(57)【要約】  ヒトＴ２ＲＮａｓｅ６ＰＬのクローニングおよび異種発現が開示される。対象において、異常な細胞の、細胞の運動性、アクチンフィラメントのアセンブリーまたはディスアセンブリー、増殖、コロニー化、分化、蓄積、および／または発生を予防、阻害および／または逆行させる方法がさらに開示される。この方法は、対象に治療上有効量のＲＮａｓｅ６ＰＬリボヌクレアーゼまたはその近縁ホモログを投与することによって行われる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項２】
Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項３】
配列番号４に記載される、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項４】
異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項５】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項６】
アクチン結合活性によって特徴付けられる、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項７】
前記リボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項８】
リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する、請求項１に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項９】
前記リボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である、請求項８に記載のＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質。
【請求項１０】
配列番号４に対して少なくとも８５％相同であり、かつＴ２リボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および異種発現系において前記ポリペプチドの発現を指令するための異種プロモーターを保有する第２のポリヌクレオチドを含む異種ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記第１のポリヌクレオチドとイン・フレームであり、かつ分泌のためのシグナルペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記第１のポリヌクレオチドは、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質をコードする、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号４に記載されるポリペプチドをコードする、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドは、アクチン結合活性によって特徴付けられる、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドのリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する、請求項１０に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドの前記アクチン結合活性は熱安定性である、請求項１７に記載の異種ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１１に記載の異種ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に修飾された細胞。
【請求項２０】
請求項１２に記載の異種ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に修飾された細胞。
【請求項２１】
請求項１３に記載の異種ポリヌクレオチドを含む、遺伝的に修飾された細胞。
【請求項２２】
配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーの熱安定性リボヌクレアーゼを単離する方法であって、この方法は：
熱変性した試料を得るために、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼを発現する細胞を含む試料を熱変性すること；
前記熱変性した試料の上清を単離すること；
Ｔ２ファミリーの熱安定性リボヌクレアーゼを有する前記上清の画分を同定すること；および
前記Ｔ２ファミリーの熱安定性リボヌクレアーゼを有する前記画分を前記上清から実質的に純粋となるまで精製すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記熱変性は、少なくとも９０℃の温度によって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記熱変性は、少なくとも１０分間行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記画分の同定は、リボ核酸分解活性のモニタリングによって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記画分の精製は、カラムクロマトグラフィーによって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記画分の精製は、アフィニティ−クロマトグラフィーによって行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼのアクチン結合活性を依然として維持しつつ、リボヌクレアーゼ活性を不活化する方法であって、この方法は、前記アクチン結合活性を依然として維持しつつ、前記リボヌクレアーゼ活性を実質的に不活化するのに十分な変性条件に前記リボヌクレアーゼを付すことを含む、方法。
【請求項３３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記リボヌクレアーゼ活性の不活化は、オートクレーブおよび化学的変性からなる群から選択されるプロセスによって行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記リボヌクレアーゼは組換えリボヌクレアーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する、Ｔ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ。
【請求項３８】
増殖、発生、分化、形質転換、腫瘍形成、腫瘍成長、コロニー化および脈管形成からなる群から選択される異常に増殖する細胞に関連するプロセスを、それを必要とする哺乳動物対象において予防、阻害または逆行させる方法であって、この方法は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する、治療上有効量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含み、それにより、前記異常に増殖する細胞に関連するプロセスを哺乳動物対象において逆行させる、方法。
【請求項３９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、アクチン結合活性によって特徴付けられる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｔ２リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
異常に増殖する細胞は癌性細胞および／または脈管形成性細胞である、請求項３８の記載の方法。
【請求項４９】
異常に増殖する細胞は癌に関連する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
異常に増殖する細胞は、パピローマ、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、メラノーマ、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、神経膠星状細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、ステント再狭窄、血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬からなる群から選択される細胞増殖性障害または疾患に関連する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記治療上有効量の前記Ｔ２リボヌクレアーゼまたは前記ポリヌクレオチドを対象に投与することは、経口投与、静脈内投与、皮下投与、全身投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入からなる群から選択される投与様式によって行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
有効成分として、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項５３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、アクチン結合活性によって特徴付けられる、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記Ｔ２リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
有効成分として、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボ核酸分解活性を実質的に欠く、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質を医薬上許容される担体と組み合わせることを含む、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防、阻害および／または逆行させるのに有用な医薬を調製する方法。
【請求項６７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボ核酸分解活性を実質的に欠く、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性を不活化することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性を不活化する工程は、オートクレーブおよび化学的変性からなる群から選択されるプロセスによって行われる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
医薬を特定の癌のための治療薬として同定することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
医薬を特定の増殖性障害または疾患のための治療薬として同定することをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
増殖性障害または疾患は、パピローマ、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、メラノーマ、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、神経膠星状細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、ステント再狭窄、血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを医薬上許容される担体と組み合わせることを含む、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防、阻害および／または逆行させるのに有用な医薬を調製する方法。
【請求項７８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
医薬を特定の癌のための治療薬として同定することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
医薬を特定の増殖性障害または疾患のための治療薬として同定することをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
特定の増殖性障害または疾患は、パピローマ、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、メラノーマ、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、神経膠星状細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、ステント再狭窄、血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
必要とする対象において腫瘍を処置する方法であって、この方法は、治療上有効量の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８４】
必要とする対象において腫瘍の発生を予防、阻害および／または逆行させる方法であって、この方法は、治療上有効量の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８５】
必要とする対象において良性腫瘍から悪性腫瘍への形質転換を予防、阻害および／または逆行させる方法であって、この方法は、治療上有効量の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８６】
必要とする対象において腫瘍脈管形成を予防、阻害および／または逆行させる方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８７】
必要とする対象において個々の腫瘍数を低下させる方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８８】
必要とする対象において腫瘍サイズを低下させる方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項８９】
必要とする対象において悪性腫瘍の数を低下させる方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項９０】
必要とする対象において組織の腫瘍への形質転換を予防し、阻害しおよび／または逆行させる方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項９１】
必要とする対象において過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態を処置および／または予防する方法であって、この方法は、治療上有効量の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項９２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記リボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
前記リボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、前記対象の細胞のゲノムに安定に組み込むことができる発現可能なポリヌクレオチドが選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
前記過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態は、炎症性疾患、神経変性病および癌からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態は、癌である、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記治療上有効量の前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたは前記リボヌクレアーゼをコードする前記発現可能なポリヌクレオチドを対象に投与することは、経口投与、静脈内投与、皮下投与、全身投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入からなる群から選択される投与様式によって行われる、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞の運動性を阻害する方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを細胞に提供することを含む、方法。
【請求項１０４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１１】
前記リボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定に組み込むことができる発現可能なポリヌクレオチドが選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１３】
前記細胞は癌細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１４】
前記提供は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１５】
必要とする対象において細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態を処置および／または予防する方法であって、この方法は、治療上有効量の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１６】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態は、炎症性疾患、神経変性病および癌からなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２２】
細胞においてアクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリーを阻害する方法であって、この方法は、請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを細胞に提供することを含み、それによって前記細胞のアクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリーを阻害する、方法。
【請求項１２３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定に組み込むことができる発現可能なポリヌクレオチドが選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞は癌細胞である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３０】
前記提供は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３１】
細胞のアポトーシスを増強する方法であって、この方法は、有効濃度の請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを細胞に提供することを含み、それによってアポトーシスを増強する、方法。
【請求項１３２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３７】
前記発現可能なポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定に組み込むことができる発現可能なポリヌクレオチドが選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３８】
前記細胞は癌細胞である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３９】
前記提供は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１４０】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを医薬上許容される担体と組み合わせることを含む、過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態を処置および／または予防するのに有用な医薬を調製する方法。
【請求項１４１】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４４】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４６】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせることを含む、細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態を治療または予防するのに有用な医薬を調製する方法。
【請求項１４７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に記載される、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系において発現される組換え蛋白質である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５０】
前記異種発現系は、細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１５２】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、化学療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の化学療法を増強する方法。
【請求項１５３】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、放射線療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の放射線療法を増強する方法。
【請求項１５４】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、光療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の光療法を増強する方法。
【請求項１５５】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、光力学療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の光力学療法を増強する方法。
【請求項１５６】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、外科的処置と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の外科的処置を増強する方法。
【請求項１５７】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、栄養療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の栄養療法を増強する方法。
【請求項１５８】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、切除療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の切除療法を増強する方法。
【請求項１５９】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、放射線療法および化学療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の放射線療法および化学療法の組み合わせを増強する方法。
【請求項１６０】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、近接照射療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の近接照射療法を増強する方法。
【請求項１６１】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、プロトンビーム療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌のプロトンビーム療法を増強する方法。
【請求項１６２】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、免疫療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の免疫療法を増強する方法。
【請求項１６３】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、細胞療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌の細胞療法を増強する方法。
【請求項１６４】
請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、または請求項１に記載のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを、フォトンビーム放射線外科療法と組み合わせて、必要とする対象に投与することを含む、癌のフォトンビーム放射線外科療法を増強する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクチン結合および抗腫瘍特性を有するヒトＴ２リボヌクレアーゼ蛋白質、ならびに酵母細胞におけるそのクローニングおよび発現に関する。さらに、本発明は、対象における固形腫瘍および転移性成長に関連する疾患および状態の治療におけるヒトＴ２リボヌクレアーゼ蛋白質の使用方法、ならびにヒトＴ２リボヌクレアーゼの精製のための新規な方法に関する。本発明は、さらに、有効成分として、一般に増殖性疾患または障害、特に癌を治療するための、Ｔ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療界および一般的集団の両方の中では、癌等の細胞増殖性疾患および障害の治療用の新規な治療剤の開発に対して継続的な興味がある。
【０００３】
哺乳動物細胞に対して（抗脈管形成のような）抗増殖性、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生特性を呈する剤は、潜在的には、抗癌薬物として用いることができる。従って、これらの剤は、天然ならびに合成源の双方から広く求められている。
【０００４】
ＲＩＢＡＳＥＳは、ＲＮＡを分解するその能力から区別される生物学的活性を呈するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）である。ＲＩＢＡＳＥＳおよびそれらの構造的ホモログは、非常に多数の細胞反応をもたらすことが知られている（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２−２１２０７；Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．１９９７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５２９−５３６）。細胞傷害性好酸球の分泌性顆粒で見出される２つの主要な蛋白質であるＥＤＮおよびＥＣＰ（ＲＮａｓｅ  Ａファミリーのメンバー）は、免疫応答に参画すると考えられている。自家不和合性植物においては、花柱Ｓ−ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｔ２ファミリーのメンバー）は花粉管の成長を阻止し、かくして、受精を妨げる。ウシガエル卵母細胞から生産されたＲＣ−ＲＮａｓｅは、イン・ビトロにて、Ｐ３８８、Ｌ１２１０白血病細胞系のような腫瘍細胞の成長を阻害し、肉腫１８０、Ｅｒｌｉｃｈ、およびＭｅｐ  ＩＩ腹水細胞のイン・ビボ殺傷に有効である（Ｃｈａｎｇ，Ｃ−Ｆ．ら、１９８８，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８３：２３１−２４４）。いくつかのＲＮａｓｅは制限されたリボヌクレアーゼ活性を呈し、その例は、血管形成を刺激するアンジオゲニンを含む（Ｆｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：５４８０−５４８６）。
【０００５】
生体は、病原体および腫瘍細胞に対する防御のために細胞外ＲＮａｓｅを用いる。例えば、ＥＣＰは寄生虫の攻撃に応答して分泌され（Ｎｅｗｔｏｎ，ＤＬ．１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９５７２−１９５７８）、抗菌および抗ウイルス活性を呈する。この活性は、血液、精液プラスマ、母乳、滑液、唾液、尿および汗を含めたほとんどのヒト体液に存在するＲＮａｓｅであるＺｉｎｃ−α２−糖蛋白質（Ｚｎα２ｇｐ）によっても呈される（Ｌｅｉ  Ｇ，ら、１９８８，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊｕｌ  １５：３５５（２）：１６０−４）。
【０００６】
細胞外ＲＮａｓｅが細胞反応において機能する特異的メカニズムは知られていない。
【０００７】
あるＲＮａｓｅの細胞傷害性活性に対する主なバリアーは、細胞膜である。ＥＣＰは、人工膜および細胞膜の双方においてチャネルを形成することが見出されている。恐らくは、ＥＤＮ（小脳プルキニエ細胞の破壊の原因である好酸球ＲＮａｓｅ）と共に顆粒膜から放出されたＥＣＰは、ＥＤＮを細胞間空間に移動させる。真菌トキシンα−サルシン（ＲＮａｓｅ  Ａファミリーのメンバー）の標的細胞への進入は、細胞膜を透過するウイルス感染に依存する（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２−２１２０７）。また、ＲＮａｓｅがエンドサイトーシスを介して細胞に進入する可能性もある。ゴルジ−破壊薬物であるレチノイン酸またはモネンシンを用いて人工的にＢＳ−ＲＮａｓｅを細胞に送達した場合、細胞傷害性は劇的に増加した（Ｗｕ  Ｙ，ら、１９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２１；２７０（２９）：１７４７６−８１）。
【０００８】
ＲＮａｓｅの細胞傷害性は、治療目的で用いることができる。ヒトＲＮａｓｅ  Ｌは、インターフェロンによって活性化され、ウイルス増殖を阻害する。ヒトＲＮａｓｅ  Ｌ遺伝子の発現は、タバコ植物における２’５’−Ａシンテターゼ遺伝子の発現と共に、キュウリモザイクウイルスから植物を保護し、ジャガイモウイルスＹの複製を妨げるのに十分である。ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、ＲＮａｓｅ  Ｌ抗ウイルス経路において遮断を誘導する（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．１９９７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５２９−５３６）。ＲＮａｓｅは特異的膜蛋白質抗体と融合して、イムノトキシンを作成することができる。例えば、ＲＮａｓｅ  Ａと、トランスフェリン受容体に対するまたはＴ細胞抗原ＣＤ５に対する抗体との融合は、前記トキシンの各々に対する特異的受容体を保有する腫瘍細胞における蛋白質合成の阻害をもたらす（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２−２１２０７；Ｎｅｗｔｏｎ  ＤＬ，ら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４；３７（１５）：５１７３−８３）。ＲＮａｓｅは動物に対して毒性が低いので、それらは、現在使用されるイムノトキシンよりも少数の望ましくない副作用を有し得る。
【０００９】
細胞傷害性リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）およびＲＮａｓｅの間の相互作用の強さに対して逆の関係にあるように見える。リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）は、リボヌクレアーゼの潜在的な致死効果からこれらの細胞を保護するように働く脊椎動物細胞内で見出される天然分子である。リボヌクレアーゼ阻害剤は、種々の親和性でもってＲＮａｓｅに結合する５０ｋＤａのサイトゾル蛋白質である。例えば、ＲＩは、Ｋｉが１０−６ないし１０−１６Ｍの範囲である、１０桁の大きさにわたる阻害定数を持つ、リボヌクレアーゼのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）スーパーファミリーのメンバーに結合する。
【００１０】
Ａ−ＲＮａｓｅ
ＯＮＣＯＮＡＳＥは、ＲＮａｓｅ  ＡおよびＢＳ−ＲＮａｓｅのように、ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーのメンバーである。ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーのメンバーは、アミノ酸配列において約３０％の同一性を共有する。非保存残基の大部分は表面ループに位置し、各ＲＮａｓｅの専用生物学的活性において重要な役割を演じているように見える。ＯＮＣＯＮＡＳＥは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｅｏｐａｒｄカエル（Ｒａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓ）卵母細胞および初期胚から単離された。それは、イン・サイチュおよびイン・ビボの双方において、種々の固形腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ  Ｓ．Ｍ．ら、１９９０  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １７；８２（２）：１５１−３）。ＯＮＣＯＮＡＳＥは、非細胞傷害性濃度において、感染したＨ９白血病細胞におけるＨＩＶ−１複製を特異的に阻害することも見出された（Ｙｏｕｌｅ  Ｒ．Ｊ．ら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２１；９１（１３）：６０１２−６）。
【００１１】
ＯＮＣＯＮＡＳＥのＲＮａｓｅ活性は比較的低いが、その酵素活性および細胞傷害性活性はある程度関連していることが認められている。Ａ−ＲＮａｓｅの三次構造は細胞傷害性および非細胞傷害性タイプの間を区別すると考えられる。例えば、ＯＮＣＯＮＡＳＥおよびＲＮａｓｅ  Ａの三次構造の間の差は、ＯＮＣＯＮＡＳＥで観察された増大した細胞傷害性が関与していると考えられる。ＯＮＣＯＮＡＳＥは、ＲＮａｓｅ  Ａとは異なり、酵素活性および細胞傷害性活性の双方で必須であるブロックされたＮ−末端Ｇｌｕ１残基（ピログルタメート）を含有する。このユニークな構造は、ＯＮＣＯＮＡＳＥが標的細胞に浸透することを可能とする（Ｂｏｉｘ  Ｅ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２５７（５）：９９２−１００７）。加えて、ＯＮＣＯＮＡＳＥにおいては、Ｌｙｓ９残基はＲＮａｓｅ  ＡのＧｌｎ１１残基を置き換え、これは、活性部位の構造をもたらすと考えられる。さらに、ＯＮＣＯＮＡＳＥおよびＲＮａｓｅ  Ａの間の一次構造のアミノ酸配列の差は、その特異性をもたらす活性部位の周辺においてトポロジー的変化を引き起こす（Ｍｏｓｉｍａｎｎ  Ｓ．Ｃ．ら、１９９２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １４（３）：３９２−４００）。
【００１２】
Ａ−ＲＮａｓｅの間の毒性の差は、ＲＩに結合するそれらの能力にも帰される。ウシ精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮａｓｅ）は、そのアミノ酸配列がＲＮａｓｅ  Ａに対して８０％同一であるが、ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーの他のメンバーとは異なり、ＢＳ−ＲＮａｓｅは二量体形態で存在する。ＢＳ−ＲＮａｓｅの四次構造はＲＩによる結合を妨げ、それにより、酵素が、ＲＩの存在下においてそのリボ核酸分解活性を保持することを可能とすることが示されている（Ｋｉｍら、１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０  Ｎｏ．５２：３１０９７−３１１０２）。ＲＮａｓｅ  Ａに対して高度の相同性を有するＯＮＣＯＮＡＳＥは、ＲＩによる結合に対して耐性である。ＲＩ−ＯＮＣＯＮＡＳＥ複合体は、ＲＩ−ＲＮａｓｅ  Ａ複合体のＫｄよりも少なくとも一億倍低いＫｄを有する。ＲＩに対するＯＮＣＯＮＡＳＥのより低い結合親和性は、リボ核酸分解活性の効果的な阻害を妨げ、ＲＮａｓｅ  ＡがそうではないのにＯＮＣＯＮＡＳＥが低濃度で細胞傷害性である理由を説明できるであろう。
【００１３】
細胞表面受容体への結合は、ＯＮＣＯＮＡＳＥ細胞傷害性において最初の工程であることが示唆されている。哺乳動物細胞表面のＯＮＣＯＮＡＳＥ受容体の性質については何も知られていない。ＯＮＣＯＮＡＳＥは、リシンの場合のように細胞表面炭水化物に結合することができるか、あるいは、それは、ポリペプチドホルモンのような生理学的に取り込まれた分子について元来発生した受容体に結合することができる（Ｗｕ  Ｙ，ら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）：１０６８６−９３）。マウスにおいては、ＯＮＣＯＮＡＳＥは、ＲＮａｓｅ  Ａよりは５０ないし１００倍遅い速度で腎臓から排出された。ＯＮＣＯＮＡＳＥのより遅い排出速度は、管状細胞に結合するそのより高い能力の結果として、および／または蛋白質分解に対するその耐性によって説明される。腎臓におけるＯＮＣＯＮＡＳＥの強い保持は、臨床的関連を有し得る（Ｖａｓａｎｄａｎｉ  Ｖ．Ｍ．ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５；５６（１８）：４１８０−６）。ＯＮＣＯＮＡＳＥは、プルキニエ細胞ＥＤＮ受容体に結合することもできる（Ｍｏｓｉｍａｎｎ  Ｓ．Ｃ．ら、１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６；２６０（４）：５４０−５２）。ＯＮＣＯＮＡＳＥの特異性もまたそのｔＲＮＡ選択性にて発現される。ウサギ網状赤血球溶解物において、およびＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において、ＯＮＣＯＮＡＳＥは、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ分解を介するよりはむしろ、ｔＲＮＡを介して蛋白質合成を阻害することが発見された。対照的に、ＲＮａｓｅ  ＡはｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを主に分解する（Ｌｉｎ  Ｊ．Ｊ．ら、１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）：１５６−６２）。
【００１４】
感受性組織培養のＯＮＣＯＮＡＳＥでの処理の結果、非常に低いレベルのＲＮＡ含有量を有する、細胞周期のＧ１期において阻止された細胞が蓄積する（Ｍｏｓｉｍａｎｎ  Ｓ．Ｃ．ら、１９９２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １４（３）：３９２−４００）。神経膠細胞において、ＯＮＣＯＮＡＳＥは、細胞密度の有意な低下なくして蛋白質合成を阻害し、これは、ＯＮＣＯＮＡＳＥが細胞静止性であることに加え細胞に対して細胞傷害性でもあることを示す（Ｗｕ  Ｙ．ら、１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）：１０６８６−９３）。化学療法剤と組み合わせたＯＮＣＯＮＡＳＥは多剤耐性を克服することができる。ビンクリスチンおよびＯＮＣＯＮＡＳＥでの処置は、ビンクリスチン単独で処置したマウスにおける４４日までと比較して、ビンクリスチン耐性腫瘍を保有するマウスの平均生存時間（ＭＳＴ）を６６日まで増加させた（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５２９−５３６）。
【００１５】
さらに、いくつかの化学療法剤はＯＮＣＯＮＡＳＥと相乗的に作用することができる。ＯＮＣＯＮＡＳＥおよびタモキシフェン（抗エストロゲン）、トリフルオロフェラジン（ステラジン、カルモジュリン阻害剤）またはロバスタチン（３−ヒドロキシル−３−メチルグルタチル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤）との組み合わせで処理したヒト膵臓腺癌およびヒト肺癌腫の腫瘍細胞系においては、より強い成長阻害が、ＯＮＣＯＮＡＳＥ単独で処理した細胞よりも観察された（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ  Ｓ．Ｍ．ら、１９９０，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｎｅｔ．２３（３）：２３７−４６）。かくして、より大きな有効性および／またはより小さな毒性での組合せ療法養生法を開発する可能性は明らかである。
【００１６】
ウシ精液ＲＮａｓｅはＲＮａｓｅ  Ａファミリーのユニークなメンバーである。というのは、それは２つのジスルフィドブリッジによって連結されたＲＮａｓｅ  Ａ−様サブユニットのダイマーを含有する唯一のＲＡａｓｅだからである。加えて、それは、基質および反応産物の双方によるアロステリック調節を維持する。該調節は、周期的ヌクレオチド加水分解相で起こる。それは、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ双方を切断する能力を有する。ＢＳ−ＲＮａｓｅは高度に細胞傷害性である。それは、マウス白血病細胞、ＨｅＬａおよびヒト胚肺細胞、マウス神経芽細胞腫細胞、およびヒト線維芽細胞およびマウスプラスマ細胞腫細胞系に対してイン・ビトロで抗腫瘍効果を呈する。イン・ビボで固形癌腫（甲状腺小胞癌腫およびその肺転移）を有するラットへ投与した場合、ＢＳ−ＲＮａｓｅは腫瘍重量の劇的な低下を誘導し、処置した動物に対して検出可能な毒性効果はなかった（Ｌａｃｃｅｔｔｉ，Ｐ．ら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：４５８２−４５８６）。人工的にモノマー化されたＢＳ−ＲＮａｓｅは、天然ダイマーＢＳ−ＲＮａｓｅよりも高いリボヌクレアーゼ活性を有するが、より低い細胞傷害性を有する（Ｄ’Ａｌｌｅｓｓｉｏ  Ｇ．ら、１９９１，ＴＩＢＳ：１０４−１０６）。これは、再度、生物学的活性に対する分子構造の重要性を示す。ＯＮＣＯＮＡＳＥのように、ＢＳ−ＲＮａｓｅは、標的細胞への侵入に先立って、標的細胞の表面の認識部位に結合する。
【００１７】
細胞傷害性であることに加えて、ＢＳ−ＲＮａｓｅは免疫抑制性でもある。ＢＳ−ＲＮａｓｅは活性化されたＴ細胞の増殖をブロックし、同種異形マウスへ移植された皮膚移植片の生存を延長することができる。ＳＢ−ＲＮａｓｅの免疫抑制性活性は、雌免疫系から精子細胞を保護する必要性によって説明される。
【００１８】
Ｔ２−ＲＮａｓｅ
植物においては、自家和合性は豊富であって、自家受精の防止において効果的である。自家不和合性を制御するＳ遺伝子座において特定の対立遺伝子を保有する花粉は、同一のＳ−対立遺伝子を保有する植物を受精させることができない。多くの自家不和合性植物、特に、ＳｏｌａｎａｃｅａｅおよびＲｏｓａｃｅａｅのメンバーにおいては、Ｔ２−ＲＮａｓｅファミリーのメンバーであるＳ−ＲＮａｓｅは、雌器官によって分泌される。Ｓ−ＲＮａｓｅは自家花粉を特異的に認識し、受精が起こる前に柱頭または花柱におけるその成長を阻止する（Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｅ．およびＮｅｗｂｉｇｉｎ，Ｅ．，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：２５７−２７９）。花粉管成長の阻止はＲＮＡ分解の直接的結果であることが提案されているが、Ｓ−ＲＮａｓｅの該管細胞への進入の態様は依然として曖昧である。
【００１９】
ＲＮａｓｅ  Ｔ２ファミリーのメンバーは、最初、真菌で同定された（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｋ．１９６９，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）。それらが、ウイルスから哺乳動物の範囲で、広く種々の生物で発見された。特に、Ｔ２−ＲＮａｓｅは、広く記載されたＲＮａｓｅ  Ａファミリーよりもかなり広い分布を示す。しかしながら、哺乳動物細胞におけるＴ２−ＲＮａｓｅのイン・ビボでの役割は依然として知られていない。
【００２０】
微生物においては、細胞外Ｔ２−ＲＮａｓｅは、一般には、培養基に存在するポリリボヌクレオチドの消化に寄与すると考えられており、それにより、拡散可能な栄養素を生起する。それらは防御剤としても働くことができる（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，１９６９，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）。
【００２１】
植物においては、Ｔ２−ＲＮａｓｅは、胚珠に向かって移動する花粉管の伸長を選択的に制限することによって、受粉プロセスにおいて役割を演じる（Ｒｏｉｚ，Ｌ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５６：３７−４１，Ｒｏｉｚ  Ｌ．ら、１９９５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．９４：５８５−５９０）。現在まで、これらのＲＮａｓｅが花粉管に影響を及ぼすメカニズムに関する論争があった。しかしながら、以下の実施例セクションにおいて詳細に記載するように、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１に関して研究する本著者らは、Ｔ２  ＲＮａｓｅ  Ｂ１が花粉管Ｆ−アクチン細胞骨格ネットワークの構造に干渉し、細胞質ストリーミングの破壊および先端へのＦ−アクチンネットワークの崩壊を引き起こすことを示した。さらに、検出できないレベルのリボ核酸分解活性を有するＲＮａｓｅ  Ｂ１での実験においては、本著者らは、花粉管成長阻止がＲＮａｓｅ活性とは独立していることを示した（Ｒｏｉｚら、準備中）。
【００２２】
かくして、癌治療剤として効果的に用いることができる細胞傷害性リボヌクレアーゼの例はほとんど存在しない。哺乳動物細胞に対して抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性を有する新しいリボヌクレアーゼが、ヒト癌の治療で利用可能な治療剤のスペクトルを増強させ、それにより、癌治療の分野において新しい展望を開くのに必要である。
【００２３】
アポトーシスおよび疾患
細胞死は、機能的および形態学的特徴の特異的組によって区別することができる、壊死およびアポトーシスと呼ばれる２つの異なるプロセスを介して起こり得る。壊死は、細胞外環境における有害な因子（例えば、低酸素症、高熱、ウイルス侵入、トキシンへの暴露、または病原体による攻撃）に対する応答として起こる外傷的細胞死である。原形質膜におけるイオンポンプおよび水ポンプは、濃度勾配を維持するそれらの能力を失い、細胞およびミトコンドリアが膨潤し、最終的に破裂し、細胞構成要素を漏出し、周囲の組織における炎症応答を引き起こす。アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死（ＰＣＤ）においては、細胞は、固有のゲノムプログラムを介して自己破壊するように誘導される。細胞は収縮し、ミトコンドリアは破壊され、チトクロームｃを放出する。核ＤＮＡは徐々に約２００塩基のモノマーおよびマルチマーに分解する。最終的に、細胞はブレビングを受け、近くのファゴサイトーシス細胞によって食されるアポトーシス体と呼ばれる小さな膜に囲まれた断片に分解する（Ｒｕｄｉｎ  ＣＭおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢ．１９９７．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．４８：２６７−８１；Ｃｈａｍｏｎｄ  Ｒ．Ｒ．ら、１９９９．Ａｌｅｒｇｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｌｉｎ．１４：３６７−３７４）。重要なことには、周囲の組織における炎症応答は誘導されない。２つの細胞死の形態間の相違を以下の表１にまとめる。
2008514224.tif 000002
【００２４】
アポトーシスは、正常なプロセスにおいて、および病理学的プロセスにおいて、ホメオスタシスの調節において中枢的な役割を演じる。胚形成の間に、アポトーシスは、オタマジャクシ尾の喪失、指および足指の分化、および脳における不必要なニューロンの除去を担う。また、アポトーシスは、月経における子宮内膜のディスアセンブリー、および老化プロセスに関与する（Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＦＪ．ら、１９９７．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ９４：１２３−１３４）。
【００２５】
アポトーシスは、生物の一体性に対する脅威を示す細胞を除去するために必要である。例えば、それは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がウイルス感染細胞を殺傷するメカニズムである（Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮ．２００１．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．８：１１３−１２６）。ＣＴＬは相互においてさえアポトーシスを誘導でき、従って、それらはその生理学的機能の完了の後に排除でき、それらが周囲の細胞にマイナスに作用するようになることを妨げる（Ｄｕｋｅ  ＲＣ．１９９２．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４０７−４１２）。
【００２６】
前眼房および精巣は、抗原がこれらの部位において免疫応答を誘導しないことが判明しているように、「免疫特権」器官として知られている。これらの部位において、細胞は、構成的に、高レベルのＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）（Ｆａｓと命名され（ＣＤ９５とも呼ばれる）且つ強力な死滅アクチベーターとしても公知の細胞表面受容体に結合するサイトカイン）を発現する。ＦａｓＬはＴ細胞に対して毒性であり、かくして、外来性組織および腫瘍グラフトの延長したおよび時には永久的な生存を許容する（阻害されたアポトーシス）（Ｎｉｅｄｅｒｋｏｒｎ  ＪＹ．２００２．Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１３−４６；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ．ら、１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５１８−５２２；Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ａ，ら、１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：３８６１−３８６５）。かくして、特異的細胞（例えば、リンパ球）におけるアポトーシスプロセスのアップレギュレーションは、グラフト拒絶の防止に有用であり得、潜在的に、免疫抑制薬物の使用の減少、および患者の生活の質の改善をもたらす。
【００２７】
種々の疾患がアポトーシスの調節に関連付けられている。それらの中には、種々の神経変性病、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、および癲癇（全て、ニューロンの選択的アポトーシスと関連する）がある。これらのニューロン死は、これらの細胞におけるアポトーシスに対する感受性の増加に関連すると思われる。
【００２８】
成熟血液細胞は、骨髄に位置する造血前駆体に由来する。造血、ならびに成熟血液細胞の維持は、多数の向性因子（エリストポエチン、コロニー刺激因子、サイトカイン）によって調節される。造血細胞の生産および排除の間のバランスは、アポトーシスによって調節される。アポトーシス調節の喪失は、多数の血液障害、例えば、無形成貧血、骨髄形成不全症候群、ＣＤ４＋Ｔ細胞リンパ球減少症およびＧ６ＰＤ不全に関連付けることができる。
【００２９】
