(57)【要約】  本発明は、ヒトＢＮＰに特異的に結合する抗体ならびに試験サンプル中におけるヒトＢＮＰまたはヒトＢＮＰの断片の定量で前記抗体を用いるイムノアッセイに関するものである。
2008530207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＮＰの環の少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合する抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片において、前記エピトープがヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトＢＮＰの環の少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合する抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片において、前記エピトープが少なくともヒトＢＮＰのアミノ酸１３（アルギニン）、アミノ酸１６（アスパラギン酸）、アミノ酸１７（アルギニン）およびアミノ酸１８（イソロイシン）を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＢＮＰもしくはヒトＢＮＰ断片のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片において、前記ヒトＢＮＰもしくはヒトＢＮＰ断片のエピトープが、ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８のアミノ酸配列を有することを特徴とするモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片。
【請求項６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有するハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６。
【請求項７】
ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片において、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有することを特徴とするモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片。
【請求項８】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片をＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと予想されるかそれを含むことがわかっている試験サンプルと接触させて抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記抗体またはＢＮＰ−抗原結合断片がハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生され、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；ならびに
（ｂ）前記抗体−Ｈｂｎｐ複合体の形成を検出する段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項９】
前記イムノアッセイがさらに、抗体−Ｈｂｎｐ複合体を少なくとも１個の検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を検出可能な標識に結合させる段階を有する請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
前記イムノアッセイが、形成された抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片に関する標準曲線によって、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片の量に関連付ける請求項９に記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
前記イムノアッセイがさらに、抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に結合する標識Ｈｂｎｐペプチド、標識Ｈｂｎｐ断片またはそれらの標識Ｈｂｎｐ類縁体を含む請求項８に記載のイムノアッセイ。
【請求項１２】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）Ｈｂｎｐに結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を、少なくとも１個の検出抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が検出可能な標識に結合しており、さらには前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が特異的に、Ｈｂｎｐのアミノ酸５〜１３を含むアミノ酸配列を有するペプチドエピトープに結合する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片についての標準曲線の使用を介して前記ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１３】
検出抗体がモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片である請求項１２に記載のイムノアッセイ。
【請求項１４】
段階（ａ）に先だって、少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化することで固定化第１の抗体を得る段階をさらに有する請求項１２に記載のイムノアッセイ。
【請求項１５】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片に結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させることで捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系１０６．３によって産生されるモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４４を有する段階；
（ｂ）前記捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を、少なくとも１個の検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が検出可能な標識に結合され、さらに前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片に関する標準曲線の使用を介して前記ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１６】
段階（ａ）に先だって、少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化することで第１の固定化抗体を得る段階をさらに有する請求項１５に記載のイムノアッセイ。
【請求項１７】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐの断片に結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化して第１の固定化抗体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記固定化捕捉抗体を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片を有すると推定される試験サンプルと接触させることで、第１の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階；
（ｃ）前記固定化捕捉抗体を、検出可能な標識に結合しているＨｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片もしくはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させて第２の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、さらに前記Ｈｂｎｐ断片もしくはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｄ）段階（ｃ）で形成された第２の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体中の検出可能な標識の量を測定する段階；ならびに
（ｅ）前記形成された第２の抗体−Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片についての標準曲線の使用を介して、前記ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片の量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１８】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を固相上に固定化して固定化Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を製造する段階であって、前記Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）前記固定化Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させる段階；
（ｃ）前記固定化Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体ならびにＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される前記試験サンプルを、検出可能な標識に結合されている少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて、固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体および固定化されていないＨｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｄ）固定化されていないＨｂｎｐ−抗体複合体を除去する段階；
（ｅ）段階（ｃ）で形成された固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｆ）前記形成された固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片に関する標準曲線の使用を介して前記ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片の量と関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１９】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させてＨｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記Ｈｂｎｐ−抗体複合体を、標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させる段階であって、前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｃ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介して、前記サンプル中のＨｂｎｐの量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項２０】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片ならびに標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を含むと推定される試験サンプルと接触させて標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体および未標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有し、さらには前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｃ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介してＨｂｎｐの量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項２１】
ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイにおいて、
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させて標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有し、さらには前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）前記標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を、ＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させる段階；
（ｃ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介して、前記サンプル中のＨｂｎｐの量に関連付ける段階
を有することを特徴とするイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＢＮＰの固有のエピトープを認識する抗体、その抗体の製造方法およびその抗体を用いるヒトＢＮＰに関するイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＡＮＰ」と称する）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＢＮＰ」と称する）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＣＮＰ」と称する）およびマンバ（Dendroaspis）ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＤＮＰ」と称する）は、「ナトリウム利尿ペプチド類」と称されるホルモン類の各構成員である。ＡＮＰおよびＢＮＰは、広範囲の生理特性を共有し、心臓性ナトリウム利尿系に属する。ＡＮＰおよびＢＮＰのいずれも心筋細胞起源のものであるが、ＣＮＰは内皮細胞起源のものである。ＤＮＰは、グリーンマンバ蛇の毒から単離されており、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰと構造的類似性を有している。
【０００３】
ＢＮＰは、それが最初にブタ脳から単離されたためにその名称を付されていることから、「ＢＮＰ」は「脳性ナトリウム利尿ペプチド」を意味した。しかしながら、ＢＮＰは心性 ナトリウム利尿系に属することから、「脳性」は「Ｂ型」に変更されている。従って、「ＢＮＰ」は現在、「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」を指す。
