(57)【要約】  本発明は、メチルピルビン酸（ピルビン酸メチルエステル）及び又はメチルピルベート（メチルピルベートは、メチルピルビン酸のイオン化形態）を、筋肉エネルギー産生増強目的で使用することに関する。このアニオンは、食事サプリメント、エネルギー賦活剤又は薬剤として使用する時、塩として製剤化できる。メチルピルベート化合物類には、（１）（ナトリウム又はカリウムメチルピルベートのような）１価のカチオンまたは（２）（カルシウム又はマグネシウムメチルピルベートのような）二価のカチオンを用いた塩及びこれらの化合物類のアナログ類が含まれ、これらはメチルピルベートの基質又は基質アナログ類として作用できる。メチルピルベート及び又はメチルピルビン酸の使用は、慢性及び又は急性ベースで経口投与または点滴で有効である。用語“メチルピルベート、メチルピルベート化合物類、メチルピルビン酸”は相互に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルピルベートを用いて哺乳類において、筋肉エネルギー産生、筋肉呼吸およびパフォーマンスを増強させる方法。
【請求項２】
メチルピルビン酸を用いることを含む哺乳類における筋肉エネルギー産生、筋肉呼吸およびパフォーマンスを増強させる方法。
【請求項３】
メチルピルベートを用いることを含む哺乳類におけるメチルピルベートレベルおよび前記効果を増強させる方法。
【請求項４】
メチルピルビン酸を用いることを含む哺乳類におけるメチルピルビン酸レベルおよび前記効果を増強させる方法。
【請求項５】
メチルピルビン酸の治療有効量を哺乳類に対して点滴または経口投与する請求項２記載の方法。
【請求項６】
メチルピルベートの治療有効量を哺乳類に対して点滴または経口投与する請求項１記載の方法。
【請求項７】
メチルピルベートの塩が（ナトリウムまたはカリウムメチルピルベートのような）１価カチオンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
メチルピルベートの塩が（カルシウムまたはマグネシウムメチルピルベートのような）２価カチオンである請求項６記載の方法。
【請求項９】
これらの化合物のアナログ類がメチルピルベートの基質類または基質アナログ類として作用できる請求項６記載の方法。
【請求項１０】
さらにメチルピルベートの塩およびそのための薬理学的に許容できる賦形剤および／または希釈剤の組成物を含む請求項６記載の方法。
【請求項１１】
メチルピルベートの塩および組成物がさらに、ビタミン類、コエンザイム類、ミネラル物質類、アミノ酸類、生薬類、クレアチン化合物類および抗酸化剤類を含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、食事サプリメントまたはエネルギー賦活剤または薬剤の形状で経口投与可能である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、食事サプリメントまたはエネルギー賦活剤または薬剤の形状で経口投与可能である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、トローチ剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、サシェット（小さな薬袋）、シロップ類またはバイアル類の形状である請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、トローチ剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、サシェット（小さな薬袋）、シロップ類またはバイアル類の形状である請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、前記塩類の少なくともひとつを約１００ｍｇ乃至約２８グラム、好適には約０．５ｇ乃至５グラム含む単位投与形状である請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、前記塩類の少なくともひとつを約１００ｍｇ乃至約２８グラム、好適には約０．５ｇ乃至５グラム含む単位投与形状である請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
クレアチン化合物類をさらに含む請求項１６記載の方法で、この化合物類は本方法において使用でき、これには、（１）クレアチンキナーゼの基質または基質アナログとして作用できるクレアチン、クレアチンリン酸およびこれらの化合物のアナログ類、（２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とクレアチンの共有結合構造アナログ類を含むクレアチンキナーゼの２基質阻害剤類、（３）クレアチンキナーゼの可逆的または不可逆的阻害剤類として作用できるクレアチンアナログ類、および（４）Ｎ−ホスホリル基を模倣している運搬不可官能基類を有するＮ−ホスホロクレアチンアナログ類が含まれる。
【請求項１９】
クレアチン化合物類をさらに含む請求項１７記載の方法で、この化合物類は本方法において使用でき、これには、（１）クレアチンキナーゼの基質または基質アナログとして作用できるクレアチン、クレアチンリン酸およびこれらの化合物のアナログ類、（２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とクレアチンの共有結合構造アナログ類を含むクレアチンキナーゼの２基質阻害剤類、（３）クレアチンキナーゼの可逆的または不可逆的阻害剤類として作用できるクレアチンアナログ類、および（４）Ｎ−ホスホリル基を模倣している運搬不可官能基類を有するＮ−ホスホロクレアチンアナログ類が含まれる。
【請求項２０】
