(57)【要約】  本発明は、既知の共重合体グラチラマー（共重合体１としても知られる）及び共重合体１関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象の心血管疾患及び障害を治療又は予防する方法であって、治療有効量の、少なくとも１種類の共重合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記共重合体が共重合体１及び共重合体１関連ヘテロ重合体から選択され、前記共重合体が少なくとも３種類のアミノ酸を含み、前記アミノ酸の各々が以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）アラニン、グリジン、及びバリン；
（ｄ）チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも３つから選択される方法。
【請求項２】
少なくとも１種類の共重合体が、ランダム共重合体、規則的共重合体、及び規則的ペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種類の共重合体が４種類の異なったアミノ酸を含有し、前記アミノ酸の各々が群（ａ）から（ｄ）までのうちの１つから選択されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種類の共重合体が、本質的には、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンからなり、正味で正の全体的電荷を有し、且つ、約２０００から約４００００ダルトンの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種類の共重合体の分子量が約１３０００から約１８０００ダルトンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種類の共重合体の分子量が約１５キロダルトンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種類の共重合体が、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンからなり、グルタミン酸約０．１４、アラニン約０．４３、チロシン約０．１０、及びリジン約０．３３のモル比を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記モル比が、グルタミン酸０．１７、アラニン０．４９、チロシン０．１０、及びリジン０．３８である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記モル比が、グルタミン酸０．１９、アラニン０．６、チロシン０．１０、及びリジン０．４である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記共重合体が酢酸グラチラマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種類の共重合体が、３種類の異なったアミノ酸を含有するターポリマーであり、前記アミノ酸の各々が群（ａ）から（ｄ）から選択されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ターポリマーが、本質的には、３種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）のいずれか１つから選択されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターポリマーが、本質的には、チロシン、アラニン、及びリジンからなり、チロシン約０．００５から約０．２５、アラニン約０．３から約０．６、及びリジン約０．１から約０．５のモル比を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ターポリマーがＹＡＫであり、２０００〜４００００ダルトンの分子量を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項１５】
前記ターポリマーが、本質的には、３種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）のうちの１つから選択されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターポリマーが、本質的には、アミノ酸であるグルタミン酸、チロシン、及びリジンからなり、グルタミン酸約０．００５から約０．３００、チロシン約０．００５から約０．２５０、及びリジン約０．３から約０．７のモル比を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ターポリマーがＹＥＫであり、約２０００〜４００００Ｄａの分子量を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ターポリマーが、本質的には、３種類の異なったアミノ酸からなり、前記アミノ酸の各々が、群（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のうちの１つから選択されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ターポリマーが、本質的には、アミノ酸であるチロシン、グルタミン酸、及びアラニンからなり、チロシン約０．００５から約０．２５、グルタミン酸約０．００５から約０．３、及びアラニン約０．００５から約０．８のモル比を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターポリマーがＹＥＡであり、約２０００〜４００００Ｄａの分子量を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種類の共重合体を含むアミノ酸が、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、並びにＬ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物からなる群から選択されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記規則的ペプチドが、配列番号１〜３２から選択されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類の共重合体が、約１５から約１００アミノ酸を含むランダム共重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種類の共重合体を、少なくとも１種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、前記少なくとも１種類の免疫調節剤が、Ｔｈ１リンパ球の活性又は存在を減弱できる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫調節剤が、α−ＩＬ−４、α−ＩＬ−１２、α−ＩＬ−１８、α−ＩＦＮ−γ、α−インテグリン、及びα−ＣＤ４＋からなる群から選択された抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫調節剤が、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インテグリン、及びＩＦＮ−γからなる群から選択された分子の発現を低減できる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫調節剤が、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、干渉ＲＮＡ、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種類の共重合体と、前記少なくとも１種類の免疫調節剤とを順次に投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種類の共重合体と、前記少なくとも１種類の免疫調節剤とを、実質的に同時に投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１種類の共重合体と、前記少なくとも１種類の免疫調節剤とを、単一組成物中で同時投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種類の共重合体と、前記少なくとも１種類の免疫調節剤とを、別々の組成物中で投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記心血管疾患及び障害が、動脈硬化、アテローム硬化症、及び心筋炎からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記医薬組成物を、経口投与に適した単位剤形に配合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記医薬組成物を、非経口注射に適した単位剤形に配合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種類の共重合体の治療有効量が、約１．０ｍｇから約５００．０ｍｇ／日までの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種類の共重合体の治療有効量が約２０．０ｍｇから約１００．０ｍｇ／日までの範囲である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の共重合体グラチラマー（共重合体１とも呼ばれる）及び共重合体１関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（心血管疾患及び障害）
心筋虚血障害は、心臓の血流が制限されたとき（虚血）、及び／又は心筋への酸素供給が損なわれたとき（低酸素）、その結果、心臓が求める酸素の必要量が供給によって満たされない場合に起こる。動脈硬化に起因する冠動脈疾患（ＣＡＤ）、特にアテローム硬化症は、虚血の最も一般的な原因である。
【０００３】
アテローム硬化症は、米国、ヨーロッパ、及びアジアの一部では、主な死因の１つとなっている。アテローム硬化症は、慢性炎症疾患の多くの特徴を有し、多数の研究において、免疫系、特にマクロファージ及びＴリンパ球の活性化に関連していることが示されている。（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙら、２００１年、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１３（１）：４５−５１）。動脈硬化病変中に存在するＴリンパ球の主要なクラスは、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方において、ＣＤ４＋であり、Ｔｈ１誘導因子であるＩＬ−１２も共に存在する（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙら、同上）。ＣＤ４＋のＴリンパ球は、Ｔｈ１又はＴｈ２系列に分化しうる。Ｔｈ２誘導因子であるＩＬ−１０も存在しているが、これは、はるかにより限定的な様式で存在している（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙら、同上）。動脈硬化病変におけるＴｈ１リンパ球の役割の証拠として、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）ｍＲＮＡ及びタンパク質の検出によって明らかにされるものがある（Ｚｈｏｕら、１９９８年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１７１７−１７２５）。
