(57)【要約】尿Ｃｙｒ６１タンパク質レベルは、上皮由来の癌（すなわち、乳癌および卵巣癌）を有する患者において上方調節される。したがって、本発明は、上皮由来の癌の予後診断的評価および診断に関する。さらに、尿サンプル中で検出されるＣｙｒ６１タンパク質の量は、疾患状態と相関し、したがって、Ｃｙｒ６１レベルは、癌の存在および転移能力を予測するために使用され得る。したがって、尿中のＣｒｙ６１のレベルを測定することは、患者における癌を診断および予後診断の両方をするために使用され得る、迅速、簡単かつ安全なスクリーニングを提供する。
2008530582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮由来の癌について患者の診断を容易化するための方法であって：
ａ．  該被験体から得られる試験尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルを測定するステップ；
ｂ．  該試験尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルを対照尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルと比較するステップ；
を含み、該対照サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルに比べ、該試験サンプルにおけるより高いレベルのＣｙｒ６１が上皮由来の癌を示す方法。
【請求項２】
上皮由来の癌を有することが疑われる患者、または上皮由来の癌を有する被験体の予後診断的な評価のための方法であって：
ａ．  第１サンプルを得るために該被験体から得られる試験尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルを測定するステップ；
ｂ．  工程（ａ）において決定された該Ｃｙｒ６１のレベルを、同じ被験体からより後の時点で得られた尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルと比較するステップ；
ｃ．  工程（ｂ）の該比較に基づいて患者の予後を評価するステップ；
を含み、該より後の時点の該同じ患者から得られた尿サンプルにおけるより高いレベルのＣｙｒ６１が癌のより攻撃的な形態への進行を示す方法。
【請求項３】
前記上皮由来の癌が、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、皮膚癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群から選択される、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃｙｒ６１のレベルが、以下のステップ：
ａ．  前記試験サンプルまたはその調製物と、Ｃｙｒ６１に特異的に結合する抗体ベースの結合部分とを接触させて、抗体−Ｃｙｒ６１複合体を形成するステップ；および
ｂ．  該複合体の存在を検出し、これにより、存在しているＣｙｒ６１のレベルを測定するステップ；
を含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体ベースの結合部分を、検出可能な標識で標識付けする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識が、放射性標識、ハプテン標識、蛍光標識および酵素標識からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体ベースの結合部分が抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
尿サンプル中のＣｙｒ６１を検出するためのキットであって、尿サンプルを保持するための容器、およびＣｙｒ６１を特異的に結合する少なくとも一つの抗体を含むキット。
【請求項１０】
前記キットが、Ｃｙｒ６１に特異的に結合する二つの抗体を含み、一方の抗体が固相に固定化されており、他方の抗体が検出可能に標識されている、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
更に、使用説明書を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
被験体の治療を指示する方法であって、該方法は、被験体から得られる尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルについて試験される該被験体を得るステップを含み、ここで、臨床医が結果を精査し、もし該被験体の尿サンプルが対照尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルよりもより高いＣｙｒ６１のレベルを有するとき、該臨床医が、該被験体に対し、上皮由来の癌に対する治療を受けるように指示する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／６５４，１１１号（２００５年２月１８日出願）についての米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、患者から得られた尿サンプルにおいてＣｙｒ６１のレベルを評価することにより、上皮由来の癌を診断および予後診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌の生存率における最も重要なファクターの一つは、早い段階での検出である。癌の初期事象を検出する臨床分析は、癌の進行を干渉および阻止する機会を提供する。遺伝子プロファイリングおよびプロテオミクスの発展に伴い、特定の癌を診断および予後診断するために使用することができる分子マーカーまたは「バイオマーカー」の同定がかなり進んできている。例えば、前立腺癌の場合には、抗原ＰＳＡ（前立腺特異抗原）が血液中において検出され得、そして、前立腺癌が存在することを示している。従って、前立腺癌のリスクを負った男性の血液は、ＰＳＡレベルの上昇により、迅速に、容易に、且つ安全にスクリーニングすることができる。
【０００４】
癌の検出分野でかなりの進展があったとは言え、当技術分野には、尚も、臨床的応用において容易に使用することができる、様々な癌に対する新たなバイオマーカーを同定する必要性が依然として存在する。例えば、これまでのところ、容易に検出可能なバイオマーカーを用いて乳癌の診断に利用できる方法は比較的僅かな選択肢しかなかった。ＥＧＦＲの過剰発現は、特にエストロゲン受容体の下方調節と相まって、乳癌患者における予後不良のマーカーである。さらに、乳癌腫瘍組織におけるＣｙｒ６１の上方調節は、特許文献１に記載されているが、Ｃｙｒ６１の検出は侵襲性手順を含み、Ｃｙｒ６１の分析のための尿の使用は、教示されていない。乳癌に対する他のマーカーは、血液中における高レベルのＭ２ピルビン酸キナーゼ（Ｍ２ＰＫ）（特許文献２）、血液中における高レベルのＺＮＦ２１７タンパク質（特許文献３）、および乳癌において新たに同定されたタンパク質であるＰＤＥＢＣの差次的発現を含み、このＰＤＥＢＣの差次的発現は、診断に有用である（特許文献４）。これらのバイオマーカーは代替的な診断方法を提供しているが、広範には使用されておらず、そして多くは、検出のために侵襲性手順を含む。更に、多くの組織化学的マーカー、遺伝子マーカーおよび免疫学的マーカーが使用されているにもかかわらず、臨床医にとっては、依然として、どの腫瘍が他の器官に転移するのかを予測するのが困難である。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００８５０４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３５８，６８３号明細書
【特許文献３】国際公開第９８／０２５３９号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１２４５４３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオマーカーの同定は、疾患の診断、予後診断および治療を改善することと深く関わっている。それ故、当技術分野においては、迅速に、容易に、且つ安全に検出することができる代替的なバイオマーカーを同定する必要性が存在する。そのようなバイオマーカーを、癌を有する被験体の進行または治療を診断し、病期を決定し、モニタリングするために使用することができる。バイオマーカーはまた、器官限局性の癌と転移性の癌との間を識別するためにも使用され得る。
