(57)【要約】ＭＤＲ−１遺伝子の発現およびＰｇＰタンパク質の合成を防止するため、または細胞における多剤耐性を逆転させるためにノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）の誘導体を使用する組成物および方法、また、ＮＤＧＡ誘導体を別の化学療法剤と併用して薬剤耐性癌および薬剤耐性感染症を治療する組成物および方法。本発明は、例えば、テトラ−ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍ４Ｎ）などのノルジヒドログアヤレト酸誘導体を利用して、Ｐｇｐタンパク質の形成および／または機能を停止させる。
2008520548.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における薬物トランスポータータンパク質Ｐｇｐの合成および機能の少なくとも１つを阻止するための、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩の使用であって、
【化１】
2008520548.tif 000027
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む、使用。
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１〜Ｒ４が、それぞれ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｎ−（ＣＨ３）２である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが、単糖残基または二糖残基を含む、請求項１記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているアミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１が−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−マルトースまたは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ガラクトースであり、Ｒ２〜Ｒ４が各々−ＯＣＨ３である、請求項５記載の使用。
【請求項７】
Ｐｇｐの合成が化学療法剤によって生じる、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
前記化学療法剤が、ドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンからなる群より選択される、請求項７記載の使用。
【請求項９】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
前記細胞が感染性微生物である、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
前記細胞が、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌である、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記ＮＤＧＡ誘導体が、細胞内で多剤耐性遺伝子１（ＭＤＲ１）の発現が化学的に誘発されるのを防止する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
前記ＮＤＧＡ誘導体が、細胞におけるＭＤＲ１の発現を防止する、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を、癌を治療するために少なくとも１つの副次的化学療法剤と併用する使用であって、
【化２】
2008520548.tif 000028
式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基を含むか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、
該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している、使用。
【請求項１５】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、前記アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
Ｒ１〜Ｒ４が、それぞれ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｎ−（ＣＨ３）２である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが単糖または二糖である、請求項１４記載の使用。
【請求項１８】
前記単糖残基または二糖残基が、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによって前記フェニル環に結合している、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−マルトースまたは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ガラクトースであり、残余のＲ基が−ＯＣＨ３である、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記副次的化学療法剤が、ドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンからなる群より選択される、請求項１４〜１９のいずれか一項記載の使用。
【請求項２１】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１４〜２０のいずれか一項記載の使用。
【請求項２２】
前記細胞が感染性微生物である、請求項１４〜２０のいずれか一項記載の使用。
【請求項２３】
前記細胞が、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌である、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記ＮＤＧＡ誘導体の前記副次的化学療法剤に対するモル比が約２０：１である、請求項１４〜２３のいずれか一項記載の使用。
【請求項２５】
前記ＮＤＧＡ誘導体の前記副次的化学療法剤に対するモル比が約２．４：１である、請求項１４〜２３のいずれか一項記載の使用。
【請求項２６】
以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩の、癌細胞における多剤耐性を防止または克服するための使用であって、
【化３】
2008520548.tif 000029
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む、使用。
【請求項２７】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、前記アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基である、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
Ｒ１〜Ｒ４が、それぞれ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｎ−（ＣＨ３）２である、請求項２６記載の使用。
【請求項２９】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが単糖残基または二糖残基を含む、請求項２６記載の使用。
【請求項３０】
Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−マルトースまたは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ガラクトースであり、かつ残余のＲ基がいずれも−ＯＣＨ３である、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
前記化学療法剤が、ドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンからなる群より選択される、請求項２６記載の使用。
【請求項３２】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２６〜３１のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
前記癌または細胞が、それぞれヒトの癌またはヒト癌細胞である、請求項１〜３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
前記癌が、乳癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記細胞が非ヒト動物の細胞である、請求項１〜３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項３６】
前記動物が哺乳類である、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
微生物における薬剤耐性を克服する方法であって、該微生物、または該微生物を含む宿主に、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩の有効量を投与することを含み、
【化４】
2008520548.tif 000030
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む、方法。
【請求項３８】
前記微生物が、ウイルス、細菌、寄生生物、および真菌からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
動物における薬剤耐性感染症を治療する方法であって、該動物に、該感染症が耐性をもつ少なくとも治療剤とともに、以下の化学式を有する化合物、またはその生理学的に受容可能な塩の有効量を投与することを含み、
【化５】
2008520548.tif 000031
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む、方法。
【請求項４０】
前記感染症が、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生生物感染症、または真菌感染症である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
以下の化学式：
【化６】
2008520548.tif 000032
を有する化合物、またはその生理学的に受容可能な塩を含む組成物であって、
式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、酸素原子を介してフェニル環に結合しているβアミノ酸残基であるか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の−ＣＨ２−基を介してフェニル基に結合した糖残基であり、かつ、残余のＲ基が−ＯＣＨ３である、組成物。
【請求項４２】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが単糖または二糖である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
前記糖が、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、およびこれらの誘導体からなる群より選択され、これらの−ＯＨ基またはアミノ基が、Ｏ−メチル基、Ｏ−アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、低級アルキル基、低級アシル基、ホスホ基、およびスルホ基から選択される置換基による結合または置換によって修飾されている、請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
Ｒ１〜Ｒ４の１つが、少なくとも２つの同種または別種の糖からなるオリゴ糖である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４５】
前記化合物が、マルトース−Ｍ３Ｎまたはガラクトース−Ｍ３Ｎである、請求項４２記載の組成物。
【請求項４６】
Ｒ１〜Ｒ４がβアミノ酸である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４７】
５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、または５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）プロパノエートを含む、請求項４１記載の組成物。
【請求項４８】
副次的化学療法剤を付加的に含む、請求項４１〜４７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４９】
前記副次的化学療法剤が、ドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンからなる群より選択される、請求項４８記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＮＤＧＡ誘導体と前記副次的化学療法剤のモル比が約２：１から約１００：１である、請求項４８記載の組成物。
【請求項５１】
以下の化学式：
【化７】
2008520548.tif 000033
を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤を含む組成物であって、
式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基を含むか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、
