(57)【要約】  蛍光検出システムは、光源（２２）と、ダイクロイックミラー（３２）と、励起口（１６）と、放出口（１４）と、検出器とを備える。光源（２２）、例えばパルス紫外線ＬＥＤは、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光標識された種からの蛍光をゲート検出できるように、十分速く減衰する発光を備える。検出器、例えば電子増幅ＣＣＤは、高利得オンチップ増幅を備えたものである。回路（２６）は、（ｉ）２０〜２００μｓの紫外線パルスの発生、（ii）１〜５μｓ秒のゲート遅延、および（iii）１０〜８００μｓの検出時間という反復サイクルを制御するのに用いられてよい。これによって、リアルタイム、またはリアルタイムに近い作動を有する時間分解蛍光顕微鏡法が可能になる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
前記蛍光を検出する検出器と
を備え、
前記蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で前記蛍光を測定できるように、前記光源からの前記発光の減衰が十分に速いものとなっている、蛍光検出システム。
【請求項２】
前記光源がパルス発光を発生させることのできるようになっている請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項３】
前記パルス発光のパルス継続時間が、約１０ｎｓ〜約２００μｓであり、次のパルスとの間の時間が、約１μｓ〜約１ｍｓである請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項４】
前記検出器によって前記発光が検出されるのを防ぐシャッターを有さない請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項５】
前記光源からの光パルスの終わりと前記検出器による検出の開始との間にゲート遅延を与える回路を有する請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項６】
前記ゲート遅延が約１０μｓより短い請求項５に記載の蛍光検出システム。
【請求項７】
前記発光または前記自己蛍光の減衰の後の時点で、前記蛍光の最大強度と前記自己蛍光の最大強度との比が約１．５対１より大きい請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項８】
前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である時間が、約１０μｓより短い請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項９】
前記光源が、紫外線波長域での発光を発生させることのできる請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１０】
時間分解蛍光検出システムである請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１１】
当該蛍光検出システムが、顕微鏡を備え、蛍光検出顕微鏡、または時間分解蛍光検出顕微鏡である請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１２】
前記検出器が、前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）を備える請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１３】
前記光源が、２〜４００ｍＷの光出力を備えたＬＥＤ光源である請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１４】
試料内の蛍光を励起する発光を発生させる光源と、前記蛍光を検出するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）とを備える蛍光検出システム。
【請求項１５】
前記ＣＣＤが、３０倍を超えるオンチップ増幅が可能である請求項１４に記載の蛍光検出システム。
【請求項１６】
前記蛍光検出システムが、時間分解蛍光検出システム、蛍光検出顕微鏡、または時間分解蛍光検出顕微鏡である請求項１４に記載の蛍光検出システム。
【請求項１７】
オフチップ積分用の積分器も備える請求項１４に記載の蛍光検出システム。
【請求項１８】
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
前記光源からの前記発光を前記試料へと向けるダイクロイックミラーと、
前記試料からの前記蛍光を拡大する対物レンズと、
前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
前記試料から前記ＣＣＤへ前記蛍光を透過させる放出口と
を備え、
前記光源が、前記蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で前記蛍光を測定できるように、前記発光の減衰が十分に速い時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項１９】
試料内の種を検出する方法であって、前記種がフルオロフォアで標識されており、
前記試料を請求項１に従う蛍光検出システムに置くステップと、
光源からの光を前記試料に当てるステップと、
前記検出器を用いて前記試料からの蛍光を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
前記試料内の蛍光体の数を判定するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記当てるステップが、前記試料にパルス光源からの光を当てるステップを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出するステップが、
前記光源からのパルスの終わりの後、所定時間の間待つステップと、
前記所定時間の後に蛍光を検出するステップと、
前記光源からの次のパルスの開始の前に前記検出を停止するステップと
を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記所定時間（ゲート遅延）が約１０μｓより短い請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光を検出する前に、前記試料からの前記蛍光を拡大するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と
を備える、蛍光顕微鏡を改造するキットであって、
前記光源が、前記蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で前記蛍光を測定できるように、前記発光の減衰が十分に速いキット。
【請求項２６】
前記光源を制御する制御装置と、
コリメータと、
前記発光に対して、反射性、部分反射性、または高反射性であり、前記蛍光に対して透過性、部分透過性、または高透過性であるダイクロイックミラーと、
前記発光を試料へ向かって透過させる第１光透過器と、
前記蛍光を検出器および／または接眼レンズへ向かって透過させる第２光透過器と、
上述の構成要素のうちの任意の１つまたは複数を収容するハウジングと
のうちの１つまたは複数をさらに備える請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
蛍光顕微鏡を改造する方法であって、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と
から選択される１つまたは複数の構成要素を前記顕微鏡に取り付けるステップを含み、
前記光源が、前記蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で前記蛍光を測定できるように、前記発光の減衰が十分に速い方法。
【請求項２８】
前記光源を制御する制御装置と、
コリメータと、
前記発光に対して、反射性、部分反射性、または高反射性であり、前記蛍光に対して透過性、部分透過性、または高透過性であるダイクロイックミラーと、
前記発光を試料へ向かって透過させる第１光透過器と、
前記蛍光を検出器および／または接眼レンズへ向かって透過させる第２光透過器と、
上述の構成要素うちの任意の１つまたは複数を収容するハウジングと
のうちの１つまたは複数を前記顕微鏡に取り付けるステップをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法に従って改造された蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出システムに関し、詳細には、時間分解蛍光検出システムに関する。
【発明の背景】
【０００２】
様々なタイプの免疫学的検定法は、直接的または間接的に対象となる種、例えば微生物に蛍光標識を付けることを含む。動物、植物、および微生物の細胞は、かなりの量の芳香族化合物を含み、その芳香族化合物の多くは、適切な波長で励起されたときに内因的に蛍光性（自己蛍光性）である。生化学文献に述べられる生物由来の蛍光物質の範囲は広く、クロロフィル、ヘモグロビン、およびタンパク質を含む。これらの自己蛍光物質が、高い量子収量（典型的には＞０．０２）を有する場合、対象となる蛍光標識がそれに対抗して検出されなければならない、偽蛍光の問題を示すことがある。
【０００３】
自己蛍光は、可視スペクトル全域で起こる可能性があり、典型的には、ナノ秒単位の寿命（τ）を有する短命の現象である。オートフルオロフォアは、１〜１００ｎｓの範囲の蛍光寿命（τ）を有することがあり、合成フルオロフォアは、２０，０００倍を超える長さのτ（ミリ秒の寿命）を有するものが入手可能である。
【０００４】
自己蛍光の問題の深刻さを軽減するために、いくつかの方法が用いられてきており、時間分解蛍光顕微鏡法（ＴＲＦＭ）は、自己蛍光の影響を大幅に除去することができると証明された技術である。時間分解蛍光顕微鏡は、周波数領域で作動する、非常に短い寿命（ナノ秒単位）のフルオロフォアを排除するように構成されたものと、時間領域を利用し、蛍光寿命の長い（マイクロ秒を超える）フルオロフォアを用いる機器という２つタイプに大別可能である。時間分解蛍光技術は、ランタニドキレートで見られる、（比較的）長い（＞３００μｓ）蛍光寿命を利用するように開発されている。ユーロピウムキレートおよびテルビウムキレートは、その有用な可視発光（それぞれ赤色および緑色）のため蛍光標識にしばしば用いられるが、ランタニドキレートイオンにエネルギーを転移するために用いられるアンテナ分子は、通常紫外線域（３２０〜３６０ｎｍ）での励起を必要とする。時間分解蛍光法は、フルオロフォアのパルス励起を用い、その後、短命の蛍光が減衰できるようにゲート遅延段階を用いる。励起源としてストロボを使用することの不都合は、減衰するアークプラズマからの光がゼロまで確実に減衰してしまうように、ゲート遅延の長さが延長されなければならないことである。ストロボのプラズマは、定格アーク時間が１または２μｓのランプでさえも数１００μｓ持続でき、プラズマからの微弱な発光が、大部分のフルオロフォアからの弱い発光をかなりの時間不明瞭にすることがある。
【０００５】
感染の初期に起こり得る稀な有機体、または有機体が一般に培養不可能である場合の検出は、自己蛍光の存在があまり多くなくても、非常に困難である。バックグラウンド自己蛍光を抑制すると、検出成功の可能性がかなり高くなり、したがって、現在、オートフルオロフォアの存在のために蛍光顕微鏡法の技術が使用されていない環境に、蛍光顕微鏡法の技術が適用可能となる。
【０００６】
現行のいずれの技術も、すべての状況下においては自己蛍光の問題を排除しないが、狭帯域フィルタの使用が最も一般的であり、容易に利用可能な技術である。この方法では、オートフルオロフォアからの競合する蛍光を最小に抑えながら、特定の狭域励起スペクトルがプローブからの蛍光を励起するために使用される。発光スペクトルは、また、自己蛍光の影響を制限するように、狭帯域内で選択的に取り込まれる。この方法は、干渉する主なオートフルオロフォアと十分に異なるスペクトル特性を有する、適切なフルオロフォアの入手に依存している。
【０００７】
時間分解蛍光検出のためのパルス励起源を発生する従来の方法は、機械的シャッター（チョッパーホイール）の使用にしばしば依存している。この技術を用いるシステムは、リアルタイムで自己蛍光を抑制する利点を有するが、理想的ではない。このシステムは、パルス反復速度が遅い、励起パルスの立ち上がりおよび立ち下がり時間が遅い、チョッパーホイールの回転が非常に速いため振動に敏感である、および観察面全体にわたっての照明が不均一である（日出日没効果）といった不都合を有する。また、機械的システムは、一般に、電子システムよりも信頼度が低いと考えられる。励起源からの光を遮断する第２の方法は、観察者に届く光の偏光面の向きを変えるように働く強誘電性液晶に基づく。液晶は、液晶が分析器の面まで回転されない限り、すべての光の通過を遮断するような方向に向けられた２つの偏光要素の間に挟まれている。出口の分析器まで通過する正しい方向まで偏光面が回転されるように、強誘電性液晶に電圧を印加することによって、光学シャッターが制御される。強誘電性液晶シャッターの不都合な点は、シャッターの動作が比較的遅く、シャッターが最大の９０％まで開かれる、または閉じられるまでに８０μｓ必要であることである。
【０００８】
理想的には、機器の最大効率のために、紫外線励起エネルギーは、非常に急速な（マイクロ秒より短い）立ち上がりおよび立下り時間で届けられるべきである。ソリッドステートの励起源は、ナノ秒単位の正確さを有する低い電圧で容易に切り替えられるが、近紫外線スペクトルの必要とされる領域、例えば３３０〜３７０ｎｍの範囲で作動する装置は、最近まで入手できなかった。ソリッドステートの紫外線源が市場に登場するまでは、パルス紫外線を発生させるいくつかの最高とは言えない方法が用いられていた。上記の方法には、紫外線に富んだ光源を遮断する機械的チョッパー、レーザ紫外線源を偏光させる音響光学スイッチ、および（われわれの原型機器の中にあるような）高速放電ストロボを含んでいた。
【０００９】
時間分解蛍光プローブからの微弱な蛍光の検出は、典型的には、数分間にわたる微弱な信号を集積する冷却式ＣＣＤカメラ、また画像増強型の、時間ゲート式ＣＣＤカメラの使用を要していた。後者は速度については利点を有するが、分解能が冷却式ＣＣＤカメラに劣り、ＴＲＦＭシステムの最終的な費用においてコストが重大な要因である。
