(57)【要約】  本発明は、TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物の新規な製造方法に関し、その方法工程は、明細書において開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むことを特徴とする、抗-TNFα免疫原性生成物の製造方法：
a) TNFαを含有する液体溶液を調製する工程；
b) EDTAを、工程a)のTNFαを含有する前記液体溶液に添加する工程；
c) 担体タンパク質を、工程b)の終了時に得られた液体溶液に添加する工程；
d) グルタルアルデヒドを、工程c)の終了時に得られた液体混合物に添加する工程；
e) グルタルアルデヒド並びにTNFαおよび前記担体タンパク質双方の遊離分子を、工程d)の終了時に得られた溶液から除去する工程；
f) ホルムアルデヒドを工程e)の終了時に得られた液体溶液に添加し、ホルムアルデヒドの存在を、96時間〜192時間の時間範囲で維持する工程；
g) ホルムアルデヒドとの反応を遮断する試薬を、工程f)の終了時に得られた液体溶液に添加する工程；および、
h) ホルムアルデヒドおよび前記遮断試薬を工程h)の終了時に得られた液体溶液から除去して、前記抗-TNFα免疫原性生成物を含有する液体溶液を得る工程。
【請求項２】
工程b)が、下記の工程を含む、請求項１記載の方法：
b1) EDTAを、工程a)のTNFαを含有する前記液体溶液に添加する工程；および、
b2) DMSOを、工程b1)の終了時に得られた液体溶液に添加する工程。
【請求項３】
工程d)が、下記の工程を含む、請求項１または２のいずれか１項記載の方法：
d1) グルタルアルデヒドを、工程c)の終了時に得られた液体混合物に添加する工程；および、
d2) EDTAを、工程d1)の終了時に得られたTNFαと前期担体タンパク質とのヘテロ複合体に添加する工程。
【請求項４】
工程a)において、TNFα濃度が、0.1mg/mL〜50mg/mLの範囲である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程a)において、TNFα濃度が、0.5mg/mL〜10mg/mLの範囲である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程b)において、最終EDTA濃度が、1mM〜500mMの範囲である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程b2)において、最終DMSO濃度が、0.5%(容量/容量)〜20％(容量/容量)の範囲である、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程c)において、TNFα対前記担体タンパク質のモル比が、5：1〜100：1である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程d)において、最終グルタルアルデヒド濃度が、0.05%(質量/質量)〜0.5%(質量/質量)である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
工程d2)において、最終EDTA濃度が、1mM〜10mMの範囲である、請求項３〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
工程e)において、グルタルアルデヒドを、透析を実施することにより、ダイアフィルトレーションによる限外濾過を実施することにより或いはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を実施することにより除去する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程f)において、ホルムアルデヒドの最終濃度が、1%(質量/質量)〜10％(質量/質量)の範囲である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
工程f)において、ホルムアルデヒドの最終濃度が、2%(質量/質量)〜５%(質量/質量)の範囲である、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
工程f)において、ホルムアルデヒドの存在を、120時間〜168時間の時間範囲で維持する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
工程g)において、前記遮断試薬が、グリシンからなる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
工程g)において、最終グリシン濃度が、0.01M〜10Mの範囲である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
工程g)において、最終グリシン濃度が、0.05M〜2Mの範囲である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
工程g)において、前記遮断試薬が、リシンからなる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
工程g)において、最終リシン濃度が、0.01M〜10Mの範囲である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
工程g)において、最終リシン濃度が、0.05M〜0.5Mの範囲である、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
工程h)において、ホルムアルデヒドおよび前記遮断試薬を、透析を実施することにより、ダイアフィルトレーションによる限外濾過を実施することにより或いはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を実施することにより除去する、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記担体タンパク質を、ジフテリアトキソイド(DT)およびその変異体、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、髄膜炎菌由来のOMPC、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、ウシ血清アルブミン(BSA)、およびインフルエンザ菌由来のプロテインDからなる群から選択する、請求項１〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記担体タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)からなる、請求項１〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
下記の工程を含むことを特徴とする、ワクチン組成物の製造方法：
a) 抗-TNFα免疫原性生成物を、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法を実施することによって調製する工程；および、
b) 工程a)において調製した前記抗-TNFα免疫原性生成物を１種以上の免疫アジュバントと混合する工程。
【請求項２５】
下記の技術的特徴の１つ以上を有する、抗-TNFα免疫原性生成物：
i) 前記生成物は、(a) 40%未満の共有結合により、さらに、60%よりも多い非共有結合により一緒に結合している(1) TNFα分子と(2) 担体タンパク質分子を含む；
ii) 前記生成物は、40：1〜60：1範囲のTNFα対前記担体タンパク質のモル比を示す；
iii) 前記生成物は、1/1000未満のTNFα中和能(NC50)を有する抗-TNFα抗体の産生を誘発する；そして、
iv) 前記生成物は、L929細胞細胞毒試験において、50ng/mlより高い、さらには400ng/mlよりも高いED50値を有する。
【請求項２６】
(i) 請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって製造した抗-TNFα免疫原性生成物または(ii) 請求項２５記載の抗-TNFα免疫原性生成物を、１種以上の製薬上許容し得る賦形剤と一緒に含むことを特徴とする、免疫原性組成物。
【請求項２７】
(i) 請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって製造した抗-TNFα免疫原性生成物または(ii) 請求項２５記載の抗-TNFα免疫原性生成物を、１種以上の免疫アジュバントと一緒に含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TNFαの生物学的活性を中和する抗体の産生によって哺乳類における体液免疫応答を得るための、TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物、並びに該生成物の製造法に関する。
上記安定な免疫原性生成物は、抗-TNFα免疫原性生成物とも或いは抗-TNFα抗体を誘発する免疫原性生成物とも称し得る。
さらに、本発明は、TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む上記安定な免疫原性生成物を含むワクチン組成物、並びに該ワクチン組成物の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
興味ある１種以上の抗原性タンパク質と少なくとも１種の担体タンパク質を含む抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物の一般的な製造方法は、NEOVACSの名義でWO 2004/024189号として公開されたPCT出願に記載されている。注目すべきことに、該PCT出願は、興味ある抗原としてTNFαを、さらに、担体タンパク質としてKLHを使用するそのようなヘテロ複合体の製造方法を開示している。この一般的な従来技術方法は、TNFαとKLHを含むヘテロ複合体を製造ために実施する場合、下記の工程を含む：
a) KLHとTNFαの混合物を得る工程；
b) 上記混合物に、グルタルアルデヒドを0.026Mの最終濃度で添加する工程；
c) 過剰のグルタルアルデヒドを、透析を実施することによって除去する工程；
d) ホルムアルデヒドを上記透析溶液に添加し、ホルムアルデヒドの存在を48時間維持する工程；
e) グリシンを、工程d)の終了時に得られた溶液に添加する工程；および、
f) 工程e)の終了時に得られた溶液による透析を実施する工程。
上記PCT出願WO 2004/024189号の実施例は、得られたTNFα/KLH免疫原性生成物が安定であり、生来のTNFαに対する良好な中和活性を有する抗体の産生を上昇させ得ることを示している。
しかしながら、時間の経過とともに、より有効なヘテロ複合体が、上記ヘテロ複合体を主活性成分として含有する適切なワクチン組成物を製造する目的のための、米国およびヨーロッパにおけるような各種の保健当局からの高レベルの条件を満たす観点から求められている。
【発明の開示】
【０００３】
本出願人は、PCT出願WO 2004/024189号に開示されている一般的方法は、TNFαと担体タンパク質を含むヘテロ複合体に応用する場合、TNFαの不活化および免疫原性の両方を、世界中の各種保健当局により承認されるべき抗-TNFαワクチン組成物を製造する観点からは、改良しなければならない最終免疫原性生成物をもたらすことを見出した。また、本出願人は、免疫原性生成物全体の安定性、とりわけ、その保存時間につれての安定性を上昇させるために改良すべきことも見出した。
本出願人は、今回、上述の各種目標に達し得るTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物の新規な製造方法を見出した。
本発明の目的は、下記の工程を含むことを特徴とする、TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物の製造方法からなる：
a) TNFαを含有する液体溶液を調製する工程；
b) EDTAを、工程a)のTNFαを含有する上記液体溶液に添加する工程；
c) 担体タンパク質を、工程b)の終了時に得られた液体溶液に添加して、TNFαと上記担体タンパク質の液体混合物を得る工程；
d) グルタルアルデヒドを、工程c)の終了時に得られた液体混合物に添加して、TNFα分子を上記担体タンパク質に部分的に共有接合させ、TNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体を得る工程；
e) グルタルアルデヒド並びにTNFαおよび上記担体タンパク質双方の遊離分子を、工程d)の終了時に得られた溶液から除去して、TNFαと上記担体タンパク質との精製ヘテロ複合体を含有する液体溶液を得る工程；
f) ホルムアルデヒドを工程e)の終了時に得られた液体溶液に添加し、ホルムアルデヒドの存在を、96時間〜192時間の時間範囲で維持する工程；
g) ホルムアルデヒドとの反応を遮断する試薬を、工程f)の終了時に得られたTNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体を含有する液体溶液に添加する工程；および、
h) ホルムアルデヒドおよび前記遮断試薬を工程h)の終了時に得られた液体溶液から除去して、TNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体を含む上記安定な免疫原性生成物を含有する液体溶液を得る工程。
【０００４】
上記の方法を実施することによって、得られる安定な免疫原性生成物に、哺乳類に１種以上の免疫アジュバント化合物と一緒に投与したとき、生来のTNFαを中和する抗体の産生を誘発させる増強された能力を与える。
“TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物”は、本明細書において使用する場合、TNFαの生物学的活性を中和する抗体を誘発させる免疫原性生成物からなり、この免疫原性生成物は、(i) TNFα分子と(ii) 担体分子との間のタンパク質結合を含み、TNFα分子の40%未満は共有化学結合によって担体分子に結合している。
上記方法によって調製した安定な免疫原性生成物は、この生成物が、上記対象者へのその投与後に、対象者の生来のTNFαに対する抗体、さらに詳細には、生来のTNFαの生物学的活性を中和する抗体を誘発するので、“免疫原性”である。
上記方法によって調製した免疫原性生成物は、該免疫原性生成物が少なくとも(i) TNFαまたは(ii) 担体分子の等電点とは異なり得るその固有の等電点を有することから、また、該免疫原性生成物が、等電点分画電気泳動アッセイにおいて、(i) TNFαおよび(ii) 担体分子それぞれに相応する２つのタンパク質バンドの少なくとも１つとは異なるタンパク質バンドとして泳動することから、“安定”である。このことは、本発明に従う免疫原性生成物が、遊離の未結合TNFα分子も遊離の未結合担体タンパク質分子も含まないことを意味する。
上記の方法によって調製した免疫原性生成物は、該免疫原性生成物が、(a) 共有結合(40%未満の共有結合)により部分的に、そして、(b) イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用等のような弱い非共有結合(60%よりも多い非共有結合)により部分的に一緒に結合している(i)抗原性TNFαと(ii) 抗原性担体タンパク質分子を含むので、“抗原性ヘテロ複合体”、即ち、TNFαと担体タンパク質との“ヘテロ複合体”を含む。
【０００５】
上記で定義し、本発明の方法に従って製造し得るTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体は、本明細書においては、より簡潔には、ヒトまたは動物において抗-TNFα抗体を誘発させるためのまたは誘発させる免疫原性生成物とも或いは抗-TNFα免疫原性生成物とも称し得る。
本発明に従う方法の工程組合せにより、最終の安定な免疫原性生成物が、上記で引用したPCT出願WO 2004/024189号に開示されている従来技術方法に従って得られるTNFαと担体タンパク質を含むヘテロ複合体よりも高い再現性でもって得られる。
注目すべきことに、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物の免疫原性活性は、１つの製造バッチから次のバッチにおいて極めて再現可能であることが判明している。
本明細書の各実施例において示しているように、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物は、生体外および生体内の双方において、ED50投与量が、最終TNFα濃度として表したとき、50ng/mlよりも高く、400ng/mlよりも高くさえあるので、検出可能なTNFα生物学活性を有していない。
また、本発明においては、高抗-TNFα抗体力価の誘発を超越して、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物は、1/1000を超える中和能NC50を有する高中和性抗-TNFα抗体の産生を誘発することも証明している。
さらに、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物は、これらの生成物が、単回ヒト治療投与量(SHTD)の400倍の量で投与したときでさえも、何らの有害な副作用も、とりわけ、心臓、肺臓、肝臓および脾臓のような臓器の炎症または何らの変化も誘発しないことから、哺乳類に安全に投与し得ることも証明している。
【０００６】