【０００６】
腫瘍増殖および転移は脈管形成依存性であるので、腫瘍の「脈管形成スイッチ」に関与するバイオマーカーは、特に有用である。腫瘍が脈管形成性になる場合、腫瘍は、累進的に拡大し、そして転移性細胞を広げ得る（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ，Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．，Ｃｅｌｌ  ８６：３５３−３６４，１９９６；Ｓｍｉｔｈ−ＭｃｕｎｅおよびＷｅｉｄｎｅｒ  Ｎ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：８００−８０４）。したがって、腫瘍の脈管形成状態へのスイッチングに関与するバイオマーカーの同定は、器官限局性の癌と転移性の癌との間を識別することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、卵巣癌および乳癌を有する患者の尿中にＣｙｒ６１タンパク質が存在し、このような癌の悪性形態を有する患者においてＣｙｒ６１タンパク質のレベルがより高い、という発見に基づくものである。従って、本発明は、上皮由来の癌（例えば乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌および皮膚癌など）の予後評価のための方法、および上皮由来の癌の診断を容易化するための方法を対象とする。治療効力についてのマーカーとしてのＣｙｒ６１もまた、開示される。
【０００８】
詳細には、尿サンプルにおけるＣｙｒ６１タンパク質のモニタリングは、卵巣癌もしくは乳癌の診断を容易にするための一次スクリーニングとして使用され得る；年齢および性別がマッチングされた健常な試験サンプルと比較して、試験被験体由来のサンプルの尿中で検出されるより高い量のＣｙｒ６１タンパク質は、癌を有する患者の指標である。換言すれば、患者が癌を有する可能性の増大が存在する。次いで、診断を確認するためのさらなる試験（例えばマンモグラフィー（乳癌）、超音波、ＰＥＴスキャニング、ＭＲＩもしくは他のあらゆるイメージング技術、生検、臨床検査、ダクトグラム（ｄｕｃｔｏｇｒａｍ））が実施され得る。さらに、時間経過にわたる患者におけるＣｙｒ６１タンパク質のレベルのモニタリングは、および時間経過にわたって発現の増大を見出すことは、癌がその攻撃性を増大していることを示すために使用され得、したがって、この患者は予後不良である。次いで、臨床医は、治療を調整し得る。したがって、尿中のＣｙｒ６１のレベルの測定は、患者における上皮由来の癌（例えば乳癌または卵巣癌）の診断および予後診断の両方に使用可能な、迅速で簡単で安全なスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
理論に縛られることはないが、Ｃｙｒ６１は、脈管形成スイッチに関与すると考えられる。したがって、Ｃｙｒ６１の検出は、癌がより脈管形成性の疾患へとスイッチングされており、したがって、より積極的な治療を必要とすることを示すと考えられる。これの支持において、Ｃｙｒ６１は、上皮間葉遷移（ＥＭＴ）に関与する分子を上方調節することが見出されている（実施例３参照）。ＥＭＴは、重要なプロセスであり、このプロセスにより、上皮細胞は間葉性の線維芽細胞様特性を獲得し、そして細胞間接着の低下および運動性の増大を示す。ＥＭＴ様事象は、腫瘍進行および悪性移行の間に起こり、癌細胞に侵襲性特性および転移性特性を与えると考えられる（Ｌｉｏｎｅｌ  Ｌａｒｕｅｌ  ａｎｄ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｂｅｌｌａｃｏｓａ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，７４４３−７４５４）。
【００１０】
一つの実施形態においては、被験体における上皮由来の癌の診断を容易化するための方法が提供される。その方法は、被験体から得られた試験尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベル測定し、その観察されたＣｙｒ６１のレベルを対照サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルと比較するステップを含む。対照サンプルと比べるときに、試験サンプルに存在するより高いレベルのＣｙｒ６１は、癌の可能性が高いことを示している。好適には、このレベルは、対照のレベルよりも１．５倍、より好適には２倍またはそれ以上である。
【００１１】
好適には、本発明の方法は、上皮由来の癌、特に乳癌および卵巣癌を早期に検出するために用いられる。例えば、被験体は、医師により、年に一度行われる健康診断の際にスクリーニングされ得る。陽性の（Ｃｙｒ６１のレベルが対照のレベルよりも高い）試験結果は、診断的評価をさらに保証する。
【００１２】
「対照サンプル」という用語は、癌を有していないものと確信される一人もしくは複数の「正常」または「健常」な個体から得られた尿サンプルを表す。対照は、当該技術分野において広く知られている方法を用いて選択されてよい。一旦、対照集団でのあるレベルが明確になると、試験尿サンプルから得られた一連の結果をその既知のレベルと直接的に比較することができる。
【００１３】
「試験サンプル」という用語は、上皮由来の癌について試験される患者から得られた尿サンプルを表す。
【００１４】
一つの態様においては、診断されるべき上皮由来の癌は、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌（例えば口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌）、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、および皮膚癌（例えば扁平上皮細胞癌および基底細胞癌）、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに身体の至る所で上皮細胞に影響を及ぼす他の公知の癌である。好ましくは、この癌は、乳癌もしくは卵巣癌である。
【００１５】
本発明はまた、同じ被験体から得られた複数の試験サンプル中に存在するＣｙｒ６１のレベルの評価をも企図し、ここで、時間経過にわたるＣｙｒ６１の量における進行性の増大は、癌腫瘍の攻撃性（例えば、転移能力）の増大を示す。このように、Ｃｙｒ６１のレベルは、疾患状態および疾患段階の予測として寄与する。サンプルは、互いに数日、数週間、または数ヶ月離して採取され得る。
【００１６】
本発明は、更に、上皮由来の癌を有する患者を治療すべく設計された治療計画の治療効力をモニタリングするためのＣｙｒ６１のレベルの評価も想定している。
【００１７】
本発明の一つの態様においては、試験尿サンプル中に存在するＣｙｒ６１のレベルは、試験サンプルまたはその調製物を、Ｃｙｒ６１タンパク質またはその一部に特異的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させることにより測定される。この抗体ベースの結合部分は、検出することができるＣｙｒ６１との複合体を形成し、これにより、Ｃｙｒ６１のレベルを測定することが可能になる。
【００１８】
抗体をベースとしたイムノアッセイは、Ｃｙｒ６１タンパク質のレベルを測定するための好適な手段である。しかし、当業者にとって公知のあらゆる手段を用いてＣｙｒ６１のレベルを評価することができる。例えば、幾つかの実施形態においては、Ｃｙｒ６１の発現レベルは、ＳＥＬＤＩ質量分析法を含め、質量分析法により評価することができる。
【００１９】
