(57)【要約】ポリペプチドなどの生体分子のインビトロ合成系のための組成物、方法、及びキットを本発明において提供する。インビトロタンパク質合成方法を使用して可溶性タンパク質の収量向上をもたらす細胞抽出物を提供する。本発明にはまた、進行中のインビトロ合成系にアミノ酸及びエネルギー源を含む供給溶液を添加し、高いタンパク質収量を得るための方法が含まれる。本発明にはまた、例えばＮＭＲなどの方法による分析用に取り込まれた標識アミノ酸を有する大量のタンパク質を産生するための、高収量インビトロ合成系の使用方法が含まれる。本発明はさらに、インビトロ合成系を使用した鋳型核酸からのタンパク質産生向上のためのベクターを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤又は表面活性剤を含む細胞抽出物を含むインビトロタンパク質合成系であって、該細胞抽出物が、細胞を溶解させて細胞溶解物を得て、上清画分を該細胞溶解物から分離することによって調製され、一つ又は複数の界面活性剤又は表面活性剤が、溶解前の細胞又は上清画分の分離前の細胞溶解物に添加される、インビトロタンパク質合成系。
【請求項２】
細胞抽出物が、上清画分を分離する前に一つ又は複数の界面活性剤又は表面活性剤を細胞溶解物に添加することによって調製される、請求項１記載のインビトロ合成系。
【請求項３】
分離が、細胞溶解物を遠心分離し、細胞抽出物として上清を取り出すことである、請求項２記載のインビトロ合成系。
【請求項４】
細胞抽出物が、一つ又は複数の界面活性剤又は表面活性剤を、一つ又は複数の界面活性剤又は表面活性剤が溶解前の細胞に添加されるところへ添加することによって調製される、請求項１記載のインビトロ合成系。
【請求項５】
少なくとも一つの界面活性剤又は表面活性剤が、少なくとも一つの界面活性剤である、請求項１記載のインビトロ系。
【請求項６】
少なくとも一つの界面活性剤が、非イオン系界面活性剤又は両性イオン系界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ系。
【請求項７】
界面活性剤が非イオン系界面活性剤である、請求項６記載のインビトロ系。
【請求項８】
界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）系の界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ系の界面活性剤、又はグリコピラノシド界面活性剤である、請求項７記載のインビトロ合成系。
【請求項９】
界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）系の界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１０】
界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２、又はＢｒｉｊ（登録商標）９７である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１１】
界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１２】
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系の界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１３】
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ＣＦ系、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ＤＦ系、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ＧＲ系、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ＱＳ系、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ系の界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１４】
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ系の界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１５】
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４０５、又はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−７０５−７０である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１６】
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１７】
界面活性剤が、グリコピラノシド界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１８】
界面活性剤が、グルコピラノシド界面活性剤、マルトピラノシド界面活性剤、又はグルカミド界面活性剤である、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項１９】
界面活性剤が、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルａ−Ｄ−グルコピラノシド、デシルβ−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシルａ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、又はオクチルグルコピラノシドである、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項２０】
界面活性剤がドデシルマルトシドである、請求項５記載のインビトロ合成系。
【請求項２１】
少なくとも一つの界面活性剤が、両性イオン系界面活性剤である、請求項３記載のインビトロ合成系。
【請求項２２】
少なくとも一つの界面活性剤が、スルホベタイン界面活性剤、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）系の界面活性剤、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）系の界面活性剤、ＣＨＡＰＳ、又はＣＨＡＰＳＯである、請求項２１記載のインビトロ合成系。
【請求項２３】
少なくとも一つの界面活性剤が、ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯである、請求項２２記載のインビトロ合成系。
【請求項２４】
少なくとも一つの界面活性剤が、ＣＨＡＰＳである、請求項２３記載のインビトロ合成系。
【請求項２５】
界面活性剤の濃度がＣＭＣ以上である、請求項１記載のインビトロ合成系。
【請求項２６】
界面活性剤の濃度がＣＭＣの２倍未満である、請求項２５記載のインビトロ合成系。
【請求項２７】
アミノ酸、少なくとも一つのエネルギー源、及び鋳型核酸を、細胞抽出物調製前に少なくとも一つの表面活性剤又は界面活性剤によって処理された細胞又は細胞溶解物から調製される細胞抽出物に添加して、インビトロタンパク質合成混合物を調製する工程；並びに
インビトロタンパク質合成混合物をインキュベートしてタンパク質を合成する工程
を含むタンパク質合成方法。
【請求項２８】
細胞抽出物が、細胞溶解物の上清の単離を目的に抽出物を遠心分離する前に少なくとも一つの表面活性剤又は界面活性剤によって処理された細胞から調製される、請求項２７記載のインビトロ合成系。
【請求項２９】
細胞抽出物が、界面活性剤により細胞を処理することにより調製される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
界面活性剤が両性イオン系又は非イオン系界面活性剤である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも一つの界面活性剤が非イオン系界面活性剤である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
界面活性剤が、Ｂｒｉｊ（登録商標）系の界面活性剤、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）系の界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系の界面活性剤、又はグリコピラノシド界面活性剤である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
界面活性剤がＢｒｉｊ（登録商標）系の界面活性剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
界面活性剤がＢｒｉｊ（登録商標）３５である、請求項３４記載の方法。
【請求項３５】
界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ（登録商標）系の界面活性剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００である、請求項３６記載の方法。
【請求項３７】
界面活性剤がグリコピラノシド界面活性剤である、請求項３２記載の方法。
【請求項３８】
界面活性剤がグルコピラノシド界面活性剤、マルトピラノシド界面活性剤、又はグルカミド界面活性剤である、請求項３８記載の方法。
【請求項３９】
界面活性剤が、ドデシルマルトシド、オクチルグルコピラノシド、又はオクチルチオグルコピラノシドである、請求項５記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも一つの界面活性剤が両性イオン系界面活性剤である、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも一つの界面活性剤が、スルホベタイン界面活性剤、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）系界面活性剤、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）系界面活性剤、ＣＨＡＰＳ、又はＣＨＡＰＳＯである、請求項４１記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも一つの界面活性剤がＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４である、請求項４２記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも一つの界面活性剤がＣＨＡＰＳである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
細胞又は細胞溶解物に添加された後の界面活性剤の最終濃度がＣＭＣ以上である、請求項２７記載の方法。
【請求項４５】
細胞又は細胞溶解物に添加された後の界面活性剤の最終濃度がＣＭＣの２倍未満である、請求項４５記載の方法。
【請求項４６】
一定時間反応混合物をインキュベートした後、合成混合物に、バッファー、アミノ酸、少なくとも一つの追加的なエネルギー源を含む供給溶液（Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加する工程であって、その少なくとも一つの追加的なエネルギー源は、拡張型合成混合物を調製するために初めの合成混合物の少なくとも一つのエネルギー源とは異なる、工程；及び
拡張型合成混合物を、更に一定時間インキュベートして少なくとも一つのタンパク質を合成する工程
を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項４７】
細胞抽出物にアミノ酸、少なくとも一つのエネルギー源、及び鋳型核酸を添加して初めのインビトロタンパク質合成混合物を調製する工程；
初めの合成混合物に、バッファー、アミノ酸、及び少なくとも一つの追加的なエネルギー源を含む供給溶液を添加する工程であって、その少なくとも一つの追加的なエネルギー源は、拡張型合成混合物を調製するために初めの合成混合物の少なくとも一つのエネルギー源とは異なる、工程；並びに
拡張型合成混合物を一定時間インキュベートしてタンパク質を合成する工程
を含む、タンパク質を合成する方法。
【請求項４８】
少なくとも一つの追加的なエネルギー源が、初めの合成混合物において提供されるエネルギー源とは異なる、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも一つの追加的なエネルギー源が酵素でない、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも一つの追加的なエネルギー源が解糖中間体である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも一つの追加的なエネルギー源が、フルクトース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸、又は３−ホスホグリセリン酸である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
供給溶液が補因子を更に含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
補因子がＮＡＤ又はＮＡＤＨである、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
初めの合成反応に少なくとも二つのエネルギー源が含まれる、請求項４７記載の方法。
【請求項５５】
初めの合成反応に少なくとも三つのエネルギー源が含まれる、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
供給溶液が、初めの合成混合物が調製されてから少なくとも１０分後に添加される、請求項４７記載の方法。
【請求項５７】
供給溶液が、初めの合成混合物が調製されてから約１５分〜約６０分後に添加される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも一つの追加的な時点に供給溶液をタンパク質合成混合物に添加する工程を更に含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも三つのエネルギー源のうちの少なくとも一つが酵素である、請求項５５記載の方法。
【請求項６０】
酵素がピルビン酸キナーゼである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも三つのエネルギー源のうちの少なくとも一つがホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）である、請求項５５記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも三つのエネルギー源のうちの少なくとも一つがアセチルリン酸である、請求項５５記載の方法。
【請求項６３】
供給溶液が塩化カルシウムを更に含む、請求項４７記載の方法。
【請求項６４】
供給溶液が、初めのインビトロタンパク質合成混合物のｐＨより高いｐＨを有する、請求項４７記載の方法。
【請求項６５】
ＩＶＰＳ抽出物を調製する工程；
ＩＶＰＳ抽出物を少なくとも２時間、その後少なくとも８時間透析する工程；  透析した細胞抽出物に反応バッファー、鋳型核酸、及び少なくとも一つの同位元素標識アミノ酸を添加してＩＶＰＳ反応を構成する工程；並びに
ＩＶＰＳ反応をインキュベートし、ＮＭＲ分析用の少なくとも一つの同位元素標識タンパク質を調製する工程
を含むＮＭＲ用のタンパク質の標識方法。
【請求項６６】
Ｎ末端アミノ酸配列タグとオープンリーディングフレームとの融合に使用可能な少なくとも一つのベクターと、
Ｃ末端アミノ酸配列タグとオープンリーディングフレームとの融合に使用可能な少なくとも一つのベクターとを含む、オープンリーディングフレームをクローニングして発現させるための一組の発現ベクターであって、
該ベクターは、発現されたタンパク質からのアミノ酸配列タグの切除に使用可能な少なくとも一つのプロテアーゼ切断部位を含む、一組の発現ベクター。
【請求項６７】
発現されたタンパク質からアミノ酸配列タグを除去することにより、合成タンパク質上に外因性アミノ酸が二つを超えて残留しない、請求項６６記載の一組の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は生命工学の分野に関する。特に本発明は、生体分子（例えば核酸及びポリペプチド）を合成、精製、標識及び／又は検出するためのインビトロの系に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
インビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）はとりわけ、タンパク合成において、インビボ又は細胞系でのタンパク質産生に使用される細胞の維持に必要とされる余分なタンパク質の産生を伴わずに、目的タンパク質を特異的に産生するという点で優位性を発揮する。細胞がタンパク質工場として用いられるとき、細胞は所望のタンパク質の産生に加え、他の必要な分子も産生する。それには不要なタンパク質が含まれるが、細胞を維持するためには必要なものである。
【０００３】
インビトロタンパク質合成は、遺伝子発現の細胞内調節が基本的に存在しないため、細胞毒性のタンパク質、不安定なタンパク質、又は不溶性のタンパク質の産生に効果的である。インビボでの一定濃度以上のタンパク質の過剰産生は困難であり、その理由として、発現量が産生物の濃度によって調節されることが挙げられる。一般に細胞に蓄積されるタンパク質の濃度は、細胞の生存に影響を及ぼすため、所望のタンパク質の過剰産生は困難である。単離及び精製工程中、多くのタンパク質は不溶性又は不安定であり、細胞内のプロテアーゼにより分解されるか、又は封入体として凝集するため、回収率が低くなる。インビトロ合成は、これらの多くの課題を回避するものである。更に、多数の配列にてタンパク質を同時及び迅速に発現させることより、この技術は、研究目的での複合アレイの開発やタンパク質のスクリーニング作業に有益なツールを提供しうる。更に、様々な非天然アミノ酸は、特殊な目的に使用するタンパク質に能率的に取り込まれうる（Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８，１９８９）。しかしながら、その全ての優れた面をもってしても、インビトロの系はタンパク質のインビボ合成の代替技術として現実に広く受け入れられたわけではない。
【０００４】
既存の大腸菌ベースの無細胞発現系は、細胞ベースの系と比較し、生成物を得るスピードや使用の容易性を含めた利点を数多く有するものである。特にプロテオミクスの分野でこれらの系が広く使用されている。Ｍｏｖａｈｅｄｚａｄｅｈら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２３５：２４７−２５５（２００３）；Ｋｉｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：８８１，１９９６；Ｐａｔｎａｉｋ及びＳｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：８６２，１９９８；Ｋｉｍ及びＳｗａｒｔｚ（１９９９）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｎｄＢｉｏｅｎｇ．６６：１８０−１８８；並びにＫｉｍ及びＳｗａｒｔｚ（２０００）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６：３８５−３９０を参照のこと。全ゲノム配列情報を得ることにより、機能が不明又は十分理解されていない無数の遺伝子及びオープンリーディングフレームの分子構造及び系統に関する膨大な情報が得られる。すなわち、ＩＶＴＴ及び、更に一般的にいえばインビトロタンパク合成の有用性は、迅速かつ効率的なタンパク合成及び機能解析にとり、将来更に重要な位置を占めると期待される。
【０００５】
しかしながら、現在のＩＶＰＳ系には限界が存在する。例えば、これらの系では、詳細な分析に使用できる程の充分量のタンパク質が産生されない。短時間（１〜６時間）において、望ましい濃度（例えばｍｇ／ｍＬ規模）で目的タンパク質の所望量（ｍｇ規模）を産生することは困難である。
【０００６】
更に、ＩＶＰＳでは、目的タンパク質への非天然（例えば検出用に標識された）アミノ酸の高効率での導入方法は、限られたものとなっている。Ｍａｍａｅｖらは、ＩＶＰＳによりタンパク質に標識アミノ酸を導入する方法を報告した（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２６：２５−３２（２００４））が、それはアミノ末端に、フルオロフォア−アミノ酸コンジュゲートにより化学的にアミノアシル化された、外因性イニシエーターのサプレッサーｔＲＮＡを付加するに留まっている。更に、Ｍａｍａｅｖらの方法は、２７〜６７％の特異的な標識に留まっている。
【０００７】
特許文献
インビトロタンパク質合成の分野の特許には、以下のリストに挙げられるものが含まれるが、それらに限定されるものではない。このリストは、同等技術の広範囲にわたる再調査を目的とせず、またこれらの特許文献リストのいずれも、その文書が実際に同等技術であることを承認するものでもない。
米国特許第５，４７８，７３０号（Ａｌａｋｈｏｖら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」）。
米国特許第５，６６５，５６３号、第５，４９２，８１７号、及び第５，３２４，６３７号（Ｂｅｃｋｌｅｒら、「Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔ．」）。
米国特許第６，３３７，１９１号（Ｓｗａｒｔｚら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｓ  ａｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｏｕｒｃｅ．」）。
米国特許第６，５１８，０５８号（Ｂｉｒｙｕｋｏｖら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ．」）。
米国特許第６，６７０，１７３号（Ｓｃｈｅｌｓら、「Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．」）。
米国特許第６，７８３，９５７号（Ｂｉｒｙｕｋｏｖら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．」）。
米国特許出願第２００２／０１６８７０６号（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００２年１１月１４日公開、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ．」）。
米国特許第６，１６８，９３１号（Ｓｗａｒｔｚら、２００２年１月８日登録、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」）。
米国特許第６，５４８，２７６号（Ｓｗａｒｔｚら、２００３年４月１５日登録、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ．」）。
米国特許出願第２００４／０１１０１３５号（Ｎｅｍｅｔｚら、２００４年６月１０日公開、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」）。
米国特許出願第２００４／０２０９３２１号（Ｓｗａｒｔｚら、２００４年１０月２１日公開、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」）。
米国特許出願第２００４／０２１４２９２号（Ｍｏｔｏｄａら、２００４年１０月２８日公開、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ．」）。
米国特許出願第２００４／０２５９０８１号（Ｗａｔｚｅｌｅら、２００４年１２月２３日公開、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｏｒ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．」）。
米国特許出願第２００５／０００９０１３号（２００５年１月１３日公開）、米国特許出願第２００５／００３２０７８号（２００５年２月１０日公開）、Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」。
米国特許出願第２００５／００３２０８６号（Ｓａｋａｎｙａｎら、２００５年２月１０日公開、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．」）。
ＰＣＴ特許出願国際公開公報第００／５５３５３号（Ｓｗａｒｔｚら、２０００年３月１５日、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」）。
これらの特許及び特許出願の全ては、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、生体分子のインビトロ合成（例えばインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ））に関する。本発明は、ＩＶＰＳに用いる組成物、方法、クローニング及び発現ベクター、並びにキットを提供する。
【０００９】
本発明はインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）のための組成物、方法及びキットに関する。本発明は、ＩＶＰＳ系、並びにその組成物、方法及びキットを含む。また、二つ以上の異なる要素（組成物、方法、キット）を組み合わせて、本発明の異なる態様とすることもできる。本発明の方法は、ＩＶＰＳ系の組成物の調製、及び効率的なＩＶＰＳ反応の実施に有用である。本発明の組成物は、目的タンパク質の産生に使用でき、いかなる給源生物（例えばウイルス、原核生物、真核生物、古細菌、動物、植物、細菌その他由来の細胞又はオルガネラ）も使用できる。
【００１０】
本発明には、ＩＶＰＳ反応の開始後に添加される、ＩＶＰＳ反応の幾つかの構成要素を含む供給溶液（Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（本明細書において「供給バッファー（Ｆｅｅｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ）」とも称される）が提供される。進行中の無細胞発現の反応系に供給溶液を添加することにより、タンパク合成を促進させ、より高い収量が実現できる。本発明は、多くの望ましい特徴（例えば高収量でのタンパク質産生、反応時間短縮など）を有する優れた供給溶液を提供するものである。
【００１１】
本発明の供給溶液には、少なくとも一つの追加的なエネルギー源及び／又は補因子が含まれる。「追加的な」とは、エネルギー源及び／又は補因子が、初めの反応混合物に排他的又は主に存在するエネルギー源及び／又は補因子と構成的に異なることを意味する。典型的には、反応時間０（ｔ＝０）での初めのエネルギー源がホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びアセチルリン酸（ＡＰ）である。補因子ＮＡＤ又はＮＡＤＨと共に供給溶液に含まれる（及び／又は初めのＩＶＰＳ反応に添加される）好適な追加的エネルギー源には、限定するものではないが、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸又は３−ホスホグリセリン酸のような解糖系の中間代謝産物が含まれる。
【００１２】
本発明はまた、ＩＶＰＳ系において可溶性タンパク質の収量増加をもたらす細胞抽出物を提供する。上記抽出物は、抽出物の調製にあたり細胞を溶解させたバッファーに脂質、表面活性剤又は界面活性剤を添加することによって調製される。
【００１３】
本発明は更に、タンパク質をコードする配列の効率的クローニング用のベクターであって、その配列がコードするタンパク質の翻訳、溶解性及び活性を向上させる配列を有するベクターを提供する。
【００１４】
他の態様において、本発明は、限定するものではないが、一つ以上の供給溶液、ＩＶＰＳ細胞抽出物、及び／又はキット化されたバージョンを含むベクターであって収量及び時間当たりのタンパク合成を最大化するベクターの使用を含む、ＩＶＰＳ方法に関する。本発明は、多量の目的タンパク質（ＰＯＩ）をｍｇ単位、好ましくは少なくとも１から約１ｍｇ／ｍＬ〜１００又は約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、約１〜約６時間で合成する方法を提供する。
【００１５】
他の態様においては、本発明は、限定するものではないが、一つ以上の供給溶液、ＩＶＰＳ抽出物及び／又はベクター及びそのキット化されたバージョンを含み、ＩＶＰＳ反応の間、外部から添加されるアミノ酸の取り込みを最大化する、ＩＶＰＳ方法及び組成物に関する。この種の外部から添加されるアミノ酸には、検出可能な標識を付与されたアミノ酸（例えば蛍光標識アミノ酸、重元素アミノ酸及び放射性同位元素標識アミノ酸）が含まれうる。これらの本発明の態様は、質量分析及び核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などに使用する、標識目的タンパク質の調製に有用である。なぜなら、対応する非標識（天然）アミノ酸を除外した形で、検出可能な標識を付与された他の非天然アミノ酸の完全な取り込みが行われるからである。本発明はまた、質量分析及びＮＭＲスペクトル解析に使用するタンパク質の完全な標識に使用可能な系及びキットを提供する。
【００１６】
他の態様においては、本発明は、目的遺伝子をクローニングし、ＩＶＰＳ系で発現させるためのベクターに関する。インビトロタンパク質合成の好適な特徴としては、それが目的遺伝子を特定の目的タンパク質の産生のために提供できる、確立された系であることが挙げられる。目的遺伝子の発現効率は、そのリーディングフレーム外の配列により影響されるため、適切な制御配列を本発明のベクターの目的遺伝子に対し、制御可能に連結してもよい。アミノ酸タグ配列の目的タンパク質への融合を可能にする二つのベクターのペアであって、二つのベクターのうちの一つがＮ末端側アミノ酸タグを有する目的タンパク質の発現に用いられ、二つのベクターのもう一方がＣ末端側アミノ酸タグを有する目的タンパク質の発現に用いられるベクターのペアが提供される。そのベクターにより、アミノ酸タグを使用して単離、アフィニティー精製、又は検出される目的タンパク質の効率的な産生が行われ、またその合成されたタンパク質へのアミノ酸付加は最小限に留まる。
