(57)【要約】  本発明はメカノ成長因子（ＭＧＦ）として公知のインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）スプライスバリアントのＣ末端を形成するＥペプチドから誘導される生物学的に活性なポリペプチドに関する。これらのペプチドを修飾して天然発生Ｅペプチドに比較してその安定性を改善させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０個までのアミノ酸残基を含み、
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含み、
未修飾ＭＧＦ  Ｅペプチドに比較して安定性を上昇させる一つまたはそれより多い修飾を組み込んでおり、
そして生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
該生物学的活性が筋肉強度、心臓保護能力および神経保護能力を高める能力から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも一つの該修飾がＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の該配列に対するものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
該修飾がＬ体アミノ酸の対応するＤ体アミノ酸への一つまたはそれより多い変換を含む、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
該修飾がＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加を含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
該ＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加がＮ末端にある、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
該修飾がポリペプチドの環化を含む、請求項１から６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
該修飾が一つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含む、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
該置換がアラニン以外のアミノ酸をアラニンと置き換えることを含む、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
該Ｃ末端Ｅペプチドが配列番号：１３のラットＥｂペプチドまたは配列番号：１４のラットＥｂペプチドである、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該Ｃ末端Ｅペプチドが配列番号：２７のヒトＥｃペプチドまたは配列番号：１５のペプチドである、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
修飾がＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
該ＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加がＮ末端にある、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該修飾がＬ体アミノ酸の対応するＤ体アミノ酸への一つまたはそれより多い変換を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号：２７または１５の１４および１５位置で１個または双方のアルギニン残基がＤ体である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号：２７または１５の１４および１５位置で双方のアルギニン残基がＤ体である、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
該修飾が一つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
該置換が５、１２、１４または１８位置にある、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
該置換がアラニン以外のアミノ酸をアラニンと置き換えることを含む、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
該アラニン置換が配列番号：１５または２７の一つまたはそれより多い（ａ）５位置のセリンをアラニンに、（ｂ）１２位置のセリンをアラニンに、（ｃ）１４位置のアルギニンをアラニンに、および（ｄ）１８位置のセリンをアラニンにすることである、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
該Ｃ末端ペプチドが配列番号：３３または３４のポリペプチドである、請求項１から９のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２２】
修飾がＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加を含む、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
該ＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の付加がＮ末端にある、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
該修飾が一つまたはそれより多いアミノ酸の置換を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
該置換が２位置にある、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
該置換がアラニン以外のアミノ酸をアラニンと置き換えることを含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
該アラニン置換が一つまたはそれより多い（ａ）２位置のセリンをアラニンにすることである、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
その配列が配列番号：３３、３４、３５または３６のものである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
該修飾が該Ｃ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の該配列のＣ末端の１個または２個のアミノ酸によるトランケーションを含む、請求項１から２８のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３０】
その配列が配列番号：２１のポリペプチドものである、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
その配列が配列番号：１６、１７、１８、１９、２８、２９、３０または３１のポリペプチドものである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
その配列が配列番号：１５または２７のものであるが、Ｎ末端でＰＥＧ化されており、そしてここで配列番号：１５または２７の１４および１５位置のアルギニン残基の双方がＤ体である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
その配列が配列番号：１５または２７のものであり、ここで配列番号：１５または２７の１４および１５位置のアルギニン残基の双方がＤ体であり、そしてそれはＰＥＧ化されていない、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
Ｃ末端でアミド化されている、請求項１から３３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項３５】
請求項１に記載の該ポリペプチドに対してＮ末端および／またはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長されている請求項１から３４のいずれかに記載のポリペプチドを含む伸長ポリペプチド。
【請求項３６】
該伸長がＣ末端のシステイン残基および／またはＮ末端のＤ−アルギニン残基を含む、請求項３５に記載の伸長ポリペプチド。
【請求項３７】
ヒト血漿中の半減期により測定されるようなその安定性が未修飾Ｅペプチドのものよりも少なくとも１０％大きい、請求項１から３６のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項３８】
ヒト血漿中の半減期により測定されるようなその安定性が未修飾Ｅペプチドのものよりも少なくとも５０％大きい、請求項３７に記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項３９】
ヒト血漿中の半減期により測定されるようなその安定性が未修飾Ｅペプチドのものよりも少なくとも１００％大きい、請求項３８に記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項４０】
ヒト血漿中のその半減期が少なくとも２時間である、請求項１から３９のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項４１】
ヒト血漿中のその半減期が少なくとも１２時間または少なくとも２４時間である、請求項３２に記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項４２】
請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび担体を含む、組成物。
【請求項４３】
請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
ヒトまたは動物身体の処置の方法において使用するための、請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド。
【請求項４５】
それを必要とする患者に有効量の請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、筋肉障害を処置する方法。
【請求項４６】
該筋肉障害が骨格筋の障害である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該筋肉障害が筋ジストロフィーまたは関連する進行性骨格筋力低下もしくは疲労、筋萎縮、悪液質、筋力低下；高齢者の筋肉減少症もしくは脆弱；または該ポリペプチドもしくは伸長ポリペプチドを外傷後の筋肉修復の目的のために投与する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
該筋ジストロフィーがデュシェンヌ型もしくはベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）もしくは先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）であり；該筋萎縮が廃用性萎縮、グルココルチコイド誘起の萎縮、老齢者の筋萎縮または脊髄傷害もしくは神経筋疾患により誘起される筋萎縮であり；該悪液質が癌、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性炎症性疾患もしくは熱傷に関連するか；または該筋力低下が泌尿器括約筋、肛門括約筋もしくは骨盤底筋におけるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該筋肉障害が心臓筋肉の障害である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
心臓の虚血もしくは機械的過負荷に応答する心筋損傷の防御もしくは制限の目的のため；心臓筋肉合成を促進するため；心臓１回拍出量を増加させることにより心拍出量を改善するため；心筋症を処置するため；急性心不全もしくは心臓に対する急性侵襲に応答する；病理学的心臓肥大を処置するため；またはうっ血性心不全を処置するために該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該急性心不全または急性侵襲が心筋炎または心筋梗塞を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
それを必要とする患者に有効量の請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、神経学的障害を処置する方法。
【請求項５３】
神経系の障害もしくは損傷に関連するニューロン喪失の防御の目的のためにまたは中枢神経系（ＣＮＳ）の維持のために該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該ニューロン喪失が神経変成障害、神経損傷または虚血に関連する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該障害が筋萎縮性側索硬化症；脊髄性筋萎縮症；進行性脊髄性筋萎縮症；乳児もしくは若年性筋肉萎縮、灰白髄炎もしくはポリオ後症候群；毒素への暴露により引き起こされる障害、運動ニューロン外傷、運動ニューロン病変もしくは神経損傷；運動ニューロンに影響する傷害；加齢に関連する運動ニューロン喪失；常染色体性もしくは伴性筋ジストロフィー；アルツハイマー病；パーキンソン病；糖尿病性ニューロパシー；末梢ニューロパシー；塞栓性もしくは出血性発作；アルコール関連脳損傷であるか；または外傷後の神経修復の目的のために該ポリペプチドもしくは伸長ポリペプチドが投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
請求項４５から５５のいずれかに定義される処置において使用するための医薬品の製造における、請求項１から４１のいずれかに記載のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドの使用。
【請求項５７】
それを必要とする患者に対して、有効量の、
５０個までのアミノ酸残基を含み、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドに対してＮ末端および／もしくはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長されている該ポリペプチドを含む伸長ポリペプチドであって、
生物学的活性を有するものを投与する、
神経学的障害を処置する方法。
【請求項５８】
該生物学的活性が神経保護能力である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
神経系の障害もしくは損傷に関連するニューロン喪失の防御の目的のためにまたは中枢神経系（ＣＮＳ）の維持のために該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
該ニューロン喪失が神経変成障害、神経損傷または虚血に関連する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該障害が筋萎縮性側索硬化症；脊髄性筋萎縮症；進行性脊髄性筋萎縮症；乳児もしくは若年性筋肉萎縮、灰白髄炎もしくはポリオ後症候群；毒素への暴露により引き起こされる障害、運動ニューロン外傷、運動ニューロン病変もしくは神経損傷；運動ニューロンに影響する傷害；加齢に関連する運動ニューロン喪失；常染色体性もしくは伴性筋ジストロフィー；アルツハイマー病；パーキンソン病；糖尿病性ニューロパシー；末梢ニューロパシー；塞栓性もしくは出血性発作；アルコール関連脳損傷であるか；または外傷後の神経修復の目的のために該ポリペプチドもしくは伸長ポリペプチドが投与される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６２】
それを必要とする患者に対して、有効量の、
５０個までのアミノ酸残基を含み、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドに対してＮ末端および／もしくはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長されている該ポリペプチドを含む伸長ポリペプチドであって、生物学的活性を有するものを投与する、
心臓筋肉の障害を処置する方法。
【請求項６３】
該生物学的活性が心臓保護能力である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
心臓の虚血もしくは機械的過負荷に応答する心筋損傷の防御もしくは制限の目的のため；心臓筋肉合成を促進するため；心臓１回拍出量を増加させることにより心拍出量を改善するため；心筋症を処置するため；急性心不全もしくは心臓に対する急性侵襲に応答する；病理学的心臓肥大を処置するため；またはうっ血性心不全を処置するために該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
該急性心不全または急性侵襲が心筋炎または心筋梗塞を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
