(57)【要約】  本願明細書には、治療有効量のカンナビノイド−１（CB−1）受容体アンタゴニストおよび腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質（MTPi）をそうした治療を必要としている動物に投与することを含む、肥満症または関連する摂食障害の治療および／または食物摂取量の減量のための併用療法が記載されている。CB−1受容体アンタゴニストおよび腸作用性MTPiは、別々にまたは一緒に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満症及び関連する摂食障害の治療を必要としている動物にカンナビノイド−１受容体アンタゴニストと腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質を含む治療有効量の併用剤を投与する段階を含む、肥満症及び関連する摂食障害を治療するための方法。
【請求項２】
食物摂取量の減量の治療を必要としている動物にカンナビノイド−１受容体アンタゴニストと腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質を含む治療有効量の併用剤を投与する段階を含む、食物摂取量の減量のための方法。
【請求項３】
カンナビノイド−１受容体アンタゴニストが、
リモナバント；
N−(ピペリジン−1−イル)−1−(2,4−ジクロロ−フェニル)−5−(4−ヨードフェニル)−4−メチル−1H−ピラゾール−3−カルボキサミド；
[5−(4−ブロモフェニル)−1−(2,4−ジクロロ−フェニル)−4−エチル−N−(1−ピペリジニル)−1H−ピラゾ−ル−3−カルボキサミド]；
N−(ピペリジン−1−イル)−4,5−ジフェニル−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
N−(ピペリジン−1−イル)−4−(2,4−ジクロロ−フェニル)−5−(4−クロロ−フェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
N−(ピペリジン−1−イル)−4,5−ジ−(4−メチルフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
N−シクロヘキシル−4,5−ジ−(4−メチルフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
N−(シクロヘキシル)−4−(2,4−ジクロロ−フェニル)−5−(4−クロロ−フェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
N−(フェニル)−4−(2,4−ジクロロ−フェニル)−5−(4−クロロ−フェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；
1−[9−(4−クロロ−フェニル)−8−(2−クロロ−フェニル)−9H−プリン−6−イル]−4−エチルアミノ−ピペリジン−4−カルボン酸アミド、もしくはその製薬的に受容可能な塩；
1−[7−(2−クロロ−フェニル)−8−(4−クロロ−フェニル)−2−メチル−ピラゾール[1,5−a][1,3,5]トリアジン−4−イル]−3−エチルアミノ−アゼチジン−3−カルボン酸アミド；
1−[7−(2−クロロ−フェニル)−8−(4−クロロ−フェニル)−2−メチル−ピラゾール[1,5−a][1,3,5]トリアジン−4−イル]−3−メチルアミノ−アゼチジン−3−カルボン酸アミド；
3−(4−クロロ−フェニル)−2−(2−クロロ−フェニル)−6−(2,2−ジフルオロ−プロピル)−2,4,5,6−テトラヒドロ−ピラゾロ[3,4−c]ピリジン−7−オン；
3−(4−クロロ−フェニル)−2−(2−クロロ−フェニル)−7−(2,2−ジフルオロ−プロピル)−6,7−ジヒドロ−2H,5H−4−オキサ−1,2,7−トリアザ−アズレン−8−オン；
2−(2−クロロ−フェニル)−6−(2,2,2−トリフルオロ−エチル)−3−(4−トリフルオロメチル−フェニル)−2,6−ジヒドロ−ピラゾロ[4,3−d]ピリミジン−7−オン；
(S)−4−クロロ−N−｛[3−(4−クロロ−フェニル)−4−フェニル−4,5−ジヒドロ−ピラゾール−1−イル]−メチルアミノ−メチレン｝−ベンゼンスルホンアミド；
(S)−N−｛[3−(4−クロロ−フェニル)−4−フェニル−4,5−ジヒドロ−ピラゾール−1−イル]−メチルアミノ−メチレン｝−4−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド；
N−ピペリジノ−5−(4−ブロモフェニル)−1−(2,4−ジクロロフェニル)−4−エチルピラゾール−3−カルボキサミド；
1−[ビス−(4−クロロ−フェニル)−メチル]−3−[(3,5−ジフルオロ−フェニル)−メタンスルホニル−メチレン]−アゼチジン；
2−(5−(トリフルオロメチル)ピリジン−2−イルオキシ)−N−(4−(4−クロロフェニル)−3−(3−シアノフェニル)ブタン−2−イル)−2−メチルプロパンアミド；
4−｛[6−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−1−ベンゾフラン−3−イル]カルボニル｝ベンゾニトリル；
1−[2−(2,4−ジクロロフェニル)−2−(4−フルオロフェニル)−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−スルホニル]−ピペリジン；および
[3−アミノ−5−(4−クロロフェニル)−6−(2,4−ジクロロフェニル)−フロ[2,3−b]ピリジン−2−イル]−フェニル−メタノン；
またはそれらの製薬的に受容可能な水和物もしくは溶媒和物、
から成る群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質が、
ジルロタピド；
ミトラタピド；
1−メチル−5−[(4'−トリフルオロメチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−1H−インドール−2−カルボン酸 (カルバモイル−フェニル−メチル)−アミド；
(S)−2−[(4'−トリフルオロメチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸(ペンチルカルバモイル−フェニル−メチル)−アミド；
(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸｛[(4−フルオロ−ベンジル)−メチル−カルバモイル]−フェニル−メチル｝−アミド；
(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸[(4−フルオロ−ベンジルカルバモイル)−フェニル−メチル]−アミド；
4−(4−(4−(4−((2−((4−メチル−4H−1,2,4−トリアゾール−3−イルチオ)メチル)−2−(4−クロロフェニル)−1,3−ジオキソラン−4−イル)メトキシ)フェニル)ピペラジン−1−イル)フェニル)−2−sec−ブチル−2H−1,2,4−トリアゾール−3(4H)−オン；および
イムプリタピド；
またはそれらの製薬的に受容可能な水和物もしくは溶媒和物、
から成る群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
併用剤が、約1.0mgから約100mgのカンナビノイド−１受容体アンタゴニストを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
併用剤が、約0.05mgから約50mgの腸作用性ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
カンナビノイド−１受容体アンタゴニストおよび腸作用性ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質が、該カンナビノイド−１受容体アンタゴニスト、該腸作用性ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質、および製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む、単一の医薬組成物として投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
カンナビノイド−１受容体アンタゴニストおよび腸作用性ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質が、
(ｉ) 該カンナビノイド−１受容体アンタゴニストおよび製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む、第一の組成物、ならびに
