(57)【要約】  試料組織破壊用および／または細胞溶解用デバイスであって、圧電材料と、前記圧電材料と接している少なくとも第２の材料とを含み、前記第２の材料が、前記圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する、前記デバイス。デバイスは、少なくとも３つの層と、バルブおよびポンプ用メンブレンとを組み立てることにより形成することができる。圧電材料は外部電圧源により作動してキャビテーションを発生させる。キャビテーションは、特に変調交流電圧によって組織破壊および／または細胞溶解を引き起こす。本発明はさらに、デバイス内で組織破壊および／または細胞溶解を行う方法であって、試料と試薬とをロードする工程、圧電材料を作動させる工程、破壊された組織および／または溶解した細胞を得る工程、ならびに溶出液を回収する工程を含む、前記方法を提供する。さらに、圧電デバイスであって、第２の材料と接する圧電材料を含み、前記第２の材料が、前記圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する、前記圧電デバイスが提供される。【選択図】図１Ａ
2008508876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料組織破壊用および／または細胞溶解用デバイスであって、圧電材料と、前記圧電材料と接している少なくとも第２の材料とを含み、前記第２の材料が、前記圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する、前記デバイス。
【請求項２】
前記第２の材料が前記圧電材料に接着または固定されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記凹凸表面がシリカビーズ層によって提供される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記シリカビーズが100〜400μmの直径を有する、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記第２の材料が50〜220 GPaのヤング率を有する、請求項１から４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記圧電材料が、ディスク、ロッドもしくはバー形状であるか、または少なくとも３つの辺を有する平面形状である、請求項１から５に記載のデバイス。
【請求項７】
使い捨て可能なものである、請求項１から６に記載のデバイス。
【請求項８】
カートリッジである、請求項１から７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記カートリッジが、導入ポートと、排出ポートと、少なくとも１つのチャンバとをさらに含む、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記カートリッジがバイオチップと一体化されている、請求項８または９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記デバイスがバイオチップデバイスであり、
解離チャンバと、
試薬および緩衝液レザバーと、
１以上のバルブと、
１以上のポンプと、
前記チャンバと前記レザバーと前記バルブとを連結するチャネルと、
をさらに含む、請求項１から１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
結合および混合チャンバ、および／または抽出／溶出／PCRチャンバをさらに含む、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記結合および混合チャンバが、圧電材料と、前記圧電材料に接している第２の材料とを含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記バルブがマイクロバルブである、請求項１１から１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記マイクロバルブが、ポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)を含む材料から形成されたメンブレンマイクロバルブを含む、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ポンプは、マイクロポンプであり、メンブレンを含む、請求項１１から１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記メンブレンが、ポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)を含む材料から形成されている、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記抽出／溶出／PCRチャンバに、磁性材料が溶着されている、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記結合および混合チャンバが、核酸分子に結合するための少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを含む、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記バイオチップが少なくとも３つの層と、前記バルブ用の１以上のメンブレンと、前記ポンプ用の１以上のメンブレンとを含み、第１の層が少なくとも前記解離チャンバと前記試薬および緩衝液レザバーとを含み、第２の層が少なくとも前記圧電材料を含み、前記バルブおよび前記ポンプが前記第２の層と第３の層との界面にあり、前記チャネルが前記第１の層と前記第２の層との界面および前記第２の層と前記第３の層との界面にある、請求項１１から２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記第１の層を覆うカバーをさらに含む、請求項２１に記載のデバイス。
【請求項２３】
デバイス内で組織破壊および／または細胞溶解を行う方法であって、
試料と試薬とをロードする工程、
第２の材料に接している圧電材料を作動させる工程（ここで、前記第２の材料は前記圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有しており、前記凹凸表面は前記試料に接している）、
破壊された組織および／または溶解した細胞を得る工程、ならびに
溶出液を回収する工程
を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記凹凸表面がシリカビーズ層によって提供される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シリカビーズが100〜400μmの直径を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記圧電材料が外部電圧源により作動する、請求項２３から２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記外部電圧源が可変周波数電圧を供給することにより前記圧電材料を作動させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が動物、ヒト、植物、または脂肪由来の組織および／または細胞試料である、請求項２３から２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が新鮮組織もしくは凍結組織および／または細胞試料である、請求項２３から２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記破壊された組織および溶解した細胞から得られた核酸を単離、精製および／または増幅する工程と、前記核酸を回収する工程とをさらに含む、請求項２３から２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸は、少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを添加し、前記ビーズに連結した核酸を回収することにより、前記破壊されたおよび／または溶解した細胞から回収され、ここで、第２の圧電材料を作動させて混合および結合効率を上げることにより前記核酸に前記ビーズ上のリンカーを結合させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
圧電材料を含む圧電デバイスであって、少なくとも第２の材料と接しており、前記第２の材料は前記圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する、前記圧電デバイス。