該Ｃ末端Ｅペプチドが配列番号：１３のラットＥｂペプチド、配列番号：１４のラットＥｂペプチド、配列番号：２７のヒトＥｃペプチド、配列番号：１５のペプチド、または配列番号：３３もしくは３４のペプチドである、請求項５７から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドが配列番号：１３、１４、１５、２７、３３または３４の配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
該ポリペプチドの配列が配列番号：１３、１４、１５、２７、３３または３４の配列のものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
請求項５９、６０、６１、６４または６５のいずれかで定義される処置において使用するための医薬品の製造における、請求項５７、５８、６２、６３、６６、６７または６８で定義されるポリペプチドまたは伸長ポリペプチドの使用。
【請求項７０】
その配列が配列番号：２７のものであって、その１４および１５位置で１個または双方のアルギニン残基がＤ体である、ポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号：２７の１４および１５位置で双方のアルギニン残基がＤ体である、請求項７０に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
その配列が配列番号：３３、３４、３５または３６のものである、ポリペプチド。
【請求項７３】
Ｃ末端で１から５個のさらなるアミノ酸および／またはＮ末端で１から５個のさらなるアミノ酸をさらに含む、請求項７０、７１または７２に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
１個またはそれより多い該さらなるアミノ酸がＤ体アミノ酸である、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
１個のさらなるＤ体アミノ酸がＮ末端に存在する、請求項７４に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
該１個のさらなるＤ体アミノ酸がＤ−アルギニンである、請求項７５に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
Ｃ末端でさらなるアミノ酸が存在しない、請求項７６に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
１個のさらなるアミノ酸がＣ末端に存在し、そしてシステインである、請求項７０から７４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項７９】
Ｎ末端でさらなるアミノ酸が存在しない、請求項７８に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
その配列が配列番号：１５または２７のものであり、Ｃ末端で１個のさらなるシステイン残基および場合によってはＣ末端で１から４個のさらなるアミノ酸ならびに／またはＮ末端で１から５個のさらなるアミノ酸が加えられている、ポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号：１５または２７の１４および１５位置で１個または双方のアルギニンがＤ体である、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
配列番号：２７または１５の１４および１５位置で双方のアルギニンがＤ体である、請求項８１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
１個またはそれより多い該さらなるアミノ酸がＤ体アミノ酸である、請求項８０、８１または８２に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
１個のＤ体アミノ酸がＮ末端に存在する、請求項８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
該１個のＤ体アミノ酸がＤ−アルギニンである、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
Ｃ末端でアミド化されている、請求項７０から８５のずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８７】
ＰＥＧ化されているか、またはそれにヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分が結合している、請求項７０から８６のずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８８】
該ＰＥＧ化またはヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の結合がＮ末端である、請求項８７に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
ＰＥＧ化されていない、請求項７０から８８のいずれかに記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はメカノ成長因子（ＭＧＦ）として公知のインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）スプライスバリアントのＣ末端を形成するＥドメインから誘導される生物学的に活性なポリペプチドに関する。これらのペプチドを修飾して天然発生Ｅドメインペプチドに比較してその安定性を改善させる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物ＩＧＦ−Ｉポリペプチドは多くのアイソフォームを有し、それは選択的ｍＲＮＡスプライシングの結果として生じる。概して二つの型のアイソフォーム、肝型および非肝型アイソフォームが存在する。肝型アイソフォームは肝臓またはその他の場所で発現され得るが、その他の場所で発現される場合は肝臓において発現されるものと等価である。これらは全身作用を有し、そして哺乳動物では主要なアイソフォームである。非肝型アイソフォームはあまり一般的ではなく、そして自己分泌／傍分泌作用を有すると考えられているものもある。本発明が関係するＭＧＦアイソフォームは後者の型である。
【０００３】
ＭＧＦ（Yang et al, １９９６；McKoy et al, １９９９）では選択的スプライシングにより分子のＣ末端部分の読み枠を変化させるインサートが導入される。このインサートはヒトＭＧＦでは４９塩基対長である。５２塩基対インサートはラットおよびウサギＭＧＦにおいて類似の効果を有する。結果的にはＭＧＦが肝型ＩＧＦ−Ｉよりもわずかに長く（ターミネーターコドンは読み枠シフトのために後で現れる）、そしてＣ末端Ｅドメインは異なる配列を有する。それはグリコシル化を欠くので、全体的により小型である。
【０００４】
ヒトＭＧＦでは、Ｃ末端は時にＥｃペプチド（配列番号：２７）と称される２４個のアミノ酸Ｅドメインにより形成される。ラットおよびウサギＭＧＦでは、対応するＥドメインは時にＥｂペプチドと称され、２５アミノ酸長である（配列番号：１３／１４）。肝型ＩＧＦ−Ｉは代わりにＣ末端でＥａペプチドを含有する。ＥａおよびＥｃ／Ｅｂペプチドの配列は前記で論じた読み枠シフトのために互いに関連性がない。現在ＭＧＦ  Ｃ末端であると認めることができるものを有するスプライスバリアントの存在は最初にChewら（１９９５）に記載されたが、彼は肝臓癌を患う患者の研究の間に肝臓組織でそれを同定したが、潜在的機能または治療的重要性に関してはそれを全く研究しなかった。
【０００５】
Goldspinkおよび共同研究者は骨格筋の障害、特に筋ジストロフィーに対して使用するために；心臓筋肉の障害に対して、特に心臓の虚血または機械的過負荷に応答する心筋損傷の防御または制限において使用するために；概して神経学的障害の処置のために；およびとりわけ神経修復のために既にＭＧＦを同定していた（第ＷＯ９７／３３９９７号；第ＷＯ０１／１３６４８３号；第ＷＯ０１／８５７８１号；第ＷＯ０３／０６６０８２号）。肝型ＩＧＦ−ＩおよびＭＧＦは様々な役割および機能を有していることが徐々に明らかになってきている。したがってHillおよびGoldspink（２００３）はラット前脛骨筋でＭＧＦが電気刺激により引き起こされた、またはブピバカイン注射の結果である機械的損傷に応答して急速に発現されるが、その発現は次いで数日内に低下することを示している。逆に肝型ＩＧＦ−Ｉはさらにゆっくりと上方調節され、そしてその増加はＭＧＦ発現の低下に見合う。加えてYangおよびGoldspink （２００２）はマウスＣ２Ｃ１２筋肉細胞系をインビトロモデルとして用いて、２４個のアミノ酸のペプチドがヒトＭＧＦのＣ末端からのＥｃペプチドに関連するが、最後から二番目の位置に元来のアルギニンよりむしろヒスチジン、およびさらなるＣ末端システインを有し、筋芽細胞増殖を増加させるが筋管形成を阻止するという点で、成熟ＩＧＦ−Ｉの活性と比較して明確に異なる活性を有することを示した。Dluzniewskaら（September ２００５）はまたこの場合も最後から二番目の位置に元来のアルギニンよりむしろヒスチジンならびに１４および１５位置でＬアルギニンのＤアルギニンへの変換によるいくつかの修飾、加えてＣ末端アミド化およびＰＥＧ化を有する関連ペプチドの強力な神経保護効果を実証した。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の要旨）
しかしながら、本発明者は元来のヒトＭＧＦ  Ｃ末端Ｅｃペプチドのヒト血漿中の半減期が短いことを見出した。故に安定化修飾が薬剤として使用するためのその可能性を高めることができる。
【０００７】
本発明者はまたＭＧＦ  Ｃ末端Ｅｃペプチドが神経保護および心臓保護特性、ならびに正常およびジストロフィー骨格筋の強度を高める能力を有することも実証した。
【０００８】
したがって、本発明は５０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し；
該ポリペプチドはインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉのメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸配列を含み；
該ポリペプチドは未修飾ＭＧＦ  Ｅペプチドに比較して安定性を上昇させる一つまたはそれより多い修飾を組み込んでおり；
そして該ポリペプチドは生物学的活性を有する。
【０００９】
本発明はまた該ポリペプチドに対してＮ末端および／またはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長された本発明のポリペプチドを含む伸長ポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明はまた本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび担体を含む組成物を提供する。
本発明はまた本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまたヒトまたは動物の身体の処置の方法において使用するための本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを提供する。
本発明はまたそれを必要とする患者に有効量の本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与することにより筋肉障害を処置する方法を提供する。該筋肉障害は例えば骨格筋の障害または心臓筋肉の障害でよい。
【００１２】
本発明はまたそれを必要とする患者に有効量の本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与することにより神経学的障害を処置する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた前記で定義された処置において使用するための医薬品の製造における本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドの使用を提供する。
【００１４】
本発明はまたそれを必要とする患者に有効量の：
５０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドはインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含むか；または該ポリペプチドに対してＮ末端および／もしくはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長された該ポリペプチドを含む伸長ポリペプチド；
ならびに生物学的活性を有する該ポリペプチドまたは伸長ポリペプチド；
を投与することにより神経学的障害を処置する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまたそれを必要とする患者に有効量の：
５０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドはインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含むか；または該ポリペプチドに対してＮ末端および／もしくはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長された該ポリペプチドを含む伸長ポリペプチド；
ならびに生物学的活性を有する該ポリペプチド；
を投与することにより心臓筋肉の障害を処置する方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた神経学的障害または心臓筋肉の障害の処置において使用するための医薬品の製造における：
５０個までのアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドはインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のメカノ成長因子（ＭＧＦ）アイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含むか；または該ポリペプチドに対してＮ末端および／またはＣ末端の非野生型アミノ酸配列により伸長された該ポリペプチドを含む伸長ポリペプチド；
ならびに生物学的活性を有する該ポリペプチド；
の使用を提供する。
【００１７】
（図面の簡単な説明）
図１：配列アラインメントは：ヒト、ラットおよびウサギＭＧＦならびにヒト、ラットおよびウサギ肝型ＩＧＦ−Ｉの各々の配列の部分によりコードされる配列（配列番号：２のアミノ酸２６から１１０ならびに配列番号：４および６の２６から１１１：以下を参照）を示し、そしてヒトＭＧＦの４９塩基対インサートおよびラット／ウサギＭＧＦの５２塩基対インサートにより創成され、読み枠シフトおよびＣ末端での相違に至るＣ末端でのＭＧＦと肝型ＩＧＦ−Ｉとの間の差異を強調表示する。
【００１８】
図２：アラニン置換ならびにＣ末端およびＮ末端トランケーションの安定性および生物学的活性に及ぼす効果：さらなる配列アラインメントによりペプチド１−６（配列番号：１５−２０）の修飾された配列および短いペプチド１−４（配列番号：２１−２４）を比較し、そしてヒト血漿中でのインキュベーションにより測定されるような安定性、および筋肉細胞系における試験により測定されるような生物学的活性における変化の影響を詳記する（試験手順の詳細は実施例参照）。
【００１９】
図では、左側の最初の二つの列はペプチドを同定し、そしてその配列を示し、置換により作られた変化を同定する。第３列は安定性に関する試験の結果（詳細は実施例５参照）を示し、そして右側の最後の列は生物学的活性に関する試験の結果（詳細はこの場合も実施例５参照）を示す。
【００２０】
図３：３週後安定化ペプチドの注射後のマウスジストロフィー筋肉の強度の上昇：
（Ａ）安定化ペプチド（左側列）およびＩＧＦ（右側列）の注射後のｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉における強縮力の変化のパーセンテージ。
（Ｂ）安定化ペプチド（左側列）およびＰＢＳベヒクル対照（右側列）の注射後のｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉における強縮力の変化のパーセンテージ。
【００２１】
図４：安定化ペプチドの投与後の心臓保護：梗塞ヒツジ心臓への安定化ペプチド（第３列、「Ｅｃドメイン」と称する）、全長ＭＧＦ（第４列）、成熟ＩＧＦ−Ｉ（第２列）および対照調製物（第１列）の投与の後に達成される駆出率の比較。
【００２２】
図５：心筋梗塞（ＭＩ）後の機能の保存を示す圧／容積ループデータ：正常（左上）および梗塞（ＭＩ）マウス（右上）心室に関して、そして安定化ペプチドのＭＩ心臓（右下、「ＭＧＦペプチド」と称する）および正常心臓（左下）に全身的に分配された安定化ペプチドの効果を示す。全パネルはＹ軸に圧力（ｍｍＨｇ）およびＸ軸に相対容積単位を示す。
【００２３】
図６：ラット脳切片系における神経保護効果：左から右に、安定化ペプチド（「ＭＧＦ」と称する）、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＢＨ、ＴＢＨ＋安定化ペプチド（２４時間）、ＴＢＨ＋ＩＧＦ−Ｉ（２４時間）、ＴＢＨ＋安定化ペプチド（４８時間）、ＴＢＨ＋ＩＧＦ−Ｉ（４８時間）で処理した後の死亡細胞のパーセンテージ。
【００２４】
図７：Ｌ体からＤ体へのアルギニンの変換およびＮ末端ＰＥＧ化を組み込む安定化ペプチドの大きな安定性を実証するウェスタンブロット：新鮮ヒト血漿中でのインキュベーションにより、様々な時間間隔の範囲に関してＬ体からＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠く対応するものに比較した安定化ペプチドの安定性を調べた。次いでウェスタンブロットを用いてこれらの時間間隔：Ａ＝０分；Ｂ＝３０分；Ｃ＝２時間；Ｄ＝２４時間にわたる各ペプチドの生存を評価した。Ｌ−Ｄ変換およびＮ末端ＰＥＧ化を伴うペプチドに関する結果を右に示し；Ｌ体からＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠くペプチドの結果は左である。