【０００４】
ａｐｏＥ遺伝子の部位特異的遺伝子破壊を有するマウスは、大動脈弓及び上行大動脈の両方に動脈硬化病変を含む深刻なアテローム硬化症を発症する。これらのマウスは、正常な飼料では約９カ月後に、或いは高脂肪食では若干３カ月後に、動脈硬化病変を発症し、心血管疾患のモデルとして用いられている。しかし、ａｐｏＥ及びＩＦＮ−γに欠失を有する複合ノックアウトマウスは、ａｐｏＥノックアウトマウスと比較して、動脈硬化病変の大きさの実質的な縮小を示した（Ｇｕｐｔａら、１９９７年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２７５２−２７６１）。ＩＦＮ−γ、又はＩＦＮ−γ放出因子であるＩＬ−１２及びＩＬ−１８をａｐｏＥ欠失マウスに注射すると、その結果、アテローム硬化症の進行が起こる（Ｌｅｅら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９：７３４−７４２）。抗体（α−ＣＤ４＋）又はサイトカイン（ＩＬ−４）によって、Ｔｈ１細胞の存在比を低下させることによっても、病変サイズの著しい低減が引き起こされた。これは、Ｔｈ表現型が脂肪性病変の発達に実際に重要であることを示唆している（Ｈｕｂｅｒら、２００１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：２６１０−２６１６）。
【０００５】
アテローム硬化症を治療するための現在利用可能な方法には、カルシウムチャネル遮断薬、β遮断薬、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、血管拡張薬、強心配糖体及び利尿剤、コレステロール低下薬、並びにアポリポタンパク質Ａ−１（アポＡ１）誘導体などの、高血圧を治療するための非特異的な薬物の使用が含まれる。しかし、これらの薬物は、アテローム硬化症に対して非特異的であり、むしろ、高血圧、血管壁の破裂、及び血栓形成など、アテローム硬化症に関連した症候の軽減を目的としたものである。
【０００６】
（共重合体１）
共重合体１（Ｃｏｐ１、酢酸グラチラマーという慣用的化学名でも知られている）は、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｌａ、及びＬ−Ｔｙｒの４種類のアミノ酸で構成された合成ランダム共重合体であり（以下「Ｃｏｐ１」）、多発性硬化症治療用に、ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）という名称で認可されている（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ編集の「Ｔｈｅ  Ｄｅｃａｄｅ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、１８３、１９９８年における、Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍら）。共重合体１は、Ｔｈ細胞に関連した免疫調節効果を有することが実証されている。
【０００７】
Ｃｏｐ１は、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｌｙｓ、及びＬ−Ｔｙｒ残基からなり、ほぼＡｌａ６部分、Ｇｌｕ２部分、Ｌｙｓ４．５部分、Ｔｙｒ１部分というモル比を有する高分子量塩基性合成ランダム共重合体であり、最初に、米国特許第３，８４９，５５０号明細書に、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を治療又は予防するための薬剤として記載された。ＥＡＥは、感受性の動物で誘導できる多発性硬化症（ＭＳ）に類似した疾患である。Ｄ−共重合体１、すなわちＤ−Ｃｏｐ１も記載されており、これは、上記４種類のアミノ酸がＤ−配置を有するもの、すなわち、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｌｙｓ、及びＤ−Ｔｙｒ残基を含有するランダム共重合体である（Ｗｅｂｂら、１９７６年、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：３３３−３３７）。
【０００８】
さらに別のいくつかの障害にもＣｏｐ１が有益な効果を与えることが、最近、動物モデルで見出された。Ｃｏｐ１は、骨髄移植の場合には、米国特許第５，８５８，９６４号明細書に開示されている通り、移植片宿主相関病（ＧＶＨＤ）に現れる免疫拒絶反応を抑制し、実質臓器移植の場合には、国際公開第００／２７４１７号パンフレットに開示されている通り、移植拒絶反応を抑制する。国際公開第２００５／００９３３３号パンフレットは、免疫抑制剤と併せて、共重合体１及び共重合体１関連ランダムヘテロ重合体を含む、移植拒絶反応を予防及び治療するための組成物及び方法を開示する。
【０００９】
国際公開第０１／５２８７８号及び第０１／９３８９３号パンフレットは、Ｃｏｐ１、Ｃｏｐ１関連ペプチド及びポリペプチド、並びにそれによって活性化されたＴ細胞が、グルタミン酸塩の毒性からＣＮＳの細胞を保護し、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）で、ニューロン変性の予防若しくは抑制、又は神経再生の促進を行うことを開示するものである。Ｋｉｐｎｉｓらは、視神経症及び緑内障などの神経変性疾患におけるＣｏｐ１の治療効果について記載している（Ｋｉｐｎｉｓら、２００２年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、８（７）：３１９−２３）。
【００１０】
自己免疫疾患の治療のためのＣｏｐ１並びに関連の共重合体及びペプチドは、本発明と同じ譲受人が指定されている国際公開第００／０５２５０号パンフレットに開示されており、この開示を、参照により、本明細書に完全に開示されているのと同様に、全体として本明細書に組み込む。
【００１１】
背景技術のいかなる部分においても、Ｃｏｐ１及び関連共重合体が心血管疾患及び障害の治療に適しているかもしれないとは、開示も示唆もしていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
アテローム硬化症を含めた心血管疾患及び障害を予防する特異的な手段及びそれを治療する特異的な手段の必要性が存在し、長い間感じられていた。本発明は、この必要性を満たし、さらに、それに関連した有用性を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、免疫調節剤を用いて心血管疾患及び障害を治療する方法を提供する。詳細には、本発明の方法は、限定されるものではないがアテローム硬化症及び心筋炎を含めた心血管疾患及び障害を治療するための、共重合体１及び共重合体１関連ヘテロ重合体又はペプチドを含めた、ランダム共重合体又は規則的共重合体を初めて開示するものである。
【００１４】
本発明は、部分的に、共重合体１がアテローム硬化症の初期発達に予期されていなかった抑制効果を示すという驚くべき発見に基づいている。アテローム硬化症を治療するために現在使用されている薬物の適用は、既に確立されている疾患の治療に限定されており、疾患の発症前若しくは発達の初期に、この疾患を予防するのには使用できないが、本発明に記載のＣｏｐ１及びＣｏｐ１関連ヘテロ重合体の活性は、アテローム硬化症の初期に、その発達を抑制する。さらに、Ｃｏｐ１及びＣｏｐ１関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドの活性は、ＭＨＣの阻害及びＴｈ１からＴｈ２へのサイトカインシフトに関連しており、Ｔｈ１細胞が高レベルであることは、とりわけアテローム硬化症を含めた様々な心血管疾患の存在及び発達に関連していることが当技術分野で知られている。したがって、いかなる特定の理論にも、作用機序にも拘泥するものではないが、Ｃｏｐ１の活性はアテローム硬化症の症候に依存せず、血液中のＴｈ１細胞の相対的な量又は存在に影響を与えるので、Ｃｏｐ１は、アテローム硬化症を予防するのに使用できる。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、それを必要とする対象の心血管疾患及び障害を治療又は予防する方法を提供し、上記方法は、治療有効量の、少なくとも１種類の共重合体を投与するステップを含み、上記共重合体は、共重合体１及び共重合体１関連ヘテロ重合体から選択され、上記共重合体は、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｄ）チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも３つから選択された少なくとも３種類のアミノ酸を含む。
【００１６】
一実施形態によれば、少なくとも１種類の共重合体が、ランダム共重合体、規則的共重合体、及び規則的ペプチドからなる群から選択される。
【００１７】
本発明の様々な実施形態によれば、本発明の方法で使用されるランダム共重合体又は規則的共重合体及びペプチドは、リジン又はアルギニンなどの正電荷を有する、適当な量のアミノ酸を含み、グルタミン酸又はアスパラギン酸などの負電荷を有するアミノ酸を併せて（好ましくはより少ない量で）含み、任意選択で、充填物として働くアラニン、グリシン、又はバリンなどの電気的に中性なアミノ酸を併せ含み、任意選択で、フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンを共に含み、上記任意選択のアミノ酸は、上記共重合体に免疫原特性を与えるように適合されている。
【００１８】
別の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、４種類の異なったアミノ酸を含有し、上記アミノ酸の各々が群（ａ）から（ｄ）までのうちの１つから選択されている。さらに別の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、正味で正の全体的電荷を有し、約２から４０キロダルトンの分子量を有する。代替の実施形態によれば、上記分子量が約１３から１８キロダルトンである。
【００１９】
さらなる実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体がは、アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸約０．１４、アラニン約０．４３、チロシン約０．１０、及びリジン約０．３３というモル比を有する。好ましい実施形態によれば、上記アミノ酸残基のモル比には、グルタミン酸０．１７、リジン０．３８、アラニン０．４９、チロシン０．１という相対的モル比が含まれる。別の好ましい実施形態によれば、前記相対的モル比は、グルタミン酸０．１９、リジン０．４、アラニン０．６、チロシン０．１である。
