(57)【要約】  本発明は、特定の抗原を指向する重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作成又はクローニングする方法に関する。前記方法は、前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を前記サンプル又は集団から単離する工程、及び前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を、前記少なくとも1つの細胞から入手する工程を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する前記少なくとも1つの細胞を単離する工程；
（c）前記少なくとも1つの細胞から、前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列を入手する工程。
【請求項２】
工程（b）が以下の工程の任意の適切な組み合わせを含む、請求項1に記載の方法：
（b-1）抗体を発現しない細胞から抗体を発現する細胞を分離する工程；
（b-2）他の抗原を指向する抗体を発現する細胞から、所望の抗原に対する抗体を発現する細胞を分離する工程；
（b-3）通常の4-鎖抗体を発現する細胞から重鎖抗体を発現する細胞を分離する工程；
ここで、前記工程は任意の順序で実施することができ、さらに前記工程の各2つ又は3つ全てはまた単一工程としても実施できる。
【請求項３】
工程（b）の後でかつ工程（c）の前に個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から、重鎖抗体を発現する細胞を個々の細胞として又は個々の細胞のセットとして単離する工程；
（c）前記抗原を指向する重鎖抗体の発現について、前記個々の細胞又は個々の細胞のセットをスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を、前記少なくとも1つの細胞から入手する工程。
【請求項５】
工程（c）で、個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記細胞サンプル又は集団を個々の細胞のセットに分ける工程；
（c）前記個々の細胞のセットを、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する細胞についてスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する前記少なくとも1つの細胞から、前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を入手する工程。
【請求項７】
工程（c）で、個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
請求項１から7のいずれかに記載の方法を用いて同定、選別、作出及び/又はクローニングされた核酸。
【請求項９】
前記核酸が遺伝的構築物の形態を有する、請求項8に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項１から7のいずれかに記載の方法を用いて同定、選別、作出及び/又はクローニングされた核酸、及び場合によって遺伝的構築物のそれ自体公知の1つ以上の更なるエレメントを含む、遺伝的構築物。
【請求項１１】
重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記方法が、請求項8若しくは9のいずれかに記載の核酸、又は請求項10に記載の遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現させることを含む、前記製造方法。
【請求項１２】
請求項8若しくは9のいずれかに記載の核酸、又は請求項10に記載の遺伝的構築物を含む、宿主細胞又は宿主生物。
【請求項１３】
請求項8若しくは9のいずれかに記載の核酸又は請求項10に記載の遺伝的構築物によってコードされるか、及び/又は請求項11に記載の方法によって入手される、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項13に記載の重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗原結合フラグメントがVHHドメインである、前記抗体又はそのフラグメント。
【請求項１５】
そのアミノ酸配列が、請求項14に記載のVHHドメインのアミノ酸配列を土台にし、及び/又は請求項8又は9に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を土台にしているナノボディ。
【請求項１６】
請求項14に記載の少なくとも1つのVHHドメイン及び/又は請求項15に記載の少なくとも1つのナノボディを含有するか又は含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１７】
請求項16に記載のタンパク質又はポリペプチドをコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
【請求項１８】
遺伝的構築物の形態を有する、請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
少なくとも1つのVHHドメイン及び/又は少なくとも1つのナノボディを含有するか又は含むタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって、前記方法が、請求項17及び/又は18に記載の核酸又は請求項18に記載の遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現させることを含む、前記タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項17及び/又は18に記載の核酸又は請求項19に記載の遺伝的構築物を含む、宿主細胞又は宿主生物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン配列の同定、選別、作出、クローニング及び/又は製造方法に関する。
特に、本発明は、免疫グロブリン配列（下記で定義される）を同定、選別、作出及び/又はクローニングする方法に関する。ここで、前記免疫グロブリン配列は重鎖抗体（下記で定義される）又はその抗原結合フラグメントである。
より具体的には、本発明は、重鎖抗体の可変ドメイン配列を同定、選別、作出及び/又はクローニングする方法に関する。
好ましい（しかしながら非制限的である）ある特徴にしたがえば、本発明は、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント、及び特に重鎖抗体の可変ドメインをコードする核酸及び/又はヌクレオチド配列を同定、選別、作出及び/又はクローニング（或いは下記では包括的に“入手”）する方法に関する。ここで、前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントは、（下記で定義されるように）特定の抗原を指向する。
本発明はまた、本発明の方法によって入手した核酸/ヌクレオチド配列；前記を含むか又は含有する遺伝的構築物；前記を含有するか及び/又は発現する宿主細胞；及び前記核酸/ヌクレオチド配列、前記遺伝的構築物、及び/又は前記宿主細胞の、例えば前記可変ドメイン配列の調製及び/又は発現を目的とする使用に関する。
本発明はまた、本発明の核酸/ヌクレオチド配列によってコードされる、及び/又は前記核酸/ヌクレオチド配列の発現によって入手することができる可変ドメイン配列；前記可変ドメイン配列の使用；及び前記可変ドメイン配列を含有する生成物又は組成物に関する。
本発明はさらに、前記可変ドメインの1つ以上を含有するか又は含むタンパク質及びポリペプチド；そのようなタンパク質又はポリペプチドの使用；前記タンパク質又はポリペプチドを含有する生成物又は組成物；及びそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド、核酸及び/又は遺伝的構築物に関する。
【０００２】
さらにまた下記で述べるように、本発明の方法及び構築物を用いて入手される可変ドメイン配列はナノボディーズ（Nanobodies(商標)）（注記：Nanobody(商標)、Nanobodies(商標)、及びNanoclone(商標)は、商標保護又はAblynx N.V.によるそのための出願の対象物である）として用いることができる。さらにまた、下記でも述べるように、本発明の方法及び構築物を用いて入手される可変ドメイン配列、そのアミノ酸配列、及び/又は前記をコードする核酸及び/又はヌクレオチド配列は、例えば下記の一般的背景技術の考察で概略する種々の方法の1つを用いることによって、ナノボディを開発、設計及び/又は調製するための出発点として用いることができる。
したがって、さらに別の特徴では、本発明はまたそのようなナノボディ；前記をコードする核酸、ヌクレオチド配列及び/又は遺伝的構築物；そのようなナノボディの使用；及びそのようなナノボディを含有する生成物又は組成物に関する。
本発明はさらに、1つ以上の前記ナノボディを含有又は含むタンパク質及びポリペプチド；そのようなタンパク質又はポリペプチドの使用；前記タンパク質又はポリペプチドを含有する生成物又は組成物；及びそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、核酸及び/又は遺伝的構築物に関する。繰り返せば、前記タンパク質又はポリペプチドは、好ましくは多価フォーマット又はマルチ特異性フォーマットを有する。
本発明はまた、上記で言及したタンパク質及びポリペプチドを調製する方法、及び/又は前記タンパク質又はポリペプチドを発現又は産生することができる宿主細胞に関する。
本発明の更なる特徴、実施態様、使用、応用及び利点は、以下の更なる記述から明白となろう。
【０００３】
重鎖抗体、VHHドメイン及びナノボディに関する全般的背景技術の考察
重鎖抗体及びその可変ドメインに関する全般的な説明のために、とりわけ以下の参考文献を引用する（前記文献は全般的な背景技術として言及される）：WO94/04678（＝EP656,946）、WO96/34103（＝EP0,822,985）及びWO97/49805（前記は全てVrije Universiteit Brusselによる）；WO97/49805（Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie）；WO94/25591（＝EP0,698,097）及びWO00/43507（Unilever N.V.）；WO01/90190（National Research Council of Canada）；WO03/025020（＝EP1,433,793）（Institute of Antibodies）；WO04/062551, WO04/041863, WO04/041865, WO04/041862及びWO04/041867（出願人）；非出願公開国際出願PCT/BE2004/000159（出願人）（2004年11月5日出願、発明の名称：EGFR及び/又はCEA（例えば癌）関連疾患及び異常の診断、予防及び治療で使用されるポリペプチド（”Polypeptides for use in the diagnosis, prophylaxis and treatment of diseases and disorders associated with EGFR and/or CEA, such as cancer”）；Hamers-Casterman et al. Nature, 363:446 (1993)；Riechmann and Muyldermans, J Immunol. Methods, 231:25-38 (1999)；Vu et al. Mol Immunol 34(No.16-17):1121-1131 (1997)；Nguyen et al. EMBO J. 19(No.5):921-930 (2000)；Arbabi Ghahroudi et al. FEBS Letters 414:521-526 (1997)；van der Linden et al. J. Immunol Methods 240:185-195 (2000)；Muyldermans, Reviews in Mol Biotechnol 74:277-302 (2001)；Nguyen et al. Advances in Immunology, 79:261 (2001)；並びに下記で言及される更なる参考文献のいくつか。
【０００４】
さらにまた、下記においては（及び前記の文献中で使用される技術にしたがえば）、天然に存在する重鎖抗体に出現する可変ドメインはまた、通常の4-鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（下記では“VHドメイン”と称されるであろう）と、及び通常の4-鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（下記では“VLドメイン”と称されるであろう）と前記を区別するために、“VHHドメイン”と称されるであろう。下記の更なる考察から明らかになるであろうが、VHHドメインは多数の固有の構造的特徴および機能的特性を有する。前記特徴及び特性は、単離VHHドメイン（天然に存在するVHHドメインと前記構造的特徴及び機能的特性を共有するナノボディも同様に）を、機能的な抗原結合ドメイン又はタンパク質として使用するについて極めて有益なものにする（すなわち、下記および上記引用文献で考察される理由により、単独では抗原結合ユニットとして不適切である、単離された天然に存在するVHドメイン又はVLドメインと比較して）。
上記に引用した全般的背景技術に記載されているように、重鎖抗体は、天然に存在する通常の4-鎖抗体（天然の状態では重鎖及び軽鎖の双方を含む）に存在する軽鎖を含まないという点で固有である。それにもかかわらず、重鎖抗体が天然に進化してきた態様のために、前記はなお高い親和性及び特異性で抗原と結合することができる（すなわち、通常の4-鎖抗体の親和性及び特異性と比較して）。
【０００５】
換言すれば、重鎖抗体は、対応する抗原と高い親和性及び高い特異性で結合するために軽鎖の存在を必要としない。この他に類のない特性によって重鎖抗体は通常の4-鎖抗体と区別される（4-鎖抗体は、抗原結合ユニットとして機能を有するためには、一方の腕の抗原と他方の腕のVH及びVL双方との間の相互作用を必要とする）。（注記：重鎖抗体は軽鎖を含まないので、前記はまた当分野では“単鎖抗体”（例えばWO02/085945参照、VLドメインと共有結合したVHドメインを含む合成ポリペプチドである、いわゆる“単鎖Fv”又は“scFv”と混同してはならない）、及び“軽鎖を欠く免疫グロブリン”（例えばEP0,656,946及び上記で言及した更なる全般的背景技術のいくつかを参照されたい）とも称され、本明細書の目的のための用語は“重鎖抗体”という用語と等価であるべきで、前記用語が本明細書で用いられるであろう）。
上記はまた、単離されたVHHドメイン（前記は本質的に、軽鎖可変領域の非存在下で及び軽鎖可変ドメインとの一切の相互作用なしに抗原と機能的に結合するように“設計”されている）は、単一の、比較的小さい、機能を有する抗原結合構造ユニット、ドメイン又はタンパク質として用いることができることを意味する。このことはまた、VHHドメインを通常の4-鎖抗体のVH及びVLと区別する（一般的にはVH及びVLは、単独では抗原結合タンパク質又はドメインとして適切ではなく、機能的抗原結合ユニットを提供するためには、例えば通常の抗体フラグメント又はscFv（VLドメインに共有結合させたVHドメインから成る）のように何らかの形態で結合させる必要がある）。
【０００６】
これらの固有の特性のために、抗原結合タンパク質又は抗原結合ドメインとして（すなわちより大きなタンパク質又はポリペプチドの部分として）のVHHドメイン及びナノボディの使用は、通常のVH及びVLドメイン、scFv又は通常の抗体フラグメント（例えばFab-フラグメント又はF(ab)2-フラグメント）の使用に較べて、以下のような顕著な利点を提供する：
−高い親和性及び高い選択性で抗原と結合させるためにただ1つの単一ドメインが要求されるだけで、したがって2つの別個のドメインを有する必要も、これら2つのドメインが正しい立体的配置及び構造で存在していることを確認する（すなわちscFvの場合のように特別に設計したリンカーの使用する）必要もない；
−VHHドメイン及びナノボディは単一の遺伝子から発現させることができ、翻訳後の折り畳み又は改変を必要としない；
−VHHドメイン及びナノボディは容易に操作して多価及びマルチ特異性フォーマットを得ることができる（下記でさらに考察される）；
−VHHドメイン及びナノボディは高度に可溶性であり、凝集傾向をもたない（Wardら（Nature, (1989)341:544））が記載したマウス由来の抗原結合ドメインの場合、前記文献にはまた“単一ドメイン抗体”と称されている）；
−VHHドメイン及びナノボディは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤又は変性条件に対して高度に安定である；
−VHHドメイン及びナノボディは、（例えば下記に更に述べるように）製造に要求される規模であっても調製が容易で比較的安価である。例えばVHHドメイン、ナノボディ及び前記を含有するタンパク質/ポリペプチドは、微生物発酵を用いて製造することができ、例えば通常の抗体フラグメントの場合のように哺乳動物発現系を使用する必要がない；
−VHHドメイン及びナノボディは、通常の4-鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して相対的に小さく、したがってそのような4-鎖抗体及びその抗原結合フラグメントよりも組織（固形腫瘍を含むが、ただし前記に限定されない）への高い浸透性を示す；
−VHHドメイン及びナノボディは、いわゆる腔結合特性を示し、したがって通常の4-鎖抗体及びその抗原結合フラグメントにとって近づきにくい標的及びエピトープにも近づくことができる。例えば、VHHドメイン及びナノボディは酵素を阻害できることが示された（例えば以下を参照されたい：WO97/49805；Transue et al. Proteins: structure, function, genetics, 32:1998；Lauwereys et al. EMBO J, 17(13):3512-3520）。
【０００７】
カメリド（Camelid）の他に、重鎖抗体はまた、例えばある種のサメの種でも天然に存在する（例えば国際特許出願WO03/014161を参照されたい）。そのような重鎖抗体に由来する可変ドメインも本発明で用いることができるが、カメリド由来の重鎖抗体及び/又はその可変ドメイン配列の使用が、とりわけ後者は哺乳動物の種に由来するため、及び/又は後者は（下記で述べるように）一般的に“ヒト化がより容易であるために”はるかに好ましい。
上記に引用した全般的な背景技術に記載されているように、天然に存在する重鎖抗体の重鎖はCH3ドメイン、CH2ドメイン及び可変ドメインを含有するが、軽鎖に加えて、通常の4-鎖抗体に天然に出現する重鎖に存在するCH1ドメインも欠いている。
全般的には、VHHドメインは、通常のVHドメインの免疫グロブリンの折り畳みを維持する構造を有する（例えば以下を参照されたい：Desmyter et al. Nature Structural Biology, 3(9):803 (1996)；Spinelli et al. Nature Structural Biology 3:752-757 (1996)；Decanniere et al. Structure 7(4):361 (1999)；Decanniere et al. Structure (1999)7(4):361；Dumoulin et al. Protein Science (2002) 11:500-511）。しかしながら、VHドメインと比較して、VHHドメインはそれらのアミノ酸配列内に（特にそれらのフレームワーク領域内に）1つ以上の置換を含み、前記置換は、VHドメインでVH/VL境界面を形成するVHHドメインの前記領域/残基をいっそう疎水性にする（上記に引用した全般的背景技術及び下記の更なる考察を参照されたい）。これらの置換によってもまた、VHHドメインは（ナノボディも同様に）、通常の4-鎖抗体に由来する天然に存在する抗原結合ドメイン（例えばWardら（上掲書）が記載したマウス由来のVH配列）と区別される。
【０００８】
全般的には、VHH配列（及びVHH配列を土台にしたナノボディ）の種々の応用については、VHH配列（及びVHH配列を土台にしたナノボディ）の使用がそのような応用で提供できる利点（すなわちVH配列と比べて）と同様に、全般的な背景技術で再度言及される。VHH配列及びナノボディのその他の潜在的な応用及び使用は当業者には明白であり、それらは例えば、前記配列が指向する抗原、及び前記VHH配列又ナノボディがそのために選択されることとなった特性に左右されるであろう。しかしながら、全般的には、VHH配列は、通常の免疫グロブリン配列（通常の抗体及びそのフラグメントがscFv及びVHドメインと同様に含まれるが、ただしこれらに限定されない）の使用が提唱されていたか、又は想定し得る、いずれの応用又は使用においても用いることが可能である。
さらにまた、上記に引用した全般的な背景技術で概略されているように、天然に存在するVHHドメインはナノボディーズ(商標)として用いることができる。さらにまた、下記でも述べるように、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列、及び/又は前記をコードする核酸及び/又はヌクレオチド配列は、例えば下記の全般的背景技術に概略する多様な方法の1つを使用することによって、ナノボディーズ(商標)を開発、設計及び/又は調製する出発点として用いることができる。
例えば、下記でさらに説明するように、特に好ましいナノボディの種類（ただし前記限定されない）は、すなわち、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を、通常のヒトVHドメインの対応する位置に存在するアミノ酸残基で置換することによって、天然に存在するVHHドメインの配列と比較してそのアミノ酸配列がヒト化されてあるナノボディである。
また別のナノボディの非制限的な種類は、下記でさらに説明するように、すなわち天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を下記に示す“ホールマーク残基”の１つに置換することによって、天然に存在するVHドメインの配列と比較して（特に天然に存在するヒトのVHドメインの配列と比較して）、そのアミノ酸配列が“ラクダ化”されてあるナノボディである。
ナノボディのさらに詳細な説明については、下記の更なる説明で言及される。
【０００９】
免疫グロブリン配列のクローニングに関する全般的従来技術の考察
免疫グロブリン配列のクローニングについては種々の方法及び技術が当分野において記載されている。
伝統的には、モノクローナル抗体がKohler & Milsteinのハイブリドーマ技術を用いて作出されてきた。前記方法では、問題の抗体を発現するB細胞が適切な新形成細胞と融合され（また別にはT細胞がリンパ腫細胞と融合され）、所望の抗体を生成するために用いることができる不朽化ハイブリドーマ細胞が提供される。
したがってハイブリドーマ技術の使用は、一般的には所望の抗原に対する抗体を発現する細胞を必要とする。そのような細胞は、非ヒト哺乳動物を所望の抗原で免疫し、前記抗原に対する免疫応答を惹起させることによって容易に作成することができる。しかしながら、ハイブリドーマ技術で使用される、所望の抗原に対する抗体を発現する適切なヒト細胞は、明白な健康上の理由のために、人間を意図的な抗原で免疫することはできないために入手は容易ではない。
通常の4-鎖抗体の免疫グロブリン配列のクローニングで増幅を用いる初期の研究のいくつかは、Larrickらが記載している（例えば以下を参照されたい：Larrick et al. Biotechnology 7(Sep. 1989):934-938；及びLarrick et al. Progress in Biotechnology (Borrebaeck et al. Ed.,) 1989, Vol.5, p.231-246）。Larrickらの研究では、PCRを用いて、個々のハイブリドーマ細胞及び/又は個々のB細胞から出発し、適切なコンセンサスプライマーを用いて可変ドメイン配列が選択的に増幅された。
個々のB細胞に由来する通常の4-鎖抗体の免疫グロブリン配列を増幅するまた別の技術は、以下の文献に記載されている：Coronella et al. Nucleic Acids Research, 2000, 28(20):e85；Takahashi et al. J Biotechnol 1996, 49:201-210；Embleton et al. Nucleic Acids Research 20(15):3831-3837；及び国際特許出願WO92/02551。
【００１０】
免疫グロブリン配列のクローニングにもっとも広く用いられる技術の１つは、例えばEP0,589,877、US5,969,108及びUS6,248,516に記載されている、いわゆる“レパートリークローニング”及び“ファージディスプレー”技術の組み合わせを含む。これら及び他の参考文献に記載されているように、レパートリークローニング及びファージディスプレーの手段による、免疫グロブリン配列（または下記では一般的に“バインダー”と称される）の選別及びクローニングは一般的に以下の工程を含む：
（a）細胞又は細胞収集物からRNA（例えば全RNA又はmRNA）サンプルを提供する工程、ここで前記細胞はある動物由来の全免疫“レパートリー”を発現することができ（例えばB細胞）、さらに前記mRNAは前記動物の全免疫レパートリーを含み；
（b）前記mRNAからcDNAを合成する工程；
（c）免疫レパートリーをコードするヌクレオチド配列を選択的に増幅する工程；
（d）前記増幅配列によってコードされるバインダーをファージ粒子表面で発現するファージ粒子を調製する工程；
（e）所望の抗原と結合することができるバインダー配列を発現するファージ粒子を選別する工程；
（f）工程（e）で選別したファージ粒子から前記バインダーコード配列を単離/クローニングする工程。
通常の4-鎖抗体の可変ドメインの配列を選択的に増幅させる、増幅工程（c）を実施するための固有のプライマーは、欧州特許出願EP0,368,684に記載されている。前記特許にしたがえば、増幅工程後に得られた配列を発現ベクターでクローニングし、タンパク質の各々が免疫グロブリン可変ドメインを含むタンパク質レパートリー発現のための核酸配列レパートリーを含む発現ライブラリーを提供する。
レパートリークローニング及びファージディスプレーの使用はまた、重鎖抗体の可変ドメイン配列のクローニングについても記載されている（例えば以下を参照されたい：Reiter et al. J Mol Biol (1999), 290:685-698）。
【００１１】
国際出願WO03/54016は、上記に引用した出願人による出願のいくつかと同様に、重鎖抗体の可変ドメインの選択的な増幅のために改善されたプライマーについて記載している。一般的には、重鎖抗体の可変ドメイン配列のクローニングに使用されるとき（さらに例えばEP0,368,684に記載されたプライマーの使用と比較して）、これらの改善されたプライマーの使用は、可変ドメイン配列のより広範囲のレパートリーのクローニングを可能にする。
レパートリークローニング及びファージディスプレーは、可変ドメイン配列のクローニング及びスクリーニングのために成功性が高く効率的な技術としてそれ自体確立されているが、これら技術の使用に伴ういくつかの欠点が存在する。
結局、上記の選別工程（e）は、所望の抗原と結合するバインダーの選別をある程度可能にするが、実際には、適切な親和性及び特異性を有するバインダーを提供するために、単離工程（f）の後で、所望の抗原に対して1回以上のさらに別のスクリーニング工程が通常要求される。これは、選別工程（f）の後で得られるバインダーのプールが、なお多くの“ノイズ”（例えば擬陽性の空ベクターなど）を含んでいるためである。
さらにまた、選別工程（e）では、バインダーはファージ粒子の表面で発現され、これらファージ粒子と結合している間に選別される。したがって、バインダーは、in vivoでそれらが発現される条件（すなわちB細胞又は他の抗体発現細胞の表面）とは非常に異なる条件下で発現され選別される。このため、“天然”の条件下で抗原と結合することができるいくつかのバインダーは、それらがファージディスプレーによって提供される“人工的”な条件に付されるときもはや抗原と結合することができないか、又はそのような条件下では親和性の低下を示すことは可能である。そのようなバインダーは、したがって、ファージディスプレーを用いるときは“陽性”と同定され得ないであろう（例えば、前記についての非制限的な利用の１つとして、B細胞上では多数のバインダーが“一緒に機能して”抗原に対して高い親和性を提供することがあり得よう。ファージディスプレーを用いるときは、そのような天然に存在する高い親和性は失われるであろう）。これに関しては、二価構築物としたときに、対応する一価構築物と比較して10倍から1000倍又はそれより大きな親和性の増加を示すバインダーが存在することは特記されるべきである（例えば、出願人による国際出願WO04/041862に記載されている抗TNFバインダー）。
【００１２】
さらにまた、選別工程が、ファージ粒子の表面で発現されるバインダーを用いて実施されるとき、前記バインダーが正しい態様で発現され抗原と結合するか否かは定かではない（すなわちB細胞の表面で前記バインダーが発現される態様と比較して）。例えば、ファージ粒子（前記はバインダー自体よりも何百倍又は何千倍大きい）との空間的又は立体的相互作用が存在する可能性があり、前記相互作用はバインダーと抗原との高親和性結合の妨げとなり得るし、又は完全に妨害することすら可能である。このような欠点は、いくつかの事例では、バインダーが十分に長い“リンカー”（例えばpIIIループ）の端に存在するファージ粒子を用いることによって幾分緩和することができるが、やはり一般的には、ファージディスプレーの手段によって選別工程を実施することは、抗原がファージ粒子の表面で発現されるときは、高親和性で抗原と結合することができるバインダーに対して強い偏りをもたらすと言えよう。このことはまた、B細胞による発現及び/又はB細胞表面での発現という“天然”の環境で高い親和性で結合することができるある種のバインダーは、ファージディスプレーの“人工的”条件下では高い親和性をもつ陽性と同定され得ないことを意味する。
ファージディスプレーのまた別の欠点は、ファージ粒子は例えば大腸菌のような微生物で調製しなければならないということである。このことは、ファージ粒子を調製するために用いられる条件に適合しないか、又は大腸菌で良好に産生されない（例えば大腸菌偏向）か、及び/又はそれらの天然の構造をこれらの条件下ではとり得ないか、及び/又は抗原に対するそれらの親和性の全て又は部分をこれらの条件下で失うバインダー（又は前記をコードする配列）は、ファージ粒子内に取り込まれないか、又は発現されず、したがって陽性が見逃されるであろう。
さらにまた、全般的にはファージディスプレー技術は、実際のところ汚染に極めて鋭敏である。
【００１３】
ファージディスプレーのまた別の欠点は、特に通常の4-鎖抗体由来のバインダーを得るために前記を実施するときは、一般的には、出発材料として用いられる“全”mRNAが、高親和性バインダーを非常に低い百分率で含むということである。これに加えて、選別工程のためにファージ粒子上で発現される配列を提供するために実施されるクローニング工程は、多くの理由から、バインダーの総数と比較して高親和性バインダー数の“希釈”をもたらす。このことは、多数のファージ粒子（すなわち108を超えるファージ粒子、しばしば1011−1012のファージ粒子又はそれより多いファージ粒子）を選別工程で用いなければならないということである。さらにまた、通常の4-鎖抗体に由来するバインダーに関しては、ファージライブラリーは非常に機能的というわけではない。なぜならば、可変重鎖又は軽鎖ドメインはその天然のバインダーパートナー（すなわちそれぞれその可変軽鎖又は重鎖ドメイン）をもたないで発現されるからである。したがって、ファージディスプレーに関しては、抗体の重鎖及び軽鎖の本来のペア形成はクローニングプロセスで失われており（その双方が抗体の結合親和性に貢献する）、これら本来のペアが回復される確率は、免疫若しくは非免疫動物又はヒト由来のBリンパ球集団から出発するときは極めて低い。一般的には、臨床的に有効であるために適切なレベルの親和性を達成するためには、相当な操作が要求される。
したがって、一般的には、ファージディスプレーの使用は、選別工程でバインダーの発現にファージ粒子を使用することに付き物の多数の欠点を有する。さらにまた、ファージディスプレーを用いて選別されたバインダーに対して実施される後続のいずれのスクリーニング工程も、明らかにファージディスプレーを用いて陽性と同定することができるバインダーにしか行き着かないであろう（すなわち、それらは先行する工程で既に識別されているからである）。このことは、ファージディスプレーに用いられるフォーマット（すなわち“人工的” 条件下でファージ粒子の表面で一価のバインダーとして発現される）は、実際には、大腸菌で発現し得るバインダーの数とタイプを制限し、及び/又は後続のスクリーニング工程で同定され得るバインダーの数とタイプを制限し、及び/又はファージ粒子の表面で一価の形態で存在するときに高親和性を示すバインダーへの偏向をもたらす。
【００１４】
前記の事柄は全て、例えば単独では（すなわち一価形では）所望の抗原に対して特に高い親和性を持たないが、B細胞に存在するときは高い親和性を有するバインダー（それらは“マルチマー”として結合するので）、及び/又は大腸菌では良好に発現されないバインダーは、ファージディスプレーを使用した場合は容易に同定又は選別することができないことを意味している。さらにまた、二価又は多価構築物としてフォーマットしたとき、対応する一価のバインダーと比較して親和性の“桁数”の増加をもたらすバインダー（例えば上記で言及した抗TNFバインダー）の容易な同定及び/又は選別は、ファージディスプレーでは許容されないであろう。
これに関しては、本明細書に引用した全般的な背景技術及び下記の更なる考察でも記載されているように、VHHドメイン及びVHHドメインを土台にしたナノボディはしばしば、医薬的使用のために、他の機能的アミノ酸配列との融合物として、例えば種々の抗原を指向する2つ以上のナノボディを含むマルチ特異性タンパク質としてフォーマットされる。実際には、出願人は、一価形で高い親和性を示すバインダーは、他のアミノ酸配列とともにフォーマットされるとき、時折、それらの親和性又は他の所望される特性を大なり小なり喪失し、一方、一価形では初めは高い親和性を示さなかった他のナノボディが実際にはそのようなフォーマットでより有用性を示すことを見出した。繰り返せば、そのようなバインダーを見出すためには、ファージ粒子の表面で一価形で存在するときに高い親和性を示すバインダーに対する偏向（前記はファージディスプレーに付き物である）は重大な欠点であろう。
【００１５】
したがって、通常のディスプレー方法は、選択した標的と特異的に結合する抗体及び他のポリペプチドの単離では顕著な成功を収めたが、いくらかの非能率性及び限界が存在する。通常方法では、多くのライブラリーメンバーが非特異的に標的又は標的を保持する固相に結合し、特異的に結合したライブラリーメンバーとともに増幅され、アフィニティー選別ラウンドの度に有効性を低下させる。前記は、何回ものアフィニティー選別で時間と労力を浪費するだけでなく、特異的な親和性を有するポリペプチドを保持するメンバーがラウンド毎に失われる。選別は、一般的には、十分なアフィニティー選別ラウンドが実施され、たとえ多くの非特異的結合メンバーがなお存在するとしても、標的に対して親和性を有するポリペプチドを保持するメンバーが相当な数に達したときに終了する。クローン単離株を釣り上げ、個々に検査して更なる選別ラウンドを介して特異的結合メンバーを失うリスクを減少させる。特異的に結合していることが示されたクローン単離株を、続いて更なる解析および大規模生産のために発現工程でクローニングする。したがって、最初のレパートリーに存在する、標的に対して特異的親和性を有するポリペプチドを保持するライブラリーメンバーのうち単離されるのは、1つ又は数個だけである。
【００１６】
発明の簡単な要旨
本発明の目的は、重鎖抗体の免疫グロブリン配列を入手するためのまた別の方法を提供することである。
特に、本発明の目的は、ファージディスプレーと併用されるレパートリークローニングの欠点をもたない、重鎖抗体の免疫グロブリン配列を入手するためのまた別の方法を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（VHHドメインを含むがただしこれに限定されない）をコードする核酸及び/又はヌクレオチド配列を同定、選別、作出及び/又はクローニングする改善された方法を提供することである。
さらに具体的には、本発明の目的は、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（VHHドメインを含むがただしこれに限定されない）をコードする核酸及び/又はヌクレオチド配列を同定、選別、作出及び/又はクローニングする改善された方法を提供することであり、ここで前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントは特定の抗原を指向する。
本発明の目的はまた、ナノボディとして用いることができるか、又はナノボディの作出のための出発点として用いることができる、重鎖抗体のそのような抗原結合フラグメント（特にVHHドメインを含むがただしこれに限定されない）を提供することである（本明細書でさらに説明される）。
本発明の更なる目的、特徴、実施態様、使用、応用及び利点は下記の更なる説明から明瞭となろう。
大まかに言えば、本発明の方法は、所望の抗原に対する重鎖抗体を発現しているか又は発現能力を有する細胞に富む細胞サンプル又は集団は、所望の免疫グロブリン配列を作出するための出発材料として、（すなわち適切な管理計画（これについては上記に引用した全般的背景技術で一般的に言及されている）を用いてカメリドの一種を所望の抗原で免疫することによって）、容易に利用することができるという事実を利用する。本発明は、そのような濃縮サンプル又は集団を出発材料として用い、所望の抗原に対する重鎖抗体を発現する個々の細胞を提供し、前記細胞から後続の工程で前記抗原に対する免疫グロブリン配列を入手することができる。下記で述べるように、前記免疫グロブリン配列は完全鎖抗体でも、その単鎖抗体でも、若しくはその抗原結合フラグメントでもよく、又は前記をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸でもよい。好ましい（ただし前記に制限されない）ある実施態様にしたがえば、本発明の方法を用いて、VHHドメイン又は前記をコードするヌクレオチド配列/核酸が提供される。
【００１７】
本発明をよりよく理解するために、特に、通常のレパートリークローニング及びファージディスプレー技術がヒトのVH及びVL配列のクローニングで通常的に用いられる場合のこれらの通常技術に関連して、ヒト供給源由来の比較的濃縮された細胞集団を提供することは（すなわちヒトVH及びVL配列を作成するための出発材料として）、単純に所望の抗原で人間を免疫することは健康上の理由から実現可能ではないので、通常は不可能であるということは改めて特記されるべきである。
したがって、ヒトのVH又はVL配列を作出するときは、通常は非濃縮ナイーブ細胞集団が出発材料として用いられる。前記出発材料は濃縮されていないので、所望の抗原を認識するバインダーは極めて低いパーセンテージで含まれている（すなわち濃縮された集団と比較して）。このことは、適切なバインダーの同定のためには、はるかに多くのVH配列及びVL配列（すなわち108−1012配列の範囲で）がスクリーニングされねばならないことを意味する。慣行では、そのような大きなライブラリーのスクリーニングは、ファージディスプレー技術を用いた場合にのみ効率的に実施され得る。
さらにまた、ファージディスプレーを用いるときは、VH配列及びVL配列は抗原との相互作用のために別々にしかスクリーニングすることができない。このことは、抗原を認識するVHドメイン及びVLドメインを同定した後で、同定されたドメインが、実際に一緒に相互作用し、対応する抗原と十分な親和性及び特異性で結合するか否かをさらに決定しなければならないことを意味する。実際、ファージディスプレーの工程では抗原との相互作用について陽性である多数のVHドメイン及びVLドメインが、適切なVH/VL結合をもたらさない。これは、ファージディスプレーの後で多くの“陽性物”の“無駄”を生じ、このことは、適切なバインダーを同定するために、さらに多くのドメインをスクリーニングしなければならないことを意味する（もちろん、VHHドメインに関してはこの問題は生じない。なぜならば、VHHドメインは十分な親和性及び特異性で抗原と結合するために軽鎖可変ドメインを必要としないからである）。
【００１８】
本方法は、非濃縮出発材料の使用と同様に、通常はそのような非濃縮出発材料の使用を必要とするレパートリークローニング及びファージディスプレーの使用に付き物のこれらの欠点を回避する。
したがって、第一の特徴にしたがえば、本発明は、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法に関する。ここで、前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントは特定の抗原を指向し、前記方法は以下の工程を含む：
