】
選択された治療モデルを使用しても、２つの投与量においていかなる血管新生阻害効果も観察できなかった。この発見はこのモデルにおける、細胞安定性にとり有効な他の物質による結果と相関する。
【００５０】
実施例５
試験プロトコル
試験結果は実施例４のそれと同様であるが、治療間隔及び投与群のみが異なる。１０匹の動物による４つの試験群をそれぞれ構成した。
群１：陰性コントロール、
群２：陽性コントロールのメルファラン（Ｇｌａｘｏ）、
群３及び４：ＭＯＣメルファラン、５ｍｇ／ｋｇ及び７．５ｍｇ／ｋｇ。
術後１０日目を、全群における治療開始日とした。第１０日目から第１７日目までの毎日の治療（治療モデルを参照）を意図していた。しかしながら、毒性のため、治療期間を第１０〜１４日目まで短縮した。試験を１８日後に終了させた（コントロールにおける腫瘍サイズが、倫理的な理由から終了を余儀なくされる程になったため）。
【００５１】
治療モデル：
【表８】
2008520617.tif 000009
注入する日を第０日として計算した。試験期間は１８日。試験の開始時は動物は４０匹で、動物は手術の間生存していた。
【００５２】
結果：
原発腫瘍
データシート：腎臓体積（ｃｍ３）
【表９】
2008520617.tif 000010
データシート：腎臓重量（ｇｒ）
【表１０】
2008520617.tif 000011
【００５３】
肺転位
データシート：肺転位の数（後期の治療１０〜１４日目）
【表１１】
2008520617.tif 000012
データシート：肺重量（ｇｒ）
【表１２】
2008520617.tif 000013
【００５４】
リンパ節転移
データシート：腸のリンパ節転移の数
【表１３】
2008520617.tif 000014
データシート：血管密度、治療１０〜１４日目における後期の開始
【表１４】
2008520617.tif 000015
【００５５】
薬物耐性の理由から治療を第１４日目に終了させた。Ｃｕ（メルファラン）２は原発腫瘍に対して８．８μｍｏｌ／ｋｇ及び１３．２μｍｏｌ／ｋｇの投与量で顕著な抗腫瘍効果を発揮した。転移抑制効果は、肺転位及びリンパ節転移に関して１３．２μｍｏｌ／ｋｇの投与量で顕著であることが明らかとなった。Ｃｕ（メルファラン）２はまた、８．８μｍｏｌ／ｋｇの投与量において著しく血管新生を阻害した。
【００５６】
実施例６．ＯＶＣＡＲ−３腫瘍細胞を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける、メルファランと比較したＣｕ（メルファラン）２の効果
２×１０６のＯＶＣＡＲ−３／Ｐ１９腫瘍細胞を雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注入した。
マウスを以下の通りに治療した。
【表１５】
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【００５７】
８０ｍｍ３の平均腫瘍量から治療を開始した。安定な及び一定速度での腫瘍成長がコントロール群において観察された。図８は、治療期間中の平均腫瘍体積を示す。
【００５８】
個々の群における治療の開始時における腫瘍体積の可能な相違を平均化し、治療群の低い絶対体積との相違を明確にするために、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を解析した。相対腫瘍体積は、同じ試験動物の治療の開始時に、第ｘ日の体積と腫瘍体積との比率として算出した。図９は、化学療法で処置された群における治療開始時点からのＲＴＶを示す。これは銅メルファランがメルファランより効果的であることを明確に示す。群２の６１．３％又はコントロールの８．２％のみが、群３（銅メルファラン）の３７日目の平均ＲＴＶを示していた。腫瘍成長は群２においてちょうど７日後に停止した。銅メルファランで処置された試験動物では、第３０日目（１０回目の治療の日）から３日間腫瘍体積が一定で、その後に腫瘍退縮が開始した。
【００５９】
図１０は２つの投与群における統計解析結果を示す。第３７日目に、両治療群（群２及び３）は、コントロール群と比較して腫瘍体積及び相対腫瘍体積において統計的有意性（ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）を示していた。更に、メルファランと比較した銅メルファランの統計学的に有意に高い効果は、治療終了後（第３７日目）に確認することができた。第３７日目における平均腫瘍体積又は平均ＲＴＶに関するｐ値（マン−ホイットニー順位和検定を使用して試験）はｐ＝０．０２１及びｐ＝０．０１であった。
【００６０】
以下の表に示すように、銅メルファランによる治療とは対照的に、メルファランのみで治療されたマウスの腫瘍体積が、試験終了後において、治療開始時の腫瘍体積よりも大きいことも明らかとなった。第３７日目において、８匹のマウス（７５％）のうち６匹がＲＴＶ＞１であった。全体的に、群２の試験動物は治療終了時に２０％の腫瘍退縮と９８％の腫瘍成長との間に位置していた。群３において、１匹の試験動物が２．７８のＲＴＶ（他の全てが０．４３〜０．７８の範囲）であった。すなわち２２％〜５７％間の腫瘍退縮が第３７日目の群３のマウスの８８％において観察できた。腫瘍退縮の頻度及び後退の程度の両方とも、銅メルファランで処置された群において非常に高かった。
群１
【表１６】
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群２
【表１７】
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群３
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】Ｃｕ（メルファラン）２のＩＲスペクトル（ＫＢｒ）を示す。
【図２】Ｃｕ（メルファラン）２の質量スペクトルを示す。
【図３】提案されるＣｕ（メル）２・２Ｈ２Ｏの構造の代表例を示す。分子組成及び分子量を構造式の下に記載する。
【図４】実施例２によるＣｕ（Ｔｆ）２の合成に係る合成モデルを示す。
【図５】実施例３の方法で処置したコントロールマウスと本発明のＣｕ（メル）２により処置したマウスにおいて、腎臓重量及び腎臓体積を比較したグラフである。
【図６】実施例３の方法で処置したマウスの肺重量及び肺転位の数を示すグラフである。コントロール群（溶媒）、Ｃｕ（メル）２群（５ｍｇ／ｋｇ／１０〜１８日）、Ｃｕ（メル）２群（７．５ｍｇ／ｋｇ／１０〜１８日）及びメルファランのみで処置されたマウスを比較した。
【図７】実施例３の方法で処置したコントロールマウス及びＣｕ（メルファラン）２により処置したマウスにおける血管密度の比較（ＣＤ３１評価）を示す。
【図８】メルファランと比較した、Ｃｕ（メルファラン）２を用いた処置における平均腫瘍体積を示す。
【図９】銅メルファラン又はメルファランのみを用いて処置した群における相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を示す。
【図１０】図９の２つの投与群における統計解析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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