【００２０】
なおさらなる実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約２０００〜４００００Ｄａである。様々な実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約２０００〜１８０００Ｄａである。特定の実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量が約４５００〜１７０００Ｄａである。一部の実施形態によれば、上記共重合体は、約５０００〜９０００Ｄａの平均分子量を有する酢酸グラチラマーである。様々な実施形態によれば、上記共重合体は、約６０００〜８０００Ｄａの平均分子量を有する酢酸グラチラマーである。
【００２１】
好ましい実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量は、約１３０００〜１８０００Ｄａである。別の好ましい実施形態によれば、本発明の共重合体の平均分子量は、約１５０００Ｄａである。
【００２２】
以上の実施形態が、例示としてのみ提示されていること、そして、上記共重合体及びそれを含む組成物は、第１の態様で定義された上述の一般的な規準が守られるならば、成分及び成分の相対的割合の両方に関して変化しうることは明らかである。
【００２３】
なお別の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、３種類の異なったアミノ酸を含有し、上記アミノ酸の各々が群（ａ）から（ｄ）までから選択されている。これらの共重合体は、ランダム共重合体でも、規則的共重合体でもよく、本明細書ではターポリマーと呼ばれる。一実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、３種類の異なったアミノ酸からなるランダムターポリマー又は規則的ターポリマーを含み、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった１つから選択されている。
【００２４】
別の実施形態によれば、前記共重合体は、グルタミン酸約０．００５から約０．３００、チロシン約０．００５から約０．２５０、及びリジン約０．３から約０．７のモル比の、グルタミン酸、チロシン、及びリジンと、薬学的に許容される担体とを含有する。このターポリマーは、以下ではＹＥＫと呼ばれるが、アラニンを実質的に含まないことが好ましい。
【００２５】
さらなる実施形態では、グルタミン酸、チロシン、及びリジンのモル比が、それぞれ約０．２６対、約０．１６対、約０．５８である。特定の実施形態によれば、ＹＥＫの平均分子量が約２０００〜４００００Ｄａである。他の実施形態によれば、ＹＥＫの平均分子量が約３０００〜３５０００Ｄａである。なお他の実施形態によれば、ＹＥＫの平均分子量が約５０００〜２５０００Ｄａである。好ましい実施形態によれば、ＹＥＫの平均分子量が約１３０００〜１８０００Ｄａである。別の好ましい実施形態によれば、ＹＥＫの平均分子量が約１５０００Ｄａである。
【００２６】
アルギニンをリジンの代わりに、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、或いはフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
【００２７】
代替の実施形態によれば、上記ターポリマーは、３種類の異なったアミノ酸からなり、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった１つから選択されている。
【００２８】
この代替の実施形態によれば、上記少なくとも１種類のターポリマーが、薬学的に許容される担体と共に、チロシン、アラニン、及びリジンを含有し、チロシン約０．００５から約０．２５、アラニン約０．３から約０．６、及びリジン約０．１から約０．５のモル比を有する。このターポリマーは、以下ではＹＡＫと呼ばれるが、グルタミン酸を実質的に含まないことが好ましい。
【００２９】
この代替の実施形態によれば、チロシン、アラニン、及びリジンのモル比が、それぞれ約０．１０対、約０．５４対、約０．３５である。特定の実施形態によれば、ＹＡＫの平均分子量が約２０００〜４００００Ｄａである。他の実施形態によれば、ＹＡＫの平均分子量が約３０００〜３５０００Ｄａである。なお他の実施形態によれば、ＹＡＫの平均分子量が約５０００〜２５０００Ｄａである。好ましい実施形態によれば、ＹＡＫの平均分子量が約１３０００〜１８０００Ｄａである。別の好ましい実施形態によれば、ＹＡＫの平均分子量が約１５０００Ｄａである。
【００３０】
特定の実施形態によれば、アルギニンをリジンの代わりに、グリシン又はバリンをアラニン又はフェニルアラニンの代わりに、或いはトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
【００３１】
なお別の代替の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、３種類の異なったアミノ酸からなるターポリマーを含有し、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｂ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なったメンバーから選択されている。
【００３２】
この代替の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを、チロシン約０．００５から約０．２５、グルタミン酸約０．００５から約０．３、及びアラニン約０．００５から約０．８のモル比で含有するターポリマーと、薬学的に許容される担体とを含む。このターポリマーは、以下ではＹＥＡと呼ばれるが、リジンを実質的に含まないことが好ましい。
【００３３】
この代替の実施形態によれば、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比は、それぞれ約０．２１対、約０．６５対、約０．１４である。ＹＥＡの平均分子量は約２０００〜４００００である。特定の実施形態によれば、ＹＥＡの平均分子量が約３０００〜３５０００Ｄａである。他の実施形態によれば、ＹＥＡの平均分子量が約５０００〜２５０００Ｄａである。好ましい実施形態によれば、ＹＥＡの平均分子量が約１３０００〜１８０００Ｄａである。別の好ましい実施形態によれば、ＹＥＡの平均分子量が約１５０００Ｄａである。アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、グリシンをアラニンの代わりに、そしてフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能である。
【００３４】
本発明の方法で使用される少なくとも１種類の共重合体は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はそれらの混合物で構成されたものでありうる。当業者に公知の通り、ほとんどの天然タンパク質にはＬ−アミノ酸が存在している。しかし、Ｄ−アミノ酸は市販されており、本発明で用いられる共重合体を作製するのに使用される一部又は全てのアミノ酸の代わりに用いることができる。本発明では、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の両方を含有する共重合体の使用、並びに本質的にはＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸のいずれかからなる共重合体の使用が企図されている。
【００３５】
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、約１５から約１００アミノ酸までのランダムポリペプチドでありうる。特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、長さが約４０から約８０アミノ酸までのランダムポリペプチドでありうる。様々な代替の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、６から２５アミノ酸の規則的合成ペプチドである。様々な代替の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体は、１０から２０アミノ酸の規則的合成ペプチドである。なお他の実施形態によれば、本発明の方法で、長さが約１５から約１００アミノ酸、或いは約４０から約８０のアミノ酸までのオリゴマーの形態にある上記ペプチドを用いることができる。
【００３６】
様々な実施形態によれば、上記少なくとも１種類の規則的合成ペプチドが、
【化１】
2008528681.tif 000002
からなる群から選択される。
【００３７】
一実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも１種類の共重合体を、少なくとも１種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、上記少なくとも１種類の免疫調節剤は、Ｔｈ１リンパ球の活性又は存在を減弱できる。別の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の免疫調節剤は、α−ＩＬ−４、α−ＩＬ−１２、α−ＩＬ−１８、α−ＩＦＮ−γ、α−インテグリン、及びα−ＣＤ４＋からなる群から選択された抗体である。なお別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インテグリン、及びＩＦＮ−γからなる群から選択された分子の発現を減少させることができる。さらに別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、リボザイム、干渉ＲＮＡ、及びアプタマーからなる群から選択される。
【００３８】
上記の組合せの薬物は、共に投与してもよく、また、順次に投与してもよい。本発明は、これらの薬剤を実質的に同時に併用投与することを包含し、上記薬剤は、これらの活性物質を固定された比率で有する、経口投与又は非経口投与に適した単一単位剤形であるか、或いは、それぞれが独立的に経口投与又は非経口注射に適した形態でありうる各薬剤用の複数且つ個別の単位剤形であることが明確に理解されよう。さらに、本発明は、別々の投与計画又は交互の投与計画さえ含めた別々の投与も明確に包含することが明確に理解されよう。
【００３９】
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体の治療有効量が、約１．０ｍｇから約５００．０ｍｇ／日までの範囲である。別法では、上記少なくとも１種類の共重合体のそのような治療有効量が、約２０．０ｍｇから約１００．０ｍｇ／日までの範囲である。
【００４０】
一実施形態によれば、上記心血管疾患及び障害は、アテローム硬化症、及び心筋炎からなる群から選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態を本明細書に記述するが、本発明は、本発明の定義に妥当する形態にある、文献に記載のＣｏｐ１を含めた、Ｇｌｕ又はＡｓｐ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はＶａｌ、及びＰｈｅ又はＴｙｒ又はＴｒｐのうちの少なくとも３つからなり、本明細書で定義した通りの、上記アミノ酸残基の相対的モル比と、平均分子量とを有するいかなる合成ランダム共重合体又は規則的共重合体の使用も包含することが理解されるよう。