【００１７】
略記及び定義
以下の記載において、組換え核酸技術で使用される多くの用語が広範囲に利用される。本明細書と請求項の明確かつ一貫した理解を可能にするため、この種の用語に与えられる範囲を含めて、以下のように定義する。
【００１８】
アミノ酸：
本発明における「アミノ酸」とは、アミノ基（−ＮΗ２）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む有機化合物である。
【００１９】
以下の表において、天然のタンパク質に通常存在する２０の天然アミノ酸、及び各アミノ酸に関連する１及び３文字表記の一覧を記載する。
【００２０】
（表１）天然アミノ酸及び遺伝子コード
2008514240.tif 000002
＊表中のコドンは、ｍＲＮＡ上に存在するときの態様である。ＤＮＡ分子における対応するコドンは、ＲＮＡ配列のあらゆるウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをチミジン（Ｔ）ヌクレオチドに置換したものである。
【００２１】
本明細書における「外来アミノ酸」の用語は、天然タンパク質には存在しないが、組換えＤＮＡを使用して発現させるタンパク質に取り込まれるアミノ酸を指すものとして使用される。本願において「天然型」及び「野生型」とは、自然界において生じる生体分子を指す。「非天然」及び「修飾された」の用語は、その天然の形態に修正又は変更を加えた生体分子を指す。
【００２２】
「アミノ酸」の用語には、天然アミノ酸（表１）及び修飾アミノ酸の両方が含まれる。修飾アミノ酸には、限定するものではないが、検出可能な標識付与された、及び／又は構造的に修飾されたアミノ酸が含まれる。タンパク合成においては、翻訳において、当然ながら好適に修飾されたアミノ酸をポリペプチドに取り込ませてもよい。
【００２３】
ヒ素含有分子：
本願において、ヒ素含有分子とは、一つ以上のヒ素原子を含むあらゆる化学物質を指す。好適なヒ素含有分子は、特定のアミノ酸配列と結合する。好適な特定のアミノ酸配列はＣ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｃ（「Ｃ」はシステインを表し、「Ｘ」はシステイン以外の任意のアミノ酸を表す）である。二ヒ素（二つのヒ素原子）化合物及び四ヒ素（四つのヒ素原子）化合物の両化合物は、ヒ素含有化合物である。四ヒ素分子は、単体ヒ素及び二ヒ素のいずれかによる分子である。
【００２４】
単体ヒ素、二ヒ素又は四ヒ素の分子は、好ましくは検出可能な基（例えば蛍光性の基、発光性の基、リン光性の基、スピン標識、光増感剤、光切断可能部分、キレート中心、重元素、放射性同位元素、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）によって検出可能な同位元素、正磁性原子及びそれらの組み合わせ）を含む。用途によっては、共有結合によるカップリングによって二ヒ素の分子を固相に固定するのが好ましい。この種の用途は、ビーズ又はアフィニティークロマトグラフィーに適する他のいずれかの基材への固定を含む。これは、タグ付きタンパク質の精製に用いられる。単体ヒ素、二ヒ素又は四ヒ素の分子は、好ましくは生体膜を通過できるものである。
【００２５】
二ヒ素分子：
本発明において、二ヒ素分子とは、二つ以上のヒ素原子を含むあらゆる化学物質を指す。好適な二ヒ素分子は、特殊なアミノ酸配列と結合する。好適な特異的なアミノ酸配列はＣ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｃ（「Ｃ」はシステインを表し、「Ｘ」はシステイン以外の任意のアミノ酸を表す）である。米国特許出願公開第２００５／０１７０６５号（二ヒ素分子に関する全ての開示内容が、本明細書に参照により組み入れられる）を参照。
【００２６】
四ヒ素分子：
二ヒ素分子の代わりに、又はそれと組み合わせて使用する他の分子には、限定されないが、四ヒ素分子が含まれる。四ヒ素分子は、Ｔｓｉｅｎらの米国特許第６，０５４，２７１号において開示される化学式を有する二つの二ヒ素分子を含む（本明細書において四ヒ素分子に関する全ての開示内容が参照により組み入れられる）。例えば、二つの二ヒ素分子は、連結基で相互に連結される。
【００２７】
細胞の抽出物又は細胞抽出物：
抽出物は、細胞溶解液若しくは浸出液、又はそれらのフラクションである。例えば、細胞抽出物は、溶解液中に含まれる他の細胞構成要素を遠心分離、濾過、選択的沈殿、選択的免疫沈降反応、クロマトグラフィー又は他の方法によって分離して得た、溶解液の一部であってもよい。例えば、ＩＶＰＳ用の細胞抽出物の通常の調製方法には、細胞可溶化物を遠心分離して膜及び他の不溶性の構成物を溶解液のペレットとし、上清（ＩＶＰＳ系に使用される抽出物）を取り出すことが含まれる。用語「細胞抽出物」及び「ＩＶＰＳ抽出物」にはまた、タンパク質又は核酸合成に必要又は要求される構成要素に関し、細胞可溶化物又は浸出液に似せて調製した構成要素の混合物が含まれる。ＩＶＰＳ抽出物は、タンパク合成反応において細胞可溶化物又は浸出物（又はそのフラクション）を模倣又は改善する、及び／又は核酸の鋳型からの合成に使用する構成要素を提供する、構成要素の混合物であってもよい。この種の混合物は、当業者にとり自明であろうが、部分的な抽出物又はそのフラクションの回収、及び／又は任意の数の個々の構成要素の混合によっても調製できる。後者は、天然由来でも、又はインビトロで合成されたものでもよい。
【００２８】
含まない：
本発明において「含まない」の用語は、所与の物質又は構成要素が存在しないことを指す。本発明においては、ある物質が組成物中に、ｖ／ｖ、ｗ／ｖ又はｗ／ｗにおいて、１％未満又は約１％、好ましくは０．１％未満又は約０．１％、最も好ましくは０．０１％未満又は約０．０１％の濃度で存在する場合、その組成物はその物質を含まないという。
【００２９】
実質的に含まない：
本発明において、ある物質が最も好ましくは２５％未満又は約２５％、好ましくは１０％未満又は約１０％、最も好ましくは５％未満又は約５％、最も好ましくは１．１％未満又は約１．１％である場合、組成物はその物質を実質的に含まないという。
【００３０】
検出可能に標識された：
「検出可能に標識された」及び「標識された」の用語は、本発明において交換して使用可能であり、分子（例えば核酸分子、タンパク質、ヌクレオチド、アミノ酸など）が、他の部分又は分子であって、様々な検出手段（例えば測定機器、目視、写真撮影、Ｘ線撮影など）によって検出されうるシグナルを生じるものを付加されている状態を指す。この種の状態においては、分子は、共有結合又はイオン結合、凝集、アフィニティーカップリング（例えば一次及び／又は二次抗体の使用を含み、そのいずれも検出可能な標識を含みうる）などを含む、様々な任意の公知技術によって、シグナルを生じさせる分子又は部分（「標識」又は「検出可能な標識」）を付加（又は「標識」）されてもよい。本発明における、標識又は検出可能に標識された分子の調製に用いられる、検出可能な標識として適切なものには、例えば放射性同位元素標識、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識及び当業者に公知の他のものが含まれる。
【００３１】
遺伝子：
「遺伝子」の用語は、本発明において、ポリペプチド、タンパク質又は非翻訳ＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の発現に必要な情報を含む核酸を意味する。遺伝子がタンパク質をコードするときは、プロモーター及び構造遺伝子のオープンリーディングフレーム配列（ＯＲＦ）、並びにタンパク質発現に関係する他の配列を含む。遺伝子が非翻訳ＲＮＡをコードするときは、プロモーター及び非翻訳ＲＮＡをコードする核酸を含む。
【００３２】
目的遺伝子（ＧＯＩ）：
「目的遺伝子」の用語は、任意の目的（例えば疾患の治療、改良された特性の付与、宿主細胞における目的タンパク質の発現、リボザイムの発現など）のために、それを操作することが望ましいと当業者が考える、あらゆるヌクレオチド配列（例えばＲＮＡ又はＤＮＡ）を指す。この種のヌクレオチド配列は、限定されないが、構造遺伝子（例えばリポーター遺伝子、選択標識遺伝子、腫瘍遺伝子、薬剤耐性遺伝子、生育因子など）のコーディング配列、並びにｍＲＮＡ又はタンパク質をコードしないノンコーディング制御配列（例えばプロモーター配列、ポリアデニル化配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列など）が挙げられる。
【００３３】
宿主：
本発明における「宿主」の用語は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクター又は任意の核酸分子の取り込み先となる、あらゆる原核生物又は真核生物（例えば哺乳類、昆虫、酵母、植物、鳥類、動物など）を指す。核酸分子は、制限されないが、目的配列、転写制御配列（例えばプロモーター、エンハンサー、阻止物質など）及び／又は複製開始点を含んでもよい。本発明における「宿主」、「宿主細胞」、「組換え宿主」及び「組換え宿主細胞」の用語は、相互に交換して使用できる。この種の宿主に関しては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【００３４】
インビトロ：
本発明において「インビトロ」の用語は、細胞又は有機体の外の系を指し、しばしば無細胞系のことを指すこともある。インビボの系は、基本的に完全な細胞であって、懸濁液又は、他の細胞若しくは固体に結合若しくは接触しているものに関する。インビトロの系は、操作がより容易であるという利点が存在する。構成要素を細胞内部に届けることがなく、細胞機能の維持にとって適切でない操作も可能である。一方、インビトロの系では破壊した細胞又は各種構成要素が使用されるため、所望の機能を発揮させることができ、またそれにより細胞の空間的関係が失われる。インビトロの系の調製時、おそらく所望の活性を左右するであろう構成要素が、廃棄される細胞残渣と共に除去されうる。すなわちインビトロの系は操作が簡便で、インビボの系とは異なる機能を発揮しうる。
【００３５】
ＩＶＴ：
「インビトロ転写」（ＩＶＴ）及び「無細胞転写」の用語は、本発明において交換可能に使用され、ＲＮＡからのタンパク質合成を含まない、ＤＮＡからＲＮＡへの無細胞合成の任意の方法を指す。好適なＲＮＡは、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【００３６】
ＩＶＴＴ：
「インビトロ転写−翻訳」（ＩＶＴＴ）、「無細胞転写−翻訳」、「ＤＮＡ鋳型からのインビトロタンパク質合成」及び「無細胞でのＤＮＡ鋳型からのタンパク質合成」の用語は、本発明において相互に交換可能に使用され、あらゆる無細胞におけるＤＮＡからのｍＲＮＡ合成（転写）及びｍＲＮＡからのタンパク質合成（翻訳）方法を指す。
【００３７】
ＩＶＰＳ：
「インビトロタンパク質合成」（ＩＶＰＳ）、「インビトロ翻訳」、「無細胞翻訳」、「ＲＮＡ鋳型からのインビトロタンパク質合成」「無細胞のＲＮＡ鋳型からのタンパク合成」及び「無細胞タンパク合成」の用語は、本発明において交換可能に使用され、あらゆるタンパク質の無細胞合成方法を指す。転写及び転写の結合を含むＩＶＴＴは、ＩＶＰＳの非限定的な一例である。
【００３８】
ＩＶＰＳ適合：
本発明において、「ＩＶＰＳ適合の」及び「ＩＶＰＳに適合した」の用語は、ＩＶＰＳ抽出物又はインビトロでのポリペプチドの産生に使用可能な系を指す。
【００３９】
キット化された：
本発明において「キット化された」の用語は、キットの形態に調製された組成物を指すために用いられる。キットは一つ以上の試薬、一つ以上の装置又は一つ以上の補給物を含む構成要素の集合体であってよく、そのキットの組成物のうち二つ以上が、プロトコル又は一般方法と同一又は異なる工程で使用されうる。任意に、上記の組成物は、一つ以上の個別容器（例えばチューブ、バイアル、バブルパック、ブリスターパックなど）中に分注した状態で、好ましくは、直接又は間接的なユーザー向け取扱説明書を添えて、例えば箱、ラック、枠箱、パッケージなどの簡便な包装形態で一緒に梱包してもよい。しかしながら、場合によりキットの一つ以上の構成要素を別に梱包してもよい。
【００４０】
核酸分子：
本発明における「核酸分子」の用語は、任意の長さの一連なりのヌクレオチド（リボＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ又はそれらの組み合わせ）を指す。核酸分子は、完全長ポリペプチド若しくはその任意の長さの断片をコードしてよく、又はノンコーディングであってよい。本発明において「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」の用語は交換して使用でき、一本鎖（ｓｓ）及び二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含んでもよい。
【００４１】
ポリメラーゼ：
本発明において、「ポリメラーゼ」は、既存の鋳型核酸を使用して核酸の合成反応を触媒する酵素を指す。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ→ＤＮＡ反応を触媒）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ→ＲＮＡ）及び逆転写酵素（ＲＮＡ→ＤＮＡ）が含まれる。
【００４２】
ポリペプチド：
本発明における「ポリペプチド」の用語は、任意の長さの一連のアミノ酸を指す。「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「タンパク質」の用語は、本発明において「ポリペプチド」の用語と交換して使用できる。
【００４３】
プロモーター：
本発明において、「プロモーター」、「プロモーター要素」又は「プロモーター配列」の用語は、目的のヌクレオチド配列に連結されたときに、目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡの転写を制御できるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、必須ではないが典型的には、そのｍＲＮＡ転写制御の目的となるヌクレオチド配列の５’側（すなわち上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写開始に関与する他の転写制御因子に対する特異的な結合部位を提供する。プロモーターは、構成的でも、又は制御可能であってもよい。プロモーターに関して「構成的」の用語が使用されるときは、そのプロモーターが刺激（例えば熱ショック、化学物質など）の非存在下でも、制御可能に連結された核酸の転写を誘導できることを意味する。対照的に、「制御可能な」プロモーターとは、刺激（例えば熱ショック、化学物質など）が存在する場合に、制御可能に連結された核酸の転写のレベルを、刺激の非存在下における、制御可能に連結された核酸の転写のレベルと異なるレベルにしうるものを指す。
【００４４】
目的タンパク質（ＰＯＩ）：
本発明において、目的タンパク質、ＰＯＩ及び「所望のタンパク質」の用語は、試験対象のポリペプチド、又は、その発現が本発明において開示される方法を実施する者により要求されるポリペプチドを指す。目的タンパク質は、その同系の目的遺伝子（ＧＯＩ）によりコードされる。ＰＯＩの相同性は公知でも公知でなくてもよい。ＰＯＩは、オープンリーディングフレームにてコードされるポリペプチドであってよい。
【００４５】
可溶化剤：
本発明において「可溶化試薬」及び「可溶化剤」の用語は、第二の、疎水性化合物が溶媒（典型的には水）に残留又は溶解するのを助長するあらゆる化合物を指す。
【００４６】
転写：
本発明において、特に明記しない限り、「転写」の用語はＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を指す。
【００４７】
翻訳：
本発明において、特に明記しない限り、「翻訳」の用語は、ｍＲＮＡ鋳型からのポリペプチドの合成を指す。
【００４８】
ベクター：
本発明において、「ベクター」の用語には、例えばプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ、適当な調節要素と関係するときに複製可能で、細胞間で遺伝子配列を転移できる、任意の遺伝的因子のことを指す。ベクターは、形質転換細胞の識別の用に適する標識を含んでよい。例えば、標識はテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を与えるものでもよい。ベクターのタイプには、クローニング用及び発現用のベクターが含まれる。
【００４９】
ベクター、クローニング：
本発明において「クローニングベクター」の用語は、宿主細胞において独立して複製可能であり、一つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位及び／又は部位特異的組換え部位の存在を特徴とするプラスミド又はバクテリオファージＤＮＡ又は他のＤＮＡ配列を指す。外来ＤＮＡ断片はこれらの部位でベクターに連結され、断片の複製及びクローニングが可能となる。
【００５０】
ベクター、発現：
本発明における「発現ベクター」の用語は、そこにクローニングされた遺伝子を発現できるベクターを指す。この種の発現は、宿主細胞の形質変換の後、又はＩＶＰＳ系において生じうる。クローニングされたＤＮＡは、通常一つ以上の制御配列（例えばプロモーター、リプレッサー結合部位、ターミネーター、エンハンサーなど）と、制御可能に連結される。プロモーター配列は構成的なものでも、誘導及び／又は抑制可能なものでもよい。
【００５１】
本明細書で用いられる組換え核酸技術の分野及び分子及び細胞生物学で使用する他の語は、その分野の当業者によって通常どおり認識される。
【００５２】
本発明の詳細な説明
インビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）
総論
精製されたｍＲＮＡ転写物、又は、インビトロ合成反応の間にＤＮＡから転写されたｍＲＮＡからのインビトロタンパク質合成をサポートする、細胞抽出物を開発した。この種のタンパク合成系は、本明細書において「ＩＶＰＳ系」と称され、ＩＶＰＳとは「インビトロ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」の頭字語である。
【００５３】
一般的な系は、目的タンパク質をコードする鋳型核酸を含む。鋳型核酸はＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）又はｍＲＮＡをコードする核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ）であり、あらゆる形態（例えば直鎖、環状、スーパーコイル型、一本鎖、二本鎖など）をとる。鋳型核酸は、所望のタンパク質の産生を誘導する。ＩＶＰＳ系は、所望のタンパク質に、検出可能な標識を付与されたアミノ酸、又は一般的でない若しくは非天然のアミノ酸の取り込み用に設計してもよい。
【００５４】
一般的なＩＶＰＳ反応において、目的タンパク質をコードしている遺伝子は転写バッファー中で発現し、ＩＶＰＳ抽出物及び翻訳バッファー中でｍＲＮＡが目的タンパク質に翻訳されるに至る。転写バッファー、ＩＶＰＳ抽出物及び翻訳バッファーは別々に添加してもよく、又はこれらの溶液のうちの二つ以上をそれらの添加前に混合してもよく、又は同時に添加してもよい。
【００５５】
インビトロでの目的タンパク質合成の際、ＩＶＰＳ抽出物に、幾つかの時点で目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含める必要がある。初期のＩＶＰＳ実験では、ｍＲＮＡは、天然の給源から精製した後に外因的に添加していたか、又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用し、クローニングされたＤＮＡからインビトロで合成して調製していた。他の系においては、ｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからインビトロにおいて得られ、転写及び翻訳の両者がこの種のＩＶＰＳ反応で生じる。転写及び翻訳系の組み合わせ、又は相互補完を用いた（同じ反応系でＲＮＡ及びタンパク質の合成を行う）技術が開発された。この種のインビトロでの転写及び翻訳（ＩＶＴＴ）系において、ＩＶＰＳ抽出物中には、単一の系内に転写（ｍＲＮＡ産生）及び翻訳（タンパク質合成）に必要な全ての構成要素が含まれる。初期のＩＶＴＴ系は、細菌抽出物に基づくものである（Ｌｅｄｅｒｍａｎ及びＺｕｂａｙ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４９：２５３，１９６７）。ＩＶＴＴ系に添加される核酸は、通常ｍＲＮＡより取得が非常に容易で、より簡便に操作（例えばクローニング、部位特異的組換えなど）できるＤＮＡである。
【００５６】
それらの調製方法又はそれらの添加順序に関係なく、ＩＶＴＴ反応混合物には以下の構成要素が含まれる。少なくとも一つのプロモーターに制御可能に連結した目的遺伝子（ＧＯＩ）、任意に一つ以上の他の制御配列とを含む鋳型核酸（例えばＤＮＡ）（例えばＧＯＩを含むクローニング用又は発現用ベクター）、ＧＯＩと制御可能に連結されているプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ、及び、任意に、鋳型核酸が制御可能に連結している任意の制御配列に結合する一つ以上の転写制御因子、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、任意に、他の転写制御因子及びその補因子、リボソーム、移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、他の任意の翻訳因子（例えば翻訳開始、伸長及び終結因子）及びそれらの補因子、アミノ酸（任意に一つ以上の検出可能なアミノ酸を含む）、一つ以上のエネルギー源（例えばＡＴＰ、ＧＴＰ）、任意に、一つ以上のエネルギー再生構成要素（例えばＰＥＰ／ピルビン酸キナーゼ、ＡＰ／酢酸キナーゼ又はクレアチンリン酸／クレアチンキナーゼ）、任意に、収量及び／又は効率を顕著に向上させる因子（例えばヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定化物質）及びそれらの補因子、並びに、任意に、可溶化剤。
【００５７】
ＩＶＰＳ反応の構成要素を以下に詳細に記載する。
【００５８】
鋳型核酸及びＲＮＡポリメラーゼ
鋳型核酸は、他の鋳型核酸又はタンパク質の直接合成に関与する核酸分子である。鋳型は、多数のヌクレオチドサブユニットから構成される分子で、ヌクレオチドサブユニットの長さやタイプにおいて変化しうる。ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、タンパク質及び核酸合成の鋳型として使用可能な核酸種である。ＤＮＡ鋳型の転写により、前記鋳型の全部又は一部と相補的なＲＮＡ鋳型が形成される。ＲＮＡ鋳型の翻訳により、その鋳型の全部又は一部がコードするタンパク質又はペプチドが産生される。すなわち、合成反応における鋳型とは、所望のタンパク質を直接又は間接的にコードする核酸の一つ以上の種である。
【００５９】
鋳型がＤＮＡ鋳型である場合、タンパク質が合成される前にＲＮＡ分子がＲＮＡポリメラーゼによって転写されなければならない。本発明の方法への使用に適するＲＮＡポリメラーゼには、タンパク質合成用に選択された鋳型を含む選択された系において活性を有する、あらゆるポリメラーゼが含まれる。ＩＶＰＳ細胞抽出物には、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ及び／又はファージ由来ＲＮＡポリメラーゼなど、適切なポリメラーゼを含めてよい。これら又は他のポリメラーゼは公知で、一つ以上の公的又は私的なデータベースの検索により当業者によって直ちに検索されうる。適切なポリメラーゼを系に補充してもよい。所望の遺伝子が制御可能に連結されているプロモーターを認識する、ＲＮＡポリメラーゼが使用される。本発明に有用なＲＮＡポリメラーゼ及び転写制御因子は公知で、当業者によって直ちに認識される。
【００６０】
ＲＮＡポリメラーゼの調節は、ＤＮＡ鋳型を使用してＲＮＡを産生するＩＶＰＳ系において有用でありえる。ＲＮＡ合成が急速なとき、ＲＮＡはリボソームによる保護が不十分と考えられる。変異型の又は調節型のＲＮＡポリメラーゼの使用により、リボソームによる生成ＲＮＡとの適当な時間における結合及び保護が行われるため、ＲＮＡを有利に節約できる。
【００６１】
あるいは、鋳型核酸は、限定されないが、リプレッサー、アクチベーター、転写及び翻訳エンハンサー、ＤＮＡ結合タンパク質などを含む任意の転写調節要因が結合する追加的な制御配列を含んでもよい。
【００６２】
移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）
一般的に、ＩＶＰＳ抽出物に含まれるｔＲＮＡ分子は、抽出物の調製に用いる給源細胞に由来する。しかしながら、本発明は、内因性のｔＲＮＡを欠失したＩＶＰＳ抽出物を提供する。上記のｔＲＮＡ欠失のＩＶＰＳ反応はｔＲＮＡ分子の添加によって制御され、それは合成物でも他の生物由来でもよい。更に、変異ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を特殊な目的に使用するタンパク質に取り込むために使用されうる。
【００６３】
荷電ｔＲＮＡ分子もまた、本発明で使用可能なｔＲＮＡ分子の範囲に含まれる。荷電ｔＲＮＡ（別名アミノアシル−ｔＲＮＡ）は、特定のｔＲＮＡと、ｔＲＮＡの３’側ＯＨ基に共有結合する特定のアミノ酸とを含んでなる。
【００６４】
アミノ酸
一般に、ＩＶＰＳ抽出物に含まれるアミノ酸の少なくとも幾つかは、抽出物の調製に用いる給源細胞に由来する。しかしながら、本発明は、内因性のアミノ酸を実質的に欠失したＩＶＰＳ抽出物を提供する。ＩＶＰＳ反応は更にアミノ酸の添加によっても制御可能であり、それは合成物でも他の生物由来のものでもよい。
【００６５】
ＩＶＰＳ系に含まれるものとは異なる生物由来のアミノ酸の非限定的な例として、藻類のアミノ酸混合物が使用できる。これらは、特定のアミノ酸、特にＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及びＴｒｐを欠き、それはＮＭＲ解析にて様々に使用可能な特徴を有する。非標識の藻類アミノ酸抽出物を、補充されるアミノ酸Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及び／又はＴｒｐと組み合わせて使用でき、それらは標識（非限定的な実施例として、２Ｈ、１３Ｃ及び／又は１５Ｎ）してもしなくてもよい。ゆえに、標識された形態の特殊なアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及び／又はＴｒｐ）は、タンパク質の特定のアミノ酸残基のみの標識に使用できる。藻類のアミノ酸混合物は、標識及び非標識の形で市販（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）されている。
【００６６】
様々な非天然アミノ酸には、限定されないが、検出可能な標識アミノ酸が含まれ、それはＩＶＰＳ反応に添加され、特殊な目的に使用するタンパク質に効率的に取り込まれうる。例えば、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１４：４００−４０３（１９８９）；Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１−３３６（１９９１）；及びＬｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１００９２−１００９７（１９９７）を参照されたい。
【００６７】
エネルギー源及びエネルギー再生用の構成要素
タンパク質及び核酸の合成は、一般にエネルギー源を必要とする。この種の合成をサポートするのに充分なエネルギー源を提供することが、本発明の特徴である。エネルギーは、転写を開始しｍＲＮＡを産生する（例えばＤＮＡ鋳型を使用し翻訳を誘導するとき、例えばＧＴＰ形態の高エネルギー−リン酸が使用される）のに必要とされる。リボソームによる一つ一つのコドンにおける各反応（三つのヌクレオチドが一つのアミノ酸に対応）の際、更にＧＴＰのＧＤＰへの加水分解が必要となる。ＡＴＰも一般的に必要とされる。タンパク合成においてアミノ酸が重合するためには、最初に活性化される必要がある。活性化には、二つの高エネルギーリン酸結合の加水分解が必要となる。すなわち、アミノ酸モノマーは、Ｍｇ２＋、ｔＲＮＡ及びＡＴＰの存在により反応し、アミノアシル−ｔＲＮＡ、ＡＭＰ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を形成する。すなわち、高エネルギーリン酸結合からの顕著な量のエネルギーが、タンパク質及び／又は核酸合成の進行に必要となる。
【００６８】
エネルギー源とは、酵素処理を受けることにより、所望の化学反応を進行させるためのエネルギーを提供しうる化学物質である。例えばＡＴＰなど、ヌクレオシドトリホスフェートで見られるような、高エネルギーリン酸結合の裂開によって合成に用いられるエネルギーが放出されるエネルギー源が、一般に使用される。例えば高エネルギーリン酸結合を形成できる他のエネルギー源も、合成反応に推進力を与えうる。インビトロ合成に用いられる典型的なエネルギー源は、グルコース、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、カルバモイルリン酸、アセチルリン酸、クレアチンリン酸、ホスホピルビン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、ピルビン酸、３−ホスホグリセリン酸、フルクトース−６−リン酸及びグルコース−６−リン酸である。高エネルギーリン酸結合に適するあらゆる給源が使用できる。例えば、ピルビン酸キナーゼは、ＰＥＰ及びＡＤＰからピルビン酸及びＡＴＰを形成する反応を媒介する。ＡＴＰは、他のリボヌクレオシド三リン酸と可逆的に置換されうる。すなわち、ＡＴＰ、ＧＴＰ及び他の三リン酸は通常、タンパク合成を維持するための同等のエネルギー源と考えられうる。
【００６９】
エネルギーを合成反応に提供するため、系にエネルギー源（例えばグルコース、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルバモイルリン酸、アセチルリン酸、クレアチンリン酸、リン酸ピルビン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、３−ホスホグリセリン酸及びグルコース−６−リン酸などの、ＡＴＰ、ＧＴＰ及び他のＮＴＰなど、高エネルギー三リン酸化合物を生成又は再生させうるもの）を含めるのが好ましい。所望の合成に適する程の、任意の量のエネルギー源を添加してもよい。例えば、それらの化学エネルギー源は、１０〜１００ｍＭの濃度となるように添加されうる。１５、２０、２５、３０、５０、６０、７０、８０又は９０ｍＭを目標濃度としてもよい。合成によりエネルギーが消費されると実際の濃度は変化し、更にこれらの給源からエネルギーが補充される。特定のエネルギー源分子の濃度は、様々な範囲（例えば約１０〜１００ｍＭ、１５〜９０ｍＭ、２０〜８０ｍＭ、３０〜６０ｍＭなど）で調整される。任意の目標濃度を、所望のエネルギー源濃度範囲の凡その境界として採用してもよい。二つ以上のエネルギー源分子が用いられるとき、各給源は同一又は異なる濃度であってもよい。