該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している、組成物。
【請求項５２】
前記ＮＤＧＡ誘導体と前記副次的化学療法剤のモル比が約２：１から約１００：１である、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
Ｍ４Ｎまたはマルトース−Ｍ３Ｎ、およびパクリタキセルをモル比約２０：１で含む組成物。
【請求項５４】
Ｍ４Ｎまたはマルトース−Ｍ３Ｎ、およびドキソルビシンをモル比約２．４：１で含む組成物。
【請求項５５】
ＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩と、癌を治療するための副次的化学療法剤との最適な投与量の組み合わせを決定する方法であって、該方法は、
（ａ）さまざまな投与量の該ＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および該副次的化学療法剤の一連の組成物を、癌細胞の培養物に投与する工程、
（ｂ）該細胞の増殖速度を測定する工程、
（ｃ）アイソボログラム法または併用指数法を用いて、該ＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩と該副次的化学療法剤の両方に対する次善の濃度に匹敵する効能を達成するのに最適な併用投与量を決定する工程
を含み、
該ＮＤＧＡ誘導体は、以下の化学式：
【化８】
2008520548.tif 000034
を有し、
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子および１個の酸素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している、
方法。
【請求項５６】
請求項５５記載の最適な投与量の組み合わせを含む組成物。
【請求項５７】
癌を治療するための請求項５６記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞における多剤耐性を防止または逆転させる化合物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（背景の情報）
天然の植物リグナンの合成誘導体であるテトラ−ｏ−メチルノルジヒドログアヤレト酸（テトラ−ｏ−メチルＮＤＧＡまたはＭ４Ｎ）は、ウイルスまたは細胞周期に関連する必須のタンパク質に結合するのではなく、これらの増殖関連遺伝子の転写を変異非感受的に阻止することによって抗ウイルス活性および抗癌活性を有し、Ｍ４Ｎの有効性を長期間利用可能にすることが発見された（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。Ｍ４Ｎは、培養細胞においても、Ｔｈｙ−／Ｔｈｙ−マウスにおける５種類のヒト癌異種移植片（乳癌、ＭＣＦ−７、肝臓癌Ｈｅｐ３Ｂ、結腸直腸癌ＨＴ−２９、前立腺癌ＬＮＣａＰ、および慢性骨髄性白血病Ｋ５６２）においても、ＳＰ１の制御を受けるＣｄｃ２とｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を阻害することができ、その結果、速やかに細胞周期のＧ２／Ｍ期での細胞停止とアポトーシスとを誘発する（非特許文献５，非特許文献６）。このプロセスの最初の段階で、Ｍ４Ｎ処理した癌細胞を、Ｍ４Ｎ存在下で、この遺伝子対の構築物である、ＳＰ１非依存的なＣＭＶプロモーター駆動型構築物によって形質転換すると、これらの細胞は、その複製能と抗アポトーシス能を回復することができる。この発見は、これら２つの遺伝子の転写に対するＭ４Ｎの作用がＳＰ１依存的であるモデルと合致する（非特許文献５）。Ｍ４ＮをＩＰおよびＩＶという経路で注射し、および経口給餌したところ、マウス組織内でのＭ４Ｎの分布および蓄積は選択的であることが分かり、血中の薬剤レベルは極端に低く、しかも一過的に存在するだけであった（非特許文献６）。また、その量は、皮下用、膣内用、およびＩＶ用の処方剤を用いたすべての毒性試験においても、イヌおよびウサギでは辛うじて検出できる程度であった。これまでに実施した毒性試験のすべてで、例えば、シスプラチンやその他の非選択的細胞毒性剤で見られる前駆細胞消失タイプの証拠は観察されなかった。これまでの臨床試験で、Ｍ４Ｎは、胃腸障害、貧血、および脱毛など全身性副作用をもたらしたことはない（６）。
【０００３】
多剤耐性遺伝子１（ＭＤＲ１）は、１７０ｋｄａの膜タンパク質ＡＴＰアーゼＰ−グリコプロテイン（Ｐｇｐ）薬物トランスポーターをコードしている（７）。ＭＤＲ１は、化学療法後に細胞毒性化合物を排出できることで広く知られているＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）ファミリー（８）の一員である（９）。Ｐｇｐタンパク質の基質には、ドキソルビシン（Ｄｏｘ）（アドリアマイシンとしても知られている）、ビンブラスチン、パクリタキセル、ビンクリスチン、およびその他多くの薬剤が含まれる（１０）。最近、ＭＤＲ−１の遺伝子発現の基礎にあるメカニズムが広く研究されている。環境シグナルに応答する高レベルのＭＤＲ−１発現は、ＭＤＲ１プロモーター部位でエンハンスソームの形になって、ユニークなＤＮＡ配列と相互作用する一群の転写因子に依存することが分かった。Ｄｏｘで誘導すると、ＭＤＲ−１の転写が速やかに進行する。このプロセスで、転写因子ＮＦ−Ｙ１がＳＰ１／ＳＰ３に結合して、Ｐ／ＣＡＦヒストンアセチルトランスフェラーゼをＭＤＲプロモーター部位に補充することが示唆されている。ヒストンのアセチル化は、活性型ＭＤＲ１転写に適合する局所的クロマチン構造の形成を一層促進する（１０）。ＭＤＲ１およびＰｇｐの合成を阻害することができる化合物の探索が多くの研究室で活発に進められてきた。例えば、ＮＦ−Ｙ１／ＰＣＡＦ複合体を標的とする化合物ＥＴ−７４３は、ＭＤＲ−１遺伝子の活性化を阻害できることが分かっている（非特許文献７）。ＭＤＲ−１プロモーターのＧＣ要素への結合についてＳＰ１／ＥＧＲ１／ＷＴ１と競合するリプレッサーＫ２−５Ｆは、ＭＤＲ−１発現を顕著に低下させた（非特許文献８）。
【非特許文献１】Ｈｗｕ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｓｅｎｇ，  Ｗ．Ｎ．，  Ｇｎａｂｒｅ，  Ｊ．，  Ｇｉｚａ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄｓ．  １．  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ＨＩＶ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．」  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）４１，  ２９９４−３０００
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ，  Ｈ．Ｓ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｌｉ，  Ｌｉ，  Ｊ．Ｎ．，  Ｐａｒｋ，  Ｒ．，  Ｍｏｌｄ，  Ｄ．，  Ｇｎａｂｒｅ，  Ｊ．，  Ｈｗｕ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｔｓｅｎｇ，  Ｗ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．  「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄｓ．  ２．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ  Ｔｅｔｒａ−ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ＮＤＧＡ．」  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  （１９９８）４１，  ３００１−３００７
【非特許文献３】Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｋｕｏ，  Ｊ．，  Ｗｕ，  Ｔ．Ｃ．，  Ｋａｓｔ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．「Ｔｅｔｒａ−ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−  ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｇ２  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００１）  ６１，  ５４９９−５５０４
【非特許文献４】Ｃｒａｉｇｏ，  Ｊ．，  Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｍ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｄｅｌｕｃｉａ，  Ａ．  「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｌａｎｔ  ｌｉｇｎａｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．」  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（２０００）Ａｌ，  １９−２８
【非特許文献５】Ｃｈａｎｇ，  ＣＣ，  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｋｕｏ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．「Ｔｅｔｒａ−ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｎｏｒｉｄｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ｃｄｃ２  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００４）１０１，  １３２３９−１３２４４
【非特許文献６】Ｐａｒｋ，  Ｒ．，  Ｃｈａｎｇ，  ＣＣ，  Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．Ｃ．，  Ｃｈｕｎｇ，  Ｙ．，  Ｈｅｎｒｙ，  Ｒ．Ａ．，  Ｌｉｎ，Ｅ．，  Ｍｏｌｄ，  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｒ．Ｃ．  「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａ−ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒｓ．」  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００５）  １１（１２）  ４６０１−４６０９
【非特許文献７】Ｓｈｅｎｇｋａｎ，  Ｊ．，  Ｇｏｒｆａｊｎ，  Ｂ．，  Ｆａｉｒｃｌｏｔｈ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔｏ，  Ｋ．  Ｗ．「Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ  ７４３，  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＭＤＲｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２０００）９７，  ６７７５−６７７９
【非特許文献８】Ｘｕ，  Ｄ．，  Ｙｅ，  Ｄ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎｏ，  ＲＸ．  「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ．」  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐａｐｅｕｔｉｃｓ（２００２）３０２，  ９６３−９７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
薬剤耐性は、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、ビンクリスチンなどの細胞毒性薬剤を使用する癌治療に付随する大きな問題の１つである。例えば、Ｄｏｘの長期使用は、ＭＤＲ−１遺伝子の高発現と細胞ＡＴＰアーゼ薬物トランスポータータンパク質Ｐｇｐの蓄積が原因となって、原発性腫瘍と転移性腫瘍において薬剤耐性を生じさせる。Ｐｇｐは、腫瘍細胞から薬物を追い出すように働くため、それが腫瘍増殖を阻害できる場所には薬剤が少ししかないという結果となる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、とりわけ、細胞および生物における薬剤耐性（例えば、多剤耐性）を治療するための組成物、用途、および方法、ならびに細胞または微生物が、１種類以上の化学療法剤または化学療法薬に対する耐性を生じたか、または生じうる癌およびその他の病気を治療するための組成物、用途、および方法を含む。
【０００６】
したがって、本発明は、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を、細胞における薬物トランスポータータンパク質Ｐｇｐの合成および機能を少なくとも１つ阻止するために使用することを含む。
【０００７】
【化９】
2008520548.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む。
【０００８】
また、本発明は、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を、少なくとも１つの副次的化学療法剤と併用して癌を治療することも含む。