(ii) 該腸作用性ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質、および製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む、第二の組成物、
を含む、二つの別々の医薬組成物として投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
(ｉ) CB−1受容体アンタゴニスト；(ii) 腸作用性MTPi；および(iii) 製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物であって、CB−1受容体アンタゴニストの量が約1.0mgから約100mgでありそして腸作用性MTPiの量が約0.05mgから約50mgである、医薬組成物。
【請求項１０】
肥満症及び関連する摂食障害の治療のための医薬品の製造における、CB−1受容体アンタゴニスト及び腸作用性MTPiの使用。
【請求項１１】
食物摂取量の減量のための医薬品の製造における、CB−1受容体アンタゴニストおよび腸作用性MTPiの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンナビノイド−１（CB−1）受容体アンタゴニストと腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質（MTPi）とを組み合わせた、肥満症または関連する摂食障害の治療および／または食物摂取量の減量のための併用療法に関している。
【背景技術】
【０００２】
肥満症は主要な公衆衛生上の問題であり、そして現在ではそれの関連する健康上のリスクを減少させるための治療を必要とする慢性疾患として認識されている。体重減少は重要な治療の成果ではあるが、肥満症の管理の主な目的の一つは、心血管系および代謝の数値データを改善して肥満症に関連する疾病率および死亡率を減少させることである。体重の５〜10％の減少が、血糖、血圧、および脂質濃度のような代謝の数値データを実質的に改善できることが示されてきた。したがって、体重の５〜10％の意図的な減少が、疾病率および死亡率を減少できるだろうと信じられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
肥満症を管理するために現在利用できる処方薬は、一般に飽満を誘導しまたは食餌性脂肪吸収を減少させることにより、体重を減少させる。しかしながら、現在まで市場で利用可能な抗肥満症治療薬は、ほんのわずかな体重減少をもたらすにすぎない。ヒトにおける最も成功した医薬投与方式は、フェンテルミンとフェンフルラミンとの、またはエフェドリン、カフェインおよび／またはアスピリンとの、併用である。これらの併用のそれぞれは安全性上の問題のために中断された。研究は進んでいるが、体重獲得を減少させるまたは抑制するためのより効果的で安全な治療的処置に対する要求はなお存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、治療有効量のカンナビノイド−１（CB−1）受容体アンタゴニストおよび腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質（MTPi）をそうした治療を必要としている動物に投与する段階を含む、肥満症または関連する摂食障害の治療をするための方法を（好ましくは、体重を減少させおよび／または体重減少を維持することで（または体重獲得を抑制することで））提供する。CB−1受容体アンタゴニストおよび腸作用性MTPiは、別々にまたは一緒に投与することができる。好ましくは、併用療法は、運動および理論にかなった食事療法と組み合わせて、投与される。
【０００５】
本発明の別の実施態様では、治療有効量のカンナビノイド−１（CB−1）受容体アンタゴニストおよび腸作用性のミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質阻害物質（MTPi）をそうした治療を必要としている動物に投与する段階を含む、食物摂取量（食物を摂取したいという欲求を含む）を減少させるための方法を提供する。CB−1受容体アンタゴニストおよび腸作用性MTPiは、別々にまたは一緒に投与することができる。好ましくは、併用療法は、運動および理論にかなった食事療法と組み合わせて、投与される。
【０００６】
上記の併用療法は、(ａ) CB−1アンタゴニスト、腸作用性MTPiおよび製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤もしくは担体を含む単一の医薬組成物として；または(ｂ) (ｉ) CB−1アンタゴニストおよび製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含有する第一の組成物、ならびに(ii) 腸作用性MTPiおよび製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含有する第二の組成物を含む、二つの別々の医薬組成物として、投与できる。この医薬組成物は、同時にまたは連続的にそしていかなる順序でも、投与できる。
【０００７】
本発明の別の実施態様において、(ｉ) CB−1受容体アンタゴニスト；(ii) 腸作用性MTPi；および(iii) 製薬的に受容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物が提供され、ここでCB−1受容体アンタゴニストの量は約1.0mgから約100mg（好ましくは約1.0mgから約50mg、より好ましくは約2.0mgから約40mg、最も好ましくは約5.0mgから約25mg）、および腸作用性MTPiの量は約0.05mgから約50mg（好ましくは約0.5mgから約30mg、より好ましくは約0.5mgから約20mg、最も好ましくは約1.0mgから約15mg）である。
【０００８】
本発明のさらに別の実施態様において、消費者が肥満症および関連する摂食障害を治療するために使用する製剤キットを提供する。このキットには、ａ) CB−1アンタゴニストおよび腸作用性MTPiを含む適切な投与剤形；ならびにｂ) この投与剤形を肥満症および／または関連する摂食障害の治療のために使用する方法および／または食物摂取を減少させるための方法を記載した手引書を、含んでいる。
【０００９】
本発明のさらに別の実施態様は、ａ) (ｉ) CB−1アンタゴニストおよび(ii) 製薬的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含有する第一の投与剤形；ｂ) (ｉ) 腸作用性MTPiおよび(ii) 製薬的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含有する第二の投与剤形；ならびにｃ) 容器、を含む製剤キットである。
【００１０】
定義
本願で用いる「治療有効量」という表現は、
(ｉ) 特定の疾患（その症状または障害を含む）を治療する、(ii) 特定の疾患の１またはそれ以上の病状を緩和し、改善しもしくは除去する、または(iii) 本願で記載された特定の疾患の１またはそれ以上の発症を防止しもしくは遅延させる（例えば、食物摂取もしくは食物摂取の欲求を減少させる）、本発明の化合物の併用剤の量を意味する。「治療すること」、「治療する」または「治療」という表現は、予防的（すなわち、体重維持）治療もまた包含する。
【００１１】
「動物」という表現は、ヒト（男性もしくは女性）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコおよびウマ）、食用動物、動物園の動物、海洋動物、鳥類および他の同様な種を意味する。「食用動物」とは、ウシ、ブタ、ヒツジおよび家禽のような食用の動物を意味する。好ましくは、この動物は、ヒトまたは愛玩動物（好ましくは、イヌのような愛玩動物）、より好ましくは、この動物はヒト（男性および／または女性）を意味する。
【００１２】
「製薬的に受容可能な」という表現は、物質または組成物が、製剤中の他の成分と、および／または、それを用いて治療される哺乳類動物と、化学的におよび／または毒性学的に適合可能でなければならないことを意味する。
「アンタゴニスト」という表現には、完全アンタゴニストおよび部分アンタゴニストの両方、ならびに逆アゴニストを含む。
「食物」という表現は、ヒトまたは他の動物に摂取される食物または飲料物を意味する。
【００１３】
図１は、ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で10mg／kg、およびジルロタピドを単独で３mg／kgと比較した、化合物Ａの10mg／kgとジルロタピドの３mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