【００２５】
図８：Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞の増殖に及ぼす８アミノ酸Ｃ末端ペプチドの効果：
（Ａ）ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦペプチド：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）プラスＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）プラスＩＧＦ−Ｉ（ｍｌあたり２ｎｇ）を含有する培地中、Ｃ２Ｃ１２細胞を２０００セル／ウェルで提供し、そして３６時間インキュベートした。次いでアラマーブルーアッセイを用いて細胞増殖を評価した。測定値の左側の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＤＭＧＦペプチドを用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.３.１参照）。測定値の中央の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＭＧＦペプチドを用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.３.１参照）。測定値の右側の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ−Ｉ単独を用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.４参照）。Ｙ軸値はアラマーブルーアッセイにおける蛍光（励起波長５３５ｎｍ、５９０ｎｍで測定；平均＋標準誤差）である。
【００２６】
（Ｂ）ペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８：５００セル／ウェルのＣ２Ｃ１２筋肉細胞。１０％ＦＢＳ中２４時間培養を実施し、続いて０．１％ＢＳＡ中２４時間飢餓状態にし、２４時間刺激し、そして次にＢｒｄＵで５時間処理した。０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８を０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉと一緒に試験した（結果の右側の組を参照）。ＢｒｄＵ組み込みを測定して達成された細胞増殖のレベルを評価した。細胞不含、培地のみ、５％ＦＢＳ含有およびＢｒｄＵ不含の対照もまた提供した。Ｙ軸の値は蛍光（３７０ｎｍでの吸光度；４ウェルに及ぶ平均＋標準誤差）である。左の最初の列は細胞が存在しない対照に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ２に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ４に関するものである。中央の三つは培地のみ（ｍｅｄ）、５％ＦＢＳ含有およびＢｒｄＵ不含の対照に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ６に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ８に関するものである。結果の右側の群は０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ−Ｉに関するものである（実施例１.４参照）。
【００２７】
配列情報
ヒト、ラットおよびウサギＭＧＦ  ＤＮＡのＤＮＡおよびアミノ酸配列を各々配列番号：１／２、３／４および５／６として列挙する配列で示す。これらは読み枠を変化させ、そして特徴的なＭＧＦ  Ｃ末端を創成する４９／５２塩基対インサートを含む、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のエクソン３／４／５／６によりコードされる成熟ＭＧＦを表すという点で全長ＭＧＦと称される。エクソン１および２は代替えのリーダー配列である。比較のためにヒト、ラットおよびウサギ肝型ＩＧＦ−Ｉ由来の対応するＤＮＡおよびアミノ酸配列を各々配列番号：７／８、９／１０および１１／１２として示す。エクソン４によりコードされる配列の最初から前方に６個のアミノ酸配列の比較を図１で作成する。
【００２８】
ラットＭＧＦのＣ末端に由来する元来のラットＥｂペプチドの配列（２５個のアミノ酸；配列番号：４のアミノ酸８７−１１１）を配列番号：１３として示す。
ウサギＭＧＦのＣ末端に由来する元来のウサギＥｂペプチドの配列（２５個のアミノ酸；配列番号：６のアミノ酸８７−１１１）を配列番号：１４として示す。
ヒトＭＧＦのＣ末端に由来する元来のヒトＥｃペプチドの配列（２４個のアミノ酸；配列番号：２のアミノ酸８７−１１０）を配列番号：２７として示す。
【００２９】
配列番号：２７のペプチドから誘導される修飾配列を配列番号：２８から３２として示す。
配列番号：２８では５位置でセリンをアラニンで置き換える。
配列番号：２９では１２位置でセリンをアラニンで置き換える。
配列番号：３０では１８位置でセリンをアラニンで置き換える。
配列番号：３１では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換える。
配列番号：３２では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして１５位置でもアルギニンをアラニンで置き換える。
【００３０】
元来のヒトＥｃペプチドはその最後から二番目の位置でアルギニンを有する。最後から二番目の位置でヒスチジンを有する元来のペプチドのバリアントが合成されており、そして配列番号：１５に示される。このペプチドをまた図２でペプチド１として記載する。配列番号：２６は最後から二番目の位置でアルギニンの代わりにヒスチジンを組み込んだ全長ヒトＭＧＦの配列を表す。配列番号：２５は配列番号：２６に関するＤＮＡコード化配列であり、そこでは最後から二番目の位置のヒスチジンはＣＡＣによりコードされ、そして残りの配列は配列番号：１のものと同一である。
【００３１】
配列番号：１５のペプチドから誘導される修飾配列を配列番号：１６から２４に示す。図２ではこれらを配列番号：１５のペプチドと、および互いに比較する。
ペプチド２（配列番号：１６）では５位置でセリンをアラニンで置き換える。
ペプチド３（配列番号：１７）では１２位置でセリンをアラニンで置き換える。
ペプチド４（配列番号：１８）では１８位置でセリンをアラニンで置き換える。
ペプチド５（配列番号：１９）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換える。
ペプチド６（配列番号：２０）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして１５位置でもアルギニンをアラニンで置き換える。
【００３２】
短いペプチド１（配列番号：２１）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして２個のＣ末端アミノ酸を除去する。
短いペプチド２（配列番号：２２）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして４個のＣ末端アミノ酸を除去する。
短いペプチド３（配列番号：２３）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして３個のＮ末端アミノ酸を除去する。
短いペプチド４（配列番号：２４）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして５個のＮ末端アミノ酸を除去する。
【００３３】
８アミノ酸ペプチド配列４個もまた配列表に含まれる。
配列番号：３３は最後から二番目の位置でヒスチジンを含有する配列番号：１５のバリアント配列の８個のＣ末端アミノ酸である。
配列番号：３４は最後から二番目の位置でアルギニンを含有する配列番号：２７の元来のヒトＭＧＦＣ末端の８個のＣ末端アミノ酸である。
配列番号：３５は２位置でセリンをアラニンで置換された配列番号：３３の配列である。したがってこれは配列番号：１８（ペプチド４）の８個のＣ末端アミノ酸に対応する。
配列番号：３６は２位置でセリンをアラニンで置換された配列番号：３４の配列である。したがってこれは配列番号：３０の８個のＣ末端アミノ酸に対応する。
参照を容易にするために、これらの配列を以下の表にも記載する。
【００３４】
【表１】
2008533114.tif 000002
【表２】
2008533114.tif 000003
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチド
本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは５０個までのアミノ酸残基の長さである。例えばそれらは１０アミノ酸長まで、３０アミノ酸長まで、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０アミノ酸長、または３５、４０、４５もしくは５０アミノ酸長まででよい。好ましくは、それらは１５から３０までのアミノ酸長、さらに好ましくは２０から２８までのアミノ酸長、最も好ましくは２２、２３、２４または２５アミノ酸長である。５から１０アミノ酸長、すなわち５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、特に８アミノ酸長のポリペプチドもまた好ましい。
【００３６】
本発明のポリペプチドはＩＧＦ−ＩのＭＧＦアイソフォームのＣ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列を含む。前記で論じたようなＭＧＦアイソフォームは、選択的スプライシングが、ＩＧＦ−ＩのＣ末端で見出されるＣ末端Ｅペプチドの読み枠を長くし、そして変化させるインサートをｍＲＮＡに導入してＥｃまたはＥｂペプチドを創成するものである。ＭＧＦアイソフォームは典型的には配列番号：２、４または６のＭＧＦの配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％または９０％の配列同一性を有する。ヒトＭＧＦ（配列番号：１および２）では、インサートは４９塩基対であり、そしてＣ末端ＥペプチドはＥｃペプチド（配列番号：２７）として公知であり、それは２４アミノ酸長である。ラットおよびウサギＭＧＦ（配列番号：３−６）ではインサートは４９塩基対であり、そしてＣ末端ＥペプチドはＥｂペプチドとして公知であり、それは２５アミノ酸長である（配列番号：１３および１４）。本発明の配列をこれらのいずれかのＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから、または任意のその他の種のＭＧＦ由来の任意のその他のＣ末端Ｅペプチドから誘導することができる。
【００３７】
生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）に合致する限り、本発明のポリペプチドに含まれ、そしてＭＧＦのアイソフォームＣ末端Ｅペプチドから誘導される配列を任意の方式で該Ｃ末端Ｅペプチドから誘導することができる。とりわけそれが正確にＣ末端Ｅペプチドの配列（例えば配列番号：１３、１４、２７または３４）を有し、そして全長ＭＧＦ分子内に単に存在するというだけではないという意味で、配列をＭＧＦのＣ末端Ｅペプチドから誘導することができる。この場合も生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）に合致する限り、その配列が変化する（以下の「修飾」参照）という意味で、それをＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導することもできる。
【００３８】
ポリペプチドはまた最大５０アミノ酸長までＣ末端Ｅペプチドから誘導される配列に対してＮ末端の元来のＭＧＦ配列を含み得る。これに代えて、任意の付加配列はＭＧＦから誘導されたものでなくてよく、すなわちこの場合も生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）に合致する限り、それは任意の配列でよい。
【００３９】
Ｃ末端ＭＧＦ  Ｅペプチドから誘導される配列はヒトＣ末端ＭＧＦ  Ｅｃペプチドの場合、少なくとも１０個、少なくとも１５個もしくは少なくとも２０個のアミノ酸、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４個のアミノ酸、またはラットもしくはウサギＣ末端ＭＧＦ  Ｅｂペプチドの場合、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５個のアミノ酸を含み得る。これに代えて、それは１０個までのアミノ酸、好ましくは５から１０個のアミノ酸、すなわち５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸、特に８個のアミノ酸を含み得る。
【００４０】
本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは一緒に集合させて、２個またはそれより多い本発明のポリペプチド、例えば本発明の同一のポリペプチドもしくは伸長ポリペプチドの複数のコピーまたは異なるものの混合物を含有する大きな構造を形成することができる。ポリペプチドの特性およびとりわけそれらが任意のＬ−Ｄ変換（以下を参照）を含有するかどうかに依存して、これらの構造を通常標準的な技術による組換え発現によりコード化ＤＮＡから、もしくは合成により組み立てられる融合タンパク質として作成するか、または融合タンパク質として発現し、そして次に適切な化学的修飾に供することができる。
【００４１】
本発明の伸長ポリペプチド
本発明の伸長ポリペプチドは本発明のポリペプチドを含み、非野生型配列により伸長される。本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端が元来のＭＧＦ配列を表す場合、次いでその配列が、それが元来のＭＧＦで隣接する任意の配列に単に連結されているのではないかもしれないという点で、これは任意の伸長配列が非ＭＧＦ配列であるということを意味している。それとは別に、伸長は任意の配列を有し得る。したがって本発明のポリペプチドをＣおよびＮ末端のいずれかまたは双方で任意の長さのアミノ酸配列により伸長することができる。例えば伸長は５個まで、１０個まで、２０個まで、５０個までまたは１００もしくは２００個まで、またはさらに多くのアミノ酸を含み得る。典型的には任意のかかる伸長は短い、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長である。例えばエキソペプチダーゼの攻撃を低減させるために、伸長は完全にＤ体アミノ酸（以下を参照）を含有するかまたはさらにはそれからなり得る。例えばポリペプチドは一方または双方の末端で１から５個のＤ体アミノ酸により伸長され得る。例えばいくつかの実施態様では、付加システイン残基をＣ末端で組み込むことができる。
【００４２】
修飾
本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドが誘導される配列を含む未修飾Ｅペプチドと比較してその安定性を上昇させる任意の様式で本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチド修飾することができる。安定性を種々の方式で上昇させることができる。例えばタンパク質のＣおよび／またはＮ末端への修飾（例えばＰＥＧ化もしくはその他の化学的修飾またはＬ−Ｄ体アミノ酸変換）がエキソペプチダーゼ攻撃に対して保護し、環化も同様であり、そして内部修飾（例えば置換、欠失、挿入および内部Ｌ−Ｄ体変換）はその切断部位を崩壊させることによりエンドペプチダーゼによる切断に対してそれを保護すると予想される。
【００４３】
例えばそれは好ましくはＮ末端でＰＥＧ化の位置を制御できる程度までのＰＥＧ化でよいが、Ｃ末端およびＣ末端とＮ末端の間のようなその他の部位でのＰＥＧ化もまた意図される。ＰＥＧ化はＰＥＧのポリペプチドへの共有結合を伴う。得られたＰＥＧ化ポリペプチドが生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）を満足させる限り、任意の適当な型の、例えば任意の適当な分子量のＰＥＧを用いることができる。
【００４４】
安定化を達成するためでも、そうでなくても、本発明のポリペプチドをその他の化学的修飾をＰＥＧ化と同様に、またはＰＥＧ化の代わりに組み込むこともできる。かかる修飾にはグリコシル化、硫酸化、アミド化およびアセチル化が含まれる。とりわけポリペプチドをＮ末端でアセチル化できるのが好ましく、またはＣ末端もしくは双方でアミド化できる。これに代えてまたは加えて、一つまたはそれより多いヘキサン酸またはアミノヘキサン酸部分、好ましくは一つのヘキサン酸またはアミノヘキサン酸部分を通常Ｎ末端で加えることができる。
【００４５】
加えてまたはこれに代えて、ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは１個またはそれより多いＤ体アミノ酸を含み得る。天然には、アミノ酸はＬ体である。Ｄ体アミノ酸を挿入することが安定性を改善できる。典型的には数個、例えば１、２、３、４または５個のＤ体アミノ酸を用いることができる。しかしながら、得られたＰＥＧ化ポリペプチドが生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）を満足させる限り、さらに多く、例えば５から１０個、１０から１５個、１５から２０個もしくは２０個またはそれより多くを用いることもできる。これらの要件を満足させれば、Ｄ体アミノ酸を用いて全ポリペプチドを合成することさえできる。