【請求項３３】
前記凹凸表面がシリカビーズ層によって提供される、請求項３２に記載の圧電デバイス。
【請求項３４】
前記シリカビーズが100〜400μmの直径を有する、請求項３３に記載の圧電デバイス。
【請求項３５】
前記第２の材料が50〜220 GPaのヤング率を有する、請求項３２から３４に記載の圧電デバイス。
【請求項３６】
前記圧電材料が、ディスク、ロッドもしくはバー形状であるか、または少なくとも３つの辺を有する平面形状である、請求項３２から３５に記載の圧電デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の処理デバイスに関する。本発明は特に、生体組織および／または細胞を処理する、圧電材料を含むカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織は通常生体マトリクス内に細胞を含んでおり、それにより機械的強さが供給されている。組織から細胞、核酸またはタンパク質を単離するためには組織破壊工程および細胞溶解工程が必要である。
【０００３】
従来の組織破壊および細胞溶解プロセスは時間がかかり多大な労力を必要とした。剪断力を発生させるためにブレンダ状のコンポーネントを有するモータ式機械ホモジナイザを用いており、ブレンダ状のコンポーネントで固体組織を物理的に粉砕し内部の細胞を解放する。次に細胞内および／または細胞間コンポーネントを抽出するために、細胞を化学的、機械的または熱的に処理して細胞を溶解させる。
【０００４】
微細加工プロセスおよび／または自動化プロセスに適合可能な他の組織破壊方法としては、酵素分解組織破壊法を用いたものがある（WO 2004/046305、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
超音波処理による胞子または細胞の破壊も報告されている(P. Belgraderら、Anal. Chem., 1999, 71:4232:4236; Belgraderら、Biosensors and Bioelectronics, 2000, 14:849-852; Taylorら、Anal. Chem., 2001, 73:492-496)。しかしこれらは細胞溶解に適用可能ではあるが、組織破壊には実用的ではない。さらに超音波デバイスは外部デバイスであり、μ-TASまたはMEMSなどの自動化システムには一体化されない。
【０００６】
細胞溶解を引き起こす外部作動手段として圧電材料が用いられてきた（P. Belgraderら、Anal. Chem., 1999, 71:4232-4236）。しかし通常、圧電材料を作動させるために高い電圧が必要であり、さらに圧電材料は熱伝導性であるため、温度の上昇による細胞分解を阻止するために絶縁体が必要である。そのためマイクロデバイス内に圧電材料を組み込むことは困難である。
【０００７】
病原性細菌検出用の完全一体型バイオチップも報告されている（R Liuら、Anal. Chem., 2004, 76(7):1824-1831）。バイオチップ内の圧電材料ディスクは、バイオチップ内での流体の混合効率を高めるにすぎない。上記完全一体型バイオチップは、チップ内に電気接続部とプリント基板とを含む。バイオチップ内に電気化学ポンプと電気接続部とが組み込まれているため、１回のみ使用する（使い捨て）用途には価格が高すぎる。
【０００８】
従ってこの分野では、生体試料、特に生体組織の処理に有用で低価格な使い捨てデバイスが必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記の問題に取り組み、使いやすく低価格でかつ効率的な生体試料処理デバイスを提供する。
【００１０】
第１の態様によると、本発明は圧電材料を含む、試料組織破壊用および／または細胞溶解用デバイスを提供する。
【００１１】
特に圧電材料は周波数変調交流電圧によって駆動される。
【００１２】
本発明の圧電デバイスは、圧電材料と、圧電材料と接している少なくとも第２の材料とを含み、第２の材料が、圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する。凹凸表面はキャビテーション効果を向上させる。
【００１３】
好ましくは、第２の材料は圧電材料に取り付けられている。特に、第２の材料は圧電材料に接着または固定されている。凹凸表面は任意の標準の方法によって形成することができ、例えば、シリカビーズ層によって提供されてもよい。例えば、シリカビーズ層が、第２の材料のうち、圧電材料と接している側とは反対側の表面に取り付けられている。シリカビーズは100〜400μmの直径を有してもよい。
【００１４】
第２の材料は任意の適した材料であってもよい。特に第２の材料は50〜220 GPaのヤング率を有する。第２の材料は金属またはポリマー材料によって形成されてもよい。例えば金属は、鋼、ステンレス鋼、真ちゅう、銅、およびアルミニウムからなる群より選択されてもよい。ポリマー材料は、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびポリ塩化ビニル(PVC)からなる群より選択されてもよい。
【００１５】
圧電材料は、ディスク、ロッドもしくはバー形状であってもよいし、または少なくとも３つの辺を有する平面形状を有してもよい。
【００１６】
デバイスは圧電材料を作動させる手段、例えば、圧電材料に取り付けられるか連結される２つの電極を含んでもよい。
【００１７】
デバイスは特に、使い捨て可能である。
【００１８】
別の態様によると、本発明のデバイスはカートリッジである。カートリッジは、導入ポートと、排出ポートと、少なくとも１つのチャンバとをさらに含んでもよい。カートリッジはそのまま用いてもよいし、バイオチップ（例えば、マイクロトータル分析システム（μ-TAS）またはラップオンチップシステム）に組み込んだり一体化させたりしてもよい。本発明のカートリッジは特に使い捨てカートリッジである。
【００１９】
別の態様によると、デバイスはバイオチップデバイスであり、
解離チャンバと、
試薬および緩衝液レザバーと、
１以上のバルブと、
１以上のポンプと、
チャンバとレザバーとバルブとを連結するチャネルと、
をさらに含む。
【００２０】
バイオチップデバイスは、生体試料調製のために用いることができる。
【００２１】
デバイスは、マイクロポンプ、結合および混合チャンバ、および／または抽出／溶出／PCRチャンバをさらに含んでもよい。結合および混合チャンバは、圧電材料と、圧電材料に接している第２の材料とをさらに含んでもよい。第２の材料は、圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有してもよい。凹凸表面は、シリカビーズ層によって提供されてもよい。デバイスはバルブをさらに含んでもよく、バルブはマイクロバルブであってもよい。マイクロバルブは、ポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)メンブレンマイクロバルブであってもよい。マイクロポンプはメンブレンを含んでもよい。メンブレンは、ポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)メンブレンであってもよい。
【００２２】
別の態様によると、デバイスは、注入孔をさらに含んでもよい。デバイスはさらに、自動汲み上げが可能となるように変更されてもよい。
【００２３】
一つの態様によると、バイオチップデバイスは、チップ内に一体化しているポンプおよびバルブを作動させるために、外部気体アクチュエータを用いる。
【００２４】
抽出／溶出／PCRチャンバに、磁性材料、例えばパーマロイ、より特定するとパーマロイピンが溶着されていてもよい。
【００２５】
結合および混合チャンバは、核酸分子に結合するための少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを含んでもよい。ビーズは磁性ビーズであってもよい。
【００２６】
デバイスはポリマー材料、例えばポリカーボネートで形成されてもよい。
【００２７】
デバイスは、チップ内に一体化されたバイオセンサと、RT-PCRと、マイクロアレイとをさらに含んでもよい。
【００２８】
別の態様によると、バイオチップデバイスは、少なくとも３つの層と、バルブ用の１以上のメンブレンと、ポンプ用の１以上のメンブレンとを含む。第１の層は少なくとも解離チャンバと試薬および緩衝液レザバーとを含み、第２の層は少なくとも圧電材料を含み、バルブおよびポンプが第２の層と第３の層との界面にあり、チャネルが第１の層と第２の層との界面および第２の層と第３の層との界面にある。
【００２９】
バイオチップデバイスは、第１の層を覆うカバーをさらに含んでもよい。
【００３０】