【００７０】
充分なエネルギーが開始時の合成系に存在しないとき、追加的なエネルギー源を補充するのが好ましい。補充は連続的に行ってもよく、又は一つ以上に分割して行ってもよい。本発明の一つの特徴として、少なくとも二つ（又は３以上、４以上、５以上、６以上等）のエネルギー源を追加し、本発明の合成反応にエネルギーを提供することが含まれる。補充されたエネルギー源のうち少なくとも一つを、目的タンパク質のインビトロ合成反応の開始前に、抽出物に添加してもよい。例えば、エネルギーを提供する一つ以上の酵素、解糖系の中間代謝物又は他のエネルギー源分子を、ＩＶＰＳ反応の開始前の時点で抽出物に添加してもよい。更に、少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つのエネルギー源を、目的タンパク質のインビトロ合成反応の初期に添加してもよい。特に、解糖中間体が補充されるエネルギー源として本発明で用いられ、限定されないが、グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）フルクトース−６−リン酸（Ｆ−６−Ｐ）及び３−ホスホグリセリン酸が含まれる。ＰＥＰ、ＡＰ、並びに補因子のＮＡＤ又はＮＡＤＨを添加してもよい。
【００７１】
エネルギー源を、インビトロ合成反応中に添加又は補充してもよい。複数のエネルギー源が系に含まれるとき、合成（特にタンパク合成）反応の加速や時間の延長がみられ、その結果、合成系におけるタンパク質及び／又は核酸産物が効率的に産生される。例えば、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びアセチルリン酸を初めのエネルギー源として使用した場合は、アセチルリン酸のみを添加した場合と比較し、タンパク質の合成量を２倍以上に増加できる。すなわち、本発明は、インビトロ合成系であって、合成反応に高エネルギーリン酸結合を提供する、少なくとも二つ、好ましくは少なくとも三つの異なるエネルギー源を含み、そのエネルギー源が酵素の基質分子となりうる系を含む。
【００７２】
エネルギー源及び補因子（グルコース−６−リン酸及びＮＡＤＨ）の特殊な組み合わせを、無細胞発現の反応における一次エネルギーの補給としての使用する技術が開示されている。米国特許第６，３３７，１９１号（Ｓｗａｒｔｚら、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｓ  ａｎ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｏｕｒｃｅ」）、及び米国特許第６，１６８，９３１号（Ｓｗａｒｔｚｒら、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＡＴＰ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」）（両文献とも酵素及び基質を含むエネルギー源及びエネルギー再生系に関するものであり、全ての開示が本明細書において参照により組み入れられる）を参照されたい。
【００７３】
ＰＣＴ特許出願国際公開公報第００／５５３５３号では、翻訳に必要なＡＴＰを補充する二つの方法が開示されている。これらの方法によれば、ＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）又はピルビン酸がＡＴＰエネルギー源の再生に使用される。開示された第一の方法は公知であり、それはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）をピルビン酸キナーゼとの共役により使用し、ＡＤＰからＡＴＰを再生させるものである。国際公開公報第００／５５３５３号における第二の方法では、ピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼとの共役により使用し、ＡＴＰを再生させている。エネルギー源及びアミノ酸は共に、タンパク合成と無関係に、これらの系において減少する（国際公開公報第００／５５３５３号；Ｋｉｍ及びＣｈｏｉ、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８４：２７，２０００）。
【００７４】
ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ阻害剤
鋳型を保持し、合成過程の寿命を最大化するのが望ましい。本発明の合成系には、鋳型を保持する構成要素を添加してもよい。鋳型の酵素的な、化学的な、又はその他の分解を防止することにより、鋳型を保持できる。ゆえに、本発明の合成系では、物質合成を改善するために抽出物に工夫を加えてもよい。抽出物がタンパク質及び／又は核酸を産生する活性を有する酵素を含むときは、これらの酵素の抑制により、系におけるより効果的な合成が実現される。すなわち、少なくとも一つの酵素阻害剤を含むインビトロ合成系は、本発明の実施態様である。ヌクレアーゼ及びホスファターゼ阻害剤の使用は、タンパク質及び／又は核酸合成効率の向上にとって有利である。また、合成反応に使用する化合物を無駄に消費する酵素を阻害することで、合成効率を改善してもよい。抽出物に存在する特異的な酵素、例えば多くの公知のヌクレアーゼ、ポリメラーゼ又はホスファターゼに対する一つ以上の阻害剤を選択でき、それを使用することで、合成効率が有利に改善されうる。
【００７５】
鋳型を保持するために、抽出物の調製に用いる細胞を選抜し、有害な酵素活性の減少、顕著な減少若しくは除去、又は酵素活性の修飾を行ってもよい。すなわち、（例えば、一つ以上の遺伝子を修飾又は変異させて）異なる活性を有するようになった細胞抽出物を含むインビトロ合成系が、本発明の実施態様である。修飾されたヌクレアーゼ又はホスファターゼ活性（例えば少なくとも一つの変異ホスファターゼ若しくはヌクレアーゼ遺伝子、又はそれらの組み合わせ）を有する細胞を細胞抽出物の合成に使用することにより、特に合成効率を有利に向上させる。例えば、ＩＶＰＳ用のＳ３０抽出物を調製するために用いる大腸菌株は、（例えば突然変異により）ＲＮａｓｅＥ又はＲＮａｓｅＡ欠損株であってよい。
【００７６】
除去、阻害、変異、修正又は調整されうるヌクレアーゼの例としては、限定されないが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（εサブユニット）、エキソヌクレアーゼＩＶＡ及び、ＩＶＢ、ＲｅｃＢＣＤ（エキソヌクレアーゼＶ）、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＲｅｃＪ、ｄＲｐａｓｅ、エンドヌクレアーゼＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ｆｐｇ、ｕｖｒＡＢＣ、ｍｕｔＨ、ｖｓｒエンドヌクレアーゼ、ｒｕｖＣ、ｅｃｏＫ、ｅｃｏＢ、ｍｃｒＢＣ、ｍｃｒＡ、ｍｒｒ、及びＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼ（例えばＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩ、ＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩＩ、ＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩＩＩ及びＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩＶ）、が含まれる。この種の除去、抑制その他により、本発明の合成反応で使用する鋳型核酸の保持又は保護が可能となる。例えば、細胞内ＤＮＡヌクレアーゼの変異、修飾、阻害などにより、ＤＮＡ鋳型が保持又は保護される。大腸菌及び他の細胞由来のこのようなＤＮａｓｅは公知である。
【００７７】
ＲＮＡヌクレアーゼの調節は、ＲＮＡ合成にＤＮＡ鋳型を使用するＩＶＰＳ系において有用でありうる。ＲＮＡ合成が急速なとき、リボソームによるＲＮＡの保護が不十分になりうる。ＲＮＡヌクレアーゼに変異、修飾、阻害等を行うことにより、ＲＮＡ鋳型を保護又は保持できる。例えば、大腸菌リボヌクレアーゼ（例えばエンドリボヌクレアーゼＩ、Ｍ、Ｒ、ＩＩＩ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、ＨＩＩ、ＩＶ、Ｆ、Ｎ、Ｐ２、０、ＰＣ及びＰＩＶ、並びにポリヌクレオチドホスホリラーゼ、オリゴリボヌクレアーゼ及びエキソリボヌクレアーゼＩＩ、Ｄ、ＢＮ、Ｔ、ＰＨ及びＲのようなエキソヌクレアーゼ）を変異、修正、阻害することにより、タンパク合成に用いるｍＲＮＡを保護できる。抽出物に使用する細胞によっては、その細胞に内在する他のリボヌクレアーゼに変異、除去、修正又は阻害等を行い、タンパク合成に用いる鋳型を保持又は保護することができる。例えば、ＩＶＰＳ用の抽出物の調製に用いる大腸菌株が、ＲＮアーゼＥ活性の減少又は欠失した突然変異株であってもよい。米国特許出願公開第２００２／０１６８７０６号は、ＩＶＰＳ系にヌクレアーゼ活性を減少させた細胞抽出物の使用に関するものであり、全ての開示内容が本明細書に参照により組み入れられる。多くのヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ阻害剤は市販されている。例えば、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、哺乳動物系のＲＮａｓｅ阻害剤として知られているが、原核生物のＲＮａｓｅｓ阻害には効果的でない。
【００７８】
更に、阻害剤（例えば鋳型核酸、特に直鎖ＤＮＡ鋳型のような直鎖鋳型と反応するヌクレアーゼの阻害剤（例えばＲｅｃＢＣＤを阻害するバクテリオファージλのＧａｍタンパク質）、又は合成反応系外の不必要又は有害な構成要素／タンパク質／酵素の阻害剤）を用い、インビトロで所望の産物の産生を促進させることができる。阻害剤は、公知のあらゆる方法により、本発明の系に使用又は含めることができる。例えば、阻害剤は、鋳型核酸の導入の前、間、又は後に系に添加してもよい。阻害剤は、抽出物の調製に用いる細胞において転写又は発現されてもよく、又はタンパク合成反応の間に転写又は発現されてもよい。阻害剤は生合成された化合物でもよいが、本発明の阻害剤は生物学的に産生される化合物に限られない。米国特許出願公開第２００２／０１６８７０６号は、ＩＶＰＳ系のヌクレアーゼ阻害剤を含む細胞抽出物の使用に関するもので、その全ての開示内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７９】
可溶化剤
ＩＶＰＳの構成成分及び／又はポリペプチド産物の可溶化を助長する物質を、ＩＶＰＳ系に添加してもよい。幾つかの本発明の態様において、一つ以上の脂質、表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）又は界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を、ＩＶＰＳ抽出物、ＩＶＰＳ反応系又は供給溶液又はその他に添加する。一つ以上の脂質、一つ以上の表面活性剤又は一つ以上の界面活性剤又はそれらの任意の組み合わせをＩＶＰＳ反応に添加し、系におけるタンパク質の収量、可溶性タンパク質の収量又は活性型タンパク質の産生を改善することができる。いかなる特定の機構に限定されるものではないが、脂質、表面活性剤及び／又は界面活性剤は、タンパク質又はＩＶＰＳ抽出物の構成要素の溶解性を改善しうる。好適な脂質にはリン脂質が含まれ、本明細書において以下に開示されている。表面活性剤には、界面活性剤でない表面活性剤であるスルホベタインを含むあらゆる表面活性剤が含まれるが、それに限定されない。好適な表面活性剤は、非イオン系及び両性イオン系の表面活性剤であり、本明細書において以下に更に記載されている。
【００８０】
幾つかの本発明の態様において、ナノスケールのリン脂質二重層のディスクをＩＶＰＳ反応混合物に添加してもよい。アポリポタンパク質Ａ１（Ａｐｏ  Ａ１）のような骨格タンパク質又はその誘導体によって取り囲まれたリン脂質二重層構造中を含むこの種のリン脂質−タンパク質粒子又は「ナノディスク」は、Ｂａｙｂｕｒｔら（Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２３：３７−４４（１９９８））、及びＢａｙｂｕｒｔ及びＳｌｉｇａｒ（ＰＮＡＳ９９：６７２５−６７３０（２００２）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２：２４７６−２４８１（２００４））の文献に記載され、また米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３にも開示されており、そのナノサイズのリン脂質二重層ディスク及び骨格タンパク質に関する全ての開示内容が参照により本発明に組み入れられる。特に膜タンパク質がＩＶＰＳ反応において合成されるときには、ナノサイズのリン脂質二重層ディスク包含体により可溶性タンパク質の収量を改善できる。ナノサイズのリン脂質二重層ディスクを、例えば０．１〜１００ｍｍ、好ましくは０．２〜５０ｍ、最も好ましくは０．５ｍｍ〜４０ｍｍの濃度で、本明細書に記載のＩＶＰＳ反応に含めてよい。例えば、ナノディスクを約１ｍｍ〜約２０ｍｍにてＩＶＰＳ反応に存在させてもよい。
【００８１】
ナノスケールのリン脂質二重層ディスクがＩＶＰＳ反応に含まれると、インビトロで翻訳された膜タンパク質の溶解性は非常に高くなる。ナノスケールのリン脂質二重層ディスクがＩＶＰＳ反応に含まれると、インビトロ翻訳された膜タンパク質は、ナノスケールのリン脂質二重層ディスクに挿入され、ナノディスク中の骨格タンパク質に存在する親和性タグにより、ナノディスク内に取り込まれ、可溶性の形態にて単離されうる。
【００８２】
ＩＶＰＳ抽出物の調製
一般に、ＩＶＰＳ反応の幾つかの構成要素（例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、翻訳因子及び補因子）は、給源生物から調製されたＩＶＰＳ抽出物の形で調製される。限定されないが、原核細胞、真核細胞、細胞器官及びウイルスを含む任意のタイプの給源生物が、ＩＶＰＳ系のための給源生物として使用可能である（例えばＰｅｌｈａｍら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７：２４７，１９７６を参照）。原核生物の系では、同時又は「共役」による転写及び翻訳が可能である点で有利である。
【００８３】
真核生物由来のＩＶＰＳ系には、限定されないが、ウサギ網状赤血球溶解物、小麦麦芽溶解物、ショウジョウバエ胚エキス、ホタテ貝溶解物（Ｓｔｏｒｃｈら、Ｊ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｂ、１７３：６１１−６２０（２００３））、マウス脳抽出物（Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２８：５８９−５９６，１９７７、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２３：８１１−８１８，１９７４）及びトリ脳（Ｌｉｕら、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｓｔａｔｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ６８，１９７５）が含まれる。
【００８４】
抽出物は、転写／翻訳系の均一性を維持しうるいかなる公知の方法によっても調製でき、また、その方法工程において転写／翻訳の段階で必要な一つ以上の構成要素が損害を受けた場合でも、その損害を受けた構成要素はその後の調製抽出物と交換できる。細菌抽出物は、Ｚｕｂａｙ（１９７３）の方法及びその変法に従って調製することができる。一般的な熟練した当業者であれば、抽出工程に関する多くの変更が、本発明の範囲内で可能であると認識するであろう。抽出物は好ましくは、通常では系に存在しない、合成に用いられる全ての必要な構成要素を含む。エネルギー及び他の構成要素を合成反応に提供する、抽出物中の酵素及び他の構成要素は、抽出された細胞の由来であっても、また抽出物の調製において添加してもよい。抽出物の補充により、存在しない、不充分に存在する、又は最適量で存在する構成要素の濃度を、追加又は増加させてもよい。抽出物は、多くの公知技術のいずれか一つ以上を使用して濃縮してもよい。
【００８５】
ＩＶＰＳ抽出物を調製する一般的方法において、抽出物は、細胞残渣を除去する工程に供される。遠心分離が、この種の固形成分を除去する一般的な方法である。濾過、クロマトグラフィー又は他の任意の分離又は精製工程を、所望の抽出物の調製に用いてよい。場合により、例えば一つ以上の望ましくない構成要素を捕捉又は除去できる親和性物質を用いて、その抽出物中の望ましくない構成要素を除去することができる。
【００８６】
本発明の幾つかの態様において、ＩＶＰＳ抽出物は、変異型の生物又は細胞から調製される。特に、ＩＶＰＳ抽出物は、ＳｌｙＤタンパク質を欠失又はそのレベルが減少した細胞から調製されうる。これは、ヒスチジン残基６つが連続する配列（「Ｈｉｓタグ」）、及び／又は、検出可能な標識（「ＦｌＡｓＨ」又は「ＬＵＭＩＯ」タグ）を付与された、ヒ素分子と結合するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を調製するためにＩＶＰＳ抽出物を使用する場合に特に望ましい。ＳｌｙＤは、これらのアミノ酸配列のいずれとも相互作用するため、野生型の細菌又はＩＶＰＳ抽出物の場合に生じた融合タンパク質をしばしばコンタミネーションさせる物質でもある。米国特許出願公開第２００５／０１３６４４９号は、ＳｌｙＤタンパク質のレベルが減少した細胞抽出物の翻訳系への使用に関するものであり、その全ての開示内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  ＩＶＰＳシステム
幾つかの実施態様において、本発明は、一つ以上のＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＩＶＰＳシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はそのアッセイ使用に関する。Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）システムは、限定されるものではないが以下のものを含む。
【００８８】
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓ発現システムは、共役する転写及び翻訳反応を利用して活性型の組換えタンパク質を産生するものである。Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓシステムには、無細胞タンパク質産生に必要な全ての構成要素が含まれる。そのキットには、転写及び翻訳を推進するのに必要な細胞内機構を含む大腸菌抽出物が含まれる。キットにはＩＶＰＳ  Ｐｌｕｓ反応バッファーも含まれ、そこには必要なアミノ酸（メチオニンを除く）及びエネルギー再生系用のＡＴＰが含まれる。反応バッファー、メチオニン、Ｔ７酵素ミックス、並びにＴ７プロモーターに制御可能に連結された目的物質のＤＮＡ鋳型が、大腸菌抽出物と混合されている。ＤＮＡ鋳型が転写される際、鋳型の３’末端がまだ転写されているときでもｍＲＮＡの５’末端にリボソームが結合し、翻訳が行われる。
【００８９】
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｌｉｎｅａｒ発現システムは、直鎖ＤＮＡ鋳型からの迅速かつ高収量なインビトロ発現に使用される。その系では大腸菌抽出物が用いられ、直鎖鋳型から完全長の活性型タンパク質を発現させるために最適化されている。その結果、直鎖鋳型は転写及び翻訳の間安定に保持され、適切にフォールディングされた産物が高収量で得られる。Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｌｉｎｅａｒ発現システムでは、少なくとも二つのオプションが、Ｔ７プロモーターで誘導される鋳型の生成に利用できる。Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｌｉｎｅａｒ発現キットは、発現の際に使用される適切な要素（Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位、Ｔ７ターミネーター配列）を含むプラスミドから生じるＰＣＲ鋳型の発現に使用可能である。ＴＯＰＯ（登録商標）ツールを有するＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｌｉｎｅａｒ発現キットには、ＰＣＲ産物に制御可能に連結できる５’及び３’エレメントが含まれる。５’エレメントには、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位及び開始コドンが含まれる。３’エレメントには、Ｖ５エピトープタグ、それに続く６×Ｈｉｓ領域及びＴ７ターミネーターが含まれる。ＴＯＰＯ（登録商標）ツールの上記エレメントは、ＴＯＰＯ（登録商標）のライゲーション反応でＰＣＲ産物に連結され、更にＰＣＲにより増幅される。
【００９０】
Ｌｕｍｉｏ（商標）テクノロジーキットを有するＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓ発現システムには、ＩＶＰＳ  Ｌｕｍｉｏ（商標）大腸菌抽出物、ＩＶＰＳ  Ｐｌｕｓ大腸菌反応バッファー、ＲＮａｓｅＡ、Ｔ７酵素ミックス、メチオニン、反応チューブ、ｐＥＸＰ３−ＤＥＳＴベクター、対照プラスミド、並びにＬｕｍｉｏ（商標）グリーン検出キット又はその構成要素が含まれる。Ｋｅｐｐｅｔｉｐｏｌａら、「Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ＬｕｍｉｏＴＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｆｏｃｕｓ２５．３：７，２００３を参照されたい。
【００９１】
これらの、また他のＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）システムは、これらの製品に関する以下に示す取扱説明書において詳述され、その全ての内容が、ＩＶＰＳ系及び方法に関する本発明の開示において参照により本明細書に組み入れられる。
ＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｃ、２００３年４月１１日（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ＿ｍａｎ．ｐｄｆ参照）。
ＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、２００３年９月２６日（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙｌｉｎｅａｒ＿ｍａｎ．ｐｄｆ参照）。
ＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ＴＯＰＯ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｄｅｍａｒｋ）  Ｔｏｏｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、２００３年９月２６日（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙｌｉｎｅａｒｗｉｔｈＴＯＰＯ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｄｅｍａｒｋ）ｔｏｏｌｓ＿ｍａｎ．ｐｄｆ参照）。
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｐｌｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、２００３年９月２６日（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙｐｌｕｓ＿ｍａｎ．ｐｄｆ参照）。
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｐｌｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  Ｌｕｍｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂ、２００４年２月２７日（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙｐｌｕｓ＿ｌｕｍｉｏ＿ｍａｎ．ｐｄｆ参照）。
【００９２】
供給溶液
幾つかの態様において、本発明は、供給溶液、並びに供給溶液の調製及び使用方法に関する。供給溶液とは、反応開始後、インビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）反応に添加される溶液である。すなわち、供給溶液が存在しない場合でも反応が進行するという点では、供給溶液はＩＶＰＳに必須の構成要素ではない。供給溶液は、ＩＶＰＳ反応の進行中に添加され、系において産生されるタンパク質の収量、可溶性タンパク質の収量又は活性タンパク質の収量の一つ以上を向上させる。
【００９３】
技術背景としては、ＩＶＰＳ系には、一般に四つのタイプのＩＶＰＳ反応が含まれる。
【００９４】
１．バッチＩＶＰＳ反応：
バッチ反応においては、合成の初速度が速く、やがて減速し、約３時間後に最終的に停止する。アミノ酸が取り込まれ又は代謝されると、反応混合物の組成が変化し、またエネルギー源が代謝されると反応抑制性の遊離リン酸が生じる。例えばＫａｗａｒｓａｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：３２０，１９９５、Ｐａｔｎａｉｋら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：８６２，１９９８及びＫｉｇａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０：１６６，１９９１を参照されたい。
【００９５】
２．供給／希釈ＩＶＰＳ反応：
ＩＶＰＳ反応は、一定時間経過後に「供給溶液」（別名「供給バッファー」）として新鮮な構成要素を供給することで延長でき、それにより反応抑制性の副産物が希釈されるという望ましい効果も奏される。しかしながら一方では、転写及び／又は翻訳因子の過度な希釈により、ＩＶＰＳ系の活性減少又は損失となりうる。
【００９６】
３．二重層積層ＩＶＰＳ反応：
より高密度の反応混合物が供給溶液によって積層され、構成要素は受動拡散で交換される。反応速度は、反応器の「非振とう」のために遅い。例えばＳａｗａｓａｋｉら、２  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５１４：１０２，２００２を参照。
【００９７】
４．連続交換ＩＶＰＳ反応：
反応チャンバーが一つ以上の透析膜によって供給溶液と隔離されており、基質及び副産物の連続的な交換が可能である。例えばＥｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：２２１，１９９２；及びＳｐｉｒｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４：１１６２，１９８８を参照。
【００９８】
本発明の供給溶液及び他の組成物は完全又は部分的に、上記四つのＩＶＰＳ反応のいずれをも含む、あらゆるタイプのＩＶＰＳ系に適用できる。好ましくは、供給溶液は、１）バッファー、２）アミノ酸、及び３）少なくとも一つのエネルギー源又はエネルギー発生酵素を含む。
【００９９】
本発明の代表的な供給溶液は、以下のうち幾つか（ただし全てである必要はない）を含む。
（ａ）バッファー（１０〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭ）、
（ｂ）１０〜５００ｍＭ（好ましくは６０〜１２０ｍＭ）の酢酸アンモニウムを含む、一つ以上の塩、
（ｃ）一つ以上の還元剤、
（ｄ）少なくとも四つのアミノ酸、及び
（ｅ）一つ以上のエネルギー源及び／又は補因子。
【０１００】
これらの構成要素の各々につき、以下に詳細に記載する。
【０１０１】
（ａ）バッファー：バッファーは、反応系のｐＨを維持するために供給溶液に含まれる。一般に、初めの反応混合物及び供給溶液で同じバッファーが使用されるが、ただし同じである必要はない。供給溶液のバッファーのｐＨは、初めの反応混合物のそれから変化してもよい。バッファーの非限定的な例として、トリス、Ｂｉｓ−トリス及びＨＥＰＥＳが含まれる。
【０１０２】
本発明の幾つかの実施態様において、１０〜１００ｍＭの最終濃度のＨＥＰＥＳバッファーが、反応系のｐＨを維持するために供給溶液に含まれる。供給溶液バッファーのｐＨは約７〜約９でよいが、好ましくは約７．５〜約８．５である。例示的な実施態様において、バッファーのｐＨは約８．０である。
【０１０３】
（ｂ）還元剤は、限定されないが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、グルタチオン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びβ−メルカプトエタノールを含んでよい。Ｇｅｔｚら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，７３−８０（１９９９）を参照。
【０１０４】
（ｃ）塩類：塩は、酸（又はそのカチオン）と塩基又は金属との結合によって形成される中性化合物である。塩類は、それらを構成するイオンに従って命名される。カチオン成分、しばしば金属イオン（例えばＣａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋）又はアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）が最初に添加され、それに続いてアニオン性（負に荷電する）構成要素が添加される。カチオンは一価（＋１）、二価（＋２）、三価（＋３）その他であってもよい。また、一価のカチオンには、限定されないが、Ｈ＋及びＫ＋が含まれる。二価のカチオンには、限定されないがＣａ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｈｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｂａ＋＋及びＳｒ＋＋が含まれる。多くのインビボ及びインビトロでの生化学反応において、二価のカチオンは補因子となる。より詳しくは、Ｃａ＋＋、Ｍｎ＋＋及びＭｇ＋＋は、酵素反応にしばしば用いられる補因子であって、ゆえに幾つかの生化学の系において好まれる。