【００４６】
ポリペプチドの任意の位置でＤ体アミノ酸を用いることができる。配列番号：２７のヒトＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドは１４および１５位置でアルギニンの１個または双方をＤ体アミノ酸と置き換えるのが好ましい。配列番号：１３および１４のラットおよびウサギ配列（ラット／ウサギ配列は連続して３個のアルギニンを含むが、ヒトでは２個しか有さないので、１４、１５および１６位置）での、および配列番号：１５のバリアント配列での対応する変化もまた好ましい。
【００４７】
加えてまたはこれに代えて、ポリペプチドの一方もしくは他方の末端または双方でＤ体アミノ酸を含み得る。これはエキソペプチダーゼ攻撃に対する保護を助けると予想される。ＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導される配列の一方または双方の末端で末端アミノ酸、例えば末端の１、２、３、４または５個のアミノ酸をＤ体に変換することによりこれを達成することができる。これに代えてまたは加えて、ポリペプチドの一方または双方の末端で１、２、３、４または５個のさらなるＤ体アミノ酸を付加することによりそれを達成することができる。かかるさらなるアミノ酸は元来のＭＧＦのＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導される配列に隣接するものに対応してもしなくてもよい。かかるさらなるアミノ酸は任意のアミノ酸でよい。この方式でＤ体で付加するための可能な１個のアミノ酸はアルギニンである。例えばＤ体アルギニン残基をＮ末端、Ｃ末端または双方で加えることができる。
【００４８】
一つの実施態様では、配列番号：２７の元来のヒトＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチド配列は保持されるが、配列番号：２７の１４および１５位置のアルギニンはＤ体に変換され、そしてＮ末端ＰＥＧ化が提供される。Ｃ末端アミド化もまた提供される。
【００４９】
別の実施態様では、配列番号：１５のヒトＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドバリアントの配列は保持されるが、配列番号：１５のアルギニン１４および１５はＤ体に変換され、そしてＮ末端ＰＥＧ化が提供される。
【００５０】
いくつかのさらなる実施態様では、配列番号：１５もしくは２７からの８個のＣ末端アミノ酸の配列、すなわち配列番号：３３もしくは３４の配列を用い、そしてＮ末端ＰＥＧ化を提供するか、またはＣ末端でヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分を付加する。Ｃ末端アミド化もまた提供される。
【００５１】
これに代えてまたは加えて、本発明のポリペプチドはその他の修飾、例えばトランケーション、挿入、内部欠失または置換を組み込むこともできる。
トランケーションに関しては、配列番号：１５のＣ末端の８個のアミノ酸に基づく短いペプチドが活性であることも見出されている。しかしながら、以下の実施例５の結果により、ＭＧＦ  Ｃ末端に関連する長いペプチドの活性は特にペプチドのＮ末端のトランケーションに非常に鋭敏であり得る。配列番号：１５のペプチドのＮ末端では、３個のアミノ酸によるトランケーションが実施例５で用いられる筋肉細胞モデルにおける活性の喪失を導いた。配列番号：１５のペプチドのＣ末端では、４個のアミノ酸によるトランケーションが筋肉細胞モデルにおける活性の喪失を導いたが、２個のトランケーションでは喪失に至らなかった。元来のヒト、ラットおよびウサギＥペプチド配列の場合、ならびにバリアントでは配列番号：１５の一つおよび元来のペプチドの長さに匹敵する長さ（例えば１８個またはそれより多いアミノ酸）を有する本発明のその他のペプチドでは、したがって活性を喪失することなく、Ｃ末端で１、２または３個のアミノ酸によりトランケートされる可能性があると予想される。活性を喪失することなく、Ｎ末端で１または２個のアミノ酸によりトランケートされる可能性があるとも予想される。
【００５２】
挿入に関しては、得られたポリペプチドが生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）を満足させ、そして５０個未満のアミノ酸を含む限り、アミノ酸の短いストレッチをヒトＣ末端ＭＧＦ  Ｅペプチドから誘導される配列に挿入することができる。各挿入は例えば１、２、３、４または５個のアミノ酸を含み得る。１個またはそれより多い、例えば２、３、４または５個のかかる挿入があり得る。
【００５３】
内部欠失に関しては、得られたポリペプチドが生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）を満足させる限り、ヒトＣ末端ＭＧＦ  Ｅペプチドから誘導される内部配列からアミノ酸の短いストレッチを欠失させることができる。一つまたはそれより多いかかる欠失、例えば１、２、３、４または５個の欠失を全部で例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸まで作ることができる。
【００５４】
置換に関しては、得られたポリペプチドが生物学的活性および安定性に関する要件（以下を参照）を満足させる限り、ポリペプチドの任意のアミノ酸を原則的に任意のその他のアミノ酸により置換することができる。一つまたはそれより多いかかる置換、例えば全部で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、１５個まで、または２０個までの置換を行うことができる。好ましくはＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導される配列では、せいぜい１０個の置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の置換を行う。好ましくは、ＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導される配列では、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のアミノ酸残基が、配列が誘導される元来のＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドのものと同一である。好ましい研究法では、ポリペプチドの一方または双方の末端の残基（末端残基）が置換される。これはエキソペプチダーゼ攻撃に対して保護すると予想される。したがって例えばＮ末端およびＣ末端位置の、または末端のものに直に隣接する位置の、または一方もしくは双方の末端から３、４もしくは５位置までの残基を置換するのが好ましいかもしれない。
【００５５】
置換は安定性または生物学的活性を上昇させることができる。例えば以下の実施例５および図２で論じる結果により、一つまたはそれより多い、配列番号：１５のペプチドの５、１２、１４および１８位置での置換は安定性を上昇させることができることが示される。同一の結果により、１２、１４および１８位置での置換はまた生物学的活性を上昇させることができることが示される。したがって配列番号：２７および１５のペプチドの５、１２、１４および１８位置で、ならびに配列番号：３３および３４の２位置での置換（これは配列番号：ａ５および２７の１８位置に対応する）が好ましい。配列番号：１３および１４のラット／ウサギＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドの５、１２、１５および１９位置への対応する置換もまた好ましい。
【００５６】
実施例５および図２で示すように、配列番号：２７もしくは１５の５、１２、１４もしくは１８位置、配列番号：３３および３４の２位置、配列番号：１３および１４の５、１２、１５および１９位置またはその他の場所で、アラニンを有する元来のアミノ酸の置換が一つの好ましい選択肢である。しかしながらその他のアミノ酸を均等に用いることができる。
【００５７】
これに代えてまたは加えて、ポリペプチドは安定性または生物学的活性に有意な影響を有さない置換を含み得る。これらは典型的には保存置換である。例えば以下の票にしたがって保存置換を作成することができる。第２列の同一の区画の、好ましくは第３列の同一行のアミノ酸を互いに置換することができる。
【００５８】
【表３】
2008533114.tif 000004
【００５９】
典型的には、本発明のポリペプチドのＬ−Ｄ変換、置換、挿入および欠失のようなアミノ酸配列修飾はＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドから誘導されるアミノ酸の配列において見出される。しかしながらポリペプチドがさらなるＭＧＦ配列を含有する場合、これに代えてまたは加えて、それらをそのさらなる配列において見出すことができる。例えば本発明のポリペプチドが、元来のＭＧＦのＥペプチドの配列（例えば配列番号：１３、１４または２７）に対してＮ末端であるさらなるＭＧＦ配列を含有する場合、その配列に修飾を見出すことができる。
【００６０】
これに代えてまたは加えて、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドの環化により安定性を上昇させることもできる。これはエキソペプチダーゼ攻撃に対して保護すると予想される。
【００６１】
本発明の好ましいポリペプチドは以下を含む。
（ｉ）２４アミノ酸長であり、そして配列番号：１５の配列を有するが、配列番号：１５の２個のアルギニン（１４および１５位置）をＬ体からＤ体に変換することにより、およびＮ末端ＰＥＧ化により安定化されるペプチド。
（ｉｉ）前記の（ｉ）のようなペプチドであるが、ＰＥＧ化を欠く、すなわち配列番号：１５の配列を有するが、配列番号：１５の２個のアルギニンをＬ体からＤ体に変換することにより安定化されたペプチド。
（ｉｉｉ）ペプチド２、３、４および５（配列番号：１６から１９）のような実施例５および図２に記載されるペプチド。
（ｉｖ）配列番号：１９の配列を有する（ここで１４位置のアルギニンはアラニンにより置き換えられている）が、Ｃ末端の２個のアミノ酸がトランケートされている、短いペプチド（配列番号：２１）のような実施例５および図２に記載されるペプチド。
（ｖ）前記の（ｉ）のペプチドに対応するが、配列番号：２７の元来のヒトＣ末端ペプチドに基づき、最後から二番目の位置にヒスチジンよりもむしろアルギニンを含有するペプチド、すなわち配列番号：２７の配列を有するが、配列番号：２７の１４および１５位置で２個のアルギニンをＬ体からＤ体に変換することにより、およびＮ末端ＰＥＧ化により安定化されたペプチド。
（ｖｉ）前記の（ｖ）のようなペプチドであるが、ＰＥＧ化を欠く、すなわち配列番号：２７の配列を有するが、配列番号：２７の１４および１５位置で２個のアルギニンをＬ体からＤ体に変換することにより安定化されたペプチド。
（ｖｉｉ）前記の（ｉｉｉ）のペプチドに対応するが、配列番号：２７の元来のヒトＣ末端ペプチドに基づき、最後から二番目の位置にヒスチジンよりもむしろアルギニンを含有するペプチド；本明細書では配列番号：２８から３１として示される。
（ｖｉｉｉ）Ｎ末端ＰＥＧ化またはＮ末端ヘキサン酸もしくはアミノヘキサン酸部分の結合を伴う配列番号：３３−３６のいずれかのペプチド。
（ｉｘ）Ｃ末端アミド化を伴う前記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）または（ｖｉｉ）のいずれかのペプチド、特にＣ末端アミド化を伴う前記の（ｉｉ）および（ｖｉ）のペプチド、すなわち１４および１５位置でのＬアルギニンのＤアルギニンへの変換ならびにＣ末端アミド化を伴うが、ＰＥＧ化を欠く配列番号：１５および２７の配列を有するペプチド。
（ｘ）Ｃ末端でさらなるシステイン残基を有する前記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のいずれかのペプチド。
（ｘｉ）Ｎ末端でさらなるＤ体アルギニン残基を有する前記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）または（ｉｘ）のいずれかのペプチド。
【００６２】
生物学的活性
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドは生物学的活性を有する。この活性を以下から選択することができる。
マウス、ヒトまたはその他の哺乳動物のジストロフィーおよび／または非ジストロフィー骨格筋における筋肉強度を増す能力（以下の実施例２参照）。好ましくは本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドはジストロフィーおよび／または非ジストロフィー筋肉において少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも１００％（例えば到達可能な最大強縮力により測定されるような）筋肉強度を増すことができる。
【００６３】
ヒツジ、マウス、ヒトまたはその他の哺乳動物における心臓保護能力（以下の実施例３参照）。好ましくは本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは梗塞または機械的過負荷の心臓における心筋損傷を防御または制限する能力を有する。本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与していない梗塞心臓と比較して、圧／容積ループにより、または駆出率を上昇させる能力を参照することにより、これを測定することができる。好ましくは本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％もしくは少なくとも１０％またはそれより多く駆出率を上昇させる能力を有する。
【００６４】
マウス、アレチネズミ、ヒトまたはその他の哺乳動物におけるインビトロまたはインビボ神経保護能力（以下の実施例４参照）。好ましくは本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドはラット器官型海馬培養および／またはその他の類似のインビトロモデルにおいて細胞死を低下させる能力を有する。好ましくはＴＢＨまたは酸化的ストレスを誘起するかもしくはその他の方式で損傷を引き起こすその他の別の薬剤への暴露の後、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％またはそれより多くかかるモデルにおいて細胞死を低下させる能力を有する。これに代えてまたは加えて、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは神経保護能力を有し得る。
【００６５】
さらに、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは全長ＭＧＦ（例えば配列番号：２、４または６）に特徴的な一つまたはそれより多い生物学的特性を有し得る。例えば本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは第ＷＯ９７／３３９９７号で同定されるＭＧＦの機能的特性を有し得る。とりわけそれらは骨格筋組織の成長を誘起する能力を有し得る。同様に本明細書で論じるように、それらは骨格筋修復に必要なタンパク質合成を上方調節する、および／または骨格筋における衛星（幹）細胞を活性化する能力を有し得る。
【００６６】
この点で、生物学的活性を評価する一つの方法は実施例５.２.２.で論じるようなアラマーブルー法である。これはポリペプチドを単核筋芽細胞と接触させ、そしてそれらが増殖を引き起こすまでの程度を評価することを伴う。これを任意の適当な方式で、例えば実施例で論じるような０から３のスケールで採点することができる。細胞分割の初期マーカーであるサイクリン１Ｄのようなサイクリンにより活性を測定することもできる。ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の使用により活性を測定することもできる。ＢｒｄＵはＤＮＡ修復の間にチミジンをそれ自体と置換し、そしてしたがってＤＮＡが複製している細胞を同定し、そしてどの程度複製および細胞分割が起こっているかを測定するためにそれを用いることができる。
【００６７】
これに代えてまたは加えて、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは第ＷＯ０１／１３６４８３号で以前に同定された神経学的特性を有し得る。したがってそれらは運動ニューロン救済に影響する能力を有し得る。とりわけそれらは未処置対象の等価な状況と比較して処置対象において神経捻除後の運動ニューロン喪失を２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％まで低下させることができる。７０％もしくはそれより多い、または８０％もしくはそれより多い運動ニューロンの喪失の低下（すなわち（喪失が）３０％もしくはそれより少ない、または２０％もしくはそれより少ない）が好ましい。救済の程度を任意の適当な技術、例えば立体学のような公知の技術を用いて計算することができる。具体的な試験としては、ラットの顔面神経捻除に応答した運動ニューロン救済の測定に依る第ＷＯ０１／１３６４８３号にて用いられる技術を用いることができる。
【００６８】