（a）前記抗原で免疫したカメリド由来の細胞サンプル若しくは集団、又は前記抗原を用いてin vitroで免疫される非免疫カメリド由来の細胞集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する前記少なくとも1つの細胞を単離する工程；
（c）前記抗原を指向する重鎖抗体、又は前記抗原を指向する重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を前記少なくとも1つの細胞から入手する工程。
簡明にするために下記の更なる説明では、本発明の方法の種々の工程は、VHH配列のクローニング、スクリーニング及び使用に言及しながらさらに詳細に記載されるであろう（前記は本発明の好ましい（ただし前記に限定されない）実施態様である）。しかしながら、本明細書に記載する方法は、重鎖抗体に由来する他のいずれの免疫グロブリンに対しても同様に適用され得ることは当業者には明白であろう。
【００１９】
工程（a）で用いられる細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含む任意の適切な細胞サンプル又は集団であり得る。例えば、前記細胞サンプル又は集団は、直接入手した血液リンパ球、リンパ節細胞若しくは他のB細胞又は脾臓細胞でもよい。
前記サンプル又は集団は、（すなわち前記抗原に対して免疫応答を惹起させるために）前記抗原で適切に免疫したカメリドから入手することができる。カメリドを抗原で免疫するための、それ自体公知の適切ないずれの方法又は管理計画を用いてもよい（前記については上記に引用した全般的な背景技術で言及されている）。
そのような適切な免疫後に、細胞サンプル又は集団を前記カメリドからそれ自体公知の態様で入手することができる（前記についてはまた上記に引用した全般的背景技術で言及されている）。例えば細胞サンプル又は集団は、全血サンプルの形で、又は重鎖抗体を発現する細胞を含む全血の部分（例えば血清サンプル）の形で、リンパ液の形で、又は組織サンプル（例えば脾臓細胞サンプル）の形で採集することができる。全血のそのような部分を入手するために、第一に全血サンプルを入手し、続いて前記から適切な部分をそれ自体公知の態様で入手することができる。
前記サンプル又は集団は、ナイーブなカメリドから、上記に記載したようなサンプリング及び単離方法を用いて入手することができる。その後で、リンパ球をex vivoで培養し、それらを1回又は繰り返し前記抗原に暴露することによってin vitroで免疫することができる。当業者には明らかなように、細胞を、また別の増殖因子、抗原提示細胞、アジュバント、抗CD40抗体、CD40L、又は前記の組み合わせとともに提供し、抗原特異的B細胞のin vitro活性化及び/又は分化を最適化させることができる。
さらに、前記の全血又は部分をそれ自体公知の細胞分類技術に付し、抗体/重鎖抗体を発現することができる細胞をさらに分離することも可能である。例えば、全血、全血の部分又はリンパ液からB細胞サンプル又は集団を得るためにそれ自体公知の技術を用いてB細胞サンプル又は集団を入手してもよい。
【００２０】
次に、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する単一細胞を前記サンプル又は集団から単離する。繰り返せば、前記はそれ自体公知の適切な任意の態様で実施することができる。適切な技術は当業者には明白であり、通常は、抗原、固定抗原、及び/又は前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する細胞の選別のために適切に目印を付した抗原の使用を必要とする。
適切な技術には例えば以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：適切に目印を付した抗原（例えば蛍光標識、磁性標識抗原）と細胞を接触させ、続いて蛍光標識抗原と結合した細胞を前記抗原と結合していない細胞から分離することができる分離技術に前記細胞を付す。前記は、それ自体公知の適切な態様で、例えばFACS装置又は別の適切な細胞分類装置を用いて実施することができる。標識抗原を調製する適切な標識及び方法もまた当業者には明白であろう。続いて、蛍光標識抗原と結合する細胞を採集し、場合によって蛍光標識抗原を分離し、さらに場合によって個々の細胞に分離する。前記はまた、当業者には明白なように、それ自体公知の態様で実施することができる。
他の技術は、抗原がその上に又はそれと結合している表面又は担体を用いることを必要とする。続いて、抗原/担体と結合していない細胞を洗い流し、その際、担体又は表面と結合した細胞を前記担体又は表面から遊離させ、採集し、さらに場合によって個々の細胞に分離する。また別には、細胞が付着した担体を媒体から分離し、その後で、担体又は表面に結合した細胞を前記担体又は表面から遊離させて採集し、場合によって個々の細胞に分離させることができる。
小粒子担体（例えば磁性マイクロビーズ）が用いられる場合、前記担体は、担体結合B細胞と非結合B細胞を分離させた後、担体結合B細胞に付着させたままにしてもよい。
【００２１】
適切な担体及び技術は当業者には明白であろう。前記には、例えば抗原被覆表面による選別、抗原を付着させた（すなわち共有結合又は他の態様による）ポリマーマトリックス又はゲルの使用、又は抗原被覆若しくは抗原付着（すなわち共有結合又は他の態様による）ビーズ（例えばDynabeads(商標)、MACSビーズ、又は他のタイプの磁性ビーズ）の使用が含まれる。前記抗原はまた、適切な膜（細胞膜又は細胞膜分画が含まれるが、ただしこれらに限定されない）に結合及び/又は存在させることができる。
担体又は表面結合B細胞の脱離が要求される場合は、例えばトリプシン又は他のプロテアーゼのような酵素の処理、例えばEDTAのような二価陽イオンキレート剤の媒体への添加、還元性リンカーが用いられているときは抗原と担体又は表面との間の物理的結合を分解する物質（例えばDTT）の添加、別の抗原結合リガンドによる競合的置換、又は前記の組み合わせによって、結合B細胞を担体又は表面から取り除くことができる。
他の技術については、例えば上記に記載した参考文献に記載されている技術で言及されている。
これに関しては、カメリドから入手した抗体発現細胞サンプル又は集団は、通常の4-鎖抗体を発現する細胞と同様に、重鎖抗体を発現する細胞（例えば全抗体発現細胞の1−60%、通常は10から30%の範囲で）を通常含んでいるであろうということは特記されるべきである。ラクダでは、全抗体発現細胞の約50%が重鎖抗体を発現する。ラマでは、全抗体発現細胞の約30%が重鎖抗体を発現する。
したがって、好ましくは、所望の抗原に対して重鎖抗体を発現する細胞の前述の分離は、もっとも好ましくは、所望の抗原に対する通常の4-鎖抗体を発現する細胞ではなく所望の抗原に対する重鎖抗体を発現する細胞のみが得られるような態様で実施される。この目的のために、所望の抗原による選別前、選別時又は選別後に、前記細胞を、重鎖抗体を発現する細胞を通常の4-鎖抗体を発現する細胞から分離する工程に付すことができる。適切な技術は当業者には明白であり、例えば、重鎖抗体を特異的に指向する抗体の使用を含むことができる。前記抗体はまた適切に標識するか、又は適切な担体若しくは表面に付着させることができる。適切な技術は当業者には明白であり、上記の節に記載した技術と類似したものであり得よう。
【００２２】
したがって、上記の実施態様では、工程（b）は以下の工程の任意の適切な組み合わせを含むことができる：
（b-1）抗体を発現しない細胞から抗体発現細胞を分離する工程；
（b-2）他の抗原を指向する抗体を発現する細胞から所望の抗原を指向する抗体を発現する細胞を分離する工程；
（b-3）通常の4-鎖抗体を発現する細胞から重鎖抗体を発現する細胞を分離する工程；
ここで、前記工程は任意の順序で実施することができ、さらに前記工程のそれぞれ2つ又は3つ全てを単一工程として実施してもよい。
また別には、細胞サンプル又は集団は、限定希釈アッセイの手段又は同様な技術によって、所望の抗原に対して重鎖抗体を発現する個々の細胞に分離することができる。
さらに別の実施態様にしたがえば、重鎖抗体を発現する活性化された細胞、特に重鎖抗体を発現する活性化形質細胞/B細胞は、サンプル中の他の細胞（すなわち、抗体を発現しない細胞、通常の4-鎖抗体を発現する細胞、及び重鎖抗体を発現する非活性化B細胞）から分離され、単一細胞として採集されるか、及び/又は単一細胞に分離され、続いて下記に記載する更なる工程で用いられる。この実施態様の1つの利点は、そのような活性化細胞は、非活性化又は“メモリー”B細胞と比較して、概してはるかに高レベルの重鎖抗体のmRNAを含み、さらに高レベルの重鎖抗体を産生することができるということである。そのような活性化細胞は、それ自体公知の任意の技術（細胞分類技術が含まれるが、ただしこれに限定されない）を用いて、サンプル中の他の細胞から分離することができる。そのような方法の非制限的な例は実施例21に記載されている。一般的には、この方法は、細胞分類工程の前に、重鎖抗体に対する第一の標識抗体を用いる第一の染色工程（細胞を固定及び透過性にする工程）及び重鎖抗体に対する第二の標識抗体を用いる第二の染色工程を含む。前記のようにして得られた細胞サンプルの分類に続いて、前記工程は活性化細胞を別々の集団として入手することを可能にする（例えば再び実施例21を参照されたい）。
【００２３】
所望の抗原に対する重鎖抗体を発現する細胞を単一細胞として採集するか、又は採集してから単一細胞に分離した後、前記重鎖抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸を前記個々の細胞から入手することができる。前記もまた、当業者には明白なように、それ自体公知の態様で実施することができる。適切な技術は、通常は適切なプライマーを用いる増幅工程を必要とし（例えばPCR又は別の適切な増幅技術を用い、さらに個々の細胞から入手したmRNAから作成したcDNAを鋳型として用いる）、続いて増幅された生成物を単離する。従来技術及び上記に引用したハンドブックを参照することができる。
例えば、可変ドメイン配列（すなわちVHH配列）の増幅のために、重鎖可変ドメイン配列の増幅用のそれ自体は公知のプライマーのいくつかを用いることができる（前記プライマーについては上記に引用した従来技術で言及されている）。VHH配列の増幅のために特に好ましいいくつかのプライマーは、国際出願WO03/54016で言及されているプライマーとともに、上記に記載した出願人による他の特許出願に記載されたプライマーのいくつかである。
前記増幅を実施するために適切な条件及び試薬と同様に、増幅配列を単離するために適切な技術もまた当業者には明瞭であろう。繰り返せば、前記に関しては上記に引用した従来技術及びハンドブックで言及されている。
このようにして入手した核酸の配列を増幅工程後に決定し、及び/又は前記核酸を用いてVHHフラグメントを発現させることができる（前記については下記の更なる説明で言及される）。
【００２４】
非制限的なある実施態様にしたがえば、増幅の前に、個々の細胞は、例えば前記個々の細胞が分割/増殖/分裂することができる条件下で、及び/又は前記細胞を刺激して所望の抗体が発現又は産生される条件下で培養することができる。適切な方法及び技術は当業者には明瞭であろう。例えば、細胞はマルチウェルプレートのウェルで適切な培養液中で培養することができる。抗体の産生又は発現を刺激するための適切な技術もまた当業者には明瞭である、例えば以下を用いた刺激が含まれ得る：適切なカメリド細胞（例えばヘルパー細胞）、EL4-B5細胞（例えば以下を参照されたい：Weber et al. J Immunol Methods (2003) 278:249-259）、OD40リガンド若しくは類似の因子、又は膜結合CD40リガンド（例えばUS6,297,052及びその中で考察される更なる参考文献を参照されたい）。
さらにまたこの工程では、細胞を培養した培養液又は上清を、所望の抗原に対する適切な重鎖抗体の存在、発現及び/又は産生についてスクリーニングすることができる。
また別の実施態様では、本発明の方法は以下の工程を含むことができる：
（a）前記抗原で免疫したカメリド由来の細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原に対して誘導された重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から重鎖抗体を発現する細胞を、少なくとも1つの個々の細胞として、又は個々の細胞のセットとして単離する工程；
（c）前記少なくとも1つの個々の細胞又は個々の細胞のセットを、前記抗原を指向する重鎖抗体の発現についてスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を前記少なくとも1つの細胞から入手する工程。
この実施態様では、工程（a）は上記に記載した態様で実施することができる。工程（b）では、先ず初めに細胞は、一方で重鎖抗体を発現する細胞、及び他方で抗体を発現しない細胞又は通常の4-鎖抗体を発現する細胞に分離される。
【００２５】
続いて、重鎖抗体を発現する細胞を個々の細胞に分離し、続いて個々の細胞の各々を、例えば上記に記載した技術の1つを用いて、所望の抗原に対する重鎖抗体の発現についてスクリーニングする。また別には、この実施態様では、個々の細胞を培養及び/又は刺激して所望の抗体を発現又は産生させることができる（繰り返せば本質的には上記に記載されたとおりである）。その後、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする。後者は抗体の発現について個々の細胞をスクリーニングする必要性を回避する。
続いて、前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばVHHドメイン）をコードする核酸が、所望の抗原を発現又は産生する1つ以上の個々の細胞から、本質的には上記に記載したように入手される。
さらに別の実施態様では、本発明の方法は以下の工程を含む：
（a）前記抗原で免疫したカメリド由来の細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記細胞サンプル又は集団を個々の細胞のセットに分ける工程；
（c）個々の細胞のセットを、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する細胞についてスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する前記少なくとも1つの細胞から、前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を入手する工程。
この実施態様では、先ず初めに、細胞サンプル又は集団は個々の細胞に分離される。続いて個々の細胞の各々は、所望の抗原を指向する重鎖抗体の発現について、本質的には上記に記載したようにスクリーニングされる。
【００２６】
また別には、この実施態様では、個々の細胞を培養及び/又は刺激して、（繰り返せば本質的には上記に記載したように）抗体を発現又は産生させることができる。その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原を指向する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする。繰り返せば、後者は抗体の発現について個々の細胞をスクリーニングする必要を回避する。
続いて、前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えばVHHドメイン）をコードする核酸が、所望の抗原を発現又は産生する1つ以上の個々の細胞から、本質的には上記に記載したように入手される。
上記の方法は中等度から高処理自動化様式での使用に、例えば適切な自動装置を用いて適用することができることは、当業者には明白であろう。この目的のためには、個々の細胞はまた適切なマルチウェルプレートのウェルで培養することができる。
個々のBリンパ球はランダムに再編された免疫グロブリン遺伝子を保持し、前記は種々のB細胞クローンによって産生される対応するタンパク質に異なる抗原特異性を付与する。再編は全てのクローンで生じ、多数のB細胞が生涯にわたって持続的に産生されるので、B細胞の総数に対してはいずれの再編についてもその相対的豊富さは極めて低い。
免疫によって又は以前の感染に対する天然の免疫を介して、動物は免疫学的にナイーブな動物の状態から免疫された状態に変化する。このプロセスの間に、問題の抗原に反応するB細胞クローンは“活性化”され、数が大量に拡張されるが、一方、非反応性細胞は増加せず、全集団における抗原反応性B細胞の相対的豊富さが高まる。同時に、親和性成熟が生じ、これによって抗原反応性B細胞は、免疫グロブリン遺伝子の変異周期を経験し、これら変異から生じるより高親和性変種が選別される。したがって免疫付与は抗原反応性B細胞の相対的豊富さの増加とより高親和性の抗体を産生するB細胞の増加の双方をもたらす。
【００２７】
したがって、本発明の好ましいある実施態様にしたがえば、細胞集団は過剰免疫動物から入手され、ここで前記抗原特異的B細胞集団は膨大な数に拡張され（1対100以上、1対10,000を超える桁数）、それらのいずれも問題の抗原に対し高親和性レセプターを進化させている。重鎖抗体の固有の構造のために、重鎖可変ドメインの遺伝子の単離のみが要求され、軽鎖可変ドメインを単離又はクローニングする必要がない。このことは、上記に示した理由のために、非免疫動物（及び特に人間）の通常の4-鎖抗体を土台にする技術（前記のような技術に対しては、非免疫（又は免疫が弱い）対象（例えば健康な人間）から入手されるサンプルを用いるときには、大規模の高処理技術（例えばレパートリークローニングおよびファージディスプレー）が、全抗原特異的B細胞レパートリーを総点検するために一般的に要求される）を超える大きな利点である。後者の事例では、極めてしばしば、最初のB細胞集団は問題の抗原に暴露された経験がない。したがって、極めてわずかの細胞しか問題の抗原に対して反応性をもたず、これら細胞は親和性成熟を経ていない。全レパートリーからこれらを単離することは、極めて包括的で鋭敏なツールがなければ実行可能ではない。問題をさらに難しくしていることには、通常の4-鎖抗体の可変ドメインでは、評価し得る親和性で抗原と結合するためには可変ドメインの完全なマッチが必要である。高度な多様性をもつ両レパートリーを別個に増幅し、さらにそれらを（scFvフラグメント又はFabフラグメントを作成するために）ランダムに組み換えることは問題を増幅させる。
【００２８】
必要とされる数字で表される規模を明確にするために、仮に1/10,000のB細胞が対象となると仮定する。この場合、全B細胞が対象の重鎖及び軽鎖遺伝子（それぞれ“H”及び“L”）を含んでいる。対象の“H”を有する遺伝子の頻度1/10,000ｘ対象の“L”を有する遺伝子の頻度1/10,000が、可能な100,000,000の組換えにつき1つの対象となる“H/L”の組み合わせを生じる。本明細書ではこの問題は“組換え希釈ペナルティー”と称されるであろう。技術的な理由で、正しい組み合わせの“H/L”遺伝子フラグメントさえも本来の完全長の組み合わせと同じ親和性で抗原と結合することができない。したがって、非免疫動物/人間から例えばscFvの作成を達成するためには、存在する全レパートリーの総括が極めてまれな生産性レセプターを捕捉するために必要となる。これに関しては、そのもの単独で抗原と結合することができるいくつかの“H”又は“L”遺伝子が存在するとしても（さらにそれら遺伝子は単独では抗原と十分には結合することができない“H”及び“L”遺伝子と比べてその数は圧倒的に限定されているであろう）、そのような遺伝子は互いに隔離された状態で高親和性については進化せず、したがって、最大でも1/10,000の頻度で存在するほとんどの“H”又は“L”遺伝子は完全に機能し得ないであろうということもまた、常に考慮する必要がある。ペアの形成を必要としないで抗原と結合する分画は極めて低く、1/10,000のヒット率をさらに低下させる。この高率の非機能性遺伝子は、基本的には、第二のまた別個の効率低下ペナルティーを構成する。したがって、全体的なヒット率は、このように隔離されたほとんどの“H”又は“L”遺伝子は非機能性であるという知見を除外したとしても、1/10,000の“H”又は“L”遺伝子頻度を基準にして予想し得る1/10,000よりもはるかに低いであろう。例えば、scFvを単離するための工程がそうであるように、したがって前記の方法は、最終的に高親和性のバインダーを得るためには、膨大な処理及び全レパートリーの総括が絶対的に要求される。
【００２９】
上記で述べたように、本発明は過剰免疫動物から出発し、この場合、抗原特異的B細胞集団は大きな数に拡張されてあり（1対100以上、1対10,000を超える桁数）、それらの全てが、対象の抗原に対して高親和性のレセプターを進化させている。レセプターの固有の構造のために、“H”遺伝子の単離のみが要求される。したがって、“L”遺伝子の単離を必要とすることなく、ランダムな“H/L”組み合わせを作成することにより対象となる組み合わせを平行して希釈することなく（“組換え希釈ペナルティー”を完全に回避する）、高親和性の抗原結合レセプターをコードする“H”遺伝子を入手することが可能である。さらにまた、全ての“H”遺伝子が“L”遺伝子を必要としないで抗原と結合できるように進化しており、したがって第二の効率ペナルティー型もまた本発明には適用されない。A：免疫動物の使用及びB：重鎖抗体に特有の効率ペナルティーが無いというこの唯一無比の組み合わせが、ランダムに釣り上げた比較的少数のB細胞クローンのスクリーニングよってすらバインダーの入手を可能にする。これに関しては、Frenkeらの文献（J. Biotech., 2000, 78:11）の表1で言及されている。
したがって、本発明では、一方で高親和性バインダーの単離（前記は過剰免疫動物、特にカメリドの免疫機能に固有である）のための非常にわずかな要求が与えられるならば、大量処理も完全な全レパートリーの総括も（これらは、人間のB細胞から出発してレパートリークローニング及びファージディスプレーを用いるときに必須である）不要である。
【００３０】
最後に、本発明は、そのもっとも好ましい実施態様で所望の抗原に対する重鎖抗体を発現している細胞を含む細胞集団とともに用いられるときにその主要な利点を提供するが、本発明を他の通常抗体産生細胞サンプルに応用することも排除されない。例えば、所望の抗原に対するヒトの又はヒト様の通常4-鎖抗体（すなわち適切な投与により産生される）を発現するトランスジェニック非ヒト動物を、本発明の方法のための出発材料として、場合によって所望の抗原発現細胞についての濃縮後に用いることができるB細胞の供給源として用いてもよい。そのようなトランスジェニック動物の非制限的なある例は、XenoMouse(商標)（Abgenix, CA, USA）である。前記は抗原による免疫に際してヒト抗体を発現するトランスジェニックマウスである。したがって、XenoMouse(商標)から得た抗体発現細胞サンプルを本発明の方法で使用する出発材料として、（場合によっては所望の抗原に対する抗体を発現する細胞について適切に濃縮した後で）用いることができる。
活性化されたB細胞は大量の可溶性免疫グロブリンを産生しこれを分泌するが、休止B細胞及び活性化B細胞は双方ともまたそれらの細胞膜に免疫グロブリンを提示している。したがって、B細胞表面に提示された免疫グロブリンと結合する抗原の検出によって、抗原結合/抗原非結合混合集団（前記集団は例えば末梢血、脾臓、リンパ節などから容易に単離し得る）で抗原結合B細胞亜集団が同定される。フローサイトメトリー装置は、非常に多数の個々の細胞と蛍光標識分子の結合を自動的に検出及び定量するので、この目的には申し分なく適切である。さらにまた、細胞当たり多数の蛍光標識と同様に細胞形態に由来するパラメーターを検出するそれら装置の能力は、サンプル中の無関係の細胞（例えば多形核細胞、マクロファージ、T細胞又は死細胞）との結合を排除するために、装置使用者が陰性コントロールを陽性マーカー（たとえばサンプル中の全てのB細胞を特定するマーカー）と同様に混合することを可能にする。最後に、最新の細胞分類装置は、装置使用者がそのようなパラメーターから恣意的に選択した任意の組み合わせを基準に個々の細胞を物理的に分類し、それらを全て一緒に１つのバルク採集容器（例えば遠心管）に入れるか、又は多くの個々の容器（例えばマイクロタイタープレートのウェル）に1つずつ分配するオプションを装置使用者に提供する。また別の多くのアプローチが同様に存在し、それらによって対象の抗原を固相又は磁性粒子に（吸収、共有結合、アフィニティ精製タグとの融合を用いて）固定し、洗浄工程又は磁石を用いて未結合細胞を洗い流す。しかしながら、これらの方法のいずれも、1つから2つのパラメーターによる分離しか効果的に実施することができないので、フローサイトメトリーよりも優れていることはいない。
【００３１】
したがって、本発明にしたがえば、免疫とフローサイトメトリーによる関連分画の分類を組み合わせることによって、開始時により豊富な対象細胞が得られ、これらの細胞の親和性が高められ、同様に更なる性状調査のためにそれら細胞の同定及び単離が容易となる。
免疫は、精製抗原、抗原の粗タンパク質混合物、大きなタンパク質上に対象となる特定の領域を提示しているペプチド若しくは免疫原性担体タンパク質と結合させたそのようなペプチドの結合物、対象となる抗原を発現している全細胞、又は後者の膜分画を用いて実施することができる。明らかに、実験的な自由性があちらこちらに多数あり、用いられる抗原の物理的な性質にもほとんど制限はない。しかしながら、抗原反応性B細胞の単離には厳格な要件が突きつけられている。例えば、この領域における古典的なフィージビリティ実験は、優れた溶解性をもつ純粋なタンパク質が本質的に無限に供給され得る実験に集中し、標識反応（ビオチニル化、標識など）にも容易に耐えるタンパク質が用いられた。前記は、実験で無関係の“パッセンジャー”抗原（例えば粗タンパク質、全細胞又は膜分画で生じるもの）と反応するB細胞の数が増大することを回避することを可能にしたが、また、プレート上に固定した同じ純粋な抗原による選別、B細胞結合ビオチニル化抗原の磁力による単離、又はフルオレセイン標識した純粋な抗原と結合した細胞の分類によって、単離抗原結合B細胞分画を単離することも可能にした。
【００３２】
病的状態の治療（モノクローナル抗体療法を含む）の適切な標的である多くの抗原が膜結合形で存在する。これら抗原の多くは、分子の限定部分を外部へ提示し、前記限定部分がモノクローナル抗体薬による結合のために利用され得る。重要なことには、多くのそのようなタンパク質の構造は、その細胞膜との緊密な結合及び/又は膜内に埋め込まれたタンパク質のサブドメイン（タンパク質自体を含む）に決定的に依存している。これら分子の強い疎水性は、前記分子を均質な程度に精製すること、及び三次元構造を基本的に改変することなく化学的標識またはアフィニティー精製タグとの融合を（不可能でないとしても）困難にする。膜タンパク質の天然の構造と反応するB細胞を単離することがモノクローナル抗体薬の製造のための基本としてそれらを使用するために所望されるので、前記の問題は重大な技術的ハードルであり、現在のところ解決されていない。本発明は、そのような膜結合タンパク質を認識するB細胞の同定及び精製のために容易に実施できる方法を含む。
例えば、第一の非制限的特徴は、ある膜結合タンパク質を発現しない模擬トランスフェクト細胞株（又は初代細胞型）及び、前者と同じ親細胞株（又は初代細胞型）に由来する“同族”細胞株であって膜結合タンパク質をコードする天然の完全長cDNAをコードする発現ベクターをトランスフェクトされた細胞株とのマッチペアの使用を含む。したがって、前記特徴は、コードヌクレオチド配列以外の標的タンパク質の構造に関する情報を要求しない。さらにまた、そのようなマッチ細胞株ペアは、膜結合タンパク質研究ツールを供給するいくつかの業者から市場で容易に入手することができる。その天然の環境での（すなわち細胞膜に埋め込まれた状態での）完全長遺伝子の発現は、その構造が、前記を天然に発現している細胞によって発現されるタンパク質の構造と適合することを担保する。また別には天然に発現している細胞型を用い、古典的遺伝子操作の“遺伝子ノックアウト”を使用して遺伝子を破壊することによって、又は対象のタンパク質発現を強力に抑制するRNAiを導入することによって適合するする非発現細胞を作成してもよい。
【００３３】
いったんマッチ細胞株ペアが上記のようにして入手されたら、細胞外膜結合タンパク質に対しなんらの変更を加えることなく、蛍光色素を用いてこれらペアを標識することができる。これは、生細胞を化学的に活性化した蛍光色素の膜透過性エステル誘導体と一緒に単にインキュベートすることによって実施することができる。これらの非極性分子は、生細胞の細胞膜を通過して細胞質へと移動し、そこでエステラーゼ活性を有する多様な酵素が前記非極性分子を加水分解して2つの高度に荷電した（すなわち極性）フラグメントを生じる。これらは、もはや膜を通過することができず、それによって細胞内に蛍光色素を効率的に捕捉することができる（Molecular Probes, probes.com/handbook/sections/1402.html）。さらにまた、色素誘導体の注意深い操作によって、生成された2つのフラグメントの1つが、エステラーゼ仲介加水分解の直後に近傍のタンパク質と化学的に反応し偶発的に共有結合を形成する分子が得られた。生細胞と低濃度のこれら色素との短時間インキュベーションは、細胞の濃厚で高度に安定な蛍光標識をもたらし、細胞内タンパク質の非常に小さな部分しか改変されないので、生存率の低下はほとんどなく、また正常な細胞機能にも変化がない。これらのうち初期の例は、5-、6-カルボキシフルオレセインジアセテートのスクシンイミジルエステル（略してCFSE）であり、この場合、最終生成物は明るい緑色蛍光性である。以来多くの他の色素が開発され、容易に利用できる試薬表が作成され、それによって細胞を標識する色を選択することができる。これらの色素のいくつかは、CFSEなど（例えばDDAO-SE）から多様に広がった蛍光スペクトルを有し、それによって潜在的な色の重なり合いを最小限にし、多色標識実験を可能にしている（Molecular Probes, probes.com/lit/bioprobes44/7.pdf）。
したがって、この非制限的特徴にしたがえば、ここに記載した態様で容易に識別することができる2つの蛍光色素で標識したトランスフェクト細胞株及びコントロール細胞株のペアが用いられる。
【００３４】
続いて任意の適切な動物（特に哺乳動物）を（非標識）トランスフェクト細胞株又はその膜タンパク質粗抽出物で免疫することができる。前記は、抗原に対して免疫応答（すなわち抗体）の発生をもたらす、それ自体公知の適切な態様で実施することができる。前記免疫原の複合的性質のために、トランスジーンタンパク質と注射した免疫原細胞株の正常な膜タンパク質の双方に高い親和性で反応するB細胞が誘発されるであろう。上記に記載したように、2つの別個の蛍光色素で非トランスジェニック及びトランスジェニック細胞株をin vitroで標識し、免疫動物由来の単離B細胞とこれらを接触させることによって、B細胞の抗原反応性が、例えば以下のようにフローサイトメトリーを用いて容易に決定されるであろう（前記については図22−25でも言及される）：
−無関係の抗原特異性を有するB細胞はどちらの蛍光標識細胞集団とも結合せず、二変量FACSプロットで二重陰性の“下部左の象限”集団を生じるであろう；
−非トランスフェクト（親）細胞株の膜上に天然に存在する膜結合タンパク質と反応するB細胞は、トランスフェクト及び非トランスフェクト細胞の双方と等しく結合し、二変量FACSプロットで対角面染色パターンを生じるであろう；
−問題のB細胞（すなわちトランスジーン細胞株によってのみコードされる膜タンパク質と結合する細胞）は、トランスフェクト細胞株のみと結合し、FACS二変量プロットでX軸又はY軸に近い単一陽性集団を生じるであろう。これらは、無関係のB細胞とは今は容易に識別することができるので、これらの集団を特定し、したがって残余の集団から物理的に単離（分類）することができる。
【００３５】
ここに記載した一般的概念から外れることなく、前記の一般的なスキームに対しいくつかの変型が可能なことはフローサイトメトリー分野の業者には明白であろう。例えば、前記蛍光性細胞と非特異的に相互作用し得る、B細胞調製物中に夾雑するマクロファージ又は多形核細胞は、それらの異なる光散乱特性によりゲート操作で排除することができる。B細胞と同じ光散乱特性を共有するTリンパ球が同様に標的細胞と結合するという極めてまれな事象では、これら細胞は、T細胞マーカーの蛍光により同定される発現（陽性同定）又は蛍光性細胞結合粒子上でのB細胞マーカーの同時発現の欠如（陰性同定）を基準にして容易に特定することができる。抗原と結合するが死んでいるB細胞（下流でのin vitro性状決定には非常に不適切である）は、膜非透過性DNA結合色素（例えばヨウ化プロピジウム（PI）又はTOPRO-3（Molecular Probes））により排除することができる。したがって、通常の観察者には、別個の多くの蛍光色素がこのタイプの実験には要求されるように見えよう。しかしながら、光散乱は細胞を染色することを必要とせず、さらにいくつかのパラメーターを用いて死細胞、非B細胞又は無関係の抗原と結合したB細胞を陰性選別できるので、これら種々の理由のために研究者にとって対象ではない比較的豊富な細胞に関する情報を失うという比較的小さな犠牲で、これら全てを同じ蛍光検出チャネルにまとめることができる（“ダンプチャネル”）。実際、この情報は、連続的に解析はするが、同じB細胞調製物のいくつかの小アリコット（インプット管）に割り振らず、対象の細胞を分類するために用いられる多重管で使用されるただ1つの試薬を用いてそれぞれを染色することによって容易に再入手することができる。
【００３６】
さらにまた、哺乳動物のカメリド科のメンバー種は、通常の4-鎖（2重鎖、2軽鎖）抗体及び非通常性の重鎖のみの（しかも機能を有する）抗体の双方を産生する能力を有することが以前に報告された。本発明では、ラマ・グラマ（lama glama）の末梢循環から単離したB細胞の別々にサブセットが、軽鎖以外の表面免疫グロブリンを提示することができることをフローサイトメトリーツールにより明らかにした。両方のB細胞区画が高親和性の抗原結合性免疫グロブリン産生形質細胞に分化することができるが、非通常性亜集団のみが重鎖単独抗体由来ナノボディーズ(商標)の産生に関連し、非通常抗体産生B細胞と一緒にこれら抗原結合B細胞が共同分類されることを回避できることは極めて有益であろう。本発明のある特徴にしたがえば、2つ以上のフローサイトメトリー適合染色試薬を同時に又は連続的に用いて、これら2つの集団を分離することができる。さらに別の陰性分類決定マーカーとして表面軽鎖のための陽性染色を使用することによって（上記で述べた死んだB細胞の特定とは異なる）、有用な分類決定マトリックスが得られる（前記によって非通常性抗原結合B細胞のみが免疫ラマの末梢区画から分類され得る）。
【００３７】
上記に記載した一般的なB細胞染色プロトコルのまた別の変型は、抗原特異的B細胞染色実体の性質に関する。明確にするために、上記のB細胞染色方法を単純化し、染色試薬として直接蛍光で標識した細胞の使用を記載する。活性化されてもB細胞は比較的小さいので、他の細胞（例えばトランスフェクト及び非トランスフェクト細胞）と相互作用するために利用できる細胞当たりの表面積は限定される。2つの蛍光性B細胞結合細胞間の立体的妨害は、したがって望ましくない競合を生じ、最終的には個々のB細胞と1つか又は数個の標的細胞しか結合できない。前記は、それが、非トランスフェクト標的細胞上で発現された正常な膜タンパク質とB細胞が反応する事例では重要な問題ではないであろう。さて、ランダムな確率的作用のために、多数のB細胞がトランスジーン特異的として分類され（すなわち1つ又は数個の細胞と結合、全てのトランスジェニック細胞で同時発生し、したがって同様に単色蛍光標識される）、一方、それらは、対象ではないがトランスフェクト細胞の親細胞株にも存在する抗原と結合することが可能である。これらの細胞を真正トランスジーン特異的B細胞と一緒に分類することは、下流の処理で“ノイズ”を増加させ、さらに多くの分類クローンを平行して処理する必要性を生じるとともに、トランスフェクト及び非トランスフェクト細胞との結合に関して、得られたナノボディーズ(商標)の広範囲のスクリーニングが要求されるであろう。先行するB細胞の選別におけるどのような増加も、下流の作業負荷及び得られた先導候補分子当りのコストに直接跳ね返ってくるであろう。したがって、B細胞染色のために全細胞を使用する代わりに以下の代替案を開発した。
【００３８】
例えばCohenら（J Biol Chem 1981, 257:1523-1531）は単純な方法を記載した。前記方法では、低張緩衝液中で単にA431細胞株をインキュベートすることによって、A431細胞株を誘発して培養液中に核の無い完全な膜小胞を放出させる。続いて、これらの小胞を単純な遠心工程によって培養液から採集し、生細胞のための不活性代替物として用いた。粘着性生細胞で生じ得るような接触誘発粘着が不要なことは、細胞保護剤の非存在下での長期凍結に対する復元力、種々の緩衝液中での4℃又は室温でも可能なインキュベーションと同様に、in vitroでの膜タンパク質結合実験の多くで細胞に代わるより便利な代替物としてこれらの小胞を用いることを可能にする。本小胞形成の“酵母の発芽”様メカニズムは細胞外に面する膜面を外側に維持することを担保するが、一方、多くの人工的な膜タンパク質抽出方法では、再構成又は人工リポソーム作成工程は、内面が外に向いた集団が支配的なもの、又は正しい面が外に向いている小胞が最良で50/50であるものを生じる。さらにまた、リポソーム作成方法とは対照的に、精製タンパク質又は潜在的に変性した抽出タンパク質を用いる必要はなく、外来脂質を導入する必要もない。
【００３９】
放出された小胞は、本来の細胞の完全な天然の細胞質タンパク質の内容物を含むので、蛍光性小胞は、低張液ショックの誘発前に、以前に考察したように膜透過性反応色素で細胞を標識することによって容易に作成することができる。模擬トランスフェクト細胞及び問題の膜タンパク質をトランスフェクトした細胞を種々の蛍光色素で標識することによって、正常なタンパク質の補足物＋トランスジェニック膜タンパク質又は正常なタンパク質のみを提示している蛍光小胞を作成することができる。これらの小胞は、まれな結合事象の極めて鋭敏な検出に有用であると期待され、例えば、蛍光色素付加人工リポソーム（Scheffoldらの報告（Nat Med 2000, 6:107-110））の操作及び使用と類似する態様で操作及び利用することができる。Scheffoldらの報告では、細胞当り非常にわずかな数で存在する膜結合分子の検出で使用するために、リポソーム表面に抗原ではなく抗体が結合された。細胞当り80分子という稀な割合で出現する分子を染色したリポソーム（前記は通常の手段では得ることができない）は、容易に識別することができる陽性染色集団を生じた。実際、蛍光の強さは、個々のB細胞の各々の表面で発現されることが判明している免疫グロブリンの数を基準に、B細胞と抗原保持小胞との間で発生すると予想される細胞当りの結合事象の数に比して2 log強いことが示された（桁数として〜104/細胞）。
【００４０】
しかしながら、放出された小胞は一般的に最初の細胞と同じ桁数の直径を有する。したがって、B細胞染色実験での有用性に関しては、この方法から得られるものは非常に少ないように思われる。しかしながら、小胞の構造的融通性は、小胞の直径よりも小さな限定的ポアサイズをもつトラックエッチング処理（track-etched）膜からこれらを繰り返し押し出すことを可能にする。この方法それ自体は、大きいが多様な直径をもつ大型多重薄層リポソーム又は一重薄層リポソームを、膜のポアサイズとほぼ同様な直径をもつ一重薄層リポソームの均質な集団に移行させることを目的として記載されたが、今や本発明の方法にしたがい、ここに記載した小胞の作成のために、平均サイズを低下させると同時に蛍光標識した大きな細胞から放出される小胞のサイズ分布を狭めるために、それ自体公知のツール及び手段を用いて利用される。
それらのサイズ低下のおかげで、はるかに多くの小胞が個々のB細胞の細胞膜に同時に接近することができ、それによって、非形質転換細胞株に由来する蛍光標識小胞が同じ細胞に結合していないからということで、ある細胞がトランスジーン特異的であると誤って決定する確率が劇的に減少した。小胞の破壊は、高い温度の使用が効率を高めることを考慮して、リポソーム押出し成形のために既に最適化された技術（例えば、非常に大きなリポソームを非常に小さなポアサイズのフィルターから無理やり押し出すのではなくて、大きなポアサイズから小さなポアサイズの膜へ徐々に下げていく）を用いて最小にすることができる。小胞膜の完全性の低下は、押出された小胞を超遠心で沈殿させ、蛍光色素が処理中に上清に遊離されたか否かを測定することによって容易にモニターすることができる。
【００４１】
Pickら（J Am Chem Soc, 2005, 127:2908-2912）は最近、サイトケラシン処理及び細胞培養の機械的攪拌の組み合わせを用いる、小さな小胞を作成するための押出し成形の必要性を回避することができるまた別のプロトコルを報告した。前記は単一工程方法であり、要求される操作工程が少なく、さらに押出し成形時の漏出点で小胞を潜在的に圧縮する必要がないので、この方法で生成される小胞と上記に記載した押出し成形の巨大小胞の比較を実施することができる。実験の全体的な哲学は、小胞形成前の細胞標識のための方法と同様に、上記に記載したものと同一であった。