【００１０】
したがって、好ましくはナノ秒の時間尺度の、速い切替速度を有する蛍光検出システムが必要である。さらに、稀な蛍光事象が検出可能になるように感度を改善した蛍光検出システムが必要である。このシステムは、比較的安価であることが好ましいであろう。
【発明の目的】
【００１１】
本発明の目的は、上述の不都合の少なくとも１つを克服または実質的に改善することである。さらなる目的は、上述の必要性のうちの少なくとも１つを、少なくとも部分的に満足させることである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の広範な形態では、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
蛍光を検出する検出器とを備え、
光源からの発光の減衰が、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるようなものであるか、もしくは検出器が、蛍光を検出するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）であるか、またはその両方である蛍光検出システムが提供される。
【００１３】
本発明の第１の態様では、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
蛍光を検出する検出器とを備え、
光源からの発光の減衰が、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるような（例えば十分に速い）ものである、蛍光検出システムが提供される。
【００１４】
発光は、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるように、発光の減衰が十分に速い光パルスとすることができる。光源は、発光もしくは自己蛍光、またはその両方の減衰後の時点において、蛍光が大きくは減衰していないものがよい。発光または自己蛍光の減衰後の時点において、蛍光は、最高強度の約５０％より少ない、または最高強度の約４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１、０．５もしくは０．１％より少ない割合だけ減衰するものがよい。時間は、発光および／または自己蛍光が、元の強度の約１５％より低くなるまで、または元の強度の約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５もしくは０．０１％より低くなるまで減衰するのに十分なものがよい。発光または自己蛍光の減衰後の時点において、蛍光の最高強度と自己蛍光の最高強度との比は、約１．５対１より大きい、または約２対１、３対１、４対１、５対１、６対１、７対１、８対１、９対１、１０対１、１５対１、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、１００対１、１５０対１、２００対１、３００対１、４００対１、５００対１、１０００対１、１５００対１、２０００対１、２５００対１、３０００対１、３５００対１、４０００対１、４５００対１もしくは５０００対１より大きいものがよい。この比は、約１．５から５０００対１、または、約１．５〜１０００対１、約１．５〜５００対１、約１．５〜１００対１、約１．５〜５０対１、約１０〜５０００対１、約１００〜５０００対１、約１００〜５０００対１、約１０００〜５０００対１、約１０〜２０００対１もしくは１００〜１０００対１であってもよく、また、約１．５対１、２対１、３対１、４対１、５対１、６対１、７対１、８対１、９対１、１０対１、１５対１、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１、１５０対１、２００対１、３００対１、４００対１、５００対１、１０００対１、１５００対１、２０００対１、２５００対１、３０００対１、３５００対１、４０００対１、４５００対１または５０００対１であってもよい。時間は、約１０μｓより短いもの、または約９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１μｓより短いものがよい。この時間は、約５０ｎｓ〜１０μｓの間、約５０ｎｓ〜１μｓの間、または約５０〜５００ｎｓ、約５０〜２００ｎｓ、約５００ｎｓ〜５μｓ、約１〜１０μｓ、約１〜５μｓ、もしくは約１〜２μｓの間とすることができ、また、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００ｎｓ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０μｓとすることができる。
【００１５】
光源は、ソリッドステートの光源とすることができ、発光ダイオード（ＬＥＤ）とすることができる。光源は、窒化ガリウム（ＧａＮ）系、または窒化インジウムガリウム（ＩｎＧａＮ）系のＬＥＤとすることができる。光源は、紫外線波長域、例えば約２７５ｍｎ〜約３９５ｎｍの間の範囲で発光を発生させることのできるものがよく、蛍光標識分子または蛍光標識で標識された種によって吸収可能である波長の発光を発生させることのできるものがよい。光源は、パルス発光を発生させることのできるものがよい。パルス発光のパルス継続時間は、約１０ｎｓ〜約２００μｓの間がよく、次のパルスとの間の時間は、約１μｓ〜約１ｍｓの間とすることができる。光源は、約２〜１００ｍＷの間の光出力を有するものとすることができる。蛍光検出システムは、時間分解蛍光検出システムとすることができる。蛍光検出システムは顕微鏡を備えることができ、蛍光検出顕微鏡、または時間分解蛍光検出顕微鏡（ＴＲＡＭ）とすることができる。蛍光検出システムは、試料からの蛍光を検出する少なくとも１つの検出器を有することができく、オペレータが試料の観察をできるようにする接眼レンズを有することができ、検出器と接眼レンズとの間を切り替える、および／または異なるタイプの検出器の間で切り替えるための切替装置を有することができる。時間分解検出システムは、ゲート遅延（すなわち光源からの光パルスの終わりと検出器による検出の開始との間の時間）を与える制御装置を有することができ、ゲート遅延は精密に制御されることができる。ゲート遅延は、約１０μｓより短いものとすることができる。システムはまた、検出器からのデータを取得、保存、および／または与えるコンピュータを有することができる。システムは、発光が検出器によって検出されるのを防ぐシャッターを有さないものとすることができる。
【００１６】
一実施形態では、試料内の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、蛍光を検出する検出器とを備え、その発光が約１０μｓ以内、または約１μｓ以内に減衰する蛍光検出システムが提供される。
【００１７】
別の実施形態では、蛍光検出システムは、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させ、その発光が約１０μｓ以内、または約１μｓ以内に減衰する光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を検出する検出器と、
任意選択で、オペレータが試料を観察できるようにする接眼レンズと、
任意選択で、検出器と接眼レンズとの間を切り替える切替装置と、
試料から検出器または接眼レンズへ蛍光を透過させる放出口と
を備える。
【００１８】
さらに別の実施形態では、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させる光源であり、その発光が約１０μｓ以内または約１μｓ以内に減衰し、約１０ｎｓ〜約２００μｓの間のパルスを有し、次のパルスとの間の時間が約１０μｓ〜約１０ｍｓの間であるパルス発光を発生させることのできる光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を拡大する対物レンズと、
試料からの蛍光を検出する検出器と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
試料から検出器へ蛍光を透過させる放出口と
を備える時間分解蛍光顕微鏡が提供される。
【００１９】
本発明の第２の態様では、試料内の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、蛍光を検出するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）とを備える蛍光検出システムが提供される。
【００２０】
ＣＣＤは、３０倍を超えるオンチップ増幅のできるものすることができ、高利得ＣＣＤとすることができる。蛍光検出システムは、時間分解蛍光検出システムとすることができる。蛍光検出システムは、顕微鏡を有するものとすることができ、蛍光検出顕微鏡または時間分解蛍光検出顕微鏡とすることができる。このシステムは、オフチップ積分用の積分器を備えるものとすることができる。積分器は、コンピュータ、データ処理装置、フィールドプログラマブルゲートアレイ、または何らかの他の適切な積分器とすることができる。
【００２１】
一実施形態では、蛍光検出システムは、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅ＣＣＤ検出器と、
試料から検出器へ蛍光を透過させる放出口と
を備える。
【００２２】
別の実施形態では、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させるパルス光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を拡大する対物レンズと、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅ＣＣＤ検出器と、
検出器からの信号を積分するオフチップ積分器と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
試料から検出器へ蛍光を透過させる放出口と
を備える時間分解蛍光顕微鏡が提供される。
【００２３】
本発明の第３の態様では、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と
を備え、
上記光源が、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるように発光の減衰が十分に速い、蛍光検出システムが提供される。光源は、発光もしくは自己蛍光、またはその両方の減衰後の時点で、蛍光が大きく減衰していないものとすることができる。
【００２４】
発光または自己蛍光の減衰後の時点で、蛍光は、その最高強度の約５０％より少ない割合、またはその最高強度の４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、１、０．５もしくは０．１％より少ない割合だけ減衰するものとすることができる。時間は、発光および／または自己蛍光が、元の強度の約１５％より低くなるまで、または元の強度の約１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５もしくは０．０１％より低くなるまで減衰するのに十分なものとすることができる。時間は約１０μｓより短いものとすることができ、約９、８、７、６、５、４、３、２または１μｓより短いものとすることができる。この時間は、約５０ｎｓ〜１０μｓの間、約５０ｎｓ〜１μｓの間、または約５０〜５００ｎｓ、約５０〜２００ｎｓ、約５００ｎｓ〜５μｓ、約１〜１０μｓ、約１〜５μｓ、もしくは約１〜２μｓの間とすることができ、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００ｎｓ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０μｓとすることができる。
【００２５】
光源は、ソリッドステートの光源とすることができ、発光ダイオード（ＬＥＤ）がよい。光源は、窒化ガリウム（ＧａＮ）系、または窒化インジウムガリウム（ＩｎＧａＮ）系のＬＥＤとすることができる。光源は、紫外線波長域、例えば約２７５ｍｎ〜３９５ｎｍの間の範囲で発光を発生させることのできるものがよく、蛍光標識分子によって吸収可能である波長の発光を発生させることのできるものがよい。光源は、パルス発光を発生させることのできるものがよい。パルス発光のパルス継続時間は約１０ｎｓ〜約２００μｓの間とすることができ、次のパルスとの間の時間は１０μｓ〜約１０ｍｓの間であるものとすることができる。ＬＥＤ光源は、約２〜１００ｍＷの間の光出力を有するものがよい。好ましい励起源は１００ｍＷの高出力である。
【００２６】
ＣＣＤは、３０倍を超えるオンチップ増幅のできるものがよく、高利得ＣＣＤがよい。蛍光検出システムは、時間分解蛍光検出システムとすることができる。このシステムは、約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置を有するものとすることができる。蛍光検出システムは、顕微鏡を備えることができ、蛍光検出顕微鏡または時間分解蛍光検出顕微鏡とすることができる。このシステムは、オフチップ積分用の積分器も備えるものとすることができる。積分器は、コンピュータ、もしくデータ処理装置、もしくはフィールドプログラマブルゲートアレイ、または何らかの他の適切な積分器とすることができる。
【００２７】
一実施形態では、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させ、その発光が約１μｓ以内に減衰する光源と、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と
を備える蛍光検出システムが提供される。
【００２８】
別の実施形態では、蛍光検出システムは、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させ、その発光が約１μｓ以内に減衰する光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
検出器からの信号を積分するオフチップ積分器と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
試料からＣＣＤへ蛍光を透過させる放出口と
を備える。
【００２９】