さらに、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物は、マカク属のサルにおいて、とりわけIgGイソタイプの抗-TNFα中和抗体の強力な産生を誘発し、このことは、これらの安定な免疫原性生成物が内生的に産生されたタンパク質に対する免疫寛容を破壊し、TNFαの中和に至る有効なワクチン接種を誘発し得、このワクチン接種は、TNFαが関与する全ての病状におけるTNFαの過産生の有害な作用を予防し得る。
さらに、本発明に従う方法を実施することによって調製した安定な免疫原性生成物は、哺乳類をTNFα誘発性関節炎に対して有効にワクチン接種することができるも証明している。さらにまた、これらの安定な免疫原性生成物は、TNFα誘発性の関節炎、炎症性滑膜炎および関節破壊を、メトトレキサートのような何らかのさらなる抗関節炎活性成分による予防的または治療的処置を補完する必要なしで、単独で使用したときに予防および/または治療し得ることも証明している。
また、本発明に従って調製した安定な免疫原性生成物は、TNFαの過産生によって生じた致死性ショックを予防および/または治療し得ることも証明している。
即ち、本発明の方法に従って調製した安定な免疫原性生成物は、急性および慢性TNFα依存性病変に対する抗-TNFα自己免疫防御を、検知し得る副作用なしで誘発する。
【０００７】
何ら特定の理論によって拘束することは望まないが、本出願人は、工程a)〜h)の特定の組合せにより、TNFα出発生成物の空間的立体構造が保たれるとともにTNFαの主要抗原エピトープの溶媒への暴露を強めて、TNFα抗原の免疫担当細胞への効率的授与を、上記安定な免疫原性生成物を哺乳類に投与したときに最高にするものと信じている。
何ら特定の理論によって拘束することは望まないが、本出願人は、工程a)〜h)の特定の組合せにより、PCT出願WO 2004/024189号に開示されている方法よりも、TNFαおよびKLHを使用したときの最終免疫原性生成物の構造的および化学的双方の良好な安定化を可能にしているものと信じている。上記方法によって得られる安定な免疫原性生成物のそのような特有の特徴は、この場合も長期の保存期間中に極めて安定であるワクチン組成物の製造を可能にする。
さらに、本発明の方法は、TNFα出発生成物の残留生物学活性のない最終の安定な免疫原性生成物の製造を可能にすることも判明している。注目すべきことに、TNFα出発生成物のED50は、本発明の約10pg/mLを有していることも判明している。本発明の方法によって得られた最終の安定免疫原性生成物は、50ng/mLよりも高い、殆どの場合400ng/mLよりも高いED50値を有する。同時に、上記最終の安定な免疫原性生成物は、高免疫原性を有している。
さらにまた、本発明に従う方法によって得られた免疫原性生成物は、上記免疫原性生成物がその生物学的不活性にもかかわらず、TNFαレセプターR1およびR2に依然として結合することから、生来のTNFαの主要立体構造を保っていることも証明している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
工程a)においては、TNFαは、マウスTNFα、ラットTNFα、ウサギTNFαおよびヒトTNFαからなる群から選ばれる生来のTNFαからなる。好ましくは、TNFαは、ヒトTNFαからなる。
本発明に従う方法のある種の実施態様においては、工程b)は、下記の工程を含む：
b1) EDTAを、工程a)のTNFαを含有する上記液体溶液に添加する工程；および、
b2) DMSOを、工程b1)の終了時に得られた液体溶液に添加する工程。
本発明によれば、工程b2)でのDMSOの添加により、最終の安定な免疫原性生成物の免疫原性が増強されたことが判明している。
本発明方法のある種の実施態様においては、工程d)は、下記の工程を含む：
d1) グルタルアルデヒドを、工程c)の終了時に得られた液体混合物に添加して、TNFα分子を上記担体タンパク質に部分的に共有接合させ、TNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体を得る工程；および、
d2) EDTAを、工程d1)の終了時に得られたTNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体に添加する工程。
従って、工程d1)の終了時には、担体タンパク質に、(i)共有結合により部分的に、そして、(ii)非共有結合により部分的に結合しているTNFα分子を含む生成物を含有する液体溶液が得られる。
本発明に従う方法は、ホルムアルデヒドと遮断試薬を、工程g)の終了時に得られた溶液から除去して、TNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体を含む精製された安定な免疫原性生成物を得るための工程h)を含む。
工程h)の終了時には、上記安定な免疫原性生成物は、事実上何ら目視し得る粒子のない透明で無色の液体溶液の形で得られる。
ある種の実施態様においては、上記方法は、工程h)の終了時に得られた溶液を凍結するさらなる工程i)も含み得る。
ある種の他の実施態様においては、上記方法は、工程h)の終了時に得られた溶液を凍結乾燥して、使用前に長期間保存し得る白色粉末を得るさらなる工程i)も含み得る。
【０００９】
工程a)の好ましい実施態様においては、TNFα濃度は、0.1mg/mL〜50mg/mL、さらにより好ましくは0.5mg/mL〜10mg/mLの範囲にある。
工程b)の好ましい実施態様においては、最終EDTA濃度は、1mM〜500mM、最も好ましくは1mM〜10mMの範囲にある。
有利には、EDTAは、7〜8.5、より好ましくは7.5〜8.1範囲のpHを有する緩衝溶液として添加する。
工程b2)の好ましい実施態様においては、最終DMSO濃度は、0.5%(容量/容量)〜20％(容量/容量)、最も好ましくは5%(容量/容量)〜20%(容量/容量)の範囲にある。
有利には、工程b2)は、10分〜50分、より好ましくは20分〜40分の時間範囲で実施する。
工程c)の好ましい実施態様においては、TNFα対上記担体タンパク質のモル比は、5：1〜100：1であり、さらにより好ましくは20：1〜80：1の範囲である。工程c)の最も好ましい実施態様においては、TNFα対上記担体タンパク質のモル比は、30：1〜70：1または40：1〜60：1の範囲である。
工程d)の好ましい実施態様においては、最終グルタルアルデヒド濃度は、0.05%(質量/質量)〜0.5%(質量/質量)である。0.02M〜0.03M範囲のグルタルアルデヒド最終濃度が適しており、最も好ましい最終グルタルアルデヒド濃度は0.026Mからなる。
有利には、工程d2)は、30分〜60分、好ましくは40分〜50分の時間範囲で実施する。
工程d2)の好ましい実施態様において、最終EDTA濃度は、1mM〜10mMの範囲にある。
【００１０】
工程e)の好ましい実施態様において、グルタルアルデヒドを、透析を実施することにより、ダイアフィルトレーションによる限外濾過を実施することにより或いはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を実施することにより除去する。
透析を実施する場合、好ましくは、6〜8 KDaのカットオフ閾値を有する透析膜を使用する。
透析工程は、好ましくは、(i) 処理用緩衝液(100mMリン酸塩、150mM NaCl pH 7.8、EDTA 5mM)によって実施する最初の２つの工程、および(ii) PBSによって実施する最後の工程を含む３工程からなる。
通常、透析工程は、使用する担体タンパク質にTNFα分子が部分的に共有接合しているTNFαと担体タンパク質とのヘテロ複合体を含有する液体溶液に対し200〜400倍の容量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような通常の緩衝液によって実施する。
ダイアフィルトレーションによる限外濾過を実施する場合は、好ましくは、10 000 KDaのカットオフ閾値を有する濾過膜を使用するが、TNFαと上記担体タンパク質とのヘテロ複合体は、限外濾過滞留物中に見出されることを理解されたい。通常、ダイアフィルトレーションにおいて使用する液体は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような緩衝溶液からなる。通常、ダイアフィルトレーションは、緩衝液の等容量により３回実施する。
工程f)好ましい実施態様においては、ホルムアルデヒドの最終濃度は、1%(質量/質量)〜10％(質量/質量)の範囲にあり、さらにより好ましくは、2%(質量/質量)〜５%(質量/質量)の範囲にある。
工程f)においては、ホルムアルデヒドの存在を、96時間〜192時間の時間範囲で維持する。
本発明によると、96時間よりも短い時間で上記ヘテロ複合体と一緒のホルムアルデヒドの存在を維持すれば、本発明に従う方法の上記好ましい実施態様に従って得られた安定な免疫原性化合物と比較したとき、経時的に有意に安定性の低い最終免疫原性化合物が生じることが判明している。
一方、本発明によると、192時間よりも長い時間で上記ヘテロ複合体と一緒のホルムアルデヒドの存在を維持すれば、高度に安定ではあるが生来のTNFαに対する高中和活性を有する抗体を誘発する能力の有意に低下した最終免疫原性化合物が生じることが判明している。
より好ましくは、工程f)においては、ホルムアルデヒドの存在を、120時間〜168時間の時間範囲で維持する。
最も好ましくは、工程f)においては、ホルムアルデヒドの存在を、130時間〜150時間の時間範囲で維持する。
有利には、工程f)は、30℃〜40℃、より好ましくは35℃〜39℃範囲の温度で実施する。
【００１１】
工程g)においては、上記タンパク質分子とホルムアルデヒドの反応を遮断する試薬は、少なくとも１個のアミノ基を含み且つ上記タンパク質分子とホルムアルデヒドとの化学反応を停止させる任意の適切な化合物からなり得る。
ある種の好ましい実施態様においては、上記遮断試薬は、グリシンからなる。
工程g)の好ましい実施態様においては、最終グリシン濃度は、0.01M〜10Mの範囲にあり、さらにより好ましくは、0.05M〜2Mの範囲にある。
工程g)のある種の他の好ましい実施態様においては、上記遮断試薬は、リシンからなる。
工程g)の好ましい実施態様においては、最終リシン濃度は、0.01M〜10M、好ましくは0.05M〜2M、最も好ましくは0.05M〜0.5Mの範囲にある。
好ましい実施態様においては、上記タンパク質分子を、1時間〜10日、最も好ましくは5日〜10日のインキュベーション時間で、リシンと接触させる。3日よりも長い、最も好ましくは少なくとも5日間のリシンとのインキュベーション時間が、最終生成物の化学構造の最適の不可逆性をもたらし、その良好な免疫原性および安定性に寄与する。
有利には、工程h)を実施する場合、液体溶液のpHを、例えば、NaOHのような塩基を使用することによって、6.8〜7.8、より好ましくは7.0〜7.6範囲のpHに調整する。
工程h)の好ましい実施態様においては、ホルムアルデヒドおよび上記遮断試薬を、透析を実施することにより、ダイアフィルトレーションによる限外濾過を実施することにより或いはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を実施することにより除去する。
工程h)において使用する透析、ダイアフィルトレーションによる限外濾過、またはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)における条件は、通常、上記工程e)について上記で定義した或いは下記の実施例において開示するような条件と同じである。
【００１２】
“担体タンパク質”または“担体タンパク質分子”なる用語は、本明細書においては、当業者にとってその通常の意味に従って使用する、即ち、ハプテン分子のような抗原性分子にカップリングさせたとき、宿主生物体において、とりわけヒトのような哺乳類において、上記抗原性分子に対する免疫応答の誘発を可能にするタンパク質を意味する。本明細書において使用するとき、上記の免疫応答は、上記抗原性分子に対して特異性の抗体の産生を包含する。
本発明の方法によれば、当業者にとって既知の広範な種々の担体タンパク質を工程c)において使用し得る。担体タンパク質は、十分なヘルパーT細胞エピトープを担持して、Tヘルパー細胞およびB細胞を活性化させ、これら細胞が十分なIL-1およびIL-2を放出するように誘発して、中和性抗-TNFα抗体を産生するB細胞クローンの増殖を誘発させるべきである。
本発明の安定な免疫原性生成物に含ませる“担体タンパク質分子”は、そのアミノ酸配列の如何にかかわらず、少なくとも15個のアミノ酸長であり、且つ、TNFα分子に部分的に共有結合させて本発明の免疫原性生成物を構成するタンパク質ヘテロ複合体を形成させるときに、多数のTNFα分子をBリンパ球に付与させるのを可能にする任意のタンパク質またはペプチドを意味する。
第１の局面によれば、担体タンパク質分子は、宿主生物体の助Tリンパ球(“Tヘルパー”)を活性化してインターロイキン2のようなサイトカイン類を産生させ得る１種以上の助Tエピトープ(“ヘルパー”)を含む少なくとも15個のアミノ酸長の１種のタンパク質または１種のペプチド或いはそのようなペプチドのオリゴマーからなり、そのようなサイトカインは、その後、成熟後にTNFαに対して産生する抗体を産生させるBリンパ球の増殖を活性化し誘発させる。
また、担体タンパク質分子は、由来する天然タンパク質のホモオリゴマーまたはホモポリマー、並びに由来する天然タンパク質のペプチドフラグメントのホモオリゴマーまたはホモポリマーからなり得る。また、興味ある抗原性タンパク質は、由来する天然タンパク質中に当初から含まれている数種の異なるペプチドフラグメントの組合せを含むヘテロオリゴマーまたはヘテロポリマーからなり得る。
【００１３】
本発明に従う方法を実施するときに使用し得るタンパク質担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド[それぞれ、DT、DT CRM197、他のDT変異体、例えば、位置Glu-148等(例えば、米国特許第4,709,017号、W093/25210号、W095/33481号等を参照されたい)、およびTT (およびTTフラグメントC)]、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、髄膜炎菌(N.meningitides)由来のOMPC、並びにツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)がある。
上記担体の機能は、TNFαに対する免疫応答を増強させるためのサイトカイン援助を提供することである。本発明において使用し得る担体の非網羅的な目録としては、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)；ウシ血清アルブミン(BSA)のような血清アルブミン；破傷風またはジフテリア毒素のような不活化細菌毒素(TTおよびDT)、またはそれらの組換えフラグメント(例えば、TTのフラグメントCのドメイン１、またはDTの転座ドメイン)；またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)がある。
本発明方法の１つの実施態様においては、上記担体は、インフルエンザ菌由来のプロテインDである(EP 0 594 610  B1号)。プロテインDは、インフルエンザ菌由来のIgD結合性タンパク質であり、Forsgrenにより特許化されている(WO  91/18926号、登録EP 0 594 610  B1号)。ある状況においては、例えば、組換えイムノゲン発現系においては、プロテインDのフラグメント、例えば、プロテインD1/3.sup.rd (プロテインDのN-末端100〜110アミノ酸を含む(WO99/10375号；WO00/50077号))を使用することが望ましい。
従って、本発明方法の好ましい実施態様においては、上記担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)およびその変異体、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、髄膜炎菌由来のOMPC、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(PPD)、ウシ血清アルブミン(BSA)、およびインフルエンザ菌由来のプロテインDからなる群から選択する。
最も好ましくは、上記担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)からなる。
【００１４】
また、本発明は、下記の工程を含むワクチン組成物の製造方法に関する：
a) TNFαの抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物を、上記で定義したような方法を実施することによって調製する工程；および、
b) 工程a)において調製したTNFαの抗原性ヘテロ複合体を含む上記安定な免疫原性生成物を１種以上の免疫アジュバントと混合する工程。
下記の実施例において示すように、上記安定な免疫原性生成物は、本明細書においては抗-TNFα免疫原性生成物とも称し得、本発明に従う方法によって得られた最終生成物からなり、特有の物理化学および生物学的特性を有する。
一般に、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物は、50kDa〜8000kDa (8MDa)範囲の分子量を有し、総タンパク質量の約30%は、1000kDa (1MDa)未満の分子量を有する。
さらに、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物は、40：1〜60：1の範囲のTNFα対上記担体タンパク質のモル比を示す。