【０００４】
ＡＮＰは、心房において心臓による分泌される。ＢＮＰは、主として心室から冠状静脈洞を通って心臓によって分泌される。ＢＮＰは、１０８アミノ酸ポリペプチド前駆体として分泌される（Valli et al., J. Lab. CHn. Med., 134(5):437-444（１９９９年１１月）参照）。成熟型のＢＮＰは、３２個以下のアミノ酸（１０８アミノ酸ポリペプチド前駆体のアミノ酸７７〜１０８を表す）から構成されており、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって閉じている１７アミノ酸の環、９アミノ酸のアミノ末端尾部および６アミノ酸のカルボキシル末端尾部を有する。ＡＮＰおよびＣＮＰは、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって閉じた１７アミノ酸の環も有する。環中の１７アミノ酸中の１１１は、前記３種類の分子間で保存されている。１７アミノ酸環構造に加えて、ＡＮＰは６アミノ酸のアミノ末端尾部および５アミノ酸のカルボキシ末端尾部を有する。ＡＮＰは、ＡＮＰの主要な貯蔵形態である１２６アミノ酸のプロ−ＡＮＰ形として産生される。アミノ酸９８と９９との間のタンパク質分解開裂後、成熟２８アミノ酸ペプチドＡＮＰが冠状静脈洞血漿中に認められる（Yandle, J. Internal Med., 235:561-576 (1994)参照）。
【０００５】
ＣＮＰは、脳および脳脊髄液で認められ、中枢神経系では前記３種類のペプチドの中で最も広く存在する。心臓ではＣＮＰはほとんど存在しない。プロ−ＣＮＰは、プロセシングされて活性ペプチドであるＣＮＰ−５３（アミノ酸５１〜１０３）またはＣＮＰ−２２（アミノ酸８２〜１０３）のいずれかとなる１０３アミノ酸ペプチドである。さらに、１７アミノ酸環構造であるＣＮＰ−２２は、５アミノ酸のアミノ末端尾部を有し、カルボキシ末端尾部を含まない。ＣＮＰ−５３は、アミノ末端での３１アミノ酸伸長を除くとＣＮＰ−２２と同一である。
【０００６】
前記のように、ＤＮＰはグリーン・マンバ蛇の毒から単離された。成熟型のＤＮＰは、３８個以下のアミノ酸で構成されている。ＤＮＰ様免疫反応性（ＤＮＰ−ＬＩ）がヒト血漿で報告されており、ＤＮＰ−ＬＩの血漿濃度が鬱血性心不全患者で上昇することが認められている（Cataliotti, et al., Mayo Clin, Proc, 76:111-1119 (2001)参照）。さらに、合成ＤＮＰの注入により、血漿および尿環状グアノシン一リン酸の上昇に伴ってナトリウム利尿および利尿が顕著になることも知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然ヒトナトリウム利尿ペプチドに関係する問題の一つは、それが血漿および血清中で不安定であるという点である。具体的には、プロテアーゼ類などの酵素がこれらのペプチドを開裂させる。例えばプロテアーゼ類は、ＢＮＰ（天然および合成）を、それのアミノ酸鎖中の各種位置で開裂させる。例えばプロテアーゼ開裂は、アミノ酸２〜３の間のＢＮＰのアミノ末端で（Shimizu et al., Clinica Chimica Acta, 316:129-135 (2002)）、そしてアミノ酸３０〜３２の間のそれのカルボキシ末端で起こることが知られている。さらに、ＢＮＰのエンドペプチダーゼ開裂も当業界では知られている（Davidson and Struthers, J Hypertension, 12:329-336 (1994)）。
【０００８】
一般集団でのヒトにおける成熟ＢＮＰ（すなわち、３２アミノ酸分子（ＢＮＰの前駆体ポリペプチドのアミノ酸７７〜１０８））（以下、「Ｈｂｎｐ」と称する）の測定が、鬱血性心不全、虚血性心疾患、心房細動および腎機能障害心臓疾患を反映することが認められている。実際、急性心筋梗塞後ならびに無症状もしくは無症候の心室機能障害中の心疾患で、ヒト血漿中のＢＮＰレベルの上昇が報告されている（Mukoyama et al., J. Clin. Invest, 87:11402-11412 (1991)、Motwani et al., Lancet, 341:1109-1113 (1993)、Yoshibayashi et al., New Eng. J. Med., 327:434 (1992)）。鬱血性心不全、慢性腎不全および重度高血圧において、ＡＮＰの循環レベル上昇が認められる。ヒト血漿中でのＣＮＰの存在については現在でも議論があり、ＣＮＰ−２２としてのそれの有無についての報告がある（Yandle, J. Internal Med., 235:561-576 (1994)参照）。
【０００９】
リガンド結合アッセイは、特異的結合性タンパク質と選択的に反応する一般にリガンドと称される物質の濃度を測定する分析技術である。特異的抗体と選択的に反応する抗原の濃度を測定するイムノアッセイは、ある種のリガンド結合アッセイの１例である。
【００１０】
血漿中のヒトナトリウム利尿ペプチド、特にはＨｂｎｐを測定するためのイムノアッセイなどのリガンド結合アッセイは、当業界で公知であり、市販されている。これらのイムノアッセイでは、少なくとも１個もしくは２個の特異的抗体ならびに少なくとも１個のキャリブレータおよび理想的には少なくとも１個の対照を使用する必要がある。キャリブレータおよび対照に加えて、イムノアッセイでは少なくとも１個の試験サンプルの使用が必要である。試験サンプルは通常、（通常はヒト患者からの）血清、血漿、全血その他の体液由来の生体サンプルである。試験サンプル中における少なくとも１個のヒトナトリウム利尿ペプチドのレベルを、イムノアッセイで定量する。
【００１１】
例えば、米国特許第６１６２９０２号（以下、「９０２特許」と称する）には、Ｈｂｎｐのエピトープ１〜１０、５〜１３および１５〜２５に対して単一特異的に反応性である単離抗体が開示されている。詳細には、「９０２特許」には、２種類の単離モノクローナル抗体が記載されている。第１のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系１０６．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４４）によって産生され、単一特異的にＨｂｎｐのエピトープ５〜１３に対して反応性である。第２のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系２０１．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４５）によって産生され、Ｈｂｎｐのエピトープ１〜１０に対して単一特異的に反応性である。９０２特許には、生体サンプルでのＨｂｎｐ量の定量を目的とした、イムノアッセイでの上記抗体の使用についても記載されている。米国特許第６６７７１２４号（以下、「１２４特許」と称する）には、ＨｂｎｐのＣ末端領域で認められるＬＹＳ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＨＩＳのアミノ酸配列を有するエピトープ、すなわちエピトープ２７〜３２に結合するモノクローナル抗体が開示されている。詳細には、１２４特許には、ハイブリドーマ細胞系ＢＣ２０３（ＦＥＲＭＢＰ−３５１５）によって産生されるモノクローナル抗体が記載されている。１２４特許には、このモノクローナル抗体を用いるＨｂｎｐについてのイムノアッセイも記載されている。
【００１２】
簡単に前述したように、天然ヒトナトリウム利尿ペプチドでの問題の一つは、これらのペプチドが血漿および血清中で不安定であるという点である。やはり前述したように、天然および合成の両方のヒトＢＮＰが、アミノ酸２〜３の間のアミノ末端とアミノ酸３０〜３２の間のカルボキシ末端でプロテアーゼ開裂を受けることが当業界で知られている。９０２特許および１２４特許に記載のイムノアッセイでの問題の一つに、試験サンプル中のＨｂｎｐがアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方でプロテアーゼ開裂を受けると、そのイムノアッセイで用いたモノクローナル抗体が試験サンプル中のＨｂｎｐを検出できないというものがある。試験サンプル中のＨｂｎｐが検出されないと、診断の見逃しまたは不正確な診断を生じる可能性がある。従って、プロテアーゼ開裂を受けないヒトナトリウム利尿ペプチド中のエピトープ、特にはＨｂｎｐに結合する抗体、ならびにその抗体を用いるイムノアッセイが当業界では必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰの環の少なくとも一部（その分子はヒトＢＮＰの１０８アミノ酸前駆体ポリペプチドのアミノ酸７７〜１０８を表す）を含むエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片など（それに限定されるものではない）の抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片（本明細書においては、互換的に「機能活性」断片とも称される）であって、前記エピトープがヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に関するものである。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰの環の少なくとも一部を含むエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片など（それらに限定されるものではない）の抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であって、前記エピトープが少なくともヒトＢＮＰのアミノ酸１３（アルギニン）、アミノ酸１６（アスパラギン酸）、アミノ酸１７（アルギニン）およびアミノ酸１８（イソロイシン）を含むアミノ酸配列を有する抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に関するものである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰもしくはそれのヒトＢＮＰ断片のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体など（それらに限定されるものではない）の抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であって、前記ヒトＢＮＰまたはそれのヒトＢＮＰ断片のエピトープが、ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８のアミノ酸配列を有する抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に関するものである。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有するハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６に関するものである。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であって、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有するモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に関するものである。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐの断片についてのイムノアッセイに関するものである。そのイムノアッセイには、下記の段階が関与する。
【００１９】
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片をＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと予想されるかそれを含むことがわかっている試験サンプルと接触させて抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記抗体またはＢＮＰ−抗原結合断片がハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生され、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；ならびに
（ｂ）前記抗体−Ｈｂｎｐ複合体の形成を検出する段階。
【００２０】
上記イムノアッセイはさらに、前記抗体−Ｈｂｎｐ複合体を少なくとも１個の検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を検出可能な標識に結合させる段階を有することができる。あるいは、前記イムノアッセイはさらに、サンプル中に存在するＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片の量もしくは濃度に従って、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片に結合する標識Ｈｂｎｐペプチド、標識Ｈｂｎｐ断片またはそれの標識Ｈｂｎｐ類縁体を含むことができる。上記イムノアッセイにおいて、前記形成された捕捉−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片に関する標準曲線によって、Ｈｂｎｐの量に関連付ける。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはそれのＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイに関するものである。そのイムノアッセイには、下記の段階が関与する。
【００２２】
（ａ）ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片に結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を、少なくとも１個の検出抗体もしくはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が検出可能な標識に結合しており、さらには前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が特異的に、Ｈｂｎｐのアミノ酸５〜１３を含むアミノ酸配列を有するペプチドエピトープに結合する段階；
（ｃ）段階（ｂ）で形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片についての標準曲線の使用を介してＨｂｎｐの量に関連付ける段階。
【００２３】
上記方法で使用される検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４４を有するハイブリドーマ細胞系１０６．３によって産生されるモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であることができる。さらに、前記方法で使用される検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識または免役−ポリメラーゼ連鎖反応標識であることができる。
【００２４】
適宜に、前記少なくとも１個の捕捉抗体を試験サンプルと接触させる前に、前記方法は、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化して、第１の固定化抗体を製造する追加段階を有することができる。