【０００９】
【化１０】
2008520548.tif 000004
ただし、式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸残基を含むか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、かつ、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、
該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している。
【００１０】
さらに、本発明は、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を使用して癌細胞における多剤耐性を防止または克服することを含む。
【００１１】
【化１１】
2008520548.tif 000005
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３、Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む。
【００１２】
また、微生物における薬剤耐性を克服する方法であって、該微生物、または該微生物を含む宿主に、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を有効量投与することを含む方法も含まれる。
【００１３】
【化１２】
2008520548.tif 000006
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む。
【００１４】
さらに、本発明は、動物における薬剤耐性感染症を治療する方法であって、該動物に、感染症が耐性をもつ少なくとも１つの治療剤とともに、以下の化学式を有する化合物、またはその生理学的に受容可能な塩を有効量投与すること含む方法を含む。
【００１５】
【化１３】
2008520548.tif 000007
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む。
【００１６】
本発明は、以下の化学式を有する化合物、または該化合物の生理学的に受容可能な塩を含む組成物を含む。
【００１７】
【化１４】
2008520548.tif 000008
ただし、式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、酸素原子を介してフェニル環に結合しているβアミノ酸残基であるか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の−ＣＨ２−基を介してフェニル基に結合している糖残基であり、かつ、残余のＲ基が−ＯＣＨ３である。
【００１８】
さらに、本発明は、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学治療剤を含む組成物を含む。
【００１９】
【化１５】
2008520548.tif 000009
ただし、式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸残基を含むか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、かつ、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、
該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している。
【００２０】
本発明は、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩と癌の治療を行うための副次的化学療法剤との最適な投与量の組み合わせを決定する方法も含む。
【００２１】
【化１６】
2008520548.tif 000010
（ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子および１個の酸素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している）。また、以下の工程を含む。
（ａ）さまざまな用量のＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤からなる一連の組成物を、癌細胞の培養液に投与すること、
（ｂ）細胞の増殖速度を測定すること、
（ｃ）アイソボログラム法または併用指数法を用いて、ＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤の次善の濃度に匹敵する効能を達成するための最適な組み合わせの投与量を決定すること。
【００２２】
本発明の上記の態様やその他の態様を、以下の項および請求項でさらに十分に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
（発明の説明）
本発明は、例えば、テトラ−ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍ４Ｎ）などのノルジヒドログアヤレト酸誘導体を利用して、Ｐｇｐタンパク質の形成および／または機能を停止させる。本発明者らは、Ｍ４Ｎが、Ｄｏｘに誘導されるＭＤＲ遺伝子の発現、Ｐｇｐタンパク質の合成などを阻害し、かつ、薬剤処理された細胞からＤｏｘが「排出」されるのを阻止することを発見した。Ｍ４Ｎ治療は、Ｄｏｘを、細胞周期のＳ期にＴｏｐＩＩ／ＤＮＡを標的とするのにより利用しやすくする。そのため、低濃度のＭ４ＮおよびＤｏｘを相乗作用的に使用して、癌の増殖を調節することができる。
【００２４】
さらに、Ｍ４Ｎおよびその誘導体が、Ｄｏｘに対する強い耐性を既に獲得している細胞株である、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞のヒト乳癌異種移植片を除去するのに極めて有効であることも発見された。Ｍ４Ｎは、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞におけるＣｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの遺伝子発現を阻止し、注目すべきことに、Ｍ４Ｎは、ＭＤＲ１遺伝子の発現を予防することもできる。その他のＮＤＧＡ誘導体も、下記のように、これらの特徴を示すはずである。
【００２５】
本明細書において使用する場合、「ノルジヒドログアヤレト酸誘導体」は、以下の構造の化合物を意味する。
【００２６】
【化１７】
2008520548.tif 000011
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、およびその生理学的に受容可能な塩からなる群より選択されるが、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ同時にＨＯ−ではない。また、この化学式をもつ化合物であって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つが糖残基であり、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるもの、およびその生理学的に受容可能な塩も含まれる。このアミノ酸残基、置換アミノ酸残基または糖残基は、任意で、１〜１０個の炭素原子によって、より普通には１〜６個の炭素原子によって、最も普通には、炭素リンカーに結合した１個の酸素原子とともにフェニル環に結合させることができる。一般的に、このリンカーは、２〜４個の−ＣＨ２−基、例えば、（糖残基）−ＣＨ２−ＣＨ２−（フェニル）を含む。Ｒ１〜Ｒ４は、一定の応用場面（例えば、癌治療）以外では同一でも、異なっていてもよいが、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ同時にＨＯ−になることはできない。Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、糖残基を含むことが好ましい。
【００２７】
置換基として用いられるアミノ酸は、天然型アミノ酸と合成アミノ酸を含む。これらは、とりわけ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、チロキシン、３−メチルヒスチジン、ε−Ｎ−メチルリジン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、アミノアジピン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、Ｎ−メチルアルギニン、およびＮ−アセチルリジンなどである。Ｒ型およびＬ型、ならびにＲ型およびＬ型の混合型のα−アミノ酸が考えられる。さらに置換基となりうるものは、以下により詳細に記載するように、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する２つ以上の−ＣＨ２−基（通常は２〜４個）を有するアミノ酸、およびその誘導体などである。したがって、アミノ酸残基は、α−、β−、γ−、またはより高次のアミノ酸の残基であり、好ましくは、その他の点では天然型アミノ酸と一致するものであろう。アミノ酸残基は、好ましくは、残基中のカルボキシル基に結合した酸素原子を介してフェニル環に結合している。
【００２８】
置換アミノ酸残基、およびアミノ酸の誘導体は、１つ以上の水素原子が、メチル基もしくはその他の直鎖型または側鎖型の低級アルキル基（１〜６個の炭素原子）、硫酸基、またはリン酸基などによって置換されている残基、例えば、アミノ基の上でジメチル置換が行われる残基を含むものである。
【００２９】
水溶液中ではＭ４Ｎの可溶性が限られるため、医薬組成物をより容易に処方または投与するために、同様の特性を有する水溶性化合物がさらに必要とされている。可溶性の改善は、例えば、Ｍ３Ｎをグリコシル化して、Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖、例えば、単糖または二糖である化合物を得ることによって達成することができる。立体構造上の理由から、糖と、フェニル基、通常は２〜４個の−ＣＨ２−基に結合している酸素原子との間に１〜１０個、より普通には１〜６個の炭素原子を含む結合基を含むのが好ましいことが分かっている。有用な糖類の例は、マルトース、ガラクトース、マンノース、フコース、グルコサミン、およびこれらの誘導体であって、糖のＯＨ基が、例えば、Ｏ−メチル基、Ｏ−アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、低級アルキル基、（１〜６個の炭素原子からなる）低級アシル基、リン酸基および／またはスルホ基、あるいは同種または別種の２つ以上の糖からなるオリゴ糖など、別の基によって置換されている誘導体である。このような化合物の例は、Ｒ１またはＲ２がマルトースであり、かつ、残余のＲ基が−ＯＣＨ３である化合物、例えば、下記の化合物などである（それぞれ、ガラクトース−Ｍ３Ｎおよびマルトース−Ｍ３Ｎと名付けられている）。
【００３０】
【化１８】
2008520548.tif 000012
治療されるべき腫瘍は、薬剤耐性、特に、細胞におけるＭＤＲ１遺伝子の存在／過剰発現が原因で生じた薬剤耐性を示す癌性または非癌性腫瘍のあらゆる腫瘍を含む（Ｌｉｎｇ，Ｖ．Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：５３−５８，１９９７）。このような腫瘍は、とりわけ、乳癌、転移性肺癌、原発性黒色腫、卵巣癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫などである。
【００３１】
「癌性腫瘍」という用語は、転移した可能性があるものでも、その可能性がないものでも、あらゆる悪性腫瘍を含もうとするものである。「非癌性腫瘍」という用語は、あらゆる良性の腫瘍を含もうとするものである。これらの用語は、当業者に慣用的に理解されているように使用されている。
【００３２】
本発明の組成物および方法によって治療することができる良性および悪性の腫瘍のさらなる例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｗ．Ｒｕｄｄｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５。これは、参照して本明細書に組み込まれる）の表１−Ｉの中に見出すことができる。治療対象となる腫瘍は、ウイルス起源であることが知られているもの、およびウイルス起源でないものを含む。本発明の組成物および方法は、固形腫瘍の治療に特に有用であると期待される。
【００３３】
「多剤耐性」または「ＭＤＲ」は、その細胞、微生物などを不活性化させるか、または破壊するための１つ以上の治療化合物に対して耐性を示す細胞または微生物など、例えば、ＭＤＲ−１遺伝子の高発現を示すものを意味する。また、「薬剤耐性」という用語も、特定の治療化合物に対して耐性を有することが知られている細胞、微生物などを意味するために使用される。
【００３４】
ＮＤＧＡ誘導体、および該誘導体を含む薬学的組成物を、通常は希釈剤、賦形剤、および担体とともに、局部的（例えば、局所的に、または腫瘍への局所注射によって）、または全身輸送によって（例えば、経口的、腹腔内、静脈内、皮下または筋肉内に）投与することが考えられる。非水溶性誘導体は、腫瘍に注射するのに適した溶剤で、例えば、ＤＭＳＯ溶液の形にして、薬学的組成物に処方することができる。局所投与の別の手段、例えば、腫瘍部位への局所適用または標的化輸送を利用することもできる。
【００３５】
水溶性の化合物または組成物を、いずれかの薬学的に許容される水溶液、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で処方することができる。当技術分野において知られ、かつ用いられているように、ＮＤＧＡ誘導体は、脂質ベースまたは水ベースの全身輸送用処方剤にして使用することもできる。
【００３６】
ＮＤＧＡ誘導体は、非極性化合物として、または遊離酸／塩基の形で、または四塩酸塩の形で、またはその他の生理学的に受容可能な塩の形で用いることができる。
【００３７】