別の実施形態においては、被験体の治療を指示するための方法が提供される。その方法は、被験体から得られた尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルについて試験される被験体を得るステップを含み、臨床医が結果を精査し、その尿が対照サンプルにおけるＣｙｒ６１よりも高いＣｙｒレベルを有する場合、臨床医は、その被験体に対し、上皮由来の癌について治療されるように指示する。その試験は、被験体が居住している場所と同じ地域で行われてもよいし、別の地域で行われてもよく、結果は、例えばウェブサイトを通じて利用可能に為され、またはその臨床医に送信される。
【００２０】
本発明の別の態様は以下で開示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、患者の尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルが上皮由来の癌の存在または不在と相関関係があることを発見した。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「上皮由来の癌」という用語は、上皮細胞から生じる癌を表し、これらに限定されないが、乳癌、基底細胞癌、腺癌、消化管癌、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌、結腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌および皮膚癌（例えば扁平上皮細胞癌および基底細胞癌）、前立腺癌、腎細胞癌、ならびに身体の至る所で上皮細胞に影響を及ぼす他の公知の癌を含む。
【００２３】
癌に関する「侵襲性の強い」または「浸潤性の」という用語は、腫瘍がその境界を越えて隣接する組織に広がる性質的傾向を表す（Ｄａｒｎｅｌｌ，Ｊ．（１９９０）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、ＮＹ）。浸潤性の癌は、腫瘍が特定の器官に限定される器官限局性の癌と対照をなすことができる。腫瘍の浸潤特性は、しばしば、タンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼなどの産生を伴い、これらのタンパク質分解酵素は、マトリックス物質および基底膜物質を分解し、腫瘍が、その被膜の境界を越えて広がることを可能にし、また、腫瘍が位置している特定の組織の境界を越えて広がることを可能にする。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「転移」という用語は、癌が発生元の器官から患者の付加的な遠位方向の部位へ拡散する状態を表す。腫瘍が転移するプロセスは多段階事象であり、細胞間マトリックスの局所的な侵襲および破壊、血管、リンパ管または他の輸送チャンネル内への侵入、その循環内における生存、それらの脈管から二次的な部位への管外遊出、および新たな場所での増殖を含む（Ｆｉｄｌｅｒら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２８、１４９−２５０（１９７８）、Ｌｉｏｔｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．４０、２２３−２３８（１９８８）、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  ９４８、１７５−２２４（１９８８）およびＺｅｔｔｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２２、６０５−６１２（１９９０））。悪性細胞の運動性の増大は、動物およびヒトの腫瘍の転移能の増強と関連している（Ｈｏｓａｋａら、Ｇａｎｎ  ６９、２７３−２７６（１９７８）およびＨａｅｍｍｅｒｌｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７、６０３−６１０（１９８１））。
【００２５】
一つの好適な実施形態においては、尿サンプルは、Ｃｙｒ６１タンパク質の分解を防ぐべく処理される。分解を抑制または防止するための方法は、これらに限定されないが、サンプルのプロテアーゼによる処理、サンプルを凍結させること、またはサンプルを氷の上に置くことを含む。好適には、分析する前には、サンプルは、Ｃｙｒ６１タンパク質の分解を防ぐことができるような条件下で恒常的に保持される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「原発腫瘍」は、被験体内における最初の部位において出現する腫瘍であり、原発腫瘍から離れた部位においてその被験体の身体に出現する「転移性腫瘍」と区別することができる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「ＬＣＩＳ」は、インサイチュでの小葉癌を表す。ＬＣＩＳは、小葉性新生物とも呼ばれており、時には、非浸潤型の乳癌として分類されることがある。ＬＣＩＳは小葉の壁部を貫通しない。ＬＣＩＳは、通常、それ自体は浸潤性の癌にならないが、この状態を有する女性は、同じ側または反対側の乳房で浸潤性の乳癌が発現する高いリスクを負っている。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ＤＣＩＳ」は、乳管内癌を表す。乳管内癌は、最も一般的なタイプの非浸潤性乳癌である。ＤＣＩＳの場合、悪性細胞は、乳管の壁部を通じてその乳房の脂肪組織に転移していない。コメド癌は、局所部分切除術後、他のタイプのＤＣＩＳよりも同じ領域で再発しやすいタイプのＤＣＩＳであり、他の形態のＤＣＩＳよりも、最終的な浸潤性乳管癌の発現と深いつながりを有している。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「Ｃｙｒ６１」は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録、Ｇｅｎｐｅｐｔ、Ｏ００６２２およびＡＡＢ５８３１９（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号１）（図２）のＣｙｒ６１タンパク質を表す。Ｃｙｒ６１は、分泌され、そして細胞表面および細胞外マトリックスに結合される、システインリッチなヘパリン結合性タンパク質である。「Ｃｙｒ６１」という用語は、改変体、ホモログ、対立形質型、突然変異型およびそれらの同等物などの種も包含する。
【００３０】
本発明は、患者における上皮由来の癌の診断を容易化するための方法を対象としている。一つの実施形態においては、本方法は、癌を有している疑いのある被験体から得られた試験サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルを測定するステップ、およびその観測されたレベルを、対照サンプル、例えば癌を有していないことが確信される個人の患者または個人の集団から得られたサンプル中において見出されるＣｙｒ６１のレベルと比較するステップを含む。正常な対照サンプルにおいて観測されるレベルよりも高いレベルのＣｙｒ６１は、癌が存在することを示している。Ｃｙｒ６１のレベルはあらゆる任意の単位で表されてよく、例えばデンシトメーター、照度計またはＥｌｉｓａプレートリーダーから得られる単位として表すことができる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「対照サンプルにおけるレベルと比べ、試験サンプルにおけるより高いレベルのＣｙｒ６１」は、対照サンプル中に存在するＣｙｒ６１の量よりも大きなＣｙｒ６１の量を表す。「より高いレベル」という用語は、統計学的に有意なレベル、または対照サンプル中において見出されるレベルを有意に上回るレベルを表す。好適には、「より高いレベル」は、少なくとも２倍大きい。
【００３２】
「統計学的に有意な」または「有意に」という用語は、統計学的な有意性を表し、一般的には、正常なマーカーの濃度を２標準偏差（２ＳＤ）上回るか、またはそれより高いことを意味する。
【００３３】
比較の目的上、試験サンプルおよび対照サンプルは同じタイプのものであり、即ち、尿から得られる。しかし、この対照サンプルはまた、健常個体から得られる尿サンプルにおいて通常見られる濃度と同じ濃度のＣｙｒ６１を含有する標準サンプルであってもよい。
【００３４】