【００２５】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイに関するものである。そのイムノアッセイは、下記の段階を有する。
【００２６】
（ａ）ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片に結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させることで捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系１０６．３によって産生されるモノクローナル抗体またはＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４４を有する段階；
（ｂ）前記捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体を、少なくとも１個の検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体を形成する段階であって、前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が検出可能な標識に結合され、さらに前記検出抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片である段階；
（ｃ）段階（ｂ）で形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−検出抗体複合体の量を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片に関する標準曲線の使用を介して前記Ｈｂｎｐの量に関連付ける段階。
【００２７】
さらに、前記方法で使用される検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識または免役−ポリメラーゼ連鎖反応標識であることができる。
【００２８】
適宜に、前記少なくとも１個の捕捉抗体を試験サンプルと接触させる前に、前記方法は、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化して、第１の固定化抗体を製造する追加段階を有することができる。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片についての異なるイムノアッセイに関するものである。このイムノアッセイは下記の段階を有する。
【００３０】
（ａ）ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片に結合する少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を固相上に固定化して第１の固定化抗体を形成する段階であって、前記少なくとも１個の捕捉抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記固定化捕捉抗体を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片を有すると推定される試験サンプルと接触させることで、第１の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階；
（ｃ）前記固定化捕捉抗体を、検出可能な標識に結合しているＨｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片もしくはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させて第２の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体を形成する段階であって、さらに前記Ｈｂｎｐ断片もしくはＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｄ）段階（ｃ）で形成された第２の固定化抗体−Ｈｂｎｐ複合体中の検出可能な標識の量を測定する段階；ならびに
（ｅ）前記形成された第２の抗体−Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片についての標準曲線の使用を介して、Ｈｂｎｐの量に関連付ける段階。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片についてのさらに別の異なるイムノアッセイに関する。このイムノアッセイは、下記の段階を有する。
【００３２】
（ａ）Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を固相上に固定化して固定化Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体を製造する段階であって、前記Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）前記固定化Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させる段階；
（ｃ）前記固定化Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体ならびにＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される前記試験サンプルを、検出可能な標識に結合されている少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片と接触させて、固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体および非固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｄ）前記非固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体を除去する段階；
（ｅ）段階（ｃ）で形成された固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｆ）前記形成された固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、ＨｂｎｐもしくはＨｂｎｐ断片に関する標準曲線の使用を介して前記Ｈｂｎｐの量と関連付ける段階。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰ（Ｈｂｎｐ）またはＨｂｎｐ断片についてのイムノアッセイに関するものであり、そのイムノアッセイは下記の段階を有する。
【００３４】
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させてＨｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有する段階；
（ｂ）前記Ｈｂｎｐ−抗体複合体を、標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させる段階であって、前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｃ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介して、前記サンプル中のＨｂｎｐの量に関連付ける段階。
【００３５】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片についてのさらに別の異なるイムノアッセイに関するものである。このイムノアッセイは下記の段階を含む。
【００３６】
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片ならびに標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を含むと推定される試験サンプルと接触させて標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体および未標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有し、さらには前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｃ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介してＨｂｎｐの量に関連付ける段階。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片についてのさらに別の異なるイムノアッセイに関する。このイムノアッセイは、下記の段階を有する。
【００３８】
（ａ）少なくとも１個の抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片を、標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させて標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する段階であって、前記抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片が、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体またはそれのＢＮＰ−抗原結合断片であり、前記細胞系がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を有し、さらには前記標識Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体が、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９または１６〜１８を含むアミノ酸配列を有する段階；
（ｂ）前記標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を、ＢＮＰまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触させる段階；
（ｃ）形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を測定する段階；ならびに
（ｄ）前記形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を、標準曲線の使用を介して、前記サンプル中のＨｂｎｐの量に関連付ける段階。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
Ｉ．背景
すなわち、１実施形態において本発明は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープまたはＨｂｎｐのアミノ酸１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する新規な抗体に関する。本発明の抗体は、非常に感受性の高い試薬であり、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の定性的および／または定量的検出において有用である。第２の実施形態において本発明は、本発明の抗体を用いるイムノアッセイに関するものである。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ヒトＢＮＰ」、「Ｈｂｎｐ」、「Ｈｂｎｐペプチド」または「Ｈｂｎｐポリペプチド」という用語は、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドの１０８アミノ酸前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８を表す３２アミノ酸分子を指す。本明細書で使用される「Ｈｂｎｐ断片」または「Ｈｂｎｐペプチド断片」という用語は、１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８のうちの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐペプチド断片とは、１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８のうちの少なくとも１０個の連続するアミノ酸；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８のうちの少なくとも１５個の連続するアミノ酸；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８のうちの少なくとも２０個の連続するアミノ酸；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７〜１０８のうちの少なくとも２５連続するアミノ酸を含むポリペプチドを指す。Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐペプチド断片の例には、Ｈｂｎｐのアミノ酸１〜３１、１〜３０、１〜２９、１〜２８、１〜２７、１〜２６、１〜２５、１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、２〜３２、２〜３１、２〜３０、２〜２９、２〜２８、２〜２７、２〜２６、２〜２５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、３〜３２、３〜３１、３〜３０、３〜２９、３〜２８、３〜２７、３〜２６、３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜３２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、４〜３２、４〜３１、４〜３０、４〜２９、４〜２８、４〜２７、４〜２６、４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、５〜３２、５〜３１、５〜３０、５〜２９、５〜２８、５〜２７、５〜２６、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、６〜３２、６〜３１、６〜３０、６〜２９、６〜２８、６〜２７、６〜２６、６〜２５、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、７〜３２、７〜３１、７〜３０、７〜２９、７〜２８、７〜２７、７〜２６、７〜２５、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、８〜３２、８〜３１、８〜３０、８〜２９、８〜２８、８〜２７、８〜２６、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、９〜３２、９〜３１、９〜３０、９〜２９、９〜２８、９〜２７、９〜２６、９〜２５、９〜２４、９〜２３、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１１〜３２、１１〜３１、１１〜３０、１１〜２９、１１〜２８、１１〜２７、１１〜２６、１１〜２５、１１〜２４、１１〜２３、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１２〜３２、１２〜３１、１２〜３０、１２〜２９、１２〜２８、１２〜２７、１２〜２６、１２〜２５、１２〜２４、１２〜２３、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜３２、１３〜３１、１３〜３０、１３〜２９、１３〜２８、１３〜２７、１３〜２６、１３〜２５、１３〜２４、１３〜２３、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１４〜３２、１４〜３１、１４〜３０、１４〜２９、１４〜２８、１４〜２７、１４〜２６、１４〜２５、１４〜２４、１４〜２３、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１５〜３２、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１６〜３２、１６〜３１、１６〜３０、１６〜２９、１６〜２８、１６〜２７、１６〜２６、１６〜２５、１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜３２、１７〜３１、１７〜３０、１７〜２９、１７〜２８、１７〜２７、１７〜２６、１７〜２５、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１８〜３２、１８〜３１、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１９〜３２、１９〜３１、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４または１９〜２３を含むアミノ酸配列などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