【００４２】
別の態様では、本発明は、心血管疾患及び障害を予防又は治療する薬物を製造するための、上述した少なくとも１種類の共重合体の使用に関する。
【００４３】
これらの実施形態及びさらなる実施形態は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、共重合体１及び共重合体１関連ヘテロ重合体又は規則的ペプチドを含めたランダム共重合体又は規則的共重合体の、心血管疾患及び障害を治療又は予防するための使用に関する。
【００４５】
（定義）
「心血管疾患の治療及び予防」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓の治療と、心臓病などの心血管に関連した他の疾患の予防及び／又は治療とを示す。「心臓病」という用語は、本明細書で使用される場合、心臓又は心筋組織が関与するいかなるタイプの疾患、障害、外傷、又は外科的治療も指す。とりわけ対象となるのは、心筋組織の低酸素及び／又は虚血、並びに／或いは心不全に関連した心臓病である。虚血から発症しうる心臓病の１タイプが再潅流損傷であり、これは、抗凝血剤、血栓溶解剤、又は抗狭心症薬療法が治療に用いられた際、或いは血管形成手術によって、若しくは冠動脈移植によって外科的に心血管系を開く際に起こりうるものなどである。本発明が対象とする別のタイプの心臓病が冠動脈疾患（ＣＡＤ）であり、これは、虚血の一般的原因である、動脈硬化、特にアテローム硬化症から発症しうる。ＣＡＤは、安定又は不安定狭心症などの症候を有し、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）及び突然心臓死を引き起こすことがある。
【００４６】
「アテローム硬化症」という用語は動脈硬化の１タイプであるが、本明細書で使用される場合、この用語は、アテローム硬化症（又は「動脈硬化」）と一般的に定義されるいかなる疾患も指す。「アテローム硬化症」という用語、及び「動脈硬化」という一般名は、本明細書では、動脈壁が肥厚化し、且つ弾性を失う疾患、しばしばコクサッキーウイルスＢと関連しており、さらに上記ウイルスよって誘導される心筋炎を含めた多数の心血管疾患を記述するのに同義的に使用する。アテローム硬化症では、動脈壁表面に、プラークと呼ばれる沈着物の増大を引き起こす過程が起こる。通常、沈着物は、大型若しくは中型の動脈の内膜（血管の最も内側の層）で起こる。プラークは、血液中に存在する脂肪質の物質、コレステロール、細胞廃棄物、線維素、及びカルシウムを含有する。プラークは、動脈を通る血流を部分的又は完全に遮断できるくらいに大きくなりうる。プラークの増大又はプラーク内で起こる破裂によって、血餅が生じることがある。その場から外れたプラーク物質は、身体の他の部分（例えば、脳、心臓、腎臓、及び足）に移動でき、その結果主としてより小さな動脈を通る血流を遮断することによって、組織及び器官に重度の損傷を与える。
【００４７】
「治療有効量」という用語は、心血管疾患及び障害を治療又は予防するという目標を実現するであろう、共重合体の量を認定するものとする。
【００４８】
（本発明を実施するための好ましい形態）
アテローム硬化症の早期徴候は子供でも特定されているが、アテローム硬化症は、しばしば加齢の過程と関連した進行性の複合的な疾患である。アテローム硬化症は、冠状動脈心疾患（ＣＨＤ）、心筋梗塞（ＭＩ）、狭心症、脳血管疾患（ＣＶＤ）、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、下肢及び足への血液の供給不足（跛行）、臓器障害、並びに糖尿病の血管合併症を含めたいくつかの状態の要因となっている。
【００４９】
アテローム硬化症の症候は、初期には微細又は軽微でありうる。この疾患は、特に心臓病の危険性が高い個体で、何年にもわたって検出されずに進行する可能性があり、したがって、アテローム硬化症は「静かな殺人者」と呼ばれている。さらに、病気の冠動脈を有する個体の子供及び兄弟の約半分は、アテローム硬化症の徴候を示しており、この疾患の発症に遺伝的要因が重要な役割を果たしていることを示している。したがって、病気の冠動脈を有する対象の家族の一員など、この疾患を有する危険性の高い対象におけるアテローム硬化症を予防するという未達成の必要性が存在する。さらに、アテローム硬化症を治療するのに通常使用される薬物の大部分は、この疾患に伴う症候を軽減することのみを対象としているので、アテローム硬化症をその初期に治療することを対象とした治療法を求める未達成の必要性が存在する。
【００５０】
本発明は、Ｃｏｐ１、又はＣｏｐ１関連ヘテロ重合体若しくは規則的ペプチドから選択された、治療有効量の共重合体を、それを必要とする対象に、単独で、若しくは免疫調節剤と併せて投与することによって、動脈硬化を予防するか、或いはその初期にこの疾患を治療する新規の方法を提供することによって、背景技術の欠点を克服するものであり、上記共重合体は、以下の共重合体のうちの１つに対応する。すなわち、
Ａ．少なくとも３種類のアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸が、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｄ）チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン
のうちの少なくとも３つから選択されている共重合体；
Ｂ．少なくとも３種類の異なったアミノ酸を含む共重合体であって、上記アミノ酸がそれぞれ、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｄ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
から選択された異なった群から選択されている共重合体：
Ｃ．アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、正味で正の全体的電荷を有する共重合体；
Ｄ．アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸約０．１４、アラニン約０．４３、チロシン約０．１０、及びリジン約０．３４というモル比を有する共重合体１；
Ｅ．アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸０．１７、リジン０．３８、アラニン０．４９、チロシン０．１０というモル比を有する共重合体１；
Ｆ．アラニン、グルタミン酸、リジン、及びチロシンを含み、グルタミン酸０．１９、リジン０．４、アラニン０．６、チロシン０．１というモル比を有する共重合体１；
Ｇ．約２０００〜４００００Ｄａ、好ましくは約１３０００〜１８０００Ｄａの平均分子量を有する、上述の共重合体のいずれか；
Ｈ．約５０００〜９０００Ｄａの平均分子量を有する酢酸グラチラマー；
Ｉ．３種類の異なったアミノ酸を有するターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が群（ａ）から（ｄ）から選択されているターポリマー；
Ｊ．３種類の異なったアミノ酸からなる規則的ターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なった１つから選択されている規則的ターポリマー；
Ｋ．アラニンを実質的に含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを含有し、グルタミン酸約０．００５から約０．３００、チロシン約０．００５から約０．２５０、及びリジン約０．３から約０．７のモル比を有するターポリマーＹＥＫ；
Ｌ．実質的にアラニンを含まず、グルタミン酸、チロシン、及びリジンを、それぞれ約０．２６、約０．１６、約０．５８というモル比で含有するターポリマーＹＥＫ；
Ｍ．上述の通りのＹＥＫであって、約２０００〜４００００Ｄａ、好ましくは約１３０００〜１８０００Ｄａの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、或いはフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるＹＥＫ；
Ｎ．３種類の異なったアミノ酸からなるＹＡＫターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）リジン及びアルギニン；
（ｂ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファン
のうちの異なった１つから選択されているＹＡＫターポリマー；
Ｏ．実質的にグルタミン酸を含まず、チロシン、アラニン、及びリジンを含有し、チロシン約０．００５から約０．２５、アラニン約０．３から約０．６、及びリジン約０．１から約０．５のモル比を有するか、或いは、チロシン、アラニン、及びリジンのモル比が、それぞれ約０．１０対、約０．５４対、約０．３５であるＹＡＫターポリマー；
Ｐ．上述の通りのＹＡＫであって、約２０００〜４００００Ｄａ、好ましくは約１３０００〜１８０００Ｄａの平均分子量を有し、アルギニンをリジンの代わりに、グリシン又はバリンをアラニン又はフェニルアラニンの代わりに、或いはトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるＹＡＫ；
Ｑ．３種類の異なったアミノ酸からなるＹＥＡターポリマーであって、上記アミノ酸の各々が、以下の群、すなわち、
（ａ）グルタミン酸及びアスパラギン酸；
（ｂ）アラニン、グリシン、及びバリン；
（ｃ）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン
のうちの異なるメンバーから選択されているＹＥＡターポリマー；
Ｒ．チロシン、グルタミン酸、及びアラニンを含有し、チロシン約０．００５から約０．２５、グルタミン酸約０．００５から約０．３、及びアラニン約０．００５から約０．８のモル比を有するか、或いは、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのモル比が、それぞれ約０．２１対、約０．６５対、約０．１４であるＹＥＡターポリマー；並びに、
Ｓ．上述の通りのＹＥＡであって、約２０００〜４００００Ｄａ、好ましくは約１３０００〜１８０００Ｄａの平均分子量を有し、アスパラギン酸をグルタミン酸の代わりに、グリシンをアラニンの代わりに、そしてフェニルアラニン又はトリプトファンをチロシンの代わりに用いることが可能であるＹＥＡ。
【００５１】
本発明の方法で使用される以上の共重合体はいずれも、ランダムアミノ酸配列（ランダム共重合体）、規則的アミノ酸配列（規則的共重合体）、又は規則的アミノ酸配列を有するペプチド（規則的ペプチド）を有しうる。
【００５２】