【０１０５】
アニオンは一価（−１）、二価（−２）、三価（−３）その他であってよい。アニオンは一般に、それらの共役酸（例えば酢酸塩、炭酸塩、塩化物、シアン化物、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩及びクエン酸塩）に従って命名される。
【０１０６】
上記の非限定的なアニオンの例のいずれも、本発明の組成物において使用する塩の一部でありえる。アミノ酸塩（例えばグルタミン酸カリウム）も同様に使用できる。
【０１０７】
好適な塩類として、限定されるものではないが、例えば、５〜５０ｍＭ、好ましくは１０〜１５ｍＭのマグネシウム塩、１８０〜２５０ｍＭ、好ましくは２３０ｍＭのグルタミン酸カリウム、１〜７５０ｍＭ、好ましくは５、１０、２０、３０、５０又は１００ｍＭのＣａＣｌ２、及び１０〜５００ｍＭ、好ましくは６０〜１２０ｍＭ、より好ましくは７０〜９０ｍＭの酢酸アンモニウム、が含まれる。本発明の幾つかの態様において、酢酸カリウムはグルタミン酸カリウムの代替となりうる。
【０１０８】
供給溶液に含まれる塩類は、初めの反応バッファーに含まれるものと同じでもよく、又は更なる塩類（例えば塩化カルシウム）を添加してもよい。供給溶液を異なる塩濃度にし、それにより供給溶液が添加された後の反応系の全体の濃度を増減させてもよい。供給バッファーへのカルシウムの添加により、例えば、ＩＶＰＳ反応において０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、より好ましくは約１〜２．５ｍＭにカルシウム濃度を増加させることにより、約１０％の収量増加が可能となる。
【０１０９】
（ｄ）アミノ酸は、０．０５〜５．０ｍＭ、好ましくは０．２５〜２．５ｍＭ、より好ましくは０．５〜２ｍＭ、最も好ましくは１．０〜１．５ｍＭで供給溶液に存在する。天然アミノ酸の全２０種又はそれらの幾つかを供給バッファーに添加してもよい。幾つかの好ましい実施例においては、全２０種が含まれる。一つ以上のアミノ酸が、他の種類のものより高い又は低い濃度で含まれていてもよい。例えば、幾つかの場合において、一つ以上のアミノ酸が特に他のものより高い濃度で存在するときに、タンパク合成がより効率的になりうる。他の場合において、特に、タンパク質は修飾アミノ酸により標識されうる。この場合、その対応する天然アミノ酸は、供給溶液において低濃度で含めてもよく、又は供給溶液中から省いてもよい。
【０１１０】
本発明の幾つかの実施態様において、ＩＶＰＳ反応は、目的タンパク質に検出可能な標識を付された及び／又は非天然のアミノ酸を能率的かつ特異的に付与するのに使用され、そこでは一つ以上のアミノ酸が標識又は修飾された形態で提供され、又は非天然又は修飾されたアミノ酸が「標準」アミノ酸と置換される。検出可能な標識を付されたアミノ酸は、蛍光物質（例えばフルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ））とのコンジュゲート、ビオチン又はストレプトアビジンとのコンジュゲート、又は、限定されないが、重元素若しくは放射性同位元素で標識されたアミノ酸（１５Ｎ標識アミノ酸、３５Ｓ標識アミノ酸、１４Ｃ標識アミノ酸、及び２Ｈ標識アミノ酸を含む）により生じうる。
【０１１１】
（ｅ）エネルギー源には、限定しないが、解糖系の中間代謝物又は他のリン酸輸送分子（例えばアセチルリン酸、クレアチンリン酸又はホスホアルギニン）が含まれる。エネルギー源は、基質分子（例えば解糖系の中間代謝物）又は酵素（例えばヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、アルギニンキナーゼ又はピルビン酸オキシダーゼ（米国特許第６，１６８，９３１号及び第６，３３７，１９１号（双方ともエネルギー源及びエネルギー発生酵素及び系に関し、本明細書において全ての開示内容が参照によって組み入れられる）を参照））であってもよい。
【０１１２】
本発明において、解糖系の中間代謝物は、供給溶液に含ませる好適なエネルギー源である（例えば、米国特許第６，３３７，１９１号（ＩＶＰＳ系のエネルギー源として解糖系の中間代謝物を使用、全ての開示内容が参照によって本明細書に組み入れられる）を参照）。限定されないが、３−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、フルクトース−６−リン酸又はグルコース−６−リン酸のような解糖系の中間代謝物、又はその他の解糖系の中間代謝物を、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭで添加してもよい。
【０１１３】
本発明において、供給溶液に含ませる好適なエネルギー源は、初めの反応バッファーに含まれないエネルギー源分子である。例えば、初めの反応ＩＶＰＳバッファーには、好ましくはアセチルリン酸及びホスホエノールピルビン酸が含まれる。発明者らは、ｔ＝０にて添加されるものと異なるエネルギー源分子を添加することにより、同じエネルギー源分子（例えばアセチルリン酸及びホスホエノールピルビン酸）を更に添加するよりもより良好な翻訳収量が得られることを見出した。好ましくは、供給溶液に添加される追加的なエネルギー源分子は、ベースとなる反応バッファーに添加されていない解糖系の中間代謝物である。好適な解糖系の中間代謝物には、限定されないが、ヒスホエノールピルビン酸、アセチルリン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸及び３−ホスホグリセリン酸の個々、又はそれらの組み合わせが含まれる。ＩＶＰＳ反応の解糖中間体の最適全体の濃度は、好ましくは２０ｍＭ〜６０ｍＭであり、８０ｍＭを上回らない。
【０１１４】
好ましくは、初め又は「ベース」のＩＶＰＳ反応バッファーは少なくとも二つのエネルギー源を含み、供給溶液はベースの反応バッファーのエネルギー源とは異なる少なくとも一つのエネルギー源を含む。それにより、反応系には供給溶液の添加後、少なくとも三つの異なるエネルギー源が添加されていることになる。好ましくは、供給溶液に含まれるエネルギー源は解糖系の中間代謝物であり、ＩＶＰＳ系に添加されると、タンパク質の収量の向上、可溶タンパク質の収量の向上、又は活性を有するタンパク質の収量の向上、のうちの少なくとも一つが得られる。他の好ましい実施態様において、供給溶液に添加される一つ以上のいずれかのエネルギー源は酵素ではない。これにより、供給バッファーにおける酵素の安定性の問題が回避され、単一の供給試薬を反応系に添加することが可能となり、更には酵素の浪費が回避される。
【０１１５】
幾つかの好ましい実施例においては、ベースの反応ＩＶＰＳバッファー又は供給バッファーに添加されるエネルギー源は、酵素ではない。供給バッファーへの酵素の不使用による利点はまた、初めの反応系にも当てはまる。しかしながら、好ましい実施態様では、一つ以上のエネルギー源生成酵素を、ＩＶＰＳ試薬の添加前（例えばＩＶＴ反応の前に実行されうる抽出物のプレインキュベーションの前又は間に、好ましくは抽出物の分注及び貯蔵前）に、Ｓ３０抽出物に添加してもよい。例えば、ピルビン酸キナーゼを抽出物のプレインキュベーション前にＳ３０抽出物に添加し、内因性の情報伝達に必要なエネルギー源として提供してもよい。すなわち、本発明の方法で使用するインビトロ系翻訳には、少なくとも四つの異なる追加的なエネルギー源を添加してもよい。例えば、インビトロ翻訳系は最低四つの異なる追加的なエネルギー源を含みうるが、その少なくとも一つは解糖系の中間代謝物である。更に、他の好ましい実施形態では、インビトロ翻訳系には、少なくとも四つの異なる追加的なエネルギー源を含めてよく、その少なくとも一つが酵素であり、またその他の少なくとも一つが解糖系の中間代謝物である。好ましい態様において、インビトロでの翻訳系には、少なくとも四つの異なる追加的なエネルギー源を含めてよく、その少なくとも一つが酵素であり、その他の少なくとも一つが、ＩＶＰＳ反応の開始後に添加されてＩＶＰＳ系の性能を強化する解糖系の中間代謝物である。本発明の方法において、少なくとも一つの解糖系の中間代謝物を、反応の開始の少なくとも１０分後にインビトロ翻訳反応の供給溶液に添加することにより、系中で合成されるタンパク質の収量、可溶性タンパクの収量、又は活性を有するタンパクの収量が向上する。非常に好適な実施態様において、インビトロ翻訳系には最低四つの異なる追加的なエネルギー源を含めてよく、その少なくとも一つが酵素であり、その他の少なくとも一つが、ＩＶＰＳ反応の開始後に添加されてＩＶＰＳ系の性能を強化する解糖系の中間代謝物であって、そこにおいて、反応開始後に添加される解糖系の中間代謝物は、系に添加される他のエネルギー源のいずれとも異なる。本発明の方法において、反応開始の少なくとも１０分後にインビトロ翻訳反応に添加される供給溶液に、少なくとも一つの解糖系の中間代謝物を添加することにより、収量、可溶性タンパクの収量又は活性を有するタンパク質の収量の一つ以上が向上する。
【０１１６】
補因子ＮＡＤ又はＮＡＤＨの存在しない供給溶液への解糖系中間代謝物の添加により、合成されるタンパク質の活性の向上が可能となり、更に、例えばＮＡＤ又はＮＡＤＨを、限定されないが、０．１〜２５ｍＭ、好ましくは０．１〜１ｍＭ共存させることにより、合成タンパク質の良好な発現及び活性を高めることができる。これらの効果は、以下の各構成要素の濃度範囲：アミノ酸  １ｍＭ〜５ｍＭ；解糖系の中間代謝物  ５ｍＭ〜１００ｍＭ；及びＮＡＤ／Ｈ  ０．１ｍＭ〜１ｍＭ、において観察されうる。
【０１１７】
一つの態様において、本発明は、多くの望ましい特徴（例えば、タンパク質の収量増加、タンパク質の溶解性増加、短いタンパク合成反応時間でタンパク質収量を同等又は増加量得ること）を有する有効な供給溶液を提供する。
【０１１８】
他の態様においては、本発明はまた、インビトロタンパク質合成を実行する方法であって、タンパク質の産生に充分な量の細胞抽出物、鋳型核酸及び試薬を含む進行中のタンパク合成反応に、供給溶液を添加する方法を含む。
【０１１９】
初めの合成混合物は、供給バッファーが存在しない状態で、タンパク合成が少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも６０分間行われるのに充分な試薬を含む。供給溶液は、進行中のタンパク合成を強化するために添加される。本発明は、いかなるタイプのＩＶＰＳ系又は技術（例えばバッチ反応、供給／希釈、二重層積層、連続交換その他）にも適用できる。供給／希釈ＩＶＰＳ系においては、反応開始（ｔ＝０）後、ＩＶＰＳ反応は随時供給溶液による補充を受ける。
【０１２０】
一つの実施態様において、上記方法には、細胞抽出物に対して、初めの合成混合物を構成する、アミノ酸、少なくとも一つのエネルギー源及び鋳型核酸を添加することと、一定時間、初めの合成混合物をインキュベートすることと、バッファー、アミノ酸及び少なくとも一つの追加的なエネルギー源を含む供給溶液を、初めの合成混合物に添加して拡張型合成混合物を調製することであって、その供給溶液に添加されている一つ以上の追加的なエネルギー源が初めの合成混合物の一つ以上のエネルギー源と異なることと、及び、追加された時間、拡張型合成混合物をインキュベートし、少なくとも一つのタンパク質を合成すること、が含まれる。
【０１２１】
好ましい実施態様において、これらの方法で使用する供給溶液には、バッファー、一つ以上の塩類、少なくとも４、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは２０種類のアミノ酸（その一つ以上が非天然（例えば標識又は修飾）であってもよい）、及び解糖中間体のエネルギー源が含まれる。好ましくは、上記供給溶液には補因子（例えばＮＡＤ又はＮＡＤＨ）も含まれる。
【０１２２】
本明細書において開示される供給溶液を使用する方法は、この種のインビトロ反応において二つの点で有用である。第一に、ＩＶＰＳ反応が新規な構成要素（反応の間に減少又は分解した構成要素及び／又は初めの反応には存在しない新規な構成要素のいずれか）で補充されることである。第二に、いかなる反応抑制性の副産物もバッファーの付加によって希釈されるため、合成反応が延長されることである。但し、転写及び／又は翻訳因子の過度の希釈は、ＩＶＰＳ系の活性の減少又は損失をもたらしうる。本発明の組成物は、濃縮形態にて調製されることで、ＩＶＰＳ系の活性低下又は損失をもたらしうる、転写及び／又は翻訳因子の過剰な希釈を回避できる。
【０１２３】
供給バッファーは、初めの合成混合物に対して、例えば初めの合成混合物容量の１０分の１〜初めの合成混合物容量の１０倍の任意の量で添加することができる。好ましくは、初めの合成混合物容量の４分の１〜初めの合成混合物容量の２倍の量を供給の際に添加する。更により好ましくは、当初のＩＶＰＳの液量の半分量〜等量を、ＩＶＰＳ反応系に添加する。しかしながら、単一のＩＶＰＳ反応系内に三つ以上のエネルギー源を存在させることもまた、それらが反応初めに添加されるか、又は一つ以上のエネルギー源が供給溶液に存在するかに関係なく、本発明の態様に含まれると解される。すなわち、本発明には、三つ以上のエネルギー源を含むＩＶＰＳ系が含まれ、そのうちの少なくとも一つが解糖系の中間代謝物である。幾つかの好ましい実施態様において、ＩＶＰＳ系は三つ以上のエネルギー源を含み、そのうちの少なくとも一つが解糖系の中間代謝物であり、また少なくとも一つが酵素である。本発明にはまた、四つ以上のエネルギー源を含むＩＶＰＳ系が含まれる。幾つかの好ましい実施態様において、ＩＶＰＳ反応には四つ以上のエネルギー源が含まれ、その少なくとも一つが解糖系の中間代謝物である。幾つかの好ましい実施態様において、ＩＶＰＳ系には四つ以上のエネルギー源が含まれ、その少なくとも一つが解糖系の中間代謝物であり、少なくとも一つが酵素である。
【０１２４】
本発明は、供給溶液をＩＶＰＳ反応に添加することによって、目的タンパク質（ＰＯＩ）をｍｇ単位の量で合成できる方法を提供する。好ましくは、上記タンパク質は少なくとも１〜約１ｍｇ／ｍＬから、又はより好ましくは約１００ｍｇ／ｍＬ〜約８００ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＩＶＰＳ反応時間のうち約１時間〜約１０時間、好ましくはＩＶＰＳ反応時間のうち約２時間〜約８時間、更に好ましくは総ＩＶＰＳ反応時間のうち約３時間〜約７時間にて合成される。例えば、０．５〜５ｍＬ（一つ以上の供給後の最終容量）での４〜６時間の反応において、タンパク質をｍｇ単位の量で合成できる。供給溶液を使用する典型的なＩＶＰＳ反応により、１〜２ｍＬの最終反応液量を用いた４〜６時間の反応により、少なくとも０．８ｍｇ、より好ましくは少なくとも１ｍｇのタンパク質が合成される。
【０１２５】
本明細書において「供給溶液」とされる組成物は、供給及び／又は希釈のないＩＶＰＳ系又は工程でも使用できることを理解すべきである。例えば、本発明の供給溶液として本明細書において記載されている組成物は、ｔ＝０の時点でバッチ反応又は連続交換系などにおいて連続的、断続的に添加してもよい。
【０１２６】
本発明の方法には、ＩＶＰＳ反応に一回、二回又はそれ以上の回数、供給溶液を添加することが含まれる。好ましくは、簡便化のために一、二回の供給が行われる。例えば、供給溶液を二つの時点でＩＶＰＳに添加することができ、その各供給では初めの合成混合物の半分量を添加してもよい。あるいは、初めの合成混合物の等量を一度に供給してもよい。なお、これらの例は限定的なものではない。
【０１２７】
ＩＶＰＳ反応の間、供給溶液を任意の時点で添加することができるが、好ましくは反応開始後の初めの１時間以内に、少なくとも一度の供給を行うべきである。以下の実施例にて説明するように、ＩＶＰＳ開始後、第一の供給が１時間以内に行われる場合、その後でその第一の供給が行われる場合よりも、反応後のタンパク質収量において良好な結果が得られる。但し、反応開始時に供給バッファーを添加することは最適ではない。それは必須の構成要素を希釈することになるためと考えられる。すなわち、供給溶液の第一の添加は、ＩＶＰＳ開始後早くとも５分後に、好ましくはＩＶＰＳ開始後早くとも１０分後に行われる。供給溶液は例えば、ＩＶＰＳの開始後１５分後又はそれ以後に添加されるのがよい。１時間後に第一の供給を行っても、それほど効果的でない。すなわち、一つ以上の供給が行われる場合、第一の供給は好ましくはＩＶＰＳ開始後約１５〜約６０分後に行われる。第二の供給を行う場合、第一の供給後の任意の時点で、好ましくは少なくとも３０分、より好ましくは少なくとも６０分後に添加される。
【０１２８】
ＩＶＰＳ抽出物及び反応系への界面活性剤の添加
本発明の幾つかの態様において、一つ以上の脂質、表面活性剤又は界面活性剤が、ＩＶＰＳ細胞抽出物又はＩＶＰＳ反応混合物に添加される。一つ以上の脂質、表面活性剤又は界面活性剤により、幾つかのタンパク質（例えば膜タンパク質）の溶解性又は活性が向上する。ＩＶＰＳ系における、一つ以上の脂質及び一つ以上の表面活性剤、一つ以上の脂質及び一つ以上の界面活性剤、一つ以上の表面活性剤及び一つ以上の界面活性剤、並びに、一つ以上の脂質及び一つ以上の表面活性剤及び一つ以上の界面活性剤、の組み合わせの使用が含まれると解される。
【０１２９】
好適な脂質は、グリセロール又はスフィンゴ脂質をベースとして形成されるリン脂質であってよく、例えば、二つの炭素原子数６〜２０の飽和脂肪酸、及び一般的に用いられるヘッドグループ（例えば、限定されないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリン）を含むことができる。頭部基は、非荷電でも、正荷電でも、負荷電でも、両性イオン性でもよい。リン脂質は、天然物（天然にて得られる）、合成物（天然にて得られない）又は天然物及び合成物の混合物であってもよい。リン脂質の例としては、ＰＣ（ホスファチジルコリン）、ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン）、ＤＨＰＣ（ジヘキサノイルホスファチジルコリン）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジヘキサノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヘキサノイルホスファチジルイノシトール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン、又は１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルイノシトールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない
【０１３０】
非界面活性剤の表面活性剤として、限定するものではないが、非界面活性剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ）などをＩＶＰＳ反応に含めてもよい。ＮＤＳＢは、スルホベタイン親水基及び短い疎水基を有する両性イオン性の化合物である。ミセルを形成して凝集できないため、ＮＤＳＢは界面活性剤とは考えられていない。
【０１３１】
イオン系、非イオン系及び両性イオン系の界面活性剤を含む界面活性剤を、ＩＶＰＳ反応に含めてもよい。非イオン系及び両性イオン系界面活性剤は、本発明の大部分の態様において好適である。幾つかの実施態様において、ＩＶＰＳ反応に添加される界面活性剤は、好ましくは１５〜３００ｍＭ、より好ましくは、２０〜５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する非イオン系又は両性イオン系界面活性剤である。
【０１３２】
アニオン系界面活性剤には、限定されるものではないが、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム塩、グリココール酸水和物（合成）、グリココール酸ナトリウム塩水和物、グリコデオキシコール酸一水和物、グリコデオキシコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３−硫酸塩二ナトリウム塩、及びグリコリトコール酸エチルエステル、
１−ブタンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム、１−ノナンスルホン酸ナトリウム、１−プロパンスルホン酸ナトリウム一水和物、及び２−ブロモエタンスルホン酸ナトリウム、
コール酸ナトリウム水和物、胆汁酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ヘキサンスルホン酸ナトリウム、オクチル硫酸ナトリウム、ペンタンスルホン酸ナトリウム、及びタウロコール酸ナトリウム、
タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム一水和物、タウロヒオデオキシコール（Ｔａｕｒｏｈｙｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ）酸ナトリウム塩水和物、タウロリトコール酸３−硫酸二ナトリウム塩、及びタウロウルソデオキシコール酸ナトリウム塩、
並びに、ケノデオキシコール酸、コール酸（雄牛又は羊胆汁）、デヒドロコール酸、デオキシコール酸メチルエステル、ジギトニン、ジギトキシゲニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン  Ｎ−オキシド、ドキュセートナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、Ｎｉａｐｒｏｏｆ４（Ｔｙｐｅ４）、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）ドデシル硫酸、及びウルソデオキシコール酸、が含まれる。
【０１３３】
カチオン系界活性剤には、限定されないが、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化ベンジルドデシルジメチルアンモニウム、及びベンジルトリメチルアンモニウムテトラクロロヨウ素酸、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ドデシルエチルジメチルアンモニウム、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、臭化トンゾニウム、及び臭化トリメチル（テトラデシル）アンモニウムが含まれる。
【０１３４】
非イオン系表面活性剤には、限定されないが、Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤、例えば、限定されないがＢｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、及びＢｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、
Ｓｐａｎ（登録商標）系界面活性剤、例えば、限定されないがＳｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、及びＳｐａｎ（登録商標）８５、
Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤、例えば、限定されないがＴｒｉｔｏｎ  ＣＦ−２１、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−３２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１２、Ｔｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６、Ｔｒｉｔｏｎ  ＧＲ−５Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  ＱＳ−４４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０２、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１５１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−２０７、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１６５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４５、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−７０５、
Ｔｅｒｇｉｔｏｌ系界面活性剤、例えば、限定されないが、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−１２）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−３０）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−５）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−７）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−９）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＮＰ−１０）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＮＰ−４）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＮＰ−４０）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＮＰ−７）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＮＰ−９）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＴＭＮ−１０）、及びＴｅｒｇｉｔｏｌ（Ｔｙｐｅ  ＴＭＮ−６）、
ＴＷＥＥＮ（登録商標）系界面活性剤、例えば、限定されないが、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６１、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８１、及びＴＷＥＥＮ（登録商標）８５、
Ｍｅｇａ系の界面活性剤、例えば、限定されないが、Ｍｅｇａ−８及びＭｅｇａ−１０、
Ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシル  ａ−Ｄ−グルコピラノシド、デシル  β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシル  ａ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、及びｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、
ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、及びヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、
ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、及びヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、
オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、及びオクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、
ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、及びペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、
ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、及びポリエチレングリコールエーテルＷ−１、
ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ステアリン酸ポリオキシエチレン１００、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、及びポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、
ステアリン酸ポリオキシエチレン４０、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ステアリン酸ポリオキシエチレン８、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、及びポリオキシエチレン２５、
テトラエチレングリコールモノデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、及びテトラエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、
トリエチレングリコールモノデシルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、トリエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、トリエチレングリコールモノオクチルエーテル、及びトリエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、
ホスフィンオキシド（例えばＡＰＯ−９、ＡＰＯ−１０、ＡＰＯ−１２）、
並びに、ビス（ポリエチレングリコールビス［イビダゾリルカルボニル］）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、チロキサポール、及びｎ−ウンデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−ａ−Ｄ−グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ＮＰ−４０、ステアリン酸プロピレングリコール、サポニン（例えばキラヤ樹皮からのサポニン）、及びテトラデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、が含まれる。
【０１３５】
両性イオン系界面活性剤には、限定されないが、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）界面活性剤、限定されないが、例えばＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１２（３−ドデシル−ジメチルアンモニオ−プロパン−１−スルホン酸エステル）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４、及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１６、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸エステル分子内塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホン酸エステル分子内塩、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホン酸エステル、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホン酸エステル、及び３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンニオ）プロパンスルホン酸エステル、