さらに、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物は、SDS含有緩衝液中におけるような、非共有結合を除去する変性条件下でインキュベートしたとき、該免疫原性生成物中に含まれるTNFα分子と担体タンパク質分子が少なくとも部分的に非共有結合、例えば、イオン相互作用、水素結合およびファンデルワールス結合のような弱い結合によって一緒に結合していることを示す２種以上のタンパク質生成物を生成する。
さらに、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物においては、上記TNFα分子と担体タンパク質分子間の共有結合は、上記抗-TNFα免疫原性生成物の常に60%よりも多いTNFα分子含有量が変性条件下においては上記担体タンパク質に結合していない分子として放出されるので、これら分子間の総結合の常に40%未満を示すことも判明している。
実施例８のような下記の実施例において示すように、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物は、少なくとも下記のタンパク質種を含む：
担体タンパク質分子に共有結合しているTNFα分子；および、下記のような非共有結合によって結合している分子：
TNFα分子のモノマー；
TNFα分子のダイマー；
TNFα分子のトリマー；
TNFα分子のダイマーおよび/またはトリマーのポリマー；
担体タンパク質のモノマー；および、
担体タンパク質のポリマー。
重要なことに、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物は、1/1000を越えるTNFα中和能(NC50)を有する抗-TNFα抗体の産生を誘発させる。
【００１５】
TNFα中和能は、TNFαの細胞毒活性の50%を中和する血清希釈からなる。本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物のこの生物学的特長は、実施例において開示しており且つ本明細書においてさらに詳述している通常の方法を使用することにより、当業者であれば、容易に、直接的に且つ確実に評価し得る。
本発明の抗-TNFα免疫原性生成物のNC50値は、従来のPCT出願WO 2004/024189号に開示されている方法に従って調製された安定な免疫原性生成物において判明したNC50値と明らかに異なっている。担体タンパク質がKLHからなる特異的抗-TNFα免疫原性生成物のNC50値間の比較は、本明細書の実施例において、とりわけ下記の表３において詳述している。
本発明に従うTNFα-KLH免疫原性生成物は、表３において見出されるように、“K7”と表示したバッチからなり、一方、従来のPCT出願WO 2004/024189号に開示されている方法に従って調製された相応する安定な免疫原性生成物は、“K10”と表示しているバッチからなる。表３に示すように、従来のPCT出願WO 2004/024189号に開示されている方法に従って調製された安定な免疫原性生成物において判明したNC50値は、1/700である。本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物において判明したNC50値は、1/1200であり、従って、従来技術の生成物において判明したNC50値のおよそ半分である。
本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物のこの良好なTNFα中和能は、工程b)におけるEDTAの使用および工程f)における96時間〜192時間の時間範囲でのホルムアルデヒドの存在の維持のような本発明に従う方法の特定の特徴の組合せによって最終生成物に付与されている。
とりわけ、本明細書の表３に示すように、工程f)における96時間〜192時間の時間範囲でのホルムアルデヒドの存在の維持は、最良の低NC50値を有する最終抗-TNFα免疫原性生成物を得るための決定要因である。
【００１６】
さらに、本明細書の表３に示すように、工程f)における96時間〜192時間の時間範囲でのホルムアルデヒドの存在の維持は、TNFα細胞毒活性を、50ng/mlよりも高い、好ましくは400ng/mlよりも高い、場合によっては少なくとも10pg/mlまでのED50 (有効投与量50)値でもって、ほぼ完全にブロックしている最終抗-TNFα免疫原性生成物を得ることも可能にしている。
本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物のTNFα中和能NC50値の評価は、実施例３に詳細に開示しており、以下に簡単に説明する。
抗-TNFα免疫原性生成物のTNFα中和能(NC50)値を測定するのに当業者が直接かつ確実に使用し得る典型的な方法は、下記の処置を含む：
a) マウスに、試験すべき抗-TNFα免疫原性生成物と完全フロイントアジュバント(CFA)の組合せを筋肉内経路により投与する処置；
b) 工程a)後の21日目に、同じマウスに、試験すべき抗-TNFα免疫原性生成物と不完全フロイントアジュバント(IFA)の組合せを筋肉内経路により投与する処置；
c) 工程a)後の28日目に、血液サンプルを、上記工程a)およびb)で処理した各々のマウスから採血する処置：
d) 工程c)で採血した血液サンプル由来の血清のどの程度の希釈が標準量のTNFαの細胞毒活性の50%を抑制するかを判定する処置。
上記NC50値評価方法を実施するに当っては、TNFα細胞毒活性を、L929細胞系を使用する通常の細胞毒性試験に従って測定する。好ましくは、TNFαの標準量は、L929細胞培養物中で20ng/mlの最終濃度を有する。
【００１７】
本明細書の実施例、とりわけ本明細書の表３において開示しているように、ED50値は、通常のL929細胞細胞毒性試験において50%の細胞毒性を誘発する本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物の最終濃度からなる。
本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物がPCT出願WO 2004/024189号に開示された安定な免疫原性生成物と異なるもう１つの特徴は、50ng/mlよりも高い、さらに400ng/mlよりも高くさえある、場合によっては10pg/mlまでのED50からなり、これに対して、上記従来技術の生成物においては約15ng/mlのED50値が判明していた。
何ら特定の理論によって拘束することは望まないが、本出願人は、本発明に従う抗-TNFα免疫原性生成物のTNF活性の欠如および高免疫原性のような良好な生物学的特性が、本発明に従う方法によって得られた抗-TNFα免疫原性生成物がPCT出願WO 2004/024189号に開示された安定な免疫原性生成物と構造的に異なっていることを例証しているものと信じている；但し、特定の構造変化は、容易に検知可能ではあり得ない。
また、本発明は、下記の技術的特徴の１つ以上を有する、TNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物にも関する：
i) 上記生成物は、(a) 40%未満の共有結合により、そして、60%よりも多い非共有結合により一緒に結合している(1) TNFα分子および(2) 担体タンパク質分子を含む；
ii) 上記生成物は、40：1〜60：1範囲のTNFα対上記担体タンパク質のモル比を示す；
iii) 上記生成物は、1/1000未満のTNFα中和能(NC50)を有する抗-TNFα抗体の産生を誘発する；
iv) 上記生成物は、L929細胞細胞毒性試験において、50ng/mlより高い、さらには400ng/mlよりも高いED50値を有する；そして、
v) 上記生成物は、50kDa〜8000kDa (8MDa)範囲の分子量を有し、総タンパク質量の約30%は1000kDa (1MDa)未満の分子量を有する。
とりわけ、本発明は、上記の特徴(i)〜(iv)を有する抗-TNFα免疫原性生成物に関する。
【００１８】
ある種の実施態様においては、担体タンパク質は、KLHからなる。
本発明の免疫原性生成物において共有結合により互いに結合している担体タンパク質分子と興味あるTNFαタンパク質の割合は、当業者であれば、容易に確認し得る。
例えば、本発明の免疫原性生成物において共有結合により担体タンパク質分子に結合しているTNFα分子の割合の判定は、下記の工程を使用して実施し得る：
(i) 溶液中の上記免疫原性生成物を変性および還元条件に供する工程；
(ii) 工程(ii)の終了時に得られるような生成物によるサイズ排除クロマトグラフィーを実施して、その間に、徐々に減少する分子量を有する各種タンパク質成分を上記サイズ排除クロマトグラフィー支持体から連続的に溶出させる工程；
(iii) 最大分子量を有するタンパク質成分を含有する溶出液画分中の、上記担体分子に共有結合により結合しているTNFα分子の量を測定する工程；
(iv) 工程(iii)において測定したTNFα量を、出発免疫原性生成物中に含ませた当初の総TNFα量と比較する工程。
【００１９】
上述の共有結合割合を判定する方法の工程(i)においては、所定量(モル数または質量での)の本発明の免疫原性生成物を変性および還元条件下でインキュベートすることにより、共有結合によっては互いに結合していない各種タンパク質成分間の弱結合の解離がもたらされる。
好ましい変性条件としては、上記免疫原性生成物を含有する溶液の総質量の、例えば、最終8M濃度での尿素の存在、或いは、例えば、1%最終濃度でのSDSの存在がある。好ましい還元条件としては、上記免疫原性生成物を含有する溶液の総質量の、例えば、5%最終濃度でのβ-メルカプトエタノールの存在がある。
共有結合により互いに結合しているTNFα分子と担体タンパク質分子の割合を判定する方法の工程(ii)においては、サイズ排除クロマトグラフィー支持体は、当業者であれば、その一般的技術知識に従って選定するであろう。例えば、当業者であれば、Pharmacia
Corporation社から“Superdex 75TM、Superdex 200TMおよびSuperdex 400TM”の商標で販売されているようなクロマトグラフィー支持体を使用し得るであろう。
工程(ii)においては、TNFα分子に共有結合している担体分子に相応する分子画分は、遊離形の興味ある抗原を含有する溶出液画分(１以上)の前に、最初に溶出する。遊離形で溶出するTNFαの量は、出発免疫原性生成物中の担体分子に共有結合していない興味ある抗原の画分に相応する。この量は、担体タンパク質分子に共有結合しているTNFα量の測定を、例えば、免疫酵素試験、放射性免疫学的試験または免疫蛍光試験において、直接または間接(“サンドイッチ”)のいずれかで、TNFαに対して特異的な抗体を使用して行い、且つ担体タンパク質分子と交差する免疫学的反応を何ら有さない高分子量画分に基づく。
工程(iii)においては、上述のようにして測定した担体タンパク質分子に共有結合により結合しているTNFαの量を、所定量(モル数または質量での)の出発免疫原性生成物中に含ませたTNFαの当初量と比較し、それによって、本発明の免疫原性生成物中の担体タンパク質分子に共有結合しているTNFαの割合を算出する。
【００２０】
本発明の免疫原性生成物中の、共有結合により互いに結合している担体タンパク質分子とTNFαの割合は、当業者であれば、下記の工程を含む第２の方法を使用して容易に確認し得る：
a) 支持体上に、担体タンパク質に対して特異的に産生させた抗体を固定する工程；
b) 工程a)において支持体上に固定させている上記担体タンパク質に対して産生させた抗体を、上記担体タンパク質とTNFαを含む試験すべき免疫原性生成物の既知量の分子と接触させる工程；
c) 工程a)において固定させた抗-担体タンパク質抗体に結合していない上記免疫原性生成物の分子を、１種以上のタンパク質変性剤を含む緩衝剤水溶液を使用することによって除去する工程；
d) d1) (i) 上記固定抗-担体タンパク質抗体と上記免疫原性生成物の分子間で工程c)において形成させた免疫原性複合体を、(ii)担体タンパク質に対して特異的に産生させた抗体と接触させる工程；
d2) 工程d1)とは別に、(i) 上記固定抗-担体タンパク質抗体と上記免疫原性生成物の分子間で工程c)において形成させた免疫原性複合体を、(ii) TNFαに対して特異的に産生させた抗体と接触させる工程；
e) e1) 上記担体タンパク質に結合している工程d1)において添加した抗体を定量する工程；
e2) TNFαに結合している工程d2)において添加した抗体を定量する工程；
f) (i) 工程e1)において測定した抗-担体タンパク質結合抗体の量と(ii) 工程e2)において測定した抗-TNFα結合抗体の量との比を算出する工程。
上記比は、出発免疫原性生成物中の、共有結合により互いに結合している担体タンパク質分子とTNFα分子の割合からなる。
【００２１】
上記の方法の工程c)においては、１種以上のタンパク質変性剤を含有する洗浄用水溶液の使用は、抗-担体タンパク質抗体に結合している上記免疫原性生成物の変性をもたらし、洗浄用溶液中への、担体タンパク質分子に共有結合していないTNFα分子の放出をもたらす。従って、上記方法の工程d2)においては、担体タンパク質分子に共有結合しているTNFα分子のみが定量される。
好ましくは、工程c)において使用する変性用緩衝溶液は、TweenR 20のような界面活性剤を0.1%(容量/容量)の最終濃度で含有する。
工程d1)およびd2)においては、結合抗体の量は、好ましくは、上記工程の各々の終了時において形成させた抗原-抗体複合体を、それぞれ、下記のような検出可能な分子によりラベル化した新たな抗体と一緒にインキュベートすることによって測定する：
(i) 工程d1)においては、抗-担体タンパク質抗体に対して特異的で、検出可能分子によってラベル化した新たな抗体；
(ii) 工程d2)においては、抗体抗-TNFαに対して特異的で、検出可能分子によってラベル化した新たな抗体。
検出可能分子は、限定することなく、放射性分子、蛍光分子または酵素のいずれかである。酵素としては、ペルオキシダーゼをとりわけ使用し得、その存在は、オルソ-フェニレンジアミン(OPD)基質とのインキュベーション後に、比色分析によって明らかにする。
上記の方法の詳細なプロトコールは、実施例において記載している。
例えば、本発明によれば、上記第１または第２の定量方法を使用して、KLH担体分子とヒトTNFα分子とのヘテロ複合体を含む免疫原性生成物において、40%未満のTNFα分子がKLH担体タンパク質分子に共有結合していることを証明している。
【００２２】
本発明の免疫原性またはワクチン組成物を製造するためには、本発明に従う方法によって得られた安定な免疫原性生成物を、必要に応じて適切なワクチンアジュバントと混合して適切な濃度に調整し、使用のために包装する。
また、本発明は、(i) 本明細書において開示した方法によって製造したTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物または(ii) 上記で説明したTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物を１種以上の製薬上許容し得る賦形剤と一緒に含むワクチン組成物にも関する。
また、本発明は、(i) 本明細書において開示した方法によって製造したTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物または(ii) 上記で説明したTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物を１種以上の免疫アジュバントと一緒に含む免疫原性組成物にも関する。
本明細書において使用するとき、用語“アジュバント”とは、混合する抗原に対する免疫応答を増強するその通常の意味の任意の物質を称する。本発明において有用なアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機ゲル類、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック(pluronic)ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールがある。BCG (カルメット・ゲランウシ型結核菌)およびコリネバクテリウム-パルヴム(Corynebacterium parvum)は、潜在的に有用なアジュバントである。
【００２３】
フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントのようなオイル系アジュバント；ミコレート系アジュバント(例えば、トレハロースジミコレート)；細菌リポ多糖類(LPS)；ペプチドグリカン類(即ち、ムレイン類、ムコペプチド類、またはN-オパカ(N-Opaca)、ムラミルジペプチド(MDP)もしくはMDPアナログのような糖タンパク質)；プロテオグリカン類(例えば、肺炎桿杆菌(Klebsiella pneumoniae)からの抽出物)；連鎖球菌調製物(例えば、OK432)；バイオスチム(Biostim) TM.(例えば、01K2)；EP 109 942、EP 180 564およびEP 231 039の“Iscom類”；水酸化アルミニウム；サポニン；DEAE-デキストラン；中性油(ミグリオールのような)；植物油(アラキン酸のような)；リポソーム類；プルロニックRTMポリオール類；リビ(Ribi)アジュバント系(例えば、GB-A-2 189 141号参照)；またはインターロイキン類、とりわけ、細胞介在免疫を刺激するインターロイキン類のような、当該技術において既知の任意のアジュバントを上記のワクチン組成物において使用し得る。放線菌目(Actinomycetales)の細菌属であるアミコラタ(Amycolata)の抽出物からなる別のアジュバントは、米国特許第4,877,612号に記載されている。さらに、独自仕様のアジュバント混合物も商業的に入手可能である。使用するアジュバントは、一部では、レシピエント生物体に依存する。投与するアジュバントの量は、動物のタイプと大きさに依存する。最適の投与量は、一般的な方法によって容易に決定し得る。