心筋梗塞および脳血管障害、虚血性腎臓損傷および多嚢胞性腎臓において、虚血性ゾーンの周囲の細胞はアポトーシスを介して排除される。
【００３０】
アポトーシスは、種々の細胞、例えば、ニューロン、筋細胞、リンパ球、肝細胞においてアップレギュレートされ、老化は、酸化的ストレス、グリケーションおよびＤＮＡ損傷等のホメオスタシス機能不全を引き起こす生理学的条件下でアポトーシスを増強することを示す証拠がある。
【００３１】
アポトーシスは、アレルギーの後期および慢性段階に参画する炎症細胞（好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージ、肥満細胞）において記載されてきた（Ｓａｍｐｓｏｎ  ＡＰ．２０００．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．３０  Ｓｕｐｐｌ  １：２２−７；Ｈａｓｌｅｔｔ  Ｃ．１９９９．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６０：Ｓ５−１１）。例えば、好酸球のアポトーシス死は気管支喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎に関連付けられている（Ｗｏｏｌｅｙ  ＫＬ  ら、１９９６．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ；１５４：２３７−２４３；Ｂｏｙｃｅ  ＪＡ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．１８：２９３−３００）。リンパ球アポトーシスは、Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａおよびＬｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅｉｎｄｕｃｅ等のアレルゲンによって誘導され得る（Ｇｕｅｒｒａ  Ｆ  ら、１９９９．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；６０：８４０−８４７）。
【００３２】
アポトーシスの阻害に関連した疾患は、細胞の過剰の蓄積が起こる疾患を含む（新生物疾患、自己免疫疾患）。かつて、これらの疾患における細胞の過剰蓄積が増大した細胞増殖によるものであると考えられていたが、現在では、欠陥的アポトーシスによるものと考えられる。
【００３３】
固形腫瘍および血液学的腫瘍双方において、悪性細胞はアポトーシスインデューサーに対して異常な応答を示す（Ｗａｔｓｏｎ  ＡＪＭ．１９９５．Ｇｕｔ  ３７：１６５−１６７；Ｂｕｒｃｈ  Ｗ．ら、１９９２．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １３：２４５−２５１）。これらの疾患において、ｐ５３、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｂｃｌ−２等の周期調節遺伝子は、悪性変性に関連する突然変異、不活化または調節不全を被る（Ｍｅｒｒｉｔ  ＡＪら、１９９４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１４−６１７；Ｉｗａｄａｔｅ  Ｙら、１９９６．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６９：２３６−２４０；Ｍｕｅｌｌａｕｅｒ  Ｌら、１９９６．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２３：８４０−８４７；Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＥＷ．１９９５．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １７：２１１−２２１）。ｂｃｌ−２の発現は、前立腺および結腸癌における、ならびに神経芽細胞腫における、より悪い予後についての予測因子であると考えられている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢ．１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２）。多数の抗新生物療法が腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが示されている（レビューについては：Ｓｕｎ  ＳＹら、２００４．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９６：６６２−６７２；Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｂｅｒｇｋａｍｅｎ  ＨおよびＫｒａｍｍｅｒ  ＰＨ．２００４．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３１：９０−１１９；Ａｂｅｎｄ  Ｍ．２００３．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ．７９：９２７−９４１参照）。
【００３４】
アポトーシスにおける欠陥は、ループスエリテマトーデス（Ｃａｒｓｏｎ  ＤＡ．およびＲｅｂｅｉｒｏ  ＪＭ．１９９３．Ｌａｎｃｅｔ．３４１：１２５１−１２５４．Ａｒｉｎｇｅｒ  Ｍ．ら、１９９４．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３７：１４２３−１４３０）、関節リウマチ（Ｌｉｕ  Ｈ．およびＰｏｐｅ  ＲＭ．２００３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３１７−２２．）および重症筋無力症（Ｍａｓｕｎｎａｇａ  Ａ．ら、１９９４．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．３９：１６９−１７２）等の自己免疫疾患をもたらし得る。
【００３５】
病原体がアポトーシスに干渉するいくつかの方法がある。例えば、（いくつかのリンパ系および上皮悪性疾患に関連する）アデノウイルスおよびエプスタイン−バールウイルスはＢｃｌ−２癌遺伝子の発現を促進し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢ．１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＷＬ．ら、１９９９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：５１８１−５１８５）、牛痘はカスパーゼを不活化するプロテアーゼ阻害剤をコードし（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，ら、１９９９．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３８８−９８．）；クラミジアはサイトゾルへのミトコンドリアチトクロームｃ放出に干渉する（Ｆａｎ  Ｔ．ら、１９９８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７：４８７−４９６）。
【００３６】
乾癬等の慢性炎症性の過剰増殖皮膚病においては、アポトーシスの異常に低い速度は、表皮過形成の発生に寄与する。ケラチノサイトは、ＩＬ−１５等のケラチノサイトアポトーシスを抑制し得るいくつかのプロ炎症性サイトカインを含めた、種々の外部および内部増殖因子に応答することが示された（Ｒｕｃｋｅｒｔ  Ｒ．ら、２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２４０−２２５０）。
【００３７】
アクチンおよび細胞運動性
アクチンは、細胞骨格を含み、全てのタイプの細胞において運動性を供する性質が不遍性である。細胞アクチン細胞骨格は、アクチンフィラメントの種々の空間的および時間的に制御されたアセンブリーに組織される。アクチンフィラメントは、細胞周囲のラメリポディウムおよび糸状足においてモノマーＧ−アクチンから重合される。これらの新しく重合されたアクチンフィラメントは高度に動的であって、迅速に代謝回転する。細胞の残りで見出されるアクチンフィラメントは、ラメリポディウムにおいて、およびラメラを通じて起こる小さな膜波立ちにおいてその起源を有する。アクチンフィラメントは、ストレスファイバー、ラメリポディウムネットワーク、糸状足束、後ろ側弧、末梢凹凸束ならびに側地線アレイのような種々のアレイに組織される（Ｓｍａｌｌ，ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；１２：１１２−２０）。これらのアセンブリーの各々の組織化は、それらに異なる機能を付与するアクチン関連蛋白質の特異的組によって制御され、安定化される。細胞中の異なるアクチンアレイの非対称かつ分極した組織化が、細胞の移動、成長、分裂、分化および防御についての基本である（Ｈｉｌｐｅｌａら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；１４：３２４２−５３）。
【００３８】
細胞運動性は、アクチン骨格の重合および脱重合の周期的ダイナミックスに依存する。細胞運動性は、細胞前部の突出および後部の引き続いての収縮を含む。突出は、ラメリポディウムおよび糸状足におけるアクチンフィラメントの前向きの周期的成長または重合に基づく。一方で、収縮は、収縮性束におけるミオシン−ＩＩと予め形成されたアクチンフィラメントとの相互作用に基づく。顕微鏡的研究は、ラメリポディウムの後ろのアクチンの逆方向流動の連続を示し、これは、ラメリポディウムにおいて発生したフィラメントの集団が、アクチン骨格の残りをなすアクチンのネットワークに寄与することを示す。かくして、アクチンフィラメントはラメリポディウムで生じ、それらがアクチン細胞骨格に取り込まれるようになるに従いそれらの関連蛋白質を放出し、次いで、他のアクチン関連蛋白質、特にミオシン−ＩＩ等の収縮性蛋白質を獲得し、細胞突出の収縮のための準備において収縮性束となる。
【００３９】
細胞の形状の変化および運動性は、癌転移、炎症病、神経変性病等の病理学的事象に関連する。細胞運動性関連蛋白質は、ウィスコット−アルドリッチ症候群等の多数の疾患の病因で同定されている（ＷＡＳ蛋白質）。ウィスコット−アルドリッチ症候群の代表的な症状として、湿疹、血小板減少症等の徴候、および感染に対する感受性が挙げられる。
【００４０】
多数のかつ増大する数の蛋白質は、アクチン細胞骨格の状態を調節し、変調することが知られており、いくつかは、部分的に重複する機能を有すると思われる。これらの蛋白質として、フィラミン、タリン、Ａｒｐ２／３複合体、α−アクチンニン、フィラメント作用蛋白質およびとげのある端部キャッピング蛋白質等のアクチンおよびインテグリン結合蛋白質が挙げられる（レビューについては、Ｂｒａｋｅｂｕｓｃｈら、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００３；２２：２３２４−３３参照）。加えて、アクチン細胞骨格、ならびに小さなＲａｓ関連ＧＴＰａｓｅ、例えば、Ｒａｃ、ＲｈｏおよびＣｄｃ４２の細胞形態および挙動の変化をもたらす異なる上流シグナリング経路の蛋白質が存在する。これらの小さなＧＴＰａｓｅに加えて、ホスホイノシタイドおよびカルシウムは、アクチンのダイナミックスおよび細胞移動を調節することが知られている。
【００４１】
現在、炎症性疾患、癌、神経変性病等に対する現存の療法についての補充としてそのような薬物に対して大きな潜在能力が存在するが、細胞運動性の特異的阻害剤は非常に少数しか入手できない。例えば、細胞の形状の変化および運動性は、癌の進行における２つの律速段階：炎症性疾患における血管エレメントからのリンパ球の血管外遊出における、および感染した宿主組織への多くの細胞寄生体の侵入的進行における、脈管形成（すなわち、血管動員）および転移（すなわち、体内の１つの位置から他の位置への腫瘍の拡大）に関連している。細胞成長阻害剤と組み合わせて、特異的細胞運動性阻害剤での処置は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療に対する多剤アプローチと同様な、炎症疾患、癌、感染等の細胞運動性および増殖の疾患のより効果的な治療を提供する能力を有する。
【００４２】
直接的にアクチンを標的とする多数の化合物が、細胞運動性を変調するにおいて効果的であることが知られている。最良な公知の化合物は、アクチンフィラメントの細胞浸透性脱安定化剤であるサイトカラシン、およびアクチンフィラメントの細胞不浸透性安定化剤であるファロイジンである（Ｊ．Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１０５（１９８７））。加えて、ラトルンクリンはアクチンフィラメントの細胞浸透性破壊剤である（Ｉ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，４９３（１９８３））。ジャスプラキノリドは、アクチンフィラメントの細胞浸透性安定化剤である（Ｍ．Ｒ．Ｂｕｂｂら、Ｃｈｅｍ．，２６９，１４８６９（１９９４））。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｍ．Ｕｅｈａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ，３８９，９９０（１９９７）、およびＭＬ−ｇ（Ｍ．Ｓａｉｔｏｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４０，２８０（１９８６））等のミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤のごとき、アクチン細胞骨格の上流の蛋白質を標的とする少数の化合物が知られている。最近、Ａｒｐ２／３複合体によるＣｄｃ４２媒介アクチン核形成に関与する蛋白質であるＮ−ＷＡＳＰの活性を阻害する環状ペプチドダイマーが発見された（Ｊ．Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１０６２４（２００１））。それにも拘らず、アクチンダイナミックスおよび細胞運動性に影響する利用可能な化合物の欠乏がある。
【００４３】
ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ
ヒトにおける染色体６の長腕の異常性は、結腸および直腸（Ｈｏｎｃｈｅｌ  Ｒ，ら、１９９６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１４５−９）、乳房（Ｄｅｖｉｌｅｅら、１９９１．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１７０５−１７１１；Ｔｈｅｉｌｅら、１９９６．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：６７７−６８５；Ｃｈａｐｐｅｌｌら、１９９７．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７５：１３２４−１３２９）、胃（Ｑｕｅｉｍａｄｏら、１９９５．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：２８−３４）、肝臓（ＤｅＳｏｕｚａら、１９９５．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０：１７２５−１７２９）、腎臓（Ｍｏｒｉｔａら、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５８１７−５８２０）、メラノーマ（Ｍｉｌｌｉｋｉｎら、１９９１．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５４４９−５４４３）、卵巣（Ｓａｉｔｏら、１９９２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：５８１５−５８１７；Ｆｏｕｌｋｅｓら、１９９３．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：５５１−５５９；Ｃｏｏｋｅら、１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２２３−２３３；Ｏｒｐｈａｎｏｓら、１９９５．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：２９０−２９３；Ｔｉｂｉｌｅｔｔｉら、１９９６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４４９３−４４９８）および子宮（Ｔｉｂｉｌｅｔｔｉら、１９９７．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７５：１８３１−１８３５）の癌腫を含めたいくつかの固形新生物に関連付けられている。染色体６ｑ２７はクローン化され、配列決定されている。植物からヒトに高度に保存された細胞質ＲＮａｓｅ遺伝子のファミリーに対して高い相同性を有するＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子は、この染色体に位置している。
【００４４】
ヒトにおける染色体６の領域の欠失（６ｑ２７）は、いくつかのヒト悪性疾患に関連付けられている（Ｃｏｏｋｅら、１９９６．Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２２３−２３３；Ｓａｉｔｏら、１９９２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：５８１５−５８１７）。この領域は、ＲＮａｓｅ  Ｔ２ファミリーに対する相同性を共有する推定腫瘍サプレッサーＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子を含有することが判明した（Ｔｒｕｂｉａら、１９９７．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：３４２−３４４；Ａｃｑｕａｔｉら、２００１，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６０：８７−１０１およびＯｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１；２２：９８０−８８）。ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子の配列は、ヒトゲノムプロジェクトで同定されている。しかしながら、ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ蛋白質は単離または精製されておらず、またヒトＴ２ＲＮａｓｅの抗腫瘍および抗転移活性は示されていない。
【００４５】
酵母からのＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）は、花粉管成長阻害について非常に重要なアクチン結合活性を保有することが示されている（Ｒｏｉｚ，Ｌ，ら、準備中）。他のＴ２  ＲＮａｓｅにおいて発見されていないものと同様な、アクチン結合、抗腫瘍および抗転移活性を有するヒトＴ２  ＲＮａｓｅ蛋白質は、外来性Ｔ２  ＲＮａｓｅ蛋白質よりも優れた治療的利点を供するであろうことは認識されるであろう。というのは、そのような天然蛋白質は、宿主によってより許容されると予測されるからである。
【００４６】
かくして、広く認識された要望があり、炎症性疾患、癌、神経変性病および感染症等の細胞運動性関連疾患の治療および予防において潜在的有用性を有する、アクチン結合活性を有するＴ２ファミリーの単離された組換えヒトリボヌクレアーゼを有するのはかなり有利であろう。
【発明の開示】
【００４７】
本発明の１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼ蛋白質が提供される。
【００４８】
本発明のもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であって、Ｔ２リボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および異種発現系において該ポリペプチドの発現を指令するための異種プロモーターを保有する第２のポリヌクレオチドを含む異種ポリヌクレオチドが提供される。
【００４９】
本発明のなおもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であって、Ｔ２リボヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド、および異種発現系において該ポリペプチドの発現を指令するための異種プロモーターを保有する第２のポリヌクレオチドを含む異種ポリヌクレオチドを含む遺伝的に修飾された細胞が提供される。
【００５０】
本発明のなおもう１つの態様によると、増殖、発生、分化、形質転換、腫瘍形成、腫瘍成長、コロニー化および脈管形成からなる群から選択される異常に増殖する細胞に関連するプロセスを、それを必要とする哺乳動物対象において予防し、阻害し、または逆行させる方法であって、治療上有効量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質（該リボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する）またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、イン・ビボでそれを発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与すること、それにより、異常に増殖する細胞に関連するプロセスを哺乳動物対象において逆行させることを含む方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらにもう１つの態様によると、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、かつアクチン結合活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーの単離されたリボヌクレアーゼが提供される。
【００５２】
本発明のさらにもう１つの態様によると、有効成分として、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と共に含む医薬組成物が提供される。
【００５３】
本発明のさらにもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせることを含み、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防し、阻害しおよび／または逆行させるのに有用な医薬を調製する方法が提供される。
【００５４】
本発明のなおもう１つの態様によると、（ｉ）対象において腫瘍を治療し；（ｉｉ）対象において腫瘍の発生を予防し、阻害しおよび／または逆行させ；（ｉｉｉ）対象において良性腫瘍から悪性腫瘍への形質転換を予防し、阻害し、および／または逆行させ；（ｉｖ）対象において腫瘍脈管形成を予防し、阻害しおよび／または逆行させ；（ｖ）対象において個々の腫瘍数を低下させ；（ｖｉ）対象において腫瘍サイズを低下させ；（ｖｉｉ）対象において悪性腫瘍の数を低下させ；そして（ｖｉｉｉ）対象において組織の腫瘍への形質転換を予防し、阻害しおよび／または逆行させる方法が提供され、該方法の各々は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現させることができるポリヌクレオチドの治療上有効量を対象に投与することによって行われる。
【００５５】
以下に記載する本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質はリボ核酸分解活性を実質的に欠く。本明細書中で用いる用語「リボ核酸分解活性を実質的に欠く」とは、（ｉ）同様な非不活化リボヌクレアーゼと比較して、０ないし１０％リボ核酸分解活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する不活化リボヌクレアーゼ（天然または組換えいずれかの）蛋白質；および／または（ｉｉ）同様な非突然変異体リボヌクレアーゼと比較して、０ないし１０％のリボ核酸分解活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する組換え突然変異体（天然またはヒト誘導）リボヌクレアーゼ蛋白質をいう。配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性の不活化は、煮沸、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択されるプロセスによって行うことができる。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によると、異常に増殖する細胞は癌性細胞である。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によると、治療上有効量のＴ２ファミリーのＲＮａｓｅを対象に投与する工程は、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入からなる群から選択される投与様式によって行われる。
【００５８】
本発明のなおさらなる態様によると、（ｉ）過剰の細胞運動性；または（ｉｉ）細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態を、それを必要とする対象において治療しまたは予防する方法が提供される。該方法の各々は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質の治療上有効量、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドの治療上有効量を対象に投与することによって行われる。
【００５９】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、過剰細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態は、炎症性疾患、神経変性病および癌からなる群から選択される。
【００６０】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、過剰の細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態は癌である。
【００６１】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する該リボヌクレアーゼ蛋白質の治療上有効量、またはイン・ビトロでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドの治療上有効量を対象に投与することは、経口投与、静脈内投与、皮下投与、全身投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入からなる群から選択される投与様式によって行われる。
【００６２】
本発明のさらにもう１つの態様によると、（ｉ）細胞の運動性を阻害し；（ｉｉ）細胞においてアクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリーを阻害し；ならびに（ｉｉｉ）細胞のアポトーシスを増強する方法が提供される。該方法の各々は、有効な濃度の、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質、あるいは治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを細胞に供することによって行われる。
【００６３】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質はＴ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である。
【００６４】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質は配列番号４に記載される。
【００６５】
記載された好ましい実施形態におけるさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系で発現された組換え蛋白質である。該異種系は細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系であり得る。
【００６６】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である。
【００６７】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質は、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。
【００６８】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質はアクチン結合活性によって特徴付けられる。
【００６９】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質のリボヌクレアーゼ活性は熱安定性である。
【００７０】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、リボヌクレアーゼ蛋白質のアクチン結合活性は熱安定性である。
【００７１】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、細胞の、または対象の細胞のゲノム安定に組み込むことができる発現可能なポリヌクレオチドが選択される。
【００７２】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該細胞は癌細胞である。
【００７３】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該提供はイン・ビトロまたはイン・ビボで行われる。
【００７４】
本発明のさらにもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する熱安定性リボヌクレアーゼ蛋白質、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。該方法は：配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを発現する細胞を含む試料を熱変性して、熱変性した試料を得、該熱変性した試料の上清を単離し；配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する熱安定性リボヌクレアーゼ蛋白質、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを有する上清の画分を同定し；配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する熱安定性リボヌクレアーゼ蛋白質、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを有する画分を該上清から実質的に純粋となるまで精製する工程を含む。
【００７５】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、熱変性は少なくとも９０℃の温度によって少なくとも１０分間行われる。
【００７６】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、画分の同定は、リボ核酸分解活性のモニタリングおよび／またはゲル電気泳動によって行われる。
【００７７】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、該画分の精製は、カラムクロマトグラフィーによって行われる。
【００７８】
本発明のなおもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドのアクチン結合活性を依然として維持しつつ、リボヌクレアーゼ活性を不活化する方法が提供され、該方法は、該アクチン結合活性を依然として維持しつつ、該リボヌクレアーゼ活性を実質的に不活化するのに十分な変性条件に該リボヌクレアーゼを付すことによって行われる。
【００７９】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、該リボヌクレアーゼの不活化は、オートクレーブ処理および／または化学的変性によって行われる。
【００８０】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該リボヌクレアーゼは組換えリボヌクレアーゼである。
【００８１】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該リボヌクレアーゼはリボヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、アクチン結合活性を有する。
【００８２】
本発明のさらなる態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチド、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせることを含み、過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態を治療および／または予防するのに有用な医薬を調製する方法が提供される。
【００８３】
本発明のなおもう１つの態様によると、細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態を治療または予防するのに有用な医薬の調製方法が提供され、該方法は配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ、または治療上有効量の、イン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチド、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせる医薬の調製方法が提供される。
【００８４】
記載された好ましい実施形態のさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質は、異種発現系で発現される組換え蛋白質である。該異種発現系は細菌発現系、酵母発現系および高等細胞発現系であり得る。
【００８５】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質は実質的にリボヌクレアーゼ蛋白質を欠く。
【００８６】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該細胞増殖性障害または疾患はパピローマ、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、メラノーマ、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、神経膠星状細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、肺癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、ステント再狭窄、および血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜症、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬からなる群から選択される。
【００８７】
記載された好ましい実施形態のなおさらなる特徴によると、該治療上有効量の該Ｔ２リボヌクレアーゼまたは該ポリヌクレオチドの対象への投与は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、全身投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入からなる群から選択される投与様式によって行われる。
【００８８】
本発明のさらにもう１つの態様によると、癌の治療を増強する方法が提供され、該増強は、癌の該治療と組み合わせて、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するリボヌクレアーゼ蛋白質、またはイン・ビボでそれをコードし、それを発現することができるポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む。該治療は化学療法、放射線療法、光療法および光力学療法、外科的処置、栄養療法、切除療法、放射線療法および化学療法の組み合わせ、近接照射療法、プロトンビーム療法、免疫療法、細胞療法およびフォトンビーム放射線外科療法であり得る。
【００８９】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１は、Ｒｏｉｚ，Ｌ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５６：３７−４１の教示に従って単離されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の吸光度およびＲＮａｓｅ活性のグラフ表示である。グラフＡは、粗製濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムクロマトグラフィーを介して得られた画分を表し、他方、グラフＢは、粗製濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥクロマトグラフィーから得られた活性画分のＭＯＮＯ−Ｑカラムクロマトグラフィーから得られた画分を表す。実線は２８０ｎｍにおける吸光度を表し、点線はＲＮａｓｅ活性を表す。
図２は、使用した精製工程を通じてのＲＮａｓｅ  Ｂ１蛋白質濃度の増加を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラムである。レーン１は粗製濾液を表し；レーン２はＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムからの溶出物を表し；レーン３はＭＯＮＯ−Ｑカラムからの溶出物を表し；レーン４は、ＲＮａｓｅ活性についてイン・サイチュウでアッセイし、トルイジンブルーで染色したレーン３の溶出物を表し；レーン５は、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化に続いて精製されたＲＮａｓｅを表す。レーン１ないし３および５はクーマシーブルーで染色させる。
図３は、桃花粉発芽（塗りつぶした四角と実線）および花粉管長さ（ボックスと点線）に対する異なる濃度のＢ１  ＲＮａｓｅのイン・ビトロ効果を示すグラフである。
図４ａおよび４ｂは、柱頭および花柱の上部分における桃花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。図４ａは対照花を表し、他方、図４ｂは受粉前にＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理された花である。バー＝０．２ｍｍ
図５ａおよび５ｂは、タンジェリン花の柱頭における花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。図５ａは、放任受粉に４８時間暴露された対照花を表す。図５ｂは、受粉に先立ってＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理された花を表す。バー＝０．１ｍｍ
図６ａおよび６ｂは、ネクタリン種子で行った生存性テストを示す。図６ａは未処理花によって生産された対照種子を表し、他方、図６ｂはＲＮａｓｅ  Ｂ１処理花によって生産された種子を表す。バー＝０．３ｍｍ
図７は、ユリ  ｃｖ．Ｏｓｎａｔ花粉管長さに対する、未処理、煮沸またはオートクレーブ処理されたＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
図８ａおよび８ｂは、イン・ビトロで成長し、ＩＫＩで染色されたユリ花粉管に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
図９ａおよび９ｂは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１未処理（図９ａ）および処理（図９ｂ）花粉管におけるオルガネラ移動および局所化を示す統合ビデオイメージから捕獲されたスチルショットを示す。
図１０ａおよび１０ｂは、成長するユリ花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。図１０ａは対照花粉管を表し、他方、図１０ｂはＲＮａｓｅ  Ｂ１処理花粉管を表す。双方の花粉管を切り出し、実験後の可視化のためにＴＲＩＴＣファロイジンで染色した。
図１１は、アクチンへのＲＮａｓｅ  Ｂ１結合を表すＳｃａｔｃｈａｒｄプロットである。Ａ−アクチン濃度（μＭ）、ＲｆフリーＲＮａｓｅ  Ｂ１濃度（μＭ）、Ｒｂ結合ＲＮａｓｅ  Ｂ１濃度（μＭ）。
図１２ａないしｃは１時間成長させたイムノゴールド銀染色ユリ花粉管を示す。図１２ａは対照を表し、他方、図１２ｂおよび１２ｃは共にＲＮａｓｅ  Ｂ１処理花粉管である。図１２ｂの花粉管をウサギプレ免疫血清ともにインキュベートし、他方、図１２ｃの花粉管は抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１ウサギポリクローナル抗体と共にインキュベートした。
図１３ａおよび１３ｂは、ＨＴ２９結腸癌細胞の生存性に対する異なる濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。細胞の複連試料を３７℃にて４８時間または７２時間成長させ、トリパンブルー差別化染色を用いて可視化し、カウントした。図１３ａは細胞の合計数を表し、他方、図１３ｂは死細胞のパーセントを表す。
図１４は、ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。細胞の複連試料を、１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で４８時間成長培地と共にプレインキュベートし、トリプシン処理し、洗浄し、系列希釈にてＲＮａｓｅ  Ｂ１フリー成長培地中に再度懸濁させ、９６ウェルマイクロタイタープレートに平板培養して、１４日間コロニー化させた。固定化およびメチレンブルーでの染色に続いてコロニーをカウントした。
図１５は、ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１への暴露時間の効果を示す。細胞の複連試料を、１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地と共に４８時間プレインキュベートし、次いで、同一濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地中で、またはＲＮａｓｅ  Ｂ１フリー培地中でコロニー化させた。コロニー化は、９６ウェルマイクロタイタープレートにて７日間行った。各処理は、ウェル当たり異なる初期数の細胞を含有した。固定化、およびメチレンブルーでの可視化の後にコロニーをカウントした。ＲＮａｓｅ  Ｂ１フリー成長培地中でプレインキュベートし、コロニー化させた細胞を対照として供した。
図１６ａないしｃは、ＨＴ２９細胞のコロニー化能力に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。対照細胞（図１６ａ）を、ＲＮａｓｅ  Ｂ１フリー成長培地中で４８時間プレインキュベートし、次いで、トリプシン処理し、コロニー化のために９６マイクロタイタプレート中で同一成長培地と共にインキュベートした。図１６ｂは、１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地中で４８時間プレインキュベートし、次いで、ＲＮａｓｅ  Ｂ１フリー成長培地中でコロニー化させた細胞を表す。図１６ｃは、プレインキュベートし、次いで、１０−６Ｍ  Ｒｎａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地中でコロニー化させた細胞を表す。細胞コロニーは、メチレンブルー染色を用いて可視化した。
図１７は、６匹のラットの各群についての処理を記載する、ラットで行ったイン・ビボ実験の模式図である。
図１８は、ＣＡＰマイクロカプセルからのＲＮａｓｅ  Ｂ１放出の速度に対する２つの異なるｐＨの効果を示す。１０ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有するマイクロカプセルを、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ１）または０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に懸濁させ、攪拌しつつ３７℃でインキュベートした。上方の溶液の試料を、ＲＮａｓｅ活性テストのために３０分毎に採取した。
図１９ａないしｄは、各実験の最後の体重によって示されるように、ラット成長速度に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１および／またはＤＭＨの効果を示す。最初のラットの体重は約２００グラムであった。ｎ＝６。１９ａ−ＰＢＳ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１は最初のＤＭＨ注射から１ないし９週間後に浸透圧ポンプを介して与えた（予防的処置）。対照として、ＤＭＨの非存在下であることを除いて前記したように処理したラットを用いた。１９ｂ−ＰＢＳ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、最初のＤＭＨ注射から１２ないし１７週間後に浸透圧ポンプを介して与えた（治療的処置）。１９ｃ−ラットには、予防的処置として、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えた。対照として、ＤＭＨの非存在下でＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したラットを用いた。１９ｄ−ラットには、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えた。
図２０ａないしｃは、予防的処置として、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（２０ａ）、Ｉ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１（２０ｂ）またはＰＢＳ（２０ｃ）を含有する浸透圧ポンプを移植したラットの糞におけるＲＮａｓｅ活性を示す。対照として、ラットを、ＤＭＨの非存在下でＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＰＢＳで処理した。ＲＮａｓｅ活性は、後の実施例セクションに記載したように測定した。
図２１は、予防的処置として、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えたラットの糞におけるＲＮａｓｅ活性を示す。対照として、ラットに、ＤＭＨの非存在下でＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを与えた。ＲＮａｓｅ活性は、実施例セクションに記載したように測定した。
図２２は、予防的処置として、浸透圧ポンプで移植したラットの末端側結腸（５ｃｍ）における異常な陰窩病巣（ＡＣＦ）の数を示す（ｎ＝６）。
図２３ａないしｃは、予防的処置として、マイクロカプセル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを与えたラットの末端側（５ｃｍ）結腸で調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す（ｎ＝６）。２３ａ−結腸当たりの腫瘍の数；２３ｂ−腫瘍のサイズ；２３ｃ−結腸当たりのＡＣＦ。
図２４ａないしｄは、切除から１時間後の内側粘膜表面において写真を撮った際の、異なるタイプの腫瘍を示す。２４ａ−赤色腫瘍；２４ｂ−白色腫瘍。２４ｃ−ピンク色腫瘍および赤色腫瘍：２４ｄ−予防的処置としての、グルコースまたはＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有するマイクロカプセルを与えたラットにおける３つのタイプの腫瘍の分布。
図２５ａないしｄは、メイヤーのヘマトキシリンおよびマルチウスイエローで染色された腫瘍の組織病理学的調査を示す。２５ａ−アデノーマまたはアデノパピローマ−良性腫瘍；２５ｂ−粘膜細胞が粘膜下組織直下に貫通する腺癌；２５ｃ−組織配置が全く中断されたよく発達した腺癌；２５ｄ−予防的処置として、カプセル化グルコースまたはＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したラットの結腸における腫瘍のアデノーマおよび腺癌タイプの分布パターン。
図２６ａないしｃは、治療的処置としての、ＰＢＳ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する浸透圧ポンプで処理したラットの末端側（５ｃｍ）結腸において調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。２６ａ−結腸当たりの腫瘍の数；２６ｂ−サイズによる腫瘍の分布；２６ｃ−脈管形成を示す、色による腫瘍の分布。
図２７ａないしｃは、治療的処置としての、マイクロカプセル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを与えたラットの末端側（５ｃｍ）結腸において調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。２７ａ―結腸当たりの腫瘍の数；２７ｂ−サイズによる腫瘍の分布；２７ｃ−脈管形成を示す、色による腫瘍の分布。
図２８ａないしｂは、アクチンについてＴＲＩＲＣで染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。２８ａ−対照細胞；２８ｂ−１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で成長させた細胞。
図２９ａないしｂは、膜アクチンについて免疫染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。２９ａ−対照細胞；２９ｂ−１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で成長させた細胞。
図３０ａないしｃは、ＦＩＴＣ免疫染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１を一次抗体として用いた。３０ａ―対照細胞；３０ｂ−細胞表面に結合したＲＮａｓｅ  Ｂ１を示す、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で成長させた細胞；３０ｃ−プレ免疫化血清（ＰＩＳ）を一次抗体として用いた。
図３１は、ユリ花粉管の長さに対する異なる蛋白質処理の効果を示す。花粉管は、実施例セクションに記載したように、２５℃で１時間イン・ビトロ成長させた。
図３２ａないしｈは、１μｇ―ｍｌアンジオゲニンの存在下または非存在下における、およびＲＮａｓｅ（各々２μＭ）の存在下または非存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌ上のＨＵＶＥＣ管形成を示す顕微鏡写真である。図３２ａ−アンジオゲニンおよびＲＮａｓｅの非存在（対照）；図３２ｂ−アンジオゲニン（陽性対照）；図３２ｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１（陰性対照）；図３２ｄ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１＋アンジオゲニン；図３２ｅ―ＲＮａｓｅ  Ｔ２（陰性対照）；図３２ｆ−ＲＮａｓｅ  Ｔ２＋アンジオゲニン：図３２ｇ−ＲＮａｓｅ  Ｉ（陰性対照）；図３２ｈ−ＲＮａｓｅ  Ｉ＋アンジオゲニン。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（図３２ｆ）と比較した、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１（図３２ｄ）による内皮細胞管形成の優れた阻害に注意されたし。
図３３ａないしｄは、ＢＤＦ１（黒色）およびＢａｌｂ／ｃ（白色）マウスでのｉｐ／ｉｐ実験におけるＢ１６Ｆ１メラノーマに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す写真である。２×１０６Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、２４時間および５日後に、マウスにさらにＲＮａｓｅ  Ｂ１（１００μｌ  ＰＢＳ中５ｍｇ／マウス）またはＰＢＳいずれかをｉ．ｐ．注射した。腫瘍の存在は、メラノーマ細胞注射から１４日後に評価した。図３３ａ―メラノーマ細胞のみを注射したＢａｌｂ／ｃ；図３３ｂ−メラノーマ細胞およびＲＮａｓｅ  Ｂ１を注射したＢａｌｂ／ｃ；図３３ｃ−メラノーマ細胞のみを注射したＢＤＦ１；図３３ｄ−メラノーマ細胞およびＲＮａｓｅ  Ｂ１を注射したＢＤＦ１。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおけるかなり小さな腫瘍（図３３ｂおよびｄ、矢印）と比較した、メラノーママウスモデルにおけるかなり発達した典型的な黒色腫瘍（図３３ａおよびｃ、矢印）に注意されたし。