図２は、ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で10mg／kg、およびジルロタピドを単独で10mg／kgと比較した、化合物Ａの10mg／kgとジルロタピドの10mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
図３は、ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で30mg／kg、およびジルロタピドを単独で３mg／kgと比較した、化合物Ａの30mg／kgとジルロタピドの３mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
図４は、ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で30mg／kg、およびジルロタピドを単独で10mg／kgと比較した、化合物Ａの30mg／kgとジルロタピド10mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
【００１４】
出願人は、食物摂取の顕著な減少が、CB−1受容体アンタゴニストと腸作用性MTP阻害物質を組み合わせて投与することで達成できることを見出した。好ましくは、併用療法は、運動および理論にかなった食事療法と組み合わせて、投与される。
【００１５】
カンナビノイド−１（CB−1）受容体アンタゴニスト：
本願で用いられる「CB−1受容体」という表現は、Ｇタンパク質共役１型カンナビノイド受容体を意味する。好ましくは、CB−1受容体アンタゴニストはCB−1受容体に選択的である。「CB−1受容体選択的」とは、化合物がカンナビノイド−２受容体（CB−2）に拮抗する活性をほとんどまたは全く持たないことを意味する。より好ましくは、CB−1アンタゴニストはCB−2受容体に比べてCB−1受容体に少なくとも約10倍より選択的である。例えば、CB−1に拮抗する阻害濃度（IC50）は、CB−2に拮抗するIC50より約10倍以上低い値である。カンナビノイド受容体リガンドのCB−1およびCB−2結合特性ならびに薬理学的活性の測定のためのバイオアッセイ方法は、Roger G. Pertweeの“Pharmacology of Cannabinoid Receptor Ligands”, Current Medicinal Chemistry. 6, 635−664 (1999) およびWO 92/02640（米国特許出願番号07/564,075、1990年8月8日出願）に記載されており、これらは参照により本願に組み入れられる。
【００１６】
適切なCB−1受容体アンタゴニストには、米国特許第5,462,960；5,596,106；5,624,941；5,747,524；6,017,919；6,028,084；6,432,984；6,476,060；6,479,479；6,518,264；および 6,566,356；
【００１７】
米国特許公開公報2003/0114495；2004/0077650；2004/0092520；2004/0122074；2004/0157838；2004/0157839；2004/0214837；2004/0214838；2004/0214855；2004/0214856；2004/0058820；2004/0235926；2004/0248881；2004/0259887；2005/0080087；2005/0026983および2005/0101592；
【００１８】
国際特許公開公報WO 03/075660；WO 02/076949；WO 01/029007；WO 04/048317；WO 04/058145；WO 04/029204；WO 04/012671；WO 03/087037；WO 03/086288；WO 03/082191；WO 03/082190；WO 03/063781；WO 04/012671；WO 04/013120；WO 05/020988；WO 05/039550；WO 05/044785；WO 05/044822；WO 05/049615；WO 05/061504；WO 05/061505；WO 05/061506；WO 05/061507；およびWO 05/103052；ならびに
【００１９】
米国特許仮出願番号60/673535（2005年4月20日出願）および60/673546（2005年4月20日出願）で開示された化合物を含んでいる。
【００２０】
上記のこれら全ての特許および特許出願は参照により本願に組み入れられる。
【００２１】
本発明の方法で使用するための、好ましいCB−1受容体アンタゴニストには、Sanofi-Synthelaboから入手できるかまたは米国特許第5,624,941に記載されたように製造できる、リモナバント（SR141716A、商標名AcompliaTMの名称でも知られている）；TocrisTM、Ellisville、ミズーリ州から入手可能なN− (ピペリジン−1−イル)−1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−ヨードフェニル)−4−メチル−1H−ピラゾール−3−カルボキサミド（AM251）；米国特許第 6,645,985に記載されたように製造できる、 [5−(4−ブロモフェニル)−1−(2,4−ジクロロ−フェニル)−4−エチル−N−(1−ピペリジニル)−1H−ピラゾール−3−カルボキサミド] (SR147778)；N−(ピペリジン−1−イル)−4,5−ジフェニル−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド、N−(ピペリジン−1−イル)−4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−クロロフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；N−(ピペリジン−1−イル)−4,5−ジ−(4−メチルフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド、N−シクロヘキシル−4,5−ジ−(4−メチルフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド、N−(シクロヘキシル)−4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−クロロフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド、および国際特許公開公報WO 03/075660に記載されたように製造できるN−(フェニル)−4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−クロロフェニル)−1−メチルイミダゾール−2−カルボキサミド；米国特許公開公報2004/0092520に記載されたように製造できる1−[9−(4−クロロ−フェニル)−8−(2−クロロ−フェニル)−9H−プリン−6−イル]−4−エチルアミノ−ピペリジン−4−カルボン酸アミドの塩酸塩、メシル酸塩およびベシル酸塩；米国特許公開公報2004/0157839に記載されたように製造できる1−[7−(2−クロロ−フェニル)−8−(4−クロロ−フェニル)−2−メチル−ピラゾール[1,5−a][1,3,5]トリアジン−4−イル]−3−エチルアミノ−アゼチジン−3−カルボン酸アミドおよび1−[7−(2−クロロ−フェニル)−8−(4−クロロ−フェニル)−2−メチル−ピラゾール[1,5−a][1,3,5]トリアジン−4−イル]−3−メチルアミノ−アゼチジン−3−カルボン酸アミド；米国特許公開公報2004/0214855に記載されたように製造できる3−(4−クロロ−フェニル)−2−(2−クロロ−フェニル)−6−(2,2−ジフルオロ−プロピル)−2,4,5,6−テトラヒドロ−ピラゾロ[3,4−c]ピリジン−7−オン；米国特許公開公報2005/0101592に記載されたように製造できる3−(4−クロロ−フェニル)−2−(2−クロロ−フェニル)−7−(2,2−ジフルオロ−プロピル)−6,7−ジヒドロ−2H,5H−4−オキサ−1,2,7−トリアザ−アズレン−8−オン；米国特許公開公報2004/0214838に記載されたように製造できる2−(2−クロロ−フェニル)−6−(2,2,2−トリフルオロ−エチル)−3−(4−トリフルオロメチル−フェニル)−2,6−ジヒドロ−ピラゾロ[4,3−d]ピリミジン−7−オン；国際特許公開公報WO 02/076949に記載されたように製造できる(S)−4−クロロ−N−｛[3−(4−クロロ−フェニル)−4−フェニル−4,5−ジヒドロ−ピラゾール−1−イル]−メチルアミノ−メチレン｝−ベンゼンスルホンアミド（SLV−319）および(S)−N−｛[3−(4−クロロ−フェニル)−4−フェニル−4,5−ジヒドロ−ピラゾール−1−イル]−メチルアミノ−メチレン｝−4−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド（SLV−326）；米国特許第6,432,984に記載されたように製造できるN−ピペリジノ−5−(4−ブロモフェニル)−1−(2,4−ジクロロフェニル)−4−エチルピラゾール−3−カルボキサミド；米国特許第6,518,264に記載されたように製造できる1−[ビス−(4−クロロ−フェニル)−メチル]−3−[(3,5−ジフルオロ−フェニル)−メタンスルホニル−メチレン]−アゼチジン；国際特許公開公報WO 