本発明の第４の態様では、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を拡大する対物レンズと、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
試料からＣＣＤへ蛍光を透過させる放出口と
を備え、
上記光源が、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるように発光の減衰が十分に速い時間分解蛍光顕微鏡が提供される。光源は、発光もしくは自己蛍光、またはその両方の減衰後の時点で、蛍光が大きく減衰していないものとすることができる。光源は、約２〜１００ｍＷの間の光出力を有することができる。顕微鏡は、オフチップ積分用の積分器も備えることができる。積分器は、コンピュータ、データ処理装置、フィールドプログラマブルゲートアレイ、または何らかの他の適切な積分器とすることができる。
【００３０】
一実施形態では、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させる光源であり、その発光が約１０μｓ以内または約１μｓ以内に減衰し、約１０ｎｓ〜約２００μｓの間のパルスを有し、次のパルスとの間の時間が約１μｓ〜約１０ｍｓの間であるパルス発光を発生させることのできる、光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を拡大する対物レンズと、
試料からの蛍光が拡大された後に、その蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
検出器からの信号を積分するオフチップ積分器と、
約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
試料からＣＣＤへ蛍光を透過させる放出口と
を備える時間分解蛍光顕微鏡が提供される。
【００３１】
本発明の第５の態様では、試料内の種を検出するおよび／または計数する方法が提供され、前記種はフルオロフォアで標識付けされており、前記方法は、
本発明に従った蛍光検出システム、または本発明に従った時間分解蛍光顕微鏡内に試料を置くステップと、
試料を光源からの光に当てるステップと、
検出器を用いて試料からの蛍光を検出するステップと、
任意選択で、試料内の蛍光体の数を判定するステップと
を含む。
【００３２】
当てるステップは、試料をパルス光源からの光に当てるステップを含み、検出するステップは、
光源からのパルスが終わった後、所定の時間だけ待つステップと、
所定の時間の後、蛍光を検出するステップと、
光源からの次のパルスが始まる前に、検出を停止するステップと
を含む。
【００３３】
所定の時間（ゲート遅延）は、約１０μｓより短いものとすることができる。この方法はまた、試料からの蛍光を検出する前にその蛍光を拡大するステップを有するものとすることができる。
【００３４】
本発明の第６の態様では、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）とから選択される１つまたは複数の構成要素を含み、
上記光源が、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるように発光の減衰が十分に速い、蛍光顕微鏡を改造するキットが提供される。光源は、発光もしくは自己蛍光、またはその両方の減衰後の時点で、蛍光が大きく減衰していないものとすることができる。
【００３５】
光源は、発光が約１μｓ以内に減衰するものとすることができる。発光または自己蛍光のパルスの減衰後の時点で、蛍光は、その最高強度の約５０％より少ない割合、またはその最高強度の４０、３０、２５、２０、２５、１０、５、２、１、０．５もしくは０．１％より少ない割合だけ減衰するものとすることができる。時間は、パルスおよび／または自己蛍光が、元の強度の約１５％より低くなるまで、または元の強度の約１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５もしくは０．０１％より低くなるまで減衰するのに十分なものとすることができる。時間は約１０μｓより短いもの、または９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１μｓより短いものとすることができる。この時間は、約５０ｎｓ〜１０μｓの間、約５０ｎｓ〜１μｓの間、または約５０〜５００ｎｓ、約５０〜２００ｎｓ、約５００ｎｓ〜５μｓ、約１〜１０μｓ、約１〜５μｓもしくは約１〜２μｓの間であってもよく、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００ｎｓ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０μｓであってもよい。光源は、約１０ｎｓ〜約２００μｓの間のパルスを有し、次のパルスとの間の時間が約１０μｓ〜約１０ｍｓの間であるパルス発光を発生させることのできるものであってもよい。光源は、約２〜１００ｍＷの間の光出力を有するものとすることができる。
【００３６】
キットは、次に列挙する要素のうち少なくとも１つを備える。
−  光源を制御する、例えば光源のパルスを制御する制御装置。制御装置は、プリント回路基板、コンピュータ、マイクロプロセッサ、チップ、マイクロチップ、または何らかの他の制御装置とすることができる。制御装置はＣＣＤを制御することができる。制御装置は、約１０μｓより短いゲート遅延を与えることのできるものであってもよい。
−  コリメータ、例えばコリメータレンズ。
−  発光に対して反射性、部分反射性、もしくは高反射性である、または蛍光に対して透過性、部分透過性、もしくは高透過性であるダイクロイックミラー。
−  試料へ向かって発光を透過させる第１の光透過器。第１の光透過器はまた、試料からダイクロイックミラーへ向かって蛍光を透過させる働きをしてもよい。第１の光透過器は、ウインドウ、ポート（例えば励起口）、または何らかの他の透過器とすることができる。第１の光透過器は、発光に対して透過性、部分透過性、高透過性とすることができ、蛍光に対して透過性、部分透過性、高透過性としてもよい。
−  検出器および／または接眼レンズへ向かって蛍光を透過させる第２の光透過器。第２の光透過器は、ウインドウ、ポート（例えば放出口）、または何らかの他の透過器であってもよい。第２の光透過器は、蛍光に対して透過性、部分透過性、高透過性であってもよい。
−  上記の構成要素うちの１つまたは複数を収容する、フィルタボックスハウジングなどのハウジング。
【００３７】
一実施形態では、キットは、
試料内の蛍光を励起するための発光を発生させ、その発光が約１０μｓ以内または約１μｓ以内に減衰する光源と、
発光を光源から試料へと向けるダイクロイックミラーと、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
試料からＣＣＤへ蛍光を透過させる放出口と
を備える。
【００３８】
別の実施形態では、キットは、
試料内の蛍光を励起するためのパルス発光を発生させ、その発光が約１０μｓ以内または約１μｓ以内に減衰する光源と、
光源のパルスを制御し、約１０μｓより短いゲート遅延を与える制御装置と、
発光を平行にするコリメータと、
発光を試料へと向けるダイクロイックミラーと、
発光を試料へ向かって透過し、試料からの蛍光をダイクロイックミラーへ向かって透過させる第１の光透過器と、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
ＣＣＤへ向かって蛍光を透過させる第２の光透過器と
を備える。
【００３９】
本発明の第７の態様では、本発明によるキットを前記顕微鏡に取り付けるステップを含む、蛍光顕微鏡を改造する方法が提供される。本方法は、前記顕微鏡に、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させる光源と、
試料からの蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）とから選択される１つまたは複数の構成要素を取り付けるステップを含むものであり、
前記光源は、蛍光を自己蛍光と区別可能である時点で蛍光を測定できるように発光の減衰が十分に速いものである。
【００４０】
本発明はまた、本発明に従ったキットを備える蛍光顕微鏡を提供し、さらに本発明の第７の態様の方法に従って改造された蛍光顕微鏡を提供する。
【００４１】
以下、添付の図面を参照して、本発明の好ましい形態を例として説明する。
【好ましい実施形態の詳細な説明】
【００４２】
本明細書に開示される本発明は、ある実施形態において、時間領域で作動し、２００μｓより長い蛍光寿命τを有する蛍光色素を使用する、時間分解蛍光顕微鏡（ＴＲＦＭ）などの蛍光検出システムの改良された構成に関する。光源によって励起されたときに試料内のオートフルオロフォアから発生される短命の自己蛍光と、合成フルオロフォアの励起から起こることのある比較的長命の蛍光とを区別するため、１つの方策は、非常に速い減衰特性を有する光源を使用することである。この方法において、励起光は急速に減衰し、その結果、比較的短い時間にわたってオートフルオロフォアが励起される。自己蛍光が十分に低いレベルにまで減衰した後も、合成フルオロフォアからの蛍光はまだ検出可能であろう。したがって、自己蛍光が十分に低いレベルまで減少した後（すなわち適切なゲート遅延の後）においてのみ検出が開始される場合、自己蛍光は合成フルオロフォアからの蛍光と区別されて、合成フルオロフォアからの蛍光のみの検出が可能になる。合成フルオロフォアが対象の種に選択的に付けられると、これによってその対象の種の検出、および任意選択で計数が可能になる。別の方策は、高感度検出器を使用することである。この方法では、自己蛍光が減衰できる比較的長い遅延の後でも、合成検出器からの残留蛍光が検出可能である。高感度検出器と急速に減衰する励起光源とを使用してこれらの方策を組み合わせることにより、発明者らは、従来技術の欠点の少なくともいくつかを回避しながら、蛍光検出の感度と選択性が大幅に改善可能であることを発見した。本発明に関連して用いる適切なフルオロフォアは、例えば国際公開第２００５／０８５１９３号パンフレットに述べられており、その内容が参照により本明細書に援用される。本発明は、パラジウムまたはプラチナを含むフルオロフォアなどの、例えば約３０〜１２０μｓの間という短い蛍光寿命（すなわち約３０〜１００μｓ、３０〜８０μｓ、３０〜５０μｓ、５０〜１２０μｓ、８０〜１２０μｓ、１００〜１２０μｓ、５０〜１００μｓ、５０〜７５μｓ、もしくは７５〜１００μｓの間、または約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０もしくは１００μｓの蛍光寿命）のフルオロフォアに関連した使用に特に適するであろう。これは、本発明で適用可能である短いゲート遅延に起因するものであろう。パラジウムまたはプラチナコプロポルフィリン標識などの金属ポルフィリンは、例えば、ｄｅＨａａｓ，Ｒ．らの「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」４７（２月）号、１９９９年、１８３〜１９６ページ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｊｈｃ．ｏｒｇ）に使用、および説明されており、その内容が参照により本明細書に援用される。
【００４３】
本システムの光源は、従来の光源よりも速い減衰時間を有するものとすることができる。本システムの検出器は、従来の検出器よりも高感度を備えるものがよい。本発明の蛍光システムは、従来のシステムに比べて改善された検出感度を有するものがよい。改良された光源および／または改良された検出器は、既存の光源および／または検出器よりも高価でなく、より安価なものであってもよい。本システムは、検出器が光を検出可能である時間の間において、光源からの発光が検出器に届くのを妨げるシャッターを有さないものであってもよい。このシステムは、検出が始まる時間までに発光が減衰してしまい、検出器によって発光が検出されないように、光源からの光パルスの終わりと検出器による検出の開始との間にゲート遅延を与える回路を有するものとしてもよい。本システムは、検出器からの信号の高速オフチップ積分が可能であるものとしてもよい。
【００４４】
ＴＲＦＭの基礎をなす原理が、Ｘ軸に時間を、Ｙ軸に光の強度を有するグラフを示す、図１に示されている。ＴＲＦＭサイクルは、プローブフルオロフォア（ランタニドキレートなど）からの蛍光、ならびに存在する可能性のある任意の自己蛍光を励起する、ここでは方形波として理想化されている、光の短いパルスで始まる。この光パルスの後、自己蛍光は、拡大図に示されているようにナノ秒単位以内に減衰するが、プローブフルオロフォアから発生する蛍光は、数１００μｓ長く持続する。時間分解段階は、励起パルスの終わりと信号取得時間の始まりとの間に起こるゲート遅延時間に対応する。信号取得時間の長さはプローブフルオロフォアの蛍光寿命に依存し、様々な溶媒環境によって異なる。最短のゲート遅延長さは、ほとんどのＴＲＦＭ機器において励起光パルスの減衰速度によって制御される。本明細書では、蛍光標識された種によって放出される「蛍光」と、フルオロフォアによって標識されていないが検査中の試料内に起こる、本来蛍光性である物質によって放出される「自己蛍光」（または本質的蛍光）とが区別される。
【００４５】
本明細書に開示されたシステムでは、検出器は、短いゲート遅延に続いて単一の励起イベントを取り込むことができ、その後、時間分解蛍光画像が外部に保存されることができる。この操作は高速で繰り返されることができ、リアルタイムで平均化された画像が最終画像を与える。上記のようにすることで、励起段階の間に光源からの光が検出器に届くのを遮断する電子的または機械的シャッターの必要がなくなり、蛍光の画像センサに対する光学転送効率を最大にすることができる。この技術は、本明細書に説明される検出器の高利得によって実現可能にされる。したがって、本明細書に開示されるシステムは、シャッターを有さないものとすることができる。検出器が制御回路によって光を検出できる時間の間は、光源からの発光が検出器に直接届くのを妨げられるようにすることができる。励起源からの発光は検出器に届くことができるが、発生されたすべての光電子が直ちにアースに分路され、励起パルスが終了するまでこの状態が維持されるように、センサへの制御線がゲート制御される。検出が開始されるときまでに発光が減衰してしまい、発光が検出器によって検出されないように、この回路は、光源からの光パルスの終わりと検出器による検出の開始との間に適切なゲート遅延を与える。
【００４６】