別の態様によると、本発明は、デバイス内で組織破壊および／または細胞溶解を行う方法であって、
試料と試薬とをロードする工程、
第２の材料に接している圧電材料を作動させる工程（ここで、第２の材料は圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有しており、凹凸表面は試料に接している）、
破壊された組織および／または溶解した細胞を得る工程、ならびに
溶出液を回収する工程
を含む、前記方法を提供する。
【００３１】
凹凸表面は任意の標準の方法によって形成することができ、例えば、シリカビーズ層によって提供されてもよい。シリカビーズは100〜400μmの直径を有してもよい。
【００３２】
本発明の方法によると、圧電材料は外部電圧源によって作動する。外部電圧源は、正弦波電圧を供給してもよい。正弦波電圧は任意の適した波形電圧であってもよく、例えば-140 V〜+140 Vのピーク間電圧を有してもよい。しかし、ピーク間電圧はこれらの特定の値に限定されない。正弦波電圧は変調周波数を有してもよい。正弦波電圧は、例えば1.0 kHz〜20 kHzであってもよい。特に外部電圧源は周波数変調電圧を供給して、圧電材料を作動させる。
【００３３】
生体試料は動物、ヒト、植物、細菌もしくはウイルスおよび／または細胞試料であってもよい。試料は新鮮組織もしくは凍結組織および／または細胞試料であってもよい。本実施形態の別の態様によると、試料は培養細胞、全血細胞、血清、尿、唾液または生検組織である。
【００３４】
本発明の方法によると、圧電材料の作動により、組織破壊および／または細胞溶解を引き起こす衝撃とキャビテーションが発生する。
【００３５】
別の態様によると、本発明の方法は、破壊された組織および溶解した細胞から得られた核酸を単離、精製および／または増幅する工程と、核酸を回収する工程とをさらに含む。核酸は、少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを添加し、ビーズに連結した核酸を回収することによって、破壊されたおよび／または溶解した細胞から回収することができる。ビーズ上のリンカーは、第２の圧電材料を作動させて混合および結合効率を上げることによって核酸に結合させる。
【００３６】
別の態様によると、本発明はさらに、圧電材料を含む圧電デバイスであって、圧電材料が少なくとも第２の材料と接しており、第２の材料が、圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する、圧電デバイスを提供する。圧電デバイスは、本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイス内で用いてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は例えば、生体試料（例えば培養細胞、全血細胞、血清、尿、唾液、組織、および生検組織）を効率的に処理するカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスを提供する。上記生体試料は、生体分子試料（例えば精製DNAまたはRNA）を遺伝子関連アッセイ用に調製するための原料試料として使用可能である。
【００３８】
本発明のデバイスは特に、特定の遺伝子を抽出する前に破壊しなければならない様々なサイズの組織試料を処理するために有用である。本発明のデバイスは特に、キャビテーションの原理に基づく技術（Liu R. H.ら、Anal. Chem., 2003, 75: 1911-1917; およびLiu R.H.ら、Lab Chip, 2002, 2(3), 151-157）を適合させることにより、組織試料破壊に圧電デバイスを用いている。本発明のデバイスによると、組織破壊と細胞溶解とを同時に行うことができる。本発明のデバイスは、培養細胞、全血細胞、血清、尿、および唾液の処理（溶解）のみに用いることも可能である。
【００３９】
一実施形態によると、本発明のデバイスは使い捨て可能である。したがって本発明のデバイスは、低価格であり特に１回のみ使用する（使い捨て）用途に適している。
【００４０】
第１の態様によると、本発明は、圧電デバイスを含む、試料組織破壊用および／または細胞溶解用デバイスを提供する。
【００４１】
本発明の圧電デバイスは、圧電材料と、圧電材料と接している少なくとも第２の材料とを含み、第２の材料が、圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有する。凹凸表面はキャビテーション効果を向上させる。
【００４２】
別の態様によると、本発明のデバイスは、試料組織破壊用および／または細胞溶解用の、圧電材料を含むカートリッジ（バイオチップカートリッジとも呼ぶ）である。カートリッジは、導入ポートと、排出ポートと、少なくとも１つのチャンバとをさらに含む。カートリッジは、組織破壊および／または細胞溶解が行われるチャンバをさらに含む。カートリッジはそのまま用いてもよいし、バイオチップ（例えば、マイクロトータル分析システム（μ-TAS）またはラボオンチップ（lab-on-a-chip）システム）に組み込んだり一体化させたりしてもよい。本発明のカートリッジは特に使い捨てカートリッジである。
【００４３】
別の態様によると、デバイスはバイオチップデバイスである。
【００４４】
したがって本発明のデバイスは、アクチュエータとして圧電材料(PZT)を用いて、新鮮組織もしくは凍結組織破壊および／または細胞溶解のための強力な衝撃およびキャビテーションを発生させる。
【００４５】
本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスの実施形態は、図面を参照することにより、よりよく理解できる。図面は説明のために提供するものであり、本発明を限定するものではない。外部源を用いてPZTデバイスを作動させることにより生体試料を処理する方法は、本発明のカートリッジとバイオチップデバイスとの両方に適用可能である。
【００４６】
カートリッジ
図１Ａは、本発明のカートリッジの外観図である。カートリッジの長手方向断面図を図１Ｂに示す。図２は、図１のカートリッジの試作品の写真である。外寸法は25mm ( 25 mm ( 6 mmであるが、本発明のカートリッジの寸法／形状はこれに限られない。当業者であれば、カートリッジの具体的用途に応じた寸法／形状を選択することができる。
【００４７】
図１、図２および図９に示すように、本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスは透明であるため、破壊プロセスが容易に観察でき実証できる。
【００４８】
カートリッジは、生体試料および試薬を導入するための導入ポートを含む。図１では、カートリッジのチャンバの側壁に導入ポートが形成されている。当業者であれば、導入ポートの形成には任意の公知の方法を用い得ることは理解される。カートリッジは、必要な生体試料および／または試薬を導入した後に導入ポートを密封する密封手段を備えている。図１は、導入ポートを密封するために用いられる4 mmの止めねじ（密封ナット）を示す。止めねじのサイズは導入ポートのサイズおよび直径に応じて選択される。カートリッジはさらに、組織破壊および／または細胞溶解を行った後に試料溶液を取り出すための排出ポートを含む。特に図１Ａに示す例では、外径1.5 mmのガラス管がチャンバに接着されており、取り出すべき破壊済み試料溶液用の排出管として作用する。この管は1 mlシリンジに連結しており、破壊完了後に得られた溶液が回収できるようになっている。当該分野で公知の任意の方法によれば、排出ポートが、製造できることおよび／またはカートリッジに適用できることは、当業者において明らかである。
【００４９】
カートリッジは圧電材料を含んでおり、圧電材料は第２の材料に接している。第２の材料は、圧電材料に接している側とは反対側に凹凸表面を有する。特に、圧電材料は、当該分野で公知の任意の適した手段で第２の材料に取り付けられている。例えばPZTが第２の材料に接着または固定されている。
【００５０】
第２の材料は任意の適した材料、例えば金属、ポリマー材料、ガラスなどであってもよい。第２の材料は例えば、鋼、ステンレス鋼、真ちゅう、銅、およびアルミニウムからなる群より選択される任意の金属であってもよい。第２の材料は、例えばポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびポリ塩化ビニル(PVC)からなる群より選択される任意の適したポリマーであってもよい。重要なことは、第２の材料が、圧電材料が作動したときに圧電材料の屈曲に耐えられるように、ある程度の剛性と抵抗性を維持することである。特に第２の材料は50〜220 GPaのヤング率（所与の材料によるワイヤ、バーまたは任意の形状の構造体における、歪みに対する応力の比（ポンド／inch2またはダイン／cm2で表す）を示す値）を有する。そのため本発明のある態様によると、ヤング率50〜220 GPaを有する任意の材料をカートリッジ用の第２の材料として用いてもよい。第２の材料が金属である場合、PZTと第２の材料とが導電性接着剤で接着されてもよい。第２の材料は、当該分野で公知の適切な手段によりPZTに固定されてもよい。