04/048317に記載されたように製造できる2−(5−(トリフルオロメチル)ピリジン−2−イルオキシ)−N−(4−(4−クロロフェニル)−3−(3−シアノフェニル)ブタン−2−イル)−2−メチルプロパンアミド；米国特許第5,747,524に記載されたように製造できる4−｛[6−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−1−ベンゾフラン−3−イル]カルボニル｝ベンゾニトリル（LY−320135）；WO 04/013120に記載されたように製造できる1−[2−(2,4−ジクロロフェニル)−2−(4−フルオロフェニル)−ベンゾ[1,3]ジオキソール−5−スルホニル]−ピペリジン；ならびにWO 04/012671に記載されたように製造できる[3−アミノ−5−(4−クロロフェニル)−6−(2,4−ジクロロフェニル)−フロ[2,3−b]ピリジン−2−イル]−フェニル−メタノン；が含まれる。
【００２２】
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質の腸阻害物質：
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（MTP）はリン脂質表面の間の脂質の輸送を媒介する。Wetterau J R等, Biochim Biophys Acta 1345, 136−150 (1997)を参照する。このタンパク質は肝の内腔（lumen）および腸のミクロソームで見出される。MTPは、MTP特異的大サブユニット（97kD）およびタンパク質ジスルファイドイソメラーゼ（PDI、58kD）から成るヘテロ二量体である。PDIは広く分布している小胞体（ER）のタンパク質であり、そしてMTPの構造および機能的統合のための必須の構成成分である。MTPはアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）含有血漿タンパク質の細胞内生産に必要である。リポタンパク質の組成中でのMTPの正確な役割はわかっていないが、ERの膜からERの内腔中で形成されるリポタンパク質粒子へと脂質を輸送している可能性が高い。アポリポタンパク質Ｂは肝VLDL（超低密度リポタンパク質）および腸カイロミクロンの主要なタンパク質成分である。MTPを阻害する物質はアポＢ含有リポタンパク質の分泌を減少させる。それゆえにMTPのどのような阻害もアポＢ含有リポタンパク質中のコレステロールおよびトリグリセリドの血漿濃度を低下させる。MTP阻害物質による腸における食物からの脂肪の吸収の阻害は、過剰な脂肪摂取がその疾患の進行を著しく助長している肥満症および糖尿病のような症状を治療するために有用であると信じられている。Grundy S M, Am J Clin Nutr 57(suppl), 563S−572S (1998)を参照。
【００２３】
本発明の実施において、腸作用性MTP阻害物質は好ましくは腸選択的である。「腸選択的」という表現は、MTP阻害物質が肝のMTPより腸のミクロソーム中のMTPにより強く曝されることを意味している。好ましくは、MTPiは肝のMTPより腸のミクロソーム中のMTPに対して３倍より選択的であり、より好ましくはこのMTPiは肝のMTPより腸のミクロソーム中のMTPに対して10倍より選択的であり、最も好ましくはこのMTPiは肝のMTPより腸のミクロソーム中のMTPに対して100倍より選択的である。選択性は通常トリグリセリド（TG）の蓄積により測定される。例えば、有用な腸作用性MTPiおよび／または腸作用性MTPiの用量は腸におけるトリグリセリドの集積をもたらし、肝では統計的に有意なトリグリセリドの蓄積をもたらさないものである。トリグリセリド含量は動物において腸および肝組織を切開し、抽出し、そしてトリグリセリド濃度を定量することにより測定できる。好ましくは腸でのTG蓄積は肝でのTG蓄積より３倍以上であり、より好ましくは腸でのTG蓄積は肝でのTG蓄積より10倍以上であり、最も好ましくは腸でのTG蓄積は肝でのTG蓄積より100倍以上である。腸でのTG蓄積と食物摂取量の減少の間の相関関係が観察されたことから、食物摂取の減少が腸MTP阻害から直接的または間接的に生じると推測することが理にかなっており；それゆえ、食物摂取量の測定が腸MTP阻害を評価するためのもう一つの有用な手段を提供する。
【００２４】
腸選択性は腸管での阻害物質の溶解性および／または投与剤形からの阻害物質の放出を制御することにより達成される。
【００２５】
ごく最近になってMTP阻害物質がイヌおよびネコでの食物摂取を減少させることが示されていた（EP1099438参照）。
【００２６】
適切な腸作用性MTPiには、米国特許第4,453,913；4,473,425；4,491,589；4,540,458；4,962,115；5,057,525；5,137,896；5,286,647；5,521,186；5,595,872；5,646,162；5,684,014；5,693,650；5,712,279；5,714,494；5,721,279；5,739,135；5,747,505；5,750,783；5,760,246；5,789,197；5,811,429；5,827,875；5,837,733；5,849,751；5,883,099；5,883,109；5,885,983；5,892,114；5,919,795；5,922,718；5,925,646；5,929,075；5,929,091；5,935,984；5,952,498；5,962,440；5,965,577；5,968,950；5,998,623；6,025,378；6,034,098；6,034,115；6,051,229；6,051,387；6,051,693；6,057,339；6,066,650；6,066,653；6,114,341；6,121,283；6,191,157；6,194,424；6,197,798；6,197,972；6,200,971；6,235,730；6,235,770；6,245,775；6,255,330；6,265,431；6,281,228；6,288,234；6,329,360；6,342,245；6,369,075；6,417,362；6,451,802；6,479,503；6,492,365；6,583,144；6,617,325；6,713,489；6,720,351；6,774,236；および6,777,414；
【００２７】
米国特許公開公報2002/028940；2002/032238；2002/055635；2002/132806；2002/147209；2003/149073；2003/073836；2003/105093；2003/114442；2003/0162788；2003/166590；2003/166637；2003/181714；2004/009988；2004/014971；2004/024215；2004/034028；2004/044008；2004/058903；2004/102490；2004/157866；および2005/234099；
【００２８】
国際特許公開公報WO 96/262205；WO 98/016526；WO 98/031366；WO99/55313；WO 00/005201；WO 01/000183；WO 01/000184；WO 01/000189；WO 01/005767；WO 01/012601；WO 01/014355；WO 01/021604；WO 01/053260；WO 01/074817；WO 01/077077；WO 02/014276；WO 02/014277；WO 02/081460；WO 02/083658；およびWO 04/017969、ならびに
【００２９】
日本特許公開公報JP2002−212179(14212179)；およびJP2002−220345(14220345)、
が含まれる。
【００３０】
アポＢ／MTP阻害物質に関する総説は、Williams, SJ. およびJ. D. Best, Expert Opin Ther Patents, 13(4), 479−488 (2003)を参照する。活性MTP阻害物質の同定のための方法については、Chang, G., 等, “Microsomal triglyceride transfer protein (MTP) inhibitors: Discovery of clinically active inhibitors using high−throughput screening and parallel synthesis paradigms,” Current Opinion in Drug Discovery & Development. 5(4), 562−570 (2002)を参照する。上記の全ての特許、特許出願および参考文献は、参照により本願に組み入れられる。
