(57)【要約】  薬物感受性腫瘍、手術不能腫瘍、乏血管性腫瘍および多剤耐性腫瘍のような腫瘍を、マイクロエマルジョンおよび重合体ミセル被包された生物学的活性薬剤を含む組成物の静脈内注射または直接的な腫瘍内注射によって治療するための方法および組成物が記載される。この方法および組成物にはまた、注射時にin situでマイクロバブルに転換するマイクロエマルジョンも含まれる。開示された方法は、超音波などのミセル崩壊方法を適用することが含まれてもよい。注射時にin situでマイクロバブルを生じるマイクロエマルジョンの流れを用いて、組織中での薬剤の投与をイメージングする方法論もまた、開示される。この方法および組成物にはまた、注射時に、キャビテーション核として、in situでマイクロバブルを生じるマイクロエマルジョンの使用を通じた腫瘍治療の増強が含まれる。この方法および組成物はまた、細胞内薬物送達を高めるのに有用である。
2008542293.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンの混合物中に被包された薬剤を腫瘍中に注射することを含む、腫瘍を治療する方法。
【請求項２】
腫瘍が乏血管性腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が多剤耐性腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が手術不能腫瘍である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が：
薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンを注射した後の腫瘍部位において、前記薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンを崩壊するための手段を適用することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項６】
薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンの崩壊をするための前記手段が超音波照射を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロエマルジョンが注射時にin situでマイクロバブルを形成する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記薬物が、ドキソルビシン、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、5-フルオロウラシル、ベツリン酸、アムホテリシンB、ジアゼパム、ナイスタチン、プロポフォール、テストステロン、エストロゲン、プレドニゾロン、プレドニゾン、2,3-メルカプトプロパノール、プロゲステロン、およびこれらの混合物を含む生物学的に活性な薬剤の、一または複数の群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が：
腫瘍を治療することができ、薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンの混合物に被包された薬剤を静脈内に注射することを含む、
腫瘍を治療する方法。
【請求項１０】
前記マイクロエマルジョンが注射時にin situでマイクロバブルを形成する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
組織への注射時にマイクロバブルに転換できるマイクロエマルジョンを調製すること；
薬物キャリアを調製すること；
薬物キャリア中へ少なくとも1種類の薬剤を被包すること；
マイクロエマルジョンを薬物キャリアと混合して、組成物を形成すること；および
被検体の少なくとも1つの腫瘍中、または腫瘍付近に組成物を注射し、したがってマイクロバブルを形成し、そして前記腫瘍を治療治療すること；
を含む、腫瘍を治療する方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの腫瘍の部位において、薬物キャリアおよびマイクロバブルを崩壊する手段を適用すること
をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
薬物キャリアおよびマイクロバブルを崩壊する前記手段が超音波照射を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記超音波照射が約100 kHzから約10 MHzで行われる、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記超音波照射が約0.5から約7 MPaの陰圧で行われる、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬物キャリアがポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）共重合体から形成された重合体ミセルである、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬物キャリアがポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（L−ラクチド）のジブロック共重合体から形成された重合体ミセルである、請求項11に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬物キャリアがポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（カプロラクトン）のジブロック共重合体から形成された重合体ミセルである、請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロエマルジョンが、パーフルオロペンタンと、ポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（L−ラクチド）、ポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（D,L−ラクチド）、ポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（カプロラクトン）、およびポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）共重合体からなる群から選択される少なくとも1つの共重合体から構成される、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
組織または循環器へマイクロエマルジョンを注射することを含み、前記マイクロエマルジョンはパーフルオロペンタンと薬物キャリアとを含み、また注射時にin situでマイクロバブルを形成し、またさらに前記マイクロエマルジョンはさらに薬剤を含み；および
超音波イメージャーを用いて前記マイクロエマルジョンを可視化すること；
を含む、組織への薬剤を導く方法。
【請求項２１】
前記薬剤は薬物キャリアにも被包される、請求項20または25に記載の方法。
【請求項２２】
薬物キャリアを調製すること；
少なくとも1つの細胞を含む組織への注射時にマイクロバブルに転換できるマイクロエマルジョンを調製すること；
薬物キャリア中に少なくとも1種類の薬剤を被包すること；
組成物を形成するためにマイクロエマルジョンを薬物キャリアと混合すること；および
組織に組成物を注射すること、および
組織において薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンを崩壊するための手段を適用して、少なくとも1つの細胞への前記薬物の送達を増強するようにすること、
を含む、細胞への薬物の送達を増強する方法。
【請求項２３】
薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンを崩壊する前記手段が、超音波照射を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記マイクロエマルジョンが少なくとも1つのパーフルオロ炭素化合物を含む、請求項1、9、11、20、22または27に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも1つのパーフルオロ炭素化合物および薬物キャリアを含み、そして注射時にin situでマイクロバブルを形成し、さらに薬剤をも含むマイクロエマルジョンを組織に注射すること；および
超音波イメージャーを用いて前記マイクロエマルジョンを可視化すること；
を含む、組織への薬剤を導く方法。
【請求項２６】
前記マイクロエマルジョンがナノ粒子を含む、請求項1、9、11、20、22、25または27に記載の方法。
【請求項２７】
組織への注射時にマイクロバブルに転換できるマイクロエマルジョンを調製すること；
薬物キャリアを調製すること；
薬物キャリアおよびマイクロエマルジョンの混合物中に少なくとも1種類の薬剤を被包し、そして組成物を形成すること；
被検体の少なくとも1つの腫瘍、または腫瘍付近に組成物を注射し、その結果マイクロバブルを形成し、そして前記腫瘍を治療すること；
を含む、腫瘍を治療する方法。
【請求項２８】
前記マイクロエマルジョンおよび／または前記薬物キャリアが少なくとも1種類の増強剤を安定剤として含む、請求項1、9、11、20、22、25または27に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が無菌である、請求項11、22または27に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬物キャリアがポリ（エチレングリコール）−co−ポリ（D,L−ラクチド）のジブロック共重合体から形成された共重合体ミセルである、請求項11に記載の方法。
【請求項３１】
超音波照射が体外、腔内または間質に適用される、請求項6、13または23に記載の方法。
【請求項３２】
超音波イメージャーが体外、腔内または間質に適用される、請求項20または25に記載の方法。
【請求項３３】
薬物キャリアが重合体ミセル、ミセル、リポソーム、ナノエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノシェル粒子およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項1、9、11、20、22、25または27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
35 U.S.C. §119（e）に基づく関連出願
本出願は、2005年5月23日付出願の米国仮出願番号60/683,829、「超音波増強ナノ粒子媒介性薬物送達のためのエコー形成性マイクロバブルおよびマイクロエマルジョン」の利益を主張し、その全ての内容は本明細書中に参考文献として援用されている。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究・開発の記載
本明細書中に記載された成果は、NIHグラント（National Institute of Health Grant）RO1 #EB 1033により支援された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する場合がある。
【０００３】
技術分野
本発明は、例えば静脈内注射または腫瘍内注射をすること、および任意的に超音波を照射することによって行われる、薬物装填ミセルまたは他のナノ粒子と混合された薬物装填マイクロバブルの腫瘍への送達を通じた、生物工学および医学に関し、およびより具体的には腫瘍のイメージングおよび治療に関する。
【０００４】
背景
乏血管性腫瘍、薬物感受性腫瘍、多剤耐性腫瘍については、化学療法剤の静脈内、全身性注射は効果的でなく、これは化学療法剤が腫瘍体積全体に達しないためであることがこれまでに観察されている。いくつかの腫瘍型において、多剤耐性は、薬物を腫瘍細胞から排出させるタンパク質ポンプの作用によるものであり；他の腫瘍型においては、腫瘍へ供給される血液量が十分でないために腫瘍細胞への薬物送達が不十分となる。
【０００５】