一般的に細胞の検出及び分類には、標的集団が稀である場合は相当なハードルが要求される。前記は、十分に免疫原性である標的で免疫された動物の場合には当てはまらないと思われるが、FACS前の標的集団濃縮はとにかく望ましいであろう。濃縮にとりかかるためのある方法は、トランスジェニック細胞株の膜小胞を磁力により標識し、標識集団のために分類前サンプルを磁石又は磁性カラムを用いて濃縮することである。しかしながら、下記の図（図25）の二変量FACSプロットから明らかなように、この方法は親細胞株と結合するB細胞もまた濃縮するであろう。したがって、比較的豊富な無関係のB細胞（下段左の象限）が磁力濃縮細胞では減少するが、単一陽性染色B細胞対二重陽性染色B細胞の割合の増加にはほとんど影響は無いであろう。また別のアプローチは、したがって、非トランスフェクト又は模擬トランスフェクト細胞株の膜小胞を磁性標識し、染色されたサンプルからFACS分類の前にこれらを枯渇させることであろう。この操作は、おそらく、単一工程で軽鎖陽性B細胞枯渇と組み合わせることができよう。
【００４２】
小胞の磁性標識戦術は、前記の蛍光標識で用いた方法と同じように実施することができよう。すなわち、小胞を調製する前に細胞株を内部から（すなわち細胞質を）標識することである。細胞の内部磁性標識は、食細胞性細胞が磁性マイクロ粒子を内在化させることによって実施するか、または非食細胞性細胞を用いるときは、粒子銃および標準的DNAトランスフェクション試薬を用いて実施された。本明細書に記載されたB細胞選別に用いられる細胞株のいずれも、おそらく実質的には食細胞ではないであろうから、前者の技術の使用は排除されるであろう。後者の2つの技術は中等度の成功率を示し、シグナル強度は低く、面倒な装置及び高価な試薬を必要とする。本発明の中で適用することができ（例えば本明細書の開示に基づいて当業者には明瞭であり、さらにこれらの引用文献に記載された方法と類似し得る態様で）、さらにより簡便に実施し得る、また別の非制限的な付加技術は、Lee & Ralphの一連の報告に記載されている（顕著なものは、Josephson Lee & Ralph Weissleder, J Immunol Meth, 2001, 256:89-105）。簡単に記せば、この方法は、細胞浸透ペプチドを磁性ナノ粒子上に固定し、前記ナノ粒子で標識されるべき細胞と単に一緒にインキュベートすることから成る。細胞浸透ペプチドは無関係のペプチドクラスを形成し、非常に多様な供給源から単離されており、それらのいずれも生細胞の細胞膜を通過して移動することができる。前記の現象が生じるメカニズムはなお十分には報告されていないが、食細胞作用を必要とするようには見えず、細胞がエネルギーを必要としているようにも見えない。重要なことには、試験した実質的に全ての細胞タイプがこれらのペプチドの標的となり、さらに前記ペプチドに付加したときには、前記ペプチド自体よりもはるかに大きな“積荷”を細胞内に一緒に輸送することができる。上記に引用した文献では、著者は、周知のHIV Tatタンパク質由来細胞浸透ペプチドとMRI造影剤として用いられる磁性粒子との連結を記載している。これらの粒子と正常なヒトT細胞との同時インキュベーションによって、細胞当り30,000ビーズまでの内在化が生じ、実質的に集団内の全ての細胞が均質な強度で染色される。
【００４３】
重要なことには、内在化はin vitroでもin vivoでも生存率の低下又は機能の低下を生じなかった。電子顕微鏡によって小ビーズクラスターとしての細胞内（もっぱら核内）染色が明瞭に示された。他の全ての浸透ペプチドは異なる移動パターンを示し、別のペプチド（例えばオリゴアルギニンホモポリマー）と磁性粒子との固定化はより細胞質性局在を生じ得ることを示した。ペプチドと適切に小さい磁性粒子（例えばMiltenyi Biotech MACSビーズ）との擬似共有結合固定化は、ビオチン/ストレプトアビジン系を用いて実施することができる（ストレプトアビジン予備被覆ビーズは容易に入手できる）。合成により生成した細胞浸透ペプチド（例えばポリ-Arg）のビオチニル化はペプチド合成工程自体に取り込むことができ、本質的に純粋で、均一的及び位置特異的にビオチニル化されたペプチドが得られる（前記は、溶液中でビーズと単に同時インキュベートすることによってビーズに結合させることができる）。長いリンカーを用いることなく浸透ペプチドとビーズ表面との直接連結は、輸送ペプチドの効率をはるかに低下させることが示されている。したがって、合成工程の間にペプチドとビオチン部分との間に長いリンカーを取り込むことによって、ペプチドをビーズ表面から伸長させ、ペプチドの機能を完全に無傷で維持する。続いて、被覆ビーズの品質を一度判定し、細胞標識での更なる使用のために保存することができる。
したがって、細胞浸透ペプチドの磁性粒子上への固定は、本発明で（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかな類似の態様で）生細胞の容易なin vitro磁性標識のために用いることができる試薬を提供する。そのような磁性標識細胞から小胞を形成することによって（特に上記に記載した蛍光標識の前、後、又は場合によっては同時に実施するときは）、二項性の蛍光/磁性検出/単離試薬が得られる。そのような二項性試薬は、FACS分類前に、膜結合抗原特異的B細胞を所望されない特異性から枯渇させるか、又はサンプル中の全細胞プールから関連分画を濃縮するために極めて重要であろう。
【００４４】
本発明の方法で（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかに類似する態様で）適切な他のFACS技術は、例えば文献（J Immunol Meth, 1989, 117:275）に記載されているか、又は当分野で公知であり（例えばB-D's FACS 440）、現時点で利用可能な高速分類装置（例えばDako-Cytomation's MoFlo；B-D's FACSaria；又はBeckman-Coulter's Altra（J. Immunol Meth, 2000, 243:13でも言及されている）が含まれる。さらにまたDaughertyら（J Immunol Meth, 2000, 243:211）は、フローサイトメトリー分類装置を用いる細胞ディスプレーライブラリー選別に関する概論を提供している（前記の技術もまた本発明で（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかな類似の態様で）用いることができる。
前記に加えて、或いはまた別に、高処理フローサイトメトリー以外のそれ自体は公知の技術を本発明で用いて、抗原結合B細胞についてPBMCサンプルを濃縮することができる。磁性マイクロビーズ（例えば2つの主要な供給業者を挙げれば、Miltenyi Biotech及びDynal Biotechから供給される）又は別の固相（例えば標準的な使い捨て培養プラスチック容器類）に抗原を固定することにより、当分野で周知の一般的に利用可能な装置を用い数千万の細胞を同時に抗原に対して“選別”することができる。続いて、非結合細胞をプラスチックから洗い流すか、又は磁石で細胞＋ビーズ懸濁物を保持し非結合細胞を全てピペットで落とすことによって、大半の無関係な非B細胞（例えばT細胞、顆粒球、NK細胞など）及び非結合B細胞が、対象であるわじかの細胞から分離される。前記方法は、合計してほんの数時間を要するだけで、実際に必要な時間の大半はインキュベーション工程から成る。H. Leyendeckersら（例えばEur. J. Immunol. 2002, 32:3126及びEur. J. Immunol. 1999, 29:1406）の一連の発表論文は、高い純度の細胞集団の入手とともに完全に近い生存率の維持及び選別後のin vitroでのB細胞刺激を得るための方法を開示している。
【００４５】
さらにまた、上記の技術の1つ以上を適切に組み合わせることができる。例えば、固相B細胞選別は、フローサイトメトリーの使用と組み合わせることができ、逆もまた可能である。N.N. Gangopadhyayら（J Immunol Meth, 2004, 292:73）の論文は、非常に希少な細胞の高度に特異的な単離を（フローサイトメトリー分類を用いて）達成するために、2つのそのような方法を組み合わせることの威力を如実に示している（細胞選別技術を用いてFACSの前に予備濃縮される）。
繰り返せば、上記に記載の全ての技術又はその任意の組み合わせを本発明で用いることができる（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明瞭な類似の態様で）。
ヒト白血球サブセット上のマーカーのために作成された試薬に関する多数の刊行物が存在するが、前記試薬はラマ及び他のラクダ類と交差反応することが見出された（Vet Immunopathol 2000, 74:17；J Camel Prac Res, 1998, 5:179；J Comp Path, 2000, 127:69；US 2002/0155604A1）。前記試薬は本発明で利用することができよう（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る類似の態様で利用することができよう）。後者の刊行物にはまた、市場で入手できる試薬を用いて通常のB細胞と非通常性B細胞を区別する非常に簡便な方法が記載されていることは特記されるべきである。
William Davis（Vet. Immunol. Immunopathol. 2000, 74:103）は、ラマの白血球細胞のために作成したモノクローナル抗体セットの開発を記載している。このモノクローナル抗体パネルによってラマの主要な全白血球細胞サブセットが明瞭に同定される。前記は市場で入手することができ、本発明で利用することができよう（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができよう）。
【００４６】
さらにまた、いくつかの供給業者（例えばBethyl Labs, Montgomery, Texas, Triple J Farms division of Kent Labs, Kentlabs.com/triplejproducts.html）は、標識された即席抗ラマ免疫グロブリンポリクローナル抗体を提供し、前記は、ラマB細胞上に存在する表面免疫グロブリンの同定のために本発明で用いることができる（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができる）。
さらにまた、あるサンプル中の全細胞をゼラチン様マトリックス滴中に（生きた状態でかつ個々に）包埋することによって、それら細胞の周囲のわずかばかりの細胞によって産生される可溶性生成物（例えば希少B細胞に由来する免疫グロブリン）を捕捉し、これらを蛍光顕微鏡又はフローサイトメーターを用いて検出するこが可能になる（例えば以下を参照されたい：One Cell Systems, onecells.com/GMDProteinsSecretionAssay.htm for schemata and details）。この方法及び装置もまた、本発明で用いることができる（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができる）。さらにまた、この具体的で非制限的な特徴はいずれの細胞集団特異的マーカーも必要とせず、ラマ特異的試薬の必要性を完全に排除している。
さらにまた、“親和性捕捉マトリックス”は、R. Manzと共同研究者ら（PNAS, 1995, 92:1921；さらにまた構造形態及び詳細については以下を参照されたい：Miltenyi Biotech, miltenyibiotec.com/macs/principle/2）又はS. Carroll（J Immunol Methods, 2005, 296:171）が記載したサイトカイン分泌検出方法に類似する方法を用いて免疫グロブリン産生B細胞の表面に作出することができる。第一の方法は、B細胞表面マーカー（B細胞に固有であるために要求されない）及び免疫グロブリンの双方と結合する、二機能性試薬の使用を必要とする。そのような試薬は、上記に挙げた第二及び第三の主要点で述べたように、市場で入手できる試薬を一緒にすることによって容易に作成することができる。これらの方法もまた、本発明で用いることができ（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができる）、Carrollらが記載した方法が特に便利であろう。
【００４７】
したがって、種々の適切な試薬が従来技術で記載されてあり、本発明で用いることができる（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができる）。これらの試薬の多くが市場の供給業者から容易に入手できる。
上記で述べたように、本発明のある非制限的特徴にしたがえば、免疫グロブリン遺伝子を単離及び性状を決定する前にB細胞は培養（拡大/増殖）されない。例えば、免疫グロブリン配列は、それ自体公知の任意の適切な技術、例えば適切な増幅技術（例えば単一細胞PCR）を用いて、単一細胞から直接入手することができる。免疫グロブリンに関する単一細胞PCRは10年前からよく記載されている（例えば以下を参照されたい:Nature, 1991, 350:502；さらにサイトメトリー/単一細胞PCRの組み合わせに関する総説には特に以下を参照されたい：J Immunol Meth, 2000, 243:25）。
さらにまた、そのような単一細胞PCRを、フローサイトメーター及び問題の生成物を用いて高処理態様で実施する方法も記載されている（RNAture GenePlates, rnature.com/pdf/an118.pdf）。これに関しては、この文献は古典的な4-鎖B細胞のための単一細胞PCRについて述べており、各細胞から2つの遺伝子をクローニングする必要があることは留意されるべきである。対照的に、本発明では、問題の配列を得るために、ただ1つの遺伝子フラグメントが各細胞当りクローニングされる必要があるだけで、したがって、単一細胞クローニング方法の技術的難度レベルが下がる。
【００４８】
したがって、一般的には、それ自体公知の単一細胞PCR技術、試薬、プロトコル及び装置を本発明で用いることができる（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で利用することができる）。
単一細胞PCRとはまた別の非制限的な選択肢はB細胞の培養及び刺激を含み、例えばB細胞刺激フィーダー細胞株の使用は、文献に一般的に言及されている。EL4-B5はマウス胸腺腫細胞株であり、Dr. Zubler（Geneva, Switzerland）によって作成された（Eur J Immunol, 1987, 17:887）。この細胞株は、マウスB細胞だけでなくヒトB細胞もまた刺激することが報告された（Eur J Immunol 1987, 17:887；J Immunol Methods 1993, 160:117）。本発明の非制限的なある特徴にしたがえば、ラマのB細胞はこの細胞株で刺激することができ、さらに、そのようにしてラマの細胞はマウスB細胞のように効率的に刺激され得ることが見出された（例えば本明細書の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、さらにこれらの引用文献に記載されている方法と同様であり得る態様で刺激することができる）。
また別の系がJ. Banchereau（Dardilly, France）によって記載され、前記は、最初はFcガンマレセプターをトランスフェクトされた線維芽細胞の表面にアゴニスト的抗CD40抗体を固定することが必要とされる（Science 1991, 251:70）。この技術のその後の変型は、CD40Lトランスフェクト細胞を利用し、一度この遺伝子はクローニングされ、配列が決定された（J Exp Med 1992, 176:1543）。本発明に至った研究では、ラマのCD40Lの配列を入手し、これを哺乳動物の発現ベクターでクローニングした。2つのラクダの細胞株（DUBCA（ATCCコードCRL-2276により公的に入手できる）及びCAKI）にトランスフェクトし、ラマCD40L過剰発現クローンが選別された。
【００４９】
また別の非制限的選択肢として、マウス及びヒトCD40Lの細胞外フラグメントをコードする組換えタンパク質が大腸菌で調製され、フィーダー細胞株の非存在下でB細胞を刺激するために用いられた（J Biol Chem 1995, 270:7025）。本発明に至る研究の中で、相同なラマCD40Lフラグメント配列を、組換えCD40Lタンパク質の供給源として大腸菌発現プラスミドでクローニングし、FACSによるB細胞の検出とともにフィーダー細胞の使用が要求されないB細胞培養の刺激に使用した。
フィーダー細胞の存在下又は非存在下でのB細胞の刺激に要求されるラマサイトカインは、刺激したラマPBMCサンプルから容易に入手することができる。刺激ヒトPBMCの上清もまた極めて有効であることを我々は証明した。さらにまた、Odbilegら（Vet Immunol Immunopathol 2004, 102:93；Vet Immunol Immunopathol 2005, 104:145）が記載したラマのサイトカイン遺伝子配列は、大腸菌又は他の任意の宿主細胞で組換えタンパク質としてこれらのサイトカインを優れた費用効率で大量生産することを可能にし、これらのサイトカインはまた、本明細書で述べる抗原産生B細胞の刺激にも用いることができる。
したがって、本発明にしたがえば、ネズミEL4-B5細胞株を用いてマウス以外の種、例えばラマB細胞を刺激することができる。また別には、公的に入手することができるラマサイトカイン遺伝子配列を公的に入手することができるラクダ由来の細胞株と一緒に用いることができる。
下記でさらに説明するように、本発明の方法を用いて同定したVHHドメインをナノボディとして用いることもできる。また別には、上記に記載した方法を用いて同定した重鎖抗体又はVHHドメインのアミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列をナノボディの生成のための出発点として用いることもできる。或いはそのような重鎖抗体又はVHHドメインをコードする核酸をそのようなナノボディの生成のための出発材料として用いることもできる。
【００５０】
したがって、例えば上記の方法で、所望の抗原に対する重鎖抗体を作成した後（上記の方法の部分として記載されたいずれかの工程で又は工程の後で）、そのような重鎖抗体又はその抗原結合部位（例えばVHHドメイン）のアミノ酸配列を、適切な配列決定技術を用いて決定することができ、そのときに、前記アミノ酸配列を有するか又は前記を土台にしたアミノ酸配列を有するナノボディを、上記に記載した方法の1つを用いて調製することができる。同様に、上記で生成したそのような重鎖抗体又はVHHドメインをコードする核酸の配列を決定することができ、その後で前記配列をナノボディ（をコードする核酸）の調製のための出発点として用いることができる。
したがって本発明はまた、そのようなナノボディ、前記をコードする核酸/ヌクレオチド配列、そのようなナノボディの1つ以上を含むタンパク質又はポリペプチド、及びそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸/ヌクレオチド配列に関するとともに、そのようなナノボディ、ポリペプチド及びタンパク質、並びにそれらの調製方法に関する。
この特徴では、上記の方法によって入手される核酸/ヌクレオチド配列は、それらの発現によって得られるVHHドメイン及び多価又はマルチ特異性構築物と同様に本発明の好ましい特徴を構成するが、いったん前記ヌクレオチド配列又はそのアミノ酸配列がそれぞれ決定されたら、そのようなVHHドメイン又は前記を土台にしたナノボディ、そのようなVHHドメイン又はナノボディを含むタンパク質又はポリペプチドを得るための種々の他の方法が、前記をコードするヌクレオチド/核酸配列を得るための種々の方法と同様に存在することは、当業者には明白であろう。
したがって、本発明は、そのもっとも広い意味において、本明細書に記載したVHHドメイン、ナノボディ、タンパク質、ポリペプチド、核酸、又は遺伝的構築物生成に関して特定の方法に限定されず、いくつかの好ましい（しかし非制限的な）方法が以下に記載される。
また別の特徴にしたがえば、本発明は、上記の方法の1つを用いて同定、選別、作出、及び/又はクローニングされた核酸に関する。前記核酸は好ましくは下記に規定するように遺伝的構築物の形態を有する。そのような遺伝的構築物（少なくとも1つの前記のような核酸及び場合によってそれ自体公知の1つ以上の更なる遺伝的構築物のエレメントを含む）はまた本発明の特徴を構成する。
【００５１】
本発明はまた、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法に関する。前記方法は、上記に記載した核酸又は上記に記載した遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現させることを含む。
本発明はまた、そのような核酸及び/又は遺伝的構築物を含む宿主細胞又は宿主生物に関する。好ましくは、前記宿主細胞又は宿主生物は、所望の重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントを発現若しくは産生するか、又は適切な条件下で前記を発現若しくは産生することができる。
本発明はまた、上記に記載した核酸又は上記に記載した遺伝的構築物によってコードされ、上記の方法によって得られる重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。前記重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントは好ましくはVHHドメインである。
本発明はまた、そのアミノ酸配列が上記のVHHドメインのアミノ酸配列を土台にしているか、及び/又は上記の核酸によってコードされるアミノ酸配列を土台にしているナノボディに関する。
本発明はまた、少なくとも１つの上記に記載したVHHドメイン及び/又は上記に記載した少なくとも1つのナノボディを含有するか若しくは含むタンパク質又はポリペプチドと同様に、そのようなタンパク質又はポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列に関する。前記核酸は、下記で定義されるように好ましくは遺伝的構築物の形態を有する。
本発明はまた、少なくとも１つのVHHドメイン及び/又は少なくとも1つのナノボディを含有若しくは含むタンパク質又はポリペプチドを製造する方法（前記方法は、上記核酸又は上記遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現することを含む）と同様に上記核酸又は上記遺伝的構築物を含む宿主細胞又は宿主生物に関する。好ましくは、前記宿主細胞又は宿主生物は、所望のタンパク質又はポリペプチドを発現若しくは産生するか、又は適切な条件下で前記を発現若しくは産生することができる。
本発明の更なる特徴は下記の詳細な説明から明らかとなろう。
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明の上記の及び他の特徴並びに実施態様は下記の更なる説明から明らかになるであろう。下記の説明では：
（a）特段に指示又は規定されない限り、用いられる全ての用語は当技術分野でのそれら用語の通常の意味を有し、前記は当業者には明白であろう。例えば、標準的なハンドブック（例えば、Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, (2nd, Ed.), Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；F. Ausubel et al, eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)；Roitt et al., “Immunology” (6th Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001);Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005)）とともに上記に引用した全般的な背景技術を参照されたい。
（b）特段に指示されない限り、“免疫グロブリン配列”という用語は（重鎖抗体を指すために又は通常の4-鎖抗体を指すために用いられているか否かに関わらず）、完全サイズの抗体、その個々の鎖と同様にそれらの全ての部分、ドメイン又はフラグメント（抗原結合ドメイン又はフラグメント、例えばVHHドメイン又はVH/VLドメインをそれぞれ含むが、ただしこれらに限定されない）を含む一般的な用語として用いられる。さらにまた、本明細書で用いられる“配列”という用語（例えば“免疫グロブリン配列”、“抗体配列”、“可変ドメイン配列”、“VHH配列”又は“タンパク質配列” のような用語）には、対応するアミノ酸配列と同様に、前記をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列が、文脈でより限定的な解釈が要求されない限り含まれることは一般的に理解されねばならない。
（c）特段に指示されない限り、具体的に詳述されていない全ての方法、工程、技術及び操作は、当業者には明らかなようにそれ自体公知の態様で実施することが可能であり、実際に実施された。繰り返せば、例えば標準的ハンドブック並びに上記に引用した一般的背景技術及びその中に引用されている参考文献で言及されている。
（d）アミノ酸残基は、表1に示されているように、標準的な3文字又は1文字アミノ酸コードにしたがって表示されるであろう。
【００５３】
表1：一文字及び三文字アミノ酸コード
2008528010.tif 000002
注記：
1時にはまた極性非荷電アミノ酸であると考えられる。
2時にはまた非極性非荷電アミノ酸であると考えられる。
3当業者には明らかなところであるが、この表で、あるアミノ酸残基がpH6.0から7.0で荷電されていると又は荷電されていないと称される事実は、前記アミノ酸残基が6.0より低いpH及び/又は7.0より高いpHで有する荷電については何も意味しない。表に挙げたアミノ酸は、当業者には明白なように、そのようにより高い又は低いpHでは荷電されていることも荷電されていないこともあり得る。
4当技術分野で公知のように、His残基の荷電は、pHのわずかなシフトにさえも大きく影響を受けるが、一般的には約6.5のpHで本質的に非荷電であると考えることができる。
【００５４】
（e）2つ以上のヌクレオチド配列を比較する目的のために、第一のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列との間の“配列同一性”のパーセンテージは以下のように算出することができる：第二のヌクレオチド配列中の対応する位置に存在するヌクレオチドと同一である第一のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数を、第一のヌクレオチド配列中のヌクレオチド総数で割り、さらに100%を乗じる。ここで、（第一のヌクレオチド配列と比較して）第二のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換又は付加は、単一のヌクレオチド（の位置）における相違とみなされる。
また別には、2つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、配列アラインメントのための公知のコンピュータアルゴリズム、例えばNCBI Blast v2.0（標準設定を使用する）を用いて計算することができる。
配列同一性の程度を決定するための他のいくつかの技術、コンピュータアルゴリズム及び設定は、例えばWO04/037999、EP0,967,284、EP1,085,089、WO00/55318、WO00/78972、WO98/49185及びGB2,357,768-Aに記載されている。
通常は、上記に概略した計算方法にしたがって2つのヌクレオチド配列間の“配列同一性”のパーセンテージを決定する目的のために、もっとも大きなヌクレオチド数をもつヌクレオチド配列を“第一” のヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を“第二”のヌクレオチド配列とする。
（f）2つ以上のアミノ酸配列を比較する目的のために、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列との間の“配列同一性”のパーセンテージは以下のように算出することができる：第二のアミノ酸配列中の対応する位置に存在するアミノ酸残基と同一である第一のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の数を、第一のアミノ酸配列中のアミノ酸総数で割り、さらに100%を乗じる。ここで、（第一のアミノ酸配列と比較して）第二のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換又は付加は、単一のアミノ酸残基（の位置）における相違とみなされる。
また別には、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、公知のコンピュータアルゴリズム、例えば、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度を決定するために上記で述べたものを用い、繰り返せば標準設定を使用して計算することができる。
通常は、上記に概略した計算方法にしたがって2つのアミノ酸配列間の“配列同一性”のパーセンテージを決定する目的のために、もっとも大きなアミノ酸残基数をもつアミノ酸配列を“第一” のアミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を“第二”のアミノ酸配列とする。
【００５５】
さらにまた、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する場合に、当業者は、いわゆる“保存的”アミノ酸置換を考慮することができる。前記は、一般的に、あるアミノ酸残基が類似の化学的構造の別のアミノ酸残基で置換され、ポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性にほとんど若しくは本質的にまったく影響を与えないアミノ酸置換ということができる。そのような保存的アミノ酸置換は、当分野で、例えばWO04/037999、GB-A-2357768、WO98/49185、WO00/46383及びWO01/09300から周知である。さらに、そのような置換の（好ましい）タイプ及び/又は組み合わせはWO04/03799及びWO98/49185並びにそれらの中で引用されている更なる参考文献の関連する教示を基準にして選択することができる。
そのような保存的置換は、好ましくは、以下の群（a）−（e）内の1つのアミノ酸が、同じ郡内の別のアミノ酸残基で置き換えられる置換である：（a）小さな脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基：Ala、Ser、Thr、Pro及びGly；（b）極性の陰性に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Asp、Asn、Glu及びGln；（c）極性の陽性に荷電した残基：His、Arg及びLys；（d）大きな脂肪族の非極性残基；Met、Leu、Ile、Val及びCys；及び（e）芳香族残基；Phe、Tyr及びTrp。
特に好ましい保存的置換は以下の通りである：AlaをGlyに又はSerに；ArgをLysに；AsnをGlnに又はHisに；AspをGluに；CysをSerに；GlnをAsnに；GluをAspに；GlyをAlaに又はProに；HisをAsnにまたはGlnに；IleをLeuに又はValに；LeuをIleに又はValに；LysをArgに、Glnに又はGluに；MetをLeuに、Tyrに又はIleに；PheをMetに、Leuに又はTyrに；SerをThrに；ThrをSerに；TrpをTyrに；TyrをTrpに；及び/又はPheをValに、Ileに又はLeuに。
【００５６】
本明細書に記載したポリペプチドに適用されるいずれのアミノ酸置換もまた、Schulzら（Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978）が発展させた種々の種の相同なタンパク質間のアミノ酸変動の頻度の解析、Chou & Fasman（Biochemistry 13:211, 1974；及びAdv. Enzymol, 1978, 47:45-149）が発展させた構造形成潜在能力の解析、及びEisenbergら（Proc Natl Acad Sci, USA 1984, 81:140-144）、Kyte & Doolittle（J Molec Biol 1981, 157:105-132）、及びGoldmanら（Ann Rev Biophys Chem 1986, 15:321-353）が発展させたタンパク質の疎水性パターンの解析を基準にすることができる（前記文献は全て参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
ナノボディの一次、二次及び三次構造に関する情報は下記の説明及び上記に引用した全般的背景技術で提供される。さらにまた、この目的のために、ラマのVHHドメインの結晶構造が、例えば以下の文献によって提供される：Desmyter et al. Nature Structural Biology 1996, 3(9):803；Spinelli et al. Natural Structural Biology 1996, 3:752-757；及びDecanniere et al. Structure 1999, 7(4):361。
（g）アミノ酸配列及び核酸配列は、それらが全長にわたって100%配列同一性（上記で定義したとおり）を有する場合は、“正確に同じ”であると称される。
（h）核酸配列又はアミノ酸配列は、例えばその天然の生物学的供給源及び/又は前記が入手された反応媒体又は培養液と比較して、前記供給源又は媒体に通常付随している少なくとも1つの他の成分、例えば別の核酸、別のタンパク質/ポリペプチド、別の生物学的成分若しくは巨大分子、又は少なくとも1つの夾雑物、不純物又は微量成分から前記が分離されているときは、“本質的に単離された（形態）”であると考えられる。具体的には、核酸配列又はアミノ酸配列は、前記が少なくとも2倍、具体的には少なくとも10倍、より具体的には少なくとも100倍、及び1000倍又はそれ以上精製されているときは、“本質的に単離されている”と考えられる。“本質的に単離された形態”の核酸配列又はアミノ酸配列は、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動技術）を用いて決定したとき、好ましくは本質的に均質である。
【００５７】
（i）特定の抗原又はタンパク質、又は前記の少なくとも1つの部分、フラグメント若しくはエピトープと結合するか、それらに対して親和性を有するか、及び/又は特異性を有し得るアミノ酸配列（例えばナノボディ、抗体又は一般的には抗原結合タンパク質ポリペプチド若しくはそのフラグメント）は、前記抗原又はタンパク質を“指向する”と称される。
（j）下記でさらに述べるように、ナノボディのアミノ酸配列及び構造は、4つのフレームワーク又は“FR” （ただし前記に限定されない）で構成されると考えることができる。前記は、当技術分野及び下記では“フレームワーク領域1”又は“FR1”と、“フレームワーク領域2”又は“FR2”と、“フレームワーク領域3”又は“FR3”と、及び“フレームワーク領域4”又は“FR4”とそれぞれ称され、前記フレームワーク領域は3つの相補性決定領域又は“CDR”によって分断され、前記は、当技術分野及び下記では“相補性決定領域1”又は“CDR1”と、“相補性決定領域2”又は“CDR2”と、及び“相補性決定領域3”又は“CDR3”とそれぞれ称される。
（k）下記でさらに述べるように、ナノボディのアミノ酸残基の総数は、110−120、好ましくは112−115の範囲、もっとも好ましくは113であり得る。しかしながら、ナノボディの部分、フラグメント又は類似体（下記でさらに述べる）は、それらの長さ及び/又はサイズに関しては、そのような部分、フラグメント又は類似体が下記で概略する更なる要件を満たし、さらにまた、好ましくは本明細書に記載する目的に適している限り特に制限を受けない。
（l）ナノボディのアミノ酸残基は、Kabatら（”Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）によって示された一般的なVHドメインの番号付与にしたがって番号が付与され、上記で引用したRiechmann & Muyldermansのカメリド由来のVHHドメインで適用されたとおりである（前記文献の図2を参照されたい）。この番号付与にしたがえば、ナノボディのFR1は1−30位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR1は31−36位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのFR2は36−49位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR2は50−65位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのFR3は66−94位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのCDR3は95−102位のアミノ酸残基を含み、さらにナノボディのFR4は103−113位のアミノ酸残基を含む。前記に関しては、VHドメイン及びVHHドメインについて当分野で周知の通り、CDRの各々におけるアミノ酸残基の総数は変動することが可能で、Kabatの番号付与で示されたアミノ酸残基の総数と一致しない可能性がある（すなわち、Kabatの番号付与にしたがえば1つ以上の位置が実際の配列によって埋められないか、又は実際の配列がKabatの番号付与によって許容されるアミノ酸残基よりも多くの残基を含み得る）ことは留意されるべきである。このことは、一般的にKabatの番号付与は、実際の配列のアミノ酸残基の実際の番号付与と一致することも一致しないこともあり得ることを意味している。しかしながら、一般的には、CDR中のアミノ酸残基の数に無関係にKabatの番号付与にしたがえば、Kabatの番号付与の1位はFR1の開始点と一致し（逆もまた同じ）、Kabatの番号付与の36位はFR2の開始点と一致し（逆もまた同じ）、Kabatの番号付与の66位はFR3の開始点と一致し（逆もまた同じ）、さらにKabatの番号付与の103位はFR4の開始点と一致する（逆もまた同じ）。
VHドメインのアミノ酸残基に番号を付与するまた別の方法（前記方法はまたカメリド由来のVHHドメイン及びナノボディに対しても同様な態様で適用することができる）は、Chothiaら（Nature 1989, 341:877-883）によって記載された方法であり、いわゆる“AbM 規定”でありいわゆる“接触規定”である。しかしながら、本詳細な説明、特許請求の範囲及び図面では、特段に指示されないかぎりRiechmann & MuyldermansによってVHHドメインに適用されたようにKabatの番号付与にしたがう。
（m）図面、配列表及び実験部分/実施例は本発明をさらに例示するためにのみ提供され、明瞭に本明細書で指示されない限り、本発明及び/又は添付の特許請求の範囲を制限するものといかなる態様においても解釈されてはならない。
【００５８】
上記で述べたように、本発明の方法は、ナノボディとして用いることができるか、又はナノボディを入手するための出発点として用いることができるVHHドメインを入手するために用いることができる。
これに関しては、しかしながら、以下の更なる説明から明瞭となるであろうが、本明細書で用いられる“ナノボディ”という用語は、カメリドの種に由来する天然に存在するVHHドメイン以上のものを包含し、例えば、天然に存在するVHHドメインの非天然類似体（例えば“ヒト化”ナノボディ（上記でも既に言及しさらに下記でも説明する））と同様に、そのような天然に存在するVHHドメイン又はそのような非天然の類似体（繰り返すが下記でさらに説明する）の部分若しくはフラグメントもまた含むことは留意されるべきである。
ある具体的な実施態様にしたがえば、本明細書で用いられる、“ナノボディ”という用語は、天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列（例えば哺乳動物、特にヒト由来の天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列）と正確に同じであるアミノ酸配列をもつポリペプチドは包含しない。
上記に挙げた参考文献から分かるように、さらに下記でも説明するように、重鎖抗体及びそれらのVHHドメインは、例えばカメリドの種（例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ及び下記で列挙されるカメリドのその他の種）から入手することができる。しかしながら、本発明は、その最も広い意味において、本明細書で用いられるナノボディを入手するための特定のいかなる供給源にも、又は本明細書で用いられるナノボディを入手するための特定のいかなる方法にも、又は本発明のポリペプチドを入手するためのいかなる方法にも限定されることはないということは留意されるべきである。例えば、下記でさらに述べる、ある好ましい（ただし非制限的な）実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドは、適切な細菌発現系で本発明の合成又は半合成核酸を用いて入手される。本明細書で用いられる、ナノボディを入手する、及び/又は本発明のポリペプチドを入手するための他のいくつかの好ましい（ただし非制限的な）方法は下記に記載されるであろう。