【００３１】
本発明の組み合わせ、医薬組成物および方法における使用のための好ましい腸作用性MTP阻害物質は、米国特許第6,720,351で記載されている方法により製造できる、ジルロタピド ((S)−N−｛2−[ベンジル(メチル)アミノ]−2−オキソ−1−フェニルエチル｝−1−メチル−5−[4'−(トリフルオロメチル)[1,1'−ビフェニル]−2−カルボキサミド]−1H−インドール−2−カルボキサミド) および 1−メチル−5−[(4'−トリフルオロメチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−1H−インドール−2−カルボン酸(カルバモイル−フェニル−メチル)−アミド；米国特許公開公報 2005/0234099に記載されたように製造できる (S)−2−[(4'−トリフルオロメチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸(ペンチルカルバモイル−フェニル−メチル)−アミド、(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸｛[(4−フルオロ−ベンジル)メチル−カルバモイル]−フェニル−メチル｝−アミド、(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸[(4−フルオロ−ベンジルカルバモイル)−フェニル−メチル]−アミド；米国特許第5,521,186および5,929,075に記載されたように製造できる (−)−4−[4−[4−[4−[[(2S,4R)−2−(4−クロロフェニル)−2−[[(4−メチル−4H−1,2,4−トリアゾール−3−イル)スルファニル]メチル−1,3−ジオキソラン−4−イル]メトキシ]フェニル]ピペラジン−1−イル]フェニル]−2−(1R)−1−メチルプロピル]−2,4−ジヒドロ−3H−1,2,4−トリアゾール−3−オン（ミトラタピドまたはR103757としても知られている）；ならびに、米国特許第6,265,431に記載されたように製造できるイムプリタピド（BAY 13−9952）が含まれる。最も好ましいのは、ジルロタピド、ミトラタピド、(S)−2−[(4'−トリフルオロメチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸(ペンチルカルバモイル−フェニル−メチル)−アミド、(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸｛[(4−フルオロ−ベンジル)メチル−カルバモイル]−フェニル−メチル｝−アミド、(S)−2−[(4'−tert−ブチル−ビフェニル−2−カルボニル)−アミノ]−キノリン−6−カルボン酸[(4−フルオロ−ベンジルカルバモイル)−フェニル−メチル]−アミド、である。
【００３２】
典型的な製剤はCB−1受容体アンタゴニストおよび／または腸作用性MTPiと、担体、希釈剤または賦形剤とを混合して製造される。適切な担体、希釈剤および賦形剤は当業者に周知であり、炭水化物、ロウ、水溶性および／または膨潤性重合体、親水性または疎水性材料、ゼラチン、油類、溶媒、水、等を含んでいる。用いられる特定の担体、希釈剤および賦形剤は、本発明の化合物が適用される手段および目的に依存する。溶媒は一般に哺乳類動物に投与して安全である（GRAS）と当業者により認められた溶媒を基礎として選択される。一般に安全な溶媒は水のような非毒性水性溶媒または他の水に溶解性もしくは混和性の非毒性溶媒である。適切な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、PEG400、PEG300）等、およびそれらの混合物が含まれる。この製剤にはまた、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、滑沢剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、不透明化剤（opaquing agents）、滑沢剤、加工助剤、発色剤、甘味剤、芳香剤、矯味矯臭剤、および他の、医薬に洗練された外観を与えるまたは医薬製造物（即ち、医薬品）の製造を助ける添加物のような、賦形剤を含んでも良い。
【００３３】
この製剤は慣用の溶解および混合工程を用いて製造できる。例えばバルクの製剤原料（化合物または化合物の安定化形態（例えば、シクロデキストリン誘導体または他の知られた錯化剤との複合体））を、上記の賦形剤の１またはそれ以上の存在下で、適切な溶媒に溶解する。化合物は典型的に医薬投与剤形へと製剤化され、医薬の容易に制御可能な用量を提供し、そして患者に的確で容易に操作可能な製品を与える。CB−1受容体アンタゴニストと腸作用性MTPiは、単一のまたは別々の投与剤形へと製剤化できる。溶解速度を促進するために水に難溶性の化合物を、投与剤形へと製剤化する前に、適切な分散剤中に分散させることが有利だろう。例えば、水不溶性または部分的な水不溶性の化合物は、溶解化または分散化剤の存在下で噴霧乾燥できる。例えば、Takeuchi, Hirofumi, 等 J Pharm Pharmacol, 39, 769−773 (1987) およびWO 05/046644を参照。水に難溶性の化合物の生物学的利用性を改善するための他の技術は、Verreck, G.,等, “The Use of Three Different solid Dispersion Formulations−Melt Extrusion, Film−coated Beads, and a Glass Thermoplastic System−to Improve the Bioavailability of a Novel Microsomal Triglyceride transfer Protein Inhibitor,” J Pharm Sci, 93(5), 1217−1228 (2004)；およびPeeters, J.,等, Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 28, 704−705 (2001) に記載されている。
【００３４】
経口投与のためには医薬組成物は通常は不連続な単位で投与される。例えば典型的な投与剤形には、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、顆粒剤、サッシェ剤および液体溶液または懸濁液が含まれ、それぞれは活性成分を粉末もしくは顆粒の形態で、または水性液体、非水性液体、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として所定量を含んでいる。
【００３５】
圧縮化錠剤は粉末または顆粒のような自由流動形態の活性成分を、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性剤および／または分散剤とともに圧縮して製造できる。
【００３６】
経口投与のための液体投与剤形には製薬的に受容可能な乳剤、溶液、懸濁剤、シロップおよびエリキシールが含まれる。活性成分に加えて液体投与剤形は、水もしくは他の溶媒のような当該分野で慣用的に用いられる不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類（例えば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ種子油、等）、グリコール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、またはそれらの物質の混合物等を含有しても良い。
【００３７】
そうした不活性希釈剤の他に、組成物には、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味剤ならびに矯味矯臭剤のような賦形剤を含んでも良い。
【００３８】
活性成分の他に、懸濁液にはさらに懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリン酸アルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天、ならびにトラガカント、またはそれらの材料の混合物等を含んでも良い。
【００３９】