ＩＩ．本発明の抗体
上記で簡単に説明したように、１実施形態において本発明は、好ましくは試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の迅速・簡単・正確かつ定性的および／または定量的検出を可能とする非常に感度の高い試薬に関するものである。本明細書で使用される場合、「試験サンプル」という用語は、哺乳動物、代表的にはヒトの血清、血漿、全血、リンパ、ＣＮＳ液、尿その他の体液由来の生体サンプルに関するものである。その試験サンプルは、当業界で公知の通常の技術を用いて製造することができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の一部を指す。エピトープは、タンパク質の３重折り畳みによって並列となった連続するアミノ酸または非連続のアミノ酸の両方から形成することができる。エピトープは代表的には、固有の空間構造での少なくとも３個以上、より通常では少なくとも５個、または少なくとも８個のアミノ酸が含む。抗体断片：抗原結合に重要であるエピトープのアミノ酸は従来の方法によって確認することができ、その方法には抗体と抗原の間の結合アフィニティの測定と組み合わせた部位指向性で領域選択的な突然変異誘発などがあるが、それに限定されるものではない。エピトープの空間構造は従来の方法によって確認することができ、それには例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴などがあるが、これらに限定されるものではない。例えば、モリスの編著を参照する（Epitope Mapping Protocols in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 66, Glenn E. Morris, ed (1996)）。
【００４３】
本発明者らは、Ｈｂｎｐ内の非常に安定なエピトープを発見し、これら領域に特異的に結合する抗体を製造した。抗体は、それの所期の標的（すなわち、ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含む直鎖ヒトＢＮＰもしくは環状ヒトＢＮＰ）に対するアフィニティが、非標的分子（すなわち、ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含まない直鎖ヒトＢＮＰもしくは環状ヒトＢＮＰ）に対するそれのアフィニティと比較した時、約２倍、好ましくは約３倍、より好ましくは約４倍である場合に、「特異的に結合する」。好ましい実施形態では、抗体その他の結合剤と抗原との間の特異的結合性とは、少なくとも１０８Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０９〜１０１０Ｍ−１の結合アフィニティ（ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含む環状ヒトＢＮＰの場合）、または少なくとも１０６〜１０８Ｍ−１の結合アフィニティ（ヒトＢＮＰのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含む直鎖ヒトＢＮＰの場合）を意味する。本発明は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体およびそれの機能的に活性な断片を提供するものであり、それにはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含み、それの間にあるアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体などがある。当業者であれば、抗体が本明細書に記載のエピトープに特異的に結合する能力が消失しない限りにおいて、本明細書に記載のエピトープを含むアミノ酸残基のうちの１以上を変更もしくは置換可能であることは明らかであろう。例えば、エピトープがＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０を含む場合、エピトープに対する抗体（またはそれの一部）の特異性およびアフィニティがあまり低下しない限りにおいて、これら８個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１個を、１以上の他のアミノ酸残基によって置き換えることが可能であると予想される。そのような変化したエピトープは、特に、イムノアッセイのためのキャリブレータ、対照または標準として用いることができる。
【００４４】
本発明の抗体は、Ｈｂｎｐの環（Ｈｂｎｐのアミノ酸１０〜２６）に結合する。本発明の抗体はＨｂｎｐの環部分に特異的に結合することから、本発明の抗体は、プロテアーゼの結果としてＨｂｎｐに対して起こる開裂による影響を受けない。従って、本発明の抗体をイムノアッセイで用いることができ、当業界で公知の他の抗体より安定（すなわち、タンパク質分解的に開裂したヒトＢＮＰに対する結合が改善されている）で検出可能なシグナルを提供する。
【００４５】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などであることができる。本発明のモノクローナル抗体は、「キメラ」および「ヒト化」抗体をも含む。キメラ抗体では、所望の生理活性を示す限りにおいて、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の相当する配列と同一であるか相同性であり、鎖の残りの部分は別の種由来であるか別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにそのような抗体の断片中の相当する配列と同一であるか相同性である（米国特許第４８１６５６７号およびモリソンらの報告（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851- 6855 (1984)）参照）。対象となるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を有する「霊長類化」抗体などがある。キメラ抗体には、ヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）応答として特徴付けられる擬陽性低減の利点もある（SJ. Thorpe, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 57:85-92 (2003)参照）。
【００４６】
さらに、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体も含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体由来の最小配列を含む非ヒト（齧歯類など）キメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、受容者の高頻度可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、アフィニティおよび能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域からの残基によって置き換わっているヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの骨格領域残基が、相当する非ヒト残基によって置き換わっている。さらに、ヒト化抗体は、受容者抗体またはドナー抗体で認められない残基を含む可能性がある。これらの修飾を行って、抗体性能をさらに洗練することができる。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１個、代表的には２個のうちの実質的に全ての可変ドメインを含み、その場合に高頻度可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、高頻度可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。前記ヒト化抗体は、少なくとも免疫グロブリン接触領域（Ｆｃ）の一部、代表的にはヒト免疫グロブリンのものを含んでいても良い。
【００４７】
上記のように、本発明の抗体はモノクローナル抗体であることができる。本発明のモノクローナル抗体は、当業界で公知の方法、特にはコーラーら（Kohler, G. and Milstein., C, Nature, 256:495 (1975)）による方法に従って製造されたハイブリドーマ細胞によって産生することができる。概してマウスは、アミノ酸１〜３２を含む全長ＨｂｎｐペプチドまたはＨｂｎｐおよびウシ血清アルブミンなどの好適な相手の免疫原性接合体で免疫化される。良好な抗体力価が得られるまで定期的なブースタ注射を行う。次に、免疫化マウスからの脾臓細胞を、当業界で通常の方法を用いて骨髄腫細胞と融合させることで（Galfre et al., Nature, 266:550 (1977)参照）、ハイブリドーマ細胞を得る。ハイブリドーマ細胞培養物からの上清を、Ｈｂｎｐに対する反応性についてスクリーニングする。試験結果が陽性であるハイブリドーマを再クローニングし、それの上清について反応性を再度調べる。この手順を用いることで、実施例でより詳細に記載のように、本発明者らはハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６を得て、それはアミノ酸１３〜２０を含むアミノ酸配列を有するＨｂｎｐ断片を特異的に認識するモノクローナル抗体を分泌する。
【００４８】
非常に免疫原生の高いエピトープが確認されたら、ポリクローナル抗血清から非モノクローナル抗体を産生させることができる。ポリクローナル抗血清は、当業界で公知の通常の技術に従って産生される。具体的には、ウサギなどの好適な動物を、アミノ酸１〜３２を含むＨｂｎｐペプチドまたはＨｂｎｐおよび好適な相手の免疫原性接合体で免疫化する。良好な抗体力価が得られるまで、定期的ブースター注射を行う。Ｈｂｎｐの各種ペプチド断片に対する免疫反応性について得られた抗血清を調べることで、所望のエピトープを確認することができる。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープなどの非常に安定なエピトープが確認されたら、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含む（包含およびその間）アミノ酸配列を有するエピトープを含み、他のエピトープ（エピトープマッピングで確認することができる）を含まず、固体担体に結合しているＨｂｎｐのペプチド断片を用いるアフィニティカラムでのポリクローナル血清のアフィニティ精製によって、このエピトープに特異的に結合する抗体を得ることができる。確認された抗体、その抗体を産生する核酸および／またはその抗体を産生する細胞を、それが確認された後に、部位特異的もしくは領域特異的突然変異誘発、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよび当業界で公知の他の技術によって操作するしても良い。
【００４９】
本発明の抗体の機能活性断片（本明細書においては、互換的に「ＢＮＰ−抗原結合断片」とも称される）が本発明において想到され、本明細書に記載のイムノアッセイで用いることもできる。本発明の抗体の「機能活性断片」は、その抗体の免疫特異性を保持しているが、選択性、結合力および／またはアフィニティは同一ではない可能性がある。機能活性断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２およびＦａｂ′などの免疫グロブリン断片などがあるが、これらに限定されるものではない。これらの断片は、当業界で公知の技術を用いて得ることができる（例えば、抗体の酵素的開裂によるものなど（Mariani et al., Mol. Immunol, 28:69-77 (1991)；Ishikawa et al., J. Immunoassay, 4:209-327 (1983)参照）。
【００５０】
ＩＩＩ．本発明のイムノアッセイ
別の実施形態において本発明は、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の定性および／または定量に用いることができるイムノアッセイに関するものである。本発明のイムノアッセイは、競争的阻害形式（フォワードまたはリバース競争阻害アッセイの両方を含む）または蛍光偏光形式で、当業界で公知の形式、好ましくはサンドイッチ形式を用いて行うことができる。
【００５１】
試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の定性的検出のためのイムノアッセイでは、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片のある種のエピトープに結合する少なくとも１個の抗体または機能活性断片をＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定されるが、それを含むことがわかっている少なくとも１個の試験サンプルと接触させて、抗体−Ｈｂｎｐ免疫複合体を形成する。次に、この免疫複合体を、当業界で通常の技術を用いて検出する。例えば、そのＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片に結合し、検出可能な標識を含む第２の抗体を、試験サンプルに加えることができ、それを用いて抗体−Ｈｂｎｐ複合体の存在を検出することができる。当業界で公知の検出可能な標識を用いることができる。検出可能な標識およびそれの抗体への付着について、下記でより詳細に議論する。
【００５２】