「重合体ミセル」は当該技術で公知である。（例えば、米国特許第6,649,702号、米国特許第6,338,859号および米国特許第6,623,729号を参照、これらのそれぞれの内容は参考文献として本明細書中に援用される）。重合体ミセルはコアーシェル構造を有し、これは標的細胞への輸送中にミセル内の含有物を保護する。「ミセル」は水溶液中に凝集する、石けん様分子のクラスタである。石けん様分子は親水性で極性のあるイオン性の頭部、および「脂肪性の」疎水性の炭素鎖の尾部を持つ。水により溶媒和されると、分子の極性頭部は微粒子の外側に位置し、炭素鎖の尾部はミセル球の内側に集合する。重合体ミセルは薬物キャリアまたは送達ビヒクルとして提唱されている（Bader, H. et al., Angew. Makromol. Chem. 123/124:457-485, 1984参照）。重合体ミセルは疎水性薬物の効率的なキャリアであり、それは両親媒性モノマーの疎水基が薬物を可溶化し、ミセルの内部コアに薬物を被包するためである。重合体ミセルは、比較的サイズが小さいこと（数10ナノメートルから数100ナノメートル）、および細網内皮系による排除を回避する傾向があるなどの様々な利点を提供する。
【０００６】
同様の両親媒性化学物質であるリポタンパク質も、化学療法的化合物の標的化および送達のためのビヒクルとして提唱されており、それは腫瘍が低密度リポタンパク質（「LDL」としても知られる）を強く必要とするためである。しかしながら、キャリアとしてのリポタンパク質の効率には疑問が呈されており、その理由として、薬物を取り込んだリポタンパク質が、正常細胞によっても認識されるために、間違った細胞への薬物送達を生じる結果を招きうるためであり、そしてLDLが腫瘍の受容体部位に対する、天然のリポタンパク質と競合せざるを得ないためである。
【０００７】
重合体ミセルを取り巻く最近の医薬品研究は、A-Bジブロック構造を持つ共重合体の使用の可能性について焦点が当てられており、ここでAは親水性のシェル部、Bは疎水性のコア部を表している。ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（「PEO-PPO-PEO」）のような、マルチブロックA-B-A共重合体は、ミセル内で自己組織化することも出来、可能性のある薬物キャリアとして記載されている（Kabanov, A.V. et al., FEBS Lett., 258:343-345, 1989参照）。ポリ（β-ベンジル-Lアスパラギン酸）（「PBLA」）、ポリ（D,L-乳酸）（「PDLLA」）またはポリ（ε-カプロラクトン）（「PCL」）などの生分解性重合体からなる疎水性コアは、疎水性薬物のリザーバとして機能して、周囲の水との接触から保護している。コアはまた、ポリ（アスパラギン酸）（「P（Asp）」）のような水溶性、親水性重合体から構成されてもよく、疎水性薬物の化学的抱合により疎水基とされるか、または、ポリイオン複合体ミセル中で見られるような2つの逆の電荷を持つポリイオンの会合を通じて形成される。
【０００８】
生分解性重合体ミセルの調製の研究は、親水性シェルの形成のためのPEGの利用に焦点が当てられている（X. Zhang, X., et al, Inter. J. Pharrn., 132:195-206, 1996; Yokoyama, M., et al., J. Control. Release, 55:219-229, 1998およびAllen, C, et al., J. Control. Release, 63:275-286, 2000参照）。
【０００９】
ポリ（N-ビニル-2-ピロリドン）（「PVP」）は、脂質基本骨格中の無極性メチレン基、および環内のメチン基によって囲まれた高極性ラクタム基を有する、水溶性、生体適合性、両親媒性の重合体である。PEGと対照的に、PVPは非イオン性およびイオン性の共存溶質に対する相互作用の多様性を示す（Molyneux, P., Proc. Int. Symp. Povidone, 1-19, 1983参照）。結合は、長いアルキル基鎖または芳香族部分を有する分子と最も著しく生じる。PEGと同様、PVPもin vivoにおけるコロイド性キャリアおよびペプチド／タンパク質の循環時間を増加されることが出来る（例えば、Kamada, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 257:448-453, 1999; Torchilin, V. P., J. Microencapsulation, 15:1-19, 1998参照）。その上、ポリ（D,L-乳酸）およびPEGのジブロック共重合体を含むナノ粒子は凍結乾燥後に凝集することが示されている（De Jaeghere, F. et al., Pharm. Res., 16:859-866, 1999参照）。この問題は、PVPのような、溶解保護材の使用によって回避出来る。
【００１０】
N-ビニルピロリドン（「VP」）は、広範囲のビニルモノマーと共重合されてもよい。VPが電気陰性モノマーと反応する場合、VPは交互共重合体（alternating copolymers）を形成する。アクリル酸塩と共役したVPは、ランダムな共重合体を生じるであろう。例えば、ポリ（L-ラクチド）（「PLLA」）およびPVPで構成されたグラフト共重合体が調製された（Eguiburu, J. L., et al., J. San Roman, Polymer, 37:3615-3622, 1996参照）。
【００１１】
いくつかの研究は、内側のコアの成分としてのポリスチレンまたはポリ（メタクリル酸メチル）（「PMMA」）のような、難生分解性重合体または非生分解性重合体の使用についてさらに述べている（例えばZhao, C. L. et al., Langmuir, 6:514-516, 1990; Zhang, L. et al., Science, 268:1728-1731, 1995およびInoue, T. et al., J. Controlled Release, 51:221- 229, 1998参照）。薬物キャリアとしての臨床的な価値を考慮するためには、非生分解性重合体は無毒であること、かつ腎排泄をするのに十分に低い分子量を有することが必要である。このような非生分解性重合体の疎水性の内側コアは、アルキル鎖のような高疎水性短鎖、またはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（「DSPE」）のようなジアシル型の脂質、から構成されてもよい。疎水性鎖は重合体の一端に結合されるか、または重合体構造中にランダムに分布されてもよい。非生分解性重合体ミセルの外側シェルは、ミセルの安定化および、プラズマタンパク質と細胞膜との相互作用を担っている。このようなミセルは、PEOのような、親水性、非生分解性、生体適合性重合体の鎖から構成されてもよい。このようなキャリアの体内分布は、主に親水性シェルの化学的アイデンティティによって調査されている。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（「PNIPA」）およびポリ（アルキルアクリル酸）のような重合体は、ミセルに対して温度またはpH感受性を与え、生体付着性質をもたらすように使用されてもよい。標的部との抱合のため、表面に官能基を提示するミセルもまた知られている（例えばScholz, C. et al, Macromolecules, 28:7295-7297, 1995参照）。
【００１２】
重合体ミセルを崩壊させる方法には、例えば、温熱性エネルギーの適用、超音波の照射、またはpHの変更が含まれる（米国特許第5,955,509号および米国特許第6,649,702号を参照、その内容は本明細書中に援用されている）。
【００１３】
発明の開示
一部の手術不能の癌性腫瘍は、全身化学療法に高い抵抗性を示す。いくつかのケースでは、高い抵抗性は多剤耐性（「MDR」）遺伝子またはMRP遺伝子によってコードされる、薬物流出ポンプの作用による。他のケースでは、腫瘍体積に供給される血液量が少ないために、薬物抵抗性が生じる。このような腫瘍を治療する一つの方法は、化学療法剤を患部に直接注射することである。しかしながら、この方法は、腫瘍の正確なイメージングおよび腫瘍体積のみへの化学療法剤の効率的な送達のような、他の障壁が存在する場合がある。
【００１４】
本発明は、癌化学療法の2つの主な合併症：毒性薬物の重篤な副作用および薬効に対する癌細胞の抵抗性、を克服することを保証する。本発明の裏にある理論的根拠は、ミセルまたは他のナノ粒子中に被包された薬物が、全身での遊離薬物の濃度を減少し、正常細胞による細胞内への薬物取り込みを少なくし、また腫瘍血管の異常な透過性によって増強された浸透効果および保持効果（EPR）経由での腫瘍間質への受動的な薬物標的化を提供することである（例えば、S.K. Hobbs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 4607-4612参照）。腫瘍への薬物標的化は正常組織での望まれない薬物相互作用を減少させる（例えばK. Kataoka et al., Adv. Drug Deliv.Rev. 47 (2001) 1130-1144; G.S. Kwon et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 16 (1995) 295-309; K. Kataoka et al., J. Control. ReI. 64 (2000) 143-153参照）。腫瘍間質でのミセルまたはナノ粒子の蓄積時に、腫瘍細胞による効率的な細胞内薬物の局所的な取り込みが、腫瘍への治療用の超音波照射によって引き起こされる（例えば、米国特許第6,649,702号で、この内容は本明細書中に参考文献として援用されている）。超音波照射は、腫瘍細胞への薬物流入の増加を結果として生じ、このことが流出ポンプの研究によって生じた薬物抵抗性の克服を手助けする（例えば、Rapoport, N. (2003) Controlled Drug Delivery to Drug- Sensitive and Multidrug Resistant cells: Effects of Pluronic Micelles and Ultrasound. in: Advances in Controlled Drug Delivery. ACS Symposium Book Series, ed. S. Dinh and P. Liu, Washington DC, 2003, pp. 85-101参照）。乏血管性腫瘍においては、超音波誘導されたシリンジ針による直接的な薬物注射により、腫瘍への薬物送達が可能となっており、その際にこの治療用超音波を照射された腫瘍は薬物拡散を高め、腫瘍細胞へのより一定の薬物送達を生じる（例えば、Gao et al., J. Control. Release 102 (2005) 203-221参照）。
【００１５】
特に、例えば、薬剤または腫瘍を治療するのに有用な、一種類または複数種類の薬剤を含むマイクロバブルおよび重合体ミセル（ジブロック共重合体またはトリブロック共重合体またはこれらの混合物の水溶液で形成される）の、静脈内注射または直接的な腫瘍内注射による腫瘍の治療についての方法と組成物が、本明細書中に開示される。本明細書中に開示される方法および組成物は、手術不能の薬物感受性腫瘍および／または薬物耐性腫瘍、乏血管性腫瘍、およびより具体的には手術不能の乏血管性腫瘍の治療に特に有用である。開示された腫瘍内送達方法はまた、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌および皮膚癌のような、明確に定義された原発病巣を伴う腫瘍の治療に有用である。本明細書中に示されるように、腫瘍の完全な治癒は、本明細書中に開示される方法および組成物を用いることによって達成する可能性がある。その上、本明細書中で開示されるこれらの方法および組成物は、乏血管性腫瘍などの上述の限定的ではない例に限定されない。これらの方法および組成物は、無数の異なる腫瘍への幅広い治療に適用され、また容易に適応されてもよいが、しかし特に、薬物流出ポンプをコードするMDRまたはMRP遺伝子の発現によって抵抗性を生じうるMDR腫瘍の治療に有用である可能性がある。
【００１６】
本発明のさらなる態様には、特に、超音波のような、一種類または複数種類のミセル崩壊テクノロジーの使用がさらに含まれる。超音波は、体外、腔内または間質に照射されてもよい。超音波照射のモード、は腫瘍の位置に依存的して決定することが出来る。超音波は、本明細書に記載された実施例で開示されるように、体外から照射されてもよい。HIFU（high intensity focused ultrasound：高密度集束型超音波）療法（腫瘍切除）は、体外の超音波トランスデューサを用いる。しかしながら、超音波はまた、内視鏡アプリケータ経由で腔内に照射されることも出来、または特別にデザインされたニードルアプリケータ経由で間質に照射されることも出来る。これらのアプリケータは市場に出回っており、また当該技術分野で知られている。食道腫瘍、膵臓腫瘍、または胆道腫瘍の治療は内視鏡的アプリケータによって行われてもよい。膣内アプリケータは既に子宮筋腫の治療に用いられている。
【００１７】