【００５９】
そのような類似体の特に好ましいある種類は天然に存在するVHHドメインであって、前記は下記でさらに詳細に記載されるように“ヒト化”されてあり、すなわち前記VHHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基は、ヒト由来の通常の4-鎖抗体（例えば上記に示されている）のVHドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の1つ以上によって置き換えられている。前記操作はそれ自体公知の態様で、例えば下記の更なる記載を基にして実施することができ、当業者には明白であろう。
ナノボディは、例えばまた、哺乳動物の別の種（例えばヒト）に由来する天然に存在するVHドメイン（すなわち天然に存在する通常の4-鎖抗体由来のVHドメイン）を“ラクダ化”することによって、すなわち前記VHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を上記に表示したアミノ酸残基の1つ以上によって置換し、上記に定義したナノボディを提供することができることもまた特記されるべきである。前記は、それ自体公知の態様で、例えばWO94/04678に記載されているように、又は下記にさらに記載されるように実施することができ、当業者には明白であろう。そのようなラクダ化は好ましくは、VH−VL境界面及び下記でもまた述べるようにいわゆるカメリド科（Camelidae）のホールマーク残基（例えばWO94/04678もまた参照されたい）に存在するアミノ酸の位置で起こり得る。
例えば、下記でもまた記載されるように、“ヒト化”及び“ラクダ化”は両方とも、そのような天然に存在するVHHドメイン又はVHドメインをコードする核酸配列をそれぞれ提供し、続いてそれ自体公知の態様で、前記ヌクレオチド配列中の1つ以上のコドンを、新しいヌクレオチド配列がヒト化又はラクダ化されたナノボディをそれぞれ提供することができるように変化させ、さらにそのようにして得たヌクレオチド配列をそれ自体公知の態様で発現させて所望のナノボディを提供することによって実施することができる。また別には、それぞれ天然に存在するVHHドメイン又はVHドメインのアミノ酸配列を土台にして、それぞれ所望のヒト化又はラクダ化ナノボディのアミノ酸配列を設計し、続いてそれ自体公知のペプチド合成技術を用いてde novoに合成してもよい。さらにまた、それぞれ天然に存在するVHHドメイン又はVHドメインのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を土台にして、所望のヒト化又はラクダ化ナノボディをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ設計し、続いてそれ自体公知の核酸合成技術を用いてde novoに合成し、その後、そのようにして得たヌクレオチド配列をそれ自体公知の態様で発現させて所望のナノボディを提供してもよい。
【００６０】
天然に存在するVHドメイン又は好ましくはVHHドメイン（のアミノ酸配列）から、及び/又は前記をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸配列から、ナノボディ及び/又は前記をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸を入手するための他の適切な方法及び技術は当業者には明白であり、前記方法は、例えば、天然に存在するVHドメイン由来の1つ以上のアミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列（例えば1つ以上のFR及び/又はCDR）を、天然に存在するVHHドメイン由来の1つ以上のアミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列（例えば1つ以上のFR又はCDR）と適切な態様で結合させて、ナノボディ（をコードするヌクレオチド配列又は核酸）を提供することを含むことができる。
本明細書で用いられるナノボディという用語は、そのもっとも広い意味において、上記に定義したナノボディ（類似体を含む）の部分又はフラグメントもまた含む（前記はまた下記でさらに説明される）。一般的には、ナノボディ及び/又は類似体のそのような部分又はフラグメントは、対応する完全長のナノボディ又は類似体のアミノ酸配列と比較して、N-末端の1つ以上のアミノ酸残基、C-末端の1つ以上のアミノ酸残基、1つ以上の連続する内部アミノ酸残基、又はその組み合わせが欠失及び/又は除去されているアミノ酸配列を有するであろう。さらにまた、1つ以上のそのような部分又はフラグメントを結合させて、本発明のナノボディを提供することもできる。好ましくは、完全長のナノボディ及び/又は類似体の1つ以上の部分又はフラグメントを含むナノボディのアミノ酸配列は、対応する完全長のナノボディのアミノ酸配列と少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性の程度を有するべきである。さらにまた、完全長のナノボディ及び/又は類似体の1つ以上の部分又はフラグメントを含むナノボディのアミノ酸配列は、好ましくは、対応する完全長のナノボディのアミノ酸配列の連続する少なくとも10アミノ酸残基、好ましくは連続する少なくとも20アミノ酸残基、より好ましくは連続する少なくとも30アミノ酸残基、例えば連続する少なくとも40アミノ酸残基を含むようなものである。
【００６１】
特に好ましいある実施態様にしたがえば、そのような部分又はフラグメントは、対応する完全長のナノボディの少なくともFR3、CD3及びFR4を含む（すなわち、例えば国際出願WO03/050531（Lasters et al.）に記載されたようなものである）。
本明細書で用いられるナノボディのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列は、所望の抗原又はそのフラグメント若しくはエピトープに対する親和性、好ましくは特異性をナノボディに提供するいずれのCDR配列でもよい。そのようなアミノ酸配列は、例えば、任意の動物（特に哺乳動物）の任意の適切な可変ドメイン（のアミノ酸配列）、例えば哺乳動物の適切な重鎖可変ドメイン又は適切な軽鎖可変ドメイン、特に所望の抗原に対して作成された抗体に由来する適切な重鎖可変ドメインに由来することができる。例えば、前記CDRは、所望の抗原に対して作成された抗体に由来する天然に存在するヒトVHドメインのアミノ酸配列に一致し得る。さらにまた、例えばそれ自体公知の態様で選別/入手した人工的な及び/又は合成により誘導したCDR配列を用いることも可能であろう。
ある好ましい実施態様にしたがえば、本明細書で用いられるナノボディのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列の1つ以上、好ましくは全てが、所望の抗原又はそのフラグメント若しくはエピトープを指向する重鎖抗体のそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列と一致する。これらのアミノ酸配列は、一般的には、所望の抗原又はそのフラグメント若しくはエピトープ（前記部分又はフラグメントは、好ましくは前記カメリド免疫応答を誘引することができるようなものである）で、前記抗原に対して免疫応答が誘引されるような態様でカメリドを免疫し、続いて前記抗原を指向する重鎖抗体のVHHドメインの関連するCDRループのアミノ酸配列をそれ自体公知の態様で決定することによって入手することができる。この場合には、制限を設けることなく、さらに下記でもまた説明されるように、ここに記載する方法は、前記VHHドメインをコードするヌクレオチド配列のクローニングを可能にするであろう。
【００６２】
さらにまた、異なる供給源に由来するナノボディのCDRで、1つ以上の天然に存在するVHHドメイン、及び/又は1つ以上の天然に存在するVHドメイン（例えばヒトVHドメイン）由来の1つ以上のCDR、及び/又は1つ以上の合成CDRを結合させることもできるが、ただし好ましさは劣る。
前記1つ以上のCDR（をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸）を入手する方法及び技術、並びに前記CDRを適切なFR（をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸）と結合させてナノボディを提供する方法及び技術は、当業者には明白であり、本明細書に記載した方法が含まれる。
上記にしたがえば、さらに本発明の好ましい（ただし非制限的な）ある特徴にしたがえば、ナノボディは、そのもっとも広い意味において以下を含むポリペプチドと定義することができる：
（a）3つの相補性決定領域/配列によって分断される4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列、前記配列では、Kabatの番号付与にしたがえば108位のアミノ酸残基はQである；
（b）3つの相補性決定領域/配列によって分断される4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列、前記配列では、Kabatの番号付与にしたがえば44位のアミノ酸残基はEであり、及び/又はKabatの番号付与にしたがえば45位のアミノ酸残基はRである；及び/又は
（c）3つの相補性決定領域/配列によって分断される4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列、前記配列では、Kabatの番号付与にしたがえば103位のアミノ酸残基は、P、R及びSから成る群から選択され、さらに特にR及びSから成る群から選択される。
【００６３】
特に、本発明の好ましい（ただし非制限的な）ある特徴にしたがえば、ナノボディは、3つの相補性決定領域/配列によって分断される4つのフレームワーク領域/配列で構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義することができ、前記配列では：
（a-1）Kabatの番号付与にしたがえば44位のアミノ酸残基は、G、E、D、G、Q、R、S、Lから成る群から選択され；さらに好ましくはG、E、又はQから成る群から選択され；さらに
（a-2）Kabatの番号付与にしたがえば45位のアミノ酸残基は、L、R、又はCから成る群から選択され；さらに好ましくはL又はRから成る群から選択され；さらに
（a-3）Kabatの番号付与にしたがえば103位のアミノ酸残基は、W、R、又はSから成る群から選択され；さらに好ましくはW又はRから成る群から選択され、さらにもっとも好ましくはWであり；
（a-4）Kabatの番号付与にしたがえば108位のアミノ酸残基はQであるか、
又は前記配列では：
（b-1）Kabatの番号付与にしたがえば44位のアミノ酸残基はQ及びEから成る群から選択され；さらに
（b-2）Kabatの番号付与にしたがえば45位のアミノ酸残基はRであり；さらに
（b-3）Kabatの番号付与にしたがえば103位のアミノ酸残基は、W、R、及びSから成る群から選択され、さらに好ましくはWであり；
（b-4）Kabatの番号付与にしたがえば108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、さらに好ましくはQであるか；
又は前記配列では：
（c-1）Kabatの番号付与にしたがえば44位のアミノ酸残基は、G、E、D、Q、R、S及びLから成る群から選択され；さらに好ましくはG、E及びQから成る群から選択され；さらに
（c-2）Kabatの番号付与にしたがえば45位のアミノ酸残基は、L、R及びCから成る群から選択され；さらに好ましくはL及びRから成る群から選択され；さらに
（c-3）Kabatの番号付与にしたがえば103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され；さらに特にR及びSから成る群から選択され；さらに
（c-4）Kabatの番号付与にしたがえば108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQである。
【００６４】
上記のナノボディの2つの特に好ましい、ただし非制限的な群は、上記の（a）の群；上記（a-1)から（a-4）の群；上記（b）の群；上記（b-1）から（b-4）の群；上記（c-1）から（c-4）の群であり、ここで：
（a）Kabatの番号付与にしたがえば44位から47位のアミノ酸残基は配列GLEWPを形成し、さらに108位のアミノ酸残基はQであるか；
又は、
（b）Kabatの番号付与にしたがえば43位から46位のアミノ酸残基は配列KERE又はKQREを形成し、さらに108位のアミノ酸残基はQ又Lはであり、好ましくはQである。
Kabatの番号付与にしたがえば43位から46位のアミノ酸残基が配列KERE又はKQREを形成するナノボディでは、37位のアミノ酸残基はもっとも好ましくはFである。Kabatの番号付与にしたがえば44位から47位のアミノ酸残基が配列GLEWを形成するナノボディでは、37位のアミノ酸残基は、Y、H、I、V又はFから成る群から選択され、さらにもっとも好ましくはVである。
したがって、いかなる態様においても制限を設けるものではないが、上記で述べた位置に存在するアミノ酸残基を基準に、本明細書で用いられるナノボディは一般的に以下の群に分類することができる：
（a）“GLEW群”：Kabatの番号付与にしたがえば44−47位にアミノ酸配列GLEWを、さらにKabatの番号付与にしたがえば108位にQを有するナノボディ。本明細書でさらに説明するように、本群内のナノボディは通常37位にVを有し、さらに103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する。本GLEW群はまたいくつかのGLEW様配列、例えば下記の表2に挙げるものを含む；
（b）“KERE群”：Kabatの番号付与にしたがえば43−46位にアミノ酸配列KERE又はKQREを、さらにKabatの番号付与にしたがえば108位にQ又Lを有するナノボディ。本明細書でさらに説明するように、本群内のナノボディは通常37位にFを、47位にL又はFを有し、さらに103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する；
（c）“103P,R,S群”：103位にP、R又はSを有するナノボディ。これらのナノボディは、Kabatの番号付与にしたがえば44−47位にアミノ酸配列GLEWを有するか、又はKabatの番号付与にしたがえば43−46位にアミノ酸配列KERE又はKQREを有することができ、後者はもっとも好ましくは、37位のF及び47位のL又はFの組み合わせを有し（KERE群について定義したとおりである）、さらにKabatの番号付与にしたがえば108位にQ又Lを有することができ、好ましくはQを有することができる。
【００６５】
さらにより一般的に、及び上記に挙げた108Q、43E/44R及び103P,R,S残基に加えて、ナノボディは、通常のVHドメインで、VH/VL境界面（の部分）を形成する1つ以上の位置に、天然に存在する対応するVH又はVHHドメイン中の同じ位置に天然に存在するアミノ酸残基よりも強く荷電された1つ以上のアミノ酸残基、及び特に1つ以上の荷電アミノ酸残基（表1に示す）を含むことができる。
そのような置換には、下記の表2に示すGLEW様配列が、いわゆる“ミクロボディーズ”についての国際出願WO00/29004で開示された置換と同様に含まれ（ただしこれらに限定されない）、前記は例えば108位のQ及び44−47位のKLEWである。
ある種の好ましいナノボディでは、11位のアミノ酸残基はL、M、S、V及びWから成る群から選択され、好ましくはLである。
さらにまた、ある種の好ましいナノボディでは、83位のアミノ酸残基はR、K、N、E、I及びQから成る群から選択され、もっとも好ましくは、K又はE（天然に存在するVHHドメインと一致するナノボディ）又はR（下記で述べるように“ヒト化”ナノボディ）である。84位のアミノ酸残基はP、A、R、S、D及びVから成る群から選択され、もっとも好ましくはP（天然に存在するVHHドメインと一致するナノボディ）又はR（下記で述べるように“ヒト化”ナノボディ）である。
さらにまた、ある種の好ましいナノボディでは、104位のアミノ酸残基はG及びDから成る群から選択され、もっとも好ましくはGである。
総合すれば、11、37、44、45、47、83、84、103、104及び108位のアミノ酸残基（ナノボディで上記に示したとおりである）はまた、本明細書では“ホールマーク残基”と称されるであろう。ホールマーク残基及びもっとも近縁のヒトVHドメイン（VH3）の対応する位置のアミノ酸残基は表2にまとめられている。
天然に存在するVHHドメインに出現するこれらホールマーク残基の特に好ましいいくつかの組み合わせは、表3に示されている。比較のために、DP-47と呼ばれるヒトVH3の対応するアミノ酸残基を斜字体で示した。
【００６６】
表2：ナノボディのホールマーク残基
2008528010.tif 000003
注記：
1必ずというわけではないが、特に43−46位でKERE又はKQREとの組み合わせで。
2通常は44−47位でGLEWとして。
3通常は43−46位でKERE又はKQREとして、例えば43−47位でKEREL、KEREF、KQREL、KQREF又はKEREGとして。また別には、例えば、TERE（例えばTEREL）、KECE（例えばKECEL又はKECER）、RERE（例えばREREG）、QERE（例えばQEREG）、KGRE（例えばKGREG）、KDRE（例えばKDREV）のような配列も可能である。他のいくつかの可能な配列（ただし好ましさは劣る）には例えばDECKL及びNVCELが含まれる。
444−47位のGLEW及び43−46位のKERE又はKQREの両方と一緒に。
5しばしば、天然に存在するVHHドメインの83−84位のKP又はEPとして。
6必ずというわけではないが、特に44−47位でGLEWとの組み合わせで。
744−47位がGLEWであるときは、108位は常にQであるという条件で。
8GLEW群はまた44−47位にGLEW様配列（例えばGVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER及びELEW）を含む。
【００６７】
【表１】
2008528010.tif 000004
【００６８】
ナノボディでは、ホールマーク残基以外の他の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然に存在するVHHドメインの対応する位置（Kabatの番号付与にしたがう）に天然に存在するいずれのアミノ酸残基でもよい。
そのようなアミノ酸残基は当業者には明白であろう。表4から7は、天然に存在するVHHドメインのER1、ER2、ER3及びER4の各位置（Kabatの番号付与にしたがう）に存在し得るいくつかの非制限的残基を示す。各位置について、天然に存在するVHHドメインの各位置でもっとも頻繁に出現する（さらにナノボディの前記位置に対してもっとも好ましい）アミノ酸残基は太字で示され、各位置について好ましいその他のアミノ酸残基には下線が付されている（注記：天然に存在するVHHドメインの26−30位で見出されるアミノ酸残基の数は、これらの位置の残基は既にCDR1の部分を形成するというChothia（上掲書）の番号付与の根拠となる仮説を支持している）。
表4から7では、ヒトVH3ドメインの各位置に存在し得る非制限的な残基のいくつかもまた示されている。繰り返せば、各位置について、天然に存在するヒトVH3ドメインの各位置にもっとも頻繁に出現するアミノ酸残基が太字で示され、他の好ましいアミノ酸残基には下線が付されている。
【００６９】
【表２】
2008528010.tif 000005
【００７０】
【表３】
2008528010.tif 000006
【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
2008528010.tif 000008
【００７３】
したがって、本発明のある好ましい（ただし非制限的な）実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドとして提示されるナノボディは以下の構造を有する：
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
前記構造式中、FR1からFR4はそれぞれフレームワーク領域1から４と称され、CDR1からCDR3はそれぞれ相補性決定領域1から3と称される。
さらに、前記において、
（a）FR1は以下のアミノ酸配列を含み：
[1]QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG[26]
（b）FR2は以下のアミノ酸配列を含み：
[36]WXRQAPGKXXEXVA[49]
（c）FR3は以下のアミノ酸配列を含み：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA[94]
及び
（d）FR4は以下のアミノ酸配列を含み：
[103]XXQGTXVTVSS[113]
ここで、ホールマーク残基はXで表示され、前記は上記で定義したとおりであり、さらに括弧内の数字はKabatの番号付与によるアミノ酸の位置を示す。
ナノボディ及び前記をコードする核酸は、本発明のポリペプチドを入手するために下記に示した態様の1つを用いて入手することができる。
本明細書で用いられるナノボディという用語は、その最も広い意味で、天然又は合成変異体、変種、対立遺伝子、アナローグ及びオルトローグ（以下では総合して“類似体”と称する）もまた含む。
そのような類似体で、ホールマーク残基は上記で定義したとおりであるべきである。
一般的には、そのような類似体は、ナノボディの相同な配列（下記でさらに定義する）の、例えば相同な配列、複数の機能的部分又は1つの機能的部分であり得る。
さらにまた、一般的には、そのような類似体は、それらのフレームワーク領域が、上記に挙げたフレームワークのアミノ酸配列とアミノ酸レベルにおいて、合計して80%より高い、好ましくは85%より高い、より好ましくは90%より高い、さらに好ましくは95%より高い、例えば96%以上、97%以上、98%以上又は99%以上の配列同一性（上記で定義したとおり）を有するようなものであるべきである（この場合前記ホールマーク残基は考慮されない）。
【００７４】
一般的には、そのような類似体では、フレームワーク領域の全体的配列同一性の程度が上記に定義したように維持されることを条件に、各フレームワーク領域の各アミノ酸残基（ホールマーク残基以外）は、任意の他のアミノ酸残基によって置き換えることができる。しかしながら好ましくは、そのような類似体では：
−上記フレームワーク配列中の１つの又は複数のアミノ酸残基が、天然に存在するVHHドメイン中の同じ場所に天然に存在する1つ又は複数のアミノ酸残基によって置換され；
及び/又は
−上記フレームワーク配列中の１つの又は複数のアミノ酸残基が、上記に記載したように、“保存的”アミノ酸置換とみなすことができる1つ又は複数のアミノ酸残基によって置換され；
及び/又は
−上記フレームワーク配列中の１つの又は複数のアミノ酸残基が、ヒトの天然に存在するVHドメイン中の同じ場所に天然に存在する1つ又は複数のアミノ酸残基によって置換され（前記は一般的には天然に存在するVHH/ナノボディの一般的な或いは前記特定の場所の“ヒト化”と称され、下記でさらに詳細に考察されるであろう）；
及び/又は
−上記の表4−7でVHドメイン及びVHHドメインの両方に対してただ1つのアミノ酸残基しか示されていない場所は、好ましくは置換されない。
さらにまた、一般的には好ましさは劣るが、そのような類似体で、フレームワーク領域の全体的配列同一性の程度が上記に定義したように維持されることを条件に、1つ以上のアミノ酸残基が前記フレームワーク領域から欠失されてあるか、及び/又は前記フレームワーク領域に挿入されてあってもよい（場合によって、上記に挙げた1つ以上のアミノ酸置換に加えて）。ホールマーク残基は欠失させるべきではない。さらにまた、もっとも好ましくは、上記の表4−7でVHドメイン及びVHHドメインの両方に対してただ1つのアミノ酸しか示されていないアミノ酸残基は好ましくは欠失されない。
【００７５】
一般的には、類似体は例えば、天然に存在するVHHドメインをコードする核酸を提供し、ヒト化されるべき1つ以上のアミノ酸残基のコードを対応するヒトのアミノ酸のためのコードに改変し、このようにして得た核酸/ヌクレオチド配列を適切な宿主又は発現系で発現させ、さらに場合によって単離し、及び/又はこのようにして得た類似体を精製し、（上記に定義したように）本質的に単離された形態で前記類似体を提供することによって入手することができる。前記は一般的にはそれ自体公知の方法及び技術を用いて実施することができ、前記は、例えば本明細書に引用したハンドブック及び参考文献及び/又は下記の更なる記載から当業者には明白であろう。また別には（及び例えば）、類似体をコードする核酸は、それ自体公知の態様で（例えば予め特定したアミノ酸配列を用いて核酸配列を合成する自動装置を用いて）合成し、適切な宿主又は発現系で発現することができ、このようにして得た類似体をこのとき場合によって単離し及び/又は精製して、（上記に定義したように）前記類似体を本質的に単離された形態で提供することができる。類似体を提供するまた別の方法は、それ自体公知のペプチド合成技術（例えば下記で述べるようなもの）を用いて適切なアミノ酸配列を化学的に合成することを含む。
さらにまた、一般的には、ナノボディ（その類似体を含む）はまたヒトVH配列（すなわちアミノ酸配列又は対応するヌクレオチド配列）、例えばヒトVH3配列（例えばDP-47、DP-51又はDP-29）から出発し、前記ヒトVHドメインのアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸残基を改変して、上記に記載したように（a）108位にQ；及び/又は（b）44位にE、及び/又は45位にR、及び好ましくは44位にE；及び/又は（c）103位にP, R又はSを有するアミノ酸配列を提供することによって、調製することができることは当業者には明白であろう。繰り返せば、前記は一般的には、前出のパラグラフで述べた種々の方法及び技術により、出発点としてヒトのVHドメインのためのアミノ酸配列及び/又はヌクレオチド配列を用いて実施することができる。
【００７６】
本明細書で用いられるナノボディという用語はまた、その最も広い意味で、上記に記載した完全な配列のナノボディ又は完全な配列の類似体の部分又はフラグメントも含む。好ましくは、そのような部分又はフラグメントは、（上記に記載したように）完全なアミノ酸配列を有する対応するナノボディ又は類似体が指向する抗原となお結合し、前記に対してなお親和性及び/又は特異性を有することができるようなものでなければならない。すなわち、前記は、適切なアッセイ、例えば当業者には明白なように抗原と前記部分又はフラグメントとの結合を決定するためのアッセイを用いて決定したとき、完全なアミノ酸配列を有する対応するナノボディ又は類似体の親和性及び/又は特異性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、例えば少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%以上の親和性及び/又は特異性を有する。
一般的には、ナノボディ及び/又は類似体の部分又はフラグメントは、対応する完全長のナノボディ又は類似体のアミノ酸配列と比較して、N-末端の1つ以上のアミノ酸残基、C-末端の1つ以上のアミノ酸残基、1つ以上の連続する内部アミノ酸残基、又はその任意の組み合わせが欠失及び/又は除去されているアミノ酸配列を有する。さらにまた、1つ以上のそのような部分又はフラグメントを結合させて本発明のナノボディを提供することもまた可能である。
好ましくは、完全長のナノボディ及び/又は類似体の1つ以上の部分又はフラグメントを含むナノボディのアミノ酸配列は、対応する完全長のナノボディのアミノ酸配列と少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、例えば少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性の程度を示さなければならない。
【００７７】
さらにまた、完全長のナノボディ及び/又は類似体の1つ以上の部分又はフラグメントを含むナノボディのアミノ酸配列は、好ましくは、対応する完全長のナノボディのアミノ酸配列の少なくとも10の連続するアミノ酸残基、好ましくは少なくとも20の連続するアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも30の連続するアミノ酸残基、例えば少なくとも40の連続するアミノ酸残基を含むようなものである。
特に好ましい実施態様にしたがえば、そのような部分又はフラグメントは、対応する完全長のナノボディの少なくともFR3、CDR3及びFR4を含む（すなわち、例えば国際出願WO03/050531（Lasters et al.）に記載されたようなもの）。
ナノボディのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列は、ナノボディに所望の抗原またはそのフラグメント若しくはエピトープに対する親和性、好ましくは特異性を提供するいずれのCDR配列でもよい。
上記の記載から、本明細書で用いられるナノボディのアミノ酸配列は、天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列（例えばカメリド及び/又はヒト由来の抗体の天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列）と少なくとも1つのフレームワーク領域内の少なくとも1つのアミノ酸の位置で相違することは明白であろう。特に、本明細書で用いられるナノボディのアミノ酸配列は、天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列（例えばカメリド及び/又はヒト由来の抗体の天然に存在するVHドメインのアミノ酸配列）と少なくとも1つのホールマーク残基において相違することは明白であろう。
上記の記載から、本明細書で用いられるナノボディのいくつかのアミノ酸配列は、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列と少なくとも1つのフレームワーク領域内の少なくとも1つのアミノ酸の位置で相違することは明白であろう。特に、本明細書で用いられるナノボディのいくつかのアミノ酸配列は、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列と少なくとも1つのホールマーク残基において相違することは明白であろう。上記で既に述べたように、このタイプのナノボディのある具体的な例は、天然に存在するVHH配列と比較して、上記に記載した態様でヒト化されているナノボディである。したがって、ある具体的な（ただし非制限的な）実施態様にしたがえば、本明細書で用いられるナノボディという用語は、FR1、FR2、FR3及びFR4のアミノ酸配列が全て、天然に存在するVHドメインのFR1、FR2、FR3及びFR4のアミノ酸配列（例えば、哺乳動物（例えばヒト）に由来する天然に存在するVHドメインの天然に存在するアミノ酸配列）と全てが正確に同じであるポリペプチドを含まない。
【００７８】
上記で述べたように、本発明はまた、少なくとも1つのVHHドメイン（本発明の方法を用いて同定される）又は前記を土台にした少なくとも1つのナノボディを含むタンパク質又はポリペプチドに関する。
本発明の非制限的な実施態様にしたがえば、本発明のそのようなポリペプチドは本質的にナノボディから成る。“本質的に〜から成る”とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が、ナノボディのアミノ酸配列（上記に述べたとおり）と正確に同じものであるか、又は、限定された数にアミノ酸残基（例えば1−10のアミノ酸残基及び好ましくは1−6のアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5又は6個のアミノ酸残基）が、ナノボディのアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の双方に付加されているナノボディのアミノ酸配列と一致することを意味する。
前記アミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性に変化を与えるものでも、前記を改変するものでも、或いは前記に影響を与えるものでも又はそうでなくてもよく、さらに、前記ナノボディに更なる機能的特性を付加しても又は付加しなくてもよい。例えば前記アミノ酸残基は：
（a）“タグ”を形成する（すなわちタグとは、例えばあるアミノ酸配列又は残基を指向するアフィニティー技術を用いてナノボディの精製を可能にするか、又は促進する前記アミノ酸配列又は残基である）。その後、前記配列又は残基は除去され、本発明のヌクレオチド配列が提供される（この目的のために、前記配列又は残基は場合によって本発明のアミノ酸配列に切断可能なリンカー配列を介して連結される）。そのような残基のいくつかの好ましい（ただし非制限的な）例は、マルチヒスチジン残基及びグルタチオン残基である。
（b）官能基を提供することができるか、及び/又はそれ自体公知の態様で官能化されてある1つ以上のアミノ酸残基であり得る。例えば、当技術分野では公知のように、例えばリジン、特にシステインのようなアミノ酸残基はPEG基の結合を可能にし（すなわちPEG付加）、前記はタンパク質の表面部位を覆い隠すことができ、したがって例えば免疫原性を低下させ、血中半減期を改善し、さらにタンパク質分解切断に対して安定化させる。
（c）例えば、異種宿主細胞又は宿主動物での発現の結果としてN-末端Met残基であってもよい。
【００７９】
又別の実施態様にしたがえば、本発明のポリペプチドはナノボディのアミノ酸配列を含むことができ、前記はそのアミノ末端、そのカルボキシ末端、又はそのアミノ末端とカルボキシ末端の両端で少なくとも1つの更なるアミノ酸残基により融合される。
繰り返せば、前記さらに別のアミノ酸配列は、ナノボディの（生物学的）特性に変化を与えるものでも、前記を改変するものでも、或いは前記に影響を与えるものでも又はそうでなくてもよく、さらに前記ナノボディに更なる機能的特性を付加しても又は付加しなくてもよい。
例えば、ある好ましい（ただし非制限的な）実施態様にしたがえば、前記さらに別のアミノ酸配列は少なくとも1つのさらに別のナノボディを含み、少なくとも2つ、例えば3つ、4つ又は5つのナノボディを含む、本発明のポリペプチドを提供することができる。この場合、前記ナノボディは、場合によって1つ以上のリンカー配列（下記で規定される）を介して連結することができる。
2つ以上のナノボディを含む本発明のポリペプチドはまた本明細書では“多価”ポリペプチドと称されるであろう。例えば本発明の“二価”ポリペプチドは、場合によって1つのリンカー配列を介して連結された2つのナノボディを含み、一方、本発明の“三価”ポリペプチドは、場合によって2つのリンカー配列を介して連結された3つのナノボディを含む、云々。
本発明の多価ポリペプチドでは、2つ以上のナノボディは同じでも異なっていてもよい。例えば、本発明の多価ポリペプチドの2つ以上のナノボディは：
−同じ抗原、すなわち前記抗原の同じ部分又はエピトープ、又は前記抗原の2つ以上の異なる部分又はエピトープを指向することができ；及び/又は、
−異なる抗原を指向することができ；又はその組み合わせを指向することができる。
【００８０】
したがって、本発明の二価ポリペプチドは、例えば：
−2つの同一のナノボディを含むことができ；
−ある抗原の第一の部分若しくはエピトープを指向する第一のナノボディ、及び前記抗原の同じ部分若しくはエピトープ又は前記抗原の別の部分若しくはエピトープを指向する第二のナノボディを含むことができ；
−又は、第一の抗原を指向する第一のナノボディ、及び前記第一の抗原とは異なる第二の抗原を指向する第二のナノボディを含むことができるが；
一方、本発明の三価のポリペプチドは、例えば：
−同じ抗原の同じ又は異なる部分若しくはエピトープを指向する3つの同一又は異なるナノボディを含むことができ；
−第一の抗原の同じ又は異なる部分若しくはエピトープを指向する2つの同一又は異なるナノボディ、及び前記第一の抗原とは異なる第二の抗原を指向する第三のナノボディを含むことができ；又は
−第一の抗原を指向する第一のナノボディ、前記第一の抗原と異なる第二の抗原を指向する第二のナノボディ、及び前記第一及び第二の抗原と異なる第三の抗原を指向する第三のナノボディを含むことができる。
少なくとも2つのナノボディを含む本発明のポリペプチド（前記ポリペプチドで少なくとも1つのナノボディは第一の抗原を指向し、少なくとも1つのナノボディは前記第一の抗原と異なる第二の抗原を指向する）はまた、“マルチ特異性”ナノボディと称されるであろう。したがって、“二特異性”ナノボディは、第一の抗原を指向する少なくとも1つのナノボディ及び第二の抗原を指向する少なくとも1つの別のナノボディを含むナノボディであり、一方、“三特異性”ナノボディは、第一の抗原を指向する少なくとも1つのナノボディ、第二の抗原を指向する少なくとも1つのまた別のナノボディ、及び第三の抗原を指向する少なくとも1つの又別のナノボディを含むナノボディである、云々。
【００８１】
したがって、そのもっとも単純な形態では、本発明の二特異性ポリペプチドは、本発明の二価ポリペプチド（上記に定義したとおり）であり、第一の抗原を指向する第一のナノボディ及び第二の抗原を指向する第二のナノボディを含み（ここで前記第一及び第二のナノボディは場合によってリンカー配列（上記で定義したとおり）を介して結合され得る）；一方、そのもっとも単純な形態の本発明の三特異性ポリペプチドは、本発明の三価ポリペプチド（上記で定義したとおり）であり、第一の抗原を指向する第一のナノボディ、第二の抗原を指向する第二のナノボディ及び第三の抗原を指向する第三のナノボディを含む（ここで前記第一、第二及び第三のナノボディは場合によって1つ以上の、特に2つのリンカー配列を介して結合され得る）。
しかしながら、上記の記載から明白なように、本発明のマルチ特異性ポリペプチドは2つ以上の異なる抗原を指向する任意の数のナノボディを含むことができるという意味で、本発明は上記の記載に限定されない。
1つ以上のVHHドメインを含む多価及びマルチ特異性ポリペプチド及びそれらの調製物については、Conrathらの文献（J Biol Chem 276(10):7346-7350）の他にEP0822985にも言及されている。
多価及びマルチ特異性ポリペプチドで使用されるリンカーは当業者には明白で、例えばgly-serリンカー、例えば(glyxsery)zタイプ（例えばWO99/42077に記載されている(gly4ser)3又は(gly3ser2)3）、ヒンジ様領域（例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域又は同様な配列）が含まれる。他の適切なリンカーについては、上記に引用した全般的な背景技術で言及されている。
リンカーはまた、多価又はマルチ特異性ポリペプチドにいくつかの官能性を提供することができる。例えば、1つ以上の荷電アミノ酸残基（上記表1参照）を含むリンカーは改善された親水性特性を提供することができ、一方、小さなエピトープ又はタグを形成又は含むリンカーは、検出、特定及び/又は精製の目的のために用いることができる。
【００８２】
さらにまたここで開示するように、所望の抗原及び少なくとも1つの血清タンパク質（例えば下記で述べる血清タンパク質）、特にヒト血清アルブミンを指向する本発明のマルチ特異性ポリペプチドは、対応する一価ナノボディと比較して血中半減期の延長を示すことができる。
上記で触れたように、本明細書に記載の方法は、特に本発明のそのような多価又はマルチ特異性ポリペプチドの生成に適している。
本発明のポリペプチドでは、少なくとも1つのナノボディがまた、通常のVHドメイン又はVHドメインの天然若しくは合成類似体と、場合によってリンカー配列を介して連結され得る。
本発明のポリペプチドでは、少なくとも1つのナノボディがまた、通常のVLドメイン又はVLドメインの天然若しくは合成類似体と、場合によってリンカー配列を介して連結され、通常のscFvフラグメントと同様な形態である（ただしVHドメインの代わりにナノボディを含む）本発明のポリペプチドが提供される。
本発明のポリペプチドでは、少なくとも1つのナノボディがまた、1つ以上のCH1、CH2及び/又はCH3ドメインと場合によってリンカー配列を介して連結され得る。例えば、適切なCH1ドメインと連結したナノボディを、例えば適切な軽鎖と一緒に用いて、通常のFabフラグメント又はF(ab')2フラグメントと類似の抗体フラグメント/構造物を作成することができる（ただし通常のVHドメインの一方又は両方（F(ab')2の場合）がナノボディに置き換えられている）。そのようなフラグメントはまた、ヘテロ特異性又は二特異性であって、すなわち2つ以上の抗原を指向することができる。適切なCH2及びCH3ドメイン（例えばカメリド由来）と連結されたナノボディを用いて、単一特異性又は二特異性重鎖抗体を作成することができる。最後に、適切なCH1、CH2及びCH3ドメイン（例えばヒト由来）と連結されたナノボディを（適切な軽鎖と一緒に）用いて、通常の4-鎖抗体と類似であるが通常のVHドメインの一方又は両方がナノボディで置き換えられている抗体を形成することができる、