これに代えてまたは加えて本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは第ＷＯ０３／０６０８８２号で同定された特性、つまり心筋の筋肉細胞の細胞死、またはアポトーシスを防御することにより虚血または機械的過負荷の後の心筋損傷を防御または制限する能力を有し得る。好ましくは本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドはそれが適用される心臓筋肉の部分におけるアポトーシスを完全に防御する能力を有する。しかしながらアポトーシスはまた部分的に防御されるだけ、すなわち限定的でもよい。本発明の処置なしで生じるものに比較して何らかの損傷の低減が達成される場合、例えば死亡する細胞の数もしくは比率により、または機能を喪失する筋肉の部分の大きさにより、または血液を送り出す心臓の全体的な能力により測定されるように、損傷が１％もしくはそれより多く、５％もしくはそれより多く、１０％もしくはそれより多く、２０％もしくはそれより多く、３０％もしくはそれより多く、５０％もしくはそれより多く、７０％もしくはそれより多く、８０％もしくはそれより多く、９０％もしくはそれより多く、９５％もしくはそれより多く、９８％もしくはそれより多く、または９９％もしくはそれより多く低減される場合、損傷は制限される。
【００６９】
とりわけインビボで低侵襲方法を用いて心拍出量、駆出率等を決定することにより、心臓損傷の低減を推測することができる。血清中のクレアチンキナーゼおよびトロポニンＴのようなマーカーを検定することもできる。これらは傷害後の心臓筋肉に対する損傷程度を決定するために臨床状況で用いられるパラメーターである。
【００７０】
アポトーシスを防御する能力を任意の適当な技術により測定することができる。例えば実施例４ならびに図３および６を参照して、心臓筋肉細胞または心臓様細胞系において、ＤＮＡフラグメント化により示されるようなアポトーシスを防御する能力によりそれを測定することができる。細胞をソルビトールまたは細胞を振盪ストレス下に置くその他の薬剤で１、２、４、６、１２、２４または４８時間、好ましくは１２から２４時間、さらに好ましくは２４時間処理し、そしてアポトーシスに関連するフラグメント化のパターンを観察できるかどうかを調べることにより、ＤＮＡフラグメント化により示されるようなアポトーシスを防御する能力を試験することができる。この方式で発現される本発明のＭＧＦポリペプチドは典型的には、６、１２または２４時間のソルビトール処理の後、これらの条件下での未処理細胞と比較してＤＮＡフラグメント化を低減させる、好ましくは排除する。
【００７１】
アポトーシスのマーカーとして働く遺伝子が発現されないか、または低発現であることもまたアポトーシスの防御の指標として働き得る。一つの適当なマーカーはＢａｘ遺伝子である。同様にアポトーシス条件下でＭＧＦトランスフェクトした細胞における抗アポトーシスマーカーの発現増加を、本発明のポリペプチドがアポトーシスを防御している徴候として考えることができる。一つの適当な抗アポトーシスマーカー遺伝子はＢｃｌ２である。アポトーシスを防御する能力をインビトロで筋細胞における細胞数の低下を防御するＭＧＦポリペプチドの能力を参照することにより測定することもできる。
【００７２】
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドの別の好ましい特性は心臓筋肉細胞における肥大表現型を誘起する能力である。とりわけインビトロで一次心臓筋細胞培養において肥大表現型を誘起する能力を評価することにより、これを試験することができる。これを決定するための好ましい方法はＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）および／またはｂＭＨＣ（ベータミオシン重鎖）の発現の増加に関して試験することである。ＡＮＦは肥大条件で上方調節される胚性マーカー遺伝子である。ｂＭＨＣは筋肉の重要な収縮性タンパク質である。
【００７３】
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドの安定性
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドはそれらが誘導される配列を含有する元来のＣ末端ＭＧＦ  Ｅペプチドと比較して安定性が上昇している。本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドとその単離された未修飾形態の元来のＣ末端ＭＧＦ  Ｅペプチドとの間（例えばＭＧＦ分子の残りから分離された未修飾形態の配列番号：１３、１４、２７または３４、および２４マー（配列番号：２７）、２５マー（配列番号：１３／１４）または８マー（配列番号：３４）として単離形態で）でかかる比較を行う。配列番号：１５および３３をヒスチジン含有配列と比較を行うこともできる。本明細書にて論じる修飾により任意の程度で安定性を高めることができる。
【００７４】
ヒト血漿における半減期に関して、または任意のその他の技術により安定性を評価することができる。とりわけ血漿を用時まで−７０℃で保存し、ペプチド１０μｇを血漿２ｍｌプラスＰＢＳ７ｍｌに加え、そして混合物を３７℃で様々な時間間隔でインキュベートした以下の実施例５.１の技術にしたがって、新鮮ヒト血漿中のタンパク質溶解性切断に対するペプチドの感受性を評価することにより安定性を測定することができる。（図７ではＡ＝０分；Ｂ＝３０分；Ｃ＝２時間；Ｄ＝２４時間。Ｌ−Ｄ変換およびＮ末端ＰＥＧ化を伴うペプチドの結果を右に；ＬからＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠くペプチドの結果を左に示す。）Ｌ−Ｄ変換およびＰＥＧ化を欠くペプチドは３０分後には比較的わずか、２時間後には非常にわずかしか検出できず、そして２４時間後には全くまたはほとんど検出できなかった。対照的にＬ−Ｄ変換およびＰＥＧ化を伴うペプチドを２時間および２４時間に多く検出することができた。
【００７５】
安定性のその他の測定は経時的な生物学的活性の喪失の決定に基づくことができる。任意の適当な方法により、例えば本明細書にて論じる生物学的活性の測定のいずれかに関するインビトロアッセイによりこれを行うことができる。
【００７６】
定量的には、比較的には、好ましい本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは対応する未修飾ＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％もしくは少なくとも５００％またはそれより多く増加した半減期を有し得る。
【００７７】
定量的には、絶対的には、好ましい本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間もしくは少なくとも４８時間またはそれより多い半減期を有し得る。
【００７８】
これに代えて、実施例５および図２のように、例えば０から３のスケールでポリペプチドまたは伸長ポリペプチドの安定性を採点することにより安定性の定量的または半定量的測定値を用いることができる。そのスケールで配列番号：１５のポリペプチドのスコアは１であった。本発明の特定のその他の修飾ポリペプチドはスコア２または３であった。本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは一般にかかるスケールでは対応する元来のＭＧＦ  Ｃ末端Ｅペプチドよりも高いスコアである。
【００７９】
本発明のさらなるペプチド
本発明のポリペプチドの多くは安定化されているが、前記で論じたように、特定の環境下では配列番号：１３、１４、２７および３４の元来のポリペプチドまたは配列番号：１５および３３のヒスチジン含有バリアントを含む安定化されていないポリペプチドが有用である可能性があり得る。本発明による神経学的および心臓障害の処置においては、本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドが比較的急速に分解される、すなわち比較的短時間にその効果を奏するのが望ましいかもしれない。したがってかかる処置の局面では安定性が要求される必要はない。
【００８０】
安定化が要求されない場合、安定化修飾が施されていない配列番号：１３、１４、２７および３４の元来のポリペプチドまたは配列番号：１５もしくは３３のヒスチジン含有バリアントを使用するのが好ましい。しかしながら修飾ポリペプチドもまた使用することができる。この態様でこれらの修飾が安定性の上昇を招くことが要求されないことを除いて、本明細書で論じる修飾のいずれかを適用することができる。
【００８１】
本発明による処置
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを用いて多くの状態を処置することができる。概してこれらを三つの分野：骨格筋の障害、心臓筋肉の障害および神経学的障害に分類する。しかしながら神経および筋肉機能は相互依存的であるので、これらのカテゴリー間、例えば神経筋障害の分野でいくつかの重複が存在し得る。
【００８２】
神経学的障害を一般に二つのカテゴリー、故障が神経系そのものにある神経性障害および筋原性または筋肉関連の神経学的障害に分けることができる。本発明にしたがって双方を処置することができる。
【００８３】
本発明による処置に感受性のある骨格筋の障害には：限定するものではないがデュシェンヌ型またはベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）および常染色体性ジストロフィーを含む筋ジストロフィー、ならびに関連する進行性骨格筋力低下および疲労；限定するものではないが廃用性萎縮、グルココルチコイド誘起の萎縮、老齢者の筋萎縮および脊髄傷害または神経筋疾患により誘起される筋萎縮を含む筋萎縮；悪液質、例えば癌、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性炎症性疾患、熱傷等に関連する悪液質；特に泌尿器括約筋、肛門括約筋および骨盤底筋のような特定の筋肉における筋力低下；高齢者の筋肉減少症および脆弱が含まれる。本発明はまた外傷後の筋肉修復においても適用を見出す。神経学的障害が関係する限り、神経変性障害の処置は一つの可能性である。運動ニューロン障害、特に運動ニューロンの神経変成障害の処置もまた可能性である。
【００８４】
神経学的（神経筋を含む）障害の実例には、筋萎縮性側索硬化症；脊髄性筋萎縮症；進行性脊髄性筋萎縮症；乳児または若年性筋肉萎縮、灰白髄炎またはポリオ後症候群；毒素への暴露により引き起こされる障害、運動ニューロン外傷、運動ニューロン病変または神経損傷；運動ニューロンに影響する傷害；ならびに加齢に関連する運動ニューロン喪失；ならびに常染色体性および伴性筋ジストロフィー；アルツハイマー病；パーキンソン病；糖尿病性ニューロパシー；末梢ニューロパシー；塞栓性および出血性発作；ならびにアルコール関連脳損傷が含まれる。本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを中枢神経系（ＣＮＳ）の維持のために使用することもできる。本発明はまた外傷後の神経修復における適用もまた見出す。
【００８５】
本発明にしたがって神経損傷を処置することもできる。この実施態様では、典型的には例えば切断された末梢神経の二つの終端の周りに導管を設置することにより、修復を行うかかる損傷の部位の周囲にポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを局在させる（第ＷＯ０１／８５７８１号参照）。
【００８６】
心臓障害に関しては、心臓筋肉タンパク質合成の促進が有利な処置である言及した疾患、心筋症；急性心不全または心筋炎もしくは心筋梗塞を含む急性侵襲；病理学的心臓肥大；およびうっ血性心不全があり得る。本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを用いて、心臓１回拍出量を増加させることにより心拍出量を改善することもできる。とりわけ本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを用いて虚血および／または機械的過負荷の後の心筋損傷を防御することができる。
【００８７】
この場合、一般的には心臓への虚血または機械的過負荷の発症後できるだけ迅速に、例えば虚血の結果である心臓発作が診断されてすぐにこれらを投与する。好ましくは５、１０、１５、３０もしくは６０分以内、または２もしくは５時間以内にこれらを投与する。ＭＧＦポリペプチドまたはポリヌクレオチドの投与に応答する虚血または機械的過負荷が一時的な状態であるのが好ましい。特に好ましい実施態様では、心臓発作に応答して本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを投与する。本発明の処置は心臓発作の患者が良好に回復し；そして正常な、活動的な生活に戻ることを助けるのに特に有効である。
【００８８】
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドの生成
標準的な技術により本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを生成することができる。それらは典型的には必要により得られたアミノ酸配列に適切な化学的修飾（例えばＰＥＧ化）を加えたペプチド合成の標準的な技術により得られる。Ｄ体アミノ酸が存在しない場合、やはり標準的な技術によりポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを代わりに適切なコード化ＤＮＡから宿主細胞における組換え発現により得ることができる。
【００８９】
任意の望ましい程度までの単離および精製もまた標準的な技術により実施することができる。本発明によるポリペプチドおよび伸長ポリペプチドは一般的には完全または部分的のいずれかで単離または精製される。単離されたポリペプチドまたは伸長ポリペプチドはそれが生成された調製物よりも高濃度でポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを含有する任意の調製物である。とりわけポリペプチドまたは伸長ポリペプチドが組換えにより得られる場合、ポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは典型的には宿主細胞から抽出され、そして主要な細胞構成成分は除去されている。
【００９０】
精製された形態のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドは一般的には、調製物中９０％より多い、例えば９５％まで、９８％まで、または９９％までのポリペプチド材料が本発明のものである調製物の部分を形成する。
【００９１】
単離されたおよび精製された調製物はしばしば本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを含有する水溶液である。しかしながら本発明のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドをその他の形態で、例えば結晶またはその他の乾燥調製物として精製または単離することができる。
【００９２】
組成物、処方、投与および用量
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドは好ましくはポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび担体を含む組成物の形態で提供される。とりわけかかる組成物はポリペプチドまたは伸長ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物でよい。任意の適当な医薬処方を用いることができる。
【００９３】
例えば適当な処方は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、殺菌性抗生物質および意図されるレシピエントの体液と等張の処方にする溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液含み得る。処方を単位用量または多回用量容器で提示することができる。例えばアンプルおよびバイアルを密封し、そして使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする凍結または凍結−乾燥（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。
【００９４】
特に前記で言及した成分に加えて、本発明の処方は問題の処方の型を考慮した当分野で慣用されるその他の薬剤を含み得る。滅菌、パイロジェン不含水性および非水性溶液が好ましい。
【００９５】
一般的には標準的な処方技術により処方を以下で論じる投与の様式に合わせる。
処置される状態に合わせた任意の適当な経路、例えば局所、皮膚、非経口、筋肉内、皮下もしくは経真皮投与により、または血流への直接注射もしくは粘膜組織への直接適用により本発明のポリペプチドを投与することができる。
【００９６】
多くの環境下で注射、例えば皮下、非経口筋肉内または静脈内注射は好ましい経路である可能性がある。静脈内注射はしばしば多くの臨床環境下で好ましい。ある環境下ではいわゆる「無針」注射または経皮投与が可能であるかもしれない。
【００９７】
骨格筋障害の処置では静脈内および筋肉内注射が好ましい経路である。例えばパッチによる、腹部の筋肉の強化のため、またはその他の目的のための局所投与もまた予想される。
心臓筋肉障害の処置では分配は一般的に静脈内である。適切な臨床環境下では（例えば心臓専門部門で）例えば心臓へのポリペプチドの分配のためにいわゆる「無針」注射系を用いる心臓への直接分配もまた可能であるかもしれない。
【００９８】
本発明のポリペプチドおよび伸長ポリペプチドを任意の適当な用量で、そして任意の適切な投与計画を用いて分配することができる。多くの因子に依存して、用量および投与計画を適合させて処置される特定の状態の最適な処置を確実にすることができることは当業者には理解されよう。いくつかのかかる因子は処置される対象の年齢、性別および臨床状態でよい。
【００９９】