図３４ａないしｅは、５×１０５（図３４ａないしｃ）または５×１０６（図３４ｄないしｅ）細胞／マウスを移植した、ｂａｌｂ／ｃマウスの肺で形成されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ病巣の発達の低下におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。図３４ａないしｂは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（１０ｍｇ／マウス、３回、４日毎、細胞注射から２４時間後に開始）またはＰＢＳ処理後の、Ｂ１６Ｆ１０移植マウスの肺の写真である。図３４ａ―ＰＢＳ；図３４ｂ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１。ＰＢＳ注射（図３４ａ、矢印）と比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理（図３４Ｂ、矢印）後のメラノーマ病巣および転移の顕著な減少に注意されたし。図３４ｃないしｅは、肺当たりの転移の数（図３４ｃ）、肺の重量（図３４ｄ）および平均転移直径（図３４ｅ）の定量的測定を示すグラフである。ＰＢＳを注射したマウスと比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおける、転移の数／肺（７６％、Ｐ＜０．００１、図３４ｃ）、平均肺重量（２５％、Ｐ＜０．０１、図３４ｄ）、および平均転移直径（２５％、Ｐ＜０．００１、図３４ｅ）の有意な減少に注意されたし。
図３５は、ヌードマウスにおけるヒトメラノーマ細胞の腫瘍成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。Ａ３７５ＳＭメラノーマ細胞（５×１０５）をヌードマウス（ｎ＝５）に皮下注射し、３日後に腫瘍細胞を注射した動物に１ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１／マウスまたはＰＢＳ（対照）いずれかを引き続いて腹腔内注射した。動物は３０日間（隔日毎、一週間に３日）注射し、腫瘍の寸法を示した時点で記録した。腫瘍の容量は（長さ×幅２）／２の方程式から計算してｍｍ３で表す。ＰＢＳを注射したマウスにおいては、腫瘍の容量は劇的に増加し、３０日以内に８００ｍｍ３のサイズに到達し、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいては、腫瘍の容量は比較的低いままであって、メラノーマ細胞注射から３０日後において１８０ｍｍ３を超えなかったことに注意されたし。
図３６ａないしｂは、ｓ．ｃ．／ｉ．ｖ．実験における、ＨＴ−２９由来ヌードマウス異種移植片における腫瘍サイズに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。ＨＴ−２９細胞（マウス当たり３×１０６）を用いて腫瘍をマウスで誘導し、マウスを、さらに、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（各々１００μｌのＰＢＳ中５ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する２回の注射）またはＰＢＳ（対照）注射に付した。図３６ａ―ＰＢＳ（対照、黄色矢印）またはＲＮａｓｅ  Ｂ１（青色矢印）処理における腫瘍の全体図。ＰＢＳ注射マウス（黄色矢印）と比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウス（青色矢印）における腫瘍のサイズの大幅な減少に注意されたし；図３６ｂは、ＰＢＳまたはＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウス（ｎ＝５）における腫瘍のサイズを示す棒グラフである。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理後の腫瘍サイズの平均６０％減少に注意されたし。
図３７は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１による脈管形成のイン・ビボ阻害を示す写真である。１００ｎｇ／スポンジのアンジオゲニンを含浸したゲルフォームを、ヌードマウスの両側に皮下移植し、４８時間後に、マウスの腹膜の両側に腹腔内注射し（７回、２日毎）、各々は異なる処理とし；一方側はＲＮａｓｅ  Ｂ１（１００μｌ中の２５０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１）で処理し、他方側はＰＢＳで処理した。血管のアンジオゲニン誘導発生のＲＮａｓｅ  Ｂ１媒介阻害を示す、ＲＮａｓｅ  Ｂ１注射の側における無視できる脈管形成（矢印を付した丸い領域、アンジオゲニンおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１）と比較した、ＰＢＳ注射の側における大幅な脈管形成（矢印を付した丸い領域、アンジオゲニン）に注意されたし。
図３８は、Ａ３７５ＳＭ細胞侵入の阻害におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す棒グラフである。Ａ３７５ＳＭ細胞をＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で処理し、２２時間後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに侵入した細胞の数をカウントした。Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターへのＡ３７５ＳＭ侵入の阻害におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の用量依存性効果に注意されたし。未処理Ａ３７５ＳＭ細胞（対照）においては、１２１６±６８細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに貫入し、１または１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理した７２５±５９または２１１±１４  Ａ３７５ＳＭ細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに貫入した。＊＝Ｐ＜０．０１；＊＊＝Ｐ＜０．００１。
図３９ａないしｂは、ｓｃ／ｉｐモデルにおけるＨＴ−２９由来ヌードマウス異種移植片を示す棒グラフである。細胞移植（１０６細胞／マウス）後２４時間に開始し、１日おきに、ＲＮａｓｅ  Ｂ１を示した濃度で注射した。腫瘍のサイズは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の開始から３０日後に測定した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の予防的（図３９ａ）および治療的（図３９ｂ）効果を示す、２つの引き続いての実験（各場合Ｎ＝６）における広い範囲の用量、０．００１ないし１ｍｇ／注射（図３９ａ）および１ないし５ｍｇ／注射（図３９ｂ）でのＲＮａｓｅ  Ｂ１処理後の腫瘍サイズの有意な低下（最大で６０％）に注意されたし。Ｃｏｎｔ．＝ＰＢＳを注射したＨＴ−２９−移植マウス。
図４０ａないしｃは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下における、ｓ．ｃ．／ｉ．ｐ．モデルでのＨＴ−２９移植ヌードマウスからの腹膜断面の顕微鏡写真である。図４０ａ−ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。筋肉に重なる薄い腹膜（矢印）に注意されたし；図４０ｂないしｃ−ウサギ抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギを用いて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウス（図４０ｂ）またはＰＢＳ処理マウス（図４０ｃ）から採取した腹膜の免疫染色。ＰＢＳ処理マウスではなく、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスの腹膜上へのＲＮａｓｅ  Ｂ１の蓄積を示す緑色蛍光に注意されたし。
図４１ａないしｃは、該ｓ．ｃ．／ｉ．ｐヌードマウスモデルのＨＴ−２９由来腫瘍からの断面の顕微鏡写真である。図４１ａ−Ｈ＆Ｅ染色；図４１ｂないしｃ−ウサギ抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギを用いる、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理（図４１ｂ）またはＰＢＳ処理（図４１ｃ）マウスに由来する腫瘍の血管の免疫染色。矢印は血管を示す。基底膜上へのＲＮａｓｅ  Ｂ１の蓄積に注意されたし。
図４２ａないしｂは、ＤＭＨ誘導結腸腫瘍でのＣＤ３１発現に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す結腸癌組織の代表的な組織病理学的切片である。ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）処理ラット（図４２ａ）からの、またはＤＭＨおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラット（図４２ｂ）からの腫瘍切片を、抗ＣＤ３１抗体（ｓｃ−８３０６抗体Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で染色した。ＤＭＨ処理ラットの腫瘍における多数の大きな血管の存在（図４２ａ）、およびＤＭＨ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットにおける血管の大幅に小さなサイズおよび数（図４２ｂ）に注意されたし。倍率×２００。サイズバー＝１００μｍ。
図４３ａないしｂは、マウスメラノーマ細胞における腫瘍のサイズおよびアポトーシスに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１のプロアポトーシス効果を示す、ヌードマウスにおける腫瘍の代表的な組織病理学的切片の顕微鏡写真である。マウスＢ１６Ｆ１由来メラノーマ細胞（２×１０６細胞／マウス）を、ＢＤＦ１およびＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔で成長させた。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスは、メラノーマ細胞での注射から２４時間および５日後に、１００μｌのＰＢＳ中の５ｍｇ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の２回の腹腔内注射を受けた。未処理対照マウスはＰＢＳ注射を受けた。１４日後に、マウスを屠殺し、分析のために試料を調製した。Ｋｌｅｎｏｗ−ＦｒａｇＥ１キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて、パラフィン断面をアポトーシスのために染色した。未処理対照（図４３ａ）における活発に分裂する核（緑色染色）と比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウス（図４３ｂ）からの腫瘍におけるアポトーシス細胞核（褐色染色）の優勢性に注意されたし。
図４４ａないしｂは、ＤＭＨ誘導結腸腫瘍におけるアポトーシス速度に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す、代表的な結腸腫瘍切片の顕微鏡写真である。ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）処理ラットからの結腸腫瘍の切片を固定し、パラフィンに包埋し、Ｋｌｅｎｏｗ−ＦｒａｇＥ１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｇｄｅ，ＭＡ）を用い、デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ−ニック末端−標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによってアポトーシスについて検定した。アポトーシス細胞を染色し、ペドオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体で可視化した（褐色染色）。図４４ａ―ＤＭＨ処理ラット；図４４ｂ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１−ＤＭＨ処理ラット。ＤＭＨ処理ラット（図４４ａ）の腫瘍切片においてはＴＵＮＥＬ陽性細胞は観察されなかったが、ＲＮａｓｅ  Ｂ１−ＤＭＨ処理ラット（図４４ｂ）の腫瘍切片においては非常に多数のＴＵＮＥＬ陽性（すなわち、アポトーシス）細胞が観察される。サイズバー＝１００μｍ。
図４５ａないしｄは、ヒト結腸癌異種移植片における腫瘍サイズおよびアポトーシスに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１のプロアポトーシス効果を示すヌードマウスでの腫瘍の代表的な組織病理学切片である。ＨＴ２９癌細胞（２．５×１０６細胞／マウス）をヌードマウスの左側臀部に注射した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウス（ｎ＝５）は、癌細胞注射から２４時間後に開始し、５日毎に、５ｍｇ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の３回の静脈内注射を受けた（図４５ｂおよびｄ）。対照マウス（ｎ＝５）は未処理のまま放置した（図４５ａおよびｃ）。腫瘍のパラフィン切片は組織学評価のためにヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって（図４５ａないしｂ）、およびアポトーシスのためにＫｌｅｎｏｗ−ＦｒａｇＥ１キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，図４５ｃないしｄ）で染色した。生きた活発に分裂する核は明るい緑色に染色され、他方、アポトーシス核は褐色に染色される。未処理対照からの腫瘍における正常な生きた外観（図４５ａ）、有糸分裂活性（図４５ｃ）と比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスからの腫瘍における、凝縮した細胞質および核（図４５ｂ）およびアポトーシス細胞の高い割合（図４５ｄ）に注意されたし。
図４６は、ＬＳ１７４Ｔ誘導腫瘍の相対的容量に対するタキソールおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示すグラフである。Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｌｇｔｏｎ，ＭＡ）ヌードマウスにＬＳ１７４Ｔ癌細胞を皮下注射し、細胞注射から１０ないし１３日後に（腫瘍が触知できる場合）、マウスを、３週間にわたって７日のうち５連続日の間、示した処理の腹腔内注射で処理した。対照：ＰＢＳまたはプロピレングリコール＋エタノール；ＲＮａｓｅ  Ｂ１：５０ｍｇ／ｋｇ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１（１０００μｇ／注射）；ＲＮａｓｅ  Ｂ１＋タキソール：５０ｍｇ／ｋｇ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１および５ｍｇ／ｋｇタキソール；タキソール：５ｍｇ／ｋｇタキソール（１００μｇ／注射）。タキソール処理マウスと比較した、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおける相対的腫瘍容量（ＲＴＶ）に対する顕著な効果、ならびにＲＮａｓｅ  Ｂ１およびタキソールの組合せ処置で処理したマウスにおける腫瘍成長の予測されない顕著な阻害に注意されたし。
図４７ａないしｂは、イン・ビトロでアクチンに結合するＲＮａｓｅ  Ｂ１の能力を示す、アクチンおよびアクチン結合蛋白質のウエスタンブロット（図４７ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白質染色（図４７ｂ）である。アクチンおよびアクチン結合蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ニトロセルロース膜に移した。該膜をアクチンと共にインキュベートし、次いで、抗アクチン、引き続いて、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ［Ａｃｔｉｎ（Ａｂ−１）Ｋｉｔ，ＣＡＴ＃ＣＰ０１−１ＥＡ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）］と共にインキュベートした。ＥＣＬ検出システム（Ｐｉｅｉｒｃ  ＣＡＴ  Ｎｏ＃２４０８０）を用いてシグナルを検出した。レーン１−ＲＮａｓｅ  Ｂ１、レーン２−アンジオゲニン、レーン３−Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｉ、レーン４−アクチン。アクチンに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の強い会合を示す、レーン１および４における強いバンド強度に注意されたし。
図４８は、Ａ３７５ＳＭメラノーマ癌細胞による全ＭＭＰ−２放出の阻害におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の用量依存性効果を示す棒グラフである。Ａ３７５ＳＭ細胞を、１または１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で、完全イーグル最小必須培地（ＣＭＥＭ）中で成長させ、培地中のＭＭＰ−２のレベルを、ＥＬＩＳＡ［Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＭＭＰ−２イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）］を用いて測定し、ｍｇ  ＭＭＰ−２／１０６細胞として表す。１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で得られた最大阻害効果に注意されたし。
図４９ａないしｂは、Ａ３７５ＳＭ（図４９ａ）またはＨＵＶＥＣ（図４９ｂ）細胞におけるＭＭＰ−２放出に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の効果を示すＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性のザイモグラムである。種々の濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で処理した細胞の上清を、ゼラチン含有ＳＤＳゲルに負荷し、電気泳動に続いて、ゲルをトリトン処理し、クーマシーブルーで染色した。ＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性の存在は、７２ｋＤａ  ＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性によるゼラチン分解を反映する青色ゲル上で白色バンドとして見られる。１μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の非存在（図４９ａ、対照）または存在下におけるＡ３７５ＳＭ細胞での強いバンド、ならびに５および１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１（図４９ａ）でのＡ３７５ＳＭ細胞の処理後のバンド強度の大幅な減少に注意されたし。また、ＨＵＶＥＣ細胞における１および１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下での７２ｋＤａ  ＭＭＰ−２のバンド強度における用量依存性減少（図４９ｂ）、ならびにＭＭＰ−９のバンド強度の減少（図４９ｂ、矢印）にも注意されたし；血清含有ＣＭＥＭ（完全イーグル最小必須培地）培地＝陽性対照。
図５０ａないしｔは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ＨＵＶＥＣ細胞におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化を示す共焦点顕微鏡写真である。ＨＵＶＥＣ細胞を０．４ｍｇ／ｍｌ（すなわち、１０μＭ）ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理し、４８時間後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＣＤ３１抗体を用い、細胞を免疫染色に付した。共焦点顕微鏡によってなされた一連のデジタル焦点の結果を示す。全てのスライスは同一の時点で行い、処理された細胞における異なる領域を示す。ＣＤ３１＝赤色、ＲＮａｓｅ  Ｂ１＝緑色。ＲＮａｓｅ  Ｂ１は（ＨＵＶＥＣ細胞の膜中でのみ発現されるＣＤ３１の赤色標識によって検出されるように）細胞膜に徐々に貫入し、細胞に進入することに注意されたし。
図５１ａないしｃは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理Ａ３７５ＳＭ細胞におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化を示す共焦点顕微鏡写真である。Ａ３７５ＳＭ細胞を０．４ｍｇ／ｍｌ（すなわち、１０μＭ）ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理し、ＲＮａｓｅ  Ｂ１免疫染色および共焦点顕微鏡を用い、２時間（図５１ａ）、４時間（図５１ｂ）または８時間（図５１ｃ）後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化を検出した。細胞膜（図５１ａ、２時間）、細胞の細胞質（図５１ｂ、４時間）および細胞核（図５１ｃ、８時間）へＲＮａｓｅ  Ｂ１が徐々に貫入することに注意されたし。また、４時間後に細胞がＲＮａｓｅ  Ｂ１に誘導されて丸くなること（図５１ｂ）、および８時間後のＡ３７５ＳＭメラノーマ細胞のアポトーシス特徴（図５１ｃ）にも注意されたし。
図５２は、Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡからのＴ２  ＲＮａｓｅの増幅を示すアガロースゲルイメージである。Ａ．ｎｉｇｅｒから調製したゲノムＤＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＡ．ｓａｉｔｏｉ  ＲＮａｓｅ  Ｍ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１９７９１、配列番号３）において同一であることが判明したアミノ酸Ｆ１０７ないしＮ１１２、およびＹ２００ないしＫ２０６に従って設計された順方向（アミノ酸Ｆ１０７ないしＮ１１２については、５’−ＴＴＹＴＧＧＧＡＲＣＡＹＧＡＲＴＧＧＡＡＹ−３’、配列番号１）および逆方向（アミノ酸Ｙ２００ないしＫ２０６について、５’−ＣＣＹＴＴＩＡＣＲＴＴＲＡＡＲＴＡＲＴＡＲＴＡ−３’、配列番号２）縮重ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付した。Ａ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅコード配列を反映する４００ｂｐ  ＰＣＲ産物の存在に注意されたし。
図５３は、（図５２ｂにあるように）Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡから調製された３００ｂｐ  ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。ＲＮａｓｅ  Ｂ１において、Ｅ１２３（ボックス化）がＡ．ｓａｉｔｏｉ  ＲＮａｓｅ  ＭのＤ１２３を置き換える以外は、ＲＮａｓｅ  ＭのＦ１０７−Ｋ２０６と同一であるアミノ酸配列のオープンリーディングフレームに注意されたし。
図５４は、染色体６ｑ２７に位置するヒト細胞外ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）のゲノム構造の模式的説明である。ゲノム配列上のエクソンの位置（黒色番号）およびエクソンの長さ（赤色番号）により９つのエクソン（黒色四角）のエクソン−イントロン境界が示される。全長遺伝子の２８５７１ｂｐのうち、（９つのエクソンに配置される）７１９ｂｐのみがオープンリーディングフレームを形成することに注意されたし。
図５５ａないしｂは、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ  ｃＤＮＡ（図５５ａ）および蛋白質（図５５ｂ）のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける存在を示す。ＲＮａｓｅ６ＰＬのコード配列を、酵母細胞を形質転換するのに用いたｐＰＩＣ９Ｋベクターにクローン化した。図５５ａ−クローン化されたインサートｃＤＮＡのＰＣＲ分析。ＲＮａｓｅ６ＰＬ  ｃＤＮＡの存在を示す７５０ｂｐ断片の存在に注意されたし。図５５ｂ−組換え酵母蛋白質の銀染色分析。酵母コロニーの１つにおける２７ｋＤａ蛋白質バンドの存在（レーン１）および組換え蛋白質を発現しない他の酵母コロニーにおけるそのような蛋白質の非存在（レーン２ないし６）に注意されたし。レーン７は、陰性対照（ＲＮａｓｅ６ＰＬインサートを含まないベクターでトランスフェクトされたコロニー）であった。
図５６は、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬの銀染色分析である。陽性酵母コロニーの組換え蛋白質は、高速ＦＰＬＣにおけるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通し、溶出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。得られた２７ｋＤａ精製蛋白質（レーン１）に注意されたし。レーン２：蛋白質分子マーカー。
図５７ａないしｂは、組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＴ２−ＲＮａｓｅ）蛋白質の熱安定性（図５７ａ）および活性（図５７ｂ）を示す。図５７ａは蛋白質ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。５５ないし１００℃に変化させた温度における２７ｋＤａ蛋白質バンド（矢印）の存在に注意されたし。図５７ｂは、上昇させる温度でインキュベートした組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅのＲＮａｓｅ活性のアガロースアッセイの写真である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養基からのヒト組換えＴ２  ＲＮａｓｅの試料アリコット（５μｌ）を、２０ｍＭ酢酸緩衝液中に０．１％ＲＮＡおよび０．８％アガロースを含有するプレートにスポットし、３７℃にて３０分間インキュベートした。水中の０．０２％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーで染色することによって、ＲＮａｓｅ活性を可視化した。５５ないし１００℃の温度の全範囲を通じての、熱−安定性ＲＮａｓｅ活性の持続に注意されたし。Ａ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）は、ＲＮａｓｅ活性の陽性対照として機能した（Ｃ）。
図５８は、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅのユリ花粉管阻害活性を示すヒストグラムである。列開されたユリ（Ｌ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ）葯からの花粉培養を、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）、Ａ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）、酵素的に加熱−不活化された組換えヒトＴ２  ＲＮＡｓｅ（ＥＩ−ＲＮａｓｅ６ＰＬ）、酵素的に加熱−不活化されたＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＥＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１）、精製された形質転換（ｐＰＩＣ９Ｋプラスミド単独）酵母培養基蛋白質（酵母蛋白質）、および緩衝液単独（対照）を補った（最終蛋白質濃度＝１μＭ）。暗所におけるインキュベーション（２時間２５℃）の後に、顕微鏡接眼レンズを用いて花粉管の長さを微視的に測定した（ｍｍ）。ＲＮａｓｅ酵素活性の加熱−不活化後においてさえ強く活性が残存する（酵母蛋白質活性の４２％、ＲＮａｓｅ６ＰＬ）、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）での有意な阻害（酵母蛋白質対照の４５％）に注意されたし。
図５９ａないしｌは、ヒト臍帯内皮細胞における管形成に対するヒトＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果を示す顕微鏡写真である。新たに単離されたヒト臍静脈内皮帯細胞（ＨＵＶＥＣ）を、図に示すように、成長因子［アンジオゲニン（１μｇ／ｍｌ）またはｂＦＧＦ（１μｇ／ｍｌ）］、およびＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１、１０μｇ／ｍｌ）、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ、１０μｇ／ｍｌ）、対照酵母培養基（ｐＰＩＣ９Ｋプラスミド単独、酵母対照）またはＰＢＳいずれかの存在下または非存在下で補足された培地中の成長−枯渇Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）被覆した９６ウェエルプレートにて、ウェル当たり１４０００細胞の密度で平板培養した。管成長を評価し、一晩のインキュベーションの後にプレートの写真を撮った。３回の個々の測定を各処理について行った。図５９ａ−（成長因子およびＲＮａｓｅを含まない）対照；図５９ｂ−アンジオゲニン；図５９ｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１；図５９ｄ−アンジオゲニン＋ＲＮａｓｅ  Ｂ１；図５９ｅ−ＲＮａｓｅ６ＰＬ；図５９ｆ−アンジオゲニン＋ＲＮａｓｅ６ＰＬ；図５９ｇ−酵母対照；図５９ｈ−アンジオゲニン＋酵母対照；図５９ｉ−ｂＦＧＦ；図５９ｊ−ｂＦＧＦ＋ＲＮａｓｅ  Ｂ１；図５９ｋ−ｂＦＧＦ＋ＲＮａｓｅ６ＰＬ；図５９ｌ−ｂＦＧＦ＋酵母対照；Ａ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１、各々、図５９ｄおよびｊ）と比較した、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ、図５９ｆおよびｋ）による内皮管形成の優れた阻害に注意されたし。
図６０は、ヒトＴ２  ＲＮａｓｅのクローニングおよび発現で用いられる合成ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列である。
図６１は、多様な系統発生的起源からの他のＴ２ファミリーメンバーとヒトＴ２ヌクレアーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列整列である。
図６２は、図６０にあるように、合成ＲＮａｓｅ６ＰＬ（配列番号４）のアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ整列であり、Ｔ２  ＲＮａｓｅファミリーメンバーのアミノ酸配列はヒトＲＮａｓｅ６ＰＬに対して最も近い相同性を有する。
図６３ａないしｏは、ヒト臍帯内皮細胞における管形成に対するヒトＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果を示す顕微鏡写真である。新たに単離されたヒト臍静脈内皮帯細胞（ＨＵＶＥＣ）を、図に示すように、さらなる成長因子［１μｇ／ｍｌアンジオゲニン（図６３ａないしｅ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（図６３ｆないしｊ）または組換えＶＥＧＦ（図６３ｋないしｏ）］、および組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ、１０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを補足した、ＦＣＳおよびＥＣＧＦを含有する培地中の成長−枯渇Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を被覆した９６ウェルプレートにて、ウェル当たり１４０００細胞の密度で平板培養した。管成長を評価し、一晩のインキュベーションの後にプレートを写真に撮った。３回の個々の測定は、各処理について行った。図６３ａ、ｆおよびｋ−対照（さらなる成長因子を含むが、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬを含まない）；図６３ｂ、ｇおよびｌ−さらなる成長因子およびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ０．５μＭ；図６３ｃ、ｈおよびｍ−さらなる成長因子およびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  １．０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１；図６３ｄ、ｉおよびｎ−さらなる成長因子およびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ５μＭ；図６３ｅ、ｊおよびｏ−さらなる成長因子およびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  １０μＭ。テストした全ての濃度における、プロ脈管形成因子の存在下での、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅによる内皮管形成の優れた阻害に注意されたし（図６３ｂないしｅ、ｇないしｊおよびｌないしｏ）。
図６４は、ＬＳ１７４Ｔ誘導腫瘍の容量に対するタキソールおよびヒトＴ２  ＲＮａｓｅの効果を示すグラフである。ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）ヌードマウスにＬＳ１７４Ｔ癌細胞を皮下注射し、細胞注射から２週間後に（腫瘍が触知できる時、８０ないし１００ｍｍ３、移植から１０ないし１３日後）、マウスを、示すように、３ないし４週間の間にわたって、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬで腹腔内、および／または示した処置のタキソール静脈内注射で処理した。ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ：０．５ｍｇ／ｋｇ  ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ（１００μｌ中１０μｇ／マウス）；タキソール：２５ｍｇ／ｋｇタキソール（１００μｌ中５００μｇ／マウス）。処理方法は以下のようであった：６ＰＬ（赤色四角）：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ単独  ２ｑＸ１２；６ＰＬ−ＰＢＳ−６ＰＬ（青色四角）：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ２ｑＸ４、ＰＢＳ  ２ｑＸ３、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ２ｑＸ５；６ＰＬ−Ｔａｘ−６ＰＬ（紫色四角）：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ２ｑＸ４、タキソール２ｑＸ３、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ２ｑＸ５；ＰＢＳ−Ｔａｘ−ＰＢＳ（緑色三角）：ＰＢＳ  ２ｑＸ４、タキソール２ｑＸ３、ＰＢＳ  ２ｑＸ５；ＰＢＳ（塗り潰ぶしていない菱形）：ＰＢＳ  ２ｑＸ１２。未処理マウスと比較した、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ処理マウスにおける（ｍｍ３で表した）腫瘍容量に対する有意な効果、ならびにＲＮａｓｅ  ６ＰＬおよびタキソールの組合せ処置で処理したマウスにおける腫瘍成長の予期せぬ相乗的阻害に注意されたし。
図６５ａないしｄは、イン・ビトロで成長したユリ花粉管中でのオルガネラの分布に対するＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す顕微鏡写真である。Ｌ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ．ｃｖ  Ｏｓｎａｔ花粉粒を前記した図９ａおよびｂにあるように発芽させ、暗所にて１μＭのＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１に２時間暴露し（図６５ａおよび６５ｃ）、アミロプラストについてはヨウ素（ＩＫＩ）（図６５ａおよび６５ｂ）、またはミトコンドリアについてはＤｉＯＣ６（図６５ｃおよび６５ｄ）で染色した。対照はＲＮａｓｅ  Ｂ１を受けなかった。ＲＮａｓｅ処理花粉における花粉管先端に向けてのオルガネラの蓄積（図６５ａおよび６５ｃ）に注意されたし。スケールバー＝１０μｍ。
図６６ａおよびｂは、ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬのアクチン結合活性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスロットブロットアッセイの写真である。図６６ａは、（インキュベーションおよび架橋から３０分後の）Ｇ−アクチンとのヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ複合体のＳＤＳ−トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）ゲル分離を示す。レーン１はＭＷサイズマーカーであり、レーン２はアクチン（ＭＷ  ４２ｋＤａ）であり、レーン３はヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ（ＭＷ  ２７ないし３０ｋＤａ）であり、レーン４はＲＮａｓｅ  ６ＰＬ−アクチン複合体である。ＲＮａｓｅ  ６ＰＬによるアクチン結合の高い親和性を示す、レーン４におけるＲＮａｓｅ  ６ＰＬ−アクチンの高分子量複合体に注意されたし。図６６ｂは、５μｇ／ｍｌ  Ｇ−アクチンとのインキュベーション、およびＨＲＰ結合二次抗ＩｇＭ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）でのケミルミネセンスによって可視化された、抗アクチンｍＡｂでの検出の後の、ニトロセルロース上のヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＧ−アクチン（陽性対照）のスロットブロットを示す。ＲＮａｓｅ  ６ＰＬおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１スロット双方におけるアクチンの検出に注意されたし。
図６７ａおよびｂは、コンカナバリンＡでのアフィニティ−クロマトグラフィーによるＲＮａｓｅ  ６ＰＬの精製を示す。図６７ａは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｎＡおよびＲＮａｓｅ  ６ＰＬの結合の後の、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｎＡカラムから０．５Ｍ  α−マンノピラノシドで溶出させた画分における蛋白質（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ、塗りつぶした四角）およびＲＮａｓｅ触媒活性（塗り潰ぶした三角）の分布を示すグラフである。画分４８ないし６１を集めた。図６７ｂは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｎＡカラムからの、プールされた画分（レーン３）における蛋白質および未結合上清（レーン２）の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離である。レーン１は分子量マーカーである。
図６８は、ヒト癌細胞のクローン原性に対する多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅの効果を示すヒストグラムである。ヒト結腸癌（ＨＴ−２９）細胞は、１０−６Ｍ  Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１、ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｉと共におよび／またはそれなくして４８時間インキュベートした。対照細胞をＲＮａｓｅ  Ｔ２フリー成長培地中で４８時間プレインキュベートした。次いで、全ての細胞をトリプシン処理し、コロニー化のために９６マイクロタイタプレート中で同一成長培地と共にインキュベートした。さらに、１μＭ  ＲＮａｓｅの存在下または非存在下で、５日間で、クローン原性を１０００細胞／ウェルでアッセイした。個々のウェルをコロニー発生についてスコア取りした。各細胞系について６回の測定を行った。細菌、酵母およびヒトＴ２  ＲＮａｓｅによるクローン形成の強力な阻害に注意されたし。
図６９ａおよびｂは、多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅによるヒト結腸癌腫瘍成長の効果的な阻害を示すヒストグラムである。ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）ヌードマウスに、ＬＳ１７４Ｔ癌細胞を皮下注射した。癌細胞移植後に、腫瘍が触知できるようになると（約１４日後）、マウスに、１日おきに、ＰＢＳ、またはＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ（図６９ａ）またはヒトＴ２ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ（図６９ｂ）（１００μｌ中の０．５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内注射した。腫瘍容量を１週間当たり３回モニターした。３０ないし４２日後にマウスを屠殺し、腫瘍を評価した。相対的腫瘍容量を、最初の処理における腫瘍に対して計算する。未処理マウスと比較した、Ｔ２  ＲＮａｓｅ処理マウスにおける（ｍｍ３で表した）相対的腫瘍容量に対する有意な効果に注意されたし。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
本発明は、アクチン結合活性を有するクローン化された組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅのためのもの、およびＴ２  ＲＮａｓｅの精製のための新規な方法のためのものである。さらに、本発明は、固形腫瘍の成長および増殖を阻害し、細胞運動性を変調し、それにより、対象において異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化、発生、炎症、および／または感染を予防し、阻害しおよび／または逆行させるための、ヒトＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドの使用を教示する。本発明は、さらに、アクチン結合活性を有するＴ２ファミリーの組換えヒトリボヌクレアーゼ、またはそれをコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物を教示する。
【００９１】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための細胞傷害性活性を持つリボヌクレアーゼの使用は新しくはなく、当該分野においては従前に示されている。ＯＮＣＯＮＡＳＥとして商業的に知られているＡファミリーのリボヌクレアーゼは、臨床試験において腫瘍組織における細胞増殖を阻害することが示されている。ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーのいくつかの他のＲＮａｓｅもまた、それらのリボ核酸分解活性に加えて、細胞傷害性活性を有することが示されている。ＯＮＣＯＮＡＳＥおよび他の細胞傷害性ＲＮａｓｅ変種の毒性は、サイトゾルリボヌクレアーゼ阻害剤蛋白質（ＲＩ）を回避し、細胞ＲＮＡを分解するそれらの能力に依存することが示されている（Ｈａｉｇｉｓら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３；３１：１０２４−３３）。
【００９２】
いくつかのリボヌクレアーゼの細胞傷害性は、ある程度それらのリボ核酸分解活性に依存するが、リボ核酸分解活性のレベルは、常には、リボヌクレアーゼについて観察された細胞傷害性のレベルに相関しない。さらに、細胞傷害性活性を全く呈しないが、リボヌクレアーゼとして同様に機能するリボヌクレアーゼのいくつかの例が存在する。最も知られている例はＲＮａｓｅ  Ａである。他の場合には、反応速度が、いくつかの他の能力において、より特異的な結合または改良される機能のために犠牲とされる。例えば、アンギゲニンの活性部位は、ＲＮａｓｅ  Ａに存在しない側鎖によってブロックされ、それを一般的な基質に対して１００００倍低い活性とするが、リボソームＲＮＡの切断においてより特異的にする。ＢＳ−ＲＮａｓｅは、それがモノマーである場合、より速いヌクレアーゼである。しかしながら、その細胞傷害性はより大きく、リボヌクレアーゼ阻害剤による阻害は、ダイマー形態ではかなり低下する。グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂは殆どの基質に対してＲＮａｓｅ  Ａよりも活性が低いが、ＢＳ−ＲＮａｓｅにおいてしばしば観察される脱アミド化（アスパラギン６７からイソアスパルテートへ）は、蛋白質におけるＨ結合構造の全鎖を切断することによって、ＲＮａｓｅ  Ａ突然変異体の活性を低下させる（Ｓｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：５２９−５３６にレビューされている）。
【００９３】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、それらのユニークな分子特徴によって特徴付けられる。ＡおよびＴ２ファミリーのＲＮａｓｅメンバー間の比較を以下の表２にまとめる（アミノ酸の位置は、各々、ファミリーＡおよびＴ２において、ＲＮａｓｅ  ＡおよびＲＮａｓｅ  Ｔ２の後である）。
2008514224.tif 000003
【００９４】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは多数の微生物において、ならびに植物において同定されており、そこでは、それらは、胚珠に向かって伸びる花粉管の伸長を選択的に制限することによって、受粉プロセスにおいて活動的な役割を演じる。
【００９５】
本発明の発明者によって発見されたように、および実施例１、２、６、１６および２０において後にさらに詳細に述べるように、Ｔ２リボヌクレアーゼファミリーの、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは、リボ核酸分解的に活性であるか、またはリボ核酸分解的に活性でないかを問わず、花粉管の伸長においてアクチンに特異的に結合し、それにより、花粉管の伸長を阻害し、また哺乳動物細胞のアクチンにも結合する。
【００９６】
アクチンは、細胞構造を維持すること、およびオルガネラの細胞内輸送を支持することの両方において活性な、細胞の必須の骨格成分であるフィラメントを形成することが知られている。その結果、アクチンフィラメントは、線維芽細胞、免疫系の細胞、神経系の細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋内皮細胞、および組織形成を含めた組織負傷および他の発生態様の修復に関連する細胞を含めた、中胚葉および／または神経外胚葉および／または外胚葉および／または内胚葉起源の種々の細胞の運動性、増殖、コロニー化、分化、形質転換、および生存を含めた、正常なおよび異常な細胞のライフサイクルを通じての多くの細胞プロセスにとって非常に重要である。多数の研究はまた、アクチンが、癌細胞の発生を制御する種々の細胞プロセスにおいて参画することを示している（Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．Ａ．＆  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０：１２３−１３０；Ｊａｍｍｙ，Ｐ．Ａ．＆  Ｃｈａｐｏｎｎｉｅｒ，Ｃ．１９９５．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１１１−１１７：Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｓ．Ｈ．１９９６．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：６６−７３；Ｔａｐｏｎ，Ｎ．ら、１９９７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：８６−９２）。かくして、例えば、アクチンフィラメントは異常な細胞増殖に参画する（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｚｈｕ，Ｘ．１９９７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：９３−９８）。悪性細胞は正常な細胞よりもサイトカラシンＢに対してより感受性であることが判明した（Ｈｅｍｓｔｒｅｅｔ  Ｇ．Ｐ．ら、１９９６．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５Ｓ：１９７−２０４）。
【００９７】
アクチンは高度に保存された蛋白質であり、進化的に離れた生物の間で高いレベルの相同性を維持するので、花粉管伸長を阻害するＲＮａｓｅ  Ｂ１のアクチン結合活性は、この理論によって拘束されることなく、哺乳動物細胞のアクチンに特異的に結合し、それにより、その増殖、コロニー化、分化および／または発生を阻害するのに利用することができると仮定される。
【００９８】
本発明を具体化することにおいて、実施例セクションの実施例２および５にさらに記載されているように、外因性ＲＮａｓｅ  Ｂ１は膜アクチンに特異的に結合し、細胞アクチンネットワーク障害を引き起こす。実施例３ないし５に示されているように、哺乳動物癌細胞に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬの効果は、イン・ビトロおよびイン・ビボでさらに調査された。そこで明瞭に示されるように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、結腸または他の場所における健康な組織に対して明らかな副作用を有さずして、（ｉ）培養で成長した腺癌細胞の成長、増殖および／またはコロニー化を実質的に減少し：ならびに（ｉｉ）予防的および／または治療的に、異常な陰窩病巣（ＡＣＦ）の数を低下させ、腫瘍の数およびサイズを低下させ、腫瘍脈管形成に干渉し、結腸癌腫ラットモデルにおいて腫瘍の悪性度およびアデノーマから腺癌への転移を低下させる。ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは同様な熱安定性を有することが判明し（図５７）、単独で、および種々のプロ脈管形成因子の存在下で（図６３）、花粉管形成（図５８）およびＨＵＶＥ細胞脈管形成（図５９）の阻害において同様な活性を示した。さらに、ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１のように、リボ核酸分解活性の不活化の後でさえ、アクチン結合、花粉管阻害性および抗脈管形成活性を保有することが示された（図５８）。
【００９９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は以下の記載に述べられる、または実施例によって説明される詳細にその適用が制限されないことは理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または種々の方法で実行されまたは行うことができる。また、本明細書中で用いる用語は、記載の目的のためであり、限定的と見なされるべきではないことが理解されるべきである。また、本発明は本明細書中に示す理論または仮定に拘束されず、またはそれによって制限されないことが理解されるべきである。
【０１００】
