(57)【要約】  少なくとも１つの永久結合を介してビシンリンカーに結合された少なくとも１種のポリマーを含む高分子プロドラッグを記載する。ビシンリンカーは、一時的結合を介してアミン含有生物学的活性部分に結合される。アミン含有生物学的活性部分（たとえば薬剤）は、一時的結合の切断により放出可能である。一例を挙げると、プロドラッグまたは対応する高分子プロドラッグリンカー試薬は、以下の構造：（式Ｉａ）を有する。式中、Ｔは、ＤまたはＡである（Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、Ａは、脱離基である）。Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分である。Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在である。Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択される。Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択される。Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択される。Ｒ１は、ポリマーである。他の例では、ポリマーＲ１は、他の位置に配置される。2008543916.tif 000041【選択図】  図６
2008543916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの永久結合を介してビシンリンカーに結合された少なくとも１種のポリマーを含む高分子プロドラッグであって、該ビシンリンカーが一時的結合を介してアミン含有生物学的活性部分に結合される、上記プロドラッグ。
【請求項２】
以下の構造：
【化１】
2008543916.tif 000022
〔式中、
Ｔは、ＤまたはＡであり、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を有する、請求項１に記載のプロドラッグまたは対応する高分子プロドラッグリンカー試薬。
【請求項３】
以下の構造：
【化２】
2008543916.tif 000023
〔式中、
Ｔは、ＤまたはＡであり、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を有する、請求項１に記載のプロドラッグまたは対応する高分子プロドラッグリンカー試薬。
【請求項４】
以下の構造：
【化３】
2008543916.tif 000024
〔式中、
Ｔは、ＤまたはＡであり、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を有する、請求項１に記載のプロドラッグまたは対応する高分子プロドラッグリンカー試薬。
【請求項５】
前記生物学的活性部分が、小分子生物学的活性剤またはバイオポリマーよりなる生物学的部分の群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
前記バイオポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびペプチド核酸よりなるバイオポリマーの群から選択される、請求項５に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ＡＣＴＨ、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼ、アルブミン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、α１−プロテイナーゼ阻害剤（ＡＰＩ）、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、アンクロドセリンプロテアーゼ、抗体（モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体、およびフラグメントまたは融合体）、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチトリプシン、アプロチニン、アスパラギナーゼ、ビファリン、骨形態形成タンパク質、カルシトニン（サケ）、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ、エンドルフィン、エンフビルチド、エンケファリン、エリスロポエチン、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、フィブリノリジン、融合タンパク質、濾胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ガラクトシダーゼ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘモグロビン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒアルロニダーゼ、イズロニダーゼ、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インターロイキン（１α、１β、２、３、４、６、１０、１１、１２）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｒｈＩＬ−１ｒａ）、インスリン、インターフェロン（α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、β１ａ、β１ｂ、γ１ａ、γ１ｂ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、ラクターゼ、ロイプロリド、レボチロキシン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、ナトリウム利尿ペプチド、パンクレリパーゼ、パパイン、副甲状腺ホルモン、ＰＤＧＦ、ペプシン、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロラクチン、プロテインＣ、オクトレオチド、セクレチン、セルモレリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ソマトロピン（成長ホルモン）、ソマトスタチン、ストレプトキナーゼ、スクラーゼ、テタヌストキシン断片、チラクターゼ、トロンビン、チモシン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ＴＳＨ、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ワクチン、ならびに植物性タンパク質（たとえばレクチンおよびリシン）よりなるポリペプチドの群から選択される、請求項６に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
前記タンパク質が、組換えＤＮＡ技術により調製されるタンパク質である、請求項６に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
前記タンパク質が、抗体フラグメント、一本鎖結合タンパク質、触媒抗体、および融合タンパク質よりなるタンパク質の群から選択される、請求項６に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
前記タンパク質が、抗体、カルシトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ヘモグロビン、インターロイキン、インスリン、インターフェロン、ＳＯＤ、ソマトロピン、ＴＮＦ、ＴＮＦレセプター−ＩｇＣ  Ｆｃ、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）よりなるタンパク質の群から選択される、請求項６に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
前記小分子生物学的活性剤が、中枢神経系活性剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、避妊剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、血管収縮剤、および心臓血管剤よりなる作用剤（少なくとも１つの第一級もしくは第二級のアミノ基を有する）の群から選択される、請求項５に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
前記小分子生物学的活性剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アミノグルテチミド、アマンタジン、ジアフェニルスルホン、エタンブトール、スルファジアジン、スルファメラジン、スルファメトキサゾール、スルファレン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン（ciprofloxaxin）、エノキサシン、ノルフロキサシン、ネオマイシンＢ、スペクチノマイシン（sprectinomycin）、カナマイシンＡ、メロペネム、ドーパミン、ドブタミン、リシノプリル、セロトニン、アシビシン、およびカルブタミドよりなる化合物の群から選択される、請求項５に記載のプロドラッグ。
【請求項１３】
Ｒ４〜Ｒ１２が、独立して、水素、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のＣ１〜Ｃ８のアルキルまたはヘテロアルキルから選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
Ｒ１が、ポリアルキルオキシ系ポリマー、たとえば、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸およびその誘導体、アルギネート、キシラン、マンナン、カラゲナン、アガロース、セルロース、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）および他の炭水化物系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アンヒドリド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ウレタン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、たとえば、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ＨＭＰＡ）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、たとえば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（エステル）、たとえば、ポリ（乳酸）またはポリ（グリコール酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（アミノ酸）、たとえば、ポリ（グルタミン酸）、コラーゲン、ゼラチン、以上に列挙されたポリマーから得られるコポリマー、グラフト型コポリマー、架橋型ポリマー、およびブロックコポリマーよりなるポリマーの群から選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
Ｒ１がヒドロゲルである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
Ｒ１が分岐状もしくは超分岐状のポリマーである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
Ｒ１がデンドリマーまたは高密度星形ポリマーである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
Ｒ１がバイオポリマーである、請求項２〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１９】
Ｒ１がタンパク質である、請求項１８に記載のプロドラッグ。
【請求項２０】
前記タンパク質が、アルブミン、抗体、フィブリン、カゼイン、または任意の他の血漿タンパク質である、請求項１９に記載のプロドラッグ。
【請求項２１】
Ｒ１が１種以上の生物学的活性物質をさらに含む、請求項２〜２０のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２２】
Ｒ１がＸへの結合のための少なくとも１つの官能基を有する、請求項２〜２１のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの官能基が、カルボン酸およびその活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール、スルホン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸およびその誘導体、ホスホン酸およびその誘導体、ハロアセチル、アルキルハライド、アクリロイル、アリールフルオリドのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、エポキシド、オキシラン、ならびにアジリジンよりなる官能基の群から選択される、請求項２２に記載のプロドラッグ。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの官能基が、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、アルデヒド、ならびにハロアセチルよりなる官能基の群から選択される、請求項２２または２３に記載のプロドラッグ。
【請求項２５】
ＸとＲ１と間に形成される結合または基が、ジスルフィド、Ｓ−スクシンイミド、アミド、アミノ、カルボン酸エステル、スルホンアミド、カルバメート、カーボネート、エーテル、チオエーテル、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ウレア、チオウレア、ホスフェート、ホスホネートよりなる結合または基の群から選択される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２６】
ＸとＲ１との間に形成される結合または基が、Ｓ−スクシンイミド、アミド、カルバメート、チオエーテル、およびウレアよりなる結合または基の群から選択される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２７】
Ａが、クロリド、ブロミド、フルオリド、ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、Ｎ−ヒドロキシアゾベンゾトリアゾリル、ペンタフルオルフェノキシ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、またはヘテロアリールよりなる脱離基の群から選択される、請求項２〜２６のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグリンカー試薬。
【請求項２８】
生物学的活性部分との共有結合コンジュゲーションおよび担体との結合のための、Ｔが脱離基Ａである、先行請求項のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグリンカー試薬プロドラッグ。
【請求項２９】
・式ＩＩＩ
【化４】
2008543916.tif 000025
で示される出発分子を提供することと、
・式ＩＩ
【化５】
2008543916.tif 000026
で示される出発分子でＡを置換することと、
・得られた中間体を固相から切り離しかつ存在する保護基をすべて切り離すことにより、式Ｖ
【化６】
2008543916.tif 000027
で示される中間体を形成することと、
・式Ｖで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３０】
・式ＶＩ
【化７】
2008543916.tif 000028
で示される出発分子を提供することと、
・少なくとも１段階の置換または還元的アルキル化により、式ＶＩＩ
【化８】
2008543916.tif 000029
で示される中間体を形成することと、
・式ＶＩＩで示される中間体を固相から切り離しかつ存在する保護基をすべて切り離すことにより、式ＶＩＩＩ
【化９】
2008543916.tif 000030
で示される中間体を形成することと、
・式Ｖで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３１】
・式ＩＸ
【化１０】
2008543916.tif 000031
で示される出発分子を提供することと、
・少なくとも１段階の置換または還元的アルキル化により、式Ｘ
【化１１】
2008543916.tif 000032
で示される中間体を形成することと、
・存在する保護基をすべて切り離すことなく式Ｘで示される中間体を固相から切り離すことにより、式ＸＩ
【化１２】
2008543916.tif 000033
で示される中間体を形成することと、
・ＸＩ式で示される中間体を活性化試薬で活性化することにより、式ＸＩＩ
【化１３】
2008543916.tif 000034
で示される中間体を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、式ＸＩＩＩ