適用のための医薬組成物（または組成物）は医薬の投与に用いる方法に従って様々な方法で包装されても良い。一般に配送のための物品にはその中に適切な形態での医薬組成物を収納した容器を含んでいる。適切な容器は当業者に知られており、ビン（プラスチックまたはガラス）、サッシェ、アンプル、プラスチックバック、金属円筒等が含まれる。容器には包装の内容物への不注意な接触を防止するための不正開封防止装置を含むこともできる。さらに、容器の表面には、容器の内容物を記載するラベルを付することができる。このラベルには適切な警告も記載できる。容器には肥満症もしくは関連する摂食障害の治療、または食物摂取量の減量のための投与剤形を使用する際の指示書を含んでも良い。
【００４０】
化合物は所望の組織（例えば、脳、腎または小腸組織）に優先的に化合物を送達するいかなる方法によっても投与できる。この方法には経口経路、非経口、十二指腸内経路、経皮等を含む。通常、化合物は、経口的に、単回（例えば、一日一回）または多数回投与で投与される。投与される化合物の量および時期はもちろん、治療すべき患者、苦痛の重さ、投与の方法および処方する医師の判断に依存するだろう。したがって患者間の変動により本願で与えられる投与量は一つの指針であって、医師は患者にとって医師が適切であると考える治療を達成するために薬物の量を変更できる。所望の治療の程度を考慮して、医師は患者の年齢、既往症の存在、生活様式、ならびに他の疾患（例えば、心血管系の疾患）の存在のような様々な要素の平衡を図らなければならない。
【００４１】
ヒトでの使用のためには腸作用性MTPiの一日投与量は、通常約0.05mgから約50mgの間、好ましくは約0.5mgから約30mgの間、より好ましくは約0.5mgから約20mgの間、最も好ましくは約1.0mgから約15mgの間である。ヒト以外の使用のためには、当業者なら動物の特定の体重のための投与量をどのように調節するかを知っている。ある環境下では、MTPiは、脂肪肝を減少させる薬剤（例えば、フィブラートまたはPPAR−αアゴニスト）と組み合わせて投与しても良い。発明の名称が「脂肪肝の治療剤」である日本公開公報2002−220345（出願番号2001−015602）、およびKersten, S., “Peroxisome Proliferator Activated Receptors and Obesity,” Eur J Pharm, 440, 223−234 (2002)を参照する。
【００４２】
ヒトでの使用のためにはCB−1受容体アンタゴニストの一日投与量は、通常約1.0mgから約100mgの間、好ましくは約1.0mgから約50mgの間、より好ましくは約2.0mgから約40mgの間、最も好ましくは約5.0mgから約25mgの間である。ヒト以外の使用のためには当業者なら動物の特定の体重のための投与量をどのように調節するかを知っている。
【００４３】
薬理学的試験
CB−1アンタゴニストの同定
本発明の実施において有用なCB−1アンタゴニストは以下に記載する実験手順の少なくとも一つを用いて同定することができる。以下の頭字語を下記の実験手順において使用する。
BSA：ウシ血清アルブミン
DMSO：ジメチルスルホキシド
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
PBS：リン酸緩衝化生理食塩水
EGTA：エチレングリコール−ビス((−アミノエチルエーテル) N,N,N',N'−四酢酸
GDP：グアノシン二リン酸
【００４４】
[3H]SR141716A：放射性標識化N−(ピペリジン−1−イル)−5−(4−クロロフェニル)−1−(2,4−ジクロロフェニル)−4−メチル−1H−ピラゾール−3−カルボキサミド塩酸塩、Amersham Biosciences、ピスカタウエイ、ニュージャージ州より入手できる。
[3H]CP−55940：放射性標識化5−(1,1−ジメチルヘプチル)−2−[5−ヒドロキシ−2−(3−ヒドロキシプロピル)−シクロヘキシル]−フェノール、NEN Life Science Product、ボストン、マサチューセッツ州より入手できる。
AM251：N−(ピペリジン−1−イル)−1−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−ヨードフェニル)−4−メチル−1H−ピラゾール−3−カルボキサミド、TocrisTM、Ellisville、ミズーリ州より入手できる。
【００４５】
インビトロ生物学的アッセイ法
CB−1およびCB−2結合特性ならびにカンナビノイド受容体リガンドの薬理学的活性を測定するためのバイオアッセイ系は、Roger G. Pertweeによる「Pharmacology of Cannabinoid Receptor Ligands」、Current Medicinal Chemistry, 6, 635−664 (1999) およびWO 92/02640（1990年8月8日に出願した米国特許出願番号07/564,075であり、参照により本願に組み入れられる）に記載されている。
【００４６】
以下のアッセイ法は、[3H] SR141716A（選択的放射性標識化CB−1リガンド）および [3H] 5−(1,1−ジメチルヘプチル)−2−[5−ヒドロキシ−2−(3−ヒドロキシプロピル)−シクロヘキシル]−フェノール（[3H] CP−55940；放射性標識化CB−1／CB−2リガンド）のそれぞれの受容体に対する結合を阻害する化合物を検出するために設計された。
【００４７】
ラットCB−1受容体結合性の実験手順
PelFreeze脳（Pel Freeze Biologicals、ロジャー、アーカンサス州より入手できる）を切り出し、組織調製用緩衝液（５mMトリス塩酸、pH＝7.4および２mM EDTA）に入れ、高速でポリトロン処理をし、そして氷上に15分間置いた。ホモジネートを次に1,000Xｇで５分間、４℃で遠心分離した。次いで、沈殿物を、用いた脳に付き25mlのTME（25nM トリス、pH＝7.4, ５mM MgCl2, および１mM EDTA）で再懸濁した。タンパク質アッセイを行い、そして、総量で20μgの組織を含む200 μlをアッセイに付した。
【００４８】
試験化合物を薬物緩衝液（0.5％ BSA、10％ DMSOおよびTME）中で希釈し、そして25μlを深底ウエルポリプロピレンプレートに加えた。 [3H] SR141716Aをリガンド緩衝液（0.5％ BSAをTMEに加える）で希釈し、そして25μlをプレートに加えた。 適切な組織濃度を決めるためにBCAタンパク質アッセイ法を用い、そして適切な濃度のラット脳組織の200μlをプレートに加えた。プレートをカバーし、そして20℃で60分間インキュベータ中に置いた。インキュベーション時間の終了時に、250μlの停止緩衝液（0.5％ BSAをTMEに加える）を反応プレートに加えた。次に、このプレートを、BSA (５mg／ml) を加えたTME中で予洗したGF／Bフィルターマット上にSkatronにより回収した。各フルターを二回洗浄した。このフィルターを終夜乾燥した。午前中に、フィルターをWallac BetaplateTM計数器（PerkinElmer Life SciencesTM、ボストン、マサチューセッツ州から入手できる）で計数した。
【００４９】
ヒトCB−1受容体結合性の実験手順
CB−1受容体cDNA（コネチカット大学のDr. Debra Kendallより入手）で形質転換したヒト胎児腎293（HEK293）をホモジネーション緩衝液（10mM EDTA, 10mM EGTA, 10mM 重炭酸Na、プロテアーゼ・インヒビター；pH＝7.4）中に回収し、そしてDounce Homogenizerでホモジナイズした。ホモジネートを次に1,000Xｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、そして25,000Xｇで20分間、４℃で遠心分離した。最終的に得られた沈殿物を１mlのTME（25mM トリス（pH＝7.4）、５mM MgCl2および１mM EDTAを含む）で再懸濁した。タンパク質アッセイを行い、そして、総量で20μgの組織を含む200μlをアッセイに付した。
【００５０】
試験化合物を、薬物緩衝液（0.5％ BSA、10％ DMSOおよびTME）中で希釈し、そして25μlを深底ウエルポリプロピレンプレートに加えた。 [3H] SR141716Aをリガンド緩衝液（0.5％ BSAをTMEに加える）で希釈し、そして25μlをプレートに加えた。適切な組織濃度を決めるためにBCAタンパク質アッセイ法を用い、そして適切な濃度のラット脳組織の200μlをプレートに加えた。プレートをカバーし、そして30℃で60分間インキュベータ中に置いた。インキュベーション時間の終了時に、250μlの停止緩衝液（0.5％ BSAをTMEに加える）を反応プレートに加えた。次に、このプレートを、BSA (５mg／ml) を加えたTME中で予洗したGF／Bフィルターマット上にSkatronにより回収した。各フルターを二回洗浄した。このフィルターを終夜乾燥した。午前中に、フィルターをWallac BetaplateTM計数器（PerkinElmer Life SciencesTM、ボストン、マサチューセッツ州から入手できる）で計数した。