アナログ類が、メチルピルビン酸の基質類または基質アナログ類として作用できる請求項５記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、メチルピルビン酸およびそのための薬理学的に許容できる賦形剤および／または希釈剤の組成物を含む請求項５記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物がさらに、メチルピルビン酸およびビタミン類、コエンザイム類、ミネラル物質類、アミノ酸類、生薬類、クレアチン化合物類および抗酸化剤類をさらに含む組成物を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、食事サプリメントまたはエネルギー賦活剤または薬剤の形状で経口投与可能である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、食事サプリメントまたはエネルギー賦活剤または薬剤の形状で経口投与可能である請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、トローチ剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、サシェット（小さな薬袋）、シロップ類またはバイアル類の形状である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、トローチ剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、サシェット（小さな薬袋）、シロップ類またはバイアル類の形状である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、約１００ｍｇ乃至約２８グラム、好適には約０．５ｇ乃至５グラム含む単位投与形状である請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、約１００ｍｇ乃至約２８グラム、好適には約０．５ｇ乃至５グラム含む単位投与形状である請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
クレアチン化合物類をさらに含む請求項２７記載の方法で、この化合物類は本方法において使用でき、これには、（１）クレアチンキナーゼの基質または基質アナログとして作用できるクレアチン、クレアチンリン酸およびこれらの化合物のアナログ類、（２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とクレアチンの共有結合構造アナログ類を含むクレアチンキナーゼの２基質阻害剤類、（３）クレアチンキナーゼの可逆的または不可逆的阻害剤類として作用できるクレアチンアナログ類、および（４）Ｎ−ホスホリル基を模倣している運搬不可官能基類を有するＮ−ホスホロクレアチンアナログ類が含まれる。
【請求項３０】
クレアチン化合物類をさらに含む請求項２８記載の方法で、この化合物類は本方法において使用でき、これには、（１）クレアチンキナーゼの基質または基質アナログとして作用できるクレアチン、クレアチンリン酸およびこれらの化合物のアナログ類、（２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とクレアチンの共有結合構造アナログ類を含むクレアチンキナーゼの２基質阻害剤類、（３）クレアチンキナーゼの可逆的または不可逆的阻害剤類として作用できるクレアチンアナログ類、および（４）Ｎ−ホスホリル基を模倣している運搬不可官能基類を有するＮ−ホスホロクレアチンアナログ類が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は筋肉刺激分野に関し、さらに詳細には、メチルピルビン酸（ピルビン酸のメチルエステル）および／またはメチルピルベート（メチルピルベートは、メチルピルビン酸のイオン化形態である）を用いてエネルギー産生を増強することに関し、これらは、筋肉エネルギー産生増強目的のために前記システムを修飾する。これは、哺乳類筋肉の収縮と拡張を可能にするであろう。
【背景技術】
【０００２】
下記の本文において、用語“メチルピルベート、メチルピルベート化合物類、メチルピルビン酸”は、相互に用いられている。
【０００３】
細胞は、生存しかつその生理機能を果たすためにエネルギーを必要とし、一般に、細胞にとって唯一のエネルギー源は血液に運搬されるグルコースと酸素であると認められている。細胞がグルコースと酸素を用いてエネルギーを産生する過程には、２つの主な構成要素がある。第一の構成要素はグルコースのピルベートへの嫌気性変換を必須とし少量のエネルギーを放出し、第二の構成要素は、ピルベートの二酸化炭素と水への酸化的変換を必要とし、大量のエネルギーが放出される。ピルベートは、生物体においてグルコースから連続的に製造される。グルコースがピルベートに変換されるプロセスには、（酸素不在下において）嫌気的に起こる一連の酵素反応が必須である。この過程は、“解糖”と称されている。少量のエネルギーがグルコースのピルベートへの解糖変換において産生されるが、はるかに大量のエネルギーが、ピルベートが二酸化炭素と水へ分解される次のさらに複雑な一連の反応において産生される。このプロセスは酸素を絶対的に必要とし“酸化的呼吸”と称され、クレーブストリカルボン酸サイクルのさまざまな酵素によりピルベート類が段階的に代謝分解されその産物が電子伝達連鎖反応により高エネルギー分子に変換される。
【０００４】
（米国特許分類）５１４／２３；５１４／５６５；５１４／２７５；５１４／３８５；５１４／３８６；５１４／３９６；５１４／５５７；５１４／５０１；５１４／５５３；５１４／５６３；５１４／５６４；５１４／５７５；５１４／６３１；５１４／６３６；５１４／６４６；５１４／５４６；５１４／５４７
【０００５】