さらに、超音波造影剤および超音波を用いたミセル崩壊のエンハンサとして同時に役立つ、新たに発見されたクラスの重合体薬物キャリアが開示される。ジブロックの共重合体、トリブロックの共重合体またはこれらの混合物によって安定化されたマイクロ液滴とのマイクロエマルジョン組成物から、in situで形成されたこれらのナノ粒子またはマイクロバブルは、腫瘍のイメージガイド下での腫瘍内治療に使用することができる。本明細書中に開示されるこれらの組成物は、組織のイメージ化が望まれる組織においての多くの治療に有用であろう。
【００１８】
マイクロバブルは、生体適合ガスまたは薬理学的に許容されるガスによって構成することが出来、例えば、米国特許第5,558,854号または米国特許第6,132,699号で記載されており、それらの内容は本明細書中に参考文献として援用されている。ガスは単一の化合物または化合物の混合物を含んでもよく、通常、フッ素を含むガスの多くがマイクロバブルを形成するのに適した候補である。好ましい態様では、マイクロバブルまたはナノバブルは、パーフルオロカーボン（PFCs）から構成される。いくつかのPFC、例えばCsF12は、室温では液体状であるが、生理的温度のような、室温より高い温度では高度にエコー形成性のあるナノ／マイクロバブルに転換する。これらの物質は、液体／ガスと呼ばれてもよい。様々な生命体の生理的温度は、例えば、米国特許第5,558,854号で開示されているように、異なってもよい。
【００１９】
本発明の様々な態様では、様々なサイズのエマルジョン液滴またはバブルを形成することができる。例えば、米国特許第5,558,854号で記載されているような、当該技術分野における様々な技術を使用して、マイクロエマルジョン／マイクロバブルを形成することができる。本発明の好ましい態様では、エマルジョン液滴は重合体化した共重合体によって安定化される。具体的な態様では、エマルジョン液滴は共重合体によって安定化され、エマルジョン液滴／バブルは重合体ミセルと共存する。さらに具体的な態様では、無菌パーフルオロカーボン溶液が無菌ミセル溶液と混合されて、ナノエマルジョンおよびマイクロバブルを形成する。滅菌は、例えば照射またはろ過のような、当該技術分野で知られるさまざまな技術を用いて行うことが出来る。
【００２０】
本発明の様々な態様では、両親媒性物質を使用して、ミセルを形成しおよび／またはマイクロバブルを安定化することが出来る。両親媒性分子は通常、極性で水溶性の部分と無極性で不溶性の部分とから構成される。両親媒性物質の例には、界面活性物質、洗剤、脂質、ある種のタンパク質、ある種の多糖類、ある種の修飾タンパク質または修飾多糖類、ある種の重合体およびある種の共重合体が含まれるが、これらには制限されない。本発明の好ましい態様では、ブロック共重合体がミセルおよび／またはマイクロバブルの形成に用いられる。ブロック共重合体の例には、PEG-PLLA（ポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（L-ラクチド））、PEG-PCL（ポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（カプロラクトン））およびプルロニックP-105が含まれる。ミセルおよび／またはエマルジョン液滴のサイズおよび／または性質は、共重合体型、ブロック比、ブロック長、共重合体濃度、および／または、液体／ガス濃度などの因子によって制御することが出来る。例えば、等量の共重合体およびPFC濃度では、PEG2000-PCL2000共重合体でのエマルジョン液滴サイズは、PEG2000-PLLA200共重合体でのサイズに比べて小さい。これらの因子および／またはそれ以上の因子に依存して、ミセルおよびエマルジョン液滴の異なる比（モル比または量比）を得ることができる。ミセルはエマルジョン液滴と共存してもよい。具体的な条件下では、系はミセルのみ、またはエマルジョン液滴のみを含んでもよい。具体的な態様では、本質的に全てのブロック重合体を使用して、エマルジョン液滴を安定化し、そのために遊離共重合体の濃度は、対応する臨界ミセル濃度（CMC）または混合臨界ミセル濃度以下であり、したがってミセルは形成されない。
【００２１】
本発明の様々な態様では、ミセル／エマルジョンの系は、例えば水溶性ポリペプチドまたは炭水化物および／または界面活性物質のような、エマルジョン液滴を安定化させるための粘性エンハンサなどの他の物質を含んでもよい。この系はまた、生理食塩水、グリセリン、TWEEN（登録商標）20等などの、薬剤的に許容されるキャリアを含んでもよい。米国特許第4,466,442号は、キャリア液体中の界面活性物質の溶液、および安定剤としての粘性エンハンサの溶液を用いることで、液体キャリア中に懸濁液またはガスマイクロバブルを産生するための様々な技術を開示する。
【００２２】
本発明の様々な態様では、ブロック共重合体は様々な重合体ビルディングブロックを含んでもよい。ビルディングブロックおよびブロック共重合体の形成は当該技術分野で知られている。重合体ブロックの例には、米国特許第5,837,221号に記載されるような代表的な合成重合体が含まれるが、これに制限されない。
【００２３】
本発明の一態様では、系を生理的温度に加熱すると粒子サイズが変化する。最初は、液滴はより大きいサイズのマイクロバブルに転換し；インキュベーションを長くすると、最大のマイクロバブルはミセルに自己構築する安定化共重合体を放出しながら次第に蒸発する。
【００２４】
本発明の様々な態様では、ミセルまたはエマルジョンバブルの形状は、球状または非球状であってもよい。例えば、ミセルは球状、非球状、円柱状、ミミズ状様の形状（worm-like）と想定できる。ミセルの形状は、共界面活性物質（co-surfactant）、温度および／または系のイオン強度のような因子に依存して変化してもよい。
【００２５】
本明細書中に開示される直接的な腫瘍内薬物送達方法には多くの利点がある。例えば、このような方法は、一般的に用いられている全身化学療法および薬物治療投与の副作用を有意に減少させる。このような副作用は、一般的に非標的組織、つまり非腫瘍または非癌性組織に対する化学療法剤の活性により引き起こされる。直接的な標的組織のみへ化学療法剤または薬剤を送達することによって達成される精度は、すなわち伝統的な化学療法に付随する、生活の質（QOL）を低下する副作用を劇的に減少する。
【００２６】
直接的な腫瘍内への薬物注射は、腫瘍体積中でのシリンジ針の正確な位置決めを必要とする。この課題は、特に組織深部に位置する腫瘍においては高い壁である。本明細書中で開示される、エコー形成性となるマイクロバブルはこの問題に焦点を当てている。というのもマイクロバブルは、薬物キャリアの性質および造影超音波剤の性質とを1つの簡便で効率的な適用に組み合わせるためである。空のマイクロバブル（つまり薬物を装填しないマイクロバブル）の流れは針誘導のためのシリンジ針先端の可視化に用いることができる。本明細書中に記載されるマイクロバブルは、本明細書中に開示される、特別に作られたエマルジョン組成物の注射時に、in situで産生される。マイクロエマルジョン組成物のマイクロ液滴がマイクロバブルに転換するにつれ、エコー形成性および音響キャビテーションの性質が実質的に増加する（E. Ungar et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 56:1291- 1314, 2004参照）。
【００２７】
さらなる態様には、開示されたマイクロエマルジョン組成物が含まれ、このエマルジョン組成物は注射時にin situでマイクロバブルに転換し、静脈内または腫瘍内注射に用いられる。このようなマイクロバブルは、例えば本明細書中に開示されたような化学療法剤を「装填」することができる。注射時に、腫瘍または組織の領域は、超音波などのエネルギーを照射されることで、マイクロバブルを崩壊させて化学療法剤または薬剤を遊離することができる。静脈内に注射した場合、薬物装填マイクロバブルは、腫瘍への効率的な薬物標的化を可能にする。というのも、本明細書中で開示されるように、薬物は主に超音波を局所的に照射された部位に送達されるためである（Z. Gao, et al., J. Control Release, 102:203-221 (2005); Z. Gao, et al., Molecular Pharmaceutics, 1:317-330 (2004)およびN. Y. Rapoport, et al., Ultrasonics, 42:943-950 (2004)参照）。腫瘍微小血管系で局所的にマイクロバブルから遊離された薬物は、腫瘍毛細管の閉塞または崩壊を誘発する可能性があるため、腫瘍への血液供給が遮断される。MHz範囲での超音波周波数では、音響エネルギーの局在性はミリメートル単位および、ミリメートル未満の体積であっても可能であり、薬物送達の正確な制御が可能である。本明細書中に開示されたマイクロバブル組成物の薬物送達特性を有するマイクロバブルは、現在市販されていない。
【００２８】
薬剤装填ミセル／エマルジョン液滴の一態様において、装填された薬剤がミセルおよびエマルジョン液滴またはバブル間で分配される。ミセルおよびエマルジョン液滴／バブル間の薬物の分配は、ミセルおよびエマルジョンを形成する物質のタイプに依存しており、またそのためにミセルおよびエマルジョン液滴のサイズまたは比に依存する。薬剤はミセルの内側に封入されるか、またはミセル内の重合体鎖に包埋されるか、またはミセルの表面に位置されてもよい。薬物分子はまた、エマルジョン液滴／バブルの内側に封入されるか、または液滴／バブルに封入された層に包埋されるか、または液滴／バブルの表面に位置されてもよい。ミセルまたはエマルジョン液滴の中または上には含まれないが、ミセルまたはエマルジョン液滴／バブルの外側の系に溶解または分散される薬剤が存在することは可能である。
【００２９】
本発明の様々な態様では、ミセルおよびエマルジョン液滴／バブルは特異的治療薬の送達に至適になるように計画されることが出来る。例えば、当該技術分野で知られる技術を用いることで、共重合体のビルディングブロックの型、ブロックの長さ、用いられる共重合体の量、液体／ガスのタイプおよび／または液体／ガスの量を、治療薬のサイズ、電荷、疎水性の程度等に依存して、治療薬として最適化することが出来る。
【００３０】
本発明の様々な態様では、治療薬はマイクロエマルジョンの生成前にミセルに装填されることが出来る。治療薬はまた、ミセルおよびマイクロエマルジョンの混合済みの系に含ませることも出来る。コロイド系治療薬を含ませる様々な技術は、薬物処方および薬物送達の分野において開発された。治療薬は、共有結合または非共有結合を介してコロイド系に取り込まれてもよいことは、着目される点である。例示的態様では、パクリタキセルのような治療薬が、混合ミセル／エマルジョン系に物理的に包括される。マイクロバブルの形成時に、マイクロバブルの高いエコー形成性は腫瘍部位へのパクリタキセルの送達を誘導し、および／または超音波照射の適用は薬物の取り込みを増強する。
【００３１】
本発明の他の態様では、in situで産生されたマイクロバブルは、血液プール造影剤、血管性血栓症治療のエンハンサおよび遺伝子デリバリーのエンハンサのような、他の多くの用途に用いることができる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、ここで開示された方法および組成物を使用して、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌および皮膚癌のような手術不能で、薬剤感受性で、乏血管性で、多種薬物感受性で、そして明確に定義された原発病巣を治療する薬物を含む。
【００３３】
本発明の他の態様には、超音波映像診断および遺伝子デリバリーにおける用途が含まれる。マイクロエマルジョンの組織への注射時に、in situで形成されたマイクロバブルは、超音波画像装置によって検出され、それにより組織のイメージングが可能であることが明らかになった。このようなイメージングは、薬剤を用いた組織の治療を誘導する際に、または治療前の組織構造のスナップショットのような、組織のイメージを単に提供するために正確性および特異性を提供する。前記治療は外科的、化学的、または他のものである。
【００３４】
ミセルの薬物キャリアとしての性質およびマイクロバブルの超音波造影剤としての性質を一つの組成物中に組み合わせることに、強い関心がある。これまでに、このような組成物は存在していない。現在市販されているマイクロバブル組成物は、アルブミンコートまたは脂質コートされた、Bristol -Meyers Squib社のDEFINITY（登録商標）、Amersham Health社のOPTISON（登録商標）などの、安定なガスバブルであり、またこれらは薬物送達としての性質を持たず、さらにきわめて高価である。
【００３５】
本明細書中に開示されるマイクロバブル組成物は：
−  特別にデザインされたマイクロエマルジョンの注射時に、in situで産生されること。このマイクロエマルジョンは安定的であり、室温で長期の有効期間および凍結融解が可能である；
−  生分解性ジブロック共重合体により生成される強固なマイクロバブル壁であり、超音波イメージングおよび／または治療用超音波の適用前のマイクロバブルを安定させること；