【００５１】
CB−２受容体結合性の実験手順
CB−2受容体cDNA（コネチカット大学のDr. Debra Kendallより入手）で形質転換したチャイニーズ・ハムスター卵巣−K1（CHO−K1）を組織調製用緩衝液（５mMトリス塩酸（pH＝7.4）２mM EDTAを含む）中に回収し、高速でポリトロン処理をし、そして氷上に15分間置いた。ホモジネートを次に1,000Xｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を回収し、そして100,000Xｇで１時間、４℃で遠心分離した。最終的に得られた沈殿物を25mlのTME（25mM トリス（pH＝7.4）、５mM MgCl2および１mM EDTAを含む）で再懸濁した。タンパク質アッセイを行い、そして、総量で10μgの組織を含む200μlをアッセイに付した。
【００５２】
試験化合物を、薬物緩衝液（0.5％ BSA、10％ DMSOおよび80.5％ TME）中で希釈し、そして25μlを深底ウエルポリプロピレンプレートに加えた。[3H] CP−55940をリガンド緩衝液（0.5％ BSAおよび99.5％ TME）で希釈し、そして25μlを１nMの濃度で各プレートに加えた。適切な組織濃度を決めるためにBCAタンパク質アッセイ法を用い、そして適切な濃度のラット脳組織の200μlをプレートに加えた。プレートをカバーし、そして30℃で60分間インキュベータ中に置いた。インキュベーション時間の終了時に、250μlの停止緩衝液（0.5％ BSAをTMEに加える）を反応プレートに加えた。次に、このプレートを、BSA (５mg／ml) を加えたTME中で予洗したGF／Bフィルターマット上にSkatronにより回収した。各フルターを二回洗浄した。このフィルターを終夜乾燥した。次に、フィルターをWallac BetaplateTM計数器で計数した。
【００５３】
CB−1 GTP( [35S] 結合アッセイ法
ヒトCB−1受容体cDNAで安定的に形質転換したCHO−K1細胞から膜を調製した。この膜はBass等の「Identification and characterization of novel somatostatin antagonists」、Molecular Pharmacology, 50, 709−715 (1996) に記載されたように細胞から調製した。GTP( [35S] 結合アッセイは、96ウエルのFlashPlateTMフォーマット中で、二回ずつ、ウエルにつき 100pM GTP([35S] および10μgの膜を用いて、50mM トリス塩酸, pH 7.4, ３mM MgCl2, pH 7.4, 10mM MgCl2, 20mM EGTA, 100mM NaCl, 30μM GDP, 0.1％ ウシ血清アルブミン、および以下のプロテアーゼ・インヒビター：100μg／ml バシトラシン、100μg／ml ベンザミジン、５μg／ml アプロチニン、５μg／ml ロイペプチン、から成るアッセイ用緩衝液中で実施した。次にこのアッセイ混合液アンタゴニストの濃度を増加させながら（10-10 M から10-5 M）10分間インキュベートし、そしてカンナビノイドアゴニストのCP−55940 (10μM)でチャレンジした。アッセイは30℃で１時間行った。次に、Flash PlateTMを2000Xｇで10分間遠心分離した。次に、GTPγ[35S] 結合の刺激を、Wallac Microbetaを用いて定量した。EC50の計算はPrismTMを用いてGraphpadで行った。
逆アゴニズムはアゴニストを存在させないで測定した。
【００５４】
CB−1 FLIPR−ベースの機能アッセイの実験手順
ヒトCB−1受容体cDNA（コネチカット大学のDr. Debra Kendallより入手）および無差別型Ｇ−タンパク質G16で共形質転換したCHO−K1細胞をこのアッセイに用いた。48時間前に、細胞を、コラーゲン被覆384ウエル黒色透明アッセイプレート上で、ウエルにつき12,500個の細胞数で植えつけた。細胞を、2.5mM プロベニシドおよびプルロニック酸（0.04％）を含むDMEM（Gibco）中の４μM Fluo−４AM（モレキュラー・プローブ）と共に、１時間インキュベートした。次にプレートをHEPES緩衝化生理食塩水（プロベニシド2.5mM含む）で過剰な色素を除くために３回洗浄した。20分後、プレートを個別にFLIPRに付し、そして蛍光レベルを80秒間にわたって連続的に観測した。化合物の添加は、ベースラインの20秒後に384ウエルに同時に行った。アッセイは３回ずつ行い、そして６点の濃度反応曲線を作成した。アンタゴニスト化合物は続いて３μM WIN 55,212−2（アゴニスト）を用いてチャレンジした。データはGraph Pad Prismを用いて解析した。
【００５５】
逆アゴニストの検出
以下の、インタクトな細胞を用いたサイクリックAMPアッセイの実験手順を、逆アゴニスト活性を測定するために用いることができる。
細胞を、96ウエル・プレート中に、100μl／ウエルの濃度で、細胞数10,000−14,000個／ウエルの植え付け密度で植えつけた。このプレートを37℃のインキュベータ中で24時間培養した。培地を除去し、そして血清を含まない培地（100μl）を加えた。次いでこのプレートを37℃のインキュベータ中で18時間培養した。
１mM IBMXを含有し血清を含まない培地を各ウエルに加え、次いで0.1％ BSAを含むPBSで10倍に希釈した10μlの試験化合物（1：10 保存溶液（DMSO中の25mMの化合物）を50％ DMSO/PBS中に）を加えた。37℃で20分間インキュベートした後、２μMのフォルスコリンを加え、次いで37℃でさらに20分間インキュベートした。培地を除去した。100μlの0.01N HClを加え、次いで室温でさらに20分間インキュベートした。
細胞溶解液（75μl）を25μlのアッセイ用緩衝液（FlashPlateTM cAMP アッセイキットで提供される。NEN Life Science Product社、ボストン、マサチューセッツ州）と共にFlash Plateに加えた。cAMP標準品およびcAMPトレーサーをキットの手順書に従って加えた。次に、フラッシュプレートを４℃で18時間インキュベートした。ウエルの内容物を吸引し、シンチレーション計数機で計数した。
【００５６】
腸作用性MTPiの同定
本発明の実施において有用な腸作用性MTPiは、下記の実験手順を用いて同定することができる。以下の下記の実験手順で用いられる試薬は、対応する供給元から購入できる。
Triton−XTM100は、Union Carbide Chemicals & Plastic Technology Corp.から入手可能な非イオン性界面活性剤である。
アプロチニンは、Apollo Scientific Ltd.、英国、から入手できる。
WACOトリグリセリドＬ型発色アッセイは、Waco chemicals、リッチモンド、バージニア州から入手可能である。
【００５７】
アポＢ分泌阻害
本発明の化合物がアポＢの分泌を阻害する活性は、HepG2細胞からのアポＢの分泌を測定する、以下の細胞ベースのアッセイ法を用いて測定された。
【００５８】
HepG2細胞（ATCC, HB−8065, Manassas、バージニア州）を、５％二酸化炭素を含む湿潤環境下の96ウエル培養プレートで、10％胎児ウシ血清を添加したダルベッコの改良型イーグル培地（増殖用培地；Gibco社、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で、約70％コンフルエントになるまで増殖させた。試験化合物は、ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mMで溶解した。この保存液から、初期用量濃度を70％ EtOH中で調製し、そして続いて連続的な希釈を、初期希釈に均等な濃度でDMSOを添加した70％ EtOH中で行った。試験化合物の希釈は、100倍で所望の濃度に調製し、そして３個ずつ、HepG2細胞を含んでいる96ウエル培養プレートの別々のウエルに加えた。40時間後に、増殖用培地を回収し、そしてアポＢに対して特異的な酵素連結型免疫吸着アッセイ法（ELISA）により測定を行った。阻害剤は、培地中へのアポＢの分泌を減少させる化合物として同定した。
【００５９】