並びに、ＢｉｇＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ジメチル−ドデシルアミン、ＤＤＭＡＵ、ラウリルジメチルアミンオキシド（ＬＡＤＡＯ、ＬＤＡＯ）、及びＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、が含まれる。
【０１３６】
本発明の幾つかの実施態様において、一つ以上のリン脂質、表面活性剤又は界面活性剤を直接反応混合物に添加し、ＩＶＰＳ反応混合物に存在させる。一つ以上の界面活性剤、表面活性剤若しくはリン脂質、又はそれらの組み合わせを、本発明の供給溶液に使用できる。
【０１３７】
本発明の幾つかの態様において、ナノスケールのリン脂質二重層ディスクを、ＩＶＰＳ反応混合物に添加してもよい。リン脂質を二重層構造に含むリン脂質−タンパク質粒子又は「ナノディスク」であって、アポリポタンパク質Ａ１（ＡｐＯ−Ａ１）のような骨格タンパク質又はその誘導体によって囲まれたものが、Ｂａｙｂｕｒｔら（Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２３：３７−４４（１９９８））、Ｂａｙｂｕｒｔ及びＳｌｉｇａｒ（ＰＮＡＳ９９：６７２５−６７３０（２００２）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１２：２４７６−２４８１（２００４））に記載されており、また米国特許出願公開第２００５／０１８２２４３号において開示されており、ナノスケールのリン脂質二重層ディスクに及びそれらの構成要素（例えばリン脂質及び骨格タンパク質）に関する全ての開示内容が参照によって本明細書に組み入れられる。特に膜タンパク質をＩＶＰＳ反応で合成するとき、ナノスケールのリン脂質二重層ディスクの添加により可溶タンパク質の収量を向上させることができる。例えば、ナノスケールのリン脂質二重層ディスクは、本明細書に記載のＩＶＰＳ反応において、０．１〜１００ｍｍ、好ましくは０．２〜５０ｍ、最も好ましくは０．５ｍｍ〜４０ｍｍの濃度で添加できる。例えば、ナノディスクを約１ｍｍから約２０ｍｍにてＩＶＰＳ反応に存在させてもよい。
【０１３８】
ナノスケールのリン脂質二重層ディスクをＩＶＰＳ反応に添加して、インビトロ翻訳された膜タンパク質の溶解性を増加させることができる。膜タンパク質（貫通型、埋め込み型及び周辺膜タンパク質を含む）は、ナノディスクの存在下でインビトロ翻訳ができ、その結果膜タンパク質はナノスケールのリン脂質二重層ディスクに挿入される。本発明の幾つかの態様において、ナノディスクに挿入された膜タンパク質は、ナノディスクの骨格タンパク質に存在する親和性タグにより単離できる。
【０１３９】
他の本発明の好ましい実施例において、一つ以上のリン脂質、表面活性剤又は界面活性剤を、ＩＶＰＳに使用する細胞抽出物の調製中に細胞又は細胞溶解物に添加して、ＩＶＰＳ反応混合物中に存在させる。リン脂質、表面活性剤又は界面活性剤は、細胞溶解前の細胞に、又は細胞溶解物からの細胞残渣除去前の細胞溶解物に添加するのが好ましい。実施例において示すように、細胞又は細胞溶解物からの細胞残渣の除去前の細胞溶解物への界面活性剤の添加により、界面活性剤なしで調製される抽出物の場合よりも多量の可溶タンパク質を生じさせる細胞抽出物が結果的に得られる。すなわち、本発明の方法では、調製物の上清を（例えば、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーその他によって）抽出する間、細胞溶解物から分離される膜及び細胞残渣は、細胞溶解物からの除去前に、一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は添加された脂質に暴露される。
【０１４０】
本発明は特定の方法に限定されるものではないが、抽出物が本発明の方法を使用して調製されるとき、特定の周辺膜タンパク質、凝集タンパク質又は他の生体分子であって、標準ＩＶＰＳ抽出物の調製の間、遠心分離によって取り除かれるものは、界面活性剤による処理によって可溶化され、細胞溶解物の遠心分離の間に上清画分に移行すると考えられる。ゆえにこれらの可溶化された構成要素は細胞溶解物の上清画分の一部となり、細胞残渣から分離されてＩＶＰＳにおける細胞抽出物として用いられる。この種の可溶化タンパク質又は生体分子により、インビトロ合成されたタンパク質の収量向上、可溶化の促進、溶解性又は活性の増加がなされる。
【０１４１】
非界面活性剤の表面活性剤及び／又はリン脂質もまた、生体分子又はタンパク合成、フォールディング又は可溶化を促進する因子の遊離を促進しうる。本発明にはまた、一つ以上の表面活性剤、一つ以上の界面活性剤又は一つ以上の脂質（限定しないが一つ以上のリン脂質）を含む抽出物を有するＩＶＰＳ系が含まれ、そこにおいて、一つ以上の表面活性剤、界面活性剤又はリン脂質が、細胞溶解に先立ち抽出物の調製に用いる細胞に添加されるか、又は、細胞溶解物からの細胞残渣除去前に、細胞抽出物の調製に用いる細胞溶解物に添加される。
【０１４２】
本発明には、ＩＶＰＳ系に使用する界面活性剤、表面活性剤又は脂質を含む細胞抽出物が含まれ、そこにおいて、その細胞抽出物は細胞を溶解して細胞溶解物を得、その細胞溶解物から細胞残渣を除去することによって調製され、そこにおいて、一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質が、細胞溶解前の細胞に、又は、細胞残渣を除去する前の細胞溶解物に添加される。本発明において、「細胞残渣」とは、溶解物の構成要素を含んでもよく、限定されないが、例えば、細胞壁の断片、細胞膜の断片、ゲノムＤＮＡの断片又は生体分子の大型の凝集体（例えばサイズ又は密度に基づいて、溶解物から遊離型リボソームを実質的に除去しない方法を使用して溶解物から除去できる）を含む。好ましくは、細胞残渣は、遠心分離又は濾過（最も好ましくは遠心分離）法を使用して溶解物から除去される。
【０１４３】
遠心分離の代替として又は補足的に、濾過、選択的沈殿、親和性による捕捉又はクロマトグラフィーを、細胞残渣又は望ましくない物質をＩＶＰＳ用の細胞抽出物として使用される細胞溶解物から分離する方法として任意に使用できる。ＩＶＰＳに使用する細胞抽出物の調製方法は、様々な真核生物及び原核生物由来の系に関して公知である。本発明は、これらのＩＶＰＳに細胞抽出物を使用するいかなる方法又はその変法であって、細胞を溶解し、細胞残渣及び／又は他の望ましくない構成要素を溶解物から除去し、ＩＶＰＳに使用する抽出物を調製する方法に適用できる。細胞残渣及び／又は望ましくない構成要素の除去は、例えば遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、親和性による捕捉などの方法でなされうる。
【０１４４】
本発明の幾つかの好適な態様において、界面活性剤又は表面活性剤は、細胞溶解バッファー、又は溶解物からの細胞残渣除去前の溶解物に添加される。本発明の幾つかの好適な態様において、界面活性剤は、細胞溶解バッファー、又は溶解物からの細胞残渣除去前の溶解物に添加される。好ましくは、界面活性剤は、非イオン系界面活性剤又は両性イオン系界面活性剤である。
【０１４５】
本発明のＩＶＰＳ抽出物の調製に用いる非イオン系界面活性剤は、非限定的な例として、グリコピラノシド（又はグルコピラノシド）、Ｂｒｉｊ系の界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ系の界面活性剤、ｎｏｎｉｄｅｔ系の界面活性剤又はＴｗｅｅｎ系の界面活性剤であってよい。幾つかの好適な非イオン系界面活性剤は、グリコピラノシド（又はグルコピラノシド）（例えばドデシルマルトシド、オクチルグルコピラノシド又はオクチルチオグルコピラノシド）、Ｂｒｉｊ系の界面活性剤（例えばＢｒｉｊ（登録商標）３５ｍ）又はＴｒｉｔｏｎ系界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）である。本発明のＩＶＰＳ抽出物の調製に用いる両性イオン系界面活性剤は、非限定的な例として、スルホベタイン界面活性剤、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）系の界面活性剤、ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）系の界面活性剤、ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯであってよく、例えばＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４又はＣＨＡＰＳであってよい。
【０１４６】
界面活性剤は、他の界面活性剤との、一つ以上の表面活性剤との、若しくは一つ以上の脂質（限定されないが例えばリン脂質）との組み合わせ、又は、一つ以上の追加的な界面活性剤、一つ以上の表面活性剤若しくは一つ以上の脂質とのいかなる組み合わせによっても使用できる。
【０１４７】
(表２）典型的な界面活性剤
2008514240.tif 000003
＊特に明記しない限りＣＭＣは５０ｍＭ  Ｎａ＋の数値である。
【０１４８】
一つの態様において、本発明には、タンパク合成に使用する抽出物の調製方法であって、バッファー中に細胞を再懸濁すること、細胞を溶解させ溶解物を得ること、一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又はリン脂質を溶解物に添加すること、及び、溶解物から細胞残渣を除去してタンパク合成に使用する抽出物を得ること、を含む方法が含まれる。好適な方法において、細胞残渣の除去には、溶解物を遠心分離し、リボソームを含む上清の少なくとも一部を除去しタンパク合成に使用する細胞抽出物を得ることが含まれる。細胞は、原核生物でも真核生物細胞でもよい。
【０１４９】
好ましい実施態様において、一つ以上の界面活性剤又は表面活性剤を、ＩＶＰＳ用の細胞抽出物として使用する細胞溶解物から細胞残渣を分離する前の、細胞溶解物に添加する。例えば、一つ以上の界面活性剤を、ＩＶＰＳに使用する細胞抽出物として使用される細胞溶解物から細胞残渣を分離する前に、細胞溶解物に添加してもよい。好ましくは、界面活性剤が抽出物の調製の際に用いられるとき、界面活性剤は、界面活性剤を細胞溶解物に添加後、その細胞溶解物の界面活性剤濃度が界面活性剤のＣＭＳと同等又はそれ以上となるような濃度において用いられる。幾つかの好ましい実施態様において、界面活性剤が抽出物の調製に用いられるとき、界面活性剤は、界面活性剤を細胞溶解物に添加した後、その細胞溶解物の界面活性剤濃度が界面活性剤のＣＭＣの２倍以下となるような濃度において用いられる。
【０１５０】
本発明には、少なくとも一つの界面活性剤、表面活性剤又は脂質を含む細胞抽出物を含むインビトロタンパク質合成系であって、その細胞抽出物は、細胞を溶解して細胞溶解物を得、その細胞溶解物から細胞残渣を除去することによって調製され、そこにおいて、一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質が、溶解物からの細胞残渣の除去前に細胞溶解物に添加される、系が含まれる。幾つかの好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも一つの界面活性剤を含む細胞抽出物を含み、その抽出物が、一つ以上の界面活性剤を細胞残渣の除去前の細胞溶解物に添加することによって調製される、インビトロタンパク質合成系が含まれる。
【０１５１】
本発明の幾つかの態様において、ＩＶＰＳ抽出物の調製に用いる細胞は、細胞の溶解前に、添加された界面活性剤、表面活性剤又は脂質に暴露される。添加される界面活性剤、表面活性剤又は脂質は、細胞の溶解が始まるのに充分な濃度又は強度では使用されない。例えば、一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質を細胞懸濁液に添加してよく、その後、細胞溶解が行われる。他の好ましい実施態様において、界面活性剤、表面活性剤又はリン脂質は、ＩＶＰＳ抽出物調製用の細胞溶解バッファーに添加される。本発明には、タンパク合成に使用する抽出物の調製方法であって、少なくとも一つの界面活性剤、表面活性剤又はリン脂質を含むバッファーに細胞を再懸濁すること、細胞を溶解させ細胞溶解物を得ること、及びＩＶＰＳに使用する細胞抽出物を調製するために細胞残渣をその溶解物から分離すること、を含む方法が含まれる。好適な方法において、細胞残渣の分離には、溶解物を遠心分離し、少なくとも一部の上清を取り除き、タンパク合成に使用する細胞抽出物を得ることが含まれる。細胞は、原核生物でも真核生物細胞でもよい。
【０１５２】
幾つかの好ましい実施態様において、一つ以上の界面活性剤又は表面活性剤が、ＩＶＰＳに使用する抽出物の調製用の未処理細胞に添加される。一つ以上の界面活性剤は、例えば、細胞溶解前の未処理細胞に添加してもよい。例えば、細胞ペレットをバッファー中に再懸濁し、一つ以上の界面活性剤をその再懸濁液に添加してもよい。好ましくは、細胞懸濁液中の界面活性剤の最終濃度が、界面活性剤のＣＭＣと同等又はそれ以上となる量の、界面活性剤を添加する。あるいは、細胞ペレットを、一つ以上の界面活性剤を含むバッファー中に再懸濁してもよく、その場合、バッファー中の界面活性剤濃度は、界面活性剤のＣＭＣ以上であるのが好ましい。幾つかの好ましい実施態様において、ＩＶＰＳ抽出物の調製の際、界面活性剤が細胞溶解前の細胞懸濁液に添加されるとき、細胞懸濁液中の界面活性剤濃度は界面活性剤のＣＭＣの２倍未満である。
【０１５３】
本発明には、界面活性剤、表面活性剤又は脂質を含む細胞抽出物を含むインビトロタンパク質合成系であって、その細胞抽出物が、細胞を溶解させて細胞溶解物を得、その細胞溶解物から細胞残渣を除去して調製され、そのとき一つ以上の界面活性剤又は表面活性剤が溶解前の細胞に添加される、系が含まれる。幾つかの好ましい実施態様において、本発明には、少なくとも一つの界面活性剤含む細胞抽出物を含むインビトロタンパク質合成系であって、その細胞抽出物が、細胞を溶解させて細胞溶解物を得、その細胞溶解物から細胞残渣を除去して調製され、そのときその細胞を、溶解前に一つ以上の界面活性剤に暴露させる、系が含まれる。
【０１５４】
本発明には、インビトロタンパク質合成方法であって、ＩＶＰＳ反応で使用する抽出物の調製に用いる細胞溶解物が、細胞溶解物からの細胞残渣の除去前に少なくとも一つの脂質、少なくとも一つの表面活性剤又は少なくとも一つの界面活性剤によって処理されている、方法が含まれる。上記方法には、インビトロタンパク質合成混合物を構成する細胞抽出物に対してアミノ酸、少なくとも一つのエネルギー源及び鋳型核酸を添加すること（その細胞抽出物は、細胞又は細胞溶解物が、その抽出物の調製前に少なくとも一つの脂質、表面活性剤又は界面活性剤によって処理されている）と、インビトロタンパク質合成混合物をインキュベートしてタンパク質を合成すること、が含まれる。上記方法の実施において、従来技術で公知のＩＶＰＳのプロトコル、又はその改良若しくは最適化法を使用してもよい。細胞抽出物は、原核生物又は真核生物由来の細胞から調製してもよい。上記方法は、バッチＩＶＰＳ、連続交換ＩＶＰＳ、二重層積層ＩＶＰＳ又は供給／希釈ＩＶＰＳに適用することができる。ＩＶＰＳ系は、ＲＮＡ又はＤＮＡの鋳型を使用できる。
【０１５５】
幾つかの実施態様において、上記方法では、細胞溶解物からの細胞残渣の除去前に一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質でその細胞溶解物を処理して調製された細胞抽出物を使用する。幾つかの好ましい実施態様において、上記方法では、細胞溶解物からの細胞残渣の除去前に一つ以上の界面活性剤でその細胞溶解物を処理して調製された細胞抽出物を使用する。幾つかの好ましい実施態様において、細胞溶解物は、一つ以上の両性イオン系界面活性剤又は一つ以上の非イオン系界面活性剤（例えば本明細書において開示されるもの）によって処理される。
【０１５６】
幾つかの実施態様において、上記方法では、細胞溶解前に一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質で細胞を処理して調製された細胞抽出物を使用する。幾つかの好ましい実施態様において、上記方法では、細胞溶解前に一つ以上の界面活性剤で細胞を処理して調製された細胞抽出物を使用する。幾つかの好ましい実施態様において、細胞は、一つ以上の両性イオン系界面活性剤又は一つ以上の非イオン系界面活性剤（例えば本明細書において開示されるもの）によって処理される。
【０１５７】
上記方法には、バッファー、アミノ酸及びインビトロ翻訳反応の初めの翻訳反応において存在するエネルギー源以外の少なくとも一つのエネルギー源を含む、供給溶液を添加することを更に含めてもよく、その場合、翻訳反応液を一定時間インキュベートした後に供給溶液を添加し、拡張された合成反応混合物が得られる。拡張された合成反応混合物は、更なる時間インキュベートされ、一つ以上のタンパク質が合成される。供給溶液及び供給溶液を使用したＩＶＰＳの実施方法は、本明細書において開示される。
【０１５８】
界面活性剤処理された細胞の抽出物又は溶解物を含むＩＶＰＳ反応系が構成されるとき、一つ以上の界面活性剤を、細胞抽出物中よりも低い濃度でインビトロ合成反応に含めてもよく、又は、界面活性剤が反応バッファーに添加される場合には、インビトロ合成反応における界面活性剤濃度は、抽出物中の濃度と比較し、同等のままか又は高くてもよい。これらの方法の幾つかの実施態様において、界面活性剤はそのＣＭＣ以上の濃度で細胞溶解物又は細胞抽出物中に存在し、ＩＶＰＳ反応においてそのＣＭＣ以下に希釈される。これらの方法の他の実施態様において、界面活性剤はそのＣＭＣと同等又はそれ以上で細胞溶解物中に存在し、また希釈される場合においても、ＩＶＰＳ反応においてそのＣＭＣ以上に維持される。
【０１５９】
上記抽出物は、ＩＶＰＳ反応系中の界面活性剤濃度を低下させるために透析してもよい。ＣＭＣ以上の濃度の界面活性剤は理論的に「透析不可能」であるが、実際的には、そのＣＭＣ以上の界面活性剤を若干希釈することは可能であり、透析の間透析バッグを膨張させ、サンプル中の界面活性剤を結果的に希釈するか、あるいは、透析バッグ内をＣＭＣ以下の濃度に希釈するに場合は、サンプル中の界面活性剤を更に透析希釈すればよい。
【０１６０】
細胞溶解バッファーへの界面活性剤の添加により、界面活性剤の初濃度における細胞膜及び構成要素の処理が可能となり、その後、ＩＶＰＳ反応系に界面活性剤含有細胞抽出物を添加することによって界面活性剤が希釈されると、ＩＶＰＳ反応系の界面活性剤濃度は低いものとなる。界面活性剤は、タンパク合成を最適にするために、溶解バッファー中の濃度に関して試験してもよい。図４において、本発明の組成物及び方法に使用できる界面活性剤の例、溶解バッファー中のそれらの濃度及び結果として生じる抽出物、並びに可溶タンパク質の収量に与えるそれらの効果を示す。０．０９％のＢｒｉｊ３５、０．１％のドデシルマルトシド、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．３％のＣＨＡＰＳは、全てＩＶＰＳ系において可溶性のＳＴＫ１７Ｂタンパク質の収量を向上させるものである。
【０１６１】
インビトロ合成による、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法に用いるタンパク質の標識方法
本発明はまた、ＮＭＲに用いる同位体標識タンパク質の標識方法を提供する。上記方法には、インビトロタンパク質合成系において少なくとも一つの同位元素で標識されたアミノ酸を含むタンパク質の合成が含まれ、そこでは供給溶液が反応開始後１時間までにインビトロ翻訳反応に添加される。上記方法には、好ましくは、ＩＶＰＳ反応の前に、少なくとも一度のバッファー交換を伴う少なくとも８時間の透析がなされた細胞抽出物の使用が含まれる。より好ましくは、細胞抽出物はＩＶＰＳ反応の前に少なくとも２時間の透析、それに続く少なくとも８時間の透析がなされ、最も好ましくは、細胞抽出物はＩＶＰＳ反応の前に少なくとも２時間の透析、それに続く少なくとも１２時間の透析がなされる。
【０１６２】
例えば、細胞抽出物はＳ３０の抽出物であってよく、またＩＶＰＳバッファー及び供給溶液は、実施例２及び供給溶液については表３において開示するような、ｍｇ単位でのタンパク質合成に使用するものと同様であってよいが、合成に使用する同系の非標識アミノ酸が同位元素標識アミノ酸に置き換わっていることを除く。
【０１６３】
あるいは、場合によっては、グルタミン酸カリウムが酢酸カリウムと置き換わっているＩＶＰＳ反応バッファー及び供給溶液の使用が有利なこともある。本発明には、ＮＭＲ分析に使用するタンパク質をＩＶＰＳ系にて調製する方法であって、細胞抽出物が少なくとも８時間透析され、反応バッファー及び供給バッファーに酢酸カリウムが含まれ、グルタミン酸カリウムが含まれない方法が含まれる。
【０１６４】
ベクター、ＤＮＡクローニング及び発現系
本発明は、幾つかの態様において、クローニング用及び発現用ベクター及びその宿主に関する。本明細書において用いられるＴＯＰＯ（登録商標）クローニングシステムは、公開された米国特許出願２００３／００２２１７９号（Ｃｈｅｓｎｕｔら、２００３年１月３０日に公開、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」）に記載されており、そのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングシステム及び方法に関する全ての開示内容が本明細書に参照により組み入れられる。
【０１６５】
本発明は、簡便なＴＯＰＯ（登録商標）ベースのＤＮＡ断片（ＰＣＲ断片を含むがこれに限らない）のクローニングに使用可能なベクターを提供し、ＤＮＡからＲＮＡへのＴ７ポリメラーゼ特異的な転写を促進する配列を提供し、更にＲＮＡに転写されると、ＲＮＡ転写物の翻訳効率を向上させる配列を提供する。
【０１６６】
更に、上記ベクターは、Ｈｉｓタグをコードする配列を含むため、転写及び翻訳過程で、クローニングされた目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にそのペプチドタグを融合させることが可能となり、それはｐＥＸＰ５−ＣＴ（配列番号：４１）又はｐＥＸＰ５−ＮＴ（配列番号：３８）ベクターを用いて行われる。更に、本発明において提供されるベクター上には、ＴＥＶプロテアーゼ部位が、６×Ｈｉｓタグ及びクローニングされた目的タンパク質との間に位置するようにコードされている。ｐＥＸＰ５−ＮＴ（配列番号：３８）ベクターの構築物により、目的遺伝子のＮ末端に２１アミノ酸のみが付加され、プロテアーゼ（ＴＥＶ）裂開の後は、合成された産物上に二つの付加的なアミノ酸だけが残る。プラスミドｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：４１）は、目的の遺伝子を停止コドンと共に挿入できるように設計されている。終止コドンが含まれない場合、クローニングされた目的タンパク質のカルボキシル末端に、Ｃ末端Ｈｉｓタグとして８つのアミノ酸が付加された形で発現される。
【０１６７】
キット
インビトロ合成用のキットもまた、本発明を特徴づけるものである。このキットには、本発明の実施に試用する試薬又は構成要素を任意の数又は組み合わせで含めることができる。本発明のキットは、好ましくは、本発明の一つ以上の構成要素であって、例えば、細胞抽出物、ＩＶＰＳ反応バッファー、供給溶液、酵素、阻害剤、アミノ酸混合物又は一つ以上のアミノ酸又はその誘導体、一つ以上のポリメラーゼ、一つ以上の補因子、一つ以上のバッファー又は緩衝塩、一つ以上のエネルギー源、一つ以上の鋳型核酸、キットの分析の効率若しくは目的物（例えば核酸及びタンパク質）の生成を測定する一つ以上の試薬、並びに、本発明の方法を実施するための、又は、本発明のキット及び／若しくはその構成要素の使用上の指示書又はプロトコル、からなる群から選択される一つ以上の要素を含む。本発明のキットには、上記の構成要素の一つ以上を任意の数の別々の容器、チューブ、バイアルなどに含めることができ、又は、この種の構成要素を上記容器中で様々に組み合わせてもよい。
【０１６８】
幾つかの実施態様において、本発明のキットには、少なくとも一つのタンパク合成用の抽出物を含めることができ、その抽出物は、細胞を、細胞溶解前に一つ以上の界面活性剤、表面活性剤又は脂質に暴露させ、抽出物を調製する方法、又は、少なくとも一つの界面活性剤、表面活性剤又は脂質を、溶解物からの細胞残渣の除去前に細胞溶解物に添加する方法により調製される。上記キットにはまた、ＩＶＴ反応バッファー、アミノ酸及びポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼ）が含まれる。上記キットに供給バッファーを添加してもよい。
【０１６９】
幾つかの実施態様において、本発明のキットは、少なくとも一つのタンパク合成用の抽出物、並びにアミノ酸及び少なくとも一つのエネルギー源を含む供給バッファーを含む。好ましくは、その細胞抽出物は、細胞溶解物を遠心分離する前に、リン脂質、界面活性剤又は表面活性剤を細胞又は細胞溶解物に添加して調製される。上記キットにはまた、好ましくは一つ以上のアミノ酸を含む少なくとも一つの溶液が含まれる。上記キットにはまた、好ましくはポリメラーゼ（好ましくはＲＮＡポリメラーゼ）が含まれる。
【０１７０】
上記キットには、本明細書において開示されるｐＥＸＰ−ＣＴ及び−ＮＴベクターを含むベクター、一つ以上の標識アミノ酸及び、好ましくは取扱説明書を添加してもよい。
【０１７１】
キットには通常、細菌宿主の特性及び／又はその精製用途に関する指示（例えばその遺伝子型）、及び／又は生体分子（例えばＨｉｓタグ付き組換えポリペプチド）の検出に関して記載されている説明書が含まれる。
【０１７２】
実施例
実施例１
供給溶液の組成
代表的な溶液は、
（ａ）バッファー（最終濃度１０〜１００ｍＭ）、
（ｂ）一種以上の塩、
（ｃ）一種以上の還元剤、
（ｄ）一種以上のエネルギー源及び／又は補因子、
（ｅ）少なくとも４種のアミノ酸、及び
（ｆ）酢酸アンモニウムを含有する。
【０１７３】
インビボ合成反応において、反応によるタンパク質収量の最適化のために、供給溶液の成分を様々な濃度で試験した。
【０１７４】
Ａ．バッファー：
反応のｐＨを維持するためにＨＥＰＥＳバッファーを添加した。供給溶液のｐＨは、ｐＨ８．０（反応初めは７．６）に上昇した。ＨＥＰＥＳバッファーは、インビトロ合成反応系での最終濃度が２０〜８０ｍＭとなるよう含有させるのが好ましく、その場合、典型的な供給溶液は、ＨＥＰＥＳの最終反応濃度が５７．５ｍＭとなる。供給溶液としてバッファーを単独で添加しても収量が上昇しなかったが、おそらくタンパク質のフォールディングを適切にすることによる、合成産物の活性を僅かな刺激効果が見られた。
【０１７５】
Ｂ．塩：
２ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在を除き、初めの反応液中の塩と同一となるように供給溶液に塩を含め、イオン強度を維持した。カルシウムの添加により、収量が約１０％上昇した。
【０１７６】
Ｃ．還元剤：
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を還元剤として用いた。
【０１７７】
Ｄ．１．エネルギー源：
試験した解糖系中間体は、ホスホエノールピルビン酸、アセチルリン酸、グルコース−６−リン酸（Ｇｌｕ−６−Ｐ）、フルクトース−６−リン酸、及び３−ホスホグリセリン酸単独、又はそれらの組み合わせである。最適な解糖系中間体の総濃度は、２０ｍＭ〜６０ｍＭ（合成反応における最終濃度）であると見出された。
【０１７８】
補因子ＮＡＤ又はＮＡＤＨを除く任意の解糖系中間体を添加することにより酵素活性が上昇し、またＮＡＤ又はＮＡＤＨを共存させると良好な発現及び活性の向上の両方が見られた。これらの効果に関し、各成分の濃度範囲を、例えばアミノ酸１〜５ｍＭ、解糖系中間体５〜１００ｍＭ、及びＮＡＤ／Ｈ  ０．１〜１ｍＭで観察した。
【０１７９】
Ｄ．２．補因子：
ＮＡＤ又はＮＡＤＨを溶液中に添加し、アッセイにおける最終濃度を０．１〜１ｍＭとした。
【０１８０】
Ｅ．アミノ酸：
アミノ酸を供給溶液中に添加し、最終濃度を１．２５ｍＭとした。５ｍＭまでのアミノ酸の最終濃度は有害ではなかった。供給溶液中に添加されたアミノ酸は、バッファー単独の添加と比較し、収量を３０％まで上昇させ（表４）、これは分解又は劣化したアミノ酸の幾らかが、新鮮なアミノ酸と交換されたことによるものと考えられる。反応開始時のアミノ酸濃度は、各アミノ酸で１．２５ｍＭであり（１．５ｍＭで添加したメチオニン及びシステインを除く）、このアミノ酸濃度の上昇は当初、収量における同様の刺激効果を生じさせなかった。したがって、後における補充が重要であると示唆された。この時点での供給溶液は、１．５ｍＭで存在するメチオニン及びシステインを除き、１．２５ｍＭの各アミノ酸が含まれている。
【０１８１】
好ましい供給溶液を、以下の表に記載する（１．５ｍＭで存在するメチオニン及びシステインを除き、一様に供給溶液中に添加された１．２５ｍＭのアミノ酸は記載しない）。表３に記載した供給溶液（アミノ酸以外）は、以下の実施例に記載するＩＶＰＳ反応にて調製及び評価された。
【０１８２】
（表３）供給溶液
2008514240.tif 000004
【０１８３】
実施例２
供給溶液中の様々な成分による収量及び活性
標準的な５０μＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）反応系を構築し、原則的に製造業者の指示に従い３７℃でインキュベートした。反応系には、大腸菌のＲＮａｓｅＡ欠損変異体の抽出液６００〜８００μｇ、２．５μｇ／ｍＬ  Ｇａｍタンパク質、８２０Ｕ  Ｔ７酵素、２０Ｕ  ＲＮａｓｅＯｕｔ、１ｍＭ  アミノ酸（メチオニンを除く）、１．５ｍＭメチオニン、及び０．５〜１μｇ鋳型ＤＮＡ（環状及び直鎖のいずれか）を含む１×ＩＶＰＳバッファー（５８ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１．７ｍＭ  ＤＴＴ、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．８８ｍＭ  ＵＴＰ、０．８８ｍＭ  ＣＴＰ、０．８８ｍＭ  ＧＴＰ、３４μｇ／ｍＬ  フォリン酸、３０ｍＭ  アセチルリン酸、２３０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１２ｍＭ  酢酸マグネシウム、８０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、０．６５ｍＭ  ｃＡＭＰ、３０ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸、２％  ポリエチレングリコール）を添加した。エッペンドルフサーモミキサーを使用し１．５〜２ｍＬ微量遠心管内で、３０℃又は３７℃のいずれかにて２〜６時間緩やかに振とう（１０００〜１４００ｒｐｍ）し、反応を進行させた。反応時間全体に亘り、異なる時間間隔において、反応液に１／２量（初めの反応液の容量に対する）の供給バッファーを供給した。