−  同様の生分解性ジブロック共重合体ミセルにより化学療法剤を効率的に被包して、薬剤キャリアとして作用すること；
−  注射時に、および腫瘍に局部的な超音波照射時に、遊離薬剤およびミセル被包薬物が、腫瘍細胞によって効率的に細胞内へ薬物を取り込まれること（Z. Gao, et al, J. Control. Release, 102:203-221 (2005); Z. Gao, et al., Molecular Pharmaceutics, 1:317-330 (2004); N.Y. Rapoport, et al., Ultrasonics, 42:943-950 (2004); N. Rapoport, International Journal of Pharmaceutics, 277:155-162 (2004); Rapoport, N., Factors Affecting Ultrasound Interactions with Polymeric Micelles and Viable Cells, Carrier-Based Drug Delivery, American Chemical Society Symposium Series, S. Swenson, Ed., Washington, D.C., 879:161-173; U.S. Patent 6,649,702およびRapoport, N., et al., Drug Delivery Systems and Sciences, 2:37-46 (2002)参照）；
−  遺伝子デリバリー薬として効率的な操作を行えること；および
−  血管性血栓症の超音波治療を向上できること、
という独特で有利な性質を持つ（以上は全てを網羅したリストではなく、また範囲を制限されることも意図されない）。
【００３６】
腫瘍内注射では、腫瘍体積中での薬物の長期保持が望まれる。本明細書中に記載したように、この目的は本明細書で開示された重合体ミセル／マイクロバブル組成物に薬物を被包することによって達成できる。薬物被包はまた正常細胞による薬剤取り込みを阻止することから、化学療法の副作用を減少させる。
【００３７】
本明細書中に記載されたように、本発明の他の態様では、癌性細胞による効率的な薬物取り込みは、超音波または超音波処理のような形で、エネルギーの適用によりさらに向上されるであろう。ナノエマルジョンおよびナノ／マイクロバブルとともに高度にエコー形成性となることが証明されている。本明細書中で後述するように、本明細書中で開示されたミセル／マイクロバブル組成物により被包された薬物の注射後の、腫瘍の局所的な超音波照射は、腫瘍体積中でミセル組成物からの薬物の遊離を引き起こし、腫瘍細胞による細胞内への薬物取り込みを増強する。
【００３８】
実施のための態様
生体の全器官組織イメージング技術の急速な進歩に伴い、化学療法薬剤を注射するために腫瘍体積に注射針を正確に位置決めすることが可能である。一つの側面では、本発明は、薬物感受性腫瘍、手術不能腫瘍、乏血管性腫瘍および多剤耐性（MDR）腫瘍などの腫瘍を治療するための実現可能な解決策を提供する。乏血管性腫瘍への直接的な腫瘍内薬物送達は、抗悪性腫瘍性組成物の非効率的な静脈内注射の、実現可能な代替方法である。注射針またはカテーテルは、超音波誘導下で腫瘍内に挿入することができ、次いで、挿入された内視鏡超音波トランスデューサ経由での治療超音波により、または体外のプローブにより、腫瘍を照射することができる。
【００３９】
本発明にしたがった、「治療すること」または「治療」は、根治を必要としない。これらの用語は、疾患の根底にある症状（例えば、腫瘍の存在など）が少なくとも減少されること、および／または症状の原因となっている、一つまたはそれ以上の細胞的、生理学的または生化学的な、根底のある原因またはメカニズムを減少させるおよび／または除去されることを意味する。文脈上で用いられる場合、減少させる、という用語は、疾患の状態に関して、疾患の分子的な状態を含むが、疾患の単なる生理的な状態を含まないことを意味する。
【００４０】
本発明の文脈上で用いられる薬物または薬剤には、腫瘍および癌を治療するのに有用な、抗新生物物質、例えば、DOX、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソールおよび5-フルオロウラシルなどが含まれる。さらに、腫瘍の治療に有用な他の薬剤、例えば、ベツリン酸、アムホテリシンB、ジアゼパム、ナイスタチン、プロポフォール、テストステロン、エストロゲン、プレドニゾロン、プレドニゾン、2,3メルカプトプロパノールおよびプロゲステロン、は、重合体ミセルと同時投与されてもよい。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合「薬剤」は、生物学的活性のある薬剤、薬物、医薬組成物、不活性物質、有機化合物、無機化合物、化学療法物質、スタチン、抗新生物性物質、または前記化学物質のどのような組み合わせをも意味することができる。
【００４２】
PEG2000-PLLA2000は、2000 Daのブロックの分子量を有する共重合体である。PEG2000-PLLA5000は、2000 Daのポリ（エチレンオキシドブロック）および5000 Daのポリ（L-ラクチドブロック）の共重合体である。PEG-PCLなどの他の共重合体にも同様の名称がつけられる。
【００４３】
本明細書中に用いられる「液滴サイズ」または「粒子サイズ」は、対応するサイズ分布のピークの最大値または平均（体積平均）ピーク値としての液滴または粒子のサイズ（直径）のいずれかを意味し、これら両方とも動的光散乱により測定される。
【００４４】
本明細書中に用いられる場合の「ナノ粒子」は、例えば、直径が約1マイクロメートルかそれより小さいサイズ形体である物体とする。ナノ粒子の例には、ミセル、リポソーム、バブルおよび液滴が含まれるが、これらに制限されない。典型的には、ミセルは、10-100 nmのサイズを有し、リポソームは100-200 nmのサイズを有し、ナノエマルジョンは100-1000 nmの液滴サイズを有する。
【００４５】
本明細書中に用いられる「室温」は、約18℃から約25℃の環境温度を意味する。
本明細書中に用いられる場合「マイクロエマルジョン」には、ナノエマルジョンが含まれる。本明細書中に用いられる場合の「マイクロバブル」には、ナノバブルが含まれる。本明細書中に用いられる場合の「マイクロ液滴」にはナノ液滴が含まれる。本明細書中に用いられる場合、「包含する」、「含む」、「含有する」、「特徴づけられる」およびこれらの文法的に同様の用語は、包括的用語または上限下限が定められていない（open-ended）用語であり、これらは付加的で記載されない要素または方法段階を除外しないが、さらなる制限的な用語である「〜から成る」および「〜から本質的に成る」もまた含まれる。
【００４６】
一種類の薬物または複数種類の薬物（「生物学的活性薬剤」および抗新生物性物質）それぞれの使用される用量は、使用される特定薬物、治療される腫瘍のサイズおよび状態、投与頻度、および患者の健康状態などの、可変性のある要因に依存するであろう。
【００４７】
本明細書中に開示される組成物は、薬剤的に許容可能な化合物または組成物として配合することができる。賦形剤、希釈剤および／またはキャリアは当該技術分野で知られている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.）を参照のこと。
【００４８】
本発明は、以下の限定的ではない実施例でさらに記述され、図解という形で提供されるが、本発明はいかなる様式においても限定することを意図しない。
【実施例】
【００４９】
実施例1
本明細書中に開示されたミセル／マイクロバブルの系を用いた腫瘍への薬物標的化の模式図
薬物標的化は、血管内皮細胞間での比較的大きなギャップによる、腫瘍血管の異常な透過性に基づく（図1参照）。ミセルおよび、おそらく小型のナノバブル（直径500 nm以下、腫瘍型に依存する）もまた、血管外遊出し、また腫瘍間質内で蓄積する。より大型のナノ／マイクロバブルは、循環系内に残留する。腫瘍局所的な治療用超音波の下で、これらはキャビテーション核として機能し、腫瘍間質内でミセルおよびナノバブルからの薬物遊離を引き起こしおよび、腫瘍細胞による細胞内への薬物取り込みを亢進する。
【００５０】
実施例2
PEG/PLLAジブロック共重合体の合成
両親媒性PEG/PLLAジブロック共重合体のライブラリは、L-ラクチドの開環重合によって合成され、触媒としてオクタン酸スズの存在下でPEG一酸のヒドロキシル基を用いて開始された（Yamamoto, Y. et al., J. Contr. Release, 77:27-38 (2001); Kim, SC, et al, Paniculate Drug Delivery, Samyang Pharmaceuticals R&D, Taejeon, 305-348, 2005, South Korea参照）。
【００５１】
L-ラクチドのPEGに対する比およびPEGの分子量を変化させることで、PLLAブロック長およびPEG-PLLAブロック長比は変えられる。以下のブロック長を用いた共重合体が合成された：
PEG：2000 Da、5000 Da
PLLA：1000 Da、2000 Da、3000 Da、5000 Da。
【００５２】
実施例3
NMRおよびGPCによるPLLA/PEGジブロック重合体の特徴付け
反応産物は1H-NMR（300 MHz）によって分析される。合成共重合体のMn（中間値）および分子量分布（Mw/Mn）は、ゲル浸透クロマトグラフィによって測定される。
【００５３】
実施例4
DOX装填ミセルおよびマイクロエマルジョンの調製
ミセル：ドキソルビシン-HCl（「DOX-HCl」）は、ジメチルスルホキシド（「DMSO」）内でトリエチルアミンとともにインキュベーションすることにより、DOXベースに転換される。DOX装填PEG2000-PLLA2000共重合体ミセルは、溶媒交換技術を用いて産生された。共重合体のDMSO中のジョイント溶液およびDOXベースを、2 kDaの分画分子量の透析膜（SpectraPor、Spectrum Medical Industries社、米国）を用いてPBS溶液中で透析された。捕捉されたDOXの量は、HPLCによって決定された。導入されたDOXの約90-95％が被包された。
【００５４】
マイクロエマルジョン：パーフルオロペンタンFLUORINERT液PFP-5050（登録商標、3MTM、米国）の一部は、DOX装填PEG2000-PLLA2000またはDOX装填PEG2000-PCL2000ミセルに加えられた。ミセルはその後、15-30秒間の20 kHz超音波（Sonics & Materials社、米国）で照射され、PEG/PLLA共重合体のミセル溶液中で形成されたDOX装填マイクロエマルジョンが調製された。PEG-PLLAミセル溶液中のPFP濃度は、0.1％から5％（V/V）の範囲で変化させ、様々な液滴サイズおよび異なるマイクロバブルサイズを得ることができる。様々な用途、例えば、シリンジ針の位置決め、血液プールのイメージングおよび薬物送達の音響的活性化のため、エコー形成性となる性質を最適化することは必要である。
【００５５】
実施例5
マイクロバブルの顕微鏡写真
マイクロエマルジョンの顕微鏡写真は、図2で表される。図2で見られるように、狭いマイクロエマルジョン粒子サイズ分布が観察される。
【００５６】
実施例6
ミセル／マイクロエマルジョンの系での粒子サイズ分布に対する加熱加熱効果の定量化
粒子サイズはZetasizer3000（Malvern Instruments社、米国）を用いて測定された。PEG2000-PLLA2000共重合体では、粒子サイズ分布では、2つのピークが顕著にあらわれた（図3参照）。室温では、図3Aの左のピーク（53.1 nm）がPEG2000-PLLA2000ミセルに対応している。図3Aの右のピーク（691.1 nm）が、マイクロエマルジョン液滴に対応している。42℃へ加熱すると、マイクロエマルジョンのパーフルオロカーボンの液滴は沸騰して、750 nmと1250 nmの間のサイズ分布となるマイクロバブルを形成する（図3B参照）。このプロセスは可逆的である。室温へ冷却すると、マイクロバブルは凝縮し、最初の粒子サイズ分布となるマイクロエマルジョンを産生する（図3C参照）。同様の効果が、PEG2000-PCL2000共重合体により安定化されたナノ液滴について観察される（図4参照）。
【００５７】
実施例7
ポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（Lラクチド）、PEG2000-PLLA2000安定化ナノ液滴