アポＢに関するELISAアッセイは以下のように行った：ヒトアポＢに対するポリクローナル抗体（Chemicon、テメキューラ、カリフォルニア州）を炭酸−重炭酸緩衝液（Pierce、ロックフォード、イリノイ州）で1：1000に希釈し、そして100μLを96ウエル・プレート（NUNC Maxisorb、ロチェスター、ニューヨーク州）の各ウエルに加えた。室温で５時間インキュベーションした後、抗体溶液を除去し、そしてウエルを、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）／0.05％Tween(R) 20（Tween(R) 20は、Cayman Chemical Co、アナーバー、ミシガン州、より入手できる）で４回洗浄した。プラスチック上の非特異的な部位は、0.5％ (w/v)ウシ血清アルブミン（BSA）、0.1％Tween(R) 20をPBSに含む溶液中で１〜1.5時間ウエルをインキュベーションすることによりブロックした。HepG2細胞由来の増殖用培地の1：20希釈液（0.004％Tween(R) 20／1％ BSAを PBSに含む溶液で作成された）の100マイクロリットル（100μL）を各ウエルに加え、そして室温で３時間インキュベートした。ウエルを吸引し、そして二次抗体であるマウス抗ヒトアポＢ（Chemicon、テメキューラ、カリフォルニア州）の1/1000希釈液（〜５μg／mL）の100μLを加える前に、４回洗浄した（0.05％Tween(R) 20をPBSに含む溶液）。室温で２時間のインキュベーションの後で、この溶液を吸引し、ウエルを再び上記のように４回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼを共役させたアフィンピュア（AffinPure）ヤギ抗マウスIgG (H＋L)（Jackson ImmunoResearch Laboratories、バーハーバー、メイン州）の1：10,000希釈液（0.004％Tween(R) 20／1％ BSAを PBSに含む溶液で作成された）の100マイクロリットル（100μL）を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベーションした。吸引後、ウエルを上記のように４回洗浄し、そして各ウエルに1−ステップウルトラTMB（テトラメチルベンジジン）ELISA試薬（Pierce、ロックフォード、イリノイ州）の50μlを加え、５分間インキュベートした。この反応を2M H2SO4の50μlを加えて停止し、そして各ウエルの吸光度を450nmで読み取った。パーセント吸光度を、ビヒクル処置上清由来の吸光度から培地単独由来の吸光度を差引いた値を、全または100％値として用いて、計算した。試験化合物の各濃度でのパーセント阻害を記録し、そしてIC50値を決定した。
【００６０】
食餌摂取量、体重およびトリグリセリド蓄積
雄Sprague Dawleyラット（Charles River Laboratoriesから入手できる）における食餌摂取に関するMTP阻害物質の効果は、0.5％メチルセルロースビヒクル中の試験化合物を０、10、30および100mg／kgの一日投与量で３日間投与した後に、低脂肪または高脂肪食餌のいずれかをラットに与えて、評価した。測定したエンドポイントには、食餌摂取量、体重、および肝および／または腸トリグリセリドが含まれる。
【００６１】
45％脂肪および炭水化物としてコーンスターチ／マルトデキストリンを含有する粉末化高脂肪実験食餌（Research Diets D01060502M）を用いた。ラットは０日と３日目に体重を測定した。食餌摂取量は−４日から３日目まで測定した。３日目の安楽死時に、血液を採取し、アプロチニン（0.6TIU／mL）を含有するEDTA試験管（75％）と血清分離用試験管（25％）に入れて凍結保存し、約0.5ｇの肝組織片を採取し、無菌的生理食塩水で洗浄し、秤量しそして液体窒素中で凍結させた。
【００６２】
肝トリグリセリドの測定のために、肝片をPBS中でホモジナイズし、そしてその一部分をクロロホルム：メタノール（２：１）で抽出した。乾燥抽出物を無水エタノール中のTriton−XTM100を用いて再構成し、そしてその一部分を、WAKOトリグリセリドＬ型発色アッセイ（カタログ番号997−37492エンザイムＡ、カタログ番号993−37592、カタログ番号996−41791脂質カリブレーター）を用いたトリグリセリド分析に使用した。当業者に周知の類似の方法を、腸トリグリセリド含量の測定に用いた。
【実施例】
【００６３】
以下で説明する実施例で使用した下記の化合物および試薬は、列記した開示情報に記載したように調製でき、または列記した供給元から入手可能である。
ジルロタピド：
((S)−N−｛2−[ベンジル(メチル)アミノ]−2−オキソ−1−フェニルエチル｝−1−メチル−5−[4'−(トリフルオロメチル)[1,1'−ビフェニル]−2−カルボキサミド]−1H−インドール−2−カルボキサミド)は、米国特許番号6,720,351（実施例44）に記載された方法を用いて調製した。
化合物Ａ：
1−[9−(4−クロロ−フェニル)−8−(2−クロロ−フェニル)−9H−プリン−6−イル]−4−エチルアミノ−ピペリジン−4−カルボン酸アミド塩酸塩は、米国特許公開公報2004/0092520（実施例 20）に記載されたように調製した。
Miglyol(R) 812：
沸点の範囲が240−270℃を有し、飽和したC8 (50−65％) および C10 (30−45％) トリグリセリドから構成されている、分画したココナッツ油であり、CONDEA Vista Co.、クランフォルド、ニュージャージ州、より入手できる。
Triacetin(R)： 三酢酸グリセリンであり、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、から入手できる。
Tween(R) 80：  ポリソルベート80であり、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、から入手できる。
Campul(R) MCM： 中鎖モノ＆ジグリセリド、ABITEC Corporation、コロンバス、オハイオ州、より入手できる。
【００６４】
以下の機能アッセイ法は、腸作用性MTPi、CB−1アンタゴニスト、ならびに腸作用性MTPiおよびアンタゴニストの、食物摂取に対する作用を測定するために用いられた。実験に用いたCB−1アンタゴニストの用量は10mg／kg および30mg／kgであった。実験に用いた腸作用性MTPiの用量は３mg／kg および10mg／kgであった。各活性成分の異なった用量を、単独でおよび互いの様々な組み合わせで、対照（ビヒクル）と比較して調べた。
【００６５】
食物摂取量
雄性Sprague-Dawleyラット（275−325グラム）を高脂肪食餌（Research Diets、脂肪から45％ kcal）に付した。動物を自動化食物摂取評価システムに終夜馴らした。食物秤量データはコンピューターへの取り込みにより収集した。最初の日の暗周期の開始の直前に、gMTP阻害剤（ジルロタピド）またはビヒクル（20％ Miglyol 812、30％ Triacetin、20％ Tween80、および30％Campul MCMを含有する自己乳化薬物送達系（SEDDS））を、PO（即ち、口から経口的に）で動物に投与した。２日目に、ジルロタピドまたはビヒクルの２回目の投与の20分前に、ラット（１群５〜10匹）にCB−1アンタゴニスト（化合物Ａ）または0.5％メチルセルロースを投与した。食物摂取量は翌日まで観測した。各処置群に関するデータは、ANOVA（分散分析）により比較した。
【００６６】
食物摂取量の観察結果を下の表１にまとめ、そして図１、２、３および４にグラフ化して図示した。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で10mg／kg、およびジルロタピドを単独で３mg／kgと比較した、化合物Ａの10mg／kgとジルロタピドの３mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
【図２】ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で10mg／kg、およびジルロタピドを単独で10mg／kgと比較した、化合物Ａの10mg／kgとジルロタピドの10mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
【図３】ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で30mg／kg、およびジルロタピドを単独で３mg／kgと比較した、化合物Ａの30mg／kgとジルロタピドの３mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
【図４】ビヒクル（薬物なし）、化合物Ａを単独で30mg／kg、およびジルロタピドを単独で10mg／kgと比較した、化合物Ａの30mg／kgとジルロタピド10mg／kgの併用剤で観察された食物摂取量の減少を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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