当業者には明白であろうが、本発明の化合物は、他の診断用または治療用の化合物、ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および担体と組み合わせて使用することができる。
【００３８】
「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および担体」は、ＮＤＧＡ誘導体と親和性があって、本発明に従って、動物、特にヒトなどの哺乳動物に局所的または全身的に投与するのに適していることが当業者に知られているような化合物を意味する。経口投与または非経口投与するのに有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，（１９９０）に記載されている、医薬技術分野において周知の方法によって調製することができる。
【００３９】
所望の治療効果を得るために投与される化合物の量は変動するが、当業者によって容易に決定することができる。投与量、投与頻度、および治療期間は、状況、主に、腫瘍のサイズおよびタイプに応じて決まる。典型的な投与量は、患者または被検対象の体表面積の約１０〜１０４μモル／ｍ２、より普通には１０２〜１０３μモル／ｍ２の範囲内にあると考えられる。
【００４０】
ＮＤＧＡ誘導体は、それ自体が有効な抗癌剤であることに加え（米国特許第６，２１４，８７４号、第６，４１７，２３４号、第６，６０８，１０８号）、臨床場面で汎用される多くの細胞毒性薬剤に付随する薬剤耐性の問題を解決することができると考えられる。これらの比較的非毒性の誘導体と、その他の細胞毒性薬剤とを低濃度で一緒に使用することにより、高効率の癌制御を達成することができる。このように、ＮＤＧＡ誘導体は、主要な化学療法剤として、癌性または良性の腫瘍に対する化学療法剤として使用されている多様な細胞毒性薬剤、例えば、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンなどとともに使用することができる。本明細書では、このような付加的化学療法剤を「副次的」化学療法剤と呼ぶことにする。ＮＤＧＡ誘導体と併用する場合、これら副次的化学療法剤は低濃度であるが、高効率を達成するのに十分である。本明細書で使用される「副次的化学療法剤」の意味に含まれる、さらなる汎用化学療法剤の一覧は、Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：ｅ５２−ｅ５９（２００４）の中に見出すことができ、その他の細胞毒性化合物も、当業者に知られていよう。
【００４１】
また、本明細書記載のＮＤＧＡ誘導体は、これらの誘導体を、薬剤耐性遺伝子の存在または過剰発現によって、微生物が耐性を有するようになった薬学的化合物と一緒に投与することにより、耐性のウイルス、細菌、およびその他同様の感染症を治療するために使用することができる。
【００４２】
このように、本発明は、細胞における薬物トランスポータータンパク質Ｐｇｐの合成および機能の少なくとも１つを阻止するために、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体の使用を提供する。
【００４３】
【化１９】
2008520548.tif 000013
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および該誘導体の生理学的に受容可能な塩からなる群より選択されるが、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ同時にＨＯ−ではない。また、この用途には、この化学式を有する化合物であって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の１つが糖残基であり，かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、ならびに該化合物の生理学的に受容可能な塩から選択される化合物も含まれる。このアミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基は、上記したように、任意で、１〜１０個、より普通には１〜６個の炭素原子、および１個の酸素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している。Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基を含むことが好ましい。
【００４４】
アミノ酸残基は、例えば、天然タンパク質の残基、またはその誘導体、あるいはアミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸の残基、またはその誘導体であってもよい。一つの実施態様においては、テトラ−ｏ−メチルノルジヒドログアヤレト酸（Ｍ４Ｎ）が使用される。化学作用による誘導は、例えば、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、およびビンクリスチンなどの化学療法剤によって引き起こすことができる。細胞は、例えば、腫瘍細胞でもよく、あるいは感染性微生物、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、または真菌などでもよい。
【００４５】
Ｐｇｐの合成および機能は、例えば、化学作用による誘導を阻害すること、ＭＤＲ１の転写を阻止すること、および／または細胞におけるＰｇｐの合成を阻止することによって防止することができる。この細胞は、例えば、腫瘍細胞でもよく、または細菌、ウイルス寄生生物、もしくは真菌などの感染性微生物であってもよい。
【００４６】
同様に、本発明は、細胞における薬剤トランスポータータンパク質Ｐｇｐの合成および機能の少なくとも１つを阻止するための方法であって、上記したＮＤＧＡ誘導体の１つの有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。
【００４７】
また、上記した誘導体は、癌を治療するために、１つ以上のその他の化学療法剤と併用することもできる。これらの副次的化学療法剤は、例えば、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、またはビンクリスチンであってよい。約２：１〜約１００：１、より頻繁には約１０：１〜５０：１（例えば、２０：１）というＮＤＧＡ誘導体対副次的化学療法剤の具体的な比率は、各薬剤の最小用量に対して最適な結果をもたらすため、特に有益であることが分かっている。これに関連して、「約」とは±２５％、すなわち、例えば、２０：１の比に関しては、１５：１〜２４：１の比を意味するものである。
【００４８】
したがって、上記したＮＤＧＡ誘導体が、癌細胞における多剤耐性を防止または克服するのに有用であること、および本発明が、ＭＤＲを防止または克服するために、有効量の上記ＮＤＧＡ誘導体を癌細胞に投与することを含む、癌細胞における多剤耐性を克服するための方法および使用を提供することは明らかである。薬剤耐性は、例えば、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、ビンクリスチン、および癌を治療するのに使用されるその他の薬剤に対する耐性であろう。
【００４９】
このように、本発明は、癌を治療するために、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、およびその生理学的に受容可能な塩を、副次的化学療法剤とともに投与することを含む、癌の治療法も提供する。
【００５０】
【化２０】
2008520548.tif 000014
ただし、式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−を有するアミノ酸残基を含むか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１〜１０個の炭素原子および１個の酸素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している。
【００５１】
このような副次的化学療法剤は、例えば、Ｄｏｘ、ビンブラスチン、パクリタキセル、および／またはビンクリスチンであろう。癌は、ヒト癌、例えば、乳癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫であってもよく、または非ヒト動物、特に哺乳動物の癌であってもよい。
【００５２】
また、本発明は、微生物における薬剤耐性を克服する方法であって、該微生物、または該微生物を含む宿主に、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩を有効量投与することを含む方法を提供する。
【００５３】
【化２１】
2008520548.tif 000015
ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨＯ−、ＣＨ３、Ｏ−、ＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、および糖残基からなる群より選択され、該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基は、任意で、１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合しているが、ただし
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ酸残基または置換アミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含む。
【００５４】
この微生物は、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物または真菌であろう。
【００５５】
したがって、本発明は、また、動物における薬剤耐性感染症を治療する方法であって、上記したようなＮＤＧＡ誘導体の有効量を、該感染症が耐性を示す、少なくとも１つの薬剤（例えば、抗生物質）とともに該動物に投与することを含む方法を提供する。感染症は、例えば、ウイルス性、細菌性、寄生虫性、または真菌性の感染症であろう。
【００５６】
また、本発明は、上記の目的のために使用される化合物および組成物も提供する。具体的には、本発明は、以下の化学式を有する化合物、または該化合物の生理学的に受容可能な塩を提供する。
【００５７】
【化２２】
2008520548.tif 000016
ただし、式中、
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、酸素原子を介してフェニル環に結合しているβ−、γ−またはより高次のアミノ酸残基を含むか、または
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の−ＣＨ２−基を介してフェニル基に結合している糖残基であり、かつ、
残余のＲ基が−ＯＣＨ３である。
【００５８】
本発明のこの態様の一つの実施態様において、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つは、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の−ＣＨ２−基を介してフェニル環に結合している、β−、γ−またはより高次のアミノ酸残基である。残余のＲ基は、例えば、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−またはＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−であってもよい。別の実施態様において、Ｒ１〜Ｒ４の１つは糖成分であり、かつ残余の基は、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−またはＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択される。
【００５９】
一つの実施態様において、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つはβ−アミノ酸であり、かつ残余のＲ基はＣＨ３Ｏ−である。β−およびγ−アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基の間に、それぞれ２個または３個のＣＨ２−基を有するアミノ酸を意味する。一つの実施態様において、β−およびγ−アミノ酸残基は、それぞれ、アミノ酸基とカルボキシル基の間に存在する、１個または２個の付加的ＣＨ２−基を有する天然アミノ酸に相当する。
【００６０】
一つの実施態様において、Ｒ１〜Ｒ４の１つは、単糖または二糖、例えば、ガラクトースまたはマルトースである。これらのタイプの誘導体の例は、上記したようにマルトース−Ｍ３Ｎおよびガラクトース−Ｍ３Ｎ、マルトース−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｍ３Ｎ、ならびにガラクトース−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｍ３Ｎである。
【００６１】
本発明の化合物のさらなる例は、５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、および５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）プロパノエートである。
【００６２】
本発明のこれら、およびその他の化合物を、任意で、副次的化学療法剤、抗生物質、および／または薬学的に許容される賦形剤または担体とともに処方して、組成物にすることができる。この点に関して、ＮＤＧＡ誘導体とその他の化学療法剤の一定の組み合わせを、例えば、約２：１〜約１００：１、例えば、２０：１という特定のモル比にして、この２つの化合物にとって次善最適濃度がもつ所定の相乗効果によって最適に輸送できることが分かっている。したがって、一つの実施態様では、本発明の薬学的組成物を、例えば、２．４：１、２０：１、５０：１など、好ましい比率に処方する。
【００６３】