好ましくは、そのような定性的イムノアッセイで用いられる抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ、またはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０の少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体である。  サンドイッチ型形式などのＢＮＰの定量的検出のためのイムノアッセイでは、少なくとも２つの抗体を用いて、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を分離および定量する。より具体的には、前記少なくとも２つの抗体が、「サンドイッチ」と称される免疫複合体を形成するＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片のある種のエピトープに結合する。概して、１以上の抗体を用いて、試験サンプル中のＨｂｎｐを捕捉することができ（これらの抗体は非常に多くの場合、「捕捉」抗体または「捕捉」抗体と称される）、１以上の抗体を用いて、検出可能な（すなわち、定量可能な）標識をサンドイッチに結合させる（これらの抗体は、非常に多くの場合、「検出」抗体または「検出」抗体と称される）。サンドイッチアッセイにおいて、エピトープに結合する両方の抗体は、アッセイ中の他の抗体のそれの個々のエピトープへの結合によって減少しないことが好ましい。すなわち、抗体を選択して、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルと接触するようになる１以上の第１の抗体が、第２またはそれ以降の抗体によって認識されるエピトープの全てまたは一部に結合して、１以上の第２の検出抗体がＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片に結合する能力を妨害しないようにすべきである。
【００５３】
本発明者らは、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する第１のモノクローナル抗体ならびにＨｂｎｐのアミノ酸５〜１３を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する第２のモノクローナル抗体を用いて、優れたイムノアッセイを行うことができることを発見した。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体である。Ｈｂｎｐのアミノ酸５〜１３を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系１０６．３によって産生されるモノクローナル抗体である。より具体的には本発明者らは、非常に感受性で、捕捉抗体としてハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されるモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ型アッセイを製造した（実施例８参照）。
【００５４】
好ましい実施形態では、同時または順次に、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される前記試験サンプルを、少なくとも１個の第１の捕捉抗体（または抗体）および少なくとも１個の第２の検出抗体と接触させることができる。サンドイッチアッセイ形式では、ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルを最初に、第１の抗体−Ｈｂｎｐ複合体の形成を可能とする条件下に、特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１個の第１の捕捉抗体と接触させる。複数の捕捉抗体を用いる場合、第１の多捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体が形成される。サンドイッチアッセイでは、前記抗体、好ましくは少なくとも１個の捕捉抗体は、試験サンプルで予想されるＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の最大量の過剰モル量で用いる。例えば、微粒子コーティング緩衝液１ｍＬ当たり約５μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの抗体を用いることができる。
【００５５】
適宜に、少なくとも１個の第１の捕捉抗体と試験サンプルを接触させる前に、前記少なくとも１個の第１の捕捉抗体を、試験サンプルからの第１の抗体−Ｈｂｎｐ複合体の分離を促進する固体担体に結合させることができる。当業界で公知の固体担体を用いることができ、それにはウェル、チューブまたはビーズの形態でのポリマー材料製の固体担体などがあるが、それらに限定されるものではない。その抗体（または抗体）を、吸着、化学カップリング薬を用いる共有結合、または乙業界で公知の他の手段によって固体担体に結合させることができ、ただし、そのような結合は抗体がＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片に結合する能力を妨害するものではない。さらに、必要に応じて、固体担体を誘導体化して、抗体上の各種官能基との反応性を可能とすることができる。そのような誘導体化には、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなど（それらに限定されるものではない）のある種のカップリング剤の使用が必要である。
【００５６】
ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を含むと推定される試験サンプルを少なくとも１個の第１の捕捉抗体と接触させた後、試験サンプルをインキュベートして、第１の捕捉抗体（または多抗体）−Ｈｂｎｐ複合体を形成できるようにする。そのインキュベーションは、約４．５〜約１０．０のｐＨで、約２℃〜約４５℃の温度で、少なくとも約１分〜約１８時間、好ましくは約２〜６分間、最も好ましくは約３〜４分間の期間にわたって行うことができる。
【００５７】
第１の／多捕捉抗体−Ｈｂｎｐ複合体の形成後、その複合体を少なくとも１個の第２の検出抗体と接触させる（第１の／多抗体−Ｈｂｎｐ−第２の抗体複合体の形成を可能とする条件下で）。第１の抗体−Ｈｂｎｐ複合体を多検出抗体と接触させる場合、第１の／多捕捉抗体−Ｈｂｎｐ−多抗体検出複合体が形成される。第１の抗体の場合と同様に、少なくとも第２の（およびそれ以降の）抗体を第１の抗体−Ｈｂｎｐ複合体と接触させる場合、第１の／多抗体−Ｈｂｎｐ−第２の／多抗体複合体の形成には上記のものと同様の条件下でのインキュベーション期間が必要である。好ましくは、少なくとも１個の第２の抗体が検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、第１の／多抗体−Ｈｂｎｐ−第２の／多抗体複合体の形成の前、それと同時またはそれの後に、少なくとも１個の第２の抗体に結合させることができる。当業界で公知の検出可能な標識を用いることができる。例えば、その検出可能な標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、酵素標識（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ペルオキシダーゼ、グルコース６−ホスフェート脱水素酵素など）、化学発光標識（アクリジニウムエステル類、ルミナール、イソルミノール、チオエステル類、スルホンアミド類、フェナントリジニウムエステル類など）、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３′６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオロセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）などの蛍光標識、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（硫化亜鉛キャッピングされたセレン化カドミウム）、温度測定標識または免役−ポリメラーゼ連鎖反応標識であることができる。標識、標識手順および標識の検出についての紹介が、ポラックらの著作（Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2nd ed., Springer Verlag, N. Y. (1997)）およびモレキュラー・プローブス社（Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon）によって出版された複合ハンドブックおよびカタログであるホーグランドらの著作（Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)）にある。
【００５８】
検出可能な標識は、直接またはカップリング剤を介して抗体に結合させることができる。使用可能なカップリング剤の１例は、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）から市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩）がある。使用可能な他のカップリング剤は、当業界で公知である。抗体への検出可能な標識の結合方法は、当業界では公知である。さらに、別名ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステルとも称されるＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミドまたは別名ＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルと称されるＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミドなどの抗体への検出可能な標識のカップリングを促進する末端基をすでに含む多くの検出可能な標識を購入または合成することができる。
【００５９】
第１の抗体／多−Ｈｂｎｐ−第２の／多抗体複合体は、標識定量に先だって、試験サンプルの残りのものから分離することができるが、それが必要というわけではない。例えば、少なくとも第１の捕捉抗体をウェルまたはビーズなどの固体担体に結合させる場合、固体担体との接触から流体（試験サンプルから）を除去することで分離を行うことができる。あるいは、少なくとも第１の捕捉抗体を固体担体に結合させる場合、それをＨｂｎｐ含有サンプルおよび前記少なくとも１個の第２の検出抗体と同時に接触させることで、第１の（多）抗体−Ｈｂｎｐ−第２の（多）抗体複合体を形成し、次に固体担体との接触からの流体（試験サンプル）の除去を行うことができる。少なくとも第１の捕捉抗体を固体担体に結合させない場合、前記第１の抗体／多−Ｈｂｎｐ−第２の／多抗体複合体は、標識の量の定量のために、試験サンプルから除去する必要はない。
【００６０】
標識された第１の抗体−Ｈｂｎｐ−第２の抗体複合体の形成後、複合体中の標識の量を、当業界で公知の技術を用いて定量する。例えば、酵素標識を用いる場合、標識化複合体を、発色などの定量可能な反応を与えるその標識用の基質と反応させる。標識が放射性標識である場合、その標識はシンチレーションカウンタを用いて定量する。標識が蛍光標識である場合、その標識は、標識を単色光（「励起波長」と称される）によって刺激し、その刺激に応答して標識によって放出される別の色（「発光波長」と称される）を検出することで定量される。その標識が化学発光標識である場合、その標識は、肉眼でまたは照度計、Ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いることで、放出された光を検出して定量される。複合体中の標識の量が定量されたら、既知濃度のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の連続希釈液を用いて得ておいた標準曲線を用いて、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の濃度を求める。ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の連続希釈液を用いる以外に、質量分析および当業界で公知の他の技術によって、標準曲線を重量測定法で得ることができる。
【００６１】
フォワード競争形式では、既知濃度の標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体の小分けサンプルを用いて、Ｈｂｎｐ抗体（ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体など）への結合に関して試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片と競争させる。Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片およびそれのＨｂｎｐ類縁体のペプチド類ならびにＨｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片およびＨｂｎｐ類縁体のペプチドの製造方法は、当業界で公知である（例えば、米国特許第６１６２９０２号参照）。
【００６２】
フォワード競争アッセイでは、固定化抗体（ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体など）を、試験サンプルならびに標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と順次または同時に接触させることができる。Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体は、サンドイッチアッセイ形式との関連で前述した検出可能な標識など、当業者には公知の検出可能な標識で標識することができる。
【００６３】
標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体、試験サンプルおよび抗体を、サンドイッチアッセイ形式に関連して前述したものと同様の条件下でインキュベートする。２つの異なる種類の抗体−Ｈｂｎｐ複合体が生じる。具体的には、形成された抗体−Ｈｂｎｐ複合体のうちの一つは検出可能な標識を含み、他方の抗体−Ｈｂｎｐ複合体は検出可能な標識を含まない。抗体−Ｈｂｎｐ複合体は、検出可能な標識の定量の前に試験サンプルの残りのものから分離することができるが、それは必要というわけではない。抗体−Ｈｂｎｐ複合体を試験サンプルの残りのものから分離するか否かとは無関係に、抗体−Ｈｂｎｐ複合体中の検出可能な標識の量を定量する。抗体−Ｈｂｎｐ複合体中の検出可能な標識の量を標準曲線と比較することで、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の濃度を求めることができる。その標準曲線は、既知濃度のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の連続希釈を用い、質量分析、重量測定および当業界で公知の他の技術によって得ることができる。
【００６４】
前記抗体−Ｈｂｎｐ複合体は、サンドイッチアッセイ形式に関連して前述した固体担体などの固体担体に抗体を結合させ、次に試験サンプルの残りのものを固体担体との接触から除去することで、試験サンプルから分離することができる。
【００６５】