本発明の一つの態様においては、二次的診断ステップが実施されてよい。例えば、もしＣｙｒ６１のレベルが癌の存在を示すものであることが判明した場合、その後に、癌の存在を確認するため、癌を検出する付加的な方法を実施することができる。種々のあらゆる付加的診断ステップを用いることができ、例えばマンモグラフィー（乳癌）、超音波、ＰＥＴスキャニング、ＭＲＩもしくは他のあらゆるイメージング技術、生検、臨床検査、ダクトグラム（ｄｕｃｔｏｇｒａｍ）、またはあらゆる他の方法などを用いることができる。
【００３５】
さらに、個々の患者におけるＣｙｒ６１レベルを追跡することにより、疾患の進行が評価され得る。例えば、患者の状態における変化は、時間経過にわたるその患者におけるＣｙｒ６１発現レベルの変化を比較することによってモニタリングされ得る。Ｃｙｒ６１レベルにおける進行的な上昇は、腫瘍の侵襲および転移についての可能性の増大を示す。
【００３６】
また、本発明の予後診断的方法は、癌を有する患者／被験体に対する適切な治療コースを決定するのにも有用である。治療コースは、癌の診断後または癌の治療後、患者に対して取られる治療的処置を表す。例えば、癌の再発、拡散または患者の生存に関する可能性の決定は、治療に保存的な方法を採用すべきか、もしくは根治的な方法を採用すべきか、または種々の治療法を組み合わせるべきかどうかを決定する上での助けとなり得る。例えば、癌が再発する可能性が高いときには、外科治療に前後して、化学療法、放射線療法、免疫療法、生物学的改変剤療法、遺伝子療法およびワクチンなどを施すことが有利であり得、または患者が治療されるタイムスパンを調節することが有利であり得る。
【００３７】
Ｃｙｒ６１のレベルの測定
Ｃｙｒ６１のレベルは、当業者にとって公知のあらゆる手段により測定されてよい。本発明においては、一般的に、抗体または抗体同等物を用いてＣｙｒ６１レベルを検出することが好適である。しかし、検出のための他の方法を使用することもできる。例えば、Ｃｙｒ６１レベルは、質量分析によってモニタリングされ得る。
【００３８】
一つの実施形態においては、Ｃｙｒ６１タンパク質のレベルは、尿サンプルをＣｙｒ６１またはＣｙｒ６１のフラグメントに特異的に結合する抗体ベースの結合部分と接触させることにより測定される。この後、抗体−Ｃｙｒ６１複合体の形成がＣｙｒ６１のレベルの測定値として検出される。
【００３９】
「抗体ベースの結合部分」または「抗体」という用語は、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性な決定基、例えばＣｙｒ６１または本発明のさらなるバイオマーカーに特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有している分子を含む。この「抗体ベースの結合部分」という用語は、全抗体、例えばあらゆるアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の抗体全体を含めるべく意図されており、また、Ｃｙｒ６１タンパク質と特異的に反応する抗体のフラグメントも含む。抗体は、従来技術を用いてフラグメント化することができる。従って、この用語は、特定のタンパク質と選択的に反応することができる、抗体分子のタンパク質分解作用により切断された部分または組換え技術によって調製された部分のセグメントを含む。そのようなタンパク質分解作用によるフラグメント及び／又は組換え技術によるフラグメントの非限定的な例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびペプチドリンカーによって接合されたＶＬおよびＶＨドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、二つもしくはそれ以上の結合部位を有する抗体を形成するために、共有結合または非共有結合により連結されていてよい。従って、「抗体ベースの結合部分」は、抗体および組換え抗体のポリクローナル、モノクローナルまたは他の精製調製物を含む。更に、「抗体ベースの結合部分」という用語は、ヒト化抗体、二重特異性抗体、および抗体分子から誘導される少なくとも一つの抗原結合決定基を有するキメラ分子を含めるべく意図されている。一つの好適な実施形態においては、抗体ベースの結合部分が検出可能に標識される。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「標識抗体」は、検出可能な手段によって標識された抗体を含み、これらに限定されないが、酵素で標識された抗体、放射活性物質で標識された抗体、蛍光物質で標識された抗体、および化学発光物質で標識された抗体を含む。また、抗体を検出可能なタグで標識することもでき、例えばｃ−Ｍｙｃ、ＨＡ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、Ｖ５またはＨＩＳなどで標識することができる。
【００４１】
Ｃｙｒ６１のレベルを検出するために抗体ベースの結合部分を使用する本発明の診断法および予後診断法において、尿サンプルに存在するＣｙｒ６１タンパク質のレベルは、検出可能に標識された抗体から発せられる信号の強度と相関関係を有している。
【００４２】
一つの好適な実施形態においては、抗体ベースの結合部分は、抗体を酵素に連結することにより検出可能に標識される。次いで、酵素は、その酵素の基質に供されたときに、例えば分光光度計により、蛍光光度計により、または視覚的な手段により検出することができる化学的な部分を生成するような仕方で、その基質と反応するであろう。本発明の抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素は、これらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。化学発光は、抗体ベースの結合部分を検出するために使用することができる別の方法である。
【００４３】
また、検出は、あらゆる他の様々なイムノアッセイを用いて達成することもできる。例えば、抗体を放射活性物質で標識することにより、ラジオイムノアッセイを用いてその抗体を検出することができる。放射性同位体は、ガンマ線カウンターまたはシンチレーションカウンターを使用する方法などにより、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。本発明の目的にとって特に有用な同位体は、３Ｈ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃなどであり、好適には１２５Ｉである。
【００４４】
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光物質で標識された抗体が適切な波長の光に曝露されるときには、蛍光により、その蛍光標識抗体の存在を検出することができる。数ある中で最も一般的に使用されている蛍光標識化合物は、ＣＹＥ染料、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【００４５】
また、抗体は、蛍光発光金属、例えば１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他の金属などで検出可能に標識することもできる。これらの金属は、金属キレート基、例えばジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などを用いて抗体に付着させることができる。
【００４６】
また、抗体は、抗体を化学発光化合物にカップリングさせることにより検出可能に標識することもできる。この後、その化学発光−抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００４７】