したがって、本発明には、また、以下の化学式を有するＮＤＧＡ誘導体、またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤を含む組成物が含まれる。
【００６４】
【化２３】
2008520548.tif 000017
ただし、式中
ｉ）Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つが、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有するアミノ酸残基を有するか、または、アミノ基とカルボキシル基の間に少なくとも２つの−ＣＨ２−基を有する置換アミノ酸残基を含み、かつ、残余のＲ基が、独立して、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択されるか、または、
ｉｉ）Ｒ１〜Ｒ４の１つが糖残基を含み、残余のＲ基が、ＨＯ−、ＣＨ３Ｏ−、およびＣＨ３（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−から選択され、
該アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、または糖残基が、任意で、１個の酸素原子および１〜１０個の炭素原子からなるリンカーによってフェニル環に結合している。
【００６５】
本発明の別の態様は、ＮＤＧＡ誘導体とその他の化学療法剤の上記したような有益な比率を決定する方法、および、これらの比率で、ＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤を含む組成物を提供する。この方法は以下の工程を含む。
（ａ）さまざまな用量のＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤からなる一連の組成物を、癌細胞の培養液に投与する工程；
（ｂ）該細胞の増殖速度を測定する工程；
（ｃ）アイソボグラム法または併用指数法を用いて、ＮＤＧＡ誘導体またはその生理学的に受容可能な塩、および副次的化学療法剤の次善最適濃度と同等の効率を達成するための最適な併用投与量を決定する工程；および
（ｄ）最適な用量を含む組成物を処方する工程。
【００６６】
好ましくは、最適に処方した組成物を、治療を必要としている患者に投与する。
【００６７】
例えば、マルトース−Ｍ３ＮまたはＭ４Ｎとパクリタキセルとの最適の組み合わせは、３２０μモル／ｍ２：１６μモル／ｍ２であることが分かっている。
【００６８】
本出願は、参照されて本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６０／６１６，１１４号に対する優先権を主張するものである。
【実施例】
【００６９】
ここで、以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照しながら、本発明をさらに詳しく説明してゆく。
【００７０】
以下の実施例は、Ｍ４Ｎおよびその他のＮＤＧＡ誘導体が、Ｓｐ１の制御を受けるＭＤＲ−１遺伝子発現を阻止することにより、Ｐｇｐの合成を調節できることを証明するものである。その結果、Ｍ４Ｎが、ＭＤＲ−１遺伝子のＤｏｘによる誘導を阻止し、ＭＣＦ−７細胞の薬剤感受性を維持する上で有効であることが示されている。Ｍ４ＮおよびＤｏｘは、ＭＣＦ−７細胞の増殖を抑制するのに相乗効果を示した。さらに、Ｍ４Ｎ処理の後、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞における細胞増殖、ＭＤＲ遺伝子発現、およびＰｇｐタンパク質合成はすべて大きく低下した。なお、実施例には、ＮＤＧＡ誘導体と副次的化学療法剤の併用は相乗的であり、インビボにおける腫瘍増殖を抑制するのに非常に効果的であることが示されている。
【００７１】
（実施例１）
（Ｍ４Ｎ処理は、培養液、およびＴｈｙ−／Ｔｈｙ−マウスの異種移植片においてＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞の細胞増殖を阻止する）
（方法）
ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８から入手可能なヒト乳癌細胞株）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と、抗生物質であるペニシリンおよびストレプトマイシンとを含む５００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１．５×１０４細胞／ウェルになるよう、２４穴プレートの中に播種した。翌日、さまざまな濃度のＭ４Ｎを加えた。さらに３日間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイ法により細胞増殖を測定した。異種移植実験では、５〜６週齢のメスの無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の脇腹の皮下に（ｓ．ｃ．）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した２×１０６個のＭＣＦ−７細胞または２×１０６個のＮＣＩ／ＡＤＲ細胞（Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃ，ＭＤから入手した）を埋め込んだ。腫瘍が６〜７ｍｍの平均直径を示したら、滅菌したフードボールに入れたＭ４Ｎ（ボール１個あたり、約３００ｍｇのＭ４Ｎを２．５ｍｌの加熱したコーンオイルの中に入れ、９グラムの基本混合粉末（Ｈａｒｌａｒ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｏ．）、２．０ｍｌのＨ２Ｏと混合したもの）を餌としてマウスに与えた。これらのマウスを、６％のＣｒｅｍａｐｈｏｒ  ＥＬ、６％エタノール、および８８％生理食塩水に溶解したＭ４Ｎを与える処理群と、溶媒のみを与える対照群とに振り分けた。この振分けは、対照群と実験群ともに、同じようなサイズの腫瘍をもつマウスを含むように行った。２ｍｇのＭ４Ｎを含む１００μＬの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射液をマウスに毎日１回ずつ３週間投与した。対照用マウスには、等量の賦形剤を投与した。２箇所の垂直方向の寸法（ＬおよびＷ）を７日間毎に１回測定し、次の公式に従って腫瘍の容積を計算した：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ／２）３×π／６。各マウスからの結果を合わせて、平均腫瘍体積を決定した。腫瘍体積の平均誤差の統計的有意性をスチューデントのｔ検定で評価した。
【００７２】
（結果）
図１に示すように、Ｍ４Ｎは、ＭＣＦ−７およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳの細胞増殖を、培養液（図１Ａ）においても、腫瘍異種移植片（図１Ｂ）においても阻害することができた。Ｍ４Ｎは、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳの増殖よりも、ＭＣＦ−７の増殖をより効果的に阻害した。７２時間以内に全細胞を停止させるには、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳでは４０μＭのＭ４Ｎが必要であったが、ＭＣＦ−７細胞では２０μＭのＭ４Ｎだけで十分であった。また、Ｍ４Ｎによって、どちらのタイプの異種移植片の腫瘍サイズも、Ｍ４Ｎを毎日ＩＰ注射するか、あるいは、フードボールにＭ４Ｎを添加して経口給餌して２１日間全身治療した後には非常に小さくなった（図１Ｂ）。
【００７３】
（実施例２）
（Ｍ４Ｎ処理の後、ＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞において、Ｃｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの発現は大きく抑制される）
（方法）
表示されたＭ４Ｎ処理濃度で処理した後、ＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞の単層をＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＥＧＴＡを用いて回収した。洗浄した細胞を沈殿させ、プロテアーゼインヒビター混合液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶解した。タンパク質の濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質濃度測定溶液を用いて測定した。２５マイクログラムのタンパク質を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、半乾性電気ブロット装置を用いて、ハイボンド増感化学発光（ＥＣＬ）ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に電気ブロットした。ウサギポリクローナル一次抗体は、Ｃｄｃ２（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｄｕｃｔｓ，カタログ番号ＤＯ４４３１−１）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ、カタログ番号ＳＣＢＴ１０８１１）、およびサイクリンＢ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号ＳＣＢＨ−４３３）に対するもの、および、マウスポリクローナル一次抗体アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号ＳＣ−８４３２）を、最終濃度０．２μｇ／ｍｌで用いた。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧであった。フィルターをＥＣＬウエスタンブロット検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像した。タンパク質のバンドを検出するために、化学発光フィルターを、Ｘ線フィルムに対向して置いた。
【００７４】
（結果）
腫瘍増殖に対する効果（図１）に加えて、Ｍ４Ｎ処理は、ＭＣＦ−７細胞（図２Ａ）およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞（図２Ｂ）において、Ｃｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの遺伝子発現を大きく阻害した。Ｍ４Ｎ（１５μＭ）処理の３日後、ＭＣＦ−７細胞では、９５％よりも高いＣｄｃ２の阻害と、６０％よりも高いｓｕｒｖｉｖｉｎの阻害が起きた。また、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞では、Ｃｄｃ２もｓｕｒｖｉｖｉｎも、Ｍ４Ｎ（４０μＭ）処理の２日後には大きく阻害された（図２Ｂ）。
【００７５】
（実施例３）
（ＭＤＲの誘導および発現に対するＭ４Ｎ）
（方法）
細胞培養および薬剤添加
ヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７をＡＴＣＣから入手した。多剤耐性細胞株であるＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳを、ＤＴＰヒト腫瘍細胞株スクリーン（ＤＴＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｃｒｅｅｎ）（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＣＩ）から入手した。どちらの細胞株も、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および抗生物質であるペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で維持した。ＮＤＧＡ誘導体であるＭ４Ｎは、既述したように（１、１３）合成した。Ｍ４Ｎおよびパクリタキセル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の保存液をジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製して、ＤＭＳＯの最終濃度が１パーセントになるよう細胞培養液に加えた。Ｄｏｘの水性保存液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を調製して、増殖培地で希釈する前にフィルター滅菌した。
【００７６】
細胞毒性アッセイ法
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳを、１ウェルあたり２×１０４細胞の濃度になるよう、２４穴プレートの中に播種し、２４時間後、増殖培地にＭ４Ｎ、Ｄｏｘ、パクリタキセル、またはＭ４ＮをＤｏｘまたはパクリタキセルと併用したものを加えた。Ｍ４Ｎは、１．５から４８μＭの濃度で使用した。Ｍ４ＮとＤｏｘを併用する場合には、２．４：１（Ｍ４Ｎ：Ｄｏｘ）という一定のモル比を用い、Ｍ４Ｎとパクリタキセルでは、比率は２０：１（Ｍ４Ｎ：パクリタキセル）であった。薬剤を加えてから３日後に、ＳＲＢアッセイ法（１４）で、パワーウェーブ（Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ）２００マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で測定した５４０ｎｍおよび６９０ｎｍ（参照）における吸光度を用いて細胞毒性を測定した。
【００７７】
薬剤相互作用の評価