Ｔ２ファミリーの１以上のリボヌクレアーゼは、本明細書において、まとめてＴ２−ＲＮａｓｅと言われる。同様に、Ｔ２ファミリーの１以上のリボヌクレアーゼをコードする１以上のポリヌクレオチドを、本明細書において、まとめて、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチド（または、それ）という。
【０１０１】
ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子は、ヒト対象における、染色体領域６ｑ２７における突然変異と（自然発生卵巣癌等の）癌の高い発生率との間の相関の発見以来、候補腫瘍および転移サプレッサー遺伝子であった。多数の研究は、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ遺伝子のクローニング、および種々の癌細胞系の細胞へのトランスフェクションを報告している（Ａｃｑｕａｔｉ，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１；２２：９８０−８８，Ｌｉｕら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；３：２０；およびＬｉｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２；２１−３８７−９９参照）。しかしながら、組換え蛋白質を単離しない、ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子の異種発現は、対立する論争のある結果を生じた。Ａｃｑｕａｔｉら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００１；２２：９８０−８８）は、卵巣腫瘍細胞における腫瘍形成性の抑制、およびトランスフェクトされたＲＮａｓｅ６ＰＬによる不滅化された細胞系における老化の誘導を報告しているが、ＲＮａｓｅ６ＰＬでのトランスフェクションによる卵巣癌細胞成長の抑制はＬｉｕらによって観察されなかった（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２；２１−３８７−９９）。かくして、Ｌｉｕらは、「クローン原性アッセイは、・・・この遺伝子が推定腫瘍サプレッサー遺伝子ではないようであることの裏付けを提供する」と結論している。
【０１０２】
本発明を具体化することにおいて、発明者らは、最初に、ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子からの７１９ｂｐオープンリーディングフレームを含むヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子の蛋白質コード配列をクローン化し、異種発現系（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現させるのに成功し、該ポリペプチドはＲＮａｓｅ６ＰＬコード配列によってコードした。予測される分子量を有する発現されたポリペプチドは培養基に分泌され、新規な精製プロセスにおいてそれから単離され、精製された。かくして、本発明者らは、最初に、Ｔ２  ＲＮａｓｅファミリーの新規なメンバーである組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬをクローン化し、発現させ、精製した（実施例１９）。精製されたヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１のそれと同様に強く活性および熱安定性を呈した（実施例２０）。また、それは同様の最適なｐＨ（４ないし５）および温度（５０℃）を示す。しかしながら、ＲＮａｓｅのＴ２ファミリーのメンバーであるヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは、他の外来性Ｔ２  ＲＮａｓｅの不利なくして、アクチン結合活性を有する他のＴ２  ＲＮａｓｅと同様に治療的および臨床的適用で用いることができる。
【０１０３】
クローン化ＲＮａｓｅ６ＰＬコード配列によってコードされるＲＮａｓｅ６ＰＬポリペプチドと、他の多様な種のＴ２  ＲＮａｓｅ蛋白質のアミノ酸配列とを比較すると、多くの他のＴ２  ＲＮａｓｅに対して配列相同性が変化するが、同様の構造を示した（図６０ないし６２）。最も近い相同性は、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓからのＴ２  ＲＮａｓｅ蛋白質に対して見出された。８２％  Ｂｌａｓｔ  ＧｅｎｅＢａｎｋ（図６２）。
【０１０４】
本明細書では、用語「相同性」は、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列の間での組み合わされた配列同一性および類似性と定義される。
【０１０５】
本発明を具体化することにおいて、発明者らは、蛋白質のリボ核酸分解触媒活性とは別で、それから独立した、Ｔ２  ＲＮａｓｅファミリーのメンバーの従前に開示されていなかったアクチン結合活性を明らかとした（後記実施例６および図３１参照）。Ｔ２  ＲＮａｓｅのアクチン結合活性はイン・ビトロで定量されており（後記実施例３、図１１参照）、細胞の成長、運動性および増殖の多様なモデルにおいて細胞表面に限局された（後記実施例３、図１２ａないし１２ｃおよび実施例５、図２９および３０参照）。さらに、Ｔ２  ＲＮａｓｅアクチン結合活性は、細胞突起におけるアクチンフィラメント組織化の破壊、ならびに管成長（後記実施例３、図９ａおよび９ｂ、および実施例５、図２８ａおよび２８ｂ参照）および脈管形成（後記実施例４、図２４ａないし２４ｃおよび２６ｃ参照）の強い阻害に相関する。さらなる結果は、Ｔ２  ＲＮａｓｅアクチン結合活性、細胞突起の破壊、および運動性の阻害が、さらに、新しく増殖するおよび確立されたよく発達した腫瘍双方において、腫瘍成長の有意な阻害（後記実施例４、図２２ないし２４参照）および悪性疾患の予防（後記実施例４、図２６参照）に相関することを明らかにした。Ｔ２  ＲＮａｓｅ処理腫瘍のミクロ組織病理学およびＤＮＡベースの（ＴＵＮＥＬ）分析は、腫瘍成長の阻害、増殖および転移成長、ならびに腫瘍容量の低下に関連した、アクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅの強いプロアポトーシス効果を明らかにした（後記実施例１４、図４３ａないし４３ｂ、４４ａないし４４ｂおよび４５ａないし４５ｂ参照）。前記背景セクションで詳細に記載したように、細胞表面における動的なアクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリーは高度に調節され、正常および異常細胞双方の細胞運動性、成長および発生の全ての態様にとって重要である。
【０１０６】
かくして、本発明の１つの態様によると、対象において異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防し、阻害しおよび／または逆行させる方法が提供される。本発明のこの態様による方法は、治療上有効量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質（該リボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する）またはＴ２ファミリーの該リボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを、それ自体、または医薬組成物の有効成分として、対象に投与することによって行われる。
【０１０７】
１つの実施形態において、リボヌクレアーゼ蛋白質はＴ２ファミリーのヒトリボヌクレアーゼ蛋白質である。好ましい実施形態において、該リボヌクレアーゼ蛋白質は配列番号４に対して少なくとも８５％、好ましくは８８％、より好ましくは９０％、なおより好ましくは９３％、さらにより好ましくは９５％、なおより好ましくは９８％、最も好ましくは１００％相同である。さらに好ましい実施形態において、リボヌクレアーゼ蛋白質は配列番号４に記載されている通りである。
【０１０８】
本発明を具体化することにおいて、腫瘍、異種移植片および転移等の異常に増殖する細胞を（実施例１０および１４、および図４３ないし４５参照）、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼに暴露すると、細胞におけるアポトーシスプロセスを増強させることが初めて発見された。Ｔ２  ＲＮａｓｅのプロアポトーシス効果は、実施例１０および１４で見られた腫瘍および転移成長ならびに増殖の抑制に相関する。アポトーシスの阻害に関連する疾患は、細胞の過剰な蓄積が起こる疾患（新生物疾患、自己免疫疾患）を含むことは認識されよう。
【０１０９】
固形腫瘍および血液学的腫瘍の双方において、悪性細胞はアポトーシスインデューサーに対して異常な応答を示す（Ｗａｔｓｏｎ  ＡＪＭ．１９９５．Ｇｕｔ３７：１６５−１６７；Ｂｕｒｃｈ  Ｗ．ら、１９９２．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  １３：２４５−２５１）。これらの疾患において、ｐ５３、ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃおよびｂｃｌ−２等の周期−調節遺伝子は、悪性変性に関連する突然変異、不活化または調節不全を被る（Ｍｅｒｒｉｔ  ＡＪら、１９９４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：６１４−６１７；Ｉｗａｄａｔｅ  Ｙら、１９９６．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６９：２３６−２４０；Ｍｕｅｌｌａｕｅｒ  Ｅら、１９９６．Ｈｅｐａｔｏｌｇｙ  ２３：８４０−８４７；Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＥＷ．１９９５．Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １７：２１１−２２１）。ｂｃｌ−２の発現は、前立腺および結腸癌において、ならびに神経芽細胞腫においてより悪い予後に関する予測因子であると考えられる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢ．１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２）。多数の抗新生物療法が腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することが示されている（レビューについては：Ｓｕｎ  ＳＹら、２００４．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９６：６６２−６７２；Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｂｅｒｇｋａｍｅｎ  ＨおよびＫｒａｍｍｅｒ  ＰＨ．２００４．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．３１：９０−１１９；Ａｂｅｎｄ  Ｍ．２００３．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｂｉｏｌ．７９：９２７−９４１参照）。
【０１１０】
アポトーシスにおける欠陥は、ループスエリテマトーデス（Ｃａｒｓｏｎ  ＤＡ．およびＲｅｂｅｉｒｏ  ＪＭ．１９９３．Ｌａｎｃｅｔ．３４１：１２５１−１２５４．Ａｒｉｅｎｇｅｒ  Ｍ．ら、１９９４．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．３７：１４２３−１４３０）、関節リュウマチ（Ｌｉｕ  Ｈ．およびＰｏｐｅ  ＲＭ．２００３．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：３１７−２２）および重症筋無力症（Ｍａｓｕｎｎａｇａ  Ａ．ら、１９９４．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．３９：１６９−１７２）等の自己免疫疾患をもたらし得る。アデノウイルス、ＥＢＶ、牛痘およびクラミジアの等の病原体（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＢ．１９９５．Ｓｃｉｅｃｅ  ２６７：１４５６−１４６２；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＷＬ．ら、１９９９．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：５１８１−５１８５，Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ＱＬ，ら、１９９９．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３８８−９８，Ｆａｎ  Ｔ．ら、１９９８．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７：４８７−４９６）は、細胞アポトーシスに干渉することも示されている。乾癬等の慢性炎症過剰増殖性皮膚病において、アポトーシスの異常に低い速度は、表皮過形成の発生に寄与する。ケラチノサイトは、ＩＬ−１５等のケラチノサイトアポトーシスを抑制し得るいくつかのプロ炎症性サイトカインを含めた、種々の外部および内部成長因子に応答することが示された（Ｒｕｃｋｅｒｔ  Ｒ．ら、２０００．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２２４０−２２５０）。
【０１１１】
かくして、本発明のもう１つの態様によると、細胞のアポトーシスを増強する方法が提供され、該方法は、有効濃度のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質（該リボヌクレアーゼ蛋白質は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有する）またはＴ２ファミリーの該リボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを該細胞に供し、それにより、アポトーシスを増強することを含む。本発明の方法による細胞のアポトーシスの増強は、前記した新生物疾患、自己免疫疾患、炎症病、過剰増殖病および乾癬症等の、アポトーシスに関連する疾患の治療および／または予防において臨床的に適用することができる。それを必要とする対象の細胞においてアポトーシスを増強するための、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドの投与は、本明細書に記載された方法のいずれかによって行うことができる。増強されたアポトーシスの検出、およびＴ２  ＲＮａｓｅへの暴露の後の細胞または組織もしくは組織試料中のアポトーシスのレベルの変化のモニタリングは、後に記載するように、当該分野で知られた細胞学的、病理学および生化学（例えば、後に記載するＴＵＮＥＬアッセイ）手段によって行うことができる。アクチン結合活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、異種発現系で発現された組換えＴ２  ＲＮａｓｅであり得る。アクチン結合活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼのアクチン結合および治療の特徴はリボ核酸分解活性とは別々で、それから独立していることが示されているが、１つの実施形態において、Ｔ２  ＲＮａｓｅはリボヌクレオ溶解活性を欠く。治療上有効量の、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを、それ自体で、または医薬組成物の有効成分として、それを必要とする細胞対象に投与することができる。
【０１１２】
かくして、本発明のもう１つの態様によると、有効成分として、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチド、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【０１１３】
本発明のなおもう１つの態様によると、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される単体と組み合わせる工程を含む、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防し、阻害しおよび／または逆行するのに有用な医薬を調製する方法が提供される。
【０１１４】
なおさらに、細胞の過剰な細胞運動性および／または異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態を治療し、および／または予防するのに有用な医薬を調製する方法が提供される。該方法は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、それをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせることによって行われる。
【０１１５】
該医薬は、好ましくは、特定の癌等の特定の増殖性障害または疾患のための治療を提供するものとして識別される。そのような識別は、例えば、当該分野で良く知られているように、医薬を含有する容器上の、またはリーフレット上の印刷で行うことができる。
【０１１６】
本発明の該方法および医薬組成物は、例えば、（ｉ）対象において腫瘍を治療し；（ｉｉ）対象において腫瘍の発生を予防し、阻害しおよび／もしくは逆行させ；（ｉｉｉ）対象において良性腫瘍から悪性腫瘍への形質転換を予防し、阻害しおよび／もしくは逆行させ；（ｉｖ）対象において腫瘍脈管形成を予防し、阻害し、および／もしくは逆行させ；（ｖ）対象において個々の腫瘍の数を減少させ；（ｖｉ）対象において腫瘍サイズを低下させ；（ｖｉｉ）対象において悪性腫瘍の数を減少させ；ならびに／または（ｖｉｉｉ）対象において組織の腫瘍への形質転換を予防し、阻害しおよび／または逆行させるのに用いることができる。
【０１１７】
Ｔ２−ＲＮａｓｅは、後の実施例１にさらに例示されるように、天然源に由来することができ、または別法として、それは、実施例１９に詳細に記載されるように、適当なポリヌクレオチド（以下の表３、および以下の記載）および発現系を用いて組換え蛋白質として生産することができる。組換え蛋白質の発現および精製は当該分野で良く知られており、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら」「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ  Ｐｌａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）を含めた多数のテキストブックおよび実験手順書のいずれか１つに詳細に記載されている複数の代替技術のいずれか１つによって行うことができる。
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【０１１８】
いくつかの適用のためには、望まれない副作用を有し得るか、または起こし得る、実質的にリボ核酸分解（リボヌクレアーゼ）活性を欠くリボヌクレアーゼを用いるのが有益であろう。本明細書において、用語「実質的にリボ核酸分解（リボヌクレアーゼ）活性を欠く」とは、（ｉ）同様の非不活化リボヌクレアーゼと比較して、０ないし１０％リボ核酸分解（リボヌクレアーゼ）活性を有するＴ２ファミリーの不活化リボヌクレアーゼ（天然または組換えいずれか）；および／または（ｉｉ）同様の非突然変異体リボヌクレアーゼと比較して、０ないし１０％リボ核酸分解（リボヌクレアーゼ）活性を有するＴ２ファミリーの組換え突然変異体（天然単離体またはヒト誘導）リボヌクレアーゼをいう。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解（リボヌクレアーゼ）活性の不活化は、オートクレーブ処理および化学的変性または不活化からなる群から選択されるプロセスによって行うことができる。
【０１１９】
本明細書において、用語「オートクレーブ処理」は、オートクレーブ中における、高圧条件（例えば、１５ｐｓｉ）で約１２１℃に加熱した超加熱スチームへの少なくとも２０分間の暴露と定義される。化学的変性は、後に詳細に記載するように（実施例６）、ヨードアセチル化等の、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのアミノ酸側鎖および／または化学的結合構造において改変を引き起こす極端なｐＨおよび化学剤への暴露によって行うことができる。
【０１２０】
以下の実施例２、６および２０にてさらに詳細に記載するように、本発明の発明者らは、ほとんど（１０％）または実質的に（０ないし１０％）リボ核酸分解活性を有さない煮沸した、オートクレーブ処理した、および化学的に不活化した（アセチル化）ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬが、そのアクチン結合および抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性の実質的に全てを保有するので、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬの細胞運動性の阻害、アポトーシスの阻害、抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性は、そのリボ核酸分解活性に依存しないことを示した。さらに、ＲＮａｓｅ６ＰＬにおける、リボ核酸分解ならびに抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性の分離についての決定的な証拠は、腫瘍形成および転移のＲＮａｓｅ６ＰＬ媒介抑制が、リボヌクレアーゼ触媒部位に標的化された二重点突然変異によって影響されないことを最近示したＡｃｑｕａｔｉら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００５；２６：１１５９−６８）によって報告されている。
【０１２１】
かくして、本発明によるＴ２−ＲＮａｓｅ蛋白質は、全く（０％）またはほとんど（１０％まで）リボ核酸分解活性を有しないが、その他の活性を保有する、天然のリボ核酸分解活性形態、あるいは別法として、サイレントな、または抑制されたリボ核酸分解形態の双方で利用することができる。従って、用語「Ｔ２−ＲＮａｓｅ」は、その他の活性にかかわらず、蛋白質の全ての抗増殖、抗コロニー化、抗分化、抗脈管形成および／または抗発生形態を含むことを意味する。かくして、１つの実施形態において、本発明のＴ２−ＲＮａｓｅは、リボヌクレアーゼ活性を実質的に欠くが、アクチン結合活性を有する。好ましい実施形態において、Ｔ２  ＲＮａｓｅのアクチン結合活性は熱安定性である。さらに、リボヌクレアーゼ活性を不活化するが、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのアクチン結合活性を維持する方法が提供される。該方法は、（前記した変性条件等の）リボヌクレアーゼ活性を実質的に不活化するが、アクチン結合活性を維持するのに十分な変性条件にリボヌクレアーゼを付すことによって行われる。
【０１２２】
所望の活性を呈するが、リボ核酸分解活性を欠く、またはそれが抑制された、直接的に、またはポリヌクレオチドから発現されたＴ２−ＲＮａｓｅを利用することが、特に有利であると認識されよう。というのは、リボ核酸分解活性は対象において望まれない副作用を生じ得るからである。
【０１２３】
本明細書中で定義されるＴ２−ＲＮａｓｅのアミノ酸配列を表すポリペプチドは、当該分野で良く知られたいくつかの方法のうちのいずれか１つによって生産することができる。例えば、該ポリペプチドは、例えば、標準的な９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ−Ｍｏｃ）化学（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．およびＳｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．１９８５，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１６５参照）または標準的なブチルオキシカルボネート（Ｔ−Ｂｏｃ）化学のいずれかを用いて、標準的なペプチド合成技術によって合成的に製造することができるが、より最近では、Ｓｈｅｐｐａｒｄによって開発されたフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ−ブチルシステムが益々広い適用を見出していることを注記する（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．１９８６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ，Ｔｈｅ  ＬＫＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３，９）。
【０１２４】
本発明を具体化するにおいて、細菌から酵母までの多様な系統発生的起源の生物に由来するＴ２ファミリーの多くのリボヌクレアーゼ（実施例１６、図４７ａないし４７ｂ）は、細胞運動性、異常な細胞増殖およびアポトーシスの治療的特徴および阻害に相関するアクチン結合活性を有することが初めて発見された。かくして、Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質は、この蛋白質を発現することが知られている生物から当該分野でよく知られた方法によって単離し、精製することもできる。そのような生物として、例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ、Ｒｈｉｓｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ；Ｐｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈｌｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｌａｔａ、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｐｙｒｕｓ  ｐｙｒｉｆｏｌｉａ、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｒａｎａ  ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ、Ｄｒｏｓｏｐｈｙｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃｒａｓｓｏｓｔｅｒａ  ｇｉｇｕｓ、Ｔｏｄａｒｏｄｅｓ  ｐａｓｉｆｉｃｕｓおよびＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓが挙げられる。しかしながら、Ｔ２−ＲＮａｓｅを生産することが未だ知られていない他の生物は、一旦それ自体が発見されると、Ｔ２−ＲＮａｓｅについての源として用いることもできると予測される。
【０１２５】
本発明のＴ２リボヌクレアーゼのいくつかの治療的および診断的使用は、精製されたＴ２  ＲＮａｓｅを必要とするであろうことは認識されるであろう。かくして、Ｔ２  ＲＮａｓｅの精製の単純で安価な方法が有利である。本発明を具体化することにおいて、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼは、リボ核酸分解活性についての収集された画分を煮沸し、カラムクロマトグラフィーによって分画し（後記実施例１９、図５５参照）、およびアッセイすることによって単離し、精製することができることが見出された。かくして、Ｔ２リボヌクレアーゼ蛋白質を単離する新規な方法も提供され、該方法は、Ｔ２リボヌクレアーゼ蛋白質を発現する細胞を含むＴ２含有試料を熱変性し、好ましくは遠心分離によって、上清を分離し、上清を分画し、Ｔ２リボヌクレアーゼ蛋白質を有する上清の画分を同定し、Ｔ２  ＲＮａｓｅ画分をかなりの純度まで精製することを含む。１つの実施形態において、上清の分画は、カラムクロマトグラフィー、例えば、過去に用いられたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、または当業者によく知られた他の蛋白質分離媒体の代わりに用いるＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｏｎＡカラムによって行われる。Ｔ２  ＲＮａｓｅ担持画分の同定は、（電気泳動移動度等の）物理的特徴、および機能的基準（リボ核酸分解活性、アクチン結合活性）に従ってなすことができる。精製されたＲＮａｓｅの物理的および機能的評価の方法は、後に記載するように、当該分野で良く知られている。
【０１２６】
別法として、かつ好ましくは、Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質は、適当な発現ベクター系を用い、それをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって組換えにより生産することができる。１つの実施形態において、発現系が細菌、酵母、または高等細胞発現系から選択される異種発現系であり、ここで、高等細胞発現系は動物または植物発現系を含む。好ましくは、適当な翻訳後修飾を提供する発現系が選択される。適当な発現ベクター系として、限定されるものではないが、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アビポックスウイルス）で感染された哺乳動物細胞；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞；プラスミド、植物ウイルスまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで形質転換された遺伝的に修飾された植物または植物細胞；酵母ベクターを含有する酵母、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌等の形質転換された微生物が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、発現系は、他のＴ２  ＲＮａｓｅファミリーメンバーのように、形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞における発現された蛋白質のグリコシル化によりグリコシル化された蛋白質である、ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬの発現に適したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのｐＰＩＣ９Ｋプラスミドである。しかしながら、後に詳細に記載するように、脱−グリコシル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１は阻害性およびアクチン結合特徴を保有することが認識されよう。ベクターの発現制御エレメントは、利用される宿主−ベクター系に依存してその強度および規格が変化し、多数の適当な転写および翻訳エレメントのいずれか１つを用いることができる。組換えにより生産されたＴ２−ＲＮａｓｅは後に記載する方法によって、あるいはアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫沈降、沈積、または当該分野で知られたいずれかの他の方法によって宿主細胞から精製することができる。
【０１２７】
精製されたＴ２−ＲＮａｓｅを用いて、適当な医薬上許容される担体および／または賦形剤を加えて、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣−作成、混練、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって本発明に従って医薬を調製することができるか、あるいは別法として、それを前記したように適当な送達ビヒクルに連結することができる。
【０１２８】
本発明によるポリヌクレオチドは天然Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質をコードすることができ、その用語は、本文中では、抗増殖性およびリボ核酸分解活性の双方を有するＴ２−ＲＮａｓｅを記載し、あるいは別法として、本発明によるポリヌクレオチドは、イン・ビボにて、リボ核酸分解活性が実質的にない蛋白質に発現される（例えば、転写および翻訳される）べき、全くまたはほとんどリボ核酸分解活性を有しないサイレントなまたは抑制されたＴ２−ＲＮａｓｅ突然変異体をコードすることができる。
【０１２９】
従って、用語「ポリヌクレオチド」は、一般にＴ２−ＲＮａｓｅに関して、あるいはいずれかの特異的なＴ２−ＲＮａｓｅに関して本明細書中で用いる場合、リボ核酸分解活性を有するか、または実質的にそれを欠くかのいずれかである、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防し、阻害しおよび／または逆行させることにおいて活性なＴ２−ＲＮａｓｅをコードするいずれのポリヌクレオチド配列もいう。リボ核酸分解活性を欠くＴ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドは、ランダム突然変異誘発、部位−特異的突然変異誘発および増強された進化技術等の、公知の分子生物学技術を用いて得ることができる。部位特異的突然変異誘発は容易に使用することができる。なぜならば、Ｔ２−ＲＮａｓｅのリボ核酸分解活性に必須のアミノ酸残基が認識されているからである（ここに引用して援用する、Ｋｕｓａｎｏら、１９９８．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：８７−９４、および前記表３参照）。
【０１３０】
アクチン機能および細胞内アクチン分布および細胞運動性の異常な、または過剰なまたは不十分な調節は、乱れた細胞機能をもたらし得、これは、次には、細胞障害をもたらし得る（または存在する細胞障害を悪化させ得る）ことは認識されよう。本明細書において、「細胞障害」は、ある種の刺激（例えば、組織損傷）に応答して適切に運動または移動する異常または不十分な細胞能力、あるいは細胞内のアクチン機能および分布を適切に調節することができないことによって特徴付けられる障害、疾患または状態を含む。
【０１３１】
本発明を具体化することにおいて、Ｔ２  ＲＮａｓｅは、細胞運動性、アクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリー、管形成および細胞増殖をイン・ビボで阻害するのみならず、イン・ビトロで測定されるように、癌細胞の運動性および侵入性を直接的に阻害することが初めて示された（実施例１２、表５）。かくして、本発明のアクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅ、およびそれを含む組成物は、癌（例えば、腫瘍脈管形成および転移）、免疫調節、神経変性および炎症疾患を含めた、運動性に関連する細胞障害を制御するための新規な治療剤として作用することができる。加えて、アクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅは、移動し、および組織負傷応答を調節するそれらの能力を介して、ある種の細胞障害および疾患を軽減するための新規な治療剤として作用することができる。
【０１３２】
かくして、本発明によると、細胞の運動性を阻害する方法が提供される。該方法は、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、かつそれをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを細胞に供することによって行われる。さらに、それを必要とする対象において過剰な細胞運動性によって特徴付けられる疾患または状態を治療し、および／または予防する方法が提供される。該方法は、治療上有効量の、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、かつそれをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを対象に投与することによって行われる。
【０１３３】
アクチンのアセンブリーおよびディスアセンブリーの破壊は、細胞の運動性、発生、成長、増殖および再生に影響する。かくして、本発明の組成物および方法は、細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患、症候群または疾患を治療するのに用いることができる。細胞の異常な蓄積によって特徴付けられる疾患または状態として、限定されるものではないが、炎症性疾患、神経変性病および癌が挙げられる。さらに、本発明の組成物および方法は、細胞におけるアクチンフィラメントのアセンブリーおよびディスアセンブリーで用いることができ、これは、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質、またはＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ蛋白質をコードし、かつそれをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを細胞に供することによって行われる。
【０１３４】
かくして、本発明は、限定されるものではないが、胆管癌、脳癌、乳癌、頸部癌；絨毛癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；メラノーマ；神経芽細胞腫；眼癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫、乳頭腫、神経膠芽細胞腫、カポシ肉腫、扁平細胞癌腫、神経星状細胞腫、頭部癌、首部癌、膀胱癌、結直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌腫、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、関節リウマチ、糖尿病性網膜障害、脈管形成、再狭窄、イン・ステント再狭窄、血管移植片再狭窄、増殖性硝子体網膜障害、慢性炎症性増殖性病、皮膚線維腫および乾癬を含めた悪性癌または非悪性癌等の癌性細胞または他の細胞のごとき異常に増殖する細胞によって特徴付けられる疾患、症候群または疾患を治療するのに用いることができる。
【０１３５】
本明細書において、用語「癌」または「腫瘍」は臨床的に記載される用語であり、これらは、異常な細胞増殖を呈する細胞によって特徴付けられる膨大な疾患を含む。用語「腫瘍」は、組織に適用される場合、一般には、過剰かつ異常な細胞増殖に特徴付けられる、いずれの異常な組織成長もいう。腫瘍は「良性」であり得、その元の病巣から拡大できず、または「悪性」または「転移性」であり得、その解剖学的部位を超えて宿主身体全体の他の領域に拡大することができる。用語「癌」は、一般には、悪性腫瘍、またはそれから生起する疾患状態を記載するのに用いられるより古い用語である。別法として、該用語は新生物としての異常な成長、および悪性新生物としての悪性異常成長をいう。
【０１３６】
本発明の配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２  ＲＮａｓｅ蛋白質は、癌を有する危険性がある対象の予防的処置で用いることができる。本明細書で用いる「癌を有する危険性がある対象」は、癌を発症する高い確率を有する対象である。これらの対象は、例えば、その存在が、癌を発症するより高い尤度に対する相関性を有することが示されている遺伝的異常性を有する対象、およびタバコ、アスベストもしくは他の化学トキシン等の癌を引き起こす剤に暴露された対象、または従前に癌について治療されたことがあって、明らかな緩解期にある対象を含む。癌を発症する危険性がある対象を本発明のＴ２  ＲＮａｓｅに暴露した場合、対象は、形成するいずれの癌も転移性となるのを防止することができよう。
【０１３７】
本発明のＴ２  ＲＮａｓｅは、対象において炎症に関連する障害を治療および／または予防するのにも有用である。アクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅに暴露された免疫または造血細胞は、移動する能力が低いであろう。かくして、アクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅは、免疫細胞移動に関連した炎症を妨げるのに、ならびに炎症障害および虚血性病を治療し、予防するのに有用である。
【０１３８】
炎症障害および虚血症病は、損傷した、あるいはそうでなければ好中球の移動および活性化を誘導してしまった局所組織領域への好中球の移動に関連する炎症によって特徴付けられる。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、負傷の部位への好中球移動に由来する好中球の過剰な蓄積は、周囲の組織を損傷する毒性因子の放出を引き起こすと考えられる。炎症病が急性発作である場合、好中球刺激によってしばしば損傷される組織は脳である。活性な好中球は脳に蓄積するので、梗塞が発症する。
【０１３９】
本明細書において、「炎症疾患または状態」は、負傷または感染の部位における局所的炎症によって特徴付けられるいずれの状態もいい、自己免疫疾患、感染性炎症性状態のある種の形態、器官移植または他のインプラントに特徴的な望ましくない好中球活性、および局所組織部位における望まない好中球蓄積において特徴付けられる実質的にいずれの他の状態も含む。これらの状態としては、限定されるものではないが、髄膜炎、大脳浮腫、関節炎、腎炎、成人呼吸逼迫症候群、膵臓炎、筋炎、神経炎、結合組織病、静脈炎、動脈炎、血管炎、アレルギー、アナフィラキシー、エールリヒア症、痛風、器官移植および／または潰瘍性結腸炎が挙げられる。
【０１４０】
本明細書において「虚血性の疾患または状態」とは、心筋または脳梗塞で見られるように、組織へ血液を供給することを担う血管のブロックまたは出血による、組織への血液供給の中断に由来する局所的炎症によって特徴付けられる疾患をいう。脳虚血性発作または脳虚血症は、脳への血液供給がブロックされた虚血性疾患の形態である。脳への血液供給のこの中断は、血管それ自体の固有のブロックまたは閉塞、閉塞の遠くで由来する源、不適切な大脳血流をもたらす減少した灌流圧もしくは増加した血液粘度、またはクモ膜下空間もしくは大脳内組織における破裂した血管を含めた、種々の原因に由来し得る。
【０１４１】
本発明のいくつかの態様において、本発明のＴ２  ＲＮａｓｅは、バリアーを横切っての腫瘍細胞の移動を妨げるのに十分な量で供される。癌の侵入および転移は、形質転換された細胞が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を通って侵入し、移動し、そして繋留−独立性成長特性を獲得するのを可能とする細胞接着特性の変化を含む複雑なプロセスである（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １９９１  ６４；３２７−３３６）。これらの変化のいくつかは、膜関連細胞骨格、および細胞内シグナリング分子を含有する細胞／ＥＣＭ接触点である病巣接着において起こる。転移性疾患は、腫瘍細胞の播種性病巣が、それらの成長および繁殖を支える組織に播かれた場合に起こり、腫瘍細胞のこの第２の拡大は、癌の大部分に関連する罹病率および死亡率を担う。かくして、本明細書で用いる用語「転移」とは、原発性腫瘍部位から離れた腫瘍細胞の侵入および移動をいう。
【０１４２】
本発明のＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、バリアーを横切るそれらの能力のテストにおいて、細胞運動性の阻害に対する感受性について細胞をアッセイすることができる。好ましくは、腫瘍細胞はバリアーを横切ることが妨げられる。腫瘍細胞に対するバリアーは、イン・ビトロ人工バリアー、またはイン・ビボ天然バリアーであり得る。イン・ビトロバリアーとして、限定されるものではないが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ等の細胞外マトリックス被覆膜が挙げられる。かくして、Ｔ２  ＲＮａｓｅを細胞に供することができ、該細胞は、次いで、Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．ら、「Ａ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ−Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｗｈｉｃｈ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）５２：３７８−３８３によって詳細に記載されているように、Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入アッセイシステムにおいて腫瘍細胞侵入を阻害するそれらの能力についてテストすることができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ｂＦＧＦに結合し、それを局所化する、ペルレカン等のヘパラン硫酸プロテオグリカン、ビトロネクチン、ならびにトランスフォーミング成長因子−ベーター（ＴＧＦ−β）ウロキナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型（ＰＡＩ−１）として知られたセルピンを含有する復元された基底膜である。転移についての他のイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイは、先行技術に記載されている。例えば、ここに引用して援用する、１９９９年８月１０日に発行された米国特許第５９３５８５０号参照。イン・ビボバリアーとは、対象の身体に存在する細胞バリアーをいう。
【０１４３】
本明細書に記載され、後の実施例セクションで例示される、アクチン結合、抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗―発生活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのいずれのリボヌクレアーゼも、本発明の教示に従って治療剤として用いることができる。同様に本明細書に記載された抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性を有する、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼをコードするいずれのポリヌクレオチドも、本発明の教示に従って治療剤として用いることができる。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼの非限定的リストは前記表３に掲げる。後の実施例によってさらに例示されるように、Ｔ２ファミリーのメンバーであるＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬは、イン・ビボおよびイン・ビトロアッセイによって測定して、抗増殖、抗コロニー化、抗分化およびまたは抗発生活性を有する。加えて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬは、それをリボヌクレアーゼ活性がないようにするように処置した場合でさえ、アクチンに結合することが示される。かくして、本発明は、それにより、当業者がそのアクチン結合、抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性について与えられたリボヌクレアーゼをテストすることができる３つの異なるアッセイを提供し、これらは、癌性細胞に対するテストされたリボヌクレアーゼの効果を測定するためのイン・ビトロアッセイ、腫瘍発生に対するテストされたリボヌクレアーゼの効果を測定するためのイン・ビボアッセイ、ならびに細胞および／または遊離アクチンに結合するテストされたリボヌクレアーゼの能力を測定するためのもう１つのイン・ビトロアッセイである。本発明をいずれかの理論によって制限することなく、アクチンに結合するリボヌクレアーゼの能力は、そのようなリボヌクレアーゼが抗増殖、抗コロニー化、抗分化および／または抗発生活性を有することを示すと考えられる。
【０１４４】
本発明によるリボヌクレアーゼは、それ自体、あるいはそれが適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物において、ヒトまたはいずれかの他の哺乳動物等の生物に投与することができる。
【０１４５】
本明細書中で使用される「医薬組成物」または「医薬」は、本明細書中に記載されるリボヌクレアーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチドの１以上と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、治療される対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１４６】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１４７】
医薬組成物はまた、限定されない、炎症性薬剤、抗菌剤、麻酔、癌治療剤などの１以上のさらなる有効成分を、主要な有効成分に加えて含むことができる。本発明の組成物と一緒に使用するのに好適な一般的に使用される追加の薬剤の詳細な説明は、以下に示される。
【０１４８】
本発明の医薬組成物は、当該分野でよく知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１４９】
本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１５０】
本発明を具体化することにおいて、アクチン結合活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの有意な治療効果は、異常な細胞増殖および蓄積の多様なモデルにおいて、広く種々の投与手段を用いて明らかにされた。Ｔ２  ＲＮａｓｅの迅速な全身摂取および分配をもたらす腹腔内投与は、ヌードマウスにおける皮下腫瘍（実施例９および１３、図３５  ３９ａないしｂ、および６４）、および腹腔内腫瘍（実施例８、図３３ａないしｄ）において、腫瘍成長および発生を抑制するにおいて効果的であることが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅのなおより迅速な全身摂取をもたらす静脈内投与もまた、皮下異種移植片（実施例１３、図３６ａないしｂ）、および静脈内腫瘍の遠隔（肺）転移拡大（実施例８、図３４ａないしｅ）を抑制し、治療するにおいて効果的なことが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅでの細胞の直接的投与、およびプレインキュベーションは、乳房癌腫（実施例１２、表６）、大腸癌腫（実施例１２、表６）、メラノーマ（実施例１２、図３８）、イン・ビボでの脈管形成因子誘導脈管形成および微小血管密度（実施例１０、図３７）、および植物（実施例１、図８および９、図６５ａないしｄ）およびヒトＨＵＶＥ細胞（実施例７、図３２ａないしｈ、５９ａないしｌおよび６３ａないしｏ）双方における細胞管形成での腫瘍成長の防止において効果的なことが判明した。Ｔ２  ＲＮａｓｅの経口投与は、マイクロカプセルの形態では、結腸腫瘍（ＤＭＨモデル）誘導において初期に投与した場合、腫瘍成長、増殖、腫瘍サイズ、腫瘍血管形成および異常な陰窩病巣の数（実施例４、図２３ａないし２３ｃ、２４ａないし２４ｄ、および２５ａないし２５ｃ）を低下させるのに効果的なことが判明した。既によく発生した腫瘍を保有する動物へのＴ２  ＲＮａｓｅの同様な経口投与は、消化プロセスおよび腸内送達されたと推定される低用量へのＲＮａｓｅの暴露にかかわらず、ラットにおける結腸癌腫瘍の血管形成および悪性の度合いを低下させた（実施例４、図２７ｃ）。組成物の効果的な腸放出をもたらすカプセル化方法は当該分野で良く知られており、それの使用は、既に確立された腫瘍の場合にはＴ２  ＲＮａｓｅの経口投与の有効性を増加させると予測されることが認識されよう。
【０１５１】
かくして、投与を行うためには、本発明の医薬組成物は適当な医薬担体、および有効量のＴ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、例えば、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、または当該分野で良く知られた方法を介するいずれかの他の効果的な手段によって投与される。
【０１５２】
静脈内、筋肉内または皮下注射のためには、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、水性溶液、好ましくは、ハンクスの溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液等の生理学的に適合する緩衝液中に処方することができる。例えば、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含有する生理学的に適当な溶液を血液循環中に全身投与して、直接的に到達または解剖学的に摘出することができない癌または腫瘍を治療することができる。有効量の、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な溶液は、標的組織の腫瘍細胞を治療するのに有効な量にて針によって標的癌または腫瘍組織に直接的に注射することができる。