薬物送達システムの相状態および液滴サイズは、共重合体のブロック長比、共重合体濃度、PFP濃度、および共重合体／PFP濃度比によって制御することができる。図5および図6に示されるように、1％の共重合体濃度、ミセルおよびナノ／マイクロ液滴は、0.1％および0.5％のPFP濃度における系の中で共存する。しかしながら、1％または5％のPFP濃度ではミセルは形成されなかった。というのも、これは全ての共重合体分子が液滴の安定化に用いられているためであり、この安定化プロセスのほうが、ミセル中での共重合体分子の自己構築よりも、エネルギー的にさらに有利であると考えられる。1％PFPにおいては、二峰性液滴分布（256 nmおよび811 nmで、対応する最大ピークでの液滴サイズが表される）が記録された。より大きな液滴が循環系内に残留するのに対して、より小さい液滴は、血管外遊出されると考えられる（図1参照）。595 nmの一つのサイズのみが5％PFPでは記録され、このことは3000 nmより大きい液滴では、機器感受性の限界により引き起こされる可能性がある。
【００５８】
液滴サイズは共重合体濃度によって制御することができる。同PFP濃度では、より低い共重合体濃度がさらに大きな液滴を引き起こす結果を生じる（表1および表2）。液滴サイズに対する共重合体濃度の効果はまた、表3および表4に要約される。
【００５９】
ミセル（24.1 nm）は、いくらかの大きなバブルの蒸発および安定化する共重合体の遊離のために上記システムのための加熱−冷却サイクル後に出現し、安定化する共重合体はその後ミセルへ自己構築する；しかしながら有意な液滴（762 nmおよび1916 nm）の有意な画分は、加熱−冷却サイクルの後にも依然として持続する（図7および図8参照）。短期的な加熱（室温から42℃に約5分間加熱した後に5〜15分のインキュベーションを42℃で行う）で、ナノ液滴はナノ／マイクロ液滴に転換する；室温への冷却時には、この効果は完全に可逆的となる。
【００６０】
【表１】
2008542293.tif 000003
【００６１】
【表２】
2008542293.tif 000004
【００６２】
粒子径の画分数は、D3によって割り算された体積率（volume fraction）に比例的であることに注意のこと。なおDは粒子の直径である。したがって、大きな液滴の大きな体積率は、その配合物中ではわずかな液滴に対応すると考えられる。同様に、配合物中の大きな液滴の存在は、ミセルの存在を「マスクする」可能性がある。したがって、ミセルの存在または非存在は、画分の数値（number fraction values）によって検証されるべきである。同じ共重合体濃度では、サイズおよび特に液滴の数はPFP濃度の増加に伴い劇的に増加する（表3および表4）。
【００６３】
【表３】
2008542293.tif 000005
【００６４】
PEG2000-PLLA2000共重合体では、ミセルおよび液滴は狭い範囲の共重合体／PFP濃度内、および1.0％の共重合体濃度においてのみ共存する（表4）。0.5％の共重合体濃度では、100 nmから260 nmのナノ粒子はより大きい液滴と共存する；より小さい粒子は、もっとも小さいと考えられるナノ液滴であるかまたはミセルコア内に溶解したPFPとのミセルである。
【００６５】
実施例8
ポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（L-ラクチド）、PEG2000-PLLA5000、安定化されたナノ液滴
PEG2000-PLLA5000は、PEG2000-PLLA2000よりも長い疎水性ブロックを持つ。PEG2000-PLLA5000共重合体のミセルコアでの強い相互作用は、ミセル／液滴平衡および液滴安定化に必要とされる、ミセル外へのユニマー拡散を抑制する。1％濃度の共重合体では、1％のPFP濃度であっても、非常にわずかな液滴が形成される（PEG2000-PLLA5000での3％液滴とPEG2000-PLLA2000での100％液滴を比較のこと）。どのような共重合体濃度でも、0.1％のPFP濃度では、液滴は形成されなかった。1％の共重合体濃度および5％のPFP濃度では、744 nmの液滴が形成された。共重合体濃度の減少が、液滴形成を引き起こし、この理由はおそらく、、ミセル外へとユニマー拡散を許容するより水和化されおよびより強固ではないミセル核を生じるためである。1％のPFP濃度でのデータは表5に表される。
【００６６】
【表４】
2008542293.tif 000006
【００６７】
【表５】
2008542293.tif 000007
【００６８】
0.2％の共重合体濃度および1％のPFP濃度においては、ナノ粒子のサイズはPEG2000-PLLA5000についての場合（850 nm）よりもPEG2000-PLLA2000についての場合（2200 nm）の方が大きいことに注意のこと。したがって、ナノ液滴のサイズは、共重合体の疎水性ブロックの長さによって調節することができる。
【００６９】
実施例9
ポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（カプロラクトン）、PEG2000-PCL2000安定化ナノ液滴
PEG2000-PLLA2000共重合体とPEG2000-PCL2000共重合体との間の1つの重要な違いは、PEG2000-PLLA2000（表4）と比較した場合の、PEG2000-PCL2000（表6）についての、ミセル／液滴共存範囲の境界である。0.2％という低いPEG-PCL共重合体濃度であっても、ミセルは保持され、また0.1％および0.5％のPFP濃度におけるナノ液滴と共存する。この知見は、PEG-PCL共重合体が混合ミセル／マイクロバブル配合物の制作のための魅力的な候補であることを示す。さらにこの例を指示するデータは図10から図14で見ることが出来る。ナノ液滴は、有意な系の希釈時（significant system dilution）に保持される（図11および12参照）。ナノ液滴から産生したナノバブルは、超音波応答性である（図14参照）。
【００７０】
【表６】
2008542293.tif 000008
【００７１】
対応するPFP濃度および共重合体濃度にて、PEG2000-PLLA2000共重合体と比較した場合、PEG2000-PCL2000ではより小さいナノ液滴が形成される。PEG-PCLについてのデータは表7に表される。PEG-PLLAでの2200 nmの液滴サイズを、PEG-PCL（0.2％の共重合体濃度、1％のPFP濃度）での580 nmと比較のこと。同様の傾向は1％の共重合体濃度において観察される（表1および表7のデータを比較のこと）。
【００７２】
最も重要なことは、加熱時のサブミクロン（200 nmから500 nm）のPEG-PCLナノバブルの、より高い安定性である。37℃でのインキュベーション時に、PEG-PLLAによって安定化した同じサイズのバブルは次第に蒸発し、また消滅するのに対し、PEG-PCLによる安定化したバブルは、加熱／冷却サイクルにおいてよりよく保持される。PEG-PLLAについて上述されたように、より大きなマイクロバブル（ミクロンサイズの範囲）は、表8で例示されるように、次第に蒸発する。バブルが蒸発するとき、安定化する共重合体が遊離され；遊離時に共重合体分子は、1％共重合体／1％PFP配合物で表されるようにミセル内で自己構築される。加熱／冷却前に、この配合物ではミセルは観察されない。というのも全ての共重合体分子がナノ／マイクロバブルの安定化に完全に用いられるためである。加熱時に、24 nmのミセルは形成される一方、ミクロンサイズのマイクロバブルは蒸発する。
【００７３】
【表７】
2008542293.tif 000009
【００７４】
【表８】
2008542293.tif 000010
【００７５】
要約すると、21から24 nmのミセルおよびより大きな会合体（174 nm）の小さい画分が、初期の共重合体溶液（PFPを含まず）では観察された。PFPの添加時、かつ20 kHzの超音波処理を15秒間行う際に、エマルジョンは形成され、また粒子サイズ分布は三峰性となる。最も小さい粒子（42 nm）はおそらくコア内で溶解したPFPとのミセルであり、より大きい粒子（274 nmおよび1500 nm）はナノ／マイクロ液滴である。3つの系の成分の全ては45倍希釈時に保持される。
【００７６】
希釈効果に関しては、粒子のサイズがいくらかは減少するが、ミセルおよびマイクロ液滴は45倍希釈においても保持される。静脈内注射は、約20-25倍での注射の系の希釈と関連することに注意のこと。
【００７７】
共重合体濃度の効果に関しては、共重合体濃度が高くなればなるほど、ナノ液滴はより小さくなる（PFPについても同様である）。PFP濃度の効果に関しては、ミセル（20 nm）は、高いPFP濃度で消失するが、より大きな会合体または小さいナノ液滴（160 nm）がより大きなナノバブルに加えて形成される。
【００７８】
加熱効果に関しては、加熱時に、ナノ液滴はマイクロバブルに転換される；いくつかのより大きなマイクロバブルは蒸発する；バブルが崩壊することにより放出された共重合体分子は、ミセルに自己構築する。より大きなバブルの消失により、冷却時に、平均液滴サイズはいくらか減少する（図7参照）。PEG-PCL共重合体により安定化されたバブルは、PEG-PLLA共重合体により安定化されたバブルよりも、加熱下ではより安定的である。
【００７９】
以下はナノ液滴の系に対する超音波効果の要約である：
1）  1 MHzのパルス超音波の下においては、ミクロンサイズの液滴はさらに小さい液滴へと崩壊され、この小さい液滴は、液滴の安定化のためのより多くの共重合体を必要とする。このことにより、ミセル（24 nm）の消失が引き起こされる。CW超音波の下では、液滴はほぼ完全に破壊され、また気体は蒸発する；遊離された共重合体はミセルを形成する。
【００８０】
2）  3 MHzの超音波の下においては、2.0 W/ cm2のより低い出力密度および低い20％の負荷サイクルの場合でさえも、液滴は効率的に、マイクロバブルに転換され、これがミセルのみを残して崩壊する（図14dおよび図14eを比較のこと）。
【００８１】
実施例10
プルロニックP-105安定化ナノ液滴
サイズ分布は、エマルジョン調製の1日後に測定された；この系は室温で保持された。液滴サイズはPEG2000-PLLA2000で観察されたものよりも小さい。プルロニックP-105では、より多くの共重合体が液滴安定化に必要とされる；0.5％のPFP濃度でのPEG2000-PLLA2000およびPEG2000-PCL2000とは対照的に、1％のプルロニック濃度では、ミセルは0.1％のPFP濃度では観察されるが、0.5％またはそれ以上のPFP濃度では観察されない（図9参照）。加熱時での安定性は、プルロニック安定化の系では不十分であり、したがって、これらについてはさらなる研究は行われなかった。
【００８２】
実施例11
薬物局在性および薬物保持
ナノ／マイクロ液滴およびマイクロバブルの蛍光顕微鏡写真は、抗癌薬ドキソルビシン（DOX）が、共重合体コートされた液滴またはバブルの表面上に局在することを示した（図15）。
【００８３】
ナノ／マイクロ液滴中の薬物保持は、7.2 kDa膜を用いた透析により測定された；DOX装填0.5％PEG2000-PLLA2000、2％PFP、0.75 mg/ml DOX配合物は200 mlのPBS中で透析された。データは、（i）上記のエマルジョン配合物からのDOX遊離が、0.5％PEG2000-PLLA2000、0.75 mg/ml DOXのミセル配合物からのDOX遊離よりもわずかに早く、そして（b）90％以上の薬物がエマルジョン内に効率的に残留されたことを示した。
【００８４】
実施例12
PEG2000-PLLA2000ミセル／マイクロエマルジョンを薬物キャリアとして用いた、A2780卵巣癌腫細胞への薬物送達
細胞は、5％のCO2を含む加湿雰囲気下にて、6穴プレートに単層で75％コンフルエンスまで培養された。超音波処理前に、増殖培地をPEG2000-PLLA2000ミセル／マイクロエマルジョンのDOX装填混合物により置換した。A2780細胞は、実施例4から実施例11で記載されたように、PBSで溶解されたかまたはPEG2000-PLLA2000ミセルに被包されたかまたはPEG2000-PLLA2000ミセルおよびPEG2000-PLLA2000/PFP マイクロバブルの混合物に被包された、20μg/mlのDOXとともに5分間インキュベートされた。マイクロエマルジョンは、0.2％のPEG2000-PLLA2000ミセル溶液に0.1％（v/v）のPFPを加え、20 kHzで15秒間、穏やかに超音波処理を行うことによって形成された。
【００８５】
超音波は、1 MHzまたは3 MHzで1分間、33％の負荷サイクル（20秒間の超音波照射時間に対応する）および1 MHz の場合は3.4W/ cm2の出力密度、3 MHzの場合は2.0 W/ cm2の出力密度で、非集束および照射された。超音波トランスデューサは、アクアソニックカップリングゲル（Aquasonic coupling gel）を通して6穴プレートの底面に接触させた。
【００８６】