適切なアジュバントとしては、限定するものではないが、界面活性剤類、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、N,N-ジオクタデシル-N’,N-ビス(2-ヒドロキシエチル-プロパンジアミン)、メトキシヘキサデシル-グリセリン、およびプルロニックポリオール類；ポラニオン(polanion)類、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸、カルボポール(carbopol)；ペプチド類、例えば、ムラミルジペプチド、MPL、アイメチル(aimethyl)グリシン、タフトシン；オイルエマルジョン；アラム；およびこれらの混合物がある。他の潜在的なアジュバントとしては、大腸菌熱不安定性毒素またはコレラ毒素のBペプチドサブユニットがある。McGhee,J.R.,et al.,"On vaccine development,"Sem.Hematol.,30:3-15(1993)。
【００２４】
サポニンのアジュバント特性は、抗体力価を免疫原まで上昇させる能力を有するものとして、長いこと知られている。本明細書において使用するとき、用語“サポニン”は、スステロイドまたはトリテルペノイドのいずれかの構造の疎水性領域を伴う親水性領域(通常、数個の糖鎖)からなる１群の植物起原の表面活性グリコシド類を称する。サポニンは多くの多様な起源から入手し得るが、有用なアジュバント活性を有するサポニン類は、何アメリカの樹木であるキラヤ サポナリア(Quillaja saponaria) (Molina)に由来している。この起源由来のサポニンを使用して、“Quil A”と命名した“均質”画分が分離されている(Dalsgaard,K.,(1974),Arch.Gesamte  Virusforsch.44:243)。
投与部位反応性は、ワクチン製剤中でのQuil Aの動物およびヒト双方の使用における主要な懸念ごとである。Quil Aのこの毒性を回避する１つの方法は、免疫賦活複合体(Immuno Stimulating Complexの略記、ISCOM.TM.として知られている)の使用である。その理由は、主として、Quil Aは、免疫賦活複合体中に取込まれたときにあまり反応性でないこと、該複合体中のコレステロールとのその結合が、細胞膜中のコレステロールに結合するその能力、従って、その細胞溶解作用を減じることである。さらに、同様なレベルのアジュバント効果を発生させるのに少なめの量のQuil Aしか必要でない。
Quil Aサポニン類を免疫賦活複合体に取込ませたときのQuil  Aサポニン類の免疫調節特性並びにこれらのサポニン類に由来するさらなる利点は、種々の刊行物、例えば、Cox and Cox,J.C.and Coulter,A.R.Advances  in Adjuvant Technology and Application in Animal  Parasite Control Utilising Biotechnology,Chapter  4,Editor Yong,W. K. CRC Press(1992)；Cox,J. C.and  Coulter,A.R.(1997)Vaccine,15(3):248-256;Cox,J.C.and
Coulter,A.R.(1999) BioDrugs 12(6):439-453)；Dalsgaard,(1974)(前出)；Morein et al.,(1989)"Immunostimulating  complex(ISCOM)",In "Vaccines:Recent  Trends  and  Progress".G.Gregoriadis,A.C.Allison and  G.Poster (Eds).Plenium  Press,New  York,p.153；オーストラリア特許明細書第558258号、第589915号、第590904号および第632067号に記載されている。
【００２５】
古典的なISCOM類は、コレステロール、サポニン、リン脂質、およびウイルスエンベロープタンパク質のような免疫原の組合せによって調製されている。ISCOMマトリックス組成物(ISCOMATRIX.TM.として知られている)は、同じように調製されるが、ウイルスタンパク質は含まない。ISCOM類は、体液および細胞免疫応答の双方を賦活させるようである。ISCOM類は、HSV-1、CMW、EBV、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)、狂犬病ウイルス、およびインフルエンザウイルスのような種々のウイルス類由来のタンパク質と一緒に調製されている；例えば、I.G.Barr et al.,Adv.Drug Delivery  Reviews,32:247-271 (1998) を参照されたい。感染因子由来の裸DNAまたはポリペプチドがそれ自体を投与したときに免疫原性に乏しい場合、ISCOM中に含ませると、増大した免疫原性を有することが観察されている。ISCOM類を配合した各種タンパク質は、主として囓歯類モデルにおいて、CTLを誘発させることが証明されている。Berzofsky, (1991), Biotechnol. Ther.2:123-135；Hsu et al.,(1996),Vaccine 14:1159-1166；Lipford et al.,(1994),Vaccine 12:73-80；Mowat et al.,(1991),Immunology 72:317-322；Osterhaus et al.,(1998),Dev. Biol. Stand. 92:49-58；Rimmelzwaan et  al.,(1997),J.Gen.Virol.78(pt.4):757-765；Sambhara et  al.,(1998),J.Infect.Dis.177:1266-1274；Sambhara  et al.,(1997),Mech.Aging  Dev. 96:157-169；Sjolander  et al.,(1997),Vaccine  15:1030-1038；Sjolander  et al.,(1998),J.Leukoc.Biol.64:713-723；Takahashi et al.,(1990),Nature  344:873-875；Tarpey  et al.,(1996),Vaccine  14:230-236；Trudel et al.,(1987),Vaccine  10:107-112；Verschoor et al.,(1999),J.Virol.73:3292-3300；Villacres-Eriksson,(1995),Clin.Exp.Immunol.102:46-52；Zugel et al.,(1995),Eur. J. Immunoll.25:451-458。
【００２６】
本発明の方法によって得られた安定な免疫原性生成物とアジュバントとの結合は、最適の免疫応答誘発のために重要であると考えられる。ビロソーム類とISCOM T.M.による研究のようなこの仮説を確認する多くの研究がなされている(Ennis,F.A.,Crux,J.,Jameson,J.,Klein,M.,Burt,D.and  Thipphawong,J.1999.Virology 259:256-261；Zurbriggen,R.,Novak-Hofer,I.,Seelig,A.and  Gluck,R.(2000),Progress in lipid Research 39:3-18；Voeten,J.T.M.,Nieuwkoop,N.J.,Lovgren-Bengtsson,K.,Osterhaus,D.M.E.and  Rimmelzwaan,G.F.2000.Euro J Imm (投稿))。ISCOM  T.M.と抗原との典型的な結合は、調製中のISCOM T.M.構造中への両親媒性抗原の取込みによって達成されている(Morein,B.,B.Sundquist,S.Hoglund,K.Dalsgaard,and  A.Osterhaus.1984.Nature 308:457)。取込みは、疎水性相互作用によっていた。キレート化および静電相互作用を使用しての、抗原を予め調製した無タンパク質免疫賦活複合体(ISCOMATRIX T.M.)と結合させるより最近の方法は、頓挫している(国際特許出願 PCT/AU98/00080-WO 98/36772号およびPCT/AU00/00110号)。
本発明に従うワクチン組成物のある種の実施態様においては、上記ワクチン組成物は、製薬賦形剤として、１種以上の荷電無機担体を含む。本発明において使用するのに適するアジュバントである荷電有機担体の例としては、限定するものではないが、サポニン、サポニン複合体、サポニンの免疫賦活複合体の任意の１以上の成分、コレステロール、およびISCOMATRIX T.M.として知られる脂質(例えば、サポニン成分および/またはリン脂質成分)、リポソームまたは水中油エマルジョンがある。(ISCOMATRIX T.M.の組成および調製は、国際特許出願 PCT/SE86/00480号；オーストラリア特許第558258号および第632067号；および、ヨーロッパ特許公報第0 180 564号に詳細に記載されている；これらの開示は、参考として本明細書に合体させる)。アジュバントのさらなる例は、限定するものではないが、Cox and Coulterの1992年、1997年および1999年の刊行物に詳述されているアジュバントである。上記の有機担体は、天然産であっても、或いは合成によりまたは組換えにより誘導されたものであってもよいことを理解すべきである。
【００２７】
また、上記ワクチン組成物は、組成物の有効性を増強するためのさらなるアジュバントも含み得る。適切なアジュバントとしては、限定するものではないが、(1) 水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩(アルム)；(2) 例えば、(a) 5%のスクアレン、0.5%のTween 80および0.5%のSpan 85を含有し(必要に応じて、種々の量のMTP-PE (下記参照)を含有するが、必須ではない)、サブミクロン粒子として調製したMF59 (PCT公報 WO 90/14837号)、(b) 10%のスクアレン、0.4%のTween 80、5%のプルロニックブロックポリマー、およびthr-MDP (下記参照)含有し、微細流動化してサブミクロンエマルジョンとするかまたは渦流処理して大粒度エマルジョンを生成させるかしたSAF、および(c) 2%のスクアレン、0.2%のTween 80、並びにモノホスホリリピッドA
(MPL)、テレハロースジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWK)からなる群からの１種以上の細菌細胞壁成分、好ましくは、MPL+CWS (Detox.TM.)を含有するRibi.TM.アジュバント系(RAS)、(Ribi Immonochem社、モントリオール州ハミルトン)のような、水中油エマルジョン(ムラミルペプチド類(下記参照)または細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫賦活剤を含むまたは含まない)；(3) Stimulon.TM.(Cambridge  Bioscience社、マサチューセッツ州ウースター)のようなサポニンアジュバント；(4)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)；(5) インターロイキン類(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、インターフェロン類(例えば、ガンマインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)等のようなサイトカイン類；(6) コレラ毒素(CT)、百日咳毒素(PT)、または大腸菌熱不安定性毒素(LT)のような細菌ADP-リボシル化毒素の解毒化変異体、とりわけ、LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；例えば、WO 93/13302号およびWO 92/19265号を参照されたい；(7) 免疫賦活剤として作用して上記組成物の有効性を増強する他の物質；並びに(8) 国際特許出願PCT/US99/17308号に記載されているような吸着マクロ分子を含むマイクロ粒子がある。アルムおよびMF59が好ましい。
【００２８】
上述したように、適切なムラミルペプチド類としては、限定するものではないが、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-s-n-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(MTP-PE)等がある。
本発明に従う免疫原性化合物に対する粘膜または全身応答を誘発させるさらなるアジュバントとしては、Vogel等の参考書に記載されているアジュバントであり得る。(Vogel F.R.,Powell M.F.and Alving C.R.,《A compendium of vaccine  adjuvants and excipients》;2nd Edition;Vogel F.R.and  Powell MF,1995, 《A summary  compendium of vaccine  adjuvants and  excipients.In:Powell  MF,Newman MJ eds.《Vaccine design:the subunit and adjuvant  approach》.New York:Plenum  publishing,1995:141-228)。
一般的には、本発明に従うワクチン組成物中に含ませ得るアジュバントとしては、限定することなしに、下記がある：
(i) 水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムのようなゲルタイプアジュバント類(Glenny AT et al.,1926;J Pathol Bacteriol;Vol.29:38-45；Gupta RK and Siber GR,1994;Biologicals;Vol.22:53-63)。
(ii) 下記のような微生物アジュバント類：
‐DNA CpGモチーフ (Chu RS et al.,199;J Exp Med;Vol.186:1623-1631)；モノホスホリルリピッドA(Schneerson R et al.,1991;J Immunol;Vol.147:2136-2140)；コレラ毒素 (Holmgren J et al.,1993;Vaccine;Vol.11:1179-1184；Okahashi N et al.,1996;Infect Immun;Vol.64:1516-1525)；
‐大腸菌熱不安定性毒素(Lycke N et al.,1992;Eur J  Immunol;Vol.22:2277-2281；de Haan L et  al.,1996;Vaccine;Vol.14:260-266；Chong C et  al.,1998.Vaccine;Vol.16:732-740)；
‐百日咳毒素(Roberts M et al.,1995;Infect  Immun;Vol.63:2100-2108；Mu HH and
Sewell WA,1994;Immunology;Vol.83:639-645)；
‐ムラミルジペプチド(Ellouz F et al.;1974;Biochem Biophys Res  Commun;Vol.59:1317-1325；Cohen LY et  al.,1996;Cell  Immunol;Vol.169:75-84)。
【００２９】
(iii) 下記のようなオイルエマルジョンおよび乳化剤系アジュバント類：
‐フロイント不完全アジュバント(Dhiman N et al.,1997;Med Microbiol  Immunol(Berlin);Vol.186:45-51；Putkonen P et  al.,1994;J Med  Primatol;Vol.23:89-94)；
‐MF59(Dupuis M et al.,1998;Cell Immunol;Vol.186:18-27；Kahn JO et  al.,1994;J  infect  Dis;Vol.170:1288-1291；Ott G et  al.,1995;Vaccine.Vol.13:1557-1562)；
‐SAF(Allison AC;1998;Dev Biol  Stand;Vol.92:3-11；Gupta RK et al.,1993;Vaccine;Vol.11:293-306；Byars NE et al.,1994;Vacine;Vol. 12 : 200-209)；
(iv) 下記のような粒状アジュバント類：
‐免疫賦活複合体(ISCOM)類 (Putkonen P et  al.,1994;J Med Primatol;Vol.23:89-94；Gupta RK et  al.,1993;Vaccine;Vol.11:293-306；Sjolander A et  al.,1997;Cell
Immunol;Vol.177:69-76)；
‐リポソーム類(Richards RL et al.,1998;Infect Immun;Vol.66:2859-2865；Fernandes I et  al.,1997;Mol  Immunol;Vol.34:569-576)；
‐生分解性ミクロスフィア類(Men Y et al.,1996;Vaccine;Vol.14:1442-1450；Shahin R et  al.,1995;Infect  Immun;Vol.63:1195-1200)；
‐サポニン類 (QS-21)(Newman MJ et al.,1992;J  Immunol;Vol.148:2357-2362；Neuzil  KM et al.,1997;Vaccine.Vol.15:525-532)；