【０１５３】
経粘膜投与の場合、浸透される障壁に適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤は当該分野では一般に知られている。
【０１５４】
経口投与の場合、本発明の医薬組成物は、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、当該分野でよく知られている医薬上許容される担体と組み合わせることによって容易に配合することができる。そのような担体により、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容されるポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１５５】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１５６】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１５７】
本発明の医薬組成物の経口送達は、胃腸管に存在するｐＨおよび酵素分解のため、成功しないであろう。かくして、そのような医薬組成物は、望ましくない環境を回避するように処方されなければならない。例えば、腸溶コーティングを経口固体処方に適用することができる。セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）およびアクリル樹脂等の酸性耐性特性を持つ物質は、ミクロカプセル化のための錠剤または顆粒をコーティングするのに最も一般に用いられる。好ましくは、湿式造粒を用いて腸溶被覆顆粒を調製し、有効成分およびコーティングの間の反応を回避する（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．およびＫａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．１９８７，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．４：７０−７４）。溶媒蒸発方法を用いることもできる。溶媒蒸発方法を用いて、糖尿病ラットに投与されるインスリンをカプセル化し、血中グルコース濃度を維持した（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、１９８６，Ｂｉｏｍａｔｅｒ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  １３：１８７−２０１およびＬｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎ  １６：８１５−８２８）。また、それを用いて、ウイルス抗原およびコンカナバリンＡ等の高分子量の生体物質をカプセル化した（Ｍａｈａｒａｊ，Ｉ．ら、１９８４，Ｊ．Ｐｈａｍａｃ．Ｓｃｉ．７３：３９−４２）。
【０１５８】
口内投与の場合、本発明の医薬組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１５９】
直腸投与の場合、坐剤は当該分野でよく知られているように使用されることができる。
【０１６０】
吸入による投与の場合、本発明に従って使用されるＴ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドと好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１６１】
本発明の医薬組成物はまた、非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための組成物は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０１６２】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドの懸濁物を、適切なオイル状注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするためにＴ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドの溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１６３】
あるいは、Ｔ２ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０１６４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１６５】
加えて、目、胃腸管、生殖泌尿器系管（例えば、泌尿器系膀胱）、肺および気管支系等のような、体腔に存在する癌または腫瘍は、針での直接的注射を介して、あるいは癌または腫瘍に罹患した中空器官に入れられたカテーテルまたは他の送達チューブを介して、有効量のＴ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な組成物（例えば、滅菌された、生理食塩水またはリン酸緩衝液、懸濁液、またはエマルジョン等の溶液）を受けることができる。Ｘ線、ソノグラム、またはファイバー光学可視化システムの等のいずれかの効果的なイメージングデバイスを用いて、標的組織を突き止め、それに近接する針またはカテーテルチューブをガイドすることができる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は浸透圧ミクロポンプによって送達することもできる。浸透圧ミクロポンプは体腔の１つに移植し、薬物は治療すべき組織に一定に放出される。この方法は、医薬組成物に対する免疫応答が経験された場合に特に有利である。この方法は、ＯＮＣＯＮＡＳＥで用いられてきた（Ｖａｓａｎｄａｎｉ  Ｖ．Ｍ．ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５；５６（１８）：４１８０−６）。
【０１６７】
別法として、かつ本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、医薬上許容される担体は、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを対象の哺乳動物細胞に送達することができる送達ビヒクルを含む。
【０１６８】
蛋白質または核酸を腫瘍または癌細胞へ、またはその上へ標的化するための多数の送達ビヒクルおよび方法は当該分野で公知である。例えば、リポソームは、蛋白質または核酸を標的細胞へ送達するのに利用できる人工膜小胞である（Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．およびＨｕｅｓｔｉｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８８，２７：４６５５−４６５９；Ｔａｎｓｗｅｌｌ，Ａ．Ｋ．ら、１９９０，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１０４４：２６９−２７４；ならびにＣｅｃｃｏｌｌ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１９８９，９３：１９０−１９４）。かくして、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、リポソーム小胞で高い効率にてカプセル化し、哺乳動物細胞に送達することができる。加えて、Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質または核酸を、例えば、ここに引用して援用するＬｅｅに対する米国特許第５９２５６２８号に記載されたように、ミセルを介して腫瘍または癌細胞を標的化するように送達することもできる。
【０１６９】
Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドをカプセル化したリポソームまたはミセルは、標的組織の異常に増殖する細胞を治療するのに有効な用量で、局所、眼内、非経口、鼻腔内、気管内、気管支内、筋肉内、皮下、またはいずれかの他の効果的な手段によって投与することができる。リポソームは、有効量のカプセル化されたＴ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有するいずれかの生理学的に適当な組成物にて投与することができる。
【０１７０】
別法として、かつ本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、送達ビヒクルは、限定されるものではないが、特異的細胞受容体またはマーカーに結合することができる抗体またはリガンドであり得る。抗体またはリガンドは適当なリンカーを介してＴ２−ＲＮａｓｅ蛋白質または核酸に直接的に連結させることができ、あるいは別法として、そのような抗体またはリガンドは、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドをカプセル化するリポソームの表面に供することができる。
【０１７１】
例えば、Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で従前に記載されたように、特異的組織または細胞に標的化するために特異的膜蛋白質抗体またはリガンドと融合させることができる。この点に関し、リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーのＲＮａｓｅと、トランスフェリン受容体に対する、またはＴ細胞抗原ＣＤ５に対する抗体との融合は、前記トキシンの各々に対する特異的受容体を保有する腫瘍細胞における蛋白質合成の阻害をもたらすことが認識される（Ｒｙｄａｋ，Ｍ．ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１２０２−２１２０７およびＮｅｗｔｏｎ  ＤＬ，ら、１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０（４）：４６３−７０）。
【０１７２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている対象の疾患の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分の量を意味する。
【０１７３】
治療効果がある量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の範囲内である。
【０１７４】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えば、対象の有効成分に対するＩＣ５０およびＬＣ５０（試験された動物の５０％における死亡を引き起こす致死量）を決定することによって、明らかにすることができる。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１７５】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は徐放性組成物の単回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１７６】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１７７】
本発明を具体化することにおいて、アクチン結合活性を有するＴ２  ＲＮａｓｅの投与は、ＴＡＸＯＬ治療の抗腫瘍効率に対して相乗効果を有することが驚くべきことに発見された（実施例１５、図４６）。同様に、アクチン結合活性を有する組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬの投与は、マウスにおけるヒトＬＳ１７４Ｔ異種移植片のＴＡＸＯＬ治療の抗腫瘍効率に対して相乗効果を有した（図６４）。かくして、本発明のＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて、単独で、あるいはそのような障害についての他の確立されたまたは実験的な治療方法と組み合わせた、異常な細胞運動性に関連する疾患または状態を治療することができる。かくして、本発明によると、癌の治療的措置を増強する方法が提供される。該方法は、治療的措置と組み合わせて、配列番号４に対して少なくとも８５％相同であるアミノ酸配列を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、または該ヌクレアーゼをコードし、かつそれをイン・ビボで発現することができるポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによって行われる。さらなる治療方法または組成物とのＴ２  ＲＮａｓｅ治療のそのような相乗活性は、そのような治療の有効臨床用量を大幅に低下させる能力を有し、それにより、しばしば破壊的な負の副作用および治療の高いコストを低下させることが認識されよう。
【０１７８】
本発明のＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドとの組み合わせに適した癌の治療のための治療的養生法として、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、光療法および光動的療法、外科的処置、栄養療法、切除療法、組み合わせた放射線療法および化学療法、近接照射療法、プロトンビーム療法、免疫療法、細胞療法およびフォトンビーム放射線外科的療法が挙げられる。
【０１７９】
本発明の化合物と共投与することができる抗癌薬物として、限定されるものではないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタニン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビスアントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴル；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；ドゥアゾマイシン；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサニトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾル；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イフォスファミド；イルモフォシン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアゾゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ニチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペール；マイトタン；マイトキサントロン塩酸塩；ニコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィメールナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌール；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフイリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフエンクエン酸；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレシン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ベロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。さらなる抗新生物剤として、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｅｉｇｈｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）のＣｈａｐｔｅｒ  ５２，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ  ＣａｌａｂｒｅｓｉおよびＢｒｕｃｅ  Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）、およびそれに対する緒言、１２０２−１２６３に開示されたものが挙げられる。
【０１８０】
本発明のＴ２  ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗炎症薬物として、限定されるものではないが、アルクロフェナック；アルクロメタゾンジプロピオン酸塩；アルゲストンアセトニド；アルファアミラーゼ；アムシナファール；アムシナフィド；アムフェナックナトリウム；アミプリローズ塩酸塩；アナキンラ；アニロラック；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；ベンジダミン塩酸塩；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン；クリプロフェン；クロベタゾールプロピオン酸塩；クロベタゾン酪酸塩；クロピラック；クロチカゾンプロピオン酸塩；コルメタゾン酢酸塩；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド；デソキシメタゾン；デキサメタゾン二プロピオン酸塩；ジクロフェナックカリウム；ジクロフェナックナトリウム；ジフロラゾン二酢酸塩；ジフルミドンナトリウム；ジフルニザール；ジフルプレドネート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラック；エトフェナメート；フェルビナック；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロラック；フェンドザール；フェンピパロン；フェンチアザック；フラザロン；フルアザコルト；フルフェナム酸；フルミゾール；フルニゾリド酢酸塩；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；フルオロメトロン酢酸塩；フルクアゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；フルチカゾンプロピオン酸塩；フラプロフェン；フルブフェン；ハルシノニド；ハロベタゾールプロピオン酸塩；ハロプレドン酢酸塩；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；ヨードプロフェン；インドキソール；イントラゾール；イソフルプレドン酢酸塩；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；ロフェミゾール塩酸塩；ロモキシカム；ロテプレドノールエタボネート；メクロフェナメートナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリゾン二酪酸塩；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モミフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；パラニリン塩酸塩；ペントザンポリサルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；ピロキシカムシンナメート；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート；プリフェロン；プロドリン酸；プロカゾン；プロキサゾール；プロキサゾールクエン酸塩；リメキソロン；ロマザリット；サルコレックス；サルナセジン；サルサレート；サンギナリウム塩化物；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダック；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシ���ム；テシミド；テトリダミン；チオピナック；チキソコルトールピバリン酸塩；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウムが挙げられる。
【０１８１】
既に前記で述べたように、本発明の態様によると、医薬組成物の有効成分は、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドである。
【０１８２】
本発明のこの態様によると、ポリヌクレオチドは医薬上許容される担体と共に哺乳動物細胞に導入され、その導入の結果、この細胞は遺伝子的に修飾され、Ｔ２−ＲＮａｓｅのそこでの発現が可能となる。
【０１８３】
最近、Ａｃｑｕａｔｉらは、ＨＥＹ４およびＳＧ１０Ｇ卵巣腫瘍細胞系へのＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ｃＤＮＡのトランスフェクションはヌードマウスにおいて腫瘍形成性を抑制し、さらに、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた、ＨＥＹ４クローン、および色素性乾皮症ＤＶ４０−不死化細胞系のクローンは、イン・ビトロでの成長の間に顕著な老化プロセスを発生することを示しており（Ａｑｕａｔｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００１  ２２；２０（８）：９８０−８）、かくして、Ｔ２  ＲＮａｓｅでのそのような遺伝的修飾の実現可能性を示す。
【０１８４】
本明細書中、および後の請求の範囲のセクションにおいて、用語「遺伝的修飾」とは、核酸を細胞に挿入するプロセスをいう。該挿入は、例えば、ウイルス感染、注入、トランスフェクション、粒子衝撃、あるいは核酸を細胞に導入するにおいて効果的ないずれかの他の手段によって行うことができ、そのうちいくつかは後にさらに詳細する。遺伝的修飾に続き、核酸は全てが、または部分的に細胞のゲノム（ＤＮＡ）に組み込まれるか、あるいは細胞のゲノムに対して外部に留まり、それにより、安定に修飾された、または一過的に修飾された細胞を供する。
【０１８５】
従って、本発明のこの態様による医薬組成物は、遺伝子治療で使用することができる。
【０１８６】
本明細書において、用語「遺伝子治療」または「遺伝的治療」は相互交換的に用いられ、癌細胞等の増殖性細胞の安定なまたは一過的な遺伝的修飾がこの細胞の増殖の阻害をもたらす療法の方法をいう。そのＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号、および配列番号３によって表３中で確認されるポリヌクレオチドのいずれか１つは、本発明に従って、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドとして使用することができる。加えて、リストされたポリヌクレオチドに対して少なくとも４０％以上相同である、および／または温和なおよび／またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でリストされたポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドも、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドとして使用することができ、但し、それによりコードされる蛋白質はＴ２−ＲＮａｓｅとして特徴付けられ、所望の活性を呈するものとする。さらに、そのようなポリヌクレオチドの部分、突然変異体キメラまたは対立遺伝子もまた、本発明に従って、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドとして使用することもできることが認識され、また、但し、そのようなポリヌクレオチドのそのような部分、突然変異体キメラまたは対立遺伝子は、所望の活性を呈するＴ２−ＲＮａｓｅをコードするものとする。
【０１８７】
Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードする新規なポリヌクレオチドの単離もまた考えられる。そのような単離は、限定されるものではないが、ライブラリースクリーニング、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、標識されたプライマー、標識された縮重プライマー等の当該分野で良く知られた方法を用いて行うことができる。ゲノムおよびｃＤＮＡポリヌクレオチドの双方は、かくして、使用することができる。
【０１８８】
本発明によるポリヌクレオチドは、当該分野で良く知られた方法を用い、ポリペプチドをコードするいずれかの他の蛋白質にイン・フレームで融合させて、融合された蛋白質をコードさせることができる。例えば、該ポリペプチドは、分泌のために、リーダー配列またはシグナルペプチドに融合させることができる。同様に、Ｔ２−ＲＮａｓｅ蛋白質は、当該分野で良く知られた方法を用い、他の蛋白質に融合（結合）させることができる。多くの方法は、蛋白質を含め、異なるタイプの分子を結合させる、または縮合（カップリング）させることが当該分野で知られている。これらの方法は本発明に従って用い、Ｔ２−ＲＮａｓｅをリガンドまたは抗体等の他の分子にカップリングさせ、それにより、特異的細胞型へのＴ２−ＲＮａｓｅの標的化および結合を助けることができる。蛋白質のいずれかの対を、当業者に知られたいずれかの結合方法を用い、一緒に結合または融合させることができる。蛋白質は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルとも呼ばれる）（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ−３４１５）、グルタルアルデヒド結合手法、またはカルボジイミド結合手法を用いて結合することができる。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態によると、該ポリヌクレオチドは、Ｔ２−ＲＮａｓｅコード配列に操作可能に連結した転写制御配列を保有する１以上のセグメントを含む。そのような転写制御配列として、限定されるものではないが、さらに後に詳細に記載されるプロモーターおよびエンハンサーを挙げることができる。これらの転写制御配列は、典型的には、コーディング領域の上流に操作可能に連結され、その転写および／または翻訳を調節するにおいて機能する。
【０１９０】
本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドは真核生物発現ベクター内に含まれる。用語「発現ベクター」とは、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードする配列、および転写制御配列を含み、かつ哺乳動物細胞内でＴ２−ＲＮａｓｅを発現することができる核酸配列をいう。
【０１９１】
哺乳動物遺伝子発現の目的で、ＤＮＡ断片をベクターに挿入する多数の方法は当該分野で知られており、それを用いて、適当な転写／翻訳制御配列および所望のＴ２−ＲＮａｓｅポリヌクレオチド配列を含む、Ｔ−２ＲＮａｓｅコーディング遺伝子発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、イン・ビトロＤＮＡ組換えおよび合成技術、ならびにイン・ビボ遺伝子組換えを含むことができる。Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドの発現は、Ｔ２−ＲＮａｓｅが組換えＤＮＡ分子で感染された、またはトランスフェクトされた宿主細胞で発現されるように、転写制御配列によって調節することができる。例えば、Ｔ２−ＲＮａｓｅの発現は、当該分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御することができる。プロモーター活性は組織特異的であってよく、または代謝産物または投与された物質によって誘導できるものであってよい。
【０１９２】
標的組織内でＴ２−ＲＮａｓｅ発現を制御するのに用いることができるプロモーター／エンハンサーとして、限定されるものではないが、天然ＲＢプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．ら、１９８９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９：１３）、ヒトβ−アクチンプロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ，Ｐ．ら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４８３１−４８３５）、マウス乳癌ウイルスロングターミナルリーピート（ＨＨＴＶ  ＬＴＲ）に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．ら、１９８４、Ｍｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：１３５４−１３６２）、Ｈｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルスのロングターミナルリピート配列（ＭＵＬＶ  ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．ら、１９８５，ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＳＶ４０初期領域プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（Ｗａｇｎｅｒ，ら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、アデノウイルスプロモーター（Ｙａｍａｄａら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２（１１）：３５６７−７１）、および単純疱疹ウイルスＬＡＴプロモーター（Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．ら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：３７９−３８４）が挙げられる。
【０１９３】
腫瘍または癌細胞の遺伝子治療で用いられる哺乳動物宿主細胞に適合する発現ベクターとして、限定されるものではないが、例えば、米国特許第５１７４９９３号によって開示された、プラスミド、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、および非複製アビポックスウイルスが挙げられる。
【０１９４】
いくつかの方法を用いて、本発明のこの態様による発現ベクターを標的哺乳動物細胞に送達することができる。
【０１９５】
例えば、生理学的に適当な溶液等の、かつ有効量の発現ベクターを含有する適当な医薬上許容される担体を局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下またはいずれかの他の効果的な手段によって投与することができる。
【０１９６】
有効量の発現ベクターを含有する生理学上適当な溶液は、血液循環系に全身投与することにより、直接的に到達できないか、あるいは解剖学的に単離することができない癌または腫瘍を治療することができる。
【０１９７】
腫瘍塊を治療するには、有効量の発現ベクターを含有する生理学上適当な溶液を、針を介して、標的腫瘍塊の腫瘍細胞を治療するのに有効な量にて、標的腫瘍塊に直接的に注射することができる。
【０１９８】
別法として、目、胃腸管、生殖泌尿器科管（例えば、泌尿器系膀胱）、肺、および気管支系等の体腔に存在する癌または腫瘍は、針での直接的注射を介して、または癌もしくは腫瘍に罹患した中空器官に入れられたカテーテルもしくは他の送達チューブを介して、有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な組成物（例えば、発現ベクターを除いて滅菌された生理食塩水またはリン酸緩衝液等の溶液）を受けることができる。Ｘ線、ソノグラム、またはファイバー光学可視化システム等の効果的なイメージングデバイスを用いて、標的組織を突き止め、針またはカテーテルチューブをガイドすることができる。
【０１９９】
「裸の」発現ベクターは、哺乳動物細胞によって活発に取り込むことができるので、もし該発現ベクターが適切にパッケージされ、またはカプセル化されれば、取り込みおよび標的化送達は増強されると認識されるであろう。
【０２００】
かくして、本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、医薬上許容される担体は、標的化様式による哺乳動物細胞への発現ベクターの送達に適した送達ビヒクルを含む。
【０２０１】
ウイルス発現ベクターは、感染または形質導入によって発現可能な形態で標的細胞へ送達ビヒクルによって導入することができる。そのような送達ビヒクルとして、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスが挙げられる。ベクター構築体を標的細胞に導入することができ、かつ、その中で細胞増殖阻害量でＴ２−ＲＮａｓｅを発現することができる送達ビヒクルは、前記したいずれかの効果的な方法によって投与することができる。
【０２０２】
別法として、そのような送達ビヒクルとして、限定されるものではないが、前記したリポソーム、ミセル、抗体またはリガンドを挙げることができる。
【０２０３】
本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドを適当な医薬上許容される担体と混合することによって、哺乳動物の哺乳動物細胞の増殖を阻害するのに有用な医薬の調製で用いることができることが認識されよう。
【０２０４】
既に記載したように、Ｔ２−ＲＮａｓｅをコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、Ｔ２−ＲＮａｓｅを発現するのが知られた生物から単離されたｍＲＮＡを増幅するためのＴ２−ＲＮａｓｅ特異的プライマーと共に逆転写ＰＣＲを用い、あるいは適当な生物からＴ２−ＲＮａｓｅをコードするＤＮＡ配列を直接的に単離して、Ｔ２−ＲＮａｓｅ特異的プライマーを用いるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリースクリーニングのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅を含めた種々の方法によって得ることができる。この場合、前記した方法を用いて、前記したＴ２−ＲＮａｓｅの活性な形態のいずれかを単離し、または作成することもできることが認識されよう。
【０２０５】
次いで、精製されたポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入することができ、あるいは適当な転写制御配列を設け、前記したように調製することができる。
【０２０６】
以下の実施例セクションにさらに例示し、かつ前記したように、特異的Ｔ２−ＲＮａｓｅまたはそれをコードするポリヌクレオチドの効果を測定するアッセイもまた本発明の教示に従って提供される。そのようなアッセイは、例えば、増殖する細胞をＴ２−ＲＮａｓｅに曝露することによって、かつ対照の未処理細胞と比較した経時的なそれらの増殖挙動に従って行うことができる。このアッセイは、全て、Ｔ２ファミリーのＲＮａｓｅ  Ｂ１についてさらに本明細書で例示するように、いずれかの特別な適用のための最も優れたＴ２−ＲＮａｓｅを選択するのみならず、イン・ビボ実験中に、あるいは対象の治療の間に、最初の治療用量に移行させることができる用量応答を確立させるために使用することができる。このアッセイを用いて、抗増殖活性部位もしくは部分、またはＴ２−ＲＮａｓｅを測定し、あるいはリボ核酸分解活性を呈しない作製された、または単離された突然変異体の活性を測定することもできる。
【０２０７】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになるだろう。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２０８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２０９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子学、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ著、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第３版）Ｎ．Ｙ．（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なお、これらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２１０】
実施例１
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｂ１  ＲＮａｓｅの特徴付け、および果実樹木における花粉管成長に対するその阻害効果
材料および方法
Ａ．ｎｉｇｅｒ細胞外ＲＮａｓｅの調製および精製
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｂ１（ＣＭＩ  ＣＣ  ３２４６２６）を、１％（ｗ／ｖ）小麦粉および０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムを含有する液体培養中で成長させた。混合物を塩酸でｐＨ３．５に調整し、オートクレーブ処理した。約１０６胞子の接種物を１００ｍｌの培地に懸濁させ、オービタルシェーカー中３０℃にて２００ｒｐｍで１００時間インキュベートした。成長培地を０．２μｍ膜を通し、１０容量の２ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６に対して３回透析した。２リットルの透析した溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６で平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ−ＴＭＡＥ  ６５０（Ｍ）２６−１０（Ｍｅｒｃｋ）カラムに負荷した。結合した蛋白質を、５ｍｌ／分の高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、同一緩衝液中の０ないし１．０Ｍ塩化ナトリウムの５００ｍｌ直線グラジエントで溶出させた。最高のＲＮａｓｅ活性を呈する画分をプールし、２ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６に対して透析し、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６で平衡化したＭＯＮＯ−Ｑ  ５／５  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに５０ｍｌアリコットを負荷した。１０ｍｌの０ないし１．０Ｍ塩グラジエントのみを１ｍｌ／分の流速で用いた以外は、溶出はＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムでのように行った。精製されたＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を用いて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１についての全長ゲノム（配列番号１５）配列、およびコードされたＢ１蛋白質に対応するより短いコーディング領域（配列番号１６）を決定した。
【０２１１】
蛋白質は２８０ｎｍでモニターし、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２４５）に従って測定した。種々の画分を、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｅｌｉ，Ｕ．Ｋ．１９７０．Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５）によって分析した。ＲＮａｓｅ活性は従前に記載されているように測定した（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５６：３７−４１）。
【０２１２】
精製されたＲＮａｓｅ  Ｂ１は、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓらによって記載された手法に従って酵素により脱グリコシル化した（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ，Ｗ．ｐ．ら、１９９１．Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．４：２５８−２６６）。該酵素を０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび５％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノールと混合し、１００℃にて５分間加熱した。一旦冷却すれば、反応混合物を５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液で２．５倍希釈した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を２０ユニット／ｍｌの最終濃度まで加え、インキュベーションを３７℃にて一晩行った。次いで、試料を試料適応緩衝液と混合し、１００℃にて５分間加熱し、１２．５％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０２１３】
ＲＮａｓｅアッセイ
５０および１２ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液を用いて確立された、１０℃増分の２０ないし１００℃の温度の範囲、および０．５ｐＨユニット増分の２．５ないし７のｐＨの範囲を用い、ＢｒｏｗｎおよびＨｏからの改変された手法に従って、ＲＮａｓｅ活性についての最適条件を決定した（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．およびＨｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄ．１９８６  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２：８０１−８０６）。１０μｌの試料を各々、４ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する４９０μｌの氷冷緩衝液に加えた。各試料の半分を、２５％（ｗ／ｖ）過塩素酸中の５０μｌの０．７５％（ｗ／ｖ）硫酸ウラニルを含有する停止溶液を直ちに加えることによって、ブランクとして用いた。残りの半分は１０分間インキュベートし、それに続いて、５０μｌの停止溶液を各々に加えた。１５０００×ｇにおける５分間の遠心分離に続き、上清を蒸留水で２０倍希釈し、吸光度を２６０ｎｍで測定した。ＲＮａｓｅ活性の１ユニットは、１分当たり１のＡ．Ｕ２６０ｎｍの速度で可溶性ヌクレオチドを放出する酵素の量と決定した。
【０２１４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、従前に記載されているように活性ゲルによって可視化した（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｚｚｚ．１５６：３７−４１）。ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有するＳＤＳゲルは、２５％（ｖ／ｖ）イソ−プロパノールを含有するｐＨ３．５の２０ｍＭ酢酸緩衝液で各々１５分間２回、次いで、緩衝液単独で各々１５分間２回洗浄することによって再生した。ＲＮａｓｅ  Ｂ−１を含有する再生されたゲルを、２０ｍＭ酢酸緩衝液中に０．１％ＲＮＡおよび０．８％アガロースを含有するプレート上に置き、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、ゲルを取り出し、アガロースプレートを水中で０．０２％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーで染色して、ＲＮａｓｅ活性を可視化した。
【０２１５】
ＲＮａｓｅの比活性は定量的なアッセイによって評価する：既知の蛋白質濃度の、増大させる容量のＴ２  ＲＮａｓｅのストック溶液を、前記したようにリボ核酸分解活性について分光学的にアッセイし、得られた値をｍｇまたはμｇ蛋白質当たりのＲＮａｓｅ活性のユニットとして表す。
【０２１６】
花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
桃ｃｖ．Ａｌｍｏｇ花粉を従前に記載されているように液体培養中でイン・ビトロにて発芽させた（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５６：３７−４１）。花粉粒を、１００μｌの１５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００μｇ／ｍｌホウ酸、２００μｇ／ｍｌ硫酸マグネシウム、２００μｇ／ｍｌ硝酸カルシウム、および種々の濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有するアリコットに懸濁させた。暗いチャンバー中での２５℃における一晩のインキュベーションに続き、発芽パーセンテージを記録した。花粉管の長さを接眼レンズマイクロメーターで調べた。
【０２１７】
花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の効果もイン・ビボでテストした。桃およびタンジェリン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ，Ｂｌａｎｃｏ  ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ）の完全な花に、ｐＨ３．５の２０ｍＭクエン酸緩衝液中の１００ユニット／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１で開花期の初期段階に噴霧した。各種において、異なる枝にある同段階のさらなる花に緩衝液単独で噴霧したか、対照として未処理のままとした。４８時間の開放受粉への曝露に続き、花柱を３：１の酢酸−エタノール（容量）中で２４時間固定し、蒸留水で洗浄し、８Ｍ水酸化ナトリウム中で一晩吸収させた。蒸留水中での徹底的な洗浄に続き、花柱を縦方向に切断し、スライド上の０．１Ｍリン酸カリウム中の０．１％（ｗ／ｖ）アニリンブルーの液滴中に各々浸漬し、カバーグラスで注意深く潰した。花粉管を落射蛍光顕微鏡によって観察した（ＷＩＢキューブを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０）。
【０２１８】
着果に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
屋外実験はネクタリン（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ  ｖａｒ．Ｎｅｃｔａｒｉｎａ  Ｆａｎｔａｓｉａ）において行った。ほぼ１０％開いた花をつけた３０ないし４０ｃｍ長の枝に、２０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ３．５および０．０２５％トリトン−Ｘ  １００中の異なる濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１を噴霧した。未処理の枝、ならびに緩衝液およびトリトン−Ｘ  １００のみを噴霧した枝を対照として供した。枝に、開花期間（１４日）の間、２ないし３日間隔で噴霧した。１ケ月後、枝当たりの果実の数を調べた。生存性テストでは、種子を胚を通って縦方向に切断し、水中の１％塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムに暗室中で２０℃にて４時間浸漬した。赤色の染色は生きた組織を示した。
【０２１９】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の精製および特徴付け
液体培養で成長したＡ．ｎｉｇｅｒは、かなりの量の細胞外ＲＮａｓｅ  Ｂ１を生じた。６０℃の温度および３．５のｐＨはＲＮａｓｅ活性で最適なことが判明し、引き続いてのＲＮａｓｅアッセイのための標準的条件として採用した。
【０２２０】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１精製は３つの工程を含んだ（表４）。最初の工程において、１０００ユニット／ｍｌおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ蛋白質を含有する粗製濾液を得た。粗製濾液をＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムに通し、プールされた活性な画分（図１、グラフＡ）は０．１ｍｇ／ｍｌ蛋白質を含有し、ＲＮａｓｅ活性は４００００ユニット／ｍｌであった。最後の工程において、プールされた画分をＭＯＮＯ−Ｑカラムに通し、活性なＲＮａｓｅ画分を溶出した（図１、グラフＢ）。この画分は、１．０５μｇ／ｍｌの蛋白質濃度、および５４３０００ユニット／ｍｌのＲＮａｓｅ活性を含んだ。４０および３２ｋＤａの２つの主な蛋白質バンドが、精製されたＲＮａｓｅ  Ｂ１画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に観察された（図２）。ＲＮａｓｅ活性ゲルは、３２および４０ｋＤａ蛋白質に対応する活性なバンドを示した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆに付した場合、単一の蛋白質バンドが２９ｋＤａに出現した。ＲＮａｓｅ活性はＰＮＧａｓｅ消化後に保持した（図示せず）。
2008514224.tif 000006
【０２２１】
花粉管および着果に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
イン・ビトロ実験において、対照花粉粒の７５％は発芽し、花粉管は長さが約０．５ｍｍに到達した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１の成長培地への添加は、用量応答様式で、発芽のパーセンテージおよび花粉管の長さを低下させた（図３）。ＲＮａｓｅ  Ｂ１は顕著な阻害効果、すなわち、０．１μｇ／ｍｌ蛋白質を表す５０ユニット／ｍｌを有し、致命的であり、他方、１２５μｇ／ｍｌのＢＳＡは花粉発芽性および管成長の半分のみを低下させた。
【０２２２】
イン・ビボにて桃の対照花粉管は、受粉から４８時間後に花柱に向けられた柱頭組織を通って成長するのが観察された（図４ａ）。同様な効果が緩衝液のみで処理した花柱で観察された。対照的に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理した柱頭で発芽した花粉粒は短い花粉管を生じ、これはいずれの成長方位も欠くように見え、花柱組織に進入できなかった（図４ｂ）。タンジェリンにおいては、その直径が２ないし３ｍｍである柱頭組織の小さな割合のみが、顕微鏡の観察視野によって捕えられた。従って、少数の花粉管のみが図５に示すように観察された。しかしながら、対照花粉管の正常な成長（図５ａ）およびＲＮａｓｅ処理花粉管の不規則な成長（図５ｂ）の間の差ははっきりと明らかであった。
【０２２３】
ネクタリンｃｖ．Ｆａｎｔａｓｉａにおいては、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は着果の低下を引き起こした（表５）。トリトンＸ−１００を含む緩衝液を噴霧したまたは未処理のままであった枝においては、着果は、各々、４８．３％および３６．３％であった。低いｐＨの緩衝液は着果に対して阻害効果を有するように見えたが、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の５００および１０００ユニット／ｍｌで処理した枝は、各々、２３．３％および１８．４％の果実を結び、これは、用量依存様式において、ＲＮａｓｅの有意な間引き効果を示した。
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【０２２４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理枝においては、多くの発生しなかった小果実が観察された。生存性テストは、対照花（未処理であるか、または緩衝液のみを噴霧）においては、胚組織は赤色に染色され（図６ａ）、他方、ＲＮａｓｅ処理花で発生した胚の組織は茶色に染色され、これは壊死を示した（図６ｂ）。
【０２２５】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｂ１細胞外ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）を均一になるまで精製した。それは３２および４０ｋＤａ糖蛋白質の２つのイソ形態を含有し、２９ｋＤａ蛋白質コアを有することが判明した。最適なＲＮａｓｅ活性は６０℃の温度および３．５のｐＨで観察された。桃（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ  ｃｖ．Ａｌｍｏｇ）およびタンジェリン（Ｃｉｔｒｕｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ，Ｂｌａｎｃｏ  ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ）においては、酵素は花粉発芽および管成長をイン・ビトロならびにイン・ビボで阻害した。屋外試験においては、ＲＮａｓｅはネクタリン（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ  ｖａｒ．ｎｅｃｔａｒｉｎａ  Ｆａｎｔａｓｉａ）着果の低下を引き起こし、正常な胚の発生を阻害した。