超音波処理後、細胞はトリプシン処理され、またDOX取り込みおよび膜ダメージはフローサイトメトリによって測定された。全ての実験は3回繰り返された。図16はマイクロバブル非存在下でのPEG-PLLAミセルから卵巣癌A2780細胞へのDOX送達に対する、超音波による増強効果を示す。細胞内への薬物取り込みの有意な増強が観察される。破線はコントロール（未処理A2780細胞）サンプルを表す。細線は、超音波処理を行わずミセル被包DOXによるA2780細胞の処理を示す。点線はミセル被包DOXで処理し、3 MHzの超音波を適用されたA2780細胞を示す。太線は、ミセル被包DOXで処理し、1 MHzの超音波を適用されたA2780細胞を示す。
【００８７】
図17は、PEG-PLLAミセル／マイクロバブルの系から卵巣癌A2780細胞へのDOX送達に対する、マイクロバブルの効果を示す。マイクロバブルの存在は、さらに、DOXの細胞内への取り込みを増強する。破線を構成するデータは、コントロール（無処理）細胞を表す。細線を構成するデータは、ミセル被包DOX（マイクロバブルなし）で処理し、3 MHzの超音波を適用されたA2780細胞を示す。太線を構成するデータは、ミセル被包DOXで処理し、3 MHzの超音波を適用するとともにマイクロバブルも同時投与されたA2780細胞を示す。このデータは、本明細書中で開示されたように、ミセル／マイクロバブルの系を用いた細胞の処理を、3 MHzの超音波照射と併用することで、効率的な細胞内への薬物取り込みを引き起こすことを示唆する。
【００８８】
腫瘍に対して適用される超音波照射の量は、腫瘍を発生する組織のタイプ、患者体内の一つまたは複数の腫瘍の位置、厚みまたは幅またはその他の特徴における腫瘍のサイズ、注射をされる薬物の量または生物学的活性薬剤の量、および当業者により決定され得るその他の環境変数などのいくつかの可変性に依存するであろう。
【００８９】
実施例13
in vivoおよびin vitroでの腫瘍細胞への超音波薬物送達に対するマイクロバブルの効果
（a）in vivoでのMDA MB231乳癌腫瘍へのDOX標的化
PFP非存在下では、DOX はPEG2000-PLLA2000ミセルに被包される点に注目すべきである；2％PFP存在下では、全ての共重合体が液滴安定化に用いられるために、ミセルは保持されない（図8）。
【００９０】
体内分布実験では、DOXはMDA MB231乳癌腫瘍を持つ4匹のマウスに静脈注射された。2匹のマウスはミセル配合物（0.5％のPEG2000-PLLA2000、0.75 mg/mlのDOX）を注射された；他の2匹のマウスはエマルジョン配合物（ミセル配合物に2％のPFPを追加したもの）を注射された。薬物注射をして4時間後、2匹のマウスの腫瘍は、2 W/ cm2の出力密度、20％の負荷サイクル（結果的に30秒間の超音波照射）で、3 MHzの超音波により150秒間超音波処理された。超音波処理の10分後、全てのマウスは犠死され、腫瘍は摘出されおよびトリプシン処理された；細胞内DOX蛍光はフローサイトメトリによって測定された。この結果は表9に示される。
【００９１】
【表９】
2008542293.tif 000011
【００９２】
表9は、（i）マイクロバブル存在下での腫瘍の超音波処理は、同じ配合物で超音波処理をしない場合の薬物送達に比べ、細胞内への薬物取り込みが劇的に増加する結果となる；および（ii）細胞内への薬物取り込みに対する超音波の効果は、ミセル配合物の存在下よりもマイクロバブルの存在下の方が遙かに強い。このことは、図7および図8のデータにより示唆された4時間のin vivoでのバブル保持を確認する。
【００９３】
（b）単層のA2780卵巣癌腫細胞による細胞内への薬物取り込みに対するマイクロバブルおよび超音波の効果
これらの実験は、さまざまな腫瘍細胞株で行われた；これらの細胞は、懸濁液中にあるか、または基質に単層で付着される。懸濁液内で集束超音波による超音波処理された卵巣癌A2780細胞についての結果は、表10に表される。データによると、超音波処理がない場合では、エマルジョンからの薬物取り込みは、ミセルからの薬物取り込みに比べてわずかに高く、このことはバブル表面でのDOX局在性および透析時のより高い遊離に従う；超音波の下においては、細胞内へのDOX取り込みに対するマイクロバブルの増強効果は非常に劇的であった：卵巣癌細胞による超音波調節下での細胞内DOX取り込みは、マイクロバブル存在下では倍増した。A2780細胞による細胞内DOX取り込みに対する、マイクロバブルおよび超音波の効果は、図17に示される。
【００９４】
（c）摘出されたMDA MB231乳癌腫瘍の細胞による細胞内薬物取り込みに対する、マイクロバブルおよび超音波の効果
摘出された腫瘍の細胞による細胞内薬物取り込みに対する、マイクロバブルおよび超音波の効果を研究するための新しい技術が開発された。表10で記載されるものと同一のPEG-PLLA/PFP/DOX配合物はこれらの実験において用いられた。乳癌MDA MB231腫瘍についての結果は表11および図18A、図18Bに示される。
【００９５】
【表１０】
2008542293.tif 000012
【００９６】
【表１１】
2008542293.tif 000013
【００９７】
（d）DOX装填PEG2000-PLLA2000ミセル／マイクロエマルジョンおよび非集束超音波を用いた、多剤耐性（MDR）卵巣癌腫A2780/AD細胞への薬物送達
図19はMDR A2780/AD細胞の処理に対する応答を示す。A2780/AD細胞でのDOX蛍光強度のヒストグラムは：（A）PBS（DOXを含まない）に溶解したDOXで処理した超音波処理をしていない細胞、および（B）DOX装填PEG2000-PLLA2000ミセルおよびマイクロバブルの存在下で1.0 MHzで1分間超音波処理された細胞、について示される（図19参照）。DOXの濃度は、どちらのサンプルにおいても20μg/mlであった。細胞は、超音波処理前に5分間DOXとインキュベートされた。超音波処理は、非集束超音波を33％の負荷サイクル、3.4 W/ cm2で1分間投与された。多剤耐性細胞による細胞内薬物取り込みの非常に有意な増強は、本明細書中に開示されたミセル／マイクロバブルの系が用いられたときに観察された。さらに、超音波処理されたサンプルは、未処理サンプルと比較すると、さらに薬物取り込みが増強された。
【００９８】
実施例14
25℃および37℃にてDOX装填PEG2000-PLLA2000ミセル／マイクロエマルジョンおよび集束超音波を用いた、MDR卵巣癌腫A2780/AD培養細胞への薬物送達
図20は、マイクロエマルジョンの存在下で、集束型1.1 MHz超音波（33％の負荷サイクル、0.5秒のパルス、6 Mpaの圧力振幅）を用いて0.5秒間超音波処理した後の、多剤耐性卵巣癌A2780/AD細胞の蛍光ヒストグラムを示す。図20Aで表される細胞において、超音波処理は25℃で行われた。図20Bでは、細胞は37℃で超音波処理された。図20から容易にわかるように、細胞内への薬物取り込みの非常に有意な増強が、37℃での超音波処理の際に観察され、このことは本明細書中に開示されるマイクロバブルの系のエコー形成性となる性質が、本明細書中に開示されるマイクロエマルジョンの系のエコー形成性となる性質より、これらの条件下で、これらの腫瘍細胞を処理した場合において、より強いことを示唆している。
【００９９】
図21は、25℃または37℃のいずれかで、マイクロエマルジョン存在下での、1.1 MHzの超音波（33％の負荷サイクル、0.5秒のパルス長、5 Mpaの圧力振幅）による0.5秒間の超音波処理後の、多剤耐性卵巣癌A2780/AD細胞の生存率を示す。本明細書中に開示されるようなマイクロバブルの系は、多剤耐性卵巣癌細胞の超音波誘導性の根絶を劇的に増強する。
【０１００】
実施例15
in vivoにおけるA2780腫瘍の処理
腫瘍：メスnu/nuマウス中のA2780卵巣癌腫瘍。この腫瘍は高度に血管化されたものとして特徴づけられる（図22参照）。
【０１０１】
重合体ミセル：ミセルはPEO/PPO/PEOトリブロック共重合体プルロニックP-105（37/56/37のPEO/PPO/PEO比）を、ジアシルリン脂質PEG2000-DSPEと混合（重量比で1:1）したものを用いて形成された（Z-G. Gao, et al, Controlled and Targeted Tumor Chemotherapy by Micellar-Encapsulated Drug and Ultrasound, J. Control. Release, 102:203-222, 2005参照）。DOXは、以下の溶媒蒸発技術を用いて混合ミセルに装填された。ミセル形成成分およびDOXはクロロホルムに溶解され、溶媒は蒸発された。DOX装填ミセルはその後、乾いた残留物にPBSを添加する時に自動的に形成された。DOX装填ミセルは、DOX薬用量が3 mg/kg（増殖速度研究）または6 mg/kg（体内分布研究）となるように、静脈内（i.v.）に注射された。
【０１０２】
超音波：1 MHz、出力密度3.4 W/ cm2および50％の負荷サイクルの非集束超音波は30秒間、局所的に、薬物注射の4時間後の腫瘍に対して適用された。
結果：腫瘍増殖の非常に有意な阻害が、ミセル／超音波技術で観察された（図23参照）。有意な薬物蓄積が、静脈内薬物注射時に腫瘍細胞内で特異的に観察された（Z-G. Gao, et al., Controlled and Targeted Tumor Chemotherapy by Micellar-Encapsulated Drug and Ultrasound, J. Control. Release, 102:203-222, 2005参照）。静脈内注射によるA2780腫瘍の有効な治療は、図22で見られるように、広範な腫瘍の血管化によるもののようである。
【０１０３】
実施例16
乏血管性腫瘍性HCT116結腸癌腫瘍の治療
腫瘍：HCT116結腸癌腫瘍はオスのnu/nuマウスの右脇腹の皮下に接種された（図24および図25参照）。A2780腫瘍とは対照的に、この腫瘍は乏血管的なものと特徴づけられる（図24参照）。
【０１０４】
重合体ミセル：DOX装填混合プルロニック（登録商標）P-105/PEG2000-DSPEミセル（Gao et al, J. Control. Release 102 (2005) 203-221参照）は、腫瘍の治療において用いられた。
【０１０５】
DOX装填ミセルは、3 mg/kg（増殖速度研究）または6 mg/kg（体内分布研究）のDOX薬用量となるように、静脈内（i.v.）または腫瘍内（i.t.）に注射された。
超音波：1 MHz、出力密度3.4 W/ cm2および33％の負荷サイクルの非集束超音波は、30秒間、局所的に、薬物注射の4時間後の腫瘍に適用された。
【０１０６】
体内分布研究：さまざまな器官の細胞によるDOX取り込みは、フローサイトメトリによって測定された。マウスは、遊離の（すなわちPBSに溶解した）DOXまたはミセル被包DOXのいずれかを腫瘍内に注射された。この組成物の注射の10時間後に、マウスは犠死され、腫瘍およびさまざまな器官は摘出され、トリプシン中で消化された。個々の細胞は分離され、2.5％のグルタルアルデヒドで固定され、フローサイトメトリによって分析された。
【０１０７】
腫瘍増殖速度：動物は、それぞれ5匹ずつを含む実験群および対照群にランダムに振り分けた。静脈内治療は、腫瘍体積が50〜100 mm3に達したときに開始された。腫瘍内治療は、腫瘍体積が150〜300 mm3に達したときに開始された。全部で4回の注射が2週間にわたって週に2回行われた。腫瘍内治療内注射には、それぞれ25μlの薬物溶液の4回の注射が、腫瘍の4カ所に行われた。
【０１０８】
結果：DOXに対する中程度の感受性（IC50 = 1.5μg/ml）にもかかわらず、結腸癌HCT116腫瘍は、薬剤配合物（PBSに溶解されるかまたは重合体ミセル内に被包されるDOX）に非依存的に、静脈内薬物注射時に、化学療法に高い抵抗性を示した。HCT116腫瘍のこの抵抗性は、おそらく乏血管化が、腫瘍への薬物送達が不十分であるという結果を引き起こした可能性があった。ゆるい毛細血管は、主にHCT116腫瘍での腫瘍表面上に位置し、この腫瘍内部ではほとんど血液が供給されず、また顕著な壊死組織および腹水が見られた。乏血管性腫瘍においては、重合体ミセルに被包されたDOXの腫瘍内注射によって、十分な治療が達成された（図26および図27参照）。
【０１０９】
図27はDOXの静脈内注射時（上側の曲線群）および腫瘍内注射時（下側の曲線群）の、HCT116腫瘍の増殖曲線を図解している。黒ひし形は、静脈内投与のコントロールサンプルを表す。白四角は、DOX/PBS静脈内処理を表す。白三角は、ミセル被包DOXの静脈内処理後の超音波処理を表す。白丸は、ミセル被包DOX腫瘍内処理を表す。黒丸は、ミセル被包DOXの腫瘍内処理後の超音波処理を表す。静脈内注射の作用と腫瘍内注射の作用の劇的な差が、HCT116結腸癌腫瘍の増殖において観察される。腫瘍内DOX注射は腫瘍増殖の抑止を引き起こす。腫瘍への局所的な超音波照射はさらに、腫瘍体積の減少および何例かの完全な腫瘍回復を生じる、腫瘍内化学療法の効果を増加した（図27参照）。