抗体への結合に関して試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片と競争するのに用いられる標識Ｈｂｎｐ（またはＨｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体）は、完全なＨｂｎｐ１〜３２、それのいずれかのＨｂｎｐ断片［ただし、前記Ｈｂｎｐ断片はＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）少なくとも１個のアミノ酸配列を含む］またはいずれかのＨｂｎｐ類縁体であることができるが、前記Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体は、抗体によって認識されるエピトープに相当するアミノ酸の配列を含む。好ましくは、用いられる抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸（ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体など）を含むエピトープに特異的に結合するか、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１６〜２０、１６〜１９、１６〜１８、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。本発明において標識および使用可能なＨｂｎｐ断片の例には、Ｈｂｎｐのアミノ酸１〜３１、１〜３０、１〜２９、１〜２８、１〜２７、１〜２６、１〜２５、１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、２〜３２、２〜３１、２〜３０、２〜２９、２〜２８、２〜２７、２〜２６、２〜２５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、３〜３２、３〜３１、３〜３０、３〜２９、３〜２８、３〜２７、３〜２６、３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜３２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、４〜３２、４〜３１、４〜３０、４〜２９、４〜２８、４〜２７、４〜２６、４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、５〜３２、５〜３１、５〜３０、５〜２９、５〜２８、５〜２７、５〜２６、５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、６〜３２、６〜３１、６〜３０、６〜２９、６〜２８、６〜２７、６〜２６、６〜２５、６〜２４、６〜２３、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、７〜３２、７〜３１、７〜３０、７〜２９、７〜２８、７〜２７、７〜２６、７〜２５、７〜２４、７〜２３、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、８〜３２、８〜３１、８〜３０、８〜２９、８〜２８、８〜２７、８〜２６、８〜２５、８〜２４、８〜２３、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、９〜３２、９〜３１、９〜３０、９〜２９、９〜２８、９〜２７、９〜２６、９〜２５、９〜２４、９〜２３、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、１０〜３２、１０〜３１、１０〜３０、１０〜２９、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、１０〜２５、１０〜２４、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１１〜３２、１１〜３１、１１〜３０、１１〜２９、１１〜２８、１１〜２７、１１〜２６、１１〜２５、１１〜２４、１１〜２３、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１２〜３２、１２〜３１、１２〜３０、１２〜２９、１２〜２８、１２〜２７、１２〜２６、１２〜２５、１２〜２４、１２〜２３、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜３２、１３〜３１、１３〜３０、１３〜２９、１３〜２８、１３〜２７、１３〜２６、１３〜２５、１３〜２４、１３〜２３、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１４〜３２、１４〜３１、１４〜３０、１４〜２９、１４〜２８、１４〜２７、１４〜２６、１４〜２５、１４〜２４、１４〜２３、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１５〜３２、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１６〜３２、１６〜３１、１６〜３０、１６〜２９、１６〜２８、１６〜２７、１６〜２６、１６〜２５、１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜３２、１７〜３１、１７〜３０、１７〜２９、１７〜２８、１７〜２７、１７〜２６、１７〜２５、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１８〜３２、１８〜３１、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１９〜３２、１９〜３１、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４または１９〜２３を含むアミノ酸配列を有するペプチド断片などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
リバース競争アッセイでは、固定化Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体を、順次または同時に試験サンプルおよび少なくとも１個の標識抗体と接触させることができる。好ましくは、前記抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ、またはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体である。その抗体は、サンドイッチアッセイ形式に関連して前述した検出可能な標識などの、当業者に公知の検出可能な標識で標識することができる。
【００６７】
Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体は、サンドイッチアッセイ形式との関連で前述した固体担体などの固体担体に結合させることができる。好ましくは、前記Ｈｂｎｐペプチド断片は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０または１６〜１９または１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含むアミノ酸配列を有する。
【００６８】
固定化Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐペプチド断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体、試験サンプルおよび少なくとも１個の標識抗体を、サンドイッチアッセイ形式に関連して前述したものと同様の条件下でインキュベートする。２つの異なる種類のＨｂｎｐ−抗体複合体が形成される。具体的には、その形成されたＨｂｎｐ−抗体複合体のうちの一方は固定化され、検出可能な標識を含むが、他方のＨｂｎｐ−抗体複合体は固定化されず、検出可能な標識を含む。固定化されていないＨｂｎｐ−抗体複合体および試験サンプルの残りのものを、洗浄などの当業界で公知の方法によって固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体の存在するものから除去する。固定化されていないＨｂｎｐ抗体複合体を除去したら、固定化Ｈｂｎｐ−抗体複合体中の検出可能な標識の量を定量する。次に、Ｈｂｎｐ−複合体中の検出可能な標識の量を標準曲線と比較することで、試験サンプル中のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の濃度を求めることができる。その標準曲線は、既知濃度のＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片の連続希釈を用い、質量分析、重量測定および当業界で公知の他の技術によって得ることができる。
【００６９】
蛍光偏光アッセイでは、１実施形態において、抗体またはそれの機能活性断片を最初に、ＨｂｎｐまたはそれのaＨｂｎｐ断片を含むと推定される未標識試験サンプルと接触させて、未標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する。次に、未標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を、蛍光標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させる。その標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体は、前記抗体またはそれの機能活性断片への結合に関して、試験サンプル中の未標識ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片と競合する。形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を求め、標準曲線を用いることで、試験サンプル中のＨｂｎｐの量を求める。
【００７０】
好ましくは、蛍光偏光アッセイで用いられる抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ、またはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体である。
【００７１】
好ましくは、前記Ｈｂｎｐペプチド断片は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０または１６〜１９または１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含むアミノ酸配列を有する。その抗体、標識Ｈｂｎｐペプチド、Ｈｂｎｐペプチド断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体ならびに試験サンプルおよび少なくとも１個の標識抗体を、サンドイッチアッセイ形式に関連して前述したものと同様の条件下でインキュベートする。
【００７２】
あるいは、別の実施形態では、抗体またはそれの機能活性断片を、蛍光標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体ならびにＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片を含むと推定される未標識試験サンプルと接触させて、標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体および未標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の両方を形成する。形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を求め、標準曲線を用いることで試験サンプル中のＨｂｎｐの量を求める。このイムノアッセイで使用される抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ、あるいはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体である。さらに、前記Ｈｂｎｐペプチド断片は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０または１６〜１９または１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含むアミノ酸配列を有する。
【００７３】
あるいは、さらに別の実施形態では、抗体（ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体など）またはそれの機能活性断片を、最初の蛍光標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはそれのＨｂｎｐ類縁体と接触させて、標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体を形成する。その標識ＢＮＰ−抗体複合体を、ＨｂｎｐまたはそれのＨｂｎｐ断片を含むと推定される未標識試験サンプルと接触させる。試験サンプル中の未標識ＨｂｎｐまたはＨｂｎｐ断片を、抗体またはそれの機能活性断片への結合に関して標識Ｈｂｎｐ、Ｈｂｎｐ断片またはＨｂｎｐ類縁体と競争させる。形成された標識Ｈｂｎｐ−抗体複合体の量を求め、標準曲線を用いることで、試験サンプル中のＨｂｎｐの量を求める。このイムノアッセイで使用される抗体は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０または１７〜２４のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ、あるいはＨｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０、１６〜１９、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含む（包含し、その間にあることを意味する）を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０のうちの少なくとも３個のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の１例は、ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６によって産生されたモノクローナル抗体である。さらに、前記Ｈｂｎｐペプチド断片は、Ｈｂｎｐのアミノ酸１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２０、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２０または１６〜１９または１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１７〜１９、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２または１９〜２１を含むアミノ酸配列を有する。
【００７４】
例として、本発明の実施例を下記に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
免疫原製造
マウスにおける免疫応答を刺激するのに用いられる抗原は、ペプチド研究所社（Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan）から入手可能なペプチド合成環状Ｈｂｎｐ（アミノ酸１〜３２を含有）とした。この環状Ｈｂｎｐは、下記に示すアミノ酸配列を有する。
【００７６】
ＮＨ２−ＳＰＫＭＶＱＧＳＧＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣＫＶＬＲＲＨ−ＣＯＯＨ（配列番号１）（Ｃ１０−Ｃ２６の間にジスルフィド結合）。
【００７７】
あるいは、Ｈｂｎｐに対して反応性であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生するための免疫原として、修飾ＢＮＰ分子を用いることができると考えられる。１個のそのような免疫原は、アミノ酸１３〜２０内に含まれるエピトープ中のアミノ酸の一つを異なるアミノ酸で置き換える。例えば、配列番号１における位置１４のリジン、配列番号１における位置１５のメチオニンまたは配列番号１における位置１９のセリンを、全てまたはそれぞれ、アラニンなど（それに限定されるものではない）の異なるアミノ酸で置き換えることができると考えられる。