【０２２６】
実施例２
Ｔ２−ＲＮａｓｅによる花粉発芽および管成長の阻害は、アクチンとの相互作用を通じて媒介される。
ＲＮａｓｅによる花粉発芽および管成長の阻害はよく認識されているが、この酵素が伸長プロセスに干渉するメカニズムが依然として不明確である。従って、この研究は、花粉管の伸長プロセスに干渉するにおけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の役割を解明するように設定される。
【０２２７】
材料および実験方法
花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ）の葯を室温にて２４時間裂開させ、次いで、新たに用いるか、または−２０℃で貯蔵した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１を実施例１に記載されたように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ成長培地濾液から生産し精製した。花粉を、イン・ビトロにて各々、水中に７％スクロース、１．２７ｍＭ  ＣａＮＯ３、０．１６ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ  Ｋ２ＮＯ３および３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含有する１００μｌの水性培養で発芽させた（ＹｏｋｏｔａおよびＳｈｉｍｍｅｎ  １９９４）。いくつかの培養は、１６μｇ／ｍｌの最終蛋白質濃度まで１００ユニット／ｍｌのＲＮａｓｅ活性を有するＲＮａｓｅ  Ｂ１を補充した。さらなる培養は、活性の５０％の喪失を生じさせるように従前に３０分間沸騰させたＲＮａｓｅ、あるいはいかなる触媒活性も欠くオートクレーブ処理したＲＮａｓｅを補充した。暗所での２５℃における２時間のインキュベーションの後、顕微鏡接眼レンズマイクロメーター下で花粉管の長さを測定した。花粉管を、ＩＫＩ（水中の０．３％Ｉ２および１．５％ＫＩ）で染色して澱粉体（アミノロプラスト）を検出するか、又はＤｉＯ６で染色してミトコンドリアを検出した。
【０２２８】
活発に伸びる１時間花粉管を顕微鏡ステージ上のガラス細胞に移した。花粉管成長パターンおよびオルガネラの運動を、Ａｐｐｌｉｔｅｃ  ＭＳＶ−８００ビデオプレゼンターを用い、Ｈｅｓｌｏｐ−ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ（Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．およびＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｙ．１９９０．Ｓｅｘ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．３：１８７−１９４）を改変してビデオ記録した。イメージはＳｃｉｏｎ  ＬＧ−３フレームグラバーによって８秒間０．８フレーム／秒で捕獲し、次いで、ＮＩＨイメージソフトウェアによってデジタル化し、統合させた。写真は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）およびＰｏｗｅｒ−Ｐｏｉｎｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏ．）ソフトウェアを用いて処理した。
【０２２９】
花粉管アクチンフィラメントに対するＲＮａｓｅの効果
花粉は、イン・ビトロにて、ＲＮａｓｅを含むまたは含まない水性培養で発芽させた。一晩のインキュベーションに続き、花粉管を温和にペレット化し、成長培地を、ＰＢＳＴ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の１０−６ＭテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）−標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で置き換えた。イン・ビボ観察のために、ユリｃｖ．Ｓｔａｒｇａｚｅｒ花を開花の開始において除雄し、１００ユニット／ｍｌのＲＮａｓｅを含有する０．５ｍｌの成長培地を柱頭を通じて花柱管に注入した。ＲＮａｓｅを含まない成長培地が注入された花を対照として用いた。液体を２５℃にて５時間花柱組織に吸収させ、それに続いて、柱頭にユリｃｖ．Ｏｓｎｅｔ花粉を手で受粉させた。２５℃における４８時間のインキュベーションに続き、各雌しべを縦方向に切断し、花粉管を注意深く切り出し、ＴＲＩＴＣ−ＰＢＳＴ溶液中に取り出し、１時間インキュベートした。柱頭における切開は花粉管に影響しなかった。というのは、その生きたプロトプラストがカロースプラグによって保護された末端部分に位置したからである。イン・ビトロおよびイン・ビボの双方の実験において、染色された花粉管をＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０を欠くＴＢＳＴ）で濯ぎ、スライドグラス上に置き、落射蛍光顕微鏡（ＵＳＨ−１０２Ｄ水銀灯を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０）で観察した。
【０２３０】
アクチンのＲＮａｓｅ  Ｂ１への結合
ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびアクチンの間の相互作用は、Ｓｉｍｍ（Ｓｉｍｍ，Ｆ．Ｃ．ら、１９８７．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：４９−５４）から改変されたように定量した。ウサギ筋肉グロブ（Ｇ−）アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を、室温にて３０分間、緩衝液Ｆ（１０ｍＭトリスｐＨ８、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１Ｍ  ＫＣｌおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中でフィラメント状（Ｆ−）アクチンへ重合した。各々３０μＭのＦ−アクチンを含有する５０μｌの試料を１ないし３３μＭのＲＮａｓｅ  Ｂ１と共に４℃にて一晩インキュベートした。対照として、各濃度のＲＮａｓｅを緩衝液Ｆ単独と共にインキュベートした。試料を１５０００ｇにおいて４０分間遠心分離し、上清のＲＮａｓｅ活性を測定した（Ｒｏｉｚ，Ｌ．Ｇｏｒｅｎ，Ｒ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．１９９５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．９４：５８５−５９０）。
【０２３１】
花粉管上でのＲＮａｓｅ  Ｂ１のイムノゴールド銀染色
イムノゴールド銀染色（ＩＧＳＳ）を用いてユリ花粉管へのＲＮａｓｅ付着を検出した。ポリクローナル抗体をウサギにおいてＲＮａｓｅ  Ｂ１に対して惹起させた（Ａｍｉｎｏｌａｂ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）。イン・ビトロで２時間のユリ花粉管をＰＢＳＴ中の２．５％グルタルアルデヒドで４℃にて一晩固定した。花粉管をＰＢＳＴ中で１時間洗浄し、１％ＢＳＡおよび２％スキムミルクを含有するＰＢＳＴ中で１時間ブロックし、ＰＢＳＴ中に１：５００希釈した抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１中で１時間インキュベートした。ウサギ免疫前血清（ＰＩＳ）を対照として用いた。花粉管を各々ＰＢＳＴ中で１０分間３回洗浄し、次いで、ＰＢＳＴ中に１：１００希釈した５ｎｍ金粒子と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ中で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ中での２回の１０分の洗浄および水中での１回の１０分の洗浄の後、銀−染色キット（ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を反応の最終発色で用いた。花粉管を組合せキット溶液中に１０ないし１５分間浸漬させ、過剰の蒸留水中で洗浄し、光学顕微鏡下で観察した（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４０）。
【０２３２】
実験結果
ＲＮａｓｅを含まない成長培地中でイン・ビトロにて発芽したユリの花粉管の対照試料は、長さが約３００μｍに到達した。同一条件下でＲＮａｓｅで処理した培養は、長さが１６０μｍまでにしか到達しなかった。ＲＮａｓｅの煮沸またはオートクレーブ処理は、各々、長さが１３０および１７０μｍの花粉管を生じた。花粉管の３つのＲＮａｓｅ処理群の間の差は、有意でないと見なされた。
【０２３３】
澱粉染色は、対照試料のアミロプラストが、先端ゾーンを除いて、花粉管に沿って拡大するのが観察された（図８ａおよび６５ｂ）。他方、ＲＮａｓｅ処理花粉管においては、ＩＫＩで染色された体は先端ゾーンに蓄積した（図８ｂおよび６５ａ）。ＤｉＯ６染色は、ミトコンドリアが対照花粉管先端には存在せず、ＲＮａｓｅ処理の後に先端に蓄積することを示した（図６５ｃおよびｄ）。
【０２３４】
活発に拡大する花粉管の統合されたビデオイメージは、細胞質流れ線を呈した（図９ａおよび９ｂ）。対照試料においては、管周囲における求頂的な流れ、および中央における求基的な流れのように、正常な花粉管発生に特徴的な連続的縦方向運動が最も普通であり、先端ゾーン直下に「逆泉」パターンを形成する（図９ａ）。先端ゾーンそれ自体は、かなり小さな体、主としてＰ−粒子によって占められ、その運動パターンは殆ど観察されなかった。ＲＮａｓｅ阻害花粉管においては、アクチンフェラメントアセンブリーの破壊は明らかである。成長の止まった成長先端は膨潤しているように見え、よく見える澱粉および脂質粒子は先端ゾーンに到達していた（図９ｂ）。連続的運動は検出できなかったが、その代わり、拡大した不規則なイメージは、ランダムに回転する細胞質体を示した。
【０２３５】
アクチンフェラメントの分布に対するＲＮａｓｅの効果を、１時間のイン・ビトロおよび４８時間のイン・ビボ花粉管で調べた。イン・ビボ花粉管は約３ないし４ｃｍの長さに到達し、それらのＴＲＩＴＣ−ファロイジン染色はイン・ビトロ管におけるよりも強かった。しかしながら、ＲＮａｓｅ効果の態様は双方の実験において同様であった。対照において、アクチンミクロフェラメントは管軸に沿って縦方向にアセンブルされ、先端ゾーンにおいて微細なネットワークを形成した（図１０ａ）。他方、ＲＮａｓｅ処理花粉管においては、Ｆ−アクチンの塊は先端細胞壁に蓄積した（図１０ｂ）。
【０２３６】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびアクチン間の相互作用は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いて定量した。アクチン−ＲＮａｓｅ  Ｂ１結合実験においては、０．４５において横軸と交わる回帰線（図１１）は、ＲＮａｓｅ：アクチンのモル比は０．４５であることを示し、これは、２つのアクチン分子が各ＲＮａｓｅ分子に結合することを示唆する。
【０２３７】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で発現した花粉は光学顕微鏡用に準備し、抗ＲＮａｓｅ抗体を用いてＩＧＳＳによってＲＮａｓｅの位置を測定した（図１２ａないしｃ）。ＲＮａｓｅなしに（図１２ａ）、またはＲＮａｓｅがあるが、ＰＩＳで処理して（図１２ｂ）成長させた花粉管において、細胞壁外部表面は銀染色を欠いた。他方、ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理した花粉管においては、明瞭なイムノゴールド銀染色が出現し、先端ゾーンに蓄積した（図１２ｃ）。
【０２３８】
この研究においては、ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）花粉発芽および管伸長が、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１によって特に阻害された。元の触媒活性の９０ないし１００％を欠く煮沸したまたはオートクレーブ処理したＲＮａｓｅは、同様な阻害効果を示した。結果は、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅが、花粉管伸長に対するＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果に明らかに関連したアクチン結合活性を有する蛋白質であることを示す。ＲＮａｓｅ  Ｂ１の触媒活性に関連しないこのアクチン結合活性は、花粉管アクチンフェラメントの配置を変更し、それにより、細胞質のストリーミング、細胞運動性および成長を破壊する。
【０２３９】
これらの結果は、Ｔ２  ＲＮａｓｅが花粉管成長の効果的な阻害剤であることを示し、花粉管Ｆ−アクチン細胞骨格ネットワークの構造に干渉することを示す。対照花粉管において、ビデオ−イメージ、ヨウ素およびＤｉＯＣ６染色は、花粉管に沿っての正常な細胞質ストリーミング、および見掛けの細胞内帯状分布を示した。ＴＲＩＴＣ−染色は、管に沿って平行束上に、および先端ゾーンにおけるデリケートなメッシュワークにて配置されたアクチンフェラメントを示した。対照的に、Ｔ２  ＲＮａｓｅ阻害花粉管は、方向付けされた細胞質ストリーミングの喪失によって、および先端に向けてのＦ−アクチンネットワークの突然の崩壊によって特徴付けられた。
【０２４０】
もし花粉管成長の阻止が、厳格に、ＲＮＡ分解および蛋白質生合成枯渇の結果であれば、ＲＮａｓｅ活性を欠く不活化されたＴ２  ＲＮａｓｅは効果的でないであろう。しかしながら、Ｔ２  ＲＮａｓｅは、そのＲＮａｓｅ活性にも拘らず、花粉管成長を阻害することが判明した。さらに、活発に成長する花粉管においては、Ｔ２  ＲＮａｓｅの添加は、数秒でオルガネラ運動の破壊をもたらし、これは、蛋白質合成の徐々にというよりは直接的な阻害を示唆する。さらに、Ｔ２  ＲＮａｓｅ処理ユリ花粉管は、数時間のオルガネラの強い回転を維持し、これは、生存性の低下がないことを示す。先端成長細胞に対するＦ−アクチンフィラメント破壊の阻害効果を示す他の研究は、正常なアクチン重合が花粉管成長に必須であることを示した。かくして、単一の仮定に限定されることを意図しないが、これらの結果は、（ＲＮａｓｅ分解を介するよりはむしろ）Ｆ−アクチン変調を介して花粉管成長を阻害するＴ２  ＲＮａｓｅの能力が、花粉管成長阻害の主な原因であることを示唆する。
【０２４１】
実施例３
ヒト結腸癌細胞に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
花粉管におけるＲＮａｓｅ  Ｂ−１について発見されたアクチン結合活性は可能な細胞傷害性活性にヒントとなったので、ヒト結腸癌細胞に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞傷害性効果を調べることを決定した。
【０２４２】
材料および実験方法および結果
細胞培養
全ての実験はイン・ビトロで行った。ヒト結腸腺癌（ＨＴ２９）細胞を、１０％胎児子ウシ血清、１％グルタミンおよび１０％抗生物質−抗真菌溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ）中で成長させた。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。ＲＮａｓｅ  Ｂ１溶液はＰＢＳ緩衝液、ｐＨ６．８中で作成した。
【０２４３】
予備的細胞生存性アッセイ
細胞を５０ｍｌフラスコでインキュベートした。各フラスコは、異なる濃度（１０−８ないし１０−６Ｍ）のＲＮａｓｅ  Ｂ１の非存在または存在下、７ｍｌ培地中に２×１０５細胞を含有した。細胞を４８時間または７２時間成長させ、次いで、生存および非生存細胞をトリパンブルー染色を用いて別々にカウントした。
全ての処理において、７２時間成長させた細胞の合計数（５５ないし６０×１０５）は、４８時間の培養後に得られた細胞の数（２５ないし３０×１０５）を約２倍だけ超えた（図１３ａ）。成長培地中でのＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在は、細胞成長に対して有意な効果を有しなかった。しかしながら、死滅した細胞の数に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の小さいが有意な効果が、４８時間および７２時間のインキュベーション双方において見出された（図１３ｂ）。
【０２４４】
クローン原性アッセイＩ
腫瘍細胞の長期間生存は、クローンを分裂させ、生産するそれらの能力によって測定する。細胞を、１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地中で４８時間プレインキュベートし、次いで、トリプシン処理し、洗浄し、そしてＲＮａｓｅ  Ｂ１を欠く成長培地に再懸濁させた。９６ウェルマイクロタイタープレートに平板培養するに先立ち、細胞を、各ウェル（２００ｍｌ）中５０ないし１０５細胞の間の範囲に系列５倍希釈に希釈した。プレートを、新鮮な成長培地を加えることなく、前記した条件で１４日間インキュベートし、その後、コロニーを固定し、メチレンブルーで染色した。各ウェル中のクローン原性細胞を、クローン可視化に続いてナンバリングした。ＲＮａｓｅ  Ｂ１を欠く培地中で最初の４８時間プレインキュベートした以外は、対照細胞を前記したように処理した。
【０２４５】
双方の処理において、同様な数のコロニーが、１００細胞を平板培養したウェルで観察された（図１４）。ＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞傷害性効果は、より高い密度の細胞を含有するウェルで出現した。各々５００細胞で平板培養したウェルにおいて、対照およびＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞は、各々ウェル当たり１８０および１００コロニーを生じた。さらに、各々１０００細胞で平板培養したウェルにおいて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞はウェル当たり約２５０コロニーを形成し、他方、対照細胞は、連続層に融合した多数のコロニーを形成し、かくして、図１４でカウントおよび説明することができなかった。より高い密度で平板培養した細胞は、培地を変更しない培養で生存しなかった。
【０２４６】
クローン原性アッセイＩＩ
増殖し、コロニー化する腫瘍細胞の能力を、ＲＮａｓｅ  Ｂ１への短時間の  ｖｓ．連続的な暴露において調べた。該実験は、（ｉ）対照細胞、（ｉｉ）１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する培地と共にプレインキュベートし、次いで、ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含まない成長培地中でコロニー化させた細胞、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）におけるようにプレインキュベートし、次いで、コロニー化アッセイの間に１０−６Ｍ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する成長培地中でインキュベートした細胞を用いて、クローン原性アッセイＩに記載したように行った。これらの実験において、最初の密度はウェル当たり２５０ないし１０００細胞の間の範囲であり、コロニー化期間は７日であった。
【０２４７】
１４日のプレインキュベーションと比較して本実験で用いた短い時間（７日）のインキュベーションは、結果として、緩和されていないコロニーをもたらし、これは、高密度の細胞を含有するウェルにおいてさえ区別できなかった。全ての密度において、ＲＮａｓｅ  Ｂ１での４８時間のプレインキュベーションは、対照と比較して、コロニー化する細胞の能力の２０ないし３０％の低下をもたらした（図１５）。しかしながら、各密度において、ＲＮａｓｅ  Ｂ１への連続的暴露は、クローン原性の劇的な９０％の低下をもたらした。図１６ａないしｃは、連続的ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞（図１６ｃ）が、ＲＮａｓｅ  Ｂ１において４８時間プレインキュベートした細胞（図１６ｂ）または対照細胞（図１６ａ）よりも小さく、染色性は低かったことを示す。この結果、ＲＮａｓｅ  Ｂ１がコロニー成長速度に影響したことを示す。
【０２４８】
かくして、本明細書中で示した結果から明瞭に示されるように、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、ヒト腺癌ＨＴ２９癌細胞に対して明瞭な細胞傷害性効果を有する。ＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞傷害性効果は、細胞生存性の低下よりはむしろ細胞クローン原性の低下を介して発現される。ＲＮａｓｅ  Ｂ１は腫瘍細胞に対して長期間の効果を有する可能性がある。ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、対照と比較してコロニー成長速度の低下を引き起こし、これは、それが増殖する細胞の能力に影響し得ることを示す。
【０２４９】
実施例４
ラットモデルにおける腫瘍発生に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１のイン・ビボ効果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の抗癌効果をさらに調べるために、イン・ビボ実験をラットにおいて行った。
【０２５０】
材料および実験方法
Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ由来の４週齢雄ラットを６つの群に分けた。いくつかの群においては、ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）の５回の毎週の注射によって結腸癌を発生するようにラットを誘導した。この実験においては、ＲＮａｓｅ  Ｂ１投与の２つの様式を調べた。浸透圧ミクロポンプによってＲＮａｓｅ  Ｂ１を結腸に直接的に適用したか、あるいは腸溶被覆マイクロカプセルを用いて経口投与した。各ラット群が受けた処置の全組を図１のスキームによって記載する。実験の間、ラットの体重を毎週測って、その成長速度に対するＤＭＨおよび／またはＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果をモニターした。ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理した群においては、各ケージから毎週糞を収集し、６０℃で乾燥した。２５０ｍｇの乾燥糞の試料を粉砕し、リン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）に再度溶解させた。遠心分離に続き、上方溶液中のＲＮａｓｅ活性をＲｏｉｚら（Ｒｏｉｚ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１２５（１）：９−１４．２０００）に記載されているように調べた。
【０２５１】
浸透圧マイクロポンプを介するＲＮａｓｅ  Ｂ１の結腸への投与
ＲＮａｓｅ  Ｂ１を浸透圧マイクロポンプ（ＡＬＺＥＴ）に負荷した。該ポンプをラットの腹部に皮下移植した。ラットの結腸の容量が約４ｍｌであると仮定して、少なくとも６週間、結腸中で１０−６Ｍの計算された濃度にて、カテーテルを介して、浸透圧ポンプはＲＮａｓｅ  Ｂ１を直接的に結腸に一定放出させた。ラットを以下のように処理した：１つの群のラットには、全ＲＮａｓｅ活性を有する、「生きた」ＲＮａｓｅ  Ｂ１（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）を含有するポンプを移植した。第２の群のラットには、いずれのＲＮａｓｅ活性も欠く、オートクレーブ不活化ＲＮａｓｅ  Ｂ１（Ｉ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１）を含有するポンプを移植した。他方、第３の群のラットには、最初の２つの群においてはＲＮａｓｅ  Ｂ１ビヒクルとして用いたＰＢＳを含有するポンプを移植し、対照として供した。
【０２５２】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の可能な予防的効果を調べるために、最初のＤＭＨ注射から１ないし９週間後に、選択されたＤＭＨ処理マウスにＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えた。次いで、ラットを屠殺し、その結腸を切り出し、ＰＢＳで、次いで、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳで洗浄した。その後、結腸を縦方向に開き、濾紙上で、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド中で少なくとも１時間固定した。ＰＢＳ中の０．０２５％メチレンブルーでの染色に続き、結腸粘膜を、異常な陰窩病巣（ＡＣＦ）について低倍率下で顕微鏡を介して観察した。ＡＣＦを末端側（５ｃｍ）結腸においてカウントした。
【０２５３】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の治療効果を調べるために、ラットの残りには、最初のＤＭＨ注射から１２ないし１７週間後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えた。結腸を切り出し、前記したように固定し、腫瘍をカウントし、測定した。組織病理学的調査のために、各腫瘍をパラフィンに包埋した。薄い（１０μｍ）切片を染色し、悪性の度合いを評価した。
【０２５４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の経口投与
マイクロカプセルの調製
マイクロカプセルはＬｉｎらによって記載された改変された手法で調製した（Ｌｉｎ  Ｊ．Ｊ．，ら、１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）：１５６−６２）。０．６グラムの凍結乾燥したＲＮａｓｅ  Ｂ１および２．４グラムのグルコースの混合物を乳鉢および乳棒によってよく粉末化した。微細な粉末を、２００ｍｌの流動パラフィンおよび２ｍｌのＳｐａｎ−８０を含有する１Ｌのビーカーに注ぎ、６００ｒｐｍにおいて２０分間攪拌した。アセトン−エタノール−セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）溶液を前記攪拌混合物（９：１酢酸：９５％エタノールの４０ｍｌ中３．２グラムのＣＡＰ）に注意深く加え、フード中さらに２時間攪拌して、痕跡量のアセトンを除去した。３０ｍｌのエーテルを加えることによって、マイクロカプセルを硬化させ、ブヒナー漏斗を用いて濾紙上で乾燥し、痕跡量の流動パラフィンを、３０ｍｌのエーテルでのさらなる２回の洗浄によって除去した。次いで、マイクロカプセルを一晩乾燥させ、微細なメッシュに通した。殆どのマイクロカプセルは２００および５００μｍの間であった。
【０２５５】
予備的実験（図１８）において、ＣＡＰマイクロカプセルは、胃環境を表す酸性ｐＨにおいて不溶性であることが判明した。しかしながら、１時間後アルカリ性ｐＨにおいて最大ＲＮａｓｅ活性に到達し、これは、マイクロカプセルはその内容物を容易に腸中に放出できることを示した。
【０２５６】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１マイクロカプセルの経口投与
ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはプラセボとしてのグルコースを含有するマイクロカプセルを、粉砕されたＰｕｒｉｎａエサと混合した。各ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットには１．６ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１の日用量を与えて、結腸中１０−５Ｍの最終濃度を得た。経口投与についての実験の詳細は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の予防的効果を評価しつつ（図１７）、遅延した停止（１１週）以外は、マイクロポンプ投与について前記した通りであった。
【０２５７】
実験結果
ラット成長速度に対する異なる処理の効果
ラット初期体重は約２００グラムであった。実験は、前記したように、各処理について異なる時点で終了した。一般に、ラットは約４００ないし５００グラムの最終体重に到達し、異なる処理の間で有意な差はなかった（図１９ａないしｄ）。しかしながら、ＤＭＨ処理群は、ＤＭＨの存在下または非存在下において、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理群と比較して体重の僅かな減少を示した。
【０２５８】
ラット糞におけるＲＮａｓｅ活性
図２０ａないしｃは、８週間の間、予防的様式で、ＲＮａｓｅ  Ｂ１、Ｉ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＰＢＳを含有する浸透圧ポンプを移植したラットの糞におけるＲＮａｓｅ活性の変化を示す（図１）。ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したラットにおいては（図２０ａ）、糞におけるＲＮａｓｅ活性は、Ｉ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１（図２０ｂ）またはＰＢＳ（図２０ｃ）で処理したラットよりも５倍高かった。この活性は５週間高く維持され、次いで、ポンプ中のＲＮａｓｅ  Ｂ１の貯蔵器が空になるにつれて徐々に減少した。基礎内因性ＲＮａｓｅ活性は、２つの後者の群の糞で検出された。
【０２５９】
同様なパターンが、マイクロカプセル化されたＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えたラットで観察されたが、グルコースのみを含有するマイクロカプセルを与えられたラットと比較して、８倍高いＲＮａｓｅ活性が検出された（図２１）。この実験において、ＲＮａｓｅ活性の暫時の減少は、ラット体重の増加および、その結果としての、結腸容量の増加の結果として説明することができる。
【０２６０】
予防剤としてのＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
ポンプ部位における感染が観察されたので、ポンプ−移植ラットを８週間後に屠殺した。この段階においては、ＡＣＦのみが明らかであった。ＡＣＦは、癌形成の初期相の間のラット結腸の癌形成性変化の代用バイオマーカーである。陰窩中の杯細胞はより大きくなり、正常な粘膜細胞と比較して強く染色された。ＡＣＦカウントは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１処置により劇的に低下した（図２２）。結腸粘膜に対する損傷効果は、ＤＭＨの非存在下で、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したラットで観察されなかった。
【０２６１】
マイクロカプセル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えたラットにおいて、実験は、最初のＤＭＨ投与に続いて１１週間継続した。その時点において、腫瘍およびＡＣＦが共に存在した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、対照と比較して、結腸当たりの腫瘍の数（図２３ａ）、腫瘍サイズ（図２３ｂ）、ならびにＡＣＦの数（図２３ｃ）の低下を引き起こした。
【０２６２】
加えて、結腸腫瘍の色の多様性が観察された；強い血液供給を有した赤色腫瘍（図２４ａ）、血管をほとんど欠く白色腫瘍（図２４ｂ）、および少数の血管しか持たない「ピンク色」腫瘍（図２４ｃ）。グルコース処理ラットにおいて、全ての腫瘍は赤色であった。他方、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットにおいて、赤味がかった腫瘍の数の大幅な低下が観察された（図２４ｄ）；腫瘍の１０％および５０％は、おのおの、ピンク色および白色であった。これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の抗血管形成効果を明らかに示す。
【０２６３】
腫瘍は組織病理学的パラメータによって良性または悪性として区別することもできよう。アデノーマと言われる良性腫瘍（図２５ａ）は増殖した粘膜層と定義され、および時々は、アデノパピローマの発生によって定義することができるが、粘膜下組織は無傷であって、他の結腸層からよく区別される。腺癌と言われる悪性腫瘍においては、粘膜細胞は粘膜下組織直下に進入し、結局は、組織の組織化の喪失に至る（図２５ｂおよび２５ｃ）。グルコースまたはＲＮａｓｅ  Ｂ１で予防的に処理されたラットにおける異なるタイプの腫瘍の分布の調査は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１が悪性の程度を明瞭に低下させたことを示した（図９ｄ）。
【０２６４】
治療剤としてのＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
浸透圧ポンプによる直接的な、または経口による適用の双方の様式において、よく発達した腫瘍を、実験の１２ないし１７週間、ＲＮａｓｅ  Ｂ１に暴露した。浸透圧ポンプによって処理されたラットにおいて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は結腸当たりの腫瘍の数の低下を引き起こした（図２６ａ）。対照に対して約５０％の阻害効果は、不活化されたリボ核酸分解活性を有するＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したラットにおいて最も有意であった。
【０２６５】
サイズ分布によって示されるように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１もまた腫瘍成長に影響した（図２６ｂ）。一般に、殆どの腫瘍は３ないし５ｍｍの直径を有したが、ＰＢＳ処理ラットにおいては、９ないし１２ｍｍを超える例外的に大きな腫瘍が出現した。この結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１が予め存在する腫瘍の発達を阻害し、または阻止することを示唆する。それにもかかわらず、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果の間に有意な差は観察されなかった。
【０２６６】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１予防的効果の実験におけるように、脈管形成のパターンもまた、浸透圧ポンプを介して適用されたＲＮａｓｅ  Ｂ１による影響を受けた（図２６ｃ）。ＰＢＳ処理ラットにおいては、腫瘍の殆ど（約８０％）はかなり血管が形成され、色は赤色であった。対照的に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットの双方においては、腫瘍の３０％のみが赤色であり、他方、他の腫瘍は血管形成が貧弱であり、ピンク色または白色に見えた。かくして、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、予め存在する腫瘍においても脈管形成を低下させるようである。
【０２６７】
カプセル化されたＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えたラットにおいては、処置の効果は、浸透圧ポンプによって得られたものよりも有意性は低かった（図２７ａないしｃ）。この結果は、蛋白質の非常に小さな割合が、カプセル化されたＲＮａｓｅ  Ｂ１を与えた場合に結腸に到達することを仮定することによって説明することができる。前記したように、マイクロカプセルは実際には胃を通過するが、小腸および盲腸を通る長い経路を依然として有する。この仮定をテストする実験は、従って、蛍光蛋白質を負荷したＣＡＰマイクロカプセルを用いて行い、ラットに与えた。６時間後にラットを屠殺し、その胃腸管の内容物を蛍光顕微鏡下で観察した。十二指腸においては、マイクロカプセルは溶解し始めたことが判明した。該溶解は、さらに回腸および空腸において進行した。マイクロカプセルが盲腸に到達すると、蛍光の殆どは盲腸内容物に拡散した。マイクロカプセルが損傷したので、ＲＮａｓｅ  Ｂ１効果は、腸および盲腸に存在するプロテアーゼにより低下し得る。
【０２６８】
経口投与されたＲＮａｓｅ  Ｂ１は予め存在する腫瘍の数およびサイズを減少させなかったという事実にもかかわらず、結腸の腫瘍タイプの間の分布は僅かに影響を受けた（図２７ｃ）。グルコース−およびＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスは、各々、約６０％および４０％赤色腫瘍を有した。本処方での経口投与されたＲＮａｓｅ  Ｂ１も脈管形成に影響を及ぼすが、中程度であるようである。
【０２６９】
実施例５
イン・ビトロにおけるヒトＨＴ−２９結腸癌細胞に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
材料および実験方法
細胞成長条件
全ての実験は、ヒト結腸腺癌（ＨＴ−２９）細胞で行った。細胞は、１０％胎児子ウシ血清、１％グルタミンおよび１％抗生物質−抗真菌剤溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充した、ＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｔ  Ｈａｅｍｅｋ）を含有する５０ｍｌフラスコ中で成長させた。細胞をトリプシン処理し、５×１０４細胞を含有する２ｍｌ培地を６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。いくつかのプレートには、１０−６Ｍの最終濃度までＲＮａｓｅ  Ｂ１を補充した。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中にて３７℃でインキュベートした。４８時間後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下での培地を、各々、各ウェル中に置き換えて、成分およびＲＮａｓｅ  Ｂ１の一定の供給を維持した。４日後に、培地を取り出し、細胞培養を、氷上で１５分間、ＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）ｐＨ７．２中の４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を異なる目的で以下のように染色した。
【０２７０】
細胞内アクチンについての直接的染色
細胞をＰＢＳ中で洗浄し、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳ中で室温にて１時間浸透させた。ＰＢＳでの３回の洗浄の後、細胞を１０−６ＭテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）−標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で１時間アクチンにつき染色し、ＰＢＳ中で４℃にて一晩放置して、いずれの過剰の染色材料も除去した。細胞をスライドガラス上の水中に広げ、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ）５１０（Ｚｅｉｓｓ）を用いて可視化した。
【０２７１】
膜アクチンについての免疫染色
細胞をホルムアルデヒドで固定し、前記したようにＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に１：５００希釈したウサギ抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、細胞を、同一条件にて、ＰＢＳ中に１：１００希釈したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧと共にさらに１時間インキュベートし、再度洗浄し、前記したように可視化した。
【０２７２】
細胞表面でのＲＮａｓｅ  Ｂ１の免疫染色
ポリクローナル抗体（Ａｍｉｏｌａｂ，Ｉｓｒａｅｌ）を精製されたＲＮａｓｅ  Ｂ１に対してウサギにおいて惹起させた。抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、前記した手法に従い、ＨＴ−２９免疫染色において一次抗体として用いた。
【０２７３】
実験結果
細胞内アクチンについての直接的染色
ＲＮａｓｅ  Ｂ１なくして成長する対照細胞において、微細なアクチンネットワークがＴＲＩＴＣで染色されて観察され、細胞質を満たしていた。明るい染色が膜表面で観察された（図２８ａ）。対照的に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞において、各細胞における細胞質の膜および末梢ゾーンは強く染色され（図２８ｂ）、これは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の外部からの添加に対する応答としてのアクチンネットワークの再編成を示した。
【０２７４】
膜アクチンについての免疫染色
ＦＩＴＣ−免疫染色は、対照細胞における膜ゾーンでのアクチンの微小な蛍光スポットを示した（図２９ａ）。この結果は、図２８ａで示されたＴＲＩＴＣ染色と合致する。この実験において、界面活性剤は使用せず、かくして、抗体は細胞質に殆ど浸透しなかった。従って、これらの細胞においては、膜アクチンは外部環境と相互作用するように見える。ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞において、かなり弱い免疫染色が観察され（図２９ｂ）、これは、膜アクチンに従前に結合したＲＮａｓｅ  Ｂ１が、抗アクチン抗体の結合に干渉したことを示唆する。
【０２７５】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理されなかったさらなる細胞は、予め混合したウサギ抗アクチンおよび１μＭアクチンと共にインキュベートした。図２９ｂに記載したように、同様な僅かな蛍光が観察された（示さず）。自然発生ＦＩＴＣ蛍光の可能性を排除するために、抗アクチンを省略する以外は、前記したように細胞を処理した。蛍光染色は検出されなかった。
【０２７６】
細胞表面でのＲＮａｓｅ  Ｂ１の免疫染色
非常に僅かなＦＩＴＣ−蛍光が、抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１と共にインキュベートした対照細胞で出現した（図３０ａ）。しかしながら、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞は強い蛍光応答を呈した（図３０ｂ）。この結果は、細胞の表面にわたって、特に細胞のエッジおよび延長でのＲＮａｓｅ  Ｂ１の顕著な存在を示す。抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１の代わりのウサギ免疫前血清（ＰＩＳ）での処理の結果、非常に弱い蛍光がもたらされた（図３０ｃ）。
【０２７７】
実施例６
ユリ花粉管成長に対するＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
材料および実験方法
ＲＮａｓｅ  Ｂ１のヨードアセチル化
ＲＮａｓｅ  Ｂ１のヨードアセチル化はＩｒｉｅら（Ｉｒｉｅ  Ｍ，ら、１９８６  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（３）：６２７−３３）に従って行った。ＲＮａｓｅ  Ｂ１を、１０ｎＭの最終濃度まで、０．１Ｍヨードアセテートを含有する２．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液に溶解させた。３７℃における一晩のインキュベーションの後、蛋白質をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５カラムで脱塩した。蛋白質を含有する画分を集め、水に対して徹底的に透析した。凍結乾燥の後、１０ｍｇの蛋白質を得た。ヨードアセチル化（ＩＡｃ−）ＲＮａｓｅ  Ｂ１  ＲＮａｓｅ活性を非修飾ＲＮａｓｅ  Ｂ１と比較した。
【０２７８】
ユリ花粉管に対するＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
凍結乾燥したＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１を、水中の７％スクロース、１．２７ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．１６ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ  ＫＮＯ３および３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するユリ花粉管成長培地中に１または５μＭの最終濃度まで溶解させた（Ｙｏｋｏｔａ，Ｅ．およびＳｈｉｍｍｅｎ，Ｔ．１９９４．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １７７：１５３−１６２）。ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ）花粉粒を、イン・ビトロにて、１０−６ＭのＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在または非存在下で、１００μｌの成長培地を含有する管中で発芽させた。さらなる対照として、ユリ花粉を、成長培地中で同一濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＢＳＡにて発芽させた。暗所での２５℃における１．５時間のインキュベーションの後、花粉管長さを光学顕微鏡下で各処理において測定した。
【０２７９】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１のヨードアセチル化
ヨードアセテートは、ＲＮａｓｅの活性部位中のヒスチジン残基への結合を介してＲＮａｓｅ活性の阻害をもたらす。ＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１のＲＮａｓｅ活性は、非処理ＲＮａｓｅ  Ｂ１と比較して９０％低かった。
【０２８０】
ユリ花粉管成長に対するＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果
対照ユリ花粉管は０．２６ｍｍの長さに到達する（図３１）。この実験においては、ＢＳＡは対照として用いた。というのは、それは花粉管に対していずれの細胞傷害性効果も有しないからである。実際に、１０−６Ｍの濃度においては、ＢＳＡは花粉管成長に対して有意な効果を有しなかった。５×１０−６Ｍ  ＢＳＡの阻害効果は、花粉管が成長培地浸透圧ポテンシャルの変化に対して敏感であるという事実の結果として説明することができる。ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１の双方は、花粉管成長に対して明瞭な阻害効果を呈した。双方の濃度において、ＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＲＮａｓｅ  Ｂ１よりも効果的であったが、差は有意でなかった。かくして、ユリ花粉管において、ＩＡｃ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１は非修飾ＲＮａｓｅ  Ｂ１と同様式で花粉管成長を阻害し、ＲＮａｓｅ活性の喪失がその阻害効果を低下させないことを示す。
【０２８１】
実施例７
Ｔ２  ＲＮａｓｅファミリーのメンバーは抗脈管形成および抗癌特性を示す。
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、基本的な特徴、例えば、触媒活性部位の完全な相同性、高温および低ｐＨにおける最適なＲＮａｓｅ活性、少なくとも２４ｋＤａの分子量（ＲＮａｓｅ  Ａファミリーのそれの２倍）、およびグリカン鎖の存在を共有することが示されている。Ｔ２  ＲＮａｓｅ蛋白質のメンバーが抗脈管形成特性を有するかを判断するために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管形成アッセイを以下のように使用した。
【０２８２】
材料および方法
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管形成アッセイ−概して、該実験はＰｏｎｏｅ，Ｍ．Ｌ．，２００１においてＲＮａｓｅ  Ｂ１について既に記載されたように行った（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍａｔｒｉｇｅｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｃ．（ｅｄ．）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２０５−２０９）。簡単に述べると、新たに単離したヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、２０％ＦＣＳ、１％グルタミン、１％抗生物質−抗真菌溶液、０．０２％のＥＣＧＦおよび５０Ｕ／１００ｍｌのヘパリンを補充したＭ１１９培地中に維持した。９６ウェルプレートのウェルを、（管形成を誘導するための）１μｇ／ｍｌアンジオゲニンを補充した、５％ＦＣＳおよび０．００５％ＥＣＧＦを含有するＭ１１９培地中の成長因子枯渇Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｐｏｎｏｅ  ＭＬ．２００１．Ｉｎ：Ｍｕｒｒｒａｙ  ＪＣ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｖｏｌ．４６：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｏｔｏｗａ  （ＮＪ）：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．ｐ．２０５−９）で被覆し、平板培養／ウェル当たり１４０００ＨＵＶＥＣで平板培養した。種々のＲＮａｓｅ、すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ２（Ｓｉｇｍａ，２９ｋＤａ）またはＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ，２７ｋＤａ）を２μＭの最終濃度で加えた。対照では、前記ＲＮａｓｅのいずれかの非存在下または存在下であるが、アンジオゲニンの非存在下で、細胞を同一条件下で平板培養した。９６ウェルプレートを加湿雰囲気および５％二酸化炭素下で３７℃にて２４時間インキュベートした。各処理について、３連で行った。
【０２８３】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＨＵＶＥＣ管形成に対して顕著な抗脈管形成効果を呈する−種々のＲＮａｓｅ（すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｉ）の能力を、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイを用いて測定した（図３２ａないしｈ）。図３２ａないしｂに示すように、アンジオゲニンおよびＲＮａｓｅの非存在下、培地中でインキュベートしたＨＵＶＥＣ（対照、図３２ａ）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ表面で唯少数のデリケートな管を形成したが、アンジオゲニンの存在下でインキュベートしたＨＵＶＥＣ（陽性対照）においては、塊状管が出現した（図３２ｂ）。加えて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ２は単独で与えた場合には細胞に対していずれの効果も有しなかった（陰性対照、各々、図３２ｃおよび３２ｅ）が、これらのＲＮａｓｅはアンジオゲニン誘導管形成を明瞭に阻害した（各々、図３２ｄおよび３２ｆ）。さらに、ＲＮａｓｅ  Ｔ２は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１よりも弱い阻害効果を有することが判明した（図３２ｆを図３２ｄと比較されたし）。それにも拘らず、管形成の完全な阻害が、１０μＭのＲＮａｓｅ  Ｂ１または５０μＭのＲＮａｓｅ  Ｔ２で得られた（データは示さず）。他方、ＲＮａｓｅ  Ｉはアンジオゲニンの非存在下（陰性対照、図３２ｇ）または存在下（図３２ｈ）で、管形成に対して顕著な阻害効果を呈した。
【０２８４】