(v) 下記のような合成アジュバント類：
‐ノニオン性ブロックコポリマー(Hunter RL et al.,1994;AIDS Res Hum  Retroviruses;Vol.10(Supl  2);S95-S98；Newman MJ  et  al.,1997;Mech  Ageing
dev;Vol.93:189-203)；
‐ムラミルペプチドアナログ類(Cohen LY et al.,1996;Cell Immunol;Vol.169:75-84；Fast DJ and  Vosika  GJ,1997;Vaccine;Vol.15:1748-1752；Bahr GM  et  al.,1995;Int J  Immunopharmacol;Vol.17:117-131)；
‐ポリホスファゼン(Payne LG et al.,1998;Vaccine;Vol.16:92-98)；
‐合成ポリヌクレオチド類(Johnson AG,1994;Clin Microbiol Rev;Vol.7:277-289；Harrington DG  et  al.,1979;Infect  Immun;Vol.24:160-166)；および、
(vi) 下記のようなサイトカイン類：
‐IFN-γ(Odean MJ et  al.,1990;Infect Immun;Vol.58:427-432)；
‐インターロイキン-12(Luis C  et  al.,1994;Science;Vol.263:235-237；Bliss  J  et al.,1996;J Immunol;Vol.156:887-894；Jankovic  D et
al.,1997,J Immunol;Vol.159:2409-2417)。
【００３０】
従って、本発明のさらなる局面は、上記で定義した安定な免疫原性生成物またはワクチン組成物の、抗体が生来のサイトカインの免疫抑制、アポトーシスまたは血管形成特性を中和する体液免疫応答のような哺乳類における免疫応答を誘発させるための使用に関する。
本発明のさらなる目的は、哺乳類に、(i) 上記で開示したようなワクチン組成物を、或いは(ii) 上記で開示したようなTNFαと担体タンパク質との抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物を１種以上の免疫アジュバントと一緒に投与する処置を含む、哺乳類における生来のTNFα活性を中和する抗体の産生を誘発させる方法からなる。
上記ワクチン組成物は、必要に応じて、製薬上のビヒクル、賦形剤または媒質として機能するワクチン適合性の製薬上許容し得る(即ち、滅菌性且つ無毒性の)液体、半固体または固体希釈剤を含み得る。当該技術において既知の任意の希釈剤を使用し得る。希釈剤の例としては、限定するものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル-およびプロピル-ヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、澱粉、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、ココナツバター、およびカカオ油がある。
また、本発明に従うワクチン組成物は、１種以上の製薬上許容し得る担体および/または希釈剤をさらに含み得、そのような担体としては、それ自体でこの組成物を受入れる個体に対して有害な応答の発生を誘発することはない任意の担体がある。適切な担体は、典型的に大きな遅代謝性のマクロ分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体(油滴またはリポソームのような)、および不活性ウイルス粒子であり得る。そのような担体は、当業者にとって周知である。
また、本発明に従うワクチン組成物は、典型的には、水、食塩水、グリセリン、エタノール等のような希釈剤も含有し得る。さらに、ウェフティング(wefting)剤または乳化剤、pH緩衝物質等のような補助物質も上記組成物中に存在し得る。
【００３１】
本発明のワクチンの適切な製剤としては、液体溶液または懸濁液いずれかの注射可能物がある。また、注射前の製薬上許容し得る液体担体中の溶液または懸濁液用に適する固形剤形も製造し得る。ワクチン製剤は、乳化し得る。本発明方法において使用するための製品において含ませ得るさらなる物質としては、限定するものではないが、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の二ナトリウムまたは四ナトリウム塩、メルチオレート(merthiolate)等のような１種以上の防腐剤がある。
上記ワクチン組成物は、必要に応じて、製薬上のビヒクル、賦形剤または媒質として機能するワクチン適合性の製薬上許容し得る(即ち、滅菌性且つ無毒性の)液体、半固体または固体希釈剤を含み得る。当該技術において既知の任意の希釈剤を使用し得る。希釈剤の例としては、限定するものではないが、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチル-およびプロピル-ヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、澱粉、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、ココナツバター、およびカカオ油がある。
上記ワクチン組成物は、伝達するのに好都合な形に包装し得る。上記組成物は、カプセル、カプレット、小袋、カケット(cachet)、ゼラチン、紙または他の容器内に封入し得る。これらの伝達剤形は、該免疫原性組成物のレシピエント生物体への受入れと適合性があるときに、とりわけ、該免疫原性組成物を単位投与形で伝達させるときに好ましい。投与量単位は、例えば、錠剤、カプセル、座薬またはカケット内に包装し得る。
注射可能用途に適する剤形としては、滅菌水溶液(水溶性である場合)または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末剤がある。これらの製剤は、製造および保存の条件下で安定でなければならないし、また、細菌または真菌のような微生物の汚染作用に対しても保存しなければならない。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成し得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によって達成し得る。
【００３２】
滅菌注射可能溶液は、所定量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した種々の他の成分と一緒に混入し、次いで濾過滅菌することによって調製する。一般に、分散液は、各種の滅菌活性成分を、基本分散媒および上記で列挙した成分からの他の必要成分を含有する滅菌ビヒクル中に混入することによって調製する。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合は、好ましい調製方法は、前以って滅菌濾過した溶液から活性成分粉末＋任意の必要な所望成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥法である。
本発明に従う活性免疫原性化合物を適切に保護した場合、該化合物は、例えば、不活性な希釈剤と一緒にまたは消化性の食用担体と一緒に経口投与し得、或いは、該化合物は、硬質または軟質シェルのゼラチンカプセル内に封入し、圧縮して錠剤とし、または食餌療法食と直接混合することもできる。経口治療投与においては、本発明に従う活性免疫原性化合物は、賦形剤と混合して、服用可能な錠剤、口内錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウェーハ剤等の形で使用し得る。そのようなワクチン組成物および製剤は、少なくとも1質量％の活性免疫原性化合物を含有すべきである。上記組成物と製剤の割合は、勿論、変動し得、好都合には、単位質量の約5〜約80%であり得る。そのような治療上有用なワクチン組成物中の活性免疫原性化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。本発明に従う好ましいワクチン組成物または製剤は、投与量単位剤形が約0.1g〜2000mgの活性免疫原性化合物を含有するように調製する。
【００３３】
また、経口投与に適する本発明に従うワクチン組成物は、液体エアゾール製剤のような液体溶液の剤形としても調製し得る。
液体エアゾール製剤は、生理学上許容し得る希釈剤中に上記免疫原性生成物および分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアゾール製剤は、上記免疫原性生成物と分散剤との微分割固形剤形からなる。液体また乾燥粉末エアゾール製剤のいずれであれ、製剤は、エアゾール化されなければならない。即ち、製剤は、液体または固体粒子に破壊されてエアゾール化投与量が鼻腔または肺の粘膜に実際に到達するのを確保にしなければならない。用語“エアゾール粒子”は、本明細書においては、経鼻または肺投与に適する、即ち、粘膜に到達する液体または固形粒子を説明するのに使用する。伝達装置の構造、製剤中のさらなる成分および粒子特性のような他の検討事項も重要である。薬物の肺投与のこれらの局面は、当該技術において周知であり、製剤の取扱い、エアゾール化手段および伝達装置の構造については、当業者であれば、せいぜい一般的な実験を必要とするだけである。特定の実施態様においては、質量中央値動的直径は、薬物粒子が肺胞に達するのを確保するためには、5マイクロメートル以下であろう[Wearley, L.L.,Crit.Rev.in  Ther.Drug
Carrier Systems 8:333(1991)]。
加圧定量吸入器および乾燥粉末吸入器のようなエアゾール伝達装置は、Newman,S.P.,(Aerosols  and the  Lung,Clarke,S.W.and  Davia,D.editors,pp.197-22)に開示されており、本発明に関連して使用し得る。
本発明に従うワクチン組成物は、任意の通常の方法により、例えば、経口、静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内または皮下注射により；経口、経皮、舌下、鼻腔内、肛門または腟伝達により、免疫化すべき対象者に投与し得る。治療は、所定期間に亘っての単回投与または複数回投与からなる。
本発明を、図面および以下の実施例により、さらに具体的に説明する。
(実施例）
実施例１〜７
【００３４】
［実施例１］
本発明に従う安定な免疫原性生成物の製造方法
A. 材料
2008542227.tif 000002
【００３５】
2008542227.tif 000003
【００３６】
B. 方法の説明
本実施例において開示する方法は、TNFαとKLHとの抗原性ヘテロ複合体を含む安定な免疫原性生成物を製造する本発明に従う方法の実施態様を例示する。
さらに、以下で詳述する方法は、上記安定な免疫原性生成物の120mgバッチを製造するために設計されている。
工程a)
30.05mLのTNFα (4.2mg/mlの)を取出し、4℃で一夜解凍せしめる(注記：126.21mgのTNFα必要)。
工程b) (または、該方法のある種の実施態様における工程b1)
90.15mlの“希釈用緩衝液”を添加して“処理用緩衝”溶液および1mg/mL (±10%)のTNFαを得る：
希釈用緩衝液＝130mM リン酸水素二ナトリウム、133mM NaCl、6.6mM EDTA、pH 7.8。
処理用緩衝液＝100mM リン酸水素二ナトリウム、150mM NaCl、5mM EDTA、pH 7.8。
工程b2)
1mg/mL (±10%)のTNFαの残りの120mLに、1.2mLのDMSOを添加する。混合物をRTで30分間保持する。10分毎の撹拌により混合し、発泡を回避するように努める。
61，34mLの“処理用緩衝液”を混合物に添加する。容器を反転させることによって緩やかに混合して、発泡を回避するように努める。
工程c)
51.6mgのKLHを添加する。注記：KLHの9.81mg/mL溶液において、5.26mLを添加する。容器を反転させることによって穏やかに混合する。この時点での総容量は、187.8mLである。
【００３７】
工程d)
グルタルアルデヒドの25%原液を、“処理用緩衝液”を使用して2.5%に希釈する。この希釈は、使用直前に行う。
20.86mLの希釈2.5%グルタルアルデヒド溶液を添加する。この時点での総容量は208.56mLであることに留意されたい。容器を反転させることによって緩やかに混合する。
ボトルを閉じて、RTで45分間インキュベートする。ボトルを15分毎に亘って緩やかに回転する。
工程e)
溶液を、処理用緩衝液に対してタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を使用して、ダイアフィルトレーションする。
pH7.6、10mM、150mM NaClの20容量のリン酸緩衝液に対しての3回の透析。
容量 1 = 2時間
容量 2 = 2時間
容量 3 = １夜
工程f)
ホルムアルデヒドの原溶液(37％)を“処理緩衝液”で１０倍希釈して、3.7%溶液を得る。この希釈は、使用直前に行う。
希釈3.7%ホルムアルデヒドを上記TNFα-KLH溶液に添加して最終濃度0.2%を得る。例えば、回収した容量が200mLである場合、添加すべき3.7%ホルムアルデヒドの量は、11.43mLである。
ボトルを密閉し、37℃で6日間インキュベートする。ボトルを1日に1回横転させる。
工程g)
6日後、2Mのグリシン(WFI中で調製)を0.1Mの最終濃度で添加する。RTで1時間インキュベートし、その間、ボトルを穏やかに横転させる。
工程h
ダイアフィルトレーションに使用するDPBS (Sigma社)のpHを確認し、必要に応じて、0.1M  NaOHを使用して、7.3±0.2の最終pHに調整する。pH調整の必要性では、通常は予想されない。
溶液を、DPBSに対するタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を使用してダイアフィルトレーションする。
2×5kDa MWCO TFF膜を使用する。
実験室規模TFF装置上の500mL(アクリル)貯蔵容器を使用する。
物質を、膜から、濃縮物(限外濾過残留物)を事前計量ポリプロピレンボトルに流し込むことによって回収する。
【００３８】
［実施例２］
本発明に従う方法によって得られた安定な免疫原性生成物の試験手順
実施例２において開示する試験手順は、当業者であれば参照し得る。しかしながら、当業者であれば、本明細書の各実施例において開示している試験手順のいずれか１つに従って試験手順を実施することも可能である。
2.1. 比色分析による総タンパク質含有量測定：ブラッドフォード試験の例
タンパク質含有量を、ブラッドフォード(Bradford)法を使用して測定する(Bradford, M. Anal. Biochem.1976.72, 248-254)。
要するに、較正曲線を、ウシ血清アルブミン(BSA)より、PBS中0.2mg/mL BSA溶液の0、10、20、30、40μLを1連の試験管にピペットで入れることによって確立する。その後、各試験管の容量を、相応する容量のDI水を添加することによって500μLにする。その後、各試験管に、500μLのブラッドフォード試薬を添加する。２つのブランクを200μLのPBSにより調製する。室温で5分間の反応後、各試験管の内容物を渦流処理し、595nmで読取る。
試験タンパク質溶液の適切な希釈液の200μLを上述したようなブラッドフォード試薬と反応させる。
KLH-TNFα中のTNFαタンパク質含有量：ELISA
4本のバイアルから採ったKLH-TNFαの4サンプルを、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) pH 7.2中で5μg/mLに希釈する。これらの希釈物を使用して、マイクロタイタープレート(Costar 3590)をウェル当り100μLでコーティーングする。4℃で１夜コーティーングせしめた後、各プレートを0.1%Tween 20含有PBSで洗浄し、各ウェルに100μLのPBS-Tween中2%ウシ胎仔血清(FCS)溶液を37℃にて2時間で満たす。各プレートをPBS-Tweenで洗浄後、抗-TNFα血清の連続希釈物 100μLを各ウェルにピペットで入れ、各プレートを37℃で2時間インキュベートし、その後、各プレートを十分に洗浄し、各ウェルに100μLのHRPラベル化抗-IgG抗血清を添加した後に、再度37℃で2時間インキュベートする。
インキュベーション後、各プレートを洗浄し、100μLのオルソ-フェニレンジアミン(OPD)溶液を各ウェルに添加する。3分後、100μLの2N 硫酸を各ウェルに添加し、各プレートを、マルチスキャン光度計内で490nmにて読取る。
【００３９】
2.2. KLH-TNFα免疫原の純度等級：IEF + ウェスタンブロット
上記免疫原の純度等級を、等電点電気泳動法(IEF)により、KLH-TNFα免疫原をKLH単独およびTNFα単独とは離れて1%アガロースプレート上で3から10のpH勾配にて泳動させることによって評価する。各サンプルの250μg/mLの適切な希釈物を適用したのち、泳動を、下記の条件下に、Phastシステム装置(Amersham  Pharmacia社)を使用して実施する：
第１段階(予備泳動)：500V、2.5mA、2.5W、15°C、5aVh
第２段階(適用)：200V、2.5mA、2.5W、15°C、5aVh
第３段階(泳動)：1500V、2.5mA、2.5W、15°C、450aVh
泳動後、各タンパク質を微細毛管によりPVDE膜に移し、各タンパク質をウェスタンブロットにより明確にする。
ウェスタンブロット検出