【００８３】
さらにまた、1つ以上のナノボディに加えて、本発明のポリペプチドはまた官能基、部分又は残基（例えば治療的に活性な物質、例えば下記に挙げるようなもの）、及び/又はマーカー又は標識（例えば蛍光マーカー、放射性同位元素など）を下記でさらに説明するように含むことができる。
当業者には明白なように、本発明のナノボディ及び/又はポリペプチドを調製するために特に有用なある方法は、一般的に以下の工程を含む：
−適切な宿主細胞又は宿主生物（本明細書ではまた“本発明の宿主”と称される）で、または本発明のナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書ではまた“本発明の核酸”と称される）のまた別の適切な発現系で発現させる工程、場合によって以下の工程が続く：
−前記のようにして得た本発明のナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程。
特にそのような方法は以下の工程を含むことができる：
−本発明の宿主を、前記本発明の宿主が本発明の少なくとも1つのナノボディ及び/又はポリペプチドを発現及び/又は産生することができるような条件下で培養及び/又は維持する工程、場合によって以下の工程が続く；
−前記のようにして得られた本発明のナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程。
本発明の核酸は、一本鎖若しくは二本鎖のDNA又はRNAの形態であることができ、好ましくは二本鎖DNAの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムDNA、cDNA又は合成DNA（例えば、対象の宿主細胞又は宿主生物での発現のために特別に適合させたコドン使用頻度を有するDNA）であり得る。
【００８４】
本発明のある実施態様にしたがえば、本発明の核酸は、上記で定義したように本質的に単離された形態である。
本発明の核酸はまた、ベクター（例えばプラスミド、コスミド又はYAC）の形態であるか、前記に存在しているか、及び/又はその部分であることができ、繰り返せば本質的に単離された形態であり得る。
本発明の核酸は、本明細書で提供される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報により、それ自体公知の態様で調製又は入手することができ、及び/又は適切な天然の供給源から単離することができる。類似体を提供するために、天然に存在するVHHドメインをコードするヌクレオチド配列を例えば位置特異的変異導入に付し、前記類似体をコードする本発明の核酸を提供することができる。さらに、当業者に明白なように、本発明の核酸を調製するために、さらにまたいくつかのヌクレオチド配列（例えばナノボディをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列及び例えば1つ以上のリンカーをコードする核酸）を適切な態様で一緒に連結することができる。
本発明の核酸を作成する技術は当業者には明白であり、例えば以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：自動DNA合成；位置特異的変異導入；2つ以上の天然及び/又は合成配列（又はその2つ以上の部分）の結合、切端短縮した発現生成物を発現させる変異の導入；1つ以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を用いて容易に消化及び/又は連結することができるカセット及び/又は領域を作成するために）、及び/又は例えば天然に存在するVH又はVHHの配列を鋳型として用いる1つ以上の“ミスマッチ”プライマーによるPCR反応を用いる変異の導入。これらの技術及び他の技術は当業者には明白で、さらにまた、上記に挙げた標準的なハンドブック（例えばSambrookら及びAusubelらの成書）同様、下記の実施例でも言及される。
【００８５】
当業者には明白なように、本発明の核酸はまた遺伝的構築物の形態を有するか、遺伝的構築物中に存在しているか、及び/又は前記の部分であり得る。そのような遺伝的構築物はまた、一般的には少なくとも１つの本発明の核酸を含み、前記は場合によって、それ自体公知の1つ以上の遺伝的構築物のエレメント（例えば1つ以上の適切な調節エレメント（例えば適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）及び下記で言及するさらに別の遺伝的構築物のエレメントと連結される。そのような少なくとも1つの本発明の核酸を含む遺伝的構築物はまた、本明細書では“本発明の遺伝的構築物”と称されるであろう。
本発明の遺伝的構築物はDNAでもRNAでもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝的構築物はまた、対象の宿主細胞又は宿主動物の形質転換に適した形態、対象の宿主細胞のゲノムDNAへの組み込みに適した形態、又は対象の宿主生物での独立した複製、維持及び/又は遺伝に適した形態である。例えば、本発明の遺伝的構築物はベクターの形態を有し、例えばプラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクター又はトランスポゾンである。特に、ベクターは発現ベクター、すなわちin vitro及び/又はin vivo（すなわち適切な宿主細胞、宿主動物及び/又は発現系）で発現を提供することができるベクターであり得る。
好ましい（ただし非制限的な）実施態様では、本発明の遺伝的構築物は以下を含む：
（a）少なくとも1つの本発明の核酸、前記は以下と機能的に結合されてある：
（b）1つ以上の調節エレメント、例えばプロモーター及び場合によって適切なターミネーター；さらにまた場合によって
（c）それ自体公知の遺伝的構築物の1つ以上のさらに別のエレメント；
前記において、“調節性エレメント”、“プロモーター”、“ターミネーター”及び“機能的に結合された”という用語は、当分野でのそれらの通常の意味を有し（下記でもさらに説明する）；さらに前記遺伝的構築物に存在する、前記“さらに別のエレメント”は、例えば3'-又は5'-UTR配列、リーダー配列、選別マーカー、発現マーカー/レポーター遺伝子、及び/又は形質転換又は組み込み（の効率）を容易にするか、又は増進させることができるエレメントであり得る。そのような遺伝的構築物のための前記及びその他の適切なエレメントは当業者には明白であり、それらは、例えば使用される構築物のタイプ；対象の宿主細胞又は宿主生物；本発明の問題のヌクレオチド配列が発現される態様（例えば構成的、一過性又は誘発性発現）；及び/又は用いられる形質転換技術に左右されるであろう。
【００８６】
好ましくは、本発明の遺伝的構築物では、前記少なくとも1つの本発明の核酸及び前記調節性エレメント、及び場合によって前記1つ以上のさらに別のエレメントは、互いに“機能的に連結されている”（前記用語は、一般的にそれら核酸及びエレメントが互いに機能的な関係にあることを意味する）。例えば、プロモーターが、コード配列の転写及び/又は発現を開始或いは制御/調節することができるならば、前記プロモーターはコード配列と“機能的に連結されている”と考えられる（この場合、前記コード配列は前記プロモーターの“制御下”にあると理解されるべきである）。一般的には、2つのヌクレオチド配列が機能的に連結されるときは、それらは同じ向きで存在し、通常はまた同じ読み枠内に存在する。それらは、通常はまた本質的に連続性であるが、ただしこれはまた要求されなくてもよい。
好ましくは、本発明の遺伝的構築物の調節エレメント及び又別のエレメントは、それらが対象の宿主細胞又は宿主動物でそれらの対象とする生物学的機能を提供することができるようなものである。
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、対象の宿主細胞又は宿主生物で“機能できる”べきである（“機能できる”という用語は、前記プロモーターが、ヌクレオチド配列（前記プロモーターが機能的に連結（上記で定義）されている例えばコード配列）の発現を開始或いは制御/調節することができることを意味する）。
いくつかの特に好ましいプロモーターには、細菌細胞での発現のためにそれ自体公知のプロモーター、例えば下記で言及するもの及び/又は実施例で使用されるものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００８７】
選別マーカーは、本発明のヌクレオチド配列で形質転換することに成功した宿主細胞及び/又は宿主生物を、形質転換されなかった宿主細胞/生物とすなわち適切な選別条件下で識別することを可能にするものであるべきである。そのようなマーカーのいくつかの好ましい（ただし非制限的な）例は、抗生物質（例えばカナマイシン又はアンピシリン）に対する耐性を提供する遺伝子、耐熱性を提供する遺伝子、又は非形質転換細胞又は生物の生存に必須であるある種の因子、化合物及び/又は（食物）成分が培養液中に存在しないときに宿主細胞又は宿主生物の維持を可能にする遺伝子である。
リーダー配列は、対象の宿主細胞又は宿主生物で、所望の翻訳後改変を可能にするもの、及び/又は転写mRNAを細胞の所望の部分又は小器官へ誘導するものであろう。リーダー配列はまた、発現生成物を細胞から分泌させることができる。したがって、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物で機能することができる任意のプロ-、プレ-、又はプレプロ-配列であり得る。リーダー配列は細菌細胞での発現には要求されないであろう。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、宿主細胞又は宿主生物で、前記遺伝的構築物（に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現の検出を可能にするものであるべきである。発現マーカーは、場合によってまた、発現生成物の（例えば細胞の特定の部分又は小器官、及び/又は多細胞生物の特定の細胞、組織、器官又は部分における）分布を明らかにすることができる。そのようなレポーター遺伝子はまた、本発明のアミノ酸配列との融合タンパク質として発現させることができる。いくつかの好ましい（ただし非制限的な）例には、蛍光タンパク質（例えばGFP）が含まれる。
【００８８】
適切なプロモーター、ターミネーター及びまた別のエレメントのいくつかの好ましい（ただし非制限的な）例には、下記の実施例で使用されるものが含まれる。本発明の遺伝的構築物に存在又は使用可能なプロモーター、選別マーカー、リーダー配列、発現マーカー及びさらに別のエレメント（例えばターミネーター、転写及び/又は翻訳エンハンサー、及び/又は組み込み因子）のいくつかの（さらに）非制限的な例については、上記で述べた一般的なハンドブック（例えばSanbrookら及びAusubelらの成書）並びにWO95/07463、WO96/23810、WO95/07463、WO95/21191、WO97/11094、WO97/42320、WO98/06737、WO98/21355、US-A-6,207,410、US-A-5,693,492及びEP1085089で提供される実施例で言及される。その他の例は当業者には明白であろう。上記に引用した全般的な背景技術及び下記で引用するさらに別の参考文献でもまた言及される。
本発明の遺伝的構築物は、一般的には、本発明のヌクレオチド配列を上記に記載した1つ以上のさらに別のエレメントに、例えば上記で述べた一般的なハンドブック（例えばSanbrookら及びAusubelらの成書）に記載されている技術を用いて適切に連結することによって提供することができる。
本発明の遺伝的構築物は、しばしば、本発明のヌクレオチド配列をそれ自体公知の適切な（発現）ベクターに挿入することによって入手されるであろう。いくつかの好ましい（ただし非制限的な）適切な発現ベクターの例は、下記の実施例で用いられるものと同様に例えば以下のものである：
−哺乳動物細胞での発現のためのベクター：pMAMneo（Clontech）、pcDNA3（Invitrogen）、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO-pSV2-neo（ATCC37593）、pBPV-1(8-2)（ATCC37110）、pdBPV-MMTneo(342-12)（ATCC37224）、pRSVgp（ATCC37199）、pRSVneo（ATCC37198）、pSV2-dhfr（ATCC37146）、pUCTag（ATCC37460）及び1ZD35（ATCC37565）、並びにウイルスを土台にした発現系、例えばアデノウイルスを土台にした発現系；
−細菌細胞での発現のためのベクター：pETベクター（Novagen）及びpQEベクター（Qiagen）；
−酵母又は他の菌類細胞での発現のためのベクター：pYES2（Invitrogen）及びピキア（Pichia）発現ベクター（Invitrogen）；
−昆虫細胞での発現のためのベクター：pBlueBacII（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
−植物又は植物細胞での発現のためのベクター：例えばカリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルスを土台にしたベクター、アグロバクテリウムの適切な株又はTiプラスミド系ベクター；
【００８９】
本発明の核酸及び/又は本発明の遺伝的構築物は、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に用いることができる。宿主又は宿主細胞は、任意の適切な細胞（菌類細胞、原核細胞又は真核細胞）若しくは細胞株又は任意の適切な菌類、原核生物若しくは真核生物でもよく、例えば以下である：
−細菌株、大腸菌、バシルス、ストレプトミセス及びシュードモナスが含まれるが、ただしこれらに限定されない；
−菌類細胞、アスペルギルス、トリコデルマ（Trichoderma）又は他の糸状菌類の種に由来する細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない；
−酵母細胞、クルイベロミセス（Kluyveromyces）又はサッカロミセスの種に由来する細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない；
−両生動物細胞又は細胞株、例えばアフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；
−昆虫由来細胞又は細胞株、例えば鱗翅類に由来する細胞/細胞株（スポドプテラ（Spodoptera）SF9及びSf21細胞、又はショウジョウバエに由来する細胞/細胞株、例えばシュナイダー（Schneider）及びKc細胞が含まれるが、ただしこれらに限定されない）；及び/又は
−植物又は植物細胞；
−哺乳動物細胞又は細胞株、例えばヒト、哺乳動物に由来する細胞又は細胞株でCHO-及びBHK細胞並びにヒト細胞又は細胞株（例えばHeLa及びCOS）を含むが、ただしこれらに限定されない。
これに関しては、上記に引用した全般的背景技術で、さらに、例えばWO94/29457；WO96/34103；WO99/42077；Riechmann, J Immunol Meth 1999, 231:25-39；van der Linden, J Biotechnology 2000, 80:261-270；Thomassen et al. Enzyme & Microbial Technology 2002, 30:273-278でも言及されている。
【００９０】
上記でも触れたように、ナノボディを使用する利点の１つは、ナノボディを土台にしたポリペプチドは適切な細菌系での発現により調製することができるということであり、さらに適切な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節エレメントなどは、例えば上記で引用した参考文献から当業者には明白であろう。しかしながら、本発明は、その最も広い意味において細菌系での発現に限定されないことは留意されるべきである。
好ましくは、本発明では、（in vitro又はin vivo）発現系（例えば細菌発現系）が用いられ、前記は医薬的使用に適した形態で本発明のポリペプチドを提供し、繰り返せば、そのような発現系は当業者には明白であろう。さらにまた当業者には明白なところであるが、医薬的使用に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成技術を用いて製造することができる。
本発明の宿主を形質転換する適切な技術は当業者には明白であり、対象の宿主細胞/宿主生物及び使用される遺伝的構築物に左右され得る。繰り返せば、これに関しては上記に示したハンドブック及び特許出願で言及されている。
形質転換の後で、本発明のヌクレオチド配列/遺伝的構築物で形質転換することに成功した宿主細胞又は宿主生物を検出及び選別する工程を実施することができる。前記は例えば、本発明の遺伝的構築物中に存在する選別性マーカーを基準にする選別工程でも、又は、本発明のアミノ酸配列を例えば特定の抗体を用いて検出することを必要とする工程でもよい。
形質転換宿主細胞（前記は適切な細胞株の形態である得る）、又は形質転換宿主生物（前記は適切な変異体系列又は株の形態であり得る）は、本発明の更なる特徴を構成する。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、それらが、本発明のアミノ酸を発現するか（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官で発現するか）、又は（例えば適切な条件下で）（少なくとも）発現する能力を有するようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のその後の世代、子孫及び/又は子を含み、前記は例えば細胞分割又は有性若しくは無性生殖によって入手することができる。
【００９１】
本発明のアミノ酸配列の生成/発現を得るために、形質転換宿主細胞又は形質転換宿主生物は一般的に、本発明の（所望の）アミノ酸配列が発現/生成される条件下で保持、維持及び/又は培養することができる。適切な条件は当業者には明白であり、通常は、使用される宿主細胞/宿主生物と同様、本発明の（対応する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに左右されるであろう。繰り返せば、これに関しては、上記の本発明の遺伝的構築物に関するパラグラフで触れたハンドブック及び特許出願で言及されている。
一般的には、適切な条件には、適切な培地の使用、食物の適切な供給源及び/又は適切な栄養物の存在、適切な温度の使用、及び場合によって適切な誘発因子又は化合物の存在（例えば本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にあるとき）が含まれ得る。前記のいずれも当業者は選択することができる。繰り返せば、そのような条件下では、本発明のアミノ酸配列は、構成的態様で、一過性態様で、又は適切に誘導されたときのみに発現され得る。
本発明のアミノ酸配列は、（先ず初めに）未成熟の形態で（上記で述べたように）生成され、続いて、使用される宿主細胞/宿主生物に応じて前記は翻訳後改変に付されることは当業者にはまた明白であろう。さらにまた、本発明のアミノ酸配列はグリコシル化され得るが、これもまた使用される宿主細胞/宿主生物に左右される。
続いて、本発明のアミノ酸配列は、それ自体公知のタンパク質の単離及び/又は精製技術（例えば（調製用）クロマトグラフィー及び/又は電気泳動技術、弁別的沈殿技術、アフィニティー技術（例えば本発明のアミノ酸と融合させた特異的に切断できるアミノ酸配列を用いる）、及び/又は調製用免疫学的技術（すなわち単離されるべきアミノ酸配列に対する抗体を用いる））を用いて、宿主細胞/宿主生物から及び/又は培地（その中で前記宿主細胞又は宿主生物が培養されている）から単離することができる。
【００９２】
一般的には、医薬的使用のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤及び/又はアジュバント、及び場合によって1つ以上のさらに別の医薬的に活性を有するポリペプチド及び/又は化合物を含む医薬調製物として処方することができる。非制限的な例によれば、そのような処方物は、経口投与、非経口投与（例えば静脈、筋肉内又は皮下注射又は静脈輸液）、局所投与、吸入による投与、皮膚貼付、移植、座薬などに適した形態を有することができる。そのような適切な投与形態（前記は投与態様に応じて固体、半個体又は液体であり得る）は、その調製に用いられる方法及び担体と同様、当業者には明白であり下記でもさらに記載される。
本発明のポリペプチド及び前記を含む組成物はまた獣医分野でも有用であろうと考えられ、前記は、本明細書の目的のために動物の疾患の予防及び/又は治療を含むだけでなく、経済的に重要な動物（例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、魚類など）のために、動物の成長及び/又は体重、及び/又は肉又は動物から得られる他の生産物の量及び/又は品質の強化もまた含む。したがって、さらに別の特徴では、本発明は、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び少なくとも１つの適切な担体（すなわち獣医分野の使用に適した担体）並びに場合によって１つ以上のさらに別の活性物質を含む、獣医分野の使用を目的とする組成物に関する。
【００９３】
実験部分
通常の抗体は、少なくとも4つのポリペプチド鎖を含む大きなマルチサブユニットタンパク質分子である。例えば、ヒトIgGは、ジスルフィド結合により機能的な抗体を形成する2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する。通常のIgGのサイズは約150kDである。相対的に大きいそれらのサイズのために、完全な抗体（例えばIgG、IgA、IgMなど）は、例えば組織浸透における問題によりそれらの治療的有用性が限定される。大変な努力が、抗原結合機能及び可溶性を維持する、より小さな抗体フラグメントの同定及び生成に向けられてきた。
抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドは、可変（V）領域又はドメイン（抗原相互反応に直接参画する）、及び定常領域又はドメイン（構造支持及び免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における機能を提供する）を含む。可変ドメインはまた抗原結合ドメインと称される。
通常抗体の抗原結合ドメインは、以下の2つの分離したドメインで構成されている：重鎖可変ドメイン（VH）及び軽鎖可変ドメイン（VL：前記はVカッパ又はVラムダのどちらかであり得る）。抗原結合部位自体は、6つのポリペプチドループ（3つはVHドメインに由来し（H1、H2及びH3）、3つはVLドメインに由来する（L1、L2及びL3））によって形成される。
VH及びVL内には、抗体間で最大の配列変動性を示す超可変領域及び変動が少ないフレームワーク領域が存在する。折り畳みによって超可変領域は一緒になって抗原結合ポケットを形成する。抗体と抗原とがもっとも接触するこれらの部位は抗体の相補性決定領域（CDR）である。第三のCDR領域（CDR3）及び特に重鎖のCDR3（CDR3）は抗体特異性で決定的な役割を果たし（Kabat & Wu， 1991）、常に抗原結合に必要とされると考えられている（WO03/050531、前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
in vivoでは、VH及びVHドメインをコードするV遺伝子の多様な一次レパートリーが、遺伝子セグメントの順列組み合わせ的再編成によって生成される。C領域は、軽鎖C領域（CL領域と称される）及び重鎖C領域（CH1、CH2及びCH3領域と称される）を含む。抗体のVH及びVHは抗原と結合し、一方、抗体の定常領域はその生物学的機能を決定する。CH2ドメインは、補体と結合してIg異化作用（分解）を制御する。CH2及びCH3ドメインは、食細胞のFcR（Fcレセプター）と結合して抗原の取り込みを促進する。Cドメインの生物学的機能は、分子の抗原特異性とは無関係である。
【００９４】
天然に存在する抗体のより小さな抗原結合フラグメントが、プロテアーゼ消化の後で数多く同定された。これらには、例えば“Fabフラグメント”（VL-CL＋VH-CH1）、“Fab'フラグメント”（重鎖ヒンジ領域をもつFab）、及び“F(ab')2フラグメント”（重鎖ヒンジ領域で結合したFab'フラグメントのダイマー）が含まれる。そのようなフラグメントは、より大きな免疫原性Fc領域をモノクローナル抗体から排除するために（この操作はまたそれら抗体の半減期を短縮する）作成することができる。
組換えの方法を用いてもっと小さな抗原結合フラグメントさえ作出された。前記は、“単鎖Fv”（可変フラグメント）又は“scFv”と称され、合成ペプチドリンカーで結合させたVL及びVHから成る。操作を施された免疫毒では、毒素配列は抗体のFc領域と置き換えられている。
モノクローナル抗体を改変するその他の遺伝子操作の例には、キメラ抗体（所望の特異性をもつマウスVH及びVL遺伝子セグメントがヒトCH及びCL遺伝子セグメントにスプライシングされている）、及びヘテロコンジュゲート（異なる抗体に由来するH-L対で作成）が含まれる。
抗体の特異性及び親和性の大半がCDR3ループに存在するために、重鎖可変領域の小さな機能的ユニットが報告されている（例えばWO00/29004、US5,702,892）。自然な状態で軽鎖を欠く、ユニークな重鎖抗体クラスをカメリドから誘導することができ、WO94/04678で開示されている（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
カメリド科（Camelidae）の重鎖抗体は、単一重鎖のホモダイマーとして見出され、前記はそれらの定常領域を介してダイマー化されている。これらカメリド科の重鎖抗体の可変ドメインは、VHHドメイン又はVHHと称され、それ自体でナノボディとして、及び/又はナノボディ入手のための出発点として用いることができる。単離されたVHHは、高い特異性で抗原と結合する能力を保持している（Hamers-Casteman et al. 1993, Nature 363:446-448）。そのようなVHHドメイン又は前記をコードするヌクレオチド配列は、カメリド科の種、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ及びグアナコで産生された抗体から誘導することができる。カメリド科以外の他の種（例えばサメ、フグ）も機能的な抗原結合重鎖抗体を産生することができ、それら（前記をコードするヌクレオチド配列）から、前記のような天然に存在するVHHを例えば本明細書に記載の方法を用いて入手することができる。
【００９５】
治療で使用するためには、ヒトのタンパク質は、患者に投与されたときおそらく免疫応答を惹起しないので好ましい。単離されたヒトVHドメインは比較的不溶性の傾向があり、しばしば発現されにくい。カメリドのVHHとヒト抗体のVHドメインとの比較によって、ヒトVHドメインのVH/VL境界面と対応するカメリドのVHHドメインのフレームワーク領域におけるいくつかの重要な相違が明らかになった。これらヒト残基のVHH類似残基に変異を導入して、“カメリド化”ヒトVHドメインを作成した。前記は抗原結合活性を維持し、なお発現及び可溶性が改善されている。
例えば免疫マウスの脾臓由来のゲノムDNA又はRNAから増幅させ、大腸菌で発現させたネズミのVH遺伝子に由来する、単一VHドメインライブラリーもまた報告されている（Ward et al. 1989, Nature 341:544-546）。単離された単一VHドメインは“dAb”又はドメイン抗体と称される。“dAb”は、抗原と特異的に結合する、抗体の単一可変ドメイン（VH又はVL）ポリペプチドである。“dAb”は、他のVドメインとは無関係に抗原と結合する。しかしながら、前記用語が本明細書で用いられるように、“dAb”は、ホモ又は他のVH若しくはVLドメインとのヘテロマルチマーとして存在することができ、この場合、他のドメインは、前記dAbによる抗原結合に必要とされない（すなわちこの場合dAbは追加されたVH又はVLドメインとは無関係に抗原と結合する）。
本明細書で用いられる、“抗原”は、抗体又は抗体の結合領域（例えば可変ドメイン）と結合する。典型的には、抗原は、in vivoで抗体応答を惹起することができる。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、又は他の分子でもよく、マルチサブユニット分子を含む。一般的には、免疫グロブリン可変ドメインは、特定の抗原に対する標的特異性について選別される。
【００９６】
ナノボディ
カメリド科の動物は、軽鎖を欠く、固有の広い範囲のレパートリーをもつ機能的重鎖抗体を発現する。カメリド科の抗体に由来するVHH分子は、既知の最小の完全な抗原結合ドメインであり（約15kDa、又は通常のIgGの十分の一）、したがって密な組織へのデリバリーに対し、さらに巨大分子間の限られた間隙に近づくために最適である。
ナノボディは、通常の抗原結合タンパク質（例えば完全サイズの通常の4-鎖抗体又は上記に記載の一般的に用いられるフラグメント及びその類似体、及び完全サイズの重鎖抗体）の有利な特徴をもつだけでなく、前記はまたさらに別の好ましい特性を示す。それらは可溶性であり、したがってそれらは保存が可能であり、及び/又はそれらは、通常の抗原結合タンパク質（例えば完全サイズの通常の4-鎖抗体又は一般的に用いられるフラグメント及びその類似体）と比較してより高濃度で投与することができる。ナノボディは室温で安定であり、したがって、それらは冷蔵装置を使用することなく調製、保存及び/又は輸送することが可能で、費用、時間及び環境を保全する。ナノボディは、厳しい条件（例えば極端なpH、変性試薬及び高温）に耐性を有し、したがって経口投与によるデリバリーに適している。ナノボディはプロテアーゼの作用に耐性を示し、前記は通常の抗体では珍しい。ナノボディは、広範囲の種々の抗原タイプに対し高い結合親和性、及び通常の抗体が認識しないエピトープと結合する能力を示す。例えば、それらは、腔隙に侵入する能力を有する伸張CDR3ループを提示する（WO97/49805）。ナノボディは、（頭対尾）融合によって場合によって1つ以上のリンカー配列を介して二機能性又はマルチ機能性分子を作成するために理想的な構築ブロックである（WO96/34103に開示されている：前記文献は参照により本明細書に含まれる）。それらの小さなサイズのために、ナノボディは、例えば通常の抗体よりも良好な組織浸透性及び身体の全ての部分へ到達する能力を有する。ラマの特定のナノボディは、ヒトの脳血管障壁を通過することができることがin vitroで示された（WO02/057445）。
さらにまた、ナノボディは、通常の抗原結合タンパク質（例えば、非ヒト哺乳動物から得られる完全サイズの通常の4-鎖抗体、又は一般的に用いられるそのフラグメント及び類似体）よりも免疫原性が少ない。カメリド科のナノボディのあるサブクラスが発見され、前記はヒトVHフレームワーク領域と95%ものアミノ酸配列相同性を示す。このことは、ヒト患者での投与時の免疫原性は極めて少ないか又は存在しさえしないと期待できることを示唆している。また別には、必要な場合でも、ナノボディのヒト化はほんの数残基の置換を要求するだけである。
上記で言及したように、本発明の方法は、そのような多価構築物の部分として、及び/又はそのような多価構築物を構築するために用いることができる免疫グロブリン配列のクローニング及び直接スクリーニングのために用いることができる。前記免疫グロブリン配列は以下を含む（ただしこれらに限定されない）：2つ以上の可変ドメイン（又は抗原結合ドメイン）及び特にVHドメイン又はVHHドメイン； VL、VH又はVHHドメインのフラグメント、例えばCDR領域（例えばCDR3領域）；通常の4-鎖抗体の抗原結合フラグメント（例えばFabフラグメント及びscFv）、重鎖抗体及びドメイン抗体；及び特にVH配列、及び特にVHH配列。ある特別な実施態様にしたがえば、本発明の方法はまた、そのような多価構築物の直接発現及び/又はスクリーニングに用いることができる。
【００９７】
2つ以上のナノボディを含む多価構築物
本発明の範囲は、上記に記載の単離ナノボディを包含するだけでなく、1つ以上のナノボディ又はそのフラグメントを含むより大きなポリペプチドとともに、前記をコードするヌクレオチド配列/核酸もまた包含する。これらの多価/マルチバレントポリペプチドは、出願者らによるEGFRを指向する多価ポリペプチドに関して全般的に国際出願PCT/BE2004/000159でより詳細に開示されている。
本発明の方法は、下記でさらに説明するように、多価（マルチバレント/マルチ特異性）ポリペプチドの非常に効率的な直接的スクリーニングを可能にする。
本発明者らは、マルチマー標的又は細胞表面抗原を指向する少なくとも2つのナノボディを含む多価ポリペプチドは、前記標的に対して並外れた高い機能的親和性という利点を有し、それらの一価の対応物と比較して予想される特性より数桁高い親和性を有することを示した（例えばWO04/041862、WO04/062551）。これら多価ポリペプチドの前記機能的親和性及びアンタゴニスト能力は、通常の二価及び多価抗原結合タンパク質（例えばscFvフラグメント）について従来技術で報告されたものよりもはるかに高い。互いに直接的に又は（短い）リンカー配列を介して連結された2つ以上のナノボディを含むそのようなポリペプチドは、通常の多価4-鎖抗体で理論的に予想される高い機能的親和性を示す。
TNF-アルファについては、TNF-アルファを指向する2つのナノボディを含む二価ポリペプチドは、トリマーサイトカインの3つのレセプター結合部位の2つをブロックし、それによってシグナルトランスダクションに必要な2つのレセプターの補充を効率的に防止できることが示された。二価タンパク質は、（Remicade(商標)のような）モノクローナル抗体で見出された大きな凝集物を形成することなくTNFと複合体を形成し、その代わり、そのような二価タンパク質は（Enbrel(商標)のような）レセプターそのもので観察された等価の複合体を生じる。
TNF-ナノボディ構造のモデリングは、それらの小さなサイズのためにナノボディはレセプター結合部位に侵入することができることを示唆した。さらにまた、短いリンカーを介して一緒に連結されたこれら2つのナノボディはサイトカインの1つのトリマーに同時に結合することができる（これは通常の4-鎖抗体にとっては立体的拘束のために不可能である）。
【００９８】
全体として、これらのデータは、非常に鋭敏なバイオアッセイで測定される、二価TNF-アルファナノボディの優れたアンタゴニストとしての有効性を解説している。
アビジティーは、多価抗体分子と結合する多価抗原の機能的親和性である。アビジティーは、反復する同一のエピトープをもつ抗原との結合を強化する。個々の抗体分子がもつ抗原結合部位が多ければ多いほど、抗原に対する前記のアビジティーは強くなる。
少なくとも2つのナノボディを含む多価ポリペプチドは、滞留時間の延長及びそれらの標的に対する親和性/アビジティーの増加を示す。これらの多価ポリペプチドを改変して、標的特異的画像化剤を提供するか、又は半減期を改善するか、又は標的となった抗原若しくは細胞の除去に必要な免疫系からの細胞を補充することにより又はADCC若しくはCDCを誘発することによりエフェクター機能を得ることができる。
上記に記載の多価ポリペプチドは、共有結合させた2つ以上の抗標的ナノボディを含むポリペプチドを指す。前記ナノボディは配列が同一であっても又は配列が異なっていてもよいが、同じ標的又は同じ抗原若しくはそのエピトープを指向する。また別には、そのような多価構築物は同じ標的の異なるエピトープを指向することができる。これに関してはまた、出願人による国際出願PCT/BE2004/000159で言及されている。
結合させるナノボディの数に応じて、多価ポリペプチドは、二価（2つのナノボディ）、三価（3つのナノボディ）、四価（4つのナノボディ）であり得るが、さらに大きい価数の分子であってもよい。
したがって、多価重鎖抗体は、治療薬及び診断薬設計のために有望な見通しを提供する。
下記でさらに述べるように、本明細書に記載した方法は、1つ以上の免疫グロブリン配列又はそのフラグメントを含む多価ポリペプチドのクローニング及び直接スクリーニングのために容易に及び有利に適合させることができる（前記多価ポリペプチドは以下を含む（ただしこれらに限定されない）：2つ以上の可変ドメイン（又は抗原結合ドメイン）及び特にVHドメイン又はVHHドメイン； VL、VH又はVHHドメインのフラグメント、例えばCDR領域（例えばCDR3領域）；通常の4-鎖抗体の抗原結合フラグメント（例えばFabフラグメント及びscFv）、重鎖抗体及びドメイン抗体（dAb）、及び特にVH配列、及び特にVHH配列）。
本発明の方法は、好ましくは1つ以上のVHHドメイン又はそのフラグメントを含む多価ポリペプチドのクローニング及び直接スクリーニングのために用いられる。
【００９９】
2つ以上のナノボディを含むマルチ特異性ポリペプチド
本発明の範囲は、上記に記載の単離ナノボディ又は前記をコードするヌクレオチド配列を含むだけでなく、他のポリペプチド（例えば血清タンパク質）と融合させた1つ以上のナノボディ又はそのフラグメントを含むより大きなポリペプチドもまた包含する。
そのような二特異性ポリペプチドは一緒に融合させた2つの別個の結合特異性を含み、もっとも単純な例では、単一標的抗原上の2つに隣接するエピトープと結合し、それによってアビジティーを高める。また別には、そのような二特異性ポリペプチドは、2つの別個の抗原を架橋することができ、強力な治療薬である。
マルチ特異性（三特異性、四特異性など）ポリペプチドは、一緒に融合させた3つ以上（3つ、4つなど）の別個の結合特異性を含み、もっとも単純な例では、単一標的抗原上の2つの隣接するエピトープと結合し、それによってアビジティーを高める。また別に、そのようなマルチ特異性ポリペプチドは、3つ以上の別個の抗原と架橋することができ、強力な治療薬（特に癌治療のための細胞傷害性T細胞の補充を目的とする）である。これらの多重特異性/マルチ特異性ポリペプチドは、EGRF及び少なくとも1つのさらに別の抗原/タンパク質を指向する多重特異性ポリペプチドについての出願人らによる国際出願PCT/BE2004/000159で全般的にさらに詳細に開示されているとおりである。
（a）所望の抗原を指向する少なくとも1つのナノボディ及び（b）対象動物の血清タンパク質を指向する少なくとも1つの結合パートナー（例えば少なくとも1つのさらに別のナノボディ）を含むポリペプチドは、前記対象動物の循環における半減期を、所望の抗原そのものを指向するナノボディの半減期と比較して顕著に延長することを本発明者らは示した（WO04/041865）。さらにまた、そのようなマルチ特異性ポリペプチドは、上記に記載したナノボディ自体の同じ有利な特性、例えばマウスで無傷であり続ける高い安定性、極端なpHに対する耐性、極端な温度での安定性、及び高い標的特異性及び親和性も示すことが見出された。
【０１００】
前記血清タンパク質は、対象動物の血清中で見出される任意の適切なタンパク質又はそのフラグメントであり得る。本発明のある特徴では、前記血清タンパク質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、タイロキシン結合タンパク質、トランスフェリン又はフィブリノゲンのいずれかである。前記対象動物は、例えばウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、サル、ロバ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、及び好ましくはヒトである。使用目的（例えば有効な治療に要求される半減期及び/又は標的抗原の局在化）に応じて、少なくとも1つのまた別の結合パートナーは、上記血清タンパク質の1つを指向することができる。
上記で触れたように、本発明の方法は、そのようなマルチ特異性構築物の部分として、及び/又はそのようなマルチ特異性構築物を構築するために用いることができる免疫グロブリン配列のクローニング及び直接スクリーニングのために用いることができる。前記免疫グロブリン配列は以下を含む（ただしこれらに限定されない）：2つ以上の可変ドメイン（又は抗原結合ドメイン）及び特にVHドメイン又はVHHドメイン； VL、VH又はVHHドメインのフラグメント、例えばCDR領域（例えばCDR3領域）；通常の4-鎖抗体の抗原結合フラグメント（例えばFabフラグメント及びscFv）、重鎖抗体及びドメイン抗体；及び特にVH配列、及び特にVHH配列。
好ましくは、本発明の別の特徴では、Igスーパーファミリー由来分子の重鎖の少なくとも部分から成るナノボディは、本発明の方法を必要とするプロセスの最終生成物であり得る。前記Igスーパーファミリー由来分子の重鎖の少なくとも部分は、CDR領域（の部分）、好ましくはCDR3領域（の部分）であり得る。前記ナノボディ又はそのフラグメントの最終生成物は一価、二価又はさらに高次の多価であっても、又は他のポリペプチドと融合若しくは結合して二特異性又はマルチ特異性ポリペプチドであってもよい。
【０１０１】
本発明は、可変抗体ドメイン（又は抗原結合ドメイン）、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、CDR領域、CDR3領域、より小さな抗原結合フラグメント（Fabフラグメント及びscFV）、軽鎖を欠く抗体、カメリド科の重鎖抗体、VHHドメイン（又はナノボディ）、カメリド化重鎖抗体、ドメイン抗体、及び重鎖抗体をクローニング又は生成する方法を開示する。