【００５１】
第２の材料は凹凸表面を含み、この表面が生体試料と接する。第１の技術的アプローチによると、第２の材料の表面のうち試料と接している側の表面が、凹凸を有するように加工される。別のアプローチによると、凹凸表面はシリカビーズ層により提供される。シリカビーズはジェット水流加工（材料を切断するためにノズルからの高圧ジェット水流を用いる工業プロセス）で用いられるものであってもよい。シリカビーズは非常に鋭利なエッジを有していてもよい。シリカビーズのサイズは任意であってよく、例えば直径100〜400 μmである。当該分野で公知の任意の方法によれば、凹凸表面を形成および提供する方法は、当業者において明らかである。
【００５２】
図１Ａでは、まず厚み0.2 mm、直径15 mmの真ちゅうまたは綿ディスクを接着剤の薄層で覆う。その後接着剤の薄層上にシリカビーズを載置し、70℃の炉内で1時間かけて硬化させる。真ちゅうディスクの反対側の表面に直径10 mmのPZTディスク（PXE5、PHILIPSTMより入手）を接着し、アクチュエータとして作用させる。PZTはディスク形状に限られず、ロッド、バー、または少なくとも３つの辺を有する平面形状（例えば三角形、正方形、矩形などの平面形状）を有する他の任意の構造体であってもよいことは当業者には明らかである。
【００５３】
カートリッジは任意の適した材料（例えばポリカーボネート）により形成することができる。コンピュータ数値制御(CNC)加工によりカートリッジを製造する際にポリカーボネートを用いてもよい。カートリッジはさらにチャンバを含み、チャンバにおいて組織破壊および／または細胞溶解が行われる。図１および図２に示すチャンバは直径14.5 mm、深さ1 mmである。チャンバの寸法／形状は具体的要件に応じて適合させるとよい。図１および図２に示すカートリッジの総容積は約165 μlである。
【００５４】
圧電材料は外部電圧源により作動する。したがってPZT材料は作動手段、例えば外部電圧源に接続した２つの電極を提供する。第２の材料が金属である場合、一方の電極をPZTに接続し、第２の電極を第２の電極に接続する。これに対して第２の材料が非導電性材料（例えばポリマー）である場合、２つの電極をPZT材料に接続する。PZTに電極を接続する手段はカートリッジに一体化させないことが好ましい。
【００５５】
PZT材料が外部源により作動すると、PZT材料と第２の材料とが生体試料溶液中で泡を発生させる。この現象はキャビテーションとして知られている。第２の材料は凹凸表面、好ましくはシリカビーズ層を有し、これにより組織の溶解と共に泡の発生が促進される。泡は生体試料に作用して、組織破壊および／または細胞溶解を引き起こす。したがって生体試料が組織、例えば腫瘍である場合、組織破壊と細胞溶解とは同時に起こる。破壊と溶解は、生体試料のタイプによって、5〜40秒以内に起こり得る。
【００５６】
上記のように、Liu R.H.ら、Anal. Chem., 2004, 76:1824-1831は、PZTディスクを含む完全一体型のバイオチップを開示しており、PZTディスクはマイクロストリーミング技術を用いて血中で免疫磁性捕捉ビーズを接種した標的細菌細胞の混合と結合を促進するために用いられている。他方、本発明のカートリッジおよびバイオチップデバイスのPZT材料は全く異なる目的で用いられる。本発明においてPZTを用いる目的は、組織破壊と細胞溶解である。
【００５７】
PZT材料を作動させてキャビテーションを引き起こすために、本発明者らは、連続的に変化する周波数を有する正弦型電圧を発生することが可能な駆動回路を内蔵している。この駆動回路の仕様は以下の通りである。
調整可能ピーク間ＡＣ電圧（adjustable peak to peak AC voltage）：Ｖ0；
調整可能基本平均周波数（adjustable fundamental, mean frequency）：ｆm；
調整可能発振周波数成分（adjustable oscillating frequency component）：Δｆ0
【００５８】
発振周波数成分は3.3 Hzで連続的に変化するように設計されている。これは瞬間駆動周波数が以下であることを示す。
ｆ＝ｆm＋Δｆ0sin(ｗsｔ)
ここで、ｗs＝２π(3.3 Hz)
【００５９】
基本周波数ｆ0は通常、圧電材料の自然周波数となるように選択される。この値は、実験で圧電材料をある範囲の正弦型入力（異なる周波数を有する）で励起することにより正確に得ることができる。圧電材料は共振時に最も激しく振動する。
【００６０】
図３に回路の接続配置を示す。様々な段での出力波形およびそのシンボルが示されている。
【００６１】
図２（Ａ）および図２（Ｂ）はそれぞれ、小型カートリッジおよび駆動回路シャーシの試作品を示す。好ましい実施形態では、キャビテーションカートリッジを駆動するとき、発振周波数成分をまずゼロに設定する。自然周波数を6.1 kHzに調整し、FFTモードでオシロスコープにより確認する。その後Δｆ0を600 Hzに設定する。これにより圧電材料は5.6 kHz〜6.6 kHzの周波数で駆動される。
【００６２】
上記のように、圧電材料は作動すると熱を発生する。P. Belgraderら(Anal. Chem., 1999, 71:4232-4236)は、温度の上昇による細胞分解を阻止するために、PZTディスクと細胞溶液との間に絶縁体（カプラー）を用いている。さらにPZTディスクはデバイスの外部要素である。溶液チャンバに熱が容易に伝導することを阻止するために絶縁体が必要である。実際、高温は生体分子（例えばRNA、DNAおよび／またはタンパク質）の質に影響を与え、特にRNAの質にとって有害である。
【００６３】
本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスにおいては、Belgraderらが用いたものよりも低い電圧を付与することにより、絶縁体（カプラー）を不要とし、さらにPZT材料を本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスに挿入可能または一体化可能とする。実際、本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスにおいては、可変（変調）周波数を付与することによりPZT材料が好適に作動する。可変周波数を用いてPZT材料を駆動することにより、発生する熱は低温となる。これは破壊時間が短いことと、キャビテーション効率が向上することによる。したがって本発明の好ましい態様では、本発明の方法は可変周波数を付与することによりPZTを作動させる工程を含む。
【００６４】
図６は、本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスにおける破壊温度の上昇を示す。温度は、ｋ型熱電対を挿入し、デジタルリーダで読み取ることにより測定した。冷却をしない場合、チャンバの温度は25℃の室温から最高66℃まで上昇した。組織破壊および／または細胞溶解は、本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイス内では5〜40秒で引き起こすことができるため、温度の上昇は25〜40℃に維持される。
【００６５】
組織破壊および／または細胞溶解の工程後、特定の被検体の精製、単離および検出のために、本発明のカートリッジ内でさらなる工程を行ってもよい。被検体は核酸、タンパク質、細菌、ウイルス、抗原などであってもよい。被検体の精製、単離および検出には、当該分野で公知の方法を用いてもよい。例えば、核酸の精製および単離の場合、免疫磁性捕捉ビーズ、少なくとも１つのポリT-オリゴ含有リンカーでコーティングされたビーズ、または特定の核酸の特定の配列に対して相捕的なリンカーでコーティングされたビーズを用いてもよい。核酸は、磁石を用いてビーズを捕獲し、洗浄し、最後にビーズに結合した核酸を回収することにより回収することができる。ビーズ−リンカーまたは免疫磁性捕捉ビーズに核酸を結合させるために、PZT材料を作動させ、当該分野で記載されているように混合および結合を促進するのに用いてもよい。さらに核酸増幅（例えばRT-PCR、PCRなど）は、必要な試薬を添加することによりカートリッジのチャンバ内で直接行うことができる。
【００６６】
カートリッジは好ましくは、単独で生物組織などの生物試料の処理に使用可能な使い捨て（１回のみ使用）デバイスである。
【００６７】