上述の如く、Ｃｙｒ６１のレベルは、イムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎｔ）検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射性測定検定法（ＩＲＭＡ）、ウェスタンブロット法または免疫組織化学的検定法などにより検出することができ、それぞれの分析法については以下でより詳しく説明されている。極めて迅速であり得るＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどのイムノアッセイが、一般的にはより好適である。抗体アレイまたはタンパク質チップを使用することもでき、例えば米国特許出願第２００３００１３２０８Ａ１号；第２００２０１５５４９３Ａ１号；第２００３００１７５１５号、および米国特許第６，３２９，２０９号；第６，３６５，４１８号を参照のこと（これらの特許文献は、参照により、それらの内容全体が本明細書に組み入れられる）。
【００４８】
イムノアッセイ
「ラジオイムノアッセイ」は、標識された（例えば放射活性物質で標識された）形態の抗原を用いて抗原の濃度を検出および測定するための技術である。抗原に対する放射活性標識の例は、３Ｈ、１４Ｃおよび１２５Ｉを含む。生物学的サンプルにおける抗原Ｃｙｒ６１の濃度は、生物学的サンプルにおける抗原を、その抗原に対する抗体への結合に関して、標識（例えば放射活性標識）抗原と競合させることにより測定される。標識抗原と非標識抗原との間の競合結合を確実化するため、標識抗原は、抗体の結合部位を飽和させるのに充分な濃度で存在する。サンプル中の抗原の濃度が高いほど、抗体に結合する標識抗原の濃度は低くなる。
【００４９】
ラジオイムノアッセイの場合、抗体に結合した標識抗原の濃度を決定するためには、抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離しなければならない。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための一つの方法は、抗−アイソタイプの抗血清を用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによるものである。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための別の方法は、ホルマリンで殺した（ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｋｉｌｌｅｄ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓを用いて抗原−抗体複合体を沈降させることによるものである。抗原−抗体複合体を遊離抗原から分離するための更に別の方法は、「固相ラジオイムノアッセイ」を実施することによるものであり、抗体がＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、ポリスチレンウェル、ポリ塩化ビニルウェルまたはマイクロタイターウェルに（例えば共有結合により）連結されている。抗体に結合した標識抗原の濃度を、既知濃度の抗原を有するサンプルに基づいて作成された標準曲線と比較することにより、生物学的サンプルにおける抗原の濃度を決定することができる。
【００５０】
「免疫放射性測定検定法」（ＩＲＭＡ）は、抗体試薬が放射活性物質で標識されているイムノアッセイである。ＩＲＭＡは、タンパク質、例えばウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）への結合体化などの技術により、多価抗原コンジュゲートを生成する必要がある。この多価抗原コンジュゲートは、一分子当たり少なくとも２個の抗原残基を有していなければならず、また、それらの抗原残基は、少なくとも２個の抗体がその抗原に結合することができるようにするのに充分な距離だけ離間していなければならない。例えば、ＩＲＭＡの場合、その多価抗原コンジュゲートを、固体表面、例えばプラスチック球などに付着させることができる。非標識の「サンプル」抗原および放射活性物質で標識された抗原に対する抗体が、上述の多価抗原コンジュゲートで被覆された球を含有する試験管に加えられる。サンプル中の抗原は、抗原抗体結合部位に関して、その多価抗原コンジュゲートと競合する。適切なインキュベーション時間の後、洗浄により非結合反応物が取り除かれ、その固相での放射能の量が決定される。結合した放射性抗体の量は、サンプル中の抗原の濃度に反比例する。
【００５１】
最も一般的な酵素免疫測定法は、「酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）」である。ＥＬＩＳＡは、標識された（例えば酵素が連結された）形態の抗体を用いて抗原の濃度を検出および測定するための技術である。種々の異なる形態のＥＬＩＳＡが存在し、それらのＥＬＩＳＡは当業者に広く知られている。ＥＬＩＳＡの技術分野において知られた標準的な技術は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ」（第２版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌらによる「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、１９６４）；およびＯｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．による１９８４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２：８９５−９０４に記載されている。
【００５２】
「サンドイッチＥＬＩＳＡ」の場合、抗体（例えば、抗−Ｃｙｒ６１）が固相（即ち、マイクロタイタープレート）に結合され、抗原（例えば、Ｃｙｒ６１）を含有する生物学的サンプルに供される。この後、非結合抗原を取り除くべく、その固相が洗われる。次いで、標識抗体（例えば、酵素が連結された標識抗体）が、結合している状態の抗原（存在する場合）に結合され、抗体−抗原−抗体のサンドイッチを形成する。抗体に連結され得る酵素の例は、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼおよびＢ−ガラクトシダーゼである。酵素が連結された抗体は、基質と反応し、測定され得る呈色反応生成物を発生させる。
【００５３】
「競合ＥＬＩＳＡ」の場合には、抗体が、抗原（即ち、Ｃｙｒ６１）を含有するサンプルと共にインキュベートされる。この後、その抗原−抗体混合物は、抗原（即ち、Ｃｙｒ６１）で被覆された固相（例えば、マイクロタイタープレート）と接触する。サンプルに存在する抗原の量が多いほど、固相への結合に利用できる遊離抗体の量が少なくなる。この後、固相に結合されたその一次抗体の量を決定すべく、標識された（例えば、酵素が連結された）二次抗体がその固相に加えられる。
【００５４】
「免疫組織化学的検定法」の場合には、組織の切片が特異タンパク質に関して試験され、この試験は、組織を、検定対象のタンパク質に特異的な抗体に供することにより行われる。この後、タンパク質の存在および量を決定するための数多くの方法のうちのいずれかの方法により、抗体が視覚化される。抗体を視覚化するために使用される方法の例は、例えば、抗体に連結された酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはベータ−ガラクトシダーゼ）を介する方法、または化学的な方法（例えば、ＤＡＢ／基質クロモゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））である。
【００５５】
診療医の好みにより、また、本開示に基づき、他の技術を用いて本発明のバイオマーカーを検出することができる。一つのそのような技法はウェスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：４３５０（１９７９））であり、適切に処理されたサンプルがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らされ、その後、固体の支持体、例えばニトロセルロースフィルターなどに移される。次いで、Ｃｙｒ６１に特異的に結合する検出可能に標識された抗体を用いて、Ｃｙｒ６１のレベルを評価することができ、そこでは、その検出可能な標識から得られる信号の強度が、存在しているＣｙｒ６１の量に対応する。それらのレベルは、例えばデンシトメトリーにより定量化することができる。
【００５６】
質量分析法