３６５ｎｍ（ＦＷＨＭ１０ｎｍ）で発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）が最近入手可能になったことが、そのＬＥＤが時間分解蛍光の用途に適するという評価を後押しした。ゲート遅延時間に続いて取り込まれる蛍光放出は、典型的には強度が低く、画像増強装置がＣＣＤカメラと併せて用いられるとよい。画像増強装置を備えたカメラは高価であり、通常、冷却を必要とし、従来型のＣＣＤカメラと比較して大型である。電圧への変換の前に電荷領域内で直接電荷を倍増できる新世代のＣＣＤ画像センサが、最近入手可能になった。倍増する量は倍増パルスの振幅に依存して調節可能であり、利得が２０００倍より大きいカスタムメイドのＣＣＤ画像センサが、日本テキサスインスツルメンツ株式会社（〒１６４−８３６６東京都新宿区西新宿６−２４−１西新宿三井ビル）から市販されている。この装置の機能は、ソリッドステートで実現される画像増強装置の機能に似ている。冷却されると、電荷増幅ＣＣＤは、強度の低い蛍光信号を有用なレベルにまで集積、増幅できる。本明細書に開示される発明は、ある実施形態において、時間分解蛍光を取り込むための電荷増幅ＣＣＤ画像センサと併せて、安価な紫外線ＬＥＤを励起源として用いるように市販の蛍光顕微鏡を改造することが説明される。
【００４７】
自己蛍光は、免疫蛍光検査法で標識された有機体の、蛍光顕微鏡法を用いた検出を妨げることのある重大な問題である。本明細書に開示されるリアルタイムの時間分解蛍光顕微鏡は、取込待ち時間なく、顕微鏡試料内の本質的な蛍光（自己蛍光）を抑制することが意図される。この機器は、短命の自己蛍光を強く抑制しながら、長命の蛍光のみを検出器（例えば目または電子カメラ）に伝達できるように構成されている。その最終結果は、非特定の自己蛍光に対するプローブ蛍光の強化である。
【００４８】
本発明のＬＥＤは、紫外線域、概して近紫外線域での放射を与えることができる。ＬＥＤによって発生される波長は、約２７５〜３９５ｎｍの間、または約３００〜４００ｎｍ、約３２５〜４００ｎｍ、約３５０〜４００ｎｍ、約３７５〜４００ｎｍ、約３００〜３７５ｎｍ、約３００〜３５０ｎｍ、約３２５〜３７５ｎｍ、もしくは約３５０〜３７５ｎｍの間の範囲とすることができ、約３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５もしくは４００ｎｍとすることができる。例えば、窒化ガリウム（ＧａＮ）ＬＥＤは、約３６５ｎｍの光を出すことができ、ＧａＮ／シリコンカーバイドＬＥＤは、約３９５ｎｍの光を出すことができる。ＬＥＤの発光のＦＷＨＭ（半値全幅）は、約５〜２０ｎｍの間、または約５〜１５ｎｍ、約５〜１０ｎｍ、約１０〜２０ｎｍ、約１５〜２０ｎｍもしくは約１０〜１５ｎｍの間とすることができ、約５、１０、１５もしくは２０ｎｍとすることができる。発光の波長は、蛍光標識を付けられた種において蛍光を励起するのに適するものとすることができる。本発明で用いられてよい他のＬＥＤは、ＩｎＧａＮ（窒化インジウムガリウム）、ＩｎＮ（窒化インジウム）、ＡｌＧａＮ（窒化アルミニウムガリウム）、またはＩｎＡｌＧａＮ（窒化インジウムアルミニウムガリウム）ＬＥＤである。約４０５ｎｍの波長を出すレーザダイオード（例えば日亜化学工業株式会社製）も入手可能である。日亜化学工業株式会社（〒１０８−００１４東京都港区芝５−３４−７）から入手可能なＩｎＧａ系の紫外線ＬＥＤの例は、型式ＮＣＣＵ００１（ピークスペクトル３８０ｎｍ）およびＮＣＣＵ０３３（ピークスペクトル３６５ｎｍ）のＬＥＤである。
【００４９】
ＬＥＤの光出力は約２ｍＷより大きいか、または約３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００ｍＷより大きいものとすることができ、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、もしくは４００ｍＷであるか、または約４００ｍＷより大きいものとすることができる。励起が強いと、フルオロフォアがより効果的に活性化される結果となる。時間分解フルオロフォアのピーク波長感度とＬＥＤ波長（それぞれ３３７ｎｍおよび３６５ｎｍ）との違いを考慮すると、これは特に意味のあることである。
【００５０】
ＬＥＤは、単一のファセットまたは複数のファセットを備えるものとすることができる。例えば、日亜化学製のあるＬＥＤは、５×５窒化ガリウムファセットからなる約１ｍｍ四方のチップを備える。この結果、試料上に強度パターンができるであろう。したがって、本システムは、強度パターンを解決するため、もしくは少なくとも部分的に除去するために、適切な光学部品と併せてビームホモジェナイザを備えてもよい、または、コンピュータまたは電子部品が、強度パターンを緩和する、解決する、もしくは少なくとも部分的に除去するためのソフトウエアを有してもよい。このような方策は、ＬＥＤが単一のモノリシック窒化ガリウムチップ備える場合には不必要であろう。
【００５１】
本技術分野で既知の多くの蛍光標識があり、これらの蛍光標識は、例えば、置換テルフェニル部分と錯体を形成したランタニドイオンを含むフルオロフォアを含むものとすることができる。このようなフルオロフォアは、例えば３４０ｎｍ近辺の最大吸収（すなわち最大吸光度）を有するものとすることができるが、吸収幅が広いために、波長約３６５ｎｍのＬＥＤにおける吸光度は、最大吸光度の約４０％とできる。これは、本発明の蛍光検出システムにとって十分な蛍光を出すであろう。ＬＥＤ発光の波長での吸光度の、フルオロフォアの最大吸光度に対する比は、約１０〜１００％の間、または１０〜８０％、１０〜６０％、１０〜４０％、２０〜１００％、４０〜１００％、６０〜１００％、２０〜９０％、３０〜８０％、もしくは３０〜６０％の間とすることができ、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％とすることができる。この比が大きくなると、フルオロフォア検出システムの感度がより高くなる。
【００５２】
時間分解蛍光顕微鏡法においては、一般に、試料が光源からの発光によって照射され、これによって試料内の蛍光を励起させる。適切なフルオロフォアで意図的に標識された種は、蛍光を検出することにより検出可能である一方、そのように標識されていない藻類などの他の種（すなわちオートフルオロフォア）も蛍光を発するであろう。しかし、意図的に標識された種からの蛍光は、典型的には、オートフルオロフォアからの蛍光が減衰するよりもずっと長い時間にわたって減衰する。典型的には、標識された種からの蛍光は、約５０μｓより長い時間、または約１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、もしくは７００μｓより長い時間、または約５０〜７５０μｓの間、または約１００〜７５０μｓ、約２００〜７５０μｓ、約５００〜７５０μｓ、約５０〜５００μｓ、約５０〜２５０μｓ、約５０〜１００μｓ、約１００〜６００μｓ、約１００〜５００μｓ、約２００〜５００μｓ、もしくは約２００〜３５０μｓの間の時間、または約５０、１００、１５０、２００、２４０、２５０、３００、３５０、４００、５００、５５０、６００、６４０、６５０、７００もしくは７５０μｓの時間にわたって減衰するものとすることができる。しかしながら、オートフルオロフォアからの蛍光は、約１μｓよりも短い時間、または約５００、２００、１００、５０、もしくは２０ｎｓよりも短い時間、または約１〜１０００ｎｓ、５〜１０００ｎｓ、１０〜１０００ｎｓ、５０〜１０００ｎｓ、１００〜１０００ｎｓ、５００〜１０００ｎｓ、１〜５００ｎｓ、１〜２００ｎｓ、１〜１００ｎｓ、１〜５０ｎｓ、１〜２０ｎｓ、１〜１０ｎｓ、１０〜５００ｎｓ、５０〜２００ｎｓ、もしくは５０〜１００ｎｓの間、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００ｎｓの時間にわたって減衰することができる。したがって、ＬＥＤからの発光パルスの後、検出開始の前にゲート遅延を挿入することにより、不要な蛍光と標識された種からの蛍光とを区別することが可能になるであろう。パルスの名目上の終わりの後（すなわち発光パルスの減衰時間の間）にＬＥＤから発光すると、オートフルオロフォアからの残留蛍光がゲート遅延を超えて長引く可能性があるため、光源からの発光の減衰は速いほうが望ましいのは明らかである。標識された種からの蛍光が、検出時間の間、可能な限り強くなるように、不要な蛍光を十分に減少させることと併せて、ゲート遅延を可能な限り短くすることが望ましいこともやはり明らかである。検出開始の前の遅延（ゲート遅延）は、約２０μｓより短いか、約１５、１０、５、２もしくは１μｓより短いか、または約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、２００、１００もしくは５０ｎｓより短くすることができ、約１０μｓ〜１０ｎｓの間、または約１０μｓ〜１００ｎｓ、１０μｓ〜５００ｎｓ、１０〜１μｓ、１０〜５μｓ、８μｓ〜５００ｎｓ、５μｓ〜５００ｎｓ、２μｓ〜５００ｎｓ、１μｓ〜１０ｎｓ、５００〜１０ｎｓ、１００〜１０ｎｓ、５μｓ〜５００ｎｓ、８〜１μｓ、もしくは５〜１μｓの間とすることができ、約１０、５０、１００、２５０、５００もしくは７５０ｎｓ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０μｓとすることができる。ゲート遅延は、ゲート遅延の後に、蛍光が自己蛍光と区別可能であるのに十分な長さとすることができる。ゲート遅延は、ゲート遅延の後に、蛍光の最大強度と自己蛍光の最大強度との比が、約１．５対１より大きいものとすることができ、または約２対１、３対１、４対１、５対１、６対１、７対１、８対１、９対１、１０対１、１５対１、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、１００対１、１５０対１、２００対１、３００対１、４００対１、５００対１、１０００対１、１５００対１、２０００対１、２５００対１、３０００対１、３５００対１、４０００対１、４５００対１もしくは５０００対１より大きくなるのに十分な長さとすることができる。この比は、約１．５〜５０００対１、または約１．５〜１０００対１、約１．５〜５００対１、約１．５〜１００対１、約１．５〜５０対１、約１０〜５０００対１、約１００〜５０００対１、約１００〜５０００対１、約１０００〜５０００対１、約１０〜２０００対１もしくは約１００〜１０００対１とすることができ、約１．５対１、２対１、３対１、４対１、５対１、６対１、７対１、８対１、９対１、１０対１、１５対１、２０対１、３０対１、４０対１、５０対１、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１、１５０対１、２００対１、３００対１、４００対１、５００対１、１０００対１、１５００対１、２０００対１、２５００対１、３０００対１、３５００対１、４０００対１、４５００対１もしくは５０００対１とすることができる。ＬＥＤからの発光パルスは、ＬＥＤを流れる電流によって起動される。したがって、パルスの長さは、電流の流れの継続時間に対応する。光パルスの終わりとみなされてよい電流の流れの停止の後、ＬＥＤからの発光が、ある時間の間にわたって減衰する。ＬＥＤによって放出される光パルスの減衰は、約１０μｓより短い、約８、５、２もしくは１μｓより短い、約７５０、５００、２５０、１００もしくは５０ｎｓより短いことを要し、または約１０ｎｓ〜約１０μｓの間、約１〜約１０μｓの間、約２〜約１０もしくは約５〜約１０μｓの間、約１００ｎｓ〜約１μｓの間、約５００ｎｓ〜約１μｓの間、約１０〜約５００ｎｓの間、約１０〜約１００ｎｓの間、約５００ｎｓ〜約１０μｓの間、約５００ｎｓ〜約８μｓの間、もしくは約５００ｎｓ〜約５μｓの間の時間を要し、約１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００もしくは９００ｎｓ、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０μｓの時間を要するものとすることができる。本目的のためには、光パルスの減衰は、パルスが元の強度の１５％まで弱くなる、または元の強度の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５もしくは０．０１％まで弱くなる時間とみなすことができる。光源は、低電圧の光源とすることができ、約１〜２０Ｖ、約１〜１０Ｖ、１〜５Ｖ、１〜２Ｖ、２〜２０Ｖ、５〜２０Ｖ、１０〜２０Ｖ、もし��は５〜１０Ｖの間の作動電圧を有するものとすることができ、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０Ｖの作動電圧を有するものとすることができる。ＬＥＤの仕事率は、約１ｍＷ〜１Ｗの間、約１〜５００ｍＷの間、または約１〜２００ｍＷ、１〜１００ｍＷ、１〜５０ｍＷ、１〜２０ｍＷ、１０〜１０ｍＷ、１〜５ｍＷ、１０〜１０００ｍＷ、１００〜１０００ｍＷ、５００〜１０００ｍＷ、１０〜５００ｍＷ、もしくは５０〜２００ｍＷの間とすることができ、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００ｍＷとすることができる。ＬＥＤの仕事率は、その使用条件の下で、蛍光色素を光漂白しないような十分な低さのものであってもよい。
【００５３】
光源からの発光はパルス化されてもよく、パルスの長さは、約１０ｎｓ〜５００μｓの間、または約１０ｎｓ〜２００μｓ、１０ｎｓ〜１００μｓ、１０ｎｓ〜１０μｓ、１０ｎｓ〜１μｓ、１０〜５００ｎｓ、１０〜１００ｎｓ、１００ｎｓ〜２００μｓ、１〜２００μｓ、１０〜２００μｓ、５０〜２００μｓ、１〜１００μｓ、もしくは１０〜１００μｓの間とすることができ、約１０、５０、１００、２５０、５００もしくは７５０ｎｓ、または約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００μｓとすることができる。各パルス間の時間は、約１μｓ〜１ｍｓの間、約１〜５００μｓ、１〜２００μｓ、１〜１００μｓ、１〜５０μｓ、もしくは１〜１０μｓの間、または約１００μｓ〜１ｍｓ、５００μｓ〜１ｍｓ、もしくは１００〜５００μｓの間とすることができ、約１、５、１０、５０、１００、２５０、５００もしくは７５０μｓ、または約１ｍｓとすることができる。本発明によるＬＥＤ光源の使用は、時間分解蛍光顕微鏡でストロボ光源と併せて通常用いられる、ＩＲフィルタなどのフィルタの必要性をなくす。ゲート遅延の後、検出器は、試料からの蛍光を検出するように、約１０〜１０００μｓの間、または約１０〜５００μｓ、１０〜２００μｓ、１０〜１００μｓ、１０〜５０μｓ、５０〜１０００μｓ、１００〜１０００μｓ、５００〜１０００μｓ、５０〜５００μｓ、もしくは５０〜２００μｓの間の時間起動されてよく、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００μｓの時間起動することとしてもよい。画像を取り込むために複数のサイクルが行われてもよく、その各サイクルは、光パルスの発生、ゲート遅延の適用、蛍光の検出を含む。１つの画像を取り込むために、１〜１０００サイクルの間のサイクルが行われてもよく、または約１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００、５０〜５００、５０〜２００、１００〜５００、もしくは２００〜３００のサイクル、および約１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、２５５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００サイクルが行われてもよい。