（国際特許分類）０４７／１２；Ａ６１Ｋ  ０３７／２６；Ａ６１Ｋ  ０３１／１９８，７０，１９，２２
【０００６】
（サーチ分野）５１４／２３，３，５６５，２７５，３８５，３８６，３９６，５４６，５４７，５５３，５５４，５０１，５６３，５６４，５７５，６３１，６３６，６４６，５５７
【特許文献１】米国特許第４８８３７８６号（Puricelli、１９８９年１１月）
【特許文献２】米国特許第５２７０４７２号（Taglialatela、１９９３年１２月）
【特許文献３】米国特許第６０８０７８６号（Santaniello、２０００年６月）
【特許文献４】欧州特許第０  ３５４  ８４８号（１９９０年２月）
【特許文献５】国際公開第ＷＯ９８／４７８５７号（１９９８年１０月）
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＡＴＰは筋肉収縮と拡張プロセスにとってのエネルギー源であり、アデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）にもうひとつのホスフェート基を付加されＡＴＰを形成し、最終的に形成される。ＡＴＰは、非常に限られた閾値以上に組織に貯蔵されることはない。したがって、スポーツ選手のような激しい肉体活動を行うヒトにとって、筋肉エネルギーレベルを維持するために一定のＡＴＰ供給源は必須である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は筋肉刺激分野に関し、さらに詳細には、このシステムを修飾するメチルピルベートを用いることによってエネルギー産生を増強することに関する。この修飾により、哺乳類筋肉の収縮と拡張が可能となるであろう。好適な使用法では、エネルギーを促進する１種以上の物質類とともにメチルピルベート塩を同時投与する。メチルピルベート化合物類の典型的投与量は、肉体活動の期間と種類とともに、体の大きさ、年齢、健康およびフィットネスレベルのような要因に依存するであろう。
【０００９】
本発明はさらに、ビタミン類、コエンザイム類、ミネラル物質類、アミノ酸類、生薬類、抗酸化剤類およびクレアチン化合物類とともにメチルピルベート化合物類を使用する方法に関し、それらは、エネルギー産生と従ってパフォーマンスを増強するために筋肉に作用する。
【００１０】
本方法で使用できるクレアチン化合物類には、（１）クレアチンキナーゼの基質または基質アナログとして作用できるクレアチン、クレアチンリン酸およびこれらの化合物のアナログ類、（２）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）とクレアチンの共有結合構造アナログ類を含むクレアチンキナーゼの２基質阻害剤類、（３）クレアチンキナーゼの可逆的または不可逆的阻害剤類として作用できるクレアチンアナログ類、および（４）Ｎ−ホスホリル基を模倣している運搬不可官能基類を有するＮ−ホスホロクレアチンアナログ類が含まれる。
【発明の効果】
【００１１】
クレアチンは、筋肉に入るとさまざまな効果を発揮する。エクササイズパフォーマンスを向上させ、ある疾病状態で見られる筋肉機能とエネルギー代謝の改善を担うことができるのがこうした効果である。急性および慢性Ｃｒ取り込みの後に観察されるエクササイズパフォーマンス増強を説明するため、いくつかのメカニズムが提案されてきた。アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）濃度は生理的プロセスを維持し、組織を低酸素誘発損傷から保護する。Ｃｒは、ＰＣｒエネルギーシステムに関与することでＡＴＰ産生に関与している。このシステムは、一時的でかつ空間的なエネルギー緩衝剤ならびにｐＨ緩衝剤として作用できる。ＣｒおよびＰＣｒは空間的エネルギー緩衝剤として内部ミトコンドリアから細胞質ゾルへのＡＴＰ輸送に関与している。クレアチンキナーゼにより触媒される可逆反応において、ＣｒおよびＡＴＰは、ＰＣｒとアデノシンジホスフェート（ＡＤＰ）を形成する。一時的エネルギー緩衝剤およびｐＨ緩衝剤の両者として作用できるのが、この反応である。電荷により生体膜を介した分配ができなくなるので、極性ＰＣｒの形成がＣｒを筋肉内に“閉じ込め”、Ｃｒ滞留を維持する。低ｐＨの際には（乳酸が蓄積するエクササイズ時において）、この反応がＡＴＰ産生に有利となるであろう。これとは逆に、ＡＴＰが好気的に産生する回復期間において（例  エクササイズセット間の休憩期間）、この反応が進みＰＣｒレベルを増加させる。このエネルギーおよびｐＨ緩衝剤は、Ｃｒがエクササイズパフォーマンスを高めるために作用するひとつのメカニズムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、筋肉エネルギー産生増強のためのメチルピルベート用途に関する。メチルピルベートは、メチルピルビン酸（ＣＨ３Ｃ（Ｏ）ＣＯ２ＣＨ３）のイオン化形態である。生理的ｐＨにおいて、水素プロトンがカルボン酸基から遊離し、それによってメチルピルベートアニオンを産生する。薬剤または食事サプリメントとして使用する時、このアニオンは、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウムのような一価または二価のカチオンを用いて塩として製剤化できる。
【００１３】
モデルとしての膵ベータ細胞
グルコースが供給された多くの細胞のエネルギー必要性は、解糖および酸化的代謝により充足され、ＡＴＰを産生する。ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰの細胞質ゾルとミトコンドリア内含量を、Ｄ−グルコース濃度を増加させつつ４５分間インキュベーションしその後ジギトニンに２０秒間暴露させたランゲルハンス島で測定した。後者の処理が、総ランゲルハンス島ＡＴＰ／ＡＤＰ比とアデニレート電荷に影響を及ぼすことはなかった。Ｄ−グルコースは、ミトコンドリア内ＡＴＰ／ＡＤＰ比よりもむしろ細胞質ゾル中におけるその比をはるかに大きく高めた。細胞質ゾル中において、シグモイドパターンがＤ−グルコース濃度上昇時にＡＴＰ／ＡＤＰ比の変化を特徴的に表していた。これらの知見は、細胞質ゾルＡＴＰが、栄養誘発インシュリン放出過程における代謝事象のイオン事象への連関に関与しているという見解と矛盾していない。