他方、本発明によるカートリッジは当該分野で公知の現行のバイオチップデバイスに挿入するように適合させることもできる。図１および図２に示すカートリッジを、例えば導入ポートおよび排出ポートを適合させることにより適合または変更し、バイオチップへの挿入に適したものにする方法は、当業者において明らかである。例えば、本発明のカートリッジは図９のデバイスに、より特定すると解離チャンバに挿入するように適合させることができる。
【００６８】
例えばカートリッジは、バイオチップ（例えば、マイクロトータル分析システム（μ-TAS）またはラボオンチップシステム）に挿入または一体化させることができる。利点は、使用後はカートリッジを廃棄して新しい使い捨てカートリッジをバイオチップに挿入できることである。これによりプロセス全体が汚染されにくくなる。
【００６９】
したがって本発明は、カートリッジまたはバイオチップ内で組織破壊および／または細胞溶解を行う方法であって、
試薬と試料とをロードする工程、
第２の材料に接している圧電材料を作動させる工程（ここで、第２の材料は圧電材料と接している側とは反対側に凹凸表面を有しており、凹凸表面は試料に接している）、
破壊された組織および／または溶解した細胞を得る工程、ならびに
溶出液を回収する工程
を含む、前記方法をさらに提供する。
【００７０】
PZT材料は外部電圧源によって作動する。外部電圧源は、例えば50 V〜400 Vのピーク間電圧を有する正弦波電圧を供給する。任意の適した正弦波電圧を付与してもよく、電圧は数千ボルトであってもよい。適したボルトを選択する方法は当業者には明らかである。特に正弦波電圧は-300 V〜+300 V、特に-180 V〜+180V、好ましくは-140 V〜+140 Vのピーク間電圧を有する。正弦波電圧は走査周波数を有し、これは1.0 kHz〜20 kHzであってもよい。走査周波数は特に3.0 kHz〜8.0 kHzである。より特定すると走査周波数は5.6 kHz〜6.6 kHzである。さらに特定すると走査周波数は3.3 kHzである。
【００７１】
上記のように、PZT材料は可変（変調）周波数によって作動するのが好ましい。PZT材料を駆動するために可変（変調）周波数を用いると、キャビテーション結果は強力で、発生する熱量は少ない。したがって本発明の好ましい態様では、本発明の方法は、可変（変調）周波数を付与することによりPZT材料を作動させる工程を含む。
【００７２】
生体試料は動物、ヒト、植物、細菌、ウイルスおよび／または細胞試料からの組織であってもよい。試料は新鮮組織または凍結組織試料であってもよい。試料は培養細胞、全血細胞、血清、尿、唾液または生検組織であってもよい。破壊および／または細胞溶解はカートリッジの解離チャンバ内で起こる。
【００７３】
前記方法は、破壊された組織および溶解した細胞から得られた核酸を単離、精製および／または増幅する工程と、核酸を回収する工程とをさらに含む。試薬は、洗浄緩衝液、溶出緩衝液および／またはRT-PCR試薬をさらに含んでもよい。
【００７４】
核酸は、少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを添加し、ビーズに結合した核酸を回収することによって、破壊および／または溶解後の細胞から回収することができる。ビーズは磁性ビーズであってもよい。核酸は、外部電磁界または永久磁界により回収してもよい。ビーズ上のリンカーは、圧電材料を作動させて混合および結合効率を上げることによって核酸に結合させてもよい。回収した核酸はDNA、RNAおよび／またはmRNAである。
【００７５】
本発明のカートリッジおよび／またはバイオチップデバイスにロードする組織試料の量は、0.1 mg〜100 mgである。解離チャンバに緩衝液を予めロードしておいてもよい。
【００７６】
さらなる実施形態によると、本発明はバイオチップであって、
解離チャンバと、
試薬および緩衝液レザバーと、
１以上のバルブと、
１以上のポンプと、
チャネルとを含み、
電気接続部が一体化されていない、バイオチップを提供する。
【００７７】
解離チャンバは破壊チャンバと呼ぶこともある。
【００７８】
バイオチップは、１以上のポンプを含み、ポンプはマイクロポンプである。
【００７９】
別の態様によると、デバイスは注入孔をさらに含んでもよい。デバイスはさらに、自動汲み上げが可能となるように変更されてもよい。
【００８０】
本発明によるバイオチップ（バイオチップデバイスとも呼ぶ）の一例を図９に示す。但し図９のバイオチップデバイスはすでにPZTディスクを含んでいる。
【００８１】
本発明のバイオチップは、使い捨てバイオチップデバイスに適した任意の材料（例えばポリマー材料）により形成することができる。ポリマー材料はポリカーボネートであってもよい。バイオチップデバイスは透明であるのが好ましく、これにより反応の様々な工程を観察し実証することができる。
【００８２】
バイオチップデバイスは少なくとも３つの層と、バルブおよびポンプ用の１以上のメンブレンを含む。４層以上を含んでもよい。これらの層はひとつに組み立てることができる。好ましくは、任意の組み立て手段を用いることにより接合させてもよいし、当該分野で公知の標準の方法を用いて溶融してもよい。但しカバー層は取り外し可能にしておく。第１の層は、少なくとも解離チャンバと、試薬および緩衝液レザバーとチャネルの一部とを含む。第２の層は、少なくとも圧電材料を含む。第２の層はさらに、チャネルの一部であって、第１の層に含まれるチャンバおよびレザバーから突出したチャネルに連通する部分を含む。バルブおよびポンプは、第２の層と第３の層との界面に形成される。さらに第２の層と第３の層との界面、および第１の層と第２の層との界面に形成されるチャネルもある。バイオチップはさらに、第１の層を覆うカバーを含む。カバーは、PZT材料が移動したときに、デバイス内の液体がこぼれるのを防止するのに役立つ。
【００８３】
特に、第２の層と第３の層との界面は、バルブおよびポンプ用の凹部を含む。当業者であればデバイスの機能を変えることなく設計に変更を加えること、特に、デバイス内の凹部の位置を変更することができる。
【００８４】
第３の層はさらに、バルブおよびポンプを作動させる手段を含む。特に第３の層は、気体源に連結してバルブを作動させるビア（ホール）を含んでもよい。
【００８５】
バイオチップデバイスの構造の一例を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。図１１Ａは、レザバー、ポンプ、バルブ、チャネル、およびチャンバの連結を示す長手方向断面図であり、図１１Ｂは、解離チャンバ、ポンプ、バルブ、チャネル、およびチャンバの連結を示す、異なる長手方向断面図である。
【００８６】
第１の層は、解離チャンバと試薬レザバーとを含む。第１の層はさらに、それぞれレザバーおよびチャンバから、第１の層と第２の層との界面に沿って延びるチャネルを含む。チャネルはさらに第２の層を通って第３の層まで延び、第２の層と第３の層との界面に設けられたポンプユニットおよびバルブユニットに到達している。
【００８７】
バイオチップはさらに、結合および混合チャンバを含む。バイオチップはさらに、抽出／溶出／PCRチャンバを含む。
【００８８】
図１１Ａは、バイオチップが第１の層内にレザバーとチャンバとを含むことを示し、図１１Ｂは、レザバーとチャンバとを含むバイオチップを示す。図１１Ａおよび図１１Ｂに示すチャンバは抽出／溶出／PCRチャンバである。混合および結合チャンバはいずれの図にも示されていない。図１１Ａおよび図１１Ｂは、同じバイオチップを示していることに留意されたい。第１の層内のコンポーネントが異なるのは、これらの図が異なる長手方向に沿った断面図を示しているからである。図１２Ａおよび図１２Ｂは、図１１のバイオチップ内の解離チャンバの拡大図である。
【００８９】
バイオチップデバイスはさらに第２のチャンバを含んでもよい。第２のチャンバは図９および図１０に示す混合および結合チャンバ（「レザバー」とも呼ぶ）である。したがって本発明のバイオチップデバイスはさらに、結合および混合チャンバ内に第２のPZT材料（第２の材料に常に接する）を含む。
【００９０】
少なくとも３つの層、バルブおよびマイクロポンプメンブレン、ならびにカバー層は、別々に形成または購入してもよく、これも本発明の範囲内である。別の態様によると、本発明は、少なくとも３つの層、カバー、および必要に応じてバルブおよびポンプ用のメンブレンを含み、さらに１以上のPZT材料を含むキットを提供する。キットはさらにカバーを含んでもよい。層、メンブレン、PZT材料は使用前に接合または組み立てることができる。接合または組み立ては、当該分野で公知の取り外し可能な固定手段を用いて行うことができる。あるいは、公知の方法または技術により層を接着または溶融してもよい。
【００９１】