本発明の方法は、リンパ球様細胞の大きな集団内で、所望の特異性又は機能をもつ抗体を産生しているリンパ球収集物を同定し、続いてそのようなリンパ球から抗体の特異性をコードする遺伝情報を取り出すことを含む。本発明の方法はさらに、リンパ球様細胞の大きな集団内で、所望の特異性又は機能をもつ抗体を産生している単一リンパ球を同定し、続いて前記リンパ球から抗体の特異性をコードする遺伝情報を取り出すことを含む。この方法は、in vivo免疫応答で産生される高親和性抗体の製造を可能にする。
本発明の方法は、伝統的なハイブリドーマ法及びIgライブラリーで達成されるよりも極めて高い効率で、非常に高い親和性をもつ抗体の同定を可能にする。
本発明の方法は、免疫動物の抗原特異的B細胞からナノボディを含む治療用可変抗体ドメインを直接入手することを可能にする。この手法は、迅速なプロトコルであるというだけでなく、極めて稀な頻度で存在する可変抗体ドメインのクローニングもまた可能にするという点で有利である。
限定的な例として、本発明の方法によって直接入手される治療用ナノボディはまた、二価（多価）ナノボディ構築物を、二特異性（又はマルチ特異性）ナノボディ構築物同様に含む。
現存の抗体選別プロセスを凌ぐ本発明の方法の利点は、抗体は、しばしば機能的作用はほとんど示さないが高い結合親和性を示すことができるということである。本発明の方法は、結合能力及び機能的特徴の両方について同時にスクリーニングすることを可能にし、最適な抗体を産生する個々のB細胞の同定を可能にする。
【０１０２】
現存の抗体選別プロセスを凌ぐ本発明の方法の主要な利点は、多価抗体構築物の直接スクリーニングである。そのような構築物の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：互いに連結された2つの同一又は非同一抗体を含む二価構築物（リンカーを含むもの含まないもの）、標的に対する抗体及び血清タンパク質又は構築物の半減期を改善する任意の物質に対する抗体を含む二特異性構築物、又は標的に対する抗体及び別の抗体、又は別の機能的タンパク質ドメイン（例えば酵素、レセプター又はリガンド）を含む任意の他の構築物。
本発明者らは、多価構築物は、特定の標識、特にマルチマー抗原又は細胞表面抗原に対する一価構築物と比較して極端に改善された結合親和性を有することができることを以前に示した（例えば、WO04/041862、WO04/062551）。現存の抗体選別プロセスは、多価構築物の潜在能力増加に関する情報を提供しない。現存の抗体選別プロセスは、強力な抗体を選別する傾向があるが、しかしながらスクリーニング相では抗原結合特性の選別に一価の抗体フラグメントのみを使用する。個々の先導フラグメントの二価構築物への編隊再形成は、試行錯誤が基本であり成功率が低く面倒なプロセスである。
本発明の方法にしたがえば、個々のクローンは二価（又は多価）構築物又は酵素融合物として直接発現することができ、又は膜に直接融合される。本発明の方法は、選別系の偏り（例えばファージ又は他のディスプレー系で観察されるマルチマーディスプレーに関連する偏り）を生じることなく、いずれの応用に対しても適用可能な直接的スクリーニングを可能にする。これは、現存の抗体選別及びスクリーニング方法を凌ぐ顕著な改善である。
本発明は、免疫グロブリン遺伝子の完全な形態のクローニングに適用することができ、免疫応答の解析に有用である。本方法を用いて、同じペプチドを含有する抗原のいくつかの形態（例えば遊離ペプチド形、完全なペプチド、担体タンパク質に結合させたペプチドなど）に対する応答を解析することができる。
現存の抗体選別プロセスを凌ぐ本発明の方法のさらに別の利点は、現存のプロセスの範囲がタンパク質の選別に限られ、さらにまた結合以外の活性（例えば触媒活性または調節活性）について直接選別が可能ではないということである。本発明の方法は、結合能力、機能的特徴、生物学的活性及び希少B細胞活性についても直接スクリーニングすることを可能にし、最適な抗体を産生する個々のB細胞の同定を可能にする。
【０１０３】
方法
本発明の特徴にしたがえば、以下の工程を含む、少なくとも1つの抗原に対する免疫グロブリンをコードするか、又は少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードするヌクレオチド配列を有する核酸のクローニング方法が提供される：
（a）前記少なくとも1つの抗原で免疫した少なくとも1頭の動物、又は前記少なくとも1つの抗原でin vitroで免疫される少なくとも1頭の非免疫動物からB-リンパ球を入手する工程、
（b）前記少なくとも1つの抗原に対して特異性をもつ少なくとも1つのB-リンパ球を前記B-リンパ球から選別する工程、
（c）工程（b）で選別した前記少なくとも1つのB-リンパ球から核酸を入手する工程、ここで前記核酸は、前記少なくとも1つの抗原に対する前記免疫グロブリンをコードするか、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンの少なくとも一部分をコードし、
（d）前記核酸を増幅及び/又はクローニングし、前記少なくとも1つの抗原に対する前記免疫グロブリンをコードするか、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンの少なくとも一部分をコードする、増幅及び/又はクローニングされた核酸を入手する工程。
好ましくは、前記方法において、少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの前記少なくとも一部分は、免疫グロブリンの可変領域であり得る。
より好ましくは、前記方法において、少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの前記少なくとも一部分は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（VHドメイン）、すなわち適切な動物由来の、具体的には哺乳動物由来の、より具体的にはヒト由来の免疫グロブリンの重鎖可変領域（VHドメイン）であり得る。
特に、前記方法において、少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの前記少なくとも一部分は、重鎖抗体由来の免疫グロブリン重鎖可変領域（VHHドメイン）であり得る。この特徴では、前記少なくとも1つの抗原で免疫される動物はカメリドの1つの種、例えばラクダ、ヒトコブラクダ又はラマである。
特に、前記方法において、
【０１０４】
上記の方法で、工程（b）は、好ましくは前記少なくとも1つの抗原に対する親和性について前記B-リンパ球をスクリーニングし、さらに少なくとも1つの抗原に対する親和性を有する少なくとも1つのB-リンパ球を選別することによって実施される。
より好ましくは、工程（b）は、好ましくは固相に固定された少なくとも1つの抗原に対してB-リンパ球を選り分け、さらに前記少なくとも1つの抗原に対する親和性を有する少なくとも1つのB-リンパ球を選別することによって実施される。
さらにまた、上記方法の工程（c）で、前記少なくとも1つのB-リンパ球から得られる核酸は、好ましくはmRNAである。工程（d）の前に、前記mRNAはそれ自体公知の態様でcDNAに変換される。
工程（d）の増幅及びクローニングは、好ましくは以下の工程によって実施される：
（d1）フレームワーク4領域の3'-末端の遠位側に位置するポリ-A部位とハイブリダイズすることができる第一のプライマー及びフレームワーク1領域の5'-末端部位若しくは5'-末端に隣接する部位とハイブリダイズすることができる第二のプライマーを用いて増幅反応を実施して、免疫グロブリン配列の可変ドメインの少なくとも部分を含む核酸を生成する工程、
（d2）天然に存在する制限酵素部位を指向する制限酵素による切断によって、機能的可変ドメインの免疫グロブリンをコードする二本鎖DNAが生成される位置に存在する、前記制限酵素部位で二本鎖DNAを切断する工程、及び
（d3）前記のようにして得た二本鎖DNAを適切なベクターにクローニングする工程。
工程（d1）の前記増幅反応は、好ましくはPCRによって実施される。さらにまた、工程（d1）の増幅反応で用いられる第一のプライマーは、好ましくはオリゴ-dT配列を含む。
工程（d2）で、二本鎖DNAは、好ましくはBstEII制限酵素部位で切断される。
工程（d1）の増幅反応で用いられる第二のプライマーは、好ましくは少なくとも1つの酵素の制限部位をコードするヌクレオチド配列を有する。
さらにまた、工程（d3）において、工程（d2）で得られた二本鎖DNAは、好ましくは非発現ベクターにクローニングされる。
【０１０５】
上記の方法はまた以下の更なる工程を含むことができる：
（e）工程（d3）で得たベクターから、前記少なくとも1つの抗原に対する前記免疫グロブリンをコードするか、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードするヌクレオチドを有する核酸を単離する工程、ここで前記核酸は前記少なくとも1つの抗原又は少なくともその部分を指向する前記免疫グロブリンの可変ドメインを含み；さらに
（f）前記少なくとも1つの抗原又は少なくともその部分を指向する前記免疫グロブリンの前記可変ドメインを適切なベクターにクローニングする工程。
そのような場合、工程（f）で用いられるベクターは、好ましくは工程（d3）で用いられるベクターと異なり、より好ましくは発現ベクターである。
工程（f）のクローニングは、遺伝子スワッピング系（例えばエントリーベクターとしてベクターpAX056a及び到着先ベクターとしてベクターpAX056ｂ）の使用を含むことができる。前記の遺伝子スワッピング系は、例えばリコンビナーゼの使用を必要とする遺伝子スワッピング系でもよい。前記はいずれも当業者には明白であろう。
多価構築物（及び通常は二価構築物）として免疫グロブリン（又はそのフラグメントの一部分）を発現させるために、工程（f）で使用されるベクターは、前記少なくとも1つの抗原又は少なくともその部分を指向する前記免疫グロブリンの可変ドメインの発現に続いて、前記少なくとも1つの抗原又は少なくともその部分を指向する前記免疫グロブリンの可変ドメインが二価構築物として得られるようなものであり得る。そのような構築物の構築、クローニング及び発現は、本明細書の更なる開示によって当業者には明白となろう。例えば、工程（f）で、前記少なくとも1つの抗原又は少なくともその部分を指向する前記免疫グロブリンの可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の2つのコピーは、発現に続いて、前記少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンの2つの連結された可変ドメイン又はその少なくとも2つの部分の（場合によってリンカー配列を介して連結された）融合物を含む二価構築物を提供するベクターを提供するような態様で、前記ベクターでクローニングされる。
【０１０６】
本発明はまた、上記の方法によって入手される、少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンをコードするか、又は少なくとも1つの抗原を指向する前記免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードするヌクレオチド配列及び/又は核酸に関する。
前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、好ましくは、前記少なくとも1つの抗原に対する哺乳動物の免疫グロブリン、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する哺乳動物の免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードし、特に、前記少なくとも1つの抗原に対するヒトの免疫グロブリン、又は前記少なくとも1つの抗原を指向するヒト免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードする。より好ましくは、前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、前記少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくともVHドメインをコードする。
別の好ましい実施態様にしたがえば、前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、前記少なくとも1つの抗原に対する重鎖抗体、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する重鎖抗体の少なくとも1つの部分をコードする。より好ましくは、前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、前記少なくとも1つの抗原に対する重鎖抗体、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する重鎖抗体の少なくともVHHドメインをコードする。
上記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、好ましくはDNAの形態、特に二本鎖DNAの形態を有する。前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、例えばベクター（例えば発現ベクター又は非発現ベクター）の形態を有する。前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸はまた遺伝的構築物の形態を有する。
ある実施態様では、多価構築物の発現のために、前記ヌクレオチド配列及び/又は核酸は、好ましくは遺伝的構築物の形態を有し、前記構築物は、適切な態様で及び適切な発現系を用いて発現させたとき、前記少なくとも1つの抗原に対する少なくとも2つの免疫グロブリン、又は前記少なくとも1つの抗原に対する前記免疫グロブリンの少なくとも2つの部分を含む多価ポリペプチドを提供するようなものである。
【０１０７】
本発明はまた、少なくとも1つの抗原に対する免疫グロブリン、又は少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードする免疫グロブリンを入手する方法に関し、前記方法は、適切な態様で及び適切な発現系を用いて、上記に記載のヌクレオチド配列又は核酸を発現させる工程を含む。本発明はまた、前記方法によって入手される、少なくとも1つの抗原に対する免疫グロブリン、又は少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくとも1つの部分をコードする免疫グロブリンに関する。好ましくは、前記免疫グロブリンは、前記少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくともVHドメインを含むか、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する重鎖抗体の少なくともVHHドメインを含む。
本発明はまた、少なくとも1つのそのような免疫グロブリン及び少なくとも1つのさらに別のアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。例えば、そのようなポリペプチドは多価又はマルチ特異性ポリペプチドであることができ、前記は例えば、前記少なくとも1つの抗原を指向する免疫グロブリンの少なくとも2つのVHドメインを含むか、又は前記少なくとも1つの抗原を指向する重鎖抗体の少なくとも2つのVHHドメインを含む。
上記の方法は、工程（f）で得た非発現ベクターから単一のクローンを分離し、さらにそれらクローンから可変ドメイン免疫グロブリンをコードする核酸を発現ベクターでクローニングし、一価又は二価フォーマット（又はより高次の価数をもつ構築物）または酵素若しくは他のタンパク質ドメインと融合されたものの発現を可能にする更なる工程をふくむことができる。
【０１０８】
B-リンパ球の入手
本方法のある工程では、B-リンパ球は、天然に軽鎖を欠く免疫グロブリンを産生することができる動物から得られる（前記動物は対象の抗原で免疫されている）。そのような免疫及びB-リンパ球の調製方法は当分野では公知である。抗原は、免疫応答を誘引することができるいずれの対象物質でもよい。抗原には、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、核酸、合成ポリマー、小有機分子、2つ以上の前述の物質の組み合わせが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
B-リンパ球を得る方法は当分野で公知であり、実施例の節で具体的な実施態様が提供される。
本発明のある実施態様にしたがえば、末梢血単核球（PBMC）は、最後の免疫の後で前記動物の精製血及び場合によって組織から調製される。PBMCを得る方法は当分野では公知である。ある特徴にしたがえば、PBMCは、フィコール・パーク(商標)（Ficoll Paque(商標)）PLUS密度勾配（Amersham Biosciences）で前記動物の血液を遠心することによって入手される。本発明の別の実施態様にしたがえば、B-リンパ球はPBMCから回収される。そのような回収は、赤血球溶解、PBMCから単球の除去及びB-リンパ球を含む生成上清の使用、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清によるB-細胞の標識及びフローサイトメトリー及び/又は免疫学的に或いは密度改変粒子によるB-細胞の分類、B-細胞以外の全ての細胞のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗血清による標識及びフローサイトメトリー及び/又は免疫学的或いは密度改変粒子による非標識細胞の分類工程を含むことができる。
【０１０９】
免疫
多くの温血動物、例えばヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ又はブタを免疫して抗体形成細胞を得ることができる。しかしながら、マウス及びラットが、取り扱いの容易さ、遺伝的特徴がよく特定されていること、及びその生命を実験に供することが容易であるという事実のために一般的に好ましい。本発明で記載したナノボディの使用のためには、ラマを用いて抗体形成細胞を入手する。
動物を免疫する方法は当分野では周知である。簡単に記せば、抗体を作成しようとする動物に選択した抗原を注射する。その場合、選択抗原には上記で考察したようにアジュバント又はハプテンを付加し、免疫応答をさらに高めることができる。通常前記物質は、腹腔、皮下又は筋肉内若しくは血流に注射される。注射を種々の間隔で繰り返し、免疫応答は通常、所望の抗体の特性を検出する適切なアッセイを用いて血清中の抗体を検出することによってモニターされる。多数の抗体形成細胞は、免疫動物の脾臓及びリンパ節で見出される。したがって、いったん免疫応答が生じたら、動物を殺し、脾臓及びリンパ節を取り出し、当分野で周知の技術を用いて単細胞懸濁物を調製する。また別には、循環リンパ球を前記動物の血液から入手する。抗体形成細胞はまた、選択した疾患の経過中に該当細胞を生じた対象者から入手することができる。例えば、原因が不明の疾患（例えば慢性関節リウマチ）をもつヒトから抗体形成細胞を入手し、前記疾患の経過に対して影響を有するか又は病因因子の同定につながり得る抗体、又は疾患の発生に中心的に関与する体成分の同定に用いることができる。同様に、抗体形成細胞は、公知の病因因子（例えばマラリア又はエイズ）に起因する疾患を罹患した対象者から入手することができる。これらの抗体形成細胞は血液又はリンパ節に由来し得ると同様に、他の疾患をもつか又は正常な組織からも得ることができる。抗体形成細胞は、抗凝固剤（例えばヘパリン、クエン酸塩又はEDTA）と一緒に採集した血液から調製することができる。抗体形成細胞は、赤血球及び多形核細胞から標準的な工程（例えばFicoll-Hypaque PLUS（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden））を用いてさらに分離させることができる。抗体形成細胞はまた、固形組織（例えばリンパ節又は腫瘍）からEDTAの存在下で酵素（例えばコラゲナーゼ及びトリプシン）を用いて分離させることによって調製することができる。
抗体形成細胞はまたは、培養技術（例えばin vitro免疫）によって得ることができる。そのような方法の例は当分野では公知である。
【０１１０】
抗原特異的B-リンパ球の入手
本発明のその後の工程にしたがえば、抗原免疫動物の血液、場合によって組織から得たB-リンパ球は抗原結合能力によって選別される。免疫動物のB-リンパ球収集サンプルは、多様な抗体を含み、それらのいくらかは前記抗原と結合するが、他は結合しない。
ある実施態様では、前記収集サンプルは単一抗原特異的B-リンパ球を含む。
B-リンパ球の膜結合免疫グロブリンを介して又はアフィニティーマトリックスを介して対象の抗原と結合する細胞によるB-リンパ球選別方法を用いることによって、そのDNA及びmRNAが対象の抗原と結合する免疫グロブリンをコードするB-細胞セットを得ることができる。そのようにして得たB-細胞セットは、種々の親和性及びエピトープ特異性をもつ特定の抗抗原抗体の不均一な混合物を含み得る。
抗原特異的B-リンパ球の選別は当分野の任意の方法にしたがって実施することができる。具体的な実施態様は実施例で提供される。
本発明のある実施態様にしたがえば、抗原特異的B-リンパ球は、抗原を被覆した試験管、フラスコ又はプレートでB-リンパ球を選り分けることによって得られる。本発明のある実施態様にしたがえば、抗原特異的B-リンパ球は、抗原で被覆した磁性微小ビーズ（例えばDynalビーズ又はMACS）を用いてB-リンパ球を選り分けることによって得られる。表面結合又はビーズ結合B-細胞は、酵素的処理（例えばトリプシン又は他のプロテアーゼ処理）、二価陽イオンキレート剤（例えばEDTA）の媒体への添加、抗原と担体又は表面との間の物理的結合を破壊する物質（例えばDTT）の添加（還元性リンカーが使用されているとき）、別の抗原結合リガンドによる競合的置換、又はそれらの組み合わせによって、ビーズ又は表面から除去することができる。小粒子担体（例えば磁性微小ビーズが用いられる場合は、前記担体は、担体結合及び非結合B-細胞を分離させた後、担体結合B-細胞に結合したままにしてもよい。本発明の実施態様にしたがえば、分泌された免疫グロブリンは、アフィニティーマトリックス（B-細胞結合部分（例えば抗CD19又は抗CD45）及び免疫グロブリン結合部分（例えば抗ラマ免疫グロブリンFc）から成る）を介して供給源B-細胞の細胞膜上で捕捉される。本発明のある実施態様にしたがえば、分泌された免疫グロブリンは、細胞周囲の半固形アフィニティーマトリックス（例えばゲル微小滴被包化法（gel microdroplet encapsulation method）で用いられる）を介して供給源B-細胞近くで保持される。
場合によって、捕捉されたB-リンパ球は、それらが抗原と結合しているか否かをチェックするためにアッセイすることができる。そのようなアッセイは当分野で公知のアッセイのいずれでもよい。アッセイの例には、蛍光標識抗原を用いるフローサイトメトリーの使用、又はヤギ抗ラマポリクローナル抗体若しくは固相（例えばニトロセルロース又はPVDF）に固定した抗原を用いるELISPOT免疫グロブリン分泌アッセイが含まれる。B-リンパ球を被覆膜と接触させ、抗体を分泌させる。前記分泌された抗体は固相に固定され、例えばヤギ抗ラマポリクローナル抗体HRP結合物及び色原体を用いて検出することができる（図1参照）。
【０１１１】
4-鎖抗体及び重鎖抗体産生B-細胞の分離
場合によって、本発明の工程で、抗原結合B-細胞の選別の前又は後で4-鎖抗体産生B-細胞を重鎖抗体産生B-細胞から分けることができる。これは、重鎖抗体特異的試薬（陽性マーカーとして）又は通常抗体特異的試薬（陰性マーカーとして）を使用してB-細胞上に存在する膜結合免疫グロブリンを標識することによって達成することができる。前記試薬には、もっぱら重鎖抗体に結合する、VHHに対して作成されたポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、重鎖抗体（陽性マーカー）又は4-鎖抗体（陰性マーカー）のどちらかの重鎖と選択的に結合するポリクローナル若しくはモノクローナル試薬、又は4-鎖抗体にのみ存在する軽鎖と結合する試薬（陰性マーカー）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのようなポリクローナル又はモノクローナル抗血清を調製及び性状を決定する方法は当業者には周知である。上記で述べたそのような陽性及び陰性マーカーの検出に適した試薬の非制限的な例は、Daleyら（Clin Diag Lab Immunol 2005, 12:380）及びUS2002/0155604A1にそれぞれ提供されている。
そのような試薬を用いる4-鎖抗体産生B-細胞及び重鎖抗体産生B-細胞の分離は、選択試薬を固相（例えばプラスチック容器又は磁性ビーズ）上に被覆するか、又は選別試薬を蛍光標識しフローサイトメトリーにより重鎖抗体提示B-細胞を、陽性及び/又は陰性ゲート処理を基準に（細胞混合物を染色するために用いられる試薬のタイプに応じて）分類する選り分け技術を用いて達成することができる。現代の細胞分類装置で可能な多指標測定のおかげで、重鎖抗体産生B-細胞の分類は、蛍光標識抗原の結合についての陽性選別、死細胞の陰性選別、他のB-細胞の存在についての陽性選別、又は非B-細胞マーカー（例えばDavisらの文献（Vet Immunol Immunopathol 2000, 74:103）に記載されたようなもの）発現細胞の陰性選別などを都合よく組み合わせることができる。
【０１１２】
B-細胞のin vitro刺激
場合によって、本発明の工程で、抗原結合B-細胞の選別又は重鎖若しくは4-鎖免疫グロブリン産生B-細胞の分離の前又は後でB-細胞をin vitroで刺激することができる。B-細胞刺激は細胞当りさらに多くの免疫グロブリンmRNAの生成、クローン拡大に至る細胞の分裂、及び培養液中に遊離される可溶性免疫グロブリンの産生の強化をもたらす。mRNA含有量の増加及びクローン拡大はともに、より多くの鋳型が増幅のために利用可能となるので、RT-PCR又は同様な方法による免疫グロブリンコードmRNA配列の回収を簡単にする。
B-細胞の効率的なin vitro刺激のために種々の方法が記載されており、前記のいずれもカメリドのB-細胞の刺激に有効であり得る。Zublerと共同研究者ら（Wen et al. Eur J Immunol 1987, 17:887）は、刺激細胞/フィーダー細胞として変異EL4のサブクローン、EL4-B5のB-細胞培養における使用を記載した。Banchereauと共同研究者ら（Valle et al. Eur J Immunol 1989, 19:1463）は、フィーダー細胞として使用されるFc-ガンマレセプター発現線維芽細胞上で提示されているアゴニスト的抗CD40モノクローナルの使用を記載した。より最近では、CD40Lの組換え可溶性フラグメント（Hollenbaugh et al. EMBO J 1992, 11:4313；Mazzei et al. J Biol Chem 1995, 270:7025）と同様に、CD40Lトランスフェクト細胞株（Armitage et al. Nature 1992, 357:80；Spriggs et al. J EXP Med 1992, 176:1543）が刺激細胞/フィーダー細胞として用いられた。
これらの系でのB-細胞の刺激はまた外因性増殖因子の供給源を要求する。活性化T-細胞（カメリドB-細胞に対して同種又は異種起源の両方）によって先に条件付けした細胞培養媒体は、そのような因子の便利な供給源として用いることができる。最近、Odbilegらは、多くのラマのサイトカインのcDNA配列を同定し（Vet Immunol Immunopathol 2004, 102:93；Vet Immunol Immunopathol 2005, 104:145）、ラマのサイトカインの組換えタンパク質としての発現及び、十分には特定されていないT-細胞条件付け培養液の代替物として精製増殖因子の規定混合物のカメリドB-細胞培養での使用を実現可能にした。
【０１１３】
in vitro刺激B-細胞のスクリーニング
刺激B-細胞による可溶性免疫グロブリンの培養液中への遊離は、抗原特異的重鎖抗体の有無についてB-細胞培養の簡便なスクリーニングを可能にする。例えば、細胞から条件付け培養液を取り出すことによって前記条件付け上清を検査し、培養液に存在する免疫グロブリン濃度を定量するために構成した免疫アッセイで前記サンプルの全部又は部分を使用して、どの刺激培養が刺激に成功したB-細胞を含むかを明らかにすることができる。これによって、免疫グロブリン遺伝子クローニング方法のその後の工程で刺激に失敗したB-細胞培養を排除することができる。重鎖免疫グロブリンのみ又は4-鎖免疫グロブリンのみのどちらかを検出するように構成した免疫アッセイで同じ上清を使用することによって、どの培養がどちらのタイプの刺激B-細胞を含むかを明らかにできる。これによって、4-鎖免疫グロブリンを産生するB-細胞クローンをその後のクローニング方法から排除することができる（重鎖免疫グロブリンのクローニングのみが機能的なナノボディをもたらすからである）。重鎖免疫グロブリン特異的又は4-鎖免疫グロブリン特異的二次検出試薬を用いて抗原結合免疫グロブリンを検出するために構成した免疫アッセイで、B-細胞条件付け上清を使用することによって、どのウェルが抗原と結合する重鎖免疫グロブリンをコードする刺激B-細胞を含み、どのウェルが抗原と結合するが無関係の（4-鎖タイプ）免疫グロブリンを産生するB-細胞を含んでいるかを決定することができる。繰り返せば、そのようなスクリーニングアッセイの使用は、下流の免疫グロブリン遺伝子のクローニングを関係のあるB-細胞クローン（抗原特異的、重鎖免疫グロブリン産生細胞）に絞ることを可能にする。重鎖又は4-鎖免疫グロブリン選択的免疫アッセイのために要求される試薬は、入手可能であり上記（“4-鎖抗体及び重鎖抗体産生B-細胞の分離”）に記載したものと同一である。
【０１１４】
刺激B-細胞条件付け上清を入手する機会をもつことによってまた、所望の機能的特性を有する免疫グロブリン（例えば、レセプター/リガンド相互作用を中和することができる免疫グロブリン（この場合レセプター、リガンドのどちらかが問題の抗原である）、レセプター活性化に対してアゴニスト作用又はアンタゴニスト作用を有するナノボディを単離するときにはそのような作用を有する免疫グロブリン、高い抗原結合親和性を有する免疫グロブリン、又は酵素活性阻害ナノボディを単離しようと試みているときには酵素活性を阻害することができる免疫グロブリン）を産生するB-細胞クローンのスクリーニングが可能になる。そのような特性についてのスクリーニングは、B-細胞培養から採集した条件付け上清から単離した抗体で実施することができるが、通常はもっと簡便に条件付け上清自体で実施することができる。抗体含有溶液（例えばB-細胞条件付け上清）を上記に述べた活性タイプについてスクリーンニングする方法は当業者には公知である。非均一方法（例えばプレート、ビーズ若しくはマイクロアレーでの色原体、蛍光又は放射能測定免疫アッセイ及びバイオアッセイ）と同様に、均一アッセイ（例えばLANCE、Alphascreen又は共焦点画像化系（例えばABI's FMAT又はEvotech's Opera））も結合アッセイ及び活性アッセイに適している。親和性決定のための方法として、バイオアッセイ、表面プラスモン共鳴又はカンチレバーMEMS系装置とともにオフ-レート選択免疫アッセイ（Friguet et al. J Immunol Methods 1985 77:305）が非限定的な例として挙げられる。
上清分析の前に条件付け上清を対応するB-細胞から分離し、上清分析の間、全B-細胞を保存しておくことによって、もっとも重要なウェルのオリジナルB-細胞培養のみに存在するB-細胞全てを回収し、これらを用い下記に記載する方法にしたがってVHHコードmRNA配列を救済することができる。条件付け上清を取り出したB-細胞ペレットは、条件付け上清分析の間、哺乳動物の生細胞を保存するために適した媒体（すなわち10%DMSO含有細胞培養液）を用いて無傷の凍結細胞として、RNA保護細胞溶解溶液（すなわちTRIzol、Invitrogen）を用いて細胞ペレットを溶解することによって調製した凍結細胞溶解物として、又は細胞を溶解することなく室温又は室温以下でRNAを分解から保護できるように設計した緩衝液（すなわちRNAlater, Ambion）中で、種々の態様で保存することができる。
【０１１５】
mRNAの調製
本発明のその後の工程にしたがえば、RNAは抗原特異的B-リンパ球から単離される。得られたRNAは核酸収集物（B-リンパ球の選り分けによって動物の免疫レパートリーから既に選別されてある）であり、問題の抗原と結合する免疫グロブリンをコードするmRNAを含んでいる。したがって、前記mRNAの収集物は、はるかに少ない無関係の（すなわち標的を指向しない）免疫グロブリンのmRNAしか含まない。RNAを単離する方法は当分野で公知であり、TRIzol試薬（Invitrogen）及びグー（Gough）法（N.M. Gough, Anal Biochem 1988, 173(1):93-5）を含む。
従来の理解とは反対に、十分な量のRNAが抗原特異的B-リンパ球から入手することができ、抗原特異的なナノボディの不均一収集物が利用可能となるほどである（実施例を参照されたい）。
細胞からナノボディへの直接アンプリコン救済方法
組換えナノボディを製造するために、個々の抗原特異的重鎖免疫グロブリン産生B-細胞から、又は単一in vitro刺激B-細胞からクローンとして増殖させた遺伝的に同一のB-細胞サンプルから、重鎖免疫グロブリン可変領域をコードするmRNAセグメント配列を救済することが必要である。この方法は、どちらかのタイプのサンプルから全RNA又はmRNAを連続的に単離し、次に逆転写酵素によってmRNAをcDNAに変換し、最後に関連する遺伝子セグメントをPCR又は同様な方法を用いて増幅することによって実施することができる。これらの個々の工程を実施する方法は下記で詳述する。
しかしながら、最初の2工程又は3工程全てを、単一試験管形式で、すなわち問題の細胞からRNA又はmRNAを単離することなく実施することができる。適切な緩衝液中の逆転写酵素及びプライマーの反応混合物が入った容器に、細胞分類装置又はマイクロ操作装置を用いて個々の細胞又は多数の細胞を加え、PCR増幅のための鋳型として適合するcDNAを得ることができることは、当分野では周知である。このPCR増幅は別の試験管で、第一の反応で生成されたcDNAの全て又は一部分を用いて実施することができる（“二工程RT-PCR”）。さらにまた、１つの連続する反応シリーズとして、細胞で直接実施した逆転写反応と生成cDNAのPCR増幅を同じ試験管で一緒にまとめることもまた可能である（“一工程RT-PCR”）。そのような合体方法のための簡便で有効なキットは多くの供給業者から容易に入手することができ、前記の2つの例はCells-to-signal（Ambicon）及びSuperscript III One-step RT-PCRシステム（Invitrogen）である。そのような一工程又は二工程RT-PCRシステムでのcDNA合成及びPCR増幅のために必要なプライマーは、別個のRNA単離、cDNA合成及びPCR増幅工程から成る連続工程による方法について下記で説明するものと同一である。
【０１１６】
cDNAの合成
本発明のその後の工程にしたがえば、一本鎖cDNAが抗原特異的B-リンパ球から単離されたmRNAから合成される。その後、前記一本鎖cDNAから二本鎖DNAを調製することができる。cDNA及び二本鎖DNAの調製方法は当分野で公知であり、具体的な実施態様は実施例の節で提供される。
本発明のある実施態様にしたがえば、一本鎖cDNAは、オリゴ-dTプライマー又はランダムプライマー及び逆転写酵素（RT）反応を用いて調製される。RT反応は、公知の方法、例えば逆転写酵素又はそのための既製キットを用いて実施することができる。逆転写のDNA-RNAハイブリッド生成物を酵素（例えばRNAse H）で処理してRNAを除去することができる。このようにして生成した前記一本鎖cDNAを精製することができる。
【０１１７】
ナノボディ増幅
本発明のその後の工程にしたがえば、ナノボディ遺伝子収集物は、非発現ベクターにクローニングするためにある増幅反応でcDNAから増幅される。前記収集物は該当動物のサンプルレパートリーを代表するものではないが、その代わりに前記抗原を指向する免疫グロブリンのみの狭い不均一な混合物に絞られている。
本発明者らは、増幅は、オリゴ-dT配列をもつユニバーサル3'末端プライマー及びフレームワーク特異的5'末端プライマー（FR1プライマーとしてもまた知られている）（図19B）を用いて実施するべきであることを見出した。オリゴ-dTプライマーの使用は収集物中の遺伝子の多様性を高める。なぜならば、そのようなプライマーの使用は、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングに対して配列変動の依存性を低下させるからである（配列変動はアイソタイプ、ハロタイプの相違又は体細胞突然変異過程で導入される変異によって引き起こされ得る）。オリゴ-dTプライマーはまた、フレームワーク4（FR4）の3'末端に天然に存在するBstEII制限部位の利用を可能にし、逆転写又はPCR反応時に3'制限部位を導入する必要性を排除することができる（そのような導入はプライマーとその鋳型との効率的なハイブリダイゼーションに影響し、それによってそのようなオリゴのアニーリング効率を低下させる）。
オリゴ-dTプライマーは、FR4領域の末端から遠位部位でアニールする。前記の位置は、本発明者らの発見によれば免疫グロブリンコードcDNA配列のC-末端から100−200ヌクレオチド離れている（図19A）。付加的な非コードDNAによるそのような長いアニーリングは、DNA合成でエラーを引き起こすか、又は生成物のサイズの増加のために増幅効率を大きく低下させるであろうということが予想される。しかしながら、ナノボディ遺伝子セグメントを含む軽鎖欠如免疫グロブリン重鎖遺伝子の3'末端又は3'末端近傍に存在しないアニーリング部位を使用することによって、近傍のプライマーを用いる増幅と比較して、抗原特異的ナノボディのより大きな多様性が提供される。したがって、予想とは反対に、そのような遠位に位置するポリ-Aプライミング部位は、当業者が予想するよりも良好な結果を提供する。
他の適切な増幅技術及びプライマーは当業者には明白で、例えば欧州特許0368684号に記載されている方法及びプライマーが含まれる。
フレームワーク領域特異的FR1プライマーは、FR1領域の直ぐ上流のリーダー配列内部又はリーダー配列とアニールする（図19B）。本発明のある特徴にしたがえば、フレームワーク特異的プライマーはFR1の少なくとも最初のヌクレオチドとアニールする。本発明のまた別の特徴にしたがえば、フレームワーク特異的プライマーは、FR1の少なくとも最初のヌクレオチドの増幅を可能にする。本発明のまた別の特徴にしたがえば、フレームワーク特異的プライマーはFR1内部でアニールする。SfiI及びNcoIを取り込んだ5'-末端プライマーの例は下記の表に提供されている。
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
固有の制限部位が、ヒト又は他の哺乳動物由来の工程の重鎖可変領域内の3'末端近くに存在することが見出された（図19A及び19B）。前記は一般的にはFR4領域の3'末端近くに位置する。そのような制限部位は、3'末端プライマー内に制限部位を要求することなく、増幅させたナノボディ遺伝子のクローニングを可能にする。本発明のある実施態様にしたがえば、前記固有の制限部位はBstEIIである。いったん入手したら、増幅DNAを発現能力のないベクターにクローニングし、抗原特異的ナノボディ遺伝子の安定的な収集物を入手することができる（好ましくは保存のために）。
また別の選択肢として、クローニング及び適切な宿主の形質転換を必要としない、無細胞タンパク質発現系（in vitro翻訳としても知られている）でナノボディ遺伝子の直接発現を可能にするプライマーを用いることができる。これらのプライマーは、ナノボディ遺伝子の3'又は5'末端に以下の1つ以上の調節エレメントを付加することができる：プロモーター及びターミネーター配列、リボソーム結合部位配列（例えばKozak配列、シャイン-ダルガーノ配列）及び翻訳開始及び停止コドン。
【０１２０】
非発現ベクターへのクローニング
続いて無細胞系、原核細胞又は真核細胞宿主細胞でタンパク質発現を提供する能力がないベクターに抗原特異的ナノボディ遺伝子の収集物をクローニングすることは、本発明の1つの特徴である。本発明の非発現ベクターは、その中でクローンニングされた遺伝子をタンパク質として発現することができない任意のベクターである。そのようなベクターは当分野で周知である。非発現ベクターへの具体的なクローニングの実施態様は実施例の節で提供される。非発現ベクターの使用は、漏出性発現ベクターにより生じる細胞の異常が発生する機会がないので、より安定的に保存されるクローンを提供する。したがって、ある抗原を指向するナノボディをコードする遺伝子収集物を長期間保存し得る。本発明では、非発現ベクターの使用はまた、そのようにして入手された収集物のサイズ及び多様性を高めることが見出された。
発現ベクターへのクローニング