【化１４】
2008543916.tif 000035
で示される中間体を形成することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３２】
・式ＸＩ
【化１５】
2008543916.tif 000036
で示される出発分子を提供することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、式ＸＩＶ
【化１６】
2008543916.tif 000037
で示される中間体を形成することと、
・式ＸＩＶで示される中間体を活性化試薬で活性化することにより、式ＸＶ
【化１７】
2008543916.tif 000038
で示される高分子プロドラッグ試薬を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３３】
・式ＸＩＩ
【化１８】
2008543916.tif 000039
で示される出発分子を提供することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、式ＸＶ
【化１９】
2008543916.tif 000040
で示される高分子リンカー試薬を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３４】
前記活性化剤がカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物である、請求項３１および３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
Ａが、クロリド、ブロミド、フルオリド、ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、Ｎ−ヒドロキシアゾベンゾトリアゾリル、ペンタフルオルフェノキシ、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルから選択される、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
約７．４のｐＨを有する溶液中に前記プロドラッグを配置する段階を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のプロドラッグの加水分解方法。
【請求項３７】
前記溶液が細胞外液である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
・請求項１〜２６のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグを提供する第１の段階と、
・該高分子プロドラッグを生存生物に投与する第２の段階と、
・実質的に非酵素的な反応により該高分子プロドラッグからアミン含有部分を切り離す第３の段階と、
を含む、生存生物へのアミン含有部分の投与方法。
【請求項３９】
前記アミン含有部分が生物学的活性部分である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的活性部分が、小分子生物学的活性剤またはバイオポリマーよりなる生物学的部分の群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バイオポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびペプチド核酸よりなるバイオポリマーの群から選択される、請求項４０に記載のプロドラッグ。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、ＡＣＴＨ、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼ、アルブミン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、α１−プロテイナーゼ阻害剤（ＡＰＩ）、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、アンクロドセリンプロテアーゼ、抗体（モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体、およびフラグメントまたは融合体）、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチトリプシン、アプロチニン、アスパラギナーゼ、ビファリン、骨形態形成タンパク質、カルシトニン（サケ）、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ、エンドルフィン、エンフビルチド、エンケファリン、エリスロポエチン、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、フィブリノリジン、融合タンパク質、濾胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ガラクトシダーゼ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘモグロビン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒアルロニダーゼ、イズロニダーゼ（idurnonidase）、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インターロイキン（１α、１β、２、３、４、６、１０、１１、１２）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｒｈＩＬ−１ｒａ）、インスリン、インターフェロン（α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、β１ａ、β１ｂ、γ１ａ、γ１ｂ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、ラクターゼ、ロイプロリド、レボチロキシン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、ナトリウム利尿ペプチド、パンクレリパーゼ、パパイン、副甲状腺ホルモン、ＰＤＧＦ、ペプシン、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロラクチン、プロテインＣ、オクトレオチド、セクレチン、セルモレリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ソマトロピン（成長ホルモン）、ソマトスタチン、ストレプトキナーゼ、スクラーゼ、テタヌストキシン断片、チラクターゼ、トロンビン、チモシン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ＴＳＨ、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ワクチン、ならびに植物性タンパク質（たとえばレクチンおよびリシン）よりなるポリペプチドの群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質が、組換えＤＮＡ技術により調製されるタンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記タンパク質が、抗体フラグメント、一本鎖結合タンパク質、触媒抗体、および融合タンパク質よりなるタンパク質の群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記小分子生物学的活性剤が、中枢神経系活性剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、避妊剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、血管収縮剤、および心臓血管剤よりなる作用剤（少なくとも１つの第一級もしくは第二級のアミノ基を有する）の群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記小分子生物学的活性剤が、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アミノグルテチミド、アマンタジン、ジアフェニルスルホン、エタンブトール、スルファジアジン、スルファメラジン、スルファメトキサゾール、スルファレン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン（ciprofloxaxin）、エノキサシン、ノルフロキサシン、ネオマイシンＢ、スペクチノマイシン（sprectinomycin）、カナマイシンＡ、メロペネム、ドーパミン、ドブタミン、リシノプリル、セロトニン、アシビシン、およびカルブタミドよりなる化合物の群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記第３の段階が細胞外液中で行われる、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記実質的に非酵素的な反応が加水分解の段階を含む、請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグにおいて、求核剤含有リンカーの実質的に非酵素的な反応により担体からアミン含有部分を切り離す方法。
【請求項５０】
前記実質的に非酵素的な反応が約７．４のｐＨで行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記担体に結合された前記アミン含有部分が細胞外液中で切り離される、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記実質的に非酵素的な反応が加水分解の段階を含む、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アミン含有部分が生物学的活性部分である、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のプロドラッグから生物学的活性分子をｉｎ  ｖｉｖｏで切り離すことにより治療上有用な濃度の生物学的活性分子を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、タンパク質、天然産物、または合成化学化合物のような生物学的活性物質のアミノ基への一時的結合を有する高分子プロドラッグに関する。
【背景技術】
【０００２】
典型的には、薬剤送達におけるポリマーは、溶媒−ポリマー混合物中に物理化学的に配合される薬剤と共に非共有結合的に使用されるか、または薬剤の官能基の１つにポリマー試薬を永久的に共有結合させることにより使用される。
【０００３】
非共有結合的薬剤カプセル化は、長時間作用性放出プロファイルを得るべくデポ製剤に適用されてきた。典型的には、薬剤は、ポリマー材料と混合され、そして薬剤がバルクポリマー材料全体にわたり分配された状態になるように処理される。そのようなポリマー−薬剤アグリゲートは、注射可能なサスペンジョンとして投与されるマイクロ粒子として造形されうるか、またはポリマー−薬剤アグリゲートは、単回ボーラス注射で投与されるゲルとして配合される。ポリマーが膨潤したときに薬剤放出が起こるか、またはポリマーの分解によりバルクポリマーの外部への薬剤の拡散が可能になる。そのような分解過程は、自己加水分解的または酵素触媒的でありうる。薬剤−ポリマーゲルのボーラス投与に基づく市販薬の例は、ルプロン・デポ（Lupron Depot）である。懸濁マイクロ粒子に基づく市販薬の例は、ヌトロピン・デポ（Nutropin Depot）である。
【０００４】
非共有結合的手法の欠点は、薬剤の無制御な突発型放出を防止するために、立体的にきわめて稠密な環境を形成するので、薬剤のカプセル化が高効率でなければならないことである。未結合の水溶性薬剤分子の拡散を抑制するには、強力なファンデルワールス接触（多くの場合、疎水性部分により媒介される）が必要である。タンパク質やペプチドのようにコンフォメーションの影響を受けやすい多くの薬剤は、カプセル化プロセス中および／またはカプセル化薬剤の後続の貯蔵中に機能を損なう。そのほかに、そのようなアミノ含有薬剤は、ポリマー分解生成物との副反応を起こしやすい（たとえば、非特許文献１を参照されたい）。さらに、薬剤の放出機序が生分解に依存して患者間で差異を生じる可能性がある。
【０００５】
他の選択肢として、永久共有結合を介して薬剤をポリマーにコンジュゲートすることが可能である。この手法は、いわゆる小分子から天然産物を含めてより大きいタンパク質まで種々のクラスの分子に適用される。
【０００６】
アルカロイドや抗腫瘍剤のような多くの小分子医薬剤は、水性流体への低い溶解性を示す。これらの小分子化合物を可溶化する一方法は、小分子化合物を親水性（水溶性）ポリマーにコンジュゲートすることである。ヒト血清アルブミン、デキストラン、レクチン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（スチレン−ｃｏ−無水マレイン酸）、ポリ（Ｎ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（ジビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸）、ヒアルロン酸のようなさまざまな水溶性ポリマーが、この目的で報告されてきた（非特許文献２）。
【０００７】
癌治療における主要な課題は、細胞傷害剤を腫瘍細胞に選択的にターゲッティングすることである。小分子抗癌剤を腫瘍組織中に蓄積しかつこの作用剤の望ましくない副作用を低減する有望な方法は、サイトトキシンを巨大分子担体に結合することである。腫瘍への高分子薬剤コンジュゲートの受動的ターゲッティングは、（非特許文献３）に記載されるように、いわゆる浸透性保持性向上効果（ＥＰＲ）に基づく。その結果として、いくつかのポリマー−薬剤コンジュゲートは、抗癌剤として臨床試験に入っている。
【０００８】
ポリ（エチレングリコール）による生体分子の共有結合修飾については、１９７０年代後半から広範囲に研究されてきた。いわゆるＰＥＧ化タンパク質は、溶解性を増大させたり、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性を低下させたり、腎クリアランスおよび酵素によるタンパク質分解の減少に基づいて循環半減期を増加させたりすることにより治療効果を改良することが示されている（たとえば、非特許文献４を参照されたい）。
【０００９】
しかしながら、ＩＮＦα２、サキナビル、またはソマトスタチンのような多くの生物学的分子は、共有結合によりポリマーを薬剤にコンジュゲートしたときに、不活性であるかまたは生物学的活性の低下を示す（非特許文献５）。
【００１０】
非共有結合性ポリマー混合物または永久共有結合のいずれもが呈する欠点を回避するために、薬剤をポリマー担体に化学的にコンジュゲートするプロドラッグ法を利用することが好ましいこともある。そのような高分子プロドラッグでは、生物学的活性部分（薬剤、治療剤、生物学的分子など）は、典型的には、担体部分と、薬剤分子のヒドロキシ基、アミノ基、またはカルボキシ基と、の間に形成される一時的結合により、高分子担体部分に結合される。
【００１１】
プロドラッグとは、それ自体ではほとんど不活性であるが予想どおりに活性代謝物にトランスフォームされる治療剤のことである（非特許文献６を参照されたい）。担体プロドラッグ法は、薬剤がｉｎ  ｖｉｖｏでポリマーから放出されてその生物学的活性を回復するように適用されうる。薬剤の徐放または制御放出が望まれる場合、プロドラッグの有する低減された生物学的活性は、放出薬剤と比較して有利である。この場合、副作用を伴ったり過量投与のリスクを生じたりすることなく、比較的大量のプロドラッグを投与することが可能である。薬剤の放出が長期間にわたり行われるので、薬剤を反復して頻繁に投与する必要性が低減される。
【００１２】
プロドラッグの活性化は、図１に示されるように、担体と薬剤分子との一時的結合を酵素的もしくは非酵素的に切断することにより、またはその両方を逐次的に組み合わせることにより、すなわち、酵素的段階を行ってから非酵素的再構成を行うことにより、実施可能である。水性緩衝溶液のように酵素を含まないｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境では、エステルやアミドのような一時的結合は、加水分解を受ける可能性があるが、対応する加水分解速度は、あまりにも遅すぎて、治療上有用ではない可能性がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境では、典型的には、エステラーゼまたはアミダーゼが存在し、エステラーゼおよびアミダーゼは、２倍から数桁に及ぶ加水分解速度の有意な触媒的促進を引き起こす可能性がある（たとえば、非特許文献７を参照されたい）。
【００１３】
ＩＵＰＡＣに基づく定義（非特許文献８で与えられる）
【００１４】
プロドラッグ
プロドラッグとは、その薬理効果を呈する前に生体内変換を受ける任意の化合物のことである。したがって、プロドラッグは、親分子の望ましくない性質を改変または除外するために一時的に使用される特定の非毒性保護基を含有する薬剤とみなしうる。
【００１５】
担体結合プロドラッグ（担体プロドラッグ）