さらに、本発明で使用するための共重合体は、Ｌ−アミノ酸若しくはＤ−アミノ酸、又はその混合物から構成されたものでよい。当業者に公知の通り、ほとんどの天然タンパク質にはＬ−アミノ酸が存在している。しかし、Ｄ−アミノ酸は市販されており、本発明のターポリマー及び他の共重合体を作製するのに使用される一部又は全てのアミノ酸の代わりに用いることができる。本発明では、Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の両方を含有する共重合体の使用、並びに本質的にはＬ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸のいずれかからなる共重合体が企図されている。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用するためのヘテロ重合体のアミノ酸モル比は、ほぼ共重合体１に好ましいものである。共重合体１のアミノ酸モル比は、グルタミン酸約０．１４、アラニン約０．４３、チロシン約０．１０、及びリジン約０．３４である。特定の実施形態によれば、共重合体１の平均分子量は、約１３０００ダルトンと約１８０００ダルトンとの間である。アテローム硬化症の治療又は予防における共重合体１の活性は、１つ又は複数の以下の置換、すなわち、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸、アラニンの代わりにグリシン、そしてリジンの代わりにアルギニンを用いた場合に残っていると予測されている。
【００５４】
共重合体１は、数カ国において、Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）、酢酸グラチラマーという商品名で、多発性硬化症（ＭＳ）の治療用に認可されている。共重合体１は、軽度の副反応を有するのみで、十分に許容されるものであることがいくつかの臨床試験で実証されている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１：６５、１９９５年）。これらの副反応は、ほとんどが注射部位における軽度の反応であった。
【００５５】
より好ましい、グルタミン酸、アラニン、及びチロシンのターポリマーすなわちＹＥＡの単量体モル比は、約０．２１対、約０．６５対、約０．１４である。
【００５６】
より好ましい、グルタミン酸、チロシン、及びリジンのターポリマー、すなわちＹＥＫの単量体モル比は、約０．２６対、約０．１６対、約０．５８である。
【００５７】
より好ましい、チロシン、アラニン、及びリジンのターポリマーすなわちＹＡＫの単量体モル比は、約０．１０対、約０．５４対、約０．３５である。
【００５８】
本明細書中上記に示した通り、本発明は、規則的なアミノ酸配列（規則的共重合体）を有するヘテロ重合体を包含する。そのようなヘテロ重合体及びペプチドの例が国際公開第００／０５２４９号パンフレットに開示されているものであり、この開示の全内容を、参照により本明細書に組み込む。前記出願書に明示的に開示されている３２種類のペプチドを、本明細書中下記の表１に再現させる。そのようなペプチド及び他の類似のペプチドは、Ｃｏｐ１に類似した活性を有すると予測されている。そのようなペプチド及び他の類似したペプチドも、Ｃｏｐ１関連ペプチド又はポリペプチドの定義に含まれると考えられ、それらの使用は、本発明の一部であると考えられる。
【表１】
2008528681.tif 000003
【００５９】
本明細書で初めて開示された通り、また本明細書中の下記に例示される通り、外因性の酢酸グラチラマーの皮下投与によって、アテローム生成性の食事で飼育されているＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるアテローム硬化症の発達が抑制される。
【００６０】
さらに、酢酸グラチラマーの皮下投与及び経口投与は、アポリポタンパク質Ｅ欠失（ａｐｏＥ−／−）マウスにおけるアテローム硬化症の進行を抑制し、動脈硬化病変を低減する。
【００６１】
ａｐｏＥ−／−マウスは、十分に確立されたアテローム硬化性モデルである。ヒトの動脈硬化病変と同様に、Ｔリンパ球がａｐｏＥ−／−病変中に存在し（Ｒｏｓｅｌａａｒら、１９９６年、Ａｒｔｈｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  １６：１０１３−１０１８）、経口免疫寛容又は免疫化のいずれかによる免疫調節が疾患に影響を与えることが示されている（Ｇｅｏｒｇｅら、２００４年、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．６２：６０３−９）。本発明は、酢酸グラチラマーのアテローム産生抑制効果を初めて開示するものである。酢酸グラチラマーは、臨床現場では現在、多発性硬化症の治療に用いられている。
【００６２】
アテローム硬化症発達の初期における酢酸グラチラマーのアテローム産生抑制効果を確認するために、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの疾患の高脂血症モデル（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙ、同上）、及びａｐｏＥ−／−マウスのアテローム硬化性モデルを用いた。アテローム硬化症に伴うＴｈ１免疫反応が有害であること、そして、Ｔｈ１分化経路を調節することによって、この疾患を治療する新規の薬理学ツールが得られる可能性があることを示す証拠が徐々に蓄積されている。したがって、Ｔｈ１分化経路の既知なホスホジエステラーゼ阻害剤であるペントキシフィリン（ＰＴＸ）を用いた１２週間の治療は、アポリポタンパク質Ｅ欠失マウスにおける動脈硬化病変の大きさを６０％低減することが最近示された（Ｌａｕｒａｔら、２００１年、１０４：１９７−２０２）。実施例に示す通り、ＧＡの毎日投与を、ＧＡの誘導によるＴｈ１からＴｈ２へのシフトに十分な期間である８週間行ったところ、未処置群と比較して、脂肪線条の面積の著しい減少が引き起こされた。アテローム硬化症における免疫調節の様々な側面を調査した最初の試みは、正常固形飼料又はアテローム生成性の固形飼料で飼育された、アポリポタンパク質Ｅ、ＬＤＬ受容体、ＩＬ−１０、又はＩＮＦ−γを欠失したマウスなどの、遺伝学的に免疫無防備状態にされた動物で行われた（例えば、Ｗｈｉｔｍａｎ  ２０００、同上）。しかし、外因的に投与された様々な化合物の、アテローム硬化症の発達への効果に関する一部の調査は、非免疫調節性処置によるアテローム硬化症の低減に注目して、アテローム生成食で飼育された感受性のＣ５７ＢＬ１６Ｊマウス系統のモデルで行われたものであり（Ｇａｒｂｅｒら、２００１年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４２、５４５−５５２；Ｇｏｎｅｎら、２００２〜０３年、７０：２１５−２１８）、血中脂質レベルへの効果がなかったのにもかかわらず、アテローム硬化症の発達が低減していたことを示した。これらの調査では、処置群及び未処置群の両方で血中脂質レベルが上昇していた。
【００６３】
本発明は、アテローム生成食で飼育された感受性マウスにおけるアテローム硬化症を抑制するのに、既存の薬物（多発性硬化症に適応される）と共に免疫調節を用いる併用の概念を実証するものである。この抗アテローム硬化効果は、血漿コレステロールレベル及びＬＤＬレベルがＧＡ処置によって影響されていないという事実にもかかわらず実現された。アテローム生成性の固形飼料を与えられた群における血漿コレステロールレベル及びＬＤＬレベルは、対照群と比較して、有意に上昇していた。この結果、及びアテローム生成食によってマウスの体重が影響を受けなかったという新知見は、以前の知見と一致している（Ｇａｒｂｅｒら、及びＧｏｎｅｎら、同上）。
【００６４】
本発明は、酢酸グラチラマーにアテローム硬化症を予防する可能性があることをさらに開示する。
【００６５】
いかなる理論にも、作用機序にも拘泥するものではないが、大動脈の脂肪線条面積を減少させるＧＡの効果は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するマウスで観測にされたように（Ａｈａｒｏｎｉ、２００１年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７２：５９８−６０５）、ＧＡが、Ｔｈ２サイトカインの分泌を増強させながら、増殖及びＴｈ１サイトカインの分泌の抑制する能力に起因しているのかもしれない。さらに、ＭＳを患っている患者にＧＡを投与すると、ＩＬ−１０レベル及びＩＬ−４レベルの上昇、並びにＩＬ−１２レベル及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）レベルの低下が通常見られる（Ｓａｌａｍａら、２００３年、Ｂｒａｉｎ、１２６：２６３８−２６４７）。Ｔｈ２細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージに発するそのようなＩＬ−１０分泌の増大は、実際に動脈硬化病変の大きさの縮小を引き起こした（Ｖａｒａｄｈａｃｈａｒｙ、同上）。さらに、ＩＬ−１０の過剰発現は、動脈硬化病変の形成を減弱させ、リンパ球及びマクロファージの表現型の変化と関連していた（Ｐｉｎｄｅｒｓｋｉら、２００２年、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．９０、１０６４−１０７１）。したがって、アテローム発生においても、ＧＡの十分に確立された効果である、ＩＬ−１０発現を増大させることによる局所的又は全身的な潜在的治療効果があると推定できる。ＧＡによって増強される別のＴｈ２サイトカインであるＴＧＦ−β（Ａｈａｒｏｎｉ、同上）も、アテローム硬化症に影響を与える役割を果たしている可能性がある。ＴＧＦ−βの免疫活性の１つは、ＣＤ４＋エフェクター経路を調節することであると提案されており、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｈ１タイプ反応の減弱を証拠としている（Ｋｏｇｌｉｎら、１９９８年、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．８３：６５２−６６０）。さらにこれから、結論として、ＴＧＦ−βの免疫調節効果は、アテローム硬化性の状態における炎症反応を調節するものかもしれないと提案されている。
【００６６】
（併用療法）
様々な実施形態によれば、本発明の方法は、少なくとも１種類の共重合体を、少なくとも１種類の免疫調節剤と併せて投与するステップをさらに含み、上記少なくとも１つの免疫調節剤は、Ｔｈ１リンパ球の活性又は存在を減弱できる。別の実施形態によれば、上記少なくとも１種類の免疫調節剤は、α−ＩＬ−４、α−ＩＬ−１２、α−ＩＬ−１８、α−ＩＦＮ−γ、α−インテグリン、及びα−ＣＤ４＋からなる群から選択された抗体である。上記α−インテグリンは、リンパ球の浸潤を防止できるものなら、いかなる分子でもよい。
【００６７】
なお別の実施形態によれば、上記免疫調節剤は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インテグリン、及びＩＦＮ−γからなる群から選択された分子の発現を抑制できる。したがって、上記免疫調節剤は、アンチセンスヌクレオチド配列、センスヌクレオチド配列、短鎖干渉ＲＮＡ、リボザイム、及びアプタマーからなる群から選択されたポリヌクレオチドでありうる。
【００６８】
近年、核酸化学及び遺伝子導入における進歩がきっかけとなって、遺伝子干渉によって疾患を治療する新規のアプローチが生まれた。アンチセンス技術は、遺伝子特異的な干渉を実現するためのプロトコールの中で最も一般的に記載されているアプローチの１つとなっている。アンチセンス戦略では、対象とする遺伝子のメッセンジャーＲＮＡに相補的な、化学量論的な量の１本鎖の核酸を細胞内に導入する。