更に、Ｃｙｒ６１は、質量分析法を用いて検出されてよく、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間計測式（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ））、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析法、核磁気共鳴分光分析法またはタンデム質量分析法（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）を用いて検出することができる。例えば、米国特許出願第２００３０１９９００１号、第２００３０１３４３０４号、第２００３００７７６１６号を参照のこと（これらの特許文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【００５７】
質量分析法は、当技術分野において広く知られており、タンパク質を定量及び／又は同定するために使用されている（例えば、Ｌｉらによる（２０００）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １８：１５１−１６０；Ｒｏｗｌｅｙらによる（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０：３８３−３９７；ならびにＫｕｓｔｅｒおよびＭａｎｎによる（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒａｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．８：３９３−４００を参照のこと）。更に、単離されたタンパク質の少なくとも部分的なデノボ配列決定を可能にする質量分析技術が開発されている。ＣｈａｉｔらによるＳｃｉｅｎｃｅ  ２６２：８９−９２（１９９３）；ＫｅｏｕｇｈらによるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：７１３１−６（１９９９）；ＢｅｒｇｍａｎによるＥＸＳ  ８８：１３３−４４（２０００）において論評されている文献（ｒｅｖｉｅｗｅｄ）。
【００５８】
特定の実施形態においては、気相イオン分光光度計が使用される。別の実施形態においては、レーザー−脱離／イオン化質量分析法を用いてサンプルが分析される。最近のレーザー脱離／イオン化質量分析法（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、二つの主な変形様式で実践することができる：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析法および表面増強レーザー脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）質量分析法。ＭＡＬＤＩの場合、被分析物がマトリックスを含有する溶液と混合され、一滴の液体が基体の表面に置かれる。この後、そのマトリックス溶液は、それらの生物学的分子と共に共結晶化する。基体が質量分析計に挿入される。レーザーエネルギーが基体表面に向けられ、生物学的分子を有意にフラグメント化することなく、生物学的分子を脱離およびイオン化する。しかし、ＭＡＬＤＩは、分析用ツールとして限界を有している。ＭＡＬＤＩは、サンプルを分画化するための手段を備えておらず、また、マトリックス材料は、特に低分子量の被分析物の場合、検出と干渉することができる。例えば、米国特許第５，１１８，９３７号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら）および米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓ  ＆  Ｃｈａｉｔ）を参照のこと。
【００５９】
ＳＥＬＤＩの場合には、脱離プロセスにおいて基体表面が積極的に関与するように、基体表面が改変されている。一つの変形様式においては、表面は、対象のタンパク質を選択的に結合する吸着剤及び／又は捕獲剤で誘導体化される。別の変形様式においては、表面は、レーザーが当たったときに脱離されないエネルギー吸収分子で誘導体化される。別の変形様式においては、表面は、対象のタンパク質を結合し、且つ、レーザーの適用時に壊される光分解性の結合を含有した分子で誘導体化される。これらのそれぞれの方法において、誘導体化剤は、一般的に、サンプルが適用される基体表面の特定の場所に局在化される。例えば、米国特許第５，７１９，０６０号およびＷＯ第９８／５９３６１号を参照のこと。これら二つの方法は、例えば、被分析物を捕獲するためにＳＥＬＤＩ親和性表面を使用し、且つ、エネルギー吸収材料をもたらすべく、マトリックス含有液体を、捕獲された被分析物に加えることにより組み合わせることができる。
【００６０】
質量分析計に関する更なる情報については、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３版、Ｓｋｏｏｇ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８５；およびＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４増補版、Ｖｏｌ．１５（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５）、１０７１−１０９４頁を参照のこと。
【００６１】
マーカーまたは他の物質の存在の検出は、典型的には、信号強度の検出を含むであろう。これは、次に、基体に結合されたポリペプチドの量および特性を反映することができる。例えば、特定の実施形態においては、第一サンプルおよび第二サンプルのスペクトルから得られた信号強度のピーク値を（例えば視覚的に、またはコンピューター分析により）比較することにより、特定の生体分子の相対的な量を決定することができる。ソフトウェアプログラム、例えばＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）などを使用して、質量スペクトルの分析に役立てることができる。そのような質量分析計およびそれらの技術は当業者に広く知られている。
【００６２】
当業者であれば、質量分析計のいずれかの構成要素（例えば、脱離ソース、質量分析器、検出など）および様々なサンプル調製物は、本明細書で説明されている他の適切な構成要素もしくは調製物と、または当技術分野において公知のそれらと組合せ得ることが理解されよう。例えば、幾つかの実施形態においては、対照サンプルは重原子（例えば１３Ｃ）を含んでいてよく、これにより、試験サンプルを、同一の質量分析実行において、その既知の対照サンプルと混ぜ合わせることが可能になる。
【００６３】
一つの好適な実施形態においては、レーザー脱離飛行時間計測式（ＴＯＦ）質量分析計が使用される。レーザー脱離質量分析法においては、結合されたマーカーを伴う基体がインレットシステムに導入される。そのマーカーは、イオン化ソースからのレーザーにより脱離され、イオン化されて気相になる。発生したイオンはイオン光学アセンブリにより収集され、その後、飛行時間計測式質量分析器内において、イオンは、短い高電圧場を通じて加速され、高真空チャンバー内に送り込まれる。高真空チャンバーの遠端において、加速されたイオンは、様々に異なる時間を掛けて、高感度検出器の表面にぶつかる。飛行時間は、イオンの質量の関数であるため、イオンが形成されてからイオンが検出器に衝突するまでの間に要した時間を利用して、特定の質量対電荷比を有する分子の存在または不在を同定することができる。
【００６４】
幾つかの実施形態においては、第一サンプルまたは第二サンプルに存在する一つもしくはそれ以上の生体分子の相対的な量が、一部では、プログラマブルデジタルコンピューターを用いてアルゴリズムを実行することにより決定される。アルゴリズムは、第一質量スペクトルおよび第二質量スペクトルにおける少なくとも一つのピーク値を同定する。この後、アルゴリズムは、質量スペクトルのうち、第一質量スペクトルのピーク値の信号強度を第二質量スペクトルのピーク値の信号強度と比較する。相対的な信号強度は、第一サンプルおよび第二サンプルに存在している生体分子の量を表している。既知量の生体分子を含有する標準サンプルを第二サンプルとして分析することにより、第一サンプルに存在している生体分子の量を一層良好に定量化することができる。特定の実施形態においては、第一サンプルおよび第二サンプルに存在する生体分子の性質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を決定することもできる。