担体結合プロドラッグとは、所与の活性物質と、改良された物理化学的性質または薬動学的性質を生成しかつ通常は加水分解切断によりｉｎ ｖｉｖｏで容易に除去しうる一時的担体基との一時的結合を含有するプロドラッグのことである。これは、図１に図式的に示されている。
【００１６】
カスケードプロドラッグ
カスケードプロドラッグとは、活性化基のアンマスキング後にかぎり担体基の切断が有効になる担体プロドラッグのことである。
【００１７】
高分子カスケードプロドラッグ
高分子カスケードプロドラッグとは、所与の活性物質と、活性化基のアンマスキング後にかぎり担体の切断が有効になる一時的高分子担体基との一時的結合を含有する担体プロドラッグのことである。
【００１８】
バイオプレカーサープロドラッグ
バイオプレカーサープロドラッグとは、担体基への結合を必要とせずに活性成分自体の分子修飾により生じるプロドラッグのことである。この修飾は、代謝的もしくは化学的に変換可能な新しい化合物を生成し、得られる化合物は、活性成分である。
【００１９】
生体内変換
生体内変換とは、生存生物または酵素製剤による物質の化学変換のことである。
【００２０】
さらなる定義：
リンカー
担体物質および薬剤のいずれからも提供されない、担体プロドラッグ中に存在する切断制御化学構造または切断制御基。
【００２１】
プロドラッグは、バイオプレカーサーおよび担体結合プロドラッグの２つのクラスに分類される。バイオプレカーサーは、担体基を含有しておらず、官能基の代謝的生成により活性化される。担体結合プロドラッグでは、活性物質は、一時的結合により担体部分に結合される。担体は、生物学的に不活性でありうるか（たとえばＰＥＧ）または標的指向性を有しうる（たとえば抗体）。本発明は、担体自体が担体タンパク質または担体ポリサッカリドまたは担体ポリエチレングリコールのような巨大分子である、高分子担体結合プロドラッグまたは巨大分子プロドラッグに関する。
【００２２】
担体プロドラッグが切断されると、増大された生物活性を有する分子状物質（薬剤）と少なくとも１種の副生成物（担体）とが生成される。切断後、生物活性物質は、あらかじめコンジュゲートされて保護されていた少なくとも１つの官能基を露出し、この基の存在は、典型的には、薬剤の生物活性に寄与する。
【００２３】
プロドラッグストラテジーを実施するために、薬剤分子中の少なくとも１つの選択される官能基を担体ポリマーへの結合に利用する。好ましい官能基は、ヒドロキシル基またはアミノ基である。したがって、結合化学条件および加水分解条件はいずれも、利用される官能基のタイプに依存する。単純な一段階切断機序では、プロドラッグの一時的結合は、多くの場合、内因的反応活性または酵素依存性により特徴付けられる。水性環境中における加水分解に対するこの結合の感受性は、酵素触媒作用の有無を問わず、高分子担体と薬剤との間の切断速度を制御する。
【００２４】
一時的結合が反応活性エステル結合である多数の巨大分子プロドラッグが、文献に記載されている。これらの事例では、生物活性物質により提供される官能基は、ヒドロキシル基またはカルボン酸基のいずれかである（たとえば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【００２５】
とくに治療用生体巨大分子の場合だけでなく特定の小分子薬剤の場合にも、巨大分子担体を生物活性物質のアミノ基（すなわち、タンパク質のＮ末端基またはリシンアミノ基）に結合することが望ましいこともある。こうした例としては、薬剤の生物活性をマスキングするのに生物活性物質の特定のアミノ基（たとえば、活性中心またはレセプター結合に関与する領域もしくはエピトープに位置するアミノ基）をコンジュゲートすることが必要な場合が挙げられよう。また、プロドラッグの調製中、アミノ基は、ヒドロキシル基やフェノール性基と比較して求核性が大きいので、より化学選択的に攻撃対象になり、担体と薬剤とをコンジュゲートするためのより良好な手段として役立つ可能性がある。このことは、とくに、多種多様な反応性官能基を含有する可能性のあるタンパク質の場合にあてはまる。この場合、非選択的コンジュゲーション反応により、十分な特徴付けまたは精製を必要とする望ましくない生成物混合物を生じて、生成物の反応収率および治療効率が低下する可能性がある。
【００２６】
アミド結合のほかに脂肪族カルバメートもまた、通常、エステル結合よりも加水分解に対してかなり安定であり、アミド結合の切断速度は、担体結合プロドラッグ中の治療有用成分の場合には遅すぎるであろう。したがって、プロドラッグのアミド結合の切断性を制御すべく隣接基のような構造化学成分を追加することが有利である。担体物質および薬剤のいずれからも提供されないそのような追加の切断制御化学構造は、「リンカー」と呼ばれる。プロドラッグリンカーは、所与の一時的結合の加水分解の速度に強い影響を及ぼしうる。こうしたリンカーの化学的性質の変化により、かなりの程度までリンカーの性質を操作することが可能である。
【００２７】
標的化放出のために特異的酵素によりアミン含有生物学的活性部分のプロドラッグ活性化を行ういくつかの例が発表されている。酵素依存性の前提条件は、リンカーの構造が、対応する内因性酵素により基質として認識される構造モチーフを提示することである（図２に示されるとおり）。こうした事例では、一時的結合の切断は、酵素により触媒される一段階過程で行われる。（非特許文献１４）には、プロテアーゼプラスミンによる抗腫瘍剤の酵素的放出についての記載がある。シタラビンが、トリペプチド配列Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓを介してポリマーα，β−ポリ（Ｎ−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（ＰＨＥＡ）に結合される。シタラビンの酵素的放出は、いろいろな種類の腫瘍塊中で濃度が比較的高いプロテアーゼプラスミンにより誘発される。
【００２８】
プロドラッグ切断の酵素触媒的促進は、器官標的化適用または細胞標的化適用に望ましい特徴である。結合を選択的に切断する酵素が、治療の対象として選択された器官または細胞型に特異的に存在する場合、生物活性物質の標的化放出が誘発される。
【００２９】
酵素依存性一時的結合の典型的な性質は、加水分解に対するその安定性である。酵素依存性一時的結合自体は、通常の投与レジームで薬剤の治療効果を引き起こしうる程度に薬剤を放出する速度で自己加水分解を受けることはないであろう。酵素が存在する場合に限り、酵素依存性一時的結合への酵素の攻撃により、酵素依存性一時的結合の切断が有意に促進され、同時に遊離薬剤の濃度が増大する。
【００３０】
β−ラクタマーゼのような特異的酵素（非特許文献１５）およびカテプシンＢのようなシステインプロテアーゼ（非特許文献１６）により活性化される抗腫瘍性高分子プロドラッグの例が報告されている。Wiwattanapatapeeら（２００３）は、５−アミノサリチル酸を結腸に送達するためのデンドリマープロドラッグについて概説している。薬剤分子は、「第３世代」のＰＡＭＡＭデンドリマーにアゾ結合によりコンジュゲートされる。５−アミノサリチル酸は、アゾレダクターゼと呼ばれる細菌酵素により結腸中で放出される（非特許文献１７）。
【００３１】
酵素支配的切断の主な欠点は、患者間の差異である。酵素レベルは、個体間で有意に異なる可能性があるので、その結果、酵素的切断によるプロドラッグの活性化に生物学的差異を生じる可能性がある。酵素レベルはまた、投与部位に依存して異なりうる。たとえば、皮下注射の場合、生体の特定の領域が他の領域よりも予測可能な治療効果を生じることが知られている。この予測不能な効果を低減させるために、非酵素的切断または分子内触媒作用に特別な関心が払われている（たとえば、非特許文献１８を参照されたい）。
【００３２】
さらに、そのような酵素依存性担体結合プロドラッグの薬動学的性質に関してｉｎ  ｖｉｖｏ−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相関を確定することは困難である。信頼性の高いｉｎ  ｖｉｖｏ−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相関の不在下では、放出プロファイルの最適化は、厄介な作業になる。
【００３３】
薬剤分子中に存在するアミノ基への一時的結合を利用する他の高分子プロドラッグは、カスケード機序に基づく。カスケード切断は、マスキング基と活性化基との構造的組合せで構成されるリンカー化合物により可能になる。マスキング基は、エステルやカルバメートのような第１の一時的結合により活性化基に結合される。活性化基は、第２の一時的結合（たとえばカルバメート）を介して薬剤分子のアミノ基に結合される。加水分解に対する第２の一時的結合（たとえばカルバメート）の安定性または感受性は、マスキング基の存在または不在に依存する。マスキング基の存在下では、第２の一時的結合は、きわめて安定的であり、治療上有用な速度で薬剤を放出する可能性は低い。マスキング基の不在下では、この結合は、反応活性が高くなり、迅速な切断および薬剤放出を引き起こす。
【００３４】
第１の一時的結合の切断は、カスケード機序の律速段階である。この第１の段階は、１，６−脱離のような活性化基の分子再構成を引き起こしうる。再構成により第２の一時的結合の反応活性がかなり高くなるので、その切断が引き起こされる。理想的には、第１の一時的結合の切断速度は、所与の治療シナリオにおける薬剤分子の所望の放出速度と同一である。さらに、第２の一時的結合の切断は、その反応活性が第１の一時的結合の切断により惹起された後、実質的に瞬間的であることが望ましい（図３参照）。
【００３５】
１，６−脱離に基づくそのような高分子プロドラッグの例は、（非特許文献１９）およびＰＣＴ特許出願である（特許文献１）、F.M.H. DeGrootら（特許文献２および特許文献３）、ならびにD. Shabatら（特許文献４）に記載されている。
【００３６】
トリメチルロックラクトン化に基づく高分子アミノ含有プロドラッグの例は、（非特許文献２０）；ＰＣＴ特許出願である（特許文献５）に記載された。このプロドラッグ系では、置換型ｏ−ヒドロキシフェニル−ジメチルプロピオン酸が、第１の一時的結合としてエステル基、カーボネート基、またはカルバメート基によりＰＥＧに結合され、第２の一時的結合としてアミド結合により薬剤分子のアミノ基に結合される。薬剤放出の律速段階は、第１の結合の酵素的切断である。この段階に続いて、ラクトン化による迅速なアミド切断が起こり、芳香族ラクトン副生成物が遊離される。
【００３７】
Greenwald、DeGroot、およびShabatにより記載された上述のプロドラッグ系の欠点は、一時的結合の切断後にキノンメチドや芳香族ラクトンのような高反応性かつ潜在的毒性の芳香族小分子副生成物が放出されることである。潜在的毒性物質は、薬剤と共に１：１の化学量論比で放出され、ｉｎ  ｖｉｖｏ濃度が高いと推定されうる。
【００３８】
１，６−脱離に基づく芳香族活性化基を有するさまざまな一群のカスケードプロドラッグは、マスキング基と担体とを構造的に分離する。これは、ポリマー担体と活性化基との間で永久結合を利用することにより達成可能である。この安定結合は、カスケード切断機序に関与しない。担体がマスキング基としての役割を果たさず、活性化基が安定結合により担体に結合される場合、活性化基のような潜在的毒性副生成物の放出が回避される。活性化基とポリマーとの安定結合はまた、未確定の薬理学的性質を有する薬剤−リンカー中間体の放出を抑制する。
【００３９】
Antczakら（非特許文献２１）には、アミン含有薬剤分子用の巨大分子カスケードプロドラッグ系の根底をなす試薬について記載している。この手法では、抗体が担体としての役割を果たし、抗体は、安定結合により、酵素的に切断可能なマスキング基を有する活性化基に結合される。図４に示されるように、エステル結合されたマスキング基を酵素的に除去すると、第２の一時的結合が切断されて薬剤化合物が放出される。
【００４０】
D. Shabatら（非特許文献２２）は、マンデル酸活性化基に基づく高分子プロドラッグ系について記載している。この系では、マスキング基は、カルバメート結合により活性化基に結合される。活性化基は、アミド結合を介してポリアクリルアミドポリマーに永久的にコンジュゲートされる。触媒抗体によるマスキング基の酵素的活性化の後、マスキング基は、環化により切断され、薬剤が放出される。活性化基は、薬剤放出後、依然としてポリアクリルアミドポリマーに結合されたままである。
【００４１】
M. R. Leeら（非特許文献２３）は、マンデル酸活性化基と酵素的に切断可能なエステル結合マスキング基とに基づく類似のプロドラッグ系を報告している。
【００４２】
それにもかかわらず、このリンカーの場合、１，６−脱離段階で、依然として高反応性芳香族中間体が生成される。芳香族部分が高分子担体に永久的に結合された状態を保持したとしても、潜在的毒性作用または免疫原性作用を伴う副反応が起こる可能性がある。
【００４３】
これらの理由により、酵素依存性でなくかつ切断中に反応性芳香族中間体を生成しない脂肪族プロドラッグリンカーを用いてアミン含有活性剤の高分子プロドラッグを形成するための新規なリンカー技術を提供することが必要とされている。
【００４４】
A. J. Garmanら（非特許文献２４）は、組織型プラスミノーゲンアクチベーター中およびウロキナーゼ中のアミノ基の可逆修飾のためにＰＥＧ５０００−無水マレイン酸を使用している。ｐＨ７．４の緩衝液でのインキュベーションに基づくマレアミン酸結合の切断によるＰＥＧ−ｕＰＡコンジュゲートからの機能性酵素の再生は、６．１時間の半減期を有する一次速度式に従う。マレアミン酸結合の欠点は、より低いｐＨ値におけるコンジュゲートの安定性の欠如である。このため、マレアミン酸結合の適用可能性は、塩基性（高）ｐＨ値で安定な活性剤に限定される。なぜなら、早期プロドラッグ切断を防止するために、活性剤ポリマーコンジュゲートの精製を塩基性（高ｐＨ）条件下で行わなければならないからである。
【００４５】
つい最近、R. B. Greenwaldら（非特許文献２５および特許文献６）は、Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）グリシンアミド（ビシン）リンカーに基づくＰＥＧカスケードプロドラッグ系を報告した。Greenwaldらの論文および特許出願に記載の系では、２つのＰＥＧ担体分子が、薬剤分子のアミノ基に結合されたビシン分子に一時的結合により結合される。プロドラッグの活性化の最初の２つの段階は、両方のＰＥＧ担体分子をビシン活性化基のヒドロキシ基に結合する第１の一時的結合の酵素的切断である。ＰＥＧとビシンとの結合が異なるとプロドラッグの活性化速度も異なると記載されている。プロドラッグの活性化の第２の段階は、ビシン活性化基を薬剤分子のアミノ基に結合する第２の一時的結合の切断である（図５）。この系の主な欠点は、一時的結合を介するビシンリンカーへのポリマーの結合およびこの第２の一時的ビシンアミド結合の遅い加水分解速度（リン酸緩衝液中ｔ１／２＞３時間）が原因で、元の親薬剤分子と比較して異なる薬動学的性質、免疫原性、毒性、および薬力学的性質を示す可能性のあるビシン修飾プロドラッグ中間体が放出されることである。
【非特許文献１】D.H. Lee et al, J. Contr. ReL, 2003, 92, 291-299
【非特許文献２】R. Duncan, Nature Rev. Drug Disc., 2003, 2, 347-360
【非特許文献３】Matsumura, Y. and Maeda, H., in Cancer Res., 1986, vol 6, pp 6387-6392
【非特許文献４】Caliceti P., Veronese F.M., Adv. Drag Deliv. Rev. 2003, 55, 1261-1277
【非特許文献５】T. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904
【非特許文献６】B.Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, page 4
【非特許文献７】R.B. Greenwald et al. J. Med. Chem. 1999, 42 (18), 3857-3867
【非特許文献８】http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem/［２００４年３月８日にアクセス］
【非特許文献９】Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, "A Hyaluronic Acid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells", Biomacromolecules 2000, 1, 208-218
【非特許文献１０】J Cheng et al, Synthesis of Linear, beta-Cyclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017
【非特許文献１１】R. Bhatt et al, Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poly(L-glutamic acid) Conjugates of 20(S)-Campthothecin, J. Med. Chem. 2003, 46, 190-193
【非特許文献１２】R.B. Greenwald, A. Pendri, CD. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667