【００６９】
国際公開第０２／１０３６５号パンフレットは、プロモーター、抑圧する遺伝子の少なくとも１つのアンチセンスヌクレオチド配列及び／又はセンスヌクレオチド配列を含有する組換え体コンストラクトを用いた形質転換による真核生物の遺伝子抑圧の方法を提示している。特定の癌状態のアンチセンスオリゴヌクレオチド治療は、米国特許第５，０９８，８９０号明細書に記載されている。米国特許第５，１３５，９１７号明細書は、ヒトインターロイキン−１受容体の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提示している。米国特許第５，０８７，６１７号明細書は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて癌患者を治療する方法を提示している。米国特許第５，１６６，１９５号明細書は、ＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提示している。米国特許第５，００４，８１０号明細書は、単純ヘルペスウイルスのＶｍｗ６５  ｍＲＮＡにハイブリッド形成でき、さらに複製を阻害するオリゴマーを提示している。米国特許第５，１９４，４２８号明細書は、インフルエンザウイルスに対する抗ウィルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提示している。米国特許第４，８０６，４６３号明細書は、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ（ヒトＴ細胞リンパ指向性ウイルスＩＩＩ型、ＨＩＶとしても知られている）の複製を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、それらを使用する方法とを提示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に投与されており、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関するいくつかの臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが有用な治療手段でありうること、並びに細胞及び動物、特にヒトを治療するための治療計画で、同じものを、有用となるように設計できることが確立されている。
【００７０】
アプタマーは、概ね核酸に結合する非オリゴヌクレオチド標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。アプタマーを生成させるのに適した物質としての１本鎖ＤＮＡの使用が米国特許第５，８４０，５６７号明細書に開示されている。ＤＮＡアプタマーの使用は、ヌクレアーゼ安定性、特に血漿ヌクレアーゼ安定性の増大、及びＰＣＲ又は他の方法による増幅の容易さを含めたいくつかの点で、ＲＮＡより有利である。通常、ＲＮＡは、増幅前に逆転写酵素を用いることによってＤＮＡに変換されるが、この過程は、すべての配列で等しく効率的なものではなく、その結果、選択されたプールから一部のアプタマーが失われる。
【００７１】
ＲＮＡ干渉は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６、１９９８年）を用いるが、ｓｉＲＮＡによって媒介された、動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。植物における対応する過程は、通常、転写後遺伝子サイレンシング又はＲＮＡサイレンシングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングの過程は、外来遺伝子の発現を防止するのに使用される、進化的に保存された細胞防衛機構であると考えられており、様々な植物相及び門によって一般的に共有されている。
【００７２】
ＲＮＡ干渉では、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を適用し、そのｄｓＲＮＡが、それに対応する遺伝子の発現を減少させる。ＲＮＡｉの現象は、その後、多くの生物に存在し、天然に存在する細胞過程であることが証明された。国際公開第００／０１８４６号パンフレットは、特異的なｄｓＲＮＡ分子を用いて、細胞に特定の表現型を与える原因となる特定の遺伝子を同定する方法を開示する。国際公開第０１／２９０５８号パンフレットは、ｄｓＲＮＡによって媒介されるＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子を開示する。国際公開第９９／０７４０９号パンフレットは、特定の抗ウイルス薬と併用される、特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特異的な組成物を開示する。国際公開第９９／５３０５０号パンフレットは、ある特定のｄｓＲＮＡを用いて、植物細胞内の核酸の形質発現を低下させる特定の方法を開示する。国際公開第０１／４９８４４号パンフレットは、標的生物における遺伝子サイレンシングを容易にするのに使用する特定のＤＮＡコンストラクトを開示する。
【００７３】
国際公開第０２／０５５６９２号、第０２／０５５６９３号パンフレット、及び欧州特許第１１４４６２３号明細書は、ＲＮＡｉを用いて、遺伝子発現を抑制する方法を開示する。国際公開第９９／４９０２９号、第０１／７０９４９号パンフレット、及びオーストラリア特許第４０３７５０１号明細書は、ｓｉＲＮＡ分子を発現する特定のベクターを開示する。米国特許第６，５０６，５５９号明細書は、ＲＮＡｉを媒介する特定のｓｉＲＮＡコンストラクトを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子発現を抑制する方法を開示する。米国特許第５，６８１，７４７号明細書は、ＰＫＣαの３’非翻訳領域の一部に特異的にハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドを用いてヒト−ＰＫＣαの発現を抑制する方法を開示する。
【００７４】
上記の組合せ薬物は、共に投与してもよく、また、順次に投与してもよい。本発明は、これらの薬剤を実質的に同時に併用投与することを明確に包含し、上記薬剤は、これらの活性物質を固定された比率で有する、経口投与又は非経口的投与に適した単一単位剤形であるか、或いは、それぞれが独立的に経口投与又は非経口注射に適した形態でありうる各薬剤用の複数且つ個別の単位剤形であることが、明確に理解されるよう。
【００７５】
上記共重合体は、当業者が利用できるいかなる手順で作製してもよい。例えば、上記共重合体は、溶液中における所望のモル比のアミノ酸を用いることによって、或いは固相合成手順によって、縮合条件下で生成させることができる。縮合条件には、適切な温度、ｐＨ、及びあるアミノ酸のカルボキシル基を別のアミノ酸のアミノ基に縮合させてペプチド結合を形成させる溶媒条件が含まれる。ペプチド結合の形成を促進させるために、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを用いることができる。側鎖部分、及び一部のアミノ基又はカルボキシル基などの官能基を望ましくない副反応から保護するために、ブロック基を用いることができる。
【００７６】
本発明の共重合体を調製するのに、米国特許第３，８４９，５５０号明細書に開示されている方法を用いることができる。例えば、開始物質としてジエチルアミンを含む無水ジオキサン中、常温で、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタミン酸、及びＮ，Ｅ−トリフルオロアセチル−リジンのＮ−カルボン酸無水物を重合させる。グルタミン酸のγ−カルボキシル基は、氷酢酸中の臭化水素によって非ブロック化することができる。トリフルオロアセチル基は、１Ｍのピペリジンによってリジンから除去する。当業者ならば、所望のアミノ酸、すなわち共重合体１における４種類のアミノ酸のうちの３種類を含有するペプチド及びポリペプチドを生成させるために、グルタミン酸、アラニン、チロシン、又はリジンのうちのいずれか１つが関与する反応を選択的に除去することによって、この方法を改変できることを容易に理解する。米国特許第６，６２０，８４７号、同第６，３６２，１６１号、同第６，３４２，４７６号、同第６，０５４，４３０号、同第６，０４８，８９８号、及び同第５，９８１，５８９号明細書は、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐ−１）を調製する改良法を開示する。この出願の目的では、「常温」及び「室温」という用語は、通常、約２０℃から約２６℃までの範囲の温度を意味する。
【００７７】
上記共重合体の分子量は、ポリペプチド合成中、又は上記ターポリマーが生成された後に調整することができる。上記分子量をポリペプチド合成中に調整するためには、ポリペプチドがほぼ所望の長さに達した時に合成が止まるように、合成条件又はアミノ酸の量を調整する。合成の後に、分子量分別カラム又はゲル上でのポリペプチドクロマトグラフィーなどの利用可能な任意のサイズ選択手順を用い、さらに所望の分子量範囲を収集することによって、所望の分子量を有するポリペプチドを得ることができる。高分子量の分子種を除去するために、これらのポリペプチドを、例えば酸加水分解又は酵素的加水分解によって、部分的に加水分解し、その後精製して、上記酸又は酵素を除去することができる。
【００７８】
一実施形態では、所望の分子量を有する共重合体を、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させて、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを形成させるステップを含む方法によって調製することができる。この反応は、１回以上の試験反応によって予め決定された時間及び温度で行う。試験反応中には、時間及び温度を変化させて、試験ポリペプチドの所与のバッチの分子量範囲を測定する。そのバッチのポリペプチドにとって最適な分子量範囲を与える試験条件を、そのバッチに使用する。したがって、試験反応によって予め決められた時間及び温度で、保護されたポリペプチドを臭化水素酸と反応させるステップを含む方法によって、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドを産生させることができる。その後、ピペリジン水溶液を用いて、所望の分子量プロフィールを有するトリフルオロアセチルポリペプチドをさらに処理して、所望の分子量を有する低毒性ポリペプチドを形成させる。
【００７９】
好ましい実施形態では、所与のバッチからの保護されたポリペプチドの試験試料を、約２０〜２８℃の温度で約１０〜５０時間、臭化水素酸と反応させる。数回の試験反応を行うことによって、そのバッチにとって最良な条件を決定する。例えば、一実施形態では、保護されたポリペプチドを、約２６℃の温度で約１７時間、臭化水素酸と反応させる。
【００８０】
（医薬組成物）