５０％有効性原理に基づく、ＣｈｏｉとＴａｌａｌａｙの併用指数（ＣＩ）アイソボログラム法（１６，１７，１８，１９）を用いて、併用薬剤効果の相乗性と拮抗性を計算した。単独および併用した各薬剤に対する用量効果曲線を、５０％有効性の等式およびプロット（１８，２０）およびＣＩの等式およびプロット（１９）を用いて連続希釈濃度でプロットした。さまざまな効果と用量におけるＣＩ値とアイソボログラムは、コンピュータソフトウエアＣｏｍｐｕＳｙｍを用いて自動的に生成させた（２０）。この方法では、相加的、相乗的、または拮抗的効果が、それぞれ、１、＜１、および＞１と表示される。各単独の薬剤と、併用した場合の薬剤についての所定の効果レベルに到達するのに必要とされる用量の比率を比較することを用いて減量指数（ＤＲＩ）を決定した。
ＲＴ−ＰＣＲ
トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、製造業者のプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムを、プラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに用いて行い、以下のプライマーを用いて行った：
ＭＤＲ１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー：
【００７８】
【化２４】
2008520548.tif 000018
およびＧＡＰＤＨに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー：
【００７９】
【化２５】
2008520548.tif 000019
ＲＴ−ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、エチジウムブロマイドで染色した。バンドの相対的強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって定量した。
【００８０】
ウエスタンブロッティング
培養細胞を、ＰＢＳ中１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＥＧＴＡの溶液の中でインキュベートした後、テフロン（登録商標）細胞スクレーパーで掻き取って回収した。この細胞を、沈殿させて、プロテアーゼインヒビター混合液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含む改変ＲＩＰＡ培地［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］の中で溶解させた。遠心分離によってライセートを清澄化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によってタンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質試料を分離し、半乾性電気ブロッティング装置を用いて、ハイボンド増感化学発光（ＥＣＬ）ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に電気ブロットし、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の取扱説明書の記載に従って検出した。使用した抗体は、ＰｇｐおよびサイクリンＢに対するウサギポリクローナル一次抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。バンドの相対的強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアで測定した。
【００８１】
ローダミン１２３流出アッセイ法
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞を、０、１．２５、２．５、３．７５、および５．０μＭのＭ４Ｎ存在下で培養した。３日後、トリプシン処理によって細胞を回収し、同じ培地であって、１．０μｇ／ｍｌのローダミン１２３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むものの中に５．０×１０６細胞／ｍｌの濃度になるよう再懸濁した。３７℃で１時間インキュベートした後、ローダミンを載荷した細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、出発時のＭ４Ｎ濃度をもつ培地に再懸濁した。流出相で、１５分毎に５．０×１０５の細胞を回収して、氷冷ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁して、励起波長４８５ｎｍ、および発光波長５３５ｎｍでの蛍光定量法で解析を行った。
【００８２】
（結果）
Ｍ４Ｎと、化学療法剤のＤｏｘおよびパクリタキセルとの併用効果の評価
Ｍ４Ｎ、Ｄｏｘ、およびパクリタキセルは、単剤として、または併用した場合に、多剤耐性ヒト乳癌細胞株ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳの増殖を用量依存的に阻害した。Ｍ４Ｎについての平均ＩＣ５０値は８．６７μＭであったが、Ｄｏｘおよびパクリタキセルの平均ＩＣ５０値は、それぞれ３．２２μＭおよび３．２６μＭであった（表１）。Ｄｏｘおよびパクリタキセルに対するＩＣ５０値は、薬剤感受性のヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ−７でこれらの２つの薬剤について報告されているＩＣ５０値が１３０ｎＭおよび６．４ｎＭであるため、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞が示すＭＤＲ表現型の指標となる（１０）。逆に言うと、本発明者らの以前の実験（５）から得られたＭＣＦ−７に対するＭ４ＮのＩＣ５０値は約７μＭであり、薬剤耐性細胞株に対するＩＣ５０値とほぼ同じであった。ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞において併用して用いる場合、Ｍ４ＮとＤｏｘは、５．６３＋２．３４μＭというＩＣ５０値を示した。Ｍ４Ｎとパクリタキセルを併用した場合には、ＩＣ５０値は３．３１＋０．１７μＭであった（表１）。
【００８３】
（表１．ヒト多剤耐性乳癌細胞における、Ｍ４Ｎの単独、およびドキソルビシンまたはパクリタキセルと併用した場合の用量−効果の関係）
【００８４】
【表１】
2008520548.tif 000020
ａＤｍ、５０％有効用量（細胞増殖を５０％阻害する、マイクロモル／リットルで表した濃度）
ｍ、用量−効果曲線の形（ｍ＝１、双曲線；ｍ＞１、Ｓ字曲線；ｍ＜１、逆Ｓ字曲線）
Ｒ、５０％有効プロットの線形相関係数
ｂＣＩ、併用指数（ＣＩ＜１、相乗効果；ＣＩ＝１、相加効果；Ｃ＞１、拮抗効果）
ｃＤＲＩ、用量減少指数（薬剤を単剤として、および併用して使用した場合に、所定の阻害程度をもたらすのに必要とされる用量を比較して測定される）。
【００８５】
アイソボログラム法および併用指数法という２つの方法を用いて、Ｍ４ＮとＤｏｘまたはパクリタキセルとの間に相乗関係があるか否かを判定した。増殖を９０％（Ｆａ＝０．９）、７５％（Ｆａ＝０．７５）、および５０％（Ｆａ＝０．５）阻害するのに必要な、Ｍ４ＮおよびＤｏｘの用量、ならびにＭ４Ｎおよびパクリタキセルの用量についてアイソボログラムを構築した。どちらの薬剤併用例に対する実験データポイントも、これらの値のそれぞれについて期待された相加効果のラインよりも低い薬剤濃度となり、Ｍ４Ｎと２つの副次的化学療法剤との間には強い相乗関係（すなわち、ＣＩ＜０．３）があることを示した（図３）。さらに、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの５０％有効性解析法（１９）を用いて、この２つの薬剤併用例について併用指数（ＣＩ）を計算した。Ｍ４ＮとＤｏｘを併用すると、高用量レベル（ＥＤ９０およびＥＤ９５）で非常に強く相乗的（ＣＩ＜０．１）であったが、Ｍ４Ｎとパクリタキセルは、全ての用量範囲にわたって強い相乗性があった（ＣＩ＝０．４１〜０．１４）（図３〜５、表１）。
【００８６】
用量減少指数（ＤＲＩ）によって、相乗的組み合わせとなる各薬剤にとって何倍の減量が可能かを決定する。用量の減量は、所望の効能を維持しつつ毒性を低下させるため重要である。それらの相乗作用の結果、ＤＲＩは、各薬剤についてかなりの減量を示した（表１）。ＤＲＩは、７５％のＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞の増殖を阻害するのに必要なＤｏｘの濃度（ＥＤ７５）を６．４７倍減らすことができること、すなわち、１１．３μＭのＭ４Ｎと同時投与することによって３０．５μＭから４．７μＭに減らすことができ、また、ＥＤ９５では、８７．６倍減らすことができることを示していた。同様に、パクリタキセルのＥＤ５０では、１９．６３倍、およびＥＤ９５では３００．３倍減らすことができた。
【００８７】
（表２．ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ異種移植物の増殖に対する、Ｍ４Ｎ、マルトースＭ３Ｎ、およびパクリタキセルの単独、および併用した場合の効果）
【００８８】
【表２】
2008520548.tif 000021
（実施例４）
ＭＤＲ１遺伝子発現およびＰ−糖タンパク質量のＭ４Ｎによる阻害
次に、本発明者らは、多剤耐性細胞で見られるＭ４Ｎと、Ｄｏｘおよびパクリタキセルとの間の相乗作用が、ＭＤＲ表現型が逆転した結果であるか否かを判定するために、ＭＤＲ１遺伝子発現に対するＭ４Ｎの効果を調べた。本発明者らは、Ｍ４Ｎが、Ｓｐ１の結合を阻害できることを介して、ＭＤＲ１の遺伝子発現を下方制御しているのかもしれないと考えた。この可能性を調べるために、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞を、０、５、１０および２０μＭのＭ４Ｎに３日間曝露し、その後、ＭＤＲ１のｍＲＮＡおよびＰｇｐの量について、全ＲＮＡおよび全タンパク質を調べた。２０μＭのＭ４Ｎで処理した後、細胞におけるＭＤＲ１のｍＲＮＡの量は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化した後の未処理群の３６．３％にまで低下していた（図６Ａ）。また、Ｐｇｐの量も減少し、その存在量が、２０μＭのＭ４Ｎに３日間曝露した後の対照量の１７．８％にまで減少していた（図６Ｂ）。さらに、５μＭのＭ４Ｎに３日間曝露したときには、Ｐｇｐが２１．８％減少した。このＰｇｐ量をサイクリンＢ１に対して標準化したが、その発現は、本発明者らの以前の結果によれば、Ｍ４Ｎの影響を受けない（４、５）。
【００８９】
その結果、Ｍ４Ｎは、多剤耐性細胞におけるＭＤＲ１  ｍＲＮＡおよびＰｇｐの構成的発現を阻害することによって、ＭＤＲ表現型を逆転しうることを示唆している。
【００９０】
（実施例５）
化学療法の後に耐性を獲得する細胞の能力に対するＭ４Ｎの効果
次に、本発明者らは、Ｍ４Ｎを用いて、細胞が化学療法を受けた後に耐性を獲得することを防止することができるか否かを調べた。ＭＤＲ１の遺伝子発現は、薬剤感受性のヒト乳癌細胞株を低用量のＤｏｘに曝露すると誘導される。本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞を、０．５μＭのＭ４Ｎ存在下または不在下で、０．０５μＭのＤｏｘで２日間処理し、ＭＤＲ１  ｍＲＮＡとＰｇｐの相対量を測定した。Ｍ４Ｎ不在下でＤｏｘによって処理したところ、ＭＤＲ１  ｍＲＮＡもＰｇｐも測定可能な程度の発現が誘導された（図７）。ＭＣＦ−７細胞では、Ｄｏｘに曝露しないと、ＭＤＲ１発現を検出することができなかった。しかし、Ｍ４Ｎによる併用処理によって、ＭＤＲ１発現の誘導は無効になった（図７）。
【００９１】
（実施例６）
多剤耐性細胞におけるローダミン１２３流出に対するＭ４Ｎの効果
多剤耐性細胞からのＤｏｘおよびパクリタキセルの流出はＰｇｐによってもたらされる。Ｐｇｐの基質であるＲｈ−１２３を用いて、薬剤流出に対する、Ｍ４ＮによるＰｇｐの下方制御の効果を調べた。ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞を、０、１．２５、２．５、３．７５および５．０μＭのＭ４Ｎ存在下で３日間インキュベートした。そして、細胞にローダミン１２３を載荷し、洗浄して、Ｍ４Ｎの存在下または不在下で流出させた。流出期間中、１５分間隔で１時間、細胞に結合したＲｈ−１２３の量を測定した。未処理の耐性細胞では、Ｅ５０（細胞によって５０％のＲｈ−１２３が保持されるまでの時間）は約１２分であった（図８）。１．２５、２．５、３．７５および５．０μＭのＭ４Ｎで細胞を処理すると、Ｅ５０が、それぞれ１２．５、１２．５、１５、および２０分に増加した。薬剤流出がゆっくりになることに関するこれらの結果は、Ｍ４Ｎによって細胞におけるＰｇｐ量が減少することと矛盾しない。
【００９２】
（実施例７）
糖置換されたＭ４Ｎ誘導体
本発明者らは、Ｍ４Ｎの３’位および４’位にあるメチル基をマルトース分子で置換して、新規の水溶性Ｍ４Ｎ類似体であるマルトースＭ３Ｎを合成した。インビトロおよびインビボにおける５種類のヒト癌細胞株に対するマルトースＭ３Ｎの抗癌活性を評価した。Ｃｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの発現に対するその阻害効果も調べた。
【００９３】
（方法）
マルトース−Ｍ３Ｎの合成
Ｍ３Ｎを、Ｍ４Ｎ合成からの副産物として得、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した（１）。Ｍ３Ｎ（０．４７ｇ）およびオクタ酢酸β−マルトース（１．８５ｇ）（２１、２３）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶解して、三フッ化ホウ素エーテル酸（２．０ｍｌ）で３〜４時間処理した。過剰な三フッ化ホウ素を分解した後、この有機溶液を、重炭酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムの冷却溶液で洗浄し、シロップ液になるまで蒸発させ、９５％ＥｔＯＨに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（５×２００ｃｍ）のカラムでクロマトグラフィーを行った。クロマトグラフィーによって、過剰量の酢酸マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、および未反応のＭ３Ｎ（未反応のＭ３Ｎは、別の回のマルトシル化（ｍａｌｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）に再利用することができる）から生成物を分離した。マルトシル化Ｍ３Ｎ（固体）を、触媒量のナトリウム・メトキシド入りの無水メタノール中で脱アセチル化し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ｘ８（水素型）を用いてのナトリウム・メトキシドを除去する。メタノール溶液を蒸発させて固体生成物を得た。最終の単離収率は、開始時におけるＭ３Ｎの３５〜４０％であったが、未反応のＭ３Ｎを再グリコシル化することによって、収率を６０％以上の上げることが可能である。