【非特許文献１３】B. Testa, J.M. Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley- VCH, 2003, Chapter 8
【非特許文献１４】G. Cavallaro et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12, 143-151
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【非特許文献１９】R.B. Greenwald et al. J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667
【非特許文献２０】R.B. Greenwald et al. J.Med.Chem. 2000, 43(3), 457-487
【非特許文献２１】Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48
【非特許文献２２】Chem. Eur. J. 2004, 10, 2626-2634
【非特許文献２３】Angew. Chem. 2004, 116, 1707-1710
【非特許文献２４】A.J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365, 1987
【非特許文献２５】Greenwald et al. J. Med.Chem. 2004, 47, 726-734
【特許文献１】国際公開第９９／３０７２７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０８３１８０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０４／０４３４９３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０４／０１９９９３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０８９７８９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０４／１０８０７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４６】
本発明は、以上に記載の欠点に対処する。本発明は、ビシンリンカーを介してポリマーをアミン含有薬剤分子の第一級もしくは第二級のアミノ基に結合することにより特徴付けられる高分子プロドラッグを提供する。ただし、ポリマーは、永久結合を介してビシンリンカーに結合され、ビシンリンカーとアミン含有薬剤分子との結合は、一時的結合である。本出願では、ビシンは、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシルまたはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシンアミドまたはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ）グリシンの同義語として使用される。担体とビシンリンカーとの永久結合の存在に基づいて、本発明に係る高分子プロドラッグは、元の未修飾薬剤分子の放出を保証する（図６）。
【課題を解決するための手段】
【００４７】
本発明は、式Ｉａ、Ｉｂ、またはＩｃ
【化１】
2008543916.tif 000003
2008543916.tif 000004
【００４８】
〔式中、Ｔ、Ｘ、およびＲ１〜Ｒ１２は、以下に定義される〕
で示される高分子プロドラッグおよび対応する高分子リンカー試薬を提供する。
【００４９】
ポリマー置換型ビシン残基の加水分解切断による本発明に係る高分子プロドラッグからの元の薬剤の放出は、式Ｉａ〔式中、Ｒ２〜Ｒ１２は水素である〕で示される高分子プロドラッグにより例示される。
【化２】
2008543916.tif 000005
【００５０】
以上に記載したように、高分子担体からの元の薬剤の放出は、ｐＨ依存性加水分解や分子内環化のような酵素的もしくは非酵素的な段階により媒介されうる。本発明の好ましい実施形態では、切断は非酵素的に行われる。ｐＨ７．４の水性緩衝液中３７℃における本発明に係る高分子プロドラッグの切断速度の半減期は、好ましくは３時間〜６ヶ月、より好ましくは１日〜３ヶ月、最も好ましくは１日〜２ヶ月である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
式Ｉａ中、式Ｉｂ中、または式Ｉｃ中のＸ、Ｔ、Ｒ１〜Ｒ１２の定義
【００５２】
ＴはＤまたはＡである。本発明に係る構造が高分子プロドラッグリンカー試薬である場合、ＴはＡであり、Ａは脱離基である。好適な脱離基Ａの非限定例としては、クロリド、ブロミド、フルオリド、ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、Ｎ−ヒドロキシアザベンゾトリアゾリル、ペンタフルオルフェノキシ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、または当業者に公知の任意の他の脱離基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
本発明に係る構造が高分子プロドラッグである場合、ＴはＤであり、Ｄは、小分子生物活性部分やバイオポリマー（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、さらにはオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ））（ただし、これらに限定されるものではない）をはじめとするアミン含有生物学的活性物質の残基である。
【００５４】
本明細書中では、多くの場合、プロドラッグについて言及されることに留意されたい。Ｔがアミン含有生物学的活性物質またはアミン含有生物学的活性部分の残基である場合、真のプロドラッグであるとみなされる。Ｔが脱離基Ａである場合、式は、高分子プロドラッグリンカー試薬を表す。簡潔にするために、本明細書中では、高分子プロドラッグリンカー試薬は、プロドラッグをも意味するものとする。真のプロドラッグを意味するか高分子プロドラッグリンカー試薬を意味するかは、文脈からわかるであろう。
【００５５】
好適な有機小分子生物活性部分としては、中枢神経系活性剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、避妊剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、血管収縮剤、および心臓血管剤のような部分（少なくとも１つの第一級もしくは第二級のアミノ基を有する）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのような化合物の例は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アミノグルテチミド、アマンタジン、ジアフェニルスルホン、エタンブトール、スルファジアジン、スルファメラジン、スルファメトキサゾール、スルファレン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン（ciprofloxaxin）、エノキサシン、ノルフロキサシン、ネオマイシンＢ、スペクチノマイシン（sprectinomycin）、カナマイシンＡ、メロペネム、ドーパミン、ドブタミン、リシノプリル、セロトニン、カルブタミド、アシビシンなどであるが、他を除外するものではない。
【００５６】
少なくとも１つの遊離アミノ基を有する好適なタンパク質およびポリペプチドとしては、ＡＣＴＨ、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼ、アルブミン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、α１−プロテイナーゼ阻害剤（ＡＰＩ）、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、アンクロドセリンプロテアーゼ、抗体（モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体、およびフラグメントまたは融合体）、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチトリプシン、アプロチニン、アスパラギナーゼ、ビファリン、骨形態形成タンパク質、カルシトニン（サケ）、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ、エンドルフィン、エンフビルチド、エンケファリン、エリスロポエチン、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ因子、フィブリノリジン、融合タンパク質、濾胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ガラクトシダーゼ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘモグロビン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒアルロニダーゼ、イズロニダーゼ（idurnonidase）、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インターロイキン（１α、１β、２、３、４、６、１０、１１、１２）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｒｈＩＬ−１ｒａ）、インスリン、インターフェロン（α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、β１ａ、β１ｂ、γ１ａ、γ１ｂ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、ラクターゼ、ロイプロリド、レボチロキシン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、ナトリウム利尿ペプチド、パンクレリパーゼ、パパイン、副甲状腺ホルモン、ＰＤＧＦ、ペプシン、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロラクチン、プロテインＣ、オクトレオチド、セクレチン、セルモレリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ソマトロピン（成長ホルモン）、ソマトスタチン、ストレプトキナーゼ、スクラーゼ、テタヌストキシン断片、チラクターゼ、トロンビン、チモシン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ＴＳＨ、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ワクチン、植物性タンパク質（たとえばレクチンおよびリシン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
そのほかにこれに包含されるのは、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を有する任意の合成ポリペプチドまたはポリペプチドの任意の部分である。さらに、組換えＤＮＡ法により調製されるタンパク質、たとえば、以上に挙げたタンパク質の突然変異体、抗体フラグメント、一本鎖結合タンパク質、触媒抗体、および融合タンパク質が包含される。
【００５８】
好ましいタンパク質は、抗体、カルシトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ヘモグロビン、インターロイキン、インスリン、インターフェロン、ＳＯＤ、ソマトロピン、ＴＮＦ、ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ、およびＧＬＰ−１である。
【００５９】
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分である。
【００６０】
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または存在しない。
【００６１】
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールなどから選択される。
【００６２】
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基（高分子アシル基を包含する）、またはヒドロキシル基用保護基（たとえば、トリチル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチル、および当業者に公知の他の保護基）から選択される。好適な保護基は、TW Greene, P.G.M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 1999, John Wiley & Sons, 3rd ed.に記載されている。
【００６３】
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ヒドロキシル、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドなどから選択される。
【００６４】
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、好ましくは、水素、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のＣ１〜Ｃ８アルキルまたはヘテロアルキルから選択される。
【００６５】
Ｒ４〜Ｒ１２は、最も好ましくは水素である。
【００６６】
本発明との関連では、「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル鎖が、任意の位置で、１つ以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉなどから独立して選択される）または基（カルボキサミド、カルボン酸エステル、ホスホン酸エステル、リン酸エステル、二重結合もしくは三重結合、カルバメート、ウレア、チオウレア、チオカルバメート、オキシム、シアノ、カルボキシル、カルボニルなどから独立して選択される）を含有するかまたはそれらにより置換されている（線状、環状、もしくは分岐状）アルキル鎖を意味する。
【００６７】
Ｒ１はポリマーである。好適なポリマーの例は、ポリアルキルオキシ系ポリマー、たとえば、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸およびその誘導体、アルギネート、キシラン、マンナン、カラゲナン、アガロース、セルロース、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、および他の炭水化物系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アンヒドリド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ウレタン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、たとえば、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ＨＭＰＡ）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、たとえば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（エステル）、たとえば、ポリ（乳酸）またはポリ（グリコール酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（アミノ酸）、たとえば、ポリ（グルタミン酸）、コラーゲン、ゼラチン、以上に列挙されたポリマーから得られるコポリマー、グラフト型コポリマー、架橋型ポリマー、ヒドロゲル、およびブロックコポリマーであるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
ヒドロゲルは、多量の水を吸収する親水性もしくは両親媒性の三次元高分子網状構造として定義されうる。網状構造は、ホモポリマーまたはコポリマーで構成され、共有結合化学架橋または物理架橋（イオン架橋、疎水性相互作用、絡合い）が存在するので不溶性である。架橋は、網状構造および物理的一体性を提供する。ヒドロゲルは、水との熱力学的相溶性を呈するので、水性媒体中での膨潤が可能である。（N.A. Peppas, P. Bures, W. Leobandung, H. Ichikawa, Hydrogels in pharmaceutical formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000, 50, 27-46を参照されたい）。網状構造の鎖は、細孔が存在しかつこうした細孔の実質的部分が１〜１０００ｎｍの寸法であるように結合される。特定の重合条件を選択することにより、ヒドロゲルは、アモルファスゲルの形態でまたはビーズ状樹脂として取得可能である。そのような軟質ビーズは、１〜１０００マイクロメートルの直径を有しうる。