本発明の別の実施態様にしたがえば、ナノボディ遺伝子の発現を所望するときは、上記に記載の収集物からナノボディ遺伝子を含むただ1つの非発現ベクターを分離し、その中のナノボディ遺伝子を発現ベクターに移す。したがってその結果、1つのナノボディの発現を指令する1つのナノボディ遺伝子が発現ベクターにクローニングされる。そのような工程を実施する手段及びそのためのベクターは当分野では周知である。クローニング方法には遺伝子の制限処理及び連結又は遺伝子スワッピングが含まれる。具体的な実施態様は実施例の節で提供される。
本発明のある特徴にしたがえば、対象のナノボディクローンがその中に存在する前記分離された非発現ベクターは、リコンビナーゼ酵素を用いるナノボディ遺伝子の移転を可能にするクローニング系の部分である。前記系は、非発現ベクター内にクローニングされてある遺伝子とフランキングする核酸配列及び交換配列の発現ベクター内の存在を必要とする（図16）。遺伝子の移転はリコンビナーゼ酵素によって促進される。そのような系は、必要に応じて又は必要とされるときに、クローニングされた遺伝子の発現ベクターへの簡便な移転を可能にする。そのような非発現/発現ベクター系には、pAX056a/pAX056ｂ（図2）、Gateway(商標)システム（Invitrogen）、及びCre-lox BD Creator(商標)システム（BD Biosciences）が含まれる。他のそのような系も本発明の範囲内である。そのようなリコンビナーゼ系を用いることによって、個々のナノボディコード遺伝子の移転は高処理形式で、しかしより重要なことには、二価（多価）又は二特異性（マルチ特異性）フォーマットで実施することができる（それらは遺伝的に融合され、そのでなければ実現可能な態様で入手することができない）。
【０１２１】
in vitroアッセイ
非発現ベクターにクローニングされたナノボディ遺伝子収集物では、抗原によるB-リンパ球選り分けを介してB-リンパ球が濃縮されているために抗原特異的ナノボディが高度に濃縮されている。したがって、結合についてアッセイする必要はない。しかしながら、確認が必要な場合には、ナノボディ遺伝子は、非発現ベクター収集物からいったん分離し、発現ベクターにクローニングしたら、前記遺伝子を発現させ、前記抗原に対する結合親和性を決定するためにアッセイすることができる。そのようなアッセイは当分野では周知であり、ELISA、他の抗原固定固相アッセイ又は均質結合アッセイが含まれる。
本発明者らは、適切な免疫グロブリンをB-リンパ球段階で予備選別することによって、より多様な高親和性抗体が見出されるだけでなく、クローニング後に一価のナノボディのスクリーニングが回避されることを見出した。むしろ、各ナノボディは、治療を目的とする応用に適した形式で個々にスクリーニングすることができる。したがって、本方法は時間を短縮し、高価な高処理自動化又はアレー型スクリーニング技術に投資する必要を排除するが、より重要なことには、治療的な使用に最適なフォーマット（しばしば多価構築物である）でナノボディをスクリーニングすることを可能にする。これらの小規模発現から得られるナノボディ生成物は、直接バイオアッセイ又はレセプター結合アッセイでスクリーニングして、もっとも強力な先導分子を同定することができる。
更なる発現及び検査
ナノボディ候補物質（先導物質）の配列を決定し、それらに対応するヌクレオチドを大規模なナノボディ製造に適したベクターで用いることができる。いったん十分な量のナノボディを入手したら、各ナノボディを更なるアッセイ（例えば安定性、親和性及び毒性アッセイ）で検査することができる。
改変
本発明の更なる実施態様にしたがえば、本発明にしたがって入手したナノボディの配列情報及び生化学データを用いて、人工的（すなわち天然には存在しない）配列をもつナノボディが生成される。
配列に対する改変には、DNA配列のコドン使用頻度の最適化、結合部位の最適化、及び配列のヒト化が含まれる。
上記に記載した改変は当分野では公知である。
【０１２２】
実施例
実施例1：EGFR抗原によるラマの免疫
獣医学部倫理委員会（University Ghent, Belgium）の承認を得た後、現今の全ての動物愛護規則にしたがい4頭のラマ（024、025、026及び027）を表皮増殖因子レセプター（EGFR）で免疫した。抗体依存免疫応答を生じさせるために、2頭の動物（024及び025）にヒトの完全な類表皮癌細胞（A431; ATCC CRL 1555；D.J. Giard, S.A. Aaronson, G.I. Todaro P. Arnstein, J.H. Kersey, H. Doski, W.P. Parks, 1973, In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors., J Natl Cancer Inst 51:1417-1423）を、一方、A431由来膜抽出物を他の2頭のラマ（026お呼び027）に注射した（前記細胞は、その細胞表面にほぼ1.2ｘ106のEGFR分子を発現している）。各動物に1週間の間隔で抗原を7回皮下に投与した（表9）。
【０１２３】
表9：免疫スケジュールと免疫ラマの組織収集物
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【０１２４】
完全な細胞で免疫するときは、各投与量は新しく採集した108のA431細胞から成っていた。膜抽出物による免疫のための投与量は108のA431細胞から調製した小胞から成っていた。小胞はCohenと共同研究者にしたがって調製した（S. Cohen, H. Ushiro, C. Stoscheck, M. Chinkers, 1982, A native 170,000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. J Biol Chem 257:1523-31）。小胞は、投与前に-180℃で保存した。2回の追加注射（アジュバントStimune（CEDI Diagnostics B.V.）との乳濁液中に8マイクログラムの精製EGFR）をラマ025の筋肉内に投与した（表1）。
【０１２５】
実施例2：ラマで誘発された免疫応答の判定
0日目、28日目及び42日目に、10mLの(前)免疫血を収集し、血清を用いて4頭の動物における免疫応答の誘発を判定した。最初のELISAを実施し、前記動物が、A431細胞上に存在するエピトープを認識する抗体を生成しているか否かを確認した。組織培養処理96ウェルプレートを、PBS（150mMのNaCl；50mMのリン酸ナトリウム、pH7.4）中の0.5%（w/v）ゼラチンで10分間被覆した後、過剰のゼラチンを除去し、A431細胞をウェル中で一晩増殖させてコンフルエントにした。細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで30分間室温にて固定した。その後、固定液をPBS中の100mMグリシンで10分間ブロッキングし、続いて4%の脱脂乳-PBS溶液で前記ウェルを再び10分間ブロッキングした。免疫動物の血清希釈物を利用し、ウサギで作成したポリクローナル抗ラマ抗血清、続いて二次ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HPR）結合物（Dako）を用いて、A431特異的抗体を検出した。基質として、21mLのABTS 2,2-アジノ-ビス(3-エチルベンゾ-チアゾリン-6-スルホン酸)-緩衝液中の35%H2O2-溶液の36μLを適用した。ABTS緩衝液は、50mMのクエン酸塩溶液（pH4）1リットルにつき222.22mgのABTSから成っていた。比色反応は、405nmでの光学密度（OD）として分光光度計により定量した。4頭全ての動物について、完全な細胞または膜小胞による免疫は顕著なA431-反応性抗体力価の誘発をもたらした（図3）。
誘発されたラマ抗体がEGFR特異的か否かを確認するために、ヒトEGFRを安定的に発現しているマウス線維芽細胞、Her14（A.M. Honegger, T.J. Dull, S. Felder, E. Van Obberghen, F. Bellot, D. Szapary, A. Schmidt, A. Ulrich, J. Schlessinger, 1987, Point mutation at the ATP binding site of EGF receptor abolishes protein-trypsine kinase activity and alters cellular routing. Cell, 51:199-209）と親のマウス線維芽細胞株NIH3T3クローン2.2（3T3）で血清中の抗体力価を上記の記載と同様に判定した。繰り返せば、Her14細胞と反応する抗体の血清力価は、親の3T3細胞に対する力価と比較して高く、免疫後の循環血清抗体はEGFR特異的であることを示した（ラマ024及び025については図4A；ラマ026及び027については図4B）。
最後に、全ての免疫動物における血清応答を精製EGFR被覆固相で確認した。精製EGFR（Sigma）及び癌胎児性抗原（CEA, Scripps）（両者とも1μg/mL）を96ウェルのマキシソープ（Maxisorp）プレート（Nunc）に4℃で一晩固定した。ウェルをPBS溶液中の1%カゼインで2時間、室温でブロッキングし、PBSで洗浄した。血清希釈物を添加後、ウサギ抗ラマ抗血清を用いて特異的に結合した免疫グロブリンを検出した。ヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ結合物（Sigma）を適用し、さらにELISA緩衝液（1.1Mジエタノールアミン；1mMのMgSO4；pH9.8）1mLにつき2mgのp-ニトロフェニルホスフェート（Sigma）基質を用い、比色反応は405nmでのODとして分光光度計により測定した。EGFRに対する顕著な液性免疫応答がラマ024、025（図5A）、026及び027（図5B）で誘発された。
【０１２６】
実施例3：B-リンパ球の入手
適切な免疫応答がラマで誘発されたとき（最後の抗原注射から4日後）、150mLの血液サンプルを採集し、末梢血単核球（PBMC）をFicoll-Paque(商標)PLUS（Amersham Biosiences）で密度勾配遠心によって精製した。典型的には、150mLの血液サンプルから約108のPBMCが単離された。抗体産生細胞のまた別の供給源として、リンパ節、脾臓又は骨髄（の生検標本）を採集した。一緒に精製された赤血球は、フィコール（Ficoll）精製白血球を20mLの溶解緩衝液（8.29g/LのNH4Cl、1.09g/LのKHCO3及び37mg/LのEDTA）にRTで懸濁し、その後直ちに200gで10分の遠心工程を実施することによって溶解させた。赤血球の溶解後、単球は、70mLのRPMI（Invitrogen）（10%ウシ胎児血清（FCS）、Glutamax(商標)、Hepes（25mM）、ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen）及び0.38%クエン酸ナトリウムを補充）に残存細胞を再懸濁することによって枯渇させた。T150組織培養フラスコで37℃、5%CO2で2時間インキュベートした後、B-リンパ球を含む上清部分を回収し、細胞を数えた。典型的には細胞の25から50%がこの手順で失われた。
【０１２７】
実施例4：EGFR特異的B-リンパ球の入手
EGFR特異的B-リンパ球は、実施例3のEGFR（精製レセプターを用いるか又は細胞外ドメインに由来する）に対するB-細胞の選り分けによって入手した。B-細胞の選り分けの前に、6ウェルの培養プレート（Costar）を、濃縮EGFレセプター分画としてA431細胞膜由来小胞（5μg/mL）2mLとともに4℃で一晩インキュベートした。2.5−5ｘ107の単球枯渇細胞をクエン酸ナトリウム補充培養液に再懸濁させた。抗原を被覆した6ウェルにほぼ107の細胞を適用し、37℃、5%CO2で2時間インキュベートした。未結合細胞をPBSで6回洗浄することによって除去した。続いて、リガンド結合部位又はオーバーラップするエピトープについて競合する過剰の分子を用いてRTで1時間競合させることによって、抗原結合B-細胞を溶出させた。このエピトープ特異的溶出に用いた分子は、EGFRリガンドEGF及びTGF-α、マウスモノクローナル抗体（mAb）2e9又はEGFRアンタゴニスト抗体225及び528であった（JD Sato, T Kawamoto, AD Le, J Mendelsohn, J Polikoff, GH Sato, 1983, Biological effects in vitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors． Mol Biol Med 1：511-529）。mAb2e9はEGFRレセプターを介して細胞に内在化することができ、レセプターを活性化しない（LH Defize, WH Moolenaar, PT van der Saag, SW de Laat, 1986, Dissociation of cellular responses to epidermal growth factor using anti-receptor monoclonal antibodies. EMBO J, 5:1187-1192）。EGFRアンタゴニストmAb225及び528はEGFR上のリガンド結合部位をブロッキングすることができ、レセプター活性の低下をもたらす。典型的には、104から105の細胞がB-細胞選り分け後に回収された。
抗原の固相固定に代わって、抗原を磁性ビーズに直接（共有結合による）又は間接的に結合させ（Dynabeads, Dynal又はMACS, Miltenyi Biotech）、その後の選り分けに用いることができる。細胞の選別に磁性ビーズを用いるときは、細胞及び過剰の抗原被覆ビーズを4℃で10分間インキュベートする。場合によって、未結合ビーズは細胞を培養液で洗浄することによって前記混合物から除去することができる。次に、ビーズ標識細胞、非標識細胞及び未結合ビーズの混合物が入った容器を強力な磁石に接近させる。この磁石システムは静止していても動いていてもよく、例えば、液流を抑制するために、したがって磁石との接触を長引かせるために不活性な物質を充填したカラムから混合物を流出させるものであってもよい。磁性ビーズ標識細胞は磁石によって保持され、一方、非標識細胞は、静止系ではピペットで液相を排出することによって、又は動的系では、非標識細胞をカラムから流出させることによって、及び/又はカラムの上端に過剰の培養液を添加することによってカラムからフラッシュ洗浄することによって、磁石固定ビーズから取り除くことができる。ビーズ標識細胞は、磁性ビーズを含む容器又はカラムを磁石から離し、ビーズ標識細胞を再懸濁させるか、又は培養液を用いてカラムからフラッシュ洗浄することによって回収することができる。
【０１２８】
実施例5：RNAの調製
溶出させたB-細胞を採集してペレットにし、1mLのTRIzol試薬（Invitrogen）に再懸濁し、続いて製造業者のプロトコルにしたがって全RNAを抽出した。細胞結合磁性ビーズの存在は溶解及びその後の精製工程を妨げないが、TRIzolホモジネートが入った容器を磁石に近づけ、ピペットでビーズを含まない液体を磁石に保持されている磁性ビーズペレットから新しい容器に移すことによって除去してもよい。
実施例6：少数の細胞を用いたmRNAの試験的抽出及びcDNA合成
少数の細胞からRNAを確実に抽出することができるか否かを決定するために、以下の2つの方法を用いてRNAを調製する試験的な実験を行った：TRIzol試薬（Invitrogen）及びGough法（NM Gough, Anal Biochem, 1988, 173(1):93-5）。107、106、105又は104のLS174T細胞のいずれかの同一のペレットから出発し、両方法を平行して用いてRNAを抽出した。TRIzol法を用いることによって、104細胞で、分光光度計を用いて確実に濃度を決定するために十分なRNAが得られるが（図6；表10）、一方、Gough法でははるかに少ない材料しか得られないことが判明した。
【０１２９】
表10：少数細胞のRNAの単離
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さらにまた、非常に少量の前記RNAからPCR鋳型級の十分に大量のベータ-アクチンcDNAを合成することができた（図7）。
実施例7：cDNAの合成
全RNAの完全なサンプルを、RT-PCR用SuperScript(商標)III第一鎖合成システム（Invitrogen）を製造業者の推奨にしたがって用い、オリゴ-dT又はランダムプライムcDNA合成のために用いた。次いで、QIAquick(商標)PCR精製キット（Qiagen）による精製の前に、cDNAをRNAseHで処理して残留するRNAを除去した。
実施例8：ナノボディの増幅
精製cDNAを鋳型として用いて、抗原濃縮B-細胞プールに由来する重鎖抗体（VHH）の可変ドメインをコードする遺伝子セグメントの収集物を増幅させた。単一免疫グロブリン特異的プライマー及びオリゴ-dTプライマーの組み合わせを用いる増幅方法（特許出願WO03/054016に記載）によって、フレームワーク1（FR1）の5'末端にSfiI制限部位が導入された。これによって、約1.6kbのフラグメント（通常のIgGを表す）及び1.3kbのフラグメント（重鎖IgG）が得られ、これらは1.5%アガロースゲル電気泳動で分離することができる。
【０１３０】
実施例9：非発現ベクターへのクローニング
BstEII制限部位はFR4に天然に存在し、したがってPCR増幅VHH収集物は、非発現“エントリー”ベクターpAX056a中のSfiI-BstEIIフラグメントとして連結された。この“エントリー”ベクターは、マルチクローニング部位を導入することによってGateway(商標)システム（Invitrogen）のpENTR2Bベクターから誘導される（前記マルチクローニング部位は、位置特異的組換えに必要なフランキングしている遺伝的エレメントを破壊することなくSfiI-BstEIIをクローニングすることを可能にする）。この方法にしたがい、我々は、抗原濃縮B-細胞プールから得られたVHHの非発現収集物を入手した。この非発現収集物からランダムにコロニーを採取することによって、我々は、ほぼ350−400bpのサイズをもつ挿入物の存在について個々のPCRによりスクリーニングすることができた。そのようなクローンは少なくとも24ヶ月の間安全に保存された。
実施例10：発現ベクターへのクローニング
Gateway(商標)システムは、多数のベクター系に対し遺伝子セグメント（前記セグメントは、陽性選別マーカーと結合させた特異的な組換え配列にフランキングしている）の迅速で極めて効率的なスワッピングを可能にし、簡便なサブクローニングを可能にする。したがって、プラスミドはpAX056a中の個々のナノボディから調製され、個々の“エントリー”クローンと“到着先”ベクターpAX056bとの間の一連の平行した組み換え反応のインプット材料として用いられる（前記はGateway(商標)LRクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen）を用い製造業者のプロトコルにしたがって実施される）。この組換え反応に続いて、pAX56b構築物中のVHHによる大腸菌WK6の熱ショック仲介形質転換がもたらされる。pAX056bは、VHHをHis6-及びc-Myc-タグ付加融合タンパク質として大腸菌の細胞質間隙での発現を可能にする。漏出性発現のために、各培養の上清を用いて抗原結合についてELISAでスクリーニングすることができる。この方法にしたがい、Her14と3T3でのシグナルを比較する細胞ELISAで、個々のクローンのほぼ30%がEGFR特異的VHHを発現することが示された。
この方法は、非発現ベクターと機能的スクリーニングのために選択した最適化Gateway(商標)適合ベクターとの間でのVHHの効率的スワッピングを可能にする。そのような到着先ベクターの例は、多価構築物としてのナノボディの再クローニングを可能にする発現ベクターである。
この系では、多数のフランキングする特異的な組換え部位を有するエントリーベクターの使用が、二価の遺伝的に融合されたナノボディの構築をただ1つの工程で可能にし、したがって、高処理態様で多数のクローンを発生させることを可能にする。この方法を用いて、極めて強力なアンタゴニストEGFR抗体が二価フォーマットで同定された。さらにまた、抗EGFRナノボディと抗アルブミンナノボディとの融合が得られ、それによって、アルブミン結合がEGFRレセプターとの結合に影響を与えないナノボディの同定が可能になった。
【０１３１】
実施例11：マウスでのコラーゲン結合脾細胞の試験的選別及びcDNA調製
2匹のマウスをコラーゲンで免疫した。最後のブースター免疫後に前記マウスから脾臓を取り出した。ほぼ1.4ｘ108脾細胞を得た。単球を枯渇させた後、残存する細胞数は1.1ｘ108であった。
抗原選別
ほぼ108の単球枯渇PBMCを抗原選別に用いた。プレートをコラーゲンで被覆し、単球枯渇脾細胞とともにインキュベートし、十分に洗浄して未結合細胞を除去した。約5000細胞がプレートに結合したままであった。RNAをこれらの選別細胞から単離し、前記RNAからcDNAを調製した。cDNAのVカッパPCRによって、通常の4-鎖抗体形成B-細胞の抗原選別後に免疫グロブリンの可変遺伝子セグメントの増幅が成功していることが示された（図8）。
実施例12：ビオチニル化C1qを抗ビオチンMACSビーズとともに用いるヒトC1qタンパク質の選別
ラマ40をヒトC1qタンパク質で免疫した。最後のブースター免疫の後、PBMCを調製し、-80℃で凍結した。融解及び洗浄後にほぼ3ｘ107の生存PBMCを入手した。ほぼ1.3ｘ107細胞が単球枯渇後に残存した。
約1.2ｘ107の単球枯渇PBMCを、MACS（Miltenyi Biotec）を用いる抗原選別に使用した。MACS抗ビオチン予備被覆ビーズをビオチニル化C1qと一緒にインキュベートし、洗浄して未結合ビオチニル化C1qを除去し、さらに単球枯渇PBMCと一緒にインキュベートした。細胞を洗浄した後、QuadroMACS磁石内にしっかりと収納したLDモデルカラムを用いてビーズ標識及び非標識細胞を分離した。分離後、選択的にヒトC1qタンパク質と結合した約5ｘ105（4％）の単球枯渇PBMCを入手し、前記からcDNAを調製した（図9及び10）。
実施例13：MACSビーズ、Dynalビーズ又はプレートによるHuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質の選別
ラマ045をヒトCD28/ヒトIgG1融合タンパク質で免疫した。最後の免疫の後でPBMCを調製し、約108の細胞が得られた。7.6ｘ107細胞が単球枯渇後に残存した。
約2.2ｘ107の単球枯渇PBMCを、MACSビーズ（Miltenyi Biotec）を用いる抗原選別に使用した。抗ヒトIgG1抗体で予備被覆したMACSビーズを、CD28/IgG1融合タンパク質溶液中で単にビーズをインキュベートすることによってCD28/IgG1融合タンパク質で被覆した。次いでビーズを洗浄し、さらに非免疫動物の熱不活化ラマ血清の存在下で細胞と緊密に接触させた。この血清によるインキュベーションは、ヒトIgG1のFcとラマリンパ球のFcレセプターとのあり得る相互作用を効率的にブロッキングし、免疫ラマ血清を用いたときに起り得る可溶性ラマ抗体によるCD28エピトープのマスキングを全く生じさせない。血清の熱不活化はラマ血清の補体により駆動される細胞溶解を完全に防止する。10分間のインキュベーション後に、過剰のビーズを簡単な洗浄工程によって除去し、QuadroMACS磁石内に保持されているLDカラムに標識し洗浄した細胞を通すことによって、非標識細胞からビーズ標識細胞を分離させた。分離後、HuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質と結合した約1.1ｘ104（0.5/mL）の単球枯渇PBMCが、磁石からカラムを取り外した後でカラムから得られた。前記細胞から全RNA及びcDNAを調製した（図11、12及び13）。
約2.2ｘ107の単球枯渇PBMCを、DynalM450/トシル抗原結合ビーズを用いる抗原選別に使用した。トシル表面活性化DynaビーズをHuCD28/IgG1融合タンパク質で被覆し、牛乳カゼインで処理し、更なるタンパク質の共有結合をブロッキングし、磁石を用いて繰り返し洗浄して遊離タンパク質を除去し、単球枯渇PBMCと緊密に接触させた。4℃で10分間のインキュベーション後に、Dynal磁石を用いて非標識細胞からビーズ結合細胞を分離させた。ビーズを分離し培養液を用いて繰り返し洗浄した後、選別されたビーズ-細胞複合体の小量を、トリパンブルー及び血球計算板による計測のために取り出した。HuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質と選択的に結合した、約3ｘ105（1.5%）の単球枯渇PBMCが得られた。前記から、TRIzol中で細胞-ビーズ複合体を溶解することによってRNA及びcDNAを調製した（図11、12及び13）。
平行して、約2.2ｘ107の単球枯渇PBMCを抗原被覆プレートでの抗原選別に使用した。プレートをHuCD28/IgG1融合タンパク質で被覆し、上記に記載したように熱不活化ラマ血清の存在下でプレート結合細胞を選別した。約5ｘ104（2.5/mL）のHuCD28結合細胞が選別された。ウェル中でTRIzolにより溶解することによって、前記細胞からRNA及びcDNAを調製した（図11、12及び13）。
CD28/Fc-ガンマ選別及び非選別ラマB-細胞集団の抗原結合ナノボディクローンのパーセンテージは表11に提示されている。
【０１３２】
表11：CD28/Fc-ガンマ選別及び非選別ラマB-細胞集団の抗原結合ナノボディクローンのパーセンテージ
2008528010.tif 000012
非発現ベクターにクローニングしさらにGateway(商標)により個々の発現ベクターに再クローニングした、Dynal選別B-細胞の抗原結合ナノボディクローンのパーセンテージは表12に示されている。
【０１３３】
表12：非発現ベクターにクローニングしさらにGateway(商標)により個々の発現ベクターに再クローニングしたDynal選別B-細胞の抗原結合ナノボディクローンのパーセンテージ
2008528010.tif 000013
*Gateway(商標)アクセプタープラスミドにおける自殺遺伝子の欠如及び抗生物質耐性による二重選別から推論された。
【０１３４】
実施例14： MACSビーズ、Dynalビーズ又はプレートでの選別を用いるヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質の選別
ラマ043をヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質で免疫し、最後の免疫後にPBMCを調製した。ほぼ108の非粘着性細胞を回収した。前記単球枯渇細胞を大雑把に均等な4部分に分割し、そのうちの1つを参考サンプルとして取り置き、3つを3種の平行的な抗原選別に用いた。
約2ｘ107の単球枯渇PBMCを、MACS（Miltenyi Biotec）を用いる抗原選別に使用した。抗ビオチン予備被覆MACSビーズを、ビオチニル化タンパク質溶液中で4℃にて一晩ビーズをインキュベートすることによってビオチニル化アルファ-v-ベータ-5インテグリンで被覆した。単球枯渇細胞懸濁物を前記抗原被覆ビーズと混合しこれらビーズを15分4℃で一緒にインキュベートする前にビーズを洗浄することにより過剰のアルファ-v-ベータ-5インテグリンを除去した。次いで細胞を洗浄し、QuadroMACS磁石内に設置したLDカラムを製造業者（Miltenyi Biotec）の指示にしたがって用いビーズ結合細胞を選別した。分離後、選択的にヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質と結合した約2.56ｘ105（1%）の単球枯渇PBMCが得られた。前記からRNA及びcDNAをビーズ/細胞複合体をTRIzol試薬中で溶解することによって調製した（図14及び15）。
平行して、約2ｘ107の単球枯渇PBMCの別の少量を、Dynal M450/トシル抗原結合ビーズを用いる抗原選別に使用した。予備活性化させたDynalビーズをヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質で共有結合により被覆し、残存する自由な結合部位を製造業者が提供したプロトコルを用いてブロッキングした。細胞を被覆ビーズと混合し、4℃でインキュベートし、続いてDynal MPC-S磁石内に置いた。溶液をピペットで取り出し、一方ビーズ及びビーズ結合細胞は試験管の壁に磁石によって固定されたままにすることによって、ビーズ結合及び非結合細胞を分離させる。試験管に保持されたビーズ/細胞塊を繰り返し新しい細胞培養液に再懸濁させ、さらに磁石を用いて再抽出して非結合細胞及び弱く結合している細胞を除去した。最後の洗浄後、ヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質と結合した約2.56ｘ105（1%）の単球枯渇PBMCが得られた。前記から、TRIzol中でビーズ/細胞複合体を溶解することによってRNA及びcDNAを調製した（図14及び15）。
平行して、約2.2ｘ107の単球枯渇PBMCの第三の少量をプレートによる抗原選別に使用した。グレイナー（Greiner）の6ウェル組織培養プレートをヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質溶液で一晩被覆し、その後、前記溶液を除去し、ウェルを新しい細胞培養液を用いて洗浄した。続いて全ての6ウェルに単球枯渇細胞の懸濁液を分配しCO2インキュベーターで37℃にて1時間インキュベートした。次に全てのウェルを新しい細胞培養液を用いて繰り返しかつ激しく洗浄し、非結合細胞を除去した。プレートの顕微鏡による精査で概算したとき、約105（1%）又はそれ未満のヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5タンパク質結合細胞が得られた。TRIzol試薬でプレート結合細胞を溶解することによって、前記からRNA及びcDNAを調製した（図14及び15）。
抗原選別及び非選別ラマB-細胞集団のインテグリンアルファ-v-ベータ-5結合ナノボディクローンのパーセンテージは表13に提示されている。
【０１３５】
表13：抗原選別及び非選別ラマB-細胞集団のインテグリンアルファ-v-ベータ-5結合ナノボディクローンのパーセンテージ
2008528010.tif 000014
【０１３６】
実施例15：ベクターにおける機能的ナノボディ発現の評価
位置特異的組換え（図2参照ｚ）を用いて非発現ベクターから発現ベクターに抗TNFアルファナノボディの遺伝子をクローニングした後、pAX51及びpAX56bでのこのナノボディの発現を大腸菌WK6で検査した。
結果は、pAX51及びpAX56bの両方から発現された“3E”ナノボディ（WO04/041862）についての良好な発現レベル及び機能的なTNF-結合を示している（図17及び18）。
実施例16：通常抗体の枯渇
通常の抗体と重鎖抗体との間の定義の相違は、後者には対を形成する軽鎖が存在しないということである。したがって、重鎖抗体を産生するB-細胞は、それらの表面結合免疫グロブリンのどちらかと対を形成するカッパ又はラムダ軽鎖をもたないと考えられる。Ablynxのフローサイトメトリー実験では、フィコエリスリン（PE）標識ポリクローナル抗ヒトカッパ-及びラムダ-軽鎖抗血清（Caltag Labs, Inc.）は、ラマ・グラマ（Lama glama）のPBMCサンプル中のリンパ球亜集団を認識することが見出された（データは示されていない）。したがって、B-細胞がその細胞膜に提示する通常の（カッパ-又はラムダ-鎖と対を形成する）免疫グロブリンをそのような試薬で標識し、続いてPEタグ付加細胞のMACS免疫磁石によって枯渇させることにより、抗原反応性とは無関係に、与えられたPBMCサンプルから通常のレパートリーは枯渇されるであろう。抗原反応性B-細胞の抗原結合濃縮と前記の工程を合体させることによって、通常のレパートリーB-細胞の抗原反応性濃縮細胞分画へのキャリーオーバーは、完全に排除できないとしても大きく減少させることができるであろう。
【０１３７】
実施例17：二価でフォーマットされた単一特異性ナノボディにおけるアビジティー作用の簡便なスクリーニング
アビジティー作用は、多価タンパク質結合分子の治療の有効性に大きく寄与し得る。しかしながら、エピトープの精密な特異性の相違、及びその結果生じる同じタンパク質を指向する異なる二価でフォーマットされた単一特異性ナノボディ上の2つの結合部位間の立体的妨害は、いくつかのナノボディの二価フォーマットでの使用を不適切にし得るであろう。開発プロセスの初期に潜在的なアビジティー作用について、多くの一価バインダーを簡便にかつ迅速にクローニングする方法がしたがって所望される。そのような方法を以下で述べる。
クローニング“原”ベクター中の一価ナノボディの大セットを、プライマーセット1及びプライマーセット2をコードする2つのユニバーサルプライマーセットを用いる、2つの平行するPCR反応セットで増幅させる（図20）。プライマーセット1は、FR1コンセンサス配列に加えてB4配列をコードする5'プライマー及びFR4コンセンサス配列に加えてB1配列をコードする3'プライマーを含む。したがって、PCR増幅は、ただ1つのPCR生成物“１”を生じ、前記はB4及びB1リコンビナーゼ認識部位によってフランキングされた一価のナノボディ配列を含む。プライマーセット2は、B1及びB2部位をそれぞれコードする同様な5'及び3'プライマーを含み、ただ1つのPCR生成物“2”を生成する。少量の鋳型ナノボディプラスミドを“マスター”マイクロタイタープレートから2つのレプリカマイクロタイタープレート（プライマーセット1及びプライマーセット2をそれぞれ含む）へ分配することによって、2セットの直線状に改変されたナノボディDNA配列が平行して96から384クローン生成される。
両アンプリコンセットが2つの別個の中間“ドナー”ベクター1及び2に組み込まれる。前記組み込みは、Invitrogen(商標)Gateway(商標)BP組換え反応を用い、それぞれプラスミド1及び2、並びにリコンビナーゼミックスを含むマイクロタイタープレートのウェルにPCR生成物“1”及び“2”を添加することによって実施される。これら2つのベクターは、上記に記載のPCRプライマーによってナノボディクローン配列に付加された、B4/B1及びB1/B2部位にそれぞれマッチするリコンビナーゼ認識部位を含む。組換え反応が生じた後で、得られたリコンビナントプラスミドを熱ショックによってコンピテント大腸菌細胞（別のマイクロタイタープレートに予め適量で添加されてある）にトランスフェクトする。細胞を深底ウェルプレートで抗生物質選別圧の下で増殖させ、全てのウェルのプラスミドを精製する。
同じナノボディ配列を含む、平行して生成した両プラスミドを最終的な“到着先”発現プラスミドと一緒にGateway(商標)LR組換え反応ミックス中で混合することによって、同じナノボディ遺伝子の両方の型が、予め決定した順序で、発現プラスミドで両融合タンパク質をコードする単一遺伝子に連結される（前記は、Gateway(商標)組換え配列がコードするリンカーによって連結され、タンパク質アフィニティー精製タグを含む）。生成されたプラスミドを続いて高温コンピテント大腸菌細胞にトランスフェクトし、前記細胞を増殖させ、全て上記に記載したとおりに深底ウェルのマイクロタイタープレートで選別する。
融合タンパク質の精製（アフィニティー精製タグを利用する）のために、平行して作成した全てのミニ培養の少量を採集する。種々の抗原結合アッセイで、アビジティー作用の証拠について精製融合タンパク質を解析する。
マイクロタイタープレート複製を操作するための自動液体操作システム、温度サイクラー及び試薬キット/消耗品、PCR、PCR生成物/プラスミド/タンパク質精製及びトランスフェクション方法は、いずれも容易に利用することができる。したがって、単純な混合とインキュベーションのGateway(商標)組換え反応、実験室用自動装置及びナノボディ基礎部分のフォーマット作成の融通性が一体となって、多価フォーマットのアビジティーについて通常抗体又は制限酵素クローニング技術を用いる場合よりもスクリーニングは容易になる。
【０１３８】
実施例18：二特異性にフォーマットした多価ナノボディで有害な機能低下作用が存在しないことについての簡便なスクリーニング
上記実施例の構想と同様に、開発サイクルの初期において、二特異性融合タンパク質で互いに抗原結合の立体的妨害が存在しないことについてスクリーニングすることは極めて有益である。そのような方法を以下で述べる。
前の実施例で説明したように、種々のPCRプライマーセットを用いることによって、5'及び3'Gateway(商標)BP認識部位を“原”プラスミドに存在するあるナノボディクローン配列に添加する。これらのPCR生成物をBP組換え反応を用いて中間“ドナー”プラスミドにクローニングする。単一の均質なLRのマルチ部位組換え反応での2つの生成されたドナープラスミドと“到着先”ベクターとの組換えによって、発現ベクター内に予め規定した順序で存在するインプットナノボディの最終的融合タンパク質遺伝子が生成される。
したがって、同じものを用いるのではなく、2つの異なるナノボディクローンを含むベクターを、PCRプライマーセット1反応及びPCRプライマーセット2反応で鋳型として用いることによって、ドナー1及びドナー2中間プラスミドが平行して生成され、それらは2つの異なるナノボディを含む（図21A）。ドナー1ベクター中のある特異性Aをもつナノボディをドナー2ベクター中の異なる特異性BをもつナノボディとのLR組換えによって、生成される組換えベクターでコードされる融合タンパク質は、一特異性二価ではなく二特異性であろう。この融合タンパク質を産生させ、上記に記載したように到着先ベクターでコードされるアフィニティー精製タグを用いて精製する。得られたタンパク質を種々のアッセイで二機能性についてスクリーニングする。
この技術のまた別の有益な特色は、同一のインプット材料及び試薬を用いて、融合タンパク質の可能な両方の方向をスクリーニングできるということ、すなわち特異性Bのナノボディに対してN-末端側に特異性Aのナノボディをもつ融合タンパク質（図21A）、又は特異性Aのナノボディに対してN-末端側に特異性Bのナノボディをもつ融合タンパク質（図21B）の二特異性をチェックすることができるということである。これを達成するために、最初に特異性Aのナノボディをもつインプットプラスミドをプライマーセット1で増幅させ、さらに中間ドナーベクター1で組換えを実施する。特異性Bのナノボディをプライマーセット2で増幅させ、ドナープラスミド2で組換えを実施する。これらの中間体のLR組換えによりナノボディA−ナノボディB二機能性融合タンパク質が生成される。特異性Bのナノボディをプライマーセット1で増幅させ、生成物をドナープラスミド1で組換えを実施し、同様に特異性Aについてはプライマーセット2及びドナープラスミド2を用いることによって、LR組換え生成物はナノボディB−ナノボディA融合タンパク質をコードするであろう。
【０１３９】
実施例19：
免疫及び非免疫ラマのB-細胞サンプル
フローサイトメトリー細胞分類装置のセットアップ用のコントロール細胞を調製するために、非免疫動物（ラマ#58）由来の凍結PBMCの小バッチを融解し、さらに、10%のウシ血清含有DMEM/F12培養液（DMEM/F12＋10%BCS）の5mLを添加し、続いて15分200gで遠心することによって洗浄した。細胞ペレットを6.25mLのDMEM/F12＋10%BCSに再懸濁し、さらに単球のT25培養フラスコ表面への選択的粘着（37℃で2時間インキュベーション）によって単球を枯渇させた。0.55ｘ106の生存細胞懸濁物をフラスコから回収した。
ヒトTNFアルファで免疫したラマ（ラマ#54）から単球枯渇PBMCを調製するために、新鮮な血液サンプルから単離し、90%ウシ胎児血清/10%DMSO中で凍結した90ｘ106のPBMCを含むバイアルを融解し、本質的には上記に記載したように（ただし30mLのDMEM/F12＋10%BCS培養液を用いる）細胞を洗浄した。血球計算板及びトリパンブルー排除を用い、71.5ｘ106細胞の回収が測定され、そのうちの68ｘ106が生存していた（3.5ｘ106又は全体の4.9%が非生存細胞であった）。続いて新しい細胞培養液を用いて前記ストックを37.5mLに希釈し（1.81ｘ106細胞/mLの細胞濃度）、さらにT150培養フラスコで37℃にて2時間インキュベートすることによって、これらの細胞から単球を枯渇させた。52.5ｘ106の非粘着性生存細胞がフラスコから回収された（4.2ｘ106又は全体の7.4%が非生存細胞であった）。
【０１４０】
ヒトTNF結合B-細胞の選別
TNF選り分けを実施して、TNFと結合することができるIgGを発現する細胞について前記細胞懸濁液を濃縮した。ラマ#54の単球枯渇細胞サンプルを3つの部分に分割した：20ｘ106細胞の2つの部分（それぞれTNFについてプレート用及びMACS用）及び12ｘ106細胞の1つの部分（コントロール実験として全B-細胞のプレート選別）。
TNFのプレート選別のために、6ウェル組織培養プレートの全ウェルをPBS中の10μg/mLのニュートラビジン（4mL/ウェル、Sigma）で4℃にて一晩被覆した。ウェルをPBSで3回（各回4mL）洗浄し、さらにビオチニル化ヒト組換えTNFアルファの0.8mg/mLストック溶液の1：500のPBS希釈物で37℃にて1時間インキュベートした。20ｘ106細胞の単球枯渇PBMC懸濁物を添加する前に、ウェルを再度PBSで3回洗浄した。続いて細胞を5%CO2インキュベーターで37℃にて1.5時間インキュベートした。インキュベーションの後、全ウェルを新しいPBSで6回（4mL/ウェル）洗浄して、プレート結合TNFに結合していない細胞を除去した。前記洗浄後にプレートに結合したままの細胞を、PBS中の5mMのEDTA（800μL/ウェル）を添加し、前記緩衝液中で5分間インキュベートしプレートから溶出させ、この後、全ウェルに1mLのDMEM/F12＋10%BCSを添加し、細胞掻きとり装置をプレートに適用することによって、残留する非溶出細胞を採集した。溶出細胞の数は、正確に数えるためにも、又は生存率を決定するためにも少な過ぎた（収量104細胞未満）。