【００１４】
膵ベータ細胞ミトコンドリア代謝の制御に関して知見を得るため、さまざまなミトコンドリア基質類、ＡＴＰ／ＡＤＰ比の変動および遊離Ｃａ２＋の呼吸に及ぼす直接的影響を、単離したミトコンドリアおよび透過クローン膵ベータ細胞（ＨＩＴ）を用いて調べた。ピルベートからの呼吸は高く、ステート３またはさまざまな酸化還元状態およびＡＴＰ／ＡＤＰ比固定値においてＣａ２＋により影響されなかった。にもかかわらず、高Ｃａ２＋はピリジンヌクレオチドフルオレセンスを上昇させ、このことは、Ｃａ２＋によるピルベートデハイドロゲナーゼの活性化を示唆していた。さらに、ピルベート存在下において、高Ｃａ２＋は、ピルベートからのＣＯ２産生を刺激し、クエン酸産生とミトコンドリアからの流出を高め、パルミテートからのＣＯ２産生を阻害した。後者の観察により、ベータ細胞脂肪酸酸化がマロニルＣｏＡばかりではなくミトコンドリア酸化還元状態によって全て制御されているわけではないことを示唆している。
【００１５】
アルファ−グリセロリン酸（アルファ−ＧＰ）酸化はＣａ（２＋）依存性であり、最大速度の１／２が約３００ｎＭ  Ｃａ２＋程度で観察された。最近、グルコース刺激クローン膵ベータ細胞（ＨＩＴ）中において呼吸上昇の前にＣａ２＋上昇が起こり、このことはＣａ２＋が最初の呼吸刺激に関与していないことを示唆している。呼吸は、ＡＤＰの振動性増加とともに基質（アルファ−ＧＰおよびピルベート）供給増加により刺激されることを示唆している。
【００１６】
Ｃａ２＋上昇はそれ自体で正味の呼吸を有意に増加させることはないであろうが、（１）アルファ−ＧＰシャトル活性化により酸化細胞質ゾルと高解糖フラックスを維持する、（２）ピルベートデハイドロゲナーゼを活性化し、間接的にピルベートカルボキシラーゼを活性化させ、クエン酸従って推定上のシグナルカップリングファクターであるマロニル−ＣｏＡとアシル−ＣｏＡの産生を持続させる、（３）ミトコンドリア酸化還元状態を高め脂肪酸からのピルベート酸化への切り替えを開始させるという重要な機能を有することができるのであろう。
【００１７】
グルコース刺激によるミトコンドリア代謝の上昇は、一般的に、インシュリン分泌の活性化に重要であると考えられている。ピルベートデハイドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は重要な制御酵素であり、ピルベートのクエン酸サイクルへの導入速度を支配していると考えられている。グルコース濃度上昇（１６乃至３０対３ｍＭ）は、単離ラット膵ランゲルハンス島ならびにクローンベータ細胞株（ＭＩＮ６）の両者においてＰＤＨ活性を増加させる。しかし、ジクロロアセテートにより惹起されたＰＤＨ活性の増加またはピルベートデハイドロゲナーゼホスファターゼの触媒サブユニットがアデノウイルスで発現したことで惹起されたＰＤＨ活性の増加には、ＭＩＮ６細胞中においてミトコンドリアピリジンヌクレオチドレベルまたは細胞質ゾルＡＴＰ濃度のグルコース誘発増加に対して全く影響がなく、さらに、単離ラットランゲルハンス島からのインシュリン分泌にも全く影響がなかった。同様に、上記のパラメータは、アデノウイルス誘発ＰＤＨキナーゼ（ＰＤＫ）過剰発現によるグルコース誘発ＰＤＨ活性の阻害に影響されなかった。したがって、ＰＤＨ複合体の活性化は、グルコース代謝の刺激およびインシュリン放出惹起において予想外にもわずかの役割しか果たしていない。
【００１８】
膵ベータ細胞において、細胞質ゾルＡＴＰの増加は、また、非常に重要なシグナル過程であり、脱分極による細胞内Ｃａ２＋増加により、インシュリン分泌に対するＡＴＰ感受性Ｋ＋チャンネル類（ＫＡＴＰ）のクロージャーを結合させる。解糖ではあるがクレーブスサイクルではないグルコースの代謝は、このシグナル伝達過程に極めて深く関与している。解糖阻害剤類がグルコース刺激インシュリン分泌を抑制する一方、ピルベート輸送またはクレーブスサイクル酵素類の阻害剤類は効果を持たなかった。ピルベートはグルコースと同程度にランゲルハンス島で代謝されるが、ピルベートは、インシュリン分泌刺激をもたらさず従ってＡＴＰを阻害しなかった。
【００１９】
膵ベータ細胞において、メチルピルベートは強力な分泌促進剤で、これを用いて刺激−分泌連関を調べる。ＭＰは、グルコースがない場合インシュリン分泌を刺激し、最大効果は５ｍＭで観察された。ＭＰは、濃度依存性（５−２０ｍＭ）にベータ細胞を脱分極した。ピルベートは、インシュリン放出を開始できなかったか（５−２０ｍＭ）または膜電位の脱分極ができなかった。単離ベータ細胞ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生は、ピルベートまたはＭＰとともにマレートまたはグルタメートの存在下インキュベーションすると媒体中にＡＴＰが蓄積することで検出された。ＭＰおよびグルタメートによるＡＴＰ産生は、ピルベート／グルタメートにより誘発されたＡＴＰ産生よりも高かった。ピルベート（５ｍＭ）またはＭＰ（５ｍＭ）は、全ランゲルハンス島においてＡＴＰ／ＡＤＰ比に全く効果がなかったが、一方、グルコース（２０ｍＭ）は全ランゲルハンス島ＡＴＰ／ＡＤＰ比を有意に増加させた。
【００２０】