【０１８４】
界面活性剤の効果を試験するアッセイにおいて、細胞を溶解したＳ３０バッファー中に界面活性剤を含ませた。該界面活性剤は、反応物中に様々な濃度で添加した：オクチルグルコピラノシド（０．６％、１．２％、２％）、オクチルチオグルコピラノシド（０．３％、０．６％、０．９％）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４（０．０１％、０．０２５％、０．０５％）、ドデシルマルトシドナトリウム（０．０１％、０．０２５％、０．０５％）、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（０．０１％、０．０２５％、０．０５％）。各界面活性剤を、その界面活性剤の臨界ミセル濃度以下、臨界ミセル濃度と同等、及び臨界ミセル濃度以上に対応する三つの濃度にて、反応物中に添加した。
【０１８５】
プラスミドＤＮＡ  １μｇ、又は直鎖鋳型２〜３μｇを用い、反応物を調製した。ＤＮＡ鋳型として用いたプラスミドは、ｐＥＸＰ１−ＬａｃＺ、ｐＣＲ２．１−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、及びｐＥＸＰ３−ＧＵＳであった。
【０１８６】
上気した成分を含有する供給溶液を、反応から３０分及び２時間後に２５μＬずつ供給した。供給溶液を、５８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２３０ｍＭ  グルタミン酸カリウム、１２ｍＭ  酢酸マグネシウム、８０ｍＭ  酢酸アンモニウム、２ｍＭ  塩化カルシウム及び１．７ｍＭ  ＤＴＴにて調製した。供給溶液にはまた、各々１ｍＭのアミノ酸（１．５ｍＭのメチオニン以外）、及び／又は３０ｍＭの解糖系中間体、例えばグルコース−６−リン酸、３−ホスホグリセリン酸（３−ＰＧＡ）又はアセチルリン酸（ＡＰ）、並びに０．３ｍＭのＮＡＤＨを添加してもよい。合成されたＧＦＰの量、及び活性（相対蛍光単位、ＲＦＵ）を測定した（表４）。以下に記載する全ての反応供給溶液は、「供給なし」又は「バッファーのみ」の対照と比較し高い収量であった。アミノ酸、Ｇｌｕ−６−Ｐ及びＮＡＤＨを含む供給溶液において最適な効果を示し、次いでアミノ酸、３−ＰＧＡ、及びＮＡＤＨを含む供給溶液が良好に作用した。
【０１８７】
アミノ酸及びエネルギー源を含有する供給溶液を３０分、及び２時間後に添加した、４〜６時間の反応において合成された一連の対照タンパク質の収量は、一貫して１ｍｇ／ｍＬより多いタンパク質量であった。
【０１８８】
（表４）供給溶液を用いたＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ反応
2008514240.tif 000005
【０１８９】
実施例３
ＬａｃＺ及びＧＦＰの発現に与える、供給時間及び供給量の効果
標準的な５０μＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｐｌｕｓの反応系を、実施例１に記載の通り構成し、３７℃でインキュベートした。指示通りの時点で供給バッファーを添加した。単回供給の場合は供給溶液を１容量（５０μＬ）添加し、二回供給の場合は供給溶液２容量（各２５μＬ）を添加した。［３５Ｓ］メチオニンの取り込みに基づき、タンパク質の総収量を算出した。発光アッセイによりＬａｃＺ活性を測定し、これを相対発光単位（ＲＬＵ）として示した。ＧＦＰ活性をその蛍光（励起：３９５ｎｍ、放射：５０９ｎｍ）により測定し、これを相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示した。
【０１９０】
一回供給の場合、両タンパク質において、溶液が反応の開始後１５分、３０分、１時間又は２時間の時点で添加された場合、活性の上昇が見られた（表５）。しかしながら、タンパク質の合成量は１５分後に供給された場合に最適であり、収量もまた３０分及び１時間後に供給された場合に上昇した。２時間後の一回供給が収量に与える効果は、それ以前での一回供給の効果と比較し顕著に低かった。
【０１９１】
二回供給の場合、両タンパク質において、供給溶液を、０及び２時間後、１５分及び２時間後、３０分及び２時間後、１時間及び２時間後、並びに１時間及び３時間後にて二回添加した場合に活性の上昇が見られた。一回供給反応の場合と同様、最初の供給を、反応の開始から１時間後以降に行った場合、タンパク質収量における効果は、それ以前（１５分、３０分、６０分後）に最初の供給を行った場合と比較し顕著に低かった。
【０１９２】
（表５）供給の時間及び量による効果
2008514240.tif 000006
【０１９３】
同様の実験において、インビトロでの発現反応中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光活性をモニターした。一連の５０μＬの反応混合物を調製し、指示された寮の供給バッファーを、時間を変えて供給した。反応は、断続的に振とうしつつ３７℃で６時間行った。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ内で、６時間のインキュベートの間、ＧＦＰ活性をモニターした。結果を図２に示す。標準的なインビトロ反応（ダイヤモンド）は、２時間後にほぼ完全に停止した。Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ−Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ供給技術を用い、（１）３０分後及び再度２時間後（四角）、又は（ｂ）１時間後及び再度２時間後及び４時間後（三角形）のいずれかの方法で供給バッファーを添加したところ、反応がほぼ一定に６時間継続した。
【０１９４】
実施例４
ｍｇ単位のタンパク質合成
以下のヒトＯＲＦを、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国特許第５，８８８，７３２号及び米国特許第６，２７７，６０８号を参照、両方のＧａｔｅｗａｙクローニング技術、方法、及びベクター系に関する全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）を使用して、ｐＥＸＰ１又はｐＥＸＰ３内に、またＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国特許第５，８５１，８０８号及び米国特許第６，８２８，０９３号、両方のＴＯＰＯ（登録商標）クローニング技術、方法、及びベクター系に関する全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）によりｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：３８）及びｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：４１）にクローニングした：脳クレアチンキナーゼＢ鎖（ＣＫＢ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ５２１１、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００１８２３）、主要組織適合性複合体、クラスＩＩ、ＤＯα、ＨＬＡ−ＤＯ−α、（ＨＬＡ−ＤＯＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ１０９５９、クレアチンキナーゼに類似した、筋（ＣＫＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ７２８７、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００１８２３）、カルモジュリン様３（ＣＡＬＭＬ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ２２３６２、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００５１８５）、及びインターロイキン２４（ＩＬ２４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ９８４６、Ｇａｎｂａｎｋ  ＢＣ００９６８１）。
【０１９５】
初めの反応容量が１ｍＬとし、１容量の（１ｍＬ）供給溶液による一回供給を３０分後に実施することを除き、実施例２に示す初めの反応条件、及び表３に示した供給溶液を用いて、インビトロでのタンパク質合成反応を行った。８種のタンパク質の代表的な収量を、３５Ｓメチオニン取り込みにより測定した。これらの実験では、初めの反応において５（Ｃｉの［３５Ｓ］メチオニン（１０μＣｉ／μＬ、１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含めた。供給バッファーを補充し、［３５Ｓ］メチオニンをベースの（開始の）反応系と同一の濃度にした（５０μＬ当たり０．５（Ｃｉ（１０μＣｉ／μＬ、１１７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ））。これらのＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）−Ｍｉｌｌｉｇｒａｍによる反応産物のうち、数種の０．２５（Ｌを、クマシーブルーで染色した４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で電気泳動し、８種のタンパク質の各収量を測定した。図３に、このＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）−Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ系内で合成された各タンパク質量を示す。発現したタンパク質は、左から右に向かってＧＦＰ、ヒトＯＲＦ脳クレアチンキナーゼ、ＬａｃＺ、６−ヒトＯＲＦ  ＭＨＣクラスＩＩ、Ｎ末端Ｈｉｓタグベクター（ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：３８））内のヒトＯＲＦ筋肉由来クレアチンキナーゼ、ヒトＯＲＦカルモジュリン様タンパク３、ヒトＯＲＦインターロイキン２４、及びＣ末端Ｈｉｓタグベクター（ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：４１）内のヒトＯＲＦ筋肉由来クレアチンキナーゼである。
【０１９６】
８種のタンパク質において、タンパク質産生量の範囲は、約８９０〜１，７００ｍｇであった。８種のタンパク質のうち５種は＞１．３ｍｇの量で産生され、８種のタンパク質のうち２種は＞１．５ｍｇの量で産生された。産生されたタンパク質の平均量は、１．２７５ｍｇであった。
【０１９７】
実施例５
細菌細胞からのＩＶＰＳ抽出物
以下のプロトコルを用いて、大腸菌を含む細菌株から、Ｓ３０抽出物を調製した。
【０１９８】
細胞ペースト
大腸菌Ｋ１２  Ａ１９細胞を、セレローズ（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ）（５ｇ／Ｌ）を添加した５０Ｌ緩衝２×ＹＴ（トリプトン  １６ｇ／Ｌ、酵母エキス  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／Ｌ、無水第二リン酸ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４  ５．６８ｇ／Ｌ、無水第一リン酸ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４  ２．６４ｇ）培地中で増殖させた。細胞を、回転盤（一般に、２５０ｒｐｍ）上にて、３７℃で、ＯＤ５９０が約３．０〜約５．０の範囲に到達するまで（通常約６〜約８時間）培養した。細胞を更に新鮮な培地中に播種し、その際、初期ＯＤ５９０が約０．０５〜約０．１０であった。その後、３７℃、２５０ｒｐｍ、５０ｓｌｐｍ、５ｐｓｉにて、ＯＤ５９０約３．０〜約３．５となるまで培養した。細胞をＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳ３型ローターに移し、５０００×ｇで１５分間遠心分離した。必要に応じて上清を吸引除去した（細胞ペーストは、次の工程に進む前に、好ましくは５日間又はそれ以下の期間−８０℃で保存してもよい）。
【０１９９】
１ｇの細胞ペーストを（−８０℃で保存した場合解凍して）、使用直前にＤＴＴを添加した１ｍＬの冷却（４℃）Ｓ３０バッファー中に再懸濁した（例えば細胞２５０ｇに対してＳ３０バッファー２５０ｍＬ）。
【０２００】
再懸濁を促進するために、細胞を数分間（泡を生成させずに）手動で緩やかに回旋した。細胞を入れる瓶内に滅菌済み撹拌棒を入れ、約１５分間緩やかに撹拌し、細胞を完全に再懸濁させた。再懸濁液を直ちに氷上に置いた。
【０２０１】
細胞溶解
細胞溶解に先立ち、細胞をＳ３０バッファー＋６ｍＭ  β−メルカプトエタノールで洗浄した。Ｓ３０バッファー、６ｍＭ  β−メルカプトエタノールを細胞に添加し、細胞ペーストが溶解するまで、２５ｍＬピペットで「破砕、撹拌」した。Ｓ３０バッファーは、１０ｍＭトリス、１４ｍＭ酢酸マグネシウム及び６０ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ８．２）である。懸濁液をＲＣ３Ｂ遠心分離機にて４，５００ｒｐｍで２０分間回転させた。上清をデカントし、洗浄を繰り返した。
【０２０２】
細胞を０．８５〜１容量（０．８５ｍＬバッファー：１ｇペレット）の１×Ｓ３０バッファー（１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ及び０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００）中に再懸濁した。場合によっては、界面活性剤を全く加えず、又は例えばＢｒｉｊ３５（０．０９％）、ドデシルマルトシド（０．１％）、及びＣＨＡＰＳ（０．３％）のような異なる界面活性剤を溶解バッファーに添加した。
【０２０３】
再懸濁細胞のサンプル５ｍＬを、水９９５ｍＬに添加し（１：２００希釈）、初期ＯＤを測定した。このサンプルをボルテックスし、水をブランクとして使用し、５９０ｎｍにて測定した。細胞破砕の直前に、再懸濁した細胞ペーストに０．１Ｍフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加した。細胞懸濁液１ｍＬあたり５μＬの０．１Ｍ  ＰＭＳＦを使用した。
【０２０４】
Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５０ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を使用し細胞を破砕した。圧力を少なくとも約２５，０００〜約３０，０００ｐｓｉに維持した。５００ｍＬの細胞懸濁液をホモジナイザーに通過させるのに通常約１５〜２０分間を要した。
【０２０５】
溶解の効率が約９０％未満の場合、細胞懸濁液を再度ホモジナイザーに通過させた。溶解効率は、以下のように計算した。
（最初の通過ＯＤ５９０／初めのＯＤ５９０（上記参照））×１００＝未溶解率（％）
１００−未溶解率（％）＝溶解効率（％）
【０２０６】
１Ｍ  ＤＴＴを溶解物に直ちに添加し、最終濃度を１ｍＭとした（例えば、溶解物２５０ｍＬにつき１Ｍ  ＤＴＴを２５０μＬ）。次いで、溶解物をＳＳ３４ローター内で、１６，０００ｒｐｍ（３０，０００×ｇ）にて４℃で４０分間遠心分離した。上清の上部４／５を無菌プラスチック製の目盛り付きピペットにより除去し、１Ｌの無菌容器内に収集した。
【０２０７】
プレインキュベーション
上清の容量を測定した。１０×プレインキュベーションミックスを上清に添加し（２回の溶解後遠心分離後）て１×最終濃度とし、溶解物を３７℃で１５０分間インキュベートした。プレインキュベーションミックスは、使用直前に、その成分を以下の順序で添加し調製した。調製後、氷上に静置した。
【０２０８】
（表６）プレインキュベーションミックス
2008514240.tif 000007
【０２０９】
プレインキュベーションミックス、１×濃度：
７３ｍＭ  トリス−酢酸、２２℃にてｐＨ８．２
１０μＭ  アミノ酸ミックス
１．１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
２．３ｍＭ  酢酸マグネシウム
２１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸
６０ｍＭ  酢酸カリウム
３．３ｍＭ  ＡＴＰ
１２６Ｕ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ
【０２１０】
混合物を３７℃の振とう水浴内で、１５０ｒｐｍにて１５０分間緩やかに振とうしながらインキュベートした。次いで、抽出物を、細胞の再懸濁に使用したＳ３０バッファーと同一濃度の１×Ｓ３０バッファー＋１ｍＭ  ＤＴＴにより、一晩で二度の交換を伴う透析を行った。次いで抽出物を分注し、−８０℃で保存した。
【０２１１】
実施例６
異なる界面活性剤を用いて調製したＩＶＰＳ抽出物を使用した、可溶性タンパク質の収量の比較
細菌細胞ペレットを、界面活性剤を添加しない、又は以下の界面活性剤の一つを添加したＳ３０バッファーに再懸濁したことを除き、上記実施例に記載の要領にてＳ３０抽出物を調製した：０．０９％Ｂｒｉｊ３５、０．１％ドデシルマルトシド、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、又は０．３％ＣＨＡＰＳ。全ての界面活性剤を、ＣＭＣの濃度以上の濃度で使用した。次いで、再懸濁した細胞をＣ５  Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ内で溶解した。溶解した細胞を上述のように遠心分離し、上清を１／１０容量の翻訳ミックス及びピルビン酸キナーゼと共にプレインキュベートした。次いで、抽出物を、Ｓ３０バッファー（界面活性剤無添加）により、一晩で二度の交換を伴う透析を行った。
【０２１２】
ＩＶＴ反応を実施例２に記載のとおり実施し、そこにおいて、表３に示した供給溶液を使用し一回供給を３０分後に行った。鋳型にはＳＴＫ１７Ｂキナーゼタンパク質（セリンスレオニンキナーゼ１７ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ２１１１４、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００４２２６．２）をコードするプラスミドを用い、異なる界面活性剤を用いて調製した抽出物を使用した。図４は、細胞溶解中の界面活性剤の添加により、界面活性剤無添加で調製したＳ３０と比較しＳＴＫ１７Ｂキナーゼタンパク質の可溶性が上昇したことを示す。非イオン系（Ｂｒｉｊ３５、ドデシルマルトシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）及び両性イオン系界面活性剤（ＣＨＡＰＳ）の双方が、可溶性タンパク質の収量を上昇させたことは注目に値する。
【０２１３】
別の実験のセットにおいて、細胞再懸濁に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＳ３０バッファーを使用し、数種のタンパク質の可溶性向上効果を試験した。図５に、細胞溶解中に界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加し及び添加せずに調製した抽出物を使用して翻訳した際の、可溶性ＧＦＰ、ＬａｃＺ、及びＳＴＫ１７Ｂキナーゼタンパク質の産生を示す。三つの場合全てにおいて、可溶性タンパク質の収量は、Ｓ３０バッファー中の界面活性剤の存在により向上した。
【０２１４】
図６に、細胞を溶解させたＳ３０バッファー中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて調製した、Ｓ３０抽出物中で合成された一連のタンパク質における可溶性の向上効果を示す。該タンパク質は、（右から左に向かって）ＣＤＣ２８タンパク質キナーゼ調節サブユニット１Ｂ（ＣＫＳ１Ｂ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ６４１６、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００１８２６）、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ３５８８、Ｇａｎｂａｎｋ  ＢＣ０１５７４９．１）、Ｓｕｍｏタンパク質（配列番号：１）、カルモジュリン様３（ＣＡＬＭＬ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ２２３６２、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００５１８５）、アデニレートキナーゼ３α様（ＡＫ３Ｌ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃ＩＯＨ１１０４６、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０１６２８２）、ＧＦＰ、脳クレアチンキナーゼＢ鎖（５２１１、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００１８２３）、及び受容体−相互作用セリン／スレオニンキナーゼ（６３６８、Ｇａｎｂａｎｋ  ＮＭ００３８２１）を含む。
【０２１５】
実施例７
界面活性剤で抽出した細胞膜をインビトロ翻訳系へ添加することによる効果
翻訳に使用される細胞抽出物から細胞膜を分離する前に一種又は二種以上の表面活性剤又は界面活性剤による細胞又は細胞溶解物の処理が、タンパク質合成の収量又は活性に有利な効果を与えるか否かを解析するため、「アッドバック（ａｄｄ  ｂａｃｋ）」実験を行った。以下の実験において、細胞を溶解し、界面活性剤の不在下で、細胞抽出物を（遠心分離を用い）調製した。界面活性剤で溶解した細胞ペレット抽出物を用いて溶解させた細胞ペレットを別に抽出し、そのペレット抽出物の一部を、ＩＶＴＴ反応に使用するＳ３０抽出物にアッドバックすることにより、界面活性剤を用いて調製した細胞ペレットの画分から抽出できる成分が、果たしてインビトロ翻訳に有利な効果を与えるかを解析した。
【０２１６】
細菌（大腸菌Ａ１９）Ｓ３０抽出物を、標準的な方法に従い調製した。端的には、洗浄済み大腸菌細胞をＳ３０バッファー（１０ｍＭ  トリス、１４ｍＭ  酢酸マグネシウム及び６０ｍＭ  酢酸カリウム（ｐＨ８．２））中に再懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５０ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）中で溶解させた。溶解物を遠心分離した。Ｓ３０上清を除去し、分割した。
【０２１７】
１Ｌの細胞培養液から得たＳ３０ペレットを、１０ｍＬのバッファー（２０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ）中に再懸濁した。再懸濁したＳ３０ペレットを５００μＬずつ１．５ｍＬチューブに分注し、氷上に置いた。多数の非イオン系及び両性イオン系の界面活性剤（デオキシコール酸ナトリウム、ドデシルマルトシドナトリウム、ジギトニン、オクチルチオグルコシド、オクチルグルコシド、又はＣＨＡＰＳ）を５０又は１００μＬずつＳ３０画分に添加し、最終濃度０．５％とし、画分及び界面活性剤を室温で３０分間インキュベートした。対照には、１００μＬのバッファー（２０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＫＣｌ）のみ、又は０．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを添加した。次いで、サンプルを微量遠心分離機内で１４，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。上清を清潔なチューブ内に移した。
【０２１８】
Ｓ３０ペレットの界面活性剤抽出物の上清１０μＬずつを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。ゲルを電気泳動し、クマシーブルーで染色した。染色したゲルを目視した結果、Ｓ３０ペレット界面活性剤抽出物を有するゲルのレーンには、バッファー又は塩でインキュベートしたＳ３０ペレットの上清を乗せたレーン内では見られない、高分子量（１２０ｋＤａ以上）の染色バンド及びその分解物が存在した。
【０２１９】
上記抽出物をＩＶＴＴ反応においても使用した。２０μＬの２．５×ＩＶＴバッファー（１４５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、４．２５ｍＭ  ＤＴＴ、３．０ｍＭ  ＡＴＰ、２．２ｍＭ  ＵＴＰ、２．２ｍＭ  ＣＴＰ、２．２ｍＭ  ＧＴＰ、８５μｇ／ｍＬ  フォリン酸、７５ｍＭ  アセチルリン酸、５７５ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム、２００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、１．６２５ｍＭ  ｃＡＭＰ、７５ｍＭ  ＰＥＰ、５％  ＰＥＧ）、最終濃度１．２５ｍＭのアミノ酸（メチオニン及びシステインが１．５ｍＭであることを除く）、０．２５μＬの３５Ｓメチオニンを有する１７μＬのＳ３０ペレット抽出物、０．７５μｇのｐＵＣＴ７−ＧＦＰプラスミドＤＮＡ、１μＬのＴ７ポリメラーゼ、及び３μＬのＳ３０ペレット抽出物を使用し、標準的な５０μＬ反応を行った。ペレットを、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ドデシルマルトシドナトリウム、０．５％ジギトニン、０．５％オクチルチオグルコシド、０．５％オクチルグルコシド、又は０．５％ＣＨＡＰＳのいずれかで処理した。翻訳反応における界面活性剤の最終濃度は、各場合において０．０３％であった。対照として、界面活性剤の代わりに０．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを用いてペレット画分をインキュベートして得た３μＬのＳ３０ペレット抽出物を用い、ＩＶＴＴ反応を実施した。更なる対照として、３μＬの２．５×ＩＶＳバッファー、又は更なるＳ３０抽出物を反応物に添加した。
【０２２０】
エッペンドルフサーモミキサー内で、１．５〜２ｍＬ微量遠心管内にて３７℃で２時間緩やかに振とう（１，０００〜１，４００ｒｐｍ）し、反応させた。
【０２２１】
活性ＧＦＰタンパク質の収量を、一定時間ＧＦＰ蛍光をモニターして評価した。タンパク質の収量は、３５Ｓメチオニンの取り込みにより測定した。図７は、大腸菌Ａｌ９株からの抽出物を使用した場合、Ｓ３０ペレットの界面活性剤抽出物のＩＶＰＳ反応への添加により、タンパク質の合成量が増大することを示す。
【０２２２】
実施例８
１５Ｎ標識細胞フリーアミノ酸のインビトロで発現したタンパク質への取り込み
１５Ｎで標識したＳＵＭＯタンパク質（配列番号：１、米国特許第６，８７２，３４３号、ＳＵＭＯタンパク質及び核酸配列、並びにそれらの使用に関する全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）を精製し、質量分析法により試験して１５Ｎの取り込みの程度を測定した。理想的には、目的タンパク質は、非標識アミノ酸を全く有さない必要があり、ＮＭＲ等の用途には均質な標識タンパク質が望ましい。図４に、対照（非標識）ＳＵＭＯタンパク質と、１５Ｎ標識したＳＵＭＯタンパク質を質量分析で検出した際の比較実験の結果を示す。上記結果は、いかなる天然の非標識アミノ酸を排除する、１５Ｎ標識アミノ酸の完全又はほぼ完全な取り込みを示す。
【０２２３】
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＮＭＲにおけるＣＡＬＭＬ３の発現及び精製
ＳＵＭＯ及びヒトＯＲＦカルモジュリン様３タンパク質（ＣＡＬＭＬ３）を、ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡベクター内にクローニングし、均一に標識した１０ｍｇ／ｍＬのＮアミノ酸を含有する５ｍＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＮＭＲ反応で発現させた。ＳＵＭＯ及びＣＡＬＭＬ３タンパク質を、上記のように合成及び精製した。最終反応物を結合バッファーで１：１に希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上で精製し、精製プロファイルをクマシー染色した４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で分析した。ピーク画分を回収し、質量分析の前に透析した。最終的な回収物は、約４ｍｇのＳＵＭＯ及び４．５ｍｇの精製ＣＡＬＭＬ３であった。
【０２２４】
ＳＵＭＯタンパク質の標識
各ＩＶＴＴ反応において、以下の成分を添加し、３０℃で４時間インキュベートした。大腸菌Ｓ３０  ２０ｍＬ、２．５×ＩＶＰＳ  ＮＭＲバッファー（１４５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、４．２５ｍＭ  ＤＴＴ、３．０ｍＭ  ＡＴＰ、２．２ｍＭ  ＵＴＰ、２．２ｍＭ  ＣＴＰ、２．２ｍＭ  ＧＴＰ、８５μｇ／ｍＬ  フォリン酸、７５ｍＭ  アセチルリン酸、５７５ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム、２００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、１．６２５ｍＭ  ｃＡＭＰ、７５ｍＭ  ＰＥＰ、５％  ＰＥＧ（バッファー中にアミノ酸存在せず））２０ｍＬ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１ｍＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）０．５ｍＬ、５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  １５Ｎ標識細胞フリーアミノ酸（反応物中の最終濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）、ＤＮＡ  １ｍｇ、３５Ｓ−メチオニン  ０．５ｍＬ、更にヌクレアーゼフリーＨ２Ｏで５０ｍＬとした。５０ｍＬの供給バッファー（２５ｍＬ  ２×供給バッファー、０．５ｍＬ  ３５Ｓメチオニン、５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬ  １５Ｎ標識細胞フリーアミノ酸、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏで５０ｍＬとした）を、各反応物に３０分後に添加した。４時間目の終わりに、５ｍＬの反応物をＴＣＡ沈殿し、タンパク質の収量を測定した。非標識タンパク質発現においては、標識したアミノ酸を非標識アミノ酸（最終反応物中１ｍＭ）で代替し、上記のＩＶＴＴ反応を実施した。