【００６５】
一つの好適な実施形態においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によりバイオマーカーのレベルが測定される。
【００６６】
抗体
本発明において使用するための抗体は商業的なソースから入手することができる。代替的に、Ｃｙｒ６１またはバイオマーカーポリペプチドの一部に対する抗体を惹起することもできる。
【００６７】
本発明において使用する抗体は、抗体を生成するための標準的な方法により製造することができ、例えばモノクローナル抗体の生成により製造することができる（Ｃａｍｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．によるＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ．ＧｒｏｔｈらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９９０）３５：１−２１；およびＫｏｚｂｏｒらによるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）。また、抗体は、当技術分野において広く知られている方法により、ファージ提示ライブラリーのような抗体ライブラリーをスクリーニングすべく、タンパク質の抗原性部分を使用することにより容易に得ることもできる。例えば、米国特許第５，７０２，８９２号（Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）およびＷＯ０１／１８０５８号（Ｎｏｖｏｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）は、バクテリオファージ提示ライブラリーおよび抗体結合ドメインフラグメントを製造するための選択方法を開示している。
【００６８】
Ｃｙｒ６１検出キット
本発明は、上皮由来の癌の検出および予後診断的な評価を行うための商業的なキットも対象としている。このキットは、当業者に広く知られているどのような構成であってもよく、また、Ｃｙｒ６１を検出するための本明細書で説明されている一つまたはそれ以上の方法を実施するのに有用などのような構成であってもよい。キットは、すべてではないにしても、尿サンプルに存在するＣｙｒ６１を検出するためのアッセイを実施する上で絶対に必要な試薬のうちの多くを提供している点で都合がよい。更に、このアッセイは、好適には、予め定められた量のＣｙｒ６１タンパク質の、キットに含まれている一つの標準サンプルまたは複数の標準サンプルと同時に実施され、従って、試験の結果を定量化することができ、または試験結果の正当性を確認することができる。
【００６９】
キットは、Ｃｙｒ６１のレベルを検出するための手段を含み、例えば、Ｃｙｒ６１タンパク質に選択的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを含んでいる。診断アッセイキットは、好適には、標準的な二抗体結合フォーマットで構築され、一つのＣｙｒ６１−特異抗体が患者のサンプルに存在するＣｙｒ６１を捕獲し、そして、捕獲されたＣｙｒ６１を検出するために別のＣｙｒ６１特異抗体が使用される。例えば、捕獲用の抗体は、固相、例えばアッセイプレート、アッセイウェル、ニトロセルロース膜、ビーズ、ディップスティック、または溶離カラムの構成要素などに固定化される。第二抗体、即ち、検出抗体は、典型的には、検出可能な標識、例えば比色分析用物質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）または放射性同位体などでタグ付けされる。
【００７０】
一つの好適な実施形態においては、キットは、尿サンプルに存在するＣｙｒ６１のレベルを検出するための手段を含む。特定の実施形態においては、キットは、Ｃｙｒ６１タンパク質を特異的に結合する、その上に固定化された抗−Ｃｙｒ６１抗体またはフラグメントを有する「ディップスティック」を含む。この後、特異的に結合されたＣｙｒ６１タンパク質は、例えば、比色分析用物質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）または放射性同位体で検出可能に標識された二次抗体を用いて検出することができる。
【００７１】
別の実施形態においては、アッセイキットは、（これらに限定されないが）以下の技術を用いてよい：競合および非競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、生物発光および化学発光アッセイ、蛍光分析によるアッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射性測定アッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡを含む酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレートおよび免疫組織化学。それぞれのキットでのアッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性および再現性は、当業者に広く知られた手段により定められる。
【００７２】
上で説明されているアッセイキットは、更に、使用説明書および尿生検のために設計された容器を提供するであろう。
【００７３】
以上または以下で引用されているすべての参考文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７４】
本発明は、以下の実施例により更に例証される。
【００７５】
これらの実施例は、本発明の理解を促進させるために与えられたものであり、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
【００７６】
実施例１  卵巣癌および乳癌についての尿バイオマーカーとしてのＣｙｒ６１の同定
本発明者らは、Ｃｙｒ６１タンパク質が、卵巣癌についてのバイオマーカーとして寄与することを同定した。特に、本発明者らは、良性および悪性の卵巣癌を有する患者由来の尿サンプルにおけるＣｙｒ６１のレベルが、癌を有さない患者由来の対照尿サンプルと比較して上昇していることを示す（図１ａおよび図１ｂ）。図１ａは、卵巣癌のイムノブロット検出を示す；対照レーン、対照サンプル；良性レーン、良性癌を有する患者由来の尿；悪性レーン、悪性癌を有する患者由来の尿。図１ｂは、卵巣癌患者由来の尿中のＣｙｒ６１免疫反応性タンパク質を検出するイムノブロットの棒グラフ定量を示す（各段階について、ｎ＝１２）。
【００７７】
本発明者らはまた、乳癌患者由来の尿におけるＣｙｒ６１のウェスタンブロッティングを実施した（図３）。癌を有さない患者由来の対照尿サンプルと比較して、以下の患者由来の尿サンプルにおいて、Ｃｙｒ６１のレベルの上昇があった：非侵襲性乳癌（ＤＣＩＳ）および侵襲性乳癌、ならびに非対称性導管過形成癌腫（ＡＤＨ）。
【００７８】
（実施例２：脈管形成スイッチの調節因子としてのＣｙｒ６１）