【００６９】
ヒドロゲルは、W.E. Hennink and C.F. van Nostrum, Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 13-36に記載されるように、ラジカル重合、アニオン重合、もしくはカチオン重合により、または縮合反応や付加反応のような化学反応により、以上に列挙されたポリマーおよびコポリマーから合成して物理架橋または化学架橋を行うことが可能である。
【００７０】
さらなる例としては、分岐状および超分岐状のポリマーが挙げられる。そのようなポリマーの例としては、デンドリマーおよび他の高密度星形ポリマーが挙げられる（R. Esfand, D.A. Tomalia, Drug Discov Today, 2001, 6(8), 427-436; P.M. Heegaard, U. Boas, Chem. Soc. Rev. 2004, 33(1), 43-63; S.M. Grayson, J.M. Frechet, Chem. Rev. 2001, 101(12), 3819-3868）。
【００７１】
Ｒ１はまた、タンパク質のようなバイオポリマーでありうる。そのようなポリマーの例としては、アルブミン、抗体、トランスフェリン、フィブリン、カゼイン、および他の血漿タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
各Ｒ１ポリマーは、本明細書に記載されるような第２のプロドラッグリンカーまたは当業者に公知の任意の他のリンカーとのコンジュゲーションによりポリマーに結合された１種以上の生物学的活性物質を有しうる。ポリマーは、さらなる置換基を有していてもよく、スペーサー部分Ｘに結合させるべく官能基化することも可能である。そのような官能基の例としては、カルボン酸およびその活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール、スルホン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸およびその誘導体、ホスホン酸およびその誘導体、ハロアセチル、アルキルハライド、アクリロイル、アリールフルオリドのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、エポキシド、オキシラン、ならびにアジリジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
Ｒ１ポリマー用の好ましい官能基としては、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、アルデヒド、ならびにハロアセチルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
とくに好ましい官能基としては、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸およびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、ならびにカーボネートおよびその誘導体が挙げられる。
【００７５】
ＸとＲ１との間に形成される好適な結合または基の例としては、ジスルフィド、Ｓ−スクシンイミド、アミド、アミノ、カルボン酸エステル、スルホンアミド、カルバメート、カーボネート、エーテル、オキシム、チオエーテル、ヒドラゾン、ウレア、チオウレア、ホスフェート、ホスホネートなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
ＸとＲ１との間に形成される好ましい結合または基としては、Ｓ−スクシンイミド、アミド、カルバメート、およびウレアが挙げられる。
【００７７】
好ましくは、Ｒ１ポリマーは、哺乳動物において、高水和性、分解性もしくは排泄性、非毒性、かつ非免疫原性である。好ましいＲ１ポリマーとしては、ポリアルコキシ系ポリマー（たとえば、Nektar Inc. 2003 catalog "Nektar Molecule Engineering - Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation"に記載されるようなポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール試薬）、および分岐状ポリマー、超分岐状ポリマー、架橋型ポリマー、ならびにヒドロゲル、さらにはアルブミンのようなタンパク質が挙げられる。
【００７８】
高分子プロドラッグの一般的合成手順
【００７９】
本発明に係る高分子プロドラッグの代表例の合成については、実施例の節に記載されている。
【００８０】
本発明に係るプロドラッグは、多種多様な方法で調製可能である。図８は、式Ｉｃで示される本発明に係る高分子プロドラッグを合成するための第１の一般的経路を示している。この第１の方法では、固相固定化中間体（ＩＶ）は、固定化出発原料（ＩＩＩ）の脱離基Ａを出発原料（ＩＩ）で置換することにより提供される。場合により、この置換は、可溶性出発原料（ＩＩＩ）を有する溶液中で実施可能である。（ＩＩＩ）中のＸは、好適な保護基ＰＧで保護可能である。好適な保護基については、TW Greene, P.G.M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 1999, John Wiley & Sons, 3rd ed.に記載されている。中間体（Ｖ）は、固相から切り離され、保護基はすべて、トリフルオロ酢酸やＤＴＴのような試薬を用いて切り離される。次に、中間体（Ｖ）をポリマーＲ１と反応させると高分子プロドラッグ（Ｉｃａ）が得られる。
【００８１】
式Ｉｂで示される高分子プロドラッグは、式Ｉｃで示されるプロドラッグに関連して以上に記載したように、たとえば出発原料ＩＩａを用いて当業者に公知の類似の方法により調製可能である。
【化３】
2008543916.tif 000006
【００８２】
図９は、式Ｉａで示される本発明に係る高分子プロドラッグを合成するための第２の一般的経路を示している。この第２の方法では、固相固定化中間体（ＶＩＩ）は、１段階もしくは２段階の求核置換または１段階もしくは２段階の還元的アルキル化により出発原料（ＶＩ）から提供される。場合により、この置換または還元的アルキル化の段階は、可溶性出発原料（ＶＩ）を有する溶液中で実施可能である。（ＩＩＩ）中のＸは、好適な保護基ＰＧで保護可能である。中間体（ＶＩＩＩ）は、固相から切り離され、保護基はすべて、トリフルオロ酢酸やＤＴＴのような試薬を用いて切り離される。次に、中間体（ＶＩＩＩ）をポリマーＲ１と反応させると高分子プロドラッグ（Ｉａａ）が得られる。
【００８３】
図１０は、式Ｉａで示される本発明に係る高分子プロドラッグを合成するためのさらなる一般的経路を示している。この方法では、固相固定化中間体（Ｘ）は、１段階もしくは２段階の求核置換または１段階もしくは２段階の還元的アルキル化により出発原料（ＩＸ）から提供される。場合により、この置換または還元的アルキル化の段階は、可溶性出発原料（ＩＸ）を有する溶液中で実施可能である。（Ｘ）中のＸは、好適な保護基ＰＧで保護可能である。中間体（ＸＩ）は、保護基を切り離すことなくヘキサフルオロ−イソプロパノールのような試薬を用いて固相から切り離される。
【００８４】
第１の経路では、カルボジイミドやＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような試薬を用いて中間体（ＸＩ）を活性化すると（ＸＩＩ）が得られる。中間体（ＸＩＩ）をアミン含有薬剤分子と反応させると中間体（ＸＩＩＩ）が得られる。中間体（ＸＩＩＩ）から保護基ＰＧを切り離した後、化合物をポリマーＲ１と反応させると高分子プロドラッグＩａａが得られる。
【００８５】
第２の経路では、トリフルオロ酢酸やＤＴＴのような試薬を用いて保護基ＰＧを（ＸＩ）から切り離し、残基をポリマーＲ１と反応させると中間体（ＸＩＶ）が得られる。カルボジイミドやＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような試薬を用いて中間体（ＸＩＶ）を活性化すると中間体（ＸＶ）が得られ、これをアミン含有薬剤と反応させると高分子プロドラッグＩａａが得られる。
【００８６】
第３の経路では、保護基ＰＧを活性化中間体（ＸＩＩ）から切り離し、残基をポリマーＲ１と反応させると中間体（ＸＶ）が得られ、次に、これをアミン含有薬剤と反応させると高分子プロドラッグＩａａが得られる。
【００８７】
当然のことながら、対応する高分子プロドラッグの合成に使用される記載の保護基または脱離基を有する概説された本発明に係るリンカー構造は、本発明の範囲内に包含されるとみなされる。
【００８８】
分子療法における高分子プロドラッグの適用
【００８９】
本発明の主な利点は、高分子プロドラッグからの未修飾生物学的活性部分の放出である。Greenwaldら（Greenwald et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734）により報告されたプロドラッグでは、生物学的活性部分は、予測不能な薬動学的性質、免疫原性、毒性、および薬力学的性質を有するビシン修飾薬剤分子として高分子担体から放出される。ビシン修飾薬剤分子の放出は、ビシンリンカーへのポリマー担体の永久結合に基づく本発明に係るプロドラッグでは起こりえない。
【００９０】
高分子プロドラッグの場合、一時的結合の切断動態は、人体の血液中に存在する条件下（ｐＨ７．４、３７℃）で進行することが望ましい。最も重要なこととして、一時的結合の切断は、加水分解に基づくものであり、かつ酵素、塩、または結合タンパク質のようなヒト血液中に存在する化学物質、生化学物質、または物理化学物質への依存性をまったく示さないかまたはごく限られた依存性を示すにすぎないことが望ましい。
【００９１】
本発明に係る高分子プロドラッグのさらなる主な利点は、その非酵素支配的切断である。すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるプロドラッグの半減期は、酵素を含まないｐＨ７．４の緩衝液中におけるプロドラッグの半減期の少なくとも５０％である。この非酵素支配的切断により、生存生物への投与後の放出速度のより良好な予測および制御が可能になり、患者間の差異が低減される。
【００９２】
驚くべきことに、このたび、ビシンリンカーを薬剤分子のアミノ基に結合する一時的結合の切断の速度をビシンリンカーのさまざまな置換またはポリマー結合により媒介される隣接基効果により制御しうることを見いだした。放出速度は、結果的にリンカーの分子構造に依存する実質的に非酵素的な化学反応により支配される。たとえば、ビシンリンカーのポリマー結合部位を変化させて化学構造の規則的修飾またはランダム修飾を行うことにより、さまざまな放出速度を有するプロドラッグリンカーを生成することが可能である。したがって、さまざまなプロドラッグリンカーを生成し、所与の医薬用途または治療用途で生じる要求に基づいて迅速切断型もしくは緩速切断型のプロドラッグリンカーを選択することが可能である。
【００９３】
酵素非依存性放出制御により、カプセル化を必要としないデポ製剤が利用可能になる。今まで、大きい細孔サイズを有するヒドロゲルのような多くの生体適合性材料は、カプセル化特性の欠如が原因で、デポ製剤に使用することができなかった。そのような高水和型で機械的に軟質の生体適合性材料から、生物学的活性部分は、ほとんどの治療用途で必要以上に迅速に放出されてしまうであろう。本発明に記載のプロドラッグリンカーと組み合わせれば、放出がリンカー切断速度だけに支配され、ポリマー担体自体の化学的分解や酵素的分解を必要としないので、生体適合特性に関して担体材料を最適化することが可能である。
【実施例】
【００９４】
材料
Ｆｍｏｃ−アミノ酸、樹脂、およびＰｙＢＯＰは、ノバビオケム（Novabiochem）から購入したものであり、カタログに従って命名されている。Ｆｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨは、ネオシステム（Neosystem）から入手した。そのほかの化学薬品はすべて、シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich）から購入した。組換えヒトインスリンは、ＩＣＮバイオメディカルズ（ICN Biomedicals）（米国）製であった。マレイミド−ＰＥＧ５ｋは、ネクター（Nektar）（米国）から入手した。５（および６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（混合異性体）は、モレキュラー・プローブス（Molecular Probes）から入手した。
【００９５】
分析
ウォーターズ（Waters）ＺＱ ４０００ ＥＳＩ装置を用いて質量分析（ＭＳ）を行い、必要に応じて、ウォーターズ（Waters）ソフトウェアＭａｘＥｎｔによりスペクトルの解釈を行った。スーパーデックス（Superdex）２００カラムを備えたアマシャム・バイオサイエンス（Amersham Bioscience）ＡＥＫＴＡ基本システム（アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Bioscience））を用いてサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【００９６】
１の合成：
【化４】
2008543916.tif 000007
【００９７】
１ｇ（５．５ｍｍｏｌ）の３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジチオールを１０ｍｌのＤＭＦ中に溶解させ、１ｇ（３．６ｍｍｏｌ）のトリチルクロリドおよび１ｍｌのピリジンを添加した。溶液を室温で３０分間攪拌し、モノ−Ｓ−トリチル保護３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジチオールをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した（収量８５０ｍｇ、２ｍｍｏｌ、５６％）。
【００９８】
３００ｍｇ（０．７１ｍｍｏｌ）のＳ−トリチル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジチオールを５ｍｌの１９／１（ｖ／ｖ）メタノール／水中に溶解させ、３００μｌのエピクロルヒドリン、５００μｌのピリジン、および５０μｌのＤＩＥＡを添加した。溶液を４０℃で１４時間攪拌し、次に、５０ｍｌの水を添加した。沈殿を濾過により捕集し、真空中で乾燥させた。沈殿を５ｍｌのジオキサン中に溶解させ、１００μｌの水および５００μｌの２−アミノエタノールを添加した。溶液を６０℃で７２時間攪拌した。１ｍｌの酢酸を添加した後、生成物１をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した（収量：２１５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、５６％）。 
ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５６４．９（ＭＷ＋Ｎａ計算値＝５６４．８ｇ／ｍｏｌ）
【００９９】
２の合成：
【化５】
2008543916.tif 000008
【０１００】
１に関連して記載したように１ｇの１，４−ジチオトレイトールを用いて２を合成した。 
ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝５３６．８（ＭＷ＋Ｎａ計算値＝５３６．７ｇ／ｍｏｌ）
【０１０１】
３および４の合成：
【化６】
2008543916.tif 000009
【０１０２】
ｆｍｏｃストラテジー（Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany）を利用してＲｉｎｋアミド樹脂上でＬｙｓ２８ｉｖＤｄｅ側鎖保護ＧＬＰ（７−３６）（配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR−アミド）を合成した。Ｎ末端ｆｍｏｃ保護基を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、そして乾燥させた。５００μｌのＤＭＦ中の４２ｍｇのブロモ酢酸（３００μｍｏｌ）および４７μｌ（３００μｍｏｌ）のＤＩＣの溶液中に５０ｍｇの樹脂（０．１１ｍｍｏｌ／ｇ、５．５μｍｏｌ）を懸濁させた。混合物を室温で３０分間振盪した。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、２００μｌのＤＭＦ中の２０ｍｇの２および１０μｌのＤＩＥＡの溶液中で樹脂を２時間インキュベートした。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、ＤＭＦ中の５％ヒドラジンと共に樹脂を３回にわたり２０分間ずつインキュベートすることにより、ｉｖＤｄｅ保護基を切り離した。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭでそれぞれ６回ずつ洗浄した。９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシラン／水を用いて９０分間かけて樹脂からのペプチドの切離しおよび保護基の除去を行った。窒素流動下で揮発性物質を除去した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより３ａを精製し、そして凍結乾燥させた。 
ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１２０４．２、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１８０６．３（ＭＷ計算値＝３６０９ｇ／ｍｏｌ）
【０１０３】
３ｂを合成するために、１．５ｍｌのＤＭＦ中の１２６ｍｇのブロモ酢酸（９００μｍｏｌ）および１４１μｌ（９００μｍｏｌ）のＤＩＣの溶液中に１５０ｍｇの樹脂（０．１１ｍｍｏｌ／ｇ、１６．５μｍｏｌ）を懸濁させた。混合物を室温で３０分間振盪した。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、６００μｌのＤＭＦ中の６０ｍｇの２および３０μｌのＤＩＥＡの溶液中で樹脂を２時間インキュベートした。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、ＤＭＦ中の５％ヒドラジンと共に樹脂を３回にわたり２０分間ずつインキュベートすることにより、ｉｖＤｄｅ保護基を切り離した。樹脂をＤＭＦでそれぞれ６回ずつ洗浄した。２０ｍｇのＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（５０μｍｏｌ）を８．２μｌのＤＩＣ（５０μｍｏｌ）、８ｍｇのＨＯＢｔ（５０μｍｏｌ）、および０．５ｍｌのＤＭＦと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次に、樹脂を反応混合物と共に２時間インキュベートし、そして樹脂をＤＭＦで６回洗浄した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて１５分間かけてＦｍｏｃ保護基を除去した。樹脂をＤＭＦで６回洗浄し、５００μｌのＤＭＦ中の１２ｍｇの５（および６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（２５μｍｏｌ）および１０μｌのＤＩＥＡの溶液と共に１時間インキュベートした。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭでそれぞれ６回ずつ洗浄し、そして乾燥させた。９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシラン／水を用いて９０分間かけて樹脂からのペプチドの切離しおよび保護基の除去を行った。窒素流動下で揮発性物質を除去した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより３ｂを精製し、そして凍結乾燥させた。 
ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１３７２．０、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝２０５７．５（ＭＷ計算値＝４１１３ｇ／ｍｏｌ）
【０１０４】
４を合成するために、５００μｌのＤＭＦ中の２５ｍｇのｂｏｃ−β−アラニン（８０μｍｏｌ）、２９μｌのＤＩＥＡ、および４２ｍｇのＰｙＢｏｐ（８０μｍｏｌ）の溶液中に５０ｍｇの樹脂（０．１１ｍｍｏｌ／ｇ、５．５μｍｏｌ）を懸濁させた。混合物を室温で３０分間振盪した。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、ＤＭＦ中の５％ヒドラジンと共に樹脂を３回にわたり２０分間ずつインキュベートすることにより、ｉｖＤｄｅ保護基を切り離した。ブロモ酢酸を以上に記載したように結合させた。ＤＭＦで樹脂を６回洗浄した後、２００μｌのＤＭＦ中の２０ｍｇの２および１０μｌのＤＩＥＡの溶液中で樹脂を１４時間インキュベートした。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭでそれぞれ６回ずつ洗浄した。９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシラン／水を用いて樹脂からのペプチドの切離しおよび保護基の除去を行った。窒素流動下で揮発性物質を除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより４を精製し、そして凍結乾燥させた。 
ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１２２７．９、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１８４１．４（ＭＷ計算値＝３６８０ｇ／ｍｏｌ）
【０１０５】
５および６の合成：
【化７】
2008543916.tif 000010
【０１０６】
それぞれ２０ｍｇの１を用いて、３および４に関連して記載したように５および６を合成した。 
５：ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］４＋＝１２１３．４、［Ｍ＋２Ｈ］３＋＝１８１９．３（ＭＷ計算値＝３６３７ｇ／ｍｏｌ）
６：ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］４＋＝１２３７．４、［Ｍ＋２Ｈ］３＋＝１８５５．２（ＭＷ計算値＝３７０８ｇ／ｍｏｌ）
【０１０７】
化合物１４の合成スキーム
【化８】
2008543916.tif 000011
【０１０８】
化合物１１の合成
７５０ｍｇの６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）ヘキサン酸（２．９ｍｍｏｌ）および１８０ｍｇの赤リン（５．８ｍｍｏｌ）を７ｍｌのＣＣｌ４中に懸濁させ、６００μｌのＢｒ２（１１．７ｍｍｏｌ）を２回に分けて添加した。反応混合物を９０℃で５時間攪拌した。冷却後、混合物を２０ｍｌの水および２０ｍｌのジエチルエーテルで希釈し、ＮａＨＣＯ３で中和した。ＮａＨＳＯ３を添加することにより過剰のＢｒ２を還元した。分離された有機層を水性ＮａＨＣＯ３で抽出した。水性層を合わせ、濃ＨＣｌで酸性化した。粗生成物を濾過により捕集し、ＥｔＯＨ−水から再結晶した。 
収量３５０ｍｇ（３６％）
ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３６４．２（ＭＷ＋Ｎａ計算値＝３６３．０ｇ／ｍｏｌ）
【０１０９】
化合物１３の合成
ｆｍｏｃストラテジー（Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany）を利用してＲｉｎｋアミド樹脂上で側鎖保護ＧＬＰ（７−３６）（配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR−アミド）を合成した。Ｎ末端ｆｍｏｃ保護基を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、そして乾燥させた。３００μｌのＤＭＦ中の３．６ｍｇの１１（１０μｍｏｌ）、１．５ｍｇのＨＯＢｔ（１０μｍｏｌ）、および１．６μｌのＤＩＣ（１０μｍｏｌ）の溶液を１０ｍｇの担持樹脂（０．２２ｍｍｏｌ／ｇ、２．２μｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で３時間振盪した。ＤＭＦおよびＤＣＭで樹脂を洗浄した後、４００ｍｌのＤＭＦ中の１９ｍｇのビス（２−ヒドロキシエチル）アミン（１８０ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、サスペンジョンを７０℃で２時間インキュベートし、１２を得た。ＤＭＦおよびＥｔＯＨで樹脂を洗浄し、次に、６０℃で４００μｌの１／９９（ｖ／ｖ）Ｎ２Ｈ４一水和物／エタノールで１時間処理し、フタルイミド保護基を除去した。ＥｔＯＨおよびＤＭＦで洗浄した後、３００μｌのＤＭＦ中の３．８ｍｇのＭｍｔ−メルカプトプロピオン酸（１０ｍｍｏｌ）、１．５ｍｇのＨＯＢｔ（１０μｍｏｌ）、および１．６μｌのＤＩＣ（１０μｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を室温で３時間振盪し、続いて、ＤＭＦおよびＤＣＭで樹脂を洗浄した。９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシラン／水を用いて樹脂からのペプチドの切離しおよび保護基の除去を行った。窒素流動下で揮発性物質を除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより１３を精製し、そして凍結乾燥させた。 
１３：収量１．２ｍｇ（１４％）
ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝１８０１．４；［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１２０１．２（ＭＷ計算値＝３６０４ｇ／ｍｏｌ）
【０１１０】
コンジュゲート７、８、９、１０、および１４の合成
１／１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水（３０μｌ）中の３（０．１μｍｏｌ）の溶液を１／１（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水（５０μｌ）および５０μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のマレイミド−ＰＥＧ５ｋ（０．２μｍｏｌ）と混合した。混合物を室温で１０分間インキュベートした。ＲＰ−ＨＰＬＣによりコンジュゲート７を精製し、そして移動相として１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．００５％トゥイーン２０（Tween 20）を用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００、流量０．７５ｍｌ／分）により分析した。 
７：ＳＥＣ保持時間：１９．５分
【０１１１】
以上に記載したように、それぞれ４、５、および６から８、９、および１０を合成した。
【０１１２】
以上に記載したように１３から１４を合成し、移動相として１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．００５％トゥイーン２０（Tween 20）を用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００、流量：０．７５ｍｌ／分）により精製した。０．０５％ＮａＮ３を含有する０．５ｍｌの緩衝液で捕集された溶出液（約１．０ｍｌ）を希釈し、そのまま放出速度の測定に供した。 
１４：ＳＥＣ保持時間：１９．７分
【０１１３】
化合物１７の合成スキーム
【化９】
2008543916.tif 000012
【０１１４】
化合物１６の合成
４ｍｌのＤＣＭ中の２００ｍｇのＤｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（０．４ｍｍｏｌ）および１４０μｌのＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）と共に１７０ｍｇの２−クロロトリチルクロリド樹脂（担持量１．２ｍｍｏｌ／ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を１．５時間インキュベートした。ＤＭＦ中のピペリジンでＦｍｏｃ保護基を切り離し、ＤＣＭおよびＤＭＦで樹脂を洗浄した。ＤＭＦ中の２０９ｍｇのＴｒｔ−メルカプトプロピオン酸（０．６ｍｍｏｌ）、９３ｍｇのＨＯＢｔ（０．６ｍｍｏｌ）、および９７μｌのＤＩＣ（０．６ｍｍｏｌ）の溶液と共に樹脂を室温で２時間振盪した。ＤＭＦ中の２％ヒドラジンで樹脂を３回処理し、Ｄｄｅ保護基を除去した。ＤＭＦで洗浄した後、２０ｍｌのＤＭＦ中の２４０ｍｇのグリコールアルデヒド二量体（２．００ｍｍｏｌ）、２５２ｍｇのＮａＣＮＢＨ３（４．００ｍｍｏｌ）、および２００μｌの酢酸の溶液を添加し、混合物を一晩振盪し、１５を得た。樹脂をＤＭＦで洗浄し、２ｍｌのピリジン中の３０９ｍｇのＭｍｔ−Ｃｌ（１．００ｍｍｏｌ）と共に室温で３時間攪拌した。樹脂をＤＣＭで洗浄し、そして乾燥させた。１／７（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ／ＤＣＭ（２×２分間）を用いて生成物１６を樹脂から切り離した。揮発性物質を窒素流動下で除去し、移動相としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ（８５：１５：０．０３（ｖ／ｖ））を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより１６を精製した。 
Ｒｆ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｅｔ３Ｎ（８５：１５：０．０３（ｖ／ｖ））＝０．５
１６：収量１０８ｍｇ（５０％）
ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝１１３１．９（ＭＷ＋Ｎａ計算値＝１１３１．６ｇ／ｍｏｌ）
【０１１５】
化合物１７の合成
４ｍｌのアセトニトリル中の６５ｍｇの１６（５９μｍｏｌ）、９．３μｌのＤＩＣ（６０μｍｏｌ）、および１３．８ｍｇのＨＯＳｕ（１２０μｍｏｌ）を室温で３時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、移動相としてヘプタン／ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ３Ｎ（５０：５０：０．０３（ｖ／ｖ））を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより１７を精製した。 
Ｒｆ（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ３Ｎ（５０：５０：０．０３（ｖ／ｖ））＝０．４）
１７：ＴＦＡ塩として収量５６ｍｇ（７７％）
ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋＝１２２８．７（ＭＷ＋Ｎａ計算値＝１２２８．６ｇ／ｍｏｌ）
【０１１６】
化合物１８の合成
【化１０】
2008543916.tif 000013
【０１１７】
ＮεＢ２９−フルオレセインインスリンの合成：
８０ｍｇ（１３．８μｍｏｌ）のｒｈインスリンを４ｍｌの１／１（ｖ／ｖ）ＤＭＦ／ＤＭＳＯ中に溶解させ、４０μｌのＤＩＥＡを添加した。８ｍｇ（１７μｍｏｌ）の５（および６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを添加し、溶液を室温で３０分間攪拌した。４ｍｌの５／５／１（ｖ／ｖ／ｖ）アセトニトリル／水／酢酸を添加し、生成物ＮεＢ２９−フルオレセインインスリンをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、そして凍結乾燥させた。１，４−ジチオトレイトールによるＮεＢ２９−フルオレセインインスリンの還元、プロテアーゼ消化、およびＭＳ分析により、コンジュゲーション部位を確認した。 
ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝３０８４．０；［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝２０５４．６（ＭＷ計算値＝６１６６ｇ／ｍｏｌ）
【０１１８】
ＤＭＦ（２０μｌ）中の４．４ｍｇの１６（４．０μｍｏｌ）、０．６μｌのＤＩＣ（４．０μｍｏｌ）、および０．９ｍｇのＨＯＳｕ（８．０μｍｏｌ）を室温で２時間反応させた。ＤＭＳＯ（６０μｌ）中の６．２ｍｇのＮεＢ２９−フルオレセイン−ｒｈインスリン（１．０μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２μｌ）に溶液を添加し、混合物を室温で９０分間攪拌した。反応混合物を酢酸で中和し、アセトニトリル／Ｈ２Ｏで希釈した。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により、ＭｍｔおよびＴｒｔで保護された適切な中間体を与えた。凍結乾燥後、ＭｍｔおよびＴｒｔで保護された中間体を９５：５（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシランと混合し、５分間攪拌した。窒素流動下で揮発性物質を除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより１８を精製し、そして凍結乾燥させた。 
ＭＳ［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝３２３８．２；［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝２１５７．２（ＭＷ計算値＝６４７２ｇ／ｍｏｌ）
【０１１９】
化合物１９の合成
【化１１】
2008543916.tif 000014
【０１２０】