【０２２５】
１３Ｃ又は１５Ｎ標識アミノ酸を用いた標識においては、適切な非標識アミノ酸を標識アミノ酸で代替した。完全アミノ酸（１３Ｃ又は１５Ｎ標識アミノ酸を含む）を用いた標識には、１００ｍｇ／ｍＬを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中に溶解し、５μＬずつを５０μＬ  ＩＶＴＴ反応に使用した。最終反応物中のアミノ酸濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。研究者の希望に応じ、濃度を変更してもよい。
【０２２６】
１０ｍＭの全２０アミノ酸の混合物５０μＬを０．２５ｍＬの２×供給バッファーに添加し、ヌクレアーゼフリー水により液量を０．５ｍＬとした。
【０２２７】
０．５ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  ＮＭＲ反応において、以下の成分を混合した。大腸菌Ｓ３０  ０．２ｍＬ、２．５×ＮＭＲ  ＩＶＰＳバッファー０．２ｍＬ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼミックス１０μＬ、１０ｍＭアミノ酸ミックス（標識アミノ酸混合物又は非標識アミノ酸混合物）５０μＬ、ＤＮＡ鋳型（環状又は直鎖）２．５〜５μｇ。次に、混合物の最終容量を、ヌクレアーゼフリー水により０．５ｍＬとした。反応物を、３０℃又は３７℃で４時間インキュベートした。反応の開始から１５〜３０分後、供給バッファー０．２５ｍＬをＩＶＴＴ反応に添加した。次いで２時間後、０．２５ｍＬの供給バッファーを反応液に添加し、３０℃又は３７℃でインキュベートした。
【０２２８】
反応後、反応物の５μＬずつを、ＮａＯＨ水１００μＬを用いて室温で５分間インキュベートした。次に、１０％の冷ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加し、４℃で数分間静置した。真空マニフォルドを使用して、沈殿したタンパク質をグラスファイバーフィルター（ＧＦ／Ｃ）で回収した。フィルターを５％ＴＣＡで２回洗浄し、最後に１００％エタノールで洗浄した。乾燥したフィルターを、シンチレーション液で満たしたシンチレーションバイアルに移した。ＴＣＡ沈殿物カウントにおける３５Ｓメチオニン取り込み量を基に、タンパク質収量を算出した。
【０２２９】
ＩＶＴＴ反応の完了後、反応物を、１６，０００×ｇで約５分間遠心分離した。サンプルを結合バッファー中で１：１に希釈し、結合バッファーで平衡化済の適当量のＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。サンプルをカラム内で約５分間インキュベートし、フロースルーを回収した。次いで、カラムを１０カラム容量の洗浄バッファーで洗浄し、前半分を洗浄物１、後半分を洗浄物２として回収した（各々５カラム容量）。１カラム容量の溶出バッファー１をカラムに添加し、カラムに結合した非特異的タンパク質を溶出した。１カラム容量の溶出バッファー２をカラムに添加し、約３〜５分間インキュベートの後タンパク質を溶出し、１カラム容量の溶出バッファー２で溶出を繰り返した。特異的に結合したタンパク質の全部をカラムから溶出した後、カラムを溶出バッファー３で洗浄した。サンプルをＮｕＰＡＧＥゲル上で泳動した。タンパク質を含有する溶出液をプールし、透析バッファーにより数時間透析した。Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ試薬を用いてタンパク質濃度を測定し、質量分析法により標識アミノ酸の取り込みパーセンテージを測定した。
【０２３０】
例えばＮａＣｌ及びＤＴＴのようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦに適合しないバッファー成分を除去するため、滴下透析法によりサンプルを０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）によりバッファー交換した。次に、バッファー交換したサンプルを、５０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ中に溶解した過飽和シナピン酸をマトリクスとして使用して、ＶＯＹＡＧＥＲ−ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ装置（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上で分析した。サンプルを、Ｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｓ−ＩＶ及びＩｎｖｉｔｒｏｍａｓｓ−３０ｋＤａに対して内的及び外的に校正した。
【０２３１】
１０ｎｇ／ｍＬ  トリプシン（シークエンシング等級の修飾トリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む２０ｍＭ  重炭酸アンモニウム（ｐＨ８．０）中で、サンプルを３７℃にて３０分間消化した。タンパク質の分解後、Ｚｉｐ−Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用したＣｌ８逆相抽出により、サンプルを濃縮した。溶出液をステンレス鋼ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳサンプルターゲット上に堆積させ、ＭａｘＩｏｎ  ＡＣ  ＭＡＬＤＩマトリクス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：１で混合した。
【０２３２】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＳＴＲ機器を使用し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。全てのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルは、加速電圧２０ｋＶ、遅延時間５０〜２５０ｎｓｅｃ、１スペクトルにつき３００のレーザーショット、レーザー強度１５００〜１７００、デジタイザー縦軸設定５００ｍＶにて、正反射モード（指定する場合を除く）で取得した。ＩｎｖｉｔｒｏＭａｓｓ  ＬＭＷ  ｃａｌｉｂｒａｎｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、スペクトルを外的又は内的に較正した。消化されたカルモジュリン及びＳＵＭＯタンパク質のペプチド質量フィンガープリントを、Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。同位体比測定器（ＣｈｅｍＳＷ）を使用し、重同位体の取り込み量を計算した。
【０２３３】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  ＳＴＲ装置を使用し、未処理タンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。線形モードにおける一定のレーザー強度１９９８の設定により、分析を行った。サンプルを、５０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）中のシナピン酸（Ｓｉｇｍａ）飽和溶液を用い１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。
取り込みパーセンテージの計算式：
取り込み＝標識時ピーク強度／（対照ピーク強度＋標識時ピーク強度）
標識ペプチドに対する１５Ｎアルギニンの取り込み（％）＝１００／（２５＋１００）＝８０％
【０２３４】
酢酸カリウム又はグルタミン酸カリウムを含む２．５×ＩＶＰＳ  ＮＭＲバッファー
ＩＶＰＳバッファー中の一成分、グルタミン酸カリウムは、タンパク質の高発現を補助する。系内のグルタミン酸カリウムは、反応液中に遊離グルタミン酸を放出する。グルタミン酸は、グルタミン及びアスパラギン酸の前駆体である。この化合物の存在により、タンパク質の１３Ｃ／１５Ｎアスパラギン酸、１３Ｃ／１５Ｎアスパラギン、１３Ｃ／１５Ｎグルタミン酸又は１３Ｃ／１５Ｎグルタミンによる標識が困難となる。この問題を克服するため、本発明者等は、タンパク質収量を低下させない、グルタミン酸カリウムの代替化合物を数々試験した。本発明者が試験した化合物のほとんどは、タンパク質収量を有意に低下させるものであった。酢酸カリウムは、グルタミン酸カリウムを置換する一選択肢であったが、タンパク質収量はグルタミン酸カリウムよりも５０％低かった。
【０２３５】
グルタミン酸塩をベースとする系
二種のＳＵＭＯペプチドについて、グルタミン酸カリウムベースのバッファーを使用した際の、安定な同位体の該ペプチドへの取り込みの程度を試験した。
【０２３６】
１５Ｎ−Ｇｌｕ
ＳＵＭＯ４７−５４ペプチド（質量ピーク９６５．４）は、そのアミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号：２）内に一つのＧｌｕ残基を含む。
【０２３７】
グルタミン酸塩の存在下、１５Ｎ  Ｇｌｕの取り込みは全く検出されなかった（取り込み０％）。
【０２３８】
１５Ｎ−Ｇｌｎ
ＳＵＭＯ７２−１０９ペプチド（質量ピーク４２２９．１）は、そのアミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：３）内に、三つのＧｌｎ残基を含む。
【０２３９】
グルタミン酸塩の存在下、１５Ｎ  Ｇｌｎの取り込みは全く検出されなかった（取り込み０％）。
【０２４０】
酢酸塩をベースとする系
ＣＡＬＭＬ３ペプチドについて、酢酸カリウムベースの組成物を使用した際の、安定な同位体の該ペプチドへの取り込みの程度を試験した。
【０２４１】
１５Ｎ−Ｇｌｕ
４７−５４ＣＡＬＭＬ３ペプチド（質量ピーク９６５．５２４２）は、そのアミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号：４）内に一つのＧｌｕ残基を含む。
【０２４２】
反応に１５Ｎ−Ｇｌｕを使用した際、通常のピークの一部（ｍ／ｚ＝９６５．５２４２）は、１５Ｎの取り込みを原因として、１ダルトン（＋１Ｄａ）「シフト」した（ｍ／ｚ＝９６６．５２３８）。取り込みパーセンテージは、グルタミン酸塩の不在下、３５％であった（取り込み３５％）。
【０２４３】
４８−５５ＣＡＬＭＬ３ペプチド（質量ピーク９６６．５３８０）は、アミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号：５）内に一つのＧｌｕ残基を含む。
【０２４４】
反応に１５Ｎ−Ｇｌｕを使用した際、通常のピークの一部（ｍ／ｚ＝９６６．５３８０）は、１ダルトン（＋１Ｄａ）だけシフトした（ｍ／ｚ＝９６７．５３４４）。取り込みパーセンテージは、グルタミン酸塩の不在下、３５％であった（取り込み３５％）。
【０２４５】
１５Ｎ−Ｇｌｎ
ＣＡＬＭＬ３  ５６−６４ペプチド（質量ピーク１０６３．５２１）は、そのアミノ酸配列：Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号：６）内に一つのＧｌｎ残基を含む。
【０２４６】
反応に１５Ｎ−Ｇｌｎを使用した際、通常のピークの一部（ｍ／ｚ＝１０６３．５２１）は、１５Ｎの取り込みを原因として、１ダルトン（＋１Ｄａ）「シフト」した（ｍ／ｚ＝１０６４．５７５９）。取り込みパーセンテージは、グルタミン酸塩の不在下、６５％であった（取り込み６５％）。
【０２４７】
Ｓ３０抽出物の透析
標識効率を評価するために、ＳＵＭＯ及びＣＡＬＭＬ３タンパク質の双方を、数種の１５Ｎ標識アミノ酸で標識した。短時間透析したＳ３０（２時間透析したＳ３０）を用いて、１５Ｎアスパラギン、１５Ｎグリシン、１５Ｎチロシン、１５Ｎグルタミン及び１５Ｎグルタミン酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用してＳｕｍｏタンパク質を合成し、取り込みにを評価した。取り込みは、同位体比測定器（ＣｈｅｍＳＷ）分析によれば、各々０％、６５％、６５％、０％及び０％であった。Ｓｕｍｏのペプチド６５−７１（Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ、配列番号：７）を用いて、標識の効率性を比較した。非標識ペプチドは、８８３．５９Ｄａの質量を有する。非標識ペプチドは、一つのグリシン及び一つのチロシンを有する。以上より、標識したペプチドの質量は、８８４．５９Ｄａであると想定される。ＭＳデータは、いずれかのアミノ酸で標識したペプチドの両方に関して、質量ピーク８８４．５Ｄａを示す。グルタミン酸カリウムを含有するＩＶＰＳバッファーを使用して、タンパク質合成を行った。
【０２４８】
Ｓ３０の短時間の透析（２時間透析）により、１５ＮアルギニンはＣＡＬＭＬ３に１００％未満で取り込まれた（８０％：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及び９１％：Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ）。Ｓ３０の延長した透析（２時間透析した後、透析バッファーを交換し、一夜透析する）を、１５Ｎアルギニン（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ）３を含む同一のタンパク質の合成に使用した場合、ほぼ１００％取り込まれた。以上より、１００％の標識を得るために長時間の透析を必要とした。
【０２４９】
実施例９
Ｎ末端タンパク質融合のためのベクター作成
ＩＶＰＳによるタンパク質の発現及び精製用に、数種のベクターを形成した。全構築物をＤＮＡシークエンシングにより確認した。この実施例では、目的のクローニングタンパク質のアミノ末端に、一種又は二種以上の目的の融合タンパク質要素が融合されているベクターの作成について説明する。
【０２５０】
プラスミドｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ（配列番号：８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を、プラスミドｐＦＫＩ０９０（配列番号：９）の形成を補助するために使用した。プラスミドｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴは、二つの複製開始点（ｆ１  ｏｒｉ及びｐＵＣ  ｏｒｉ）、正の選択用のアンピシリン耐性遺伝子、及びクローニングカセットを含む。クローニングカセットは、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）に対して操作可能に結合したＴ７プロモーター、開始コドン（ＡＴＧ）、Ｈｉｓタグ配列（６×Ｈｉｓ）、Ｘｐｒｅｓｓ（商標）エピトープ（Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、配列番号：１０）、エンテロキナーゼ（ＥＫ）切断部位、ａｔｔＲ１部位、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）、ｃｃｄＢ遺伝子、及びａｔｔＲ１部位を、この順序で含む。ａｔｔ部位は、部位特異的組み換えによってａｔｔＲ１部位とａｔｔＲ２部位間のベクターのセグメントが除去され、そのセグメントが目的遺伝子で置き換えられるものであり、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術によるクローニング反応を実施する際に使用される。除去されたセグメント断片は、負の選択に有用なｃｃｄＢ遺伝子も含む。ｃｃｄＢ遺伝子産物は、機能的ｃｃｄＡ遺伝子を欠く細胞を殺傷するため（Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：７３５、１９９２）、ｃｃｄＢ＋ベクターは、ｃｃｄＡ−株、例えば、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ｃｃｄＢ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ（商標）Ｔ１ファージ耐性細胞［Ｆ−ｍｃｒＡ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）  ８０ｌａｃＺＭ１５  ｌａｃＸ７４  ｒｅｃＡ１  ａｒａ１３９  Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ（ＳｔｒＲ）  ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ  ｔｏｎＡ：：Ｐｔｒｃ  ｃｃｄＡ−］（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で増やす。クローニング反応物のｃｃｄＡ＋細胞内への形質転換により、ａｔｔＲ１−ａｔｔＲ２セグメントを保持するベクターが、それらの宿主細胞を殺傷することにより、負の選択によってクローニング産物から除外されることを確実にする。
【０２５１】
ＩＶＰＳ反応において翻訳を向上させる配列を含むｍＲＮＡをもたらすベクター配列は、あるタンパク質の発現を増強する。この実施例で説明したＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの場合、対応するＤＮＡ配列をベクターに添加することにより、発現増強ステムループ構造（Ｐａｕｌｕｓ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ７８、２００４）がｍＲＮＡ内に形成された（図８）。
【０２５２】
二つの異なるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＲＢＳと５’−ＣＣＣＴＴ−３’ＴＯＰＯ（登録商標）充填部位（ｃｈａｒｇｉｎｇ  ｓｉｔｅ）との間の異なるスペーシングを含む５個のＤＮＡ断片を、ｐＥＸＰ２誘導体内のｃｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに隣接してクローニングした。３５Ｓ−Ｍｅｔの存在下、ｐＦＫ１０３２及び他の構築物を使用し、ｃｙｃｌｅ３  ＧＦＰの無細胞合成を行った。発現溶解物をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルで分離し、タンパク質をクマシー染色及びオートラジオグラムにより検出した。３５Ｓメチオニンの取り込みを基に収量を測定し、収量１ｍｇ毎の相対発光単位（ＲＬＵ）を基に特異的活性を測定し、オートラジオグラム上での完全長バンドの密度を基に完全長タンパク質の相対的な量を測定した。図８に示すプラスミドのうち、「ＴＯＰＯ（登録商標）２」の名称のＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ反応にて最適な構築物を確認し、このベクターを使用して更なるベクターを作製した。
【０２５３】
プラスミドｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴは、ＰＣＲ鋳型として機能した。最初にプライマーＴＡ−ＩＮ−Ｆ（配列番号：１７）及びＴＡ−Ｂ（配列番号：１８）を使用し、次にプライマーＯＵＴ−Ｆ（配列番号：１９）及びＴＡ−Ｂ（配列番号：１８）を使用して、ＰＣＲ断片をタンデムに増幅した（表７）。得られたＰＣＲ断片をＸｂａＩ及びＢｃＩＩで消化し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで既に処理したｐＵＣＴ７ＧＦＰ内にクローニングした。続いて、得られたプラスミドからの２個のＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩを使用した２サイクルの制限酵素処理及び自己ライゲーションにより除去し、プラスミドｐＦＫＩ０９０（配列番号：９）を得た。
【０２５４】
本願に記載の試験において、Ｈｉｓタグに対する２種の抗体を使用した。抗ＨｉｓＧは、Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｇ（配列番号：３７）（タンパク質の任意の箇所に発生）を認識する抗体であり、認識はグリシンに依存し、一方で、抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体はカルボキシ末端のＨ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−Ｈ−（ＣＯＯＨ）（配列番号：３８）を認識し、認識はカルボキシル基に依存する。抗ＨｉｓＧ及び抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体の両方、並びにその様々な標識誘導体は、市販（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）されている。抗ＨｉｓＧはＣ末端Ｈｉｓタグを認識しないため、本願に記載する実験ではＮ末端Ｈｉｓタグを検出するために使用される。
【０２５５】
抗ＨｉｓＧによる、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含む目的のクローニングタンパク質の検出を可能にするため、グリシンのコドンをｐＦＫＩ０９０内の６×Ｈｉｓコード配列に隣接して導入し、ｐＦＫＩ０９０内の１００ｂｐ  ＸｂａＩ−Ｂｓｕ３６１断片を、プライマーｐＥＸＰ１−ＴＯＰＯ（登録商標）−ＦＯＲ（配列番号：２０）及びｐＥＸＰ１−ＴＯＰＯ（登録商標）−ＲＥＶ（配列番号：２１）を用いてｐＦＫＩ０９０から増幅したＤＮＡ断片と交換した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩ及びＢｓｕ３６１で処理し、ＸｂａＩ及びＢｓｕ３６１で同様に処理したｐＦＫＩ０９０バックボーンＤＮＡ内にライゲーションし、プラスミドｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：３９）を作製した。
【０２５６】
図８は、図９に示すｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内のコード配列を示す。効果的なＴＯＰＯ（登録商標）−ＴＡクローニングは、上述したように、ｃｃｄＢ遺伝子を排除して負の選択を可能にすると考えられる。この構築物は、２１個のアミノ酸のみを目的の遺伝子のＮ末端上に追加し、プロテアーゼ（ＴＥＶ）切断後、追加の２個のアミノ酸のみを合成産物上に残留させる（図９Ｂ及び図９Ｃ）。これはｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴベクターと比較して有利であり、該ベクターは、ベクターから発現させた際、目的タンパク質に余分な５１個のアミノ酸を付加し、プロテアーゼ（ＥＫ）切断後でさえも最終的なタンパク質産物中に追加の１９個のアミノ酸を残留させる。
【０２５７】
（表７）Ｎ末端及びＣ末端ベクターの構築に使用するオリゴヌクレオチド
2008514240.tif 000008
＊これらのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、５’−リン酸化及びＨＰＬＣ精製済みのものを購入した。
【０２５８】
実施例１０
ｐＥＸＰ−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）を使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニング
ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを使用した、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングの一般的な工程図を図１０に示す。ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを用いたＴＯＰＯ（登録商標）クローニングの幾つかの実施例を、以下に示す。
【０２５９】
ＴＯＰＯ（登録商標）充填
プラスミドｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（１００μｇ）を、５０℃で１６時間、最終液量５００μＬにて、１００Ｕの制限酵素ＢｆｕＡ１（ＮＥＢ）で完全に消化した。８０μＬの４Ｍ  ＬｉＣｌ及び１ｍＬのエタノールを添加し、ＤＮＡをエタノール沈殿した。この混合液を−８０℃で１０分間インキュベートし、４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１００μＬの無菌水に再懸濁した。
【０２６０】
各断片１．８ｐｍｏｌに相当する消化ＤＮＡ５μｇを、以下のようにＴＯＰＯ（登録商標）アダプテーションに使用した。最初に、消化ＤＮＡ（配列番号：４０）を、リン酸化し、かつＨＰＬＣ精製したアダプターオリゴヌクレオチドとライゲーションした。オリゴヌクレオチドを最初に１００℃で２分間インキュベートした。ライゲーション反応液は、５μｇの消化プラスミド、３．２ｎｍｏｌ（約１７μｇ）のリン酸化及びＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドＩＤＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）−Ｂ−ＴＡ−Ｆ、８００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、５μＬの１０×リガーゼバッファー（ＮＥＢ）を含み、無菌水を５０μＬとなるまで添加した。反応を室温で３０分間行った。次に、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、原則的にメーカーの指示に準拠し、遊離オリゴヌクレオチドを除去した。ＤＮＡを５０μＬの無菌水で溶出し、ワクシニアＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩを充填した。以下の試薬を、総反応液量５０μＬにて、所定の順序で加えた（表８）。
【０２６１】
（表８）ＴＯＰＯ（登録商標）充填反応
2008514240.tif 000009
【０２６２】
ＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼ反応物を、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、６μＬの１０×Ｓｔｏｐ  ＴＯＰＯ（登録商標）バッファーを添加し、反応物を室温で５分間インキュベートした。ＴＯＰＯ充填ＤＮＡをゲル精製し、他のＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに関するメーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に準拠し保存した。
【０２６３】
ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング
ベクターのＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングの性能を評価するため、ｌａｃＺαペプチドをレポーターとしてコードするＤＮＡ断片を使用した。この断片のベクター内へのクローニングが成功すると、Ｘ−ｇａｌプレート上にＴＯＰ１０形質転換細胞の青色コロニーを生成する一方、他の構築物では白色コロニーを生成する。充填ＤＮＡを用いた一回のＴＯＰＯ（登録商標）反応により、２，７１２コロニーを生成し、そのうち４４（１．６％）のみが白色であった。ほぼ全て（９８．４％）のコロニーが青色であり、これはすなわち、これらがｌａｃＺを発現し、非常に効率的で正確にクローニングされたことを示す。
【０２６４】
ＰＣＲ断片のＴＯＰＯ（登録商標）−ＴＡクローニングを、ＴＯＰＯ（登録商標）ＴＡクローニングマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示どおりに実施した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び遺伝子特異的プライマーを使用し、ヒトＯＲＦを増幅した。「終止なし（Ｎｏ  ｓｔｏｐ）」Ｃ末端構築物において、逆方向プライマーはＴＡＧ配列を含んでいなかった。端的には、１μＬのＰＣＲ反応物を、１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）ベクター及び１μＬの塩溶液と共に、６μＬの最終反応液量にて、室温で１０分間インキュベートした。得られた構築物でＴｏｐ１０細胞を形質転換し、コロニーＰＣＲによりスクリーニングした（Ｚｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：６９６、１９８９）。次いで、陽性クローンをシークエンシングにより確認した。
【０２６５】
実施例１１
Ｃ末端タンパク質融合用のベクター作製
ＩＶＰＳによるタンパク質の発現及び精製用に、数種のベクターを構築した。全ての構築物をＤＮＡシークエンシングで確認した。この実施例では、目的のクローニングタンパク質のカルボキシル末端側で、一種又は二種以上の所望の融合タンパク質要素と融合されるベクターの作製について説明する。ベクターは終止コドンを含むクローニングにより完全長の目的の天然タンパク質を生成する選択肢を研究者に与え、又は終止コドンを含ませずにクローニングした場合、Ｃ末端Ｈｉｓタグは、目的タンパク質と８つの追加アミノ酸（ＫＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号：４１）とを含む融合タンパク質の一部として発現されると想定される。
【０２６６】
リボソーム結合部位と開始コドンとの間のベクターのＮ末端配列を解析し、ＴＯＰＯ（登録商標）部位の最良のスペーシングを決定した。プラスミドｐＦＫＩ０３２（配列番号：４２）を、試験構築物を構築するための鋳型として使用し、また対照ベクターとしての役割も果たした。ｐＦＫＩ０３２プラスミドは、Ｔ７プロモーターから終止コドンを有するｃｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子の第一のＡＴＧまでの、天然型Ｔ７配列を有する。終止コドンの後の３’配列は、ａｔｔｔＬ２部位及びＴ７ターミネーターを含む。
【０２６７】