【００５４】
本発明に従った蛍光検出システムの感度を改善する手段は、システムの検出器の感度を改善することである。検出器は、蛍光検出用の任意の適切な検出器とすることができ、例えばＣＣＤ、ＣＭＯＳ、光電子倍増管、ソリッドステート源もしくは何らかの他の電子検出器、写真フィルムなどの感光フィルムであってもよく、または人の目であってもよい。ＣＣＤは、非常に低いノイズ、非常に高い感度、電気的に可変の電荷領域利得を有するものがよい。蛍光検出システムは、種を画像化するためではなく、種を計数するのに使用される可能性があるため、ＣＣＤは低解像度ＣＣＤとすることができる。ＣＣＤは、オンチップ増幅を有するものがよく、増幅は２０倍より大きいか、または３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、もしくは１０００倍より大きいものとすることができ、約２０〜１０００倍の間、または約２０〜５００、２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０、５０〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００、３０〜５００、もしくは５０〜２００倍の間とすることができ、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００倍とすることができる。ＣＣＤは冷却されてもよい。本発明での使用に適するＣＣＤは、例えばＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製の「Ｉｍｐａｃｔｒｏｎ」ＣＣＤである。検出器は、可視域、すなわち約４００〜７００ｎｍの波長の範囲、または約４００〜５５０ｎｍ、５５０〜７００ｎｍ、５００〜６００ｎｍ、もしくは６００〜７００ｎｍの間の範囲の蛍光を検出可能なものとすることができ、約４００、４５０、５００、４５０、６００、６５０および７００ｎｍから選択される１つまたは複数の波長を有する蛍光を検出可能なものとすることができる。本発明と併せて用いられてよい適切なユーロピウム系のフルオロフォアは、約６１７ｎｍの蛍光を出すことができる。本発明に従ったシステムは、２つ以上の検出器を有してもよく、また、２つ以上のタイプの検出器を有してもよい。検出器は、同時に検出するように構成されていてもよく、または検出器と検出器の間を切り替える切替装置があってもよい。
【００５５】
本発明に従った蛍光検出システムは、顕微鏡、顕微鏡の対物レンズ、拡大レンズまたは何らかの他の拡大装置などの拡大装置を備えてよい。拡大装置から得ることのできる倍率は、約２Ｘ〜２０００Ｘの間、または約２Ｘ〜１０００Ｘ、２Ｘ〜５００Ｘ、２Ｘ〜１００Ｘ、２Ｘ〜５０Ｘ、１００Ｘ〜２０００Ｘ、５００Ｘ〜１０００Ｘ、５００Ｘ〜２０００Ｘ、１０Ｘ〜１０００Ｘ、もしくは１００Ｘ〜５００Ｘの間とすることができ、約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、もしくは２０００Ｘとすることができる。
【００５６】
本発明に従った蛍光システムは、試料を視覚的に観察するために、１つの接眼レンズ、または１対の接眼レンズを有するものとすることができる。この蛍光システムは、観察者への被害を防止するために、接眼レンズに有害な放射が届くのを防止する手段をさらに備えてもよい。この手段は、シャッターもしくはフィルタを備えるとよく、自動もしくは手動で作動されてよく、または適所に常置されてよい。
【００５７】
本発明はまた、蛍光顕微鏡を改造するキット、ならびにそのようなキットを取り付けることによって蛍光顕微鏡を改造する方法を含む。蛍光顕微鏡は、実験室の設備、特に生物学実験室で広く用いられているものである。本発明は、より効果的な検出システムをもたらすために、比較的安価なキットを用いてそのような顕微鏡を改造する手段を提供する。このキットは、例えばフィルタボックス組立体を含むことができ、その一例が図２に概略的に示されている。
【００５８】
図２を参照すると、フィルタボックス組立体１０は、放出口１４および励起口１６を取り付けられたハウジング１２を備える。ハウジング１２はまた、光源組立体２０がその中に取り付けられた穴１８を有する。光源組立体２０はＬＥＤ２２を備え、ＬＥＤ２２は、目標の蛍光標識を付けられた種の蛍光を励起させることのできる波長（概ね約３５０〜４００ｎｍの範囲）の紫外線光を発生可能であり、ＬＥＤ２２を制御できるプリント回路基板２６に電気結線２４によって接続されている。光源組立体２０はまた、円錐形のレンズ支持体３０に取り付けられたコリメータレンズ２８を有する。紫外線光をＬＥＤ２２から励起口１６へと向けるために、ダイクロイックミラー３２が設けられる。ミラー３２は、ＬＥＤ２２から放出される紫外線光の周波数に対して高反射性であり、ＬＥＤ２２によって放出される紫外線光による励起に際して試料から放出される蛍光の周波数に対して高透過性である。放出口１４も、ＬＥＤ２２によって放出される紫外線光による励起に際して試料から放射される蛍光の周波数に対して高透過性であり、励起口１６は、ＬＥＤ２２によって放出される紫外線光の周波数と、ＬＥＤ２２によって放出される紫外線光による励起に際して試料から放射される蛍光の周波数との両方に対して高透過性である。
【００５９】
ＬＥＤダイ製造の性質から発生する、試料への強度変調パターンの形成を回避するために、ビームホモジェナイザが光学部品内に組み込まれてもよい。ＬＥＤダイは、５×５マトリックスの相互連結されたチップ要素（ファセット）の形態である。
【００６０】
作用について説明する。回路基板２６が紫外線ＬＥＤ２２を結線２４を介して制御して紫外線発光を出すと、その紫外線光はレンズ支持体３０を介して、その紫外線発光を平行にするコリメータレンズ２８へと進む。平行にされた紫外線発光はミラー３２に進み、ミラー３２は、この紫外線光を励起口１６を介して顕微鏡の対物レンズ（図示せず）へ向かって反射し、対物レンズは、その紫外線光を試料（図示せず）へ向かって通す。紫外線発光は、試料内の蛍光を活性化し、蛍光発光は、蛍光を拡大する顕微鏡の対物レンズを通り、励起口１６を通ってダイクロイックミラー３２に向かう。ダイクロイックミラー３２は、蛍光発光の波長に対して透過性であり、蛍光発光を放出口１４を経て検出器、例えばＣＣＤまたは接眼レンズ（図示せず）へと透過する。
【００６１】
時間分解蛍光顕微鏡法による操作では、ＣＣＤ検出器が、放出口１４を介して通過する信号を受信するように配置されるとよく、回路基板２６に接続される。この場合、回路基板２６は、紫外線ＬＥＤ２２にパルス状の紫外線発光を出させる。約５０〜２００μｓの間の長さである紫外線発光のパルスは、上記のようにＬＥＤ２２から試料へと向けられ、蛍光発光を検出器へ向かって進ませる。この場合、回路基板２６は、紫外線発光パルスの終わりの後、一定のゲート遅延まで、検出器を非作動状態に（すなわち信号を検出できないように）保持する。ゲート遅延は、試料内の標識されていない種からの自己蛍光が、その遅延時間の終わりまでに減衰してしまうように設定され、約１〜５μｓの間であってもよい。遅延時間が終わると、回路基板２６が検出器を起動して蛍光信号を検出し、それによって自己蛍光よりも長い蛍光寿命を有する、標識された種からの蛍光放出が検出される。約１０〜８００μｓの間であってよい適切な検出時間が終わると、回路基板２６は検出器を非作動状態に戻す、その後、紫外線光のさらなるパルスを放出するように紫外線ＬＥＤ２２を起動する。その後、紫外線発光の各パルスに対して、上述のシーケンスが繰り返される。
【００６２】
従来技術のＴＲＦＭ構成の不都合は、ストロボプラズマの減衰時間が比較的長く、その結果、短いゲート時間が用いられる場合に、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）が減少することである。ゲート遅延時間は、短命の蛍光がその間に減衰できる、ＴＲＦＭの時間分解段階である。ストロボにおける問題は、主なアーク放電の後、グロープラズマが存在し、それが数１００μｓ持続して、ストロボプラズマが相当減衰してしまうまで合成プローブからの蛍光の取込を妨げることである。このゲート遅延時間が５０μｓと長い結果、合成プローブによって放出される元の蛍光強度は約２０％失われ、５μｓ以内に完全に消されてしまうような励起源であれば、元の蛍光放出を９８％より多く取り込めるであろう。最近、所望の特性を有する紫外線照明の新しい光源が入手可能になった。ピーク波長約３６５ｎｍの発光ダイオード（ＬＥＤ）が、日本の日亜化学工業株式会社から入手可能であり、この発光ダイオードは、数μｓ以内で残像なく切替が可能である。
【００６３】
従来技術のＴＲＦＭの最も高価な要素は、冷却式の高解像度ＣＣＤカメラに接続された時間ゲート式のマイクロチャンネルプレート画像増強装置である、画像取込装置である。ＤｉｃａｍＰｒｏカメラは値段が約７万ドルであり、より安価な代替品が好まれるであろう。ＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（米国、テキサス州ダラス）による最近の開発は、非常に低い光レベルで画像取込ができるオンチップ増幅を備えたＣＣＤ要素に結実した。本発明では、ＣＣＤは、短いゲート遅延時間（５μｓ）の後、単一の励起イベントを取り込む「単発モード」で作動されてよく、その後、時間分解蛍光画像が高速メモリの中に外部的に保存される。この操作は、例えば３００〜５００μｓ毎という高速で繰り返され、各フレームは、リアルタイムでデジタル的に平均化されて最終画像をもたらす。この技術は、励起段階中に光がカメラに届くのを妨げるための電子シャッターの必要性をなくし、画像センサへの蛍光の光学転送効率を最大化する。この技術は、本明細書に記述されるＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＣＣＤ画像センサなどの検出器の高利得によって実現可能にされる。
【００６４】
このＣＣＤ要素を用いたカメラは、いくつかの供給業者から市販されているが、本発明者らは、励起段階の間に画像センサを停止する必要をなくすために、特別に開発した電子部品にチップを接続する力量を有する。これが、自己蛍光を抑制するために、リアルタイムまたはリアルタイムに近い状態（例えば約１００ｍｓの待ち時間）で作動できるＴＲＦＭをもたらす。これにより、分析される各フレームに対して７秒の取込時間を必要とする現在のＴＲＦＭ構成に対して、かなりの利点がもたらされる。
【００６５】
本明細書に開示される本発明の新規な特徴は、次のものを含む。
−  時間領域ＴＲＦＭの励起源として紫外線発光ＬＥＤの使用。この装置は、以前は市販されておらず、今でも開発目的の「エンジニアリングサンプル」として分類されている。
−  Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社の「Ｉｍｐａｃｔｒｏｎ」プロセスＣＣＤチップが最近入手可能になったことで、このチップをＴＲＦＭ構成に組み込むことができた。このＣＣＤ要素は、オーストラリアではまだ入手できず、意図されているチップの用途に適するように電子部品を構成することで、さらなる価値が追加される。
【実施例】
【００６６】
３６５ｎｍ（ＦＷＨＭ  １０ｎｍ）で発光する発光ダイオード（ＬＥＤ）が最近入手可能になったことで、時間分解蛍光用途におけるこのＬＥＤの適性の評価が促された。ＬＥＤは起動が容易で、ナノ秒単位の切替速度という利点を有するが、発光の波長は最善の場合（３３７ｎｍ）よりも長い。それにもかかわらず、実験室製のＴＲＦＭにおいて、ストロボに代わる励起源として紫外線ＬＥＤが用いられた。ＬＥＤ（型式ＮＣＣＵ００３、定格１００ｍＷ、日亜化学（日本）製）が、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｓｃｏｐ、ＺｅｉｓｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）のフィルタボックスハウジングに合うように改造され、１００００：１の強い自己蛍光性の濃縮水に混合された蛍光標識済ジアルディア被覆体から、蛍光を励起するのに用いられた。このＬＥＤは、繰返し数５００Ｈｚ、ピーク電流７９３ｍＡで、１００μｓの間パルスが入れられた。ＬＥＤの紫外線発光の線幅が狭いために、励起フィルタおよび発光フィルタを取り除くことができ、その結果、ＴＲＦＭの感度が大きく改善された。型式ＮＣＣＵ０３３のＬＥＤはＩｎＧａＮのＬＥＤであり、以下の仕様、パルス順電流最大１０００ｍＡ、パルス幅≦１０ｍｓ、デューティー比≦１／１０；動作温度−１０〜８５℃；ピーク波長３６０から３７０ｎｍの間、典型的には約３６５ｎｍ、スペクトル半幅約８ｎｍ；光出力１３０〜１５４ｍＷ（ランクＰ３）、１１０〜１３０ｍＷ（ランクＰ２）、９２−１１０ｍＷ（ランクＰ１）を有する。
【００６７】