インシュリン分泌をほとんど刺激しないピルベートに対比して、メチルピルベートは、有効なミトコンドリア基質として作用すると示唆されてきた。メチルピルベートは、ピルベートと対比して０．５ｍＭグルコース存在下、電気的活性を惹起した。したがって、メチルピルベートは、グルコースと同様、細胞質ゾルの遊離Ｃａ（２＋）を最初低下させたがその後増加させた。しかし、グルコースと対比して、メチルピルベートは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオートフルオレセンスをわずかしか低下させず、ＡＴＰ産生またはＡＴＰ／ＡＤＰ比に影響を及ぼさなかった。したがって、ＭＰ誘発ベータ細胞膜脱分極またはインシュリン放出は、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生に直接的に関連していない。
【００２１】
メチルピルベートがジャーカットＴリンパ球ミトコンドリアの内膜を横断するカチオン流を直接的に阻害するという知見は、この代謝物が、還元等価物を付与することなく呼吸サイクルを活性化することによってベータ細胞中におけるＡＴＰ産生を増加させるであろうということを示唆している。このメカニズムは、ＡＴＰ産生がわずかに一過性に増加することを説明できるであろう。さらに、メチルピルベートは、標準的全細胞構造で測定したＫ（ＡＴＰ）電流を阻害した。したがって、裏表にひっくり返したパッチ中におけるシングルチャンネル電流は、メチルピルベートにより阻害された。したがって、代謝の活性化ではなくＫ（ＡＴＰ）チャンネルの阻害は、メチルピルベートによる膵ベータ細胞中電気的活性の誘導を媒介する。
【００２２】
メチルピルベートは、膜透過アナログとして、ＫＡＴＰのブロック、〔Ｃａ２＋〕の持続的上昇、およびグルコース誘発インシュリン分泌の６倍増加をもたらした。このことは、ミトコンドリアピルベート代謝に由来するＡＴＰが、グルコースチャレンジに対するＫＡＴＰ応答制御に実質的に寄与していないことを示唆している。ベータ細胞内部におけるＡＴＰのサブコンパートメント化という考えを支持している。しかし、メチルピルベートによるクレーブスサイクルの正常を越えた刺激は、ＡＴＰの細胞内分配を凌駕しそれによりインシュリン分泌を駆動させることができる。
【００２３】
メチルピルベートの代謝を、単離ラット膵ランゲルハンス島におけるピルベートの代謝と比較した。メチルピルベートは、ミトコンドリア内ピルベート代謝物のアミノ酸類への変換をより効率的に支持し、Ｄ−〔５−３Ｈ〕グルコース利用を阻害し、Ｄ−〔３，４−１４Ｃ〕グルコースまたはＤ−〔６−１４Ｃ〕グルコース酸化とＤ−〔５−３Ｈ〕グルコース利用の比を高く維持し、グルコース由来２−ケト酸類の対応するアミノ酸類へのミトコンドリア内変換を阻害し、Ｌ−〔Ｕ−１４Ｃ〕グルタミンで前標識したランゲルハンス島からの１４ＣＯ２生産を促進した。メチルピルベートがまた、ピルベートよりもより顕著なミトコンドリアアルカリ化をもたらしたのは明白であり、そのことは、フルオレセインプローブまたは１４Ｃ−標識５，５−ジメチル−オキサゾリジン−２，４−ジオンを使用したｐＨ測定値比較から判断した。
【００２４】
これとは逆に、ピルベートは、より効率的にラクテート生産を増加させＬ−アラニンを産生させた。これらのひとつにまとめられる知見は、外来性ピルベートと比較して、そのメチルエステルがランゲルハンス島細胞の細胞質ゾル領域よりもむしろミトコンドリア領域で優先的に代謝されることを示唆している。メチルピルベートのインシュリン親和性作用の陽性および陰性成分類は、還元性等価物、ＡＴＰおよびＨ＋の正味の産生変化に関連づけられると提案されている。
【００２５】
メチルピルベートは、単離ラット膵ランゲルハンス島からのインシュリン放出に二重の効果を発揮することがわかった。陽性のインシュリン親和性作用は、Ｄ−グルコース低濃度で明確であった。２．８乃至８．３ｍＭ範囲においておよび１０．０ｍＭを超えない前記エステル濃度において、低下Ｋ＋伝導度のような栄養刺激インシュリン放出過程に典型的な特徴を示し、Ｃａ２＋流入を増強し、プロインシュリン生合成刺激を増強した。しかし、Ｄ−グルコース高濃度（１６．７ｍＭ）においておよび／または前記メチルエステル高濃度（２０．０ｍＭ）において、メチルピルベートの陰性インシュリン親和性作用も観察された。それが、ＡＴＰ産生に及ぼすメチルピルベートのいかなる悪影響にも起因していないことは明らかであり、そのことはもしかしたら形質膜の高分極によるのかも知れない。後者の変化に対するイオン性決定因子（類）は、同定されなかった。メチルピルベートの二元的な効果は、おそらく、エステル除去時における急激かつ逆説的インシュリン放出刺激を含めて分泌応答が異常な時間的経過を示すことを説明できるであろう。
【００２６】
膵ベータ細胞代謝を、定量的２光子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈイメージングを用いて膵ランゲルハンス島のグルコースおよびピルベート刺激時に調べた。細胞質およびミトコンドリアの間で空間的に分離された酸化還元変化が観察され、これを、全ランゲルハンス島インシュリン分泌と比較した。予測したとおり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびインシュリン分泌の両者とも、グルコース刺激に応答して持続的に増加した。対比して、ピルベートは、はるかに低いＮＡＤ（Ｐ）Ｈ応答を起こし、インシュリン分泌をもたらさなかった。ピルベート濃度が低いと細胞質ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを低下させたが、ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）Ｈには影響を及ぼさなかった。一方、高濃度では、細胞質およびミトコンドリアレベルを上昇させた。しかし、ピルベート刺激ミトコンドリア増加は一過性で、ベースライン付近レベルで平衡となっていた。ミトコンドリアピルベートトランスポータおよびマレート−アスパルテートシャトルの阻害剤を用いて、グルコース−およびピルベート刺激ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ応答メカニズムを解明した。