ＲＢＳ及びＴＯＰＯ（登録商標）部位変異体を含むＤＮＡ配列を、上述したようにＰＣＲ変異誘発によりクローニングした。ＴＯＰＯ（登録商標）２バージョン（配列番号：１４）を開始材料として使用し、ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（配列番号：４３）を作製した。端的には、存在する二つのＢｓａＩ部位を除去し、５’及び３’のＢｓａＩ部位、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング部位、及び６×Ｈｉｓ配列を加え、バックグラウンドを低減するために二つのＢｓａＩ部位間の大きい方の断片をクローニングすることにより実施される。
【０２６８】
プライマーＮＭＲＦｏｒ（配列番号：２４）及びＲＴＲｅｖ（配列番号：２５）を用いたｐＦＫＩ０３２（配列番号：４２）プラスミドのＰＣＲにより、ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを作製した（表７）。ＰＣＲ断片は、ＲＢＳ及びＴＯＰＯ（登録商標）２部位変異を含んでいた。１２０ｂｐ断片を、ＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化した後、ゲル精製した。ｐＦＫ１０３２ベクターもまたＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化した。ｐＦＫ１０３２バックボーンを精製し、新しいＲＢＳ及びＥｃｏＲＩ部位を有する１２０ｂｐのＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩ断片とのライゲーションに使用した。陽性クローンの配列確認をし、変異誘発反応の鋳型として使用した。
【０２６９】
望ましくないＢｓａＩ部位をベクターから除去するため、Ｇｅｎｅ  Ｔａｉｌｏｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、存在する二つのＢｓａＩ部位に変異導入した。ＡｍｐＢＳＡＦｏｒプライマー及びＡｍｐＢＳＡＲｅｖプライマー（表７）を使用し、アンピシリン耐性遺伝子内のＳｅｒ１３におけるＴＣＴのコドンをＳｅｒ  ＴＣＡと置換した。４５ＢＳＡＦｏｒプライマー（配列番号：２８）及び４５ＢＳＡＲｅｖプライマー（配列番号：２９）を使用し、未翻訳配列の４５番目の部位に一つのアデニン（Ａ）ヌクレオチドを挿入した。シークエンシングにより二つの突然変異を確認した後、陽性クローンを同定した。
【０２７０】
所望の３’ＢｓａＩ部位、ＴＯＰＯ（登録商標）アダプション部位及び６×Ｈｉｓコード配列を、プライマーＲｅｖＡａｔＩＩ（配列番号：３０）及びＢＳＡＴＡｆｏｒ（配列番号：３２）を用いたｐＣＲＴ７−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、配列番号：４４）によるＰＣＲにより得て、新たに作製したベクターに挿入した。ＰＣＲ産物及び変異型ベクターを、ＥｃｏＲＩ及びＡａｔＩＩで消化した。２４０ｂｐ断片を精製し、調製したバックボーン内にライゲーションした。このステップにより、ａｔｔＢ２部位も除去された。陽性クローンを配列決定し、以降の構築に使用した。
【０２７１】
所望の５’ＢｓａＩ部位及びＴＯＰＯ（登録商標）アダプション部位を挿入するため、ＢＳＡＴＡ（配列番号：３２）及びＮＭＲＦｏｒ（配列番号：２４）プライマーを使用し、ＲＢＳ、ＴＯＰＯ（登録商標）アダプション部位、ＢｓａＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位を含む、ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの最終５’配列を含むＰＣＲ断片を増幅した。１２６ｂｐのＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した後精製し、同じ制限酵素で消化した調製済みのバックボーン内にライゲーションした。陽性クローン（ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）−ＳＭ（配列番号：４５））を単離した。このクローンは、ＥｃｏＲＩカットバック（ｃｕｔ−ｂａｃｋ）部位を含む１８塩基からなる開始断片により分離された２個のＢｓａＩ部位を有していた。より大きい（２７ｂｐ）部分を、ＢｓａＩ部位間に挿入した。ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）の最後から２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ベクターを、ＮＭＲｆｏｒ（配列番号：２４）及びＴＡＥＣＯＲＩ（配列番号：３３）プライマーを用いたＰＣＲ反応の鋳型として使用した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩで消化し、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）−ＳＭのＤＮＡ内にライゲーションした。ＰＣＲ後にコロニースクリーニングを行い、クローンを選択し、その全体を配列決定した。
【０２７２】
このプラスミドｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（配列番号：４２）を図１１に示す。目的遺伝子は、終止コドンと共に挿入してもよい。終止コドンが含まれない場合、Ｃ末端Ｈｉｓタグは、クローニングした目的タンパク質のカルボキシル末端に８個の追加のアミノ酸が追加された形で発現される。
【０２７３】
実施例１２
ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）を使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニング
ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニングの一般的な工程を図１２に示す。ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニングの数個の実施例を以下に示す。
【０２７４】
ＴＯＰＯ（登録商標）充填
プラスミドｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（１００μｇ）を、５００ＵのＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）を用い、４００μＬにて、ＮＥＢバッファー３中で２時間消化させ、直鎖状にした。次いで、５００ＵのＢｓａＩ（ＮＥＢ）を用い、反応物に制限酵素を補充し、５０℃で４時間インキュベートしてベクターを消化した。３Ｍ酢酸ナトリウム４０μＬ、及びエタノール８８０μＬを添加しＤＮＡをエタノール沈殿した。混合物を−８０℃で１０分間インキュベートし、４℃で３０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、６８μＬのＴＥに再懸濁した。大きい断片をイソプロパノール沈殿により除去した。これは３Ｍ酢酸ナトリウム６μＬ、及びイソプロパノール７３μＬを加え、５分間遠心分離する前に、室温で５分間インキュベートすることにより行った。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、無菌水１００μＬに再懸濁した。
【０２７５】
消化したＤＮＡ（配列番号：４７）  １０μｇを、ＴＯＰＯ（登録商標）−アダプテーションに使用した。最初に、調製したＤＮＡをリン酸化及びＨＰＬＣ−精製アダプターオリゴヌクレオチドと一晩ライゲーションさせた。オリゴヌクレオチドを最初に１００℃で２分間インキュベートした。ライゲーション反応は、１０μｇの消化したプラスミド、２５μｇ（２００モル過剰）のリン酸化及びＨＰＬＣ−精製オリゴヌクレオチドＩＤＴ−ＴＯＰＯ（登録商標）−Ｂ−ＴＡ−Ｆ（配列番号：２２）、４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１０μＬの１０×リガーゼバッファー（ＮＥＢ）を含み、無菌水で１００μＬにした。翌日、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、原則的にメーカーの指示に準拠し、遊離オリゴヌクレオチドを除去した。ＤＮＡを５０μＬの無菌水に溶解した。最後に、ＤＮＡにワクシニアＴＯＰＯ（登録商標）イソメラーゼＩを充填した。以下の試薬を、その通りの順序で、総反応容量１００μＬとなるように添加した（表９）。反応物を３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、１１μＬの１０×Ｓｔｏｐ  ＴＯＰＯ（登録商標）バッファーを添加し、反応物を室温で５分間インキュベートした。ＴＯＰＯ（登録商標）充填したＤＮＡをゲル精製し、最終推定濃度２．５μＬ／μｇ（合計１２５０μＬ）に希釈し、他のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの説明書どおり保存した。
【０２７６】
（表９）ＴＯＰＯ（登録商標）充填反応
2008514240.tif 000010
【０２７７】
ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング
ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）構築物を、原則的に上記のとおり完全長タンパク質の発現レベルに関して、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＸＰ４ベクターと比較した。各レーンからの完全長産物のＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒによる解析結果を、各発現構築物内のメチオニンの合計数で割ることにより発現を測定した。ＯＲＦの各対に関して最も高い発現を示したものの数値を標準とし、パーセンテージで表示した。
【０２７８】
全て終止コドンを含むキナーゼクローンＩＯＨ６４１６（１８２６）、ＩＯＨ５２１１（４９１４）、ＩＯＨ６３６８（４５５３）（そのＧａｔｅｗａｙ組み換えに使用したＯＲＦエントリークローンは全て終止コドンを含むため）を、二つのベクターによる発現レベルの比較を行った。ほとんどの場合、総発現レベルは、ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内でほぼ５倍の高い収量を得たＩＯＨ６４１６（１８２６）を除き、同様であった。また、ｐＥＸＰ４産物と比較して、ｐＥＸＰ−ＣＴ産物ではバックグラウンドが少なかった。
【０２７９】
実施例１３
ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターからのタンパク質発現
ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ対ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）の発現レベルの比較
ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターから発現した産物の相対的な品質及び収量を評価するため、異なる６の哺乳動物種由来ＯＲＦを（１）ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にＴＯＰＯ（登録商標）クローニングし、また（２）Ｇａｔｅｗａｙ（商標）技術を用いてａｔｔＬ×ａｔｔＲ組み換えによりｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴベクター内にクローニングした。上記の「供給」法により、無細胞反応を行った。２μＬのサンプルをアセトン沈殿し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。電気泳動の後、ゲルをクマシーブルー染色し、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒのスクリーンに露出した。完全長産物の相対存在量を、ホスファストレージオートラジオグラフィーにより測定し、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴソフトウエア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００可変モードイメージャーにより解析した。
【０２８０】
Ｎ末端構築物からの完全長産物の発現レベル及び量を比較した。各レーンからの完全長産物のホスファイメージャー解析結果を、各発現構築物内のメチオニン数で割ることにより発現レベルを測定した。ＯＲＦの各対に関して最も高い発現を示したものの数値を標準とし、パーセンテージで表示した。
【０２８１】
試験の結果、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターから発現させた場合、試験した６配列のうち四つは、ｐＥＸＰ１から発現した場合と比較し平均２倍高い発現を示した。ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴから発現させた場合は、唯一ＯＲＦ（ＩＯＨ１１０４６）がより高い収量を示し、またもう一つ（ＩＯＨ３５８８）の場合では同等のレベルにて発現した。他のタンパク質、例えばＧＦＰは、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターの場合に有意に高発現した（図示せず）。また、実際、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターから発現させた全配列において、ｐＥＸＰ１から発現したものと比較し、切断産物又は不完全産物の産生が少なかった。
【０２８２】
ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）及びｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにおける発現比較
ベクターｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（ＣＴ）及びｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）（ＮＴ）を、ＣＡＬＭＬ３、ＩＯＨ６４１６、ＩＯＨ５２１１及びＩＯＨ６３６８タンパク質の発現に使用した。発現プラスミド内にクローニングしたこれらＯＲＦを用いてインビトロ合成反応において合成したタンパク質を、４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ビス／トリスゲルで電気泳動し、ゲルをオートラジオグラフィーし、タンパク質レベルを分析した。図１３は、ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）又はｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）からの四つのＯＲＦの発現レベルを比較するグラフを示す。
【０２８３】
新しいＴＯＰＯ（登録商標）ベクター内にクローニングした様々なＯＲＦの発現レベルの試験において、幾つかの遺伝子はＮ末端ベクター内で良好に発現する一方、他の遺伝子はＣ末端の場合に良好に発現することが観察された。タンパク質の発現レベルは、タンパク質依存性であることが公知であり、単に６×Ｈｉｓタグのようなコード配列を一端から他端へ移動するだけでも、全ての場合においてタンパク質収量に劇的な効果を与えうる。ＣＡＬＭＬ３を除き、タグの移動により発現レベルの強い差異が観察された。全ての場合において、ＣＡＬＭＬ３  ＯＲＦは、終止コドンと共にＣＴ−ベクター内にクローニングされ、発現レベルは、Ｎ末端タグを有する融合タンパク質と、６×Ｈｉｓタグを有さないタンパク質との間で比較した。
【０２８４】
実施例１４
タンパク質の検出及び精製
アミノ末端融合タンパク質（ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標））の検出及び精製
Ｈｉｓ６タグ及びニッケル樹脂によるタンパク質の検出及び精製を、ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターからインビトロ発現させたタンパク質に関して行った。Ｎ末端ベクターの場合、合成した産物をＴＥＶプロテアーゼで処理してＨｉｓ６タグを除去し、この除去を、それが未使用Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂へ結合しないことにより確認した。
【０２８５】
ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターから発現させた６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質の精製において、合成ＧＦＰを含有する１００μＬのＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ反応物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上に直接チャージした。チャージしたサンプル２μＬ、フロースルー、３つの洗浄画分（Ｗ）及び３つの溶出画分（Ｅ）を分析した。サンプルを４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルにて電気泳動し、これをクマシーブルー染色した。その結果、サンプル中のほとんどのタンパク質が樹脂に結合せず、そのためフロースルー中に存在することが示された。しかしながら、Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、３回の洗浄の間結合した状態で保持及び残留し、第一の溶出時に遊離した。次の溶出では、（存在した場合）非常に少量のタンパク質が含まれ、Ｈｉｓタグ付きタンパク質は一回の溶出で効率よく遊離したことが示された。
【０２８６】
ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターから調製されたタンパク質産物はまた、ＴＥＶプロテアーゼにより効率良く切断された。ＧＦＰを含むｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）構築物によるＩＶＰＳ反応由来のサンプルをカラムにチャージし、最初のフロースルー、５ｍＭイミダゾールによる２回の洗浄、及び２０ｍＭイミダゾールによる２回の洗浄においてサンプルを採取した。タンパク質を、２００ｍＭイミダゾールにより溶出した。溶出したタンパク質をＴＥＶプロテアーゼで消化したところ、効率良いタンパク質分解が見られたＴＥＶ処理したタンパク質は、第二のＰｒｏＢｏｎｄ（商標）カラムに捕捉されず、予想通りのＨｉｓ６タグの除去が示された。
【０２８７】
カルボキシル末端での融合タンパク質（ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標））
プラスミドｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＣＡＬＭＬ３（終止コドンなし）を、２００μＬのＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ−Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ反応にて発現させた。２５μＬの反応物を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に直接チャージした。カラムを３回洗浄し、結合したタンパク質を４画分に溶出した。各画分のサンプルを、二つの４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で分離した。一方のゲルはＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、他方はニトロセルロースに転写し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｒｅｅｚｅ（商標）抗マウス化学発光キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、抗ＨｉｓＣによりプローブした。ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）構築物から生成されたＨｉｓタグ付きタンパク質を検出するために、抗ＨｉｓＣ（Ｃ末端）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体（Ｌｉｎｄｎｅｒ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１４０、１９９７）は、タンパク質のカルボキシ末端のポリヒスチジンアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体である。抗Ｈｉｓ（Ｃ末端）抗体は、配列−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＣＯＯＨを認識し、末端ヒスチジン残基の遊離カルボキシル末端は、エピトープ認識部位の一要素である。その結果、ＣＡＬＭＬ３−６×Ｈｉｓタンパク質がＮｉ−ＮＴＡカラム上で効率良く精製されたことが示された。
【０２８８】
実施例１５
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｍｉｌｌｉｇｒａｍ  ＩＶＴＴキット
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＩＶＰＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、ｍｇ規模のタンパク質を発現させるためのキットを含む。このようなキットには、１）ＩＶＰＳ大腸菌抽出物、２）２．５×ＩＶＰＳ反応バッファー、３）２×ＩＶＰＳ供給バッファー、４）Ｔ７酵素ミックス、５）５０ｍＭ  アミノ酸ミックス（Ｍｅｔ及びＣｙｓを除く）、６）７５ｍＭ  Ｍｅｔ、及び７）７５ｍＭ  Ｃｙｓが含まれる。キットにはヌクレアーゼフリーの蒸留水も含まれる。キットにはまた、ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＣＡＬＭＬ３発現対照プラスミドも含まれる。
【０２８９】
キットに用いられる大腸菌抽出物は、細胞溶解に先立ち、抽出物の調製用の細胞を、最終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファー中に再懸濁して調製される。
【０２９０】
２．５×ＩＶＰＳ反応バッファーは、１４５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、４．２５ｍＭ  ＤＴＴ、３．０ｍＭ  ＡＴＰ、２．２ｍＭ  ＵＴＰ、２．２ｍＭ  ＣＴＰ、２．２ｍＭ  ＧＴＰ、８５μｇ／ｍＬ  フォリン酸、７５ｍＭ  アセチルリン酸、５７５ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム、２００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、１．６２５ｍＭ  ｃＡＭＰ、７５ｍＭ  ＰＥＰ、５％ＰＥＧである。
【０２９１】
２×供給バッファーは、１１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８）、３．４ｍＭ  ＤＴＴ、６８μｇ／ｍＬ  フォリン酸、４６０ｍＭ  酢酸カリウム、２８ｍＭ  酢酸マグネシウム、１６０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、４ｍＭ  ＣａＣ１２、１．３ｍＭ  ｃＡＭＰ、９０ｍＭ  グルコース−６−リン酸、及び１ｍＭ  ＮＡＤである。
【０２９２】
幾つかのキットには、クローニングベクターｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）及びｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）も含まれる。幾つかのキットにはコンピテント細胞も含まれる。
【０２９３】
上記キットには、ＩＶＰＳ反応を複数回行うのに十分な試薬が含まれる。
【０２９４】
キットには、取り扱い説明書が含まれる。
【０２９５】
実施例１６
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＮＭＲ  ＩＶＴＴキット
Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）ＩＶＰＳ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、ＮＭＲ分析用の、ＩＶＰＳにて標識され得るタンパク質の発現キットを含む。このようなキットは、１）ＩＶＰＳ大腸菌抽出物、２）２．５×ＩＶＰＳ反応バッファー、３）２×ＩＶＰＳ供給バッファー、４）Ｔ７酵素ミックス、５）各アミノ酸の２００ｍＭ溶液（Ｌｅｕを除く）、及び６）１５０ｍＭ  Ｌｅｕ、を含む。キットにはヌクレアーゼ−フリー蒸留水も含まれる。キットにはまた、ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＣＡＬＭＬ３発現対照プラスミドも含まれる。
【０２９６】
キットに用いられる大腸菌抽出物は、細胞溶解に先立ち、抽出物調製用の細胞を、最終濃度０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するバッファー中に再懸濁して調製される。
【０２９７】
２．５×  ＩＶＰＳ反応バッファーの組成は、１４５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、４．２５ｍＭ  ＤＴＴ、３．０ｍＭ  ＡＴＰ、２．２ｍＭ  ＵＴＰ、２．２ｍＭ  ＣＴＰ、２．２ｍＭ  ＧＴＰ、８５μｇ／ｍＬ  フォリン酸、７５ｍＭ  アセチルリン酸、５７５ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム、２００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、１．６２５ｍＭ  ｃＡＭＰ、７５ｍＭ  ＰＥＰ、５％  ＰＥＧである。
【０２９８】
２×供給バッファーの組成は、１１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ８、３．４ｍＭ  ＤＴＴ、６８μｇ／ｍＬ  フォリン酸、４６０ｍＭ  酢酸カリウム、２８ｍＭ  酢酸マグネシウム、１６０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ、４ｍＭ  ＣａＣ１２、１．３ｍＭ  ｃＡＭＰ、９０ｍＭ  グルコース−６−リン酸、及び１ｍＭ  ＮＡＤである。
【０２９９】
幾つかのキットには、クローニングベクターｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）及びｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）も含まれる。
【０３００】
キットは、ＩＶＰＳ反応を複数回行うのに十分な試薬を含む。
【０３０１】
キットには取り扱い説明書が含まれる。
【０３０２】
別に定義しない限り、本願にて使用する全ての技術及び科学用語は、バイオテクノロジー分野の当業者により一般に理解されている意味である。本明細書にて言及する全刊行物、特許出願、特許及びその他の参照は、その全内容が参照により組み入れられる。一部に齟齬が存在する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
【０３０３】
見出しは読者の理解を補助するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【０３０４】
本願にて引用する全参考文献は、その全内容が参照により組み入れられる。
【０３０５】
本発明の一つ又は二つ以上の実施態様の詳細を、添付の図面及びその下の注記において説明する。本発明の他の特徴、課題及び効果は、本発明の記載から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】供給溶液を用いたインビトロタンパク質合成（ＩＶＰＳ）の典型的な流れを示す。
【図２】緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のリアルタイム発現を示す。
【図３】本発明のＩＶＰＳ系を使用した、各種タンパク質のｍｇ単位での産生を示す。
【図４】ＩＶＰＳに用いる細胞抽出物の調製に使用した界面活性剤の、可溶タンパク質の合成量に与える効果を示す。
【図５】細胞抽出物の調製に使用した界面活性剤の効果を示す。
【図６】細胞抽出物の調製に使用した界面活性剤の効果を示す。
【図７】Ｓ３０ペレットの界面活性剤による抽出物のＩＶＰＳ反応への添加による、タンパク質の合成量に与える効果を示す。
【図８】本発明の幾つかの発現ベクターのクローニングカセット配列、並びにオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示す図である。「ＲＢＳ」の下の下線部の配列はリボソーム結合部位を、二重下線部の文字はＴＯＰＯ（登録商標）配列（５’−ＣＣＣＴＴ）を、「ＡＴＧ」の下の下線部の配列は開始コドンを示す。
【図９】ｐＥＸＰ５  ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを示す。（Ａ）はベクターマップを、（Ｂ及びＣ）はｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）によってコードされるヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。矢印は、グルタミン（「Ｑ」）及びセリン（「Ｓ」）残基との間のＴＥＶ切断部位を示す。ＴＥＶ切断の後、主ポリペプチド鎖に二つの追加的なアミノ酸残基のセリン及びロイシン（「Ｌ」）のみが残る。ＧＯＩは目的遺伝子の略記である。
【図１０】ｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニング法を示す。
【図１１】ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを示す。（Ａ）はベクターマップを、（Ｂ）は終止コドンがＧＯＩに存在しない時に産生されるアミノ配列（ＫＧＨＨＨＨＨＨ）を含む、クローニングカセットのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。
【図１２】ｐＥＸＰ５−ＣＴ／ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターを使用したＴＯＰＯ（登録商標）クローニング法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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