１／４（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水（２０μｌ）中の１８（１．５ｎｍｏｌ）の溶液を１／４（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水（１０μｌ）および５０μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中のマレイミド−ＰＥＧ５ｋ（１．９ｎｍｏｌ）と混合し、室温で２分間インキュベートした。移動相として１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％トゥイーン２０（Tween 20）を用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００、流量：０．７５ｍＬ／分）により化合物を精製した。捕集された溶出液（約１．５ｍＬ）をそのまま放出速度の測定に供した。 
１９：ＳＥＣ保持時間：１８．８分
【０１２１】
ＮεＢ２９コンジュゲート化化合物２０の合成
【化１２】
2008543916.tif 000015
【０１２２】
ＮＭＰ中の８μｌの８３ｍＭ  １７（０．６μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６０μｌ）中の６．２ｍｇのｒｈインスリン（１．０μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．５μｌ）に添加し、混合物を室温で９０分間攪拌した。反応混合物を酢酸で中和し、アセトニトリル／Ｈ２Ｏで希釈した。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製により、ＴｒｔおよびＭｍｔで保護された適切な中間体を与えた。凍結乾燥後、ＴｒｔおよびＭｍｔで保護された中間体を９５：５（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシランと混合し、５分間攪拌した。窒素流動下で揮発性物質を除去し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより２０を精製し、そして凍結乾燥させた。ＤＴＴ還元およびＭＳ分析によりインスリン修飾の位置を確認した。 
ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝２０３８．１；［Ｍ＋４Ｈ］４＋＝１５２８．１（ＭＷ計算値＝６１１２ｇ／ｍｏｌ）
【０１２３】
化合物２１の合成
【化１３】
2008543916.tif 000016
【０１２４】
１９に関連して記載したように２０から２１を合成した。 
２１：ＳＥＣ保持時間：１８．６分
【０１２５】
２２の合成
【化１４】
2008543916.tif 000017
【０１２６】
ｆｍｏｃストラテジー（Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg, Germany）を利用してＲｉｎｋアミド樹脂上でＬｙｓ２８ｉｖＤｄｅ側鎖保護ＧＬＰ（７−３６）（配列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR−アミド）を合成した。Ｎ末端ｆｍｏｃ保護基を除去し、樹脂をＤＣＭで洗浄し、そして乾燥させた。５００μｌのＤＭＦ中の２０ｍｇのＦｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨ（５０μｍｏｌ）、２５ｍｇのＰｙＢｏｐ（５０μｍｏｌ）、および１７μｌのＤＩＥＡの溶液中で１５０ｍｇの樹脂（０．１１ｍｍｏｌ／ｇ、１６．５μｍｏｌ）を１時間インキュベートした。９６／２／２  ＤＭＦ／ピペリジン／ＤＢＵを用いてｆｍｏｃ保護基を除去した後、５００μｌのＤＭＦ中の１７．４ｍｇのＴｒｔ−メルカプトプロピオン酸（５０μｍｏｌ）、２５ｍｇのＰｙＢｏｐ（５０μｍｏｌ）、および１７μｌのＤＩＥＡ（１００μｍｏｌ）の溶液中で樹脂を１時間インキュベートした。５００μｌの９／１（ｖ／ｖ）ＤＭＦ／ヒドラジン中の樹脂を２時間インキュベートすることにより、ｉｖＤｄｅ保護基を除去した。ＤＭＦで樹脂を洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨを結合し、以上に記載したようにｆｍｏｃ保護基を除去した。次に、５００ｍｌのＤＭＦ中の１６ｍｇの５（および６）−カルボキシフルオレセイン−スクシンイミジルエステルおよび６μｌのＤＩＥＡの溶液と共に樹脂を２時間インキュベートした。９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ）ＴＦＡ／トリエチルシラン／水を用いて９０分間かけて樹脂からのペプチドの切離しおよび保護基の除去を行った。窒素流動下で揮発性物質を除去した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより２２を精製し、そして凍結乾燥させた。 
ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１３４５．９、［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝２０１６．９（ＭＷ計算値＝４０３４ｇ／ｍｏｌ）
【０１２７】
ｒＨＳＡ−マレイミド（２３）の合成
【化１５】
2008543916.tif 000018
【０１２８】
１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、３２ｍＭナトリウムオクタノエート、０．００１５％トゥイーン−８０（Tween-80）中の５００μｌの３ｍＭ  ｒＨＳＡ（１．５μｍｏｌ）溶液を１００μｌの０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０と混合した。１．５ｍｇのＮ，Ｎ’−ビスマレイミドプロピオニル−２−ヒドロキシ−１，３−ジアミノプロパン（３．７５μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２０分間反応させた。移動相として１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００  ２６／６０、流量：４ｍｌ／分）により化合物２３を精製した。 
ＥＳＩ−ＭＳ＝６６９００（ＭＷ計算値＝６６８６４ｇ／ｍｏｌ）
【０１２９】
ｂｏｄｉｐｙ標識化ｒＨＳＡ（２４）の合成
１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、３２ｍＭナトリウムオクタノエート、０．００１５％トゥイーン−８０（Tween-80）中の５００μｌの３ｍＭ  ｒＨＳＡ（１．５μｍｏｌ）溶液を２５０μｌの０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０と混合した。ＤＭＳＯ中の４３μｌの１００ｍＭ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ，ＳＴＰエステル（Molecular Probes）を添加し、混合物を室温で２０分間反応させた。移動相として１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００  ２６／６０、流量：４ｍｌ／分）によりＢｏｄｉｐｙ標識化ｒＨＳＡ（２４）を精製した。
【０１３０】
２５の合成
【化１６】
2008543916.tif 000019
【０１３１】
０．７５ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６中の４５ｍｇの２３を２５０μｌの０．５ｍｌホウ酸ナトリウムｐＨ８と混合し、５０μｌのＤＭＳＯ中の８ｍｇの２２を添加した。溶液を室温で２０分間インキュベートした。移動相として１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いてＳＥＣ（カラム：スーパーデックス（Superdex）２００  ２６／６０、流量：４ｍｌ／分）により２５を精製した。 
ＭＳ：７０８７０（ＭＷ計算値＝７０８９８ｇ／ｍｏｌ）
【０１３２】
２６の合成
【化１７】
2008543916.tif 000020
【０１３３】
２５に関連して記載したように２３および３ｂを用いて２６を合成した。 
ＭＳ：７０９５０（ＭＷ計算値＝７０９７７ｇ／ｍｏｌ）
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｒＨＳＡコンジュゲート２６からのフルオレセイン−ＧＬＰ−１の放出
ラットへの注射後にコンジュゲートに結合した状態を保持するフルオレセイン−ＧＬＰ−１の量を決定することにより、減算を行ってｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｒＨＳＡコンジュゲート２６からのフルオレセインＧＬＰ−１の放出を測定した。これは、２つの異なるｒＨＳＡ−フルオレセイン−ＧＬＰ−１コンジュゲートを比較することにより行われた。一方の構築物では、フルオレセイン標識化ＧＬＰ−１は、可逆リンカーを用いてアルブミンに結合され（コンジュゲート２６）、対照構築物では、標識化ＧＬＰ−１は、ｒＨＳＡに永久結合された（コンジュゲート２５）。きわめて正確なｉｎ  ｖｉｖｏ速度を取得しかつ注射部位の差異を抑制するために、内部標準を使用した。この内部標準は、非コンジュゲート化ｂｏｄｉｐｙ標識化ｒＨＳＡ（２４）を共注射することにより提供された。
【０１３５】
対照実験では、一群の５匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。４５０μｌの１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の５６ｎｍｏｌの２５および９７ｎｍｏｌの２４の混合物を各ラットに皮下注射した。血漿サンプルを所定の時間間隔で採取し、フルオレセインおよびＢｏｄｉｐｙの蛍光を測定した。フルオレセイン／Ｂｏｄｉｐｙ蛍光の規格化比を時間に対してプロットした（図７、三角）。
【０１３６】
主実験では、一群の３匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。４５０μｌの１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の４０ｎｍｏｌの２６および７２ｎｍｏｌの２４の混合物を各ラットに皮下注射した。対照実験のときと同一の時間間隔で血漿サンプルを採取し、フルオレセインおよびＢｏｄｉｐｙの蛍光を測定した。フルオレセイン／Ｂｏｄｉｐｙ蛍光の規格化比を時間に対してプロットした（図７、四角）。
【０１３７】
主実験で得られたデータを対照実験で得られたデータで割り算して時間に対してプロットすると、コンジュゲート２６からのフルオレセインＧＬＰ−１の放出速度が得られる。
【０１３８】
緩衝液ｐＨ７．４中におけるコンジュゲートからのペプチドまたはフルオレセイン−ペプチドの放出
水性緩衝液ｐＨ７．４中におけるリンカー加水分解により、（フルオレセイン）−ペプチドコンジュゲート７、８、９、１０、１４、１９、２１、および２６からの（フルオレセイン）−ペプチドの放出を行った。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％トゥイーン２０（Tween 20）中に凍結乾燥コンジュゲートを溶解させた。（フルオレセイン）ペプチドコンジュゲートの再溶解されたコンジュゲートおよび捕集されたＳＥＣ溶出液を３７℃でインキュベートし、所定の時間間隔でサンプルを採取し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ペプチドコンジュゲート）および２１５ｎｍにおけるＵＶ検出によりまたはＳＥＣ（フルオレセインペプチドコンジュゲート）および５００ｎｍにおける検出により分析した。それぞれ元のペプチドまたはフルオレセイン−ペプチドの保持時間に関連するピークを積分してインキュベーション時間に対してプロットし、カーブフィッティングソフトウェアを適用して対応する放出半減期を推定した。
【表１】
2008543916.tif 000021
【０１３９】
略号：
Ａｄｏ  ８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
Ｂｏｃ  ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｂｏｄｉｐｙ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ−Ｘ
ＤＢＵ  １，３−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン
ＤＣＭ  ジクロロメタン
（ｉｖ）Ｄｄｅ  １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル
ＤＩＣ  ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ  ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＳＣ  ジスクシンイミジルカーボネート（disuccinidylcarbonate）
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｅｑ  化学量論的当量
ｆｍｏｃ  ９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨ  Ｆｍｏｃ８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
ＨＦＩＰ  ヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＥＰＥＳ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）
ＨＯＢｔ  Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＬＣＭＳ  質量分析結合液体クロマトグラフィー
Ｍａｌ  マレイミドプロピオニル
Ｍｍｔ  ４−メトキシトリチル
ＭＳ  質量スペクトル
ＭＷ  分子質量
Ｎｐｙｓ  ３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル
ＰｙＢＯＰ  ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｒＨＳＡ  組換えヒト血清アルブミン
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ  室温
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
Ｓｕｃ  スクシンイミドプロピオニル
ＴＥＳ  トリエチルシラン
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＵＶ  紫外
ＶＩＳ  可視
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、担体結合プロドラッグを示している。
【図２】図２は、酵素依存性担体結合プロドラッグを示している。
【図３】図３は、マスキング基が担体の一部であるときのカスケードプロドラッグを示している。
【図４】図４は、マスキング基が担体とは異なりかつ担体が活性化基に永久結合されているときの酵素依存性カスケードプロドラッグを示している。
【図５】図５は、マスキング基が担体の一部であるときのビシン活性化基を有する担体結合カスケードプロドラッグを示している。
【図６】図６は、担体がビシンリンカーに永久結合されているときのビシンリンカーを有する担体結合プロドラッグを示している。
【図７】図７は、高分子プロドラッグのｉｎ  ｖｉｖｏ切断を示している。
【図８】図８は、一般的合成方法を示している。
【図９】図９は、一般的合成方法を示している。
【図１０】図１０は、一般的合成方法を示している。
【図１】
2008543916.tif 000042
【図２】
2008543916.tif 000043
【図３】
2008543916.tif 000044
【図４】
2008543916.tif 000045
【図５】
2008543916.tif 000046
【図６】
2008543916.tif 000047
【図７】
2008543916.tif 000048
【図８】
2008543916.tif 000049
【図９】
2008543916.tif 000050
【図１０】
2008543916.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月22日(2008.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの永久結合を介してビシンリンカーに結合された少なくとも１種のポリマーを含み、該ビシンリンカーが一時的結合を介してアミン含有生物学的活性部分に結合される高分子プロドラッグであって、該プロドラッグまたは対応する高分子プロドラッグリンカー試薬が、以下の構造：
【化１】
2008543916.tif 000052
〔式中、
Ｔは、ＤまたはＡであり、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を有する、上記プロドラッグ。
【請求項２】