かくして、これらの結果が、高度に発散した源からのＴ２  ＲＮａｓｅの抗脈管形成特性を明瞭に示す。現在までに、Ｔ２ファミリーに属する多様な系統発生起源のＲＮａｓｅの抗脈管形成活性を示し、または示唆した刊行物はないため、これらの結果は本発明にとってユニークである。
【０２８５】
実施例８
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、Ｂ１６Ｆ１およびＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞誘導腫瘍の成長を阻害する。
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の抗癌特性をテストするために、イン・ビボメラノーママウスモデルを以下のように作製した。
【０２８６】
材料および実験方法
全身腹腔内メラノーママウスモデルで用いたマウスおよび腫瘍細胞−ＣＤ  ＢＤＦ１およびＢａｌｂ／ｃマウスを腫瘍誘導で用いた。マウスメラノーマＢ１６Ｆ１（低転移性）は、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＬＴＤ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。
【０２８７】
メラノーマ全身腹腔内マウスモデルの作製−メラノーママウスモデルは本質的には記載されているように作製した（Ｇｅｒａｎら、１９７２．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｉｍａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｒｅａｐｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｐａｒｔ  ３  Ｖｏｌ  ３  Ｎｏ２）。簡単に述べれば、２×１０６Ｂ１６Ｆ１低転移性細胞を各マウスの腹腔に注射し、癌腫瘍の存在を、マウスの総括的な観察および／または組織病理学的調査によって、メラノーマ細胞注入の１４日後に評価した。
【０２８８】
メラノーマ全身腹腔内マウスモデルへのＲＮａｓｅ  Ｂ１腹腔内投与−Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞注射から２４時間および５日後に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（１００μｌのＰＢＳ中５ｍｇ／マウス）またはＰＢＳ単独を腹腔に注射した。
【０２８９】
全身静脈内（ｉ．ｖ．）メラノーママウスモデルで用いられるマウスおよび腫瘍細胞−Ｂａｌｂ／ｃマウスをマウスＢ１６Ｆ１０（高度に転移性の）メラノーマ細胞の静脈内投与に用いた。
【０２９０】
メラノーマ全身静脈内マウスモデルの作製−Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（５×１０５または５×１０６細胞／マウス）をＢａｌｂ／マウスの側尾静脈に注射し、癌腫瘍の存在を、マウスの総括的観察および／または組織病理学的調査によって、メラノーマ細胞注射の１４日後に評価した。
【０２９１】
メラノーマ全身静脈内マウスモデルへのＲＮａｓｅ  Ｂ１静脈内投与−細胞注射から２４時間後に開始し、合計３回の注射での４日間隔で、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（１００μｌのＰＢＳ中１０ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１）またはＰＢＳをメラノーママウスモデルの側尾静脈に静脈内注射した。実験の最後に、肺を取り出し、秤量し、表面転移を定量した。
【０２９２】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はメラノーマ全身腹腔内マウスモデルにおいて腫瘍成長を顕著に阻害する−腹腔内／腹腔内（すなわち、メラノーマ細胞およびＲＮａｓｅ  Ｂ１双方の腹腔内注射）メラノーママウスモデルにおけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を、処理したマウスの腹部腔における定性的腫瘍観察によってメラノーマ細胞注射から１４日後にスコア取りした。図３３ａおよびｃに示すように、ＢＤＦ１およびＢａｌｂ／ｃマウスの双方において、メラノーマ細胞は、腹部腔を満たし、腸にわたって拡大する塊状腫瘍を誘導した。他方、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいて、唯少数の小さな腫瘍が観察され（図３３ｂ，ｄ）、これは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の腫瘍成長阻害効果を示した。この実験において、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の合計量は１０ｍｇ／マウスであった。同様の結果は、マウスを、１０ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１の単回注射によって、あるいは１ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１の１０回の毎日の注射によって処理した場合に観察された（データは示さず）。
【０２９３】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はメラノーマ全身静脈内マウスモデルにおいて、高度に転移性の悪性メラノーマ腫瘍の転移／コロニー化および成長を阻害する−静脈内／静脈内（すなわち、メラノーマ細胞およびＲＮａｓｅ  Ｂ１の双方の静脈内注射）メラノーママウスモデルにおいて、尾静脈に注射されたメラノーマ細胞は、約２週間で肺転移の発生をもたらす。図３４ａないしｃに示すように、５×１０５のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞注射から２週間後に、ＲＮａｓｅ処理マウスにおける唯少数の転移（図３４ｂ）と比較して、多数の転移がＰＢＳ注射マウスで観察された（図３４ａ）。転移の数の定量的測定は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいて有意な減少７６％を示した（Ｐ＜０．００１、図３４ｃ）。５×１０６細胞／マウスの初期ボーラスを用いる場合、ＰＢＳ注射マウスにおける転移はかなり強く、カウントするのに余りにも密であった（データは示さず）。これらのマウスにおいて、肺重量（図３４ｂ）および腫瘍サイズ（図３４ｂ）の測定は、ＰＢＳ処理マウスと比較して、ＲＮａｓｅ  Ｂ１腫瘍マウスにおける肺重量（Ｐ＜０．０１、図３４ｄ）および腫瘍サイズ（Ｐ＜０．００１、図３４ｅ）の２５％の有意な低下を示した。
【０２９４】
従って、これらの結果は、確信されることには、ＲＮａｓｅ  Ｂ１を用いて、高度に転移性の悪性メラノーマ腫瘍の成長および転移を効果的に阻害することができることを示す。
【０２９５】
実施例９
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、Ａ３７５ＳＭ注射メラノーママウスモデルにおいて腫瘍成長、肺転移およびＭＭＰ−２生産を阻害する。
癌腫瘍の成長を阻害するＲＮａｓｅ  Ｂ１の能力をさらに確実なものとするために、ＲＮａｓｅ  Ｂ１をＡ３７５ＳＭメラノーマ細胞誘導マウスモデルに以下のように注射した。
【０２９６】
材料および実験方法
メラノーママウスモデルを作製するのに用いるマウス−雄無胸腺Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｒｅａ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入した。マウスを、特異的病原体がない条件下で層流キャビネットに収容し、２ないし９週齢に用いた。
【０２９７】
メラノーマ細胞−高度に腫瘍形成性かつ転移性ヒトメラノーマＡ３７５ＳＭ細胞系はＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸから入手した。接種のための腫瘍細胞を調製するために、指数関数的成長期にある細胞を、０．２５％トリプシン／０．０２％エチレンジアミン４酢酸溶液（ｗ／ｖ）へ短時間暴露することによって収穫した。フラスコを鋭く叩いて、細胞を散らばらせ、補充した培地を加えた。細胞懸濁液をピペット処理して、単一細胞懸濁液を得た。細胞を洗浄し、所望の細胞濃度まで、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋フリーのハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁させた。細胞生存性はトリパンブルー排除によって測定し、＞９０％生存性の単一細胞懸濁液のみを用いた。
【０２９８】
メラノーママウスモデルの作製−皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍は、１０５腫瘍細胞／０．１ｍｌ  ＨＢＳＳをマウスの右側頭皮領域にわたって注射することによって生じさせた。皮下腫瘍の成長は、マウスの毎週の調査、およびキャリパーでの腫瘍の測定によってモニターした。メラノーマ細胞注射の５週間後にマウスを屠殺し、腫瘍をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｒ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中で凍結し、またはホルマリン固定し、次いで、免疫染色およびヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理した。
【０２９９】
実験的肺転移の作製−肺転移を形成するために、０．１ｍｌのＨＢＳＳ中の１０６腫瘍細胞をヌードマウスの側尾静脈内（ｉ．ｖ．）に注射した。マウスをメラノーマ細胞注射から６０日後に屠殺し、肺を取り出し、水中で洗浄し、腫瘍節のカウンティングを容易にするために２４時間Ｂｏｕｉｎの溶液で固定した。表面腫瘍節の数を、解剖顕微鏡下でカウントした。
【０３００】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１投与−皮下および静脈内メラノーマ細胞注射マウスを、共に、１ｍｇ／１００μｌのＲＮａｓｅ  Ｂ１水溶液で、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって１日置きに処理した。
【０３０１】
ＣＤ３１およびＭＭＰ−２免疫組織化学分析−凍結した組織の切片を腫瘍異種移植片から調製した。組織切片スライドをＰＢＳで２回濯ぎ、ＰＢＳ中の３％過酸化水素の使用によって、内因性ペルオキシダーゼを１２分間ブロックした。次いで、試料をＰＢＳで３回洗浄し、５％正常ウマ血清および１％正常ヤギ血清を補充したＰＢＳ（ｐＨ７．５）よりなる蛋白質ブロッキング溶液と共に室温にて１０分間インキュベートした。過剰なブロッキング溶液を排出し、試料を、モノクローナルラット抗ＣＤ３１（１：８００）抗体の１：１００希釈、または抗ＭＭＰ−２（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１：２００希釈と共に４℃にて１８時間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで４回濯ぎ、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ１、抗ウサギＩｇＧ、または抗ラットＩｇＧの適当な希釈と共に室温にて６０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで濯ぎ、ジアミノベンジジン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と共に５分間インキュベートした。次いで、切片を蒸留水で３回洗浄し、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で逆染色した。微小血管密度（ＭＶＤ）の定量のために、ＣＤ３１染色試料の１０の視野を１００倍の倍率でカウントした。また、ホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍の切片（４μｍ厚み）をルーチン的な組織学的調査のためにＨ＆Ｅで染色した。
【０３０２】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理は、Ａ３７５ＳＭメラノーマ細胞注射マウスにおいて腫瘍のサイズを有意に低下させた−ヒトメラノーマ細胞の腫瘍成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果は二組のヌードマウスにおいて測定した。ヌードマウスの最初の組（ｎ＝５）において、Ａ３７５ＳＭメラノーマ細胞（５×１０５）を皮下注射し、３日後、腫瘍細胞を注射した動物に、引き続いて、１ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１または対照ＰＢＳを３０日間１日置きに腹腔内注射した。ＰＢＳで処理した動物における腫瘍細胞は徐々に成長し、大きな腫瘍を生じ、７００ｍｍ３平均容量までのサイズに到達した（図３５、対照）。対照的に、ＲＮａｓｅ  Ｂ１での処理は、同一期間の間に腫瘍成長を最大１００ｍｍ３平均容量まで低下させた（図３５、ＲＮａｓｅ  Ｂ１）。第２の組のヌードマウス（ｎ＝８）において、第１の組について記載されたように正確にマウスを注射し、処理し、それは、腫瘍成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の正確に同一な効果を示した（データは示さず）。
【０３０３】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理は、Ａ３７５ＳＭメラノーマ細胞注射マウスにおいて肺転移の発生および数を有意に低下させた−ヒトメラノーマ細胞の転移に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を調べるために、Ａ３７５ＳＭ  １０６細胞をヌードマウスに静脈内注射して、実験的肺転移を生じさせた。５日後、腫瘍細胞を注射した動物はまた、１ｍｇのＲＮａｓｅ  Ｂ１または対照ＰＢＳで６０日間１日置きに腹腔内注射した。Ａ３７５ＳＭ細胞の肺転移の発生および数の双方は、対照群と比較すると、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいて低下したことが判明した。対照マウスにおいて、Ａ３７５ＳＭ細胞は多数の肺転移（メジアン，６５；範囲，１６ないし２００）を生じ、他方、ＲＮａｓｅ  Ｂ１での処理は、ヌードマウスにおいて転移を形成するＡ３７５ＳＭ細胞の能力を有意に阻害した（メジアン，１０；範囲，０ないし７５；Ｐ＜０．０５）。
【０３０４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理は、Ａ３７５ＳＭメラノーママウスモデルにおいてＭＭＰ−２の発現を減少させる−ＲＮａｓｅ  Ｂ１がイン・ビボにてＭＭＰ−２の発現を抑制するか否かを判断するために、腫瘍異種移植片の組織切片を、ＭＭＰ−２特異的抗体を用いる免疫組織化学分析に付した。ＭＭＰ−２染色は対照注射Ａ３７５ＳＭ腫瘍で観察されたが、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理腫瘍において有意に減少した（データは示さず）。かくして、ＲＮａｓｅ  Ｂ１はメラノーマ細胞においてイン・ビボでＭＭＰ−２の発現を有意に阻害した。
【０３０５】
概して、これらのデータは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１でのマウスの処理が腫瘍の成長および転移の抑制をもたらし、かつＭＭＰ−２等の脈管形成因子の合成の阻害をもたらすことを示す。
【０３０６】
実施例１０
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の局所的皮下投与は脈管形成を阻害する。
ＭＭＰ−２は重要な脈管形成因子であるので、本発明者らは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１がイン・ビボで脈管形成に影響し得るか否かを以下のように判断した。
【０３０７】
材料および実験方法
脈管形成の局所的誘導−１００ｎｇ／スポンジのアンジオゲニンを含浸させたゲルフォームを、ヌードマウスの両側に皮下移植し、２日後に、マウスに、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（１００μｌ中２５０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１）を片側に、ＰＢＳを他方側に、２日毎に７回腹腔内注射した。
【０３０８】
ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１の免疫蛍光染色−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪから得られた）凍結ゲルフォーム検体を切片化し（１０ないし１２μｍ）、正に荷電されたスライド上に設置し、３０分間風乾した。次いで、切片を冷アセトン中で５分間固定し、続いて、１：１アセトン：クロロホルムの溶液中で５分インキュベートし、アセトン単独中でさらに５分間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の４％魚ゼラチンを含有する蛋白質−ブロッキング溶液と共に室温にて２０分間インキュベートし、ラットのモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１：８００希釈と共に４℃にて１８時間インキュベートした。抗体のインキュベーションに続き、スライドをＰＢＳで３回濯ぎ（各々３分）、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に結合した二次ヤギ抗ラット抗体の１：２００希釈と共に室温にて暗所で１時間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで３回洗浄し（各々３分）、次いで、水中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、三塩酸塩、三水和物１０ｍｇ／ｍＬを含む蛍光用のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ設置培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｅｎ）を設置した。免疫蛍光顕微鏡は、Ｃｈｒｏｍａ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＴ）からの１００Ｗ  ＨＢＯ水銀球およびフィルター組を備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を用いて行って、赤色、緑色、および青色蛍光イメージを個々に捕獲した。イメージは、Ｃ５８１０  Ｈａｍａｍａｔｓｕ色冷却３ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて捕獲し、Ｏｐｔｉｍａｓイメージングソフトウェア（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）を用いてデジタル化した。Ａｄｏｂｅ  ＰｈｏｔｏＳｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてイメージをさらに処理した。内皮細胞を赤色蛍光によって同定した。
【０３０９】
ＴＵＮＥＬアッセイ−ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイでは、Ｋｌｅｎｏｗ−ＦｒａｇＥｌキット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いた。切片（１０μｍ）をキシレン中で脱パラフィン化し、続いて、暫時のエタノール溶液（１００、１００、９５および７０％エタノール−各々５分）中に再度水和した。調製物をプロテイナーゼＫ処理に１５分間付し、ＰＢＳ中で十分に洗浄し、製造業者によって供された平衡緩衝液中で室温にてプレインキュベートした。過剰の液体を落とした後、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼおよびジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを調製物に適用した。スライドを３７℃にて１時間インキュベートし、予め加温した停止／洗浄緩衝液中で３７℃にて３０分間洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄した。特異的染色は、結合体としてフェロキシダーゼを担持する抗ジゴキシゲニン抗体の添加によって達成した。逆染色の後、カバーグラス下にスライドを設置し、茶色のアポトーシス細胞を光学顕微鏡によって可視化した。
【０３１０】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は血管のアンジオゲニン誘導発生を阻害する−イン・ビボにて脈管形成を阻害するＲＮａｓｅ  Ｂ１の能力をテストするために、アンジオゲニン含浸ゲルフォームをヌードマウスの両側に皮下移植し、続いて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＰＢＳを腹腔内注射した。図３７に示されるように、アンジオゲニン−ＰＢＳ処理の結果、血管の塊状発生がもたらされた（図３７、アンジオゲニン）が、アンジオゲニン−ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の結果、血管が顕著に減少した（図３７、アンジオゲニンおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１）。
【０３１１】
これらの結果は、イン・ビボで脈管形成を阻害するＲＮａｓｅ  Ｂ１の能力を示す。
【０３１２】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＡ３７５ＳＭ誘導瘍において腫瘍ＭＶＤを低下させる−微小血管密度（ＭＶＤ）によって示される腫瘍関連新生血管形成は、抗ＣＤ３１抗体を用いて免疫組織化学によって測定した。視野当たりの腫瘍ＭＶＤの顕著な低下は、対照腫瘍と比較して、ＲＮａｓｅ  Ｂ１での処理に続いて観察された。ＭＶＤの平均数は、対照の未処理Ａ３７５ＳＭ誘導腫瘍についての４３±７と比較して、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理Ａ３７５ＳＭ腫瘍において１２±５であった（データは示さず）。さらに、ＴＵＮＥＬ陽性腫瘍細胞の数は、調べた腫瘍におけるＭＶＤと強く相関した。アポトーシスを受けている腫瘍細胞の数は、対照マウスでの腫瘍におけるよりもＲＮａｓｅ  Ｂ１処理動物においてより高かった。かくして、アポトーシス細胞のパーセンテージは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理Ａ３７５ＳＭメラノーマ腫瘍において３１．２±７．３％であった。対照的に、アポトーシス細胞のパーセンテージは、対照Ａ３７５ＳＭ腫瘍に対して２．２±１．１％であった。
【０３１３】
かくして、これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理が、メラノーマ腫瘍関連新生血管形成を有意に減少させ、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させることを示す。
【０３１４】
実施例１１
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＤＭＨモデルにおいて微小血管密度を低下させる。
材料および実験方法
ラット−６週齢で体重が約１６０ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ由来異系交配雄ラットから得られた。
【０３１５】
ＤＭＨ−１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。ＤＭＨを使用直前にＰＢＳ中の１．５％ＥＤＴＡの溶液に溶解させ、溶液のｐＨをｐＨ６．５にした。
【０３１６】
ＤＭＨモデルの作製−ＤＭＨをラットに筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した（４０ｍｇ／ｋｇ体重）。注射の時点において、ラットは体重が２５０グラムであった。
【０３１７】
腫瘍は、ＤＭＨの皮下注射で投与したジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を用いてラットで誘導した（１５ｍｇ／１００ｇ体重、５週間の間一週間について１回）。対照群にはＰＢＳ＋ビヒクル（ＥＤＴＡ）の注射を与えた。
【０３１８】
ＤＭＨ−モデルの分析−ラットはまずエーテルで麻酔し、次いで、屠殺した。各ラットから、結腸を切り出し、異常な陰窩病巣（ＡＣＦ）または腫瘍をカウントし、測定した。対照からの、およびＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットからの腫瘍を固定し、パラフィン中に包埋し、腫瘍切片を、さらに、組織病理学（Ｈ＆Ｅ染色）、血管モニタリングのための抗ＣＤ−３１抗体での免疫染色、またはアポトーシスについてのＴＵＮＥＬアッセイによって分析した。
【０３１９】
ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１の免疫蛍光染色−は、前記した実施例１０に記載されているように行った。簡単に述べると、ＤＭＨまたはＤＭＨ＋ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスで発生した腫瘍からのパラフィン切片（１０μｌ）を、ＰＥＣＡＭ−１（Ｈ−３００）抗体を用いるＣＤ３１免疫染色に付した（ｓｃ−８３０６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。メジアン腫瘍断面における血管をカウントし、その直径を測定した。各腫瘍において、血管の合計面積および腫瘍−断面積の間の比率を計算した。実験は２回反復し、各処理は６ないし１０匹のラットに適用した。
【０３２０】
実験結果
腫瘍関連新生血管形成は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１−ＤＭＨ処理マウスにおいて減少した−ＣＤ３１免疫染色は、腫瘍内の血管の存在を明らかとし、微小血管密度（ＭＶＤ）の計算の基礎として供した。図４２ａないしｂに示すように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１投与は、腫瘍当たりの血管（脈管形成）の数を顕著に低下させることが判明した。
【０３２１】
実施例１２
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、メラノーマ、結腸および乳頭癌腫細胞の侵入性／コロニー化能力をイン・ビトロで阻害する。
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は癌細胞の形態およびアクチン組織化に影響することが示されたので、本発明者らは、さらに、ＲＮａｓｅ  Ｂ１が細胞運動性に影響するか否かを以下のようにさらに調べた。
【０３２２】
材料および実験方法
結腸癌腫（ＨＴ−２９）または乳癌細胞（ＺＲ−７５−１）侵入／コロニー化アッセイ−ＨＴ−２９結腸癌細胞またはＺＲ−７５−１細胞を、１および１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で４日間処理した。市販の２４ウェル侵入チャンバー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のウェルおよびＭａｔｒｉｇｅｌ被覆インサートを０．５ｍｌの無血清培地中で一晩再水和し、製造業者の指示に従って処理した。０．５ｍｌのＨＴ−２９対照（すなわち、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の非存在下）、または２．５×１０４細胞を含有するＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞懸濁液を、各々、チャンバーの頂部に加え、１０％ＦＣＳを含有する０．７５０ｍｌのＤＭＥＭ培地を下方チャンバーに加えた。侵入チャンバーを３７℃の細胞培養インキュベーター中で２２時間インキュベートした。インサートの膜の上方表面の非侵入細胞をスクラビングによって除去した。膜の下方表面の細胞をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（商標）染色で染色した。膜を固定し、光学顕微鏡下で細胞を２００倍倍率でカウントした。アッセイは三連で行った。
【０３２３】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルター侵入アッセイ−Ａ３７５ＳＭ細胞をＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で処理し、２２時間後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに侵入した細胞の数をカウントした。
【０３２４】
Ａ３７５ＳＭ細胞からのＭＭＰ−２放出−転移性Ａ３７５ＳＭ細胞（５×１０３）を完全イーグル最小必須培地（ＣＭＥＭ）中で成長させ、６ウェルプレート中で平板培養し、２４時間付着させた。細胞を１または１０μＭのＲＮａｓｅ  Ｂ１、あるいはＰＢＳで４日間処理した。４日間の処理は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１がＭＭＰ−２放出に影響するのに最適なことが判明した。５日目に、ＣＭＥＭを取り出し、無血清培地で一晩置き換えた。上清を集め、遠心分離し、培地を５００μｌの試料にアリコットし、−２０℃にて貯蔵した。全ＭＭＰ−２は、キンチキンＭＭＰ−２イムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって測定した。試料をキットによって供給された希釈剤中に１０倍希釈した。ＭＭＰ−２は供給業者の指示に従って測定し、結果を細胞数に従って調整した。
【０３２５】
ＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性（ザイモグラム）−ＭＭＰ−２活性は、基材−含浸ゲル上で測定した。ＨＵＶＥＣ細胞または転移性Ａ３７５ＳＭ細胞（５×１０３）を６ウェルプレート中で平板培養し、２４時間付着させた。細胞を１ないし５または１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１、あるいはＰＢＳで４日間処理した。４日間の処理は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１がＭＭＰ−２活性に影響するのに最適であることが判明した。５日目に、ＣＭＥＭを取り出し、無血清培地で一晩置き換えた。上清を集め、容量を細胞数につき調整し、負荷し、非還元条件下でゼラチン含浸（１ｍｇ／ｍｌ；Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）ドデシル硫酸ナトリウム／８％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、続いて、２．５％トリトンＸ−１００（ＢＤＨ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）中で３０分間振盪した。次いで、ゲルを、ｐＨ７．６の５０ミリモル／Ｌトリス、０．２モル／Ｌ  ＮａＣｌ、５ミリモル／Ｌ  ＣａＣｌ２（ｗ／ｖ）中で３７℃にて１６時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、ゲルを、メタノール／酢酸／Ｈ２Ｏ（３０：１０：６０）中の０．５％クーマシーＧ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で染色した。ＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性の存在は青色ゲル上の白色バンドとして見られる。
【０３２６】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はイン・ビトロにてＨＴ−２９またはＺＲ−７５−１侵入性を低下させる−以下の表６に示すように、ＨＴ−２９およびＺＲ−７５−１細胞はＭａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに進入することができた。驚くべきことに、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は有意かつ用量依存的に（１および１０μＭ）結腸癌腫細胞の侵入性／コロニー化能力を阻害することが判明した。
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【０３２７】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はイン・ビトロにてＡ３７５ＳＭ侵入性を低下させる−Ａ３７５ＳＭ細胞は１または１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下で処理し、細胞侵入性の程度をｍａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターにて測定した。図３８に示すように、Ａ３７５ＳＭ侵入性の阻害に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の有意な用量依存性効果を観察した。未処理Ａ３７５ＳＭ細胞（対照）においては、１２１６±６８細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに進入したが、１または１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理した７２５±５９または２１１±１４  Ａ３７５ＳＭ細胞はＭａｔｒｉｇｅｌ被覆フィルターに進入した。
【０３２８】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＭＭＰ−２の分泌を有意に阻害する−ＭＭＰ−２放出のレベルをＡ３７５ＳＭ細胞からイン・ビトロで測定した。図４８に示すように、全ＭＭＰ−２放出を阻害するにおけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の用量依存性効果が得られ、最大阻害効果は１０μＭ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下で観察された。
【０３２９】
ＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性はＲＮａｓｅ  Ｂ１処理に続いて低下する−Ａ３７５ＳＭまたはＨＵＶＥＣ細胞の上清のザイモグラムを用いて、ＭＭＰ−２活性を決定した。図４９ａないしｂに示すように、未処理Ａ３７５ＳＭ（図４９ａ）およびＨＵＶＥＣ（図４９ｂ）細胞は共に強いＭＭＰ−２活性を呈し、ＲＮａｓｅ処理細胞は７２ｋＤａ  ＭＭＰ−２のバンド強度の用量依存性減少を呈し、これは、減少したＭＭＰ−２活性を示唆する。同様に、用量依存性減少もまた、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理細胞でのＭＭＰ−９活性で観察された（図４９ｂ）。
【０３３０】
考え合わせると、これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の抗脈管形成／抗癌特徴を明瞭に示す。
【０３３１】
実施例１３
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の静脈内および腹腔内投与は、ＨＴ−２９結腸癌モデルにおいて腫瘍のサイズを低下させる。
材料および実験方法
ｓ．ｃ．／ｉ．ｖ．結腸癌異種移植片モデルの作製−ヒト結腸癌起源の腫瘍（ＨＴ−２９）を、実験の開始において、体重が１８ないし２０グラムの４ないし５週齢ヌードマウス（ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ）雄に移植した。ＨＴ−２９細胞（２×１０６／マウス）をマウスの左側臀部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１、１００μｌのＰＢＳ中５ｍｇ）またはＰＢＳ単独を、結腸癌細胞の投与から２４時間、５日および１０日後に、尾静脈に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。１５日後に、マウスを屠殺し、腫瘍または注射の領域を組織病理学的実験によって評価した。
【０３３２】
対照およびＴ２  ＲＮａｓｅ処理腫瘍のパラフィン切片を、アポトーシスの証拠のために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で、Ｋｌｅｎｏｗ−ＦｒａｇＥｌキット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で染色した。
【０３３３】
ｓ．ｃ．／ｉ．ｐ．結腸癌異種移植片モデルの作製−結腸癌細胞（ＨＴ−２９）およびヌードマウス（ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ）は該ｓ．ｃ．／ｉ．ｖ．モデルに関してであった。実験の初日において、細胞をマウスの左側臀部に注射した（１０６細胞／マウス）。ＲＮａｓｅ  Ｂ１を腹腔に注射し、２日目に開始し、１日毎に注射した。２つの実験を行った。最初の実験においては、１００μｌのＰＢＳ中の１および５ｍｇ／注射の用量のＲＮａｓｅ  Ｂ１を適用した。第２の実験においては、０．０１ないし１ｍｇ／注射の間の範囲のＲＮａｓｅ  Ｂ１の用量を用いた。ＰＢＳ単独を対照として注射した。サイズ測定および組織病理学的調査のために、腫瘍を実験の３０日目に切り出した。方程式（長さ×幅２）／２を用いて腫瘍容量を計算した。
【０３３４】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の静脈内投与は腫瘍重量を効果的に低下させることができる−ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいては、腫瘍重量の６０％低下が対照と比較して観察された（図３６ａないしｂ）。これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の静脈内投与が、結腸癌腫成長を阻害するにおいてかなり効果的であることを示す。
【０３３５】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の腹腔内投与は腫瘍のサイズを効果的に低下させる−ｓｃ／ｉｐマウスモデルにおいて、ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＨＴ−２９由来−癌腫の成長を有意に阻害した（図３９ａないしｂ）。１および５ｍｇ／注射の治療用量（５０および２５０ｍｇ／ｋｇ）において、腫瘍の用量は、各々、４４％および４１％だけ低下した（Ｐ＜０．０５、図３９ｂ）。０．００１、０．０１、０．１、０．５および１ｍｇ／注射（各々、０．０５、０．５、５、２５および５０ｍｇ／ｋｇ）においては、腫瘍容量は、対照と比較して、各々、３％、４１．５％、３４．４％、５１．１％および６２．２％（図３９ａ）だけ低下した（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、１ないし４μｇ／１００μｌ（０．２５ないし１μＭ）の間の範囲の濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１がクローン原性の速度に対して同様な阻害効果を有する、ＨＴ−２９細胞での従前のイン・ビトロ実験と合致する。かくして、これらの結果は、結腸腫瘍サイズに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の予防（図３９ａ）ならびに治療（図３９ｂ）効果を示す。
【０３３６】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は処理されたマウスの腹膜に蓄積する−図４０ａないしｃに示すように、ウサギ抗ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギを用いる免疫組織化学染色は、ＰＢＳ処理マウスにおいてはそうでないが（図４０ｃ）、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおける（図４０ｂ）ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在を明らかにした。加えて、処理したマウスの断面のＲＮａｓｅ  Ｂ１免疫染色は、腫瘍血管の基底膜へのＲＮａｓｅ  Ｂ１の蓄積を明らかにした（図４１ａないしｃ）。
【０３３７】
かくして、これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１が腹膜に進入し、次いで、腫瘍血管の基底膜への道を見出すことを示す。
【０３３８】
投与の腹腔内様式はヌードマウスにとって非毒性であるように思われることが言及するに値する。というのは、体重および他の挙動パラメータは、実験を通じて未処理マウスのそれと同等なままだからである。
【０３３９】
実施例１４
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は癌動物モデルにおいてアポトーシスを増強する。
材料および実験方法
ＴＵＮＥＬアッセイ−は前記した実施例１０に記載したように行った。
【０３４０】
メラノーママウスモデル−Ｂ１６Ｆ１誘導メラノーママウスモデルは、前記実施例８に記載したように作製した。
【０３４１】
結腸癌マウスモデル−ＤＭＨおよびＨＴ−２９結腸癌モデルは、各々、前記実施例１１および１３に記載される。
【０３４２】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、Ｂ１６Ｆ１誘導メラノーマ細胞腫瘍においてアポトーシスを増強する−腫瘍内のアポトーシスの速度を測定するために、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理または未処理メラノーママウスモデルからの腫瘍組織切片をＴＵＮＥＬアッセイに付した。図４３ａないしｂに示すように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理マウスにおいては、アポトーシス速度は、未処理メラノーママウスモデルと比較して顕著に増加した。
【０３４３】
ＲＮａｓｅ処理ＤＭＨ−結腸癌ラットモデルにおける増強されたアポトーシス速度−図４４ａに示すように、ＤＭＨ結腸癌モデルから得られた腫瘍は、無視できるレベルのアポトーシスを呈した。他方、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ラットから得られた腫瘍は顕著なレベルのアポトーシスを呈した（図４４ｂ）。２００倍倍率の１０の異なる顕微鏡視野を３つの異なる組織切片でカウントすると、アポトーシス細胞の数は対照未処理腫瘍において２．０１±０．２／顕微鏡視野であり、ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理動物の腫瘍においては３７±５／顕微鏡視野であることが判明した。
【０３４４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１で処理したＨＴ−２９結腸癌腫誘導マウスにおける高い割合のアポトーシス細胞−図４５ａないしｄに示すように、未処理ＨＴ−２９誘導結腸癌腫マウスは生きたかつ活発に分裂する核を呈したが（図４５ａおよびｃ）、ＲＮａｓｅ処理マウスは凝縮した細胞質および核（図４５ｂ）ならびに高い割合のアポトーシス細胞（図４５ｂ）を呈した。
【０３４５】
概して、これらの結果は、種々の癌誘導動物モデルに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の顕著なアポトーシス効果を示し、癌および炎症／虚血性病のような、細胞のアポトーシスおよび異常な蓄積の障害の処置におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の使用を示唆する。
【０３４６】
実施例１５
Ｔ２  ＲＮａｓｅおよびタキソールは、結腸癌異種移植片モデルにおける相対的腫瘍容量の阻害に対する相乗的効果を呈する。
Ｔ２  ＲＮａｓｅが樹立された腫瘍についての腫瘍成長を阻害できるか否かをテストし、かつＴ２  ＲＮａｓｅがタキソール（一般的な結腸癌細胞傷害性薬物）による相加的または相乗的効果を呈するかを判断するために、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬを、以下のように、結腸癌異種移植片モデルについてタキソールと一緒に使用した。
【０３４７】
材料および実験方法
（以下のプロトコルはＦｕｊｉｉ  Ｔ．，ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３  ２３：２４０５−２４１２に基づく）
動物−ＲＮａｓｅ  Ｂ１：各々体重が２０グラムの７週齢のヌード雄マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）。ＲＮａｓｅ６ＰＬ：各々体重が３０グラムで、自由に正常な食事をとらせ、かつ病原体フリーの条件下の、７ないし９週齢の雄ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）。
【０３４８】
癌細胞−ヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔ。ＬＳ１７４Ｔ癌細胞［マウス当たり１×１０６細胞（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）または１００μｌ培地当たりマウス当たり５×１０５細胞（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）］を、前記したように、ヌードマウスの左側臀部に皮下注射した。
【０３４９】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１投与−腫瘍が触知できると（細胞注射から１０ないし１３日後）開始し、かつ１日おきに３週間の腹腔内注射よりなる。ＲＮａｓｅ  Ｂ１容量は１０および１０００マイクログラム／１００μｌ／注射（各々０．５および５０ｍｇ／ｋｇ）。
【０３５０】
ＲＮａｓｅ６ＰＬ投与−腫瘍が触知でき（８０ないし１００ｍｍ３）、かつマウスを以下の処理群（ｎ＝６）にランダム化した、移植から１０ないし１３日後に実験を開始した：群１：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、２ｑｘ１２腹腔内注射（０．５ｍｇ／ｋｇ）、群２：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、２ｑｘ４、続いてＰＢＳ、２ｑｘ３および、次いで、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、２ｑｘ５、群３：ＰＢＳ、２ｑｘ４、続いてタキソール  ２ｑｘ３静脈内注射（２５ｍｇ／ｋｇ）、ついで、ＰＢＳ、２ｑｘ５、群４：ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、２ｑｘ４腹腔内注射（０．５ｍｇ／ｋｇ）、続いてタキソール  ２ｑｘ３静脈内注射（２５ｍｇ／ｋｇ）および、次いで、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、２ｑｘ５。腫瘍化したマウスの対照群には１００μｌのＰＢＳを１２回腹腔内にて２日ごとに与えた。
【０３５１】
腫瘍が触知できる（直径３ないし５ｍｍ）場合に処置を開始した。ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬの双方については、腫瘍は３つの直交直径においてキャリパーで一週間当たり３回測定した。腫瘍容量は半楕円体についての式［（長さ×幅２）／２］によって記載されるように計算し、平均値として表した。実験は最初の処置の３０日後に（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）または２４日後（ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ）停止し、次いで、全てのマウスを同時に殺し、オートプシーに付し、それらの腫瘍組織を収穫した。免疫組織化学およびＨ＆Ｅ−染色手法では、腫瘍の１つの部分をホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。
【０３５２】
タキソール調製および投与−ＲＮａｓｅ  Ｂ１−タキソール研究では（図４６）：５０ｍｇのタキソールを１８ｍｌのプロピレングリコールおよび３ｍｌのエタノールに溶解させ、それに続いて、９ｍｌの水を加えた。タキソールは３週間にわたって７日のうち５連続日の間腹腔内注射によって投与し、腫瘍が触知できると開始した（細胞注射から１３日後）。対照にはＰＢＳまたはポリプロピレングリコール＋エタノールを与えた。タキソールおよびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ実験では（図６４）、商業的タキソール調製物［５２７ｍｇの精製されたクレモフォールＥＬおよび４９．７％  ｖ／ｖ脱水アルコール中６ｍｇ／ｍｌのストックパクリタクセル注射（６ｍｇ）、ＵＳＰ，Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］を使用前にＰＢＳで希釈し、前記したように、尾静脈に静脈内注射した。
【０３５３】
実験の間、キャリパーを用いて腫瘍を１週間に２回測定した。腫瘍容量を、方程式（長さ×幅２）／２（半楕円体）を用いて計算した。各マウスにタグを付け、個々にモニターした。相対的腫瘍容量（ＲＴＶ）はＲＴＶ＝Ｖｉ／Ｖ０と定義され、ここに、Ｖｉはいずれかの与えられた時点における腫瘍容量であり、Ｖ０は最初の処置の時間におけるそれであった。実験の最後において、試料を組織学のために採取した。
【０３５４】
実験結果
高度に脈管形成性のＬＳ１７４Ｔ細胞系を、組み合わせたＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、ならびにタキソール処置で用いた。図４６で明瞭に示すように、タキソールは相対的腫瘍容量（ＲＴＶ）に対してわずかな効果を呈するに過ぎないが、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は腫瘍成長を阻害するにおいて有利な効果を呈する。しかしながら、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびタキソールを同時にマウスに注射した場合、腫瘍成長の有意な阻害が観察され、これは、タキソール処置に対してＲＮａｓｅ  Ｂ１の相加的効果よりもむしろ相乗的効果を示した。さらに、終点におけるＲＴＶは、各々、対照、タキソール、ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ  Ｂ１＋タキソール処置において１５８．２、１９５．３、６１．４および１３．４３であり（図４６）、これは腫瘍成長の効果的な抑制を最初に示すものである。
【０３５５】
タキソールと共に組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ蛋白質を用いる結果（図６４）もまた相乗的効果を示し、ヒトＴ２  ＲＮａｓｅが、もう１つの抗癌処置と共に投与した場合に腫瘍の成長および容量を相乗的に阻害するというさらなる証拠を提供する。
これらの結果は、組み合わせた処置が各薬物単独よりも腫瘍成長速度を阻害するより大きな潜在能力を有することを示す。これらの結果は、同様に予め樹立された腫瘍の成長を阻害する多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅの能力をさらに示す（ＲＮａｓｅ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ６ＰＬ）。
【０３５６】
実施例１６
多様なＴ２  ＲＮａｓｅにおけるアクチン結合
Ｔ２ファミリーの多様なＲＮａｓｅのアクチン結合活性を調べた。
材料および実験方法
アクチンウエスタンブロット−このアッセイはＨｕら、１９９３（Ａｃｔｉｎ  ｉｓ  ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：１２１７−２１）に記載された方法に基づく。簡単に述べれば、ＲＮａｓｅ  Ｂ１、アンジオゲニン、ＲＮａｓｅ  Ｉ（１μｇの各蛋白質）および（陽性対照としての）Ｇ−アクチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてウエスタンブロット分析に付した。ニトロセルロース膜をＢＳＡで一晩ブロックし、２５μｇのＧ−アクチンを含有する５ｍｌの緩衝液中でさらに一晩インキュベートし、それに続いて、モノクローナルマウス抗アクチンＩｇＭを適用し、続いてＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭアクチン（Ａｂ−１）キット［ＣＡＴ  ＃  ＣＰ０１−１ＥＡ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）］を適用した。ＨＲＰ由来シグナルは、Ｓｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）増強−ケミルミネセンスシステム（ＥＣＬ，Ｐｉｅｒｃｅ）によって検出した。