【実施例２】
【００７８】
免疫化
用いたマウスモデルは、５〜６週齢の雌ＲＢｆ／Ｄｎｊ（Jax Labs, Harbor, Maineから）であった。その動物を、５〜１０μｇブーストでフロイントアジュバント（DIFCO, Detroit, Michigan）およびＲＩＢＩアジュバント（Corixa, Hamilton, Montana）を交代で用い、１２週間かけて６回にわたりＨｂｎｐ（上記実施例１からの配列番号）で免疫化した。６回目のブーストから２週間後に、血清サンプルを、マイクロタイターＥＩＡで調べた。生理食塩水で希釈したウサギ抗マウスＦｃＩｇ（ＲＡＭＦｃ）（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を、０．１μｇ／ウェルでコーティングし、インキュベートし、次に２％魚ゼラチンで遮断した。プレートを洗浄し、順次希釈マウス血清サンプルを加えて１時間インキュベートした。アミノ酸１〜３２を含むＢＮＰペプチド（配列番号１）を、正常マウス血清（Fitzgerald Industries International, Concord, MA）で希釈し、ウェルに加えた。インキュベーションおよび洗浄後、検出試薬であるアルカリホスファターゼ（以下、「１０６−アルカリホスファターゼ」と称する）に結合したモノクローナル抗体（以下、「ｎｉＡｂ」と称する）１０６．３を各ウェルに加えた。ｐ−ＮＰＰ基質系（KPL, Gaithersburg, MD）で発色を行い、力価が＞１／１００００である２匹のマウス＃１４９４および１４９９を融合用に選択した。動物をさらに１週間休息させてから、生理食塩水脾臓内前融合ブーストで１０μｇのＨｂｎｐ（配列番号１）を投与した。
【実施例３】
【００７９】
脾臓細胞融合
前融合ブーストから３日後、実施例２のマウスからの脾臓Ｂ細胞を、ＳＰ２／０骨髄腫細胞系とのＰＥＧ介在融合で用いた。細胞を、血清を含まない培地に再懸濁させ、遠心によってペレットとした。上清は廃棄した。１５〜３０秒間かけて１ｍＬをゆっくり加え、次に１分間インキュベートし、そして血清を含まない培地で洗浄することで、分子量（ＭＷ）が１４５０であるポリエチレングリコール（ATCC, Manassasm, Virginia）を細胞に曝露した。細胞を、１０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah）を含むＨＡＴ補充Ｈ−ＳＦＭ（Life Technologies, Grand Island, NY）に再懸濁させ、細胞１〜５×１０５個／ウェルの濃度で平板培養した。プレートを３７℃で１０日間インキュベートしてから、実施例２で前述したマイクロタイターＥＩＡを用いてスクリーニングした。
【実施例４】
【００８０】
スクリーニングおよび選択
プレートを３７℃で１０日間インキュベートした後、実施例２で前述したマイクロタイターサンドイッチＥＩＡを用いてスクリーニングを行った。陽性培養物を拡散させ、冷凍した。飽和上清を回収し、アミノ酸１〜２６（配列番号２）、Ｈｂｎｐペプチドの「ロリポップ様」修飾（下記の表１参照）を含むＨｂｎｐペプチド断片に対する反応性を再度調べることで、アミノ酸２７〜３２（配列番号６）を含むＨｂｎｐ  Ｃ末端領域に対して反応性のｍＡｂを回避した。マイクロウェルプレートを、０．１μｇ／ウェルのＲＡＭＦｃでコーティングし、魚ゼラチンで遮断した。プレートを洗浄し、順次希釈し、上清を加えた。次に、アミノ酸１〜２６を含むＨｂｎｐペプチド断片をビオチンに結合させ（配列番号３）（Abbott Laboratories, GPRD, Abbott Park, IL；下記の表１参照）、ウェルに加え、インキュベートし、洗浄した。シグナル検出物質であるストレプトアビジン−ＨＲＰＯ接合体（Zymed, San Francisco, CA）を、１／５０００希釈で一気に加え、インキュベートし、洗浄してから、ＯＰＤ基質系（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）で発色させた。ハイブリッド３−６３１が、このアッセイ構成でアミノ酸１〜２６を含むビオチン化Ｈｂｎｐペプチド断片に対して反応性であると評点され、さらなる試験に選択した。（図１参照）。
【００８１】
次に、ハイブリッド３−６３１ｍＡｂを、一連の未標識環化環Ｈｂｎｐペプチドを用いて置換ＥＩＡで調べた。Ｈｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（配列番号１）、アミノ酸１〜２６を含むＨｂｎｐペプチド断片（配列番号２）（Abbott Laboratories, GPRD, Abbott Park, IL；下記表１参照）およびアミノ酸１０〜２６を含む修飾Ｈｂｎｐ断片（配列番号４）（Abbott Laboratories, GPRD, Abbott Park, IL；下記表１参照）を用いて、ビオチン化Ｈｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（配列番号５）に対して、３−６３１ｍＡｂへの結合に関して競争させた（下記表１参照）。ＲＡＭＦｃコートされたマイクロタイタープレートを終夜インキュベートし、洗浄し、２％魚ゼラチンで遮断した。力価測定した試験抗体を１時間反応させてから、プレートを洗浄し、次に０．０００２９〜２９００．０Ｎｍ遊離ペプチドの範囲の濃度で、修飾ペプチドパネルおよび対照Ｈｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（配列番号１）の連続希釈したものを加えた。プレートを再度洗浄し、ビオチン化Ｈｂｎｐ接合体を加え、結合３−６３１抗体への結合に関して未標識ペプチドと競合させた。それぞれアミノ酸１〜２６（配列番号２参照）および１０〜２６（配列番号４参照）を含む修飾Ｈｂｎｐペプチド断片について行ったように、対照Ｈｂｎｐ環化ペプチド（アミノ酸１〜３２）は、３−６３１抗体への結合に関して、ビオチン化１−３２シグナルを良好に遮断した（図２参照）。
【００８２】
ハイブリッド３−６３１を、限界希釈法によってクローニングし、密集成長が認められるまで３７℃でインキュベートした。ビオチンに接合したＨｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）を用いた以外は実施例２で上述のＥＩＡで、クローン上清を調べた。（下記表１参照）。確認された上清細胞系である３−６３１−２６４を取って、血清を含まない培地Ｈ−ＳＦＭ（Life Technologies）に移した。その細胞系を再度サブクローニングし、その際にＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメータを用いてＡlｅｘａ−６３３（Molecular Probes）に接合したヤギ抗マウスＩｇで染色した単一細胞を単離した。培養物を１０〜１４日間インキュベートし、ビオチンに接合したＨｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）を用いる前記のマイクロタイターＥＩＡ（実施例２参照）によってスクリーニングした（下記表１参照）。 規模拡大および細胞バンキングを目的として、細胞系３−６３１−４３６を選択した。その細胞バンクは、長期間にわたって液体窒素冷凍庫で保存した。
【００８３】
表１
１．修飾環状ＢＮＰアミノ酸１〜２６「ロリポップ様」配置
【００８４】
【化１】
2008530207.tif 000003
（Ｃ１０〜Ｃ２６の間にジスルフィド結合）
【００８５】
２．ビオチン化修飾環状ＢＮＰアミノ酸１〜２６「ロリポップ様」配置
【００８６】
【化２】
2008530207.tif 000004
（Ｃ１０〜Ｃ２６の間にジスルフィド結合）
【００８７】
３．修飾環状ＢＮＰアミノ酸１０〜２６「ライフセーバー様」配置
【００８８】
【化３】
2008530207.tif 000005
（Ｃ１〜Ｃ１７の間にジスルフィド結合）
【００８９】
４．ビオチン化環状ＢＮＰアミノ酸１〜３２
【００９０】
【化４】
2008530207.tif 000006
（Ｃ１０〜Ｃ２６の間にジスルフィド結合）
【００９１】
５．環状ＢＮＰアミノ酸２７〜３２のＣ末端
【００９２】
【化５】
2008530207.tif 000007
【００９３】
６．環状ＡＮＰ−２８アミノ酸
【００９４】
【化６】
2008530207.tif 000008
（Ｃ７〜Ｃ２３の間にジスルフィド結合）
【００９５】
７．環状ＣＮＰ−２２アミノ酸
【００９６】
【化７】
2008530207.tif 000009
（Ｃ６〜Ｃ２２の間にジスルフィド結合）。
【実施例５】
【００９７】
抗体の特性決定
放射性同位体測定
３−６３１−４３６細胞系からの精製抗体を、アイソストリップ（Isostrip）マウスモノクローナル抗体アイソタイプ化キット（Roche Diagnostics）を用いて調べた。０．３μｇ／ｍＬサンプルの少量サンプル１５０μＬを、増殖管に加え、混合した。アイソストリップを管に加え、帯片の帯域に発色があるまで５〜１０分間インキュベートした。結果から、３−６３１−４３６ｍＡｂがκ軽鎖を有するマウスＩｇＧ２ａサブタイプであることがわかった。
【００９８】
電気泳動評価
製造者の説明に従い、ファスト・システム（Phast System, Amersham/Pharmacia）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦゲルで精製抗体を評価した。ＤＴＴ処理した試験サンプルを、０．１〜０．４ｍｇ／ｍＬの濃度でＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルの列に負荷した。銀染色による発色で、軽鎖分子量（ＭＷ）が約２１ｋＤａであり、重鎖ＭＷが約４６ｋＤａであることがわかった。ＩＥＦ試験サンプルを、０．１５〜０．６ｍｇ／ｍＬで列に負荷した。ＩＥＦ試験の発色から、Ｐｉ範囲が６．０〜６．８であり、９本の可視帯域のあることがわかった。
【００９９】
アフィニティ測定
３−６３１−４３６ｍＡｂおよびＨｂｎｐ抗原の相互作用についてのアフィニティ結合速度および結合定数を、バイアコア（Biacore, Biacore, Inc., Sweden）で評価した。ＧＡＭＦｃ（KPL, Gaithersburg, MD）コートチップを用いて、精製３−６３１−４３６または１０６．３抗体を捕捉した。次に、遊離Ｈｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２） （配列番号１）を各ｍＡｂと相互作用させ、データを分析用に回収した。下記の表２を参照する。
【０１００】
【表１】
2008530207.tif 000010
【０１０１】
さらに、アミノ酸１〜２６（配列番号２）を含む修飾環状Ｈｂｎｐ断片に結合する３−６３１−４３６ｍＡｂのアフィニティ結合速度および結合定数を、上記のバイアコアアッセイで求めた。下記の表３を参照する。
【０１０２】
【表２】
2008530207.tif 000011
【０１０３】
交差反応性
ＡＮＰおよびＣＮＰに対する３−６３１−４３６ｍＡｂの反応性を、置換マイクロタイターＥＩＡで求めた。遮断ＲＡＭＦｃコートプレートを、ｍＡｂとともに１時間インキュベートし、洗浄した。連続希釈した遊離未接合ＡＮＰ（配列番号７）（Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan）およびＣＮＰ（配列番号８）（Peptide Institute, Inc.）を、ｍＡｂと１時間反応させてから、洗浄し、ビオチン化Ｈｂｎｐ接合体（配列番号３）を加えた。プレートをインキュベートし、洗浄し、検出試薬であるストレプトアビジン−ＨＲＰＯを加えた。発色後、データ解析では、３−６３１−４３６ｍＡｂのＡＮＰおよびＣＮＰに対する交差反応性は認められなかった（図３参照）。
【０１０４】
追加試験
精製３−６３１−４３６抗体を調べて、抗体が直鎖形態のＨｂｎｐに結合する能力を求めた。ペプチド環化プロセスを用いずにＨｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（配列番号１）を製造することで、２個の内部システインは代表的なＨｂｎｐ環を生じるジスルフィド結合を形成しなかった。これらの直鎖Ｈｂｎｐ試薬は、アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）が製造したものであり、ジスルフィド結合を切断する還元条件下で処理された環状Ｈｂｎｐペプチドに似たものである。上記のバイアコアアッセイを用いて、３−６３１−４３６ｍＡｂが直鎖ペプチドに結合し得ることを確認した。下記の表４を参照する。
【０１０５】
【表３】
2008530207.tif 000012
【０１０６】
化学発光アッセイも開発して、還元条件に類似した条件で分子中に存在する直鎖型のＨｂｎｐへの３−６３１−４３６の結合能力を求めた。固相に結合した３−６３１−４３６抗体を用いるサンドイッチアッセイを用いて、濃度０および１００００ｐｇ／ｍＬで直鎖および環形態のＨｂｎｐのいずれかを捕捉した。アクリジニウムに接合した１０６．３ｍＡｂをサンプルウェルに加えた。化学発光シグナルが誘発され、ワラック（Wallac）化学発光読取装置で読み取った（図４参照）。
【実施例６】
【０１０７】
抗体の産生および精製
３−６３１−４３６ 細胞系を血清を含まない培地に拡散させ、細胞約０．４×１０５個／ｍＬｄｅローラー瓶に接種した。培養物を１回転／分で、１０〜１４日間または最終培養液が得られるまでインキュベートした。上清を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。ペリコン（Pellicon）システムを用いて上清を濃縮し、０．４５μｍフィルターで濾過した。ｍＡｂ濃縮液を１．５Ｍグリシン ／ ３Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．９）で１：１希釈し、ＡＫＴＡ自動精製システム（Amersham/Pharmacia）を用いる予め平衡とした５ｍＬタンパク質Ａカラムに乗せた。 カラムを５倍結合干渉液で洗浄し、基底線が得られたら、ｍＡｂをｐＨ３．０クエン酸緩衝液で溶離した。次に、そのｍＡｂをＰＢＳへの緩衝液交換用の７０ｍＬ  Ｇ２５カラムに移した。抗体を小分けし、−７０℃で保存した。
【実施例７】
【０１０８】
エピトープ分析
環状Ｈｂｎｐアラニン置換ペプチドパネルを用いるアラニン突然変異誘発スクリーニング法を用いて、３−６３１−４３６ｍＡｂの結合部位を確認した。Ｈｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（配列番号１）の１個のアミノ酸を、アラニンアミノ酸に置き換えることで、下記の表５に示した構成員２８個のパネルを形成した（配列番号９〜配列番号３６）。アミンカップリングによるカルボキシメチル−デキストランバイオセンサー（バイアコアＣＭ５チップ）上へのＧＡＭＦｃの固定化によって、高密度ヤギ抗マウスＦｃ（ＧＡＭＦｃ）抗体表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを製造した。約１０ＫｒｕのＧＡＭＦｃをバイオセンサーのカップリングさせた。１２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡおよび１２ｍｇ／ｍＬ  カルボキシメチルデキストランナトリウム塩を含むＨＢＳ−ＥＰ（バイアコア）からなる脱気／真空濾過流動緩衝液で、抗体および各Ｈｂｎｐペプチドを、それらの試験濃度（それぞれ、１０μｇ／ｍＬおよび２０〜２００００Ｎｍ）まで希釈した。抗ＢＮＰｍＡｂ（３−６３１−４３６および１０６．３）６０μＬおよび非特異的基準ｍＡｂを、異なるフローセルを通して１０μＬ／分で流動させて、各フローセルが約０．８〜１．２Ｋｒｕの捕捉ｍＡｂを含むようにした。そのチップを、流量１００μＬ／分の流動緩衝液で１０分間平衡とさせてから、ペプチド１５０μＬおよび次に緩衝液を、バイオコア２０００上のＫＩＮＪＥＣＴ（会合９０秒、解離３００秒）を用いて、捕捉ｍＡｂ表面に順次注入した。次に、２５℃で流量１００μＬ／分での１０ｍＭ  グリシン（ｐＨ１．８）の３回の３５秒パルスで表面を再生させた。