ニトロセルロース膜を、5%ミルク-TBS Tween 20中に室温で１夜浸漬することによって飽和させ。その後、膜を、10%ミルク-TBS Tween 20中に希釈した一次ポリクローナル抗-TNFα(hu)または抗-KLH抗体のいずれかと一緒に室温で1時間インキュベートする。その後、膜を、TBS-Tween 20で5分間に4回洗浄し、次いで、10%ミルク-TBS Tween 20で希釈した二次HRPラベル化抗体と一緒に室温で1時間インキュベートする。再び、膜をTBS Tween 20で4回洗浄し、各スポットを、ECL Plus Kit(Amersham  Pharmacia社)を使用する化学発光により明確にする。
【００４０】
3. 上記安定な免疫原性生成物中のTNFα-KLH共有結合の割合
3.1. 方法１：変性および還元条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー
試験キノイド溶液を、非共有結合の解離をもたらす変性(尿素8M最終濃度)および還元(ベータ-メルカプトエタノール5％最終濃度)条件に供する。得られた溶液を、KLHおよび共有KLH-TNFα構築物の分子量よりもはるかに低い600kDa画分限界のために選定したSuperdex 200TM(Pharmacia社)を充填したサイズ排除カラムにより溶出させる。KLHに共有結合しているサイトカイン分子のみが排除容量中に存在する。後者を、KLHとの交差免疫反応を有さない抗-TNFαAb類によるサンドイッチELISA法を使用して、TNFα(特異性TNFα抗原)についてアッセイする。結果を、同じELISA法により測定する出発溶液中のTNFα力価のパーセントとして表す。このパーセントは、TNFαキノイド中の％TNFα-KLH共有結合に等しい。
3.2. 方法２：tween洗浄による二重サンドイッチELISA
PBS (10 mM、pH 7.3、NaCl 150 mM)中の抗-KLHポリクローナルAbの1mg/mLの溶液を使用して、マイクロタイタープレート(Coaster、高結合性)をウェル当り100μLで37℃にて2時間コーティーングする。PBST (Tween 20を0.1%(容量/容量)で含むPBS)による3回の洗浄サイクル後に、各ウェルを、2% FCSを含有するPBSにより1時間30分で満たす。各ウェルを、再び、PBSTにより3回洗浄する。
その後、試験キノイドの２つの同一希釈物群(10、5、0.156μg/mL)を各ウェルに添加し、2時間インキュベートする。各ウェルをPBSTで3回洗浄し、その解離作用(Tween 20による)により、KLHに非共有結合している全ての分子が排除され、KLHは、支持体コーティーング捕捉Abに固定されている。第１群の試験希釈物を抗-KLH Abと一緒にインキュベートし、一方、第２群を抗-TNFαAbと一緒にインキュベートする。37℃で1時間30分インキュベートした後、各ウェルを上記のようにして洗浄し、次いで、特定のペルオキシダーゼ結合二次Abと一緒にインキュベートする。
OPD、即ち、ペルオキシダーゼ基質の添加により、第１群における固定抗-TNFαAbおよび第２群における固定抗-KLH Abの定量比色分析検出が可能になる。２つの群の固定Abの比がキノイド中のKLHに共有結合しているTNFαのパーセントを与える。
【００４１】
4. KLH-TNFαキノイドの免疫学的活性の抗原性試験：ELISA
この試験は、免疫原(抗原誘導体また担体タンパク質に結合している抗原のいずれか)の、生来の抗原と対比しての特異性抗体と結合する能力を判定することを意図する。この試験は、本質的に、逆ELISAからなる。
試験中の免疫原の１連の増分希釈剤物を、ポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェル中に分配する。試験すべきタンパク質に対して特異性のポリクローナル抗体を、ウェル内に固定した免疫原と反応させる。プレートを洗浄することによって過剰の未反応抗体を除去した後、ウェル内の免疫原によって固定されたAbを、該第１抗体に特異性のHRPラベル化Abと反応させることによって定量的に明確にする；適切な基質を添加することによって発色する黄色は、固定タンパク質の量に直接比例する。各ウェルの光学密度(OD)を吸光度マイクロプレートリーダーによって測定する。試験サンプルのタンパク質含有量を較正曲線から判定する。
5. キノイド類の免疫原性
免疫原性調製物の免疫原性は、下記の通りである：
１．特異性抗-TNFαポリクローナルAbの形成を誘発するその能力レベル(生体内で測定したとき)；および、
２．その中和能。後者は、免疫化マウスからサンプルリングした抗血清のTNFαの特異的生物学的活性を抑制する能力を定量することによって生体外で測定する。
１．そのためには、5匹の別々のケ−ジに囲い、飼料を含むペレット中標準給餌と水を自由に与えた20匹の7週齢のBalb/cマウス(18〜20g体重)を、ISA 51中の試験免疫原(ISA 51中の1：1(容量/容量))エマルジョン)の0.1mL (10μg)の筋肉内投与により、0日、7日目、14日目および21日に免疫化する。免疫原の5μgのブースター注射は、60日目にISA 51中の1：1エマルジョンの0.1mlとして投与する。血液サンプルを、眼窩後方穿刺により免疫化開始2日前に、さらに再び最後の注入後の12日目に、ELISAによる抗体レベルの測定のために採血する。3匹の対照マウスは、IFA中のPBSの1：1(容量/容量)エマルジョンを受ける。
血清Ab力価は、OD > 0.3を与える希釈の逆数として表す。
【００４２】
6. 免疫原性(生体外)
PPD/TT抗原により賦活し、種々のキノイド投与量により処理したT細胞の増殖試験(3H-チミジンの取込みによる)。
PBMSを、Ficoll勾配遠心分離による血液分離によって、健常ドナーから新たに分離する。細胞を、丸底96ウェルプレート中に、10%のFCSを含むRPMIc培地中の15,000個細胞/ウェルで導入する。キノイドを濃度 1μg/mLで100ng/mLへ、次いで、PPDまたはTTを0.16%で添加する。各プレートを、37℃、5% CO2で6日間インキュベートせしめる。トリチウム化チミジンを、インキュベーション終了前18時間で、0.5μCi/ウェルで添加する。細胞増殖を、βシンチレーションカウンターによる分析する。
【００４３】
7. KLH-TNFαキノイドの生物学的特性決定
TNFαバイオアッセイ：アクチノマイシンDの存在下でのマウスL929細胞の細胞溶解
材料：
‐PBS中のL929マウス線維芽細胞系(ATCC Cat. No. CCL-1) KLH-TNFα (マウスまたはヒト)キノイド(標準)、NEOVACS社。
‐組換えマウスTNFα Peprotech (315-01A)またはヒトTNFα Peprotech (300-01A)培養培地(10% FCS (ウシ胎仔血清)、2mM グルタミン、100U/ml ペニシリン(ストレプトマイシン)添加RPMI)。
‐アッセイ培地(2% FCS、2mM グルタミン、100U/ml ペニシリン(ストレプトマイシン)添加RPMI)。
‐予備インキュベーション培地：2mM グルタミン、100U/ml ペニシリン(ストレプトマイシン)添加HL1。
‐96ウェル平底培養プレート(Costar社、3595)。
‐アクチノマイシンD、4℃で保存した1000μg/mL (光からの保護)。
‐マイナス20℃に保ったPBSストックアリコート中のMTT溶液(Sigma社、M5655) 5mg/mLストック(光からの保護)。
‐DMSO (SIGMA社、471267)。
試験時間：
24時間インキュベーション
1時間アッセイ準備
方法：
１．１連の２倍希釈物中のKLH-TNFαマウスまたはヒトキノイドおよび標準を、96ウェルプレート内の列２から11までの50μL/ウェルのアッセイ培地中に希釈し、適切な希釈で開始する。列１はブランクとして残す。
２．7.5 105/mLの密度のL929細胞懸濁液を、1μg/mLのアクチノマイシンDを添加した(光から保護した)アッセイ培地中で調製する。50μL/ウェルの細胞懸濁液を、同じプレートに列1から12まで添加する。
３．プレートを、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO2で24時間インキュベートする。
４．Ca2+、Mg2+を含まないPBSで2回洗浄する。
５．50μL/ウェルのアッセイ培地中40%のMTT溶液を添加し、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO2で4時間インキュベートする。
６．プレートを空にし、各ウェルに50μLのDMSOを添加する。
７．プレートを550〜630nmで読取る。
８．データを分析する。
【００４４】
［実施例３］
KLH-TNFα(ヒト)キノイドの各種調製物の比較試験
特異性担体タンパク質KLHに複合体化させたヒトTNFαからなるヒトTNFαキノイドの各種調製を実施した。
さらに正確には、KLH-TNFα(ヒト)の各種調製物を、実施例１に開示した同じ一般的方法によるが、(i) DMSOの割合、(ii) グルタルアルデヒド濃度( 2.5または22.5mM)並びに(iii) 中間生成物のホルムアルデヒドとのインキュベーション時間(0.2〜6日のインキュベーション時間)の変更でもって製造した。
その後、ヒトTNFαの生物学的活性の喪失についてアッセイした。また、最終キノイド生成物中の立体配座Bエピトープの保持を、(i) L929細胞系に対するヒトTNFαの細胞毒性アッセイによりさらにまた、(ii) 本実施例において開示する免疫原性アッセイにより試験した。
A. 材料および方法
A.1. KLH-TNFα(ヒト)キノイド中のTNFα生物学的活性の不存在についてのアッセイ
ヒトTNFαは、Dアクチノマイシンの存在下では、マウスのL929細胞系の線維芽細胞に対して細胞毒活性を有し、この細胞毒活性を、MTT (3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロマイド)を使用する細胞生存率試験によって評価する。このアッセイは、生存細胞のミトコンドリアNADPHレダクターゼによる紫青色を有する還元生成物ホルマザンへのMTT還元に基づく。
このアッセイにおいては、細胞の代謝活性により、その生存率の評価を可能にする。
KLH-TNFαキノイドの生物学的活性の評価は、L929細胞を、マイクロ培養プレートの平底ウェル中で、Dアクチノマイシン(1μg/ml)と一緒の徐々に減少する量(50ng/mLから0mg/mLへ)の上記キノイド生成物の存在下にインキュベートすることからなる。
その後、細胞培養を、5% CO2を含む湿潤雰囲気中で、37℃で24時間実施する。
24時間の培養時間の後、細胞培養物上清を廃棄し、MTTアッセイ溶液と置換える。
MTTとの37℃での4時間のインキュベーション後、MTT溶液を除去し、DMSOを添加する。
均質化後、細胞培養上清の光学密度を、570nmの波長で分光光度計により分析する。
結果は、570nmでの光学密度(O.D.)として表す。並行して、0〜10ng/mlのTNFα範囲でインキュベートする細胞培養を、対照として実施する。
最終結果は、培養L929細胞の50%の溶解を誘発する投与量であるLD50とも称する致死投与量50として表す。
【００４５】
A.2. グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドによる化学処理後の、最終KLH-TNFα(ヒト)キノイド中のヒトTNFαの立体配座Bエピトープの保持についてのアッセイ：免疫原性アッセイ
上記化学処理後の、最終KLH-TNFα(ヒト)キノイド中のヒトTNFαの立体配座Bエピトープの保持についての試験は、体重18〜20gのC57Bl/6における免疫原性活性の試験により行う。
0日目において、3匹のマウス群に、筋肉内経路により、完全フロイントアジュバント(CFA)中エマルジョンの0.2ml (50μg)を注入する。
不完全フロイントアジュバント中のキノイド生成物の25μgの２回目の注入物を、21日目に投与する。眼窩後方からの採血を、マウス毎に、１回目の注入前、さらにまた、28日目に行う。各マウス群からの血清を集める。
体液応答を、免疫化マウスの血清中のヒトTNFαに対して特異性のIgGイソタイプ抗体を検出することによって測定する。体液応答は、ELISAアッセイによって測定し、抗体力価(0.3よりも高い光学密度を示す希釈度-1)で表す。
KLH-TNFα(ヒト)キノイドで免疫化したマウスからの血清の中和能は、以下で説明するようなL929細胞に対するTNFα細胞毒アッセイにより測定する。
L929細胞を、2日目および28日目にサンプリングしている血清プールからの各種希釈物(1/100〜1/12800の希釈物)で処理し、次いで、室温で40分間、さらにその後、20ng/mlのヒトTNFαと一緒に4℃で20分間インキュベートする。
細胞培養を、湿潤雰囲気、5% CO2中で、37℃にて24時間続ける。
24時間の細胞培養時間後、細胞培養物上清を除去し、MTT溶液と置換える。
37℃で4時間のインキュベーション後、MTTを除去し、MDSOを添加する。
均質化後、細胞培養上清の光学密度を、570nmの波長で分光光度計により分析する。
結果は、細胞培養物上清の光学密度(O.D.)として表す。0〜10ng/mlのTNFα範囲でインキュベートする細胞培養を、対照として並行して実施する。
TNFαの細胞毒活性を中和する血清は、L929細胞に対するTNFαの細胞毒活性作用を阻止する。
結果は、ヒトTNFαの細胞毒活性の50%を中和する血清希釈度に相応する中和能50％、即ち、NC50として表す。
【００４６】
B：結果
下記の表３は、種々の化学処理に従って調製した最終KLH-TNFα(ヒト)キノイドによって得られた結果を示している。
表３
2008542227.tif 000004
上記表３に示すように、最良の結果は、(i) 1%濃度のDMSOによるおよび(ii) 22.5mMの濃度のグルタルアルデヒドによる化学処理、その後の、(iii) 6日間のホルムアルデヒドによる化学処理を含むKLH-TNFα(ヒト)キノイドの製造方法によって得られている。得られた最終KLH-TNFα(ヒト)生成物は、ヒトTNFαの細胞毒活性を欠いており、生来のヒトTNFαの生物学的活性を中和するポリクローナル抗体の産生を誘発させている。
即ち、上記表３のK7に開示した条件に従う製造方法は、立体配座Bエピトープを保持していることから、上記生成物に含まれたヒトTNFαサイトカインの不活化を可能にしている。
上記表３の“K7”と表した条件に従って製造したKLH-TNFα(ヒト)最終生成物は、前記実施例１に従って製造した生成物と同じである。
この最良のTNFαキノイド生成物は、以下の実施例において、とりわけ、自己系において生来のTNFαを中和するポリクローナル抗体を誘発させるその能力を試験する観点でのトランスジェニックマウスモデルにおいて試験する生成物である。
【００４７】
［実施例４］
マウスにおけるKLH-TNFα(ヒト)キノイドの急性毒試験
本試験の目的は、がん性悪液質および/または種々の自己免疫疾患(例えば、関節リウマチ、クローン病および乾癬)の治療において使用する幅広い治療用ワクチンとして使用するための、本発明に従うKLH-TNFα(ヒト)キノイドを含むワクチン組成物の特徴的性質を明確にすることであった。
とりわけ、寛容性および危険性のないことに関しての上記ワクチン特性を試験した。
従って、最初の毒性試験は、SWISSマウスにおいて実施した。
A. 材料および方法
46匹の雌SWISSマウスを、(i)4匹の処置されない動物の１群、および(ii)それぞれ、下記を受ける14匹の３群に振り分けた：
a) 対照群(アジュバントビヒクル)：n = 14
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の、大腿部位の筋肉内経路注入(IM)；
対照群は、製剤におけるアジュバント使用の局部および全身反応性を評価するのに使用する。
b) 処置群(第１投与量：単回治療ヒト投与量、STHDの2.000倍)：Ｎ＋14
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中50μg/マウスでのKLH-TNFα(ヒト)キノイドの、大腿部位の筋肉内経路注入(IM)；
c) 処置群(第２投与量：単回治療ヒト投与量、STHDの4000倍)：n = 14
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中100μg/マウスの投与量でのKLH-TNFα(ヒト)キノイドの、大腿部位の筋肉内経路注入(IM)；
d) 本試験に含ませた処置しない、生来のマウス群 (n = 4)
投与量のコンピュータ計算はヒト使用における単回投与量に関係しており、この投与量は、80μg/注射/個々人である：1 SHTD (単回治療ヒト投与量)、即ち、1.15μg/kg。
KLH-TNFα(ヒト)キノイドの注入は、試験の5日目(D5)に実施した。
上記処置に対する動物応答を、下記のパラメーターに従って試験した：
a. 直後、短期間、および長期間(投与後10日間の観察期間)の死亡数。
b. 処置に対する局所または全身反応性。
c. KLH-TNFα(ヒト)キノイド投与後10日目(D15)までの動物の一般状態および体重を示す曲線。
観察期間(D20)後の5日目に、生存動物を屠殺し、下記の対照を実施した：
d. 局所寛容性を評価するための、注入部位局所の筋肉の顕微鏡組織病理検査。
d. 上記免疫賦活物質投与に対する臓器応答の指数値としての、肺臓、心臓、肝臓および脾臓の質量検査。
【００４８】
B. 結果
マウスに極めて高投与量(各マウスにおいて単回治療ヒト投与量の約4000倍)で投与したとき、上記KLH-TNFα(ヒト)キノイドは、10日間の全観察期間において、また、試験群の各々において、下記によって例証されるように何らの有害作用ももたらしていない：
1) 直後または中期間の死亡は生じていない；
2) 注入部位での局所反応も、全身反応もない。
3) 試験群のいずれにおいても、マウスの成長曲線に対する影響もない。