上記のように、第２の材料はPZT材料を支持して作動中に屈曲することを防止する任意の適した材料により形成するとよい。したがって、第２の材料は50〜220 GPaのヤング率を有する。第２の材料は金属、ポリマー、ガラスなどであってもよい。金属は、鋼、ステンレス鋼、真ちゅう、銅、およびアルミニウムからなる群より選択されてもよいが、他の金属も使用可能である。ポリマー材料は、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタクリレート）(PMMA)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびポリ塩化ビニル(PVC)からからなる群より選択されてもよいが、他の公知のポリマーも使用可能である。
【００９２】
第２の材料は、試料および／または細胞と接する凹凸表面を有してもよい。凹凸表面は特に、シリカビーズ層により提供される。シリカビーズは直径100〜400 μmであってもよい。第２の材料の表面のうち、解離チャンバ内の生体試料に接する表面も凹凸表面であってもよい。
【００９３】
PZT材料は任意の形状（例えばディスク、ロッド、バー）であってもよいし、少なくとも３つの辺を有する平面形状を有する構造体であってもよい。
【００９４】
PZT材料は外部電圧源によって作動させる必要がある。したがってPZT材料および第２の材料は、PZT材料を作動させる手段、例えば２つの電極を含む。第２の材料が金属である場合、一方の電極をPZTに接続し、第２の電極を第２の材料に接続する。第２の材料がポリマーなどの非導電性材料である場合、２つの電極を共にPZT材料に接続する。PZT材料に電極を接続する手段はカートリッジに一体化していないことが好ましい。例えば２つの取り外し可能ピンまたは他の接続手段がバイオチップデバイスに挿入されて外部電圧源とPZT材料とを接続することができる。この接続手段は、取り外し可能であってもよい。
【００９５】
バイオチップのバルブはマイクロバルブである。当該分野で公知の任意の適した材料で形成されたメンブレンをバルブ開口部に載置する。マイクロバルブのメンブレンは、ポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)により形成されることが好ましい。マイクロバルブは外部気体源により作動する。外部気体源は真空および／または圧縮空気を供給してマイクロバルブを作動させる。
【００９６】
本発明のバイオチップはさらに、マイクロポンプ用のメンブレンを含む。マイクロポンプメンブレンはポリ（ジメチルシロキサン）(PDMS)により形成されてもよい。マイクロポンプは外部気体源により作動する。外部気体源は真空および／または圧縮空気を供給してマイクロポンプを作動させる。
【００９７】
図９および図１０に示すように、バイオチップはさらに抽出／溶出／PCRチャンバを含んでもよい。抽出／溶出／PCRチャンバにはパーマロイピンを溶着させていてもよい。被検体（例えば核酸）に連結または結合した磁性ビーズを引き寄せるために、チャンバ下方に外部電磁石を取り付けてもよい。
【００９８】
結合および混合チャンバは、混合および結合を促進するために、第２の材料と接するさらなるPZT材料を含んでもよい。結合および混合チャンバはさらに、核酸分子または免疫磁性捕捉ビーズに結合する少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを含んでもよい。核酸分子に結合するための少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズは磁性ビーズであってもよい。
【００９９】
バイオチップはさらに、バイオチップに一体化可能な他のコンポーネント（例えばバイオセンサ、RT-PCRおよびマイクロアレイ）を含んでもよい。図１０はデバイスの作用プロセスを示す。マイクロポンプは、かさ高い（bulky）マイクロ流動デバイスである。本発明のバイオチップ設計によると、用いるマイクロポンプの数を減らして代わりに試薬を案内するマイクロバルブを用いる。図１０に示すバイオチップデバイスは、９個のバルブと１台の流体操作用マイクロポンプ、組織解離用のPZT作動式チャンバとビーズ-mRNA結合用のPZT作動式レザバー、ならびに洗浄緩衝液Ａ、洗浄緩衝液Ｂ、溶出液／RT-PCR試薬および生成物（RNA、mRNAまたはcDNA、要件によって変わる）貯蔵用の４つのレザバーを含む。mRNA抽出およびPCRは、磁性材料（例えばパーマロイ、より特定するとパーマロイピン）が溶着されたマイクロチャンバ内で行われる。チャンバ下方に電磁石を設けてもよい。
【０１００】
図９は試作品デバイスの写真である。流体を操作するポンプおよびバルブは、外部気体源によって作動する。
【０１０１】
図１０に見られるように、デバイスを用いる前に試薬をそれぞれのレザバーおよびチャンバに予めロードしておく。重量0.1 mg〜100 mgの組織試料を、PBS緩衝液70 μl〜100 μlを予めロードした解離チャンバ内に載置する。シリカビーズでコーティングしたPZT材料を作動させて、強力なキャビテーションと衝撃力を組織試料に与える。これにより、60秒以内に組織試料が解体する。同時に組織試料の細胞が完全に溶解する。バルブV1〜V2およびV4〜V5を開けてマイクロポンプをオンにする。結合用緩衝液および磁性ビーズを予めロードした結合および混合レザバーに、生体分子を含む解離後の生体溶液を通す。このレザバーには、混合効率を上げるPZT材料も内蔵されている。磁性ビーズ（オリゴdTでコーティングした）を組織溶解液と混合すると、オリゴdTによりmRNAが捕捉されて磁性ビーズの表面に結合する。バルブV3、V4およびV5を開けて瞬時にマイクロポンピングを行うことにより、磁性ビーズを溶出用の抽出およびPCRチャンバに移動させる。この時点で電磁石は作用している。マイクロポンプを長時間オンに維持しておくことにより、結合チャンバ内の試薬が抽出／PCRチャンバを数回通過するようにする。これにより、ほぼすべてのビーズが確実に抽出／PCRチャンバに回収される。バルブV3を閉じると、結合レザバーが廃棄物材料と化学物質の貯蔵に用いられる。ビーズが抽出／PCRチャンバ内に捕獲されると、V6をまず開けて次いでV7を開ける。これにより洗浄緩衝液Ａおよび洗浄緩衝液Ｂがチャンバまで移動してmRNAを精製することができる。最終工程では、バルブV8を開けて溶出緩衝液またはPCR試薬を抽出／PCRチャンバまで汲み上げ、mRNA溶出またはPCR増幅を行う。組織をロードしてからmRNA溶出までのプロセス時間は約15分である（PCR熱サイクルは含まない）。時間の大半はmRNA精製プロセスに費やされる。
【０１０２】
試薬送達用の一体型ポリマーマイクロポンプ
バイオチップデバイスに用いるマイクロポンプは、流体をある位置からマイクロチャネルを介して別の特定の位置まで推進するに十分な圧力を生成しなければならない。最も有望なアプローチは、チャンバを２つのチェックバルブまたは２つのノズル／拡散器構造体のいずれかで結合させる、ダイヤフラムポンプという概念である。近年、異なる作動原理に基づき異なる技術によって製造された複数のマイクロポンプが報告され且つ開発されている（Disier Mailleferら、MEMS 1999, Orlando, Florida； R.Linnemannら、第11回MEMS年次国際ワークショップ、1998, Heidelberg German, pp.532-5371）。
【０１０３】
メンブレンポンプの場合、自己プライマー化および泡許容などの高性能プロセスのためには最大限の圧縮率を達成することが不可欠である。圧縮率は以下のように定義される。
ε＝(ΔＶ＋Ｖ0)／Ｖ0
【０１０４】
ここでΔＶはストローク容量であり、Ｖ0はデッドボリュームである。より高い圧縮率を達成するためには、デッドボリュームは最小に、ストローク容量は最大にしなければならない。
【０１０５】
作動マイクロポンプとしては、圧電アクチュエータ、形状記憶合金、静電アクチュエータおよび熱−気体アクチュエータが用いられてきた。これらのポンプは複雑な製造プロセスを必要とする。しかしマイクロアクチュエータが生成する力が限られているため、これらのポンプが生成する流量は限られており、生成する圧力も比較的低い。ポンプのストローク容量も限られている。そのため良好なポンプ性能を達成することは困難である。さらにこれらのポンプは本発明のバイオチップデバイス同様、使い捨てるには高価すぎる。
【０１０６】
本発明のバイオチップ設計では、アクチュエータメンブレンおよび導入／排出バルブメンブレンとして低ヤング率(20 Mpa)、高伸張度、生体適合性および良好な密閉性を有するPDMS材料を選択した。比較的高い圧縮率によりマイクロポンプは自己プライマー化および泡許容を達成することが可能になる。PDMSの密閉性能が良好であるため、逆流はない。ポリカーボネートプレートは複数の機能、すなわち第１にバイオチップデバイスの構築、第２にポンプハウジングおよびバルブハウジングの形成のための機能を有する。