本発明で使用されるランダム共重合体及び規則的共重合体は、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物中に配合することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬及び抗真菌薬、等張剤及び吸収遅延剤、甘味料、並びに同様のものが含まれる。薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤及び接着剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、充填剤、風味剤、甘味剤、並びに緩衝剤及び特定の治療組成物を調製するのに必要となりうる吸収剤など種々の物質を含めた広範な物質から調製することができる。薬学的活性物質と、そのような媒体及び薬剤との併用は、当技術分野で周知である。なんらかの従来の媒体又は薬剤が活性成分と非適合でない限り、治療組成物中でのその使用が企図されている。
【００８１】
したがって、本発明に従った使用に供する医薬組成物は、薬学的に使用できる製剤に活性化合物を加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む１つ又は複数の生理的に許容される担体を用いて、従来の方法で配合することができる。適切な配合は、選択された投与経路に依存する。
【００８２】
注射用には、本発明の化合物を水溶液中、好ましくは、ハンク液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中に配合することができる。経粘膜投与用には、透過させるべき障壁に適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤、例えばＤＭＳＯ又はポリエチレングリコールは、当技術分野で一般的に知られている。
【００８３】
経口投与用の化合物は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と併せることによって、容易に配合することができる。そのような担体は、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及び同様のものとして、患者による経口摂取用に配合するのを可能にする。経口利用するための製剤は、固体の賦形剤を用いて作製でき、任意選択で、この結果得られた混合物を研摩し、必要に応じて適当な補助剤を添加した後に、粉末混合物を加工して、錠剤又は糖衣剤コアを得る。適当な賦形剤は、中でも、ラクトース、ショ糖、マンニトール、又はソルビトールを含めた糖などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容される重合体である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸若しくはアルギン酸塩などの崩壊剤を添加することができる。
【００８４】
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、並びにゼラチン製の密閉軟カプセル、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルク若しくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意選択による安定化剤との混合物中に活性成分を含有できる。
【００８５】
軟カプセル中では、活性化合物を、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体中に溶解又は懸濁させることができる。さらに、安定化剤を添加してもよい。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に適した製剤中にあるべきである。
【００８６】
口腔内投与用には、組成物は従来の方法によって配合された錠剤又はトローチ剤の形態を取ることができる。
【００８７】
非経口的投与用の医薬組成物は、水溶性型活性成分の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製できる。適当な親油性溶媒若しくは媒体には、胡麻油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなど、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有しうる。上記懸濁液は、任意選択で、適切な安定化剤、又は化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含有しうる。
【００８８】
米国特許第６，２１４，７９１号明細書は、摂食又は吸入を介した、共重合体−１の経口投与によって、多発性硬化症を治療する方法を開示する。共重合体−１が経口的に摂取する場合、それを他の食物形態と混合して、固体、準固体、懸濁液、又はエマルジョン形態で摂取してもよく、また、それを、水、懸濁剤、乳化剤、調味料、及び同様のものを含めた薬学的に許容される担体と混合させてもよい。一実施形態では、経口組成物が腸溶性のものである。共重合体−１は、上述した特定の形態で、吸入又は点鼻薬によって経鼻投与することもできる。さらに、気管又は気管支路の粘膜上皮細胞に共重合体−１を送達するのに、経口吸入を用いることもできる。
【００８９】
本発明の様々な実施形態によれば、上記少なくとも１種類の共重合体の治療有効量は、約１．０ｍｇから約５００．０ｍｇ／日までの範囲である。別法では、上記少なくとも１種類の共重合体のそのような治療有効量が、約２０．０ｍｇから約１００．０ｍｇ／日までの範囲である。
【００９０】
本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために、下記の実施例を提示する。しかし、それらは、いかなる意味においても、本発明の広範な範囲を限定するものと理解するべきではない。当業者ならば、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示されている原理の多数の変形形態及び変更形態を容易に生み出すことができる。
【００９１】
以上の実施形態は概ね筒状の配置を利用しているが、他の形態も本発明の範囲内にあることを当業者ならば理解するであろう。したがって、入口並びに／或いは第１の断面及び／又は第２の断面は、多角形の横断面を有する可能性もあり、その場合、外径の寸法に関して上記に論じた制限は、代わりに外周長に適用されるであろう。
【実施例】
【００９２】
（材料及び方法）
（Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス）
平均体重１９ｇの月齢１４カ月の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（Ｈａｒｌａｎ社）を、ランダムに３つの群（各群に５匹の動物）に分割した。これらの群は、２週間の新環境順応期間に入った。陽性対照である群Ａと、処置群である群Ｂとに、１．２５％コレステロール、０．５％コール酸ナトリウム、及び１５％脂肪を含有するアテローム生成性の高脂肪食（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｅｋｌａｄ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｅｔｓ社、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）ＴＤ８８０５１所在）を与えた。陰性対照である群Ｃは、正常なマウス固形飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ社、標準食）で飼育した。各動物の平均飼料摂取が約５ｇ／日となるように配慮して、固形飼料を供給した（Ｗａｌｋｅｒら、１９９９年、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９、２６７３−２６７９）。飼料及び高圧滅菌水の補給を１日おきに行った。検査期間中すべての動物の体重を毎週計量した。マウスは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅの標準的動物飼育要件に従って通気されたケージ中、温度制御された環境で、１２時間の明暗サイクルの下に飼育した。
【００９３】
新環境順応の後、群Ａ（陽性対照）及び群Ｃ（陰性対照）の動物に、０．２ｍｌのＰＢＳを皮下（ＳＣ）注射で毎日与えた。群Ｂ（処置群）の動物には、ＰＢＳ中にある酢酸グラチラマー（ＧＡ）（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）をＳＣ注射で毎日与えた（０．５ｍｇ／０．２ｍｌ）。すべてのマウスについて、８週間後に眼球後採血を行い、人的に頚椎脱臼させることによって屠殺した。それらの動物の心臓及び上行大動脈を摘出し、ダルベッコのＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でリンスし、脂肪線条形成の評価に使用した。
【００９４】
（ａｐｏＥ−／−マウス）
ａｐｏＥ−／−（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに１０回戻し交雑）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から入手し、特異病原体不在条件下で、正常な固形飼料を与えて飼育した。すべての実験手順を、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ動物飼育委員会の承認の下で行った。
【００９５】
月齢８カ月のａｐｏＥ−／−マウス（１０１匹のマウス）を、各群につき１５匹の７群に分割した（０日目の群は例外；ｎ＝１１）。対照群−時間０（群Ｉ）は、処置前の動脈硬化病変の面積を測定するために、処置を行う前に屠殺した。処置は、８週間の期間にわたって毎日行った。対照群（群ＩＩ）には、ＰＢＳ（０．２ｍｌ）を経口投与した。対照群ＩＩＩには、ＰＢＳ（０．２ｍｌ）を皮下（ＳＣ）注射した。群ＩＶは、ＰＢＳ中のＧＡ（５．０μｇ／０．２ｍｌ）で経口的に処置した。群Ｖは、ＰＢＳ中のＧＡ（２５０μｇ／０．２ｍｌ）で経口的に処置した。群ＶＩには、ＰＢＳ中のＧＡ（０．５ｍｇ／０．２ｍｌ）を皮下（ＳＣ）注射した。群ＶＩＩには、ＰＢＳ中のＧＡ（２．０ｍｇ／０．２ｍｌ）を皮下（ＳＣ）注射した。
【００９６】
（血漿中脂質濃度）
血漿分離を行うために、全血試料を遠心分離し、各群の血漿試料をプールした。Ｋｏｎｅｌａｂ社製３０ｉ自動分析器（Ｋｏｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フィンランド国エスポー（Ｅｓｐｏｏ））を用いて、総血漿コレステロール濃度、並びに低密度及び高密度リポタンパク質コレステロール（それぞれＬＤＬ及びＨＤＬ）濃度を各群で測定した。
【００９７】
（アテローム硬化性脂肪線条領域の定量）