【０１１０】
生体内分布の研究は、重合体ミセル被包DOXのほうがPBS中に溶解したDOXよりもかなり長く腫瘍組織内に保持されることを示した（図28参照）。図28は、腫瘍内注射時の、遊離のDOXまたはミセル被包DOXの、腫瘍細胞の蛍光ヒストグラムを示す。細線はコントロールを表し、点線はPBS（DOXを含まない）に溶解したDOXを表し、および太線はミセル被包DOXを表す。
【０１１１】
腫瘍内注射の10時間後、腫瘍細胞内で、ミセル被包DOXが遊離DOX（すなわちPBSに溶解されたDOX）よりも遙かに効率的に保持された。PBS溶解DOXで処理した動物の心臓細胞では、DOX取り込みが有意に観察されたのに対し、ミセル被包DOXでは、心臓細胞によるDOX取り込みは観察されなかった（データ非掲載）。このような非標的組織での薬物取り込みは、DOX心毒性を引き起こす。興味深いことに、被包DOXで処理された動物の肝細胞および腎細胞では、DOXは見られなかった。しかしながら、これらの動物では、いくらかのDOXが脾臓細胞で観察された。遊離DOXにより処理した動物では、脾臓細胞中のDOXの細胞内濃度は、ミセル被包DOXにより処理した動物よりもわずかに高かった。
【０１１２】
組成物を静脈内注射された動物では、遊離DOXおよびミセル被包DOXのいずれにおいても、注射の10時間後の腫瘍細胞による著しい吸収は見られなかった。したがって、静脈内注射は、腫瘍細胞へは薬物を送達しなかった。静脈内注射とは対照的に、腫瘍内DOX注射は、標的腫瘍細胞へ薬物を効率的に送達した。ミセル被包DOXは、腫瘍内で長い保持時間および腫瘍細胞内の優先的な局在性に示される様に、遊離DOXよりもより効率的である。
【０１１３】
実施例17
in vivoでのMDA MB231腫瘍増殖に対するマイクロバブルおよび超音波の効果
nu/nuマウスに、静脈内、皮下、または腫瘍内のいずれかに注射されたマイクロバブル懸濁液は、どのような副作用も生じなかった。皮下または腫瘍内に注射した場合、マイクロバブルは注射部位に数週間残留し、したがって、超音波刺激作用のもとで、要望に応じて薬物を送達する薬物貯蔵物として機能出来る；注射部位に形成された「こぶ」は、おそらくは安定化共重合体の生分解によって、一ヶ月後までには漸減および完全消滅した。
【０１１４】
MDA MB231腫瘍はnu/nuマウスに接種された。8つの処理群全体が、このような実験で研究された：
1−コントロール
2−ミセル配合物の静脈内（iv）注射（PFPなし、超音波なし）
3−マイクロバブル配合物の静脈内注射（PFPなし、超音波なし）
4−ミセル配合物の腫瘍内（it）注射（PFPなし、超音波なし）
5−マイクロバブル配合物の腫瘍内注射（PFPなし、超音波なし）−処理1回
6−ミセル配合物の静脈内注射、超音波あり
7−マイクロバブル配合物の静脈内注射、超音波あり
8−マイクロバブル配合物の腫瘍内注射、超音波あり−処理1回
マウスは、2％（量）のPFPと配合されたPEG2000-PLLA2000（PBS溶液中0.5％重合体）（マイクロバブル配合物として表示される）中に被包された3 mg/kgのDOXを用いて処理された。何匹かのマウスは非集束3 MHz超音波を、出力密度2 W/ cm2および20％の負荷サイクルで150秒間超音波処理された。静脈内薬物注射の4時間後、または直接的な腫瘍内注射の15分後に、超音波を腫瘍へ局所的に適用した。静脈内注射による4回の処理が行われ、処理間には3日間の間隔をあけた（処理群2、3、6および7）。同様の処理スケジュールがミセル配合物の腫瘍内注射のために行われた（処理群4）。マイクロバブル配合物による1回のみの腫瘍内処理は処理群5および8について行われた。
【０１１５】
超音波処理を行わないマイクロバブル配合物の静脈内注射または腫瘍内注射時には、腫瘍増殖に対する薬物装填マイクロバブルの効果は見られず、このことからマイクロバブルによる薬物保持の有意な度合いが示唆される。しかしながら、マイクロバブル配合物の、静脈内注射（処理群DおよびCを比較のこと）または腫瘍内注射（処理群FおよびE、またはHおよびGを比較のこと）が3 MHzの超音波処理と併用された場合、腫瘍増殖の劇的な抑制が観察された。処理1ヶ月後の腫瘍の写真は図29に示される。治療プロトコルおよび投与時の腫瘍齢は表12に示される。
【０１１６】
【表１２】
2008542293.tif 000014
【０１１７】
写真で明らかなように、超音波の腫瘍処理と併用されたマイクロバブル配合物の静脈内注射および腫瘍内注射は、腫瘍増殖の抑止および疾患の安定化に効果的であった。しかしながら超音波処理を行わない場合、マイクロバブル配合物の静脈内注射は、ミセル配合物の注射よりも効果が少なかった。また、超音波処理を行わない場合、マイクロバブル配合物の腫瘍内注射は、腫瘍増殖防止には効果的でなかった。
【０１１８】
本発明の理論によって制限されるものではないが、以下は本明細書中に記載された良好な結果を説明するのに役立つと考えられる。
【０１１９】
1. 超音波処理がない場合、マイクロバブル配合物の静脈内注射は、ミセル配合物の静脈内注射よりも効果的ではない。この効果の原因となる可能性として、薬物装填ミセルは腫瘍体積に蓄積する一方、大きなマイクロバブルは毛細血管を通して浸透せず、また超音波処理をしない限り、腫瘍へ薬物を標的化しないことがあげられる。
【０１２０】
2. 腫瘍の超音波処理は、ミセル配合物およびマイクロバブル配合物の双方の作用を増強した。マイクロバブルの存在下では、超音波処理された腫瘍の増殖は完全に阻害された（処理群7）。
【０１２１】
3. 腫瘍超音波処理を併用された腫瘍内注射は1回の注射でも、効果的に腫瘍増殖を防ぎ、疾患の安定化を生じた。これらのデータは図29の写真で図解される。
【０１２２】
実施例18
多剤耐性乳癌MCF7/AD腫瘍の増殖に対する、腫瘍超音波処理を併用したミセル被包パクリタキセルの静脈内注射および腫瘍内注射の効果
超音波処理がない場合、これらの腫瘍は、臨床パクリタキセル配合物（パクリタキセル注射）またはミセル配合物（mPEG-PDLLAミセル内の被包されたパクリタキセル）のいずれかによる処理に対して非常に抵抗性がある；後者の配合物はSamyang Pharmaceuticals社（韓国）で開発され、また寄付された。しかしながら、超音波の照射により、腫瘍増殖の有意な抑制が観察された；80％のケースでは、腫瘍は完全に消散された。このことは、静脈内薬物注射および腫瘍内薬物注射の両方ともにおいて、本当に起きたことである。例として、図30は、腫瘍超音波処理を併用したミセル被包パクリタキセルの腫瘍内注射によって処理されたマウスの写真を示す。図30で示される2つの腫瘍の左側のみが直接的な注射によって処理され、右側の腫瘍はコントロールとして用いられた。処理された腫瘍は、処理の一ヶ月半後には完全に消散したことから、超音波によって増強された、多剤耐性腫瘍の腫瘍内化学療法の高効率性が示された。
【０１２３】
実施例19
超音波イメージング
（a）水、ナノエマルジョン（室温で）、またはナノ／マイクロバブル（37℃で）で充填されたファントムキャピラリの7.5 MHzでの超音波イメージは、PEG2000-PCL2000 1％-1％の系について図31に示された。ナノエマルジョンおよびナノ／マイクロバブルの両方はエコー形成性であることを立証した；しかしながらマイクロバブルはナノ液滴よりもより高い超音波造影を示した。
【０１２４】
（b）室温にて維持されたウシ肝臓（左）または37℃で予熱されたアガロース組織ファントム（右）中に注射された、実施例9で記載された、空のマイクロバブルまたは薬物装填マイクロバブル（0.2％濃度のPEG2000-PLLA2000、0.1％濃度のPFP）の7.5 MHzでの超音波イメージ。イメージは、並行して行われたOptison（登録商標）で得られたイメージに匹敵した。
【０１２５】
本発明は特定の態様で記載されているが、本発明は、本開示の趣旨および範囲内で、さらに変更されうる。本発明はどの薬物キャリアとも用いられてよく、薬物キャリアの構造を、超音波処理された組織で装填薬物が局所的に遊離されるように、マイクロバブル増強超音波の作用下で崩壊することができる。例えば、超音波照射のようなエネルギー崩壊技術は、リポソームによる薬物遊離または送達を増強する。超音波補助されたリポソームによる薬物遊離の技術は、2005年8月にアメリカ国立保健研究所の臨床センターの放射線部門におけるセミナーにて本発明者により報告され、またScience誌上で報告された（Harder, B. "Ultrasound's New Focus, can it eradicate tumors", Science, April 29, 2006; Vol. 169, No. 17, p 264）。これら2つの報告の内容は、本明細書中に参考文献として援用される。マイクロバブルとともに用いられることが可能な薬物キャリアのリストには、ミセル、リポソーム、ナノエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノバブル、ナノシェル粒子などが含まれるが、これらに限定されない。ミセル、リポソーム、ナノエマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノバブル、ナノシェル粒子を薬物キャリアとして用いる技術は、薬物送達の分野で知られている。
【０１２６】
本出願は、したがって、これらの通常の原理を用いた本発明の、どのようなバリエーション、使用、または改作をカバーすることを意図される。さらに、本出願は、本発明に付随し、また添付クレームの範囲内にあたる、当該技術分野で知られている、または慣習的な実施から派生するような、本開示からの逸脱をもカバーすることが意図される。
【０１２７】
本明細書中に引用した、刊行物、特許および特許出願を含む、全ての参考文献は、参考文献として援用されるため、あたかも各参考文献が、個別に、および特異的に、参考文献として援用されるために示唆され、またこれら全体で明記されたのと同程度で、参考文献として援用される。本明細書中で考察された参考文献は、本出願の出願日前の開示として単に提供された。本明細書は、本発明者は、先行するこのような開示を発明前という長所として権利を与えない、という承認としてみなされることにはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図1は、本発明の一つの態様の模式図を示す。ミセルおよび／または小型のマイクロバブル（直径は数百ナノメートル以下で、腫瘍型に依存する）に被包された薬物は、腫瘍間質中で血管外遊出され、大型のマクロバブル（直径700 nmまたはそれ以上）中に被包された薬物は循環器内に残留する。これらのより大きなマイクロバブルは、キャビテーション核として機能する。腫瘍へ向けられた超音波の作用の下で、マイクロバブルは周期的に変動し、また崩壊することで、腫瘍体積中でミセルおよび／または小型のナノバブルからの薬物の遊離を引き起こし、そして腫瘍細胞による細胞内への薬物取り込みを増加させる。
【図２】図2は、ポリ（エチレングリコール）-co-ポリ（L-ラクチド）（PEG2000-PLLA2000）のミセル溶液中のパーフルオロペンタン（「PFP」）マイクロエマルジョンの顕微鏡写真を示す。
【図３−１】図3（A）は、図2の組成物のマイクロエマルジョンの室温でのサイズ分布を示す。図3（B）は、図2の組成物のマイクロバブルの42℃でのサイズ分布を示す。
【図３−２】図3（C）は、図2の組成物のマイクロバブルを42℃から室温へ冷却したときのマイクロバブルのサイズ分布を示す。
【図４】図4は、1％のPEG-2000-PCL2000、1％のPFP系での粒子サイズ分布に対する37℃への加熱効果を示す。加熱時に、ナノ液滴（細線）が、より大型のマイクロバブル（太線）へと転換するが、PEG-PCLの系では、加熱効果は可逆的であり、冷却時に、最初の粒子サイズ分布が効率的に回復される（破線）。
【図５】図5は、0.1％（v/v）のPFP濃度（A）、1％（v/v）のPFP濃度（B）での、PEG2000-ブロック-PLLA2000共重合体の粒子サイズ分布を示す。（A）は主にミセル（21.4 nm）を示し、（B）は主に液滴（256および811 nm）を示す。本明細書で示される粒子のサイズは、最大ピークに対応するサイズである。
【図６】図6は、0.2％濃度のPEG2000-ブロック-PLLA2000および0.5％濃度のPFPでの粒子サイズ分布を示す。0.2％の共重合体濃度での1800 nmの液滴サイズを、1.0％の共重合体濃度での800-1200 nmと比較する。
【図７】図7は、37℃において、さまざまな時間インキュベートした、0.5％のPEG2000-PLLA2000、2％のPFP、0.75 mg/ml のDOXの系での平均バブルサイズを示す。バブルサイズは室温（RT）で測定された。この系はさらに、細胞培養および動物実験にも用いられた。上述したデータは、ナノ／マイクロバブルが、静脈内注射によって少なくとも4時間は循環器内で保持されるであろうことを意味している。4時間の加熱後の粒子サイズ分布は2つの別々の試験である図19に示される。