前記生物学的活性部分が、小分子生物学的活性剤またはバイオポリマーよりなる生物学的部分の群から選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項３】
前記バイオポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、およびペプチド核酸よりなるバイオポリマーの群から選択される、請求項２に記載のプロドラッグ。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ＡＣＴＨ、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼ、アルブミン、α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、α１−プロテイナーゼ阻害剤（ＡＰＩ）、アルテプラーゼ、アニストレプラーゼ、アンクロドセリンプロテアーゼ、抗体（モノクローナル抗体またはポリクロナール抗体、およびフラグメントまたは融合体）、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチトリプシン、アプロチニン、アスパラギナーゼ、ビファリン、骨形態形成タンパク質、カルシトニン（サケ）、コラゲナーゼ、ＤＮアーゼ、エンドルフィン、エンフビルチド、エンケファリン、エリスロポエチン、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＤＣ因子、フィブリノリジン、融合タンパク質、濾胞刺激ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ガラクトシダーゼ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヘモグロビン、Ｂ型肝炎ワクチン、ヒルジン、ヒアルロニダーゼ、イズロニダーゼ、免疫グロブリン、インフルエンザワクチン、インターロイキン（１α、１β、２、３、４、６、１０、１１、１２）、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ｒｈＩＬ−１ｒａ）、インスリン、インターフェロン（α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、β１ａ、β１ｂ、γ１ａ、γ１ｂ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子、ラクターゼ、ロイプロリド、レボチロキシン、黄体形成ホルモン、ライム病ワクチン、ナトリウム利尿ペプチド、パンクレリパーゼ、パパイン、副甲状腺ホルモン、ＰＤＧＦ、ペプシン、血小板活性化因子アセチルヒドラーゼ（ＰＡＦ−ＡＨ）、プロラクチン、プロテインＣ、オクトレオチド、セクレチン、セルモレリン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ソマトロピン（成長ホルモン）、ソマトスタチン、ストレプトキナーゼ、スクラーゼ、テタヌストキシン断片、チラクターゼ、トロンビン、チモシン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦレセプター−ＩｇＧ  Ｆｃ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ＴＳＨ、尿酸オキシダーゼ、ウロキナーゼ、ワクチン、ならびに植物性タンパク質（たとえばレクチンおよびリシン）よりなるポリペプチドの群から選択される、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項５】
前記タンパク質が、組換えＤＮＡ技術により調製されるタンパク質である、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項６】
前記タンパク質が、抗体フラグメント、一本鎖結合タンパク質、触媒抗体、および融合タンパク質よりなるタンパク質の群から選択される、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項７】
前記タンパク質が、抗体、カルシトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ヘモグロビン、インターロイキン、インスリン、インターフェロン、ＳＯＤ、ソマトロピン、ＴＮＦ、ＴＮＦレセプター−ＩｇＣ  Ｆｃ、グルカゴン様ペプチド（たとえばＧＬＰ−１）よりなるタンパク質の群から選択される、請求項３に記載のプロドラッグ。
【請求項８】
前記小分子生物学的活性剤が、中枢神経系活性剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤、避妊剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、血管収縮剤、および心臓血管剤よりなる作用剤（少なくとも１つの第一級もしくは第二級のアミノ基を有する）の群から選択される、請求項２に記載のプロドラッグ。
【請求項９】
前記小分子生物学的活性剤が、ダウノラビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アミノグルテチミド、アマンタジン、ジアフェニルスルホン、エタンブトール、スルファジアジン、スルファメラジン、スルファメトキサゾール、スルファレン、クリナフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ノルフロキサシン、ネオマイシンＢ、スペクチノマイシン、カナマイシンＡ、メロペネム、ドーパミン、ドブタミン、リシノプリル、セロトニン、アシビシン、およびカルブタミドよりなる化合物の群から選択される、請求項２に記載のプロドラッグ。
【請求項１０】
Ｒ４〜Ｒ１２が、独立して、水素、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のＣ１〜Ｃ８のアルキルまたはヘテロアルキルから選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１１】
Ｒ１が、ポリアルキルオキシ系ポリマー、たとえば、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸およびその誘導体、アルギネート、キシラン、マンナン、カラゲナン、アガロース、セルロース、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）および他の炭水化物系ポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（アンヒドリド）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ウレタン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（アクリルアミド）、たとえば、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ＨＭＰＡ）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、たとえば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（エステル）、たとえば、ポリ（乳酸）またはポリ（グリコール酸）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（アミノ酸）、たとえば、ポリ（グルタミン酸）、コラーゲン、ゼラチン、以上に列挙されたポリマーから得られるコポリマー、グラフト型コポリマー、架橋型ポリマー、およびブロックコポリマーよりなるポリマーの群から選択される、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１２】
Ｒ１がヒドロゲルである、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１３】
Ｒ１が分岐状もしくは超分岐状のポリマーである、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１４】
Ｒ１がデンドリマーまたは高密度星形ポリマーである、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１５】
Ｒ１がバイオポリマーである、請求項１に記載のプロドラッグ。
【請求項１６】
Ｒ１がタンパク質である、請求項１５に記載のプロドラッグ。
【請求項１７】
前記タンパク質が、アルブミン、抗体、フィブリン、カゼイン、または任意の他の血漿タンパク質である、請求項１６に記載のプロドラッグ。
【請求項１８】
Ｒ１が１種以上の生物学的活性物質をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項１９】
Ｒ１がＸへの結合のための少なくとも１つの官能基を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの官能基が、カルボン酸およびその活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール、スルホン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸およびその誘導体、ホスホン酸およびその誘導体、ハロアセチル、アルキルハライド、アクリロイル、アリールフルオリドのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、エポキシド、オキシラン、ならびにアジリジンよりなる官能基の群から選択される、請求項１９に記載のプロドラッグ。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの官能基が、チオール、マレイミド、アミノ、カルボン酸およびその誘導体、カーボネートおよびその誘導体、カルバメートおよびその誘導体、アルデヒド、ならびにハロアセチルよりなる官能基の群から選択される、請求項１９または２０に記載のプロドラッグ。
【請求項２２】
ＸとＲ１と間に形成される結合または基が、ジスルフィド、Ｓ−スクシンイミド、アミド、アミノ、カルボン酸エステル、スルホンアミド、カルバメート、カーボネート、エーテル、チオエーテル、イミン、オキシム、ヒドラゾン、ウレア、チオウレア、ホスフェート、ホスホネートよりなる結合または基の群から選択される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２３】
ＸとＲ１との間に形成される結合または基が、Ｓ−スクシンイミド、アミド、カルバメート、チオエーテル、およびウレアよりなる結合または基の群から選択される、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。
【請求項２４】
Ａが、クロリド、ブロミド、フルオリド、ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、Ｎ−ヒドロキシアゾベンゾトリアゾリル、ペンタフルオルフェノキシ、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、またはヘテロアリールよりなる脱離基の群から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグリンカー試薬。
【請求項２５】
生物学的活性部分との共有結合コンジュゲーションおよび担体との結合のための、Ｔが脱離基Ａである、先行請求項のいずれか１項に記載の高分子プロドラッグリンカー試薬プロドラッグ。
【請求項２６】
・式ＩＩＩ
【化２】
2008543916.tif 000053
で示される出発分子を提供することと、
・式ＩＩ
【化３】
2008543916.tif 000054
で示される出発分子でＡを置換することと、
・得られた中間体を固相から切り離しかつ存在する保護基をすべて切り離すことにより、式Ｖ
【化４】
2008543916.tif 000055
で示される中間体を形成することと、
・式Ｖで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項２７】
・式ＶＩ
【化５】
2008543916.tif 000056
で示される出発分子を提供することと、
・少なくとも１段階の置換または還元的アルキル化により、式ＶＩＩ
【化６】
2008543916.tif 000057
で示される中間体を形成することと、
・式ＶＩＩで示される中間体を固相から切り離しかつ存在する保護基をすべて切り離すことにより、式ＶＩＩＩ
【化７】
2008543916.tif 000058
で示される中間体を形成することと、
・式Ｖで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項２８】
・式ＩＸ
【化８】
2008543916.tif 000059
で示される出発分子を提供することと、
・少なくとも１段階の置換または還元的アルキル化により、式Ｘ
【化９】
2008543916.tif 000060
で示される中間体を形成することと、
・存在する保護基をすべて切り離すことなく式Ｘで示される中間体を固相から切り離すことにより、式ＸＩ
【化１０】
2008543916.tif 000061
で示される中間体を形成することと、
・ＸＩ式で示される中間体を活性化試薬で活性化することにより、式ＸＩＩ
【化１１】
2008543916.tif 000062
で示される中間体を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、式ＸＩＩＩ
【化１２】
2008543916.tif 000063
で示される中間体を形成することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項２９】
・式ＸＩ
【化１３】
2008543916.tif 000064
で示される出発分子を提供することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、式ＸＩＶ
【化１４】
2008543916.tif 000065
で示される中間体を形成することと、
・式ＸＩＶで示される中間体を活性化試薬で活性化することにより、式ＸＶ
【化１５】
2008543916.tif 000066
で示される高分子プロドラッグ試薬を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３０】
・式ＸＩＩ
【化１６】
2008543916.tif 000067
で示される出発分子を提供することと、
・保護基ＰＧを切り離した後で式ＸＩＩで示される中間体中のＸにポリマーＲ１を結合することにより、式ＸＶ
【化１７】
2008543916.tif 000068
で示される高分子リンカー試薬を形成することと、
・式ＸＩＩで示される中間体をアミン含有薬剤Ｄと反応させることにより、高分子プロドラッグを形成することと、
〔式中、
Ｄは、アミン含有生物学的活性部分の残基であり、
Ａは、脱離基であり、
Ｘは、Ｒ１３−Ｙ１のようなスペーサー部分であり、
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素炭素結合、もしくは遊離電子対を含有する任意のヘテロ原子であるか、または不在であり、
Ｒ１３は、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリールから選択され、
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素、アシル基、またはヒドロキシル基用保護基から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１２は、独立して、水素、Ｘ−Ｒ１、置換型もしくは非置換型の線状、分岐状、もしくは環状のアルキルまたはヘテロアルキル、アリール、置換型アリール、置換型もしくは非置換型のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから選択され、
Ｒ１は、ポリマーである〕
を含む、高分子プロドラッグの合成方法。
【請求項３１】
前記活性化剤がカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの混合物である、請求項２８および２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
Ａが、クロリド、ブロミド、フルオリド、ニトロフェノキシ、イミダゾリル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、Ｎ−ヒドロキシアゾベンゾトリアゾリル、ペンタフルオルフェノキシ、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルから選択される、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
約７．４のｐＨを有する溶液中に前記プロドラッグを配置する段階を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のプロドラッグの加水分解方法。
【請求項３４】
前記溶液が細胞外液である、請求項３３に記載の方法。              
【国際調査報告】
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