黄体の形成および退化は、それぞれ劇的な血管形成プロセスおよび血管退行プロセスを伴う。この内分泌腺は、したがって、脈管形成をオンおよびオフにする分子機構を説明するための研究モデルとして有用である。本研究において、本発明者らは、６日目および１０日目の黄体の退行を誘導するためにＰＧＦ２αを使用した。黄体組織を、ＰＧＦ２α投与の３０分間後に収集した。遺伝子マイクロアレイ分析は、Ｃｙｒ６１（脈管形成誘導因子）は、ＰＧＦα２注射後６日目および１０日目の両ＣＬにおいて、差次的に発現された。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、この遺伝子が、初期ＣＬにおいて、中間期段階および後期段階よりも有意に高い（ｐ＜０．０１）レベルで発現されたことを示した。さらに、Ｃｙｒ６１発現は、黄体退行の間に減少した。免疫組織化学は、Ｃｙｒ６１タンパク質が、黄体上皮細胞および黄体ステロイドジェニック細胞（ｌｕｔｅａｌ  ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）の両方に局在することを明らかにした。Ｃｙｒ６１の調節を研究するために、黄体ステロイドジェニック細胞および黄体上皮細胞を、ＣＬの中間期から単離し、そしてＰＧＦ２αおよびＴＮＦαで処理した。ＰＧＦ２αは、黄体ステロイドジェニック細胞および黄体上皮細胞の両方においてＣｙｒ６１発現に影響を及ぼさなかったが、ＴＮＦαは、黄体上皮細胞においてＣｙｒ６１発現を刺激したが黄体ステロイドジェニック細胞においてその転写レベルを低下させた。結論として、初期ＣＬにおけるＣｙｒ６１の高い発現は、この遺伝子が、黄体脈管形成に関連し得ることを示唆する。退行中のＣＬにおけるＣｙｒ６１の低下したレベルは、この遺伝子の下方調節が、黄体退行のチェックポイントであり得ることを示す。さらに、ＴＮＦαは、Ｃｙｒ６１発現を、黄体上皮細胞および黄体ステロイドジェニック細胞において差次的に調節する。したがって、このデータは、Ｃｙｒ６１が、脈管形成スイッチの主要な調節因子であり、黄体の生活環の間に脈管形成を「オン」および「オフ」にすることを示唆する。
【００７９】
（実施例ＩＩＩ：上皮間葉遷移（ＥＭＴ）の調節因子としてのＣｙｒ６１）
攻撃的な癌の発症におけるＣｙｒ６１の潜在的な役割を評価するために、本発明者らは、Ｃｙｒ６１を過剰発現する安定的なＯＶ５（卵巣細胞）細胞株（ＯＶ５−Ｃｙｒ６１）を調製した。本発明者らは、上皮間葉遷移（ＥＭＴ）および移動／侵襲に関与することが知られている多くの分子が、Ｃｙｒ６１によって調節されることを見出した。ＲＴ−ＰＣＲおよびＣｙｒ６１を過剰発現する細胞株を用いて、本発明者らは、Ｃｙｒ６１の上方調節が、ステロイド受容体、インテグリン受容体、ＶＥＧＦおよびメタロプロテアーゼの発現を変えることを見出した（データは示さず）。例えば、ステロイド受容体ＥＲα発現が上方調節され、一方、ＡＲ発現は下方調節される；ＭＭＰ−９発現（ＲＴ−ＰＣＲ）および活性（ザイモグラムによる）、ならびにＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−１９の発現は上方調節され、一方、ＭＭＰ−１３，ＭＭＰ−１０およびＭＴ１−ＭＭＰの発現に影響を及ぼさないようである；ＭＭＰ−７発現は下方調節される；β６インテグリン、β３インテグリン、α６インテグリンおよびαＶインテグリンの発現は、上方調節される；そしてＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃは、これらの細胞株において上方調節される。
【００８０】
ＯＶ５−Ｃｙｒ６１細胞株を用いて、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ検定法により、Ｃｙｒ６１がＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルを刺激することをさらに決定した（データは示さず）。ＲＴ−ＰＣＲを用い、本発明者らは、ＥＭＴ関連遷移因子であるＳｎａｉｌが上方調節され、一方で、ＳＩＰ−１、ＴｗｉｓｔおよびＳｌｕｇは影響を受けないようであることを見出した。
【００８１】
攻撃的な癌の発症におけるＣｙｒ６１の関与のさらなる支持において、本発明者らは、スクラッチ移動検定法および腫瘍侵襲検定法を実施した。改変型スクラッチ移動検定法を用いて、細胞の運動性を評価した。簡潔にいうと、ベクター対照およびＣＹＲ６１過剰発現ＯＶＣＡＲ−５細胞を、６０ｍｍシャーレ中に培養した。細胞がコンフルーエントに達した後、無菌ピペットチップによってスクラッチ（細胞のない領域）を作製した。浮遊細胞を、培地で３回洗浄することによって除去した。細胞を、新鮮な培地で５時間インキュベートした。２本のスクラッチの間の距離を、インキュベーションの前と後とで記録した。細胞運動率を、距離の減少をインキュベーション時間で除算することによって計算した。このアッセイの結果は、Ｃｙｒ６１の過剰発現が、運動性を上昇させることをはっきりと示した。Ｃｙｒ６１を過剰発現する細胞は、Ｃｙｒ６１を過剰発現しない細胞よりも２倍遠く移動した（データは示さず）。
【００８２】
ＣＹＲ６１過剰発現細胞の侵襲性を、２４ウェル腫瘍侵襲システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて製造業者の指示書にしたがって評価した。ＯＶＣＡＲ−５ベクター対照およびＣＹＲ６１過剰発現細胞を、７０％コンフルーエントまで増殖させ、次いでトリプシン処理して、無血清培地中に再浮遊させた。５×１０４個の細胞を、上チャンバ内に播種した。全量（７５０μｌ）の培地を、化学誘引剤として使用し、そして下のチャンバ内に加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間のインキュベーションの後、培地を上チャンバから除去した。次いで、挿入プレートを、Ｈａｎｋｓ緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ）中４μｇ／ｍｌ  Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを１ウェルあたり０．５ｍｌ含む新しい２４ウェルプレートに移し、そして３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ＢＤ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ膜は、標識細胞のみをＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ膜を通して侵入させ、蛍光顕微鏡下で可視化する。この検定法の結果は、Ｃｙｒ６１の過剰発現が、侵襲性を増大させることを示す（データは示さず）。
【００８３】
したがって、Ｃｙｒ６１は、攻撃的な癌において見出される細胞表現型と一致する細胞表現型の発症に関与する。
【００８４】
（参考文献）
以上および以下に引用されている参考文献は、参考として本明細書中で援用される。
【００８５】
【表１】
2008530582.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００８６】
本明細書に組み込まれており、また、本明細書の一部を構成している添付図面は、本発明の種々の実施形態を明らかにするものであり、また、その解説と相まって、本発明の目的、利点および原理を説明する役割を果たしている。
【図１】図１ａおよび図１ｂは、卵巣癌患者の尿中で検出されたＣｙｒ６１を示す。図１ａ；卵巣癌患者由来の尿中のＣｙｒ６１免疫反応性タンパク質を検出するイムノブロット（ＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３細胞抽出物；対照、対照サンプル；良性、良性癌を有する患者由来の尿；悪性、悪性癌を有する患者由来の尿）。図１ｂ；卵巣癌患者由来の尿中のＣｙｒ６１免疫反応性タンパク質を検出するイムノブロットの棒グラフ定量。各段階について、ｎ＝１２。
【図２】図２は、Ｃｙｒ６１（配列番号：１）のアミノ酸配列を示している。
【図３】図３は、乳癌患者由来の尿中のＣＹＲ６１のウエスタンブロットを示す。卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−５（ＯＶ５）からの細胞溶解物を、陽性対照として使用した（レーン１）。ＣＹＲ６１免疫反応性タンパク質は、それぞれ以下に由来する尿において検出されなかった：年齢、性別をマッチングされた健常対照（ＣＴＬ）（レーン２）、インサイチュの乳管内癌（ＤＣＩＳ）（レーン３）、非対称性導管過形成（ＡＤＨ）（レーン４）、侵襲性乳房腫瘍患者（侵襲性）（レーン６）、および転移性乳房腫瘍患者（Ｍｅｔ）（レーン７）。
【図１】
2008530582.tif 000004
【図２】
2008530582.tif 000005
【図３】
2008530582.tif 000006
【国際調査報告】
2008530582.tif 000007
2008530582.tif 000008
2008530582.tif 000009