いくつかの改変を有するＰａｉｇｅｎらの方法（Ｐａｉｇｅｎら、１９８７年、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．６８：２３１−２４０）に従って、大動脈における脂肪線条形成の組織学的評価を行った。簡潔には、心筋の頂端２／３を摘出し、液体窒素中で冷却されたイソペンタンを用いて、基底部分をＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ社）中で瞬間冷凍させた。冷凍組織ブロックをクライオスタット上に配置し、上行大動脈の１０μｍ連続切片を収集し、未染色の切片を検査することによって、大動脈洞の最も頭側な部分の位置決定が可能になるまで、電荷コーティングされたＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）ガラススライド上に置いた。この切片が同定された後、４００μｍにわたる上行大動脈をカバーする４０枚の切片を収集した。収集された４０枚の切片を１枚おきにオイルレッドＯ（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ社）で染色し、ヘマトキシリン（Ｍｅｒｃｋ社）染色で対比染色を行い、以降の評価に使用した。オイルレッドＯで染色された脂肪線条領域は、コンピューター顕微鏡面積測定システム（Ｎｉｋｏｎミクロ−マクロシステムｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００；ＮｉｋｏｎデジタルカメラＤＸＭ  １２００  ＣＣＤ；  Ｎｉｋｏｎ  ×２０／０．７５レンズ倍率）及びＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰ用のＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ画像分析ソフトウェアを用いて客観的に測定した。染色総面積（各動物における全２０枚の切片について計算した）は、各動物の切片１枚あたりで平均した。その後、１切片あたりの面積を各群の動物に関して平均し、μｍ２で提示した。
【００９８】
（統計的分析）
Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの体重の比較には、１要因分散分析を用いた。陰性対照群のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（群Ｃ）では、脂肪線条が検出されなかったので、大動脈脂肪線条面積の定量化で得られた結果の統計分析に参加したのは、２つの群（Ａ及びＢ）のみであった。Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６データの分析には、スチューデントのｔ検定を用いた。２つの試料では分散が等しくないと仮定した。結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）で提示し、ｐ≦０．０５を有意であるとした。
【００９９】
ａｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞における病変進行に関する、処置群と対照群との比較には、スチューデントのｔ検定を用いた。
【０１００】
（実施例１．Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの生存率及び体重への酢酸グラチラマー（ＧＡ）処置の効果）
検査開始時に記録された、群Ａ（陽性対照）、Ｂ（処理される）、及びＣ（陰性対照）の平均体重は、それぞれ、１８．８２±１．１２、１８．９６±１．２８、及び１９．１０＋１．１４ｇであった（図１）。検査開始の１０週間後における、群Ａ、Ｂ、及びＣの平均体重は、それぞれ２４．９８±１．９３、２４．２０±０．９４、及び２６．９０±２．１７ｇであった（図１）。したがって、１０週間の検査中における、群Ａ、Ｂ、及びＣの動物の体重増加は、それぞれ、６．１６±２．９３、５．２４±１．４０、及び７．８０±２．２０であった。脂肪線条の発達を較正するために、５匹の追加のマウスをコレステロールの多い飼料で飼育した。検査を開始した後、アテローム生成性の固形飼料で飼育された群Ａ及びＢの動物は、正常なマウス固形飼料で飼育された群Ｃの動物より、平均の体重増加が少なかった。しかし、初期体重にも、１０週間後の体重にも、又は検査中における体重増加にも、統計的な相違は見出されなかった。継続的に体重を低下させた後に、ＧＡで処置されている群Ｂの動物１匹、及び追加のアテローム生成食摂取群のマウス１匹が、それぞれ検査に入ってから５週間後及び６週間後に死体で発見された。ＰＭ分析では、これらの動物におけるいかなる異常も発見されなかった。群Ｂにおける５匹中の４匹の動物と、群Ａ及びＣにおける５匹全部の動物が検査の最後まで残った。
【０１０１】
（実施例２．Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの血漿中脂質濃度への酢酸グラチラマー（ＧＡ）処置の効果）
群Ａ及びＢで測定された総血漿コレステロール濃度は、それぞれ、２６４及び２７９ｍｇ／ｄｌであり、これは群Ｃの２倍を超える高濃度であった（図２）。群Ａ及びＢで測定されたＬＤＬ濃度は、それぞれ１７８及び１８３ｍｇ／ｄｌであり、これは群Ｃの７倍を超える高さであった。群Ａ及びＢで測定されたＨＤＬ濃度は、それぞれ５４及び５１ｍｇ／ｄｌであり、これは群Ｃより低かった（図２）。したがって、アテローム生成食は、コレステロール及びＬＤＬの増加、並びにＨＤＬ濃度の低下を引き起こした。ＧＡ処置は、脂質濃度に影響しなかった。
【０１０２】
（実施例３．Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウスのアテローム硬化性脂肪線条面積への酢酸グラチラマー（ＧＡ）処置の効果）
コレステロールの多い飼料で飼育されていた、群Ａにおける５匹すべてのマウスの大動脈中で脂肪線条が発達していた（図３Ａ）。対照的に、対照群Ｃにおける５匹の動物のいずれにおいても（図３Ｃ）、また、ＧＡで処置された群Ｂで検査の最後まで残っていた４匹の動物のうちの２匹においても（図３Ｂ）、分析された大動脈切片（２０切片）中には脂肪線条が見出されなかった。図４Ａに示されている通り、ＧＡ処置を受け、脂肪線条を有していた２匹のマウスにおける、オイルレッド０で染色され、コンピューター顕微鏡法で定量化された平均面積は、陽性対照群Ａにおける平均面積より有意に（ｐ＝０．０１４）小さかった（４０％のみ）。群Ｂにおける４匹のマウスすべてと比較して計算した場合、脂肪線条の面積の減少は、未処置のマウスと比較して４倍であった（図４Ｂ）。これらの図において、印（＊）は、未処置群との相違が有意であることを示す（ｐ≦０．０５）。
【０１０３】
（実施例４．ａｐｏＥ−／−マウスにおけるアテローム硬化症の進行への酢酸グラチラマー（ＧＡ）処置の効果）
高用量及び低用量のＧＡは、皮下投与されたものも、経口投与されたものも。ａｐｏＥ−／−マウスの体重増加、血漿トリグリセリド（ＴＧ）、及び血漿中コレステロールレベルに影響しなかった（図５〜６）。
【０１０４】
対照群及び処置群の大動脈洞における動脈硬化病変の進行を計算した。群Ｉ（時間０）と比較して、有意な病変面積の増大が群ＩＩＩ（Ｓ．Ｃ．ＰＢＳ）で検出された（９２４２５μｍ２、ｐ＝０．０４６）。経口投与（５０μｇ）又はＳ．Ｃ．投与（５００μｇ）された低用量のＧＡは病変進行に影響しなかったが、経口投与又はＳ．Ｃ．投与の両方で、高用量のＧＡ（それぞれ２５０μｇ及び２ｍｇ）は、対照と比較して、病変領域の進行を実質的に同様に、すなわち、それぞれ３７．７％及び４４．４％抑制した（図７）。
【０１０５】
大動脈のアテローム硬化面積を、以下の群、すなわちＩ（時間０）；ＩＩＩ（Ｓ．Ｃ．ＰＢＳ）；Ｖ、（経口ＧＡ、２５０μｇ）；及びＶＩＩ（Ｓ．Ｃ．ＧＡ、２．０ｍｇ）の対照マウス及び処置マウスで測定した。時間０と比較して、有意な病変面積の増大が、対照Ｓ．Ｃ．群及び経口ＧＡ（２５０μｇ）群で検出された（Ｔｕｋｅｔ検定、Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
Ｓ．Ｃ．投与された高用量のＧＡ（２．０ｍｇ）は、対照群ＩＩＩと比較して、病変領域の進行を有意に（ｔ検定、Ｐ＝０．００９）、５２％抑制した（図８）。
【０１０７】
特定の実施形態に関する以上の記述は、本発明の一般的な性質をかくも完全に明らかにするであろうから、他の者も、現在の知識を適用することによって、過度の実験をせずに、また、一般的な概念から逸脱せずに、そのような特定の実施形態を容易に改変し、且つ／又は様々な適用に適応させることができ、したがって、そのような適応及び改変は、開示された実施形態の等価物の意味及び範囲の中にあると理解されるべきであり、また、そのように意図されている。本明細書に使用された術語又は用語は、限定ではなく、説明を目的としたものであることが理解されよう。開示された様々な機能を実施する手段、物質、及びステップは、本発明から逸脱せずに、様々な代替形態をとることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ＰＢＳ（群Ａ及びＣ；それぞれ円及び三角形）又は酢酸グラチラマー（群Ｂ；正方形）を用いた１０週間の治療中におけるＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの平均体重を示す図である。
【図２】群ＡからＣ（それぞれ黒色、灰色、及び白色）のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスがら得られた血漿試料中の脂質濃度を示す図である。
【図３Ａ】オイルレッドＯで染色された、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（群Ａ）由来の大動脈洞マイクロセクションを示す図である。
【図３Ｂ】オイルレッドＯで染色された、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（群Ｂ）由来の大動脈洞マイクロセクションを示す図である。
【図３Ｃ】オイルレッドＯで染色された、Ｃ５７ＢＬ／Ｊ６マウス（群Ｃ）由来の大動脈洞マイクロセクションを示す図である。
【図４Ａ】オイルレッドＯで染色された、群Ａのマウス由来の大動脈切片の平均面積を示す図である。
【図４Ｂ】オイルレッドＯで染色された、群Ａのマウス由来の大動脈切片の群Ｂと比較した相対面積を示す図である。
【図５】ＰＢＳ又は酢酸グラチラマーを用いた８週間の治療中における、ａｐｏＥ−／−マウスの平均体重を示す図である。
【図６】酢酸グラチラマー又はＰＢＳを毎日投与されたａｐｏＥ−／−マウスから得られた血漿試料中のコレステロール（黒色）及びトリグリセリド（ＴＧ；白色）の濃度を示す図である。
【図７】ＰＢＳ（黒色）、低用量の酢酸グラチラマー（灰色）、又は高用量の酢酸グラチラマー（濃灰色）で処置されたａｐｏＥ−／−マウスの大動脈洞における動脈硬化病変面積の拡大を示す図である。
【図８】ＰＢＳ又は酢酸グラチラマーで処置されたａｐｏＥ−／−マウスの大動脈弁領域における病変の割合を示す図である。
【図１】
2008528681.tif 000004
【図２】
2008528681.tif 000005
【図３Ａ】
2008528681.tif 000006
【図３Ｂ】
2008528681.tif 000007
【図３Ｃ】
2008528681.tif 000008
【図４Ａ】
2008528681.tif 000009
【図４Ｂ】
2008528681.tif 000010
【図５】
2008528681.tif 000011
【図６】
2008528681.tif 000012
【図７】
2008528681.tif 000013
【図８】
2008528681.tif 000014
【配列表】
2008528681000001.app
【国際調査報告】
2008528681.tif 000015