【００９４】
当業者には分かるとおり、出発化合物を適当に変えつつこの方法を用いて、ガラクトースＭ３Ｎおよびその他の糖類誘導体を作成することができる。このような化合物を、その有効性について、上記および下記に記載した方法を用いて試験することができる。
【００９５】
細胞培養およびマルトース−Ｍ３Ｎ処理
ヒト腫瘍細胞株をＡＴＣＣ（Ｍａｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂを、１０％ＦＢＳを添加したイーグルＭＥＭで維持し、ヒト乳癌細胞株であるＭＣＦ７を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで増殖させ、ヒト結腸直腸癌細胞株のＨＴ２９を、１０％ＦＢＳを含むマッコイ５ａ培地で培養し、ヒト前立腺癌細胞株のＬＮＣａｐを、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で維持し、また、ヒト赤白血病細胞株のＫ５６２を、１０％ＦＢＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）の中で増殖させた。すべての培養液には、抗生物質のペニシリンとストレプトマイシンが含まれていた。ＥＪｒａｓ形質転換Ｃ５７Ｂ１６（Ｂ６）マウス胚細胞を全長ＨＰＶ１６でトランスフェクションしてＣ３細胞株を作成した。Ｃ３細胞は、５％ＦＢＳにペニシリンとストレプトマイシンを加えたものを添加したＩＭＤＭの中で増殖および維持した。
【００９６】
細胞培養実験には、マルトース−Ｍ３Ｎを１０ｍＭの濃度になるように溶解した後、濾過滅菌した。細胞を、完全培地の中で１ｃｍ２当り約２×１０３細胞数になるよう播種した。播種してから２４時間後、増殖培地を除去して、所望の濃度のマルトース−Ｍ３Ｎを含む培地と置換した。
【００９７】
細胞生存率
２００００個の細胞を、２４穴プレートの各ウェルに播種した。２４時間後、培地を、さまざまな濃度のマルトース−Ｍ３Ｎを含む新しい培地と交換した。３日間インキュベートした後、培地を、５００μｇのＭＴＴ、５％ＦＢＳ、およびＰＢＳに溶かした１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＭＴＴ溶液に変えた。インキュベートしてから２時間後、ＭＴＴ溶液を除去して、１ウェル当り５００μｌのＤＭＳＯで置換した。可溶化した色素を９６穴プレートに移して、ＥＬＩＳＡ読み取り装置を用いて、５４０ｎｍの波長で読み取った。
【００９８】
ウエスタンブロッティング
所望の薬剤インキュベーション時間の後、培地を回収し、単層培養細胞をテフロン（登録商標）ポリスマンで掻き取って、ＰＢＳ中１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＥＧＴＡの溶液の中に入れた。細胞を沈殿させ、改変ＲＩＰＡ培地［５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および１％プロテアーゼインヒビター混合液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）］の中で溶解させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質濃度アッセイ溶液を用いてタンパク質抽出物を定量し、−８０℃で保存した。ウエスタンブロットのため、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、半乾性電気ブロッティング装置を用いて、ハイボンド増感化学発光ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に電気ブロットし、増感化学発光キットの取扱説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の記載に従って検出した。使用した抗体は、Ｃｄｃ２、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、およびβ−アクチンに対するウサギポリクローナル一次抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ−二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。
【００９９】
マウスにおけるＣ３細胞に誘導された腫瘍のマルトース−Ｍ３Ｎ処理
４匹のＣ５７ｂ１／６マウスの肩の間の皮下に、５×１０５個のＣ３細胞を接種した。約２０日間、腫瘍を発生させた。そして、マウスに、０．１ｍｌの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶かした１０ｍｇ、２０ｍｇ、または４０ｍｇのマルトース−Ｍ３Ｎの注射液を毎日腫瘍内に注射した。処理した４日後、マウスを安楽死させて、腫瘍を切り出し、直ちに固定してから、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドに保存した。そして、Ｃｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎに対する抗体を用いて組織学および免疫組織学を行うために組織試料をＰａｒａｇｏｎ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）に送った。
【０１００】
（結果）
ヒト腫瘍に対するマルトース−Ｍ３Ｎのインビトロおよびインビボにおける抗癌活性
マルトース−Ｍ３Ｎの増殖阻害作用を、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＴ２９、Ｋ５６２、ＬＮＣａＰ、およびＭＣＦ７を含む５種類のヒト癌細胞株において評価した。細胞を３日間マルトース−Ｍ３Ｎに曝露したところ、調べた細胞株のすべてで、細胞の生存率が用量依存的に減少し、ＩＣ５０値が２０μＭから４０μＭという結果となったが、これは、Ｍ４Ｎで観察されたパターンと非常によく似ていた（図９Ａ）。マルトース−Ｍ３Ｎで処理したＨｅｐ３Ｂの核のＤＡＰＩ染色を行って、アポトーシス小体の核凝縮を同定し（図９Ｂ）、かつ、アポトーシスによって起こるマルトース−Ｍ３Ｎに関連した細胞死を確認した。
【０１０１】
Ｃｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの遺伝子発現のマルトース−Ｍ３Ｎによる阻害
マルトース−Ｍ３Ｎが、Ｃｄｃ２タンパク質およびｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の産生能力を抑制するか否かを調べるために、細胞培養液を増殖阻害用量のマルトース−Ｍ３Ｎに曝露し、処理の２４および７２時間後にタンパク質を抽出した。タンパク質試料のウエスタンブロット解析の結果、処理細胞ではＣｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎのタンパク質発現が低下することが示された。Ｍ４Ｎと比較すると、マルトース−Ｍ３Ｎは、同様のＣｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎのタンパク質発現に対する阻害を示した（図１０）。
【０１０２】
インビボ抗腫瘍活性
マルトース−Ｍ３Ｎのインビボにおける抗腫瘍効果に関する予備試験において、さまざまな濃度のマルトース−Ｍ３Ｎを含む腫瘍内注射液を１日１回ずつ４日間にわたってＣ３腫瘍に投与した。この処理後、マウスを安楽死させ、写真を撮り、組織試料をＨ＆Ｅ、Ｃｄｃ２、およびｓｕｒｖｉｖｉｎの染色によって解析した。処理された腫瘍の色は、対照に較べて濃く見えた。この変色は、Ｈ＆Ｅ染色によって明らかにされるアポトーシスおよび壊死の量が上昇することと関係していた。また、処理された腫瘍では、対照腫瘍と比較して、Ｃｄｃ２タンパク質およびｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の両方とも発現量が低下していることを示した（図１１）。
【０１０３】
（実施例８）
ヌードマウスにおけるＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ耐性乳癌異種移植片に対するＭ４Ｎまたはマルトース−Ｍ３Ｎおよびパクリタキセルの併用療法
（方法）
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ多剤耐性乳癌異種移植片をもつヌードマウスを、Ｍ４Ｎとパクリタキセルとの相乗作用をさらに調べるための併用療法のモデルとして使用した。
【０１０４】
５〜６週齢のメスのＴ細胞欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入して、無菌室で飼育した。マウスを含むすべての実験は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って行った。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した１×１０６個のＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞をマウスの両脇腹の皮下に移植した。腫瘍が２〜４ｍｍの平均直径を示したら、マウスを無作為に、Ｍ４Ｎまたはマルトース−Ｍ３Ｎを単独で投与されたか、パクリタキセルとの併用したものを投与された処理群（各群あたり７匹のマウス）、溶媒単独に振り分けた。腹腔内（ｉ．ｐ．）投与をするには、Ｍ４Ｎ、マルトース−Ｍ３Ｎ、およびパクリタキセルを、２０％（ｖ）無水エタノール、２０％（ｖ）クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＦＬ、ＰＥＧ３００、＜１１％（ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む、最近開発された還元（ｒｅｄｕｃｅｄ）クレモフォール溶液に溶解した（２２）。各薬剤または併用剤について、０．０５ｍｌの連日注射を行った。
【０１０５】
腫瘍を、２箇所の垂直方向の寸法で７日間毎に１回測定し、次の公式に従って腫瘍の容積を計算した：
腫瘍体積＝（ａ２×ｂ）／２、
ただし、式中、ａは腫瘍の幅（小さい方の直径）であり、ｂは長さ（大きい方の直径）である（２３）。各処理群について、平均腫瘍体積および標準誤差を計算した。Ｖが一定の時点における平均腫瘍体積であり、Ｖ０が０日目の平均腫瘍体積である相対的平均腫瘍体積（Ｖ／Ｖ０）（２３）を測定し、以下の等式を使用して腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）を測定した：
Ｔ／Ｃ（％）＝処理されたものの相対的平均腫瘍体積／対照の相対的平均腫瘍体積×１００。
【０１０６】
抗腫瘍活性に対する最低レベル（Ｔ／Ｃ≦４２％）に関するＮＣＩの基準を採用した。実験を終えたら、腫瘍を切り出してホルムアルデヒドで固定した。そして、ヒトＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）に対する抗体を用いて組織学および免疫組織学を行うために、組織試料をＰａｒａｇｏｎ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓに送った。
【０１０７】
Ｍ４Ｎおよびパクリタキセルの２種類の用量を、どちらも２０：１（Ｍ４Ｎ：パクリタキセル）という一定のモル比で、インビトロ試験により表１に示したように相乗作用ありと判定されたところにしたがって採用した。パクリタキセルの８および１６μモル／ｍ２という用量は、別の実験（２２）から得られた値に基づく準最大量であり、Ｍ４Ｎの１６０および３２０μモル／ｍ２という用量は、本発明者らが、以前、ＭＣＦ−７乳癌異種移植片を用いて行った実験（５）で使用した最大耐量を減らして得た。さらに、ＮＤＧＡ誘導体も試験した。マルトース−Ｍ３Ｎは、Ｍ４Ｎの水溶性の代替物質として開発されたものであるが、整合性を図るため、本実験では、Ｍ４Ｎとパクリタキセルと同じ還元クレモフォール溶媒系に溶解した。溶媒だけを投与した対照マウスでは、外植された腫瘍は、２週間の処置期間にわたって目に見えて大きくなり、平均腫瘍体積はほぼ３倍の大きさになった（表２）。また、腫瘍増殖は、準最大用量のＭ４Ｎ（３２０μモル／ｍ２）、パクリタキセル（１６μモル／ｍ２）、またはマルトース−Ｍ３Ｎ（３２０μモル／ｍ２）のいずれかで処理したマウスでも顕著であり、２週間後の相対的な平均腫瘍体積は、それぞれ１．３３、１．５９、および１．２５であった。しかし、Ｍ４Ｎとパクリタキセル、またはマルトース−Ｍ３Ｎとパクリタキセルの併用剤で処理したマウスでは、最終的な相対的平均腫瘍体積が１よりも小さくなって、腫瘍サイズが全体に小さくなったことを示した（表２）。さらに、それぞれの薬剤併用用量に対する腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ）値は、すべて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの基準（２４）による抗腫瘍活性の最小レベルである≦４２％よりも小さくなった。
【０１０８】