【図８】図8は、0.5％のPEG2000-PLLA2000、2％のPFP、0.75 mg/ml のDOXの配合物を37℃で4時間加熱した後の粒子サイズ分布を示す。2つの別々の実験結果が示されている。700 nm〜800 nmのサイズのナノバブルおよび200 nm〜300 nmの小型ナノ液滴は、4時間の加熱後も保持されている。より小型のナノ液滴は、腫瘍毛細管壁を通して浸透し、腫瘍間質中に蓄積されると期待される。より大型のバブルは循環系内に残留する；腫瘍局所的な超音波でのバブルの崩壊は、より小型のナノ粒子からの薬物遊離、および腫瘍細胞による細胞内薬物取り込みを増加させる。
【図９】図9は、1.0％濃度のプルロニックP-105に関して、粒子サイズ分布のPFP濃度への依存性を示す。PFP濃度が0.1％ではミセルは観察されたが、ナノ液滴（580 nm〜680 nm）のみがこの系で存在する場合、0.5％または1％のPFP濃度では観察されなかった。エマルジョン作製1日後にサイズ分布が測定され、またこの系は室温で保持された。
【図１０】図10は、初期のPEG2000-PCL2000溶液（PFPを含まない）中での粒子サイズ分布を示す。
【図１１】図11は、0.3％のPEG2000-PCL2000、1.0％のPFPの系での粒子サイズ分布を示す。
【図１２】図12は、45倍に希釈した0.3％のPEG2000-PCL2000、1.0％のPFPの系での粒子サイズ分布を示す。
【図１３】図13は、PEG2000-PCL2000共重合体濃度の、ナノバブルサイズに及ぼす効果を示す（PFP濃度は1％）。
【図１４−１】図14（A）は、超音波処理前の粒子サイズ分布を示す。図14（B）は、室温で1.1 MHzの集束超音波による超音波処理後の粒子サイズ分布を示す（超音波パラメータ：周波数1.1 MHz、圧力振幅0.55 Mpa、負荷サイクル（duty cycle）30％、持続時間15秒、パルス長0.5秒）。大型の液滴（1500 nm）はより小型の液滴（657 nm）へと崩壊する。液滴の数はミセルが消失するにつれて増加する。超音波はより小型の液滴（274 nm）には効果がない。
【図１４−２】図14（C）は、37℃での非集束1-MHz超音波処理後の粒子サイズ分布を示す。超音波パラメータ：周波数1.0 MHz、出力密度3.4 W/ cm2、負荷サイクル33％、持続時間30秒。この効果は、より多くの液滴が崩壊されて小型の共重合体結合物（associates）（130 nm）になるような分布へと移行することを除き、室温で観察された効果（図10cを参照）と同様である。
【図１４−３】図14（D）は、室温での非集束1-MHz超音波連続波（CW）による超音波処理後の粒子サイズ分布を示す。超音波パラメータ：CW 1.0 MHz、出力密度3.4 W/ cm2、持続時間60秒。微小液滴はマイクロバブルへと転換し、そして崩壊を受ける。遊離された共重合体分子は、ミセル（28 nm）へと自己構築する。図14（E）は、0.5％のPEG2000-PLLA2000、2％のPFPの系を非集束3.0-MHz超音波によって37℃で超音波処理した後の粒子サイズ分布を示す。超音波パラメータ：周波数3.0 MHz、出力密度2.0 W/ cm2、負荷サイクル20％、照射持続時間60秒。液滴は崩壊され、ミセル（28 nm）集団が形成される。
【図１５】図15は、PEG2000-PCL2000 DOX装填マイクロバブルの位相差顕微鏡写真（左）および蛍光顕微鏡写真（右）を示す。
【図１６】図16は、マイクロバブル非存在下での、PEG2000-PLLA2000ミセルによる、卵巣癌A2780細胞へのDOX送達に対する超音波の効果の増加を示す。細胞内への薬物取り込みの有意な増加が観察される。破線はコントロールサンプル（無処理A2780細胞）を表す。細線は、A2780腫瘍細胞のミセル被包DOXでの処理（超音波照射なし）を表す。点線は、ミセル被包DOXで処理したA2780腫瘍細胞を表し、超音波は3 MHzの周波数で照射された。太線は、ミセル被包DOXで処理したA2780腫瘍細胞を表し、超音波は1 MHzの周波数で照射された。
【図１７】図17は、PEG2000-PLLA2000ミセル／マイクロバブルの系を用いた、卵巣癌A2780細胞へのDOX送達に対するマイクロバブルの効果を示す。超音波処理されたサンプル内でのマイクロバブルの存在は、細胞内へのDOX取り込みをさらに増加する。破線はコントロール細胞を表す。細線は、ミセル被包DOXで処理されたA2780腫瘍細胞を表し、超音波は3 MHzの周波数で照射された。太線は、ミセル被包DOXで処理されたA2780腫瘍細胞を表し、超音波は3 MHzの周波数で照射され、そしてマイクロバブルが同時投与された。
【図１８】図18は、摘出されたMDA MB231腫瘍の細胞による細胞内へのDOX取り込みに対する、マイクロバブルおよび超音波の効果を示す。（A）マイクロバブルなし。（B）マイクロバブルあり。配合：[DOX]= 0.75 mg/ml、[PEG-PLLA] = 0.5％、[PFP] = 2％。超音波パラメータ：非集束超音波、周波数3 MHz、出力密度2 W/ cm2、負荷サイクル50％、持続時間1分。測定は細胞内DOX蛍光に基づく。
【図１９】図19は、多剤耐性卵巣癌A2780/AD細胞による細胞内へのDOX取り込みに対する、マイクロバブルおよび超音波の効果を示す。DOX（20 μg/ml）はPEG-PLLAミセル内で送達された。超音波パラメータ：非集束超音波、周波数1 MHz、出力密度3.4 W/ cm2、負荷サイクル33％、持続時間1分。
【図２０】図20は、25℃でのマイクロエマルジョン存在下（A）および37℃でのマイクロバブル存在下（B）における、1.1 MHzの非集束超音波（負荷サイクル33％、パルス長0.5秒、5 Mpa）によって0.5秒間超音波処理された後の、多剤耐性卵巣癌A2780/AD細胞の蛍光ヒストグラムを示す。
【図２１】図21は、25℃または37℃のいずれかにおいてマイクロエマルジョンの存在下で、1.1 MHzの超音波（負荷サイクル33％、パルス長0.5秒、5 Mpa）によって0.5秒間超音波処理された後の、多剤耐性卵巣癌A2780/AD細胞の生存率を示す。
【図２２】図22は、照射A2780ヒト卵巣癌腫瘍を接種したnu/nuマウスの写真を示す
【図２３】図23は、メスnu/nuマウスに接種されたA2780卵巣癌腫瘍の増殖曲線を示す。静脈内処理には、上から下へ以下のものを用いる：無処理コントロール；PBS（DOXなし）に溶解したDOX；混合プルロニック（登録商標）P-105（BASF）/PEG2000-DSMEミセル内に被包されたDOX；混合プルロニック（登録商標）P-105/PEG2000-DSMEミセル内に被包され、1 MHzの非集束超音波で30秒間、3.4 W/cm2、負荷サイクル50％によって処理されたDOX。DOXは3 mg/kgの量になるように投与され、また超音波はDOXの静脈内注射を行った4時間後に照射された。
【図２４】図24は、オスnu/nuマウスの乏血管性HCT116ヒト結腸癌腫瘍の内部を示す。
【図２５】図25は、重合体ミセル被包DOXによる腫瘍内処理前の、HCT116ヒト結腸癌腫瘍を持つオスnu/nuマウスを示す。
【図２６】図26は、重合体ミセル被包DOXによる腫瘍内処理後の、HCT116ヒト結腸癌腫瘍を持つオスnu/nuマウスを示す。
【図２７】図27は、ドキソルビシン（「DOX」、ADRIAMYCIN（登録商標）またはRUBEX（登録商標））の静脈内および腫瘍内注射によるHCT116腫瘍の成長曲線を示す。黒ひし形は、コントロールサンプルを表す。白四角は、リン酸緩衝液（「PBS」）に溶解したDOXを静脈内注射により処理した腫瘍を表す。白三角は、超音波処理後のミセル被包DOXの静脈内処理を表す。白丸は、ミセル被包DOXの静脈内処理を表す。黒丸は、超音波処理後のミセル被包DOXの腫瘍内処理を表す。静脈内注射と腫瘍内注射との効果の劇的な差は、HCT116結腸癌腫瘍の増殖において観察された。
【図２８】図28は、遊離のDOXまたはミセル被包DOXを腫瘍内注射して10時間後の腫瘍細胞の蛍光ヒストグラムを示す：細線はコントロール（無処理マウス中のHCT116腫瘍細胞）を表し、点線はPBS（DOXなし）に可溶化するDOXを表し、太線はミセル被包DOXを表す。
【図２９】図29は、乳癌MDA MB231腫瘍を接種されたマウスの写真を示す。マウスは、2％（v/v）のPFP（マイクロバブル配合物として本明細書中に表示されている）とともに配合されたPEG2000-PLLA2000（PBS溶液中、0.5％の重合体）に被包された3 mg/kgのDOXにより、処理された。何匹かのマウスは非集束3-MHz超音波を2 W/ cm2の出力密度、20％の負荷サイクルによって150秒間、超音波処理された。コントロール腫瘍は劇的な増殖が明らかになり（AおよびBを比較のこと）；静脈内注射については、処理は腫瘍が写真Cに表すサイズに達したときに開始され；腫瘍増殖は完全に抑制された（写真CおよびDを比較のこと）。腫瘍内注射については、腫瘍が写真EおよびGに表されるサイズに達したときに処置が開始され；処置は結果として疾患の安定化を引き起こした（FおよびE、またはHおよびGを比較のこと）。図29の写真番号は、表12に含まれる。
【図３０】図30は、多剤耐性乳癌MDF7/AD腫瘍を接種されたマウスの写真（左写真）を示す。左側の腫瘍は、PEG-PLLAミセルに被包されたパクリタキセルの4回の腫瘍内注射（週に2回）によって処理され；処理腫瘍は、薬物を注射された15分後に、非集束1-MHz超音波を3.4 W/ cm2の出力密度、33％の負荷サイクルによって30秒間超音波処理された。処理腫瘍の体積は漸減した（中央の写真パネル；処理終了から三週間後に撮影された）；処理された腫瘍の完全回復は処理から1ヶ月半後に観察された（右写真）。
【図３１】図31は、（左から右に）37℃でのマイクロバブル、室温でのマイクロエマルジョン、および水を充填したファントム毛細管の7.5 MHzでの超音波画像を示す。
【図３２】図32は、シリンジ針から放出されるナノ液滴またはマイクロバブルの流れの7.5 MHzでの超音波画像を示す。（A）本明細書中で開示されたように、マイクロエマルジョン組成物の流れを室温でウシ肝臓中に注射するシリンジ針。（B）マイクロバブル組成物の流れを42℃でアガロースゲルに注射するシリンジ針。シリンジ針の先から放出されるマイクロバブルの流れおよび針の上部のマイクロバブル雲が見て取れる。
【図２】
2008542293.tif 000015
【図３−１】
2008542293.tif 000016
【図３−２】
2008542293.tif 000017
【図４】
2008542293.tif 000018
【図５】
2008542293.tif 000019
【図６】
2008542293.tif 000020
【図７】
2008542293.tif 000021
【図８】
2008542293.tif 000022
【図９】
2008542293.tif 000023
【図１０】
2008542293.tif 000024
【図１１】
2008542293.tif 000025
【図１２】
2008542293.tif 000026
【図１３】
2008542293.tif 000027
【図１４−１】
2008542293.tif 000028
【図１４−２】
2008542293.tif 000029
【図１４−３】
2008542293.tif 000030
【図１５】
2008542293.tif 000031
【図１６】
2008542293.tif 000032
【図１７】
2008542293.tif 000033
【図１８】
2008542293.tif 000034
【図１９】
2008542293.tif 000035
【図２０】
2008542293.tif 000036
【図２１】
2008542293.tif 000037
【図２２】
2008542293.tif 000038
【図２３】
2008542293.tif 000039
【図２４】
2008542293.tif 000040
【図２５】
2008542293.tif 000041
【図２６】
2008542293.tif 000042
【図２７】
2008542293.tif 000043
【図２８】
2008542293.tif 000044
【図２９】
2008542293.tif 000045
【図３０】
2008542293.tif 000046
【図３２】
2008542293.tif 000047
【図１】
2008542293.tif 000048
【図３１】
2008542293.tif 000049
【国際調査報告】
2008542293.tif 000050
2008542293.tif 000051