さらに、試験終了時(D20)に屠殺した動物からの臓器の目視検査は、臓器の変化も脾臓および肝臓の容量増大もないことを示していた。
さらに、心臓、肺臓、肝臓および脾臓の質量は、全群の試験動物において同様な様態で変化していた。
【００４９】
［実施例５］
ヒトTNFについて試験したトランスジェニックマウスモデルにおけるKLH-TNFα(ヒト)キノイドの免疫原性試験
KLHの免疫原性活性と比較した場合の、KLH-TNFαキノイド調製物の免疫原性活性(体液性)を、5週齢のB6.SJL-Tg (TNF) N2マウス(10匹の群)において試験した。これらのマウスは、Taconic Company社(USA)から提供され、ヒトTNFα遺伝子に対してトランスジェニックであるマウス(半接合体)からなる。
A. 材料および方法
0日目および7日目に、マウス(10匹の群)は、ISA51中エマルジョンの0.2ml (30μg)の注入を筋肉内経路により受けた。ISA51中25μgの２回目の注入を、28日目に行った。その後、眼窩後方採血をマウス毎に35日目に行う。
B. 結果
１．体液応答
体液応答は、ヒトTNFαに対して特異性のIgGタイプ抗体の免疫化マウスの血清中の存在によって測定する；体液応答は、ELISAアッセイによって測定し、抗体力価(0.3よりも高い光学密度を示す希釈度-1)として表す。図２は、得られた抗体力価を示している。
実施例１に従って得られたKLH-TNFα(ヒト)最終生成物により免疫化したマウスからの血清は、高レベルのIgGタイプ抗体力価を有しているのに対し、KLHで免疫化したマウスからの血清は、これらの抗体を欠如している。
これらの抗体の中和活性を、L929細胞に対するTNFα細胞毒アッセイによって測定した。結果は、図３に示している。
KLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物によって誘発された抗体は、高レベルの中和活性を有する。
【００５０】
［実施例６］
マカク属のサルにおけるKLH-TNFα(ヒト)キノイドの免疫原性試験
KLH単独の免疫原性活性と比較した場合の、KLH-TNFα(ヒト)キノイドの免疫原性活性を、MDS pharma社(フランス国リヨン)から提供されたマカク属のサルにおいて試験した。マカク属のサルが自然産生するTNFαは、ヒトTNFαと98.1%のアミノ酸相同性を共有することに留意すべきである。
A. 材料および方法
0日目、21日目および49日目に、アカゲサルは、(i) 80μgまたは20μgいずれかのKLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物または(ii) KLH単独を含有するISA51中の上記キノイドのエマルジョン0.5mlの注入を筋肉内経路によって受けた。採血を、動物毎に、28日目、56日目および68日目に行った。
B. 結果
1. 体液応答
体液応答は、免疫化アカゲサルの血清中のヒトTNFαに対して特異性のIgGイソタイプ抗体の存在を検出することによって測定した。体液応答は、ELISAアッセイによって測定し、抗体力価(0.3よりも高い光学密度を示す希釈度-1)として表す。得られた抗体力価の結果は、図４に報告している。
上記KLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物により免疫化したマカク属のサルからの血清は、抗-TNFαIgGイソタイプ抗体力価を有するのに対し、KLH単独で免疫化したマカク属のサルからの血清は、これらの抗体を欠如している。
抗-TNFα抗体力価は、80μgのKLH-TNFα(ヒト)キノイドを受けたマカク属のサルの血清においては一層重要である。
上記抗体の中和活性を、L929細胞に対するTNFα細胞毒アッセイによって測定した。これらのアッセイ結果は、図５に示している。
KLH-TNFα(ヒト)によって誘発された抗体は、極めて高い中和活性を有している。
【００５１】
［実施例７］
huTNFαトランスジェニックマウス中のTNFαに対する活性免疫化の治療有効性の評価
活性成分としてKLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物を使用するTNFαに対する活性免疫化方法の治療有効性の評価を、Taconic Company社(USA)から提供された5週齢のトランスジェニックマウスhuTNFαB6.SJL-Tg (TNF) N2において試験した。これらのTNFαトランスジェニックマウスは、4〜5週齢で自己多発性関節炎を発症している。
A. 材料および方法
1. 免疫化
マウスは、ISA51中エマルジョンの0.2mlの筋肉内経路による１回注入を、0日目、7日目および28日目に受けた。10匹のマウス４群を以下に述べるようにして処置した：
群A：PBS：200μlのPBS
群B：KLH：200μlのKLH
群C：KLH-TNF：200μlのKLH-TNF
群D：KLH-TNF＋MTX：200μlのKLH-TNFおよび１回目の免疫化から開始し屠殺までの週3回のメトトレキサート(1mg/kg) (注入当り200μlの腹腔内注入。
マウスは、(i) 0日目および7日目：30μgのKLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物、および(ii) 28日目：15μgの同じ調製物を受けた。
眼窩後方採血を、マウス毎に35日目に行った。また、マウスを屠殺した時点の57日目にも、採血を行った。
【００５２】
2. 関節炎の臨床検診および定量評価
臨床検診は、試験開始時点、その後、週２回行った。
評価は、適用した治療の知識を有していない観察者が実施した。各関節部(指、足根、足首、手首)の関節炎の臨床的重篤度を、0 = 正常；1 = 紅斑；2 = 腫れ；3 = 変形；4 = 大きな変形または壊死の0から4で変動する点数の帰属によって評価した。これらの点数を合計して、動物毎に毎日の関節炎スコアを得た。各群における平均値を、治療日毎に算出した。
3. 関節炎の組織学検査および定量評価
動物全てを、試験開始後57日目に屠殺した。後足を切除し、ホルモル中で固定し、脱灰し、次いで脱水し、その後、パラフィンブロック内に含ませた。その後、5μm厚の組織スライスを、マイクロトームにより作成した。少なくとも４枚の連続切片を各後足から作成して、関節疾患の正確な空間的評価を確保するようにした。その後、各スライド調製物をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色し、光学顕微鏡で観察した。病変を、三点法尺度(0 = 正常；3 = 重篤)に従い、各切片について定量的に評価した。この組織学スコアは、２つのパラメーター、即ち、一方の軟骨および骨の破壊(軟骨および骨の厚さ、不規則性、および侵食の存在)並びに他方の炎症(滑膜拡散、細胞炎症性浸潤)に分類し得る。
4. 統計処理
結果値を、平均および平均からの標準偏差(SDM)として示す。スチューデントt検定および分散分析(ANOVA)を行った。
【００５３】
B. 結果
1. 体液応答
体液応答は、免疫化アカゲサルの血清中のヒトTNFαに対して特異性のIgGイソタイプ抗体の存在を検出することによって測定する。体液応答は、ELISAアッセイによって測定し、結果を、抗体力価(0.3よりも高い光学密度を示す希釈度-1)として表す。
得られた抗体力価の結果は、図６に報告している。
2. 関節炎の臨床検診および定量評価(経時的臨床スコアの進展)
経時的臨床スコアの進展を図７に報告している。(i) KLH-TNF (ヒト)キノイドによるまたは(ii) MTXと併用したKLH-TNF (ヒト)キノイドによるマカク属のサルの処置は、臨床検診によって評価された関節炎スコアの大きな統計的に有意な低下を誘発している。比較として、KLHによりまたはPBS緩衝液により処置した対照動物において判定した関節炎スコアよりもはるかに低かった。
疾病発現および重篤性発症パラメーターの評価
疾患発症および疾患重篤度の評価は、下記の表４に報告している。
‐疾病発現日は、動物毎に、臨床検診によって判定した。疾患を決して発症しなかった動物は、計上していない。
‐スコア“A MAX”は、試験中に各動物の至った最高スコアに相当する。スコア“A MAX”は、疾患重篤度のパラメーターを示す。
‐発症率は、試験終了前に関節炎を発症した動物数を意味し、各群の動物総数を考慮している。
表４
2008542227.tif 000005
結果は、KLH-TNFαおよびKLH-TNFα＋MTXによる処置が、統計的に有意な様態で下記を誘発していることを示している：
‐KLH単独またはPBSによって処置した対照動物と比較しての、関節炎発現の遅延；
‐関節炎重篤度の軽減；および、
‐疾病動物数の減少。
【００５４】
3. 関節炎の組織学検査および定量評価
結果は、下記の表５に報告している。
表５
2008542227.tif 000006
KLH-TNFおよびKLH-TNF + MTXによる処置は、統計的に有意な様態で、組織変性(破壊および関節炎炎症パラメーター)の軽減を誘発している。
C. 結論
huTNFαトランスジェニックマウスの実施例１に従うKLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物によるワクチン接種は、臨床および組織学分析の結果により示されているように、動物を炎症および関節破壊から明らかに保護している。
KLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物により処置した動物群は、関節保護に関しては、MTXと併用したKLH-TNFα(ヒト)キノイド調製物により処置した動物群と区別できない；これらの結果は、KLH-TNFα(ヒト)キノイド単独での大きな効果が、これらの試験条件においては、MTXの実際の有益な効果を隠蔽しているという事実によって説明し得る。
KLHにより処置した動物群は、PBS緩衝液により処置した動物群と区別できない。
本発明に従う安定な免疫原性生成物の生物学的性質に関する更なる結果を、下記の実施例８〜１２において開示する。
【００５５】
［実施例８〜１２］
A. 実施例８〜１２の材料および方法
A.1. 試薬
KLHは、Intracel社(カリフォルニア州サンジエゴ)から；hTNFαは、Boehringer Ingelheim社(ドイツ国マンハイム)から；マウスTNFαは、Cytolab社(イスラエル国レホボト)から；hTNFαレセプターRIおよびRII、hTNFα、マウスIL2およびマウスIFNγELISAキットは、R&D system社(フランス国リール)から；ISA51アジュバントは、Seppic社(フランス国パリ)から購入した。
A.2. 動物
4〜5週齢の雌および雄異型接合hTNFトランスジェニックマウス(1006-T)は、Taconic社から；6〜8週齢雌C57Bl/6およびBalb/cマウスは、Charles River社(フランス国L'Arbresles)から購入した。マウスは、無病原体条件に維持された。ウサギは、Charles Rivers
breeding社(フランス国L'Arbresles)およびMDSPharma社のMacaca mulata(フランス国St-Germain-sur-L'Arbresles)において保育された。
A.3.免疫原の調製
hTNFα-KLH免疫原は、実施例１に開示した方法を実施することによって調製した。
A.4.SDS/PAGE、銀染色およびイムノブロッティング
非還元条件下でのSDS-PAGE分析は、Laemmli(Laemmli,U.K.(1970),Nature 227:680-85)に従って実施した。12% SDS-PAGE上で、各タンパク質を、銀染色、オートラジオグラフィー(Le Roy F.,Bisbal  C.,Silhol  M.,Martinand C.,Lebleu  B.&Salehzada  T.(2001).The  Journal of  Biological  Chemistry,276:48473-482.)、または適切な抗体を使用するイムノブロッティング分析よって明確にした。
A.5. ゲル濾過クロマトグラフィー
上記ヘテロ複合体を、DPBSで前以って平衡させたSuperose 6 10/300 GLゲル濾過カラム (Amersham  bioscience社、フランス国オルセー)上に乗せ、平衡化に使用したのと同じ緩衝液により、0.2ml/分で溶出させた。
【００５６】
A.6. 細胞培養
マウスL929細胞系(ATCC、CCL 1)を、10%のFCSを含有するRPMI-1640培地中で培養した。精製マウス脾細胞を、5%のFCSおよび50μMの2-β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地中に再懸濁させ、KLH (30μg/ml)、hTNFα(3μg/ml)およびマウスTNFα(1μg/ml)抗原を含むまたは含まない培養培地中でインキュベートした。
A.7. T細胞増殖アッセイ
抗原活性化脾細胞を4日間培養し、次いで、3H-チミジンと一緒に18時間脈動させた。細胞を、18時間後、フィルターマット上で収穫し、DNA中へのチミジン取込みを、ベータカウンターを使用して定量した。賦活指数は、次のように表す：[(賦活細胞からのcpmの平均)−未賦活細胞からのcpmの平均]/(未賦活細胞からのcpmの平均)。>2より大きいSI値を陽性とみなした。
A.8. TNFαおよびレセプターアッセイ
A.8.1. 直接レセプター結合アッセイ
ターゲットレセプターへの上記ヘテロ複合体およびhTNFα結合性を、hTNFαRIまたはRIIの50ng/ウェルで予めコーティーングしたプレートを使用して測定した。各サンプルの連続希釈物をそのレセプターと一緒にインキュベートし、結合hTNFαを、ビオチン化ヤギポリクローナル抗-hTNFαAb (R&D  Systems社)を使用して検出した。血清またはIgGがhTNFαのそのレセプターへの結合を抑制する能力を評価するために、hTNFαを、hTNFαRIを固定したプレートに移す前に、試験血清またはIgGの連続希釈物で先ず予備処理した。遮断力価は、hTNFα結合の50%を中和する血清希釈度の逆数として表した。
A.8.2. 抗-hTNFαAb力価アッセイ
免疫化および対照マウスの血清中の特異性抗-hTNFαAb力価を、直接ELISAにより測定した。50ng/ウェルのhTNFαによる事前コーティーングELISAプレートを、免疫化および対照マウスからの血清連続希釈物と一緒にインキュベートした。特異的IgGを、ペルオキシダーゼウサギ抗-マウスIgG (Zymed社、カリフォルニア州)を使用して検出した。終点力価を、0.3のO.D.を示す最高サンプル希釈度の逆数として表した。
A.8.3. cytokine定量
hTNFα、マウスIL2およびマウスIFNγを、血清および培養物上清中でELISAにより測定した。
【００５７】
A.9. hTNFαバイオアッセイ
hTNFα活性を、L929細胞毒アッセイ(Bloquel、2004年)を使用して評価した。hTNFαおよびヘテロ複合体の連続希釈物を、アクチノマイシンD (1μg/ml)の存在下に、L929細胞と一緒に18時間インキュベートし、生存細胞数を、MTTアッセイにより測定した。超免疫血清またはIgGがhTNFα活性を中和する能力を、血清およびIgGをhTNFαと一緒にインキュベートした後に、同様にして測定した。中和力価は、hTNFα活性の50%を中和する血清希釈度の逆数として表す。
A.10. 免疫化
動物をISA51増強キノイド(Seppic社)または対照調製物(5〜30μg)の3回または4回のi.m.注入により免疫化した。血清は、3回目または4回目の免疫化後8〜12日目および屠殺時に集めた。
A.11. 抗体精製
イムノグロブリン(IgG)および特異性抗-hTNFαまたは抗-KLH抗体を、プロテインG IgG精製キット(Pierce社)、またはhTNFまたはKLH結合Sepharose 4Bカラム(Sigma Chemical社、ミズーリ州セントルイス)上でのアフィニティクロマトグラフィーを使用して、免疫化または対照マウス血清から精製した。
結合力は、BIAcore 3000 技法を使用して測定した(Lofas,S.,Johnsson B.(1990)J.Chem.Soc.Chem.Commun.21:1526；Karlsson,R.,Falt A.,  (1997)J.Immunol.Methods 200:121)。
A.12. 致死性ショック
対照およびhTNFαキノイド免疫化マウス(C57Bl/6またはTTg)を、最後の免疫化注入後の10日目に、PBS中20mgのＤ-ガラクトサミンの存在下にｈTNFαによってIP攻撃した。80〜90%致死開始投与量のhTNFαを投与した。動物生存率を注入後24時間で記録した(Lehmann V J Exp  Med 1997 657)。これらの試験においては、肝臓の肉眼分析を、TNFα投与後8時間で屠殺した下位群のマウスにおいて実施した。
【００５８】
A.13. 関節炎追跡調査