発明者の経験に基づいて、０.２から１０ｍｇの範囲に、例えば０.２から０.８ｍｇ、好ましくは約０.５ｍｇの用量が有効であることが予想される。例えば１ｍｇ／ｍｌの濃度のポリペプチドまたは伸長ポリペプチドを含有する溶液を０.１から１ｍｌの量で用いることができる。問題の適用および臨床環境に依存して単回または多回投与を行うことができる。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例は本発明を説明するものである。
（実施例）
１．ペプチド
１.１  実施例２、３、４および６のペプチド
実施例２、３、４および６で用いるペプチドは配列番号：１５の配列を有し、そこで元来の配列（配列番号：１、２および２７参照）の最後から二番目のアルギニンはヒスチジンにより置き換えられており、１４および１５位置の天然発生Ｌ体の代わりにＤ体アルギニン、ならびにコハク酸橋によるＮ末端のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体（Ｏ'Ｏ−ビス(２アミノプロピル）ポリエチレングリコール１９００）（Jeffamine）への共有結合、ならびにＣ末端でのアミド化を用いることにより安定化されている。
【０１０１】
１.２  実施例５のペプチド
ペプチド合成器を用いて標準的な技術により合成された実施例５のペプチドをAlta Biosciences, Birmingham, UK から入手した。これらのペプチドはＰＥＧ化されており、そしてＬ−Ｄ変換およびＣ末端アミド化されていない。
【０１０２】
また前記の１.１のものに対応するペプチドは同一のＬ−Ｄ変換を有するが、ＰＥＧ化されておらず、これもまた安定化に関して試験している（以下の５.２.３参照）。ペプチド合成器を用いて標準的な技術によりこのペプチドを合成した。生成物をＨＰＬＣにより精製し、そしてＭＡＬＤＩ−ＭＳにより分析した。
【０１０３】
１.３  実施例７のペプチド
１.３.１  実施例７.１のペプチド
実施例７.１のペプチドは安定性を改善するための修飾を加えた８個のアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（配列番号：３３）を有した。図８でＤＭＧＦと称されるペプチドでは、前記の１.１におけるようなＮ末端ＰＥＧ化により安定化を達成した。図８でＣＭＧＦと称されるペプチドでは、ヘキサン酸のＮ末端結合により安定化を達成した。ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦの双方をまたＣ末端でアミド化した。
【０１０４】
１.３.１実施例７.２のペプチド
実施例７.２ではペプチドＡ２、Ａ４およびＡ６は配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号：３４）を有した。ペプチドＡ２、Ａ４およびＡ６をＣ末端でアミド化した。ペプチドＡ２はＮ末端で未修飾であった。ペプチドＡ４はＮ末端に結合したヘキサン酸部分を有した。ペプチドＡ６はＮ末端に結合したアミノヘキサン酸部分を有した。
ペプチドＡ８は配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（配列番号：３３）を有し、Ｃ末端でアミド化され、そしてＮ末端に結合したヘキサン酸部分を有した。
【０１０５】
１.４  ＩＧＦ−Ｉペプチド
比較のために、ＩＧＦ−Ｉペプチドを使用した。これは全てのスプライスバリアントに共通であり、そしておよそ７０アミノ酸長であるエクソン３および４によりコードされるＩＧＦ−Ｉ受容体結合ドメインである。実施例１−４では、これをPeproTech, EC, UK から入手した。実施例６ではそれをSigma−Aldrich（ＥＲ２  ＩＧＦ−Ｉ）から入手した。ＩＧＦ−Ｉペプチドを実施例７でも使用した。
【０１０６】
２.  安定化ペプチドのジストロフィー筋肉への注射
筋肉内注射を用いて（化学的に安定化されたペプチド１７μｇを含有する２５μｌの週２回注射）、非ジストロフィーマウスの前脛骨筋において数週間以内に筋肉強度を２５％より多くまで上昇させた。この筋肉はｍｄｘマウスの筋肉ような病的なものではない（以下を参照）が、反復注射によりそれを物理的に損傷させた可能性はある。
【０１０７】
ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるのと同一の型の変異を有するｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉で筋肉内注射（週２回３週間）に関してほぼ３５％までの大きな上昇（図３Ａ、３Ｂ）が記録された。ＩＧＦ−Ｉの注射により図３Ａに示すようにほぼ５％の上昇に至っただけであった。同じ根拠で安定化ペプチドとＰＢＳベヒクルのみの対照との間の比較の結果を図３Ｂに示す。
筋肉保護および修復に関係するこれらのデータにより、安定化ペプチドがジストロフィーおよび非ジストロフィー筋肉の強度の上昇に有効であることが示される。
【０１０８】
３.  安定化ペプチドによる心臓保護および心筋修復
ヒツジ心臓において冠状動脈の回旋の辺縁枝にカテーテル挿入し、そしてマイクロスフェアの少量ボーラスを注射して限局性虚血を誘起することにより心筋梗塞（ＭＩ）を誘起した。１５分後に同一のカテーテルを用いて全長ＭＧＦ（元来のＣ末端ペプチドにＭＧＦおよび肝型ＩＧＦ−Ｉに共通のエクソン３および４によりコードされる配列を加えたもの）または安定化ペプチドを注射した（２００ｎｍ、冠内）が、動物は依然麻酔下であった。対照として成熟肝型ＩＧＦ−Ｉを使用した。安定化ペプチド単独の使用により、生存心筋のパーセンテージならびにＭＩ後の心エコーおよび駆出機能のコンピューター分析により測定される駆出率が著明に増加することが見出された。全長ＭＧＦはまた有意であるがより小さな効果を有した。成熟肝型ＩＧＦ−Ｉはさらに小さな効果を有した。結果を図４に示すが、それは手順を実施した１日前の駆出率と比較した６日目の駆出率のパーセンテージの変化を示している。このような安定化ペプチドは虚血損傷からの心筋の保護に非常に有効であった。
【０１０９】
さらなる実験をマウスで実施した。これらの研究では、マウス心臓の左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を結紮することによりＭＩを生み出した。これは左心室拡張引き起こし、それの進行は心不全に至る。全身投与された安定化ペプチドにより、血液を送り出す心臓の能力および損傷された心臓がもはや静脈還流に立ち向かうことができない場合の結果である拡張を実証する圧／容積ループ（図５）により測定されるような、心臓の強度および機能を著明に改善した。これは安定化ペプチドの全身投与により、心筋壁筋肉が保護されそして厚みを増すことで著明に改善される。したがって心臓発作の直後の患者の処置にかなりの可能性がある。
【０１１０】
４.  虚血および一般的な損傷の後の安定化ペプチドによる神経保護
４.１  インビトロでの神経保護効果
安定化ペプチドの神経保護効果をラット器官型海馬培養における選択的神経細胞死の十分に特徴付けされたモデルを用いてインビトロで実証した。
【０１１１】
Sarnowska（２００２）によるわずかな修飾を加えたStoppiniら（１９９１）の方法にしたがって７−１０日齢のウィスターラットから海馬切片を調製した。簡単にはラットをベトブタールで麻酔し、氷冷しそして断頭した。速やかに脳を２ミリモル／ｌ  Ｌグルタミン、５ｍｇ／ｍｌグルコース、１％アンフォテリシンＢ、０.４％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する９６％ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ−（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含）の氷冷使用液（ｐＨ７.２）に移した。海馬を分離し、そしてMcIlwain組織チョッパ−を用いて４００μｍ切片に切断した。６ウェルプレートで Millicell−ＣＭ膜（Millipore）を培養培地（ｐＨ７.２）：５０％ＤＭＥＭ、２５％ＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ、２５％ＨＳ、２ミリモル／ｌ  Ｌグルタミン、５ｍｇ／ｍｌグルコース、１％アンフォテリシンＢ、０.４％ペニシリン−ストレプトマイシン１ｍｌで、湿潤大気および５％ＣＯ２中３２℃で３０分間予備平衡にした。４個の選択された切片を各膜上に置いた。５％ＣＯ２、湿度１００％大気中３２℃で２週間切片を培養した。切片の生存性を光学顕微鏡下で毎日検査し、そしてさらにヨウ化プロピジウム染色により実験の日に評価し、そして初期ＰＩ取り込みを記録するためにＭＣ−１００９５カメラ（Carl Zeiss Jena GmbH）が付いた蛍光顕微鏡（Zeiss Axiovert ２５）下で観察した（Sarnowska, ２００２）。
【０１１２】
培養下１４日後に３０ｍＭ  ＴＢＨ（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド）を３時間添加することにより酸化ストレスを誘起した。その後、切片を新鮮培養培地に移した。得られた細胞死を実験の開始後２４および４８時間に評価した。
【０１１３】
安定化ペプチドまたは比較の目的で組換えＩＧＦ−Ｉは実験開始時に最終濃度１００ｎｇ／ｍｌまで培養培地に加えられ、そして培地中に継続的に存在した。ＭＧＦが作用する経路を調べるために、特異的抗ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＡＢ−１）遮断抗体（Oncogene）を培地中に１時間含めた後、切片をＴＢＨおよびＭＧＦまたはＩＧＦ−１ペプチドに暴露した。製造者の推奨にしたがって抗体の濃度（１０００ｎｇ／ｍｌ）を用いた。
【０１１４】
切片の詳細な画像を得るために、共焦点レーザー走査顕微鏡（Zeiss ＬＳＭ５１０）を使用した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の励起のためにヘリウム・ネオンレーザー（５４３ｎｍ）を用いた。獲得した後、Zeiss ＬＳＭ５１０ソフトウェアパッケージｖ.２.８を用いて画像を処理した。組織劣化の定量的測定を画像分析器ＫＳ３００（Carl Zeiss Jena GmbH）を用いて実施した。
【０１１５】
ＴＢＨ誘発の２４および４８時間後にＰＩ染色した培養物の蛍光画像で細胞損傷を定量化した。細胞死の相対的程度を以下のような各々の標準化ＣＡ１領域から計算した：細胞死％＝（実験蛍光強度（ＦＩ）−バックグラウンドＦＩ） ／（最大ＦＩ−バックグラウンドＦＩ）×１００、ここで最大ＦＩは１００ｍＭグルタミン酸塩への暴露で全細胞を死滅させることにより得られた。
【０１１６】
全ての測定値を５回の独立した培養調製物に関して繰り返し、そして８個の切片を各実験条件で使用した。結果間の差異の統計的有意性を、一方向Ａｎｏｖａ、続いてダネット検定を用いて計算した（GraphPad Prism ３.０２）。
【０１１７】
前記で論じたようなＴＢＨ（ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド）により限局性損傷の誘導の後にラット脳切片を単離した。処理および未処理脳切片で得られた細胞死を決定した。これを図６で説明する。ペプチド処置なしでは、ＴＢＨは２４時間以内に約６０％の細胞を死亡させたが、安定化ペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）で処置した後は８５％の保護が観察された。これもまた全長ＭＧＦの部分であるＩＧＦ−Ｉ受容体ドメインペプチド（ｒＩＧＦ−Ｉ）もまた神経保護性（以前に報告されたように）であった。しかしながらこれの程度は低く（７２％）、そしてＩＧＦ−Ｉの保護効果が際だったのは２４時間までであったが、安定化ペプチドの神経保護効果は４８時間後に依然明白に観察されたので、安定化ペプチドは有意により長く機能した。
【０１１８】
４.２  アレチネズミモデルにおける神経保護効果
脳虚血のアレチネズミモデルを用いてその他の実験を実施した。神経保護を評価するために、安定化ペプチドまたはＩＧＦ−Ｉ受容体結合ドメインの投与後に脳で共焦点懸濁液検査を実施した。アレチネズミ脳で総頸動脈の両側結紮により常に特異的海馬病変を生じる：ＣＡ１領域で、錘体神経は虚血後３−４日で死に始める。
【０１１９】
体重５０−６０ｇの雄スナネズミを使用した。以前に記載されたように（Domanska−Janik et al., ２００４）厳密に制御された正常温度条件下でＮ２Ｏ：Ｏ２（７０：３０）中ハロタン麻酔下で総頸動脈の５分間結紮により虚血侵襲を起こした。レーザードップラーフローメトリー（Muro, Inc.）により脳血流を連続的にモニタリングした。１群の動物に再灌流時に即座に左頸動脈に直接２５μｇの用量で注射により安定化ペプチドまたはＩＧＦ−Ｉ（ＰＢＳ中１μｇ／μｌ）を投与した。偽手術した動物には同一用量のペプチドを注射した。
【０１２０】
通常手順の１０−１５分後に処置動物はその足で立ち、そして未処置動物のように挙動した。動物を１週間回復させ、次いでペントバルビタール麻酔下で氷冷したＰＢＳ中４％パラハルムアルデヒドを灌流した。パラフィン包埋しそして固定した、ヘマトキシリン／エオシン染色した１０ｍｍ厚の切片で組織学的評価を実施した。Zeiss Axioscop ２下で冠状切片の持続した無傷のニューロンの平均数としてＣＡ１海馬領域の細胞損傷の程度を定量した。ＣＡ１領域の少なくとも三つの規定された３００μｍ領域をＭＣ１００９５カメラ（Carl Zeiss Jena GmbH）を用いて捕捉し、そしてコンピューター支援画像分析システム（ＫＳ３００、Carl Zeiss Jena GmbH）で計数した。
【０１２１】
対照動物ではＣＡ１領域で採点された３００μｍの長さあたりの形態学的に無傷のニューロンの平均数は１２１.２５±１２.５（平均±ＳＤ、ｎ＝５）であった。約１２％（１５.２±５、ｎ＝７）のニューロンのみが虚血の発現を生き延びた未処置動物とは対照的に、再灌流直後の安定化ＭＧＦ  Ｃ末端ペプチドの左頸動脈への注射（２５μｇの単回ボーラス）により非常に有意な神経保護が提供された。注射部位で８３.２±２５（ｎ＝１０）（手術を行っていない対照値７４.５％）ニューロン、および対側で６５.８±３０（ｎ＝１０）（手術を行っていない対照値５４％）のスコアであった。したがって安定化ＭＧＦ  Ｃ末端ペプチドでの処置により、高比率のＣＡ１海馬ニューロンが虚血侵襲を生き延びることが可能になる。たいていの動物では保護効果が両側で際だつが、少数は注射（左）部位で主に明白であった。
【０１２２】
対照的にＩＧＦ−Ｉペプチド２５μｇの類似の注射はＣＡ１ニューロンの虚血後生存にはほとんど影響しなかった；侵襲の７日後には１９.２±７.３ニューロン（ｎ＝５）が残り、それは対照ニューロン細胞数の１５.８％に過ぎず、そして未処置虚血後群と有意な差はない。
【０１２３】
５.  修飾ペプチドの生物学的活性および安定性
５.１  Ｌ−Ｄ変換およびＮ末端ＰＥＧ化により安定化されたペプチド
前記の実施例２、３および４で用いたペプチドは、１４および１５位置で天然発生Ｌ体の代わりにＤ体アルギニン、ならびにＮ末端へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合、ならびにＣ末端でのアミド化を用いることにより安定化されている配列番号：１５（これはアルギニンが最後から二番目の位置でヒスチジンにより置き換えられている以外はＭＧＦのヒトＥｃペプチド（配列番号：２７）の配列に対応する）の配列を有した。
【０１２４】
このペプチドの生物学的活性を実施例２、３および４で確認する。
その安定性を図７で実証する。ＰＥＧ化および１４および１５位置でのアルギニンのＬ−Ｄ変換を伴う、および伴わないペプチドの安定性を、新鮮ヒト血漿中のタンパク質溶解性切断に対するペプチドの感受性を評価することにより調べた。
【０１２５】
血漿を用時まで−７０℃で保存した。ペプチド１０μｇを血漿２ｍｌプラスＰＢＳ７ｍｌに加えた。この混合物を様々な時間間隔で３７℃でインキュベートした。次いで配列番号：１５のアミノ酸配列を有するペプチドに対して特異性を有するポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロッティングを使用してこれらの時間間隔で各ペプチドを検出した。（図７ではＡ＝０分；Ｂ＝３０分；Ｃ＝２時間；Ｄ＝２４時間。Ｌ−Ｄ変換およびＮ末端ＰＥＧ化を伴うペプチドの結果を右に；ＬからＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠くペプチドの結果は左である。）Ｌ−Ｄ変換およびＰＥＧ化を欠くペプチドは３０分後には比較的わずか、２時間後には非常にわずかしか検出できず、そして２４時間後には全くないかまたはほとんど検出できない。対照的にＬ−Ｄ変換およびＰＥＧ化を伴うペプチドは２４時間後でさえに多く検出することができた。
【０１２６】
５.２  さらなるペプチド、セリンまたはアルギニンのアラニンでの置き換えならびにＣ末端およびＮ末端トランケーション
５.２.１  さらなるペプチド
本明細書ではヒトＭＧＦのＣ末端由来の元来のヒトＥｃペプチドの配列を配列番号：２７として示す。配列番号：１５のペプチドでは最後から二番目のアミノ酸（これは元来のペプチド（配列番号：２および２７参照）のアルギニンである）をヒスチジンで置き換える。配列番号：１５のペプチドを図２ではペプチド１として記載する。
【０１２７】
配列番号：１５の配列から誘導されるさらに修飾された配列を配列番号：１６から２４として示し、そして図２の配列番号：１５の配列と比較するが、ここではそれらをペプチド２−６および短いペプチド１−４と称する。
【０１２８】