【０１０７】
PDMSメンブレンと上下ポンプハウジングにより気密ポンプチャンバが形成される。圧縮空気および真空を付与してマイクロポンプを作動させる。上下ポンプハウジング内のマイクロポンプチャンバの深さは200 μmであってもよい。これによりPDMS作動メンブレンの偏向を制限する。そのため精密なストローク容量を達成することができる。流量は汲み上げ媒体の粘性、排出および導入圧力に対して高感度ではない。
【０１０８】
外部気体源はバイオチップデバイスの底部に連結されて、ポンプを作動させる。連結層内に導入および排出孔が形成され、レザバー層に設けられたマイクロチャネルを介して連通する。
【０１０９】
PDMSは光により規定可能(photo definable)ではなく、フォトリソグラフィーによりパターニングできない。さらにスピンコーティングにより厚みを均一にすることもできない。そのため本発明のデバイス内のPDMSメンブレンはマイクロモールドで成形している。２つに分離したPDMS溶液（Sylgardl84シリコンエラストマー、Dow Corning）を用いてメンブレンを鋳造する。溶液のＡ部分およびＢ部分を10:1の割合で混合する。その後これをモールドにゆっくりと注入し、約1時間に亘って真空乾燥器内に載置しすることにより、PDMS混合物内に捕獲された気泡を放出する。気泡が見えなくなると、平坦かつ平滑なブレードがモールドの上面と接した状態でそのブレードを上面に滑らせる。これにより、硬化したPDMSメンブレンの厚みがモールド深さと同一となることを確実にする。その後構造体全体を70℃の炉内で1時間に亘って硬化させる。最終的に厚みの均一なPDMSメンブレンが得られ、モールドから出すことができる。
【０１１０】
独立型のポンプは、バイオチップデバイスと一体化させる前に製造され特徴づけられる。図１３（Ａ、Ｂ）は実験結果を示す。汲み上げ媒体として水を用いた場合、最大ポンプヘッドは2 mであった。流量は作動周波数に比例し、出力圧力（ポンプヘッド）とは無関係であった。
【０１１１】
流体案内用マイクロバルブ
バイオチップデバイスのさらなる重要なコンポーネントはマイクロバルブである。シリコン材料およびポリマー材料により形成されたマイクロチェックバルブおよびマイクロアクティブバルブが報告されている。チェックバルブの設計は簡素であるが、流方向が単一であるなどの固有の制限事項により用途が限られる。さらに内蔵マイクロアクチュエータアクティブマイクロバルブは使い捨てバイオチップに用いるには高価すぎる。
【０１１２】
本発明のバイオチップでは、本発明のマイクロポンプ構造同様、流体案内用の簡素なPDMSメンブレンマイクロバルブを設計している。マイクロバルブは、本発明のマイクロポンプ同様、外部気体源によって作動する。
【０１１３】
バルブはバイオチップデバイスの連結層内に構築され、レザバー層内に設けられたマイクロチャネルと容易に連通する。PDMSメンブレンの可撓性によりバルブは-0.1 atmの圧力で機能する。閉じたときの密封性も非常に良好である。図１４は導入圧力に対する流量を示す。
【０１１４】
mRNA抽出／PCR／溶出用多機能チャンバ
利用可能ないくつかの生体試料分離技術のうち、磁性バイオ分離技術が非常に将来性のある技術であると考えられてきた。利点はDNA、RNAおよびmRNAなどの生物分子の操作が容易であることである。バイオチップデバイスでは、表面がオリゴ(dT)でコーティングされたダイナルビーズ(Dynal Beads)がmRNA抽出用に用いられる。ビーズは直径約2.5 μmである。
【０１１５】
mRNA抽出、洗浄およびPCR処理は容量20 μlの多機能チャンバ内で行われる。ポリイミド（P12525より、MicroChemより入手）10 μlでコーティングされた金属プレートをチャンバの底部に載置する。小型電磁石をチャンバ下方に載置して磁界を発生させる。直流電流が電磁石を駆動すると、磁界がビーズを引き寄せてビーズを確実にチャンバ内に維持する。電磁石が交流電流で駆動されると、周波数22 kHzで、ピークのある電流が金属プレートに生じてPCR増幅用の熱を発生させる。16℃/sの加熱率と9.6℃/sの冷却率が達成される。この非接触加熱法により、加熱コンポーネント（電磁石）とセンサがバイオチップデバイスから分離し、それによりバイオチップデバイスの費用対効果が上昇する。
【０１１６】
本発明はさらに、カートリッジまたはバイオチップ内で組織破壊および／または細胞溶解を行う方法であって、
試薬と試料とをロードする工程、
第２の材料に接している圧電材料を作動させる工程、
破壊された組織および／または溶解した細胞を得る工程、ならびに
溶出液を回収する工程
を含む、前記方法を提供する。
【０１１７】
PZT材料を作動させ、外部電圧源を用いた作動により組織破壊および／または細胞溶解を行う方法は、カートリッジを用いる方法に関して上記したものと同じである。
【０１１８】
バイオチップデバイスは、PZT材料を作動させる手段（例えば上記したように２つの電極）を含む。２つのPZT材料がある場合、すなわち一方のPZT材料が解離チャンバ内にあり他方のPZT材料が混合および結合チャンバ内にある場合、各PZT材料が２つの電極を有する。
【０１１９】
圧電材料の作動により、組織破壊をもたらす強力な衝撃およびキャビテーションが発生する。この破壊および／または細胞溶解は解離チャンバ内で起こる。
【０１２０】
ロードする試料は通常、0.1 mg〜100 mgである。試料は動物、ヒト、植物もしくは細菌および／またはウイルス試料であってもよい。試料は新鮮組織試料であってもよいし、凍結組織試料であってもよい。試料は培養細胞、全血細胞、血清、尿、唾液、または生検組織であってもよい。
【０１２１】
解離チャンバには緩衝液が予めロードされている。
【０１２２】
前記方法はさらに、破壊された組織および溶解した細胞から得られた核酸を単離、精製および／または増幅する工程と、核酸を回収する工程とを含む。試薬は、洗浄緩衝液と溶出／RT PCR試薬とを含む。
【０１２３】
核酸は、少なくとも１つのリンカーでコーティングされたビーズを添加し、ビーズに連結した核酸を回収することにより、破壊されたおよび／または溶解した細胞から回収することができる。ビーズは磁性ビーズであってもよい。あるいは免疫磁性捕捉ビーズを用いてもよい。ビーズ上のリンカーは、第２の圧電材料を作動させて混合および結合効率を上げることにより、核酸または免疫磁性捕捉ビーズに結合させることができる。
【０１２４】
単離、精製および／または増幅工程は、図９および図１０に示すようにチャンバ内で行うことができる。核酸は外部電磁石により回収される。回収された核酸分子はDNA、RNAおよび／またはmRNAである。
【０１２５】
本発明の概略を説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照することにより、より容易に理解できる。以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【０１２６】
実施例
以下の実施例１は、カートリッジについて行ったものであるが（例えば図１、図２）、本発明のバイオチップデバイス（例えば図９）についても適用可能である。
【実施例１】
【０１２７】
カートリッジおよび／またはバイオチップデバイス  −  実験の準備
重量1 mg〜50 mgの新鮮ラット肝臓組織試料と凍結ラット肝臓組織試料とを用いて実験を行った。導入ポートを介して組織をカートリッジのチャンバに挿入する前に行った前処理は、水で組織を洗浄したことだけである。洗浄は血液などの組織片を除去するために行った。凍結組織試料は、液体窒素(-180℃)中で切断したばかりの組織から得た。チャンバが他の組織（例えば心臓、筋肉および腎臓組織）を破壊できることは証明されていた。
【０１２８】
前処理した組織をリン酸緩衝食塩水(PBS)100 μlと共に小型カートリッジチャンバに載置した。導入ポートを止めねじで密封した後、パワーアンプで圧電ディスクを駆動した。カートリッジは透明であるため、破壊プロセスを容易に観察することができた。
【０１２９】
重量5 mg〜50 mgの新鮮試料をラット肝臓組織から直接切り取った。ラットの肝臓組織、心臓組織、筋肉組織および腎臓組織を続けて用いて実験を行った。
【０１３０】
小型Ｋタイプ熱電対をチャンバに挿入して温度を測定することにより、核酸に対するカートリッジチャンバ温度の影響を調べた。
【０１３１】
破壊時間および組織サイズ
図４（Ａ）および（Ｂ）は、PBS溶液100 μlで20秒かけて破壊したラットの新鮮肝臓組織10 mgを含む有機溶液を示す。組織は完全に破壊されて直径7.8 μm未満の粒体になった。溶液中に細胞は見られなかった。このことは、組織中に含まれていた細胞が破壊工程で溶解したことを示す。
【０１３２】