処置期間の最初と終わりの体重を記録して、マウスの健康と快適さを評価した。用量のそれぞれについて、体重の平均変化量は小さく（−０．９＋１．３）、対照群の変化量と有意には差がなかった（表２）。平均体重の減少を示した僅か２つの処理群は、Ｍ４Ｎおよびパクリタキセルの高用量単剤群であった（それぞれ−０．２および−０．９）。いずれの群にも死亡と記録されたマウスはいなかった。相乗作用のある薬剤の併用療法の利点は、化学療法剤を準最大用量で使用できる点にある。このことは、体重の安定性および死亡率が０であることで示されているように、この治療法の毒性が低下したことに反映されている。
【０１０９】
（実施例９）
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳヒト乳癌異種移植片腫瘍におけるＰ糖タンパク質量のＭ４Ｎおよびマルトース−Ｍ３Ｎによる阻害
薬剤耐性乳癌異種移植片の増殖を阻害する、Ｍ４Ｎとパクリタキセルの間にある明らかな相乗作用の根本にあるメカニズムを調べるために、Ｐｇｐの存在について腫瘍を解析した。実施例８の処理群のそれぞれから採取した異種移植腫瘍の生検の組織切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色するか、Ｐｇｐ特異的抗体を用いて免疫化学的に染色した。対照群の腫瘍切片は、ほとんどの腫瘍細胞の表面で、Ｐｇｐに対する強固な茶色の抗体による染色を示した（図１２）。パクリタキセルで処理された腫瘍においても同様のパターンが見られた。これに対し、Ｍ４ＮおよびマルトースＭ３Ｎで処理された腫瘍は、Ｐｇｐタンパク質の量が減少したことと一致して抗体染色の劇的な低下を示した。Ｍ４Ｎとパクリタキセルを併用して処理した腫瘍では、Ｈ＆Ｅ染色によって中央部にいくらか壊死を伴う腫瘍の緩解と、Ｐｇｐ抗体染色が見られないという結果になるはずである（図１２）。マルトース−Ｍ３Ｎ／パクリタキセル処理された腫瘍でも、同様にＰｇｐ量が低下した。
【０１１０】
（実施例１０）
長鎖アミノ酸を含むＮＤＧＡ誘導体
Ｒ１〜Ｒ４が少なくとも１つの「長鎖」アミノ酸置換基を含むＮＤＧＡ誘導体、およびその誘導体（上記にて定義されている）も有用であると期待される。このような置換基は、アミノ基とカルボキシル基の間に存在する少なくとも２個（通常は２〜４個）の−ＣＨ２−基を有する。これらの化合物の誘導体は、とりわけ、アミノ基がジメチル置換をもつ化合物、例えば：
５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート
【０１１１】
【化２６】
2008520548.tif 000022
５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）プロパノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）プロパノエート
【０１１２】
【化２７】
2008520548.tif 000023
このような誘導体は、当業者が日常的な方法によって作成することが可能である。例えば、以下の手順を、出発物質を適当に代えながら用いて、別の類似誘導体を得ることができる。
【０１１３】
５−（（２Ｓ，３Ｒ）−４−｛３，４−ビス［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル｝−２，３−ジメチルブチル）−２−［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（メソ−２，３−ジメチル−１，４−ビス｛３，４−ビス）［４−（ジメチルアミノ）ブタノイルオキシ］フェニル｝ブタン）（スキーム１参照）
ＮＤＧＡ（１．０５ｇ、３．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）および４−（ジメチルアミノ）酪酸塩酸（ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（３．４８ｇ、２０．７６ｍｍｏｌ、６．０当量）のジクロロメタン（１０ｍｌ）の溶液に、ＤＣＣ（４．２８ｇ、２０．７６ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＤＭＡＰ（４２２．７ｇ、３．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この反応混合液を、窒素下室温で２４時間撹拌した。反応混合液中のジシクロヘキシルウレアを濾過して排除した後、得られた溶液を減圧下で濃縮した。そして、アセトン（２５０ｍＬ）を残留物に加えて、得られた溶液を、良質な（ｅｘｃｅｌ）ＨＣｌ（ｇ）で泡立てた。沈殿物を水に溶解し、室温のアセトンで２回再沈殿させ、産物を白色の固体にした。
【０１１４】
多くの注意と資源が、アジュバント化学療法を行った後に生じうる複数の抗癌剤に対する耐性を逆転させることに向けられてきた。第一世代のＭＤＲ拮抗剤は、Ｐｇｐにも結合する薬理学的活性化合物であった。これらの薬剤は、臨床使用するには毒性が強すぎるというその他の薬理学的な性質があるため、結局のところうまく行かなかった。本発明者らは、Ｍ４Ｎおよびその他のＮＤＧＡ誘導体が、多剤耐性癌細胞におけるＭＤＲ表現型を逆転させ得ることを明らかにした。Ｍ４Ｎおよびその他のＮＤＧＡ誘導体は、他に例を見ないほど、Ｄｏｘやパクリタキセルなどの化学療法剤に対して細胞を再感作させるという仕事をするのに適している。さらに、本発明の化合物は、Ｄｏｘによって誘導されるＭＤＲ１の遺伝子発現を阻害することもできるため、化学療法の初期段階で投与すれば、ＭＤＲの発生を予防するのに有用であるのにちがいない。これらの知見は、癌治療するために有用ないくつかの戦略をもたらす。例えば、癌が複数の抗癌剤に対して耐性になった患者を、癌細胞のＭＤＲ表現型を逆転させるために本発明の化合物で治療し、その後、もとの化学療法剤など（例えば、Ｄｏｘまたはパクリタキセル）で再治療することができる。さらに、本発明の化合物を低用量で最初のアジュバント化学療法計画に加えて、ＭＤＲが発生するのを予防することができる。
【０１１５】
Ｄｏｘは、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ複合体の形になっている新たに合成されたＤＮＡを標的とする効果的な細胞毒性薬剤である（２５、２６）。単独で投与すると、Ｄｏｘは、最初はＭＣＦ−７の増殖を抑制するのに極めて効果的であるが、Ｄｏｘ耐性を避けることができない。本発明者らは、低濃度のＭ４Ｎを用いて、Ｄｏｘ感受性ＭＣＦ−７細胞においても、Ｄｏｘ耐性ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞においても、ＭＤＲ−１の遺伝子発現を抑制することができることを明らかにした。ＭＤＲ−１の遺伝子産物であるＰｇｐタンパク質は、Ｄｏｘなどの細胞毒性薬剤を排出できることが一般に知られている。上記に詳しく説明した結果では、Ｍ４Ｎ処理の後Ｐｇｐを除去できることが示されている（図６）。Ｐｇｐが存在しなければ、より多量のＤｏｘを、その細胞毒性を必要とする部位で使用できるはずである。
【０１１６】
ＭＤＲ遺伝子の発現を抑制することに加えて、Ｍ４Ｎは、細胞周期のＧ２／Ｍ期に、独立して細胞増殖の制御を行う。ＮＤＧＡ誘導体は、協同して作用する別の抗癌剤とともに、薬剤耐性の発生および宿主毒性を結果としてもたらすことなく、転移性腫瘍の増殖を抑え続けるという際立った利点を提供するはずである。
【０１１７】
本明細書で引用した特許文献および刊行物はすべて、参考として本明細書に援用される。
【０１１８】
【化２８】
2008520548.tif 000024
【０１１９】
【化２９】
2008520548.tif 000025
【０１２０】
【化３０】
2008520548.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ＭＣＦ細胞およびＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞の増殖に対するＭ４Ｎ処理の効果。Ａ．培養液中。Ｂ．Ｔｈｙ−／Ｔｈｙ−マウスの異種移植片中。
【図２】ＭＣＦ−７細胞およびＮＣＩ／ＡＤＲ細胞におけるＣｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの産生に対するＭ４Ｎ処理の効果−ウエスタンブロット解析。
【図３】ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞における、Ｍ４Ｎ、Ｄｏｘ、パクリタキセル、およびこれらを併用したものの用量効果曲線。Ａ．Ｍ４Ｎとドキソルビシン（Ｄｘ）を単独および併用したとき。Ｂ．Ｍ４Ｎとパクリタキセル（Ｐｘ）を単独および併用したとき。Ｘ軸は、薬剤の用量をμモル／リットルで表し、ｙ軸はＦａ、すなわち、影響を受けた細胞の画分（増殖阻害）。
【図４】ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞において、Ｍ４ＮをＤｏｘまたはパクリタキセルと併用したときの解析。Ａ．さまざまな影響量（Ｆａ）における、Ｍ４Ｎとドキソルビシン（Ｄｘ）を併用したときのアイソボログラム。Ｂ．さまざまな影響量（Ｆａ）における、Ｍ４Ｎとパクリタキセル（Ｐｘ）を併用したときのアイソボログラム。
【図５】ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞において、Ｍ４ＮをＤｏｘまたはパクリタキセルと併用したときの解析。Ａ．Ｍ４Ｎとドキソルビシン（Ｄｘ）を併用したときのＣＩプロット。Ｂ．Ｍ４Ｎとパクリタキセル（Ｐｘ）を併用したときのＣＩプロット。
【図６】ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳヒト乳癌細胞におけるＭＤＲ１遺伝子発現およびＰｇｐ量に対するＭ４Ｎの影響。Ａ．０、５、１０および２０μＭのＭ４Ｎで３日間処理した細胞から得た全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって生成されたＭＤＲ１およびＧＡＰＤＨ（標準化対照）のｃＤＮＡのアガロースゲル解析。結果を、ＧＡＰＤＨに対して標準化した棒グラフの形にした。Ｂ．０、５、１０および２０μＭのＭ４Ｎで３日間処理した細胞におけるＰｇｐおよびサイクリンＢ１（標準化対照）のタンパク質量のウエスタンブロット解析。結果を、サイクリンＢ１に対して標準化した棒グラフの形にした。
【図７】ＭＣＦ−７細胞におけるドキソルビシンによるＭＤＲ１遺伝子発現の誘導に対するＭ４Ｎの影響。ＭＣＦ−７細胞を、５μＭのＭ４Ｎの存在下または不在下で、０．０５μＭのドキソルビシンで２日間処理するか、未処理の状態に置き、その後、ＭＤＲ１の遺伝子発現、およびＰｇｐタンパク質の量について全ＲＮＡおよびタンパク質を解析した。Ａ．ＲＴ−ＰＣＲによって生成されたＭＤＲ１およびＧＡＰＤＨ（標準化対照）のｃＤＮＡのアガロースゲル解析。ＳＴＤ、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞由来のｃＤＮＡ。Ｂ．ＰｇｐおよびサイクリンＢ１（標準化対照）のタンパク質量のウエスタンブロット解析。ＳＴＤ、ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞由来のタンパク質の解析結果。
【図８】ローダミン１２３のＰｇｐ介在による流出の阻害。０、１．２５、２．５、３．７５および５．０μＭのＭ４Ｎ存在下で３日間インキュベートしたＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞を、ローダミン１２３を保持することができるかについて調べた。細胞中に残留したローダミン１２３のパーセント割合を時間に対してプロットした。
【図９Ａ】（Ａ）ヒト腫瘍細胞株の増殖に対するマルトースＭ３Ｎの効果。ＨＴ２９、ＬＮＣａＰ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｋ５６２、およびＭＣＦ７をさまざまな濃度のマルトースＭ３Ｎで７２時間処理した。細胞の生存率（パーセント）をＭＴＴアッセイ法によって測定して、３回反復データ点の平均値±ＳＤで表した。
【図９Ｂ】（Ｂ）未処理Ｈｅｐ３Ｂ細胞、または６０μＭのマルトースＭ３Ｎで７２時間処理したものをＤＡＰＩで染色した。矢印はアポトーシス小体を示す。
【図１０】ヒト腫瘍細胞におけるＣｄｃ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の発現に対するマルトースＭ３Ｎの効果。対照細胞［Ｃ］、または２４時間および７２時間マルトースＭ３Ｎ［Ｍ］に曝露した細胞から全タンパク質抽出物を調製し、ウエスタンブロット解析法によりＣＤＣ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎの量を解析した。βアクチンを泳動量対照として用いた。
【図１１】Ｃ３腫瘍のアポトーシス、ならびにＣＤＣ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎのタンパク質量に対する腫瘍内マルトースＭ３Ｎの効果。表記された濃度のマルトースＭ３Ｎまたはプラセボ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を４日間毎日腫瘍内注射して処理したマウスから腫瘍を切り出した。固定した腫瘍を切片にして、Ｈ＆Ｅ染色法、ならびにＣＤＣ２およびｓｕｒｖｉｖｉｎに特異的な抗体を用いた免疫化学解析法によって解析した。
【図１２】ヌードマウスにおけるＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ乳癌異種移植腫瘍のＰｇｐタンパク質量に対する、Ｍ４ＮおよびマルトースＭ３Ｎ（Ｍａｌ−Ｍ３Ｎ）を単独、またはパクリタキセル（Ｐｘ）と併用した場合の効果。Ｍ４Ｎ（３２０μモル／ｍ２）、Ｍａｌ−Ｍ３Ｎ（３２０μモル／ｍ２）、またはＰｘ（（１６μモル／ｍ２）を単独または併用したもので２週間毎日ｉ．ｐ．注射されて処理されたマウスから得たホルムアルデヒド固定された腫瘍を切片にして、Ｈ＆Ｅ染色法、ならびにヒトＰｇｐに特異的な抗体を用いた免疫化学染色法によって解析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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