ＴＲＦＭの励起源としてのＮＣＣＵ００３  ＬＥＤの有効性を評価するために、１００００：１の濃縮水試料が免疫蛍光的に標識されたジアルディア被覆体と混合された。濃縮水は、大量の水（典型的には１０〜１００リットル）から約１ミクロンを超える直径の顕微鏡的粒子をすべて回収することによって調製されてよい。分離工程は、濾過または凝集技術を用いてよく、ここに用いられた１００００：１濃縮液を調製するのには後者の方法が用いられた。濃縮水は、蛍光標識された対象物を従来型の蛍光顕微鏡を用いて検出するのを困難な作業にする、強い自己蛍光性の藻類、鉱物粒子および有機堆積物を含んでいた。ジアルディア被覆体は、最近報告された（Ｃｏｎｎａｌｌｙ、豪州特許出願第２００４９０１１９６号）、ＢＨＨＴより疎水性の低い派生物である免疫複合体のＢＨＨＳＴで標識された。図３の画像ａは、励起源としてＬＥＤを使用し、ロングパスフィルタ（４２０ｎｍより長い波長で９０％を超える透過率）備えたＴＲＦＭで取り込まれた。画像ａに見られるウインドウ形状は、焦点において対象物に重ねられたＬＥＤダイマトリックスの画像の結果である。この人為構造は、ＬＥＤ光線が顕微鏡の対物レンズに届く前に、従来の光学的方法（擦りガラス、レンズ列など）を用いてＬＥＤ光線を均質化することにより除去可能である。画像増強装置は低利得（５％）で作動され、画像は合計２５５（ループ回数２５５）の画像取得から構築された。４個のピクセルを１つに結合するように、ピクセルビニングが起動された。ピクセルビニングは、２×２アレイのピクセルに蓄積される電荷を増やすので強度は４倍上昇されるが、水平軸および垂直軸の両方で解像度が半分になる。図３の画像ｂは、画像増強装置利得５０％、２×２ピクセルビニング、ループ回数２５５、およびゲート遅延５μｓを用いて取り込まれた。ジアルディア被覆体は、フルオロフォア対タンパク質比２４を有すると推定される免疫複合体で標識されていた。被覆体の標識は、約１４ヶ月前にあらかじめ行われ、それ以後、その被覆体は重炭酸塩緩衝液中に４℃で保存されていた。図４は、図３の画像に対応する画像強度のグラフを示す。
【００６８】
ＬＥＤの電子駆動装置
ＬＥＤを駆動するため、およびカメラを起動するために用いられる２つのパルス出力を与えるために、双対単安定マルチバイブレータパッケージ（７４ＬＳ２２１）が用いられた。この回路図は、図５に示されている。約１ｋＨｚの周波数で作動する外部方形波発生器が、単安定装置を導通状態にするために用いられる。入力トリガの立下り（ＩＣ１Ａのピン１）が、１００μｓの負の出力パルスをピン４で開始し、それによって、トランジスタＱ１を導通状態にさせて、その結果、出力トランジスタＱ２を導通状態にして、ＬＥＤのスイッチを入れる。ＩＣ１Ａの１００μｓのタイミングサイクルが終了すると、Ｑ２はオフにされ、Ｄ１を介して低く保たれていたＩＣ１Ｂのピン１０の電圧がロジックハイ状態に戻り、カメラの電子部品を起動するのに用いられる第２の１００μｓパルスを開始する。ゲート遅延時間の開始は、カメラトリガがロジックハイ状態にされる時間に対応し、ゲート遅延時間の長さは、カメラの電子部品またはファームウエア内で外部的に制御され、カメラトリガパルスの継続時間による影響は受けない。入力電圧９．０Ｖについては、図５のＬ１を流れる電流は７９３ｍＡであり、電圧が７．６Ｖまで落とされたときに、この電流は５６０ｍＡまで下げられた。出力パルス幅は１０２μｓであった。各パルス間の関係は、図７に示されている。ＬＥＤ駆動装置の立下りと、カメラトリガパルスの立ち上がりとの間の遅延は非常に短く（〜４ｎｓ）、両パルスは約９０μｓの継続時間を有する。カメラと共に供給されるソフトウエアによって、カメラトリガパルスの立ち上がりの開始からプログラマブルゲート遅延が導入できるようになり、それによって、この機能をサポートするための電子的ハードウエアの必要性が全くなくなる。図６に示すオシロスコープの波形は、図５に示された回路図にＴＰ‘Ａ’およびＴＰ‘Ｂ’と記された点におけるサンプリング電圧によって得られた。瞬間的なピーク電流は、（抵抗器Ｒ４およびＲ７からなる）負荷抵抗器の両端間の電圧差に注目することによって導かれた。この技術を用いて、ピーク電流は７９３ｍＡ、入力電圧はＬＥＤのアノード側において＋９．００ボルトと測定された。図３に示された画像は、ＬＥＤ励起源および９．００ボルトの入力電圧を用いて取り込まれた。すべての波形は、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ  ５００ＭＨｚデジタルオシロスコープ（ＴＤＳ５２０）で取り込まれた。図７に示すオシロスコープの波形は、ＬＥＤの光出力パルスとカメラのトリガパルスとの間のタイミングを示すために取り込まれた。高速フォトトランジスタがＬＥＤ出力の近くに配置され、光出力パルスをサンプリングするのに用いられた。フォトトランジスタは反応が非常に速いが、３６５ｎｍのＬＥＤ波長に対しては比較的低い感度を有していたため、オシロスコープの高利得設定が用いられた。高利得設定の結果、ＴＲＦＭの作動について有意性の全くない、明らかに雑音の多い光出力パルスになった。
【００６９】
紫外線ＬＥＤの電源は、ＬＥＤを通る電流がより容易に制御可能になるように、調整された入力から電圧調整器にもたらされる。ＬＥＤは、１００μｓという短い時間オンにされ、２ｍｓのかなり長い時間オフにされて、それによってデューティー比が１／２０になり、この装置はこの短時間だけその最大定格（５００ｍＡ）よりもずっと高い電流に耐えられる。
【００７０】
カメラトリガ入力は、ＴＴＬ入力を受けるように構成されており、単安定装置（ピン５）からの出力は、短い（８００ｍｍ）の同軸ケーブルを介してカメラに直接供給された。出力駆動トランジスタは、ＬＥＤ駆動信号のタイミングを遅らせるかなりの内部容量を有する高電圧高電流の装置である。光出力パルスの終わりと、カメラのトリガパルスの始まりとの間の同期関係を維持するためには、Ｑ２のコレクタから（ダイオードＤ１を介して）第２単安定装置へのトリガ入力として出力信号をもたらすことが必要と分かった。
【００７１】
画像センサ
時間分解フルオロフォアによって放出される蛍光は強度が低く、光の増幅が必要である。従来型の電荷結合素子（ＣＣＤ）画像センサに画像増強装置（典型的には１０，０００倍利得）が備わっている場合は、その画像センサが、微弱な蛍光を取り込むのに使用可能である。画像増強ＣＣＤは、典型的には７０，０００豪ドルほどの値段の比較的大型で複雑な組立体であり、そのため、時間分解蛍光技術を用いた安価な画像解像顕微鏡を製作することができない。
【００７２】
オンチップで適度の利得（３０〜１００倍）を達成できる新時代の市販の光増幅ＣＣＤが最近入手できるようになったが、同じプロセスを用いる先進技術では、最大２０００倍の利得を備える画像センサを作ることができる。この画像センサは、日本テキサスインスツルメンツ社から市販されている。電荷増幅ＣＣＤを備えた時間分解蛍光顕微鏡を構成する利点は、費用がかなり削減できることである。画像増強装置に燐光出力の画像化の必要性がないため、カメラは、画像増強ＣＣＤの約１０分の１のコストで製作可能であり、画像品質は優れている。その代わり、典型的な（浜松製）マイクロチャンネルプレートアレイ画像増強装置の１２μｍチャンネルに比べて、７．４μｍピクセルの解像度（ＴＣ２５３ＳＰＤ、ＴｅｘａｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）では、蛍光がセンサの表面上に直接画像化可能である（面積で２．６倍の違い）。さらに、ＴＣ２５３ＳＰＤセンサの分光量子効率は、ユーロピウムキレート（６１７ｎｍ）の発光波長において最大（４０％）であるが、一方、画像増強装置のＳ２０光電陰極は、同じ波長で２０％より低い量子効率を有する。ＴＣ２５３ＳＰＤセンサのシャッター速度は、励起パルスに関連して正確に制御可能であり、２００μｓ（１／５０００秒）という短さに設定できる。これによって、励起段階の間に光がセンサに届くのを妨げる物理的シャッターがなくても、センサを１サイクルのみ作動させることができる。ＴＣ２５３ＳＰＤセンサは、電圧への変換の前に、電荷領域において直接、電荷を増大させる。電荷担体倍増（ＣＣＭ）を達成するために、低ノイズ単担体衝撃イオン化工程が用いられる。このイオン化工程は、高磁場領域を介して繰り返される担体移動の際に起こる。増幅利得は、振幅を増幅パルスに合わせて変えることにより調整されてよい。ＴＣ２５３ＳＰＤ  ＣＣＤセンサの仕様は、チップサイズ１１．６８ｍｍ（Ｈ）ｘ１２．４０ｍｍ（Ｖ）、ピクセルサイズ７．４ミクロン（Ｈ）x７．４ミクロン（Ｖ）；アスペクト比（Ｈ：Ｖ）４：３；フレーム率３０Ｈｚ；データ転送速度１２．５ＭＨｚ；シャッター１／６０秒から１／５００００秒；標準感度１，２００ｍＶ／ｌｕｘ／秒、最大負荷容量６．０ｐＦ、電荷倍増利得１〜２０００、（標準約２００）、超過雑音指数最低１（標準約１．４）、ダイナミックレンジＣＣＭ利得なし６６ｄＢ、ダイナミックレンジＣＣＭ利得あり７２ｄＢ、電荷変換利得ＣＣＭ利得なし１４ｕＶ／ｅ、信号応答遅延時間１６ｎｓ、出力抵抗３２０ｏｈｍ、アンプ雑音相当信号ＣＣＭ利得なし２０ｅ、アンプ雑音相当信号標準ＣＣＭ利得あり最大１．０ｅ、応答直線性ＣＣＭ利得なし１、応答直線性ＣＣＭ利得あり１、電荷転送効率０．９９９９４〜１．０（シリアルまたはパラレル転送）、供給電流バイポーラトランジスタ出力電流なし最大４ｍＡ（標準２．７ｍＡ）、感度標準ＣＣＭ利得あり５６００Ｖ／Ｌｘ・ｓ（ＩＲフィルタなし）、７００Ｖ／Ｌｘ・ｓ（ＩＲフィルタあり）、感度ＣＣＭ利得なし２８Ｖ／Ｌｘ・ｓ（ＩＲフィルタなし）、３．５Ｖ／Ｌｘ・ｓ（ＩＲフィルタあり）、飽和信号出力（ＣＣＭ利得なし）６００ｍＶ、飽和信号出力（標準ＣＣＭ利得）１１００ｍＶ、ゼロ入力オフセット出力９０ｍＶ、電子シャッター性能最短１／５０００ｓ、標準１／３０ｓを含む。
【００７３】
Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社は、同社のセンサが、冷却されたとき、または十分に短い積分時間が用いられるときに、単一の光子を検出可能であると報告している。画像センサからのアナログ出力は、その後８ビットから１６ビット表示（２５６から６５，５３５レベル）のデジタルフォーマットに変換され、高速ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）に保存される。各フレームが取り込まれると、高速デジタル計算を行うためにフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＧＰＡ）を用いる、図８に示すシステムを用いて、リアルタイムで、デジタル情報が電子的に平均化されるか、または前のフレームと積分される。オフチップ積分を用いる利点は、ＬＥＤがオンのとき、励起段階の間に画像センサが飽和するのを防ぐのに典型的には必要である光学シャッターを排除することに起因する。現在、不透過モードから透過モードに数マイクロ秒で切替可能な光学シャッターはない。さらに、電子シャッター（液晶装置、ニオブ酸リチウムなど）の透過は、極性の移動を切替技術として用いるため、その透過は典型的には５０％より低く、そのためせいぜい１つの偏光モードを透過する程度である。機械的チョッパーは、最良の調整レベルを与えるが、動作速度に限界があり、試料の不均一な照明を引き起こす（日出日没効果）。さらに、光学チョッパーホイールは、特に高速で動作するときに振動をもたらすことがある。用途がこれらの短所を許容できる場合であっても、電子的または機械的シャッターはＴＣ２５３ＳＰＤ画像センサと共に用いられ、積分は最大３３ｍｓの間行われるであろう。この操作モードは、センサが、合計８２の励起事象からの蛍光発光を積分できるようにし（励起時間１００μｓおよび積分時間３００μｓという時間の間）、合計積分発光間隔は２４ｍｓになる。
【００７４】
時間分割蛍光顕微鏡の概要
紫外線ＬＥＤ励起ＴＲＦＭの構成のブロック図が図８に示されている。このシステムの構成に最大の柔軟性をもたらすので、タイミング調整および制御はフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）に基づく。ＴＣ２５３ＳＰＤ画像センサは、複雑な一連の電圧をチップに印加することを必要とし、アナログ電子部品のこの部分もＦＰＧＡによって制御される。
【００７５】
図８は、紫外線ＬＥＤ励起を用いるソリッドステートＴＲＦＭおよび電荷増幅ＣＣＤ画像センサのブロック図を示す。中央の制御要素は、カメラ制御およびＬＥＤ励起を調整するのに用いられるフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）である。アナログ映像信号のデジタル（８〜１６ビット）信号への変換は、リアルタイムでの画像処理操作を容易にする。そのため、図８のシステム５０では、顕微鏡５２はＺｅｉｓｓ社のＡｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡であり、顕微鏡５２は、水銀アークランプ５４、および紫外線ＬＥＤ（図示せず）を保持する紫外線ＬＥＤフィルタハウジング５６を取り付けられ、台６０の上に配置された試料を励起する２つの選択可能な光源をなしている。水銀アークランプは、比較的安価な広域波長発光源であり、そのため、様々なフルオロフォアが従来の落射蛍光モードで画像化可能である。紫外線ＬＥＤは、約３６５ｎｍの波長で光出力を出すことができる。顕微鏡５２はまた、試料を視覚的に観察するための複数の接眼レンズ６２（ただし１つの接眼レンズ６２を有する単眼顕微鏡を用いることも可能）、および試料の画像を拡大するための複数の対物レンズ６４を有する。シャッター５７は、オペレータが接眼レンズ６２を介して試料を観察している間、アークランプ５４からの照明が試料に達するのを妨げるために設けられている。シャッター５７は、手動で作動されてよい。画像センサ５８は、台６０の上に置かれた試料からの蛍光を受けるように配置されたＴＣ２５３ＳＰＤ  Ｉｍｐａｃｔｒｏｎ  ＣＣＤである。ＬＥＤおよびセンサ５８の作動およびタイミングを制御するために、制御および取込装置７０が設けられている。装置７０はＦＰＧＡ  ７２を備え、ＦＰＧＡ  ７２は、センサ５８およびＬＥＤにタイミング信号を出すタイミング調整および制御信号発生装置７４を有し、また、センサ５８から発せられる処理済のデータを受信するデジタル信号処理（ＤＳＰ）装置７６を有する。信号発生装置７４はまた、アナログ映像処理回路７８に信号を出し、アナログ映像処理回路７８は、その信号をセンサ５８からの信号と共に処理し、アナログ信号をＡＤ変換器８０に与えることができる。ＡＤ変換器８０は、処理回路７８からのアナログ信号をデジタル信号に変換し、そのデジタル信号をＦＰＧＡ  ７２のＤＳＰ装置７６に供給することができる。信号発生装置７４とＦＰＧＡ  ７２のＤＳＰ装置７６は両者とも、データを保存、処理および提示できるコンピュータ８２に、信号を送ることができる。装置７４は、ハウジング５６内のＬＥＤへ直接的に、ならびにカメラの露出および起動制御装置８６を介してセンサ５８へ間接的に、という両方で制御信号を送ることのできる紫外線ＬＥＤ駆動装置８４にも接続されている。信号伝送がその間に起こる、上述の構成要素は、デジタルまたはアナログ信号を適切に伝送することのできる適切な信号伝送ケーブルで接続されている。
【００７６】