【０３５７】
ＲＮａｓｅ  ６ＰＬアクチン結合アッセイ：スロットブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ＳｌｏｔＢｌｏｔ（Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて直接的にブロットした２５μｇ（５０μｇ中）のＲＮａｓｅ  ６ＰＬ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１、またはＧ−アクチンを含有するニトロセルロース膜を、０．２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×リン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スキムミルクで４℃にて一晩ブロックし、０．２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＰＢＳ中の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ミルクで各々１０分間２回洗浄した。次いで、膜を、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  ＡＴＰを含有する新たに調製した２ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液（緩衝液Ｇ）で室温にて１０分間平衡化し、引き続いて、５μｇ／ｍｌのＧ−アクチンを添加して４℃にて一晩インキュベートした。膜を０．２５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１×ＰＢＳ中の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ミルクで室温にて毎回１０分間３回洗浄し、２ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２ｍＭ  ＣａＣｌ２中の抗アクチン−ＩｇＭ抗体（１／５０００）で１時間プローブした。次いで、膜を、０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＰＢＳで１０分間３回洗浄し、第２の抗体、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）と、前記したように１／１００００の希釈にて反応させた。膜を、基質としてのルミノール（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）を含有する検出試薬を用いて増強されたケミルミネセンス（ＥＣＬ）で処理し、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ）に暴露して、結合した抗体を可視化した。
【０３５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるアクチン結合アッセイは１２．５％ＳＤＳ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲルで行った。溶液中の蛋白質結合はＨｕら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０：１２１７−１２２１）に従って行った。ＲＮａｓｅ６ＰＬおよびＧ−アクチンをエッペンドルフチューブ中で、緩衝液Ｇ中１：１（モル：モル）の比率にて予め混合し、室温にて３０分間インキュベートした。次いで、１−３（ジメチルアミノ）プロピル］−３エチル−カルボジイミドメチオダイド（ＥＤＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を５ｍＭの最終濃度まで加えた。室温でのさらに３０分間のインキュベーションの後、架橋された複合体をウェルに溶出させた。各未反応対照もゲルに適用した：ＲＮａｓｅ６ＰＬおよびＧ−アクチンは、それらの間の複合体のように同一の予備処理を従前に受けた。
【０３５９】
実験結果
細菌およびＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅのアクチン結合特性−図４７ａないしｂに示すように、アクチン−ウエスタンブロット分析は、Ｇ−アクチンへのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  ＩおよびＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１双方の強い会合を示し、これは、それらのアクチン結合能力を示す。
【０３６０】
ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬのアクチン結合−図６６ａおよび６６ｂに示すように、細菌および酵母Ｔ２  ＲＮａｓｅのように、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬはアクチンに対して強くかつ特異的な結合を示した。密な会合にて分子と反応するに過ぎない架橋剤１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチル−カルボジイミドメチオダイド（ＥＤＣ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、アクチンに対するヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬの高い親和性が示された（図６６ａ、レーン４参照）。アクチンと反応したＲＮａｓｅ  ６ＰＬおよびＲＮａｓｅ  Ｔ２のスロットブロットもまた、抗アクチン抗体で検出可能な双方のリボヌクレアーゼに対するアクチンの結合を示す（図６６ｂ）。このシリーズの実験において、アクチンもまたブロットされて、アクチンに対する抗アクチン結合の特異性を示す（底部スロット）。
【０３６１】
これらの結果は、広く多様な（細菌からヒトまで）起源のＴ２  ＲＮａｓｅに特徴的な強いアクチン結合活性のさらに直接的な証拠を提供し、これは、異常に増殖する細胞の増殖、コロニー化、分化および／または発生を予防し、阻害しおよび／または逆行させる際のＴ２  ＲＮａｓｅの効率、ならびに細胞の運動性および成長に対する効果に相関する。
【０３６２】
実施例１７
ＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化
材料および実験方法
培養された細胞の免疫細胞化学染色−Ａ３７５ＳＭまたはＨＵＶＥＣ細胞をチャンバースライド上で培養し、冷アセトンで２０分間固定した。スライドを濯ぎ、次いで、４％ゲルフィッシュで室温にて２０分間ブロックした。チャンバースライドを一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。０．０１Ｍ  ｐＨ７．４  ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中の４％ゲルフィッシュで希釈したＦＩＴＣ結合抗ウサギ二次抗体と共に６０分間インキュベートした。ＨＵＶＥＣ  ＣＤ３１免疫染色のために、検体を、ラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の１：８００希釈と共に４℃にて１８時間インキュベートした。試料をＰＢＳで各々３分間３回濯いだ後、スライドを、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に結合した二次ヤギ抗ラット抗体の１：２００希釈と共に室温にて暗所にて１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回各々３分間洗浄し、水中のＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、三塩酸塩、三水和物１０ｍｇ／ｍＬ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏ）と共に蛍光用のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ設置培地を設置した。スライドを、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡で観察した。Ｚ−セクションおよびＸＺ−セクションは、ＬＭＳ５１０ソフトウェアを用いることによって３Ｄ走査から得た。
【０３６３】
実験結果
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＨＵＶＥＣ細胞内に局所化される−図５０ａないしｔに示すように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１は細胞膜に徐々に進入し、これは、ＣＤ３１免疫染色の赤色標識によって検出され、細胞に進入する。
【０３６４】
ＲＮａｓｅ  Ｂ１はＡ３７５ＳＭメラノーマ細胞の核に到達する−図５１ａないしｃに示すように、ＲＮａｓｅ  Ｂ１への２時間の暴露中に、細胞の形態は変化し、丸くなるが（図５１ａ）、４時間後には、いくつかの細胞の細胞質内にＲＮａｓｅ  Ｂ１が観察され（図５１ｂ）、８時間後に、細胞核に到達する（図５１ｃ）。メラノーマＡ３７５ＳＭ細胞の多くは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１への８時間の暴露後にアポトーシスの特徴を呈することが言及するに値する（図５１ｃ）。
【０３６５】
かくして、これらの結果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１がＨＵＶＥＣおよびメラノーマＡ３７５ＳＭ細胞双方に進入し、メラノーマ細胞においてアポトーシスを誘導することを示す。該結果は、細胞へのＲＮａｓｅ  Ｂ１進入が、花粉管で観察された直後の応答と対照的には、数時間続く遅いプロセスであることも明瞭に示す。
【０３６６】
実施例１８
ＲＮａｓｅ  Ｂ１をコードする遺伝子のクローニング
ＲＮａｓｅ  Ｂ１が真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒによって生産されるメカニズムは未だ知られていない。ＲＮａｓｅ  Ｔ２−ファミリーメンバーである、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ２（Ｏｚｅｋｉら、１９９１．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔ２  ｇｅｎｅ（ｍｔＢ）  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．１９：３６７−７３）およびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｒｈ（Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、１９８８．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｓｅ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０３：４０８−１８）をコードする遺伝子はクローン化されている。ＲＮａｓｅ  Ｂ１の遺伝学の理解は非常に重要である。というのは、組換え蛋白質生産についての潜在能力が増大し得るからである。ＲＮａｓｅ  Ｂ１のアミノ酸配列を調べるために、それをまずトリプシンおよびキモトリプシンで消化し、液体クロマトグラフィーマススペクトル（ＬＣ−ＭＳ）によって断片を分析し、データーベースに対して比較した。いくつかのペプチド配列はＡ．ｓａｉｔｏｉ  ＲＮａｓｅ  Ｍ（受託番号：Ｐ１９７９１；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９０．Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｓｅ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０：３０３−３１０）に対して１００％相同であることが判明し、同時に、それらは該蛋白質配列の６０％よりなるものであった（データは示さず）。ｔａｘｏｎｓ  ｓａｉｔｏｉおよびｐｈｏｅｎｉｃｕｓは、従前は、Ａ．ｎｉｇｅｒ群の変種として分類されていたことに言及するのは興味深い（Ａｌ−Ｍｕｓａｌｌａｍ，Ａ．１９８０．Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰｈＤ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。同定されたアミノ酸配列は、ゲノムＤＮＡで用いることができるＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能とした。殆どのアミノ酸は少なくとも２つのヌクレオチドコドンによってコードされるので、本発明者らは、以下のように、Ａ．ｎｉｇｅｒコドン用法に従って、低い縮重性を有する縮重プライマーを用いた：順方向プライマー−５’−ＴＴＹＴＧＧＧＡＲＣＡＹＧＡＲＴＧＧＡＡＹ−３’（アミノ酸Ｆ１０７−Ｎ１１２について）（配列番号１）および逆方向プライマー−５’−ＣＣＹＴＴＩＡＣＲＴＴＲＡＡＲＴＡＲＴＡＲＴＡ−３’（アミノ酸Ｙ２００ないしＫ２０６についての逆相補体）（配列番号２）。文字「Ｙ」とはヌクレオチドＣまたはＴのいずれかをいい、文字「Ｒ」とはヌクレオチドＡまたはＧのいずれかをいう。デオキシイノシン（Ｉ）は４つのヌクレオチドのいずれかを置き換える。
【０３６７】
実験結果
ＰＣＲ増幅後に得られた主な４００−ｂｐバンド（図５２）をゲルから切り出し、ＤＮＡ配列分析のためにｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化した。得られた３００ヌクレオチドは１００アミノ酸についてのオープンリーディングフレームを作り出し（図５３）、これは（各々、ＲＮＡＳＥ  Ｂ１およびＲＮａｓｅ  Ｍにおけるアスパラギン酸をグルタミン酸が置き換えた位置１２３を除いて）ＲＮａｓｅ  ＭのＦ１０７ないしＫ２０６に殆ど完全にマッチした。この配列は該遺伝子の中央領域を表す。この配列を用い、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  Ｂ１からのＲＮａｓｅ  Ｂ１遺伝子の完全な配列を決定し（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ１１５３７６、配列番号１５）、ＲＮａｓｅ  Ｂ１蛋白質のアミノ酸配列を決定した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＺ２２５３０、配列番号１６）。
【０３６８】
実施例１９
ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ蛋白質のクローニングおよび精製
ヒトにおける染色体６の領域（６ｑ２７）の欠失は、いくつかのヒト悪性疾患と関連すると考えられてきた（Ｃｏｏｋｅら、１９９６．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５：２２３−２３３；Ｓａｉｔｏら、１９９２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：５８１５−５８２７）。この領域は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含めた、ＲＮａｓｅ  Ｔ２ファミリーと相同性を共有する推定腫瘍サプレッサーＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子を含有することが判明している（Ｔｒｕｂｉａら、１９９７．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４２：３４２−３４４；Ａｃｑｕａｔｉら、２００１．Ｍｅｔｈ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６０：８７−１０１）。Ｔ２−ファミリーＲＮａｓｅの抗癌能力のため、ヒトＲＮａｓｅ  Ｔ２は、内因性ヒト起源のその存在により、癌を治療するためのかなり有利な剤を表し、それにより、ヒトに投与した場合に最適に非免疫原性であって非毒性である。ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ蛋白質を抗癌剤として用いることができる可能性をテストするために、ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ蛋白質を以下のように合成した。
【０３６９】
材料および実験方法
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるヒトＲＮＡｓｅ６ＰＬ蛋白質の発現−ＲＮａｓｅ６ＰＬについての遺伝子の配列はヒトゲノムプロジェクトにおいて同定され（ゲノム配列：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ＿００７４２２；ｃＤＮＡ配列：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３７３０）、図５４に模式的に掲げる。全長遺伝子の２８７５１ｂｐのうち、７１９ｂｐのみがオープンリーディングフレームを形成する。組換えＲＮＡｓｅ６ＰＬ蛋白質を生産するために、合成７１９ｂｐ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＡｒｔ  ＧｍｂＨ，ドイツ国）をｐＰＩＣ９Ｋプラスミドに連結し、さらに、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母に形質転換した。組換え酵母を誘導条件下で（すなわち、１％メタノールの存在下で）成長させ、得られたコロニーをＲＮＡｓｅ６ＰＬインサートの存在についてテストした。
【０３７０】
酵母クローンからのヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質の精製−組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質を精製するために、陽性コロニー（すなわち、ＲＮＡｓｅ６ＰＬインサートｃＤＮＡを含有するコロニー）を製造業者の指示に従って発酵させ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、培地上清を熱処理し（９０℃にて１０分間）、続いて、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７を用いる透析によって緩衝液を交換した。比較的純粋な蛋白質を、５ｍｌ／分の流速の５ｍｌカラムを用いる高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）におけるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．）に負荷した。活性なＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質を溶出させるために、０ないし１ＭのＮａＣｌグラジエントを（２０分間の間）カラムに適用し、溶出した蛋白質を０．５ｍｌの画分に集めた。別法として、選択された発現するコロニーからの蛋白質抽出物を５０００ｒｐｍにおいて１０℃にて１０分間遠心分離し、上清を、各々、０．４５および０．２μｍフィルターに通した。濾過した上清を、連続的に回転させつつ、４℃にて、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４緩衝液で予め平衡化した４％架橋ビーズ化アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に固定化されたコンカナバリンＡと一晩バッチ様式で反応させた。溶出および収集のために、カラム（３．５×１．３ｃｍ）を蛋白質抽出物−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣｏｎＡスラリーで調製し、平衡緩衝液で洗浄した。次いで、ＲＮａｓｅ  ６ＰＬを５００ｍＭメチルα−Ｄマンノピラノシドで溶出させ、５ｍｌ／チューブの画分を集めた。２８０ｎｍにおける光学密度、およびＲＮａｓｅ活性を画分について測定し、ピーク画分（図６７ａ）をプールし、透析し、凍結乾燥した。次いで、精製した画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥでさらに分析した（図６７ｂ）。
【０３７１】
ＲＮａｓｅ活性のアッセイ−基質としての１％（ｗ／ｖ）アガロース中の０．１％（ｗ／ｖ）ｔｏｒｕｌａ酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用い、ＲＮａｓｅ活性を拡散プレートアッセイによって測定した。試料１０μｌを直径１５ｃｍのペトリ皿に加え、３７℃で３０分間インキュベートした、次いで、基質を水中の０．０２％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーで染色した。ＲＮａｓｅ活性は、青色のバックグラウンド上の白色ハローによって示した。
【０３７２】
ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬの物理化学的評価−温度最適化のために、種々の温度におけるＲＮａｓｅ  ６ＰＬのインキュベーションに続いて反応混合物に残存するＲＮａｓｅ活性のパーセントを前記したように０ないし７０℃の温度範囲にわたってアッセイした。ｐＨ最適化のために、酢酸ナトリウム緩衝液で調整した３．５ないし７のｐＨ範囲にて、ＲＮａｓｅ活性を前記したように測定した。
【０３７３】
実験結果
ヒトＲＮａｓｅ  ６ＰＬ遺伝子の構造−ＲＮａｓｅ６ＰＬについての遺伝子の配列をヒトゲノムプロジェクトにおいて同定した。図５４に模式的に示すように、全長遺伝子の２８７５１ｂｐのうち、（９つのエクソンに配置された）７１９ｂｐのみがオープンリーディングフレームを形成する（配列番号３）。
【０３７４】
ＲＮＡｓｅ６ＰＬ酵母クローンの同定−ＲＮａｓｅ６ＰＬのコーディング領域をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母のｐＰＩＣ９Ｋプラスミドにクローン化し、１つのクローンは約７５０ｂｐの遺伝子インサートを含有することが見出され（図５５ａ）、これは、酵母における組換えＲＮａｓｅ６ＰＬのクローニングを示す。
【０３７５】
組換えＲＮａｓｅ６ＰＬをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母において生産する−陽性コロニーを適当な条件下で培養して、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬを過剰発現させた。酵母蛋白質抽出物を高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）におけるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｕ．Ｋ．）に通し、あるいはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣｏｎＡアフィニティーカラムに通すことによってアフィニティ−精製した。溶出した蛋白質を、ＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質の存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥでテストした。図５６に示すように、２７ｋＤａ蛋白質は、１５ｍｇの精製されたＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質よりなる溶出された画分から得た。
【０３７６】
精製された組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質は種々の温度において熱安定性である−組換え蛋白質の熱安定性は、５５ないし１００℃の上昇温度でのＲＮａｓｅ６ＰＬの１０分間のインキュベーションに続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。図５７ａに示すように、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬはテストした全ての温度にて安定であった。
【０３７７】
組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬは種々の温度にて触媒的に活性である−組換えＲＮａｓｅ６ＰＬの触媒活性を、ＲＮＡを分解するその能力によってイン・ビトロでテストした。図５７ｂに示すように、組換え蛋白質は、５５ないし１００℃の種々の温度における（１０分間の）蛋白質のインキュベーションに続いてＲＮＡを分解することができた。ＲＮａｓｅ６ＰＬリボ核酸分解活性の定量的アッセイで評価すると、最適活性は約５０℃にて検出された（図６４）。ＲＮａｓｅ６ＰＬのリボ核酸分解活性についての最適ｐＨは、酵母Ｔ２  ＲＮａｓｅと同様に４および５の間であった。
【０３７８】
概して、これらの結果は、酵母での蛋白質合成の間における組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ蛋白質の正確な折畳みを示す。加えて、上昇温度における熱安定性および活性は、組換え蛋白質が、ＲＮａｓｅ  Ｔ２ファミリーのメンバーに典型的な特徴的特性を呈することを示す。
【０３７９】
実施例２０
ヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）はイン・ビトロにて花粉管形成を阻害する
花粉管成長を頂ドームに焦点を当てた拡大の部位にて偏光させる。細胞質オルガネラは逆噴射様式によって花粉管に沿って移動し、頂下領域に主として濃縮される。細胞質ストリーミングおよび花粉管の成長は、細胞骨格蛋白質によって調節され、そのフィラメント状（Ｆ−）アクチンは主な役割を演じる。アクチンフィラメントは、花粉管に沿った長い束が落ち、頂ドームにおいて散漫なメッシュワークを形成するにつれて配置される。Ｆ−アクチン構造の中断は、成長の阻害をもたらす。植物起源のＴ２ファミリーのＲＮａｓｅは、リボ核酸分解活性に拘らず、花粉管成長を阻害することが示されている。かくして、ＲＮａｓｅ６ＰＬの哺乳動物起源（ヒト）に拘らず、我々は、ＲＮａｓｅ６ＰＬの存在下および非存在下で花粉管伸長をテストした。
【０３８０】
材料および方法
ユリ花粉管アッセイ−ユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ  Ｔｈｕｎｂ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ）花を室温に２４時間維持した。裂開した葯からの花粉を、別に前記したように、７％スクロース（ｗ／ｖ）、１．２７ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、０．１６ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ  ＫＮＯ３および３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４を含有する１００μｌの水性培養中でイン・ビトロで発芽させた（ＹｏｋｏｔａおよびＳｈｉｍｍｅｎ  １９９４．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １７７：１５３−１６２）。花粉培養を、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬまたはＲＮａｓｅ  Ｂ１で１μＭの最終蛋白質濃度まで補充した。さらなる培養を、同一濃度の（１．５気圧の存在下で１２０℃にて２０分間オートクレーブ処理した）酵素的に熱不活化された（ＥＩ−）ＲＮａｓｅを補充した。陰性対照は、培養および精製の同一手法に付された、ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子インサートなしのｐＰＩＣ９Ｋプラスミドを含有する酵母培養であった。暗所での２５℃における２時間の花粉培養のインキュベーションに続き、花粉管の長さをアイピースマイクロメーターによって微視的に測定した。
【０３８１】
実験結果
組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬはイン・ビトロにて花粉管形成を阻害する−花粉管の長さは、ユリ花粉管のアクチンフィラメントに対する組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬの脈管形成効果についての機能的アッセイとして用いた。図５８に示すように、ＲＮａｓｅ６ＰＬは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１で達成された阻害（対照に対して３６．５％）と同様に、酵母蛋白質対照に対して４５％だけ花粉管成長を効果的に阻害した。
【０３８２】
図５８にさらに示すように、酵素的に不活化されたＲＮａｓｅ６ＰＬ（ＥＩ−ＲＮａｓｅ６ＰＬ）は、ＥＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１のように、いずれのＲＮａｓｅ活性をも欠き、花粉管伸長に対してその阻害効果を依然として維持する（各々、４２％および５５％）。
【０３８３】
これらの結果は、ＲＮａｓｅ６ＰＬが、他のアクチン結合Ｔ２  ＲＮａｓｅのように、加熱不活化後においてさえ、花粉管形成に対する阻害効果を呈することを示す。
【０３８４】
ヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）は、イン・ビトロにて抗脈管形成特性を示す
脈管形成および血管形成は、癌の生存および発達に必須である（レビューについては、ＶａｌｌｅｅおよびＲｉｏｒｄａｎ  １９９７．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５３，８０３−１５、ならびに、Ｓｔｒｙｄｏｍ  １９９８．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４：８１１−２４参照）。アンジオゲニンは脈管形成についての効果的なインデューサーとして知られており、いくつかの癌細胞（例えば、ＨＴ−２９）においては、主な成長因子の１つである。内皮細胞においては、アクチンはアンジオゲニンに対する細胞表面受容体であるので、本発明者らは、ＲＮａｓｅ６ＰＬが、ＲＮａｓｅ  Ｂ１について先に示したように、脈管形成を阻害するためのアンジオゲニンまたはｂＦＣＦもしくはＶＥＧＦに対する競合体として働くことができると仮定した。
【０３８５】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）管形成アッセイ−は、培地を成長因子［アンジオゲニン、ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ（１μｇ／ｍｌ）］、およびＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮＡＳＥ  Ｂ１、１０μ／ｇｍｌ）、組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ、図５８において１０μｇ／ｍｌ、および図６３において０．５ないし１０μＭ）、対照酵母培養基（ｐＰＩＣ９Ｋプラスミド単独、酵母対照）またはＰＢＳいずれかの存在下または非存在下で補充した以外は、前記実施例７に記載したように行った。
【０３８６】
実験結果
ＲＮａｓｅ６ＰＬはＨＵＶＥＣ管形成に対する有意な抗脈管形成効果を呈する−組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬの抗脈管形成効果を、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイでテストした。図５８ａないしｌで示すように、ＲＮａｓｅ６ＰＬは、ＲＮａｓｅ  Ｂ１のように、１０μＭの濃度で、ＨＵＶＥＣにおけるアンジオゲニン−またはｂＦＧＦ誘導管形成を有意に破壊した。また、後記表６にさらに示すように、ＲＮａｓｅ６ＰＬの抗脈管形成効果は、ＲＮａｓｅ  Ｂ１のそれよりも有意に高かった。
2008514224.tif 000009
【０３８７】
ヒトＴ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）は、対照（ＰＢＳ）アッセイウェルにおける管形成の程度と比較して、アンジオゲニン、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦ（図６３ａないし６３ｏ）等の種々のプロ脈管形成因子の存在下でＨＵＶＥ細胞管形成も顕著に阻害した。ＨＵＶＥ細胞培養における脈管形成の完全な阻害は、５μＭ  ＲＮａｓｅ  ６ＰＬの濃度で明らかである（図６３ｄ、ｈおよびｎ）。
【０３８８】
ここに提示したＲＮａｓｅ６ＰＬの抗脈管形成特徴はＴ２−ＲＮａｓｅファミリーのメンバーに典型的であり、これは、ヒトＴ２−ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  ６ＰＬ）が、ＲＮａｓｅ  Ｂ１の同一の抗癌／抗脈管形成能力を保有することを強く示す。
【０３８９】
実施例２１
多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅは癌細胞のクローン原性を阻害する
前記で示したように、Ａ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１は、イン・ビトロコロニー形成アッセイにおいてヒト結腸癌細胞のクローン原性能力を阻害する。広く多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅが特徴的な活性のある範囲にわたって強い類似性を維持するか否かを判断するために、ヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞のクローン原性に対する細菌、酵母およびヒト起源からのＴ２  ＲＮａｓｅの効果を調べた。
【０３９０】
材料および方法
クローン原性アッセイ−コロニー形成アッセイは、若干改変したが、本質的に前記したように行った。ヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を、フラスコ当たり１０５細胞の濃度にて５０ｍｌフラスコ中で成長させた。該培地は、１μＭのＡ．ｎｉｇｅｒ  Ｔ２  ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ  Ｂ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  ＩまたはＲＮａｓｅ  ６ＰＬ（ヒトＴ２  ＲＮａｓｅ）の存在下または非存在下で、１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、および１％抗生物質−抗真菌溶液を補充した７ｍｌのＤＭＥＭを含有し、細胞移植の２４時間後に交換した。細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で３７℃でインキュベートした。４８時間後に１０００細胞／ウェルを、１μＭ  ＲＮａｓｅの存在下または非存在下で２００μｌ培地中の９６ウェルプレートに播き、５日間成長させた。コロニーの数をカウントした。６つの個々の測定を各ＲＮａｓｅで行った。
【０３９１】
結果：
図６８は、ヒト癌細胞のクローン原性、またはコロニーに組織化するヒト癌細胞の能力は、起源に拘らず、Ｔ２  ＲＮａｓｅの投与によって大幅に損なわれることを明確に示す。明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０３９２】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許、特許願、および受託番号によって特定される配列はすべて、個々の刊行物、特許、特許願または配列が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１】Ｒｏｉｚ，Ｌ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．１５６：３７−４１の教示に従って単離されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の吸光度およびＲＮａｓｅ活性のグラフ表示である。
【図２】使用した精製工程を通じてのＲＮａｓｅ  Ｂ１蛋白質濃度の増加を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラムである。
【図３】桃花粉発芽（塗りつぶした四角と実線）および花粉管長さ（ボックスと点線）に対する異なる濃度のＢ１  ＲＮａｓｅのイン・ビトロ効果を示すグラフである。
【図４】柱頭および花柱の上部分における桃花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図５】タンジェリン花の柱頭における花粉管成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図６】ネクタリン種子で行った生存性テストを示す。
【図７】ユリ  ｃｖ．Ｏｓｎａｔ花粉管長さに対する、未処理、煮沸またはオートクレーブ処理されたＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図８】イン・ビトロで成長し、ＩＫＩで染色されたユリ花粉管に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図９】ＲＮａｓｅ  Ｂ１未処理（図９ａ）および処理（図９ｂ）花粉管におけるオルガネラ移動および局所化を示す統合ビデオイメージから捕獲されたスチルショットを示す。
【図１０】成長するユリ花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図１１】アクチンへのＲＮａｓｅ  Ｂ１結合を表すＳｃａｔｃｈａｒｄプロットである。
【図１２】１時間成長させたイムノゴールド銀染色ユリ花粉管を示す。
【図１３ａ】ＨＴ２９結腸癌細胞の生存性に対する異なる濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図１３ｂ】ＨＴ２９結腸癌細胞の生存性に対する異なる濃度のＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図１４】ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図１５】ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１への暴露時間の効果を示す。
【図１６】ＨＴ２９細胞のコロニー化能力に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図１７】６匹のラットの各群についての処理を記載する、ラットで行ったイン・ビボ実験の模式図である。
【図１８】ＣＡＰマイクロカプセルからのＲＮａｓｅ  Ｂ１放出の速度に対する２つの異なるｐＨの効果を示す。
【図１９ａ−ｂ】各実験の最後の体重によって示されるように、ラット成長速度に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１および／またはＤＭＨの効果を示す。
【図１９ｃ−ｄ】各実験の最後の体重によって示されるように、ラット成長速度に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１および／またはＤＭＨの効果を示す。
【図２０】予防的処置として、ＲＮａｓｅ  Ｂ１（２０ａ）、Ｉ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１（２０ｂ）またはＰＢＳ（２０ｃ）を含有する浸透圧ポンプを移植したラットの糞におけるＲＮａｓｅ活性を示す。対
【図２１】予防的処置として、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えたラットの糞におけるＲＮａｓｅ活性を示す。
【図２２】予防的処置として、浸透圧ポンプで移植したラットの末端側結腸（５ｃｍ）における異常な陰窩病巣（ＡＣＦ）の数を示す（ｎ＝６）。
【図２３】予防的処置として、マイクロカプセル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを与えたラットの末端側（５ｃｍ）結腸で調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す（ｎ＝６）。
【図２４】切除から１時間後の内側粘膜表面において写真を撮った際の、異なるタイプの腫瘍を示す。
【図２５】メイヤーのヘマトキシリンおよびマルチウスイエローで染色された腫瘍の組織病理学的調査を示す。
【図２６】治療的処置としての、ＰＢＳ、ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはＩ−ＲＮａｓｅ  Ｂ１を含有する浸透圧ポンプで処理したラットの末端側（５ｃｍ）結腸において調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図２７】治療的処置としての、マイクロカプセル化ＲＮａｓｅ  Ｂ１またはグルコースを与えたラットの末端側（５ｃｍ）結腸において調べた異なるパラメータに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図２８】アクチンについてＴＲＩＲＣで染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。
【図２９】膜アクチンについて免疫染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。
【図３０】ＦＩＴＣ免疫染色したヒト結腸癌腫ＨＴ−２９  ４−ｄ培養細胞を示す。
【図３１】ユリ花粉管の長さに対する異なる蛋白質処理の効果を示す。
【図３２】１μｇ―ｍｌアンジオゲニンの存在下または非存在下における、およびＲＮａｓｅ（各々２μＭ）の存在下または非存在下におけるＭａｔｒｉｇｅｌ上のＨＵＶＥＣ管形成を示す顕微鏡写真である。
【図３３】ＢＤＦ１（黒色）およびＢａｌｂ／ｃ（白色）マウスでのｉｐ／ｉｐ実験におけるＢ１６Ｆ１メラノーマに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す写真である。
【図３４ａ−ｂ】５×１０５細胞／マウスを移植した、ｂａｌｂ／ｃマウスの肺で形成されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ病巣の発達の低下におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図３４ｃ−ｅ】５×１０５（図３４ｃ）または５×１０６（図３４ｄないしｅ）細胞／マウスを移植した、ｂａｌｂ／ｃマウスの肺で形成されたＢ１６Ｆ１０メラノーマ病巣の発達の低下におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図３５】ヌードマウスにおけるヒトメラノーマ細胞の腫瘍成長に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図３６】ｓ．ｃ．／ｉ．ｖ．実験における、ＨＴ−２９由来ヌードマウス異種移植片における腫瘍サイズに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す。
【図３７】ＲＮａｓｅ  Ｂ１による脈管形成のイン・ビボ阻害を示す写真である。
【図３８】Ａ３７５ＳＭ細胞侵入の阻害におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す棒グラフである。
【図３９】ｓｃ／ｉｐモデルにおけるＨＴ−２９由来ヌードマウス異種移植片を示す棒グラフである。
【図４０】ＲＮａｓｅ  Ｂ１の存在下または非存在下における、ｓ．ｃ．／ｉ．ｐ．モデルでのＨＴ−２９移植ヌードマウスからの腹膜断面の顕微鏡写真である。
【図４１】ｓ．ｃ．／ｉ．ｐヌードマウスモデルのＨＴ−２９由来腫瘍からの断面の顕微鏡写真である。
【図４２】ＤＭＨ誘導結腸腫瘍でのＣＤ３１発現に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す結腸癌組織の代表的な組織病理学的切片である。
【図４３】マウスメラノーマ細胞における腫瘍のサイズおよびアポトーシスに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１のプロアポトーシス効果を示す、ヌードマウスにおける腫瘍の代表的な組織病理学的切片の顕微鏡写真である。
【図４４】ＤＭＨ誘導結腸腫瘍におけるアポトーシス速度に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す、代表的な結腸腫瘍切片の顕微鏡写真である。
【図４５】ヒト結腸癌異種移植片における腫瘍サイズおよびアポトーシスに対するＲＮａｓｅ  Ｂ１のプロアポトーシス効果を示すヌードマウスでの腫瘍の代表的な組織病理学切片である。
【図４６】ＬＳ１７４Ｔ誘導腫瘍の相対的容量に対するタキソールおよびＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示すグラフである。
【図４７】イン・ビトロでアクチンに結合するＲＮａｓｅ  Ｂ１の能力を示す、アクチンおよびアクチン結合蛋白質のウエスタンブロット（図４７ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白質染色（図４７ｂ）である。
【図４８】Ａ３７５ＳＭメラノーマ癌細胞による全ＭＭＰ−２放出の阻害におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の用量依存性効果を示す棒グラフである。
【図４９】Ａ３７５ＳＭ（図４９ａ）またはＨＵＶＥＣ（図４９ｂ）細胞におけるＭＭＰ−２放出に対するＲＮａｓｅ  Ｂ１処理の効果を示すＭＭＰ−２コラゲナーゼ活性のザイモグラムである。
【図５０】ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理ＨＵＶＥＣ細胞におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図５１】ＲＮａｓｅ  Ｂ１処理Ａ３７５ＳＭ細胞におけるＲＮａｓｅ  Ｂ１の細胞局所化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図５２】Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡからのＴ２  ＲＮａｓｅの増幅を示すアガロースゲルイメージである。
【図５３】Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムＤＮＡから調製された３００ｂｐ  ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列である。
【図５４】染色体６ｑ２７に位置するヒト細胞外ＲＮａｓｅ（ＲＮａｓｅ６ＰＬ）のゲノム構造の模式的説明である。
【図５５】組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ  ｃＤＮＡ（図５５ａ）および蛋白質（図５５ｂ）のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおける存在を示す。
【図５６】組換えＲＮａｓｅ６ＰＬの銀染色分析である。
【図５７ａ】組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＴ２−ＲＮａｓｅ）蛋白質の熱安定性を示す。
【図５７ｂ】組換えヒトＲＮａｓｅ６ＰＬ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのＴ２−ＲＮａｓｅ）蛋白質の活性（図５７ｂ）を示す。
【図５８】組換えヒトＴ２  ＲＮａｓｅのユリ花粉管阻害活性を示すヒストグラムである。
【図５９ａ−ｈ】ヒト臍帯内皮細胞における管形成に対するヒトＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果を示す顕微鏡写真である。
【図５９ｉ−ｌ】ヒト臍帯内皮細胞における管形成に対するヒトＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果を示す顕微鏡写真である。
【図６０−１】ヒトＴ２  ＲＮａｓｅのクローニングおよび発現で用いられる合成ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列である。
【図６０−２】ヒトＴ２  ＲＮａｓｅのクローニングおよび発現で用いられる合成ＲＮａｓｅ６ＰＬ遺伝子のヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列である。
【図６１−１】多様な系統発生的起源からの他のＴ２ファミリーメンバーとヒトＴ２ヌクレアーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列整列である。
【図６１−２】多様な系統発生的起源からの他のＴ２ファミリーメンバーとヒトＴ２ヌクレアーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列整列である。
【図６１−３】多様な系統発生的起源からの他のＴ２ファミリーメンバーとヒトＴ２ヌクレアーゼとのＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列整列である。
【図６２】図６０にあるように、合成ＲＮａｓｅ６ＰＬ（配列番号４）のアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ整列であり、Ｔ２  ＲＮａｓｅファミリーメンバーのアミノ酸配列はヒトＲＮａｓｅ６ＰＬに対して最も近い相同性を有する。
【図６３】ヒト臍帯内皮細胞における管形成に対するヒトＴ２  ＲＮａｓｅの阻害効果を示す顕微鏡写真である。
【図６４】ＬＳ１７４Ｔ誘導腫瘍の容量に対するタキソールおよびヒトＴ２  ＲＮａｓｅの効果を示すグラフである。
【図６５】イン・ビトロで成長したユリ花粉管中でのオルガネラの分布に対するＡ．ｎｉｇｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｂ１の効果を示す顕微鏡写真である。
【図６６】ヒトＲＮａｓｅ６ＰＬのアクチン結合活性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスロットブロットアッセイの写真である。
【図６７】コンカナバリンＡでのアフィニティ−クロマトグラフィーによるＲＮａｓｅ  ６ＰＬの精製を示す。
【図６８】ヒト癌細胞のクローン原性に対する多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅの効果を示すヒストグラムである。
【図６９】多様な起源のＴ２  ＲＮａｓｅによるヒト結腸癌腫瘍成長の効果的な阻害を示すヒストグラムである。
【配列表フリーテキスト】
【０３９４】
配列番号１および２は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３は、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬクローン化コード配列である。
配列番号４は、組換えＲＮａｓｅ６ＰＬ産物の配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９ａ−ｂ】
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【図１９ｃ−ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４ａ−ｂ】
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【図３４ｃ−ｅ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７ａ】
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【図５７ｂ】
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【図５８】
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【図５９ａ−ｈ】
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【図５９ｉ−ｌ】
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【図６０−１】
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【図６０−２】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６１−３】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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