ペプチド２（配列番号：１６）では、５位置でセリンをアラニンで置き換える。ペプチド３（配列番号：１７）では１２位置でセリンをアラニンで置き換える。ペプチド４（配列番号：１８）では１８位置でセリンをアラニンで置き換える。ペプチド５（配列番号：１９）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換える。ペプチド６（配列番号：２０）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そしてまた１５位置でアルギニンをアラニンで置き換える。短いペプチド１（配列番号：２１）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして２個のＣ末端アミノ酸を除去する。短いペプチド２（配列番号：２２）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして４個のＣ末端アミノ酸を除去する。短いペプチド３（配列番号：２３）では１４位置でアルギニンをアラニンと置き換え、そして３個のＮ末端アミノ酸を除去する。短いペプチド４（配列番号：２４）では１４位置でアルギニンをアラニンで置き換え、そして５個のＮ末端アミノ酸を除去する。
【０１２９】
５.２.２  さらなるペプチドの生物学的活性
インビトロ系を用いてＣ末端ペプチドが単核筋芽細胞（衛星細胞）の複製を誘起する能力を測定することにより生物学的活性を決定した。アラマーブルー法を用いて細胞数を決定した。これを０から３のスケールで評価し、そして結果を図２に示す。
【０１３０】
０＝６時間で細胞数の測定可能な増加がない。
１＝４時間で細胞数の有意な増加。
２＝２時間で細胞数の有意な増加。
３＝１時間で細胞数の有意な増加。
有意性はｔ検定を用いてｐ＞０.０５のレベルであった。
【０１３１】
配列番号：１５のペプチド（ペプチド１）はその短い半減期のために活性をほとんどまたは全く示さなかった。ペプチド２（配列番号：１６）および短いペプチド１（配列番号：２１）の活性スケールでのスコアは１であった。ペプチド４および５（配列番号：１８および１９）の活性スケールでのスコアは２であった。ペプチド３（配列番号：１７）の活性スケールでのスコアは３であった。ペプチド６（配列番号：２０）および短いペプチド２、３および４（配列番号：２２、２３および２４）は測定可能な活性を呈さなかった（スコアゼロ）。
【０１３２】
５.２.３  さらなるペプチドの安定性
各ペプチドを新鮮ヒト血漿に導入し、そして前記の実施例５.１で論じたようにウェスタンブロッティングを用いてそれの安定性を決定した。生物学的活性と同様に、安定性を０から３のスケールで採点した。結果を図２に示す。
【０１３３】
以下の方式で、無傷で残り、そして特異的抗体に結合するペプチドの量として安定性を決定した：
１＝１／２時間までに結合する検出可能な抗体の著しい喪失。
２＝２時間までの検出可能な結合の著しい喪失。
３＝２４時間までに結合する検出可能な抗体の著しい喪失がない。
【０１３４】
配列番号：１５のペプチド（ペプチド１）のスコアは１であった。ペプチド６（配列番号：２０）もまたスコア１であった。ペプチド３および４（配列番号：１７および１８）はスコア２であった。ペプチド２および５（配列番号：１６および１９）はスコア３であった。
【０１３５】
実施例１−４のペプチドのこのスケールでのスコアもまた３であった。同一であるが、ＰＥＧ化を欠くペプチドもまたこのスケールでスコア３であった。短いペプチド１−４はまだ試験していないが、とにかく短いペプチド２から４は生物学的活性を欠くと思われる。
【０１３６】
６.  ジストロフィー、ＡＬＳおよび健常ヒト筋肉における筋肉衛星細胞増殖に及ぼす安定化ペプチドの効果
前記の１.１の安定化ペプチドをこれらの実験で使用した。前記の１.３のＩＧＦ−Ｉペプチドで比較を行った。
【０１３７】
６.１  要旨
増殖／分化アッセイを用いて先天的筋ジストロフィー（ＣＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）および運動ニューロン疾患または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者の生検から、ならびに健常筋肉から一次ヒト筋肉細胞培養物を誘導した。細胞培養物を二つのペプチドで処理し、そして免疫細胞化学的技術を用いて分化マーカーデスミンを発現する細胞およびＤＡＰＩを用いて核の全数を検出した。クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびタンパク質アッセイを用いてペプチド処理後の筋肉分化を決定した。安定化ペプチドは正常（非疾患性）筋肉に関する幹（デスミン陽性）細胞増殖をかなり増加させた（正常（非疾患性）四肢において３８.４±２.５％から５７.９±３.２％および正常（非疾患性）頭蓋顔面筋肉生検に関しては４９.８±２.４％から６８.８±３.９％）。初期筋肉幹細胞数は筋肉疲労を有する患者では低かったが、安定化ペプチドはさらに増加を誘起した（ＣＭＤ１０.４±１.７％から１７.５±１.６％；ＦＳＨＤ１１.７±１.３％から２０.４±２.１％およびＡＬＳ４.８±１.１％から７.２±０.８％）。その結果により安定化ペプチドが筋管形成には影響を及ぼさないが、それは筋芽細胞の前駆細胞増殖を増加させるが、成熟ＩＧＦ−Ｉは分化を強化したことも確認された。
【０１３８】
６.２  ヒト筋肉由来細胞の単離
以前に記載されたように（Lewis et al., ２０００；Sinanan et al., ２００４）一次ヒト筋肉細胞培養物を単離した。簡単にはEastman and Middlesex Hospitals, London, UKでインフォームドコンセントの後に選択的手術の間に健常成人およびＣＭＤ患者から頭蓋顔面（咬筋）筋肉生検を入手した。Royal Free Hospital, London, UKで同意した健常成人、ＦＳＨＤおよびＡＬＳ患者から、局所麻酔下でヒト下肢（外側広筋）筋肉試料を針生検により入手した。同一の障害を有する数人の患者から生検をプールして一次培養物で十分数の細胞を入手した。ＤＭＥＭ（高グルコース；Invitrogen）を補充した抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン；１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン；２.５μｇ／ｍｌフンギゾン；Invitrogen）でこれらを洗浄し、ハサミで刻み、そして組織フラグメントを０.２％ゼラチンコートした（Sigma−Aldrich）Ｔ１５０ｃｍ２培養フラスコ（Helena Biosciences）に蒔いた。外植片培養物をＤＭＥＭ、２０％ＦＣＳ（PAA Laboratories）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Invitrogen）からなる血清含有成長培地（ｓＧＭ）中でインキュベートし、そして５％ＣＯ２を含む９５％に加湿した空気中３７℃で維持した。外植片からの単核細胞の遊走の最初の高まりを□−波と称し、そしてこの集団をこの研究全体にわたって使用した。トリプシンＥＤＴＡ（Invitrogen）を用いて遊走ヒト筋肉細胞を酵素的に収集し、そしてｓＧＭ中７０−８０％コンフルエントまで継代培養した。継代数ｘ（Ｐｘ）をサブコンフルエント細胞の連続収集のｘ番目として定義した。Ｐ３−５コホートを用いて全実験を実施した。次いで以下で記載する実験で使用するまで低温条件下で広げた細胞を貯蔵した。各病変筋肉培養に用いた処置の各々に関して、および二つの型の健常筋肉に関して少なくとも６回実行した。
【０１３９】
６.３  インビトロでの筋原性前駆（幹）細胞集団の決定
以前に記載されたように（Sinanan et al., ２００４）筋原性前駆細胞の数の評価を実施した。細胞をゼラチンコート（０.２％）した１３ｍｍカバースリップに初期密度４.５×１０３セル／ｃｍ２で再度蒔いた。ＦＣＳ中のＩＧＦおよび関連タンパク質の交絡効果を回避するために、血清不含の規定の培地（ｄＧＭ）；ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５ｎｇ／ｍｌ）、ホロトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（５ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（３９０ｎｇ／ｍｌ）、ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）、ビタミンＨ（Ｄ−ビオチン；２５０ｎｇ／ｍｌ）、ビタミンＥ（Trolox；２５μｇ／ｍｌ）（Sigma−Aldrich）、アルブマックス、アルブマックス−１（０.５ｍｇ／ｍｌ）（Invitrogen）、フェツイン（５００μｇ／ｍｌ）（Clonetics／BioWhittaker）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ中で細胞を培養した。２４時間接着させた後、ｒＩＧＦ−Ｉ（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴うおよび伴わない、ならびにモノクローナルＩＧＦ−Ｉ受容体抗体（Ａｂ−１、１００μｇ／ｍｌ、Oncogene）を伴うおよび伴わないで安定化ペプチド（１０ｎｇ／ｍｌ）を必要に応じてｄＧＭ中に加えた。使用するペプチドは（前記の１.１および１.３参照）以前に記載されたように（Dluzniewska et al, ２００５）合成されたＭＧＦ／ＩＧＦ−ＩＥｃペプチドのＥドメイン（２４個のアミノ酸残基）に関連する安定化ペプチドおよびヒトＩＧＦ−Ｉペプチド（７０個のアミノ酸残基）（Sigma−Aldrich  ＥＲ２  ＩＧＦ−Ｉ）であった。全培地を２−３日毎に交換した。種々の時点で免疫細胞化学的分析のために培養物を試料採取した。
【０１４０】
６.４  免疫細胞化学
適切な時点で細胞をメタノールで１０分間（−２０℃）固定し、続いて０.５％ Triton−Ｘ１００で１０−１５分間デタージェント透過処理を行った。次いで細胞を抗体希釈溶液（ＡＤＳ；１０％ＦＣＳ、０.０２５％アジ化ナトリウム、０.１Ｍリジンを加えたＰＢＳ）で希釈した抗デスミン（１：１００；クローンＤ３３、ＤＡＫＯ、Glostrup, Denmark）抗体と共に６０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ（１：２００；Jackson ImmunoResearch Laboratories／Stratech Scientific）に抱合させたクラス特異的抗マウスＩｇＧ抗体を用いて可視化した。蛍光ＤＮＡ副溝結合プローブ、ＤＡＰＩ（１.０ｎｇ／ｍｌ；Sigma−Aldrich）を最終抗体インキュベーション工程に導入することにより核を同定した。カバースリップにグリセロール基盤のアンチフェード剤、Citifluor（Citifluor Ltd）を載せ、そして透明マニキュアで密封した。Leica ＦＷ４０００画像処理ソフトウェアを備えたLeica ＤＭＩＲＢ倒立顕微鏡を用いて、細胞関連の蛍光および形態を各々落射蛍光およびLeica コントラスト変調（ＬＭＣ）顕微鏡法により可視化した。増殖アッセイに関しては、視野で全ての青色および緑色蛍光陽性細胞を計数した。体系的様式で、各カバースリップで少なくとも３０の視野を計数し；したがって各カバースリップで少なくとも１００セルを計数した。細胞数をＤＡＰＩ陽性細胞の全数に対するデスミン陽性細胞のパーセンテージとして比較した。
【０１４１】
６.５クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）アッセイ
以前に公開されたプロトコール（Auluck et al., ２００５）を用いてこのアッセイを実施した。ＣＰＫは筋管形成のマーカーであるので、それの測定により筋形成の定量的比較が可能になる（Goto et al., １９９９）。酵素ＣＰＫはアデノシン−５−ジホスフェート（ＡＤＰ）の可逆的リン酸化を触媒してアデノシン−５−トリホスフェート（ＡＴＰ）および遊離クレアチンを形成する。ＣＰＫ活性に比例する反応の最終生成物である無機リンの形成を測定することにより両方向性で反応を続けることができる。無機リン酸塩の発生（Fiske and Subbarow, １９２５）手順に基づく比色法を用いてこれを測定した。次いで培養物のタンパク質含量に関してこれを表現した。
【０１４２】
以前に広げた一次ヒト筋肉細胞培養物を０.２％ゼラチンコートした９６ウェルプレートに１０×１０４セル／ウェルで再度蒔いた。ｓＧＭ中細胞を７０／８０％コンフルエントまで培養し、次いで培地を以前に記載された（Dluzniewska et al, ２００５）ように合成した安定化ペプチド（２４個のアミノ残基）および／またはヒトＩＧＦ−Ｉペプチド（７０個のアミノ残基）（Sigma−Aldrich  ＩＧＦＥＲ２）を含有する分化培地（ＤＭ；ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ））に換えた。４８時間後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして次に０.５ｍＭブリシンバッファー（ｐＨ６.７５）中−７０℃で凍結保存した。固定した細胞を急速解凍により溶解し、そして製造者の指示書（Sigma−Aldrich）にしたがってＣＰＫアッセイキットを使用した。Pierce マイクロＢＣＡキット（PerBio Science, UK Ltd., Northumberland, UK）を用いてアルブミン標準曲線に対して各試料タンパク質濃度を決定した。
【０１４３】
６.６  統計分析
StatView ４.５１（SAS Institute Inc., Cherwell Scientific Publishing Ltd, Oxford, UK）を用いる一方向ＡＮＯＶＡ検定を適用し、続いてフィッシャーのＰＬＳＤ事後検定を行った。ｐ＜０.０５を有意であると考えた。健常筋肉の二つの型を含む各条件に関する四つの型の実験の全実行（最低６回）に関してデータを集め、そして平均±ｓ.ｄ.として表した。
【０１４４】
６.７  ヒト筋肉一次培養における筋原性前駆細胞の比率
試験した全ての筋肉から筋原性（デスミン陽性）細胞のパーセンテージを決定した（以下の表を参照のこと）。正常（非疾患性）筋肉は有意な比率のデスミン陽性細胞を含有したが、病変筋肉が含有した筋原細胞の比率はかなり低かった。
【０１４５】
表：ペプチド添加前に異なる比率の筋原性（デスミン陽性）細胞を含有する様々な筋肉供給源から誘導したヒト一次筋肉培養
【表４】
2008533114.tif 000005
【０１４６】
６.８  正常（非疾患性））ヒト一次筋肉前駆細胞に及ぼす効果
安定化ペプチドは正常頭蓋顔面（咬筋）一次培養物で増殖を増加させた（デスミンに随伴される核の全核に対する比率の変化）（４９.８±２.４％から６８.８±３.９％まで；ｐ＜０.０００１）。ＩＧＦ−Ｉはまた穏やかな増加を誘起した（４９.８±２.４％から５８.４±４.２％まで；ｐ＜０.０００１）。興味深いことに、デスミン陽性細胞増殖比率に及ぼす安定化ペプチドの効果が、ＩＧＦ−Ｉを加えた場合に阻止されることが見出された（６８.８±３.９％から５９.５±４.２％まで；ｐ＜０.０００１）。正常下肢（大腿四頭筋）一次培養で認められた効果は頭蓋顔面筋肉で認められたものに類似した。安定化ペプチドは筋肉前駆細胞増殖を有意に増加させた（３８.４±２.５％から５７.９±３.２％まで；ｐ＜０.０００１）。ＩＧＦ−Ｉは増殖に関してわずかな効果しか有さなかった（３８.４±２.５％から４７.１±３.５％まで；ｐ＜０.０００１）が、ＩＧＦ−Ｉは、二つのペプチドを組み合わせて加えた場合に安定化ペプチドに対する応答を完全に抑止した（５７.９±３.２％から３８.８±０.６％まで；ｐ＜０.０００１）。
【０１４７】
６.９  細胞増殖から誘導された疾患状態のヒト一次筋肉に誘導される増殖に及ぼす効果
安定化ペプチドが再現性可能に、そして有意に正常筋肉におけるデスミン陽性細胞数を増加させることができるという観察の後、疾患状態筋肉に及ぼす効果を試験した。先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）から誘導した一次培養物で、安定化ペプチドは筋肉前駆細胞増殖を有意に増加させた（１０.４±１.７％から１７.５±１.６％まで；ｐ＜０.０００１）が、ＩＧＦ−Ｉの効果は小さかった（１０.４±１.７％から１３.２±１.７％まで；ｐ＝０.００５）。双方のペプチドを組み合わせた場合もやはり正常筋肉に関するような阻止効果が観察され、安定化ペプチドの効果は対照レベルまで低下した（１７.５±１.６％から１３.１±１.２％まで；ｐ＝０.０００１）。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＦＳＨＤ由来の筋肉細胞の細胞増殖に及ぼす安定化ペプチドの効果は類似の結果を生み出した。安定化ペプチドはこれらの障害におけるデスミン発現細胞の数を著明に増加させた（ＡＬＳ４.８±１.１％から７.２±０.８％まで；ｐ＝０.０００２、ＦＳＨＤ１１.７±１.３％から２０.４±２.１％まで；ｐ＜０.０００１）。正常筋肉の場合のように、ＩＧＦ−Ｉはやはり極わずかな効果しか有さなかった（ＡＬＳ４.８±１.１％から４.７±１.４％まで；ｐ＝０.７７１９、ＦＳＨＤ１１.７±１.３％から１４.１±１.６％まで；ｐ＝０.０１０７）。双方のアイソフォームを一緒に用いた場合、ＭＧＦ誘起のデスミン発現増加はやはり阻止された（ＡＬＳ７.２±０.８％から５.３±１.０％まで；ｐ＝０.００２４、ＦＳＨＤ２０.４±２.１％から１４.５±１.４％まで；ｐ＜０.０００１）。
【０１４８】
６.１０  ＩＧＦ−Ｉ受容体に関連するＭＧＦ  Ｅドメインによる前駆細胞増殖の増加
正常筋肉では、安定化ペプチドによる増殖の増加は抗ＩＧＦＩＲ抗体の存在により阻止されなかった（ＭＧＦ処理では６８.８±３.９％、およびＭＧＦに加えてＡｂ−Ｉ処理した細胞では７１.１±６.２％；ｐ＝０.２４７２）。ＣＭＤおよびＡＬＳ筋肉の双方に関しても同一の効果が観察された（ＣＭＤに関しては１７.５±１.６％対１６.７±１.８％；ｐ＝０.４５８９；ＡＬＳに関しては７.２±０.８％対６.５±０.８％；ｐ＝０.２９３３）。これはＭＧＦ  Ｅドメインの作用がＩＧＦ−Ｉ受容体を伴わないことを示している。