TNFのMACS選別のために、20ｘ106の単球枯渇PBMCストックの少量を4℃の新しく脱気したPBS/2%FCSに100ｘ106細胞/mLの密度で再懸濁させた。ビオチニル化TNFを細胞に添加し（採集希釈1/200）、穏やかに混合して4℃にて15分インキュベートした。続いて細胞を4℃の脱気PBS/2%FCSの10mLを用いて2回洗浄し、4℃の脱気PBS/2%FCSの80μLに再懸濁させ、その後、20μLの抗ビオチンMACSビーズストックを添加した。細胞とビーズを4℃で15分一緒にインキュベートした。続いて細胞を再度4℃の脱気PBS/2%FCS（10mL）を用いて洗浄し、4℃の脱気PBS/2%FCS（500μL）に再懸濁し、さらにQuadroMACS磁石（ビーズ、カラム、磁石は全てMiltenyi Biotecから入手）に設置した予熱LSカラムの最上部に置いたMACSプレフィルターに適用した。緩衝液をカラムから排出させた。続いて3mLの4℃脱気PBS/2%FCSを前記プレフィルターに適用することによってカラムを3回洗浄し、洗浄と洗浄の間は常にカラムから液体がドリップするのを停止させた。次いで、プレフィルターをカラムから除去し、カラムを磁石から外した。5mLの4℃脱気PBS/2%FCSをカラムの上部に適用し、さらに、カラムとともに提供された滅菌栓を用いてカラムの最上部に圧を加えることにより、陽性選別された細胞を清浄な新しい遠心管に採集した。2mLの新しい緩衝液をカラムに再適用し、前記溶出方法を繰り返した。得られた溶出細胞懸濁液を同じ管に収集することによってプールした。カラム溶出細胞を遠心し、最終体積500μLが遠心管に残るまでもっとも最上部の緩衝液を取り除いた。前記体積の媒体中で細胞を再懸濁させた。抗原選別分画の生存細胞収量は、約5ｘ105で新たな死細胞は2ｘ105（全抗原選別収量の28%）と決定された。
参照実験の目的で、同じ単球枯渇細胞サンプルの少量から抗原選別的ではない態様でB-細胞を単離した。前記は、先にPBS中の2μg/mLのヤギ抗ラマIgG（Bethyl Laboratories）（4mL/ウェル）を用いて4℃で一晩被覆した6ウェルの組織培養プレートの3ウェルで12ｘ106の細胞小部分を選り分け、TNFのプレート選別について上記に記載した同じ洗浄及び溶出を実施することによって達成された。約7.5ｘ104の生存細胞が溶出後に得られた。Bethyのこのヤギ抗ラマIgGポリクローナル抗血清は、ウェスタンブロット及びELISAの両方で4-鎖タイプのラマIgG（“IgG1”）だけでなく両タイプの重鎖抗体（“IgG2”及び“IgG3”）ともまた結合することが以前に決定され、したがっていずれのタイプのB-細胞に対しても選択性をもたないと予想される。
【０１４１】
細胞の染色及び分類
通常のレパートリー発現B-細胞による抗原選別（又はコントロール）B-細胞集団の夾雑が予想されるが、しかしながら重鎖抗体産生B-細胞のみが下流のナノボディクローニングに対して当面関係を有する。さらにまた、B-細胞刺激に用いられる多くのマイクロタイタープレートの全ウェル又は数ウェルに既知の小数の生存細胞を分配する方法が所望されていた。したがって、フローサイトメトリー細胞分類装置を用いて、既知数の細胞をB-細胞刺激マイクロタイタープレートの全ウェルに分配し、一方、同時に非生存細胞及び/又は4-鎖免疫グロブリン提示B-細胞を分類装置から排除した。死細胞は、死細胞特異的なヨウ化プロピジウム染色（PI， Sigma）を用いる染色について負のゲート処理を基準に分類装置から排除し、一方、4-鎖免疫グロブリン提示B-細胞は、2つのラマ交差反応性ヤギ抗ヒトカッパ及びヤギ抗ラムダ軽鎖特異的試薬（両方とも蛍光発色団フィコエリスリン（PE）で標識、ヤギ抗ヒトカッパ-PE、ヤギ抗ヒトラムダ-PEは両物質ともにCaltagより入手）による染色に対して負のゲート処理を基準に排除した。
上記に記載した全3選別方法で溶出した細胞を、細胞懸濁液150μL当たり両蛍光抗体の各ストック溶液の5μLを添加することによって、プレート/カラム溶出直後にカッパ及びラムダ発現について染色した。染色液/細胞混合物を4℃にて30分暗所でインキュベートし、さらに繰り返し洗浄して過剰な染色液を除去した。PIストック（PBS中に1mg/mL）の1μLを前記洗浄細胞懸濁液に解析の5分前に添加した。
フローサイトメトリーの光散乱及び蛍光検出のチャンネル設定を適切に構成し、同様にPI及びPEの蛍光についての補整行列を計算するために、上記に記載した選別を通して得ることができる細胞よりもさらに多くの細胞が工程中に要求され失われる。したがって、分類工程とは無関係にはるかに大量のラマPBMCを調製し（非免疫ラマ#58；手順については実施例の先頭を参照されたい）、フォワード/サイド分散設定の最適化のために染色しないで用いた。サンプル集団の一部分を、上記の方法にしたがって、抗カッパ及び抗ラムダ試薬のみ、PIのみ、又は両方で染色した。続いてこれらの非陽性、単一陽性及び二重陽性集団を、適切な蛍光検出チャンネル指標の設定だけでなく、適切なPI/PE補整行列の設定にも用いた。同様に、この無関係のサンプルを用いて、細胞分類装置の滴下遅延設定及び96ウェルのマイクロタイタープレートへの分類小滴の分配を最適化させた。
検出及び分類のために最適な設定をいったん規定したら、PE/PI二重染色抗原又はコントロール選別B-細胞サンプルを解析した。陽性分類ゲートはフォワード/サイド散乱プロフィルを基準に完全なリンパ球で設定し、陰性ゲートはPI及びPE陽性染色について設定した。陽性ゲート内にあるが両陰性ゲート外である細胞のみが、96ウェルの組織培養マイクロタイタープレートへ各ウェル（いずれも100μLの細胞培養液を含む）につき3又は6細胞で分類された。
【０１４２】
分類したB-細胞の刺激
分類B-細胞のin vitro刺激のために、50,000の放射線照射EL4-B5細胞（2500rad、Gamma cell 3000, Elan, MDS Nordion）を、一連の96ウェルマイクロタイタープレートの全ウェルに、ウェル当り200μLの体積のDMEM/F12＋10%BCS培養液（1%のラマT-細胞条件付け上清（TSN）を含む）に分配した。ラマT-細胞の条件付け上清は、1μg/mLのフィトヘマグルチニン（PHA， Sigma）を用い、数頭の非免疫ラマから単離したPBMCをin vitro刺激することによって以前に調製した。これらの培養から得た無細胞上清を、プロテインA及びプロテインGカラムの両方を通過させることによって、B-細胞培養で使用する前に免疫グロブリンを枯渇させた。
全プレートの4ウェル以外の全ウェルに、各ウェルにつき3個の分類B-細胞を加えた。B-細胞培養プレートを5%のCO2で37℃にて合計11日間インキュベートした。培養液は、培養3日目に1回、1%のラマTSNを含む新しい培養液と交換した。
【０１４３】
B-細胞培養条件付け培養液のスクリーニング
分類したB-細胞刺激のクローニング効率を決定するために、全ウェルのB-細胞培養条件付け培養液をラマ免疫グロブリンの産生について分析した。前記を実施するために、Nunc Maxisorp ELISAプレートを、50μL/ウェルのヤギ抗ラマIgG（Bethyl）（PBSで1：1000希釈）で4℃にて一晩被覆し、次の朝洗浄し、PBS中の1%カゼイン溶液で室温にて1時間ブロッキングし、再度洗浄した。次いで、50μLのB-細胞培養上清を全B-細胞培養プレートのウェルの上部から細胞ペレットをかき乱すことなく採集し、1%のBSA及び0.05%のトゥイーン20を含む50μLのPBSを用いて1：2に希釈し、続いてELISAプレートのウェルに加えた。ラマ#54の同じ血液サンプル（前記はTNF結合B-細胞の選別に用いられた）から採取した1μLの血清を、前記B-細胞プレートで分類B-細胞を加えられなかった4つのウェルの2つに一致する、各プレートの2つのウェルに添加した（ELISAの陽性コントロール）。ELISAプレートを室温で1時間インキュベートし、続いて再び洗浄した。ウェル当り50μLのヤギ抗ラマIgG-HRP結合物（Bethyl）（1%BSA及び0.05%のトゥイーン20含有PBSで1：4000に希釈）を全ウェルに加えた。ELISAプレートを再び室温で1時間インキュベートし、洗浄し、各ウェル当り50μLの強化K-Blue TMB基質（Neogen）を用いて反応させた。ウェル当り50μLのH2SO4（2M）を添加して反応を停止させ、全ウェルの光学密度を450nmでELISAリーダーを用いて測定した。上記に示したように、ヤギ抗ラマIgGは4-鎖免疫グロブリンに対しても重鎖免疫グロブリンに対しても選択性をもたない。さらにこのELISAは以前にラマIgG11、IgG2及びIgG3を同様な感度で検出できると判定された。
バックグラウンドに対して2倍の発色（ODとして表現）を示すウェルを免疫グロブリン産生について陽性と判断した。バックグラウンドリファレンスとして、放射線照射EL4-B5細胞及び枯渇処理TSNのみを加え、ELISAプレートで追加の血清を加えなかった、各プレートにつき2つのウェルに対応するELISAウェルのODを用いた。
このようにして、刺激が成功したB-細胞を含むウェルがどれであるかが決定された。続いて、B-細胞の刺激後増殖（outgrowth）について陽性のウェルのパーセンテージを、陽性ウェルの数を分類B-細胞を加えたスクリーニングウェルの数（各プレートに92）で割ることによって算出することができた。結果は下記の表14に示されている。
これら刺激後増殖B-細胞培養のどれがTNFに反応性のB-細胞に由来するかを決定するために、これらの条件付け培養液上清を、TNF反応性についてスクリーニングした。前記を実施するために、Nunc Maxisorpプレートを、PBS中のニュートラビジン（2μg/mL）を用いて4℃にて一晩被覆した。プレートを洗浄し、PBS中の1%カゼインを用いて室温で1時間ブロッキングした。続いて、プレートを洗浄し、さらにビオチニル化組換えヒトTNF（PBS 1%カゼインで1：2000に希釈、50μL/ウェル）で4℃にて一晩被覆した。再びプレートを洗浄し、30μLのB-細胞培養上清（1%カゼイン/PBSの30μLで1：2に希釈）を加え、室温で1時間インキュベートした。ヤギ抗ラマIgG-HRP結合物（Bethyl）を二次抗体として用い、続いてELISAプレートを発色させ、以前のELISAについて記載した手順と同様に測定及び判定した。
このようにして、TNFに反応性である刺激後増殖B-細胞を含むウェルがどれであるかが決定された。刺激後増殖B-細胞培養のパーセンテージは、抗TNF反応陽性と記録されたウェルの数をスクリーニングした刺激後増殖B-細胞培養の数で割ることによって算出された。結果は下記の表14に、刺激後増殖B-細胞培養の集団内のTNF反応性ウェルのパーセンテージとして示されている。
【０１４４】
表14：B-細胞培養の増殖及びTNF反応性のELISAスクリーニング
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図から分かるように、この3細胞/ウェルの細胞播種密度での刺激後増殖は全てのプレートで50%を優に超えている。限定希釈実験の統計分析によって、このクローニング効率においてさえも、刺激後増殖ウェルの大半は“マルチヒット”から生じないこと、すなわち、各ウェルにつきただ1つの刺激後増殖B-細胞から（ウェルに分配された3つの細胞の1つを超えない）生じたことが明らかにされた。高いクローニング効率が与えられるならば、実際的に有用な増殖レベルを失うことなく播種密度を各ウェルあたりさらに低い細胞数に減少させることが実現可能であり、さらに少なくするか（2細胞/ウェル）、又は潜在的マルチヒットウェルが排除されるであろう（1細胞/ウェル）。さらにまた、抗原の選別が極めて顕著な抗原特異的B-細胞濃縮をもたらすことが明白である。なぜならば、非特異的B-細胞単離は、１％を超える抗原反応性B-細胞培養を生じなかったが、それに対して、同じ細胞サンプルによるMACS及びプレート仲介TNF選別については、それぞれ13%及び6%であったからである。
これら刺激後増殖を示す、TNF反応性B-細胞培養のどれが重鎖型抗体を産生するB-細胞に由来し、どれが通常抗体産生B-細胞に由来するかを決定するために、TNF反応性ウェルの条件付け培養液上清をTNF反応性について再スクリーニングした。ただし非選択性ヤギ抗ラマIgGポリクローナル抗血清（Bethyl）の代わりに、IgG1、IgG2及びIgG3選択性モノクローナル抗体（Daleyら（Cli Diagnos Lab Immunol 2005, 12:380）に記載されたCornell University（NY）から入手）が検出二次試薬として用いられた。前記を実施するために、3枚のNunc Maxisorpプレートのレプリカをニュートラビジンで被覆し、ブロッキングし、ビオチニル化TNFで再被覆し、ELISAについて以前に記載したように、刺激後増殖B-細胞培養上清の希釈した条件付け上清とともにインキュベートした。しかしながら、ヤギ抗ラマIgG-HRP結合物（Bethyl）を使用する代わりに、1μg/mLの精製マウス抗ラマIgG1、抗IgG2又は抗IgG3（それぞれ27E10、19D8及び8E1クローン）を、それぞれ3枚のレプリカELISAプレートの各々で二次抗体として用いた。これらはHRPに直接結合されてなかったので、室温で1時間のインキュベーション工程の後にプレートを洗浄し、さらにプレート当り50μLのウサギ抗マウス-HRP結合物（DakoCytomation）（1：5000に希釈）とともにインキュベートした。この三次抗体結合物は、いずれのタイプのラマIgGとも直接結合しないことが以前に決定され、したがってアッセイの選択性はこの試薬によって偏向を受けないことが確認されている。このさらに1時間の室温でのインキュベーションの後で、以前のELISAについて記載した手順と同様に、ELISAプレートを再び洗浄し、発色させ、読み取り及び判定した。
このようにして、TNFと反応する刺激後増殖B-細胞を含むことが既に判明しているウェルで産生されるTNF反応性免疫グロブリンのタイプが決定された。結果は下記の表15に示されている。
【０１４５】
表15：TNF反応性B-細胞培養によって産生される免疫グロブリン型のELISAスクリーニング
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表15から分かるように、条件付け上清による簡便で直接的なELISAアッセイを用いて、TNF反応性B-細胞を含む全ウェルのほぼ半分が与えられたタイプの免疫グロブリンに割り当てることができた。本実験で用いた免疫グロブリン軽鎖染色による陰性ゲート処理手法を用いて、B-細胞刺激前の細胞分類時の4-鎖抗体産生B-細胞の枯渇は不完全であることが証明された。前記を実施するためには、陰性ではなく陽性ゲート処理手法を使用し、さらに交差反応性試薬ではなく種特異的試薬を用いることによって、より良好な選択性が一般的に得られるであろうということは、細胞分類分野の業者には明らかであろう。明らかに、B-細胞培養上清のELISAスクリーニングのために本実験で用いたラマIgG2及びIgG3特異的マウスモノクローナル抗体は、前記を実施するために極めて適切な試薬セットを構成する。最後に、混合シグナル培養をともに6細胞/ウェルの培養プレートから得るのは全く価値がない。この場合、非常に高い刺激後増殖のために（ウェルに播種されたB-細胞の〜80%）、いくらかのマルチヒットウェルを得る危険性は極めて高い。そのような混合培養は3細胞/ウェルでは明らかではなく、上記で示したように、播種密度を2又は1細胞/ウェルにさらに減少させることによって、マルチヒット培養の機会をそれぞれ低下又は排除することになろう。
【０１４６】
実施例20：
B-細胞によって産生される免疫グロブリンのELISAによる型分けが、これらの培養から回収することができる遺伝情報と適合することを確認するために、実施例19に記載したB-細胞培養の条件付け上清を、その重鎖型免疫グロブリン又は4-鎖型免疫グロブリンの産生を検出するELISAを用いて、そのTNFに対する反応性に関係なくスクリーニングした。前記を実施するために、ELISAプレートの3枚のレプリカを実施例19に記載した最初のELISAの手法のように、ヤギ抗ラマIgG（Benthyl）で被覆し、ブロッキングし、希釈B-細胞培養条件付け培養液とともにインキュベートしたが、ただしレプリカプレート1、2及び3では、ラマIgG1、IgG2及びIgG3選択性マウスモノクローナル抗体をそれぞれ用いて検出し、さらに同実施例に記載した免疫グロブリン型分けTNF捕捉ELISAの場合のように発色させ、解析した。このようにして、我々は、比較的大量の免疫グロブリンを産生している（平行した3つのELISAのいずれかでOD＞0.3）全培養の83%で産生された免疫グロブリンの型を明確に同定することができた。
このELISAによる型分けが、これらB-細胞から救済することができる免疫グロブリンのmRNA配列と一致するか否かを確認するために、選択したTRIzol溶解B-細胞培養細胞ペレットから業者（Invitrogen）の指示にしたがい全RNAを単離し、単一工程RT-PCR反応（Superscript III一工程RT-PCR）を前記単離RNAのほんの小さな部分を用いて実施した。前記反応は、ラマの4-鎖免疫グロブリン及び重鎖免疫グロブリンの両方を増幅することができるが、どちらかのタイプを増幅したときは別個の長さのPCR生成物を生じるプライマーセット（フォワード：免疫グロブリンFR1特異的、リバース：CH2ドメイン特異的）を用いて実施した。したがって、RT-PCR反応後に、SYBRグリーン染色アガロースゲルでPCR生成物の存在を検出することによって、単一工程反応でB-細胞培養から可変領域遺伝子配列の救済の実現可能性が証明され、一方、同じゲルでの生成物の長さの決定によって、救済された遺伝子フラグメントによってコードされる免疫グロブリンの型（4-鎖か重鎖か）に関する情報が提供される。
アンプリコンは、利用可能なRNA分画で単一工程RT-PCR反応を用いて、スクリーニングした全B-細胞培養から得ることができた。入手可能な、RT-PCRによる型分けの結果と明確なELISAによる型分けとの一致は下記の表16に要約されている。RT-PCRの列の“C”は、通常の4-鎖型の免疫グロブリン（IgG1に対応する）由来のアンプリコンの検出を示し、“VHH”は、IgG2又はIgG3重鎖免疫グロブリン由来のアンプリコンを示す。
【０１４７】
表16：ELISA及びRT-PCR免疫グロブリン型分けの一致
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したがって、可変領域配列は、刺激B-細胞培養から単一工程RT-PCR反応を用いて確実に救済することができ、さらに13のB-細胞培養のうち12で、ELISA型分けは増殖B-細胞が産生する免疫グロブリン配列の型分けに関する正確な情報を提供した。したがって、通常のB-細胞又は通常及び非通常B-細胞の混合物を含む培養の不要な増幅を先行して回避することができる。上記の実施例で特記したように、混合シグナル培養はともに6細胞/ウェル培養から由来し、そのような二重シグナルは、スクリーニングしたはるかに多くのウェル当り3細胞の培養プレートからは得られなかった。さらに、細胞の播種密度の減少は、そのようなマルチヒットの危険性をさらに減少又は完全に排除するであろう。
【０１４８】
実施例21：活性化細胞の非活性化細胞からの分離
個々のB-リンパ球はランダムに再編された免疫グロブリン遺伝子を保持する（前記遺伝子は、多様なB-細胞クローンによって産生される対応するタンパク質に対し種々の抗原特異性を付与する）。再編が全てのクローンで生じ、さらに多数のB-細胞が生涯にわたって持続的に産生されるので、B-細胞の総数に対して任意のある再編の相対的豊富さは極めて低い。
免疫によって又は以前の感染に対する天然の免疫を介して、動物は免疫学的にナイーブな動物の状態を免疫された状態に変換される。このプロセスの間、問題の抗原と反応するB-細胞クローンは“活性化”されて大きな数の増加が生じ、一方、非反応性細胞は増加せず、全体の集団における前記抗原反応性B-細胞のはるかに大きな相対的豊富さを生じる。同時に、親和性成熟が惹起され、それによって、抗原反応性B-細胞は免疫グロブリン遺伝子における変異サイクルを受け、より強い親和性をもつ変種の選別がこれらの変異から生じる。したがって、免疫は、抗原反応性B-細胞の相対的豊富さの増加とともにより強い親和性抗体産生B-細胞をもたらす。
活性化B-細胞（“形質細胞”）は、大量の可溶性免疫グロブリンを産生及び分泌するが、それらの細胞膜上にはこの免疫グロブリンの極めてわずかな量しか提示しない。以前に活性化されたB-細胞の一部は記憶B-細胞となるであろう。これらは相当量の免疫グロブリンを産生及び分泌しないが、相当な数の抗体をそれらの細胞膜上に提示する（図26A参照）。
免疫グロブリンの細胞表面提示は、細胞表面免疫グロブリンと抗原との結合をベースにして、実験者がわずかな関連細胞しか含まない細胞サンプルからこれら免疫グロブリンを濃縮することを可能にする。我々は、以前に、対象の抗原と結合する、B-細胞がコードする非通常的（軽鎖を欠く）免疫グロブリン単離するためにこの方法の使用の仕方を記載した。しかしながら、これらの記憶細胞は免疫グロブリンを活発には産生しないので、それらはほんのわずかな量の免疫グロブリンコードmRNAしか含まない。結果として、極めて鋭敏なしかし風変わりな方法、例えばネストRT-PCRが分類された単一細胞から直接遺伝子を単離するために要求される。また別には、種々の公知の刺激方法（例えばCD40Lトランスフェクト線維芽細胞、フィーダー/刺激細胞、例えばEL4-B5細胞、又は組換えCD40L）を用いて、分類された個々の記憶B-細胞をin vitroで再活性化することができる。そのような再活性化細胞は分裂するとともに（〜100クローンの増殖細胞を生じる）、個々の細胞当たり大きく増量した免疫グロブリンmRNAを産生する。この二重標的mRNA増幅工程は、免疫グロブリン遺伝子配列の簡便で確実な単一工程RT-PCR回収を可能にするが、B-細胞のin vitro活性化を可能にするために更なる時間を必要とする。さらにまた、大パネルのB-細胞のそれぞれのin vitro刺激は相当な技量を必要とする。
我々は、本明細書で、対象の抗原と結合する非通常的免疫グロブリンを産生する個々の形質細胞の細胞分類による直接単離のための方法を述べる。この方法は、休止記憶細胞ではなく形質細胞を採集するので、これら細胞は単一工程RT-PCR遺伝子回収にいっそう適合させやすい。したがって、対象の細胞の分類後にin vitroでB-細胞を活性化することはもはや要求されない。結果として、多数のリード分子の入手のために要求される時間、努力及び経験は減少する。
本方法は、カメリドの非通常的免疫グロブリンと通常的免疫グロブリンの存在下で特異的に結合する、ただ1つの試薬（好ましくはモノクローナル抗体であるが必ずというわけではない）の使用を必要とする（図26B、上段パネル）。そのような試薬は、Daleyらの文献（Clin Diagn Lab Immunol 2005, 12(3):380-6）に記載されたように、ラマ・グラマ（lama glama）について容易に入手できる。これらのハイブリドーマは単一特異性のマウス抗ラマ非通常的IgG免疫グロブリンを無制限に供給し、前記免疫グロブリンは、現在利用可能な膨大な蛍光色素群と、標準的な抗体結合技術を用いて容易に結合させることができる。したがって、今や同じモノクローナル抗体から異なる蛍光色素をもつ2つの結合物質を生成することは極めて簡単である（図26B、下段パネル）。
未分画のラマ末梢血単核球を第一の結合物を用いて染色するとき、表面免疫グロブリンのみが検出されるであろう。したがって、前記サンプルを解析するとしたならば、記憶B-細胞を非B-細胞から容易に区別でき、一方、形質細胞は非B-細胞より蛍光が強いことはほとんどないであろう（図26C、上段パネル）。
しかしながら、このようにして染色した細胞サンプルをまた、フローサイトメトリー細胞解析及び分類で習熟した者にとって周知の方法を用いて固定し透過性にすることができる。固定によって細胞表面上の表面結合染色が維持され、一方、完全な細胞溶解を引き起こすことなく洗剤（例えばサポニン）を用いて細胞をその後透過性にすることができる。固定はまた、細胞膜の開放にもかかわらず細胞内分子の細胞内保持をもたらす。透過性付与は、大きな分子（例えばモノクローナル抗体/蛍光色素結合物）が細胞内環境に近づくことを可能にする（これは透過性付与の前には不可能である）。したがって、形質細胞内に存在する大量の細胞内免疫グロブリンを、表面免疫グロブリンの染色に用いた抗体と同じ抗-非通常ラマIgGモノクローナル抗体の第二の色素結合物を用いて染色することができる。標的分子の局所におけるこの高い豊富さは、表面免疫グロブリンと比較して接近が限定されるにもかかわらず、強い蛍光シグナルの獲得を担保する（図26、下段パネル）。
穏やかな固定及び透過性付与に必要な試薬についての記載は一般的に知られている文献で見出すことができる（通常はそれぞれパラホルムアルデヒド及びサポニン補充緩衝食塩水）。しかしながら高度に最適化された多くの商標登録された既製品の緩衝液もまた市場で入手することができる。B-細胞リンパ球の診断のためのツールとして何年も前に報告されたフローサイトメトリーによる細胞内軽鎖の検出のように、概念の証明が限定的であるものもまた文献で見出すことができる（例えば例として以下を参照されたい：Bardales et al. J Histochem Cytochem 1989(Jan), 37(1):83-9）。
これまでのところ、我々は、混合ラマ細胞集団で、非通常型抗体を産生する形質細胞を同定する方法（ただ1つの特異的なモノクローナル抗体を必要とする）を明らかにした。しかしながら、対象の抗原と結合する抗体を産生する形質細胞分画はこの集団の極めて少数を構成する可能性が高い。血液サンプル採取の少し前に動物を追加免疫することによってこの分画を顕著に増加させることは可能であるかもしれないが、それにもかかわらず、全形質細胞集団内でこれらの細胞を同定することが所望されよう。
治療的に重要な多くの抗原は、免疫グロブリンと同様なサイズであるか又は小さい。前記よりも大きなものの場合、特定の小さなサブドメインと結合する抗体のみが対象となり、サブドメインは単離して又は融合タンパク質として（例えば免疫グロブリンの定常領域と融合されて）得ることができる。したがって、第三の蛍光色素で予め標識した抗原で透過性を付与した細胞を染色することは特に問題があるというわけではないはずである（なぜならば、これらより小さな分子はいっそう容易に細胞内区画に接近して、続いて抗免疫グロブリンモノクローナル抗体蛍光色素結合物に接近することができるからである）。また別には、ビオチニル化抗原を用いて透過性付与細胞を染色し、第二の工程反応で蛍光色素結合ストレプトアビジンを用いて検出することができる。したがって、第三の蛍光色素と直接又は間接的に結合させた精製抗原を用いて、抗原と結合する免疫グロブリンを産生する形質細胞の亜集団を特別に標識することができる（図26D）。抗原-色素で染色した集団のサブゲート処理の前に、全形質細胞集団で電子的ゲート処理を実施することによって、休止状態の抗原特異的B-細胞（それらの表面免疫グロブリン上で抗原-色素結合物と結合する可能性がある）を間違って取り込むことを回避することができる（図26D）。形質細胞では、免疫グロブリンの細胞内局所濃度は非常に高いので、相対的に大量の抗原結合部位が利用可能であり、高い染色濃度を得ることができ、バックグラウンド染色に比して陽性集団の明瞭な同定をいっそう簡単にする。
フローサイトメーターを用いて対象の細胞集団を同定する特定の方法がいったん確立されたら、フローサイトメトリー細胞分類装置を用いて問題の集団を単離するための技術的障害はもはや存在しない。mRNA単離、cDNAの逆転写、及びクローンの特異的免疫グロブリン遺伝子のPCR増幅又は直接的な単一工程RT-PCR増幅のために、抗原反応性で非通常的抗体を産生する個々の形質細胞をマイクロタイタープレートのウェルに直接分類することができる。
分類細胞のmRNAから免疫グロブリン遺伝子を救済することは、この方法にとって最大の技術的ハードルとなることは予想し得る。それにもかかわらず、RNAse阻害試薬が今や利用可能であり、これらを用いた細胞分類後のRT-PCRによるmRNA回収がBarrettらの文献に報告されている（Nature Genetics 1999, 23:32及びBiotechniques 2002, 32(4):888-90, 892, 894, 896）。形質細胞は特に免疫グロブリンmRNAに富むので、この工程は方法の妨げとならないはずである。
この一般的な方法の輪郭について工夫を凝らす余地は多く存在する。例えば、一般的に希少細胞集団の同定は、2つの異なる色素を用いて問題の集団を同定することによって利益を受ける。この具体例では、抗原結合はもっともわずかな細胞集団を規定する。2つの異なる蛍光色素と結合させた抗原の混合物で細胞を染色することによって、偽陽性分類を減らすことができる。
全体として相対的に豊富な形質細胞、及び特に抗原特異的形質細胞は、分類されるべき血液サンプルを採取する少し前に過剰な免疫で前免疫動物を追加免疫することによって増加させることができる。本明細書に記載した方法を用いる、調製的ではなくむしろ解析的なフローサイトメトリーは、免疫スケジュールの最適化の指標に用いることができる。
透過性付与形質細胞は、透過性付与B-細胞よりもはるかに多くの、抗ラマIgG結合に利用することができる免疫グロブリンエピトープ総数を含むと予想される（総数とは表面提示＋細胞内含有）。したがって、固定/透過性付与細胞を一工程反応で染色するために単一の色素と結合させたただ1つのモノクローナル抗体を用い、単一蛍光リードアウトチャンネルで2つの明瞭なピークとしてこれらの集団をはっきりと区別することは実現可能なことである（染色の強さ及び陽性染色集団ピークの幅に左右される）。この方法は、手順として簡便性が増すという利点を有するだけでなく、細胞分類装置で要求される蛍光リードアウトチャネルの数が減り、すなわちハードウェアに対する要求が少なくなり多色補正の問題を少なくする。
使用した用語及び表現は説明のため及び非限定的に用いられ、さらにそのような用語及び表現の使用において、表示及び説明した特長をもついずれの等価物またはその部分も除外しようとするものではない。本発明の範囲内において種々の改変が可能であることは理解されよう。
本明細書に記載した全ての参考文献は参照により本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】選別及び非選別集団における抗原特異的ラマB細胞の検出。
【図２】位置特異的組換え（Gateway(商標)）による個々のナノボディ遺伝子の発現ベクターpAX56bによる再クローニング。
【図３】免疫ラマにおけるA431腫瘍細胞に対する誘発血清応答。
【図４】4A及び4B：免疫ラマ024/025（パネルA）及び026/027（パネルB）におけるヒトEGFR発現マウス線維芽細胞（Her14）と親マウス線維芽細胞NIH3T3クローン2.2アクセプター細胞に対する血清応答。
【図５】5A及び5B：精製ヒトEGFRに対する免疫ラマ024/025（パネルA）及び026/027（パネルB）の血清応答。
【図６】少数の細胞から確実なRNA単離が可能であることを示すゲル電気泳動の結果。
【図７】少数の細胞から確実なRNA合成が可能であることを示すゲル電気泳動の結果。
【図８】DBAマウスのコラーゲン選別：非選別及び選別細胞から調製した核酸によるVカッパPCR。
【図９】HuC1q選別：濃縮前及び選別後のナノボディの増幅。
【図１０】HuC1q選別：濃縮前及び選別後のナノボディのロングヒンジからFR1領域、CH2からFR1領域の増幅。
【図１１】HuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質選別：リーダー-オリゴdT増幅選別分画。
【図１２】HuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質選別：FR1-ヒンジ増幅選別分画。
【図１３】HuCD28/Fc-ガンマ融合タンパク質選別：FR1-CH2増幅選別分画。
【図１４】ヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5選別：RNAの完全性チェック。
【図１５】ヒトインテグリンアルファ-v-ベータ-5選別：cDNA品質管理PCR。
【図１６】非発現ベクターpAX56a中のナノボディ収集物のクローニング。
【図１７】発現ベクターpAX56bにおけるナノボディ生成を示すクーマシー染色SDS-PAGE及びウェスタンブロットの結果。
【図１８】発現ベクターpAX56bにおける機能的ナノボディ生成を示す結合アッセイの結果。
【図１９】19A：ナノボディ配列の組成及び遠位ポリ-A配列の位置；19B：FR1及びオリゴ-dTプライマーを用いるPCR、BstEIIを用いる制限処理はナノボディ遺伝子を提供する。
【図２０】二価フォーマットのナノボディ。
【図２１】21A及び21B：二特異性フォーマットのナノボディ：特異性AのナノボディのN-末端と相対する特異性Bのナノボディ（図21A）、及び特異性BのナノボディのN-末端と相対する特異性Aのナノボディ（図21B）。
【図２２】フローサイトメトリーによるB細胞の検出及び単離で使用される、ある与えられた膜結合タンパク質を保持する蛍光小胞の作成。
【図２３】23A及び23B：図23Aは、免疫動物の血液/リンパ節などのサンプルで遭遇する可能性があるB細胞レパートリーを示す。図23Bは、ある与えられた膜結合タンパク質を保持する蛍光小胞を用いたB細胞の多様なレパートリーの染色が、どのようにして二変量FACSプロットで3つの別個の集団を生じるかを示す。上左の象限に含まれる細胞のゲート処理及びそれに続く分類によって、問題のトランスジェニックタンパク質と結合するB細胞のみが選別される。
【図２４】無関係の特異性をもつB細胞枯渇の予備分類磁性枯渇及び分類時の検出で使用される、親細胞株の膜結合タンパク質レパートリーを保持する磁性蛍光小胞の作成。
【図２５】25Aは、親細胞株の膜結合タンパク質レパートリーを保持する磁性蛍光小胞及びトランスジェニック株の非磁性蛍光小胞との種々のB細胞特異性染色混合物を示す。磁石は、トランスフェクトされた宿主細胞に存在する無関係の膜結合タンパク質に特異的なB細胞のみを保持するであろう。図25Bは、分類前に無関係の特異性をもつB細胞を磁石により枯渇させた後の二変量プロットB細胞集団を示す。パターンは今や以下の2つの集団にのみ分けられる：無関係のT及びB細胞の大集団（下左象限）及びトランスジェニック膜タンパク質特異的B細胞（上左象限）。
【図２６】図26A：活性化B細胞（“形質細胞”）及び記憶B細胞による可溶性免疫グロブリンの産生及び分泌の比較模式図。図26B：通常的免疫グロブリンの存在下でカメリドの非通常的免疫グロブリンと特異的に結合するモノクローナル抗体の模式図（上段パネル）；2つの異なる蛍光色素で標識した前記モノクローナル抗体（下段パネル）。図26C：形質細胞と記憶B細胞を識別するための、PBMCの表面マーカー染色（上段パネル）とPBMCの表面マーカー及び細胞内染色（下段パネル）の比較模式図。図26D：PBMCの表面マーカー及び細胞内の抗体-色素染色、続いてPBMCの表面マーカー及び細胞内の抗原-色素染色によって細胞を単離するためのプロトコルの模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月27日(2006.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する前記少なくとも1つの細胞を単離する工程；
（c）前記少なくとも1つの細胞から、前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列を入手する工程。
【請求項２】
工程（b）が以下の工程の任意の適切な組み合わせを含む、請求項1に記載の方法：
（b-1）抗体を発現しない細胞から抗体を発現する細胞を分離する工程；
（b-2）他の抗原を指向する抗体を発現する細胞から、所望の抗原に対する抗体を発現する細胞を分離する工程；
（b-3）通常の4-鎖抗体を発現する細胞から重鎖抗体を発現する細胞を分離する工程；
ここで、前記工程は任意の順序で実施することができ、さらに前記工程の各2つ又は3つ全てはまた単一工程としても実施できる。
【請求項３】
工程（b）の後でかつ工程（c）の前に個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記サンプル又は集団から、重鎖抗体を発現する細胞を個々の細胞として又は個々の細胞のセットとして単離する工程；
（c）前記抗原を指向する重鎖抗体の発現について、前記個々の細胞又は個々の細胞のセットをスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を、前記少なくとも1つの細胞から入手する工程。
【請求項５】
工程（c）で、個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を含む、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を作出又はクローニングする方法であって、前記重鎖抗体又は抗原結合フラグメントが特定の抗原を指向する、前記作出又はクローニング方法：
（a）前記抗原で免疫したカメリドから細胞サンプル又は集団を提供する工程、ここで前記細胞サンプル又は集団は、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現するか又は発現能力を有する少なくとも1つの細胞を含み；
（b）前記細胞サンプル又は集団を個々の細胞のセットに分ける工程；
（c）前記個々の細胞のセットを、前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する細胞についてスクリーニングする工程；
（d）前記抗原を指向する重鎖抗体を発現する前記少なくとも1つの細胞から、前記抗原を指向する重鎖抗体をコードするか、又は前記抗原を指向する前記重鎖抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸又はヌクレオチド配列を入手する工程。
【請求項７】
工程（c）で、個々の細胞を培養及び/又は刺激して、抗体を発現又は産生させ、その後で、個々の細胞の各々に由来する培養液又は上清を、所望の抗原に対する重鎖抗体の存在についてスクリーニングする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
細胞がＢ細胞又は脾臓細胞である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項1から8のいずれかに記載の方法を用いて同定、選別、作出及び/又はクローニングされた核酸。
【請求項１０】
請求項1から8のいずれかに記載の方法を用いて同定、選別、作出及び/又はクローニングされた核酸、及び場合によって遺伝的構築物のそれ自体公知の1つ以上の更なるエレメントを含む、遺伝的構築物。
【請求項１１】
重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記方法が、請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載の遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現させることを含む、前記製造方法。
【請求項１２】
請求項9に記載の核酸、又は請求項10に記載の遺伝的構築物を含む、宿主細胞又は宿主生物。
【請求項１３】
請求項9に記載の核酸又は請求項10に記載の遺伝的構築物によってコードされるか、及び/又は請求項11に記載の方法によって入手される、重鎖抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
請求項13に記載の重鎖抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗原結合フラグメントがVHHドメインである、前記抗体又はそのフラグメント。
【請求項１５】
そのアミノ酸配列が、請求項14に記載のVHHドメインのアミノ酸配列を土台にし、及び/又は請求項9に記載の核酸によってコードされるアミノ酸配列を土台にしているナノボディ。
【請求項１６】
請求項14に記載の少なくとも1つのVHHドメイン及び/又は請求項15に記載の少なくとも1つのナノボディを含有するか又は含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１７】
請求項16に記載のタンパク質又はポリペプチドをコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
【請求項１８】
遺伝的構築物の形態を有する、請求項17に記載の核酸。
【請求項１９】
少なくとも1つのVHHドメイン及び/又は少なくとも1つのナノボディを含有するか又は含むタンパク質又はポリペプチドを製造する方法であって、前記方法が、請求項17及び/又は18に記載の核酸又は請求項18に記載の遺伝的構築物を適切な宿主細胞又は宿主生物で発現させることを含む、前記タンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
請求項17及び/又は18に記載の核酸又は請求項18に記載の遺伝的構築物を含む、宿主細胞又は宿主生物。
【国際調査報告】
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