破壊時間と組織試料のサイズとの関係を比較するために時間を記録した。付与した駆動電圧と周波数はそれぞれ250Ｖppおよび6.2 kHzであった。各試料の重量は３回測定した。図５に実験結果を示す。重量25 mg〜50 mgの組織の場合、完全に破壊するまでの時間はほぼ同じで、13秒未満である。これより少量の組織および細胞試料の場合、プロセスに必要な時間はより短かった。
【０１３３】
凍結組織試料の結果も同様であったが、破壊時間は僅かに短かった。凍結組織は新鮮組織より堅く、そのためチャンバで破壊することが容易であった。
【０１３４】
作動時間およびチャンバ温度
圧電ディスクは作動すると熱を発生させる。高温は生物分子の質に影響を与え、特にRNAの質にとって有害である。破壊されていない組織と本発明のカートリッジのチャンバ内の有機組織溶液混合物とを含む破壊チャンバに熱が容易に伝導したかどうかを証明するために、ｋタイプ熱電対を挿入しデジタルリーダで読み取ることにより破壊温度の上昇を測定した。破壊チャンバ温度の変化を図６に示す。冷却をしない場合、チャンバ温度の上昇は最高66℃に維持された。
【０１３５】
遺伝子の質のテスト
従来の抽出方法を用いて、全RNAおよびmRNAの質をテストした。ラットの肝臓の新鮮組織および凍結組織を用いた。ホモジナイザー破壊と小型チャンバ破壊とを別々に用いてテストを行った。
【０１３６】
遺伝子の質のチェック
Agilent BioChem Workstation 84X装置により精製および生産ODテストを行った。新鮮組織および凍結組織のA280/A260の平均割合はそれぞれ1.98および1.99であり、ホモジナイザーで破壊した新鮮組織の割合2.00に非常に近かった。
【０１３７】
図７に示すように、上記装置を用いてRNA総生産量テストも行った。破壊チャンバによる、新鮮組織および凍結組織の平均総RNA生産量はそれぞれ5.50 μgおよび5.45 μgであり、ホモジナイザーで破壊した新鮮組織の生産量5.40 μgに匹敵した。
【０１３８】
mRNAをダイナルオリゴ(dT)磁性ビーズで抽出し、洗浄緩衝液で精製した。選択した乳房腫瘍関連遺伝子およびハウスキーピング遺伝子（例えばCD59、ケラチン19、TP53、ベータアクチン、GAPDH、シクロフィリンおよびβ-マイクログロブリン）を、MJ Research PCT-200を用いた30サイクルのRT-PCRにより増幅した。RT-PCRプライマーはSigmat HSRT-100 DuraScript RT-PCRキットから得た。
【０１３９】
図８（Ａ）は、新鮮組織と凍結組織から抽出したTP53 mRNAに関するアガロースゲル結果を示す。その後cDNAをRT-PCRから得た。本発明者のテストでの最長の全長cDNAは1176 bpsであった。図８（Ｂ）は、360 bps、β-マイクログロブリンのうち最短のものに関するアガロースゲル結果を示す。これらの図によると、抽出されたmRNAは無傷であり、ゲル写真内で正しい位置にある。mRNAの生産量は0.155 μg/mg組織であった。
【０１４０】
結論
ほ乳類の組織破壊と細胞溶解を高速かつ同時に行うための、本発明の試作品小型カートリッジを用いた。組織破壊は、走査周波数高電圧駆動法により30秒以内で行われた。RNAおよびmRNAの総生産量はそれぞれ、新鮮組織または凍結組織1 mg当たり約5.45 μgおよび0.155 μg/mgであった。ゲル電気泳動により、無傷のRNAおよびmRNAが得られたことが示された。これにより本発明の使い捨てカートリッジは、図１および図２に示すように、組織の破壊と核酸分子の回収を効率的かつ迅速に行う使いやすいデバイスであると証明された。したがってカートリッジは遺伝子検出用の効率的デバイスとして用いてもよい。特に、生体試料が生検組織である場合、本発明のカートリッジは癌バイオマーカーの決定および遺伝子関連分析の効率的な診断方法を提供する。
【実施例２】
【０１４１】
バイオチップデバイス（図９および図１０）
本発明のバイオチップデバイス（図９、図１０および図１１）においては、ほ乳類組織破壊および細胞溶解用の小型キャビテーションチャンバを同時に用いる。チャンバにはアクチュエータとしてPZTディスクを用いて、新鮮組織または凍結組織を解離するための強力な衝撃およびキャビテーションを発生させる。厚み0.2 mm、直径15 mmの真ちゅうディスクの一方の表面上に、接着剤（Araldite - Rapid)層を塗布してシリカビーズを接着させる。他方の表面上には、直径10 mmの圧電ディスク(PXE5、PHILIPSTMより入手)を接着させる。シリカビーズは非常に鋭利なエッジを有しており、これを圧電ディスク側とは反対側の表面に接着する。用いるビーズは直径100μm〜400μmまで様々である。共に、ノズルからの高圧水流を用いて金属を切断するジェット水流マシーン内に載置する。特製のPZTディスクを用いて最大解離効率を達成する。
【０１４２】
組織解離チャンバは14.5 mm（直径） ( 0.7 mmであり、容積は115μlである。チャンバの側壁に設けた導入孔を介して組織および試薬をチャンバにロードした。
【０１４３】
圧電アクチュエータは、小型および高エネルギー密度などの利点を有するが、圧電ディスクは作動させるのに比較的高い電圧を必要とする（Madou, Marc J., CRC press, 1997, 416-419）。ピーク間電圧280 V時に走査周波数3 Hzの出力正弦波を有する実験室製造パワーアンプを用いて、PZTディスクを作動させた（但し5.4 kHz〜6.6 kHzの走査周波数を用いてもよい）。実験により、この走査周波数では、組織解離チャンバでより強いキャビテーションが得られ、したがって組織解離性能が高まったことが判明した。
【０１４４】
実施例１に記載した、ラットの肝臓組織が完全に解離するために必要な時間を異なる組織サイズごとに示した実験を行った。結果を図４（Ａ）および（Ｂ）ならびに図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】カートリッジデバイスの外観図である。
【図１Ｂ】カートリッジデバイスの断面図である。
【図２】（Ａ）は、カートリッジデバイスの試作品の写真である。（Ｂ）は、本発明のカートリッジおよびバイオチップデバイスに用いる駆動回路シャーシ（ボディ）を示す図である。
【図３】走査周波数高電圧電源の動作原理を示す回路の接続配置を示す図である。
【図４】（Ａ）は、ラットの肝臓組織由来の細胞片を含む破壊溶液の光学画像を示す図であり、グリッド寸法は100μmである。（Ｂ）は、ラットの心臓組織由来の細胞片を含む破壊溶液の光学画像を示す図であり、グリッド寸法は100μmである。
【図５】平均破壊時間(s)と組織試料重量(mg)との関係を示す図である。破壊効率は、光学画像により決定される必要時間に対する、破壊する組織の初期サイズにより表される。
【図６】破壊チャンバ温度の変化を経時的に示す図である。
【図７】RNAのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。左から右に、Ｍ：マーカー、１：ホモジナイザーによって破壊された新鮮組織、２および３：小型チャンバによって破壊された新鮮組織、４および５：小型チャンバによって破壊された凍結組織である。１８Ｓおよび２８Ｓはそれぞれ、18Sおよび28SのリボソームRNAの位置を示す。
【図８】（Ａ）は、新鮮組織および凍結組織から抽出されたTP53遺伝子のRT-PCR生成物に関するアガロースゲル結果を示す図である。本発明者によるテストで最長のmRNAは、1176 bpsであった。（Ｂ）は、360 bps、β-マイクログロブリンの最短cDNAに関する、上記と同様の結果を示す図である。
【図９】バイオチップデバイスの一実施形態を示す図である。
【図１０】バイオチップデバイスの模式的構造を示す図である。
【図１１Ａ】３層を含むバイオチップデバイスの構造を示し、レザバー、ポンプ、バルブ、チャネルおよびチャンバの連結を示す長手方向断面図である。
【図１１Ｂ】３層を含むバイオチップデバイスの構造を示し、解離チャンバ、ポンプ、バルブ、チャネルおよびチャンバの連結を示す、異なる長手方向に沿った断面図である。
【図１２Ａ】図１１Ｂの解離チャンバを詳細に示す図であって、解離チャンバが内部に試料を含んでいない状態を示す図である。
【図１２Ｂ】図１１Ｂの解離チャンバを詳細に示す図であって、解離チャンバが内部に生体試料と溶液とを含んでいる状態を示す図である。
【図１３】（Ａ）は、流量と駆動周波数（動作周波数(Hz)）との関係を調べた実験結果を示す図である。（Ｂ）は、流量と圧力特性（ポンプヘッド）との関係を調べた実験結果を示す図である。
【図１４】マイクロバルブが開状態であるときの流量とマイクロバルブの圧力との関係を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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