これらのデータは、グルコース刺激ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびインシュリン分泌はピルベート輸送に依存しないがＮＡＤ（Ｐ）Ｈシャトル作用に依存していることを明らかにした。対比して、ピルベート刺激細胞質ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ応答は、両方の阻害剤類によって増強された。マレート−アスパルテートシャトル阻害剤は、驚くべきことに、ピルベート刺激インシュリン分泌を可能にした。これらのデータは、解糖がグルコース刺激インシュリン分泌において重要な役割を果たすモデルを裏付けている。これらのデータに基づいて、それが、トリカルボン酸サイクル酵素類のアロステリック阻害とミトコンドリアピルベート輸送のｐＨ依存性を含むグルコース刺激インシュリン分泌のメカニズムであるとして提案した。
【００２７】
ピリジンジヌクレオチド類（ＮＡＤおよびＮＡＤＰ）は、全ての生細胞におけるエネルギー伝達と代謝に必須の何百という酸化還元反応に関与しているユビキチン性コファクターである。ＮＡＤは、全生物において欠くことができない酸化還元コファクターである。さまざまな種におけるＮＡＤ生合成に必要な遺伝子類のほとんどが、公知となっている。さらに、ＮＡＤはまた、いくつかの核たんぱく質類のＡＤＰリボシル化のため、遺伝子沈黙制御に関与している沈黙情報レギュレータ２（Ｓｉｒ２）様ヒストンデアセチラーゼのため、およびサイクリックＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）依存性Ｃａ（２＋）シグナル作用のための基質として、作用する。ピリジンヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ（ＰＮＡＴ）はＡＴＰのＡＭＰ官能基とのピリジンモノヌクレオチド（ＮＭＮまたはＮａＭＮ）の縮合を触媒するＮＡＤ生合成経路における欠くことのできない中心的酵素であり、ＮＡＤ（またはＮａＡＤ）を形成する。
【００２８】
（１）ピルベートは、単離膵ランゲルハンス島において、その周囲のグルコース濃度に対してのインシュリン放出速度に関するシグモイド曲線を左にシフトさせる。この効果の大きさはピルベート（５−９０ｍＭ）濃度に関連し、濃度３０ｍＭでは、２ｍＭグルコースにより惹起される効果と同等である。
【００２９】
（２）８ｍＭ  グルコース存在下において、ピルベートに対する分泌応答は即時過程であり、２相パターンを示す。
【００３０】
（３）ピルベートのインシュリン親和性作用は、４５Ｃａ流出阻害および４５Ｃａ正味取り込み刺激と一致する。４５Ｃａ取り込みとインシュリン放出の関係は、ピルベート存在下において通常のパターンを示す。
【００３１】
（４）外来性のピルベートは、グルコース代謝に由来する量に近似する量でランゲルハンス島に急激に蓄積する。〔２−１４Ｃ〕ピルベートの酸化は、〔１−１４Ｃ〕ピルベート脱カルボキシル化速度の６４％を示し、濃度３０ｍＭでは、８ｍＭ−  〔Ｕ−１４Ｃ〕グルコースの速度に匹敵する。
【００３２】
（５）ラクテートへのピルベート変換について補正すると、３０ｍＭピルベートの酸化は、還元性等価物約３１４ｐｍｏｌ／１２０分／ランゲルハンス島の正味の生産に対応する。
【００３３】
（６）ピルベートは解糖速度に影響を及ぼさないが、グルコースの酸化を阻害する。グルコースはピルベート酸化に影響を及ぼさない。
【００３４】
（７）ピルベート（３０ｍＭ）は、ＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰのランゲルハンス島細胞における濃度に影響を及ぼさない。
【００３５】
（８）ピルベート（３０ｍＭ）はグルコース存在下で還元ニコチンアミドヌクレオチド類の濃度を増加させるが、しかしグルコース不在の場合増加させない。還元ニコチンアミドヌクレオチド類の濃度と４５Ｃａ取り込みとの間には密接な相関が見られる。
【００３６】
（９）ピルベートは、グルコースと同様、脂質生成をある程度刺激する。
【００３７】
（１０）ピルベートはグルコースに対比して、内因性栄養物の酸化を顕著に阻害する。後者の効果は、ピルベート酸化速度とそのインシュリン親和性作用の大きさに明らかな食い違いがあることを説明する。
【００３８】
（１１）インシュリン放出を刺激するピルベートの効果は、還元ニコチンアミドヌクレオチド類のランゲルハンス島細胞における濃度を増加させるピルベートの能力に依存していると結論した。
【００３９】
グルコース刺激インシュリン分泌は、細胞代謝フラックスに依存性の多段過程である。未改変の膵ランゲルハンス島についてのこれまでの研究では、２光子ＮＡＤ（Ｐ）ＨイメージングをＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとも称する）からの酸化還元シグナル組み合わせの定量的測定値として用いてきた。これらの研究では、非分泌剤であるピルベートが−細胞に入りＮＡＤ（Ｐ）Ｈの一過性上昇をもたらすことが明らかになっている。さらにピルベートの代謝的な成り行きを特性解析するため、１光子フラボプロテイン顕微鏡検査が、リポアミドデハイドロゲナーゼ（ＬｉｐＤＨ）オートフルオレセンスの同時アッセイとして開発されている。このフラボプロテインは、ミトコンドリアＮＡＤＨと直接的に平衡となっている。この方法を用いると、グルコース−用量応答が、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ両者の増加と矛盾していない。対比して、ピルベート刺激で観察したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの一過性上昇はＬｉｐＤＨの有意な変化を伴わず、そのことは、ピルベートが細胞ＮＡＤＰＨを上昇させるがＮＡＤＨを増加させないことを示唆している。メチルピルベートは、比較すると、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの顕著な応答を刺激した。これらのデータは、外来性ピルベートがミトコンドリアＮＡＤＨの有意な増加を誘発しないという新しい証拠を示している。このように能力がないことにより、インシュリンの刺激分泌に必要なＡＴＰを産生できないことになる。結局、これらのデータは、限定されたＰＤＨ依存性代謝または他の代謝メカニズムによるＮＡＤＨ応答の緩衝作用と一致している。