【０１０９】
解離定数（ＫＤ）を各ペプチドについて求め、自由エネルギー（ΔＧ）に直接計算した。野生型（ＷＴ）と突然変異体の間のエネルギー差を計算し（ΔΔＧ）、プロットした。１．５〜２．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上のΔΔＧ値を結合に関するホットスポットと見なし、それは機能性結合エピトープの一部である（Bogan & Thorn., JMB, 280:1-9 (1998) and Ma, Elkayam, Wolfson, andNussinov, PNAS USA, 100: 5772-7 (2003)）。抗ＢＮＰ−３−６３１−４３６との結合に機能上重要であるＨｂｎｐ上の残基は、Ｒ１３、Ｄ１６、Ｒ１７および１１８である。これらのアミノ酸は、抗ＢＮＰ３−６３１−４３６とＨｂｎｐの機能的結合エピトープを形成する。抗ＢＮＰ１０６．３との結合に関して機能的に重要なＨｂｎｐ上の残基は、Ｖ５、Ｑ６、Ｇ７、Ｇ９、Ｆ１１および Ｒ１３である。これらのアミノ酸は、抗ＢＮＰ１０６．３とＨｂｎｐの機能的結合エピトープを形成する。図５ａおよび５ｂを参照する。
【０１１０】
３−６３１−４３６ｍＡｂ機能的エピトープ（太字および下線で示した）：
【０１１１】
【化８】
2008530207.tif 000013
１０６．３ｍＡｂ機能的エピトープ（太字および下線で示した）：
【０１１２】
【化９】
2008530207.tif 000014
【０１１３】
【表４】
2008530207.tif 000015
【実施例８】
【０１１４】
ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５によって産生されたモノクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイ
アーキテクト（ARCHITECT；登録商標）−Ｈｂｎｐアッセイ（以下、「Ａｒｃ−ＢＮＰ」）と称するの場合、常磁性粒子をｍＡｂ１０６．３（配列番号６）でコーティングした。このｍＡｂは、Ｈｂｎｐペプチド上のアミノ酸５〜１３を含むアミノ酸配列に結合する。モノクローナル抗体１０６．３は、米国特許第６１６２９０２号に記載されている。モノクローナル抗体１０６．３を、米国特許第６１６２９０２号に記載の技術を用いて、常磁性粒子（Polymer Laboratories, Amhorst, MA）上にコーティングした。具体的には、ＥＤＡＣ カップリングを用いた（ＥＤＡＣは一般的には、１級アミンと結合するアミドに関するカルボキシル活性化剤として用いられる。さらに、それはホスフェート基と反応する。それは、ペプチド合成、タンパク質の核酸への架橋および免疫接合体の製造において用いられる。ＥＤＡＣの化学式は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。ＥＤＡＣは、シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.）から市販されている）。粒子を洗浄し、ＢＳＡでオーバーコートした。この粒子を用いて、試験品との最初のインキュベーション時のアッセイでＢＮＰペプチドを捕捉した。
【０１１５】
モノクローナル抗体ＢＣ２０３を、アクリジニウムに接合し（Albany Molecular Research Inc., Albany, N. Y.）、第２のインキュベーション時のアッセイで用いて、粒子結合Ｈｂｎｐペプチドを検出する。その接合は、ＢＣ２０３のアクリジニウム−カルボキサミドエステルへの反応によって起こった。モノクローナル抗体ＢＣ２０３は、ＨｂｎｐのＣ末端領域、すなわちエピトープ２７〜３２で認められるＬＹＳ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＨＩＳのアミノ酸配列を有するエピトープに結合する。モノクローナル抗体ＢＣ２０３は、塩野義（Shionogi & Co., Ltd, Osaka, Japan）から市販されており、米国特許第６６７７１２４号に記載されている。
【０１１６】
修飾Ａｒｃ−ＢＮＰアッセイの場合、常磁性粒子をｍＡｂ３− ６３１−４３６でコーティングした。これらを用いて、試験品との第１のインキュベーション時のアッセイで、Ｈｂｎｐペプチドを捕捉する。ＭａｂＢＣ２０３をアクリジニウムに接合させたのと同様にして、モノクローナル抗体１０６．３をアクリジニウムに接合させ、第２のインキュベーション時のアッセイで用いて、粒子結合Ｈｂｎｐペプチドを検出する。
【０１１７】
分解血漿を、両方のアーキテクト（登録商標）形式でアッセイし、Ｈｂｎｐ濃度を時間点の関数としてプロットした。分解サンプルの検出向上について調べるため、パネルを下記のように作った。ＥＤＴＡ−血漿（正常な健常個体から集めたもの）にＨｂｎｐペプチド（アミノ酸１〜３２）（Peptide International, Louisville, KY）を加え、室温で２４時間まで放置して、Ｈｂｎｐペプチドを分解させた。プロテアーゼ阻害薬を、一定の時間点（０、４、６、８、１０、２４時間）で添加蓄積物の小分けサンプルに加えた。時間点０時間から初めて時間点２４時間までこれらの小分けサンプルを取った。小分けサンプルを、各時間点で−７０℃の冷凍庫に入れた。これらの小分けサンプルを解凍して、各種アッセイ形式での試験に供した。修正形式でのアーキテクト（登録商標）結果は、分解時間の関数としてのＨｂｎｐシグナル保持に対する顕著な改善を示している。最初のＡｒｃ−ＢＮＰ形式は、わずか４時間の分解時間後であっても、Ｈｂｎｐシグナルが非常に低下することを示している。これは、修飾Ａｒｃ−ＢＮＰ形式が改善であることを示している。
【０１１８】
ＢＮＰイムノアッセイは、アーキテクト（登録商標）装置で行った（この装置については、米国特許第５４６８６４６号に記載されている）。
【０１１９】
キャリブレータ溶液または試験品を含む小分けサンプルを、微粒子として反応容器の同じウェルに入れて、反応混合物を形成した。キャリブレータ溶液は、Ｈｂｎｐ全長ペプチドを含んでいた。１６％ショ糖、アジ化ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１％ＢＳＡを含む希釈液中の捕捉抗体でコーティングした４．５μｍ微粒子を、サンプリングプローブによって、サンプリングセンターの反応容器の適切なウェルにピペットで入れた。反応混合物を、約３７℃の温度で約４分間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物をアーキテクト（登録商標）ライン希釈液（Line Diluent）で洗浄して、捕捉されなかったキャリブレータまたは試験品を除去した。アーキテクト（登録商標）ライン希釈液は、アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois）から市販されている。
【０１２０】
ＢｇＧ（ウシγ−グロブリン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ショ糖、プロクリン（ProClin；登録商標）３００（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO、プロクリン（登録商標）３００の有効成分は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンである。プロクリン（登録商標）３００は、修飾グリコールおよびカルボン酸アルキルなどの多くの不活性成分をも含む。）およびアジ化ナトリウムを含む緩衝液中の約５０〜１００ｎｇ／ｍＬでのｍＡｂ−アクリジニウム−接合体を、反応容器に入れ、得られた混合物を約３７℃の温度で約４分間インキュベートした。インキュベーション後、反応容器をアーキテクト（登録商標）ライン希釈液で洗浄して、未結合材料を除去した。
【０１２１】
過酸化水素と次に水酸化ナトリウムの溶液を反応容器に加え、化学発光シグナルをアーキテクト（登録商標）装置の化学発光微粒子イムノアッセイ（ＣＭＩＡ）光学アセンブリによって測定した。
【０１２２】
アーキテクト（登録商標）システムは、代表的には相対発光量（以下、「ｒｌｕ」）で測定されるアクリジニウムシグナルを測定するものである。そのアッセイは、各キャリブレータについて２回行った。下記の表６および７ならびに図６および７にある結果は、２つのアッセイの平均を示している。具体的には、表６および図６の結果は、分解血漿のｐｇ／ｍＬでのＢＮＰで示してある。表７および図７での結果は、分解後の時間０濃度％で示してある。
【０１２３】
【表５】
2008530207.tif 000016
【０１２４】
【表６】
2008530207.tif 000017
【実施例９】
【０１２５】
ＡＴＣＣ寄託情報
マウスハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３６は、２００４年１２月２１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection（以下、「ＡＴＣＣ」と称する）（10801 University Blvd., Manassas, VA20110-2209）に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６４７６を割り当てられた。
【０１２６】
当業者であれば、目的を遂行し、上記ならびに本発明に固有の目的および利点が得られるように本発明を調整することは容易に理解できよう。本明細書に記載の分子複合体および方法、手順、処理、分子、具体的な化合物は、現時点で好ましい実施形態を代表するものであり、例として挙げられたものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および精神を逸脱しない限りにおいて、本明細書に開示の本発明に対して各種の置き換えおよび修正を行うことが可能であることは、当業者には容易に明らかであろう。
【０１２７】
本明細書で言及されている全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものである。特許および刊行物はいずれも、参照することで、あたかも各個々の刊行物が参照によって具体的かつ個別に示されたと同程度に、本明細書に組み込まれるものとする。
【０１２８】
本明細書に具体的に開示されていない要素もしくは複数要素、限定もしくは複数の限定がなくとも、本明細書に説明的に記載されている本発明は、好適に実施することができる。従って、例えば、本明細書における各場合で、「含む」、「本質的に・・・からなる」「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと代えることができる。使用されている用語および表現は、説明の用語として使用されているものであって、限定的なものではなく、そのような用語および表現は、指示および記載されている特徴またはそれの一部の均等物を除外するものではく、特許請求される本発明の範囲に含まれる限りにおいて、各種の変更が可能であることは明らかである。従って、理解すべき点として、本発明は好ましい実施形態および適宜の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書で開示の概念の修正および変更を当業者が行うことは可能であり、そのような修正および変更が添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲に包含されると考えられる。
【０１２９】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、それによって、本発明が、そのマーカッシュ群の個々の構成員もしくは構成員の下位群によっても記載されることは、当業者には明らかであろう。例えば、Ｘが、臭素、塩素および要素からなる群から選択されると記載されている場合、Ｘが臭素である請求項ならびにＸが臭素および塩素である請求項が完全に記載されていることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ビオチン化Ｈｂｎｐペプチド断片（アミノ酸１〜２６含有）ならびにハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体およびハイブリドーマ細胞系１０６．３から産生されたモノクローナル抗体を用いて実施した間接酵素イムノアッセイ（以下、「ＥＩＡ」）を示す図である。
【図２】全長環状Ｈｂｎｐ（アミノ酸１〜３２）ならびに多くのＨｂｎｐ環ペプチド断片およびハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体およびハイブリドーマ細胞系ＢＣ２０３から産生されたモノクローナル抗体を用いて実施した置換ＥＩＡの結果を示すグラフである。
【図３】全長環状Ｈｂｎｐ（アミノ酸１〜３２）、全長環状ＡＮＰ（アミノ酸１〜２８）および２２アミノ酸型の環状ＣＮＰならびにハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体およびハイブリドーマ細胞系１０６．３から産生されたモノクローナル抗体を用いて実施した置換ＥＩＡの結果を示すグラフである。
【図４】直鎖および環状ＢＮＰ（アミノ酸１〜３２）に対する抗ＢＮＰ反応性を測定するアッセイの結果を示すグラフである。
【図５ａ】アラニン置換およびハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体を有する環状Ｈｂｎｐペプチドの突然変異誘発パネルを用いるビアコア機能的エピトープマッピングの結果を示すグラフである。
【図５ｂ】アラニン置換およびハイブリドーマ細胞系１０６．３から産生されたモノクローナル抗体を有する環状Ｈｂｎｐペプチドのパネルを用いるビアコア機能的エピトープマッピングの結果を示すグラフである。
【図６】ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体（「修飾Ａｒｃ−ＢＮＰ」と称する）と対照（「Ａｒｃ−ＢＮＰ」と称する）を用いる実施例８に記載のサンドイッチアッセイの結果を示す図である（結果は、分解血漿のＨｂｎｐ  ｐｇ／ｍＬで示してある）。
【図７】ハイブリドーマ細胞系３−６３１−４３５から産生されたモノクローナル抗体（修飾Ａｒｃ−ＢＮＰ）と対照（Ａｒｃ−ＢＮＰ）を用いた実施例８のサンドイッチアッセイの結果を示す図である（結果は、分解後の時間０濃度の％で示してある）。
【図１】
2008530207.tif 000018
【図２】
2008530207.tif 000019
【図３】
2008530207.tif 000020
【図４】
2008530207.tif 000021
【図５ａ】
2008530207.tif 000022
【図５ｂ】
2008530207.tif 000023
【図６】
2008530207.tif 000024
【図７】
2008530207.tif 000025
【配列表】
2008530207000001.app
【国際調査報告】
2008530207.tif 000026
2008530207.tif 000027
2008530207.tif 000028