【０１４９】
６.１１  最終分化防御に及ぼすＭＧＦ  Ｅドメインの効果
前記６.４のＣＰＫアッセイでは、安定化ペプチドは一次筋芽細胞分化および筋管形成を促進しなかった。対照的に筋形成のこの段階でＩＧＦ−Ｉの添加によりデスミンを発現する細胞の数が減少するので、ＩＧＦ−Ｉは１０ｎｇ／ｍｌの濃度で明らかに筋管形成を刺激する。実際に１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉの存在で、安定化ペプチドはアゴニストとして、そして用量依存的な様式で作用し、筋芽細胞融合に適格する段階までの分化を防御した。１０ｎｇ／ｍｌの全身性ＩＧＦ−Ｉを伴う１００ｎｇ／ｍｌ安定化ペプチドの減少は同一用量のＩＧＦ−Ｉを伴う１０ｎｇ／ｍｌ  ＭＧＦよりも低かった。
【０１５０】
６.１２  結論
安定化ペプチドはＣＭＤ、ＦＳＨＤおよびＡＬＳの患者ならびに健常個体に由来する一次筋肉培養において前駆細胞増殖を有意に誘起した。安定化ペプチドはＩＧＦ−Ｉが有意に加速させる過程である筋管形成に影響しなかった。これにより、生物学的に活性なＭＧＦ  Ｅドメインが成熟ＩＧＦ−Ｉと比較して明確な活性を有することが実証される。我々の知見により、ＩＧＦ−Ｉアイソフォームの異なる作用は恐らく異なる受容体により媒介されることが示される。ＩＧＦ−Ｉ受容体の遮断により、ＭＧＦ  ＥドメインがＩＧＦ−Ｉに対する異なるシグナリング経路を介して衛星細胞増殖を増加させ、そして初期衛星細胞活性化は成熟ＩＧＦ−Ｉにより影響されるものから区別される過程である証拠が提供される。
【０１５１】
神経学的な状態および加齢における筋肉疲労は衛星細胞の喪失によるものであると提唱されている。我々はＣＭＤ、ＦＳＨＤおよびＡＬＳの患者由来の前駆（デスミン陽性）細胞の全筋芽細胞に対する比率が、健常個体由来の筋芽細胞の比率と比較して低いことを実証した。したがって衛星細胞の欠如のため、または衛星細胞活性化のためのいくつかの因子の発現不能のために筋肉が変成したかどうかは未解決である。我々は老齢者が筋肉を維持するために要求されるレベルでＭＧＦを発現することができないことを以前に実証し（Hameed et al., ２００４）、ＦＳＨＤおよびＡＬＳ患者に関して類似の知見を有した（公開されていない知見）。
【０１５２】
特定の神経筋疾患を有する患者で死亡の主な原因の一つは筋肉疲労である。筋肉喪失はＭＧＦ発現不能に繋がり得て、そしてヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルであるｍｄｘマウスのその筋肉は機械的刺激の間でさえＭＧＦを生成することができない（Goldspink et al., １９９６）。De Bari らは間充織幹細胞がｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉に導入された場合、ジストロフィンの筋線維鞘発現およびＭＧＦ発現もまた回復されることを見出した（De Bari et al., ２００３）。したがってＭＧＦの生成は細胞膜の適応性に依存でき、そしていくつかの型のメカノトランスダクション機構、例えばジストロフィン複合体を伴う可能性がある。
【０１５３】
ＩＧＦ−Ｉが神経栄養因子であり、そして神経変成障害、特にＡＬＳに臨床適用される可能性を有していることは少し前からわかっていた。動物モデルを用いて、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉ（成熟ＩＧＦ−Ｉ）の全身分配を動物モデルで用い、そしてＡＬＳ患者を処置している。最近では、ＡＡＶ２ベクターによるＩＧＦ−Ｉ遺伝子治療と組み合わせた場合、ＡＬＳの動物モデルの処置において運動がいくらかの相乗効果を有することが報告された（Kaspar et al., ２００５）。
【０１５４】
しかしながら本明細書で提示したデータにより、通常のＩＧＦ−Ｉではなく、ＭＧＦの活性を筋肉疲労の処置で使用するのがこの上ないことが示されるが、それが筋肉維持および修復に要求される筋肉衛星（幹）細胞プールを補充する有効な方法を提供するためである。これはＭＧＦスプライスバリアントの発現において明白な欠陥があるＣＭＤ、ＦＳＨＤおよびＡＬＳのような障害において、本発明のペプチドを筋肉変成のための治療薬として使用することを支持している。細胞治療目的のために培養下の筋肉衛星細胞を増やために本発明のペプチドを用いる可能性もある。
【０１５５】
７.  ８のアミノ酸ペプチドでの細胞増殖アッセイ
７.１  ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦペプチド
前記の１.３.１で記載し、そして図８ＡでＤＭＧＦおよびＣＭＧＦとして称された８アミノ酸ペプチドを、ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）、ＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−Ｉ（２ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、ウェルあたり２０００セルの密度でＣ２Ｃ１２筋肉細胞の増殖を誘起する能力に関して試験した。２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＤＭＧＦおよびＣＭＧＦ（図８の左側および中央の結果の組を参照）を２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉ単独と共に試験した（図８の右側の結果の組を参照）。３６時間のインキュベーションの後、アラマーブルーアッセイを用いて達成された細胞増殖のレベルを評価した。培地のみを含有する対照もまた提供した。
【０１５６】
ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦの双方が細胞増殖を誘起した。アラマーブルーアッセイにおける蛍光に関して結果を図８Ａに示す。ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦに関する全ての値およびＩＧＦ−Ｉ単独の値は培地のみの対照の値とは統計的に異なった。ＤＭＧＦ／ＣＭＧＦの濃度上昇につれて増殖のレベル上昇が観察された。
【０１５７】
７.２  ペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８
前記の１.３.２で記載し、そして図８ＢでＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８として称された８アミノ酸ペプチドを、ウェルあたり５００セルの密度でＣ２Ｃ１２筋肉細胞の増殖を誘起する能力に関して試験した。１０％ＦＢＳ中２４時間培養を行い、続いて０.１％ＢＳＡ中２４時間飢餓状態にし、２４時間刺激し、そして次にＢｒｄＵで５時間処理した。０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８を０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉと共に試験した（図８Ｂの右側の結果の組を参照）。ＢｒｄＵの組み込みを測定して達成された細胞増殖のレベルを評価した。細胞不含、培地のみ、５％ＦＢＳ含有およびＢｒｄＵ不含の対照もまた提供した。
ペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８は細胞増殖を誘起した。蛍光に関して結果を図８に示す（３７０ｎｍでの吸光度；４ウェルにわたる平均＋標準誤差）。
【０１５８】
（参照文献）
Domanska−Janik et al. Brain Res. Mol. Brain Res. １２１, ５０−５９（２００４）
Hill and Goldspink, J. Physiol. ５４９.２, ４０９−４１８（２００３）
McKoy et al, J. Physiol. ５１６.２, ５７３−５９２（１９９９）
Sarnowska, Folia Neuropathol. ４０[２], １０１−１０６（２００２）
Stoppini, et al, J. Neurosci Methods ３７, １７３−１８２（１９９１）
Yang et al, J. Muscle Res. Cell Motil. １７, ４８７−４９５（１９９６）
Yang and Goldspink, FEBS Letts. ５２２, １５６−１６０（２００２）
Auluck et al, Euro. J. Oral Sci.１１３：２１８−２４４（２００５）
De Bari et al, J. Cell Biol. ６０：９０９−９１８（２００３）
Dluzniewska  et al, FASEB J. １９：１８９６−１８９８（２００５）
Fiske and Subbarow, J. Biol. Chem. ６６：３７５−４００（１９２５）
Goldspink et al, J. Physiol. ４９５P：１６２−１６３P（１９９６）.
Goto et al, Anal. Biochem. ２７２：１３５−１４２（１９９９）
Hameed et al, J. Physiol. ５５５：２３１−２４０（２００４）
Kaspar et al,  Ann. Neurol. ５７：６４９−６５５（２００５）
Lewis et al, Muscle Res. Cel. Motil. ２１：２２３−２３３（２０００）
Sinanan et al,  Biotechnol. Appl. Biochem. ４０：２５−３４（２００４）
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】配列アラインメントは：ヒト、ラットおよびウサギＭＧＦならびにヒト、ラットおよびウサギ肝型ＩＧＦ−Ｉの各々の配列の部分によりコードされる配列（配列番号：２のアミノ酸２６から１１０ならびに配列番号：４および６の２６から１１１：以下を参照）を示し、そしてヒトＭＧＦの４９塩基対インサートおよびラット／ウサギＭＧＦの５２塩基対インサートにより創成され、読み枠シフトおよびＣ末端での相違に至るＣ末端でのＭＧＦと肝型ＩＧＦ−Ｉとの間の差異を強調表示する。
【図２】アラニン置換ならびにＣ末端およびＮ末端トランケーションの安定性および生物学的活性に及ぼす効果：さらなる配列アラインメントによりペプチド１−６（配列番号：１５−２０）の修飾された配列および短いペプチド１−４（配列番号：２１−２４）を比較し、そしてヒト血漿中でのインキュベーションにより測定されるような安定性、および筋肉細胞系における試験により測定されるような生物学的活性における変化の影響を詳記する（試験手順の詳細は実施例参照）。  図では、左側の最初の二つの列はペプチドを同定し、そしてその配列を示し、置換により作られた変化を同定する。第３列は安定性に関する試験の結果（詳細は実施例５参照）を示し、そして右側の最後の列は生物学的活性に関する試験の結果（詳細はこの場合も実施例５参照）を示す。
【図３】３週後安定化ペプチドの注射後のマウスジストロフィー筋肉の強度の上昇：（Ａ）安定化ペプチド（左側列）およびＩＧＦ（右側列）の注射後のｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉における強縮力の変化のパーセンテージ。（Ｂ）安定化ペプチド（左側列）およびＰＢＳベヒクル対照（右側列）の注射後のｍｄｘマウスのジストロフィー筋肉における強縮力の変化のパーセンテージ。
【図４】安定化ペプチドの投与後の心臓保護：梗塞ヒツジ心臓への安定化ペプチド（第３列、「Ｅｃドメイン」と称する）、全長ＭＧＦ（第４列）、成熟ＩＧＦ−Ｉ（第２列）および対照調製物（第１列）の投与の後に達成される駆出率の比較。
【図５】心筋梗塞（ＭＩ）後の機能の保存を示す圧／容積ループデータ：正常（左上）および梗塞（ＭＩ）マウス（右上）心室に関して、そして安定化ペプチドのＭＩ心臓（右下、「ＭＧＦペプチド」と称する）および正常心臓（左下）に全身的に分配された安定化ペプチドの効果を示す。全パネルはＹ軸に圧力（ｍｍＨｇ）およびＸ軸に相対容積単位を示す。
【図６】ラット脳切片系における神経保護効果：左から右に、安定化ペプチド（「ＭＧＦ」と称する）、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＢＨ、ＴＢＨ＋安定化ペプチド（２４時間）、ＴＢＨ＋ＩＧＦ−Ｉ（２４時間）、ＴＢＨ＋安定化ペプチド（４８時間）、ＴＢＨ＋ＩＧＦ−Ｉ（４８時間）で処理した後の死亡細胞のパーセンテージ。
【図７】Ｌ体からＤ体へのアルギニンの変換およびＮ末端ＰＥＧ化を組み込む安定化ペプチドの大きな安定性を実証するウェスタンブロット：新鮮ヒト血漿中でのインキュベーションにより、様々な時間間隔の範囲に関してＬ体からＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠く対応するものに比較した安定化ペプチドの安定性を調べた。次いでウェスタンブロットを用いてこれらの時間間隔：Ａ＝０分；Ｂ＝３０分；Ｃ＝２時間；Ｄ＝２４時間にわたる各ペプチドの生存を評価した。Ｌ−Ｄ変換およびＮ末端ＰＥＧ化を伴うペプチドに関する結果を右に示し；Ｌ体からＤ体への変換およびＮ末端ＰＥＧ化を欠くペプチドの結果は左である。
【図８】Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞の増殖に及ぼす８アミノ酸Ｃ末端ペプチドの効果：（Ａ）ＤＭＧＦおよびＣＭＧＦペプチド：ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）プラスＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）プラスＩＧＦ−Ｉ（ｍｌあたり２ｎｇ）を含有する培地中、Ｃ２Ｃ１２細胞を２０００セル／ウェルで提供し、そして３６時間インキュベートした。次いでアラマーブルーアッセイを用いて細胞増殖を評価した。測定値の左側の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＤＭＧＦペプチドを用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.３.１参照）。測定値の中央の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＣＭＧＦペプチドを用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.３.１参照）。測定値の右側の群は２、５、５０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ−Ｉ単独を用いた実験に関する結果を示す（詳細は実施例１.４参照）。Ｙ軸値はアラマーブルーアッセイにおける蛍光（励起波長５３５ｎｍ、５９０ｎｍで測定；平均＋標準誤差）である。（Ｂ）ペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８：５００セル／ウェルのＣ２Ｃ１２筋肉細胞。１０％ＦＢＳ中２４時間培養を実施し、続いて０．１％ＢＳＡ中２４時間飢餓状態にし、２４時間刺激し、そして次にＢｒｄＵで５時間処理した。０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ２、Ａ４、Ａ６およびＡ８を０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−Ｉと一緒に試験した（結果の右側の組を参照）。ＢｒｄＵ組み込みを測定して達成された細胞増殖のレベルを評価した。細胞不含、培地のみ、５％ＦＢＳ含有およびＢｒｄＵ不含の対照もまた提供した。Ｙ軸の値は蛍光（３７０ｎｍでの吸光度；４ウェルに及ぶ平均＋標準誤差）である。左の最初の列は細胞が存在しない対照に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ２に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ４に関するものである。中央の三つは培地のみ（ｍｅｄ）、５％ＦＢＳ含有およびＢｒｄＵ不含の対照に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ６に関するものである。次の四つは０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のペプチドＡ８に関するものである。結果の右側の群は０.１、１、１０および１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ−Ｉに関するものである（実施例１.４参照）。
【図１】
2008533114.tif 000006
【図２】
2008533114.tif 000007
【図３Ａ】
2008533114.tif 000008
【図３Ｂ】
2008533114.tif 000009
【図４】
2008533114.tif 000010
【図５】
2008533114.tif 000011
【図６】
2008533114.tif 000012
【図７】
2008533114.tif 000013
【図８】
2008533114.tif 000014
【配列表】
2008533114000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月14日(2007.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008533114000001.app
【国際調査報告】
2008533114.tif 000034
2008533114.tif 000035
2008533114.tif 000036
2008533114.tif 000037
2008533114.tif 000038
2008533114.tif 000039
2008533114.tif 000040