【００４０】
解糖およびミトコンドリアにおけるグルコース代謝は、膵ベータ細胞からのグルコース誘発インシュリン分泌にとって極めて重要である。ピルベート以外に解糖由来の１種以上の因子類が、インシュリン分泌につながるミトコンドリアシグナルの産生に必要であるように思われる。解糖由来還元形態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の電子は、ＮＡＤＨシャトルシステムを介してミトコンドリアに移送される。ＮＡＤＨシャトル機能を停止させることにより、グルコース誘発ＮＡＤＨオートフルオレセンス、ミトコンドリア膜電位、およびアデノシン三リン酸含量の増加が低下し、グルコース誘発インシュリン分泌が停止した。ＮＡＤＨシャトルは、明らかに、解糖をミトコンドリアエネルギー代謝の活性化と連関させ、インシュリン分泌を惹起する。
【００４１】
グリセロールリン酸シャトルとマレート−アスパルテートシャトルから構成されるＮＡＤＨシャトルシステムの膵ベータ細胞からのグルコース誘発インシュリン分泌に果たす役割を決定するため、グリセロールリン酸シャトルの速度限定酵素であるミトコンドリアグリセロール−三リン酸デハイドロゲナーゼｍＧＰＤＨを欠失しているマウスを用いた。両方のシャトルをマレート−アスパルテートシャトルの阻害剤であるアミノオキシアセテートで処理したｍＧＰＤＨ欠失ランゲルハンス島で停止させると、グルコース誘発インシュリン分泌が、ほとんど完璧に停止した。こうした条件下において、解糖フラックスとグルコース由来ピルベートのミトコンドリアへの供給は影響を受けなかったが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオートフルオレセンス、ミトコンドリア膜電位、Ｃａ２＋のミトコンドリアへの導入およびＡＴＰ含量のグルコース誘発増加が大きく低下した。この研究により、ＮＡＤＨシャトルシステムが、解糖をミトコンドリアエネルギー代謝の活性化に連関させグルコース誘発インシュリン分泌を惹起するために必須であるという新しい直接的証拠が得られ、従って、この研究によりグルコース誘発インシュリン分泌の代謝シグナルについての古典的モデルを新たにできる。
【００４２】
グルタメート−オキザロアセテートトランスアミナーゼ阻害剤従ってマレート−アスパルテートシャトル阻害剤であるアミノ−オキシ酢酸０．４ｍｍｏｌとブタ総頸動脈をインキュベーションすると、Ｏ２消費を２１％ほど阻害し、ホスホクレアチン含量を低下させ、トリカルボン酸サイクル活性を阻害した。解糖およびラクテート産生速度は速くなったが、グルコース酸化は阻害された。アミノ−オキシ酢酸のこうした効果には、マレート−アスパルテートシャトル阻害と細胞質酸化還元電位の上昇およびＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加という証拠があり、それらは、ラクテート／ピルベートとグリセロール−三−リン酸／ジハイドロキシアセトンホスフェート代謝物酸化還元カップル類の濃度比増加によって示唆された。脂肪酸であるオクタン酸の添加により、マレート−アスパルテートシャトル阻害によるエネルギー特性への悪影響を正常化した。マレート−アスパルテートシャトルが血管平滑筋中細胞質からのＮＡＤＨ還元等価物のクリアランスに関する主な方式であると結論した。グルコース酸化とラクテート産生は、シャトル活性により影響を受ける。この結果は、細胞質ＮＡＤＨ酸化還元電位増加がミトコンドリアエネルギー代謝を傷害するという仮説を裏付ける。
【００４３】
ベータ−メチレンアスパルテートはアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．１）の特異的阻害剤であり、それを用いて、ラット脳シナプトゾーム中におけるマレート−アスパルテートシャトルの役割を調べた。ラット脳細胞質ゾル、“遊離”ミトコンドリア、シナプトゾルおよびシナプス性ミトコンドリアを２ｍＭのベータ−メチレンアスパルテートとインキュベーションすると、アスパルテートアミノトランスフェラーゼがそれぞれ６９％、６７％、４９％および７６％ほど阻害される結果となった。“遊離”脳ミトコンドリアの再構成マレート−アスパルテートシャトルは、同程度（５３％）阻害された。
【００４４】
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ阻害とそれによるマレート−アスパルテートシャトルの阻害の結果、下記の変化が、シナプトゾームで観察された：ピルベートデハイドロゲナーゼ反応とトリカルボン酸サイクルによるグルコース酸化の低下；アセチルコリン合成低下；および細胞質酸化還元状態の増加であり、これは、ラクテート／ピルベート比によって測定した。これらの変化の主な理由は、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比の変化による直接的結果というよりはむしろ、トリカルボン酸サイクルを介した炭素流量低下（すなわち、オキザロアセテートの形成低下）に帰すことができる。
【００４５】