操作においては、オペレータは、台６０の上に置かれた試料を、接眼レンズ６２を介して観察することにより、試料を所望の通りに配置する。オペレータは、複数の対物レンズ６４から選択することにより、適切な倍率を選択することもできる。代替として、自動化されたシステムでは、顕微鏡の対物レンズに対するスライドの動きを容易にするために、顕微鏡はモータ付きのｘ−ｙ台が備えられてよい。最初に試料を載せる以外にオペレータの介入の必要をなくすために、焦点（ｚ軸）もコンピュータ制御システムによって制御されてよい。作動中には、コンピュータシステムがスライドを所定の原点に動かし、その後、時間分解蛍光モードでスライドをスキャンし、停止して、推定される対象の蛍光のｘ−ｙ軸を記録する。スライド全体が自動モードでスキャンされ、その結果がホストコンピュータに記録される。任意選択で、オペレータは、記録されたそれぞれのｘ−ｙ位置に進むように制御システムに要求することによって、選択された対象の同定を検証するように警告されることもできるであろう。試料内の蛍光プローブからの蛍光信号を測定するために、１つのパルス信号がＦＰＧＡ  ７２から駆動装置８４に送られ、もう１つがセンサ５８に送られる。駆動装置８４への信号は、パルス信号のＬＥＤへの進行を開始させ、その後、対物レンズ６４を介して試料にパルス紫外線励起を与える。センサ５８へのパルス信号は、紫外線励起パルスが終わった後の所定のゲート遅延に際して始まり、次の紫外線励起パルスの開始の前に終わる時間の間だけ、センサ５８を起動して、試料からの蛍光信号を受け取らせる。駆動装置８４への信号は、センサ５８に適切なカメラ制御を起こすための制御装置８６も起動し、蛍光データが適切なタイミングで確実に取り込まれるようにする。センサ５８からの映像出力信号は、アナログ映像処理装置７８によってレベルを変更され、増幅されて、その後、変換器８０の（８から１６ビットの）アナログデジタル変換部に渡される。デジタル出力はメモリにバッファされ、ＦＰＧＡモジュール７２のＤＳＰ装置７２によって、ハードウエアコード畳み込みアルゴリズムを用いて信号対雑音比を高めるように処理される。ＤＳＰ装置７６からのデジタル信号出力は、ＵＳＢ２．０またはＦｉｒｅＷｉｒｅ（１３９４）のような高速シリアルリンクプロトコルを介してホストＰＣ  ８２に接続される。
【００７７】
結果
図３の画像ａ）では、従来式の落射蛍光モードで観察したとき、免疫蛍光で標識されたジアルディア被覆体に比べて中央のチリモ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ、三角形の有機体）の蛍光が強い。自己蛍光は大きく抑制されているが、５μｓの短いゲート遅延が与えられると、２つのジアルディア被覆体は、暗い背景に対して輪郭が際立って鮮明であるのが画像ｂ）に示されている。従来式の落射蛍光モードおよびＴＲＦＭモードでの被覆体の蛍光強度の（ピーク時）自己蛍光強度に対する比（０から２５５の目盛り上のピクセル値）を測定することにより、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）の改善が認められた。従来式の落射蛍光モードでの信号強度の自己蛍光に対する比は１２３／２１６であり、Ｓ／Ｎ比は０．５７であった。１２．９８という大きく改善されたＳ／Ｎ比が、時間分解モードを使用して達成され（１０９／８．４）、そのためＳ／Ｎ比の効果的な改善は約２３倍であった（１５．９８／０．５７）。図３に示す画像は、白線で示すようにサンプリングされ、図４に示す強度の線形状が提示されており、図４はＴＲＦＭモードで達成される自己蛍光の減少をより明らかに示す。Ｓ／Ｎ比は、図４に示す線形状によって報告されたデータを用いて計算されたが、自己蛍光のピーク強度（チリモの中央リングで測定、２５２）が等式に代入された場合、達成されるＳ／Ｎ比の改善は３６倍である。ストロボベースのシステムに対するＬＥＤ励起の主な利点は、一旦励起パルスが消滅すると、大きな発光出力が何もないことである。ＢＨＨＳＴキレートは、２４０から６２０μｓの間の典型的な蛍光寿命（τ）を有し、５μｓのゲート遅延が与えられたとき、第１の場合は約２％、第２の場合は０．８減少する。５０μｓのゲート遅延の後に発光が取り込まれる場合、蛍光強度は、より相当大幅に失われ、それぞれ１８．８％および７．７％の損失になる。ストロボプラズマを減衰させるために、ストロボＴＲＦＭには、より長いゲート遅延が必要とされる。ストロボプラズマからの光は、メインアーク放出の後、最長１００μｓまでかなりのレベルで存在しており、これによってＳ／Ｎ比がさらに低下する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】励起パルスおよびそれに続く蛍光減衰の間の時間にわたる光の強度を示すグラフである。
【図２】本発明に従った蛍光検出システムの一部をなしてよいＬＥＤフィルタボックス組立体の概略図である。
【図３】ゲート遅延時間０μｓおよび５μｓをそれぞれ用いて、画像ＡおよびＢが紫外線ＬＥＤ励起ＴＲＦＭで取り込まれた蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図３に示された２つのジアルディア被覆体を横断する線に沿った位置の関数としてピクセル強度を示すグラフである。
【図５】本発明に従ったＴＲＦＭにおいて、ＬＥＤを駆動し、検出器を起動する双対単安定マルチバイブレータパッケージの回路図である。
【図６】抵抗器（およびしたがってＬＥＤ）を通るピーク電流７９２ｍＡに対応する負荷抵抗器（Ｒ４およびＲ７）の両端の電圧差３．９６ボルトを示すように波形が重ねられた、図５の回路のＴＰ‘Ａ’およびＴＰ‘Ｂ’と印された各テスト箇所のアースに対する電圧差を示す、それらテスト箇所で取り込まれたオシロスコープの波形を示す図である。
【図７】カメラ起動パルスがナノ秒単位の遅延を有する光出力パルスの後に起こることを表す、フォトトランジスタによって検出されたＬＥＤの光出力パルスとカメラ起動パルスの開始との関係を示すグラフである。
【図８】本発明に従ったソリッドステートＴＲＦＭのブロック図である。
【図１】
2008517280.tif 000003
【図２】
2008517280.tif 000004
【図３】
2008517280.tif 000005
【図４】
2008517280.tif 000006
【図５】
2008517280.tif 000007
【図６】
2008517280.tif 000008
【図７】
2008517280.tif 000009
【図８】
2008517280.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光パルスを発生させるパルス光源であり、前記発光パルスが、前記試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光を励起することもできる、前記パルス光源と、
前記蛍光を検出し、蛍光信号を出力するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
前記光源および前記ＣＣＤを制御する制御回路と
を備えるシャッターを有さない時間分解蛍光検出システムであって、
前記制御回路がまた、前記発光パルスを発生させるために前記光源にパルス信号を与えることと、ゲート遅延の間、前記ＣＣＤを非作動状態に保持することによって、前記発光パルスと前記ＣＣＤによる検出の開始との間に前記ゲート遅延を与えることと、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である検出時間の間に前記蛍光の検出ができるように、前記ゲート遅延の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動することとができる、蛍光検出システム。
【請求項２】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生される信号をアースへ分路することを含む請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項３】
前記パルス光源が、減衰の速い光源である請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項４】
前記制御回路が、前記ＣＣＤを単一の励起サイクルで前記蛍光の検出ができるようにすることができ、前記励起サイクルが、単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項５】
前記制御回路が、前記ＣＣＤを前記励起サイクルの後に前記蛍光信号の出力ができるようにすることのできる請求項４に記載の蛍光検出システム。
【請求項６】
前記ＣＣＤが、高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）を備える請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項７】
前記蛍光信号を処理する信号処理装置をさらに備える請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項８】
前記ＣＣＤが、前記蛍光信号を時間分解蛍光画像として出力できる請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項９】
前記時間分解蛍光画像を保存する外部高速メモリをさらに備える請求項８に記載の蛍光検出システム。
【請求項１０】
前記ＣＣＤが、単一の励起パルスの後、前記蛍光信号を単一の時間分解蛍光画像として出力することのできる請求項２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１１】
前記制御回路が、前記検出時間の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態に戻すことのできる請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１２】
前記検出時間が約１０〜８００μｓである請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項１３】
前記制御回路が、プリント回路基板、コンピュータ、マイクロプロセッサ、チップ、マイクロチップ、または何らかの他の制御装置の群から選択される制御装置を備える請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１４】
前記パルス光源が、連続した発光パルスを発生させることができ、前記発光パルスのそれぞれの長さが、約１０ｎｓ〜約２００μｓであり、次のパルスとの間の時間が、約１μｓ〜１ｍｓである請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１５】
前記制御回路が、前記ＣＣＤを、複数の励起サイクルで前記蛍光の検出ができるようにし、各励起サイクルが、発光パルス、ゲート遅延時間、および検出時間を含み、前記蛍光信号が、各励起サイクルの後に前記ＣＣＤから出力される請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１６】
前記出力された蛍光信号のオフチップ積分用の積分器をさらに備える請求項１５に記載の蛍光検出システム。
【請求項１７】
前記ゲート遅延が約１０μｓより短い請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１８】
前記発光パルス減衰時間または前記自己蛍光の後の時点で、前記蛍光の最大強度と前記自己蛍光の最大強度との比が約１．５対１より大きい請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項１９】
前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である時間が、約１０μｓより短い請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項２０】
前記光源が、紫外線波長域での発光を発生させることのできる請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項２１】
前記光源が紫外線（ＵＶ）ＬＥＤであり、当該蛍光検出システムが、紫外線光を前記ＬＥＤから前記試料に向けるように配置されたダイクロイックミラーをさらに含み、前記ダイクロイックミラーが、前記ＬＥＤから放出される前記紫外線光の周波数に対して高反射性であり、前記ＬＥＤによって放出される前記紫外線光での励起に際して前記試料によって放出される蛍光の周波数に対して高透過性である請求項１または２に記載の蛍光検出システム。
【請求項２２】
顕微鏡を備え、前記顕微鏡が蛍光検出顕微鏡である請求項１に記載の蛍光検出システム。
【請求項２３】
前記光源が、２から４００ｍＷの間の光出力を備えたＬＥＤ光源である請求項１、２、３または２０のいずれか一項に記載の蛍光検出システム。
【請求項２４】
前記パルス光源の性質から発生する、前記試料への強度変調パターンの形成を回避するために、ビームホモジェナイザをさらに含む請求項１〜２３のいずれか一項に記載の蛍光検出システム。
【請求項２５】
試料内の蛍光を励起するための発光パルスを発生させるパルス光源であり、前記発光パルスが、前記試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光を励起することもできる、前記パルス光源と、
前記蛍光を検出し、蛍光信号を出力するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と
を備え、
前記光源および前記ＣＣＤが制御回路によって制御され、前記制御回路はまた、前記発光パルスを発生させるために前記光源にパルス信号を与えることと、
ゲート遅延の間、前記ＣＣＤを非作動状態に保持することによって、前記発光パルスと前記ＣＣＤによる検出の開始との間に前記ゲート遅延を与えることと、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である検出時間の間に前記蛍光の検出ができるように、前記ゲート遅延の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動することとができる、蛍光検出システム。
【請求項２６】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生される信号をアースへ分路することを含む請求項２５に記載の蛍光検出システム。
【請求項２７】