ヒトTNFαトランスジェニックマウス1006-Tは、第8週齢から、Tg197系統(strain)として自発関節炎を発症する(Keffer,J.,Probert,L.,Cazlaris,H.,Georgopoulos,S.,Kaslaris,E.,Kioussis,D.&Kollias,G.(1991)Embo  J 10,4025-31)。マウスを、4本の足の関節炎の証拠について、盲検手法を使用してモニターした。各四肢において、臨床重篤度を、0(正常)から3(変形を伴う重篤な炎症)で点数付けした(Williams,R.O.,Feldmann,M.&Maini,R.N.(1992)Proc  Natl Acad Sci U.S.A.89,9784-8；Thwin,M.M.,Douni,E.,Aidinis,V.,Kollias,G.,Kodama,K.,Sato,K.,Satish,R.L.,Mahendran,R.&Gopalakrishnakone,P.(2004)Arthritis  Res Ther 6,R282-94)。臨床観察日毎の平均関節炎スコアを、処置群毎に算出した。組織学分析においては、脚部を自由に切開し、別途開示されているようにして処理した(Bessis,N.,Guery,L.,Mantovani,A.,Vecchi,A.,Sims,J.E.,Fradelizi,D.&Boissier,M.C.(2000)Eur  J Immunol 30,867-75)。広範囲の切片を各々の足からカットし、少なくとも４枚を検査した。病変を、膝、足首および足の関節毎に、4点法尺度(0〜3、0は正常、3は重篤)を使用して前述したようにして、滑膜炎(滑膜拡散、炎症性細胞浸潤)または関節破壊(骨および軟骨の厚さおよび不規則性、および侵食の存在)のいずれかについて盲検評価した(Saidenberg-Kermanac'h,N.,Corrado,A.,Lemeiter,D.,deVernejoul,M.C.,Boissier,M.C.&Cohen-Solal,M.E.(2004)Bone  35,1200-7；Miellot,A.,Zhu,R.,Diem,S.,Boissier,M.C.,Herbelin,A.&Bessis,N.(2005)Eur  J Immunol 35,3704-13)。
A.14. 統計解析
全ての統計を、StatViewバーション5.0ソフトウェアを使用して実施した。ANOVAを使用して、臨床スコア、患部四肢の数、体重増、発症率のような反復測度を解析した。定量データの比較においては、ノンパラメトリックマン・ウィットニー検定を使用した。イエーツの補正によるカイ2乗法を使用して定性データを比較した。
【００５９】
B. 実施例８〜１２の結果
実施例８：安定な免疫原性生成物(hTNFαキノイド)の生物学的性質
A. 免疫生化学特性決定
ヒトTNFαキノイドは、SDS-PAGEにおいて、約250、105および40kDaの分子量(MW)を示す３つのバンドとして泳動していたKLH-hTNFαヘテロ複合体である(図８-a)。このキノイドのかなり大きな割合が泳動しておらず、積み重ねゲルのレベルで可視化されている。ｈTNFαとKLHの双方は、特異性抗体によって同定されていた(図８-a)。
泳動の同様なダイアグラムは、図８-bに示すようにKLHまたはhTNFαいずれかでの125Iラベル化キノイドによって得られた。４つのピークが、Superose 6ゲル濾過において分散していた。１つのピークは、排除容量内にあるが、３つの他のピークは、MW440、158および13.7kDaを有していた(図８-c)。
B. TNFα生物活性の不存在
上記キノイドは、標準L929試験により評価したとき、最高濃度においてさえも如何なるTNFα誘発性細胞毒性を欠如していた(図８-d)。
ヒトTNFαキノイドは、その生物活性の望ましい欠如にもかかわらず、hTNFαレセプターI (p55)およびレセプターII (p75)の双方に結合していた(図８-e)。
【００６０】
実施例９：ヒトTNFαに対してのトランスジェニックのマウス(TTgマウス)における抗-TNFα抗体の誘発
TTgマウスにおいて、TNFαキノイドによる免疫化は、高力価の抗-TNFαAbを誘発していたのに対し、不活化TNFαまたは対照KLHによる免疫化は、何ら検出可能な抗-TNFαAbを誘発し得てなかった。比較として、Balb/cマウスにおいては、キノイドまたは不活化TNFαによる免疫化の双方が抗-TNFαAbを誘発していた(図９-a)。TTgおよびBalbCマウスにおいては、キノイド以外のKLH免疫化も、抗-KLH Abの産生をもたらしていた(図示せず)。標準のL929細胞毒性試験により評価したとき、キノイド免疫化TTgマウスからの高希釈での超免疫血清は高希釈においてさえもTNFα生物活性を中和していたのに対し、KLH免疫化マウスからの血清の効果はなかった(図９-b)。活性は、ブースター処理後2〜4週間でピークであり、3ヶ月以内で著しく(>50%)傾斜しており(図９-c)、TNFαR1およびR2レセプターの結合を阻害していた(図９-d)。抗-hTNFαAbは、主として、IgG1 (52%)およびIgG2a (48%)に属していた。無視し得る量のIgG3、IgMおよびIgEが、イソタイピングELISAキットにより測定したとき存在していた。超免疫血清からの最終精製IgGは、Biacore技法により評価したとき、5×10-8 M〜10-10  M範囲のKDでもって、hTNFαに対する高親和性を示し、hTNFαのそのレセプターIおよびIIへの結合を阻害していた(図９-f)。これらの結果は、循環性hTNFαが、免疫化していないマウスにおける9pg/mlでの存在とは対照的な免疫化マウスの血清において検出されなかった理由を説明している。
【００６１】
実施例10：上記安定な免疫原性生成物(hTNFαキノイド)の安全性
高投与量のTNFαキノイド(100μgまでの)投与は、異なる系統のマウス(Balb/c、C57Bl/6、Swiss)、ウサギまたはサル(マカク属のサル)において局所および全身の臨床上の副作用を発生させなかった。また、D-ガラクトサミン処置C57Bl/6マウスに投与した生来のhTNFαが24時間以内の死亡(8匹のマウスの8匹)をもたらしたのに対し、hTNFαキノイドの作用はなかった。さらにまた、キノイド免疫化は、望ましくない抗-hTNFα細胞自己免疫応答並びに免疫化TTgマウスの長期成長および生存の障害のような有害作用も誘発してなかった。
キノイド免疫化TTgマウスからの脾細胞の生体外培養物は、T細胞増殖により、また、培養物上清中のサイトカイン(IL-2およびIFNγ)産生により試験したとき、hTNFα自体に対し何ら細胞介在免疫応答を誘発していなかった(図１０(A、B、C)-a)。これに反して、キノイド免疫化Balb/Cマウスは、対照の免疫化していない動物と比較して、異種hTNFαに対する注目すべき細胞介在免疫を示した(図示していない)。muTNFαに対する細胞応答は、対照と比較して免疫化マウスにおいて検出できなかった(図１０(A、B、C)-b)。最後に、免疫化TTgマウスにおいては、KLHを受けている対照動物の応答に等しいKLH抗原に対する匹敵する陽性T細胞応答が観察されが、検知し得る臨床的効果は有してなかった(図１０(A、B、C)-c)。
キノイド免疫化マウス(n=8)の成長は、体重により判定したとき、50日目までは対照の免疫化していない動物(n=7)の成長と匹敵していたが、後期段階では有意に良好になった(図１１-a)。マウスは、免疫化後120日目に、関節組織の比較組織学試験のために屠殺した。TTgマウスの他の群は、その関節炎の臨床的進行を観察するためにより長期で追跡した。これらの動物のうち、対照(n=3)は、その関節炎の重篤性故に、150日目で屠殺した。対照的に、3匹のhTNFαキノイド免疫化TTgマウスは、重篤な関節炎のないままであった(現在、210日を越えている)。
【００６２】
実施例１１：安定な免疫原性生成物(hTNFαキノイド)によるワクチン接種によって誘発された中和抗体によるTNFα-ガラクトサミン致死性ショックの予防
TNFαの腹腔内投与は、ガラクトサミンの存在下において、マウスの致死性ショックを誘発し得る。この作用は、投与量依存性である。表１に示しているように、C57Bl/6マウスにおいては、致死性ショックは11μgの投与量で起っており、TTgマウスにおいては、死亡は1μgほどの低い投与量で記録した。
11μgのhTNFαで処置したワクチン接種していない対照は、全て死亡したが、hTNFαキノイド免疫化C57Bl/6マウスの死亡はなかった(下記の表６)。免疫化動物が致死性ショックに耐えたのみならず、臨床的に健常なままであることは注目に値する。さらにまた、1ヶ月間隔の繰返しのhTNFα-ガラクトサミン投与も作用を有していなかった(データは示していない)。
重要なことに、キノイド免疫化TTgマウスもhTNFα依存性致死性ショックに耐えたのに対し、対照TTgマウスは死亡した(表６)。高めの投与量のhTNFα(2μg)の投与も、hTNFαキノイド免疫化TTgマウスに対して作用を有してなかった(表６)。これらの動物は、2週間後の繰返しのhTNFαショック後も生存しており、現在まで完全に健常なままである。
免疫化マウスにおいては、上記ショックに対する防御は、中和性抗-TNFαAbに基づいていた。TNFα(11μg)-D-ガラクトサミン投与後1時時間で非特異性IgG (1mg)を受けた対照C57Bl/6マウスは24時間以内に死亡したのに対し、超免疫血清からの特異性精製ポリクローナルIgGを投与したマウスは生存していた(対照群に対してP<0.001)。これらの試験において、対照および免疫化マウスのさらなる下位群をhTNFα投与後の8時間で屠殺し、肉眼組織分析を行ったところ、対照においては肝臓萎縮が見られたが免疫化マウスにおいては見られなかった(対照に対してP<0.02) (表７)。
【００６３】
実施例１２：安定な免疫原性生成物(hTNFαキノイド)によるワクチン接種はTTgマウスを関節炎発症から防御する
7週齢TTgマウスをKLH/TNFαキノイドでワクチン接種し、120日間モニターした。対照群は、KLH処置および食塩水処置マウスからなり、いずれも関節炎に冒されてなかった。全ての対照マウスが炎症および関節変形を伴う多発性関節炎を発症したのに対し(図１１)、キノイドワクチン接種マウスは、臨床兆候発症の遅延(P<0.05)、最高臨床指数の低スコア(P<0.01) (表８)、並びに極めて拡散性の低い疾患およびはるかに少ない患部四肢(P<0.0001) (図１１-b)でもって周辺部の関節疾患しか有していなかった(P<0.0001) (図４-c)。全ての動物は臨床上の関節炎を発症していたが、疾患は、TNFαキノイド免疫化群においてのみ逆転していた(図１１-d)；120日目では、1匹を除いた全ての動物が、対照群とは対照的に、処置群において保護されていた(表８) (P<0.001)。
組織学評価は、低組織学スコアを示した処置動物において炎症および関節破壊の明白な低減を示した(P<0.01) (表８)；これに反して、対照マウスは、軟骨および骨侵食に関連する拡散性滑膜炎並びに単核球および多形核白血球による細胞浸潤を伴う関節炎の有意な証拠を示した。組織学的滑膜炎または破壊の発生率は、TNFαキノイド処置マウスにおいては有意に低下していた(表８)。
【００６４】
表６：TNFα依存性致死性ショック
D-ガラクトサミン存在下のhTNFαを、最後のブースター処理後の10日目に、対照およびキノイド免疫化C57Bl/6およびTTgマウスに0.1ml PBS中のIPによって投与した。24時間後の動物生存によって評価したときの致死性ショックの防御は、免疫化マウスにおいてのみ観察された。*対照に対してP<0.01 (カイ-2)。
2008542227.tif 000007
【００６５】
表７：超免疫IgGによるTNFα依存性ショックの中和
各群のマウスは、対照およびキノイド免疫化C57Bl/6マウス由来のプロテインG精製マウスIgGのIV注入前30分に0.1ml PBS中のIPによるD-ガラクトサミンとhTNFαを受けた。
*対照に対してP<0.001 (カイ-2)。† P<0.02 (カイ-2)。
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【００６６】
表８：TNFαキノイド(KLH-TNF)ワクチン接種マウスおよび対照(KLH)マウスにおける120日目での関節炎の臨床および組織学スコア
組織学によって評価したときの炎症および破壊の発症率は、炎症/破壊のスコア = 0.5を有するマウスの数である。A max：最高関節炎臨床スコア。結果は、平均±SEMで示している。*KLHに対してP<0.05、†KLHに対してP<0.01 (マン・ウィットニー)、‡KLHに対してP<0.001 (カイ-2)
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明に従う安定な免疫原性生成物を製造するための一般的手順を例示する図式である。
【図２】(A) KLH単独または(B) 実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物によって免疫化したマウスにおける体液応答を示すグラフである。横座標：各個体、縦座標：IgG抗-TNFα抗体力価。
【図３】(A) KLH単独または(B) 実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物によって免疫化したマウスが産生した血清抗体の抗-TNFα中和活性を示すグラフである。各曲線は、１匹のマウスからの血液血清に相応する。横座標：TNFα活性の中和パーセント、縦座標：血清希釈。
【図４】(A) KLH単独、(B) 実施例１において開示したようにして製造した20μgの安定な免疫原性生成物、および(C) 実施例１において開示したようにして製造した80μgの安定な免疫原性生成物によって免疫化したマカク属のサルの体液応答を示すグラフである。横座標：最初の注入後の日数、縦座標：IgG抗-TNFα抗体力価。
【図５】(A) KLH単独、(B) 実施例１において開示したようにして製造した20μgの安定な免疫原性生成物、および(C) 実施例１において開示したようにして製造した80μgの安定な免疫原性生成物によって免疫化したマカク属のサルが産生した血清抗体の抗-TNFα中和活性を示すグラフである。横座標：TNFα活性の中和パーセント、縦座標：血清希釈。
【図６】(A) 対照PBS緩衝液、(B) KLH単独、(C) 実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物、および(D) メトトレキサートと組合せた実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物で免疫化したトランスジェニックhuTNFα B6.SJL-Tg(TNF)N2マウスの体液応答を示すグラフである。横座標：各個体、縦座標：IgG抗-TNFα抗体力価。
【００６８】
【図７】下記を注入したトランスジェニックhuTNFα B6.SJL-Tg(TNF)N2において判定した関節炎臨床スコアを示すグラフである：    NaCl [◆]    KLH単独 [■]    実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物 [▲]    メトトレキサートと組合せた実施例１において開示したようにして製造した安定な免疫原性生成物 [■]  横座標：最初の注入後の日数、縦座標：関節炎臨床スコア。
【図８】hTNFα-キノイドの特性決定を示す。  図８-a) 1：RPN800 MWマーカー、2：KLH (0.8μg)、3：hTNFα (0.8μg)、4：12%のSDS-PAGE上に取込ませた3μgのキノイド。銀染色またはウェスタンブロッティングのいずれかによる明像化。  図８-b) オートラジオグラム  1：MWマーカー、2：125I-hTNFα、3：hTNFα上でラベル化したキノイド、4：KLH上でラベル化したキノイド、5：125I-KLH。  図８-c) Superose 6カラム(10×300)上で濾過したキノイド(50μg)。DBPSによる0.2mlでの溶出。カラムは、１連のMWマーカーを適用することによって前以って較正した。  図８-d) L929細胞でのTNFα(◆)およびキノイド(◇)の生物学的活性の比較評価。e) TNFαのレセプターI (◆)およびII ( )への、並びにキノイドのレセプターI (◇)およびII (□)への結合性の比較。
【図９】TTgおよびBalb/cマウスにおける抗体応答を示すグラフである。  図９-a) Balb/cマウスと比較した、キノイド、不活化TNFα(iTNFα)またはKLHで免疫化したTTgにおける血清抗-TNFαAb力価。  図９-b)〜９-e)：キノイド(◇)およびKLH (◆)免疫化マウスにおける評価：    図９-b) 血清希釈による中和能    図９-c) 時間の関数としての血清中和能    図９-d) レセプターIに対する血清hTNFα結合抑制    図９-e) IgG中和能    図９-f) TNFαレセプターIに対するIgG結合抑制。  免疫化方式1：3週間間隔での2回i.m.注射およびブースター処理(6週間で5μg)、２：10μgの2回i.m.注射および5μgのブースター処理。
【００６９】
【図１０】hTNFαに対するマウス脾細胞の細胞介在免疫を示す。  KLH (n=3) (◆)およびキノイド (n=2) (◇)で免疫化したマウスからの精製脾細胞。Balb/cおよびTTgマウスを1日目、8日目、29日目に免疫化した。ブースター処理は90日目に行い、脾臓を屠殺時(120日目)に採集した。各脾細胞を、生体外で96時間、a) hTNFα、b) マウスTNFα(muTNFα)およびc) KLH抗原による賦活した。特異的細胞増殖をいずれも3H-チミジン取込みによって測定し、それぞれ44時間および72時間後の、賦活指数(図１０-A)或いは培養上清中でのIL2 (図１０-B)およびIFN-γ(図１０-C)産生として表した(材料および方法の項参照)。
【図１１】hTNFαキノイドによるワクチン接種がhTNFαトランスジェニックマウスにおける臨床上の関節炎を改善していることを示す。  7週齢マウスを、1日目、7日目および28日目に、KLH-TNFα(白丸) (n=8)mまたはKLH (黒丸) (対照群、n=7)により免疫化した。群間の差は、いずれのパラメーターにおいても統計的に有意であった：  図１１-a) 試験開始からの体重増の進展。P<0.5 (ANOVA)；  図１１-b) 患肢数。P<0.0001 (ANOVA)；  図１１-c) 関節炎の臨床スコア。P<0.0001 (ANOVA)；  図１１-d) ワクチン接種群における疾患の退行を示す関節炎の毎日の発症率(パーセント) (P<0.01 (ANOVA)。  この試験は、同様な結果でもって二回繰返した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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