アミノオキシアセテートはピリドキサール依存性酵素類の阻害剤であり、ガンマ−アミノブチレート代謝阻害に日常的に用いられている。モルモット脳皮質シナプトゾームに対するこの阻害剤の生体エネルギー特性効果を調べた。それは、マレート−アスパルテートシャトルを阻害することによってミトコンドリアによる細胞質ゾルＮＡＤＨの再酸化を防止し、細胞質ゾルＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ酸化還元電位をマイナス方向に２６ｍＶだけシフトさせ、ラクテート／ピルベート比を増加させ、解糖性ピルベートを用いるミトコンドリアの能力を阻害させる。３−ハイドロキシブチレート／アセトアセテート比は有意に低下し、このことは、ミトコンドリアＮＡＤ＋／ＮＡＤＨカップルの酸化を示唆している。この結果は、単離神経末端における細胞質ゾルＮＡＤＨの再酸化においてマレート−アスパルテートシャトルが主な役割を果たしていることと矛盾していない。アミノオキシアセテートは呼吸能を限定し、ミトコンドリア膜電位とシナプトゾームＡＴＰ／ＡＤＰ比をグルコース欠損と同程度にまで低下させる。
【００４６】
細胞質酸化還元電位（Ｅｈ）とＮＡＤＨ／ＮＡＤ比を酸化された細胞内での代謝物酸化還元カップルに対する還元された細胞内での代謝物酸化還元カップルの比で測定し、この変動が、ミトコンドリアエネルギー特性に影響を及ぼししかも血管平滑筋の興奮および収縮反応性を変化させるのであろう。これらの仮説を検証するため、さまざまな基質中でブタ総頸動脈片をインキュベーションし細胞質酸化還元状態を実験的に操作した。代謝物カップル〔ラクテート〕／〔ピルベート〕ｉおよび〔グリセロール三−リン酸〕／〔ジハイドロキシアセトンホスフェート〕ｉの酸化還元電位は直線的に変化し（ｒ＝０．９４５）、このことは、この２種の細胞質酸化還元系間における平衡および細胞質ＮＡＤＨ／ＮＡＤとの平衡を示唆している。１０ｍｍピルベート（〔ｌａｃｔ〕／〔ｐｙｒ〕＝０．６）含有生理食塩水（ＰＳＳ）中でのインキュベーションにより、Ｏ２消費が約４５％増加し、トリカルボン酸（ＴＣＡサイクル）のアナプレロテック反応をもたらす一方、１０ｍｍラクテート−ＰＳＳ（〔ｌａｃｔ〕／〔ｐｙｒ〕＝４７）とインキュベーションしても全く効果がなかった。ＫＣｌを外部から高分極を起こさせる用量（１０ｍＭ）だけ添加すると、グルコース−ＰＳＳ（−０．８＋／−０．８ｇ）またはピルベート−ＰＳＳ（−２．１＋／−０．８ｇ）中でインキュベーションした筋肉の安静時緊張が低下したが、ラクテート−ＰＳＳ（１．５＋／−０．７ｇ）中における収縮を増加させた（ｎ＝１２−１８、ｐ＜０．０５）。８０ｍｍ  ＫＣｌ（脱分極）による収縮速度と大きさは、ラクテート−ＰＳＳ（Ｐ＝０．００１）中で低下した。ＫＣｌ濃度−応答曲線の傾きは、ピルベート＞グルコース＞ラクテート（Ｐ＜０．０００１）であることを示唆した；ラクテート（２９．１＋／−１．０ｍＭ）中におけるＥＣ５０は、グルコース（３２．１＋／−０．９ｍｍ）またはピルベート（３２．２＋／−１．０ｍＭ）中におけるよりも小さかった、Ｐ＜０．０３。この結果は、平滑筋の興奮性に影響を及ぼしミトコンドリアエネルギー特性に悪影響を及ぼす細胞質酸化還元電位の効果と矛盾していない。
【００４７】
細胞質ＮＡＤＨ／ＮＡＤ酸化還元電位は、血管平滑筋のエネルギー代謝と収縮反応性に影響を及ぼす。細胞質ゾルにおけるＮＡＤＨ／ＮＡＤ酸化還元状態は主に解糖により決定され、それは、平滑筋中で２種の機能的に独立した細胞質コンパートメントに分離されており、そのひとつは、Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅの活性にエネルギーを与える。解糖コンパートメント変動が細胞質ゾルＮＡＤＨ／ＮＡＤ酸化還元状態に及ぼす効果を、検証した。１０マイクロモルのウアバインによりＮａ（＋）−Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅを阻害すると、その結果、解糖とラクテート産生が低下した。これにもかかわらず、ラクテート／ピルベートおよびグリセロール−三−リン酸／ジハイドロキシアセトンホスフェート（従って、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ）の解糖代謝物酸化還元カップルの細胞内濃度および細胞質酸化還元状態は、変化しなかった。代謝物酸化還元カップルが一定濃度であることと酸化還元電位は、下記に起因していた。
【００４８】
１）同時輸送にＨ（＋）の利用可能性が低下したことに続いてのモノカルボキシレートＢ−Ｈ（＋）トランスポータの活性低下によって、ラクテートおよびピルベートの流出が低下したこと、および
【００４９】
２）細胞外空間からのラクテート（さらにおそらくピルベート）の取り込み増加が起こり、それはおそらく、モノカルボキシレート−Ｈ（＋）トランスポータにより媒介されており、そのことは、Ｎａ（＋）−Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅの活性低下と特異的に関連していた。
【００５０】
細胞質ゾルの２種の解糖コンパートメントの酸化還元電位は平衡を維持していること、かつ、細胞質ＮＡＤＨ／ＮＡＤ酸化還元電位がＮａ（＋）−Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅのための細胞質ゾルコンパートメントにおいて解糖フラックスが変動するにもかかわらず静止状態で一定のままであると結論した。
【００５１】
メチルピルベートを、特定態様を参考に説明してきた。当業者は、下記の請求の範囲の精神と範囲から逸脱することなく他に修飾も強調も行うことができる。
【００５２】
特に重要と考えられる本発明の特徴に注目して上述の明細書を記載してきたが、特に強調していない箇所でもこれまで述べた特許可能な特徴に関して出願人が保護を請求していることを理解されたい。
【国際調査報告】
2008508312.tif 000002
2008508312.tif 000003