前記パルス光源が、減衰の速い光源である請求項２６に記載の蛍光検出システム。
【請求項２８】
前記制御回路が、前記検出器を単一の励起サイクルで前記蛍光の検出ができるようにし、前記励起サイクルが、単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む請求項２６に記載の蛍光検出システム。
【請求項２９】
前記制御回路が、前記検出器を前記励起サイクルの後に前記蛍光信号の出力ができるようにする請求項２８に記載の蛍光検出システム。
【請求項３０】
前記検出器が、単一の励起パルスの後、前記蛍光信号を単一の時間分解蛍光画像として出力することのできる請求項２５に記載の蛍光検出システム。
【請求項３１】
前記ＣＣＤが、３０倍を超えるオンチップ増幅が可能である請求項２５に記載の蛍光検出システム。
【請求項３２】
時間分解蛍光検出システム、蛍光検出顕微鏡、または時間分解蛍光検出顕微鏡である請求項２５に記載の蛍光検出システム。
【請求項３３】
オフチップ積分用の積分器も備える請求項２５に記載の蛍光検出システム。
【請求項３４】
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光パルスを発生させるパルス光源であり、前記発光パルスが、前記試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光を励起することもできる、前記パルス光源と、
前記発光を前記光源から前記試料に向けるダイクロイックミラーと、
前記試料からの前記蛍光を拡大する対物レンズと、
前記試料からの前記蛍光を検出し、蛍光信号を出力する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
前記蛍光を前記試料から前記ＣＣＤへ透過する放出口と、
前記発光パルスを発生させるためにパルス信号を前記光源に与え、ゲート遅延の間、前記ＣＣＤを非作動状態に保持することによって、前記光パルスと前記ＣＣＤによる検出の開始との間に約１０μｓより短い前記ゲート遅延を与え、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である検出時間の間に前記蛍光の検出ができるように、前記ゲート遅延の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動する制御回路と、
を備える、時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３５】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生される信号をアースへ分路することを含む請求項３４に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３６】
前記パルス光源が、減衰の速い光源である請求項３５に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３７】
前記ＣＣＤが、蛍光信号を時間分解蛍光画像として出力することのできる請求項３５に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３８】
前記時間分解蛍光画像を保存する外部高速メモリをさらに備える請求項３７に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項３９】
前記検出器が、単一の励起パルスの後、前記蛍光信号を単一の時間分解蛍光画像として出力することのできる請求項３５に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項４０】
前記制御回路が、前記検出器を単一の励起サイクルで前記蛍光の検出ができるようにし、前記励起サイクルが、単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む請求項３４に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項４１】
前記制御回路が、前記検出器を前記励起サイクルの後に前記蛍光信号の出力ができるようにする請求項４０に記載の時間分解蛍光顕微鏡。
【請求項４２】
試料内の種を検出する方法であって、前記種がフルオロフォアで標識されており、
前記試料を請求項１に記載の時間分解蛍光検出システムに置くステップと、
前記試料をパルス光源からの光パルスに当てるステップと、
単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む少なくとも１つの励起サイクルにおいて、ＣＣＤを使用して前記試料からの蛍光を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４３】
前記試料内の蛍光体の数を判定するステップをさらに含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出するステップが、
前記光源からのパルスの終わりの後、所定時間の間待つステップであり、前記所定時間が前記ゲート遅延と実質的に等しい、前記ステップと、
前記所定時間の後の前記検出時間の間に蛍光を検出するステップと、
前記検出時間の終わり、前記光源からの次のパルスの開始の前に、前記検出を停止するステップと
を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記蛍光が単一の励起サイクルにおいて検出され、前記励起サイクルが、単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＣＤが、前記励起サイクルの後に前記蛍光信号を出力する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記所定時間が約１０μｓより短い請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記蛍光を検出する前に、前記試料からの前記蛍光を拡大するステップをさらに含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記蛍光が複数の励起サイクルにおいて検出され、前記ＣＣＤが、各励起サイクルの後に蛍光信号を出力して複数の蛍光信号を出し、前記複数の蛍光信号が積分される請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
シャッターを有さない時間分解蛍光顕微鏡をもたらすために蛍光顕微鏡を改造するキットであって、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光パルスを発生させるパルス光源であり、前記発光パルスが、前記試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光を励起することもできる、前記パルス光源と、
前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
前記光源および前記ＣＣＤを制御する制御回路であり、前記発光パルスを発生させるために前記光源にパルス信号を与え、ゲート遅延の間、前記ＣＣＤを非作動状態に保持することによって、前記発光パルスと前記ＣＣＤによる検出の開始との間に前記ゲート遅延を与え、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である検出時間の間に前記蛍光の検出ができるように、前記ゲート遅延の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動することのできる、前記制御回路と
を備えるキット。
【請求項５１】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生された信号をアースへ分路することを含む請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
前記パルス光源が、減衰の速い光源である請求項５０に記載のキット。
【請求項５３】
前記制御回路が、プリント回路基板、コンピュータ、マイクロプロセッサ、チップ、マイクロチップ、または何らかの他の制御装置の群から選択される制御装置を備える請求項５０に記載のキット。
【請求項５４】
コリメータと、
前記光源からの前記発光に対して、反射性、部分反射性、または高反射性であり、前記蛍光に対して透過性、部分透過性、または高透過性であるダイクロイックミラーと、
前記発光を試料へ向かって透過させる第１光透過器と、
前記蛍光を検出器および／または接眼レンズへ向かって透過させる第２光透過器と、
上述の構成要素のうちの任意の１つまたは複数を収容するハウジングと
のうちの１つまたは複数をさらに備える請求項５０に記載のキット。
【請求項５５】
シャッターを有さない時間分解蛍光顕微鏡をもたらすために蛍光顕微鏡を改造する方法であって、
試料内の蛍光標識された種の蛍光を励起するための発光を発生させるパルス光源であり、前記発光パルスが、前記試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光を励起することもできる、前記パルス光源と、
前記試料からの前記蛍光を検出する高利得オンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）と、
前記光源および前記ＣＣＤを制御する制御回路であり、前記発光パルスを発生させるために前記光源にパルス信号を与え、ゲート遅延の間、前記ＣＣＤを非作動状態に保持することによって、前記発光パルスと前記ＣＣＤによる検出の開始との間に前記ゲート遅延を与え、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である検出時間の間に前記蛍光の検出ができるように、前記ゲート遅延の終わりに前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動することのできる、前記制御回路と
を備える方法。
【請求項５６】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生された信号をアースへ分路することを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記パルス光源が、減衰の速い光源である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記制御回路が、前記ＣＣＤを単一の励起サイクルで前記蛍光信号の検出ができるようにすることができ、前記励起サイクルが、単一の発光パルス、単一のゲート遅延、および単一の検出時間を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＣＤが、単一の励起パルスの後、前記蛍光信号を単一の時間分解蛍光画像として出力することのできる請求項５６に記載の蛍光検出システム。
【請求項６０】
前記制御回路が、プリント回路基板、コンピュータ、マイクロプロセッサ、チップ、マイクロチップ、または何らかの他の制御装置の群から選択される制御装置を備える請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
コリメータと、
前記発光に対して、反射性、部分反射性、または高反射性であり、前記蛍光に対して透過性、部分透過性、または高透過性であるダイクロイックミラーと、
前記発光を試料へ向かって透過させる第１光透過器と、
前記蛍光を前記ＣＣＤおよび／または接眼レンズへ向かって透過させる第２光透過器と、
上述の構成要素うちの任意の１つまたは複数を収容するハウジングと
のうちの１つまたは複数を前記顕微鏡に取り付けるステップをさらに含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５５に記載の方法に従って改造された蛍光顕微鏡。
【請求項６３】
試料内の種を検出する方法であって、前記種がフルオロフォアで標識されており、
ａ）発光パルスを発生させるパルス光源を設けるステップと、
ｂ）高利得を有するオンチップ増幅電荷結合素子（ＣＣＤ）を設けるステップと、
ｃ）前記光源および前記検出器を制御する制御回路を設けるステップと、
ｄ）前記発光パルスを発生させるために、前記制御回路から前記光源へパルス信号を出すステップと、
ｅ）前記フルオロフォアの蛍光を励起するために、前記試料を前記発光パルスに当てるステップと、
ｆ）所定の時間待つステップであり、前記励起パルスによって励起された、試料内に存在する任意のオートフルオロフォアの自己蛍光が検出されないように、前記所定の時間の間、前記回路がＣＣＤを非作動状態に保持する、前記ステップと、
ｇ）前記所定の時間が経過した後、前記蛍光を前記自己蛍光と区別可能である所定の検出時間の間に前記蛍光を検出するように前記検出器を作動状態に切り替えて蛍光信号を発生させるために、前記制御回路を用いて前記ＣＣＤを前記非作動状態から起動するステップと、
ｈ）前記所定の検出時間の後、前記制御回路を用いて前記ＣＣＤを前記非作動状態に戻すステップと、
ｉ）前記ＣＣＤから前記蛍光信号を出力するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
前記制御回路によって保持される前記ＣＣＤの前記非作動状態が、前記ゲート遅延の間に前記ＣＣＤによって発生された信号をアースへ分路することを含む請求項６３に記載の蛍光検出システム。
【請求項６５】
ステップａ）が、速い減衰特性を有する発光パルスを発生させる減衰の速いパルス光源を設けるステップを含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ステップ（ｇ）の前記蛍光信号が、時間分解蛍光画像を含み、
ステップ（ｉ）が、前記検出器から前記時間分解蛍光画像を出力するステップと、外部高速メモリに前記画像を保存するステップとを含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
ステップ（ｉ）において、前記蛍光信号が信号処理装置へ出力される請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
複数の蛍光信号を発生させ、オフチップ積分器に出力することによって前記検出された蛍光を積分するためにステップｃ）からｇ）を繰り返すステップを含む請求項６３に記載の方法。
【国際調査報告】
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